(57)【要約】  本発明は、ＢＲＣＡ１の発現レベルを基に膀胱癌に罹った患者の臨床転帰を予測する方法であって、ＢＲＣＡ１発現レベルが高いことが良くない予後を示すものである方法に関する。さらに、本発明は、特に腫瘍の外科的除去に先立って化学療法で治療されている患者におけるＢＲＣＡ１の発現レベルを基に、膀胱癌に罹った患者の化学療法に対する反応を予測する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者からの試料におけるＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなる、膀胱癌に罹った患者の臨床転帰を予測する方法であって、該試料におけるＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルが基準レベルと比べて低いことが良い臨床転帰を示す、方法。
【請求項２】
前記試料が腫瘍生検材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リンパ節転移を測定することをさらに含んでなる方法であって、リンパ節転移が陰性である場合にそれが良い臨床転帰を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルが、前記ＢＲＣＡ１遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのレベルまたはＢＲＣＡ１タンパク質のレベルを測定することにより決定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が腫瘍の外科的切除を受けている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者がネオアジュバント療法で治療されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ネオアジュバント療法が化学療法である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ネオアジュバント化学療法がシスプラチンによる化学療法である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記シスプラチンによる化学療法が、シスプラチン、シスプラチン−メトトレキサート−ビンブラスチン、ゲムシタビン−シスプラチン、メトトレキサート−ビンブラスチン−ドキソルビシン−シスプラチン（ＭＶＡＣ）、シクロホスファミド−ドキソルビシン−シスプラチン（ＣＩＳＣＡ）、ドーズデンスＭＶＡＣ（ｄｄＭＶＡＣ）、シスプラチン−アドリアマイシン（ＣＡ）、シスプラチン−メトトレキサート（ＣＭ）、シスプラチン−フルオロウラシル（ＣＦ）およびメトトレキサート−ビンブラスチン−エピルビシン−シスプラチン（ＭＶＥＣ）の群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記臨床転帰の予測が無病生存期間および全生存期間として測定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
患者からの試料におけるＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなる、膀胱癌に罹った患者がネオアジュバント療法に反応するか否かを予測する方法であって、該発現レベルが基準値よりも低いかまたは同程度の場合に、該患者がネオアジュバント化学療法による治療に反応することが予測される、方法。
【請求項１２】
前記試料が腫瘍生検材料である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リンパ節転移を測定することをさらに含んでなり、リンパ節転移が陰性である場合に、該患者がネオアジュバント化学療法による治療に反応することが予測される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルが、前記ＢＲＣＡ１遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのレベルまたはＢＲＣＡ１タンパク質のレベルを測定することにより決定される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ネオアジュバント療法が化学療法である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ネオアジュバント化学療法がシスプラチンによる化学療法である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記シスプラチンによる化学療法が、シスプラチン、シスプラチン−メトトレキサート−ビンブラスチン、ゲムシタビン−シスプラチン、メトトレキサート−ビンブラスチン−ドキソルビシン−シスプラチン（ＭＶＡＣ）、シクロホスファミド−ドキソルビシン−シスプラチン（ＣＩＳＣＡ）、ドーズデンスＭＶＡＣ（ｄｄＭＶＡＣ）、シスプラチン−アドリアマイシン（ＣＡ）、シスプラチン−メトトレキサート（ＣＭ）、シスプラチン−フルオロウラシル（ＣＦ）およびメトトレキサート−ビンブラスチン−エピルビシン−シスプラチン（ＭＶＥＣ）の群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断および治療の分野に関し、特に、膀胱癌患者からの試料における特定のバイオマーカーの発現に基づいて、該患者に個別診断および治療を提供する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膀胱癌は、米国だけでも毎年新たに５０，０００人が診断されている、最も一般的な新生物の一つである。ほとんどの膀胱癌は移行上皮癌（膀胱の内壁を通常は形成する細胞で始まる癌）である。他のタイプとしては、扁平上皮癌（薄く平らな細胞で始まる癌）および腺癌（粘液やその他の体液を生成して放出する細胞で始まる癌）が挙げられる。扁平上皮癌および腺癌を形成する細胞は、慢性的な刺激および炎症の結果として膀胱の内壁で発生する。
【０００３】
膀胱癌は通常、手術（経尿道切除、根治的膀胱切除もしくは膀胱部分切除）、放射線治療または化学療法で治療する。局所進行膀胱癌の患者の場合、ネオアジュバント化学療法に続いて膀胱切除を行なうと手術のみの場合に比べて生存期間が改善されるが、病的反応（ｐＴ０〜１Ｎ０Ｍ０）を獲得している患者においては特にそうである。
【０００４】
Bellmunt et al (Ann. Oncol., 2007, 522-528)（非特許文献１）には、ＤＮＡ修復に関与する様々な遺伝子の発現レベルを基に、化学療法に反応する進行性および転移性の膀胱癌患者の生存期間を予測する方法が記載されている。この著者らは予後マーカーとしてＥＲＣＣ１を同定することはできたが、ＲＲＭ１、ＢＲＣＡ１およびカベオリン−１等の他の遺伝子の発現レベルと生存期間との相関関係については何ら確認することができなかった。
【０００５】
Urushibara et al (Jpn J Clin Oncol., 2007, 37:56-61)（非特許文献２）では、ｈｓｐ６０の発現レベルを、膀胱切除およびネオアジュバント化学放射線治療後の膀胱癌患者の生存期間を予測するための独立因子として使用することができる、と報告されている。
【０００６】
Takata et al (Clin. Cancer Res., 2005, 11:2625-2636)（非特許文献３）には、ＭＶＡＣによるネオアジュバント化学療法に反応する侵襲性膀胱腫瘍と非応答性腫瘍との間で発現レベルが異なる１４の遺伝子が記載されている。
【０００７】
Sarkis et al. (J.Clin.Oncol., 1995, 13:1384-1390)（非特許文献４）には、ｐ５３遺伝子に変異を有する患者はＭＶＡＣによるネオアジュバント化学療法に反応してさらによくない臨床転帰を示した、と記載されている。
【０００８】
Inoue et al (Clin. Cancer Res., 2000, 6:4866-4873)（非特許文献５）には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出された血管新生因子の発現レベルが、外科的切除およびＭＶＡＣネオアジュバント療法後の膀胱癌患者における高い再発率および転移率と相関関係にある、と記載されている。
【０００９】
しかしながら、膀胱切除およびネオアジュバント（術前）化学療法に対する膀胱癌患者の臨床転帰を予測するのに有用なさらなるマーカーに対する必要性が依然として存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Bellmunt et al (Ann. Oncol., 2007, 522-528)
【非特許文献２】Urushibara et al (Jpn J Clin Oncol., 2007, 37:56-61)
【非特許文献３】Takata et al (Clin. Cancer Res., 2005, 11:2625-2636)
【非特許文献４】Sarkis et al. (J.Clin.Oncol., 1995, 13:1384-1390)
【非特許文献５】Inoue et al (Clin. Cancer Res., 2000, 6:4866-4873)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
第１の態様において、本発明は、膀胱癌に罹った患者からの試料におけるＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなる、該患者の臨床転帰を予測する方法であって、該試料におけるＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルが基準レベルと比べて低いことが良い臨床転帰を示す方法に関する。
【００１２】
第２の態様において、本発明は、膀胱癌に罹った患者からの試料におけるＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなる、該患者がネオアジュバント療法に反応するか否かを予測する方法であって、該発現レベルが基準値よりも低いかまたは同程度の場合に、該患者はネオアジュバント化学療法による治療に反応することが予測される方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＢＲＣＡ１  ｍＲＮＡの発現レベルが低い（≦13.57）、中間の（13.57〜26.77）、および高い（＞26.77）患者の累積生存率を示すカプランマイヤー曲線である。「打ち切り」（censored）という用語は、最終転帰を観察する前のサンプルのロスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、術前（ネオアジュバント）化学療法の後に膀胱腫瘍を外科的に切除した膀胱癌に罹った患者の臨床転帰が、ＢＲＣＡ１の発現レベルと密接な相関関係にあることを見出した。したがって、第一の態様において、本発明は、膀胱癌に罹った患者からの試料におけるＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなる、該患者の臨床転帰を予測する方法であって、該試料における発現レベルが基準レベルと比べて低いことは良い臨床転帰を示すものである方法に関する。
【００１５】
臨床転帰の予測は、腫瘍学において用いられ、かつ当業者に公知の任意の終点測定法を用いて行なうことができる。病気の進行を記述するための有用な終点パラメータとして、以下のものが挙げられる。
−無病進行。これは、本明細書で用いるように、研究期間中に病気が再発していない、完全寛解状態の患者の割合を記述する。
−奏功。これは、本発明で用いるように、治療を受けた人の中で完全奏功または部分奏功が認められた人の割合を記述する。
−腫瘍制御。これは、本発明で用いるように、治療を受けた人の中で完全奏功、部分奏功、やや有効または６カ月以上の安定病態が認められた人の割合に関する。
−無増悪生存期間。これは、本明細書で用いるように、治療開始から最初に癌の増殖を計測するまでの期間と定義される。
−６カ月無憎悪生存率またはＰＦＳ６”率。これは、本明細書で用いるように、治療開始後の最初の６カ月間に進行がない人の割合に関する。
−生存期間中央値。これは、本明細書で用いるように、研究に参加した患者の半数が依然として生存している期間に関する。
【００１６】
「膀胱癌」という用語は膀胱の腫瘍に関し、移行上皮癌、扁平上皮癌および腺癌等の膀胱癌に現れる典型的ないずれかの組織学的亜型；表在性癌、筋層浸潤性癌または転移性疾患癌等のいずれかの臨床亜型；ならびにＴ０〜Ｔ４、Ｎ０〜Ｎ４およびＭ０〜Ｍ１腫瘍等のいずれかのＴＭＮ分類を含む。
【００１７】
本明細書で用いる「試料」という用語は、患者から得ることができる任意の試料に関する。本方法は、生検試料、組織、細胞または体液（血清、唾液、精液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ）、涙、粘液、汗、乳汁、脳抽出物等）等の、患者からのあらゆるタイプの生物学的試料に適用することができる。特定の実施形態において、該試料は腫瘍組織試料またはその一部である。さらに特定の実施形態において、該腫瘍組織試料は膀胱癌に罹った患者からの膀胱腫瘍組織試料である。該試料は、医療関連分野の当業者に周知の方法を用いて、生検等の従来の方法で得ることができる。生検材料から試料を得る方法としては、塊の分割もしくは顕微解剖、または当業者に公知のその他の細胞分離法が挙げられる。さらには、腫瘍細胞は穿刺吸引細胞診により得ることができる。試料は、その保存および取扱いを簡素化するために、ホルマリン固定してパラフィン包埋するか、または、まず凍結させ、次いで急速凍結が可能になる超極低温培地への浸漬を経てからＯＣＴコンパウンド等の低温凝固性培地に包埋してもよい。
【００１８】
本発明の方法は、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルを決定することを必要とする。好ましい実施形態において、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルの決定は、ＢＲＣＡ１遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの発現レベルを測定することによって行なうことができる。この目的のためには、生物学的試料を処理して、組織や細胞構造を物理的または機械的に破壊し、細胞内成分を水溶液または有機溶液中に放出し、さらなる分析のために核酸を作製してもよい。この核酸は当業者に公知の手順で試料から抽出されるが、市販もされている。次いで、当技術分野において一般的ないずれかの方法、例えば、Sambrook, Fischer and Maniatis, Molecular Cloning, a laboratory manual, (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989)によって、ＲＮＡが凍結試料または新鮮な試料から抽出される。抽出プロセス中にＲＮＡが分解しないように注意することが好ましい。
【００１９】
特定の実施形態において、発現レベルは、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織試料から得たｍＲＮＡを用いて決定される。ｍＲＮＡは、保存用病理試料または最初に脱パラフィン化した生検試料から単離することができる。典型的な脱パラフィン法には、パラフィン化した試料を例えばキシレン等の有機溶媒で洗浄することが含まれる。脱パラフィン化した試料は、低級アルコールの水溶液で再水和してもよい。好適な低級アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノ−ルが挙げられる。脱パラフィン化した試料は、例えば、低級アルコール溶液で、その濃度を下げながら次々と洗浄することで再水和してもよい。あるいは、試料の脱パラフィン化と再水和を同時に行なう。次いで試料を溶解させ、ＲＮＡを試料から抽出する。
【００２０】
全ての遺伝子発現プロファイリングの手法（ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＡＧＥまたはＴａｑＭａｎ）が上述の本発明の態様を実施する際に用いるのに好適であるが、遺伝子ｍＲＮＡ発現レベルは、多くの場合ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法）で決定される。検出は、個々の試料または組織マイクロアレイ中で行なうことができる。
【００２１】
ｍＲＮＡ発現の値を異なる試料間で正規化するために、試験用試料中の目的のｍＲＮＡの発現レベルとコントロールＲＮＡの発現とを比較することが可能である。本明細書で用いる「コントロールＲＮＡ」は、非腫瘍形成性細胞に対し、腫瘍細胞において発現レベルが変化しないか、またはほんのわずかな量しか変化しないＲＮＡに関する。好ましくは、コントロールＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子に由来し、かつ構成的に発現して必須の細胞機能を果たすタンパク質をコードするｍＲＮＡである。本発明に用いる好ましいハウスキーピング遺伝子としては、β−２−ミクログロブリン、ユビキチン、１８−Ｓリボソームタンパク質、シクロフィリン、ＧＡＰＤＨおよびアクチンが挙げられる。好ましい実施形態において、コントロールＲＮＡはβ−アクチンｍＲＮＡである。一実施形態において、相対的遺伝子発現の定量は、内在性コントロールとしてβ−アクチンを、キャリブレーターとして市販のＲＮＡコントロールを用いて比較Ｃｔ法に従って計算した。最終結果は、２−（ΔＣｔ  試料ΔＣｔ  キャリブレーター）の式に従って決定し、式中、キャリブレーターおよび試料のΔＣＴ値は、β−アクチン遺伝子の値から標的遺伝子のＣＴ値を引くことによって決定する。
【００２２】
ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルの決定には基準値が関連している必要があるが、この基準値は、ネオアジュバント化学療法的治療に先立って癌患者からの生検試料中の腫瘍組織を回収する際に測定される、ＢＲＣＡ１の発現レベルの中央値に相当している。この中央値が確定すれば、患者からの腫瘍組織に発現するこのマーカーのレベルとこの中央値とを比較することができ、よって「低」「普通」または「高」のレベルを割り当てることができる。基準レベルの元となる試料の回収物は、同タイプの癌の患者から構成されることが好ましい。いずれの場合においても、回収物に含まれる試料数は異なり得る。遺伝子試料の発現が「増加」または「減少」しているかを決定するのに用いる基準値は、ネオアジュバント化学療法的治療に先立って癌患者からの生検により得られる各腫瘍試料からそれぞれ同量のＲＮＡをプールすることで得られるＲＮＡ試料において測定されるＢＲＣＡ１の発現レベルの中央値に対応して使用される。この中央値が確定すれば、患者からの腫瘍組織に発現するこのマーカーのレベルとこの中央値とを比較することができ、よって「増加」または「減少」のレベルを割り当てることができる。特定の実施形態において、基準値の少なくとも１．１倍、１．５倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、または基準値に比べてさらにそれ以上に発現が増加している場合、発現が「増加」したと見なす。特定の実施形態において、基準値の少なくとも０．９倍、０．７５倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、０．０２５倍、０．０２倍、０．０１倍、０．００５倍、または基準値に比べてさらにそれ以下に発現が減少している場合、発現が「減少」したと見なす。
【００２３】
被験者間のバラつき（例えば、年齢、人種等に関する面）により、ＢＲＣＡ１の絶対的な基準値を確定することは（事実上不可能とまではいかないが）非常に困難である。したがって、特定の実施形態において、ＢＲＣＡ１発現の「増加」または「減少」に対する基準値は、通常の被験者（すなわちＮＳＣＬＣや膀胱癌の診断を受けていない人）から単離された試料群のＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルを試験することを含む、従来の手段でパーセンタイル（percentile）を計算することにより決定される。こうして「増加」したレベルを割り当てることができるが、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルが通常の集団において５０パーセンタイル以上、例えば、通常の集団において６０パーセンタイル以上、通常の集団において７０パーセンタイル以上、通常の集団において８０パーセンタイル以上、通常の集団において９０パーセンタイル以上、および通常の集団において９５パーセンタイル以上の発現レベルの試料に対して割り当てることが好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態において、ＢＲＣＡ１発現値は三分位（terciles）に分割される。一例としては、リアルタイム定量ＰＣＲを用いて、シスプラチン化学療法を受けた膀胱癌患者からの５１個の腫瘍生検材料におけるＢＲＣＡ１  ｍＲＮＡレベルを決定し、その遺伝子発現値を三分位に分割した。結果が転帰（ＤＦＳおよびＭＳ）と相関関係にある場合、ＢＲＣＡ１レベルが低三分位（第１三分位）（tercile 1）の患者は、高および中三分位の患者に比べて、再発リスクが有意に減少し（ＤＦＳ）、生存期間が有意に改善した（ＭＳ）ことが観察された（図１および表１参照）。
【００２５】
別の実施形態において、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルは、ＢＲＣＡ１タンパク質の発現を測定することにより決定される。ＢＲＣＡ１タンパク質の発現レベルの決定は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットまたは免疫蛍光法等の免疫学的手法により行なうことができる。ウェスタンブロットは、あらかじめ変性条件下にてゲル電気泳動で分解し、特異的な抗体および展開系（例えば化学発光系）と一緒にインキュベーションすることにより膜（通常はニトロセルロース）上に固定化したタンパク質を検出することが基本となっている。免疫蛍光法による分析では、顕微鏡検査によって発現および細胞内局在を分析するために、標的タンパク質に特異的な抗体を使用することが必要である。通常、研究中の細胞は、あらかじめパラホルムアルデヒドで固定され非イオン洗剤で透過化処理されている。ＥＬＩＳＡは酵素で標識した抗原または抗体を用いることが基本となっているため、標的抗原と標識抗体の間で結合体（conjugates）が形成されることで、酵素的に活性な複合体が形成されることになる。構成要素の一方（抗原または標識抗体）が支持体上に固定化されるため抗体−抗原複合体が支持体上に固定化されることになり、そのため、酵素によって例えば分光測光法または蛍光光度法で検出可能な産物へと変換される基質を添加することによって、これを検出することができる。この手法では標的タンパク質の正確な位置確認やその分子量の決定はできないが、種々の生物学的試料（血清、血漿、組織ホモジネート、ポスト核（postnuclear）上清、腹水等）中の標的タンパク質を非常に特異的に、かつ高感度に検出することができる。好ましい実施形態において、ＢＲＣＡ１タンパク質は、コーティングしたスライド上に固定化された生物学的試料の薄片を用いて免疫組織化学（ＩＨＣ）分析によって検出される。次いでこの薄片は、パラフィン化した組織試料由来の場合には脱パラフィン化され、抗原を回収するように処理される。検出は、個々の試料または組織マイクロアレイ中で行うことができる。
【００２６】
標的タンパク質の量を検出するためには、標的タンパク質に高親和性に結合することが知られているいずれの抗体または試薬を用いてもよい。とは言うものの、ポリクローナル血清、ハイブリドーマ上清またはモノクローナル抗体等の抗体；Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ等の抗体断片；ジアボディ（diabodies）；トリアボディ（triabodies）；テトラボディ（tetrabodies）およびヒト化抗体を使用することが好ましい。
【００２７】
さらに別の実施形態において、ＢＲＣＡ１タンパク質発現レベルの決定は、集めた患者試料を含有する組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を構築し、免疫組織化学の手法でＢＲＣＡ１タンパク質の発現レベルを決定することによって行なうことができる。免疫染色強度は、この方法の再現性を維持するために、２つの異なる病理学者によって評価し、一律で明確なカットオフ基準を用いて記録してもよい。不一致は、同時に再評価することで解決できる。簡単に言うと、免疫染色の結果は、腫瘍細胞における発現および各マーカーに対する特異的カットオフを考慮に入れつつ、陰性発現（０）対陽性発現、ならびに低発現（１＋）対中（２＋）および高（３＋）発現として記録してもよい。カットオフは、全般的な基準としては再現性を促進するために、可能であれば生物学的事象を解釈するために選択した。
【００２８】
ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルの決定には基準値が関連している必要があるが、この基準値は、ネオアジュバント化学療法的治療に先立って癌患者からの生検試料中の腫瘍組織を回収する際に測定される、ＢＲＣＡ１の発現レベルの中央値に相当している。この中央値が確定すれば、患者からの腫瘍組織に発現するこのマーカーのレベルとこの中央値とを比較することができ、よって「低」「普通」または「高」のレベルを割り当てることができる。
【００２９】
本発明者らは、リンパ節転移、すなわちリンパ管侵襲の程度が、ＢＲＣＡ１発現レベルの値とともに、シスプラチンによるネオアジュバント療法で治療されている膀胱癌に罹った患者の臨床転帰に対する予測マーカーとして使用できることも見出した。したがって、別の実施形態において、本発明の方法はリンパ節転移を測定することをさらに含んでなり、ここで、リンパ節転移が陰性である場合にそれが臨床転帰が良いことを示す。
【００３０】
本明細書で用いる「リンパ節転移」（lymph node involvement）という表現は、腫瘍細胞が、腫瘍を含んだ組織の近くにあるリンパ節および血管へ広がることと理解され、当業者に公知の標準的な手順で決定される。
【００３１】
別の実施形態において、本発明の方法は、腫瘍の外科的切除を受けた患者に適用される。さらにより好ましい実施形態において、臨床転帰を予測される膀胱癌に罹った患者は、術前（ネオアジュバント）療法で治療される。膀胱癌の好適なネオアジュバント療法としては、放射線療法、化学療法または化学放射線療法が挙げられる。好ましい実施形態において、ネオアジュバント療法は化学療法である。好ましくは、ネオアジュバント化学療法はシスプラチンによる化学療法であり、より好ましくは、シスプラチンによるネオアジュバント化学療法は、シスプラチン、シスプラチン−エトトレキサート（ethotrexate）−ビンブラスチン、ゲムシタビン−シスプラチン、メトトレキサート−ビンブラスチン−ドキソルビシン−シスプラチン（ＭＶＡＣ）、シクロホスファミド−ドキソルビシン−シスプラチン（ＣＩＳＣＡ）、ドーズデンス（dose-dense）ＭＶＡＣ（ｄｄＭＶＡＣ）、シスプラチン−アドリアマイシン（ＣＡ）、シスプラチン−メトトレキサート（ＣＭ）、シスプラチン−フルオロウラシル（ＣＦ）およびメトトレキサート−ビンブラスチン−エピルビシン−シスプラチン（ＭＶＥＣ）の群から選択される。
【００３２】
本発明者らは、リンパ管侵襲の程度が、膀胱癌に罹った患者の臨床転帰の予測マーカーとして使用できることも見出した。したがって、別の態様において、本発明は、膀胱癌に罹った患者におけるリンパ管侵襲を決定することを含んでなる、該患者の臨床転帰を予測する方法に関し、ここで、リンパ管侵襲の拡大が不十分な臨床転帰を示す。
【００３３】
リンパ管侵襲の程度を基に臨床転帰を決定される患者は、腫瘍の外科的切除を受けた患者、好ましくは、ネオアジュバント療法で治療されている患者であってよい。好適なネオアジュバント療法は、ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルの決定に基づいて臨床転帰を予測する方法に関連して上述したものである。臨床転帰は、上述のパラメータ（無病進行、奏功、腫瘍制御、無増悪生存期間、生存期間中央値、６カ月無増悪生存期間、全生存期間等）のいずれかを用いて測定することができる。
【００３４】
本発明者らの研究結果により、ＢＲＣＡ１の発現と患者がネオアジュバント化学療法に反応する可能性とが相関関係にある、膀胱癌に罹った患者のための個別化治療の開発が可能になる。したがって、別の態様において、本発明は、膀胱癌に罹った患者からの試料におけるＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルを決定することを含んでなる、該患者がネオアジュバント化学療法に反応するか否かを予測する方法に関し、ここで、発現レベルが基準値よりも低いかあるいは同程度の場合に、該患者はネオアジュバント化学療法による治療に反応することが予測される。
【００３５】
「試料」という用語は既に定義されており、生検試料、組織、細胞または体液（血清、唾液、精液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ）、涙、粘液、汗、乳汁、脳抽出物等）等の、患者からのあらゆるタイプの生物学的試料に適用することができる。特定の実施形態において、該試料は腫瘍組織試料またはその一部である。さらに特定の実施形態において、該腫瘍組織試料は膀胱癌に罹った患者からの膀胱腫瘍組織試料またはホルマリン包埋した膀胱組織試料である。
【００３６】
ＢＲＣＡ１遺伝子の発現レベルの決定は、ＢＲＣＡ１遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの発現レベルを測定すること、または前述のいずれかの手順を用いてＢＲＣＡ１遺伝子産物の発現レベルを測定することによって行なわれる。この値は、コントロールハウスキーピングｍＲＮＡまたはタンパク質を用いて正規化し、ネオアジュバント化学療法的治療に先立って癌患者からの生検試料中の腫瘍組織を回収する際に測定されるＢＲＣＡ１の発現レベルの中央値に相当する基準値と比較しなければならない。この中央値が確定すれば、患者からの腫瘍組織に発現するこのマーカーのレベルとこの中央値とを比較することができ、よって「低」「普通」または「高」のレベルを割り当てることができる。
【００３７】
本発明者らは、リンパ節転移、すなわちリンパ管侵襲の程度をＢＲＣＡ１遺伝子発現レベルと組み合わせて用いて、膀胱癌に罹った患者がネオアジュバント化学療法に反応するか否かを予測する方法の信頼性を高められることも見出した。したがって、別の実施形態において、膀胱癌に罹った患者がネオアジュバント化学療法に反応するか否かを予測する方法は、リンパ節転移を測定することをさらに含んでなり、ここで、リンパ節転移が陰性である場合に、患者はネオアジュバント化学療法による治療に反応することが予測される。
【００３８】
別の実施形態において、患者がネオアジュバント化学療法による治療の候補者に選ばれたら使用してもよいネオアジュバント化学療法薬は、好ましくはシスプラチンによる化学療法である。より好ましくは、シスプラチンによるネオアジュバント化学療法は、シスプラチン、シスプラチン−メトトレキサート−ビンブラスチン、ゲムシタビン−シスプラチン、メトトレキサート−ビンブラスチン−ドキソルビシン−シスプラチン（ＭＶＡＣ）、シクロホスファミド−ドキソルビシン−シスプラチン（ＣＩＳＣＡ）、ドーズデンスＭＶＡＣ（ｄｄＭＶＡＣ）、シスプラチン−アドリアマイシン（ＣＡ）、シスプラチン−メトトレキサート（ＣＭ）、シスプラチン−フルオロウラシル（ＣＦ）およびメトトレキサート−ビンブラスチン−エピルビシン−シスプラチン（ＭＶＥＣ）の群から選択される。
【００３９】
以下の実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４０】
方法
局所進行膀胱癌の患者５１人から経尿道的切除によって得た腫瘍生検材料において、定量ＰＣＲでＢＲＣＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルを分析した。４４人の患者がｃＴ３〜４Ｎ０Ｍ０として臨床的に病期分類され、５人の患者が所属リンパ節を有し（ｃＴｘＮ＋）、２人の患者が遠隔リンパ節を有していた。３５人の患者に、シスプラチン、メトトレキサートさらにビンブラスチンを与え、１６人の患者をゲムシタビンさらにシスプラチンで治療した。ＢＲＣＡ１遺伝子発現は、Specht K, et al. (2001) (Am. J. Pathol., 158, 419-429およびKrafft AE, et al. (1997) Mol. Diagn. 3, 217-230によって先に記載されているように測定した。キシレンおよびアルコールを用いて標準組織試料を脱パラフィン化した後、トリス−クロリド、ＥＤＴＡ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびプロテイナーゼＫを含む緩衝液中に試料を溶解させた。次いでＲＮＡをフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールで抽出し、その後、グリコーゲンおよび酢酸ナトリウムの存在下にて、イソプロパノールで沈殿させた。ＲＮＡをＲＮＡ保存液（アンビオン社；オースティン、テキサス州、米国）中に再懸濁させ、ＤＮＡの混入を避けるためにＤＮアーゼＩで処理した。Ｍ−ＭＬＶレトロトランスクリプターゼ酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。各遺伝子に対して特異的なプライマーおよびプローブを含む１２．５−μｌの反応系中のTaqman Universal Master Mix（ＡＢ；アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）に、鋳型ｃＤＮＡを加えた。プライマーとプローブのセットは、Primer Express 2.0 Software（ＡＢ）を用いて設計した。遺伝子発現の定量は、ABI Prism 7900HT Sequence Detection System（ＡＢ）を用いて行なった。ＢＲＣＡ１  ｍＲＮＡ発現分析用のプライマーおよびプローブは、参照配列ＮＭ＿００７２９４（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink）に従って設計した。フォワードプライマーはエクソン８（４２９２ｂｐ〜４３１７ｂｐ位置）に、リバースプライマーはエクソン９（４３３６ｂｐ〜４３６０ｂｐ位置）に、プローブはエクソン８／９ジャンクション（４３１３ｂｐ〜４３３３ｂｐ位置）に位置する。これらのプライマーと一緒に生成されたＰＣＲ産物のサイズは６９ｂｐであった。プライマーおよび５’標識蛍光レポーター色素（6FAM）プローブは以下の通りであった：β−アクチン：フォワード５’  ＴＧＡ  ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ３’（配列番号１）、リバース５’  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＣＧＣ  ＡＣＧ  ＡＴＴ  Ｔ  ３’（配列番号２）、プローブ５’  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ３’（配列番号３）；ＢＲＣＡ１：フォワード５’  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＴＡ  ３’（配列番号４）、リバース５’  ＧＣＴ  ＴＴＡ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＴＡＴ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  Ｔ  ３’（配列番号５）、プローブ５’  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＧＧ  ３’（配列番号６）。相対的遺伝子発現の定量は、内在性コントロールとしてβ−アクチンを、キャリブレーターとして市販のＲＮＡコントロール（ストラタジーン社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を用いて比較Ｃｔ法によって計算した。最終結果は以下のように決定した：２−（ΔＣｔ  試料ΔＣｔ  キャリブレーター）、式中、キャリブレーターおよび試料のΔＣＴ値は、β−アクチン遺伝子の値から標的遺伝子のＣＴ値を引くことによって決定する。全ての実験において、Ｃｔ値の標準偏差（ＳＤ）が＜０．２０である三つ組のみを採用した。加えて、分析したそれぞれの試料について、ゲノムＤＮＡの混入が無いことを確実にするために、コントロールを差し引いたレトロトランスクリプターゼを同一プレートで使用した。
【００４１】
結果
３サイクルの化学療法の中央値の後、４９人の患者（９６％）で膀胱切除を行なった。２５人の患者（５０％）で有意な病的反応（ｐＴ０またはＴ１）が得られた。ＢＲＣＡ１レベルと病的反応の間に密接な相関関係が見られた。低／中ＢＲＣＡ１レベルの患者の２１人（６５％）で病的反応が得られたが、高ＢＲＣＡレベルの患者では４人（２６％）のみであった（Ｐ＝０．０１）。無病生存期間（ＤＦＳ）中央値は、低ＢＲＣＡ１レベルの患者１７人で１２０カ月、中ＢＲＣＡ１レベルの患者１７人で１８４カ月、高ＢＲＣＡ１レベルの患者１７人ではわずか１４カ月であった（Ｐ＝０．０２）。ＤＦＳの多変量解析では、ＢＲＣＡ１レベルとリンパ管侵襲のみが独立した予後マーカーとして現れた（表２参照）。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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