(57)【要約】本発明は、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するための新規な方法を特徴としている。本発明は、セイヨウニワトコレクチン（ＳＮＡ）による総血清ＰＳＡのα２，６−結合シアル化を、そして総及び遊離血清ＰＳＡのα２，３−結合シアル化を分析する、レクチン免疫吸着アッセイの開発に基づいている。次いでこれらの新規なアッセイは、ＰＳＡの癌特異性を改善するための糖タンパク質分析の潜在的な役割についての臨床研究を実施するために用いた。本発明は、１つ又はそれ以上のレクチン及びＰＳＡ特異抗体、並びに使用説明書を含有してなる、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するためのキットも特徴としている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が、健常対象由来ＰＳＡの糖鎖付加パターンと比較して、変化しているＰＳＡ糖鎖付加パターンを有しているかを確認すること（ここで変化した糖鎖付加パターンは対象が前立腺癌を有していることを示す）を含有してなる、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法。
【請求項２】
糖鎖付加パターンが、ＰＳＡのα２，３−結合シアル化又はα２，６−結合シアル化である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＳＡ糖鎖付加パターンを、１つ又はそれ以上のレクチン免疫吸着アッセイで確認する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
１つ又はそれ以上のレクチン免疫吸着アッセイが、ＰＳＡ抗体と１つ又はそれ以上のレクチンの間に血清ＰＳＡを挟み込む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１つ又はそれ以上の免疫吸着アッセイが、ＳＮＡによる総ＰＳＡ、ＭＡＬＩによる総ＰＳＡ、ＭＡＬＩＩによる総ＰＳＡ、ＭＡＬＩによる遊離ＰＳＡ及びＭＡＬＩＩによる遊離ＰＳＡよりなる群から選ばれる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
方法が、少なくとも２つのレクチン免疫吸着アッセイを含有している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
方法が、少なくとも３つのレクチン免疫吸着アッセイを含有している、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
方法が、少なくとも４つのレクチン免疫吸着アッセイを含有している、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
方法が、５つのレクチン免疫吸着アッセイを含有している、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＳＡ特異抗体を用いて生体試料からＰＳＡを単離することを更に含有してなる、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＳＡ特異抗体が遊離ＰＳＡに対して特異的である、請求項４又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＳＡ特異抗体が総ＰＳＡに対して特異的である、請求項４又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
使用前に、抗体由来の１つ又はそれ以上のグリカンのレクチンへの結合を除去するために抗体を処理する、請求項１０、１１又は１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
抗体を酸化によって処理する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗体を使用前に酸化する、請求項１０、１１又は１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象を、遊離ＰＳＡの濃度に基づいて前もって選択する、請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
対象を、総ＰＳＡの濃度に基づいて前もって選択する、請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
遊離ＰＳＡの濃度が約１０％〜約２５％である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
総ＰＳＡの濃度が約２〜１０ｎｇ／ｍｌである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
変化しているＰＳＡ糖鎖付加パターンが、癌を有する対象において、より不均一なパターンである、請求項１〜１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
対象が、健常対象由来ＰＳＡのα２，６−シアル化パターンと比較して、変化しているＰＳＡα２，６−シアル化パターンを有しているかを確認すること（ここで変化したＰＳＡα２，６−シアル化パターンは前立腺癌を示す）を含有してなる、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法。
【請求項２３】
ＰＳＡα２，６−シアル化パターンをレクチン免疫吸着アッセイで確認する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
レクチン免疫吸着アッセイが、ＳＮＡによる総ＰＳＡのレクチン免疫吸着アッセイである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
総ＰＳＡ特異抗体を用いて生体試料から総ＰＳＡを単離することを更に含有してなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
対象を、遊離ＰＳＡの濃度に基づいて前もって選択する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
遊離ＰＳＡの濃度が約１０％〜約２５％である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象を、総ＰＳＡの濃度に基づいて前もって選択する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
総ＰＳＡの濃度が約２〜１０ｎｇ／ｍｌである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
使用前に、抗体由来の１つ又はそれ以上のグリカンのレクチンへの結合を除去するために抗体を処理する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
処理が酸化である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗体を使用前に酸化する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
対象が、健常対象由来ＰＳＡのα２，３−シアル化パターンと比較して、変化しているＰＳＡα２，３−シアル化パターンを有しているかを確認すること（ここで変化したＰＳＡα２，３−シアル化パターンは前立腺癌を示す）を含有してなる、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法。
【請求項３５】
ＰＳＡα２，３−シアル化パターンをレクチン免疫吸着アッセイで確認する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
レクチン免疫吸着アッセイが、ＳＮＡによる総ＰＳＡのアッセイである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
総ＰＳＡ特異抗体を用いて生体試料から総ＰＳＡを単離することを更に含有してなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
対象を、遊離ＰＳＡの濃度に基づいて前もって選択する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
遊離ＰＳＡの濃度が約１０％〜約２５％である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象を、総ＰＳＡの濃度に基づいて前もって選択する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
総ＰＳＡの濃度が約２〜１０ｎｇ／ｍｌである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
使用前に、抗体由来の１つ又はそれ以上のグリカンのレクチンへの結合を除去するために抗体を処理する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
処理が酸化である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
抗体を使用前に酸化する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
対象が、健常対象由来ＰＳＡのα２，６−シアル化パターンと比較して、変化しているＰＳＡα２，６−シアル化パターンを有しているかを確認すること（ここで変化したＰＳＡα２，６−シアル化パターンは前立腺癌を示し、そしてＰＳＡの変化していないα２，６−シアル化パターンは良性前立腺肥大症を示す）を含有してなる、対象が癌又は良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）を有しているか否かを確認する方法。
【請求項４７】
対象が、癌又はＢＰＨの何れかを有していると前もって確認されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＰＳＡα２，６−シアル化パターンをレクチン免疫吸着アッセイで確認する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
レクチン免疫吸着アッセイが、ＳＮＡによる総ＰＳＡのアッセイである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
総ＰＳＡ特異抗体を用いて生体試料から総ＰＳＡを単離することを更に含有してなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
使用前に、抗体由来の１つ又はそれ以上のグリカンのレクチンへの結合を除去するために抗体を処理する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
抗体を使用前に酸化する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
対象由来ＰＳＡの試料が、健常対象由来ＰＳＡと比較して、シアル酸、Ｏ−結合ガラクトース又はＦｕｃａｌ−６群を有するＭａｎ／ＧｌｃＮａｃによる糖鎖付加の増大したレベルを有しているかを確認すること（ここで、健常対象由来ＰＳＡと比較して、シアル酸、Ｏ−結合ガラクトース又はＦｕｃａｌ−６群を有するＭａｎ／ＧｌｃＮａｃによる糖鎖付加の増大したレベルを有しているＰＳＡは、前立腺癌を示す）を含有してなる、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法。
【請求項５５】
ＰＳＡ糖鎖付加パターンを１つ又はそれ以上のレクチン免疫吸着アッセイで確認する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＰＳＡ特異抗体を用いて生体試料からＰＳＡを単離することを更に含有してなる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
ＰＳＡ特異抗体が、遊離ＰＳＡに対して特異的である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＰＳＡ特異抗体が、総ＰＳＡに対して特異的である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
使用前に、抗体由来の１つ又はそれ以上のグリカンのレクチンへの結合を除去するために抗体を処理する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
使用前に抗体を酸化する、請求項５６〜５８の何れか一項に記載の方法。
【請求項６１】
抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する、請求項６０に記載の方法
【請求項６２】
対象が、癌の家族歴に基づいて前もって選択されている、請求項５４〜６１の何れか一項に記載の方法。
【請求項６３】
シアル酸による糖鎖付加をレクチンＳＮＡ−１を用いて確認する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
Ｏ−結合ガラクトースによる糖鎖付加をレクチンジャカリンを用いて確認する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
Ｆｕｃａ−１-６群を有するＭａｎ／ＧｌｃＮＡｃによる糖鎖付加をレクチンＬｃＨを用いて確認する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６６】
１つ又はそれ以上のレクチン及びＰＳＡ特異抗体、並びに使用説明書を含有してなる、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するためのキット。
【請求項６７】
レクチンが、ＳＮＡ、ＭＡＬＩ、及びＭＡＬＩＩよりなる群から選ばれる、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
レクチンが、ジャカリン及びＬｃＨより更に選ばれる、請求項６６に記載のキット。
【請求項６９】
ＰＳＡ特異抗体が遊離ＰＳＡに対して特異的である、請求項６６に記載のキット。
【請求項７０】
ＰＳＡ特異抗体が総ＰＳＡに対して特異的である、請求項６６に記載のキット。
【請求項７１】
使用前に、抗体由来の１つ又はそれ以上のグリカンのレクチンへの結合を除去するために抗体を処理する、請求項６６に記載のキット。
【請求項７２】
抗体が酸化されている、請求項６６に記載のキット。
【請求項７３】
抗体が過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されている、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
総ＰＳＡに対して特異的な抗体、及びα２，６−シアル化に対して特異的なレクチン、並びに使用説明書を含有してなる、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するためのキット。
【請求項７５】
抗体が酸化されている、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
抗体が過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されている、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
レクチン：ＳＮＡ−１、ジャカリン、及びＬｃＨ；ＰＳＡ特異抗体；並びに使用説明書を含有してなる、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するためのキット。
【請求項７８】
抗体が酸化されている、請求項７７に記載のキット。
【請求項７９】
抗体が過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されている、請求項７８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００８年７月２５日に出願された、米国仮特許出願第６１／０８３，６４２号の優先権を主張し、その全内容は参照することにより本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
米国において、前立腺癌は、男性に最もよく見られる悪性腫瘍であって、癌による死亡原因の第２位である。米国だけで毎年３００，０００人を越える男性が前立腺癌と診断されている。過去１０年間にわたり前立腺癌の罹患率及びその死亡率の両方が増大している。最近、乳癌の女性もＰＳＡを示すことが指摘されている。乳房の腫瘍におけるＰＳＡ産生はエストロゲン及び／又はプロゲステロンの存在に関連している。一般に、女性血清中のＰＳＡ濃度は検出不可能である。
【０００３】
現在、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）が、前立腺癌の早期発見に使用可能な最良の腫瘍マーカーである。しかしながら、ＰＳＡは、男性癌患者において上昇し得るとともに良性の前立腺疾患の男性においても存在するので、特異性がない。通常用いられているＰＳＡのアッセイのカットオフ値は４．０ｎｇ／ｍＬであるが、ＰＳＡの全範囲に渡って前立腺癌の危険性があると認識されているので、２．０ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ及び２．８ｎｇ／ｍＬのより低いカットオフ値が示唆されている。総ＰＳＡ４〜１０ｎｇ／ｍＬの男性が総ＰＳＡの診断的グレーゾーンにあり、この内生検では４人中３人が癌の兆候を示さず、これは多数の不必要な生検をもたらしてしまう。
【０００４】
糖鎖付加は、最も普遍的なタンパク質の翻訳後修飾の１つであって、タンパク質相互作用、細胞間の認識、接着、及び移動に関与している。最近、細胞表面の糖鎖付加が癌のような疾患状態で変化することを示唆する証拠が増えていて、これは糖鎖付加が病気の発症に関連していることを示している。従って、糖タンパク質の糖鎖付加パターンが、病気診断の特異性を改善すると期待できる。例えば、ＰＳＡは、食品医薬品局（ＦＤＡ）で承認されている前立腺癌スクリーニング及びモニタリング用の血清マーカーである。しかしながら、ＰＳＡ単独では、全症例に対して、特に血清中４〜１０ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ濃度である「診断的グレーゾーン」において、初期段階の癌を識別するために十分に特異的ではない。
ＰＳＡは、Ａｓｎ−４５に結合しているＮ−オリゴ糖鎖を有している糖タンパク質として報告されている。ＰＳＡのタンパク質濃度に加え、ＰＳＡ糖鎖構造の変化を、正常由来と癌由来のＰＳＡを区別するために使用できるだろう。従って、ＰＳＡタンパク質濃度が正常と癌の群を区別できない場合に、ＰＳＡの糖鎖付加パターンは、癌検出のための新規な生体分子マーカーとして用いられる可能性を有する。
【０００５】
血清中では、総ＰＳＡの大部分が抗タンパク分解酵素と複合体を形成しているのに対して、５〜４５％が遊離の、非複合体形態にある。その診断的グレーゾーンにおけるＰＳＡの癌特異性を向上させるための検討において、前立腺癌の男性が、前立腺癌ではない男性と比較すると、総ＰＳＡに対してより低い比率の遊離体を有していることが見出された。それ故に、総ＰＳＡ濃度が４〜１０ｎｇ／ｍＬである場合の前立腺癌のリスク評価のために、遊離ＰＳＡの割合（遊離ＰＳＡ％）が推奨されている。遊離ＰＳＡ％が＞２５％であることは癌の危険性が低いことを（例えば、確率＝８％）を示唆し、一方遊離ＰＳＡ％が＜１０％であることは癌の危険性が高いこと（例えば、確率＝５６％）を示している。しかしながら、遊離ＰＳＡ％について試験した患者の大部分は、癌の危険性が約２５％である中等度（例えば、１０〜２０％）、従って、別の診断的グレーゾーンに該当した。遊離ＰＳＡが、癌特異的（例えば、［−２］ｐｒｏＰＳＡ）及び良性特異的（例えば、ＢＰＳＡ）形態の両方からなっているという知見が遊離ＰＳＡ％の限界を説明している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、当該技術分野において、前立腺癌検出の改善された方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下に記載するように、本発明は、対象が前立腺癌であるか否かを確認するための新規な方法を特徴としている。本発明は、セイヨウニワトコレクチン（sambucus nigra lectin；ＳＮＡ）による、総血清ＰＳＡのα２，６−結合シアル化、そして総及び遊離血清ＰＳＡのα２，３−結合シアル化を分析する、レクチン免疫吸着アッセイ（総ＳＮＡ、総ＭＡＬＩ、遊離ＭＡＬＩ、総ＭＡＬＩＩ、及び遊離ＭＡＬＩＩ）の開発に基づいている。これらの新規なアッセイは、次いで、ＰＳＡの癌特異性を改善するための糖タンパク質分析の潜在的な役割についての臨床研究を実施するために用いられた。
【０００８】
従って、第１の態様では、本発明は、対象が、健常対象由来ＰＳＡの糖鎖付加パターンと比較して、変化している前立腺特異抗原（ＰＳＡ）糖鎖付加パターンを有しているかを確認すること（ここで変化した糖鎖付加パターンは対象が前立腺癌を有していることを示す）を含有してなる、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法を特徴としている。
【０００９】
一実施態様では、糖鎖付加パターンは、ＰＳＡのα２，３−結合シアル化又はα２，６−結合シアル化である。
【００１０】
上記態様の何れか１つの別の実施態様では、ＰＳＡ糖鎖付加パターンは、１つ又はそれ以上のレクチン免疫吸着アッセイによって確認される。
更なる実施態様では、１つ又はそれ以上のレクチン免疫吸着アッセイは、血清ＰＳＡをＰＳＡ抗体と１つ又はそれ以上のレクチンの間に挟み込む。
【００１１】
更に別の実施態様では、１つ又はそれ以上のアッセイは、ＳＮＡによる総ＰＳＡ、ＭＡＬＩによる総ＰＳＡ、ＭＡＬＩＩによる総ＰＳＡ、ＭＡＬＩによる遊離ＰＳＡ及びＭＡＬＩＩによる遊離ＰＳＡよりなる群から選ばれる。
【００１２】
更なる実施態様では、方法は少なくとも２つのレクチン免疫吸着アッセイを含んでいる。
更に別の実施態様では、方法は少なくとも３つのレクチン免疫吸着アッセイを含んでいる。  更なる別の実施態様では、方法は少なくとも４つのレクチン免疫吸着アッセイを含んでいる。  その他の関連する実施態様では、方法は少なくとも５つのレクチン免疫吸着アッセイを含んでいる。
【００１３】
一実施態様では、上記態様の何れか１つの方法は、ＰＳＡ特異抗体を用いて生体試料からＰＳＡを単離することを更に含んでいる。
別の実施態様では、ＰＳＡ特異抗体は、遊離ＰＳＡに対して特異的である。
別の実施態様では、ＰＳＡ特異抗体は、総ＰＳＡに対して特異的である。
【００１４】
ある特定の実施態様では、使用前に、抗体を処理して、抗体の１つ又はそれ以上のグリカンがレクチンに結合することを取り除く。
更に関連する実施態様では、処理が酸化である。
上記態様の何れか１つの更なる実施態様では、使用前に抗体を酸化する。
【００１５】
別の実施態様では、抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化することが好ましい。
上記態様の何れか１つの別の実施態様では、対象は遊離ＰＳＡ濃度に基づいて前もって選択されている。
上記態様の何れか１つの別に関連している実施態様では、対象は総ＰＳＡ濃度に基づいて前もって選択されている。
【００１６】
更なる実施態様では、遊離ＰＳＡの濃度は、約１０％〜約２５％である。
別の更なる実施態様では、総ＰＳＡの濃度は、約２〜１０ｎｇ／ｍＬである。
【００１７】
上記態様の何れか１つの別の実施態様では、変化したＰＳＡ糖鎖付加パターンは、癌を有する対象では、より不均一なパターンである。
【００１８】
別の態様では、本発明は、対象が、健常対象由来ＰＳＡのα２，６−シアル化パターンと比較して、変化したＰＳＡα２，６−シアル化パターンを有しているかを確認すること（ここで、変化したＰＳＡα２，６−シアル化パターンは前立腺癌を示している）を含有している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法を特徴としている。
【００１９】
一実施態様では、ＰＳＡα２，６−シアル化パターンはレクチン免疫吸着アッセイで確認する。
別の実施態様では、レクチン免疫吸着アッセイはＳＮＡによる総ＰＳＡのアッセイである。
【００２０】
更に別の実施態様では、方法は更に、総ＰＳＡ特異抗体を用いて、生体試料から総ＰＳＡを単離することを含有している。
別の実施態様では、対象は遊離ＰＳＡ濃度に基づいて前もって選択されている。
更なる実施態様では、遊離ＰＳＡの濃度は、約１０％〜約２５％である。
別の実施態様では、対象は総ＰＳＡ濃度に基づいて前もって選択されている。
更なる実施態様では、総ＰＳＡの濃度は、約２〜１０ｎｇ／ｍＬである。
【００２１】
別の特定の実施態様では、使用前に、抗体を処理して、抗体の１つ又はそれ以上のグリカンがレクチンに結合することを取り除く。
関連する実施態様では、処理が酸化である。
別の実施態様では、抗体を使用前に酸化する。
関連する実施態様では、抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、対象が、健常対象由来ＰＳＡのα２，３−シアル化パターンと比較して、変化したＰＳＡα２，３−シアル化パターンを有しているかを確認すること（ここで、変化したＰＳＡα２，３−シアル化パターンは前立腺癌を示している）を含有している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法を特徴としている。
【００２３】
一実施態様では、ＰＳＡα２，３−シアル化パターンはレクチン免疫吸着アッセイで確認する。
別の実施態様では、レクチン免疫吸着アッセイはＳＮＡによる総ＰＳＡのアッセイである。別の実施態様では、方法は更に、総ＰＳＡ特異抗体を用いて、生体試料から総ＰＳＡを単離することを含有している。
【００２４】
更なる実施態様では、対象は遊離ＰＳＡ濃度に基づいて前もって選択されている。
関連する実施態様では、遊離ＰＳＡの濃度は、約１０％〜約２５％である。
別の実施態様では、対象は総ＰＳＡ濃度に基づいて前もって選択されている。
更なる実施態様では、総ＰＳＡの濃度は、約２〜１０ｎｇ／ｍＬである。
【００２５】
別の特定の実施態様では、使用前に、抗体を処理して、抗体の１つ又はそれ以上のグリカンがレクチンに結合することを取り除く。
関連する実施態様では、処理が酸化である。
【００２６】
別の実施態様では、抗体を使用前に酸化する。
関連する実施態様では、抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、対象が、健常対象由来ＰＳＡのα２，６−シアル化パターンと比較して、変化したＰＳＡα２，６−シアル化パターンを有しているかを確認すること（ここで、変化したＰＳＡα２，６−シアル化パターンは前立腺癌を示し、そして変化していないＰＳＡのα２，６−シアル化パターンは良性前立腺肥大を示す）を含有している、対象が前立腺癌又は良性前立腺肥大（ＢＰＨ）を有しているか否かを判定する方法を特徴としている。
【００２８】
一実施態様では、対象は癌又はＢＰＨの何れかを有していることが前もって確認されている。
別の実施態様では、ＰＳＡα２，６−シアル化パターンはレクチン免疫吸着アッセイで確認する。
更なる実施態様では、レクチン免疫吸着アッセイはＳＮＡによる総ＰＳＡのアッセイである。
【００２９】
関連する実施態様では、方法は更に、総ＰＳＡ特異抗体を用いて、生体試料から総ＰＳＡを単離することを含有している。
別の特定の実施態様では、使用前に、抗体を処理して、抗体の１つ又はそれ以上のグリカンがレクチンに結合することを取り除く。
関連する実施態様では、処理が酸化である。
別の実施態様では、抗体を使用前に酸化する。
関連する実施態様では、抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、対象由来ＰＳＡの試料が、シアル酸、Ｏ−結合ガラクトース又はＦｕｃａｌ−６群を有するＭａｎ／ＧｌｃＮＡｃによる糖鎖付加が健常対象由来ＰＳＡと比較して増加レベルを有しているか否かを確認すること（ここで、健常対象由来ＰＳＡと比較して、シアル酸、Ｏ−結合ガラクトース又はＦｕｃａｌ−６群を有するＭａｎ／ＧｌｃＮＡｃによる糖鎖付加の増加レベルを伴うＰＳＡは前立腺癌を示す）を含有している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法を特徴としている。
【００３１】
一実施態様では、ＰＳＡ糖鎖付加パターンは１つ又はそれ以上のレクチン免疫吸着アッセイによって確認される。
【００３２】
別の実施態様では、上記の何れか一つの方法は更に、ＰＳＡ特異抗体を用いて生体試料からＰＳＡを単離することを含有している。
一実施態様では、ＰＳＡ特異抗体は、遊離ＰＳＡに対して特異的である。
別の実施態様では、ＰＳＡ特異抗体は、総ＰＳＡに対して特異的である。
【００３３】
別の特定の実施態様では、使用前に、抗体を処理して、抗体の１つ又はそれ以上のグリカンがレクチンに結合することを取り除く。
関連する実施態様では、処理が酸化である。
【００３４】
上記の何れか一つの方法の別の実施態様では、抗体を使用前に酸化する。
関連する実施態様では、抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する。
【００３５】
上記の何れか一つの方法の更に別の実施態様では、対象は癌の家族歴に基づいて前もって選択されている。
【００３６】
関連する実施態様では、シアル酸による糖鎖付加はレクチンＳＮＡ−１を用いて確認される。
【００３７】
別の関連する実施態様では、Ｏ−結合ガラクトースによる糖鎖付加はレクチンジャカリン（Ｊａｃａｌｉｎ）を用いて確認される。
更なる実施態様では、Ｆｕｃａｌ−６群を有するＭａｎ／ＧｌｃＮＡｃによる糖鎖付加は、レクチンＬｃＨを用いて確認される。
【００３８】
別の態様では、本発明は、１つ又はそれ以上のレクチン及びＰＳＡ特異抗体、並びに使用説明書を含有している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するためのキットを特徴としている。
【００３９】
一実施態様では、レクチンが、ＳＮＡ，ＭＡＬＩ及びＭＡＬＩＩよりなる群から選ばれる。
関連する実施態様では、レクチンが更に、ジャカリン及びＬｃＨから選ばれる。
【００４０】
更なる実施態様では、ＰＳＡ特異抗体は遊離ＰＳＡに対して特異的である。
別の更なる実施態様では、ＰＳＡ特異抗体は総ＰＳＡに対して特異的である。
関連する実施態様では、抗体は酸化されている。
別の更なる実施態様では、抗体は過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されている。
【００４１】
別の態様では、本発明は、総ＰＳＡに特異的な抗体及びα２，６-シリル化に特異的なレクチン、並びに使用説明書を含有している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するためのキットを特徴としている。
【００４２】
一実施態様では、抗体は酸化されている。
更なる関連する実施態様では、抗体は過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されている。
【００４３】
更に別の態様では、本発明は、レクチンＳＮＡ−１、ジャカリン、及びＬｃＨ、ＰＳＡ特異抗体、並びに使用説明書を含有している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するためのキットを特徴としている。
【００４４】
一実施態様では、抗体は酸化されている。
更なる関連する実施態様では、抗体は過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されている。
【００４５】
本発明のその他の特徴及び利点は、詳細な説明から、そして特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【００４６】
例として挙げられているが、記載されている特定の実施態様に本発明を限定することを意図していない、以下の詳細な説明は、参照することにより本明細書に取り込まれている、添付の図面を併用することによって理解できるだろう。本発明の多くの好ましい特徴及び実施態様は、限定されない実施例を通して及び添付図面を参照して、記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、総又は遊離ＰＳＡについての５つのレクチン免疫吸着アッセイの結合曲線を示すグラフである。
【図２】図２（Ａ−Ｅ）は、総ＳＮＡ（Ａ）、総ＭＡＬＩ（Ｂ）、遊離ＭＡＬＩ（Ｃ）、総ＭＡＬＩＩ（Ｄ）及び遊離ＭＡＬＩＩ（Ｅ）のアッセイによる、３つの前立腺癌血清プールと３つの非癌血清プールの間の、総及び遊離ＰＳＡのシアル化を比較して示すグラフ群である。癌群及び非癌群におけるプール１は２１回測定したが、プール２と３は３回測定した。これら６つのプールは、調和した総ＰＳＡ及び遊離ＰＳＡのレベルを有している：癌及び非癌群のプール１、２、３の総ＰＳＡ濃度はそれぞれ５．２６、５．０４、５．９２、５．２０、５．０３及び４．９４ｎｇ／ｍＬであり、遊離ＰＳＡ濃度はそれぞれ０．９８、０．８４、１．１５、１．１３、１．６１及び０．８０ｎｇ／ｍＬである。
【図３】図３（Ａ−Ｃ）は、（Ａ）遊離ＰＳＡが４．７〜３１．８％範囲の全５２対象、（Ｂ）遊離ＰＳＡが１０〜２０％範囲の２１の対象のサブセット、及び（Ｃ）遊離ＰＳＡが１０〜２０％の１６の対象の別の検討における、癌及び非癌群のＲＯＣ分析を示す３つのグラフである。
【図４】図４（Ａ及びＢ）は、高密度レクチンマイクロアレイを用いた、ヒト精液ＰＳＡの糖鎖付加パターンの検出を示す。
【図５】図５は、開発した免疫アッセイについての２つのレクチン候補の結合曲線を示す２つのグラフである。
【図６】図６は、前立腺組織試料において開発したＥＣＬによる免疫アッセイを用いた、標的グリカン−レクチン結合の検証を示す、２つのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
Ｉ．定義
別段の定義がない限り、本明細書で用いられている技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されている意味を有している。
【００４９】
以下の参考文献は、本発明で用いられている多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。 Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いられている、以下の用語は、別に特定しない限り、それらに帰している意味を有している。
【００５０】
別に特定しない限り、「ａ」又は「ａｎ」は「１つ又はそれ以上の」を意味する。
【００５１】
明確に言明していないか或いは内容から明瞭でない限り、本明細書で用いられる用語「又は」は、包括的であると理解される。
【００５２】
用語「抗体」は、エピトープ（例えば、抗原）を特異的に結合して認識する、１つの免疫グロブリン遺伝子又は複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドリガンド、又はその断片を示すように意図されている。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、カッパ及びラムダ軽鎖定常領域遺伝子、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー重鎖定常領域遺伝子、及び多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を包含している。抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、又は多種のペプチダーゼで消化されて産生した、よく特徴付けられた多数の断片として存在する。これは、例えば、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２断片を包含する。本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗体全体の修飾によって産生されたか、或いは組み換えＤＮＡ方法論を用いてデノボ合成されたかの何れかの抗体断片も包含する。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は単鎖抗体も包含する。抗体の「Ｆｃ」部分は、１つ又はそれ以上の重鎖定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含有しているが、重鎖可変領域を包含していない、免疫グロブリン重鎖の部分を示す。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「糖鎖付加パターン」は、ＰＳＡのプール中に存在するグリカン構造（オリゴ糖）の提示を示すように意図されている。グリコプロファイル(glycoprofile）を、例えば、ＰＳＡのプール中に存在する1つ又はそれ以上のグリカン構造にそれぞれ対応する複数のピークとして表示できる。
【００５４】
用語「レクチン免疫吸着アッセイ」は、レクチンと抗体又は抗原に関する免疫化学試験を示すように意図されている。好ましい実施態様では、免疫吸着アッセイは、血清ＰＳＡを抗体と1つ又はそれ以上のレクチンの間に挟み込むための免疫吸着アッセイを示すように意図されている。特定の好ましい実施態様では、レクチンは、ＰＳＡ Ａｂに捕捉されたＰＳＡの糖鎖付加の変化を検出するために用いられるか、或いはＰＳＡを結合した後にＰＳＡ Ａｂで検出するために用いられる。
【００５５】
用語「前立腺特異抗原（ＰＳＡ）」は、ヒトのカリクレイン遺伝子ファミリーのメンバーである３３ｋＤａキモトリプシン様タンパク質を示すように意図されている。好ましい実施態様では、ＰＳＡは前立腺の細胞で産生されるタンパク質である。
【００５６】
用語「試料」は、これに限定されないが、尿、血液、血清、精液、唾液、糞便、又は組織を含有している、対象由来の体液又は体組織の何れかを示すように意図されている。本明細書で用いられるような試料は、濃縮しなくてもよく、又は標準的な方法を用いて濃縮してもよい。
【００５７】
用語「シアル化された」又は「シアル化」は、1つ又はそれ以上のシアル酸部分による共有結合修飾を示す。ある特定の実施態様では、シアル化はＰＳＡのシアル化である。ある特定の実施態様では、シアル化はＰＳＡの２，６−結合シアル化でよい。別の実施態様では、シアル化はＰＳＡの２，３−結合シアル化でよい。
【００５８】
用語「対象」は、動物、より好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトを示すように意図されている。
【００５９】
本明細書で引用されている、それぞれの特許、特許出願、又は参考文献は、それぞれが独立して参照することにより取り込まれているように、参照することにより本明細書に取り込まれている。
【００６０】
前立腺特異抗原
ヒトカリクレインＩＩＩ（ｈｋ３）、セミニン（seminin）、セメノゲラーゼ（semenogelase）、γ−セミノタンパク質、及びＰ−３０としても知られている、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーのメンバーで、正常な、肥厚性の、そして悪性の前立腺上皮によって排他的に合成される３３ｋＤａキモトリプシン様タンパク質である。ＰＳＡの組織特異的な関係が、ＰＳＡを、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）及び前立腺腫瘍（ＣａＰ）又は転移性癌を確認するための魅力的なバイオマーカーとしている。
ＰＳＡの正常な血清及び血液濃度は一般に５ｎｇ／ｍＬ未満で、上昇した濃度はＢＰＨ又はＣａＰの指標となる。例えば、転移性ＣａＰの末期で２００ｎｇ／ｍＬの血清濃度が測定されている。通常用いられているＰＳＡのアッセイのカットオフ値は４．０ｎｇ／ｍＬであるが、ＰＳＡの全範囲に渡って前立腺癌の危険性があると認識されているので、２．０ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ及び２．８ｎｇ／ｍＬのより低いカットオフ値が示唆されている。
【００６１】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は前立腺の上皮細胞で産生されるタンパク質として最もよく知られている。正常男性の血清中には少量のＰＳＡが存在して、前立腺癌又はその他の前立腺疾患の存在で多くの場合に上昇する。現在、前立腺癌の早期発見の方法としてＰＳＡ濃度を測定するために血液検査が用いられている。ＰＳＡが正常値より高いことは、限局性及び転移性前立腺癌の両方と関連している。
【００６２】
精液に加えて、唾液腺、膵臓、胸腺（正常な胸腺組織及び乳癌、乳腺嚢胞症）、多種の乳腺分泌液（乳頭吸引液、授乳中女性の母乳）、尿道周囲腺、子宮内膜組織、羊水、気管支肺胞洗浄液、腹水、胸水、及び脳脊髄液中にＰＳＡの存在が明らかにされている。女性の血清中には非常に低いＰＳＡ濃度が検出される。卵巣腫瘍、甲状腺腫瘍、胆管腫瘍、肺腫瘍、膀胱腫瘍、汗腺腫瘍、副尿道管腺腫瘍、唾液腺腫瘍、膵臓腫瘍、腎臓、結腸及び肝臓腫瘍を包含する多種の腫瘍内でもＰＳＡは検出されている。
【００６３】
ＰＳＡは通常、非常に低い濃度で血液中に存在している；ＰＳＡの正常値は０〜４ｎｇ／ｍｌと定義される。ＰＳＡの上昇した濃度は、男性の前立腺癌又は女性の乳癌若しくはその他の癌の存在を示唆するものであり得る。血液中の大部分のＰＳＡは血清タンパク質と結合している。少量のＰＳＡは血清タンパク質と結合していない。この形態のＰＳＡは遊離ＰＳＡと呼ばれている。
【００６４】
方法
本発明は診断の又は予後の検査を提供する。好ましい態様では、本発明は、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法を提供し、方法は、健常対象由来ＰＳＡの糖鎖付加パターンと比較して変化したＰＳＡ糖鎖付加パターンを、対象が有しているか否かを確認することを含有していて、ここで、変化した糖鎖付加パターンは、対象が前立腺癌を有していることを示す。
特定の実施態様では、本明細書に記載されている方法は、現状方法を用いて診断上の「グレーゾーン」に入っている対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するために特に有用である。
【００６５】
本明細書で用いられる用語「グレーゾーン」は、癌の又は癌ではないとの明確な診断を行える特定の検査の値を意味する。
【００６６】
実験的な及びヒトの癌の実質的に全てのタイプで、異常な糖鎖付加が報告されている。特に、１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐構造における、及びＮ−結合グリカンの順序における変化、Ｏ−結合ＴＮ抗原のシアル化の変化、及びシアル化及び非シアル化ルイス因子の発現レベルの変化、全てが腫瘍の進展と関連している。
【００６７】
一般に、Ｎ−結合糖タンパク質の何れの糖質部分も、このトリマンノシルコアに付加したモノサッカリドの構造及び部位に基づく３つの主要なカテゴリー：高マンノース、混成物又は複合体：の内の１つに入れることができる。これらの構造の全てについては、タンパク質への結合はアミノ酸、アスパラギンを介している（Ｎ−結合）。Ｎ−結合糖類では、還元末端コアは正確に保存されて（Ｍａｎ３ＧｌｙＮＡｃ２）、グリコシルアミン結合は常にＧｌｙＮＡｃ残基を介している。Ｎ−結合オリゴ糖類の広大な多様性は、コアモチーフを超えるオリゴ糖鎖の変化に起因している。第１に、コアの二分岐腕の微分的拡張（differential extension)があげられる。第２に、変化が三分岐及び四分岐構造をもたらす増大した分岐に起因することである。この場合では、幾つかのアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが二分岐構造に作用して、より高次に分岐したオリゴ糖類を形成できる。
【００６８】
Ｏ−結合グリカンは、ペプチド鎖のセリン又はスレオニンへのＯ−グリコシド結合によってタンパク質に結合する。Ｎ−結合糖とは違って、Ｏ−結合糖は、多数の異なったコアに基づいていて、高度な構造多様性をもたらす。Ｏ−結合グリカンは一般に、Ｎ−結合型よりも小さくて、タンパク質上にＯ−結合型糖鎖付加の位置を決めるコンセンサスモチーフが存在しない。
【００６９】
糖鎖付加パターンの変化は、タンパク質の特異性及び／又は構造、及び結果としてのそれらの機能を変化させると知られていて、長い間糖鎖付加の変化が腫瘍進行のマーカーであると考えられてきた。
【００７０】
糖鎖付加パターンは、ＰＳＡのプール中に存在するグリカン構造（オリゴ糖）の提示に言及するよう意図されている。グリコプロファイルを、例えば、ＰＳＡのプール中に存在する１つ又はそれ以上のグリカン構造にそれぞれが対応する複数のピークとして表示させることができる。
【００７１】
本発明方法の好ましい実施態様では、対象由来ＰＳＡの糖鎖付加パターンを、健常対象由来ＰＳＡの糖鎖付加パターンと比較する。例えば、対象を、疾患を有していないコントロールの対象と比較して疾患を有している対象であるとすることができる。２つの試料の間で異なっているＰＳＡ糖鎖付加のパターンを、疾患のバイオマーカとして、例えば、診断目的のために、そして薬剤標的の候補であるとして用いることができる。このようなバイオマーカーを、対象の治療、例えば薬剤治療に対する応答をモニターするためにも用いることができる。
【００７２】
本発明の方法は、多数の適用、例えば、ＰＳＡ糖鎖付加のパターンの経時的変化を検出すること；ＰＳＡ糖鎖付加の活性化又は不活性化の個体間パターンを検出すること；診断法の開発；薬剤の発見及び開発のためのバイオマーカーの同定；治療用糖タンパク質の開発（例えば、プロセス改変、プロセス適格性／妥当性をモニター、試験）；又は糖タンパク質治療薬の精製において；を有している。バイオマーカーは、単一のマーカー、又は糖タンパク質プロファイル若しくは糖タンパク質パターン変化であってもよい。
【００７３】
ＰＳＡ糖鎖付加パターンは、免疫吸着アッセイによって確認できる。好ましくは、ＰＳＡ糖鎖付加パターンを、１つ又はそれ以上のレクチン免疫吸着アッセイによって確認する。当該技術分野で少なくとも１６０のレクチンが知られている。例は、これに限定されないが、イヌエンジュマメ（Maackia amurensis）レクチンＩ（ＭＡＬＩ）、イヌエンジュマメレクチンＩＩ（ＭＡＬＩＩ）、セイヨウニワトコレクチン（ＳＮＡ，ＥＢＬ）コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）、小麦胚芽レクチン（wheat germ agglutinin; ＷＧＡ）、ジャカリンレクチン（Ｊａｃａｌｉｎ）、ヒイロチャワンタケのレクチン（Aleuria aurantia lectin；ＡＡＬ）、アマリリスレクチン（Hippeastrum hybrid lectin；ＨＨＬ、ＡＬ）、ハリエニシダレクチンＩ（Ulex europeaus Agglutinin I；ＵＥＡ  Ｉ）、ロータスマメレクチン（Lotus tetragonolobus lectin；ＬＴＬ）、及びスノウドロップレクチン（galanthus nivalis lectin；ＧＮＬ）を包含する。レクチンの商業的供給源は、Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, Calif. )、GALAB Technologies (Geesthacht, Germany)、及びSigma (St. Louis, Mo.）を包含する。また、レクチンを天然資源から単離するか又は合成することができる。
【００７４】
特定の好ましい実施態様では、１つ又はそれ以上のレクチン免疫吸着アッセイは、ＳＮＡによる総ＰＳＡ、ＭＡＬＩによる総ＰＳＡ，ＭＡＬＩＩによる総ＰＳＡ、ＭＡＬＩによる遊離ＰＳＡ、ＭＡＬＩＩによる遊離ＰＳＡ、ＬｃＨによるＰＳＡ、ＳＮＡ−１によるＰＳＡ、及びジャカリンによるＰＳＡから選ばれる。
【００７５】
特定の実施態様では、例えば、ＰＳＡ抗体、好ましくはＰＳＡモノクローナル抗体を選択された表面、好ましくは、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのようなタンパク質親和性を示す表面上に固定化して、１晩培養することができる。洗浄して完全に吸着されなかった物質を除去した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、又は粉乳の溶液のような、試験抗血清に関して抗原的に中性であることが知られている非特異的タンパク質で、アッセイプレートのウェルを結合するかコートするのが好ましい。これは固定された表面上の非特異的吸着部位をブロックできるようにして、それによって抗原の表面への非特異的結合に起因するバックグラウンドを減少する。
【００７６】
抗体をウェルへ結合し、非反応性物質を用いてコーティングしてバックグラウンド減少し、そして洗浄して非結合物質を除去した後、免疫複合体（抗原／抗体）形成をもたらす方法で、固定した表面を試験する試料と接触させる。
ある特定の例示的実施態様では、レクチンがＰＳＡ抗体上の糖質決定基と結合するのを防ぐために、プレート上にコーティングされている抗体を過ヨウ素酸ナトリウム緩衝剤で処理することが好ましい。
【００７７】
試験する試料と結合している抗体の間の特異的な免疫複合体の形成、及びそれに続く洗浄の後、免疫複合体形成の発生及び量さえも、これを標的に対する特異性を有しているレクチンに曝すことによって確認することができる。
【００７８】
検出方法として、レクチンが、適切な発色物質と培養すると着色を生じるであろう関連酵素を有しているか、又は例えば、ストレプトアビジン基質を用いて検出可能なビオチン標識を有していることが好ましいであろう。従って、例えば、ビオチンが結合しているレクチンを、ストレプトアビジンと共に、複合体形成の進行を助ける条件下で、ある期間（例えば、室温で１時間）、接触させて及び培養することが望ましいだろう。
【００７９】
電気化学発光（electrochemiluminescence）は、ビオチン標識化ＰＳＡの量を検出するために使用することができる。
【００８０】
変化したＰＳＡ糖鎖付加、例えば、α２，６−シアル化又はα２，３−シアル化の確認は、免疫ブロット又はウェスタンブロット分析でも実施できる。例えば、ＰＳＡ抗体を、ニトロセルロース、ナイロン、又はこれらの組み合わせのような、固体の支持マトリック上に固定化されているタンパク質を同定するための高親和性第１試薬として、免疫沈降とそれに続くゲル電気泳動と共に用いることができる。これらは、不都合なバックグラウンドをもたらす抗原の検出に用いられる第２試薬に対する抗原の検出に用いるための単一工程の試薬として用いることができる。ウェスタンブロッティングと共に用いられる免疫学に基づく検出法は、本明細書に記載されているような、特定のレクチンに対する酵素的に、放射標識の、又は蛍光的に標識された第二抗体を包含している。
【００８１】
ある特定の好ましい実施態様では、方法は少なくとも２つのレクチン免疫吸着アッセイを含んでいる。別の好ましい実施態様では、方法は少なくとも３つのレクチン免疫吸着アッセイを含んでいる。更なる好ましい実施態様では、方法は少なくとも４つのレクチン免疫吸着アッセイを含んでいる。更なる好ましい実施態様では、方法は少なくとも５つのレクチン免疫吸着アッセイを含んでいる。好ましくは、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するのに必要な数のレクチン免疫吸着アッセイを含んでいる。
【００８２】
シアル酸は、３つの基本的形態を示す、炭素が９個のカルボキシル化された糖である。「シアル化された」とは、１つ又はそれ以上のシアル酸部分による共有結合修飾を示す。最も一般的なものは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸；しばしば、ＮｅｕＳＡｃ、ＮｅｕＡｃ、又はＮＡＮＡと略称される）である。次に一般的な形態は、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕＧｃ）で、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されている。第３の基本的シアル酸は、２−ケト−３−デオキシ−ノニュロソン酸（ＫＤＮ）である。
細胞表面又は血清タンパク質に結合しているグリカンの還元末端に一般に見られる、シアル酸は、正常組織に比べて、腫瘍細胞で一般に過剰に発現されている。これらの末端シアル酸は、細胞接着に関与していて、細胞表面受容体の成分である。過剰なシアル化は、特異的な細胞認識部位を覆う可能性があり、これが癌細胞に対する生理的な応答の重要な要素である。
シアル酸を含有しているタンパク質である、ルイスＸ及びルイスＡ血液型抗原も、一般に腫瘍において過剰に発現される。腫瘍細胞表面におけるシアル酸の更なる質的及び量的変化は、悪性腫瘍への進行と関連している。腫瘍細胞は、それらの細胞膜上で発現される、それらの侵攻能力に影響を及ぼす、シアロ−グリコ−複合体を変えることができる。
生体試料におけるタンパク質シアル化の定量的及び定性的評価は、タンパク質の過剰シアル化に関連する疾患の診断、予後診断及びモニタリングに重要な貢献をすると次第に認識されてきている。このような疾患は、糖尿病及び骨髄腫、上皮癌、乳癌、卵巣癌、口腔癌、消化管癌、前立腺癌、子宮内膜癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、及び甲状腺癌を包含する。
【００８３】
本発明の好ましい実施態様では、糖鎖付加パターンは、ＰＳＡのα２，３−結合シアル化又はα２，６−結合シアル化である。
【００８４】
従って、本発明は、健常対象由来ＰＳＡのα２，３−シアル化パターンと比較して、対象が、変化したＰＳＡα２，３−シアル化パターンを有しているか否かを確認することを含有していて、変化したＰＳＡα２，３−シアル化パターンが前立腺癌を示している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法を特徴としている。
【００８５】
本発明は、健常対象由来ＰＳＡのα２，６−シアル化パターンと比較して、対象が、変化したＰＳＡα２，６−シアル化パターンを有しているか否かを確認することを含有していて、変化したＰＳＡα２，６−シアル化パターンが前立腺癌を示している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法も特徴としている。
【００８６】
この方法は、例えば、本明細書に記載されている免疫吸着アッセイを用いて実施することができる。
【００８７】
好ましい実施態様では、シアル化パターン、特にＰＳＡα２，３−シアル化又はＰＳＡα２，６−シアル化のパターンは、レクチン免疫吸着アッセイによって確認する。好ましくは、レクチン免疫吸着アッセイは、ＳＮＡを用いる総ＰＳＡのアッセイである。総ＰＳＡは総ＰＳＡ特異抗体を用いて生体試料から単離することができる。
【００８８】
ある実施態様では、本明細書に記載されているように測定された、ＰＳＡは、単独で、又はその他のマーカー又は臨床兆候と組み合わせて、腫瘍がもはや寛解期にないか否かを確認するために用いる。ある実施態様では、本明細書に記載されているように測定されたＰＳＡは、単独で、又はその他のマーカー又は臨床兆候と組み合わせて、腫瘍の程度を確認するために用いる。後者の場合、遊離ＰＳＡの割合を総ＰＳＡと比較できる（遊離ＰＳＡの割合が低ければ低いほど、前立腺癌の存在の可能性が高くなる）。
【００８９】
本発明の方法は、癌性組織から良性組織を確認するためにも用いることができる。
【００９０】
例えば、本発明の別の態様では、方法は、健常対象由来ＰＳＡのα２，６−シアル化パターンと比較して変化したＰＳＡα２，６−シアル化パターンを対象が有しているか否かを確認することを含有していて、変化したＰＳＡα２，６−シアル化パターンが前立腺癌を示し、変化していないＰＳＡα２，６−シアル化パターンが良性前立腺肥大を示している、対象が癌又は良性前立腺肥大（ＢＰＨ）を有しているか確認することを包含している。
【００９１】
ある特定の場合では、対象は癌又はＢＰＨの何れかを有していると前もって確認されている。
【００９２】
ＰＳＡα２，６−シアル化パターンは、本明細書に記載されている抗体及び方法、例えば、１つ又はそれ以上のレクチン免疫吸着アッセイを用いて確認することができる。ある特定の実施態様では、レクチン免疫吸着アッセイはＳＮＡによる総ＰＳＡのアッセイである。例示的な実施態様では、総ＰＳＡは、総ＰＳＡ特異抗体を用いて生体試料から単離することができる。
【００９３】
別の態様では、本発明は、対象由来のＰＳＡの試料が、健常対象由来のＰＳＡと比較して、シアル酸、Ｏ−結合ガラクトース、又はＦｕｃａｌ−６群を有するＭａｎ／ＧｌｃＮＡｃによる糖鎖付加の増大したレベルを有しているかどうかを確認することを含有していて、健常対象由来のＰＳＡと比較して、シアル酸、Ｏ−結合ガラクトース、又はＦｕｃａｌ−６群を有するＭａｎ／ＧｌｃＮＡｃによる糖鎖付加の増大したレベルを有するＰＳＡが前立腺癌を示している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認する方法を特徴としている。
【００９４】
好ましくは、これらの方法を用いて、ＰＳＡ糖鎖付加パターンは、１つ又はそれ以上のレクチン免疫吸着アッセイによって確認される。
【００９５】
更なる例示的実施態様では、方法は更に、ＰＳＡ特異抗体を用いて生体試料からＰＳＡを単離することも含有している。ＰＳＡ特異抗体は遊離ＰＳＡに特異的であってよく、或いはＰＳＡ特異抗体は総ＰＳＡに特異的であってもよい。
【００９６】
本発明の方法で有用な抗体は、本明細書に記載されている。
【００９７】
ある特定の実施態様では、対象は癌の家族歴に基づいて前もって選択されている。
【００９８】
特定の実施態様では、シアル酸による糖鎖付加は、レクチンＳＮＡ−１を用いて確認される。別の特定の実施態様では、Ｏ−結合ガラクトースによる糖鎖付加はレクチンジャカリンを用いて確認される。別の特定の実施態様では、Ｆｕｃａｌ−６群を有するＭａｎ／ＧｌｃＮＡｃによる糖鎖付加はレクチンＬｃＨを用いて確認される。
【００９９】
糖タンパク質の糖鎖付加パターンの変化は、疾患の存在又は進行をモニターするために、疾患を有する対象を健常対象と比較して；疾患、例えば前立腺癌発症の可能性をモニターするために、健常者を異なった時点で；疾患に対する治療の影響を評価するために、治療を受けている疾患を有する対象において；対象に対する治療の影響を評価するために；そして疾患の再発の何れの可能性もモニターするために治療後に、アッセイすることができる。
【０１００】
糖鎖付加パターンの変化は、患者が前立腺癌を有していること、或いは患者はもはや寛解期ではないということの表示である。
【０１０１】
ある特定の実施態様では、変化したＰＳＡ糖鎖付加パターンは癌を有する対象ではより不均一なパターンである。
【０１０２】
対象及び試料
本明細書に記載されているような方法で用いられる試料は何れの適切な試料であってよい。試料が生体試料であることが好ましい。例えば、幾つかの実施態様では、試料は、血液、血清、又は血漿であろう。幾つかの実施態様では、試料又は一連の試料は血清試料である。個体は動物、例えば、哺乳動物、例えばヒトであってよい。
【０１０３】
試料は単一の試料であっても、或いは一連の試料であってもよい。一連の試料を採取する場合は、これらを適切な間隔、例えば、数分、数時間、数日、数週、数月、又は数年の間隔で採取することができる。個体を長期間追跡する場合は、試料の間隔を数月、又は数年とすることができる。診断、予後診断、及び治療の方法は、単一試料から、又は１つ又はそれ以上の一連の試料から、或いはその一連の試料の変化から確認することができる、例えば、ある特定の速度での濃度の増大は重篤な疾患を示すのに対して、遅い速度での増大又は増大しないことは比較的良性であるかそれほど重篤ではない疾患を示す。変化の速度は、数時間、数日、数週、数月又は数年にわたって測定することができる。所定の個体の変化の速度は、幾つか場合には、絶対値より高い関連性を有する。別の状況では、個体における、数日、数週間、数ケ月或いは数年に渡る値の上昇は疾患の侵攻及び悪化、或いは癌の再発を示す可能性がある。
【０１０４】
幾つかの実施態様では、少なくとも１つの試料は、ＰＳＡ濃度が上昇する疾患、例えば癌を示す１つ又はそれ以上の症状を有する個人が、医療従事者の元を訪れた時点に、あるいその近い時点に、採取される。更に、前立腺癌及び乳癌は血液中で検出可能なその他の分子マーカーを有している。ＰＳＡに加えて、これらのマーカーの検出は、癌性疾患のより確実な）診断をもたらすことができる。前立腺癌に対するその他の分子マーカーは当該技術分野で公知であって、これに限定されないが、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＫＩＡＡ １８、ＫＩＡＡ ９６、前立腺癌腫瘍抗原−１（prostate carcinoma tumor antigen-1；ＰＣＴＡ−１）、前立腺分泌タンパク質（ＲＳＰ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ヒト腺性カリクレイン２（ＨＫ−２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）ＰＴＩ−１、ＣＬＡＲ１（米国特許第６，３６１，９４８号）、ＰＧ１、ＢＰＣ−１、前立腺特異トランスグルタミナーゼ、サイトケラチン１５、セメノゲリンＩＩ（semenogelin II）、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ、ＰＤ−４１、ｐ５３、ＴＣＳＦ（米国特許第５，８５６，１１２号）、ｐ３００、アクチン（actin）、ＥＧＦＲ、及びＨＥＲ−２／ノイプロテインを包含し、更に当業者にとって明らかであろうその他のマーカーも包含する。
【０１０５】
一態様では、本明細書に記載されている方法は、上に示したマーカーの１つについての１つの試験が最終的診断を可能にしなかった後に、実施される。
【０１０６】
本発明の好ましい実施態様では、対象は遊離ＰＳＡのレベルに基づいて予め選択される。ある特定の好ましい実施態様では、遊離ＰＳＡのレベルは約１０％〜約２５％である。
【０１０７】
別の例では、対象は癌の家族歴に基づいて予め選択される。
【０１０８】
抗体
本発明のある特定の実施態様では、ＰＳＡは、ＰＳＡ特異抗体を用いて生体試料から単離される。抗体は、天然の抗体でよく、更には、非天然の抗体、例えば単鎖抗体、キメラ、二元機能性及びヒト化の抗体を包含するもの、更にこれらの抗原結合断片でもよい。幾つかの実施態様では、抗体は遊離ＰＳＡに対して特異的である。幾つかの実施態様では、抗体は総ＰＣＡに対して特異的である。幾つかの実施態様では、抗体はＰＳＡ複合体に対して特異的である。幾つかの実施態様では、ＰＳＡの１つ又はそれ以上の特定の形態に対して特異的な抗体を、例えば、複合ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、総ＰＳＡ等の結合パートナーに用いることができる。抗体の混合物、例えば、ＰＳＡの様々な形態（遊離、複合等）に対する抗体の混合物、又は混合物の混合物、も本発明に包含される。ある特定の実施態様では、使用前に抗体を酸化する。特に、抗体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化することが好ましい。
【０１０９】
当然のことながら、抗体が産生するＰＳＡの選択エピトープ又は領域により、例えば遊離ＰＳＡに対する、複合ＰＳＡに対する等のその特異性が確認されるであろうことは理解されるだろう。幾つかの実施態様では、抗体はＰＳＡの特定のアミノ酸領域に対して特異的である。
【０１１０】
幾つかの実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は結合パートナーとして有用である。
【０１１１】
抗体を産生する方法は確立されている。当業者は、多くの方法、例えば、Antibodies, A Laboratory Mannual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), Cold spring Harbor, N.Y. に記載されているような方法が、抗体産生に使用可能であることに気付くだろう。結合断片又は疑似抗体であるＦａｂ断片も、多くの手法（Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C., ed.), 1955, Oxford University Press, Oxford; J. Immuonol. 149, 3914-3920 (1922)）によって、遺伝子情報から調製できるということを当業者は理解できるだろう。本発明方法で用いられる抗体は、公知の技術に従って得ることができ、モノクローナル又はポリクローナルであってもよく、そして（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又はヒトを包含する起源の何れの種のものであってもよく、或いはキメラ抗体であってもよい。例えば、M. Walker et al., Molec. Immunol. 26:403 (1989) を参照されたい。抗体は、米国特許第４，４７４，８９３号又は同第４，８１６，５６７号、及び国際特許出願公開第ＷＯ／１９９８／０２２５０９号（これらは参照によりその全てを本明細書に取り込まれている）に開示されている方法に従って産生される組み換えモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、米国特許第４，６７６，９８０号及び同第５，５０１，９８３号（これらは参照によりその全てを本明細書に取り込まれている）に開示されている方法に従って作成される特異的抗体によって化学的に構築されていてもよい。遊離及び複合ＰＳＡに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体は、市場でも入手できる（Daco, Carpenteria, Calif., Scantibodies, Inc. Santee, Calif., BiosPacific, Emeryville, Calif.）。
【０１１２】
幾つかの実施態様では、抗体は、哺乳動物の、例えば、ヤギポリクローナル抗−ＰＳＡの、抗体である。抗体はＰＳＡの特異的領域に特異的でよい。捕捉結合パートナー及び検出結合パートナー対、例えば、捕捉及び検出の抗体対を、本発明の実施態様で用いることができる。従って、幾つかの実施態様では、一般に、２つの結合パートナー、例えば２つの抗体が用いられる、異種のアッセイプロトコルが用いられる。一方の結合パートナーは、通常固体の支持体上に固定されている捕捉パートナーであり、他方の結合パートナーは、通常付着した検出可能な標識を伴う検出結合パートナーである。幾つかの実施態様では、１対の捕捉結合パートナーのメンバーは、ＰＳＡの全ての或いは実質的に全ての形態に特異的である抗体である。例としては、抗体、例えば、遊離ＰＳＡ、及び複合ＰＳＡに特異的なモノクローナル抗体である。従って、抗体は総ＰＳＡに結合すると考えられる。
【０１１３】
幾つかの実施態様では、多様な種と交差反応する抗体を使用することが有用である。このような実施態様は、例えば、癌のマーカーとしてＰＳＡの血中への放出を測定することによる薬物毒性の測定を包含している。交差反応する抗体は、１つの種、例えば、非−ヒト種で行われる毒性の検討を可能にし、そしてその結果をアッセイの試薬中に同じ抗体又は抗体対を用いて、別の種、例えば、ヒトの研究又は臨床的観察に直接移行することを可能にするので、アッセイ間のばらつきを減少できる。
【０１１４】
キット
本発明は更にキットを提供する。
【０１１５】
本発明のある特定の好ましいキットは、１つ又はそれ以上のレクチン及びＰＳＡ特異抗体、並びに使用説明書を含有している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するためのキットを包含している。別の好ましいキットは、総ＰＳＡに対して特異的な抗体、及びα２，６−シアル化に対して特異的なレクチン、並びに使用説明書を含有している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するためのキットを包含している。本発明の別のキットは、レクチンＳＮＡ−１、ジャカリン、及びＬｃＨ、ＰＳＡ特異抗体、並びに使用説明書を含有している、対象が前立腺癌を有しているか否かを確認するためのキットを包含している。
【０１１６】
キットの成分としての結合パートナー、例えば、抗体、固体の支持体、及び蛍光標識は、本明細書に記載されているような適切な何れの成分であってもよい。
【０１１７】
キットは、本発明の方法において有用な試薬、例えば、結合反応において用いられる緩衝液及びその他の試薬、洗浄液、アッセイが行われる装置を前処理するための緩衝液又はその他の試薬、及び試料を装置に通すための溶出緩衝液又はその他の試薬、を更に包含してもよい。
【０１１８】
キットは、１つ又はそれ以上の標準品、例えば、高度に精製したＰＳＡ、又はこれらの多種断片、複合体等の標準品のような、本発明のアッセイで用いるための標準品を包含していてもよい。キットは更に説明書を包含していてもよい。
【０１１９】
レクチンが、ＳＮＡ、ＭＡＬＩ、及びＭＡＬＩＩよりなる群から選ばれることが好ましい。ＰＳＡ特異抗体が、遊離ＰＳＡに対して特異的であってもよく、或いは総ＰＳＡに対して特異的であってもよい。ある特定の実施態様では、抗体が、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されている。
【０１２０】
以下の実施例は、説明する目的で提示されていて、その他の開示を限定する目的で提示されるものではない。
【実施例】
【０１２１】
実施例１：前立腺癌検出のためのグリコプロテオミクス：ＰＳＡ糖鎖付加パターンの変化
現在、血清の前立腺癌特異抗原（ＰＳＡ）が、４〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲でのその低い特異性にもかかわらず、前立腺癌の早期発見のために用いられている。異常な糖鎖付加が腫瘍発症の基本特性であるので、本検討の１つの目的は、ＰＳＡ糖鎖付加の変化がＰＳＡの癌特異性を改善するために用いることができるか否かを検討することである。
【０１２２】
本検討は、５つのレクチン免疫吸着アッセイ（総ＳＮＡ、総ＭＡＬＩ、遊離ＭＡＬＩ、総ＭＡＬＩＩ、及び遊離ＭＡＬＩＩ）の開発を記述している。これは、セイヨウニワトコレクチン（sambucus nigra lectin：ＳＮＡ）による総血清ＰＳＡのα２，６−結合シアル化、及びイヌエンジュマメ（maackia amurensis）レクチンＩ及びＩＩ（ＭＡＬＩ及びＩＩ）の両方による総及び遊離血清ＰＳＡのα２，３−結合シアル化を分析する。次いで、これらのアッセイは、ＰＳＡの癌特異性の改善における糖タンパク質分析の潜在的役割の臨床研究を実施するために用いた。
【０１２３】
レクチン免疫吸着アッセイ
以下に示す、表１はレクチン免疫吸着アッセイで用いた捕捉抗体及びレクチン、更にそれらが認識する糖質部分をまとめている。表１は血清中のＰＳＡシアル化を直接分析するための５つのレクチン免疫吸着アッセイを示す。
【０１２４】
【表１】
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【０１２５】
セイヨウニワトコの樹皮から単離された、ＳＮＡはガラクトースにα２，６−結合しているシアル酸の二糖構造に結合する（Knibbs et al., 1991）。ＭＡＬＩ（ＭＡＬ、ＭＡＡ、又はＭＡＭとしても知られている）及びＭＡＬＩＩ（ＭＡＨとしても知られている）の両方はイヌエンジュマメの種から単離される。ＭＡＬＩはガラクトースにα２，３−結合し、次いでＮ−アセチルグルコサミンにβ１，４‐結合するシアル酸の三糖構造に結合する（Knibbs et al., 1991）のに対して、ＭＡＬＩＩは、その特異性は明確に定義されていないが、２，３−結合シアル酸を含む特定の糖質構造だけに結合すると見られる（Kawaguchi et al., 1974）。
【０１２６】
分析成績
ヒト精液ＰＳＡを混ぜたプールした女性の血清を用いて確立した、これら５つのアッセイの結合曲線が、図１に示されている。実験は、プールした血清を用いるか、或いは個体の血清試料由来の血清において（すなわち、プールしていないもの）実施できることに留意されたい。ヒト精液ＰＳＡは、その糖質部分にα２，３−結合及びα２，６−結合のシアル酸の両方を有している（Tabares et al., 2006; Peracula et al., 2003; Tajiri et al., 2008）ので、標準物質として用いた。これらのアッセイ全てにおいて、レクチンの、ＰＳＡ抗体に捕捉されたＰＳＡ分子上の糖質との結合の結果として、総ＰＳＡと遊離ＰＳＡの濃度増加と共に、電気化学発光シグナルが増大する。これら５つのアッセイのＬＯＤはそれぞれ、１．３５、０．１４、０．３２、０．０７、及び０．０４ｎｇ／ｍＬのＰＳＡであると計算された（表１）。これらは通常用いられているＰＳＡ評価のアッセイカットオフ値（４．０ｎｇ／ｍＬ）をはるかに下回っていたので、その診断グレーゾーン（４〜１０ｎｇ／ｍＬ）に用いることができる。このアッセイの同時再現性を評価するために、以下の表２に示すように、２つの男性血清プールを、２つの異なった内因性総ＰＳＡ及び遊離ＰＳＡ濃度で、１実行当たり２７回測定した。表２は、電気化学発光強度を用いて測定した５つのレクチン免疫吸着アッセイの同時再現性（Ｎ＝２７）を示す。
【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
遊離ＭＡＬＩＩアッセイの１つについての１０％未満のＣＶを除いて、５つのアッセイ全てにおいて、５％未満のＣＶを示して、優れた再現性を明らかにした。ＰＳＡ標準品に存在している非ＰＳＡタンパク質の重要ではない量（２％未満）は、ｉ）ＰＳＡ抗体は血清からＰＳＡ分子を捕捉するために用いられ、そしてｉｉ）結合曲線は、Beckman ACCESS Hybritech PSA and Free PSA assays によって測定された総ＰＳＡ及び遊離ＰＳＡ濃度を用いて確定されたので、ＰＳＡの糖質部分を確認するためのアッセイ又はそれらの性能に影響を与えない。
【０１２９】
血清中のＰＳＡ分子の糖鎖付加パターン
５つのレクチン免疫吸着アッセイを用いて、前立腺癌と非癌の間の遊離及び総ＰＳＡ分子のシアル化パターンをプール血清で比較した（図２）。上記のように、当然ながら、実験は、プール血清を用いても、個体由来の血清試料（すなわち、非プール血清）を用いても、同様に効果的に実施できる。それらの群内及び群間の類似性及び相違性を明らかにするために、各群に対して３つの血清プールを調製した。９６ウェルのプレート上に流せる試料の数に限りがあることを考慮して、各群のプール１は２１回測定したのに対して、プール２及び３は３回測定した。この比較から観察された有意なＰＳＡシアル化パターンでは、前立腺癌血清が相対的に大きな群内変動を示したのに対して、非癌血清は３つのプールにわたってより一貫したＰＳＡのシアル化を示し、このことは非癌由来よりも癌由来ＰＳＡのより不均一なシアル化パターンを示す。
【０１３０】
臨床成績
生検で前立腺癌（ｎ＝２６）又は非癌（ｎ＝２６）であることを確認された５２の対象においてこれらのアッセイの臨床成績を評価した。ＰＳＡ濃度、遊離ＰＳＡの％、測定したＰＳＡ糖鎖付加についての癌及び非癌群の間の比較が、以下に示す、表３に示されている。表３は、ＰＳＡ濃度、ＰＳＡの算定％、及び測定したＰＳＡ糖鎖付加について、癌（ｎ＝２６）と非癌（ｎ＝２６）の間の比較を示す。
【０１３１】
【表３】
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【０１３２】
全般に、表３は、２つの試験群が、総ＰＳＡ濃度に関しては統計的に差がなかった（ｐ＝０．２５）が、遊離ＰＳＡ濃度及び遊離ＰＳＡ％には統計的な差があった（それぞれ、ｐ＝０．００２５及びｐ＜０．００１）ことを示した。癌群において総ＰＳＡ濃度は高かった（癌：９．０８±５．１６ｎｇ／ｍＬ及び非癌：７．６５±３．５２ｎｇ／ｍＬ、平均値±ＳＤ）という事実にもかかわらず、総ＳＮＡ、総ＭＡｌＩ及びＭＡＬＩＩは癌群におけるより非癌群において高かった。このことは、差は統計的に有意ではなかった（それぞれ、ｐ＝０．４７、０．６７、及び０．５８）が、癌群におけるよりも非癌群においての総ＰＳＡのより高いシアル化を示唆しているだろう。
【０１３３】
全５２の対象（遊離ＰＳＡ％が４．７〜３１．８の範囲）及び遊離ＰＳＡ％が１０〜２０％範囲の２１の対象の癌及び非癌群のＲＯＣ分析が、それぞれ図３Ａ及び３Ｂに示されている。全５２の対象において遊離ＰＳＡ％（ＡＵＣ０．８５）が５つのアッセイ全て（ＡＵＣ０．５３〜０．６３）に対して優れていた（ｐ＜０．０５、図３Ａ）。しかしながら、遊離ＰＳＡ％が１０〜２０％範囲の２１の対象のサブセットでは、この差は統計的に有意ではないが（ｐ＝０．２７）、ＡＵＣ（０．７１ｖｓ．０．５４、図３Ｂに示した）が示しているように、総ＳＮＡアッセイが遊離ＰＳＡ％より優れた臨床成績を有していると見なされた。これらの２１の対象において、遊離ＰＳＡ％は、非癌群（１４．９８±３．２８％、平均値±ＳＤ、ｎ＝１１）と癌群（１４．９３±３．１９％、ｎ＝１０）の間で同等であったのに対して、総ＳＮＡアッセイでは、後者における平均（１７００４９±４９０６０）より前者における平均（２０４７１３±４０９６５）がより高い傾向を示した（ｐ＝０．０９）。しかしながら、その他の４つのレクチンアッセイは、１０〜２０％範囲の遊離ＰＳＡ％に渡る改善を示さなかった（図３Ｂに示されている）。
【０１３４】
１０〜２０％範囲の遊離ＰＳＡ％にわたる総ＳＮＡアッセイ成績の改善された傾向が１６の対象の別の集合（前立腺癌８、非癌８）にアッセイを適用して確認された。癌群（５．８１±２．３３ｎｇ／ｍＬ及び１４．５３±３．２０％）及び非癌群（４．９８±１．４７ｎｇ／ｍＬ及び１５．１４±２．６６％）における、総ＰＳＡ及び遊離ＰＳＡ％は、統計的な差がなかった（それぞれ、ｐ＝０．４０及び０．６８）。これらの１６の対象におけるＲＯＣ分析により、遊離ＰＳＡ％と比べた総ＳＮＡの改善された成績傾向が確認された（ＡＵＣ０．８０ｖｓ０．５３、図３Ｃ）。
【０１３５】
ＰＳＡは前立腺癌に対して利用可能な最も優れた腫瘍マーカーであるが、癌特異性が欠如しているために完全ではない。２５％を越えるカットオフ値及び１０％未満のカットオフ値をそれぞれ用いて、低い程度から高い程度の癌の危険性を評価することによって、遊離ＰＳＡ％はＰＳＡの癌特異性を改善した。しかしながら、中程度の遊離ＰＳＡ％（１０〜２０％）は未だ難題をもたらしている（Soroll et al., 2008）。実際には、患者の大部分がこの中程度の遊離ＰＳＡ％を有している。ＰＳＡが、その分子量の８．３％の糖質を有する２３７アミノ酸の一本鎖の糖タンパク質である（Belanger et al., 1995）ことを考慮して、改善するための取り組みは、アミノ酸及び糖質の両方の部分で、ＰＳＡの癌特異的形態を探索することに集中している。前者の１つの例は、プロリーダー配列中に２つの追加のアミノ酸を有しているＰＳＡの切断型前駆体形態である、［−２］ｐｒｏＰＳＡである（Mikolajczyk et al. 2004）。最近、［−２］ｐｒｏＰＳＡの自動免疫アッセイが開発されて多施設研究で用いられ、これは、［−２］ｐｒｏＰＳＡが、特に２〜１０ｎｇ／ｍＬの総ＰＳＡ範囲において、遊離ＰＳＡ％より優れた前立腺癌の予知因子であったことを示した（Sokoll et al. 2008）。
【０１３６】
癌特異性を担持していると思われるＰＳＡの糖鎖付加形態の探索は約２０年前に開始された（Barak et al. 1989; Chan et al. 1991）が、進展は遅い。それにもかかわらず、グリカン分析の最近の科学技術の進歩によって、特に精液及び非癌血清由来のＰＳＡと比較したときに前立腺癌由来ＰＳＡの異なったグリカン構造を説明した最近の発表（Tabares et al., 2006; Peracula et al., 2003; Tajiri et al., 2008）後に、新たな関心が寄せられている。このことは血清におけるＰＳＡ糖鎖付加を検出するための臨床的に有用で直接的なアッセイの開発が将来有望であることを示唆した。
【０１３７】
本発明は、血清におけるＰＳＡシアル化を直接分析するための５つのレクチン免疫吸着アッセイの開発について記載している。レクチン免疫吸着アッセイは、レクチンをグリカン構造を検出するためのプローブとして用いることを除けば、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）と似ている（Lotan et al. 1979）。純粋な形態で容易に入手可能な、レクチンは、１）これらは相補的糖結合部位を介して単糖類又はオリゴ糖類に対する特異性を有していて、２）これらは通常タンパク質骨格と相互作用しないので、グリカン構造のプローブとして広く用いられている。しかしながら、レクチン免疫吸着アッセイは、３つの理由により、少数の研究室でのみ用いられている。第１に、これらのアッセイで用いられる抗体は脱グリコシル化する必要があるか、別には、レクチンが、抗体が捕捉したタンパク質上のグリカンと結合するだけでなく抗体上のグリカンにも結合してしまい、高いバックグラウンドを生じる（McCoy et al. 1983; Mehta et al. 2008; Gornik et al. 2007）。第２に、レクチンの結合親和性（１０６〜５×１０７Ｍ−１の範囲）が抗体のそれ（〜１０８〜１０１２Ｍ−１）より１００〜１０，０００倍低く（Lotan et al., 1979; Davies et al. 1994）、そして目的の検体が通常血清中で非常に低い濃度（〜ｎｇ／ｍＬ）を有するので、これらのアッセイの検出の限界が〜ｎｇ／ｍＬ範囲と十分ではない。第３に、グリカンはグリカンのみに特異性を有していてタンパク質には有していないので、これらは、レクチン免疫吸着アッセイにおける目的の糖タンパク質以外のバックグラウンド糖タンパク質上のグリカン構造にも結合して（Gornik et al. 2007）、感受性を悪化させるバックグランドを増大する。これは、血清タンパク質の大部分が糖鎖付加されているために、特に血清材料を用いるときに問題となり得る。
【０１３８】
本発明は、高いバックグラウンドを減少して、結合特異性を増大して、そして感度の高い検出方法を用いる、相応の分析的に高い感度であって血清中のＰＳＡシアル化の直接分析に特異的である、５つのレクチン免疫吸着アッセイの開発について記載している。本明細書に記載されているアッセイにおいて、血清試料からＰＳＡを捕捉するために用いられる総及び遊離ＰＳＡ抗体は、その場(in  situ)で２０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化する。これは抗体上の糖質構造を選択的に破壊して、レクチンのそのグリカンへの結合を阻害し、抗体の結合能力を保全する（Gornik et al. 2007）。更に、レクチンのバックグラウンド糖タンパク質のグリカンとの結合由来の高いバックグラウンド信号を、１％のＢＳＡを検出緩衝液中に添加することによって減少する。結合特異性を増大するために、ビオチン化レクチン及びストレプタビジンＳＵＬＦＯ−ＴＡＧは、レクチンの結合がその低い結合親和性によって減少してしまう長期に渡る洗浄を阻止するために別々の工程でそれらを用いるよりむしろ、検出緩衝液中で一緒に混合する。最後に、ＭＳＤプラットフォームで電気化学発光を用いて、検出法の感度を増大させた。
【０１３９】
これらのアッセイの分析的な利点は多種多様である。第１に、９６ウェルのプレートを用いると、これらのアッセイはハイスループットとなり、１日の内に数百の試料の分析が可能になる。第２に、 Taberes らが質量分析によるオリゴ糖のプロファイルを用いて実施したのと同様に (Taberes et al. 2006）、前立腺癌血清中のＰＳＡシアル化を精液中のそれと比較するよりむしろ、これらのアッセイは、１０ｎｇ／ｍＬ未満のＰＳＡを有する非癌血清中のＰＳＡシアル化を分析して、それらを対応する前立腺癌血清と比較するのに十分な検出限界（０．０４〜１．３５ｎｇ／ｍＬ）を有している。最後に、これらは血清中のＰＳＡシアル化を、これを間接的に測定するレクチン親和性クロマトグラフィー（Ohyama et al. 2004）とは対照的に、直接検出する。これらの特徴の結果として、これら５つのレクチン免疫吸着アッセイは、ＰＳＡの癌特異性の改善における、糖タンパク質分析の潜在的役割の臨床研究のための優れた手段である。
【０１４０】
プール血清の検討から得た結果は、ＰＳＡのα２，３−結合及びα２，６−結合シアル化が、非癌におけるよりも、癌においてより不均一であることを示した。上記のように、プール血清を用いても、個体由来の試料（すなわち、プールしていないもの）を用いても、実験を同様に効果的に実施できるということに留意されたい。この観察は、前立腺癌由来のＰＳＡが、二分岐のオリゴ糖のみを有している正常ＰＳＡとは異なり、二分岐、三分岐、及び恐らく四分岐のオリゴ糖の混合物であるという、グリカン構造分析からの知見と一致していて、これは前立腺上皮の発癌性形質転換がＰＳＡのＮ−結合糖化処理に特異的に影響するという仮説（Prakash et al. 2000）を支持する。更に、ＭＡＬＩ及びＭＡＬＩＩによって評価されたα２，３−結合シアル化パターンは非常に類似していて、ＭＡＬＩ及びＩＩが、ＰＳＡ上のより類似の糖質構造と結合する可能性があることを示した。
【０１４１】
これら５つのレクチン免疫吸着アッセイの臨床成績の評価は、総ＰＳＡのα２，６−結合シアル化が、１０〜２０％範囲の遊離ＰＳＡより優れた前立腺癌の予知因子であろうということを明らかにした。
【０１４２】
Ohyama et al による以前の報告は、総ＰＳＡのＤＮＡ結合画分が前立腺癌をＢＰＨと区別できないことを示したが、我々の検討はこれが有望であることを示した。この差は、材料の種類、用いる方法、更には診断的グレーゾーンに入る遊離ＰＳＡ％を有している臨床的に意義のある患者に注目したことにも起因している。われわれの検討が癌症例群と非癌対照群において同じ総ＰＳＡの濃度を有する試料を用いたのに対して、Ohyama et al の文献は、癌の群に非癌群よりも非常に高い総ＰＳＡ濃度を有する試料を用いた（平均総ＰＳＡ濃度：８９ｎｇ／ｍＬ ｖｓ ８．８ｎｇ／ｍＬ）（Ohyama et al）。高いレベルのＰＳＡが、一般に大量且つ高い悪性度の癌と関連があって、この癌は、低いレベルのＰＳＡに関連している少量且つ低い悪性度の癌とは異なった糖鎖付加ＰＳＡを産生しうるために、この際立った相違が、癌群において糖鎖付加ＰＳＡの異なった形態の存在をもたらす可能性がある。更に、Ohyama et alらの文献 では、レクチン親和性クロマトグラフィー、次いでＰＳＡの免疫検出を用いた。糖鎖付加ＰＳＡのクロマトグラフ分離は、レクチン免疫吸着アッセイによって検出されたものと異なった形態の糖鎖付加ＰＳＡを検出するかもしれない。それらの結果は逆を説明している一方で、これらの違いが、何故われわれのＭＡＬＩＩアッセイは、非癌から前立腺癌を識別できないかを説明しているのかもしれない。
【０１４３】
本明細書に提示されている結果は、２１の対象での最初の検討及び１６の対象での別の検討の両方において、総ＰＳＡのα２，６−結合シアル化についてのアッセイが、その診断的グレーゾーンにおける遊離ＰＳＡ％（遊離ＰＳＡ％＝１０〜２０％）と比較して、前立腺癌の検出を改善するということも示唆している。別の糖質部分（例えば、フコース）を認識するレクチンを用いる免疫吸着アッセイも想定される。これらのアッセイは、癌遺伝子における無秩序な糖鎖付加及び進行を理解するのにも役立ち、非癌患者からの前立腺癌の識別を改善するために臨床的に用いることができる。
【０１４４】
実施例２：臨床材料由来の候補糖タンパク質の糖鎖付加パターン分析
この検討において、糖鎖付加パターンプロファイリング用の感度が良くハイスループットな分析を確立するためにモデルタンパク質としてＰＳＡを選択した。健常者と癌患者由来のＰＳＡの区別される糖鎖付加パターンを調査するために、ＰＳＡタンパク質を最初に正常及び癌の組織試料から抽出した。ＰＳＡタンパク質を同量に調節し、そして高密度レクチンマイクロアレイでプロファイルしてＰＳＡ糖質パターンを広範囲に検出した。正常群と癌群の間で異なったシグナルを示すレクチンを標的候補マーカーとして選択した。グリカン−レクチン相互作用を定量的に分析するために、ＥＣＬをベースとする超高感度レクチン−抗体免疫アッセイを開発して、臨床試料中の標的ＰＳＡグリカン−レクチン結合をｎｇ／ｍＬレベルで分析した。開発したレクチン−抗体免疫アッセイを用いるレクチンマイクロアレイ検討の分析結果を立証するために、プールした正常組織及び癌組織の試料の追加セットを用いた。ここでも、プール血清を用いても、個体由来の血清試料（すなわち、プールしていないもの）を用いても、実験を同様に効果的に実施できるということに留意されたい。
【０１４５】
高密度レクチンマイクロアレイを用いる標的糖タンパク質の糖鎖付加パターの検出
高密度レクチンマイクロアレイの感度を確認するために、高密度レクチンマイクロアレイを用いて異なった量のＰＳＡをプロファイルした。９４のレクチンをＮＨＳエステル化学を用いてガラススライド上に固定した。以下の表４に示すように、それぞれのレクチンを４濃度勾配に連続希釈してそれぞれの濃度で２回出力した。表４は、レクチンマイクロアレイを用いる前立腺組織及び血清由来のＰＳＡと結合する検出可能なレクチンのリストを示している（数字はシグナル対ノイズ比を表し、シグナルは特定のレクチンのＰＳＡに対する結合であり、ノイズは同一レクチンのＰＳＡ無しの時のものである）。
【０１４６】
【表４】
2011529184.tif 000005
【０１４７】
グリカン−レクチン結合は抗原−抗体結合と同様には特異的ではないので、糖鎖付加分析では検出感度が重要な問題である。検出特異性を増大するために、第１及び第２抗体の追加の酸化処理を用いて、糖のシス−ジオール基を破壊して固定化レクチンと抗体の間の相互作用を回避することが好ましい。図４Ａは、レクチンマイクロアレイの陰性（ＴＢＳＴ緩衝液）及び陽性（２００ｎｇのＰＳＡタンパク質）試験を示す。陰性スライドの低いシグナルは、レクチンマイクロアレイが低いバックグラウンドノイズを有していることを明らかにした。レクチンのシグナルはＰＳＡタンパク質の添加後のみに観察され、このことはＰＳＡのグリカンがレクチンスポットと特異的に結合したことを示している。検出可能シグナルの基準を（１）レクチンスポットのＳ／Ｎ比＞１．５；（２）試料（精液ＰＳＡのＳ／Ｎ比）の特定のレクチンのブランク（陰性試験のＳ／Ｎ比）に対する比＞１．２：と設定した。検出可能なレクチンスポット全てについて、シグナルは、ＰＳＡの量と関連していて、ＰＳＡレベルが高くなると増加した。幾つかのグリカン−レクチン結合の検出限界（ＬＯＤ）は：ＳＮＡ−１についてはグリカン−レクチン結合のＰＳＡ０．２ｎｇ；ＣＡＬＳＥＰＡ及びＬｃＨ ＡについてはＰＳＡ２ｎｇ；ＬｃＨについてはＰＳＡ２０ｎｇ；そしてスクシニルＣｏｎＡ及びＭＮＡ−ＭについてはＰＳＡ２００ｎｇであると明らかになった。２つのレクチン：ＳＮＡ−１及びＣＡＬＳＥＰＡのグリカン−レクチン結合曲線を例として図４Ｂに示した。
【０１４８】
高密度レクチンマイクロアレイを用いる臨床試料から抽出したＰＳＡタンパク質の糖鎖付加プロファイリング
ＰＳＡ免疫沈降法を用いて、プールした臨床試料：正常前立腺組織（Ｎ−Ｔ＿１、Ｎ−Ｔ＿２）及び前立腺癌組織（Ｃ−Ｔ＿１、Ｃ−Ｔ＿２）：から最初にＰＳＡタンパク質を抽出した。検出シグナルを増強するために、それぞれの試料から抽出した４０ｎｇのＰＳＡをレクチンマイクロアレイでプローブした。ＰＳＡがないブランク試料を陰性対照として用いた。上記と同じ基準を用いて、検出可能なシグナルを区別した。両方のアレイ上に検出可能なシグナルを有しているレクチンを表１に挙げた。次いで、正常及び癌の組織由来のレクチンシグナルを比較した。３つのレクチン、ＳＮＡ−１、ジャカリン、及びＬｃＨは、以下の表５に示されているように、レクチンマイクロアレイにおいてＣ−Ｔ＿１及びＣ−Ｔ＿２の両方の癌群で上方制御されることが示されている。
【０１４９】
【表５】
2011529184.tif 000006
【０１５０】
このデータは、総ＰＳＡタンパク質が、癌組織中のレクチンＳＮＡ−１、ジャカリン、及びＬｃＨに対応する、シアル酸、Ｏ−結合ガラクトース、及びＦｕｃａ １−６群を有するＭａｎ／ＧｌｃＮＡｃをより多く有していることを示した。更に、プールした前立腺癌血清（Ｃ−Ｓ＿１、Ｃ−Ｓ＿２）から抽出したＰＳＡ４０ｎｇを、処理手続きに従ってレクチンマイクロアレイでプローブした。良性前立腺肥大（ＢＰＨ）血清及び正常血清中のＰＳＡが超低量のため、対照群として、十分な量のＰＳＡがＢＰＨ又は正常血清から採取できなかった。従って、癌血清と良性／正常血清の間でレクチンマイクロアレイを用いて糖質パターンの直接比較は不可能であった。しかしながら、癌血清中の検出可能なレクチンシグナルが有用な情報をもたらした。血清中の検出可能なレクチンシグナルは、癌検出のための新規な血清マーカーとして選択される可能性を有しているので、血清の検出可能なグリカン−レクチン結合が血清マーカーを発見するための候補群をもたらしている。全体的に見て、３つのレクチンを更なる検証研究に対する標的候補として選択した。これらは全ては、癌と正常組織の間で異なった発現パターンを示しており、血清試料中に検出可能であった。これらの糖質は、前立腺癌を正常組織と区別するための候補グリカンマーカーになる可能性を有していて、その検証研究において超高感度免疫アッセイに用いて検証されるだろう。
【０１５１】
標的グリカン−レクチン分析のための超高感度電気化学発光による免疫アッセイの開発
グリカン−レクチン結合比を定量的に測定するために、電気化学発光（ＥＣＬ）による免疫アッセイを、粗製の臨床材料中のＰＳＡ糖鎖付加パターンを検出するために超高感度分析の開発に適用した。癌血清から抽出したＰＳＡを、プールした健常な女性血清に異なった量で混入した。最終ＰＳＡ濃度は、臨床ＰＳＡアッセイを用いて測定して、４６９．３、１２９．７、３６．１、８．８、２．５６、０．６９〜０．１９ｎｇ／ｍＬであった。最初にＰＳＡタンパク質を複雑な臨床混合物からＰＳＡモノクローナル抗体で捕捉し、次いで、ビオチンラベルで予め標識してあるレクチンと結合させた。ＥＣＬ検出試薬に抱合されているストレプタビジンがビオチンラベルを認識した。リーディングバッファーを添加した後に、ＥＣＬプレートに検出電圧をかけると、電気化学発光シグナルが観察された。ＳＮＡ及びジャカリンのアッセイの両方で、混入したＰＳＡタンパク質の量の増大とともに、電気化学発光シグナルが増大した。ビオチン化ＬｃＨを市販供給源から入手できなかったので、ＬｃＨアッセイを開発することができなかった。グリカン−レクチン結合曲線を、特殊な結合様式を用いてヒル傾斜（Hill-slope）と一致させて統計的パラメータを算出した。ＳＮＡ及びジャカリン結合のＬＯＤｓ及びＣＶｓを図５に示す。図５は、これらの開発された免疫アッセイがＰＳＡの診断的グレーゾーン（４〜１０ｎｇ／ｍＬ）での糖鎖付加パターンの分析に、優れた再現性を有して適合していることを示している。
【０１５２】
前立腺癌組織試料における開発されたＥＣＬによる免疫アッセイを用いる標的レクチン−グリカン結合の検証
開発されたＥＣＬによる免疫アッセイを用いて標的グリカン−レクチン相互作用を検証するために、異なった患者材料からプールする正常及び癌の組織試料の追加のセットを調製した。両方のプール試料を１倍のＴＢＳＴ緩衝液を用いて希釈して、正常群と癌群で同レベルのＰＳＡ濃度にした。ＳＮＡ及びジャカリン免疫アッセイの両方で、プールした前立腺癌組織試料が正常組織よりも高いシグナルを有していることを示した。これらの結果は、図６に示されているように、レクチンマイクロアレイ検討の分析結果と一致した。
【０１５３】
タンパク質の糖鎖付加は、膜タンパク質、細胞表面タンパク質、及び分泌タンパク質を含む細胞外環境に発現されるタンパク質の最も一般的なタンパク質修飾の１つである。これらのタンパク質は、治療或いは診断目的で最も利用しやすいタンパク質の１つである。また、ＦＤＡ（食品医薬品局）承認の癌タンパク質マーカーは全て糖タンパク質である。前立腺癌の診断のためのＰＳＡのような、糖タンパク質マーカーの検出力を増強するために、マーカータンパク質の糖質発現についての本検討は、癌検出を改善する方法として提供された。ＦＤＡ承認のマーカーの大部分は臨床試料中の少量タンパク質を対象にしている。更に、糖分析用に従来のクロマトグラフィー或いは電気泳動法を用いて臨床材料から少量存在するタンパク質を十分に採取するのが困難であることもある。例えば、公表論文の大部分は、精液由来のＰＳＡと前立腺癌細胞株から採取したＰＳＡを用いるように、非臨床試料由来ＰＳＡタンパク質のグリカンパターンを比較しなければならなかった。ＰＳＡの糖質が異なった細胞培養環境で発現されるので、報告されている結果がＰＳＡのグリカンパターンの臨床的状態を示していないということは驚くべきことではない。従って、糖鎖付加発現の検討は臨床適用のためには臨床材料との直接関連付けられるのが好ましい。
【０１５４】
臨床試料中の少量のマーカータンパク質を考慮すれば、糖質プロファイリングについては検出感度が最も重要視すべきことである。ＬＯＤをｎｇ或いはｎｇ／ｍＬレベルにまで減少させるために、本明細書に記載されている実験手法を両方の分析に対して最適化した。レクチンマクロアレイ検出については、レクチンと他のタンパク質由来のグリカンとの相互作用を避けるために、ＰＳＡタンパク質を最初に臨床試料から抽出した。次いで、ＰＳＡ抗体を加えてサンドイッチＥＬＩＳＡを完結させて検出特異性を増大させた。ＰＳＡ抗体及び蛍光標識を酸化して、糖のシス−ジオール基を破壊し、それによってレクチンとこれらのタンパク質由来グリカンとの相互作用を減少した。全ての処置を組合せることによって、レクチンマイクロアレイの幾つかのレクチンのＬＯＤｓをＰＳＡの０．２ｎｇ及び２ｎｇに減少した。ＥＣＬによるレクチン−抗体免疫アッセイについては、ＭＳＡプレート上にコーティングしたＰＳＡ抗体を過酸で処理して糖の基を破壊した。
【０１５５】
電気化学発光（ＥＣＬ）検出は、従来のＥＬＩＳＡと比較して、超高感度な分析法である。ＥＣＬ検出において、リーディング電圧がプレートに加わると、ＥＣＬ−標識検出試薬からの発光を機器が測定する。励起光源は検出に対する更なるバックグラウンドノイズを引き起こさなかった。また、電極の表面近く（プレートの下部）に存在した抗体に捕捉されたＰＳＡ−レクチン複合体のみを検出できた。ウェルの壁に付着した非特異結合タンパク質は、電気エネルギーを得ることができずに、このシステムにノイズを生じる。レクチンマイクロアレイとＥＣＬ検出の両方が、本検討において適切に優れた再現性をもって、ＰＳＡのｎｇ或いはｎｇ／ｍＬ以下でのＰＳＡ糖鎖付加パターンの分析を可能にした。
【０１５６】
検出処理能力は臨床的検出の別の検討事項である。レクチンマイクロアレイは、１つの単一試験で数百のレクチンをプロフィルできる。しかしながら、臨床試料の更なる処理が必要である。レクチンと別の組織又は血清タンパク質由来のグリカンとの相互作用を避けるために、標的タンパク質を臨床試料から単離しなければならなかった。これはプレプロファイリングに対しては最適な手段であったが、大量の臨床試料のセットに対して糖鎖付加発現をプロファイルするには適していないだろう。ＥＣＬによる免疫アッセイは、従来のＥＬＩＳＡと同様なフォーマットを有した。ＰＳＡタンパク質は、ＭＳＤプレートにコーティングしてあるＰＳＡ抗体によって複雑な臨床試料から捕捉することができた。更なる試料処理は必要なかった。臨床材料をこの検出プラットフォームではプレートに直接添加することができる。従って、大量の臨床試料を分析するためのハイスループットな検出が可能である。
【０１５７】
好ましくも、正常臨床試料と癌臨床試料の間の糖鎖付加パターンを比較するために、定量分析を好ましく確立した。レクチンマイクロアレイは、レクチンスポットがレクチン分子のある特定の量しか保持しないので、絶対定量分析を適切にもたらすことができない。ＰＳＡタンパク質の量が、特に低レクチン濃度スポットで、固定化レクチンの量を超えると、スポットが飽和して実際のＰＳＡレベルを示すことができない。従って、標的グリカン−レクチン結合についての超高感度ＥＣＬによる免疫アッセイを適切に開発して、レクチンマイクロアレイの結果を追加の臨床試料セットを用いて検証した。
【０１５８】
本明細書に記載されているデータ及び結果は、臨床材料中の糖鎖付加パターンを検討するために、高密度レクチンマイクロアレイ及びＥＣＬによるレクチン−抗体免疫アッセイを組み合わせた二相の分析プラットフォームを表している。大量のレクチンを、標的グリカン−レクチン結合を予備スクリーニングするために、癌患者由来の標的タンパク質で適切にプロフィルした。ＥＣＬによる免疫アッセイを選択されたレクチン標的に対して好ましく開発して、レクチンマイクロアレイの結果を追加のプールされた試料セットを用いて検証した。この方法は、前立腺の正常な及び癌の組織試料由来のＰＳＡタンパク質の糖鎖付加の変化をプロファイルするために用いられている。レクチンＳＮＡ及びジャカリンは、癌試料において上方制御されたシグナルを示し、ＥＣＬによる免疫アッセイを用いて検証されている。詳細なグリカン構造が無くても、この二相の分析プラットフォームは、臨床材料中の糖鎖付加パターンをプロフィルするための、的確な、超高感度の、再現可能な、そしてハイスループットの方法で、癌関連情報を提供できる。
【０１５９】
方法
本発明は、これに限定されないが、以下の方法で実施された。
ヒト血漿試料
生検の前に、前立腺癌を生検で確認されている患者２６人及び非癌を生検で確認されている患者２６人から個々の血清試料を得た。非癌群及び癌群の総ＰＳＡ濃度を、大多数（８７％）が４〜１０ｎｇ／ｍＬの総ＰＳＡ濃度を有するように、整合した。更に、前立腺を有する患者及び有していない患者から、それぞれ、３つの前立腺癌血清プール及び３つの非癌血清プールを調製した。これら６つのプールの総及び遊離ＰＳＡ濃度の両方を整合して、総ＰＳＡ濃度が５〜６ｎｇ／ｍＬの範囲に、そして遊離ＰＳＡ濃度が０．８〜１．６ｎｇ／ｍＬになるようにした。総ＳＮＡアッセイの臨床成績を検証するための別個の検討に用いた１６の対象（癌８及び非癌８）は、３．１〜１０．４ｎｇ／ｍＬの範囲の総ＰＳＡ濃度及び９．２〜２０．３％の範囲の遊離ＰＳＡ％を有していた。
【０１６０】
試薬
メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）９６ウェル標準プレート、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ、及びＭＳＤプレートリード緩衝液Ｔ(４Ｘ)は、 Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD）から入手した。総及び遊離ＰＳＡモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ ＢＰ００１及びＡＰ００３Ｓ）は、 Scripps Laboratory から入手した。ヒトＰＳＡ（ヒト精液由来の１００％遊離ＰＳＡ)は Lee Biosolutions, Inc (St.Louis, MO）から入手した。ビオチン化セイヨウニワトコレクチン（ＳＮＡ）、ビオチン化イヌエンジュマメレクチンＩ（ＭＡＬＩ）、ビオチン化イヌエンジュマメレクチンＩＩ（ＭＡＬＩＩ）は 、Vector Laboratories (Burlingame, CA）から入手した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びツイン２０は Sigma-Aldrich (St,Louis, MO）から入手した。１０Ｘトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）は Bio-Rad (Hercules, CA）から入手した。
【０１６１】
レクチン免疫吸着アッセイ
ＭＳＤプレートを３０μＬのＰＳＡモノクローナル抗体で７．５ｕｇ／ｍＬの濃度でコーティングして、４℃で１晩培養した。結合しない抗体溶液を破棄して、５％ＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液１５０μＬを用い、室温（ＲＴ）で１時間振盪してブロックした。次に、ＴＢＳ＋０．１％（ｖ／ｖ）ツイン２０を用いて、プレートを３回洗浄した。レクチンがＰＳＡ抗体上の糖質決定基と結合するのを防ぐために、プレートにコーティングしてある抗体を、４℃で１時間、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中で調製した１５０μＬの過ヨウ素酸ナトリウム緩衝液で処理した。１４、１５  処理に続いて、プレートを前記のように洗浄し、５０μＬの血清試料をそれぞれのウェルに添加して、室温で２時間、振盪培養した。ＴＢＳ＋０．１％ツイン２０緩衝液でプレートを１０回洗浄して、８０μＭのビオチン化レクチン（例えば、ＳＮＡ、ＭＡＬＩ又はＭＡＬＩＩ）及び５μＭのＭＳＤストレプタビジンＳＵＬＦＯ−ＴＡＧを含有している２５μＬの検出緩衝液をそれぞれのウェルに添加して、ＲＴで１時間培養した。最後に、１５０μＬの１Ｘ ＭＳＤプレートリード緩衝液をそれぞれのウェルに添加し、MSD SECTOR Imager ２４００を用いて電気化学発光（ＥＣＬ）検出を行った。
【０１６２】
分析成績の評価
多種濃度のヒト精液ＰＳＡと混合したプール女性血清（最終濃度：０．０１、０．７６、２．３４、７．０５、２３．０３、及び４６．８６ｎｇ／ｍＬ）をアッセイを開発するために用いた。バックグラウンドのシグナル（０ｎｇ／ｍＬ濃度）にバックグラウンドの標準偏差（ＳＤ）の３倍を足すことによって、検出限界（ＬＯＤ）を算出した。これらのプール中の総及び遊離ＰＳＡ濃度は同じであった。内因性総ＰＳＡ（４．１２ｎｇ／ｍＬ及び１１．２２ｎｇ／ｍＬ）及び内因性遊離ＰＳＡ（０．９１ｎｇ／ｍＬ及び０．９９ｎｇ／ｍＬ）の２つのレベルでプール男性血清を用いて、同時再現性（ｎ＝２７）を評価した。これらの試料中の総及び遊離ＰＳＡ濃度を、それぞれBeckman ACCESS Hybritech PSA 及び Free PSA assay、を用いて測定した。
【０１６３】
データ分析
これら５つのレクチン免疫吸着アッセイから得られたＰＳＡ糖鎖付加の結果を、電気化学発光強度で表した。検討群間の差を比較するために、マンホイットニーＵ検定を用いた。ＲＯＣ曲線を構築して、それらの領域及び信頼区間（ＣＩｓ）を計算するために統計ソフトウェア ＭｅｄＣａｌｃ を用いた。
【０１６４】
材料
Nexterion H Slide は、SCHOTT North America Inc. (Lousville, KY）から購入した。９４のレクチンは、Dr. Heng Zhu から提供され、そして４つの市販の供給源から集めた（表４に示されている）。精液由来のヒトＰＳＡは、Lee BioSolutions, Inc. (St.Louis, MO）から入手した。マウス抗−ヒトＰＳＡ抗体は、Scripps Laboratories (San Diego, CA）から入手した。ウサギ抗−マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７複合体は、Invitrogen (Eugene, OR）から入手した。非タンパク質ブロッカーは、Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL）から入手した。レクチンマイクロアレイ用の培養チャンバー及びホルダーは、Whatman Schleicher & Schuell (Keene, NH）から入手した。抗−ヒトＰＳＡ（総）抗体をコーティングした電磁ビーズは、Beckman Coulter Inc. (Fullerton, CA）から入手した。MESO SCALE DISCOVERY(MSD) ３８４ウェル標準プレート、ブロッカーキット、MSD SMLFO-TAG、ＭＳＤプレートリード緩衝液Ｔ（４Ｘ）を含有している、電気化学発光アッセイは、Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD）から購入した。ウサギ抗−ヒトＰＳＡ抗体は、Affinity Bioreagents (Golden, CO）から入手した。過ヨウ素酸ナトリウムは、Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA）から入手した。ビオチン化ジャカリン及びビオチン化セイヨウニワトコレクチン（ＳＮＡ）は、Vector Laboratories (Burlingame, CA）から入手した。その他の全ての化学品及び試薬は、Sigma-Aldrich(St.Louis, MO）から購入した。
【０１６５】
プール前立腺癌組織
Ｎ−Ｔ＿１、Ｎ−Ｔ＿２、Ｎ−Ｔ＿３、プール健常前立腺組織Ｃ−Ｔ＿１、Ｃ−Ｔ＿２、Ｃ−Ｔ＿３、及びプール前立腺癌血清Ｃ−Ｓ＿１、Ｃ−Ｓ＿２は、Johns Hopkins University の Clinical Chemistry Laboratory で調製された。ＰＳＡ濃度は、Beckman ACCESS Hybritech ＰＳＡアッセイを用いて測定した。
【０１６６】
レクチンマイクロアレイの製作及び品質管理
レクチンタンパク質を０．０２％のツイン２０及び２５％のグリセロールを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中に、最終濃度が１μｇ／μＬになるように再懸濁した。スポット形態を改善するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、０．０５μｇ／μＬ）も緩衝液に添加した。Chip Writer Pro (Bio-Rad, Hercules, CA）マイクロアレイヤーを用いて Nexterion H Slides 上にレクチンをプリントした。４つの濃度のレクチンを各ブロックに２回プリントして、スライド当たり６組のレクチンブロックをプリントした。プリントした後、スライドをアルミホイルで覆って、後で使うために４℃で保管した。レクチンスポッティングの品質をモニターするために、マイクアレイを、１００倍に希釈した５４９ ＮＨＳ エステル（DyLight）を用いて室温で１時間染色した。染色したスライドをＴＢＳＴ（１×ＴＢＳ＋０．１％ツイン２０）で２回洗浄し、続いて水で１回洗浄した。乾燥したスライドを、GenePix 4100B (Axon, Sunnyvale, CA）スキャナーを用い分解能１０μｍでスキャンした。スキャニングの条件は、Ｃｙ３チャンネルで６００ｍＶのレーザー出力及び３３％のＰＭＴ値であった。
【０１６７】
精液ＰＳＡを用いる高密度レクチンマイクロアレイの感度試験
レクチンマイクロアレイを培養チャンバー及びアレイホルダーに組み入れて、以下の手順を用いてＰＳＡ試料をプローブした。最初に、レクチンマイクロアレイを表面ブロッキングするために、ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０)中のエタノールアミン５０ｍＭに１時間浸した。ブロックされたスライドをＴＢＳＴ緩衝液を用いて１回、続いて水で洗浄した。スライドを５００ｇで５分間回転させて乾燥した。第２に、精液から単離した０ｎｇ、０．０２ｎｇ、０．２ｎｇ、２ｎｇ、２０ｎｇ、及び２００ｎｇのＰＳＡタンパク質を、１×ＴＢＳＴ緩衝液を用いて２００μＬに希釈した。試料をレクチンブロックのそれぞれのセットに添加して、室温（ＲＴ）で２時間ゆっくり振盪して培養した。次いでマイクロアレイを、２００μＬの１×ＴＢＳＴ緩衝液で３回濯いで、結合していないタンパク質を除去した。第３に、第１抗体（マウス抗−ヒトＰＳＡ抗体）及び第２抗体（ウサギ抗−マウスＩｇＧ−Alexa Fluor ６４７複合体）を２０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムと４℃で１時間暗所で混合して、糖基のシス−ジオール結合を酸化した。２μｇ／ｍＬ酸化マウス抗−ヒトＰＳＡ抗体の２００μＬをマイクロアレイと１時間ゆっくり振盪してハイブリダイズした。遊離の抗体を除去するために追加の洗浄を行った。第４に、２μｇ／ｍＬ酸化ウサギ抗−マウスＩｇＧ−Alexa Fluor ６４７複合体の２００μＬを第２抗体として添加して、マイクロアレイと１時間ゆっくり振盪してハイブリダイズした。ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄した後、マイクロアレイを培養チャンバーから取り出して水で２回洗浄した。アレイを５００ｇで５分間回転して乾燥し、次いで直ちに、GenePix 4000B スキャナーにより波長６４７ｎｍ及びＰＭＴ設定８００でスキャンした。スライドの画像を GenePix ３．０ソフトウェアを用いて分析して、自作の「ＧＡＬ」ファイルを用いて数値形式（ＧＰＲ）に変換した。スポットのフォアグランド強度の中央値、スポットのバックグランド強度の中央値、及びレクチンタンパク質の同定をこの分析で用いた。各レクチンスポットのＳＮ比（スポットのバックグランド強度の中央値に対するスポットのフォアグランド強度の中央値）を各レクチンの検出限界（ＬＯＤ）を分析するために用いた。
【０１６８】
高密度レクチンマイクロアレイを用いる臨床試料から抽出したＰＳＡのグリカンプロファイリング
各プール臨床試料（Ｎ−Ｔ＿１、Ｎ−Ｔ＿２、Ｃ−Ｔ＿１、Ｃ−Ｔ＿２、Ｃ−Ｓ＿１、Ｃ−Ｓ＿２）の５０μＬを抗−ヒトＰＳＡ（総）抗体をコーティングした電磁ビーズ１００μＬと４℃で１２時間培養した。ビーズを１×ＴＢＳＴ緩衝液で６回洗浄した。１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．３）を１００μＬ用いて電磁ビーズからＰＳＡタンパク質を３回溶出した。溶出液を集めて、３０μＬの１０×ＴＢＳＴ緩衝液及び５μＬ〜１０μＬの３０％ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調整した。Beckman ACCESS Hybritech ＰＳＡアッセイを用いて最終ＰＳＡ濃度を測定した。各プール臨床試料のＰＳＡタンパク質４０ｎｇを１×ＴＢＳＴ緩衝液２００μＬに希釈した。上記の操作手順を用いてＰＳＡ試料をレクチンマイクロアレイと培養した。ＰＳＡタンパク質を含有していない２００μＬの１×ＴＢＳＴ緩衝液をこの試験の陰性対照として用いた。対応するレクチンスポットのブランクアレイのＳＮ比で割った臨床ＰＳＡタンパク質のＳＮ比をデータ分析に用いた。
【０１６９】
ＰＳＡタンパク質の標的グリカン−レクチン相互作用についての電気化学発光による超高感度免疫アッセイ
グリカン−レクチン相互作用を定量的に検出するために、ＥＣＬによる分析を用いて、標的レクチンに対する超高感度免疫アッセイを確立した。３８４−ＭＳＤプレートを最初に１０μｇ／ｍＬマウス抗−ヒトＰＳＡ抗体１０μＬで１晩４℃でコーティングした。次いで、ＭＳＤプレートを５０μＬの非タンパク質ブロッカーを用いて室温で１時間ゆるやかに振盪してブロックした。１×ＴＢＳＴ緩衝液を用いてプレートを洗浄した。レクチン−ＰＳＡ抗体結合由来のバックグランドを減少するために、コーティングされているＰＳＡモノクローナル抗体を、４℃の暗所で１時間２０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを５０μＬ用いて酸化して、糖のシス−ジオール基を破壊した。１×ＴＢＳＴ緩衝液を用いて、過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを３回洗い流した。プール前立腺癌血清から抽出したＰＳＡタンパク質を、プール健常女性血清を用いて希釈して、４倍希釈によって１０００ｎｇ／ｍＬ〜０．２４４ｎｇ／ｍＬの濃度勾配を作成した。Beckman ACCESS Hybritech ＰＳＡアッセイを用いて最終ＰＳＡ濃度を測定した。１０μＬの試料をＭＳＤのウェル内で緩やかに振盪して室温で２時間、３通りに培養した。ＴＢＳＴ緩衝液を用いて結合しなかったタンパク質を３回洗い流した。次いで、２０μｇ／ｍＬのビオチン化レクチン及び５μｇ／ｍＬのストレプタビジンＳＭＬＦＯ−ＴＡＧの１０μＬをそれぞれのウェルに添加して、室温で１時間緩やかに振盪して培養した。１×ＴＢＳＴ緩衝液を用いて、過剰のレクチン及びＳＭＬＦＯ−ＴＡＧを３回洗い流した。最後に５０μＬの１Ｘ ＭＳＤリード緩衝液を各ウェルに添加して、MSD SECTOR Imager ２４００を用いて直ちに読み込んだ。それぞれのグリカン−レクチン結合に対する検出感度を分析するために Prism ソフトウェアを用いてデータを分析した。
【０１７０】
前立腺癌組織にあるＰＳＡタンパク質の標的グリカン−レクチン相互作用についての、開発された電気化学発光による免疫アッセイを用いる検証検討
最初に、プール前立腺の癌組織（Ｃ−Ｔ＿２）及び正常組織（Ｎ−Ｔ＿２）の試料を１×ＴＢＳＴ緩衝液で希釈して、総ＰＳＡタンパク質を同じレベルに調節した。Beckman ACCESS Hybritech ＰＳＡアッセイを用いて、総ＰＳＡ濃度を測定して、最終濃度は；Ｎ−Ｔ＿２試料で１６２．２０ｎｇ／ｍＬ、そしてＣ−Ｔ＿２試料で１６３．３６ｎｇ／ｍＬであった。１×ＴＢＳＴ緩衝液を陰性対照として用いた。ＥＣＬによる抗体−レクチン免疫アッセイの手順は上記の通りである。手短には、プレートをブロックして酸化した後に、１０μＬの各試料を３通りに３８４−ＭＳＤプレートに添加した。次いで、１０μＬの２０μｇ／ｍＬビオチン化ジャカリン又はＳＮＡを５μｇ／ｍＬのストレプタビジンＳＭＬＦＯ−ＴＡＧと混合して、ＰＳＡタンパク質で個々にプローブした。MSD Sector Imager ２４００を用いる電気化学発光検出のために、５０μＬの１×ＭＳＤプレートリード緩衝液を各ウエルに添加した。正常群と癌群の間のグリカン−レクチン結合比の差を分析するために、Prism ソフトウェアを用いてデータを分析した。
【０１７１】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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