(57)【要約】本明細書に説明されているように、バイオセンサー、生細胞、及び経路活性化合物を使用したＧＰＣＲシグナリング経路の分析及び解明をなすシステムと方法を提供する。
2011515065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＣＲシグナリング経路の決定方法であって、
バイオセンサに生細胞を固定するステップと、
前記生細胞において細胞内ｃＡＭＰを増加させ且つタンパク質キナーゼＡを活性化する物質に、当該固定された生細胞を接触せしめるステップと、
当該物質に接触せしめられた生細胞をＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップと、
前記物質が存在する場合と存在しない場合における前記生細胞に関する前記ＧＰＣＲリガンド誘起のバイオセンサの応答を検出し且つ比較するステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記物質はアデニラート活性剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記アデニラート活性剤は、ホルスコリン、ＮＫＨ４７７、１，９ジデオキシ‐ホルスコリン、７‐デアセチル‐７‐Ｏ‐へミスチニル‐ホルスコリン、又はそれら組み合わせの内の少なくとも１つを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
前記物質は細胞浸透性ｃＡＭＰ類似物質を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項５に記載の方法であって、
前記細胞浸透性ｃＡＭＰ類似物質は、（Ｓ）−アデノシン、環状３’、５’−（ハイドロゲンホスホロチオエート）トリエチルアンモニウム、８−ブロモアデノシン−３’、５’−環状リン酸、８−クロロアデノシン−３’、５’−環状リン酸、Ｎ６，２’−Ｏ−ジブチリルアデノシン−３’、５’−環状リン酸、又はそれらの組合せのうちの少なくとも１つことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記ＧＰＣＲリガンドは、前記生細胞内に発現した受容体を介したシグナリングを調節する作用物質、部分作用物質、逆作用物質、又はそれらの組合せ、のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記固定された生細胞を前記物質に接触せしめる前記ステップは、第１に細胞内ｃＡＭＰを増大せしめ、かつ、第２にタンパク質キナーゼＡを活性せしめることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
バイオセンサ上に生細胞を固定する前記ステップは、約１パーセントから約９９パーセントのバイオセンサ表面被覆率を有する密集度が得られるまで生細胞をバイオセンサ表面に培養するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記増大された細胞内ｃＡＭＰレベルは、
Ｇｑ若しくはＧ１２／１３シグナリングに対して部分的な抑制効果を与え、
異種脱感作によりＧｓシグナリングを完全に減衰せしめ、
異種感作によりＥＣ５０濃度においてＧｉシグナリングを増強せしめ、
生細胞ＧＰＣＲシグナリングの抽出及び決定を可能にせしめることを特徴とする方法。
【請求項１０】
ホスホリパーゼＣ抑制剤をアデニールサイクラーゼ活性剤と合成するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、
刺激を用いて、前記固定された生細胞の前処理、中間処理、後処理、又はそれら組合せのうち少なくとも１つをさらに含む方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、
前記ＧＰＣＲリガンド誘起のバイオセンサの応答により、ＧＰＣＲシグナリング経路に与える周知の治療用化合物若しくは治療候補化合物の陽性若しくは陰性の効果が特定されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、
前記ＧＰＣＲリガンド誘起のバイオセンサの応答は、異なるクラスのＧタンパク質シグナリングを識別し、ＧＰＣＲのシグナリングと非ＧＰＣＲのシグナリングとを識別し、又は、それら双方を識別することを特徴とする方法。
【請求項１４】
ＧＰＣＲシグナリング経路の決定方法であって、
バイオセンサに生細胞を固定するステップと、
当該固定された生細胞をＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップと、
前記生細胞において細胞内ｃＡＭＰを増加させ且つタンパク質キナーゼＡを活性化する物質に、当該ＧＰＣＲリガンドに接触せしめられた生細胞を接触せしめるステップと、
前記ＧＰＣＲリガンドが存在する場合と存在しない場合における前記生細胞に関する前記物質誘起のバイオセンサの応答を検出し且つ比較するステップと、を含む方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
前記ＧＰＣＲは、ヒト類表皮Ａ４３１細胞に発現した内因性ニコチン酸受容体ＨＭ７４ａであることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、
前記ＧＰＣＲリガンドは、前記生細胞内に発現した前記ＧＰＣＲを介してシグナリングを調整する作用物質、部分作用物質、逆作用物質、又はそれらの組合せ、のうちの少なくとも１つを含むことを特徴する方法。
【請求項１７】
ＧＰＣＲシグナリング経路の決定方法であって、
バイオセンサに生細胞を固定するステップと、
前記細胞内において細胞内ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性を抑制する物質に、当該固定された生細胞を接触せしめるステップと、
当該ＰＬＣ抑制されたが生細胞をＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップと、
前記物質が存在する場合と存在しない場合における前記生細胞の前記ＧＰＣＲリガンド誘起のバイオセンサの応答を検出し且つ比較するステップと、を含む方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、
前記細胞内において細胞内ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性を抑制する前記物質は、
ＰＬＣ抑制剤、ＰＬＣ遺伝子抑制干渉ＲＮＡ、又はそれらの組合せ、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記ＰＬＣ抑制剤はＵ７３１２２を含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
前記ＰＬＣ活性の前記抑制は、Ｇｓ若しくはＧ１２／１３シグナリングに対して限定的効果を与え、
Ｇｑ信号通信を完全に減衰せしめ、
Ｇｉシグナリングを部分的に減衰せしめ、
生細胞のＧＰＣＲシグナリングの抽出及び決定を可能にせしめることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【先願の米国出願の利益の請求】
【０００１】
本出願は、２００７年１０月６日に出願された米国仮出願第６０／９９７，９１０号、２００７年１１月３０日に出願された米国特許出願第１１／９９８，７１１号の利益を主張する。この先願の米国出願の内容及びこの明細書で引用された公報、特許、及び特許出願の全てが参考として組み込まれている。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、共鳴導波グレーティングバイオセンサンサ又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ等の光学バイオセンサに関し、特に、バイオセンサベースの生細胞分析を利用したＧＰＣＲシグナリング経路の分析方法に関する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、バイオセンサベースの生細胞分析を利用したＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）等受容体シグナリング経路の分析及び解明に対して直接的方法及び間接的方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、本開示の実施例におけるアデニールサイクラーゼアイソフォーム依存性細胞シグナリング経路を示す概略図である、
【図２】図２は、本開示の実施形態におけるＧｑ（Ｇαｑ）、Ｇｉ（Ｇαｉ）、Ｇｓ／ｏ（Ｇαｓ／ｏ）、及びＧβγ介在シグナリング経路から、細胞内アデニールサイクラーゼまでのクロストークと、ｃＡＭＰレベルに与えるその影響と、を示す概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本開示の実施形態における静的Ａ４３１細胞におけるＮＥＣＡ誘起のＧｓ応答に与えるホルスコリンの前処理の効果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本開示の実施形態における静的Ａ４３１細胞におけるホルスコリン誘起のＧｓ反応に対して与えるＮ−エチルアデノシン−５’−ウロン酸（ＮＥＣＡ：Ｎ−ｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’−ｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）前処理の効果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、本開示の実施形態における静的Ａ４３１細胞におけるヒスタミン誘起のＧｑ応答に対して与えるホルスコリン前処理の効果を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本開示の実施形態における静的Ａ４３１細胞におけるホルスコリン誘起のＧｑ反応に対して与えるヒスタミン前処理の効果を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、本開示の実施形態における静的Ａ４３１細胞におけるニコチン酸誘起のＧｉ反応に対して与えるホルスコリン前処理の効果を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本開示の実施形態における静的Ａ４３１細胞におけるニコチン酸誘起のＧｉ反応に対して与えるホルスコリン前処理の効果を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、本開示の実施形態におけるＲＷＧバイオセンサを使用した生細胞における３つのクラスの（Ｇｑ‐、Ｇｓ‐、及びＧｉ‐）ＤＭＲ信号のＧＰＣＲシグナリングを示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本開示の実施形態におけるＲＷＧバイオセンサを使用した生細胞における３つのクラスの（Ｇｑ‐、Ｇｓ‐、及びＧｉ‐）ＤＭＲ信号のＧＰＣＲシグナリングを示す図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本開示の実施形態におけるＲＷＧバイオセンサを使用した生細胞における３つのクラスの（Ｇｑ‐、Ｇｓ‐、及びＧｉ‐）ＤＭＲ信号のＧＰＣＲシグナリングを示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、本開示の実施形態における静的Ａ４３１細胞におけるヒスタミン誘起のＤＭＲ信号に与えるＵ７３１２２の前処理の効果と、そのＰ−ＤＭＲ振幅とをそれぞれ示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本開示の実施形態における静的Ａ４３１細胞におけるヒスタミン誘起のＤＭＲ信号に与えるＵ７３１２２前処理の効果と、そのＰ−ＤＭＲ振幅とをそれぞれ示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明の様々な実施形態が、添付の図面を参照して詳細に説明されるであろう。様々な実施形態に対する言及は、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明は、添付した請求の範囲によってのみ限定される。さらに、本明細書に述べられたいかなる実施例も、限定することを目的とはしていないし、特許請求の範囲に記載された発明の多くの実施形態の内、いくつかについて説明しているにすぎない。
【定義】
【０００６】
「分析（Ａｓｓａｙ）」、「分析する（Ａｓｓａｙｉｎｇ）」等の用語は、例えば、外因性刺激を用いた刺激に対する細胞の光学的応答又はバイオインピーダンスの応答の存在の有無、量、程度、動特性、及びタイプを決定する分析を意味する。外因性刺激は、例えば、リガンド候補化合物、アデニラート活性剤、ｃＡＭＰ類似体、又はＧＰＣＲリガンド若しくはリガンド候補等である。
【０００７】
「付着する（Ａｔｔａｃｈ）」、「付着（Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」、「接着（ａｄｈｅｒｅ）」、「接着された（ａｄｈｅｒｅｄ）」、「接着（ａｄｈｅｒｅｎｔ）」、「固定された（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）」等の用語は、物理吸着又は化学結合等の処理若しくはそれらの組み合わせ等によって、例えば、本開示の細胞等の構成要素を、表面に、固定し、準備し、培養等することを一般に意味する。特に、「細胞の付着（ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」、「細胞の接着（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）」等の用語は、細胞固定材料、相溶剤（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミン、ゼラチン、ポリリジン等）、若しくはそれら双方を用いて培養し、相互作用せしめることによって、表面との細胞の相互作用又は表面との細胞の結合を意味する。実施形態において、バイオセンサ上に生細胞を固定するステップは、例えば、約１パーセントから約９９パーセントのバイオセンサ表面被覆率及び同様の密集度値若しくは範囲等を有する密集度が得られるまで生細胞をバイオセンサ表面に培養するステップを含み得る。
【０００８】
「付着性細胞（Adherent cells）」とは、原核生物の細胞若しくは真核細胞等の細胞、細胞株又は細胞システムを意味し、かかる細胞、細胞株又は細胞システムは、基板の外部表面に関連付けられ、基板の外部表面上に固定され、又は特定の接触を維持する。培養後のかかる細胞は、洗浄媒質交換処理、すなわち、多くの細胞ベースの分析に必須である処理に対して抵抗力を有し、耐性を有し得る。「弱付着性細胞（Weakly adherent cells）」とは、原核生物の細胞若しくは真核細胞等の細胞、細胞株又は細胞システムを意味し、かかる細胞、細胞株又は細胞システムは、細胞培養中に、基板の表面と弱く相互作用し、基板の表面と弱く関連し、基板の外部表面と弱く接触する。しかしながら、これらのタイプの細胞、例えば、人間の胎児性腎臓（ＨＥＫ：ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞は、洗浄液若しくは媒質の交換等の物理的摂動によって、基板の表面から容易に解離する傾向がある。「懸濁細胞（Suspension cells）」とは、望ましくは、媒質で培養される細胞又は細胞株を意味し、当該媒質において細胞は、培養中に、基板の表面に付着し若しくは固着しない。「細胞の培養（Cell culture）」又は「細胞培養（Cell culturing）」とは、原核生物細胞若しくは真核細胞が一定条件下で培養される処理を意味する。「細胞の培養（Cell culture）」とは、多細胞の真核細胞、特に動物細胞から得られた細胞の培養と、複合生体組織及び臓器の培養と、を意味する。
【０００９】
「細胞（Cell）」等の用語は、半透明の膜によって外部的に結合された通常小なる微小質量の原形質を意味し、１つ以上の細胞核と他の多種の細胞小器官を任意で含み、かかる他の多種の細胞小器官は、生命の基本的な機能を単独で発揮し又は生命の基本的な機能を実行する他の同等の集団と相互作用することができ、独立的に機能することができる生物の最小構造ユニットを形成し、合成細胞構造体、細胞モデルシステム、人工の細胞システムを含む。
【００１０】
「細胞システム（Cell system）」等の用語は、互いに相互作用して、生物学的機能、生理学的機能又は病態生理学的機能を発揮する１より多いタイプの細胞（又は単一タイプの細胞の異なる形態）の集合を意味する。かかる細胞システムは、例えば、器官、生体組織、幹細胞、分化した肝細胞等の細胞を含む。
【００１１】
「マーカ（Marker）」等の用語は、少なくとも１つの細胞ターゲット（例えば、Ｇｑ−共役受容体、Ｇｓ−共役受容体、Ｇｉ−共役受容体、Ｇ１２／１３−共役受容体、イオンチャンネル、受容体チロシンキナーゼ、トランスポータ、ナトリウム‐プロトン交換体、細胞核受容体、セルキナーゼ、細胞性タンパク質、等）の活性を調節することができ、且つ、バイオセンサによって測定されるように、信頼性の高い検出可能な出力若しくは応答が得られる分子、生物分子、又は生物製剤を意味する。目的とする細胞ターゲットの分類及び後に生ずるセル事象に依存して、マーカは、例えば、ＧＰＣＲ、受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）、イオンチャネル、細胞核受容体、細胞酵素アデニールサイクラーゼ等に対する、例えば、作用物質、部分的作用物質、逆作用物質等の活性剤であり得る。また、マーカは、特定の種類の細胞ターゲットに対しては抑制物質となり得るし、例えば、アクチンフィラメント若しくはマイクロチューブに対しては抑制物質又はかく乱物質となり得る。
【００１２】
「検出する（Detect）」等の用語は、感知されたシグナリング経路を発見し又は感知し、かつ、感知されたシグナリング経路と経路のシグナリングがない場合とを区別する本開示の装置及び方法の能力を意味する。
【００１３】
「特定する（Identify）」等の用語は、シグナリング経路を検出しかつ解明する本開示の装置及び方法の能力を意味する。
【００１４】
「治療候補化合物（Therapeutic candidate compound）」、「治療候補物質（therapeutic candidate）」、「予防的候補物質（prophylactic candidate）」、「予防的物質（prophylactic agent）」、「リガンド候補（ligand candidate）」等の用語は、バイオセンサ若しくは病原体に付着した細胞と相互作用する潜在能力にとって重要であり、自然に生ずる分子若しくは材料又は合成的な分子若しくは材料を意味する。治療候補物質又は予防候補物質は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、イオン、脂質等の細胞ターゲット若しくは病原体、又は、生細胞若しくは病原体の同様の構造体若しくは要素のうち少なくとも１つと特に結合し又は相互作用し得るし、例えば、化合物、生物学的分子、ペプチド、タンパク質、生物試料、薬物候補の小分子、薬物候補の生物学的分子、薬物候補の小分子‐生物の置換体、及び同様の材料若しくは実在の分子、又はそれら組み合わせを含む。
【００１５】
「バイオセンサ（Biosensor）」等の用語は、生物学的要素を物理化学的検出構成要素に結合せしめる検体を検出するデバイスを意味する。バイオセンサは、通常３つの部分から構成される。すなわち、（生体組織、微生物、病原体、細胞、又はこれらの組合せ等の）生物学的構成部又は要素、（例えば、光学的、圧電的、熱測定、若しくは磁気的な物理化学的手法で動作する）検出要素と、双方の構成部に関連付けられたトランスデューサと、から構成され得る。生物学的構成部若しくは生物学的要素とは、例えば、生細胞であり得る。実施形態において、光学的バイオセンサは、例えば、生体細胞における分子認識事象又は分子刺激事象を定量化可能な信号に変換する光学変換装置を含み得る。
【００１６】
”含む（Include）”、”含む（includeｓ）”等は、含んで（including）を意味するがこれに限定されない。
【００１７】
例えば、成分の構成要素、濃度、堆積、処理温度、処理時間、収量、流速、圧力等の値の量、及びその範囲を修飾する「約（About）」という用語は、例えば、生じうる数量における変分を意味する。かかる変分は、本開示の実施形態を説明するのに使用されており、例えば、化合物、構成、濃度、使用製剤に対して使用された通常の計測と取扱を介して、これら手法における不注意な誤動作を介して、方法を実行するのに使用される製造方法、ソース、又は出発物質若しくは成分の純度における差等を介して、例えば、生じ得る。また、「約（About）」という用語は、特定の初期濃度若しくは混合度を有する成分又は処方の経時変化に起因して異なる量、及び、特定の初期濃度若しくは混合度を有する成分又は処方の混合処理又は処理工程に起因して異なる量を包含する。“約”という用語によって修飾された本明細書に添付された特許請求の範囲は、これら量の均等物を含む。
【００１８】
実施形態において「〜本質的に成る（Consisting essentially of）」とは、本明細書に定義されたＧＰＣＲシグナリング経路検出、分析、若しくはそれらの双方、バイオセンサの表面上の製剤若しくは成分、及び、本開示の物品、デバイス、若しくは装置に対する方法を例えば意味し、特許請求の範囲に記載された構成要素又はステップと、構成物、物品、若しくは装置の基本的且つ新規な特性と、特定の反応物質、特定の添加物または成分、特定の物質、特定の細胞若しくは細胞株、特定の表面修飾剤または条件、特定のリガンド候補物質、可変選択された同等の構造、材料、又は処理等の本開示の製造方法及び使用方法と、に物質的に影響を与えない他の構成要素又はステップと、を含み得る。本開示の構成要素若しくはステップの基本特性に有形的に影響し若しくは本開示に不要な特性を与え得るアイテムは、例えば、バイオセンサの表面に対する細胞の低減された親和性、リガンド候補若しくは同様の刺激に応答した異常な若しくは逆の細胞の活性化、及び同様の特性を含む。
【００１９】
特に指定しない限り、本明細書で使用された不定冠詞“ａ”“ａｎ”、又は対応する定冠詞“ｔｈｅ”は、少なくとも１つ、又は１つ以上を意味する。
【００２０】
当業者にはよく知られている簡略が使用され得る（例えば、時間又は（複数の）時間に対して「ｈ」若しくは「ｈｒ」、（複数の）グラムに対して「ｇ」若しくは「ｇｍ」、ミリリットルに対して「ｍＬ」、及び室温に対して“ｒｔ”、ナノメータに対して「ｎｍ」、等の簡略）。
【００２１】
要素、成分、添加剤、細胞のタイプ、抗体等、及びその範囲に対して開示された特定の値又は好ましい値は、例示する目的のためにあるに過ぎず、それらは他の定義された値又は定義された範囲内の他の値を除外するものでない。
【００２２】
開示された構成、装置、及び方法は、いかなる値をも有する構成、装置、及び方法を含み、或いは、本明細書に記載された値、特定の値、より特定の値、及び好ましい値のいかなる組合せをも有する構成、装置、及び方法を含む。
【００２３】
実施形態において、本開示の方法は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）のシグナリング経路の分析、定量、又はそれら双方を提供する。かかる分析、定量、又はそれら双方は、例えば、ＧＰＣＲリガンド誘起のバイオセンサの応答に対するホルスコリン刺激された細胞の効果を測定することによって行われ、例えば、ホルスコリン誘起のバイオセンサ応答に対するＧＰＣＲリガンド刺激された細胞の効果を測定することによって行われる。
【００２４】
実施形態において、方法は、例えば、ＧＰＣＲシグナリング経路の決定方法を含み得る。かかる方法は、バイオセンサに生細胞を固定するステップと、当該固定された生細胞を、前記生細胞における細胞内ｃＡＭＰを増加させ且つタンパク質キナーゼＡを活性化する物質に接触せしめるステップと、当該物質に接触せしめられた生細胞をＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップと、前記物質が存在する場合と存在しない場合における前記生細胞に関する前記ＧＰＣＲリガンド誘起のバイオセンサの応答を検出し且つ比較するステップと、を含む。
【００２５】
実施形態において、方法は、例えば、バイオセンサ上に生細胞を培養するステップと、細胞内ｃＡＭＰレベルの増大を生じせしめ、次にタンパク質キナーゼＡの活性化を生じせしめる物質に当該培養された生細胞を接触せしめるステップと、これらアデニラート活性剤又はｃＡＭＰ類似物質が接触した細胞を、ＧＰＣＲリガンドに対して接触せしめるステップと、を含み得る。
【００２６】
実施形態において、方法は、例えば、ＧＰＣＲシグナリング経路の決定方法を含み得る。かかる方法は、バイオセンサ上に生細胞を固定するステップと、当該固定された生細胞をＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップと、前記生細胞において細胞内ｃＡＭＰを増加させ且つタンパク質キナーゼＡを活性化する物質に当該ＧＰＣＲリガンドに接触せしめられた生細胞を接触せしめるステップと、前記ＧＰＣＲリガンドが存在する場合と存在しない場合における前記生細胞に関する前記物質誘起のバイオセンサの応答を検出し且つ比較するステップと、を含む。
【００２７】
実施形態において、方法は、例えば、バイオセンサ上に生細胞を培養するステップと、細胞内ｃＡＭＰレベルの増大を生じせしめ、次にタンパク質キナーゼＡの活性化を生じせしめる物質に当該培養された生細胞を接触せしめるステップと、これらアデニラート活性剤又はｃＡＭＰ類似物質が接触した細胞を、ＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップを含む。
【００２８】
細胞内ｃＡＭＰレベルの増大を生じせしめ、次にタンパク質キナーゼＡの活性化を生じせしめる物質は、例えば、ホルスコリン又はその派生物質等のアデニラート活性物質を含む。その派生物質は、ＮＫＨ４７７、１，９ジデオキシ‐ホルスコリン、７‐デアセチル‐７‐Ｏ‐へミスチニル‐ホルスコリン、又は細胞浸透性ｃＡＭＰ類似物質である。細胞浸透性ｃＡＭＰ類似物質は、（Ｓ）−アデノシン、環状３’、５’−（ハイドロゲンホスホロチオエート）トリエチルアンモニウム、８−ブロモアデノシン−３’、５’−環状リン酸（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）、８−クロロアデノシン−３’、５’−環状リン酸、又は、Ｎ６，２’−Ｏ−ジブチリルアデノシン−３’、５’−環状リン酸等である。これらｃＡＭＰ類似物質は、細胞膜透過性があり、直接細胞内に取り入られ、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（タンパク質キナーゼＡ、ＰＫＡ）の活性化を直接的に引き起こす。
【００２９】
実施形態において、代替的方法は、例えば、バイオセンサ上に生細胞を培養するステップと、当該培養された生細胞をＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップと、細胞内ｃＡＭＰレベルの増大を生じせしめ、次にタンパク質キナーゼＡの活性化を生じせしめる物質に当該ＧＰＣＲリガンドに接触せしめられた生細胞を接触せしめるステップと、を含み得る。
【００３０】
実施形態において、代替的方法は、例えば、ＧＰＣＲシグナリング経路の決定方法を含み得る。かかる方法は、バイオセンサ上に生細胞を固定するステップと、前記細胞内における細胞内ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性を抑制する物質に当該固定された生細胞を接触せしめるステップと、当該ＰＬＣ抑制されたが生細胞をＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップと、前記物質が存在する場合と存在しない場合における前記生細胞に関する前記ＧＰＣＲリガンド誘起のバイオセンサの応答を検出し且つ比較するステップと、を含む。
【００３１】
実施形態において、方法は、例えば、バイオセンサ上に生細胞を培養するステップと、当該培養された生細胞をＵ７３１２２若しくは干渉ＲＮＡ等のホスポリパーゼＣ抑制物質若しくは抑制体に接触せしめるステップと、ホスホリパーゼＣにより抑制された細胞をＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップと、を含み得る。
【００３２】
本開示の方法は、例えば、ＧＰＣＲシグナリング経路に与える周知の治療用化合物若しくは未知の治療候補化合物の陽性及び陰性の効果を特定する際に有益であり得る。したがって、前述の方法は、刺激を用いた固定生細胞の前処理、中間処理、又は後処理のさらなるステップを含み得る。
【００３３】
実施形態において、本開示は、リガンド誘起バイオセンサ信号の研究において観測された詳細な生化学シグナリング経路を抽出し且つ解明する方法を提供する。本開示方法はすべての種類のＧＰＣＲシグナリングに適用可能である。本開示の方法は、異なる種類のＧタンパク質シグナリングを区別し、ＧＰＣＲのシグナリングと非ＧＰＣＲのシグナリングとを区別し得る。本開示の方法は、アデニールサイクラーゼ（ＡＣ：ａｄｅｎｅｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ）活性物質（例えば、ホルスコリン、ＮＫＨ４４７）を使用し得るし、又は、ホスホリパーゼＣ抑制物質と組み合わせて独立に使用され得る（例えば、Ｕ７３１２２、合成アミノステロイド、すなわち、１−［６−［［１７β−３−メトキシエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−１７−ｙｌ］アミノ］ｈｅｘｙｌ］−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−２，５−ｄｉｏｎｅ、又は干渉ＲＮＡ）。
【００３４】
本明細書に開示されたバイオセンサベースの生細胞分析を利用する経路分析若しくは経路抽出のツールとして、本開示は、バイオセンサベースの細胞分析を使用して、シグナリング経路を抽出し若しくは解明するユニバーサルな手法を提供する。
【００３５】
実施形態において、本開示の方法はツーステップ分析を含み得る。また、本開示の方法は、受容体を介在する細胞シグナリングに関する有益な情報を提供し得る。
【００３６】
実施形態において、本開示は、無標識バイオセンサベースの細胞分析を使用して、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）のシグナリング経路を分析する方法を提供する。本方法は、生細胞におけるすべての種類のＧＰＣＲシグナリングに対して利用可能である。実施形態における方法は、ＧＰＣＲリガンドによって誘起されたバイオセンサの応答に及ぼすｃＡＭＰ増加細胞、ホスホリパーゼＣ抑制細胞、若しくはその双方の効果に基づいており、ｃＡＭＰが生成する化学物質若しくは細胞浸透性ｃＡＭＰ類似物質によって誘起されたバイオセンサの応答に及ぼすＧＰＣＲリガンド刺激によって刺激された細胞の効果に基づいている。使用され得るバイオセンサは、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサ、共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ）バイオセンサ等の光学バイオセンサ、バイオインピーダンスバイオセンサ、共鳴ミラー等のデバイス等の電気的バイオセンサを含む。
【００３７】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）は細胞表面受容体の中で最も大きい群であり、細胞表面受容体は、細胞内ループ及び細胞外ループによって接合された７つの螺旋膜貫通領域の共通な構造モチーフを共有している。ＧＰＣＲｓは、異なる細胞システムにおいて異なる発現パターンにより、実質的に全細胞内で発現せしめられる。ＧＰＣＲｓの細胞外リガンドは多様的であり、生体アミン、アミノ酸、イオン、小型ペプチド、たんぱく質、及び生物活性な脂質を含む。ＧＰＣＲ活性物質のこのような多様性により、この受容体の種類の生理学的重要性が強調される。より詳しく述べると、ＧＰＣＲｓは、神経伝達、走化性、炎症、細胞の増殖等の処理を含む広範な生理学的過程を制御する。ＧＰＣＲｓは、例えばアストマ、癌腫、炎症、及び心臓血管疾患を含むほとんど全ての主要クラスの疾病に関わっている。
【００３８】
健康及び疾病におけるそれらの役割と、小分子の薬物による治療の干渉に対するそれら潜在能力と、を想定すると、ＧＰＣＲｓは、ヒトゲノムにおいて最大の且つ最も成功したクラスの薬物に対して有能なターゲットに相当する。臨床的に利用可能なすべての薬物のうち約５０％は直接若しくは間接的にＧＰＣＲｓに対して活性的であるものの、これら薬物は、周知なすべてのＧＰＣＲｓのうち数パーセントに対してのみ活性的である。ヒトゲノムは、最大１，０００ＧＰＣＲをエンコードしており、その内の約４００が、内因性リガンドと結合すると期待された非化学的刺激受容体であると考えられている。これらの多く（約１５０）が、それら同族のリガンドとして分類され、若しくは生物学的機能は未だに知られていない「オーファン」ＧＰＣＲｓとして分類されている。これら受容体の「非−オーファン化」（すなわち、それら同族のリガンド又は生物学的機能の適用若しくは決定）は、新規治療ターゲット及び新規治療効果を提供し得る。
【００３９】
ＧＰＣＲ薬物の発見と開発における継続的成功が、分析技術及び分析方法における発展に寄与している。ＧＰＣＲスクリーニングの分析は、全体的細胞分析と無細胞分析とに広範に分類され得る。細胞ベースの分析によって、刺激に応答した細胞の振る舞いに関して高精度な指標が提供される。無細胞分析を使用して得られたデータと比較すると、細胞システムにおける化合物調節されたＧＰＣＲ機能に関する直接測定によって、はるかに有益な情報が提供される。かかる情報とは、例えば、より密接に生理的環境に類似した条件下における化合物の作用、モード、及び機構である。これら利益により、薬物のスクリーニング及び試験を目的とする全体的細胞システムの使用が高められ、促進されている。
【００４０】
ＧＰＣＲｓは、広範な一連の細胞シグナリング経路に関与している。かかる細胞シグナリング経路は、Ｇタンパク質依存性経路及びＧタンパク質独立性経路の双方を介して、介在されており、たいては、リガンドに依存している。ＧＰＣＲシグナリングは、川下のシグナリングネットワークの空間的且つ時間的フラックスによってコード化されている。かかるシグナリングネットワークは、細胞内のシグナリング及び調節機構によって厳密に制御される。ＧＰＣＲシグナリングについて説明する多くのモデルにおいて、一旦、作用物質の結合によって活性構造で安定化されると、受容体が特定の細胞内ドメインを介して単一のＧタンパク質と相互作用する機能的なモノメリックエンティティであることが想定されている。リガンドがＧＰＣＲに結合すると、例えば、受容体の構造に変化が生ずる。受容体の活性化は、順番に、Ｇαサブユニットに対するＧＴＰ−ＧＤＰ交換を介して、関連Ｇタンパク質ヘテロトリマの活性化を引き起こす。そして、活性化されたＧタンパク質は、いくつかの細胞内酵素の活性化を調節する。いくつかの細胞内酵素の活性化により、いくつかの主要な細胞内第２メッセンジャ生成が、順番に制御される。かかる第２メッセンジャは、例えば、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、ｃＧＭＰ、Ｃａ２＋、イノシトール・トリスリン酸、アラキドン酸である。そして、これら第２メッセンジャは、遺伝子転写及び細胞機能を調整するイオンチャンネル及びキナーゼを含む下流にあるいくつかのターゲットに作用する。
【００４１】
合成化合物によって介在された細胞内シグナリングにおける予測不可能性が原因で、測定されたシグナリング事象に依存して単一化合物は作用物質又は拮抗物質として作用するであろう。さらに、測定された所定の事象において、効果不足により、受容体の活性化が不足するとは限らない。したがって、理想的なＧＰＣＲスクリーンは、単一の分析に依存するべきでなく、むしろ、統合された手法が、多くのシグナリング事象を測定するのに採用されるべきである。細胞シグナリング経路から独立した技術は、ＧＰＣＲ活性化が、多くの状況下においてＧタンパク質独立シグナリングをも引き起こし得るという最近の調査結果を想定すると、それら経路バイアスの分析技術よりも優れているだろう。
【００４２】
バイオセンサベースの細胞分析によって、より生理的に関連した環境下で、内因性受容体の活性化を観測することが可能となる。かかる非侵襲的能力は、リガンド薬理学に関してより魅力的な指標を与え得る。大抵のＧＰＣＲ細胞分析は、細胞に関して特定の工学技術若しくは操作を利用しており、これは、確実であり且つ信頼性のある検出を得るために所定の感度を達成することを目的とする。これら人工的システムにおいて、リガンドの力価又は効果が変更され得る。これは、例えば、受容体の高い発現レベル又はターゲットの細胞生理学における特定の操作（例えば、ＧＦＰ−タグ付け、又はトランスフェクション作用）の干渉に帰属する。例えば、α２Ａ−アドレナリン作用受容体（α２ＡＡＲ）は、Ｇαｉプロテインに結合すると一般に信じられており、アデニレートサイククラーゼ活性の抑制を引き起こす。天然のＨＥＬ９２．１．７細胞において、薬物のＬｅｖｏｍｅｄは、α２ＡＡＲの逆作用物質であり、ｃＡＭＰ生成の増大を引き起こす。しかしながら、トランスフェクトされたＰＣ１０において、線維芽細胞Ｌｅｖｏｍｅｄは、陽性の作用物質であることが見出され、ｃＡＭＰ生成の抑制を引き起こす。
【００４３】
さらに、バイオセンサベースの細胞分析においては、蛍光標識を必要としない。かかる蛍光標識は、多数の従来分析において検出の際に広く使用されている。かかる標識の非依存性により、ＧＰＣＲスクリーンのデータ品質が大幅に改善され得る。蛍光性細胞の構成要素、標識、若しくは化合物の干渉が最小化され若しくは排除されるからである。
【００４４】
バイオセンサベースの細胞分析は、積分されたバイオセンサの応答を測定している。例えば、ＲＷＧバイオセンサは、細胞内におけるリガンドによって誘起された動的質量再分布（ＤＭＲ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｓｓ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を観測する。これに反して、電気バイオセンサ、生細胞においてリガンドによって誘起されたバイオインピーダンスの変化を測定している。リガンドは細胞内の１つより多い数の受容体を活性化し得るし、受容体によって、複数のシグナリング経路が導かれる。この交絡の可能性が原因で、活性化された特定の経路を、リガンドによって誘起されたバイオセンサの応答に帰属させることは、バイオセンサ応答の形状及び動特性を測定するだけでは、困難である。
【００４５】
１．バイオセンサベースの細胞分析とバイオセンサ基板
一般に、無標識細胞に基づく分析は、生体細胞におけるリガンド誘起の応答を観測することを目的としてバイオセンサを採用している。バイオセンサは、光学的、電気的、熱的、音響的、磁気的トランスデューサ等のトランスデューサを通常利用しており、分子認識事象又は細胞層におけるリガンド誘起の変化を定量化可能な信号に変換する。これら無標識バイオセンサは分子の相互作用の分析に通常使用され得る。かかる分析は、分子複合体が経時によってどのように形成し且つ分離するのかを特徴付けることを含む。本発明は、ほとんどすべてのタイプのバイオセンサ表面に利用可能であるものの、ＲＷＧバイオセンサと電気バイオセンサのみが例示されている。
【００４６】
ＲＷＧバイオセンサ
ＲＷＧバイオセンサは、例えば、埋め込まれたグレーティング構造を有する基板（例えば、ガラス）と、細胞層と、から構成される。ＲＷＧバイオセンサは回折格子によって導波路に対する光の共鳴結合を利用し、界面において次々に電磁場が形成される溶液表面の界面において全内反射が生ずる。かかる電磁場はセンサの表面から指数関数的に減衰する事実上エバネッセントである。電磁場が初期値に関して１／ｅに減衰する距離は、侵入深さとして知られており、特定のＲＷＧバイオセンサに関して、設計に応じた関数となるものの、通常約２００ｎｍのオーダーである。このタイプのバイオセンサは、かかるエバネセント波を利用して、センサ表面の近傍の若しくはセンサの表面における細胞層のリガンド誘起の変化を特性化している。
【００４７】
電気バイオセンサ  −
電気バイオセンサは、例えば、基板（例えば、プラスチック）、電極、及び細胞層から構成される。この電気的な検知手法において、細胞は基板上に並べられた小さな金の電極上に培養され、システムの電気インピーダンスが経時的に調べられる。インピーダンスは細胞層の電気伝導率の変化の指標となる。通常、固定周波数若しくは変動周波数を有する小定電圧が、電極又は一連の電極に印加され、回路を介した電流の経時的に観測される。リガンド誘起の電流変動により、細胞応答に関する指標が与えられる。細胞全体を検出するインピーダンス測定のアプリケーションは１９８４年に実証された。それ以来、インピーダンスベースの測定は、細胞の付着及び拡散、細胞の微小運動、細胞の構造変化、及び細胞の死を含む広い範囲の細胞の事象を研究することを目的として利用されてきた。古典的インピーダンスシステムは、小さな検出電極を使用しかつ大きな基準電極を使用しているのが原因で、分析に際して変動が大きいという欠点を有する。かかる変動性を克服するために、ＣｅｌｌＫｅｙ  ｓｙｓｔｅｍ（ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ、南サンフランシスコ、カリフォルニア州）やＲＴ‐ＣＥＳ（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ株式会社、サンディエゴ、カリフォルニア州）等の最新世代のシステムは、ミクロ電極アレイを有する集積回路を利用している。
【００４８】
ＲＷＧバイオセンサを用いたＧＰＣＲ活性の光信号  −
細胞は、例えば、通常数十ミクロンを有する比較的大きい寸法の動的な物体である。ＲＷＧバイオセンサは、細胞の底部におけるリガンド誘起の変化の検出を可能にし、エバネセント波の侵入度によって決定される。その上、光学的バイオセンサの空間分解能は、入射光源のスポットサイズ（約１００ミクロン）によって決定される。したがって、一般に、非常に密集した細胞層が、最適な分析結果を得るのに使用され、センサの構成は、例えば基板、導波薄膜、及び細胞層から構成される３層導波複合体と見なされ得る。細胞生物物理学と組み合わせて３層導波バイオセンサ理論に従って、全体の細胞の検知に関しては、有効屈折率におけるリガンドによって誘起された変化、すなわち検出された信号ΔＮが数式（１）により与えられる。
【００４９】
（数式１）
2011515065.tif 000003
【００５０】
ここで、Ｓ（Ｃ）は細胞層に対するシステムの感度であり、Δｎｃはバイオセンサによって検知された細胞層の局所的な屈折率のリガンド誘起の変化である。ΔＺｃは細胞層への侵入深さであり、αは特定の屈折率の増大（タンパク質に対しては約０．１８／ｍＬ／ｇ）であり、ｚｉは、質量の再分配が生ずる距離であり、ｄは細胞層内の薄片の仮想的厚さである。ここで、細胞層は垂直方向において均等に離間された部分に分割される。検出された信号が細胞層の底部分の屈折率Δｎｃの変化に一次的に正比例することが想定されている。細胞内の所定体積の屈折率は、主にタンパク質等の生物分子の濃度によって主に決定されると仮定すると、Δｎｃは検出ボリューム内の細胞のターゲット又は分子集合の局所濃度変化に正比例する。重み付け因子ｅｘｐ（−ｚｉ／ΔＺｃ）は、指数関数的に減衰するエバネッセント波の特性を考慮して、生ずる局所的タンパク質濃度の変化が考慮されている。したがって、検出された信号は、センサの表面から異なる距離で生じる質量再分布を合計したものであり、各々が全ての応答に対して不均一に貢献する。数式（１）が示していることは、ＲＷＧバイオセンサを用いて検出された信号は、所的なタンパク質濃度変化の結果として、かかる変化が生ずる場所、時間の結果として、主として垂直な集団再分布に対して敏感であることである。検出された信号は、動的集団再分布（ＤＭＲ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｓｓ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）信号と呼ばれている。
【００５１】
ＧＰＣＲの活性化は、一連の空間的かつ経時的な事象を引き起こす。かかる事象は、リガンドの結合、受容体の活性化、タンパク質の補充、受容体の内部化及び再利用化、第２メッセンジャの代替、細胞骨格のリモデリング、遺伝子の発現、細胞付着の変化等の事象を含む。各細胞の事象は、細胞の動力学、持続時間、振幅、及び質量の移動に関してそれ自身の特性を有する。したがって、細胞事象が生ずる位置に依存して、これらの細胞事象が、ＤＭＲ信号全体に対して異なる寄与をなし得ることが合理的に想定されている。さまざまなＧＰＣＲｓをターゲットとする作用物質のパネルを使用して、介在されたシグナリング経路を反映する３つのクラスのＤＭＲ信号がヒト類表皮癌Ａ４３１細胞において特定された（Ｆａｎｇ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ａｓｓａｙｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ，”  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００７，  ５５，  ３１４−３２２）（図６を参照）。受容体が結合したＧタンパク質に依存して、ＤＭＲ信号の各々は特定のクラスのＧＰＣＲｓ活性と相関しているので、得られたＤＭＲ信号は、Ｇｑ−ＤＭＲ信号、Ｇｓ−ＤＭＲ信号、及びＧｉ−ＤＭＲ信号とそれぞれ称されている。各クラスのＤＭＲ信号は、異なるクラスのＧＰＣＲｓを介して介在された固有のシグナリングの集合を反映した異なる運動特性及び動的特性を示す。興味深いことに、Ｇｑ‐タイプのＤＭＲ信号は急激に変化するものの、Ｇｓ‐タイプＤＭＲ信号は比較的遅い。本明細書に開示されるようにオーファンＧＰＣＲｓのＧタンパク質カップリング機構を特定するのにＤＭＲ信号に関して固有の特性が使用され得る。
【００５２】
しかしながら、両方のＧｑ−ＤＭＲ信号とＧｓ−ＤＭＲ信号は、テストされた多数の細胞株にわたって遍在しない場合、かなり普遍的であることがわかったが、Ｇｉ−ＤＭＲ信号は受容体と同様に細胞の成分に強い依存を示す。その上、同一の細胞株における異なる受容体の活性化又は異なる細胞株における同一の受容体の活性化を介して介在された同じクラスのＤＭＲ信号に対して、振幅や動力学等の微細な特徴において、有意差がしばしばある。かかる差は、各受容体固有のシグナリングと同様に、ＧＰＣＲシグナリングにおける細胞の状況関して重要な役割を反映している。したがって、その動特性及び形状に基づいて、特定のシグナリング経路をＧＰＣＲリガンド誘起の光学応答に帰属せしめることは、大抵困難である。ＧＰＣＲリガンドによって活性化され且つリガンドによって誘起された光学応答を支配するその動特性及び形状に基づいて、経路の抽出が、主シグナリング経路を決定するのに、大抵は必要である。
【００５３】
ＧＰＣＲ活性に関するバイオインピーダンス信号−
典型的なインピーダンスベースの細胞分析において、細胞は搬送されて、培養ウェルの底に配置された金電極に接触せしめられる。センサーシステムの総インピーダンスはバイオセンサを囲むイオン環境により、主に決定される。電界を印加すると、イオンは電界によって指向された運動を行い、濃度勾配による拡散を受ける。細胞全体について検出する際には、全電気インピーダンスは、電界溶液の抵抗、細胞のインピーダンス、電極／溶液界面におけるインピーダンス、及び電極／細胞界面におけるインピーダンスの４つの成分を有する。さらに、細胞のインピーダンスは、抵抗とリアクタンスとの２つの成分を含む。細胞のイオン強度に関する伝導特性は抵抗成分を与えるものの、不完全なコンデンサとして作用する細胞膜は周波数に依存する応答成分に寄与する。したがって、全インピーダンスは、例えば、細胞の生存能力、細胞の密集度、細胞の数、細胞の形態、細胞の付着度、イオン環境、細胞内の水分、検出周波数等を含む多くの要因の関数となる。
【００５４】
ＲＴ−ＣＥＳシステムにおいては、印加された小電位の割合は細胞内部に連結されている。細胞に印加されたかかる信号は、典型的ほ乳動物細胞の静止膜電位よりもはるかに小さいと信じられている。その結果、細胞の機能に対してほとんど妨害しないか、若しくは全く妨害しない。ＲＴ−ＣＥＳシステムは、インピーダンスのこれら変化を測定し、細胞インデックスと呼ばれるパラメータとしてそれを表示する。数式（２）に従って、細胞インデックスが計算される。
【００５５】
（数式２）
2011515065.tif 000004
【００５６】
Ｎは、インピーダンスが測定された振動数ポイントの数であり（例えば、１０ｋＨｚ、２５ｋＨｚ、及び５０ｋＨｚに対してＮ＝３）、Ｒ０（ｆ）とＲｃｅｌｌ（ｆ）は、それぞれ、ウェルにおいて細胞が存在しない場合と存在する場合における周波数電極抵抗である。
【００５７】
ＣｅｌｌＫｅｙシステムにおいて、センサーシステムのインピーダンス変化は、受容体刺激に応答して生ずる細胞層のインピーダンス（デルタＺ又はｄＺ）の変化に帰属される。低周波数において、印加された小電位は、細胞外の電流（ｉｅｃ）を誘起する。かかる細胞外の電流（ｉｅｃ）は、層内の個々の細胞の周囲に流れる。しかしながら、イオンチャンネルによる細胞膜を介した伝導電流も低測定周波数において重要であり得る。高周波数において、それらは、細胞性の膜に侵入する細胞透過電流（ｉｔｃ）を誘起する。各ウェルに対して測定された電流に対する印加電圧の比が、オームの法則により説明されるように、インピーダンス（Ｚ）となる。
【００５８】
細胞が受容体リガンド等の刺激に曝される際に、シグナル変換事象が活性化され、アクチン細胞骨格の調節等、複雑な細胞事象が引き起こされる。かかる複雑な細胞事象は、例えば、細胞の密着性、細胞の形態、及び体積、細胞間相互作用について変化を生じせしめる。これら細胞の変化は、細胞外電流及び細胞内電流の流れに対して個別的又は集団的に影響を与え、これにより、測定されたインピーダンスの強度及び特性に影響を与える。３つのクラスのＧＰＣＲｓ活性化を介して介在する３つのタイプのインピーダンス信号が知られている（Ｌｅｕｎｇ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｓｓｏｃ．Ｌａｂ．Ａｕｔｏｍａｔ．，２００５，１０，２５８）。理論によって制限されないものの、これらインピーダンス信号はアクチン細胞骨格に与える異なる効果に起因すると信じられている。かかるアクチン細胞骨格は、異なるクラスのＧＰＣＲｓの活性化に応答して、インピーダンスによって測定された細胞パラメータに影響を与える。Ｇｑ−ＧＰＣＲｓ及びＧｉ−ＧＰＣＲｓの活性化によって、アクチン重合が増強されるものの、Ｇｓ−ＧＰＣＲｓの刺激によって、アクチン解重合が引き起こされることが示されている。
【００５９】
２．ＧＰＣＲシグナリングとシグナリングの積分
生体組織に共通の特性は、環境変化と共に有機体の活性化を絶えず調整する動的能力にある。環境と交信する機能は多数経路を介して達成される。かかる多数経路は、外部環境や細胞内の異なる領域等から信号を受信しかつ処理する。個々の経路は、直線的な器官の管に沿って信号を伝え、その結果、個々の細胞機能が調整される。このタイプの情報転送は、調節機構に関する細胞の能力範囲に関して重要な部分となっている。しかしながら、より多数の細胞シグナリング成分及び経路が特定されかつ研究されると、これらの直線的経路は、独立のエンティティではなく、大なるネットワークの部分であることが明らかになっている。
【００６０】
異なるタイプ細胞のネットワーク及び構成に関する初期研究から得られた１つの驚くべき結果は、細胞のタイプ特有の入力（すなわち、受容体）から信号を受信し、かつ、細胞のタイプに特有の機構に係合する一般的な信号通信ネットワークがあり得るということである。シグナリング成分及びそれら相互作用パターンに関する分子の特定は、細胞のタイプに特有なものであり得るが、これらの構成の全体的な機能と化学的信号回路の論理は、細胞のタイプに応じて維持される。
【００６１】
理論によって制限されないものの、ネットワークはシグナリング経路間の内部接続から生じ得ると信じられている。同一のシグナリング成分が複数入力から信号を受信することができるので、かかる内部接続が生じ得る。かかるネットワークは、同様のクラスのシグナリング経路内で生じ得る。かかる同様のクラスのシグナリング経路は、例えば、Ｒａｓ経路とＲｈｏ経路との間、又はＧｓα／ｃＡＭＰ及びＭＡＰキナーゼ経路等の異なる経路間である。
【００６２】
ＧＰＣＲシグナリング
ＧＰＣＲｓは、一連の様々な知覚性刺激及び化学的刺激に応答する７つの膜貫通型スパニングタンパク質のスーパーファミリを構成している。その様々な知覚性刺激及び化学的刺激とは、例えば、光、におい、味、フェロモン、ホルモン、化学的伝達物質である。ＧＰＣＲｓは、これら刺激によって与えられた情報を、細胞内の第２メッセンジャ変換する。その細胞内の第２メッセンジャは、重要な信号として細胞によって解釈される。この処理過程は、ヘテロトリメリックグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を用いて、種々のエフェクタシステムに対して、それら相互作用を介して作用物質活性のＧＰＣＲｓの結合を含む。ＧＰＣＲに対する作用物質の結合は、受容体の形態状態を選択する。その受容体の形態状態は、Ｇタンパク質サブユニット上のＧＴＰへのＧＤＰの交換を促進し、Ｇタンパク質Ｇ−サブユニット及びＧ−サブユニットの解離を可能にせしめるように想定されている。その後に、活性されたＧ−及びとＧ−サブユニットは、エフェクタ酵素とイオンチャンネルの活性化を、正の調整、負の調整、若しくはその双方の調整を実行する。ＧＰＣＲの作用物質の活性化はエフェクタシステムのＧたんぱく質依存の活性化をもたらし、１）Ｇタンパク質結合のフィードバック調節、２）受容体エンドサイトーシス、及び３）Ｇタンパク質独立性信号変換経路を介したシグナリングを可能にする一連の分子相互作用を適切に設定する。
【００６３】
ヘテロ３量体Ｇタンパク質を介したシグナリングに加えて、ＧＰＣＲｓは、Ｇタンパク質独立性信号変換錯体の形成と区分化を促進する足場として作用することが現在認識されている。ＧＰＣＲｓを結合せしめ、ＧＰＣＲｓをＧタンパク質独立性信号変換経路に結合せしめ若しくはＧタンパク質の特異性及び作用物質の選択性を変更するより多くのタンパク質が特定されている。ＧＰＣＲ相互作用タンパク質のリストは、例えば、ＧＲＫｓ、アレスチン、カルモジュリン、カルシオン、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）、チューブリン、受容体活性変更ヤヌスキナーゼ２、ＰＤＺドメイン含有タンパク質（例えば、ＮＨＥＲＦ、ＲＧＳ１２）、ＳＨ３ドメイン含有アダプター分子（例えば、Ｇｒｂ２、Ｎｃｋ、ｃ−Ｓｒｃ、及びエンドフィリン）、小Ｇタンパク質、及び同様のたんぱく質を含む。
【００６４】
受容体に結合されたＧタンパク質に依存して、ＧＰＣＲｓは少なくとも４つの主カテゴリに分類され得る。かかる受容体は、Ｃａ２＋の可動化を引き起こすＧｑ−共役受容体、Ｃａ２＋の可動を引き起こすＧｑ−共役受容体、ｃＡＭＰを低減せしめるＧｉ／ｏ−共役受容体、ｃＡＭＰの集積を生じせしめるＧｓ−共役受容体、Ｒｈｏ等の小ＧＴＰを活性化するＧ１２／１３−共役受容体を含む。
【００６５】
細胞内ｃＡＭＰレベルのＧＰＣＲシグナリングと積分
アデニリルシクラーゼ（ＡＣｓ）は、細胞情報伝達ネットワーク内のジャンクション若しくは信号インテグレータとして見なされてきた。異なるアデニリルシクラーゼアイソフォームには、異なる信号受信能力がある。すべてのアデニリルシクラーゼアイソフォームは、Ｇｓ共役受容体からの信号に対応してｃＡＭＰを生成することができる。しかしながら、これらアイソフォームは、種々の入力から信号を受信する能力において異なる。細胞内のｃＡＭＰレベルは多くの経路間の信号のバランスに関する指標として機能し得る。アデニリルシクラーゼの信号受信能力について詳細に説明するこの複雑な状況が、図１に示されている。図面を参照すると、図１は、アデニールサイクラーゼイソフォーム依存性細胞シグナリング経路を示す概略図である。アデニールサイクラーゼは、複数の調整力のあるシグナリング経路のターゲットであり、自身が属するシクラーゼ群に依存して、異なる応答をし得る。
【００６６】
細胞において、９つのＡＣイソフォームがあり、そのすべてがＧｓαによって活性化され、全てではないがいくつかかが、Ｇｉ／ｏαサブユニットによって抑制される。多かれ少なかれ、ＡＣアイソフォームの各々は、１つより多いシグナリング経路から入力を受信するので、細胞応答は、自身が発現するイソ酵素によって調整される。実施例において、Ｃａ２＋／ＣａＭＩＩ（カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ）はＡＣＩ（アデニールサイクラーゼサブタイプ１）を活性化するものの、Ｃａ２＋はＡＣＶ（アデニールサイクラーゼサブタイプ５）及びＡＣＶＩ（ＡＣサブタイプ６）を抑制する。別の実施例において、ＡＣＶ及びＡＣＶＩはＧｉαによって抑制されるものの、ＡＣＩＩ（ＡＣサブタイプ２）及びＡＣＩＶ（ＡＣサブタイプ４）は、Ｇｉαに対して無反応であるように見える。
【００６７】
また、細胞のｃＡＭＰ反応は刺激される受容体のＧタンパク質の選択度／特異性に依存している。Ｃａ２＋は、反対に、異なるアデニリルシクラーゼに影響する。ＡＣＩはＣａ２＋／ＣａＭＩＩによって刺激され、ＡＣＶ及びＡＣＶＩはＣａ２＋によって抑制され、リン酸化反応は種々の形態のＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）及びＰＫＡによって抑制され、ＡＣＩＩ、ＩＶ、及びＶＩＩのＡＣは、細胞内のＣａ２＋変化に対して鈍感であるようである。無傷細胞において、Ｃａ２＋の効果は、発現されたイソ酵素のみに依存するのではなく、Ｃａ２＋の増加が生ずるサイトにも依存し得る。ＡＣＩＩを発現する細胞において、ＡＣＩＶ若しくはＡＣＶＩＩはＣａ２＋を増加させ、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）は、ｃＡＭＰの増加を引き起こす。かかるｃＡＭＰは、Ｃａ２＋及び酵素を形成するｃＡＭＰのＤＡＧ刺激されたリン酸化反応によって調節され得る。対照的に、ＰＫＡ介在リン酸化反応は、ＡＣＶとＡＣＶＩの負のフィードバックレギュレータとして作用し得る。
【００６８】
酵素アデニールサイクラーゼの９つの細胞膜に束縛されたアイソフォームは、細胞内ｃＡＭＰレベルを調節するためにＧタンパク質共役受容体を通して作用する化学的伝達物質と薬物によって大きく調整される。一般に、Ｇｓ共役受容体の急性の活性化はｃＡＭＰの蓄積を刺激するものの、Ｇｉ／ｏ共役受容体の急性の活性化はｃＡＭＰの蓄積を通常は抑制する。Ｇタンパク質共役受容体の永続的な活性化によって、その後の薬物調節されたｃＡＭＰの蓄積が変更されることも確立されている。持続する受容体の活性化に続いて、これら変更は細胞適応型の応答を表していると信じられている。
【００６９】
異種感作
一般的に観測された１つの現象、すなわち、アデニールサイクラーゼの異種感作は、Ｇｉ／ｏ共役受容体持続的な活性化に続く薬物による刺激されたｃＡＭＰの累積に対する高応答性によって特徴付けられる。アデニールサイクラーゼの異種感作は、慢性の鎮静剤投与に続く耐性及び使用中止に関して説明するために当初は提案され、細胞が抑制受容体の持続された活性化に適応する機構であり得る。かかる適応型の機構は、例えば、薬物依存及び薬物乱用からの使用中止の処理において、及び、分裂病と鬱病を含む精神神経系症状において、役割を果たすように提案されてきた。また、異種感作は、複数のＧｉ／ｏたんぱく質の同時活性化を必要とし得る。例えば、全内因性のＧｉ／ｏプールが利用可能であった細胞の感作と比べると、選択性Ｇｏ−誘起の異種感作の強さは、低減されるようである。
【００７０】
異種脱感作
受容体介在の細胞応答の脱感作は、複数の経路を要する複雑な処理である。かかる複雑な処理は、ａ）Ｇタンパク質から解かれた受容体、ｂ）原形質膜から離間した受容体の隔離、ｃ）シグナリングタンパク質の下降調整を含む。受容体脱感作は一般的に相同である（すなわち、特有の受容体でありかつ受容体の占有に依存する）。
対照的に、活性物質によるアデニールサイクラーゼの直接活性化又は細胞透過性ｃＡＭＰによるＰＫＡの直接的な活性化は、異種脱感作と関連付けられた受容体のリン酸化反応を大部分は引き起こし得る（すなわち、非特定的の受容体であり、受容体の占有に依存しない）。
【００７１】
細胞内Ｃａ２＋レベルのＧＰＣＲシグナリングと積分
同様に、また、細胞内Ｃａ２＋レベルはＧＰＣＲシグナリングにおいて重要な役割を果たす。細胞内Ｃａ２＋レベルはイオンチャンネルによって一般的に調整される。複数のＧタンパク質介在経路は１つにまとまって、カルシウムチャンネルを調節することが知られている。事象の複雑なタイミングはいくつかのシグナリング経路の構成部と細胞骨格構造及び足場構造の動的ネットワーク間の相互作用によって制御される。その細胞骨格構造及び足場構造は、これら構成とカルシウムチャンネル間の相互作用のための層として機能し得る。カルシウムチャンネルの変更を誘起することが知られた受容体の多くが、百日咳毒素（ＰＴＸ）を有する細胞の前処理がカルシウムチャンネルの抑制を止めるという観測によって示されているように、ヘテロトリメリックＧｉ／ｏたんぱく質に結合される。カルシウムチャンネルの抑制は、細胞膜によって範囲を定められた信号若しくは第２のメッセンジャによって調節された信号を介して生じ得る。細胞膜によって範囲を定められた経路は、Ｇタンパク質βγーサブユニット（Ｇβγ）の直接結合によって調節され、Ｃａｖ２．２チャンネルの電圧依存性抑制という結果となる。
【００７２】
無標識バイオセンサ分析用いた経路の抽出
ＧＰＣＲシグナリングは高度化され、非常に複雑である。受容体は、Ｇタンパク質依存性経路及びＧタンパク質独立性経路を介して、シグナリングを介在し得るし、受容体は複数のＧたんぱく質依存性経路を介して介在し得る。無標識バイオセンサ分析は、積分された細胞の応答（例えば、光学バイオセンサを用いたＤＭＲ信号、若しくは、電気バイオセンサを用いたバイオインピーダンス）を測定するので、受容体の活性化により、非定型的なバイオセンサ反応若しくは出力信号が引き起こされる。これは、例えば、リガンドと細胞のコンテクスト（又は、バックグラウンド）の特性に依存している。例えば、２つの内因性のＧｉ−共役受容体、ＬＰＡ受容体（図６Ｃ）、及びニコチン酸受容体（図５Ａ）は、同一のＡ４３１細胞膜において２つの異なるタイプのＤＭＲ信号を引き起こす。これは、受容体によって誘起されたシグナリング処理の複雑性及び特異性を反映している。その上、Ａ４３１細胞における同一のＬＰＡ受容体は、完全に静的な状態対増殖状態（図６Ｃ、データは示されていない）等の細胞の状況に依存して、異なるタイプのＤＭＲ信号を引き起こすであろう。したがって、無標識バイオセンサ分析は、リアルタイムで、受容体シグナリングに続いて、明確な動力学応答を提供するものの、動力学応答の動特性のみが、経路の特定のための予測的な指標でなくてもよい。
【００７３】
バイオセンサシグナリングを統合する方法を利用することによって、少なくとも２つの異なる手法は、無標識バイオセンサ分析を使用して、ＧＰＣＲシグナリングを抽出するのに使用され得る。ホルスコリン若しくはＮＫＨ４４７等のＡＣ活性物質、又は細胞プリアンブルｃＡＭＰ類似物質等のＰＫＡ活性物質を使用して、第１方法（方法１）は、細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇せしめる。ＧＰＣＲリガンドによって誘起されたバイオセンサの出力に及ぼす高ｃＡＭＰレベルの特異な効果若しくは作用に基づいて、ＧＰＣＲシグナリングを抽出することができる。前記増大された細胞内ｃＡＭＰレベルは、Ｇｑ若しくはＧ１２／１３シグナリングに対してほとんど抑制効果を与えないか若しくは全く与えず、異種脱感作によりＧｓシグナリングを完全に減衰せしめ、異種感作によりＥＣ５０濃度におけるＧｉシグナリングを増強せしめる。
【００７４】
Ｕ７３１２２等のＰＬＣ抑制物質若しくはＰＬＣ遺伝子抑制干渉ＲＮＡのうちの一方を使用して、第２方法（方法２）は細胞内のホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性の活性化を抑制する。かかる手法は、無標識分析を使用して、ＧＰＣＲシグナリングを抽出する補完的な方法を提供する。ＰＬＣ活性の抑制はＧｓ若しくはＧ１２／１３シグナリングに対してはほとんど効果を示さないものの、Ｇｑシグナリングを完全に減衰せしめ、Ｇｉシグナリングを部分的に減衰せしめる。２つの手法は、無標識細胞分析を使用して、ＧＰＣＲシグナリングを抽出するのに独立して使用され得るし、組み合わせても使用され得る。上記２つの方法と、示されたＧＰＣＲに与えるそれら方法のそれぞれの効果が、添付した表にまとめられている。
【００７５】
【表１】
2011515065.tif 000005
【００７６】
実施例
以下の実施例は、上述した開示を使用する方法をより完全に説明し、さらに開示の種々な態様を行うように想定された最良の態様を詳しく説明するために用いている。これらの実施例は本開示の範囲を限定してはおらず、説明及び例示を目的として提示されていると理解される。
【００７７】
バイオセンサベースの生細胞分析によって、細胞応答の検出結果が、ホルスコリンによるアデニールサイクラーゼの活性化に続いてＧタンパク質共役受容体等の活性化によって得られる。ホルスコリンによるアデニールサイクラーゼの持続的活性化により、受容体のタイプに依存して、作用物質刺激に対してＧタンパク質共役受容体が敏感になり若しくは鈍感になる。
【００７８】
実験方法
材料  −
ホルスコリン及びエピネフリンは、Ｔｏｃｒｉｓ（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。ヒスタミン及びニコチン酸は、シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）（ミズリー州、セントルイス）から入手した。Ｅｐｉｃ社登録商標３８４ウェル細胞分析マイクロプレートはコーニング株式会社（コーニング、ニューヨーク州）から入手した。各ウェルが共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ）バイオセンサから成るマイクロプレートは、すぐに培養することができ、いかなる前処理も必要とせずに直接的に使用された。
【００７９】
細胞の培養  −
人間の表皮癌Ａ４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）が、ダルベッコの未改質Ｅａｇｌｅ媒質（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）内で培養された。かかる媒質には、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルのグルコース、２ｍＭのグルタミン、及び抗生物質が加えられた。１０％のＦＢＳを含む５０ＬのＤＭＥＭ媒質に３〜８回浮遊された約１．８×１０４の細胞が３８４ウェルマイクロプレートの各々のウェル内に設けられ、３７℃で空気／５％ＣＯ２下で１日間培養され、かかる細胞を続いて無血清ＤＭＥＭにおいて継続して培養することによって、約２０時間、放置した。
【００８０】
光学的バイオセンサシステム及び細胞分析  −
コーニング登録商標Ｅｐｉｃ登録商標波長送受観測システムが使用された。システムは、独立型とすることができ、温度制御ユニット、光学検知ユニット、及びロボティックスを有するオンボード液体処理ユニットから構成され得る。温度制御ユニットが、必要に応じて温度変動を最小にするべく内蔵されている。このユニット内に、センサーマイクロプレートと化合物ソースプレートの双方を処理する２つの並列スタックがある。一旦、安定した温度が得られると（通常１時間以内）、センサーマイクロプレートは、ロボティクスによって、検知システムの直上のプレートホルダに自動的に搬送され、ソースプレートは適切なコンパートメントに移動されるので、オンボード液体処理ユニットによって容易に処理可能である。
【００８１】
検知ユニットが、統合されたファイバオプティクスの中心に設けられ、例えば、生細胞内のリガンド誘起の動的質量再分布に起因する共鳴光の波長シフトが測定される。マイクロプレートの底部を介した垂直入射によって、光ファイバとコリメータレンズとを介して生成された８３０ｎｍを中心とする広帯域白色光源が、グレーティングの小領域を照明するのに使用された。反射光を記録する検出ファイバは照光ファイバを用いて１束にされた。一連の照光／検出ヘッドが直線的に配置されるので、反射スペクトルは、３８４ウェルのマイクロプレートの同じカラム内にある１６ウェルから一度に収集される。プレート全体が照光／検出ヘッドによってスキャンされて、各センサが複数回扱われ、各カラムは連続して扱われ、６秒若しくは１３秒の時間間隔で細胞応答の動的測定が行われた。
【００８２】
動的分析を目的として、細胞は、ＨＢＳＳ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳを有するＨａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液を用いて洗浄された。検知システム内で１時間培養した後に、センサープレートがスキャンされ、ベースラインの応答が記録された。そして、化合溶液が、オンボード液体処理システムを使用して、センサープレートに移され、細胞応答が別の期間に記録された。同様に、第２の任意のステップは、例えば、異なる化合溶液を添加するステップを含み、かかるステップが実行されると、第２リガンド誘起の応答に対する第１の化合物の効果が決定される。化合物が導入されると、センサーマイクロプレートのリッドが、短期間（例えば、約１分）を除いて、分析中、維持された。プレートリッドは、ロボティクスによって自動的に処理された。すべての分析測定が被制御温度（２８℃）にて実行された。
【００８３】
統計的分析  −
明確に言及しない限り、各測定若しくは各化合物に対して、３回測定が行われた。標準偏差がこれら測定値（ｎ＝３）から得られた。分析係数の変動は、通常約１０％未満であることが見出された。投与量依存性応答の全てが、（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄから利用可能な）Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた非線形回帰法を使用して分析された。
【００８４】
結果および議論
図２は、標的細胞内に出現するアデニールサイクラーゼの下位集合に依存して、ｃＡＭＰレベルを増大させ又は低減せしめ得るＧｑ（Ｇαｑ）、Ｇｉ（Ｇαｉ）、Ｇｓ／ｏ（Ｇαｓ／ｏ）、及びＧβγ介在シグナリング経路から、細胞内アデニールサイクラーゼまでのクロストークと、を示す概略図である。
【００８５】
図３Ａは、ホルスコリン前処理から生じる光学応答の実施例を示しており、かかるホルスコリン前処理に続いて静的Ａ４３１細胞におけるＧｓ共役受容体（Ａ２アデノシン受容体）の活性化処理が行われた。通常、ホルスコリンによるアデニールサイクラーゼの活性化が、Ｇｓ共役受容体の活性化によって相乗的に作用するものの、種々の濃度のホルスコリンを用いたＡ４３１細胞の１時間の前処理は、続いて１００ｎＭのＮＥＣＡの暴露処理がなされて（Ｎ−エチルアデノシンー５’−ウロン酸、Ａ２‐特有作用物質）、異種脱感作を引き起こす、すなわち、その作用物質による刺激に対するＡ２受容体の応答能力が低減された。同様に、種々の濃度のＮＥＣＡを用いたＡ４３１細胞の１時間の前処理は、アデニールサイクラーゼを減感せしめ、ホルスコリン誘起応答（図３Ｂ）を減衰せしめる。異種脱感作に関する観測が示していることは、クロストークがシグナリング経路間において生じ、これはアデニールサイクラーゼの活性化とＡ２受容体の活性化から生ずることである。理論によって制限されないものの、これら２つの経路間のクロストークに関して考えられる機構は、ホルスコリンによるアデニールサイクラーゼの活性化の際に、ｃＡＭＰが生成され且つＰＫＡを活性化することにある。ＰＫＡがＧｓ受容体をリン酸化し得るし、Ｇｓ介在反応を完全に抑制せしめる。したがって、図３Ａ及び３Ｂは、３Ａ）ＮＥＣＡ誘起のＧｓ応答に対するホルスコリン前処理の効果と、３Ｂ）静的Ａ４３１細胞におけるホルスコリン誘起の反応に対するＮＥＣＡ前処理の効果と、をそれぞれ示している。種々の濃度のホルスコリンを用いたＡ４３１細胞の前処理（３００＝５ｎｍ、３１０＝４４ｎｍ、３２０＝１７４ｎｍと、３３０＝３４８ｎｍ、３４０＝６９０ｎｍ）が行われ、続いて１００ｎＭのＮＥＣＡの暴露処理がなされた結果、ＮＥＣＡ誘起の応答の減衰を引き起こす。ホルスコリンによる抑制効果は、シグナリング経路間のクロストークに帰属すると信じられており、ホルスコリンによるアデニールサイクラーゼの活性化とＮＥＣＡによるＡ２アデノシン受容体の活性化から生じる。同様に、種々の濃度のＮＥＣＡを用いたＡ４３１細胞の前処理（３５０＝３ｎｍ、３６０＝３８４ｎｍ、３７０＝６９６ｎｍ、３８０＝５ｎｍ、３９０＝１１ｎｍ）に続いて１Ｍのホルスコリンによる処理をした結果、Ａ２受容体作用物質が１．３ｎＭのＩＣ５０とのホルスコリンの結合を抑制することを示した。
【００８６】
図４Ａは、ホルスコリン前処理から生じる細胞応答の実施例を示している。かかるホルスコリン前処理に続いて静的Ａ４３１細胞においてＧｑ−共役受容体（Ｈ１ヒスタミン受容体）の活性化処理が行われた。種々の濃度のホルスコリンを用いたＡ４３１細胞の１時間の前処理に続いて１００ｎＭのヒスタミン（Ｈ１−特有作用物質）の暴露によって処理したところ、部分的な脱感作をも引き起こした。
【００８７】
ホルスコリンの前処理による投与量依存の部分的な抑制は約１８４ｎＭのＩＣ５０を引き起こした。これは、ホルスコリンの効能に対応する。作用物質誘起の脱感作に関する観測は、この場合、アデニールサイクラーゼの特定のアイソフォームにおけるいくつかのクロストークがシグナリング経路間において生じ、これは、ホルスコリンによるすべての内因性のアデニールサイクラーゼの活性化とＨ１受容体の活性化から生ずることを再度示している。図４Ａ及び４Ｂは、４Ａ）ヒスタミン誘起のＧｑ応答に対して与えるホルスコリン前処理の効果、及び、４Ｂ）静的Ａ４３１細胞におけるホルスコリン誘起の反応に対するヒスタミン前処理の効果をそれぞれ示している。種々の濃度のホルスコリンを用いたＡ４３１細胞の前処理（４００＝３ｎｍ、４１０＝５ｎｍ、４２０＝１７４ｎｍ、４３０＝６９６ｎｍ、４４０＝２，７８４ｎｍ）に続いて１００ｎＭのヒスタミンの暴露処理がなされた結果、ヒスタミン−誘起の応答の減衰を引き起こした。ホルスコリンによる抑制効果は、シグナリング経路間のクロストークに帰属すると信じられている。これは、ホルスコリンによるアデニールサイクラーゼの活性化とヒスタミンによるＨ１ヒスタミン受容体の活性化とから生じる。同様に、種々の濃度のホルスコリンを用いたＡ４３１細胞の前処理（４５５＝３０ｎＭ、４６０＝９０ｎＭ、４６５＝９．９ｎＭ、４７０＝２７０ｎＭ、４７５＝８１０ｎＭ）に続いて１Ｍのホルスコリンによる処理をしたところ、Ｈ１受容体作用物質が、３０１ｎＭのＩＣ５０とのホルスコリンの結合を抑制することを示した。
【００８８】
図５は、ホルスコリン前処理から生じる細胞応答の実施例を示している。かかるホルスコリン前処理に続いて静的Ａ４３１細胞においてＧｉ‐共役受容体（ニコチン酸受容体ＨＭ７４受容体）の活性化処理が行われた。Ｇｓ−共有受容体及びＧｑ−共有受容体の活性化と対比して、種々の濃度のホルスコリンを用いたＡ４３１細胞の１時間の前処理に続いて２５Ｍニコチン酸（ＨＭ７４−特有作用物質）の暴露によって処理したところ、Ｈ１−誘起の応答の増強を引き起こし、ホルスコリンのＥＣ５０において最大値に達する。図５Ａは、静的Ａ４３１細胞におけるニコチン酸誘起のＧｉ応答に対するヒスタミン前処理の効果を示している。種々の濃度のホルスコリンを用いたＡ４３１細胞の前処理（すなわち、５００＝０ｎｍ、５１０＝４ｎｍ、５２０＝３２ｎｍ、５３０＝１２５ｎｍ、５４０＝４，０００ｎｍ、５５０＝３２，０００ｎｍ）に続いて２５Ｍのニコチン酸によって処理したところ、ニコチン酸誘起の応答の増強が引き起こされた。Ｇｉ応答の増強作用は、異種感作に帰属すると信じられている。
【００８９】
図６Ａ乃至６Ｃは、ＲＷＧバイオセンサを使用した生細胞における３つのクラスのＤＭＲ信号のＧＰＣＲシグナリング（Ｇｑ‐、Ｇｓ‐、及びＧｉ‐）を示している。すなわち、６Ａ）ＧｑシグナリングとそのＤＭＲ信号（チャイニーズハムスター細胞、１０ユニット／ｍＬのトロンビンにおけるプロテアーゼ活性されたレセプターサブタイプ１）と、６Ｂ）Ｇｓシグナリング及びそのＤＭＲ信号（Ａ４３１細胞、２ｎＭエピネフリンにおける２ーアドレナリン作用受容体）と、６Ｃ）Ｇｉシグナリング及びそのＤＭＲ信号（Ａ４３１，１００ｎＭ  ＬＰＡのリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）受容体サブタイプ１）と、を示している。破線矢印は作用溶液が導入された時間を示している。
【００９０】
図７Ａは、静的Ａ４３１細胞におけるヒスタミン誘起のＤＭＲ信号に対するＵ７３１２２の効果を示している。種々の濃度のＵ７３１２２を用いたＡ４３１細胞の前処理（すなわち、７００＝０Ｍ、７１０＝１．７８Ｍ、７２０＝７．１５Ｍ、７３０＝２８．５Ｍ、７４０＝１１４Ｍ、７５０＝２２８Ｍ）に続いて１，０００ｎＭのヒスタミンを用いて刺激の処理を行ったところ、ヒスタミン誘起のＤＭＲ応答の投与量依存性が抑制される。ヒスタミンは、Ａ４３１細胞に内因的に発現したＧｑ−共役受容体ヒスタミン受容体サブタイプ１に対して、天然の作用物質である。図７Ｂに示されたヒスタミン反応のＰ−ＤＭＲ振幅に基づいて、高投与量におけるＵ７３１２２がヒスタミン反応を完全に抑制し得る。
【００９１】
本開示は、種々の特定の実施形態及び技術を参照して説明されてきた。しかしながら、本開示の精神及び範囲内において多くの変更及び改良を行うことができることが理解されるはずである。
【参照】
【００９２】
１．Ｙ，  Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｌａｂｅｌ−Ｆｒｅｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ”，  ＰＣＴ  Ａｐｐ．  Ｎｏ．  ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３５３９  （Ｐｕｂ．Ｎｏ．  ＷＯ  ２００６／１０８１８３）（Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．  ＳＰ０５−０３７）．
２．Ｆａｎｇ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｇｒａｔｉｎｇ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｅｎｓｉｎｇ，”  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．，  （２００６）  ９１，  １９２５−１９４０．
【図１】
2011515065.tif 000006
【図２】
2011515065.tif 000007
【図３Ａ】
2011515065.tif 000008
【図３Ｂ】
2011515065.tif 000009
【図４Ａ】
2011515065.tif 000010
【図４Ｂ】
2011515065.tif 000011
【図５Ａ】
2011515065.tif 000012
【図５Ｂ】
2011515065.tif 000013
【図６Ａ】
2011515065.tif 000014
【図６Ｂ】
2011515065.tif 000015
【図６Ｃ】
2011515065.tif 000016
【図７Ａ】
2011515065.tif 000017
【図７Ｂ】
2011515065.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月8日(2010.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＣＲシグナリング経路の決定方法であって、
バイオセンサに生細胞を固定するステップと、
前記生細胞における細胞内ｃＡＭＰを増加させ且つタンパク質キナーゼＡを活性化する物質に当該固定された生細胞を接触せしめるステップと、
当該物質に接触せしめられた生細胞をＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップと、
前記物質が存在する場合と存在しない場合における前記生細胞の前記ＧＰＣＲリガンド誘起のバイオセンサの応答を検出し且つ比較するステップと、を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記増大された細胞内ｃＡＭＰレベルは、
Ｇｑ若しくはＧ１２／１３シグナリングに対して部分的な抑制効果を与え、
異種脱感作によりＧｓシグナリングを完全に減衰せしめ、
異種感作によりＥＣ５０濃度におけるＧｉシグナリングを増強せしめ、生細胞ＧＰＣＲシグナリングの抽出及び決定を可能にせしめることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
刺激を用いて、前記固定された生細胞の前処理、中間処理、後処理、又はそれら組合せのうち少なくとも１つを含みことを特徴とする方法。
【請求項４】
ＧＰＣＲシグナリング経路の決定方法であって、
バイオセンサに生細胞を固定するステップと、
当該固定された生細胞をＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップと、
細胞内ｃＡＭＰを増加させ且つ前記生細胞におけるタンパク質キナーゼＡを活性化する物質に当該ＧＰＣＲリガンドに接触せしめられた生細胞を接触せしめるステップと、
前記ＧＰＣＲリガンドが存在する場合と存在しない場合における前記生細胞の前記物質誘起のバイオセンサの応答を検出し且つ比較するステップと、を含む方法。
【請求項５】
ＧＰＣＲシグナリング経路の決定方法であって、
バイオセンサに生細胞を固定するステップと、
前記細胞内における細胞内ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）活性を抑制する物質に当該固定された生細胞を接触せしめるステップと、
当該ＰＬＣ抑制された生細胞をＧＰＣＲリガンドに接触せしめるステップと。
前記物質が存在する場合と存在しない場合における前記生細胞の前記ＧＰＣＲリガンド誘起のバイオセンサの応答を検出し且つ比較するステップと、を含む方法。
【国際調査報告】
2011515065.tif 000019
2011515065.tif 000020
2011515065.tif 000021