(57)【要約】  複数の軟骨細胞を含む細胞試料を提供するステップと、細胞試料を培養して組織工学的に作製された軟骨構築物を生成するステップと、生化学的試薬、機械力、静水圧またはそれらの任意の組合せの使用を含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するステップとを含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を組み立てるための組成物および方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の軟骨細胞を含む細胞試料を提供するステップと、
前記細胞試料を培養して組織工学的に作製された軟骨構築物を生成するステップと、
生化学的試薬、機械力、静水圧またはそれらの任意の組合せの使用を含む前記組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するステップと
を含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を組み立てる方法。
【請求項２】
生化学的試薬が、グリコサミノグリカン除去剤、成長因子およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生化学的試薬が、コンドロイチナーゼ−ＡＢＣ、ＴＧＦ−β１およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
機械力が直接圧縮である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
静水圧が定常静水圧である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
静水圧が非定常静水圧である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
非定常静水圧が正弦パターンの大きさを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
組織工学的に作製された軟骨構築物を提供するステップと、
生化学的試薬、機械力、静水圧またはそれらの任意の組合せの使用を含む前記組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するステップと
を含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理する方法。
【請求項９】
生化学的試薬が、グリコサミノグリカン除去剤、成長因子およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生化学的試薬が、コンドロイチナーゼ−ＡＢＣ、ＴＧＦ−β１およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
機械力が直接圧縮である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
静水圧が定常静水圧である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
静水圧が非定常静水圧である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非定常静水圧が正弦パターンの大きさを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法により形成される組織工学的に作製された軟骨構築物。
【請求項１６】
請求項８に記載の方法により形成される組織工学的に作製された軟骨構築物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示の全体が参照により組み込まれる、２００８年３月３日に出願された米国仮特許出願第６１／０３３，０９４号の利益を主張する。
【０００２】
政府の権益の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成番号Ｒ０１  ＡＲ０５３２８６の下での支援によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
軟骨がそれ自体を修復できないことにより、患者および社会の両方にとって負担となる無数の臨床状態が導かれる。組織工学（ＴＥ）は、新しい組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長およびその後の移植によりこの負担を低減するための１つの見込みのあるアプローチである。
【０００４】
ＴＥのある１つの挑戦は、移植された構築物が天然条件（環境、機械的負荷など）の下で機能できるように、健常天然組織のものと同様の生体力学的特性を有する組織を創出することである。このような生体力学的特性は、なかでも、組織の基本的構造の巨視的な機能提示と生化学的含量を含む。
【発明の概要】
【０００５】
関節軟骨ＴＥにおける努力は、今までのところ、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含量を含む構築物と、それによる機能的レベルに近い圧縮剛性を創出している。しかし、天然コラーゲン含量と、それによる引張特性は、課題として残っている。
【０００６】
本開示は、ある実施形態において、全般的に、組織工学的に作製された構築物を組み立てる方法に関する。特に、本開示は、ある実施形態において、組織工学的に作製された軟骨を組み立てる改善された方法に関する。
【０００７】
ある実施形態において、本開示は、複数の軟骨細胞を含む細胞試料を提供するステップと、細胞試料を培養して組織工学的に作製された軟骨構築物を生成するステップと、生化学的試薬、機械力、静水圧またはそれらの任意の組合せの使用を含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するステップとを含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を組み立てる方法を提供する。
【０００８】
ある実施形態において、本開示は、組織工学的に作製された軟骨構築物を提供するステップと、生化学的試薬、機械力、静水圧またはそれらの任意の組合せの使用を含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するステップとを含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理する方法を提供する。
【０００９】
本開示のいくつかの具体的な例示的実施形態は、以下の記載および添付の図面を部分的に参照することにより理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】組織工学的に作製された軟骨構築物を組み立てるための自己集合プロセスの例を示す図である。
【図２】Ｃ−ＡＢＣ処理の例における全ての群についての自己集合組織構築物の代表的な全体および組織学的な写真を示す：２週目対照（Ａ〜Ｅ）、２週目Ｃ−ＡＢＣ処理（Ｆ〜Ｊ）、４週目対照（Ｋ〜Ｏ）、４週目Ｃ−ＡＢＣ処理（Ｐ〜Ｔ）。目盛りの印＝Ａ、Ｆ、Ｋ、Ｐにおいて１ｍｍ、および縮尺バー＝Ｅにおいて２００μｍは、全ての組織学的画像に当てはまる。４週目でのＣ−ＡＢＣ処理構築物（Ｑ）におけるＧＡＧ染色の回復、および全ての処理群（Ｃ、Ｈ、Ｍ、Ｒ）におけるＩ型コラーゲン染色がないことに注目されたい。
【図３】Ｃ−ＡＢＣ処理の例からの全コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンのプロットを示す。全コラーゲンは、Ｃ−ＡＢＣ処理の後、４週目にて有意に増加した（＊対照から有意に異なる、ｐ＜０．０５）。さらに、ＩＩ型コラーゲンも有意に増加することが示された。
【図４】Ｃ−ＡＢＣ処理の例からの構築物の剛性および透過性のプロットを示す。Ｃ−ＡＢＣ処理構築物の集合係数（ＨＡ）は、４週目で未処理構築物と等しくなるまで回復した。４週目での透過性（ｋ）は、Ｃ−ＡＢＣ処理とともに有意に減少した（＊、†それぞれの時点にて対照から有意に異なる、ｐ＜０．０５）。
【図５】Ｃ−ＡＢＣ処理の例からの引張係数および最大引張強さのプロットを示す。みかけのヤング率（ＥＹ）および最大引張強さ（ＵＴＳ）はともに、調べた両方の時点にてＣ−ＡＢＣ処理の後に有意に増加した（それぞれ４週目にて４７および７８％）（＊、†それぞれの時点にて対照から有意に異なる、ｐ＜０．０５）。
【図６】ＨＰ処理が、集合係数（ＨＡ）およびヤング率（ＥＹ）を有意に増加させることを示す。ＧＡＧ／ＷＷおよびコラーゲン／ＷＷにおける並行した増加が見出された。構築物の全体の形態または細胞充実性における違いは見出されなかった。コラーゲンＩＩの生成が観察され、免疫組織化学を行ったときにコラーゲンＩの生成はなかった。２つの対照群の間に違いは見出されなかった（すなわち、袋に入れたが圧力を印加しなかったものと、ペトリ皿に保持したものとの間）。
【図７】ＨＰを加えることが、ＨＡ、ＥＹ、ＧＡＧ／ＷＷおよびコラーゲン／ＷＷに影響する重要な因子であることが見出されたことを示す。１０〜１４日目でのＨＰの印加は、構築物の特性に最大の影響を与えた。ＨＰを加えると、２．４倍高いＨＡ、１．４倍高いＧＡＧ／ＷＷ、１．６倍高いＥＹ、および１．４倍高いコラーゲン／ＷＷが見出された。
【図８】２週目（図８ａ）および４週目（図８ｂ）での構築物の湿潤重量のプロットを示し、これは、直接圧縮の印加により増加することが見出された。
【図９】２週目（図９ａ）および４週目（図９ｂ）での構築物の厚さのプロットを示し、これは、直接圧縮の印加により増加することが見出された。
【図１０】集合係数（ＨＡ）により示される構築物の剛性のプロットを示し、これは、直接圧縮の印加により有意に増加することが見出された。
【図１１】ＨＰおよびＴＧＦ−β１での処理の組合せが、ＷＷ当たりのコラーゲンおよびヤング率に対して、対照を超える、相乗的な正の影響をもたらしたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
特許または出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図を含む。カラーの図（複数可）を含むこの特許または特許出願の公報のコピーは、要求および必要な費用の支払いにより米国特許商標庁によって提供される。
【００１２】
本開示は、種々の改変および代替の形態により影響を受けるが、具体的な例示的実施形態は、図面に示され、以下により詳細に記載される。しかし、具体的な例示的実施形態の記載は、開示される特定の形態に本発明を限定することを意図せず、逆に、この開示は、添付の特許請求の範囲により部分的に記載される全ての改変および等価物をカバーするものであることを理解されたい。
【００１３】
本開示は、ある実施形態において、全般的に、組織工学的に作製された構築物を組み立てる方法に関する。特に、本開示は、ある実施形態において、組織工学的に作製された軟骨を組み立てる改善された方法に関する。
【００１４】
ある実施形態において、本開示は、複数の軟骨細胞を含む細胞試料を提供するステップと、細胞試料を培養して組織工学的に作製された軟骨構築物を生成するステップと、生化学的試薬、機械力、静水圧またはそれらの任意の組合せの使用を含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するステップとを含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を組み立てる方法を提供する。
【００１５】
ある実施形態において、本開示は、組織工学的に作製された軟骨構築物を提供するステップと、生化学的試薬、機械力、静水圧またはそれらの任意の組合せの使用を含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するステップとを含む、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理する方法を提供する。
【００１６】
本開示の方法とともに用いられる細胞および細胞試料は、軟骨細胞、軟骨分化細胞、線維軟骨細胞、線維軟骨分化細胞およびそれらの組合せを含んでよい（本明細書において軟骨細胞と記載される）。
【００１７】
軟骨細胞は、関節軟骨細胞を含んでよい。一般的に、関節軟骨細胞は、ウシもしくはブタ供給源または別の動物供給源からであってよい。代わりに、構築物がｉｎ  ｖｉｖｏ組織置換のために用いられるならば、関節軟骨細胞の供給源は、患者自身の組織の小さい生検組織からの自己由来軟骨であってよいが、但し、該患者が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖の開始として用い得る健常な関節軟骨を有することを条件とする。軟骨細胞の別の適切な供給源は、提供者または株化細胞から得られる組織適合性軟骨組織からのものなど同種異系軟骨細胞である。本開示の方法とともに用いられる線維軟骨細胞は、半月板線維軟骨細胞を含んでよい。一般的に、半月板線維軟骨細胞は、ウシもしくはブタ供給源、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のための別の適切な動物供給源からであってよい。代わりに、構築物がｉｎ  ｖｉｖｏ組織置換のために用いられるならば、半月板線維軟骨細胞の供給源は、患者自身の組織の小さい生検組織からの自己由来線維軟骨であってよいが、但し、該患者が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖の開始として用い得る健常な半月板線維軟骨を有することを条件とする。線維軟骨細胞の別の適切な供給源は、例えば提供者または株化細胞から得られる組織適合性線維軟骨組織からのような同種異系線維軟骨細胞である。
【００１８】
ある実施形態において、本開示の方法とともに用いられる軟骨細胞は、間葉系細胞、胚細胞、誘導多能性幹細胞、皮膚細胞またはその他の幹細胞に由来してよい。
【００１９】
細胞および細胞試料は、組織工学的に作製された軟骨構築物を生成するために十分な数の軟骨細胞を含む細胞試料を得るための任意の供給源および部位に由来してよい。本開示の恩恵を受ける当業者は、本発明の方法において用いるために適切であり得る細胞試料が得られるさらなる供給源および部位を認識する。
【００２０】
このような細胞および細胞試料は、組織工学的に作製された軟骨構築物を生成するために十分な数の軟骨細胞を含む細胞試料を得るために適切な任意の手段により得てよい。ある実施形態において、このような手段は、天然組織の酵素消化を含んでよい。このような酵素消化のために適切な酵素は、それらに限定されないが、１または複数のコラゲナーゼを含む。
【００２１】
細胞および細胞試料は、任意の適切な手段および条件を用いて培養して、組織工学的に作製された軟骨構築物を生成してよい。このような手段および条件の選択は、それらに限定されないが、細胞試料の播種濃度、細胞試料が培養される培地、および細胞試料が培養される容器の形状を含む。このような条件の選択は、なかでも、細胞試料の供給源と、組織工学的に作製された軟骨構築物の所望のサイズおよび形状に依存してよい。本開示の恩恵を受ける当業者は、本発明の方法において有用な組織工学的に作製された軟骨構築物を生成するための適切な手段および条件を認識する。
【００２２】
ある実施形態において、細胞試料を培養して組織工学的に作製された軟骨構築物を生成するステップは、自己集合プロセスを用い得る。このような自己集合プロセスの例を、図１に示す。この例示的な自己集合プロセスにおいて、細胞試料は、適切な条件下で、円筒形のアガロース鋳型中で培養されて、ディスク形状の組織工学的に作製された軟骨構築物を生成する。
【００２３】
組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するステップは、任意の所望の時点で行ってよく、これは、組織工学的に作製された軟骨構築物の生成中または後であってよい。ある実施形態において、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するステップは、生化学的試薬、機械力、静水圧またはそれらの任意の組合せの使用を含んでよい。このような処理は、なかでも、処理される組織工学的に作製された軟骨構築物の形態学的、生化学的および／または生体力学的な特性を改良し得る。
【００２４】
種々の生化学的試薬を用いて、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理してよい。このような生化学的試薬は、処理される組織工学的に作製された軟骨構築物の形態学的、生化学的および／または生体力学的な特性を改良するために適切な任意の生化学的試薬を含む。このような適切な生化学的試薬は、それらに限定されないが、ギルコサミノグリカン（ＧＡＧ）除去剤、成長因子およびそれらの任意の組合せを含んでよい。本発明の方法において用いるために適切であり得るＧＡＧ除去剤の例は、コンドロイチナーゼ−ＡＢＣ（Ｃ−ＡＢＣ）、アグリカナーゼ、ケラチナーゼ、ＮａＣｌまたはグアニジニウム−ＨＣｌ抽出物およびそれらの組合せである。本発明の方法において用いるために適切であり得る成長因子の例は、トランスフォーミング成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）である。本開示の恩恵を受ける当業者は、本発明の方法において有用であり得るさらなる生化学的試薬を認識し得る。本発明の方法において有用な生化学的試薬を用いて、組織工学的に作製された軟骨構築物の生成中または後の任意の時点にて、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理してよい。処理時間のこのような選択は、なかでも、所望の処理の程度および選択された具体的な生化学的試薬に依存してよい。本開示の恩恵を受ける当業者は、組織工学的に作製された軟骨構築物を、本発明の方法において有用な生化学的試薬で、いつ処理するかを選択できる。
【００２５】
ある実施形態において、ＧＡＧ除去剤を用いる処理は、組織工学的に作製された軟骨構築物を、実質的にプロテアーゼ非含有のＣ−ＡＢＣで、２Ｕ／ｍｌ培地の活性にて、３７℃で４時間処理することを含んでよい。限定ではなく説明として、このような処理は、なかでも、組織工学的に作製された軟骨構築物からＧＡＧを実質的に除去し、この１回のＧＡＧ除去剤処理後の培養期間の後に、全コラーゲン濃度が増加し、ＧＡＧが生成され、みかけのヤング率のような引張特性が増加し得る。ある実施形態において、このような改善は、組織工学的に作製された軟骨構築物の圧縮剛性が実質的に増加することなく生じ得る。
【００２６】
ある実施形態において、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するために用いられるＧＡＧ除去剤の濃度は、０．００１Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌまで変動してよい。ある実施形態において、ＧＡＧ除去剤処理の時間は、０．０１時間から４週間までの間で変動してよい。ある実施形態において、ＧＡＧ除去剤処理は、組織工学的に作製された軟骨構築物の生成中および／または後の種々の時点で行ってよい。ある実施形態において、ＧＡＧ除去剤は、１回の処理とは反対に繰り返し用いてよい。このような変動は、なかでも、種々の程度のＧＡＧ除去をもたらし、処理される組織工学的に作製された軟骨構築物の形態学的、生化学的および／または生体力学的な特性の改良を補助し得る。例えば、Ｃ−ＡＢＣを用いる２週間および４週間の処理は、デコリンに影響し、６週目で３．４ＭＰａのヤング率をもたらした。
【００２７】
組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するために本発明の方法において用いられる機械力は、処理される組織工学的に作製された軟骨構築物の形態学的、生化学的および／または生体力学的な特性の改良に適切な任意の量および任意の手段により印加してよい。適切な機械力の例は、直接圧縮である。ある実施形態において、適切な機械力の選択は、適切なひずみおよび振動数の選択を含んでよい。このようなひずみおよび振動数の選択は、なかでも、組織工学的に作製された軟骨構築物のサイズおよび形状に依存してよい。本開示の恩恵を受ける当業者は、本発明の方法において有用であり得る適切なひずみおよび振動数を認識する。
【００２８】
ある実施形態において、機械力の使用は、７〜約１７％のひずみおよび０〜約１Ｈｚの振動数の使用を含んでよい。ある実施形態において、このような機械力は、組織工学的に作製された軟骨構築物の生成の１〜４日後に、６０秒サイクルで（すなわち、６０秒間の機械力、その後６０秒間は機械力なし）、１日当たり合計で約１時間の機械力印加で印加してよい。限定ではなく説明として、このような機械力処理は、なかでも、組織工学的に作製された軟骨構築物の湿潤重量（ｗｗ）、厚さおよび湿潤重量に対するＧＡＧ濃度の比（ＧＡＧ／ｗｗ）のうちの１つまたは複数を増加させ得る。
【００２９】
ある実施形態において、機械力処理は、機械力を印加しない期間の変動などの変動（すなわち非反復）様式で印加してよい。ある実施形態において、機械力は、非連続的な複数の日に印加してよい。ある実施形態において、機械力は、約０．１％〜約９９％の範囲の異なるひずみで印加してよい。ある実施形態において、種々の大きさの機械力を、同じ処理中に印加してよい。機械力処理におけるこのような変動は、なかでも、処理される組織工学的に作製された軟骨構築物の形態学的、生化学的および／または生体力学的な特性の改良を補助する場合がある。
【００３０】
組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するために本発明の方法において用いられる静水圧（ＨＰ）は、処理される組織工学的に作製された軟骨構築物の形態学的、生化学的および／または生体力学的な特性の改良に適切な任意の量および任意の手段により印加してよい。ある実施形態において、本発明の方法において用いられるＨＰは、定常ＨＰであってよい。ある実施形態において、適切なＨＰの選択は、ＨＰ処理の適切な大きさおよび期間の選択を含んでよい。本開示の恩恵を受ける当業者は、本発明の方法において有用であり得るＨＰ処理の適切な大きさおよび期間を認識する。
【００３１】
ある実施形態において、組織工学的に作製された軟骨構築物を処理するための静水圧の使用は、組織工学的に作製された軟骨構築物の生成の前または後の５日間、１０ＭＰａの定常ＨＰを１日当たり１時間の使用を含んでよい。ある実施形態において、このような静水圧処理は、集合係数、ヤング率、湿潤重量に対するＧＡＧの比（ＧＡＧ／ｗｗ）および湿潤重量に対するコラーゲンの比（コラーゲン／ｗｗ）の１つまたは複数を増加させ得る。
【００３２】
ある実施形態において、静水圧は、非連続的な複数の日に反復して印加してよい。ある実施形態において、静水圧は１日当たり複数回、所望により静水圧を印加しない期間の変動とともに印加してよい。ある実施形態において、静水圧の大きさは、約０．０１〜約２０ＭＰａの範囲であってよい。ある実施形態において、静水圧の種々の大きさは、同じ処理において用いてよい。ある実施形態において、非定常ＨＰを、所望により種々の振動数で用いてよい。ある実施形態において、このような非定常ＨＰ処理は、正弦波パターンの大きさを有してよい。
【００３３】
ある実施形態において、組織工学的に作製された軟骨構築物は、生化学的試薬、機械力および静水圧の１つまたは複数の組合せを含む処理により処理してよい。例えば、組織工学的に作製された軟骨構築物の組合せ処理は、ＴＧＦ−β１と、１０ＭＰａの定常静水圧との処理を含んでよい（後者は、組織工学的に作製された軟骨構築物の生成後５日間、１日当たり１時間）。このような組合せ処理は、なかでも、コラーゲン／ｗｗおよびヤング率に対して相乗的な正の影響をもたらし得る。
【００３４】
よって、本発明は、言及され、かつ本発明において固有の目的および利点を達成するためによく適合されている。当業者により多数の変更を行い得るが、このような変更は、添付の特許請求の範囲により部分的に記載される本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【００３５】
組織工学的に作製された軟骨構築物のＣ−ＡＢＣ処理
組織工学的に作製された構築物を、プロテアーゼ非含有Ｃ−ＡＢＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、２Ｕ／ｍＬ培地の活性にて、３７℃で４時間処理した。処理後の構築物を、４００ｍＬの新鮮な培地で５回、十分に洗浄した。Ｃ−ＡＢＣ処理は、構築物からのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の除去をもたらした（図２）。この１回のＣ−ＡＢＣ処理後の２週間の培養後に、全コラーゲン含量ならびにＩＩ型コラーゲン含量および濃度は著しく異ならなかったが、全コラーゲン濃度は、４週目に、未処理と比較してＣ−ＡＢＣ処理群において増加した（図３）。さらに、ＧＡＧは回復し（図２）、処理構築物および未処理対照の圧縮剛性は同様であった（図４）。引張特性は、みかけのヤング率および最大引張強さについてそれぞれ４７および７８％増加した（図５）。
【００３６】
組織工学的に作製された軟骨構築物の静水圧処理
１０ＭＰａの定常ＨＰを、１日当たり１時間で、組織工学的に作製された構築物に、最初の播種からｔ＝６〜１０日目、ｔ＝１０〜１４日目、ｔ＝１４〜１８日目に印加した。１０〜１４日目のＨＰ印加が構築物特性に対して最大の影響を有し、２．４倍高い集合係数（ＨＡ）、１．４倍高いＧＡＧ／ｗｗ、１．６倍高いヤング率（ＥＹ）および１．４倍高いコラーゲン／ｗｗをもたらしたことが観察された（図６および７）。
【００３７】
組織工学的に作製された軟骨構築物の直接圧縮処理
７、１０および１７％ひずみならびに０、０．１および１Ｈｚでの直接圧縮（ＤＣ）を、播種後１１〜１４日目に、６０秒のサイクル（すなわち６０秒間の直接圧縮、その後直接圧縮せずに６０秒間）で、１日当たり合計１時間の圧縮にて印加した。形態学的に、ＤＣ印加は、湿潤重量（図８）および厚さ（図９）の有意な増加をもたらした。播種後１５日目に、１７％、０．１Ｈｚレジメンは、全てのその他の処理はより高い傾向であったが、ＨＡが有意に増加した構築物をもたらした（図１０）。この時点で、１７％、１Ｈｚを除いた全てのレジメンが、ＧＡＧ／ｗｗを有意に増加させることも見出された。１７％、０．１Ｈｚレジメンは、機械的特性を有意に改善することが特に見出された。
【００３８】
組織工学的に作製された軟骨構築物の組合せ処理
成長因子とＨＰとの組合せ効果の使用について、ＴＧＦ−β１と１０ＭＰａの定常静水圧との組み合わせた使用（後者は、播種後１０〜１４日目に１日当たり１時間）は、対照を超えて、コラーゲン／ｗｗおよびヤング率に対する相乗的な正の影響をもたらした（図１１）。
【００３９】
よって、本発明は、言及され、かつ本発明において固有の目的および利点を達成するためによく適合されている。当業者により多数の変更を行い得るが、このような変更は、添付の特許請求の範囲により部分的に記載される本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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