(57)【要約】本発明は、哺乳動物における呼吸器系疾患の治療に使用することができる候補分子を同定するためのスクリーニング方法の使用に関し、前記スクリーニング方法は、試験分子の存在下におけるＴＡＳＫ‐２ポリペプチドの機能的活性が、前記試験分子の不在下におけるＴＡＳＫ‐２ポリペプチドの機能的活性と比較して、低減または除去されるかどうかを測定し、試験分子が前記機能的活性を低減または除去する場合に該試験分子は候補分子とみなされることを含むステップを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における中枢神経系の機能障害に起因する呼吸器系疾患の治療に使用することができる候補分子を同定するためのスクリーニング方法の使用であって、前記スクリーニング方法は、試験分子の存在下におけるＴＡＳＫ‐２ポリペプチドの機能的活性が、前記試験分子の不在下におけるＴＡＳＫ‐２ポリペプチドの機能的活性と比較して低下または除去されるかどうかを測定し、試験分子が前記機能的活性を低減または除去する場合に該試験分子は候補分子とみなされるステップを含むことを特徴とする、使用。
【請求項２】
ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドの機能的活性が低減または除去されるかどうかを測定するステップは、
ｉ）機能的活性を示すＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを発現する細胞を前記試験分子と接触させること、および
ｉｉ）前記試験分子の存在下で、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドの機能的活性およびその発現のうち少なくともいずれか一方を計測すること
を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記細胞はＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを内在性のものとして発現する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記細胞はＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを組換え型として発現する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記機能的活性は、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを横断するイオン流の計測、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを発現する細胞の膜電位の変化の計測、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを発現する細胞の細胞内イオン濃度の変化の計測、からなる群から選択される計測によって測定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記機能的活性はＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを横断するイオン流の計測によって測定され、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを横断するイオン流はルビジウムイオンの流出である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
睡眠時無呼吸症候群、呼吸器型の乳幼児突然死症候群、高地に起因する病的呼吸のモデルからなる群から選択される中枢神経系の機能障害に起因する呼吸器系疾患の治療に使用することができる分子の同定における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の呼吸器系疾患の治療に使用することができる化合物をスクリーニングする方法の使用に関する。特に、本発明は呼吸器系疾患の治療に使用することができる新しい候補分子を同定するために使用可能である。
【０００２】
以下の記述において、カッコ内の参照番号（Ｒｅｆ）は実施例の後に提示された参照文献一覧を指す。
【背景技術】
【０００３】
生理的必要性に対する中枢性の呼吸の適応は、主として脳幹にある特殊化した神経細胞の電気的活動の変化を伴う、化学感受性の現象である。これらの呼吸神経細胞は小集団をなして分布し、脳幹内で、尾側延髄球の腹外側部から橋背側部まで及ぶ柱状部を形成している（非特許文献１および非特許文献２）。このような理由から、イオンチャネルの欠損が、呼吸器系の生理病理学的状態、例えば高地での長期滞在、または睡眠時無呼吸症候群および乳幼児突然死症候群のような様々な疾病に関与することは驚くべきことではない。
【０００４】
哺乳動物では、呼吸は動脈血中の３つの化学的パラメータ：
ｉ）二酸化炭素の増加、すなわち高炭酸ガス、
ｉｉ）血液ｐＨの低下、すなわちアシドーシス、
ｉｉｉ）血中酸素濃度の低下、すなわち低酸素、
によって制御される。
【０００５】
したがって、呼吸を制御する神経回路網の活動は様々な前記パラメータに適応する（非特許文献３）。
上記パラメータの変化は化学受容体を用いて計測される。これらの化学受容体は、頸動脈小体の化学受容体により末梢レベルで、また縫線核および後部菱形核にある中枢性化学受容体により脳幹において、ｐＨおよび動脈ＣＯ２分圧における変化を検出する（非特許文献４）。化学受容体の電気信号は、生物体の生理的必要性に対する呼吸活動の適応に関与する。
【０００６】
呼吸の調節不全を伴う障害の中でも、睡眠時無呼吸症候群は重大な公衆衛生上の問題である。この症候群は肥満と関係していることが多い。例えば、米国では約３００万人の男性および１５０万人の女性が睡眠時無呼吸症候群を患っている。この症候群は、非特許文献５において示されるように、例えば心疾患を悪化させることにより、該症候群の患者の健康に対して悪影響を及ぼす可能性がある。
【０００７】
様々な型の睡眠時無呼吸は、睡眠中の病的な呼吸休止（成人では１０秒超過、子どもでは８秒超過）を伴い、脳および末梢組織への酸素供給の低下により低酸素症を引き起こす。睡眠時無呼吸症候群の病因は多様であり、根底にあることが考えられる障害に従って分類可能である。例えば、閉塞性睡眠時無呼吸のサブグループは、適切かつ有効な換気を妨げる上気道の閉塞を特徴とする。中枢性睡眠時無呼吸のサブグループは、脳幹における呼吸調節すなわち一時的にのみ機能する呼吸筋の神経制御の機能不全を特徴とする。混合型無呼吸のサブグループは、閉塞性無呼吸が加わった中枢性無呼吸に相当する。
【０００８】
興味深いことに、中枢性の無呼吸のうちの１つ（「非高炭酸ガス性の中枢性睡眠時無呼吸」）は、低炭酸ガス血症と呼ばれる動脈血中二酸化炭素濃度の低下をもたらす換気亢進の期間を特徴とする。二酸化炭素の減少はひいては脳幹の呼吸中枢の刺激の失敗を引き起こし、その結果呼吸はより長く休止し、その結果として動脈中酸素濃度の低下が誘発される。
【０００９】
明らかに、この型の睡眠時無呼吸の患者では低酸素による呼吸の刺激が遅延する。
呼吸における刺激の低下をもたらすいくつかの要因：例えばアルコールおよび精神安定剤のような呼吸に影響を及ぼす物質、または高地での滞在は、睡眠時無呼吸症候群を悪化させる可能性がある。
【００１０】
現在、睡眠時無呼吸症候群の治療には外科的処置および上気道を陽圧にするデバイスが必要である。
睡眠時の経鼻的持続気道内陽圧法（ｎＣＰＡＰ）で構成される呼吸支援による治療は、臨床症状を改善するための現時点で最も有効な方法である。しかしながら、この治療は、患者がマスクによってシステムに恒久的に接続されることを必要とする。したがって、該技術はあまり実際的ではないという事実から、この技術の治療的成功には限界がある。
【００１１】
外科手術およびｎＣＰＡＰ治療に加えて、睡眠時無呼吸の患者の呼吸を改善するために、例えばプロゲステロン、テオフィリン、アセタゾラミドおよびプロトリプチリン（ｐｒｏｔｒｉｐｔｙｌｉｎ）の使用によるいくつかの薬学的な手法が試みられている。
【００１２】
これらの物質は、少なくとも一部の患者で呼吸を刺激することができるとはいえ、該物質のいずれも睡眠時無呼吸症候群の治療に本当に有効であるとは見出されていない。その上、これらの物質の中には大きな副作用を示すものもある。したがって、多くの製薬企業が睡眠時無呼吸症候群を治療するための新しい分子を捜している。
【００１３】
これまで、研究者らは、呼吸を刺激すると思われるＴＡＳＫ‐１カリウムチャネル阻害剤の開発に関心を寄せてきた。ＴＡＳＫ‐１チャネルは、ＴＡＳＫ１、ＴＡＳＫ２およびＴＡＳＫ３チャネルを含むファミリーに属している。該チャネルは、４つの膜貫通ドメインおよび２つのチャネルドメインを備えたＫ＋チャネル（Ｋ２Ｐチャネル）である（非特許文献６）。これらのチャネルは、モノマー、ヘテロダイマーおよびホモダイマーの形で活性を有する（非特許文献７、非特許文献８および非特許文献９）。これらのチャネルはＫ＋電流を生じ、該Ｋ＋電流は、外界の酸性化により、かつＧタンパク質共役型受容体の活性化後に抑制される（非特許文献１０）。該チャネルは揮発性麻酔薬（例えばハロタン、イソフルラン）によって活性化される（非特許文献１１を参照）。
【００１４】
ＴＡＳＫ‐１チャネルは、脳、副腎、血管および心臓に豊富である。ＴＡＳＫ‐１の「ノックアウト」マウスでなされた観察に基づいて、ＴＡＳＫ‐１の遺伝的不活性化は、アルドステロン分泌障害、動脈性高血圧および心電図変化をもたらすことが見出された。さらに、肺高血圧症も観察される場合がある。これらの様々な理由から、ＴＡＳＫ‐１阻害剤の使用は、治療的処置に関して受け入れやすい解決法であるようには思われない。
【００１５】
近年、二重変異型ＴＡＳＫ１／ＴＡＳＫ３マウスにおいて高炭酸ガスに応答した中枢性化学感受性は維持される一方、縫線核の化学感受性は排除されることが示された（非特許文献１２）。
【００１６】
用語「乳幼児突然死症候群」は、説明のつかない幼い子どもの死亡例に使用され、１歳未満の子どもの死亡の主因である。ほとんどの場合、死因は明らかには特定されないが、呼吸障害が主な役割を果たすようである。リスクを有する子どもについて、呼吸監視システムは利用可能であるが、薬物治療はまだ存在していない。
【００１７】
高地では、低酸素により換気の増大がもたらされ、換気の増大は次に動脈血中二酸化炭素の減少（低炭酸ガス血症）を引き起こし、その結果動脈血ｐＨが増大する（呼吸性アルカローシス）。呼吸性アルカローシスは呼吸の調節に影響し、特に睡眠相においては不規則な状態の呼吸をもたらす。呼吸性アルカローシスを抑制することができる物質（例えばアセタゾラミド）は、腎臓による炭酸水素塩の排泄を増大させることによって動脈血ｐＨの低下をもたらし、高地での呼吸の状態および随伴症状を改善することが示されている。しかしながら、アセタゾラミドの使用は、例えば電解質のホメオスタシスを乱すことによって副作用を引き起こす可能性がある。
【００１８】
要するに、これらの呼吸器系疾患を治療することが現時点で知られている物質はほとんどなく、既知の物質は有効性が不十分であるか、または長期間の治療における使用を制限する副作用を示す。その上、研究者らは呼吸器系疾患の治療用の新たな候補物質を実証する手段を有していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｒｉｃｈｔｅｒ  ＤＷ，Ｓｐｙｅｒ  ＫＭ（２００１）“Ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｒｈｙｔｈｍｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌｓ”．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２４，４６４−４７２（Ｒｅｆ１）
【非特許文献２】Ｆｅｌｄｍａｎ  ＪＬ，Ｄｅｌ  Ｎｅｇｒｏ（２００６）“Ｌｏｏｋｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎ：ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｒｈｙｔｈｍ”．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，７，２３２−２４２．（Ｒｅｆ２）
【非特許文献３】Ｆｅｌｄｍａｎ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）“Ｂｒｅａｔｈｉｎｇ：ｒｈｙｔｈｍｉｃｉｔｙ，ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ，ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｖｉｔｙ”：Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２６，２３９−２６６（Ｒｅｆ３）
【非特許文献４】Ｓｅｖｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）“Ｍｉｄｂｒａｉｎｓｅｒｏｔｏｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｒｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｐＨ  ｃｈｅｍｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，６，１１３９−１１４０．（Ｒｅｆ４）
【非特許文献５】Ｎａｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ−ｒｅｐｏｒｔｅｄ  ｓｌｅｅｐ  ａｐｎｅａ：ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｓｕｒｖｅｙ”．Ｃｈｅｓｔ  １２１（６）：１７４１−１７４７（Ｒｅｆ５）
【非特許文献６】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），“Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ＬＶ．Ｎｏｍｅｍｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｔｗｏ−Ｐ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ”．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ，５７，５２７−５４０．（Ｒｅｆ６）
【非特許文献７】Ｃｚｉｒｊａｋ  Ｇ，Ｅｎｙｅｄｉ  Ｐ（２００１），“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ＴＡＳＫ−１  ａｎｄ  ＴＡＳＫ−３  ｔｗｏ  ｐｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ”．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７，５４２６−５４３２．（Ｒｅｆ７）
【非特許文献８】Ｋａｎｇ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），“Ｆｕｎｃｔｉｏｎｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＡＳＫ−１／ＴＡＳＫ−３  ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｓ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｓｅｌｌｓ”．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，５５４，６４−７７（Ｒｅｆ８）
【非特許文献９】Ｂｅｒｇ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），“Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ＴＷＩＫ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｃｉｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｋ＋（ＴＡＳＫ）ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＴＡＳＫ−１（ＫＮＣＫ３）  ａｎｄ  ＴＡＳＫ−３（ＫＮＣＫ９）  ｓｕｂｕｎｉｔｓ”．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２４，６６９３−６７０２（Ｒｅｆ９）
【非特許文献１０】Ｍａｔｈｉｅ  Ａ（２００７）“Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｔｗｏ  ｐｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，５７８，３７７−３８５（Ｒｅｆ１０）
【非特許文献１１】Ｐａｔｅｌ  ＡＪ，Ｈｏｎｏｒｅ  Ｅ（２００１）“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ２Ｐ  ｄｏｍａｉｎ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ”．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２４，３３９−３４６（Ｒｅｆ１１）
【非特許文献１２】Ｍｕｌｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）“ＴＡＳＫ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｐＨ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｓｅｌｅｃｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｂｕｔ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ”．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２７，１４０４９−１４０５８．（Ｒｅｆ１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、呼吸器系疾患の治療のための新たな候補分子を同定するために使用することが可能な、新たな手段が現実に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明の説明
本発明は特に、哺乳動物の呼吸器系疾患の治療のための候補分子を同定するために使用可能なスクリーニング方法の提供により前述の必要性に対処するものであり、前記スクリーニング方法は、試験分子の存在下におけるＴＡＳＫ‐２ポリペプチド（ＫＣＮＫ５）の機能的活性が、前記試験分子の非存在下における前記ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドの機能的活性と比較して低下または除去されるかどうかを測定することで構成されるステップを含む。
【００２２】
本発明の手法の適用時にＴＡＳＫ‐２の活性が低下することが見出されるか、または除去される場合、その試験分子は哺乳動物の呼吸器系疾患の治療のための候補分子であるとみなされる。
【００２３】
本発明の発明者らは、ＫＣＮＫ５とも呼ばれるＴＡＳＫ‐２チャネルが脳幹の呼吸中枢のある領域内に存在し、呼吸において驚くべき役割を果たすことを事実上最初に実証した。新生児マウスから得られた脳幹調製物でのｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験は、酸素欠乏時に呼吸活動の激しい低下を示す。この低下は、ＴＡＳＫ‐２チャネルを無効化したマウスから得られた脳幹調製物では観察されない。したがって、ＴＡＳＫ‐２の阻害または欠如は酸素欠乏からの保護をもたらす。このデータは、ある種の神経細胞における上記チャネルの発現が直接的または間接的に化学受容に関係していることを示す。
【００２４】
本発明の発明者らはまた、直接的または間接的に化学受容に関係することが知られているある種の神経細胞における、上記ＴＡＳＫ‐２チャネルの発現も実証した。
本発明者らはさらに、不活性なＴＡＳＫ‐２チャネルについて無効化した突然変異型マウス（ＴＡＳＫ‐２ノックアウトマウス）は、低酸素時に、野生型マウスが強い呼吸抑制を示すのに対して顕著な呼吸維持を示すことを実証した。これらの結果は、マウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＴＡＳＫ‐２チャネルの不活性化は低酸素時の換気応答を大きく変更し、結果として呼吸を刺激することを実証している。
【００２５】
興味深いことに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養システムの使用により、低酸素に対するＴＡＳＫ‐２プロモータの感度に起因してＴＡＳＫ‐２の発現が低酸素の数時間後に低下することが実証された（Ｂｒａｚｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＴＡＳＫ−２（ＫＣＮＫ５）ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｙｐｏｘｉａ”．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３６：１２５１−１２５８（Ｒｅｆ１３））。
【００２６】
そのため、低酸素（例えば高地滞在時）への適応には、ＴＡＳＫ‐２チャネルの発現低下による身体の防御機構が含まれる可能性がある。しかしながら、この生理的適応には恐らく数時間を要し、短時間の低酸素への即時型反応には機能しない。
【００２７】
このような短時間の低酸素の場合には、ＴＡＳＫ‐２の薬理学的不活性化が、ＴＡＳＫ‐２発現の負の調節という防御機構を先取りする助けとなる可能性がある。
さらに、複数の化学感受性呼吸神経細胞群において発現することにより呼吸の調節に同様に関与すると思われるＴＡＳＫ‐１チャネルおよびＴＡＳＫ‐３チャネル（Ｓｉｒｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）“Ｔｈｅ  ＴＡＳＫ−１  ｔｗｏ−ｐｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ｉｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ａｎｅｓｔｈｅｓｉｃ”．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０，６３４７−６３５４（Ｒｅｆ１４））とは対照的に、中枢神経系におけるＴＡＳＫ‐２の発現は極めて低く、呼吸回路由来の特定の神経細胞群に限定されている（Ｒｅｙｅｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｕｌｅｌ  ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｗｏ  ｐｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ”．  Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３，３０８６３−３０８６９（Ｒｅｆ１５））。さらに、ＴＡＳＫ‐２は、ＴＡＳＫ‐１が非常に強く発現する心臓においては発現しないかまたは発現が非常に弱い。したがって、ＴＡＳＫ‐２の中枢神経系における極めて限定された発現および心臓における事実上の発現欠如は、ＴＡＳＫ‐２を特異的に抑制するためには大きな利点である。
【００２８】
ＴＡＳＫ‐２のペプチド配列、細胞膜における構成およびコード遺伝子は、国際公開第００／２７８７１号パンフレット（ＰＣＴ／ＩＢ９９／０１８８６、ＣＮＲＳに帰属、１９９９年１１月９日に出願、２０００年５月に公開）に記載されている。この文献には、ヒトおよびマウスにおけるＴＡＳＫ‐２の細胞分布、成体の腎臓におけるＴＡＳＫ‐２  ｍＲＮＡの分布、ＴＡＳＫ‐２の染色体地図、トランスフェクションされたＣＯＳ細胞およびツメガエル卵母細胞におけるＴＡＳＫ‐２の発現、ｐＨに対するＴＡＳＫ‐２電流の感度、ならびにｐＨによるＴＡＳＫ‐２の調節、ならびにＴＡＳＫ‐２の生物物理学的かつ薬理学的特性についても記載されている。これらの要素を、本発明を理解しかつ適用するために本願において使用することができる。
【００２９】
「呼吸器系疾患」とは、中枢神経系の機能障害に起因する呼吸障害、特に、脳幹にある脳の呼吸中枢の機能不全に関係した任意の呼吸障害を指す。
呼吸器系疾患の中では、限定するものではないが：睡眠時無呼吸症候群、呼吸器型の乳幼児突然死症候群、高地に起因する病的呼吸のモデル、オンディーヌの呪いすなわち先天性中枢性低換気症候群、薬物による（例えばバルビツール酸系薬物またはモルヒネ系薬物の吸収による）偶発的または自発的な中毒に起因する障害、全身麻酔に関係した呼吸抑制、急性呼吸不全および重度の低酸素血症を挙げることができる。
【００３０】
「試験分子」とは、ＴＡＳＫ‐２チャネルの活性またはその発現を低減または除去するかどうか測定するために本発明の方法によって試験される分子を指す。
「候補分子」とは、本発明の適用によりＴＡＳＫ‐２チャネルの活性またはその発現を低減または除去するとして同定された分子を指す。
【００３１】
本発明は、ヒトであれ動物であれ哺乳動物の呼吸器系疾患の治療用候補分子を同定することができる。
本発明を適用するための試験分子は、例えば分子バンクで無作為に、または例えばイオンチャネルと一体化することができる生物学的に許容可能な分子の中から、選択可能である。
【００３２】
ＴＡＳＫ‐２活性を低減または除去すると思われる試験分子として、本発明者らは例えば、キニーネ、キニジン、クロフィリウム、リドカイン、ブピバカイン、ドキサプラム、およびハロタンのような揮発性麻酔薬を挙げることができる。
【００３３】
候補分子として、本発明者らは、例えばＴＡＳＫ‐２に対する抗体も挙げることができる。この抗体は当業者によく知られた技術によって生産可能である。この抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはＦａｂフラグメントであってよい。
【００３４】
「機能的活性」とは、カリウムチャネルが細胞膜を通り抜けるイオンの移動を実施および制御する能力を指す。
本発明によれば、ＴＡＳＫ‐２の機能的活性を測定するステップは、イオンチャネルの活性を測定するための当業者によく知られた方法のうちの１つによって実施可能である。例を挙げると、該ステップは、国際公開第０５／０５４８６６号パンフレット（ＰＣＴ／ＥＰ／２００４／０１２８２３、バイエル・ヘルスケアＡＧ、２００４年１１月１２日に出願、２００５年６月１６日に公開）の文献中にＫＣＮＫ２チャネルについて記載されているような方法で構成されてもよいし、前述の文献の国際公開第００／２７８７１号パンフレットにＴＡＳＫ‐２、ＴＷＩＫ‐１、ＴＲＥＫ‐１およびＴＡＳＫ‐１チャネルについて記載されているような方法で構成されてもよいし、または国際公開第０２／００７１５号パンフレット（ＰＣＴ／ＩＢ０１／０１４３６、ＣＮＲＳ、２００１年６月２７日に出願、２００２年１月３日に公開）に記載のＴＲＥＫ‐２チャネルについて記載されているような方法で構成されてもよい。
【００３５】
本発明によれば、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドの機能的活性が低減または除去されるかどうかを測定することから構成されるステップは、
ｉ）機能的活性を示すＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを発現する細胞を前述の試験分子と接触させること、および
ｉｉ）前述の試験分子の存在下で、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドの機能的活性またはその発現のうち少なくともいずれか一方を計測すること、を含むことができる。
【００３６】
このステップの適用例は前述の３つの文献に具体的に記載されている。
本発明によれば、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを発現する細胞は、該ポリペプチドを内在性のものとして発現してもよいし、組換え型として発現してもよい。本発明を適用するために細胞でこのポリペプチドを発現させるのに使用可能な方法は、例えば国際公開第００／２７８７１号パンフレット（ＣＯＳ細胞またはツメガエル卵母細胞）およびその他前述の文献に記載されている。
【００３７】
一般に、本発明によれば、機能的活性は、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを横断するイオン流、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを発現する細胞の膜電位の変化、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを発現する細胞の細胞内イオン濃度の変化、からなる群から選択された１つまたはいくつかのパラメータによって計測可能である。本発明で使用可能なチャネルの機能的活性の計測の例は、例えば前述の３つの文献それぞれにおいて提示されている。
【００３８】
本発明によれば、機能的活性は、例えばＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを横断するイオン流の計測によって測定可能であり、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを横断するイオン流は、例えばルビジウムイオンの流出であってよい。好ましくは、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドを横断するイオン流は、ルビジウムイオンの流出の測定により計測され、これは例えば、例としてはギルらの２００７年の文献（Ｇｉｌｌ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７“Ａ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｒｂ（  ＋）−ｆｌｕｘ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｖ１．３  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ”．Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５，３７３８０（Ｒｅｆ１６））に示されているような、原子吸光分析法により測定可能である。
【００３９】
本発明によれば、ＴＡＳＫ‐２の活性を好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは７５％、９０％または１００％低減する試験分子は、ＴＡＳＫ‐２の活性を低減するための候補分子として同定される。
【００４０】
特に、本発明は、睡眠時無呼吸症候群、呼吸器型の乳幼児突然死症候群、高地に起因する病的呼吸のモデルからなる群から選択された呼吸器系疾患の治療のための候補分子の同定を可能にする。
【００４１】
候補分子の同定における次のステップは、例えば呼吸障害を示す動物モデルまたは呼吸器系疾患を引き起こす状態に置かれた動物モデルに候補分子を投与した後に、呼吸器系疾患に対する前記分子の効果を検討するステップであってよい。
【００４２】
したがって、本発明の別の態様は、呼吸器系疾患の治療用組成物の調製のために、ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドの機能的活性を調整するかまたは発現を阻害するかのうち少なくともいずれか一方の分子の使用に関する。
【００４３】
本発明の１つの変更形態によれば、ＴＡＳＫ‐２の遺伝子発現を増大、低減または除去することができる分子を探索するために分子をスクリーニングすることも可能である。例えば、該スクリーニングは、試験される各分子について、ＴＡＳＫ‐２をコードするｍＲＮＡのレベルまたは生成されたＴＡＳＫ‐２を測定することで構成される。これは当業者によく知られた任意の方法によって測定可能である。該方法は定性的方法で構成されてもよいし、定量的方法で構成されてもよい。本発明で使用することができる測定方法は、例えば国際公開第０５／０５４８６６号、同第００／２７８７１号および同第０２／００７１５号パンフレットに見出すことができる。ＴＡＳＫ‐２をコードするｍＲＮＡまたはＴＡＳＫ‐２の存在は、例えば、当業者によく知られた免疫化学的方法のうちの１つにより、例えばイムノアッセイ、ウェスタンブロット法、または免疫組織化学分析法により測定可能である。
【００４４】
本発明のスクリーニングは細胞を用いる系で行われてもよいし、細胞を用いない系で行われてもよい。ＴＡＳＫ‐２を発現する任意の細胞を使用することができる。ＴＡＳＫ‐２ポリペプチドは、その細胞内で本来発現されるものであってもよいし、当業者によく知られた遺伝子組換え技術により細胞内に導入されてもよい。本発明において使用可能な遺伝子組換えプロトコールの例は、前述の３つの文献に記載されている。
【００４５】
したがって、この変更形態によれば、候補分子は例えば、チャネルの転写を阻止すると思われる、ＴＡＳＫ‐２（またはＫＣＮＫ５）をコードするポリヌクレオチド配列の相補配列であってもよい。
【００４６】
レトロウイルス、アデノウイルス、ワクチンウイルスもしくはヘルペスウイルス、または他の細菌ウイルスに由来する発現ベクターを使用して、標的とする器官、組織または細胞集団に相補的ヌクレオチド配列を送達することができる。当業者によく知られた方法を、ＴＡＳＫ‐２をコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を発現するベクターの構築に使用することができる（Ｓｃｏｔｔ  ＪＫ，Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ（１９９０）“Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｌｉｂｒａｒｙ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６−３９０（Ｒｅｆ１７））。当業者によく知られた方法を使用して、ＴＡＳＫ‐２をコードする配列と転写および翻訳を制御する要素とを含んでいる発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの組換えＲＮＡ技術、合成技術およびｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子組換えが含まれる。前述の３つの文献には、本発明の適用のためのベクターの構築に使用可能な方法について記載されている。
【００４７】
他の利点については、添付の図面を参照しながら例証として提供された以下の実施例を読めば明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】吻側延髄球の腹側面に存在するＴＡＳＫ‐２チャネルの写真。
【図２】中枢性化学感受性の機構におけるＴＡＳＫ‐２チャネルの介在をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証する以下の実施例２の実験結果を表すヒストグラム。図中、縦軸は呼吸リズムの頻度を表し（毎分のサイクル数で表示）、横軸はこの実施例で使用された様々な試験を表す。白色のバーは野生型マウスで得られた結果、黒色のバーは突然変異型ＴＡＳＫ‐２マウスで得られた結果に相当する。
【図３】呼吸の機構におけるＴＡＳＫ‐２チャネルの介在をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証する以下の実施例３の実験結果を表すヒストグラム。図中、縦軸は１分間あたりの呼吸の流量すなわちＭＶを体重１ｇあたりのｍｌ／分で表し、横軸はこの実施例で適用された様々な試験を表す。
【図４】ヒトのＴＡＳＫ‐２チャネルをコードするＤＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ細胞上でのＴＡＳＫ‐２電流（強度Ｉ、ピコアンペア（ｐＡ））の「パッチクランプ」記録を示す図。
【図５】成体マウスの脳幹に存在するＴＡＳＫ‐２チャネルの位置について説明する図。Ａ：全脳、顔面神経運動核（ＶＩＩ）近辺の脳幹の腹側面、ならびに後部菱形核および顔面周囲呼吸群（ＲＴＮ／ｐｆＲＧ）を示す拡大図。Ｂ〜Ｅ：冠状断面におけるＴＡＳＫ‐２発現細胞の位置。Ｂ：中脳、背側縫線（ＤＲ）。Ｃ：吻側橋、外側上オリーブ核（ＬＳＯ）。Ｄ：尾側橋、腹側面（ＲＴＮ／ｐｆＲＧ）および小細胞網状核（ＰＣＲｔＡ）。Ｅ：吻側延髄球、ＶＩＩの尾側末端部。Ｆ：脳幹の矢状断面におけるＴＡＳＫ‐２発現細胞の分布を示す簡略図。その他の略語：３Ｎ、動眼神経核；４Ｖ、第４脳室；７Ｎ、顔面神経核；１０Ｎ、迷走神経背側運動核；１２Ｎ、舌下神経核；Ａｍｂ、疑核；ＡＰ、最後野；ＣＩＣ、尾側下丘核；ＩＬＬ、中間外側絨帯核；Ｉ０、下オリーブ核；ｍｅ５、三叉神経中脳路；Ｓｏｌ、孤束核。
【図６】覚醒マウスでの高炭酸ガスおよび短期間の低酸素への応答における、プレチスモグラフ技術によって計測された呼吸の適応を示す図。この適応は野生型マウスまたはＴＡＳＫ‐２無効化マウスにおいて類似している。図中、縦軸は、体重１ｇあたりのｍｌ／分で表示される１分間あたりの呼吸の流量（ＭＶ）、呼吸頻度（ＲＦ）、および現在の体積（ＶＴ）を表し、横軸は、この実施例で使用された様々な試験を時間の関数として表す。
【図７】ＡおよびＢは、長期間の低酸素への応答における、プレチスモグラフ技術によって計測された呼吸の適応を示す図。野生型マウスで観察された大幅な呼吸抑制は、ＴＡＳＫ‐２無効化マウスでは全く存在しない。Ａでは、縦軸は、現在の体積（ＶＴ）、呼吸頻度（ＲＦ）、およびｍｌ／分／ｇで表示される１分間あたりの呼吸の流量（ＭＶ）を表し；横軸は、この実施例で使用された様々な試験を時間の関数として表す。Ｂでは、同じパラメータがより長い時間尺度で表わされている；ＴＥ、呼気時間。Ｃでは、様々な時点（Ｂで最下行に示した１、２、３および４）における個々の動物についての原データ線の例が表わされている。低酸素の雰囲気への変化の直後に、野生型マウスおよび突然変異型マウスは呼吸の増大を示す（時点２）。この応答の後、野生型マウスでのみ観察される抑制（時点３）が続く。１２時間の低酸素の後（時点４）、換気状態はすべてのマウスにおいて同様である。
【図８】低酸素環境に１２時間維持されたマウスの腎臓および脳幹におけるＴＡＳＫ‐１、ＴＡＳＫ‐２およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）のメッセンジャーＲＮＡの発現を表すヒストグラム。このヒストグラムは定量的ＰＣＲの結果（１群当たりマウス８匹）で構成されている。
【図９】Ａ：１日齢のマウスの顔面神経運動核の周囲に位置する帯域（後部菱形核および顔面周囲呼吸群）および全脳におけるＴＡＳＫ‐２の発現を示す図。上記帯域は「一括（ｅｎ  ｂｌｏｃ）」記録技術で保存される。Ｂ：延髄球の構造および橋の最尾側部分の構造が保存されている「一括」調製物の略図。頸根Ｃ４に配置された電極は、呼吸活動を表す横隔神経の活性を記録するために使用することができる。Ｃ：吸気相（ＴＩ）および呼気相（ＴＥ）の大きさ、表面および持続時間を計測するために使用された吸気バーストの暗号化（Ｃ４）および積分（∫Ｃ４）の例を示す図。Ｄ：野生型（ｔａｓｋ２＋／＋）または突然変異型（ｔａｓｋ２−／−）マウスの「一括」調製物について得られた酸素正常状態（対照）および酸素欠乏状態における呼吸活動（∫Ｃ４）の例を示す図。Ｅ：野生型（ＮＴ）、ヘテロ接合型（ｔａｓｋ２＋／−）またはホモ接合型（ｔａｓｋ２−／−）のマウスに関する、対照条件、酸素欠乏、呼吸性もしくは代謝性のアシドーシスおよびアルカローシスにおける呼吸頻度（ＲＦ）を示すヒストグラム。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
実施例
実施例１：脳幹神経細胞におけるＴＡＳＫ‐２発現の実証
本実施例の実験は、脳幹の呼吸中枢に属する主要な神経構造体にＴＡＳＫ‐２チャネルが存在することを実証する。これらの実験はヘテロ接合突然変異型の成体マウス（ＴＡＳＫ‐２＋／−）を用いて実行された。無効化されるＴＡＳＫ‐２遺伝子には、酵素（βガラクトシダーゼ）をコードする配列への置換が行われる。この酵素のおかげで、加水分解されると青変する基質としてＸ‐Ｇａｌを使用する古典的な組織化学的検出技術によって、正常にＴＡＳＫ‐２チャネルを発現する細胞を容易に同定することが可能である。
【００５０】
パラホルムアルデヒドを用いた固定処置の後、神経組織の試料が採取され、次いで、クライオスタットを用いて得た厚さ３０μｍの脳幹横断切片に対してＸ‐ＧＡＬ検出技法が行われる。この反応が終わると、ＴＡＳＫ‐２チャネルを発現する細胞は青く着色される（図１の矢印）。
【００５１】
得られた結果から、脳幹の個々の帯域におけるＴＡＳＫ‐２発現細胞の存在が明らかとなる。例として、図１は吻側延髄球の腹側面に存在するＴＡＳＫ‐２チャネルを示している。同図は、吻側延髄球の腹側面（後部菱形核、ＲＴＮ）の神経細胞にＸ‐ｇａｌ標識が存在することを示す横断切片である。
【００５２】
多くの研究で示されるように、この帯域は、体液（血液、脳脊髄液すなわちＣＳＦ）の化学的変動に応答した中枢性化学感受性すなわち換気の適応において基本的な役割を果たす。これらのチャネルが呼吸の制御に関与する重要な帯域において特有の位置にあることから、ＴＡＳＫ‐２に作用する手法による呼吸の特異的調整を検討することが可能である。
【００５３】
実施例２：呼吸の適応の中枢機構におけるＴＡＳＫ‐２チャネルの介在のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実証
本実施例において、本発明者らは、野生型マウス（活性を有するＴＡＳＫ‐２チャネル）と、活性を有するＴＡＳＫ‐２チャネルを発現しない（「ＴＡＳＫ‐２−／−」）突然変異型ＴＡＳＫ‐２マウスとを使用した。上記マウスは、公開状態で米国サンフランシスコのＷ．スカルネス（Ｗ．ＳＫＡＲＮＥＳ）研究室によって最初に作られた。該マウスは、遺伝的背景をＣ５７ＢＩ／６Ｊとして戻し交配された後、本発明者らの研究室で飼育および繁殖が行われた。
【００５４】
本実施例の実験は、酸素欠乏時の呼吸活動の変化を実証する。これらの実験は、「一括」調製により１〜３日齢のマウスを用いて単離された脳幹調製物に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行された。
【００５５】
野生型マウスまたは突然変異型マウス（ＴＡＳＫ‐２−／−）の脳幹を氷中で直ちに切り分け、周囲組織から単離し、次いでカルボゲン（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）中で平衡化した人工ＣＳＦ（ＣＳＦａ）の中に入れる。脊髄分節Ｃ４の前根は横隔膜に神経を分布させる横隔神経の起始部にある。この神経根を、調製物により自然に生じた周期的な呼吸活動を収集するためにガラス電極の内側に取り入れる。根Ｃ４の電気的活動は、呼吸のパラメータ（頻度、大きさ、持続時間）を後に分析するために、フィルタ処理され、増幅され、視覚化され、コンピュータに保存される。この試験は、ＣＳＦａまたはその化学組成物に溶解される気体の量を変化させることと、呼吸活動を比較することとで構成された。
【００５６】
図２は、本実施例（「一括」調製物：野生型マウスおよびＴＡＳＫ‐２−／−マウスにおいて記録された横隔神経の根Ｃ４の呼吸頻度および電気的活動）の実験結果を表すヒストグラムである。対照：人工ＣＳＦを９５％Ｏ２、５％ＣＯ２の中で平衡化。酸素欠乏：９５％Ｎ２、５％ＣＯ２。縦軸は呼吸の周期的活動の頻度（１分間あたりのサイクル数で表す）を、横軸は本実施例で使用される様々な試験を表す。白色のバーは野生型マウスで得られた結果、黒色のバーは突然変異型ＴＡＳＫ‐２マウスの結果に相当する。
【００５７】
得られた結果は、対照条件（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）では野生型動物と突然変異型ＴＡＳＫ‐２マウスとの間に呼吸頻度の差がないことを実証している。酸素欠乏条件（酸素を含まない気体：９５％Ｎ２、５％ＣＯ２で平衡化されたＣＳＦａ）では、野生型マウスの呼吸頻度は約４０％減少する。低酸素性呼吸抑制と呼ばれるこの古典的な反応は、突然変異型のＴＡＳＫ‐２−／−マウスでは観察されない（統計比較、＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
【００５８】
これらの実験は、酸素欠乏にさらされたマウスのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの呼吸活動は、ＴＡＳＫ‐２チャネルをコードする遺伝子を無効化した後では有意に頻度が高いことを実証している。したがって、呼吸抑制の状態では、ＴＡＳＫ‐２に作用する手法による中枢性の呼吸活動の回復を検討することが可能である。
【００５９】
実施例３：呼吸の機構におけるＴＡＳＫ‐２チャネルの介在のｉｎ  ｖｉｖｏでの実証
本実施例においても、本発明者らは野生型マウスおよび突然変異型ＴＡＳＫ‐２マウスを使用した。
【００６０】
マウスの呼吸はプレチスモグラフ（フランス国所在のＥＭＫＡテクノロジーズ）で計測された。
図３は、低酸素（８％Ｏ２）への長期曝露による野生型マウスおよびＴＡＳＫ‐２−／−マウスの換気反応を示す本実施例の実験結果を表すヒストグラムである。この図では、縦軸は、ｍｌ／分／ｇで表された１分間あたりの呼吸の流量（ＭＶ）を表し、横軸は本実施例で使用された様々な試験を表す。白色のバーは野生型マウスで得られた結果、黒色のバーは突然変異型ＴＡＳＫ‐２マウスで得られた結果に相当する。
【００６１】
様々な酸素への曝露条件について試験した。１分間あたりの呼吸の流量（ｍｌ／分／ｇ）が、対照（ｃｏｎ）（２１％酸素）および海抜６５００ｍの高地に相当する８％酸素の低酸素状態において計測された。低酸素は１〜６時間について試験された。
【００６２】
低酸素は、すべての動物において呼吸の一過性の増加を引き起こした（末梢化学受容器の刺激に伴う呼吸亢進）（図示せず）。第２に、低酸素への長期曝露は呼吸運動の低下すなわち抑制を引き起こし、これは野生型マウスでのみ観察された。最初の呼吸亢進に続く動脈血中二酸化炭素の低減は、野生型マウス（図１のヒストグラム中で白色）においてその呼吸の低減の重要な要因であった。
【００６３】
しかしながら、ＴＡＳＫ‐２チャネルが無効化された動物は低酸素の期間全体にわたって持続的な換気状態を示した。
ＴＡＳＫ‐２チャネルが不活性化された後では、低炭酸ガス（呼吸性アルカローシス）の状態にあるときを含めて低酸素が呼吸の強力な刺激であることは明らかである。呼吸性アルカローシスはもはや中枢神経系のＴＡＳＫ‐２チャネルを活性化することができない可能性が高い。
【００６４】
これらの実験の結果は、ＴＡＳＫ‐２ノックアウトマウスが低酸素時に野生型マウスと比較して呼吸の増大を示すことを明示している。
したがって、ＴＡＳＫ‐２の阻害は呼吸器系疾患の治療の手段であるように思われる。
【００６５】
結論として、ＴＡＳＫ‐２カリウムチャネルの不活性化は、低酸素状態において呼吸を刺激する手段であると考えられ、先行技術で使用される治療方法とは異なる新しい戦略である。
【００６６】
実施例４：脳幹におけるＴＡＳＫ‐２の発現位置
この実験で使用されるマウスおよび条件は、実施例１と同一である。
ＴＡＳＫ‐２−／−マウスの作製に使用されたベクターは、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２８，２４１−２４９（Ｒｅｆ１８）に記載されているようなβガラクトシダーゼをコードする遺伝子を含んでいる。ＴＡＳＫ‐２細胞の発現は、ＴＡＳＫ‐２−／＋マウスにおいて活性を促すＴＡＳＫ‐２プロモータを使用して視覚化された。驚くべきことに、Ｘ‐ｇａｌによる特異的標識は脳幹のわずかな領域に限定されている。ＴＡＳＫ‐２を発現する細胞は、脳の他の領域には見出されなかった。
【００６７】
延髄球に見出される標識は、腹側面の腹外側部に限定されている。
ＴＡＳＫ‐２を発現する細胞は、閂の前方５００−７００μｍから顔面神経運動核（ＶＩＩ）の吻側極へ、１．５ｍｍ以上にわたって伸びる両側性の柱状部を形成する。これらの細胞は、脳幹の表面の周縁帯域、および柔組織中１００〜３００μｍの深さに位置する塊を形成する（図５を参照）。この領域は、後部菱形核および顔面周囲呼吸群（ＲＴＮ／ｐｆＲＧ）が集まっている顔面周囲領域に相当する。
【００６８】
橋では、ＴＡＳＫ‐２を発現する細胞は、外側上オリーブ（図５Ｃ）、小細胞網状核（図５Ｄ）、ならびに背側縫線核および中間外側絨帯において観察される。尾側下丘では部分的な標識が検出される。
【００６９】
標識は、横隔膜運動核に相当する頸髄では検出されなかった。
実施例１および本実験において実証されるように、ＴＡＳＫ‐２チャネルは、吻側延髄球の腹側面、特に後部菱形核（ＲＴＮ）および顔面周囲呼吸群（ｐｆＲＧ）に相当する領域に存在する。
【００７０】
得られた結果は、脳幹の個別の帯域におけるＴＡＳＫ‐２発現細胞の存在を実証する。
呼吸の制御に関与する重要な帯域中で上記チャネルが１か所に位置することから、ＴＡＳＫ２に作用する手法による呼吸の特異的な調整を検討することが可能である。
【００７１】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウスの呼吸に対する低酸素および高炭酸ガスの影響
この実験に使用されるマウスは、上記の実施例２で使用されたものと同一である。
【００７２】
この実験では、１０匹のＴＡＳＫ‐２＋／＋マウスおよび７匹のＴＡＳＫ‐２−／−マウスが使用された。
中枢性および末梢性の化学受容器は、血液中のｐＨおよび気体の変動を検出することにより、呼吸の適応に寄与する（Ｖｉｚｅｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）“Ｂｉｐｈａｓｉｃ  ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｃａｔｓ  ｔｏ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｈａｓ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｏｒｉｇｉｎ”．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，６３，１６５８−１６６４．（Ｒｅｆ１９））。頸動脈小体に位置する末梢性化学受容器細胞は、低酸素に応答した換気の迅速な増大をより特異的に制御する。
【００７３】
短期間の低酸素または高炭酸ガスに応答した呼吸の適応について、野生型マウスおよび突然変異型マウス（ＴＡＳＫ‐２−／−）で検討が行われた。
マウスの呼吸はプレチスモグラフ（フランス国所在のＥＭＫＡテクノロジーズ）を用いて計測された。
【００７４】
正常な状態（２１％酸素）では、呼吸パラメータはＴＡＳＫ‐２−／−および野生型マウスで同一であった。
いずれの種類のマウスも、５％ＣＯ２を含む環境（高炭酸ガス）に応答して同様の呼吸の増大を示した（図６Ａ）。２１％から９％への酸素濃度の低下も、両方の種類のマウスで同一の呼吸の増大を引き起こした（図６Ｂ）。
【００７５】
この低酸素は一過性であり、数分後に最大の呼吸増大がみられた。
この実験は、頸動脈小体に位置する末梢性化学感受性細胞の酸素感受性と関係する、短期間の低酸素に応答した正常な呼吸の適応を実証している。突然変異型マウスにおける高炭酸ガスに対する応答にも変化はない。
【００７６】
実施例６：ＴＡＳＫ‐２の転写に対する長期間の低酸素の影響
長期間の低酸素に対する応答についても検討が行われた。この応答は８％酸素で数時間にわたり計測された。
【００７７】
この実験で使用されるマウスは、直前の実施例で使用されたマウスと同一である。
８匹のＴＡＳＫ‐２＋／＋マウスおよび７匹のＴＡＳＫ‐２−／−マウスがこの実験に使用された。
【００７８】
２時間の低酸素の間に、対照のマウスにおいて呼吸の低下が観察された（図７Ａ）。ｍｌ／分／ｇで表される１分間あたりの呼吸の流量（ＭＶ）についての低酸素による抑制は、特に呼吸頻度（ＲＦ）の低下に起因していた。慢性的な低酸素に応答して引き起こされるこの呼吸抑制は、ＴＡＳＫ‐２−／−マウスには存在しなかった。
【００７９】
この実施例は、低酸素に対する初期応答がＴＡＳＫ‐２−／−マウスにおいて正常であることを示している。この応答は末梢性化学受容器の刺激に相当する（Ｔａｋａｋｕｒａ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｃｈｅｍｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｐｕｔｓ  ｔｏ  ｒｅｔｒｏｔｒａｐｅｚｏｉｄ  ｎｕｃｌｅｕｓ（ＲＴＮ）ＣＯ２−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ”．Ｊ．Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，６３，１６５８−１６６４（Ｒｅｆ２０））。しかしながら、慢性的な低酸素によって引き起こされる中枢性の呼吸抑制はＴＡＳＫ‐２−／−マウスには全く存在しない。
【００８０】
したがって、この実験は、ＴＡＳＫ‐２チャネルが低酸素に対する延髄の感受性にとって重要な要素であることを明白に示している。
本実験および実施例２で実証されたように、ＴＡＳＫ‐２カリウムチャネルの不活性化は、呼吸抑制を阻害しかつ低酸素の状態において呼吸を刺激する方法である。したがって、この不活性化は、先行技術で使用される治療方法とは異なる新しい戦略である。
【００８１】
パウエルらの文献（Ｐｏｗｅｌｌ  ＦＬ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）“Ｔｉｍｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ”．  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１１２，１２３−１３４．（１９９８）（Ｒｅｆ２１））に記載されているような慢性的な低酸素に対する呼吸の適応について、以下の条件すなわち５３００ｍの高地に相当する１０％酸素で２０時間の条件で検討が行われた。
【００８２】
低酸素の最初の３〜４時間の間、対照のマウスは、呼気時間の延長を伴う呼吸流量の強い抑制および呼吸頻度の低下を示した。この段階の後に、呼気時間の短縮を特徴とする適応段階が続き、１０〜１２時間後に正常値に戻った（図８ＢおよびＣ）。
【００８３】
低酸素の期間全体において、呼吸パラメータはＴＡＳＫ‐２−／−マウスでは変化しなかった。したがって、これらのマウスは適応後の対照マウスに類似した呼吸の表現型を示した。
【００８４】
さらに、ＴＡＳＫ‐２の発現が計測された。
マウスは１０％酸素の環境に２４時間置かれ、次いでＴＡＳＫ‐２（ならびに対照のＴＡＳＫ‐１およびエリスロポエチン）のメッセンジャーＲＮＡの発現が計測された。
【００８５】
ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ（Ｒ）Ｍｉｎｉキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用してマウスの腎臓および脳幹から単離された。逆転写については、逆転写酵素（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））が製造業者提供のプロトコールに従って使用された。リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応は、ＳＹＢＲ（Ｒ）グリーンＰＣＲキット（キアゲン）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒ）システム（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））で実施された。ＴＡＳＫ‐２、ＴＡＳＫ‐１およびエリスロポエチンの遺伝子の転写が計測され、βアクチンの発現に対して標準化された。
【００８６】
使用したプライマー、およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の実施条件は以下のとおりとした。βアクチン用プライマー：センスプライマー、５’ＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴ３’（配列番号１）；アンチセンスプライマー、５’ＧＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＣＴＧ３’（配列番号２）。エリスロポエチン用プライマー：センスプライマー、５’ＡＧＡＡＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧ３’（配列番号３）；アンチセンスプライマー、５’ＴＧＴＣＴＡＴＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴ３’（配列番号４）。ＴＡＳＫ‐２用プライマー：センスプライマー、５’ＧＣＴＴＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＧＴＧＧ３’（配列番号５）；アンチセンスプライマー、５’ＡＡＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣ３’（配列番号６）。
【００８７】
プライマーのハイブリダイゼーション温度は５５℃であった。
結果から、ＴＡＳＫ‐２をコードするｍＲＮＡの量は低酸素の際に腎臓および脳幹では変化しないことが実証された。（図８ＡおよびＢ）。
【００８８】
よって、ＴＡＳＫ‐２遺伝子の転写は長期間の低酸素の間に変化しない。したがって、ＴＡＳＫ‐２カリウムチャネルは、低酸素状態において呼吸抑制を阻害しかつ呼吸を刺激するための新しい標的である。先に実証されたように、したがってＴＡＳＫ‐２の不活性化は、先行技術で使用される治療方法とは異なる新しい戦略である。
【００８９】
実施例７：中枢性の呼吸の適応機構におけるＴＡＳＫ‐２チャネルの介在のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実証
この実験は、実施例２で使用されたのと同一の条件およびマウスで実施された。
【００９０】
この実験は、酸素欠乏、アシドーシスおよびアルカローシスの際の呼吸活動の変化を実証する。
中枢性の化学受容器を含めた新生児マウス由来の脳幹の「一括」調製が行なわれた（図９Ａ〜Ｃ）。
【００９１】
「一括」調製は１〜３日齢のマウスについて行なわれた。各マウスはハロタンで麻酔された。脳幹および頸髄が単離されて記録用チャンバ内に移され、腹側部を上向きとして人工脳脊髄液を用いて４ｍｌ／分の速度でかん流が行われた。
【００９２】
呼吸頻度、吸気バーストの持続時間、呼吸の大きさおよび表面積が計測された。
１０匹のＴＡＳＫ‐２＋／＋マウス、８匹のＴＡＳＫ‐２＋／−マウス、および７匹のＴＡＳＫ‐２−／−マウスがこの実験に使用された。
【００９３】
基礎となる呼吸頻度は正常な条件下では各個体すべてにおいて同一であった。対照のマウスでは、代謝性または呼吸性アシドーシスにより呼吸頻度の増大（約＋４０％）が引き起こされ、一方アルカローシスおよび酸素欠乏により呼吸頻度の著しい減少（約−４０％）が引き起こされた。
【００９４】
ＴＡＳＫ‐２−／−マウスは、ｐＨの変化に対しては同様の呼吸頻度の低下を示した。しかしながら、酸素欠乏に対する上記反応はＴＡＳＫ‐２−／−マウスでは全くみられなかった（図９ＤおよびＥ）。
【００９５】
この実験は、ＴＡＳＫ‐２−／−マウスにおいて、呼吸頻度の変化を伴わない吸気持続時間の増大によって表される、低酸素に対する反応が存在することを示している。
したがって、ＴＡＳＫ‐２カリウムチャネルは、低酸素状態における呼吸抑制を阻害しかつ呼吸を刺激するための新しい標的である。
【００９６】
実施例８：本発明によるスクリーニングの適用
成人におけるＴＡＳＫ‐２の分布、ＴＡＳＫ‐２の染色体地図、ＴＡＳＫ‐２の生物物理学的特性および薬理学的特性ならびに外部ｐＨによるＴＡＳＫ‐２の調節は、国際公開第００／２７８７１号パンフレットに従って検討された。
【００９７】
次のスクリーニングが使用される。ＨＥＫ細胞（ヒト胎児腎臓細胞）は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＴＭ）法によってヒトＴＡＳＫ‐２チャネル遺伝子由来の相補的ＤＮＡを含んでいるプラスミド（ｐＩＲＥＳ‐ＣＤ８‐  ｈＴＡＳＫ２）でトランスフェクションされる。２４時間の培養後、電位固定法（全細胞型のパッチクランプ法）を使用してＴＡＳＫ‐２電流が記録される。−９５Ｖの自然電位から−８０〜＋４５ｍＶの範囲の変数値への電位の急転によって電流が活性化される。
【００９８】
電流は、ＥＰＣ‐１０増幅器（ヘカ（ＨＥＫＡ））を使用して全細胞型で記録される。「パッチ」ピペットには、９５のＫグルコナート、３０ｍＭのＫＣｌ、４．８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭのグルコース、２．３８ｍＭのＭｇＣｌ２、０．７２６ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、３ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．２の溶液が入っている。外部溶液はリンゲル液すなわち：１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、５ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４である。
【００９９】
様々な薬物を外部浴槽の灌流によって様々な濃度で適用可能であり、該薬物の影響は対照条件と比較した電流の変化によって評価される。
図４の実施例では、バッチ内に０．９ｍＭのドキサプラムを適用すると、電位の急転によって証明されるように電流が２５％減少することが示されている。
【０１００】
【表１】
2011501657.tif 000002
【０１０１】
【表２】
2011501657.tif 000003
【図１】
2011501657.tif 000004
【図２】
2011501657.tif 000005
【図３】
2011501657.tif 000006
【図４】
2011501657.tif 000007
【図５】
2011501657.tif 000008
【図６】
2011501657.tif 000009
【図７】
2011501657.tif 000010
【図８】
2011501657.tif 000011
【図９】
2011501657.tif 000012
【配列表】
2011501657000001.app
【国際調査報告】
2011501657.tif 000013
2011501657.tif 000014
2011501657.tif 000015
2011501657.tif 000016
2011501657.tif 000017
2011501657.tif 000018