(57)【要約】我々は、少なくとも第１及び第２ポリペプチドを連結するべく機能する修飾ペプチドリンカーであって、糖成分を付加するためのモチーフを含むペプチドリンカーについて記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドリンカーによって間接的に連結された第１及び第２のポリペプチドからなり、前記ペプチドリンカーが少なくとも１つの糖成分を付加する為の少なくとも１つのモチーフを含むように修飾されていることを特徴とする融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記第１のポリペプチドがリガンドであり、前記第２のポリペプチドが該リガンドの結合しうる同族の受容体である請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記第２のポリペプチドが前記の同族受容体細胞外ドメインよりなる請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記リガンドがサイトカインである請求項１から３のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記リガンドが血管新生促進ポリペプチドである請求項１から３のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記リガンドが成長ホルモンである請求項１から３のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記リガンドがタイプＩインターフェロンである請求項１から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記第１のポリペプチドがインターフェロンβであり、前記第２のポリペプチドがインターフェロン受容体のインターフェロンβ結合ドメインを有する、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドが、図２７、２８、２９、３０又は３１に表されているアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の融合ポリペプチド
【請求項１０】
少なくともドメインの１つに成長ホルモンポリペプチドを有する、請求項１から３のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドが第１及び第２の成長ホルモンポリペプチドを有する、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記融合ポリペプチドが、図２３、２４，２５又は２６に示されたアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記リガンドがペプチドホルモンである、請求項１から３のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドがソマトスタチン１４である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記融合ポリペプチドが、図３２，３３，３４，３５又は３６に示されたアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドがソマトスタチン２８である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
前記融合ポリペプチドが、図３８，３９，４０又は４１に示されたアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記第１のポリペプチドがソマトスタチン１４であり、前記第２のポリペプチドがソマトスタチン２８である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１９】
前記融合ポリペプチドが、図４２又は４３に示されたアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドリンカー分子が、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ又はＡｓｍ−Ｘａａ−Ｔｈｒ  （ここでＸはプロリン以外のいずれかのアミノ酸）というグリコシル化モチーフの１つのコピーを有する又はより構成される、請求項１から１９のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドリンカー分子が、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ又はＡｓｍ−Ｘａａ−Ｔｈｒというグリコシル化モチーフを含むことを特徴とするモチーフ（Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５）の少なくとも１つのコピーを有する、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記ペプチドリンカーが、
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｓｅｒ３Ｘａａ４Ｘａａ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｘａａ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｓｅｒ４Ｘａａ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｘａａ１Ｘａａ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ３Ｘａａ４Ｘａａ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｘａａ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ４Ｘａａ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；そして
Ｘａａ１Ｘａａ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
より構成されるグループから選択されたアミノ酸モチーフの少なくとも１つのコピーを有する、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドリンカーが、
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｓｅｒ３Ｇｌｙ４Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｇｌｙ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｓｅｒ４Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｇｌｙ１Ｇｌｙ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ３Ｇｌｙ４Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｇｌｙ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ４Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；そして
Ｇｌｙ１Ｇｌｙ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
より構成されるグループから選択されたモチーフの少なくとも１つのコピーを有する、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
前記ペプチドリンカーが、
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｓｅｒ３Ｓｅｒ４Ｇｌｙ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｇｌｙ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｓｅｒ４Ｇｌｙ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｓｅｒ１Ｓｅｒ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ３Ｓｅｒ４Ｇｌｙ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｓｅｒ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ４Ｇｌｙ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；そして
Ｓｅｒ１Ｓｅｒ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
より構成されるグループから選択されたモチーフの少なくとも１つのコピーを有する、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２５】
前記ペプチドリンカー分子が、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒというグリコシル化モチーフを含むことを特徴とするモチーフ（Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５）の少なくとも１つのコピー及びモチーフ（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）の少なくとも１つのコピーを有し、該ペプチドリンカーが５−５０アミノ酸であることを特徴とする、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記ペプチドリンカー分子が、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒというグリコシル化モチーフを含むことを特徴とするモチーフ（Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５）の少なくとも１つのコピー及びモチーフ（Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ）の１つのコピーを有し、該ペプチドリンカーが５−５０アミノ酸であることを特徴とする、請求項２１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２９】
請求項２７又は２８に記載の核酸分子又はベクターにより形質移入又は形質転換された細胞。
【請求項３０】
賦形剤又は担体を含み、請求項１から２６のいずれかに記載のポリペプチドを含有する医薬品組成物。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、図４６ａ、４６ｂ，４６ｃ，４６ｄ，４６ｅ又は４６ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、図４７ａ、４７ｂ，４７ｃ，４７ｄ，４７ｅ又は４７ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、図４８ａ、４８ｂ，４８ｃ，４８ｄ，４８ｅ又は４８ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、図４９ａ、４９ｂ，４９ｃ，４９ｄ，４９ｅ又は４９ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、図５０ａ、５０ｂ，５０ｃ，５０ｄ，５０ｅ，５０ｆ又は５０ｈに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、図５１ａ、５１ｂ，５１ｃ，５１ｄ，５１ｅ，５１ｆ又は５１ｈに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、図５２ａ、５２ｂ，５２ｃ，５２ｄ，５２ｅ，５２ｆ又は５２ｈに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、図５３ａ、５３ｂ，５３ｃ，５３ｄ，５３ｅ，５３ｆ又は５３ｈに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、図５４ａ又は５４ｂに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、図５５ａ又は５５ｂに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、図５６ａ又は５６ｂに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、図５７ａ又は５７ｂに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、図５８ａ、５８ｂ，５８ｃ，５８ｄ，５８ｅ又は５８ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが、図５９ａ、５９ｂ，５９ｃ，５ｄ，５９ｅ又は５９ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが、図６０ａ、６０ｂ，  ６０ｃ，  ６０ｄ，  ６０ｅ又は６０ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが、図６１ａ、６１ｂ，６１ｃ，６１ｄ，６１ｅ又は６１ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが、図６２ａ、６２ｂ，６２ｃ、６２ｄ又は６２ｅに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
前記ポリペプチドが、図６３ａ、６３ｂ，６３ｃ，６３ｄ又は６３ｅに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、図６４ａ、６４ｂ，６４ｃ，６４ｄ又は６４ｅに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５０】
前記ポリペプチドが、図６５ａ、６５ｂ，６５ｃ，６５ｄ又は６５ｅに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５１】
前記ポリペプチドが、図６６ａ、６６ｂ，６６ｃ，６６ｄ，６６ｅ又は６６ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５２】
前記ポリペプチドが、図６７ａ、６７ｂ，６７ｃ，６７ｄ，６７ｅ又は６７ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５３】
前記ポリペプチドが、図６８ａ、６８ｂ，６８ｃ，６８ｄ，６８ｅ又は６８ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５４】
前記ポリペプチドが、図６９ａ、６９ｂ，６９ｃ，６９ｄ，６９ｅ又は６９ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５５】
前記ポリペプチドが、図７０ａ、７０ｂ，７０ｃ，７０ｄ，７０ｅ，７０ｆ，７０ｇ，７０ｈ，７０ｉ，７０ｊ，７０ｋ，７０ｍ，７０ｎ，７０ｏ又は７０ｐに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが、図７１ａ、７１ｂ，７１ｃ，７１ｄ，７１ｅ，７１ｆ，７１ｇ，７１ｈ，７１ｉ，７１ｊ，７１ｋ，７１ｍ，７１ｎ，７１ｏ又は７１ｐに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５７】
前記ポリペプチドが、図７２ａ、７２ｂ，７２ｃ，７２ｄ，７２ｅ，７２ｆ，７２ｇ，７２ｈ，７２ｉ，７２ｊ，７２ｋ，７２ｍ，７２ｎ，７２ｏ又は７２ｐに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５８】
前記ポリペプチドが、図７３ａ、７３ｂ，７３ｃ，７３ｄ，７３ｅ，７３ｆ，７３ｇ，７３ｈ，７３ｉ，７３ｊ，７３ｋ，７３ｍ，７３ｎ，７３ｏ又は７３ｐに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項５９】
前記ポリペプチドが、図７４ａ、７４ｂ，７４ｃ，７４ｄ，７４ｅ，７４ｆ，７４ｇ，７４ｈ，７４ｉ，７４ｊ，７４ｋ又は７４ｍに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項６０】
前記ポリペプチドが、図７５ａ、７５ｂ，７５ｃ，７５ｄ，７５ｅ，７５ｆ，７５ｇ，７５ｈ，７５ｉ，７５ｊ，７５ｋ又は７５ｍに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項６１】
前記ポリペプチドが、図７６ａ、７６ｂ，７６ｃ，７６ｄ，７６ｅ，７６ｆ，７６ｇ，７６ｈ，７６ｉ，７６ｊ，７６ｋ又は７６ｍに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項６２】
前記ポリペプチドが、図７７ａ、７７ｂ，７７ｃ，７７ｄ，７７ｅ，７７ｆ，７７ｇ，７７ｈ，７７ｉ，７７ｊ，７７ｋ又は７７ｍに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項６３】
前記ポリペプチドが、図７８ａ、７８ｂ又は７８ｃに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項６４】
前記ポリペプチドが、図７９ａ、７９ｂ又は７９ｃに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項６５】
前記ポリペプチドが、図８０ａ、８０ｂ又は８０ｃに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される、請求項２から４のいずれかに記載の融合ポリペプチド。
【請求項６６】
請求項３１−６５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項６７】
請求項６６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項６８】
請求項６６又は６７に記載の核酸分子又はベクターにより形質移入又は形質転換された細胞。
【請求項６９】
賦形剤又は担体を含み、請求項３１から６５のいずれかに記載のポリペプチドを含有する医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも第１及び第２ポリペプチドを連結するべく機能する修飾ペプチドリンカーであって、糖成分を付加するためのモチーフを含むペプチドリンカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコシル化とは、張り出した糖鎖基を蛋白、ポリペプチド又はペプチドに付加することであり、これにより該蛋白、ポリペプチド又はペプチドの活性及び／又はバイオアベイラビィリティが変化する。このプロセスは、翻訳と同時又は翻訳後になされ、酵素を媒介として行われる。グリコシル化には２つのタイプが存在する；アスパラギン側鎖へのＮ結合型グリコシル化とセリン又はスレオニンアミノ酸側鎖へのＯ結合型グリコシル化である。Ｎ結合型グリコシル化は最も一般的な翻訳後修飾であり、真核細胞の小胞体内にて行われる。Ｎ結合型グリコシル化は２つの主要なタイプよりなる；２つのＮ−アセチルグルコサミンを含む高マンノースオリゴサッカライド及びその他のタイプの糖グループを含む複合オリゴサッカライドである。グリコシル化ポリペプチドに含まれるペプチドモチーフはＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒであり、ここでＸはプロリン以外のいかなるアミノ酸でもよい。これは酵素であるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴ）によって触媒される；Ｙａｎ＆  Ｌｅｎｎａｒｚ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２８０（５），  ３１２１−３１２４  （２００５）参照のこと。ＯＴはその触媒作用により、ドリコール結合ピロリン酸ドナーからオリゴサッカリル成分（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）をアスパラギン側鎖に転移させる。核となるペンタサッカライドは全てのＮ結合型オリゴサッカライドに共通しており、様々なＮ結合型オリゴサッカライドにおいて、その土台としての役割を担っている。
【０００３】
Ｏ結合型グリコシル化は一般的ではない。セリン又はスレオニン残基がこれらのアミノ酸側鎖にある酸素を介して糖とグリコシル結合により結合している。通常は、Ｎ−アセチルグルコサミンがこの結合様式により、細胞内蛋白質に結合している。
【０００４】
グリコシル化により、生物学的に活性のある蛋白の機能が変わることが知られている。例えば、ＷＯ０１／３６００１には、免疫原性を軽減し、薬物動態（ＰＫ）を改善する目的で、Ｎ結合型グリコシル化を含んでいる修飾インターフェロンＹ複合物についての記載がある。ＷＯ２００４／０２０５７８は、ＩＬ−２０受容体を介して優先的に情報伝達される、遺伝子工学により産生されたＩＬ−２０変異体のＮ結合型グリコシル化について開示している。ＷＯ２００５／０７０１３８は、本来グリコシル化されない、例えば、Ｇ−ＣＳＦといった、治療用ペプチドをＯ結合型グリコシル化することにより、免疫原性を軽減し、バイオアベイラビリティを改善することができることを記載している。グリコシル化Ｇ−ＣＳＦの更なる例はＷＯ２００７／１０８８８２に開示されており、トランスジェニック細胞中で発現させ、Ｇ−ＣＳＦのグリコシル化バターンが変化していた。ＷＯ２００７／０２２７９９は、天然のグリコシル化インターフェロンβと比較した場合、それと異なるグリコシル化蛋白質を、より多量に生産し、供給する無血清条件下での組み換えグリコシル化インターフェロンβの製造過程を記載している。ＷＯ２００７／０８４４４１は、より多くのグリコシル化を伴うことで、ＰＫの改善した卵胞刺激ホルモン変異体及びその受胎治療への利用について開示している。ＷＯ２００７／１３６７５２は、４本の炭化水素鎖；Ｎ結合型グリコシル化部位３つとＯ  結合型部位１つを含む蛋白であるエリスロポエチンの均一なグリコシル化の過程について開示している。グリコシル化組み換え蛋白の産生に関連する問題としてグリコシル化の均一性がある。エリスロポエチンのＰＫを改善する試みの更なる例が、ＷＯ００／３２７７２、ＷＯ０１／０２０１７及びＷＯ０３／０２９２９１に記載されている。
【０００５】
出願人の同時係属中の出願ＷＯ０１／９６５６５に、サイトカインとこれらの同族受容体の細胞外ドメインとの融合よりなる融合蛋白が、そのＰＫ及びアゴニスト活性を改善することについて記載されている。該サイトカイン及び細胞外ドメインは互いに柔軟なペプチドリンカーを介して連結されており、これによってそれぞれのドメインが互いのドメインと呼応して動くことを可能にしている。例としては成長ホルモン（ＧＨ）がある。
【０００６】
ＧＨは２つの膜結合成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）と、ＧＨ上でサイト１及びサイト２と呼ばれる２つの別部位を介して、連なって結合する。サイト１は高親和性結合部位であり、サイト２は低親和性部位である。１つのＧＨ分子は１つのＧＨＲとサイト１を介して結合する。２つ目のＧＨＲはサイト２を介して補充され、ＧＨＲ：ＧＨ：ＧＨＲ複合体を形成する。該複合体は内部移行して、遺伝子発現変動につながる情報伝達カスケードを活性化する。ＧＨＲの細胞外ドメインは２つの連結されたドメインより構成され、各ドメインはおよそ１００アミノ酸よりなり（ＳＤ−１００）、細胞表面に最も近接しているＣ端末側ＳＤ−１００ドメイン（ｂ）と、最も離れたＮ端末側ＳＤ−１００ドメイン（ａ）である。これら２つのドメインの構造変化は、ホルモン結合により、３量体ＧＨＲ−ＧＨ−ＨＧＲが形成される際に生じる。ラットに投与されたＧＨキメラ融合蛋白は、天然のＧＨに比べて３００倍もその消失が減少し、その単回投与は、天然のＧＨで見られるよりも著しく１０日間での成長を促進した。該成長ホルモン融合は相互に結合するヘッドトゥーテール構造の２量体を形成し、これにより、天然においてはＧＨとその結合蛋白によって生じる様な不活性ホルモンの蓄積を生じさせている。更なる例は、出願人の同時係属中の出願ＷＯ０３／０７０７６５において開示されており、それには、ＧＨ中のサイト１及びサイト２への修飾を含む修飾ＧＨ融合蛋白について及び該蛋白がＧＨ受容体活性化に対するアンタゴニストとして作用することについて記載されている。
【０００７】
新規なキメラ融合蛋白についての更なる例は、以下に示す蛋白についての未公開の特許出願に記載されている：成長ホルモン（ＵＳ６０／９５１，１２２；  ０７１７９８５．６）；修飾成長ホルモン（ＵＫ０７１９８１８．７；  ＵＳ６０／９７９，０１０）  レプチン（ＵＫ０７１５２１６．８；  ＵＳ６０／９５６，３６０）；エリスロポエチン（ＵＫ０７１５１２６．９；  ＵＳ６０／９５６，３１９）；顆粒球コロニー刺激ホルモン（ＵＫ０７１５１３３．５；  ＵＳ６０／９５６，３０３）；インターフェロン（ＵＫ０７１５３８３．６；  ＵＳ６０／９５６，３４３）；インターロイキン（ＵＫ０７１５５５７．５；  ＵＳ６０／９５６，３７２）；  ＩＧＦ−１（ＵＫ０７１５２１３．５；  ＵＳ６０／９５６，３３３）とプロラクチン（ＵＫ０７２４６５４．９；  ＵＫ０７２４６５６．４）；及び  ペプチドホルモンキメラ（ＵＫ０７２５２０１．８）。これらの内容は、そのまま参考文献に記載されている。
ＷＯ０３／０３４２７５において、出願人は、例えば成長ホルモンやレプチンといった、受容体を介したシグナル伝達のアゴニストとして作用するサイトカインのオリゴマー（例としては２量体や３量体）よりなる融合蛋白について記載した。該サイトカイン部分はまた、互いに柔軟なペプチドリンカーを介して連結される。該オリゴマーは、活性を有するものの、キメラ融合蛋白と比較した場合、ＰＫは改善されない。
【０００８】
ポリペプチドを連結するペプチドリンカー分子は当該技術分野において既知のものである。例えば、ＷＯ２００６／０１０８９１には、硬直した及びやや硬直したペプチドリンカー分子について記載されており、該分子は、へリックス領域を有するその他の蛋白性成長ホルモン間を直列に連結することで、その屈曲性を制限している。ＥＰ０  ５７３  ５５１には、セリンを多く含有するペプチド連結分子（Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ）ｘ（ここでｘは１−１０コピーの間であることを特徴とする）について記載されており、該分子は、溶解性や蛋白分解酵素による代謝に対する抵抗性を改善するために、融合蛋白中のドメインや単鎖抗体フラグメントを連結するのに有効である。ＷＯ８８／０９３４４においては、グリシンを多く含有し、抗体フラグメントの重鎖と軽鎖を連結する連結分子（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）について記載している。このようにペプチド連結分子はポリペプチドドメインを互いに連結し、活性及び／またはＰＫが改善された機能的複合体を形成する手段として確立している。
【発明の概要】
【０００９】
出願人は、糖成分を付加する為のモチーフを含むように修飾し、それによって少なくとも２つの活性のあるポリペプチド結合部分間をつなぐグリコシル化ペプチドリンカーを形成する修飾ペプチド連結分子を開示する。
【００１０】
本発明の１つの態様においては、ペプチドリンカーによって間接的に連結された第１及び第２のポリペプチドからなり、前記ペプチドリンカーが少なくとも１つの糖成分を付加する為の少なくとも１つのモチーフを含むように修飾されていることを特徴とする融合ポリペプチドを提供する。
本発明のより好ましい実施例においては、前記第１のポリペプチドがリガンドであり、前記第２のポリペプチドが該リガンドの結合しうる同族の受容体であり、好ましくは、前記リガンドと結合するドメインを有する又はより構成される細胞外ドメインである。
本発明の別の好ましい実施例においては、前記リガンドがケモカインである。
【００１１】
“ケモカイン”とは、分裂促進性、走化性又は炎症性活性を有する細胞により分泌される、構造的に関連性のある低分子量因子のグループを指す。これらは本来、４つの保存されたシステイン残基を共有する７０から１００残基からなる陽イオン性蛋白である。これらの蛋白は２つのＮ末端にあるシステインのスペーシングに基づき、２つのグループに分類することが出来る。第１のグループでは、この２つのシステインが１残基によって隔てられている（Ｃ−ｘ−Ｘ）のに対し、第２のグループにおいては、これらは隣り合っている（Ｃ−Ｃ）。”Ｃ−ｘ−Ｃ”ケモカインのメンバーの例として、血小板第４因子（ＰＦ４）、血小板塩基蛋白（ＰＢＰ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、黒色腫成長刺激活性蛋白（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症性蛋白２（ＭＩＰ−２）、マウスＭｉｇ（ｍ１１９）、ニワトリ９Ｅ３（又はｐＣＥＦ−４）、ブタ肺マクロファージ走化因子Ｉ及びＩＩ（ＡＭＣＦ−Ｉ及びＩＩ）、前Ｂ細胞刺激因子（ＰＢＳＦ）及びＩＰ１０が含まれるが、これらに限定されるものではない。”Ｃ−Ｃ”グループのメンバーの例として、単球走化性蛋白１（ＭＣＰ−１）、単球走化性蛋白２（ＭＣＰ−２）、単球走化性蛋白３（ＭＣＰ−３）、単球走化性蛋白４（ＭＣＰ−４）、マクロファージ炎症性蛋白１α（ＭＩＰ−１−α）、マクロファージ炎症性蛋白１β（ＭＩＰ−１−β）、マクロファージ炎症性蛋白１γ（ＭＩＰ−１−γ）、マクロファージ炎症性蛋白３α（ＭＩＰ−３−α）、マクロファージ炎症性蛋白３β（ＭＩＰ−３−β）、ケモカイン（ＥＬＣ）、マクロファージ炎症性蛋白４（ＭＩＰ−４）、マクロファージ炎症性蛋白５（ＭＩＰ−５）、ＬＤ７８β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＩＳ−ε（ｐ５００）、胸腺及び活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、Ｉ−３０９、ヒト蛋白ＨＣＣ−１／ＮＣＣ−２、ヒト蛋白ＨＣＣ−３が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
本発明の更に好ましい実施例としては、前記リガンドが血管新生促進ポリペプチドである。
【００１３】
血管新生を生ずるべく、内皮細胞を促進／活性化するいくつかの成長因子が知られている。これらは血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ    Ａ）、ＶＥＧＦ  Ｂ、ＶＥＧＦ  Ｃ及びＶＥＧＦ  Ｄ、形質転換成長因子（ＴＧＦｂ）、酸性及び塩基性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ）及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む。ＶＥＧＦは非常に特異的な活性部位を有する内皮細胞特異的な成長因子であり、即ち、内皮細胞の増殖、移動及び分化を促進する。ＶＥＧＦは２つの同一の２３ｋＤポリペプチドよりなる複合体である。ＶＥＧＦは違った分子量を有する４つの異なるポリペプチドとしても存在することが出来、各のポリペプチドはオルタナティブスプライシングにより生じたｍＲＮＡに由来する。ｂＦＧＦは繊維芽細胞や内皮細胞の増殖を刺激するべく機能する成長因子である。ｂＦＧＦは、分子量１６．５ｋＤの単鎖ポリペプチドである。ｂＦＧＦにはいくつかの分子形が見いだされており、これらはＮ末端領域の長さが異なっている。しかしながら、これら異なる分子形の生体に対する機能はどれも同一であるように見える。ｂＦＧＦは分泌腺によって産生される。
【００１４】
本発明の好ましい実施例としては、前記血管新生促進ポリペプチドが、ＶＥＧＦ  Ａ、ＶＥＧＦ  Ｂ、ＶＥＧＦ  Ｃ、ＶＥＧＦ  Ｄ、ＴＧＦｂ、ａＦＧＦとｂＦＧＦ及びＰＤＧＦから構成されるグループより選択されたものである。
本発明の更に好ましい実施例としては、前記リガンドが成長因子であるものである。
【００１５】
インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ１）及びその同族の受容体ＩＧＦ１Ｒは、ヒトＧＨと併存することで、正常な成長及び発達に必須である。これに加えて、ＩＧＦ１Ｒはまた、悪性形質転換にも関与している（Ｂａｓｅｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）。ＩＧＦ１、ＩＧＦ２及びインシュリン受容体は、緊密に関係しており、ＩＧＦ１Ｒはまた、ＩＧＦ２によっても活性化されうる。ＩＧＦ１Ｒは、およそ７４０残基のα鎖が、細胞質側にチロシンキナーゼドメインを有する膜貫通β鎖（９０ｋＤａ）とジスルフィド基により連結した形で構成されている。２つのα鎖がジスルフィド基により連結されることにより、該受容体は細胞膜上でα２：β２からなる４量体を形成している（Ｈｕｂｂａｒｄ  ａｎｄ  Ｔｉｌｌ，  ２０００）。該α鎖はいくつかのドメインから構成されており、２つのＬドメイン、Ｌ１（１−１５０残基）及びＬ２（３００−４６０残基）、は主としてホルモン結合に関与している。該Ｌドメインはシステインを多く含むドメイン（１５１−２９９）及びこれに続くフィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（４６０−７００）に区分される（Ｂａｓｅｒｇａ  Ｒ，  Ｈｏｎｇｏ  Ａ，  Ｒｕｂｉｎｉ  Ｍ，  Ｐｒｉｓｃｏ  Ｍ  ＆  Ｖａｌｅｎｔｉｓ  Ｂ  （１９９７）  “Ｔｈｅ  ＩＧＦ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ，  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ”  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３３２：  Ｆ１０５−Ｆ１２６）；  Ｈｕｂｂａｒｄ  ＳＢ  ＆  Ｔｉｌｌ，  ＪＨ  （２０００）  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ”  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９；  ３７３−３９８）。
【００１６】
本発明の好ましい実施例としては、前記リガンドがインシュリン様成長因子１である。
本発明の好ましい実施例としては、前記リガンドがヒトインシュリン様成長因子１であり、図１のアミノ酸配列によって表されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体ドメインが、図２のアミノ酸配列によって表されるＩＧＦ−１受容体ポリペプチドを有する又はより構成されるものである。
【００１７】
本発明の好ましい実施例としては、前記リガンドがインシュリン様成長因子２である。
本発明の好ましい実施例としては、前記リガンドがヒトインシュリン様成長因子２であり、図３のアミノ酸配列によって表されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体ドメインが、図４ａ又は４ｂのアミノ酸配列によって表されるＩＧＦ−２受容体ポリペプチドを有する又はより構成されるものである。
【００１８】
本発明の好ましい実施例としては、前記リガンドがサイトカインである。
サイトカインはいくつかの様々な細胞機能に関与している。これらには免疫系の調節、エネルギー代謝の制御及び成長及び発達のコントロールが含まれる。サイトカインはその効果を標的細胞の細胞表面に発現する受容体を介して媒介する。サイトカイン受容体は３つの別々のサブグループに分類することが出来る。タイプ１（成長ホルモン（ＧＨ）ファミリー）受容体は、細胞外ドメインのＮ末端部分にある４つの保存されたシステイン残基とＣ末端部分にある保存されたＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフの存在によって特徴づけられている。このＣｙｓ繰り返しモチーフはまた、タイプ２（インターフェロンファミリー）及びタイプ３（腫瘍壊死因子ファミリー）にも存在する。
【００１９】
本発明の好ましい実施例としては、前記サイトカインが、成長ホルモン、レプチン、エリスロポエチン、プロラクチン、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のｐ３５サブユニット、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロピン（ＣＴ−１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、インターフェロンタイプＩ、ＩＩ又はＩＩＩより構成されるグループから選択されたものである。
【００２０】
本発明の好ましい実施例としては、前記インターフェロンがタイプＩインターフェロンである。
好ましくは、前記タイプＩインターフェロンが、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンε、インターフェロンκ及びωインターフェロンより構成されるグループから選択されたものである。
本発明の好ましい実施例としては、インターフェロンαが、ＩＦＮＡ  １、ＩＦＮＡ  ２、ＩＦＮＡ  ４、ＩＦＮＡ  ５、ＩＦＮＡ  ６、ＩＦＮＡ  ７、ＩＦＮＡ  ８、ＩＦＮＡ  １０、ＩＦＮＡ  １３、ＩＦＮＡ  １４、ＩＦＮＡ  １６、ＩＦＮＡ  １７、ＩＦＮＡ  ２１より構成されるグループから選択されたものである。
本発明の別の好ましい実施例においては、前記第１のポリペプチドがインターフェロンβであり、前記第２のポリペプチドがインターフェロン受容体のインターフェロンβ結合ドメインを有している。
【００２１】
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、図２７、２８、２９、３０又は３１に表されているアミノ酸配列を有している。
本発明の別の好ましい実施例においては、前記サイトカインが、成長ホルモン、レプチン、エリスロポエチン、プロラクチン及びＧ−ＣＳＦより構成されるグループから選択されたものである。
本発明の好ましい実施例としては、成長ホルモンがヒト成長ホルモンポリペプチドである。
好ましくは、前記ヒト成長ホルモンポリペプチドが図５に示されるアミノ酸配列によって表されるものである。
【００２２】
本発明の好ましい実施例としては、前記ヒト成長ホルモンポリペプチドが、少なくとも１つの受容体結合ドメインを修飾した修飾ヒト成長ホルモンポリペプチドである。
本発明の好ましい実施例としては、成長ホルモンの前記受容体結合ドメインがサイト１結合ドメインである。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施例においては、成長ホルモンの前記受容体結合ドメインがサイト２結合ドメインである。
本発明の好ましい実施例においては、前記修飾ヒト成長ホルモンがサイト１及びサイト２の両方で修飾されている。
本発明の好ましい実施例としては、前記サイト２の修飾が、図５に表わされているアミノ酸配列のグリシン１２０になされているものである。
本発明の別の好ましい実施例においては、前記サイト２の修飾が、アルギニン、アラニン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン及びグルタミン酸より構成されるグループから選択されたアミノ酸とグリシンとの置換である。
【００２４】
本発明の別の好ましい実施例においては、前記置換が、グリシン１２０をアルギニン又はリジン又はアラニンとするものである。好ましくは、前記置換がグリシン１２０をアルギニンとするものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体ドメインが、図６のアミノ酸配列によって表される成長ホルモン受容体ポリペプチドを有する又はより構成されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、レプチンがヒトレプチンであり、図７に示されるアミノ酸配列によって表されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体ドメインが、図８のアミノ酸配列によって表されるレプチン受容体ポリペプチドを有する又はより構成されるものである。
【００２５】
本発明の好ましい実施例としては、エリスロポエチンがヒトエリスロポエチンであり、図９に示されるアミノ酸配列によって表されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体ドメインが、図１０のアミノ酸配列によって表されるエリスロポエチン受容体ポリペプチドを有する又はより構成されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、プロラクチンがヒトプロラクチンであり、図１１に示されるアミノ酸配列によって表されるものである。
【００２６】
本発明の好ましい実施例としては、プロラクチンが少なくとも１つの受容体結合ドメインで修飾されていることを特徴とする修飾ヒトプロラクチンである。
本発明の好ましい実施例としては、前記修飾プロラクチンポリペプチドが、前記アミノ酸配列が図１１に示されるヒトプロラクチンの１２９位で修飾されていることを特徴とするアミノ酸配列を有するものである。
本発明の別の好ましい実施例においては、前記修飾がアミノ酸置換である。好ましくは、前記置換がグリシンアミノ酸残基をアルギニンアミノ酸残基で置き換えるものである。
好ましくは、前記修飾が更に、図１１に示されるアミノ酸配列の、少なくとも９，１０、１１，１２，１３又は１４のＮ末端アミノ酸残基を欠損するものである。
【００２７】
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体ドメインが、図１２のアミノ酸配列によって表されるプロラクチン受容体ポリペプチドを有する又はより構成されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、Ｇ−ＣＳＦがヒトＧ−ＣＳＦであり、図１３に示されるアミノ酸配列によって表されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体ドメインが、図１４のアミノ酸配列によって表されるＧ−ＣＳＦ受容体ポリペプチドを有する又はより構成されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記リガンドがペプチドホルモンである。
【００２８】
本発明の好ましい実施例としては、前記ペプチドホルモンが、抗利尿ホルモン、オキシトシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン、カルシトニン、グルカゴン、アミリン、Ａ型ナトリウム排泄増加ホルモン、Ｂ型ナトリウム排泄増加ホルモン、グレリン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＹＹ３−３６、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン又はこれらの相同物又は類縁体より構成されるグループから選択されたものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合蛋白が成長ホルモン放出ホルモンを有している。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施例としては、前記融合蛋白がソマトスタチン又はその相同物又は類縁体を有している。好ましくは、ソマトスタチンはソマトスタチン１４であり、あるいは、ソマトスタチンはソマトスタチン２８である。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合蛋白がアミノ酸配列ＡＧＣＫＮＦＦＷ  ＫＴＦＴＳＣを有している。
本発明の別の好ましい実施例としては、前記融合蛋白がアミノ酸配列ＳＡＮＳＮＰＡＭＡＰＲＥＲＫＡＧＣＫＮＦＦＷ  ＫＴＦＴＳＣを有している。
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体結合ドメインが細胞外受容体結合ドメインである。
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体結合ドメインがソマトスタチン１受容体のソマトスタチン結合ドメインを有している。
【００３０】
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体結合ドメインがソマトスタチン２受容体のソマトスタチン結合ドメインを有している。
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体結合ドメインがソマトスタチン３受容体のソマトスタチン結合ドメインを有している。
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体結合ドメインがソマトスタチン４受容体のソマトスタチン結合ドメインを有している。
本発明の好ましい実施例としては、前記受容体結合ドメインがソマトスタチン５受容体のソマトスタチン結合ドメインを有している。
本発明の好ましい実施例としては、前記細胞外受容体結合ドメインがソマトスタチン結合ドメインを有する又はより構成されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記細胞外受容体結合ドメインが、表１に関連する図１５のアミノ酸配列によって示されたソマトスタチン結合ドメインを有する又はより構成されるものである。
【００３１】
本発明の別の好ましい実施例としては、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドがソマトスタチン１４である。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、図３２，３３，３４，３５又は３６に示されたアミノ酸配列を有する。
本発明の別の好ましい実施例としては、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドがソマトスタチン２８である。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、図３８，  ３９，  ４０又は４１に示されたアミノ酸配列を有する。
本発明の別の好ましい実施例としては、前記第１のポリペプチドがソマトスタチン１４であり、前記第２のポリペプチドがソマトスタチン２８である。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、図４２又は４３に示されたアミノ酸配列を有する。
【００３２】
本発明の別の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）αサブユニットを有する。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、図１６のアミノ酸配列によって示された（ＦＳＨ）αサブユニットを有する又はより構成されるものである。
ＦＳＨαサブユニットは黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に共通する構造であることが知られており、それ故、ＦＳＨαサブユニットに係る請求項はＬＨ及びＦＳＨに係る請求項に相当する。それぞれのホルモンのβサブユニットによって受容体特異性が生じているのである。
本発明の別の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）βサブユニットを有する。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、図１７のアミノ酸配列によって示された（ＦＳＨ）βサブユニットを有する又はより構成されるものである。
【００３３】
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）の細胞外ドメインを有する又はより構成されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、表２に関連する図１８のアミノ酸配列によって示された卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）の細胞外ドメインを有する又はより構成されるものである。
本発明の別の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドがＬＨβサブユニットを有する又はより構成されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、図１９に示されたＬＨβサブユニットを有する又はより構成されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドがＬＨ受容体の細胞外ドメインを有する又はより構成されるものである。
【００３４】
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、表３に関連する図２０に示されたＬＨ受容体の細胞外ドメインを有する又はより構成されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドがＴＳＨβサブユニットを有する又はより構成されるものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、図２１に示されたアミノ酸を有する又はより構成されるものである。
本発明の更に好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドがＴＳＨ受容体の細胞外ドメインを有するものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、表４に関連する図２２に示されたＴＳＨ受容体の細胞外ドメインを有する又はより構成されるものである。
本発明の別の好ましい実施例としては、前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、受容体ポリペプチドと結合するリガンド結合ドメインであり、該ドメインが直列に連結していることを特徴とするリガンド結合ドメインである。
【００３５】
本発明の更なる好ましい実施例としては、ポリペプチドの結合ドメインが互いに同一又は類似しているものである。
本発明の別の好ましい実施例としては、前記リガンド結合ドメインが異なるものである。
本発明の更なる好ましい実施例としては、少なくとも１つのドメインが成長ホルモン結合ドメインを有するものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが第１及び第２の成長ホルモンポリペプチドを有するものである。
【００３６】
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドが、図２３、２４，２５又は２６に示されたアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、成長ホルモン又は成長ホルモン変異体の、少なくとも２つの結合ドメインを有するものである。
本発明の別の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、プロラクチン又はプロラクチン変異体の、少なくとも２つの結合ドメインを有するものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記プロラクチン変異体ポリペプチドが、ヒトプロラクチンの１２９位に修飾を受けることを特徴とするアミノ酸配列を有するものである。
本発明の好ましい実施例においては、前記修飾がアミノ酸置換である。好ましくは、前記置換がグリシンアミノ酸残基をアルギニンアミノ酸残基で置き換えるものである。好ましくは、前記修飾が更に、少なくとも９，１０、１１，１２，１３又は１４のＮ末端アミノ酸残基の欠損を含む。
本発明の別の好ましい実施例としては、ポリペプチドの結合ドメインが互いに異なるものである。
【００３７】
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、成長ホルモン結合ドメインである第１の結合ドメインと、プロラクチン結合ドメインである第２の結合ドメインを有する。
好ましくは、前記ポリペプチドは成長ホルモン結合ドメイン及びプロラクチン結合ドメインより構成される。
本発明の別の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、修飾成長ホルモン結合ドメインである第１の結合ドメインと、修飾プロラクチン結合ドメインである第２の結合ドメインを有する。
好ましくは、前記ポリペプチドは修飾成長ホルモン結合ドメイン及び修飾プロラクチン結合ドメインより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記修飾成長ホルモン結合ドメインはアミノ酸位置グリシン１２０でのアミノ酸の置換を有するものである。
【００３８】
好ましくは、前記修飾は、アルギニン、リジン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン及びグルタミン酸より構成されるグループから選択されたアミノ酸とグリシン１２０との置換である。
本発明の好ましい実施例としては、前記修飾は、アルギニンアミノ酸残基とグリシン１２０との置換である。
本発明の更に好ましい実施例としては、前記修飾プロラクチン結合ドメインがグリシン１２９の修飾を有している。好ましくは、前記修飾はアルギニンアミノ酸残基とグリシン１２９との置換である。好ましくは、前記修飾は更に、少なくとも９，１０、１１，１２，１３又は１４のＮ末端アミノ酸残基の欠損を有するものである。
本発明の別の好ましい実施例としては、前記第１及び第２のポリペプチドが抗体可変領域結合ドメインを有するものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記抗体可変領域結合ドメインが同一又は類似のエピトープに結合する。
【００３９】
本発明の別の好ましい実施例としては、前記抗体可変領域結合ドメインが異なるエピトープに結合し、二価である。
イムノグロブリン又は抗体の様々なフラグメントは当該技術分野において既知であり、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、ｓｃＦｖｓ等がある。Ｆａｂフラグメントは多量体蛋白であり、イムノグロブリン重鎖可変領域及びイムノグロブリン軽鎖可変領域の免疫活性のある部分が互いに共有結合したものから構成され、抗原に特異的に結合することが出来る。Ｆａｂフラグメントは、無処置のイムノグロブリン分子を蛋白切断（例えば、パパインによる）することにより産生される。Ｆａｂ２フラグメントは２つの連結したＦａｂフラグメントからなる。これら２つのフラグメントがイムノグロブリンヒンジ領域によって連結されることにより、結果としてＦ（ａｂ’）２フラグメントが生じる。Ｆｖフラグメントは多量体蛋白であり、イムノグロブリン重鎖可変領域及びイムノグロブリン軽鎖可変領域の免疫活性のある部分が互いに共有結合したものから構成され、抗原に特異的に結合することが出来る。フラグメントは又、１つの軽鎖可変領域のみを含む単鎖ポリペプチド、又は軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、重鎖可変領域を伴わないフラグメント、もしくは重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、軽鎖部分を伴わないフラグメント、そして、例えば米国特許Ｎｏ６，２４８，５１６に記載されている、抗体フラグメントから形成された多選択性を有する抗体であってもよい。Ｆｖフラグメント又は単領域（ドメイン）フラグメントは、一般的には、関連する特定領域の宿主細胞株中で発現することにより産生される。これら及びその他のイムノグロブリン又は抗体フラグメントは、本発明の適用範囲内にあり、Ｐａｕｌ，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  やＪａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（上部に引用）といった標準的な免疫学の教科書にも記載されている。今日、分子生物学により、これらのフラグメントの直接の合成（細胞での発現又は化学合成による）又はこれらの組み合わせによる合成が可能となっている。
【００４０】
単一の可変領域、いわゆる単鎖抗体可変領域フラグメント（ｓｃＦｖｓ）を産生することは可能である。もし特定の単クローン抗体のハイブリドーマが存在するのであれば、ＲＴ  ＰＣＲにより前記ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡからｓｃＦｖｓを単離することは当業者にとって周知の範囲内である。これに代わって、ｓｃＦｖｓを発現するクローンを同定するのにファージディスプレイスクリーニングを用いることが出来る。あるいは、該フラグメントは“ドメイン抗体フラグメント”である。ドメイン抗体は抗体の最も小さな結合部分である（およそ１３ｋＤａ）。この技術の事例はＵＳ６，  ２４８，  ５１６、ＵＳ６，  ２９１，  １５８、ＵＳ６，  １２７，  １９７及びＥＰ０３６８６８４に開示されており、これらの内容は全て、そのまま参考文献に記載されている。
【００４１】
本発明の好ましい実施例としては、前記抗体フラグメントが単鎖抗体可変領域フラグメントである。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図４６ａ、４６ｂ，４６ｃ，４６ｄ，４６ｅ又は４６ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図４７ａ、４７ｂ，４７ｃ，４７ｄ，４７ｅ又は４７ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図４８ａ、４８ｂ，４８ｃ，４８ｄ，  ４８ｅ又は４８ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
【００４２】
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図４９ａ、４９ｂ，４９ｃ，４９ｄ，  ４９ｅ又は４９ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図５０ａ、５０ｂ，５０ｃ，５０ｄ，５０ｅ，５０ｆ又は５０ｈに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図５１ａ、５１ｂ，５１ｃ，５１ｄ，５１ｅ，５１ｆ又は５１ｈに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図５２ａ、５２ｂ，５２ｃ，５２ｄ，５２ｅ，５２ｆ又は５２ｈに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図５３ａ、５３ｂ，  ５３ｃ，５３ｄ，５３ｅ，５３ｆ又は５３ｈに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
【００４３】
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図５４ａ又は５４ｂに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図５５ａ又は５５ｂに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図５６ａ又は５６ｂに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図５７ａ又は５７ｂに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
【００４４】
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図５８ａ、５８ｂ，５８ｃ，５８ｄ，  ５８ｅ又は５８ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図５９ａ、５９ｂ，５９ｃ，５ｄ，５９ｅ又は５９ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図６０ａ、６０ｂ，６０ｃ，６０ｄ，６０ｅ又は６０ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図６１ａ、６１ｂ，６１ｃ，６１ｄ，６１ｅ又は６１ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図６２ａ、６２ｂ，６２ｃ，６２ｄ又は６２ｅに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
【００４５】
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図６３ａ、６３ｂ，６３ｃ，６３ｄ又は６３ｅに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図６４ａ、６４ｂ，６４ｃ，６４ｄ又は６４ｅに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図６５ａ、６５ｂ，６５ｃ，６５ｄ又は６５ｅに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図６６ａ、６６ｂ，６６ｃ，６６ｄ，  ６６ｅ又は６６ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
【００４６】
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図６７ａ、６７ｂ，６７ｃ，６７ｄ，６７ｅ又は６７ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図６８ａ、６８ｂ，６８ｃ，６８ｄ，６８ｅ又は６８ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図６９ａ、６９ｂ，６９ｃ，６９ｄ，６９ｅ又は６９ｆに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図７０ａ、７０ｂ，７０ｃ，７０ｄ，７０ｅ，７０ｆ，７０ｇ，７０ｈ，７０ｉ，７０ｊ，７０ｋ，７０ｍ，７０ｎ，７０ｏ又は７０ｐに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図７１ａ、７１ｂ，７１ｃ，７１ｄ，７１ｅ，７１ｆ，７１ｇ，７１ｈ，７１ｉ，７１ｊ，７１ｋ，７１ｍ，７１ｎ，７１ｏ又は７１ｐに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
【００４７】
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図７２ａ、７２ｂ，７２ｃ，７２ｄ，７２ｅ，７２ｆ，７２ｇ，７２ｈ，７２ｉ，７２ｊ，７２ｋ，７２ｍ，７２ｎ，７２ｏ又は７２ｐに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図７３ａ、７３ｂ，７３ｃ，７３ｄ，７３ｅ，７３ｆ，７３ｇ，７３ｈ，７３ｉ，７３ｊ，７３ｋ，７３ｍ，７３ｎ，７３ｏ又は７３ｐに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図７４ａ、７４ｂ，７４ｃ，７４ｄ，７４ｅ，７４ｆ，７４ｇ，７４ｈ，７４ｉ，７４ｊ，７４ｋ又は７４ｍに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
【００４８】
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図７５ａ、７５ｂ，７５ｃ，７５ｄ，７５ｅ，７５ｆ，７５ｇ，７５ｈ，７５ｉ，７５ｊ，７５ｋ又は７５ｍに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図７６ａ、７６ｂ，７６ｃ，７６ｄ，７６ｅ，７６ｆ，７６ｇ，７６ｈ，７６ｉ，７６ｊ，７６ｋ又は７６ｍに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図７７ａ、７７ｂ，７７ｃ，７７ｄ，７７ｅ，７７ｆ，７７ｇ，７７ｈ，７７ｉ，７７ｊ，７７ｋ又は７７ｍに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図７８ａ、７８ｂ又は７８ｃに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
【００４９】
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図７９ａ、７９ｂ又は７９ｃに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ポリペプチドが、図８０ａ、８０ｂ又は８０ｃに示された配列より構成されるグループから選択されたアミノ酸配列を有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ペプチドリンカー分子が柔軟なペプチドリンカーである。
【００５０】
本発明の好ましい実施例としては、前記ペプチドリンカー分子が、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ又はＡｓｍ−Ｘａａ−Ｔｈｒ  （ここでＸはプロリン以外のいずれかのアミノ酸）というグリコシル化モチーフの１つのコピーを有する又はより構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ペプチドリンカー分子が少なくとも５アミノ酸残基を有する。
本発明の好ましい実施例としては、前記ペプチドリンカーが５−５０アミノ酸残基を有する。
本発明のより好ましい実施例としては、前記ペプチドリンカーが５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５又は５０アミノ酸残基より構成される。
本発明の好ましい実施例としては、前記ペプチドリンカー分子が、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ又はＡｓｍ−Ｘａａ−Ｔｈｒというグリコシル化モチーフを含むことを特徴とするモチーフ（Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５）の少なくとも１つのコピーを有する。
【００５１】
本発明の好ましい実施例としては、前記ペプチドリンカーが、
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｓｅｒ３Ｘａａ４Ｘａａ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｘａａ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｓｅｒ４Ｘａａ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｘａａ１Ｘａａ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ３Ｘａａ４Ｘａａ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｘａａ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ４Ｘａａ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；そして
Ｘａａ１Ｘａａ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
より構成されるグループから選択されたアミノ酸モチーフの少なくとも１つのコピーを有するものである。
【００５２】
好ましくは、前記ペプチドリンカーが、
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｓｅｒ３Ｇｌｙ４Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｇｌｙ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｓｅｒ４Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｇｌｙ１Ｇｌｙ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ３Ｇｌｙ４Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｇｌｙ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ４Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；そして
Ｇｌｙ１Ｇｌｙ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
より構成されるグループから選択されたモチーフの少なくとも１つのコピーを有するものである。
【００５３】
本発明の別の好ましい実施例としては、前記ペプチドリンカーが、
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｓｅｒ３Ｓｅｒ４Ｇｌｙ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｇｌｙ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｓｅｒ４Ｇｌｙ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｓｅｒ１Ｓｅｒ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ａｓｎ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ３Ｓｅｒ４Ｇｌｙ５，  ここでＸａａ２はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
Ｓｅｒ１Ａｓｎ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ４Ｇｌｙ５，  ここでＸａａ３はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；そして
Ｓｅｒ１Ｓｅｒ２Ａｓｎ３−Ｘａａ４−Ｔｈｒ５，  ここでＸａａ４はプロリン以外のいずれかのアミノ酸；
より構成されるグループから選択されたモチーフの少なくとも１つのコピーを有するものである。
【００５４】
本発明の好ましい実施例としては、前記ペプチドリンカー分子が、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒというグリコシル化モチーフを含むことを特徴とするモチーフ（Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５）の少なくとも１つのコピー及びモチーフ（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ）の少なくとも１つのコピーを有し、該ペプチドリンカーが５−５０アミノ酸であることを特徴とするものである。
本発明の好ましい実施例としては、前記ペプチドリンカー分子が、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒというグリコシル化モチーフを含むことを特徴とするモチーフ（Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５）の少なくとも１つのコピー及びモチーフ（Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ）の１つのコピーを有し、該ペプチドリンカーが５−５０アミノ酸であることを特徴とするものである。
【００５５】
本発明の好ましい実施例としては、前記融合ポリペプチドリンカーが、マンノース、ガラクトース、ｎ−アセチルグルコサミン、ｎ−アセチルノイラミン酸、ｎ−グリコリルノイラミン酸、ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、グルコース、ラムノース、キシロース又は、例としては、オリゴサッカライドにおけるこれらの糖の組み合わせより構成されるグループから選択された少なくとも１つの糖の付加によって修飾されたものである。
【００５６】
適当な糖質成分には単糖、オリゴ糖及び多糖が含まれ、天然で生じる糖蛋白又は生体系中に存在するいかなる糖質成分をも含む。例としては、選択的に保護されうるグリコシル又はグリコシド誘導体であり、例としては、選択的に保護されうるグルコシル、グルコシド、ガラクトシル又はガラクトシド誘導体がある。グリコシル及びグリコシドグループはα及びβグループを含む。適当な糖質成分には、グルコース、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸及びマンノース、及び少なくとも１つのグルコース、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸及び／又はマンノースを有するオリゴ糖又は多糖が含まれる。
【００５７】
糖成分のいかなる官能基も、当業者にとって周知の保護基を用いることにより、選択的に保護することが出来る（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”第２版、Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１，参照。これらの明細は参考文献に記載されている。）。糖成分の−ＯＨ基のための適当な保護基には、アセテート（Ａｃ）、ベンジル（Ｂｎ）、シリル（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳｉ）及びｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＭＤＰＳｉ）、アセタール、ケタール及びメトキシメチル（ＭＯＭ）が含まれる。どの保護基もペプチドリンカーへの糖成分の付加前又は後に除去してもよい。
【００５８】
本発明の好ましい実施例としては、前記糖が無保護である。
特に好ましい糖成分には、Ｇｌｃ（Ａｃ）４β−，Ｇｌｃ（Ｂｎ）４β−，Ｇａｌ（Ａｃ）４β−，Ｇａｌ（Ｂｎ）４β−，Ｇｌｃ（Ａｃ）４α（１，４）Ｇｌｃ（Ａｃ）３α（１，４）Ｇｌｃ（Ａｃ）４β−，β−Ｇｌｃ，βＧａｌ，−Ｅｔ−β−Ｇａｌ，−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ，Ｅｔ−α−Ｇｌｃ，−Ｅｔ−α−Ｍａｎ，−Ｅｔ−Ｌａｃ，−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）２，−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）３，−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）２，−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）３，−Ｅｔ−α−Ｇｌｃ（Ａｃ）４，−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）２，−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）３，−Ｅｔ−β−Ｇｌｃ（Ａｃ）４，−Ｅｔ−α−Ｍａｎ（Ａｃ）３，−Ｅｔ−α−Ｍａｎ（Ａｃ）４，−Ｅｔ−β−Ｇａｌ（Ａｃ）３，−Ｅｔ−β−Ｇａｌ（Ａｃ）４，−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）５，−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）６，−Ｅｔ−Ｌａｃ（Ａｃ）７及びこれらの無保護相当物が含まれる。
好ましくは、糖成分を構成している、天然に存在する糖由来のサッカライド単位はどれも、それぞれが天然に存在する光学異性体であり、Ｄ体（例えば、Ｄ−グルコース又はＤ−ガラクトース）又はＬ体（例えば、Ｌ−ラムノース又はＬ−フコース）のいずれかでありうる。アノマー性結合はα−又はβ−結合でありうる。
【００５９】
本発明の更なる態様においては、グリコシル化されうるペプチドリンカーを含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
本発明の更なる態様においては、本発明に係る核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明の好ましい実施例としては、前記ベクターは、本発明に係る核酸分子を発現するべく改造した発現ベクターである。
【００６０】
本発明に係る核酸を含むベクターは、特に、該ベクターが、安定なトランスフェクションのため、ゲノムへの組み換え用の細胞に核酸を導入するのに使用しているのであれば、プロモーターやその他の制御配列を含んでいる必要はない。好ましくは、宿主細胞での転写のために、ベクター中の核酸が適当なプロモーター又はその他の制御因子に実施可能な形で連結される。該ベクターは、複数の宿主で機能する二機能性の発現ベクターであってもよい。「プロモーター」とは、転写開始部位の上流に位置するヌクレオチド配列であり、転写に必要な全ての制御領域を含んでいる。適当なプロモーターには、常時発現型、組織特異型、誘導型、発生型又は真核又は原核細胞における発現用のその他のプロモーターが含まれる。「実施可能な形で連結」とは、プロモーターから開始される転写にとって適当な位置及び向きで、同一の核酸分子の一部として連結することである。プロモーターに実施可能な形で連結されたＤＮＡはプロモーターの「転写開始制御下にある」。
【００６１】
好ましい実施例においては、プロモーターが常時発現型、誘導型又は調節可能型プロモーターである。
本発明の更なる態様においては、本発明に係る核酸分子又はベクターにより形質移入又は形質転換された細胞を提供する。
好ましくは、前記細胞は真核細胞である。あるいは、前記細胞は原核細胞である。
本発明の好ましい実施例としては、前記細胞が、真菌細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ，  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ，  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐｐ）、ほ乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）、植物細胞より構成されるグループから選択されるものである。
【００６２】
本発明の更なる態様においては、賦形剤又は担体を含んだ、本発明に係るポリペプチドを有する医薬品組成物を提供する。
本発明の好ましい実施例としては、前記医薬品組成物が更なる治療剤と併用されるものである。
投与する際には、本発明に係る医薬品組成物は、調剤上容認できる調製をして投与される。該調製は、通常、調剤上容認できる濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性のある担体及びオプションとしてその他の治療剤を含んでいてもよい。
本発明に係る医薬品組成物は、注射を含む、従来のいかなる経路を介しても投与することが出来る。投与及び塗布は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、体腔内、関節内、皮下、外用（眼）、真皮（例えば、皮膚又は粘膜へのクリーム脂溶物挿入）、経皮または鼻腔内であってもよい。
【００６３】
本発明に係る医薬品組成物は、有効量にて投与される。“有効量”とは、単独、又は更なる用量又は相乗的に効果を発揮する剤と共に投与することで、望まれる反応を生ずる医薬品／組成物の用量である。これは、疾患の時間的進行の遅延に関与するだけでもよいが、疾患の進行を継続的に抑制することに関与する方がより好ましい。これは、従来の方法により監視することが出来、又は、診断方法によってもモニターすることが出来る。
対象への本医薬品組成物の投与量は、様々な限定要素に応じて、特に、使用される投与方法及び対象の状態（例えば、年齢、性別）に応じて、選択することが出来る。投与する際には、本発明に係る医薬品組成物は調剤上容認できる用量及び調剤上容認できる組成で投与される。薬に使用される場合には、塩は調剤上容認されるものでなければならないが、調剤上容認されない塩を、調剤上容認される塩を調製するために、便宜上使用してもよく、本発明の適用範囲から除外していない。こうした薬理上及び調剤上容認できる塩には、以下に示す酸から調製される塩が含まれるが、これに限定されるものではない：塩化水素、臭化水素、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸及びこれらの類縁体。又、調剤上容認できる塩は、ナトリウム、カリウム又はカルシウム塩といったアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩として調製されることも可能である。
【００６４】
本医薬品組成物は、もし望まれるのであれば、調剤上容認できる担体とともに併用してもよい。ここで用いられる「調剤上容認できる担体」なる用語は、ヒトへの投与に適切な１つ又は複数の適合する固体又は液体の充填剤、希釈剤又は被包物質を意味する。「担体」なる用語は、天然又は合成の、有機又は無機成分であり、活性のある成分と組み合わせることで、投与を容易にするものを意味する。本医薬品組成物の成分はまた、本発明に係る分子及び成分間で、これらの相互作用により所望の薬剤効果を実質的に損なわないような形で、混在することが出来る。
本医薬品組成物は、塩の形での酢酸、塩の形でのクエン酸、塩の形でのホウ酸及び塩の形でのリン酸を含む、適切な緩衝剤を含んでいてもよい。
本医薬品組成物はまた、オプションとして、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラオキシ安息香酸エステル及びチメロサールといった適切な防腐剤を含んでいてもよい。
【００６５】
本医薬品組成物は、従来通り、単位剤形にて提供してもよく、製薬の技術分野において周知な、何らかの方法により調整してもよい。全ての方法は、活性物質を１つ又は複数の副成分を構成要素とする担体と会合させる段階を含む。一般に、該組成物は、活性化合物を液状担体、微細に分割した固形担体、又はその両方と均一かつ密に会合させることによって調製され、その後必要であれば、成形される。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、トローチ剤といった分離した単位として提供されてもよく、各は予定された用量の活性化合物を含んでいる。その他の組成物には、水溶性の液体又はシロップ、エリキシル剤又は乳濁液といった非水溶性の液体による懸濁液が含まれる。
【００６６】
非経口投与に適した組成物は、通常、滅菌した水溶性又は非水溶性調製物を含み、受容者の血液と等張であることが好ましい。該調製物は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いた既知の方法に従って処方されてもよい。滅菌した注射可能な調製物は又、例えば１，３−ブタンジオールといった、無害で非経口の条件を満たす希釈剤又は溶媒よりなる、滅菌した注射可能な溶液又は懸濁液であってもよい。水、リンガー液及び等張食塩水は、使用される可能性のある容認しうる溶媒に含まれる。これに加えて、滅菌した不揮発性油は、通常、溶媒又は懸濁用培地として用いられる。この目的のためには、合成モノ−又はジ−グリセリドを含む、いかなる混合不揮発性油も用いることが出来る。更に、オレイン酸といった脂肪酸も注射可能な調製物に使用することが出来る。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適した担体処方はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡに見いだすことが出来る。
【００６７】
本明細書の記載及び請求を通じて、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」と「ｃｏｎｔａｉｎ」及びこれらの単語のバリエーション、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、は「含まれるがこれに限定しない」ことを意味し、その他の成分、添加物、構成要素、整数又は段階を除外することは意図しておらず、又、実際のところ除外しない。
本明細書の記載及び請求を通じて、文脈が異なる内容を要求しない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈が異なる内容を要求しない限り、明細書は単数形と同様に複数形を考慮するものと理解される。
本発明の特別な態様、実施例又は例示と関連して記載された特色、整数、特徴、化合物、化学成分又はグループは、もし、両立しえないのでないのであれば、ここで記載された他のいかなる態様、実施例又は例示にも適用しうるものと理解される。
【００６８】
本発明の実施例は例示及び以下に示す図を参照して説明される：
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１はヒトインシュリン様成長因子１のアミノ酸配列である。
【図２】図２はヒトＩＧＦ−１受容体ポリペプチド細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
【図３】図３はヒトＩＧＦ−２のアミノ酸配列である。
【図４】図４ａはＩＧＦ−２受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列であり、図４ｂはＩＧＦ−２に対する結合ドメインである。
【図５】図５はヒト成長ホルモンのアミノ酸配列である。
【図６】図６はヒト成長ホルモン受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
【図７】図７はヒトレプチンのアミノ酸配列である。
【図８】図８はヒトレプチン受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
【図９】図９はヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列である。
【図１０】図１０はヒトエリスロポエチン受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
【図１１】図１１はヒトプロラクチンのアミノ酸配列である。
【図１２】図１２はヒトプロラクチン受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
【図１３】図１３はヒトＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列である。
【図１４】図１４はヒトＧ−ＣＳＦ受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
【図１５】図１５はヒトソマトスタチン受容体１のアミノ酸配列である。
【図１６】図１６はヒトＦＳＨαサブユニットのアミノ酸配列である。
【図１７】図１７はヒトＦＳＨβサブユニットのアミノ酸配列である。
【図１８】図１８はヒトＦＳＨ受容体のアミノ酸配列である。
【図１９】図１９はヒトＬＨβサブユニットのアミノ酸配列である。
【図２０】図２０はヒトＬＨ受容体のアミノ酸配列である。
【図２１】図２１はヒトＴＳＨβのアミノ酸配列である。
【図２２】図２２はヒトＴＳＨ受容体のアミノ酸配列である。
【図２３】図２３は成長ホルモンタンデムＧＨＴ−Ｇ１を図示する：ほ乳類細胞にて発現したＧＨ−ＧＨタンデム。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。ＧＨ分泌シグナルは太字かつ小文字で表記。
【図２４】図２４は成長ホルモンタンデムＧＨＴ−Ｇ２を図示する：ほ乳類細胞にて発現したＧＨ−ＧＨタンデム。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。ＴはＳと置き換わっている。ＧＨ分泌シグナルは太字かつ小文字で表記。
【図２５】図２５は成長ホルモンタンデムＧＨＴ−Ｇ３を図示する：ほ乳類細胞にて発現したＧＨ−ＧＨタンデム。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。Ｎの前でＷはＧと置き換わっている。ＧＨ分泌シグナルは太字かつ小文字で表記。
【図２６】図２６は成長ホルモンタンデムＧＨＴ−Ｇ４を図示する：ほ乳類細胞にて発現したＧＨ−ＧＨタンデム。グリコシル化シグナル（ＮＡＴ）はＧ４Ｓユニット間に位置する。ＧＨ分泌シグナルは太字かつ小文字で表記。
【図２７】図２７はインターフェロンβキメラ７Ｂ１−Ｇ１を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。
【図２８】図２８は  インターフェロンβキメラ７Ｂ１−Ｇ２を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。ＴはＳと置き換わっている。
【図２９】図２９はインターフェロンβキメラ７Ｂ１−Ｇ３を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。Ｎの前でＷはＧと置き換わっている。
【図３０】図３０はインターフェロンβキメラ７Ｂ１−Ｇ４を図示する。これはＮＡＴグリコシル化モチーフを取り込んでいる。
【図３１】図３１はインターフェロンβキメラ７Ｄ１−Ｇ０を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。
【図３２】図３２はソマトスタチン−１４タンデム［ＳＭＳ１４−Ｇ１］を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。
【図３３】図３３はソマトスタチン−１４タンデム［ＳＭＳ１４−Ｇ２］を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。ＴはＳと置き換わっている。
【図３４】図３４はソマトスタチン−１４タンデム［ＳＭＳ１４−Ｇ３］を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。Ｎの前でＷはＧと置き換わっている。
【図３５】図３５はソマトスタチン−１４タンデム［ＳＭＳ１４−Ｇ４］を図示する。グリコシル化シグナル（ＮＡＴ）はＧ４Ｓユニット間に位置する。
【図３６】図３６はソマトスタチン−１４タンデム［ＳＭＳ１４−Ｇ６］を図示する。２つのＧ４ＳリピートにてＮはＧと置き換わっている。
【図３７】図３７はソマトスタチン−２８タンデム［ＳＭＳ２８−Ｇ１］を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。
【図３８】図３８はソマトスタチン−２８タンデム［ＳＭＳ２８−Ｇ２］を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。ＴはＳと置き換わっている。
【図３９】図３９はソマトスタチン−２８タンデム［ＳＭＳ２８−Ｇ３］を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。Ｎの前でＷはＧと置き換わっている。
【図４０】図４０はソマトスタチン−２８タンデム［ＳＭＳ２８−Ｇ４］を図示する。グリコシル化シグナル（ＮＡＴ）はＧ４Ｓユニット間に位置する。
【図４１】図４１はソマトスタチン−２８タンデム［ＳＭＳ２８−Ｇ６］を図示する。２つのＧ４ＳリピートにてＮはＧと置き換わっている。
【図４２】図４２はソマトスタチン−２８：ソマトスタチン−１４タンデム［ＳＭＳ２８１４−Ｇ１］を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。
【図４３】図４３はソマトスタチン−１４：ソマトスタチン−２８タンデム［ＳＭＳ１４２８−Ｇ１］を図示する。中央部のＧ４ＳにてＮはＧと置き換わっている。
【図４４】図４４は非還元条件下におけるＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ発現ＧＨタンデム分子のウエスタンブロットを示す。レーン１；ＧＨＴ−０（野生型）、レーン２；ＧＨＴ−１、レーン３；ＧＨＴ−２、レーン４；ＧＨＴ−３、レーン５；ＧＨＴ−４。
【図４５】図４５  野生型ＧＨタンデム（ＧＨＴ−０）又はリンカーによる変異ＧＨタンデム分子（ＧＨＴ−１−４）を発現した形質導入ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞から採取した培地サンプルの生物活性。バイオアッセイは、完全長ＧＨＲを発現したＨｅｋ２９３細胞を用い、ルシフェラーゼ発現とリンクさせたＳＴＡＴ−５レポーター遺伝子アッセイに基づいた。全ての分子研究において該アッセイ中のＧＨ活性が示された。
【図４６ａ】図４６ａは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ１−Ｖ０未処理のアミノ酸配列である。
【図４６ｂ】図４６ｂは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ１−Ｖ０処理済みのアミノ酸配列である。
【図４６ｃ】図４６ｃは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ１−Ｖ１未処理のアミノ酸配列である。
【図４６ｄ】図４６ｄは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ１−Ｖ１処理済みのアミノ酸配列である。
【図４６ｅ】図４６ｅは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ１−Ｖ２未処理のアミノ酸配列である。
【図４６ｆ】図４６ｆは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ１−Ｖ２処理済みのアミノ酸配列である。
【図４７ａ】図４７ａは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ２−Ｖ０未処理のアミノ酸配列である。
【図４７ｂ】図４７ｂは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ２−Ｖ０処理済みのアミノ酸配列である。
【図４７ｃ】図４７ｃは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ２−Ｖ１未処理のアミノ酸配列である。
【図４７ｄ】図４７ｄは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ２−Ｖ１処理済みのアミノ酸配列である。
【図４７ｅ】図４７ｅは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ２−Ｖ２未処理のアミノ酸配列である。
【図４７ｆ】図４７ｆは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ２−Ｖ２処理済みのアミノ酸配列である。
【図４８ａ】図４８ａは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ３−Ｖ０未処理のアミノ酸配列である。
【図４８ｂ】図４８ｂは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ３−Ｖ０処理済みのアミノ酸配列である。
【図４８ｃ】図４８ｃは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ３−Ｖ１未処理のアミノ酸配列である。
【図４８ｄ】図４８ｄは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ３−Ｖ１処理済みのアミノ酸配列である。
【図４８ｅ】図４８ｅは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ３−Ｖ２未処理のアミノ酸配列である。
【図４８ｆ】図４８ｆは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ３−Ｖ２処理済みのアミノ酸配列である。
【図４９ａ】図４９ａは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ４−Ｖ０未処理のアミノ酸配列である。
【図４９ｂ】図４９ｂは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ４−Ｖ０処理済みのアミノ酸配列である。
【図４９ｃ】図４９ｃは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ４−Ｖ１未処理のアミノ酸配列である。
【図４９ｄ】図４９ｄは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ４−Ｖ１処理済みのアミノ酸配列である。
【図４９ｅ】図４９ｅは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ４−Ｖ２未処理のアミノ酸配列である。
【図４９ｆ】図４９ｆは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ７−Ｇ４−Ｖ２処理済みのアミノ酸配列である。
【図５０】図５０ａは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ１−Ｖ０のアミノ酸配列である；  図５０ｂは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ１−Ｖ１のアミノ酸配列である；  図５０ｃは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ１−Ｖ２のアミノ酸配列である；  図５０ｄは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ１−Ｖ３のアミノ酸配列である；  図５０ｅは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ１−Ｖ０のアミノ酸配列である；  図５０ｆは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ１−Ｖ１のアミノ酸配列である；  図５０ｇは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ１−Ｖ２のアミノ酸配列である；  図５０ｈは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ１−Ｖ３のアミノ酸配列である。
【図５１】図５１ａは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ２−Ｖ０のアミノ酸配列である；  図５１ｂは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ２−Ｖ１のアミノ酸配列である；  図５１ｃは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ２−Ｖ２のアミノ酸配列である；  図５１ｄは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ２−Ｖ３のアミノ酸配列である；  図５１ｅは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ２−Ｖ０のアミノ酸配列である；  図５１ｆは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ２−Ｖ１のアミノ酸配列である；  図５１ｇは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ２−Ｖ２のアミノ酸配列である；  図５１ｈは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ２−Ｖ３のアミノ酸配列である。
【図５２】図５２ａは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ３−Ｖ０のアミノ酸配列である；  図５２ｂは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ３−Ｖ１のアミノ酸配列である；  図５２ｃは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ３−Ｖ２のアミノ酸配列である；  図５２ｄは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ３−Ｖ３のアミノ酸配列である；  図５２ｅは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ３−Ｖ０のアミノ酸配列である；  図５２ｆは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ３−Ｖ１のアミノ酸配列である；  図５２ｇは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ３−Ｖ２のアミノ酸配列である；  図５２ｈは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ３−Ｖ３のアミノ酸配列である。
【図５３】図５３ａは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ４−Ｖ０のアミノ酸配列である；  図５３ｂは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ４−Ｖ１のアミノ酸配列である；  図５３ｃは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ４−Ｖ２のアミノ酸配列である；  図５３ｄは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ８−Ｇ４−Ｖ３のアミノ酸配列である；  図５３ｅは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ４−Ｖ０のアミノ酸配列である；  図５３ｆは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ４−Ｖ１のアミノ酸配列である；  図５３ｇは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ４−Ｖ２のアミノ酸配列である；  図５３ｈは成長ホルモン融合ポリペプチド１Ｂ９−Ｇ４−Ｖ３のアミノ酸配列である。
【図５４】図５４ａ  ＥＰＯ−Ｇ１．１は、ほ乳類細胞にて発現したＥＰＯ−Ｌ１−ＥＰＯｒＥＣ（ＥＰＯｒＥＣに（Ｇ４Ｓ）４に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＥＰＯ）のアミノ酸配列である（長さ＝シグナル配列を除いて４０６アミノ酸）。シグナル配列は太字で表記；  図５４ｂ    ＥＰＯ−Ｇ１．２は、ほ乳類細胞にて発現したＥＰＯ−Ｌ２−ＥＰＯｒＥＣ（ＥＰＯｒＥＣに（Ｇ４Ｓ）３に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＥＰＯ）のアミノ酸配列である。配列はほ乳類細胞株にて発現した、シグナル配列を伴う全配列を表す（長さ＝シグナル配列を除いて４０１アミノ酸）。シグナル配列は太字で表記。
【図５５】図５５ａ  ＥＰＯ−Ｇ２．１は、ほ乳類細胞にて発現したＥＰＯ−Ｌ１−ＥＰＯｒＥＣ（ＥＰＯｒＥＣに（Ｇ４Ｓ）４に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＥＰＯ）のアミノ酸配列である（長さ＝シグナル配列を除いて４０６アミノ酸）。シグナル配列は太字で表記；  図５５ｂ  ＥＰＯ−Ｇ２．２は、ほ乳類細胞にて発現したＥＰＯ−Ｌ２−ＥＰＯｒＥＣ（ＥＰＯｒＥＣに（Ｇ４Ｓ）３に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＥＰＯ）のアミノ酸配列である。配列はほ乳類細胞株にて発現した、シグナル配列を伴う全配列を表す（長さ＝シグナル配列を除いて４０１アミノ酸）。シグナル配列は太字で表記。
【図５６】図５６ａ  ＥＰＯ−Ｇ３．１は、ほ乳類細胞にて発現したＥＰＯ−Ｌ１−ＥＰＯｒＥＣ（ＥＰＯｒＥＣに（Ｇ４Ｓ）４に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＥＰＯ）のアミノ酸配列である（長さ＝シグナル配列を除いて４０６アミノ酸）。シグナル配列は太字で表記；  図５６ｂ  ＥＰＯ−Ｇ３．２は、ほ乳類細胞にて発現したＥＰＯ−Ｌ２−ＥＰＯｒＥＣ（ＥＰＯｒＥＣに（Ｇ４Ｓ）３に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＥＰＯ）のアミノ酸配列である。配列はほ乳類細胞株にて発現した、シグナル配列を伴う全配列を表す（長さ＝シグナル配列を除いて４０１アミノ酸）。シグナル配列は太字で表記。
【図５７】図５７ａ  ＥＰＯ−Ｇ４．１は、ほ乳類細胞にて発現したＥＰＯ−Ｌ１−ＥＰＯｒＥＣ（ＥＰＯｒＥＣに（Ｇ４Ｓ）４に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＥＰＯ）のアミノ酸配列である（長さ＝シグナル配列を除いて４０６アミノ酸）。シグナル配列は太字で表記；  図５７ｂ  ＥＰＯ−Ｇ４．２は、ほ乳類細胞にて発現したＥＰＯ−Ｌ２−ＥＰＯｒＥＣ（ＥＰＯｒＥＣに（Ｇ４Ｓ）３に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＥＰＯ）のアミノ酸配列である。配列はほ乳類細胞株にて発現した、シグナル配列を伴う全配列を表す（長さ＝シグナル配列を除いて４０１アミノ酸）。シグナル配列は太字で表記。
【図５８】図５８ａ  ＧＣＳＦ−Ｇ１．１。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−３（Ｉｇ，  ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）をコードするアミノ酸配列。アミノ酸配列長＝５１１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図５８ｂ  ＧＣＳＦ−Ｇ１．２。ほ乳類細胞株で発現した、ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−３（Ｉｇ，  ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ８に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ８−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）をコードするアミノ酸配列。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；アミノ酸配列長＝５２１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図５８ｃ  ＧＣＳＦ−Ｇ１．３。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−２（Ｉｇ及びＢＮ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−２）をコードするアミノ酸配列。アミノ酸配列長＝４０４アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図５８ｄ  ＧＣＳＦ−Ｇ１．４。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン２−３（ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（２−３）をコードするアミノ酸配列。＊は停止コドンを示す。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；  図５８ｅ  ＧＣＳＦ−Ｇ１．８ｂアミノ酸配列長＝４１６アミノ酸（シグナル配列を含まず）；図５８ｅ  ＧＣＳＦ−Ｇ１．５。ＧＣＳＦにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦｒＥＣ（ドメイン１−３）を含むＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）−Ｌ６−ＧＣＳＦをコードするアミノ酸。アミノ酸配列長＝５１１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図５８ｆ  ＧＣＳＦ−Ｇ１．６。ほ乳類細胞株で発現した、ＧＣＳＦにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦｒＥＣ（ドメイン２−３）を含むＧＣＳＦｒＥＣ（２−３）−Ｌ６−ＧＣＳＦをコードするアミノ酸。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；アミノ酸配列長＝４１６アミノ酸（シグナル配列を含まず）。
【図５９】図５９ａ  ＧＣＳＦ−Ｇ２．１。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−３（Ｉｇ，  ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）をコードするアミノ酸配列。アミノ酸配列長＝５１１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図５９ｂ  ＧＣＳＦ−Ｇ２．２。ほ乳類細胞株で発現した、ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−３（Ｉｇ，  ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ８に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ８−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）をコードするアミノ酸配列。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；アミノ酸配列長＝５２１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図５９ｃ  ＧＣＳＦ−Ｇ２．３。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−２（Ｉｇ及びＢＮ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−２）をコードするアミノ酸配列。アミノ酸配列長＝４０４アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図５９ｄ  ＧＣＳＦ−Ｇ２．４。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン２−３（ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（２−３）をコードするアミノ酸配列。＊は停止コドンを示す。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；図ＧＣＳＦ−Ｇ２．８ｂアミノ酸配列長＝４１６アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図５９ｅ  ＧＣＳＦ−Ｇ２．５。ＧＣＳＦにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦｒＥＣ（ドメイン１−３）を含むＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）−Ｌ６−ＧＣＳＦをコードするアミノ酸。アミノ酸配列長＝５１１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図５９ｆ  ＧＣＳＦ−Ｇ２．６。ほ乳類細胞株で発現した、ＧＣＳＦにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦｒＥＣ（ドメイン２−３）を含むＧＣＳＦｒＥＣ（２−３）−Ｌ６−ＧＣＳＦをコードするアミノ酸。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；アミノ酸配列長＝４１６アミノ酸（シグナル配列を含まず）。
【図６０】図６０ａ  ＧＣＳＦ−Ｇ３．１。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−３（Ｉｇ，  ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）をコードするアミノ酸配列。アミノ酸配列長＝５１１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図６０ｂ  ＧＣＳＦ−Ｇ３．２。ほ乳類細胞株で発現した、ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−３（Ｉｇ，  ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ８に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ８−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）をコードするアミノ酸配列。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；アミノ酸配列長＝５２１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図６０ｃ  ＧＣＳＦ−Ｇ３．３。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−２（Ｉｇ及びＢＮ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−２）をコードするアミノ酸配列。アミノ酸配列長＝４０４アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図６０ｄ  ＧＣＳＦ−Ｇ３．４。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン２−３（ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（２−３）をコードするアミノ酸配列。＊は停止コドンを示す。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；図ＧＣＳＦ−Ｇ３．８ｂアミノ酸配列長＝４１６アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図６０ｅ  ＧＣＳＦ−Ｇ３．５。ＧＣＳＦにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦｒＥＣ（ドメイン１−３）を含むＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）−Ｌ６−ＧＣＳＦをコードするアミノ酸。アミノ酸配列長＝５１１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図６０ｆ  ＧＣＳＦ−Ｇ３．６。ほ乳類細胞株で発現した、ＧＣＳＦにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦｒＥＣ（ドメイン２−３）を含むＧＣＳＦｒＥＣ（２−３）−Ｌ６−ＧＣＳＦをコードするアミノ酸。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；アミノ酸配列長＝４１６アミノ酸（シグナル配列を含まず）。
【図６１】図６１ａ  ＧＣＳＦ−Ｇ４．１。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−３（Ｉｇ，  ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）をコードするアミノ酸配列。アミノ酸配列長＝５１１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図６１ｂ  ＧＣＳＦ−Ｇ４．２。ほ乳類細胞株で発現した、ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−３（Ｉｇ，  ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ８に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ８−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）をコードするアミノ酸配列。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；アミノ酸配列長＝５２１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図６１ｃ  ＧＣＳＦ−Ｇ４．３。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン１−２（Ｉｇ及びＢＮ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（１−２）をコードするアミノ酸配列。アミノ酸配列長＝４０４アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図６１ｄ  ＧＣＳＦ−Ｇ４．４。ＧＣＳＦ細胞外受容体ドメイン２−３（ＢＮ及びＢＣ）にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦを含むＧＣＳＦ−Ｌ６−ＧＣＳＦｒＥＣ（２−３）をコードするアミノ酸配列。＊は停止コドンを示す。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；図ＧＣＳＦ−Ｇ４．８ｂアミノ酸配列長＝４１６アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図６１ｅ  ＧＣＳＦ−Ｇ４．５。ＧＣＳＦにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦｒＥＣ（ドメイン１−３）を含むＧＣＳＦｒＥＣ（１−３）−Ｌ６−ＧＣＳＦをコードするアミノ酸。アミノ酸配列長＝５１１アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図６１ｆ  ＧＣＳＦ−Ｇ４．６。ほ乳類細胞株で発現した、ＧＣＳＦにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＧＣＳＦｒＥＣ（ドメイン２−３）を含むＧＣＳＦｒＥＣ（２−３）−Ｌ６−ＧＣＳＦをコードするアミノ酸。シグナル配列は太字かつ小文字で表記；アミノ酸配列長＝４１６アミノ酸（シグナル配列を含まず）
【図６２】図６２ａ  ＩＦＮ−Ｇ１．１はＬＲ  ７Ａ１のアミノ酸配列である；  図６２ｂ  ＩＦＮ−Ｇ１．２はＬＲ  ７Ｂ１のアミノ酸配列である；  図６２ｃ  ＩＦＮ−Ｇ１．３はＬＲ  ７Ｃ１のアミノ酸配列である；  図６２ｄ  ＩＦＮ−Ｇ１．４はＬＲ  ７Ｄ１のアミノ酸配列である；  図６２ｅ  ＩＦＮ−Ｇ１．５はＬＲ  ａ７Ｂ１のアミノ酸配列である。
【図６３】図６３ａ  ＩＦＮ−Ｇ２．１はＬＲ  ７Ａ１のアミノ酸配列である；  図６３ｂ  ＩＦＮ−Ｇ２．２はＬＲ  ７Ｂ１のアミノ酸配列である；  図６３ｃ  ＩＦＮ−Ｇ２．３はＬＲ  ７Ｃ１のアミノ酸配列である；  図６３ｄ  ＩＦＮ−Ｇ２．４はＬＲ  ７Ｄ１のアミノ酸配列である；  図６３ｅ  ＩＦＮ−Ｇ２．５はＬＲ  ａ７Ｂ１のアミノ酸配列である。
【図６４】図６４ａ  ＩＦＮ−Ｇ３．１はＬＲ  ７Ａ１のアミノ酸配列である；  図６４ｂ  ＩＦＮ−Ｇ３．２はＬＲ  ７Ｂ１のアミノ酸配列である；  図６４ｃ  ＩＦＮ−Ｇ３．３はＬＲ  ７Ｃ１のアミノ酸配列である；  図６４ｄ  ＩＦＮ−Ｇ３．４はＬＲ  ７Ｄ１のアミノ酸配列である；  図６４ｅ  ＩＦＮ−Ｇ３．５はＬＲ  ａ７Ｂ１のアミノ酸配列である。
【図６５】図６５ａ  ＩＦＮ−Ｇ４．１はＬＲ  ７Ａ１のアミノ酸配列である；  図６５ｂ  ＩＦＮ−Ｇ４．２はＬＲ  ７Ｂ１のアミノ酸配列である；  図６５ｃ  ＩＦＮ−Ｇ４．３はＬＲ  ７Ｃ１のアミノ酸配列である；  図６５ｄ  ＩＦＮ−Ｇ４．４はＬＲ  ７Ｄ１のアミノ酸配列である；  図６５ｅ  ＩＦＮ−Ｇ４．５はＬＲ  ａ７Ｂ１のアミノ酸配列である。
【図６６】図６６ａ  ＩＧＦ１−Ｇ１．１はＬＲ５Ａ１のアミノ酸配列である；  図６６ｂ  ＩＧＦ１−Ｇ１．２はＬＲ５Ｂ１のアミノ酸配列である；  図６６ｃ  ＩＧＦ１−Ｇ１．３はＬＲ５Ｃ１のアミノ酸配列である；  図６６ｄ  ＩＧＦ１−Ｇ１．４はＬＲ５Ｄ１のアミノ酸配列である；  図６６ｅ  ＩＧＦ１−Ｇ１．５はＬＲ５Ｅ１のアミノ酸配列である；  図６６ｆ  ＩＧＦ１−Ｇ１．６はＬＲ５Ｆ１のアミノ酸配列である。
【図６７】図６７ａ  ＩＧＦ１−Ｇ２．１はＬＲ５Ａ１のアミノ酸配列である；  図６７ｂ  ＩＧＦ１−Ｇ２．２はＬＲ５Ｂ１のアミノ酸配列である；  図６７ｃ  ＩＧＦ１−Ｇ２．３はＬＲ５Ｃ１のアミノ酸配列である；  図６７ｄ  ＩＧＦ１−Ｇ２．４はＬＲ５Ｄ１のアミノ酸配列である；  図６７ｅ  ＩＧＦ１−Ｇ２．５はＬＲ５Ｅ１のアミノ酸配列である；  図６７ｆ  ＩＧＦ１−Ｇ２．６はＬＲ５Ｆ１のアミノ酸配列である。
【図６８】図６８ａ  ＩＧＦ１−Ｇ３．１はＬＲ５Ａ１のアミノ酸配列である；  図６８ｂ  ＩＧＦ１−Ｇ３．２はＬＲ５Ｂ１のアミノ酸配列である；  図６８ｃ  ＩＧＦ１−Ｇ３．３はＬＲ５Ｃ１のアミノ酸配列である；  図６８ｄ  ＩＧＦ１−Ｇ３．４はＬＲ５Ｄ１のアミノ酸配列である；  図６８ｅ  ＩＧＦ１−Ｇ３．５はＬＲ５Ｅ１のアミノ酸配列である；  図６８ｆ  ＩＧＦ１−Ｇ３．６はＬＲ５Ｆ１のアミノ酸配列である。
【図６９】図６９ａ  ＩＧＦ１−Ｇ４．１はＬＲ５Ａ１のアミノ酸配列である；  図６９ｂ  ＩＧＦ１−Ｇ４．２はＬＲ５Ｂ１のアミノ酸配列である；  図６９ｃ  ＩＧＦ１−Ｇ４．３はＬＲ５Ｃ１のアミノ酸配列である；  図６９ｄ  ＩＧＦ１−Ｇ４．４はＬＲ５Ｄ１のアミノ酸配列である；  図６９ｅ  ＩＧＦ１−Ｇ４．５はＬＲ５Ｅ１のアミノ酸配列である；  図６９ｆ  ＩＧＦ１−Ｇ４．６はＬＲ５Ｆ１のアミノ酸配列である。
【図７０】図７０ａ  ＩＬ２−Ｇ１．１はＬＲ６Ａ１のアミノ酸配列である；  図７０ｂ  ＩＬ２−Ｇ１．２はＬＲ６Ｂ１のアミノ酸配列である；  図７０ｃ  ＩＬ２−Ｇ１．３はＬＲ６Ｃ１のアミノ酸配列である；  図７０ｄ  ＩＬ２−Ｇ１．４はＬＲ６Ｄ１のアミノ酸配列である；  図７０ｅ  ＩＬ２−Ｇ１．５はＬＲ６Ｅ１のアミノ酸配列である；  図７０ｆ  ＩＬ２−Ｇ１．６はＬＲ６Ｅ２のアミノ酸配列である；  図７０ｇ  ＩＬ２−Ｇ１．７はＬＲ６Ｆ１のアミノ酸配列である；  図７０ｈ  ＩＬ２−Ｇ１．８はＬＲ融合ＩＬ７ｓｓ−ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７Ｒαのアミノ酸配列である；  図７０ｉ  ＩＬ２−Ｇ１．９はＬＲ融合ＩＬ７ｓｓ−ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ２Ｒγのアミノ酸配列である；  図７０ｊ  ＩＬ２−Ｇ１．１０はＬＲ融合ＩＬ７Ｒａｓｓ−ＩＬ７Ｒα−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７０ｋ  ＩＬ２−Ｇ１．１１はＬＲ融合ＩＬ２ｇｓｓ−ＩＬ２γ−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７０ｌ  ＩＬ２−Ｇ１．１２はＬＲ融合ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７Ｒαのアミノ酸配列である；  図７０ｍ  ＩＬ２−Ｇ１．１３はＬＲ融合ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ２Ｒγのアミノ酸配列である；  図７０ｎ  ＩＬ２−Ｇ１．１４はＬＲ融合ＩＬ７Ｒα−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７０ｏ  ＩＬ２−Ｇ１．１５はＬＲ融合ＩＬ２γ−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７０ｐ  ＩＬ２−Ｇ１．１６はＬＲａ７Ｂ１のアミノ酸配列である。
【図７１】図７１ａ  ＩＬ２−Ｇ２．１はＬＲ６Ａ１のアミノ酸配列である；  図７１ｂ  ＩＬ２−Ｇ２．２はＬＲ６Ｂ１のアミノ酸配列である；  図７１ｃ  ＩＬ２−Ｇ２．３はＬＲ６Ｃ１のアミノ酸配列である；  図７１ｄ  ＩＬ２−Ｇ２．４はＬＲ６Ｄ１のアミノ酸配列である；  図７１ｅ  ＩＬ２−Ｇ２．５はＬＲ６Ｅ１のアミノ酸配列である；  図７１ｆ  ＩＬ２−Ｇ２．６はＬＲ６Ｅ２のアミノ酸配列である；  図７１ｇ  ＩＬ２−Ｇ２．７はＬＲ６Ｆ１のアミノ酸配列である；  図７１ｈ  ＩＬ２−Ｇ２．８はＬＲ融合ＩＬ７ｓｓ−ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７Ｒαのアミノ酸配列である；  図７１ｉ  ＩＬ２−Ｇ２．９はＬＲ融合ＩＬ７ｓｓ−ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ２Ｒγのアミノ酸配列である；  図７１ｊ  ＩＬ２−Ｇ２．１０はＬＲ融合ＩＬ７Ｒａｓｓ−ＩＬ７Ｒα−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７１ｋ  ＩＬ２−Ｇ２．１１はＬＲ融合ＩＬ２ｇｓｓ−ＩＬ２γ−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７１ｌ  ＩＬ２−Ｇ２．１２はＬＲ融合ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７Ｒαのアミノ酸配列である；  図７１ｍ  ＩＬ２−Ｇ２．１３はＬＲ融合ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ２Ｒγのアミノ酸配列である；  図７１ｎ  ＩＬ２−Ｇ２．１４はＬＲ融合ＩＬ７Ｒα−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７１ｏ  ＩＬ２−Ｇ２．１５はＬＲ融合ＩＬ２γ−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７１ｐ  ＩＬ２−Ｇ２．１６はＬＲａ７Ｂ１のアミノ酸配列である；
【図７２】図７２ａ  ＩＬ２−Ｇ３．１はＬＲ６Ａ１のアミノ酸配列である；  図７２ｂ  ＩＬ２−Ｇ３．２はＬＲ６Ｂ１のアミノ酸配列である；  図７２ｃ  ＩＬ２−Ｇ３．３はＬＲ６Ｃ１のアミノ酸配列である；  図７２ｄ  ＩＬ２−Ｇ３．４はＬＲ６Ｄ１のアミノ酸配列である；  図７２ｅ  ＩＬ２−Ｇ３．５はＬＲ６Ｅ１のアミノ酸配列である；  図７２ｆ  ＩＬ２−Ｇ３．６はＬＲ６Ｅ２のアミノ酸配列である；  図７２ｇ  ＩＬ２−Ｇ３．７はＬＲ６Ｆ１のアミノ酸配列である；  図７２ｈ  ＩＬ２−Ｇ３．８はＬＲ融合ＩＬ７ｓｓ−ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７Ｒαのアミノ酸配列である；  図７２ｉ  ＩＬ２−Ｇ３．９はＬＲ融合ＩＬ７ｓｓ−ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ２Ｒγのアミノ酸配列である；  図７２ｊ  ＩＬ２−Ｇ３．１０はＬＲ融合ＩＬ７Ｒａｓｓ−ＩＬ７Ｒα−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７２ｋ  ＩＬ２−Ｇ３．１１はＬＲ融合ＩＬ２ｇｓｓ−ＩＬ２γ−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７２ｌ  ＩＬ２−Ｇ３．１２はＬＲ融合ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７Ｒαのアミノ酸配列である；  図７２ｍ  ＩＬ２−Ｇ３．１３はＬＲ融合ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ２Ｒγのアミノ酸配列である；  図７２ｎ  ＩＬ２−Ｇ３．１４はＬＲ融合ＩＬ７Ｒα−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７２ｏ  ＩＬ２−Ｇ３．１５はＬＲ融合ＩＬ２γ−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７２ｐ  ＩＬ２−Ｇ３．１６はＬＲａ７Ｂ１のアミノ酸配列である；
【図７３】図７３ａ  ＩＬ２−Ｇ４．１はＬＲ６Ａ１のアミノ酸配列である；  図７３ｂ  ＩＬ２−Ｇ４．２はＬＲ６Ｂ１のアミノ酸配列である；  図７３ｃ  ＩＬ２−Ｇ４．３はＬＲ６Ｃ１のアミノ酸配列である；  図７３ｄ  ＩＬ２−Ｇ４．４はＬＲ６Ｄ１のアミノ酸配列である；  図７３ｅ  ＩＬ２−Ｇ４．５はＬＲ６Ｅ１のアミノ酸配列である；  図７３ｆ  ＩＬ２−Ｇ４．６はＬＲ６Ｅ２のアミノ酸配列である；  図７３ｇ  ＩＬ２−Ｇ４．７はＬＲ６Ｆ１のアミノ酸配列である；  図７３ｈ  ＩＬ２−Ｇ４．８はＬＲ融合ＩＬ７ｓｓ−ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７Ｒαのアミノ酸配列である；  図７３ｉ  ＩＬ２−Ｇ４．９はＬＲ融合ＩＬ７ｓｓ−ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ２Ｒγのアミノ酸配列である；  図７３ｊ  ＩＬ２−Ｇ４．１０はＬＲ融合ＩＬ７Ｒａｓｓ−ＩＬ７Ｒα−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７３ｋ  ＩＬ２−Ｇ４．１１はＬＲ融合ＩＬ２ｇｓｓ−ＩＬ２γ−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７３ｌ  ＩＬ２−Ｇ４．１２はＬＲ融合ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７Ｒαのアミノ酸配列である；  図７３ｍ  ＩＬ２−Ｇ４．１３はＬＲ融合ＩＬ７−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ２Ｒγのアミノ酸配列である；  図７３ｎ  ＩＬ２−Ｇ４．１４はＬＲ融合ＩＬ７Ｒα−（Ｇ４Ｓ）４−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７３ｏ  ＩＬ２−Ｇ４．１５はＬＲ融合ＩＬ２γ−（Ｇ４Ｓ）５−ＩＬ７のアミノ酸配列である；  図７３ｐ  ＩＬ２−Ｇ４．１６はＬＲａ７Ｂ１のアミノ酸配列である；
【図７４】図７４ａ  レプチン(LEPTIN)−Ｇ１．１はＬＲ２Ａ１のアミノ酸配列である；  図７４ｂ  レプチン−Ｇ１．２はバクテリア発現の為に改変したＬＲ２Ａ１のアミノ酸配列である；  図７４ｃ  レプチン−Ｇ１．３はＬＲ２Ｂ１のアミノ酸配列である；  図７４ｄ  レプチン−Ｇ１．４はＬＲ２Ｄ１のアミノ酸配列である；  図７４ｅ  レプチン−Ｇ１．５はＬＲ２Ｅ１のアミノ酸配列である；  図７４ｆ  レプチン−Ｇ１．６はＬＲ２Ｆ１のアミノ酸配列である；  図７４ｇ  レプチン−Ｇ１．７はＬＲ２Ｇ１のアミノ酸配列である；  図７４ｈ  レプチン−Ｇ１．８はＬＲ２Ｈ１のアミノ酸配列である；  図７４ｉ  レプチン−Ｇ１．９はＬＲ２Ｉ１のアミノ酸配列である；  図７４ｊ  レプチン−Ｇ１．１０はＬＲ２Ｊ１のアミノ酸配列である；  図７４ｋ  レプチン−Ｇ１．１１はＬＲ２Ｋ１のアミノ酸配列である；  図７４ｌ  レプチン−Ｇ１．１２はＬＲ２Ｌ１のアミノ酸配列である；  図７４ｍ  レプチン−Ｇ１．１３はＬＲ２Ｍ１のアミノ酸配列である；
【図７５】図７５ａ  レプチン−Ｇ２．１はＬＲ２Ａ１のアミノ酸配列である；  図７５ｂ  レプチン−Ｇ２．２はバクテリア発現の為に改変したＬＲ２Ａ１のアミノ酸配列である；  図７５ｃ  レプチン−Ｇ２．３はＬＲ２Ｂ１のアミノ酸配列である；  図７５ｄ  レプチン−Ｇ２．４はＬＲ２Ｄ１のアミノ酸配列である；  図７５ｅ  レプチン−Ｇ２．５はＬＲ２Ｅ１のアミノ酸配列である；  図７５ｆ  レプチン−Ｇ２．６はＬＲ２Ｆ１のアミノ酸配列である；  図７５ｇ  レプチン−Ｇ２．７はＬＲ２Ｇ１のアミノ酸配列である；  図７５ｈ  レプチン−Ｇ２．８はＬＲ２Ｈ１のアミノ酸配列である；  図７５ｉ  レプチン−Ｇ２．９はＬＲ２Ｉ１のアミノ酸配列である；  図７５ｊ  レプチン−Ｇ２．１０はＬＲ２Ｊ１のアミノ酸配列である；  図７５ｋ  レプチン−Ｇ２．１１はＬＲ２Ｋ１のアミノ酸配列である；  図７５ｌ  レプチン−Ｇ２．１２はＬＲ２Ｌ１のアミノ酸配列である；  図７５ｍ  レプチン−Ｇ２．１３はＬＲ２Ｍ１のアミノ酸配列である；
【図７６】図７６ａ  レプチン−Ｇ３．１はＬＲ２Ａ１のアミノ酸配列である；  図７６ｂ  レプチン−Ｇ３．２はバクテリア発現の為に改変したＬＲ２Ａ１のアミノ酸配列である；  図７６ｃ  レプチン−Ｇ３．３はＬＲ２Ｂ１のアミノ酸配列である；  図７６ｄ  レプチン−Ｇ３．４はＬＲ２Ｄ１のアミノ酸配列である；  図７６ｅ  レプチン−Ｇ３．５はＬＲ２Ｅ１のアミノ酸配列である；  図７６ｆ  レプチン−Ｇ３．６はＬＲ２Ｆ１のアミノ酸配列である；  図７６ｇ  レプチン−Ｇ３．７はＬＲ２Ｇ１のアミノ酸配列である；  図７６ｈ  レプチン−Ｇ３．８はＬＲ２Ｈ１のアミノ酸配列である；  図７６ｉ  レプチン−Ｇ３．９はＬＲ２Ｉ１のアミノ酸配列である；  図７６ｊ  レプチン−Ｇ３．１０はＬＲ２Ｊ１のアミノ酸配列である；  図７６ｋ  レプチン−Ｇ３．１１はＬＲ２Ｋ１のアミノ酸配列である；  図７６ｌ  レプチン−Ｇ３．１２はＬＲ２Ｌ１のアミノ酸配列である；  図７６ｍ  レプチン−Ｇ３．１３はＬＲ２Ｍ１のアミノ酸配列である；
【図７７】図７７ａ  レプチン−Ｇ４．１はＬＲ２Ａ１のアミノ酸配列である；  図７７ｂ  レプチン−Ｇ４．２はバクテリア発現の為に改変したＬＲ２Ａ１のアミノ酸配列である；  図７７ｃ  レプチン−Ｇ４．３はＬＲ２Ｂ１のアミノ酸配列である；  図７７ｄ  レプチン−Ｇ４．４はＬＲ２Ｄ１のアミノ酸配列である；  図７７ｅ  レプチン−Ｇ４．５はＬＲ２Ｅ１のアミノ酸配列である；  図７７ｆ  レプチン−Ｇ４．６はＬＲ２Ｆ１のアミノ酸配列である；  図７７ｇ  レプチン−Ｇ４．７はＬＲ２Ｇ１のアミノ酸配列である；  図７７ｈ  レプチン−Ｇ４．８はＬＲ２Ｈ１のアミノ酸配列である；  図７７ｉ  レプチン−Ｇ４．９はＬＲ２Ｉ１のアミノ酸配列である；  図７７ｊ  レプチン−Ｇ４．１０はＬＲ２Ｊ１のアミノ酸配列である；  図７７ｋ  レプチン−Ｇ４．１１はＬＲ２Ｋ１のアミノ酸配列である；  図７７ｌ  レプチン−Ｇ４．１２はＬＲ２Ｌ１のアミノ酸配列である；  図７７ｍ  レプチン−Ｇ４．１３はＬＲ２Ｍ１のアミノ酸配列である；
【図７８】図７８ａ  ＰＲＬ−Ｇ１．１は８Ｂ７ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔアミノ酸蛋白配列にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬである；４３９アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図７８ｂ  ＰＲＬ−Ｇ１．２は８Ｂ８ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬ（Ｇ１２９Ｒ変異）である。シグナル配列は太字で表記。Ｇ１２９Ｒ変異は反転表示；（４３９アミノ酸はシグナル配列を含まず）；  図７８ｃ  ＰＲＬ−Ｇ１．３は８Ｂ９ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬ（Ｎ末端残基１−９欠損／Ｃ１１Ｓ／Ｇ１２９Ｒ変異）より構成される。シグナル配列は太字で表記。Ｃ１１Ｓ及びＧ１２９Ｒ変異は反転表示；４３０アミノ酸（シグナル配列を含まず）。
【図７９】図７９ａ  ＰＲＬ−Ｇ２．１は８Ｂ７ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔアミノ酸蛋白配列にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬである；４３９アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図７９ｂ  ＰＲＬ−Ｇ２．２は８Ｂ８ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬ（Ｇ１２９Ｒ変異）である。シグナル配列は太字で表記。Ｇ１２９Ｒ変異は反転表示；（４３９アミノ酸はシグナル配列を含まず）；  図７９ｃ  ＰＲＬ−Ｇ２．３は８Ｂ９ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬ（Ｎ末端残基１−９欠損／Ｃ１１Ｓ／Ｇ１２９Ｒ変異）より構成される。シグナル配列は太字で表記。Ｃ１１Ｓ及びＧ１２９Ｒ変異は反転表示；４３０アミノ酸（シグナル配列を含まず）。
【図８０】図８０ａ  ＰＲＬ−Ｇ３．１は８Ｂ７ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔアミノ酸蛋白配列にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬである；４３９アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図８０ｂ  ＰＲＬ−Ｇ３．２は８Ｂ８ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬ（Ｇ１２９Ｒ変異）である。シグナル配列は太字で表記。Ｇ１２９Ｒ変異は反転表示；（４３９アミノ酸はシグナル配列を含まず）；  図８０ｃ  ＰＲＬ−Ｇ３．３は８Ｂ９ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬ（Ｎ末端残基１−９欠損／Ｃ１１Ｓ／Ｇ１２９Ｒ変異）より構成される。シグナル配列は太字で表記。Ｃ１１Ｓ及びＧ１２９Ｒ変異は反転表示；４３０アミノ酸（シグナル配列を含まず）
【図８１】図８１ａ  ＰＲＬ−Ｇ４．１は８Ｂ７ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔアミノ酸蛋白配列にＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬである；４３９アミノ酸（シグナル配列を含まず）；  図８１ｂ  ＰＲＬ−Ｇ４．２は８Ｂ８ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬ（Ｇ１２９Ｒ変異）である。シグナル配列は太字で表記。Ｇ１２９Ｒ変異は反転表示；（４３９アミノ酸はシグナル配列を含まず）；  図８１ｃ  ＰＲＬ−Ｇ４．３は８Ｂ９ｖ２のアミノ酸配列であり、これはＰＲＬＲｅｘｔにＧ４Ｓｘ６に基づく糖修飾リンカーを介して連結したＰＲＬ（Ｎ末端残基１−９欠損／Ｃ１１Ｓ／Ｇ１２９Ｒ変異）より構成される。シグナル配列は太字で表記。Ｃ１１Ｓ及びＧ１２９Ｒ変異は反転表示；４３０アミノ酸（シグナル配列を含まず）。
【図８２】表１は全長ソマトスタチン１受容体中のドメイン及び全長アミノ酸配列を示す。
【図８３】表２は全長ＦＳＨ受容体中のドメイン及び全長アミノ酸配列を示す。
【図８４】表３は全長ＬＨ受容体中のドメイン及び全長アミノ酸配列を示す；
【図８５】表４は全長ＴＳＨ受容体中のドメイン及び全長アミノ酸配列を示す；そして表５は例及び図に引用された成長ホルモンタンデム構造の命名を示す。
【実施例】
【００７０】
材料と方法
免疫学的試験
融合蛋白又は受容体のポリクローナル及びモノクローナル抗体との結合を評価するイムノアッセイは当該技術分野において既知である。市販されている抗体は、サンプル中の融合蛋白又は受容体を検出するのに利用することが出来、また、競合阻害試験にも利用出来る。
【００７１】
融合蛋白の組み換え産生
融合蛋白の構成要素は、リガンド又は受容体にアニーリングし、ターゲットベクターへのクローニングに適した制限部位を導入するように設計されたプライマーを使用したＰＣＲ法により、産生される。本ＰＣＲ法のテンプレートはターゲット遺伝子を含み、これはＩＭＡＧＥクローン、ｃＤＮＡライブラリ又は注文合成遺伝子から入手できる。適当な制限部位をフランキング領域に伴うリガンド及び受容体遺伝子を合成した後、これらをターゲットベクター中のリンカー領域のいずれかのサイドで連結する。本コンストラクトを以下に示す様な修飾をすることにより、誤りのないリンカーを含み、フランキング領域中の制限部位を除いたものとした；リンカー領域のいずれかのサイドにある唯一の制限部位間へのカスタム合成したＤＮＡ部分の挿入、ｓｓＤＮＡ修飾技術によるリンカー領域の変異、適当な制限部位間へのプライマーデュプレックス／マルチプレックスの挿入又はＰＣＲによる修飾。
別の方法としては、最初に、所望のリガンド又は受容体領域に連結すべくデザインされたフランキング領域を伴うリンカーを、オリゴヌクレオチドデュプレックス及び二重鎖ＤＮＡを形成するべく処理されたものを作成することにより、合成した。その後、本リンカー配列を“メガプライマー”として用いてＰＣＲを行った。メガプライマーとは、リガンド及び受容体の逆のエンドに対してデザインされたプライマーであり、該メガプライマーは、鋳型としてのリガンド及び受容体に、及び、と共に、連結される。末端プライマーは、所望の発現ベクターへの連結の為の適切な制限部位を伴うべくデザインした。
【００７２】
グリコシル化融合蛋白の発現及び精製
発現は適当な系（例えば、ほ乳類ＣＨＯ細胞）において行われ、これはＬＲ融合遺伝子を産生するベクターによって使い分けた。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡの１つ又は複数を含みうる様々な方法を用いて発現を分析した。
適当なレベルの発現がなされた後、ＬＲ融合蛋白をより大規模に発現させ、精製及びその後の分析に十分な量の蛋白を産生した。
精製は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水結合クロマトグラフィー、硫安沈殿、ゲルろ過、分子篩クロマトグラフィー及び／又はアフィニティークロマトグラフィー（ニッケル／コバルトレジン、抗体不動化レジン及び／又はリガンド／受容体不動化レジン）といったクロマトグラフィー技術の１つ又は複数の適当な組み合わせを用いて行った。
精製蛋白は、ブラッドフォード法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎａｔｉｖｅ  ＳＤＳ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡの１つ又は複数を含みうる様々な方法を用いて、分析した。
【００７３】
グリコシル化融合蛋白の評価
融合蛋白を分析するのに、変性ＰＡＧＥ、ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥゲル及びウエスタンブロットを用い、ウエスタンブロットは該融合蛋白の高次構造に関係なく反応する抗体を用いて行われた。溶液中で未変性状態にある蛋白の分子量に関する情報は、スーパーロースＧ２００分析カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィー及び分析用超遠心分離といった技術により取得することが出来た。
【００７４】
成長ホルモンタンデム分子の合成
本方法は、蛋白の分子量を増加するためにグリコシル化リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒの様々な繰り返しよりなる）を用いる。Ｎ結合型グリコシル化認識配列は、直列に連結したＧＨ分子のリンカー領域（配列はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒのいずれかより構成され、ここでＸはプロリン以外のいずれかのアミノ酸）に挿入する。
全ての分子は合成遺伝子であり、ほ乳類の発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ−ｌｉｎｋに連結した。蛋白は分泌産物として、成長ホルモン分泌シグナルの制御の下、発現した。
【００７５】
ほ乳類での安定発現
ほ乳類での発現系は、改変したインビトロゲンのベクターｐＳｅｃＴａｇ−Ｖ５／ＦＲＴ−Ｈｉｓｔを用いて確立されている。
【００７６】
インビトロゲンのＦｌｐ−Ｉｎシステム
本システムは高発現可能な宿主ゲノム中の特定部位に挿入した安定なクローンを急速に産生することを可能とする。該システムは分泌型又は細胞質発現型蛋白のいずれにおいても利用しうる。Ｆｌｐ−Ｉｎ宿主細胞株（ｆｌｐ−ｉｎ  ＣＨＯ）は、転写活性のある遺伝子座に位置するＦｌｐリコンビナーゼ標的（ＦＲＴ）部位を１か所だけ有している。
安定細胞株はベクター（ＦＲＴ標的部位を含む）及びｐＯＧ４４（ｆｌｐリコンビナーゼを一過的に発現するプラスミド）をＦｌｐ−Ｉｎ細胞株に共導入することにより産生する。分泌にはハイグロマイシンＢを用いた。ＤＮＡの挿入位置は指定されるので、クローン選択は不要である。Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞株の培養：作成説明書に従い、基本的な細胞培養技術を用いた。
【００７７】
Ｆｕｇｅｎｅ−６を用いたＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞の安定導入
導入前日、ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＨａｍｓ  Ｆ１２培地（全容量１０ｍｌ）中にて、１００ｍｍペトリ皿につき６  ｘ  １０Ｅ５ずつ播種した。翌日、５７０μｌの無血清培地（抗生物質不含）を１．５ｍｌ  ポリプロピレンチューブに加えた。その後、３０μｌのＦｕｇｅｎｅ−６を加え、穏やかに回転させることで混合した。２μｇの所望のプラスミドを１８μｇのｐＯＧ４４（プラスミドの宿主ゲノムへの正確な組み込みのために必要なリコンビナーゼ酵素を含むプラスミド）と組み合わせたプラスミド混合物を、それぞれの導入ごとに別々に用意した。対照群はプラスミドを含めなかった。これをｆｕｇｅｎｅ−６と、穏やかに回転させることで混合し、室温にて１５分間静置後、Ｆ１２培地＋１０％  ＦＣＳ中のＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞を含む各ペトリ皿表面に滴下投与した。該皿を穏やかに回転させ、確実に混合した上で、３７℃／５％  ＣＯ２条件下にて２４時間維持した。翌日、培地を、６００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含む選択用培地に交換した。細胞は常に６０％又はそれ以下の細胞密度に維持した。細胞は、対照群の細胞（非導入細胞）が死滅するまで（即ち、ハイグロマイシン非耐性）、６００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ存在下で培養維持した。
【００７８】
安定ＣＨＯ細胞株からの発現評価
所望の蛋白を発現しているＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞株を、コンフルエントな状態で、７５ｃｍ２フラスコ中で、無血清培地にておよそ３−４日間培養し、各サンプルを採取、２５ｍＭ  ＤＴＴ存在下又は非存在下で同容量のＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液と混合し、６５℃にて１５分間加熱した。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、ＰＶＤＦ膜に転写した。  ＰＢＳ−０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０中の５％（ｗ／ｖ）ミルク蛋白によりブロッキングした後、セイヨウワサビ  ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役２次抗体と共にＧＨ特異的抗体を用いてサンプルの検出を行った。可視化は、ＨＲＰ検出キットを用いた写真用フィルム上への化学発光により行った。
【００７９】
一過的導入からの発現評価
ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞は、６穴プレートの各ウェルに、全容量２ｍｌの培地（ＤＭＥＭ，  Ｆ１２，  １０％  ＦＣＳ＋Ｐ／Ｓ＋Ｌ−グルタミン＋ゼオシン）中で０．２５ｘ１０Ｅ６細胞ずつ播種した。細胞は一晩培養維持した。細胞に対して、表１に記載した指定の試薬比率にて、ＴｒａｎｓＩＴ−ＣＨＯ試薬（Ｍｉｒｕｓ）又はｆｕｇｅｎｅ−６を用いて導入を行った。手短に記載すると、ＴｒａｎｓＩＴ試薬を使用した場合、無血清培地（ＯＰＴＩ  ＭＥＭ）２００μｌを導入ごとに１．５ｍｌ  ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆチューブに加え、その後、２μｌ  ＤＮＡを添加した。該チューブを室温にて１５分間維持した。その後、１μｌのＣＨＯ  Ｍｏｊｏ試薬を加え、混合しさらに１５分間維持した。培地を無血清に替えてから、この導入用混合物を適切なウェルの表面にピペットにて滴下した。Ｆｕｇｅｎｅ−６試薬を使用した場合、手短に記載すると、無血清培地（ＯＰＴＩ  ＭＥＭ）９４μｌを導入ごとに１．５ｍｌ  ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆチューブに加え、その後、２μｌ  ＤＮＡを添加した。該チューブを室温にて１５分間維持した。この導入用混合物を、無血清培地を含んだ、適切なウェルの表面にピペットにて滴下した。全てのプレートは３７℃／５％  ＣＯ２にて２−３日間培養維持した。必要な場合は、アセトン沈殿により、サンプルを濃縮した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図５０ａ】
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【図５０ｂ】
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【図５０ｃ】
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【図５０ｄ】
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【図５０ｅ】
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【図５０ｆ】
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【図５０ｇ】
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【図５０ｈ】
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【図５１ａ】
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【図５１ｂ】
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【図５１ｃ】
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【図５１ｄ】
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【図５１ｅ】
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【図５１ｆ】
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【図５１ｇ】
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【図５１ｈ】
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【図５２ａ】
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【図５２ｂ】
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【図５２ｃ】
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【図５２ｄ】
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【図５２ｅ】
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【図５２ｆ】
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【図５２ｇ】
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【図５２ｈ】
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【図５３ａ】
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【図５３ｂ】
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【図５３ｃ】
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【図５３ｄ】
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【図５３ｅ】
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【図５３ｆ】
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【図５３ｇ】
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【図５３ｈ】
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【図５４ａ】
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【図５４ｂ】
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【図５５ａ】
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【図５５ｂ】
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【図５６ａ】
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【図５６ｂ】
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【図５７ａ】
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【図５７ｂ】
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【図５８ａ】
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【図５８ｂ】
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【図５８ｃ】
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【図５８ｄ】
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【図５８ｅ】
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【図５８ｆ】
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【図５９ａ】
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【図５９ｂ】
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【図５９ｃ】
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【図５９ｄ】
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【図５９ｅ】
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【図５９ｆ】
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【図６０ａ】
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【図６０ｂ】
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【図６０ｃ】
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【図６０ｄ】
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【図６０ｅ】
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【図６０ｆ】
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【図６１ａ】
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【図６１ｂ】
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【図６１ｃ】
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【図６１ｄ】
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【図６１ｅ】
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【図６１ｆ】
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【図６２ａ】
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【図６２ｂ】
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【図６２ｃ】
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【図６２ｄ】
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【図６２ｅ】
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【図６３ａ】
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【図６３ｂ】
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【図６３ｃ】
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【図６３ｄ】
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【図６３ｅ】
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【図６４ａ】
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【図６４ｂ】
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【図６４ｃ】
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【図６４ｄ】
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【図６４ｅ】
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【図６５ａ】
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【図６５ｂ】
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【図６５ｃ】
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【図６５ｄ】
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【図６５ｅ】
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【図６６ａ】
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【図６６ｂ】
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【図６６ｃ】
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【図６６ｄ】
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【図６６ｅ】
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【図６６ｆ】
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【図６７ａ】
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【図６７ｂ】
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【図６７ｃ】
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【図６７ｄ】
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【図６７ｅ】
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【図６７ｆ】
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【図６８ａ】
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【図６８ｂ】
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【図６８ｃ】
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【図６８ｄ】
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【図６８ｅ】
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【図６８ｆ】
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【図６９ａ】
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【図６９ｂ】
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【図６９ｃ】
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【図６９ｄ】
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【図６９ｅ】
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【図６９ｆ】
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【図７０ａ】
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【図７０ｂ】
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【図７０ｃ】
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【図７０ｄ】
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【図７０ｅ】
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【図７０ｆ】
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【図７０ｇ】
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【図７０ｈ】
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【図７０ｉ】
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【図７０ｊ】
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【図７０ｋ】
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【図７０ｌ】
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【図７０ｍ】
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【図７０ｎ】
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【図７０ｏ】
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【図７０ｐ】
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【図７１ａ】
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【図７１ｂ】
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【図７１ｃ】
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【図７１ｄ】
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【図７１ｅ】
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【図７１ｆ】
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【図７１ｇ】
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【図７１ｈ】
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【図７１ｉ】
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【図７１ｊ】
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【図７１ｋ】
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【図７１ｌ】
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【図７１ｍ】
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【図７１ｎ】
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【図７１ｏ】
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【図７１ｐ】
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【図７２ａ】
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【図７２ｂ】
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【図７２ｃ】
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【図７２ｄ】
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【図７２ｅ】
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【図７２ｆ】
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【図７２ｇ】
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【図７２ｈ】
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【図７２ｉ】
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【図７２ｊ】
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【図７２ｋ】
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【図７２ｌ】
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【図７２ｍ】
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【図７２ｎ】
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【図７２ｏ】
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【図７２ｐ】
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【図７３ａ】
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【図７３ｂ】
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【図７３ｃ】
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【図７３ｄ】
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【図７３ｅ】
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【図７３ｆ】
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【図７３ｇ】
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【図７３ｈ】
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【図７３ｉ】
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【図７３ｊ】
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【図７３ｋ】
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【図７３ｌ】
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【図７３ｍ】
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【図７３ｎ】
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【図７３ｏ】
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【図７３ｐ】
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【図７４ａ】
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【図７４ｂ】
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【図７４ｃ】
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【図７４ｄ】
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【図７４ｅ】
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【図７４ｆ】
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【図７４ｇ】
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【図７４ｈ】
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【図７４ｉ】
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【図７４ｊ】
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【図７４ｋ】
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【図７４ｌ】
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【図７４ｍ】
2011512134.tif 000221
【図７５ａ】
2011512134.tif 000222
【図７５ｂ】
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【図７５ｃ】
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【図７５ｄ】
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【図７５ｅ】
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【図７５ｆ】
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【図７５ｇ】
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【図７５ｈ】
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【図７５ｉ】
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【図７５ｊ】
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【図７５ｋ】
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【図７５ｌ】
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【図７５ｍ】
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【図７６ａ】
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【図７６ｂ】
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【図７６ｃ】
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【図７６ｄ】
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【図７６ｅ】
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【図７６ｆ】
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【図７６ｇ】
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【図７６ｈ】
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【図７６ｉ】
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【図７６ｊ】
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【図７６ｋ】
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【図７６ｌ】
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【図７６ｍ】
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【図７７ａ】
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【図７７ｂ】
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【図７７ｃ】
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【図７７ｄ】
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【図７７ｅ】
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【図７７ｆ】
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【図７７ｇ】
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【図７７ｈ】
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【図７７ｉ】
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【図７７ｊ】
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【図７７ｋ】
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【図７７ｌ】
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【図７７ｍ】
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【図７８ａ】
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【図７８ｂ】
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【図７８ｃ】
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【図７９ａ】
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【図７９ｂ】
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【図７９ｃ】
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【図８０ａ】
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【図８０ｂ】
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【図８０ｃ】
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【図８１ａ】
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【図８１ｂ】
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【図８１ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図４５】
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【図４６ａ】
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【図４６ｂ】
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【図４６ｃ】
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【図４６ｄ】
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【図４６ｅ】
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【図４６ｆ】
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【図４７ａ】
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【図４７ｂ】
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【図４７ｃ】
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【図４７ｄ】
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【図４７ｅ】
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【図４７ｆ】
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【図４８ａ】
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【図４８ｂ】
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【図４８ｃ】
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【図４８ｄ】
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【図４８ｅ】
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【図４８ｆ】
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【図４９ａ】
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【図４９ｂ】
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【図４９ｃ】
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【図４９ｄ】
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【図４９ｅ】
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【図４９ｆ】
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【図８２】
2011512134.tif 000309
【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2011512134.tif 000313
2011512134.tif 000314
2011512134.tif 000315