(57)【要約】網膜色素上皮(ＲＰＥ)障害に関連する疾患または障害の治療方法であって、そのような治療方法を必要とするヒトに有効量の黒大豆 (Glycine max (L.) Merr) 産物を投与することを含んでなり、黒大豆産物が黒大豆の種皮、または黒大豆のもしくは黒大豆種皮のアルコール抽出物である、治療方法を提供する。
2011513316.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜色素上皮(ＲＰＥ)障害に関連する疾患または障害の治療方法であって、そのような治療方法を必要とするヒトに有効量の黒大豆(Glycine max (L.) Merr)産物を投与することを含んでなる治療方法。
【請求項２】
必要とするヒトにＲＰＥの機能を高めるのに有効な量の黒大豆産物を投与することを含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
黒大豆産物がＲＰＥの食作用の能力の増大に有効である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
網膜色素上皮に関連する疾患または障害がＲＰＥの機能障害に関連する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
網膜色素上皮障害に関連する疾患または障害が、網膜剥離、視覚機能の喪失、血管網膜関門漏出である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
網膜色素上皮障害に関連する疾患が、増殖性硝子体網膜症、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性、糖尿病性網膜症、黄斑変性および脈絡膜血管新生である請求項１記載の方法。
【請求項７】
黒大豆産物が液体である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
黒大豆産物が乾燥形態である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
黒大豆産物が黒大豆の種皮、または黒大豆のもしくは黒大豆種皮のアルコール抽出物である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
黒大豆産物が黒大豆の種皮である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
黒大豆産物が、黒大豆のまたは黒大豆種皮のアルコール抽出物である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記アルコール抽出物が、黒大豆のまたは黒大豆種皮のエタノール抽出物である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記エタノール抽出物が、黒大豆を、水に少なくとも１０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有する溶媒で抽出することにより調製される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶媒が水に３５％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
黒大豆産物を経口投与する請求項１記載の方法。
【請求項１６】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）の食作用を高める方法であって、該細胞を有効量の黒大豆(Glycine max (L.) Merr)産物で処置することを含んでなる方法。
【請求項１７】
黒大豆産物が黒大豆の種皮、または黒大豆のもしくは黒大豆種皮のアルコール抽出物である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
黒大豆産物が、黒大豆のまたは黒大豆種皮のアルコール抽出物である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記アルコール抽出物が、黒大豆のまたは黒大豆種皮のエタノール抽出物である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記エタノール抽出物が、黒大豆を、水に少なくとも１０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有する溶媒で抽出することにより調製される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶媒が水に３５％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有する、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（原文に記載なし）
【背景技術】
【０００２】
黒い種皮を有する大豆の一種である黒大豆(Glycine max (L.) Merr)は、長年、健康食品や中国の伝統的な医薬におけるハーブとして利用されており、薬効が長年研究されている。いくつかの中国の医薬書には黒大豆が解毒剤、抗炎症薬および血液栄養素として用いられる旨が記載されている。
【０００３】
特に、黒大豆の植物化学物質は、マウスにおいて移植可能なヒト膀胱癌の増殖および腫瘍の血管新生を阻害し（Zhou JR et al., Cancer Res. 58(22):5231-81999,1998)；抗酸化活性を示す黒大豆は、低比重リポタンパク酸化を減少し、酸化関連疾患の予防に重要な役割を担いうる（Takahashi. R et al, J Agric Food Chem., 53(11):4578-82, 2005)。
【０００４】
網膜色素上皮(ＲＰＥ)は、網膜の表層の単層細胞であり、Bruch膜と光受容体の間に存在する。ＲＰＥの上部の絨毛プロセスは光受容体の外節に結合しており、ＲＰＥの底部の基底陥入はBruch膜を介して脈絡膜と結合している。ＲＰＥは、毒性の物質および脈絡膜と網膜の代謝物を除去または効果的に輸送することができるため、ＲＰＥは血液網膜関門を形成している。さらに、ＲＰＥは、光受容、光刺激により桿状体細胞および錐状体細胞から分離した外節の貪食、ファゴソームの異化、細胞外マトリクスおよびメラニンの合成、薬物の解毒、光受容体の外節の再生に必須な成分の提供、ビタミンＡの貯蔵および輸送、ロドプシンの合成、および網膜の吸着力の形成等の多くの機能を有する (Wenzel et al., Progress in RetinalおよびEye Research 24: 275-306, 2005)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
統計によれば、ラットのＲＰＥは、一日の光刺激による桿状体細胞および錐状体細胞から分離した25000の外節を除去することができ、これは高頻度の食作用代謝の重要性を明白に示している(MayersonおよびHall, The Journal of Cell Biology, 103:299-308, 1986)。ＲＰＥの正常な食作用は網膜における光受容体の健康を維持するために非常に重要な役割を担っている。一旦ＲＰＥの食作用の能力が低下すれば、光受容体の変性が生じる(Wenzel et al., Progress in RetinalおよびEye Research 24: 275-306, 2005)。従って、ＲＰＥ機能を維持することは視覚系にとって非常に重要である。これまでのところ、ＲＰＥ障害に関連する疾患／障害の良好な治療法はない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、黒大豆(Glycine max (L.) Merr)の産物が、食作用の能力等のＲＰＥ機能を高める予想外の効果を有するという発見に基づく。
【０００７】
従って、本発明の一態様は、網膜色素上皮(ＲＰＥ)障害に関連する疾患または障害の治療方法であって、そのような治療方法を必要とするヒトに有効量の黒大豆産物を投与することを含んでなる治療方法に関する。本発明の実施形態では、黒大豆産物は黒大豆の種皮または黒大豆のまたはその種皮のアルコール抽出物である。
【０００８】
本発明の更なる態様は、有効量の上記黒大豆産物で細胞を処置することによりＲＰＥの食作用を高める方法に関する。
【０００９】
本発明の１またはそれ以上の実施形態の詳細は、以下に記載する。本発明の他の特徴または利点は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明と請求の範囲から明らかである。
【００１０】
上記の要旨、並びに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよく理解されるであろう。本発明を説明すること目的として、現在の好ましい実施形態を図面に示す。但し、本発明が、示された具体的な配置や手段に限定されないことは当然理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａおよび図１ＢはＲＰＥの食作用に対する黒大豆抽出物の効果を示す。抽出物（ＢＧ３５Ｅ）は黒大豆を３５％（ｖ／ｖ）エタノールで抽出することにより調製した。*はP＜0.05;**はP＜0.01;***はP＜0.001を示す。
【００１２】
【図２】図２Ａおよび図２ＢはＲＰＥの食作用に対する黒大豆抽出物の効果を示す。抽出物（ＢＧＳＣ３５Ｅ）は黒大豆の種皮を３５％（ｖ／ｖ）エタノールで抽出することにより調製した。*はP＜0.05;**はP＜0.01;***はP＜0.001を示す。
【００１３】
【図３】図３Ａおよび図３Ｂはそれぞれ、黒大豆抽出物（ＢＧＳＣ３５Ｅ）で処置した眼科的欠陥を有するマウスのａ波およびｂ波を示す。ａ波およびｂ波は網膜電図（ＥＲＧ）によって測定した。*はP＜0.05;**はP＜0.01;***はP＜0.001を示す。
【００１４】
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、黒大豆の種皮から調製した黒大豆産物（ＢＧＳＣ）で処置した眼科的欠陥を有するマウスのｂ波を示す。ｂ波はＥＲＧにより測定した。*はP＜0.05;**はP＜0.01;***はP＜0.001を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において用いる以下の用語は、請求の範囲および明細書をよく解釈するために用いられる。
【００１６】
本明細書において用いられる冠詞「a」および「an」は、その冠詞の文法上の対象の１または１以上（即ち、少なくとも１）を意味する。例えば、「an element」は１つのelementまたは１以上のelementである。
【００１７】
本明細書において用いる「黒大豆のアルコール抽出物」なる語は、黒大豆またはその種皮を、アルコールを含有する溶媒（例えば、１０〜１００％（ｖ／ｖ）の濃度でエタノールまたはメタノールを含有する溶媒）で抽出することにより調製された抽出物を意味する。
【００１８】
本明細書において用いられる「網膜色素上皮（ＲＰＥ）」は、網膜視細胞に栄養を与えている神経感覚網膜の直ぐ外側の色素細胞層を意味し、脈絡膜の下と網膜視細胞の上に強固に接着している。ＲＰＥは、色素顆粒が密に詰まった六角形の細胞の単層からなり、１日につき約３０〜１００ディスクの回転率で、廃棄されたディスクの貪食および消化が行なわれている。
【００１９】
本明細書において用いる「網膜色素上皮の障害に関連する疾患または障害」なる用語は、ＲＰＥの食作用の能力の低下またはトランスレチナールの異性化等のＲＰＥ障害に関連する疾患または障害を意味する。ＲＰＥの機能が低下または失われると、網膜細胞はアポトーシスを受け、その下層にある支持組織から剥離し、視覚機能の喪失、失明、網膜剥離または血液網膜関門漏出に至る(Martin L. Katz, Arch Gerontol Geriatr., 34(3):359-70, 2002)。網膜色素上皮障害に関連する障害としては網膜色素上皮の剥離等の網膜剥離 (Tabandeh et al., Retina., 26(9):1063-9, 2006; Zayit-Soudry et al., Survey of Ophthalmology,  52(3):227-43, 2007)、視覚機能の喪失および血液網膜関門漏出が挙げられるがこれに限定されない。さらに、ＲＰＥの障害は、増殖性硝子体網膜症(Lee J.J. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 43(9):3117-24, 2002)、加齢性黄斑変性症(AMD) (Zarbin M.A., Archives of Ophthalmology, 122(4):598-614, 2004; Feher J. et al., Neurobiology of Aging, 27(7):983-93, 2006)、網膜色素変性、糖尿病性網膜症、黄斑変性および脈絡膜血管新生(Imamura Y. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(30):11282-7, 2006; Tabandeh H., et al., Retina, 26(9):1063-9, 2006）等が挙げられるがこれに限定されない様々な疾患をもたらし得る。
【００２０】
「ＲＰＥ障害に関連する疾患／障害を処置する」または「ＲＰＥ障害に関連する疾患／障害の処置」なる語は、ＲＰＥ障害に関連する疾患／障害、その疾患／障害の症状、またはその疾患／障害になりやすい傾向を有する患者に対して、その疾患、その疾患／障害の症状、またはその疾患／障害になりやすい傾向の、治癒、修復、軽減、緩和、改変、救済、改善、改良、または影響を及ぼすことを目的として、本明細書に記載の黒大豆産物の適用または投与することを意味する。
【００２１】
本明細書において用いられる「有効量」なる語は、それを必要とする患者に対して１またはそれ以上の他の活性成分を投与することで、その患者に対し治療効果をもたらすに必要な各活性成分の量を意味する。当業者に認識されているように、この有効量は、投与経路、使用する添加剤および他の活性成分の併用によって変わる。本発明によれば、有効量は、網膜色素上皮の機能を高めるのに効果的な量を意味する。
【００２２】
本発明は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）障害に関連する疾患または障害を治療するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の黒大豆(Glycine max (L.) Merr)産物を投与することを含んでなる方法を提供する。本発明によれば、黒大豆産物は黒大豆の種皮、または黒大豆のまたはその種皮のアルコール抽出物である。黒大豆産物は当分野で周知または一般的に用いられている任意の方法によって調製することができる。
【００２３】
本発明の一例では、黒大豆産物は黒大豆の種皮であり、例えば、脱穀機で黒大豆から種皮を直接脱穀し、細かく粉砕してよい。
【００２４】
本発明の一例では、黒大豆産物は黒大豆のまたはその種皮のアルコール抽出物であってよい。アルコール抽出物は、任意の標準的なまたは当業者に一般的に用いられている方法によって得ることができる。例えば、抽出物は、黒大豆またはその種皮をアルコールを含有する溶媒（例えばエタノールまたはメタノールを１０〜１００％（ｖ／ｖ）の濃度で含有する溶媒）で抽出することにより調製することができる。具体的な例では、黒大豆抽出物は黒大豆を、適当な温度にて十分な時間アルコールを含有する溶媒に浸漬した後、不溶性の豆物質を、例えば濾過、により取り除いて液体の黒大豆抽出物とすることにより得られる。場合により、該産物を、例えば留去により、さらに乾燥して乾燥形態の産物を得ることができる。アルコールを含有する溶媒は１０〜１００％（ｖ／ｖ）のアルコール、および他の１またはそれ以上の適当な溶媒（例えば、水エタノールまたはメタノール）を含有する溶媒であってよい。本発明の例では、アルコールを含有する溶媒は、水にエタノールを含有する溶媒である。さらに好ましくは、溶媒は、水に少なくとも１０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有し、より好ましくは水に３５％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有する。本発明の具体的な例では、抽出物は以下のステップ
（１）黒大豆（ホール）またはその種皮を準備する、
（２）該黒大豆（ホール）またはその種皮を、水に３５％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有する溶媒で抽出する、
（３）得られた可溶性画分を回収する、および場合により、
（４）回収した可溶性画分を乾燥する
を含んでなるプロセスにより調製した。
【００２５】
本発明によれば、予想外にも、黒大豆産物が網膜色素上皮の機能を高めるのに効果的であることが見出され、このことは、実施例２に示されるようにＲＰＥの食作用の能力の増大(MayersonおよびHall, The Journal of Cell Biology, 103:299-308, 1986)、本明細書の実施例３および４に示されるように、眼科的な欠陥を有するマウスモデルにおいてｂ波の修復能力(Thom W. Mittag et al., Exp Eye Res., 69:677-683, 1999)に関して、当分野で一般的に用いられ周知の方法またはモデルによって確認された。従って、本発明はＲＰＥ障害に関連する疾患または障害を治療するための方法であって、上記黒大豆産物の有効量をその治療を必要とする患者に投与することを含んでなる方法を提供する。
【００２６】
本発明の黒大豆産物は食品、食餌組成物または医薬組成物の形態であってよい。一例では、黒大豆産物を製薬的に許容し得る担体または添加剤、および場合によりさらなる治療活性成分と混合して、医薬組成物を形成してもよい。医薬組成物に適した担体または添加剤は、その組成物の活性成分に適合し(および、好ましくは、活性成分の安定化が可能な）、治療される患者に有害でないという意味において「許容し得る」ものでなければならない。担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｄ＆Ｃ イエロー＃１０、微晶性セルロース、マンニトール、グルコース、脱脂粉乳、ポリビニルピロリドン、およびデンプン、またはそれらの組合せが挙げられる。医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉体または液体の様々な形態で存在し得る。
【００２７】
本発明によれば、上記組成物は、適当な経路（例えば、経口投与）で投与することができる。経口投与のための固形製剤は、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、アカシア、スクロース、微晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、アルギン酸等の適当な担体を含み得る。この固形製剤は、小腸で放出するように設計することができる。例えば、組成物をそれぞれ小腸または大腸のｐＨで溶解または分散して薬物を腸で放出する腸溶ポリマーを含んでなるマトリクスまたは壁または密閉容器（closure）を有する固形のサブユニットまたはカプセルコンパートメントに密閉する。
【００２８】
更なる例では、本明細書に記載の黒大豆産物は食品または食品サプリメントの一成分である(例えば、栄養補助食品またはハーブ製品)。そのような食品は食品工業において任意の標準的で一般に用いられている方法により製造することができる。
【００２９】
これ以上詳述しなくても、当業者は上記の説明に基づいて、本発明を最大の程度まで利用することができると考える。従って、以下の具体的な実施形態は、単なる例示と解釈されるべきであり、如何なる意味においても残りの開示に限定を加えるものではない。本明細書において引用した刊行物はすべて本明細書の一部を構成する。
【実施例】
【００３０】
実施例１：黒大豆産物の調製
はじめに、黒大豆産物を、黒大豆（ホール）を脱穀機で脱穀し、細かく粉砕して黒大豆の種皮を得ることにより、調製した（ＢＧＳＣ）。
【００３１】
もう一つの黒大豆産物は、黒大豆（ホール）２ｋｇを、２０Ｌの３５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で抽出し、１０４．１５ｇのエタノール抽出物（ＢＧ３５Ｅ）を得ることにより、黒大豆（ホール）から調製した。
【００３２】
３つ目の黒大豆産物は、小型試験用脱穀機で黒大豆の種皮を脱穀し、種皮を回収し、得られた種皮を、３５％（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液で抽出して１１７．２５ｇの粗製抽出物（ＢＧＳＣ３５Ｅ）を得ることにより、黒大豆の種皮から調製した。
【００３３】
実施例２：ＲＰＥの食作用に対する黒大豆抽出物の効果（ＢＧ３５ＥおよびＢＧＳＣ３５Ｅ）
ＲＰＥの調製
新鮮なウシの眼を、屠殺後２〜３時間以内に畜殺場から集めた。ウシの眼の表面をヨードチンキで殺菌した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）バッファー溶液で２回洗浄した。ウシの眼を切開して水晶体、硝子体および網膜を順に取り出し、切開した眼を０．０１％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、Sigma、USA)で４０分間処理した後、５％トリプリシン(Merck, Germany)で１５分間処理した。次いで、眼を丸いチップの付いたピンセットで軽く押し数回ピペッティングすることによりＲＰＥの単細胞を得た。ピペットに取った溶液をＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ (ウシ胎児血清, GIBCO (Gaithersburg, USA)を含有するDulbecco修飾Eagle培地, Gibco (Gaithersburg, USA)）に加え、湿度５％ＣＯ2、３７℃のインキュベーター内でインキュベートした。細胞がコンフルエントになるまで培地を５〜６日毎に交換した。細胞を、０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡを含有する培地で継代培養した。生物活性試験に用いた主な細胞は５または６継代目の細胞とした。
【００３４】
桿体外節（ＲＯＳ）の調製
新鮮なウシの眼を氷で冷やし、畜殺場から入手後３０分間光に暴露した。ウシの眼の表面をヨードチンキで殺菌した後、Ｈａｎｋバッファー溶液で２回洗浄した。ウシの眼を切開して水晶体および硝子体を順に取り出した後、網膜を取り出し、小片に切り分け、これを２０％スクロースを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで処理した。細胞の溶液を４℃にて３時間攪拌した後、それぞれ孔サイズ３００、２２０、１１０、７４、５３および１０メッシュのフィルター(Small Parts , Miami, USA)で濾過した。ＲＯＳの数を計測した後、ＲＯＳを各バイアル当たり１×１０8個に分注し、バイアルを−２０℃で保存した。
【００３５】
フルオレセインイソチオシアネート−ＲＯＳ（ＦＩＴＣ−ＲＯＳ）の調製
保存したＲＯＳ溶液を解凍し、懸濁物を除去した。得られた溶液を、１０％スクロースを含有するホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）７００ｍＬと混合した後、ＦＩＴＣ粉末(Invitrogen, USA)を、ＲＯＳに対し１／１,０００の重量比で添加した。得られた溶液を４℃にて１．５時間攪拌した。ＲＯＳに結合しなかった未結合のＦＩＴＣは、２０％スクロースを含有する２０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．２）で洗浄することにより除去した。次いで、このＲＯＳ溶液を１０,０００ｒｐｍにて１０分間遠心した。上記の関係するステップを数回繰り返し、ＦＩＴＣ−ＲＯＳのペレットを得た。最後に、このペレットを、２．５％スクロースを含有するＤＭＥＭに溶解した。
【００３６】
in vitoroでのＲＰＥ食作用の能力の試験
ＲＰＥを１×１０4細胞／ｍｌに調整し、１０％ＦＣＳ  ＤＭＥＭを含有する９６ウェルプレートに播種した。４８時間インキュベートした後、培地を２％ＦＣＳ  ＤＭＥＭに置換し、ＢＧ３５ＥまたはＢＧＳＣ３５Ｅのいずれか２０μＬを、０．１、１、１０または１００μｇ／ｍＬの濃度で各ウェルにそれぞれ添加した。さらに、ポジティブコントロールとして１０％ＦＣＳをウェルに添加し、ブランクのウェル（２％ＦＣＳを添加）をコントロールとした。１日インキュベートした後、２０μＬのＦＩＴＣ−ＲＯＳ溶液を各ウェルに加え、４時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を除き、各ウェルについてペレットを得た。各ウェルのペレットを２．５％スクロース／ＰＢＳで数回洗浄した。次いで、全ＲＯＳ（外部および内部）をCyto-Fluorometer (Ex fliter: 485/20 nm, Em filter 530/25 nm)により計数した。さらに、外部で結合したFITC-標識ROSをFluoroQuench Dyeを添加することにより除去した後、貪食されたROS(摂取食作用)を測定した。
【００３７】
結果
図１Ａに示されるように、１００μｇ／ｍＬのＢＧ３５Ｅで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣの総食作用指数はコントロールの２％ＦＣＳで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣと比較して１．２５倍高かった。一方、１０μｇ／ｍＬのＢＧ３５Ｅで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣは、コントロールの２％ＦＣＳで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣと比較して１．５倍高かった。図１Ｂに示されるように、１μｇ／ｍＬのＢＧ３５Ｅで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣの摂取食作用指数は、コントロールの２％ＦＣＳで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣと比較して１．２４倍高かった。０．１μｇ／ｍＬのＢＧ３５Ｅで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣの摂取食作用指数は、コントロールの２％ＦＣＳで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣよりも高かった。
【００３８】
図２Ａに示されるように、ＲＯＳ−ＦＩＴＣを黒大豆の種皮の抽出物（ＢＧＳＣ３５Ｅ）でインキュベートしたとき、同様の結果がみられた。１０μｇ／ｍＬのＢＧＳＣ３５Ｅで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣにおける総食作用指数は、２％ＦＣＳで処置した場合と比較して１．３７倍高かった。さらに、１μｇ／ｍＬのＢＧＳＣ３５Ｅで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣの総食作用指数は、コントロールの２％ＦＣＳで処置した場合と比較して１．５５倍高かった。図２Ｂを見ると、１０μｇ／ｍＬのＢＧＳＣ３５Ｅで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣにおける摂取食作用指数はコントロールの２％ＦＣＳで処置した場合と比較して１．２６倍高く、１μｇ／ｍＬのＢＧＳＣ３５Ｅで処置したＲＯＳ−ＦＩＴＣの摂取食作用指数は、コントロールの２％ＦＣＳで処置した場合と比較して１．５５倍高かった。結果として、図１および図２では、黒大豆抽出物（ＢＧ３５Ｅ）または黒大豆種皮抽出物（ＢＧＳＣ３５Ｅ）とインキュベートした後に、ＲＰＥの食作用の能力が増大したことがみとめられた。
【００３９】
実施例３：眼科的欠陥を有するマウスモデルにおける黒大豆抽出物（ＢＧＳＣ３５Ｅ）の効果
マウス網膜電図（ＥＲＧ）モデル
ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（１０週齢）を、正常群（健常マウス）、対照群（光による損傷、ＢＧＳＣ３５Ｅ処置なし）、用量１０ｍｇ／ｋｇ（体重）のＢＧＳＣ３５Ｅで処置した群（ＢＧＳＣ３５Ｅ  １０ｍｇ／ｋｇ）、用量４０ｍｇ／ｋｇ（体重）のＢＧＳＣ３５Ｅで処置した群（ＢＧＳＣ３５Ｅ  ４０ｍｇ／ｋｇ）、または用量１６０ｍｇ／ｋｇ（体重）のＢＧＳＣ３５Ｅで処置した群（ＢＧＳＣ３５Ｅ  １６０ｍｇ／ｋｇ）に無作為にグループ化した。各群のマウスを５匹とし、餌と水を十分に与えた。ＢＧＳＣ３５Ｅ処置の最初の日を第０日とした。−１、１、７、１３および１９日目にａ波およびｂ波の振幅をＥＲＧにより測定した。
【００４０】
−５日目に、試験のために、光に正常に反応したマウスを選択した。−１日目に、マウスを暗所で２４時間飼育した。アベルチンを（４００ｍｇ／ｋｇ（体重））を腹腔内投与して麻酔した後、マウスを加温パッドに置いて体温を維持した。１％シクロペントレートで瞳孔を開大させ、１％プロパラカインで麻酔した。各マウスについて、金線ループ電極を角膜に配置し、金線示差電極を舌に配置した。参照電極は頭部に取り付けた。マウスの眼を６ボルトのＬＥＤ光（波長５００−５７５ｎｍ、強度５,０００ルクス）に１ミリ秒暴露した。マウスのａ波およびｂ波の振幅をＥＲＧにより測定し、通常の条件下および光の暴露から２時間後に記録した。
【００４１】
結果
図３Ａに示されるように、用量４０ｍｇ／ｋｇおよび１６０ｍｇ／ｋｇのＢＧＳＣ３５Ｅで処置したマウスはａ波を修復する能力を有していた。用量４０ｍｇ／ｋｇまたは１６０ｍｇ／ｋｇのＢＧＳＣ３５Ｅで処置したマウスの第１３日目のａ波の強度は、第１日目の強度と比較して１５０％を超える増大が認められた。用量１６０ｍｇ／ｋｇのＢＧＳＣ３５Ｅで処置したマウスの第１９日目のａ波の強度もまた、第１日目の強度と比較して１５０％を超える増大が認められた。
【００４２】
図３Ｂに示されるように、対照群と用量４０ｍｇ／ｋｇおよび１６０ｍｇ／ｋｇのＢＧＳＣ３５Ｅで処置したマウスはｂ波を修復する能力を有することが認められた。対照群と用量４０ｍｇ／ｋｇまたは１６０ｍｇ／ｋｇのＢＧＳＣ３５Ｅで処置したマウスの第１３日目および第１９日目のｂ波の強度は、第１日目と比較して増大していることが認められた。用量４０ｍｇ／ｋｇのＢＧＳＣ３５Ｅで処置したマウスの第７日目のｂ波の強度もまた、第１日目と比較して有意に増大していることが認められた（ｐ＜０．００１）。上記から、ＢＧＳＣ３５Ｅで処置したマウスは異常なＥＲＧ状態を修復する能力を有していた。このことはＢＧＳＣ３５ＥがＲＰＥ機能の増大に効果を有しており、眼疾患の治療に用いることができることを示している。
【００４３】
実施例４：眼科的欠陥を有するモデルマウスにおける黒大豆種皮（ＢＧＳＣ）の効果
マウス網膜電図（ＥＲＧ）モデル
ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（１０週齢）を、正常群（健常マウス）、対照群対照群（光による損傷、ＢＧＳＣ処置なし）、用量８０ｍｇ／ｋｇ（体重）のＢＧＳＣで処置した群（ＢＧＳＣ  ８０ｍｇ／ｋｇ）または用量２５０ｍｇ／ｋｇ（体重）のＢＧＳＣで処置した群（ＢＧＳＣ  ２５０ｍｇ／ｋｇ）に無作為にグループ化した。各群のマウスを５匹とし、餌と水を十分に与えた。ＢＧＳＣ処置の最初の日を第０日とした。−５、０および１５日目にｂ波の振幅をＥＲＧにより測定した。
【００４４】
−５日目に、試験のために、光に正常に反応したマウスを選択した。−１日目に、マウスを暗所で２４時間飼育した。アベルチンを（４００ｍｇ／ｋｇ（体重））を腹腔内投与して麻酔した後、マウスを加温パッドに置いて体温を維持した。１％シクロペントレートで瞳孔を開大させ、１％プロパラカインで麻酔した。各マウスについて、金線ループ電極を角膜に配置し、金線示差電極を舌に配置した。参照電極は頭部に取り付けた。マウスの眼を６ボルトのＬＥＤ光（波長５００−５７５ｎｍ、強度５,０００ルクス）に１ミリ秒暴露した。マウスのｂ波の振幅をＥＲＧにより測定し、通常の条件下および光の暴露から２時間後に記録した。
【００４５】
同じプロトコルに従い、４０、１６０または６４０ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量のＢＧＳＣでマウスを処置し、正常群および対照群を試験した。−４、２、９および１６日目にマウスのｂ波の振幅をＥＲＧにより測定した。
【００４６】
結果
図４Ａに示されるように、用量８０ｍｇ／ｋｇおよび２５０ｍｇ／ｋｇのＢＧＳＣで処置したマウスはｂ波を修復する能力を有していた。用量８０ｍｇ／ｋｇのＢＧＳＣで処置したマウスの第１５日目のｂ波の強度は、第０日目の強度と比較して有意に増大していることが認められた（ｐ＜０．０５）。
【００４７】
図４Ｂに示されるように、用量４０ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇまたは６４０ｍｇ／ｋｇのＢＧＳＣで処置したマウスはｂ波を修復する能力を有することが認められた。用量１６０ｍｇ／ｋｇまたは６４０ｍｇ／ｋｇのＢＧＳＣで処置したマウスの第９日目および第１６日目のｂ波の強度は、第２日目と比較して増大していることが認められた。上記から、ＢＧＳＣで処置したマウスは異常なＥＲＧを修復する能力を有していた。このことはＢＧＳＣがＲＰＥ機能の増大に効果を有しており、眼疾患の治療に用いることができることを示している。
【００４８】
その他の実施形態
本明細書中に開示したすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書中に開示した特徴はそれぞれ、同一、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴で置き換えられてもよい。即ち、特に明示しないかぎり、開示した各特徴は、一連の一般的な均等または類似の特徴の一例にすぎない。
【００４９】
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的特徴を容易に突き止め、本発明の精神と範囲から逸脱しない限りにおいて、本発明の様々な変更および修飾を行って種々の用途および条件に適応させることができるであろう。即ち、その他の実施形態もまた特許請求の範囲内にある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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