(57)【要約】  本発明は、薬学および医化学の分野に属し、一般式（Ｉ）によって表わされる新規な分子（特にＦＭ１９Ｇ１１と呼ばれる分子）およびこれらの分子を含有する薬学的組成物に関連する。上記薬理学的に最適化された組成物は、低酸素誘導性写因子（ＨＩＦ）によって修飾された、癌、炎症、組織修復、幹細胞の分化、および再生医療に関連する病理的プロセスに直接的および／または間接的に関与する、遺伝子の転写を修飾および／または阻害することができる。本発明は、さらに上記分子（Ｉ）を合成する方法に関連し、また、上述の病理的プロセスを治療するための薬物の製造における該分子（Ｉ）の使用方法にも関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で表わされ、
【化１】
2011517664.tif 000039
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は互いに独立して以下の（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかであればよく、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）分枝がある、あるいは直線状の−（ＣＨ２）ｎ−Ｈアルキル基（ただし、必要に応じて不飽和度を有する）であって、ｎ＝１〜１０であり、好ましくはメチルまたはエチルである、
（ｉｉｉ）−ＣＯＯＨカルボン酸または式−ＣＯＯＲで表わされるエステル（ただし、Ｒは分枝がある、あるいは直線状の−（ＣＨ２）ｎ−Ｈアルキル基（必要に応じて不飽和度を有する）であって、ｎ＝１〜１０であり、好ましくはメチルまたはエチルである）、
（ｉｖ）−ＯＨヒドロキシル基、−ＮＯ２基、
（ｖ）ハロゲン；−ＣＨａ３基（ただし、Ｈａはハロゲン）であって、好ましくはＣＦ３である、
（ｖｉ）−ＮＨＣＯＲ（ただしＲは、分枝がある、あるいは直線状の−（ＣＨ２）ｎ−Ｈアルキル基（必要に応じて不飽和度を有する）であって、ｎ＝１〜１０であり、好ましくはメチルまたはエチルである）、
ｘ、ｙ、およびｚは＝１〜４であり、
２−（４−メトキシフェニル）−２−オキソエチル３−（２，４−（ジニトロ）ベンズアミド）ベンゾアート（ただし、Ｒ１は２，４−ｄｉ−ＮＯ２、Ｒ２はＨ、Ｒ３は４−ＯＭｅ）および２−４−（ニトロフェニル）−２−オキソエチル３−（４−ブロモ）ベンズアミド）ベンゾアート（ただし、Ｒ１は４−Ｂｒ、Ｒ２はＨ、Ｒ３は４−ＮＯ２）を除く、化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
ＦＭ１９Ｇ１１と呼ばれ、Ｒ１が２，４−ｄｉ−ＮＯ２であり、Ｒ２が−Ｈであり、Ｒ３が−ＣＨ３（４）である、請求項１に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項３】
Ｒ１が２−ＮＯ２、４−ＣＦ３であり、Ｒ２が−Ｈであり、Ｒ３が−ＣＨ３（７）である、請求項１に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項４】
Ｒ１が２−ＣＦ３、４−ＮＯ２であり、Ｒ２が−Ｈであり、Ｒ３が−ＣＨ３（１０）である、請求項１に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項５】
Ｒ１が２−４−ＣＦ３であり、Ｒ２が−Ｈであり、Ｒ３が−ＣＨ３（１３）である、請求項１に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項６】
Ｒ１が−Ｈであり、Ｒ２が−Ｈであり、Ｒ３が−ＣＨ３（１６）である、請求項１に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項７】
Ｒ１が２−４−ＮＯ２であり、Ｒ２が−Ｈであり、Ｒ３が−ＣＦ３（１７）である、請求項１に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項８】
Ｒ１が２−４−ＮＯ２であり、Ｒ２が−Ｈであり、Ｒ３が−Ｈ（１９）である、請求項１に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項９】
Ｒ１が４−ＮＯ２であり、Ｒ２が−Ｈであり、Ｒ３が−ＣＨ３（２２）である、請求項１に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
Ｒ１が２−ＮＯ２であり、Ｒ２が−Ｈであり、Ｒ３が−ＣＨ３（２５）である、請求項１に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
Ｒ１が２−４−ＮＯ２であり、Ｒ２が−Ｈであり、Ｒ３が−ＯＨ（２６）である、請求項１に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
Ｒ１が２−４  ＮＯ２であり、Ｒ２が−Ｈであり、Ｒ３が−ＣＯ２Ｈ（２９）である、請求項１に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の、ＦＭ１９Ｇ１１と呼ばれる一般式（Ｉ）で表わされる化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を得るための方法であって、以下のスキームに示すステップを含む方法。
【化２】
2011517664.tif 000040
【請求項１４】
低酸素誘導性写因子（ＨＩＦ）により修飾された遺伝子の転写を調節する薬物を調製するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項１５】
ＨＩＦ、ＶＥＧＦ、ＰＨＤ３、ＭＭＲ類、Ｓｏｘ２、およびＯｃｔ３／４の群から選択される、１つ以上の遺伝子の転写を調節する薬物を調製するための、請求項１４に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項１６】
Ｎａｎｏｇ、Ｎｏｔｃｈ１、ｐ５３、およびｐ３００の群から選択される、１つ以上の遺伝子の転写を調節する薬物を調製するための、請求項１４に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項１７】
低酸素条件下でＨＩＦの自己分泌制御において、該ＨＩＦの転写を阻害する薬物を調製するための、請求項１５または１６に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項１８】
低酸素条件下でＨＩＦ１αおよびＨＩＦ２αの転写を顕著に阻害する薬物を調製するための、請求項１７に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項１９】
低酸素条件下でＶＥＧＦおよび／またはＰＨＤ３の転写を顕著に阻害する薬物を調製するための、請求項１５に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項２０】
低酸素条件下および正常酸素条件下でＭＭＲ修復遺伝子の発現を誘導する薬物を調製するための、請求項１５に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項２１】
低酸素条件下および正常酸素条件下で上記ＭＭＲ修復遺伝子であるＭＳＨ６およびＭＬＨ１の発現を誘導する薬物を調製するための、請求項２０に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項２２】
上記薬物が、低酸素条件によって引き起こされる腫瘍の表現型に関連する、ゲノムの不安定性を防止する、請求項２０または２１に記載の利用。
【請求項２３】
正常酸素条件下でＳｏｘ２およびＯｃｔ３／４の発現を誘導する薬物を調製するための、請求項１５に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項２４】
正常酸素条件下でＮａｎｏｇおよび／またはＮｏｔｃｈの発現を誘導する薬物を調製するための、請求項１６に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項２５】
上記薬物は、幹細胞集団の増加を誘導し、該幹細胞の自己再生を増加させる、請求項２３または２４に記載の利用。
【請求項２６】
低酸素条件下でＳｏｘ２およびＯｃｔ３／４の発現レベルを低減する薬物を調製するための、請求項１５に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項２７】
低酸素条件下でｐ５３腫瘍阻害因子の発現を誘導する薬物を調製するための、請求項１６に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項２８】
上記誘導が成人の歯髄幹細胞内で起こる、請求項２７に記載の利用。
【請求項２９】
上記薬物の作用形態は、ｍＴＯＲ経路の活性化を誘導する、請求項２６または２７に記載の利用。
【請求項３０】
上記ｍＴＯＲ経路の活性化は、ＤＮＡ損傷に対する応答を誘発し、その結果、ｐ５３が活性化し、ｐ５３依存的に細胞周期のＧ１／Ｓ期停止を引き起こす、請求項２９に記載の利用。
【請求項３１】
低酸素条件下でｐ３００の発現を修飾する薬物を調製するための、請求項１６に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項３２】
上記薬物によって、後成的な現象によるクロマチンリモデリングが可能になる、請求項３１に記載の使用方法。
【請求項３３】
血管新生の病理を治療するための薬物を調製するための、請求項１４〜３２のいずれか一項に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項３４】
癌を治療するための薬物を調製するための、請求項１４〜３３のいずれか一項に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項３５】
上記癌が、乳癌、結腸癌、膀胱癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、甲状腺癌、胃癌、肝癌、リンパ腫、またはメラノーマである、請求項１４〜３４のいずれか一項に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項３６】
腫瘍を治療するための薬物を調製するための、請求項１４〜３３のいずれか一項に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項３７】
炎症の原因となる病理を治療するための薬物を調製するための、請求項１４〜３３のいずれか一項に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項３８】
再生医学に用いるための、請求項１４〜３３のいずれか一項に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項３９】
幹細胞の分化に関連する用途に用いるための、請求項３８に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項４０】
組織の変性の原因となる病理を治療するための薬物を調製するための、請求項１４〜３３のいずれか一項に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩の利用。
【請求項４１】
薬学的に有効な量の、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩と、
キャリアまたは希釈液、および／または生理学的に許容可能な補助剤とを含んでなる、薬学的組成物。
【請求項４２】
上記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、ＦＭ１９Ｇ１１（４）、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩である、請求項４１に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
請求項１４〜４０のいずれか一項の記載にしたがって、血管新生の病理の治療または防止するのに利用可能な、請求項４１または４２に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物を有する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の薬学的組成物、キャリアまたは希釈液、および／または１つ以上の補助剤を備え、個々の病例において、組成物の投与ルートに応じて１つ以上の容器に共にまたは別々に収容されていてもよい、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、薬学および医化学の分野に属し、一般式（Ｉ）によって表わされる新規な分子（特にＦＭ１９Ｇ１１と呼ばれる分子）およびこれらの分子を含有する薬学的組成物に関する。上記薬学的に最適化された組成物は、低酸素誘導性写因子（；以後“ＨＩＦ”）によって修飾された、癌、炎症、組織修復、幹細胞の分化、および再生医療に関連する病理的プロセスに直接的および／または間接的に関与する、遺伝子の転写を修飾および／または阻害することができる。
【０００２】
本発明は、さらに上記分子（Ｉ）の合成方法に関するとともに、上述の病理的プロセスを治療するための薬物の製造における該分子（Ｉ）の使用方法にも関する。
【０００３】
〔背景技術〕
実質的に、生物の細胞はすべて、栄養分のレベルの変化に対して敏感であって、中でも酸素は、細胞生理学において最も重要である。細胞の酸素レベルの低下は、例えば、新しい血管を形成する内皮細胞における細胞増殖（つまり、血管新生として知られる現象）における酸素の重要性に密接に関連している。腫瘍細胞は、酸素の枯渇に対して、一連の特徴的な遺伝子を活性化することによって応答する。これにより、腫瘍細胞は、この悪条件に対して生き延び、反応することができるようになる。最近、低酸素誘導性写因子（ＨＩＦ）が、酸素の欠如に対する細胞応答の主要制御因子として、複数の研究の対象となっている。また、科学文献において、ＨＩＦは、癌、炎症、心血管病理および神経変性病理、ならびに一般に血管新生病理と称される病理（例えば、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、動脈硬化プラーク、子宮内膜症、クローン病、乾癬、良性前立腺肥大、および癌など）の病理的プロセスに広く関連している（Folkman, “Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery? “ Nat. Rev. Drug Disc., 2007; 6, 273-286; Mazure, “Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression" Nature, 2006; 44, 437- 443）。治療は、特に癌の治療の場合、異なる作用様式および非蓄積的な毒性を有する複数の活性化合物の混合物である組成物を、ますます利用するようになってきている。したがって、併用療法を実施するためには、腫瘍学的な疾病に対する治療において、非常に多くの効果的な化合物の特性を特定することが必要であり、現在の個別化医療の傾向をさらに考慮すれば、この必要性は特に大きい。
【０００４】
幹細胞は、診療において応用できる潜在的な可能性だけでなく、腫瘍のプロセスの病因の研究に特に関連している。ある種の脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫、髄芽腫、および星状細胞腫）は、例えば、ある種の神経の前駆体と同様の多分化能を有する細胞を含有している、という証拠がある。低酸素が、成体幹細胞の未分化プロセスに密接に関連する因子であることは、最近検証された。実際に、いくつかの成体幹細胞の位置は、低酸素領域および／または高度に血管新生した領域に一致する（Palmer et al. “Vascular niche for adult hippocampal neurogenesis, "The Journal of Comparative Neurology 2000; 425, 479-494.; Maurer et al., “Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in rat neural stem cells" Neurosci. Lett. 2003; 344, 165-168）。同じ組織に由来する幹細胞は、同じ微小環境に曝されることによって易感染性となり、また影響を受け、このような幹細胞を使用することが、病変した細胞系の再生のためのアッセイにおいて効率的な代替策となり得る。したがって、本発明は、さらに、再生医学の現代の分野に潜在的に関連する。
【０００５】
〔ＨＩＦおよび癌〕
低酸素現象の根底にある細胞および分子的な基礎は、複雑かつ多様であるが、鍵となる分子がいくつか知られるようになってきた。酸素レベルの低下（低酸素状態）に対する細胞の適応応答は、特徴的な遺伝子発現パターンを誘導することによって行われる。低酸素に対する細胞応答を調節する、鍵となるこれら分子のうちの１つが、低酸素誘導性写因子（ＨＩＦ）である。ＨＩＦは、２つのサブユニットからなるヘテロ二量体である。これらサブユニットは、恒常的に発現（ＨＩＦ  １β）することも、低酸素に誘導されて発現（ＨＩＦ１α、ＨＩＦ２α）することもある。正常酸素条件下では、ＨＩＦ１αおよびＨＩＦ２αは、ユビキチン化プロセスおよびプロテアソームによる急速な分解プロセスを介して制御されるため、検出不可能である。ＶＨＬ発癌遺伝子タンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の認識基質として作用する。Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体は、ＨＩＦ１αおよびＨＩＦ２αにシグナルを送り、ＨＩＦ１αおよびＨＩＦ２αは、プロテアソームによって分解される。ＶＨＬ／ＨＩＦ１α複合体およびＶＨＬ／ＨＩＦ２α複合体は、どちらも、タンパク質内に配置された２つのプロリン残基に特異的な水酸化に依存する。なお、この水酸化は、２−オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ（プロリル−ヒドロキシラーゼ）の新しいファミリーによって触媒される（Semenza G.L. "Targeting HIF-1 for cancer therapy" Nature Rev. 2003; 3, 721-732; Lando D. et al. “Oxygen-dependent regulation of hypoxia-inducible factors by prolyl and asparaginyl hydroxylation" Eur J Biochem. 2003; 270, 781-90）。これら酵素における酸素が触媒反応に必要であるので、後者が、酸素の存在に対する実際のセンサーであり、ＨＩＦ１α／ＨＩＦ２αの細胞質レベルを調節すると、一般に認容されている。細胞が正常酸素圧下にあり、かつ能動態的な増殖をしているという条件では、その増殖、および増殖因子によってトリガーされる生存経路は、ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＲａｓ／ＲＡＦ／ＭＥＫＫシグナル経路の活性化により、ＨＩＦ１α／ＨＩＦ２αの発現を誘導することが観察される（Poulaki V. et al. “Acute intensive insulin therapy exacerbates diabetic blood-retinal barrier breakdown via hypoxia-inducible factor-1alpha and VEGF" J Clin Invest. 2002 ; 109, 805-15; Hudson C.C. et al. "Regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha expression and function by the mammalian target of rapamycin" Mol Cell Biol. 2002; 22:7004-14; Guba M. et al., "Rapamycin inhibits primary and metastatic tumor growth by antiangiogenesis: involvement of vascular endothelial growth factor" Nat. Med 2002 ; 8, 128-35）。細胞が酸素欠乏に直面すると、ＨＩＦ１α／ＨＩＦ２αがサイトゾルに蓄積し、この蓄積によって、ＨＩＦ１α／ＨＩＦ２αは、ＨＩＦ１βと相互作用し、核に転位する。そして、２００を超える互いに異なる遺伝子が活性化する。これら遺伝子は、ＨＩＦの標的遺伝子として記述され、これら転写因子によって誘導される細胞応答を媒介する。（Semenza G.L. "Targeting HIF-1 for cancer therapy" Nature Rev. 2003; 3, 721-732; Paul S.A et al., “HIF at the crossroads between ischemia and carcinogenesis" J. Cel. Physiol. 2004; 200, 20-30）。ＨＩＦにより誘導される遺伝子の一部は、増殖因子として知られている分子因子に含まれる。この増殖因子の例をいくつか挙げると、血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔ���ｒ；  ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；  ＩＧＦ）、およびトランスフォーミング増殖因子β（ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β；  ＴＧＦβ）などがある。能動態的な細胞増殖のプロセスに、細胞中の酸素欠乏の発生が直接的または間接的に関与していることを考慮すれば、低酸素は、生理的な特徴として考えてもよい。細胞の酸素レベルの低下、およびその結果として起こる、細胞質ＨＩＦタンパク質の安定化は、骨髄由来の循環内皮細胞の補充、ならびに虚血性プロセスおよび腫瘍プロセスにおいて血管新生を促進する血管内皮細胞の増殖などの効果を生じる（Harris et al., “Hypoxia a key regulatory factor in tumour growth." Nat Rev Cancer. 2002; 2, 38-47; Takahashi T. et al., “Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization" Nat Med. 1999; 5, 434-8）。ＨＩＦは、エネルギー、生存、血管新生、細胞遊走、および細胞接着代謝に関連する反応を媒介する多種多様な遺伝子によって調節され得る。また、腫瘍増殖プロモーターとしてのＨＩＦの重要性は、実証されている（Mazure, “Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression", Nature 2006; 44, 437- 443; Semenza G.L. "Targeting HIF-1 for cancer therapy" Nature Rev. 2003; 3, 721-732）。ＨＩＦは、酸素恒常性の「コントローラ」として作用すること、および細胞の生存および増殖を促進することに加えて、プログラム細胞死（アポトーシス）誘導因子としての機能を有し、低酸素にある組織内に存在する応答であり得るアポトーシス促進性の遺伝子を誘導する（Pouyssegur et al., “Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression" Nature 2006; 441, 437-443）。
【０００６】
また、ＫｅｉｔｈおよびＳｉｍｏｎは、幹細胞におけるＨＩＦ活性の低減により、その幹細胞の分化が促進し、放射線療法および化学療法後における悪性の表現型を有する細胞の再増殖が減少するであろうと提案している（Keith, B and Simon, MC, (2007) Hypoxia-inducible factors, stem cells, and cancer. Cell 129: 465-72.）。ＨＩＦの安定化は、血管新生促進性のサイトカイン（例えば、血管内皮増殖因子）の放出またはアポトーシスによって、放射線療法に対する腫瘍の脈管構造の耐性を促進する（Moeller BJ, Cao Y, Li CY, Dewhirst MW. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 2004 May;5(5):429-41.); Moeller BJ, Dreher MR, Rabbani ZN, Schroeder T, Cao Y, Li CY, Dewhirst MW, Pleiotropic effects of HIF-1 blockade on tumor radiosensitivity. Cancer Cell. 2005 Aug;8(2):99-110）。したがって、ＨＩＦの活性化をブロックすることは、ある病理学では、複数の研究者によって非常に望ましいと考えられている。ＨＩＦが活性化されて腫瘍増殖を促進する方法について、考察しているレビューもある（Rankin EB, Giaccia AJ. The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis. Cell Death Differ. 2008 Apr;15(4):678-85. Epub 2008 Feb 15; Peinado H, Cano A. A hypoxic twist in metastasis. Nat Cell Biol. 2008 Mar;10(3):253-4; Bertout JA, Patel SA, Simon MC. The impact of O2 availability on human cancer. Nat Rev Cancer. 2008 Dec;8(12):967-75）。これらの理由により、ＨＩＦのタンパク質が薬学的な標的として考えられ、新薬を発見するために、複数の戦略が立てられている。ただし、それに続く規制当局による薬の認可には必要とされる毒性プロファイルにおいて、薬学的な要件に適応しない阻害剤が多い。徹底した調査が２０年を超える時間をかけてなされてきたが、それでもなお、ＨＩＦの転写活性およびタンパク質の発現を修飾する新しい化合物または小分子の探索は、可能であり、かつ推奨される。こうすることによって、ＨＩＦ阻害剤を、単独でまたは血管新生の病理に対して効果的なその他の薬との組み合わせにおいて、抗腫瘍薬としてまたは再生医学において、さらに移植医療において使用される幹細胞の前条件づけにおいて使用する手法が開発された。
【０００７】
幹細胞の特性を有する複数種の腫瘍細胞が単離されて以来、腫瘍幹細胞という概念について、世界中の科学者の間で関心が集まっている。低酸素条件は、細胞周期のＳ期におけるＤＮＡ複製中にＤＮＡに生じる変異のための修復遺伝子（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ  ｇｅｎｅｓ；  ＭＭＲ）の発現を減少させるという分子現象を促進することが知られている（Mihaylova VT, et al., “Decreased expression of the DNA mismatch repair gene Mlh1 under hypoxic stress in mammalian cells" Mol Cell Biol. 2003 May; 23(9):3265-3273.）。例えば遺伝性非ポリープ性結腸癌（ｎＰＣＣ）などのある種の疾病は、これら修復遺伝子の欠損に関連している。その欠損の結果、ＤＮＡのマイクロサテライト配列が不安定になり、また、修復遺伝子の欠損は、ｎＰＣＣ腫瘍の９５％、孤発性の結腸腫瘍の１５％において検出される。幹細胞は長時間持続する。そして、遺伝子材料の修復システムの動作条件が悪化している場合、幹細胞は、半減期が短い他の種類の細胞に比べて、変異を蓄積する可能性が高くなる。幹細胞において低酸素条件下でこれらのＭＭＲ遺伝子が減少すると、未修復の変異が増加して蓄積する可能性があり、さらにこの増加・蓄積により悪性表現型を獲得する可能性が高くなり得る。過去に発表された研究結果を考慮すれば、修復遺伝子の発現は、抑制後、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）として知られる）により回復され得ることが知られている（Cameron EE, et al., “Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer" Nat Genet. 1999 Jan; 21(1):103-107.）。この薬剤は、遺伝子のプロモーター領域に配置されているヒストンのアセチル化の程度を高めることができる。この薬剤は、クロマチンに対し、遺伝子を調節する転写因子がアクセス可能な高次構造を付与する。癌を遅らせるまたは防止する遺伝子をある薬剤が回復させるという事実があれば、その薬は抗腫瘍薬の候補となる。ＴＳＡは、現在、乳癌治療の前臨床段階にある薬剤である（Vigushin DM, et al., “Trichostatin A is a histone deacetylase inhibitor with potent antitumor activity against breast cancer in vivo" Clin Cancer Res. 2001 Apr; 7(4):971-6）。
【０００８】
〔ＨＩＦおよび再生医学〕
ある発癌性のプロセスの病因は、幹細胞の潜在的な自己再生能および分化能に密接に関連しており（Clarke MF. “Neurobiology: at the root of brain cancer" Nature, 2004; 432, 281-2.）、再生医学の治療可能性に関連している。幹細胞の分裂、分化、および機能のプロセスは、栄養分や酸素の利用可能性などを含めた、環境からの複雑なシグナルによって調節される。成人の脳においてだけではなく、胚発生の間にも、生理的な低酸素は、互いに異なる前駆細胞および幹細胞の増殖および未分化に関連している（Studer L et al., “Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen." ., J Neurosci.,2000; 20(19), 7377-83; Morrison SJ, et al. “Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells." J Neurosci. 2000; 20(19), 7370-6）。最近の結果によれば、神経幹細胞は、高い血管新生ニッチに関連しており、ＨＩＦが中枢神経系発生において必須であることが実証されている（Sharp F.R. and Bernaudin M, “HIF1 and oxygen sensing in the brain.", Nature Rev. 2004, 5, 437-448; Ryan E R, Lo J & Johnson, “HIF-1 alpha is required for solid tumor formation and embryonic vascularization." EMBO J., 1998; 17, 3005-3015; Ding and Schultz, “A role for chemistry in stem cell biology" Nature Biotech., 2004; 22, 833-840）。最近の結果は、分子レベルの低酸素メカニズムと、異なる組織において細胞分化プロセスを媒介する、分子の未分化因子（例えば転写因子ＮｏｔｃｈやＯｃｔ−４など）との相乗作用も実証している。低酸素による、これら２つの重要な細胞シグナル経路間の相乗作用により、これら重要な未分化マーカーを介した細胞分化経路が調節される（Gustafsson and et al., “Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state." Developmental Cell, 2005; 9, 617-628; Covello et al., “HIF-2alpha regulates Oct-4: effects of hypoxia on stem cell function, embryonic development, and tumor growth." Genes & Development 2006; 20, 557-570）。
【０００９】
本発明では、以下の幹細胞モデルを使用した。
・Ｃ１７．２細胞株。これは、多能性の神経の前駆物質の細胞株であって、新生仔ネズミの小脳の外顆粒層に由来し、レトロウイルスを介したｖ−ｍｙｃ遺伝子の導入によって不死化される（Snyder EY, et al., “Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum" Cell. 1992 Jan; 10(68), 33-51）。この細胞株は、均一な神経前駆体を際限なく提供し、操作性の観点から神経幹細胞であると考えられる（Parker MA, et al., “Expression profile of an operationally-defined neural stem cell clone. 1", Exp Neurol. 2005 Aug, 194(2), 320-32）。これらの細胞は、新生仔ネズミの小脳に移植されると、小脳の正常発生に関与する。これらの細胞は異常な可塑性を有し、脳損傷を受けると患部に向かって移動し、分化してニューロンまたはグリアとなり、他の神経細胞に結合したり他の神経細胞からの結合を受けたりし、さらに、損傷した組織の正常な細胞構築に関わるが腫瘍は形成しない（Snyder et al., “Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum" Cell. 1992 Jan; 10(68), 33-51）。これらの理由によって、神経変性疾患において神経を再生させるための細胞治療および移植として、上記細胞が有用である可能性が提案されている（Wei-Guo Liu, et al. “Dopaminergic neuroprotection by nurturing-expressing c17.2 neural stem cells in a rat model of Parkinson disease" Parkinsonism and Related Disorders 2007; 13, 77-88; Snyder EY, et al., “Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex." Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Oct; 14, 94(21), 11663-8）。Ｃ１７．２は、一旦移植されると腫瘍化の表現型へと進化するように見えるだけではなく、腫瘍細胞に対してハラスメントまたは迫害的な行動を示すように見える。神経膠腫が発生しているマウスの脳にＣ１７．２が注射されると、これらの細胞は、腫瘍の侵入エッジに向かって移動し、その周囲を囲んだ。上記細胞は、主要な腫瘍の塊から逃げた悪性細胞の小さい島を囲む能力をも有している（Aboody KS, et al.“Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas.", Proc Natl Acad Sci USA 2000 Nov 7; 97(23), 12393-5）。本願発明者らは、これらの細胞を、遺伝子治療の研究に使える可能性のある道具であると考える。なぜならば、該細胞は、腫瘍の塊に対して作用する、治療に用いられる可能性のある遺伝子を放出できるからである。さらに、Ｃ１７．２は、脊髄再生モデルにおいてアッセイされている（Teng YD, “Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells.", Proc Natl Acad Sci USA 2002 Mar 5; 99(5), 3024-9）。これらの細胞が注射された動物において、影響された肢の機能回復が観察された。この機能回復は、損傷した領域において浸漬された神経線維の部分再生に起因している可能性がある。Ｏｕｒｅｄｎｉｋらは、動物のパーキンソン病のモデルにおいて、これらの細胞がドーパミン神経機能の再確立に対して、どのように寄与するのかを示している（Ourednik J et al., “Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons" Nat Biotechnol. 2002 Nov 20; 11, 1103-10）。この場合、遺伝子治療における上記細胞の潜在的能力が、上記細胞が果たすことのできる、神経プロテクターとしての役割、または損傷したニューロンおいて機能を再確立する中での��割とともに、再度示された。
・中枢神経系（ＣＮＳ）の上衣の領域および上衣下の領域からの、成人の神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）の初代培養。魚や有尾目の両生類のように、ある種の成体の脊椎動物において、脊髄は再生成可能である。ただし、脊椎動物のほとんどがこの潜在的能力を発生の途中で失ってしまう。有尾目の両生類の脊髄において、軸索は、成長して、損傷の前に神経支配した構造と再接続するだけではなく、失われたニューロンおよびグリア細胞を置き替えることもできる。この再生の源は、中央のチャネルに並んで、軟膜の表面まで延びている上衣細胞の集団であるように見える（Egar M, Singer M “The role of ependyma in spinal cord regeneration in the urodele, Triturus" Exp Neurol 1972; 37, 422-430; Benraiss A, et al. “Adenoviral brain-derived neurotrophic factor induces both neostriatal and olfactory neuronal recruitment from endogenous progenitor cells in the adult forebrain." J Neurosci 2001; 21, 6718-6731; Echeverri K. and Tanaka EM “Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration." Science 2002; 298, 1993-1996; Ferretti et al." Changes in spinal cord regenerative ability through phylogenesis and development: lessons to be learnt.", Dev Dyn 2003; 226, 245-256.）。いくつかの中枢神経系損傷のモデルにおいて、上衣細胞の増殖および分化の存在について記載されている。このことは、再生力を有する内在性の源の存在を暗示している（Johansson CB, et al. “Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system.", Cell 1999; 96, 25-34）。この神経発生プロセスは、炎症性のプロセスを提示し、その結果、軸索変性および脱髄、ならびに脊髄の外的損傷が発生する、両方のモデルにおいて（どちらも多発性硬化症において）記載されている（Danilov et al., “Neurogenesis in the adult spinal cord in an experimental model of multiple sclerosis.". European J Neuroscience 2006; 23, 394-400; Ke Y, et al. “Early response of endogenous adult neural progenitor cells to acute spinal cord injury in mice." Stem Cells 2006. Published online）。ただし、神経発生プロセスが起こるという事実にもかかわらず、これらの神経の前駆物質は、変性組織を置き替えて、失われた機能を回復させるには不十分である。成体の哺乳類において、脊髄の中央のチャネルに並んだ上衣細胞は、インビトロで、ニューロスフェア（神経幹細胞によって形成されるコロニー）を形成することができる（Danilov A, et al. “Neurogenesis in the adult spinal cord in an experimental model of multiple sclerosis." European J Neuroscience 2006; 23, 394 - 400）。脳の脳室下の領域に由来する成体幹細胞は、インビトロで、未分化スフェロイドとして増殖し、ニューロン、アストロサイト、またはオリゴデンドロサイトに分化する（Weiss S, et al. “Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis" J Neuroscience 1996; 16, 7599-7609）。したがって、上記成体幹細胞は、損傷した髄質の組織を再構築するために至適な道具である。ただし、これらの幹細胞のインビボの移植からは、良好な結果が得られない。これらの細胞は、未分化の状態のまま残るか、またはアストログリアの表現型をともなって出現して神経膠瘢痕に寄与するかのいずれかである（Ricci-Vitiani L, et al. “Influence of local environment on the differentiation of neural stem cells engrafted onto the injured spinal cord." Neurol Res. 2006; 28(5), 488-92）。したがって、成人の神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）、特に中枢神経系（ＣＮＳ）の上衣の領域および上衣下の��域の神経前駆細胞の初代培養は、生理的に低酸素の環境に存在する幹細胞の振る舞いを、インビトロにおいて研究するのに適したモデルである。ＮＰＣは、自己再生能および多分化能を有し、ニューロン、アストロサイト、またはオリゴデンドロサイトに分化する。近年、幹細胞および／または成人ＮＰＣは、神経変性疾患または中枢神経系の外的損傷の修復プロセスにおいて、非常に魅力的な源であることが判明している。神経前駆細胞を移植したものは、急性損傷後の脊髄に既に存在する軸索の経路に沿って統合および再接続される（Vroemen, et al. “Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways" Eur J Neurosci. 2003; 18(4), 743-51）。Ａｋｉｙａｍａらは、成人の脳に由来する神経前駆細胞の移植が、脱髄された脊髄において再ミエリン化プロセスを促進することを示している（Akiyama Y, et al. “Transplantation of clonal neural precursor cells derived from adult human brain establishes functional peripheral myelin in the rat spinal cord" Exp Neurol. 2001, 167(1), 27-39）。
・骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）。骨髄間葉系幹細胞は、骨髄（ＢＭ）の子座の一部を形成する細胞である。また、該細胞は、インビトロで、腫瘍を誘導せずに、軟骨細胞、骨細胞、および脂肪細胞などの多様な細胞のタイプに分化できる。さらに、該細胞は、多様な組織の再生能を有することが判明しており、組織細胞治療において使用されている。近年では、ＢＭＭＳＣに対する関心が高まっていて、多様な研究から、これらの細胞が、インビトロで心筋細胞に分化することが示唆された。ただし、催奇性の化合物、５−アザシチジンを誘発試薬として使用する必要があるので、この戦略の臨床上の適応性は限定される（Laflamme M.A. and Murry M.A. “Regenerating the heart" Nature Biotechnology, 2005; 23:845-856.）。また、未刺激のＢＭＭＳＣを、梗塞後の状態でラットおよびブタの心臓に直接注射すると、心室機能が改善することを示唆する証拠がある（Ma J. et al., “Time course of myocardial stromal cell-derived factor 1 expression and beneficial effects of intravenously administered bone marrow stem cells in rats with experimental myocardial infarction" Basic Res Cardiol. 2005; 100:217-223）。Ｇｎｅｃｃｈｉ  Ｍらによる研究から生まれた新しい理論（Gnecchi M. et al. “Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-modified mesenchymal stem cells" Nature Medicine. 2005; 111:367-368）は、間葉系幹細胞に由来するパラクリン細胞保護因子の分泌を利用しており、その結果、これらのＢＭＭＳＣを低酸素条件下に置くことで生成される培地が低酸素で培養されたラットの心室の心筋細胞に添加されたときに、これらの心筋細胞のアポトーシスが減少する。この結果は、ＢＭＭＳＣの心臓筋形成分化の結果である替わりに、組織の保護および修復におけるＢＭＭＳＣ作用の「パラクリン仮説」理論に関与している。これらの分泌された因子の単離は、虚血組織における損傷を防止するための、治療上有用な応用が可能である。この系統のヒトの成体幹細胞は、Ｉｎｂｉｏｍｅｄ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｓａｎ  Ｓｅｂａｓｔｉａｎ，  スペイン（www.inbiomed.com）から入手可能であり、具体的には、最近創立された細胞バンクＩｎｂｉｏｂａｎｋ（www.inbiobank.org）から入手可能である。ＢＭＭＳＣは、ＣＤ２９＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ４５−、およびＣＤ３１という典型的な表現型を有する（Pittenger MF et al., “Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells" Science 1999; 284: 143-147; Javazon EH et al., “Mesenchymal stem cells: paradoxes of passaging", Exp Hematol 2004 May; 32(5):414-25）。ＢＭＭＳＣは、細胞２０００個／ｃｍ２の密度で播種され、９０％のコンフルエンスに到達すると、再度トリプシン処理によってサブ培養される。使用される培地は、１０％のウシ胎仔血清を補充した低グルコースのＤＭＥＭである。
・歯髄細胞は、出生後のヒトの歯髄組織に存在する特異的な間葉系幹細胞であり、象牙芽細胞と並んだ細管により形成された石灰化マトリックスからなる、象牙質−歯髄複合体の原因となり、また、血管を含み、かつ歯の生理的な構造を形成する繊維組織の原因でもある（Gronthos S, et al. “Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo" Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Dec 5; 97(25):13625-30.; Gronthos S et al. “Stem cell properties of human dental pulp stem cells" J Dent Res 2002 Aug; 81(8):531-5）。これらの細胞は、インビトロで、象牙芽細胞、脂肪細胞、および神経形態を有する細胞に分化することができる。脳および心臓における、低酸素および再酸素化に対する細胞応答は、虚血性損傷の病変形成の関連モデルとして広く研究されている。したがって、歯髄幹細胞の反応および活性を、低酸素状態（Kim S, Edwall L, Trowbridge H, Chien S. “Effects of local anesthetics on pulpal blood flow in dogs", J Dent Res. 1984; 63(5), 650-2; Kim S, et al., “Functional alterations in pulpal microcirculation in response to various dental procedures and materials" Proc Finn Dent Soc. 1992; 88, Suppl 1, 65-71）およびインビトロで再酸素化の条件下で研究すれば、ＨＩＦ修飾因子を使用するという利点もあり、インサイツの虚血性の損傷の病変形成の関連モデルを作製できる。
【００１０】
〔血管新生阻害剤〕
複数の異なる作用様式によってＨＩＦ１の転写活性を修飾する阻害剤を保護し、細胞のシグナル経路および／または構造上のもしくは後成的な現象に対して影響を与える化合物が存在する。該化合物の一部については詳細を表１に記すが、Ｊ．  Ｆｏｌｋｍａｎによる血管新生に関する最近のレビュー記事では、網羅的に記載および説明されている（“Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery?" Nat. Rev Drug Discovery, 2007, 6, 273-286）。
【００１１】
【表１】
2011517664.tif 000002
【００１２】
低酸素に関連する病理の治療または予防のための、ＨＩＦ因子阻害剤（血管新生阻害剤であると考えられる）である多様な化合物および該化合物を含有する薬学的組成物について記載し、その特許権を主張する、多くの特許文献が現在の技術的状況において存在する。このような特許文献の一部を以下に列挙する。
【００１３】
国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ２−２００７／０２２４１２号明細書には、血管新生の疾病または障害を有するまたは有する危険性のある被検者の組織において、低酸素誘導性写因子の阻害剤およびそれとは別の抗血管新生剤（例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン１、インターロイキン８（ＩＬ−８）またはアンジオスタチン、トロンボスポンジンまたはタムスタチン直接血管新生阻害剤など）を投与することを含む、併用療法を使うことによって、望ましくない血管新生を治療するための方法が記載されている。
【００１４】
国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ２−２００５／０８９４９０号明細書には、この発明の阻害剤化合物のうちの１つを有効な量で患者に対して投与することを含んだ、患者においてＨＩＦ誘導性の低酸素を阻害するための化合物および方法が記載され、その特許権が主張されている。請求項に記載された、癌を治療するための方法は、放射能照射または化学療法からなる治療をするとともに、該化合物のうちの１つを投与することからなる。
【００１５】
国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ１−２００６／０６６７７５号明細書は、ＨＩＦ  １αのｐ３００に対する阻害が必要な、病理治療用薬物の調製のために、ジケトジチオピペラジンの抗生物質（例えば、ケトシン（ｃｈａｅｔｏｃｉｎ）およびグリオトキシン）を使用することに関する。
【００１６】
国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ１−０２／３６５７４号明細書は、ＨＩＦ  １αを阻害するのに十分な量のゲルダナマイシン誘導体を投与することによって、細胞において癌を除去する、あるいは患者においてインビトロおよびインビボの両方で癌を治療するために使用されるゲルダナマイシン誘導体に関する。
【００１７】
米国特許出願公開第２００６００３９６１号明細書は、ＯＳ−９の、ＨＩＦ１およびＨＩＦ１αプロリルヒドロキシラーゼ双方との相互作用に関する。ＯＳ−９の機能損失によって、非低酸素条件下において、ＨＩＦ１αタンパク質のレベルおよびＨＩＦ１の転写のレベルが増加する。これらのデータは、ＯＳ−９が、ＨＩＦ１αタンパク質のレベルをＯ２に依存する形態で調節する多タンパク質複合体の必須成分であることを示唆している。この複合体を修飾する薬剤、および該薬剤を特定するための方法についても記載されている。
【００１８】
国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ１−２００４／０９１６４８号明細書は、腫瘍細胞または組織を、３（５’ヒドロキシメチル２’フリル）１−ベンジル−インダゾール、またはその新規な誘導体のうちの１つを含有する組成物に接触させることを含んだ、ＨＩＦ１の発現、およびＨＩＦ１、血管新生、腫瘍増殖、または腫瘍の進行／転移によって調節される遺伝子の発現を、阻害するための方法および薬学的組成物に関する。この出願に続いて、国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ２−２００５／０３０１２１号明細書において、同じ出願人が、腫瘍細胞または腫瘍組織において誘導性の低酸素発現因子を阻害するために、３（５’ヒドロキシメチル２’フリル）１−ベンジル−インダゾール以外の、ある複素環化合物を使って、インビボでの腫瘍の増殖を阻害することについて記載している。
【００１９】
国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ２−２００４／０８７０６６号明細書および国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ２−２００７／０２５１６９号明細書は、どちらも同じ出願人が所有しており、１つ目の特許出願明細書では、ＨＩＦ１因子誘導性の低酸素に関連する病理の治療または予防のために、２，２−ジメチルベンゾピランに由来する化合物を含んだ薬学的組成物を、必要に応じて他の細胞分裂阻害剤と組み合わせて使用する。また、二つ目の特許出願明細書では、同じメカニズムによって発生した肺癌または膀胱癌に対して、アリール−スルホンアミド誘導体を含んだ薬学的組成物を使用する。
【００２０】
上記のように、これらのおよびその他の特許文献は、ＨＩＦ活性の阻害、およびその阻害と血管新生調節との関係を開示している。ただし、これらの文献はどれも、本発明の目的である一般式（Ｉ）の分子によって表わされる、ＨＩＦ活性阻害剤としての化合物に関連する化合物について一切言及していない。
【００２１】
文献「Hypoxia inducible factor-1: a novel target for cancer therapy」（Belozerov Vladimir E. and Van Meir Edwin G., published in Anti-Cancer Drugs, 16(9): 901-909, 2005）は、低酸素誘導性転写因子（ＨＩＦ  １）を、腫瘍細胞が低酸素に順応するために必要な多数の分子レベルの現象における修飾因子として示している。これが、ＨＩＦ  １が抗癌剤の開発にとって魅力的な標的になる理由である。この文献は、最近開発された、ＨＩＦ１の機能を阻害するいくつかの小分子について言及している。これらの分子は、多種多様なメカニズムによってＨＩＦ１のシグナル経路を遮断する。このメカニズムには、ＨＩＦ１αタンパク質の合成、安定化、核移行、および標的遺伝子のトランス活性化の阻害が含まれる。該文献はＨＩＦと癌プロセスと間の関係、および抗癌剤の開発のためのＨＩＦを阻害する分子の使用を開示している。ただし該文献は、一般式（Ｉ）で表わされるいずれの化合物についても言及していない。
【００２２】
構造が一般式（Ｉ）に従う化合物は、２種類だけ（いずれの場合も生物活性は全くない）が文献に記載されている。米国特許出願公開第２００６２２３８１２号明細書の４７ページには、化学式Ｂ１Ｃ１１として、２−４−（（メトキシ）フェニル）−２−オキソエチル３−（２，４−（ジニトロ）ベンズアミド）安息香酸が記載されている。なお、該米国特許出願は、例えばアルツハイマー病などの神経変性の病状の治療に用いる薬学的組成物を調製するために、タンパク質凝集体の形成阻害およびタンパク質の凝集体の脱重合をすることができる、化合物を使用することに関する。また、２−４−（（ニトロ）フェニル）−２−オキソエチル３−（４−ブロモ）ベンズアミド）安息香酸が、文献（Kim, S. Y. et al., “Pharmacophore-based virtual screening: the discovery of novel methionyl-tRNA synthetase inhibitors", Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 4898-4907）中に示されている。この文献には、新しいメチオニルｔＲＮＡ合成酵素の阻害剤を探すために、５０８１４３種類の化合物を登録した化学データベースから仮想的な選択を行うことについて記載されている。これらのｄｏｓ化合物は、いずれも、ＨＩＦの活性の調節および／または阻害と無関係である。
【００２３】
前述のことを考慮すれば、生物学的に関連した遺伝子の転写を修飾する能力を有する分子メカニズムを認識することを目標として合成分子を設計することは、化学と生物学との合流点における、治療における非常に大きな潜在的能力を有する、生物工学の最大の課題の１つであると考えられる。治療、特に癌の治療の場合、異なる作用様式および非蓄積的な毒性を有する複数の活性化合物の混合物である組成物を、ますます利用するようになってきている。
【００２４】
〔図面の簡単な説明〕
図１：化合物ＦＭ１９Ｇ１１および類似体の化学合成を示す。
【００２５】
図２：ＨＩＦの転写活性の新規阻害剤である、ＦＭ１９Ｇ１１を示す。Ａ）はＦＭ１９Ｇ１１の化学構造を示す。Ｂ）は、プロモーター領域に存在するＨＩＦのタンパク質のＨＲＥ反応配列に結合することによって、該タンパク質に反応して活性化されたルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を使った、ＨＩＦの転写活性の研究結果を示す。ＨＲＥの９個の反復に融合したルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を恒常的に過剰発現させるＨｅＬａ細胞の培養物を、低酸素条件（Ｏ２１％、図中青色の棒グラフ）または正常酸素条件（Ｏ２２０％、図中赤色の棒グラフ）で、ＦＭ１９Ｇ１１を濃度を増加させながら（０μＭ〜１μＭ）使用して、６時間かけて処理した。ルシフェラーゼの活性を示す単位は、絶対値で表わす。Ｃ）は、Ｂに図示したＨＩＦの転写活性の阻害を、ルシフェラーゼ活性アッセイから計算した結果を示す。
１００−（（（ＲＬＵＨｘ＋ＦＭ１９Ｇ１１−ＲＬＵＨｘ＋ＤＭＳＯ）＊１００／ＲＬＵＨｘ−ＲＬＵＨｘ＋ＤＭＳＯ）））
実験は三組実施した。
【００２６】
図３：ＨＩＦの転写活性の制御における、ＦＭ１９Ｇ１１の特異性の研究結果を示す。該遺伝子のプロモーター領域において、上記ＨＩＦのタンパク質（ＨＲＥ）に対して反応する配列に融合したルシフェラーゼ・レポーター遺伝子、ｃ−ｊｕｎ／ｃ−ｆｏｓ（ＴＲＥ）によって形成された化合物に融合したルシフェラーゼ・レポーター遺伝子、またはＡＴＦ２／ＪｕｎＢ（ＣＲＥ）によって形成された化合物に融合したルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を恒常的に過剰発現させるＨｅＬａ細胞を、それぞれの刺激の存在下（ＨＲＥの場合は低酸素状態（Ｏ２１％）、ＴＲＥの場合はｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの同時発現、ＣＲＥの場合はＡＴＦ２およびＪｕｎＢの同時発現）で６時間培養した。転写活性を阻害する際のＦＭ１９Ｇ１１の活性を、濃度を増加させながら（０μＭ〜１μＭ）、ルシフェラーゼ活性を測定し、次式を適用することによって決定した。
１００−（（（ＲＬＵＨｘ＋ＦＭ１９Ｇ１１−ＲＬＵＨｘ＋ＤＭＳＯ）＊１００／ＲＬＵＨｘ−ＲＬＵＨｘ＋ＤＭＳＯ）））
実験は三組実施した。
【００２７】
図４：ＨｅＬａ細胞において、ＶＥＧＦのメッセンジャーＲＮＡの発現レベルを定量化するための、実時間ポリメラーゼ連鎖反応を示す。ＨｅＬａ細胞は、低酸素条件（Ｏ２１％、ＨＰＸ）または正常酸素条件（Ｏ２２０％、ＮＭ）で、ＦＭ１９Ｇ１１または当量体積のキャリア（ＤＭＳＯ、コントロール）の存在下で、該ＦＭ１９Ｇ１１またはキャリアの濃度を増加させながら（０．０３μＭ〜０．３μＭ）、２４時間培養した。全ＲＮＡ量の変化に起因する発現量の変化を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の恒常的発現によって補正した。上記各試料におけるＶＥＧＦ／ＧＡＰＤＨの発現量の比の値を、コントロール酸素正常状態（＝１）において得られた発現レベルに対して相対化した。実験は三組実施した。
【００２８】
図５：ＨｅＬａ  ９ＸＨＲＥ細胞において、ＨＩＦおよびＰＨＤ３（正のコントロールとして。なぜならばＨＩＦ１αの標的遺伝子であるから）の２つのαアイソフォームを認識する抗体を使用したウエスタンブロット法による、タンパク質の発現の解析結果を示す。ＧＡＰＤＨを、タンパク質の添加コントロールとして含めた。第１のレーンは無処理の細胞に対応する。第２のレーンは、低酸素条件下でＦＭ１９Ｇ１１を用いて処理された細胞に対応し、第３のレーンは、低酸素状態で培養された細胞に対応する。実験は三組実施した。刺激時間は９時間であった。互いに独立して実施した３組の実験を代表して、１組の実験を図示している。
【００２９】
図６：Ｃ１７．２細胞において、ＨＩＦ１αおよびＰＨＤ３（正のコントロールとして。なぜならばＨＩＦ１αの標的遺伝子であるから）を認識する抗体を使用したウエスタンブロット法による、タンパク質の発現の解析結果を示す。Ｂアクチンを、タンパク質の添加コントロールとして含めた。第１のレーンは無処理の細胞に対応する。第２のレーンは、低酸素条件下で培養された細胞に対応する。第３、第４、および第５のレーンは、ＦＭ１９Ｇ１１（それぞれ１２５、２５０、５００）を濃度を増加させながら用いて処理され、低酸素条件下で培養された細胞に対応する。実験は三組実施した。刺激時間は３時間および２４時間であった。赤色の矢印は、ＰＨＤ３（標的遺伝子ＨＩＦ）の発現が大きく減少していることを示している。互いに独立して実施した３組の実験を代表して、１組の実験を図示している。
【００３０】
図７：ＦＭ１９Ｇ１１（５００ｎＭ）の存在下で、酸素正常状態または低酸素状態で培養された間葉系幹細胞の核タンパク質からの抽出物を使用して実施した、ウエスタンブロットの結果を示す。単クローンの抗ＭＬＨ１および抗ＭＳＨ６抗体を、解析において使用した。Ａは、骨髄の間葉系幹細胞において得られた結果である。１−Ｎｘ  ３ｈ；２−Ｈｘ  ３ｈ；３−Ｈｘ  ３ｈ＋１９Ｇ１１；４−Ｈｘ  １８ｈ；５−Ｈｘ  １８ｈ＋１９Ｇ１１；６−Ｈｘ  ２４ｈ；７−Ｈｘ  ２４ｈ＋１９Ｇ１１。Ｂは、歯髄の間葉系幹細胞において得られた結果である。１３−Ｎｘ  ７２ｈ；１４−Ｎｘ  ７２ｈ＋１９Ｇ１１；１５−Ｈｘ  ７２ｈ；１６−Ｈｘ  ７２ｈ＋１９Ｇ１１。実験は三組実施した。刺激時間は３時間であった。互いに独立して実施した３組の実験を代表して、１組の実験を図示している。
【００３１】
図８：ｅｐＮＰＣにおいて、ＰＨＤ３およびＶＥＧＦのメッセンジャーＲＮＡの発現レベルを定量化するための、実時間ポリメラーゼ連鎖反応を示す。ｅｐＮＰＣは、低酸素条件（Ｏ２１％）で、５００ｎＭのＦＭ１９Ｇ１１または当量体積のキャリア（ＤＭＳＯ）の存在下で、０時間（ベースライン状態、１）４８時間培養された。全ＲＮＡ量の変化に起因する発現量の変化を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の恒常的発現によって補正した。上記各試料におけるＰＨＤ３またはＶＥＧＦ／ＧＡＰＤＨの発現量の比の値を、ベースラインの発現レベル（時間Ｏ＝１のときに酸素正常状態または低酸素状態）に対して相対化した。実験は三組実施した。
【００３２】
図９：ヒトの歯髄の幹細胞において、ＨＩＦ−１およびその標的遺伝子ＶＥＧＦおよびＣＯＸ−２の発現に対する、化合物ＦＭ１９Ｇ１１の効果を示す。
【００３３】
図１０：ヒトの歯髄の幹細胞において、アポトーシスおよび生存率に対する、化合物ＦＭ１９Ｇ１１の効果を示す。
【００３４】
図１１：未分化状態のマーカーＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、およびその標的遺伝子ＴＧＦα、ならびにＮａｎｏｇそれぞれのメッセンジャーＲＮＡの発現を研究するための、半定量的な逆転写ＰＣＲを示す。ｅｐＮＰＣを、正常酸素条件（Ｏ２２０％）または低酸素条件（Ｏ２１％）下で、５００ｎＭのＦＭ１９Ｇ１１またはそのキャリア（＋）またはＤＭＳＯ（−）の存在下で、４８時間培養した。恒常的なＧＡＰＤＨ遺伝子の発現は、どの条件であっても、アッセイされた試料の量に大きな変化がないことを示している。実験は三組実施した。
【００３５】
図１２：正常酸素条件（Ｏ２２０％）または低酸素条件（Ｏ２１％）下で、ＦＭ１９Ｇ１１の存在下でその用量を増加させながら４８時間培養された、ｅｐＮＰＣのＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、およびβ−アクチン（ローディングコントロール）のタンパク質の発現レベルの研究のための、ウエスタンブロットの結果を示す。実験は三組実施した。
【００３６】
図１３：正常酸素条件（Ｏ２２０％）下で、ＦＭ１９Ｇ１１の存在下でその用量を増加させながら４８時間培養された、ｅｐＮＰＣのＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｎｏｔｃｈ−１、およびβ−アクチン（添加コントロール）のタンパク質の発現レベルの研究のための、ウエスタンブロットの結果を示す。実験は三組実施した。
【００３７】
図１４：ｈＥＳＣにおいて、Ｓｏｘ２およびＯＣ３／４のメッセンジャーＲＮＡの発現レベルを定量化するための、実時間ポリメラーゼ連鎖反応の結果を示す。マトリゲル上で培養されたｈＥＳＣのコロニーを、正常酸素条件（Ｏ２２０％）または低酸素条件（Ｏ２１％）下で、５００ｎＭのＦＭ１９Ｇ１１または当量体積のそのキャリア（ＤＭＳＯ）の存在下で、４８時間処理した。全ＲＮＡ量の変化に起因する発現量の変化を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の恒常的発現によって補正した。上記各試料におけるＳｏｘ２またはＯｃｔ３／４／ＧＡＰＤＨの発現量の比の値を、ベースラインの発現レベル（酸素正常状態−キャリア＝１）に対して相対化した。実験は三組実施した。
【００３８】
図１５：ｅｐＮＰＣがオリゴデンドロサイトに分化する様子を示す（標的とする分化）。Ａ）は、分化プロトコールのスキームである。ｅｐＮＰＣを、正常酸素条件（Ｏ２２０％）または低酸素条件（Ｏ２１％）下で、分化のプロセスの初期（１日目〜３日目）および該プロトコールの終了時（３５日目〜３８日目）に、ＦＭ１９Ｇ１１またはそのキャリア（ＤＭＳＯ）を用いて処理した。オリゴデンドロサイト、ＮＧ２、ＲＩＰ、およびＯ４についてのマーカーの発現を、免疫組織化学的方法によってすべての条件下で判定した。
【００３９】
図１６：ＦＭ１９Ｇ１１の存在下で、ｅｐＮＰＣの増殖性の活性を定量化したものを示す。ｅｐＮＰＣを、正常酸素条件（Ｏ２２０％）または低酸素条件（Ｏ２１％）下で、５００ｎＭのＦＭ１９Ｇ１１またはそのキャリアの存在下で、同じ個数で３日間培養した。生成されたＡＴＰの量を、細胞培養の代謝活性の指標として定量化することによって、増殖性の活性を判定した。ＦＭ１９Ｇ１１の存在下で得られた結果を、キャリアであるＤＭＳＯ（＝１）の存在下で得られた値に対して相対化した。
【００４０】
図１７：ｅｐＮＰＣの培養から得られるニューロスフェアの形成／増幅に対するＦＭ１９Ｇ１１の効果を示す。５００ｎＭのＦＭ１９Ｇ１１またはそのキャリア（ＤＭＳＯ）の存在下でｅｐＮＰＣ（１６，０００個の細胞）を４８時間培養して得られたものの、位相差写真である。
【００４１】
図１８：細胞パネルに対するＦＭ１９Ｇ１１の毒性を示す。細胞株、ＨｅＬａ  ９ｘ−ＨＲＥ−Ｌｕｃ、ＰＲＣ３、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７、およびＭＤＡ−ＭＢ  ４３５−Ｓにおいて、細胞毒性の研究を実施した。ＦＭ１９Ｇ１１（０μＭ〜３０μＭ）の存在下で濃度を増加させながら、１０％の不活化されたウシ胎仔血清、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ培地で、正常酸素条件下で、該細胞株を７２時間培養した。培養物の生存率（％）を、市販のキット、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使って決定した。
【００４２】
図１９：化合物ＦＭ１９Ｇ１１の魚（メダカ）の胚に対する毒性のアッセイを示す。
【００４３】
図２０：化合物ＦＭ１９Ｇ１１の分析的ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００４４】
図２１：互いに異なる時間において、ウシ血清中のＦＭ１９Ｇ１１の、インキュベーションを行った抽出物のクロマトグラムを示す。
【００４５】
図２２：ＦＭ１９Ｇ１１は、ヒトの大腸癌細胞（ＨＴ２９）においてＤＮＡ損傷応答のトリガーとなる。ＤＮＡ損傷応答において鍵となるシグナル経路、具体的には、ＡＴＲ／ＡＴＭとして知られている経路、ＤＮＡ損傷の修復（ＭＭＲ、ＢＲＣＡ１、Ｈ２ＡＸ）の経路に関わるキナーゼのリン酸化が進むことによる活性化の増加が、細胞周期（ＣＨＫ１、ＣＨＫ２）の制御の点においても、ＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）を用いて処理された腫瘍細胞ＨＴ２９において検出された。６−ＴＧ（５μＭ、１０μＭ、２５μＭ）またはエトポシド（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）を用いた処理を、コントロールとして、また、ＤＮＡの一本鎖（ＡＴＲ−ＣＨＫ１）または二重鎖（ＡＴＭ−ＣＨＫ２）それぞれにおいて損傷に反応して活性化されるタンパク質比較のために含めた。
【００４６】
図２３：動態的研究によれば、ＡＴＲの急速な活性化は、ＨＣＴ１１６細胞株のどちらにおいても、ＤＮＡの一本鎖における損傷に関連している。０．５μＭのＦＭ１９Ｇ１１を用いて１時間処理した後、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋、のｐ５３細胞における、ＡＴＲおよびｐ５３、ならびに、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞におけるＡＴＲのリン酸化または活性化の増加が検出された。上述の結果は、代表的なウエスタンブロット実験を濃度測定の解析にかけた後に得られた。ただし、互いに独立した３組の実験でも同様の結果が得られた。
【００４７】
図２４：ＦＭ１９Ｇ１１によって誘導された周期停止に対する、ｐ５３の効果を示す。ＡではＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞、ＢではＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞を、互いに異なる濃度のＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ）またはキャリアに対して、３日間または６日間曝露して、互いに異なる細胞周期相において細胞の分布をフローサイトメトリーによって分析した。グラフは、異なる濃度のＦＭ１９Ｇ１１によって引き起こされた、それぞれの細胞周期相細胞の割合（％）の分布に対する効果を示している。図示された結果は１組の実験を代表するものである。ただし、互いに独立した３組の実験において、非常に近い割合が得られた。
【００４８】
図２５：動態的研究によれば、ＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）を用いて処理されたＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞におけるＡＫＴ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６／サイクリンＤ１シグナル経路が、急速かつ効率的に活性化される（倍率の変化≧２）。ｍＴＯＲも、ＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞において、ＦＭ１９Ｇ１１を用いて処理した後に、急速にリン酸化された（ただし、倍率の変化の増加は、２よりわずかに小さい）。
【００４９】
図２６：ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞を、ＦＭ１９Ｇ１１（１０μＭ）、ラパマイシン（登録商標）（ｍＴＯＲ阻害剤）（１００ｐｍｏｌ）に単独で、または両方の薬を組み合わせて、上述の濃度で曝露した。両方の薬（１００ｐｍｏｌ）に対して同時にインキュベーションを行ったところ、ＦＭ１９Ｇ１１を用いた処理によってＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞において発生するＳ期の周期停止が、防止された。
【００５０】
図２７：細胞中のＡＴＰの総含有量は、ＦＭ１９Ｇ１１を用いて処理されたヒトの大腸癌細胞の割合（％）として、また、ＤＭＳＯを用いて４８時間処理された対応する細胞株に対して相対的に、定量化された細胞生存率と相関関係がある。
【００５１】
図２８：ＨＴ２９のヒトの大腸癌細胞およびＦＭ１９Ｇ１１を用いて処理されたＨＣＴ１１６細胞の間代性アッセイの結果を、処理後１０まで監視した。ＩＣ５０を、濃度とともに割合を外挿することによって、決定した。ＦＭ１９Ｇ１１を、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭの濃度で使用した。
【００５２】
図２９：半流動性の寒天培地における、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋、およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞のコロニーの形成を示す。不活性な寒天内で成長した、それぞれのタイプの細胞のコロニーの個数を、播種から１０日後に定量化した。表は、レンズの拡大率を４ｘにして、５つの異なるフィールドによって、上述の各細胞株（±ＳＤ）コロニーの個数を勘定して得られた互いに異なるカウント方法を示している。結果は、播種され、キャリア（ＤＭＳＯ）またはＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）を用いて処理された細胞を計数した、互いに独立した３組の実験のカウントを示している。ＨＴ２９癌化細胞株における典型的なコロニーの形成を示す写真を、半流動性の培地に播種してから１０日後に撮影した。
【００５３】
図３０：Ｃ１７．２神経幹細胞およびネズミのニューロスフェアは、低酸素条件下で、ＭＳＨ６修復タンパク質のレベルが低下するが、ＦＭ１９Ｇ１１の存在下で回復する。正常酸素条件下では、ＤＭＳＯを用いた処理によってＭＳＨ６タンパク質が減少しても、ＦＭ１９Ｇ１１によって救出されることが、Ｃ１７．２細胞において観察される。
【００５４】
図３１：低酸素状態によって引き起こされる、ネズミのニューロスフェア（神経幹細胞）におけるゲノムの不安定性を、ＦＭ１９Ｇ１１で処理することによって防止する。マイクロサテライト配列マーカーのための、特異的な蛍光標識を施したプライマーを使用することによって、酸素正常状態（Ｎｘ）、低酸素状態（Ｈｘ）、または低酸素状態＋ＦＭ１９Ｇ１１（Ｈｘ＋１９Ｇ１１）におけるニューロスフェアのゲノム安定性を、分析した。図中、使用したマーカーのうち２種類（ｍＢＡＴ５９およびｍＢＡＴ６７）が、どのようにして、低酸素条件に起因するＤＮＡの欠失または挿入を示したのかが観察できる。ＦＭ１９Ｇ１１を用いて処理することによって、（参照またはコントロールとして使用される）酸素正常状態の特性が回復でき、こうして、低酸素状態によって引き起こされるゲノムの不安定性が防止できた。
【００５５】
図３２：ＦＭ１９Ｇ１１は、Ｃ１７．２神経幹細胞において、正常酸素条件および低酸素条件下で、ｐ３００（ヒストンアセチル化酵素の一種）およびＤＮＡ修復タンパク質（ＭＬＨ１およびＭＳＨ６）の発現を変化させる。ＦＭ１９Ｇ１１は、全体的なタンパク質のアセチル化の程度に影響する。ＴＳＡを、ヒストンアセチル化を強制的に発生させる薬剤のための正のコントロールとして含めた。
【００５６】
図３３：正常酸素条件または低酸素条件（図中左側）の下で、酸素状態の変化（ＨＩＦα）、未分化マーカー（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４）、ヒストンアセチル化酵素（ｐ３００）、およびアセチル化ヒストンＨ３に対して順応するという、タンパク質の発現に対してＦＭ１９Ｇ１１によって引き起こされる効果を示す。酸素正常状態および低酸素状態におけるヒストンＨ３のアセチル化状態に対するＦＭ１９Ｇ１１の影響を、免疫沈降を目的として抗ＡｃＨ３抗体（アセチル化ヒストンＨ３）を使用し、定量的なＰＣＲ（右側のグラフ）によってＤＮＡを定量化し、染色質の免疫沈降によって判定した。
【００５７】
図３４：ＦＭ１９Ｇ１１のアセチルトランスフェラーゼまたはヒストン脱アセチル化酵素活性の評価を示す。上側のグラフは、無処理、キャリアまたはＦＭ１９Ｇ１１で処理済み、または正常酸素条件または低酸素条件下で培養済みの細胞のタンパク質の抽出物のアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を示している。タンパク質の抽出物は、抗ｐ３００抗体を用いて先に免疫沈降させ、ＮＡＤＨを検出することによって、アセチルトランスフェラーゼ活性を測定した。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）活性の評価を、異なる濃度のＦＭ１９Ｇ１１で処理されたＨｅＬａ細胞のタンパク質の抽出物を用いて実施した。正のコントロールとして、ＴＳＡの濃度を固定して（１μＭ）含め、無処理の細胞の抽出物をコントロールとして使用した。実験は、ヒストン脱アセチル化酵素活性を検出するためのＢｉｏｍｏｌキット（ＨＤＡＣ  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，  Ｂｉｏｍｏｌ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＡＫ−５０３）の指示にしたがって実施した。
【００５８】
〔発明の対象〕
本発明の対象の１つは、一般式（Ｉ）によって表わされる化合物、特にＦＭ１９Ｇ１１と呼ばれる、ＨＩＦ転写因子を修飾、調節、および／または阻害することができる化合物に関する。該化合物は、癌、炎症、自己免疫疾患、および再生医療に関連する疾病の治療に有用である。
【００５９】
【化１】
2011517664.tif 000003
【００６０】
本発明のもう１つの対象は、一般式（Ｉ）で表わされる分子またはその塩を合成する方法に関する。
【００６１】
本発明のもう１つの対象は、治療的に有効な量の、一般式（Ｉ）で表わされる少なくとも１つの分子を含有する、血管新生に関連する疾病を治療するための薬学的組成物である。本発明の目的である修飾因子および／または阻害剤は、同一薬学的組成物内または別の薬学的組成物内に存在していてもよい。
【００６２】
発明のもう１つの対象は、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩を、低酸素誘導性写因子によって修飾された遺伝子の転写を調節するための薬物を調製する用途に用いる使用方法に関する。ある特定の実施例において、上記薬物は、ＨＩＦ、ＶＥＧＦ、ＰＨＤ３、ＭＭＲｓ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｎｏｔｃｈ１、ｐ５３、およびｐ３００の群から選択される、１つ以上の遺伝子の転写を調節する。別の特定の実施例において、上記薬物は、癌の治療に適用可能である。さらに別の特定の実施例において、上記薬物は、腫瘍の治療に適用可能である。また別の実施例において、上記薬物は、炎症の原因となる病理に適用可能である。さらに別の実施例において、上記薬物は、再生医学、特に幹細胞の分化に適用可能である。さらにもう１つの実施例において、上記薬物は、組織の変性の原因となる病理学の治療に適用可能である。
【００６３】
本発明のもう１つの目的は、上記薬学的組成物を備えるキットに関する。
【００６４】
〔発明の詳細な説明〕
治療薬として潜在的な活性を有する天然の化合物および合成化合物を選択することが、最近の十年間は、薬学的な活性を有する分子の候補を得る方法であった。２０世紀末にいたる前には、これらの化合物は、「コンビナトリアルライブラリー」に基づいて選択され始めた（John Nielsen et al., “Synthetic Methods for the Implementation of Encoded Combinatorial Chemistry" J. Am. Chem. Soc. 1993; 115, 9812-9813）。また、２１世紀の現在では、薬学と情報技術との融合が、疾病の治療法および治療の機会を提供しており、これは前例のない現象である。コンピュータ科学が、薬の発見、開発、および製造のすべての分野に入り込んでいる。コンビナトリアルライブラリーまたは化合物ライブラリーとは、ある目的をもって選択された化学物質を多数収集した記録である。この目的の例としては、薬理学的な活性を有する個々の小さな分子をコンビナトリアルライブラリーにおいて特定するためのプロセスにしたがって、新しい、潜在的能力を有する薬を特定すること（欧州特許出願公開第０７５１９５０号明細書）、例えば、プロテアーゼ阻害薬として開発されたアミドの、ある一般式で表わされる調製物を特定すること（欧州特許出願公開第０９５００４５号明細書）、または鎮痛性および／または抗炎症性の特定のための、新しい治療標的およびその使用方法を特定すること（スペイン特許出願公開第２２６５２０１号明細書）などが挙げられる。コンビナトリアルライブラリーの登場が、新薬発見のプロセスを革命的に変化させた。新しい技術を使えば、一日あたり５０，０００個〜１００，０００個の試料を研究することができ、生物学および医学の世界の情報を劇的に変化させた（Ashis K. Mukherjee and Anil C. Ghosh. “The challenges in information technology based drug discovery" Int. J. Inf. Man. 2002, (IJITM), vol. 1, No. 4, 345-356）。
【００６５】
データベースからの分子の選択は、例えば、１５件の化合物ライブラリーから得られる約２百万種類の化合物から選択することができる（Mozziconacci J.C. et al., 9th Electronic Computational Chemistry Conference (ECCC) 03-2003, Internet and World Wide Web）。このようにして、構造に関する解析が実施され、ライブラリーの特異性および多様性が評価された。これらの化合物における薬剤との類似度が、例えば、可撓性、原子の種類、官能基、および「５の法則」などの共通する化学的特性を使って調べられた。１９９７年にＬｉｐｉｎｓｋｉら（"Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings" .Adv. Drug Delivery Rev. 1997; 23 (1-3), 3-25）が、下表に規定された４つのパラメータに基づいて化合物の吸収度または透過度を測定する、「５の法則」と呼ばれる方法を記載した。
【００６６】
【表２】
2011517664.tif 000004
【００６７】
具体的には、次に列挙する商業用の化合物ライブラリーを大量にスクリーニングし、続いて逆重畳積分することによって、一般式（Ｉ）で表わされる、活性を有する本発明の分子が特定された。すなわち、Ｋｅｙ  ｏｒｇａｎｉｃｓ、ＣｈｅｍＳｔａｒ；  ＩｎｔｅｒｂｉｏＳｃｒｅｅｎ、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｉｍ  Ｔｅｃ、Ｔｒｉｐｏｓ、Ｓｐｅｃｃｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｏｔａｖａ、Ｓａｉｎｅｓ、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ、およびＰｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙの商業用の化合物ライブラリーである。これらのライブラリーの中から、Ｍｙｒｉａｎｓｃｒｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＰｒｅｓｔｗｉｃｋが、薬剤としての潜在的能力を有する化合物の構造上の多様性および性質をうまく表現しているので、選択された。したがって、化合物ライブラリーＣｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｅ  Ｆｅｌｉｐｅ（ＣＩＰＦ）を構成する化合物の選択基準は、以下の項目に基づく内部の基準である。
・構造上の多様性、Ｔａｎｉｍｏｔｏ係数の推定に基づいた化学的空間(chemical space)のカバー
・Ｌｉｐｉｎｓｋｉの５の法則
・ｃｌｏｇＰ≦５
・分子量は３００と９００との間
・反応性。ＨＢドナーおよびアクセプター
・はっきりしない細胞毒性
・合成の容易さ。３〜１０のステップからなる合成方法、または（合成化学者の見解によれば）同様のプロセスをともなう構造上の複雑さが記載されている。
【００６８】
第１の態様において、本発明は、下記の一般式（Ｉ）から選択され、
【００６９】
【化２】
2011517664.tif 000005
【００７０】
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は互いに独立して以下の（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかであればよい。すなわち、
（ｉ）水素、
（ｉｉ）分枝がある、あるいは直線状の−（ＣＨ２）ｎ−Ｈアルキル基（ただし、必要に応じて不飽和度を有する）であって、ｎ＝１〜１０であり、好ましくはメチルまたはエチルである、
（ｉｉｉ）−ＣＯＯＨカルボン酸または式−ＣＯＯＲで表わされるエステル（ただし、Ｒは分枝がある、あるいは直線状の−（ＣＨ２）ｎ−Ｈアルキル基（必要に応じて不飽和度を有する）であって、ｎ＝１〜１０であり、好ましくはメチルまたはエチルである）、
（ｉｖ）−ＯＨヒドロキシル基、−ＮＯ２基、
（ｖ）ハロゲン；−ＣＨａ３基（ただし、Ｈａはハロゲン）であって、好ましくはＣＦ３である、
（ｖｉ）−ＮＨＣＯＲ（ただしＲは、分枝がある、あるいは直線状の−（ＣＨ２）ｎ−Ｈアルキル基（必要に応じて不飽和度を有する）であって、ｎ＝１〜１０であり、好ましくはメチルまたはエチルである）、
ｘ、ｙ、およびｚは＝１〜４であり、
２−（４−メトキシフェニル）−２−オキソエチル３−（２，４−（ジニトロ）ベンズアミド）ベンゾアート（ただし、Ｒ１は２，４−ｄｉ−ＮＯ２、Ｒ２はＨ、Ｒ３は４−ＯＭｅ）および２−４−（ニトロフェニル）−２−オキソエチル３−（４−ブロモ）ベンズアミド）ベンゾアート（ただし、Ｒ１は４−Ｂｒ、Ｒ２はＨ、Ｒ３は４−ＮＯ２）を除く、化合物、または該化合物の、薬学的に許容可能な塩に関する。
【００７１】
一般式（Ｉ）で表わされる化合物から選択される本発明を代表する化合物は、ＦＭ１９Ｇ１１と呼ばれる化合物であり、Ｒ１＝２，４−ｄｉ−ＮＯ２、Ｒ２＝Ｈ、およびＲ３＝４−ＣＨ３である。
【００７２】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、生物において大きな刺激作用を引き起こさず、化合物の生物活性または性質を低減しない、化合物の製剤形態をいう。薬学的な塩は、本発明の化合物を無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ型トルエンスルホン酸、サリチル酸などと反応させることによって得られる。
【００７３】
さらに、本発明は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物を合成する、一般に３つのステップからなる方法に関する。図１は、化合物の合成の概要を示す。この化合物は、例えば、詳細を後述するようにすることによって得られる。
【００７４】
本発明の別の態様は、有効な含有量の、式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物と、１つ以上のキャリアまたは希釈液、および必要に応じて１つ以上の生理学的に許容可能な補助剤とを含んでなる、薬学的組成物に関する。
【００７５】
一般に、各化合物について最低１０μＭ、好ましくは最低１００ｎＭの用量を投与することが望ましい。投与量は、好ましくは１００ｎＭ〜５００ｎＭの範囲である。ただし、これより小さな用量で使用してもよい。上記用量は単一の用量であってもよく、粉末または固形の形態で投与してもよい。投与間隔は固定する必要がなく、数日、数週間、または数ヶ月間にわたって継続投与または周期的もしくは持続的に放出する投与形態でもよい。ただし、一日一回、または一日に数回という周期性が勧められる病例もある。
【００７６】
薬学的組成物（または阻害剤）を投与する有効な用量は、化合物の効果および阻害剤としての化合物の効力に依存する。「有効な用量」という用語は、血管新生および疾病の症状が減弱されるだけの、所望の効果を引き起こすために十分な量の活性化合物に関連する。上記用量は、望ましくない副次的効果を引き起こす比率で使用してはならない。臨床的アセスメントを行えば、例えば、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全などを治療的に有害および非治療可能にする。一般に、用量は年齢、健康状態、性別、および患者の疾病の程度にともなって変化し、個々の病例において決定されればよい。
【００７７】
薬学的組成物の形態を有する活性化合物の投与ルートは、解決すべき問題および患者に応じて、静脈内投与（ＩＶ）、筋肉内投与（ＩＭ）、皮下投与（ＳＣ）、皮内投与（ＩＤ）、腹腔内投与（ＩＰ）、くも膜下腔内投与、つまり脊髄の周囲の空間への投与（ＩＴ）、眼内投与（ＩＯ）、胸膜内投与（ＩＰｌ）、子宮内投与（ＩＵ）、直腸投与、腟投与、局所的投与、腫瘍内投与などであってもよい。
【００７８】
必要であれば、本発明の化合物を、プロドラッグとして投与してもよい。「プロドラッグ」という用語は、「インビボ」状態では元の薬になる薬剤を指す。ある状況では、プロドラッグの方が元の薬より投与しやすいことがある。例えば、プロドラッグは、経口投与によって生物が利用可能であるが、元の化合物はそうではない。または、プロドラッグの方が溶解度が高く、したがって静脈内投与が可能である。
【００７９】
本発明の対象である化合物は、薬学的に許容可能な、希釈液またはキャリアとして作用する賦形剤と混合してもよい。この賦形剤は、有効成分と互換性を有し、薬学的に許容可能な、治療的に許容可能な方法に適した使用量になっている。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合わせなどが挙げられるが、これに限られるものではない。さらに、所望であれば、上記組成物が、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝液などの、有効成分の有効性を安定化させるまたは改善する物質を含有してもよい。
【００８０】
一般に、本発明の修飾因子および／または阻害剤の化合物は、バッファ溶液中で、５．５と７．０との間のｐＨで、より好ましくは５．５〜６．０との間のｐＨで、より好ましくは５．５にｐＨを調整して製剤しなければならない。ｐＨは、例えば塩酸などの適切な酸を添加することによって、調整してもよい。さらに、水性の「キャリア」は、２種類以上の生理食塩水緩衝液、および塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ブドウ糖、ポリエチレングリコール、およびその他の溶質など）を含有してもよい。さらに、液体組成物は、水に加えてまたは水の替わりに、他の液体溶液（例えば、グリセリンの液体溶液、植物油など）を含有してもよい。
【００８１】
本発明の化合物は、上記成分の、薬学的に許容可能な塩を含有してもよい。薬学的に許容可能な塩には、酸の添加によって形成される（阻害剤の構造を有するアミノ基をともなって形成される）塩が含まれる。この塩は、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または例えば酢酸、酒石酸、マンデル酸などの例えば有機酸を用いて形成される。カルボキシル基のラジカルをともなって形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、および例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来する。
【００８２】
本発明の別の態様は、、一般式（Ｉ）で表わされる１つ以上の化合物を有する薬学的組成物、キャリアまたは希釈液、および／または１つ以上の補助剤を備えたキットである。これらは、個々の病例において、組成物の投与ルートに応じて１つ以上の容器に共にまたは別々に収容されていてもよい。
【００８３】
化合物ライブラリーを構成する化合物の選択基準は、構造上の多様性、ファルマコフォアの代表性、キラル中心の個数、溶解度、および該化合物の化学合成のしやすさに基づく内部基準である。ＣＩＰＦの収集データは、ＨＩＦ反応配列（ＨＩＦ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ；  ＨＲＥ）のアッセイを介して選択された（実施例１）。また、活性化合物は、２つの異なる転写因子Ｊｕｎ  Ｂ（ＣＲＥ）およびｃ−Ｆｏｓ（ＴＲＥ）の反応配列に基づいて、活性の阻害に逆らう効力および細胞アッセイに対するその選択性によって選択された（実施例２）。これらの効力および選択性基準にしたがって得られる阻害剤の最良のものを選択すると、それはＦＭ１９Ｇ１１であった。この活性化合物を選択するには、十分な量の該活性化合物を得る必要があった。したがって、本発明は、さらに、化合物ＦＭ１９Ｇ１１（図１）を化学合成によって得るための方法に関連する。化合物ＦＭ１９Ｇ１１の中間体および構造類似体を、化学合成によって得るための方法につても記載する。これらの類似体は、構造と活性との関係（ＳＡＲ）に関する研究（実施例３〜３１）において比較する。
【００８４】
開発した研究対象物は、本発明の化合物が、ＨＩＦの標的遺伝子（例えば、プロリル−ヒドロラーゼ３（ＰＨＤ  ３）、自己分泌制御におけるＨＩＦそのもの、および腫瘍細胞モデルにおける血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））の転写をどのようにして阻害するのかを示す（実施例３２）。この阻害活性は、神経前駆細胞のモデル、成体の脊髄上衣の神経前駆細胞（ｅｐＮＳＣ）（実施例３４および３５）の初代培養、最後に、歯髄の間葉系の細胞モデル（実施例３６および３７）においても示される（実施例３３）。
【００８５】
本発明は、互いに異なる組織の表現をともなう哺乳類の細胞株のパネルに対して、ならびに、魚の胚のモデルにおける脊椎動物の生物体全体に対して（実施例４５）、ＦＭ１９Ｇ１１の細胞毒性が低いことを実証する（実施例３９）。
【００８６】
本発明は、ｅｐＳＰＣが分化してオリゴデンドロサイトになるプロセスの進行を、低酸素条件下で、本発明の化合物ＦＭ１９Ｇ１１がどのようにして可能にするのかを示している（実施例４２）。また、正常酸素条件下で、該化合物がどのようにして自己再生を可能にし、未分化状態を維持するのかを示している（実施例４３）。
【００８７】
本発明は、ＨＰＬＣを使用し、ＦＭ１９Ｇ１１の保持時間を算出することによってＦＭ１９Ｇ１１を特徴づける（実施例４６）。この分析方法は、ウシ血清においてＦＭ１９Ｇ１１の安定性を確立する役目をする（実施例４７）。
【００８８】
本研究は、ＨＴ２９のヒトの大腸癌細胞において、どのようにしてＦＭ１９Ｇ１１が、ＤＮＡ損傷応答をトリガーするのか（実施例４８）、また、このプロセスに関与する活性化の動態的変化（実施例４９）についても検討する。
【００８９】
本発明の化合物は、ヒトの結腸癌の腫瘍細胞において、ｐ５３依存的に細胞周期のＧ１／Ｓ期停止を誘導する（実施例２０）。また、ｍＴＯＲシグナル経路と細胞周期のＳ期停止との間に存在する関連性について実施例５１において詳述する。
【００９０】
本発明の実施例５６は、ＦＭ１９Ｇ１１が、後成的な現象によってクロマチンを除去する能力を、どのようにして有しているのかを示す。
【００９１】
これらの全ての特徴によって、本発明の化合物は、血管新生、炎症、アポトーシス、および細胞治療の病理的プロセスに対する修飾因子および／または阻害剤の候補となりうる。
【００９２】
〔実施例〕
以下に記載する具体的な実施例は、ここで本発明の特徴を例証する役目をする。これらの実施例は、例証を提供することだけを目的としてここに記載されているのであって、請求項において記載された本発明に対してなんらの制限を加えるものではない。
【００９３】
〔実施例１：ＨＩＦ  １のアッセイ、および化合物ＦＭ１９Ｇ１１の選択〕
ＨＩＦの活性に対して直接作用する阻害剤を特定するために、初めに、科学文献ではＨｅＬａとして知られている頸部腫瘍株から、安定に組換え可能な株を作製した。該頸部腫瘍株は、ヒトの血管内皮増殖因子（ｈＶＥＧＦ）の部位−９８５と−９５１との間に位置する領域が、９回反復し（９Ｘ）、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子（ＬＵＣ）に融合された、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の配列を含有する。このプラスミドは、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｄｅ  Ｌａ  Ｐｒｉｎｃｅｓａ  ｏｆ  Ｍａｄｒｉｄ病院のＤｒ．  Ｍａｎｕｅｌ  Ｏｒｔｉｚ  ｄｅ  Ｌａｎｄａｚｕｒｉから提供を受けたたもので、９ＸＨＲＥ−ＬＵＣと呼ばれ、市販のキット（Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  Ｍａｘｉ−Ｐｒｅｐ、  Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を使って調製された。形質移入を、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ，  ｃａｔ．１８１４４４３）を使って、製造業者の指示にしたがって実施した。μｇ  ＤＮＡとμｇ  ＦｕＧｅｎｅとの比は、１：３であった。形質移入された細胞株は、哺乳類細胞内でハイグロマイシン耐性遺伝子が発現し、形質移入されたクローンのを選択を可能にするベクターｐＣＭＶ−Ｈｙｇｒｏｍを、同時導入することによって生成した。４８時間後に、増殖培地を、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含有する新しい培地と交換した。抗生物質に対して耐性を有するクローンを収集し、ＲＴ−ＰＣＲにより分析して、所望の構成を有するクローンを選択した。通例のように、不活化された１０％のウシ胎仔血清（Ｗｈｉｔｔａｃｋｅｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で継代培養を行うことより、ＨｅＬａ  ９ＸＨＲＥ−ＬＵＣ細胞株を対数増殖期に維持した。この細胞を、５％のＣＯ２および３００ｎＭのＤｅｓｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ（ＤＦＸ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する加湿環境下で、３７℃で培養した。
【００９４】
ＣＩＰＦの収集データの化合物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの市販の収集データから選択したものであるが、これらの化合物は、５ｍＭの終濃度でＤＭＳＯに可溶化し、−８０℃で保存した。ルシフェラーゼアッセイにおけるこれらの化合物の濃度は、反応を行った多ウェルプレートのウェルで最終的に１ｍｃＭであった。ルシフェラーゼアッセイは、白色の９６穴のプレート（Ｖａｌｔｅｃｋｎｏｖａ  ｒｅｆ．  ３９１７）内で行われ、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のキットを製造業者が提供する指示にしたがって使用した。分析した１２，２５０種類の化合物から、上記化合物ＦＭ１９Ｇ１１を選択した。ＦＭ１９Ｇ１１は、化学的な低酸素条件（３００ｎＭ  ＤＦＸ）下で、８０ｎＭのＩＣ５０を有していたが、これは、低酸素チャンバー（ＩＮ  ＶＩＶＯ２  ４００  ＲＵＳＫＩＮＮ）において物理的な低酸素条件（Ｏ２１％）下で、後に確認した活性である。
【００９５】
図２ＡはＦＭ１９Ｇ１１の化学構造を示し、図２Ｂは、ＦＭ１９Ｇ１１について、８０ｎＭから得られた対応するＩＣ５０の用量応答曲線を示している。図２Ｃは、低酸素条件（Ｏ２１％）および正常酸素条件（Ｏ２２０％）下における、ＦＭ１９Ｇ１１によるＨＩＦ１αの活性阻害（単位は、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ））の関係を示している。
【００９６】
〔実施例２：ＦＭ１９Ｇ１１の選択性の研究〕
活性化合物ＦＭ１９Ｇ１１を用いた選択性アッセイは、白色の９６穴のプレートにおいて、ＡＰ−１複合体における転写因子の転写活性を示す、組換え型の株Ｈｅｋ  ２９３−ＴＲＥ−ＬＵＣおよびＨｅｋ  ２９３−ＣＲＥ−ＬＵＣを用いて実施された。転写活性を測定するためのルシフェラーゼアッセイは、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のキットを使用して、製造業者が提供する指示にしたがって実施した。上記Ｈｅｋ  ２９３−ＴＲＥ−ＬＵＣおよびＨｅｋ  ２９３−ＣＲＥ−ＬＵＣの株は、ＡＰ−１複合体の転写因子の応答エレメント、特に、ｃ−ＦＯＳおよびＪＵＮＢの応答エレメントをそれぞれに含有する。Ｈｅｋ  ２９３−ＴＲＥ−ＬＵＣおよびＨｅｋ  ２９３−ＣＲＥ−ＬＵＣの株は、Ｄｒ．  Ｒｏｓａ  Ｆａｒｒａｓから提供を受けたものである。
【００９７】
図３は、これらの３つの細胞株に対して実施されたアッセイにおいて観察される、ルシフェラーゼの発現阻害による、ＦＭ１９Ｇ１１の選択的な活性を示す。上記ＨｅＬａ  ９ＸＨＲＥ−ＬＵＣ株（黒色の棒グラフ）では、阻害剤の濃度に用量依存した阻害になっている一方、Ｈｅｋ  ２９３−ＴＲＥ−ＬＵＣ（灰色の棒グラフ）およびＨｅｋ  ２９３−ＣＲＥ−ＬＵＣ（白色の棒グラフ）では、転写レベルは、ＬＵＣレポーター遺伝子のルミネッセンス発光によって測定され、実施した実験条件下では、いかなる場合においても影響されることがなかった。
【００９８】
図１は、本発明の化合物の調製を要約したものである。
【００９９】
〔実施例３。メチル３−アミノベンゾアートの合成〕
【０１００】
【化３】
2011517664.tif 000006
【０１０１】
３−アミノ安息香酸（０．３ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）の無水メタノール（３．２６ｍｌ）溶液に、塩化チオニル（０．３７ｍｌ、３．２７ｍｍｏｌ）をゆっくりと０℃で添加した。反応物を１６時間攪拌し、そしてＮａＨＣＯ３の飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＣＨ２ＣａＣｌ２で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、精製せずに以下の過程で使用した（収量：９０％）。
【０１０２】
〔実施例４。メチル３−（（２，４−ジニトロ）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１０３】
【化４】
2011517664.tif 000007
【０１０４】
２，４−ジニトロ安息香酸（０．１７ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２ＣａＣｌ２（４ｍｌ）溶液に、Ｎｏ．１（０．１１ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．２３ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．２５ｇ、１．６５ｍｍｏｌ）、およびＥｔ３Ｎ（０．２３ｍｌ、１．６５ｍｍｏｌ）を添加した。３時間撹拌した後、反応物を、ＮＨ４ＣａＣｌの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＣＨ２ＣａＣｌ２で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（２：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：６１％）。ｍｐは１４０℃〜１４３℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ３．９４（ｓ、３Ｈ）、７．５９（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．８６（ｄｔ、Ｊ１＝７．８Ｈｚ、Ｊ２＝１．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．０２（ｄｃ、Ｊ１＝９．０Ｈｚ、Ｊ２＝１．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．２５（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．４５（ｔ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．７６（ｄｄ、Ｊ１＝８．４Ｈｚ、Ｊ２＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．９４（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、１０．２（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ５１．６、１１９．８、１２０．５、１２４．１、１２５．２、１２８．３、１２９．２、１３０．９、１３７．５、１３８．８、１４７．０、１４８．６、１６２．７、１６６．０。Ｃ１５Ｈ１１Ｎ３Ｏ７（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は３４５．０５９７、実験値は３４５．０５７０であった。
【０１０５】
〔実施例５。３−（（２，４−ジニトロ）ベンズアミド）安息香酸の合成。〕
【０１０６】
【化５】
2011517664.tif 000008
【０１０７】
Ｎｏ．２（０．１ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の４：１  ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（１５ｍｌ）溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．０３６ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１６時間攪拌し、そして１Ｍの塩化水素で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、つづけて精製をせずに使用した（収量：９９％）。ｍｐは２６０℃〜２６３℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ２．９０（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）、７．５８（ｔ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９０（ｄｔ、Ｊ１＝７．８Ｈｚ、Ｊ２＝１．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．０（ｄｔ、Ｊ１＝８．２Ｈｚ、Ｊ２＝１．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．２（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．４（ｔ、Ｊ＝１．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．７（ｄｄ、Ｊ１＝８．６Ｈｚ、Ｊ２＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．９（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、１０．２（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  １２１．５、１２２．７、１２５．８、１２７．２、１３０．１、１３０．８、１３２．５、１３３．１、１３９．３、１４０．５、１４８．７、１５０．２、１６４．４、１６８．０。Ｃ１４Ｈ９Ｎ３Ｏ７（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は３３１．０４４０、実験値は３３１．０４３０であった。
【０１０８】
〔実施例６。２−オキソ−２−（ｐ−トリル）エチル３−（（２，４−ジニトロ）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１０９】
【化６】
2011517664.tif 000009
【０１１０】
酸Ｎｏ．３（０．２ｇ、０．６ｍｍｏｌ）の１：１  Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（６ｍｌ）溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３の水溶液を、ｐＨが６．５になるまで添加して、セシウム塩を得た。この塩を減圧下で濃縮し、ＤＭＦ（３．２ｍｌ）に再溶解させ、ブロモメチル−ｐ−トリルケトン（０．１４１ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を添加した。３時間撹拌した後、反応物を、塩化ナトリウムの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（３：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：５４％）。ｍｐは１６８℃〜１７０℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ２．３７（ｓ、３Ｈ）、５．４１（ｓ、２Ｈ）、７．１８〜７．２５（ｍ、３Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．６９（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．８５（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．０１（ｓ、１Ｈ）、８．３０（ｄｄ、Ｊ１＝８．３Ｈｚ、Ｊ２＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．６４（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．９５（ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ２１．９、６６．４、１２０．０、１２１．３、１２５．２、１２６．６、１２７．８、１２８．２、１２９．４、１２９．７、１３０．６、１３１．１、１３７．３、１３７．４、１４５．７、１４６．３、１４８．１、１６２．６、１６５．３、１７３．９、１９２．８。Ｃ２３Ｈ１７Ｎ３Ｏ８（Ｍ＋）について算出したＨＭＲＳ（ＥＩ）は４６３．１０１５、実験値は４６３．０９９９であった。
【０１１１】
〔実施例７。メチル３−（２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１１２】
【化７】
2011517664.tif 000010
【０１１３】
２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）安息香酸（０．１４ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２ＣａＣｌ２（３ｍｌ）溶液に、Ｎｏ．１（０．０８ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．１７ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．１９ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）、およびＥｔ３Ｎ（０．１７ｍｌ、１．２４ｍｍｏｌ）を添加した。１６時間撹拌した後、反応物を、ＮＨ４ＣａＣｌの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＣＨ２ＣａＣｌ２で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：９０％）。ｍｐは１３３℃〜１３６℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ３．７５（ｓ、３Ｈ）、７．３０（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．６６（ｓ、１Ｈ）、７．６９（ｓ、１Ｈ）、７．７９（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．８１（ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．９１（ｓ、１Ｈ）、８．１７（ｓ、１Ｈ）、８．４６（ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ５２．６、１２１．５、１２２．０（ｃ、３ＪＣＦ＝３．７Ｈｚ）、１２２．５（ｃ、１ＪＣＦ＝２７５．４Ｈｚ）、１２５．３、１２６．５、１２９．５、１３０．０、１３０．８（ｃ、３ＪＣＦ＝３．２Ｈｚ）、１３１．０、１３３．４（ｃ、２ＪＣＦ＝３４．８Ｈｚ）、１３５．４、１３７．５、１４６．４、１６３．９、１６７．０。１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２．４ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  −６３．１（ｓ、３Ｆ）。Ｃ１６Ｈ１１Ｆ３Ｎ２Ｏ５（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は３６８．０６２０、実験値は３６８．０６２０であった。
【０１１４】
〔実施例８。３−（２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）安息香酸の合成。〕
【０１１５】
【化８】
2011517664.tif 000011
【０１１６】
Ｎｏ．５（０．１ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の４：１  ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（２０ｍｌ）溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．５６ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１６時間攪拌し、そして１Ｍの塩化水素で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、つづけて精製をせずに使用した（収量：８３％）。ｍｐは２６４℃〜２６７℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ７．４０（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｄｔ、Ｊ１＝７．８Ｈｚ、Ｊ２＝１．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．８８（ｄｃ、Ｊ１＝７．８Ｈｚ、Ｊ２＝１．１Ｈｚ）、８．０１（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．１４（ｄｄ、Ｊ１＝７．８Ｈｚ、Ｊ２＝０．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．３０（ｔ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．３４（ｓ、１Ｈ）、９．９７（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  １２１．８、１２２．５（ｃ、３ＪＣＦ＝４．１Ｈｚ）、１２４．９、１２６．３、１２３．８（ｃ、１ＪＣＦ＝２７２．７Ｈｚ）、１３０．０、１３１．５、１３２．３、１３３．０（ｃ、２ＪＣＦ＝３５．３Ｈｚ）、１３６．９、１３９．７、１４８．０、１６３．９、１６７．２。１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２．４ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  −１１１．６（ｓ、３Ｆ）。Ｃ１５Ｈ９Ｆ３Ｎ２Ｏ５（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は３５４．０４６３、実験値は３５４．０４７３であった。
【０１１７】
〔実施例９。２−オキソ−２−（ｐ−トリル）エチル３−（２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１１８】
【化９】
2011517664.tif 000012
【０１１９】
酸Ｎｏ．６（０．０６ｇ、０．２ｍｍｏｌ）の１：１  Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（２ｍｌ）溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３の水溶液を、ｐＨが６．５になるまで添加して、セシウム塩を得た。この塩を減圧下で濃縮し、ＤＭＦ（１．０ｍｌ）に再溶解させ、ブロモメチル−ｐ−トリルケトン（０．０３ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。４時間撹拌した後、反応物を、塩化ナトリウムの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：３２％）。ｍｐは１７９℃〜１８１℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ２．２９（ｓ、３Ｈ）、５．５８（ｓ、２Ｈ）、７．２４（ｓ、１Ｈ）、７．２６（ｓ、１Ｈ）、７．４４（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．７７（ｄｔ、Ｊ１＝８．０Ｈｚ、Ｊ２＝１．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．８０（ｓ、１Ｈ）、７．８３（ｓ、１Ｈ）、７．９１（ｄｃ、Ｊ１＝８．１Ｈｚ、Ｊ２＝１．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．０２（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．１４（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．３４（ｓ、１Ｈ）、８．３７（ｔ、Ｊ＝１．４Ｈｚ、１Ｈ）、１０．０４（ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ２０．２、６６．２、１２０．２、１２２．４（ｃ、１ＪＣＦ＝２７２．１Ｈｚ）、１２１．１（ｃ、３ＪＣＦ＝３．９Ｈｚ）、１２３．９、１２４．９、１２７．３、１２８．８、１２８．９、１３０．１、１３０．２、１３１．３、１３１．５、１３５．６、１３８．５、１４４．２、１４６．６、１６２．７、１６４．７、１９１．０。１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２．４ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  −６３．０６（ｓ、３Ｆ）。Ｃ２４Ｈ１７Ｆ３Ｎ２Ｏ６（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は４８６．１０３８、実験値は４８６．１０３３であった。
【０１２０】
〔実施例１０。メチル３−（４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１２１】
【化１０】
2011517664.tif 000013
【０１２２】
４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）安息香酸（０．１７ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２ＣａＣｌ２（２ｍｌ）溶液に、Ｎｏ．１（０．１ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．２１ｇ、１．１１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．２２ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）、およびＥｔ３Ｎ（０．２０ｍｌ、１．４８ｍｍｏｌ）を添加した。１６時間撹拌した後、反応物を、ＮＨ４ＣａＣｌの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＣＨ２ＣａＣｌ２で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（５：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：６９％）。ｍｐは１０２℃〜１０４℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ３．７４（ｓ、３Ｈ）、７．２７（ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．６３〜７．７２（ｍ、３Ｈ）、７．９６（ｔ、Ｊ＝１．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．２１（ｄｄ、Ｊ１＝８．４Ｈｚ、Ｊ２＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．３１（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．８０（ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ５２．５、１２１．４、１２２．３（ｃ、３ＪＣＦ＝４．９Ｈｚ）、１２２．５（ｃ、１ＪＣＦ＝２７３．６Ｈｚ）、１２５．１、１２６．６、１２７．１、１２９．３（ｃ、２ＪＣＦ＝２５．１Ｈｚ）、１２９．５、１３０．３、１３１．２、１３７．４、１４０．８、１４８．３、１６４．１、１６６．８。１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２．４ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  −５９．６（ｓ、３Ｆ）。Ｃ１６Ｈ１１Ｆ３Ｎ２Ｏ５（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は３６８．０６２０、実験値は３６８．０６１８であった。
【０１２３】
〔実施例１１。３−（４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）安息香酸の合成。〕
【０１２４】
【化１１】
2011517664.tif 000014
【０１２５】
Ｎｏ．８（０．０８ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の４：１  ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（１３ｍｌ）溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．０３９ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１６時間攪拌し、そして１Ｍの塩化水素で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、つづけて精製をせずに使用した（収量：９９％）。ｍｐは２５０℃〜２５５℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ７．４１（ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．７２（ｄｔ、Ｊ１＝７．５Ｈｚ、Ｊ２＝１．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．８９（ｄｃ、Ｊ１＝９．０Ｈｚ、Ｊ２＝１．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．０２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．３２（ｔ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．４７〜８．５２（ｍ、２Ｈ）、９．９６（ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  １２２．６、１２３．４（ｃ、３ＪＣＦ＝５．３Ｈｚ）、１２５．８、１２７．１、１２９．０、１３０．０（ｃ、２ＪＣＦ＝３２．９Ｈｚ）、１３０．７、１３２．２、１３３．１、１４０．５、１４３．１、１４９．９、１６５．６、１６８．１。１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２．４ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  −５９．３（ｓ、３Ｆ）。Ｃ１５Ｈ９Ｆ３Ｎ２Ｏ５（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は３５４．０４６３、実験値は３５４．０４７５であった。
【０１２６】
〔実施例１２。２−オキソ−２−（ｐ−トリル）エチル３−（４−ニトロ−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１２７】
【化１２】
2011517664.tif 000015
【０１２８】
酸Ｎｏ．９（０．０７ｇ、０．２ｍｍｏｌ）の１：１  Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（２ｍｌ）溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３の水溶液を、ｐＨが６．５になるまで添加し、セシウム塩を得た。この塩を減圧下で濃縮し、ＤＭＦ（１．０ｍｌ）に再溶解させ、ブロモメチル−ｐ−トリルケトン（０．０４ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。４８時間撹拌した後、反応物を、塩化ナトリウムの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：２８％）。ｍｐは１６５℃〜１６６℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ２．２８（ｓ、３Ｈ）、５．５９（ｓ、２Ｈ）、７．２４（ｓ、１Ｈ）、７．２７（ｓ、１Ｈ）、７．４５（ｔ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７７（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．８１（ｓ、１Ｈ）、７．８３（ｓ、１Ｈ）、７．９３（ｄｄ、Ｊ１＝７．２Ｈｚ、Ｊ２＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．０４（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．３９（ｔ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．４８（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）、８．５０〜８．５３（ｍ、１Ｈ）、１０．０（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ２０．２、６６．３、１２０．３、１２１．４（ｃ、３ＪＣＦ＝４．６Ｈｚ）、１２３．９、１２５．０、１２６．９、１２７．３、１２８．０（ｃ、３ＪＣＦ＝６．３Ｈｚ）、１２８．８、１２８．９、１２９．５（ｃ、１ＪＣＦ＝２８５．８Ｈｚ）、１３０．０、１３０．２、１３８．４、１４０．８、１４４．１、１４７．９、１６３．５、１６４．６、１９０．９。１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２．４ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  −５９．６０（ｓ、３Ｆ）。Ｃ２４Ｈ１７Ｆ３Ｎ２Ｏ６（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は４８６．１０３９、実験値は４８６．１０２６であった。
【０１２９】
〔実施例１３。メチル３−（２，４−ビス−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１３０】
【化１３】
2011517664.tif 000016
【０１３１】
２，４−ビス−（トリフルオロメチル）安息香酸（０．３２ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２ＣａＣｌ２（５ｍｌ）溶液に、Ｎｏ．１（０．１６ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．３５ｇ、１．８７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．３８ｇ、２．５０ｍｍｏｌ）、およびＥｔ３Ｎ（０．３４ｍｌ、２．５０ｍｍｏｌ）を添加した。１６時間撹拌した後、反応物を、ＮＨ４ＣａＣｌの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＣＨ２ＣａＣｌ２で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（３：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：５０％）。ｍｐは１３０℃〜１３２℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ３．８２（ｓ、３Ｈ）、７．４１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．６１（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）、７．７３〜７．８１（ｍ、２Ｈ）、７．８５〜７．９４（ｍ、３Ｈ）、８．０２（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ５２．５、１２１．２（ｃ、３ＪＣＦ＝５．１Ｈｚ）、１２１．４、１２４．０、１２４．８、１２５．１、１２６．５、１２８．６（ｃ、２ＪＣＦ＝３４．５Ｈｚ）、１２９．３、１２９．６、１３１．２、１３２．８（ｃ、２ＪＣＦ＝３２．１Ｈｚ）、１３７．６、１３８．８。１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２．４ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  −５９．２（ｓ、３Ｆ）、−６３．１（ｓ、３Ｆ）。Ｃ１７Ｈ１１Ｆ６ＮＯ３（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は３９１．０６４３、実験値は３９１．０６４５であった。
【０１３２】
〔実施例１４。３−（２，４−ビス−（トリフルオロメチル）ベンズアミド）安息香酸の合成。〕
【０１３３】
【化１４】
2011517664.tif 000017
【０１３４】
Ｎｏ．１１（０．２ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）の４：１  ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（２９ｍｌ）溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．０８５ｇ、２．０４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１６時間攪拌し、そして１Ｍの塩化水素で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、つづけて精製をせずに使用した（収量：９７％）。ｍｐは２３８℃〜２４１℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ７．４１（ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．７２（ｄｔ、Ｊ１＝７．８Ｈｚ、Ｊ２＝１．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．９０（ｄｃ、Ｊ１＝８．１Ｈｚ、Ｊ２＝０．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．９４（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．０４（ｍ、２Ｈ）、８．３３（ｔ、Ｊ＝１．７、１Ｈ）、９．８４（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  １２０．４、１２３．０、１２３．５、１２４．９、１２７．４（ｃ、２ＪＣＦ＝３１．９Ｈｚ）、１２８．６、１２９．０、１２９．３、１３０．８、１３０．９（ｃ、２ＪＣＦ＝３３．５Ｈｚ）、１３８．４、１３９．２、１６３．９、１６５．９。１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２．４ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  −５９．２（ｓ、３Ｆ）、−６３．１（ｓ、３Ｆ）。
【０１３５】
〔実施例１５。２−オキソ−２−（ｐ−トリル）エチル３−（２，４−ビス（トリフルオロメチル）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１３６】
【化１５】
2011517664.tif 000018
【０１３７】
酸Ｎｏ．１２（０．０７ｇ、０．２ｍｍｏｌ）の１：１  Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（２ｍｌ）溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３の水溶液を、ｐＨが６．５になるまで添加し、セシウム塩を得た。この塩を減圧下で濃縮し、ＤＭＦ（１．０ｍｌ）に再溶解させ、ブロモメチル−ｐ−トリルケトン（０．０４ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。１２時間撹拌した後、反応物を、塩化ナトリウムの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（３：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：３１％）。ｍｐは１６１℃〜１６３℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ２．３６（ｓ、３Ｈ）、５．４６（ｓ、２Ｈ）、７．２０〜７．２３（ｍ、２Ｈ）、７．３８（ｔ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７３（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．７７〜７．８５（ｍ、４Ｈ）、７．８９〜７．９４（ｍ、２Ｈ）、８．１１（ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ２１．８、６６．５、１２１．３、１２３．７、１２５．１、１２６．６、１２７．８、１２８．１、１２８．９（ｃ、２ＪＣＦ＝４０．７Ｈｚ）、１２９．４、１２９．５、１２９．６、１３０．２、１３１．４、１３７．４、１３８．７、１４２．５、１４５．１、１６４．３、１６５．４、１９１．８。１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２．４ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  −５９．２（ｓ、３Ｆ）、−６３．１（ｓ、３Ｆ）。Ｃ２５Ｈ１７Ｆ６ＮＯ４（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は５０９．１０６１、実験値は５０９．１０６２であった。
【０１３８】
〔実施例１６。メチル３−（ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１３９】
【化１６】
2011517664.tif 000019
【０１４０】
安息香酸（０．４ｇ、３．６ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２ＣａＣｌ２（８ｍｌ）溶液に、Ｎｏ．１（０．２ｇ、１．８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．５ｇ、２．７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．５ｇ、３．７ｍｍｏｌ）、およびＥｔ３Ｎ（０．５ｍｌ、３．７ｍｍｏｌ）を添加した。１６時間撹拌した後、反応物を、ＮＨ４ＣａＣｌの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＣＨ２ＣａＣｌ２で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（５：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：２０％）。
【０１４１】
〔実施例１７。３−（ベンズアミド）安息香酸の合成。〕
【０１４２】
【化１７】
2011517664.tif 000020
【０１４３】
Ｎｏ．１４（０．０５ｇ、０．２ｍｍｏｌ）の４：１  ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（１４ｍｌ）溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．０３ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１６時間攪拌し、そして１Ｍの塩化水素で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、つづけて精製をせずに使用した（収量：９０％）。
【０１４４】
〔実施例１８。２−オキソ−２−（ｐ−トリル）エチル３−（ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１４５】
【化１８】
2011517664.tif 000021
【０１４６】
酸Ｎｏ．１５（０．０４ｇ、０．２ｍｍｏｌ）の１：１  Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（２ｍｌ）溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３の水溶液を、ｐＨが６．５になるまで添加し、セシウム塩を得た。この塩を減圧下で濃縮し、ＤＭＦ（１．０ｍｌ）に再溶解させ、ブロモメチル−ｐ−トリルケトン（０．０４ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。１２時間撹拌した後、反応物を、塩化ナトリウムの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（３：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：５２％）。ｍｐは１５８℃〜１６０℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ２．４０（ｓ、３Ｈ）、５．５１（ｓ、２Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．４１〜７．５５（ｍ、４Ｈ）；７．８１（ｓ、１Ｈ）；７．８４〜７．８８（ｍ、４Ｈ）；８．０２（ｓ、１Ｈ）；８．１１〜８．１４（ｍ、２Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ２２．１、６６．９、１２１．６、１２５．５、１２６．２、１２７．４、１２８．２、１２９．１、１２９．６、１２９．９、１３２．０、１３２．３、１３４．９、１３８．６、１４５．３、１６５．９、１６６．２、１９２．１。Ｃ２３Ｈ１９ＮＯ４（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は３７３．１３１４、実験値は３７３．１２９９であった。
【０１４７】
〔実施例１９。２−オキソ−２−（４−トリフルオロメチル）エチル３−（２，４−（ジニトロ）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１４８】
【化１９】
2011517664.tif 000022
【０１４９】
酸Ｎｏ．３（０．２ｇ、０．６ｍｍｏｌ）の１：１  Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（２ｍｌ）溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３の水溶液を、ｐＨが６．５になるまで添加し、セシウム塩を得た。この塩を減圧下で濃縮し、ＤＭＦ（１．０ｍｌ）に再溶解させ、４−（トリフルオロメチル）フェナシルブロミド（０．０６ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。１２時間撹拌した後、反応物を、塩化ナトリウムの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（１：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：３４％）。ｍｐは１９８℃〜２００℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ５．５３（ｓ、２Ｈ）、７．４１〜７．４７（ｍ、１Ｈ）、７．７４（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、２Ｈ）、７．８５〜７．９３（ｍ、３Ｈ）、８．０１（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、８．１０〜８．１８（ｍ、２Ｈ）、８．５０（ｄｄ、Ｊ１＝８．１Ｈｚ、Ｊ２＝２．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．８７（ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ６７．９、１２０．８、１２１．８、１２５．５、１２６．５、１２６．８（ｃ、１ＪＣＦ＝３．５Ｈｚ）、１２９．３、１２９．５、１３０．３、１３１．３、１３１．８、１３５．０（ｃ、２ＪＣＦ＝３２．４Ｈｚ）、１３８．４、１３９．９、１４７．９、１４９．５、１６３．７、１６６．０、１９２．６。１９Ｆ  ＮＭＲ（２８２．４ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  −６３．３０（ｓ、３Ｆ）。Ｃ２３Ｈ１４Ｆ３Ｎ３Ｏ８（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は５１７．０７３３、実験値は５１７．０７５９であった。
【０１５０】
〔実施例２０。２−フェニル−２−オキソエチル３−（２，４−（ジニトロ）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１５１】
【化２０】
2011517664.tif 000023
【０１５２】
酸Ｎｏ．３（０．１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）の１：１  Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（４ｍｌ）溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３の水溶液を、ｐＨが６．５になるまで添加し、セシウム塩を得た。この塩を減圧下で濃縮し、ＤＭＦ（２ｍｌ）に再溶解させ、２−ブロモアセトフェノン（０．０７ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加した。１２時間撹拌した後、反応物を、塩化ナトリウムの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（２：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：６３％）。ｍｐは１２４℃〜１２６℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ５．４１（ｓ、２Ｈ）、７．２５（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．４２（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．５７（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．７２（ｍ、４Ｈ）、７．８５（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．９７（ｓ、１Ｈ）、８．３３（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．６４（ｓ、１Ｈ）、８．８６（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ６１．０、６６．９、１２０．２、１２１．５、１２５．５、１２６．７、１２８．１、１２８．６、１２９．４、１２９．７、１２９．９、１３１．０、１３３．８、１３４．９、１３７．６、１３７．７、１４６．５、１４８．３、１６３．２、１６５．８、１９３．８。Ｃ２２Ｈ１５Ｎ３Ｏ８（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は４４９．０８５９、実験値は４４９．０８７１であった。
【０１５３】
〔実施例２１。メチル３−（４−ニトロベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１５４】
【化２１】
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【０１５５】
４−ニトロ安息香酸（０．３３ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２ＣａＣｌ２（９ｍｌ）溶液に、Ｎｏ．１（０．２７ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．５７ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．６１ｇ、４．０ｍｍｏｌ）、およびＥｔ３Ｎ（０．５５ｍｌ、４．０ｍｍｏｌ）を添加した。１６時間撹拌した後、反応物を、ＮＨ４ＣａＣｌの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＣＨ２ＣａＣｌ２で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：３７％）。
【０１５６】
〔実施例２２。３−（４−ニトロベンズアミド）安息香酸の合成。〕
【０１５７】
【化２２】
2011517664.tif 000025
【０１５８】
Ｎｏ．２０（０．１６ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の４：１  ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（１２ｍｌ）溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．０９２ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１６時間攪拌し、そして１Ｍの塩化水素で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、つづけて精製をせずに使用した（収量：８０％）。
【０１５９】
〔実施例２３。２−オキソ−２−（ｐ−トリル）エチル３−（４−ニトロベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１６０】
【化２３】
2011517664.tif 000026
【０１６１】
酸Ｎｏ．２１（０．１ｇ、０．３ｍｍｏｌ）の１：１  Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（２ｍｌ）溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３の水溶液を、ｐＨが６．５になるまで添加し、セシウム塩を得た。この塩を減圧下で濃縮し、ＤＭＦ（１．０ｍｌ）に再溶解させ、ブロモメチル−ｐ−トリルケトン（０．７ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加した。１２時間撹拌した後、反応物を、塩化ナトリウムの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：３１％）。ｍｐは１７２℃〜１７３℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ２．２９（ｓ、３Ｈ）、５．５８（ｓ、２Ｈ）、７．２５（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．４３（ｔ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．７５（ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．８２（ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、８．０７（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．１６（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、８．２４（ｄ、Ｊ＝８．３Ｈｚ、２Ｈ）、８．４２（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ２２．４、６８．４、１２２．９、１２５．２、１２６．５、１２６．９、１２９．５、１３０．６、１３０．７、１３１．１、１３２．１、１３３．６、１４１．１、１４２．２、１４６．３、１５１．５、１６５．６、１６６．９、１９３．１。Ｃ２３Ｈ１８Ｎ２Ｏ６（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は４１８．１１７９、実験値は４１８．１１６４であった。
【０１６２】
〔実施例２４。メチル３−（２−ニトロベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１６３】
【化２４】
2011517664.tif 000027
【０１６４】
２−ニトロ安息香酸（０．３３ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２ＣａＣｌ２（９ｍｌ）溶液に、Ｎｏ．１（０．２７ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（０．５７ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．６１ｇ、４．０ｍｍｏｌ）、およびＥｔ３Ｎ（０．５５ｍｌ、４．０ｍｍｏｌ）を添加した。１６時間撹拌した後、反応物を、ＮＨ４ＣａＣｌの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＣＨ２ＣａＣｌ２で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：２５％）。ｍｐは１７５℃〜１７６℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ３．９０（ｓ、３Ｈ）、７．５３（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．７７〜７．８５（ｍ、２Ｈ）、７．８７〜７．９３（ｍ、２Ｈ）、８．０２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．１６（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．４５（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ５３．６、１２２．２、１２５．６、１２５．９、１２６．５、１３０．７、１３０．７、１３２．６、１３４．５、１３５．４、１４１．１、１４８．６、１６６．１、１６７．７。Ｃ１５Ｈ１２Ｎ２Ｏ５（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は３００．０７４６、実験値は３００．０７５４であった。
【０１６５】
〔実施例２５。３−（２−ニトロベンズアミド）安息香酸の合成。〕
【０１６６】
【化２５】
2011517664.tif 000028
【０１６７】
Ｎｏ．２３（０．１２ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）の４：１  ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（９．５ｍｌ）溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．０７２ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を１６時間攪拌し、そして１Ｍの塩化水素で処理した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、つづけて精製をせずに使用した（収量：７５％収量）。ｍｐは２６２℃〜２６５℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ７．３９（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．６３〜７．７８（ｍ、４Ｈ）、７．９０（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．０１（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．３２（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  １２１．７、１２４．８、１２５．２、１２６．１、１２９．９、１３１．８、１３２．２、１３３．８、１３４．８、１４０．２、１４７．９、１６５．３、１６７．３。
【０１６８】
〔実施例２６。２−オキソ−２−（ｐ−トリル）エチル３−（２−ニトロベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１６９】
【化２６】
2011517664.tif 000029
【０１７０】
酸Ｎｏ．２４（０．０４ｇ、０．１ｍｍｏｌ）の１：１  Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（２ｍｌ）溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３の水溶液を、ｐＨが６．５になるまで添加し、セシウム塩を得た。この塩を減圧下で濃縮し、ＤＭＦ（１．０ｍｌ）に再溶解させ、ブロモメチル−ｐ−トリルケトン（０．０３ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加した。１２時間撹拌した後、反応物を、塩化ナトリウムの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：３４％）。ｍｐは１６６℃〜１６８℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ２．３５（ｓ、３Ｈ）、５．４１（ｓ、２Ｈ）、７．２１（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、７．３１（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４１〜７．４７（ｍ、１Ｈ）、７．５６〜７．６３（ｍ、２Ｈ）、７．７１〜７．７７（ｍ、２Ｈ）、７．８８（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．９４（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．０７（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）、８．５８（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ２１．８、５３．５、６６．５、１２１．３、１２４．５、１２５．１、１２６．２、１２８．０、１２８．８、１２９．２、１２９．６、１２９．９、１３０．６、１３１．４、１３２．６、１３３．９、１３７．９、１４５．２、１４６．１、１６４．７、１６５．４、１９２．１。Ｃ２３Ｈ１８Ｎ２Ｏ６（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は４１８．１１６９、実験値は４１８．１１６４であった。
【０１７１】
〔実施例２７。２−（４−ヒドロキシフェニル）−２−オキソエチル３−（２，４−（ジニトロ）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１７２】
【化２７】
2011517664.tif 000030
【０１７３】
酸Ｎｏ．３（０．２ｇ、０．６ｍｍｏｌ）の１：１  Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（１２ｍｌ）溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３の水溶液を、ｐＨが６．５になるまで添加し、セシウム塩を得た。この塩を減圧下で濃縮し、ＤＭＦ（６ｍｌ）に再溶解させ、４−（（（三級のブチル）ジメチル）シリルオキシ）フェナシルブロミド（０．２ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。１２時間撹拌した後、反応物を、塩化ナトリウムの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：５９％）。融点は２２９℃〜２３０℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ５．５３（ｓ、２Ｈ）、６．８５（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、７．４５（ｔ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７７（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．８３（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．９２（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．１０（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．３４（ｓ、１Ｈ）、８．６１（ｄ、Ｊ＝８．２、１Ｈ）、８．７７（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）、９．２２（ｓ、１Ｈ）、１０．１１（ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ６８．２、１１７．２、１２１．６、１２２．４、１２２．５、１２５．９、１２６．１、１２７．２、１２８．２、１３０．０、１３１．０、１３１．９、１３２．６、１３９．１、１４０．６、１４８．８、１５０．２、１６４．０、１６４．４、１６６．７、１９１．７。Ｃ２２Ｈ１５Ｎ３Ｏ８（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は４６５．０８０８、実験値は４６５．０８１４であった。
【０１７４】
〔実施例２８。２−（（トリメチル）シリル）エチル４−（２−（ブロモ）アセチル）ベンゾアートの合成。〕
【０１７５】
【化２８】
2011517664.tif 000031
【０１７６】
４−（２−（ブロモ）アセチル）安息香酸（０．１５ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）のＣＨ２ＣａＣｌ２（５ｍｌ）溶液に、ＤＭＡＰ（０．０１ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（０．１４ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）、および２−トリメチルシリルエタノール（０．１１ｍｌ、０．８０ｍｍｏｌ）を、０℃で添加した。混合物を室温で４時間攪拌し、それから減圧下で濃縮した。残留物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（３：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：４７％）。融点は６０℃〜６１℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ０．０２（ｓ、９Ｈ）、１．０５〜１．１１（ｍ、２Ｈ）、４．３５〜４．４１（ｍ、４Ｈ）、７．９５（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．０７（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  −１．５、１７．３、３０．６、６３．９、１２８．７、１２９．７、１３５．１、１３７．１、１６５．５、１９０．７。Ｃ１４Ｈ１９ＢｒＯ３Ｓｉ（Ｍ＋）について算出したＨＲＭＳ（ＥＩ）は、３４２．０２８６、実験値は３４２．０２０６であった。
【０１７７】
〔実施例２９。２−オキソ−２−（４−（（（２−（トリメチル）シリル）エトキシ）カルボニル）フェニル）エチル３−（２，４−（ジニトロ）ベンズアミド）ベンゾアートの合成。〕
【０１７８】
【化２９】
2011517664.tif 000032
【０１７９】
酸Ｎｏ．３（０．０７ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の１：１  Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（４ｍｌ）溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３の水溶液を、ｐＨが６．５になるまで添加し、セシウム塩を得た。この塩を減圧下で濃縮し、ＤＭＦ（２ｍｌ）に再溶解させ、Ｎｏ．２７（０．０７ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。１２時間撹拌した後、反応物を、塩化ナトリウムの飽和水溶液で加水分解した。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（４：１）を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：５６％）。ｍｐは８６℃〜８７℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  −０．６（ｓ、９Ｈ）、１．０５〜１．１０（ｍ、２Ｈ）、４．３３〜４．３９（ｍ、２Ｈ）、５．６８（ｓ、２Ｈ）、７．４８（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．７８〜７．８２（ｍ、１Ｈ）、７．９１〜７．９５（ｍ、１Ｈ）、８．０６（ｓ、４Ｈ）、８．１１（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．３９（ｔ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．６１（ｄｄ、Ｊ１＝８．３Ｈｚ、Ｊ２＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、８．７９（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、１０．５３（ｂｒｏａｄ  ｓ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  −０．６、１８．６、６４．９、６８．６、１２１．５、１２２．５、１２６．２、１２７．２、１２９．６、１３０．０、１３１．０、１３１．２、１３２．１、１３２．６、１３６．６、１３９．１、１３９．２、１４０．６、１４８．７、１５０．２、１６４．６、１６６．７、１９３．７。
【０１８０】
〔実施例３０。４−（２−（３−（２，４−ジニトロベンズアミド）ベンゾイルオキシ）−アセチル）安息香酸の合成。〕
【０１８１】
【化３０】
2011517664.tif 000033
【０１８２】
Ｎｏ．２８（０．０４ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に、ＣｓＦ（０．０６ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で６時間攪拌し、それから１Ｍの塩化水素で加水分解した。粗生成物をＥｔ２Ｏで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。生成物を、ＡｃＯＨの３％ＥｔＯＡｃ溶液を溶出剤として用いて、フラッシュ・クロマトグラフィーによって精製した（収量：７７％）。ｍｐは２８４℃〜２８６℃であった。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＭｅＯＤ）  δ  ５．６５（ｓ、２Ｈ）、７．４８（ｔ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．８４〜７．８８（ｍ、１Ｈ）、７．９１（ｓ、１Ｈ）、７．９６（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．０２〜８．１１（ｍ、４Ｈ）、８．３３（ｔ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．６０（ｄｄ、Ｊ１＝８．３Ｈｚ、Ｊ２＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．９０（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＯＣＤ３）  δ  ６６．９、１１９．８、１２１．１、１２１．３、１２４．７、１２５．５、１２７．９、１２８．３、１２９．３、１２９．９、１３０．６、１３０．９、１３６．０、１３７．６、１３７．８、１３９．０、１４７．２、１４８．８、１５５．０、１６２．７、１６５．１、１９２．１。
【０１８３】
〔実施例３１。ＦＭ１９Ｇ１１および構造類似体による、ＨＩＦの活性阻害。〕
ＨＩＦ応答配列に基づく細胞アッセイの方法論にしたがって（実施例１）、合成の中間体化合物およびいくつかの合成類似体に対して試験を行い、ＦＭ１９Ｇ１１のＳＡＲを得た。得られた結果を表２に示す。
【０１８４】
【表３】
2011517664.tif 000034
【０１８５】
【表４】
2011517664.tif 000035
【０１８６】
【表５】
2011517664.tif 000036
【０１８７】
〔実施例３２。ＨｅＬａ腫瘍細胞株におけるＦＭ１９Ｇ１１による、ＨＩＦの標的遺伝子の阻害〕
３２．１  リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による、ＨＩＦ−１の標的遺伝子の遺伝子発現の解析。
【０１８８】
ｑＰＣＲ反応を、最終的な体積を２０μｌとして行った。２０μｌの内訳は、相補ＤＮＡが１μｌ、３００ｎＭのＦＷプライマーが１μｌ、３００ｎＭのプライマーが１μｌ、ＳＹＢＲ緑Ｉが１０μｌ、Ｈ２Ｏが７μｌであった。このｑＰＣＲ反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで、以下のステップで実施した。すなわち、
５０℃    ２分間  １サイクル
９５℃  １０分間  １サイクル
９５℃  １５秒間
６０℃  １分間  ４０サイクル
ｑＰＣＲを用いた定量化は、各ｑＰＣＲ実験におけるそれぞれの相補ＤＮＡに対する閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ；  Ｃｔ）の決定に基づいている。試料のＣｔは、蛍光シグナルが、装置の最低検出レベルより大きくなる、最少ＰＣＲサイクル数として規定される。したがって、異なる試料のＣｔ値を使用して、各試料における鋳型相補ＤＮＡの存在量が算出される。なぜならば、Ｃｔ値は、相補ＤＮＡの初期量に正比例し、したがって、伝令ＲＮＡのレベルを算出するための基準となるからである。
【０１８９】
遺伝子の相対的な発現レベルは、Ｃｔの増加、すなわち、（ΔＣｔ）＝Ｃｔ（遺伝子）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ）によって表わされる。ＰＣＲ反応の指数関数的な性質を有するので、Ｃｔの増加は、等式２−（ΔＣｔ）を使って線型に書き換えられる。得られた結果から、遺伝子ＶＥＧＦおよびＧＡＰＤＨの場合について、閾値サイクル（Ｃｔ）が内部コントロールとして算出される。ソフトウェアはＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ５７００  ＳＤＳであった。
【０１９０】
ＶＥＧＦおよびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルの解析を実施した。Ｐｒｉｍｅｒ３プログラムを用いてプライマーを設計した。配列は以下のようになる。
【０１９１】
【表６】
2011517664.tif 000037
【０１９２】
ＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルを、ＶＥＧＦについて、化合物ＦＭ１９Ｇ１１の存在下または非存在下で、０．３μＭ、０．１μＭ、および０．０３μＭにおいて、ＧＡＰＤＨを内部標準として使って、低酸素条件または正常酸素条件下で、ＨｅＬａ  ９ｘＨＲＥ細胞において、ｑＰＲＣによって２４時間測定した。図４から見てとれるように、使用した濃度において、化合物ＦＭ１９Ｇ１１の存在下では、ＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルが低下している。
【０１９３】
３２．２  免疫学的な解析（ウエスタンブロット）による、ＨＩＦ−１の標的遺伝子のタンパク質の発現の解析。
【０１９４】
低浸透圧緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｌｍＭのＫＣｌＯ、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ、２ｍＭのバナジン酸ナトリウム、４μｇ／ｍｌのペプスタチン、４μｇ／ｍｌのロイペプチン、および４μｇ／ｍｌのアプロチニン）を使って、ＨｅＬａ９ＸＨＲＥ／ＬＵＣ細胞を溶解させ、氷で２０分間保存し、次に１，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。こうして上清を回収し、使用するまで−２０℃で保存した。Ｂｒａｄｆｏｒｄによって記載された比色分析クーマシーブルー法によって、タンパク質の定量化を実施した。市販のシステムを、製造業者（ＰＩＥＲＣＥ  Ｃｈｅｍ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＩＩ．  ＵＳＡ）の指示にしたがって使用した。ウシ血清アルブミン（Ａ−７９０６，  ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ，  ＵＳＡ）を使用して、検量線（０μｇ〜２００μｇのタンパク質）を生成した。各試料を５μｌずつピペットで９６穴のプレートに仕込み、１５０ｍｌのクーマシー溶液を添加し、室温で５分間暗黒中で維持し、ＯＤ５９５ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄの統計プログラムを利用して、標準系統を算出し、上記各試料について値を外挿した。最終的な値を、タンパク質のｍｃｇ／ｍｃｌで表わした。抽出物のタンパク質の電気泳動を、ポリアクリルアミドゲルにおいて変性条件下で実施した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。低分子ポリペプチド用のタンパク質の市販の混合物（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、分子サイズの標準として使用した。ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へのタンパク質の導入を、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ導入システム系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使って実施した。二次抗体を、ペルオキシダーゼ酵素に結合させ、その活性を使用して抗原−抗体結合を検出した。検出には、高感度化学ルミネッセンス・システム（ウエスタンブロット解析によるＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用した。上記膜を、製造業者の推奨項目にしたがって、最近調製したＥＣＬ免疫検出システムの検出用溶液１および２（混合比＝１：１）の混合物において、２分間インキュベーションした。使用した一次抗体は、単クローンの抗ＨＩＦ−１α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、単クローンの抗ＨＩＦ−１α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、単クローンの抗ＨＩＦ−２α（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ）を１：５００に希釈したもの、単クローンの抗ＰＨＤ−３（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ）を１：１０００に希釈したもの、単クローンの抗ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびハウスキーピングタンパク質としてＧＡＰＤＨを１：５０００に希釈したものであった。使用した二次抗体は、ＨＩＦ−１αに対する単クローンの抗ネズミのＩｇＧ抗体、ＨＩＦ−２α、ＰＨＤ−３、およびＧＡＰＤＨに対するロバの抗ウサギのＩｇＧ、およびＶＥＧＦに対するロバの抗ヤギのＩｇＧであるが、すべて１：５０００に希釈したものである。
【０１９５】
図５は、ＨｅＬａ９ＸＨＲＥ−ＬＵＣにおいて、ＦＭ１９Ｇ１１が、標的タンパク質ＰＨＤ３、ＨＩＦ１α、およびＨＩＦ２αを阻害している様子を示す。ウエスタンブロット解析による細胞株。化合物ＦＭ１９Ｇ１１（０．３ｍＭ）の存在下および非存在下で、ＨｅＬａ  ９ｘＨＲＥ細胞を、低酸素条件または正常酸素条件下に９時間おいた。抗ＨＩＦ−１α、抗ＨＩＦ−２α、および抗ＰＨＤ３３の抗体を使用した。ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして使用した。化合物ＦＭ１９Ｇ１１の存在下で、ＰＨＤ３とともに、ＨＩＦ  １αおよび２αの発現において減少が観察される。
【０１９６】
〔実施例３３。Ｃ１７．２幹細胞における、ＨＩＦの活性の阻害〕
１０％のウシ胎仔血清、５％のウマ血清、１％のグルタミン（２ｍＭ）、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾンとを補充した、高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使って、Ｃ１７．２を未分化状態で培養した。正常酸素条件および低酸素条件の双方とも、細胞を１５００個／ｃｍ２で播種した。酸素正常状態での細胞の培養を、恒温器内で、Ｏ２２０％、ＣＯ２５％、３７℃、および標準湿度（９４％）の条件で実施した。低Ｏ２濃度の条件を、ガスの混合物（Ｏ２１％、ＣＯ２５％、およびＮ２９４％）を用いて、低酸素チャンバー（Ｉｎｖｉｖｏ２  ４００、Ｒｕｓｋｉｎｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を３７℃で使用することによって創出した。正常酸素条件および低酸素条件下で、細胞を異なる期間（３、６、９、２４、４８時間）維持した。つぎに細胞を回収し、タンパク質およびｍＲＮＡを、製造業者の指示にしたがって市販のキットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ／ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ）を使って抽出した。研究中に使用した１９Ｇ１１の濃度は、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、および５００ｎＭであった。ＩＣ５０＞１μＭであったので、これらの濃度を、その化合物の存在に起因するＣ１７．２の毒性を評価した後に得られた結果にしたがって、使用した。
【０１９７】
図６は、Ｃ．１７．２の神経幹細胞株において、ＦＭ１９Ｇ１１がＨＩＦ１αの標的遺伝子を阻害している様子を示す。低酸素状態（Ｈｘとは、Ｏ２１％となる低酸素条件を指す）および正常酸素条件（Ｏ２２０％）の双方とも、化合物ＦＭ１９Ｇ１１を、異なるナノモル／リットル（ｎＭ）濃度で使用した。
【０１９８】
〔実施例３４。マウスおよびヒトの幹細胞モデルにおける、修復（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ−ＭＭＲｓ）タンパク質の修復〕
得られた結果によれば、低酸素状態におかれたＣ１７．２神経幹細胞は、ＤＮＡ修復（ミスマッチ修復、ＭＭＲ）システムが阻害された。図３２は、１９Ｇ１１（５００ｎＭ）の存在下または１９Ｇ１１を溶解させたキャリア（ＤＭＳＯ）の存在下で、正常酸素条件または低酸素条件下で培養されたＣ１７．２神経幹細胞の核からのタンパク質抽出物を使って実施した、ウエスタンブロットを示す。抗ＭＬＨ１およびＭＳＨ６のモノクローナル抗体を、解析において使用した。Ｎｘは酸素正常状態を意味し、Ｈｘは低酸素状態を意味している。
【０１９９】
図３２は、細胞治療において提案された幹細胞が望ましくない腫瘍形質転換を経ることを防止できる可能性のある、これらの修復タンパク質の発現を、１９Ｇ１１がどのようにして再確立することができるのかを示す。１９Ｇ１１であっても、後者によって引き起こされうる阻害から救出するのだから、ＭＭＲの発現の回復はキャリア（ＤＭＳＯ）が原因ではない。修復遺伝子の発現の増加は、低酸素状態においてのみ発生するのではなく、正常酸素条件下でも発生する。
【０２００】
これらの研究結果を、例えば骨髄または歯髄間葉系細胞などの、他のヒト幹細胞に拡張した。図７は、１９Ｇ１１（５００ｎＭ）の存在下で、酸素正常状態または低酸素状態において培養された間葉系幹細胞の核タンパク質からの抽出物を使って実施した、ウエスタンブロットを示す。抗ＭＬＨ１およびＭＳＨ６のモノクローナル抗体を、解析において使用した。図７Ａは、骨髄の間葉系幹細胞において得られた結果を示す。実験条件は、１−Ｎｘ  ３ｈ；２−Ｈｘ  ３ｈ；３−Ｈｘ  ３ｈ＋１９Ｇ１１；４−Ｈｘ  １８ｈ；５−Ｈｘ  １８ｈ＋１９Ｇ１１；６−Ｈｘ  ２４ｈ；７−Ｈｘ  ２４ｈ＋１９Ｇ１１であった。なお、Ｎｘは酸素正常状態を意味し、Ｈｘは低酸素状態を意味する。パネルＢは、歯髄の間葉系幹細胞において得られた結果を示す。実験条件は、１３−Ｎｘ  ７２ｈ；１４−Ｎｘ  ７２ｈ＋１９Ｇ１１；１５−Ｈｘ  ７２ｈ；１６−Ｈｘ  ７２ｈ＋１９Ｇ１１であった。Ｎｘは酸素正常状態を意味し、Ｈｘは低酸素状態を意味する。
【０２０１】
このように、回復（例えばＣ１７．２について記載した回復）が、このケースでも観察された。
【０２０２】
先に報告されている科学的な結果を考慮すれば、阻害後に、修復遺伝子の発現は、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）として知られるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によって回復可能であることがわかる（Cameron EE, et al., “Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer" Nat Genet. 1999 Jan; 21(1):103-107.）。この薬剤は、上記の遺伝子のプロモーター領域に位置するヒストンのアセチル化の程度を、上昇させることができる。これにより、クロマチンに、これらの遺伝子を調節する転写因子がアクセスできる高次構造が付与される。したがって、抗アセチル−リジン抗体を使って得られた結果は、１９Ｇ１１が、異なるタンパク質のアセチル化全体の程度を増加させ、ＴＳＡ自体よりさらに一層効果的にＭＭＲの発現を救出することを示す。癌を遅らせるまたは防止する遺伝子を、薬が回復させるという事実は、その薬を抗腫瘍薬となる可能性のある候補にする。この意味において、ＴＳＡは、現在、乳癌治療のための前臨床段階にある薬である（Vigushin DM, et al., “Trichostatin A is a histone deacetylase inhibitor with potent antitumor activity against breast cancer in vivo" Clin Cancer Res. 2001 Apr; 7(4):971-6）。
【０２０３】
図３２は、１９Ｇ１１（５００ｎＭ）の存在下または１９Ｇ１１を溶解させたキャリア（ＤＭＳＯ）の存在下で、酸素正常状態または低酸素状態において培養されたＣ１７．２のまたは神経幹細胞の核タンパク質からの抽出物を使って実施した、ウエスタンブロットを示す。ローディングコントロールとして使用された抗βアクチンとともに、抗アセチル−リジン、抗ＭＬＨ１、およびＭＳＨ６のモノクローナル抗体を、解析において使用した。なお、Ｎｘは酸素正常状態を意味し、Ｈｘは低酸素状態を意味する。結果は、ＦＭ１９Ｇ１１が、ＭＭＲの発現を、ＴＳＡより効果的に回復させることができることを示している。
【０２０４】
〔実施例３５。上衣の成体幹細胞（ｅｐＮＳＣ）の初代培養における、ＨＩＦの標的遺伝子の発現レベルの、ＦＭ１９Ｇ１１による制御〕
【０２０５】
〔３５．１  成体の脊髄の上衣神経の前駆体（ｅｐＮＳＣ）の初代培養。〕
２〜３ヶ月の月齢の成体のウィスター系のラットを使用した（動物は、実験やその他の科学的な目的のために使用される動物の保護に関する、欧州委員会のＤＧＸＩのために準備された書類（Ｎｏ．Ｌ３５８、ＩＳＳＮ  ０３７８〜６９７８）の第２．１節（許容可能な安楽死法）を遵守した作用様式にしたがって、Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｅ  Ｆｅｌｉｐｅ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、スペイン）の動物の愛護と福祉に関する委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｂｅｉｎｇ）からプロトコールの承認を受けて取り扱った）。動物を屠殺すると、脊髄の背側の一部を切開し、組織を、処理に備えて洗浄培地（ＤＰＢＳ−グルコース）中で４℃で維持した。結合組織細胞の割合を低減するために、もっとも表在性の血管とともに、髄膜を削除した。無菌条件下で、髄質の組織を切断して、およそ１ｍｍ３の複数の部分に分けた。これを洗浄培地において３７℃で１０分間インキュベーションし、同じ培地を使って軽度の遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分）によって２回洗浄した。組織は、完全培地［５ｍＭのヘペス、３ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．６％のグルコース、２０ｎＭのプロゲステロン、３ｍＭのＮａ亜セレン酸塩、１００μｇ／ｍｌのアポトランスフェリン、１０μＭのプトレシン、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、２５μｇ／ｍのインスリン、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、２ｇのウシ血清アルブミン、およびヘパリン３５７Ｕ／ｍｌを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中で最終的に均質化した。組織懸濁液を、シリコン処理したガラス製ピペットに繰り返し通して、細胞懸濁液を得るまで、その直径をブンゼンバーナーを用いて小さくした。７日後に、神経前駆細胞がニューロスフェア（ＮＳＣｓ）を形成した。初代培養中に浮游しているＮＳＣを回収し、細胞の残存物、死細胞、およびその他の、培養プレートに接着している細胞のタイプ（例えば、線維芽細胞、ミクログリア、アストログリアなど）から分離した。次に、背の低い取り付けプレート（Ｎｕｎｃ）内で、ＮＳＣを培養し（こうすることによって、ＮＳＣがプラスチックに接着することを防止でき、結果的に分化を防止できる）、恒温器内で３７℃、９４％の湿度およびＣＯ２５％（正常酸素条件）で維持した。低酸素チャンバー（Ｉｎｖｉｖｏ２  ４００、Ｒｕｓｋｉｎｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使って、Ｏ２１％、ＣＯ２５％、およびＮ２９４％の気体の混合物を用いて、３７℃でＯ２濃度が低い条件（低酸素条件）を作り出した。該ＮＳＣを、正常酸素条件および低酸素条件下で、化合物１９Ｇ１１の存在下または非存在下で、それぞれ異なる時間（３時間、６時間、９時間、２４時間、４８時間）、５００ｎＭ（用量はＩＣ５０未満、＞１μＭ、Ｃ１７．２細胞株においてはさらに効果的）の終濃度で維持した。
【０２０６】
〔３５．２。ＶＥＧＦ、ＰＨＤ３、およびＧＡＰＤＨの転写性の発現レベルの検出〕
市販のキットＲＮＡｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示にしたがって使用して、全てのＲＮＡを単離した。市販のキットＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して、各試料の全ＲＮＡを１μｇずつレトロ転写した。Ｔａｑｍａｎプローブ、およびＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍによってｒＶＥＧＦ用に設計されたプライマー（Ｒｅｆ  Ｒｎ００５８２９３５＿ｍ１）、ｒＰＨＤ３（Ｒｅｆ  Ｒｎ００５７１３４１＿ｍ１）およびｒＧＡＰＤＨ（Ｒｅｆ  Ｒｎ０１７７５７６３＿ｇ１）を使って、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施した。該ｑＰＣＲを、５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内で、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）１ｘで、４０ｎｇの相補ＤＮＡ（全ＲＮＡの当量）、および各プローブおよびプライマーを２５０ｎＭずつ用いて、最終的な体積を２０μｌにして、二組で進めた。増幅用に選択したプログラムは、以下のようであった。すなわち、５０℃で２分間をｘ１、９５℃で１０分間をｘ１、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間をｘ４０であった。ＶＥＧＦおよびＰＨＤ３の発現レベルを、ＧＡＰＤＨ（恒常的発現遺伝子）の発現レベルに対するＣｔの増加として表わした。すなわち、
Ｃｔ（ΔＣｔ）＝Ｃｔ（ＶＥＧＦまたはＰＨＤ３）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ）
である。低酸素条件（Ｈｘ）下の各ΔＣｔを、正常酸素条件（Ｎｘ）下の値で正規化した。すなわち、
ΔΔＣｔ＝Ｃｔ（ｈｘ）−Ｃｔ（Ｎｘ）
である。ＰＣＲ反応が指数関数的な性質を有するので、Ｃｔの増加は、等式２−ΔΔＣｔを使って線型に書き換えられた。
【０２０７】
図８は、低酸素条件下のｅｐＮＳＣの初代培養における、（定量的な逆転写ＰＣＲによる）ＰＨＤ３およびＶＥＧＦの発現レベルの研究を示す（白色の棒グラフ）。図８は、第１のケースでは３時間〜２４時間の時間依存的な増加を示し、第２のケースでは９時間までは時間依存的な増加を示し、その後４８時間までは、酸素正常状態におけるレベルに対して逆転していることを示している。ＰＨＤ３の増加およびＶＥＧＦの増加は、どちらも、５００ｎＭのＦＭ１９Ｇ１１（黒色の棒グラフ）の存在下で、低酸素状態に６時間〜２４時間曝露すると大きく阻害されている。
【０２０８】
〔実施例３６。成人の歯髄の幹細胞の初代培養における、ＨＩＦの標的遺伝子の発現レベルのＦＭ１９Ｇ１１による制御。〕
・初代培養の条件。
【０２０９】
使用した培地は、１０％ウシ胎仔血清を補充した低いグルコースＤＭＥＭであった。成人（年齢１９歳〜２９歳）のヒトの第三大臼歯から得られた、ヒトの歯髄の間葉系間葉系幹細胞株［Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｔａｌ  ｐｕｌｐ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  （ＤＰＳＣｓ）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ２０００  Ｄｅｃ  ５；  ９７（２５）：１３６２５−３０．；  Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，．”  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｔａｌ  ｐｕｌｐ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ”  Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ，  ２００２  Ａｕｇ；  ８１（８）：５３１−５］が、ＣＩＰＦの心臓再生部門（Ｃａｒｄｉｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｐｔ．）によって提供された。該細胞を、２０００個／ｃｍ２の密度で播種し、９０％のコンフルエンスに到達すると、再度トリプシン処理によってサブ培養した。
【０２１０】
・ＨＩＦ−１αの発現に対するＦＭ１９Ｇ１１の活性の研究
上記歯髄細胞を、２１ｃｍ２のプレートに、２０００個／ｃｍ２で播種した。培養物がサブコンフルエンスｉ到達すると、平行アッセイにおいて、物理的な正常酸素条件および低酸素条件（Ｏ２１％、Ｎ２９４％、およびＣＯ２５％）下で、化合物ＦＭ１９Ｇ１１を０．５μＭの濃度で２４時間添加した。つぎに、渙散緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ値８、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％のＮａＮ３、０．１％のＮＰ４０、０．５％の１１−デオキシコルチコステロン、１ｘのプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で、タンパク質を抽出し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で定量化し、ＨＩＦ−１α（１２０ｋＤａ）の発現を判定するために、３０μｇを１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。検出には、抗ＨＩＦ−１α（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）一次抗体および抗ＧＡＰＤＨ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）一次抗体を使用し、つぎに、（ＨＩＦ−１αに対する）ヤギの抗ネズミ二次抗体および（ＧＡＰＤＨに対する）ロバの抗ウサギ二次抗体を、ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、１：５０００に希釈）、化学ルミネッセンス検出系（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、１：５０００に希釈）、およびオートラジオグラフィーフィルム（コダック）（図９Ａを参照）と合わせて使用した。
【０２１１】
・ＶＥＧＦ、ＣＯＸ−２、およびＧＡＰＤＨの転写性の発現レベルの検出
市販のキットＲＮＡｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示にしたがって使用して、全てのＲＮＡを単離した。市販のキットＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して、各試料の全ＲＮＡを１μｇずつレトロ転写した。Ｔａｑｍａｎプローブ、およびＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍによってｈｓＶＥＧＦ用に設計されたプライマー（Ｒｅｆ  ＨＳ００１７３６２６＿ｍ１）、ｈｓＣＯＸ−２（Ｒｅｆ  Ｈｓ００１５３１３３＿ｍ１）、およびｈｓＧＡＰＤＨ（Ｒｅｆ  ＨＳ  ９９９９９９０５＿ｍ１）を使って、定量的なポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ；  ｑＰＣＲ）を実施した。該ｑＰＣＲを、５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内で、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）１ｘで、４０ｎｇの相補ＤＮＡ（全ＲＮＡの当量）、および各プローブおよびプライマーを２５０ｎＭずつ用いて、最終的な体積を２０μｌにして、二組で進めた。増幅用に選択したプログラムは、以下のようであった。すなわち、５０℃で２分間をｘ１、９５℃で１０分間をｘ１、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間をｘ４０であった。ＶＥＧＦおよびＣＯＸ−２の発現レベルを、ＧＡＰＤＨ（恒常的発現遺伝子）の発現レベルに対するＣｔの増加として表わした。すなわち、
Ｃｔ（ΔＣｔ）＝Ｃｔ（ＶＥＧＦまたはＰＨＤ３）−Ｃｔ（ＧＡＰＤＨ）
である。低酸素条件（Ｈｘ）下の各ΔＣｔを、正常酸素条件（Ｎｘ）下の値で正規化した。すなわち、
ΔΔＣｔ＝Ｃｔ（ｈｘ）−Ｃｔ（Ｎｘ）
である。ＰＣＲ反応が指数関数的な性質を有するので、Ｃｔの増加は、等式２−ΔΔＣｔを使って線型に書き換えられた。
【０２１２】
図９は、物理的な低酸素状態に１８時間曝露した後の、ＨＩＦ−１αの発現の誘導を示す。図９Ａから分かるように、濃度が０．５のμＭの化合物ＦＭ１９Ｇ１１が、ＨＩＦ−１αの発現を阻害した。ＧＡＰＤＨを、内部の添加コントロールとてし使用した。図１１ｂに図示したように、低酸素条件（白色の棒グラフ）下の歯髄の幹細胞の培養物における３時間、６時間、および１８時間での、ＶＥＧＦおよびＣＯＸ−２（定量的な逆転写ＰＣＲによる）発現レベルの研究によれば、ＨＩＦの標的遺伝子のいずれの場合にも、酸素正常状態におけるレベルに対して、６時間で最大の発現を示している。０．５μＭのＦＭ１９Ｇ１１の存在下で、低酸素条件（黒色の棒グラフ）下で、ＶＥＧＦの増加およびＣＯＸ−２の増加は、どちらも、６時間および１８時間で阻害されている（図９Ｂ）。ただし、該化合物は、正常酸素条件下ではいかなる効果ももたらさなかった（灰色の棒グラフ）。
【０２１３】
〔実施例３７：成人の歯髄の幹細胞の初代培養において、低酸素状態で発生する死およびアポトーシスの減少の、ＦＭ１９Ｇ１１による制御。〕
０．５μＭの化合物の存在下および非存在下で、正常酸素条件および低酸素条件に供した細胞培養物にもとづいて、アポトーシスの研究を実施した。細胞膜の外側部分におけるホスファチジルセリンの存在は、アポトーシスプロセスに特徴的なことであり、この存在について、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（蛍光色素Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して製造業者の指示にしたがって検出した。上記の互いに異なる条件に供した細胞を、アネキシンＶを使って４℃で３０分間インキュベーションした。つぎに、細胞をヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ；ＰＩ）でインキュベーションし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。ＰＩ−／ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋細胞を初期のアポトーシス細胞として、ＰＩ＋／ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋細胞を後期のアポトーシス細胞として、およびＰＩ＋／ＡｎｎｅｘｉｎＶ−細胞を死細胞として規定した。したがって、アポトーシス細胞の総数は、初期のアポトーシス細胞および後期のアポトーシス細胞の合計である。
【０２１４】
図１０から分かるように、低酸素状態は、７２時間におけるポトーシス細胞の総数を低減し、０．５μＭの化合物ＦＭ１９Ｇ１１は、この効果を反転させることができる（図１０Ａ）。さらに、上記化合物も、低酸素状態で発生している死の減少を反転させる（図１２Ｂ）。最終的に、図１０Ｃは、低酸素状態において、細胞死およびアポトーシスに関与する腫瘍阻害因子ｐ５３の発現の減少、および低酸素状態においてＦＭ１９Ｇ１１で細胞を治療した際のｐ５３の回復を示している。
【０２１５】
〔実施例３９：低酸素条件および正常酸素条件における、成体の上衣の幹細胞（ｅｐＳＰＣ）の初代培養における未分化状態のマーカー発現の、ＦＭ１９Ｇ１１よる制御〕
成体の脊髄の上衣の神経の前駆体（ｅｐＳＰＣ）の初代培養を、実施例３５．１において既に説明した条件にしたがって、実施した。
【０２１６】
未分化状態が維持される原因である遺伝子（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＴＧＦ−α）の転写性の発現レベルおよび伝達性の発現レベルの検出。市販のキットＲＮＡｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示にしたがって使用して、全てのＲＮＡを単離した。市販のキットＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して、各試料の全ＲＮＡを１μｇずつレトロ転写した。メッセンジャーＲＮＡ（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＴＧＦα、およびＧＡＰＤＨ）を増幅するためのプライマー（詳細は後記）を使って、半定量的なＰＣＲ（ｓｑＰＣＲ）を実施した。該ｓｑＰＣＲは、エッペンドルフサーマルサイクラーで、最終的な体積を５０μｌとして、１ＵのＴａｑポリメラーゼ、４０ｎｇの相補ＤＮＡ（全ＲＮＡの当量）、および３００ｎＭの各プライマーを使って進めた。増幅用に選択したプログラムは、以下のようであった。すなわち、［９５℃で３分間］をｘ１、［５５℃で３０秒間、７２℃で５分間、９５℃で３０秒間］をｘ３５、および７２℃で１０分であった。発現レベルは、臭化エチジウムで染色した１ｘＴＡＥ緩衝液内の１％アガロースゲル内で観察した。添加の差異に起因する発現の変化を、ＧＡＰＤＨの恒常的発現遺伝子の発現差異によって補正した。実験は三組（３匹の異なるラットの細胞）実施した。
【０２１７】
なお、ｏｃｔ３／４およびｏｃｔ４の命名法に関連して、アイソフォーム３がラットには存在しないこと、ただしヒトにおいては、抗体またはその発現の判定を各アイソフォームについて明らかにすることが難しいことを考慮すれば、この遺伝子の正名は、ヒトではｏｃｔ  ３／４であり、ラットではＯｃｔ  ４であることを、強調しておく。
【０２１８】
【表７】
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【０２１９】
未分化状態のマーカーＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＮｏｔｃｈ１のタンパク質レベルを、実施例３５．１に記載の方法論にしたがって、免疫学的な解析（ウエスタンブロット）によって決定した。Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＮｏｔｃｈ１を検出するための一次抗体を、Ａｂｃａｍ（ＵＫ）から入手した、また、βアクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、ＵＫにおいて入手した抗体）の発現を、ローディングコントロールとした。
【０２２０】
低レベルの酸素（Ｏ２１％）に曝された培養物中において、化合物ＦＭ１９Ｇ１１が５００ｎＭの濃度で４８時間存在したこと（図１１）が、低酸素状態によって誘導されたＳｏｘ２およびＯｃｔ４のメッセンジャーＲＮＡレベルでの、発現の下方制御、およびそのそれぞれの標的遺伝子、ＮａｎｏｇおよびＴＧＦ−αのレベルでの、発現の下方制御を示している。
【０２２１】
低酸素条件（Ｏ２１％）においてＦＭ１９Ｇ１１の濃度が増加（図１２）することによって、用量依存的に、両方のタンパク質Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４の発現が阻害される。
【０２２２】
ただし、正常酸素圧または高酸素レベル条件（〜２０％）の下では、ＦＭ１９Ｇ１１（５００ｎＭ）が４８時間存在（図１３）することによって、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４両方の発現、ならびにｅｐＳＰＣのその他の未分化状態のマーカー（例えばＮａｎｏｇおよびＮｏｔｃｈ１など）の発現が著しく誘導される。
【０２２３】
〔実施例４０：ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）において未分化状態が維持される原因となる遺伝子である、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ３／４の発現レベルの、ＦＭ１９Ｇ１１による調節〕
Ｈ９ヒト胚細胞（ｈＥＳＣ）株の培養。ｈＥＳＣ株を維持および増殖（多くとも７０パス以下）させるために、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｗｅｄｅｎ）（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．［１９９８］）で不活化されたネズミ線維芽細胞の単層の上で、ｈＥＳＣを培養する。ＳＯｘ２およびＯｃｔ３／４の転写性の変化を研究するために、ｈＥＳＣの未分化なコロニーを機械的な解離によって、マトリゲル（登録商標）の薄層で被覆した培養プレートに移植し、培養上清の存在下で培養する。培養上清は、集密的かつ不活化されたネズミの線維芽細胞を、ゼラチン（０．１％；Ｓｉｇｍａ）で被覆したプレートに播種して得た培養物から得る。
【０２２４】
Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、およびＧＡＰＤＨの転写性の発現レベルの検出。実施例３５に記載の実験条件を使って、手順は同じであり、この場合、ヒトのＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、およびＧＡＰＤＨ（Ｓｏｘ２：Ｈｓ０１０５３０４９＿ｓ１；Ｏｃｔ３／４：Ｈｓ０１８９５０６１＿ｕ１；ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）に対するＴａｑＭａｎのプローブを含んでいた。図１４に示すように、低酸素培養条件、つまり、低酸素状態（Ｏ２１％）の下で、処理が４８時間続いた後に、化合物ＦＭ１９Ｇ１１が５００ｎＭの濃度で存在することによって、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ３／４どちらの発現も、著しく阻害される。両方のメッセンジャーＲＮＡの発現レベルは、低酸素条件下と正常酸素条件（高酸素培養条件Ｏ２２０％未満）下とで対比させながら誘導される。
【０２２５】
〔実施例４２：ＦＭ１９Ｇ１１の存在が、低酸素条件下で、ｅｐＳＰＣがオリゴデンドロサイトに分化するプロセスの進行を可能にする〕
低酸素圧状態が幹細胞の分化を阻止する。また、このプロセスが、ＨＩＦのタンパク質の活性に起因することがわかっている。上衣の幹細胞が低濃度の酸素（Ｏ２１％）に曝されることによって、オリゴデンドロサイトのグリア株に向かう、分化の進行が防止される。このことは、培養物の形態的特徴とこの細胞株（ＮＧ２、ＲＩＰ、Ｏ４）の典型的なマーカーの低い発現率との両方によって、明瞭に示されている。化合物ＦＭ１９Ｇ１１（５００ｎＭ）、つまり、ＨＩＦ−１αタンパク質とＨＩＦ−２αタンパク質との両方の阻害剤が存在することによって、正常酸素条件下で存在するオリゴデンドロサイトマーカーの発現レベルが、その表現型の発現レベルとともに回復する。
【０２２６】
正常酸素条件および／または低酸素条件下で、ＦＭ１９Ｇ１１の存在下または非存在下における、細胞マーカーＲＩＰ、ＮＧ２、およびＯ４の発現の解析を、免疫細胞化学的な手法によって実施した（図１５）。細胞培養物を、パラホルムアルデヒド（４％）で固定した後に、トリトン（０．０５％）で１０分間透過処理した。また、ウシ胎仔血清（１％）との非特異的な結合を阻止した後、対応する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＵＳＡより入手）でインキュベーションした。互いに異なる蛍光色素、つまり、ウサギのＩｇＧのローダミンおよびネズミのＩｇＧのフルオレセインと複合した二次抗体が、上記一次抗体の特異的な標識化を明らかにする。核の対比染色には、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、ＵＫ）を使用した。
【０２２７】
〔実施例４３：ＦＭ１９Ｇ１１が存在することによって、上衣の幹細胞（ｅｐＳＰＣ）の自己再生が改善され、正常酸素条件下でその未分化状態が維持される。〕
標準酸素濃度下、つまり〜２０％において、化合物ＦＭ１９Ｇ１１（５００ｎＭ、４８時間）が存在することによって、上衣の幹細胞（ｅｐＳＰＣ）の増殖率が増加する（図１６）。ただし、この状況は、低酸素条件（Ｏ２１％）下では再生されない。ＡＴＰ（代謝活性の増加に直接関連し、増殖活性に直接関連する代謝物）の蓄積を、市販のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）の発光細胞の生存率キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して判定した。
【０２２８】
正常酸素条件（Ｏ２２０％）下で化合物ＦＭ１９Ｇ１１が存在していることが、個々の様式で脱凝集させた上衣の幹細胞（ｅｐＳＰＣ）の集団からのニューロスフェアの形成にとって、有利に作用する（図１６）。
【０２２９】
〔実施例４４。細胞パネルに対するＦＭ１９Ｇ１１の毒性の研究。〕
ＨｅＬａ  ９ｘ−ＨＲＥ−Ｌｕｃ、ＰＲＣ３、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７、およびＭＤＡ−ＭＢ  ４３５−Ｓの細胞株の、細胞毒性の研究を実施した。１０％の不活化されたウシ胎仔血清、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ培地において、細胞株を培養した。該細胞を、ＣＯ２５％を含有する加湿雰囲気で、３７℃で培養した。化合物の細胞毒性効果を、用量が０．５μＭ〜３０μＭの範囲でアッセイした。細胞を、透明な９６穴のプレートに５０μｌ／ウェルで、ＨｅＬａ  ９ｘ  ＨＲＥについては５，０００個／ウェルで播種し、ＣＯ２５％を含有する加湿雰囲気で３７℃で７２時間培養した。つぎに、供給者（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＴＢ１６９，  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の指示にしたがって、比色分析のＭＴＳアッセイを実施した。代謝活性を有する生細胞は、ＭＴＳを、培地に可溶の生成物である、ホルマザンに還元することができる。ホルマザンの吸光度は４９０ｎｍで測定可能であり、培養物の中の生細胞の個数に正比例する。図１８を見ればわかるように、ＨＩＦ応答配列のアッセイにおいて使用したどの細胞株においても、ＦＭ１９Ｇ１１の、ＩＣ５０の５００倍を超える濃度での５０％致死量（１００ｎＭの範囲で）には達しなかった。
【０２３０】
〔実施例４５。ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）の胚およびメダカ（メダカ）の胚に対する、ＦＭ１９Ｇ１１の毒性の研究。〕
魚の胚は、脊椎動物動物において薬を評価するアッセイに適したモデルとなる、一連の特性を有する（ＺｏｎＺｏｎ，  Ｌ．Ｉ．  ＆  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｒ  （２００５）．  “Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ”．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ，  ４，  ３５−４４；  Ｍｅｄａｋａ，  Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄａｋａ  ａｓ  Ｔｅｓｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００３，  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，  Ｊａｐａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｊａｐａｎ）。一方で、魚の胚は透明かつ子宮外で発生し、したがって、誘導された表現型が容易に観察でき、毒性アッセイにおいてはもっともよく使用されているモデルであるマウスに比べて、維持がはるかに安価で簡単であり、さらに、結果がすばやく得られる。化合物の毒性について、脊椎動物において発生を研究するための動物モデルとしてしっかりと確立されている、ゼブラフィッシュおよびメダカの２つの魚モデルにおいて試験を行った。
【０２３１】
まず最初に、ゼブラフィッシュの胚について、１ｘのＹａｍａｍｏｔｏ緩衝液の初期の段階（１と８との間）および後期の段階（２０を超えた段階）において、胚を１０個／ウェル、６個／ウェル、および４個／ウェルで、１００μｌの体積に配置して多様な実験を実施し、胚を２６℃で２４時間培養した。つづいて化合物ＦＭ１９Ｇ１１を、負のコントロールを用いて１０μＭおよび５０μＭの濃度で添加した。胚の内在性死亡率を分析する添加物は加えなかった。また、１％のＤＭＳＯ（上記化合物の溶媒）および５％のＤＭＳＯを、溶媒の死亡率を分析するために加えた。全ての場合において、溶媒が、６０％〜９０％の高死亡率を誘導した。
【０２３２】
５％未満の濃度では、ＤＭＳＯが致死的な効果を有しないメダカの胚を使って、同じ実験を実施した。胚を６個／ウェル配置し、最終的な体積を１００μｌとし、胞胚の段階および神経胚の段階にある胚を使用して独立した実験を行った。使用した濃度（１０μＭおよび５０μＭ）では、大きな致死率（１０％を超える致死率）は観察されなかった。得られた結果は、ＦＭ１９Ｇ１１が胚の生存率に対して影響を与えないことを示していた（全ての胚が生存していた）。胚の発生にとっては有機毒性であると解釈することのできる、可視の形態変化は、観察されなかった。
【０２３３】
ＦＭ１９Ｇ１１が胚（絨毛膜）の保護層を横切らない可能性をなくすために、０．５ｍＭの濃度の上記化合物を、絨毛付近（胚と絨毛膜との間）にマイクロ注射した。実験１：ｎ＝１５、誘導された死亡率２０％、ＤＭＳＯコントロール＝０％。結果は同じであった。胚の発生において、異常は観察されなかった。また、注射をした胚の生存率に対するなんらの効果も観察されなかった。図１９の画像は、５０μＭのＦＭ１９Ｇ１１を使って４日間処理したメダカの胚を示す。（Ａ）は、複数個のウェルを備えたプレートのあるウェルに１０個のメダカの胚が入った写真である。（Ｂ）および（Ｃ）は、５０μＭのＦＭ１９Ｇ１１で１日間処理した胚の写真である。（Ｄ）は、上記化合物で処理していないメダカの胚の写真である。
【０２３４】
〔実施例４６。ＦＭ１９Ｇ１１の検出のための分析方法〕
上記化合物ＦＭ１９Ｇ１１の解析を、ＲＰ１８  Ｌｉｃｈｒｏｃａｒｔ  ２５０−４（５μｍ）の分析用カラムを使って、ＨＰＬＣによって、均一濃度法（５９：４１  ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）で、０．８ｍｌ／分の流れで行った。化合物の保持時間は、１２．７分間であった（図２０）。
【０２３５】
〔実施例４７：ウシ血清中のＦＭ１９Ｇ１１の安定性〕
ＦＭ１９Ｇ１１の安定性を、ウシ血清（１０％のＰＢＳで安定化したもの）中でインキュベーションし、つづいてＨＰＬＣによって解析することによって、判定した。血清中の濃度が０．５ｍＭおよび１．０ｍＭの試料を調製し、１００μＬの部分標本を、異なるインキュベーション時間（０時間、０．５時間、１時間、２時間、および３時間）で抽出した。該試料を−８０℃保存した。各試料において抽出を実施するために、８００μＬのＨ２Ｏ、９００μＬのＣＨＣｌ３、および１滴のイソプロパノールを添加し、得られた混合物を遠心分離にかけ、上清を取り除いた。抽出物を濃縮し、ＨＰＬＣ（５９：４１  ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）による解析に使用する移動相において、残留物を懸濁させた。各試料を２５μＬずつ注射した（図２１）。
【０２３６】
〔実施例４８：ＦＭ１９Ｇ１１は、ヒトの大腸癌細胞（ＨＴ２９）においてＤＮＡ損傷応答をトリガーする〕
ウエスタンブロット法によって得られた結果によれば、ＦＭ１９Ｇ１１は、ヒトの大腸癌細胞（ＨＴ２９）においてＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）をトリガーする。２４時間の処理後に、異なる濃度のＦＭ１９Ｇ１１（０．２５μＭまたは０．５μＭ）でＨＴ２９細胞を処理すると、初期のＤＤＲフェーズ（Ｈ２ＡＸ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６）、損傷シグナルメディエーター（ＢＲＣＡ１）、トランスレーター（ＡＴＭ、ＡＴＲ）、またはＤＮＡ損傷応答（ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ｐ５３）のエフェクターに関与するタンパク質のリン酸化が効率的に増加した（図２２）。
【０２３７】
図２２は、ＦＭ１９Ｇ１１が、どのようにして、ヒトの大腸癌細胞（ＨＴ２９）においてＤＮＡ損傷応答をトリガーするのかを示す。ＤＮＡ損傷応答において、鍵となるシグナル経路に含まれるキナーゼのリン酸化の増大による活性増加を、ＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）で処理したＨＴ２９腫瘍細胞において検出した。具体的には、ＡＴＭ／ＡＴＲとして知られた経路、ＤＮＡ損傷修復経路（ＭＭＲ、ＢＲＣＡ１、Ｈ２ＡＸ）、また、細胞周期のコントロール点（ＣＨＫ１、ＣＨＫ２）における経路について、検出した。６−ＴＧ（５μＭ、１０μＭ、２５μＭ）またはエトポシド（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）を用いた処理も、コントロールとして、また、一本鎖ＤＮＡ（ＡＴＲ−ＣＨＫ１）または二本鎖ＤＮＡ（ＡＴＭ−ＣＨＫ２）の損傷に応答して活性化される各タンパク質を比較するために、実施した。
【０２３８】
〔実施例４９：ＤＤＲに関与するタンパク質の活性化の動態的変化〕
ＨＴ２９において観察されるＤＮＡ損傷に加えて、ＦＭ１９Ｇ１１が、その他の結腸癌の癌化細胞株（具体的にはＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞）において、上述のＤＤＲをトリガーするかどうかを評価した。ｐ５３癌抑制遺伝子は、ヒトの腫瘍の５０％において変異し、遺伝毒性ストレスに対する応答において鍵となる要素である。これは、ｐ５３癌抑制遺伝子が、ＤＮＡ修復または細胞周期停止に重要な遺伝子の転写を、活性化させるからである。
【０２３９】
ＦＭ１９Ｇ１１によって引き起こされる可能性のある効果におけるｐ５３の関与の度合いを判定するために、ｐ５３が発現したＨＣＴ１１６大腸癌細胞株、および相同組換えによりｐ５３が不活化された同じＨＣＴ１１６株を、使用した（Bunz, F, Dutriaux, A, Lengauer, C, Waldman, T, Zhou, S, Brown, JP et al., (1998) Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science 282: 1497-501; Bunz, F, Hwang, PM, Torrance, C, Waldman, T, Zhang, Y, Dillehay, L et al., (1999) Disruption of p53 in human cancer cells alters the responses to therapeutic agents. J Clin Invest 104: 263-9.）。ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞を、ＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）に対して異なる時間曝露した。ＡＴＲタンパク質、およびＡＴＲによりリン酸化され得るｐ５３（Tibbetts, RS, Brumbaugh, KM, Williams, JM, Sarkaria, JN, Cliby, WA, Shieh, SY et al., (1999) A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev 13: 152-7.）のリン酸化（活性）パターンは、ｐ５３を発現させることのできるＨＣＴ１１６細胞において分析された。また、同様に、ｐ５３欠損細胞のＡＴＲについても分析された。（図２３）。両方のＨＣＴ１１６細胞株において、ＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）を用いた処理によって、ＡＴＲのリン酸化が急速に進行（１時間後）し、つづいて異なる刺激時間を通じて減少することが、検出された。ＡＴＲのこの急速な活性化は、ＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）を用いた処理の１時間後に起こる、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞におけるｐ５３の活性化に一致する。しかし、ｐ５３の活性化は、分析している異なる時間について、薬を用いていない細胞の発現に実質的に左右されるままである。
【０２４０】
このように、図２３は、両方のＨＣＴ１１６細胞株における一本鎖ＤＮＡの損傷に関連して、ＦＭ１９Ｇ１１がＡＴＲの急速な活性化を引き起こすことを示す動態的研究を示す。０．５μＭのＦＭ１９Ｇ１１を用いた１時間の処理後、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋のｐ５３細胞におけるＡＴＲおよびｐ５３のリン酸化すなわち活性化の進行が、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞のＡＴＲのリン酸化すなわち活性化の進行とともに、検出された。上記の結果は、代表的なウエスタンブロット法実験を濃度測定の解析にかけた後に得られた。ただし、同様の結果が、互いに独立した３組の実験において得られた。
【０２４１】
〔実施例５０：ヒトの結腸癌腫瘍細胞において、ＦＭ１９Ｇ１１は、ｐ５３依存的にＧ１／Ｓ期の周期停止を誘導する。〕
他のＤＮＡ損傷剤（.Lim, DS, Kim, ST, Xu, B, Maser, RS, Lin, J, Petrini, JH et al., (2000) ATM phosphorylates p95/nbs1 in an S-phase checkpoint pathway. Nature 404: 613-7.; Jazayeri, A, Falck, J, Lukas, C, Bartek, J, Smith, GC, Lukas, J et al., (2006) ATM- and cell cycle-dependent regulation of ATR in response to DNA double-strand breaks. Nat Cell Biol 8: 37-45; .Liu, JS, Kuo, SR, Beerman, TA and Melendy, T, (2003) Induction of DNA damage responses by adozelesin is S phase-specific and dependent on active replication forks. Mol Cancer Ther 2: 41-7; Ranjan, P and Heintz, NH, (2006) S-phase arrest by reactive nitrogen species is bypassed by okadaic acid, an inhibitor of protein phosphatases PP1/PP2A. Free Radic Biol Med 40: 247-59.）について記載されているように、ＨＣＴ１１６の腫瘍細胞において、ＦＭ１９Ｇ１１によるＤＤＲの活性化が、Ｇ１／Ｓ期を通して、細胞周期進行遅延を引き起こしたかどうかを調べた。ＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋細胞およびＨＣＴ１１６  ｐ５３−／−細胞を、上記キャリア（ＤＭＳＯ）またはＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ）に対して、３日間または６日間曝露した。ｐ５３を発現させることのできる細胞において、５μＭまたは１０μＭのＦＭ１９Ｇ１１を用いた処理により、処理の７２時間後に、Ｇ１／Ｓ期の周期停止が起き、６日後にはさらに顕著であった。ただし、ｐ５３欠損細胞においては、ＦＭ１９Ｇ１１は、Ｇ１／Ｓ期の周期ブロッキングを引き起こさなかった。このことは、ＦＭ１９Ｇ１１によって引き起こされるＳ期の周期停止は、ｐ５３タンパク質に依存することを示唆している（図２４）。
【０２４２】
したがって、図２４は、ＦＭ１９Ｇ１１によって誘導された周期停止に対する、ｐ５３の効果を示す。細胞周期の異なるフェーズにおける細胞分布を、フローサイトメトリーを利用して分析するために、（Ａ）ではＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞、（Ｂ）ではＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞が、異なる濃度のＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ）またはキャリアに、３日間または６日間曝露された。グラフは、細胞周期の各フェーズの細胞の割合の分布に対する、異なる濃度のＦＭ１９Ｇ１１による効果を示している。図示された結果は実験を代表するものである。ただし、互いに独立した３組の実験において、非常に近い割合が得られた。
【０２４３】
〔実施例５１：ＦＭ１９Ｇ１１は、ＨＣＴ１１６細胞におけるｍＴＯＲシグナル経路の活性化の動態変化に対して影響を与える。ｍＴＯＲシグナル経路とＳ期の周期停止との関連〕
ｐ５３には腫瘍抑制剤としての重大な役割があるので、ＦＭ１９Ｇ１１が、ＨＣＴ１１６細胞において、細胞周期の進行に対する有利な作用、特にｍＴＯＲ細胞のシグナル経路に関与するタンパク質活性化の動態的変化に対して、どのように影響したのかを分析した。細胞の進行の増加は、ＤＮＡ損傷を発生させる複製的なストレスに起因している可能性がある（Bartkova, J, Horejsi, Z, Koed, K, Kramer, A, Tort, F, Zieger, K et al., (2005) DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis. Nature 434: 864-70; Bartkova, J, Rezaei, N, Liontos, M, Karakaidos, P, Kletsas, D, Issaeva, N et al., (2006) Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature 444: 633-7; Di Micco, R, Fumagalli, M, Cicalese, A, Piccinin, S, Gasparini, P, Luise, C et al., (2006) Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature 444: 638-42）。ＦＭ１９Ｇ１１によってトリガーされたＤＤＲが、ｍＴＯＲシグナル経路によって修飾される細胞周期進行シグナルの増加に関連するのかどうか、調べた。ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞においてだけではなく、ＨＴ２９または幹細胞においても、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ｐ７０Ｓ６のリン酸化が増加、またはサイクリンＤ１の発現が増加することは、ＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）を用いた処理後に、このシグナル経路が活性化されることを示唆しており、このような増加が短時間で観察された。ＦＭ１９Ｇ１１の存在によって媒介される、ＨＣＴ１１６細胞におけるサイクル活性化の増加は、癌遺伝子によって媒介される活性化において起きるのと同様に、ＤＤＲに関連する経路の活性化と一致した（（Bartkova, J, Horejsi, Z, Koed, K, Kramer, A, Tort, F, Zieger, K et al., (2005) DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis. Nature 434: 864-70; Bartkova, J, Rezaei, N, Liontos, M, Karakaidos, P, Kletsas, D, Issaeva, N et al., (2006) Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature 444: 633-7; Di Micco, R, Fumagalli, M, Cicalese, A, Piccinin, S, Gasparini, P, Luise, C et al., (2006) Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature 444: 638-42）。ＦＭ１９Ｇ１１を用いた処理によって引き起こされる、ＡＫＴ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６／サイクリンＤ１の経路のリン酸化パターンは、ＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞において異なる。ただし、ＦＭ１９Ｇ１１を用いた処理に起因する、ＡＴＲ経路の急速な活性化は保存される（図２５）。
【０２４４】
図２５の動態的研究は、ＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）を用いて処理されたＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞における、ＡＫＴ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６／サイクリンＤ１のシグナル経路の急速かつ効率的な活性化（倍率の変化≧２）を示す。ｍＴＯＲも、ＦＭ１９Ｇ１１を用いた処理後のＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞において、急速にリン酸化された（ただし、倍率の変化の増加は、２よりわずかに小さい）。
【０２４５】
Ｓ期の周期停止が、ＦＭ１９Ｇ１１によるＡＫＴ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６の経路の誘導に関連するかどうかを解明するために、ＦＭ１９Ｇ１１（１０μＭ）をｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン（１００ｐｍｏｌ））と組み合わせて用いて、ＨＣＴ１１６細胞を処理した。さらに、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞をＦＭ１９Ｇ１１（１０μＭ）を用いて処理しただけの場合には、該細胞において誘導されるＳ期の停止が、観察されなかった（図２６）。
【０２４６】
ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞を、ＦＭ１９Ｇ１１（１０μＭ）、ラパマイシン（登録商標）（ｍＴＯＲ阻害剤）（１００ｐｍｏｌ）のいずれか単独、またはこれらを組み合わせたものに対して、上述の濃度で曝露した。両方の薬（１００ｐｍｏｌ）の同時のインキュベーション使用され場合、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞において、ＦＭ１９Ｇ１１を用いた処理によって発生するＳ期の周期停止が防止された。
【０２４７】
端的に述べれば、ＦＭ１９Ｇ１１が、ｍＴＯＲ経路および細胞周期進行シグナル（サイクリンＤ１の増加）の活性化を誘導する。このことが、癌遺伝子と同様に、複製的なストレスによるＤＮＡ損傷シグナルのトリガーを引き起こし（（Bartkova, J, Horejsi, Z, Koed, K, Kramer, A, Tort, F, Zieger, K et al., (2005) DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis. Nature 434: 864-70; Bartkova, J, Rezaei, N, Liontos, M, Karakaidos, P, Kletsas, D, Issaeva, N et al., (2006) Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature 444: 633-7; Di Micco, R, Fumagalli, M, Cicalese, A, Piccinin, S, Gasparini, P, Luise, C et al., (2006) Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature 444: 638-42）、その結果、Ｇ１／Ｓ期の周期停止の原因となるｐ５３の活性化を引き起こす。このことが、上記薬の作用様式が、ＦＭ１９Ｇ１１と同様に、作用するためにはｐ５３に依存しなければならない、シスプラチンなどの他の薬比較すると、新規なものである理由である。
【０２４８】
〔実施例５２：ｐ５３が、薬ＦＭ１９Ｇ１１に対して、ヒトの大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９）を感作する〕
ヒトの大腸癌細胞（ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９）に対するＦＭ１９Ｇ１１の効果を判定するために、代謝的に活動性を有する細胞に関連するＡＴＰを定量化することによって、ＨＴ２９細胞、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞、およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞において、細胞生存率のアッセイを実施した。図２７に図示した結果は、ＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞が、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋またはＨＴ２９（ｐ５３を発現させることのできる細胞）が示す感受性に比較すると、処理（０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１０００μＭ）の４８時間後には、ＦＭ１９Ｇ１１の存在に対してそれほど敏感てはないことを示している。
【０２４９】
細胞のＡＴＰの総含有量（図２８）は、ＤＭＳＯで４８時間処理された対応する細胞株に対するＦＭ１９Ｇ１１で処理されたヒトの大腸癌細胞の割合として、定量化された細胞生存率と相関性がある。
【０２５０】
〔実施例５３：ヒトの大腸癌細胞のコロニーの形成に対する、ＦＭ１９Ｇ１１の効果〕
ｐ５３を発現させることのできる（ＨＴ２９およびＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋）腫瘍細胞およびｐ５３が欠損している腫瘍細胞（ＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−）腫瘍細胞における、ＦＭ１９Ｇ１１の毒性を決定するために、間代性アッセイを行った。ＨＴ−２９細胞、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞、およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞を、一旦培養プレートに接着させると、ＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ）の濃度を増加させることによって、これらの細胞を７２時間刺激した。刺激の１０日後に、処理細胞および無処理の細胞の、プレート中に形成されたコロニーの個数を決定した。コロニーの個数を調べたところ（図２８）、ＨＴ２９細胞、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞、およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞の間代性を、ＦＭ１９Ｇ１１が減少させることを示し、このとき、生存ＩＣ５０は、それぞれ１μＭ、３．５μＭ、および１６．５μＭであった。したがって、ＨＣＴ１１６におけるＩＣ５０値の比の定量化によれば、ＨＣＴ１１６細胞においてｐ５３の機能が損失することによって、ＦＭ１９Ｇ１１の耐性が４．７１倍に増加する。
【０２５１】
この、ＨＴ２９ヒトの大腸癌細胞およびＦＭ１９Ｇ１１で処理したＨＣＴ１１６細胞の間代性アッセイの結果を、処理後１０まで監視した（図２８）。ＩＣ５０を、濃度とともに割合を外挿することによって、決定した。ＦＭ１９Ｇ１１を、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭの濃度で使用した。
【０２５２】
〔実施例５４：足場に依存しない細胞増殖〕
足場に依存しない細胞増殖は、インビボにおける腫瘍細胞の腫瘍形成能の予測を可能にする研究である。足場に依存しない細胞増殖の研究を、半流動性の寒天において、ＨＴ２９細胞、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞、およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞について実施した。キャリア（ＤＭＳＯ）またはＦＭ１９Ｇ１１の存在下でのコロニー形成の効率を判定するために、該寒天を毎日監視した。この目的のために、出発物質は、半流動性の寒天中に懸濁させた７５×１０３個の細胞であり、これを１０日後まで維持した。ＨＴ２９（ｐ≦０．００５）およびＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋（ｐ≦０．０３３）などの、ｐ５３を発現させることのできる細胞をＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）で処理した場合、半流動性の寒天培地では、キャリア（ＤＭＳＯ）で処理した細胞に比較すると、これらの細胞のコロニーの増殖の大きな減少を観察することが可能であった（図２９）。ＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞において、コロニーの形成の減少は観察されない。倒立顕微鏡の拡大率４ｘの光学的なフィールドにおいてコロニーをカウントすることによって、互いに独立した３組の実験において、コロニーの増殖を定量化した。
【０２５３】
図２９は、半流動性の寒天培地中における、ＨＴ２９細胞、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞、およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞のコロニーの形成を示す。不活性な寒天内で成長した、それぞれのタイプの細胞のコロニーの個数を、播種から１０日後に定量化した。表は、レンズの拡大率を４ｘにして、５つの異なるフィールドによって、上述の各細胞株（±ＳＤ）コロニーの個数を勘定して得られた互いに異なるカウント方法を示している。結果は、播種され、キャリア（ＤＭＳＯ）またはＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）を用いて処理された細胞を計数した、互いに独立した３組の実験のカウントを示している。ＨＴ２９癌化細胞株における典型的なコロニーの形成を示す写真を、半流動性の培地に播種してから１０日後に撮影した。
【０２５４】
〔実施例５５：ＦＭ１９Ｇ１１が、ＭＭＲの発現の減少を回復させ、低酸素条件によって引き起こされるゲノムの不安定性を防止する。〕
幹細胞において低酸素条件によって引き起こされる、ＤＮＡ変異修復（ＭＭＲ）遺伝子の発現の減少によって、ゲノムが不安定になることがある（Rodriguez-Jimenez FJ, M-MV, Lucas-Dominguez R, Sanchez-Puelles JM. Hypoxia Causes Down-Regulation of Mismatch Repair System and Genomic Instability in Stem Cells. Stem Cells. May 29 2008）。ゲノムの不安定性は、腫瘍の表現型の獲得に広く関連付けられている（Scherer, SJ, Avdievich, E and Edelmann, W, (2005) Functional consequences of DNA mismatch repair missense mutations in murine models and their impact on cancer predisposition. Biochem Soc Trans 33: 689-93; Fishel, R, Lescoe, MK, Rao, MR, Copeland, NG, Jenkins, NA, Garber, J et al., (1993) The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell 75: 1027-38; Aaltonen, THE, Peltomaki, P, Leach, FS, Sistonen, P, Pylkkanen, L, Mecklin, JP et al., (1993) Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science 260: 812-6; Eckert, A, Kloor, M, Giersch, A, Ahmadi, R, Herold-Mende, C, Hampl, JA et al., (2007) Microsatellite instability in pediatric and adult high-grade gliomas. Brain Pathol 17: 146-50）。ＦＭ１９Ｇ１１は、ＤＮＡ修復タンパク質の発現を回復できる。このことが、低酸素状態のニッチに置かれた幹細胞においてゲノムが不安定になることを防止することができ、さらにこのことが生物にとって妥協をもたらすのかもしれない。なぜならば、幹細胞は自己再生、または先祖細胞にゲノムの不安定性が存在していても存続する、さらに特殊な細胞に分化することができるからである。低酸素条件下で下方制御される修復タンパク質の発現を、ＦＭ１９Ｇ１１が増加させる可能性を考慮すれば、ＨＩＦ腫瘍増殖因子、ＤＮＡ損傷応答のトリガー、または細胞の周期停止を阻害する上述の性質があるからという理由だけではなく、低酸素条件下でゲノムの不安定性の増加を防止する薬としても、ＦＭ１９Ｇ１１を抗腫瘍薬となる可能性のあるものと考えることもできる。
【０２５５】
図３０は、Ｃ１７．２神経幹細胞およびネズミのニューロスフェアが、低酸素条件下で、ＭＳＨ６修復タンパク質のレベルの低下（この低下はＦＭ１９Ｇ１１のの存在下で回復する）をどのように経験するのかを示す。正常酸素条件下で、ＤＭＳＯで処すること理によってＭＳＨ６タンパク質が減少（この減少はＦＭ１９Ｇ１１によって回復する）することが、Ｃ１７．２細胞において観察される。
【０２５６】
図３１は、低酸素状態によって引き起こされる、ネズミのニューロスフェア（神経幹細胞）におけるゲノムの不安定性が、ＦＭ１９Ｇ１１を用いた処理によって、どのように防止されるのかを示す。マイクロサテライト配列マーカーに対して特異的な蛍光標識を施したプライマーを使用することによって、酸素正常状態（Ｎｘ）、低酸素状態（Ｈｘ）、または低酸素状態＋ＦＭ１９Ｇ１１（Ｈｘ＋１９Ｇ１１）において、ニューロスフェアのゲノム安定性を分析した。上記の図において、使用されたうちの２つのマーカー（ｍＢＡＴ５９およびｍＢＡＴ６７）が、低酸素条件に起因するＤＮＡにおける欠失または挿入を、どのように示したのかが観察される。ＦＭ１９Ｇ１１を用いた処理によって、（参照またはコントロールとして使用される）酸素正常状態の特性が回復できるようになり、それゆえ、低酸素状態によって引き起こされるゲノムの不安定性が防止できる。
【０２５７】
〔実施例５６：ＦＭ１９  Ｇ１１は、後成的なイベントによって染色質を再造形する能力を有する。〕
研究室における知見によれば、ＦＭ１９Ｇ１１には、ｐ３００（ヒストンアセチル化酵素）の発現に対して影響を与える能力がある。つまり、ＦＭ１９Ｇ１１は、ＤＮＡ（ヌクレオソーム）が渦巻状になっており、染色質を形成するヒストンに、アセチル基を導入する。細胞のタイプによって、ＦＭ１９Ｇ１１は、ｐ３００の発現の変化、およびある染色体領域のアセチル化の程度の変化に対して有利に作用する。例えば、以前の知見（Rodriguez-Jimenez FJ, M-MV, Lucas-Dominguez R, Sanchez-Puelles JM. Hypoxia Causes Down-Regulation of Mismatch Repair System and Genomic Instability in Stem Cells. Stem Cells. May 29 2008）によれば、低酸素状態およびそれに関連する後成的なイベントが、ＤＮＡ変異（ＭＳＨ６、ＭＬＨ１）の場合の、修復タンパク質のレベルの低下を引き起こす。低酸素状態では、ＭＬＨ１遺伝子およびＭＳＨ６遺伝子のプロモーター領域におけるヒストンＨ３のアセチル化の減少に起因して、染色質の閉構造が生成されることが、上述の研究対象物において観察された。ただし、ＦＭ１９Ｇ１１の存在下では、キャリアで処理した細胞に対して、ｐ３００および修復タンパク質が増加した。ヒストンのアセチル化を防止するＴＳＡ（ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬）でタンパク質を処理した場合、薬がどのようにして、タンパク質全体の脱アセチル化の大幅な増加を引き起こすのか、観察することができた。
【０２５８】
ＴＳＡが、乳癌における抗腫瘍薬となる可能性のあるものとして提案されていて、現在、前臨床の段階にある（Vigushin, DM, Ali, S, Pace, PE, Mirsaidi, N, Ito, K, Adcock, I et al., (2001) Trichostatin A is a histone deacetylase inhibitor with potent antitumor activity against breast cancer in vivo. Clin Cancer Res 7: 971-6.）。ＦＭ１９Ｇ１１は、タンパク質のアセチル化を、ＴＳＡと同じぐらいまたはそれ以上に効率よく、強制的に進める。ＦＭ１９Ｇ１１は、このタイプの神経幹細胞（Ｃ１７．２）において、アセチル化を強制的に進め、かつ、ＭＬＨ１修復タンパク質およびＭＳＨ６修復タンパク質の観察される回復に関連する可能性のある、薬のように振る舞う。なぜならば、以前の研究を考慮すれば、これらのタンパク質が後成的なプロセスによって制御されるからである（Rodriguez-Jimenez FJ, M-MV, Lucas-Dominguez R, Sanchez-Puelles JM. Hypoxia Causes Down-Regulation of Mismatch Repair System and Genomic Instability in Stem Cells. Stem Cells. May 29 2008）。
【０２５９】
図３２は、ＦＭ１９Ｇ１１がどのようにして、正常酸素条件および低酸素条件下で、Ｃ１７．２神経幹細胞においてｐ３００（ヒストンアセチル化酵素）およびＤＮＡ修復タンパク質（ＭＬＨ１およびＭＳＨ６）の発現の変化を引き起こすのかを示す。ＦＭ１９Ｇ１１は、タンパク質全体のアセチル化の程度に対して影響する。ＴＳＡを、ヒストンのアセチル化を強制的に進める薬に対する、正のコントロールとして使用した。
【０２６０】
細胞がＦＭ１９Ｇ１１で処理された場合、アセチル化の程度の変化は明らかであるが、それぞれの細胞のタイプの遺伝的背景が、ＦＭ１９Ｇ１１によって引き起こされる後成的な変化に対して影響し、その結果、発現の増加または減少に影響する。したがって、脊髄から得られる上衣細胞は、ヒストンＨ３全体のアセチル化の全体的な程度が比較的低く、ＦＭ１９Ｇ１１は染色質の閉構造をさらに生成する。物理的な低酸素条件下で、ＦＭ１９Ｇ１１は、この細胞のタイプにおいて、あるタンパク質（例えば、ＨＩＦαの２つのアイソフォーム、上述のｐ３００、および上記未分化マーカー（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４））の減少を引き起こすことができる。ヘテロクロマチンの高次構造（閉構造）を付与し、かつ、転写活性化因子がアクセスすることを防止する、ヒストンＨ３のアセチル化の減少に、これらのタンパク質の減少が関連している。
【０２６１】
図３３は、正常酸素条件または低酸素条件（図中左側）の下で、ＦＭ１９Ｇ１１によってタンパク質の発現に対して引き起こされる、酸素変化（ＨＩＦα）、未分化マーカー（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４）、ヒストンアセチル化酵素（ｐ３００）、およびアセチル化ヒストンＨ３に対して順応する効果を示す。酸素正常状態および低酸素状態におけるヒストンＨ３のアセチル化の状態に対する、ＦＭ１９Ｇ１１の影響を、染色質の免疫沈降によって、そのために抗ＡｃＨ３抗体（アセチル化ヒストンＨ３）を使い、定量的なＰＣＲ（右側のグラフ）によってＤＮＡを定量化して、決定した。
【０２６２】
ＦＭ１９Ｇ１１は、ヒストンＨ３のアセチル化の程度に対して影響を与えることができ、したがって、染色質の高次構造に対して影響を与えることができるので、ＦＭ１９Ｇ１１が、ヒストンＨ３へのアセチル基の導入に対して有利に作用するか、または逆にヒストンＨ３の脱アセチル化を防止するかどうかを評価した。どちらの効果も、ヒストンＨ３のアセチル化の程度の増加を引き起こすと考えられる。アセチルトランスフェラーゼｐ３００を認識する抗体を使用して、免疫沈降アッセイを実施した。さらに、キット「ＨＡＴ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ」（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を使って、アセチルトランスフェラーゼ活性を測定するアッセイを、実施した。この方法はＡＤＨの検出からなるが、なぜならば、ペプチドのアセチル化が、ＮＡＤＨの生成に必須の補酵素として作用するコエンザイムＡの遊離型の放出を引き起こすからである。ＦＭ１９Ｇ１１で処理されたＣ１７．２細胞において、酸素の割合に関わらず、免疫沈降物のアセチルトランスフェラーゼ活性が増加することが観察された。ただし、キットＨＤＡＣ  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｍｏｌ，  ＡＫ−５０３）を用いて実施したアッセイから得られた結果によれば、ＦＭ１９Ｇ１１は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬としての活性を示さなかった。
【０２６３】
図３４Ａは、無処理、キャリアまたはＦＭ１９Ｇ１１で処理済み、および正常酸素条件または低酸素条件下で培養済みの、細胞のタンパク質抽出物のアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を示している。タンパク質抽出物を先に抗ｐ３００抗体で免疫沈降させ、アセチルトランスフェラーゼ活性を、ＮＡＤＨを検出することによって測定した。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）活性の評価（図３４Ｂ）を、異なる濃度のＦＭ１９Ｇ１１で処理されたＨｅＬａ細胞のタンパク質抽出物を用いて実施した。正のコントロールとして、固定濃度のＴＳＡ（１μＭ）を含めて、無処理の細胞の抽出物をコントロールとして使用した。実験は、ヒストン脱アセチル化酵素活性を検出するための、Ｂｉｏｍｏｌのキット（ＨＤＡＣ  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，  Ｂｉｏｍｏｌ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＡＫ−５０３）の指示にしたがって実施した。
【図面の簡単な説明】
【０２６４】
【図１】化合物ＦＭ１９Ｇ１１および類似体の化学合成を示す。
【図２】ＨＩＦの転写活性の新規阻害剤である、ＦＭ１９Ｇ１１を示す。Ａ）はＦＭ１９Ｇ１１の化学構造を示す。Ｂ）は、プロモーター領域に存在するＨＩＦのタンパク質のＨＲＥ反応配列に結合することによって、該タンパク質に反応して活性化されたルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を使った、ＨＩＦの転写活性の研究結果を示す。ＨＲＥの９個の反復に融合したルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を恒常的に過剰発現させるＨｅＬａ細胞の培養物を、低酸素条件（Ｏ２１％、図中青色の棒グラフ）または正常酸素条件（Ｏ２２０％、図中赤色の棒グラフ）で、ＦＭ１９Ｇ１１を濃度を増加させながら（０μＭ〜１μＭ）使用して、６時間かけて処理した。ルシフェラーゼの活性を示す単位は、絶対値で表わす。Ｃ）は、Ｂに図示したＨＩＦの転写活性の阻害を、ルシフェラーゼ活性アッセイから計算した結果を示す。１００−（（（ＲＬＵＨｘ＋ＦＭ１９Ｇ１１−ＲＬＵＨｘ＋ＤＭＳＯ）＊１００／ＲＬＵＨｘ−ＲＬＵＨｘ＋ＤＭＳＯ）））実験は三組実施した。
【図３】ＨＩＦの転写活性の制御における、ＦＭ１９Ｇ１１の特異性の研究結果を示す。該遺伝子のプロモーター領域において、上記ＨＩＦのタンパク質（ＨＲＥ）に対して反応する配列に融合したルシフェラーゼ・レポーター遺伝子、ｃ−ｊｕｎ／ｃ−ｆｏｓ（ＴＲＥ）によって形成された化合物に融合したルシフェラーゼ・レポーター遺伝子、またはＡＴＦ２／ＪｕｎＢ（ＣＲＥ）によって形成された化合物に融合したルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を恒常的に過剰発現させるＨｅＬａ細胞を、それぞれの刺激の存在下（ＨＲＥの場合は低酸素状態（Ｏ２１％）、ＴＲＥの場合はｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの同時発現、ＣＲＥの場合はＡＴＦ２およびＪｕｎＢの同時発現）で６時間培養した。転写活性を阻害する際のＦＭ１９Ｇ１１の活性を、濃度を増加させながら（０μＭ〜１μＭ）、ルシフェラーゼ活性を測定し、次式を適用することによって決定した。１００−（（（ＲＬＵＨｘ＋ＦＭ１９Ｇ１１−ＲＬＵＨｘ＋ＤＭＳＯ）＊１００／ＲＬＵＨｘ−ＲＬＵＨｘ＋ＤＭＳＯ）））実験は三組実施した。
【図４】ＨｅＬａ細胞において、ＶＥＧＦのメッセンジャーＲＮＡの発現レベルを定量化するための、実時間ポリメラーゼ連鎖反応を示す。ＨｅＬａ細胞は、低酸素条件（Ｏ２１％、ＨＰＸ）または正常酸素条件（Ｏ２２０％、ＮＭ）で、ＦＭ１９Ｇ１１または当量体積のキャリア（ＤＭＳＯ、コントロール）の存在下で、該ＦＭ１９Ｇ１１またはキャリアの濃度を増加させながら（０．０３μＭ〜０．３μＭ）、２４時間培養した。全ＲＮＡ量の変化に起因する発現量の変化を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の恒常的発現によって補正した。上記各試料におけるＶＥＧＦ／ＧＡＰＤＨの発現量の比の値を、コントロール酸素正常状態（＝１）において得られた発現レベルに対して相対化した。実験は三組実施した。
【図５】ＨｅＬａ  ９ＸＨＲＥ細胞において、ＨＩＦおよびＰＨＤ３（正のコントロールとして。なぜならばＨＩＦ１αの標的遺伝子であるから）の２つのαアイソフォームを認識する抗体を使用したウエスタンブロット法による、タンパク質の発現の解析結果を示す。ＧＡＰＤＨを、タンパク質の添加コントロールとして含めた。第１のレーンは無処理の細胞に対応する。第２のレーンは、低酸素条件下でＦＭ１９Ｇ１１を用いて処理された細胞に対応し、第３のレーンは、低酸素状態で培養された細胞に対応する。実験は三組実施した。刺激時間は９時間であった。互いに独立して実施した３組の実験を代表して、１組の実験を図示している。
【図６】Ｃ１７．２細胞において、ＨＩＦ１αおよびＰＨＤ３（正のコントロールとして。なぜならばＨＩＦ１αの標的遺伝子であるから）を認識する抗体を使用したウエスタンブロット法による、タンパク質の発現の解析結果を示す。Ｂアクチンを、タンパク質の添加コントロールとして含めた。第１のレーンは無処理の細胞に対応する。第２のレーンは、低酸素条件下で培養された細胞に対応する。第３、第４、および第５のレーンは、ＦＭ１９Ｇ１１（それぞれ１２５、２５０、５００）を濃度を増加させながら用いて処理され、低酸素条件下で培養された細胞に対応する。実験は三組実施した。刺激時間は３時間および２４時間であった。赤色の矢印は、ＰＨＤ３（標的遺伝子ＨＩＦ）の発現が大きく減少していることを示している。互いに独立して実施した３組の実験を代表して、１組の実験を図示している。
【図７】ＦＭ１９Ｇ１１（５００ｎＭ）の存在下で、酸素正常状態または低酸素状態で培養された間葉系幹細胞の核タンパク質からの抽出物を使用して実施した、ウエスタンブロットの結果を示す。単クローンの抗ＭＬＨ１および抗ＭＳＨ６抗体を、解析において使用した。Ａは、骨髄の間葉系幹細胞において得られた結果である。１−Ｎｘ  ３ｈ；２−Ｈｘ  ３ｈ；３−Ｈｘ  ３ｈ＋１９Ｇ１１；４−Ｈｘ  １８ｈ；５−Ｈｘ  １８ｈ＋１９Ｇ１１；６−Ｈｘ  ２４ｈ；７−Ｈｘ  ２４ｈ＋１９Ｇ１１。Ｂは、歯髄の間葉系幹細胞において得られた結果である。１３−Ｎｘ  ７２ｈ；１４−Ｎｘ  ７２ｈ＋１９Ｇ１１；１５−Ｈｘ  ７２ｈ；１６−Ｈｘ  ７２ｈ＋１９Ｇ１１。実験は三組実施した。刺激時間は３時間であった。互いに独立して実施した３組の実験を代表して、１組の実験を図示している。
【図８】ｅｐＮＰＣにおいて、ＰＨＤ３およびＶＥＧＦのメッセンジャーＲＮＡの発現レベルを定量化するための、実時間ポリメラーゼ連鎖反応を示す。ｅｐＮＰＣは、低酸素条件（Ｏ２１％）で、５００ｎＭのＦＭ１９Ｇ１１または当量体積のキャリア（ＤＭＳＯ）の存在下で、０時間（ベースライン状態、１）４８時間培養された。全ＲＮＡ量の変化に起因する発現量の変化を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の恒常的発現によって補正した。上記各試料におけるＰＨＤ３またはＶＥＧＦ／ＧＡＰＤＨの発現量の比の値を、ベースラインの発現レベル（時間Ｏ＝１のときに酸素正常状態または低酸素状態）に対して相対化した。実験は三組実施した。
【図９】ヒトの歯髄の幹細胞において、ＨＩＦ−１およびその標的遺伝子ＶＥＧＦおよびＣＯＸ−２の発現に対する、化合物ＦＭ１９Ｇ１１の効果を示す。
【図１０】ヒトの歯髄の幹細胞において、アポトーシスおよび生存率に対する、化合物ＦＭ１９Ｇ１１の効果を示す。
【図１１】未分化状態のマーカーＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、およびその標的遺伝子ＴＧＦα、ならびにＮａｎｏｇそれぞれのメッセンジャーＲＮＡの発現を研究するための、半定量的な逆転写ＰＣＲを示す。ｅｐＮＰＣを、正常酸素条件（Ｏ２２０％）または低酸素条件（Ｏ２１％）下で、５００ｎＭのＦＭ１９Ｇ１１またはそのキャリア（＋）またはＤＭＳＯ（−）の存在下で、４８時間培養した。恒常的なＧＡＰＤＨ遺伝子の発現は、どの条件であっても、アッセイされた試料の量に大きな変化がないことを示している。実験は三組実施した。
【図１２】正常酸素条件（Ｏ２２０％）または低酸素条件（Ｏ２１％）下で、ＦＭ１９Ｇ１１の存在下でその用量を増加させながら４８時間培養された、ｅｐＮＰＣのＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、およびβ−アクチン（ローディングコントロール）のタンパク質の発現レベルの研究のための、ウエスタンブロットの結果を示す。実験は三組実施した。
【図１３】正常酸素条件（Ｏ２２０％）下で、ＦＭ１９Ｇ１１の存在下でその用量を増加させながら４８時間培養された、ｅｐＮＰＣのＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｎｏｔｃｈ−１、およびβ−アクチン（添加コントロール）のタンパク質の発現レベルの研究のための、ウエスタンブロットの結果を示す。実験は三組実施した。
【図１４】ｈＥＳＣにおいて、Ｓｏｘ２およびＯＣ３／４のメッセンジャーＲＮＡの発現レベルを定量化するための、実時間ポリメラーゼ連鎖反応の結果を示す。マトリゲル上で培養されたｈＥＳＣのコロニーを、正常酸素条件（Ｏ２２０％）または低酸素条件（Ｏ２１％）下で、５００ｎＭのＦＭ１９Ｇ１１または当量体積のそのキャリア（ＤＭＳＯ）の存在下で、４８時間処理した。全ＲＮＡ量の変化に起因する発現量の変化を、ＧＡＰＤＨ遺伝子の恒常的発現によって補正した。上記各試料におけるＳｏｘ２またはＯｃｔ３／４／ＧＡＰＤＨの発現量の比の値を、ベースラインの発現レベル（酸素正常状態−キャリア＝１）に対して相対化した。実験は三組実施した。
【図１５】ｅｐＮＰＣがオリゴデンドロサイトに分化する様子を示す（標的とする分化）。Ａ）は、分化プロトコールのスキームである。ｅｐＮＰＣを、正常酸素条件（Ｏ２２０％）または低酸素条件（Ｏ２１％）下で、分化のプロセスの初期（１日目〜３日目）および該プロトコールの終了時（３５日目〜３８日目）に、ＦＭ１９Ｇ１１またはそのキャリア（ＤＭＳＯ）を用いて処理した。オリゴデンドロサイト、ＮＧ２、ＲＩＰ、およびＯ４についてのマーカーの発現を、免疫組織化学的方法によってすべての条件下で判定した。
【図１６】ＦＭ１９Ｇ１１の存在下で、ｅｐＮＰＣの増殖性の活性を定量化したものを示す。ｅｐＮＰＣを、正常酸素条件（Ｏ２２０％）または低酸素条件（Ｏ２１％）下で、５００ｎＭのＦＭ１９Ｇ１１またはそのキャリアの存在下で、同じ個数で３日間培養した。生成されたＡＴＰの量を、細胞培養の代謝活性の指標として定量化することによって、増殖性の活性を判定した。ＦＭ１９Ｇ１１の存在下で得られた結果を、キャリアであるＤＭＳＯ（＝１）の存在下で得られた値に対して相対化した。
【図１７】ｅｐＮＰＣの培養から得られるニューロスフェアの形成／増幅に対するＦＭ１９Ｇ１１の効果を示す。５００ｎＭのＦＭ１９Ｇ１１またはそのキャリア（ＤＭＳＯ）の存在下でｅｐＮＰＣ（１６，０００個の細胞）を４８時間培養して得られたものの、位相差写真である。
【図１８】細胞パネルに対するＦＭ１９Ｇ１１の毒性を示す。細胞株、ＨｅＬａ  ９ｘ−ＨＲＥ−Ｌｕｃ、ＰＲＣ３、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７、およびＭＤＡ−ＭＢ  ４３５−Ｓにおいて、細胞毒性の研究を実施した。ＦＭ１９Ｇ１１（０μＭ〜３０μＭ）の存在下で濃度を増加させながら、１０％の不活化されたウシ胎仔血清、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ培地で、正常酸素条件下で、該細胞株を７２時間培養した。培養物の生存率（％）を、市販のキット、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使って決定した。
【図１９】化合物ＦＭ１９Ｇ１１の魚（メダカ）の胚に対する毒性のアッセイを示す。
【図２０】化合物ＦＭ１９Ｇ１１の分析的ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２１Ａ】互いに異なる時間において、ウシ血清中のＦＭ１９Ｇ１１の、インキュベーションを行った抽出物のクロマトグラムを示す。
【図２１Ｂ】互いに異なる時間において、ウシ血清中のＦＭ１９Ｇ１１の、インキュベーションを行った抽出物のクロマトグラムを示す。
【図２１Ｃ】互いに異なる時間において、ウシ血清中のＦＭ１９Ｇ１１の、インキュベーションを行った抽出物のクロマトグラムを示す。
【図２１Ｄ】互いに異なる時間において、ウシ血清中のＦＭ１９Ｇ１１の、インキュベーションを行った抽出物のクロマトグラムを示す。
【図２２】ＦＭ１９Ｇ１１は、ヒトの大腸癌細胞（ＨＴ２９）においてＤＮＡ損傷応答のトリガーとなる。ＤＮＡ損傷応答において鍵となるシグナル経路、具体的には、ＡＴＲ／ＡＴＭとして知られている経路、ＤＮＡ損傷の修復（ＭＭＲ、ＢＲＣＡ１、Ｈ２ＡＸ）の経路に関わるキナーゼのリン酸化が進むことによる活性化の増加が、細胞周期（ＣＨＫ１、ＣＨＫ２）の制御の点においても、ＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）を用いて処理された腫瘍細胞ＨＴ２９において検出された。６−ＴＧ（５μＭ、１０μＭ、２５μＭ）またはエトポシド（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）を用いた処理を、コントロールとして、また、ＤＮＡの一本鎖（ＡＴＲ−ＣＨＫ１）または二重鎖（ＡＴＭ−ＣＨＫ２）それぞれにおいて損傷に反応して活性化されるタンパク質比較のために含めた。
【図２３】動態的研究によれば、ＡＴＲの急速な活性化は、ＨＣＴ１１６細胞株のどちらにおいても、ＤＮＡの一本鎖における損傷に関連している。０．５μＭのＦＭ１９Ｇ１１を用いて１時間処理した後、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋、のｐ５３細胞における、ＡＴＲおよびｐ５３、ならびに、ＨＣＴ１１６ｐ５３−／−細胞におけるＡＴＲのリン酸化または活性化の増加が検出された。上述の結果は、代表的なウエスタンブロット実験を濃度測定の解析にかけた後に得られた。ただし、互いに独立した３組の実験でも同様の結果が得られた。
【図２４】ＦＭ１９Ｇ１１によって誘導された周期停止に対する、ｐ５３の効果を示す。ＡではＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞、ＢではＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞を、互いに異なる濃度のＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ）またはキャリアに対して、３日間または６日間曝露して、互いに異なる細胞周期相において細胞の分布をフローサイトメトリーによって分析した。グラフは、異なる濃度のＦＭ１９Ｇ１１によって引き起こされた、それぞれの細胞周期相細胞の割合（％）の分布に対する効果を示している。図示された結果は１組の実験を代表するものである。ただし、互いに独立した３組の実験において、非常に近い割合が得られた。
【図２５】動態的研究によれば、ＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）を用いて処理されたＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞におけるＡＫＴ／ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６／サイクリンＤ１シグナル経路が、急速かつ効率的に活性化される（倍率の変化≧２）。ｍＴＯＲも、ＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞において、ＦＭ１９Ｇ１１を用いて処理した後に、急速にリン酸化された（ただし、倍率の変化の増加は、２よりわずかに小さい）。
【図２６】ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞を、ＦＭ１９Ｇ１１（１０μＭ）、ラパマイシン（登録商標）（ｍＴＯＲ阻害剤）（１００ｐｍｏｌ）に単独で、または両方の薬を組み合わせて、上述の濃度で曝露した。両方の薬（１００ｐｍｏｌ）に対して同時にインキュベーションを行ったところ、ＦＭ１９Ｇ１１を用いた処理によってＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋細胞において発生するＳ期の周期停止が、防止された。
【図２７】細胞中のＡＴＰの総含有量は、ＦＭ１９Ｇ１１を用いて処理されたヒトの大腸癌細胞の割合（％）として、また、ＤＭＳＯを用いて４８時間処理された対応する細胞株に対して相対的に、定量化された細胞生存率と相関関係がある。
【図２８】ＨＴ２９のヒトの大腸癌細胞およびＦＭ１９Ｇ１１を用いて処理されたＨＣＴ１１６細胞の間代性アッセイの結果を、処理後１０まで監視した。ＩＣ５０を、濃度とともに割合を外挿することによって、決定した。ＦＭ１９Ｇ１１を、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭの濃度で使用した。
【図２９】半流動性の寒天培地における、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６／ｐ５３＋／＋、およびＨＣＴ１１６／ｐ５３−／−細胞のコロニーの形成を示す。不活性な寒天内で成長した、それぞれのタイプの細胞のコロニーの個数を、播種から１０日後に定量化した。表は、レンズの拡大率を４ｘにして、５つの異なるフィールドによって、上述の各細胞株（±ＳＤ）コロニーの個数を勘定して得られた互いに異なるカウント方法を示している。結果は、播種され、キャリア（ＤＭＳＯ）またはＦＭ１９Ｇ１１（０．５μＭ）を用いて処理された細胞を計数した、互いに独立した３組の実験のカウントを示している。ＨＴ２９癌化細胞株における典型的なコロニーの形成を示す写真を、半流動性の培地に播種してから１０日後に撮影した。
【図３０】Ｃ１７．２神経幹細胞およびネズミのニューロスフェアは、低酸素条件下で、ＭＳＨ６修復タンパク質のレベルが低下するが、ＦＭ１９Ｇ１１の存在下で回復する。正常酸素条件下では、ＤＭＳＯを用いた処理によってＭＳＨ６タンパク質が減少しても、ＦＭ１９Ｇ１１によって救出されることが、Ｃ１７．２細胞において観察される。
【図３１】低酸素状態によって引き起こされる、ネズミのニューロスフェア（神経幹細胞）におけるゲノムの不安定性を、ＦＭ１９Ｇ１１で処理することによって防止する。マイクロサテライト配列マーカーのための、特異的な蛍光標識を施したプライマーを使用することによって、酸素正常状態（Ｎｘ）、低酸素状態（Ｈｘ）、または低酸素状態＋ＦＭ１９Ｇ１１（Ｈｘ＋１９Ｇ１１）におけるニューロスフェアのゲノム安定性を、分析した。図中、使用したマーカーのうち２種類（ｍＢＡＴ５９およびｍＢＡＴ６７）が、どのようにして、低酸素条件に起因するＤＮＡの欠失または挿入を示したのかが観察できる。ＦＭ１９Ｇ１１を用いて処理することによって、（参照またはコントロールとして使用される）酸素正常状態の特性が回復でき、こうして、低酸素状態によって引き起こされるゲノムの不安定性が防止できた。
【図３２】ＦＭ１９Ｇ１１は、Ｃ１７．２神経幹細胞において、正常酸素条件および低酸素条件下で、ｐ３００（ヒストンアセチル化酵素の一種）およびＤＮＡ修復タンパク質（ＭＬＨ１およびＭＳＨ６）の発現を変化させる。ＦＭ１９Ｇ１１は、全体的なタンパク質のアセチル化の程度に影響する。ＴＳＡを、ヒストンアセチル化を強制的に発生させる薬剤のための正のコントロールとして含めた。
【図３３】正常酸素条件または低酸素条件（図中左側）の下で、酸素状態の変化（ＨＩＦα）、未分化マーカー（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４）、ヒストンアセチル化酵素（ｐ３００）、およびアセチル化ヒストンＨ３に対して順応するという、タンパク質の発現に対してＦＭ１９Ｇ１１によって引き起こされる効果を示す。酸素正常状態および低酸素状態におけるヒストンＨ３のアセチル化状態に対するＦＭ１９Ｇ１１の影響を、免疫沈降を目的として抗ＡｃＨ３抗体（アセチル化ヒストンＨ３）を使用し、定量的なＰＣＲ（右側のグラフ）によってＤＮＡを定量化し、染色質の免疫沈降によって判定した。
【図３４】ＦＭ１９Ｇ１１のアセチルトランスフェラーゼまたはヒストン脱アセチル化酵素活性の評価を示す。上側のグラフは、無処理、キャリアまたはＦＭ１９Ｇ１１で処理済み、または正常酸素条件または低酸素条件下で培養済みの細胞のタンパク質の抽出物のアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を示している。タンパク質の抽出物は、抗ｐ３００抗体を用いて先に免疫沈降させ、ＮＡＤＨを検出することによって、アセチルトランスフェラーゼ活性を測定した。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）活性の評価を、異なる濃度のＦＭ１９Ｇ１１で処理されたＨｅＬａ細胞のタンパク質の抽出物を用いて実施した。正のコントロールとして、ＴＳＡの濃度を固定して（１μＭ）含め、無処理の細胞の抽出物をコントロールとして使用した。実験は、ヒストン脱アセチル化酵素活性を検出するためのＢｉｏｍｏｌキット（ＨＤＡＣ  Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，  Ｂｉｏｍｏｌ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＡＫ−５０３）の指示にしたがって実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ）】
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【図９Ｂ）】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３４】
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【図１０】
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【図１５】
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【図１７】
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【図２２】
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【図２９】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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