(57)【要約】本発明は、対象における血液脳関門透過性を増加させる方法に関する。この方法は、増加した血液脳関門透過性から利益を得る可能性のある対象を選択する段階、および、選択された対象を治療に供する段階を含む。この治療は、前記対象における血液脳関門透過性を増加させるのに有効な条件下で、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる。対象において血液脳関門透過性を減少させる方法、中枢神経系の障害または状態について対象を治療する方法、および、血液脳関門透過性を増加させるのに効果的な化合物を選別する方法、ならびに、薬剤も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における血液脳関門透過性を増加させる方法であって、
増加した血液脳関門透過性から利益を得る可能性のある対象を選択する段階と、
前記対象における血液脳関門透過性を増加させるのに有効な条件下で、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる治療に、前記選択された対象を供する段階と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記選択された対象を、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させる治療に供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された対象を、アデノシン受容体を調節する治療に供する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ａ２ａアデノシン受容体アゴニストが投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ａ１アデノシン受容体アンタゴニストが投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記選択された対象を、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる治療に供する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記選択された対象が、精神医学的／行動性障害およびＣＮＳ疾患からなる群から選択される状態を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記選択された対象が、統合失調症、躁鬱病、認知症、および、双極性障害からなる群から選択される精神医学的／行動性障害を有している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
対象における血液脳関門透過性を減少させる方法であって、
減少した血液脳関門透過性から利益を得る可能性のある対象を選択する段階と、
前記対象における血液脳関門透過性を減少させるのに有効な条件下で、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を減少させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を減少させる治療に、前記選択された対象を供する段階と、
を含む、方法。
【請求項１０】
前記選択された対象を、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を減少させる治療に供する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択された対象を、アデノシン受容体を調節する治療に供する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
Ａ２ａアデノシン受容体アンタゴニストが投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ａ１アデノシン受容体アゴニストが投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記選択された対象を、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を減少させる治療に供する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、炎症性疾患を有している、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、リンパ球が脳内に入り込むことによって媒介される状態を有している、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、中枢神経系の脳炎、パーキンソン病、てんかん、ＨＩＶによる神経学的兆候−ＡＩＤＳ、ループスの神経学的後遺症、ハンチントン病、および脳腫瘍からなる群から選択される状態を有している、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、髄膜炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）脳炎、および進行性多巣性白質脳症からなる群から選択される状態を有している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
中枢神経系の障害または状態について対象を治療する方法であって、
前記中枢神経系の前記障害または状態を有している対象を選択する段階と、
前記中枢神経系の前記障害または状態を治療するのに有効な治療用物質を提供する段階と、
アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる血液脳関門透過剤を提供する段階と、
前記治療用物質および前記血液脳関門透過剤を、前記治療用物質が血液脳関門を通過して前記障害または状態を治療するのに有効な条件下で、前記選択された対象に投与する段階と、
を含む、方法。
【請求項２０】
前記治療用物質および前記血液脳関門透過剤が、共に結合される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記血液脳関門透過剤が、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記血液脳関門透過剤が、アデノシン受容体を調節する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
Ａ２ａアデノシン受容体アゴニストが投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ａ１アデノシン受容体アンタゴニストが投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記血液脳関門透過剤が、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与する段階が、静脈内に行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
血液脳関門透過性を増加させるのに効果的な化合物を選別する方法であって、
未改変の動物と比較して、低下したＣＤ７３発現レベル、低下したアデノシン発現レベル、および／または、調節されたアデノシン受容体活性を有する改変された動物を提供する段階と、
１つまたは複数の候補化合物を提供する段階と、
前記１つまたは複数の候補化合物を前記改変された動物に投与する段階と、
前記１つまたは複数の候補化合物がアデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させるかどうかを評価する段階と、
前記改変された動物において、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させるこれら候補化合物を、血液脳関門透過性を増加させるのに潜在的に効果的であるとみなす段階と、
を含む、方法。
【請求項２８】
中枢神経系の障害または状態を治療するのに有効な治療用物質と、
アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる、血液脳関門透過剤と、
を含む、薬剤。
【請求項２９】
前記治療用物質および前記血液脳関門透過剤が、共に結合されている、請求項２８に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／０３５，２５０号、および２００８年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／０３７，１４５号の恩典を主張するものであり、これら米国仮特許出願の内容全体を参照によって本願明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、血液脳関門透過性の調節に関する。
【背景技術】
【０００３】
中枢神経系（「ＣＮＳ」）に入り込む血液に対する関門は、本明細書において血液脳関門（「ＢＢＢ」）と集合的に呼ばれる。ＢＢＢは、脳内の４００マイルの毛細血管および血管を覆う、内皮細胞の極めて緊密な層である（ランソホフ（Ransohoff）ら著、「中枢神経系への白血球移動のための３つまたはそれ以上の経路（Three or More Routes for Leukocyte Migration Into the Central Nervous System）」、ネイチャー・レビューズ・イミュノロジー（Nature Rev. Immun.）、３：５６９〜５８１、２００３年（非特許文献１））。ＢＢＢ細胞間のほぼ不透過性の接合部は、約２０種類の異なるタンパク質が互いにかみ合うことによって形成される。分子は、膜に埋め込まれたタンパク質輸送体を介して、あるいは、ＢＢＢ細胞の蝋質外膜を直接すり抜けることによってＢＢＢ細胞に入り込まなければならない。外来化合物は、いったん内側に入り込むと、外来物質を排除するよう予備刺激された様々な混然としたタンパク質ポンプおよび高濃度の代謝酵素を避けなければならない。これらの障害物を避けたら、外来分子はその後、ＢＢＢ細胞の内膜を通過して最終的に脳へ達しなければならない。これらの精巧な防御により、ＢＢＢは潜在的な損傷から脳を隔離することができるが、ＢＢＢはまた、脳内の疾患部位への神経薬の送達も妨害する。学術研究機関ならびにバイオテクノロジーおよび医薬品産業の研究者は、ＢＢＢを迂回すること、または、ＢＢＢに潜在的な薬物を脳へ入れさせることを学んでいる。彼らは、ＢＢＢを通って受動的に拡散するか、または栄養輸送体に乗って移動して脳の内側に達することができる小薬物を設計している。他の者は、脳が無意識に飲み込むことになるように設計された潜在的な治療用物質を付着させている。
【０００４】
脳細胞に血液を供給する毛細血管は、血液脳関門を構成する（ゴールドシュタイン（Goldstein）ら著、「血液脳関門（The Blood-Brain Barrier）」、サイエンティフィック・アメリカン（Scientific American）、２５５：７４〜８３、１９８６年（非特許文献２）；パードリッジ（Pardridge）著、「血液脳関門を通る受動体介在性ペプチド輸送（Receptor-Mediated Peptide Transport Through the Blood-Brain Barrier）」、エンドクリン・レビューズ（Endocrin. Rev.）、７：３１４〜３３０、１９８６年（非特許文献３））。脳毛細血管を形成する内皮細胞は、身体の他の組織内に見出される細胞と異なる。脳毛細血管の内皮細胞は、血液から脳およびＣＮＳの他部分への分子の受動拡散に対抗する連続壁を形成する密着した細胞間接合部により共に結合される。これらの細胞はまた、他の組織において毛細血管壁を横切る多少の無差別輸送を可能にする飲作用胞をほとんど有しない、という点で異なる。また、無制限通過を可能にし得る細胞間を延びる連続間隙またはチャネルを欠いている。
【０００５】
血液脳関門は、脳環境が絶えず制御されることを確実にするように機能する。ホルモン、アミノ酸、およびイオンなどの、血液中の様々な物質のレベルは、食事および運動などの活動によってもたらされ得る頻繁な小変動を起こす（ゴールドシュタインら著、「血液脳関門」、サイエンティフィック・アメリカン、２５５：７４〜８３、１９８６年；パードリッジ著、「血液脳関門を通る受動体介在性ペプチド輸送」、エンドクリン・レビューズ、７：３１４〜３３０、１９８６年（非特許文献４））。脳が、血液脳関門によって血清成分中のこれらの変化から保護されなければ、その結果は、無制御な神経活動となり得る。
【０００６】
脳は、血流から完全に隔離されるわけではない。もしそうなら、脳は、栄養素の欠乏に起因して、および、身体の残りの部分と化学物質を交換する必要があることから、適切に機能することができないであろう。毛細血管の内皮細胞内部の特異的輸送システムの存在が、脳が正常な成長および機能に必要な全ての化合物を制御された方法で受け取ることを確実にする。多くの場合、これらの輸送システムは、特定の分子と選択的に結合し関門膜を横切ってこの分子を輸送する、膜結合タンパク質からなる。これらの輸送体タンパク質は、溶質担体輸送体（solute carrier transporters）として知られている。
【０００７】
ＢＢＢは、ＣＮＳ疾患において潜在的毒性化合物への曝露からＣＮＳを保護することによって通常の条件下で保護機能を果たすと考えられているが、ＢＢＢは、治療化合物がＣＮＳ内に入り込むことを妨げることによって治療努力を妨害することもある。例えば、多くの細菌感染症および真菌感染症は、感染症部位がＣＮＳの外側にある場合は容易に治療することができるが、ＣＮＳ内のそのような感染症はしばしば、非常に危険で、薬物の有効量を感染症部位に送達することができないことに起因して治療するのが非常に困難である。同様に、ＢＢＢの作用が、ＣＮＳの外側に位置するガンの治療よりも、脳ガンの治療をより困難にしている。ＣＮＳの外側に非常に大量の薬物を投与することによってＣＮＳ内に有効量の薬物を送達することが可能であっても、（血液中などの）ＣＮＳの外側の薬物レベルはその後、腎臓、肝臓、および他の生命維持に必要な器官に有害な毒性レベルに達するほど高くなることがしばしばある。したがって当技術分野において、化合物のＣＮＳ内への送達を改善するための方法の必要性が存在する。
【０００８】
加えて、浮腫、脳外傷、脳卒中、および多発性硬化症を有している患者は、主要な損傷部位の近傍におけるＢＢＢの破損を示す。破損レベルは、これらの疾患の臨床転帰に深刻な影響を及ぼしうる。例えば、多発性硬化症（「ＭＳ」）を有している患者におけるＢＢＢ破損度は、疾患の重症度に相関する。人がＭＳ「攻撃」を受けている場合、血液脳関門は、脳または脊髄の一部分において破損していて、それによりＴリンパ球と呼ばれる白血球細胞が血液脳関門を越え、かつミエリンを破壊しうることが、磁気共鳴映像法（「ＭＲＩ」）を使用して示された。
【０００９】
この関門の重要性にも関わらず、ＢＢＢの完全性および／または透過性を制御する分子機構についてほとんど知られていない。ゆえに、そのような研究を促進する、特に診断的および／または治療的応用のための、組成物および方法に対する重要な必要性が依然として存在する。
【００１０】
本発明は、当技術分野におけるこれらおよび他の欠陥を克服することを対象にしている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ランソホフ（Ransohoff）ら著、「中枢神経系への白血球移動のための３つまたはそれ以上の経路（Three or More Routes for Leukocyte Migration Into the Central Nervous System）」、ネイチャー・レビューズ・イミュノロジー（Nature Rev. Immun.）、３：５６９〜５８１、２００３年
【非特許文献２】ゴールドシュタイン（Goldstein）ら著、「血液脳関門（The Blood-Brain Barrier）」、サイエンティフィック・アメリカン（Scientific American）、２５５：７４〜８３、１９８６年
【非特許文献３】パードリッジ（Pardridge）著、「血液脳関門を通る受動体介在性ペプチド輸送（Receptor-Mediated Peptide Transport Through the Blood-Brain Barrier）」、エンドクリン・レビューズ（Endocrin. Rev.）、７：３１４〜３３０、１９８６年
【非特許文献４】ゴールドシュタインら著、「血液脳関門」、サイエンティフィック・アメリカン、２５５：７４〜８３、１９８６年；パードリッジ著、「血液脳関門を通る受動体介在性ペプチド輸送」、エンドクリン・レビューズ、７：３１４〜３３０、１９８６年
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、対象における血液脳関門透過性を増加させる方法に関する。この方法は、増加した血液脳関門透過性から利益を得る可能性のある対象を選択する段階、および、選択された対象を処置に供する段階を含む。この処置は、対象における血液脳関門透過性を増加させるのに有効な条件下で、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる。
【００１３】
本発明はまた、対象における血液脳関門透過性を減少させる方法に関する。この方法は、減少した血液脳関門透過性から利益を得る可能性のある対象を選択する段階、および、選択された対象を処置に供する段階を含む。この処置は、対象における血液脳関門透過性を減少させるのに有効な条件下で、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を減少させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を減少させる。
【００１４】
本発明はまた、中枢神経系の障害または状態について対象を処置する方法に関する。この方法は、中枢神経系の障害または状態を有している対象を選択する段階、および、中枢神経系の障害または状態を治療するのに有効な治療用物質を提供する段階を含む。アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる、血液脳関門透過剤が、提供される。治療用物質および血液脳関門透過剤は、治療用物質が血液脳関門を通過して障害または状態を治療するのに有効な条件下で、選択された対象に投与される。
【００１５】
本発明はまた、血液脳関門透過性を増加させるのに効果的な化合物を選別する方法に関する。この方法は、未改変の動物と比較して、低下したＣＤ７３発現レベル、低下したアデノシン発現レベル、および／または、調節されたアデノシン受容体活性を有する改変された動物を提供する段階を含む。また、１つもしくは複数の候補化合物が提供され、その１つもしくは複数の候補化合物は、該改変された動物に投与される。その後、その１つもしくは複数の候補化合物がアデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させるかどうかが、評価される。該改変された動物において、アデノシンレベルまたは生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させるこれら候補化合物はその後、血液脳関門透過性を増加させるのに潜在的に効果的であるとみなされる。
【００１６】
本発明はまた、薬剤に関する。この薬剤は、中枢神経系の障害または状態を治療するのに有効な治療用物質、および血液脳関門透過剤を有する。この血液脳関門透過剤は、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる。
【００１７】
本発明の方法および薬剤は、血液脳関門に影響を与える障害を有している対象に対する改善された治療を提供する。加えて、本発明は、そのような患者の治療的処置を高めるために血液脳関門を制御する改善された方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｃｄ７３−／−マウスが実験的自己免疫性脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）に耐性を示すことを証明するグラフである。ＥＡＥを誘導し、疾患活動性を毎日監視し、平均ＥＡＥ評点を、ｃｄ７３−／−マウス（白抜き菱形、ｎ＝１１）、および野生型マウス（ｃｄ７３＋／＋）（塗り潰された正方形、ｎ＝１３）について計算した。示された結果は、１１回の別個の実験を代表している。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、ｃｄ７３−／−Ｔ細胞が、ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−マウスに移植されると、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１７の値の上昇を生じ、ＥＡＥ感受性に影響を与えることを示している。図２Ａは、未処置およびＥＡＥ誘導後１３日目の、ｃｄ７３−／−マウスおよび野生型マウスからの脾細胞において測定されたＣＤ４およびＦｏｘＰ３の発現を示している。図２Ｂは、未処置およびＭＯＧ免疫化後１３日目の野生型マウスからの脾細胞であって、ＣＤ４およびＣＤ７３の細胞表面発現についてフローサイトメトリーにより分析された、脾細胞を示している。図２Ｃは、免疫された野生型マウスまたはｃｄ７３−／−マウスからの分別された細胞であって、１×１０４の照射された脾細胞および０μＭまたは１０μＭのＭＯＧペプチドで培養された、分別された細胞を示している。１８時間の時点で上澄み液を取り、サイトカインＢｉｏ−ｐｌｅｘアッセイを行った。結果は、０μＭおよび１０μＭのＭＯＧペプチド群間のサイトカインレベルの倍率変化（fold change）を表している。サンプルは、４匹のマウスから蓄え、３つの同様の実験から１つを代表する。図２Ｄは、Ｔ細胞欠損ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒα−/−マウス内に養子移入された、ＭＯＧ免疫化ｃｄ７３−/−マウス（白抜き菱形、ｎ＝５）、または、野生型マウス（塗り潰された正方形、ｎ＝５）からの脾臓およびリンパ節のＣＤ４＋Ｔ細胞を示している。ＥＡＥを誘導し、疾患進行を毎日監視した。結果は２つの別個の実験を代表している。
【図３】図３Ａ〜図３Ｌは、ＥＡＥ誘導の後にＣＮＳリンパ球浸潤をほとんど、または全く示さないｃｄ７３−／−マウスを示している；すなわち、ドナーｃｄ７３−/−Ｔ細胞は、ＥＡＥ誘導の後にｃｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−レシピエントマウスのＣＮＳに浸潤する。ＥＡＥ誘導後１３日目の野生型マウス（図３Ａ〜図３Ｃ）およびｃｄ７３−／−マウス（図３Ｄ〜図３Ｆ)からの凍結組織切片をＣＤ４抗体で標識付けした。図３Ｇは、ＥＡＥ誘導後１３日目の野生型マウスおよびｃｄ７３−／−マウスからの凍結組織切片内の、領域ごとに定量化された脳および脊髄内のＣＤ４＋浸潤リンパ球の平均数を示している。マウス１匹あたり、１つの脳につき８つの解剖学的に同様の領域、および１つの脊髄につき４つの領域を、１０×倍率で分析した（ｎ＝５マウス／群）。エラーバーは、平均値の標準誤差を表している。図３Ｈ〜図３Ｌは、ＥＡＥ誘導後、第１２日目（図３Ｋ）、第１８日目（図３Ｈおよび図３Ｌ）、または第２２日目（図３Ｉおよび図３Ｊ）の野生型マウス（図３Ｈ〜図３Ｊ）または、ｃｄ７３−／−マウス（図３Ｋ〜図３Ｌ）からＣＤ４＋細胞を受け取ったＥＡＥ誘導ｔｃｒα−／−マウスからのＣＤ４抗体で標識付けされた海馬（図３Ｈ、図３Ｉ、および図３Ｋ）ならびに小脳（図３Ｊおよび図３Ｌ）の凍結組織切片を示している。ヘマトキシリン（hemotoxylin）染色された核の背景（青色）に対するＨＲＰ抗ラットＩｇ＋ＡＥＣ（赤色）を用いて免疫反応性を検出した。矢印がリンパ球浸潤の部位を示す。スケールバーは５００μｍを表す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｋは、ＥＡＥ誘導後にＣＮＳリンパ球浸潤をほとんど、または全く示さないｃｄ７３−／−マウスを示している；すなわち、ｃｄ７３−／−Ｔ細胞は、ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−マウスへの移入およびＥＡＥ誘導の後、ＣＮＳに浸潤する。ＥＡＥ誘導後１３日目の野生型マウス（図４Ａ〜図４Ｃ）およびｃｄ７３−／−マウス（図４Ｄ〜図４Ｆ)からの凍結組織切片をＣＤ４５抗体で標識付けした。ＥＡＥ誘導後、第１２日目（図４Ｊ）、第１８日目（図４Ｇおよび図４Ｋ）、または第２２日目（図４Ｈおよび図４Ｉ）の野生型マウス（図４Ｇ〜図４Ｉ）または、ｃｄ７３−／−マウス（図４Ｊ〜図４Ｋ）からＣＤ４＋細胞を受け取ったＥＡＥ誘導ｔｃｒα−／−マウスからのＣＤ４５抗体で標識付けされた海馬（図４Ｇ、図４Ｈ、および図４Ｊ）ならびに小脳（図４Ｉおよび図４Ｋ）の凍結組織切片を示している。ヘマトキシリン（hemotoxylin）染色された核の背景（青色）に対するＨＲＰ抗ラットＩｇ＋ＡＥＣ（赤色）を用いて免疫反応性を検出した。矢印がリンパ球浸潤の部位を示す。スケールバーは５００ｍｍを表す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、ミエリン特異的Ｔ細胞が、ＥＡＥ誘導後、ｃｄ７３−／−マウスの脳に効率的に入り込まないことを示している。ＭＯＧ３５−５５に特異的なＴ細胞レセプターを発現させる、ＭＯＧ３５−５５免疫化形質転換２ｄ２マウスからのＶβ１１＋Ｔ細胞を、脾臓およびリンパ節から分離し、ＥＡＥ誘導を伴って野生型マウスまたはｃｄ７３−／−マウスへ養子移入した。移入およびＥＡＥ誘導後、１日目、３日目、８日目、および１５日目に、脾臓（図５Ａ）、リンパ節（図５Ｂ）、および脳（図５Ｃ）を取り出し、細胞を収穫した。細胞をＣＤ４５およびＶβ１１発現についてフローサイトメトリーによって分析した。データは、与えられたそれぞれの日のそれぞれの器官について、ＣＤ４５＋集団中のＶβ１１＋細胞のパーセンテージにおける相対倍率変化（relative fold change）（ＲＦＣ）を表す。数値は、１．０を基準値に等しいものとし、移入／ＥＡＥ誘導後１日目の時点の各器官で見出された細胞パーセンテージに基準化した。
【図６】図６Ａ〜図６Ｄは、養子移入された、野生型マウスからのＣＤ７３＋Ｔ細胞が、ＥＡＥ感受性をｃｄ７３−／−マウスに与えることができるということを示している。図６Ａは、ＭＯＧ免疫化野生型マウスの脾臓およびリンパ節からのＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮し、野生型マウス（塗り潰された正方形、ｎ＝５）またはｃｄ７３−／−マウス（白抜き菱形、ｎ＝５）へ養子移入して、続いて、付随するＥＡＥを誘導したことを示している。２つの独立した実験のうちの一方からの結果を示している。図６Ｂは、先に免疫化された野生型マウスおよびｃｄ７３−／−マウスの脾臓およびリンパ節からのＴ細胞をＣＤ４およびＣＤ７３発現に基づいて分別し、ｃｄ７３−／−マウス内に養子移入して、続いて、付随するＥＡＥを誘導したことを示している（ｎ＝５／各群）。塗り潰された正方形はＣＤ７３を発現させる野生型マウスからのドナー細胞を表し；白抜き正方形はＣＤ７３発現を欠く野生型マウスからのドナー細胞を表し；白抜き菱形はｃｄ７３−／−マウスからのドナー細胞を表す。図６Ｃ〜図６Ｄは、未処置の野生型マウス（図６Ｃ左）およびｃｄ７３−／−マウス（図６Ｃ右）ならびにＥＡＥ誘導後１２日目の野生型マウス（図６Ｄ）からのＣＮＳ脈絡叢の凍結組織切片を、ＣＤ７３特異的抗体で（図６Ｃ）、またはＣＤ４５特異的抗体（図６Ｄ）で染色したことを示している。ヘマトキシリン（hemotoxylin）染色された核の背景（青色）に対するＨＲＰ抗ラットＩｇ＋ＡＥＣ（赤色）を用いて免疫反応性を検出した。括弧がＣＤ７３染色を指し示している。矢印はＣＤ４５リンパ球染色を指し示している。スケールバーは５００μｍを表す。
【図７】図７Ａ〜図７Ｄは、アデノシン受容体遮断がマウスをＥＡＥの発症から保護するということを示している。図７Ａは、ＥＡＥが誘導された場合の平均ＥＡＥ評点を示しており、疾患活動性を毎日監視し、平均ＥＡＥ評点を、飲料水単独（塗りつぶされた形状）、または広域スペクトルアデノシン受容体アンタゴニストカフェインが０．６ｇ／ｍＬを加えた飲料水（白抜き形状）のどちらか一方を与えられた、野生型マウス（正方形）およびｃｄ７３−／−マウス（菱形）において計算した。結果は１回の実験による（一群につき、ｎ＝５マウス）。図７Ｂは、Ｚ３１０マウス脈絡叢細胞株におけるＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子と比べたアデノシン受容体ｍＲＮＡの発現レベルを示している。サンプルを３通りで実行した；エラーバーは平均値の標準誤差を表す。図７Ｃは、マウスを、ＥＡＥ誘導の１日前に、およびＥＡＥ誘導後第３０日目まで毎日、４５％ＤＭＳＯ中、２ｍｇ／ｋｇのＡ２ａアデノシン受容体アンタゴニストＳＣＨ５８２６１（皮下に１ｍｇ／ｋｇおよび腹腔内に１ｍｇ／ｋｇ）（塗りつぶされた正方形、ｎ＝４マウス／群）、または、４５％ＤＭＳＯ単独（白抜き正方形、ｎ＝５マウス／群）で処置した後の結果を示している。これらの結果は、２つの実験を代表している。図７Ｄは、ＥＡＥ誘導後１５日目のＳＣＨ５８２６１処置およびＤＭＳＯ処置のマウスからの凍結組織切片内の、領域ごとに定量化された脳および脊髄中のＣＤ４＋浸潤リンパ球の平均数を示している。マウス１匹あたり、１つの脳につき８つの解剖学的に同様の領域、および１つの脊髄につき４つの領域を、１０×倍率で分析した（ｎ＝４マウス）。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【図８】Ａ２ａアデノシン受容体アンタゴニストＳＣＨ５８２６１がＥＡＥ誘導後に脈絡叢におけるＩＣＡＭ−１上方制御を防ぐことを示している。マウスを、ＥＡＥ誘導の１日前に、およびＥＡＥ誘導後第３０日目まで毎日、ＤＭＳＯ中のＡ２ａアデノシン受容体アンタゴニストＳＣＨ５８２６１、２ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／ｋｇは皮下に与え、１ｍｇ／ｋｇは腹腔内に与えた）（ｎ＝４マウス／群）、またはＤＭＳＯ単独（ｎ＝５マウス／群）で処置した。これらの結果は１回の実験による。ＥＡＥ誘導後１５日目の、ＳＣＨ５８２６１およびＤＭＳＯで処置されたマウスからの凍結組織切片を、脈絡叢におけるＩＣＡＭ−１発現について調べた。４０×倍率における、ＩＣＡＭ−１（赤色染色、白い矢印）およびＤＡＰＩ（青色、核）に染色された、ＤＭＳＯで処置された野生型（左）、またはＳＣＨ５８２６１で処置された野生型（右）。画像は４匹の別個のマウスによるものである。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、細胞外アデノシンを欠き、ゆえにアデノシン受容体を介する適切なシグナル伝達ができないＣＤ７３−／−マウスを、ＮＥＣＡで処置し、その結果、ＰＢＳ対照に対してほぼ５倍の色素移動の増加をもたらしたことを示している（図９Ａ）。ＮＥＣＡで処置された野生型マウスはまた、対照マウスを超える増加を示している（図９Ｂ）。百日咳はマウスＥＡＥモデルにおいて血液脳関門漏出を誘導することが知られているので、百日咳を陽性対照として使用した。
【図１０】ヒト内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３上でのアデノシン受容体発現を示している。
【図１１】ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜上に播種してコンフルエントまで増殖させた後の結果を示している；ＮＥＣＡ（一般的なアデノシン受容体（ＡＲ）アゴニスト）、ＣＣＰＡ（Ａ１ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ  ２１８６０（Ａ２ＡＡＲアゴニスト）、またはＤＭＳＯ媒体を用いて、あるいは用いずに、２×１０６のジャーカット細胞を上層チャンバに加え、移動した細胞を２４時間後に数えた。
【図１２】Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜にＺ３１０細胞を播種しコンフルエントまで増殖させた後の結果を示している；ＮＥＣＡ（ｎ＝１、一般的なＡＲアゴニスト）、ＣＣＰＡ（ｎ＝１、Ａ１ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ  ２１８６０（ｎ＝１、Ａ２ＡＡＲアゴニスト）、またはＤＭＳＯ媒体（ｎ＝１）を用いるか、または用いずに、２×１０６のジャーカット細胞を上層チャンバに加え、移動した細胞を２４時間後に数えた。
【図１３】ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を２４ウェルプレート上でコンフルエントまで増殖させた後の結果を示している；様々な濃度のＮＥＣＡ（一般的なＡＲアゴニスト）、ＣＣＰＡ（Ａ１ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ  ２１８６０（Ａ２ＡＡＲアゴニスト）、ＤＭＳＯ媒体、またはＦｏｒｋｓｏｌｉｎ（ｃＡＭＰを誘導する）を用いて、あるいは用いずに細胞を処理し；１５分後、溶解バッファーを加えて、反応を停止させるために細胞を−８０℃で凍結させて；ｃＡＭＰ  Ｓｃｒｅｅｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスター・シティー）を使用して、ｃＡＭＰレベルを検定した。
【図１４】２００８年２月１２日にＣＦＡ／ＭＯＧ３５−５５＋ＰＴＸで免疫化し、４１日間毎日評点を付けた、雌Ａ１アデノシン受容体ノックアウト（Ａ１ＡＲＫＯ、ｎ＝５）マウス、および野生型（ＷＴ、ｎ＝５）マウスの結果を示している。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｂは、脳内皮を通るＦＩＴＣ−デキストラン溢出によって測定された、カフェインを給餌された野生型マウスの脳、およびカフェインを給餌されたＣＤ７３−／−マウスの脳を示している。
【図１６】アデノシン受容体アンタゴニストであるＳＣＨ５８２６１がＦＩＴＣデキストラン溢出を阻害する間、アデノシン受容体アゴニストであるＮＥＣＡで処置された野生型マウスの血液脳関門を横切るＦＩＴＣデキストラン溢出の結果をグラフの形で示している。
【図１７】マウスをアデノシン受容体アゴニストであるＮＥＣＡで処置した後、ＢｉｏＴｅｘ分光光度計によって６２０ｎｍにおいて測定された、血液脳関門を横切るエバンスブルー色素溢出の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の一態様は、対象における血液脳関門透過性を増加させる方法を対象にしている。この方法は、増加した血液脳関門透過性から利益を得る可能性のある対象を選択する段階、および、選択された対象を治療に供する段階を含む。この治療は、対象における血液脳関門透過性を増加させるのに有効な条件下で、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる。
【００２０】
アデノシンは、低酸素、虚血、または炎症状態において生成される代謝困難の細胞シグナルである。その主な仕事は、酸素供給／要求率の増加、プレコンディショニング、抗炎症作用、および、血管形成の刺激を含む、様々な受容体介在性メカニズムによって、組織損傷を減らし修復を促進することである（ジェイコブソン（Jacobson）ら著、「治療標的としてのアデノシン受容体（Adenosine Receptors as Therapeutic Targets）」、ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー（Nat. Rev. Drug Discov.）、５：２４７〜２６４、２００６年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。アデノシンの生物学的効果は最終的には、受容体分布の異なるパターンおよび／または特定の細胞タイプにおける４つの既知のアデノシン受容体（「ＡＲ」）サブタイプの親和性によって決定される。
【００２１】
ＣＤ７３（エクト−５’−ヌクレオチダーゼ）は、エクト−酵素活性を有する７０ｋＤグリコシル−ホスファチジル−イノシトール−アンカー細胞表面分子である。これは多くの細胞タイプ上に豊富に発現され、その細胞タイプには、リンパ球のサブセット（ヤマシタら著、「マウスリンパ球におけるＣＤ７３発現およびＦｙｎ依存性シグナル伝達（CD73 Expression and Fyn-Dependent Signaling on Murine Lymphocytes）」、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Eur. J. Immunol.）、２８：２９８１〜２９９０、１９９８年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、内皮細胞（ヤマシタら著、「マウスリンパ球におけるＣＤ７３発現およびＦｙｎ依存性シグナル伝達」、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー、２８：２９８１〜２９９０、１９９８年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、および、上皮細胞（ストローメイヤー（Strohmeier）ら著、「ヒト腸管上皮におけるＣＤ７３の表面発現、極性化、および機能的意義（Surface Expression, Polarization, and Functional Significance of CD73 in Human Intestinal Epithelia）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J. Clin. Invest.）、９９：２５８８〜２６０１、１９９７年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）が含まれる。これは、ヌクレオシド−５’−一リン酸（ＡＭＰおよびＩＭＰ）をアデノシンおよびイノシンのようなヌクレオチドに分解することによるプリンサルベージ経路の一部である。
【００２２】
ＣＤ７３制御の適切な方法は、内容全体を参照により本願明細書に組み込むヤルカネン（Jalkanen）に付与された米国特許出願公開第２００６／０１９８８２１（Ａ１）号に記載されているように、組換えＣＤ７３タンパク質を投与すること、あるいは、内皮のＣＤ７３発現を誘導することができるサイトカインまたは別因子によるか、あるいは、両療法の組み合わせによることを含む。より詳細には、本発明において使用されるべき適切な物質は、ＣＤ７３遺伝子の転写を直接的または間接的に上方制御するサイトカインまたは他の因子を含む。本発明での使用のために適切なサイトカインは典型的には、インターフェロンまたはインターロイキンであるが、他の物質も使用されうる。該サイトカインがインターフェロンである場合、該インターフェロンは、α−、β−、γ−、ω−、または任意の他のインターフェロンであってよく、前述したインターフェロンの任意のサブタイプであることもできる。特にα−インターフェロンおよびβ−インターフェロンが本発明での使用に適していると考えられる。内皮のＣＤ７３発現を誘導できる任意のインターロイキンもまた、本発明での使用に適している。そのようなインターロイキンの例には、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＩＬ−２０が含まれる。
【００２３】
一実施形態では、組換えＣＤ７３タンパク質またはサイトカインまたは双方の投与は、上昇した発現により、または組換えＣＤ７３タンパク質の直接的投与により得られる、上昇したＣＤ７３レベルの結果として産生されるアデノシンの源を保護するために、アデノシン一リン酸（「ＡＭＰ」）の投与と組み合される。
【００２４】
組換えＣＤ７３タンパク質またはサイトカインまたは双方の投与は、ＡＭＰがアデノシン二リン酸（「ＡＤＰ」）またはアデノシン三リン酸（「ＡＴＰ」）に転換するのを防ぐアデニル酸キナーゼ阻害剤の投与と共に行うことができる。
【００２５】
代替的に、組換えＣＤ７３タンパク質またはサイトカインまたは双方の投与は、アデノシンの変質を防ぐアデノシンデアミナーゼ阻害剤の投与と組み合わせてもよい。このことはさらに、ＡＭＰ、および任意にＡＭＰがアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に転換するのを防ぐアデニル酸キナーゼ阻害剤も投与することと組み合わせることもできる。
【００２６】
（上述したようにＣＤ７３により生成されうる）細胞外アデノシンは、免疫細胞が中枢神経系に入り込むことを調整する。したがって、ＢＢＢ透過性は、局所アデノシン濃度と共にアデノシン受容体活性により調節される：Ａ１受容体は、低アデノシン濃度で活性化され（高親和性）、Ａ２ａは、高アデノシン濃度で活性化される（低親和性）。ゆえに、アデノシン有用性を増加させることは、ＢＢＢの透過性を増加させることになる。逆に、アデノシンの有用性を減少させることは、ＢＢＢの透過性を減少させることになる。加えて、ＣＤ７３レベルまたは活性を増加させることは、詳細を上述したように追加の局所アデノシンを産生し、それによりＢＢＢの透過性を増加させることになる。
【００２７】
ＣＤ７３酵素活性のプリンヌクレオシド生成物であるアデノシンは、細胞表面上の特異的受容体に結合する。アデノシンは、多くの生理学的および病理学的現象に関与すると報告されている。アデノシンは、全ての生細胞中に見出され、虚血または２０無酸素（20 anoxia）などの適切な条件下で放出されることができ、この場合アデノシンはその後、様々な生理学的効果を生み出すようにアデノシン受容体に作用することができる。
【００２８】
アデノシン受容体は現在、細胞外アデノシンと結合する内在性膜タンパク質として知られており、これによりＧタンパク質として知られている特異的グアニンヌクレオチド結合タンパク質を介して膜貫通シグナルを起こして、アデニル酸シクラーゼ、カリウムチャネル、カルシウムチャネル、およびホスホリパーゼＣを含む様々な第２メッセンジャー機構を調節する。以下の文献の内容全体を参照により本願明細書に組み込む、スタイルズ（Stiles）著、「アデノシン受容体他：生理学的調節の分子機構（Adenosine Receptors and Beyond: Molecular Mechanisms of Physiological Regulation）」、クリニカル・リサーチ（Clin. Res.）、３８（１）：１０〜１８、１９９０年；スタイルズ著、「アデノシン受容体（Adenosine Receptors）」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol Chem.）、２６７：６４５１〜６４５４、１９９２年を参照されたい。
【００２９】
Ａ２Ａアデノシン受容体を活性化することは、ＢＢＢの透過性を増加させることになる。適するアデノシン受容体Ａ２Ａ活性化因子は、当技術分野で周知であるＡ２Ａアゴニストである（プレス（Press）ら著、「アデノシン受容体アンタゴニストおよびアゴニストの治療可能性（Therapeutic Potential of Adenosine Receptor Antagonists and Agonists）」、エキスパート・オピニオン・オン・セラピューティック・パテンツ（Expert Opin. Ther. Patents）、１７（８）：１〜１６、２００７年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。他のＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストは、リンディン（Lindin）らに付与された米国特許第６，２３２，２９７号および米国特許出願公開第２００３／０１８６９２６（Ａｌ）号、サブロッキ（Zablocki）らに付与された米国特許出願公開第２００５／００５４６０５（Ａ１）号、ならびにリー（Li）らに付与された米国特許出願公開第２００６／００４０８８８（Ａｌ）号、同第２００６／００４０８８９（Ａｌ）号、同第２００６／０１００１６９（Ａｌ）号および同第２００８／００６４６５３（Ａ１）号に記載されているアゴニストを含み、これら特許文献の内容全体を参照により本願明細書に組み込む。そのような化合物は、オルソン（Olsson）らに付与された米国特許第５，１４０，０１５号および同第５，２７８，１５０号；クリスタリー（Cristalli）に付与された米国特許第５，５９３，９７５号；ミヤサカ（Miyasaka）らに付与された米国特許第４，９５６，３４５号；ハッチンソン（Hutchinson）ら著、「ＣＧＳ  ２１６８０Ｃ，優先的降圧作用を有するＡ２選択的アデノシン受容体アゴニスト（CGS 21680C, an A2 Selective Adenosine Receptor Agonist with Preferential Hypotensive Activity）」、ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティックス（J. Pharmacol. Exp. Ther.）、２５１：４７〜５５、１９８９年；オルソンら著、「Ｎ６置換Ｎ−アルキルアデノシン−５’−ウロンアミド（N6-Substituted N-alkyladenosine-5'-uronamides）：Ａ１およびＡ２アデノシン受容体のための認識基を有する二官能性リガンド（Bifunctional Ligands Having Recognition Groups for A1 and A2 Adenosine Receptors）」、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J. Med. Chem.）、２９：１６８３〜１６８９、１９８６年；ブリッジェズ（Bridges）ら著、「Ｎ６−［２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−（２−メチルフェニル）エチル］アデノシンおよびそのウロンアミド誘導体 （N6-[2-(3,5-dimethoxyphenyl)-2-(2-methylphenyl)ethyl]adenosine and its Uronamide Derivatives）：アデノシンＡ２受容体のための高親和性および高選択性の双方を有する新規のアデノシンアゴニスト（Novel Adenosine Agonists With Both High Affinity and High Selectivity for the Adenosine A2 Receptor）」、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、３１：１２８２、１９８８年；ハッチンソン（Hutchinson）ら著、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、３３：１９１９、１９９０年；ウキーダ（Ukeeda ）ら著、「２−アルコキシアデノシン（2-Alkoxyadenosines）：冠状動脈Ａ２アデノシン受容体における強力で選択的なアゴニスト（Potent and Selective Agonists at the Coronary Artery A2 Adenosine Receptor）」、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、３４：１３３４、１９９１年；フランシス（Francis���ら著、「一連のＮ−アルキル化  ２−アミノアデノシンにおける高度に選択的なアデノシンＡ２受容体アゴニスト（Highly Selective Adenosine A2 Receptor Agonists in a Series of N-alkylated 2-aminoadenosines）」、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、３４：２５７０〜２５７９、１９９１年；ヨネヤマ（Yoneyama）ら著、「選択的アデノシンＡ２受容体アゴニスト、２−（１−オクチニル)−アデノシン（ＹＴ−１４６）の血管降圧薬メカニズムはグリベンクラミド感受性Ｋ＋チャネルの開放を含む（Vasodepressor Mechanisms of 2-(1-octynyl)-adenosine (YT-146), a Selective Adenosine A2 Receptor Agonist, Involve the Opening of Glibenclamide-sensitive K+ Channels）」、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（Eur. J. Pharmacol.）、２１３（２）：１９９〜２０４、１９９２年；ピート（Peet）ら著、「アデノシンＡ１およびＡ２受容体のための選択性を有する立体構造的に制限されたキラル（フェニルイソプロピル）アミノ−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンおよびプリン（Conformationally Restrained, Chiral (phenylisopropyl)amino-substituted pyrazolo[3,4-d]pyrimidines and Purines with Selectivity for Adenosine A1 and A2 Receptors）」、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、３５：３２６３〜３２６９、１９９２年；ならびに、クリスタリーら著、「Ａ２アデノシン受容体における選択的アゴニストとしてのアデノシンの２−アルキニル誘導体およびアデノシン−５’−Ｎ−エチルウロンアミド（2-Alkynyl Derivatives of Adenosine and Adenosine-5'-N-ethyluronamide as Selective Agonists at A2 Adenosine Receptors）」、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、３５（１３）：２３６３〜２３６８、１９９２年に、記載されているように合成されうる。これら文献の内容全体を参照により本願明細書に組み込む。これらのアデノシンＡ２Ａ受容体アゴニストは、例示的であり、限定的ではないと意図されている。
【００３０】
Ａ１アデノシン受容体のブロッキングつまり不活性化もまた、ＢＢＢの透過性を増加させることになる。適するアデノシン受容体Ａ１不活性化因子は、当技術分野で周知であるアデノシン受容体Ａ１アンタゴニストである（プレスら著、「アデノシン受容体アンタゴニストおよびアゴニストの治療可能性」、エキスパート・オピニオン・オン・セラピューティック・パテンツ、１７（８）：１〜１６、２００７年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。適するアデノシン受容体Ａ１アンタゴニストには、以下の特許文献の内容全体を参照により本願明細書に組み込む、ハーショル（Hocher）らに付与された米国特許出願公開第２００８／００２７０８２（Ａ１）号、ベラルディネッリ（Belardinelli）らに付与された米国特許第５，４４６，０４６号および同第５，６６８，１３９号、ニーリィ（Neely）に付与された米国特許第６，１１７，９９８号、ならびに、ウィルスン（Wilson）らに付与された米国特許第７，２４７，６３９号に、記載されたアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
ＢＢＢ透過性を増加させることにおいて、選択された対象は、中枢神経系（「ＣＮＳ」）障害を有していてよい。
【００３２】
（精神医学的／行動性疾患または障害を包含する）ＣＮＳの障害には、後天性てんかん様失語症、急性散在性脳脊髄炎、副腎白質ジストロフィー、脳梁の脳梁欠損症、失認、アイカルディ症候群、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、無脳症、アンゲルマン症候群、血管腫症、無酸素症、失語症、失行症、クモ膜嚢腫、クモ膜炎、アルノルト−キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、毛細血管拡張性運動失調症、注意欠陥多動性障害、自閉症、聴覚処理障害、自律神経機能不全、背部痛、バッテン病、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性限局性筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進症、両側性前頭頭頂多少脳回（bilateral frontoparietal polymicrogyria）、ビンスワンガー病、眼瞼痙攣、ブロッホ−サルズバーガー症候群、腕神経叢損傷、脳膿瘍、脳傷害、脳損傷、脳腫瘍、脊椎腫瘍、ブラウン−セカール症候群、カナヴァン病、手根管症候群（ｃｔｓ）、灼熱痛、中枢痛症候群、橋中心髄鞘崩壊症、中心核ミオパシー、頭部障害、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、大脳萎縮症、脳性巨人症、脳性小児麻痺、シャルコー−マリー−トゥース病、キアリ奇形、舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（「ＣＩＤＰ」）、慢性疼痛、慢性局所疼痛症候群（chronic regional pain syndrome）、コフィン−ラウリー症候群、昏睡（遷延性植物状態を含む）、先天性両側顔面神経麻痺、大脳皮質基底核変性症、頭蓋動脈炎、頭蓋骨癒合症、クロイツフェルト−ヤコブ病、累積外傷障害、クッシング症候群、巨細胞性封入体病（「ＣＩＢＤ」）、サイトメガロウイルス感染症、ダンディー−ウォーカー症候群、ドーソン病（Dawson disease）、ド・モルシエ症候群、デジュリーヌ−クルンプケ麻痺、デジュリーヌ−ソッタス病、睡眠相後退症候群、認知症、皮膚筋炎、発達性統合運動障害、糖尿病性神経障害、びまん性硬化症、自律神経障害、計算力障害、書字障害、失読症、ジストニー、早期幼児てんかん性脳障害、トルコ鞍空洞症候群、脳炎、脳ヘルニア、脳三叉神経血管腫症、遺糞症、転換、エルプ麻痺、先端紅痛症、本態性振戦、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性痙性麻痺、熱性痙攣、フィッシャー症候群、フリードライヒ運動失調症、ゴーシェ病、ゲルストマン症候群、巨細胞動脈炎、巨大細胞封入体病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、異所性灰白質、ギラン−バレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症、ハラーフォルデン−シュパッツ病、頭部外傷、頭痛、片側顔面痙攣、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性多発神経炎性運動失調症、耳帯状疱疹、帯状疱疹、ヒラヤマ症候群（hirayama syndrome）、全前脳症、ハンチントン病、水無脳症、水頭症、コルチゾン過剰症、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎（immune-mediated encephalomyelitis）、封入体筋炎、色素失調症，乳児性フィタン酸蓄積症、乳児レフスム病、点頭てんかん、炎症性ミオパシー、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進症、ジュベール症候群、カーンズ−セイアー症候群、ケネディ病、キンズボーン症候群、クリッペル−フェーユ症候群、クラッベ病、クーゲルベルク−ヴェランダー病、クールー、ラフォラ病、ランバート−イートン無筋力症症候群、ランダウ−クレフナー症候群、延髄外側（ワレンベルグ）症候群、学習障害、リー��、レノックス−ガストー症候群、レッシュ−ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レヴィ小体認知症、滑脳症、閉じ込め症候群、ルーゲーリッグ病、腰部椎間板疾患、ライム病−神経学的後遺症、マシャード−ジョセフ病（脊髄小脳失調症３型）、大脳症、巨大脳症、メルカーソン−ローゼンタール症候群、メニエール病、髄膜炎、メンケス病、異染性白質ジストロフィー、小頭症、偏頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、小卒中、ミトコンドリア筋症、メビウス症候群、単肢筋萎縮症、運動ニューロン病、運動技能障害、もやもや病、ムコ多糖症、多発梗塞認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、体位性低血圧を伴う多系統萎縮症、筋ジストロフィー、筋痛性脳脊髄炎、重症筋無力症、ミエリン破壊びまん性硬化症（myelinoclastic diffuse sclerosis）、乳児ミオクローヌス性脳症、ミオクローヌス、ミオパシー、筋細管性ミオパシー、先天性ミオトニー、睡眠発作、神経線維腫症、神経遮断性悪性症候群、エイズの神経学的兆候、ループスの神経学的後遺症、神経性筋強直症、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、ニーマン−ピック病、非２４時間睡眠覚醒症候群、非言語的学習障害、オサリヴァン−マクラウド症候群（O'sullivan-mcleod syndrome）、後頭神経痛、潜在性脊髄癒合不全続発（occult spinal dysraphism sequence）、大田原症候群（ohtahara syndrome）、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌス−ミオクローヌス症候群、視神経炎、起立性低血圧症、使い過ぎ症候群、反復視、感覚異常、パーキンソン病、先天性パラミオトニー、腫瘍随伴疾患、発作（paroxysmal attacks）、パリー−ロンベルク症候群（ロンベルク症候群としても知られている）、ペリツェウス−メルツバッハー病、周期性四肢麻痺、末梢神経障害、遷延性植物状態、広汎性発達障害、光くしゃみ反射、フィタン酸蓄積症、ピック病、つままれた神経（pinched nerve）、下垂体腫瘍、ＰＭＧ、ポリオ、多小脳回、多発性筋炎、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛（「ＰＨＮ」）、感染後性脳脊髄炎、体位性低血圧、プラダー−ウィリー症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性顔面片側萎縮（ロンベルク症候群としても知られている）、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性灰白質萎縮症（progressive sclerosing poliodystrophy）、進行性核上麻痺、偽脳腫瘍、ラムゼー−ハント症候群（Ｉ型およびＩＩ型）、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経性ジストロフィー、レフサム病、反復運動障害、反復性ストレス障害、下肢静止不能症候群、レトロウイルス関連ミエロパシー、レット症候群、ライ症候群、ロンベルク症候群、狂犬病、舞踏病、サンドホフ病、統合失調症、シルダー病、裂脳症、感覚統合機能不全、中隔視神経異形成症、ゆさぶられっ子症候群、帯状疱疹、シャイ−ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、ＳＮＡＴＩＡＴＩＯＮ、ソトス症候群、痙縮、二分脊椎、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮、脊柱管狭窄、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、進行性核上麻痺を参照、脊髄小脳失調症、全身硬直症候群、脳卒中、スタージ−ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、表在性鉄沈着症、シドナム舞踏病、失神、共感覚、脊髄空洞症、遅発性ジスキネジー、テイ−サックス病、側頭動脈炎、破傷風、脊髄係留症候群、トムゼン病、胸郭出口症候群、三叉神経痛性チック、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性脳虚血発作、伝染性海綿様脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺症、トリパノソーマ症、結節性硬化症、側頭動脈炎を含む脈管炎、フォン・ヒッペル−リンダウ病（「ＶＨＬ」）、ビリウスク脳脊髄炎（Viliuisk encephalomyelitis）（「ＶＥ」）、ワレンベルグ症候群、ウェルドニッヒ−ホフマン病、ウェスト症候群、むち打ち症、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、および、ツェルウェガー症候群が含まれうるが、これらに限定されない。ゆえに、全てのＣＮＳ関連状態および障害は、ＢＢＢ経路の薬物送達により治療されうることが認識される。
【００３３】
本発明の化合物は、経口的、非経口的、例えば皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内滴下により、または、鼻、咽喉、および気管支の粘膜などの粘膜への適用により、投与されうる。これら化合物は、単独または適切な薬学的担体とともに投与されてもよく、錠剤、カプセル、粉末、液剤、懸濁剤または乳剤などの固形または液状でありうる。
【００３４】
本発明の活性化合物は、例えば不活性希釈剤を用いて、または同化性食用担体を用いて経口的に投与されてもよく、あるいは、本発明の活性化合物は、殻の堅いカプセルまたは殻の軟らかいカプセル内に封入されてもよく、あるいは、本発明の活性化合物は、錠剤に圧縮されてもよく、あるいは、本発明の活性化合物は、治療食の食品と直接組み合わされてもよい。治療的経口投与については、これら活性化合物は、賦形剤と組み合わされてもよく、錠剤、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップなどの形態で使用されてもよい。そのような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有すべきである。これらの組成物中の化合物のパーセンテージは、当然ながら変えてもよく、好都合に単位重量の約２％〜約６０％の間であってよい。そのような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、適した投与量が得られるような量である。本発明による好ましい組成物は、経口投与量単位が約１〜２５０ｍｇの間の活性化合物を含有するように調製される。
【００３５】
錠剤、カプセルなどはまた、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；第二リン酸カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモでんぷん、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；および、スクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤も含有することができる。投与量単位形態がカプセルである場合、上記種類の材料に加えて、脂肪油などの液体担体も含有することができる。
【００３６】
様々な他の材料が、被覆剤として、または投与量単位の物理的形態を変更するために、存在してもよい。例えば、錠剤は、セラック、糖、またはその双方で被覆されてもよい。シロップは、活性成分に加えて、甘味剤としてスクロース、保存料としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、ならびに、サクランボ味またはオレンジ味などの香味料を含有してもよい。
【００３７】
これら活性化合物はまた、非経口的に投与されてもよい。これら活性化合物の溶液または懸濁剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中に調製されうる。分散系もまた、グリセロール、液体ポリエチレン・グリコール、およびそれらの油中混合物に調製されうる。例示的な油は、例えばピーナッツ油、ダイズ油または鉱油である、石油由来、動物由来、植物由来、または合成由来の油である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、ならびに、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、液体担体、特に注射可能溶液に好ましい。貯蔵および使用の通常条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を妨げるために保存料を含有する。
【００３８】
注射使用に適している薬学的形態には、無菌の水溶液または水分散系、および、無菌の注射可能な溶液または分散系の即時調製のための無菌粉末が含まれる。全ての場合において、この形態は、無菌でなければならず、そして容易な注射器利用性（syringability）が存在する程度に流体でなければならない。この薬学的形態は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、これらの適切な混合物、ならびに植物油を含有する、溶媒または分散媒でありうる。
【００３９】
本発明の化合物はまた、エーロゾルの形態で気道に直接投与されてもよい。エーロゾルとして使用するために、溶液または分散系中の本発明の化合物は、例えば、従来の補助剤を含むプロパン、ブタンまたはイソブタンのような炭化水素噴射剤である、適切な噴射剤と共に加圧エーロゾル容器内に包装されてもよい。本発明の材料はまた、ネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧形態で投与されてもよい。
【００４０】
本発明の別の態様は、対象における血液脳関門透過性を減少させる方法を対象にしている。この方法は、減少した血液脳関門透過性から利益を得る可能性のある対象を選択する段階、および、選択された対象を治療に供する段階を含む。この治療は、対象における血液脳関門透過性を減少させるのに有効な条件下で、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を減少させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を減少させる。
【００４１】
本発明のこの態様は、上述された薬学的製剤および投与方法を使用して実行されうる。
【００４２】
詳細に上述したように、ＢＢＢの透過性は、局所のアデノシンレベル、ＣＤ７３、および、アデノシン受容体活性により制御される。アデノシン受容体の活性を変えることは、当技術分野において周知であるアデノシン受容体アンタゴニストおよび／またはアゴニストを提供することにより達成されうる（プレスら著、「アデノシン受容体アンタゴニストおよびアゴニストの治療可能性」、エキスパート・オピニオン・オン・セラピューティック・パテンツ、１７（８）：１〜１６、２００７年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。
【００４３】
血液関門透過性を減少させるために対象のアデノシン受容体活性を変えることは、その対象にＡ２Ａアデノシン受容体アンタゴニストおよび／またはＡ１アデノシン受容体アゴニスト（ただし、これらに限定されない）を投与することにより達成されうる。
【００４４】
いくつかのアデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストが、当業者に知られており、個別的または本明細書に記載された方法と併せて使用されうる。そのようなアンタゴニストには、（−）−Ｒ，Ｓ）−メフロキン（Ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ（商標）として販売されているラセミ混合物の活性鏡像異性体）、３，７−ジメチル−１−プロパルギルキサンチン（ＤＭＰＸ）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−７−メチル−８−（ｍ−メトキシスチリル）−１−プロパルギルキサンチン（ＭＸ２）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−８−（３−メトキシスチリル）−７−メチル−１−プロパルギルキサンチンリン酸二ナトリウム塩（3-(3-hy- droxypropyl)-8-(3-methoxystyryl)-7-methyl-l- propargylxanthin phosphate disodium salt）（ＭＳＸ−２のリン酸プロドラッグである、ＭＳＸ−３）、７−メチル−８−スチリルキサンチン誘導体、ＳＣＨ  ５８２６１、ＫＷ−６００２、アミノフリルトリアゾロ−トリ−アジニルアミノエチルフェノール（ＺＭ  ２４１３８５）、および８−クロロスチリル−カフェイン、ＫＦ１７８３７、ＶＲ２００６、イストラデフィリン、ＶＥＲ  ６４８９、ＶＥＲ  ６６２３、ＶＥＲ  ６９４７、ＶＥＲ  ７１３０、ＶＥＲ  ７１４６、ＶＥＲ  ７４４８、ＶＥＲ  ７８３５、ＶＥＲ  ８１７７ＶＥＲ−１１１３５、ＶＥＲ−６４０９、ＶＥＲ  ６４４０、ＶＥＲ  ６４８９、ＶＥＲ  ６６２３、ＶＥＲ  ６９４７、ＶＥＲ  ７１３０、ＶＥＲ  ７１４６、ＶＥＲ  ７４４８、ＶＥＲ  ７８３５、ＶＥＲ  ８１７７などのＶＥＲＮＡＬＩＳ薬物、ピラゾロ[４，３−ｅ]１，２，４−トリアゾロ[１，５−ｃ]ピリミジンおよび５−アミノ−イミダゾロ−[４，３−ｅ]−１，２，４−トリアゾロ[１，５−ｃ]ピリミジンなど（リー（Li）らに付与された米国特許出願公開第２００６／０１２８７０８号：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、ピラゾロ[４，３−ｅ]−[１，２，４]−トリアゾロ[１，５−ｃ]ピリミジン（例えば、内容全体を参照により本願明細書に組み込んだ、ケーゼ（Kase）らに付与された国際公開第０１／９２２６４号を参照のこと）、２，７−二置換−５−アミノ−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン（例えば、内容全体を参照により本願明細書に組み込んだ、ケーゼらに付与された国際公開第０３／０４８１６３号を参照のこと）、２，５−二置換−７−アミノ−[１，２，４]トリアゾロ[１，５−ａ][１，３，５]トリアジン（例えば、内容全体を参照により本願明細書に組み込んだ、ヴ（Vu）ら著、「強力で選択的なアデノシンＡ２ａ受容体アンタゴニストとしての[１，２，４]トリアゾロ[１，５−ａ][１，３，５]トリアジンのピペラジン誘導体（Piperazine Derivatives of [1,2,4]Triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as Potent and Selective Adenosine A2a Receptor Antagonists）」、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、４７(１７)：４２９１〜４２９９、２００４年を参照のこと）、９−置換−２−（置換-エチン−１−イル）−アデニン（9-substituted-2-(substituted-ethyn-1-yl)-adenines）（例えば、内容全体を参照により本願明細書に組み込んだ、ビーグルホール（Beauglehole）らに付与された米国特許第７，２１７，７０２号を参照のこと）、７−メチル−８−スチリルキサンチン誘導体、ピラゾロ[４，３−ｅ)１，２，４−トリアゾロ[１，５−ｃ]ピリミジン、および５−アミノ−イミダゾロ−[４，３−ｅ]−１，２，４−トリアゾロ[１，５−ｃ]ピリミジン（例えば、内容全体を参照により本願明細書に組み込んだ、リー（Li）らに付与された米国特許出願公開第２００６／０１２８７０８号を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。これらのアデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストは、例示的であり、限定するものではないことが意図される。
【００４５】
適するＡ１アデノシン受容体アゴニストには、内容全体を参照により本願明細書に組み込んだ、サブロッキ（Zablocki）らに付与された米国特許出願公開第２００５／００５４６０５（Ａ１）号に記載されたアゴニストが含まれる。
【００４６】
ＢＢＢ透過性を減少させることにおいて、選択された対象は、炎症性疾患を有していてよい。そのような炎症性疾患には、炎症の媒介物質が血液脳関門を通過する疾患が含まれる。そのような炎症性疾患には、細菌感染、ウイルス感染、または自己免疫疾患により引き起こされる炎症が含まれるが、これらに限定されない。さらに詳細には、そのような疾患には、髄膜炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）−１、脳炎、単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）脳炎、トキソプラズマ脳炎（Toxoplams gondii encephalitis）、および、進行性多巣性白質脳症が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
ＢＢＢ透過性が減少される場合、選択された対象はまた、リンパ球が脳へ入り込むことによって媒介される状態を有していてもよい。このような治療可能な他の状態には、脳の脳炎、パーキンソン病、てんかん、ＨＩＶによる神経学的兆候−ＡＩＤＳ、ループスおよびハンチントン病の神経学的後遺症、髄膜炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎、ＨＳＶ脳炎、ならびに進行性多巣性白質脳症が含まれる。
【００４８】
本発明のさらに別の態様は、中枢神経系の障害または状態を有する対象を治療する方法を対象にしている。この方法は、中枢神経系の障害または状態を有している対象を選択する段階、および、中枢神経系の障害または状態を治療するのに有効な治療用物質を提供する段階を含む。血液脳関門透過剤（blood brain barrier permeabilizing agent）が提供され、この血液脳関門透過性剤は、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいはＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる。治療用物質および血液脳関門透過剤は、その治療用物質が血液脳関門を通過して障害または状態を治療するのに有効な条件下で、選択された対象に投与される。
【００４９】
本発明のこの態様は、上述された薬剤および投与方法を用いて実行されうる。
【００５０】
治療用物質は、ＣＮＳの疾患または状態の治療において有用な任意の治療用物質を含んでよい。そのような他の化合物は、抗生物質、抗寄生虫剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、および抗腫瘍剤を含むが、これらに限定されない任意のクラスの薬物または薬剤であってよい。抗寄生虫剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤などと共に投与される場合、血液脳関門透過剤の化合物は、疾患の治療に適する任意の投与方法および投与経路によって、典型的には薬学的組成物として、投与されてよい。
【００５１】
治療薬は、（例えば、神経変性疾患の発症を阻害するか、または防ぐ）治療用物質として、または予防薬として送達されうる。治療用物質は、治療される根本的な障害の根絶または改善を引き起こす。予防薬は、疾患を発症させる危険性のある患者に、または、診断がまだされていないとしても、そのような疾患の１つまたはそれ以上の生理学的症状を訴える患者に投与される。代替的に、予防薬投与は、特に根本的な障害の生理学的症状が周期的に現れる場合、その症状の発症を避けるために適用されてもよい。この後者の実施形態では、該療法は、根本的な兆候の代わりに、付随する生理学的症状について予防をするものである。特定の適用に有効な実際量は、とりわけ、治療される状態および投与経路に依存する。
【００５２】
治療用物質は、免疫抑制剤、抗炎症薬、増殖抑制薬、抗遊走剤（anti-migratory agents）、抗線維化剤、アポトーシス促進薬、カルシウムチャネル遮断薬、抗悪性腫瘍薬、抗体、抗血栓剤、抗血小板剤、Ｉｌｂｌｌｌｌａ剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、化学療法剤、血栓溶解薬、血管拡張薬、抗菌薬すなわち抗生物質、有糸分裂阻害薬、増殖因子アンタゴニスト、フリーラジカル捕捉剤、生物製剤、放射線治療剤、放射線不透過性剤、放射性標識化剤、抗凝血薬（例えばヘパリンおよびその誘導体）、血管新生抑制薬（例えば、サリドマイド）、血管形成薬、ＰＤＧＦ−Ｂおよび／またはＥＧＦ阻害剤、抗炎症薬（例えば乾癬薬）、リボフラビン、チアゾフリン、ｚａｆｕｒｉｎ、抗血小板剤（例えばシクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばアセチルサリチル酸)）、ＡＤＰ阻害剤（クロピドグレルおよびｔｉｃｌｏｐｄｉｐｉｎｅなど)、ホスホジエステラーゼＩＩＩ阻害剤（hosphodiesterase III inhibitors）（シロスタゾールなど)、糖タンパク質ＩＩ／ＩＩＩＩａ剤（lycoprotein II/IIIIa agents）（アブシキシマブなど）、エプチフィバチドおよびアデノシン再取込み阻害剤（ジピリダモール（dipyridmoles）などの治癒および／または促進剤（例えば抗酸化剤および窒素酸化物ドナー））、制吐薬、制嘔吐剤、トリプジオリド（tripdiolide）、ジテルペン、トリテルペン、ジテルペンエポキシド、ジテルペノイドエポキシド、トリエポキシド、または、雷公藤（tripterygium wifordii hook F）（ＴＷＨＦ）、ＳＤＺ−ＲＡＤ、ＲＡＤ、ＲＡＤ６６６、または４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン、これらの誘導体、これらの薬学的塩、ならびに、これらの組み合わせでありうる。
【００５３】
本発明の別の態様において、治療可能剤は、生理活性タンパク質またはペプチドである。そのような生理活性タンパク質またはペプチドの例には、細胞調節ペプチド、走化性ペプチド、抗凝固ペプチド、抗血栓ペプチド、抗腫瘍ペプチド、抗感染ペプチド、成長増強ペプチド、および、抗炎症ペプチドが含まれる。タンパク質の例には、抗体、酵素、ステロイド、成長ホルモンおよび成長ホルモン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモンならびにそのアゴニストおよびアンタゴニスト類似体、ソマトスタチンおよびその類似体、ゴナドトロピン、ペプチドＴ、チロカルシトニン、副甲状腺ホルモン、グルカゴン、バソプレシン、オキシトシン、アンギオテンシンＩおよびＩＩ、ブラジキニン、カリジン、副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インスリン、グルカゴン、ならびに、前述の分子の多数の類似体および同類物が含まれる。本発明のいくつかの態様において、ＢＢＢ透過性は、抗生物質または抗感染治療可能剤を送達するために本明細書の上記の１つまたは複数の方法によって調節される。そのような抗感染剤は、微生物の活性を減少させるか、または微生物を死滅させる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、治療用物質および血液脳関門透過剤は、単一「化合物」製剤として調製される。このことは、複数の既知方法の任意のものによって達成されうる。例えば、治療用物質および血液脳関門透過剤は、単一の薬学的に許容可能な賦形剤に混ぜ合わせることができる。別のアプローチでは、治療用物質および血液脳関門透過剤は、別個の賦形剤中で調製され、その別個の賦形剤をマイクロカプセル化してから混ぜ合わせるか、あるいは、その別個の賦形剤が別個の薄膜を形成して単一丸剤などにすることもできる。
【００５５】
一実施形態では、治療用物質および血液脳関門透過剤は、共に結合される。いくつかの実施形態では、治療用物質および血液脳関門透過剤は、単一化合物を形成するために、直接的に共に結合されるか、または、「テザー（tether）」または「リンカー（linker）」により共に結合される。特定の理論に縛られずに、このような結合された化合物が改善された特異性／選択性を提供すると考えられている。
【００５６】
直接またはリンカー／テザーにより分子を結合するためのいくつかの化学は、当業者に周知である。二官能性化合物を形成するために治療用物質と血液脳関門透過剤とを結合させるために利用される特定の化学は、治療用物質の化学的性質および所望とされる「リガンド間の」間隔によって決まる。様々な治療用物質および血液脳関門透過剤は典型的に、成分を共に結合させるために、リンカー上または対置される成分上（すなわち治療用物質または血液脳関門透過剤のどちらか一方）の適する官能基と反応するのに利用可能な様々な官能基（例えばカルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（―ＮＥＥ）など）を含有する。
【００５７】
代替的に、これら成分は、追加の反応性官能基に曝露または結合するために誘導体化されうる。この誘導体化は、イリノイ州ロックフォードのピアース・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemical Company）より入手可能のリンカー分子など、いくつかのリンカー分子の任意のものの結合を含むことができる。
【００５８】
本明細書において使用される「リンカー」または「テザー（tether）」は、二官能性または多官能性化合物を形成するために、２つ以上のリガンド（例えば、治療用物質または血液脳関門透過剤）を結合させるように使用される分子である。該リンカーは典型的には、二官能性または多官能性部分を含む成分の全てに共有結合を形成することができるように選択される。適するリンカーは、当業者に周知であり、直鎖または分枝鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカー、アミノ酸、核酸、デンドリマー、合成ポリマー、ペプチドリンカー、ペプチドおよび核酸類似体、炭水化物、ポリエチレングリコールなどを含むが、これらに限定されない。成分の１つまたは複数がポリペプチドである場合、該リンカーは、構成アミノ酸に、それらの側基により（例えば、システインへのジスルフィド結合により）、または、末端アミノ酸のα炭素アミノ基またはカルボキシル基により、結合されうる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、第一治療用物質上の基と反応する１つの官能基、および血液脳関門透過剤上の官能基と反応する別の基を有する二官能性リンカーは、二官能性化合物を形成するために使用されうる。代替的に、誘導体化は、遊離アルデヒド基を生成するために成分を過ヨウ素酸で化学的処理（例えば、糖タンパク質、炭水化物、または核酸などの糖部分のグリコール開裂）することを含んでもよい。これらの遊離アルデヒド基は、リンカーを化合物と結合させるためにリンカー上のヒドラジン基または遊離アミンと反応させることができる（例えば、内容全体を参照により本願明細書に組み込む、ロドウェル（Rodwell）らに付与された米国特許第４，６７１，９５８号を参照されたい）。抗体または抗体断片などのポリペプチドの遊離スルフヒドリル基を生成するための手順もまた知られている（内容全体を参照により本願明細書に組み込む、ニコロッティ（Nicolotti）らに付与された米国特許第４，６５９，８３９号を参照されたい）。
【００６０】
治療用物質および血液脳関門透過剤が双方ともペプチドである場合、二官能性化合物は化学的に合成されるか、あるいは、互いに直接的に結合されるか、またはペプチドリンカーにより結合された、双方の成分を含む融合タンパク質として組換え的に発現されうる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、リシン、グルタミン酸、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を基にした異なる長さのリンカーが成分を結合するために使用される。分子をＰＥＧに結合するための化学は当業者に周知である（例えば、以下の文献の内容全体を参照によって本願明細書に組み込んだ、ベロネーゼ（Veronese）著、「ペプチドおよびタンパク質ペグ化（Peptide and Protein PEGylation）：問題および解決法の概説（a Review of Problems and Solutions）」、バイオマテリアルズ（Biomaterials）、２２：４０５〜４１７、２００１年；ザリプスキー（Zalipsky）ら著、「薬物のポリエチレングリコールへの結合（Attachment of Drugs to Polyethylene Glycols）」、ヨーロピアン・ポリマー・ジャーナル（Eur. Plym. J.）、１９(１２)：１１７７〜１１８３、１９８３年；オルソン（Olson）ら著、「ポリ（エチレングリコール）化ヒト増殖ホルモンアンタゴニストの調製および特性評価（Preparation and Characterization of Poly(ethylene glycol)ylated Human Growth Hormone Antagonist）」、ポリ（エチレングリコール）の化学および生物学的応用（Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications）、１７０〜１８１、ハリスおよびザリプスキー編集、ＡＣＳ、ワシントンＤＣ、１９９７年；デルガド（Delgado）ら著、「ＰＥＧ結合タンパク質の使用および特性（The Uses and Properties of PEG-Linked Proteins）」、クリティカル・レビューズ・イン・セラピューティック・ドラッグ・キャリアー・システム（Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys.）、９：２４９〜３０４、１９９２年；ペドレー（Pedley）ら著、「抗ＣＥＡ抗体のポリ（エチレングリコール）修飾による腫瘍局在化増加の可能性（The Potential for Enhanced Tumour Localisation by Poly(ethylene glycol) Modification of anti-CEA Antibody）」、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Brit. J. Cancer）、７０：１１２６〜１１３０、１９９４年；エア（Eyre）およびファーヴァ（Farver）著、テキストブック・オブ・クリニカル・オンコロジー（Textbook of Clinical Oncology）、３７７〜３９０（ホルレーブ（Holleb）ら編集、１９９１年）；リー（Lee）ら著、「ポリエチレングリコールと結合した単一鎖Ｆｖタンパク質の長期循環寿命（Prolonged Circulating Lives of Single-chain of Fv Proteins Conjugated with Polyethylene Glycol）：共役化学および化合物の比較（a Comparison of Conjugation Chemistries and Compounds）」、バイオコンジュゲイト・ケミストリー（Bioconjug. Chem.）、１０：９７３〜９８１、１９９９年；ヌッチ（Nucci）ら著、「ポリ（エチレングリコール）−修飾タンパク質の治療的価値（The Therapeutic Value of Poly(Ethytene Glycol)-Modified Proteins）」、アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビューズ６：１３３〜１５１、１９９１年；フランシス（Francis）ら著、「ポリエチレングリコール修飾（Polyethylene Glycol Modification）：腫瘍標的に対する改善された方法論の関連性（Relevance of Improved Methodology to Tumour Targeting）」、ジャーナル・オブ・ドラッグ・ターゲティング（J. Drug Targeting）、３：３２１〜３４０、１９９６年、を参照されたい）。
【００６２】
ある実施形態において、治療用物質および血液脳関門透過剤の結合は、グルタルアルデヒド、ＥＤＣＩ、塩化テレフタロイル、臭化シアンなどのそのような結合試薬の使用により、または、還元的アミノ化により、達成されうる。ある実施形態において、成分は、国際公開第９３１７７１３（Ａ）号に開示された種類のヒドロキシ酸リンカーによって結合されうる。ＰＥＧリンカーはまた、様々なＰＥＧテザー薬物の調製のために利用されうる（例えば、内容全体を参照によって本願明細書に組み込んだ、リー（Lee）ら著、「不安定エステル官能性を有する基質におけるアジドから一級アミンへの還元（Reduction of Azides to Primary Amines in Substrates Bearing Labile Ester Functionality）：葉酸テザー薬物の調製のためのＰＥＧ可溶化「Ｙ」形状イミノ二酢酸試薬の合成（Synthesis of a PEG-Solubilized, “Y”-Shaped Iminodiacetic Acid Reagent for Preparation of Folate-Tethered Drugs）」、オーガニック・レタース（Organic Lett.）、１： １７９〜１８１、１９９９年を参照されたい）。
【００６３】
本発明のさらなる態様は、血液脳関門透過性を増加させるのに効果的な化合物を選別する方法を対象にしている。この方法は、未改変の動物と比較して、低下したＣＤ７３発現レベル、低下したアデノシン発現レベル、および／または、調節されたアデノシン受容体活性を有する改変された動物を提供することを含む。また、１つもしくは複数の候補化合物も提供され、その１つもしくは複数の候補化合物は、該改変された動物に投与される。その後、その１つもしくは複数の候補化合物がアデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させるかどうかが、評価される。該改変された動物において、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させるこれら候補化合物はその後、血液脳関門透過性を増加させるのに潜在的に効果的であるとみなされる。
【００６４】
本発明のある実施形態において、本発明の方法はまた、形質転換動物を使用して実施されてもよい。形質転換動物は、大きく２つのタイプ、すなわち「ノックアウト」および「ノックイン」に分類されうる。「ノックアウト」は、好ましくは標的遺伝子発現がほんのわずかになるか、または検知されないような標的遺伝子の機能の減少を結果としてもたらす、形質転換配列の導入による標的遺伝子の変化を有する。「ノックイン」は、例えば、標的遺伝子の追加複写物の導入により、あるいは、標的遺伝子の内因性複写物の発現増加を提供する調節配列を作動可能に挿入することにより、標的遺伝子の発現増加を結果としてもたらす宿主細胞ゲノムにおける変化を有する形質転換動物である。ノックインまたはノックアウト形質転換動物は、標的遺伝子に対してヘテロ接合性またはホモ接合性でありうる。本発明の形質転換動物は、ＣＤ７３、アデノシン、および／またはアデノシン受容体を過剰発現または低発現させることができるノックアウトまたはノックインとして大きく類別されうる。
【００６５】
本発明のある実施形態において、形質転換動物は、ＢＢＢ透過性調節を決定、識別、および／または定量化するためのモデル系を提供するように設計される。そのような決定は、ＢＢＢ透過性の崩壊または改変の前または後を含む、動物の寿命の間の任意の時点で行われうる。形質転換モデル系はまた、ＢＢＢ透過性を促進する、すなわち増加させる生物学的活性剤の開発のために使用されうる。さらに、モデル系は、（例えば、外傷または疾患の結果によるＢＢＢ開放など、ＢＢＢ「開放」（すなわち透過性増加）後に）試験剤が関門を修復するか、または透過性を減少させるかどうかを検定するために利用されうる。さらに、生体外技術を含む、細胞に基づく環境、すなわち細胞培養環境で行われるさらなる研究または検定のために、本発明の形質転換動物から細胞を単離することができる。
【００６６】
本発明のある実施形態では、該動物モデルは、その動物の神経系においてＢＢＢ透過性状態の改変をもたらす手順を受けることが可能な任意のヒト以外の脊椎動物を含む。好ましいモデル生物体には、哺乳類、ヒト以外の霊長類、およびげっ歯類が含まれるが、これらに限定されない。好ましいモデルの非限定例は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウサギ、ブタ、チンパンジー、および、サルである。これらの試験動物は、野生型または形質転換型でありうる。
【００６７】
現在、胚顕微操作における技術進歩により、異種ＤＮＡを哺乳類の受精卵に導入することも可能である。例えば、全能性または多能性幹細胞が、顕微注射、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感染、または他の手段により形質転換されうる。これらの形質転換された細胞はその後、胚の中に導入され、そしてその胚はその後、形質転換動物に発育することになる。好ましい実施形態では、発育中の胚を、所望の導入遺伝子を含有するウィルスベクターに感染させて、感染させた胚から該導入遺伝子を発現する形質転換動物を生み出す。別の好ましい実施形態では、所望の導入遺伝子は、好ましくは単一細胞期に、胚の前核または細胞質に同時注入され、その胚は成熟した形質転換動物に発育することができる。形質転換動物を生み出すためのこれらおよび他の異なる方法は、当技術分野において十分に確立されており、ゆえに本明細書において詳述しない。例えば、内容全体を参照により本願明細書に組み込んだ、米国特許第５，１７５，３８５号、および同第５，１７５，３８４号を参照されたい。
【００６８】
ＢＢＢ透過性は、当技術分野において知られている様々な指示薬を利用することによって試験されうる。例えば、分子量が１８０ダルトンを超える色素、トレーサーまたはマーカーは、無処理ＢＢＢを通過するのを阻まれる。検定は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、またはサルを含むがこれらに限定するものではない、実験動物に行われうる。適する指示薬には、血液脳関門透過性を決定、可視化、測定、識別、または定量化するために利用される、当技術分野において知られている任意の色素、マーカー、またはトレーサーが含まれる。非限定例には、エバンスブルーおよびフルオレセインナトリウムが含まれる。
【００６９】
本発明のやはりさらなる態様は、薬剤を対象にしている。この薬剤は、中枢神経系の障害または状態を治療するのに有効な治療用物質、および、血液脳関門透過剤を有し、この血液脳関門透過剤は、アデノシンレベルおよび／または生物学的利用能を増加させ、アデノシン受容体を調節し、ならびに／あるいは、ＣＤ７３レベルおよび／または活性を増加させる。
【００７０】
この医薬は、上述した方法と実質的に同じ方法で調製され投与されうる。
【実施例】
【００７１】
〔実施例１−マウス〕
Ｃｄ７３−／−マウスは、先に記載されており（トンプスン（Thompson）ら著、「低酸素中の血管漏出におけるエクト−５’−ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）の重要な役割（Crucial Role for Ecto-5’-Nucleotidase (CD73) in Vascular Leakage During Hypoxia）」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（J. Exp. Med.）、２００：１３９５〜１４０５、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、Ｃ５７ＢＬ／６に対して１４世代にわたり戻し交配させた。Ｃｄ７３−／−マウスは、感染に対する明白な感受性を有さず、リンパ器官のサイズおよび細胞構成、ならびに生体内および生体外検定におけるＴおよびＢ細胞応答に基づき、正常であると思われる（トンプスンら著、「低酸素中の血管漏出におけるエクト−５’−ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）の重要な役割」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン、２００：１３９５〜１４０５、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。Ｃ５７ＢＬ／６マウス、およびＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのｔｃｒα−／−マウスは、ザ・ジャクソン・ラボラトリーズ（The Jackson Laboratories）から購入された。マウスは、コーネル大学またはトゥルク大学において特定病原体未感染条件下で、飼育され収容された。アデノシン受容体遮断実験のために、ＤＭＳＯ（ＰＢＳ中４５体積％）中、０．６ｇ／Ｌのカフェイン（Ｓｉｇｍａ）または２ｍｇ／ｋｇのＳＣＨ５８２６１（１ｍｇ／ｋｇを皮下および１ｍｇ／ｋｇを腹腔内）、あるいは４５％ＤＭＳＯ単独を加えた飲料水をマウスに与えることを、ＥＡＥ誘導の１日前から始め、実験の間中、継続した。マウスに実行される全ての手順は、関連動物審査委員会（relevant animal review committee）により承認された。
【００７２】
〔実施例２−ＥＡＥ誘導および評価〕
ＥＡＥは、スワンボルグ（Swanborg）著、「ヒト脱髄疾患のためのモデルとしてのげっ歯類における実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Rodents as a Model for Human Demyelinating Disease）」、クリニカル・イミュノロジー・アンド・イミュノパソロジー（Clin. Immunol. Immunopathol.）、７７：４〜１３、１９９５年、および、バイノ（Bynoe）ら著、「自己抗原ペプチドによる皮膚免疫は実験的アレルギー性脳脊髄炎を防止するＴサプレッサー細胞を誘導する（Epicutaneous Immunization with Autoantigenic Peptides Induces T Suppressor Cells that Prevent Experimental Allergic Encephalomyelitis）」、イミュニティー（Immunity）、１９：３１７〜３２８、２００３年に記載されているように、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（「ＭＯＧ」）ＥＡＥ誘導措置をマウスに実施することによって誘導される。これら文献の内容全体を参照により本願明細書に組み込む。つまり、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（ＰＢＳ中３ｍｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ）との１：１乳濁液（５０μＬ）を各々の側腹部に皮下注射した。百日咳毒素（ＰＴＸ、２０ｎｇ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を、免疫化した時点、および２日後に再び、静脈内に与えた（ＰＢＳ２００μＬ）。疾患症状重症度：すなわち、０＝疾患なし、０．５〜１＝弱い／力のない尾部、２＝力のない尾部および部分的な後肢麻痺、３＝完全後肢麻痺、４＝後肢および前肢両方の麻痺、５＝死亡、に基づいて、ＥＡＥについてマウスに毎日評点を付けた。評点４のマウスは安楽死させた。
【００７３】
〔実施例３−Ｔ細胞調製および養子移入〕
ＰＴＸを用いずにＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチドでマウスに抗原刺激をした。１週間後、脾臓およびリンパ節からリンパ球を採取し、赤血球を溶解するためにＡＣＫ緩衝剤（０．１５ＭのＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭのＫＨＣＯ３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）と共にインキュベートした。ＣＤ８(ＴＩＢ−１０５)、ＩＡｂ，ｄ，ｖ，ｐ，ｑ，ｒ（２１２．Ａ１）、ＦｃＲ（２．４−Ｇ２)、Ｂ２２０（ＴＩＢ−１６４）、ＮＫ１．１（ＨＢ１９１）に対する抗体と、それからＢｉｏＭａｇヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、および、ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｑｉａｇｅｎ）と共に細胞をインキュベートした。負の磁気を高めた後、ＣＤ４＋細胞を、直接使用するか、あるいは特定の亜集団にさらに分別した。分別のために、ＣＤ４に対する抗体（ＲＭ４−５）およびＣＤ７３に対する抗体（ＴＹ／２３）で細胞を染色し、いくつかの実験では、ＣＤ２５に対する抗体（ＰＣ６１）で細胞を染色し、その後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して分離した。分別後の純度は決まって９９％を超えていた。養子移入のために、ＣＤ４＋細胞または分別されたＴ細胞の全てを洗浄し、無菌ＰＢＳ中に再懸濁した。レシピエントマウスは無菌ＰＢＳ２００μＬ中２．５×１０６個以下の細胞を静脈内に受け取った。
【００７４】
〔実施例４−フローサイトメトリー〕
細胞懸濁液をＣＤ４に対する蛍光色素結合抗体（ＲＭ４−５）、ＣＤ７３に対する蛍光色素結合抗体（ＴＹ／２３）、またはＦｏｘＰ３に対する蛍光色素結合抗体（ＦＪＫ−１６ｓ）で染色した。細胞内ＦｏｘＰ３染色は、メーカー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の使用説明書にしたがって実行された。染色された細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に得た。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）でデータを分析した。
【００７５】
〔実施例５−Ｔ細胞サイトカイン検定〕
ＭＯＧ免疫化マウスから分別されたＴ細胞を、照射されたＣ５７ＢＬ／６の脾細胞の存在下で、０μＭまたは１０μＭのＭＯＧペプチドと共に培養した。１８時間の時点で上澄み液を収集して、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１β、およびＴＮＦαについてＢｉｏ−ｐｌｅｘサイトカイン（Ｂｉｏｒａｄ）検定を利用して分析した。
【００７６】
〔実施例６−免疫組織化学（「ＩＨＣ」）〕
麻酔をかけたマウスをＰＢＳで灌流し、脳、脾臓、および脊髄を分離し、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ−ＯＣＴ培養液中で瞬間凍結した。５μｍ切片（矢状方向の脳）をＳｕｐｅｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ）に貼り付け、アセトン中で固定して、−８０℃で保管した。免疫染色のために、内因性ペルオキシダーゼを遮断するためにスライドをＰＢＳ中０．０３％のＨ２Ｏ２で解凍、処理し、正常ヤギ血清（Ｚｙｍｅｄ）中のカゼイン（Ｖｅｃｔｏｒ）で遮断し、その後、抗ＣＤ４５（ＹＷ６２．３）、抗ＣＤ４（ＲＭ４−５）、または抗ＩＣＡＭ−１（３Ｅ２）と共にインキュベートした。スライドをビオチン化ヤギ抗ラットＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ）と共にインキュベートし、ＡＥＣ（赤）基質キット（AEC (Red) substrate kit）（Ｚｙｍｅｄ）およびヘマトキシリン対比染色を用いて展開した。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇと共にカバースリップを乗せ、それを光の下で撮影した（Ｚｅｉｓｓ）。
【００７７】
〔実施例７−リアルタイムｑ−ＰＣＲ〕
トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡをＺ３１０脈絡膜叢細胞株から分離した（ツェン（Zheng）ら著、「マウス脈絡叢からの不死化Ｚ３１０脈絡叢上皮細胞株の確立および特性評価（Establishment and Characterization of an Immortalized Z310 Choroidal Epithelial Cell Line from Murine Choroid Plexus）」、ブレイン・リサーチ（Brain Res.）、９５８：３７１〜３８０、２００２年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。ｃＤＮＡをＲｅｖｅｒｓｅ−ｉＴキット（ＡＢＧｅｎｅ）を使用して合成した。ＡＲに特異的なプライマー（要求に応じて利用可能）を、遺伝子発現レベルを決定するために使用し、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲシステムで作動するＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎキット（ＡＢＧｅｎｅ）を使用してＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子レベルに標準化した。各ｑＰＣＲ生成物の特異性を測定するために融解曲線分析を行った。
【００７８】
〔実施例８−ＥＡＥにおけるＣＤ７３の役割評価〕
アデノシンの免疫調節および免疫抑制特性に起因して、ＥＡＥにおけるＣＤ７３の役割を評価した。Ａ１アデノシン受容体（ＡＲ）−欠損マウスにおける悪化したＥＡＥの報告に基づいて（ツツイ（Tsutsui）ら著、「Ａ１アデノシン受容体上方制御および活性化は、多発性硬化症モデルにおける神経炎症および脱髄を軽減する（A1 Adenosine Receptor Upregulation and Activation Attenuates Neuroinflammation and Demyelination in a Model of Multiple Sclerosis）」、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（J. Neurosci.）、２４：１５２１〜１５２９、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む)、細胞外アデノシンの産生を触媒することができないｃｄ７３−／−マウスは、重篤なＥＡＥを体験することが予想された。驚いたことに、ｃｄ７３−／−マウスは、ＥＡＥの誘導に対して強い耐性を示した。しかしながら、ｃｄ７３−／−マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＮＳ抗原に対して免疫反応を生じる能力を有しており、ｃｄ７３＋／＋Ｔ細胞−欠損マウスに養子移入した場合、重篤なＥＡＥを引き起こす。野生型マウスからのＣＤ７３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞もまた、ｃｄ７３−／−レシピエントに移入された場合、疾患を引き起こした。これは、リンパ球上またはＣＮＳ中のいずれかにおけるＣＤ７３発現が、ＥＡＥの間リンパ球が脳へ入り込むために必要であることを示唆する。ｃｄ７３＋／＋マウスは、広域スペクトルＡＲアンタゴニストカフェインおよびＡ２ａＡＲ特異的アンタゴニストＳＣＨ５８２６１によりＥＡＥ誘導から保護されていたので、このデータは、ＣＤ７３それ自体ではなく、ＣＤ７３により産生された細胞外アデノシンが、ＥＡＥの間リンパ球がＣＮＳ中に入り込むことを調整するということを示唆している。これらの結果は、ＥＡＥの発症を調整することにおけるＣＤ７３およびアデノシンの役割を明らかにした最初のものである。
【００７９】
〔実施例９−Ｃｄ７３−／−マウスはＥＡＥ誘導に耐性を示す〕
ＣＤ７３がＥＡＥの進行の間に炎症を制御することにおいて役割を担うかどうかを決定するために、Ｃｄ７３−／−マウスおよび野生型（Ｃｄ７３＋／＋）マウスに、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（「ＭＯＧ」）ＥＡＥ誘導措置を実施した（スワンボルグ著、「ヒト脱髄疾患のためのモデルとしてのげっ歯類における実験的自己免疫性脳脊髄炎」、クリニカル・イミュノロジー・アンド・イミュノパソロジー、７７：４〜１３、１９９５年；バイノら著、「自己抗原ペプチドによる皮膚免疫は実験的アレルギー性脳脊髄炎を防止するＴサプレッサー細胞を誘導する」、イミュニティー、１９：３１７〜３２８、２００３年：これら文献の内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。ＥＡＥの発症についての毎日の監視から、ｃｄ７３−／−マウスが、それらの野生型対照物と比較して疾患重症度の劇的な減少を常に示すことが明らかになった（図１）。疾患誘導の３週間後までに、ｃｄ７３−／−マウスは、野生型マウスの平均ＥＡＥ評点２．０（力のない尾部および部分的な後肢麻痺）と比較して、たった０．５（弱い尾部）の平均ＥＡＥ評点を有した（図１）。
【００８０】
〔実施例１０−ｃｄ７３−／−マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＯＧの免疫化に応答する〕
その後、ＥＡＥの誘導に対するｃｄ７３−／−マウスの耐性は、免疫反応を抑制するｃｄ７３−／−リンパ球の能力の強化、または、これらのリンパ球がＭＯＧの刺激に応答することができないことの、いずれか一方によって説明されうるかどうかを問うた。自然発生的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞、すなわちＴｒｅｇは、積極的に誘導されたＥＡＥを調整することができる（コーム（Kohm）ら著、「最前線：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞は積極的実験的自己免疫性脳脊髄炎の間に抗原特異的自己反応性免疫反応および中枢神経系炎症を抑制する（Cutting Edge: CD4+CD25+ Regulatory T Cells Suppress Antigen-Specific Autoreactive Immune Responses and Central Nervous System Inflammation During Active Experimental Autoimmune Encephalomyelitis）」、ジャーナル・オブ・イミュノロジー（J. Immunol.）、１６９：４７１２〜４７１６、２００２年：この内容全体を本願明細書に組み込む）。Ｔｒｅｇは最近になってＣＤ７３を発現することが示され、いくつかの報告はＣＤ７３の酵素活性がＴｒｅｇ機能に必要とされていると示唆しているので（コービー（Kobie）ら著、「制御性Ｔ細胞および抗原刺激された中立ＣＤ４  Ｔ細胞はＣＤ７３を発現し、これは５’−アデノシン一リン酸をアデノシンに転換することによりエフェクターＣＤ４  Ｔ細胞を抑制する（T Regulatory and Primed Uncommitted CD4 T Cells Express CD73, Which Suppresses Effector CD4 T Cells by Converting 5’-Adenosine Monophosphate to Adenosine）」、ジャーナル・オブ・イミュノロジー、１７７：６７８０〜６７８６；デアグリオ（Deaglio）ら著、「制御性Ｔ細胞に発現したＣＤ３９およびＣＤ７３により触媒されたアデノシン産生は、免疫抑制を媒介する（Adenosine Generation Catalyzed by CD39 and CD73 Expressed on Regulatory T Cells Mediates Immune Suppression）」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（J. Exp. Med.）、２０４：１２５７〜１２６５、２００７年：これら文献の内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、Ｔｒｅｇの数および抑制活性がｃｄ７３−／−マウスにおいて正常であったかどうかを問うた。図２Ａに示されているように、ＥＡＥ誘導の前または後のいずれにおいても、野生型マウスおよびｃｄ７３−／−マウスにおけるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの頻度に有意な相違はなかった。同様に、ＣＤ７３を発現したＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは、野生型マウスにおいてＥＡＥ誘導の後、穏やかにしか変化しなかった（図２Ｂ）。加えて、ＭＯＧ抗原特異的ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞増殖を阻害する野生型およびｃｄ７３−／−Ｔｒｅｇの抑制能力に有意な相違は観察されなかった。ｃｄ７３−／−Ｔ細胞がＭＯＧペプチドで刺激された際に反応することができるかどうかを決定するために、サイトカインを増殖し生成するこれら細胞の能力を評価した。ＭＯＧ免疫化ｃｄ７３−／−マウスおよび野生型マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、様々な濃度のＭＯＧペプチドに応答した生体外増殖において同様の程度を示した。しかしながら、ＭＯＧ免疫化ｃｄ７３−／−マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型のＣＤ７３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ７３−ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、生体外ＭＯＧ刺激に続いてより高いレベルのＩＬ−１７およびＩＬ−１βを分泌した（図２Ｃ）。上昇したレベルのＩＬ−１７は、ＭＳ（Matuseviciusら著、「血液およびＣＳＦ単核細胞におけるインターロイキン−１７ｍＲＮＡ発現は多発性硬化症において増大する（Interleukin-17 mRNA Expression in Blood and CSF Mononuclear Cells is Augmented in Multiple Sclerosis）」、マルチプル・スクラロウシス（Mult. Scler.）、５：１０１〜１０４、１９９９年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、およびＥＡＥの発症（コミヤマ（Komiyama）ら著、「ＩＬ−１７は実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症において重要な役割を担う（IL-17 Plays an Important Role in the Development of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis）」、ジャーナル・オブ・イミュノロジー、１７７：５６６〜５７３、２００６年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）と関連し、一方、高いレベルの炎症性ＩＬ−１βサイトカインは、ＭＳに対する危険因子であり、（デ・ヨング（de Jong）ら著、「再発性多発性硬化症の感受性および進行に対する危険因子としてのＩＬ−１βおよびＩＬ−１Ｒａの産生（Production of IL-1beta and IL-1Ra as Risk Factors for Susceptibility and Progression of Relapse-Onset Multiple Sclerosis）」、ジャーナル・オブ・ニューロイミュノロジー（J. Neuroimmunol.）、１２６：１７２〜１７９、２００２年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）かつ、ＩＬ−１７産生のエンハンサーである（サットン（Sutton）ら著、「自己免疫性脳脊髄炎を媒介するＩＬ−１７産生Ｔ細胞の誘導におけるインターロイキン（ＩＬ）−１の重要な役割（A Crucial Role for Interleukin (IL)-1 in the Induction of IL-17-Producing T Cells That Mediate Autoimmune Encephalomyelitis）」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン、２０３：１６８５〜１６９１、２００６年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−αの分泌について、ＭＯＧ刺激に続く野生型Ｔ細胞とｃｄ７３−／−Ｔ細胞との間に相違は観察されなかった（図２Ｃ）。全体的に、これらの検定からの結果は、ｃｄ７３−／−Ｔ細胞はＭＯＧの免疫化に十分に応答できることを示唆している。
【００８１】
それから、ｃｄ７３−／−マウスからのＴ細胞が、ＥＡＥを引き起こす能力を有するかどうかを決定した。このことを試験するために、ＭＯＧ免疫化ｃｄ７３−／−マウスの脾臓およびリンパ節からのＣＤ４＋Ｔ細胞を、ｔｃｒα−／−（ｃｄ７３＋／＋）レシピエントマウスに移入した後にＥＡＥを誘導する能力について評価した。ｔｃｒα−／−マウスは、内因性Ｔ細胞を欠いており、それら自身でＥＡＥを発症させることができない（エリオット（Elliott）ら著、「αβ＋Ｔ細胞を欠くマウスは実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導に耐性を示す（Mice Lacking Alpha Beta + T Cells are Resistant to the Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis）」、ジャーナル・オブ・ニューロイミュノロジー、７０：１３９〜１４４、１９９６年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。ｃｄ７３−／−ドナーからＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったＣｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−レシピエントマウスは、野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったＣｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−レシピエントマウスと比較すると、より重篤な疾患を顕著に発症させた（図２Ｄ）。野生型およびｃｄ７３−／−ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−レシピエントマウスへの移入に続いて、等しい程度の増殖を示した。したがって、ｃｄ７３−／−マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥＡＥを誘導できるだけでなく、ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−マウスに移入されると野生型マウスに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞よりもさらに重篤なＥＡＥを引き起こす。これらの結果は、ｃｄ７３−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞がＭＯＧ刺激に応答して上昇したレベルの（ＥＡＥを悪化させることで知られている）ＩＬ−１７およびＩＬ−１βを分泌した、生体外検定と一貫性があり（図２Ｃ）、ｃｄ７３−／−マウスが、非造血細胞におけるＣＤ７３発現の欠如（ＣＮＳにおける発現の欠如が最も起こりうる）のため、ＭＯＧ誘導ＥＡＥに耐性を示すことを示唆している。
【００８２】
〔実施例１１−Ｃｄ７３−／−マウスは、ＥＡＥ誘導後にリンパ球のＣＮＳへの浸潤をほとんど／全く示さない〕
ＥＡＥは、主にＣＤ４＋Ｔ細胞媒介疾患であり（モンテロ（Montero）ら著、「ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞による実験的自己免疫性脳脊髄炎の調整（Regulation of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by CD4+, CD25+ and CD8+ T Cells）：枯渇抗体を使用した分析（Analysis Using Depleting Antibodies）」、ジャーナル・オブ・オートイミュニティー（J. Autoimmun.）、２３：１〜７、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、ＥＡＥ進行の間、リンパ球はまず、ＣＮＳ抗原に対する炎症反応を開始するためにＣＮＳへのアクセスを獲得しなければならず、この結果、軸索脱髄および麻痺をもたらす（ブラウン（Brown）ら著、「炎症および神経変性事象の時間経過および分布は実験的自己免疫性脳脊髄炎の病変形成のための構造的基礎を提案する（Time Course and Distribution of Inflammatory and Neurodegenerative Events Suggest Structural Bases for the Pathogenesis of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis）」、ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジー（J. Comp. Neurol.）、５０２：２３６〜２６０、２００７年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。ｃｄ７３−／−マウスにおいてＥＡＥ誘導に続いてＣＮＳリンパ球浸潤が観察されるかどうかを決定するために、脳および脊髄切片を免疫組織化学的検査によりＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４５＋細胞の存在について検査した。Ｃｄ７３−／−マウスは、ＭＯＧ免疫化後１３日目の時点で、野生型マウスと比較して（図３Ａ〜図３Ｃ、図３Ｇ）、脳および脊髄におけるＣＤ４＋リンパ球（図３Ｄ〜図３Ｇ）およびＣＤ４５＋リンパ球（図４（補足：図１））の頻度に劇的な減少を示した。加えて、２ｄ２  ＴＣＲ形質転換マウスからのＭＯＧ特異的Ｔ細胞（ベテッリ（Bettelli）ら著、「ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質−特異的Ｔ細胞受容体形質転換マウスは自発性自己免疫視神経炎を発症させる（Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein-Specific T Cell Receptor Transgenic Mice Develop Spontaneous Autoimmune Optic Neuritis）」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン、１９７：１０７３〜１０８１、２００３年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）を野生型マウスまたはｃｄ７３−／−マウスのいずれかに移入しＥＡＥ誘導を伴う、リンパ球追跡実験において、ＣＮＳにおける２ｄ２細胞のパーセンテージは、野生型レシピエントマウスにおいて経時的に数倍増加したが、ｃｄ７３−／−レシピエントにおいては全く増加しなかった（図５）。全体的に、これらの結果は、ｃｄ７３−／−マウスにおけるＥＡＥ誘導に対する観察された保護は、著しく減少したＣＮＳリンパ球浸潤と関連することを示唆している。それにもかかわらず、ＭＯＧ免疫化ｃｄ７３−／−マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥＡＥを発症させるよう付随して誘導されたｃｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−マウスに移入すると、ＣＮＳへのアクセスを獲得する能力を有した（図３Ｋおよび図３Ｌ）。実際のところ、より早期およびより広範囲のＣＮＳにおけるＣＤ４＋リンパ球浸潤が、野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったｃｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−マウスにおいてよりも（図３Ｈ〜図３Ｊ）、ｃｄ７３−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったｃｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−マウスにおいて（図３Ｋ、図３Ｌ）観察された。したがって、これらの結果は、ｃｄ７３−／−マウスからのドナーＴ細胞はｃｄ７３＋／＋レシピエントマウスのＣＮＳに浸潤する能力を有することを証明している。
【００８３】
〔実施例１２−ＣＤ７３は効率的なＥＡＥの発症のためにリンパ球上またはＣＮＳ中のいずれかにおいて発現されなければならない〕
次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ７３発現が、ＣＮＳ中のＣＤ７３発現の欠如を補い、ＥＡＥの発症を可能にするかどうかを問うた。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＯＧ免疫化野生型マウスからｃｄ７３−／−レシピエントへ養子移入し、付随してＥＡＥを誘導し、同様に処置された野生型レシピエントと疾患活動性を比較した（図６Ａ）。野生型レシピエントが予想通り、ＥＡＥ誘導に続いて疾患を発症させた一方、ｃｄ７３−／−レシピエントもまた、疾患誘導の３週間後までに平均疾患評点１．５で顕著なＥＡＥを発症させた。これは、ｃｄ７３−／−マウスが通常これと同時点で示した平均評点０．５よりも（図１）、はるかに高かった。ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ７３発現とＥＡＥ感受性との関連をさらに定義付けるために、免疫化野生型マウスからの分別されたＣＤ７３＋ＣＤ４＋およびＣＤ７３−ＣＤ４＋Ｔ細胞、または、免疫化ｃｄ７３−／−マウスからの完全ＣＤ４＋(ＣＤ７３−)Ｔ細胞を、ＥＡＥ誘導を伴ってｃｄ７３−／−レシピエントに移入した（図６Ｂ）。野生型マウスからのＣＤ７３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったＣｄ７３−／−マウスは、誘導後３週間の時点で、約１．５の平均評点でＥＡＥを発症させた。反対に、野生型由来ＣＤ７３−ＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったｃｄ７３−／−マウスは、有意なＥＡＥを発症させなかった。加えて、ＣＤ７３発現ｔｃｒα−／−マウスにおいて重篤なＥＡＥを引き起こす（図２Ｄ）能力を有するｃｄ７３−／−ドナーマウスからのＣＤ４＋細胞はまた、レシピエントｃｄ７３−／−マウスにおいてＥＡＥを増強することはできなかった（図６Ｂ）。したがって、Ｔ細胞上のＣＤ７３発現は、非造血細胞におけるＣＤ７３発現の欠如を部分的に補うことができるが、ＣＤ７３が両区画において発現される場合に、ＥＡＥは最も効果的に誘導される。
【００８４】
ＥＡＥの発症を促進するＣＤ７３発現非造血細胞の正体は、知られていない。ＢＢＢにおける血管内皮細胞が、多くの種類の内皮細胞がＣＤ７３を発現するので、有望な候補として見なされた（ヤマシタ（Yamashita）ら著、「マウスリンパ球におけるＣＤ７３発現およびＦｙｎ依存シグナル伝達（CD73 Expression and Fyn-Dependent Signaling on Murine Lymphocytes）」、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー、２８：２９８１〜２９９０、１９９８年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。しかしながら、免疫組織化学的検査から、マウス脳内皮細胞が、ＣＤ７３−であることが明らかになった。しかしながら、これらの実験の間、ＣＤ７３は脳内の脈絡叢上で高度に発現されることが観察された（図６Ｃ）。脈絡叢とは、ＥＡＥ進行の間にリンパ球がＣＮＳ内へ入り込む入口点である（ブラウンら著、「炎症および神経変性事象の時間経過および分布は実験的自己免疫性脳脊髄炎の病変形成のための構造的基礎を提案する」、ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジー、５０２：２３６〜２６０、２００７年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。図４Ｄは、ＥＡＥ誘導後１２日目の野生型マウスの脈絡叢と関連するリンパ球の浸潤を示す。また、極微のＣＤ７３染色が脊髄の髄膜下領域上に観察された。総合すると、これらの結果は、ＣＤ７３の発現が、Ｔ細胞上であろうとＣＮＳ中（おそらく脈絡叢上）であろうと、効率的なＥＡＥの発症に必要であるということを示唆している。
【００８５】
〔実施例１３−アデノシン受容体アンタゴニストは、ＥＡＥ誘導からマウスを保護する〕
ＣＤ７３はＡＭＰのアデノシンへの分解を触媒し、ＡＲはＣＮＳ中に発現されるので（ツツイら著、「Ａ１アデノシン受容体上方制御および活性化は、多発性硬化症モデルにおける神経炎症および脱髄を軽減する」、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、２４：１５２１〜１５２９、２００４年；ローシー（Rosi）ら著、「神経細胞アデノシンＡ２Ｂ受容体への脳炎の影響（The Influence of Brain Inflammation Upon Neuronal Adenosine A2B Receptors）」、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー（J. Neurochem.）、８６：２２０〜２２７、２００３年：これら文献の内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、次に、ＡＲシグナル伝達がＥＡＥ進行の間、重要であるかどうか決定した。野生型およびｃｄ７３−／−マウスを、ＥＡＥ実験の１日前およびＥＡＥ実験の継続期間にわたって、飲料水中０．６ｇ／Ｌの広域スペクトルＡＲアンタゴニストカフェイン（ダッリーニャ（Dall'Igna）ら著、「神経保護のアデノシン受容体アンタゴニストとしてのカフェイン（Caffeine as a Neuroprotective Adenosine Receptor Antagonist）」、アナルズ・オブ・ファーマコセラピー（Ann. Pharmacother.）、３８：７１７〜７１８、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）により処置し、これはマウス１匹あたり１日４．０ｍｇのカフェインとなる、おおよその投与量に対応する（ヨハンソン（Johansson）ら著、「マウス脳におけるＡ１およびＡ２Ａアデノシン受容体ならびにＡ１  ｍＲＮＡ（A1 and A2A Adenosine Receptors and A1 mRNA in Mouse Brain）：長期カフェイン処置の効果（Effect of Long-Term Caffeine Treatment）」、ブレイン・リサーチ（Brain Res.）、７６２：１５３〜１６４、１９９７年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）（図７Ａ）。カフェインを摂取した野生型マウスは、ＥＡＥの発症から劇的に保護された（図７Ａ）。これは先に公開された結果に匹敵する（ツツイら著、「Ａ１アデノシン受容体上方制御および活性化は、多発性硬化症モデルにおける神経炎症および脱髄を軽減する」、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、２４：１５２１〜１５２９、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。予想通りに、カフェインを摂取したｃｄ７３−／−マウスは、ＥＡＥを発症させなかった（図７Ａ）。ＣＤ７３が脈絡叢上で高度に発現されるので（図６Ｃ）、次に、ＡＲもまた脈絡叢上で発現されるかどうかを決定した。Ｚ３１０マウス脈絡叢細胞株を利用して（ツェンら著、「マウス脈絡叢からの不死化Ｚ３１０脈絡叢上皮細胞株の確立および特性評価」、ブレイン・リサーチ、９５８：３７１〜３８０、２００２年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、Ａ１およびＡ２ａアデノシン受容体サブタイプのｍＲＮＡのみをｑＰＣＲにより検出した（図７Ｂ）。Ａ１ＡＲ−／−マウスが、疾患誘導に続いて重篤なＥＡＥを発症させることが先に示されているので（ツツイら著、「Ａ１アデノシン受容体上方制御および活性化は、多発性硬化症モデルにおける神経炎症および脱髄を軽減する」、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、２４：１５２１〜１５２９、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、ＳＣＨ５８２６１（メラニ（Melani）ら著、「選択的Ａ２Ａ受容体アンタゴニス��ＳＣＨ５８２６１は神経学的欠損から脳損傷およびラット局所脳虚血におけるｐ３８ＭＡＰＫ活性化を保護する（The Selective A2A Receptor Antagonist SCH 58261 Protects From Neurological Deficit, Brain Damage and Activation of p38 MAPK in Rat Focal Cerebral Ischemia）」、ブレイン・リサーチ、１０７３〜１０７４：４７０〜４８０、２００６年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、Ａ２ａサブタイプに特異なＡＲアンタゴニストによる野生型マウスの処置が、ＥＡＥの発症を防ぐことができるかどうかを問うた。野生型マウスに、１ｍｇ／ｋｇのＤＭＳＯ中ＳＣＨ５８２６１またはＤＭＳＯ単独を腹腔内および皮下の両方で（合計２ｍｇ／ｋｇ）ＥＡＥ誘導の１日前、および実験の全期間にわたって３０日間、毎日与えた（図７Ｃ）。ＳＣＨ５８２６１を摂取した野生型マウスは、ＤＭＳＯ単独を摂取した野生型マウスと比較して、ＥＡＥの発症から劇的に保護された（図７Ｃ）。加えて、ＳＣＨ５８２６１を与えられた野生型マウスは、ＤＭＳＯ処置された野生型マウスと比較して、ＥＡＥ誘導後１５日目の時点で、脳および脊髄におけるＣＤ４＋リンパ球の頻度に有意な低下を示した（図７Ｄ）。脈絡叢上の接着分子（ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＭａｄＣＡＭ−１など）がＥＡＥの病変形成において役割を担うことを研究が示しているので（エンゲルハート（Engelhardt）ら著、「中枢神経系炎症における脈絡叢の関与（Involvement of the Choroid Plexus in Central Nervous System Inflammation）」、マイクロスコピカル・リサーチ・アンド・テクノロジー（Microsc. Res. Tech.）、５２：１１２〜１２９、２００１年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、ＳＣＨ５８２６１処置が、ＥＡＥ誘導に続いて脈絡叢上での接着分子発現に影響を及ぼしたかどうかを決定した。ＤＭＳＯおよびＳＣＨ５８２６１で処置された野生型マウスからの脈絡叢の比較は、Ａ２ａＡＲ遮断が、通常はＥＡＥ進行の間に起こるＩＣＡＭ−１の上方制御を防いだことを示す（図８）。
【００８６】
これらの結果に基づいて、ｃｄ７３−／−マウスが細胞外アデノシンの産生を触媒することができないことが、ＭＯＧ免疫化に続いてＥＡＥを効率的に発症させることへの失敗を説明し、脈絡叢でのＣＤ７３発現およびＡ２ａＡＲシグナル伝達がＥＡＥ進行のための必要条件であると、結論を下した。
【００８７】
この研究の目的は、ＭＳについての動物モデルのＥＡＥにおけるＣＤ７３の役割を評価することであった。ＣＤ７３が、通例免疫抑制性である細胞外アデノシンの形成を触媒し（Ｂｏｕｒｓら著、「免疫および炎症における内因性シグナル伝達分子としてのアデノシン５’−三リン酸およびアデノシン（Adenosine 5’-Triphosphate and Adenosine as Endogenous Signaling Molecules in Immunity and Inflammation）」、ファーマコロジー・アンド・セラピューティックス（Pharmacol. Ther.）、１１２：３５８〜４０４、２００６年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、Ａ１ＡＲ−／−マウスが重篤なＥＡＥを示すので（ツツイら著、「Ａ１アデノシン受容体上方制御および活性化は、多発性硬化症モデルにおける神経炎症および脱髄を軽減する」、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、２４：１５２１〜１５２９、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、本発明者らは、ｃｄ７３−／−マウスもまた重篤なＥＡＥを発症させる可能性があると予測した。しかしながら、ｃｄ７３−／−マウスは、ＥＡＥ誘導に対して高度な耐性を示し、このことは、おびただしい量の研究が、ｃｄ７３−／−マウスはより炎症になりやすいことを証明していることを考慮すると驚くべき発見である。例えば、ｃｄ７３−／−マウスはよりブレオマイシン誘導肺損傷にかかりやすく（ウォリメル（Volmer）ら著、「エクト-5'-ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）媒介アデノシン産生は、ブレオマイシン誘導肺損傷のマウスにおける組織保護である（Ecto-5'-Nucleotidase (CD73)-Mediated Adenosine Production is Tissue Protective in a Model of Bleomycin-Induced Lung Injury）」、ジャーナル・オブ・イミュノロジー、１７６：４４４９〜４４５８、２００６年：この内容全体を本願明細書に組み込む）、より血管炎症および新生内膜肥厚になりやすい（ツェルネッケ（Zernecke）ら著、「ＣＤ７３／エクト−５’−ヌクレオチダーゼは血管炎症および新生内膜肥厚を防ぐ（CD73/ecto-5'-Nucleotidase Protects Against Vascular Inflammation and Neointima Formation）」、サーキュレイション（Circulation）、１１３：２１２０〜２１２７、２００６年：この内容全体を本願明細書に組み込む）。これらの報告と一致して、本発明者らは、ｃｄ７３−／−Ｔ細胞はＭＯＧ刺激に続いて高レベルのＥＡＥ関連炎症性サイトカイン、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１７を産生したということを示した。さらに、Ｔ細胞を欠くが末梢全体にわたってＣＤ７３を発現するｔｃｒα−／−マウスへのｃｄ７３−／−Ｔ細胞の養子移入は、結果として、抗炎症メディエーターとしてアデノシンが果たす役割に一致するＭＯＧ免疫化に続いて重篤なＣＮＳ炎症をもたらした。ＭＳに対する最も効果的な療法の１つであるＩＦＮ−β治療が生体外および生体内の両方において内皮細胞上でのＣＤ７３発現を上方制御することを示したことに注目することは興味深い（アイラス（Airas）ら著、「多発性硬化症の治療におけるIFN-βの作用機構（Mechanism of Action of IFN-Beta in the Treatment of Multiple Sclerosis）：ＣＤ７３およびアデノシンに対する特別参照（A Special Reference to CD73 and Adenosine）」、アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシス（Ann. N. Y. Acad. Sci.）、１１１０：６４１〜６４８、２００７年：この内容全体を本願明細書に��み込む）。ゆえに、ＩＦＮ−βがＭＳ患者に恩恵をもたらす機構は不完全にしか理解されていないが、既知の抗炎症および神経保護効果を伴うアデノシン産生の増加が要因になりうる。
【００８８】
ＥＡＥ誘導に対する耐性と一致して、ｃｄ７３−／−マウスは、野生型マウスと比較してＥＡＥの間ＣＮＳに浸潤する細胞のより低い頻度を有した。このことはまた、ＣＤ７３産生アデノシンが低酸素の間に血管内皮を横切る好中球の移動、および流入領域リンパ節の高内皮細静脈を横切るリンパ球の移動を制限することが先に示されているので、予期しなかった発見であった（トンプスン（Thompson）ら著、「低酸素中の血管漏出におけるエクト−５’−ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）の重要な役割」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン、２００：１３９５〜１４０５、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。対照的に、本発明者らのデータは、ＣＤ７３およびＣＤ７３により産生された細胞外アデノシンは病原性Ｔ細胞のＣＮＳ内への効率的な通過にとって必要とされることを示唆している。したがって、ＣＤ７３およびアデノシンがＥＡＥの間にＣＮＳリンパ球浸潤において担う役割は、神経炎症の調節におけるそれらの役割よりも重大である。
【００８９】
ＣＮＳ中へのＴ細胞移動のためにＣＤ７３がどこで発現されるべきかを知ることは重要である。ＣＤ７３は、Ｔ細胞のサブセット上（ヤマシタら著、「マウスリンパ球におけるＣＤ７３発現およびＦｙｎ依存性シグナル伝達」、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー、２８：２９８１〜２９９０、１９９８年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）ならびにいくつかの上皮細胞上（ストローメイヤーら著、「ヒト腸管上皮におけるＣＤ７３の表面発現、極性化、および機能的意義」、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション、９９：２５８８〜２６０１、１９９７年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）および内皮細胞上（ヤマシタら著、「マウスリンパ球におけるＣＤ７３発現およびＦｙｎ依存性シグナル伝達」、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー、２８：２９８１〜２９９０、１９９８年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）に見出される。ここで提示されるデータは、ｃｄ７３−／−Ｔ細胞はＭＯＧ免疫化に十分応答するが、ＣＤ７３が非造血組織内で発現されないかぎり、ｃｄ７３−／−Ｔ細胞はＣＮＳに入り込むことはできない、ということを明らかに証明している（すなわちｃｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−マウスはｃｄ７３−／−マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞の養子移入後ＥＡＥを発症させる）。非造血細胞上のＣＤ７３の欠如はまた、Ｔ細胞上のＣＤ７３発現により幾分補うことができる（すなわちｃｄ７３−／−マウスは、ＣＤ７３−ではなくＣＤ７３＋のＣＤ４＋Ｔ細胞が養子移入されるとＥＡＥにかかりやすくなる）。ＣＮＳ内のＣＤ７３の適切な源としてＢＢＢ内皮細胞が検討される一方で、ＣＤ７３はヒト脳内皮細胞上に発現されるので（アイラスら著、「多発性硬化症の治療におけるＩＦＮ−βの作用機構：ＣＤ７３およびアデノシンに対する特別参照」、アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシス、１１１０：６４１〜６４８、２００７年：この内容全体を本願明細書に組み込む）、免疫組織化学的検査は、マウス脳内皮細胞はＣＤ７３−であることを明らかにした。しかしながら、ＣＤ７３は、血液と脳脊髄液（ＣＳＦ）との間の関門を形成しＣＮＳ内のリンパ球免疫監視を調整する役割を有する脈絡叢上皮細胞上に高度に発現されることが見出された（ステファン（Steffen）ら著、「ＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＭＡｄＣＡＭ−１は、脈絡叢上皮上に発現されるが脈絡叢内皮上では発現されず、生体外でリンパ球の結合を媒介する（CAM-1, VCAM-1, and MAdCAM-1 are Expressed on Choroid Plexus Epithelium but Not Endothelium and Mediate Binding of Lymphocytes In Vitro）」、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Am. J. Pathol.）、１４８：１８１９〜１８３８、１９９６年：この内容全体を本願明細書に組み込む）。該脈絡叢はまた、ＥＡＥ進行の開始の間、Ｔ細胞のための入口点であると示唆されている（ブラウンら著、「炎症および神経変性事象の時間経過および分布は実験的自己免疫性脳脊髄炎の病変形成のための構造的基礎を提案する」、ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジー、５０２：２３６〜２６０、２００７年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。ＥＡＥおよびＭＳの双方においてＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１結合を介するリンパ球−脳内皮細胞の相互作用の役割は、十分に証明されてきたが（ライス（Rice）ら著、「多発性硬化症のための抗α４インテグリン療法（Anti-Alpha4 Integrin Therapy for Multiple Sclerosis）：機構および原理（Mechanisms and Rationale）」、ニューロロジー（Neurology）、６４：１３３６〜１３４２、２００５年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、おそらく内皮ＢＢＢを横切るリンパ球移動は、少なくともＥＡＥについては、疾患発症よりも疾患維持および進行のために、より重要である。
【００９０】
次の問題は、ＣＤ７３がＴ細胞のＣＮＳへの移動をどのように促すかである。初期の取り組みでは、リンパ球ＣＤ７３は、ＬＦＡ−１依存方法でヒトリンパ球を内皮細胞に結合することを促進できる、ということを示した（アイラスら著、「ＣＤ７３会合は、リンパ球機能関連抗原−１−依存機構により、リンパ球の内皮細胞への結合を促進する（CD73 Engagement Promotes Lymphocyte Binding to Endothelial Cells Via a Lymphocyte Function-Associated Antigen-1-dependent Mechanism）」、ジャーナル・オブ・イミュノロジー、１６５：５４１１〜５４１７、２０００年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。しかしながら、このことは、ＣＤ７３欠損Ｔ細胞はＣＮＳに入り込み、ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒα−／−マウスに重篤な疾患を引き起こすことがあるので、ＥＡＥではＣＤ７３の機能であるようには思われない（図２Ｄ）。代替的に、ＣＤ７３は、細胞表面ＡＲのためのリガンドである細胞外アデノシンを産生するために酵素として機能することができる。カフェインまたはＳＣＨ５８２６１によるＡＲ遮断はマウスをＥＡＥから保護しうることを考慮すると、現在与えられている研究に関連するのはこの後者の機能である。広域スペクトルＡＲアンタゴニストカフェインもまた、特定のホスホジエステラーゼを阻害するが（チョウイ（Choi）ら著、「カフェインおよびテオフィリン類似体（Caffeine and Theophylline Analogues）：アデノシン受容体アンタゴニストとしておよびホスホジエステラーゼ阻害剤としての活性と行動的影響との相関関係（Correlation of Behavioral Effects With Activity as Adenosine Receptor Antagonists and as Phosphodiesterase Inhibitors）」、ライフ・サイエンシス（Life Sci.）、４３：３８７〜３９８、１９８８年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、ＥＡＥ進行の広域スペクトルＡＲアンタゴニストカフェインの調節は、たいがいＡＲシグナル伝達への影響による（ツツイら著、「Ａ１アデノシン受容体上方制御および活性化は、多発性硬化症モデルにおける神経炎症および脱髄を軽減する」、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、２４：１５２１〜１５２９、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。この説は、ＳＣＨ５８２６１もまたＡ２ａＡＲシグナル伝達を特異的に阻害することによってＥＡＥ進行を防ぐという事実により支持される。ＣＤ７３ならびにＡ１およびＡ２ａＡＲサブタイプは脈絡叢上で発現されるので、脈絡叢においてＣＤ７３により産生された細胞外アデノシンは、自己分泌方式でシグナル伝達することができる。
【００９１】
該Ａ１およびＡ２ａＡＲは機能的に互いに対して拮抗し、アデノシンに対して異なる親和性を有するので（カルタ（Quarta）ら著、「側坐核の殻内でのグルタミン酸およびドーパミン放出におけるアデノシンＡ１およびＡ２ａ受容体が果たす正反対の調節性役割。慢性的カフェイン曝露の効果（Opposite Modulatory Roles for Adenosine A1 and A2A Receptors on Glutamate and Dopamine Release in the Shell of the Nucleus Accumbens.  Effects of Chronic Caffeine Exposure）、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー、８８：１１５１〜１１５８、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、アデノシンの細胞外濃度が、該Ａ１およびＡ２ａ受容体を発現する細胞がどのように応答するのかを決定する：ゆえに、低濃度のアデノシンはＡ１サブタイプを活性化し、より高濃度がＡ２ａサブタイプを刺激する機構的スイッチを作り出す（シルエラ（Ciruela）ら著、「アデノシンＡ１−Ａ２Ａ受容体ヘテロマーによる線条体グルタミン酸作動性神経伝達のシナプス前制御（Presynaptic Control of Striatal Glutamatergic Neurotransmission by Adenosine A1-A2A Receptor Heteromers）」、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、２６：２０８０〜２０８７、２００６年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。ＣＮＳにおいて、このＡ１／Ａ２ａ相互作用が神経炎症を媒介することにおいて重要であると示唆する根拠があり、ここで、Ａ１シグナル伝達は保護的である一方、Ａ２ａシグナル伝達は炎症を促進する。例えば、Ａ１アデノシン受容体を欠くマウスは疾患誘導に続いて重篤なＥＡＥを発症させる一方（ツツイら著、「Ａ１アデノシン受容体上方制御および活性化は、多発性硬化症モデルにおける神経炎症および脱髄を軽減する」、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、２４：１５２１〜１５２９、２００４年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、Ａ２ａアンタゴニストを与えられたマウスは、ＥＡＥから完全に保護される（図５Ｃ）。加えて、Ａ２ａ受容体を欠くマウスは、一過性局所虚血により誘導された脳損傷から保護される（チェン（Chen）ら著、「Ａ(２Ａ)アデノシン受容体欠損は、マウスにおける一過性局所虚血により誘導された脳損傷を和らげる（A(2A) Adenosine Receptor Deficiency Attenuates Brain Injury Induced by Transient Focal Ischemia in Mice）」、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス、１９：９１９２〜９２００、１９９９年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。したがって、脈絡叢におけるＣＤ７３産生アデノシンシグナル伝達は、ＣＮＳでの炎症を調節することにおいて非常に重要な役割を担うように思われる。
【００９２】
このアデノシンシグナル伝達はおそらく、脈絡叢での接着分子の発現を調整するだろう。複数の研究は、脈絡叢での接着分子、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＭａｄＣＡＭ−１の上方制御が、ＥＡＥ進行と関連することを示した（エンゲルハートら著、「中枢神経系炎症における脈絡叢の関与」、マイクロスコピカル・リサーチ・アンド・テクノロジー、５２：１１２〜１２９、２００１年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）。Ａ２ａＡＲアンタゴニストＳＣＨ５８２６１で処置されたマウスは、通常ＥＡＥ誘導に続いて起こるような脈絡叢ＩＣＡＭ−１発現の増加を経験しないので（図８）（エンゲルハートら著、「中枢神経系炎症における脈絡叢の関与」、マイクロスコピカル・リサーチ・アンド・テクノロジー、５２：１１２〜１２９、２００１年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む）、この結果は、Ａ２ａＡＲシグナル伝達がＥＡＥ進行の間、ＩＣＡＭ−１を増加させることを示唆している。
【００９３】
要約すると、このデータは、ＣＤ７３がＥＡＥの進行において重大な役割を担うことを示す。ＣＤ７３を欠くマウスは、ＥＡＥ誘導と関連する変性症状およびＣＮＳ炎症から保護される。このことは、ＥＡＥの間にリンパ球がＣＮＳ内へ効率的に入り込むためのＣＤ７３発現およびＡＲシグナル伝達の必要性を証明する最初の研究である。ここに提示されたデータは、ＭＳおよび他の神経炎症疾患に対する新規療法へつながることになる旅路の第１歩を印する可能性がある。
【００９４】
〔実施例１４−ＢＢＢはアデノシン受容体の活性化を通して調節されうる〕
この実験の目的は、血液脳関門はアデノシン受容体の活性化によって調節されうるかどうかを決定することであった。ＮＥＣＡは、Ａ１、Ａ２ａおよびＡ３アデノシン受容体に対して同様の親和性を有し、かつＡ２ｂアデノシン受容体に対して低い親和性を有する非選択的アデノシン受容体アゴニストである。アデノシン受容体の活性化が血液脳関門（ＢＢＢ）を横切るエバンスブルー色素の溢出を誘導するかどうかを決定するために、非選択的アデノシン受容体アゴニストである、ＮＥＣＡ（ｎ＝５、１００μＬ  ０．０１ｎＭ）；Ａ２ａアデノシン受容体特異的アンタゴニストである、ＳＣＨ５８２６１（ｎ＝５、１ｍｇ／ｋｇ）；ＢＢＢ漏出を誘導することで知られており、そのため陽性対照として使用される薬剤である、百日咳毒素（ｎ＝７、２００μＬ）；および、媒体対照としてＰＢＳ（ｎ＝５、１００μＬ）でマウスを処置した。細胞外アデノシンを産生する能力を欠くＣＤ７３−／−マウスもＮＥＣＡで処置した（ｎ＝４、１００μＬ  ０．０１ｎＭ)。処置は２００μＬの１％エバンスブルー色素の静脈注射（計２μｇの色素を注射）の１時間前に、単一静脈注射として施された。エバンスブルーを投与して４時間後に、ケタミン／キシラジン混合物でマウスに麻酔をし、左心室を介して氷冷ＰＢＳで灌流した。脳を採取し、ｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、５μＬ／ｍｇ（体積：重量）で均質化した。組織をＤＭＦ中で７２時間、室温でインキュベートして色素を抽出した。抽出に続いて、組織／溶媒混合物を３０分間５００×ｇで遠心分離し、１００μＬの上澄み液をＢｉｏＴｅｘ分光光度計で６２０ｎｍにおいて読み取った。データを、μｇ  エバンスブルー／ｍＬ  ＤＭＦとして表す。
【００９５】
一般的なアデノシン受容体アゴニストＮＥＣＡでマウスを処置することは、血液脳関門を横切る色素の移動を誘導することができる。このことは、この関門がアデノシン受容体の活性化を通して調節されうることを示唆する。図９Ａにおいて、細胞外アデノシンを欠き、ゆえにアデノシン受容体を通して適切にシグナル伝達することができないＣＤ７３−／−マウスをＮＥＣＡで処置し、その結果、色素移動においてＰＢＳ対照に対してほぼ５倍の増加をもたらした。本発明者らは、このアンタゴニストを使用したＡ２ａアデノシン受容体の遮断はリンパ球が脳へ入り込むことを防ぐことができる、ということを示したので、ＳＣＨ５８２６１を陰性対照として使用した(ミルズ（Mills）ら著、「実験的自己免疫性脳脊髄炎の間、リンパ球が中枢神経系内へ効率的に入り込むためにＣＤ７３が必要である（CD73 is Required for Efficient Entry of Lymphocytes into the Central Nervous System During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis）」、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス（Proc. Natl. Acad. Sci.）、１０５（２７）：９３２５〜９３３０、２００８年：この内容全体を参照により本願明細書に組み込む)。図９Ｂにおいて、ＮＥＣＡで処置された野生型マウスもまた、対照マウスを超える増加を示している。百日咳がマウスＥＡＥモデルにおいて血液脳関門漏出を誘導することが知られているので、百日咳を陽性対照として使用する。
【００９６】
〔実施例１５−Ａ２ａおよびＡ２ｂアデノシン受容体はヒト内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３上に発現される〕
生体外で血液脳関門（ＢＢＢ）を確立するために、ＢＢＢ特性を有するとして先に説明されたヒト脳内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（ウエクスラー（Weksler）ら著、「ヒト成人脳内皮細胞株の血液脳関門特異的特性（Blood-brain Barrier-specific Properties of a Human Adult Brain Endothelial Cell Line）」、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー、１９（１３）：１８７２〜４、２００５年；ポラー（Poller）ら著、「薬物輸送研究のためのヒト血液脳関門モデルとしてのヒト脳内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（The Human Brain Endothelial Cell Line hCMEC/D3 as a Human Blood-brain Barrier Model for Drug Transport Studies）」、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー、１０７（５）：１３５８〜１３６８、２００８年：これら文献の内容全体を参照により本願明細書に組み込む）を取得した。ここで、これらの細胞におけるアデノシン受容体の発現パターンを確立した。
【００９７】
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をコンフルエントまで増殖させて採取し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）をメーカーの使用説明書にしたがって使用してＲＮＡを抽出した。Ｖｅｒｓｏ  ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用してｃＤＮＡを合成し、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスター・シティー）を使用してリアルタイムＰＣＲを実行した。
【００９８】
図１０に示されているように、Ａ２ａおよびＡ２ｂアデノシン受容体は、ヒト内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３において発現されることが見出された。
【００９９】
〔実施例１６−脳内皮細胞のアデノシン受容体刺激は、ＢＢＢを通るリンパ球移動を促進する〕
血液脳関門（ＢＢＢ）は内皮細胞から構成される。ＥＡＥの後期の間、リンパ球はＢＢＢを横断することが知られている。脳内皮細胞のアデノシン受容体刺激がＢＢＢを通るリンパ球移動を促進することができるかどうかを決定するために、生体外ＢＢＢを確立した。ＢＢＢ特性を有するとして先に説明されたヒト脳内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（ウエクスラーら著、「ヒト成人脳内皮細胞株の血液脳関門特異的特性」、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー、１９（１３）：１８７２〜４、２００５年；ポラーら著、「薬物輸送研究のためのヒト血液脳関門モデルとしてのヒト脳内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３」、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー、１０７（５）：１３５８〜１３６８、２００８年：これら文献の内容全体を参照により本願明細書に組み込む）を取得した。
【０１００】
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌ上に播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。ＮＥＣＡ（一般的なアデノシン受容体（ＡＲ）アゴニスト）、ＣＣＰＡ（Ａ１ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ  ２１８６０（Ａ２ＡＡＲアゴニスト）、またはＤＭＳＯ媒体を用いて、あるいは用いずに、２×１０６のジャーカット細胞を上層チャンバに加えた。２４時間後、下層チャンバ内の移動した細胞を数えた。数値を、ＨＣＭＥＣＤ３を播種していないｔｒａｎｓｗｅｌｌを通って移動した細胞の数と比べる。
【０１０１】
図１１に示されたように、広域スペクトルアデノシン受容体アゴニストであるＮＥＣＡはいくらかの移動を誘導した。Ａ２ａアデノシン受容体アゴニストであるＣＧＳは、より低濃度で使用された場合、生体外ＢＢＢを横切るリンパ球移動を促進した。Ａ１アゴニストであるＣＣＰＡは、高レベルでリンパ球移動を誘導した。これは、おそらくＣＣＰＡに対してより低い親和性を有し、ゆえにＣＣＰＡのより高いレベルでのみ活性化される、Ａ２ａアデノシン受容体の活性化に起因する。
【０１０２】
〔実施例１７−Ａ２ａアデノシン受容体活性化はＣＰを横切るリンパ球移動を促進する〕
脈絡叢（「ＣＰ」）はＣＮＳ内へのリンパ球移動を制御する。ＣＰはＡ１およびＡ２ａアデノシン受容体を発現させる。マウスにおいて、Ａ２ａアデノシン受容体活性が遮断されるとＥＡＥが妨げられる。Ａ１アデノシン受容体が欠損しているとＥＡＥが助長される。Ａ２ａアデノシン受容体活性化がＣＰを横切るリンパ球移動を促進すると仮定された。Ｚ３１０細胞は、マウス脈絡叢細胞株である。
【０１０３】
この仮定を試験するために、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜にＺ３１０細胞を播種しコンフルエントになるまで増殖させた。ＮＥＣＡ（ｎ＝１、一般的なＡＲアゴニスト）、ＣＣＰＡ（ｎ＝１、Ａ１ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ  ２１８６０（ｎ＝１、Ａ２ＡＡＲアゴニスト）、またはＤＭＳＯ媒体（ｎ＝１）を用いるか、または用いずに、２×１０６のジャーカット細胞を上層チャンバに加えた。２４時間後、下層チャンバ内の移動した細胞を数えた。数値を、Ｚ３１０を播種していないｔｒａｎｓｗｅｌｌを通って移動した細胞の数と比べ、その結果を図１２に示した。
【０１０４】
図１２に示されているように、広域スペクトルアデノシン受容体アゴニストであるＮＥＣＡは移動を誘導した。Ａ２ａアデノシン受容体アゴニストであるＣＧＳは、ＣＰを横切るリンパ球移動を促進した。Ａ１アゴニストであるＣＣＰＡは、高いレベルでリンパ球移動を誘導した。これはおそらく、ＣＣＰＡに対してより低い親和性を有し、そのため高いレベルのＣＣＰＡでのみ活性化されるＡ２ａアデノシン受容体の活性化に起因する。
【０１０５】
〔実施例１８−ヒト脳内皮細胞はアデノシン受容体誘導ｃＡＭＰ調整に感受性がある〕
アデノシン受容体活性化は、細胞内のｃＡＭＰレベルを調整する。アデノシン受容体誘導ｃＡＭＰ調整に対するヒト脳内皮細胞の感受性を決定するために、ヒト脳内皮細胞を様々な濃度のアデノシン受容体アゴニストを用いて培養し、その後、図１３に示されているようにｃＡＭＰレベル分析を行った。
【０１０６】
ＨＣＭＥＣＤ３細胞を２４ウェルプレート上でコンフルエントまで増殖させた。アデノシン受容体（「ＡＲ」）刺激はｃＡＭＰレベルに影響を及ぼすことが知られているので、様々な濃度のＮＥＣＡ（一般的なＡＲアゴニスト）、ＣＣＰＡ（Ａ１ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ  ２１８６０（Ａ２ＡＡＲアゴニスト）、ＤＭＳＯ媒体、またはＦｏｒｋｓｏｌｉｎ（ｃＡＭＰを誘導する）を用いて、あるいは用いずに細胞を処理した。１５分後、溶解バッファーを加えて、反応を停止させるために細胞を−８０℃で凍結させた。複製サンプルを各条件に使用した。ｃＡＭＰ  Ｓｃｒｅｅｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスター・シティー）を使用して、ｃＡＭＰレベルを検定した。
【０１０７】
図１３に示されているように、広域スペクトルアデノシン受容体アゴニストＮＥＣＡはｃＡＭＰレベルを増加させた。このことは、これらの細胞がアデノシン受容体シグナル伝達に応答できることを立証している。高レベルのＣＣＰＡ、Ａ１アデノシン受容体アゴニストは、ｃＡＭＰレベルを増加させた。この場合もやはり、おそらく、ＣＣＰＡに対してより低い親和性を有し、そのため高レベルのＣＣＰＡでのみ活性化されるＡ２ａアデノシン受容体の活性化に起因する。Ａ２ａアデノシン受容体アゴニストであるＣＧＳは、ヒト脳内皮細胞株においてｃＡＭＰレベルをわずかに増加させた。  
【０１０８】
〔実施例１９−雌Ａ１アデノシン受容体ノックアウトマウスは野生型よりもより重篤なＥＡＥを発症させる〕
Ａ１およびＡ２ａアデノシン受容体を脈絡叢上に発現させる。Ａ２ａアデノシン受容体アンタゴニストは、マウスをＥＡＥから保護する。Ａ１アデノシン受容体を欠くマウスは野生型対照よりもより重篤なＥＡＥを発症する傾向があるのであろうか？この質問に答えるために、野生型マウス、およびＡ１アデノシン受容体ヌルマウスの疾患プロファイルを比較した。
【０１０９】
雌Ａ１アデノシン受容体ノックアウト（Ａ１ＡＲＫＯ、ｎ＝５）マウス、および野生型（ＷＴ、ｎ＝５）マウスを、２００８年２月１２日にＣＦＡ／ＭＯＧ３５−５５＋ＰＴＸで免疫化し、４１日間毎日評点を付けた。図１４に結果を図示したように、Ａ１ＡＲＫＯマウスは、野生型よりもより重篤なＥＡＥを発症させ、また、野生型よりもより速い速度で疾患を発症させる。
【０１１０】
〔実施例２０−アデノシン受容体アンタゴニストを給餌された野生型マウスからの脳は、アデノシン受容体アンタゴニストを給餌されたＣＤ７３−／−マウスからの脳よりも高いレベルのＦＩＴＣ−デキストランを有する〕
一般的なアデノシン受容体アンタゴニストであるカフェインの血液脳関門透過性への影響を検査するために、マウスにカフェインを数日間給餌し、その後、内皮透過性を評価するために一般的に使用されるＦＩＴＣデキストランを注射した。
【０１１１】
さらに詳細には、マウスに、水中の０．６ｇ／Ｌカフェイン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、または普通の水を５日間適宜給餌した。マウスにＦＩＴＣデキストラン（１０，０００ＭＷ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）を腹腔内注射し、３０分後、マウスを氷冷ＰＢＳで左心室を介して灌流した。脳を取り出しＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ、カリフォルニア州トランス）内で瞬間凍結し、切片にするまで−８０℃で保管した。組織切片（５μｍ）を光学顕微鏡検査のためにヘマトキシリンで、また、蛍光対比染色のためにＤＡＰＩで染色した。結果を図１５に示した。
【０１１２】
図１５Ａに示されているように、カフェインを給餌されたＣＤ７３−／−マウスからの脳切片の可視化は、野生型マウスよりも緑色の濃さがはるかに薄いことを表し、このことは血液脳関門を横切るＦＩＴＣデキストランのより少ない溢出を示している。野生型マウスからの脳切片は、血液脳関門を横切るより多くのＦＩＴＣ−デキストラン溢出を示す、非常に濃い緑の背景を示した（図１５Ｂ）。図１６は、野生型マウスの結果をグラフの形で示している。
【０１１３】
〔実施例２１−アデノシン受容体アゴニストＮＥＣＡは血液脳関門を横切るエバンスブルー色素溢出を増加させる〕
この実験の目的は、血液脳関門がアデノシン受容体の活性化によって調節されうるかどうかを決定することであった。ＮＥＣＡは、Ａ１、Ａ２ＡおよびＡ３アデノシン受容体に対する同様の親和性を有し、また、Ａ２ｂアデノシン受容体に対する低い親和性を有する、非選択的アデノシン受容体アゴニストである。
【０１１４】
アデノシン受容体の活性化が血液脳関門（ＢＢＢ）を横切るエバンスブルー色素の溢出を誘導するかどうかを決定するために、まず第１日目にマウスを、非選択的アデノシン受容体アゴニストであるＮＥＣＡ（ｎ＝２、１００μＬ  ０．０１ｎＭ）、および媒体対照としてＰＢＳ（ｎ＝２、１００μＬ）で処置した。その後、第２日目に、ＥＡＥを誘導するために、マウスをＣＦＡ−ＭＯＧ３５−５５および百日咳で免疫化した。その後、ＮＥＣＡまたはＰＢＳを第３日目、第５日目、第７日目、および第９日目に１日おきに投与した。第１０日目に、マウスに２００μＬの１％エバンスブルー色素（計２μｇの色素を注射）を静脈内注射した。エバンスブルーを投与して６時間後に、ケタミン／キシラジン混合物でマウスに麻酔をし、左心室を介して氷冷ＰＢＳで灌流した。脳を採取し、ｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、５μＬ／ｍｇ（体積：重量）で均質化した。組織をＤＭＦ中で７２時間、室温でインキュベートして色素を抽出した。抽出に続いて、組織／溶媒混合物を３０分間５００×ｇで遠心分離し、１００μＬの上澄み液をＢｉｏＴｅｘ分光光度計で６２０ｎｍにおいて読み取った。データは、ｐｇ  エバンスブルー／ｍＬ  ＤＭＦとして表し、図１７に示されている。
【０１１５】
この実験は、一般的なアデノシン受容体アゴニストＮＥＣＡでマウスを処置することが、ＥＡＥに対して免疫化されたマウスのＣＮＳ内にエバンスブルー色素が移動することを誘導する、ということを証明している。このことは、ＥＡＥモデルにおける血液脳関門がアデノシン受容体の活性化を通して調節されうる、ということを示唆している。ＮＥＣＡで処置された野生型ＥＡＥマウスは、ＰＢＳ対照ＥＡＥマウスを超えるＢＢＢ透過性の増加を示している。
【０１１６】
好ましい実施形態が本明細書において詳細に描写され説明されたが、様々な修正、追加、置換などを本発明の精神から逸脱することなく実施することが可能であり、したがってこれらは以下の特許請求の範囲に定めされるとおり本発明の範囲内にあると見なされることは、当業者にとっては明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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