(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアドレナリン受容体（ＡＲ）の細胞外α１ループ２またはβ２ループ１上のエピトープを認識する抗体に対するＥＤ５０が５００ｎＭ未満であり、配列番号１または配列番号５で示されるアミノ酸配列からなり、前記抗体が前記エピトープと結合することにより、γ−セクレターゼ活性の上昇、β−アミロイド分子の放出の増加、および／または脳血管細胞、グリア細胞、もしくはニューロンの細胞機能障害がもたらされ、前記ＥＤ５０値がバイオアッセイによって測定されるペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、ヒトα−ＡＲサブタイプＡ、Ｂ、もしくはＣ、またはこれらの組み合わせのα１細胞外ループ１エピトープ、およびβ２ＡＲの細胞外ループ１を認識し、前記組み合わせが、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、ＢおよびＣ、ＡおよびＢおよびＣである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
医学的活性物質として用いるための、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが、アルツハイマー病（Ｍｏｒｂｕｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）を患う患者の抗体と結合することを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、磁性ナノ粒子、常磁性ナノ粒子、および／または非磁性ナノ粒子へ不動化および／または固定されていることを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが固相へ結合されていることを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
直鎖状、分岐鎖状、または環状の形態であり、前記ペプチドの閉環が、２つのシステインが存在する場合はジスルフィド架橋を介して、もしくはアミド環化を介して行われ、または、側鎖を介して、Ｃ末端からＮ末端を介して、もしくは側鎖とＣ末端からＮ末端との組み合わせを介して行われる、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、アミノ基、アミド、ヒドラジド、アジド、カルバミン酸、アセチル基、ビオチン基、マーカー、スペーサー、および／またはリンカーをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
ａ）請求項１に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）ａ）のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子；ならびに
ｅ）遺伝コードのため、ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列と縮重している核酸分子
を含む群から選択される単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／またはＲＮＡであることを特徴とする、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項９または請求項１０に記載の核酸分子によりコードされるペプチド。
【請求項１４】
化学的に活性化された有機ポリマー、無機ポリマー、合成ポリマー、または混合ポリマーからなるアフィニティクロマトグラフィまたは固相抽出のための固相であって、前記固相の表面に請求項１〜請求項８及び請求項１３の少なくとも１項に記載のペプチドが不動化されている固相。
【請求項１５】
架橋アガロース、セルロース、シリカゲル、ポリアミド、またはポリビニルアルコールからなる請求項１４に記載の固相。
【請求項１６】
前記ペプチドが、共有結合または吸着によって前記固相に結合される、請求項１４または請求項１５に記載の固相。
【請求項１７】
前記ペプチドが、リンカー／スペーサーによって前記固相の表面から離れて位置する、請求項１４〜請求項１６のいずれか１項に記載の固相。
【請求項１８】
請求項９または請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の宿主細胞、請求項１〜請求項８及び請求項１３のいずれか１項に記載のペプチド、および／または請求項１４〜請求項１７のいずれか１項に記載の固相を含むキットであって、前記キットの内容物を組み合わせるための、および／または製剤を提供するための説明書をさらに含む、キット。
【請求項１９】
固相上の免疫グロブリン含有サンプルから免疫グロブリンを除去するための装置であって、請求項１４〜請求項１７のいずれかに記載の固相を含み、免疫グロブリン含有サンプルを投入する手段を備える、装置。
【請求項２０】
前記免疫グロブリンが、α−アドレナリン受容体と相互作用を起こすアゴニスト活性を示す自己抗体であることを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
患者から免疫グロブリンを除去することにより、γ−セクレターゼ活性の上昇、β−アミロイド分子の放出の増加、および／または脳血管細胞、グリア細胞、もしくはニューロンの細胞機能障害に起因する疾患を治療するための装置を製造するための、請求項１９または請求項２０に記載の免疫吸着装置の使用。
【請求項２２】
請求項１〜請求項８及び請求項１３のいずれか１項に記載のペプチドを含む、クロマトグラフィのための装置。
【請求項２３】
前記ペプチドが、請求項１４〜請求項１７のいずれか１項に記載の固相に結合されることを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アドレナリン受容体のα１ループ２またはβ２ループ１上のエピトープを認識する抗体に対して結合親和性を有するペプチド、単離された核酸分子、有機ポリマー、無機ポリマー、合成ポリマー、もしくは混合ポリマーからなるアフィニティクロマトグラフィまたは固相抽出のための固相、核酸分子を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、固相上の免疫グロブリン含有流体から免疫グロブリンを除去するための装置、本発明の核酸分子、ペプチド、および／または固相、ならびに薬理学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物、本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明の宿主細胞を含むキット、ならびに本発明のペプチドを含むクロマトグラフィのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
発見者であるアロイス・アルツハイマー（Ａｌｏｉｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）（１８６４〜１９１５）にちなんで名付けられたアルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の変性疾患である。その特徴は、重要な脳機能に広範囲にわたる影響をもたらす凝集タンパク質の沈着によって引き起こされる、脳細胞の構造および機能の変化である。以下の臨床的および認知的特徴が重要である：
・最初は短期記憶の障害、後に長期記憶の障害
・単純な認識パターンの認知障害
・発話および明瞭な発音の進行性喪失
・臭覚、空間見当識の進行性喪失、および日常的な作業を行う能力の低下
【０００３】
「ＡＤ」の診断は種々の方法で得られ、例えば、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴断層撮影法（ＭＲＴ）などの画像法、および脳脊髄液中の関連する病的分子の濃度を実験室において化学的に測定する方法などがある。脳波記録法（ＥＥＧ）も考えることができる。ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＴ）などの認知検査は次第に重要になりつつある。
【０００４】
治療を施さない場合、当該疾患は、数年間にわたって臨床状態（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍａｇｅ）が悪化する結果となり、最後には死を迎えることが避けられない「一方通行」である。疾患のステージが進行したものであるほど、患者にかかるケアおよび費用が増加する。これは認知症のその他の形態にも当てはまるが（ＡＤは全認知症ケースの約３分の２を占める）、それらに関しては本発明では扱わない。
【０００５】
当該疾患の罹患率は、年齢に大きく依存している。年齢が６０〜７０歳の場合、罹患率は約１％であり、年齢が７０〜８０歳の場合、罹患率は約１０％という高さとなる。ドイツではヒトの寿命が延び続けていることから、症例数がさらに増加することが予想される。
【０００６】
現在、ドイツにおけるＡＤの年間発症数は、１３０，０００〜１４０，０００件（Ｈａｌｌａｕｅｒ、２００３）であるが、この数字には説明が必要である。軽度の形態の場合はほとんど目立たないことから、該患者の大部分は恐らく疾患の重症度が中程度であるだろう。
【０００７】
数年前、当該疾患は依然として治癒することができない運命の巡り合わせであると考えられていた。重度のケースでは、鎮静のために、鎮静薬および神経遮断薬による治療が行われてきた。一方で、第一世代の薬物が入手可能であり、これらは、中間的な中程度のステージに主に用いられる。例には、Ａｘｕｒａ（活性成分：メマンチン）またはＥｘｅｌｏｎｅ（活性成分：リバスチグミン）などの認可医薬が含まれる。研究の発表状況によると、これらの薬剤は、軽度および中程度の重症度のＡＤに対して良好な効果を有する。
【０００８】
しかし、Ｅｘｅｌｏｎｅおよびその他のコリンエステラーゼ阻害薬の臨床的効果は、メタ分析によって否定されている。認可医薬は市販されており製剤の処方は可能であるが、すべての患者が治療されるわけではまったくない。
【０００９】
アセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェン、インドメタシン、またはＣＯＸ２阻害薬などの抗炎症薬により、ＡＤに対するある程度の予防効果が引き起こされると考えられる。確かに、局所的および全身的な炎症または炎症メディエーターが、恐らくは神経原線維形成を促進することにより、生命体／脳において疾患を促進する役割を果たしている。
【００１０】
スタチンなどのコレステロール低下薬も、ＡＤ発症のリスクに対して有利な影響を有すると考えられる。少なくとも、コレステロール低下薬を服用している患者は、ＡＤの発症率が低い。しかし、このことを裏付ける確かな科学的データはない。
【００１１】
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害薬などの降圧薬でも同じような状況である。これらの活性物質の直接の効果に加えて、収縮期血圧の低下も、観察される予防効果と一般的に関連している。
【００１２】
患者をβ−アミロイドにより免疫化することは、治療の実験段階である。それに反応して、免疫系が抗体を産生し、結果的に局所的な炎症反応によってアミロイド斑を破壊する。この手法は有望と考えられるが、高いリスクを伴うため、議論の余地がないというわけではない。恐らく、治療的に用いられる個々の炎症免疫反応は、必要とされるほどの精度では投薬することができない。その他の実験的な治療の手法は、明らかに斑の形成において役割を担っている脳の銅イオンの欠乏を補うことに基づいている。
【００１３】
薬物が、基本的に進行を停止することができるだけであるのか、または患者の認知状態を臨床的に改善することもできるのかという問題は、現在のところまだ解決されていない。現在利用可能な手段は、臨床的な状況を改善するというよりも、安定化させるものである。
【００１４】
ＡＤの病因自体はまだ最終的に明らかにされていない。数多くのリスク因子が認識されている。これらには、年齢、高血圧、高コレステロールレベル、過体重、アポリポタンパク質Ｅ４、銅欠乏、特定の遺伝的素因、および恐らく酸化的ストレスが含まれる。該疾患の発症は、多因性である可能性が非常に高い。
【００１５】
ＡＤの発症および進行において役割を担うか、または担う可能性のある分子に関する文献は非常に数多く存在する。ここで、用語の定義に関して、いわゆる病的分子のほとんどは、健康な生物における生理学的な構造およびプロセスの構成要素であると言うことができる。これらは、血漿中もしくは局所的に組織中、細胞間または細胞内の濃度限界を超える場合に、病的であると見なされる。このことは、溶解したタンパク質および凝集した分子（例えば、斑の形態のβ−アミロイド）の両方に当てはまる。
【００１６】
２つの異なった、それ自体が病的なタンパク質分子が、脳の細胞間または細胞内の空間に凝集または沈着すると、シグナル伝達およびニューロンの相互作用において基礎的なニューロン機能障害が引き起こされる。このようなタンパク質は、基本的に、神経毒性のあるβ−アミロイドペプチド（アミロイド斑の形態でポリマーとして凝集）、および神経原線維変化として凝集したポリマーであるタウタンパク質である。
【００１７】
いわゆるアミロイドは、明らかに、ＡＤ発症の原因として関与している。その後、神経細胞の膜からの該分子の酵素開裂によって、アミロイド−β４０／４２の形成が増加する。その結果、単一のβ−アミロイド分子、β−アミロイドオリゴマー、およびそのアミロイド斑への凝集の濃度が局所的に増加する。このような斑は、神経による刺激の正常な伝達、および細胞間の情報伝達を阻害する。前駆体分子からの凝集性β−アミロイドの開裂は、いわゆるγ−セクレターゼによって引き起こされる。該酵素の活性は、β２−アドレナリン受容体によって制御される。
【００１８】
斑はさらに、通常は神経細胞の軸索路に生理学的に局在しているタウタンパク質の神経原線維変化を発生させる場合もある。このような凝集体の沈着は、脳領域の広い範囲にわたって発生する。斑形成のプロセスは、疾患の初期から発病まで何年もかけて進行する。
【００１９】
斑および神経原線維変化はいずれも、死亡したＡＤ患者の脳切片中に、顕微鏡で良好に視覚化することができ、診断の重要な部分である。
【００２０】
アポリポタンパク質Ｅ４の役割を含む、その他の分子の病理機序における役割についても同時に議論されている。さらに、レオロジー的に関連する血漿タンパク質が、少なくとも間接的に、臨床的な状況の発生に関与していると考えられている。これらには、アルファ−２マクログロブリン、フィブリノーゲンの全身レベルおよび局所濃度の増加または中程度の増加が含まれるが、酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）など、酸化的ストレス反応由来の酸化血漿タンパク質も含まれる。
【００２１】
これらの分子の作用が総合して脳領域の血液循環の低下の原因となり該疾患の開始が誘発され、進行および維持が促進される場合がある。表１は、重要な病的分子の概説を示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
ＧＰＣＲに対するａｇＡＡＢに関連する疾患群の中で最も詳細に研究されたものは、心疾患である。心筋炎、拡張型心筋症、周産期心筋症、シャーガス病、および心室性不整脈では、臨床的に診断された疾患を有する患者の血清中に、β１−ＡＲに対するａｇＡＡＢを検出することができる。
【００２４】
ＤＣＭおよび心筋炎は重度の心臓疾患であり、慢性心筋炎がＤＣＭへ発展することがあるという仮説が立てられている。両疾患共に、エンテロウイルスまたはその他による感染が主たる病原因子であり得るが、炎症反応が自己免疫疾患へ発展することもある。後のステージでは、病原因子は検出不能である場合があり、炎症反応さえも低下する場合があるが、慢性の進行性心不全と診断される。ＤＣＭは、重度の心不全が特徴的である。その他の病原因子を除外することができる、ＤＣＭのサブセットである特発性ＤＣＭでは、最大８０％のβ１−アドレナリン作動性ＡＡＢの罹患率が顕著である。
心筋炎およびＤＣＭでは、β１−アドレナリン作動系およびレニン−アンジオテンシン系のアンタゴニスト、ならびに身体の安静による治療が優先的に行われる。
【００２５】
治療上の目標は、心臓の過剰刺激を低減し、不整脈を防止することである。ベータ遮断薬を治療に用いてアドレナリン作動性の過剰刺激を低減すると、研究対象とした患者の心臓死および入院加療が著しく減少する。心室性不整脈は、拡張型ＤＣＭにおける突然死の主たる原因であり、心室頻拍がβ１−ＡＲに対するａｇＡＡＢの検出と強い関連性を有することが示されている。
【００２６】
ＤＣＭにおける心不全が慢性的に進行すると、効果のある薬物療法がもはや不可能な疾患ステージへと至る。このステージでは、ある程度の年数の間持続可能な治療法として考慮することができるのは、心臓移植のみである。心臓移植の理由の約半数がＤＣＭである。治療の選択肢を広げることができれば、重度の心不全のケースにおける多数の早期死亡を阻止することができる可能性が非常に高いであろう。
【００２７】
ＤＣＭと同様に、周産期心筋症は左心室の拡張を特徴とし、生命に関わる障害へと発展する可能性がある。南アフリカの女性における発症率は約１：１０００である一方、欧米諸国の白色人種ではこの疾患は稀である。周産期心筋症の病因については未知の部分が多い。定義として、該疾患は、出産前の最終月および出産後の４ヶ月の間に診断される。最近、周産期心筋症を患う患者１０人のサンプルのすべての血清中において、β１−ＡＲに対するａｇＡＡＢが存在することが示された。
【００２８】
シャーガス病は、寄生生物トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）がその原因であり、南アメリカでは非常に一般的である。症状の中でも、患者は多くの場合、コリン作動性システムの全体に影響を及ぼす自律神経障害症候群の一部として、心筋炎を発症する。自律神経障害症候群は、ムスカリン性Ｍ２アセチルコリン受容体に対する機能性ＡＡＢによっても引き起こされるとする強い証拠が存在する。Ｍ２−受容体に対するａｇＡＡＢの罹患率は５０〜９４％の範囲である。シャーガス病では、β１−ＡＲに対するＡＡＢも、約５３％のケースで見いだされる。この状況は、付帯徴候として機能性拮抗作用を有する、Ｔ．クルージ由来の、元来同一である抗原の抗原模倣（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｍｉｍｉｃｒｙ）を意味している可能性がある。
【００２９】
前述のａｇＡＡＢの病因の性質に関して、以下の段落では、臨床的に関連のある証拠を有するシグナル伝達の現象のみを考慮する。β−ＡＲの活性化により、Ｇ−タンパク質三量体中のＧｓ−タンパク質が刺激されてアデニル酸シクラーゼが活性化され、ｃＡＭＰの上昇が引き起こされる。一方、ムスカリン性アセチルコリン受容体およびニコチン性アセチルコリン受容体に結合したアゴニストリガンドは、Ｇｉ−タンパク質を阻害することによりアデニル酸シクラーゼを阻害する。しかし、この単純なパターンが、個々の受容体にまで拡張されなければならない。
【００３０】
心筋炎またはＤＣＭ患者の血清由来の自己抗体は、アゴニストであるイソプレナリンと同程度の陽性変時作用を示す。イソプレナリンは、明らかに細胞中のｃＡＭＰ濃度を増加させ、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを活性化する。ＤＣＭ患者からのＡＡＢが、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを活性化することが示されている。一方、ｃＡＭＰの蓄積に対するＡＡＢの影響はむしろ僅かであった。しかし、心筋細胞中における細胞質プロテインキナーゼＡおよび膜結合プロテインキナーゼＡは、ＡＡＢ刺激によって活性化されることが示されている。ラット心筋細胞においてアポトーシスを誘発する抗β１受容体モノクローナルＡＢもｃＡＭＰおよびプロテインキナーゼＡを介して作用し、ＭＡＰキナーゼ、特にｐ３８キナーゼは、複数のＧＰＣＲの下流で活性化されるが、炎症性サイトカインのシグナル伝達カスケードでも活性化される。したがって、ａｇＡＡＢによるβ１−ＡＲの刺激は炎症誘発作用も有し得ることを示唆することができる。
【００３１】
ｃＡＭＰ非依存性の重要なシグナル伝達経路も存在する。Ｌ型Ｃａ２＋チャネルは、プロテインキナーゼＡによるリン酸化によって活性化されるだけでなく、Ｇタンパク質のサブユニットによっても直接活性化される。したがって、Ｃａ２＋流入による刺激は、自己免疫性心筋炎およびＤＣＭにおけるＡＡＢの病因的役割についての重要な経路であり得る。ラットおよびヒト心筋細胞に対する活動電位は、β１−ＡＲに対するａｇＡＡＢの投与によって延長され、そして次に、起電性のＮａ＋／Ｃａ２＋交換体を活性化し、その結果、心臓の電気的不安定性をもたらす。細胞内カルシウムの過負荷も、β１−アドレナリン刺激と同様に、リモデリングの重要な現象として知られている。トランスジェニックラットのモデルにおいて、β１−ＡＲは、心房性ナトリウム利尿因子の転写促進に仲介されるアクチンの再構築にとって極めて重要であった。
【００３２】
すべてを合わせて考えると、β−アドレナリン作動性の過剰刺激、細胞内カルシウムの過負荷、およびβ１−ＡＲの下方制御の部分的な欠如が、心筋炎およびＤＣＭの疾患発生に関与している可能性がある。
動物実験の結果は、組織培養実験で得られたａｇＡＡＢの病因的関連性に関するインビトロのデータを裏付けている。Ｊａｈｎｓらは、β１−ＡＲの第二細胞外ループで免疫化することにより、ラットにおいてアゴニスト抗体を誘発することができた。該動物は、ヒト拡張型心筋症に類似した拡張型心筋症を発症した。この誘発した抗体／免疫グロブリンを健康な動物に移植すると、やはりＤＣＭを引き起こす。
【００３３】
β１−ＡＲに対するアゴニスト抗体の誘発はウサギでも行われ、ａｇＡＡＢおよびＤＣＭが発生した。ペプチドカラムを用いた特異的免疫吸着により動物の血漿からａｇＡＡＢを除去すると、左室駆出率として測定される心筋機能の改善が見られる。
【００３４】
さらに多くの刊行物で、ＤＣＭを患う患者における除去（免疫吸着）療法の臨床的有用性に関して報告されている。有効な心臓薬物治療が不可能である心疾患の臨床段階において、除去療法により、長期間にわたるａｇＡＡＢの低下、活性化された炎症性白血球の心筋組織からの消滅、および重要な心機能の上昇がもたらされる。
【００３５】
ａｇＡＡＢと関連するか、またはこれに起因する疾患のその他の例には、妊娠高血圧腎症および血管壊死性腎臓拒絶反応（アンジオテンシン−１受容体に対するａｇＡＡＢ、または開放隅角緑内障（β２−アドレナリン受容体に対するａｇＡＡＢがある。
【００３６】
国際公開第０２／０９３１７４号は、ＡＤを治療する方法および装置を開示する。当該方法には、体液中、好ましくは血液または血液製剤中のマーカーである生化学的マーカー、具体的には、ヒトグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の循環自己抗体を除去することが含まれる。該発明は、さらに、自己抗体の除去に効果的である免疫系の調節を行う装置またはプロセスも含む。
【００３７】
Ｄ．Ｍ．Ｗａｌｓｈらは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００５）Ｖｏｌ．３３、ｐａｒｔ  ５、ＰＰ  Ｉ０８７〜１０９０に、Ａβの可溶性オリゴマーが、アルツハイマー病の最も初期のエフェクターの１つであることを開示する。著者らは、アミロイドに基づく３つの顕著な治療標的である、Ａβ産生に関与するセクレターゼの阻害、Ａβ凝集の阻害、およびＡβに対する免疫化に向けた化合物の試験について報告している。各ケースにおいて、オリゴマー産生を低減することができる化合物、または積極的にＡβオリゴマーと結合する抗体はまた、これらの天然の細胞由来オリゴマーのシナプス毒性作用を寛解させる。
【００３８】
Ｎｏｒｍａｎ  Ｒ．Ｒｅｌｋｉｎらは、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ（２００８）、Ｆｅｂｒ．２０、Ｅ−ｐｕｂｌ．において、βＡに対する天然の抗体が体内のβＡレベルを低下させ、当該抗体の静脈内投与によって、軽度のＡＤを有する患者の脳機能を改善することができることを開示している。
【００３９】
Ｄｅｎｎｉｓ  Ｊ．Ｓｅｌｋｏｅらは、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００３、４３：５４５−８４．において、アミロイドに基づく治療を予測する分子の理解について考察している。脳の変性疾患は、最も不明瞭で難治性のヒト疾病の１つであると長い間考えられていた。しかし、その機構の理解が最近になって進んだことにより、疾患修飾薬の可能性に目前まで迫った。この進歩は、恐らくアルツハイマー病のケースで最も良く例示される。分子病理学および遺伝学の適用により、これまでに家族性アルツハイマー病と関連付けられた４つの遺伝子すべてが、アミロイドβ−タンパク質（Ａβ）の脳内レベルを慢性的に上昇させることが分かった。したがって、前駆体からＡβを発生させるプロテアーゼであるβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼの小分子阻害薬が活発な開発下にあり、マウスのモデルにおいてインビボでの効力を示したものもある。別の手法として、Ａβに対する能動免疫または受動免疫が広範囲にわたるマウスでの前臨床確認を受けているが、ヒトに対する顕著な副作用のない効果的な製剤は依然として待ち望まれている状態である。いくつかのその他の可能性のある治療法も概説されている。これらの様々な手法の１つもしくは２つ以上が最終的に認知症を遅延または予防することが証明された場合、アルツハイマー病は、器官の中で最も複雑であるヒト大脳皮質に対する還元主義的生物学（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎｉｓｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ）の適用の重要な成功例となるであろう。
【００４０】
欧州特許出願公開第１８３２６００号は、緑内障に関連する自己抗体と相互作用を起こすペプチドをコードする核酸分子、該ペプチド自体、前記核酸分子およびペプチドを含む医薬組成物、ならびに前記ペプチドの、特に除去療法における、緑内障の治療のための使用に関する発明を開示する。該ペプチドは、β２アドレナリン受容体の細胞外ループ２の一部分であるエピトープに相当する。
【００４１】
国際公開第０２／３８５９２号は、免疫グロブリンに対して高い親和性を有するペプチドに関する発明を開示する。
【００４２】
Ｙ．Ｍａｇｎｕｓｓｏｎらは、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）７８、４２〜４８．において、ベータ−２アドレナリン受容体とは異なる、ヒトベータ−１アドレナリン受容体の第二細胞外ループの抗原性分析について報告している。
【００４３】
Ｙａｎｘｉａｎｇ  Ｎｉらは、γ−セクレターゼ活性を刺激しアミロイド斑の形成を促進する、β２−アドレナリン受容体の活性化について報告している。この報告によると、β２−ＡＲの活性化により、γ−セクレターゼ活性およびアミロイド斑形成が刺激され、アルツハイマー病の疾患発病において、β２−ＡＲの異常な活性化がＡβの蓄積に寄与している可能性があると推測される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４４】
本発明の目的は、ＡＤの治療に用いることができる化合物を提供することである。別の目的は、アドレナリン受容体に対する自己抗体に起因した高レベルのγ−セクレターゼを患う個体において、β２−アドレナリン受容体を介したγ−セクレターゼ活性を低下させることができる化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００４５】
本発明は、γ−セクレターゼ活性の上昇、β−アミロイド分子の放出の増加、および／または脳血管細胞、グリア細胞、もしくはニューロンの細胞機能障害に起因する疾患を患う患者の血漿中における、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、β２およびα１アドレナリン受容体（ＡＲ）に対するアゴニスト自己抗体（ａｇＡＡＢ）の発見に基づいている。具体的には、該疾患はＡＤである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】アルツハイマー病の患者（ｎ＝１１〜１４）の抗体は、β２アドレナリン受容体およびα１アドレナリン受容体を介してラット心筋細胞を刺激する。
【図２】アルツハイマー病の患者（ｎ＝６）由来の抗体は、β２アドレナリン受容体の第一細胞外ループと結合する。
【図３】アルツハイマー病の患者（ｎ＝６）由来の抗体は、β２−ＡＲの第一細胞外ループ中に埋め込まれたペプチドエピトープと結合する。
【図４】アルツハイマー病の患者（ｎ＝６）のβ２アドレナリン受容体に対する抗体は、免疫グロブリンＧサブクラス１に属する。
【図５】アルツハイマー病の患者（ｎ＝６）由来の抗体は、α１アドレナリン受容体の第二細胞外ループと結合する。
【図６】アルツハイマー病の患者（ｎ＝５）由来の抗体は、α１Ａアドレナリン受容体の第二細胞外ループ中に埋め込まれたペプチドによって中和される。
【図７】アルツハイマー病の患者（ｎ＝５）由来のα１Ａアドレナリン受容体に対する抗体は、免疫グロブリンＧサブクラス１に属する。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明のある実施形態では、前記目的は、γ−セクレターゼ活性の上昇、β−アミロイド分子の放出の増加、および／または脳血管細胞、グリア細胞、もしくはニューロンの細胞機能障害に起因する疾患を患っていることが疑われるかまたは患っている患者から、免疫グロブリンを除去することによって解決される。免疫グロブリンの除去は、固体担体上にそれぞれの免疫グロブリンを吸着させることによって実施することができる。このような方法は、それ自体としては本技術分野において公知である。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は、γ−セクレターゼ活性の上昇、β−アミロイド分子の放出の増加、および／または脳血管細胞、グリア細胞、もしくはニューロンの細胞機能障害に起因する疾患を、患者から免疫グロブリンを除去することにより治療する装置を製造するための免疫吸着装置の使用に関する。
【００４９】
本発明の別の実施形態では、この目的は、アドレナリン受容体のヒトα１ループ２およびβ２ループ１上のエピトープを認識する抗体に対する、ＥＤ５０が５００ｎＭ未満、特に１０ｎＭ未満であるペプチドによって解決され、該抗体がエピトープと結合することにより、γ−セクレターゼ活性の上昇、および／または病的β−アミロイドの放出の増加、および／または脳血管細胞、グリア細胞、もしくはニューロンの細胞機能障害がもたらされ、ＥＤ５０の値は、ａｇＡＡＢの同定に用いられたバイオアッセイによって測定される。
【００５０】
特に、本発明のペプチドは、α−アドレナリン受容体サブタイプＡ、Ｂ、もしくはＣ、またはこれらの組み合わせのヒトα１ループエピトープを認識する。
【００５１】
本発明のある実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸配列、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９
からなり、
ａ）
Ｘ１＝アミノ基、アミド、アセチル基、ビオチン基、マーカー、スペーサー、リンカー、Ｃ、ＧＫＫ、ＳＧＫＫ、もしくは欠失、
Ｘ２＝Ａ、Ｇ、α−Ａｂｕ、Ｆ、Ｈｐｈ、Ｈｙｐ、Ｎａｌ、Ｐ、Ｐｉｐ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、もしくは欠失、
Ｘ３＝Ｈｙｐ、Ｐ、Ｐｉｐ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、もしくは欠失、
Ｘ４＝Ａａｄ、Ａｓｕ、Ｄ、Ｅ、Ｈａｒ、Ｋ、Ｎ、Ｏｒｎ、Ｑ、Ｒ、
Ｘ５＝Ａａｄ、Ａｓｕ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、
Ｘ６＝Ａａｄ、Ａｓｕ、Ｄ、Ｅ、Ｈａｒ、Ｋ、Ｎ、Ｏｒｎ、Ｑ、Ｒ、
Ｘ７＝Ｆ、Ｈｐｈ、Ｈｙｐ、Ｎａｌ、Ｐ、Ｐｉｐ、Ｗ、Ｙ、もしくは欠失、
Ｘ８＝Ａ、α−Ａｂｕ、β−Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙ、もしくは欠失、
Ｘ９＝アミド、ヒドラジド、アジド、カルバミン酸、マーカー、スペーサー、リンカー、Ｃ、ＧＫＫ、ＳＧＫＫ、もしくは欠失、または、
ｂ）
Ｘ１＝アミノ基、アミド、アセチル基、ビオチン基、マーカー、スペーサー、リンカー、Ｃ、ＧＫＫ、ＳＧＫＫ、もしくは欠失、
Ｘ２＝Ｆ、Ｈｐｈ、Ｈｙｐ、Ｎａｌ、Ｐ、Ｐｉｐ、Ｗ、Ｙ、
Ｘ３＝Ａ、α−Ａｂｕ、Ｄａｂ、Ｇ、Ｈｙｌ、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、
Ｘ４＝Ａａｄ、Ａｓｕ、Ｄ、Ｅ、Ｈｙｐ、Ｎ、Ｐ、Ｐｉｐ、Ｑ、
Ｘ５＝Ａａｄ、Ａｓｕ、Ｄ、Ｅ、Ｈｙｐ、Ｎ、Ｐ、Ｐｉｐ、Ｑ、
Ｘ６＝Ａ、α−Ａｂｕ、Ｇ、Ｈｙｌ、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｓ、Ｖ
Ｘ７＝Ｆ、Ｈｐｈ、Ｈｙｐ、Ｎａｌ、Ｐ、Ｐｉｐ、Ｗ、Ｙ、
Ｘ８＝γ−Ａｂｕ、Ａｈｘ、β−Ａ、Ｇ、もしくは欠失、
Ｘ９＝アミド、ヒドラジド、アジド、カルバミン酸、マーカー、スペーサー、リンカー、Ｃ、ＧＫＫ、ＳＧＫＫ、もしくは欠失、または、
ｃ）
Ｘ１＝アミノ基、アミド、アセチル基、ビオチン基、マーカー、スペーサー、リンカー、Ｃ、ＧＫＫ、ＳＧＫＫ、もしくは欠失、
Ｘ２＝Ａ、α−Ａｂｕ、Ｄａｂ、Ｇ、Ｈｙｌ、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｒ、もしくは欠失、
Ｘ３＝Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈｐｈ、Ｍ、Ｎａｌ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、
Ｘ４＝Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、
Ｘ５＝Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、
Ｘ６＝Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈｐｈ、Ｍ、Ｎａｌ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、
Ｘ７＝Ａ、α−Ａｂｕ、Ｄａｂ、Ｇ、Ｈｙｌ、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｒ、
Ｘ８＝Ａｂｕ、Ａｈｘ、β−Ａ、Ｇ、もしくは欠失、
Ｘ９＝アミド、ヒドラジド、アジド、カルバミン酸、マーカー、スペーサー、リンカー、Ｃ、ＧＫＫ、ＳＧＫＫ、もしくは欠失、または、
ｄ）
Ｘ１＝アミノ基、アミド、アセチル基、ビオチン基、マーカー、スペーサー、リンカー、Ｃ、ＧＫＫ、ＳＧＫＫ、もしくは欠失、
Ｘ２＝Ａａｄ、Ａｓｕ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈｐｈ、Ｎ、Ｎａｌ、Ｑ、Ｗ、Ｙ、
Ｘ３＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈｃｙ、Ｓ、Ｓｅｃ、
Ｘ４＝Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｎ、Ｎａｌ、Ｑ、Ｗ、Ｙ、
Ｘ５＝Ｆ、Ｈｐｈ、Ｎａｌ、Ｗ、Ｙ、
Ｘ６＝Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｎ、Ｎａｌ、Ｑ、Ｗ、Ｙ、
Ｘ７＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈｃｙ、Ｓ、Ｓｅｃ、
Ｘ８＝Ａａｄ、Ａｓｕ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈｐｈ、Ｎ、Ｎａｌ、Ｑ、Ｗ、Ｙ、
Ｘ９＝アミド、ヒドラジド、アジド、カルバミン酸、マーカー、スペーサー、リンカー、Ｃ、ＧＫＫ、ＳＧＫＫ、もしくは欠失、
であり、
Ａａｄは、α−アミノアジピン酸；α−Ａｂｕは、α−アミノ酪酸；Ａｈｘは、ε−アミノへキサン酸；Ａｓｕは、α−アミノスベリン酸；β−Ａは、β−アラニン；Ｄａｂは、α，γ−ジアミノ酪酸；γ−Ａｂｕは、γ−アミノ酪酸；Ｈａｒは、ホモアルギニン；Ｈｃｙは、ホモシステイン；Ｈｐｈは、ホモフェニルアラニン；Ｈｙｌは、δ−ヒドロキシリジン；Ｈｙｐは、ヒドロキシプロリン；Ｎａｌは、β−（１−または２−ナフチル）−アラニン；Ｏｒｎは、オルニチン；Ｐｉｐは、ピペコリン酸；Ｓｅｃは、セレノシステイン、ならびに、アミノ酸の一文字コードは、ＩＵＰＡＣ命名法に従う一般的なＬ−アミノ酸および対応するＤ−アミノ酸を表す。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、本発明のペプチドは、リンカーおよび／またはスペーサーが、α−アミノカルボン酸ならびにそのホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマー、α，ω−アミノカルボン酸およびその分岐鎖状オリゴマーもしくはヘテロオリゴマー、その他の脂肪族アミノ酸および／もしくは芳香族アミノ酸ならびに直鎖状および分岐鎖状のホモオリゴマーもしくはヘテロオリゴマー；アミノオリゴアルコキシアルキルアミン；マレインイミドカルボン酸誘導体；アルキルアミンオリゴマー；４−アルキルフェニル誘導体；４−オリゴアルコキシフェニル誘導体もしくは４−オリゴアルコキシフェノキシ誘導体；４−オリゴアルキルメルカプトフェニル誘導体もしくは４−オリゴアルキルメルカプトフェノキシ誘導体；４−オリゴ−アルキルアミノフェニル誘導体もしくは４−オリゴアルキルアミノフェノキシ誘導体；（オリゴアルキルベンジル）フェニル誘導体もしくは４−（オリゴアルキルベンジル）フェノキシ誘導体、ならびに４−（オリゴ−アルコキシベンジル）フェニル誘導体もしくは４−（オリゴアルコキシ−ベンジル）フェノキシ誘導体；トリチル誘導体；ベンジルオキシアリール誘導体もしくはベンジルオキシアルキル誘導体；キサンテン−３−イルオキシアルキル誘導体；（４−アルキルフェニル）アルカン酸誘導体もしくはω−（４−アルキルフェノキシ）アルカン酸誘導体；オリゴアルキルフェノキシアルキル誘導体もしくはオリゴアルコキシフェノキシアルキル誘導体；カルバミン酸誘導体；アミン；トリアルキルシリル誘導体もしくはジアルキルアルコキシシリル誘導体；アルキル誘導体もしくはアリール誘導体、および／またはこれらの組み合わせを含む群から選択されることを特徴とする。
【００５３】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは：
ａ）アミノ酸配列
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９
からなるペプチドであって、Ｘ１〜Ｘ９は上記で述べたものと同じ意味を有するペプチド；
ｂ）ａ）のアミノ酸配列と機能的に類似するのに十分な相同性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；
ｃ）欠失、付加、置換、転座、逆位、および／または挿入によって修飾され、ａ）またはｂ）のアミノ酸配列と機能的に類似する、アミノ酸配列ａ）またはｂ）のペプチド；
ｄ）アミノ酸配列ａ）、ｂ）、またはｃ）と同一または別のペプチドで分岐もしくは伸長によって修飾され、ホモオリゴマーペプチドまたはヘテロオリゴマーペプチドを形成する、アミノ酸配列ａ）、ｂ）、またはｃ）のペプチド、
からなる群から選択されることを特徴とする
【００５４】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、ｂ）で特定されるアミノ酸配列が、ａ）で特定されるアミノ酸配列のいずれに対しても、少なくとも４０％の相同性を有することを特徴とする。さらに、本発明のペプチドは、ｂ）で特定されるアミノ酸配列が、ａ）で特定されるアミノ酸配列のいずれに対しても、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、特に好ましくは９０％の相同性を有することを特徴とする。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸配列ＡＰＥＤＥＴ、ＷＫＥＰＡＰ、ＰＰＤＥＲＦ、ＫＭＷＴＦＧ、またはＦＧＮＦＷＣＥからなることを特徴とする。
【００５６】
本発明によると、本発明のペプチドは、医学的活性物質として用いることができる。本発明のペプチドは、アルツハイマー病を患う患者の抗体と結合することができる。
【００５７】
本発明のペプチドは、さらに、磁性ナノ粒子、常磁性ナノ粒子、および／または非磁性ナノ粒子へ不動化および／または固定されている場合があることを特徴とする。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、本発明のペプチドは、固相へ結合されていることを特徴とする。
【００５９】
本発明のペプチドは、直鎖状および分岐鎖状、ならびに環状の形態で存在していてもよい。ペプチドの閉環は、例えば、２つのシステインが存在する場合はジスルフィド架橋を介して行われ、またはアミド環化を介して行われ、任意に、側鎖を介して、Ｃ末端からＮ末端を介して、または後者の組み合わせを介して行われてもよい。
【００６０】
本発明のペプチドは、該ペプチドが結合する免疫グロブリンが、ヒトβ２−ＡＲおよびα−ＡＲと相互作用するａｇＡＡＢであることをさらに特徴とする場合がある。
【００６１】
先行請求項のいずれかのペプチドは、アミノ基、アミド、ヒドラジド、アジド、カルバミン酸、アセチル基、ビオチン基、マーカー、スペーサー、および／またはリンカーをさらに含むことを特徴とする。
【００６２】
本発明の主題は：
ａ）請求項１に記載のペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）ａ）のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子；
ｃ）ａ）またはｂ）のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）のヌクレオチド配列と機能的に類似するのに十分な相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｅ）遺伝コードのため、ａ）〜ｄ）のヌクレオチド配列へ変性した核酸分子；ならびに、
ｆ）欠失、付加、置換、転座、逆位、および／または挿入によって修飾され、ａ）〜ｅ）のヌクレオチド配列と機能的に類似する、ａ）〜ｅ）のヌクレオチド配列の核酸分子、
を含む群から選択される、単離された核酸分子でもある。
【００６３】
ｄ）で特定されるヌクレオチド配列を有する本発明の核酸分子は、ａ）〜ｃ）で特定されるヌクレオチド配列のいずれに対しても、少なくとも４０％、特には少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、特に好ましくは９０％の相同性を有する。
【００６４】
本発明の核酸分子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／またはＲＮＡである。
【００６５】
本発明の主題は、本発明の核酸分子を含むベクターでもある。
【００６６】
本発明のベクターを含む宿主細胞もまた、本発明の主題である。
【００６７】
アフィニティクロマトグラフィまたは固相抽出のための固相も本発明の主題であり、前記固相は、所望により化学的に活性化されていてもよい、有機ポリマー、無機ポリマー、合成ポリマーまたは混合ポリマー、好ましくは、架橋アガロース、セルロース、シリカゲル、ポリアミド、およびポリビニルアルコールを含み、例えば共有結合または吸着によって前記固相の表面に本発明のペプチドが不動化されている。具体的には、このペプチドは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、および／またはＸ９の位置で固相と共有結合することができる。リンカーまたはスペーサーによって、前記ペプチドが担体表面から離れて位置することが有利であることがある。
【００６８】
固相上の免疫グロブリン含有サンプルから免疫グロブリンを除去するための装置もまた本発明の主題であり、該装置は本発明の固相を含む。免疫グロブリン含有サンプルを投入する手段も提供される。
【００６９】
本発明の別の主題は、本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のペプチド、および／または本発明の固相を含み、任意に、薬理学的に許容されるキャリア物質を含む、医薬組成物である。
【００７０】
さらに、本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のペプチド、本発明の固相、および／または請求項２８に記載の医薬組成物を含み、任意に、キットの内容物を組み合わせるための、および／または製剤を提供するための、説明書を含むキットである。
【００７１】
本発明のペプチドを含むクロマトグラフィのための装置も本発明の主題である。具体的には、前記装置は、ペプチドが本発明の固相に結合されていることを特徴とする。
【００７２】
本発明は、さらに、本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のペプチド、本発明の固相、本発明の医薬組成物、本発明のキット、本発明の装置を、ＡＤの予防、診断、治療に使用すること、およびＡＤなどの神経変性疾患の治療のための薬物の作製またはスクリーニングに使用することにも関する。
【００７３】
本発明は、さらに、固相に結合した本発明のペプチドにより自己抗体を結合および／または除去することによってアルツハイマー病を治療する方法も開示する。
【実施例】
【００７４】
実施例、物質、および方法
新生仔の心臓細胞の単離および培養は、過去の報告に従って実施した（Ｗａｌｌｕｋａｔ，Ｇ．  ａｎｄ  Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ａ．１９８７．アレルギー性喘息および拡張型心筋症を有する患者の血清ガンマグロブリン画分の、培養ラット心筋細胞における変事性β−アドレナリン受容体へ影響（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ｏｎ  ｃｈｒｏｎｏｔｒｏｐｉｃ  β−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．）、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７８：６３４〜６３９）。
【００７５】
細胞培養
簡単に述べると、０．２５％の粗トリプシン溶液を用いて、ウィスターラット（１〜２日齢）の心室を刻んだものから単細胞を解離し、加湿空気で平衡化したＨａｌｌｅ  ＳＭ  ２０−Ｉ培地中、８００細胞／ｍｍ２の密度で単層培養した。前記培地は、１０％の熱不活性化ＦＣＳおよび２μｍｏｌ／Ｌのフルオロデオキシウリジン（Ｓｅｒｖａ、ハイデルベルグ、ドイツ）を含有しており、後者は非筋細胞の増殖を防止する。
【００７６】
３日目または４日目に、細胞を２ｍＬの新鮮な血清含有培地中にて２時間インキュベートした。フラスコあたり、７〜１０個の選択された細胞または同調的に収縮する細胞集団を１５秒間計数した。脈動数の変化は、１分間あたりの拍動で表した。この手順を異なる培養物で２回繰り返し、各サンプルに対して合計で最大３０個の細胞を表す結果を得た。
【００７７】
免疫グロブリン画分、アゴニスト薬物およびアンタゴニスト薬物、ペプチドなどは、示したように、単独でまたは累積的に添加した。自発的に拍動する心筋細胞の基礎収縮数は、１６２±４分であった。
【００７８】
免疫グロブリン画分の調製
免疫グロブリン画分は、１〜２ｍＬの血清サンプルから、４０％の飽和度で硫酸アンモニウム沈殿法により単離した。沈殿物を洗浄し、透析バッファー（１５４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム；ｐＨ７．２）に溶解した。沈澱、洗浄、および溶解の手順を２回繰り返した。
【００７９】
最後に、免疫グロブリンを１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中へ取り出し、１Ｌの透析バッファーに対して４℃で３０時間透析した。透析の間、バッファーを５回交換した。自己抗体の検出のために、免疫グロブリン画分を、１：２０または１：４０の希釈率でフラスコに添加した。
【００８０】
透析後、ＩｇＧ画分は１０〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度を特徴とし、最大でそのうちの１０μｇ／ｍＬが特異的受容体抗体である。このＩｇＧ溶液５０μＬを、以下のペプチド濃度のペプチド：５０μＬのＩｇＧ溶液あたり１００μｇ／ｍＬの緩衝化溶液５μＬ、と共にプレインキュベートする。この混合物を室温にて３０分間プレインキュベートし、続いて、先の栄養溶液をピペットで除去した後に、細胞培養バイアル中に充填する。培地の量は２ｍＬである。したがって、最終濃度は、ＩｇＧが０．５〜０．７５ｍｇ／ｍＬであり、ペプチドが０．５μｇである。ペプチド（１０ｍｅｒ）の分子量が１ＫＤ、およびＩｇＧの分子量が１５０ＫＤに設定される場合、ａｇＡＡＢは過剰に存在することになる。
【００８１】
中和実験については、ヒトβ２ＡＲまたはα１Ａ−ＡＲの３つの細胞外ループの配列に対応する合成ペプチドを、５０μＬの免疫グロブリン画分へ過剰に（５０μＬ中０．５μｇ）添加した。この混合物を、室温で１時間、振盪およびインキュベートした。次に、２ｍＬの培地中で培養した新生仔ラット心筋細胞へ１００μＬのサンプルを添加し、１：４０の最終希釈率とした。ペプチド／免疫グロブリン混合物の添加約６０分後に、拍動数を１５秒間カウントした。
【００８２】
エピトープを中和する自己抗体を識別するために、ヒトβ２−ＡＲの第一の細胞外ループまたはα１Ａ−ＡＲの第二の細胞外ループの配列に対応する合成オーバーラップペプチドを免疫グロブリンへ添加した。室温で１時間インキュベートした後、サンプルを上述のように使用した。
【００８３】
ＥＤ５０の計算
新生仔ラット心筋細胞の刺激に対するａｇＡＡＢの５０％効果量の推定については、ヒトβ２アドレナリン受容体のループ１またはヒトα１アドレナリン受容体（サブタイプＡ）のループ２のエピトープと結合するアフィニティクロマトグラフィで精製した抗体である抗体を、拍動数の増加の最大値が観測されるまで、新生仔ラットの心筋細胞を含む組織培養物へ、抗体濃度を増加させながら経時的に添加した。ＥＤ５０は、コンピュータプログラムによって計算した。
【００８４】
患者
Ｃｌｉｎｉｃ  ｏｆ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｕｅｄｅｎｓｃｈｅｉｄよりアルツハイマー型認知症の患者１４人の血清の提供を受けた。コントロールは、ベルリンのＭａｘ  Ｄｅｌｂｒｕｃｋ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅからの健康なドナーの血清からの免疫グロブリン画分である。
【００８５】
免疫グロブリン製剤のため、サンプルを４，０００ｇで３０分間遠心分離し、−２０℃で保存した。試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）から購入した。他の化学物質はすべて分析グレードであった。
【００８６】
結果
図は以下を示す：
図１：アルツハイマー病の患者（ｎ＝１１〜１４）の抗体は、β２アドレナリン受容体およびα１アドレナリン受容体を介してラット心筋細胞を刺激する。β２アドレナリンアンタゴニストＩＣＩ  １１８，５５１は、アゴニスト抗体の刺激作用を特異的に、しかし部分的に遮断する。αアドレナリンアンタゴニストであるプラゾシンを細胞培養物へ追加で添加した場合に、収縮の細胞活性の阻害がより効果的に観察される。１４の血清サンプルのうち１１のサンプル、または免疫グロブリンが、心筋細胞を活性化する。
【００８７】
図２：アルツハイマー病の患者（ｎ＝６）由来の抗体は、β２アドレナリン受容体の第一の細胞外ループと結合する。細胞外ループペプチド１、２、または３を患者の免疫グロブリンとコインキュベートすると、ループ１のみが、抗体を介した細胞拍動数の増加を中和する。
【００８８】
図３：アルツハイマー病の患者（ｎ＝６）由来の抗体は、β２‐ＡＲの第一細胞外ループ中に埋め込まれたペプチドエピトープと結合する。免疫グロブリンをループ１ペプチドのオーバーラップエピトープ（２アミノ酸）とコインキュベートすると、エピトープＦＧＮＦＷＣＥで、抗体を介した拍動数増加の中和が観察された。
【００８９】
図４：アルツハイマー病の患者（ｎ＝６）のβ２アドレナリン受容体に対する抗体は、免疫グロブリンＧサブクラス１に属する。免疫グロブリンをサブクラス１〜４に対して特異的であるモノクローナル抗体とコインキュベートすると、ＩｇＧ１に対するモノクローナル抗体で実施された沈澱でのみ、抗体を介した活性が消滅した。
【００９０】
図５：アルツハイマー病の患者（ｎ＝６）由来の抗体は、α１アドレナリン受容体の第二細胞外ループと結合する。ループ１、２、または３を患者の免疫グロブリンとコインキュベートすると、ループ２のみが、抗体を介した細胞拍動数の増加を中和する。
【００９１】
図６：アルツハイマー病の患者（ｎ＝５）由来の抗体は、α１Ａアドレナリン受容体の第二細胞外ループ中に埋め込まれたペプチドによって中和される。オーバーラップペプチド（１または２アミノ酸）を免疫グロブリンとコインキュベートした。アミノ酸配列ＡＰＥＤＥＴのペプチドが、免疫グロブリンの細胞活性を中和する。
【００９２】
図７：アルツハイマー病の患者（ｎ＝５）由来のα１Ａアドレナリン受容体に対する抗体は、免疫グロブリンＧサブクラス１に属する。免疫グロブリンをサブクラス１〜４に対して特異的であるモノクローナル抗体とコインキュベートすると、ＩｇＧ１に対するモノクローナル抗体で実施された沈澱でのみ、抗体を介した活性が消滅した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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