(57)【要約】  本発明は、試料中の分析物、とりわけ炭水化物、より詳しくは糖の存在または量を測定するために、ファブリックを用いて試料を分析するための方法、装置およびキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物の存在または量を測定する方法であって、
該試料をファブリックに適用すること；
該試料中に分析物が存在する場合に該分析物を化学的に修飾すること；
該化学的に修飾された分析物の存在または量を検出すること
を含む方法。
【請求項２】
分析物が炭水化物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
炭水化物が糖である請求項２記載の方法。
【請求項４】
糖がフルクトース、デキストリン、ラクトース、マルトースまたはスクロースを含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
化学的修飾および検出が室温で行われる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
化学的修飾および検出がファブリックの別々の領域で行われる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
さらに、化学的に修飾された分析物の検出を干渉する薬剤を不活化することを含む請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
化学的修飾および干渉薬剤の不活化が化学的に修飾された分析物を検出する前に行われる請求項６記載の方法。
【請求項９】
化学的修飾が、糖の環におけるエーテル結合の開環および／またはアルデヒド基の生成のための酸化剤との反応である請求項３または４記載の方法。
【請求項１０】
化学的修飾化剤が過ヨウ素酸または過ヨウ素酸塩である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
化学的修飾反応の後かつ化学的に修飾された炭水化物の検出の前に、化学的に修飾された炭水化物の検出を干渉する過剰量の酸化剤が不活化される請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
化学的に修飾された炭水化物の検出が、該化学的に修飾された炭水化物の存在下で可視的な色の変化を与える銅含有化合物でなされる請求項９、１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
ファブリックが合成ファブリック材料である請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ファブリックがポリエステルファブリックである請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
試料が、毛細管作用を経てファブリックを通って移動し、かつ化学的な修飾の手段、干渉薬剤を不活化する手段および検出手段が、該試料が通って移動する該ファブリックの逐次的領域にある請求項７または１１記載の方法。
【請求項１６】
ファブリックを表面に接触させること、および該表面を拭き取るかまたは該表面から試料を吸収することを含む方法により、試料がファブリックに適用される請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ファブリックまたは表面が、ファブリックと表面とが互いに接触される前に緩衝溶液と接触される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ファブリックに試料を適用することにより室温で行われる非酵素法を含む試料中の糖の測定方法。
【請求項１９】
前記ファブリックが、糖に対する酸化剤として、過ヨウ素酸ナトリウムまたは過ヨウ素酸を含み、前記方法がチオ硫酸ナトリウムまたは硫酸第一鉄ナトリウムにより該過ヨウ素酸ナトリウムまたは過ヨウ素酸を中和することを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
分析物を化学的に修飾するための手段を運ぶファブリック、化学的に修飾された分析物を検出するための手段および任意に干渉物質を不活化する手段を含む請求項１〜１９記載の方法を実行するのに適する検査装置。
【請求項２１】
前記ファブリックが、試料または試薬を一方通行させる不浸透性の層および／または層物質によって層状にされる請求項２０記載の装置。
【請求項２２】
層状にされる不浸透性の層が少なくとも１つの開口部を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
試料または試薬を一方通行に流す前記層状にされた層が、試料または試薬が試料を適用された表面へ逆流することを制限する請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
試料中の炭水化物の存在または量を検出するための装置であって、該装置がファブリック層を通して試料が連続的に移動するように調整されたファブリック層を含み、該ファブリック層が
炭水化物を化学的に修飾する手段を含む化学修飾エリア；
化学的に修飾された炭水化物の検出を干渉する薬剤を不活化する手段を含む不活化エリア；および
化学的に修飾された炭水化物を検出する手段を含む指示エリア
を含む請求項２０〜２３のいずれかに記載の装置。
【請求項２５】
炭水化物を化学的に修飾するための試薬として過ヨウ素酸または過ヨウ素酸ナトリウムを含み、さらにビシンコニン酸を用いる銅錯化剤を用いて該化学的に修飾された炭水化物を検出する前に、該化学的に修飾する試薬を中和するためのチオ硫酸ナトリウムまたは硫酸第一鉄ナトリウムを含むファブリック材料の層を含む請求項２記載の方法を実行するための装置。
【請求項２６】
請求項２０〜２５のいずれかに記載の検査装置を製造する方法であって、
ロール−ツー−ロール印刷が前記ファブリック材料との接触面に導入される一方で該接触面のロールは回転させられ、該接触面のロールと該ファブリック材料が相対的に動かされる中で、分析物を化学的に修飾するための試薬および該化学的に修飾された分析物を検出するための試薬を、印刷によって該ファブリック材料に塗布する工程；および
該ファブリック材料を二枚の不浸透性の層の間に積層し、該不浸透性の層の一枚が、該ファブリック材料と並べられる少なくとも一つの開口部を有し、該開口部を通って試料が表面からファブリック材料へと吸収される工程
を含む方法。
【請求項２７】
前記ロール−ツー−ロール印刷が、グラビア印刷である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ファブリック材料；および
化学的に修飾する薬剤によって前記分析物を修飾するための手段；および
干渉試薬を不活化するための手段；および
化学的に修飾された分析物を検出する手段
を含む検査装置を含み、試料中の分析物の存在または量を測定するためのキット。
【請求項２９】
前記ファブリック材料、または試料となるべき表面もしくは前記試料を生み出す表面を、湿らすための緩衝溶液をさらに含む請求項２８記載のキット。
【請求項３０】
表面の汚染、とりわけ微生物の増殖を促進する物質による汚染を示すために、表面上の炭水化物の存在を検出するための請求項１〜１９のいずれかに記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の分析物（analyte）、とりわけ炭水化物、より詳しくは糖の存在または量を測定するために、ファブリック（fabric）を用いて試料を分析するための方法、装置およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
実験室、病院の受付、家庭、公共施設および工業用生産プラントにおいて周囲の衛生状態への注目は高まっている。この動向は、場所の使用者または清掃者がその場所の衛生状態を素早く確認できるような方法の開発へと向かっている。これらの方法は大変単純で扱いやすく、かつ迅速で安価なものであるべきである。
【０００３】
衛生状態は、表面上の細菌濃度などの微生物の存在、または細菌の増殖を促す物質の存在を測定することで確認することができる。現行の方法を用いて表面から微生物を分析することは時間がかかり、専門的な知識を要する。細菌や真菌などの微生物の増殖を促す物質、たとえば糖類やタンパク質などを分析することは、ほぼ同等の信頼度で表面の清潔さを示す。
【０００４】
タンパク質の存在を測定するために利用できる迅速かつ高感度な検査が存在し、それらはブロモクレゾールグリーンとタンパク質との反応に基づく。そのような検査は、例えば特許出願、国際公開第２００６／１２２７３３号パンフレットに記載され、様々な膜の使用に基づいた既存の検査形式が網羅的に論じられている。当該出願は、ロールツーロール（roll-to-roll）または他の印刷技術で膜に試薬を塗る様々な方法についても広く論じている。
【０００５】
糖類などの炭水化物を分析する既知の方法のほとんどは、色の変化により糖類が示される方法に基づく。色の変化に基づく方法のほとんどは糖類の分光光度アッセイのために開発された。現在まで、表面上の糖類の存在を測定するために利用できるような安価で迅速、かつ簡単な検査は存在していない。糖類に関する問題はそれらの安定した構造であり、これは糖類の分析には、特異的かつ有望な不安定酵素、かなり高温での培養、長い反応時間および／または健康に有害または使用が危険な化学物質が必要であることを意味する。
【０００６】
色の変化に基づいて糖類を分析する利用可能な方法はいくつかある。銅の還元に基づく方法としては、フェーリング試薬、アルセノモリブデン酸塩およびＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイがある。糖の測定に適用可能な他の方法としては、シアン化鉄およびＤＮＳ（ジニトロサリチル酸）法、アセタール形成に基づく方法、アントロン法、フェナジン基、シッフ試薬およびテトラゾリウムブルーなどの指示法、ならびに円偏光二色性、光吸収および蛍光に基づくボロン酸センサーがある。糖類の測定に適用可能な他の方法としては、グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼおよびヘキソキナーゼなどの酵素法、および生物発光および化学発光などの発光方法がある。
【０００７】
その使用可能な方法は、それ自体では、糖類をファブリック法により検出する検査形式での使用には適用できない。銅還元に基づく方法は全て、充分な速度で反応させるために加熱を要する。
【０００８】
米国特許第６，５８６，１９５号において、糖類を示すためにヤーヌスグリーンＢが用いられている。この特許は還元糖類が、塩基性条件下で充分高い濃度、約１０ｇ／ｌの濃度でヤーヌスグリーンＢを還元でき、この場合ヤーヌスグリーンＢは青色から灰色へと変化するということを記載している。青色から灰色への変化というこの反応では、検出限界に近い濃度での検査結果を判断することは大変困難であるので、この色の変化は最適ではない。
【０００９】
アセタール形成に基づく方法およびアントロン法は、高濃度の強酸を使用するため、ファブリックに基づく迅速な検査の開発においては不適切である。
【００１０】
指示薬法は単純な試薬組成を含み、ファブリックに印刷するために必要な試薬の量を減らす。糖の濃度が充分に高い場合、指示薬の色の変化は室温でも観測することができる。欠点は、例えばフルクトースなどの高い還元力を有する糖類しか検出できないことである。また、市販されている指示薬は乏しい。
【００１１】
酵素および発光に基づく方法は鋭敏かつ迅速である。いくつかの酵素に関連する欠点としては、それらのコストおよび不安定な特性があげられる。さらに、特定の糖類にのみ作用するという酵素の特異的作用により、全てまたはほとんどの炭水化物の総濃度を示すべきである迅速検査ではそのような酵素は使用できない。発光に基づく方法は糖修飾酵素と共にのみ実行可能であり、ゆえに酵素法と同一の問題を共有する。
【００１２】
本分野において専門家に周知の方法および専門家が使用する試薬は、それ自体は迅速診断方法に適用されない。例えば、シアン化合物は酸性環境において毒性の高い物質であるシアン化水素として放出されるので、シアン化鉄法は糖類の迅速な分析に適さない。いくつかの方法は室温で機能しないおそれがあり（例えばＤＮＳ法またはヤーヌスグリーンＢ）、安定性に乏しいおそれもある（例えば酵素を要する方法、シッフ試薬およびアセタール形成試薬）。いくつかの方法はまた高い酸性またはアルカリ性条件を要する。
【００１３】
よって、表面上の炭水化物を測定するための迅速かつ鋭敏な検査への要望がある。とりわけ、温度を上昇させることなく行なうことができる検査が必要とされている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、試料中の分析物の存在または量を測定する方法であって、
該試料をファブリックに適用すること；
該試料中に分析物が存在する場合に該分析物を化学的に修飾すること；
該化学的に修飾された分析物の存在または量を検出すること
を含む方法に関する。
【００１５】
１つの実施態様では、例えば試薬などの分析物を化学的に修飾する手段は、試料がファブリックに適用される前にファブリック上に存在する。好ましくは、試薬はファブリック上に印刷されるか、別な方法でファブリック上に配置される、またはファブリックに吸収されるか結合される。
【００１６】
本発明の１つの実施態様では、方法はさらに化学的に修飾された分析物の検出を妨げる薬剤を不活化することを含む。好ましくは、化学修飾および干渉薬剤の不活化は、化学的に修飾された分析物を検出する前に実施される。この実施態様によれば、例えば薬剤、試薬、試料中に存在する組成物または物質、ファブリックに塗布されるかアッセイの処置中に形成されるアッセイ試薬などの試料または干渉物はすべて、たとえば中和により、または沈殿によりその活動を妨げることによる不活化に対する対象物となる可能性がある。１つの実施態様では、干渉薬剤を不活化する手段は、試料がファブリックに適用される前にファブリック上に存在する。これらの手段は、ファブリック上に印刷されるか、別な方法でファブリック上に配置されるか、またはファブリックに吸収されるか結合される。１つの実施態様では、分析物を化学的に修飾する手段および干渉薬剤を不活性化する手段の両方が、試料がファブリックに適用される前にファブリック上に存在する。
【００１７】
本発明はまた、上記の方法を実行するのに適した検査装置を提供し、この装置は分析物を化学的に修飾する手段、化学的に修飾された分析物の薬剤を検出する手段および任意には干渉薬剤を不活化する手段を担持するファブリックを含む。１つの実施態様によれば、前述の手段は、好ましくは装置が使用される際に、試料が連続した順番でこれらの部分を通って移動できるように、例えば領域（region）、帯域（zone）または区画（section）として連続的に塗布または印刷される。
【００１８】
本発明は、試料における分析物の存在または量を測定するためのキットであって、ファブリック材料；化学的に修飾する薬剤によって分析物を修飾するための手段；干渉試薬を不活化するための手段；および化学的に修飾された分析物を検出する手段を含む検査装置を含むキットをさらに提供する。
【００１９】
さらに、本発明はロール−ツー−ロール印刷方式に関し、この方法では試薬および前述の手段はファブリック上の特定の場所に、連続的に印刷される。
【００２０】
１つの実施態様では分析物は炭水化物である。またある実施形態では炭水化物は糖である。好ましくは、糖はフルクトース、デキストリン、ラクトース、マルトースおよび／またはスクロースを含む。
【００２１】
本発明は試料をファブリックに適用することにより室温で行われる非酵素法を含む、試料中の糖を測定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】水分吸収（moisture-absorbing）ファブリック法の構造的原理。
【図２】異なるファブリックの領域に存在する試薬を示している、糖検査に適したファブリックの具体的な例。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、試料中の分析物を化学的に再構築または修飾することができ、そして任意には干渉試薬または薬剤および／またはアッセイ中に形成された生成物をアッセイ中に不活化できるような方法で試料を分析するための方法、装置およびキットに関する。
【００２４】
この方法は、安定な分析物または試料中に見られる形では測定が困難な分析物の測定に広く適用できる。本発明の方法は、試料中の炭水化物、とりわけ糖類の存在を測定するのに特に適している。
【００２５】
本発明は、水分吸収ファブリック法を用いる試料中の糖類の検出に関する。この方法は反応温度を上昇させることなく実施することができる。また本発明は、この方法において使用するためのファブリック含有装置に関する。装置の製造において、アッセイで使用される化学物質は従来の印刷技術を用いてファブリック上に移され得る。製造に適する方法は、国際公開第２００６／１２２７３３号パンフレットに詳細に開示されており、これは参照によって本明細書に組み込まれる。プラスチック膜の間にファブリックを層状にすることにより、液体がファブリックに沿って迅速に移動することが可能となる。しかしながら、この製造手順は、再構築する薬剤、不活化する薬剤および一般的なアッセイ試薬が適用される場所が明らかに異なるため、より複雑で困難なことから、国際公開第２００６／１２２７３３号パンフレットに開示される手順とは異なる。本発明の方法および装置は迅速検査として実用的である。迅速検査に関する基本的な要件は、単純さ、感度、特異性、安全性、使いやすさ、廃棄可能性および印刷技術を用いた工業生産に対する適合性である。
【００２６】
本発明の検査は任意の適切な分析物に適用され得るが、便宜上、以下の記述では分析物が炭水化物である実施態様を詳細に論じる。本発明の検査は炭水化物、とりわけフルクトース（果糖）、デキストリン、ラクトース（乳糖）、マルトース（麦芽糖）およびスクロース（グラニュー糖）などの糖類を、好ましくは視覚的な色の変化を用いて測定するために使用され得る。従来の方法を活用すると、フルクトースが最も測定しやすい一方で、スクロースおよびデンプンは測定が最も困難である。スクロースおよびデンプンは、他の前述した糖類よりも還元力がかなり低いので、測定するのが最も困難である。本発明は、スクロースなどの中性糖類の存在を含む、１５０μｇの糖類の存在を検出することができる。
【００２７】
衛生状態を評価するために、指示検査は実際には主に定性的なものであり、所定の感度範囲内で試料中の糖の存在を示す。本発明は検出限界が１ｇ／ｌの感度まで炭水化物、とりわけ糖類の存在を示すことができる。これは、１０×１０ｃｍ２の表面から採取された５００μｌの試料中で５００μｇの糖類を検出する能力に相当する。糖類に対する検出限界は（同様の単位を使用する場合）、好ましくは０．５ｇ／ｌ（２５０μｇ）、より好ましくは０．２ｇ／ｌ（１００μｇ）、０．１ｇ／ｌ（５０μｇ）、０．０５ｇ／ｌ（２５μｇ）、０．０２ｇ／ｌ（１０μｇ）または０．０１ｇ／ｌ（５μｇ）である。
【００２８】
本発明は、例えば病院、診療所、実験室、食品産業、乳製品工場、製パン所、醸造所および飲料産業において、衛生状態を測定する単純かつ安価な装置を可能にする。
【００２９】
「炭水化物」とは、炭素、酸素および水素を含む化合物であり、好ましくは糖である。
【００３０】
「糖」とは、水溶性の単糖類、オリゴ糖類または多糖類である。
【００３１】
ファブリック上での連続的な反応が本発明の方法を実行するために使用され得る。簡潔には、試料はあらかじめ定められた特定の順番で、所望の化学物質と反応するためにファブリックへ導入される。
【００３２】
試料は、通常は検査されるべき表面上をファブリックでふき取ることによりそのファブリックに導入される。他の実施態様もまた考えられる。例えば、ファブリックは検査される表面に置かれる場合もあれば、検査場所から採取された液体試料が例えばピペットまたは同様の移動手段を用いてファブリックに導入される場合もある。表面および／またはファブリックはそれらが接触する前に処理され得る。例えば、それらのうちの１つ（好ましくは表面）は、液体試料の提供を補助するために水溶液で濡らされ得る。水溶液は例えば噴霧または洗浄液として利用され得る。これは、検査される表面が乾燥しているか、またはそれ自体が適当な液体試料を生むのに充分な水分を有していない場合に特に望ましい。水溶液は、一般的には水または例えば緩衝剤のようなアッセイを実施する上で有益な物質を含む溶液である。
【００３３】
緩衝剤は、分析物を修飾するためまたは修飾された分析物を検出するために用いられる化学的作用を妨害する化合物を含むべきではない。例えば、分析物が炭水化物の場合、化学修飾は一般的に酸化であり、検出工程は一般的に、正の結果を可視的に示す色を有する金属錯体の使用を伴う。この実施態様において、水溶液から好適に取り除かれるべき干渉試薬は、銅と錯体を形成するヨウ素酸塩およびリン酸塩、ならびに酸化を干渉する炭水化物と錯体を形成するホウ酸およびホウ酸塩を含むがこれらに制限されるものではない。緩衝液は第一級、第二級および第三級アルコールを含み得るが、ジアルコール、トリアルコールなどの多価アルコールは好ましくない。また水溶液は、デンプンまたは検査装置中での移動がクロマトグラフィの分離によりさらに制限されるその他の多糖類を検出するためにヨウ素やＫＩなどの安定化剤を含み得る。
【００３４】
適当な水溶液は、ＡＣＳまたはプロアナリシスのグレードに従って調製された緩衝剤である。当該水溶液はまた金属カチオン不純物を低い含量で有するべきである。好適には０．００２％以下または０．００１％以下の鉄を有する。好ましくは、鉛のような重金属を１０ｐｐｍ以下または５ｐｐｍ以下で含む。より好適には、水溶液中の金属カオチン不純物の含有量は低ければ低いほどよい。
【００３５】
一度液体試料がファブリックへ誘導されると、最初の工程は一般的には炭水化物を化学的に修飾することである。該炭水化物が糖である場合、好適には室温での測定を可能にするような方法で再構築または修飾される。ある実施形態では、糖類は糖の環構造におけるおよびモノマー間のエーテル結合を開くことでより反応性にされ、それに続く酸化過程ではアルデヒド基の数が増加される。炭水化物を化学的に修飾する手段は、試薬、例えば過ヨウ素酸もしくは過ヨウ素酸ナトリウムなどの過ヨウ素酸塩、またはセリウム（ＩＶ）塩など他の種類の化学化合物であってよい。このような化学的修飾手段は、好ましくは２つのヒドロキシル基間の炭水化物鎖を開裂させるのに充分な酸化電位を有する酸化剤であり、好ましくは無色である。
【００３６】
炭水化物をより簡単に検出できる形状へ修飾することに関して予期され、また本発明の方法および試験装置の基礎として使用され得るその他の反応には、以下のものが挙げられるがそれらに限定されるものではない。
・−ＯＨ基が弱酸によりα−型からβ−型へと変えられる、変旋光。
・糖−ＯＨおよびアルコール間の酸素架橋（エーテル）の酸触媒による生成。
・例えばＣｕ２＋などの弱い酸化剤の存在における、グルコン酸などのカルボン酸の生成。
・高温で強酸を用いる、グルクロン酸などのジカルボン酸の生成。
・ＮａＢＨ４による糖アルコールへの還元（エーテル環の切断およびヒドロキシル末端基の形成）。
・酢酸ナトリウムおよび無水酢酸が存在する場合の酢酸エステルの生成。
・例えば酸化銀およびヨウ化メチルなどの存在によるアルデヒドの生成。
【００３７】
分析物を、化学的に修飾された分析物を検出する前に化学的に修飾する方法は、以前はファブリック上で用いられなかった手順であると考えられる。本発明の方法では、試料と修飾または再構成手段とが出会い、好ましくは干渉薬剤が不活化され、所望の組成物または物質のみがファブリック材料中でさらに移動するべきである。
【００３８】
「干渉薬剤」は、もし化学的に修飾された分析物が検出される時に存在すれば、化学的に修飾された分析物の検出を妨害する物質である。干渉薬剤は試料中にもともと存在してもよく、分析物の化学的修飾由来の余分な試薬であり得、または例えば反応の生成物または副産物など、分析物を化学的に修飾する反応の結果として存在し得る。
【００３９】
分析物が炭水化物の場合、干渉薬剤の例としては、銅と錯体を形成するヨウ素酸塩およびリン酸塩、ならびに炭水化物の酸化を干渉する炭水化物と錯体を形成する傾向にあるホウ酸およびホウ塩酸などが挙げられる。また、金属カチオンのような還元薬剤は銅を還元することができるので、糖なしでも着色反応を導く。
【００４０】
干渉薬剤は化学的修飾が起こる際にファブリックの同じ領域で不活化されてもよく、化学的に修飾された分析物を含む試料が通過するファブリックの後ろの領域で不活化されてもよい。好ましくは、不活化は後ろの領域で起こる。また不活化は化学的に修飾された分析物が検出される前に起こる。
【００４１】
化学的に修飾された分析物は、その後検出される。分析物が炭水化物の場合、検出は好ましくはＢＣＡアッセイを用いて実行される。ＢＣＡ法では、Ｃｕ２＋がアルカリ煮沸下で糖を酸化させる。酒石酸は、水酸化銅の沈殿の形成を防止するＣｕ２＋に対する錯化剤として用いられる。この過程でＣｕ２＋はビシンコニン酸と反応するＣｕ＋へと還元され、糖の存在によるものと考えられる有色錯体を形成する。
【００４２】
ＢＣＡ法はインキュベーションを用いる一方で微小な量の還元銅でもＢＣＡ錯体として検出でき、用いられる試薬はファブリック上の安定した化合物中で凝固するように導かれ得る。
【００４３】
例えば天然のセルロースおよびビスコースに基づくファブリックは、炭水化物を検出するために用いられる場合に偽陽性を生じさせやすいので、好適なファブリックは合成ファブリックである。用いられ得る合成ファブリックは、セルロース−およびビスコース−不含ファブリック、ポリエステルファブリック、ポリエタン、ポリアミドファブリック、ポリプロピレンファブリック、塩化ポリビニルファブリックおよびそれらの組み合わせを含む。１つの実施態様では、ファブリックはポリエステルファブリックである。
【００４４】
本明細書で使用される「ファブリック」という用語は、液体試料を吸収できかつ毛細管現象により該試料を移動または担持できるあらゆる材料を含むものとして定義される。一般的に用いられる用語は、「マトリックス」であり、相当する性質を有する材料である。「修飾する」という用語は、再構成も意味するものとして使用され定義される。「領域」という用語は、例えば多段階検査の「帯域（zone）」「相（phase）」「エリア（area）」「区画（section）」も意味するものとして使用され定義される。「拭き取り（wiping）」という用語は「掃きよせ（sweeping）」も意味するものとして使用され定義される。拭き取りの間、ファブリックは表面から液体を吸収する。「物（product）」という用語は、あらゆる薬剤、試薬、組成物または物質を意味するものとして使用され定義される。
【００４５】
本発明のある実施態様では、ＢＣＡ法がファブリック上で機能するように適用される。適切な装置の製造において、液状の化学物質はファブリック状に印刷されそこで乾燥する。固体状では、化学物質はファブリックに沿って移動することもなければ、蒸発によって希釈されることもなく、液状における安定性に比べて安定性が改善する。本発明の迅速な診断検査は、色の変化を引き起こす反応に基づいて表面上の糖類の検出を可能にし、上記の検査に関連する問題として説明されている欠点を排除する。本発明の検査装置は使い捨てで、ロール−ツー−ロール印刷法を用いて製造でき、コストを低く抑える。検査の実行は簡単であり、特別な訓練を要しない。さらに、含まれる化学物質は日々使用するのに安全なものである。
【００４６】
糖類を測定して表示するための利用可能な方法はいくつか存在し、これらの検査は上記序章において論じた。文献に見られる方法はＢＣＡおよび様々な指示薬を含む。これらの方法は検査の成功に関する好ましい要件の１つを満たす。つまり、これらは室温で色の変化を生じさせる。欠点は、それらは高い糖濃度を必要とするが、熱触媒作用によって表示される量はごく僅かであるということである。しかしながら、文献で論じられている性質は、ファブリックを用いて直接使用できる方法には充分でない。本発明はこれらの問題および加熱の必要性を排除する一方で、その検査は低い糖濃度でも測定するのに充分敏感である。本発明は試験管方法の条件をファブリック上に創設することを可能にし、湿った表面からファブリックへと移動させられた試料が糖を含んでいる場合、色の変化を受けるようにする。
【００４７】
本発明によると、その試験方法に使用される試薬は、印刷することによりファブリックへ移動させられた。印刷は検査装置の製造コストに効果的である上、印刷エリア全体に渡る均質な試薬濃度を確実にする。最も一般的なロール−ツー−ロール印刷法は凸版印刷、グラビア印刷、オフセット印刷およびシルクスクリーン印刷を含み、またいくつかの応用法ではインクジェット法も含む。
【００４８】
グラビア印刷が本発明の印刷方法として好適である。しかしながら当業者にとっては、わずかな修正を伴うことで他の印刷方法も使用でき得るということは明白であろう。グラビア印刷は、有意に異なる流体力学的性質を有するインクの使用を可能とする、インク移動の手順の単純さ、ならびにその方法の良好な化学移動および化学物質耐性ゆえに好ましい。実施例においては、印刷はテーブルトップの試験印刷機を用いて行われた。
【００４９】
吸湿性のファブリックを検査することは、液体試料を含有する糖を充分な量で清浄な表面へと適用することを伴った。ファブリックの端は、液体試料が指示エリアに到達するまで試料と接触した状態のままにされた。
【００５０】
全ての方法は、フルクトース、デキストリン、ラクトース、マルトースおよびスクロースと共に検査され、スクロースは還元糖というよりも中性である。
【実施例】
【００５１】
実施例１
生物学的ファブリックおよび合成ファブリックの両方を試験した。初期段階では、セルロースおよびビスコース、つまり糖のような群を含む生物学的なファブリックは、その糖様の機能がゼロ試料にも検査中の色の変化を引き起こすので、使用に適していないと考えられていた。それゆえ、合成のセルロースおよびビスコース不含ファブリックも検査され、ゼロ試料での色の変化は観測されなかった。検査された合成ファブリックから、疎水性の性質が少ないという理由でポリエステルファブリックがポリプロパンよりも好都合であるということが見出された。
【００５２】
実験の間、糖類検出のために用いられたヴァーフェンシュミット（Waffenschmidt）またはスミス（Smith）プロトコルは以下の通りである（Smithら、Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid, 1985, 150, 76-85; Waffenschmidtら、Anal. Biochem. 1987, 165, 337-340）。
【００５３】
ＢＣＡ法を用いる還元糖検出のための、ヴァーフェンシュミットらのプロトコル：
溶液組成
溶液Ａ
・ＢＣＡ  ９７１ｍｇ
・Ｎａ２ＣＯ３×Ｈ２Ｏ  ３１．７５ｇ
・ＮａＨＣＯ３  １２．１ｇ
・ａｄ．Ｈ２Ｏ  ５００ｍｌ
溶液Ｂ
・ＣｕＳＯ２×５Ｈ２Ｏ  ６２４ｍｇ
・Ｌ−セリン  ６３１ｍｇ
・ａｄ．Ｈ２Ｏ  ５００ｍｌ
【００５４】
溶液は通常１：１で混合される。
【００５５】
糖試料は溶液ＡおよびＢの混合物１ｍｌと混合される。この糖含有混合物は１００℃の加熱ブロックで１５分間保持される。約２０分で室温まで冷ました後、吸光度は５６０ｎｍで記録される。
【００５６】
還元単糖類の検出限界は約５ｎｍｏｌである。グルコース５ｎｍｏｌとは約０．９μｇである。
【００５７】
ＢＣＡ法を用いるタンパク質の検出のための、スミスらのプロトコル中で用いられる溶液組成は表３．１に示される。
【００５８】
【表１】
2011514516.tif 000002
【００５９】
溶液ＡおよびＢは通常５０：１の割合で混合される。
【００６０】
試料溶液および溶液ＡおよびＢの混合物はそれぞれ１：２０の割合で混合される。検出の時間制限が狭い場合およびタンパク質が微小な量しか残らない場合、混合物はインキュベートされる。
【００６１】
吸光度は分光光度計を用いて測定された。異なる時間およびインキュベーション温度が用いられる場合、同様の吸光度の読み取りが達成される。これは表３．２で表される。
【００６２】
【表２】
2011514516.tif 000003
【００６３】
スミスプロトコルはタンパク質の分析を意図するものだが、還元糖の検出にも用いることができる。これは、還元糖（グルコース）の干渉効果が存在する表３．３で示される。
【００６４】
【表３】
2011514516.tif 000004
【００６５】
「ウォーターブランク補正（water blank correction）」では、すべての試薬がブランク中に存在し、かつ試料とブランクの量を同一に維持するために試料の量と同じ量の純水を足される。ブランクの吸光度が記録され、吸光量が試料の吸光度から差し引かれ、汚染物質、試薬、実験器具などにより生じる吸光度を是正する。
【００６６】
「干渉ブランク補正（interference blank correction）」は、「ウォーターブランク補正」と同様であるが、ブランクは試料中と同量の干渉薬剤も含む。したがって、干渉薬剤、汚染物質、試薬、実験器具などにより生じる吸光度を、試料から差し引くことができる。
【００６７】
スミスプロトコルによる実験において用いられるＢＣＡ試薬の組成物は表３．１に列挙される。試験管法では、試薬は５０Ａ：１Ｂの割合で混合され、その後試料がインキュベートされた。
【００６８】
ＢＣＡ方法で用いられる化学物質は、プレーン（plain）上に移動させられ、異なる緩衝剤がテーブルトップの試験印刷機を用いてファブリックに塗られた。種々のファブリックエリア、ｐＨ値およびＢＣＡ化学物質の組み合わせのエリアが試験され、さらなる開発研究のための基礎を築いた。検査観測およびそれらに関する説明は表３．４に記載される。
【００６９】
【表４】
2011514516.tif 000005
【００７０】
ＢＣＡ法は、ファブリック上に試験管法の最適な条件を作り出す目的でさらに開発された。生物学的ファブリックは陰性対照反応における陽性の結果により適していないことが判明したので、ポリエステルファブリックを基体として選択した。これは、ポリエステルファブリックが正しくない対照反応を起こす還元基を含まないためである。
【００７１】
緩衝剤およびｐＨの影響を調べるために、ファブリックをｐＨ１０．２で、０．１Ｍの炭酸塩緩衝剤で洗浄し、その結果をｐＨ４．７の酢酸塩緩衝剤と比較した。ＢＣＡ試薬溶液は、炭酸ナトリウム緩衝剤で洗浄されたファブリック上に、Ａ＋１／２Ｂの割合、つまり溶液Ｂが印刷の前に水により半分の濃さまで薄められた状態で印刷された。溶液Ａが初めに印刷され、印刷部が乾燥すると１／２の溶液Ｂが添加された。表３．１は希釈前の溶液組成を記載する。
【００７２】
初期の検査では、ｐＨ４．７の酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄したファブリック上でのフルクトースに対する検出限界は５ｇ／ｌであった。他の検査された糖類は色の変化を起こさなかった。ｐＨ１０．２の炭酸塩緩衝液はフルクトースの検出限界を１ｇ／ｌまで低くしたが、他の糖類はそれでも色の変化を起こさなかった。
【００７３】
試験管法の分析は試料のインキュベーションを含むので、ファブリック法に対する熱の影響を、湿ったファブリックを糖類と共に８０℃のオーブンに３０分間置くことで検査した。熱の効果はファブリックにおいても明白であり、フルクトースの検出限界は０．０５ｇ／ｌであったが、変色反応は他の糖類には観測されなかった。
【００７４】
銅錯化剤は方法の１要素であるので、検査の能力改善を試みるために、様々な錯化剤が検査された。以前の検査においては酒石酸ナトリウムがＣｕ２＋の錯化剤として用いられたが、現在はヴァーフェンシュミットが、Ｌ−セリンが酒石酸ナトリウムよりも効果的な銅の錯化剤になるということを発見したので、Ｌ−セリンに置き換えられた。
【００７５】
以下の検査は、ヴァーフェンシュミットの試薬組成に基づくものであった（Waffenschmidtら、前記）。ファブリックは同じ炭酸塩緩衝剤により処理され、化学物質は以前の検査と同様の方法でファブリック上に印刷された。２種類の異なる試薬割合、Ａ＋ＢおよびＡ＋１／２Ｂが印刷に用いられた。表３．５は溶液ＡおよびＢの組成を示す。
【００７６】
【表５】
2011514516.tif 000006
【００７７】
糖類がファブリック上で検査された場合、水とのゼロ反応は強く、ファブリックは２週間以内で自発的に紫へと変わった。Ｌ−セリンはＣｕ２＋をキレート化し、徐々にＣｕへと還元させると考えられており、その後強く着色されたＢＣＡの銅錯体を形成した。それゆえ、さらなる研究開発においてはヴァーフェンシュミットプロトコルよりもスミスプロトコルの方が好まれると思われる。
【００７８】
上記の検査に基づいて、正しいｐＨ値、緩衝液および錯化剤はその方法に充分な感度を与えるものではないということが認識された。ＢＣＡ法を用いた糖類検出を改善するのに適切な触媒は、この文献からは特定できなかった。
【００７９】
銅の酸化力はＢＣＡ法においてある役割を果たす。このことおよび上記の結果および結論に基づいて、銅よりも強力な酸化剤を見つける試みがなされた。本発明によれば、適切な変色指示薬を用いて酸化剤の還元を検出することが可能である。
【００８０】
しかしながら、より強力な酸化剤を採用することは、いくつかの問題を引き起こした。物質の酸化力が増加するにつれて、その物質の毒性およびほかの物質への反応性も増加する。反応性はいくつかの物質に対して自発的な分解または還元を引き起こし、検査の安定性および機能を弱める。
【００８１】
そこで、本発明者らは、色の変化に基づく方法を用いて糖類をより検出しやすくするような方法で、糖類そのものを修飾または再構成し得ることがわかった。したがって、本発明者らは、糖類に含まれるアルデヒド基の数を増加させる目的で糖類を酸化させることを試みた。なぜなら銅還元に基づく方法において、銅ととりわけ反応するのがアルデヒド基だからである。
【００８２】
糖類の酸化に適した３つの化学物質が文献から特定された。それらは過ヨウ素酸、過ヨウ素酸ナトリウムおよびデス・マーティン（Dess-Martin）過ヨウ素酸塩であり、アルデヒド基を増加させるような方法で糖類を酸化する。後述のように、本発明者らは、アルデヒド基の数の増加がこの方法の検出限界を低くすることを見出しており、低い還元力を有する糖類および中性の糖類も検出することを可能にした。
【００８３】
実施例２
試験管法において表３．１に列挙された糖、過ヨウ素酸ナトリウムおよびＢＣＡ試薬は、所定の手順で試験管に加えられた。糖を含む試験管は室温で５分以内に色が変化したが、ゼロ反応（陰性対照）は５分より後に生じた。ＢＣＡ法が今や室温でも機能的であり、中性の糖類でさえも色の変化を起こすことから、この検査は重大な進歩を証明した。ゼロ反応はＢＣＡ試薬に含まれる酒石酸ナトリウムによるものであった。
【００８４】
酒石酸ナトリウムの影響が、表３．１に示されるＢＣＡ混合液の溶液Ａを酒石酸ナトリウムなしで調製することにより調べられた。試験管法において、全ての糖類が色の変化を起こすことができなかった。これは酒石酸ナトリウムの酸化作用によるものである可能性があり、この場合、銅は糖類により還元されるが、酒石酸ナトリウムにより再度酸化される（Ｃｕ＋→Ｃｕ２＋）。
【００８５】
ファブリックを用いるＢＣＡ法の一部として、酒石酸ナトリウムが検査された。ＢＣＡ試薬は前の検査と同様の方法でファブリック上に印刷され、酒石酸ナトリウムは最後に加えられた。これは陰性対照試料と糖含有試料の間の明白な時間制限を確立するためであった。
【００８６】
結果に基づいて、酒石酸ナトリウムは検査の感度を増強するために用いられるだけでなく、糖に誘導される色の変化が３０〜４０分後にファブリック上で観察されるように方法を干渉することが結論付けられた。それゆえ、糖を再構成または修飾した後に、酒石酸ナトリウムを中和および／または不活化する方法が必要とされた。
【００８７】
実施例３
本発明者らの先行試験の結果および本発明者らの発明の問題解決により、連続して反応するような化学物質を含む多段階検査、つまり多領域または多帯域検査を採用するに至った。毛細管作用により試料溶液がファブリックに流れ、ファブリック上の特定エリアに印刷されている化学物質と反応する。
【００８８】
検査概念においては、調査された表面にある糖の不純物は、必要な化学物質を含有する吸湿性のファブリックを通して運ばれる。ファブリックにおいて、液体試料中の糖類は所定の順番で化学物質と反応する。ゆえに実施例２に記載されているように、通常反応を阻害したりまたはゼロ反応を起こしたりする反応性の化学物質でも、試薬として用いられ得る。なぜなら、その反応性の化学物質はＢＣＡ分析物の指示エリアの前に不活化することができるからである。したがって、本発明の構成および不活化が活用される場合、上記の試験管法で用いられる試薬は、迅速な多段階検査におけるファブリック材料上に用いられ得る。
【００８９】
初期の試験管方法では、酒石酸ナトリウムは室温でのＢＣＡ方法を促進することが見出された。問題は、数分後に陰性試料で陽性の検査結果が生じること、および方法をファブリックにより機能させる困難性であった。本発明者らは、付加的な工程を含むことで方法が改善され得ることを認識した。
【００９０】
糖類の環構造およびモノマー間の結合はエーテル結合を含むということが知られている。このエーテル結合を開くことは糖の酒石酸ナトリウムとの反応、さらには銅との反応を促進する。ハロゲン酸、ヨウ化水素および臭化水素、または低いｐＨ値がエーテル結合の破壊に用いられ得る（Claydenら、Organic Chemistry, OUP 201, p.434）。ハロゲン化水素は固体状でファブリック上に固定できないので、直接的には使用できない。
【００９１】
糖類のエーテル結合は酸性条件において破壊され、この状態は硫酸を用いる試験管法の検査で達成された。次に、糖類は酒石酸ナトリウムで酸化され、過剰量の酒石酸ナトリウムはチオ硫酸ナトリウムで中和された。溶液はＢＣＡ試薬を加える前に水酸化ナトリウムで中和された。化学量論比が、化学物質の濃度を最適化するための開始時点として使用され、結果表４．１に示される濃度に帰着した。
【００９２】
【表６】
2011514516.tif 000007
【００９３】
上述の方法はスクロースで色の変化を生じ、ゼロ試料（陰性対照）は試験管法の検査において２４分後に色が変化した。
【００９４】
本発明者らの発明の洞察によると、糖類の反応性は多段階工程において増加する可能性があり、それらの測定を妨害する試薬は、試料中の分析物の指示前に不活化され得る。
【００９５】
ファブリック検査が展開する間に、化学物質はファブリック上に印刷され、その後ファブリックはストリップへと切断された。ストリップは連続したファブリックと同様の構造を形成するよう並行して置かれ、プラスチックの膜の間に層状にされた。当初の選択は酢酸セルロースプラスチックであったが、親水性の性質により、液体がプラスチックとファブリックの界面で移動した。この問題は、試料液をファブリック中に保持する疎水性のプラスチックを用いることで解決された。図１は、吸湿性のファブリックによる方法の構造の一例を描く。種々の試薬を含有するファブリックの種々の領域が存在する場合もある。図１の種々の色は、潜在的な試薬エリアを描く。
【００９６】
したがって、ファブリック材料を含む検査装置が提供され、ファブリックは、一続きのファブリックを形成するために連続して結び付けられた一連の別個のストリップか、一枚のファブリックのいずれかを含む。別個のストリップはそれぞれ少なくとも１つの試薬を含み、好適には１つ試薬のみであり、一方で、一枚のファブリックは所定および連続した順番でファブリック上に提供された１つより多くの試薬を含む。このファブリック材料は２枚の不浸透性の層によって層状にされ、不浸透性の層のうち１枚は少なくとも１つの開口部、好適には複数の開口部を有する。開口部の形状は円形、三角形、四角形、正方形または同様のいかなる形状でもよい。開口部の大きさは０．０１ｍｍの穿孔から２ｃｍより大きいものまで変化し得るが、開口部が単一の場合、開口部の大きさは２ｃｍ以上である。ファブリック材料中の液体の毛細管移動を容易にするために、不浸透性の部材は通常疎水性の材料で作られる。適切な材料は不織ポリプロピレン材料を含む。
【００９７】
また、装置は少なくとも１つのサンプリング開口部を含む形式を提供し得る。この開口部は透明または不透明な不浸透性の層によって層状にされた一連の試薬帯域を含む通路へ続き、不浸透性の層は、少なくとも１つの層状にされていない開口部または検査指示領域を含む透明な積層で終結する。
【００９８】
明らかに、拭き取りまたは吸収検査装置は、例えば試料が検査され、干渉試薬を不活化するように修正するなど、本発明の原理を活かすことが可能なあらゆる形状を有し得る。例えば装置の片側、例えば試料を拭き取ったり吸収したりするエリアと同一または反対側の面に、検査指示領域を有することも可能である。
【００９９】
前述のように本発明は好適には一層のファブリックの、例えば連続的に異なる帯域へ塗布された試薬を含む側方流動の検査形式に関する。このような側方流動検査が様々な設計ならびに技術的および方法論的なアプローチを含むことは、当業者にとっては明白である。
【０１００】
装置は任意的に、試料を通過させる一方で試薬または試料の逆流を制限するファブリック材料の層を含み得る。この層はしばしば半浸透性の層とも呼ばれる。例えば、半浸透性の層は疎水性の材料で作られ得る。適切な疎水性材料は不織ポリプロピレン材料である。
【０１０１】
試験管法で用いられる酒石酸ナトリウム・チオ硫酸ナトリウム法は、テーブルトップの試験印刷機で、別々のファブリック上にそれぞれの試薬を印刷することでファブリックに移される。多段階検査の目的は酸性条件で糖の環を破壊し、酒石酸ナトリウムで糖鎖を、還元アルデヒド基を含有する短い炭素鎖へと酸化することである。ＢＣＡ方法を干渉する過剰量の酒石酸ナトリウムは、指示の前にチオ硫酸ナトリウムで中和され、結果として生じるアルデヒド基を含有する炭素鎖により銅が還元され、強力な吸収性錯体が形成される。
【０１０２】
用いられたファブリックは、０．１Ｍの炭酸塩緩衝剤によりｐＨ１０．２で前処理されたポリエステルファブリックであった。ＢＣＡ試薬はＡ＋１／２Ｂの割合で、前処理されたファブリックに印刷された。他の試薬は、前処理されていないファブリックに塗布された。
【０１０３】
検査の間、少量の過剰なチオ硫酸ナトリウムがゼロ反応を引き起こすので、酒石酸ナトリウムを中和するチオ硫酸ナトリウムをファブリック上に含む方法を用いることは好ましくない。さらに、この方法に伴う検出限界は高いので、１ｇ／ｌ未満の濃度を有する糖溶液は、可視的な色の変化を起こさなかった。チオ硫酸ナトリウムの代わりに硫酸第一鉄を用いることが好ましい。硫酸第一鉄は過ヨウ素酸塩をヨウ素酸塩へ還元し、同時に三価第二鉄イオンへと酸化する。
【０１０４】
７２ｇ／ｌの濃度の硫酸鉄（II）（ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ）、１１．３ｇ／ｌの濃度の過ヨウ素酸ナトリウム、０．１Ｍの濃度の硫酸およびＡ＋１／２ＢのＢＣＡ試薬が、別々のファブリック上に印刷された。それらは、最初に硫酸、次に過ヨウ素酸ナトリウム、最後に硫酸第一鉄となるような単一の構造へと積層された。これに反応エリアとして清浄なファブリックストリップが続き、その後ＢＣＡ試薬が続く。試料がファブリックに沿って移動すると、以下に示す反応系列の発生が予測される（Waffenschmidtら、前記; Claydenら、Organic Chemistry, OLIP 2001, 146, 344, 1369; Caldwellら、J. Biol. Chem. 1938, 123, 595-606）。
【０１０５】
【化１】
2011514516.tif 000008
【０１０６】
第一段階において環構造は硫酸により開環される。次の段階で過ヨウ素酸塩がジオールを切断し、糖類をアルデヒドへと酸化する。過ヨウ素塩酸は硫酸第一鉄により中和され、最終段階において銅が形成されたアルデヒドにより還元され、ＢＣＡとの着色錯体が形成される。
【０１０７】
試料がファブリックに沿って移動すると、硫酸第一鉄は指示エリアまで運ばれ偽陽性反応を引き起こすことが分かった。これは、銅と反応する二価の鉄によるものであり、鉄の酸化および銅の還元、Ｆｅ２＋＋Ｃｕ２＋→Ｆｅ３＋＋Ｃｕ＋となる。硫酸第一鉄は過ヨウ素酸ナトリウムによって完全に酸化され、かつゼロ反応を引き起こさないように、適切な量で存在するべきである。三価鉄はもはや銅と反応しないが、その赤褐色が、形成されたＢＣＡ銅錯体の紫色を覆う可能性があるため、指示エリアに運ばれたものは検出限界を弱める。
【０１０８】
炭酸塩緩衝剤の帯域は、鉄が指示エリアへ運ばれることを防ぐために挿入された。ファブリックは０．１Ｍの炭酸塩緩衝剤とｐＨ１０．２で塗られ、摂氏６０度の炉の中で乾燥された。炭酸塩層は硫酸第一鉄の後ろかつ指示エリアの前に置かれた。鉄は、アルカリ性の炭酸塩層において炭酸イオンおよび水酸化物イオンと反応して、以下に示す化合物を形成する（Smithら、前記）。
【０１０９】
Ｆｅ２＋＋ＣＯ３２−→ＦｅＣＯ３
Ｆｅ２＋＋２ＯＨ−→Ｆｅ（ＯＨ）２
Ｆｅ３＋＋３ＯＨ−→Ｆｅ（ＯＨ）３
可溶性である代わりに、現れた鉄化合物の析出物はファブリック上で蓄積する化合物の移動を止める。
【０１１０】
結果として生じる検査は機能的で、糖を含有する試料で反応が得られたが、一方で陰性対照試料は無色のままであった。この方法の検出限界は０．５ｇ／ｌであった。ファブリック上における糖検査の、機能的な検査の概念作用の一例は図２に示されており、１.拭き取りエリア、２．硫酸、３．過ヨウ素酸ナトリウム、４.硫酸第一鉄、５．炭酸塩緩衝剤、および６．Ａ＋１／２ＢのＢＣＡを含む。過ヨウ素酸ナトリウムおよび硫酸の層は、過ヨウ素酸により置き換えられ得るということが留意されるべきである。
【０１１１】
一般的に本発明で記載される方法は、一枚のファブリック上に化学物質を並べて印刷すること、または種々のファブリック上にそれぞれ印刷することを含み、種々のファブリックは一続きのファブリック構造を形成するために並べて層状にされる。検査はファブリック中の別々のストリップから収集されたので、これらの層は検査が展開する間も存続できた。しかしながら、一続きの一片のファブリックがロール−ツー−ロールの大量生産で用いられ、ファブリックの部分を炭酸塩緩衝剤で洗浄することを実際問題として困難にするだろう。それゆえ、必要とされる量の炭酸塩緩衝剤が印刷によって移されなければならない。１モル濃度の炭酸塩緩衝剤が指示エリアに印刷された。鉄が析出する場所のファブリック上にある炭酸塩緩衝剤の量は、例えば溶液をｐＨ１０．２に飽和させるなど、炭酸塩緩衝液のモル濃度を増加させることで増幅され得る。溶液は、２４．９ｍｌ／ｍ２の容量を移動できる印刷シリンダーを用いてファブリック上に二度印刷された。印刷されたエリアにおいて、鉄は炭酸塩として析出し、試料液と共に移動することが阻止されるので、これにより、硫酸第一鉄の量を最適化する必要はなくなる。緩衝液のモル濃度を調節すること、および印刷シリンダーにおける網目の大きさおよびカップの深さを変更することにより、移される試薬の量を管理することができる。
【０１１２】
前述のように、化学物質の量は、過ヨウ素塩酸ナトリウムをオルト過ヨウ素酸Ｈ５IＯ６（ＨＩＯ４×２Ｈ２Ｏ）で置き換えることでさらに軽減され得る（Masudaら、J. Org. Chem. 1994, 59, 5550-5555）。オルト過ヨウ素酸は固体状で利用可能であり、ファブリック上で安定である。オルト過ヨウ素酸のｐＫＡ値は１．６４なので、オルト過ヨウ素酸もまた糖の環の開環において弱い硫酸に置き換わる。
【０１１３】
検査の感度を強化するために、ファブリック上のＢＣＡ試薬の比率はさらに最適化された。試験管法において、溶液Ａおよび溶液Ｂは５０：１の比率で一緒に混合された。１：１（Ａ＋Ｂ）および２：１（Ａ＋１／２Ｂ）という著しく高い比率は、試薬をファブリック上に印刷する場合に用いられた。この場合、銅の青色が紫色のＢＣＡ錯体の観測を干渉した。銅溶液は水で１：１０（１／１０Ｂ）まで希釈された。銅の量を減少させることは検出限界を低くし、以前用いられていた０．５ｇ／ｌの糖溶液に代わって０．１ｇ／ｌの糖溶液の色の変化が検出され得る。
【０１１４】
実施例４
ある実施態様において、室温で糖を検出するための検査装置は、５つの異なる領域およびそれらのエリア上に印刷された５つの異なる化学物質および／または試薬液を含有した。第１のエリアについては、化学物質を含有しない掃引または吸引領域である。その後液体試料は、印刷されたオルト過ヨウ素酸を含有するエリアへと移動し、そこで糖の環構造およびモノマー間のエーテル結合が切断される。さらにこのエリアで、糖類はオルト過ヨウ素酸によりアルデヒドへと酸化される。次のエリアは、過ヨウ素酸塩をヨウ素酸塩へと還元させ、同時に三価の第二鉄へと酸化する硫酸第一鉄を含む。第一鉄および第二鉄イオンは鉄炭酸塩および水酸化第二鉄として、炭酸塩緩衝剤を含有する次のエリアで析出する。最後の機能的な層は、２４．９ｍｌ／ｍ２のインクを移動できるシリンダーで印刷された、ＢＣＡ検査の純粋なＡ溶液および１：１０に希釈されたＢ溶液を含む。紫色は０．５ｇ／ｌの糖を含有する３００μｇのサンプルで生じ、液体試料中の、例えばフルクトース、サッカロース、ラクトース、マルトースまたはデキストリンなどの糖類１５０μｇを検出する能力を示す。しかしながら、検査の感度は上記の糖の順序に沿って減少し、したがって、最初の糖ではより低い糖濃度でさえ検出可能である。
【０１１５】
オルト過ヨウ素酸は個別の酸、例えば弱硫酸および過ヨウ素酸ナトリウムなどの層によって置き換えることができる。硫酸第一鉄の代わりに、図２に示されるようにチオ硫酸ナトリウムもまた、過ヨウ素酸塩の不活化に用いられ得る。
【０１１６】
吸湿性ファブリックの上記概念は試験管でも検査された。この検査形態の試薬を用いて、化学物質は試験管中で表５．１に示される手順で測定された。硫酸第一鉄が加えられた後、三価の鉄イオンが溶液中で形成されるため、溶液はいくらか濁った。炭酸塩とされた第一鉄および第二鉄ならびに水酸化物は５分以内に試験管の底へと沈降し、その後ＢＣＡ混合液に含まれる溶液Ａが加えられた。
【０１１７】
【表７】
2011514516.tif 000009
【０１１８】
１ｇ／ｌの糖濃度では、溶液はただちに紫色へと変化した。色は時が経つにつれて暗くなり続けたが、これは銅がゆっくりと還元していることによるものだと推測される。０．０１ｇ／ｌの糖濃度では、発色が可視的な検出可能レベルまで至るのに、単糖類および二糖類では７分かかった。発色は、デキストリンおよびスターチでは遅かった。
【０１１９】
本発明および関連する検査の利点の一つは、ロール−ツー−ロール印刷方法での加工可能性である。このため、検査で用いられる化学物質はすべて印刷方法によりファブリック上に移すことができる。好適な検査の製造は、ファブリック上に逐次印刷される５つの化学物質を含む。ファブリックは印刷の間伸縮するので、装置には高い精度で整列する能力が要求される。さらに、多くの試薬は無色であるので、印刷の質を監視することおよび種々のエリアの配置をさらに複雑にする。本発明によれば、印刷ユニットの数と用いられる試薬の数が一致するプレスによる印刷が一番簡単である。この場合、好適な検査のために推奨される印刷ユニットの数は５つである。この種類の装置は、１つの作業の間に全ての化学物質をファブリック上に印刷できる。これは、種々の化学物質の層を配置することおよび伸縮に関連する問題の衝撃を減少させる。なぜなら伸縮が全ての印刷ユニットに同一に影響するからである。
【０１２０】
本発明の下で展開した検査は、室温で機能する糖検出のための初めての非酵素検査である。本発明の方法は、多くの検査で検出できなかった中性の糖類の測定も可能である。本発明により与えられる重要な洞察は分析物の化学的修飾であり、例えば糖類の過ヨウ素酸による化学的修飾、および指示段階およびファブリックの使用前の干渉剤の不活化である。本発明の１つの実施態様は、吸湿性ファブリックに基づく柔軟な検査であって、ファブリック上での干渉化学物質の析出を容易にし、したがってファブリック上でのそれらのさらなる移動を阻止する検査を提供する。
【図１】
2011514516.tif 000010
【図２】
2011514516.tif 000011
【国際調査報告】
2011514516.tif 000012
2011514516.tif 000013
2011514516.tif 000014