(57)【要約】  ＣＤ３４を発現する増幅ヒト臍帯血細胞を得るための方法を提供する。本方法は、臍帯血細胞の増加の促進に適切な共培養条件下で十分な量の月経血細胞と共に十分な量の臍帯血細胞を播種すること、および臍帯血細胞の少なくとも２回以上の集団倍化を支援する培養条件下で月経血細胞と共に臍帯血細胞を共培養することを含む。本方法は、増幅ヒト臍帯血細胞を成長させて、コロニー形成細胞、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずるためにも提供される。増幅細胞は、ＣＤ３４、ＳＳＥＡ−４およびＨＬＡ−ＩＩを発現することができる。増幅細胞の組成もまた提供される。
2011501960.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト臍帯血細胞の集団倍化を促進するヒト月経血細胞と共に、適切な培養条件で、ヒト臍帯血細胞の増加から得られたＣＤ３４を発現するヒト細胞の集団。
【請求項２】
前記ヒト細胞の集団がＳＳＥＡ４もまた発現する、請求項１に記載のヒト細胞の集団。
【請求項４】
前記ヒト細胞の集団がＨＬＡ−ＩＩもまた発現する、請求項１に記載のヒト細胞の集団。
【請求項５】
前記ＣＤ３４を発現するヒト細胞の集団が、凍結保存剤、培養培地、成長培地、または分化培地のうちのいずれか１つ中に懸濁される、請求項１に記載のヒト細胞の集団。
【請求項６】
前記ＣＤ３４を発現するヒト細胞の集団が、少なくとも２回以上の集団倍化の結果である、請求項１に記載のヒト細胞の集団。
【請求項７】
前記ヒト細胞の集団が、コロニー形成細胞、コロニー形成細胞顆粒球（ＣＦＵ−ＧＭ）マクロファージ、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずることができる、請求項１に記載のヒト細胞の集団。
【請求項８】
臍帯血細胞の増加のために適切な条件で十分な量の月経血幹細胞と共に十分な量の臍帯血幹細胞を共培養すること、及び
少なくとも２回の集団倍化を介して十分な量の、培養中の臍帯血細胞を増殖させること
を含むプロセスによって得られるＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の集団。
【請求項９】
前記プロセスが、十分な量の、培養中の臍帯血細胞を成長させて、コロニー形成細胞（ＣＦＵ）、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずる更なる工程を含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記プロセスが、十分な量の、培養中の臍帯血細胞を増殖させた後にＣＤ３４を発現する臍帯血細胞を単離する更なる工程を含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記プロセスが、十分な量の、培養中の臍帯血細胞を増殖させた後にＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の集団を凍結保存する更なる工程を含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記ＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の集団が、適切な培養条件下で十分な量の臍帯血細胞を増殖させた後にＨＬＡ−ＩＩもまた発現する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記ＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の集団が、適切な培養条件下で十分な量の臍帯血細胞を増殖させた後にＳＳＥＡ４もまた発現する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記十分な量の、培養中の臍帯血細胞の増殖が、臍帯血細胞を成長させて、コロニー形成細胞、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずることを含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１５】
ＣＤ３４を発現する増幅ヒト臍帯血細胞を得る方法であって、
臍帯血細胞の増加の促進に適切な共培養条件下で十分な量の月経血細胞と共に十分な量の臍帯血細胞を播種すること、及び
臍帯血細胞の少なくとも２回以上の集団倍化を支援する培養条件下で月経血細胞と共に臍帯血細胞を共培養すること、
を含む方法。
【請求項１６】
前記ＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の共培養が、臍帯血細胞を増幅して、少なくとも１種以上のＳＳＥＡ−４およびＨＬＡ−ＩＩを発現させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅ヒト臍帯血細胞が、高レベルのＣＤ３４を発現する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記臍帯血細胞の共培養が、臍帯血細胞を増幅して、コロニー形成細胞、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、ＣＤ３４について増幅したヒト臍帯血細胞を免疫選択すること、ヒトへの注入のための培養から増幅したヒト臍帯血細胞を単離すること、増幅したヒト臍帯血細胞を凍結保存すること、又は増幅した臍帯血細胞を細胞系譜へと分化させること、のさらなる工程の少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、増幅ヒト臍帯血細胞を成長させて、コロニー形成細胞、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずる工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年１０月３１日に出願され、「月経血幹細胞と共に臍帯血由来細胞を共培養する方法」と題する、米国仮特許出願第６１／００１，４５６号の優先権を主張し、その全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、ヒト細胞培養および共培養を介して単離された細胞集団を増強する方法に一般的に関する。より具体的には、本発明は、ＣＤ３４を発現する増幅臍帯血由来細胞の改善された細胞集団を得るために、月経血幹細胞と共に共培養する臍帯血由来細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
臍帯血は、ヒト身体の多数の障害を治療する能力を備えた幹細胞の認められているソースである。臍帯血は、ＣＤ３４細胞を含む単核細胞を含む造血系祖先細胞が豊富なソースである。家族は、子または家族のメンバーの医学的に必要な場合に備えて、幹細胞が豊富なソースを保存する潜在的利益のために、臍帯血の回収を決定することができる。
【０００４】
臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）とも呼ばれる臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）は、出生時に臍帯および胎盤中に残存する血液である。この血液は幹細胞が豊富なソースであり、将来の使用の可能性のために回収され、プロセシングされ、凍結保存することができる。臍帯血幹細胞は、高生着率であり、組織不適合についてより寛容であり、重篤な移植臓器対個体反応疾患（幹細胞移植における主要な合併症）が低率であり、めったに潜伏ウィルスが混入しないので有利である。
【０００５】
臍帯血により治療可能なヒト不全症の数は、過去十年間にわたって有意に増大した。一例として、臍帯血細胞を使用して、癌、骨髄不全関連症候群、血液疾患、代謝障害、免疫不全障害、および他の疾患状態の様々な形態の少なくとも７０形態を治療した。例えば、臍帯血細胞を使用して、以下のものが治療されてきた。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、血球貪食性リンパ組織球症、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ランゲルハンス細胞組織球症、リンパ腫様肉芽腫症、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、無巨核球性血小板減少症、自己免液性好中球減少症（重症）、先天性赤血球異形成貧血、周期性好中球減少症、ダイアモンド−ブラックファン貧血、エヴァンズ症候群、ファンコニ貧血、グランツマン病、若年性皮膚筋炎、コストマン症候群、赤血球形成不全、シュバッハマン症候群、重症再生不良性貧血、先天性鉄芽球性貧血、血小板減少性橈骨欠損症（ＴＡＲ症候群）、先天性角化異常症、鎌形赤血球貧血症（ヘモグロビンＳＳ）、ＨｂＳＣ疾患、鎌状赤血球β−サラセミア、α−サラセミアメジャー（胎児水腫）およびβ−サラセミアメジャー（クーリー貧血）、β−中間型サラセミア、Ｅ−βサラセミア、Ｅ−β＋サラセミア、副腎白質ジストロフィー、ゴーシェ病（幼児）、異染性ロイコジストロフィー、クラッベ病（グロボイド細胞性ロイコジストロフィー）、ギュンター病、ヘルマンスキー−プドゥラック症候群、ハーラー症候群、ハーラー−シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群、マロトー‐ラミー症候群、ムコリピド蓄積症ＩＩ型、ＩＩＩ型、αマンノシドーシス、ニーマン‐ピック病、Ａ型およびＢ型、サンドフ（Ｓａｎｄｏｆｆ）症候群、テイ−サックス病、バッテン病（遺伝性神経セロイドリポフスチン症）、レッシュ−ナイハン病、毛細血管拡張性運動失調、慢性肉芽腫症、ディ・ジョージ症候群、ＩＫＫγ欠損症、Ｘ連鎖免疫調節異常多腺性内分泌障害、ムコリピド蓄積症、ＩＩ型、ミエロカテシス（ｍｙｅｌｏｋａｔｈｅｓｉｓ）、Ｘ連鎖免疫不全症、重症複合免疫不全症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患、オーメン症候群、細網形成障害、胸腺異形成、白血球接着不全症、および大理石骨病。
【０００６】
ヒト障害の治療において、臍帯血細胞の回収および使用には限定がある。第一に、臍帯血細胞は出生後のみに回収されうる。このことは、臍帯血を回収できる回数に対して有意な限定を課す。第二に、臍帯血は、限定的な量の幹細胞を含む少量の体積で回収される。特定の障害は、多数の幹細胞の注入または移植を必要とする。回収可能な臍帯血細胞が少量であるので、多数の細胞を必要とする療法のためのかかる細胞の使用は実行不可能になる。
【０００７】
臍帯血細胞の限定を克服する進歩を発展させる研究が進行中である。複数の臍帯血単位を組み合わせるか、または移植の前に単一臍帯血単位中の幹細胞を増幅する技術が開発されている。かかる技術は、幹細胞の集団が障害を治療するにはあまりにも少量であというる問題に対処するために開発された。この開発があっても、臍帯血幹細胞は、細胞培養中で増幅するのが困難であることが証明されている。幹細胞が豊富である限定されたソースはなお障害の治療に対する制限を有する。
【０００８】
インビトロの分析系は、多能性祖先、ならびに赤血球、顆粒球、単球マクロファージ、および巨核球骨髄細胞系譜の系譜が限定された祖先の定量に開発されている。適切な半固形マトリックス中で培養された場合、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）と呼ばれる個別の祖先は、増殖して分離した細胞集団またはコロニーを形成する。ＣＦＣ分析は、栄養素およびサイトカインを補足したメチルセルロースまたはコラーゲンなどの半固形培地へと細胞懸濁物を置き、続いてインキュベーションすることによって実行される。次に、ＣＦＣは、コロニー内の１つまたは複数のタイプの造血系系譜細胞の形態的認識に基づいて分類および列挙される。コロニー評価および列挙は、光学顕微鏡法によってインシトゥーで、または個別のコロニーを取り出し、次に細胞化学方法および免疫細胞化学的方法を使用して細胞を染色することによって行うことができる。
【０００９】
メチルセルロースを含む様々なゲル化剤は、ＣＦＣ分析に使用されてきた。メチルセルロースは、十分な光学的透明度を備えた安定したゲルを形成する、比較的不活性なポリマーである。それは、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２−メルカプトエタノール、インスリン、トランスフェリン、およびコロニー刺激因子のソースとして組換えサイトカインまたは馴化培地を含む化合物を補足した培養培地中で一般的には使用される。メチルセルロースベースの培地は、他のタイプの半固形マトリックスよりも赤芽球系譜細胞の十分な成長を許容し、したがって同じ培養内で赤芽球、顆粒球、単球および多能性ＣＦＣの分析を可能にする。この培地は、ヒト赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）および顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の検出および列挙を可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
進歩はあるのだが、ヒト障害の治療で使用される大量の幹細胞を産生する臍帯幹細胞の増加を改善する方法が引き続き必要とされている。本発明はこの必要性を満たすことに向けられる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、月経血細胞（ｍｅｎｓｔｒｕａｌ  ｃｅｌｌ）の集団と共に共培養した場合、臍帯血由来の幹細胞が十分多数に増殖するという発見に基づく。この発見は、月経血幹細胞が臍帯血幹細胞と共に培養において支持機能を供給して、臍帯血細胞の増殖を増強することを示した。臍帯血細胞は、回収、凍結保存および保存のために現在の業界基準に従って回収される。臍帯血幹細胞と共に共培養するために使用された月経血幹細胞は、米国特許公報第２００８０２４１１１３号の教示に従って回収することができる。臍帯血細胞および月経血細胞の共培養は、ＣＤ３４、ＳＳＥＡ４およびＨＬＡ−ＩＩを発現する細胞の増加を促進する培養環境を生成する。
【００１２】
米国特許公報第２００８０２４１１１３号の教示は、本発明における使用に適切な月経血幹細胞集団を回収する多数の方法を提供する。共培養のために使用される月経血幹細胞は、新鮮な月経血幹細胞または凍結保存した月経血幹細胞から得ることができる。月経血幹細胞はＣＤ１１７または他の細胞表面マーカーについて単離され、細胞培養を介してさらに増幅することができる。月経血幹細胞は特定の細胞マーカーについてもまた単離され、次に増加のために培養することができる。米国特許公報第２００８０２４１１１３号中で記述される月経血幹細胞のいかなる集団も、本発明の共培養の方法およびプロセスにおいて使用することができる。
【００１３】
したがって、本発明は、臍帯血細胞の増殖の改善のために、月経血細胞と共に臍帯血細胞を共培養する方法を提供する。
【００１４】
関連する態様において、本発明は、ヒト臍帯血細胞の集団倍化（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ）を促進するヒト月経血細胞と共に、適切な培養条件で、ヒト臍帯血細胞の増加から得られたＣＤ３４を発現するヒト細胞の集団を提供する。細胞の集団はＳＳＥＡ４およびＨＬＡ−ＩＩを発現する。
【００１５】
本発明の細胞の集団は、凍結保存剤、培養培地、成長培地、または分化培地のうちのいずれか１つ中に懸濁し得る。
【００１６】
本発明のＣＤ３４を発現するヒト細胞の集団は、少なくとも２回以上の集団倍化から生じる。
【００１７】
本発明の細胞の集団は、コロニー形成細胞（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞（ｂｌｏｏｄ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）のうちのいずれか１つを生ずることができる。
【００１８】
他の態様において、本発明は、臍帯血細胞の増加に適切な条件で十分な量の月経血幹細胞と共に十分な量の臍帯血幹細胞を共培養し、次に、少なくとも２回の集団倍化を介して十分な量の培養中の臍帯血細胞を増殖させることを含むプロセスによって得られたＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の集団もまた提供する。十分な量の培養中の臍帯血細胞を増殖させる工程は、臍帯血細胞を成長させて、コロニー形成細胞、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずることを含む。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明のプロセスは、十分な量の培養中の臍帯血細胞を成長させて、コロニー形成細胞（ＣＦＵ）、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずる工程を含み得る。
【００２０】
なお他の実施形態において、本発明のプロセスは、十分な量の培養中の臍帯血細胞を増殖させた後に、ＣＤ３４を発現する臍帯血細胞を単離する工程を含み得る。
【００２１】
さらなる実施形態において、本発明のプロセスは、十分な量の培養中の臍帯血細胞を増殖させた後に、ＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の集団を凍結保存する工程を含み得る。
【００２２】
本発明のプロセスによって得られたＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の集団は、適切な培養条件下で十分な量の臍帯血細胞を増殖させた後に、ＣＤ３４、ＳＳＥＡ４およびＨＬＡ−ＩＩのうちの少なくとも１つもまた発現し得る。
【００２３】
なおさらなる態様において、本発明は、ＣＤ３４を発現する増幅ヒト臍帯血細胞を得る方法を提供する。本発明の方法は、臍帯血細胞の増加の促進に適切な共培養条件下で、十分な量の月経血細胞と共に十分な量の臍帯血細胞を播種して、臍帯血細胞の少なくとも２回または複数回の集団倍化を支援する培養条件下で、月経血細胞と共に臍帯血細胞を共培養する工程を含み得る。
【００２４】
ある実施形態において、ＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の共培養は、臍帯血細胞を増幅して、少なくとも１種または複数のＳＳＥＡ４およびＨＬＡ−ＩＩを発現させることを含む。
【００２５】
他の実施形態において、本発明の増幅ヒト臍帯血細胞は高レベルのＣＤ３４を発現する。さらに、本発明の臍帯血細胞の共培養は、臍帯血細胞を増幅して、コロニー形成細胞、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずることを含む。
【００２６】
代替の実施形態において、本発明の方法は、増幅ヒト臍帯血細胞をＣＤ３４について免疫選択すること、ヒトへの注入のために増幅ヒト臍帯血細胞を培養から分離すること、増幅ヒト臍帯血細胞を凍結保存すること、または増幅臍帯血細胞を細胞系譜へと分化させること、のさらなる工程のうちの少なくとも１つを含み得る。
【００２７】
なお他の実施形態において、本発明の方法は、増幅ヒト臍帯血細胞を成長させて、コロニー形成細胞、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずる工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の図式的なフローチャートを示した図である。
【図２ａ】実施例１において記述した造血系コロニー形成細胞のためのメソカルト（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ）４０５３半固形メチルセルロース培地中で、解凍後にプレーティングし培養した臍帯８７１Ｒ細胞の細胞培養の写真である。臍帯８７１Ｒ細胞は、１ウェルあたり１ｍｌの培地中で１ウェルあたり５０，０００細胞でプレーティングされた。細胞培養８日後の細胞の写真（２００×）である。コロニー形成細胞（ＣＦＵ）の成長のない半固形培養培地中の遊離した細胞を実証する。
【図２ｂ】実施例１において記述した造血系コロニー形成細胞のためのメソカルト４０５３半固形メチルセルロース培地中で、解凍後にプレーティングし培養した臍帯８７１Ｒ細胞の細胞培養の写真である。臍帯８７１Ｒ細胞は、１ウェルあたり１ｍｌの培地中で１ウェルあたり５０，０００細胞でプレーティングされた。細胞培養９日後の細胞の写真（４０×）である。コロニー形成細胞（ＣＦＵ）の成長のない半固形培養培地中の遊離した細胞を実証する。
【図３ａ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり１０，０００細胞をプレーティングし８日間細胞培養した後にヘモグロビン産生の赤い色調を明示するＢＦＵ−Ｅを示す、培養における細胞の写真（１００×）である。
【図３ｂ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。コロニー形成細胞のためのメチルセルロース培地中の遊離細胞の培養８日後の写真（１００×）である。
【図３ｃ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり２１，６００細胞で細胞をプレーティングし８日間細胞培養した後にヘモグロビン産生の赤い色調を明示するＢＦＵ−Ｅを示す、培養における細胞の写真（２００×）である。
【図３ｄ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり２１，６００細胞で細胞をプレーティングし８日間細胞培養した後にヘモグロビン産生の赤い色調を明示するＢＦＵ−Ｅを示す、培養における細胞の写真（２００×）である。
【図３ｅ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり５，０００細胞で細胞をプレーティングし８日間培養した後に初期のＢＦＵ−Ｅ産生を示す、培養中の細胞の写真（４０×）である。
【図３ｆ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり１０，０００細胞をプレーティングし９日間細胞培養した後にヘモグロビン産生の赤い色調を明示するＢＦＵ−Ｅを示す、培養中の細胞の写真（１００×）である。
【図３ｇ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり１０，０００細胞をプレーティングし９日間細胞培養した後にヘモグロビン産生の赤い色調を明示するＢＦＵ−Ｅを示す、培養中の細胞の写真（１００×）である。
【図３ｈ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり１０，０００細胞をプレーティングし９日間細胞培養した後にヘモグロビン産生の赤い色調を明示するＢＦＵ−Ｅを示す、培養中の細胞の写真（４０×）である。
【図３ｉ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり２１，６００細胞をプレーティングし９日間培養した後にヘモグロビン産生の赤い色調を明示するＢＦＵ−Ｅを示す、細胞培養の写真（１００×）である。
【図３ｊ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり２１，６００細胞をプレーティングし９日間培養した後にヘモグロビン産生の赤い色調を明示するＢＦＵ−Ｅを示す、細胞培養の写真（１００×）である。
【図３ｋ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり２１，６００細胞をプレーティングし９日間培養した後にヘモグロビン産生の赤い色調を明示するＢＦＵ−Ｅを示す、細胞培養の写真（４０×）である。
【図３ｌ】実施例２において記述したＣＦＵのためのメチルセルロース培地中で培養されるＭ２８１００ＲＭ月経血細胞の写真である。この濃度ではコロニー形成能のない培地中の遊離細胞の写真である。
【図４ａ】１ウェルあたり１０，０００細胞でプレーティングしたＭ２８１０１Ｒ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり１０，０００細胞でＭ２８１０１Ｒ月経血細胞をプレーティングし８日間細胞培養した後にＣＦＵ−ＧＭを示す、培養中の細胞の写真（４０×）である。
【図４ｂ】１ウェルあたり１０，０００細胞でプレーティングしたＭ２８１０１Ｒ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり１０，０００細胞で細胞をプレーティングし９日間培養した後にＣＦＵ−ＧＭ産生を示す、培養中の細胞の写真（４０×）である。
【図４ｃ】１ウェルあたり２１，６００細胞でプレーティングしたＭ２８１０１Ｒ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり２１，６００細胞で細胞をプレーティングし数日間細胞培養した後にＢＦＵ−Ｅ産生を示す、培養中の細胞の写真（１００×）である。
【図４ｄ】１ウェルあたり５，０００細胞でプレーティングしたＭ２８１０１Ｒ月経血細胞の写真である。１ウェルあたり５，０００細胞で細胞をプレーティングし９日間細胞培養した後の遊離細胞の写真（４０×）である。
【図５ａ】実施例４において記述したＭ２８１００ＲＭ月経血細胞および臍帯８７１Ｒ細胞の共培養の写真である。１ウェルあたり１０，０００細胞でプレーティングしたＭ２８１００ＲＭ月経血細胞、および１ウェルあたり５０，０００細胞でプレーティングした臍帯８７１Ｒ細胞の８日間の培養後の写真（１００×）を示す。ＣＦＵ−ＧＭコロニー形成を明示する。
【図５ｂ】実施例４において記述したＭ２８１００ＲＭ月経血細胞および臍帯８７１Ｒ細胞の共培養の写真である。１ウェルあたり２１，６００細胞でプレーティングしたＭ２８１００ＲＭ月経血細胞、および１ウェルあたり５０，０００細胞でプレーティングした臍帯８７１Ｒ細胞の８日間の細胞培養後の写真（２００×）である。
【図５ｃ】実施例４において記述したＭ２８１００ＲＭ月経血細胞および臍帯８７１Ｒ細胞の共培養の写真である。１ウェルあたり２１，６００細胞でプレーティングしたＭ２８１００ＲＭ月経血細胞、および１ウェルあたり５０，０００細胞でプレーティングした臍帯８７１Ｒ細胞の８日間の細胞培養後の写真（１００×）である。
【図５ｄ】実施例４において記述したＭ２８１００ＲＭ月経血細胞および臍帯８７１Ｒ細胞の共培養の写真である。１ウェルあたり５，０００細胞でプレーティングした月経血細胞、および１ウェルあたり５０，０００細胞でプレーティングした臍帯血細胞による９日間の培養後のＣＦＵ−ＧＭの一部の写真（４０×）である。
【図５ｅ】実施例４において記述したＭ２８１００ＲＭ月経血細胞および臍帯８７１Ｒ細胞の共培養の写真である。１ウェルあたり１０，０００細胞でプレーティングしたＭ２８１００ＲＭ月経血細胞、および１ウェルあたり５０，０００細胞でプレーティングした臍帯８７１Ｒ細胞の８日間の培養後の写真（１００×）を示す。ＣＦＵ−ＧＭコロニー形成を明示する。
【図５ｆ】実施例４において記述したＭ２８１００ＲＭ月経血細胞および臍帯８７１Ｒ細胞の共培養の写真である。１ウェルあたり２１，６００細胞でプレーティングしたＭ２８１００ＲＭ月経血細胞、および１ウェルあたり５０，０００細胞でプレーティングした臍帯８７１Ｒ細胞の９日間の細胞培養後の写真（１００×）である。
【図５ｇ】実施例４において記述したＭ２８１００ＲＭ月経血細胞および臍帯８７１Ｒ細胞の共培養の写真である。１ウェルあたり１０，０００細胞でプレーティングしたＭ２８１００ＲＭ月経血細胞、および１ウェルあたり５０，０００細胞でプレーティングした臍帯８７１Ｒ細胞の９日間の培養後の写真（１００×）を示す。ＢＦＵ−Ｅコロニー形成を明示する。
【００２９】
【図６ａ】実施例５において記述したＭ２８１０１Ｒ月経血細胞および臍帯８７１Ｒ細胞の共培養の写真である。メチルセルロース半固形造血系培地中の遊離細胞を明示する。異なる濃度でプレーティングした場合、単独で培養したＭ２８１０１Ｒ月経血細胞はＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅを産生することができた。
【図６ｂ】実施例５において記述したＭ２８１０１Ｒ月経血細胞および臍帯８７１Ｒ細胞の共培養の写真である。メチルセルロース半固形造血系培地中の遊離細胞を明示する。異なる濃度でプレーティングした場合、単独で培養したＭ２８１０１Ｒ月経血細胞はＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅを産生することができた。
【図６ｃ】実施例５において記述したＭ２８１０１Ｒ月経血細胞および臍帯８７１Ｒ細胞の共培養の写真である。メチルセルロース半固形造血系培地中の遊離細胞を明示する。異なる濃度でプレーティングした場合、単独で培養したＭ２８１０１Ｒ月経血細胞はＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅを産生することができた。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
図１〜６を参照して、ＣＤ３４を発現する細胞の数を増幅するために月経血細胞と共に臍帯血細胞を共培養するプロセスおよび方法は、本発明によって提供される。本発明のプロセスおよび方法によって得られたＣＤ３４を発現する増幅ヒト細胞の組成もまた提供される。
【００３１】
全臍帯血は、ＣＤ３４＋細胞を含む単核細胞を含む造血系祖先細胞の豊富なソースである。臍帯血幹細胞は、ＣＤ３４＋細胞を含む単核細胞を含む。臍帯血幹細胞は、新生児の娩出後であるが一般的に胎盤が娩出される前に、臍帯から抽出した全臍帯血から得られる。娩出の瞬間は新生児の幹細胞を採取する唯一の機会である。さらに回収は経膣分娩および帝王切開分娩の両方で安全である。臍帯血を回収するために、臍帯血は臍帯から血液回収バッグの中へ抜き取られる。臍帯血は梱包材中にパッケージングされ、回収の３６〜４８時間以内にプロセシングするために実験室へ発送される。
【００３２】
全血は、新生児の出生に後続して臍帯のクランプ後に臍帯から回収される。全臍帯血の体積は約１１０ｍｌでありえる。回収された臍帯血サンプルは、プロセシングのために実験室へ業界基準下で発送される。
【００３３】
密度勾配分離（フィコール／ハイパック）を使用して無菌状態下で臍帯血をプロセシングして、ＣＤ３４を発現する細胞の集団を含む単核細胞を分離する。臍帯血は滅菌された５０ｍｌチューブへと小分けする。チューブを４７０ｇで約１５分間遠心分離する。遠心分離後に、パックされた細胞は１体積あたり１：３の比率であるべきである。遠心分離後のチューブから血漿を除去することができるか、またはパックされた細胞に対する体積を１：３の比率で達成するようにチューブにＤＰＢＳを追加することができる。各々のチューブは多くとも約３５ｍｌの体積を有するべきである。１０ｍｌのＬＳＭを各々のチューブの下層に置く。各々のチューブを４００ｇで約３０分間遠心分離する。血漿の上層を除去する。単核細胞および血漿を含む次の層を取り出して、別の５０ｍｌチューブに移す。
【００３４】
５０ｍｌチューブ中の細胞は、ＲＰＭＩ対細胞混合物が約１：２比率でＬ−グルタミンを含む１×ＲＰＭＩ０１６４０を使用して、最大約４５ｍｌの体積で懸濁されるべきである。細胞懸濁物を含むチューブは４７０ｇで約１５分間遠心分離することができる。遠心分離後に、上清を除去する。少量のＲＰＭＩを追加して、沈殿を再懸濁する。１５ｍｌチューブに細胞懸濁物を移す。１５ｍｌチューブ中の細胞懸濁物を４００ｇで約１５分間遠心分離する。上清をデカントし、ＲＰＭＩを使用して５ｍｌまで沈殿を再懸濁する。５ｍｌのＤＭＳＯ／自己血漿（１ｍｌのＤＭＳＯおよび４ｍｌの自己血漿）を滴下して追加する。速度制御フリーザー中のＤＭＳＯ／自己血漿中の細胞懸濁物の温度を約−８５℃まで低下させる。約−１８５℃またはそれ以下の液体窒素タンク中にチューブを置く。
【００３５】
語句「月経血細胞」は、米国特許公報第２００８０２４１１１３号の方法のうちのいずれかに記載の月経流出物から回収された細胞に関して使用される。月経血細胞は、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ８１、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、およびＨＬＡクラスＩを含むが、これらに限定されない細胞マーカーまたは細胞内マーカーの少なくとも１つを発現するが、ＣＤ３およびＭＨＣ  ＩＩを低レベルで発現するかまたは発現しない細胞を含む。細胞の前述の特徴は例示的な特徴として提供されるが、月経血細胞の追加および代わりの細胞表面特徴は、米国特許公報第２００８０２４１１１３号において開示された表および図でそれに対して提供された特徴、凍結保存の前および後の特徴、ＣＤ１１７選択の前および後の特徴、細胞培養の前および後の特徴、または任意の組合せの特徴を含むが、これらに限定されず、米国特許公報第２００８０２４１１１３号における開示の全体にわたって提供される。さらに、米国特許公報第２００８０２４１１１３号は、その全体を参照することにより本明細書に組み入れられ、本発明の月経血細胞に関するさらなる開示を提供する。臍帯血幹細胞と共に共培養するために使用された月経血細胞は、米国特許公報第２００８０２４１１１３号の教示に従って、月経流出物から回収し、濃縮し、凍結保存することができ、後に本発明の方法に従って解凍することができる。あるいは、米国特許公報第２００８０２４１１１３号の教示は、本発明における使用に適切な月経血細胞を得る多数の方法を提供する。
【００３６】
用語「細胞（ｃｅｌｌ）」は適用において単数の意味で使用することができるが、用語「細胞（ｃｅｌｌｓ）」もまた本発明により使用される１つより多い細胞を指すように使用することができる。
【００３７】
特定の細胞は、多数の別個の細胞タイプへと分化する細胞能力に起因して、天然で多能性であることが認識される。多能性細胞は、多数の異なる哺乳類細胞タイプへと分化を行う能力を保持する。一例として、本発明において使用される月経血細胞は、例えば神経細胞系譜および心臓形成細胞系譜、軟骨形成細胞系譜、脂肪形成細胞系譜、および骨形成細胞系譜などの、様々な細胞系譜へと分化する能力を示す。
【００３８】
本発明の方法および組成
【００３９】
治療上の使用のために増幅ＣＤ３４細胞の使用は、多数の理由で有利であろう。特に、増幅ＣＤ３４細胞は、（ａ）他の臍帯血細胞増幅方法との比較では増殖のためにより少ない臍帯血細胞の使用を必要とし、（ｂ）月経血細胞との共培養において増殖性であり、（ｃ）自己適用が可能であり、（ｄ）同種異系の適用（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が可能であり、（ｅ）ソースとしてカスタマイズ再生医療法に使用し得る。
【００４０】
本発明は、ヒト臍帯血細胞の集団倍化を促進するヒト月経血細胞と共に、適切な培養条件で、ヒト臍帯血細胞の増加から得られたＣＤ３４を発現するヒト細胞の集団を提供する。細胞の集団はＳＳＥＡ４およびＨＬＡ−ＩＩもまた発現する。
【００４１】
本発明の細胞の集団は、凍結保存剤、培養培地、成長培地、または分化培地のうちのいずれか１つ中に懸濁し得る。
【００４２】
本発明のＣＤ３４を発現するヒト細胞の集団は、少なくとも２回以上の集団倍化から生じる。
【００４３】
本発明の細胞の集団は、コロニー形成細胞、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずることができる。
【００４４】
本発明は、臍帯血細胞の増加に適切な条件で十分な量の月経血細胞と共に十分な量の臍帯血幹細胞を共培養し、次に少なくとも２回の集団倍化を介して十分な量の培養における臍帯血細胞を増殖させることを含むプロセスによって得られたＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の集団もまた提供する。十分な量の培養における臍帯血細胞を増殖させる工程は、臍帯血細胞を成長させて、コロニー形成細胞、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずることを含む。
【００４５】
本発明のプロセスは、十分な量の培養における臍帯血細胞を成長させて、コロニー形成細胞（ＣＦＵ）、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずる工程を含み得る。
【００４６】
本発明のプロセスは、十分な量の培養における臍帯血細胞を増殖させた後にＣＤ３４を発現する臍帯血細胞を単離する工程を含み得る。
【００４７】
本発明のプロセスは、十分な量の培養における臍帯血細胞を増殖させた後にＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の集団を凍結保存する工程を含み得る。
【００４８】
本発明のプロセスによって得られたＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の集団は、適切な培養条件下で十分な量の臍帯血細胞を増殖させた後にＣＤ３４、ＳＳＥＡ４、およびＨＬＡ−ＩＩの少なくとも１つもまた発現み得る。
【００４９】
本発明は、ＣＤ３４を発現する増幅ヒト臍帯血細胞を得る方法を提供する。本発明の方法は、臍帯血細胞の増加の促進に適切な共培養条件下で十分な量の月経血細胞と共に十分な量の臍帯血細胞を播種する工程、および臍帯血細胞の少なくとも２回または複数回の集団倍化を支援する培養条件下で月経血細胞と共に臍帯血細胞を共培養する工程を含む。
【００５０】
ＣＤ３４を発現するヒト臍帯血細胞の共培養は、臍帯血細胞を増幅して、少なくとも１種または複数のＳＳＥＡ４およびＨＬＡ−ＩＩを発現させることを含む。本発明の増幅ヒト臍帯血細胞は、高レベルのＣＤ３４を発現する。
【００５１】
本発明の臍帯血細胞の共培養は、臍帯血細胞を増幅して、コロニー形成細胞、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずることを含む。
【００５２】
本発明の方法は、ＣＤ３４のために増幅するヒト臍帯血細胞を免疫選択すること、ヒトへの注入のために増幅ヒト臍帯血細胞を培養から分離すること、増幅ヒト臍帯血細胞を凍結保存すること、または増幅臍帯血細胞を細胞系譜へと分化させること、のさらなる工程の少なくとも１つを含み得る。
【００５３】
本発明の方法は、増幅ヒト臍帯血細胞を成長させて、コロニー形成細胞、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）および顆粒球−赤血球−マクロファージ−巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の血液系譜前駆細胞のうちのいずれか１つを生ずる工程を含む。
【００５４】
培養のための細胞の調製物
【００５５】
臍帯血細胞サンプルおよび月経血細胞サンプルは保存において凍結保存することができる。あるいは、臍帯血細胞サンプルおよび月経血細胞サンプルのいずれかまたは両方は、回収された生の血液サンプルからプロセシングした後に新鮮でありえる。臍帯血細胞サンプルおよび月経血細胞サンプルのいずれかまたは両方が凍結保存される事例において、凍結保存した臍帯血細胞および／または月経血細胞は、培養のための調製において解凍されなくてはならない。臍帯血細胞サンプルおよび月経血細胞サンプルのいずれかまたは両方が新鮮である事例において、細胞は培養のために調製し得る。
【００５６】
凍結保存細胞を解凍するプロセスは、凍結保存細胞を解凍し、次に遠心分離を介してそれらを洗浄する工程を含む。凍結保存細胞は、凍結保存から細胞のバイアルを取り出して、凍結サンプルの少数のかけらが残るまで約３７〜４０℃ウォーターバス中でバイアルを撹拌することによって解凍される。凍結保存細胞は完全に解凍するべきではない。部分的に解凍された細胞は、ＤＮａｓｅ（１００ｍｌあたり１０滴）を含む冷却したチャンの（Ｃｈａｎｇ'ｓ）完全培地に移し、反転によって穏やかに混合する。チャンの完全培地は、部分的に解凍した細胞に対して５：１比率で混合するべきである。例えば、２５ｍｌのチャンの完全培地を５ｍｌの解凍細胞に合わせる。この時点で、チャンの完全培地および解凍細胞の約１００〜２００μｌのサンプルを、さらに詳細に以下で記述されたフローサイトメトリー分析のために取り出し得る。
【００５７】
次に解凍細胞を懸濁したチャンの完全培地溶液を、およそ周囲温度で約１２０ｇ約５分間の遠心分離の第１の工程を行い得る。一旦遠心分離が完了すれば上清を除去し、細胞および恐らく他の残屑の沈殿を緩やかな反転によってチャンのＤＮａｓｅ不含有完全培地中で再懸濁する。次にチャンの完全培地中で懸濁した細胞は、およそ周囲温度で約１２０ｇ約５分間の遠心分離の第２の工程を行い得る。一旦第２の遠心分離工程が完了すれば上清を除去し、細胞の沈殿を７ｍｌの１５％ＦＢＳチャンの成長培地中で再懸濁する。
【００５８】
チャンの完全培地は、ＭＥＭα培地、チャンＢ、チャンＣ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、およびＥＳ−ＦＢＳを含む。チャンの完全培地は、６５０ｍｌのＭＥＭα培地、１８０ｍｌのチャンＢ（基本培地）（１８％ｖ／ｖ）、２０ｍｌのチャンＣ（２％ｖ／ｖ）、１０ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００単位／ｍｌのペニシリンＧナトリウムおよび１０，０００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）、１０ｍｌのＬ−グルタミン２００ｍＭ（１００×）、および１５０ｍｌのＥＳ−ＦＢＳ（１９％ｖ／ｖ）を組み合わせることによって調製される。
【００５９】
凍結保存細胞を解凍し洗浄するプロセスを使用して、培養のために凍結保存された臍帯血細胞および月経血細胞を調製し得る。
【００６０】
フラスコ中の培養を介する細胞の増加
【００６１】
解凍した臍帯血細胞または新鮮な臍帯血細胞を、解凍した月経血細胞または新鮮な細胞と共にプレーティングして、フラスコ中で細胞を共培養する。臍帯血細胞および月経血細胞は、組織培養用の処理をしていないＴ−２５フラスコ中で共培養することができる。細胞は、１フラスコあたり約１０，０００，０００細胞を上回るべきでない。十分な数の臍帯血細胞を、フラスコ中で月経血細胞の十分な数と共に共培養する。１つの実施形態において、臍帯血細胞は約１，０００細胞〜約１０，０００細胞にわたりうるが、月経血細胞は約１０，０００細胞〜約５０，０００細胞にわたりうる。月経血細胞が臍帯血細胞の増加を促進する支持機能を提供する限り、他の量の臍帯血細胞および月経血細胞は十分でありえる。
【００６２】
事前に培養した臍帯血細胞および月経血細胞は、約４８時間の継代時間で１ｃｍ2あたり約２，０００でプレーティングし得る。より多くの細胞がプレーティングされるならば、細胞は約２４時間の継代を介して進めることができる。臍帯血細胞および月経血細胞は、約７ｍｌ、約１５ｍｌ、および約３０ｍｌのチャンの完全培地で、組織培養用の処理をしていないＴ−２５、Ｔ−７５、およびＴ−１７５のフラスコ中でそれぞれプレーティングし得る。
【００６３】
細胞が約７０〜８０％のコンフルエントになるまで、臍帯血細胞および月経血細胞の共培養を約３６℃〜約３８℃のＣＯ2インキュベーター中でインキュベートし得る。
【００６４】
臍帯血細胞および月経血細胞の共培養は、トリプシン処理工程によってフラスコから解離し得る。共培養した臍帯血および月経血細胞が解離できる状態になっていることが明らかな場合、フラスコ中の培地を吸引し、次に非組織培養用フラスコは、Ｔ−２５フラスコについては約５ｍｌ、Ｔ−７５フラスコについては約１０ｍｌ、またはＴ−１５７フラスコについては約２５ｍｌの体積のカルシウムまたはマグネシウム不含有ＤＰＢＳにより洗浄する。洗浄後に、細胞を、Ｔ−２５フラスコについては約１．５ｍｌ、Ｔ−７５フラスコについては約３ｍｌ、およびＴ−１７５フラスコについては約６ｍｌの体積のＴｒｙｐＬＥ酵素により、約３６℃〜約３８℃で覆い得る。ＴｒｙｐＬＥ酵素を細胞と共に約３６℃〜約３８℃のＣＯ2インキュベーター中で約５分間インキュベートし得る。インキュベーション後に細胞を外し、フラスコの内容物は、細胞を覆うのに最初に使用したＴｒｙｐＬＥ酵素の同じ体積で希釈し得る。次に、懸濁した細胞の内容物を含むＴｒｙｐＬＥ酵素溶液を、５０ｍｌ遠心分離チューブに移し得る。カルシウムまたはマグネシウム不含有ＤＰＢＳを使用して、Ｔ−２５フラスコについては約５ｍｌ、Ｔ−７５フラスコについては約１０ｍｌ、およびＴ−１７５フラスコについては約２５ｍｌの体積でフラスコの内容物を洗浄し得る。本発明の実施において使用されるフラスコは組織培養用の処理をしていないフラスコでありえる。約５０ｍｌのＤＰＢＳを、ＴｒｙｐＬＥ酵素および懸濁した細胞の内容物を含む５０ｍｌ遠心分離チューブに追加し得る。
【００６５】
５０ｍｌ遠心分離チューブは、周囲温度で約１２０ｇ約５分間遠心分離することができる。２０μｌなどの沈殿の小さなアリコートを取り出して、手動の血球計数器または自動化装置により細胞のカウントを実行することができる。遠心分離後に上清を除去して廃棄し、残存する沈殿を約７ｍｌのチャンの完全培地中に懸濁する。
【００６６】
チャンの完全培地中に懸濁した共培養した増幅細胞は、凍結保存のために調製することができるか、ＣＤ３４細胞についての免疫選択を行なうことができるか、ヒトへの注入のために調製することができるか、または任意の数の細胞経路に沿った細胞分化のために調製することができる。
【００６７】
共培養情報は細胞培養の経過の間に得ることができる。培地は約３日ごとまたはそれ以上で交換し得る。共培養が１０，０００，０００以上の細胞を含むならば、共培養における細胞は同じ培養条件下で継代培養するために取り出すことができるか、またはあるいは本出願において記述した凍結保存方法に従って凍結保存することができる。
【００６８】
プレートでの培養を介する細胞の増加
【００６９】
細胞は、プレーティング技術を使用して滅菌条件下で共培養することができる。本発明の方法において使用される培地は、ＣＢ中のＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭの検出のためにｈＳＣＦ、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ｈＩＬ−３、ｈＧ−ＣＳＦ、ｈＥＰＯを含むメソカルト４０３４でありえる。−８０℃で保存した培養培地（メソカルト＃４０３４）は、約２〜８℃または室温で解凍される。共培養のための解凍した培養培地および細胞を、プレーティングの前に氷上に約１５分間置く。約０．３ｍｌの細胞懸濁物を培養培地を含むチューブに追加し、ボルテックスにより撹拌し、氷上で約３０分間インキュベートする。シリンジを使用して、１ウェルあたり約１ｍｌで４ウェル培養プレートの３ウェル中に培養培地を均一に分配する。プレートの第４のウェルへ約１ｍｌのＤＰＢＳを追加する。プレートは滅菌された条件下で約１４〜約２１日間約３７℃でインキュベートするべきである。
【００７０】
フローサイトメトリー分析
【００７１】
共培養した臍帯血細胞および月経血細胞のサンプルは、増幅したか増幅しないかにかかわらず、全細胞数、色素排除を介するトリパンブルーによる細胞生存率、および細胞表面マーカーの発現について分析することができる。
【００７２】
増幅し共培養した臍帯血細胞および月経血細胞の全細胞カウントおよび細胞生存率は、血球計数器による手動カウント、フローサイトメーター、または例えばバイセル（ＶｉＣｅｌｌ）（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）社）もしくは顕微鏡画像に表示された細胞をカウントするのに適切なソフトウェアなどの、細胞カウントを得るのに適切な他の手段によって定量し得る。
【００７３】
増幅し共培養した臍帯血細胞および月経血細胞は、フローサイトメトリーによって分析することができる。１×ＮＨ４ＣＬ溶解溶液は、５０ｍｌチューブの中へ約３６ｍｌの蒸留水および４ｍｌの１０×溶解溶液を追加することによって、ステムキット（ＳｔｅｍＫｉｔ）から調製し得る。約５０μｌの細胞サンプルを２本のチューブに追加して、分析を実行することができる。１本のチューブはＣＤ３４＋／生存率の分析のためのものであり、２本目のチューブはアイソクロニック対照のためのものである。約１０μＬの７−ＡＡＤ生存率用色素を各々のチューブに追加し得る。約１０μＬのＣＤ４５−ＦＩＴＣ／ＣＤ３４−ＰＥを第１のチューブに追加し得る。約１０μＬのＣＤ４５−ＦＩＴＣ／ＣＴＲＬ−ＰＥを第２のチューブに追加し得る。混合物をボルテックスにより撹拌し、次に遮光して、約１５℃〜約３０℃で少なくとも２０分間インキュベートし得る。次に約１ｍｌの１×ＮＨ４ＣＬ溶解溶液を各チューブに追加し、ボルテックスにより撹拌し得る。混合物は約１５℃〜約３０℃で約２０分間インキュベートし得る。約１００μＬのステム−カウントフルオロスフェア（Ｓｔｅｍ−Ｃｏｕｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）を各チューブに追加し、ボルテックスにより撹拌し得る。次にサンプルを分析のためにフローサイトメーター上に流すべきである。
【００７４】
細胞表面マーカー、細胞生存率、および他の細胞特性を分析するために、増幅し共培養した臍帯血細胞および月経血細胞も、フローサイトメトリーによって分析することができる。新鮮な細胞のサンプルは、細胞溶解後に以下のプロトコールに従ってもまた分析することができる。
【００７５】
増幅し共培養した臍帯血細胞および月経血細胞のサンプルは、約２０００ｒｐｍで約７分間遠心分離することができる。上清を除去し、約１００μｌの洗浄培地（２５％ＨＳＡ、ＤＮＡｓｅ、ヘパリン、ならびにＣａ＋およびＭｇ＋含有ＨＢＳＳ）中に細胞を再懸濁することができる。次に再懸濁した細胞は、ブラッド・バンク・セロフュージ（Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ  Ｓｅｒｏｆｕｇｅ）中で約１分間遠心分離することができる。上清はデカントすることができ、細胞を約１．２ｍｌのシース液を中で再懸濁し、ボルテックスにより撹拌した。
【００７６】
シース液中の細胞は任意の数の細胞表面マーカーについて分析することができる。限定するのではなく一例として、表Ａにおいて記述されているように、約１００μｌのシース液中の細胞のサンプルを、各チューブ中に１つの試薬あたり１０μｌまたは２０μｌの体積のいずれかで以下の試薬を含む各チューブに追加し、次にチューブをボルテックスにより撹拌して試薬およびサンプルを混合する。
【００７７】
表Ａ：フローサイトメトリーロード図表
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【００７８】
２０分間室温（１５〜３０℃）でインキュベートする。遮光する。ＲＢＣを含む新鮮なサンプルで実行するならば、５００μｌの溶解溶液を追加し、さらに１０分間室温でインキュベートし、遮光する。密度勾配または解凍したサンプルで実行する場合は、溶解しない。サンプルを溶解しなかった場合は、２０分のインキュベーション後に１ｍｌの洗浄培地により洗浄する。１分間遠心分離し、次に上清をデカントする。サンプルを溶解したならば、１分間サンプルを遠心分離し、溶解物をデカントする。１ｍｌの洗浄培地を追加し、ボルテックスにより撹拌し、再び遠心分離し、次に再びデカントする。各チューブに５００μＬのシース液を追加し、ボルテックスにより撹拌し、ＦＣ５００フローサイトメーターを実行する。
【００７９】
細胞マーカー分析の前に、全細胞カウントを細胞サンプルで実行することができる。任意の数の陽性対照は、カスミ（Ｋａｓｕｍｉ）−３対照細胞または他の対照細胞を使用して、フローサイトメトリー分析のために設定し得る。
【００８０】
細胞カウントおよび細胞生存率分析のための資材は、フローサイトメーター、イソフロー・シース液（Ｉｓｏｆｌｏｗ  Ｓｈｅａｔｈ  Ｆｌｕｉｄ）、コールター・クレンズ洗浄剤（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｌｅｎｚ  Ｃｌｅａｎｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ）、ならびにＣＤ４５−ＦＩＴＣ／ＣＤ３４−ＰＥ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ／アイソクロニック対照−ＰＥ、７−ＡＡＤ生存率用色素、ステム−カウント・フルオロスフェア、塩化アンモニウム（ＮＨ４ＣＬ）溶解溶液１０×濃縮および２２％のウシアルブミン溶液を含むが、これらに限定されない試薬を含むが、これらに限定されない。ステムキット（商標）ＣＤ３４＋ＨＰＣエニュメレーション・キット（Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）添付文書−バージョン０３（ＰＮＩＭ２３９０）；ベックマン・コールター製品是正処置、ＣＸＰ２．０＆２．１パネルインタラプション−３／１０／０６、ＰＣＡＭ−Ｄ−１０１３；１４．３ステムラボ（ＳｔｅｍＬａｂ）、ビルド番号、バージョン３．２．１  ２００７０６２６０８５６を参照。フローサイトメトリーのための資材は、イソフロー・シース液；コールター・クレンズ洗浄剤；ならびに以下の試薬（使用の前に約２０〜２５℃）：ＣＤ１１７−ＰＥ、ＣＤ２９−ＦＩＴＣ、ＣＤ３４−ＥＣＤ、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＥＣＤ、ＣＤ９０−ＰＣ５、ＣＤ１０５−ＰＥ、ＣＤ１６６−ＰＥ、ＩｇＧＦＩＴＣ、ＩｇＧ−ＰＥ、ＩｇＧ−ＥＣＤ、ＩｇＧ１−ＰＣ５、ＨＬＡ−Ｉ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１３３−ＰＥ、ＨＬＡ−ＩＩ  ＥＣＤ、ＣＤ９−ＦＩＴＣ、ＣＤ５４−ＰＥ、ＣＤ１０−ＰＣ５、ＣＤ５９−ＦＩＴＣ、ＣＤ６３−ＰＥ、ＣＤ１３−ＰＣ５、ＣＤ４９ｅ−ＦＩＴＣ、ＣＤ８１−ＰＥ、ＣＤ４９ｆ−ＰＣ５、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ、ＣＤ３８−ＰＣ５、ＣＤ２９−ＦＩＴＣ、ＣＤ１０５−ＰＥ（ＣＤ４１−ＥＣＤ）、ＣＤ３−ＰＣ５、ＣＤ１９−ＦＩＴＣ、ＮＡＮＯＧ−ＦＩＴＣ、ＳＳＥＡ３−ＰＥ、ＳＳＥＡ４−ＰＥ、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ、ＣＤ５６−ＰＥ、７−ＡＡＤ生存率用色素、塩化アンモニウム（ＮＨ４ＣＬ）溶解溶液１０×濃縮、洗浄培地（ＨＢＳＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋含有ハンクス）５００ｍｌ、ヘパリン５ｍｌ、２５％ヒト血清アルブミン５０ｍｌ、１アンプルＤＮＡＳＥを含む）、カスミ−３細胞（ＣＤ３４＋細胞）、タイマー、およびボルテックスミキサーもまた含むが、これらに限定されない。
【００８１】
増幅細胞の凍結保存
【００８２】
フラスコおよびさらにプレートにおける組織培養から得られた、チャンの完全培地中に懸濁し共培養した増幅細胞は、凍結保存のために調製し得る。増幅細胞をチャンの完全培地中に再懸濁し得る。１つの実施形態において、増幅細胞は１：１比率で凍結保存剤と合わせ得る。例えば、５ｍｌバイアルは約２．５ｍｌの細胞および２．５ｍｌの凍結保存剤を含み得る。増幅細胞の懸濁物は凍結保存剤の追加の前に少なくとも約１５分間氷上に置くべきである。
【００８３】
凍結保存剤は、４：１の比率でＥＳ−ＦＢＳとＤＭＳＯ（９９％）を組み合わせることによって調製される。例えば、約２ｍｌのＥＳ−ＦＢＳは０．５ｍｌのＤＭＳＯに追加し得る。ＥＳ−ＦＢＳはＤＭＳＯの追加の前に少なくとも約１５分間氷上で冷却し得る。一旦冷却されたならば、ＥＳ−ＦＢＳをＤＭＳＯに追加する。ＥＳ−ＦＢＳおよびＤＭＳＯは、少なくとも約１５分間冷却し得る。
【００８４】
代替の実施形態において、他の凍結保存培地を使用し得る。例えば、例えば、クリオストア（ＣｒｙｏＳｔｏｒ）ＣＳ１０もしくはＣＳ５（バイオライフ（Ｂｉｏｌｉｆｅ）社）、プロパンジオールおよびショ糖により補足された胚の凍結保存培地（ビトロライフ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）社）、またはＳＡＧＥ培地（クーパー・サージカル（Ｃｏｏｐｅｒ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ）社）などの凍結保存剤を使用して、解凍後の高細胞生存率転帰を維持し得る。グリセロールは他の凍結保存剤（ＤＭＳＯなど）と共に使用し得るか、または適切なタンパク質を含む培地中で約１０％の濃度で単独で使用し得る。
【００８５】
凍結保存剤は、増幅細胞の懸濁物に氷上で一滴ずつ追加し得る。増幅細胞および懸濁した増幅細胞の溶液は穏やかに混合し得る。溶液は、凍結保存のための調製において所望される体積のバイアルの中へ小分けし得る。バイアルはクリオバイアルでありえる。速度制御フリーザーへと置く準備ができるまで、バイアルは氷上で維持される。
【００８６】
凍結保存剤中の増幅細胞の調製物は、複数の温度低下工程に暴露して、速度制御フリーザーまたは他の適切なフリーザーシステム（モニタリングダンプフリーズまたはフリーズコンテナー（ナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）社））を利用して、約−９０℃の最終温度まで増幅細胞の温度を低下させることができる。適切な速度制御フリーザーは、クリオメド・サーモ・フォーマ・コントロールド・レート・フリーザー（Ｃｒｙｏｍｅｄ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｏｒｍａ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒａｔｅ  Ｆｒｅｅｚｅｒ）７４５４（サーモ・エレクトロン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）社）、プラナー・コントロールド・レート・フリーザー・クリオ（Ｐｌａｎａｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒａｔｅ  Ｆｒｅｅｚｅｒ  Ｋｒｙｏ）１０／１６（ＴＳサイエンティフィック（ＴＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社）、ゴーディナー（Ｇｏｒｄｉｎｉｅｒ）、バイオ−クール−ＦＴＳシステムズ（Ｂｉｏ−Ｃｏｏｌ−ＦＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびアシンプトート（Ａｓｙｍｐｔｏｔｅ）ＥＦ６００、バイオストア（ＢＩＯＳＴＯＲ）ＣＢＳ  ２１００シリーズを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
温度低下工程は速度制御フリーザーにおいてプログラムし得る。凍結保存剤および増幅細胞は、フリーザー中での最終的な保存のための調製において、速度制御した温度低下を行い得る。速度制御低下は、細胞生存率を維持するようにデザインし得る。クリオ−メドフリーザー（サーモ・エレクトロン社）、液体窒素シリンダーおよびポータブルクリオ−メドフリーザーを、フリーザー中での最終的な保存のための調製における速度制御した低下に使用し得る。約−９０℃の温度を達成するようにクリオバイアルまたはクリオバッグ（ｃｒｙｏｂａｇ）中で細胞は速度制御低下を行い得る。
【００８８】
クリオバッグ中に回収された増幅細胞のサンプルについて、以下の速度制御した低下プロフィールを増幅細胞に対して行い得る：約４℃で待機、−６．０℃まで１分につき１．０℃（サンプル）、−５０．０℃まで１分につき２５．０℃（チャンバー）、−１４．０℃まで１分につき１０．０℃（チャンバー）、−４５．０℃まで１分につき１．０℃（チャンバー）、−９０．０℃まで１分につき１０．０℃（チャンバー）、および終了（サンプルは−８５．０℃またはそれ以下で）。
【００８９】
クリオバイアル中に回収された増幅細胞のサンプルについて、以下の速度制御した低下プロフィールを細胞に対して行い得る：４．０℃で待機、−３．０℃まで１分につき１．０℃（チャンバー）、−２０．０℃まで１分につき１０．０℃（チャンバー）、−４０．０℃まで１分につき１．０℃（チャンバー）、−９０．０℃まで１分につき１０．０℃（チャンバー）、および終了。
【００９０】
一旦凍結保存剤および増幅細胞の混合物が約−８５℃またはそれ以下になれば、凍結保存バイアルは低温保存ユニットに移され、約−１３５℃またはそれ以下の温度で液体窒素の蒸気中に保存されるか、またはあるいはバイアルは液体窒素の液体相中に保存し得る。例えば適切な低温保存ユニットは、ＬＮ２フリーザーＭＶＥ１８３０（チャート・インダストリーズ（Ｃｈａｒｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）社）を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
増幅細胞の免疫選択
【００９２】
臍帯血細胞および月経血細胞の共培養を介して増幅した細胞は、少なくとも１つの所望される細胞マーカーについて選択し得る。一例として、所望される細胞マーカーはＣＤ３４、ＨＬＡ−ＩＩ、またはＳＳＥＡ−４でありえる。細胞に対して、所望されない細胞を除去するネガティブな選択工程もまた行い得る。細胞選択プロセスの全体にわたって、無菌技術を使用し得る。細胞選択は、新鮮な細胞、または事前に凍結保存し共培養した解凍細胞について使用し得る。細胞選択は、２５０万細胞〜１０００万細胞で実行し得る。細胞は、２５０万未満の細胞を含むサンプルまたは１０００万以上の細胞を含むサンプルからもまた選択し得る。
【００９３】
細胞選択のための資材は、ＤＮａｓｅ、パルモザイム（ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社）−１アンプル、ネガティブまたはポジティブに選択される任意の抗細胞表面マーク（例えば抗ＣＤ３４抗体）、ヤギ抗マウスＩｇＧマイクロビーズ、および磁石体を含むが、これらに限定されない。
【００９４】
増幅して共培養した臍帯血細胞および月経血細胞の１．０×１０6以上の細胞を含む細胞懸濁物を約４℃で約７分間約３００ｇで遠心分離した。上清は細胞沈殿を乱さずに除去し得る。沈殿は約１００μｌの洗浄培地により再懸濁し得る。１つの実施形態において、抗細胞表面抗体は抗ＣＤ３４抗体である。溶液中の細胞は、氷上で約２０分〜約２５分間インキュベートし得る。インキュベーション後に、約２ｍｌの洗浄培地を細胞に追加し、穏やかに混合し得る。混合物は約４℃で約１０分間約３００ｇで遠心分離し得る。遠心分離後に、上清は沈殿を乱さずに吸引し得る。沈殿は約８０μｌの洗浄培地中に再懸濁し得る。約２０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧを細胞懸濁物に追加し、穏やかに混合し得る。混合物は氷上で約３０分間インキュベートし得る。インキュベーション後に、約２ｍｌの洗浄培地を追加すること、および次に溶液を混合することによって、細胞を洗浄し得る。細胞は約４℃で約１０分間約３００ｇで遠心分離し得る。
【００９５】
カラムを使用して、選択されない細胞から選択した細胞を分離し得る。カラムは約５００μｌのワーキングバッファー中で湿らせることによって調製し得る。遠心分離後に、上清は沈殿を乱さずに吸引し得る。沈殿は約５００μｌのワーキングバッファー中に再懸濁し得る。細胞接着を回避するために、追加のＤＮａｓｅを細胞に追加し得る。細胞懸濁物はピペットを使用して、カラムに追加し得る。抗体に標識された細胞（陽性画分）は、マックス（ＭＡＣＳ）セパレーターによって提供される磁石体にさらされるカラムに付着するに違いない。未標識細胞（陰性画分）はカラムを通って流出するものであり、回収するべきである。
【００９６】
細胞懸濁物をカラムを通して流出させ、陰性画分として回収した後、カラムは１洗浄あたり５００μｌのワーキングバッファーを使用して、少なくとも３回洗浄し得る。各洗浄は、次の洗浄の前にカラムを通して完全に流出させ得る。各洗浄は陰性画分と共にし得る。約１００μｌの陰性画分を分析のために取り出し得る。血球計を使用する細胞カウント、およびトリパンブルーまたは他の方法を使用する生存率測定を実行し得る。表現型分析は、以前に論じられたようなフローサイトメトリーを使用するか、または他のフローサイトメトリー法を使用して行い得る。陰性画分は凍結保存のために調製し得るか、またはさらなる細胞の増殖および増加ならびに後のプロセシングのために培養を行い得る。
【００９７】
陰性画分を回収し、カラムを洗浄した後に、陽性画分を回収するために他のチューブをカラムの下に置くことができる。約１ｍｌのワーキングバッファーをカラムに追加し、カラムから磁石体を取り除くことができる。ワーキングバッファーおよび陽性画分が回収されるべきである。プランジャーを使用して、陽性画分についてのカラムから可能な限り多くの標識細胞を除去し得る。トリパンブルーまたはフローサイトメトリーを使用する細胞カウントおよび生存率を含むが、これらに限定されない分析のために、約１００μｌの陽性画分を取り出すことができる。陽性画分は、凍結保存、培養、または治療用の使用のために調製し得る。
【００９８】
所望される細胞マーカーを発現する細胞を免疫選択する工程は、図１で示されるような本発明の実施形態に従って行い得る。特に、選択は、少なくとも臍帯血細胞および月経血細胞を共培養する工程の後に行い得る。特定の細胞マーカーを発現する月経血幹細胞を選択する工程は、選択された細胞マーカーを発現する濃縮された細胞の集団を提供し、それはさらなる細胞培養、凍結保存、または治療用の使用のために使用し得る。
【００９９】
１つの実施形態において、細胞の集団からＣＤ３４を発現する増幅細胞を選択する工程は、抗ヒトＣＤ３４抗体により増幅細胞を標識すること、および次に抗ヒトＣＤ３４抗体に結合が可能な磁気標識抗体によりＣＤ３４幹細胞−抗ヒトＣＤ３４抗体複合体を標識することを含む。さらに、本方法は、抗ヒトＣＤ３４抗体によりＣＤ３４を発現する細胞を標識すること、および次に抗ヒトＣＤ３４抗体に結合が可能な磁気標識抗体によりＣＤ３４細胞−抗ヒトＣＤ３４抗体複合体を標識することを含む。ＣＤ３４を発現する細胞を選択する方法は、本発明に従って実行または増幅したＣＤ３４を発現する細胞を選択することを含むことができる。細胞を免疫選択する工程は、ＣＤ３４細胞、抗ヒトＣＤ３４抗体、および磁気標識抗体を含む複合体を磁石体に暴露して、カラムに磁気標識抗体および複合体の残りを引き付けること、および分析のためのカラムを通して他のすべてのＣＤ３４陰性細胞を洗浄することを含む。
【０１００】
ＣＤ３４を発現する細胞を選択する工程の全体にわたって、細胞の細胞懸濁物およびワーキングバッファー（ＤＮａｓｅを含有するマックス（登録商標）分離ランニングバッファー、ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）社）は、低温で維持することができる。他の磁気分離キットは使用のために適切でありえる（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社）。
【０１０１】
細胞懸濁物は約１０分間約３００ｇで遠心分離し得る。沈殿は抗ヒトＣＤ３４抗体を含むワーキングバッファー中に懸濁し得る。例えばワーキングバッファーは、例えばＰＢＳ（約ｐＨ７．２）、ウシ血清アルブミン、ＥＤＴＡおよび約０．０９％のアジド（または適切な溶液）（ＢＤバイオサイエンス社）を含み得る。沈殿は、例えば約１００μｌのワーキングバッファーおよび約５ｕμｇのヒトＣＤ３４について親和性を有する精製抗体の中に懸濁し得る。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルでありえる。抗体は、ヒトＣＤ３４に結合可能な精製されたＩｇＧまたは他の抗体でありえる。抗体はマウス抗ＣＤ３４抗体でありえる。
【０１０２】
細胞、ワーキングバッファーおよび抗ＣＤ３４の抗体を含む溶液を、インキュベーション期間の間インキュベートする。例えば、インキュベーション期間は氷上で約２０分〜約２５分の間を含み得る。あるいはインキュベーション期間は、温度が少なくとも約２℃〜約８℃であるならば約２０分未満、または少なくとも室温であるならば約５分〜約１０分に短縮し得る。インキュベーション期間後に、細胞を含む溶液をワーキングバッファーにより洗浄して未結合の抗体を除去し、次に遠心分離し得る。例えば、遠心分離は約１０分間約３００ｇで行い得る。遠心分離後に、上清は吸引し、分析のために保存でき、沈殿をワーキングバッファー中に懸濁する。例えば、ワーキングバッファーの体積は約８０μｌでありえる。
【０１０３】
添付されるマイクロビーズを有し、抗ヒトＣＤ３４抗体に対する親和性を有する第２バッチの抗体は、沈殿の懸濁に使用するワーキングバッファーに追加する。マイクロビーズは例えば、酸化鉄および多糖を含み得る。マイクロビーズは生体分解性でありえる。マイクロビーズはミルテニー・バイオテク社を介して入手可能である。例えば、抗体の第２バッチは、ヒトＣＤ３４について親和性を有する抗体について特異的であり、例えばヤギ抗マウスＩｇＧ抗体などである。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルでありえる。抗体は、マウス抗体の軽鎖および／または重鎖に結合することができる。抗体は、例えば製品１３０−０４８−４０１としてミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なヤギ抗マウスＩｇＧマイクロビーズコンジュゲートでありえる。前述のヤギ抗マウスＩｇＧの２ｍｌバイアルを、およそ１．０×１０9の全未分離細胞のために使用し得る。
【０１０４】
細胞懸濁物を、第２のインキュベーション期間の間インキュベートする。例えばインキュベーション期間は、約３０分〜約３５分の範囲でありえる。あるいはインキュベーション期間は、インキュベーションが約２℃〜約８℃で行われる場合は約３０分未満、またはインキュベーションがおよそ室温で行なわれる場合は約５〜約１０分でありえる。インキュベーション期間が完了した後に、細胞は例えば約２ｍｌのワーキングバッファーなどのワーキングバッファーにより洗浄し、次に細胞を遠心分離する。例えば、遠心分離は約１０分間約３００ｇで行い得る。上清は吸引して分析のために保存することができ、細胞を含む沈殿を、例えば約５００μｌのワーキングバッファーなどのワーキングバッファー中に懸濁する。
【０１０５】
細胞分離
【０１０６】
ＣＤ３４細胞をＭＳのカラムを使用してワーキングバッファー中の細胞懸濁物から分離し、ＣＤ３４幹細胞を分離し得る。例えば、ＭＳカラム（ミルテニー・バイオテク社）または他の適切なカラムを使用し得る。あるいは、細胞を分離する他の適切な方法を使用し得る。ユニット、マルチスタンド、ＭＳカラムおよびマイクロビーズを含むミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なミニマックス（ＭｉｎｉＭＡＣＳ）キットは、ＣＤ３４細胞選択のために使用し得る。ＭＳカラムはワーキングバッファーによるリンスによって調製し得る。例えば、カラムのリンスに使用するワーキングバッファーの体積は約５００μｌでありえる。カラムを、ミルテニー・バイオテク社を介して入手可能なマックスセパレーターの磁石体、または磁石体を提供する適切なセパレーター中に置く。
【０１０７】
ワーキングバッファー中の細胞懸濁物を、ピペットまたはある体積液体を移すことができる他の器具によりカラムに追加する。抗ヒトＣＤ３４抗体により標識されたＣＤ３４細胞（それはマイクロビーズに付着した抗体と結合する）は、マックスセパレーターの磁石体のためにカラム中で保持される。いずれの未標識細胞は、ワーキングバッファーと一緒にカラムを通して流出するべきであり、細胞表現型決定および細胞カウントのために滅菌済みチューブ中に回収し得る。カラムを通って流出する未標識細胞を陰性画分として同定し得る。カラムは細胞懸濁物の追加後にワーキングバッファーにより洗浄し得る。例えばカラムは、少なくとも３回、またはすべてもしくは実質的にすべての未標識細胞がカラムを通って通過する任意の量の回数で洗浄し得る。洗浄工程からの排出物は、細胞の表現型決定およびカウントのために回収し得る。排出物は陰性画分としても同定し得る。
【０１０８】
カラムが洗浄された後に、標識されたＣＤ３４細胞をカラムから回収し得る。標識されたＣＤ３４細胞は、滅菌されたチューブをカラムの下に置き磁石体からカラムを除去することによって回収される。一旦カラムが磁石体から除去されれば、標識されたＣＤ３４細胞はカラムを通って通過し、滅菌されたチューブの中へ入る。カラム中の残存する標識されたＣＤ３４細胞は、カラムにワーキングバッファーを追加してカラムを通して細胞を洗浄することによって、および任意にプランジャーによるカラムを剥がして細胞を放出するよって、洗い出すことができる。回収された標識したＣＤ３４細胞は、陽性画分として同定し得る。標識されたＣＤ３４細胞のより精製された集団を得るために、陽性画分は、任意に、以前に開示された洗浄手順に従って、カラムを通すことを少なくとも１回以上実行し得る。陽性画分を約１０分間約３００ｇで遠心分離し、上清を吸引し得る。沈殿を約５ｍｌのワーキングバッファー中に懸濁し得る。
【０１０９】
陽性画分および陰性画分を血球計数器により分析して、全生存細胞のカウントを得る。陰性画分は表現型決定のためのフローサイトメトリーによって分析される。任意に、陽性画分はフローサイトメトリーを使用して表現型を決めることができる。
【０１１０】
ＣＤ３４または他の所望される細胞マーカーを発現する細胞を含む陽性画分は、本発明の方法に従って凍結保存のために調製し得る。約１ｍｌのヒト血清アルブミン、約３ｍｌのＤＰＢＳおよび約１ｍｌのＤＭＳＯを、約５ｍｌの陽性画分に追加する。あるいは、例えば完全培地またはウシ血清アルブミン、ウシ胎仔血清、ウシ胎仔血清、タンパク質血漿画分、または自己血清などの他の培養培地は、凍結保存のために細胞を調製する工程で使用し得る。増幅細胞を含む溶液を混合し、氷上で約１０分間冷却する。約１ｍｌのＤＭＳＯを凍結保存剤として追加する。あるいは、約６％のＨＥＳヒドロキシエチルデンプンおよび約５％のＤＭＳＯの約１ｍｌの混合物を、凍結保存剤として使用し得る。結果として生じる溶液をクリオバイアルの中へ小分けする。あるいは、結果として生じる溶液は例えば凍結保存バッグなどの凍結保存のために適切な任意の容器の中へ小分けすることができる。次にクリオバイアルは、本発明の速度制御フリーザープロトコールに従って速度制御フリーザー（クリオメッド（Ｃｒｙｏｍｅｄ）社）中で凍結保存する。一旦増幅細胞を含む溶液が約−９０℃の標的温度に到達すれば、クリオバイアルを長期間保存用フリーザーの中へ移し、約−１３５℃またはそれ以下で保存する。あるいは、クリオバイアルまたは他の適切な凍結保存容器を、モニタリングダンプフリーズへと置き、約−８０℃に凍結し、次に約−１３５℃でまたはそれ以下で長期間保存フリーザー中の液体窒素の気相の中へ移すことができる。
【０１１１】
増幅細胞の治療用の使用
【０１１２】
本発明によって得られたＣＤ３４を発現する増幅細胞を、治療用の使用のために調製してヒト障害を治療し得る。１つの実施形態において、増幅細胞、共培養を介する増加から免疫選択したＣＤ３４細胞、または凍結保存後に解凍された増幅細胞を、レシピエントへの静脈内注入のために調製し得る。
【０１１３】
静脈内注入のための技術は、ヒトへの細胞注入について許容される手段に従って実行することができる。静脈内注入は、増幅したＣＤ３４細胞の自己注入または同種異系注入（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）を含み得る。
【０１１４】
増幅細胞の分化
【０１１５】
本発明の増幅したＣＤ３４臍帯血細胞は身体中の２６０の体細胞のうちのいかなるものへも分化することができる。例えば、細胞は、少なくとも肝細胞、膵細胞、筋原細胞、骨形成細胞、軟骨形成細胞、脂肪細胞、上皮細胞、神経細胞、角化細胞、および心筋細胞へと分化することができる。共培養システムにおいて見られるように、細胞は、他の素因のある細胞と共に培養した場合に、肝細胞、膵細胞、筋原細胞、骨形成細胞、軟骨形成細胞、脂肪細胞、上皮細胞、神経細胞、角化細胞および心筋細胞などに分化する能力もまた保持することができる。分化から得られた細胞および共培養から得られた細胞は、置換療法または再生療法、他の治療用適用、薬用化粧品、器官拒絶の治療法、および他の適用のための処理において使用される可能性もまた有し得る。
【０１１６】
本発明によって得られたＣＤ３４を発現する増幅した臍帯血細胞は、特異的な細胞系譜への分化のために調製し得る。１つの実施形態において、増幅細胞、共培養を介する増加から免疫選択したＣＤ３４細胞、または凍結保存後に解凍された増幅細胞は、細胞分化のために調製し得る。
【０１１７】
分化のための技術は、ヒトに細胞分化について許容される手段に従って実行することができる。
【実施例】
【０１１８】
以下の実施例は、限定ではなく実例として提示される。当業者は、特に本明細書において引用された様々な参照の教示の観点から、実施例で具体化された本発明の変形を行うことができ、それらの開示は参照することによってそれらの全体を組み入れられることを認識するだろう。
【０１１９】
実施例１−臍帯８７１Ｒの培養
【０１２０】
臍帯血細胞８７１Ｒを本出願中で記述された方法に従って回収し、臍帯血回収産業において使用した。
【０１２１】
臍帯８７１Ｒ細胞のための臍帯血サンプルを、本出願中で記述された臍帯血のためのプロセシングおよび凍結保存の方法に従って、回収の約２日後にプロセシングし、凍結保存した。臍帯８７１Ｒ細胞は約２．５年間凍結保存で保持した。臍帯８７１Ｒ細胞は本出願中で記述した解凍方法に従って解凍した。
【０１２２】
培養−プレート
【０１２３】
約３ｍｌの培養培地（メソカルト＃４０３４−半固形培地）を室温で解凍し、次に臍帯細胞希釈物（５００，０００細胞／ｍＬ）と共に氷上に１５分間置いた。１５分後に約０．３ｍｌの臍帯細胞希釈物を培養培地のチューブへと接種した。チューブを穏やかにボルテックスにより撹拌し、次に氷上で約３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、培養培地および臍帯８７１Ｒ細胞を、４ウェル培養プレートの最初の３ウェルへと均一に分割した。１ミリリットルのＤＰＢＳを湿度の補助として第４のウェルに追加し、細胞を３７℃でインキュベートした。
【０１２４】
培養−フラスコ
【０１２５】
臍帯８７１Ｒ細胞を、凍結保存細胞を解凍し、次に本出願において開示された遠心分離を介してチャンの完全培地中で洗浄する工程にかけた。細胞の沈殿を約７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で再懸濁した。
【０１２６】
再懸濁した臍帯８７１Ｒ細胞を、組織用の処理をしていないＴ２５培養フラスコにおいて、７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で約１，０００，０００細胞で播種した。細胞は約３６℃〜約３８℃のＣＯ2インキュベーター中でインキュベートした。第１の継代では接着細胞はなかった。
【０１２７】
表Ｂ−Ｍ２８１００ＲＭ、Ｍ２８１００ＲＭ、Ｍ２８１０１Ｒ、Ｍ２８１０１Ｒ＋８７１Ｒおよび８７１Ｒのプレート培養
2011501960.tif 000004
【０１２８】
実施例２−Ｍ２８１００ＲＭ月経血細胞の培養
【０１２９】
月経血幹細胞Ｍ２８１００ＲＭを、約９ｍｌの月経流出物を回収すること、ならびにカルシウムおよびマグネシウムを含有し抗生物質を含有しない獲得培地ＤＰＢＳおよび防腐剤不含有ヘパリン中で回収物を約２４時間〜約４８時間以内にプロセシング施設に発送することによって、米国特許公報第２００８０２４１１１３号の方法に従って回収した。月経流出物サンプルを抗生物質中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、遠心分離を介して濃縮し、１０％ＤＭＳＯ凍結保存剤と共に混合し、米国特許出願公報第２００８０２４１１１３号の教示に従って凍結保存した。
【０１３０】
Ｍ２８１００ＲＭ月経血細胞のための月経流出物サンプルをプロセシングし、Ｍ２８１００ＲＭ月経血細胞を回収の約２日後に凍結保存した。細胞は約８か月間凍結保存で保持し、次に本出願中で記述した方法に従ってＣＦＵのために解凍した。
【０１３１】
培養−プレート
【０１３２】
培養培地（メソカルト＃４０３４−半固形培地）の３本の３ｍｌチューブを、５０，０００細胞／ｍｌ、１００，０００細胞／ｍｌ、および２１，６００細胞／ｍｌの細胞希釈で、室温で解凍し、次に氷上に１５分間置いた。１５分後に、約０．３ｍｌの各月経血細胞希釈物をメソカルト＃４０３４半固形培地のチューブへと接種した。チューブを穏やかにボルテックスにより撹拌し、次に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、培養培地および月経血幹細胞を、４ウェルプレートの最初の３ウェルへと均一に分割した。１ｍｌのＤＰＢＳを湿度の補助として第４のウェルに追加し、細胞を３７℃でインキュベートした。細胞培養の特定の結果を表Ｂ中に要約する。
【０１３３】
培養−フラスコ
【０１３４】
Ｍ２８１００ＲＭ月経血細胞を、凍結保存細胞を解凍し、次に本出願において開示された遠心分離を介してチャンの完全培地中で洗浄する工程にかけた。細胞の沈殿を約２５ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で再懸濁した。
【０１３５】
再懸濁したＭ２８１００ＲＭ月経血細胞を、組織培養用の処理をしていないＴ２５フラスコにおいて、７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で約２２１，０００の細胞で播種した。細胞が約７０〜８０％のコンフルエントになるまで、細胞を約３６℃〜約３８℃のＣＯ2インキュベーター中でインキュベートした。細胞は表Ｃで示した複数の継代を行なった。表Ｃ中で示す１５％のチャンの完全培地の完全な交換を含む継代を約３日または４日後に行った。
【０１３６】
表Ｃ−Ｍ２８１００ＲＭ月経血細胞の培養
2011501960.tif 000005
【０１３７】
実施例３−Ｍ２８１０１Ｒの培養
【０１３８】
月経血幹細胞Ｍ２８１００ＲＭを、約９ｍｌの月経流出物を回収すること、ならびにカルシウムおよびマグネシウムを含有し抗生物質を含有しない獲得培地ＤＰＢＳおよび防腐剤不含有ヘパリン中で回収物を約２４時間〜約４８時間以内にプロセシング施設に発送することによって、米国特許公報第２００８０２４１１１３号の方法に従って回収した。月経流出物サンプルを抗生物質中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、遠心分離を介して濃縮し、１０％ＤＭＳＯ凍結保存剤と共に混合し、米国特許出願公報第２００８０２４１１１３号の教示に従って凍結保存した。
【０１３９】
Ｍ２８１０１Ｒ月経血細胞のための月経流出物を、回収の約３日後に、本出願中で記述した月経血幹細胞のプロセシングおよび凍結保存の方法に従って、回収後にプロセシングし、凍結保存した。細胞は約７か月間凍結保存で保持した。Ｍ２８１０１Ｒ月経血細胞は本出願中で記述した解凍方法に従って解凍した。
【０１４０】
培養−プレート
【０１４１】
培養培地（メソカルト＃４０３４−半固形培地）の３本の３ｍｌのチューブを室温で解凍し、次にＭ２８１０１Ｒ月経血細胞の細胞希釈物（５０，０００細胞／ｍｌ、１００，０００細胞／ｍｌ、および２１６，０００細胞／ｍｌ）と共に氷上に１５分間置いた。１５分後に、０．３ｍｌの各月経血細胞希釈物を培養培地のチューブへと接種した。次にチューブを穏やかにボルテックスにより撹拌し、次に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、培養培地中の月経血細胞を、４ウェルプレートの最初の３ウェルへと均一に分割した。１ミリリットルのＤＰＢＳを湿度の補助として第４のウェルに追加し、細胞を３７℃でインキュベートした。細胞培養の特定の結果は表Ｂ中に要約する。
【０１４２】
培養−フラスコ
【０１４３】
Ｍ２８１０１Ｒ月経血細胞を、凍結保存細胞を解凍し、次に本出願において開示された遠心分離を介してチャンの完全培地中で洗浄する工程にかけた。細胞の沈殿を約２５ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で再懸濁した。
【０１４４】
再懸濁した月経血細胞を、組織培養用の処理をしていないＴ２５フラスコにおいて、７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で約７２４，７８０細胞で播種した。細胞が約７０〜８０％のコンフルエントになるまで、細胞を約３６℃〜約３８℃のＣＯ2インキュベーター中でインキュベートした。細胞は表Ｄ中で示した複数の継代を行なった。表Ｄ中で示す１５％のチャンの完全培地の完全な交換を含む継代を約３日または４日後に行なった。
【０１４５】
表Ｄ−Ｍ２８１０１Ｒ月経血細胞の培養
2011501960.tif 000006
【０１４６】
実施例４−Ｍ２８１００ＲＭ月経血細胞および臍帯８７１Ｒの培養
【０１４７】
月経血幹細胞Ｍ２８１００ＲＭを、約１０ｍｌの月経流出物の回収すること、ならびにカルシウムおよびマグネシウムを含有し抗生物質を含有しない獲得培地ＤＰＢＳおよび防腐剤不含有ヘパリン中で回収物を約２４時間〜約４８時間以内にプロセシング施設に発送することによって、米国特許公報第２００８０２４１１１３号の方法に従って回収した。月経流出物サンプルを抗生物質中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、遠心分離を介して濃縮し、１０％ＤＭＳＯ凍結保存剤と共に混合し、米国特許出願公報第２００８０２４１１１３号の教示に従って凍結保存した。
【０１４８】
月経血幹細胞Ｍ２８１００Ｒのための月経流出物を、回収の約２日後に、本出願中で記述した月経血幹細胞のプロセシングおよび凍結保存の方法に従って、回収後にプロセシングし、凍結保存した。細胞は約６か月間凍結保存で保持した。Ｍ２８１００Ｒ細胞は本出願中で記述した解凍方法に従って解凍した。
【０１４９】
臍帯８７１Ｒ細胞のための臍帯血サンプルを、本出願中で記述した臍帯血のプロセシングおよび凍結保存の方法に従って、回収の約２日後にプロセシングし、凍結保存した。臍帯８７１Ｒ細胞は約２．５年間凍結保存で保持した。臍帯８７１Ｒ細胞は本出願中で記述した解凍方法に従って解凍した。
【０１５０】
培養−プレート
【０１５１】
培養培地（メソカルト＃４０３４−半固形培地）の３本の３ｍｌチューブを室温で解凍し、次に細胞希釈物（５０，０００細胞／ｍｌのＭ２８１００Ｒ＋５００，０００細胞／ｍｌの臍帯８７１Ｒ；１００，０００細胞／ｍｌのＭ２８１００Ｒ＋５００，０００細胞／ｍｌの臍帯８７１Ｒ；および２１６，０００細胞／ｍｌのＭ２８１００Ｒ＋５００，０００細胞／ｍｌの臍帯８７１Ｒ）と共に氷上に１５分間置いた。１５分後に、０．３ｍＬの培養培地中の各細胞希釈物を培養培地の個別のチューブへと接種した。次にチューブを穏やかにボルテックスにより撹拌し、次に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、培養培地中の各細胞希釈物を、個別の４ウェルプレートの最初の３ウェルへと均一に分割した。１ｍｌのＤＰＢＳを湿度の補助として各プレートの第４のウェルに追加し、細胞を３７℃でインキュベートした。細胞培養の特定の結果を表Ｂ中に要約する。
【０１５２】
培養−フラスコ
【０１５３】
臍帯８７１Ｒ細胞およびＭ２８１０１Ｒ月経血細胞を、凍結保存細胞を解凍し、次に本出願において開示された遠心分離を介してチャンの完全培地中で洗浄する工程に個別にかけた。細胞の沈殿を約７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で再懸濁した。
【０１５４】
再懸濁したＭ２８１０１Ｒ月経血細胞を、組織培養用の処理をしていないＴ２５フラスコにおいて、約２２１，４００細胞で７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で約１，０００，０００の臍帯８７１Ｒ細胞と共に播種した。細胞が約７０〜８０％のコンフルエントになるまで、細胞を約３６℃〜約３８℃のＣＯ2インキュベーター中でインキュベートした。細胞は表Ｅで示した複数の継代を行った。表Ｅ中で示す１５％のチャンの完全培地の完全な交換を含む継代を約３日または４日後に行った。
【０１５５】
表Ｅ−Ｍ２８１０１Ｒ月経血細胞および臍帯８７１Ｒ細胞の培養
2011501960.tif 000007
【０１５６】
実施例５−Ｍ２８１０１Ｒ＋臍帯８７１Ｒの培養
【０１５７】
月経血幹細胞Ｍ２８１０１Ｒを、約９ｍｌの月経流出物を回収すること、ならびにカルシウムおよびマグネシウムを含有し抗生物質を含有しない獲得培地ＤＰＢＳおよび防腐剤不含有ヘパリン中で回収物を約２４時間〜約４８時間以内にプロセシング施設に発送することによって、米国特許公報第２００８０２４１１１３号の方法に従って回収した。月経流出物サンプルを抗生物質中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、遠心分離を介して濃縮し、１０％ＤＭＳＯ凍結保存剤と共に混合し、米国特許出願公報第２００８０２４１１１３号の教示に従って凍結保存した。
【０１５８】
月経血幹細胞Ｍ２８１０１Ｒのための月経流出物を、回収の約３日後に、本出願中で記述した月経血幹細胞のプロセシングおよび凍結保存方法に従って、回収後にプロセシングし、凍結保存した。細胞は約６か月間凍結保存で保持した。Ｍ２８１０１Ｒ細胞は本出願中で記述した解凍方法に従って解凍した。
【０１５９】
臍帯８７１Ｒ細胞のための臍帯血サンプルを、本出願中で記述した臍帯血のプロセシングおよび凍結保存の方法に従って、回収の約２日後にプロセシングし、凍結保存した。臍帯８７１Ｒ細胞は約２．５年間凍結保存で保持した。臍帯８７１Ｒ細胞は本出願中で記述した解凍方法に従って解凍した。
【０１６０】
培養−プレート
【０１６１】
培養培地（メソカルト＃４０３４−半固形培地）の３本の３ｍｌチューブを室温で解凍し、次に細胞希釈物（５０，０００細胞／ｍｌのＭ２８１０１Ｒ＋５００，０００細胞／ｍｌの臍帯８７１Ｒ；１００，０００細胞／ｍｌのＭ２８１０１Ｒ＋５００，０００細胞／ｍｌの臍帯８７１Ｒ；および２１６，０００細胞／ｍｌのＭ２８１０１Ｒ＋５００，０００細胞／ｍｌの臍帯８７１Ｒ）と共に氷上に１５分間置いた。１５分後に、０．３ｍｌの培養培地中の各細胞希釈物を培養培地の個別のチューブへと接種した。次にチューブを穏やかにボルテックスにより撹拌し、次に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、培養培地中の各細胞希釈物を、個別の４ウェルプレートの最初の３ウェルへと均一に分割した。１ｍｌのＤＰＢＳを湿度の補助として各プレートの第４のウェルに追加し、細胞を３７℃でインキュベートした。細胞培養の特定の結果を表Ｂで要約する。
【０１６２】
培養−フラスコ
【０１６３】
臍帯８７１Ｒ細胞およびＭ２８１０１Ｒ月経血細胞を、凍結保存細胞を解凍し、次に本出願中で開示された遠心分離を介してチャンの完全培地中で洗浄する工程にかけた。細胞の沈殿を約７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で再懸濁した。
【０１６４】
再懸濁した月経血細胞を、組織培養用の処理をしていないＴ２５フラスコにおいて、約７２４，０００細胞で７ｍｌの１５％のチャンの完全培地の中で約１，０００，０００の臍帯血幹細胞と共に播種した。細胞が約７０〜８０％のコンフルエントになるまで、細胞を約３６℃〜約３８℃でＣＯ2インキュベーター中でインキュベートした。細胞は表Ｆで示した複数の継代を行なった。表Ｆ中で示す１５％のチャン完全培地の完全な交換を含む継代を約３日または４日後に行った。
【０１６５】
表Ｆ−Ｍ２８１０１Ｒ月経血細胞＋臍帯８７１Ｒ細胞の培養
2011501960.tif 000008
【０１６６】
実施例６−Ｍ２−０４８の培養
【０１６７】
月経血幹細胞Ｍ２−０４８を、約９．７ｍｌの月経流出物を回収すること、ならびにカルシウムおよびマグネシウムを含有し抗生物質を含有しない獲得培地ＤＰＢＳおよび防腐剤不含有ヘパリン中で回収物を約２４時間〜約４８時間以内にプロセシング施設に発送することによって、米国特許公報第２００８０２４１１１３号の方法に従って回収した。月経流出物サンプルを抗生物質中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、遠心分離を介して濃縮し、１０％ＤＭＳＯ凍結保存剤と共に混合し、米国特許出願公報第２００８０２４１１１３号の教示に従って凍結保存した。
【０１６８】
月経血幹細胞Ｍ２−０４８のための月経流出物を、回収の約３日後に、本出願中で記述した月経血幹細胞のプロセシングおよび凍結保存の方法に従って、回収後にプロセシングし、凍結保存した。細胞は約３か月間凍結保存で保持した。Ｍ２−０４８細胞は本出願中で記述した解凍方法に従って解凍した。
【０１６９】
培養−プレート
【０１７０】
培養培地（メソカルト＃４０３４−半固形培地）の３本の３ｍｌのチューブを室温で解凍し、次に５０，０００細胞／ｍｌ、１００，０００細胞／ｍｌ、および２１６，０００細胞／ｍｌの細胞希釈で氷上に１５分間置いた。１５分後に、約０．３ｍｌの各Ｍ２細胞希釈物をメソカルト＃４０３４半固形培地のチューブへと接種した。チューブを穏やかにボルテックスにより撹拌し、次に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、培養培地および月経血幹細胞を、４ウェルプレートの最初の３つのウェルへと均一に分割した。１ｍｌのＤＰＢＳを湿度の補助として第４のウェルに追加し、細胞を３７℃でインキュベートした。
【０１７１】
培養−フラスコ
【０１７２】
Ｍ２−０４８月経血細胞を、凍結保存細胞を解凍し、次に本出願中で開示された遠心分離を介してチャンの完全培地中で洗浄する工程にかけた。細胞の沈殿を約７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で再懸濁した。
【０１７３】
再懸濁した月経血細胞を、組織培養用の処理をしていないＴ２５フラスコにおいて、７ｍｌの１５％のチャン完全培地中で約１，０００，０００細胞で播種した。細胞が約７０〜８０％のコンフルエントになるまで、細胞を約３６℃〜約３８℃でＣＯ2インキュベーター中でインキュベートした。細胞は表Ｇで示した複数の継代を行った。表Ｇ中で示す１５％のチャンの完全培地の完全な交換を含む継代を約３日または４日後に行った。
【０１７４】
表Ｇ−Ｍ２−０４８月経血細胞の培養
2011501960.tif 000009
【０１７５】
実施例７−Ｍ２−０４８＋混合した臍帯（５００６−２１８０および５０１３−２６７０）の培養
【０１７６】
月経血幹細胞Ｍ２−０４８を、月経流出物を回収すること、ならびにカルシウムおよびマグネシウムを含有し抗生物質を含有しない獲得培地ＤＰＢＳおよび防腐剤不含有ヘパリン中で回収物を４８時間以内にプロセシング施設に発送することによって、米国特許公報第２００８０２４１１１３号の方法に従って回収した。月経流出物サンプルを抗生物質中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、遠心分離を介して濃縮し、１０％ＤＭＳＯ凍結保存剤と共に混合し、米国特許出願公報第２００８０２４１１１３号の教示に従って凍結保存した。
【０１７７】
月経血幹細胞Ｍ２−０４８のための月経流出物を、回収の約３日後に、本出願中で記述した月経血幹細胞のプロセシングおよび凍結保存の方法に従って、回収後にプロセシングし、凍結保存した。細胞は約３か月間凍結保存で保持した。Ｍ２−０４８細胞は本出願中で記述した解凍方法に従って解凍した。
【０１７８】
臍帯５００６−２１８０細胞のための臍帯血サンプルを、本出願中で記述した臍帯血のプロセシングおよび凍結保存の方法に従って、回収の約１日後にプロセシングし、凍結保存した。臍帯５００６−２１８０細胞は約３年間凍結保存で保持した。臍帯５００６−２１８０細胞は本出願中で記述した解凍方法に従って解凍した。
【０１７９】
臍帯５０１３−２６７０細胞のための臍帯血サンプルを、本出願中で記述した臍帯血のプロセシングおよび凍結保存の方法に従って、回収の約１日後にプロセシングし、凍結保存した。臍帯５０１３−２６７０細胞は約３年間凍結保存で保持した。臍帯５０１３−２６７０細胞は本出願中で記述した解凍方法に従って解凍した。
【０１８０】
培養−プレート
【０１８１】
培養培地（メソカルト＃４０３４−半固形培地）の１本の３ｍｌチューブを室温で解凍し、次に５０，０００細胞／ｍｌ、１００，０００細胞／ｍｌ、および２１６，０００細胞／ｍｌの臍帯５００６−２１８０細胞希釈と共に氷上に１５分間置いた。１５分後に、約０．３ｍｌの各細胞希釈物をメソカルト＃４０３４半固形培地のチューブへと接種した。チューブを穏やかにボルテックスにより撹拌し、次に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、培養培地および月経血幹細胞を、４ウェルプレートの最初の３ウェルへと均一に分割した。１ｍｌのＤＰＢＳを湿度の補助として第４のウェルに追加し、細胞を３７℃でインキュベートした。
【０１８２】
培養−フラスコ
【０１８３】
再懸濁した臍帯５００６−２１８０細胞を、２つの組織培養用の処理をしていないＴ２５フラスコにおいて、７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で約２，０００，０００細胞で播種した。細胞が約７０〜８０％のコンフルエントになるまで、細胞を約３６℃〜約３８℃のＣＯ2インキュベーター中でインキュベートした。細胞は複数の継代を行った。１５％のチャンの完全培地の完全な交換を含む継代を約３日または４日後に行った。
【０１８４】
培養−プレート
【０１８５】
培養培地（メソカルト＃４０３４−半固形培地）の２本の３ｍｌのチューブを室温で解凍し、次に５０，０００細胞／ｍＬ、１００，０００細胞／ｍＬ、および２１６，０００細胞／ｍＬの臍帯５０１３−２６７０細胞希釈物を氷上に１５分間置いた。１５分後に、約０．３ｍｌの各Ｍ２細胞をはメソカルト＃４０３４半固形培地のチューブへと接種した。チューブを穏やかにボルテックスにより撹拌し、次に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、培養培地および月経血幹細胞を、４ウェルプレートの最初の３ウェルへと均一に分割した。１ｍｌのＤＰＢＳを湿度の補助として第４のウェルに追加し、細胞を３７℃でインキュベートした。
【０１８６】
表Ｉ−臍帯５０１３−２６７０のプレート培養
2011501960.tif 000010
【０１８７】
培養−フラスコ
【０１８８】
臍帯５０１３−２６７０細胞を、凍結保存細胞を解凍し、次に本出願において開示された遠心分離を介してチャンの完全培地中で洗浄する工程にかけた。細胞の沈殿を約７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で再懸濁した。
【０１８９】
再懸濁した月経血細胞を、２つの組織培養用の処理をしていないＴ２５フラスコにおいて、７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中で約２，０００，０００細胞で播種した。細胞が約７０〜８０％のコンフルエントになるまで、細胞を約３６℃〜約３８℃のＣＯ2インキュベーター中でインキュベートした。細胞は複数の継代を行なった。１５％のチャン完全培地の完全な交換を含む継代を約３日または４日後に行なった。
【０１９０】
培養−プレート
【０１９１】
培養培地（メソカルト＃４０３４−半固形培地）の３本の３ｍｌのチューブを室温で解凍し、次に細胞希釈物（１０，０００細胞／ｍｌのＭ２−０４８月経血細胞＋２５０，０００細胞／ｍｌの臍帯５００６−２１８０；１０，０００細胞／ｍｌのＭ２−０４８月経血細胞＋２５０，０００細胞／ｍｌの臍帯５０１３−２６７０；１０，０００細胞／ｍｌのＭ２−０４８月経血細胞＋５００，０００細胞／ｍｌの臍帯５０１３−２６７０）と共に氷上に１５分間置いた。１５分後に、約０．３ｍｌの各細胞希釈物をメソカルト＃４０３４半固形培地の個別のチューブへと接種した。チューブを穏やかにボルテックスにより撹拌し、次に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、培養培地および月経血幹細胞を、４ウェルプレートの最初の３ウェルへと均一に分割した。１ｍｌのＤＰＢＳを湿度の補助として第４のウェルに追加し、細胞を３７℃でインキュベートした。
【０１９２】
表Ｊ−臍帯５０１３−２６７０＋Ｍ２−０４８のプレート培養
2011501960.tif 000011
【０１９３】
培養−フラスコ
【０１９４】
継代４から採取した１，０００，０００のＭ２−０４８月経血細胞、および１００，０００の臍帯５００６−２１８０細胞を、組織培養用の処理をしていないＴ２５フラスコにおいて、７ｍｌの１５％のチャンの完全培地の中で接種した。１，０００，０００のＭ２−０４８月経血細胞および１，０００，０００の臍帯５０１３−２６７０細胞を、７ｍｌの１５％のチャンの完全培地中に播種した。トリプシン処理後に、２つの細胞培養は、Ｍ２−０４８、および臍帯５０１３−２６７０と混合した臍帯５００６−２１８０として混合された。細胞が約７０〜８０％のコンフルエントになるまで、細胞を約３６℃〜約３８℃のＣＯ2インキュベーター中でインキュベートした。細胞は複数の継代を行った。１５％のチャン完全培地の完全な交換を含む継代を約３日または４日後に行った。
【０１９５】
表Ｋ−培養：Ｍ２−０４８−０１のＰ４＋混合した臍帯５００６−２１８０および臍帯５０１３−２６７０
2011501960.tif 000012
【０１９６】
実施例６および７の表現型分析
【０１９７】
Ｍ２−０４８、臍帯５００６−２１８０、ならびに継代７で回収された臍帯５０１３−２６７０およびＭ２−０４８月経血細胞培養の混合培養を含む３，２４０，０００細胞は、本出願中で記述した方法に従って表現型分析を行った。表現型分析の結果を表Ｌで示す。
【０１９８】
表Ｌ−細胞培養のフローサイトメトリー分析
2011501960.tif 000013
【０１９９】
実施例８−Ｍ２−０４８月経血細胞、５００６−２１８０臍帯細胞、および５０１３−２６７０の細胞の様々な濃度の培養
【０２００】
培養培地（メソカルト＃４０３４−半固形培地）の７本の３ｍｌのチューブを室温で解凍し、次に、細胞希釈物（２５，０００細胞／ｍｌの５００６−２１８０臍帯細胞；２５，０００細胞／ｍｌの５０１３−２６７０臍帯細胞；５０，０００の細胞／ｍｌの５０１３−２６７０臍帯細胞；１，０００細胞／ｍｌのＭ２−０４８；２５，０００細胞／ｍｌのＭ２−０４８＋１，０００細胞／ｍｌの５００６−２１８０臍帯細胞；２５，０００細胞／ｍｌのＭ２−０４８＋１，０００細胞／ｍｌの５０１３−２６７０臍帯細胞；および５０，０００細胞／ｍｌのＭ２−０４８＋１，０００細胞／ｍｌの５０１３−２６７０臍帯細胞）と共に氷上に１５分間置いた。１５分後に、各細胞希釈物をメソカルト＃４０３４半固形培地の個別のチューブへと接種した。チューブを穏やかにボルテックスにより撹拌し、次に氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、培養培地および月経血細胞、臍帯細胞、ならびに月経血細胞および臍帯細胞の組合せをそれぞれ、インキュベーションのために７つの異なる４ウェルプレートのウェルへと均一に分割した。１ｍｌのＤＰＢＳを湿度の補助として７つの異なる４ウェルプレートの各々の第４のウェルに追加し、細胞を３７℃でインキュベートした。
【０２０１】
表Ｍ−臍帯５００６−２１８０細胞、臍帯５０１３−２６７０細胞、Ｍ２−０４８月経血細胞、Ｍ２−０４８月経血細胞＋臍帯５００６−２１８０細胞、Ｍ２−０４８月経血細胞＋臍帯５０１３−２６７０細胞、およびＭ２−０４８月経血細胞＋臍帯５０１３−２６７０細胞のプレート培養
2011501960.tif 000014
【０２０２】
本発明の好ましい実施形態が示され記述されたが、そのより広範囲の態様において本発明から逸脱することなく、多くの変化および修飾を行なえることが当業者に明らかだろう。したがって添付された請求項は、本発明の趣旨および範囲内にあるように、かかる変化および修飾をすべて包含するように意図される。
【図１】
2011501960.tif 000015
【図２ａ】
2011501960.tif 000016
【図２ｂ】
2011501960.tif 000017
【図３ａ】
2011501960.tif 000018
【図３ｂ】
2011501960.tif 000019
【図３ｃ】
2011501960.tif 000020
【図３ｄ】
2011501960.tif 000021
【図３ｅ】
2011501960.tif 000022
【図３ｆ】
2011501960.tif 000023
【図３ｇ】
2011501960.tif 000024
【図３ｈ】
2011501960.tif 000025
【図３ｉ】
2011501960.tif 000026
【図３ｊ】
2011501960.tif 000027
【図３ｋ】
2011501960.tif 000028
【図３ｌ】
2011501960.tif 000029
【図４ａ】
2011501960.tif 000030
【図４ｂ】
2011501960.tif 000031
【図４ｃ】
2011501960.tif 000032
【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【国際調査報告】
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