(57)【要約】(i) ペプチド作用物質とピレンとを含む結合体を対象に投与する段階を含む、血液脳関門を横断してペプチド作用物質を送達するための方法、ならびに関連する検出および治療方法を開示する。2011517666.tif 000012
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド作用物質; および
ピレン
を含む結合体を対象に投与する段階を含む、ペプチド作用物質を血液脳関門を横断して送達するための方法。
【請求項２】
ペプチド作用物質が治療剤または検出剤である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ペプチド作用物質が、神経学的状態に関連する標的タンパク質を特定することができる、請求項2記載の方法。
【請求項４】
ペプチド作用物質が、神経学的状態に関連するタンパク質または構造に選択的に結合する、請求項3記載の方法。
【請求項５】
ペプチド作用物質が、α-ヘリックス立体構造からβ-シート立体構造への立体構造変化を起こす標的タンパク質の領域に対応するアミノ酸配列を含むが、標的タンパク質の完全長配列を含まない、請求項4記載の方法。
【請求項６】
検出剤がSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:6を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ペプチド作用物質が、神経学的状態に関連するタンパク質または構造に特異的な抗体である、請求項4記載の方法。
【請求項８】
ペプチド作用物質が、神経学的状態を処置するのに有用な治療剤である、請求項2記載の方法。
【請求項９】
結合体が検出可能な標識をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
ピレンがピレンの誘導体である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ピレンの誘導体がアルキルピレン、アミノピレン、カルボン酸ピレン、酪酸ピレン、アルブミン-ピレン、PEG化ピレン、遊離カルボキシル基を含むピレン誘導体および遊離アミン基を含むピレン誘導体からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
結合体が二つまたはそれ以上のピレン部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
結合体が、ペプチドと比べて血液脳関門を横断する透過性の増強を示す、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
(a) 対象に(i) ペプチド検出剤と(ii) ピレンとを含む結合体を投与する段階、および
(b) 対象の脳内に局在した結合体を検出する段階
を含む、インビボでの検出方法。
【請求項１５】
結合体が二つまたはそれ以上のピレン部分を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
ペプチド検出剤が、ペプチド検出剤のC末端およびN末端の少なくとも一つから選択される位置でピレンに結合される、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
ペプチド検出剤が、ペプチド検出剤のC末端およびN末端の各々でピレン部分に結合される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
段階(b)が、ピレンエキシマーの形成を検出する段階を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも一つのピレン部分が、遊離カルボキシル基を含むピレン誘導体であり、かつ少なくとも一つのピレン部分が、遊離アミン基を含むピレン誘導体である、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
ペプチド検出剤が、神経学的状態に関連するタンパク質または構造を特定することができる、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
ペプチド検出剤が、特定の立体構造または自己凝集状態のタンパク質を特定することができる、請求項14記載の方法。
【請求項２２】
検出剤がSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:6を含む、請求項14記載の方法。
【請求項２３】
結合体が検出可能な標識をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項２４】
標識が、フルオロフォア、MRI造影剤、イオン放射体および放射性標識からなる群より選択される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
(i) ペプチド治療剤と(ii) ピレンとを含む結合体の治療的有効量を、処置の必要がある対象に投与する段階を含む、神経学的状態を処置する方法。
【請求項２６】
ペプチド治療剤が神経学的状態の処置に有用である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
ペプチド治療剤が抗アミロイド剤である、請求項25記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2008年3月21日付で出願した米国特許仮出願第61/038,634号に対する優先権の恩典を主張するものであり、これらの全内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は広くは、血液脳関門(BBB)を横断してペプチド、タンパク質および抗体を送達する分野に関する。より具体的には、本発明は、ピレン-作用物質結合体を用いBBBを横断してペプチド、タンパク質または抗体を送達するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
神経学的状態の検出および処置は、血液脳関門(BBB)の結果としての、脳への内因成分および外因投与成分の不透過性のため困難であることが多い。BBBはペプチド、タンパク質、大きな巨大分子、非ペプチド分子、イオンおよび水溶性非電解質のような、末梢の作用物質から脳を効果的に隔離する。例えば、荷電分子または親水性分子および約700 kDaを超える分子量を有する分子は、BBBを通過しないと一般的に認められている。また、約21アミノ酸残基のペプチドのようなペプチドはBBBを効率的に通過せず、いずれもアルツハイマー病に関連する40残基のAβ40タンパク質および42残基のAβ42タンパク質のようなさらに長いペプチドも通過しないと一般的に認められている。したがって、BBBは、検出剤ならびに、それ以外には、種々の神経学的障害の診断および処置において有用でありうる治療用物質の送達を阻止する。
【０００４】
作用物質を脳へ効果的に輸送するという過去の試みではリポソーム製剤を用いて、およびナノ粒子を用いて作用物質を担体分子に結合することが含まれた。例示的な担体分子としては天然に存在するポリアミン(米国特許第5,670,477号(特許文献1))、リゾチーム、ヘモグロビン、チトクローム-cおよびサブスタンス-P (米国特許第5,604,198号(特許文献2))ならびに糖(米国特許第5,260,308号(特許文献3))のような担体が挙げられる。Aβタンパク質を脳へ効果的に輸送するという過去の試みではOX26またはプトレシンのような担体に結合された、Aβ40またはさらに小さな断片、例えばAβ1-30が使用された。特にAβタンパク質に向けて、BBBを横断する輸送を媒介するために糖化最終産物(RAGE)の受容体も提唱されている。
【０００５】
しかしながら、ペプチド、タンパク質および抗体を含む、ペプチド作用物質をBBBを横断して送達するための方法、作用物質およびキットに対する必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第5,670,477号
【特許文献２】米国特許第5,604,198号
【特許文献３】米国特許第5,260,308号
【発明の概要】
【０００７】
一つの態様によれば、本発明は、ペプチド作用物質とピレンとを含む結合体を対象に投与する段階を含む、ペプチド結合体を血液脳関門を横断して送達するための方法を提供する。いくつかの態様において、ペプチド作用物質は、神経学的障害に関連するタンパク質または構造を特定できる検出剤である。別の態様において、ペプチド作用物質は、神経学的状態の処置に有用な治療剤である。いくつかの態様において、ペプチド作用物質は、α-ヘリックス立体構造からβ-シート立体構造への立体構造変化を起こす標的タンパク質の領域に対応するアミノ酸配列を含むが、標的タンパク質の完全長配列を含まない。他の態様において、ペプチド作用物質は、神経学的状態に関連するタンパク質または構造に特異的な抗体である。一つの態様において、結合体は検出可能な標識をさらに含む。別の態様において、結合体はアルキル化ピレン類似体、酪酸ピレン、PEG化ピレン、ピレン-アルブミン類似体、遊離カルボキシル基を含むピレン誘導体および遊離アミン基を含むピレン誘導体のような、ピレン誘導体を含む。いくつかの態様において、結合体は二つまたはそれ以上のピレン部分を含む。
【０００８】
別の態様によれば、本発明は、ペプチド検出剤とピレンとを含む結合体を対象に投与する段階、および対象の脳内に局在している結合体を検出する段階を含む、インビボでの検出方法を提供する。一つの態様において、検出剤は、神経学的状態に関連するタンパク質または構造を特定することができる。いくつかの態様において、結合体は二つまたはそれ以上のピレン部分を含む。いくつかの態様において、少なくとも一つのピレン部分は、遊離カルボキシル基を含むピレン誘導体であり、かつ少なくとも一つのピレン部分は、遊離アミン基を含むピレン誘導体である。一つの態様において、ピレンは、ペプチドの少なくともN末端もしくはC末端で、またはペプチドのN末端およびC末端の両方でペプチド検出剤に結合される。別の態様において、検出剤は、特定の立体構造または自己凝集状態のタンパク質を特定することができる。別の態様において、局在した結合体の検出はピレンエキシマーの検出を伴う。
【０００９】
別の態様において、本発明は、ペプチド検出剤、ピレンおよび検出可能な標識を含む結合体を対象に投与する段階、および対象の脳内に局在した結合体を検出する段階を含む、インビボでの検出方法を提供する。いくつかの態様において、標識はフルオロフォア、MRI造影剤、イオン放射体または放射性標識である。
【００１０】
他の態様において、本発明は、神経学的状態を処置するための方法を提供する。この方法は、ペプチド治療剤とピレンとを含む結合体の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。一つの態様において、ペプチド作用物質は抗アミロイド剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】トランスジェニックマウスに鼻腔内投与された媒体、ペプチド-作用物質ピレン結合体または酪酸ピレンにより1 mm2あたりに検出されたAβプラークの数を示す。
【図２】鼻腔内投与された結合体(AD185)の蛍光(-) vs チオフラビンS染色(▲)により大脳皮質中に検出されたAβプラークの相関を示す。
【図３Ａ】静脈内投与された結合体(AD185)の蛍光(-) vs チオフラビンS染色(■)により大脳皮質中に検出されたAβプラークの相関を示す。
【図３Ｂ】静脈内投与された結合体(AD185)の蛍光(-) vs チオフラビンS染色(■)により海馬中に検出されたAβプラークの相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本発明の特定の態様について記述および開示する前に、本明細書において用いられる特定の材料、方法および組成物は、ほんの一例として提示されるものであり、本発明の範囲を限定するものではないと理解されるべきである。本明細書において用いられる技術的および科学的用語は、特に規定のない限り、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。参照される公知の方法論を明記している刊行物および他の資料は、全文が記載されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００１３】
組換えDNA技術の一般的原理を明記している標準的な参考資料は、Sambrook, J., et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N.Y.; McPherson, M.J. Ed. (1991) Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; Jones, J. (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford; Austen, B.M. and Westwood, O.M.R. (1991) Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxfordを含む。当業者に公知の任意の適当な材料および/または方法を、本発明を実施する際に利用することができる。しかしながら、好ましい材料および方法について記述する。以下の記述および実施例のなかで参照される材料、試薬などは、特に断りのない限り、商業的供給源から入手可能である。
【００１４】
本明細書において用いられる場合、「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その(the)」という単数形は単数形だけを指すよう明示的に記述されていない限り、単数形も複数形もともに指す。
【００１５】
「約」という用語および総じて範囲の使用は、約という用語により修飾されているか否かを問わず、包含される数が本明細書に記載の正確な数に限定されないことを意味し、本発明の範囲から逸脱することなしに、引用されている範囲内の実質的範囲をいうよう意図される。本明細書において用いられる場合、「約」は当業者によって理解されるものであり、これが使用される状況に応じてある程度変動するであろう。この用語が使用される状況が当業者に明確に示されずにこの用語が使用される場合、「約」は特定の用語の±10%までを意味する。
【００１６】
本明細書において用いられる場合、「対象」とは、ヒトおよび家畜、例えばネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギなどを含む、検出または治療的処置を必要とする任意の哺乳類を表す。「対象」はマウスおよび他の小型哺乳類を含め、研究の場で用いられる動物も含む。典型的な対象は、神経学的状態、疾患もしくは障害の危険性があるものでもよく、またはそのような状態に罹患していることが疑われるものでもよく、あるいは特定の状態に関連する危険性または状態を判定することが望まれるものでもよい。本明細書において用いられる場合、「治療的」処置は、既存の状態を処置するための、対象が危険性のあるもしくは発症している状態を予防するための、または健康維持のための治療剤の投与を含む。
【００１７】
本明細書において用いられる場合、「治療的有効量」という語句は、このような処置を必要とする患者において薬物を投与する場合に特異的な薬理学的反応をもたらす、対象に対する薬物投与量を意味する。治療的有効量は、このような投与量が当業者によって治療的有効量であると見なされても、本明細書において記述する状態/疾患を処置するのに必ずしも有効ではないことを強調しておく。
【００１８】
本明細書において用いられる場合、「ペプチド」とは、ペプチド結合を介して連結された2つまたはそれ以上の個々のアミノ酸(天然に存在するか否かを問わない)の任意の重合体をいう。本明細書において用いられる場合、「ペプチド作用物質」という用語は、ペプチド、タンパク質および抗体を含む。ペプチドは完全長タンパク質の断片を含み、ここで断片は完全長タンパク質の少なくとも5個の隣接アミノ酸、少なくとも10個の隣接アミノ酸、少なくとも15個の隣接アミノ酸、少なくとも20個の隣接アミノ酸、または少なくとも25個の隣接アミノ酸を含むことができる。ペプチドは合成ペプチドも含む。
【００１９】
本明細書において用いられる場合、「立体構造」または「立体構造の制約」とは、特定のタンパク質立体構造、例えば、α-ヘリックス、平行および逆平行β鎖、ロイシンジッパー、ジンクフィンガーなどの存在をいう。さらに、立体構造の制約はさらなる構造情報を伴わないアミノ酸配列情報を含むことができる。一例として、「-C-X-X-C-」は、二つのシステイン残基が、この特定の制約との関連においてはそれぞれの実体が無関係であるような他の二つのアミノ酸残基によって隔てられていなければならないことを示す立体構造の制約である。「立体構造の変化」は一つの立体構造から別の立体構造への変化である。
【００２０】
「Aβタンパク質」という用語はAβ34、Aβ37、Aβ38、Aβ40およびAβ42を含め、Aβタンパク質の全ての形態をいうよう本明細書において用いられる。
【００２１】
「組換えタンパク質またはペプチド」とは、組換えDNA技術により産生される、すなわち、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードする外来性の組換えDNA発現構築体によって形質転換された細胞、微生物または哺乳類から産生されるタンパク質またはペプチドをいう。大部分の細菌培養物において発現されたタンパク質またはペプチドには、通常、グリカンがないと考えられる。酵母において発現されたタンパク質またはペプチドは、哺乳類細胞において発現されたものとは異なるグリコシル化パターンを持ちうる。
【００２２】
本明細書において用いられる場合、ペプチド作用物質に関連して「天然に存在する」または「天然の」という用語は、体内にある、または自然界に存在する供給源から回収される、作用物質(例えば、ペプチド、タンパク質および抗体)をいう。天然のペプチド作用物質は、アセチル化、グリコシル化、リン酸化、脂質結合、アシル化およびカルボニル化を含むがこれらに限定されない翻訳後修飾を含めて、化学的または酵素的に修飾することができる。
【００２３】
本明細書において用いられる場合、ペプチド作用物質に関連して「合成(の)」という用語は、その作用物質が天然に存在するのではなく、化学的合成、生化学的方法または組み換え方法のような他の手段によって得られうることを明示する。
【００２４】
「類似体」、「断片」、「誘導体」および「変異体」という用語は、本明細書におけるペプチドをいう場合、本明細書において記述するように、参照ペプチドと実質的に類似の機能活性または実質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持する、そのようなペプチドの類似体、断片、誘導体および変種を意味する。「類似体」とは、あるペプチドのアミノ酸配列を含んだプロ-ポリペプチドを含む。
【００２５】
「断片」とは本明細書に開示するインビトロのアッセイ法において示されるように、基準ペプチドと実質的に類似の機能活性または実質的に同じ生物学的機能もしくは活性を保持するペプチドの一部分である。
【００２６】
「誘導体」とは、本明細書において開示する機能を実質的に保存し、かつさらなる構造および付帯機能を含んだ本発明のペプチドへの全ての修飾、例えば、PEG化ペプチドまたはアルブミン融合ペプチドを含む。
【００２７】
「変種」とは、基準ペプチドのアミノ酸配列に実質的に類似のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。「実質的に類似の」という用語は、配列が共通の構造ドメイン(例えば配列相同性)および/または共通の機能活性を有することを意味する。例えば、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約100%同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、十分に類似していると本明細書において定義される。変種はストリンジェントな条件の下で、基準ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるペプチドを含む。そのような変種は概して、基準ペプチドの機能活性を保持する。変種は、突然変異誘発により、アミノ酸配列が異なるペプチドも含む。
【００２８】
「実質的に類似の機能活性」および「実質的に同じ生物学的機能または活性」とはそれぞれ、各ペプチドの生物学的活性が同じ手順またはアッセイ法により測定される場合に、生物学的活性の程度が基準ペプチドによって示されるその生物学的活性の約50%〜100%もしくはそれ以上の範囲内、80%〜100%もしくはそれ以上の範囲内、または約90%〜100%もしくはそれ以上の範囲内であることを意味する。例えば、作用物質の類似体または誘導体は、定量的にはより大きいまたはより小さい活性を示しうるが、定性的には関心対象の作用物質と同じ生物学的活性を示しうる。作用物質の所与の類似体または誘導体の適合性を日常的なスクリーニング方法により検証して、類似体または誘導体が関心対象の作用物質のものと実質的に類似している関心対象の活性を示すことを確認することができる。類似体または誘導体は、PEG部分を含む、かつインビボでいっそう長い血中半減期を示しうるPEG化された作用物質のような、さらなる構造的特徴を保有し、および/またはさらなる機能的特性を示しうる。
【００２９】
二つのペプチド間の「類似性」は、アミノ酸配列を比較することによって判定される。一つのポリペプチドのアミノ酸はもう一つのポリペプチドの対応アミノ酸に対し、同一であるまたは保存的アミノ酸置換であるなら類似している。保存的置換はDayhoff, M.O.(編), The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978)に、およびArgos, P. (1989) EMBO J. 8:779-785に記述されているものを含む。例えば、以下の群の一つに属するアミノ酸同士は保存的変化または置換を示す。
2011517666.tif 000003
【００３０】
本発明のいくつかの局面は、タンパク質の特定の立体構造または自己凝集状態などの、タンパク質の特定の構造状態に関連する疾患および状態の診断および処置に関する。関連の態様について開示しているPCT出願PCT/US2007/016738 (WO 2008/013859)および米国特許出願第11/828,953号は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明のいくつかの局面は、疾患状態に関連するものなどの、誤って折り畳まれたタンパク質および自己凝集したタンパク質を含む、特定の構造状態のタンパク質のインビボでの検出のための結合体および方法、ならびにそれらの疾患状態の処置のための結合体および方法を提供する。いくつかの態様において、タンパク質はアミロイド形成性疾患と関連している。
【００３１】
タンパク質が特定の立体構造状態または凝集状態をとる場合のヒトまたは動物の疾患に関連するタンパク質は、当技術分野において公知である。そのような疾患の例としては、アルツハイマー病(AD)、脳アミロイド血管症(CAA)および脳血管疾患(CVD)を含め、アミロイド形成性疾患が挙げられる。本明細書において用いられる場合、「アミロイド形成性疾患」とは、アミロイドプラークまたはアミロイド沈着が体内に形成される疾患である。アミロイド形成は糖尿病、AD、スクレイピー、狂牛病(BSE)、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、慢性消耗病(CWD)、関連する伝達性海綿状脳症(TSE)のような、いくつかの障害に見られる。
【００３２】
さまざまな疾患がタンパク質の特定の構造型(例えば、「誤って折り畳まれたタンパク質」または自己凝集したタンパク質)に関連している一方で、異なる構造型のタンパク質(例えば、「正常なタンパク質」)は有害ではない。多くの場合に、正常なタンパク質が可溶性であるのに対し、誤って折り畳まれたタンパク質は不溶性凝集体を形成する。そのような不溶性タンパク質の例としては、伝達性海綿状脳症(TSE)におけるプリオン; アルツハイマー病(AD)、脳アミロイド血管症(CAA)および脳血管疾患(CVD)のアミロイドプラークにおけるAβペプチド; パーキンソン病のレヴィー小体におけるα-シヌクレイン沈着、前頭側頭認知症およびピック病における神経原線維濃縮体中のタウ; 筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ; ならびにハンチントン病におけるハンチンチンが挙げられる。例えば、Glenner et al., J. Neurol. Sci. 94:1-28, 1989; Haan et al., Clin. Neurol. Neurosurg. 92(4):305-310, 1990を参照されたい。
【００３３】
多くの場合、これらの不溶性タンパク質は、β-プリーツシート立体構造に共通の特徴を有する非分枝性の原線維で構成される凝集体を形成する。CNSにおいて、アミロイドは脳髄膜血管(脳血管沈着物)に、および脳実質(プラーク)に存在しうる。ヒトおよび動物モデルにおける神経病理学的研究によって、アミロイド沈着物の近位にある細胞ではその正常な機能が妨げられることが示されている。例えば、Mandybur, Acta Neuropathol. 78:329-331, 1989; Kawai et al., Brain Res. 623:142-146, 1993; Martin et al., Am. J. Pathol. 145:1348-1381, 1994; Kalaria et al., Neuroreport 6:477-80, 1995; Masliah et al., J. Neurosci. 16:5795-5811, 1996を参照されたい。他の研究によってさらに、アミロイド原線維が神経変性を実際に惹起しうることが示されている。例えば、Lendon et al., J. Am. Med. Assoc. 277:825-831, 1997; Yankner, Nat. Med. 2:850-852, 1996; Selkoe, J. Biol. Chem. 271:18295-18298, 1996; Hardy, Trends Neurosci. 20:154-159, 1997を参照されたい。
【００３４】
タンパク質の誤った折り畳みを引き起こす根本的な分子機構はよく理解されていないが、上記の神経学的障害の全てに共通する特徴は、一体となってβ-シート構造を形成する原線維の形成である。タンパク質の単量体が結び付いて原線維を形成し、引き続き各末端の位置で原線維の伸長が行われる、核形成段階を伴う複雑な機構により原線維形成および続けてプラーク沈着に関連した二次β-シート構造の形成が起こる。したがって、原線維形成を破壊できるペプチド、タンパク質または抗体プローブは疾患進行を阻止し、かくして治療的に重要であろう。さらに、病変タンパク質の特定の自己会合状態に結び付くことができる作用物質は、誤って折り畳まれたタンパク質の特定の形態を検出および定量化するのに、ならびに疾患の進行に対する洞察を提供するのに有用な診断ツールである。したがって、自己凝集の特定の状態にある特異的なタンパク質と結び付くことができる高度選択的ペプチド作用物質は、検出剤としても治療用途のためにも有用である。
【００３５】
A. BBBを横断してペプチド作用物質を送達するための方法
本出願人は、ピレン担体に結合された、薬学的に関連するペプチド作用物質、例えば、ペプチド、タンパク質および抗体が対象への投与時に血液脳関門(BBB)を通過する能力の増強を示すことを発見した。
【００３６】
一つの態様において、(i) ペプチド作用物質と(ii) ピレンとを含む結合体を対象に投与する段階を含む、BBBを横断してペプチド作用物質を送達するための方法が提供される。いくつかの態様において、ペプチド作用物質はペプチド、タンパク質または抗体である。いくつかの態様において、ペプチド作用物質は検出剤または治療剤である。具体的な態様において、ペプチド作用物質は、神経学的状態に関連する標的タンパク質または構造(特異的な立体構造または自己凝集状態のような)を特定できる検出剤である。他の態様において、ペプチド作用物質は、神経学的状態を処置する際に有用な治療剤である。本明細書において用いられる場合、「特定できる」とは、ペプチド作用物質が標的タンパク質または構造に選択的かつ優先的に結合することを意味する。
【００３７】
結合体は、対象への投与に適した任意の組成物、例えば結合体および薬学的に許容される担体を含む組成物に処方することができる。結合体は、任意の適当な手段により、例えば鼻腔内投与、静脈内投与、腹腔内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、口腔投与または経皮投与により投与することができ、それに応じて処方することができる。例えば、薬学的に許容される担体は、組成物が非経口投与に適応されるように、液体であってよく、または経口投与用に処方された、固体、すなわち、カプセル殻と媒体、錠剤、丸剤などであってもよい。あるいは、薬学的に許容される担体は、組成物が吸入に適応されるように噴霧可能な液体または固体の形態であってもよい。薬学的に許容される担体は当技術分野において公知であり、非限定的に、溶解剤または懸濁剤、例えば水またはごま油、落花生油もしくは綿実油のような天然に存在する植物油あるいはオレイン酸エチルなどのような合成脂肪媒体を含むことができる。緩衝剤、保存剤、酸化防止剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤および香料添加剤を組成物に含めることもできる。
【００３８】
本明細書において記述される方法において、同じまたは異なる検出剤、治療剤、ピレン部分および/または標識を含む一つまたは複数の結合体を使用することができ、各結合体を同じ組成物中であるいは同じ経路によりまたは一つもしくは複数の異なる経路により同時にまたは連続的に投与できる一つまたは複数の異なる組成物中で提供することができる。
【００３９】
いくつかの態様において、ピレン結合ペプチド作用物質は、非結合型の活性作用物質のものよりも少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍大きい、またはそれ以上大きいような、非結合型の活性作用物質のものよりも実質的に大きいBBB横断透過性を示す。
【００４０】
BBB横断透過性の一つの尺度は、注射された量に比べておよび他の組織に進入した量に比べて脳に進入した結合体の量(%IDI)である。いくつかの態様において、ピレン結合体は1〜10のオクタノール/水分配係数を有する。
【００４１】
BBBを横断するペプチドの透過性を増大するために使われる担体の中には、ペプチド-担体結合体の半減期を増大する効果を有するものもあると考えられている。例えば、かなりの量の構造サイズをペプチド-担体結合体に付加する担体は、ペプチドの分解速度または除去速度を低減することができる。Aβ40ペプチドは、例えば、正常な生理学的条件下において末梢内でも脳内でも分解される。しかしながら、例えば、プトレシンまたはOX26を担体として用いた結合体は、Aβ40の半減期を劇的に増大する。半減期の増大は脳内濃度の増大に寄与するというような、いくつかの利点を持ちうるが、脳内での非特異的な局在の増大のような、著しい不利点も持ちうる。これは、例えば、非特異的に局在した結合体がインビボでの撮像の感受性および/または選択性を低減する高いバックグラウンドに寄与するなら、特に懸念となりうる。
【００４２】
本明細書において記述される結合体は、この難点に悩まされることがない。例えば、ピレンにより両末端で標識されたAβペプチドを含む結合体を用いて行った実験から、脳脊髄液の分析によって判定した場合、投与から6時間後に結合体が除去されることが明らかにされ、血中結合体の証拠は示されなかった。
【００４３】
結合体の局在および除去または分解の速度は、例えば、マウスに結合体を投与し、投与後の異なる時点で、例えば、投与後2分、10分、30分、60分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間またはそれ以上を含む時点で分析のためにそれらを殺処理することにより実験的に評価することができる。
【００４４】
結合体の無毒性は、例えば、当技術分野において公知である、インビトロでのアッセイ法およびインビボでのげっ歯類毒性試験を用いて実験的に検証することができる。
【００４５】
B. ペプチド作用物質
ペプチド作用物質の性質は、アミノ酸残基を含むこと以外には限定されない。ペプチド作用物質は、天然に存在するペプチドの変種または誘導体を含め、合成ペプチドまたは天然に存在するペプチドであってよい。ペプチドは直鎖状ペプチド、環状ペプチド、拘束性ペプチドまたはペプチド模倣体であってよい。環状ペプチドを作出するための方法は当技術分野において周知である。例えば、環化は、ヘッドトゥテールにて、N末端残基またはC末端残基に対する側鎖で、およびリンカーによる環化で達成することができる。環状ペプチドの感受性および活性は、その三次元構造を制御する環状ペプチドの環サイズ全体に依る。環化はかくして、疾患状態の進行を探索するための、および病変タンパク質の特異的な自己凝集状態を標的化するための強力なツールを提供する。
【００４６】
いくつかの態様において、ペプチド作用物質は、神経学的状態に関連する標的タンパク質または構造に特異的に結合する。これらの態様により、本発明は診断または治療のための、神経学的状態に関連する標的タンパク質または構造の選択的な標的化に有用な作用物質を提供する。
【００４７】
いくつかの態様において、ペプチド作用物質は、PCT出願PCT/US2007/016738 (WO 2008/013859)および米国特許出願第11/828,953号に記述されているペプチドプローブであり、これらの全内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。その中で記述されているように、そのようなペプチドプローブは検出剤としておよび/または治療剤として有用でありうる。PCT出願PCT/US2007/016738 (WO 2008/013859)および米国特許出願第11/828,953号に記述されている例示的なペプチドプローブは、α-ヘリックス立体構造からβ-シート立体構造への立体構造変化を起こす標的タンパク質の領域に対応するアミノ酸配列を含み、ペプチドプローブそれ自体がα-ヘリックス立体構造からβ-シート立体構造への立体構造変化を起こすが、標的タンパク質の完全長配列を含まない。例えば、ペプチドプローブは、標的タンパク質配列由来の5〜50個、10〜50個、5〜25個または10〜25個の隣接アミノ酸のような、少なくとも5個、少なくとも10個、最大で約25個までのおよび最大で約50個までの隣接アミノ酸を含め、標的タンパク質配列由来の少なくとも5個、または約10個〜約25個の隣接アミノ酸からなることができる。いくつかの態様において、ペプチドプローブは、β-シート立体構造にある標的タンパク質と接触された場合に立体構造変化を起こすことができる。
【００４８】
PCT出願PCT/US2007/016738 (WO 2008/013859)および米国特許出願第11/828,953号に記述されているように、その中で記述されているペプチドプローブは、サンプル中でまたはインビボでタンパク質を検出するのに、および自己凝集に特異的な立体構造または状態のような、特異的な構造状態(例えば、標的の構造状態)にあるタンパク質を検出するのに有用である。例えば、ペプチドプローブがα-ヘリックスもしくはランダムコイル立体構造(または溶解状態)である場合にはエキシマーを形成しないが、ペプチドプローブがβ-シート立体構造(または不溶性の凝集状態)にある場合にはエキシマーを形成するように、ペプチドプローブをピレンに結合させることができる。標的の構造状態は疾患に関連しうるのに対し、異なる構造状態は疾患に関連していない。標的の構造状態は疾患を引き起こす可能性があり、疾患の症状の要因である可能性があり、他の要因の結果としてサンプルにおいてもしくはインビボにおいて見られる可能性があり、またはそうでなければ疾患に関連している可能性がある。
【００４９】
いくつかの態様において、ペプチド作用物質は、PCT出願PCT/US2007/016738 (WO 2008/013859)および米国特許出願第11/828,953号のSEQ ID NO 34のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチド作用物質は、ADの検出および処置との関連で有用である、PCT出願PCT/US2007/016738 (WO 2008/013859)および米国特許出願第11/828,953号のSEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38またはSEQ ID NO:45のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチド作用物質はWO 2008/013859のSEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38またはSEQ ID NO:45から選択される。他の態様において、ペプチド作用物質はWO 2008/013859のSEQ ID NO 34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38またはSEQ ID NO:45以外である。いくつかの態様において、ペプチドはWO 2008/013859のSEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:38から選択される。いくつかの態様において、ペプチドは、WO 2008/013859のSEQ ID NO 34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37もしくはSEQ ID NO:45から選択されるペプチドまたは別のペプチドを含め、WO 2008/013859のSEQ ID NO:36またはSEQ ID NO:38以外である。いくつかの態様において、ペプチドはWO 2008/013859のSEQ ID NO:36である。いくつかの態様において、ペプチドは、WO 2008/013859のSEQ ID NO 34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37もしくはSEQ ID NO:45から選択されるペプチドまたは別のペプチドを含め、WO 2008/013859のSEQ ID NO:36以外である。いくつかの態様において、ペプチドはWO 2008/013859のSEQ ID NO:38である。いくつかの態様において、ペプチドは、WO 2008/013859のSEQ ID NO 34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37もしくはSEQ ID NO:45から選択されるペプチドまたは別のペプチドを含め、WO 2008/013859のSEQ ID NO:38以外である。
【００５０】
SEQ ID NO:1 (WO 2008/013859のSEQ ID NO:34)
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SEQ ID NO:2 (WO 2008/013859のSEQ ID NO:35)
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SEQ ID NO:5 (WO 2008/013859のSEQ ID NO:38)
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【００５１】
他の態様において、ペプチド作用物質は、脳卒中、脳血管疾患、てんかん、伝達性海綿状脳症(TSE)のような、他の神経学的状態に関連する標的タンパク質または構造; アルツハイマー病(AD)、脳アミロイド血管症(CAA)および脳血管疾患(CVD)のアミロイドプラークにおけるAβペプチド; パーキンソン病のレヴィー小体におけるα-シヌクレイン沈着、前頭側頭認知症およびピック病における神経原線維濃縮体中のタウ; 筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ; ならびにハンチントン病におけるハンチンチン、およびグリア芽腫、下垂体部腫瘍または髄膜腫のような良性およびがん性脳腫瘍に特異的に結合する。
【００５２】
いくつかの態様において、ペプチド作用物質は、β-シートからα-ヘリックスへの変化、非構造からβ-シートへの変化などのような、上記のα-ヘリックスからβ-シートへの変化以外の立体構造変化を起こす。そのようなペプチド作用物質は、神経学的状態に関連する標的ペプチドまたは構造との相互作用によってそのような立体構造変化を起こすことができる。
【００５３】
他の態様において、ペプチド作用物質は抗アミロイド抗体E610およびNG8のような、アミロイド形成性疾患に関連する標的タンパク質または構造などの(自己凝集に特異的な立体構造または状態などの)、神経学的状態に関連する標的タンパク質または構造に特異的に結合する抗体である。他の神経学的状態に関連するタンパク質または構造に特異的に結合する抗体と同様に、他の抗アミロイド抗体が当技術分野において公知である。
【００５４】
他のペプチド検出剤は蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、ストレプトアビジン、酵素、酵素基質、および当技術分野において公知の他のペプチド検出剤を含む。
【００５５】
例示的なペプチド治療剤としてはペプチド巨大分子および小ペプチドが挙げられる。例えば、神経栄養タンパク質は、本明細書において記述される方法との関連でペプチド作用物質として有用である。神経栄養タンパク質は神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3 (NT-3)、ニューロトロフィン-4 (NT-4)、ニューロトロフィン-5 (NT-5)、インスリン様成長因子(IGF-IおよびIGF-II)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、上皮成長因子(EGF)、グリア由来ネキシン(GDN)、形質転換成長因子(TGF-αおよびTGF-β)、インターロイキン、血小板由来成長因子(PDGF)およびS100βタンパク質、ならびにそれらの生物活性誘導体および類似体を含む。
【００５６】
また、神経活性ペプチドは視床下部放出ホルモン、脳下垂体ホルモン、下垂体ペプチド、無脊椎動物ペプチド、胃腸ペプチド、心臓に見られるそれらのペプチド、例えば心房性ナトリウム利尿ペプチド、および他の神経活性ペプチドのサブクラスを含む。
【００５７】
視床下部放出ホルモンのサブクラスは適当な例として、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンおよび成長ホルモン放出ホルモンを含む。
【００５８】
脳下垂体ホルモンのサブクラスはバソプレッシン、オキシトシン、およびニューロフィジンのような化合物によって例示される。
【００５９】
下垂体ペプチドのサブクラスは副腎皮質刺激ホルモン、β-エンドルフィン、α-メラニン細胞刺激ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、成長ホルモンおよびチロトロピンによって例示される。
【００６０】
適当な無脊椎動物ペプチドはFMRFアミド、ヒドラヘッド(hydra head)活性化因子、プロクトリン、小心臓性ペプチド、ミオモジュリン、ブッカリン(buccolins)、産卵ホルモンおよびバッグ細胞ペプチドによって例示される。
【００６１】
胃腸ペプチドは、血管作動性腸管ペプチド、コレシストキニン、ガストリン、ニューロテンシン、メチオニンエンケファリン、ロイシンエンケファリン、インスリンおよびインスリン様成長因子IおよびII、グルカゴン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド、ボンベシン、モチリンならびにセクレチンのような神経学的に活性な化合物を含む。
【００６２】
他の神経活性ペプチドの例としては、アンギオテンシンII、ブラジキニン、ダイノルフィン、オピオコルチン、睡眠ペプチド、カルシトニン、CGRP (カルシトニン遺伝子関連ペプチド)、ニューロペプチドY、ニューロペプチドYy、ガラニン、サブスタンスK (ニューロキニン)、フィザレミン、カッシニン、ウペロレイン、エレドイシンおよび心房性ナトリウム利尿ペプチドが挙げられる。
【００６３】
ペプチド作用物質はカルシウム結合タンパク質および他のシナプス小胞タンパク質のような、シナプス小胞の成員に関連するタンパク質も含む。カルシウム結合タンパク質のサブクラスは、細胞骨格結合タンパク質、例えばカルデスモン、アネキシン、カレレクトリン(哺乳類)、カレレクトリン(シビレエイ)、カルパクチンI、カルパクチン複合体、カルパクチンII、エンドネキシンI、エンドネキシンII、タンパク質II、シネキシンI; および酵素調節因子、例えばp65を含む。
【００６４】
他のシナプス小胞タンパク質は、移動阻害因子(例えばシナプシンIa、bおよびシナプシンIIa、b)、可能な融合タンパク質、例えばシナプトフィジン、ならびに未知機能のタンパク質、例えばp29、VAMP-1,2 (シナプトブレビン)、VAT1、rab 3Aおよびrab 3Bを含む。
【００６５】
ペプチド作用物質はα-、β-およびγ-インターフェロン、エポエチン、フィルグラスチム(Fligrastim)、サルグラモスチン(Sargramostin)、CSF-GM、ヒト-IL、TNFおよび他の生物工学薬も含む。
【００６６】
ペプチド作用物質は組み換え生物工学法を用いて得られたペプチド、タンパク質および抗体も含む。
【００６７】
ペプチド作用物質は、直接的にまたは間接的に、タンパク質がアミロイドプラークもしくは沈着を凝集することおよび/もしくは形成することを阻害する、ならびに/またはアミロイドプラークもしくは沈着の脱凝集もしくは減少を促進する、「抗アミロイド剤」または「抗アミロイド形成性剤」も含む。抗アミロイド剤は、当技術分野において「アミロイドバスター」または「プラークバスター」と総称される作用物質も含む。これらはペプチド模倣的な薬物であって、アミロイド原線維と相互作用してそれらを徐々に溶解する薬物を含む。「ペプチド模倣」とは、生体分子が生物学的に活性な他のペプチド分子の活性を模倣することを意味する。「アミロイドバスター」または「プラークバスター」は、アミロイド原線維が安定性を保つのに必要な補因子を吸収する作用物質も含む。
【００６８】
抗アミロイド剤は、PCT出願PCT/US2007/016738 (WO 2008/013859)および米国特許出願第11/828,953号に記述されている抗体およびペプチドプローブを含み、これらの全内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。その中で記述されているように、所与の標的タンパク質に対するペプチドプローブはそのタンパク質に特異的に結合し、標的タンパク質の特定の構造型に優先的に結合することができる。いかなる理論によっても束縛されることを欲しないが、ペプチドプローブによる標的タンパク質の結合は標的タンパク質の高次集合体の形成を阻止し、それによって、標的タンパク質に関連する疾患を予防しもしくは処置し、および/または疾患のさらなる進行を予防しうると考えられる。例えば、標的タンパク質のモノマーとのペプチドプローブの結合によって、標的タンパク質の自己凝集が阻止されるであろう。同様に、可溶性オリゴマーまたは不溶性凝集体とのペプチドプローブの結合によって、さらなる凝集ならびに原線維前駆体および原線維の形成が阻止され、その一方で、原線維前駆体または原線維とのペプチドプローブの結合によって、その構造のさらなる拡大が阻止されるであろう。さらなる凝集を遮断することに加えて、この結合は同様に、平衡を再び可溶性モノマーの方に有利な状態に戻し、さらに疾患の進行を阻止し、疾患症状を軽減しうる。
【００６９】
例示的な検出剤として上述されているペプチド作用物質の多くが治療剤としても有用であること、および例示的な治療剤として上述されているペプチド作用物質の多くが検出剤としても有用であることを当業者は認識するであろう。すなわち、これらの記述子は、決して限定するものではない。
【００７０】
いくつかの態様において、ペプチド作用物質は、一つもしくは複数の保存的なアミノ酸置換、付加もしくは欠失、および/またはBBBを横断する結合体の透過性をさらに増強する一つもしくは複数のアミノ酸置換、付加もしくは欠失のような、一つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失を有する、上記のペプチド作用物質の変種である。例えば、より疎水性のアミノ酸配列をもたらすアミノ酸置換、付加または欠失は、BBBを横断する結合体の透過性をさらに増強することができる。
【００７１】
C. ピレン
ピレンはピレンであってよく、または非ペプチド作用物質への結合時に、BBBを横断する作用物質の透過性を向上させる任意のピレン誘導体もしくは類似体であってもよい。
【００７２】
ピレンは4つの縮合ベンゼン環からなる。
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【００７３】
「ピレン」誘導体または類似体とは、ピレン炭素原子の一つまたは複数が置換されているまたはさらなる部分に結合されている、ピレンの4つの縮合ベンゼン環を含む分子を意味する。例示的なピレン誘導体としては、例えば、O、NもしくはS原子を含む部分(例えば、カルボニル、アミン、スルフヒドリル)でまたはハロゲンで置換されてもよい、C1〜C20直鎖または分枝鎖、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアシル基のような、直鎖または分枝鎖、置換または非置換アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアシル基で、ピレン炭素原子の一つまたは複数が置換されている、アルキル化ピレンが挙げられる。いくつかの態様において、ピレン誘導体は、各々がピレン炭素原子に直接付着されてもよい、またはピレン炭素から1個もしくは複数個の原子だけ、例えば1〜3個、1〜5個もしくはそれ以上の原子だけ離れている炭素原子の位置に付着されるなどの、上記の直鎖もしくは分枝鎖、置換もしくは非置換アルキル、アルケニル、アルキニルもしくはアシル基上の任意の位置に付着されてもよい、一つもしくは複数の遊離カルボキシル基および/または一つもしくは複数の遊離アミン基を含む。いくつかの態様において、ピレンは一つもしくは複数の酢酸部分および/または一つもしくは複数のエチルアミン部分で置換される。いくつかの態様において、ピレン誘導体は単一のメチル、エチル、プロピルまたはブチル基で置換される。いくつかの態様において、ピレンは酪酸ピレンなど、短鎖脂肪酸で置換される。別の態様において、ピレンはアルブミン、トランスフェリン(transferring)または抗体のFc断片に結合される。いくつかの態様において、置換基は炭素-炭素結合、アミノ基、ペプチド結合、エーテル、チオエーテル、ジスルフィドまたはエステル結合を通じてピレンに付着される。
【００７４】
ピレン誘導体は当技術分野において公知の方法によって作出することができる。例えば、脂肪酸を四環性の足場に付着させるために置換ピレンを用いることができる。ピレンの官能化アルキル誘導体を含む、適当な試薬および誘導体化反応は、当技術分野において公知である。例えば、アミノピレンを1,4-ブタン二酸メチルエステルと反応させて、ピレンのブタン酸誘導体を得ることができる。あるいは、1-チオシアナトピレンを4-アミノブタン酸メチルエステルと反応させて、ピレンのチオ置換ブタン酸誘導体を得ることもできる。他の代替反応は、ピレンボロン酸および置換脂肪酸を反応させて、ピレンの脂肪酸誘導体を得ることを含む。
【００７５】
他の態様において、ピレン誘導体はPEG化ピレン、すなわち、ポリエチレングリコール(PEG)に結合されたピレンである。そのようなピレン誘導体はインビボでより長い血中半減期を示すことができる。他の態様において、ピレン誘導体はアルブミンに結合されたピレンである。
【００７６】
いくつかの態様において、ピレン誘導体はピレンと比べて毒性の低下を示す。いくつかの態様において、ピレン誘導体は上記のPEG化ピレンなどの、ピレンと比べてインビボで血中半減期の増大を示す。いくつかの態様において、ピレン誘導体はアルブミン結合ピレンなどの、ピレンと比べてBBBを横断する透過性のさらに高い増大を示す。いくつかの態様において、ピレン誘導体は1〜10のオクタノール/水分配係数を有する。
【００７７】
D. 結合体
ペプチド作用物質は化学(共有)結合を含め、当技術分野において公知の任意の手段によってピレンに結合させることができる。いくつかの態様において、ペプチド作用物質は側鎖残基を通じてピレンに直接結合される。一つの態様において、ピレンはリジン残基のε-アミノ基を介してペプチド作用物質に結合される。クロロピレンのような、ピレンの誘導体を、パラジウム触媒交差カップリング反応によってリジンのε-アミノ基にカップリングさせることができる。他の態様において、ペプチド作用物質はリンカーによってピレンに結合される。リンカーとして使用される化合物は、当技術分野において周知であり、置換されてもよいC1〜C20アルキル基、アルカン酸、アルケン酸、アルキン酸、アルコキシド基、アミノアルカン酸、アルキルアミン、アルコキシ基、二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、エチレンオキシド重合体(PEG)、置換されてもよいアリール基、アルキニルピリジル、アルキニルビピリジル、フタル酸、リンゴ酸およびマレイン酸、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヘテロ二官能性試薬ならびに基特異的な反応剤、例えばマレイミド部分、ジチオ部分(SH)およびカルボジイミド部分を含む。
【００７８】
結合体は、作用物質とともに生きた生物においてピレンを発現させることを含む方法などの、化学合成法または生物工学法によって形成させることができる。そのような生物工学法は、合成による生物学的過程または進化の直接操作およびピレン-作用物質結合体の組み合わせのスクリーニングを含む。
【００７９】
いくつかの態様において、ペプチド作用物質は単一のピレン部分に結合される。他の態様において、ペプチド作用物質は二つまたはそれ以上のピレン部分に結合される。ペプチド作用物質が二つまたはそれ以上のピレン部分に結合される場合、各ピレン部分は作用物質に(直接的にまたはリンカーを通じて)結合されうる。
【００８０】
一つの態様において、ピレン部分はそのN末端またはC末端でペプチド作用物質に結合される。別の態様において、ピレン部分は内部(非末端)アミノ酸残基でペプチド作用物質に結合される。二つのピレン部分を用いる態様において、一方のピレン部分がペプチド作用物質の各末端に結合されるか、一方のピレン部分がN末端もしくはC末端に結合されかつもう一方が内部残基で結合されるか、または両方が内部残基で結合されうる。三つ以上のピレン部分がペプチド作用物質に結合される場合、それらの部分は末端および内部残基の任意の序列または組み合わせに位置付けられうる。いくつかの態様において、ピレン部分は互いに近接して結合される一方で、他の態様において、それらはペプチド作用物質上に間隙を介してまたは離れた位置で位置付けられる。他の態様において、一つまたは複数のピレン部分が一つまたは複数のピレン部分に(直接的にまたはリンカーを介して)結合され、このうちの少なくとも一つが直接的にまたはリンカーを介して、ペプチド作用物質に結合される。
【００８１】
ピレン部分の位置にかかわらず、結合体はBBBを横断する作用物質の透過性の増強を示すことができる。
【００８２】
いくつかの態様において、結合体は、ピレンエキシマーを形成できるようにピレンで標識される。すなわち、ペプチド作用物質は、所望に応じて、同じまたは異なるペプチド作用物質分子に結合されたピレン部分間でのエキシマーの形成を可能とするようにピレン部分に結合される。これらの態様によれば、二つまたはそれ以上のピレン部分は、例えば、ペプチド作用物質の特定の立体構造に関連しうるような、同じペプチド作用物質分子上のピレン部分間の相互作用によるエキシマーの形成を可能とするように同じペプチド作用物質分子に結合されうる。あるいは、エキシマーの形成は、例えば、ペプチド作用物質分子間の局在、結合および/または相互作用に関連しうるような、異なるペプチド作用物質分子上のピレン部分間の相互作用によるものでありうる。
【００８３】
いくつかの態様において、上記のように、異なるピレン誘導体が使用され、そのうちの少なくとも一つが一つもしくは複数の遊離カルボキシル基(酢酸部分などの)を含み、そのうちの少なくとも一つが一つもしくは複数の遊離アミン基(エチルアミン部分などの)を含む。この態様によれば、一つのピレン誘導体上の遊離カルボキシル基と別のピレン誘導体上の遊離アミン基との間の相互作用は、例えば塩橋の形成を介してなど、ピレン誘導体間の相互作用を安定化し、エキシマー形成付加物を安定化しおよび/またはエキシマーの蛍光を最大化しうる。これらの態様によれば、二つの異なるピレン誘導体は、例えば、ペプチド作用物質の特定の立体構造に関連しうるような、例えば同じペプチド作用物質分子上の異なるピレン誘導体間の相互作用によるエキシマー形成を安定化するためになど、同じペプチド作用物質分子に結合されうる。あるいは、例えば、ペプチド作用物質分子間の局在、結合および/または相互作用に関連しうるような、例えば異なるペプチド作用物質分子間の相互作用によるエキシマー形成を安定化するためになど、一つのペプチド作用物質分子に一つのピレン誘導体が結合され、異なるペプチド作用物質分子に異なるピレン誘導体が結合されうる。
【００８４】
いくつかの態様において、結合体は検出可能な標識で標識される。例えば、結合体は標識に、共有結合的にまたは非共有結合的に、カップリングまたは融合されているペプチド作用物質を含みうる。ペプチド作用物質が検出剤である態様において、検出可能な標識は検出の向上または追加条件下での検出を与えうる。ペプチド作用物質が治療剤である態様において、検出可能な標識は治療剤により与えられる治療に加えて検出を与えうる。
【００８５】
本明細書において用いられる場合、「検出可能な標識」は、検出できる任意の部分を含む。選択される特異的な標識は、分析に用いられる分析技術に応じて、大きく異なりうる。標識は、短い疎水性ペプチド配列で末端キャップされうる、ペプチド作用物質のアミノ末端またはカルボキシ末端の位置でまたは近傍で複合体化されまたは共有結合されうる。本発明のいくつかの局面において、ペプチド作用物質のアミノ末端もカルボキシ末端もともに、サイズが約1〜約5アミノ酸に及ぶ小さな疎水性ペプチドで末端キャップされる。これらのペプチドは天然のものでも合成によるものでもよいが、天然のものである(すなわち、標的タンパク質に由来する)ことが多い。標識はペプチドのアミノ末端および/もしくはカルボキシ末端の位置でもしくは近傍で、またはその他任意の適当な位置で付着されうる。
【００８６】
本明細書において用いられる場合、「検出可能な標識」は、結合体を標識するのに有用な化学的または生化学的部分である。「検出可能な標識」は、蛍光剤(例えば、フルオロフォア、蛍光タンパク質、蛍光性半導体ナノ結晶)、リン光剤、化学発光剤、発色剤、消光剤、色素、放射性核種、金属イオン、金属ゾル、リガンド(例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、ハプテンなど)、酵素(例えば、ベータ-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど)、酵素基質、酵素補因子(例えば、NADPH)、酵素阻害剤、シンチレーション剤、阻害剤、磁性粒子、オリゴヌクレオチド、および当技術分野において公知の他の部分を含むことができる。
【００８７】
作用物質または標識がフルオロフォアである場合、フルオロフォアの一つまたは複数の特徴を用いて、標識結合体の状態を評価することができる。例えば、フルオロフォアの励起波長は、結合体が結合しているか遊離しているかに基づいて異なりうる。いくつかの態様において、蛍光の放出波長、強度または極性化も結合体の状態に基づいて変わりうる。
【００８８】
本明細書において用いられる場合「フルオロフォア」とは、光により励起されて蛍光またはリン光を放出しうる化学基である。「クエンチャ」とは、蛍光供与体からの蛍光シグナルを消光できる作用物質である。第一のフルオロフォアは、第二のフルオロフォアを励起する蛍光シグナルを放出しうる。第一のフルオロフォアは、第二のフルオロフォアにより消光されるシグナルを放出しうる。本明細書において開示するプローブは、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を起こすことができる。
【００８９】
フルオロフォアおよびクエンチャは以下の作用物質(または以下の商品名で販売されているフルオロフォアおよびクエンチャ)を含むことができる: 1,5 IAEDANS; 1,8-ANS; ウンベリフェロン(例えば、4-メチルウンベリフェロン); アクラジマム(acradimum)エステル、5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン; 5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM); 5-カルボキシテトラメチルローダミン(5-TAMRA) ; 5-FAM (5-カルボキシフルオレセイン); 5-HAT (ヒドロキシトリプタミン) ; 5-ヒドロキシトリプタミン(HAT); 5-ROX (カルボキシ-X-ローダミン); 5-TAMRA (5-カルボキシテトラメチルローダミン); 6-カルボキシローダミン6G; 6-CR 6G; 6-JOE; 7-アミノ-4-メチルクマリン; 7-アミノアクチノマイシンD (7-AAD); 7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン; 9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン; ABQ; 酸性フクシン(Acid Fuchsin); ACMA (9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン); アクリジンオレンジ(Acridine Orange); アクリジンレッド(Acridine Red); アクリジンイエロー(Acridine Yellow); アクリフラビン(Acriflavin); アクリフラビンフュールゲン(Acriflavin Feulgen) SITSA; アレキサフルオル(Alexa Fluor) 350(商標); アレキサフルオル430(商標); アレキサフルオル488(商標); アレキサフルオル532(商標); アレキサフルオル546(商標); アレキサフルオル568(商標); アレキサフルオル594(商標); アレキサフルオル633(商標); アレキサフルオル647(商標); アレキサフルオル660(商標); アレキサフルオル680(商標); アリザリンコンプレキソン(Alizarin Complexon); アリザリンレッド(Alizarin Red); アロフィコシアニン(Allophycocyanin) (APC); AMC; AMCA-S; AMCA (アミノメチルクマリン(Aminomethylcoumarin)); AMCA-X; アミノアクチノマイシン(Aminoactinomycin) D; アミノクマリン(Aminocoumarin); アミノメチルクマリン(Aminomethylcoumarin) (AMCA); アニリンブルー(Anilin Blue); ステアリン酸アントロシル; APC (アロフィコシアニン(Allophycocyanin)); APC-Cy7; APTS; アストラゾンブリリアントレッド(Astrazon Brilliant Red) 4G; アストラゾンオレンジ(Astrazon Orange) R; アストラゾンレッド(Astrazon Red) 6B; アストラゾンイエロー(Astrazon Yellow) 7GLL ; アタブリン(Atabrine); ATTO-TAG(商標) CBQCA; ATTO-TAG(商標) FQ; オーラミン(Auramine); オーロホスフィン(Aurophosphine) G; オーロホスフィン; BAO 9 (ビスアミノフェニルオキサジアゾール(Bisaminophenyloxadiazole)); 硫酸ベルベリン(Berberine Sulphate); ベータラクタマーゼ(Beta Lactamase); BFP青色偏移GFP (BFP blue shifted GFP) (Y66H); 青色蛍光たんぱく質(Blue Fluorescent Protein); BFP/GFP FRET; ビマン(Bimane); ビスベンズアミド(Bisbenzamide); ビスベンズイミド(Bisbenzimide) (ヘキスト(Hoechst)); ブランコファー(Blancophor) FFG; ブランコファーSV; BOBO(商標)-1; BOBO(商標)-3; ボディピ(Bodipy) 492/515; ボディピ493/503; ボディピ500/510; ボディピ505/515; ボディピ530/550; ボディピ542/563; ボディピ558/568; ボディピ564/570; ボディピ576/589; ボディピ581/591; ボディピ630/650-X; ボディピ650/665-X; ボディピ665/676; ボディピFL; ボディピFL ATP; ボディピF1-セラミド(Ceramide); ボディピR6G SE; ボディピTMR; ボディピTMR-X結合体; ボディピTMR-X, SE; ボディピTR; ボディピTR ATP; ボディピTR-X SE; BO-PRO(商標)-1; BO-PRO(商標)-3; ブリリアントスルホフラビン(Brilliant Sulphoflavin) FF; カルセイン(Calcein); カルセインブルー(Calcein Blue); カルシウムクリムソン(Calcium Crimson) (商標); カルシウムグリーン(Calcium Green); カルシウムオレンジ(Calcium Orange); カルコフルオアホワイト(Calcofluor White); カルボキシ-X-ローダミン(5-ROX); カスケー��ブルー(Cascade Blue) (商標); カスケードイエロー(Cascade Yellow); カテコールアミン(Catecholamine); CCF2 (GeneBlazer); CFDA; CFP-シアン蛍光たんぱく質(Cyan Fluorescent Protein); CFP/YFP FRET; クロロフイル(Chlorophyll); クロモマイシン(Chrornomycin) A; CL-NERF (レシオ色素、pH) (Ratio Dye, pH); CMFDA; セレンテラジン(Coelenterazine) f; セレンテラジンfcp; セレンテラジンh; セレンテラジンhcp; セレンテラジンip; セレンテラジンn; セレンテラジンO; クマリンファロイジン(Coumarin Phalloidin); C-フィコシアニン(phycocyanine); CPMメチルクマリン; CTC; CTCホルマザン(Formazan); Cy2(商標); Cy3.1 8; Cy3.5(商標); Cy3(商標); Cy5.1 8 ; Cy5.5(商標); Cy5(商標); Cy7(商標); シアン(Cyan)GFP; 環状AMPフルオロセンサー(cyclic AMP Fluorosensor) (FiCRhR); ダブシル(Dabcyl); ダンシル(Dansyl); ダンシルアミン(Dansyl Amine); ダンシルカダベリン(Dansyl Cadaverine); ダンシルクロリド(Dansyl Chloride); ダンシル(Dansyl)DHPE; ダンシルフルオリド(Dansyl fluoride); DAPI; ダポキシル(Dapoxyl); ダポキシル2; ダポキシル3; DCFDA; DCFH (ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(Dichlorodihydrofluorescein Diacetate)); DDAO; DHR (ジヒドロローダミン(Dihydorhodamine) 123); Di-4-ANEPPS; Di-8-ANEPPS (ノンレシオ) (non-ratio); DiA (4-Di-16-ASP); ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(Dichlorodihydrofluorescein Diacetate) (DCFH); DiD-脂溶性トレーサー(Lipophilic Tracer); DiD (DiIC18(5)); DIDS ; ジヒドロローダミン(Dihydorhodamine) 123 (DHR); DiI (DiIC18(3)); ジニトロフェノール(Dinitrophenol); DiO (DiOC18(3)); DiR; DiR (DiIC18(7)); DNP; ドーパミン(Dopamine); DsRed; DTAF; DY-630-NHS; DY-635-NHS; EBFP; ECFP; EGFP; ELF 97; エオシン(Eosin); エリスロシン(Erythrosin); エリスロシンITC ; エチジウムブロミド(Ethidium Bromide); エチジウムホモダイマー(Ethidium homodimer)-1 (EthD-1); オイクリシン(Euchrysin); ユーコライト(EukoLight); 塩化ユウロピウム(III) (Europium (III) chloride); EYFP; ファストブルー(Fast Blue); FDA; フォイルゲン(Feulgen) (パラローザニリン(Pararosaniline)); FITC; フラゾオレンジ(Flazo Orange); フルオ(Fluo)-3; フルオ-4; フルオレセイン(Fluorescein) (FITC); フルオレセインジアセテート(Fluorescein Diacetate); フルオロ-エメラルド(Fluoro-Emerald); フルオロ-ゴールド(Fluoro-Gold) (ヒドロキシスチルブアミジン(Hydroxystilbamidine)); フルオル・ルビー(Fluor-Ruby); フルオルX (FluorX); FM 1-43(商標); FM 4-46; フラレッド(Fura Red) (商標); フラレッド(商標)/フルオ-3; フラ-2(Fura-2); フラ-2/BCECF; ゲナクリルブリリアントレッド(Genacryl Brilliant Red) B; ゲナクリルブリリアントイエロー(Genacryl Brilliant Yellow) 10GF; ゲナクリルピンク(Genacryl Pink) 3G; ゲナクリルイエロー(Genacryl Yellow) 5GF; GeneBlazer (CCF2); 蛍光たんぱく質(例えば、GFP (S65T); 赤色偏移GFP (GFP red shifted) (rsGFP); GFP野生型(GFP wild type)、非UV励起(non-UV excitation) (wtGFP); GFP野生型、UV励起(UV excitation) (wtGFP); およびGFPuv); グロキサン酸(Gloxalic Acid); グラニュラーブルー(Granular Blue); ヘマトポルフィリン(Haematoporphyrin); ヘキスト33258; ヘキスト33342; ヘキスト34580; HPTS; ヒドロキシクマリン(Hydroxycoumarin); ヒドロキシスチルブアミジン(Hydroxystilbamidine) (フルオロゴールド(FluoroGold)); ヒドロキシトリプタミン(Hydroxytryptamine); インド(Indo)-1; インドジカルボシアニン(Indodicarbocyanine) (DiD); インドトリカルボシアニン(Indotricarbocyanine) (DiR); イントラホワイト(Intrawhite) Cf; JC-1; JO-JO-1; JO-PRO-1; ラウロダン(Laurodan); LDS 751 (DNA); LDS 751 (RNA); リューコファー(Leucophor) PAF; リューコファーSF; リューコファーWS; リサミンローダミン(Lissamine Rhodamine); リサミンローダミンB; カルセイン(Calcein)/エチジウムホモダイマー(Ethidium homodimer); LOLO-1; LO-PRO-1; ルシファーイエロー(Lucifer Yellow); ルミノール(luminol)、ライソトラッカーブルー(Lyso Tracker Blue); ライソトラッカーブルー・ホワイト(Lyso Tracker Blue-White); ライソトラッカーグリーン(Lyso Tracker Green); ライソトラッカーレッド(Lyso Tracker Red); ライソトラッカーイエロー(Lyso Tracker Yellow); ライソセンサーブルー(LysoSensor Blue); ライソセンサーグリーン(LysoSensor Green); ライソセンサーイエロー/ブルー(LysoSensor Yellow/Blue); Magグリーン(Mag Green); マグダラレッド(Magdala Red) (フロキシン(Phloxin) B); Mag-フラレッド(Mag-Fura Red); Mag-フラ-2 (Mag-Fura-2); Mag-フラ-5 (Mag-Fura-5); Mag-インド-1 (Mag-Indo-1); マグネシウムグリーン(Magnesium Green); マグネシウムオレンジ(Magnesium Orange); マラカイトグリーン(Malachite Green); マリーナブルー(Marina Blue); マキシロンブリリアントフラビン(Maxilon Brilliant Flavin) 10 GFF; マキシロンブリリアントフラビン8 GFF; メロシアニン(Merocyanin); メトキシクマリン(Methoxycoumarin); ミトトラッカーグリーン(Mitotracker Green) FM; ミトトラッカーオレンジ(Mitotracker Orange); ミトトラッカーレッド(Mitotracker Red); ミトラマイシン(Mitramycin); モノブロモビマン(Monobromobimane); モノブロモビマン(mBBr-GSH); モノクロロビマン(Monochlorobimane); MPS (ルグリーンピロニンスチルベン(Methyl Green Pyronine Stilbene)); NBD; NBDアミン(Amine); ナイル レッド(Nile Red); NED(商標); ニトロベンゾキシアジドール(Nitrobenzoxadidole); ノルアドレナリン(Noradrenaline); ヌクレアファストレッド(Nuclear Fast Red); ヌクレアイエロー(Nuclear Yellow); ニロサンブリリアントフラビン(Nylosan Brilliant Iavin) E8G; オレゴングリーン(Oregon Green); オレゴングリーン488-X; Oregon Green(商標); オレゴングリーン (商標) 488; オレゴングリーン (商標) 500; オレゴングリーン(商標) 514; パシフィックブルー(Pacific Blue); パラローザニリン(Pararosaniline) (フォイルゲン(Feulgen)); PBFI; PE-Cy5; PE-Cy7; PerCP; PerCP-Cy5.5; PE-テキサスレッド(PE-TexasRed) [レッド613]; フロキシン (Phloxin) B (マグダラレッド(Magdala Red)); ホルワイト(Phorwite) AR; ホルワイトBKL; ホルワイトRev; ホルワイトRPA; ホスフィン(Phosphine) 3R; フィコエリスリン(Phycoerythrin) B [PE]; フィコエリスリン(Phycoerythrin) R [PE]; PKH26 (Sigma); PKH67; PMIA; ポントクロームブルーブラック(Pontochrome Blue Black); POPO-1; POPO-3; PO-PRO-1; PO-PRO-3; プリムリン(Primuline); プロシオンイエロー(Procion Yellow); ヨウ化プロピジウム(Propidium Iodid) (PI); PyMPO; ピレン(Pyrene); ピロニン(Pyronine); ピロニンB; ピロザールブリリアントフラビン(Pyrozal Brilliant Flavin) 7GF; QSY 7; キナクリンマスタード(Quinacrine Mustard); レッド613 [PE-テキサスレッド]; レゾルフィン(Resorufin); RH 414; Rhod-2; ローダミン(Rhodamine); ローダミン110 ; ローダミン123; ローダミン5 GLD; ローダミン6G; ローダミンB; ローダミンB 200; ローダミンB エキストラ; ローダミンBB; ローダミンBG; ローダミングリーン; ローダミンファリシジン(Rhodamine Phallicidine); ローダミンファロイジン(Rhodamine Phalloidine）; ローダミンRed; ローダミンWT; ローズベンガル(Rose Bengal); R-フィコシアニン(phycocyanine); R-フィコエリスリン(phycoerythrin) (PE); RsGFP; S65A; S65C; S65L; S65T; サファイア(Sapphire) GFP; SBFI; セロトニン(Serotonin); セブロンブリリアントレッド(Sevron Brilliant Red) 2B; セブロンブリリアントレッド4G; セブロンブリリアントレッドB; セブロンオレンジ(Sevron Orange); セブロンイエロー(Sevron Yellow) L; sgBFP(商標); sgBFP(商標) (スーパーグロウ(super glow) BFP); sgGFP(商標); sgGFP(商標) (スーパーグロウGFP); SITS; SITS (プリムリン(Primuline)); SITS (スチルベンイソチオスルホン酸(Stilbene Isothiosulphonic Acid)); SNAFLカルセイン; SNAFL-1; SNAFL-2; SNARFカルセイン; SNARF1; ナトリウ
ムグリーン(Sodium Green); スペクトラムアクア(SpectrumAqua); スペクトラムグリーン(SpectrumGreen); スペクトラムオレンジ(SpectrumOrange); スペクトラムレッド(Spectrum Red); SPQ (6-メトキシ-N-(3-スルホプロピル)キノリニウム); スチルベン(Stilbene); スルホローダミン(Sulphorhodamine) B can C; スルホローダミン(Sulphorhodamine) G エキストラ; SYTO 11 ; SYTO 12; SYTO 13; SYTO 14; SYTO 15; SYTO 16; SYTO 17; SYTO 18; SYTO 20; SYTO 21; SYTO 22; SYTO 23; SYTO 24; SYTO 25; SYTO 40; SYTO 41; SYTO 42; SYTO 43; SYTO 44; SYTO 45; SYTO 59; SYTO 60; SYTO 61 ; SYTO 62; SYTO 63; SYTO 64; SYTO 80; SYTO 81; SYTO 82; SYTO 83; SYTO 84; SYTO 85; SYTOXブルー(Blue); SYTOXグリーン(Green); SYTOXオレンジ(Orange); TET(商標); テトラシクリン(Tetracycline); テトラメチルローダミン(Tetramethylrhodamine) (TRITC); テキサスレッド(Texas Red) (商標); テキサスレッド-X (Texas Red-X) (商標)結合体; チアジカルボシアニン(Thiadicarbocyanine) (DiSC3); チアジンレッド(Thiazine Red) R; チアゾールオレンジ(Thiazole Orange); チオフラビン(Thioflavin) 5; チオフラビンS; チオフラビンTCN; チオライト(Thiolyte); チオゾールオレンジ(Thiozole Orange); チノポール(Tinopol) CBS (カルコフロールホワイト(Calcofluor White)); TMR; TO-PRO-1; TO-PRO-3; TO-PRO-5; TOTO-1; TOTO-3; トリコロール(Tricolor) (PE-Cy5); TRITC テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TetramethylRodaminelsoThioCyanate); トゥルーブルー(True Blue); トゥルーレッド(TruRed); ウルトラライト(Ultralite); ウラニン(Uranine) B; ウビテックス(Uvitex) SFC; VIC(登録商標); wt GFP; WW 781 ; X-ローダミン; XRITC; キシレンオレンジ(Xylene Orange); Y66F; Y66H; Y66W; イエロー(Yellow) GFP; YFP; YO-PRO-1; YO-PRO-3; YOYO-1; YOYO-3; およびそれらの塩。
【００９０】
作用物質は、別の反応分子への結合を促進するように改変されているフルオロフォアの誘導体を含むことができる。したがって、作用物質は、作用物質のアミン反応性誘導体、例えばイソチオシアネート誘導体および/またはスクシンイミジルエステル誘導体を含むことができる。
【００９１】
インビボでの検出の態様において、インビボでの検出に有用な作用物質を用いることができる。例えば、フッ素-18のような、磁気共鳴撮像法に有用な作用物質を化学発光物質のように、使用することができる。
【００９２】
一つの態様において、標識はPETまたはMRI造影剤である。MRIは当初、非侵襲的に確定診断をする手段を提供することが望まれたが、造影剤の添加は多くの場合、造影されている組織に対する感受性および/または特異性を向上させる。MRI造影剤は陽性剤または陰性剤を含むことができる。陽性剤には一般に常磁性分子または短縮T1緩和剤が含まれるが、その二つの組み合わせも使用される。常磁性、陽性GI造影剤の例としては、塩化第二鉄、クエン酸第二鉄アンモニウムおよびガドリニウム-DTPA (マンニトール有りおよび無しの)が挙げられる。短縮T1緩和時間造影剤には鉱油、油乳剤およびスクロースポリエステルが含まれる。反磁性剤は、陰性造影剤、例えば、カオリンおよびベントナイトの混合物として使用される。別の反磁性造影剤は硫酸バリウムの懸濁液である。さらに、パーフルオロオクチルブロミド(PFOB)などの、パーフルオロ化学剤を陰性MRI造影剤として使用することもできる。超常磁性剤を経口の陰性MRI造影剤として使用することができる。マグネシウムアルブミン小球体、経口磁性粒子(Nycomed A/S, Oslo, Norway)および超常磁性酸化鉄(AMI121, Advanced Magnetics, Cambridge, Mass.)のような化合物が一般に使用される。これらの化合物は、直径がおよそ250〜350オングストロームの小さな酸化鉄結晶を含有し、Fe2O3およびFe3O4の混合物である。
【００９３】
別の態様において、作用物質は放射性物質である。例えば、該作用物質は、このために現在利用されている機械によって検出されるのに十分なエネルギーの陽電子放出をもたらすことができる。そのような実体の一例には、酸素-15 (陽電子放出により壊変する酸素の同位体)が含まれる。別の例はフッ素-18を有する化合物、例えばF-18フルオロ-L-ドーパ(FDOPA)、F-18フルオロチロシン(FTYR)、フルオロデオキシグルコース(FDG)およびC11原子を含有する化合物(例えば、C-11メチオニン(MET))である。
【００９４】
上記のように、プローブは、プローブのN末端またはC末端にカップリングされた蛍光タンパク質を同様に含んだ融合タンパク質の中に含まれてもよい。蛍光タンパク質は当技術分野において記述のペプチドリンカーを介してカップリングされてもよい(米国特許第6,448,087号; Wurth et al., J. Mol. Biol. 319:1279-1290 (2002); およびKim et al., J. Biol. Chem. 280:35059-35076 (2005)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)。いくつかの態様において、適当なリンカーは長さが約8〜12アミノ酸であってよい。さらなる態様において、リンカーのアミノ酸残基の約75%を超えるものがセリン、グリシンおよびアラニン残基から選択される。
【００９５】
検出可能な標識はオリゴヌクレオチドも含む。例えば、当技術分野において公知の方法(例えば、PCR、TMA、b-DNA、NASBAなどのような増幅アッセイ法)により検出できるオリゴヌクレオチドタグにペプチドプローブをカップリングさせることができる。
【００９６】
作用物質または標識がフルオロフォアである場合、フルオロフォアの一つまたは複数の特徴を用いて、標識された結合体の状態を評価することができる。例えば、フルオロフォアの励起波長は、結合体が結合しているか遊離しているかに基づいて異なることができる。いくつかの態様において、フルオロフォアの放出波長、強度または極性化は、結合体の状態に基づいて変わることもできる。
【００９７】
E. ペプチド結合体によるインビボでの検出
同様に提供されるのは、BBBを通過し、脳内に局在した結合体を検出するためのインビボ検出(インビボでの撮像)方法である。本明細書において用いられる場合、「脳内に局在した」とは、血液脳関門を通過したことを意味し、脳周囲の体液中での局在を含む。
【００９８】
一つの態様において、この方法は、(a) 対象に(i) ペプチド検出剤と(ii) ピレンとを含む結合体を投与する段階、および(b) 対象の脳内に局在した結合体を検出する段階を含む。いくつかの態様において、ペプチド検出剤は、脳内に局在するタンパク質および構造に特異的に結合し、それによってタンパク質または構造の選択的標的化をもたらす。いくつかの態様において、結合体は、上記のように、アルツハイマー病に関連する誤って折り畳まれたAβタンパク質もしくはAβプラークなどの、脳内に局在し神経学的状態に関連するタンパク質もしくは構造、または他の神経学的状態に関連する他のタンパク質もしくは構造に特異的に結合し、それによってタンパク質または構造の選択的標的化をもたらす。
【００９９】
別の態様において、この方法は、(a) 対象に(i) ペプチド作用物質と(ii) ピレンとを含む結合体であって、検出可能な標識で標識された結合体を投与する段階、および(b) 対象の脳内に局在した結合体を検出する段階を含む。いくつかの態様において、結合体は、上記のように、アルツハイマー病に関連する誤って折り畳まれたAβタンパク質もしくはAβプラークなどの、神経学的状態に関連するタンパク質もしくは構造のような、脳内に局在したタンパク質もしくは構造、または他の神経学的状態に関連する他のタンパク質もしくは構造に特異的に結合し、それによってタンパク質または構造の選択的標的化をもたらす。
【０１００】
例えば、検出剤または標識はフルオロフォア、MRI造影剤、イオン放射体(PET)、放射性物質(シンチレーションカウンタ)などであることができる。結合体はフーリエ変換赤外線、紫外線、MRI、PET、シンチレーションカウンタ、または蛍光、光散乱、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、蛍光消光のような、検出剤または標識を検出するのに適した手段、および当業者によって日常的に使用される種々のクロマトグラフィー法によって検出することができる。
【０１０１】
いくつかの態様において、検出する段階はピレンエキシマーの形成を検出する段階を含む。エキシマーとは、必ずしも共有結合性ではない、かつ光子によって励起された分子的実体と励起されていない同一の分子的実体との間で形成される付加物である。この付加物は天然では一過性であり、光子の放出によって蛍光を発するまで存在する。エキシマーは、特定波長の光での励起によって、異なる波長で光を放出する二つのフルオロフォアの相互作用を示し、これはどちらかのフルオロフォアが単独で作用することによって放出されるものとは光度も異なる。通常の発光スペクトルの波長よりも長い波長の新たな蛍光バンドの生成によって、エキシマー(またはエキシマーの形成)を認識することが可能である。エキシマーは、励起スペクトルがモノマーのそれと同一であるので、蛍光共鳴エネルギー転移と区別することができる。エキシマーの形成はフルオロフォアの幾何学的配置に依存し、それらの間の距離によって大きく影響される。
【０１０２】
一つの態様において、ピレン部分はペプチド作用物質の各末端に存在し、フルオロフォア間のエキシマーの形成は、ペプチド立体構造の全体がα-ヘリックスまたはランダムコイルである限り無視できるが、エキシマーは、ピレン部分が互いに接近されるような、構造変化(立体構造変化などの)をペプチド作用物質が起こす場合に形成される。ペプチド上の他の位置に存在するピレン部分も、エキシマーの形成が立体構造依存的である限り、これに関連して有用でありうる。さらに、エキシマーの形成の度合いは、存在するタンパク質被分析物の量に直接関連する。例えば、ペプチド作用物質がPCT出願PCT/US2007/016738 (WO 2008/013859)および米国特許出願第11/828,953号に記述されているペプチドプローブである場合、ペプチド作用物質は、β-シート立体構造にあるまたは自己凝集の特定の状態にあるアミロイドタンパク質のような、標的タンパク質または構造と接触するまたは相互作用する際にエキシマーの形成に至る立体構造変化を起こしうる。したがって、本発明の方法は、エキシマーの形成を検出することにより脳内の標的タンパク質または構造の検出およびインビボ撮像を可能にする。
【０１０３】
エキシマーの形成は光学的特性の変化によって検出することができる。そのような変化はプローブに付着したフロオロフォアに応じて、数多く他にある中でも、UV、IR、CD、NMRまたは蛍光を含め、公知の蛍光分析技術により測定することができる。光学的特性のこれらの変化の度合いは、この変化に伴う構造状態をとった結合体の量に直接関連し、そうするとこれは、存在する標的タンパク質または構造の量に直接関連している。
【０１０４】
本明細書において記述される結合体はまた、他のインビボでの検出方法において有用である。例えば、結合体は、心臓、肺、肝臓、腎臓または任意の組織を含む任意の臓器などの、その他任意のインビボ部位における標的タンパク質または構造(特定の立体構造または自己凝集の状態などの)を検出するために使用することができる。関心対象の特異的な場所には、血管組織またはリンパ組織を含めることもできる。本明細書において記述される結合体はまた、生体顕微鏡検査法において標的タンパク質または構造を検出および撮像する際に有用である。
【０１０５】
いくつかの態様において、異なる蛍光標識(例えば、GFPなどの)を含む結合体を、FRET法においてピレン結合体とともに用いることができる。蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)は、「供与体」フルオロフォアから適切に位置付けられた「受容体」フルオロフォアへのエネルギーの無放射転移を伴う。FRETが起きうる距離は1〜10 nmに限られ、それゆえ、この技術は、供与体フルオロフォアおよび受容体フルオロフォアで標識された、二種の分子が相互の10 nm以内に存在するかどうかを実証するために使用される。共焦点撮像によるFRETの測定は、分子相互作用の細胞内局在を判定可能にする。
【０１０６】
FRETは、供与体フルオロフォアの放出スペクトルが受容体の吸収スペクトルと大いに重複する(>30%)場合に起きうる。CFPおよびYFP標識融合タンパク質の組み合わせが生細胞におけるFRET測定に広く使われている。FRETに使われている他の供与体および受容体フルオロフォアの対は、CFPおよびdsRED、BFPおよびGFP、GFPまたはYFPおよびdsRED、Cy3およびCy5、Alexa488およびAlexa555、Alexa488およびCy3、FITCおよびRhodamine (TRITC)、YFPおよびTRITCまたはCy3を含む。
【０１０７】
いくつかの態様において、結合体は、上記のペプチドプローブが標的タンパク質または構造と相互作用する場合に起きうるような、β-シート立体構造などの、特定の立体構造をペプチドがとる場合にFRETが起きうるように位置付けられている、ピレン部分および別のフルオロフォアで標識されたペプチドを含む。そのような結合体の対象への投与は、FRETシグナルの検出による局在化結合体の検出を可能にする。
【０１０８】
F. ペプチド結合体による治療
同様に提供されるのは、BBBを横断して治療剤を送達する段階を含む神経学的障害を処置する方法である。一つの態様において、この方法は、(a) 対象に(i) ペプチド治療剤と(ii) ピレンとを含む結合体を投与する段階を含む。別の態様において、結合体は検出可能な標識で標識され、この方法は対象の脳内に局在した結合体を検出する段階をさらに含む。いくつかの態様において、ペプチド治療剤は抗アミロイド剤である。いくつかの態様において、この方法は治療的有効量の結合体を投与する段階を含む。いくつかの態様において、結合体は、上記のように、アルツハイマー病に関連する誤って折り畳まれたAβタンパク質もしくはAβプラークなどの、神経学的状態に関連するタンパク質もしくは構造のような、脳内に局在したタンパク質もしくは構造、または他の神経学的状態に関連する他のタンパク質もしくは構造に特異的に結合し、それによってタンパク質または構造の選択的標的化をもたらす。
【実施例】
【０１０９】
以下の例は、限定することなく本発明のさらなる例証を提供する。
【０１１０】
実施例1
以下は、BBBを通過するペプチド-ピレン結合体の能力について例証する。類似の方法論を用いて、本明細書に記述される方法によって用いるための所与の結合体の適合性を確認することができ、および/または結合体が非結合型の作用物質と比べてBBBを横断する透過性の増強を示すことを確認することができる。
【０１１１】
以下は、ペプチド作用物質結合体がインビボでAβプラーク(例えば、アルツハイマー病に関連するAβタンパク質の不溶性自己凝集体)を標的化する能力について例証する。ピレンを結合するために付加C末端リジン残基を有する(例えばSEQ ID NO:5)、Aβタンパク質の残基番号16-35 (SEQ ID NO:3)に対応するAβに特異的な、かつピレンにより各末端で標識したペプチド作用物質を用いる。
2011517666.tif 000011
【０１１２】
インビボ試験では10ヶ月齢のホモ接合性hAPP751SLトランスジェニックマウス4匹および同腹子対照(トランス遺伝子を保有しない同胞種) 4匹を用いる。予定した30分の投与間隔を、処置後の動物の状態に応じて調整しながら、一投与あたり液体10 μlで(0.1〜2.0 mg/mlの濃度で)、標識ペプチド作用物質結合体を鼻腔内に投与する。
【０１１３】
処置の終わった時点で、マウスを殺処理し、CSFおよび脳を抽出する。(全てのマウスを標準的な吸入麻酔、イソフルラン、Baxterにより鎮静させる)。
【０１１４】
脳脊髄液を大後頭孔の鈍的切開および露出によって得る。露出後、パスツールピペットを大後頭孔中0.3〜1 mmのおおよその深さに挿入する。流れが完全に止まるまで、吸引および毛細管作用によりCSFを回収する。CSFをすぐに凍結し、使用するまで-80℃で保管した。
【０１１５】
CSFサンプル採取の後に、胃、胃内容物および脳を素早く取り除く。脳を二等分し、全マウスの右脳を室温で1時間、新たに作出した4%パラホルムアルデヒド/PBS (pH 7.4)中にて浸漬固定し、24時間15%スクロース/PBS溶液に移して、凍結保護を確実にする。その後、脳を翌日に液体イソペンタン中で凍結し、組織学的検査に用いるまで-80℃で保存する。もう一方の脳半分を後で使うために液体イソペンタン中で素早く衝撃凍結する。
【０１１６】
最高用量のペプチド作用物質結合体で処置したトランスジェニックマウスからの、ならびに対照マウスからのおよびトランスジェニック媒体対照(例えば、ペプチド作用物質結合体に用いた希釈剤)からの画像を記録して、ペプチド作用物質結合体が血液脳関門(BBB)を通過することを確認するが、実際、ペプチド作用物質結合体は血液脳関門を通過する。
【０１１７】
ペプチド作用物質結合体による染色の特異性を評価するため、顕微鏡のUV-2AおよびB-1Eフィルタを用い蛍光を励起して、より低いスペクトルにおいて起こりうる自己蛍光を検出する。連続的なスライスにおいて蛍光部分を記録して、不純物(例えば、ほこり)が蛍光を引き起こしていないことを確実にする。トランスジェニックのスライスをチオフラビンSで染色して、プラーク負荷を評価する。
【０１１８】
上記のように、hAPP751SLトランスジェニックマウスは脳辺縁中のある種の血管においてhAPPを発現する。ペプチド作用物質結合体は、脳内の血管外側のアミロイドおよび凝集体に結合する。非トランスジェニックマウスにおいて、ペプチド作用物質結合体は嗅球に達するが、特定できる形態学的構造に結合しない。
【０１１９】
実施例2
以下の例では、上記のAβペプチド-作用物質結合体が鼻腔内投与後に脳内のAβプラークを選択的に標的化する能力について確認する。
【０１２０】
hAPPトランスジェニックマウス3匹の3群を媒体(10% DMSO)、上記のAβペプチド-作用物質結合体または酪酸ピレンで処置した。1時間にわたって20分間隔で10 μlの注射を3回マウスに行った。6時間後にマウスを殺処理し、組織を回収した。固定した凍結組織およびUV-2Aフィルタを装備した顕微鏡を用いて矢状切片の蛍光発光を行った。Image-Pro-Plusソフトウェア(Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD)を用いデジタル画像上で全てのプラーク計数を行った。
【０１２１】
図1に見られるように、結合体(「ピレン-ペプチド結合体」)で処置したマウスだけがAβプラークの蛍光標識を示したが、媒体または酪酸ピレンで処置したマウスはそうでなかった。バックグラウンドレベルの蛍光しか示さなかった結合体処置群のマウスには、抗Aβ抗体(6E10抗体)またはチオフラビンS (これはアミロイドプラークに特異的である)染色によって判定した場合にAβプラークはほとんど含まれていなかった。図2は、結合体の蛍光(AD185)とチオフラビンSの染色との相関を示す。正の相関は、r2=0.555およびp=0.005で、海馬(データ不掲載)においても大脳皮質(図2中にプロット)においてもともに認められた。
【０１２２】
矢状脳連続切片を、6E10抗体またはチオフラビンSのいずれかで染色し、結合体で標識した切片の蛍光像とともに重ね合わせた。これらのデータから、結合体の蛍光が抗体およびチオフラビンSプラーク染色と一致することが明らかであり、Aβプラークに対する結合体の特異性がさらに実証された。
【０１２３】
実施例3
以下の例では、上記のAβペプチド-作用物質結合体が静脈内投与後に脳内のAβプラークを選択的に標的化する能力について確認する。
【０１２４】
hAPPトランスジェニックマウスに尾静脈を通じて30 mg/kgの用量で上記のAβペプチド-作用物質結合体を静脈内投与した。結合体の投与から6時間後にマウスを殺処理し、上記の撮像用に脳切片を調製した。切片を結合体の蛍光について撮像した後に、これは蛍光が退色し、それからチオフラビンS染色液で染色された。このデータから、大脳皮質(図3A)でも海馬(図3B)でも、結合体の蛍光(AD185)とチオフラビンS染色との間に有意な相関関係があることが明らかにされた。
【０１２５】
本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本発明の実践においてさまざまな変更および変形がなされてもよいことは当業者には明らかであろう。本発明の他の態様は、本発明の明細および実践の考慮から当業者には明らかであろう。本明細書および実施例は例示のみとみなされるべきであり、発明の真の範囲および趣旨は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年11月29日(2010.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2011517666.tif 000018
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