(57)【要約】  本発明は、哺乳動物の中枢神経系の損傷の治療のための新規方法及び組成物を提供する。これらの方法は、神経回復、機能的な神経学的回復、間質細胞移植及び神経変性疾患の治療を強化するために、血液-脳関門透過薬との併用で間質細胞を投与することを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系（CNS）損傷を有する哺乳動物の損傷中枢神経系組織における神経回復を強化方法であって、該哺乳動物に、有効量の間質細胞及び血液-脳関門（BBB）透過薬を該哺乳動物に非経口投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記間質細胞が、骨髄間質細胞、脂肪組織由来間質細胞、肝臓間質細胞及びウォートンジェリー間質細胞からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記間質細胞が骨髄間質細胞である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記BBB透過薬が、アルキルグリセロール、RMP-7及びマンニトールからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記BBB透過薬がマンニトールである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前記間質細胞及びBBB透過薬が血管内に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記間質細胞が動脈内投与され、かつ前記BBB透過薬が静脈内投与される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記BBB透過薬が、前記間質細胞の投与前に又は該投与とほぼ同時に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約2時間から投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約12時間から投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約1週から投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約1週〜約1月投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記中枢神経系損傷が、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、低酸素-虚血、発作、感染及び中毒からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記中枢神経系損傷が、虚血性又は出血性脳卒中である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記中枢神経系損傷が、テイ-サックス病、サンドホフ病、ハーラー症候群、クラッベ病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ハンチントン病、癲癇、多発性硬化症、棘筋萎縮症（SMA）、フリードライヒ運動失調症、ダウン症候群、ウエルニッケ-コルサコフ症候群及びクロイツフェルト-ヤコブ病からなる群から選択される中枢神経系の疾患、障害又は状態から生じる、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
前記間質細胞及びBBB透過薬の投与後に、前記損傷中枢神経系組織は、間質細胞及びBBB透過薬を投与されなかった哺乳動物の同じ損傷中枢神経系組織と比較して、シナプトフィジン、ニューロンクラスIIIβ-チューブリン（TUJ1）及びダブルコルチン（DCX1）の発現が増加する、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
中枢神経系損傷を有する哺乳動物の認識及び／又は運動機能の神経学的回復を強化する方法であって、間質細胞及び血液-脳関門（BBB）透過薬を該哺乳動物に非経口投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記間質細胞及びBBB透過薬の投与後に、前記哺乳動物の認識及び／又は運動機能の神経学的回復が、該間質細胞及びBBB透過薬を投与されなかったのと同じ損傷哺乳動物の認識及び／又は運動機能の神経学的回復に比較して大きい、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記間質細胞が、骨髄間質細胞、脂肪組織由来間質細胞、肝臓間質細胞及びウォートンジェリー間質細胞からなる群から選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
前記BBB透過薬が、アルキルグリセロール、RMP-7及びマンニトールからなる群から選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
前記間質細胞及びBBB透過薬が血管内に投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
前記間質細胞が動脈内投与され、かつ前記BBB透過薬が静脈内投与される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記BBB透過薬が、前記間質細胞の投与前に又は該投与とほぼ同時に投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後に投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２７】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約2時間から投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２８】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約12時間から投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２９】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約1週から投与される、請求項19記載の方法。
【請求項３０】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約1週〜約1月投与される、請求項19記載の方法。
【請求項３１】
前記中枢神経系損傷が、脳卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷からなる群から選択される、請求項19記載の方法。
【請求項３２】
前記中枢神経系損傷が、虚血性又は出血性脳卒中である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
中枢神経系損傷を有する哺乳動物の損傷中枢神経系組織における間質細胞の移植を強化する方法であって、有効量の間質細胞及びBBB透過薬を該哺乳動物に非経口投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記損傷中枢神経系組織に移植される間質細胞の数が、前記間質細胞及びBBB透過薬の投与後に、間質細胞及びBBB透過薬を投与されなかった哺乳動物の同じ損傷中枢神経系組織に移植される間質細胞の数に比較して多い、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
前記間質細胞が、骨髄間質細胞、脂肪組織由来間質細胞、肝臓間質細胞及びウォートンジェリー間質細胞からなる群から選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
前記BBB透過薬が、アルキルグリセロール、RMP-7及びマンニトールからなる群から選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
前記間質細胞及びBBB透過薬が血管内に投与される、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
前記間質細胞が動脈内投与され、かつ前記BBB透過薬が静脈内投与される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記BBB透過薬が、前記間質細胞の投与前に又は該投与とほぼ同時に投与される、請求項33記載の方法。
【請求項４０】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後に投与される、請求項33記載の方法。
【請求項４１】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約2時間から投与される、請求項33記載の方法。
【請求項４２】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約12時間から投与される、請求項33記載の方法。
【請求項４３】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約1週から投与される、請求項33記載の方法。
【請求項４４】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約1週〜約1月投与される、請求項33記載の方法。
【請求項４５】
前記中枢神経系損傷が、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、低酸素-虚血、発作、感染及び中毒からなる群から選択される、請求項33記載の方法。
【請求項４６】
前記中枢神経系損傷が、虚血性又は出血性脳卒中である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
中枢神経系損傷を有する哺乳動物の損傷中枢神経系組織を治療する方法であって、有効量の間質細胞及び血液-脳関門透過薬を非経口投与することを含む、前記方法。
【請求項４８】
前記間質細胞が遺伝子改変されている、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
前記間質細胞が、神経成長因子、神経膠由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子及び血管内皮成長因子からなる群から選択される成長因子の発現を増加させるために遺伝子改変されている、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
前記間質細胞が、骨髄間質細胞、脂肪組織由来間質細胞、肝臓間質細胞及びウォートンジェリー間質細胞からなる群から選択される、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
前記BBB透過薬が、アルキルグリセロール、RMP-7及びマンニトールからなる群から選択される、請求項48記載の方法。
【請求項５２】
前記間質細胞及びBBB透過薬が血管内に投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５３】
前記血液-脳関門透過薬が、前記間質細胞の投与前に又は該投与とほぼ同時に投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５４】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後に投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５５】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約2時間から投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５６】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約12時間から投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５７】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約1週から投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５８】
前記間質細胞及びBBB透過薬が、中枢神経系損傷後約1週〜約1月投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５９】
前記中枢神経系損傷が、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、低酸素-虚血、発作、感染及び中毒からなる群から選択される、請求項48記載の方法。
【請求項６０】
前記中枢神経系損傷が、虚血性又は出血性脳卒中である、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
前記中枢神経系損傷が、テイ-サックス病、サンドホフ病、ハーラー症候群、クラッベ病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ハンチントン病、癲癇、多発性硬化症、棘筋萎縮症（SMA）、フリードライヒ運動失調症、ダウン症候群、ウエルニッケ-コルサコフ症候群及びクロイツフェルト-ヤコブ病からなる群から選択される中枢神経系の疾患、障害又は状態から生じる、請求項48記載の方法。
【請求項６２】
有効量の間質細胞及びBBB透過薬を含む組成物。
【請求項６３】
前記間質細胞が遺伝子改変されている、請求項62記載の組成物。
【請求項６４】
前記間質細胞が、神経成長因子、神経膠由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子及び血管内皮成長因子からなる群から選択される成長因子の発現を増加させるために遺伝子改変されている、請求項63記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府利益の表明）
本発明は、NIH-NINDSにより与えられたグラント番号NS042345の下に政府支援を得てなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００２】
（本発明の背景）
（発明の分野）
本発明の技術分野は、全般的に、損傷した中枢神経系の治療に関する。より具体的には、本発明は、間質細胞及び血液-脳関門透過薬を投与することによる損傷した中枢神経系の治療を志向する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
大部分の中枢神経系（CNS）損傷は、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、低酸素-虚血、発作、感染及び中毒によって引き起こされ、その全てはCNSへの血液供給の破壊を直接的に又は間接的に引き起こし得る。これらの損傷は、一般に、虚血、不可逆脳及び／又は脊髄の損傷、損傷したCNS組織のアポトーシス、ある事例においては負傷した個人の死亡をもたらす。
【０００４】
脳卒中は、先進諸国における3番目の主要な死因である。脳卒中は、成人障害の主要な誘因の1つであり、世界中でおよそ40,000,000人が発症する。脳卒中の一因となる脳血管構造の変化の性質には、脳の血管において形成される凝血（血栓）、別の場所から脳にたどり着いた凝血若しくはアテローム動脈硬化性斑又は他の物質の一部（塞栓）、及び血管の出血を含む。従って、脳卒中は、脳血管出血又は凝血塊の結果としての血流減少により引き起こされる場合があり、それにより、損傷した組織の不十分な血液供給、虚血及び／又は梗塞を結果的にもたらす。
【０００５】
脳内出血（ICH）としても公知である出血性脳卒中は、35%〜52%の30日死亡率で脳卒中の10%〜15%を引き起こし；その死の半分は、最初の2日以内に起こる（Broderick JP, Brott T, Tomsick T, Miller R, Huster G.の文献 J Neurosurgery. 1993;78:188-191; Anderson CS, Chakera TM, Stewart-Wynne EG, Jamrozik KD.の文献 J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1994;57:936 -940; Counsell C, Boonyakarnkul S, Dennis M, Sandercock P, Bamford Jの文献, Cerebrovasc Dis.1995;5:26 -3）。2002年に米国においてICHを有した約67,000人の患者のうち、20%のみが、損傷後6ヵ月で機能的に無関係であると予測された（Counsell C, Boonyakarnkul S, Dennis M, Sandercock P, Bamford Jの文献, Cerebrovasc Dis.1995;5:26 -3）。
【０００６】
実質的な進行性出血は、ICHを有する患者において、特に発症後の最初の3〜4時間に起こり、これは該患者における神経学的な悪化に関連する。さらに、ある研究は、脳卒中患者がしばしば脳卒中後3〜6時間まで治療さえ受けないことを実証した（Evensonらの文献、2001 Neuroepidemiology, 20(2): 65-76)。通常、急性脳卒中治療は、有効であるために発作後はじめの数時間以内に施術されなければならず、該治療は、損傷したCNS組織において全く神経回復効果を提供しない。従って、効果的な脳卒中治療のための時間枠が、急性神経保護脳卒中治療のために現在利用可能であるものを超えて延長できる場合（すなわち、脳卒中後数分又は数時間というよりむしろ、おそらくは数日又は数週）、全てではないにしても、ほとんどの脳卒中患者を治療する機会があり得る。このような治療は、これらの患者における神経回復及び機能的な神経学的回復も強化し得る。これらの観察からみて、現在、超急性相の虚血を上回って有効であり得る新規な細胞的及び薬理学的な治療アプローチを探索する緊急の必要性が存在する。神経可塑性及び次の神経学的回復のために脳の固有な特性を増幅することは、損傷を受けた脳の構造的及び機能的な再組織化（すなわち、可塑性）を強化するように設計された脳卒中後回復治療においてきわめて重要になる。
【０００７】
胚組織からのドナー幹細胞の大脳内移植は、神経細胞に分化することが示されている（Snyderらの文献、1997 Adv Neurol. 72:121-32)。線条体内胎児移植片は、損傷を受けた基底神経節回路を再構築し、虚血の哺乳動物モデルにおける行動欠陥を改善するために使用された（Gotoらの文献、1997 Exp Neurol. 147:503-9)。成体組織に移植される胎児の造血幹細胞（HSC）又は胚に移植される成体HSCは、該細胞が播種された微小環境内で内在性細胞を反映したキメラを生じる（Geigerらの文献、1998, Immunol Today 19:236-41）。別のグループは、多能性幹細胞が成体CNSに含まれ、成体脳が新しいニューロンを形成できることを見出した（Gageの文献, 1998 Curr. Opin. Neurobiol. 8:671-6; Kempermann及びGageの文献, 1998 Nat Med. 4:555-7）。
【０００８】
神経幹細胞は、インビトロ及びインビボで、ニューロン、星状細胞及びオリゴデンドロサイトに分化するそれらの能力のために、脳卒中及び他のCNS疾患の治療の重要な細胞治療的候補である。幹細胞の強力な多能性能は、一般に、脳卒中などの神経回路が複雑に破壊された疾患又は損傷を効果的に治療することを可能にし、そこでは、複数の細胞集団に影響を与える。実際、近年、多くの注目が、虚血性脳卒中、脳外傷及び脊髄損傷を含む実験的な神経学的状態を改善する未分化多能性幹細胞の能力に集中している（Choppらの文献、2000; Liらの文献、2000；及びMahmoodらの文献、2003）。具体的には、ヒト胎生期神経幹細胞をICHのコラゲナーゼモデルに使用して神経機能を回復させ、出血の部位への細胞の遊走を実証した。しかしながら、現在利用可能な内科治療は、治療細胞の神経回復、機能的な神経学的回復及び移植を改善又は強化することに関して、一貫的又は一義的な利点を示さなかった。
【０００９】
細胞に基づく療法のための別の潜在的手段はヒト臍帯血細胞（HUCB）であり、これは造血幹細胞の比較的高いパーセンテージを有し、動物モデルにおける虚血性脳卒中を治療するために使用された。いくつかのグループは、HUCB細胞が生存し、正常及び罹患動物のCNSに移動したことを実証し、虚血性脳卒中、脊髄損傷及び脳内出血の動物モデルにおいて機能的な回復を促進することを示した（Chenらの文献、2001 Stroke, 32(11): 2682-8; Luらの文献、2002 Cell Transplant, 11(3): 275-81; Saportaらの文献、2003 J. Hematotherapy & Stem Cell Research, 12: 271-278)。HUCB細胞は、虚血性脳卒中、脊髄損傷及び脳内出血を治療するために使用されたが、HUCB治療の長期間有効性、及び中枢神経系に移植して神経回復を促進するするそれらの潜在性については、なお疑問が残る。
【００１０】
間充織幹細胞（MSC）としても公知である骨髄間質細胞（BMSC）は、細胞療法のために使用される可能性がある（Pereiraらの文献、1995; Pereiraらの文献、1998; Pittengerらの文献、1999;及び、Prockopらの文献、2003）。BMSCは、自己複製能、及び多種類の非血液学的組織の分化を有する。損傷した脳組織を修復及びリモデリングするためのBMSCの潜在的使用は、損傷の異なる動物モデルを使用して報告された（Choppらの文献、2000; Mahmoodらの文献、2003; Liらの文献、2001; Kopenらの文献、1999; Liらの文献、2002;及び、Liらの文献、2000）。BMSC療法は、脳における神経回復変化を誘発し、これはいくつかの作用機構を反映する。
【００１１】
神経学的な損傷の以前のモデルにおいて、BMSCは、脳病変の標的部位へと血液-脳関門を通過することが示された（Liらの文献、2001; Mahmoodらの文献、2003;及び、Zhangらの文献、2002）。新生児マウスにおいて、BMSCは、発育過程の脳の全体にわたって広く遊走し、ニューロン及び星状細胞に分化する能力を示した（Kopenらの文献、1999）。ラットに全身的に注入されたBMSCは、優先的に虚血皮質に遊走する（Eglitisらの文献、1999）。
【００１２】
最近の研究において、ヒトBMSCは、虚血性脳卒中及び閉頭部損傷の動物モデルにおいて顕著な利点を示した（Liらの文献、2002、及びMahmoodらの文献、2003）。神経損傷のこれらのモデルにおいて、BMSCは、脳室下領域から神経幹細胞などの内在性の脳由来細胞を誘導し、回復過程に参加する能力を有するようである。しかしながら、脳損傷の領域に局在し、神経成長因子、神経膠由来神経成長因子、脳由来神経成長因子及び血管内皮成長因子などの成長因子の局所濃度を上昇させるBMSCの能力は、最も重要であり得る（Villarsらの文献、2000; Liらの文献、2002;及び、 Luらの文献、2004）。これらの成長因子は、血管新生、神経新生、ニューロン遊走及びシナプスの可塑性を支持し、増幅する（Carmelietらの文献、2002、及びJinらの文献、2002）。従って、BMSCは、小さな生化学及び分子工場及び触媒としてふるまうようであり、虚血境界線において血管新生及び脈管安定化を強化する多くのサイトカイン及び栄養要因を実質細胞内で産生し、誘導する（Chenらの文献、2003）。しかしながら、当該技術は、BMSC治療様式の効力を高めるための方法を提供できていない。
【００１３】
いくつかのグループは、様々なBMSC濃度及び投与経路を調査し、神経損傷のBMSC治療の治療有効性を実証した。ラットMCA閉塞モデルを使用した調査は、静脈内投与された1,000,000のhBMSCが、動物の回復において顕著な利点を示すことができないことを実証したが、動脈内に注入された2,000,000のhBMSCは、神経機能を向上させた（Chenらの文献、2003、及びLiらの文献、2001）。動脈内細胞療法を使用する実験的外傷脳損傷モデル（TBI）における以前の仕事は、投与の直接経路を提供したが、治療細胞それ自身によって小血管脳血管血栓症により増加した脳虚血を生じた（Luらの文献、2001）。
【００１４】
実験的なICHを治療するMSCの適用は、虚血性脳卒中及びTBIの治療のためより広範囲には研究されなかった。コラゲナーゼにより誘発されたICHを治療するために頸動脈を介して送達される2,000,000の間充織幹細胞の4用量は、ラットにおいて運動機能を改善した（Uedaらの文献、1998）。別のICH損傷モデルにおいて、あるグループは、BMSCがICH（例えば、損傷の部位）周辺に局在し、活発な神経回復及び神経再生の特徴が3,000,000〜8,000,000のBMSCの静脈(IV)投与後に存在することを実証した（Seyfriedらの文献、2006）。この研究は、損傷した部位に動員されたhBMSCの数が3,000,000〜8,000,000のBMSCの静脈内点滴後にプラトーに達したことを示した（Seyfriedらの文献、2006）。従って、複数回投与及び／又は多数のBMSCを送達することは既に損傷した脳の毛細血管系における付加的な脳血管閉塞を引き起こす重大なリスクをもたらすので、より少ないBMSCで有効であり得る単回治療が従来技術に要求される。
【００１５】
BMSCの投与が、損傷を受けたCNSの機能的な神経学的改善を生じるにもかかわらず、これらの改善は部分的でしかなく、ICH及び哺乳動物のCNSの損傷の治療のためにBMSCを使用することの有効性における増加に大きな余地を残す。従って、治療細胞の神経回復、機能的な神経学的回復及び移植を強化する目的で、CNS損傷を治療するために使用される細胞に基づく療法を改善する方法及び組成物について緊急の必要が従来技術において存在する。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、中枢神経系損傷を有する哺乳動物に対し、細胞に基づく治療薬及び血液-脳関門透過薬を含む治療組成物を投与することを提供する。
【００１７】
一実施態様において、本発明は中枢神経系（CNS）損傷を有する哺乳動物の損傷中枢神経系組織における神経回復を強化する方法であって、該哺乳動物に有効量の間質細胞及び血液-脳関門（BBB）透過薬を、該哺乳動物に非経口投与することを含む、前記方法を提供する。関連する実施態様において、間質細胞は、以下からなる群から選択される：骨髄間質細胞、脂肪組織由来間質細胞、肝臓間質細胞及びウォートンジェリー間質細胞。ある種の実施態様において、間質細胞は、骨髄間質細胞である。
【００１８】
関連する実施態様において、BBB透過薬は、以下からなる群から選択される：アルキルグリセロール、RMP-7及びマンニトール。特定の態様において、BBB透過薬は、マンニトールである。
【００１９】
さらに関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、血管内に投与される。他の関連する実施態様において、間質細胞は動脈内投与され、BBB透過薬は静脈内投与される。特定の関連する実施態様において、BBB透過薬は、間質細胞の投与前に又はほぼ同時に投与される。
【００２０】
他の関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後に投与される。特定の態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後1、2、4、8、又は12時間を越えて投与される。さらに関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約1ヵ月投与される。ある種の実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約1週間投与される。関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約48時間投与される。
【００２１】
特定の関連する実施態様において、哺乳動物は、ヒトである。
【００２２】
他の関連する実施態様において、中枢神経系損傷は、以下からなる群から選択される：脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、低酸素-虚血、発作、感染及び中毒。他の関連する実施態様において、中枢神経系損傷は、虚血性又は出血性脳卒中である。さらに関連する実施態様において、中枢神経系損傷は、以下からなる群から選択される中枢神経系の疾患、障害又は状態から生じる：テイ-サックス病、サンドホフ病、ハーラー症候群、クラッベ病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（amyotropic lateral sclerosis）（ALS）、ハンチントン病、癲癇、多発性硬化症、棘筋萎縮症（SMA）、フリードライヒ運動失調症、ダウン症候群、ウエルニッケ-コルサコフ（Wemicke-Korsakoff）症候群及びクロイツフェルト-ヤコブ病。
【００２３】
ある種の実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬の投与の後、損傷中枢神経系組織は、間質細胞及びBBB透過薬を投与されていない哺乳動物の同じ損傷中枢神経系組織と比較して、シナプトフィジン、ニューロンクラスIIIβ-チューブリン（TUJ1）及びダブルコルチン（DCX1）の発現増加を有する。
【００２４】
別の実施態様において、本発明の方法は、中枢神経系損傷を有する哺乳動物の認識及び／又は運動機能の神経学的回復を強化することを提供し、該方法は、間質細胞及び該哺乳動物に対する血液-脳関門（BBB）透過薬を非経口投与することを含む。関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬の投与の後、哺乳動物の認識及び／又は運動機能の神経学的回復は、間質細胞及びBBB透過薬を投与されなかった同じ損傷した哺乳動物の認識及び／又は運動機能の神経学的回復と比較して、より大きい。
【００２５】
さらに関連する実施態様において、間質細胞は、以下からなる群から選択される：骨髄間質細胞、脂肪組織由来間質細胞、肝臓間質細胞及びウォートンジェリー間質細胞。
【００２６】
他の関連する実施態様において、BBB透過薬は、以下からなる群から選択される：アルキルグリセロール、RMP-7及びマンニトール。
【００２７】
特定の関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、血管内に投与される。関連する実施態様において、間質細胞は動脈内投与され、BBB透過薬は静脈内投与される。
【００２８】
さらに関連する実施態様において、BBB透過薬は、間質細胞の投与前に又はほぼ同時に投与される。他の関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後12時間を越えて投与される。ある種の実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約1ヵ月投与される。特定の態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約1週間投与される。より特定の実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約48時間投与される。
【００２９】
関連する実施態様において、中枢神経系損傷は、以下からなる群から選択される：脳卒中、外傷性脳損傷及び脊髄損傷。さらに関連する実施態様において、中枢神経系損傷は、虚血性又は出血性脳卒中である。
【００３０】
別の実施態様において、本発明の方法は、中枢神経系損傷を有する哺乳動物の損傷中枢神経系組織における間質細胞の移植を強化することであって、該哺乳動物に有効量の間質細胞及びBBB透過薬を非経口投与することを含む、前記方法を提供する。関連する実施態様において、損傷中枢神経系組織に移植される間質細胞の数は、該間質細胞及びBBB透過薬の投与後、間質細胞及びBBB透過薬を投与されなかった哺乳動物の同じ損傷中枢神経系組織に移植される間質細胞の数と比較して、より多い。
【００３１】
特定の関連する実施態様において、間質細胞は、以下からなる群から選択される：骨髄間質細胞、脂肪組織由来間質細胞、肝臓間質細胞及びウォートンジェリー間質細胞。
【００３２】
さらに関連する実施態様において、BBB透過薬は、以下からなる群から選択される：アルキルグリセロール、RMP-7及びマンニトール。
【００３３】
他の関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、血管内に投与される。関連する実施態様において、間質細胞は動脈内投与され、BBB透過薬は静脈内投与される。
【００３４】
さらに関連する実施態様において、BBB透過薬は、間質細胞の投与前に又はほぼ同時に投与される。特定の態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後12時間を越えて投与される。関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約1ヵ月投与される。さらに関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約1週間投与される。さらに他の関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約48時間投与される。
【００３５】
関連する実施態様において、中枢神経系損傷は、以下からなる群から選択される：脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、低酸素-虚血、発作、感染及び中毒。特定の関連する実施態様において、中枢神経系損傷は、虚血性又は出血性脳卒中である。
【００３６】
別の実施態様において、本発明の方法は、中枢神経系損傷を有する哺乳動物の損傷中枢神経系組織を治療することであって、有効量の間質細胞及び血液-脳関門透過薬を非経口投与することを含む、前記方法を提供する。
【００３７】
ある種の実施態様において、間質細胞は、遺伝子改変されている。関連する実施態様において、間質細胞は、以下からなる群から選択される成長因子の発現を増加させるために遺伝子改変されている：神経成長因子、神経膠由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子及び血管内皮成長因子。特定の態様において、間質細胞は、以下からなる群から選択される：骨髄間質細胞、脂肪組織由来間質細胞、肝臓間質細胞及びウォートンジェリー間質細胞。
【００３８】
さらに関連する実施態様において、BBB透過薬は、以下からなる群から選択される：アルキルグリセロール、RMP-7及びマンニトール。
【００３９】
他の関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、血管内に投与される。
【００４０】
特定の関連する実施態様において、血液-脳関門透過薬は、間質細胞の投与前に又はほぼ同時に投与される。関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後12時間を越えて投与される。さらに関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約1ヵ月投与される。他の関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約1週間投与される。さらに他の関連する実施態様において、間質細胞及びBBB透過薬は、中枢神経系損傷後、約12時間〜約48時間投与される。
【００４１】
特定の関連する実施態様において、中枢神経系損傷は、以下からなる群から選択される：脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、低酸素-虚血、発作、感染及び中毒。特定の態様において、中枢神経系損傷は、虚血性又は出血性脳卒中である。他の関連する実施態様において、中枢神経系損傷は、以下からなる群から選択される中枢神経系の疾患、障害又は状態から生じる：テイ-サックス病、サンドホフ病、ハーラー症候群、クラッベ病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ハンチントン病、癲癇、多発性硬化症、棘筋萎縮症（SMA）、フリードライヒ運動失調症、ダウン症候群、ウエルニッケ-コルサコフ症候群及びクロイツフェルト-ヤコブ病。
【００４２】
別の実施態様において、本発明の方法は、有効量の間質細胞及びBBB透過薬を含む組成物を提供する。関連する実施態様において、間質細胞は、遺伝子改変されている。さらに関連する実施態様において、間質細胞は、以下から選択される群から選択される成長因子の発現を増加させるために遺伝子改変されている：神経成長因子、神経膠由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子及び血管内皮成長因子。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】機能的な神経学的試験の結果を提供する。4つの群（対照、ヒト初代線維芽細胞（FB）；マンニトール（MT）；ヒト骨髄間質細胞（hBMSC）；併用療法、hBMSC+MT）の神経学的重篤度スコア（NSS）（右パネル）及びコーナーターン試験（CTT）（左パネル）の定量的棒グラフの結果を提示する。
【図２】4つの群（対照、ヒト初代線維芽細胞（FB）；マンニトール（MT）；ヒト骨髄間質細胞（hBMSC）；併用療法、hBMSC+MT）の対側正常領域に比較したICH領域の定量的線条体組織損失割合の棒グラフの提示を提供する。統計的有意性レベルは、*P＜0.05である。
【図３】対照及び併用療法ラット線条体の切片のmAb 1281、BrdU、シナプトフィジン、TUJ1及びDCXの代表的な免疫染色及び定量的免疫反応性を提供する。全ての治療群の定量的免疫反応性を各パネルの右面上に棒グラフとして示す。組合せ群の損傷領域の近くの細胞の亜集団におけるBrdU及びTUJ1の共局在を下のパネルに示す。矢印は、BrdU及びTUJ1両方に陽染した細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
(発明の詳細な説明)
A．神経学的な損傷を治療及び予防する方法
本発明は、部分的には、損傷した哺乳動物の中枢神経系（CNS）に治療組成物を投与することに基づく。本明細書で使用する用語「中枢神経系」又は「CNS」は、哺乳動物の脳及び脊髄を含むと解釈されるべきである。該用語は、嗅覚及び視覚脳神経も含む。CNSの組織には、脳の組織、脊髄、視神経、上述した組織の個々の領域、及び前記組織及び領域を含むニューロン及び非神経細胞を含むが、これに限定されるものではない。
【００４５】
本発明の方法及び組成物は、損傷後、拡張された時間枠の間に損傷CNSを有する患者に効果的に投与されるものを含む、細胞に基づく治療組成物を許容する。従って、本発明の方法は、これまで可能であると考えられたよりも多数の患者を効果的に治療する機会を提供する。さらに、本発明は、細胞に基づく治療薬との併用で血液-脳関門を透過させる薬剤を投与することによる、細胞に基づく治療薬の動脈内送達と関連する脳血管閉塞のリスクを低下させる方法及び組成物を提供する。
【００４６】
本発明によれば、損傷した中枢神経系の細胞に基づく療法の安全性及び有効性を強化することは、主に、血液-脳関門を透過し、損傷したCNS組織に入る細胞治療薬の能力により決定される。以前の研究は、3,000,000〜8,000,000のhBMSCの静脈内点滴の後に損傷した中枢神経系部位に動員されるhBMSCの数がプラトーに達することを示し、これは血液-脳関門が損傷部位に到達しているhBMSCの律速段階の1つであり得ることを示唆する（Seyfriedらの文献、2006）。血液-脳関門は、それ自身の間にタイトジャンクションを維持する血管内皮細胞の連続層から成る複雑な脈管構造である。血液-脳関門の特性は、非常に選択的な交換系が、脳にとっての恒常的環境を正常な生理的状態で提供するために、血液と脳の間に進化してきたことを示唆する。この制御環境は、高血圧症のような生理学的条件下における透過性の増大によって、又は外傷、虚血、腫瘍及びアレルギー性若しくは炎症性疾患などの病的状態によって発生している内皮膜の物理的損傷によって、変化し得る。加えて、血液-脳関門の透過性の増大は、ケミカルメディエータ、例えばブラジキニン、セロトニン、ヒスタミン、アラキドン酸、ロイコトリエン及びフリーラジカルの放出によって引き起こされ得る。
【００４７】
BBBの透過率を上昇させるケミカルメディエータの使用は、脳実質にドラッグデリバリーを増加させるために使用する場合、有利であり得る。実験的及び臨床的用途において、合成ノナペプチド及びブラジキニン類似体であるセレポート（Cereport）（以前にはRMP-7と呼ばれた）が、脳腫瘍への選択的ドラッグデリバリーを増加させ、モルモットにおいてガンシクロビルに対する血液眼バリアの透過性を増加させることが発見された。静脈又は頚動脈内経路により投与される場合、セレポートは、脳内皮上の受容体のβ2サブクラスの刺激を介して選択的に血液-脳関門を開く。この刺激は遊離細胞内Ca2+の急速な一過的増加をもたらし、これは次々に内皮細孔径の増加を引き起こす。この影響は、β2受容体刺激のタキフィラキシー又は除感作のために一過的である（〜20分）。
【００４８】
血液-脳関門の透過性を改善でき、神経学的損傷の細胞に基づく療法における改善の潜在的手段を提供できる別の化合物は、マンニトールである。例えば、マンニトールは、体液/水の増加によって引き起こされる医学的状態を予防又は治療するために使用される糖アルコール及び浸透圧調節物質である（Winkler及びMunoz-Ruizの文献, 1995）。補助的治療として、マンニトールは、広範囲の脳病変を有する水腫又は頭蓋内圧を減少させるために多用された（Schwarzらの文献、1998並びにMcGraw及びHowardの文献, 1983）。また、マンニトールはバリアを構成する緊密に結合した内皮細胞を一時的に収縮させることによって血液-脳関門を開くために使用され、このようにして薬剤が脳に直接送達されるのを可能にする（Kroll及びNeuweltの文献, 1998）。
【００４９】
脳脈管系におけるマンニトールの影響の別の示唆された機構は、増加した内皮透過性及び小血管拡張である（Machiらの文献、1996）。粘性を低下させ、より良好な毛細血管流が可能になるので、脳血流量のレオロジはマンニトールにより改善できる（Burkeらの文献、1981）。マンニトールは、細胞の腫脹を予防し、損傷部位の近傍で次なる細胞損傷を軽減できる（Tranum-Jensenらの文献、1981）。まだいくらか議論の余地があるにもかかわらず、高用量のマンニトールは急性外傷性脳損傷を治療し、高い頭蓋内圧を低下させることが報告された（Cruzらの文献、2001、及びTranum-Jensenらの文献、1981）。
【００５０】
従って、マンニトールが損傷後の急性ストレスに対する組織耐性を強化し得ること、及びマンニトールが損傷部位の近傍でより多くの生細胞をサルベージできることが、可能性としてある（Lizasoainらの文献、2006）。このようにして、マンニトールは、脳卒中ショックを減弱でき、したがって損傷した組織の生存時間枠を延長できる（Chenらの文献2008）。しかしながら、マンニトールなどの薬剤の使用は、ICHのための治療として、又は、損傷CNS組織のための細胞に基づく治療薬に対する補助様式として、十分に研究されてこなかった。
【００５１】
従って、各種実施態様において、本発明は、神経回復及び機能的な神経学的回復を強化するために、損傷CNSにおけるBMSCの移植を強化するために、CNS損傷に関連する組織損失を減少させるために、並びに損傷CNSにおいてより多くの内在性細胞を活性化するために、損傷CNSを有する哺乳動物に間質細胞及び血液-脳関門透過薬を非経口的に投与し、シナプス新生、未成熟ニューロン形成及びニューロン遊走を増加させることを提供する。
【００５２】
特定の実施態様において、間質細胞は、BMSC、脂肪組織由来間質細胞（ADSC）；肝臓間質細胞（LSC）；及び、ウォートンジェリー間質細胞；からなる群から選択される。
【００５３】
各種実施態様において、血液-脳関門透過薬は、マンニトール、RMP-7及び他の適切なアルキルグリセロールからなる群から選択される。
【００５４】
特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬は、間質細胞とほぼ同時又はその前に、別々に又は同じ組成物で投与できる。特定の実施態様において、本発明の組成物は、CNSに対する損傷後に、個人に投与される。特定の実施態様において、本発明の組成物は、損傷したCNSを有する個人にCNS損傷の発生後、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも1週、少なくとも2週、少なくとも3週、及び少なくとも1月に投与される。ある種の実施態様において、間質細胞及び血液-脳関門透過薬の両方は、CNS損傷の発生後、約1週〜1月、約12時間〜1月、約12時間〜2週、約12時間〜1週、約12時間〜72時間、約12時間〜48時間、又は約12時間〜24時間に投与される。
【００５５】
本発明の方法は、血液-脳関門透過薬との併用で、間質細胞の非経口投与（すなわち、静脈内及び動脈内並びに他の適切な非経口経路）、髄腔内投与、脳室内投与、実質内投与（脊髄、脳幹又は運動皮質を含む）、大槽内投与、頭蓋内投与、線条体内投与又は黒質内投与を意図する。
【００５６】
特定の実施態様において、間質細胞及び血液-脳関門透過薬の両方の投与は、静脈又は動脈経路によってなし得る。特定の実施態様において、間質細胞は、血液-脳関門透過薬とは異なる経路を介して投与される。ある種の実施態様において、損傷したCNSを有する個人に対する有効量の間質細胞の動脈内投与前に、同時に、又は後に、血液-脳関門透過薬が静脈内投与される。他の実施態様において、損傷したCNSを有する個人に対する間質細胞の動脈内投与前に、同時に、又は後に、血液-脳関門透過薬が動脈内投与される。他の関連する実施態様において、損傷したCNSを有する個人に対する間質細胞の静脈内投与前に、同時に、又は後に、血液-脳関門透過薬が静脈内投与される。さらに他の実施態様において、損傷したCNSを有する個人に対する間質細胞の静脈内投与前に、同時に、又は後に、血液-脳関門透過薬が動脈内投与される。
【００５７】
各種実施態様において、血液-脳関門透過薬の投与を含む方法で投与される間質細胞は、同じ治療利益を達成するために、血液-脳関門透過薬なしに同じ損傷CNSに投与される間質細胞の量と同じ又はそれよりも少ない。特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬との併用で投与される間質細胞の有効量の数は、100kgあたり1×1012細胞未満、100kgあたり1×1011細胞未満、100kgあたり1×1010細胞未満、100kgあたり1×109細胞未満、100kgあたり1×108細胞未満、100kgあたり1×107細胞未満、100kgあたり5×106細胞未満、100kgあたり4×106細胞未満、100kgあたり3×106細胞未満、100kgあたり2×106細胞未満、100kgあたり1×106細胞未満、100kgあたり5×105細胞未満、100kgあたり4×105細胞未満、100kgあたり3×105細胞未満、100kgあたり2×105細胞未満、100kgあたり1×105細胞未満、100kgあたり5×104細胞未満、又は100kgあたり1×104細胞未満である。
【００５８】
各種実施態様において、本発明の方法及び組成物は、損傷した哺乳動物のCNS又はCNS組織において神経回復を強化する。本明細書で使用する用語「神経回復」又は「神経回復的」は、シナプスの可塑性（例えば、シナプス新生）、未成熟な神経細胞の形成（例えば、神経新生）、血管新生、ニューロン遊走、並びに白質及び軸索リモデリングを含む事象を記載し、これらの全ては損傷したCNSにおける機能的な神経学的改善に寄与し得る。ある特定の理論に拘束されることを望むものではないが、損傷中枢神経系組織が、様々な方法で、個体発生を再現することが理解される（Cramerらの文献、2000及びGoldmanらの文献、1996）。例えば、脳卒中及び他の中枢神経系損傷後、脳組織は発生の初期段階に復帰し、それゆえ、サイトカイン、栄養因子及び成長因子による刺激に高度に応答性となる。
【００５９】
ある種の実施態様において、強化された神経回復は、本発明の方法により、部分的には、本発明の治療細胞に基づく組成物を投与することにより損傷CNSの内在性細胞において、成長因子、例えば脳由来神経成長因子（NGF）、神経膠由来神経栄養因子（GDNF）、毛様体神経栄養因子（CTNF）、脳由来成長因子（BDNF）、血小板由来成長因子（PDGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）及び血管内皮成長因子（VEGF）及び他のサイトカインの発現を誘導することにより、達成される。従って、特定の実施態様において、「神経回復を強化する」ことは、細胞に基づく治療薬、例えば間質細胞及び血液-脳関門透過薬の投与により、損傷していないCNS又は損傷したCNSを治療していない対照又は治療した対照のいずれかに比較して、損傷したCNSにおけるシナプス新生、神経新生、血管新生及び／又はニューロンの遊走を起こす細胞の割合又は量を増加させることに関連する。
【００６０】
特定の実施態様において、哺乳動物の損傷中枢神経系組織における強化された神経回復は、間質細胞及び血液-脳関門透過薬を投与されなかった個人における同損傷中枢神経系組織と比較してのシナプトフィジン、ニューロンクラスIIIβ-チューブリン（TUJ1）及びダブルコルチン（DCX1）の発現増加により実証される。当業者は、神経回復の指標が、とりわけシナプトフィジン、ニューロンクラスIIIβ-チューブリン（TUJ1）及びダブルコルチン（DCX）などの遺伝子の発現増加を含むことが理解されるであろう。シナプトフィジン発現は、シナプス新生を示し；TUJ1は、未成熟なニューロン及び神経前駆細胞において発現され；及び、DCXは、遊走性ニューロンにおいて発現される。
【００６１】
用語「未成熟なニューロン」及び「神経前駆細胞」は、通常、本発明の多くの態様において互換的に使用される。未成熟なニューロンは、神経/ニューロン表現型マーカー、なかでも例えばムサシ-1、ネスチン、NeuN、クラスIIIβ-チューブリン、GFAP、NF-L、NF-M、微小管関連タンパク質（MAP2）、S100、CNPase、グリピカン（特にグリピカン4）、ニューロンペントラキシンII、ニューロンPAS 1、ニューロン成長関連タンパク質43、神経突起成長拡張タンパク質、ビメンチン、Hu、インターネキシン、O4、ミエリン塩基性タンパク及びプレイトロフィンの1以上の発現によってさらに検出し得る。もちろん、当業者は、シナプス形成、神経新生及びニューロン遊走を検出するために一般に使用される多くの他の「マーカー」があり、その各々が神経回復を決定付けることの使用に適していることを認識できる。
【００６２】
神経回復は、通常、損傷に応答してCNSにおいて起こる内在性の反応である。例えば、成体脳の脳卒中後のTUJ1発現増加によって特徴づけられる神経芽細胞集団は、脳室下帯（SVZ）において非常に増殖し、これらの細胞は梗塞に接している領域に動員され、そこで該細胞はニューロンに分化し、このことにより失われたニューロンを置き換えることができる（Parentらの文献、Ann Neurol 2002; 52:802-813；Arvidssonらの文献、Nature Medicine 2002; 8: 963-970)。ニューロン細胞遊走の増加は、DCX発現増加により実証される。加えて、神経芽細胞は、毛細血管系と相乗的に作用して、局所微小環境における血管新生（VEGF発現増加によって特徴づけられる）及びシナプス形成（増加したシナプトフィジン及び成長関連タンパク質43の発現によって特徴づけられる）を刺激し、それにより神経回復及び機能的な神経学的回復を強化できる。
【００６３】
他の各種実施態様において、本発明の方法は、損傷したCNSを有する哺乳動物の認識及び／又は運動機能の神経学的回復を強化することを提供する。中枢神経系に対する損傷は、損傷の性質に応じて自発運動量及び／又は認識能力の態様に負の影響を与えると考えられる。例えば、ラットの中大脳動脈閉塞モデルにおいて、自発運動量、神経機能及び認知パフォーマンスの欠損が実験群対対照群において観察された（Borlognanらの文献、1998; Roofらの文献、2001）。
【００６４】
認識及び運動機能の神経学的回復の両方は、認識及び運動機能の神経学的回復を決定するために、当業者に公知の様々な共通に実施されている方法を使用してアッセイできる。齧歯動物において、例えば、機能的な神経学的回復の一般的な認識試験には、モーリス水迷路（MWM）、受動的回避課題、Y-迷路/T-迷路、恐怖条件付け、及び対象認識課題を含む。運動技術の機能的な神経学的回復を測定するために使用される一般的試験には、コーナーターン試験（CTT）、神経学的重篤度スコア（NSS）、オープンフィールド自発運動量試験、ロータロッド試験、握力分析、狭路歩行分析、平均台試験及び傾斜スクリーン試験を含む。同様に、当業者は、ヒトで共通に実施される機能的な神経学的な分析を使用して、ヒトにおける認識及び運動機能の神経学的回復のレベルを決定する。
【００６５】
本発明の他の各種実施態様は、損傷した哺乳動物CNSにおける細胞に基づく治療薬、例えば間質細胞の移植を強化する方法を提供する。本明細書で使用する用語「移植する」又は「移植」は、損傷したCNS又はCNS組織における細胞に基づく治療薬の生着を意味し、該細胞に基づく治療薬は、該療法の投与後少なくとも2週間、少なくとも1月間又は少なくとも1年間、損傷したCNSに存在し続ける。
【００６６】
任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明は、部分的に、細胞に基づく治療薬の強化された移植が治療細胞と内在性細胞との間のコミュニケーションの効率増加をもたらすことを意図する。細胞コミュニケーションのレベルの増加は、CNSに対する損傷後の神経再生過程に参加する内在性の細胞の生来の能力を増強する。従って、移植された細胞が損傷したCNS細胞を分化させ、置き換えることを形式的には除外できないが、当業者は、内在性中枢神経系によって情報伝達された神経再生シグナルの増加が、本発明の細胞治療の移植増加並びに治療方法の重要な利益的結果及び組成物により媒介されることを認識する。
【００６７】
B．中枢神経系の疾患、障害及び状態
本発明の方法は、sic、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、低酸素-虚血、感染及び中毒を含む、CNSに対する1以上の多くの異なる型の損傷を有する哺乳動物における神経回復、機能的な神経学的回復及び細胞に基づく治療的移植を強化するために使用できる。当業者は、幼児及び成人発症の遺伝性及び／又は神経変性疾患もCNSへの損傷を含み、これが本発明の方法及び組成物によって効果的に治療できることを認識するであろう。
【００６８】
本発明の治療組成物は、例えば、テイ-サックス病及び関連するサンドホフ病、ハーラー症候群及び関連するムコ多糖症及びクラッベ病を含む、CNSの損傷を有する成人及び新生児及び子供に投与できる。CNSの成人病に関して、本発明の方法及び組成物は、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、癲癇などを含むがこれらに限定されない様々な神経疾患の神経回復、機能的な回復及び治療に有用である。多発性硬化症の治療も意図される。
【００６９】
本発明に従って治療できるCNSの他の神経変性疾患及び関連する損傷には、AIDS認知複合；多発性硬化症及び急性トランスフェラーゼ脊髄炎などの脱髄疾患；実験的な自己免疫脳脊髄炎（EAE）；皮質脊髄（ecorticospinal）系の病変などの錐体外路及び小脳障害；基底神経節又は小脳障害の障害；ハンチントン舞踏病及び老年性舞踏病などの多動性運動障害；CNSドーパミン受容体を遮断する薬剤により誘導されるものなどの薬物性運動障害；パーキンソン病などの運動低下運動障害；進行性核上性麻痺（progressive supra-nucleopalsy）；小脳の構造病変；脊髄小脳変性、例えば脊髄性運動失調、フリードライヒ運動失調症、小脳皮質変性、多系統変性（メンセル（Mencel）、デジェリーヌトーマス（Dejerine Thomas）、シ-ドラガー（Shi-Drager）及びマチャド-ジョセフ（Machado-Joseph））、システルミオ（systermioc）障害、例えばルフサム病（Rufsum's disease）、無βリポタンパク質血症（abetalipoprotemia）、運動失調症、毛細血管拡張症；及び、ミトコンドリア多系統障害；多発性硬化症、急性横断性脊髄炎などの脱髄性コア障害；及び、運動単位の障害、例えば神経原性筋萎縮症（前角細胞変性、例えば筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄筋萎縮及び若年性脊髄筋萎縮）；アルツハイマー病；中年のダウン症候群；びまん性レビー小体病；レビー小体型の老人性認知症（Demetia）；ウエルニッケ-コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト-ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎ヘレロルデン-スパッツ病（Subacute sclerosing panencephalitis hallerrorden-Spatz disease）；及び、ボクシング認知症（Dementia pugilistica）；を含むが、これに限定されるものではない。例えば、本明細書に引用され、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるBerkowら(編) (1987), メルクマニュアル（The Merck Manual）, (第15版), Merck and Co., Rahway, N.J.を参照されたい。
【００７０】
C．本発明の細胞
本発明の方法及び組成物は、損傷したCNS又はCNS組織を治療するために、有効量の細胞に基づく治療薬、例えば間質細胞の投与を提供する。本明細書で使用する用語「有効量」には、本明細書の他の部分で記載する意図される機能、例えば神経回復、機能的な神経学的回復又は移植を強化することを達成するのに必要な細胞に基づく治療薬の量を含む。有効量は、使用される細胞に基づく治療薬の型、年齢、体重、性別、一般健康、治療される状態の重篤性、並びに細胞に基づく治療薬、例えば間質細胞で投与される血液-脳関門透過薬の型及び量を含む、多くの因子により決まる。本発明は、本明細書に記載する血液-脳関門透過薬を含む治療における有効量の細胞に基づく治療薬が、血液-脳関門透過薬の不在下において同程度の治療を達成するのに必要とされる有効量の細胞に基づく治療薬よりも一般的には少ないことを意図する。
【００７１】
各種実施態様において、任意の型の細胞が本発明に従って使用できる。ある種の実施態様において、任意の中胚葉系列、内皮系列又は外胚葉系列の細胞は、血液-脳関門透過薬との併用で、損傷した中枢神経系を有する患者に投与できる。
【００７２】
本発明の特定の実施態様において、好ましい細胞に基づく治療薬は間質細胞である。本発明の特定の実施態様において、間質細胞は、骨髄間質細胞、脂肪組織由来間質細胞（ADSC）；肝臓間質細胞（LSC）；又はウォートンジェリー間質細胞；である。間質細胞は、間充織幹細胞ともいい、幹細胞及び前駆細胞を含む混合細胞集団である。しかしながら、用語「間質細胞」は、明確に確立された基準によって、幹細胞活性を示すこれらの細胞のサブセットのために留保されるべきである（Horwitzらの文献、2005. 「MSCの命名の説明：細胞療法の地位確立のための国際社会（Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy Position Statement）」, Cytotherapy, 7, 393-395頁）。
【００７３】
一実施態様において、骨髄間質細胞（BMSC）は、細胞に基づく治療薬として使用される。本明細書で使用する用語「骨髄間質細胞」、「BMSC」、「髄間質細胞」、「間充織幹細胞」又は「MSC」は互換的に使用され、骨細胞、軟骨細胞、ミオサイト、脂肪細胞及び中枢神経系の神経細胞及び非神経性細胞の幹細胞様前駆体として扱うことができる、骨髄中の細胞の少画分をいう。BMSCは、広範に研究されてきた（Castro-Malaspinaらの文献、1980, Blood 56:289-30125; Piersmaらの文献、1985, Exp. Hematol 13:237-243; Simmonsらの文献、1991, Blood 78:55-62; Beresfordらの文献、1992, J. Cell. Sci. 102:341-351; Liesveldらの文献、1989, Blood 73:1794-1800; Liesveldらの文献、Exp. Hematol 19:63-70; Bennettらの文献、1991, J. Cell. Sci. 99:131-139）。BMSCは、様々な供給源から商業的に得ることができる。例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ及びウマから単離されたBMSCは、Cognate Bioservices社（Baltimore, MD）から入手可能である。あるいは、BMSCは、当業者に周知の方法によって、任意の動物から新たに単離できる。いくつかの実施態様において、間質細胞は哺乳動物由来であり、特定の態様において、間質細胞はヒト由来である。
【００７４】
BMSCの供給源並びにそれらの供給源からBMSCを得る方法及び培養方法は、従来技術に記載されている（例えば、Friedensteinらの文献、1976 Exp. Hematol. 4 : 267-274 ; Friedensteinらの文献、1987, Cell Tissue Kinetics 20 : 263-272 ; Castro-Malaspinaらの文献、1980, Blood 56 : 289-301 ; Metsらの文献、1981, Mech. Aging Develop. 16 : 81-89 ; Piersmaらの文献、1985, Exp. Hematol. 13 : 237-243 ;Owenらの文献、1988, 「脊椎動物硬組織の細胞及び分子生物学（Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues）」, Ciba Foundation Symposium, Chichester, U.K., 42-60; Caplan, 1991, J.Orthoped.Res. 9:641-650;Prockop,1997,Science 276:71-74 ;Beresfordらの文献、1992, J.Cell Sci. 102:341-351;Chengらの文献、1994,Endocrinology 134:277-286 ; Rickardらの文献、1994, Develop. Biol. 161: 218-228 ; Clarkらの文献、1995, Ann. N. Y. Acad. Sci. 770 : 70-78)。BMSCは、実質的に任意の骨髄から得ることができ、例えば、ヒトのドナーの腸骨稜の吸引によって得られる骨髄を含む。ドナーから骨髄を得る方法は周知技術である。
【００７５】
間質細胞は、間質細胞が正常に増殖する生育促進条件において培養でき、該条件には任意のセットの条件（温度、雰囲気、増殖培地組成物、湿度、攪拌度、その他）を含むことができる。これらの条件はいずれも決定的ではない。温度は、正常なヒト体温（すなわち、約37℃）に近くあるべきであるが、間質細胞が増殖できる任意の温度であり得る（例えば、30〜43 ℃）。間質細胞は、空気雰囲気、又は例えば5% CO2を補充された空気雰囲気において、増殖し得る。増殖培地は、間質細胞の増殖を支持するのに十分な栄養及び因子を含む、任意の液体培地であり得る。このような培地は、例えば、炭素源（例えば、グルコース）及び最小の必須栄養素を含み、好ましくは、哺乳動物血清（例えば、ウシ胎仔血清）、抗生物質（例えば、ペニシリン又はストレプトマイシン）及びL-グルタミン（すなわち、タンパク質生合成のためのアミノ酸供給を改善する）の1以上を含む。
【００７６】
哺乳動物血清は、総増殖培地の体積に対し1%〜20%の濃度で使用できる。血清は、それが間質細胞の活発な成長を支持することを保証するために好ましく事前選別し；いくつかのロットは、同じ供給元から提供されたロットでさえも、間質細胞の活発な成長を支持しない。あるいは、哺乳動物血清は、1以上の成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インシュリン成長因子、又は内皮成長因子）で置換できる。増殖培地は、例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含まず、ウシ胎仔血清、抗生物質及びL-グルタミンを補充した最小必須培地-α；ダルベッコ最小必須培地；及び、当業者に周知の他のもの；であり得る。増殖培地は、間質細胞の培養の間、1回以上（例えば、3又は4日ごと）好ましく置換される。
【００７７】
当業者は、例えば、BMSCが増殖できると同時に多能性状態（すなわち、例えば骨芽細胞、脂肪細胞及びCNSの細胞などの多数の細胞型うちの1つに分化する能力）を保持することを認識するであろう。さらに、インビトロでBMSCを様々な細胞型に分化させる方法は、従来技術において記載されている（例えば、WO 96/30031、WO 99/43286及び米国特許第7,279,331号）。
【００７８】
本発明の方法で投与される間質細胞（例えば、BMSC）は、約1時間〜1年間、当該技術分野において公知の方法を使用して培養できる。いくつかの実施態様において、本発明の間質細胞は、約1〜30日、約5〜20日又は約3〜14日間の培養で維持でき、好ましくは約14日、10日又は7日以内に回収される。
【００７９】
間質細胞は、該細胞を増殖培地の存在下で増殖表面上に播種することにより増殖でき、その後（例えば、10日後）に細胞を回収する。あるいは、間質細胞増殖は段階的に実施でき、これは該細胞が2回以上増殖することを意味する。例えば、第1の増殖表面上での第1の増殖の後、間質細胞を回収し、それから第2の増殖表面上の増殖培地において増殖する。もちろん、2回増殖させた間質細胞を回収し、同法を使用する増殖の1以上の更なるラウンドに供することができる。実施できる増殖及び回収のラウンド数に対する理論的制限はない。
【００８０】
しかしながら、大半の用途について、通常、約10サイクル以下の間質細胞の増殖及び回収が必要であり、わずか1、2、3、4又は5サイクルが、本明細書に記載されている多くのものを含む多くの用途（例えば、損傷したCNSの治療又はCNS組織の治療のための細胞に基づく治療薬としての使用）に十分であることが認識される。
【００８１】
加えて、当業者は、本明細書に記載されている間質細胞の異なる型を単離する方法が当該技術分野において公知であると認識するであろう（例えば、ADSC, Rodbell (1964) J Biol Chem 239:375、及びHanuerらの文献、(1989) J Clin Invest 84:1663-1670; LSC, 米国特許出願公開公報第2006/0057125号;及びウォートンジェリー間質細胞, McElreaveyらの文献、1991, Biochem. Soc. Trans. 第636回会合 Dublin 19:29S、及び米国特許出願公開公報第2004/0136967号）。
【００８２】
いくつかの実施態様において、哺乳動物に導入される間質細胞は異なるドナー由来であり（同種異系）、又は治療される個人から得られた間質細胞でもよい（自家性）。さらに、個人に導入される間質細胞は、完全に異なる種から得ることができる（異種性）。
【００８３】
D．血液-脳関門透過薬
当業者は、当該技術分野において公知であり、かつ商業的に利用可能な様々な血液-脳関門透過薬があり、それら全てが本発明の方法に従った使用に適することを認識するであろう。例えば、セレポート（例えば、RMP-7）は、Alkermes社（Cambridge, MA）から入手可能な市販の血液-脳関門透過薬である。他の特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬は、なかでもRMP-7、マンニトール、他の適切なアルキルグリセロール、及び分枝鎖親油性分枝のホスホ-誘導体（例えば、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる米国特許番号7,186,703に記載されるものを含む）からなる群から選択される。特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬は、マンニトールである。
【００８４】
関連する実施態様において、血液-脳関門透過薬は、血液-脳関門の透過率を上昇させるのに十分な濃度で投与される。例えば、血液-脳関門透過薬がマンニトールである特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬は、約0.25g/kg〜3g/kg、約0.5g/kg〜2.5g/kg、約1g/kg〜2g/kg、約1.25g/kg〜1.75g/kg又は約1.5g/kgの濃度で投与される。特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬（例えば、マンニトール）は、0.10g/kg超、0.25g/kg超、0.50g/kg超、0.75g/kg超、1.0g/kg超、1.25g/kg超、1.50g/kg超、1.75g/kg超、若しくは2.00g/kg超、又はそれより大きな濃度で投与される。
【００８５】
例えば、血液-脳関門透過薬がセレポートである他の関連する実施態様において、血液-脳関門透過薬は、約0.01μg/kg〜1mg/kg、約0.1μg/kg〜100μg/kg、若しくは約1μg/kg 〜10μg/kgの濃度で、又はその間の任意の濃度増分で、投与される。例えば、特定の実施態様において、セレポートは、約1μg/kg、約2μg/kg、約3μg/kg、約4μg/kg、約5μg/kg、約6μg/kg、約7μg/kg、約8μg/kg、約9μg/kg、又は約10μg/kgで投与される。
【００８６】
特定の実施態様において、セレポートは、0.005μg/kg超、0.01μg/kg超、1.0μg/kg超、10μg/kg超、50μg/kg超、100μg/kg超、250μg/kg超、500μg/kg超、若しくは1000μg/kg超、又はそれより大きな濃度で投与される。当業者技術により理解されるように、任意の特定の血液-脳関門透過薬の投与量は、当該技術分野におけるルーチン方法を使用して決定できる。加えて、製造業者の推奨投与量は、血液-脳関門透過性の意図された持続時間を引き出すために使用できる。上記投与量は単に例示であり、これに関して制限されるものと解釈されるべきではない。
【００８７】
特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬は、血液-脳関門の一時的な透過性を誘導する。関連する実施態様において、透過の持続時間は、約1分〜約1時間、約2分〜45分、約5分〜30分、約10分〜30分、又は約15分〜25分である。
関連する実施態様において、血液-脳関門の一時的な透過性は、約1分、2分、5分、10分、15分、20分、25分、30分、35分、40分、45分、50分、55分若しくは60分間、又はその間にある任意の分の持続時間、維持される。
【００８８】
E．損傷したCNSの神経回復の強化
損傷したCNSの神経回復治療における最近の注意は、虚血性脳卒中、頭部外傷及び脊髄損傷を含む実験的な神経学的損傷後に神経学的転帰を改善する際の未分化多能性間質細胞（例えば、BMSC）の使用法に集中してきた（Choppらの文献、2000; Eglitisらの文献、1999;及びMahmoodらの文献、2003）。しかしながら、血液-脳関門は、脳への多くの血液由来物質の侵入を制御し、潜在的に治療薬剤が脳に入ることを排除し得る。重要なことに、BMSCは、実験条件下において、血液-脳関門を通り脳病変の標的部位に至ることが示された（Prockopらの文献、1997; Liらの文献、2001;及びZhangらの文献、2002）。BMSCは、ニューロン及び星状細胞に分化する能力が示され、及び損傷を受けた皮質に優先的に遊走する能力を有する（Kopenらの文献、1999）。特に重要性なのは、成長因子を分泌するか又はその分泌を刺激するBMSC能力であり、これは神経再生及び神経回復に貢献する局所環境を作る（Chopp及びLiの文献, 2002）。
【００８９】
多数の報告において、ヒトBMSCで治療された動物は、虚血性脳卒中及び外傷性脳損傷後に著しい改善を示した（Mahmoodらの文献、2003；Liらの文献、2001；Liらの文献、2002；Liらの文献、2000；及びLuらの文献、2004）。減少した組織損失、有糸分裂活性、未成熟なニューロン形成、シナプス新生及びニューロン遊走により証明されたように、Seyfried及び同僚は、出血性脳卒中又は脳内出血（ICH）を被ったラットにおいてhBMSC注入の有益な効果を実証した（Seyfriedらの文献2006）。しかしながら、最低注入濃度を使用してhBMSCの最大治療的送達を得ることは、臨床的に関連する懸念である。BMSCの最低限量の治療的可能性を最大化するため、本発明は、間質細胞との併用で血液-脳透過薬の投与を提供する。
【００９０】
本発明の各種実施態様は、中枢神経系損傷に対する内在性反応の増幅によって、損傷した哺乳動物のCNSの神経回復を強化することを目指す。特定の実施態様において、これは間質細胞及び血液-脳関門透過薬の有効量の組合せを投与することにより達成され、そのようにして、損傷したCNSのシナプス新生、神経新生及びニューロン遊走を強化する。従って、これらの神経回復事象の1以上を強化する細胞に基づく治療薬は、損傷したCNSにおける神経回復を強化でき、機能的な神経学的回復を改善できる。さらにまた、この神経回復反応は、間質細胞の投与を血液-脳関門透過薬と組み合わせることにより強化される。
【００９１】
一実施態様において、哺乳動物の損傷CNS組織において神経回復を強化する方法は、有効量の間質細胞及び血液-脳関門透過薬の投与により達成される。本明細書で使用する用語「血液-脳関門透過薬（blood-brain barrier permeabilizer）」及び「血液-脳関門透過薬（blood-brain barrier permeabilizing agent）」は、血液-脳関門の完全性を乱すことができる物質を意味する。本発明の方法は、部分的には、脳に入る間質細胞の数の増加及び神経栄養性成長因子のレベルの上昇を促進し、そのようにして哺乳動物の損傷CNSの神経回復を強化するための血液-脳関門の破壊を意図する。特定の実施態様において、哺乳動物は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ及びウマからなる群から選択される。他の実施態様において、哺乳動物は、ヒトである。
【００９２】
F．本発明の細胞の投与
本発明の各種実施態様において、哺乳動物の損傷CNSの神経回復を強化する方法は、有効量の間質細胞及び血液-脳関門透過薬の投与により達成される。特定の実施態様において、治療効果を達成するために損傷したCNSを有する哺乳動物に投与される間質細胞の量は、血液-脳関門透過薬を投与するステップを含まない方法で治療効果を達成するために同じ損傷CNSを有する哺乳動物に投与しなければならない間質細胞の量より少ないか、ほぼ同量であるか、又はそれよりも多い。例えば、血液-脳関門透過薬によって、より多くの細胞が損傷したCNSに達することができるので、より少数の細胞が投与され得る。ある種の実施態様において、より多数の細胞が、負の副作用（例えば、脳血管閉塞）なく血液-脳関門透過薬との併用で使用できる。
【００９３】
特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬との併用で投与される有効量の間質細胞の数は、同じ損傷CNSを有する哺乳動物への血液-脳関門透過薬の投与を欠如している方法で投与される間質細胞の数より、少なくとも若しくは約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍又は10倍少ない。他の実施態様において、血液-脳関門透過薬との併用で投与される有効量の間質細胞の数は、同じ損傷CNSを有する哺乳動物への血液-脳関門透過薬の投与を欠如している方法で投与される間質細胞の数より、約5倍、約2倍〜4倍又は約2.5倍〜3.5倍少ない数にほぼ等しい。特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬との併用で投与される有効量の間質細胞の数は、同じ損傷CNSを有する哺乳動物への血液-脳関門透過薬の投与を欠如している方法で投与される間質細胞の数の99%未満、95%未満、90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満又は10%未満である。
【００９４】
いくつかの実施態様において、損傷したCNSを有する哺乳動物に投与される有効量の間質細胞の数は、100kgの哺乳動物当たり約1×104〜約1×1013細胞である。いくつかの実施態様において、投与される有効量の間質細胞の数は、100kg当たり約1×106〜約1×109細胞、又は100kg当たり約1×108〜約1×1012細胞である。いくつかの実施態様において、投与される有効量の間質細胞の数は、100kg当たり約1×109〜約5×1011細胞である。いくつかの実施態様において、投与される有効量の間質細胞の数は、100kg当たり約5×1010細胞である。いくつかの実施態様において、投与される有効量の間質細胞の数は、100kg当たり1×1010細胞である。
【００９５】
特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬との併用で投与される有効量の間質細胞の数は、100kg当たり約1×1012細胞未満、100kg当たり約1×1011細胞未満、100kg当たり約1×1010細胞未満、100kg当たり約1×109細胞未満、100kg当たり約1×108細胞未満、100kg当たり約1×107細胞未満、100kg当たり約5×106細胞未満、100kg当たり約4×106細胞未満、100kg当たり約3×106細胞未満、100kg当たり約2×106細胞未満、100kg当たり約1×106細胞未満、100kg当たり約5×105細胞未満、100kg当たり約4×105細胞未満、100kg当たり約3×105細胞未満、100kg当たり約2×105細胞未満、100kg当たり約1×105細胞未満、100kg当たり約5×104細胞未満、100kg当たり約1×104細胞未満、又は100kg当たり約1×103細胞未満である。当業者は、本発明の方法にかかる有効量の間質細胞の正確な適用量を決定するために、ルーチン的方法を使用することができるであろう。
【００９６】
ある種の実施態様において、細胞に基づく療法の脳血管閉塞のリスクを低下させるために、血液-脳関門透過薬の同時投与を含まない方法と比較して、血液-脳関門透過薬との併用でより少ない間質細胞を含む有効量を投与することは有益である。当業者は、このような閉塞が、損傷したCNSにおける神経回復及び機能的な神経学的回復に有害であろうこと理解するであろう。
【００９７】
本発明の方法は、CNSに対する損傷の発生からある程度の時間が経った後に、良好に神経回復及び機能的な神経学的回復を強化することに有用である。典型的には、虚血性及び出血性脳卒中の急性管理は発作の数時間以内に起こり、主に神経保護効果をもたらす。さらに、神経学的損傷のいくつかの急性管理は特定の事例において必要であり得ると考えられる一方で、本発明の方法によって提供されるように、これらの治療は神経回復及び機能的な神経学的回復の原因となる損傷したCNSの長期持続的細胞変化を確立するのに必ずしも役立たない。
【００９８】
一実施態様において、損傷した哺乳動物のCNSにおける神経回復を強化する方法は、有効量の間質細胞及び血液-脳関門透過薬の投与により達成され、該方法において、間質細胞及び血液-脳関門透過薬の両方はCNS損傷の発生の後に投与される。他の関連する実施態様において、間質細胞及び血液-脳関門透過薬の両方は、CNS損傷後少なくとも12時間で、損傷したCNSを有する個人に投与される。他の関連する実施態様において、間質細胞及び血液-脳関門透過薬の両方は、CNS損傷の発生後、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約3時間、少なくとも約4時間、少なくとも約5時間、少なくとも約6時間、少なくとも約7時間、少なくとも約8時間、少なくとも約9時間、少なくとも約10時間、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間、少なくとも約48時間、少なくとも約72時間、少なくとも約1週、少なくとも約2週、少なくとも約3週、又は少なくとも約1月で、損傷したCNSを有する個人に投与される。さらに、他の関連する実施態様において、間質細胞及び血液-脳関門透過薬の両方は、CNS損傷の発生後、約1週〜1月、約12時間〜1月、約12時間〜2週、約12時間〜1週、約12時間〜72時間、約12時間〜48時間、又は約12時間〜24時間で投与される。当業者は、本発明の方法及び組成物が、CNS損傷後少なくとも12時間を含むCNS損傷後の任意の時間に実施でき、さらに所望の効果を引き出し得ることを認めるであろう。
【００９９】
有効量の間質細胞及び血液-脳関門透過薬の投与のタイミングは、特定の実施態様において、多くのCNS損傷の急性治療戦略のためのウインドウよりある程度の時間が経った後にあるので、より多くの患者が治療の候補であることが意図される。さらに、本発明の特定の方法により利用されるこのような後期段階での治療は、強化された神経回復及び機能的な神経学的回復を結果的にもたらし、これは従来技術において現在利用されている急性管理戦略又は他の後期段階療法において示されてはいない。
【０１００】
本発明の方法は、部分的に、有効量の間質細胞及び血液-脳関門透過薬の投与が正確に同時に起こる必要がないことを意図する。特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬は、損傷したCNSを有する個人への間質細胞の投与前、該投与と同時、又は該投与後に、投与される。特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬は、損傷したCNSへの間質細胞の投与の直前又は該投与の約30分、20分、10分、5分、2分、1分又は30秒前に、投与される。ある種の実施態様において、血液-脳関門透過薬は、損傷したCNSへの間質細胞の投与の直前若しくは該投与の約30分前、又は間質細胞投与前の約0〜30分の間の任意の時間間隔で、投与される。特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬は、損傷したCNSへの間質細胞の投与前約24時間、18時間、12時間、6時間、3時間、2時間又は1時間に加えられる。
【０１０１】
本発明の方法は、当業者に公知の様々な経路による有効量の間質細胞及び血液-脳関門透過薬の投与を意図する。本明細書で使用する用語「投与」又は「投与する」は、本発明の間質細胞及び血液-脳関門透過薬が治療目的で損傷CNSを有する個人に送達されるプロセスを記載するために、当該明細書の全体にわたり使用される。
【０１０２】
本発明の組成物の投与は、本発明の方法で使用する間質細胞を最終的に必要とされる標的部位に遊走させるもののなかでもとりわけ、非経口投与（静脈内及び動脈内並びに他の適切な非経口経路に言及するそのような用語）、髄腔内投与、脳室内投与、実質内投与（脊髄、脳幹又は運動皮質に含む）、大槽内投与、頭蓋内投与、線条体内投与及び黒質内投与を含むがこれらに限定されない多くの方法で達成できる。
【０１０３】
特定の実施態様において、投与は、治療される疾患又は状態によって変更でき、例えば静脈的若しくは動脈的に非経口経路を介して、又は脳の罹患組織への直接投与によって、好ましくなされ得る。脳血管損傷における例について、本発明の間質細胞の送達のための動脈内経路は、罹患組織の脈管領域に直接的に所与の細胞量の送達を最大化する理論的展望から魅力的である。臨床的観点から、動脈内経路は、化学療法、腫瘍及び動静脈奇形の塞栓、並びに頭蓋内動脈狭窄又は急性血栓性閉塞の脈管内治療を含む他の療法とともに広範に使用されるので魅力的である。
【０１０４】
特定の実施態様において、本発明の方法は、CNS損傷部位への間質細胞遊走に有益な影響を与えることができ、間質細胞の血管内投与に関連する複雑性を減らすことができ、それゆえ神経回復及び機能的な神経学的回復を強化することができる、本明細書に他に記載されている範囲で供給されるマンニトールなどの血液-脳関門透過薬の比較的高用量の投与を意図する。
【０１０５】
一実施態様において、哺乳動物の損傷CNS組織における神経回復を強化する方法は、有効量の間質細胞及び血液-脳関門透過薬の非経口投与により達成される。関連する実施態様において、間質細胞及び血液-脳関門透過薬の両方の投与は、静脈内又は動脈内経路によってなされ得る。特定の実施態様において、間質細胞は、血液-脳関門透過薬とは異なる経路を介して投与される。当業者は、間質細胞及び血液-脳関門透過薬について異なる投与経路を使用することが、間質細胞の投与時間に対する血液-脳関門透過薬の投与時間を変えないことを理解するであろう。
【０１０６】
例えば、本発明の特定の方法において、血液-脳関門透過薬は、損傷したCNSを有する個人に対する有効量の間質細胞の動脈内投与の前に、該投与と同時に、又は該投与後に、静脈内投与される。他の実施態様において、血液-脳関門透過薬は、損傷したCNSを有する個人に対する有効量の間質細胞の動脈内投与の前に、該投与と同時に、又は該投与後に、動脈内投与される。他の関連する実施態様において、血液-脳関門透過薬は、損傷したCNSを有する個人に対する間質細胞の静脈内投与の前に、該投与と同時に、又は該投与後に、静脈内投与される。さらに他の関連する実施態様において、血液-脳関門透過薬は、損傷したCNSを有する個人に対する間質細胞の静脈内投与の前に、該投与と同時に、又は該投与後に、動脈内投与される。当業者は、哺乳動物の損傷CNSの神経回復を強化することについて本明細書に記載されている間質細胞、血液-脳関門透過薬、有効量の間質細胞、間質細胞及び血液-脳関門透過薬投与のタイミング及び経路、並びに細胞及び薬剤の投与量が、全般的に、認識及び運動機能の神経学的回復を強化し、哺乳動物の損傷したCNSにおける間質細胞の移植を強化することを導く本発明の方法及び組成物を用いる使用に適していることを認めるであろう。
【０１０７】
G．損傷したCNSにおける機能的な神経学的回復の強化
本発明の他の各種実施態様は、間質細胞及び血液-脳関門透過薬（例えば、マンニトール）の有効量の非経口（parental）投与により、損傷したCNSを有する哺乳動物の認識及び運動機能の神経学的回復を強化する方法に関する。本明細書で使用する用語「機能的な神経学的回復」又は「認識及び運動機能の神経学的回復」は、本発明の方法又は組成物の利用の結果として、損傷したCNSを有する哺乳動物における認知スキル又は運動及び／若しくは自発運動活性の改善を意味する。改善は、治療の前及び後における任意の所与の機能的な神経学的作業における差異として測定できる。従って、損傷したCNSを有する哺乳動物の認識及び運動機能の神経学的回復を強化することは、有効量の間質細胞及び血液-脳関門透過薬を哺乳動物に投与した場合における所与の機能的な神経学的作業能力を、間質細胞及び血液-脳関門透過薬を投与していない（すなわち、間質細胞単独又は血液-脳関門透過薬単独）同じ損傷CNSを有する哺乳動物における作業能力と比較した場合における増加を意味する。
関連する実施態様において、認識及び運動機能の神経学的回復は、約1%〜100%、約5%〜75%、約10%〜60%、約25%〜50%又は約35%〜40%強化され、ここで100%とは哺乳動物の損傷していないCNSに存在する正常レベルの認識及び運動神経機能を表す。特定の実施態様において、認識及び運動機能の神経学的回復は、約1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%若しくは100%又はその間の任意のパーセンテージ回復で強化される。
【０１０８】
H．損傷したCNSにおける間質細胞移植の強化
本発明の他の各種実施態様は、間質細胞及びマンニトールなどの血液-脳関門透過薬の非経口（parental）投与により、哺乳動物の損傷したCNS組織における間質細胞の移植を強化する方法に関する。本明細書で使用する用語「移植」は、治療が施された約2週〜約1年後の損傷した哺乳動物CNSにおける投与された間質細胞の存在を意味する。従って、損傷した哺乳動物のCNSにおいて間質細胞の移植を強化することは、血液-脳関門透過薬の不在下で間質細胞を用いる治療後に損傷CNSに存在する投与された間質細胞の数に比較して、間質細胞及び血液-脳関門透過薬を含む治療後約2週〜約1年の時点での損傷CNSに存在する投与された間質細胞の数の増加を意味する。
【０１０９】
本発明は、部分的に、哺乳動物の損傷CNS組織に移植された間質細胞の数の増加が、損傷CNS組織の内在性の細胞によって多くの神経再生を促進し、それゆえ前記損傷CNSの神経回復、機能的な神経学的回復及び神経再生の速度及び／又は程度を強化することにより哺乳動物に利益を与えることを意図する。
【０１１０】
移植された間質細胞は、当業者に公知の多くの技術を使用して検出できる。哺乳動物の損傷中枢神経系組織における遺伝子改変間質細胞の組込み、分化及び遊走を追跡するためのタンパク質は、緑色蛍光タンパク質（GFP）、任意の他の蛍光タンパク質（例えば、強化型緑色、シアン色、黄色、青色及び赤色蛍光タンパク質; Clontech, Mountain View, Calif.）、又は他のタグタンパク質（例えば、LacZ、FLAG、Myc、His6、V5など）を含み得るがこれらに限定されない。
【０１１１】
哺乳動物の損傷中枢神経系組織における遺伝子改変間質細胞の組込み、分化及び遊走を追跡することは、ベクター又はウイルスから発現される検出可能な分子を使用することに限定されない。間質細胞の遊走、組込み及び分化は、移植された骨髄間質細胞の局在を許容する一連のプローブを使用して測定できる。そのようなプローブには、5000塩基対ごとに約1つ存在する豊富な転移因子であり、それゆえ当業者が移植された細胞の進展を追跡できる、ヒトに特有なAluについてのプローブを含む。移植された細胞の追跡は、限定ではないがNeuN、MAP2、神経線維タンパク質その他などの本明細書の他の部分で詳述される細胞特異的マーカーについての抗体又は核酸プローブを使用することによりさらに達成できる。
【０１１２】
また、間質細胞を投与された哺乳動物の損傷CNSの内在性の細胞から投与された間質細胞を識別できる任意の型のプローブ、抗体、マーカー、ラベル、タグ、核酸又はタンパク質等を使用して本発明の間質細胞の移植を定量化し得ることは、当業者に認められるであろう。
【０１１３】
特定の実施態様において、血液-脳関門透過薬との併用での有効量の間質細胞の投与は、間質細胞が血液-脳関門透過薬なしに投与される場合に観察される移植の量に比較して約1.1倍〜10倍、約1.2倍〜5倍、約1.25倍〜2.5倍、又は1.25倍〜2倍、間質細胞の移植を強化する。ある種の実施態様において、間質細胞の移植は、少なくとも1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、5倍、10倍、又はそれを上回って強化される。特定の態様において、該移植は、損傷CNS組織において、又は損傷CNS組織に隣接して発生する。
【０１１４】
I．本発明の方法で使用される遺伝子改変間質細胞
本発明の方法及び組成物はまた、（例えば、治療目的のために、又は哺乳動物の損傷中枢神経系組織におけるそれらの組込み、分化及び遊走を追跡する方法のために）外来性タンパク質又は分子を発現している間質細胞との併用での血液-脳関門透過薬の投与を提供する。従って、本発明は、発現ベクターを含む間質細胞の使用を包含する。細胞について記載されたものなどの間質細胞における外来性DNAの随伴的発現を有する間質細胞への外来性DNAの導入のための方法は、例えばSambrookらの文献(2001, 「分子クローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、及びAusubelらの文献(2007, 「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley & Sons, New York)を全般的に参照されたい。
【０１１５】
導入遺伝子を細胞にもたらすための手段は周知である。哺乳動物細胞内に核酸を送達し、発現させる様々な方法は、当業者に公知である。そのような方法には、例えば、ウイルスベクター、リポソーム系遺伝子送達を含む（WO 93/24640; Mannino Gould-Fogeriteの文献, BioTechniques, vol. 6(7):682-691 (1988);米国特許第5,279,833号; WO 91/06309; Felgnerらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84:7413-7414 (1987);及びBudkerらの文献、Nature Biotechnology, vol. 14(6):760-764 (1996)）。当業者に公知の他の方法には、電気穿孔法（米国特許第5,545,130号、第4,970,154号、第5,098,843号及び第5,128,257号）、遺伝子直接導入、細胞融合、沈殿法、微粒子銃及び受容体媒介型取り込み（米国特許第5,547,932号、第5,525,503号、第5,547,932号及び第5,460,831号）を含む。米国特許第5,399,346号も参照されたい。
【０１１６】
広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウィルス（MuLV）、テナガザル白血病ウィルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）及びそれらの組み合わせに基づくものを含む。例えば、Buchscherらの文献、J. Virol., vol. 66(5):2731-2739 (1992); Johannらの文献、J. Virol., vol. 66(5):1635-1640 (1992); Sommerfeltらの文献、Virol., vol. 176:58-59 (1990); Wilsonらの文献、J. Virol., vol. 63:2374-2378 (1989); Millerらの文献、J. Virol., vol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700、並びに「基礎免疫学、第3版（Fundamental Immunology, Third Edition）」(Paul編, 1993)中Rosenburg及びFauciの文献)を参照されたい。
【０１１７】
AAV系ベクターは、例えば、核酸及びポリペチドのインビトロ産生、並びにインビボ及びエクスビボ遺伝子療法手順において、細胞に標的核酸を導入するためにも使用される。Westらの文献、Virology, vol. 160:38-47 (1987);米国特許第4,797,368号; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy, vol. 5:793-801 (1994); Muzyczkaの文献, J. Clin. Invest., vol. 94:1351 (1994)、及びAAVベクターの概要についてSamulskiの文献(上掲)を参照されたい。組換えAAVベクターの構築は、Lebkowski, 米国特許第5,173,414号; Tratschinらの文献、Mol. Cell. Biol., vol. 5(11):3251-3260 (1985); Tratschinらの文献、Mol. Cell. Biol. Vol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat及びMuzyczkaの文献, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 81:6466-6470 (1984);及びSamulskiらの文献、J. Virol., vol. 63:03822-3828 (1989)を含む、数多くの刊行物に記載されている。
【０１１８】
遺伝子改変間質細胞を使用する遺伝子治療は、身体への直接的な遺伝子導入を超えるいくつかの特有な利益を提供する。第一に、間質細胞に対する治療的導入遺伝子の添加は患者の外で起こり、これは、導入遺伝子を含み、かつ十分量の治療薬を産生する間質細胞のみを選択して機能させることができるので、臨床医に制御の重要な尺度を付与する。
【０１１９】
従って、本発明の方法は間質細胞の投与も提供し、単離された核酸が該細胞に導入され、該所望の核酸によりコードされるタンパク質がそれから発現するときに、以前は該細胞内に存在しなかったか若しくは発現していなかった、又は該導入遺伝子が導入される前のレベルで若しくはそれとは異なる状況で現在発現する場合に、利益が得られる。そのような利益は、治療的利益であり得、又は、所望の核酸の発現が研究室においてインビトロで若しくは該細胞が帰する哺乳動物において研究できるシステム、導入された核酸を含む細胞が調査、診断及び治療ツールとして使用できるシステム、並びに哺乳動物において選択された疾患状態のための新規な診断及び治療ツールの開発に有用である哺乳動物モデルを産生するシステムが今日提供されてきたという事実を含み得る。
【０１２０】
所望の単離された核酸を発現している間質細胞の投与は、該単離された核酸の産物を、該遺伝子産物のより高いレベルが異常な発現及び／又は活性に関連する疾患、障害又は状態を治療又は軽減するのに有用である別の細胞、組織又は哺乳動物全体に提供するために使用することができる。従って、本発明は、所望のタンパク質の発現、タンパク質レベル及び／又は活性の増加が、CNSが関与する疾患、障害又は状態を治療又は軽減するために有用であり得る所望の単離された核酸を発現している間質細胞の投与を意図する。
【０１２１】
加えて、本発明の各種実施態様は、有効量の間質細胞及びマンニトールなどの血液-脳関門透過薬の非経口投与により、哺乳動物の損傷CNSを治療する方法を提供する。本発明の特定の実施態様において、マンニトールなどの血液-脳関門透過薬、並びに様々なCNS成長因子、栄養因子及びサイトカインを発現するように遺伝子改変された有効量の間質細胞を用いる哺乳動物の損傷CNSの治療は、該遺伝子改変間質細胞及び血液-脳関門透過薬が投与されない、又は間質細胞だけが投与される哺乳動物における同じ損傷CNSと比較する場合に、該哺乳動物における神経回復、神経再生及び機能的な神経学的回復をさらに強化することが意図される。
【０１２２】
本明細書の他の部分で記載されているように、遺伝子改変間質細胞を利用している本発明の方法が、実質的に中枢神経系の任意の疾患、障害又は状態を治療するのに有用であることはさらに意図される。
【０１２３】
ある種の実施態様において、損傷した中枢神経系を有する哺乳動物に対する有効量の間質細胞及び血液-脳関門透過薬の投与前に、間質細胞は、栄養因子、成長因子、サイトカイン、ニューロトロフィン、例えば神経成長因子、神経膠由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子及び血管内皮成長因子などの分子を産生するように遺伝子改変でき、これはCNSに既に存在する細胞に有益である。
【０１２４】
例えば、間質細胞は、損傷CNSを有する哺乳動物への導入前に培養でき、かつ遺伝子改変できる。改変された間質細胞は、改変BMSCの強化された移植を促進するために、マンニトールなどの血液-脳関門透過薬と共に損傷CNSを有する哺乳動物に投与される。遺伝子改変BMSCの強化された移植の増加は、遺伝子改変間質細胞及び血液-脳関門透過薬を投与しない哺乳動物の同じ損傷CNSと比較した場合に、哺乳動物における神経回復、神経再生及び機能的な神経学的回復をさらに強化するであろう。
【０１２５】
J．本発明の細胞に基づく組成物
本発明はさらに、神経回復、機能的な神経学的回復、間質細胞移植を強化して、本明細書に全体に記載されている損傷した哺乳動物の中枢神経系の治療を提供するために使用できる組成物を提供する。本発明の組成物は、血液-脳関門透過薬に加えて、遺伝子改変されている若しくは改変されていない有効量の間質細胞を含む。特定の実施態様において、間質細胞は、骨髄間質細胞、脂肪組織由来間質細胞、肝臓間質細胞又はウォートンジェリー間質細胞である。関連する実施態様において、血液-脳関門透過薬は、アルキルグリセロール、RMP-7又はマンニトールである。当業者は、本明細書の他の部分で記載されている間質細胞及び血液-脳関門透過薬の濃度範囲が本発明の組成物に適切であることを直ちに認めるであろう。
【０１２６】
ある種の実施態様において、本発明の組成物は、有効量の遺伝子改変されている若しくは改変されていない間質細胞及び血液-脳関門透過薬を、任意に医薬として許容し得る担体、添加物又は賦形剤との併用で含む。特定の本発明の態様において、間質細胞及び血液-脳関門透過薬を含む組成物は、無菌の食塩水、リンガー液、ハンクス調整塩溶液（HBSS）又はアイソライト（Isolyte）S（pH 7.4）をさらに含み得る。任意の本発明の組成物は、無血清細胞培地を任意に含むことができる。
【０１２７】
本発明はここで、以下の実施例によりさらに完全に記載される。しかしながら、本発明は、多くの異なる実施態様で実施でき、かつ本明細書に記載される実施態様に限定されるものとして解釈すべきでなく；むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底しかつ完全であるように、及び当業者に本発明の範囲を完全に伝達するように提供される。
【実施例】
【０１２８】
（実施例１）：マンニトールの前投与は、hBMSCの動脈内送達を改善して、ラット脳内出血（ICH）モデルにおける機能的な神経学的回復を大幅に向上させた
（実験概要)
以前の研究から、3,000,000〜8,000,000個のhBMSCの血管注入法がICHのラットモデルにおける機能的な神経学的回復を大幅に向上させることは明らかだった（Seyfriedらの文献、2006）。その後、出願人らはさらに、血液-脳関門透過薬（この事例ではマンニトール）及びhBMSCの同時投与が、ICHの後の血管内MSC送達の効率をさらに向上させ（すなわち、より少ない注入細胞が、マンニトールの非存在下で投与される3,000,000〜8,000,000個のhBMSCと同じ治療有効性を達成するのに要求された）、対照治療と比較した場合に改善された機能的な神経学的転帰を生じることを発見した。
【０１２９】
hBMSCとマンニトールの同時投与は、別々に投与される治療、又はヒト線維芽細胞の対照投与とは対照的に、実験的に誘導されたICHに供された成体雄ウィスターラットの機能的な神経学的転帰を大幅に改善した。ICHは、自己由来血液の線条体内注入により、36匹の雄のウィスターラットにおいて誘導された。4つのICH後群（N=9）を用意した：1群、1,000,000個のヒト線維芽細胞の動脈内注射のみを受けた陰性対照；2群、マンニトールの静脈内注射；3群、1,000,000個のhBMSCの動脈内注射；4群、マンニトールの静脈内注射の後に1,000,000個のhBMSCの動脈内注射。全ての動物は2週間の実験期間を生き残り、機能的転機を神経学的重篤度スコア（NSS）及びコーナーターン試験のスコアを使用して測定した。図1は、マンニトール及びhBMSC併用療法を受けたラットのみがコーナーターン及びNSS試験において有意な改善を呈したことを示す。
【０１３０】
この実験の結果は、マンニトールの同時投与がhBMSCに動脈内投与される低用量の効率を上昇させることを示した。該療法は早死を生じず、実験的に誘導されたICHについての有効な治療であった。この研究は、ICHを治療するために動脈内投与される場合、マンニトール及びhBMSCの併用療法がいずれかの療法単独よりも機能的な神経学的回復を増加させるのに有効であることを実証した。
【０１３１】
(材料及び方法)
動物及び試薬。成体雄ウィスターラットは、ジャクソン研究所から購入した。全ての動物研究は、ヘンリーフォードヘルスシステムの動物保護機関及び使用委員会（IACUC）のガイドライン下で行われた。ヒト骨髄間質細胞（hBMSC）は、Cognate Therapeutics（Sunnyville、CA）により提供された。ヒト初代線維芽細胞は、Theradigm（Baltimore, MD）により提供された。マンニトールは、Sigma（St. Louis, MO）から得られた。
【０１３２】
静脈出血、マンニトールの静脈内注入及びhBMSCの動脈内注入の動物外科的手順。270〜320グラムの体重の36匹の雄のウィスターラットを脳内出血研究のために使用した。定位的安定化及び局在を前述したような全身麻酔ラットにおいて使用した（Seyfriedらの文献、2006）。ICHは、大腿静脈から得られた100μlの自己由来血液を、10μl/分の安定した注入速度で右線条体に注入することにより誘導した（Seyfriedらの文献、2004）。ICHの24時間後に、動物を4つの実験群に分けた。1群は、対照としてリン酸塩緩衝食塩水（PBS）中1,000,000個のヒト初代線維芽細胞の（内頸動脈を介する）動脈内注入のみを受けた。2群は、尾静脈を介しPBS中1.5g/kgの用量でマンニトールの静脈内注射を受けた。3群は、PBS中1,000,000個のhBMSCの動脈内（内頸動脈）注入を受けた。4群は、1.5g/kgの用量でのマンニトールの静脈内注射の10分後にPBS中1,000,000個のhBMSCの動脈内注射を受けた。全ての治療は、ICH誘導の24時間後に投与された。全てのラットは、14日間のICH後1日目から開始する100mg/kgのBrdUの腹腔内投与も毎日受けた。
【０１３３】
機能的な神経学的試験。機能的な神経学的転帰は、Seyfriedらの文献（2006）において以前に記載されているように、神経学的重篤度スコア試験（NSS）（Chenらの文献、2001）及びコーナーターン試験（Zhangらの文献、2002）で測定した。
【０１３４】
統計解析。機能的スコアの統計解析は、独立サンプルについてのスチューデント両側t検定を使用して実施した。データを平均±標準誤差として提示し、P値＜0.05を有意であるとみなした。
【０１３５】
(結果)
ICH動物モデルにおいてマンニトールの静脈内投与後のhBMSCの動脈内注射は、大幅に改善した機能的な神経学的転帰をもたらす。4群の成体雄ウィスターラットは材料及び方法の節にて説明したように処置し、機能的な神経学的転帰をICHの 1、7及び14日後のNSS及びコーナーターン試験スコアによって評価した。全ての動物は、2週間の実験期間を生き残った。図1に示すように、4種類の処置の投与直後であるICH後1日目において、NSS及びコーナーターン試験の両方で4群全ての間に見かけ上の差異は観測されなかった。実験的に誘導されたICHの7日後に、NSSにより測定される機能的な神経学的転帰は、マンニトール及びhBMSC併用療法群のみについて、統計的に有意な改善を示し始めた（図1、右パネル、4群）。卒中後第2週の終わりに、マンニトール及びhBMSC併用療法群は、ヒト線維芽細胞療法対照群と比較して、NSS及びコーナー試験（P＜0.05）により評価される大幅に改善した機能的な神経学的転帰を呈した（図1、1群及び4群を比較）。個々のマンニトール及びhBMSC療法群は、改善の傾向を示したが、任意の統計的に有意な神経学的改善を示すことができなかった（図1、2群及び3群）。
【０１３６】
静脈マンニトール後の低用量の動脈内hBMSCの併用療法は、発作後7日という早い時期にこのラットICHモデルにおける安全かつ有効な治療であることを証明した。治療的処置は早死を生じず、hBMSCの前にマンニトールがある場合にのみ、有意な機能的利益があった。BMSCの前にマンニトールを投与することによって、NSS及びコーナーターン試験により測定される機能的な神経学的転帰の有意な改善は、以前に記載されたものよりもかなり低い用量のBMSCで達成された（Seyfriedらの文献、2006）。
【０１３７】
動脈内投与されたhBMSCから構成される療法は脳虚血のモデルにおいて有効であり、ICHモデルにおけるマンニトールの利益は特有の凝血病態生理学の異なる性質のためにより明らかであり得る。実質性血腫は、急性集団効果を作り出し、周囲の小血管を圧縮し、血管原性血液分解生成物を分泌し；マンニトールはこれらの効果を相殺し得ると共に、同時に細胞の送達を向上させ得る（Boulardらの文献、2003）。これらの結果は、損なわれた脈管構造を標的とする療法のための重要な分岐を有し、又は、水腫が所与の療法の効果を制限することができ、警告（caveats）なしに高用量のBMSCと関連し得るのと同じ利益を得るためにより少ない用量のBMSCをマンニトールと共に投与するのに有利であり得る状況において重要な分岐を有する。
【０１３８】
（実施例２）：マンニトール及びhBMSCでの処置は、単独でhBMSCを用いる治療と比較して、ラットICHモデルにおける組織損失を有意に減少させた
（実験概要)
この実験では、マンニトール及びhBMSCの同時投与が、ラットICHモデルにおける脳組織損失の程度における統計的に有意な減少を生じるという仮説を試験した。発作の14日後に、パラフィン脳切片を、実施例Iにおいて使用した成体雄ウィスターラットから調製した。各ラット脳からの6つの切片をヘマトキシリン及びエオジン（H & E）で染色し、細胞の総数を計数した。処置していない対側半球のパーセンテージとしての同側線条体組織損失のパーセンテージは、他の治療群と比較して、マンニトール及びhBMSC併用療法群において有意に減少した（図2）。
【０１３９】
これらの実験からの結果は、マンニトール及びhBMSCの併用療法が改善された機能的な神経学的転帰を提供するのみならず、ラットICHモデルにおける組織損失も有意に減少させることを実証した。加えて、ICH後の脳組織損失における有意な減少は、併用療法群についてのみ実証された（図2、4群）。
【０１４０】
(材料及び方法)
組織学及び免疫組織化学。手術後14日目に動物を麻酔し、4%パラホルムアルデヒド-リン酸緩衝食塩水で経心的に灌流した。脳組織を切除し、ホルマリンで固定し、2mm厚切片にスライスした。切片をパラフィン包埋し、6つの切片の合計について各ラット脳のブレグマ+0.1mm〜-0.86mmで6μmの厚さで切った40番目ごとの冠状切片をH & E染色及び免疫化学的染色に使用した。対側の線条体性と比較した線条体組織損失のパーセンテージは、画像分析システム（Data Translation, Marlboro, MA）を使用して算出した。
【０１４１】
統計解析。ICH関連性組織損傷の領域の統計解析は、独立スチューデントt検定を使用して実施した。データを平均±標準誤差として提示し、P値＜0.05を有意とみなした。
【０１４２】
(結果)
実施例Iにおける実験対象であった36匹の成体雄ウィスターラットは、ICH罹患領域における治療群での脳組織損失の程度を検討するため更に分析した。組織損失のパーセンテージは、他の3群における組織損失のパーセンテージを参照して、マンニトール及びhBMSC併用療法を受けているラットにおいて顕著に低下した。
【０１４３】
同側線条体組織損失のパーセンテージは、正常な半球の線条体組織損失に関して算出された。出血側の線条体組織の実際の損失割合は、図2において以下の通りに示される：ヒト線維芽細胞= 32.4±2.8%；1,000,000個のhBMSC単独= 24±3.4%（P＞0.05）；マンニトール単独= 25.9±1.75%（P＞0.05）；並びに、hBMSC及びマンニトール= 21±3.2%（P＜0.01）。従って、対照群と比較した場合、線条体組織損失のパーセンテージは、併用群において有意に低下した。また、マンニトール又はhBMSCが単独で投与される場合にも改善傾向が観測されたが、この傾向は統計的に有意でなかった。
【０１４４】
この実験におけるマンニトール後の動脈内hBMSCの併用療法は、脳軟化症又は組織損失の量の有意な減少を実証した。この減少した組織損失は、動物がマンニトール及びhBMSCを受けた場合にのみ有意であり、動物が動脈内hBMSCを単独で受けた場合には有意でなかった。これらの結果は、神経学的な虚血モデルの組織損失を減少させる際におけるマンニトール及びhBMSC併用療法の付加的な陽性効果を浮き彫りにした。
【０１４５】
（実施例３）：
病変部近傍のICHラット脳切片の免疫染色は、マンニトール及びhBMSC併用療法群における強化された神経回復を示した
（実験概要）
この実験は、マンニトール及びhBMSCの同時投与が、ラットICHモデルにおける脳組織損失の程度の統計的に有意な減少を生じるという仮説を試験した。発作の14日後に、パラフィン脳切片を実施例Iの成体雄ウィスターラットから調製した。各ラット脳からの6つの切片は、後述するように、神経回復の指標となる抗体にハイブリダイズさせた。
【０１４６】
これらの実験からの結果は、マンニトール及びhBMSCの併用療法が、増加したmAb 1281染色により証明されたように同側ラット線条体におけるhBMSCの移植を強化したことを実証し、またBrdU、シナプトフィジン、ダブルコルチン及びニューロンβ-チューブリンアイソタイプIIIの増加した染色により証明されたように増加した神経回復も実証した。
【０１４７】
(材料及び方法)
試薬。5'-ブロモ-2'デオキシウリジン（BrdU）は、Sigma（St. Louis, MO）から得られた。以下の一次抗体を使用した：BrdUに対するモノクローナル抗体（1:100 Dako, Carpenteria, CA.）；シナプトフィジン（1:1,000 mAb, クローンSY 38; Chemicon. Temecula,CA.）；ダブルコルチン（DCX）（1:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、ニューロンβ-チューブリンアイソタイプIII（TUJ1）（1:5,000 mAb; Covance, Berkeley, CA）、及び抗核（1:500; 全てのヒト細胞型に特異的; Chemicon. Temecula,CA）
【０１４８】
組織学及び免疫組織化学。手術後14日目に動物を麻酔し、4%パラホルムアルデヒド-リン酸緩衝食塩水で経心的に灌流した。脳組織を切除し、ホルマリンで固定し、2mm厚切片にスライスした。切片をパラフィン包埋し、6つの切片の合計について各ラット脳のブレグマ+0.1mm〜-0.86mmで6μmの厚さで切った40番目ごとの冠状切片をH & E染色及び免疫化学的染色に使用した。切片は、5% 正常ヤギ血清、1% BSA及び0.05% Tween-20を含むトリス-緩衝食塩水においてブロックした。切片は、それから、BrdU（増殖細胞のマーカー）、TUJ1（未成熟なニューロンのマーカー）、DCX（遊走神経芽細胞のマーカー、Fengらの文献、2001）及びmAb 1281（ヒト核に特異的なマーカー、Mahmoodらの文献、2003）の局在のために一次抗体でインキュベートした。全ての免疫染色は、一次抗体の省略を使用する、及び免疫染色手順の品質管理のための免疫前血清の使用の2種の陰性対照を用いて同時に実施した。シナプトフィジン、TUJ1及びDCXの半定量測定のために、同じブロックからの様々なレベルの一連の6つのスライドを使用した。シナプトフィジンは、線条体性領域で測定した。TUJ1及びDCXは、脳室下帯で測定した。シナプトフィジン、TUJ1及びDCXは、MCID画像分析システム（Imaging Research社, St. Catharines, ON, Canada）で連絡された3-CCDカラービデオカメラ（モデルDXC-970MD; Sony社, Tokyo, Japan）を使用することにより、20×対物レンズ（Olympus BX40; Olympus Optical社, Tokyo, Japan）の下でデジタル化された。シナプトフィジン、TUJ1及びDCXについて、データは、視野（628×480μm2）の総面積で割った各視野における免疫陽性面積のパーセンテージとして表した（Chenらの文献、2003）。BrdU-陽性細胞の数は、病変周辺の境界で計数した。MAB1281の定量データは、各スライドの病変周辺の境界におけるMAB1281免疫反応細胞の総数として表した。免疫組織化学的分析及び同側組織損失のパーセンテージはまた、増殖している未成熟ニューロン及びニューロン遊走を描写する役割を果たした。
【０１４９】
統計解析。機能的スコア、ICH関連組織の損傷面積及び組織化学的結果の統計解析は全て、独立スチューデントt検定を使用して実施した。平均±標準誤差及びP値＜0.05が有意であるとみなし、データを提示した。
【０１５０】
(結果)
実施例1及び2の実験に供された36匹の成体雄ウィスターラットからの脳切片は、BrdU、mAb 1281、並びにシナプトフィジン、TUJ1及びDCX遺伝子の発現について、免疫組織化学的に染色した。
【０１５１】
図3Aに示すように、mAb 1281を使用する免疫組織化学は、組合せ群の損傷領域においてhBMSC群（157±21）よりも実質的に多くの陽性染色細胞（216±16、P＜0.05）が存在したことを実証し、これはマンニトールがhBMSCを効果的に損傷部位に遊走させることを強化したことを示唆した。mAb 1281免疫染色に基づくと、損傷領域に動員されたhBMSCの数は、マンニトール治療単独と比較した場合に、併用療法群において著しく増加した。
【０１５２】
BrdUに対する免疫染色は、有意に多くのBrdU陽性染色細胞が、対照群と比較して、マンニトール及びhBMSC併用療法群における損傷部位周辺の境界領域（P＜0.05）に存在することを明らかにした（図3B）。BrdU陽性細胞の数のこの増加は、マンニトール及びhBMSCが相乗的に細胞増殖及び損傷領域への移入を促進するように作用することを示唆する。1つの興味をそそる観察は、マンニトール単独が損傷部位の近傍でBrdUマーカーを有意に増加させた（P＜0.05）ことであり、これはマンニトール自体がDNA複製を開始する分裂促進活性を含み得ることを示唆する。
【０１５３】
マンニトール及びhBMSC併用療法群の免疫組織化学的染色は、対照群のものと比較して、ICH罹患領域におけるシナプトフィジン、TUJ1及びDCX発現（P＜0.05）における有意な増加を示した（図3、パネルC、D及びE）。増加したシナプトフィジン発現は、増加したシナプス新生を示唆する。TUJ1発現の増加は増殖している未成熟なニューロンの増加と一致し、DCX発現の増加はニューロン遊走の増加を示す。任意の新しい未成熟なニューロンが形成されるかどうか検出するために、BrdU及びTUJ1両方での共免疫染色を実施した。図3Fにおいて実証されるように、BrdU及びTUJ1についての二重染色は、未だ分裂していないニューロンマーカーを発現した細胞の亜細胞を示し、これは未成熟なニューロンが併用治療群の回復段階の間に新しく形成されたことを示唆した。
【０１５４】
この実験におけるマンニトール後の動脈内hBMSCの併用療法は、損傷領域に到達しているhBMSCの数がマンニトール注入によって有意に増加するということを実証し、これは毛細血管系及び／又はより良好な血液-脳関門浸透による送達が改善されたことを示唆した。加えて、対照と比較してICH罹患領域においてBrdU陽性細胞の存在の増加がある場合、マンニトールはICH後の神経回復過程における有効な補助であることが示された。機能的な神経学的転帰の統計的に有意な改善が示されなかった場合であっても、マンニトール又はhBMSCのいずれかを単独で用いて治療する場合、マンニトール単独又は低用量のhBMSC単独は、損傷部位で有意に細胞増殖を誘発した。これは、hBMSC及びマンニトールを使用する併用療法が真に相乗的であり、このICHモデルにおいて有意な機能的な神経学的回復をもたらしたことを示唆する。
【０１５５】
MSCの動脈内注入療法の有益な効果は、マンニトールの静脈内注射により増幅された。これは、5'-ブロモ-2'デオキシウリジン取込みを有する細胞の数及びニューロンマーカーに対する抗体で染色される未成熟な細胞の数の増加をもたらす。マンニトールの前投与は、有意に、ICHの領域に位置するhBMSCの数を増加させ、神経再生及び神経回復の組織化学的パラメータを改善し、ICHの解剖学的及び神経病理学的帰結を低減した。この研究はさらに、ICHを治療するために動脈内投与される場合、マンニトール及びhBMSCの併用療法がいずれかの療法単独よりも有効であったことを示唆した。
【０１５６】
さらにまた、この研究は、従来の急性管理療法の正常な期間をはるかに越える中枢神経系の損傷治療が、本明細書に記載されている本発明の組成物を用いることで可能であったこと、及び損傷を受けた中枢神経系組織の再構築に非常に有効であったことを示した。
【０１５７】
本明細書において参照し、及び／又は出願データシートに収載された上記の米国特許、米国特許出願刊行物、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許刊行物の全ては、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
上記から、本発明の具体的実施態様が説明の目的で本明細書に記載されているが、様々な変更が本発明の精神及び範囲から逸脱することなくなし得ることは明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の記載によるものを除き、限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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