(57)【要約】本発明は、生物マーカーを使用して癌を検出する方法を提供する。本発明は、１つには、タンパク質、核酸、多型、代謝産物、およびその他の分析物などの、ある生物学的マーカー（本明細書では、「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ」と呼ぶ）、ならびにある生理学的条件および状態が、転移性腫瘍を発症するリスクの高い被験体において存在し、または変化するという発見に関する。したがって、一態様では、本発明は、被験体における転移性腫瘍を発症するリスクを評価するための方法を提供する。
2011526693.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定レベルの予測精度を用いて、被験体における転移性腫瘍を発症するリスクを評価するための方法であって、
ａ．前記被験体から得たサンプル中の、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１からなる群から選択された２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを測定するステップと、
ｂ．前記サンプル中の前記２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルの臨床的に有意な変化を測定するステップであって、前記変化が、前記被験体において転移性腫瘍を発症するリスクが高いことを示しているステップと
を含む方法。
【請求項２】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ２６〜４０、４２〜６０、６４、６５、６７〜７３、７５〜９５、９７、９８、１００〜１０２、１０４〜１２５、１２７〜１３４、１３６、１３９〜１７６、１７８〜１８９、１９１〜２０９、２１１、２１３〜２１６、２１９〜２２６、２２８〜２３８、２４０〜２６０、２６２〜２７０、２７２〜３６０からなる群から選択された１個または複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍に関連する少なくとも１つの標準的なパラメータを測定するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルが、電気泳動または免疫化学的手法によって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫化学的検出が、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、または酵素結合免疫吸着アッセイによって行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が、原発性腫瘍、再発性腫瘍、または転移性腫瘍を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが腫瘍生検標本である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生検標本が、コア生検標本、切除組織生検標本、または切開組織生検標本である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
５個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの発現レベルを測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
所定レベルの予測精度を用いて、被験体における転移性腫瘍を発症するリスクを評価するための方法であって、
ａ．前記被験体から得たサンプル中の、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１からなる群から選択された２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを測定するステップと、
ｂ．前記２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを基準値と比較するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記基準値が指標値である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
所定レベルの予測精度を用いて、被験体における腫瘍の進行を評価するための方法であって、
ａ．第１の期間で、前記被験体から得た第１のサンプル中の、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１からなる群から選択された２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出するステップと、
ｂ．第２の期間で、前記被験体から得た第２のサンプル中の２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出するステップと、
ｃ．ステップ（ａ）で検出された前記２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを、ステップ（ｂ）で検出された量または基準値と比較するステップと
を含む方法。
【請求項１３】
前記第１のサンプルが、前記腫瘍の治療前に前記被験体から採取される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のサンプルが、前記腫瘍の治療後に前記被験体から採取される、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
所定レベルの予測精度を用いて、転移性腫瘍の治療の有効性をモニタするための方法であって、
ａ．第１の期間で、被験体から得た第１のサンプル中の、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１からなる群から選択された２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出するステップと、
ｂ．第２の期間で、前記被験体から得た第２のサンプル中の、２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを検出するステップと、
ｃ．ステップ（ａ）で検出された前記２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを、ステップ（ｂ）で検出された量または基準値と比較するステップであって、治療の有効性が、前記被験体から得た２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルの変化によってモニタされるステップと
を含む方法。
【請求項１６】
前記被験体が、前記転移性腫瘍の治療を事前に受けている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のサンプルが、前記転移性腫瘍の治療前に前記被験体から採取される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２のサンプルが、前記転移性腫瘍の治療後に前記被験体から採取される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
所定レベルの予測精度を用いて、腫瘍であると診断された被験体に関する治療レジメンを選択するための方法であって、
ａ．第１の期間で、前記被験体から得た第１のサンプル中の、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１からなる群から選択された２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルを検出するステップと、
ｂ．任意選択で第２の期間で、前記被験体から得た第２のサンプル中の２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルを検出するステップと、
ｃ．ステップ（ａ）で検出された前記２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを、基準値または任意選択でステップ（ｂ）で検出された量と比較するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
前記被験体が、前記腫瘍の治療を事前に受けている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のサンプルを、前記腫瘍を治療する前に前記被験体から採取する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２のサンプルを、前記腫瘍を治療した後に前記被験体から採取する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１からなる群から選択された２個以上のマーカーの有効量の、マーカーレベルのパターンを含む、転移性腫瘍基準発現プロファイル。
【請求項２４】
請求項２０に記載のプロファイルを作成するのに十分な、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１からなる群から選択された対応するＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出する複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ検出試薬を含むキット。
【請求項２５】
前記検出試薬が、１つもしくは複数の抗体またはその断片を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記検出試薬が１種または複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
前記検出試薬が１種または複数のアプタマーを含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２８】
請求項２３に記載の１つまたは複数の転移性腫瘍基準発現プロファイルと、任意選択で追加の試験結果および被験体情報とを含有する機械可読媒体。
【請求項２９】
生理学的または生化学的な経路に関連した転移を示す１個または複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含む、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパネル。
【請求項３０】
前記生理学的または生化学的な経路が、細胞移動、新脈管形成、細胞外マトリックス分解、またはアノイキスを含む、請求項２６に記載のパネル。
【請求項３１】
腫瘍の進行を示す１個または複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含む、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパネル。
【請求項３２】
疾患の予後を示す生物マーカーを同定する方法であって、
ａ）対照と比較して前記疾患において示差的に発現する１つまたは複数の遺伝子を同定して、遺伝子標的リストを作成するステップと、
ｂ）前記疾患の進行の機能的局面に関連した前記標的リストの１つまたは複数の遺伝子を同定するステップと
を含み、それによって前記疾患の予後を示す生物マーカーを同定する方法。
【請求項３３】
進化的に保存された変化を含む、前記遺伝子標的リストの１つまたは複数の遺伝子を同定して、第２の遺伝子標的リストを作成するステップ
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患が癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌が転移性癌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記機能的局面が、細胞移動、新脈管形成、細胞外マトリックス分解、またはアノイキスである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）前記ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを発現する細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記細胞を、候補化合物を含む組成物と接触させるステップと、
（ｃ）物質が前記ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの発現または活性を変化させるか否かを決定するステップと
を含み、それにより、前記化合物の存在下で観察された前記変化が、前記細胞を、前記化合物を含まない組成物と接触させたときに観察されない場合、前記同定された化合物は、前記ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を調節する方法。
【請求項３８】
前記細胞を、インビボ、エキソビボ、またはインビトロで接触させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
被験体の癌を治療する方法であって、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を調節する化合物を前記被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
被験体の癌を治療する方法であって、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴにより調節される化合物の活性または発現を調節する薬剤を前記被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項４１】
前記化合物がＴＧＦβまたはＣＸＣＲ４である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記薬剤がＴＧＦβ阻害剤またはＣＸＣＲ４阻害剤である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
腫瘍を有する患者を治療する方法であって、
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３６０の２個以上が、前記腫瘍から得たサンプルにおいて測定して臨床的に有意な形で変化する場合に、患者が腫瘍を有していると特定するステップと、
腫瘍転移を予防または低減する治療レジメンで前記患者を治療するステップと
を含む方法。
【請求項４４】
アジュバント治療を必要とする腫瘍患者を選択する方法であって、
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３６０の２個以上を測定することにより、前記患者における転移のリスクを評価するステップであって、前記患者から得た腫瘍サンプル中の前記２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの臨床的に有意な変化は、前記患者がアジュバント治療を必要としていることを示すステップ
を含む方法。
【請求項４５】
腫瘍患者に治療決定を知らせる方法であって、
前記患者から得た腫瘍サンプル中の、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３６０の２個以上に関する情報を得るステップと、
前記２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが臨床的に有意な様式で変化する場合に、前記患者における腫瘍転移を予防または低減する治療レジメンを選択するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００８年６月２６日に出願された米国出願第６１／０７５，９３３号の利益を主張し、この内容は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、癌転移に伴う生物学的徴候および癌転移をもたらす遺伝的決定因子の同定と、そのような生物学的徴候および決定因子を癌のスクリーニング、予防、診断、治療、モニタリング、および予後に使用する方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
転移は、ほとんどの致死性固形腫瘍の主な特徴であり、局所制御を飛び越えかつ周囲のマトリックスを通して浸潤する能力を腫瘍細胞に与え、脈管構造またはリンパ管内に移行して生存し、最終的には外来の土壌でコロニー化し成長する、遺伝的なまたは後成的な変質によって誘導される複雑な多段階の生物学的プロセスを示す（Ｇａｏｒａｖ  Ｐ．ＧｕｐｔａおよびＪｏａｎ  Ｍａｓｓａｇｕｅ（２００６年）Ｃｅｌｌ）。そのような転移をもたらす遺伝的事象が、腫瘍が成長し拡大するにつれて確率的に獲得できることに関しては、全体として意見の一致が見られるものであり、確かに、全身腫瘍組織量は転移のリスクに関する正の予測子である。一方、山のような証拠は、一部の腫瘍がその最も早い段階から転移する能力を得ている可能性がある（またはない）という主張を普及させた。一部の腫瘍がその生活史の初期において、転移に関して「生来のものである」という考えは、同等に初期段階の腫瘍（すなわち、同様の腫瘍組織量）に関する広く様々な結果の臨床観察によって裏付けされる。これに対して、転移の転写状態は、他の転移よりもそれに一致した原発性のものにより類似していることが示されてきた（Ｐｅｒｏｕら、２０００年）。さらに、癌ゲノムにおける大規模なゲノム異常は、良性から悪性の状態に移行する初期に生じることが、実証されている（非特許文献１；非特許文献２）。その他の著者にはＭａｒｃｕｓ  Ｂｏｓｅｎｂｅｒｇが含まれ、その進化の初期段階に獲得された遺伝的事象の特定の補体が、少なくとも一部では、その転移能を含む腫瘍の生物学的挙動を最終的には決定することになることを示唆している。したがって本発明者らは、腫瘍の転移能の遺伝的決定因子が、初期段階の原発性悪性腫瘍において以前から存在しており、そのような決定因子は、転移性播種に寄与するまさにそのプロセスにおいて機能的に活性であると推論する。したがって、そのような転移決定因子は、可能性ある治療標的であるだけでなく癌性疾患の攻撃性の決定因子でもあり、したがって転移決定因子は、予後決定因子でもある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｈｉｎ，Ｋ．、ｄｅ  Ｓｏｌｏｒｚａｎｏ，Ｃ．Ｏ．、Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｄ．、Ｊｏｎｅｓ，Ａ．、Ｃｈｏｕ，Ｗ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｅ．Ｇ．、Ｋｕｏ，Ｗ．Ｌ．、Ｌｊｕｎｇ，Ｂ．Ｍ．、Ｃｈｅｗ，Ｋ．、Ｍｙａｍｂｏ，Ｋ．ら（２００４年）、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ３６巻、９８４〜９８８頁
【非特許文献２】Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｋ．Ｌ．、Ｍｉｌｌａｒｄ，Ｍ．、Ｂｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｗ．、およびＤｅＰｉｎｈｏ，Ｒ．Ａ．（２００１年）、Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ２８巻、１５５〜１５９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、１つには、タンパク質、核酸、多型、代謝産物、およびその他の分析物などの、ある生物学的マーカー（本明細書では、「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ」と呼ぶ）、ならびにある生理学的条件および状態が、転移性腫瘍を発症するリスクの高い被験体において存在し、または変化するという発見に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、一態様では、本発明は、被験体における転移性腫瘍を発症するリスクを評価するための方法を提供する。転移性腫瘍を発症するリスクは、被験体から得たサンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルを測定することによって決定される。被験体が転移性腫瘍を発症するリスクが高いことは、サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルの臨床的に有意な変化を測定することによって決定される。あるいは、被験体が転移性腫瘍を発症するリスクが高いことは、有効量のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを基準値と比較することによって決定される。いくつかの態様では、この基準値が指標である。
【０００７】
別の態様では、本発明は、第１の期間で、被験体から得た第１のサンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルを検出し、第２の期間で、被験体から得た第２のサンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルを検出し、検出されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルを基準値と比較することによって、被験体における腫瘍の進行を評価するための方法を提供する。いくつかの態様では、第１のサンプルは、腫瘍の治療前に被験体から採取され、第２のサンプルは、腫瘍の治療後に被験体から採取される。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、第１の期間で、被験体から得た第１のサンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルを検出し、任意選択で第２の期間で、被験体から得た第２のサンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルを検出することによって、治療の有効性をモニタし、または転移性腫瘍の治療レジメンを選択するための方法を提供する。第１の期間で検出されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルを、第２の期間で検出されたレベルまたは基準値と比較する。治療の有効性は、被験体から得たＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量のレベルの変化によってモニタされる。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量が、腫瘍から得たサンプルにおいて測定して臨床的に有意に変化した場合に、患者が腫瘍を有していると特定し、腫瘍転移を予防または低減する治療レジメンで患者を治療することによって、腫瘍を有する患者を治療する方法を提供する。
【００１０】
一態様では、本発明は、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量を測定することにより、患者における転移のリスクを評価することによって、アジュバント治療を必要とする腫瘍患者を選択する方法であって、患者から得た腫瘍サンプル中の２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの臨床的に有意な変化は、患者がアジュバント治療を必要としていることを示す方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、患者から得た腫瘍サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量に関する情報を得、２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが臨床的に有意に変化した場合に、患者における腫瘍転移を予防または低減する治療レジメンを選択することによって、腫瘍患者に治療決定を知らせる方法を提供する。
【００１２】
様々な実施形態では、評価／モニタリングは、所定レベルの予測性により実現される。所定レベルの予測性とは、その方法が、許容されるレベルの臨床または診断精度を提供することを意味する。臨床および診断精度は、本明細書に記述される方法など、当技術分野で公知の方法によって決定される。
【００１３】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴには、例えば、本明細書に記述されるＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３６０が含まれる。１、２、３、４、５、１０、またはそれ以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが測定される。好ましくは、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１から選択された少なくとも２個のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが測定される。任意選択で、本発明の方法は、腫瘍に関連する少なくとも１つの標準的なパラメータを測定するステップをさらに含む。
【００１４】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルは、電気泳動または免疫化学的手法によって測定される。例えば、決定因子のレベルは、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、または酵素結合免疫吸着アッセイによって検出される。
【００１５】
被験体は、原発性腫瘍、再発性腫瘍、または転移性腫瘍を有する。いくつかの態様では、サンプルは、腫瘍の治療を事前に受けている被験体から採取される。あるいは、サンプルは、腫瘍の治療前に被験体から採取される。サンプルは、コア生検標本、切除組織生検標本、もしくは切開組織生検標本などの腫瘍生検標本、または循環腫瘍細胞を有する血液サンプルである。
【００１６】
本発明には、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３６０から選択された２個以上のマーカーの有効量の、マーカーレベルのパターンを含有する、転移性腫瘍基準発現プロファイルも含まれる。好ましくは、このプロファイルは、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１のマーカーレベルのパターンを含有する。１つまたは複数の転移性腫瘍基準発現プロファイルと、任意選択で追加の試験結果および被験体情報とを含有する機械可読媒体も含まれる。別の態様では、本発明は、対応するＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出する複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ検出試薬を含むキットを提供する。検出試薬は、例えば、抗体またはその断片、オリゴヌクレオチド、またはアプタマーである。
【００１７】
別の態様では、本発明は、生理学的または生化学的な経路に関連した腫瘍の転移または進行を示す１個または複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含有するＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパネルを提供する。生理学的または生化学的経路には、例えば、含まれる。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、対照と比較して疾患において示差的に発現した１つまたは複数の遺伝子を同定して、遺伝子標的リストが作成し；疾患の進行の機能的局面に関連した標的リストの１つまたは複数の遺伝子を同定することによって、疾患の予後を示す生物マーカーを同定する方法を提供する。機能的局面は、例えば、細胞移動、血管新生、細胞外マトリックス分解、またはアノイキス耐性である。任意選択で、この方法は、進化的に保存された変化を含む、遺伝子標的リストの１つまたは複数の遺伝子を同定して、第２の遺伝子標的リストが作成するステップを含む。この疾患は、例えば、転移性癌などの癌である。
【００１９】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを発現する細胞を提供し、細胞を、候補化合物を含む組成物と接触させ（例えば、インビボ、エキソビボ、またはインビトロ）、物質がＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を変化させるか否かを決定することによって、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を調節する化合物が同定される。化合物の存在下で観察された変化が、細胞を、化合物を含まない組成物と接触させたときに観察されない場合、同定された化合物は、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性または発現を調節する。
【００２０】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの活性もしくは発現を調節する化合物を被験体に投与することによって、またはＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴにより調節された化合物の活性もしくは発現を調節する薬剤を被験体に投与することによって、被験体の癌が治療される。化合物は、例えば、（ｉ）ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴポリペプチド；（ｉｉ）ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴをコードする核酸；（ｉｉｉ）ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴをコードする核酸の発現または活性を低下させる核酸、その誘導体、断片、類似体、および相同体；（ｉｖ  ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに特異的な抗体などのＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの発現または活性を低下させるポリペプチドであってもよい。本明細書で使用される「抗体」（Ａｂ）という用語は、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、２重特異的抗体）、ヒト化またはヒト抗体、Ｆｖ抗体、ダイアボディ、および抗体断片を含む。例えば、化合物はＴＧＦβであり、薬剤はＴＧＦβ阻害剤である。別の例は、ＣＸＣＲ４であり、薬剤はＣＸＣＲ４拮抗薬である。
【００２１】
他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が関係する当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記述されるものと同様のまたは均等な方法および材料を、本発明の実施に際して使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記述する。本明細書に記述される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により明らかに組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めた本発明の明細書が優先する。さらに、本明細書に記述される材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定しようとするものではない。
【００２２】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および特許請求の範囲から明らかにされ、そのような記述および範囲に包含されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１−１】図１は、メラノサイト特異的ＭＥＴ発現が、皮膚メラノーマの形成を促進させることを示す図である。（Ａ）メラノサイトを、指示される動物から収集し、培養に適応させた。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを、デオキシサイクリン（ＤＯＸ）の存在下でまたは存在させない状態で成長させた培養メラノサイトから抽出し、ＭＥＴの発現（Ｔｇ  ＭＥＴ）を、導入遺伝子特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲにより評価した。Ｒ１５、リボソームタンパク質Ｒ１５内部対照；−ＲＴ、逆転写酵素ＰＣＲ対照なし。（Ｂ）原発性腫瘍（Ｔ１〜Ｔ６）を、ドキシサイクリンに関してｉＭｅｔ動物から収集し、遺伝子特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、メラノサイトマーカーチロシナーゼ、ＴＲＰ１、およびＤｃｔの発現を評価した。ＸＢ２、マウスケラチノサイト細胞系；Ｂ１６Ｆ１０、マウスメラノーマ細胞系；Ｒ１５、リボソームタンパク質Ｒ１５内部対照；−ＲＴ、逆転写酵素ＰＣＲ対照なし。（Ｃ）ＭＥＴ誘発性原発性メラノーマにおける、Ｓ１００のメラノサイト特異的免疫組織化学的染色。ｔ、腫瘍；ｆ、濾胞；ｆｍ、濾胞性メラノサイト；ａ、脂肪細胞。（Ｄ）ＭＥＴ誘発性原発性メラノーマにおける、ｔｏｔａｌ  ｃ−Ｍｅｔおよびリン酸化ｃ−Ｍｅｔの免疫組織化学的染色。（Ｅ）ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＭＥＴ誘発性原発性メラノーマにおけるＨＧＦ発現を分析するために行った（Ｔ１〜Ｔ６）。腫瘍発現データは、２種のＩｎｋ４ａ／Ａｒｆメラノサイト細胞系での発現に対して正規化される。
【図１−２】図１は、メラノサイト特異的ＭＥＴ発現が、皮膚メラノーマの形成を促進させることを示す図である。（Ａ）メラノサイトを、指示される動物から収集し、培養に適応させた。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを、デオキシサイクリン（ＤＯＸ）の存在下でまたは存在させない状態で成長させた培養メラノサイトから抽出し、ＭＥＴの発現（Ｔｇ  ＭＥＴ）を、導入遺伝子特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲにより評価した。Ｒ１５、リボソームタンパク質Ｒ１５内部対照；−ＲＴ、逆転写酵素ＰＣＲ対照なし。（Ｂ）原発性腫瘍（Ｔ１〜Ｔ６）を、ドキシサイクリンに関してｉＭｅｔ動物から収集し、遺伝子特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、メラノサイトマーカーチロシナーゼ、ＴＲＰ１、およびＤｃｔの発現を評価した。ＸＢ２、マウスケラチノサイト細胞系；Ｂ１６Ｆ１０、マウスメラノーマ細胞系；Ｒ１５、リボソームタンパク質Ｒ１５内部対照；−ＲＴ、逆転写酵素ＰＣＲ対照なし。（Ｃ）ＭＥＴ誘発性原発性メラノーマにおける、Ｓ１００のメラノサイト特異的免疫組織化学的染色。ｔ、腫瘍；ｆ、濾胞；ｆｍ、濾胞性メラノサイト；ａ、脂肪細胞。（Ｄ）ＭＥＴ誘発性原発性メラノーマにおける、ｔｏｔａｌ  ｃ−Ｍｅｔおよびリン酸化ｃ−Ｍｅｔの免疫組織化学的染色。（Ｅ）ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＭＥＴ誘発性原発性メラノーマにおけるＨＧＦ発現を分析するために行った（Ｔ１〜Ｔ６）。腫瘍発現データは、２種のＩｎｋ４ａ／Ａｒｆメラノサイト細胞系での発現に対して正規化される。
【図２−１】図２は、Ｍｅｔ活性化が転移性メラノーマの発症を誘導させ、肺への播種を促進させることを示す図である。（Ａ）Ｂｏｙｄｅｎチャンバに、無血清媒体に加えた５×１０４ｉＭｅｔ腫瘍細胞（系ＢＣ０１４）を播いた。チャンバを、５０ｎｇ／ｍｌの組換えＨＧＦを含まないおよび含む化学誘引物質（１０％の血清を含有する媒体）内に置き、２４時間インキュベートした。浸潤性細胞を、クリスタルバイオレットで染色することにより可視化した。（Ｂ）ドキシサイクリンで誘発させたｉＭｅｔトランスジェニックマウスの背部皮膚の原発性皮膚紡錘体細胞メラノーマのＨ＆Ｅ染色切片であり、遠位転移がリンパ節副腎および肺に存在している。（Ｃ）５×１０５細胞を、ＳＣＩＤおよびマウスの尾部静脈に注射し、肺結節の形成を追跡し、転移性播種を相関させた。左パネル：ＨＲＡＳ＊メラノーマ細胞系を注射した（０／４マウス）ＳＣＩＤ動物の尾部静脈から収集した無結節肺組織のＨ＆Ｅ染色切片；右パネル：ＭＥＴ誘導ＢＣ０１４細胞系（ｉＭｅｔ）（３／４マウス）を注射したＳＣＩＤ尾部静脈から収集した、結節浸潤肺組織のＨ＆Ｅ染色切片。ｔ、腫瘍。
【図２−２】図２は、Ｍｅｔ活性化が転移性メラノーマの発症を誘導させ、肺への播種を促進させることを示す図である。（Ａ）Ｂｏｙｄｅｎチャンバに、無血清媒体に加えた５×１０４ｉＭｅｔ腫瘍細胞（系ＢＣ０１４）を播いた。チャンバを、５０ｎｇ／ｍｌの組換えＨＧＦを含まないおよび含む化学誘引物質（１０％の血清を含有する媒体）内に置き、２４時間インキュベートした。浸潤性細胞を、クリスタルバイオレットで染色することにより可視化した。（Ｂ）ドキシサイクリンで誘発させたｉＭｅｔトランスジェニックマウスの背部皮膚の原発性皮膚紡錘体細胞メラノーマのＨ＆Ｅ染色切片であり、遠位転移がリンパ節副腎および肺に存在している。（Ｃ）５×１０５細胞を、ＳＣＩＤおよびマウスの尾部静脈に注射し、肺結節の形成を追跡し、転移性播種を相関させた。左パネル：ＨＲＡＳ＊メラノーマ細胞系を注射した（０／４マウス）ＳＣＩＤ動物の尾部静脈から収集した無結節肺組織のＨ＆Ｅ染色切片；右パネル：ＭＥＴ誘導ＢＣ０１４細胞系（ｉＭｅｔ）（３／４マウス）を注射したＳＣＩＤ尾部静脈から収集した、結節浸潤肺組織のＨ＆Ｅ染色切片。ｔ、腫瘍。
【図３−１】図３は、細胞浸潤に関する低複雑性の機能的遺伝的スクリーニングと結びつけた多次元異種間ゲノム分析により、転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが同定されることを示す図である。（Ａ）ｉＨＲＡＳ＊およびｉＭｅｔ皮膚メラノーマから作成された発現プロファイルのＳＡＭ分析によって差別的に発現した遺伝子（１５９７プローブ集合）を、ヒト転移性メラノーマにおける増幅および欠失領域内に存在する遺伝子でまたはヒト原発性および転移性メラノーマの間で差別的に発現した遺伝子を用いたオルソログマッピングで二分して、３６０候補を定めた。（Ｂ）ｉＨＲＡＳ＊およびｉＭｅｔマウスメラノーマの間で差別的に発現した遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（１５９７プローブ集合、上部）と、異種間積算遺伝子リスト（３６０のフィルタリング済み遺伝子リスト、下部）とを、等サイズの９個のランダムに引き出した遺伝子集合と比較した。上位４つの有意な機能的分類を示す。破線は、ＩＰＡによる有意性を示す。（Ｃ）浸潤に関して低複雑性の遺伝子スクリーニングを示すフローチャート。レンチウイルス系で発現した２９５の上方制御／増幅候補のうち１９９を表す２３０クローンを、ＴＥＲＴ不死化ヒト原発性メラノサイト（ＨＭＥＬ４６８）に個々に形質導入し、９６ウエルマトリゲル浸潤プレートで浸潤に関してアッセイをした。浸潤性は、蛍光媒介定量を介して測定し、値をＧＦＰ対照に対して正規化した。２つの独立したスクリーニングでベクター対照から２×標準偏差だけ大きいスコアを示す候補（ｎ＝４５）を、標準的な２４ウエルマトリゲル浸潤チャンバを使用するＨＭＥＬ４６８またはＷＭ３２１１での２次確認スクリーニング用に選択した。（Ｄ）浸潤前遺伝子に関する低複雑性の遺伝子スクリーニングのヒストグラム概要。ＨＭＥＬ４６８プライム化メラノサイトに個々の転移前候補ｃＤＮＡウイルスを形質導入し、その後、９６ウエルトランスウエル浸潤アッセイプレートに投入した。浸潤性を、蛍光媒介定量を介して測定し、値を空ベクター対照に対して正規化した。２つの独立したスクリーニングの試みにおいて、ＧＦＰ対照から２×標準偏差の浸潤を誘導する候補ｃＤＮＡは、プライマリースクリーニングヒット（ｎ＝４５）と見なした。（Ｅ）対照３１に対する浸潤活性の倍数増加のサマリーヒストグラムは、転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを確認した。
【図３−２】図３は、細胞浸潤に関する低複雑性の機能的遺伝的スクリーニングと結びつけた多次元異種間ゲノム分析により、転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが同定されることを示す図である。（Ａ）ｉＨＲＡＳ＊およびｉＭｅｔ皮膚メラノーマから作成された発現プロファイルのＳＡＭ分析によって差別的に発現した遺伝子（１５９７プローブ集合）を、ヒト転移性メラノーマにおける増幅および欠失領域内に存在する遺伝子でまたはヒト原発性および転移性メラノーマの間で差別的に発現した遺伝子を用いたオルソログマッピングで二分して、３６０候補を定めた。（Ｂ）ｉＨＲＡＳ＊およびｉＭｅｔマウスメラノーマの間で差別的に発現した遺伝子のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（１５９７プローブ集合、上部）と、異種間積算遺伝子リスト（３６０のフィルタリング済み遺伝子リスト、下部）とを、等サイズの９個のランダムに引き出した遺伝子集合と比較した。上位４つの有意な機能的分類を示す。破線は、ＩＰＡによる有意性を示す。（Ｃ）浸潤に関して低複雑性の遺伝子スクリーニングを示すフローチャート。レンチウイルス系で発現した２９５の上方制御／増幅候補のうち１９９を表す２３０クローンを、ＴＥＲＴ不死化ヒト原発性メラノサイト（ＨＭＥＬ４６８）に個々に形質導入し、９６ウエルマトリゲル浸潤プレートで浸潤に関してアッセイをした。浸潤性は、蛍光媒介定量を介して測定し、値をＧＦＰ対照に対して正規化した。２つの独立したスクリーニングでベクター対照から２×標準偏差だけ大きいスコアを示す候補（ｎ＝４５）を、標準的な２４ウエルマトリゲル浸潤チャンバを使用するＨＭＥＬ４６８またはＷＭ３２１１での２次確認スクリーニング用に選択した。（Ｄ）浸潤前遺伝子に関する低複雑性の遺伝子スクリーニングのヒストグラム概要。ＨＭＥＬ４６８プライム化メラノサイトに個々の転移前候補ｃＤＮＡウイルスを形質導入し、その後、９６ウエルトランスウエル浸潤アッセイプレートに投入した。浸潤性を、蛍光媒介定量を介して測定し、値を空ベクター対照に対して正規化した。２つの独立したスクリーニングの試みにおいて、ＧＦＰ対照から２×標準偏差の浸潤を誘導する候補ｃＤＮＡは、プライマリースクリーニングヒット（ｎ＝４５）と見なした。（Ｅ）対照３１に対する浸潤活性の倍数増加のサマリーヒストグラムは、転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを確認した。
【図４】図４は、記述されるｎｅｖｉ、原発性、および転移性メラノーマ腫瘍試験片の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）で行われた代表的なＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ（Ａ）Ｆａｓｃｉｎ１（ＦＳＣＮ１）および（Ｂ）ＨＳＦ１に関する、タンパク質発現の自動化定量分析（ＡＱＵＡ（登録商標））を示す図である［Ｃａｍｐ，Ｒ．Ｌ．、Ｃｈｕｎｇ，Ｇ．Ｇ．、およびＲｉｍｍ，Ｄ．Ｌ．、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８（１１巻）、１３２３〜１３２７頁（２００２年）］。情報コアは、それぞれ細胞質および核細胞区画が染色されるＦＳＣＮ１およびＨＳＦ１のＡＱＵＡ（登録商標）スコアに関して評価した。有意性（Ｓ；５％）は、Ｆｉｓｈｅｒ検定に基づく。結果の概要に関しては表２を参照されたい。
【図５】図５は、（Ａ）Ｋ平均階層クラスタリングと、（Ｂ）２９５のステージＩ〜ＩＩの乳癌のコホートにおける上記から得た２つのサブクラスの全体（上部）および転移無し（下部）の生存に関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析とを示す図である［乳癌のデータは：ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒ，  Ｍ．Ｊ．ら、Ａ  ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４７（２５巻）、１９９９〜２００９頁（２００２年）；  ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ，  Ｌ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５（６８７１巻）、５３０〜５３６頁（２００２年）］。
【図６】図６は、インビトロアノイキススクリーニング法を示す図である。（Ａ）インビトロアノイキススクリーニング戦略。（Ｂ）ラット腸上皮（ＲＩＥ）細胞は、低接着プレートに塗布したときに生存度が低下した。ＲＩＥ細胞は、９６ウエルＵＬＣプレートまたは接着プレートに２４時間塗布した。ＡＴＰレベルを、細胞生存度に関して測定し、２４時／０時の時間でのレベルの比として得た。（Ｃ）ＲＩＥはＶ５−ｍＴｒｋＢを発現する。ＲＩＥ細胞を感染させ、４８時間で細胞溶解物を単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解した。ウェスタンブロット分析を、α−Ｖ５抗体で行った。
【図７】図７は、様々な遺伝子がＲＩＥ細胞にアノイキス耐性を与えることを示す図である。ＲＩＥ細胞を、候補遺伝子の１種を発現するレトロウイルスに感染させ、超低クラスタープレートに塗布し、細胞の生存度を塗布後２４時間で測定した。値を、０時間の生存度に対して示す。全ての読取りは、３回ずつ行った。強調されているのは、空ベクター、ＢＤＮＦ、またはｍＴｒｋＢ（正の対照）の読取りである。
【図８】図８は、中央値よりも２標準偏差大きいラット腸上皮（ＲＩＥ）細胞にアノイキス耐性を与えた２０個の候補遺伝子を示す図である。９個の候補遺伝子（ＨＮＲＰＲ、ＣＤＣ２０、ＰＲＩＭ２Ａ、ＨＲＳＰ１２、ＥＮＹ２、ＭＧＣ１４１４１、ＲＥＣＱＬ、ＳＴＫ３、およびＭＸ２）は、２つの独立したスクリーニングに関して中央値よりも１標準偏差大きい値を与えた。これらの遺伝子は、指示された染色体上に位置付けられる。
【図９】図９は、遺伝子によって、ＲＩＥ細胞が懸濁液中に維持された後に付着するという能力が与えられることを示す図である。候補遺伝子を発現するＲＩＥ細胞を、ＵＬＣプレート上に２４時間塗布した。懸濁液中の細胞を接着プレートに移し、２４時間後に接着した細胞をクリスタルバイオレットで染色した。細胞生存度を、２４時間／０時間として示す。全ての読取りは、それぞれ３回行った。
【図１０】図１０は、転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが、腫瘍原性を促進させる状態を示す図である。（Ａ）ＧＦＰまたは示された転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを安定に発現するＨＭＥＬ４６８細胞を、ＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）に皮下注射し、これらを臨床試験によって腫瘍形成をモニタした。周囲の筋線維（ｍ）および脂肪細胞（ａ）を通した局所浸潤を示す、代表的なＨ＆Ｅ染色原発性腫瘍（ｔ）が示されている。（Ｂ）ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ誘導腫瘍原性アッセイから収集されたデータをまとめた表である。
【図１１−１】図１１は、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ  ＨＯＸＡ１が、細胞浸潤および肺播種能を促進させる状態を示す。（Ａ）ＨＭＥＬ４６８におけるＨＯＸＡ１の異所性発現は、ＦＡＫ（Ｔｙｒ３９７；左パネル）の高い活性化をもたらし、それに応じてトランスウエル浸潤アッセイでのマトリゲルを通し浸潤の増大をもたらした（右パネル；図１１Ｃにおいて定量化されている。）。（Ｂ）図１１Ｃで定量化された、ＷＭ１１５およびＷＭ３２１１形質導入細胞系でのＨＯＸＡ１発現を確認するための、ＨＯＸＡ１−Ｖ５に関するウェスタンブロット分析（左パネル）、およびトランスウエル浸潤アッセイの代表的な画像（右パネル）。（Ｃ）図１１Ａ〜Ｂに示された浸潤チャンバデータの定量化。（Ｄ）ＧＦＰまたはＨＯＸＡ１を安定に発現するＨＭＥＬ４６８細胞を、ＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）の尾部静脈に静脈内注射し、注射後１２週での肺結節に関して剖検により試験をした。巨視的（および微視的）な肺結節を、ＨＯＸＡ１コホート（ｎ＝３）の５０％で検出したが、対照では検出されなかった。１匹の、ＨＭＥＬ４６８−ＨＯＸＡ１を注射した動物から切除した、肺結節（ｔ）および周囲の肺実質（ｌ）の代表的なＨ＆Ｅ顕微鏡写真。（Ｅ）空ベクター（ＥＶ）またはＨＯＸＡ１を発現するＷＭ１１５メラノーマ細胞を、ヌードマウスに皮下注射し、注射後４６日目に測定した。（Ｆ）皮内注射されたＷＭ１１５−ＨＯＸＡ１細胞を保持するヌードマウスから単離した肺の、代表的な転移。
【図１１−２】図１１は、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ  ＨＯＸＡ１が、細胞浸潤および肺播種能を促進させる状態を示す。（Ａ）ＨＭＥＬ４６８におけるＨＯＸＡ１の異所性発現は、ＦＡＫ（Ｔｙｒ３９７；左パネル）の高い活性化をもたらし、それに応じてトランスウエル浸潤アッセイでのマトリゲルを通し浸潤の増大をもたらした（右パネル；図１１Ｃにおいて定量化されている。）。（Ｂ）図１１Ｃで定量化された、ＷＭ１１５およびＷＭ３２１１形質導入細胞系でのＨＯＸＡ１発現を確認するための、ＨＯＸＡ１−Ｖ５に関するウェスタンブロット分析（左パネル）、およびトランスウエル浸潤アッセイの代表的な画像（右パネル）。（Ｃ）図１１Ａ〜Ｂに示された浸潤チャンバデータの定量化。（Ｄ）ＧＦＰまたはＨＯＸＡ１を安定に発現するＨＭＥＬ４６８細胞を、ＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）の尾部静脈に静脈内注射し、注射後１２週での肺結節に関して剖検により試験をした。巨視的（および微視的）な肺結節を、ＨＯＸＡ１コホート（ｎ＝３）の５０％で検出したが、対照では検出されなかった。１匹の、ＨＭＥＬ４６８−ＨＯＸＡ１を注射した動物から切除した、肺結節（ｔ）および周囲の肺実質（ｌ）の代表的なＨ＆Ｅ顕微鏡写真。（Ｅ）空ベクター（ＥＶ）またはＨＯＸＡ１を発現するＷＭ１１５メラノーマ細胞を、ヌードマウスに皮下注射し、注射後４６日目に測定した。（Ｆ）皮内注射されたＷＭ１１５−ＨＯＸＡ１細胞を保持するヌードマウスから単離した肺の、代表的な転移。
【図１２】図１２は、ＨＯＸＡ１により誘導されたトランスクリプトーム分析により、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析によって定義されたＳｍａｄ３網状組織を特定した状態を示す図である。分子網状構造は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用して生成された。網状構造は、結節（遺伝子）および縁部（結節間の生物学的関係）として、グラフにより示す。実線は、直接的な相互作用を示し、破線は、間接的な相互作用を示す。赤および緑色は、それぞれトランスクリプトーム分析で過発現しまたは未発現した遺伝子を示す。物体の形状は、タンパク質が属する機能的ファミリーを示す。遺伝子のファミリーおよび内容については、補助的な表ｓ３を参照されたい。（Ｂ）示されるＨＯＸＡ１形質導入細胞系を、ＲＴ−ｑＰＣＲを使用してＳＭＡＤ３発現に関して評価した。値は、ＧＡＰＤＨ内部対照およびＧＦＰ実験対照に対して計算した。誤差棒は、標準誤差を示す。
【図１３−１】図１３は、ＨＯＸＡ１の異所性発現が、ＴＧＦβ情報伝達応答の上方制御を通して細胞浸潤を強化することを示す。（Ａ）ＨＯＸＡ１を異所的に発現するＷＭ１１５細胞を、ＴＧＦβ誘発性３ＴＰ−Ｌｕｘルシフェラーゼ受容体でトランスフェクトし、その後、ＴＧＦβを用いてまたは用いずに処理することにより、ＧＦＰ発現対照と比較した応答性を評価した。誤差棒は、標準誤差を示す；両側ｔ検定：−ＴＧＦβ、ｐ＝０．００３；＋ＴＧＦβ、ｐ＜０．０００１。（Ｂ）ＴＧＦβと共にまたはＴＧＦβ無しで１０％血清または１％血清中に繁殖させたＷＭ１１５細胞を安定に発現するＧＦＰまたはＨＯＸＡ１からの全細胞溶解物を、指示される抗体を使用してウェスタンブロットにより分析した。（Ｃ）ＨＯＸＡ１を安定に発現するＷＭ１１５細胞に、ＳＭＡＤ３  ｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＭＡＤ３）または非標的ｓｈＲＮＡ（ｓｈＮＴ）を形質導入し、マトリゲルトランスウエル浸潤チャンバに投入して、ＧＦＰ対照ウイルス（ＧＦＰ）が形質導入されたＷＭ１１５親細胞系と比較した細胞浸潤のアッセイを行った。浸潤チャンバの代表的な画像を右パネルに示す、両側ｔ検定：ＧＦＰ対ｓｈＮＴ、ｐ＝０．０００８；ｓｈＮＴ対ｓｈＳＮＡＤ３、ｐ＝０．００２２。（Ｄ）空ベクター（ＥＶ）またはＨＯＸＡ１を発現するＷＭ１１５メラノーマ細胞を、ヌードマウスに皮下注射した。得られた異種移植腫瘍切片を、抗ホスホＳＭＡＤ３で免疫染色することにより、ＨＯＸＡ１腫瘍試験片でのＳＭＡＤ３活性化を確認した。
【図１３−２】図１３は、ＨＯＸＡ１の異所性発現が、ＴＧＦβ情報伝達応答の上方制御を通して細胞浸潤を強化することを示す。（Ａ）ＨＯＸＡ１を異所的に発現するＷＭ１１５細胞を、ＴＧＦβ誘発性３ＴＰ−Ｌｕｘルシフェラーゼ受容体でトランスフェクトし、その後、ＴＧＦβを用いてまたは用いずに処理することにより、ＧＦＰ発現対照と比較した応答性を評価した。誤差棒は、標準誤差を示す；両側ｔ検定：−ＴＧＦβ、ｐ＝０．００３；＋ＴＧＦβ、ｐ＜０．０００１。（Ｂ）ＴＧＦβと共にまたはＴＧＦβ無しで１０％血清または１％血清中に繁殖させたＷＭ１１５細胞を安定に発現するＧＦＰまたはＨＯＸＡ１からの全細胞溶解物を、指示される抗体を使用してウェスタンブロットにより分析した。（Ｃ）ＨＯＸＡ１を安定に発現するＷＭ１１５細胞に、ＳＭＡＤ３  ｓｈＲＮＡ（ｓｈＳＭＡＤ３）または非標的ｓｈＲＮＡ（ｓｈＮＴ）を形質導入し、マトリゲルトランスウエル浸潤チャンバに投入して、ＧＦＰ対照ウイルス（ＧＦＰ）が形質導入されたＷＭ１１５親細胞系と比較した細胞浸潤のアッセイを行った。浸潤チャンバの代表的な画像を右パネルに示す、両側ｔ検定：ＧＦＰ対ｓｈＮＴ、ｐ＝０．０００８；ｓｈＮＴ対ｓｈＳＮＡＤ３、ｐ＝０．００２２。（Ｄ）空ベクター（ＥＶ）またはＨＯＸＡ１を発現するＷＭ１１５メラノーマ細胞を、ヌードマウスに皮下注射した。得られた異種移植腫瘍切片を、抗ホスホＳＭＡＤ３で免疫染色することにより、ＨＯＸＡ１腫瘍試験片でのＳＭＡＤ３活性化を確認した。
【図１４】図１４は、ＦＳＣＮ１またはＨＯＸＡ１を過発現するＨＲＡＳ＊（Ｍ３ＨＲＡＳ）が形質導入されたｌｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−マウス誘導メラノサイトを示す図である。（Ａ）トランスウエル浸潤アッセイでマトリゲルを通して高められた浸潤。（Ｂ）ヌードマウスで高められた皮下腫瘍成長。（Ｃ）ＳＣＩＤマウスに静脈内尾部静脈注射をした後の、高い肺結節形成。Ｃにおいて、ＦＳＣＮ１コホートの肺／肥満度指数の差は、極めて病的なＨＯＸＡ１コホートによって要求されたアッセイ終点でのこれら動物の比較的良好な健康状態により、有意ではないことに留意されたい。
【図１５−１】図１５は、空ベクター（対照群）またはＨＯＸＡ１（群１）を発現する（Ａ）ＷＭ１１５メラノーマ細胞および（Ｂ）形質転換されたヒトメラノサイト（ＨＭＥＬ４６８）から抽出されたＲＮＡを、ＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイ（Ｓｕｐｐｅｒａｒｒａｙ）を使用する定量的ｑＰＣＲ分析に使用して、転移に関連する遺伝子のパネルの発現を分析した。得られる異種移植腫瘍切片を、抗ＣＸＣＲ４で免疫染色して、ＨＯＸＡ１腫瘍試験片（図１３）の過発現を確認した。対照と実験群との間の閾値差次発現を満足する遺伝子が示されている。
【図１５−２】図１５は、空ベクター（対照群）またはＨＯＸＡ１（群１）を発現する（Ａ）ＷＭ１１５メラノーマ細胞および（Ｂ）形質転換されたヒトメラノサイト（ＨＭＥＬ４６８）から抽出されたＲＮＡを、ＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイ（Ｓｕｐｐｅｒａｒｒａｙ）を使用する定量的ｑＰＣＲ分析に使用して、転移に関連する遺伝子のパネルの発現を分析した。得られる異種移植腫瘍切片を、抗ＣＸＣＲ４で免疫染色して、ＨＯＸＡ１腫瘍試験片（図１３）の過発現を確認した。対照と実験群との間の閾値差次発現を満足する遺伝子が示されている。
【図１６】図１６は、空ベクター（ＥＶ）またはＨＯＸＡ１を発現するＷＭ１１５メラノーマ細胞および形質転換したヒトメラノサイト（ＨＭＥＬ４６８）を、ヌードマウスに皮下注射した状態を示す。得られる異種移植切片を、抗ＣＸＣＲ４で免疫染色することにより、ＨＯＸＡ１腫瘍試験片での過発現を確認した。
【図１７】図１７（Ａ）は、スピッツ母斑およびメラノーマＦＦＰＥ試験片のコホートにおけるＵＢＥ２ＣのＲＮＡ発現のＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ分析を示す。（Ｂ）原発性Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠損ＭＥＦに、ＨＲＡＳＶ１２、ＭＹＣ、およびＵＢＥ２Ｃを発現する示されたベクターをトランスフェクトした。Ｖｃｃ＝ＬａｃＺベクター対照；棒は±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図１８】図１８（Ａ）は、空ベクター（ｅｖ）、Ｇｅｍｉｎｉｎ、またはＮｅｄｄ９（正の対照）を安定に発現するＷＭ３２１１メラノーマ細胞を、トランスウエル浸潤アッセイでのマトリゲルを通して、浸潤に関してアッセイを行った。（Ｂ）空ベクター（ｅｖ）、Ｇｅｍｉｎｉｎ、またはＣａｖｅｏｌｉｎ  １（負の対照）を安定に発現するＷＭ３２１１細胞から抽出した全細胞溶解物の免疫ブロット分析。抗ホスホＦＡＫおよび抗ホスホＥＲＫは、それぞれ活性化したＦＡＫおよびＥＲＫ種を示す。（Ｃ）空ベクター（ＥＶ）またはＧｅｍｉｎｉｎ（ＧＥＭＮ）を安定に発現するＷＭ３２１１細胞を、ホスホ−ＦＡＫ（Ｐ−ＦＡＫ；赤）に関して免疫染色することにより、図１８Ｂで観察された高いＦＡＫ活性化を確認した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、転移性腫瘍を有し、または転移性腫瘍を発症するリスクのある被験体に関連した徴候、およびそのような被験体をもたらす決定因子の同定に関する。
【００２５】
ヒトおよびマウスのデータ集合同士の異種間比較によれば、ヒトメラノーマの生物学に関する偶発的癌遺伝子を同定するための生物学的フィルタをもたらすことが証明されている。本発明の研究において、その原発性腫瘍が転移する明白な可能性を示すメラノーマの２匹のマウスモデルを使用して、転移において示差的に発現する遺伝子を同定した。転移性（ｉＭｅｔ）および非転移性（ｉＨＲＡＳ＊）ＧＥＭモデル由来の原発性腫瘍の発現プロファイル比較では、異種間分析による生物学的フィルタリングによって優先順位が付けられかつアレイＣＧＨにより得られた増幅および欠失のパターンに重ねられた、１５９７個の示差的に発現した遺伝子のリストが明らかにされた。進化的に保存された変化（例えば、マウスおよびヒトにおいて）は、より本質的なものであると仮定され；したがって、ヒト転移性腫瘍から得たゲノムデータを有するＧＥＭモデル（定義された遺伝的背景の利点および明らかな表現型相関を有する。）から得た発現データの三角法は、優先順位付けを可能にし、ヒトの関連性を１５９７個の候補に割り当てた。
【００２６】
２９５個の上方制御され／増幅された、および６５個の下方制御され／欠失された遺伝子の、表現型により誘導される進化的に保存された転移候補リストは、示差的転移性を有する皮膚メラノーマの２つの遺伝子組換えマウスモデルのトランスクリプトームを比較し、その後、ヒト原発性および転移性メラノーマのゲノムおよびトランスクリプトームのプロファイルに関して三角法を行うことによって、明らかにされた。これらの候補は、転移拡散での３つの主なステップ（すなわち、原発性腫瘍部位からの回避、循環、最後に遠位異種部位でコロニー化および増殖する。）に対応する、循環およびコロニー化における浸潤、アノイキス耐性、または生存に関する低複雑性遺伝子スクリーニングに入れられた。これまで、浸潤スクリーニングは、ＴＥＲＴ固定化ヒトメラノサイトおよびメラノーマ細胞に浸潤促進活性を与えることが可能な３１個の確認された転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを定めてきた。転移候補の独立した部分集合は、仮にそうであるとしても一部だけが浸潤スクリーニングのＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴと重なり合う、アノイキス耐性またはコロニー化スクリーニングから得た追加のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴとして定義されることになると予測される。これまで、アノイキス耐性スクリーニングは、浸潤ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴと重なることなく懸濁液中に生存を与えることが可能な、定義された９個の確認されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを有している。これらのＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは一緒にまたはその部分集合として、転移性播種に関与する主なステップを包含することになる。
【００２７】
原発性腫瘍は、遺伝的に不均質であると認識される。原発性腫瘍内の副集団における転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが増殖上の利点を与え最終的に遠位部位への播種を誘導させる場合、転移性誘導体は、その原発性の対応物よりも均質になり、したがってそのような転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの発現の進行相関パターンを示すことが予測される。これらＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの２５個の発現パターンを評価するために、本発明者らは、Ｏｎｃｏｍｉｎｅの発現プロファイリングデータの概要を利用した（Ｒｈｏｄｅｓ  Ｄ．Ｒ．ら、ＯＮＣＯＭＩＮＥ：  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａ−ｍｉｎｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ６巻、１〜６頁、２００４年）。しかし、これら２５個の転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの大多数は、浸潤または転移に特異的に結び付けられていないが、これらの全ては、メラノーマおよび非メラノーマ固形腫瘍の両方で進行する腫瘍グレードまたは予後に有意に相関した発現パターンを示す。例えば、２５個のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのうち１２個は、原発性疾患よりも転移において高い発現を示す。脳（グリオーマ）腫瘍、メラノーマのような別の間葉腫瘍では、転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの１３個が、進行相関発現パターンを示し、すなわち、より高いグレードのグリオーマで発現が増大した。これらの中で６個は、結果に対して正の相関を示した。前立腺癌では、転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの１０個が、原発性から転移まで発現の有意な増加を示した。肺では、５個が、高い腫瘍グレードと相関を示した。最も有意な重なり合いは、乳腺癌で観察され、２５個の転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのうち１３個は、腫瘍進行のステージまたはグレードと相関を示した。さらに、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの１３個は、予後と相関することが報告された。
【００２８】
したがって本発明は、転移性腫瘍に関連したＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出することによって、転移性腫瘍を持ちまたは転移性腫瘍を経験するリスクのある、転移性腫瘍に対して無症候性の被験体も含めた被験体を、同定するための方法を提供する。これらの徴候およびＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、癌の治療および療法を受けた被験体をモニタし、癌を有する被験体で有効となり得る療法および治療を選択しもしくは修正するのにも有用であり、そのような治療および療法の選択および使用は、腫瘍の進行を遅くし、またはその発症を実質的に遅延させもしくは予防し、または腫瘍転移の発生を低下させもしくは予防するものである。
【００２９】
（定義）
「精度」は、測定されまたは計算された量（試験で報告された値）と、その実際の（または真の）値との適合性の程度を指す。臨床精度は、真の結果（真陽性（ＴＰ）または真陰性（ＴＮ））対誤判別された結果（偽陽性（ＦＰ）または偽陰性（ＦＮ））の割合に関係し、感受性、特異性、陽性的中率（ＰＰＶ）、もしくは陰性的中率（ＮＰＶ）、またはその他の尺度の中でも可能性、オッズ比と言える。
【００３０】
本発明の文脈における「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ」は、限定するものではないが、タンパク質、核酸、および代謝産物を、これらの多型、変異、変種、修飾、サブ単位、断片、タンパク質−リガンド複合体、および分解生成物、タンパク質−リガンド複合体、元素、関連する代謝産物、およびその他の分析物またはサンプル由来の尺度と共に包含する。ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、変異タンパク質または変異核酸を含むこともできる。ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、非血液感染性因子または健康状態の非分析的生理学的マーカー、例えば本明細書で定義された「臨床パラメータ」、ならびに本明細書でも定義される「伝統的な実験室でのリスク因子」も包含する。ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、数学的に生成された任意の計算された指標、または、時間的傾向および差を含む前述の測定のいずれか１つもしくは複数の組合せも含む。利用可能な場合には、および本明細書で他に記述されない場合、遺伝子産物であるＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、公文書での略称、またはｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｎａｍｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  （ＨＧＮＣ）によって割り当てられかつｔｈｅ  ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）にこの出願日に列挙された遺伝子記号をベースにして同定され、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅとも呼ばれる。
【００３１】
「（１個または複数の）ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ」は、そのレベルが転移性腫瘍を有しまたは転移性腫瘍を発症し易くなりまたは転移性腫瘍のリスクのある被験体において変化する、全ての核酸またはポリペプチドの１種または複数を包含する。個々のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを表１にまとめ、これらをまとめて本明細書では、とりわけ「転移性腫瘍関連タンパク質」、「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴポリペプチド」、または「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質」と呼ぶ。ポリペプチドをコードする、対応する核酸を、「転移性腫瘍関連核酸」、「転移性腫瘍関連遺伝子」、「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ核酸」、または「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ遺伝子」と呼ぶ。他に指示しない限り、「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ」、「転移性腫瘍関連タンパク質」、「転移性腫瘍関連核酸」は、本明細書に開示される配列のいずれかを指すことを意味する。ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質または核酸の、対応する代謝産物も、前述の伝統的なリスクマーカー代謝産物と同様に測定することができる。
【００３２】
健康状態（例えば、年齢、家族歴、および伝統的なリスク因子として一般に使用されるその他の測定値）の生理学的マーカーを、「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ生理機能」と呼ぶ。ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの前述の種類の１つまたは複数、好ましくは２つ以上を数学的に組み合わせた測定値から得た計算された指標を、「ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ指標」と呼ぶ。
【００３３】
「臨床パラメータ」は、限定するものではないが、年齢（Ａｇｅ）、人種（ＲＡＣＥ）、性別（Ｓｅｘ）、または家族歴（ＦａｍＨＸ）など、被験体の健康状態またはその他の特徴の全ての非サンプルまたは非分析物生物マーカーを包含する。
【００３４】
「循環内皮細胞」（「ＣＥＣ」）は、炎症を含めたある状況で、血流に剥落する血管内壁からの内皮細胞であり、癌の病因に関連した新しい脈管構造の形成に寄与する。ＣＥＣは、腫瘍進行および／または抗新脈管形成療法に対する応答のマーカーとして役立てることができる。
【００３５】
「循環腫瘍細胞」（「ＣＴＣ」）は、原発性腫瘍から転移に剥落する上皮由来の腫瘍細胞であり、循環内に進入する。末梢血中の循環腫瘍細胞の数は、転移性癌を有する患者の予後に関連する。これらの細胞は、上皮細胞を検出する免疫学的方法を使用して、分離し定量することができる。
【００３６】
「ＦＮ」は、偽陽性であり、疾患状態の試験では、疾患被験体を誤って非疾患または正常であると分類することを意味する。
【００３７】
「ＦＰ」は、偽陽性であり、疾患状態の試験では、正常な被験体を誤って疾患を有すると分類することを意味する。
【００３８】
「式」、「アルゴリズム」、または「モデル」は、任意の数学的方程式、アルゴリズム的、分析的、もしくはプログラムされたプロセス、または１つもしくは複数の連続したもしくはカテゴリー的入力（本明細書では、「パラメータ」と呼ぶ。）を得、かつ出力値を計算する統計的技法であり、時々「指標」または「指標値」と呼ばれる。「式」の非限定的な例には、合計、比、および回帰演算子が含まれ、例えば、係数または指数、生物マーカー値の変換および正規化（限定するものではないが、性別、年齢、または人種などの臨床パラメータをベースにした正規化スキームを含む。）、規則および指針、統計的分類モデル、および歴史的集団で訓練された神経回路網がある。ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴおよびその他のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを組み合わせる際に特に使用されるものは、被験体サンプルで検出されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルと転移性疾患の被験体のリスクとの関係を決定するための、１次および非１次方程式と統計的分類分析である。パネルおよび組合せ構成において、特に興味深いものは、構造的および共同統計分類アルゴリズムであり、リスク指標構成の方法であり、とりわけ、相互相関、主成分分析、（ＰＣＡ）、因子軸回転、ロジスティック回帰（ＬｏｇＲｅｇ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｅｉｇｅｎｇｅｎｅ線形判別分析（ＥＬＤＡ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ランダム予報（ＲＦ）、帰納的分配木（ＲＰＡＲＴ）、ならびにその他の関連ある決定木分類技法、収縮重心（ＳＣ）、ＳｔｅｐＡＩＣ、Ｋｔｈ最短隣接、ブースティング、判別木、神経回路網、Ｂａｙｓｃｉａｎネットワーク、サポートベクターマシン、および隠れマルコフモデルなどの確立された技法を含む、パターン認識フィーチャーを利用するものである。その他の技法は、当業者に周知のＣｏｘ、Ｗｅｉｂｕｌｌ、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ、およびＧｒｅｅｎｗｏｏｄモデルも含めた、生存および時間事象ハザード分析で使用することができる。これら技法の多くは、順方向選択、逆方向選択、または段階的選択などのＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ選択技法、所与のサイズの遺伝的アルゴリズムの全ての可能性あるパネルの全数調査と組み合わせて有用であり、またはこれら技法そのものは、それ自体の技法において生物マーカー選択法を含んでいてもよい。これらは、追加の生物マーカーとモデル改良とのトレードオフを定量するために、かつ過剰適合を最小限に抑えるのを助けるために、Ａｋａｉｋｅ情報基準（ＡＩＣ）またはＢａｙｅｒ情報基準（ＢＩＣ）と結合してもよい。得られる予測モデルは、ブートストラップ、リーブワンアウト（ＬＯＯ）、および１０倍クロス確認（１０倍ＣＶ）などの技法を使用して、その他の研究で確認することができまたは当初慣れていた研究でクロス確認することができる。様々なステップで、誤検出率（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）は、当技術分野で公知の技法により、値の順列によって推定することができる。「医療経済効用関数」は、ケア基準に診断または治療の介入を導入する前後で理想化された適用可能な患者集団での臨床結果範囲の予測された確率の組合せから得られた式である。これは、そのような介入の精度、有効性、および性能特��の推測値と、各結果に関連した費用および／または値の測定（有用性）であって、ケアの実際の医療制度コスト（サービス、サプライ、装置、および薬物など）から得ることができ、かつ／または各結果をもたらす生活の質で調整した年数（ＱＡＬＹ）当たりの推定許容値として包含する。全ての予測された結果全体を通して、ある結果に関して予測される集団サイズとそれぞれの結果の期待効用との積の合計は、ケアの所与の基準の全医療経済効用である。（ｉ）介入のあるケア基準に関して計算された全医療経済効用と、（ｉｉ）介入の無いケア基準に関する全医療経済効用との差は、医療経済コストまたは介入の値の全体的な尺度をもたらす。これは、それ自体が分析される全患者群の中で（または介入群の中でのみ）分割されて、単位介入当たりのコストに到達し、市場ポジショニング、価格決定、および医療制度の受入れの前提事項として、そのような決定を案内する。そのような医療経済効用関数は、介入の費用効果を比較するのに一般に使用されるが、保険制度が支払いをしようとするＱＡＬＹ当たりの許容される値、または、新しい介入に必要な許容される費用効果のある臨床性能特性を推定するのに変換してもよい。
【００３９】
本発明の診断（または予後）介入では、各結果（疾患分類診断試験では、ＴＰ、ＦＰ、ＴＮ、またはＦＮであってもよい。）が異なるコストを有するので、医療経済効用関数は、特異性よりも感受性を、またはＮＰＶよりもＰＰＶを、臨床状況および個々の結果のコストおよび値に基づいて優先的に支持してもよく、したがって、より直接的な臨床または分析性能尺度とは異なる可能性のある医療経済性能および値の別の尺度をもたらす。これらの異なる測定および相対的なトレードオフは、一般に、全ての性能尺度が不完全を好むことになるが異なる程度まで、エラー率０の完全試験（０予測被験体結果誤判別またはＦＰおよびＦＮとも呼ばれる。）の場合でのみ集中することになる。
【００４０】
「測定する」または「測定」、あるいは「検出する」または「検出」は、そのような物質の定性的または定量的な濃度レベルの誘導を含めた、臨床または被験体由来サンプル中の、所与の物質の存在、不存在、定量、活性、または量（有効量にすることができる。）を評価すること、または、被験体の非分析物臨床パラメータの値もしくは分類を別の方法で評価することを意味する。
【００４１】
「陰性予測値」または「ＮＰＶ」は、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＮ）または全ての陰性試験結果の真陰性率によって計算される。これは、試験をしようとする集団の、疾患の有病率および試験前確率によっても本質的に影響を受ける。
【００４２】
例えば、臨床診断試験などの試験の特異性、感受性と、陽性および陰性予測値について論じている、Ｏ’Ｍａｒｃａｉｇｈ  ＡＳ、Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＲＭ、「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｖａｌｕｅ  Ｏｆ  Ａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔ，  Ｈｏｗ  Ｔｏ  Ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｍｉｓｌｅａｄｉｎｇ  Ｏｒ  Ｃｏｎｆｕｓｉｎｇ  Ｒｅｓｕｌｔｓ」、Ｃｌｉｎ．Ｐｅｄ．１９９３年、３２（８巻）：４８５〜４９１頁を参照されたい。しばしば、連続診断試験測定を使用する２元疾患状態分類アプローチでは、感受性および特異性は、Ｐｅｐｅら、「Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｄｄｓ  Ｒａｔｉｏ  ｉｎ  Ｇａｕｇｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ，  ｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｍａｒｋｅｒ」、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、２００４年、１５９（９巻）：８８２〜８９０頁による受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線によってまとめられ、また、曲線下面積（ＡＵＣ）またはｃ統計、すなわち、単一の値でのみ試験（またはアッセイ）カットポイントの全範囲にわたって試験、アッセイ、または方法の感受性および特異性の表示を可能にする指標によってまとめられる。例えば、Ｓｈｕｌｔｚ、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、１４章、Ｔｅｉｔｚ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＢｕｒｔｉｓおよびＡｓｈｗｏｏｄ（編）、４版、１９９６年、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９２〜１９９頁；およびＺｗｅｉｇら、「ＲＯＣ  Ｃｕｒｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａｎ  Ｅｘａｍｐｌｅ  Ｓｈｏｗｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  Ａｍｏｎｇ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌｉｐｉｄ  Ａｎｄ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｏｒｏｎｏｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、３８（８巻）：１４２５〜１４２８頁も参照されたい。尤度関数、オッズ比、情報理論、予測値、較正（適合度を含む。）、および再分類測定を使用する代替の手法は、Ｃｏｏｋ、「Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｍｉｓｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｃｕｒｖｅ  ｉｎ  Ｒｉｓｋ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００７年、１１５巻：９２８〜９３５頁に要約されている。
【００４３】
最後に、試験によって定義された被験体コホートでのハザード率と絶対および相対リスク率は、臨床精度および有効性のさらなる測定値である。基準限界、識別限界、およびリスク閾値を含めた異常なまたは疾患値を定義するのに、多数の方法が頻繁に使用されている。
【００４４】
「分析精度」は、測定プロセスそのものの再現性および予測精度を指し、変動係数などの測定値と、異なる時間、使用者、装置、および／または試薬を用いた同じサンプルまたは対照の一致および較正の試験にまとめることができる。新しい生物マーカーを評価する際のこれらおよびその他の課題は、Ｖａｓａｎ、２００６年にもまとめられている。
【００４５】
「性能」は、とりわけ臨床および分析精度、使用特性（例えば、安定性、使い易さ）、医療経済値、および試験の成分の相対コストなどのその他の分析およびプロセス特性も含めた、診断または予後試験の全体的な有用性および質に関する用語である。これら因子のいずれかは、優れた性能の源であってよく、したがって試験に役立てることができ、関連あるものとしてＡＵＣや結果までの時間、寿命などの、適切な「性能マトリックス」によって測定してもよい。
【００４６】
「陽性予測値」または「ＰＰＶ」は、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）または全ての陽性試験結果の真陽性率によって計算される。これは疾患の有病率および試験がなされる集団の試験前確率の影響を本質的に受ける。
【００４７】
本発明の文脈における「リスク」は、転移性事象への変換のように、ある事象が特定の期間にわたって生じる確率に関し、対照の「絶対」リスクまたは「相対」リスクを意味することができる。絶対リスクは、関連ある時間コホートに関する測定後の実際の観察を参照しながら、または関連ある期間に関して追跡された統計的に有効な歴史コホートから明らかにされた指標値を参照しながら、測定することができる。相対リスクは、低リスクコホートの絶対リスクまたは平均集団リスクと比較した被験体の絶対リスクの比を指し、これは臨床リスク因子がどのように評価されるかによって変動する可能性がある。オッズ比、すなわち所与の試験結果に関する陽性事象と陰性事象との割合も、非変換に一般に使用される（オッズは、式ｐ／（１−ｐ）に従い、但しｐは事象の確率であり、（１−ｐ）は非事象の確率である。）。
【００４８】
本発明の文脈における「リスク評価」または「リスクの評価」は、事象または疾患状態が生じる可能性がある確率、オッズ、または尤度、事象または１つの疾患状態から別の状態への変換、すなわち原発性腫瘍から転移性腫瘍または転移を発症するリスクへの変換、または１次的な転移性事象のリスクから２次的な転移性事象への変換の発生率を予測することを包含する。リスク評価は、予め測定した集団に対する絶対的なまたは相対的な意味で、将来の臨床パラメータ、伝統的な実験室リスク因子の値、またはその他の癌の指標の予測を含むこともできる。本発明の方法は、転移性腫瘍のリスクの連続的またはカテゴリー的測定を行うのに、したがって転移性腫瘍のリスクがあると定義された被験体のカテゴリーのリスクスペクトルを診断し定義するのに使用してもよい。カテゴリー的シナリオでは、本発明は、正常なおよび転移性腫瘍のより高いリスクにあるその他の被験体コホートを区別するのに使用することができる。そのような異なる使用は、異なるＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの組合せおよび個別的なパネル、数学的アルゴリズム、および／またはカットオフポイントを必要とする可能性があるが、それぞれの意図される用途には精度および性能に関して同じである前述の測定にかけてもよい。
【００４９】
本発明の文脈における「サンプル」は、被験体から単離された生体サンプルであり、例としてかつ限定することなく、組織生検標本、全血、血清、血漿、血液細胞、内皮細胞、リンパ液、腹水、間質液（「細胞外液」とも呼ばれ、細胞間の空間に見出される流体を包含し、とりわけ歯肉溝滲出液が含まれる。）、骨髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、粘液、痰、汗、尿、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、または任意のその他の分泌液、排出物、またはその他の体液を含むことができる。
【００５０】
「感受性」は、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）または疾患被験体の真陽性率によって計算される。
【００５１】
「特異性」は、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）または非疾患もしくは正常な被験体の真陰性率によって計算される。
【００５２】
「統計的に有意な」とは、変化が、偶然によってのみ生じると予測され得るもの（「偽陽性」の可能性がある。）よりも大きいことを意味する。統計的有意は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。一般に使用される有意性の尺度には、少なくとも所与のデータポイントのように極端な結果を得る確率を示すｐ値が含まれ、このデータポイントは、偶然でのみ得られた結果であると想定される。結果はしばしば、０．０５以下のｐ値で非常に有意であると見なされる。
【００５３】
本発明の文脈における「被験体」は、好ましくは哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシにすることができるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、腫瘍転移の動物モデルを代表する被験体として、有利に使用することができる。被験体は、オスまたはメスにすることができる。被験体は、原発性腫瘍または転移性腫瘍を有するものと、また任意選択で腫瘍の治療介入を既に受けておりまたは受けているものと予め診断されまたは特定されたものにすることができる。あるいは被験体は、転移性腫瘍を有するものと予め診断されていないものにすることもできる。例えば被験体は、転移性腫瘍に関する１つまたは複数のリスク因子を示すものにすることができる。
【００５４】
「ＴＮ」は真陰性であり、疾患状態の試験において、非疾患または正常な被験体を正確に分類することを意味する。
【００５５】
「ＴＰ」は、真陽性であり、疾患状態の試験において、疾患被験体を正確に分類することを意味する。
【００５６】
「伝統的な実験室のリスク因子」は、被験体サンプルから単離されまたは得られた生物マーカーに対応するもので、臨床実験室で現在評価されておりかつ伝統的なグローバルリスクアセスメントアルゴリズムで使用されている。腫瘍転移に関する伝統的な実験室のリスク因子には、例えば、ｂｒｅｓｌｏｗ厚、潰瘍化、増殖指標、腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。腫瘍転移に関するその他の伝統的な実験室のリスク因子は、当業者に公知である。
【００５７】
（本発明の方法および使用）
本明細書に開示される方法は、転移性腫瘍を発症するリスクがある被験体、転移性腫瘍を有すると既に診断されたまたは診断されていない被験体、および原発性腫瘍または転移性腫瘍の治療および／療法を受けている被験体で使用される。本発明の方法は、原発性腫瘍または転移性腫瘍を有する被験体の治療レジメンをモニタしまたは選択するのに、および転移のリスク因子を示す被験体など、転移性腫瘍を有すると予め診断されていない被験体をスクリーニングするのに使用することもできる。好ましくは、本発明の方法は、転移性腫瘍に関して無症候性の被験体を特定および／または診断するのに使用される。「無症候性」は、伝統的な症状を示さないことを意味する。
【００５８】
本発明の方法は、伝統的なリスク因子のみをベースにして、既に転移性腫瘍を発症するリスクがより高い被験体を特定および／または診断するのに使用してもよい。
【００５９】
転移性腫瘍を有する被験体は、被験体由来サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効数（２個以上にすることができる。）の量（存在または不存在を含む。）量を測定し、次いでこの量を基準値と比較することによって、特定することができる。次いでタンパク質、ポリペプチド、核酸、およびポリヌクレオチドと、タンパク質、ポリペプチド、核酸、およびポリヌクレオチドの多型、変異したタンパク質、ポリペプチド、核酸、およびポリヌクレオチドなどの生物マーカーの発現の量およびパターンの変化、または、被験体サンプル中の代謝産物もしくは他の分析物の分子量の変化を基準値と比較したものが、特定される。
【００６０】
基準値は、同じ癌を有する被験体、同じまたは類似する年齢範囲を有する被験体、同じまたは類似する人種群の被験体、癌の家族歴を有する被験体などを含むがこれに限定するものではない集団研究から得られた数または値に対するもの、または、癌の治療を受けている被験体の出発サンプルに対するものにすることができる。そのような基準値は、癌転移の数学的アルゴリズムおよび計算された指標から得られた、集団の統計分析および／またはリスク予測データから得ることができる。基準ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ指標は、統計的および構造的分類のアルゴリズムおよびその他の方法を使用して構成し使用することもできる。
【００６１】
本発明の一実施形態では、基準値は、転移性腫瘍を発症するリスクが無いかまたはそのようなリスクが低い１つまたは複数の被験体から得られた対照サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量である。本発明の別の実施形態では、基準値は、転移性腫瘍に関して無症候性のおよび／または伝統的なリスク因子に欠けている、１つまたは複数の被験体から得られた対照サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量である。別の実施形態では、そのような被験体は、診断上関連ある期間に関してモニタされかつ／または定期的に再試験され（「長期的研究」）、そのような試験の後に、転移性腫瘍が継続して存在しないことを確認する（疾患または事象がない生存）。そのような期間は、基準値を決定するための初期試験データから１年、２年、２から５年、５年、５から１０年、１０年、または１０年以上であってもよい。さらに、適正に保存された歴史的被験体サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの遡及的測定を、これら基準値を確立するのに使用してもよく、したがって必要とされる研究時間が短縮される。
【００６２】
基準値は、癌の治療および／または療法の結果として転移性リスク因子の改善を示す被験体から得られたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を含むこともできる。基準値は、公知の浸潤性または非浸潤性技法によって疾患であることが確認された、または転移性腫瘍を発症するリスクが高い、または転移性腫瘍に罹患している被験体から得られたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を含むこともできる。
【００６３】
別の実施形態では、基準値は、指標値または基礎値である。指標値または基礎値は、転移性腫瘍を有していない、または転移に対して無症候性の、１つまたは複数の被験体からのＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量の複合サンプルである。基礎値は、癌の治療または療法の結果として転移性腫瘍リスク因子の改善が示された被験体から得たサンプル中に、ある量のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含むこともできる。この実施形態では、被験体由来サンプルとの比較を行うために、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量は同様に計算されかつ指標値と比較される。任意選択で、転移性腫瘍を有しまたは転移性腫瘍を発症するリスクが高いことが明らかにされた被験体は、癌の進行を遅らせまたは転移性腫瘍を発症するリスクを低下もしくは予防する治療レジメンを受けるように選択される。
【００６４】
転移性腫瘍の進行、または癌治療レジメンの有効性は、経時的に被験体から得た有効量（２つ以上であってもよい。）のサンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出し、検出されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を比較することによって、モニタすることができる。例えば、第１のサンプルは、被験体が治療を受ける前に得ることができ、１つまたは複数の後続サンプルは、被験体の治療後または治療中に採取される。癌は、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量が基準値に対して経時的に変化する場合、進行性（または、あるいは、治療が進行を予防しない。）と見なされ、それに対して癌は、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量が経時的に一定（基準集団に対して、すなわち本明細書で使用される「一定」）である場合には進行性ではない。本発明の文脈で使用される「一定」という用語は、基準値に対する経時的な変化を含むと解釈される。
【００６５】
例えば、本発明の方法は、腫瘍の攻撃性を区別しかつ／または腫瘍の病期（例えば、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩ期、またはＩＶ期）を評価するのに使用することができる。この方法により、患者を、高または低リスク群に階層化し、それに応じて治療することが可能になる。
【００６６】
さらに、特定の被験体への投与に適した治療または予防薬は、被験体から得られたサンプル中に有効量（２個以上でよい。）のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出し、この被験体由来サンプルを、被験体由来サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量（２個以上でよい。）を決定する試験化合物に曝すことによって、特定することができる。このように、癌を有する被験体または転移性腫瘍を発症するリスクがある被験体において使用される治療または治療レジメンは、被験体から得られたサンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量に基づいて選択することができ、基準値と比較することができる。２つ以上の治療または治療レジメンに関しては、癌の発症を遅延させまたは進行を遅くするよう被験体で使用するにはどの治療または治療レジメンが最も効果的になるかを決定するために、並行して評価することができる。
【００６７】
本発明はさらに、被験体由来サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量（２個以上でよい。）を決定し、基準サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量と比較し、被験体サンプル中の量の変化を基準サンプルと比較して特定することによって、転移性腫瘍に関連するマーカー発現の変化をスクリーニングするための方法を提供する。
【００６８】
本発明はさらに、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量が、腫瘍から得たサンプルにおいて測定して臨床的に有意に変化した場合に、患者が腫瘍を有していると特定し、腫瘍転移を予防または低減する治療レジメンで患者を治療することによって、腫瘍を有する患者を治療する方法を提供する。
【００６９】
さらに本発明は、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量を測定することにより、患者における転移のリスクを評価することによって、アジュバント治療を必要とする腫瘍患者を選択する方法であって、患者からの腫瘍サンプル中の２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの臨床的に有意な変化は、患者がアジュバント治療を必要としていることを示す方法を提供する。
【００７０】
患者から得た腫瘍サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量に関する情報を得、２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが臨床的に有意に変化する場合に、患者における腫瘍転移を予防または低減する治療レジメンを選択することによる、腫瘍患者の治療決定に関する情報。
【００７１】
基準サンプル、例えば対照サンプルが、転移性癌を有していない対照から得たものである場合、または基準サンプルが、転移性腫瘍への急速な進行の高い尤度を有する者に対する値を反映する場合、試験サンプルおよび基準サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量が類似していることは、治療が効果的であることを示す。しかし、試験サンプルおよび基準サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量が異なることは、臨床結果または予後がそれほど好ましくないことを示す。
【００７２】
「効果的」とは、治療が、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物の量または活性の減少をもたらすことを意味する。本明細書に開示されるリスク因子の評価は、標準的な臨床プロトコルを使用して実現することができる。有効性は、転移性疾患を診断し、特定し、または治療するための任意の公知の方法に関連して決定することができる。
【００７３】
本発明は、転移に関連した一般的な生理学的経路を示す１個または複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ、例えば、転移に関連した異なる疾患状態または後遺症を排除しまたはこれらを区別するのに使用することができる１個または複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含む、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパネルも提供する。単一のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、本発明による前述の特徴のいくつかを有していてもよく、あるいは、本発明の所与の適用例に向けて適切な場合には１個または複数のその他のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの代わりに使用してもよい。
【００７４】
本発明は、２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物を結合させる検出試薬を有するキットも含む。本発明によって、検出試薬、例えば２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質または核酸をそれぞれ結合することができる抗体および／またはオリゴヌクレオチドのアレイも提供される。一実施形態では、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴがタンパク質であり、アレイは、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ発現における統計的に有意な変化を基準値と比較して測定するのに十分な、有効量のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３６０を結合する抗体を含有する。別の実施形態では、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが核酸であり、アレイは、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ発現における統計的に優位な変化を基準値と比較して測定するのに十分な、有効量のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３６０を結合するオリゴヌクレオチドまたはアプタマーを含有する。
【００７５】
別の実施形態では、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴがタンパク質であり、アレイは、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ発現における統計的に有意な変化を基準値と比較して測定するのに十分な、有効量のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１を結合する抗体を含有する。別の実施形態では、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが核酸であり、アレイは、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ発現における統計的に有意な変化を基準値と比較して測定するのに十分な、有効量のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１を結合するオリゴヌクレオチドまたはアプタマーを含有する。
【００７６】
本発明によれば、転移性腫瘍を発症するリスクがある１つまたは複数の被験体を治療するための方法であって、１つまたは複数の被験体からのサンプル中に存在するＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量の変化量の存在を検出し；転移性疾患を発症するリスクが低い１つまたは複数の被験体であるいは転移性疾患の伝統的なリスク因子のいずれかを示さない被験体で測定された基礎値に、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの変化量または活性が戻るまで、１種または複数の癌調節剤で１つまたは複数の被験体を治療する方法も提供される。
【００７７】
本発明によれば、転移性腫瘍を有する１つまたは複数の被験体を治療するための方法であって、１つまたは複数の被験体からのサンプル中に存在するＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量の変化レベルの存在を検出し；転移性腫瘍を発症するリスクが低い１つまたは複数の被験体で測定された基礎値に、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの変化量または活性が戻るまで、１種または複数の癌調節剤で１つまたは複数の被験体を治療することによる方法も提供される。
【００７８】
本発明によれば、癌と診断された被験体における転移性腫瘍を発症するリスクの変化を評価するための方法であって、第１の期間で、被験体から得た第１のサンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量（２個以上でよい。）を検出し、第２の期間で、被験体から得た第２のサンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量を検出し、第１と第２の期間で検出されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を比較する方法も提供される。
【００７９】
（本発明の診断および予後指標）
本発明によれば、転移性腫瘍の診断および予後が可能になる。転移性腫瘍を発症するリスクは、試験サンプル（例えば、被験体由来サンプル）中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、およびその他の分析物の有効量（２個以上でよい。）を測定し、多数の個々のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの結果からおよび非分析物臨床パラメータからの情報を単一の測定値または指標へと組み合わせるために数学的アルゴリズムまたは式をしばしば利用して、有効量を基準または指標値と比較することによって、検出することができる。転移性腫瘍のリスクが高いことが明らかにされた被験体は、任意選択で、転移性腫瘍の発症を予防しまたは遅延させるための予防または治療化合物の投与などの治療レジメンを受けるように選択することができる。
【００８０】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物の量は、試験サンプル中で測定することができ、基準限界、識別限界、またはカットオフポイントもしくは異常値を定義するリスク画定閾値などの技法を利用して「正常対照レベル」と比較することができる。「正常対照レベル」は、転移性腫瘍に罹患していない被験体で典型的に見出される、１個もしくは複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴまたは組み合わせたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの指標のレベルを意味する。そのような正常対照レベルおよびカットオフポイントは、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴが単独で使用されるのかまたはその他のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴと組み合わせた方式で１つの指標として使用されるのかに基づいて、変化してもよい。あるいは正常対照レベルは、臨床的に関連ある対象期間を通して転移性腫瘍を発症することのない予め試験された被験体からの、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパターンのデータベースにすることができる。
【００８１】
本発明は、転移性腫瘍に変換されるリスクの連続的またはカテゴリー的測定を行うのに使用してもよく、したがって、転移性事象を有するリスクがあると定義された被験体のカテゴリーのリスクスペクトルを診断し定義するのに使用してもよい。カテゴリー的シナリオでは、本発明の方法は、正常および疾患被験体コホートを区別するのに使用することができる。その他の実施形態では、本発明は、転移性事象を有するリスクにあるものと、転移性事象にさらに急速に進行するもの（あるいは、転移性事象までの推定される対象期間がより短いもの）、よりゆっくり進行するもの（または、転移性事象までの対象期間がより長いもの）、または転移性腫瘍を有するもの、正常なものとが区別されるように使用してもよい。そのような異なる使用は、個々のパネル、数学的アルゴリズム、および／またはカットオフポイントで、異なるＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの組合せを必要とする可能性があるが、前述の同じ精度測定と、意図される用途に関連したその他の性能マトリックスの下に置いてもよい。
【００８２】
転移性事象を有するリスクがある被験体を特定することによって、この被験体が転移性疾患状態に変換されるのを遅延させ、低減させ、または予防するために、様々な治療介入または治療レジメンを選択し開始することが可能になる。ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物の有効量のレベルは、転移性疾患または転移性事象の治療経過をモニタすることも可能にする。この方法では、生体サンプルを、癌の治療レジメン、例えば薬物治療を受けた被験体から得ることができる。必要に応じて、生体サンプルは、治療の前、間、または後の様々な時点で被験体から得られる。
【００８３】
機能的に活性なＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに基づいて、その機能を明らかにすることにより、例えば多くのＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを有する被験体は、そのような経路、例えばＴＧＦβシグナル伝達を通して機能するＨＯＡＸ１を優先的に標的とする薬剤／薬物で管理することができ、したがって、高ＨＯＸＡ１被験体は、ＴＧＦβ阻害剤で治療することができる。またはＨＯＸＡ１は、ＣＸＣＲ４、転移に関与しかつＴＧＦｂの上流で作用することが報告されているケモカイン軸を活性化し、したがって、ＣＸＣＲ４と拮抗する薬物／薬剤を使用することができる。
【００８４】
本発明は、患者または被験体集団を、任意の数のセッティングでスクリーニングするのに使用することもできる。例えば、健康管理組織、公衆衛生団体、または学校保健プログラムは、上述のような介入が必要なものを特定するために、または疫学的データを収集するために、被験体群をスクリーニングすることができる。保険会社（例えば、健康、生命、または障害）は、補償範囲または価格設定を決定する過程で申込者を、または可能性ある介入を目的として既存のクライアントを、スクリーニングしてもよい。そのような集団スクリーニングで収集されたデータは、特に癌または転移性事象のような状態への任意の臨床的進行と関係している場合、例えば健康管理組織、公衆衛生団体、および保険会社の運用において、価値あるものになる。そのようなデータアレイまたは収集は、機械可読媒体に記憶させることができ、改善されたヘルスケアサービス、費用効果のあるヘルスケア、改善された保険運用などを提供するために、任意の数の健康関連データ管理システムで使用することができる。例えば、米国特許出願第２００２／００３８２２７号；米国特許出願第２００４／０１２２２９６号；米国特許出願第２００４／０１２２２９７号；および米国特許第５，０１８，０６７号を参照されたい。そのようなシステムは、以下にさらに詳述するように、内部データストレージから直接、または遠隔にある１つもしくは複数のデータストレージ部位から、データにアクセスすることができる。
【００８５】
機械可読記憶媒体は、前記データを使用するための命令によってプログラムされた機械を使用したときに、経時的なまたは薬物療法に応答した転移性疾患リスク因子に関連する被験体情報などであるがこれに限定されない様々な目的で使用することが可能な、機械可読データまたはデータアレイでコードされたデータ記憶材料を含むことができる。本発明の生物マーカーの有効量の測定および／またはこれら生物マーカーからのリスクに関して得られる評価は、とりわけプロセッサ、データ記憶システム（揮発性および不揮発性メモリおよび／または記憶素子を含む。）、少なくとも１つの入力装置、および少なくとも１つの出力装置を含む、プログラマブルコンピュータで実行される、コンピュータプログラムで実施することができる。プログラムコードは、上述の機能を実行し出力情報を生成するために、入力データに適用することができる。出力情報は、当技術分野で公知の方法により、１つまたは複数の出力装置に適用することができる。コンピュータは、例えば、従来設計のパーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、またはワークステーションであってもよい。
【００８６】
各プログラムは、コンピュータシステムと通信するための高レベル手続き型またはオブジェクト指向プログラミング言語で実行することができる。しかし、プログラムは、必要に応じてアセンブリまたは機械言語で実行することができる。言語は、コンパイラ型またはインタープリタ型言語である。そのようなコンピュータプログラムのそれぞれは、本明細書に記述される手順を実行するために記憶媒体または装置がコンピュータによって読まれるときに、コンピュータを設定し操作するための汎用または専用目的のプログラマブルコンピュータで読取り可能な記憶媒体または装置（例えば、ＲＯＭまたは磁気ディスケットまたはこの開示の他の箇所で定義されるようなその他のもの）に記憶することができる。本発明の健康関連データ管理システムは、コンピュータプログラムで構成されたコンピュータ可読記憶媒体として実装されると見なしてもよく、そのように構成されたこの記憶媒体によれば、コンピュータは、本明細書に記述される様々な機能を実効するために特定のおよび所定の手法で操作される。
【００８７】
次いでＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物の有効量のレベルを決定し、基準値、例えばその転移状態が知られている対照の被験体または集団と、または指標値もしくは基礎値と比較することができる。基準サンプルまたは指標値もしくは基礎値は、治療が行われた１つまたは複数の被験体から得てもよくまたは導き出してもよく、または、癌もしくは転移性事象を発症するリスクが低い１つまたは複数の被験体から得てもよくまたは導き出してもよく、または、治療を行った結果として改善が見られた被験体から得てもよくまたは導き出してもよい。あるいは、基準サンプルまたは指標値もしくは基礎値は、治療が行われていない１つまたは複数の被験体から得てもよくまたは導き出してもよい。例えばサンプルは、治療の進行をモニタするために、癌または転移性事象の初期治療と癌または転移性事象の後続の治療を受けた被験体から収集してもよい。基準値は、本明細書に開示されるような、集団研究からのリスク予測アルゴリズムまたは計算された指標から得られた値を含むこともできる。
【００８８】
したがって本発明のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、癌を持たずまたは転移性事象を有するリスクがなく、癌または転移性事象を発症することが予測されない被験体の、「基準ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴプロファイル」を生成するのに使用することができる。本明細書に開示されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、癌を有し、または転移性事象を有するリスクがある被験体から得られた「被験体ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴプロファイル」を生成するのに使用することもできる。被験体ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴプロファイルは、癌または転移性事象を発症するリスクがある被験体を診断しまたは特定するために、疾患の進行ならびに疾患の進行の速さをモニタするために、また治療法の有効性をモニタするために、基準ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴプロファイルと比較することができる。本発明の基準および被験体ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴプロファイルは、とりわけＶＣＲによって読取り可能であるようなアナログテープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＵＳＢフラッシュ媒体などであるがこれらに限定されない機械可読媒体に入れることができる。そのような機械可読媒体は、臨床パラメータおよび伝統的な実験室リスク因子の測定値などであるがこれらに限定されない追加の試験結果を含むこともできる。あるいは、またはさらに、機械可読媒体は、病歴および任意の関連ある家族歴などの被験体情報を含むこともできる。機械可読媒体は、本明細書に開示されるようなその他の疾患リスクアルゴリズムおよび計算された指標に関する情報を含有することもできる。
【００８９】
被験体の遺伝子構造の相違は、それらが様々な薬物代謝する相対的な能力の相違をもたらす可能性があり、癌または転移性事象の症状またはリスク因子を調節することができる。癌を有しまたは癌もしくは転移性事象を発症するリスクがある被験体は、年齢、人種、およびその他のパラメータを様々にすることができる。したがって、本明細書に開示されるＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの使用は、単独での使用および薬物代謝の公知の遺伝的要因と一緒に組み合わせた使用の両方において、選択された被験体で試験される推定上の治療または予防薬が被験体の癌または転移性事象を治療しまたは予防するのに適したものになる所定レベルの予測精度を可能にする。
【００９０】
特定の被験体に適した治療薬または薬物を特定するために、被験体からの試験サンプルを治療薬または薬物に曝すこともでき、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質、核酸、多型、代謝産物、またはその他の分析物の１種または複数のレベルを決定することができる。１個または複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルは、治療または治療薬もしくは薬物への曝露の前および後に被験体から得られたサンプルと比較することができ、または、そのような治療もしくは曝露の結果としてリスク因子（例えば、臨床パラメータまたは伝統的な実験室リスク因子）に改善が見られた１つまたは複数の被験体から得られたサンプルと比較することができる。
【００９１】
被験体細胞（すなわち、被験体から単離された細胞）は、候補薬剤の存在下でインキュベートすることができ、試験サンプル中のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ発現のパターンを測定して基準プロファイル、例えば転移性疾患基準発現プロファイルまたは非疾患基準発現プロファイルまたは指標値または基礎値と比較する。試験薬剤は、栄養補助食品を含めた任意の化合物または組成物またはこれらの組合せにすることができる。例えば、試験薬剤は、癌治療レジメンで頻繁に使用され、その薬剤を本明細書に記述する。
【００９２】
本発明の前述の方法は、癌であると診断された、および外科的介入を受けた被験体の、進行および／または改善を評価またはモニタするのに使用することができる。
【００９３】
（本発明の性能および精密測定）
本発明の性能、したがって絶対的および相対的臨床有用性は、上述のように多数の方法で評価してもよい。性能の様々な評価の中で、本発明は、臨床診断および予後に精度をもたらすものである。診断または予後試験、アッセイ、また方法の精度は、これらの試験、アッセイ、または方法によって、癌を有しまたは癌もしくは転移性事象のリスクがある被験体を区別できる能力に関係し、被験体が、「有意な変化」（例えば、臨床的に有意な「診断的に有意な」）をＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルに有するか否かに基づく。「有効量」とは、（１個または複数の）ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに関する所定のカットオフポイント（または閾値）とは異なり、したがって被験体が（１個または複数の）ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴがＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴである癌を有しまたは転移性事象を有するリスクがあることを示す「有意な変化」（例えば、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの発現または活性レベル）をもたらすためのＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの適切な数（１個または複数でよい。）の測定値を意味する。正常と異常との間のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴレベルの相違は、好ましくは統計的に有意である。以下に示すようにかつ本発明を全く限定することなく、統計的有意性の実現、したがって好ましい分析、診断、および臨床精度は、一般に、統計的に有意なＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ指標を実現するための、いくつかのＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの組合せをパネル内で一緒に使用し数学的アルゴリズムと組み合わせるが、必ずしも必要というわけではない。
【００９４】
疾患状態のカテゴリー的診断では、試験（またはアッセイ）のカットポイントまたは閾値を変化させることによって、通常は感受性および特異性を変化させるが、定性的に逆相関にある。したがって、被験体の状態を評価するために提案された医学的試験、アッセイ、または方法の精度および有用性の評価の際には、感受性および特異性の両方を常に考慮すべきであり、感受性および特異性はカットポイントの範囲全体にわたって有意に変化し得ることから、感受性および特異性が報告されるカットポイントが何か心に留めておくべきである。全ての潜在的なカットポイント値を包含するＡＵＣなどの統計の使用は、本発明を使用するほとんどのカテゴリー的リスク測定に好ましいが、連続リスク測定の場合、観察された結果またはその他の判断基準に対する適合度および較正の統計が好ましい。
【００９５】
所定レベルの予測精度とは、この方法が、許容可能なレベルの臨床または診断精度を提供することを意味する。そのような統計、すなわち「許容可能な程度の診断精度」の使用は、本明細書では、ＡＵＣ（試験またはアッセイ用のＲＯＣ曲線下面積）が少なくとも０．６０、望ましくは少なくとも０．６５、より望ましくは少なくとも０．７０、好ましくは少なくとも０．７５、より好ましくは少なくとも０．８０、最も好ましくは少なくとも０．８５である、試験またはアッセイ（ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの臨床的に有意な存在を決定するための本発明の試験などであり、それによって、癌の存在および／または転移性事象を有するリスクが示される。）と定義される。
【００９６】
「非常に高度な診断精度」とは、ＡＵＣ（試験またはアッセイ用のＲＯＣ曲線下面積）が少なくとも０．７５、０．８０、望ましくは少なくとも０．８５、より望ましくは少なくとも０．８７５、好ましくは少なくとも０．９０、より好ましくは少なくとも０．９２５、最も好ましくは少なくとも０．９５である、試験またはアッセイを意味する。
【００９７】
あるいは、この方法は、癌、転移性癌、または治療に対する応答の存在または不存在を、少なくとも７５％の精度で、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の精度で予測する。
【００９８】
任意の試験の予測値は、試験の感受性および特異性と、試験がなされる集団の状態の有病率に依存する。ベイズの定理に基づくこの概念によれば、スクリーニングされる状態が個々にまたは集団に存在する可能性が高くなるほど（試験前の確率）、陽性試験の妥当性は高くなり、かつその結果が真陽性である可能性が高くなる。したがって、状態が存在する可能性が低い任意の集団で試験を使用する際の問題は、陽性結果が限られた値を有することである（すなわち、偽陽性になり易い。）。同様に、非常に高いリスクの集団では、陰性試験結果は偽陰性になり易い。
【００９９】
その結果、ＲＯＣおよびＡＵＣは、低疾患有病率を試験した集団（毎年１％未満の発生率（出現率）を有するもの、または指定された対象期間全体を通して１０％未満の累積有病率を有するものと定義される。）での、試験の臨床的有用性に関して、誤った方向に導く可能性がある。あるいは、この開示の中の別の場所で定義された絶対リスクおよび相対リスクを用いて、臨床的有用性の程度を決定することができる。試験がなされる被験体の集団は、試験の測定値により４分の１ずつに分類することもでき、その上位４分の１（集団の２５％）は、癌または転移性事象を発症する最高相対リスクを有する被験体の群を含み、下位４分の１は、癌または転移性事象を発症する最低相対リスクを有する被験体の群を含む。一般に、低罹患率集団において上位から下位４分の１までの相対リスクの２．５倍超を有する試験またはアッセイから得られた値は、「高度な診断精度」を有すると見なされ、各４分の１に関して相対リスクの５から７倍を有する値は、「非常に高い程度の診断精度」を有すると見なされる。それにも関わらず、臨床的に有用な各４分の１に関する相対リスクの単に１．２から２．５倍を有する試験またはアッセイから得られた値は、疾患のリスク因子として広く使用され；それらは、将来の転移性事象の予測に関して総コレステロールを有しまた多くの炎症性生物マーカーに関するような場合である。しばしば、そのようなより低い診断精度試験は、前述のグローバルリスク評価指標で行われたように、治療的介入に関して意味のある臨床閾値を得るために追加のパラメータと組み合わせなければならない。
【０１００】
医療経済効用関数は、所要の試験の性能および臨床値を測定する、さらに別の手段であり、それぞれの臨床的および経済的値の実際の測定を基にして、潜在的なカテゴリー的試験結果の重み付けからなる。医療経済動向は、医療経済効用関数が特に、試験をした被験体の正確な判別の利益と誤判別のコストとに関する経済的値を与えるので、精度に密に関係している。性能測定として、試験の標的価格を超えた、試験当たりの医療経済値（試験コストの前）の増加をもたらす性能レベルを実現する試験を必要とすることは、異常ではない。
【０１０１】
一般に、診断精度を決定する代替方法は、疾患カテゴリーまたはリスクカテゴリー（転移性事象を有するリスクにあるものなど）が、治療用途での閾値がまだ確立されておらずまたは病気に罹る前の診断に関する判断基準が存在していないような、関連ある医師会および医療活動によってまだ明確に定義されていない場合に、連続測定で一般に使用される。リスクの連続測定では、計算された指標に関する診断精度の測定は、典型的には予測連続値および実測値（または歴史的指標計算値）との間の曲線の当て嵌めと較正とを基にし、Ｒ平方、Ｈｏｓｍｅｒ−ＬｅｍｅｓｈｏｗのＰ値統計、および信頼区間などの測定値を利用する。そのようなアルゴリズムを使用する予測値を、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により商用化された将来の乳癌再発リスクに関する試験の場合のように、歴史的観察コホート予測を基にした信頼区間（通常は９０％または９５％Ｃｌ）を含めて報告することは、異常ではない。
【０１０２】
一般に、診断精度の程度、すなわちＲＯＣ曲線のカットポイントを定義し、許容可能なＡＵＣ値を定義し、本発明のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの有効量を構成するものの相対濃度の許容可能な範囲を決定することによって、当業者は、所定レベルの予測精度および性能を有する被験体を特定し、診断し、見通しを立てるために、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを使用することが可能になる。
【０１０３】
（本発明のリスクマーカー（ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ））
本発明の生物マーカーおよび方法によれば、当業者は、癌または転移性事象のいかなる症状も示さないにも関わらず癌または転移性事象を発症するリスクがあり得る被験体を、特定し、診断し、またはその他の手法で評価することが可能になる。
【０１０４】
１５９３個の生物マーカーは、転移性疾患を有する被験体において変化しまたは修正された存在または濃度レベルを有することがわかったことが、明らかにされた。
【０１０５】
表１は、本発明の、３６０個の過発現／増幅または下方制御／欠失がなされた表現型によって誘導された、進化的に保存されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含む。ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜２５、４１、６１、６２、６３、６６、７４、９６、９９、１０３、１２６、１３５、１３７、１３８、１７７、１９０、２１０、２１２、２１７、２１８、２２７、２３９、２６１、および２７１は、浸潤前決定因子として特定された。
【０１０６】
【表１−１】
2011526693.tif 000003
【０１０７】
【表１−２】
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【０１０８】
【表１−３】
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【０１０９】
【表１−４】
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【０１１０】
【表１−５】
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【０１１１】
【表１−６】
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【０１１２】
【表１−７】
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【０１１３】
【表１−８】
2011526693.tif 000010
当業者なら、本明細書に示されるＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、多型、イソフォーム、変異体、誘導体、核酸および前駆タンパク質を含む前駆体、切断産物、受容体（可溶性および膜貫通受容体を含む。）、リガンド、タンパク質−リガンド複合体、および翻訳後修飾変種（架橋またはグリコシル化など）、断片、および分解産物、ならびに任意の多単位核酸、タンパク質、および糖タンパク質構造であって、完全に組み立てられた構造の構成サブ単位としてＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのいずれかを含んだものを含むが、これらに限定されない全ての形および変種を包含することを理解するであろう。
【０１１４】
当業者なら、上記列挙されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、転移性疾患に関連するとは一般に認められない多くを含めた生理学的および生物学的経路の多様な集合から得られることに、留意するであろう。種々のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのこれらのグループ分けは、高い有意性のセグメント内にあっても、疾患の進行の病期または速度の種々のシグナルを前もって知らせることができる。ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのそのような明らかなグループ分けによって、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴからのより生物学的に詳細なかつ臨床的に有用なシグナルが可能になり、それと共に、多数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴシグナルと組み合わせたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴアルゴリズム内でのパターン認識の機会も可能になる。
【０１１５】
本発明は、一態様では、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの部分集合に関し；その他のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴおよび上記表１に列挙されておらずこれら生理学的および生物学的経路に関連している生物マーカーも、シグナルおよび情報がこれらの研究から得られたものであることを考えれば有用であると証明することができる。その他の生物マーカー経路関与因子（すなわち、上記表１のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのリストに含まれた生物マーカーを有する共通経路におけるその他の生物マーカー関与因子）が癌または転移性事象における関連ある経路関与因子でもあるような程度まで、これらの因子は、表１でこれまで開示されてきたように、例えばＣＸＣＲ４などの生物マーカーと機能的に均等であってもよい。これらのその他の経路関与因子は、本発明の文脈においてＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴとも見なされ、但しこれらの因子は、良好なバイオマーカーのある定義された特徴をさらに共有し、本明細書に開示された生物学的プロセスおよび有用なシグナル対雑音比での前記生物マーカーのバイオアベイラビリティなどの分析的に重要な特徴と、血清などの有用でアクセス可能なサンプルマトリックスとの両方への関与を含む可能性がある。そのような要件は、典型的には、生物学的経路の多くのメンバーの診断有用性を限定し、分泌物質を構成する経路メンバーでのみ頻繁に生ずるが、これらは、癌または転移性事象の疾患進行に関連してもしなくても、アポトーシスまたは内皮リモデリングもしくはその他の細胞代謝回転もしくは細胞壊死性経過などのその他の理由により、細胞の原形質膜でアクセス可能なものならびに細胞死により血清中に放出されるものである。しかし、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに関するこの高い基準を満たす、残されたおよび将来の生物マーカーは、非常に価値あるものとなるようである。
【０１１６】
さらに、その他の列挙されていない生物マーカーは、表１のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴとして列挙された生物マーカーに、非常に高度に相関することになる（本出願の目的では、任意の２個の変数は、０．５以上の決定係数（Ｒ２）を有する場合、「非常に高度に相関した」と見なされることになる。）。本発明は、前述のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに対するそのような機能的および統計的均等物を包含する。さらに、そのような追加のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの統計的有用性は、多数の生物マーカーと任意の新しい生物マーカーとの間の相互相関に実質的に依存し、しばしば、基礎をなす生物学の意味を詳述するためにパネル内での操作を必要とすることになる。
【０１１７】
列挙されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの１個または複数、好ましくは２個以上は、本発明の実施に際して検出することができる。例えば、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個以上、２７０個以上、２８０個以上、２９０個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出することができる。
【０１１８】
いくつかの態様では、本明細書に記述される３６０個の全てのＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを検出することができる。ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの数を検出することができる好ましい範囲は、１から３６０個、特に２、５、１０、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０個の間から選択された任意の最小値であって、公知の全ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ、特に５、１０、２０、５０、および７５個までの任意の最大値と組み合わせたものによって結び付けられた範囲を含む。特に好ましい範囲には、２〜５個、２〜１０個、２〜５０個、２〜７５個、２〜１００個、５〜１０個、５〜２０個、５〜５０個、５〜７５個、５〜１００個、１０〜２０個、１０〜５０個、１０〜７５個、１０〜１００個、２０〜５０個、２０〜７５個、２０〜１００個、５０〜７５個、５０〜１００個、１００〜１２５個、１２５〜１５０個、１５０〜１７５個、１７５〜２００個、２００〜２１０個、２１０〜２２０個、２２０〜２３０個、２３０〜２４０個、２４０個〜２５０個、２５０〜２６０個が含まれる。
【０１１９】
（ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴパネルの構造）
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのグループ化は、「パネル」に含めることができる。本発明の文脈における「パネル」は、複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを含む生物マーカーの群（これらがＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ、臨床パラメータ、または伝統的な実験室リスク因子であるか否かに関わらず）を意味する。パネルは、追加の生物マーカー、例えば臨床パラメータ、伝統的な実験室リスク因子であって、癌または癌転移と共に存在しまたはこれらに関連することが公知であるものを、表１に列挙されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの選択された群と組み合わせて含むこともできる。
【０１２０】
上述のように、列挙された個々のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ、臨床パラメータ、および伝統的な実験室リスク因子の多くは、単独で使用しかつＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの多数の生物マーカーパネルのメンバーとしてではない状態で使用する場合、個々の正常な被験体、転移性事象を有するリスクにある被験体、および癌を有する被験体を、選択された一般集団において互いに信頼性をもって区別する際に、ほとんどまたは全く臨床的な用途がなく、したがって、これら３つの状態の間で任意の被験体を分類するのに、単独で信頼性をもって使用することができない。これら集団のそれぞれにおいて、十分に行われた研究で一般に生じるように、それらの平均測定値に統計的に有意な差がある場合であっても、そのような生物マーカーは、個々の被験体に対するそれらの適用可能性を制約し続ける可能性があり、その被験体に関する診断または予後予測にほとんど寄与しない。統計的有意性の一般的尺度は、観察が偶然によってのみ引き起こされた可能性を示すｐ値であり；好ましくは、そのようなｐ値は０．０５以下であり、問題の観察が偶然によって生じた機会が５％以下であることを表す。そのようなｐ値は、行われた研究のパワーに著しく依存する。
【０１２１】
この個々のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ性能と、伝統的な臨床パラメータおよび２〜３個の伝統的な実験室危険因子だけを組み合わせる式の一般的な性能とにも関わらず、本発明は、２個以上のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのある特定の組合せを、１つまたは複数の生理学的または生物学的経路に関与することが公知であるＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの組合せを含んだ多数の生物マーカーパネルとして使用することもでき、また、そのような情報を組み合わせて、個々のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを超えた組合せの性能特性を組み合わせかつ多くの場合はその性能特性を拡張する、統計的分類アルゴリズムおよびその他を含めた様々な式の使用を通して臨床的に有用なものにできることに留意した。これら特定の組合せは、許容可能なレベルの診断精度を示し、多数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴからの十分な情報が導かれた式と組み合わされた場合、１つの集団から別の集団へと移すことが可能な高レベルの診断精度が、信頼性をもってしばしば実現される。
【０１２２】
２個よりも少ない特定のまたはより低い性能のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを、意図される徴候に向けて新規なおよびより有用な組合せへとどのように組み合わせるかという一般概念は、本発明の重要な態様である。多数の生物マーカーは、しばしば、適正な数学的および臨床的アルゴリズムが使用される場合、個々の構成要素よりも良好な性能をもたらすことができ；これは、感受性および特異性の両方でしばしば明らかであり、より大きなＡＵＣをもたらす。第２に、既存の生物マーカーには、改善されたレベルの感受性または特異性を新しい式を通して実現するために必要であったように、新規な感知できない情報がしばしば存在する。この隠された情報は、次善の臨床性能を独自に有すると一般に見なされる生物マーカーの場合であっても、有効になり得る。事実、単独で測定された単一の生物マーカーに対する高偽陽性率に関する次善の性能は、一部の重要な追加の情報が、第２の生物マーカーおよび数式との組合せが存在しないことが明らかではない生物マーカーの結果の情報内に含まれる指標になり得ると考えられる。
【０１２３】
当技術分野で公知のいくつかの統計的およびモデリングアルゴリズムを使用して、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの選択を支援すると共に、これらの選択を組み合わせたアルゴリズムを最適化することができる。因子および交差生物マーカー相関／共分散分析などの統計的ツールは、パネル構造へのより合理的なアプローチを可能にする。ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ間のＥｕｃｌｉｄｅａｎ標準化距離を示す、数学的クラスタリングおよび分類木は、有利に使用することができる。そのような統計的分類技法の、経路によって知らされた播種は、特定の経路または生理学的機能の全体への寄与を基にした個々のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの選択に基づく合理的な手法となり得るので、用いてもよい。
【０１２４】
最終的に、統計的分類アルゴリズムなどの式は、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴを選択するためにかつ多数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴからの結果を単一指標へと組み合わせるのに必要な最適な式を作成し導き出すために、直接使用することができる。しばしば、前進的（０ポテンシャル説明パラメータ）および後退的選択（全ての利用可能なポテンシャル説明パラメータ）などの技法が使用され、ＡＩＣまたはＢＩＣなどの情報基準は、パネルの性能および診断精度と使用されるＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの数との間のトレードオフを定量するのに使用される。前進的または後退的選択パネルにおける個々のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの位置は、そのアルゴリズム用の漸増的情報内容の提供に密接に関連付けることができ、したがって、寄与のオーダーは、パネル内のその他の構成要素であるＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴに非常に依存している。
【０１２５】
臨床アルゴリズムの構築
任意の式を使用して、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの結果を組み合わせて、本発明の実行に有用な指標となすことができる。上記したように、そのような指標は、種々のその他の指示のうちとりわけ、ある疾患状況が別の疾患状況へ変換する確率、尤度、絶対的もしくは相対的なリスク、時間もしくは速度を示してもよく、または転移性疾患の将来の生物マーカーの測定値を予測してもよいが、これらに限定されない。これは、特定の期間もしくは範囲について、または残りの生涯リスクについてであってもよく、あるいは単に別の基準被験体集団と比べた指標として提供してもよい。
【０１２６】
種々の好ましい式を本明細書に記載するが、本明細書および上記の定義において言及するもの以外のいくつかのその他のモデルおよび式の型が、当業者には周知である。使用される実際のモデルの型または式自体は、トレーニング集団におけるその結果の性能および診断の精度の特徴に基づいて、見込みがあるモデルの領域から選択され得る。その式自体の詳細は通常、関連のあるトレーニング集団におけるＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの結果から得ることができる。その他の用途のうちとりわけ、そのような式によって、一連の被験体クラスへの、１つまたは複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのインプットから得られた（例えば、被験体が、正常なクラス、転移性事象を有するリスクがあるクラス、癌を有するリスクがあるクラスの一員であることを予測するのに有用である）フィーチャーの空間を位置付けて、ベイズのアプローチを使用してリスクの確率関数の推定値（例えば、癌もしくは転移性事象のリスク）を得ること、またはクラス条件付き確率を推定し、次いで、先の場合と同様に、ベイズの規則を使用してクラスの確率関数を求めることを意図することができる。
【０１２７】
好ましい式には、広いクラスの統計学的分類アルゴリズム、特に、判別分析の使用がある。判別分析の目標は、以前に同定されたフィーチャーのセットから、クラスの一員であることを予測することである。線形判別分析（ＬＤＡ）の場合、いくつかの判断基準による群間における分離を最大化するフィーチャーの線形の組合せを同定する。異なる閾値を用いる、固有遺伝子（ｅｉｇｅｎｇｅｎｅ）に基づいたアプローチを使用するＬＤＡ（ＥＬＤＡ）、または多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）に基づいた踏み石アルゴリズムのために、フィーチャーを同定することができる。ホテリング−ローリーの統計量に基づいて非分離の確率を最小化する前向きアルゴリズム、後向きアルゴリズムおよびステップワイズアルゴリズムを実施することができる。
【０１２８】
固有遺伝子に基づいた線形判別分析（ＥＬＤＡ）は、Ｓｈｅｎら、（２００６年）によって開発された、フィーチャーを選択する技法である。この式は、改変された固有値解析（ｅｉｇｅｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、多変量のフレームワーク中のフィーチャー（例えば、生物マーカー）を選択して、最も重要な固有ベクター（ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ）と関連性があるフィーチャーを同定する。「重要な」は、何らかの閾値と比べて分類しようとするサンプル間における差の最大の分散を説明する固有ベクターと定義される。
【０１２９】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、２つのクラスを分離する超平面を見出そうとする分類式である。この超平面は、サポートベクター、すなわち、この超平面からまさしくマージンの距離だけ離れているデータ点を含有する。現在のデータ寸法では分離超表面が存在しそうにない事象においては、元々の変数の非線形関数をとることにより、データをより大きな寸法に投影することによって、次元を大きく拡大する（ＶｅｎａｂｌｅｓおよびＲｉｐｌｅｙ、２００２年）。必要ではないが、ＳＶＭのためのフィーチャーにフィルターをかけることによってしばしば、予測が改善される。最も良好な一変量のフィーチャーを選択するために非パラメトリックなクラスカル−ワリス（ＫＷ）検定を使用して、サポートベクターマシンためのフィーチャー（例えば、バイオマーカー）を同定することができる。また、ランダムフォレスト（ＲＦ、Ｂｒｅｉｍａｎ、２００１年）または再帰分割（ＲＰＡＲＴ、Ｂｒｅｉｍａｎら、１９８４年）も別個にまたは組み合わせて使用して、最も重要である生物マーカーの組合せを同定することができる。ＫＷおよびＲＦの両方では、全フィーチャーからいくつかのフィーチャーを選択する必要がある。ＲＰＡＲＴは、利用可能な生物マーカーのサブセットを使用して、単一の分類木を生み出す。
【０１３０】
予測式に当てはめる前に、個々のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの測定値の結果に前処理をして、より貴重な形態の情報となすために、その他の式を使用することができる。最も注目すべきは、対数関数またはロジスティック関数等のいずれかの通常の数学的変換を使用して、生物マーカーの結果を、集団の平均値等に関して、正規またはその他の分布状態として正規化することはいずれも当業者には周知である。特に興味深いのは、年齢、性別（ｇｅｎｄｅｒ）、人種または性（ｓｅｘ）等の臨床パラメータに基づいた一連の正規化であり、特定の式が、あるクラスに属する被験体に対してもっぱら使用されるか、または臨床パラメータをインプットとして連続的に組み合わせる。その他の場合には、分析対象に基づいた生物マーカーを組み合わせて、計算した変数となし、これらを、それに続いて、式に当てはめる。
【０１３１】
正規化される見込みがある一被験体の個々のパラメータ値に加えて、Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏら、（２００１年）ＪＡＭＡ  ２８６巻：１８０〜１８７頁に概要が述べられている技法、またはその他の類似の正規化および再較正の技法に従って、全ての被験体または任意の公知のクラスの被験体についての全体的な予測式自体を、再較正するかまたは別の場合には集団の予想有病率および平均生物マーカーパラメータ値についての調整に基づいて調整することができる。そのような疫学的調整統計量は、モデルに当てはめる過去のデータの登録簿によって、連続的に捕捉、確認、改善およびアップデートすることができ、これらのデータは、機械可読性であってもよく、もしくはそうではなくてもよく、またはこれらの統計量の補足、確認、改善およびアップデートは時には、保管サンプルの遡及的クエリーもしくはそのようなパラメータおよび統計量の過去の研究を参照することによって行ってもよい。式の再較正またはその他の調整の対象であり得る追加の例として、オッズ比の限界についてのＰｅｐｅ，  Ｍ．Ｓ．ら、２００４年による研究；ＲＯＣ曲線に関するＣｏｏｋ，  Ｎ．Ｒ．、２００７年による研究において使用されている統計量が挙げられる。最後に、絶対的なリスクに対して較正し、分類子またはリスクの式の各種の数値結果についての信頼区間を提供するために、実際の臨床集団ならびに研究結果および観察されたエンドポイントを参照することにより、分類子の式自体の数値結果を処理後に変換することができる。この例が、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のＯｎｃｏｔｙｐｅ  Ｄｘ製品における再発スコアの式のアウトプットに関して選ばれた実際の臨床研究を使用して得られた絶対的なリスクの提示、およびそのリスクについての信頼区間である。さらなる改変は、分類子またはリスクの式のアウトプットに基づき、年齢または性等のそれらの臨床パラメータによって定義かつ選択された、研究のより小さな亜集団についての調整である。
【０１３２】
臨床パラメータとの組合せ、および伝統的な実験室リスク因子
本発明の実行に際しては、上記の臨床パラメータのうちのいずれかを、ある式へのＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのインプットとして、または特定のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのパネルおよび式を使用して測定しようとする関連のある集団を定義する事前選択の判断基準として使用することができる。また、上記で注目したように、臨床パラメータは、生物マーカーの正規化および前処理において、またはＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの選択、パネルの構築、式の型の選択および誘導、ならびに式の結果の後処理においても有用な場合がある。伝統的な実験室リスク因子についても、ある式へのインプットまたは事前選択の判断基準のいずれかとして、類似アプローチをとることができる。
【０１３３】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの測定
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのレベルまたは量の実際の測定値を、タンパク質または核酸のレベルにおいて、当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定することができる。例えば、核酸レベルにおいては、これらの配列のうちの１つまたは複数を特異的に認識するプローブを使用するノーザンハイブリダイゼーション解析およびサザンハイブリダイゼーション解析、ならびにリボヌクレアーゼプロテクションアッセイを使用して、遺伝子発現を決定することができる。あるいは、例えば、遺伝子の示差的に発現した配列に対して特異的なプライマーを使用する逆転写に基づいたＰＣＲアッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、またはＰａｎｏｍｉｅｓ，Ｉｎｃ．による、分枝鎖ＲＮＡを増幅および検出する方法によって、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を測定することもできる。また、タンパク質レベルにおいても、例えば、本明細書に記載する遺伝子産物がコードするペプチドのレベルを測定することによって、またはそれらの細胞内における局在化もしくは活性を、例えば、ＡＱＵＡ等の技術プラットフォームを使用して測定することによって、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量を決定することができる。そのような方法は、当技術分野では周知であり、そのような方法として、例えば、遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体に基づいたイムノアッセイ、アプタマー、または分子インプリントが挙げられる。任意の生物学的な材料を、タンパク質またはその活性の検出／定量化のために使用することができる。あるいは、適切な方法を選択して、分析した各タンパク質の活性によって、マーカー遺伝子がコードするタンパク質の活性を決定することもできる。
【０１３４】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴであるタンパク質、ポリペプチド、突然変異およびそれらの多型を、任意の適切な様式で検出することができるが、典型的には、被験体由来のサンプルを、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴであるタンパク質、ポリペプチド、突然変異または多型に結合する抗体と接触させ、次いで、反応産物の有無を検出することによって検出する。抗体は、上記で詳細に論じたように、前述の抗体のモノクローナル、ポリクローナル、キメラまたは断片であってよく、反応産物を検出するステップは、任意の適切なイムノアッセイを用いて実施することができる。被験体由来のサンプルは典型的には、上記したように、生物学的液体であり、上記の方法を実施するために使用した生物学的液体と同じサンプルであってよい。
【０１３５】
本発明に従って実施するイムノアッセイは、均一アッセイであっても、または不均一アッセイであってもよい。均一アッセイの場合、免疫学的反応は通常、特異的抗体（例えば、抗ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴタンパク質抗体）、標識された分析対象、目的のサンプルを含む。抗体が標識された分析対象に結合すると、標識から発生するシグナルが直接的または間接的に改変される。免疫学的反応およびその程度の検出の両方を、均一溶液中で実施することができる。利用することができる免疫化学標識には、フリーラジカル、放射性同位体、蛍光染料、酵素、バクテリオファージまたは補酵素がある。
【０１３６】
不均一アッセイのアプローチの場合、試薬は通常、サンプル、抗体および検出可能なシグナルを発生させるための手段である。上記のサンプルを使用することができる。抗体を、ビーズ（プロテインＡおよびプロテインＧのアガロースビーズ等）、プレートまたはスライド等の支持体上に固定化し、液相中で、抗原を含有することが疑われる検体と接触させることができる。次いで、支持体を液相から分離し、支持相または液相のいずれかを検出可能なシグナルについて、そのようなシグナルを発生させるための手段を利用して調べる。シグナルは、サンプル中の分析対象の存在と関係がある。検出可能なシグナルを発生させるための手段は、放射性標識、蛍光標識または酵素標識の使用を含む。例えば、検出すべき抗原が、第２の結合部位を含有する場合、その部位に結合する抗体を、検出可能な基にコンジュゲートさせ、分離ステップの前に、液相の反応溶液に添加することができる。固体の支持体上の検出可能な基の存在によって、試験サンプル中の抗原の存在が示される。適切なイムノアッセイの例は、オリゴヌクレオチド、免疫ブロット、免疫蛍光法、免疫沈降、化学発光法、電気化学発光（ＥＣＬ）または酵素結合免疫アッセイである。
【０１３７】
当業者であれば、本明細書に開示する方法を実施するのに有用であり得る多数の特異的なイムノアッセイのフォーマットおよびそれらの変更形態に精通しているであろう。一般に、Ｅ．  Ｍａｇｇｉｏ、Ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、（１９８０年）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．）を参照されたい。また、Ｓｋｏｌｄらに対する米国特許第４，７２７，０２２号、標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｆｏｒｒｅｓｔらに対する米国特許第４，６５９，６７８号、標題「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｄａｖｉｄらに対する米国特許第４，３７６，１１０、標題「Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｌｉｔｍａｎらに対する米国特許第４，２７５，１４９号、標題「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｓｓａｙｓ」、Ｍａｇｇｉｏらに対する米国特許第４，２３３，４０２号、標題「Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ」、およびＢｏｇｕｓｌａｓｋｉらに対する米国特許第４，２３０，７６７号、標題「Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  ａｓ  Ｌａｂｅｌ」も参照されたい。
【０１３８】
受動結合等の公知の技法に従って、抗体を、診断アッセイに適した固体の支持体（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧのアガロース等のビーズ、ラテックスまたはポリスチレン等の材料から形成されたマイクロスフェア、プレート、スライドまたはウエル）にコンジュゲートさせることができる。同様に、公知の技法に従って、本明細書に記載する抗体を、検出可能な標識または基、例として、放射標識（例えば、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、および蛍光標識（例えば、フルオレセイン、Ａｌｅｘａ、緑色蛍光タンパク質、ローダミン）にコンジュゲートさせることもできる。
【０１３９】
また、抗体は、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴであるタンパク質、ポリペプチド、突然変異および多型の翻訳後修飾、例として、チロシンリン酸化、スレオニンリン酸化、セリンリン酸化、グリコシル化（例えば、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ）を検出するのに有用な場合もある。そのような抗体は、１つまたは複数の目的のタンパク質中のリン酸化されたアミノ酸を特異的に検出し、本明細書に記載するイムノブロット、免疫蛍光法およびＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用され得る。これらの抗体は、当業者には周知であり、市販されている。また、翻訳後修飾は、反射マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析（ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）における準安定イオンを使用して決定することもできる（Ｗｉｒｔｈ，  Ｕ．ら（２００２年）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２巻（１０号）：１４４５〜５１頁）。
【０１４０】
酵素活性を示すことが知られているＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのタンパク質、ポリペプチド、突然変異および多型については、インビトロにおいて当技術分野で公知の酵素アッセイを使用して、それらの活性を決定することができる。そのようなアッセイとして、多くの中でもとりわけ、キナーゼアッセイ、ホスファターゼアッセイ、レダクターゼアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。公知のアルゴリズム、例として、ヒルプロット、ミカエリス−メンテン式、ラインウィーバー−バーク解析等の線形回帰プロット、およびスキャッチャードプロットを使用して速度定数ＫＭを測定することによって、酵素活性の動態調節を決定することができる。
【０１４１】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの配列についてのデータベースエントリーによって提供される配列情報を使用し、当業者に周知の技法を使用して、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの配列の発現を、（それらが存在する場合）検出し、測定することができる。例えば、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの配列に対応する、配列データベースエントリーに属する配列、または本明細書に開示する配列に属する配列を使用して、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析または特定の核酸配列を特異的にかつ好ましくは定量的に増幅する方法においてＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのＲＮＡ配列を検出するためのプローブを構築することができる。別の例として、これらの配列を使用して、例えば、増幅に基づいた検出方法、例として、逆転写に基づいたポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）においてＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの配列を特異的に増幅するためのプライマーを構築することもできる。遺伝子発現の変化に、遺伝子の増幅、欠失、多型および突然変異が伴う場合、試験集団と基準集団とでの配列比較を、試験細胞集団および基準細胞集団において調べたＤＮＡ配列の相対的な量を比較することによって行うことができる。
【０１４２】
本明細書に開示する遺伝子の発現を、当技術分野で公知の任意の方法を使用してＲＮＡレベルで測定することができる。例えば、これらの配列のうちの１つまたは複数を特異的に認識するプローブを使用するノーザンハイブリダイゼーション解析を使用して、遺伝子の発現を決定することができる。あるいは、例えば、示差的に発現した配列に対して特異的なプライマーを使用する逆転写に基づいたＰＣＲアッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、発現を測定することもできる。また、例えば、その他の標的増幅の方法（例えば、ＴＭＡ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ）、またはシグナル増幅の方法（例えば、ｂＤＮＡ）等を使用して、ＲＮＡを定量化することもできる。
【０１４３】
あるいは、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴのタンパク質および核酸の代謝産物を測定することもできる。用語「代謝産物」は、代謝過程の任意の化学的または生化学的な産物、例として、生物学的分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物または脂質）のプロセシング、切断または消費によって産生された任意の化合物を含む。代謝産物は、当業者に公知の多様な方法で検出することができ、それらには、屈折率分光法（ＲＩ）、紫外分光法（ＵＶ）、蛍光分析、放射化学分析、近赤外分光法（ｎｅａｒ−ＩＲ）、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、光散乱分析（ＬＳ）、質量分析、熱分解質量分析、比濁分析、分散型ラマン分光法、質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー、質量分析と組み合わせたマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、質量分析と組み合わせたイオンスプレー分光法、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、およびＩＲ検出がある。（ＷＯ０４／０５６４５６およびＷＯ０４／０８８３０９を参照されたい。これらは、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている。）この点に関しては、上記で言及した検出方法、または当業者に公知のその他の方法を使用して、その他のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの分析対象を測定することができる。例えば、サンプル中の循環カルシウムイオン（Ｃａ２＋）を、蛍光染料、例として、Ｆｌｕｏシリーズ、とりわけ、Ｆｕｒａ−２Ａ、Ｒｈｏｄ−２を使用して検出することができる。その他のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの代謝産物も同様に、そのような代謝産物を検出するために特異的に設計または手直しした試薬を使用して検出することができる。
【０１４４】
キット
また、本発明は、キットの形態として一緒に包装されたＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの検出試薬、例えば、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ核酸の一部に対して相補性を示す相同な核酸配列、例として、オリゴヌクレオチド配列を有することによって、１つまたは複数のＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ核酸を特異的に同定する核酸、またはＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ核酸がコードするタンパク質に対する抗体も含む。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ遺伝子の断片であってよい。例えば、これらのオリゴヌクレオチドは、２００、１５０、１００、５０、２５または１０ヌクレオチド長以下であってよい。キットは、別個の容器中に、核酸または抗体（固体のマトリックスにすでに結合しているか、またはそれらをマトリックスに結合させる試薬が別個に包装されているかのいずれか）、（正および／もしくは負の）対照処方、ならびに／または検出可能な標識、例として、とりわけ、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、シアニン染料、Ａｌｅｘａ染料、ルシフェラーゼ、放射標識を含有することができる。アッセイを実施するための指示（例えば、書類、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を、キット中に含めることができる。アッセイは、例えば、当技術分野で公知のノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチＥＬＩＳＡの形態であってよい。
【０１４５】
例えば、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの検出試薬を、多孔性条片等の固体のマトリックス上に固定化して、少なくとも１つのＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの検出部位を形成することができる。多孔性条片の測定または検出の領域は、核酸を含有する複数の部位を含むことができる。また、試験条片は、負および／または正の対照のための部位も含有することができる。あるいは、対照部位を、試験条片とは別個の条片上に設けてもよい。場合により、異なる検出部位が、異なる量の固定化核酸、例えば、第１の検出部位においてはより多い量を、かつそれに続く部位ではより少ない量を含有してもよい。試験サンプルを添加すると、検出可能なシグナルを示す部位の数によって、サンプル中に存在するＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの量の定量的な指示が得られる。検出部位は、任意の適切に検出可能な形状に構成することができるが、典型的には、試験条片の幅にわたる棒状または点状の形状をとる。
【０１４６】
あるいは、キットは、１つまたは複数の核酸配列を含む核酸基板アレイを含有する。アレイ上の核酸は、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３６０によって示される１つまたは複数の核酸配列を特異的に同定する。種々の実施形態では、ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１〜３６０によって示される配列のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、４０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０または２７５個以上の発現を、アレイに対する結合によって同定することができる。基板アレイは、例えば、固体の基板、例えば、米国特許第５，７４４，３０５号に記載されている「チップ」であってよい。あるいは、基板アレイは、溶液アレイ、例えば、ｘＭＡＰ（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、Ｃｙｖｅｒａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＣｅｌｌＣａｒｄ（Ｖｉｔｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ’Ｍｏｓａｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）であってもよい。
【０１４７】
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴの検出のための抗体の適切な供給元として、例えば、Ａｂａｚｙｍｅ、Ａｂｎｏｖａ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐ、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｂｉｏｓｅｎｓｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃｙｔｏｌａｂ、ＤＡＫＯ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＧｌｏｂｏＺｙｍｅｓ、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ、Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ、Ｂｉｏｇｅｎｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＫＭＩ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｋｏｍａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＬａｂＦｒｏｎｔｉｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌｅｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｉｆｅｓｃｒｃｅｎ、Ｍａｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｍｅｄｉｃｌｏｎｅ、ＭｉｃｒｏＰｈａｒｍ  Ｌｔｄ．、ＭｏｄｉＱｕｅｓｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｎｅｏｃｌｏｎｅ、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｏｒｂｉｇｅｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｎｖｅｒａ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｏｌｙｍｕｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｏｌｙｓｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｐｒｏｍｃｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ、Ｐｒｏｔｏｓ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｃａｒｃｈ、ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｂｏｓｃｒｅｅｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ、Ｔｅｃｈｎｏｐｈａｒｍ、Ｔｅｒｒａ  Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｔｒｉｌｌｉｕｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、およびＺｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ等の商業的な供給元が挙げられる。しかし、当業者であれば、表１のＤＥＴＥ���ＭＩＮＡＮＴのうちのいずれかに対する抗体、核酸プローブ、例えば、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを日常的に作製することができる。
【実施例】
【０１４８】
（実施例１）
一般的な方法
トランスジェニックマウスおよび原発性腫瘍
リバーステトラサイクリントランス活性化因子、Ｔｅｔプロモーター、およびチロシナーゼエンハンサー／プロモーター導入遺伝子を、（Ｇａｎｓｓ，  Ｍｏｎｔｏｌｉｕら  １９９４年；Ｃｈｉｎ，  Ｐｏｍｃｒａｎｔｚら  １９９７年；Ｃｈｉｎ，  Ｔａｍら  １９９９年）の記載に従って使用した。マウスｃ−Ｍｅｔ  ｃＤＮＡ（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｆ  Ｖａｎｄｅ−Ｗｏｕｄｅ、Ｇｒａｎｄ  Ｒａｐｉｄｓ、ＭＩにより寄贈された）を、（Ｃｈｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  １９９９年）の記載に準じて、Ｔｅｔプロモーターの制御下でクローニングした。複数の導入遺伝子樹立系統を、予想される頻度で得た。明確に定義された活性化因子系統（Ｔｙｒ／ｒｔＴＡ、系統３７、Ｃｈｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  １９９９年）ならびに３つの独立したレポーター系統（Ｍｅｔ１５、Ｍｅｔ２８およびＭｅｔ４０）を、これらの研究のために使用した。
【０１４９】
インビボにおける導入遺伝子の発現を活性化するために、離乳年齢のＭＥＴトランスジェニックマウスに、飲料水からドキシサイクリンを与え（２μｇ／ｍｌ、スクロース水中）、自発的な腫瘍の発生について観察した。サブセットの動物（３週齢）にａｖｅｒｔｉｎ（０．５ｇ／ｋｇ体重）を用いて腹腔内麻酔を施し、背部に２０ｍｍの長方形の創傷を設け、続いて縫合した。動物を、腫瘍の発生、または健康不良の出現について２週に１回観察した。瀕死状態に近い動物または腫瘍の負担を顕著に示す動物を屠殺し、続いて、詳細な剖検を行った。（Ｃｈｉｎ，  Ｌ．ら  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ、１９９７年）の以前の記載に従って、組織学的解析のために、腫瘍検体を１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋した。十分な検体が入手可能である場合には、原発性腫瘍を急速冷凍して、それに続く解析に供し、細胞系を生成した。
【０１５０】
細胞培養。メラノーマ細胞系を、マウス腫瘍から、コラーゲナーゼ＋ヒアルロニダーゼ（２ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を用いて２時間消化し、続いて、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて培養することによって得た。メラニン形成細胞培養物を、記載１０に従って新生仔マウスの表皮から生成し、５％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２００ｐＭコレラ毒素、２００ｎＭ  １２−Ｏテトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）を含有するＲＰＭＩ１６４０中に維持した。トランスジェニックｃ−Ｍｅｔ発現を、培養細胞中で、２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを添加することによって誘導した。Ｍ３  ＢＲＡＦメラニン形成細胞、ＨＭＥＬ４６８予備刺激メラニン形成細胞、ＷＭ３２１１およびＷＭ１１５を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０中に維持した。ＨＭＥＬ４６８は、Ｇａｒｒａｗａｙら１１に記載されているように、ＰＭＥＬ／ｈＴＥＲＴ／ＣＤＫ４（Ｒ２４Ｃ）／ｐ５３ＤＤ／ＢＲＡＦＶ６００Ｅ細胞のサブクローンを同定する。
【０１５１】
組織学的解析および免疫組織化学的染色。マウスを機関のガイドラインに従って屠殺し、臓器を１０％緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン包埋した。病変の分類および腫瘍転移の検出を可能にするために、組織切片を、Ｈ＆Ｅを用いて染色した。ｃ−Ｍｅｔタンパク質を検出し、その活性化の状況を決定するために、腫瘍サンプルを、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製の全ｃ−Ｍｅｔ抗体およびリン酸ｃ−Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１３４９）抗体を用いて免疫染色した。腫瘍は、Ｓｉｇｍａ製のＳ１００抗体を用いて免疫染色した。
【０１５２】
ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム定量的ＰＣＲによる遺伝子発現。遺伝子発現を解析するために、全ＲＮＡを、原発性皮膚黒色腫または培養細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、製造元のプロトコールに従って単離した。全ＲＮＡを、ＲＱ１デオキシリボヌクレアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理し、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして用い、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する逆転写反応のために、１μｇの全ＲＮＡを使用した。コード領域を、ＰＣＲ、またはＭｘ３０００ＰリアルタイムＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上でのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する定量的リアルタイムＰＣＲにより増幅した。リボソームタンパク質Ｒ１５を、内部発現対照として使用した。プライマー配列を以下に示す：
【０１５３】
【化１】
2011526693.tif 000011
ＳＭＡＤ３プライマーは、Ｓｕｐｅｒａｒｒａｙ製であった。
【０１５４】
遺伝子発現プロファイリングおよびデータ解析。Ｍｅｔ誘導型およびＨＲａｓ誘導型のマウス腫瘍ＲＮＡを、上記の記載に従って抽出し、標識し、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０  Ａｒｒａｙに製造元のプロトコールに従ってハイブリダイズさせた。発現データを、Ｒ／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ（ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）を使用して処理した。解析を、記載１２に従って実施した。手短に述べると、バックグラウンドの補正方法はＭＡＳ（ｖ４．５）であり、正規化の方法は一定とし、ＰＭの調整方法はＭＡＳ（ｖ５）であり、発現値の略式は中央値分散分析（ＲＭＡ）であった。Ｐ／Ｍ／Ａ呼び出し方法はＭＡＳ５であった。全部で１２個の腫瘍サンプルのうち、少なくとも２つの現在の呼び出しを有するプローブセット（１６，４３４個のプローブセット）を、６つのｉＭｅｔ腫瘍と６つのｉＨＲａｓ腫瘍との間におけるさらなる示差的発現解析のために選択した。Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ＳＡＭ  ２．０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｔａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／〜ｔｉｂｓ／ＳＡＭ／）を、示差的発現解析のために使用した１３。２つのクラスの対応のない標本の解析を実施し、続いて、最小２倍の変化についてフィルターをかけ、誤検出率が０．０５未満となるようにデルタ値を調整した。ＧＦＰまたはＨＯＸＡ１のいずれかを形質導入した細胞（ＨＭＥＬ４６８、ＷＭ１１５、ＷＭ３２１１）から抽出し、続いて、標識したｃＤＮＡを、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０に製造元のプロトコールに従ってハイブリダイズさせて、上記のＳＡＭにより、ＨＯＸＡ１誘導性転写の解析を実施した。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して、転移性メラノーマ中において顕著に調節されている細胞の機能および経路をさらに解析した。
【０１５５】
マウス遺伝子発現とヒトアレイＣＧＨデータとの比較。（上記した）マウス腫瘍の発現解析から得た非冗長性の示差的発現プローブセットを、アレイ−ＣＧＨ（ＧＥＯアクセッション番号ＧＳＥ７６０６）によって同定されたヒト転移性メラノーマ中においてコピー数異常を示したヒトオルソログに位置付けた。相同遺伝子（ｈｏｍｏｌｏｇｅｎｅ）データベース（ＮＣＢ１）を使用して、ｉＭｅｔ腫瘍対ｉＲａｓ腫瘍において示差的に発現した遺伝子について、オルソロガスなヒト遺伝子を同定した。（ｉＲａｓ腫瘍と比べて）ｉＭｅｔ腫瘍中において上方制御または下方制御され、ヒトでの転移においてそれぞれ増幅または欠失している遺伝子を選択した。
【０１５６】
目的変数なしのクラスター化およびカプラン−マイヤーの生存解析。転移性決定因子の発現プロファイルを使用して、Ｒを使用するＫ平均法クラスター化（ｈｔｔｐ；／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｅｔ．ｏｒｇ／）により、２９５個の乳腺腫瘍１４；１５を２つの群にクラスター化した。これら２つのクラスター化された群についてのカプラン−マイヤーの生存解析を、Ｒにおける生存パッケージを使用して実施し、Ｐ値を、Ｒにおける生存統計パッケージを使用して計算した。
【０１５７】
ＤＮＡ構築物および低複雑度ライブラリー。ｐＲｅｔｒｏｓｕｐｅｒＳｍａｄ３およびｐ３ＴＰＬｕｘは、Ａｄｄｇｅｎｅ製であった（それぞれ、１５７２６番および１１７６７番）。低複雑度ｃＤＮＡライブラリーのために、１９９個の遺伝子に相当する２３０個のｃＤＮＡを、ＯＲＦｅｏｍｅコレクション（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手し、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５  ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＧａｔｅｗａｙ組換えにより、製造元の提案に従って高スループットに導入した。浸潤スクリーニングにおいて良好なスコアを示した候補ｃＤＮＡは、Ｖ５エピトープを使用して配列および発現を確かめ、同種のクローン調製物を、全ての浸潤検証研究のために使用した。
【０１５８】
９６ウエル上でのウイルスの産生、形質導入およびトランスウエル浸潤アッセイ。９６ウエルの平底プレート中、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（抗菌性）中に、各ウエルにつき、１００μｌ中およそ３×１０４個の２９３Ｔ細胞を播種し、２４時間後（約９０％コンフルエント）にトランスフェクションを行った。各ウエルにおけるトランスフェクションのために、１５０ｎｇのウイルス骨格および１１０ｎｇのレンチウイルスパッケージングベクターを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１５μｌに希釈した。得られたベクターのミックスを、０．６μｌのＬｉｐｔｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ１５μｌと組合せ、室温で２０分間インキュベートし、２９３Ｔ細胞を覆う１００μｌの培地に添加した。トランスフェクションのおよそ１０時間後に、培地をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓで交換し、４回のウイルス上清の収集を、トランスフェクションの３６時間後から開始し、それらを組み合わせた。感染の２４時間前に９６ウエルの平底プレート中に播種した標的細胞（ＨＭＥＬ４６８）（７０〜８０％コンフルエント）に、８μｇ／ｍｌポリブレンを含有するウイルス上清１５０μｌを添加した。細胞を２回感染させ、第２の感染後、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ中で２４時間回復させ、その後、細胞をトリプシン処理し（ｔｒｙｐｓｉｚｅｄ）、９６ウエルの腫瘍浸潤プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に製造元の推奨に従って適用した。浸潤細胞を、４μＭ  Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してインビボにおいて標識して検出し、４９４／５１７ｎｍ（Ａｂｓ／Ｅｍ）における蛍光によって測定した。正のスコアを示す候補を、ベクター対照から２×標準偏差のスコアを示すものとして同定した。
【０１５９】
トランスウエル浸潤アッセイ。標準的な２４ウエル浸潤チャンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を活用して、浸潤性を、製造元の提案に従って評価した。手短に述べると、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳを用いて２回濯ぎ、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁させ、ＨＭＥＬ４６８は７．５×１０４細胞／ウエルで、ＷＭ３２１１は２．０×１０４で、ＷＭ１１５は５．０×１０４で播種した。チャンバーを、三つ組または四つ組で播種し、化学誘引物質としての１０％血清含有培地中に置き、さらに、インプット対照として、チャンバーを二つ組で細胞培養プレート中に置いた。２２時間のインキュベーション後に、チャンバーを１０％ホルマリン中に固定し、クリスタルバイオレットを用いて染色して、手作業で数えるか、またはＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ）を用いてピクセルの定量化を行った。細胞数の差について、データを、対照に対するインプット細胞について正規化した（添加対照）。ＨＯＸＡ１媒介型浸潤に対するＳＭＡＤ３のノックダウンを評価するために、ＳＭＡＤ３を標的にすることが検証されたｓｈＲＮＡ構築物（ｐＳＵＰＥＲ−ｓｈＳＭＡＤ３）、およびウイルスを、標準的なレトロウイルス産生プロトコールを使用して得た。浸潤を比較するために、並行して、対照細胞には、非標的ｓｈＲＮＡ（ｐＳＵＰＥＲ−ｓｈＮＴ）を形質導入した。
【０１６０】
異種移植研究および尾静脈注射研究。ＨＭＥＬ４６８細胞に、ＧＦＰウイルスまたはＨＯＸＡ１ウイルスのいずれかを安定に形質導入した。異種移植研究のために、細胞を、ＣＢ−ｌ７−ｓｃｉｄ（Ｃ．Ｂ−Ｉｇｈ−１ｂ／ｌｃｒＴａｃ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ；Ｔａｃｏｎｉｃ）マウスの両側腹部中に、１×１０６細胞／部位で皮下に移植した。肺への播種能力を評価するために、５．０×１０５個の細胞を、ＣＢ−１７−ｓｃｉｄマウスの尾静脈中に注射した。全ての動物を、腫瘍の発生についてモニタし、続いて、死体解剖および腫瘍の組織学的解析を行った。
【０１６１】
ＴＧＦβレポーターアッセイ。６ウエルプレート中に、細胞を、三つ組で、２×１０５細胞／ウエルで播種し、２４時間後に、ｐ３ＴＰＬｕｘレポーター（１μｇ／ウエル）および対照レポーター（Ｒｅｎｉｌｌａ、２０ｎｇ／ウエル）によるトランスフェクションを行った。２４時間のインキュベーション後、細胞を、ＴＧＦβ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて２４時間処理し、Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用してルシフェラーゼ解析（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造元のプロトコールに従って行って、ｆｉｒｅｆｌｙ／Ｒｅｎｉｌｌａの比によって示されるレポーターの活性化を得た。ｐ値を、両側Ｔ検定を使用して計算した。
【０１６２】
イムノブロット解析。細胞を、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて表示に従って処理し、続いて、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）および１×ホスファターゼ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００μＭ  ＥＤＴＡ、１００μＭ  ＥＧＴＡ、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１％デオキシコール酸ナトリウム）を使用して溶解させた。溶解用緩衝液中、４℃での３０分間のインキュベーション後、分離した全細胞抽出物を、１０ｋ、４℃で１０分間遠心分離することによって清澄化し、次いで、タンパク質濃度を、ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ）によって決定した。タンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離することによって可視化し、ＰＢＳ＋ツイーン−２０中の５％ミルクでブロックしたＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上にブロットし、次いで、表示する抗体と共にインキュベートした。以下の抗体を、イムノブロットのために使用した：ｐＳｍａｄ３および全Ｓｍａｄ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、アルファ−チューブリン（Ｓｉｇｍａ）、Ｖ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ホスホ−ＦＡＫ（ｐＹ３９７：ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０１６３】
Ｐａｎｏｍｉｃｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＲＮＡに基づいた発現アッセイ。タンパク質に基づいた発現解析の代替として、また、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｐｌｅｘ技術（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を活用して、ＰＤのＲＮＡ発現も評価した。配列ではなくレポーターシグナルを増幅することによって、ＲＮＡを検出および定量化するための独特のアプローチを提供するＱｕａｎｔｉＧｅｎｅプラットフォームは、分枝ＤＮＡ技術、すなわち、サンドイッチ核酸ハイブリダイゼーションアッセイに基づいている（Ｆｌａｇｅｌｌａ，  Ｍ．、Ｂｕｉ，  Ｓ．、Ｚｈｅｎｇ，  Ｚ．、Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｃ．Ｔ．、Ｚｈａｎｇ，  Ａ．、Ｐａｓｔｏｒ，  Ｌ．、Ｍａ．  Ｙ．、Ｙａｎｇ，  Ｗ．、Ｃｒａｗｆｏｒｄ，  Ｋ．Ｌ．、ＭｃＭａｓｔｅｒ，  Ｇ．Ｋ．ら（２００６年）Ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３５２巻、５０〜６０頁）。この技術によって、新鮮組織、凍結組織またはホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織のホモジネート中のＲＮＡ発現を定量的に確実に測定することができる（Ｋｎｕｄｓｅｎ，  Ｂ．Ｓ．、Ａｌｌｅｎ，  Ａ．Ｎ．、ＭｃＬｅｒｒａｎ，  Ｄ．Ｆ．、Ｖｅｓｓｅｌｌａ，  Ｒ．Ｉ、Ｋａｒａｄｅｍｏｓ，  Ｊ．、Ｄａｖｉｅｓ，  Ｊ．Ｅ．、Ｍａｑｓｏｄｉ，  Ｂ．、ＭｃＭａｓｔｅｒ，  Ｇ．Ｋ．およびＫｒｉｓｔａｌ，  Ａ．Ｒ（２００８年）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ＤＮＡ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  １０巻、１６９〜１７６頁）。図１７Ａに示すように、実現可能性パイロットから、ＦＦＰＥブロック中にある２１個のスピッツ母斑検体および２２個の悪性のメラノーマ検体中のＵＢＥ２ＣのＲＮＡ発現を確実に測定できることが示されている。各遺伝子の解析は、優れた再現性を達成し、変動係数（ＣＶ）の値は８〜９％の範囲であり、したがって、最高の品質管理基準を満たした。したがって、この方法は、入手可能な抗体がない目的の候補の発現パターンに関する最初の洞察を探り出すための理想的な代替方法を我々にもたらす。注目すべきことに、ＵＢＥ２ＣのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｐｌｅｘ解析は、ＵＢＥ２Ｃの発癌活性を示す結果を裏付けた。具体的には、我々は、古典的な同時形質転換アッセイを使用して、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠損初代マウス胚性線維芽細胞中において、ＵＢＥ２Ｃが活性化されたＨＲＡＳｖ１２と連携して、形質転換病巣の形成を増加させることを示している（図１７Ｂ）。
【０１６４】
他の箇所で詳細に記載したように、自動化定量的解析（ＡＱＵＡ（登録商標））によって、細胞内コンパートメント内部のタンパク質濃度の正確な測定が可能になる［Ｃａｍｐ，  Ｒ．Ｌ．、Ｃｈｕｎｇ，  Ｇ．Ｇ．およびＲｉｍｍ，  Ｄ．Ｌ．、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８巻（１１号）、１３２３〜１３２７頁（２００２年）］。手短に述べると、一連の高解像度の単色像を、ＰＭ−２０００顕微鏡によって撮影した。各薄片試料について、ＤＡＰＩ、サイトケラチンおよび一次抗体に特異的なシグナルからのシグナルを使用して、焦点が合っている像および焦点が合っていない像を得た。サイトケラチンとＳ１００とのシグナルから腫瘍「マスク」を生み出すことによって、腫瘍を、間質性および非間質性の要素とは区別した。これによって、薄片試料の目視検査によって設定した強度閾値に基づいた二成分マスク（各ピクセルが、「オン」または「オフ」のいずれかである）が生み出された。シグナル強度（０〜２５５の規模でスコア化した）を、特定のコンパートメントの面積で割ることによって、各細胞内コンパートメント中の目的のタンパク質のＡＱＵＡ（登録商標）のスコアを計算した。１スポット当たり５％未満の腫瘍面積を示す検体は、対応する腫瘍検体には相当しないことから、自動化定量的解析に含めなかった。
【０１６５】
（実施例２）
表現型から誘導した進化的に保存されている転移徴候の同定
ここでは、非常に異なる転移の可能性を有する遺伝子工学的に作製されたマウス（ＧＥＭ）モデルを、とりわけ、微小転移またはマクロ転移の記載および追跡期間に関する変数を含む、ヒト癌の解析に内在する当惑させられる不確実性を軽減するための１つの生物学的な系として使用した。活用した２つのマウスメラノーマモデルは、（ｉ）Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠損バックグラウンドにおいてチロシナーゼ誘導型のｒｔＴＡおよびｔｅｔ−Ｍｅｔの導入遺伝子から構成される新たに開発されたＭｅｔ誘導型ＧＥＭモデル（Ｔｙｒ−ｒｔＴＡ；Ｔｅｔ−Ｍｅｔ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−、以下、「ｉＭｅｔ」）、および（ｉｉ）以前に記載されているＨＲＡＳｖ１２Ｇ誘導型マウスメラノーマモデル（Ｔｙｒ−ｒｔＴＡ；Ｔｅｔ−ＨＲＡＳＶ１２Ｇ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−、以下、「ｉＨＲＡＳ＊」）１２であった。表現型の特徴付けから、７５％のｉＭｅｔマウスが、生検部位においてメラノーマを発症し、平均潜伏期間は１２週間であることが示されている。これらの腫瘍は、メラニン形成細胞マーカー陽性であり、リン酸活性化（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｍｅｔ受容体およびＨＧＦの発現を示す（図５Ａ〜Ｅ）；さらに、派生したｉＭｅｔメラノーマ細胞は、トランスウエルチャンバー浸潤アッセイにおいて、組換えＨＧＦに応答してロバストな浸潤活性を示す（図２Ａ）。ヒトにおける進行した転移性メラノーマ中のＨＧＦ−ＭＥＴシグナル伝達の活性化１３と同様、新規のトランスジェニック動物におけるｉＭｅｔメラノーマも、リンパ節に一様に転移し、それに加えて、それぞれヒトメラノーマの場合の転移性播種の一般的な部位である副腎および肺実質にも時には広がる（図２Ｂ）。この浸透性の高い転移性表現型は、非転移性の原発性皮膚黒色腫によって特徴付けられるｉＨＲＡＳ＊メラノーマモデル１２；１４とは著しく対照的である。尾静脈アッセイにおいて、原発性メラノーマから得られた細胞系のうち、ｉＨＲＡＳ＊ではなくｉＭｅｔが、肺に播種することができることが実証されたことによって、この対照的な転移の可能性が補強された（図２Ｃ）。
【０１６６】
ｉＨＲＡＳ＊とｉＭｅｔとの間の転移性傾向の疑いの余地のない差によって、ｉＨＲＡＳ＊モデルおよびｉＭｅｔモデルに由来する原発性皮膚黒色腫のトランスクリプトームの比較に基づいて表現型誘導型原発性腫瘍転移徴候を生成することが可能になった。＜０．０５の誤発見率で≧２倍の示差的発現を示す１５９７個のプローブセットから構成されるこのマウス転移徴候を、次には、（ｉ）ヒト転移性メラノーマにおいて、コピー数異常（ＣＮＡ）中に存在し、かつ／または（ｉｉ）ヒトの原発性メラノーマと転移性メラノーマとの間で示差的発現を示す、非常に多数の遺伝子と整合させて、２９５個の上方制御された／増幅している遺伝子と、６５個の下方制御された／欠失している遺伝子を得た（図３Ａ；表４）。これらの遺伝子から得られる生物学的活性の型に関する早期の洞察を探り出すために、我々は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、知識ベース経路解析を実施して、３６０個の遺伝子のリストについて、より大型の１５９７個のマウス転移徴候に対してフィルターをかけることによって、どの遺伝子機能が顕著なスコアを示すかを定義した。ＩＰＡの呼び出しの有意性を評価するために、我々は、同一サイズの無作為抽出リストを生成して、平行分析を行った。図３Ｂに示すように、我々は、マウス転移発現徴候が、この無作為抽出リストと比べて、ＤＮＡの複製および組換え、癌、細胞サイクル、ならびに細胞死に関与する遺伝子機能の何らの過剰描写を示すことを見出した。それと比較して、種間／プラットフォーム間でフィルターをかけたリストは、これらの同じ機能の著しくより強力な強化を示し、それに加えて、マウス発現徴候のみの場合には明らかでなかった新しい機能のネットワーク、すなわち、「細胞の集合および組織化」の出現も示した（図３Ｂ）。この比較から、表現型誘導型転移徴候と種間比較とにおける三角測量が、腫瘍の形成および転移のプロセスと強力につながる遺伝子ネットワークの強化に役立ち得ることが示唆された。
【０１６７】
（実施例３）
転移性ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴについての機能性遺伝子のスクリーニング
特に、癌細胞を広げる必須の能力である細胞の動きおよび浸潤との関連性を考えると、細胞の集合および組織化の遺伝子の強力な強化には勇気付けられた。この観察に刺激されて、我々は、浸潤を引き起こす遺伝子を同定するための低複雑度遺伝子スクリーニングを実行した（図３Ｃ）。さらに、これらのスクリーニングは、上方制御された遺伝子には治療の可能性が予想されることから、それらにもっぱら焦点を当てた。具体的には、２９５個の独特の上方制御された／増幅している候補のうちの１９９個に対応する２３０個の利用可能なＯＲＦ（表５）を、ヒトＯＲＦｅｏｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｈｏｒｆｄｂ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／）から入手し、レンチウイルスの発現系に導入して、ＨＭＥＬ４６８、すなわち、ＴＥＲＴ不死化初代ヒトメラニン形成細胞系１５に形質導入した。一次スクリーニングのために、我々は、９６ウエルのトランスウエル浸潤アッセイを活用し、蛍光定量的読取りを行って、マトリゲルを通るＨＭＥＬ４６８の遊走および浸潤を増強する、候補の決定因子遺伝子の能力を測定した。マトリゲルは、細胞外マトリックスを刺激する。負および正の対照として、ＧＦＰレンチウイルスおよびＮＥＤＤ９１６レンチウイルスをそれぞれ使用した。一次スクリーニングを２回繰り返し、ＧＦＰ対照から２標準偏差のスコアを再現性よく示した４５個の候補を、一次スクリーニングのヒットと見なした（図３Ｃ〜Ｄ）。次いで、これら４５個の一次ヒットの二次検証スクリーニングを、三つ組で、標準的な２４ウエルマトリゲルのトランスウエル浸潤チャンバーを使用して実施し、ＨＭＥＬ４６８メラニン形成細胞中で、浸潤を、ＧＦＰ対照と比較して、少なくとも１．５倍増強することができる２５個の遺伝子を得た（図３Ｅおよび表３）。さらにまた、関連の遺伝子またはこれら２５個の決定因子のうちの１つと複合することが知られている遺伝子も、機能アッセイに加えて、追加の６個の決定因子を同定した。
【０１６８】
（実施例４）
ヒトの原発性および転移性のメラノーマのＴＭＡにおける発現の進行相関性
転移決定因子の発現を、悪性メラノーマの進行と相関させるための努力において、我々は、ＡＱＵＡにより、（Ｃａｍｐ，  Ｒ．Ｌ．、Ｄｏｌｌｅｄ−Ｆｉｌｈａｒｔ，  Ｍ．、Ｋｉｎｇ，  Ｂ．Ｌ．およびＲｉｍｍ，  Ｄ．Ｌ．（２００３年）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｓｈｏｗｓ  ｔｈａｔ  ｂｏｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＨＥＲ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｏｕｔｃｏｍｅ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３巻、１４４５〜１４４８頁）の記載に従って、代表的な決定因子に対する市販されている抗体を使用して、良性母斑、原発性メラノーマおよびメラノーマ転移の検体を含有する組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）のＩＨＣ解析を実施した。表２、および図４Ａ〜Ｂの代表的なデータに要約されているように、ＢＲＲＮ１を除いて、全てのその他の試験した決定因子（ＨＳＦ１、ＭＣＭ７、ＨＯＸＡ１、ＦＳＣＮ１、ＡＣＰ５、ＵＢＦ２ＣおよびＫＮＴＣ２）が、原発性または転移対良性母斑では、有意により高い発現を示す。
【０１６９】
【表２】
2011526693.tif 000012
（実施例５）
転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは、非系列特異的であり、予後を示す
ゲノムの不安定性が腫瘍形成を引き起こして、共通の明確に異なる遺伝子プロファイルを示す、不均一な細胞亜集団から構成される原発性腫瘍を生み出すことは十分に確立されている。したがって、原発性腫瘍中の転移決定因子−発現の亜集団には増殖上の利点が与えられ、そうした亜集団が究極的に広がる場合、転移決定因子の発現が、より均一に派生した転移病変においては、強化されて現れることに起因して増加することは理にかなっている。そのような進行関連発現を評価するために、２５個の決定因子を、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ２４上の非常に多数の発現プロファイリングデータにおいて調べた。これら２５個の転移決定因子の大多数は以前には、腫瘍の進行に関係があると見なされたことがないにもかかわらず、転移性メラノーマにおいて原発性メラノーマと比べて発現の増加を示した７個の決定因子に加えて、これら２５個全てが、１つまたは複数の非メラノーマ固形腫瘍において進行相関性発現パターンを示した（表３）。例えば、９個の決定因子は、より高いグレードの神経膠腫において統計学的に有意な発現増加を示した。前立腺腺癌においては、転移決定因子のうちの９個が、原発性から転移への発現の有意な増加を示した。同様に、肺においても、５個が、腫瘍グレードの増加との相関性を示した。最も顕著なオーバーラップを、乳房腺癌について観察し、２５個の転移決定因子のうちの１２個が、腫瘍進行の段階またはグレードとの相関性を示した。
【０１７０】
次に、乳房腺癌プロファイルにおいて顕著なオーバーラップを得たことから、我々は、公開されている乳房における治療成果アノテートトランスクリプトームデータ５；６を使用して、これらの決定因子がより広く予後を示す可能性を探索した。乳癌トランスクリプトームデータセットは、これら２０個の転移決定因子のうちの１９個についてのプローブを含み、これらを徴候として使用して、Ｋ平均目的変数なしの分類アルゴリズムによって、２９５個の乳房腫瘍のコホートを階層化した（図５Ａ；表７）。得られたサブグループは、全体的生存（ｐ＝２．６−９）および無転移生存（ｐ＝２．１−６）において有意な差を示すことが見出された（図５Ｂ）。階層クラスタリングを使用して分類を実施した場合にも、類似の分離を得た。（未公開のデータ）。
【０１７１】
早期段階の乳癌においてロバストな予後を示す可能性、および複数の非メラノーマ癌型における進行相関性発現の広いパターンから、これら２５個の転移決定因子は、系列特異的ではなく、多種多様な腫瘍型において作動する中心的なプロセスを引き起こす可能性が高いことが示されているが、これらの大部分は文献中では、浸潤または転移に関係があると見なされたことがない。それに代わって、多くは、遺伝子−オントロジー上で、紡錐体チェックポイント制御または染色体凝縮における公知の役割を有する細胞サイクルまたは増殖の遺伝子としてアノテートされている。例えば、いくつかの決定因子（例えば、ＢＲＲＮ１、ＫＮＴＣ２、ＳＰＡＧ５、ＵＢＥ２Ｃ、ＣＥＮＰＭおよびＭＣＭ７）は、ＤＮＡ有糸分裂の進行、紡錘体およびＤＮＡ複製のプロセスを調節することが公知である。他方、ＢＲＲＮ１、ＫＮＴＣ２およびＵＢＥ２Ｃは、転移しない原発性乳房腫瘍２５と比べて、転移した原発性腫瘍と関連性がある転移性乳癌徴候において強化された２０個の遺伝子による機能性モジュール（２０−ｇｅｎｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｕｌｅ）中に含まれる。同様に、ＭＣＭ７は、前立腺癌を含めた、複数の浸潤性癌について芳しくない予後を示すマーカーとして同定されたことがある２６。総合すると、これらのタンパク質が、細胞の浸潤および転移の誘導に直接的または間接的に寄与する仕組みは依然として不明であるが、我々は、これらの有糸分裂チェックポイントタンパク質が、細胞の動きのための細胞骨格機構の制御において二重の役割を果たし得ると憶測している。
【０１７２】
（実施例６）
アノイキス耐性を付与する遺伝子の同定
転移は、複雑な多段階プロセスである（Ｇｕｐｔａ，  Ｇ．  Ｐ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，  Ｊ．（２００６年）Ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ、Ｃｅｌｌ  １２７巻、６７９〜６９頁）。完全な転移が生じるためには、腫瘍細胞は、原発性腫瘍部位において増殖し、循環系またはリンパ系内に浸入し、循環する間生存し、浸出し、二次腫瘍を形成することができなければならない。これを達成するために、循環する腫瘍細胞は、アノイキスまたはマトリックス付着の喪失により誘導されるアポトーシスを克服することができなければならない（Ｓｉｍｐｓｏｎ，  Ｃ．  Ｄ．、Ａｎｙｉｗｅ，  Ｋ．およびＳｃｈｉｍｍｅｒ，  Ａ．  Ｄ．（２００８年）Ａｎｏｉｋｉｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２７２巻、１７７〜１８５頁）。アノイキス耐性をアノイキス感受性細胞に付与する遺伝子を同定するために、我々は、アノイキス感受性についてのインビトロにおけるスクリーニングを最適化した（図６Ａ）。我々は、細胞表面付着を阻止するヒドロゲル層でコートしたプレート上に播種した細胞（超低クラスター）が、インビボにおいて循環している細胞懸濁液を、インビトロにおいて部分的に再現するであろうと仮定した。
【０１７３】
パイロット研究において、我々は、メラノーマ細胞系のコホートをスクリーニングし、メラノーマ段階（例えば、局在化、浸潤性）に関わらず、全てがアノイキス耐性であることを見出した。それに代わって、我々および他者は、ラット腸上皮（ＲＩＥ）細胞は、接着性が喪失すると生存を低下させることを見出した（図６Ｂ）（Ｄｏｕｍａ，  Ｓ．、Ｖａｎ  Ｌａａｒ，  Ｔ．、Ｚｅｖｅｎｈｏｖｅｎ，  Ｊ．、Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ，  Ｒ．、Ｖａｎ  Ｇａｒｄｅｒｅｎ，  Ｅ．およびＰｅｅｐｅｒ，  Ｄ．  Ｓ．（２００４年）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｏｉｋｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴｒｋＢ、Ｎａｔｕｒｅ  ４３０巻、１０３４〜１０３９頁）。ＲＩＦ細胞は不死化しているが、形質転換されていない細胞系である。アノイキスを被る細胞は、アポトーシス経路を開始し、一方、付着が喪失しても生存可能である細胞は、アノイキス耐性を示す。したがって、我々は、細胞代謝の指標であるＡＴＰ生成を、細胞生存率の定量化可能な感度のよい尺度として測定した。
【０１７４】
Ｇａｔｅｗａｙ組換えシステムを使用して、種間癌ゲノミクス解析によって同定した候補ＯＲＦのうちの１９９個を、レトロウイルスベクターＭＳＣＶ／Ｖ５中にクローニングした。ウェスタンブロットによる解析によれば、ｍＴｒｋＢ、および無作為抽出した異なるｃＤＮＡサイズのクローンがＲＩＥ中で発現し、したがって、我々の発現システムの機能性が実証された（図６Ｃ、未公開のデータ）。
【０１７５】
アノイキス耐性をスクリーニングするために、２９３Ｔ細胞を、６ウエルプレート上に蒔き、１つのＯＲＦを含有するＭＳＣＶ／Ｖ５およびパッケージングベクターｐＣＬ−Ｅｃｏによりコトランスフェクトした（図６Ａ）。細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトし、ウイルスを複数の時点で収集した。ＲＩＥ細胞を６つのウエル上に蒔き、プレーティングの２４時間後に、これらの細胞に、４８時間目および７２時間目のウイルス上清を連続的に感染させた。ＲＩＥを、最後の感染の２４時間後に収集し、単一細胞懸濁液（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を生成して、９６ウエルのＵＬＣプレート上に、７０００細胞／ウエルを三つ組で蒔いた（０時間）。ベースライン細胞数を決定するために、細胞を、０時間において溶解し、ＡＴＰレベルを測定した（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。ＵＬＣプレーティングの２４時間後に、細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏを用いて溶解し、溶解液を、読取りのために、９６ウエルの、不透明なウエルを有するルミノメーター用プレートに移した。我々の解析では、ＡＴＰレベルを２４時間目に０時間目と比較し、したがって、ＡＴＰレベルの変化の倍数を求めた（図７）。
【０１７６】
神経栄養因子受容体ＴｒｋＢは、インビトロにおいては、アノイキス耐性をアノイキス感受性細胞に付与し、インビボにおいては、腫瘍形成および肺における播種を促すことが示されたことがある（３）。マウスＴｒｋＢ（ｍＴｒｋＢ）およびＴｒｋＢに対するヒトリガンドであるＢＤＮＦが、ベクター単独よりも大きなアノイキス耐性をＲＩＥに付与したことから、我々は、我々のスクリーニングについて自信を高めるに至った（図７）。同一の二つ組のスクリーニングにおいて、遺伝子のうちの平均２１％が、全ての候補遺伝子の中央値から１標準偏差超を示した。２０個の遺伝子は、スクリーニングのうちの少なくとも一方において、中央値から２標準偏差超を示した（図８）。これらの遺伝子のうちの９個は、両方のスクリーニングにおいて、中央値から１標準偏差超を示し、一方、これら９個のうちの７個の遺伝子は、スクリーニングのうちの少なくとも一方において、中央値から２標準偏差超を示した（ＨＮＲＰＲ、ＣＤＣ２０、ＰＲＩＭ２Ａ、ＨＲＳＰＩ２、ＥＮＹ２、ＭＧＣ１４１４１、ＲＥＣＱＬ）。興味深いことに、これら９個の遺伝子のうち、ＳＴＫ３、ＰＲＩＭ２Ａ、ＣＤＣ２０、ＲＥＣＱＬ、ＨＮＲＰＲ、ＥＮＹ２およびＭＧＣ１４１４１は、メラノーマサンプル中で、正常対メラノーマ、または原発性対転移のいずれかにおいて、より高い発現を示したことがある（Ｏｎｃｏｍｉｎｅ、ＧＥＯ）。さらに、９個の遺伝子全てが、乳房、肺または脳のいずれかの腫瘍において発現増加を示したこともあり、このことからも、我々の優先順位リストがその他の癌型において妥当性を有することが実証されている（Ｏｎｃｏｍｉｎｅ）。
【０１７７】
我々の９個の候補遺伝子を発現する細胞の生存率の増加を、非接着性状態において確認するために、我々は、付着喪失期間後の付着能力の保持を調べた。目的の遺伝子を発現するＲＩＥをＵＬＣプレートに移し、２４時間後に、懸濁液中の全ての細胞を接着プレートに移した。接着性細胞を、クリスタルバイオレットを用いて染色し、生存細胞を定量化した。図９に示すように、ＲＩＥ細胞は、懸濁液中に２４時間置くと、接着プレートに付着する能力を低下させた。しかし、９個の遺伝子は全て、細胞を懸濁液中に置いた後、ＲＩＥの、再付着し、生存し続ける能力を増加させた（図９）。そのような能力は、二次部位においてコロニー形成するように運命付けられた循環腫瘍細胞に必要な特徴であろう。
【０１７８】
（実施例７）
転移ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴは発癌性である
転移決定因子は、形質転換プロセスの早期に獲得され、原発性腫瘍中に先在することから、これらの転移遺伝子もまた、増殖性の利点を原発性腫瘍にもたらす本物の癌遺伝子であり得るであろうと想定されたことがある２；２２。これに対処するために、我々は、これらの転移決定因子が、明らかな腫瘍形成能をＴＥＲＴ不死化メラニン形成細胞であるＨＭＥＬ４６８に付与することができるかどうかを調べた。ＨＯＸＡ１に加えてまた、我々は、３個のその他の決定因子、すなわち、ＡＮＬＮ、ＢＲＲＮ１およびＫＮＴＣ２も選択して、試験を行った。これは、それらが、メラノーマにおける無転移生存と負に相関する２５４個の遺伝子による徴候（２４５−ｇｅｎｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）上に含まれるからである２３。実際に、ＨＯＸＡ１形質導入ＨＭＥＬ４６８は、大型の腫瘍（２ｃｍ）を発生させ、局所的な浸潤の組織病理学的証拠を示し（図１０Ａ）、浸透率は１２週間後には３３％（６つの皮下移植部位中、ｎ＝２）であり、一方、ベクター形質導入対照は、注入の２１週間後まで、いずれの腫瘍も発生させなかった（図１０Ｂ）。同様に、ＡＮＬＮ、ＢＲＲＮ１およびＫＮＴＣ２を形質導入した細胞も、ベクター対照と比べて、腫瘍形成能の増強を示した（図３Ｂ）。総合して、我々は、転移決定因子は実際にそれら自体が本物の癌遺伝子であり、またこれらは浸潤性の挙動を引き起こすこともできると結論付けた。
【０１７９】
（実施例８）
インビトロおよびインビボにおけるＨＯＸＡ１およびＦＳＣＮ１についての検証データ
次に、転移決定因子を同定する手段としてのこの統合的アプローチをさらに検証するために、我々は、ホメオボックス転写因子であるＨＯＸＡ１の綿密な検証を実施した。ＨＯＸＡＩの上方制御が、乳房、ＮＳＣＬＣおよびメラノーマを含めた、複数の癌において報告されている１７；１８；１９が、浸潤および転移における役割が示唆されたことはない。過剰発現研究において、ＨＯＸＡ１は強制されると、接着斑キナーゼであるＦＡＫのリン酸化の増加を劇的に惹起した（図１１Ａ）。ＦＡＫは、増殖因子およびインテグリンによって刺激される細胞の運動性および浸潤の調節における主要なシグナル伝達分子である２０。したがって、ＨＯＸＡ１過剰発現ＨＭＥＬ４６８は、インビトロにおいては、１０倍の浸潤増加を示し、インビボにおいては、肺における播種能力を獲得した（図１１Ａ、Ｄ）。重要なことに、この浸潤促進活性は、ＨＭＥＬ４６８メラニン形成細胞系に特異的ではなかった。これは、ＨＯＸＡ１が、ＷＭ１１５ヒトメラノーマ細胞およびＷＭ３２１１ヒトメラノーマ細胞の浸潤も同様に増強することができたことによる（図１１Ｂ〜Ｃ）。実際にまた、表３に要約するように、ＷＭ１１５メラノーマ細胞およびＷＭ３２１１メラノーマ細胞中で浸潤アッセイを行った決定因子のうちの多くも、ＨＭＥＬ４６８メラニン形成細胞を上回る浸潤促進活性を示した。ＨＯＸＡ１の発癌および転移の可能性を、弱い発癌性を示すメラノーマ細胞系ＷＭ１１５を使用して試験した追加の検証アッセイから、ヌードマウスにおいては、ＨＯＸＡ１の過剰発現が、異種移植された細胞の腫瘍増殖を著しく増強することが示されており（図１１Ｅ）、これは、その他のヒトおよびマウスの細胞系を使用したデータと一致する。また、ＨＯＸＡ１の過剰発現によって、ヌードマウスの側腹部内に皮内移植した場合のＷＭ１１５細胞の腫瘍増殖の増加も生じ、生じた原発性腫瘍は、腫瘍の発生に続いて容易に肺に転移し（図１１Ｆ）、一方、対照（空のベクター細胞）は、原発性腫瘍を形成しない。
【０１８０】
ヒト細胞系におけるこれらの研究に加えて、また、我々は、ＨＯＸＡ１およびＦａｓｃｉｎ  １（ＦＳＣＮ１）の、マウス細胞系を使用する試験も行った。ヒト細胞系を使用した浸潤の結果（図１１Ａ〜Ｃ）と同様、両方の候補の発現によって、ＨＲＡＳ＊を形質導入したＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−マウス由来メラニン形成細胞（Ｍ３ＨＲＡＳ細胞として知れられている。Ｋｉｍ，  Ｍ．、Ｇａｎｓ，  Ｊ．Ｄ．、Ｎｏｇｕｅｉｒａ，  Ｃ．、Ｗａｎｇ，  Ａ．、Ｐａｉｋ，  Ｊ．Ｈ．、Ｆｅｎｇ，  Ｂ．、  Ｂｒｅｎｎａｎ，  Ｃ．、Ｈａｈｎ，  Ｗ．Ｃ．、Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ，  Ｃ．、Ｗａｇｎｅｒ，  Ｓ．Ｎ．ら（２００６年）、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ＮＥＤＤ９  ａｓ  ａ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｇｅｎｅ、Ｃｅｌｌ  １２５巻、１２６９〜１２８１頁）のマトリックス浸潤能力が著しく増加した（図１２Ａ）。さらに、ＨＯＸＡ１およびＦａｓｃｉｎ  １の両方の過剰発現によって、ヌードマウスの側腹部上に異種移植した場合、Ｍ３ＨＲＡＳ細胞の増殖する能力（図１２Ｂ）、および尾静脈への静脈内注射に続いて、眼に見える肺小結節を形成する能力（図１２Ｃ）も顕著に増強された。尾静脈への静脈内注射は、転移についての代理アッセイである。
【０１８１】
（実施例９）
ＨＯＸＡ１は、ＴＧＦβシグナル伝達の調節を介して浸潤を促す癌遺伝子である
次に、ＨＯＸＡ１の浸潤活性の分子基盤を探索するために、我々は、対照およびＨＯＸＡ１を形質導入したＨＭＥＬ４６８細胞、ＷＭ１１５細胞およびＷＭ３２１１細胞の発現プロファイリングに基づいて、ＨＯＸＡ１トランスクリプトームを決定した（図１１Ｂ）。示差的に発現した遺伝子リストの知識ベース経路解析によって、多重ノードとしてのＳＭＡＤ３上に中心を置く、ＴＧＦβシグナル伝達遺伝子のネットワークが明らかになった（図１３Ａおよび表６）。したがって、我々は、ＴＧＦβシグナル伝達の転移における公知の役割を考慮して、ＴＧＦβシグナル伝達がＨＯＸＡ１によって調節されるかどうかを評価した。我々は、ＴＧＦβ応答性レポーター構築物（ｐ３ＴＰ−Ｌｕｘ）を使用して、ＨＯＸＡ１の異所発現が、基礎レポーター活性を増強する（１１．０倍、ｐ＝０．００３）ことのみならず、また、ＴＧＦβリガンドに応答して、対照と比較して９．３倍の増加ももたらす（ｐ＝０．０００１；図１４Ａ）ことを見出した。それに対応して、１０％および１％の両方の血清培養条件下では、活性化ｐ−ＳＭＡＤ３および全ＳＭＡＤ３が、ＴＧＦβ刺激によって上昇し（図１４Ｂ）、このことは、ＲＮＡ発現解析により裏付けられた（図１３Ｂ）。さらに、ＨＯＸＡ１媒介型浸潤は、ＳＭＡＤ３のノックダウンにより抑止され（図１４Ｃ）、したがって、ＨＯＸＡ１の浸潤促進活性は、ＴＧＦβ−ＳＭＡＤのシグナル伝達に機能的につながっていた。ＴＧＦβ−ＳＭＡＤのシグナル伝達は、癌の転移を司る中心経路である２１。
【０１８２】
腫瘍において、ＨＯＸＡ１の過剰発現がＳＭＡＤ３リン酸化の状況に影響を与えるかどうかを調べるために、我々は、空のベクターまたはＨＯＸＡ１を発現するＷＭ１１５メラノーマ細胞に由来する異種移植腫瘍検体を活用して（図１１Ｅ）、ＳＭＡＤ３に対するリン酸特異的抗体を使用して免疫組織化学解析を行った。ＨＯＸＡ１の過剰発現によりＳＭＡＤ３のリン酸化の増加が生じた我々の観察（図１４Ｂ）と同様、我々は、ＨＯＸＡ１過剰発現腫瘍においても、ＳＭＡＤ３のリン酸化の増加を見出した（図１４Ｄ）。
【０１８３】
（実施例）
ＣＸＣＲ４
ＨＯＸＡ１の生物学的機能に関する洞察を得るために、我々は、空のベクターおよびＨＯＸＡ１を過剰発現するＷＭ１１５メラノーマ細胞およびＨＭＥＬ４６８メラニン形成細胞からｃＤＮＡを調製してＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（Ｓｕｐｐｅｒａｒｒａｙ）上で使用し、転移と関連性がある遺伝子のパネルの発現を解析した。これら２つの細胞系間で共有される、最も多く過剰発現した遺伝子は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４であった（図１５）。これは、ケモカインであるストロマ由来因子−１（ＳＤＦ−１）に対して特異的な受容体である。多くの型の癌において、腫瘍細胞によるＣＸＣＲ４の発現と、芳しくない予後とが相関付けられたことがあり、こうした発現は、細胞転移において、ＳＤＦ−１を発現する臓器に対する走化性勾配の確立を通して決定的な役割を果たす（Ｆｕｌｔｏｎ  ＡＭ、  Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．２００９年３月；１１巻（２号）：１２５〜３１頁）。ＨＯＸＡ１とＣＸＣＲ４との間の関係をさらに調べるために、我々は、空のベクターおよびＨＯＸＡ１を過剰発現する異種移植腫瘍におけるＣＸＣＲ４の発現を、免疫組織化学を使用して評価した。ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ解析と同様、我々は、ＷＭ１１５−ＨＯＸＡ１異種移植腫瘍およびＨＭＥＬ４６８−ＨＯＸＡｌ異種移植腫瘍の両方においても、ＣＸＣＲ４の発現が著しく増加することを見出した（図１６）。これらのデータは、ＨＯＸＡ１によりＣＸＣＲ４の発現の増加が生じ、それに続いて、ＣＸＣＲ４が、ＨＯＸＡ１の過剰発現によって開始された転移シグナル伝達プログラムに影響を与えるモデルと一致する。
【０１８４】
要約すると、統合的機能ゲノミクスのアプローチによって、浸潤を能動的に引き起こすものでもあり、かつ本物の癌遺伝子でもある転移決定因子の同定を可能にするに至った。メラノーマの状況において発見されたこれらの転移決定因子は、早期乳房腺癌において予後を示すことが分かり、多種多様な非メラノーマ腫瘍型において進行相関発現を示した。これらの知見から、転移決定因子は、いくつかの早期段階の原発性腫瘍中に存在し、これらの腫瘍を攻撃的に振舞うようにプログラムすることができ、したがって、芳しくない臨床治療成果をもたらすという実験的証拠が得られている。これらの決定因子のほとんどが、癌または転移に関連付けられたことがないことから、これらは、機能ベースの予後を示す生物マーカーおよび新しい治療的侵略の道のための基礎を提供することができる。
【０１８５】
【表３−１】
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【０１８６】
【表３−２】
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【０１８７】
【表４−１】
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【０１８８】
【表４−２】
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【０１８９】
【表４−３】
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【０１９０】
【表４−４】
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【０１９１】
【表４−５】
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【０１９２】
【表４−６】
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【０１９３】
【表４−７】
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【０１９４】
【表５−１】
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【０１９５】
【表５−２】
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【０１９６】
【表５−３】
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【０１９７】
【表５−４】
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【０１９８】
【表５−５】
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【０１９９】
【表６】
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【０２００】
【表７−１】
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【０２０１】
【表７−２】
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【０２０２】
【表７−３】
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【０２０３】
【表７−４】
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【０２０４】
【表７−５】
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【０２０５】
【表７−６】
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【０２０６】
【表７−７】
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【０２０７】
【表７−８】
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【０２０８】
【表７−９】
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【０２０９】
【表７−１０】
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【０２１０】
【表７−１１】
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【０２１１】
【表７−１２】
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【０２１２】
【数１】
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【０２１３】
【数２】
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【図１６】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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