(57)【要約】  本発明は、心筋細胞のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）トランスフェクションを用いてフォスフォランバン（ＰＬＢ）の発現又は活性を低下させることを通じて不完全な心臓内Ｃａ２＋恒常性を調節することによって、心不全を治療するためのターゲットされたＲＮＡｉに関する。心室性不整脈を低減する方法及び被験体の心不全からの生存率の全般的な改善のための方法も開示する。さらに、本発明は、ＲＮＡｉによる治療に対する感受性の分析に使用可能な方法であって、医薬品組成物と、キットと、及び、ＲＮＡｉ配列を含むベクターとを含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の心不全を治療する方法において、必要性がある対象にＲＮＡｉ発現カセットを具えるベクターを投与するステップを具え、前記カセットが、対象の心不全を治療するのに有効な量の、発現生成物がフォスフォランバン（ＰＬＢ）の発現又は活性を低下させるＲＮＡｉ配列を具えていることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ＲＮＡｉ発現カセットが配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を具えており、それによってベクター投与前と比較して対象の収縮機能を改善することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記ベクターがウイルス粒子であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記ベクターがプラスミドであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、前記ウイルス粒子がパルボウイルスであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記パルボウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記ＡＡＶが血清型９であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記ＰＬＢ  ｍＲＮＡの発現を阻害することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項２に記載の方法において、前記配列番号１の配列がＡＡＶの末端反復に隣接していることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の方法において、前記ウイルス粒子ベクターのゲノムが自己相補的であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、前記対象が哺乳類であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記対象がヒトであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターと、薬学的に許容可能な担体とを具える医薬品組成物において、前記ベクターが、発現生成物がそのＲＮＡをフォスフォランバン（ＰＬＢ）の発現又はＰＬＢ活性を低下させるＲＮＡｉ発現カセットを具えていることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の医薬品組成物において、前記ＲＮＡｉ発現カセットのＲＮＡ発現生成物が、緊縮条件下においてＰＬＢ遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を具えていることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の医薬品組成物において、前記ＲＮＡｉ発現カセットが配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を具えていることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項１６】
請求項１３に記載の医薬品組成物において、前記ＲＮＡ発現生成物が配列番号２に記載されているターゲット配列をさらに具えていることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項１７】
請求項１３に記載の医薬品組成物において、前記組成物が静脈内投与に適していることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項１８】
請求項１３に記載の医薬品組成物において、前記組成物が動脈内投与に適していることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項１９】
請求項１３に記載の医薬品組成物において、前記組成物が脳室内投与に適していることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項２０】
請求項１３に記載の医薬品組成物において、前記組成物が心臓弁灌流に適していることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項２１】
請求項１３に記載の医薬品組成物において、前記ＡＡＶが血清型９であることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つのＡＡＶ末端反復を具えているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにおいて、前記ベクターが、発現生成物がフォスフォランバン（ＰＬＢ）ｍＲＮＡの発現又はＰＬＢ活性を低下させるＲＮＡｉ発現カセットを具えていることを特徴とするＡＡＶベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のアデノ随伴ウイルスにおいて、前記ＲＮＡｉ発現カセットのＲＮＡ発現生成物が、緊縮条件下においてＰＬＢ遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を具えており、それによって心筋細胞に形質導入することを特徴とするＡＡＶベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載のＡＡＶベクターにおいて、前記ＲＮＡｉ発現カセットが配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を具えていることを特徴とするＡＡＶベクター。
【請求項２５】
請求項２２に記載のＡＡＶベクターにおいて、前記ＲＮＡ発現生成物が配列番号２に記載されているターゲット配列をさらに具えていることを特徴とするＡＡＶベクター。
【請求項２６】
請求項２２に記載のＡＡＶベクターにおいて、前記ＡＡＶが血清型９であることを特徴とするＡＡＶベクター。
【請求項２７】
筋小胞体（ＳＲ）内へのカルシウム取り込みを増加させる方法において、筋組織サンプルをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに接触させるステップを具え、前記ベクターがＲＮＡｉ発現生成物をコードするポリヌクレオチド配列を具えており、それによって、筋小胞体におけるカルシウム取り込みを増加させることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、前記ＲＮＡｉが、緊縮条件下においてＰＬＢ標的遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を具えており、それによって、心筋細胞の収縮性をベクターとの接触前の収縮性よりも強めることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法において、前記ベクターが配列番号１に記載されているヌクレオチド配列をさらに具えることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の方法において、前記ＲＮＡｉが配列番号２に記載されているターゲット配列を具えていることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２７に記載の方法において、ＲＮＡｉ発現カセットのＲＮＡコード領域の発現がＰＬＢ遺伝子の発現を下方制御することを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２７に記載の方法において、前記ＲＮＡｉベクターが、ＰＬＢターゲット遺伝子のＲＮＡコード領域と少なくとも約９０％相同な配列を具えていることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２７に記載の方法において、前記ＰＬＢ形質発現を少なくとも１０％抑制することを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項２７に記載の方法において、前記ＡＡＶゲノムが自己相補性であることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項２７に記載の方法において、前記ＡＡＶが血清型９であることを特徴とする方法。
【請求項３６】
ｉ）フォスフォランバン（ＰＬＢ）の発現又はＰＬＢ活性を低下させるＲＮＡｉ発現生成物をコードするポリヌクレオチド配列を具えているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターと；
ｉｉ）１又はそれ以上の緩衝剤と；
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の構成要素の使用についての説明書と；
ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の構成要素を具える包装容器と、
を具えていることを特徴とするキット。
【請求項３７】
請求項３６に記載のキットにおいて、前記ＲＮＡｉが、緊縮条件下においてＰＬＢ標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を具えていることを特徴とするキット。
【請求項３８】
請求項３６に記載のキットにおいて、前記ベクターが配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を具えていることを特徴とするキット。
【請求項３９】
請求項３６に記載のキットにおいて、前記ＲＮＡｉが配列番号２に記載されているターゲット配列をさらに具えていることを特徴とするキット。
【請求項４０】
請求項３６に記載のキットにおいて、前記ＡＡＶが血清型９であることを特徴とするキット。
【請求項４１】
被験体の細胞内カルシウムの調節異常による慢性心不全（ＨＦ）のためのＲＮＡｉによる治療に対する被験体の感受性を診断する方法において、
（ａ）被験体の筋組織サンプルをアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターに接触させるステップであって、前記ベクターが、フォスフォランバン（ＰＬＢ）ｍＲＮＡの発現又は活性を低下させるＲＮＡｉ発現生成物をコードするポリヌクレオチド配列を具えているステップと；
（ｂ）前記筋組織サンプルをＡＡＶ９ベクター接触させる前後に組織サンプル中の筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼポンプ（ＳＥＲＣＡ）の活性を測定するステップであって、前記ＳＥＲＣＡ活性の上昇が心不全のためのＲＮＡｉによる治療に被験体の感受性と相関しているステップと、
を具えることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法において、前記ＲＮＡｉが、緊縮条件下においてＰＬＢ標的遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を具えていることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項４１に記載の方法において、前記ベクターが配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を具えていることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項４１に記載の方法において、前記ＲＮＡｉが配列番号２に記載されているターゲット配列をさらに具えていることを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４１に記載の方法において、前記被験体がヒトであることを特徴とする方法。
【請求項４６】
慢性心不全を有する被験者体の生存率を改善する方法において、ベクターを投与するステップを具え、前記ベクターがＲＮＡｉ発現生成物をコードするポリヌクレオチド配列を具えており、前記ＲＮＡｉ発現生成物が、フォスフォランバン（ＰＬＢ）ｍＲＮＡの発現又はＰＬＢ活性を低下させ、収縮機能を改善するものであり、それによって被験体の生存を改善することを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法において、前記ＲＮＡｉが、緊縮条件下においてＰＬＢ標的遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を具えていることを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４６に記載の方法において、前記ベクターがウイルス粒子又はプラスミドであることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法において、前記ウイルス粒子がパルボウイルスであることを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法において、前記パルボウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法において、前記ＡＡＶが血清型９であることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項４８に記載の方法において、前記ウイルス粒子が配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を具えていることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法において、前記配列番号１がＡＡＶの末端反復に隣接していることを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項４６に記載の方法において、前記ＲＮＡｉが配列番号２に記載されているターゲット配列をさらに具えていることを特徴とする方法。
【請求項５５】
請求項４６に記載の方法において、前記被験者がヒトであることを特徴とする方法。
【請求項５６】
被験体の心室性不整脈を低減する方法において、ＲＮＡｉ発現生成物をコードするポリヌクレオチド配列を具えているベクターを投与するステップを具え、前記ＲＮＡｉが心室機能を改善するヌクレオチド配列を具えており、それによって被験者の心室性不整脈を低減することを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法において、前記ベクターがウイルス粒子又はプラスミドであることを特徴とする方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法において、前記ウイルス粒子がパルボウイルスであることを特徴とする方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法において、前記パルボウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であることを特徴とする方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法において、前記ＡＡＶが血清型９であることを特徴とする方法。
【請求項６１】
請求項５７に記載の方法において、前記ウイルス粒子が配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を具えていることを特徴とする方法。
【請求項６２】
請求項５６に記載の方法において、前記ＲＮＡｉが配列番号２に記載されているターゲット配列をさらに具えていることを特徴とする方法。
【請求項６３】
請求項５６に記載の方法において、前記被験体がヒトであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くは心臓病を治療する方法に関し、より詳細には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ターゲットＡＡＶ９ベクターによる送達を含む、ＲＮＡｉを用いてフォスフォランバン（ＰＬＢ）を低下させて慢性心不全を治療する方法、及び、慢性心不全のＲＮＡｉによる治療に対する感受性を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、２００万人を超えるアメリカ人が心不全に罹患しており、人口の高齢化につれて経済的損失及び人的損失が増大し続けるであろう。うっ血性心不全は、毎年４００，０００人を超える新規患者が報告されており、６５歳以上の患者における最も一般的な入院患者の診断である。５年以内の死亡率が６０％であり、致命的な不整脈（心突然死、ＳＣＤ）による２３〜５２％の死亡がみられ、予後が悪い。
【０００３】
心不全とは、心臓血液拍出量を生理学的要求に一致させることができないことである。従って、心不全は、特異的疾患ではなく、虚血性心疾患、心筋症（膨張性、拘束性、肥大性）、弁膜性心疾患及び慢性高血圧、並びに、糖尿病を含む大部分の心臓病の終末点を表す症候群である。さらに、心不全の症状は、急性心筋梗塞、心臓手術後（スタンニング、低体温麻酔）、又は、血管再生治療後（すなわち、再潅流障害、血栓溶解療法後、経皮経管冠動脈形成術又は冠状動脈バイパス移植）のような事例において、急性症状（すなわち、急性心不全又は心源性ショック）を呈することもある。
【０００４】
収縮の低下は、うっ血性心不全の主たる特徴である。また、心筋細胞にカルシウムを貯蔵する筋小胞体（ＳＲ）は、興奮と収縮との組み合わせと同様に心筋収縮能において重要な役割を果たしている。収縮力の発生は、筋小胞体に蓄積されたＣａ２+の量に依存している。筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡａ）の存在量の増加又はフォスフォランバン（ＰＬＢ）のリン酸化の増加、及び／又は、ＰＬＢ存在量における減少は、筋小胞体によるＣａ２＋取り込みの増加に寄与し、それによって心筋細胞収縮を強化する。
【０００５】
ＰＬＢは、筋肉に特異的なリンタンパク質である５３個のアミノ酸である。脱リン化されたＰＬＢは、ＳＥＲＣＡ２ａに結合し、心筋の筋小胞体に入るカルシウム量を調節する。プロテインキナーゼＡによってリン酸化されると、ＳＥＲＣＡ２ａのＰＬＢの阻害が再び生じ、筋小胞体へのカルシウム流入が増加し、筋肉収縮が強まる。
【０００６】
心筋遺伝子療法は、虚血性心筋症、うっ血性心不全及び悪性不整脈を含む多数の心臓血管疾患の治療に用いることができる。心筋遺伝子送達に有用なベクターは、冠動脈又は静脈洞への直接的な心筋内注射又は点滴後に、様々な遺伝子組み換えを用いた心筋細胞の効率的で安定的な形質導入を可能にするであろう。例えば、左心室の心臓筋に直接注射したプラスミドＤＮＡベクターは、注射領域近傍の心筋細胞によって６ヶ月間発現した。しかしながら、このアプローチの治療的有用性は、心筋細胞への形質導入の効率が低いこと（注射領域の心筋細胞の０．１％〜１．０％）によって限定的である。
【０００７】
複製欠損アデノウイルス（ＲＤＡｄ）ベクターの心筋内注射及び冠動脈内注射の両方を用いて、インビボにおいて、齧歯動物、ウサギ及びブタの心筋細胞に、効率的に形質導入した。しかしながら、アデノウイルスを介した遺伝子導入の実現可能性は、ウイルス及び外来の導入遺伝子タンパクに対する免疫反応によって限定されている。この免疫反応は、著しい心筋炎症（ウイルスで形質導入した細胞が感染から３０日以内に除去された）を引き起こし、それによって免疫応答性の宿主において一時的な組み換え遺伝子発現をもたらす。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、心筋細胞のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）トランスフェクションを用いて、フォスフォランバン（ＰＬＢ）の発現を減少させて不完全な心臓のＣａ２＋恒常性を調節することによって重篤な心不全を治療するためのＲＮＡｉに関する。上記方法は、開示されている方法を用いて、対象の心不全の生存率の全般的な改善だけでなく、心室性不整脈を低減することにも関する。さらに、本発明は、ＲＮＡｉによる治療に対する感受性の診断に用いることができる方法を提供し、医薬品組成物、キット、及び、実質的にＰＬＢ活性を低下させるＲＮＡｉからなるベクターを含む。
【０００９】
このようにして、本発明は、対象の心不全を治療する方法を提供する。上記方法は、必要性がある対象にＲＮＡｉ発現カセットを含むベクターを投与するステップを含み、前記カセットは、その発現生成物がフォスフォランバン（ＰＬＢ）活性を低下させるＲＮＡｉ配列を、対象の心不全を治療し、前記ベクターの投与前よりも対象の収縮機能を改善するのに有効な量で具えている。一実施形態においては、前記ベクターがウイルス粒子である。他の実施形態においては、前記ベクターがプラスミドである。他の実施形態においては、前記ウイルス粒子がパルボウイルスである。他の実施形態においては、前記パルボウイルスがＡＡＶ血清型９を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。さらに別の実施形態においては、前記ＲＮＡｉ発現カセットが配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を含む。関連実施形態においては、前記配列番号１がＡＡＶ末端反復に隣接している。他の実施形態においては、ＰＬＢ遺伝子発現が少なくとも１０％抑制される。他の実施形態においては、前記ＲＮＡｉ配列が配列番号２に記載されているターゲット配列を含む。そのようなものとして、前記ＲＮＡｉ発現カセットは、緊縮条件下でＰＬＢ遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第１ヌクレオチド配列、及び、第１ヌクレオチド配列の相補的な逆方向反復配列であり、第１ヌクレオチド配列にハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第２ヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つのＲＮＡコードする。一実施形態においては、ＲＮＡループ構造によって２つのヌクレオチド配列が結合される。他の実施形態においては、対象がヒトなどの哺乳類である。
【００１０】
本発明は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬品組成物であって、前記ベクターは、そのＲＮＡ発現生成物がフォスフォランバン（ＰＬＢ）の活性及び／又は発現を低下させるＲＮＡｉ発現カセットを具えている医薬品組成物をさらに提供する。一実施形態においては、ＲＮＡｉ発現カセットのＲＮＡ発現生成物は、緊縮条件下においてＰＬＢ遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記緊縮条件は、限定されないが、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び、１％ＳＤＳを具える溶液中で４２℃でハイブリダイズさせるステップと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを具える溶液中で６５℃で洗浄するステップとを含む。他の実施形態においては、前記ＲＮＡｉ発現カセットが配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を含む。他の実施形態においては、前記ＲＮＡ発現生成物が配列番号２に記載されているターゲット配列を含む。他の実施形態においては、前記組成物は、静脈内投与、動脈内投与、脳室内投与又は心臓弁灌流に使用できる。
【００１１】
本発明は、少なくとも１つのＡＡＶ末端反復を含むアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記ベクターがＲＮＡｉ発現カセットを具え、前記ＲＮＡｉ発現カセットの発現生成物がフォスフォランバン（ＰＬＢ）ｍＲＮＡの発現又はＰＬＢ活性を低下させるベクターをさらに提供する。一実施形態においては、ＲＮＡｉ発現カセットのＲＮＡ発現生成物が、緊縮条件下においてＰＬＢ遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。他の実施形態においては、前記ＲＮＡｉ発現カセットが配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を含む。他の実施形態においては、前記ＲＮＡ発現生成物が配列番号２に記載されているターゲット配列を含む。
【００１２】
本発明は、筋小胞体（ＳＲ）中へのカルシウム取り込みを増加させる方法をさらに提供する。前記方法は、筋組織サンプルをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに接触させるステップを含み、前記ベクターは、ＲＮＡｉ発現生成物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、それによって、筋小胞体におけるカルシウム取り込みを増加させ、ベクターとの接触前の収縮と比較して心筋細胞の収縮を強める。一実施形態においては、ＲＮＡｉは、緊縮条件下においてＰＬＢターゲット遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。他の実施形態においては、前記ベクターが配列番号１に記載されているヌクレオチド配列を含む。他の実施形態においては、前記ＲＮＡｉが配列番号２に記載されているターゲット配列を含む。他の実施形態においては、前記ＲＮＡｉ発現カセットのＲＮＡコード領域がＰＬＢ遺伝子発現を下方制御する。他の実施形態においては、前記ＲＮＡｉベクターがＰＬＢターゲット遺伝子のＲＮＡコード領域と少なくとも約９０％同一の配列を含む。
【００１３】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含むキットであって、前記ベクターが、フォスフォランバン（ＰＬＢ）ｍＲＮＡ又はＰＬＢ活性の発現を低下させるＲＮＡｉ発現生成物をコードするポリヌクレオチド配列、１つ以上のバッファー、これらの成分を用いる際の説明書、及び、これらの成分を具える包装容器を具えるキットをさらに提供する。ある実施形態においては、前記ＲＮＡｉが緊縮条件下でＰＬＢターゲット遺伝子ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
本発明は、対象の細胞内カルシウムの調節異常に起因する慢性心不全（ＨＦ）のためのＲＮＡｉによる治療に対する対象の感受性を診断する方法をさらに提供する。前記方法は、対象の筋組織サンプルをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに接触させるステップであって、前記ベクターがフォスフォランバン（ＰＬＢ）ｍＲＮＡの発現又は活性を低下させるＲＮＡｉ発現生成物をコードするポリヌクレオチド配列を含むステップと、前記筋組織サンプルを前記ＡＡＶベクターに接触させる前及び後の組織サンプルにおけるカルシウムＡＴＰアーゼポンプ（ＳＥＲＣＡ）の活性を測定するステップであって、ＳＥＲＣＡ活性の増加は、ＲＮＡｉによる心不全治療に対する対象の感受性と相関しているステップと、を具える。
【００１５】
本発明は、慢性心不全（ＨＦ）を有する対象の生存を改善する方法をさらに提供する。上記方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与するステップを含み、前記ベクターが、細胞中のフォスフォランバン（ＰＬＢ）ｍＲＮＡの発現の減少及びＰＬＢタンパクの量の減少をもたらすＲＮＡｉ発現生成物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡｉが、緊縮条件下においてＰＬＢターゲット遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。一実施形態においては、前記ベクターが収縮機能を改善し、それによって対象の生存率を改善する。他の実施形態においては、前記ＡＡＶが血清型９である。
【００１６】
本発明は、対象の心室性不整脈を低減する方法をさらに提供する。上記方法は、フォスフォランバン（ＰＬＢ）ｍＲＮＡの発現又は心室機能を改善するＰＬＢ活性を低下させるＲＮＡｉ発現生成物をコードするポリヌクレオチド配列を具えるウイルス粒子を投与するステップを具え、それによって、対象の心室性不整脈を低減させる。一実施形態においては、このウイルス粒子はＡＡＶ９である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、心不全（ＨＦ）治療用のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ベクターの開発における様々なベクターによるターゲット抑制を実証するノーザンブロットのパネルを示す図である。初代新生児ラット心筋細胞（ＰＮＣＭ）におけるｓｈＲＮＡ発現ベクターのターゲット抑制効果の比較を示す。レーン上に与えられている細胞当たり粒子容量（ｐ／ｃ）で各ベクターを用いて治療した後に、それぞれ第５日（上部）又は第１０日（下部）に細胞を回収した。次いで、ラットＰＬＢ特異的プローブを用いてノーザンブロットを行った。そのブロットを縞状にし、β−アクチン−特異的プローブを用いて再ハイブリダイズさせて、均等なＲＮＡローディングを確認した。レーン１〜１８は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースとするベクターＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ（レーン１−６）、ＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ−ＣＭＶ―β−イントロン（レーン７−１２）、及び、ＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰ（レーン１３−１８）に対するＲＮＡｉ媒介性ＰＬＢ−ｍＲＮＡ下方制御の量依存性を示す。レーン１９−２４は、ＡＡＶ−ｓｈＧＦＰを用いた処理後に、非特異ｓｈＲＮＡについてのコントロールがＰＬＢ−ｍＲＮＡ発現をもたらすことを示している。ＡＡＶ−ｓｈＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をターゲットにするｓｈＲＮＡ配列を生成する（レーン１９−２４）。ＡＡＶとの比較のために、アデノウイルスベクターＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ（レーン２５−２８）を用いた。ＡｄＶ―ｓｈＰＬＢ（レーン２５−２８）と同様に、４×１０３ｐ／ｃ（レーン１及び２）の最低用量でｒＡＡＶ−ｓｈＰＬＢを用いて、第１０日までにＰＬＢ−ｍＲＮＡを９８％以上除去した。ｒＡＡＶ−ｓｈＰＬＢベクター（レーン７−１２）中にＣＭＶ−ＧＦＰ発現カセットを組み込んでインビボ画像化によって容易に検出できるタグをベクターに与えることにより、感染細胞における強いＧＦＰ発現をもたらしたが（図示せず）、予想外にＰＬＢ遺伝子抑制効果を消失させた。ＣＭＶ−β−イントロンカセットの組み込み（レーン１２−１８）の効果は、類似していたが、それほど顕著ではなかった。
【００１８】
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａのベクターによって生産された細胞内ｓｈＲＮＡ量を示す図である。ＣＭＶ−ＧＦＰカセットの存在下においては、ｓｈＰＬＢ生成が消失した（レーン１３−１８）。一方で、付加配列がないＵ６−ｓｈＰＬＢベクターは、５日間（レーン１−３）及び１０日間（レーン４−６）安定した発現を示した。ＡｄＶｓｈＰＬＢによって、第５日に非常に多量のｓｈＰＬＢが生成され、その後、ＮＲＣＭにおいて急速に減少した。
【００１９】
【図１Ｃ】図１Ｃは、アデノウイルス及びＡＡＶベクターの詳細地図を示す図である。ＡＡＶ−ｓｈＰＬＢは、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ及びそれらの対応ｓｈＧＦＰコントロールベクターのようなＵ６−ｓｈＲＮＡ発現系を有する。さらに、ＣＭＶを含む４つのベクターは、Ｕ６−ｓｈＲＮＡ配列と頭を付き合わせる方向で、ＣＭＶ−ＧＦＰを有するカセット又はＣＭＶ−β−イントロンカセットを運び、ウシ成長ホルモン（ｂｇＨ）末端シグナルによってそれらから分離される。
【００２０】
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＮＲＣＭ処理中におけるＰＬＢタンパクのウエスタンブロット解析を左のパネルに示し、ベクター添加後第３日、第５日及び第７日におけるその定量を右側に示す写真及び図である。ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ及びｒＡＡＶ６―ｓｈＰＬＢは、細胞内ＰＬＢを、第７日にベースラインのそれぞれ９％及び１３％まで下方制御する結果となった。
【００２１】
【図１Ｅ】図１Ｅは、未処理細胞と区別することができない推移を有するＡＡＶ９−ｓｈＧＦＰグループと比較して著しく高い振幅及び促進された推移動態（短縮されたＴＴＰ及びτ）を示したＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢ処理中のＮＲＣＭにおける［Ｃａ２＋］ｉ推移を示す図である。ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ処理もＡｄＶ−ｓｈＧＦＰコントロールよりも著しく高い振幅をもたらした。ＡＡＶ９グループとは対照的に、ＴＴＰは、τに差がないＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ対ＡｄＶ−ｓｈＧＦＰグループにおいて長くなった。
【００２２】
【図１Ｆ】図１Ｆは、図１Ｅに示されている［Ｃａ２＋］ｉ推移の統計的評価を示す図である。＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．０１を示す。
【００２３】
【図２Ａ】図２Ａは、インビボにおける心不全のＲＮＡｉ治療用のプロトコルを示すフロー図である。インビボにおけるＲＮＡｉ治療で用いる動物を最初に２つのグループ：大動脈バンド（ＴＡＢ）を有する５６匹の動物の第１グループ、及び、疑似手術した１２匹の第２グループに分けた。ＴＡＢ動物において、２５〜３０週を経過させることで、心臓ＲＮＡｉベクター移入前の連続心臓超音波検査による評価に比べて、左心室（ＬＶ）が拡張し、短縮率（ＦＳ）が２５％減少した。ＴＡＢを受けた最初の５６匹のうちの４０匹の動物が生存した。これらの動物を分割して、Ａｄ−ｓｈＧＦＰ（ｎ＝１０）又はＡｄ−ｓｈＰＬＢ（ｎ＝１０）又はコントロールベクターＡＡＶ９−ｓｈＧＦＰ（ｎ＝１０）又はＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢ（ｎ＝１０）のいずれかを受けさせた。ベクター注射は、２００μｌのアデノウイルス（３×１０１０ｐｆｕ）又はＡＡＶ９（５×１０１１ベクターゲノム）ベクター溶液を含む２２Ｇのカテーテルを通して実行した。カテーテルを左室心尖部から大動脈起始部に前進させ、大動脈及び主肺動脈をカテーテル部位に対して遠位で４０秒間締め、溶液を注射した。心臓超音波検査、チップカテーテル、形態測定及び組織学的検査による結果評価を、アデノウイルスベクターグループにおいて１カ月後に、及び、ＡＡＶベクター処理グループ（図３Ａ−３Ｆを参照されたい。）において３カ月後に行った。１カ月後、ＡｄＶグループにおいては１０匹中８匹及び１０匹中９匹動物が生き残った。３カ月後、ｒＡＡＶ−ｓｈＰＬＢにおいては１０匹中９匹が生き残り、ｒＡＡＶ−ｓｈＧＦＰグループにおいては１０匹中６匹が生き残った。心臓で発現されるマイクロＲＮＡに関するさらなる研究をこれらのグループにおいて同時に行った。
【００２４】
【図２Ｂ】図２Ｂは、緑色蛍光タンパクを発現するｒＡＡＶ９−ＧＦＰベクター（下部）、又は、食塩水（上部）を静脈内に注射したラットの心臓を示す写真である。注射１カ月後に、心臓を切除し、ＧＦＰイメージングによって視覚化した。ｒＡＡＶ９−ＧＦＰグループの心臓断面において概ね均一なシグナルが認められ、食塩グループにおいてはシグナルが認められなかった。
【００２５】
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｒＡＡＶ９−ＧＦＰで処理したラットの心臓のＧＦＰ螢光における概略示す写真であり、１カ月で表面積の９０％に届いている。
【００２６】
【図２Ｄ】図２Ｄは、ラットにｒＡＡＶ９−ＧＦＰを静脈内注射した１カ月後の様々な器官におけるＧＦＰの免疫組織化学染色を示す写真である。アデノウイルスベクター（ＡｄＶ−ＧＦＰ）の静脈内注射後には心臓においてＧＦＰは検出されなかったが（ａ）、ｒＡＡＶ９−ＧＦＰ処理は、概ね均一な強いＧＦＰ発現（ｂ）及び（ｃ）をもたらした。ＧＦＰ免疫反応が完全にない（丸で囲まれている）領域はほとんどなく、他は均一な細胞質染色（丸で囲まれている）を示している。ＲＮＡｉベクターから生成されるｓｈＲＮＡとは対照的に、１カ月以上に渡る高発現が細胞において安定なＧＦＰの沈着物（矢印）の形成に明らかにもたらした領域において、染色が特に濃かった。それぞれの細胞において発現のばらつきがあり、平均７０％の心筋細胞が免疫組織化学によって陽性であった。（ｅ）は、細胞小片のかすかな染色を有する骨格筋を示す。一方で、肝臓はそれぞれの細胞が顕著なシグナルを示しているだけであった（ｄ）。肺においてはシグナルは認められなかった。心臓に対するｒＡＡＶ９−ＧＦＰ発現の最高親和性を裏付けるウエスタンブロット分析によるＧＦＰ定量と共にＡＡＶ９分散に関するさらなるデータを図２Ｊに示す。肝臓及び骨格筋では少量の発現がみられ、肺では非常に弱い発現しかみられなかった。
【００２７】
【図２Ｅ】図２Ｅは、ｒＡＡＶ９−ＧＦＰの静脈内注射の１週間後及び４週間後の肝臓のヘマトキシリン―エオシン染色が毒性の根拠を示さないことを示す写真である。ｒＡＡＶ−ｓｈＲＮＡベクターにも肝毒性がなかった。
【００２８】
【図２Ｆ】図２Ｆは、ｓｈＧＦＰコントロールグループと比較して、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ治療の１カ月後及びｒＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢ治療の３カ月後の心臓のＰＬＢタンパクが著しく減少したことを示すノーザンブロットのパネルの写真である。ＮＣＸ及びＧＡＰＤＨタンパクは変化しなかった。ＳＥＲＣＡ２ａは、シャムと比較して、心不全であったｓｈＧＦＰグループにおいて減少した。一方で、ＳＥＲＣＡ２ａは、ｓｈＰＬＢグループの両方において有意に増加した。
【００２９】
【図２Ｇ】図２Ｇは、様々な処理グループのウェスタンブロットの統計的評価を示す図である。＊は、ＡｄＶ−ｓｈＧＦＰと比較してｐ＜０．０５であることを表す。♯は、ｒＡＡＶ９−ｓｈＧＦＰと比較してｐ＜０．０５であることを表す。
【００３０】
【図２Ｈ】図２Ｈは、ｒＡＡＶ９−ＧＦＰを静脈内注射した１カ月後の心臓のＧＦＰ発現を示す写真である。左側の４枚のパネル（ｒＡＡＶ９−ＧＦＰ）は、一次ＧＦＰ抗体を伴っており、右側の２枚のパネル（コントロール）は、一次ＧＦＰ抗体を伴っていない。ＡＡＶ９分散に関する更なるデータは、心臓に対するｒＡＡＶ９−ＧＦＰ発現の最高親和性を示している。肝臓及び骨格筋では少量の発現がみられ、肺では非常に低かった。
【００３１】
【図２Ｉ】図２Ｉは、ｒＡＡＶ９−ＧＦＰを静脈内注射した１カ月後の他の器官におけるＧＦＰ発現を示す写真である。一次ＧＦＰ抗体を用いて左のパネル（ＲＡＡＶ９−ＧＦＰ）を示す。対して、抗体を用いないものを右のパネル（コントロール）に示す。
【００３２】
【図２Ｊ】図２Ｊは、ｒＡＡＶ９−ＧＦＰを静脈内注射した後の様々な器官におけるＧＦＰ定量を免疫ブロットによって示す写真及び図である。
【００３３】
【図３Ａ】図３Ａは、心不全に対するＲＮＡｉ治療の機能的及び形態的な効果を証明する一連の図である。心拡張の左室機能の血行動態パラメーターに対するＲＮＡｉ治療の影響がここに要約されている。ＴＡＢ後のラットにおける高左室充填圧（ＬＶＥＤＰ）は、ｓｈＧＦＰコントロール（レーン２及び４）と比較して、ｓｈＰＬＢベクター（レーン３及び５）によって有意に低下した。圧力低下の最大速度（−ｄＰ／ｄｔ）はｓｈＰＬＢ治療によって有意に上がり、等容性弛緩時定数Ｔａｕも同様であった。３カ月のｒＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ治療（レーン５）の後に値が正常範囲（レーン１）に戻った。
【００３４】
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａと類似した収縮期の左室機能に対する治療効果を示す一連の図である。心臓超音波検査によってｒＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ治療の３か月後に短縮率（ＦＳ）が正常化されたことが示されている一方で、ＦＳ改善は顕著であるが、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢに対してはそれほど顕著でなかった。血圧上昇の最大速度（＋ｄＰ／ｄｔ）は、コントロールと比較して改善された。収縮期血圧（ＬＶＳＰ）も同様であった。
【００３５】
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＴＡＢで誘導された左室肥大（レーン２及び４）を表す死後形態計測を示す一連の図であり、記録された左室重量及び左室／体重（ＬＶ／ＢＷ）比はベースライン（レーン１）の約２／３超である。後者は、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ又はｒＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢ（レーン３及び５）を用いた治療の１カ月後又は３カ月後に正常範囲内に減少した。心臓肥大は両方のベクタータイプによって有意に減少した。
【００３６】
【図３Ｄ】図３Ｄは、図３Ｃと同様に、心臓形態の超音波心臓検診データを要約する一連の図であり、形態測定の調査結果を裏付けている。
【００３７】
【図３Ｅ】図３Ｅは、心不全動物におけるＲＮＡｉ治療後の心臓コラーゲン量を示す図である。ｒＡＡＶ９−ｓｈＲＮＡ治療によって３カ月で線維化が有意に減少する結果となった。コントロールベクターには効果がなかった。
【００３８】
【図３Ｆ】図３Ｆは、いずれの治療方法によっても心筋細胞直径の有意な低下が誘導されることを示す図である。
【００３９】
【図３Ｇ】図３Ｇは、ＲＮＡｉ治療中における心臓のＢＮＰ  ｍＲＮＡ量を示す図である。‡は、ＡＡＶ９−ｓｈＧＦＰ対ＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢについてｐ＜０．０５であることを表す。¶は、ＡｄＶ−ｓｈＧＦＰ対ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢについてｐ＜０．０５であることを表す。
【００４０】
【図４Ａ】図４Ａは、ＲＮＡｉ治療中における細胞内マイクロＲＮＡの評価を示す一連の図である。図に示されているように、インビボ治療（ＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ、ＡＡＶ−ｓｈＧＦＰ、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ）用に後で用いたベクターでは、治療中に心臓で発現される５つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲｓ）の細胞内量は、治療していないＰＮＣＭと比較して変わらなかったが、ＣＭＶプロモータを有するベクターは、これらの細胞内量を有意に変化させた。
【００４１】
【図４Ｂ】図４Ｂは、標準ＰＮＣＭ培養条件下で得られた図４Ａのデータとは対照的に、細胞内ｍｉＲＮＡ量が肥大症誘導医薬品の存在下で有意に変化したことを示す一連の図である。
【００４２】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＲＮＡｉ治療中における心臓のｍｉＲＮＡ−１及びｍｉＲＮＡ−１３３量を示す一連の図である。‡は、ＡＡＶ９−ｓｈＧＦＰ対ＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢについてｐ＜０．０５であることを表す。¶は、ＡｄＶ−ｓｈＧＦＰ対ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢについてｐ＜０．０５であることを表す。
【００４３】
【図５Ａ】図５Ａは、ｓｈＲＮＡ生成に対するＣＭＶプロモータの干渉を示す図である。図に示されているように、図１Ａ及び図１Ｂにおいて分析した異なるＡＡＶベクターに加えて、ＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰ（機能性ＧＦＰカセットを有する）対ＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ−ＧＦＰ（ＣＭＶプロモータがない）、及び、ＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ−ＣＭＶ−β−イントロン対ＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ−β−イントロン（ＣＭＶなし）で直接的にベクターを比較する。
【００４４】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＡＡＶ６ｓｈＰＬＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰマーカベクターと共にインキュベートした５日後の培養心筋細胞の単分子層を示す写真であり、ＡＡＶ６偽型に対する非常に高いトランスダクション率と一致する。
【００４５】
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＭＣＶから、終結シグナルを経て、ＲＮＡｉを媒介する短ヘアピンの適切な形成を損なう非常に短いｓｈＲＮＡ配列までのリードスルーにおけるＵ６−ｓｈＰＬＢ−ｂＧＨ方向の乱されたｓｈＲＮＡ生成についてのあり得る原因を示す図である。
【００４６】
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＲＮＡｉ治療中のＮＲＣＭにおけるカルシウム恒常性の変化を示す一連の図である。
【００４７】
【図５Ｅ】図５Ｅは、ＲＮＡｉ治療中のＮＲＣＭにおけるカルシウム恒常性の変化を示す一連の図である。
【００４８】
【図６】図６は、心不全を有し、ＡＡＶ９／ＰＬ−ＲＮＡｉを用いて治療したラットにおける改善された生存率を示す図である。図６は、ベクターを単独で用いるか又はＧＦＰと共に用いたコントロールと比較して、ＡＡＶ９／ＰＬ−ＲＮＡｉの発現を用いたＲＮＡｉ遺伝子導入によるフォスフォランバンの阻害が、圧負荷されて心不全への移行段階にある肥大症を有するラットの生存率に与える効果を示す。
【００４９】
【図７】図７は、ブタの虚血再潅流モデルにおいて心室性不整脈が低減された結果を示す図である。ＧＦＰを用いたコントロールベクターと比較して、この試験では、ＡＡＶ９／ＰＬ−ＲＮＡｉの発現を用いた。
【００５０】
【図８】図８は、ブタの虚血再潅流モデルにおける改善された心室機能の結果を示す図である。ベクターを単独で用いるか又はＧＦＰと共に用いるコントロールと比較して、この試験では、ＡＡＶ９／ＰＬ−ＲＮＡｉの発現を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明の組成物、方法及び治療方法について述べる前に、本発明は、記載されている特定の組成物、方法及び実験条件に限定されず、組成物、方法及び条件を変更してもよいことがが理解されるであろう。本発明の範囲は添付の請求項のみにおいて限定され、ここで用いられる用語は、特定の実施形態を記載するためだけのものであり、限定するようには意図されていないことも理解されるであろう。
【００５２】
この明細書及び添付されている特許請求の範囲で用いているように、単数形（「ａ」、「ａｎ」「ｔｈｅ」）は、別段の定めがなければ、複数のものを含む。従って、例えば「前記方法」への言及は、ここに記載されている類型であって、この開示を参照した当業者らに明らかである類型の１つ以上の方法及び／又はステップを含む。
【００５３】
ここで用いる技術的用語及び科学的用語のすべては、別段の定めがない限り、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載されているものに類似するか又は同等である任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験で用いることができるが、以下に非限定的な方法及び材料を記載する。
【００５４】
本発明の実施は、別段の定めがない限り、当該技術分野内のウイルス学、微生物学、分子生物学、及び、組換ＤＮＡ技術の従来的方法を使用する。そのような技術は、文献に充分に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（現行版）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ, ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，現行版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，現行版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  （Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，現行版）；ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｅｓｓｅｎ，ｅｄ．）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照されたい。
【００５５】
本発明は、心臓のＣａ２＋恒常性の重要な調節因子であるＰＬＢに相補的なＲＮＡｉを用いた対象における心不全（ＨＦ）の治療を成功裏に実証している。合成した小さい干渉ＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介するが、インビボにおける使用は、血漿中での不安定性及びターゲット細胞中への低い移送性によって制限されている。本出願人らは、アデノウイルスの短ヘアピン型ＲＮＡベクター（ＡｄＶ−ｓｈＲＮＡ）が心筋細胞（ＰＮＣＭ）においてＰＬＢを抑制し、インビボにおいて心不全動物の血流動態を改善することを証明した。本出願人らは、心臓機能の回復、心臓拡張及び肥大症の回復、並びに、生存率の改善を達成したＲＮＡｉを運ぶ心臓作用性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターも開発した。ＰＮＣＭにおいて、フェニレフリンに誘発される肥大症関連マイクロＲＮＡのデレギュレーションをＲＮＡｉベクターによって元に戻した。収縮能に対するそれらの効果を越えて、ＲＮＡｉターゲッティングは、マイクロＲＮＡ量を変化させ、それによって、血流動態因子又は神経液活性化がなくても細胞の転写プログラムを直接的に変化させる。
【００５６】
一実施形態においては、心不全の治療方法が開示されており、この方法は、必要性がある対象に治療的有効量のＲＮＡｉ発現カセットを投与するステップにおいて、前記カセットが、その発現生成物がフォスフォランバン（ＰＬＢ）の発現及び／又は活性を減少させるウイルス粒子ベクター及びＲＮＡｉ配列を、対象の心筋細胞に形質導入するのに有効な量で含み、それによってＲＮＡｉ発現カセットを発現させて対象の心不全を治療するステップを具える。
【００５７】
本発明は、局所的に誘導したＲＮＡｉによって心臓病を治療する方法を開示する。心不全は依然として発展途上国における死亡率の主要原因である。現行の薬物療法は有効性が限定的であり、進行した心不全においては左室補助装置又は心臓移植が最終的な選択肢である。心不全は複合的要因の結果として生じることもあるが、不完全な心臓のＣａ２＋恒常性が重要な最終共通路であると認識されている。心不全は、ＳＥＲＣＡ２ａの発現低下及び／又はＰＬＢリン酸化から結果的に生じる、ＰＬＢで制御される筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼポンプの機能不全に部分的に起因する（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９９）２７７：Ｈ４７４〜４８０）。リン酸化されていないＰＬＢは、ＳＥＲＣＡ２ａのＣａ２＋親和性を低く維持し、結果として、筋小胞体へのＣａ２＋取り込みを減少させ、弛緩を遅くし、筋小胞体Ｃａ２＋負荷を減少させるが、β−アドレナリン刺激に対するＰＬＢリン酸化は、この阻害を低下させる（ＭａｃＬｅｎｎａｎ，Ｄ．Ｈ．＆  Ｋｒａｎｉａｓ，Ｅ．Ｇ．Ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ：ａ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４，５６６−７７（２００３））。ＰＬＢ遺伝子の生殖細胞切除（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ（１９９４）７５：４０１−４０９）、及び、ドミナントネガティブＰＬＢ突然変異体用の体細胞遺伝子移行（Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００２）８：８６４−８７１；Ｉｗａｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（２００４）１１３：７２７−７３６）、及び、ＰＬＢアンチセンスＲＮＡ（Ｅｉｚｅｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２０００）１０１：２１９３−２１９９；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９９）１００：９７４−９８０）又は細胞内の抑制性ＰＬＢ抗体を用いて、ＳＥＲＣＡ２ａ活性及び収縮能を増大させ、心不全モデルを治療した（Ｄｉｅｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ（２００５）６７：６７８−６８８；Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ（２００４）１８：１３１２−１３１４；Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ−ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃａｌｃｉｕｍ  ＡＴＰａｓｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｄｅｆｅｃｔ  ｉｎ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｃｅｌｌ  ９９，３１３−２２（１９９９））。化学合成した短い干渉ＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡｓ）によって媒介されるＲＮＡｉは、心筋細胞においてインビトロでさえも有効性及び安定性が低かった（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ，ＪＭｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ（２００４）３７：６９１−６９８）。
【００５８】
合成低分子干渉ＲＮＡの根本的な２つの限界は、血漿及びターゲット細胞中での急速な分解、並びに、適切な移送及びインビボでのターゲッティングの問題である。ウイルスベクターは、これらの限界を克服する潜在能力を有する。本発明において、Ｃａ２＋を操作するタンパクを含む他の心臓タンパクの発現が変化しなかったことは、ターゲット特異性が高いことを示している。このように、一連のベクター及びそれらの有効性の決定要因の機能的特性評価を行って、その後、重篤な心不全の動物モデルにおいて、従来のアデノウイルスベクターと共に、最適化されたパルボウイルス（すなわち、ＡＡＶ）を決定し、及び、ＲＮＡｉ治療中の心筋細胞マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）経路を決定した。このように、ここで与えるデータは、インビボにおける心臓機能の回復、及び、病的な肥大及び拡張の減少を証明する。
【００５９】
ここで用いられている「パルボウイルス」との用語は、自己複製するパルボウイルス及びディペンドウイルスを含むパルボウイルス科を包含する。自律性パルボウイルスには、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属及びコントラウイルス属のメンバーが含まれる。自律性パルボウイルスは、限定されないが、例えば、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、タイワンアヒルパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、及び、他の自律性パルボウイルスを含む。他の自律性パルボウイルスは当業者に知られている。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｃｈａｐｔｅｒ  ６９（４ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。
【００６０】
パルボウイルスは、約５０００のヌクレオチド長のゲノムを有する小さい単鎖非エンベロープＤＮＡウイルス科である。その科に含まれるのは、アデノウイルス（Ａｄ）及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノウイルスは、気道の膜、目、腸及び尿路に感染する一群のウイルスを表す。アデノウイルスは、エンドソーム経由で輸送できる最大サイズである（すなわち、エンベロープ融合は必要ではない）ので、最大の非エンベロープウイルスを表す。ウイルス粒子も、宿主細胞への付着を助けるカプシドの各ペントンベースに付属した独特な「スパイク」又は繊維を有する。ＡＡＶは、定義によれば、増殖感染サイクルを開始及び維持する別のウイルス（一般的にはアデノウイルス又はヘルペスウイルス）との重感染を必要とする依存パルボウイルスである。そのようなヘルパーウイルスの非存在下においてもなお、ＡＡＶは、レセプタ媒介性結合及び内在化によってターゲット細胞に感染するか又はトランスダクションする能力があり、非分裂細胞及び分裂細胞のいずれにおいても核に浸透する。
【００６１】
核内に入ると、ウイルスが脱殻し、導入遺伝子が多数の異なる形態から発現する。最も難分解性であるものは環状の単量体である。ＡＡＶは、安定に形質導入された細胞の１〜５％のゲノムに統合されるであろう（Ｎａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１１３４３−３４９，２００２）。導入遺伝子の発現は非常に安定であり得て、第ＩＸ因子のＡＡＶ送達を用いた研究においては、イヌモデルが、ウイルスによる単独の直接的な注射の４．５年後に治療的レベルのタンパクを発現し続けている。ヘルパーウイルスの非存在下においてはＡＡＶ感染から子孫ウイルスが生産されないので、形質導入の範囲は、ウイルスに感染した最初の細胞だけに限定されている。本発明においてＡＡＶを適切な遺伝子療法ベクターにしているのはこの特徴である。更に、レトロウイルス、アデノウイルス及び単純性疱疹ウイルスとは異なり、ＡＡＶは、ヒト病原性及び毒性がないと考えられる（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：２５１，２００３  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：３４６−５８，２００３）。
【００６２】
ＡＡＶのゲノムは、一般に遺伝子を２個だけ含む。「ｒｅｐ」遺伝子は、ＤＮＡ複製に用いられる少なくとも４つの分離したタンパクをコードする。「ｃａｐ」遺伝子生成物は、別々にスプライシングされてウイルスのカプシドを構成する３つのタンパクを生成する。新生ウイルス中にゲノムを詰め込むときに、逆方向末端反復のみ（ＩＴＲ）が必須の配列である。ｒｅｐ及びｃａｐは、ゲノムから削除してもよく、最適な異種配列で置換してもよい。しかしながら、ＡＡＶをベースとする異種構築物を複製し、新生ウイルス粒子に詰め込むために必要とされるタンパクを生産するために、ｒｅｐとｃａｐとのタンパクをトランスで提供しなければならない。ヘルパー機能は、アデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの重感染によって一般的に提供される、１以上のＤＮＡ発現プラスミドの形でトランスで提供してもよい。そのゲノムが通常は２個の遺伝子だけをコードするので、送達手段として、ＡＡＶが一本鎖の４．５キロベース（ｋｂ）の詰め込み能力で限定されていることは驚くべきことではない。しかしながら、このサイズ制限は、置換遺伝子治療用に送達可能な遺伝子を限定する可能性もあるが、そのことはＲＮＡｉなどの短い配列の詰め込み及び発現に悪影響を及ぼさない。
【００６３】
ＲＮＡｉ応用のためのＡＡＶの有用性は、インビトロにおいてＡＡＶを用いてｓｈＲＮＡを送達することによってｐ５３及びカスパーゼ８発現を抑制する試験で証明された（Ｔｏｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：５７１２−１５，２００３）。ＡＡＶ−２空ベクター中に適切な配列をクローニングした後に、感染性ＡＡＶウイルス粒子をＨＥＫ２９３細胞中で生成し、ヒーラＳ３細胞に感染させるために用いた。内因性カスパーゼ８及びｐ５３の量の用量依存的な減少が証明された。Ｂｏｄｅｎらも、使用済み媒体におけるｐ２４生産によって評価されているように、インビトロにおいてＡＡＶを用いてｓｈＲＮＡを送達することによって組織培養系（Ｂｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（２１）：１１５２３１−３５，２００３）におけるＨＩＶ複製を抑制した。
【００６４】
しかしながら、ＡＡＶを運搬手段としてＲＮＡｉ発現構築物に用いるときには、技術的なハードルをクリアしなければならない。例えば、ヒト人口の数パーセントが特定のＡＡＶ血清型に対する中和抗体を有している可能性がある。しかしながら、中和抗体を有する患者のパーセンテージが非常に低いいくつかのＡＡＶ血清型が存在しているので、他の血清型を用いることもでき、あるいは、偽型を用いてもよい。特性が明らかにされた少なくとも９個の異なる血清型が存在しており、単離されたが、それほど研究されていない他の数十個の血清型も存在している。もう１つの限界は、ＡＡＶに対して生じ得る免疫反応の結果から、ＡＡＶに基づく治療を一度しか実施できないことである。しかしながら、非ヒト由来の代替的血清型の使用は、反復実施を可能にするかもしれない。送達したゲノムの投与経路、血清型及び組成物のすべてが組織特異性に影響を及ぼし得る。
【００６５】
ＲＮＡｉ発現構築物と共に非修飾ＡＡＶ系を用いることにおける別の限界は、形質導入が非能率になり得るということである。インビボにおける安定な形質導入は、細胞の５〜１０％に限定される可能性がある。しかしながら、安定な形質導入レベルを高める様々な方法が当業界において知られている。１つのアプローチは、他の血清型に由来するｃａｐタンパクを用いてＡＡＶ−２ゲノムを詰め込む偽型を用いることである。例えば、Ｍｉｎｇｏｚｚｉらは、ＡＡＶ−２対応物に代えてＡＡＶ−５ｃａｐ遺伝子を用いることによって、安定な形質導入を肝細胞の約１５％に増加させた（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（２０）：１０４９７−５０２，２００２）。Ｔｈｏｍａｓらは、インビボにおいてＡＡＶ８カプシド遺伝子を用いてマウス肝細胞の３０％超に形質導入した（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，近刊）。Ｇｒｉｍｍら（Ｂｌｏｏｄ．２００３−０２−０４９５）は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５及びＡＡＶ−６を用いて、ＡＡＶ−２を完全に偽型にした。最高レベルの導入遺伝子発現は、ウイルス粒子を用いて偽型にしたＡＡＶ−６によって誘導され、ＡＡＶ−２よりも２０００％近く高い導入遺伝子発現をもたらした。従って、本発明は、偽型ＡＡＶウイルスを用いて高い形質導入レベルを達成し、それに対応するＲＮＡｉ多重プロモータ発現構築物の発現における増加を意図する。
【００６６】
ここで用いられているように、「アデノ随伴ウイルス」という用語（ＡＡＶ）は、限定されないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、鳥ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、及び、現在知られている他のＡＡＶを含む。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｃｈａｐｔｅｒ  ６９（４ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。最近、新しいＡＡＶ血清型及び分岐群と推定されるものが多数確認された（例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，（２００４)Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：６３８１−６３８８；Ｍｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３−：３７５−３８３を参照されたい。）。一実施形態においては、ＡＡＶがＡＡＶ９型である。
【００６７】
様々な血清型のＡＡＶ及び自律性パルボウイルスのゲノム配列、並びに、末端反復（ＴＲｓ）、Ｒｅｐタンパク及びカプシドサブユニットの配列は、当業界で知られている。そのような配列は、文献、又は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を含む（限定されない）ＧｅｎＢａｎｋなどの公共データベースにおいて見つけることができる。これらの開示は、パルボウイルス及びＡＡＶ核酸及びアミノ酸配列を教示する目的で、ここにおいて言及することによって組み込まれている。また、例えば、ここにおいて言及することにより組み込まれているＳｒｉｖｉｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：９３９；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３−：３７５−３８３；国際公開公報ＷＯ００／２８０６１，ＷＯ９９／６１６０１，ＷＯ９８／１１２４４；及び、米国特許第６，１５６，３０３号を参照されたい。
【００６８】
ここで用いられている「向性」という用語は、例えば組み替えウイルスの異種ヌクレオチド配列の発現などのように、細胞内ウイルスゲノムによって運搬される配列の発現（例えば転写及び任意に翻訳）を後に選択的に伴う、特定の細胞又は組織へのウイルスの優先的な侵入を意味する。当業者は、例えば誘導可能なプロモータ又は他の方法で制御される核酸配列に対するトランス作用因子の非存在下においては、ウイルスゲノムからの異種核酸配列の転写が開始されない可能性があることを理解できるであろう。ｒＡＡＶゲノムの場合には、ウイルスゲノムからの遺伝子発現が、安定に統合されたプロウイルスからであってもよく、統合されていないエピソーム及び細胞内でウイルスがとり得る他の形態からであってもよい。
【００６９】
ここで用いられているように、別段の定めがない限り、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド及びタンパク（天然又は非天然を含む）の両方を包含する。
【００７０】
ここで用いられているように、「単離された」ポリペプチド（例えば「単離されたペプチド」又は「単離されたタンパク」）は、例えば、細胞若しくはウイルスの構造成分又はポリペプチドに付随して一般的にみられる他のポリペプチド又は核酸などの天然に存在する生命体又はウイルスの他の成分の少なくともいくつかから、少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。
【００７１】
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列（天然又は非天然ヌクレオチドを含む）であってもよいが、代表的実施形態においては、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ配列である。
【００７２】
ここで用いられているように、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば「単離されたＤＮＡ」又は「単離されたＲＮＡ」）は、例えば、細胞若しくはウイルスの構造成分、又は、ポリヌクレオチドに付随して一般的にみられる他のポリペプチド若しくは核酸などの天然に存在する生命体又はウイルスの他の成分の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。
【００７３】
ここで用いられているように、ウイルスベクターを「単離」又は「精製」する（又は文法的に同等のもの）ことは、出発物質中の他の成分の少なくともいくつかからウイルスベクターを少なくとも部分的に分離することを意味する。
【００７４】
「治療ポリペプチド」は、細胞又は対象におけるタンパクの欠如又は欠陥から結果的に生じる症状を緩和又は低減できるポリペプチドである。代替的に、「治療ポリペプチド」は、例えば抗不整脈効果、心不全における生存の改善などのように、対象に他の点で利益を与えるものである。
【００７５】
細胞による核酸組成物の取り込みを表すために「トランスフェクション」を用いる。外因性の核酸組成物が細胞膜を通過すると、細胞が「トランスフェクト」される。当業界において多くのトランスフェクション技術が周知である。例えば、［６９，７０］，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，及び［７１］を参照されたい。そのような技術を用いて、適切な宿主細胞中に、プラスミドベクター及び他の核酸分子などの１つ以上の核酸組成物を導入することができる。この用語は、遺伝物質の安定的な取り込み及び一時的な取り込みの両方を意味する。本発明の目的において、「形質導入（トランスダクション）」は、ウイルスベクターを介した「トランスフェクション」の特別な形態である。
【００７６】
「形質導入（トランスダクション）」は、インビボ、インビトロ、又は、エキソビボにおいて、組み換えＡＡＶウイルス粒子などのウイルス又はウイルスベクターを介した、レシピエント細胞への、レシピエント細胞中への、又は、レシピエント細胞内での核酸組成物の送達を意味する。形質導入は、トランスフェクションの特別な形態である。つまり、トランスフェクションという用語は、形質導入という用語を含む。
【００７７】
「治療する」という用語は、文法的に同等のものを含めて、対象の病状の重症度を下げるか、若しくは、少なくとも部分的に改善するか、若しくは、回復させること、及び／又は、少なくとも１つの臨床症状のある程度の緩和、鎮静化、若しくは、低減を達成すること、及び／又は、病状の進行を遅延させること、及び／又は、病気又は疾患の発症を予防又は遅延させることを意味する。従って、「治療」という用語は、予防養生及び治療養生の両方を意味する。
【００７８】
「異種ヌクレオチド配列」又は「異種核酸」は、天然ウイルス中に存在していない配列である。通常、異種核酸は、ポリペプチド又は翻訳されない対象ＲＮＡ（例えば細胞又は対象への送達するためのもの）をコードするオープンリーディングフレームを具える。
【００７９】
ここで用いられているように、「ウイルスベクター」、「ベクター」又は「遺伝子送達ベクター」という用語は、核酸伝達手段として機能し、ＡＡＶカプシド内に詰め込まれたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を具えるウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を意味する。代替的に、いくつかの文脈においては、「ベクター」という用語は、ベクターゲノム／ウィルスＤＮＡのみを表すために用いることができる。
【００８０】
「ｒＡＡＶベクターゲノム」又は「ｒＡＡＶゲノム」は、１以上の異種ヌクレオチド配列を具えるＡＡＶゲノム（すなわちｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、ウイルスを生成するために、シスで末端反復（ＴＲ）の１４５塩基だけしか通常は必要としない。ウイルスの他のすべての配列は、必須ではなく、トランスで与えられてもよい（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。一般的に、ｒＡＡＶベクターゲノムは、最小限の末端反復だけを保持して、ベクターによって効率的に詰め込むことができる導入遺伝子のサイズを最大化する。構造的タンパク及び非組織的タンパクをコードする配列を、トランスで（例えば、プラスミドなどのベクターから、又は、詰め込み細胞中に安定にその配列を統合することによって）与えてもよい。ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つの末端反復配列（例えばＡＡＶ末端反復配列）、任意に２つの末端反復（例えば２つのＡＡＶ末端反復）を具え、これらの末端反復配列は、異種ヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端に通常存在するが、それらに隣接している必要はない。末端反復は、互いに同一又は異なっていてもよい。
【００８１】
「ＡＡＶ末端反復」又は「ＡＡＶ  ＴＲ」は、限定されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１を含む任意のＡＡＶから由来してもよい。末端反復が所望の機能（例えば複製、ウイルス詰め込み、統合、及び／又はプロウイルス救命など）を媒介する限り、ＡＡＶ末端反復は、野生型の端子反復配列（例えば、野生型配列が、挿入、欠失、切断又はミスセンス突然変異によって変化していてもよい）を必要としない。
【００８２】
「末端反復」又は「ＴＲ」という用語は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌに付与された米国特許第５，４７８，７４５号に記載されている「二重Ｄ配列（ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」などの逆方向末端反復のような、ヘアピン構造及び機能を構成する任意のウイルスの末端反復及び合成配列を含む。自律性パルボウイルス及びＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６９＆７０（４ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）にさらに詳細に記載されている。また、ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＡＡＶ２（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５−１０），ＡＡＶ４（Ｐａｄｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７−５８），ＡＡＶ５（Ｗａｌｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：  ３３６１−７１）ａｎｄ  ＣＰＶ（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７−５２０  ａｎｄ  Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１４５６−６４）の説明を参照されたい。「ＡＡＶミニ遺伝子」は、最小限のＡＡＶ１末端反復及び異種核酸成分からなる構築物を意味する。ウイルスベクター、プラスミドベクターなどを含む任意の適切なベクター上でミニ遺伝子を運搬して本発明によるｒＡＡＶを生産してもよい。
【００８３】
さらに、本発明のウイルスベクターは、「ターゲット」されているウイルスベクター（例えば、定方向向性を有する）、及び／又は、国際公開公報ＷＯ００／２８００４及びＣｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：６１９に記載されている「ハイブリッド」パルボウイルス（つまり、ｒＡＡＶゲノム及びウイルスカプシドが異なるパルボウイルスに由来するもの）であってもよい。
【００８４】
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許出願公開公報ＷＯ０１／９２５５１に記載されている二本鎖パルボウイルス粒子であってもよい。従って、いくつかの実施形態においては、二本鎖（二重）ゲノムを本発明のウイルスカプシド内に詰め込むことができる。
【００８５】
さらに、ウイルスのカプシド又はゲノムは、挿入、欠失、及び／又は置換を含む他の修飾を含むことができる。
【００８６】
従って、ここで用いられているように、「ウイルスベクター」という用語は、ハイブリッドの、ターゲットされた、二本鎖のウイルス粒子並びにパルボウイルス及びＡＡＶの他の修飾された形態を包含する。
【００８７】
ここで用いられているように、「脊椎動物」という用語は、哺乳動物、鳥類、魚又は爬虫類を包含する。例えば、脊椎動物は、哺乳類であってもよい。「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒト霊長類、家畜動物（例えばヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ロバ、ウマ）、実験室試験動物（例えばネズミ、マウス、ラビット、モルモット、ハムスター）、ペット（例えばイヌ、ネコ）、又は、捕獲した野生動物を含む。哺乳動物は、限定されないが、ヒト及びネズミ科哺乳動物を含む。
【００８８】
本発明は、一部分において、心不全を治療する方法として、ＲＮＡｉを介して遺伝子抑制を容易にして、心臓細胞におけるカルシウム流れの調節に直接的に又は間接的に関係する、１以上の転写的活性遺伝子領域を下方制御又は抑制する薬剤の適用に基づいている。一実施形態においては、心不全を治療する方法であって、必要性のある対象に治療的有効量のＲＮＡｉ発現カセットを投与するステップを具え、前記カセットは対象の心筋細胞に形質導入するのに有効な量でウイルス粒子ベクター及びＲＮＡｉ配列を含み、前記ＲＮＡｉ配列の発現生成物がフォスフォランバン（ＰＬＢ）ｍＲＮＡの発現を減少させ、それによって、ＲＮＡｉ発現カセットを発現させて対象の心不全を治療する方法を開示する。
【００８９】
「ＲＮＡ干渉」という用語は、通常、二本鎖ＲＮＡ分子が、前記二本鎖ＲＮＡ分子又は短ヘアピンＲＮＡ分子と実質的又は完全に相同な核酸配列の発現を変化させるプロセスを意味する。理論付けられていないが、作用機構は、限定されないが、直接的又は間接的なＰＬＢ遺伝子の発現の下方制御、ＰＬＢ  ｍＲＮＡにおける減少、及び／又は、ＰＬＢ活性の低下を含む。「ＲＮＡｉ」という用語は、ＲＮＡ干渉を誘発するＲＮＡ配列であって、ベクターから転写されるものを意味する。「短ヘアピンＲＮＡ」又は「ｓｈＲＮＡ」という用語は、二本鎖領域及びループ領域を有するＲＮＡ構造を意味する。ステムループ又はパンハンドル二次構造を有するＲＮＡ分子を特に含むように理解すべきである。本発明のいくつか実施形態においては、ＲＮＡｉは、まずｓｈＲＮＡとして発現される。
【００９０】
「ＲＮＡｉ発現カセット」という用語は、少なくとも１つの［プロモータＲＮＡｉ−ターミネータ］単位を有する本発明の実施形態によるカセットを意味する。「複合プロモータＲＮＡｉ発現カセット」という用語は、２つ以上の［プロモータＲＮＡｉ−ターミネータ］単位を具えるＲＮＡｉ発現カセットを意味する。「ＲＮＡｉ発現構築物」、「ＲＮＡｉ発現ベクター」という用語は、少なくとも１つのＲＮＡｉ発現カセットを含むベクターを意味する。
【００９１】
ＲＮＡｉは、通常、ターゲットとＲＮＡｉとの同一な配列によって最適化される。１００％より低い相同性であってもＲＮＡ干渉現象がみられるが、特異的二本鎖領域を形成するためには、相補領域が互いに十分に相同でなければならない。ＲＮＡ干渉を生じさせるのに有効な二本鎖領域を実現するための正確な構造的規則は、完全には確認されていないが、通常、約７０％の同一性で充分である。従って、本発明のいくつかの実施形態において、ＲＮＡｉとＰＬＢとの相同性は、少なくとも７０％のヌクレオチド配列の同一性であり、少なくとも７５％のヌクレオチド配列の同一性であってもよい。この相同性は、限定されないが、少なくとも８０％のヌクレオチド配列の同一性を含み、少なくともの８５％又は９０％ものヌクレオチド配列の同一性である。一実施形態においては、ターゲット配列とＲＮＡｉのセンス鎖との配列相同性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のヌクレオチド配列の同一性である。
【００９２】
さらに考慮すべきことは、ＲＮＡ二本鎖においては、ＧがＣと対になるほど強くないが、ＧがＵと対になるという点において、ＲＮＡにおける塩基対合がＤＮＡとは微妙に異なっているということである。さらに、ＲＮＡｉの有効性のために、アンチセンス鎖がターゲット配列と相同であることがさらに重要である。いくつかの状況においては、２１個のヌクレオチドのうちの１７個のヌクレオチドがＲＮＡｉを開始させるのに充分であることが知られているが、他の状況においては、２１個のヌクレオチドのうちの１９個又は２０個の同一性が必要である。理論付けられていないが、一般的なレベルでは、二本鎖領域の中央部分において端部よりもさらに高い相同性が必要である。ある程度の抑制が求められるだけの状況においては、完全な相同性に対して所定の程度の欠損を特定の構築物中に設計することによってＲＮＡｉ活性を低下させ、ターゲット遺伝子生成物を部分的にサイレンシングするか又は抑制してもよい。そのようなケースにおいては、アンチセンス配列の１つ又は２つの塩基しか変更することができない。一方で、センス鎖は、突然変異に対してより強い耐性がある。理論付けられていないが、これは、触媒的に活性であるアンチセンス鎖に起因する可能性がある。従って、センス鎖と及びターゲット遺伝子の転写領域との間の同一性が低下しても、アンチセンス鎖が完全にその転写物と完全にハイブリダイズする場合は特に、必ずしもＲＮＡｉ活性が低下しないであろう。センス鎖における突然変異（ターゲット遺伝子の領域の転写と同一でないもの）は、ヘアピン構築物の配列決定を支援するのに有効であり、ヘアピン転写物のダイサープロセッシングを調整すること又はＲＮＡｉ経路の他の態様などの他の目的に潜在能力がある。
【００９３】
「ハイブリダイズ」及び「アニーリング」という用語（これらと文法的に同等のものを含む）は、本明細書においてはヌクレオチド配列に関して区別なく用いられ、それらの相補性によってワトソンクリック塩基対を形成することができるヌクレオチド配列を意味する。また、当業者は、特にＲＮＡ配列と関連して、非ワトソンクリック型塩基対が可能であることを理解するであろう。例えば、いわゆる「ゆらぎ塩基対」は、ＲＮＡにおいてグアノシン残基とウラシル残基との間に生じ得る。
【００９４】
ＲＮＡｉ発現カセットのＲＮＡ発現生成物によって、ＲＮＡ干渉を誘導する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）複合体が生成され、従って、哺乳類遺伝子の発現を下方制御するか又は減少させる。「ｄｓＲＮＡ」は、２つのワトソンクリック塩基対の相補的ＲＮＡ鎖を具えるリボ核酸複合体を意味する。前記ｄｓＲＮＡ複合体は、６５℃における０．２×ＳＳＣの洗浄ステップを含む緊縮条件下で少なくとも１つの哺乳動物遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第１ヌクレオチド配列、及び、前記第１ヌクレオチド配列に相補的な第２ヌクレオチド配列を具える。第１ヌクレオチド配列が第３ヌクレオチド配列（例えばＲＮＡループ）によって第２ヌクレオチド配列に連結して、第１ヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とが同じＲＮＡ分子の一部であるようにしてもよい。代替的に、第１ヌクレオチド配列が１つのＲＮＡ分子の一部であってもよく、また、第２ヌクレオチド配列が他のＲＮＡ分子の一部であってもよい。従って、ｄｓＲＮＡ複合体が分子間ハイブリダイゼーション又はアニーリングによって形成されてもよいし、又は、前記ｄｓＲＮＡ複合体が分子間ハイブリダイゼーション又はアニーリングによって形成される。
【００９５】
本明細書中において、「相補的」は、ワトソン−クリック型塩基対を示すように通常の方法で用いられている。「非相補的」は、非ワトソン−クリック型塩基対を意味するように用いられ、そのような非相補的配列は、ゆらぎ塩基対又はその他の相互作用を形成してもよい。しかしながら、本発明の文脈において、「対にならない」配列への言及は、ワトソンクリック型塩基対が生じない配列に特に関する。従って、非ワトソン−クリック型塩基対が理論上又は実際上生じるか否かに関わらず、配列の本発明によるスペーシング又はバブルシーケンスの実施形態を、対にならない配列としてここに記載して図示する。
【００９６】
２つ以上のポリヌクレオチドの配列関係を説明するために用いられる用語には、「基準配列」、「比較領域」、「配列類似性」、「配列同一性」、「配列類似性のパーセンテージ」、「配列同一性のパーセンテージ」、「実質的類似」、「実質的同一」が含まれる。「基準配列」は、長さにおいて、少なくとも１０、高い頻度で１５〜２５、３０などのようにしばしば２５を超えるモノマー単位であり、ヌクレオチドを含む。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似した配列（つまり完全なポリヌクレオチド配列の一部だけ）、及び、（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列を具えている可能性があるので、２つ（又はそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、通常、「比較領域」について２つのポリヌクレオチドの配列を比較し、配列類似性の局所的領域を確認及び比較することによって行う。「比較領域」は、隣接している通常は少なくとも約１０の残基の概念的部分であって、基準配列と比較される部分を意味する。前記比較領域は、２つの配列の最適なアラインメントのために、基準配列（付加又は欠失を具えていない）と比較して約２０％以下の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を具えていてもよい。比較領域を整列させるための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズム（例えば、ギャップ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン，米国）をコンピューター処理によって実装することによって、又は、検査、及び、選択した様々な方法のいずれかによって生成される最善のアラインメント（つまり、比較領域について最も高いパーセンテージの相同性となる）によって行ってもよい。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌによって開示されたプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照する。配列分析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌのＵｎｉｔ１９．３でみつけることができる。「配列同一性のパーセンテージ」は、例えば、比較領域について２つの最適に整列した配列を比較するステップと、両方の配列において同一の核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を与えるステップと、比較領域中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）によってマッチした位置の数を除するステップと、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを与えるステップと、によって算出してもよい。本発明の目的において、「配列同一性」は、ソフトウェアに添付されているレファレンスマニュアルにおいて用いられている標準的初期設定を用いて、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム(ウインドウズ用バージョン；Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア、米国、から入手可能)によって算出される「マッチパーセンテージ」を意味することが理解できるであろう。
【００９７】
代替的に、ポリヌクレオチドについての相同性／同一性をハイブリダイゼーション試験によって測定することができる。ここで用いられているように、第１核酸配列又はフラグメント（例えばプライマー、プローブなど）が選択的に第２核酸配列にハイブリダイズすると考えられ、従って、（ｉ）ハイブリダイゼーションの厳密性が低い又は高い条件である例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄｉｔｈｉｏｎ，１９８９）に記載されているような一般的なハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下において、又は、（ｉｉ）例えば、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温；その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃、３０分で１回；２×ＳＳＣ、室温、各１０分で２回といった、最大で約２５〜３０％の塩基対不整合を許容する厳格な洗浄条件下、又は、（ｉｉｉ）標準的なＰＣＲ条件下又は「タッチダウン」ＰＣＲ条件下において、そのような第２配列が第１配列又は変異体に特異的にハイブリダイズすることができるか又は特異的にポリメラーゼチェーン反応を開始することができれば、「実質的相同」を示す。
【００９８】
ここで用いられている「ハイブリダイズ条件」という用語は、通常、核酸の２つの相補鎖間、特に、少なくとも７個のヌクレオチド長を有するＲＮＡの２つの相補鎖間のハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。ハイブリダイズ条件は、当業界で周知であり、限定されるものではないが、細胞内生理的条件などの生理学的条件を含む。
【００９９】
本発明のＲＮＡｉは、短い二本鎖の、又は、特に部分的に二本鎖の（例えば、パンハンドル、ステムループ及びヘアピン）ＲＮＡであって、正常な哺乳動物細胞において有毒でないＲＮＡを具えていてもよい。細胞毒性を示さない限り、本発明のＲＮＡｉの長さに特段の制限はない。ＲＮＡｉは、例えば、約１０〜７１ｂｐの長さ、約１５〜４９ｂｐの長さ、約１５〜３５ｂｐの長さ、及び、約１９〜２９ｂｐの長さ又は約１９〜２１ｂｐの長さであってもよい。ＲＮＡｉの二本鎖ＲＮＡ部位は、完全に相同であってもよく、又は、配列ミスマッチ（各鎖において対応ヌクレオチドが相補的でない）、突出部（１つの鎖における対応する相補ヌクレオチドの欠如）などによって対にならない部位を含んでいてもよい。そのような対にならない部分は、ＲＮＡｉの二本鎖形成又は有効性を著しく妨げない程度まで許容することができる。
【０１００】
「低分子干渉ＲＮＡ」又は短鎖干渉ＲＮＡは、典型的なオリゴヌクレオチド合成などのような当業界で知られている方法によって製造することができ、多くの場合、化学修飾することによって、低分子干渉ＲＮＡの半減期及び／又は有効性を増加させ及び／又はさらに強固な送達製剤を可能にする。当業界においてオリゴヌクレオチドの多数の修飾が知られている。例えば、米国特許第６，６２０，８０５号は、ポルフィリンなどの正味の正電荷を有する大員環と結合したオリゴヌクレオチドを開示している。米国特許第６，６７３，６１１号は様々な製法を開示している。米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号、第２００４／０１７１０３２号及び第２００４／０１７１０３１号は、シクロブチルヌクレオシド、シクロペンチルヌクレオシド、プロリンヌクレオシド、シクロヘキセンヌクレオシド、ヘキソースヌクレオシド又はシクロヘキサンヌクレオシドなどの多環糖代用物を具える修飾を含むオリゴマー、及び、リンを含まないヌクレオシド間結合を含むオリゴマーを開示している。米国特許出願公開第２００４／０１７１５７９号は、修飾されたオリゴヌクレオチドであって、該修飾が、糖部位の２’構成基であって、Ｈ又はＯＨでないものを開示している。米国特許出願公開第２００４／０１７１０３０号は、−ＢＨ２ＣＮ、−ＢＨ３、及び、−ＢＨ２ＣＯＯＲ（ＲはＣ１〜Ｃ１８アルキル基である）からなる群より選択されるホウ素含有置換基を有する修飾された結合塩基であるホウ素化されたＣ及びＵ又はＴを具える反対鎖中のシトシン、ウラシル又はチミン塩基に結合させるための修飾された塩基を開示している。米国特許出願公開第２００４／０１６１８４４号は、３’アミノホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート又はアミノアルキルホスホロチオアミデートヌクレオシド間結合などのホスホロアミデートヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを開示している。米国特許出願公開第２００４／０１６１８４４号は、さらに他の修飾された糖及び／又は骨格修飾であって、いくつかの実施形態においては、前記修飾が、ペプチド核酸、ペプチド核酸模倣体、モルホリノ核酸、アミド結合を有するヘキソース糖、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、又は、非環式骨格部位であるものを開示している。米国特許出願公開第２００４／０１６１７７７号は、３’末端のＣＡＰ基を有するオリゴヌクレオチドを開示している。米国特許出願公開第２００４／０１４７４７０号は、オリゴマー化合物を開示している。そのオリゴマー化合物は、ヌクレアーゼ抵抗性を改善するか又はオリゴマー化合物の薬物的動態及び薬力学的特性を修正するか若しくは強める１つ以上の架橋を含むオリゴマー化合物であり、そのような架橋がジスルフィド、アミド、アミン、オキシム、オキシアミン、オキシイミン、モルホリノ、チオエーテル、尿素、チオ尿素又はスルホンアミド部位を具えている。米国特許出願公開第２００４／０１４７０２３号は、第１タイプのヌクレオチドを有する２つの末端ＲＮＡ部分と、第２タイプのヌクレオチドを有する内部ＲＮＡ部分とを具えるギャップマーを開示している。ここで第１タイプのヌクレオチドは少なくとも１つの糖置換基を独立に含み、糖置換基がハロゲン、アミノ、トリフルオロアルキル、トリフルオロアルコキシ、アジド、アミノオキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、Ｏ−、Ｓ−、又は、Ｎ（Ｒ＊）−アルキル基；Ｏ−、Ｓ−、又は、Ｎ（Ｒ＊）−アルケニル基；Ｏ−、Ｓ−、又は、Ｎ（Ｒ＊）−アルキニル基；Ｏ−、Ｓ−、又は、Ｎ−アリール基、Ｓ−、Ｏ−、又は、Ｎ（Ｒ＊）−アラルキル基；を具え、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基又はアラルキル基は、置換されている又は置換されていないアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基であってもよく；置換されていれば、その置換は、アルコキシ、チオアルコキシ、フタルイミド、ハロゲン、アミノ、ケト、カルボキシル、ニトロ、ニトロソ、シアノ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、イミダゾール、アジド、ヒドラジノ、アミノオキシ、イソシアナト、スルホキシド、スルホン、ジスルフィド、シリル、複素環若しくは炭素環基、又は、挿入剤、レポーター基、接合体、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキルエングリコール又は、式（−Ｏ−アルキル）ｍのポリエーテル（ｍは１から約１０である）；及び、Ｒ＊は水素又は保護基であり；又は、米国特許出願公開第２００４／０１４７０２２号が開示している修飾された糖、及び／又は、糖部位における２’−ＯＣＨ３置換基などの骨格修飾を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１０１】
従って、一態様において、本発明は、心不全を治療する方法であって、必要性がある対象に治療的有効量のＲＮＡｉ発現カセットを投与するステップであって、前記カセットは、その発現生成物が対象の心筋細胞に形質導入するのに有効な量でフォスフォランバン（ＰＬＢ）ｍＲＮＡの発現を減少させるウイルス粒子ベクター及びＲＮＡｉ配列を含み、それによって、前記ＲＮＡｉ発現カセットを発現させて前記対象の心不全を治療するステップを含む方法を開示する。
【０１０２】
本明細書中における「プロモータ」又は「プロモータ配列」への言及は、最も広い構成を含むように意図されており、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核小体ＲＮＡの小核、又は、任意のＲＮＡポリメラーゼの任意のクラスによって転写される任意の種類のＲＮＡなどのポリヌクレオチド又はポリペプチドをコードする配列の転写を開始させるＤＮＡ制御領域を含む。本明細書中で意図されている「プロモータ」は、ＣＣＡＡＴボックス配列及びさらなる制御因子（すなわち、上流活性化配列、エンハンサー及びサイレンサー）を伴い又は伴うことなく、真核細胞における正確な転写開始に必要なＴＡＴＡボックスを含む古典的ゲノム遺伝子の転写制御配列も含んでいてもよい。
【０１０３】
プロモータは、必ずではないが、通常、制御する配列の上流又は５’に位置している。更に、プロモータを具える制御因子は、通常、制御する配列の転写の開始領域の２ｋｂ内に位置している。
【０１０４】
本文脈において、「プロモータ」という用語は、哺乳動物細胞において、単離された核酸分子の発現を付与するか、活性化するか、又は、強める合成分子若しくは融合分子又は誘導体を記載するためにも用いられる。別のプロモータ又は同じプロモータが、植物、動物、昆虫、菌類、酵母又は細菌細胞において機能するために必要とされることもある。プロモータは、構造遺伝子の発現をさらに強めるために１つ以上の具体的な制御因子のさらなるコピーを含んでいてもよく、その構造遺伝子は、次いで遺伝子の空間的発現及び／又は一時的発現を制御及び／又は変更する。例えば、構造遺伝子の発現に誘導性を与える制御因子は、核酸分子を発現させる異種プロモータ配列に隣接していてもよい。
【０１０５】
配列をプロモータ配列の調節管理下に置くことは、発現がプロモータ配列によって制御されるように前記分子の位置を決定することを意味する。プロモータは、通常、制御する遺伝子に対して５’（上流域）に位置する。異種プロモータ／構造遺伝子の組合せ構造においては、プロモータの位置は、通常、遺伝子転写開始部位と距離があってもよく、その距離はプロモータと該プロモータが制御する遺伝子との間の自然状態（すなわち、プロモータが由来した遺伝子）における距離と概ね同じである。当業界において知られているように、この距離におけるいくらかの変動は、プロモータ機能を損なうことなく受け入れることができる。同様に、制御下に置かれる異種遺伝子に対する制御配列因子の位置決定は、該因子の自然状態、すなわち、該因子が由来した遺伝子の位置によって規定されている。さらに、当業界で知られているように、この距離においていくらかの変動が生じることもある。
【０１０６】
プロモータは、恒常的に、又は、発現が生じる細胞、組織若しくは器官に対して差次的に、又は、発現が生じる発生段階に対して差次的に、又は、特に、生理学的ストレス、調節タンパク、ホルモン、病原体若しくは金属イオンなどの刺激に対して差次的に配列の発現を制御してもよい。
【０１０７】
本発明のいくつかの実施形態における有用なプロモータは、組織特異的又は細胞特異的であってもよい。「組織特異的」という用語は、プロモータに適用されるときには、異なる種類の組織（例えば心臓）において同じ対象ヌクレオチド配列の発現を相対的に欠損させながら、特定種類の組織（例えば筋組織）の対象ヌクレオチド配列の選択的遺伝子発現を導くことができるプロモータを指す。「細胞特異的」という用語は、プロモータに適用されるときには、同じ組織内の異なる種類の細胞において対象ヌクレオチド配列の発現を相対的に欠損させながら、特定種類の細胞において同じ対象ヌクレオチド配列の選択的遺伝子発現を導くことができるプロモータを指す（例えば、Ｈｉｇａｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１９（１）：７８−８８，２００４；Ｈｏｇｇａｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１（１２）：１１５１−５９，２００２；Ｓｏｈａｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８９（１）：２０−２５，２００１；ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４（１）：７９−８９，２００４を参照されたい。)。「細胞特異的」という用語は、プロモータに適用されるときには、単一組織内の領域において対象ヌクレオチド配列の選択的遺伝子発現を促進することができるプロモータも意味する。あるいは、プロモータは、恒常的あってもよく又は制御可能であってもよい。さらに、異なる特異性を有するようにプロモータを修飾してもよい。
【０１０８】
「恒常的」という用語は、プロモータについて言及するときには、特定の刺激（例えば熱ショック、化学薬品、光など）の非存在下において、プロモータが、操作可能に連結された核酸配列の転写を導くことができることを意味する。一般的に、恒常的プロモータは、実質的にすべての細胞及び組織において、コード配列の発現を導くことができる。ＲＮＡｉを転写するために用いられるプロモータは、ユビキチン、ＣＭＶ、β−アクチン、ヒストンＨ４、ＥＦ−１α、又は、ｐｇｋ遺伝子に対するプロモータなどのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩによって制御される構成的プロモータであってもよいし、ＲＮＡポリメラーゼＩによって制御されるプロモータ因子であってもよい。他の実施形態においては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、Ｕ１、β−アクチン又はハイブリッドＰｏｌＩＩプロモータなどのＰｏｌＩＩプロモータを使用する。他の実施形態においては、Ｕ６プロモータ（例えば、Ｕ６−１、Ｕ６−８、Ｕ６−９）、Ｈ１プロモータ、７ＳＬプロモータ、ヒトＹプロモータ（ｈＹｌ、ｈＹ３、ｈＹ４（Ｍａｒａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２（１５）：３０４５−５２，１９９４を参照されたい。）及びｈＹ５（Ｍａｒａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４（１８）：３５５２−５９，１９９４を参照されたい。））、ヒトＭＲＰ−７−２プロモータ、アデノウイルスＶＡ１プロモータ、ヒトｔＲＮＡプロモータ、５ｓリボソームＲＮＡプロモータ、並びに、これらのプロモータの機能的ハイブリッド及び組合せなどのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって制御されるプロモータ因子を使用する。
【０１０９】
代替的に、いくつかの実施形態においては、ＲＮＡｉの誘導性発現を可能にするプロモータを選択することが最も有利である。そのようなプロモータを用いた誘導性発現のための数多くの系は、当業界において知られており、限定されるものではないが、テトラサイクリン反応系及びラックオペレーター抑制系（ＷＯ０３／０２２０５２Ａ１及び米国特許出願２００２／０１６２１２６Ａ１参照）、エクジソン制御系、又は、グルココルチコイド、プロゲスチン、エストロジェン、ＲＵ−４８６、ステロイド、甲状腺ホルモン、サイクリックＡＭＰ、サイトカイン、制御因子のカルシフェロールファミリーによって制御されるプロモータ、若しくは、メタロチオネインプロモータ（無機金属によって制御される）を含む。
【０１１０】
１つ以上のエンハンサーがウイルス複合プロモータＲＮＡｉ発現構築物中に存在することによって対象遺伝子の発現を増加させてもよい。本発明の実施形態における使用に適切なエンハンサーは、Ａｐｏ  Ｅ  ＨＣＲエンハンサー、直近に述べたＣＭＶエンハンサー（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１−１７，２００３を参照されたい。）、及び、当業者に知られている他のエンハンサーを含む。
【０１１１】
本発明においては、プロモータは、少なくとも、哺乳動物細胞においてターゲット遺伝子が発現される期間、及び、該細胞においてターゲット遺伝子の検出可能な発現が開始される直前にも、該細胞において核酸分子の発現を制御できるものであってもよい。プロモータは、恒常的であってもよいし、誘導性であってもよく、発生的に制御されていてもよい。
【０１１２】
本文脈において、「操作可能な結合で」又は「制御下で操作可能な」、又は、同様の「操作可能にリンクされた」という用語は、構造遺伝子の発現が、細胞内において空間的につながっているプロモータ配列によって制御されることを示すように理解されなければならない。
【０１１３】
いくつかの実施形態においては、ＲＮＡｉ発現カセット内において、又は、複数のＲＮＡｉ発現カセットを具えるＲＮＡｉ発現ベクターの異なるカセット間において、可変強度のプロモータを使用してもよい。例えば、２つ以上の強力なプロモータ（ＰｏｌＩＩＩ型プロモータなどの）の使用は、例えば、利用可能なヌクレオチド又は転写に必要な他の細胞内構成要素の蓄えを消耗することによって細胞に負担を与える可能性がある。追加的に又は代替的に、いくつかの強力なプロモータの使用は、細胞において有毒レベルのＲＮＡｉの発現を生じさせる可能性がある。従って、いくつかの実施形態においては、複合プロモータＲＮＡｉ発現カセット中の１以上のプロモータは、カセット中の他のプロモータよりも弱くてもよいし、又は、カセット中のすべてのプロモータが、最大レートよりも少ないレートでＲＮＡｉを発現するものであってもよい。分子技術を用いて、又は、例えば転写レベルを低下させる制御因子などの他の方法によって、プロモータを修飾してもよいし、又は、修飾しなくてもよい。
【０１１４】
ベクターもさらなる遺伝因子を含んでいてもよい。ベクターに含まれていてもよい因子の種類は、いかようにも限定されるものではなく、当業者が選択することができる。例えば、さらなる遺伝因子は、ＧＦＰ又はＲＦＰのような蛍光マーカータンパクのための１以上の遺伝子などのレポーター遺伝子；β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ又は分泌胚性アルカリフォスファターゼなどのような分析が容易な酵素；又は、ホルモン又はサイトカインのように容易に免疫測定を使用できるタンパクを含んでいてもよい。本発明の実施形態において用途を見つけることができる他の遺伝因子は、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドリン酸基転移酵素、ジヒドロ葉還元酵素、ヒグロマイシンＢリン酸基転移酵素、薬剤抵抗性、などのような細胞において選択的な増殖優位性を与えるタンパクをコードするもの、又は、栄養要求体から失われている生合成能力を与えるタンパクをコードする遺伝子を含む。レポーター遺伝子がＲＮＡｉ発現カセットと共に含まれていれば、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）配列が含まれていてもよい。さらなる遺伝因子は、独立したプロモータ／エンハンサーに操作可能に連結され、制御されてもよい。さらに、バクテリアにおけるベクターの増殖に適した複製開始点を使用してもよい。複製開始点の配列は、通常、ターゲット細胞、組織、及び／又は器官において発現されるＲＮＡｉ及び他の遺伝子配列から単離されている。そのような複製開始点は、当業界において知られており、ｐＵＣ、ＣｏｌＥ１、２−ミクロン又はＳＶ４０複製開始点を含む。
【０１１５】
ここに記載されているベクター又はその一部分もまた、そこで発現される細胞のゲノムに組み込むように構成されていてもよい。当業者は、宿主細胞のゲノムに遺伝子配列又は発現カセットを組み込むために、特定のさらなる遺伝子配列が必要となる可能性があることを認識するであろう。
【０１１６】
一実施形態において、ベクターの効果は、ＰＬＢの転写のレベルを実質的に低下させずに、ＰＬＢの機能的発現を低下させることである。代替的に又は追加的に、合成遺伝子を含む遺伝子構築物は、総ＲＮＡの定常状態レベルを実質的に低下させない。
【０１１７】
従って、別の態様においては、本発明は、ここで定義されているような１つ又はそれ以上のＲＮＡｉ発現カセットを具えるＲＮＡｉ発現ベクターを意図している。
【０１１８】
本発明のＲＮＡｉは、発現生成物に翻訳するためのターゲット転写物の翻訳の能力の変化を結果的に生じさせるか又は容易にする。発現生成物は通常タンパクであるが、本発明は、遺伝的制御に関与している転写された非コードＲＮＡ、ｅＲＮＡ、又は、転写物からスプライシングされたイントロンの形態の発現生成物をさらに意図している。
【０１１９】
「変化した能力」への言及は、限定されないが、遺伝子操作されていない細胞と比較して、約１０％〜約１００％、及び、約２０％〜約９０％といった翻訳レベルの低下を含む。一実施形態においては、ターゲット内因性配列に対応する遺伝子がタンパク生成物に実質的に翻訳されない。変化した翻訳能力は、遺伝子操作されていない細胞においてＰＬＢをコードする遺伝子の発現によって促進される表現型の何らかの変化によって簡易に決定される。本発明の遺伝因子を運ぶ任意の細胞は「遺伝子操作されている」と考えられる。遺伝子変化は永続的であってもよいし又は一時的であってもよい。例えば、細胞が遺伝因子を取り込んで、転写物を生成するときに、一時的な遺伝子変化が生じる。代替的に、遺伝因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は高分子核酸の投与などによって、翻訳のレベルを直接的に低下させる。いずれの場合においても、その分子は、細胞が分裂するときになくなってもよい遺伝子抑制機構を促進する。遺伝因子が細胞ゲノムに統合され、該因子が娘細胞に伝わるときに、永続的な遺伝子抑制が生じる可能性がより高い。
【０１２０】
ターゲット遺伝子の発現を調節する目的で、標準的な方法を用いて、細胞、組織又は器官にＲＮＡｉ又はＲＮＡｉの発現構築物を投与してもよい。有用な投与方法には、リポソームで媒介されるトランスフェクション又はトランスフォーメーション、弱毒ウイルス粒子状物質は細菌細胞を用いた細胞のトランスフォーメーション、細胞接合、当業者に知られているか又はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）に記載されているトランスフォーメーション又はトランスフェクション処置が含まれる。核酸分子は、とりわけ、例えば、任意にウイルス粒子中のリポソーム内に入れて、裸のＤＮＡ若しくはＲＮＡとして、弱毒ウイルス又はウイルス外被に付随して又は輸送タンパク又は金などの不活性担体として、組み換えウイルスベクター又は細菌ベクターとして、又は、遺伝子構築物として、導入してもよい。
【０１２１】
一実施形態においては、任意の適切なウイルスをベースとするウイルス送達系を用いて本発明のＲＮＡｉ発現構築物を送達してもよい。さらに、ハイブリッドウイルス系が有用である場合もある。ウイルス送達系の選択は、心筋細胞又はその他のターゲット組織中への送達の効率、系の導入効率、病原性、免疫学的問題及び毒性問題などのような様々なパラメーターに依存するであろう。すべての用途に適している単一のウイルス系が存在しないことは明らかである。本発明において用いるウイルス送達系を選択するときは、ウイルス粒子構築物を含むＲＮＡｉ発現が：１）再現性良く安定に増殖する；２）高力価に精製することができ；及び、３）ターゲット送達（広く分布していないターゲット組織（例えば心筋細胞）への複合プロモータＲＮＡｉ発現構築物の送達）を介在させることができる系を選択することが重要である。
【０１２２】
さらに、ハイブリッドウイルス系を用いて２つ以上のウイルス系の有用な特性を組み合わせてもよい。例えば、野生型ＡＡＶの部位特異的な組込機構を、アデノウイルスの効率的な内在化特性及び核ターゲット特性と組み合わせてもよい。アデノウイルス又はヘルペスウィルスの存在下において、ＡＡＶは、増殖的複製サイクルを受けるが、ヘルパー機能の非存在下においては、ＡＡＶゲノムは、染色体１９上の特定部位に組み込まれる。ＡＡＶゲノムの組み込みは、ＡＡＶｒｅｐタンパクの発現を必要とする。従来のｒＡＡＶベクターは、ｒｅｐを含むすべてのウイルス遺伝子が欠如しているので、該ベクターを染色体１９に特異的に組み込むことができない。しかしながら、この特徴を適切なハイブリッド系で利用することができる。さらに、非ウイルスの遺伝因子を用いて、部位特異的な組み換えを可能にする遺伝因子などのようなウイルス送達系において所望の特性を達成してもよい。
【０１２３】
ＲＮＡｉ発現構築物はウイルス粒子中に詰め込まれる。当業界において知られている任意の方法を用いて、ゲノムがウイルスＲＮＡｉ発現構築物のコピーを具えている感染性ウイルス粒子を生産する。詰め込み細胞系は、限定されないが、２９３、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＰｅｒＣ６、Ｄ１７、ＭＤＣＫ、ＢＨＫ、Ｃｆ２Ｔｈ、又は、当業者が知っているか若しくは開発した他の系を含む、ウイルスタンパクを発現することができる任意の細胞系であってもよい。パッケージング細胞系の１つは、例えば、ここで言及することによって組み込まれている米国特許第６，２１８，１８１号に記載されている。
【０１２４】
代替的に、必要なウイルスタンパクを安定に発現しない細胞系に２つ以上の構築物を同時に遺伝子導入して、機能性粒子状物質を効率的に生産してもよい。構築物の１つは、ウイルスＲＮＡｉ発現カセットを具え、他のプラスミドは、細胞が機能性ウイルス（複製及びパッケージ構築物）並びに他のヘルパー機能をもたらすのに必要なタンパクをコードする核酸を具える。
【０１２５】
詰め込み細胞系、又は、複製及び詰め込み構築物は、エンベロープ遺伝子生成物を発現しない可能性もある。そのような実施形態においては、ウイルスのＲＮＡｉ発現構築物と同時にトランスフェクトされる独立した構築物に、エンベロープ遺伝子をコードする遺伝子を提供することができる。エンベロープタンパクがウイルス粒子の宿主領域に対して部分的に関与するので、ウイルスが偽型であってもよい。「偽型」ウイルスは、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパクを有するウイルス粒子である。当業者は、ウイルス送達系及びターゲットにする細胞に対して適切な偽型を選択することができる。特異的な宿主領域を付与することに加えて、選択した偽型がウイルスが非常に高い力価で濃縮させるようにしてもよい。代替的に、感染を特定の種類に限定する（例えば、狭宿主性エンベロープは、例えばマウス細胞だけに感染させ、両種性エンベロープは、例えばヒト細胞及びマウス細胞の両方に感染させる。）狭宿主性エンベロープタンパクを用いてウイルスを偽型にすることができる。さらに、肝細胞のためのアシアログリコプロテイン、又は、レセプタで媒介される結合のためのトランスフェリンなどのように、細胞特異的なターゲティングに遺伝子操作したリガンドを用いてもよい。
【０１２６】
パッケージング細胞系における生産後に、ＲＮＡｉ発現カセットを含むウイルス粒子を精製し、定量する（滴定した）。精製方法は、限定されないが、密度勾配遠心分離又はカラムクロマトグラフ法を含む。
【０１２７】
ここで開示されているＲＮＡｉ又はＲＮＡｉ発現カセットは、限定されないが、注射又は灌流を介して心臓に適用することによって心筋細胞に導入してもよい。
【０１２８】
一実施形態においては、ＲＮＡｉ発現カセットを、ターゲット細胞中にインビトロ又はエクスビボで導入し、次いで動物に入れて治療に影響を与えてもよいし、又は、インビボ投与によって生命体、器官又は細胞に直接的に投与してもよい。ウイルス感染による送達が、送達の１つの方法であってもよい。使用し易い任意のプロトコルも用いて、哺乳動物宿主にカセットを具えるベクターを投与してもよく、様々な多数のそのようなプロトコルが当業界において知られている。
【０１２９】
ＡＡＶベクターを、注射用製剤、又は、薬学的に許容可能で適切な担体又は賦形剤中に溶解させるか、懸濁させるか若しくは乳化させることによって投与用製剤に調剤することができる。そのような薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の例は、油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル又はプロピレングリコールなどのような水性又は非水溶媒を含み、必要であれば、可溶化剤、等張剤、沈澱防止剤、乳化剤、安定剤及び保存剤などの従来の添加剤を共に含む。
【０１３０】
一実施形態においては、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬品組成物であって、前記ベクターは、そのＲＮＡ発現生成物がフォスフォランバン（ＰＬＢ）ｍＲＮＡの発現を減少させるＲＮＡｉ発現カセットを含み、細胞においてＰＬＢタンパクの量を減少させ、前記ＲＮＡｉ発現カセットのＲＮＡ発現生成物が、緊縮条件下でＰＬＢ遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む医薬品組成物を開示する。
【０１３１】
一態様においては、ＲＮＡｉ発現カセットが、ヌクレオチド配列５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＣＧＣＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＧＣＣＧＡＧＣＧＡＧＴＡＡＧＧＴＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＴ３’（配列番号１）を含む。別の一態様においては、ＲＮＡ発現生成物が、ターゲット配列５’ＵＡＣＣＵＵＡＣＵＣＧＣＵＣＧＧＣＵＡ３’（配列番号２）を含む。
【０１３２】
さらに別の態様において、本発明は、ＲＮＡｉ発現構築物を含む医薬品組成物であって、前記ＲＮＡｉ構築物が、ＰＬＢ若しくは誘導体、それらのオルソログ又はホモログを含むヌクレオチド配列の少なくとも一部に少なくとも７０％相同であるヌクレオチド配列を含む配列をターゲットにするＲＮＡｉをそれぞれ具える１つ以上のＲＮＡｉ発現カセットを含む医薬品組成物を意図する。
【０１３３】
本発明の方法及び組成物は、遺伝子発現の調節において意図された結果又は所望の結果を達成するのに有効な量のＲＮＡｉ又はＲＮＡｉカセットの投与を含む。通常、これを表現型で評価する。薬学分野においてよく知られているように、いくつかの場合においては、最も有効な投与量を決定するために、ある程度のルーティン試行錯誤が必要となることが予想される。
【０１３４】
本明細書中における「遺伝治療」への言及は、遺伝子療法を含む。本発明によってさらに意図されているた遺伝子治療には、細胞を、除去し、遺伝子操作し、次いで、患者に戻す体細胞遺伝子治療が含まれる。遺伝子治療は、一時的であってもよいし又は永続的であってもよい。好ましくは、前記動物はヒトである。
【０１３５】
別の一態様においては、本発明は、さらに、ここに記載されているｄｄＲＮＡｉ発現カセット又はゲノムに組み込まれた形態又はその一部分を具える遺伝子操作された細胞にも及ぶ。一態様においては、前記細胞が哺乳動物細胞である。関連態様においては、前記細胞が、霊長類又はげっ歯動物細胞であり、ヒト細胞又はマウス細胞を含んでいてもよい。
【０１３６】
適切な医薬薬学懸濁液中にＡＡＶベクターを含む投与用医薬キットも開示する。この態様において、本発明は、前記組み換えアデノ随伴ウイルスベクター又はウイルス粒子の送達用の医薬キットを提供する。前記キットは、所定用量の投与用容器を含んでいてもよい。前記キットは、所定用量の送達のための遺伝子導入ベクター又はウイルス粒子を含む懸濁液であって、（ａ）ＲＮＡｉ発現カセットを具えるＡＡＶ遺伝子導入ベクター又はウイルス粒子、（ｂ）生理学的に適合する担体、を具える懸濁液を含んでいてもよい。
【０１３７】
本発明は、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成することができ、従って、ＲＮＡ干渉を誘導することができるＲＮＡ分子をコードするＲＮＡｉ発現カセットをも提供する。そのようなＲＮＡｉ発現カセットは、細胞内に導入したときに、分子内で二本鎖ＲＮＡ複合体を形成することができる単一のＲＮＡ分子を生じさせるｒＡＡＶゲノムの一部としての単一のＤＮＡ分子であってもよい。しかしながら、１より多いｒＡＡＶゲノム又はＲＮＡｉ発現カセット又はＲＮＡコード領域を、同時に又は連続的に細胞に導入して、分子間で二本鎖ＲＮＡ複合体を形成することができる２つ以上のＲＮＡ分子を生じさせてもよいことは、以下の説明から理解されるであろう。一般的に、分子内又は分子間であっても二本鎖ＲＮＡ複合体を形成することができる２つのＲＮＡ部位は、その発現が下方制御されるか又は減少される遺伝子又は核酸配列の少なくとも一部分がセンス配列であり、少なくとも一部分がアンチセンス配列である。
【０１３８】
ＲＮＡｉ発現カセットの設計は、本発明の範囲を限定するものではない。ＲＮＡｉ発現カセットを設計するための様々な方法を適用することができ、様々な設計に基づいたＲＮＡｉ発現カセットがインビボにおいてＲＮＡ干渉を誘導することができるであろう。すべてのＲＮＡｉ発現カセットに共通する特徴は、それらがＲＮＡ分子をコードするＲＮＡコード領域を具え、該ＲＮＡ分子が、分子内又は分子間で二本鎖のＲＮＡ複合体を形成することによって、単独で又はその他のＲＮＡ分子と組み合わされてＲＮＡ干渉を誘導することができるということである。
【０１３９】
様々な設計原理を用いてその同じ目的を達成することができ、その様々な設計原理は当業者に知られている。例えば、ＲＮＡｉ発現カセットが１つ以上のＲＮＡ分子をコードしてもよい。二本鎖ＲＮＡ複合体は、ＲＮＡｉ発現カセットからのＲＮＡ発現の後又はその発現中に、単一の自己相補的ＲＮＡ分子又は２つの相補的ＲＮＡ分子のいずれかによって形成されてもよい。核内又は核外で二本鎖ＲＮＡ複合体の形成を開始してもよい。
【０１４０】
一態様においては、生理的条件下においてｍＲＮＡの分子の少なくとも一部にハイブリダイズすることができる第１ＲＮＡ部位と、生理的条件下においてその少なくとも一部が第１ＲＮＡ部位にイブリダイズすることができる第２ＲＮＡ部位とを具える二本鎖ＲＮＡ複合体を提供する。一態様においては、第１部位と第２部位とが、同一ＲＮＡ分子の一部であり、細胞内に存在するような生理的条件下でハイブリダイズすることができ、ハイブリダイゼーションにおいて、第１部位と第２部位とが二本鎖ＲＮＡ複合体を形成する。
【０１４１】
別の一態様においては、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成するための直鎖ＲＮＡ分子であって、前記ＲＮＡが、細胞内ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分にハイブリダイズすることができる第１部分と、少なくとも一部分が第１部位にハイブリダイズしてヘアピン二本鎖ＲＮＡ複合体を形成することができる第２部位と、を具える直鎖ＲＮＡ分子を提供する。
【０１４２】
さらに別の態様においては、上記方法は、インビボにおける部分的な又は完全な二本鎖特性を有するＲＮＡのＡＡＶで媒介される発現を具える。
【０１４３】
ある実施形態において、本発明は、ＲＮＡ分子を含むリボザイムを用いて二本鎖ＲＮＡ複合体を生成し、それによって、二本鎖ＲＮＡの生成に伴うある既知の障害を克服してもよい。例えば、リボザイム機能性を用いてポリアデニル化信号を除去し、それによって細胞核からのＲＮＡ分子の放出を防ぐか又は最小化してもよい。他の実施形態においては、本発明は、二本鎖ＲＮＡの比活性を増強するＲＮＡ又はタンパクをコードするＲＮＡ分子の一部分の能力に基づいている。この比活性を増強する一部分であって、ＲＮＡ分子の一部分の一例は、二本鎖ＲＮＡ複合体の細胞内分解を抑制するＨＩＶＴａｔタンパクをコードする分子の一部である。
【０１４４】
本発明は、対象の心臓においてＰＬＢの発現を抑制することによって、対象の心不全を治療するか、又は、心室性不整脈を減少させるか、又は、心不全後の対象の生存期間を延長させる方法であって、前記方法は、治療的有効量の医薬品組成物を対象に投与するステップを具え、前記医薬品組成物は、二本鎖ＲＮＡ複合体を形成することができる少なくとも１つのＲＮＡ分子をコードする１以上のＲＮＡｉ発現カセットを具えるｒＡＡＶウイルス粒子を具えており、ハイブリダイズ条件下でその２本鎖ＲＮＡ複合体の一部分は、ＰＬＢ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの少なくとも一部分にハイブリダイズすることができる。
【０１４５】
別の実施形態においては、筋小胞体（ＳＲ）中へのカルシウム取り込みを増加させる方法であって、筋組織サンプルをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに接触させるステップを具える方法を開示している。ここで、前記ベクターは、ＲＮＡｉ発現生成物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記ＲＮＡｉは、緊縮条件下でＰＬＢ標的遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、それによって、筋小胞体におけるカルシウム取り込みを増加させる。
【０１４６】
本発明の目的において、「哺乳動物対象」は、限定されず、ヒト、チンパンジー及び他の類人猿及び猿類などの非ヒト霊長類を含む任意の哺乳綱；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの家畜；イヌ及びネコなどの家畜哺乳類；マウス、ラット、ハムスター、ラビット及びモルモットなどのげっ歯動物を含む実験動物を意味する。この用語は特定の年齢や性別を明示するものではない。従って、成人の対象及び新生児の対象、同様に、雄又は雌のいずれをも包含するように意図されている。
【０１４７】
本発明の目的において、ここで用いられている「患者」又は「対象」又は「患者」という用語は、脊椎動物、特に、家畜、競技動物、霊長類及びヒトを含む（これらに限定されない）哺乳類を指し、特にこの用語はヒトを指す。
【０１４８】
本発明のウイルス粒子を、ヒト又は非ヒト哺乳動物の患者に投与するために、薬学的に許容可能な送達媒体（すなわち、生理的適合性担体）に懸濁させてもよい。当業者は、選択した核酸移入ベクターの性質に応じて適切な担体を容易に選択することができる。医薬品組成物は治療的有効量の二本鎖ＲＮＡ複合体を生産するのに充分な遺伝物質を具えているであろう。医薬品組成物は薬学的に許容可能な賦形剤も含むであろう。そのような賦形剤は、組成物を投与される患者に対してそれ自体が有害な免疫反応を誘導せず、かつ、過度の毒性を与えることなく投与できる任意の医薬品も含む。薬学的に許容可能な賦形剤は、限定されないが、水、食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含む。薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び、アセタート、プロピオネート、マロナート、ベンゾアートなどの有機酸塩が前記組成物に含まれていてもよい。追加的に、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのような媒体中に存在していてもよい。他の担体の例には、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、胡麻油及び水が含まれる。この担体の選択は、本発明を限定するものではない。本発明の組成物は、ＡＡＶウイルス粒子及び担体に加えて、任意に、保存剤又は化学的安定剤などのその他の従来の薬剤成分を含んでいてもよい。適切な例示的成分には、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、プロピルガレート、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。薬学的に許容可能な賦形剤の充分な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ社、ニュージャージ、１９９１）にみつけることができる。
【０１４９】
再構成することができる送達系のための溶液、懸濁液及び粉末には、懸濁化剤（例えばゴム、ザンタン、セルロース化合物及び糖）、湿潤剤（例えばソルビトール）、可溶化剤（例えばエタノール、水、ＰＥＧ及びプロピレングリコール）、界面活性剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｐａｎ、トゥイーン及びセチルピリジン）、保存剤及び酸化防止剤（例えば、パラベン、ビタミンＥ及びビタミンＣ、並びに、アスコルビン酸）、凝結防止剤、コーティング剤及びキレート剤（例えばＥＤＴＡ）などの媒体が含まれる。
【０１５０】
本発明において、インスタント医薬品組成物の投与は、当業者に知られている様々な方法及び送達システムのいずれを用いても達成又は実行することができる。投与を、例えば、静脈内に、経口的に、インプラントにより、口腔粘膜に、経皮的に、筋肉内に、又は、皮下に行ってもよい。この組成物は、静脈内投与、動脈内投与、脳室内投与又は心臓弁灌流に適している可能性がある。さらに、インスタント医薬品組成物は、理想的には、日常的に使用されている１つ以上の薬学的に許容可能な担体を含む。そのような担体は当業者に知られている。日常的に使用されている多数の担体を使用する以下の送達系は、インスタント組成物の投与のための想定される多数の実施形態の代表的なものに過ぎない。
【０１５１】
注射可能な薬剤送達系は、溶液、懸濁液、ゲル、ミクロスフェア及び重合体注射剤を含み、溶解度を変化させる薬剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール及びスクロース）及びポリマー（例えば、ポリカプリラクトン及びＰＬＧＡ）などの賦形剤を具えていてもよい。移植可能な系は、棒及び盤を含み、ＰＬＧＡ及びポリカプリラクトンなどの賦形剤を含んでいてもよい。
【０１５２】
コンピュータによる所定の方法を用いて、動物データに基づいて、インスタント医薬品組成物の治療的に又は予防的に有効な量を決定することができる。他の要因のなかでも、選択した輸送ベクターの特質、投与経路、治療する哺乳類（例えば、ヒト若しくは非ヒト霊長類、又は他の哺乳類）、治療する対象の年齢と体重と全身状態、治療する疾患の重症度、治療する心臓内領域の位置、及び、投与様式に依存するであろう。従って、患者に応じて適切な投薬量を変えてもよい。当業者は、適切な有効量を容易に決定することができる。
【０１５３】
本発明による前記ベクターのインビボにおける送達のための治療的に有効なヒト投薬量は、溶液１ｍｌ当たりおよそ１０１０〜１０１４の濃度の機能的ベクターを含む約２０ｍｌから約５０ｍｌの範囲の食塩水であると考えられる。すべての副作用に対する治療的利益を比較検討して投薬量を調整する。さらに別の実施形態においては、ＡＡＶの薬学的有効量は、通常、１×１０５〜１×１０５０のゲノムｒＡＡＶ、およそ１０８〜１０２０のゲノムＡＡＶ、およそ１０１０〜１０１６のゲノム、又は、およそ１０１１〜１０１６のゲノムＡＡＶの濃度の範囲内である。ヒト用量は、約１×１０１３のＡＡＶゲノムＡＡＶであってもよい。そのような濃度を、約０．００１ｍｌから１００ｍｌ、０．０５〜５０ｍｌ又は１０〜２５ｍｌの担体溶液中において送達してもよい。当業者は、用量応答カーブを確立させるルーチン試験によってその他の有効量を容易に確立することができる。
【０１５４】
投薬処理は、一回量投与工程又は複数回投与工程であってもよい。さらに、被験体に適切になるような用量で投与してもよい。当業者は、適切な投与回数を容易に決定することができる。しかしながら、代替的投与経路を考慮して、又は、すべての副作用に対する治療的利益を比較検討して、投薬量を調整する必要があることもある。組み換えベクターを用いる治療的適応に応じて、そのような投薬量を変更してもよい。
【０１５５】
目的とする細胞に入り込み、伝達された核酸組成物の充分なレベルの機能性を保証して、過度の副作用を伴わずに又は医学分野の当業者によって決定することができる医学的に許容可能な生理的効果を伴って治療的利益を与えるのに充分な量でベクター粒子を投与する。
【０１５６】
任意に、特定の実施形態においては、本発明によるＡＡＶによって媒介される送達を、その他のウイルス及び非ウイルスベクターによる送達と組み合わせてもよい。限定されるものではないが、アデノウイルスのベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純性疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクター及びパキュロウイルスベクターを含むそのような他のウイルスベクターを、容易に選択することができ、当業界で知られている方法によって作製してもよい。同様に、限定されるものではないが、リポソーム、脂質ベースのベクター、ポリプレックスベクター、分子接合体、ポリアミン及び多陽イオンベクターを含む非ウイルスベクターを、容易に選択することができ、当業界で知られている方法によって作製してもよい。これらの代替的経路によって投与する場合、投薬量は上記範囲内であることが好ましい。
【０１５７】
動物（ヒトを含む）は、二本鎖ＲＮＡゲノムを有する病原体に対する自然防御機構を有している。すなわち、細胞質ゾル中に二本鎖ＲＮＡが存在すると、インターフェロン関連経路の活性化が誘導され、それによってＲＮＡ干渉が抑制される。従って、それらの経路の活性化を回避するためには、二本鎖ＲＮＡ複合体の長さが３０塩基対を越えるべきでなく、３０塩基を越えるべきでないことは二本鎖ＲＮＡ構造体の設計における第１原則である。
【０１５８】
ある実施形態においては、二本鎖ＲＮＡ複合体の長さは、例えばダイサーに依存する切断によって生じるＲＮＡ生成物にサイズが対応するように、少なくとも２０、２１又は２２塩基対長である。
【０１５９】
以下の実施例によって本発明を説明することを意図しているが、本発明が限定されるものではない。
【０１６０】
実施例１
材料及び方法
組み換えアデノウイルス及びＡＡＶベクターの開発
インビトロ研究用に偽型ｒＡＡＶ２．６のような、インビボ作業用にｒＡＡＶ２．９のような組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを開発した。これらのいずれもが、示されているｓｈＲＮＡ発現カセットと共に、同じＡＡＶ２ベクターゲノムをそれぞれ含んでいた。また、ｒＡＡＶ２．６にプラスミドＡＡＶ６ｃａｐを用い、ｒＡＡＶ２．９にＡＡＶ９ｃａｐを用いた例外を除き、これらを同様に加工した。一本鎖（「単量体」）ｒＡＡＶベクターと比較して能力が高いので、すべてのインビトロ研究及びインビボ研究を通して、相補的（「二量体」）ｒＡＡＶゲノムを用いた。培養した原発性新生児ラット心筋細胞（ＰＮＣＭ）においてＰＬＢ発現を効率的にかつ安定に抑制したアデノウイルス（ＡｄＶ）ベクターであるＡｄＶ−ｓｈＰＬＢにおいて以前に用いたｓｈＲＮＡ発現カセットから、ｓｈＲＮＡ及びマーカとしてＧＦＰを共発現し、それによって心不全（ＨＦ）動物を用いた試験においてベクター追跡を可能にするＡｄＶ及びｒＡＡＶベクターを開発することが求められた。しかしながら、ＣＭＶ−ＧＦＰ成分を含まない元のＡｄＶ−ｓｈＰＬＢベクターと比較して、構築物の１つであるｒＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰは、非常に低い抑制活性を示した（図１Ａ）。Ｕ６−プロモータ−ｓｈＲＮＡカセットと反対に進行するＣＭＶ−ＧＦＰカセットにおける転写と共に、ｒＡＡＶベクターがＧＦＰ制御下でＣＭＶを生成した。ＣＭＶプロモータ自体及び／又はＧＦＰ配列が抑制活性の欠損に関与しているか否かを試験するために、ＧＦＰに変えてイントロン性「スタッファ」配列を用いて、ベクター、ｒＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ−ＣＭＶ−β−イントロンを構築した。ｒＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰ（２．３０ｋｂ長）及びｒＡＡＶ−ｓｈＰＬＢ−ＣＭＶ−β−イントロン（２．５５ｋｂ長）のいずれもが、カプシド中に詰め込むのに要求されると考えられる長さを有していた。ＣＭＶ及びＧＦＰ又はβ−イントロンのいずれも含まないが、ＡｄＶ−ＰＬＢに由来するオリジナルのＵ６−ｓｈＰＬＢカセットだけを含む第３のベクターは、全体ベクターゲノムサイズが１．１５ｋｂであった。しかしながら、この「最小限の」ｒＡＡＶ―ｓｈＰＬＢを、おそらく鎖状体として、標準処理中に効率的に詰め込んだ。ベクターマップを図１Ｃに示す。
【０１６１】
ウイルスベクターの生産及び精製
Ｚｏｌｏｔｕｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ（１９９９）６（６）：９７３−９８５）に記載されている２つのプラスミドプロトコルを用いて以下の修飾を加えてｒＡＡＶ９−ｓｈＧＦＰ及びｒＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢを生産した。リン酸カルシウム沈殿物を加える前に、トリプルフラスコ中で２９３−Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を２４時間（ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ）培養した。７２時間後、イオジキサノール密度勾配（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ，Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社、ロングウッド、フロリダ）によってベンゾナーゼ処理を行った細胞粗溶解物からウイルスを除去し、次いで、ヘパリンアガロースＩ形親和性クロマトグラフィー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ）を行った。最後に、ウイルスをＶｉｖａｓｐｉｎ２０遠心濃縮器５０Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ社、カールズバッド、カリフォルニア）を用いて遠心分離し、乳酸リンゲル液（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ディアフィールド、イリノイ）中に調剤し、−８０℃で保存した。
【０１６２】
ベクターの品質評価及び滴定
電気泳動後銀染色法によってベクター貯蔵生化学的純度（＞９５％）を評価した。ＳＹＢＲ（商標）ＧＲＥＥＮ  ＴＡＱ  ＲＥＡＤＹＭＩＸ（商標）（ＳＩＧＭＡ社、セントルイス、ミズーリ）及びプライマーであるＣＭＶ−Ｆ及びＣＭＶ−Ｒを用いたリアルタイムＰＣＲ法（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によってゲノムを含む粒子（ｇｃｐ）を測定した。
【０１６３】
心筋細胞培養におけるベクター評価
発生学的に調節されるものの、ＳＥＲＣＡ２ａ／ＰＬＢ系が、ＮＲＣＭにおいて適切に機能し、また、ＳＥＲＣＡ２ａ／ＰＬＢ系をターゲットにするアデノウイルス遺伝子導入法が、胎児心筋細胞及び成人心筋細胞のいずれにおいても成功したので、原発性胎児心筋細胞（ＮＲＣＭ）は、インビボにおいて最終的な試験を行う前のＲＮＡｉに基づいたすべての心臓治療の予備的試験に適している。両方の細胞種がインビトロ予備試験に好適であるが、培養心筋細胞と損傷を受けていないインビボの心臓と間に多くの相違があるため、培養細胞におけるＲＮＡに基づいたインビトロ治療研究のすべてがかなり予備的なものになる。
【０１６４】
細胞培養：生後１日〜３日の子ウィスターラットの心室組織から、原発性心筋細胞（ＰＮＣＭ）及び原発性胎児心筋細胞（ＮＲＣＭ）を調製した。６穴皿においてＰＮＣＭを培養した。
【０１６５】
フォスフォランバン抑制の評価：ＮＲＣＭ及びラット心臓におけるＰＬＢ、Ｔｎｌ、ＮＣＸ、及び、ＳＥＲＣＡ２ａのｍＲＮＡ及びタンパク発現レベル、並びに、ラット心臓におけるＳＥＲＣＡ２ａ及びＮＣＸタンパクを、（Ｆｅｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６）近刊）に記載されているノーザンブロット解析によって測定した。
【０１６６】
ＲＮＡｉ治療中のカルシウム推移：８μＭのＦｌｕｏ−４／ＡＭと共に２０分間ローディング（１２０Ｈｚにおける撮像、１画像当たり８．３ミリ秒）した後に、［１Ｈｚにおける電気刺激中に［Ｃａ２＋］ｉ推移を測定した。ＮＲＣＭ（括弧内は細胞数を表す。）の５つの治療グループ：ＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢ（ｎ＝２６）、ＡＡＶ９−ｓｈＧＦＰ（ｎ＝２６）、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ（ｎ＝７１）、ＡｄＶ−ｓｈＧＦＰ（ｎ＝４９）及び治療していないコントロール細胞（ｎ＝３２）を研究した。推移の振幅（収縮期［Ｃａ２＋］ｉ（Ｆ／Ｆ０））、ピークに達するまでの時間（ＴＴＰ）（ミリ秒）、その減衰の時定数τ（ミリ秒）を測定した。ＮＲＣＭのＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢ治療中の［Ｃａ２＋］ｉ推移の測定（図１Ｅ及び図１Ｆ）は、治療していない細胞と区別することができない推移を有するＡＡＶ９−ｓｈＧＦＰグループと比較して、このベクターが、著しく高い振幅及び（短縮されたＴＴＰ及びτを有する）促進された振幅動態をもたらすことを示している。ＡｄＶ−ｓｈＧＦＰグループと比較して、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ治療も振幅が著しく大きかったＡＡＶ９グループとは対照的に、ＴＴＰは、ＡｄＶ−ｓｈＧＦＰ対ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢにおいて持続的であり、τに差は認められなかった。従って、ＡｄＶグループにおいてローディング（図１Ｄ）を行う筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ２＋のさらなる研究を以下のように行った。ＳＥＲＣＡ２ａを介してＣａ２＋の筋小胞体への再取り込みをブロックする２０ｍＭのカフェインの急速添加を後で行ったこと以外は同様に、８μＭのＦｌｕｏ−４／ＡＭと共にＮＲＣＭを２０分間ローディングした後に、１Ｈｚにおける電気刺激中に［Ｃａ２＋］ｉ推移を再度測定した。電気的に刺激した［Ｃａ２＋］ｉ推移を、カフェインで誘導したものと比較し、Ｃａ２＋の放出率を算出した（Ｋｏｃｋｓｋａｍｐｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  Ｃａ２+  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｔｒｉａｌ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｓ(１，４，５)Ｐ３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃａ２+  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｅｒｉｎｕｃｌｅａｒ  Ｃａ２+  ｓｔｏｒｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８；１２１：１８６−１９５，及びこの文献で引用されている文献を参照されたい。)。
【０１６７】
肥大化の誘導：１００μＭの濃度におけるフェニレフリン（ＰＥ）、１０μＭにおけるアンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ−ＩＩ）及び１００ｎＭにおけるエンドセリン−１（ＥＴ−１）をインビトロ研究の一部において肥大刺激として用いた。ＰＮＣＭ／ＮＲＣＭにおいて、ベースライン条件下（図４Ａ）又は肥大化薬剤の存在下（図４Ｂ−図４Ｄ）のいずれかにおいて、細胞内ｍｉＲＮＡを定量するＴＡＱＭＡＮ（商標）分析を行った。単独で又はそれぞれのＲＮＡｉベクターと共に培養２日目に薬剤を添加した。
小分子ＲＮＡ分析：以下のプライマーを用いたＴＡＱＭＡＮ（商標）分析によって短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現レベルを測定した。心臓細胞内ｍｉＲＮＡ経路に対して、ベクター由来ｓｈＲＮＡによってベクター用量依存的に生じ得る影響の調査において、ＴＡＱＭＡＮ（商標）分析を用いて、心臓で発現されることが知られている以下のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ−１、ｍｉＲＮＡ−２４、ｍｉＲＮＡ−１３３ａ、ｍｉＲＮＡ−２０８及びｍｉＲＮＡ−１９５を定量した。
【０１６８】
Ｔａｑｍａｎによる遺伝子発現の定量及びｓｈＲＮＡ生成量の定量
マイクロＲＮＡ分析：心筋細胞ｍｉＲＮＡｓに対するベクター由来ｓｈＲＮＡｓによって生じ得る影響の調査において、ＴＡＱＭＡＮ（商標）分析を用いて、機能的に心臓において発現されることが知られている２つのｍｉＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡ−１及びｍｉＲＮＡ―１３３ａ）を定量した（図４Ａ−図４Ｃ）。
ＢＮＰ分析：ベクター治療したラットの心臓において、心臓のＢＮＰ遺伝子発現量をＴＡＱＭＡＮ（商標）によって同様に定量した（図３Ｇ）。
ｓｈＰＬＢ生成：以前に公表されているプロトコル（Ｆｅｃｈｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  Ａｄｅｎｏｖｅｃｔｏｒ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００７；１４：２１１−２１８；ａｎｄ  Ｆｅｃｈｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ｂ３  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｍｍｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｊｕｎ  ２００７；１４（１２）：９６０−９７１）に従って、様々なＲＮＡｉベクター（図１Ｂ）による短ヘアピンＲＮＡ転写を定量した。
【０１６９】
経大動脈結束
４週齢のＳＤラット（７０〜８０ｇ）を腹腔内ペントバルビタール（６５ｍｇ／ｋｇ）によって麻酔し、通風機上に置いた。大動脈起始部を露出させるように胸骨上切開を行い、０．５８ｍｍの内径を有するタンタルクリップ（Ｗｅｃｋ社）を上行大動脈に置いた。疑似グループの動物にはクリップを挿入しない同様の手順を行った。次いで、鎖骨上の切り口を閉じ、ラットをケージに戻した。鎖骨からアプローチしたのは、遺伝子送達中に開胸が必要であり、最初の大動脈結束において胸部を開かないことによって、遺伝子送達を行うときの癒着を回避するためである。
【０１７０】
まず動物を２つのグループ：大動脈結束を有する５６匹の動物の第１グループと、疑似手術を行った１２匹の動物の第２グループとに分割した（疑似手術をおこなった動物のうちの１０匹が生存した）。大動脈結束を行った動物においては、２５〜３０週後に左室拡張が発症すると共に心臓遺伝子導入前において短縮率が２５％低下した。圧負荷肥大を受けた最初の５６匹から４０匹のみの動物が生存した。これらをさらに分けてＡｄ−ｓｈＧＦＰ（ｎ＝１０）又はＡｄ−ｓｈＰＬＢ（ｎ＝１０）又はＡＡＶ９−ｓｈＧＦＰ（ｎ＝１０）又はＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢ（ｎ＝１０）のいずれかに供した。
【０１７１】
連続的超音波心臓検診評価
２２週間の結束の後に、軽度に麻酔した動物（ペントバルビタール４０ｍｇ／ｋｇ、腹膜内に）において週単位で連続的超音波心臓検診評価を行った。ＧＥ  Ｖｉｖｉｄ−７超音波機器及び１２ＭＨｚの広帯域送受信機を用いて経胸的Ｍモード及び断層心エコーを行った。乳頭中央高さの左心室短軸像を用い、後壁厚、拡張期の左心室の大きさ、短縮率の測定値を集めた。結束後１２週における短縮率と比較して２５％を超える短縮率（ＦＳ）の低下が検出されてから３日以内にすべての動物において遺伝子導入を行った。疑似手術したラットにおいては第２７週に遺伝子送達を行った。
【０１７２】
静脈注射後のＡＡＶ９ベクターの心臓内分布
マーカタンパクであるＧＦＰを発現するベクターｒＡＡＶ９−ＧＦＰ又は食塩水のいずれかをラットの静脈内に注射した。ｒＡＡＶ９−ＧＦＰ又は食塩水の送達の１カ月後に、心臓を除去し、蛍光システム（Ｍａｅｓｔｒｏ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ、ウォバーン、マサチューセッツ）において５１０ｎｍで視覚化すると、青色光の４９０ｎｍにおける単一励起ピークを有していた。図２Ｂ及び図２Ｃは、観察された画像を示している。
【０１７３】
この巨視的スケールにおけるＧＦＰ発現の視覚化に加えて、ｒＡＡＶ９−ＧＦＰを静脈内注射に注射した１カ月後に、ＧＦＰ免疫組織化学的染色を行って顕微鏡的次元（図２Ｄ、図２Ｈ及び図２Ｉ）でＧＦＰの分布を評価した。３０％過酸化水素を用いた内因性ペルオキシダーゼの阻害後に、ＰＢＳ緩衝液中で洗浄し、ウサギの抗ｈｒＧＦＰポリクローナル抗体（ＶＩＴＡＬＩＴＹ（商標）、カタログ＃２４０１４２、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を１：１０００に希釈して１２０分間加えた。洗浄後に、第２のものとして、ヤギの抗ウサギポリクローナル免疫グロブリン／ＨＲＰ抗体（カタログ＃Ｐ０４４８、Ｄａｋｏ社、グロストラップ、デンマーク）を１：５０に希釈して６０分間使用した。染色及びヘマラムを用いた対比染色は、（Ｎｏｕｔｓｉａｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ−Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  Ｃｏ−Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  αｖβ３  ａｎｄ  αｖβ５  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  Ｓａｒｃｏｌｅｍｍａ  ａｎｄ  Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ｄｉｌａｔｅｄ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ−Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００１；１０４：２７５−２８０）に準拠した。
【０１７４】
様々な器官におけるＧＦＰ発現のウエスタンブロット解析のために、ウサギの抗ｈｒＧＦＰポリクローナル抗体（（ＶＩＴＡＬＩＴＹ（商標）、カタログ＃２４０１４２、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を１：５０００希釈にして４℃で一晩用いた。第２のものとして、ポリクローナルヤギ抗ウサギ免疫グロブリン／ＨＲＰ抗体(カタログ＃Ｐ０４４８、Ｄａｋｏ社、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を１：２０００に希釈して室温で６０分間用いた。その後、ＧＦＰウェスタンブロットをＸ線フィルムに５分間暴露させた。これらのフィルムの定量化を図２Ｊに与える。
【０１７５】
インビボＲＮＡｉ治療のための実験プロトコル
アデノウイルス送達系は当業界において周知である。簡潔に、ラットを麻酔し、開胸を行った後に、２００μｌのアデノウイルス溶液（３×１０１０ｐｆｕ）を含む２２Ｇカテーテルを左心室の頂端から大動脈起始部に進めた。カテーテルの部位に対して遠位において大動脈及び主肺動脈を４０秒間締め付け、溶液を注射し、次いで、胸を閉じて動物が回復するようにした。ｒＡＡＶ９を用いた試験のために、両方のｒＡＡＶ９ｓｈＲＮＡの５×１０１１ベクターゲノムを用いて単純な尾静脈注射を行った。模擬グループの動物に食塩水を注射した。
【０１７６】
ＲＮＡｉ治療中の血流動態評価
様々な治療グループにおけるアデノウイルス遺伝子導入の後の様々な段階にあるラットに、４０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで麻酔し、機械的に酸素を供給した。その後、正中切開によって胸を開いて心臓を露出させた。その後、左心室の頂端に小さな切り口を作り、２．０Ｆｒ．高忠実度圧力変換器（ＭＩＬＡＲ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、テキサス）を左心室に導入した。圧力測定を１ＫＨｚにおいてデジタル化し、さらなる解析のための保存した。左室収縮期圧（ＬＶＳＰ）、拡張終期左室圧（ＬＶＤＰ）、血圧上昇（＋ｄＰ／ｄｔ）及び血圧低下（−ｄＰ／ｄｔ）の最大速度、並びに、弛緩の時定数（ｔ）を様々なグループにおいて測定又は推定した。等容性弛緩の経時変化を方程式：Ｐ＝Ｐ０ｅ−ｔ/ｔ+ＰＢを用いて測定した（ここでＰは、左心室の等容性圧力であり、Ｐ０は、ピーク−ｄＰ／ｄｔの時に圧力であり、ＰＢは残留圧力である。）。
【０１７７】
ＲＮＡｉ治療後の心臓の組織学的検査
心筋細胞サイズ及び心臓の線維化：
動物の部分集合について組織学的分析を行い、筋細胞サイズ（ＣＭＤ）及びコラーゲン含有量（ＣＡＰ）を評価した。ＬＶ試験片を１０％のホルマリンによって固着させ、パラフィンに埋め込んだ。断片（厚さ３μｍ）を、ヘマトキシリンエオシンで染色してＣＭＤを測定し、アザンマロリーで染色してＣＡＰを評価した。長手方向に向けられた心筋細胞において、核横断幅をＣＭＤとして測定した（図３Ｆ）。それぞれのアザンマロリー切片上の６つの部位においてデジタル写真を得た。間質／血管周囲コラーゲン領域及び筋細胞領域を、ＮＩＨイメージャーを用いて電子化されたピクセルを数えることによってそれぞれ決定した（図３Ｅ）。
【０１７８】
統計分析
データを平均値±ＳＤとして与える。ＳＴＡＴＶＩＥＷ分析（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、Ｂａｒｋｅｌｅｙ、カリフォルニア）を用いた分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって多重比較を行った。統計的有意差をＰ＜０．０５のレベルとした。二要因分散分析を行って、異なるグループ間で異なる血流動態パラメータを比較した。変数を様々に間隔をおいて調査したエコーデータについては、反復測定を用いて分散分析を行った。統計的有意差をｐ＜０．０５のレベルとした。
【０１７９】
実施例２
ＲＮＡｉベクター系の最適化
一見して小さな構造的差異を有するＡＡＶ−ｓｈＰＬＢベクターが、インビトロのＰＮＣＭにおいて非常に異なるｓｈＲＮＡ生成率及びターゲット抑制を示した（図１）ので、ウイルスＲＮＡｉベクターの抑制有効性の決定子を調査した。ＰＮＣＭにおけるこれらの最初の研究として、インビトロにおいてＡＡＶ２．９よりも高い形質導入有効性を有するＡＡＶ２．６偽型を用いた。図２及び図３に報告されている後のＲＮＡｉ治療研究においては、インビボにおいて心臓への形質導入に優れているＡＡＶ２．９のみを使用した。インビトロ試験によって、ｓｈＰＬＢベクターを有する細胞を標識するためのＧＦＰマーカタンパクの共発現が、ｓｈＰＬＢ生成生産（図１Ｂ）及びＰＬＢ抑制をほとんど消失させたことが示された（図１Ａ）。ＧＦＰがＣＭＶによって駆動され、また、ＣＭＶがβイントロンに連結されていれば、ｓｈＲＮＡ転写に用いられるＵ６プロモータを含む発現カセット中のＣＭＶプロモータの存在によってｓｈＲＮＡ生成が非常に減少する（図５Ａ）。図１は、効率的な詰め込みには短すぎると以前に考えられていたＡＡＶ構築物によって、群を抜いて高い有効性が示されたことを示している。ＰＮＣＭにおけるＡｄＶ−ｓｈＰＬＢによるｓｈＲＮＡ転写を、ＡＡＶ６−ｓｈＰＬＢによるものと比較すると、アデノウイルスについては１０日目までに１／３に減少したが、ＡＡＶベクターについては一定の発現を示した（図１Ｂ）。４×１０３ｐ／ｃの用量における両方のベクターについて、ＰＬＢ発現の消失は＞９８％であった。興味深いことに、インビボにおける画像化によって検出可能にするためのＣＭＶ−ＧＦＰカセット組み込みによって、ターゲットを抑制できないベクターが予想外にできた。ＣＭＶプロモータで駆動される標識遺伝子発現は、Ｕ６−ｓｈＲＮＡベクターにおける使用に明らかに不適であり、最も単純で効率的なＵ６−ｓｈＲＮＡベクター（図１）をインビボにおけるＲＮＡｉ用に選択した。
【０１８０】
ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢと比較してｓｈＲＮＡ生成が非常に安定であること及びインビボにおける長期安定性の理由により、インビボにおける長期治療にｒＡＡＶ９−ｓｈＲＮＡを使用した。短期治療にアデノウイルスベクターを使用した。インビトロにおいては、数日のｍＲＮＡのレベルと比較すると、タンパクレベルにおいてはＰＬＢ消失の遅延があり、タンパクは、７日目においてそれぞれベースラインの９％（ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ）及び１２％（ｒＡＡＶ６−ｓｈＰＬＢ）で安定していた（図１Ｄ）。ＮＲＣＭのＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢ治療中の［Ｃａ２＋］ｉ推移の測定（図１Ｅ及び図１Ｆ）は、治療していない細胞と区別することができない推移を有するＡＡＶ９−ｓｈＧＦＰグループと比較して、このベクターによって、著しく高い振幅及び促進された推移動態（ＴＴＰ及びτが短縮された）となったことを示している。ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ治療も、ＡｄＶ−ｓｈＧＦＰと比較して著しく高い振幅であった。ＡＡＶ９グループとは対照的に、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ対ＡｄＶ−ｓｈＧＦＰにおいてＴＴＰが持続的であった。また、τには差がなかった。ＡｄＶグループにおける筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ２＋負荷の研究は、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ対ＡｄＶ−ｓｈＧＦＰグループにおける、増大した筋小胞体Ｃａ２＋負荷、及び、筋小胞体からのわずかなＣａ２＋放出（ＦＲ）を示している（図５Ｄ）。インビトロにおける形質導入による細胞対細胞での多様性に関して、図５Ｂは、インビトロにおいて均一なｓｈＰＬＢ発現の直接的な証明に対する最良のあり得る推定として機能するｒＡＡＶ−ＧＦＰマーカベクターで治療したＮＲＣＭにおける非常に均一なＧＦＰ発現を示している。ｓｈＰＬＢとＧＦＰとの共発現がその抑制する能力を消滅させるので（図１Ｂ及び図１Ｃ）、最近の技術を用いても後者を直接的に視覚化することができない。インビボにおけるラットの心臓中のＲＮＡｉベクターの均一な空間的及び時間的分布も、ＲＮＡｉ治療（図３Ａ−図３Ｄ）に用いられるのと同じ種類（ｒＡＡＶ９）のＧＦＰベクターの蛍光画像化（図２Ｂ及び図２Ｃ）によって間接的に推測される。図２Ｄ及び図２Ｈ−図２Ｊは、ｒＡＡＶ９−ＧＦＰを静脈内に注射した後の心臓及び他の器官のＧＦＰ免疫組織化学染色を示している。心臓における強く概ね均一な発現は、肝臓及び骨格筋の薄い染色及び肺の全く見えない染色（定量については図２Ｊを参照されたい）と対象的であった。
【０１８１】
実施例３
インビボＲＮＡｉ治療の有効性
大動脈を横断して締め付けると、ラットは３０週後に重篤な心不全になった。インビボＲＮＡｉ治療のための実験プロトコルの概略を図２に示す。ＲＮＡｉ治療に用いられるのと同じ種類（ｒＡＡＶ９）のＧＦＰベクターの蛍光画像化及び免疫組織学分析は、静脈内注射の１カ月後に、巨視的及び顕微鏡的スケールにおいて非常に均一な心臓内ＧＦＰ発現を示し、ＲＮＡｉベクターによって生成される心臓内ｓｈＲＮＡ発現レベルに接近すると推定される（図２Ｂ−図２Ｄ）。インビボにおけるｓｈＰＬＢ生成量を直接的に測定することは、最近の技術を用いても実現不可能である。図２Ｆ及び図２Ｇは、ＡｄＶ―ｓｈＰＬＢ又はｒＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢのいずれかを用いた治療の後に、心臓内ＰＬＢタンパクが有意に低下したことを示している。ＳＥＲＣＡ２ａタンパクは心不全の心臓において減少したが、一方で、ｓｈＰＬＢ治療によって心臓のＳＥＲＣＡ２ａタンパクが増加した。ＮＣＸは有意に変化しなかった。
【０１８２】
ＡｄＶ−ｓｈＧＦＰコントロールベクター（ＧＦＰをターゲットにするｓｈＲＮＡ配列を生成する）と比べると、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢの大動脈起始部注射による治療は、重篤な心不全の短期間治療のモデルとして機能した。注射１カ月後に、拡張機能（図３Ａ）は、コントロールグループよりも、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢにおいて有意に（ｐ＜０．０５）低く、左室拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）が１０±３ｍｍＨｇ対１４±４ｍｍＨｇであり、左室圧低下の速度（−ｄｐ／ｄｔ）が５２１５±５４０対４０１７＋４７１ｍｍＨｇ／秒であり、等容性弛緩時定数Ｔａｕ（τ）が１７±３対２４±４ミリ秒であった。収縮機能（図３Ｂ）が同様に改善し、左室収縮期圧（ＬＶＳＰ）が９０±５対７８±４ｍｍＨｇであり、左室圧上昇の速度（＋ｄｐ／ｄｔ）は７．４４８±６５９対５．６２４±６９８ｍｍＨｇ／秒であり、短縮率（ＦＳ）が４６．１±３．２対３９．１±３．７％であった。血流動態対する有益な効果を越えて、左室重量の大幅な増加及び拡張は、ＴＡＢの後に１カ月に有意に低下し、左室重量が１．３４±０．２２対１．８７±０．２１ｇであり、左室／体重（ＬＶ／ＢＷ）比が２．４±０．２対３．２±０．２×１０−３であり、左室／脛骨長さ（ＬＶ／ＴＬ）比が２９．３±４対４３．３±５であった（図３Ｃ）。これらの死後の形態測定データは、心臓超音波検査と関連性があった（図３Ｄ）。生存率は８／１０対９／１０であった。
【０１８３】
ＡＡＶ９−ｓｈＧＦＰベクターと比較して、最も効率的なＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢを尻部の静脈内に注射する治療は、重篤な慢性心不全の長期療法のモデルとして機能した。注射の３カ月後に、コントロールグループと比較して、拡張機能（図３Ａ）は、ＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢ治療において有意に改善され、もはや疑似手術された（大動脈結束がない）非心不全グループとも有意な差がなく、ＬＶＥＤＰが８±３ｍｍＨｇ対１８±４（非心不全：６±２）ｍｍＨｇであり、−ｄｐ／ｄｔが５．７２２±５０３対３．８７７±６４３（非心不全：６．０３２±３４４）ｍｍＨｇ／秒であり、Ｔａｕが１６±３対２３±４（非心不全：１４±３）ミリ秒であった。拡張期の機能的パラメーターよりも小さかったが、収縮機能（図３Ｂ）も回復し、ＬＶＳＰが９２±４対８０±３（非心不全：９８±４）ｍｍＨｇであり、＋ｄｐ／ｄｔが７．８５１±８０３対４．９９７±７６６（非心不全：８．７７２±８３２）ｍｍＨｇ／秒であり、短縮率（ＦＳ）が５０．１±２．１対３５．２±５．１％（非心不全：５２．２±４．１）であった。この治療は、血流動態のみならず、３カ月後に左室肥大及び拡張を減少させ、左室重量が１．３４±０．１２対１．７６±０．２７ｇ（非心不全：１．１１±０．０９）であり、ＬＶ／ＢＷが２．２±０．１対３．１±０．２ｘ１０−３（非心不全：１．８±０．２）であり、ＬＶ／ＴＬが２７．２±４対４５．３±５（非心不全：２４．５±４）であった（図３Ｃ）。心臓超音波検査によって、左室壁厚さ及び拡張の減少を確認した（図３Ｄ）。組織学的検査によって、ｒＡＡＶ９−ｓｈＲＮＡ治療の３カ月後に心筋細胞サイズ及び心臓内コラーゲンの両方の低下したことが示された（図３Ｅ及び図３Ｆ）。ＡＡＶ９−ｓｈＰＬＢで治療した動物の３カ月後の生存率は、コントロールグループにおいて９／１０対６／１０であった。
【０１８４】
実施例４
心不全のＲＮＡｉ治療
これらのデータは、ＲＮＡｉが急性及び、潜在的に可逆的なＨｆの中に単に一時的に望ましいかもしれないので、むしろ中間的時間スケールについては、アデノウイルスベクターが充分であり、長期間安定なＡＡＶ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００５）２３：３２１−３２８；Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００４）１０：８２８−８３４；Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００６）１４：４５−５３；Ｐａｃａｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒ  Ｒｅｓ（２００６）９９：ｅ３−９）よりも有利な点を与える可能性があることを示唆している。実際に、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ治療の１カ月後の拡張機能及び収縮機能並びに左室形態の有意な改善は、アデノウイルス系に由来する少なくとも機能的な治療的利益の証拠である。ＲＮＡｉベクター構造には、治療的有効性（図１Ａ及び図１Ｂ）の損失及びｍｉＲＮＡ経路のかく乱を回避するためのさらなる制限があるものの、古典的遺伝子導入治療(ｄｅｌ  Ｍｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００４）１０１：５６２２−５６２７；Ｓａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ（２００７) ４２：８５２−８６１；Ｓａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００７）２９２：Ｈ１２０４−１２０７；ｓａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００６）１３：３８７−９９６）について以前に証明されたものは、ＲＮＡｉをベースとする方法においても明らかに機能し得る。
【０１８５】
ＡＡＶからのｓｈＲＮＡの生成は、いくつかの態様において古典的遺伝子導入（図１）とは異なるが、本発明のＡＡＶ治療グループのデータは、ＡＡＶをベースとするｓｈＲＮＡの生成が心臓機能及びおそらく生存を改善することができる量で数カ月間安定したままであるという第１の証拠を提供する。霊長類（Ｐａｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６））において心臓作用性であるので、ここで用いられているＡＡＶ９ベクターは、ヒト心不全における用途の第１要件の１つを満たしている。げっ歯動物とは対照的に、遺伝子突然変異による永続的なＰＬＢ欠失又はＰＬＢ機能不全が心筋症に関係している（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）２９９：１４１０−１４１３；  Ｈａｇｈｉｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００６）１０３：１３８８−１３９３；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，（２００６）１１３：９９５−１００４）ので、おそらくヒトにおいて制御可能なＰＬＢ調整が最も必要とされるだろう。しかしながら、現在のベクタープラットフォームによれば、薬剤で制御可能なＲＮＡｉが可能であると考えられる。
【０１８６】
ＲＮＡｉ治療後に、心不全グループと比較して、ＳＥＲＣＡ２ａ発現が増加することがわかった。このことは、ＲＮＡｉ治療が左室機能を正常化したという事実と一致している。ＳＥＲＣＡ２ａ発現は、心不全の程度を示す周知のマーカであるので、ｓｈＰＬＢによるＲＮＡｉ治療後におけるその増加は、心臓機能の改善された状態を反映している。
【０１８７】
実施例５
ＲＮＡｉ治療中の心筋細胞マイクロＲＮＡ発現
ＲＮＡｉの細胞内機構は、何百万年にも渡って発展したものであり、特定の遺伝子を抑制するものとして知られている最も効率的で用途の広いメカニズムである。ｓｈＲＮＡは、内因性プロセスを模倣することによって、治療効果を媒介するこの機構を利用して、アンチセンスＲＮＡよりもはるかに低い濃度に抑制することができるが、細胞内ｍｉＲＮＡ経路（Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４４１：５３７−５４１）を阻害する可能性がある。ｍｉＲＮＡが心臓の形態形成（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ（２００７）１２９：３０３−３１７）、肥大化（Ｃａｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００７）１３：６１３−６１８；ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１６：５７５−５７９）、不整脈原性（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００７）１３：４８６−４９１）、及び、不全（Ｔｈｕｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００７）１１６：２５８−２６７；ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００６）１０３：１８２５５−１８２６０）に重要な役割を果たすので、ＲＮＡｉベクターの生じ得る副作用をＰＮＣＭ／ＮＲＣＭにおいてｍｉＲＮＡレベルで調査した。まず、標準培養条件下において、次いで、肥大化を誘導する薬剤であるフェニレフリン（ＰＥ）の存在下で調査を行った。この肥大性刺激の非存在下においては、インビボで用いたベクターのいずれもが、心臓において周知の機能的意義を有する細胞内ｍｉＲＮＡ１、２１、１３３ａ、１９５及び２０８に対していかなる有意な効果も示さなかった（図４Ｂ）。ＰＥの存在下においては、培養５日目にいくつかの心筋細胞ｍｉＲＮＡの著しい低下が認められた（図４Ａ）。驚くべきことに、抗肥大化能（Ｃａｒｅ，ｅｔ  ａｌ（２００７）ＭｉｃｒｏＲＮＡ−１３３  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １３，６１３−８；ａｎｄ  ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６、５７５−９）、及び、抗不整脈原生能（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉＲ−１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｒｒｈｙｔｈｍｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｃ  ＧＪＡｌ  ａｎｄ  ＫＣＮＪ２．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １３，４８６−１９１）を有するｍｉＲＮＡレベルのこの低下は、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ又はＡＡＶ６−ｓｈＰＬＢを用いて治療したＰＮＣＭにおいて元に戻り、これらのベクターが、これらのｍｉＲＮＡレベルをベースラインに戻した。
【０１８８】
ＰＥの存在下においては、培養５日目に心筋細胞ｍｉＲＮＡの著しい低下が認められた（図４Ｂ）。驚くべきことに、抗肥大化能（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，（２００７）；Ｃａｒｅ  ｅｔ  ａｌ，（２００７））、及び、抗不整脈原生能（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，（２００７））を有するｍｉＲＮＡのこの低下は、ＡｄＶ−ｓｈＰＬＢ又はＡＡＶ６−ｓｈＰＬＢを用いて治療したＰＮＣＭにおいて元に戻り、これらのベクターが、これらのｍｉＲＮＡレベルをベースラインに戻した。特定に注目すべきは、ｍｉＲＮＡ−１３３及びｍｉＲＮＡ−１である。悪性不整脈は心不全における重要な合併症であるので、新規な治療によってｍｉＲＮＡ−１などの任意の不整脈関連マイクロＲＮＡの制限が解除されてしまうことを、おそらく重大な副作用とみなすべきである（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７））。しかしながら、インビトロのデータは、ＰＥで誘導されたｍｉＲＮＡ−１低下がｓｈＰＬＢ治療によって打ち消されたことを示している（図４Ａ−図４Ｃ）。ＡＡＶ−ｓｈＰＬＮ治療グループにおける生存改善の傾向と同時に、現在までのところ、不整脈原生がこの治療の副作用であるという証拠は存在していない。ｓｈＰＬＢベクターで治療したラットの心臓は、ｓｈＧＦＰグループよりも高いｍｉＲＮＡレベルを有していた（図２Ｈ−図２Ｊ）。ＲＮＡｉベクターによって生じ得る副作用に関して、肝臓のヘマトキシリンエオシン染色（図２Ｅ）及びベクター注射後の他の器官は、全く病理所見を示さなかった。
【０１８９】
ｍｉＲＮＡ−１３３は、心筋細胞サイズの抑制において重大な役割を果たしており（Ｃａｒｅ  ｅｔ  ａｌ（２００７））、ＲＮＡｉ治療による肥大化低減に関して注目されている。インビトロでのｓｈＰＬＢ治療によってｍｉＲＮＡ−１３３レベルが元に戻る分子メカニズムに関わりなく、それらの上昇には抗肥大化効果があるに違いない。ＲＮＡｉ治療中の改善された収縮機能及び拡張機能は、全域的Ｃａ２＋推移を介して、興奮収縮連関（ＥＣＣ）に対するその影響から結果的に直ち生じているが、観察された左室肥大化及び拡張の著しい低減（図３Ｃ、図３Ｄ及び図３Ｆ）は、ＲＮＡｉ治療が全域的Ｃａ２＋サイクルの単一成分のみを主としてターゲットにしているので、容易に推論されるものではない。しかしながら、予想外にも、この厳密にターゲットされた干渉は、ＰＥによって誘導されたいくつかのｍｉＲＮＡ抑制を正常なレベルに戻した（図４Ａ）。血流動態ストレス及びインビボの心不全でみられるようなサイトカイン活性化の神経液は、インビトロにおいて何の役割も果たすことができないので、この復元は、明らかに細胞内レベルでのＣａ２＋恒常性の調整から結果的に生じている。細胞内ｍｉＲＮＡに対するＰＬＢ消失の直接的効果を推定することができないので、ＲＮＡｉによって誘導されるＣａ２＋恒常性における変化は、収縮関連の全域的Ｃａ２＋推移だけでなく、核膜腔において生成される分離されて隔絶されたＣａ２＋信号にも明らかに影響しており（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（２００６）１１６：６７５−６８２；Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ  Ｊ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（２００６）１１６：６２３−６２６）、それによって肥大化時などの転写の変化を決定する。ＰＥによって誘導され、ＲＮＡｉによって直されるｍｉＲＮＡ抑制は、変化したＣａ２＋恒常性から結果的に生じる細胞の制御ネットワークにおける間接的変化を単純に反映し得る。代替的に、後者は、直接的に第１のターゲットとしてｍｉＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る。
【０１９０】
これらの結果に基づいて、心臓病のために、非常に効果的な局所的ＲＮＡｉ治療的方法が開発されてきた。最適化されたＲＮＡｉベクター及び大動脈起始部へのベクター注射を用いてＲＮＡｉを心臓に限定したときは、毒性又は乱されたｍｉＲＮＡ経路の証拠は存在しなかった。理論に縛られるものではないが、肥大化に関連するｍｉＲＮＡの制限解除がベクターｍｉＲＮＡによって元に戻ることは、ｍｉＲＮＡが治療的プロセスに関与していることを示唆している。ＲＮＡｉで媒介されるＰＬＢをアデノベクターによって短期的に抑制することによって１カ月後に心臓機能が改善されたが、最適化された心臓作用性ＡＡＶ９ベクターに由来する長期的ＲＮＡｉは、心不全ラットにおいて機能、形態及び生存を３カ月間以上改善した。
【０１９１】
さらに、開示されているベクターの使用は、虚血灌流のモデルにおける心室性不整脈の低減及び心室機能の改善をもたらす。さらに、ＰＬＢの阻害は、心不全に移行しつつある圧負荷肥大を有する動物の生存期間を伸ばす。
【０１９２】
上記実施例を参照して本発明を説明したがが、変更例及び変形例が本発明の精神及び範囲内に包含されることは理解されるであろう。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲においてのみ限定されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2011512326.tif 000003
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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