(57)【要約】  被験者が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を患う危険性を診断するための方法であって、被験者から試料を調製する工程と、上記試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量を決定する工程と、上記ＣＤ４＋２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量が、健康な被験者のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量と比較して減少している場合に、ＣＯＰＤを患う危険性を診断する工程と、を有する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を患う危険性を診断するための方法であって、
被験者から試料を調製する工程と、
上記試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量を決定する工程と、
上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量が、健康な被験者のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量と比較して減少している場合に、ＣＯＰＤを患う危険性を診断する工程と、を有する方法。
【請求項２】
被験者の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を診断するための方法であって、
被験者から試料を調製して、当該試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量を決定する工程と、
上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量が、健康な被験者のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量と比較して増加している場合に、ＣＯＰＤを診断する工程と、を有する方法。
【請求項３】
上記試料は、血液であり、好ましくは、ヘパリン添加血液であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量は、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて決定されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量は、フローサイトメトリー、特に、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）によって決定されることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記健康な被験者のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量は、全ＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団の１．７％〜２．５％であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記ＣＯＰＤを患う危険性は、上記試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量が、健康な被験者のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％減少している場合に診断されることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記ＣＯＰＤを患う危険性は、上記試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量が、全ＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団の０．８％〜１．６％である場合に診断されることを特徴とする請求項１、３〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量が全ＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団の２．７％よりも多い場合に、ＣＯＰＤが診断されることを特徴とする請求項２〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
被験者におけるＣＯＰＤステージＩ／ＩＩとＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶとを区別するための方法であって、
ＣＯＰＤを患っている被験者から試料を調製する工程と、
上記試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量を決定する工程と、
上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量が、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶを患っている被験者に由来する試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量と比較して減少している場合に、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩが診断される工程、または、上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量が、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩを患っている被験者に由来する試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量と比較して増加している場合に、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶが診断される工程と、を有する方法。
【請求項１１】
上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量が全ＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団の２．７％〜４．５％である場合に、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩが診断されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量が全ＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団の５％〜１２％である場合に、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶが診断されることを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
被験者における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の進行を観察するための方法であって、
被験者から試料を調製する工程と、
上記試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量を決定する工程と、
上記被験者の上記試料中の上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量と、上記被験者の以前の試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量とを比較する工程と、を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、被験者が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を患う危険性を診断するための方法に関する。
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、世界的に、主要な死亡原因の一つである。２０２０年には、虚血性心疾患および脳血管疾患のみが、世界人口の間において、より高い死亡率を占める。過去数年で、蔓延率および入院率が劇的に上昇してきた。幾つかの研究によって、全ての喫煙者がＣＯＰＤの臨床的な特徴を示す訳ではないが、喫煙とＣＯＰＤの進行との間に強い因果関係があることが示されている（Higenbottam T et al. (1980) Lancet 315:409-411）。病原は、気道のリモデリング（remodelling）および異常な炎症に起因する気道閉塞によって特徴付けられる。ＣＯＰＤは、慢性気管支炎および気腫を包含し、これらは共に、組織の破壊によって特徴付けられる。気流の制限が徐々に進行し、呼吸困難と運動能力の制限とを引き起こす。しかしながら、機能障害は肺に限定されず、ＣＯＰＤの患者は、心疾患を含む全身的な障害を患う危険性も高い。Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Diseases(ＧＯＬＤ)のガイドラインに従った気道閉塞の診断では、スパイロメトリー（spirometry）を使用する必要がある。気管支拡張薬後の（Postbronchodilator）  ＦＥＶ１／ＦＶＣ（１秒あたりの強制的な呼気量／強制肺活量）が７０%未満であることは、不可逆的な気道閉塞であることを示しており、それ故に、当該ＦＥＶ１／ＦＶＣは、ＣＯＰＤの診断にとって主要なパラメーターであると考えられる（Global Strategy for Diagnosis, Management, and Prevention of COPD. Global Initiative FOR Chronic Obstructive Lung Disease, 2007, www.goldcopd.com）。現在、患者は、肺活量データおよび臨床所見に基づいた複数のＧＯＬＤステージに分類される。疾患の活動性（activity）を示す血清中のマーカーを検出することは、診断プロセスおよび治療プロセスにおいて、特に注目されている。
【０００３】
喫煙は、上記疾患の主要な危険要因として広く認知されているが、特定の病原メカニズムの説明は、不明なままである。数十年間、好中球およびマクロファージ（先天性免疫の一部）が、ＣＯＰＤを患っている患者に生じる気道のリモデリングプロセスにおいて重要であると考えられてきた。近年のレポートは、ＣＯＰＤ患者の気管支肺胞洗浄物（BAL）および唾液の中のＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞（適応免疫システムの一部）の増加を証明することによって、上記病原論に挑戦してきた。これらのＴリンパ球は、健康なドナーまたは非ＣＯＰＤ喫煙者の細胞と比較して、より多くのパーフォリンを含むとともに、細胞傷害活性を示した。抗原刺激は、大きなクローンサイズへ成長する抗原特異的なT細胞の急激な増加を引き起こす。当該増加は、予めプログラムされたクローンの制限（clonal contraction）によって平衡化される。この工程は堅固であって、様々な記憶Ｔ細胞を維持するために、通常は十分な工程である。しかしながら、慢性的な抗原に対する露出（例えば、ＨＩＶウイルス感染、およびＣＭＶウイルス感染）は、モノクローナルなＴ細胞集団の増加を引き起こす。更に、年齢が、T細胞のホメオスタシスに深く関わっている。
【０００４】
ＣＯＰＤを診断するための臨床診療に用いられている唯一の方法はスパイロメトリーである。スパイロメトリーは肺の機能を測定する肺機能試験であって、特に、吸い込まれおよび吐き出され得る、気体の量（体積）および／または速度（流量）が測定される。しかしながら、この試験は、他の肺の疾患（例えば、喘息および肺線維症）の診断にも用いられる。それ故に、このような方法は、ＣＯＰＤを信頼性高く診断するための唯一の試験として機能することはない。それ故に、医者は、ＣＯＰＤの診断のために、症状(例えば、呼吸困難、慢性咳、または痰)、および／または、リスクファクターへ暴露された経歴なども考慮する。ＣＯＰＤを診断するために、または、ＣＯＰＤの様々な形態を区別するために、このような方法を用いると誤診を引き起こす恐れがある。それ故に、患者は、発症後直ちに、最も良い治療を受けることができない。
【０００５】
それ故に、本発明の目的は、疾患の初期から、被験者において明確にＣＯＰＤを診断するための方法および手段、または、被験者がＣＯＰＤを患うリスクを決定するための方法および手段を提供することにある。
【０００６】
本発明は、被験者が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を患う危険性を診断するための方法であって、
被験者から試料を調製する工程と、
上記試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量を決定する工程と、
上記ＣＤ４＋２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量が、健康な被験者のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量と比較して減少している場合に、ＣＯＰＤを患う危険性を診断する工程と、を有する方法、に関する。
【０００７】
本発明の別の態様は、被験者の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を診断するための方法であって、
被験者から試料を調製して、当該試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量を決定する工程と、
上記ＣＤ４＋２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量が、健康な被験者のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量と比較して増加している場合に、ＣＯＰＤを診断する工程と、を有する方法、に関する。
【０００８】
被験者のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量を決定することが、ＣＯＰＤの診断、特に、被験者におけるＣＯＰＤステージＩ／ＩＩおよびＩＩＩ／ＩＶの診断を可能にするマーカーとして機能し得ることが判明した。上記マーカーは、被験者が将来ＣＯＰＤを患う危険性を決定することをも可能にする。生活様式が原因でＣＯＰＤを患う危険性があると考えられる全ての人（例えば、煙草に曝されている人、喫煙者など）が、ＣＯＰＤを患うわけではない。それ故に、被験者がＣＯＰＤを患う危険性があるとする診断は、ＣＯＰＤを予防するために非常に有用である。更に、ＣＯＰＤを診断し、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩとＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶとを区別することはまた、有用である。ＣＯＰＤの両方のステージを区別することは、異なる治療を行うために有用である。結果的にＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞を決定することは、治療の進行、または、疾患自体の進行を決定するためにも有用である。
【０００９】
本発明の方法では、表面のＣＤ２８を有しないＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞が決定される。表面のＣＤ２８の量が減少しているＣＤ４＋  Ｔ細胞は、当該方法から除外される。更に、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞は、ＣＤ２８を生産することができない、異なるタイプの細胞である。ＣＤ４＋ＣＤ２８＋  Ｔ細胞の一般的なＣＤ２８の量と比較して、単にＣＤ２８の量が減少している別のＣＤ４＋  Ｔ細胞は、上記規定に含まれない。Gadgil A.等は、そのようなＣＤ４＋  Ｔ細胞について記載している（Proc Am Thorac Soc 3 (2006): 487-488）。これらの細胞では、依然としてＣＤ２８を発現しているものの、ＣＤ２８の発現が下方制御（down-regulated）されている。
【００１０】
本発明の方法に用いられる上記マーカーは、単独で用いられることも可能であるし、あるいは、ＣＯＰＤを発症する危険性があるヒトのＣＯＰＤの診断に用いられている公知のあらゆる他のマーカーと共に用いられることも可能である。
【００１１】
ＣＤ４は、ヘルパーＴ細胞および他の細胞（例えば、調節Ｔ細胞（regulatory T cell）、単球、マクロファージ、および、樹状細胞）の表面に発現する糖タンパク質である。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の活性化に必要な補助刺激シグナルを発するＴ細胞上に発現される分子の一つである。ＣＤ２８は、Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）のレセプターである。Ｔｏｌｌ様レセプターリガンンドによって活性化された時、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）において、Ｂ７．１の発現が上昇する。抗原提示細胞におけるＢ７．２の発現は、変化しない（constitutive）（P. Sansoni et al. Exp. Gerontology 43 (2008): 61-65. FA. Arosa. Immunol and Cell Biol. 80 (2002): 1-13）。
【００１２】
複製にストレスが与えられた（replicatively stressed）ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、表現型および機能の多様な変化を生じる。最も広く知られている表現型の変化は、補助刺激表面マーカーであるＣＤ２８が消失することである。ＣＤ４＋  Ｔ細胞の増加（expansion）およびＣＤ２８の消失は、恐らく老化（senescent）である。このことは、幾つかの自己免疫疾患（例えば、糖尿病、関節リウマチ、ヴェグナー肉芽腫症、多発性硬化症、および、強直性脊椎炎など）において記載されてきた。ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞は、クローンとして増加（clonally expanded）するとともに、自己反応性Ｔ細胞を含むことが知られており、自己免疫疾患において直接的な役割を担っていると考えられている。これらの増加したＣＤ４＋  クローンタイプは、典型的なヘルパーＴ細胞と、表現型の上で異なっている。ＣＤ２８遺伝子の転写が阻害されているために、クローンとして増加したＣＤ４＋  Ｔ細胞は、表面上において、主要な補助刺激分子であるＣＤ２８の発現が欠損している。ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞は、多量のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を放出するとともに、細胞内にパーフォリンおよびグランザイムＢを含み、これらに対して、標的細胞を溶解させる能力を付与する。これらが、クローン化された巨大な集団へと増加すれば、特に、Ｔ細胞の増殖因子が無いときに生じるＢｃｌ−２の下方制御の欠損を引き起こす。ＣＤ２８分子が無い場合、これらの例外的なＣＤ４＋  Ｔ細胞は、別の補助刺激経路を利用する。ＣＤ４＋ＣＤ２８−  Ｔ細胞におけるこれらの機能的な特徴点の幾つかは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を連想させる。
【００１３】
ＮＫ細胞と同様に、ＣＤ４＋ＣＤ２８−  Ｔ細胞は、細胞傷害性であるとともに、ＮＫ細胞レセプター（例えば、ＣＤ９４およびＣＤ１５８）を発現し得る。ＮＫ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と相互作用する多様なレセプターのファミリーによって厳密に制御されており、ＮＫ細胞によって媒介される細胞傷害やサイトカインの生産を制御するシグナルを生じる。ＭＨＣクラスＩによって媒介されるＮＫ細胞の全長レセプターの誘導によって、ＮＫ細胞の細胞溶解活性およびサイトカイン放出を抑制する、ドミナント阻害シグナル（dominant inhibitory signal）が発せられる。これらのレセプターはまた、短くなった細胞内ドメインを有するとともに活性化シグナルを伝達する、高い相同性を有するメンバーを含んでいる。
【００１４】
ＣＯＰＤの重症度を分類するために、スパイロメトリーによるパラメーターが用いられる。これらのパラメーターは、ＣＯＰＤの重症度を４つのステージに分類する（表Ａ参照）。スパイロメトリーは、診断に必要であるとともに、ＣＯＰＤの病理変化の重症度に関する有用な説明を提供する。スパイロメトリーの特定の切点（cut-points）（例えば、気管支拡張薬後（post-bronchodilator）のＦＥＶ１／ＦＶＣ比＜０．７０、または、ＦＥＶ１＜８０、５０または３０％と予想される）が、ＣＯＰＤステージＩ〜ＩＶの決定に用いられる。
【００１５】
表Ａ：スパイロメトリーによるＣＯＰＤの分類（www.goldcopd.comによる）。気管支拡張薬後のＦＥＶ１に基づいた重症度。
【００１６】
【化１】
2011526683.tif 000002
【００１７】
ＦＥＶ１：１秒あたりの努力呼気肺活量；ＦＶＣ：強制肺活量；呼吸不全：海抜ゼロ地点で呼吸を行っている間に、酸素（ＰａＯ２）の動脈血分圧が８．０ｋＰａ（６０ｍｍＨｇ）よりも低く、このとき、ＣＯ２（ＰａＣＯ２）の動脈血分圧が６．７ｋＰａ（５０ｍｍＨｇ）よりも高くても高くなくてもよい。
【００１８】
ＣＯＰＤを系統立てするために用いられ得るＦＥＶ１およびＦＶＣ（表Ａ参照）を決定するための方法は、本技術分野において周知である（例えば、Eaton T, et al. Chest (1999) 116:416-23; Schermer TR, et al. Thorax (2003) 58:861-6; Bolton CE, et al. Respir Med (2005) 99:493-500参照）。
【００１９】
個々の患者におけるＣＯＰＤの影響は、気流の制限の程度のみではなく、症状（特に、息切れ、および、運動能力の低下）の重症度にも依存する。気流の制限の程度と症状との間には、不完全な関連性しか存在しない。ＣＯＰＤに特徴的な症状は、慢性および進行性の呼吸困難、咳、並びに、痰である。慢性的な咳および痰は、何年もかけて、気流の制限へ発展し得る。この様式は、ＣＯＰＤの危険性を有する喫煙者およびその他を特定するため、および、疾患が未だ重篤な健康問題ではないときに介入するための特徴的な機会を提供する。
【００２０】
逆に、重篤な気流の制限は、慢性的な咳および痰を伴うことなく発症し得る。ＣＯＰＤは気流の制限に基づいて規定されているが、実際の医療的な救済を求めるための決定および、施されるべき診断の決定）は、通常、患者のライフスタイルにおける特有の症状の影響によって決定される。
【００２１】
ステージＩ：軽度のＣＯＰＤ  −  軽度の気流の制限（ＦＥＶ１／ＦＶＣ＜０．７０；ＦＥＶ１８０％と予測される）によって特徴付けられる。慢性的な咳および痰が生じ得るが、常時ではない。このステージでは、このステージでは、個人は、自身の肺機能が異常であることに通常気付かない。
【００２２】
ステージＩＩ：中程度のＣＯＰＤ  −  悪化した気流の制限（ＦＥＶ１／ＦＶＣ＜０．７０；５０％  ＦＥＶ１＜８０％と予測される）によって特徴付けられ、典型的に悪化した状態（exertion）へ進行する息切れを伴う。時々、咳および痰を伴う。呼吸器の症状が慢性化する、または疾患が悪化するために、ステージＩＩでは、典型的に患者が治療を求める。
【００２３】
ステージＩＩＩ：重度のＣＯＰＤ  −  更に悪化した気流の制限（ＦＥＶ１／ＦＶＣ＜０．７０；３０％  ＦＥＶ１＜５０％と予測される）、更なる息切れ、運動能力の低下、倦怠感、および繰り返される悪化によって特徴付けられ、これらはほとんど常に、患者のクオリティーオブライフに影響を及ぼす。
【００２４】
ステージＩＶ：極めて重度のＣＯＰＤ  −  重度の気流の制限（ＦＥＶ１／ＦＶＣ＜０．７０；ＦＥＶ１＜３０％と予測される、または、ＦＥＶ１＜５０％と予測される、それに加えて、慢性的な呼吸不全が存在する）によって特徴付けられる。呼吸不全は、海抜ゼロ地点で呼吸を行っている間に、Ｏ２（ＰａＯ２）の動脈における分圧が８．０ｋＰａ（６０ｍｍＨｇ）未満であると規定され、このとき同時に、ＣＯ２（ＰａＣＯ２）の動脈における分圧が６．７ｋＰａ（５０ｍｍＨｇ）よりも高くても高くなくてもよい。呼吸不全は、肺性心（cor pulmonale）のような心臓にも影響を及ぼし得る（例えば、右心不全）。肺性心の臨床的徴候には、頚静脈圧の上昇、および足首の浮腫の形成が含まれる。たとえＦＥＶ１が３０％よりも高いと予測されたとしても、これらの症状が存在するときはいつでも、患者は、ステージＩＶつまり極めて重度のＣＯＰＤである。このステージでは、クオリティーオブライフが、非常に顕著に損なわれ、症状の悪化が、生命を脅かし得る。
【００２５】
本明細書に用いられる用語「ＣＯＰＤを患う危険に曝される（at risk to develop COPD）」は、危険な環境に曝されている個人、または、ＣＯＰＤを患う遺伝性素因を有し得る個人の集団を意図する。ＣＯＰＤの形成に関与する要因には、遺伝性素因、煙草の煙のような粒子への曝露、職業的なほこり（有機または無機）、通気の悪い住居内でバイオマスを用いて暖房または調理を行うことによる屋内空気の汚染、屋外の大気汚染、肺の成長および発達、酸化的ストレス、性別、年齢、呼吸器感染、社会的地位、栄養、ならびに、併存疾患が含まれる。ＣＯＰＤを患う危険に曝されているヒトは、慢性的な咳、慢性的な痰、および、通常のスパイロメトリーに苦しめられる。しかしながら、これらの症状に苦しめられているヒトは、必ずしも、ＣＯＰＤステージＩへ進むわけではない。
【００２６】
本明細書において用語「健康な被験者（human subjects）」または「健康なヒト」は、ＣＯＰＤ、または、あらゆる別の肺疾患を患っていないヒトを意図する。更に、これらの個人は、その生涯の中で、あらゆる重篤な肺疾患を患っていない。「健康なヒト」には、定期的に危険因子（例えば、煙草、または、別の有害物質）に曝露されるヒトも含まない。
【００２７】
本発明によれば、「健康なヒト」におけるマーカーの量は、少なくとも、５人、１０人、１５人または２０人の「健康なヒト」における当該マーカーを定量することによって決定される。
【００２８】
被験者の試料は、好ましくは、血液であり、更に好ましくは、ヘパリン添加血液である。
【００２９】
ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量を決定するために、好ましくは、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ２８抗体が用いられる。抗体を使用すれば、表面にＣＤ４およびＣＤ２８のような抗原を発現している細胞を、特異的に検出したり、任意に定量したりすることができる。
【００３０】
本明細書において用語「抗体」は、抗原に結合することが可能な、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはこれらの断片を意図する。別の抗体および抗体の断片（例えば、組み換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＦａｂまたはＦｖ断片のような抗体の断片、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって選択される断片、など）も、本明細書に記載された方法に用いることが可能である。
【００３１】
ポリクローナル抗体と同様に、モノクローナル抗体を準備する方法は、よく確立されている（Harlow E. et ah, 1988. Antibodies. New York: Cold Spring Harbour Laboratory）。ポリクローナル抗体は、標準的な免疫方法および採血方法を用いて、様々な種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダ、ウマなどを挙げることが可能であるが、これらに限定されない）内で作製される。高力価の動物血液は、通常の選択的な塩析処置（例えば、硫酸アンモニウムを用いた沈殿法）によって分画される。そして、標準的な方法に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムおよびｌｅｐｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いた連続したアフィニティークロマトグラフィーによって、特定の免疫グロブリン画分が得られる。精製されたポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と同様に、特異性が特定される。このような特徴付けは、トレーサーが付加されたタンパク質を用いる標準的な方法（例えば、抗体結合に拮抗する、非ラベル化された潜在的な交差反応物の増加する濃度と競合する、放射性同位体またはビオチン）によって行われる。更に、別の標準的な方法（例えば、還元条件下または非還元条件下における、よく確立されているドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、および、ウエスタンブロット法）によって、結合試験が行われる。
【００３２】
モノクローナル抗体は、よく確立された標準的な実験方法にしたがって作製することができる（"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" by P. Tijssen (hi Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Eds: R.H. Burdon and P.H. van Kinppenberg; Elsevier Publishers Biomedical Division, 1985)）。当該実験方法は、KohlerおよびMilsteinの方法（Kohler G., Milstein C. Nature 256:495, 1975）に基づいている。当該方法では、免疫された動物から脾臓細胞を取り出した後に、骨髄腫細胞と融合さるか、または、ＥＢウイルス（Epstein-Barr virus）によって形質転換することによって、抗体生産細胞を不死化させる。その後、所望の抗体を発現しているクローンが、スクリーニングされる。当該分野において周知である他の方法を用いることも可能である。抗体はまた、当業者に周知である別の方法（例えば、特定のＤＮＡを免疫する方法であるが、当該方法に限定されない）によっても作製され得る。
【００３３】
ＣＤ４およびＣＤ２８へ特異的に結合する抗体は、好ましくは、フローサイトメトリーに用いられ、特に、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）に用いられ、これによって、試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量が決定される。上記抗体は、表面にＣＤ４および／またはＣＤ２８を発現しているラベル化された細胞に対して用いられる。
【００３４】
フローサイトメーター内のラベル化された細胞を検出するために、ＣＤ４およびＣＤ２８へ結合する上記抗体は、好ましくは、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、ＧＦＰ、ＣＦＳＥ、ＣＦＤＡ−ＳＥ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ＰＥ−Ｃｙ５（ＴＲＩ−ＣＯＬＯＲ）、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＩ、ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ、または、ＡＰＣ−Ｃｙ７が付加されている。
【００３５】
ＣＯＰＤを診断するため、または、ＣＯＰＤを患う危険性を診断するためには、それよりも高いまたは低ければ疾患を診断することができる基準点（cut-off levels）を規定することが有利である。本発明の好ましい実施形態によれば、健康な被験者におけるＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量は、全ＣＤ４＋細胞の２．５％よりも低く、より好ましくは２．３よりも低く、更には、１．７％よりも高く、より好ましくは１．８％よりも高い。全ＣＤ４＋細胞に対するＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量は、健康な被験者において、１．７％〜２．５％の範囲で変化する。
【００３６】
全ＣＤ４＋  Ｔ細胞の数は、周知の方法によって決定される。本発明の別の好ましい実施形態によれば、ＣＯＰＤを患う危険性は、健康なヒトのＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量と比較して、試料内のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量が、少なくとも１０％好ましくは少なくとも２０％減少した場合に診断される。勿論、試料内のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量は、また、少なくとも１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％にまで減少し得る。特に好ましい実施形態によれば、ＣＯＰＤを患う危険性があるヒトにおけるＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量は、全ＣＤ４＋細胞の数の０．８％〜１．６％（好ましくは、０．９％〜１．５％、および、１％〜１．４％）である。
【００３７】
更に好ましい実施形態によれば、ＣＯＰＤを患っているヒトにおけるＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量は、全ＣＤ４＋細胞の２．７％よりも多く、好ましくは２．８％よりも多く、更に好ましくは３％よりも多い。
【００３８】
本発明の方法は、他の生物（例えば、ウマ、イヌ、ネコ、またはウシ）へも適用し得る。
【００３９】
本発明の別の態様は、被験者におけるＣＯＰＤステージＩ／ＩＩIとＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶとを区別するための方法であって、
−ＣＯＰＤを患っている被験者から試料を調製する工程と、
−上記試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量を決定する工程と、
−上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量が、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶを患っている被験者に由来する試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量と比較して減少している場合に、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩが診断される工程、または、上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量が、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩを患っている被験者に由来する試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量と比較して増加している場合に、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶが診断される工程と、を有する方法に関する。
【００４０】
本明細書に開示されているＣＯＰＤマーカーは、既に規定したＣＯＰＤステージＩ／ＩＩを患っている被験者と、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶを患っている被験者とを区別することにも適している。これらのＣＯＰＤステージを区別することは、治療法を決定する上で重要である。例えば、幾つかの症状または断続的な症状（ステージＩおよびＩＩ）を示している患者では、短時間で作用する吸入用の気管支拡張薬を用いれば、十分に呼吸困難を制御できる。吸入用の気管支拡張が利用できない場合には、徐放性のテオフィリンを用いた通常の処置を施すことを考慮すべきである。短時間で作用する気管支拡張薬によって必要に応じて処置したにもかかわらず、日々の活動時の呼吸困難が緩和されないヒトに関しては、長期間効果がある吸入用の気管支拡張薬による通常の処置を施す必要がある。ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶを患っているヒトでは、吸入用のグルココルチコステロイド（glucocorticosteroids）を用いた通常の処置によって、症状の悪化の程度が減少するとともに、健康状態が改善する。これらのヒトでは、吸入用のグルココルチコステロイドを用いた通常の処置が、長期間効果がある吸入用の気管支拡張薬に加えられるべきである。ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶを患っているヒトにおいて、慢性的な呼吸不全が生じる場合には、外科治療および／または長期間の酸素処置（long term oxygen）を施すことを検討すべきである。
【００４１】
ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩとＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶとを区別することができる基準値は、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩおよびＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶを各々患っているヒトから得られた試料のプール（pool）の中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量を決定することによって、見積もられ得る。このようなプールは、少なくとも５人、好ましくは少なくとも１０人、より好ましくは少なくとも２０人のＣＯＰＤを患っているヒトであって、別の方法（例えば、スパイロメトリー）によって様々なＣＯＰＤステージが診断されているヒトから得られる試料を含み得る。上述したように、全ＣＤ４＋細胞に対するＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の量は、被験者において、１．７％〜２．５％の範囲で変化し得る。ＣＯＰＤを患う危険性があるヒトは、全ＣＤ４＋  Ｔ細胞の０．８％〜１．６％のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞を含む。ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩを患っているヒトは、全ＣＤ４＋  Ｔ細胞の２．７％〜４．５％（好ましくは、２．８％〜４．３％）のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞を含む。ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶを患っているヒトは、全ＣＤ４＋  Ｔ細胞の５％〜１２％（好ましくは、６％〜１０％）のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞を含む。
【００４２】
本発明の別の実施形態では、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩは、ＩＮＦ−γの量を決定することによって、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶと区別され得る。
【００４３】
本発明の更なる態様は、被験者における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の進行を観察するための方法であって、
−被験者から試料を調製する工程と、
−上記試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量を決定する工程と、
−上記被験者の上記試料中の上記ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量と上記被験者の以前の試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量とを比較する工程と、を有する方法、に関する。
【００４４】
本明細書中に開示されているマーカーは、ＣＯＰＤの進行、およびＣＯＰＤの治療の進行を観察するためにも用いられ得る。このような方法は、異なる時間間隔でヒトから採取した試料中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の量を比較することを包含する。上記方法によって得られた結果は、医者が適切な治療を設定することを可能にする。
【００４５】
以下の図面および実施例によって本発明を更に説明するが、本発明は、これらに限定されない。
【００４６】
図１は、末梢血流中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の割合を示している。結果は、ｍｅａｎ＋／−ＳＥＭにて示されている。
【００４７】
図２は、補助刺激ＣＤ２８（co-stimulatory CD28）を有しておらず、細胞内の細胞溶解性タンパク質であるパーフォリン（ａ）およびグランザイムＢ（ｂ）が抑制されている、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の部分集合を示している。結果は、ｍｅａｎ＋／−ＳＥＭにて示されている。
【００４８】
図３は、ＮＫ細胞レセプターであるＣＤ９４およびＣＤ１５８の細胞表面における発現が著しく増加したＣＤ４／ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞を示している。結果は、ｍｅａｎ＋／−ＳＥＭにて示されている。
【００４９】
図４は、ＣＤ４＋におけるＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌの割合（％）と、ＦＥＶ１％、ＭＥＦ５０％、または、ＭＥＦ２５％との関係を示すスキャッチャープロット（scatterplots）を示している。スピアマンの相関係数（Spearman’s correlation coefficients）およびｐ値（p-values）が得られる。
【００５０】
図５は、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌの割合の測定結果に基づいた、喫煙者の部分集合においてＣＯＰＤを予測するためのＲＯＣ曲線を示している。
【００５１】
〔実施例〕
〔実施例１〕
〔材料および方法〕
〔患者〕
少なくとも４０歳である合計６４人のボランティアが、この試験に参加した。健康な非喫煙者（ｎ＝１５）、健康な喫煙者（ｎ＝１４）、ＧＯＣＤ診断基準でＣＯＰＤＩおよびＩＩと判定される喫煙者（ｎ＝１９）、および、ＧＯＣＤ診断基準でＣＯＰＤＩＩＩおよびＩＶと判定される喫煙者（ｎ＝１６）２３が、募集された。試験開始前１４日以内に、ＷＨＯおよびGlobal Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease（ＧＯＬＤ）（Global Strategy for Diagnosis, Management, and Prevention of COPD. Global Initiative FOR Chronic Obstructive Lung Disease, 2007, www.goldcopd.com）のガイドラインによって急性増悪期（acute exacerbation）であると判定されたＣＯＰＤの患者は、除外された。喘息、自己免疫疾患、または、他の関連した肺疾患（例えば、肺癌、周知のａ１−抗トリプシン欠乏症）を患った経験がある者も、除外された。更に、全ての患者は、周知の冠動脈疾患、末梢動脈障害および頚動脈疾患を患っていない者であった。身長および体重（Seca; Vogel and Halke, Germany）が測定され、肥満度指数（ＢＭＩ）が決定された。同じ型のスパイロメーター（AutoboxV6200, SensorMedics, Austria）を用いて、肺機能（ＦＥＶ１、ＦＶＣ、およびＦＥＶ１／ＦＶＣ比率）が測定された。気道閉塞の基準に合致した場合には、２００μｇのサルブタモールを吸入する前、および、吸入して１５分〜３０分後に、測定を行った。室内の空気を呼吸しながら座って安静している状態で、動脈血ガス（ＰａＯ２、ＰａＣＯ２）が得られた。動脈血ガスの測定は、ＡＢＬ  ５１０  ｇａｓ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Radiometer, Denmark）を用いて行った。European Community for Steel and Coal prediction equations（Quanje PH et al. Eur Respir J Suppl 16 (1993): 5-40）に従って、絶対値として、並びに、年齢、性別および身長に基づく予測値の割合として、結果を示した。通常の予測値は、Austrian Society of Pulmonary Medicine（Harnoncourt K et al. Osterreich. Arztetg. 37 (1982): 1640-1642）の基準値に由来するものであった。
【００５２】
〔フローサイトメトリー解析〕
ヘパリン添加血液試料を、蛍光色素によって標識された抗体と共に、氷上にてインキュベートした。抗体のインキュベーションに先立って、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Becton Dickinson, Becton Drive, Franklin Lakes, New Jersey, USA）を加えることによって、赤血球を溶解した。次いで、ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ４（BD Biosciences Pharmingen, USA）、ＰＥにて標識した抗ＣＤ１５８（R&D Systems, USA）、ＰＥ−Ｃｙ５にて標識した抗ＣＤ２８（Biolegend, USA）、および、ＰＥを結合した抗ＣＤ９４（eBioscience, USA）の様々な組み合わせを用いて、細胞を染色した。染色された細胞を、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ  ５００  フローサイトメーター（Beckman Coulter, USA）を用いて解析した。細胞内の染色には、ＰＥを結合した抗パーフォリン抗体および抗グランザイムＢ抗体（BD Biosciences Pharmingen, USA; Serotec, Germany）を用い、サポニン溶液を用いて細胞膜の透過化（permeabilization）を行った後で、これらの抗体と前染色された細胞とをインキュベートした。
【００５３】
〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）〕
全血を遠心分離処理した後で得られる血清試料中のＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０を定量するために、ＥＬＩＳＡ法（BenderMedSystems, Austria）を用いた。
【００５４】
特定の抗原を認識するモノクローナル抗体を用いて９６穴プレートをコーティングし、4℃にて朝までインキュベートした。洗浄した後、アッセイ用のバッファーを用いて、２時間、プレートをブロッキング（blocked）した。更に洗浄した後、試料と、抗原の濃度が規定されている基準物質（standards）とを、製造者（manufacturer）が記載しているようにインキュベートした。次いで、プレートを洗浄するとともに、酵素が結合したポリクローナル抗体を用いてインキュベートした。適切な回数のインキュベーションおよび更なる洗浄の後、ＴＭＢ基質溶液を加えた。次いで、Ｗａｌｌａｃ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ  １４２０（PerkinElmer, USA）を用いて、発色を観察した。得られた光学濃度（Ｏ．Ｄ．）の値を、既知の濃度の抗原を用いて作製した基準物のＯ．Ｄ．値から算出された標準曲線と比較した。
【００５５】
〔新鮮に調製された末梢血単核細胞の刺激〕
新鮮に調製された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、標準的なフィコール密度勾配遠心分離法によって分離した。次いで、ＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、当該細胞の数を数えた。そして、当該細胞を、９６穴の平底プレートへ、１つの穴あたり、１×１０５細胞／２００μＬの無血清のＵｌｔｒａ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Cambrex Corp., USA）、となるように移した。なお、上記Ｕｌｔｒａ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍは、０．２％のゲンタマイシン硫酸塩（Sigma, USA）、０．５％のβ−メルカプト−エタノール（Sigma, USA）、および１％のＬ−グルタミン（Sigma, USA）を含んでいる。抗ＣＤ３（ＣＤ３）（１０μｇ／ｍＬ）またはフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）（７μｇ／ｍＬ）を加えた後、当該プレートを、１８時間、加湿された雰囲気下（５％  ＣＯ２、３７℃）へ移した。上清を採取して、−２０℃にて保存した。
【００５６】
〔上清中のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２の定量〕
上述したように、刺激された細胞の上清中のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２の定量は、ＥＬＩＳＡ法（BenderMedSystems, Austria）を用いて行った。
【００５７】
〔統計学的な方法〕
母数によらないウイルコクソン検定（non-parametric Wilcoxon tests）を用いて、健康な非喫煙者、健康な喫煙者、ＣＯＰＤ  ＩおよびＩＩの患者、並びに、ＣＯＰＤ  ＩＩＩおよびＩＶの患者の間で、主要な評価項目であるＣＤ４＋におけるＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌの割合に関する二つ一組の比較を行った。複数の試験（６つのグループの比較）を調整するために、更に、６つの比較の間のファミリーワイズエラーレート（family wise error rate）を制御するための、母数によらないＮｅｍｅｎｙｉ−Ｄａｍｉｃｏ−Ｗｏｌｆｅ−Ｄｕｎｎ（ＮＤＷＡ）試験を行った（新しいＲパッケージにおける、機能の一方向試験（function one-way-test in the coin R-package））。各群において、平均のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌの割合に関する、パラメーター９５％信頼区間を算出した。ｅｘ  ｖｉｖｏのＣＤ３およびＰＨＡにおいて、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２についてグループ間で比較するために、ＮＤＷＤ試験を用いた多重度解析（the multiplicity adjusted analysis with the NDWD-test）が報告される。スピアマンの相関係数（spearman’s correlation coefficient）を用いて、血清のサイトカイン濃度と肺機能のパラメーターとの相関関係を算出した。
【００５８】
スピアマンの相関係数を用いて、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の割合と、肺活量のＦＥＶ１％、ＭＥＦ５０％の予測値、およびＭＥＦ２５％の予測値との相関関係を見積もった。ウイルコクソンの符号付き検定（Wilcoxon Signed Rank tests）を用いて、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞とＣＤ４＋ＣＤ２８＋細胞との間で、パーフォリン、グランザイムＢの流行率（prevalence）およびＣＤ９４、ＣＤ１５８の発現を比較した。更に、各変数の平均率のパラメーター９５％信頼区間（parametric 95% confidence intervals）が与えられる。
【００５９】
喫煙者の部分集合において、変数ＣＯＰＤ（ｙｅｓ／ｎｏ）に依存するとともに変数ＣＤ４ＣＤ２８ｎｕｌｌ％に依存せずに、ロジスティック回帰を行った。異常値を明らかにするために、当該解析では、上記割合の平方根（square root）を用いた。ＣＤ４ＣＤ２８ｎｕｌｌの割合の予測能力（predictive capacity）を評価するために、そのＡＵＣを用いて、ＲＯＣ曲線を算出した。
【００６０】
〔結果〕
〔試験された患者の人口統計学上の特徴〕
患者の人口統計学上の特徴を表１および２に示す。健康な非喫煙者、健康な喫煙者、ＧＯＬＤで分類されたＣＯＰＤ  ＩおよびＩＩ、ＧＯＬＤで分類されたＣＯＰＤ  ＩＩＩおよびＩＶが含まれる。全てのグループにおいて、類似した数の患者が含まれており、年齢および性別も同様に分布している。
【００６１】
表１：臨床上の特徴点（気道閉塞の重症度は、肺機能試験（ＬＦＴ）を用いて、全ての被験者について決定された；ＣＯＰＤの患者は、ＧＯＬＤによるＣＯＰＤの診断基準に合った患者であった）。データは、言及しない限り、平均値（mean）にて示されている。
【００６２】
【表１】
2011526683.tif 000003
【００６３】
（略記：ＣＯＰＤ  −  Chronic Obstructive Pulmonary Disease；ＦＶＣ  −  Forced Vital Capacity；ＦＥＶ１  −  １秒あたりの努力呼気肺活量（Forced Expiratory Volume in 1 second）；ＭＥＦ  ＝  Maximal Expiratory Flow；ＳＤ  −  Standard Deviation）
【００６４】
表２：全ての被験者に関する臨床上の特徴点および喫煙状況。データは、言及しない限り、平均値（mean）にて示されている。（ＳＤ  −  standard deviation）
【００６５】
【表２】
2011526683.tif 000004
【００６６】
〔ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞は、ＣＯＰＤを患っている患者において増加する〕
慢性閉塞性肺疾患を患っている患者にてＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞が増加しているか否かを試験するために、多重染色フローサイトメトリーを用いて血液試料を検査した。図１および表４は、全ＣＤ４＋細胞中のＣＤ4＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の割合を示している。ＣＯＰＤ  ＩＩＩおよびＩＶのグループは、健康な非喫煙者および健康な喫煙者のグループと比較して、著しく数値が上昇していた（Wilcoxon test: p=0.012, p=0.002）。加えて、ＣＯＰＤ  ＩおよびＩＩのグループと健康な喫煙者のグループとの間に、著しい差異が観察された（Wilcoxon test: p=0.046）。多重度を修正した後では（after correcting for multiplicity）、ＣＯＰＤ  ＩＩＩおよびＩＶのグループと健康なグループとの間の差異のみが著しい。
【００６７】
〔刺激されていないＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞は、細胞溶解性タンパク質であるパーフォリンおよびグランザイムＢを含む〕
ＣＤ４＋細胞内における、細胞溶解性タンパク質であるパーフォリンおよびグランザイムＢの細胞質内の含有量（intra-cytoplasmic content）を調べるために、サポニン溶液と共にインキュベートして細胞内を染色した後で、フローサイトメトリーにて血液試料を解析した。パーフォリンの含有量は、ＣＤ４＋ＣＤ２８＋細胞と比較して、ＣＤ4＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞において、より優勢であった。図２（ａ）。（４６．１３％［３９．３４−５２．９１］対４．６８％［３．０４−６．３２］、ｐ＜０．００１；全、平均値（mean）［９５％  ＣＩ］）ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の細胞内におけるグランザイムＢの陽性染色（positive staining）は、ＣＤ４＋ＣＤ２８＋細胞よりも、頻度が高かった。図２（ｂ）。（７８．６３％［７２．６５−８４．６１］対２．３６％［１．６３−３．１１］、ｐ＜０．００１；全、平均値（mean）［９５％  ＣＩ］）。
【００６８】
〔ＣＤ4＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞上における、ナチュラルキラー細胞レセプターの増加〕
ＣＤ４＋細胞の表面上のＣＤ９４およびＣＤ１５８の発現を評価するために、フローサイトメトリー解析を行った。図３（ａ）〜図３（ｂ）は、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞における、表面抗原であるＣＤ９４およびＣＤ１５８の発現の増加を示している。（ＣＤ９４、１０．００％［６．０４−１３．９７］対１．４１％［０．８５−１．９７］、ｐ＜０．００１；ＣＤ１５８、９．３５％［６．２２−１２．４７］対２．００％［１．６１−２．３９］、ｐ＜０．００１；全、平均値（mean）［９５％  ＣＩ］）。
【００６９】
〔スパイロメトリーの通常のパラメーターと負に相関する（correlates negatively）ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の割合〕
我々のフローサイトメトリーのデータと通常の臨床データとを照合するために、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌの割合を、肺活量のＦＥＶ１、ＭＥＦ５０％の予測値、および、ＭＥＦ２５％の予測値と関連付けた。全てのパラメーターが、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の割合と、統計学的に極めて負の相関を示した。（スピアマンの相関係数：ＦＥＶ１％、Ｒ＝−０．４９、ｐ＜０．００１；ＭＥＦ５０％、Ｒ＝−０．４０、ｐ＝０．００１；ＭＥＦ２５％、−０．３８、ｐ＝０．００２）。図４（ａ）〜図４（ｃ）。
【００７０】
〔喫煙者のＣＯＰＤにおけるＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の割合の予測能力（Prediction Capacity）〕
喫煙者の部分集合に対するロジスティック回帰分析において、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の独立変動率（independent variable percent）は、ＣＯＰＤと非常に関連があることを示した（ｐ＝０．０１２）。対応するＲＯＣ曲線（図５）は、ＡＵＣ＝０．７６の曲線の下側に領域（area）を有している。
【００７１】
〔血清のサイトカイン濃度（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０）と、ＦＥＶ１％、ＭＥＦ５０％、ＭＥＦ２５％との相関〕
表３は、血清サイトカインであるＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０と、通常の肺機能パラメーターとの、母数によらない相関関係を示している。
【００７２】
表３：血清サイトカイン濃度と肺機能試験のパラメーターとの相関。係数（coefficients）およびｐ値（p-values）は、本実施例に加わった全ての患者について算出された。
【００７３】
【表３】
2011526683.tif 000005
【００７４】
〔ＣＯＰＤの初期のステージを患っている患者の刺激を受けたＰＢＭＣｓは、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、増加した量のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを生産する〕
末梢血単核細胞の機能的な活性を調べるために、リンパ球特異的な抗ＣＤ３およびフィトヘムアグルチニン（phytohemagglutinin）を用いて、ブラストジェネシス  アッセイ（blastogenesis assay）を行った。当該アッセイは、５人の患者のみが含まれるＣＯＰＤ  ＩＩＩおよびＩＶを除いて、１グループについて７人の患者に対して行った。表４に、グループ平均値（Groupwise mean）および９５％信頼区間を示す。
【００７５】
表４：表４は、末梢血流中のＣＤ4＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の割合を示している。更に、抗ＣＤ３またはＰＨＡよる刺激を受けたＰＢＭＣの上清中のサイトカインの発現が示されている。全てのデータは、平均値として記載されている。
【００７６】
【表４】
2011526683.tif 000006
【００７７】
ＣＯＰＤ  ＩおよびＩＩを患っている患者の上清では、健康な喫煙者と比較して、ＩＦＮ−γの濃度が著しく増加しており（ＮＤＷＤ試験：ＣＤ３：ｐ＝０．０４９；ＰＨＡ：ｐ＝０．０６２）；健康なグループにおける濃度、ならびに、ＣＯＰＤ  ＩＩＩおよびＩＶを患っている患者のグループにおける濃度は、ＣＯＰＤ  ＩおよびＩＩを患っている患者のグループと比較して、低いものの、顕著な相違はなかった。残りの二つ一組の比較中には、統計的に有意なものはなかった。
【００７８】
ＣＯＰＤ  ＩおよびＩＩのグループは、健康な喫煙者（ＮＤＷＤ試験：ｐ＝０．００１）および非喫煙者（ＮＤＷＤ試験：ｐ＝０．０４７）と比較して、ＴＮＦ−α（ＰＨＡ）の濃度が著しく上昇しており、ＣＯＰＤ  ＩＩＩおよびＩＶの患者（ＮＤＷＤ試験：Ｐ＝０．０５４）と比較して、濃度がわずかに上昇していた。残りの二つ一組の比較中には、統計的に有意なものはなかった。ＴＮＦ−α（ＣＤ３）については、グループ間に顕著な差異は観察されなかった。ＩＬ−１２（ＰＨＡ）については、他のグループと比較して、ＣＯＰＤ  ＩおよびＩＩのグループにおいて、より濃度が高かった。しかしながら、ＣＯＰＤ  ＩＩＩおよびＩＶのグループに対する差異のみが、統計的に有意であった。ＩＬ−１２（ＣＤ３）の濃度は、グループ間の相違において有意ではなかった。
【００７９】
〔結論〕
血液中を循環しているリンパ球およびそれらの部分集合の全数は、厳密なホメオスタティック  コントロール（homeostatic control）の下にある。この実施例は、ＣＯＰＤを患っている患者が、機能的に異なる、および表現型の上で異なるＣＤ４＋  Ｔ細胞の部分集合の存在に重大な変化を有していることを示した。補助刺激ＣＤ２８を有していないこと、および、細胞溶解性タンパク質であるグランザイムＢおよびパーフォリンを細胞内に蓄えていることによって特徴付けられるＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンは、たとえ喫煙を止めた後であっても、ＣＯＰＤ患者における継続した組織の炎症状態の原因になり得る。ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  クローンタイプによって他のＣＤ4＋  Ｔ細胞が置き換えられる基本的なメカニズムは、完全には理解されていない。しかしながら、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の表現型の解析および機能解析は、これらが、ＮＫ細胞と関係しており、ＮＫ様Ｔ細胞２６（NK-like T-cells 26）の集団を形成することを示している。ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞が、ＩｇスーパーファミリーであるＭＨＣクラスＩ認識レセプター（ＣＤ９４、ＣＤ１５８）を発現することが見出された。本データは、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞が、ＮＫ細胞と多数の特徴点を共有しており、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞が、先天性免疫の機能特性と適応免疫の機能特性とを兼ね備え得ることを裏付けている。
【００８０】
関連する免疫機能を検証するために、試験されたグループの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離して、当該細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、特異的および非特異的なＴ細胞刺激によって活性化した。ＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  ＩおよびＩＩに由来する組織の白血球では、対照と比較して、マクロファージおよび樹状細胞の活性を増加させることが知られているサイトカインであるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌量が増加することが証明され得る。この観察結果は特に興味深い。というのも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるこの現象は、疾患の進行における初期のステージ（ＧＯＬＤステージＩおよびＩＩ）にある患者でのみ観察され、このことは、ＮＫ様Ｔ細胞が、初期の肺組織破壊の誘発に特定の役割を果たしていることを示している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける当該発見は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ１０の血中濃度が、最近悪化していないＣＯＰＤ患者において上昇しているか否か検討することを可能にする。しかしながら、これらのタンパク質は、スパイロメトリーのパラメーターの悪化に伴って増加するわけではない。それ故に、組織のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞クローンの存在がＣＯＰＤの診断に関係があるか、検討された。ロジスティック回帰分析が行われ、当該ロジスティック回帰分析は、組織のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞の存在によって、高い確率でＣＯＰＤを診断できることを可能にした。
【００８１】
どんな競合機構がＣＯＰＤの原因であろうとも、ＣＯＰＤにおける組織の慢性炎症の存在は、様々な共存する病的状態（co-morbidities）（例えば、悪液質、骨粗鬆症、および心疾患）と関連している。ＣＯＰＤを患っている患者の半分よりも多い人が心臓血管が原因で死亡することから、ＣＯＰＤと心疾患とは、とりわけ密接に関連している。不安定狭心症（ＵＡ）を患っている患者が、安定狭心症（ＳＡ）を患っている患者と比較して、増加したＩＦＮ−γ生産に対するバイアス（bias）を有する、機能的なＴ細胞のレパートリー（ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ）の不安定性（perturbation）によって特徴付けられることも、優れた試験によって示されている。ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞が、ＵＡを患っている患者の血液中、および、不安定なプラークを含む冠状動脈に由来する抽出物中に見出されるという事実は、ＵＡにおいて循環しているＣＤ２８欠損ＣＤ４＋細胞の増加が、組織の炎症の維持のみならず、アテローム性動脈硬化症および組織の変性において病理的役割を果たしていることを示唆している（恐らくは、プロ炎症性サイトカインを高濃度に合成することによる）。興味深いことに、このことに直接関連して、関節リウマチ（ＲＡ）を患っている患者では、臨床前のアテローム硬化性の変化（動脈内皮機能不全および頚動脈壁肥厚を含む）に直接関与する、循環しているＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ  Ｔ細胞が増加していることが見出されている。Ｔ細胞のプール（pool）の不安定性の観察は、ＣＯＰＤにおいて以前から観察されている長期間の心血管系の危険（long-term cardiovascular risk）の説明に関係があるかもしれない。
【００８２】
慢性的な抗原への露出（例えば、煙草の煙の含有物を介する）は、潜在的に遺伝的に影響を受け易い患者のＴ細胞において、ＣＤ２８を消失させるとともに、ＮＫ細胞レセプターの発現を上させる。当該誘導された免疫の老化（immunological senescence）は、Ｂｃｌ−２のようなシグナルによって誘導されるアポトーシスの制御異常を伴い、細胞傷害性のＴ細胞が長生きすることが助長されるとともに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＴ細胞が誘発するＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌が増加される。しかしながら、何故に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−α生産の増加が、Ｔ細胞特異的な誘発後に、ＣＯＰＤ  ＩおよびＩＩにおいてのみ明らかになったのかは明らかではないままである。これらのデータから、何故にＣＯＰＤ患者における喫煙の中止が、肺組織における炎症プロセスに基づく進行性細胞（progressive cell）を完全には減少できないのか、明らかであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】末梢血流中のＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞の割合を示している。
【図２ａ】補助刺激ＣＤ２８（co-stimulatory CD28）を有しておらず、細胞内の細胞溶解性タンパク質であるパーフォリンが抑制されている、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の部分集合を示している。
【図２ｂ】補助刺激ＣＤ２８（co-stimulatory CD28）を有しておらず、細胞内の細胞溶解性タンパク質であるグランザイムＢが抑制されている、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の部分集合を示している。
【図３ａ】ＮＫ細胞レセプターであるＣＤ９４の細胞表面における発現が著しく増加したＣＤ４／ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞を示している。
【図３ｂ】ＮＫ細胞レセプターであるＣＤ１５８の細胞表面における発現が著しく増加したＣＤ４／ＣＤ２８ｎｕｌｌ細胞を示している。
【図４ａ】ＣＤ４＋におけるＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌの割合（％）と、ＦＥＶ１％との関係を示すスキャッチャープロット（scatterplots）を示している。
【図４ｂ】ＣＤ４＋におけるＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌの割合（％）と、ＭＥＦ５０％との関係を示すスキャッチャープロット（scatterplots）を示している。
【図４ｃ】ＣＤ４＋におけるＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌの割合（％）と、ＭＥＦ２５％との関係を示すスキャッチャープロット（scatterplots）を示している。
【図５】図５は、ＣＤ４＋ＣＤ２８ｎｕｌｌの割合の測定結果に基づいた、喫煙者の部分集合においてＣＯＰＤを予測するためのＲＯＣ曲線を示している。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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