(57)【要約】  本発明は疾患関連部分等の標的部分に１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ抗原型の標的部分の投与及び／又は標的部分に１個以上の非天然アミノ酸を組込んだものに対する抗体であって、天然標的部分に対して交差反応性の抗体の投与により、標的部分に対する免疫応答を対象で誘発及び／又は強化するための方法と組成物を含む。    【図１】
2011514322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的部分に対する免疫応答を対象で誘発又は強化するための方法であって、
１個以上の非天然アミノ酸を含む非天然免疫原を準備する段階と；
非天然免疫原を対象に投与し、非天然免疫原に対する抗体でありながら標的部分に対して交差反応性である１種以上の抗体を対象に産生させる段階を含み；
それにより、標的部分に対する免疫応答を誘発又は強化する前記方法。
【請求項２】
免疫応答がＢ細胞介在性応答及び／又はＴ細胞介在性応答を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非天然免疫原を準備する段階が直交翻訳系で非天然免疫原を作製する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
非天然免疫原を準備する段階がｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系で非天然免疫原を作製する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
非天然免疫原が２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種以外の非天然アミノ酸を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
免疫原の２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種の化学修飾以外の方法で非天然免疫原を作製する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
免疫原の２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種の翻訳後修飾以外の方法で非天然免疫原を作製する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
対象がヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ニワトリ、小型鳥類、大型鳥類、爬虫類、及び両生類から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
標的部分がポリペプチドを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的部分がポリペプチド及び／又は糖質を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
標的部分が対象の自己部分である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
標的部分が疾患関連部分である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
自己部分が自己免疫疾患に関連する自己抗原、腫瘍関連抗原、アルツハイマー病関連抗原、アミロイドβ４０、アミロイドβ４２、乳癌関連抗原、卵巣癌関連抗原、前立腺癌関連抗原、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、家系特異的腫瘍関連抗原、メラノサイト−メラノーマ家系抗原、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼもしくはチロシナーゼ関連蛋白質、チロシナーゼ関連蛋白質２、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、突然変異ｒａｓ、再構成ｂｃｒ／ａｂ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、突然変異もしくは野生型ｐ５３、チトクロームＰ４５０  １Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖの異常発現イントロン配列、ＣＡ１９−９、ｐ５３、ＯＣＡＡ、ＨＯＸＢ７、Ｃａ１２５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＣＴＡ−１、Ｃａ１５−３、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−１、ＣＸＣＲ４、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＣＰＲ）、又はＣＡ２７−２９の１種以上である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
標的部分が対象の自己部分以外のものである請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
標的部分が細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、原生動物、蠕虫、又はプリオンに由来する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標的部分が細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、マイコプラズマ抗原、原生動物抗原、蠕虫抗原、プリオン抗原、ＨＩＶ抗原、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇａｇ、ＨＩＶｐｏｌ、ＨＩＶｅｎｖ、ＨＩＶｔａｔ、ＨＩＶｎｅｆ、ＨＩＶｒｅｖ、カリシウイルスカブシド抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、デルタ肝炎原因物質、単純ヘルペスウイルス糖蛋白質、水痘帯状疱疹ウイルス糖蛋白質、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルス核蛋白質、ＨＰＶカブシド蛋白質、バラインフルエンザウイルスヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ、ポリオウイルスカブシドポリペプチド、ＨｅｐＡ抗原、ワクシニアウイルスポリペプチド、狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｇ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＡ、ｂ型インフルエンザ桿菌外膜蛋白質、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ、マイコバクテリウムｍＡＰＧ、化膿連鎖球菌Ｍ蛋白質、肺炎連鎖球菌莢膜多糖体、ペスト菌Ｆ１、ペスト菌Ｖ抗原、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲蛋白質（ＰｆＣＳＰ）、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト表面蛋白質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝細胞期抗原１の熱帯熱マラリア原虫カルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ｃ−ｔｅｒｍ）、熱帯熱マラリア原虫輸送蛋白質１（ＰｆＥｘｐ−１）、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２８、Ｐｆｓ２５、又はＰｆｓ２３０の１種以上である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
標的部分が細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、原生動物、蠕虫、プリオン、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、キャプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、デルマトフィルス属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモバルトネラ属（Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、Ｌ型菌、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ネオリケッチア属（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、アデノウイルス、アルファウイルス、カリシウイルス、コロナウイルス、ＣＭＶ、ジステンパーウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、ＥＢＶ、フラビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘパドナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎原因物質、Ｅ型もしくはＦ型肝炎ウイルス、ＧＢＶ−Ｃ、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、免疫不全ウイルス、ＨＩＶ、伝染性腹膜炎ウイルス、インフルエンザウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、白血病ウイルス  マールブルグウイルス、オルトミクソウイルス、パピローマウイルス、ＨＰＶ、パラインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、ＲＳＶ、パルボウイルス、ペスチウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、アブシジア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍ���ｎｉｕｍ）、アルタナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バシジオボラス属（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、ビポラリス属（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、コニディオボラス属（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カーブラリア属（Ｃｕｒｖａｌａｒｉａ）、エピデルモフィトン属（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、エクソフィアラ属（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、マズレラ属（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ）、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）、ミクロスポラム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、モニリエラ属（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フィアレモニウム属（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）、フィアロフォラ属（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードアレシェリア属（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ）、シュードミクロドキウム属（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、リノスポリジウム属（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、スコレコバシディウム属（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、ステムフィリウム属（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、キシロハイファ属（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）、バランチジウム属（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）、ベスノイチア属（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、エイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）、エンセファリトゾーン属（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ）、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、ハモンディア属（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）、ヘパトゾーン属（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ）、イソスポラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、ミクロスポリジア属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、ネオスポラ属（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）、ノゼマ属（Ｎｏｓｅｍａ）、ペンタトリコモナス属（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、サルコシスチス属（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、タイレリア属（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、アカントケイロネマ属（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａ）、アエルロストロンギルス属（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、アンシロストーマ属（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍ���）、アンギオストロンギルス属（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、アスカリス属（Ａｓｃａｒｉｓ）、ブルギア属（Ｂｒｕｇｉａ）、ブノストムーム属（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）、キャピラリア属（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）、チャベルチア属（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）、クーペリア属（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）、クレノソーマ属（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）、ジクチオカウルス属（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）、ジオクトフィーマ属（Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ）、ジペタロネーマ属（Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａ）、裂頭条虫属（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）、ジピリジウム属（Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍ）、ディロフィラリア属（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）、ドラクンクルス属（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ）、エンテロビウス属（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）、フィラロイデス属（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）、ヘモンクス属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、ラゴキラスカリス属（Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓ）、ロア糸状虫属ポリペプチド、マンソネラ属（Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ）、ムエレリウス属（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）、ナノフィエツス属（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）、ネカトール属（Ｎｅｃａｔｏｒ）、ネマトジルス属（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）、エソファゴストム属（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）、オンコセルカ属（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）、オピストルキス属（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）、オステルタギア属（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、パラフィラリア属（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）、パラゴニムス属（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）、パラスカリス属（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）、フィサロプテラ属（Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａ）、プロトストロンギルス属（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）、スピロセルカ属（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）、スピロメトラ属（Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ）、ステファノフィラリア属（Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ）、ストロンギロイデス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）、ストロンギルス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、テラジア属（Ｔｈｅｌａｚｉａ）、トキサスカリス属（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ）、トキソカラ属（Ｔｏｘｏｃａｒａ）、トリキネラ属（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、トリコストロンギルス属（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、トリチュリス属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ウンシナリア属（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）、又はウケレリア属（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）の１種以上に由来する請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
標的部分が第１のアミノ酸配列を含み、非天然免疫原が第２のアミノ酸配列を含み、前記第２の配列は第１の配列の１個以上の天然アミノ酸が第２の配列では１個以上の非天然アミノ酸で置換されているという点を除き、第１のアミノ酸配列と同一である請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
標的部分が第１のアミノ酸配列を含み、非天然免疫原が第２のアミノ酸配列を含み、前記第２の配列は第２のアミノ酸配列が更に１個以上の付加的な非天然アミノ酸を含むという点を除き、第１のアミノ酸配列と同一である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
１種以上の交差反応性抗体が非天然免疫原上の対応するエピトープに対して同一の配列を含む標的部分上のエピトープに特異的である請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
１種以上の交差反応性抗体が非天然免疫原上の対応するエピトープに対して異なる配列を含む標的部分上のエピトープに特異的である請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
非天然免疫原上の対応するエピトープ上の異なる配列が１個以上の非天然アミノ酸を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１個以上の非天然アミノ酸が抗体に接触可能である請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
非天然免疫原が標的部分と実質的に同様の構造を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
非天然免疫原が標的部分と実質的に同様の三次及び／又は四次構造を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
非天然アミノ酸が２０種類の標準アミノ酸の１種以外のものであり、非天然アミノ酸が下式：
【化１】
2011514322.tif 000013
2011514322.tif 000014
（式中、Ｒは２０種類の標準天然アミノ酸のいずれかで使用される側鎖以外の任意置換基であり；Ｒ１は２０種類の標準天然アミノ酸の１種で使用される任意置換基であり；Ｒ２はＲ２−Ｒ１が一緒になって２０種類の標準天然アミノ酸のいずれかの側鎖以外のものとなるような任意置換基であり；ＺはＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’であり；Ｒ’はＨ以外の任意置換基であり；Ｘ及びＹは各々Ｓ又はＯである）の構造を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
非天然アミノ酸がｐ−ニトロフェニルアラニン、ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ボロニルＰｈｅ、ｏ−ボロニルＰｈｅ、ｍ−ボロニルＰｈｅ、ｐ−アミノＰｈｅ、ｏ−アミノＰｈｅ、ｍ−アミノＰｈｅ、ｐ−アシルＰｈｅ、ｏ−アシルＰｈｅ、ｍ−アシルＰｈｅ、ｐ−ＯＭｅＰｈｅ、ｏ−ＯＭｅＰｈｅ、ｍ−ＯＭｅＰｈｅ、ｐ−スルホＰｈｅ、ｏ−スルホＰｈｅ、ｍ−スルホＰｈｅ、５−ニトロＨｉｓ、３−ニトロＴｙｒ、２−ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｉｌｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２−ニトロＴｒｐ、４−ニトロＴｒｐ、５−ニトロＴｒｐ、６−ニトロＴｒｐ、７−ニトロＴｒｐ、３−アミノチロシン、２−アミノチロシン、Ｏ−スルホチロシン、２−スルホオキシフェニルアラニン、３−スルホオキシオキシフェニルアラニン又はｐ−カルボキシフェニルアラニン、ｏ−カルボキシフェニルアラニン、及びｍ−カルボキシフェニルアラニンから構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
標的部分がＴＮＦαである請求項１２に記載の方法。
【請求項２９】
対象がマウスであり、標的部分がｍＴＮＦαであり、免疫原が非天然ｍＴＮＦαである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
非天然ｍＴＮＦαがｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ｍＴＮＦαを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
非天然ｍＴＮＦαがｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４−ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１３−ｍＴＮＦαから構成される群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
対象がヒトであり、標的部分がｈＴＮＦαであり、免疫原が非天然ｈＴＮＦαである請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
非天然ｈＴＮＦαがｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８７−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０５−ｈＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１４−ｈＴＮＦαから構成される群から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
対象における疾患状態を予防的又は治療的に処置する方法であって、前記方法が非天然免疫原を対象に投与する段階を含み、前記免疫原が１個以上の非天然アミノ酸を含み、前記非天然免疫原が疾患状態に関連する標的部分であって対象の体内に存在する１個以上の標的部分又は対象の体内に存在することが可能な１個以上の標的部分に対して交差反応性の抗体の産生を対象の体内で刺激する前記方法。
【請求項３５】
対象における疾患状態を予防的又は治療的に処置する方法であって、前記方法が、
１個以上の標的部分に対する抗体を作製する段階として、１個以上の非天然アミノ酸を含む非天然免疫原に対する抗体でありながら標的部分に交差反応性の抗体を作製する段階と；
抗体を対象に投与する段階を含む前記方法。
【請求項３６】
予防的又は治療的処置が対象にＢ細胞介在性応答及び／又はＴ細胞介在性応答を誘起する段階を含む請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
非天然免疫原を直交翻訳系で作製する請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３８】
非天然免疫原をｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系で作製する請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３９】
非天然免疫原が翻訳後修飾又は化学修飾されたアミノ酸を含まない請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４０】
非天然免疫原が２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種以外の非天然アミノ酸を含む請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４１】
免疫原の２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種の化学修飾以外の方法で非天然免疫原を作製する請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４２】
免疫原の２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種の翻訳後修飾以外の方法で非天然免疫原を作製する請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４３】
疾患状態が自己免疫疾患、癌、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、マイコプラズマ感染症、プリオン感染症、原生動物感染症、又は蠕虫感染症である請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４４】
対象がヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ニワトリ、小型鳥類、大型鳥類、爬虫類、及び両生類から構成される群から選択される請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４５】
標的部分がポリペプチドを含む請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４６】
標的部分がポリペプチド及び／又は糖質を含む請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４７】
標的部分が対象の自己部分である請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４８】
標的部分が疾患関連部分である請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項４９】
標的部分が自己免疫疾患に関連する自己抗原、腫瘍関連抗原、アルツハイマー病関連抗原、アミロイドβ４０、アミロイドβ４２、乳癌関連抗原、卵巣癌関連抗原、前立腺癌関連抗原、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、家系特異的腫瘍関連抗原、メラノサイト−メラノーマ家系抗原、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼもしくはチロシナーゼ関連蛋白質、チロシナーゼ関連蛋白質２、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、突然変異ｒａｓ、再構成ｂｃｒ／ａｂ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、突然変異もしくは野生型ｐ５３、チトクロームＰ４５０  １Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖの異常発現イントロン配列、ＣＡ１９−９、ｐ５３、ＯＣＡＡ、ＨＯＸＢ７、Ｃａ１２５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＣＴＡ−１、Ｃａ１５−３、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−１、ＣＸＣＲ４、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＣＰＲ）、又はＣＡ２７−２９の１種以上である請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
標的部分が対象の自己部分以外のものである請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項５１】
標的部分が細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、原生動物、蠕虫、又はプリオンに由来する請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
標的部分が細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、マイコプラズマ抗原、原生動物抗原、蠕虫抗原、プリオン抗原、ＨＩＶ抗原、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇａｇ、ＨＩＶｐｏｌ、ＨＩＶｅｎｖ、ＨＩＶｔａｔ、ＨＩＶｎｅｆ、ＨＩＶｒｅｖ、カリシウイルスカブシド抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、デルタ肝炎原因物質、単純ヘルペスウイルス糖蛋白質、水痘帯状疱疹ウイルス糖蛋白質、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルス核蛋白質、ＨＰＶカブシド蛋白質、バラインフルエンザウイルスヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ、ポリオウイルスカブシドポリペプチド、ＨｅｐＡ抗原、ワクシニアウイルスポリペプチド、狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｇ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＡ、ｂ型インフルエンザ桿菌外膜蛋白質、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ、マイコバクテリウムｍＡＰＧ、化膿連鎖球菌Ｍ蛋白質、肺炎連鎖球菌莢膜多糖体、ペスト菌Ｆ１、ペスト菌Ｖ抗原、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲蛋白質（ＰｆＣＳＰ）、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト表面蛋白質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝細胞期抗原１の熱帯熱マラリア原虫カルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ｃ−ｔｅｒｍ）、熱帯熱マラリア原虫輸送蛋白質１（ＰｆＥｘｐ−１）、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２８、Ｐｆｓ２５、又はＰｆｓ２３０の１種以上である請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
標的部分が細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、原生動物、蠕虫、プリオン、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、キャプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、デルマトフィルス属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモバルトネラ属（Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、Ｌ型菌、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ネオリケッチア属（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、アデノウイルス、アルファウイルス、カリシウイルス、コロナウイルス、ＣＭＶ、ジステンパーウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、ＥＢＶ、フラビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘパドナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎原因物質、Ｅ型もしくはＦ型肝炎ウイルス、ＧＢＶ−Ｃ、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、免疫不全ウイルス、ＨＩＶ、伝染性腹膜炎ウイルス、インフルエンザウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、白血病ウイルス  マールブルグウイルス、オルトミクソウイルス、パピローマウイルス、ＨＰＶ、パラインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、ＲＳＶ、パルボウイルス、ペスチウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、アブシジア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍ���ｎｉｕｍ）、アルタナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バシジオボラス属（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、ビポラリス属（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、コニディオボラス属（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カーブラリア属（Ｃｕｒｖａｌａｒｉａ）、エピデルモフィトン属（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、エクソフィアラ属（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、マズレラ属（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ）、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）、ミクロスポラム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、モニリエラ属（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フィアレモニウム属（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）、フィアロフォラ属（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードアレシェリア属（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ）、シュードミクロドキウム属（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、リノスポリジウム属（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、スコレコバシディウム属（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、ステムフィリウム属（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、キシロハイファ属（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）、バランチジウム属（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）、ベスノイチア属（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、エイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）、エンセファリトゾーン属（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ）、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、ハモンディア属（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）、ヘパトゾーン属（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ）、イソスポラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、ミクロスポリジア属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、ネオスポラ属（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）、ノゼマ属（Ｎｏｓｅｍａ）、ペンタトリコモナス属（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、サルコシスチス属（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、タイレリア属（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、アカントケイロネマ属（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａ）、アエルロストロンギルス属（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、アンシロストーマ属（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍ���）、アンギオストロンギルス属（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、アスカリス属（Ａｓｃａｒｉｓ）、ブルギア属（Ｂｒｕｇｉａ）、ブノストムーム属（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）、キャピラリア属（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）、チャベルチア属（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）、クーペリア属（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）、クレノソーマ属（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）、ジクチオカウルス属（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）、ジオクトフィーマ属（Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ）、ジペタロネーマ属（Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａ）、裂頭条虫属（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）、ジピリジウム属（Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍ）、ディロフィラリア属（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）、ドラクンクルス属（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ）、エンテロビウス属（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）、フィラロイデス属（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）、ヘモンクス属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、ラゴキラスカリス属（Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓ）、ロア糸状虫属ポリペプチド、マンソネラ属（Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ）、ムエレリウス属（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）、ナノフィエツス属（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）、ネカトール属（Ｎｅｃａｔｏｒ）、ネマトジルス属（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）、エソファゴストム属（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）、オンコセルカ属（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）、オピストルキス属（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）、オステルタギア属（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、パラフィラリア属（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）、パラゴニムス属（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）、パラスカリス属（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）、フィサロプテラ属（Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａ）、プロトストロンギルス属（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）、スピロセルカ属（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）、スピロメトラ属（Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ）、ステファノフィラリア属（Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ）、ストロンギロイデス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）、ストロンギルス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、テラジア属（Ｔｈｅｌａｚｉａ）、トキサスカリス属（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ）、トキソカラ属（Ｔｏｘｏｃａｒａ）、トリキネラ属（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、トリコストロンギルス属（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、トリチュリス属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ウンシナリア属（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）、又はウケレリア属（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）の１種以上に由来する請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
標的部分が第１のアミノ酸配列を含み、非天然免疫原が第２のアミノ酸配列を含み、前記第２の配列は第１の配列の１個以上の天然アミノ酸が第２の配列では１個以上の非天然アミノ酸で置換されているという点を除き、第１のアミノ酸配列と同一である請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項５５】
標的部分が第１のアミノ酸配列を含み、非天然免疫原が第２のアミノ酸配列を含み、前記第２の配列は第２のアミノ酸配列が更に１個以上の付加的な非天然アミノ酸を含むという点を除き、第１のアミノ酸配列と同一である請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項５６】
１種以上の交差反応性抗体が非天然免疫原上の対応するエピトープに対して同一の配列を含む標的部分上のエピトープに特異的である請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項５７】
１種以上の交差反応性抗体が非天然免疫原上の対応するエピトープに対して異なる配列を含む標的部分上のエピトープに特異的である請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項５８】
非天然免疫原上の対応するエピトープ上の異なる配列が１個以上の非天然アミノ酸を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
１個以上の非天然アミノ酸が抗体に接触可能である請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項６０】
非天然免疫原が標的部分と実質的に同様の構造を含む請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項６１】
非天然免疫原が標的部分と実質的に同様の三次及び／又は四次構造を含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
非天然アミノ酸が２０種類の標準アミノ酸の１種以外のものであり、非天然アミノ酸が下式：
【化２】
2011514322.tif 000015
2011514322.tif 000016
（式中、Ｒは２０種類の標準天然アミノ酸のいずれかで使用される側鎖以外の任意置換基であり；Ｒ１は２０種類の標準天然アミノ酸の１種で使用される任意置換基であり；Ｒ２はＲ２−Ｒ１が一緒になって２０種類の標準天然アミノ酸のいずれかの側鎖以外のものとなるような任意置換基であり；ＺはＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’であり；Ｒ’はＨ以外の任意置換基であり；Ｘ及びＹは各々Ｓ又はＯである）の構造を含む請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項６３】
非天然アミノ酸がｐ−ニトロフェニルアラニンである請求項に記載の方法。
【請求項６４】
非天然アミノ酸がｐ−ニトロフェニルアラニン、ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ボロニルＰｈｅ、ｏ−ボロニルＰｈｅ、ｍ−ボロニルＰｈｅ、ｐ−アミノＰｈｅ、ｏ−アミノＰｈｅ、ｍ−アミノＰｈｅ、ｐ−アシルＰｈｅ、ｏ−アシルＰｈｅ、ｍ−アシルＰｈｅ、ｐ−ＯＭｅＰｈｅ、ｏ−ＯＭｅＰｈｅ、ｍ−ＯＭｅＰｈｅ、ｐ−スルホＰｈｅ、ｏ−スルホＰｈｅ、ｍ−スルホＰｈｅ、５−ニトロＨｉｓ、３−ニトロＴｙｒ、２−ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｉｌｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２−ニトロＴｒｐ、４−ニトロＴｒｐ、５−ニトロＴｒｐ、６−ニトロＴｒｐ、７−ニトロＴｒｐ、３−アミノチロシン、２−アミノチロシン、Ｏ−スルホチロシン、２−スルホオキシフェニルアラニン、３−スルホオキシオキシフェニルアラニン又はｐ−カルボキシフェニルアラニン、ｏ−カルボキシフェニルアラニン、及びｍ−カルボキシフェニルアラニンから構成される群から選択される請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項６５】
標的部分がＴＮＦαである請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項６６】
疾患状態が内毒素ショック、脳マラリア、自己免疫疾患、多臓器不全、多発性硬化症、心機能障害、アテローム性動脈硬化症、虚血再潅流傷害、インスリン抵抗性、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸疾患、悪液質、敗血症ショック、エイズ、移植片対宿主病、細菌感染防御性肉芽腫、成人呼吸窮迫症候群、及びシリカ肺線維症の１種以上である請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
対象がマウスであり、標的部分がｍＴＮＦαであり、免疫原が非天然ｍＴＮＦαである請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
非天然ｍＴＮＦαがｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ｍＴＮＦαを含む請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
非天然ｍＴＮＦαがｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４−ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１３−ｍＴＮＦαから構成される群から選択される請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
対象がヒトであり、標的部分がｈＴＮＦαであり、免疫原が非天然ｈＴＮＦαである請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
非天然ｈＴＮＦαがｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８７−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０５−ｈＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１４−ｈＴＮＦαから構成される群から選択される請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ワクチンの製造方法であって、
非天然アミノ酸を含まない抗体治療用標的部分を同定する段階と；
１個以上の非天然アミノ酸を含み、対象に投与すると、対象が非天然免疫原に対する抗体でありながら標的部分に対して交差反応性の抗体を産生するように標的部分と構造的に類似する非天然免疫原を準備する段階と；
非天然免疫原を１種以上の医薬的に許容可能なアジュバント、キャリヤー又は賦形剤と混合し、ワクチンを製造する段階を含む前記方法。
【請求項７３】
非天然免疫原を準備する段階が直交翻訳系で非天然免疫原を作製する段階を含む請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
非天然免疫原を準備する段階がｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系で非天然免疫原を作製する段階を含む請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
非天然免疫原が２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種以外の非天然アミノ酸を含む請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
免疫原の２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種の化学修飾以外の方法で非天然免疫原を作製する請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
免疫原の２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種の翻訳後修飾以外の方法で非天然免疫原を作製する請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
対象がヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ニワトリ、小型鳥類、大型鳥類、爬虫類、及び両生類から構成される群から選択される請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
標的部分がポリペプチドを含む請求項７２に記載の方法。
【請求項８０】
標的部分がポリペプチド及び／又は糖質を含む請求項７２に記載の方法。
【請求項８１】
標的部分が対象の自己部分である請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
標的部分が疾患関連部分である請求項７２に記載の方法。
【請求項８３】
標的部分が自己免疫疾患に関連する自己抗原、腫瘍関連抗原、アルツハイマー病関連抗原、アミロイドβ４０、アミロイドβ４２、乳癌関連抗原、卵巣癌関連抗原、前立腺癌関連抗原、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、家系特異的腫瘍関連抗原、メラノサイト−メラノーマ家系抗原、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼもしくはチロシナーゼ関連蛋白質、チロシナーゼ関連蛋白質２、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、突然変異ｒａｓ、再構成ｂｃｒ／ａｂ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、突然変異もしくは野生型ｐ５３、チトクロームＰ４５０  １Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖの異常発現イントロン配列、ＣＡ１９−９、ｐ５３、ＯＣＡＡ、ＨＯＸＢ７、Ｃａ１２５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＣＴＡ−１、Ｃａ１５−３、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−１、ＣＸＣＲ４、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＣＰＲ）、又はＣＡ２７−２９の１種以上である請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
標的部分が対象の自己部分以外のものである請求項７２に記載の方法。
【請求項８５】
標的部分が細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、原生動物、蠕虫、又はプリオンに由来する請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
標的部分が細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、マイコプラズマ抗原、原生動物抗原、蠕虫抗原、プリオン抗原、ＨＩＶ抗原、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇａｇ、ＨＩＶｐｏｌ、ＨＩＶｅｎｖ、ＨＩＶｔａｔ、ＨＩＶｎｅｆ、ＨＩＶｒｅｖ、カリシウイルスカブシド抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、デルタ肝炎原因物質、単純ヘルペスウイルス糖蛋白質、水痘帯状疱疹ウイルス糖蛋白質、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルス核蛋白質、ＨＰＶカブシド蛋白質、バラインフルエンザウイルスヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ、ポリオウイルスカブシドポリペプチド、ＨｅｐＡ抗原、ワクシニアウイルスポリペプチド、狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｇ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＡ、ｂ型インフルエンザ桿菌外膜蛋白質、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ、マイコバクテリウムｍＡＰＧ、化膿連鎖球菌Ｍ蛋白質、肺炎連鎖球菌莢膜多糖体、ペスト菌Ｆ１、ペスト菌Ｖ抗原、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲蛋白質（ＰｆＣＳＰ）、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト表面蛋白質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝細胞期抗原１の熱帯熱マラリア原虫カルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ｃ−ｔｅｒｍ）、熱帯熱マラリア原虫輸送蛋白質１（ＰｆＥｘｐ−１）、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２８、Ｐｆｓ２５、又はＰｆｓ２３０の１種以上である請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
標的部分が細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、原生動物、蠕虫、プリオン、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、キャプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、デルマトフィルス属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモバルトネラ属（Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、Ｌ型菌、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ネオリケッチア属（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、アデノウイルス、アルファウイルス、カリシウイルス、コロナウイルス、ＣＭＶ、ジステンパーウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、ＥＢＶ、フラビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘパドナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎原因物質、Ｅ型もしくはＦ型肝炎ウイルス、ＧＢＶ−Ｃ、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、免疫不全ウイルス、ＨＩＶ、伝染性腹膜炎ウイルス、インフルエンザウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、白血病ウイルス  マールブルグウイルス、オルトミクソウイルス、パピローマウイルス、ＨＰＶ、パラインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、ＲＳＶ、パルボウイルス、ペスチウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、アブシジア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍ���ｎｉｕｍ）、アルタナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バシジオボラス属（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、ビポラリス属（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、コニディオボラス属（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カーブラリア属（Ｃｕｒｖａｌａｒｉａ）、エピデルモフィトン属（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、エクソフィアラ属（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、マズレラ属（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ）、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）、ミクロスポラム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、モニリエラ属（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フィアレモニウム属（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）、フィアロフォラ属（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードアレシェリア属（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ）、シュードミクロドキウム属（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、リノスポリジウム属（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、スコレコバシディウム属（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、ステムフィリウム属（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、キシロハイファ属（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）、バランチジウム属（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）、ベスノイチア属（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、エイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）、エンセファリトゾーン属（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ）、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、ハモンディア属（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）、ヘパトゾーン属（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ）、イソスポラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、ミクロスポリジア属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、ネオスポラ属（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）、ノゼマ属（Ｎｏｓｅｍａ）、ペンタトリコモナス属（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、サルコシスチス属（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、タイレリア属（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、アカントケイロネマ属（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａ）、アエルロストロンギルス属（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、アンシロストーマ属（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍ���）、アンギオストロンギルス属（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、アスカリス属（Ａｓｃａｒｉｓ）、ブルギア属（Ｂｒｕｇｉａ）、ブノストムーム属（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）、キャピラリア属（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）、チャベルチア属（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）、クーペリア属（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）、クレノソーマ属（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）、ジクチオカウルス属（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）、ジオクトフィーマ属（Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ）、ジペタロネーマ属（Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａ）、裂頭条虫属（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）、ジピリジウム属（Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍ）、ディロフィラリア属（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）、ドラクンクルス属（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ）、エンテロビウス属（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）、フィラロイデス属（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）、ヘモンクス属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、ラゴキラスカリス属（Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓ）、ロア糸状虫属ポリペプチド、マンソネラ属（Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ）、ムエレリウス属（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）、ナノフィエツス属（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）、ネカトール属（Ｎｅｃａｔｏｒ）、ネマトジルス属（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）、エソファゴストム属（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）、オンコセルカ属（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）、オピストルキス属（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）、オステルタギア属（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、パラフィラリア属（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）、パラゴニムス属（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）、パラスカリス属（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）、フィサロプテラ属（Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａ）、プロトストロンギルス属（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）、スピロセルカ属（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）、スピロメトラ属（Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ）、ステファノフィラリア属（Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ）、ストロンギロイデス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）、ストロンギルス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、テラジア属（Ｔｈｅｌａｚｉａ）、トキサスカリス属（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ）、トキソカラ属（Ｔｏｘｏｃａｒａ）、トリキネラ属（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、トリコストロンギルス属（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、トリチュリス属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ウンシナリア属（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）、又はウケレリア属（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）の１種以上に由来する請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
標的部分が第１のアミノ酸配列を含み、非天然免疫原が第２のアミノ酸配列を含み、前記第２の配列は第１の配列の１個以上の天然アミノ酸が第２の配列では１個以上の非天然アミノ酸で置換されているという点を除き、第１のアミノ酸配列と同一である請求項７２に記載の方法。
【請求項８９】
標的部分が第１のアミノ酸配列を含み、非天然免疫原が第２のアミノ酸配列を含み、前記第２の配列は第２のアミノ酸配列が更に１個以上の付加的な非天然アミノ酸を含むという点を除き、第１のアミノ酸配列と同一である請求項７２に記載の方法。
【請求項９０】
１種以上の交差反応性抗体が非天然免疫原上の対応するエピトープに対して同一の配列を含む標的部分上のエピトープに特異的である請求項７２に記載の方法。
【請求項９１】
１種以上の交差反応性抗体が非天然免疫原上の対応するエピトープに対して異なる配列を含む標的部分上のエピトープに特異的である請求項７２に記載の方法。
【請求項９２】
非天然免疫原上の対応するエピトープ上の異なる配列が１個以上の非天然アミノ酸を含む請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
１個以上の非天然アミノ酸が抗体に接触可能である請求項７２に記載の方法。
【請求項９４】
非天然免疫原が標的部分と実質的に同様の構造を含む請求項７２に記載の方法。
【請求項９５】
非天然免疫原が標的部分と実質的に同様の三次及び／又は四次構造を含む請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
非天然アミノ酸が２０種類の標準天然アミノ酸の１種以外のものであり、非天然アミノ酸が下式：
【化３】
2011514322.tif 000017
（式中、Ｒは２０種類の標準天然アミノ酸のいずれかで使用される側鎖以外の任意置換基であり；Ｒ１は２０種類の標準天然アミノ酸の１種で使用される任意置換基であり；Ｒ２はＲ２−Ｒ１が一緒になって２０種類の標準天然アミノ酸のいずれかの側鎖以外のものとなるような任意置換基であり；ＺはＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’であり；Ｒ’はＨ以外の任意置換基であり；Ｘ及びＹは各々Ｓ又はＯである）の構造を含む請求項７２に記載の方法。
【請求項９７】
非天然アミノ酸がｐ−ニトロフェニルアラニン、ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ボロニルＰｈｅ、ｏ−ボロニルＰｈｅ、ｍ−ボロニルＰｈｅ、ｐ−アミノＰｈｅ、ｏ−アミノＰｈｅ、ｍ−アミノＰｈｅ、ｐ−アシルＰｈｅ、ｏ−アシルＰｈｅ、ｍ−アシルＰｈｅ、ｐ−ＯＭｅＰｈｅ、ｏ−ＯＭｅＰｈｅ、ｍ−ＯＭｅＰｈｅ、ｐ−スルホＰｈｅ、ｏ−スルホＰｈｅ、ｍ−スルホＰｈｅ、５−ニトロＨｉｓ、３−ニトロＴｙｒ、２−ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｉｌｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２−ニトロＴｒｐ、４−ニトロＴｒｐ、５−ニトロＴｒｐ、６−ニトロＴｒｐ、７−ニトロＴｒｐ、３−アミノチロシン、２−アミノチロシン、Ｏ−スルホチロシン、２−スルホオキシフェニルアラニン、３−スルホオキシオキシフェニルアラニン又はｐ−カルボキシフェニルアラニン、ｏ−カルボキシフェニルアラニン、及びｍ−カルボキシフェニルアラニンから構成される群から選択される請求項７２に記載の方法。
【請求項９８】
標的部分がＴＮＦαである請求項７２に記載の方法。
【請求項９９】
対象がマウスであり、標的部分がｍＴＮＦαであり、非天然免疫原が非天然ｍＴＮＦαである請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
非天然ｍＴＮＦαがｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ｍＴＮＦαを含む請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
非天然ｍＴＮＦαがｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４−ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１３−ｍＴＮＦαから構成される群から選択される請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
対象がヒトであり、標的部分がｈＴＮＦαであり、免疫原が非天然ｈＴＮＦαである請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
非天然ｈＴＮＦαがｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８７−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０５−ｈＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１４−ｈＴＮＦαから構成される群から選択される請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項７２に記載の方法により製造されたワクチン。
【請求項１０５】
ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ＴＮＦαを含む非天然ＴＮＦαを細胞で生産する方法であって、
アミノ酸８６位に少なくとも１個のセレクターコドンを含み、ＴＮＦαをコードする核酸を含む細胞を適切な培地で増殖させる段階と；
ｐＮＯ２Ｐｈｅを準備する段階を含み；
細胞が更に、
セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
Ｏ−ｔＲＮＡをｐＮＯ２Ｐｈｅで優先的にアミノアシル化し、セレクターコドンに応答してｐＮＯ２Ｐｈｅをアミノ酸８６位に組込むことにより、非天然ＴＮＦαを生成する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
を含む前記方法。
【請求項１０６】
ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ｍＴＮＦαを含む非天然ＴＮＦα。
【請求項１０７】
ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４−ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１３−ｍＴＮＦαから構成される群から選択されるＴＮＦαを含む非天然ＴＮＦα。
【請求項１０８】
ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８７−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０５−ｈＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１４−ｈＴＮＦαから構成される群から選択されるＴＮＦαを含む非天然ＴＮＦα。
【請求項１０９】
請求項１０６、１０７又は１０８に記載の非天然ＴＮＦαを含有する組成物。
【請求項１１０】
請求項１０６、１０７又は１０８に記載の非天然ＴＮＦαに対する抗体。
【請求項１１１】
請求項１０６、１０７又は１０８に記載の非天然ＴＮＦαに対する抗体であって、非天然アミノ酸を含まないＴＮＦαに対して交差反応性である前記抗体。
【請求項１１２】
請求項１１０又は１１１に記載の抗体を含有する組成物。
【請求項１１３】
ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４を含む非天然ＲＢＰ４。
【請求項１１４】
請求項１１３に記載の非天然ＲＢＰ４を含有する組成物。
【請求項１１５】
請求項１１３に記載の非天然ＲＢＰ４に対する抗体であって、非天然アミノ酸を含まないＲＢＰ４に対して交差反応性である前記抗体。
【請求項１１６】
請求項１１５に記載の抗体を含有する組成物。
【請求項１１７】
免疫原の合成中に１個以上の非天然アミノ酸を非天然免疫原に組込む請求項１、３４、３５又は７２に記載の方法。
【請求項１１８】
翻訳後修飾又は合成後化学修飾以外の方法で１個以上の非天然アミノ酸を非天然免疫原に組込む請求項１、３４、３５又は７２に記載の方法。
【請求項１１９】
直交翻訳、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳、ネイティブケミカルライゲーション、発現蛋白質ライゲーション、又は固相合成法の１種以上により１個以上の非天然アミノ酸を非天然免疫原に組込む請求項１、３４、３５又は７２に記載の方法。
【請求項１２０】
非天然免疫原がグリコシル化、ニトロアリール修飾、硝酸化、アルキル化、アセチル化、酸化、硫酸化、又はリン酸化された２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種以上を含む請求項１、３４、３５又は７２に記載の方法。
【請求項１２１】
翻訳後修飾以外の方法又は化学修飾以外の方法により、１個以上のアミノ酸をグリコシル化、ニトロアリール修飾、硝酸化、アルキル化、アセチル化、酸化、硫酸化、又はリン酸化する請求項１、３４、３５又は７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）からの助成番号ＨＬ−１６４１１（５ＲＯ１ＧＭ６２１５９）として米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利をもつ。
【０００２】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮特許出願第６１／０６５，１４８号（出願日２００８年２月８日）；６１／０６５，５１５号（出願日２００８年２月１２日）；６１／１３５，９４７号（出願日２００８年７月２５日）；６１／１３７，６７６号（出願日２００８年７月３１日）；６１／２０３，９４８号（出願日２００８年１２月２９日）；６１／０６５，１４７号（出願日２００８年２月８日）；６１／０６５，５９０号（出願日２００８年２月１２日）；６１／１３５，９６９号（出願日２００８年７月２５日）；６１／１３７，６３５号（出願日２００８年７月３１日）；及び６１／２０３，９４７号（出願日２００８年１２月２９日）の優先権と特典を主張し、その開示内容全体を全目的で本明細書に援用する。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ標的部分（即ち自己部分又は外来部分）に対応する免疫原を投与することにより、自己抗原（例えばＴＮＦα又は無数の他の自己抗原のいずれか）に対する免疫応答を対象に誘発するため、又は外来（非自己）抗原に対する免疫応答を対象に誘発もしくは強化するための組成物と方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
現代医療の大きな課題の１つは（例えば自己抗原に対する対象の免疫寛容により）対象による抗体産生を誘起しない病態又は強力／強靭な抗体応答を誘起しない病態（例えば所定の細菌／ウイルス感染症）の治療に関する。このような分類に該当する多数の病態が存在する。例えば、対象自身の自己蛋白質に起因又は関連する病態は（クローン病、内毒素ショック、脳マラリア等に関与／関係する）ＴＮＦα、（ＳＬＥに関与する）ＩＬ１０等の部分に関連する場合がある。更に、対象がＨＩＶ、ＣＭＶ、結核、及びブドウ球菌等の各種ウイルス及び細菌感染症に対して強靭な抗体応答を誘発することは困難であると思われる。
【０００５】
このような免疫応答の問題に対処するために多数の異なるアプローチが提案されている。例えば、所定のアプローチはアジュバント／キャリヤーの改善、抗原への強力なＴ細胞エピトープの導入、コンジュゲートワクチン、コンビネーションワクチンを検討している。例えば、Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．Ｃ．Ｊ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｈａｍ，Ｄ．Ａ．Ｊｒ．，Ｅｄｓ．（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００６），ｐｐ．２３５−２５５；Ｍａｋｅｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１（３）：３９９−４１０（２００２）；Ｄａｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：６６６（１９９９）；及びＲｅｓｔｉｆｏ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：６５８（１９９６）参照。他のアプローチは非特異的標識抗原（即ちジアゾニウム誘導体化抗原）による免疫を試みている。Ｗｅｉｇｌｅ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １２１：２８９（１９６５）参照。
【０００６】
しかし、特定自己蛋白質（例えばＴＮＦα）、及び／又は各種病原体（例えば細菌、ウイルス、真菌、及び／又はプリオン病原体）に由来する特定蛋白質に対する対象の免疫応答を誘発又は強化するための方法と組成物として、より良好でより広範に適用可能な方法と組成物が引き続き必要とされている。本発明は通読後に明らかな通り、これら及び他の利点を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
自己蛋白質に対する強い免疫応答を選択的に誘導できること、又は外来抗原の特定エピトープの免疫原性を強化できることは癌、蛋白質フォールディング病、及び感染症（例えば細菌又はウイルス感染症）を含む多数の疾患状態用のワクチンの製造に有意義である。本発明はワクチン接種に使用する非天然免疫原を作製するため又は受動免疫で使用する抗体を作製するために蛋白質への非天然アミノ酸の組込みを利用する。本発明において、非天然アミノ酸を付加する免疫原はワクチン接種／免疫する対象の体内に存在する標的部分（例えば疾患関連部分）又は対象の体内に存在することが可能な標的部分（例えば疾患関連部分）に対応する。非天然アミノ酸を組込んだ免疫原を対象に投与する態様において、非天然アミノ酸の存在は標的（例えば疾患関連）部分に対して交差反応性の免疫応答を免疫原に対して誘起する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の側面において、本発明は対象の体内に存在するか又は対象の体内に存在することが可能な標的部分（例えばポリペプチド、糖質、又は両者の組合せ）に対する免疫応答（例えばＢ細胞介在性応答及び／又はＴ細胞介在性応答）を対象に誘発又は強化する方法を提供する。前記方法は１個以上の非天然アミノ酸を含む非天然免疫原を準備する段階と、非天然免疫原を対象に投与する段階を含む。対象（例えばヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ニワトリ、小型鳥類、大型鳥類、爬虫類及び／又は両生類）は非天然免疫原に対する１種以上の抗体を産生し、前記抗体は標的部分に対して交差反応性である（従って標的に対する免疫応答を誘発又は強化する）。
【０００９】
免疫応答を誘発又は強化するために対象に投与する非天然免疫原は対象の体内に存在する少なくとも１個の標的部分（又は対象の体内に存在することが可能な少なくとも１個の部分）に対応する。所定態様において、標的部分は第１のアミノ酸配列を含むことができ、非天然免疫原は、標的部分の配列の１個以上の天然アミノ酸が免疫原の配列では１個以上の非天然アミノ酸で置換されているという点を除き、標的の配列と同一の第２のアミノ酸配列を含むことができる。代替的又は付加的に、標的部分は第１のアミノ酸配列を含むことができ、非天然免疫原は、免疫原の配列が更に１個以上の付加的な非天然アミノ酸を含むという点を除き、標的部分の配列と同一の第２のアミノ酸配列を含むことができる。各種態様において、非天然免疫原はこの免疫原が由来する標的部分と実質的に同様の構造を含むことができ、及び／又はこの免疫原が由来する標的部分と実質的に同様の三次及び／又は四次構造を含むことができる。
【００１０】
非天然免疫原に存在する１個以上の非天然アミノ酸は場合により抗体に接触可能とすることができる。この側面の方法で産生された１種以上の交差反応性抗体は場合により非天然免疫原上の対応するエピトープと同一の配列を含む標的部分上のエピトープに特異的でもよい。他方、交差反応性抗体は場合により非天然免疫原上の対応するエピトープと異なる配列（例えば場合により１個以上の非天然アミノ酸を含む別の配列）を含む標的部分上のエピトープに特異的でもよい。
【００１１】
この側面では、標的部分に由来する非天然免疫原を種々の方法で作製することができる。好ましい態様では、直交翻訳系で非天然免疫原を作製する。他方、場合により（例えば選択圧組込み法による）ｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系；（例えば非天然アミノ酸で化学的にアシル化されたｔＲＮＡを使用する）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系；翻訳後修飾以外の方法；又は免疫原に存在する２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種の化学修飾以外の方法で非天然免疫原を作製することもできる。
【００１２】
非天然免疫原に組込むことができる非天然アミノ酸は場合により２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種以外の任意非天然アミノ酸を含むことができる。組込むことができる非天然アミノ酸は更に２０種類の標準アミノ酸の１種以外の任意非天然アミノ酸を含むことができ、非天然アミノ酸は下式：
【化１】
2011514322.tif 000003
の構造を含み、式中、Ｒは２０種類の標準天然アミノ酸のいずれかで使用される側鎖以外の任意置換基であり；Ｒ１は２０種類の標準天然アミノ酸の１種で使用される任意置換基であり；Ｒ２はＲ２−Ｒ１が一緒になって２０種類の標準天然アミノ酸のいずれかの側鎖以外のものとなるような任意置換基であり；ＺはＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’であり；Ｒ’はＨ以外の任意置換基であり；Ｘ及びＹは各々Ｓ又はＯであり、Ｒ’がＨの場合にはＲはＬ配置をとる。所定態様において、免疫原に組込むことができる１個以上の非天然アミノ酸は場合により、ｐ−ニトロフェニルアラニン、ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ボロニルＰｈｅ、ｏ−ボロニルＰｈｅ、ｍ−ボロニルＰｈｅ、ｐ−アミノＰｈｅ、ｏ−アミノＰｈｅ、ｍ−アミノＰｈｅ、ｐ−アシルＰｈｅ、ｏ−アシルＰｈｅ、ｍ−アシルＰｈｅ、ｐ−ＯＭｅＰｈｅ、ｏ−ＯＭｅＰｈｅ、ｍ−ＯＭｅＰｈｅ、ｐ−スルホＰｈｅ、ｏ−スルホＰｈｅ、ｍ−スルホＰｈｅ、５−ニトロＨｉｓ、３−ニトロＴｙｒ、２−ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｉｌｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２−ニトロＴｒｐ、４−ニトロＴｒｐ、５−ニトロＴｒｐ、６−ニトロＴｒｐ、７−ニトロＴｒｐ、３−アミノチロシン、２−アミノチロシン、Ｏ−スルホチロシン、２−スルホオキシフェニルアラニン、３−スルホオキシオキシフェニルアラニン又はｐ−カルボキシフェニルアラニン、ｏ−カルボキシフェニルアラニン、及びｍ−カルボキシフェニルアラニンの１種以上を含むことができる。
【００１３】
所定態様において、免疫応答を誘発又は強化させる標的部分は非自己部分（例えば細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、原生動物、蠕虫、又はプリオンに由来する部分）とすることができる。非自己標的部分は場合により細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、マイコプラズマ抗原、原生動物抗原、蠕虫抗原、プリオン抗原、ＨＩＶ抗原、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｇａｇ、ＨＩＶｐｏｌ、ＨＩＶｅｎｖ、ＨＩＶｔａｔ、ＨＩＶｎｅｆ、ＨＩＶｒｅｖ、カリシウイルスカブシド抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、Ｂ型肝炎表面抗原、デルタ肝炎原因物質、単純ヘルペスウイルス糖蛋白質、水痘帯状疱疹ウイルス糖蛋白質、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルス核蛋白質、ＨＰＶカブシド蛋白質、バラインフルエンザウイルスヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ、ポリオウイルスカブシドポリペプチド、ＨｅｐＡ抗原、ワクシニアウイルスポリペプチド、狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｇ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＡ、ｂ型インフルエンザ桿菌外膜蛋白質、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ、マイコバクテリウムｍＡＰＧ、化膿連鎖球菌Ｍ蛋白質、肺炎連鎖球菌莢膜多糖体、ペスト菌Ｆ１、ペスト菌Ｖ抗原、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲蛋白質（ＰｆＣＳＰ）、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト表面蛋白質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝細胞期抗原１の熱帯熱マラリア原虫カルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ｃ−ｔｅｒｍ）、熱帯熱マラリア原虫輸送蛋白質１（ＰｆＥｘｐ−１）、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２８、Ｐｆｓ２５、又はＰｆｓ２３０の１種以上を含むことができる。
【００１４】
標的非自己部分は場合により細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、原生動物、蠕虫、プリオン、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、キャプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、デルマトフィルス属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモバルトネラ属（Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、Ｌ型菌、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ネオリケッチア属（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、アデノウイルス、アルファウイルス、カリシウイルス、コロナウイルス、ＣＭＶ、ジステンパーウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、ＥＢＶ、フラビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘパドナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎原因物質、Ｅ型もしくはＦ型肝炎ウイルス、ＧＢＶ−Ｃ、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、免疫不全ウイルス、ＨＩＶ、伝染性腹膜炎ウイルス、インフルエンザウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、白血病ウイルス  マールブルグウイルス、オルトミクソウイルス、パピローマウイルス、ＨＰＶ、パラインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、ＲＳＶ、パルボウイルス、ペスチウイルス、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、アブシジア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、アクレモニウ���属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アルタナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バシジオボラス属（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、ビポラリス属（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、コニディオボラス属（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カーブラリア属（Ｃｕｒｖａｌａｒｉａ）、エピデルモフィトン属（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、エクソフィアラ属（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、マズレラ属（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ）、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）、ミクロスポラム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、モニリエラ属（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フィアレモニウム属（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）、フィアロフォラ属（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードアレシェリア属（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ）、シュードミクロドキウム属（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、リノスポリジウム属（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、スコレコバシディウム属（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、ステムフィリウム属（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、キシロハイファ属（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）、バランチジウム属（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）、ベスノイチア属（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、エイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）、エンセファリトゾーン属（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ）、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、ハモンディア属（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）、ヘパトゾーン属（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ）、イソスポラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、ミクロスポリジア属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、ネオスポラ属（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）、ノゼマ属（Ｎｏｓｅｍａ）、ペンタトリコモナス属（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、サルコシスチス属（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、タイレリア属（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、アカントケイロネマ属（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａ）、アエルロストロンギルス属（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、アンシロストーマ属（Ａｎ���ｙｌｏｓｔｏｍａ）、アンギオストロンギルス属（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、アスカリス属（Ａｓｃａｒｉｓ）、ブルギア属（Ｂｒｕｇｉａ）、ブノストムーム属（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）、キャピラリア属（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）、チャベルチア属（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）、クーペリア属（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）、クレノソーマ属（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）、ジクチオカウルス属（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）、ジオクトフィーマ属（Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ）、ジペタロネーマ属（Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａ）、裂頭条虫属（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）、ジピリジウム属（Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍ）、ディロフィラリア属（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）、ドラクンクルス属（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ）、エンテロビウス属（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）、フィラロイデス属（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）、ヘモンクス属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、ラゴキラスカリス属（Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓ）、ロア糸状虫属ポリペプチド、マンソネラ属（Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ）、ムエレリウス属（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）、ナノフィエツス属（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）、ネカトール属（Ｎｅｃａｔｏｒ）、ネマトジルス属（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）、エソファゴストム属（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）、オンコセルカ属（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）、オピストルキス属（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）、オステルタギア属（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、パラフィラリア属（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）、パラゴニムス属（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）、パラスカリス属（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）、フィサロプテラ属（Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａ）、プロトストロンギルス属（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）、スピロセルカ属（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）、スピロメトラ属（Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ）、ステファノフィラリア属（Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ）、ストロンギロイデス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）、ストロンギルス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、テラジア属（Ｔｈｅｌａｚｉａ）、トキサスカリス属（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ）、トキソカラ属（Ｔｏｘｏｃａｒａ）、トリキネラ属（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、トリコストロンギルス属（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、トリチュリス属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ウンシナリア属（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）、又はウケレリア属（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）の１種以上に由来（又は起因）することができる。
【００１５】
本発明の他の態様において、免疫応答を誘発又は強化する標的部分は場合により対象の自己部分を含むことができる。自己部分は場合により各種疾患関連部分のいずれか（例えば自己免疫疾患に関連する自己抗原、腫瘍関連抗原、アルツハイマー病関連抗原、アミロイドβ４０、アミロイドβ４２、乳癌関連抗原、卵巣癌関連抗原、前立腺癌関連抗原、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、家系特異的腫瘍関連抗原、メラノサイト−メラノーマ家系抗原、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼもしくはチロシナーゼ関連蛋白質、チロシナーゼ関連蛋白質２、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、突然変異ｒａｓ、再構成ｂｃｒ／ａｂ１、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、突然変異もしくは野生型ｐ５３、チトクロームＰ４５０  １Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖの異常発現イントロン配列、ＣＡ１９−９、ｐ５３、ＯＣＡＡ、ＨＯＸＢ７、Ｃａ１２５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＣＴＡ−１、Ｃａ１５−３、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−１、ＣＸＣＲ４、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＣＰＲ）、又はＣＡ２７−２９）を含むことができる。
【００１６】
所定態様において、標的自己部分はＴＮＦαであり、非天然免疫原は非天然ＴＮＦαである。例えば、対象がマウスである態様において、標的部分はｍＴＮＦαとすることができ、免疫原は非天然ｍＴＮＦα（例えばｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４−ｍＴＮＦα、又はｐＮＯ２Ｐｈｅ１１３−ｍＴＮＦαを含む非天然ｍＴＮＦα）とすることができる。
【００１７】
同様に、対象がヒトである態様において、標的自己部分はｈＴＮＦαとすることができ、免疫原は非天然ｈＴＮＦα（例えばｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８７−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０５−ｈＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１４−ｈＴＮＦα）とすることができる。
【００１８】
別の側面において、本発明は例えばＢ細胞介在性応答及び／又はＴ細胞介在性応答を対象に誘発することにより、対象の疾患状態を予防的又は治療的に処置する方法を提供する。各種態様において、疾患状態は限定されないが、自己免疫疾患、癌、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、マイコプラズマ感染症、プリオン感染症、原生動物感染症、又は蠕虫感染症の１種以上が挙げられる。この側面の第１組の方法は、１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ非天然免疫原を対象（例えばヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ニワトリ、小型鳥類、大型鳥類、爬虫類、又は両生類）に投与する段階を含む。こうして非天然免疫原は疾患状態に関連する対象の体内の１個以上の標的部分（例えばポリペプチド及び／又は糖質）又は対象の体内に存在することが可能な１個以上の標的部分に対して交差反応性の抗体の産生を対象の体内で刺激する。この側面の第２組の方法において、本発明は１個以上の標的部分（例えば疾患状態／病態に関連する疾患関連部分）に対する抗体を産生させることにより対象の疾患状態を予防的又は治療的に処置する段階を含む。このような抗体の産生は１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ非天然免疫原に対する抗体を産生させる段階を含み、前記抗体は標的部分に対して交差反応性である。その後、抗体を対象に投与する。
【００１９】
この側面の方法における非天然免疫原は一般に対象の体内の少なくとも１個の標的部分（又は対象の体内に存在することが可能な少なくとも１個の標的部分）に対応する。各種態様において、標的部分は第１のアミノ酸配列を含むことができ、非天然免疫原は、標的の配列の１個以上の天然アミノ酸が免疫原の配列では１個以上の非天然アミノ酸で置換されているという点を除き、標的の配列と同一の第２のアミノ酸配列を含むことができる。代替的又は付加的に、標的部分は第１のアミノ酸配列を含むことができ、非天然免疫原は第２のアミノ酸配列を含むことができ、免疫原の配列は免疫原の配列が更に１個以上の付加的な非天然アミノ酸を含むという点を除き、標的の配列と同一である。非天然免疫原はこの免疫原が由来する標的部分と実質的に同様の構造を含むことができ、及び／又はこの免疫原が由来する標的部分と実質的に同様の三次及び／又は四次構造を含むことができる。
【００２０】
この側面の方法の非天然免疫原に存在する１個以上の非天然アミノ酸は場合により抗体に接触可能とすることができる。１種以上の交差反応性抗体は場合により非天然免疫原上の対応するエピトープと同一の配列を含む標的部分上のエピトープに特異的でもよい。他方、交差反応性抗体は場合により非天然免疫原上の対応するエピトープと異なる配列（例えば場合により１個以上の非天然アミノ酸を含む別の配列）を含む標的部分上のエピトープに特異的でもよい。
【００２１】
この側面の各種態様において、対象に投与されるか又は抗体が産生される免疫原は先述の側面又は本明細書の他の箇所に記載する方法のいずれかにより作製することができる。非天然免疫原は場合により任意非天然アミノ酸（例えば先述の側面又は本明細書の他の箇所に記載する非天然アミノ酸のいずれか）を含むことができる。標的部分は場合により（例えば先述の側面又は本明細書の他の箇所に記載する非自己部分のいずれかを含む）非自己部分、又は自己部分（例えば先述の側面又は本明細書の他の箇所に記載するもの等の疾患関連自己部分）を含むことができる。
【００２２】
この側面の所定態様において、標的部分はＴＮＦαであり、疾患状態を予防的又は治療的に処置する方法は場合により以下の疾患状態、即ち内毒素ショック、脳マラリア、自己免疫疾患、多臓器不全、多発性硬化症、心機能障害、アテローム性動脈硬化症、虚血再潅流傷害、インスリン抵抗性、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸疾患、悪液質、敗血症ショック、エイズ、移植片対宿主病、細菌感染防御性肉芽腫、成人呼吸窮迫症候群、及びシリカ肺線維症のいずれか１種以上を処置する段階を含む。
【００２３】
対象がマウスである所定態様において、標的部分はｍＴＮＦαとすることができ、免疫原は非天然ｍＴＮＦα（例えばｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４−ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１３−ｍＴＮＦαを含む非天然ｍＴＮＦα）とすることができる。対象がヒトである所定態様において、自己部分はｈＴＮＦαとすることができ、免疫原は非天然ｈＴＮＦα（例えばｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８７−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０５−ｈＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１４−ｈＴＮＦα）とすることができる。
【００２４】
別の側面において、本発明はワクチンの製造方法（及び前記方法により製造されたワクチン）を提供し、前記方法は非天然アミノ酸を含まない抗体治療標的部分（例えばポリペプチド及び／又は糖質）を同定する段階と、１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ非天然免疫原を準備する段階と、非天然免疫原を１種以上の医薬的に許容可能なアジュバント、キャリヤー又は賦形剤と混合し、ワクチンを製造する段階を含む。これらの方法で準備する非天然免疫原は、例えば先述の側面又は本明細書の他の箇所に記載するような対象に投与したときに、対象が標的部分に対して交差反応性の抗体を非天然免疫原に対して産生するように、標的部分と構造的に同様とすることができる。
【００２５】
この側面の方法における非天然免疫原は対象の体内存在する少なくとも１個の標的部分（又は対象の体内に存在することが可能な少なくとも１個の標的部分）に対応する。各種態様において、標的部分は第１のアミノ酸配列を含むことができ、非天然免疫原は、標的の配列の１個以上の天然アミノ酸が免疫原の配列では１個以上の非天然アミノ酸で置換されているという点を除き、標的の配列と同一の第２のアミノ酸配列を含むことができる。代替的又は付加的に、標的部分は第１のアミノ酸配列を含むことができ、非天然免疫原は第２のアミノ酸配列を含むことができ、免疫原の配列は免疫原の配列が更に１個以上の付加的な非天然アミノ酸を含むという点を除き、標的の配列と同一である。非天然免疫原はこの免疫原が由来する標的部分と実質的に同様の構造を含むことができ、及び／又はこの免疫原が由来する標的部分と実質的に同様の三次及び／又は四次構造を含むことができる。
【００２６】
非天然免疫原に存在する１個以上の非天然アミノ酸は場合により抗体に接触可能とすることができる。１種以上の交差反応性抗体は場合により非天然免疫原上の対応するエピトープと同一の配列を含む標的部分上のエピトープに特異的でもよい。他方、交差反応性抗体は場合により非天然免疫原上の対応するエピトープと異なる配列（例えば場合により１個以上の非天然アミノ酸を含む別の配列）を含む標的部分上のエピトープに特異的でもよい。
【００２７】
各種態様において、ワクチンを製造するために準備する免疫原は上記側面又は本明細書の他の箇所に記載する方法のいずれかによりそれ自体作製することができる。また、非天然免疫原は場合により上記側面又は本明細書の他の箇所に記載する非天然アミノ酸のいずれかを含むことができる。標的部分は場合により（例えば上記側面又は本明細書の他の箇所に記載する非自己抗原又は部分のいずれかを含む）非自己部分、又は自己部分（例えば上記側面又は本明細書の他の箇所に記載するもののいずれか等の疾患関連自己部分）を含むことができる。
【００２８】
この側面の所定態様において、標的自己部分はＴＮＦαとすることができる。例えば、対象がマウスである態様において、標的自己部分はｍＴＮＦαとすることができ、免疫原は非天然ｍＴＮＦα（例えばｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４−ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１３−ｍＴＮＦαを含む非天然ｍＴＮＦα）とすることができる。対象がヒトである態様において、標的自己部分はｈＴＮＦαとすることができ、免疫原は非天然ｈＴＮＦα（例えばｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８７−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０５−ｈＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１４−ｈＴＮＦα）とすることができる。
【００２９】
別の側面において、本発明は更にｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ＴＮＦαを含む非天然ＴＮＦαを細胞で作製する方法を提供する。前記方法は細胞を適切な培地で増殖させる段階を含む。このような態様において、細胞はＴＮＦαをコードし、アミノ酸８６位に少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含むことができる。細胞は更にセレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、Ｏ−ｔＲＮＡをｐＮＯ２Ｐｈｅで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができる。前記方法は更に、ｐＮＯ２Ｐｈｅを準備し、（Ｏ−ＲＳ）にＯ−ｔＲＮＡをｐＮＯ２Ｐｈｅで優先的にアミノアシル化させ、セレクターコドンに応答して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにｐＮＯ２Ｐｈｅをアミノ酸８６位に組込ませ、非天然ＴＮＦαを産生させる段階を含む。本発明の他の態様としては、（例えば所望免疫原の核酸、所望位置の適切なセレクターコドン、所望アミノ酸の存在、及び適切な対応する直交機構ＯＲＳ、ＯｔＲＮＡ等を）適宜改変した同様の方法により免疫原の任意所望位置に任意所望非天然アミノ酸を組込んだ他の任意非天然免疫原の作製方法が挙げられる。
【００３０】
本発明は更に非天然ＴＮＦαを提供する。本発明により提供される非天然ｍＴＮＦαとしては、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４−ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１３−ｍＴＮＦαが挙げられる。本発明により提供されるｈＴＮＦαとしては、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８７−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０５−ｈＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１４−ｈＴＮＦαが挙げられる。本発明はこれらの非天然ＴＮＦαを含有する組成物も提供する。
【００３１】
本発明は上記非天然ＴＮＦαに対する抗体と、これらの抗体を含有する組成物も提供する。本発明は非天然アミノ酸を含まない天然ＴＮＦαと、１個以上の非天然アミノ酸を組込んだＴＮＦαに対して交差反応性の抗体と、これらの抗体を含有する組成物も提供する。
【００３２】
本発明はｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４を含む非天然ｍＲＢＰ４と、前記非天然ｍＲＢＰ４を含有する組成物も提供する。更に、本発明はこの非天然ｍＲＢＰ４に対する抗体でありながら、非天然アミノ酸を含まないＲＢＰ４に対して交差反応性の抗体と、これらの抗体を含有する組成物も提供する。
【００３３】
本発明の各種側面において、非天然免疫原に組込まれる１個以上の非天然アミノ酸は免疫原の合成中に組込まれる。所定態様では、翻訳後修飾又は合成後化学修飾以外の方法で１個以上の非天然アミノ酸を非天然免疫原に組込む。従って、各種態様では、直交翻訳、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳、ネイティブケミカルライゲーション、発現蛋白質ライゲーション、又は固相合成法の１種以上により１個以上の非天然アミノ酸を非天然免疫原に組込む。本発明の各種態様において、非天然免疫原はグリコシル化、ニトロアリール修飾、硝酸化、アルキル化、アセチル化、酸化、硫酸化、又はリン酸化された（例えば翻訳後修飾以外の方法又は化学修飾以外の方法によりグリコシル化、ニトロアリール修飾、硝酸化、アルキル化、アセチル化、酸化、硫酸化、又はリン酸化された）２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種以上を含む。
【００３４】
所定態様において、本発明は本明細書に記載する方法及び組成物に有用な材料を含むキットないし製品を提供する。このようなキットは場合により１個以上の容器、ラベル、及び説明書と、抗体及び／又は非天然免疫原の構築用成分及び／又は実際の抗体及び／又は非天然免疫原（例えば非天然ＴＮＦα）を含むことができる。キットは更に場合により１種以上の抗体（例えば非天然免疫原に対する抗体でありながら、対象の体内に存在する天然標的部分に対して交差反応性の抗体）及び／又は１種以上の非天然免疫原と、場合により他の成分（例えば各種抗生物質、各種抗真菌剤等）を含むことができる。このような非天然免疫原としては限定されないが、本発明により提供される非天然ＴＮＦαの任意１種以上又は本明細書に記載する他の任意非天然免疫原が挙げられる。キットは場合により成分を保存するため又は成分を混合／調製するための（例えばガラス、プラスチック、ナイロン、綿、ポリエステル、金属等の）チューブ又は他の容器と、前記成分を対象（例えば処置を必要とするヒト等）に投与するために使用する１個以上の器具を含む。所定態様において、成分を対象に投与するために使用する器具は成分を保存及び／又は混合／調製する容器を含む。
【００３５】
キットは更に場合により本発明の抗体／非天然免疫原成分以外の他のコンポーネント（例えば緩衝液、希釈剤、フィルター、創傷被覆材、包帯、アプリケータ、ガーゼ、バリヤー、半透性バリヤー、舌圧子、針、及びシリンジ等）を含むことができる。
【００３６】
所定態様において、キットは１種以上の病態／疾患状態について対象を処置するためのキットの使用に関する説明書（例えば一般に書面の説明書）を含む。所定態様において、キットは使用者が使用方法又は詳細な使用方法について問合せするためのＵＲＬアドレス又は電話番号等を含む。キットは単位用量、バルクパッケージ（例えば多用量パッケージ）、又は単位用量未満とすることができる。
【００３７】
当業者に自明の通り、本発明の方法及び組成物は単独で使用することもできるし、組合せて使用することもできる。
【００３８】
本発明のこれら及び他の特徴は添付図面と特許請求の範囲を参照して以下の詳細な記載を通読すると、更によく理解されよう。
【００３９】
定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定装置又は生体系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形の不定冠詞及び定冠詞はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「表面」と言う場合には「２個以上の表面の組合せ」を含み、「細菌」と言う場合には「細菌混合物」を含み、他の用語についても同様である。
【００４０】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。本発明の試験の実施には本明細書に記載するものと同様又は等価の任意方法及び材料を使用することができるが、好ましい材料と方法は本明細書に記載するものである。本発明の記載及び特許請求の範囲において、以下の用語は以下の定義に従って使用される。
【００４１】
抗体：本明細書で使用する「抗体」とは免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的又は部分的にコードされる１個以上のポリペプチドを含む蛋白質を意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子としてはκ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子と、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκ又はλとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ又はεとして分類され、夫々免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥに相当する。典型的な免疫グロブリン（例えば抗体）構造単位は四量体から成る。各四量体は同一のポリペプチド鎖２対から構成され、各対は「軽」鎖（約２５ｋＤ）１本と「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）１本をもつ。各鎖のＮ末端は抗原認識に主に関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。可変領域軽鎖（ＶＬ）及び可変領域重鎖（ＶＨ）なる用語は夫々これらの軽鎖と重鎖を意味する。
【００４２】
抗体は例えば無傷の免疫グロブリン又は各種ペプチダーゼによる消化により生成された多数の十分に特性決定されたフラグメントとして存在することができる。従って、例えば、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合下の抗体を消化し、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１と結合した軽鎖であるＦａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’２を生成する。Ｆ（ａｂ）’２を穏和な条件下で還元すると、ヒンジ領域のジスルフィド結合が切断され、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は本質的にヒンジ領域の部分をもつＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）参照）。各種抗体フラグメントが無傷の抗体の消化により表されるが、当業者に自明の通り、このようなＦａｂ’フラグメント等は化学的方法又は組換えＤＮＡ法の使用によりｄｅ  ｎｏｖｏ合成することができる。従って、本明細書で使用する抗体なる用語は無傷の抗体の修飾により生成された抗体フラグメント又は組換えＤＮＡ法を使用してｄｅ  ｎｏｖｏ合成された抗体フラグメントも含む。抗体としては１本鎖抗体が挙げられ、（直接又はペプチドリンカーを介して）可変領域重鎖と可変領域軽鎖を結合して連続ポリペプチドを形成する１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）抗体が挙げられる。
【００４３】
２個以上の異なる部分と「交差反応」する抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ又は当業者に公知の他の方法により判定した場合に、異なる部分の各々と結合することが可能である。例えば、非天然ＴＮＦα（例えばｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα等の本明細書に記載する非天然ＴＮＦαのいずれか１種）と結合し、（非天然アミノ酸を含まない）野生型（ないし天然）ＴＮＦαとも結合する抗体はこれらの２分子と交差反応する。本発明の特定態様において、非天然蛋白質に対する抗体は天然型の同一蛋白質（即ち非天然アミノ酸を含まないという点を除き、同一の蛋白質）と交差反応する。各種態様において、非天然分子と結合する抗体は、非天然分子に対する抗体の結合能の約１〜５０％又は５０〜１００％又はそれ以上で天然型の同一分子と交差反応する。
【００４４】
抗原：本明細書において「抗原」なる用語はこれを免疫した対象に抗体応答を誘導する分子又は物質の意味で使用する。抗原は蛋白質、ペプチド、糖質、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然もしくは合成化合物（又はその組合せ）とすることができる。抗原は例えば生得（自己）抗原でもよいし、例えば細菌、ウイルス、寄生虫、真菌等に由来するものでもよい。この用語は各種腫瘍抗原、自己免疫疾患関連抗原等のいずれをも意味する。
【００４５】
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共働する成分又は所定の相互特異性の側面をもつ成分、例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を意味し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で特異的にアミノアシル化する。
【００４６】
から誘導：本明細書で使用する「から誘導」なる用語は特定分子もしくは生物から単離された成分、あるいは特定分子もしくは生物又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。例えば、第２のポリペプチドから誘導されるポリペプチドは第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に同様のアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドの場合には、誘導種は例えば自然突然変異誘発、人工的特異的突然変異誘発又は人工的ランダム突然変異誘発により得ることができる。ポリペプチドを誘導するために使用する突然変異誘発は意図的に特異的でも意図的にランダムでもよいし、両者の混合でもよい。第１のポリペプチドから誘導される別のポリペプチドを作製するためのポリペプチドの突然変異誘発は（例えばポリメラーゼの非忠実性に起因する）ランダムなイベントとすることができ、誘導されたポリペプチドの同定は例えば本明細書に引用する参考文献に記載されているような適当なスクリーニング法により実施することができる。ポリペプチドの突然変異誘発は一般にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
【００４７】
標的部分又は標的分子：「標的部分」、「標的分子」、「標的蛋白質部分」、「標的抗原」等とは、本発明を利用して免疫応答を誘発／強化することが望ましい部分（例えば蛋白質、ペプチド、糖質、脂質、核酸、又はその任意の組合せ）を意味する。従って、標的部分は生得（自己）又は外生（外来）分子とすることができる。当然のことながら、本明細書における特定例（例えばＴＮＦα）の列挙は限定的とみなすべきではなく、標的部分（及びそれに対応する非天然免疫原）は免疫応答を所望される任意分子とすることができる。従って、標的部分は非天然免疫原をモデル化又は設計する原型となる部分、非天然免疫原が由来する部分、非天然免疫原が対応する部分等である。以下に更に説明するように、非天然免疫原は、非天然免疫原が１個以上の非天然アミノ酸を含む（更に、例えば直交翻訳系、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系等及び／又は翻訳後もしくは化学修飾以外の方法により作製される）という点を除き、標的部分と同一又はほぼ同一の配列を含む。多くの態様において、標的部分は疾患関連部分、即ち疾患状態（例えば癌、自己免疫疾患、又は細菌、ウイルス、プリオン、マイコプラズマ、真菌、寄生虫等の感染性生物に由来／起因する疾患等）により対象に発生又は存在する部分である。天然標的部分（即ち非天然アミノ酸を含まない）は抗原性及び／又は免疫原性でもそうでなくてもよい（例えば低免疫原性でもよい）。特定態様において、非天然型の標的部分（例えば天然標的部分と同様であるが、標的部分における対応する天然アミノ酸の置換及び／又は標的部分のアミノ酸への付加として１個以上の非天然アミノ酸を含む部分）は（天然標的部分が抗原性及び／又は免疫原性であるか否かに関係なく）抗原性及び／又は免疫原性である。このような非天然標的部分を本明細書では「非天然標的分子」、「非天然抗原」、又はより多くの場合には「非天然免疫原」等と言う。従って、本明細書において「非天然」免疫原、部分、分子等とは、１個以上の非天然アミノ酸を含むものである。所定のこのような非天然部分において、非天然アミノ酸は場合により完全又は部分的に抗体に接触可能である（例えば抗体は非天然アミノ酸を含む部分の領域と結合することができる）。
【００４８】
有効量：「有効量」なる用語は所望結果を生じるために十分な用量又は量を意味する。所望結果としては、前記用量又は量を投与したレシピエントにおける客観的又は主観的改善（例えば交差反応性抗体の産生、長期生存、腫瘍数及び／又はサイズの減少、疾患状態の有効な予防又は部分的予防等）が挙げられる。
【００４９】
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生産を誘導するためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。所定側面において、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードさせるための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。別の側面において、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を誘導するためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用する転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスのようにポリペプチドをコードすることもできる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードするトリプレットコドンにも適用する。所定側面において、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面において、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を意味する。
【００５０】
免疫原：本明細書で使用する「免疫原」とは場合により対象に投与することができ、免疫応答を誘導する部分を意味する。「非天然免疫原」は１個以上の非天然アミノ酸を含み、免疫応答を誘導するために対象に投与することができる部分（例えば疾患関連部分等の標的部分）を意味する。上記も参照。本発明の非天然免疫原では、このような免疫応答により産生される血清抗体、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞は非天然アミノ酸を含まない対応する天然標的部分（例えば免疫原が由来する部分、免疫原をモデル化／設計する原型となる部分、免疫原が対応する部分等）に対して交差反応性であり、天然標的部分に対する免疫応答を誘発すると有利である。従って、所定態様において、非天然免疫原は非天然免疫原が由来する天然標的部分（又は非天然免疫原が対応する部分等）に関連する疾患に対して防御性である（又は疾患状態を治療するために使用可能な）免疫応答を誘導することができる。
【００５１】
免疫原性組成物：「免疫原性組成物」とは、１個以上の分子を含み、組成物を対象に投与すると、前記部分に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答を対象に誘発する組成物である。免疫原性組成物は注射、吸入、経口、鼻孔内及び粘膜（例えば直腸内又は膣内）投与によりレシピエント対象に直接導入することができる。
【００５２】
免疫的応答又は免疫応答：部分又はその組成物に対する「免疫的応答」又は「免疫応答」とは前記部分に対する細胞性及び／又は抗体介在性免疫応答が対象に生じることである。通常、免疫応答としては限定されないが、以下の作用、即ち前記部分の１種以上の抗原に特異的な（好ましくは）抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はγδＴ細胞の産生の１種以上が挙げられる。各種態様において、対象は前記部分による新規攻撃に対する耐性を強化するように、及び／又は前記部分に起因／関連する疾患状態の臨床重篤度を低下するように、治療又は予防免疫応答を示す。
【００５３】
〜に応答して：非天然分子の直交作製に関して本明細書で使用する「〜に応答して」なる用語は、Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡと結合した非天然アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込むのを媒介するプロセスを意味する。
【００５４】
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、あるいは細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する能力に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率（例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率）でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する能力に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できないことを意味する。直交分子は細胞内に機能的に正常な相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当細胞の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。第１の直交分子と共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対）の効率に比較して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞において共働する導入相補成分を含む。
【００５５】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ：本明細書で使用する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてＯ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然、非天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するチロシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、あるいはＯ−ＲＳと呼ぶシンテターゼと同一又は相同である。
【００５６】
直交ｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは例えば（１）天然に存在するｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に同様であるか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体ｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体ｔＲＮＡと相同であるか、（５）直交ｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡと相同であるか、あるいは（６）直交ｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡの保存的変異体である。Ｏ−ｔＲＮＡはアミノ酸を負荷した状態でも負荷しない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「Ｏ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼにより非天然アミノ酸を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、Ｏ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドにほぼ任意の非天然アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
【００５７】
医薬組成物：本明細書において「医薬組成物」なる用語は動物又はヒトを含む対象に医薬として使用又は投与するのに適した組成物を意味する。医薬組成物は一般に有効量の活性剤（例えば本発明の抗体及び／又は非天然免疫原）と医薬的に許容可能なキャリヤー、緩衝液、アジュバント等を含有する。「医薬的に許容可能」ないし「薬理的に許容可能」な材料とは、生物学的又は他の観点で有害でない材料であり、即ちこのような材料は望ましくない生体作用を全く（又は殆ど）生じずに、又はこの材料を含有する組成物の成分と有害に相互作用せずに、製剤又は組成物として個体に投与することができる。
【００５８】
ポリペプチド：ポリペプチドは必ずしもそうでなくてもよいが、一般に共有ペプチド結合により結合した任意長のアミノ酸残基（天然又は非天然又はその組み合わせ）の任意オリゴマーである。ポリペプチドは任意起源に由来することができ、例えば天然に存在するポリペプチド、組換え分子遺伝技術により作製されたポリペプチド、細胞もしくは翻訳系に由来するポリペプチド、又は無細胞合成手段により作製されたポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドはそのアミノ酸配列（例えばその成分アミノ酸残基の一次構造）により特徴付けられる。本明細書で使用するポリペプチドのアミノ酸配列とは全長配列に限定されず、部分配列でも完全配列でもよい。更に、ポリペプチドは特定生理活性の有無により限定されない。本明細書で使用する「蛋白質」なる用語はポリペプチドと同義である。「ペプチド」なる用語は限定されないが、例えば２〜２５アミノ酸長の短いポリペプチドを意味する。
【００５９】
優先的にアミノアシル化する：直交翻訳系に関して本明細書で使用する場合に、Ｏ−ＲＳが発現系で任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷するときにＯ−ＲＳはコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、従って、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００６０】
（ａ）Ｏ−ＲＳが内在ｔＲＮＡに比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するとき、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを任意天然アミノ酸でアミノアシル化する場合に比較してそのアミノアシル化が非天然アミノ酸に特異的であるときにＯ−ＲＳは「Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。即ち、非天然アミノ酸と天然アミノ酸がＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在するとき、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸よりも高頻度で非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する。非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましい。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に非天然アミノ酸を負荷することがより好ましい。天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者が等モル濃度で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ｔＲＮＡの非天然アミノ酸負荷とＯ−ｔＲＮＡの天然アミノ酸負荷の相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００６１】
予防的処置：「予防的処置」とは疾患、疾病ないし病態の徴候もしくは症状を示さないか、又は疾患、疾病ないし病態の初期徴候もしくは症状しか示さない対象に施用する処置であり、疾患、疾病ないし病態を発症する危険を軽減、防止又は低下させる目的で施用する。予防的処置は疾患ないし病態に対する予防的処置として機能する。「予防活性」とは疾病、疾患ないし病態の徴候もしくは症状を示さない（又はその初期徴候もしくは症状しか示さない）対象に施用した場合に対象が疾病、疾患ないし病態を発症する危険を軽減、防止又は低下させる非天然免疫原及び／又は抗体、又はその組成物等の物質の活性である。「予防的に有用な」物質又は化合物（例えば本発明の非天然免疫原及び／又は抗体）とは疾病、疾患ないし病態の発症を軽減、防止、処置又は低下させるのに有用な物質又は化合物を意味する。
【００６２】
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン）等のナンセンスコドン、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
【００６３】
対象：本明細書で使用する「対象」なる用語は限定されないが、例えばヒト、非ヒト霊長類（例えばサル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、又は他の非ヒト哺乳動物を含む哺乳類と、例えば鳥類（例えばニワトリ又はアヒル）等の非哺乳類脊椎動物を含む非哺乳類を包含する。所定態様において、本発明の方法及び組成物は非ヒト動物を（予防的及び／又は治療的の両面で）処置するために使用される。多くの商業的に重要な動物は本発明で場合により処置することができる例えば各種癌又は自己免疫疾患、又は（例えばウイルス／細菌等の）各種感染症にかかり易い。
【００６４】
治療的処置：「治療的処置」とは疾病、疾患ないし病態の症状又は徴候を示す対象に施用する処置であり、例えば一般に徴候／症状を発生させた疾患状態を軽減及び／又は除去することにより、疾病、疾患ないし病態の徴候又は症状を軽減又は除去する目的で施用する。「治療活性」とは疾病、疾患ないし病態の徴候又は症状を示す対象に施用した場合に徴候又は症状を除去又は軽減する蛋白質及び／又は抗体、又はその組成物等の物質の活性である。「治療的に有用な」物質又は化合物（例えば非天然免疫原及び／又は抗体）とは疾病、疾患ないし病態のこのような徴候又は症状を軽減、処置又は除去するのに有用な物質又は化合物を意味する。
【００６５】
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。
【００６６】
処置：本明細書で使用する「処置」は一般に感染もしくは再感染の予防、症状の軽減もしくは除去、及び／又は病原体もしくは疾患状態の実質的もしくは完全な除去を意味する。処置は例えば感染前、疾患状態の開始前、又は疾患状態の主要症状の発現前に予防的に実施してもよいし、例えば病原体の感染後、疾患状態の開始後、又は疾患状態の主要症状の発現後に治療的に実施してもよい。
【００６７】
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」（ＵＡＡ）なる用語は２０種類の標準天然アミノ酸の１種又は希少天然アミノ酸（例えばセレノシステイン又はピロリジン）以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を意味する。例えば、本発明の各種態様では、非天然アミノ酸としてｐ−ニトロフェニルアラニン（図１Ａ）、ｐ−スルホチロシン、及びｐ−カルボキシフェニルアラニンを利用する。所定態様において、非天然アミノ酸としては、限定されないが、ｐ−ニトロフェニルアラニン、ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ボロニルＰｈｅ、ｏ−ボロニルＰｈｅ、ｍ−ボロニルＰｈｅ、ｐ−アミノＰｈｅ、ｏ−アミノＰｈｅ、ｍ−アミノＰｈｅ、ｐ−アシルＰｈｅ、ｏ−アシルＰｈｅ、ｍ−アシルＰｈｅ、ｐ−ＯＭｅＰｈｅ、ｏ−ＯＭｅＰｈｅ、ｍ−ＯＭｅＰｈｅ、ｐ−スルホＰｈｅ、ｏ−スルホＰｈｅ、ｍ−スルホＰｈｅ、５−ニトロＨｉｓ、３−ニトロＴｙｒ、２−ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｉｌｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２−ニトロＴｒｐ、４−ニトロＴｒｐ、５−ニトロＴｒｐ、６−ニトロＴｒｐ、７−ニトロＴｒｐ、３−アミノチロシン、２−アミノチロシン、Ｏ−スルホチロシン、２−スルホオキシフェニルアラニン、３−スルホオキシオキシフェニルアラニン又はｐ−カルボキシフェニルアラニン、ｏ−カルボキシフェニルアラニン、及びｍ−カルボキシフェニルアラニンが挙げられる。この場合も、当然のことながら、本発明は特定の非天然アミノ酸に限定されない。非天然アミノ酸に関する他の情報については以下に記載する。
【００６８】
当然のことながら、上記用語及びその他の用語については、以下に更に詳述／記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ｐＮＯ２Ｐｈｅの化学構造と、ｍＴＮＦα三量体の蛋白質構造と、ｐＮＯ２Ｐｈｅを突然変異体ｍＴＮＦα蛋白質に組込む効率と忠実度を調べるために実施した実験の結果を示す。
【図１−Ｄ】ｐＮＯ２Ｐｈｅの化学構造と、ｍＴＮＦα三量体の蛋白質構造と、ｐＮＯ２Ｐｈｅを突然変異体ｍＴＮＦα蛋白質に組込む効率と忠実度を調べるために実施した実験の結果を示す。
【００７０】
【図２】ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ｍＴＮＦαのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。
【００７１】
【図３】ｗｔ−ｍＴＮＦαのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。
【００７２】
【図４】突然変異体ｍＴＮＦα蛋白質の三次構造に及ぼすＴｙｒ８６ｐＮＯ２Ｐｈｅ置換の影響を調べるために実施したＦＰＬＣ実験の結果を示す。
【００７３】
【図５】各種ｍＴＮＦα突然変異体のＮＦκＢ−Ｌｕｃ活性分析を示す。
【００７４】
【図６】（ａ）ＰＢＳ、（ｂ）ＷＴ−ｍＴＮＦα、（ｃ）ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又は（ｄ）Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの血清力価を示す。
【００７５】
【図７】ｗｔ  ｍＴＮＦα又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ２マウスのｗｔ  ｍＴＮＦα及びｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαに対する血清力価を示す。
【００７６】
【図８】アジュバントの不在下でｗｔ  ｍＴＮＦα、又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ−２マウスの血清力価を測定するために実施したｗｔ  ｍＴＮＦα又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαに対するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００７７】
【図９】アジュバントの存在下又は不在下でＰｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ２マウスのｗｔ  ｍＴＮＦα及びＰｈｅ８６ｍＴＮＦαに対する血清力価を示す。
【００７８】
【図１０】図１０ＡはｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα又はＰｈｅ４２ｍＴＮＦαを免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのｗｔ  ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα、及びＰｈｅ４２ｍＴＮＦαに対する血清力価を示す。図１０ＢはｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα又はＰｈｅ４２ｍＴＮＦαを免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのＷＴ  ｍＴＮＦα、ＰＢＳ、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦαに対する血清力価を示す。
【００７９】
【図１１】ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαの免疫がＴＮＦα依存性重度内毒素血症モデルでマウスの生存率を改善するか否かを調べるために実施した実験の結果を示す。
【００８０】
【図１２】ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６−ｍＴＮＦαのトリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳシーケンシングの結果を示す。
【００８１】
【図１３】Ｈｉｓ６−Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（ＷＴ）又はＨｉｓ６−ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα上のＮ末端Ｈｉｓ６タグの存在がその後の免疫実験に影響を与えないことを示すために実施した実験の結果を示す。
【００８２】
【図１４】血清力価持続性を測定するために実施した実験の結果を示す。
【００８３】
【図１５】Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示す。
【００８４】
【図１６−Ａ】ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα免疫が、ＷＴ  ｍＴＮＦαに対する有意交差反応性を示し、マウスで少なくとも４０週間持続するＩｇＧ応答へのクラススイッチを促進することを示す。
【図１６−Ｂ】ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα免疫が、ＷＴ  ｍＴＮＦαに対する有意交差反応性を示し、マウスで少なくとも４０週間持続するＩｇＧ応答へのクラススイッチを促進することを示す。
【図１６−Ｃ】ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα免疫が、ＷＴ  ｍＴＮＦαに対する有意交差反応性を示し、マウスで少なくとも４０週間持続するＩｇＧ応答へのクラススイッチを促進することを示す。
【００８５】
【図１７】ｍＴＮＦα上の４カ所の表面露出部位が有意な免疫原性を示すことを示す。
【００８６】
【図１８】各種ｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＴＮＦα突然変異体を免疫したマウスではリポ多糖（ＬＰＳ）攻撃後に有意な生存率利得があることを示す。
【００８７】
【図１９】自己抗原ｍＲＢＰ４へのｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みがｍＲＢＰ４に対する寛容低下を生じるか否かを調べるために実施した実験の結果を示す。
【００８８】
【図２０】ＷＴ  ｍＴＮＦαがｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαにより誘導した寛容低下を持続できないことを示す。
【００８９】
【図２１】３個のｍＴＮＦαフラグメントの質量分析を示す。
【図２１−Ｃ】３個のｍＴＮＦαフラグメントの質量分析を示す。
【００９０】
【図２２】３個のｍＴＮＦαフラグメントとの抗ｍＴＮＦα  ｍＡｂの結合を示す。
【００９１】
【図２３】ｍＴＮＦαの表面露出部位へのｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みを確認するために実施した実験の結果を示す。
【００９２】
【図２４】ｍＲＢＰ４の表面露出部位へのｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みを確認するために実施した実験の結果を示す。
【００９３】
【図２５−Ａ】ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４とｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４のトリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳ分析がｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みのパターンと一致することを示す。
【図２５−Ｂ】ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４とｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４のトリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳ分析がｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みのパターンと一致することを示す。
【００９４】
【図２６】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４の免疫原性を測定するために実施した実験の結果を示す。
【００９５】
【図２７−Ａ】（Ａ）はｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４のｐＮＯ２Ｐｈｅ含有トリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳシーケンシングの結果を示す。（Ｂ）はｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４のｐＮＯ２Ｐｈｅ含有トリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳシーケンシングの結果を示す。
【図２７−Ｂ】（Ａ）はｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４のｐＮＯ２Ｐｈｅ含有トリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳシーケンシングの結果を示す。（Ｂ）はｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４のｐＮＯ２Ｐｈｅ含有トリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳシーケンシングの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
概要
自己蛋白質もしくは他の自己分子に対する強い免疫応答を選択的に誘導できること、又は外来抗原の特定エピトープの免疫原性を強化できることは癌、蛋白質フォールディング病、及び感染症（例えば細菌、ウイルス、又は他の種類の感染症）を含む多数の疾患状態用のワクチンの製造に有意義である。本発明はワクチン接種に有利に使用することができる非天然免疫原を作製するため又は受動免疫用抗体を作製するために蛋白質への非天然アミノ酸の直接組込みを利用する。本発明において、非天然アミノ酸を組込む蛋白質はワクチン接種／免疫する対象の体内に存在する標的部分（例えば疾患関連部分）に対応する（又は対象の体内に存在することが可能な標的部分に対応する）。非天然アミノ酸を組込んだ免疫原を対象に投与する態様において、非天然アミノ酸の存在は非天然免疫原に対する免疫応答を誘起する。このような応答により産生される抗体は免疫原が由来する（又は対応する）天然標的部分に対して交差反応性であり、標的部分に対する免疫応答を誘発すると有利である。本発明の方法は対象の体内に存在する（又は存在することが可能な）非免疫原性又は低免疫原性標的部分に対する免疫応答を誘発するのに特に有用である。本発明は更に非天然免疫原（即ち非天然アミノ酸を含む免疫原）に対して産生される抗体でありながら、対象の体内に存在する（又は存在することが可能な）対応する天然標的部分（この場合も例えば疾患関連部分）に対して交差反応性の抗体を対象に投与する態様を含む。いずれの態様でも、本発明は生得自己蛋白質（例えばＴＮＦα）であるか、外来分子（例えば細菌抗原）であるかに関係なく、標的部分による攻撃に対する免疫防御を強化する。
【００９７】
１例において、本明細書に記載する発明はＴＮＦαの活性に関連する疾病の治療及び／又は予防に有用であり得る組成物と方法を提供する。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は多くの慢性炎症性疾患（例えば敗血症ショック、関節リウマチ、脳マラリア、及びクローン病）の悪化及び／又は発症に関係する多面的サイトカインである。本発明は非天然ＴＮＦα（例えば抗体に接触可能な１個以上の免疫原性非天然アミノ酸を含むＴＮＦα）の作製方法を提供する。本発明は更にＴＮＦαに対する免疫寛容を解除するため、例えば生体の内在ＴＮＦαに対する免疫応答を誘発又は強化するように免疫系を誘導するために、非天然ＴＮＦαを使用する方法を提供する。例えば非天然ＴＮＦαに対して誘発され、ＴＮＦα上のエピトープと交差反応する抗体で内在ＴＮＦαを中和すると、例えば内毒素ショック、脳マラリア、自己免疫疾患、多臓器不全、多発性硬化症、心機能障害、アテローム性動脈硬化症、虚血再潅流傷害、インスリン抵抗性、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸疾患、悪液質、敗血症ショック、エイズ、移植片対宿主病、細菌感染防御性肉芽腫、成人呼吸窮迫症候群、及び／又はシリカ肺線維症等の疾患の症状を緩和又は改善することができる。
【００９８】
ＴＮＦαを含む所定態様では、高度に免疫原性のニトロフェニル部分を含む非天然アミノ酸ｐ−ニトロフェニルアラニンでｍＴＮＦα蛋白質の８６位のチロシン残基を置換し、有用な治療及び／又は予防特性をもつ非天然ＴＮＦα誘導体を生成する。対象（例えばマウス）における治療的及び／又は予防的処置に使用することができるその他の非天然ＴＮＦα誘導体としては、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４−ｍＴＮＦα、又はｐＮＯ２Ｐｈｅ１１３−ｍＴＮＦαが挙げられる。対象（例えばヒト）における治療的及び／又は予防的処置に使用することができるその他の非天然ＴＮＦα誘導体としては、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８７−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０５−ｈＴＮＦα、又はｐＮＯ２Ｐｈｅ１１４−ｈＴＮＦαが挙げられる。
【００９９】
別の例において、本明細書に記載する発明は更にレチノール結合蛋白質４（ＲＢＰ４）の活性に関連する疾病の治療及び／又は予防に有用であり得る組成物と方法を提供する。ＲＢＰ４は例えばマシュー・ウッド症候群、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、及びシュタルガルト病等の存在／発症に関係があるとされている。
【０１００】
非天然免疫原による免疫寛容解除
現代医療の大きな課題の１つは特定の低免疫原性外来抗原の免疫原性を増加するため、例えば中和抗体を誘発するため、又は自己抗原に対する寛容を選択的に克服するための堅牢な方法の開発であった。自己と非自己を免疫学的に区別するプロセスで重要なのは、主に自己反応性Ｂ又はＴ細胞の不在又は不活性化による自己免疫疾患を避けるために、哺乳動物の免疫系を自己蛋白質に対して「寛容化」する自己寛容の概念である。これらの課題に対処するために、改良型アジュバント及びキャリヤーの開発、抗原への強力なＴ細胞特異的エピトープの導入、脂質複合、コンビネーションワクチン等の数種類のストラテジーが推進されている。例えばＤａｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：６６６（１９９９）；Ｍａｋｅｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １：３９９（２００２）；Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：６５８（１９９６）；Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．Ｃ．Ｊ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｈａｒｎ，Ｄ．Ａ．Ｊｒ．，Ｅｄｓ．（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００６），ｐｐ．２３５−２５５；及びＺｕａｎｙ−Ａｍｏｒｉｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｕｔｏ  Ｖａｃ  ＴＮＦ１０６：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：１５４−１６３参照。ジアゾニウム誘導体で非特異的に高度に標識したウサギサイログロブリンをウサギに免疫すると、天然サイログロブリンに対する交差反応性抗体を誘導することが立証されている。Ｗｅｉｇｌｅ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １２１：２８９（１９６５）参照。しかし、このようなアプローチは他の抗原等に応用するように改変／制御しにくい。また、自己癌細胞をジニトロフェニル基で非特異的に誘導体化する方法もメラノーマ患者でワクチンとして利用されている（Ｂｅｒｄ，Ｄ．（２００４）“Ｍ−Ｖａｘ：ａｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ，ｈａｐｔｅｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ３：５２１−５２７）。その他の参考文献については随所（例えば下記実施例）に引用する。
【０１０１】
従来の試みと異なり、本発明は非天然免疫原を作製するために、標的部分（例えば疾患関連部分）の標的エピトープにおける１個以上の天然アミノ酸を（特定の所望位置で）１個以上の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）により置換する。代替的又は付加的に、非天然免疫原を作製するために、１個以上の特定の非天然アミノ酸残基を標的部分の標的エピトープに付加することができる。このような非天然アミノ酸置換及び／又は付加により、（例えば対象の体内の）野生型（ｗｔ）天然標的蛋白質の対応する領域に対して強力な免疫応答（例えばＴ細胞応答及び／又はＢ細胞応答）を誘起することが可能であり且つ免疫原性で場合により構造的に保存性の１個以上のエピトープを非天然免疫原に形成することができる。また、以下に更に説明するように、非天然免疫原に応答して産生される交差反応性抗体は非天然アミノ酸を含まない対応する天然標的分子の領域にも特異的になり得る。下記参照。モノクローナル抗体又はキメラ薬剤を使用して寛容を解除しようとする従来の試みは高頻度の注射と大量の蛋白質を必要とするため、問題があったが、本発明は場合によりこれらの試みよりも優れていると思われる。本明細書に記載するように、所定態様では、本発明の非天然免疫原を利用して対象に産生される抗体の血清持続性により、処置中に必要なブースター免疫の頻度を減らすことができる。
【０１０２】
Ｂ細胞はＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）又は膜結合型免疫グロブリンにより血液又はリンパ中の遊離（可溶性）抗原（例えば非天然免疫原）を認識する。抗原の認識後、Ｂ細胞はこれをインターナライズし、ＭＨＣと複合体化した抗原のフラグメントをその表面に提示する。活性化されると、Ｂ細胞はメモリーＢ細胞に分化することができ、抗原（非天然免疫原）が由来（対応）する疾患関連標的部分の中和等の作用、及び／又はエピトープが抗体に接触可能な感染性標的物質の破壊を助長できる抗体を産生及び分泌する。
【０１０３】
抗原（例えば非天然免疫原）に特異的なＴ細胞（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞）は例えばＢ細胞により提示されるＭＨＣと複合体化したペプチドフラグメントと結合する。その後、Ｔ細胞は増殖し、免疫細胞増殖分化を刺激するサイトカインを放出することができる。これらのプライミングされたＴ細胞の一部はメモリー細胞に分化し、例えば非天然免疫原が由来する標的（例えば疾患関連）部分に対する迅速な防御と、より迅速で有効な二次免疫応答を誘起する能力を付与する。この活性はＴリンパ球増殖アッセイで定量することができる（実施例１及び２参照）。
【０１０４】
５０種類を越える非天然アミノ酸が特異的ナンセンス及びフレームシフトコドンに応答して細菌、酵母又は哺乳動物細胞で遺伝的にコードされている。例えばＷａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８（２００１）；Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４（２００３）；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２３９（２００７）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１：７５６６（２００４）；及びＷａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４４：３４（２００４）、並びに本明細書に引用するための参考文献参照。これらのアミノ酸としては、金属結合性アミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸、蛍光アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、光反応性アミノ酸及び化学反応性アミノ酸が挙げられる。例えば、フェニルアラニン誘導体であるｐ−ニトロフェニルアラニン（ｐＮＯ２Ｐｈｅ，図１Ａ）が分光距離プローブ用として高い忠実度と良好な効率でアンバーナンセンスコドンに応答して細菌の蛋白質に組込まれている。Ｔｓａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２８：４５７２（２００６）参照。本明細書の実施例と記載ではｐＮＯ２Ｐｈｅの使用について述べるが、当然のことながら、これは限定的とみなすべきではなく、本発明は任意非天然アミノ酸の使用を包含する（例えば、限定されないが、本明細書に列挙するもの及び／又は本明細書に引用する参考文献に記載されているものが挙げられる）。本発明の各種態様で使用することができる非天然アミノ酸に関する他の情報について以下に記載する。
【０１０５】
非天然免疫原による免疫寛容解除の例      
恐らくπ電子不足系は抗体結合部位と共通のＴｙｒ及びＴｒｐ側鎖と相互作用する傾向があるという理由から、ニトロアリール基は高度に免疫原性のハプテンとして従来から使用されている（Ｋｅｉｎａｎ，Ｅｄ．，Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００５），１−２８頁参照）。その密接な構造類似性により、該当標的部分（例えば疾患関連部分）におけるＰｈｅ→ｐＮＯ２Ｐｈｅ又はＴｙｒ→ｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異は免疫原が由来（対応）する野生型天然標的部分に対して交差反応性の強靭な免疫応答を誘発する免疫原を生じることができる。
【０１０６】
従って、実施例に示すように、マウスに例えばマウス腫瘍壊死因子α（ｍＴＮＦα）のＴｙｒ８６→ｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異体を免疫すると、野生型ｍＴＮＦα（ｗｔ  ｍＴＮＦα）に対する高力価抗体応答を生じ、マウスをリポ多糖（ＬＰＳ）攻撃に対して効果的に防御する。
【０１０７】
ｍＴＮＦαは感染、炎症及び自己免疫現象の調節に関与する十分に特性決定されたサイトカインであり（Ｖａｓｓａｌｌｉ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：４１１（１９９２）参照）、その発現、構造、機能、及びシグナル伝達メカニズムを含むｍＴＮＦαの生物学的性質は広く研究されているため、本発明の各種側面を例証するための標的蛋白質としてｍＴＮＦαを選択した。例えばＶａｓｓａｌｌｉ，前出；Ｂａｅｙｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５５：７７２（１９９９）；Ｐｅｎｎｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８２：６０６０（１９８５）；Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：１３９７（１９９６）；Ｂａｅｙｅｎｓ，Ｈ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５３：３２９（１９９７）；及びＡｇｇａｒｗａｌ，Ｖｉｌｃｅｋ，Ｊ．，Ｅｄ．，Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２），１−５８７頁参照。更に、ｍＴＮＦαノックアウトマウスは生存可能であり、明白な表現型異常を示さない（Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ，前出参照）ため、マウスはＴＮＦに対する中和免疫応答に耐え、ワクチン接種した動物を抗ＴＮＦα抗体産生と生物学的活性について分析できると思われる。更に、抗ＴＮＦα抗体（Ｋｎｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：１４４３（１９９３）；及びＰｒｅｓｅｎｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４０：１３９８（１９９９））と可溶性キメラＴＮＦα受容体（Ｐｅｐｐｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７４：１４８３（１９９１）；及びＷｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８４：４３３（１９９５））は関節リウマチの治療に広く使用されている。従って、臨床用のＴＮＦα特異的ワクチンが得られるならば望ましい（Ｄａｌｕｍ，前出；Ｓｐｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：７４５０（２００７）；Ｂｕａｎｅｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３：１９４４２（２００６）；Ｃａｐｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：３１４４（２００４））。三量体ｍＴＮＦαのＸ線結晶構造（Ｂａｅｙｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５５：７７２（１９９９）；及びＢａｅｙｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５３：３２９（１９９７））に基づき、１個のＴｙｒ８６→ｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異体ｍＴＮＦα（ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα，図１Ｂ参照）を本発明の例証用抗原として選択した。Ｔｙｒ８６は各種哺乳動物ＴＮＦ間で高度に保存されており、この部位の突然変異は蛋白質フォールディング又は三量体形成に影響を与えないことが分かっている。Ｔｙｒ８６の突然変異は細胞毒性の有意低下も生じるため、ワクチン接種目的に有利である。例えばＶａｎ  Ｏｓｔａｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ７：５（１９９４）；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２６３５０（１９９３）；及びＺｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：２４０６９（１９９２）参照。
【０１０８】
実施例２は、例えばＴＮＦαに対するポリクローナルＩｇＧ抗体応答の性質と持続性を特性決定し、野生型レチノール結合蛋白質４、即ちｍＲＢＰ４に対する抗体応答の誘発を立証する（従って、免疫機能に無関係の自己蛋白質による本発明の使用を立証する）ことにより、本発明の広範な利用可能性を更に例証する。興味深いことに、実施例２は更に、ｐＮＯ２Ｐｈｅにより誘導される自己寛容解除がＷＴ  ｍＴＮＦαの複数のエピトープに対する抗体応答を生じることも示し、前記エピトープは非天然免疫原ＴＮＦαのｐＮＯ２Ｐｈｅ残基を含む領域に対応する天然ＴＮＦαの領域を必ずしも含まない。従って、本発明の非天然免疫原を免疫する結果、免疫グロブリンエピトープスプレディングが生じ、誘導エピトープとは異なるエピトープが誘発中の免疫応答の主要標的となるという利点がある。下記参照。非天然免疫原が由来する疾患関連部分全体にわたるエピトープに対する免疫の拡大は、ワクチン設計で特に必要とされる現象である。免疫系が疾患関連部分上の複数の標的を攻撃する能力を強化すると、この部分に対する免疫応答の効率及び／又は強靭性を増すことができる。
【０１０９】
当然のことながら、下記実施例の例証は本発明のＴＮＦα又はＲＰＢ４に止まらない。本明細書の記載から明らかなように、各種態様は非天然ＴＮＦα及びＲＰＢ４部分に任意非天然アミノ酸の１個以上を含むことができる。更に、このような非天然免疫原に存在する非天然アミノ酸は場合により免疫原内の任意位置に存在することができる。天然ＴＮＦα及びＲＢＰ４の対応する天然アミノ酸に置換する非天然アミノ酸は保存的アミノ酸置換でもよいし、非保存的アミノ酸置換でもよい。また、非天然免疫原性ＴＮＦα及びＲＢＰ４は多数の方法の任意のもので作製することができる。多くの態様は非天然アミノ酸の直接組込み手段として直交翻訳（下記参照）を利用するが、他の直接組込み法（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系、固相合成法等）も場合により使用できる。本発明の態様は直交翻訳等の直接組込み法と併用又は追加使用する場合を除き、一般に翻訳後又は化学修飾法を使用しない。
【０１１０】
免疫応答を増強／強化するための方法及び組成物
本明細書の実施例及び記載から明らかなように、本発明の非天然免疫原は標的部分に関連する疾患に対して防御性の（又は疾患状態を治療するために使用可能な）強靭な交差反応性抗体応答を天然標的部分（例えば非天然アミノ酸を含まない疾患関連蛋白質）に対して誘発することができる。従って、本発明は該当標的部分の特定エピトープ（例えば疾患関連部分の表面露出エピトープ又はＴ細胞エピトープ）に非天然アミノ酸を部位特異的に組込むことにより免疫自己寛容を解除することができる。例えば、以下の簡略スキームにおいて、標的部分（例えば疾患関連部分）はエピトープ１、２及び３を含む。非天然免疫原も前記部分のエピトープ１、２及び３に由来又は対応する（例えば同一配列をもつ）エピトープ１、２及び３を含む。他方、非天然免疫原のエピトープ２は標的部分の対応する天然アミノ酸に置換する非天然アミノ酸（星印で示す）を含む。非天然免疫原における非天然アミノ酸の存在は、標的部分の異なるエピトープを認識することができる交差反応性抗体の産生をもたらすことができる（エピトープスプレディング）。例えば、（非天然アミノ酸を含む非天然免疫原のエピトープに対応しない）エピトープ１及び３と（非天然アミノ酸をもつ非天然免疫原のエピトープに対応する）エピトープ２に対して交差反応性の抗体を産生することができる。
【表１】
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【０１１１】
該当標的部分の特定エピトープに非天然アミノ酸を部位特異的に組込むことにより免疫自己寛容を解除し、非天然免疫原を作製する方法は、蛋白質フォールディング病や癌に関連するもの（例えば夫々アミロイドβ（１−４２）ペプチド又は前立腺特異的抗原）を含む多数の内在部分（例えば蛋白質）に適用可能である。更に、このアプローチは低免疫原性エピトープに対して強力な抗体応答を誘発し、外来標的部分（例えばウイルス、細菌、真菌、プリオン、又は寄生虫感染に起因する外来標的）に対して中和抗体を産生させることもできる。
【０１１２】
当然のことながら、本発明の各種態様は、対象に接種すると、非天然免疫原に対する抗体、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞でありながら標的部分（例えば非天然アミノ酸を含まず、対象の体内に存在するか又は対象の体内に存在することが可能な疾患関連部分）に対して交差反応性の抗体、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞の産生をもたらす非天然免疫原（即ち１個以上の非天然アミノ酸を含むという点を除き、標的部分に対応する分子）の投与を利用する。更に他の態様では、天然標的部分と交差反応し、対象に予防／治療剤として投与される抗体を産生させるために非天然免疫原を使用することができる。
【０１１３】
従って、所定態様において、本発明は１個以上の非天然アミノ酸を含む非天然免疫原を対象に投与することにより、対象の体内の標的部分（例えば疾患関連部分、対象の自己分子、対象の体内の病原体に由来する分子、又は対象の体内に存在することが可能な病原体に由来する分子等）に対する免疫（ないし免疫的）応答を誘発する方法を含む。非天然アミノ酸を含まない標的部分に対応する免疫原に対する抗体が対象により産生され、この抗体は特定標的部分に対して交差反応性である。この場合も、当然のことながら、産生される抗体は非天然免疫原上に非天然アミノ酸をもつエピトープに対応する標的部分上のエピトープに対して必ずしも特異的ではない。本発明の方法は標的（例えば疾患関連）部分に対する対象の免疫寛容を解除するために使用することができる。また、本明細書では直交翻訳系又は他の直接組込み法（下記参照）による作製について記載するが、免疫原性非天然抗原を作製後に他の方法（例えば化学修飾等）で修飾してもよい。このような間接法は一般に直交法等の直接組込み法と併用又は追加使用される。
【０１１４】
以下により詳細に説明するように、対象に免疫応答を誘発するために使用する免疫原は一般に対象の体内の標的部分又は対象の体内に存在することが可能な標的部分（例えば対象に感染することが可能な細菌に由来する部分、対象に発生することが可能な腫瘍に由来する部分等）の「非天然」型を含む。換言するならば、非天然免疫原は場合により標的部分の１個以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸で置換されているという点を除き、標的部分と同一のアミノ酸配列／構造を含むことができる（その他の例については下記実施例のセクション参照）。代替的又は付加的に、非天然免疫原は標的部分のアミノ酸配列に１個以上の非天然アミノ酸残基を付加した配列を含むことができる。特定態様において、非天然アミノ酸置換及び／又は付加は元の標的部分に対して非天然免疫原の立体配座構造を変化させない（又はごく僅かしか変化させない）。従って、非天然免疫原と標的部分の三次及び／又は四次構造は同一であるか、又は相互に非常に類似することができる。非天然免疫原における１個以上の非天然アミノ酸の配置は場合により、例えばその位置に配置することにより免疫原が由来する標的部分に対して免疫原の立体配座が変化するか否か、その位置により非天然アミノ酸が抗体に接触可能になるか（例えば抗体が非天然アミノ酸を含む領域と結合できるか）否か等に基づいて選択される。非天然免疫原に組込まれる非天然アミノ酸は（標的部分の対応する天然アミノ酸に対して）保存的置換でもよいし、非保存的置換でもよい。
【０１１５】
本発明の他の態様は１種以上の非天然免疫原を投与することにより、及び／又はこのような非天然免疫原に対する抗体でありながら、対応する天然標的部分に対して交差反応性の１種以上の抗体を投与することにより、対象を予防的及び／又は治療的に処置する方法に関する。
【０１１６】
本発明は更に少なくとも処置の対象になると予想される標的部分（例えば疾患関連部分）（例えばＴＮＦα）を同定することによるワクチン製造方法を含む態様を含む。当然のことながら、このような標的部分は一般に「天然」であり、非天然アミノ酸を含まない。前記方法は更に非天然免疫原、即ち１個以上の非天然アミノ酸（例えば非天然アミノ酸置換及び／又は付加）を含む標的部分の対応する「非天然」型を準備する段階を含む。この場合も、非天然免疫原を対象に投与すると、免疫原に対する抗体でありながら標的部分に対して交差反応性の抗体を産生するように、免疫原は標的部分と同一又はほぼ同一の構造立体配座を含むことができる。本発明は更にこのような方法により作製されたワクチンも含む。
【０１１７】
当然のことながら、本発明の各種態様において、天然標的部分は免疫応答が誘発されるとき、及び／又は予防的処置が施用されるとき等に対象の体内に存在していてもよいし、存在していなくてもよい。従って、本発明の標的部分が対象の体内に存在すると記載する場合には、当然のことながら、標的部分が対象の体内に存在することが可能な場合も含む。従って、標的部分は対象に発生する可能性がある腫瘍に由来するものでもよいし、対象に感染する可能性がある感染性物質に由来するものでもよいし、その他のものでもよい。
【０１１８】
従って、随所に説明するように、各種態様において、標的部分は疾患関連部分、生得部分、外来部分等とすることができる。標的部分はそれ自体非免疫原性でもよいし、部分免疫原性又は低免疫原性等でもよい。外来性の標的部分は任意生物（例えば細菌、ウイルス等）に由来することができる。自己標的部分は任意自己抗原（例えば腫瘍関連抗原等）とすることができる。非天然免疫原に組込まれる非天然アミノ酸は任意非天然アミノ酸とすることができ（下記参照）、免疫原の任意位置に配置することができる。標的部分における天然アミノ酸に対して、免疫原における非天然アミノ酸の置換は保存的置換でも非保存的置換でもよい。更に、以下に詳述するように、非天然免疫原は多数の直接組込み法（例えば直交翻訳、固相合成法等）の任意のものにより作製することができる。本発明の典型的な態様は翻訳後修飾や化学修飾等の間接組込み法により非天然免疫原を作製しない（但し、このような方法を場合により直交翻訳等の直接組込み法と併用又は追加使用することや、直交翻訳等の直接組込み法の後に使用することは可能である）。
【０１１９】
疾患状態と疾患関連標的部分
本発明の方法及び組成物は多様な病態／疾患状態を予防的及び／又は治療的に処置するために使用することができる。例えば、本発明は免疫疾患の処置に使用することができる。このような免疫疾患としては限定されないが、自己免疫疾患（例えば糖尿病、関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、多発性硬化症（例えばＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５／ＣＤ９５等のＭＳ関連抗原に関連するもの）、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹様皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、癩性リバーサル反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ぶどう膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性感音難聴、再生不良性貧血、純赤血球性貧血、特発性血小板減少症、多発軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ぶどう膜炎及び間質性肺線維症）、移植片対宿主病、移植、及びアレルギー（例えばアトピー性アレルギー）が挙げられる。本発明は更に糖尿病／心血管病（例えばＲＢＰ４に関連するもの）等の非自己免疫／非感染性病原体を原因とする疾患状態や、アルツハイマー病（例えば疾患関連部分は例えばアミロイドβ４０、アミロイドβ４２等を含むことができる）等の特発性原因の疾患状態を処置することもできる。
【０１２０】
本発明の方法及び組成物の各種態様はＴＮＦα活性に関連する疾患状態（例えば悪液質、敗血症ショック、細菌感染防御性肉芽腫、成人呼吸窮迫症候群、シリカ肺線維症、自己免疫疾患、多臓器不全、多発性硬化症、心機能障害、アテローム性動脈硬化症、虚血再潅流傷害、インスリン抵抗性、及び炎症性腸疾患等）を予防的及び／又は治療的に処置するために使用することもできる。本発明の他の態様はＲＢＰ４活性に関連する疾患状態（例えばマシュー・ウッド症候群、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、及びシュタルガルト病等）を予防的及び／又は治療的に処置するために使用することができる。
【０１２１】
他の態様において、本発明の方法及び組成物は各種癌（例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、皮膚癌等）を予防的及び／又は治療的に処置するために使用することができる。このような処置としては限定されないが、腫瘍関連抗原が存在する癌の処置が挙げられる。多数の癌（例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌等）について腫瘍関連抗原が知られている。腫瘍関連抗原としては限定されないが、結腸癌と他の癌に由来する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、及びＮＹ−ＥＳＯ（精巣の免疫特権領域及び各種腫瘍細胞で発現される非突然変異抗原）；同一組織に由来する正常及び新生細胞で発現される抗原である家系特異的腫瘍関連抗原（例えばメラノサイト−メラノーマ家系抗原ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連蛋白質、又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；腫瘍細胞中で突然変異した遺伝子又は正常細胞と異なる腫瘍内レベルで転写された遺伝子に由来するエピトープ蛋白質／ペプチド（例えば突然変異ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂ１再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、突然変異又は野生型ｐ５３、チトクロームＰ４５０  １Ｂ１、及び異常発現イントロン配列（例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ））；ミエローマ及びＢ細胞リンパ腫でユニークなイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン再構成；ヒトパピローマウイルス蛋白質Ｅ６及びＥ７等の腫瘍ウイルスプロセスに由来するエピトープ蛋白質／ペプチド；並びに癌胎児抗原やα胎児蛋白質等の腫瘍選択的発現を伴う非突然変異腫瘍胎児蛋白質が挙げられる。
【０１２２】
特定態様において、本発明は卵巣癌を処置するために使用することができ、及び／又は標的疾患関連部分は例えば卵巣癌関連抗原、ＣＡ１９−９、ｐ５３、ＯＣＡＡ、ＨＯＸＢ７、Ｃａ１２５等を含むことができる。更に他の態様において、本発明は前立腺癌を処置するために使用することができ、及び／又は標的疾患関連部分は例えば前立腺癌関連抗原、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＣＴＡ−Ｉ等を含むことができる。本発明の他の態様は乳癌の処置を含むことができ、及び／又は標的疾患関連部分は例えばＣＡ１５−３、ＣＡ２７−２９、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ等を含むことができる。本発明で利用することができる腫瘍関連抗原に関するその他の情報は例えば“Ｔｕｍｏｒ−Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ｂｙ  Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，”Ｂｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２：３３７−３６５，１９９４；及び“Ａ  ｌｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，”Ｒｅｎｋｖｉｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ５０：（１）３−１５  ＭＡＲ  ２００１に記載されている。
【０１２３】
他の態様において、本発明は限定されないが、例えばＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−１、ＣＸＣＲ４、又はＧ蛋白質共役型受容体（ＧＣＰＲ）のいずれか等の自己抗原に関連する疾患、障害等を処置するために使用することができる。本発明により対処することができる多数の腫瘍関連抗原及び対応する癌と、自己抗原及び免疫疾患が当業者に周知である。
【０１２４】
所定態様において、本発明は非天然抗原がＨＩＶ／ＡＩＤＳに関連する標的疾患関連部分（例えばｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０等）に対応し得るＨＩＶ感染症の処置を含む。他の代表的なＨＩＶ部分としては、限定されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｎｅｆ、及びｒｅｖが挙げられる。
【０１２５】
他の態様において、本発明はウイルス感染症を処置するために使用することができ、非天然免疫原はウイルスに関連する標的疾患関連部分に対応することができ、ウイルスとしては、例えばアデノウイルス、アルファウイルス、カリシウイルス（例えばカリシウイルスカブシド抗原）、コロナウイルス、ＣＭＶ（例えばｐｐ６５）、ジステンパーウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、ＥＢＶ（例えばｇｐ３４０又は核抗原３Ａ）、フラビウイルス（例えばＨｅｐ  Ｃ（例えばコア抗原））、ヘパドナウイルス（例えばＨｅｐ  Ｂ（例えばＢ型肝炎コア又は表面抗原ＨｂｓＡｇ、ないしエンベロープＡｇ  ｐｒｅ  Ｓ２、もしくはｐｒｅ  Ｓ１  ａｇ））、デルタ肝炎原因物質、Ｅ型もしくはＦ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（例えばＶＰ１）、ＧＢＶ−Ｃ、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス蛋白質、例えばＩ型糖蛋白質ＧもしくはｇｐＤもしくはＣＰ２７、又は水痘帯状疱疹ウイルス糖蛋白質、例えばＩＥ６２もしくはｇｐ１ないしエンベロープ蛋白質）、免疫不全ウイルス（例えばＨＩＶ（例えばエンベロープ又はプロテアーゼ））、伝染性腹膜炎ウイルス、インフルエンザウイルス（例えばＡ型インフルエンザヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、又は核蛋白質）、ＬＣＭＶ（例えば核蛋白質）、白血病ウイルス  マールブルグウイルス、オルトミクソウイルス、パピローマウイルス（例えばＨＰＶ（例えばＨＰＶカプシド蛋白質））、パラインフルエンザウイルス（例えばヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ（例えばＦ又はＧ蛋白質））、パルボウイルス、ペスチウイルス、ピコルナウイルス（例えばＶＰ１、ＶＰ２、もしくはＶＰ３等のポリオウイルスカプシドポリペプチド、又はＨｅｐ  Ａ抗原）、ポックスウイルス（例えばエンベロープ蛋白質等のワクシニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルス（例えば狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｇ）、レオウイルス、レトロウイルス、ライノウイルス（例えばヒトライノウイルスカプシド）、風疹ウイルス（例えばカプシド蛋白質）、又はロタウイルスが挙げられる。
【０１２６】
更に他の態様において、本発明は細菌又はマイコバクテリア感染症を処置するために使用することができ、非天然免疫原は細菌又はマイコバクテリアに関連する標的疾患関連部分に対応するように作製することができ、細菌又はマイコバクテリアとしては、例えばアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）（例えば百日咳菌表面蛋白質）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）（例えばＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＡ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）（例えばブルセラ属菌表面蛋白質）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、キャプノサイトファーガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）（例えばＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ表面蛋白質）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、デルマトフィルス属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモバルトネラ属（Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えばｂ型インフルエンザ桿菌外膜蛋白質）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、Ｌ型菌、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば表面蛋白質）、結核菌等のマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｌｉｐｏａｒａｂｉｎｏｍａｎｎａｎ、マイコバクテリアｍＡＰＧ、ＥＳＡＴ−６、Ａｇ８５Ｂ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば髄膜炎菌クラス１外膜蛋白質）、ネオリケッチア属（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えばブドウ球菌ＧＰ−１）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば化膿連鎖球菌Ｍ蛋白質又は肺炎連鎖球菌莢膜多糖体又は連鎖球菌属表面蛋白質Ａｇ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）（例えばコレラ菌ＴｃｐＡピリンサブユニット）、及びエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（例えばペスト菌Ｆ１及びＶ抗原）が挙げられる。
【０１２７】
本発明の他の態様は真菌感染症の処置用の方法及び組成物等を含むことができ、作製される非天然免疫原は真菌に関連する標的疾患関連部分に対応することができ、真菌としては、例えばアブシジア属（Ａｂｓｉｄｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アルタナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バシジオボラス属（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、ビポラリス属（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、コニディオボラス属（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カーブラリア属（Ｃｕｒｖａｌａｒｉａ）、エピデルモフィトン属（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、エクソフィアラ属（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、マズレラ属（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ）、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）、ミクロスポラム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、モニリエラ属（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フィアレモニウム属（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）、フィアロフォラ属（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードアレシェリア属（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ）、シュードミクロドキウム属（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、リノスポリジウム属（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、スコレコバシディウム属（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、ステムフィリウム属（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、及びキシロハイファ属（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）等が挙げられる。
【０１２８】
本発明の所定態様は原生動物感染症の処置用の方法及び組成物等を含むことができ、作製される非天然免疫原は寄生原生動物に関連する標的疾患関連部分に対応することができ、寄生原生動物としては、例えばバベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）、バランチジウム属（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ）、ベスノイチア属（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、エイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）、エンセファリトゾーン属（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ）、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、ハモンディア属（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）、ヘパトゾーン属（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ）、イソスポラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）（例えばｇｐ６３等のリーシュマニア主要表面糖蛋白質）、ミクロスポリジア属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、ネオスポラ属（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）、ノゼマ属（Ｎｏｓｅｍａ）、ペンタトリコモナス属（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（例えば熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲蛋白質（ＰｆＣＳＰ）、スポロゾイト表面蛋白質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝細胞期抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ｃ−ｔｅｒｍ）、輸送蛋白質１（ＰｆＥｘｐ−１）、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２８、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２３０）、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、サルコシスチス属（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、タイレリア属（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）、トキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、及びトリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）が挙げられる。
【０１２９】
本発明の更に他の態様は蠕虫感染症の処置用の方法及び組成物を含むことができ、作製される非天然免疫原は寄生蠕虫に関連する標的疾患関連部分に対応することができ、寄生蠕虫としては、例えばアカントケイロネマ属（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａ）、アエルロストロンギルス属（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、アンシロストーマ属（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）、アンギオストロンギルス属（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、アスカリス属（Ａｓｃａｒｉｓ）、ブルギア属（Ｂｒｕｇｉａ）、ブノストムーム属（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）、キャピラリア属（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）、チャベルチア属（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）、クーペリア属（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）、クレノソーマ属（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）、ジクチオカウルス属（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）、ジオクトフィーマ属（Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ）、ジペタロネーマ属（Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａ）、裂頭条虫属（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）、ジピリジウム属（Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍ）、ディロフィラリア属（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）、ドラクンクルス属（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ）、エンテロビウス属（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）、フィラロイデス属（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）、ヘモンクス属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、ラゴキラスカリス属（Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓ）、ロア糸状虫属ポリペプチド、マンソネラ属（Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ）、ムエレリウス属（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）、ナノフィエツス属（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）、ネカトール属（Ｎｅｃａｔｏｒ）、ネマトジルス属（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）、エソファゴストム属（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）、オンコセルカ属（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）、オピストルキス属（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ）、オステルタギア属（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、パラフィラリア属（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）、パラゴニムス属（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）、パラスカリス属（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）、フィサロプテラ属（Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａ）、プロトストロンギルス属（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）、スピロセルカ属（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）、スピロメトラ属（Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ）、ステファノフィラリア属（Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ）、ストロンギロイデス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）、ストロンギルス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、テラジア属（Ｔｈｅｌａｚｉａ）、トキサスカリス属（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ）、トキソカラ属（Ｔｏｘｏｃａｒａ）、トリキネラ属（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、トリコストロンギルス属（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、トリチュリス属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ウンシナリア属（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）、及びウケレリア属（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）が挙げられる。
【０１３０】
本発明の他の態様は外部寄生虫感染症の処置用の方法及び組成物を含むことができ、作製される非天然免疫原は外部寄生虫に関連する標的疾患関連部分に対応することができる。このような外部寄生虫としては、例えばノミ；マダニとヒメダニを含むダニ；ブヨ、蚊、サンドフライ、ブラックフライ、ホースフライ、ホーンフライ、ディアフライ、ツェツェバエ、サシバエ、蝿蛆症の原因となるハエ及びヌカバエ等のハエ類；アリ；クモ、シラミ；ケダニ；並びにナンキンムシやサシガメ等の半翅類昆虫が挙げられる。更に他の態様において、免疫原は花粉ないしアレルゲンの標的部分に対応することができる。
【０１３１】
非天然アミノ酸
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種類の遺伝的にコードされる以下の標準αアミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。本発明の各種態様において、非天然免疫原に組込まれる１個以上の非天然アミノ酸は任意非天然アミノ酸とすることができる。従って、当然のことながら、本明細書における特定非天然アミノ酸の列挙は必ずしも本発明を限定するとみなすべきではない。例えば直交成分を含む翻訳系を使用してｉｎ  ｖｉｖｏコードすることにより多様な非天然アミノ酸が蛋白質に組込まれている。参考のために、例えばＬｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２３９−２４４；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ３５：２２５−２４９；Ｘｉｅ  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００６）“Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ”Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：７７５−７８２；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ，４４（１）：３４−６６（２００５）及びＣｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）“Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−９６７参照。
【０１３２】
更に、本発明の各種態様では、例えばサプレッサーｔＲＮＡを所望の非天然アミノ酸で化学的にアシル化し、免疫原生合成に対応することが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ抽出液に添加する生合成法を使用して非天然アミノ酸を免疫原にｉｎ  ｖｉｔｒｏ組込むことができる。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法に関する記載については、例えばＶ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５，３４：６２１（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４  １８２−１８８（１９８９）；及びＪ．Ｄ．Ｂａｉｎ，Ｃ．Ｇ．Ｇｌａｂｅ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ，Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ，“Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１  ８０１３−８０１４（１９８９）参照。利用可能な合成ペプチド化学（又はこのような方法により天然アミノ酸を非天然アミノ酸に変換することもできる）、又は翻訳後プロセシングにより、天然生産又は合成生産された蛋白質に非天然アミノ酸を付加することもできる。しかし、この場合も当然のことながら、このような翻訳後修飾と化学修飾は一般に分子の合成中に１個以上の非天然アミノ酸の組込み（例えば直交翻訳、固相合成法等の直接組込み）との併用又は追加使用として実施する。従って、アミノ酸の翻訳後付加又は化学修飾は実施するとしても、一般に、分子の合成中に付加された非天然アミノ酸を既にもっている分子のみに実施する。免疫原への非天然アミノ酸の非直交組込みに関するその他の情報については以下に記載する。
【０１３３】
αアミノ酸の一般構造は式Ｉ：
【化２】
2011514322.tif 000005
により表される。
【０１３４】
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種類の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種類の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。なお、例えば免疫応答を強化するために使用する本発明の非天然アミノ酸は上記２０種類のαアミノ酸以外の天然化合物でもよい。
【０１３５】
本発明で使用する非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
【０１３６】
非天然アミノ酸において、例えば、式ＩにおけるＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、エーテル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、エノン、イミン、エステル、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、アミノ酸側鎖と結合した糖部分、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に対して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素等）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、並びに１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。
【０１３７】
別の側面において、本発明は下式ＩＶ：
【化３】
2011514322.tif 000006
により表される一般構造をもつ非天然アミノ酸を利用することができる。
【０１３８】
この構造をもつ非天然アミノ酸は一般にＲ１が２０種類の天然アミノ酸の１種（例えば、チロシン又はフェニルアラニン）で使用される置換基であり、Ｒ２がＲ２−Ｒ１として一緒になって２０種類の標準天然アミノ酸のいずれかの側鎖以外のものとなるような置換基である任意構造である。従って、この種の非天然アミノ酸は天然アミノ酸誘導体とみなすことができる。
【０１３９】
非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化４】
2011514322.tif 000007
の構造により表されるような修飾主鎖構造も含むことができ、上記式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般にＨ以外の任意置換基である（Ｒ’がＨである場合には、ＲはＬ配置をとる）。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩＩにより示すようにアミノ基又はカルボキシル基に置換を含むことができる。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種類の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α炭素における置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
【０１４０】
所定側面において、本発明はＬ体の非天然アミノ酸を利用する。しかし、本発明はＬ体の非天然アミノ酸の使用に限定されるものではない。これらの非天然アミノ酸のＤ体も本発明で利用できると考えられる。
【０１４１】
本発明の各種態様は、更に、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシン等のチロシン類似体を含むことができ、置換チロシンはアルキニル基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分岐鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はアルキニル基、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、ニトロ、チオール基又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシルアラニン、７−アミノクマリンアミノ酸、７−ヒドロキシクマリンアミノ酸、ニトロベンジルセリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン及びｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。更に、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）、３，４，６−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロチロシン、３−チオールチロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。本発明の各種態様に含むことができる他の非天然アミノ酸としては、例えばｐ−ニトロフェニルアラニン、ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ボロニルＰｈｅ、ｏ−ボロニルＰｈｅ、ｍ−ボロニルＰｈｅ、ｐ−アミノＰｈｅ、ｏ−アミノＰｈｅ、ｍ−アミノＰｈｅ、ｐ−アシルＰｈｅ、ｏ−アシルＰｈｅ、ｍ−アシルＰｈｅ、ｐ−ＯＭｅＰｈｅ、ｏ−ＯＭｅＰｈｅ、ｍ−ＯＭｅＰｈｅ、ｐ−スルホＰｈｅ、ｏ−スルホＰｈｅ、ｍ−スルホＰｈｅ、５−ニトロＨｉｓ、３−ニトロＴｙｒ、２−ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｉｌｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２−ニトロＴｒｐ、４−ニトロＴｒｐ、５−ニトロＴｒｐ、６−ニトロＴｒｐ、７−ニトロＴｒｐ、３−アミノチロシン、２−アミノチロシン、Ｏ−スルホチロシン、２−スルホオキシフェニルアラニン、３−スルホオキシオキシフェニルアラニン又はｐ−カルボキシフェニルアラニン、ｏ−カルボキシフェニルアラニン、及びｍ−カルボキシフェニルアラニンが挙げられる。更に他の態様は、脂肪族、アリール又は複素環で置換されたボロン酸、ｐ−ボロノフェニルアラニン、ｏ−ボロノフェニルアラニン、又はｍ−ボロノフェニルアラニン等の非天然アミノ酸を含むことができる。本発明の各種態様において、非天然免疫原はグリコシル化、ニトロアリール修飾、硝酸化、アルキル化、アセチル化、酸化、硫酸化、又はリン酸化された（例えば翻訳後修飾以外の方法又は化学修飾以外の方法によりグリコシル化、ニトロアリール修飾、硝酸化、アルキル化、アセチル化、酸化、硫酸化、又はリン酸化された）２０種類の天然に存在する標準アミノ酸の１種以上を含む。直交翻訳系を使用して組込むことができる各種非天然アミノ酸の構造は公知である。各々その開示内容全体を本明細書に援用する本明細書に引用する参考文献参照。
【０１４２】
非天然アミノ酸の化学的合成
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については、例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては、例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）」；Ｍａｔｓｏｕｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｄｄ，（１９４９）“Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ（１９５９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）“Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ），”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ（１９８９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ（１９８５）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉ��ｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−ａ−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）“Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）も参照。
【０１４３】
非天然アミノ酸の細胞取込み
細胞による非天然アミノ酸取込みは例えば遺伝的にコードする直交対（セレクターコドンを認識するＯｔＲＮＡに負荷するＯＲＳ）により免疫原に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の１つである。例えば、αアミノ酸は電荷密度が高いため、取込みにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取込まれる。どの非天然アミノ酸が取り込まれるかを調べる迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）；及びＬｉｕ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ（１９９９）“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ”，ＰＮＡＳ  ９６：４７８０−４７８５における毒性アッセイ参照。取込みは種々のアッセイで容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
【０１４４】
非天然アミノ酸の生合成
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明の各種態様はこのような方法を提供する。例えば、新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより、場合により宿主細胞で非天然アミノ酸の生合成経路を作製する。付加する新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、（ＷＯ２００２／０８５９２３，前出に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は例えばＧｅｎｂａｎｋに登録されている。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
【０１４５】
実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノを生産するように既存経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため（又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるため）には、酵素及び他の生合成経路成分を進化させる方法として利用可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸を生産（又は新規シンテターゼを生産）するように新規酵素及び／又は前記酵素の経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで開発するためには、場合によりＤＮＡシャフリングを使用する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）“Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために関連（例えば相同）遺伝子のファミリーをシャフリングする。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の１例はＣｒａｍｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１に記載されている。例えばＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）“Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１２０５に記載されているような「ハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ＩＴＣＨＹ）」と呼ばれるＤＮＡ組換え法を使用して（生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに）新規酵素を作製することもできる。このアプローチは１種以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７，及びＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９），“Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，”Ｂｉｏｌ���ｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４も参照。本発明で場合により使用される別のアプローチは例えば非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集団突然変異誘発法を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダムに突然変異させ、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はＤｅｌｅｇｒａｖｅ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１５４８−１５５２に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばＡｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９７−３００；又はＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び／又は経路成分改変にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発法を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ（「非確率論的」突然変異誘発法と呼ぶことが多い）を使用すると、酵素及び／又は経路成分を作製した後に、（例えば非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ生産のための）１種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばＳｈｏｒｔのＷＯ００／４６３４４「遺伝子ワクチン及び酵素の非確率論的作製（ＮＯＮ−ＳＴＯＣＨＡＳＴＩＣ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ）」参照。
【０１４６】
このような突然変異法の代替方法の１例は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である（「全ゲノムシャフリング」と呼ぶことが多い）。例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸（又はその中間体）の生産能に関する生物（例えば大腸菌又は他の細胞）の選択により、このアプローチを本発明の各種態様に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産するように細胞で既存及び／又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の刊行物に教示されている方法を適用することができる：Ｐａｔｎａｉｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｃｉｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７−７１２；及びＺｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒａｐｉｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ７，４１５（６８７２）：６４４−６４６。
【０１４７】
例えば所望化合物を生産するための他の生物及び代謝経路改変技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路改変アプローチを教示している刊行物の例としては、Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（２００３）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３  ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９；Ｂｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｉｇｏ”Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：１２７−１３３；Ｂａｎｔａ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０），６２２６−３６；Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｒａｐｉｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５、及び他の多数の文献が挙げられる。
【０１４８】
使用する方法に関係なく、一般に本発明の改変生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然の細胞内の量）で生産されるが、他の細胞内アミノ酸の濃度を有意に変化させたり細胞内資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ  ｖｉｖｏ生産される典型的な濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を改変し、非天然アミノ酸を作製した後、場合によりｉｎ  ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
【０１４９】
非天然免疫原
対象に免疫応答を誘発するために本発明で使用する非天然免疫原は一般に対象の体内の標的（例えば疾患関連）部分又は対象の体内に存在することが可能な標的部分（例えば対象に感染することが可能な細菌に由来する部分、対象に発生することが可能な腫瘍に由来する部分等）の「非天然」型を含む。換言するならば、非天然免疫原は場合により標的部分の１個以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸で置換されているという点を除き、標的部分と同一のアミノ酸配列／構造を含む（例証については下記実施例のセクション参照）。代替的又は付加的に、非天然免疫原は１個以上の非天然アミノ酸残基を付加するという点を除き、標的部分と同一のアミノ酸配列を含むことができる。本発明の非天然免疫原は例えば１０個以上の非天然アミノ酸、５〜１０個の非天然アミノ酸、５個以下の非天然アミノ酸、又は２個以下の非天然アミノ酸等を含むことができる。非天然免疫原は例えば合計アミノ酸に対して１０％以上、５〜１０％、５％以下、２％以下、又は１％以下の百分率の非天然アミノ酸を含むことができる。この場合も、当然のことながら、本発明の非天然免疫原は多数の異なる非天然アミノ酸の１個以上を含むことができる。
【０１５０】
本発明の非天然免疫原における１個以上の非天然アミノ酸の位置は必ずしも限定的とみなすべきではない。従って、例えば、非天然アミノ酸は免疫原のＣ又はＮ末端のどちらに存在することもでき、あるいは非天然アミノ酸は免疫原の一次アミノ酸配列の内部の任意位置に存在することができる。下記実施例のセクション参照。非天然アミノ酸の配置（及びこの特定非天然アミノ酸の選択）は場合により多数の要素に依存し得る。例えば、非天然アミノ酸の位置／選択は場合により免疫原が由来する（対応する）天然標的蛋白質部分に対して免疫原の構造立体配座をさほど変化させない。従って、得られる非天然免疫原の構造立体配座は場合により抗体交差反応性が生じるように、対応する天然標的部分と依然として密接に一致することができる。従って、本発明の所定態様において、特定非天然アミノ酸と免疫原におけるその特定位置は天然標的部分に対して免疫原の（例えば三次／四次）構造変化を最小限にするように選択することができる。所定態様において、非天然アミノ酸の選択とその配置の選択はこのような選択／配置が感染性、細胞毒性等を低下させるのに役立つか否かも考慮することができる。免疫原に組込まれる非天然アミノ酸は場合により置換する天然アミノ酸と構造的に異なるものとすることができる。従って、所定態様において、特定非天然アミノ酸は標的部分の天然アミノ酸の非保存的代替物である。標的部分のＬｙｓ残基を非天然免疫原ではｐＮＯ２Ｐｈｅで置換した下記実施例参照。他の態様において、非天然アミノ酸は天然アミノ酸の保存的代替物である。また、免疫原における非天然アミノ酸の位置は抗体接触性及び／又はその血清抗体、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞応答の誘発能も考慮することができる。従って、本発明の各種非天然免疫原において、非天然アミノ酸は抗体に接触可能とすることができ、例えば表面に露出させることができる。
【０１５１】
各種態様において、非天然アミノ酸は任意非天然アミノ酸とすることができる。上記に加え、本発明で使用することができる非天然アミノ酸は側鎖基が天然アミノ酸と異なるが、非天然アミノ酸は蛋白質を構成する２０種類のαアミノ酸以外の天然化合物でもよい。本発明で利用される非天然アミノ酸としては、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；並びにプロリン以外の環状アミノ酸が挙げられる。
【０１５２】
各種態様において、本発明の非天然免疫原（例えば非天然ＴＮＦα）はｐ−ニトロフェニルアラニン、ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ボロニルＰｈｅ、ｏ−ボロニルＰｈｅ、ｍ−ボロニルＰｈｅ、ｐ−アミノＰｈｅ、ｏ−アミノＰｈｅ、ｍ−アミノＰｈｅ、ｐ−アシルＰｈｅ、ｏ−アシルＰｈｅ、ｍ−アシルＰｈｅ、ｐ−ＯＭｅＰｈｅ、ｏ−ＯＭｅＰｈｅ、ｍ−ＯＭｅＰｈｅ、ｐ−スルホＰｈｅ、ｏ−スルホＰｈｅ、ｍ−スルホＰｈｅ、５−ニトロＨｉｓ、３−ニトロＴｙｒ、２−ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｉｌｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２−ニトロＴｒｐ、４−ニトロＴｒｐ、５−ニトロＴｒｐ、６−ニトロＴｒｐ、７−ニトロＴｒｐ、３−アミノチロシン、２−アミノチロシン、Ｏ−スルホチロシン、２−スルホオキシフェニルアラニン、３−スルホオキシオキシフェニルアラニン又はｐ−カルボキシフェニルアラニン、ｏ−カルボキシフェニルアラニン、及びｍ−カルボキシフェニルアラニンの１種以上を含むことができる。この場合も、当然のことながら、特定非天然アミノ酸の列挙は本発明を限定するものとみなすべきではなく、本発明では例えば本明細書に記載するような他の非天然アミノ酸も使用することができる。
【０１５３】
例えば蛋白質結晶構造解析、ＮＭＲ等による蛋白質形状／立体配座の判定と、特定ポリペプチドへの非天然アミノ酸の組込みが行われた場合のその効果の判定は、当業者に容易に理解されよう。非天然免疫原の作製とこのような免疫原の構造立体配座及び抗体接触可能性の判定の例については下記実施例に示す。このような判定は場合により非天然免疫原における特定非天然アミノ酸の選択及び／又は配置を助長することができる。
【０１５４】
本発明の非天然免疫原は多数の標的部分を主体とすることができ、ポリペプチド／蛋白質のみならず、糖質、脂質、ハプテン及び／又は他の非蛋白分子と結合したポリペプチド／蛋白質でもよい。本発明の免疫原としては、限定されないが、本明細書に記載する標的（例えば疾患関連）部分のいずれかが挙げられる。
【０１５５】
本明細書に記載する１分類の有用な態様において、非天然免疫原は非天然ＴＮＦαを含み、高度に免疫原性（Ｅ．Ｋｅｉｎａｎ，Ｅｄ．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００５）ｐｐ．１−２８）で且つ構造保存的で抗体に接触可能なｐ−ニトロフェニルアラニン（ｐＮＯ２Ｐｈｅ，図１Ａ）、例えばＰＮＯ２Ｐｈｅ８６ＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４−ｍＴＮＦα、又はｐＮＯ２Ｐｈｅ１１３−ｍＴＮＦαを含むことができる。このような態様では、置換突然変異により天然ｍＴＮＦαと実質的に同様の三次及び四次蛋白質構造を非天然ｍＴＮＦαに維持することができ、従って、非天然ｍＴＮＦαに対して産生された中和抗体がｗｔ  ｍＴＮＦα上の対応するエピトープと交差反応する確率を増すことができる。本明細書の他の箇所に詳述するように、非天然アミノ酸の置換及び／又は付加は場合により内在ｍＴＮＦαに対して非天然ｍＴＮＦαの立体配座構造を変化させない（又は有意に変化させない）。ヒト対象における治療的及び／又は予防的処置に利用することができる非天然ｈＴＮＦαとしては、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８７−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０５−ｈＴＮＦα、又はｐＮＯ２Ｐｈｅ１１４−ｈＴＮＦαが挙げられる。
【０１５６】
一般に、血清ＴＮＦα濃度の上昇は各種疾患状態に結び付けられる。しかし、当然のことながら、免疫応答を誘発させる対象及び／又は予防的処置を施す対象等は疾患状態に相当する血清ＴＮＦα濃度を示さなくてもよい。従って、当然のことながら、本発明の抗体及び／又は非天然免疫原はＴＮＦα関連疾患を示す個体と示さない個体のいずれにも投与することができる。
【０１５７】
本発明の他の態様において、非天然免疫原は例えばＲＢＰ４関連疾患状態を治療及び／又は予防するために非天然ＲＢＰ４を含むことができる。非天然ＲＢＰ４を作製するためには任意天然ＲＢＰ４を１個以上の非天然アミノ酸で置換することができる。当然のことながら、ＴＮＦα又は他の任意標的部分と同様に、置換は天然アミノ酸を構造保存的非天然アミノ酸で置換（してもよいが、）する必要はない。代替的又は付加的に、非天然ＲＢＰ４を作製するために、１個以上の付加的な非天然アミノ酸を（その内部の天然アミノ酸に「置換」するのではなく）ＲＢＰ４ポリペプチドに付加することができる。非天然ＴＮＦα免疫原と本発明の他の任意免疫原構築について上述したように、非天然ＲＢＰ４は場合により天然ＲＢＰ４と実質的に同様の構造を含むことができ、従って、（標的ＲＢＰ４上のこのようなエピトープが非天然アミノ酸を組込んだ非天然ＲＢＰ４のエピトープに対応するか否かに関係なく）非天然ＲＢＰ４に対して産生された中和抗体が天然ＲＢＰ４上の対応するエピトープと交差反応する確率を増すことができる。当然のことながら、この場合も、標的部分の天然アミノ酸に置換するために使用される非天然免疫原の非天然アミノ酸は保存的置換である必要はない。下記実施例参照。対象における治療的及び／又は予防的処置に利用することができる非天然ＲＢＰ４としては、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４と、その対応するヒト対応物が挙げられる。
【０１５８】
非天然免疫原の作製
当然のことながら、本発明の非天然免疫原は各種方法で構築することができ、一般には直接組込み法により構築することができる。従って、本明細書の記載及び実施例は主に非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために直交翻訳系を使用するが、対象に投与する非天然免疫原を作製するため、例えば免疫原が対応する標的部分に対する免疫応答を誘発するため、又は例えば標的部分を中和するように対象に投与する交差反応性抗体の作製で使用される非天然免疫原を作製するために、場合により他の方法も使用できる。多くの態様では、合成後の分子中の天然アミノ酸の翻訳後修飾又は化学修飾ではなく（但し、このような方法を場合により直接組込みアプローチと併用又は追加使用してもよい）、免疫原の構築中（例えば直交翻訳、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成又は化学合成法等による免疫原の構築中）に非天然アミノ酸を非天然免疫原に付加する。従って、本明細書には非天然アミノ酸を組込んだ分子の特定構築方法（例えば直交翻訳）について詳述するが、必ずしもこのような方法は限定的とみなすべきではない。非天然アミノ酸を組込んだ分子の他の構築方法（非翻訳後及び非化学修飾を含む）も本発明の多くの態様に含まれる。
【０１５９】
当然のことながら、（例えば本明細書に記載及び言及するもの等の直交翻訳系による）免疫原への非天然アミノ酸の遺伝子組込みは、所定態様において、固相ペプチド合成法や他の同様のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法による非天然免疫原の作製にまさる利点を提供する。例えば、免疫原への非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組込みは非天然免疫原を合成するために生細胞の生合成機構を使用する。このようなｉｎ  ｖｉｖｏ生産は非天然アミノ酸により導入された活性／官能基を付加したという点を除き、野生型（天然）標的部分と同様の厳密な機能的免疫原（又は他の任意部分）を生産することができる。従って、これは野生型（天然）標的部分又は野生型部分に対して交差反応性の強靭な免疫応答を誘発するのに役立つ。更に、非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みの新規バイオテクノロジーツールを使用すると、高収率低コストで免疫原の適正な（即ち対応する標的部分と同様又は同一の）野生型立体配座を生じ易くすることができる。固相ペプチド合成法等の他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を使用する非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の全合成法は、所定態様ではより短い分子（例えば〜６０〜１００アミノ酸）に標的を狭めると共に、変性蛋白質を低収率で生産し、場合により相互にライゲーション等することができる。
【０１６０】
直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ技術
本明細書に説明するように、（対象に生得又は外来の）天然標的部分に対する免疫応答を誘発するために本発明で使用される非天然免疫原は一般に直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼシステムにより構築される。従って、直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対に関連する活性を理解することにより、本発明の新規組成物及び方法の理解が深まる。一般に、非天然アミノ酸を遺伝コードに付加するためには、宿主翻訳機構で効果的に機能することができるが、該当翻訳系に対して「直交性」のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと適切なｔＲＮＡを含む新規直交対が必要である。従って、直交部分は翻訳系に内在性のシンテターゼとｔＲＮＡから独立して機能する。直交対の望ましい特徴としては、内在ｔＲＮＡによりデコードされないセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン）等の特定コドンのみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、そのコグネイトｔＲＮＡをただ１個の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化ないし「負荷」するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡは更に一般に内在シンテターゼによりアミノアシル化されないか、低度にしかアミノアシル化即ち負荷されない。例えば大腸菌宿主系では、直交対は大腸菌に存在する４０種類の内在ｔＲＮＡのいずれとも交差反応しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、大腸菌に存在する２１種類の内在シンテターゼのいずれでもアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含む。
【０１６１】
本発明における１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の作製に適した直交翻訳系の一般原理と、直交翻訳系の一般作製方法は当分野で公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝子コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００６／１１０１８２（出願日２００５年１０月２７日、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」）；及びＷＯ２００７／１０３４９０（出願日２００７年３月７日、発明の名称「真正細菌宿主細胞における直交翻訳成分の発現用システム（ＳＹＳＴＥＭＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＩＮ  ＥＵＢＡＣＴＥＲＩＡＬ  ＨＯＳＴ  ＣＥＬＬＳ））参照。例えばＬｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２３９−２４４；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１８６８、発明の名称「遺伝的にコードされるボロン酸アミノ酸（Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｂｏｒｏｎａｔｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ）」、出願日２００８年１０月３０日；ＷＯ２００７／０４７３０１、発明の名称「ファージディスプレイポリペプチドの選択的翻訳後修飾（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、出願日２００６年１０月１１日；及びＷＯ２００６／１１０１８２、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）」、出願日２００５年１０月２７日も参照。これらの出願は各々その開示内容全体を本明細書に援用する。非天然アミノ酸を組込む直交翻訳系と、その作製及び使用方法の記載については、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）“Ｅｘｐａ��ｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４４：３４−６６；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２２７−２３８；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）“Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：５４８−５５４；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ３５：２２５−２４９；Ｄｅｉｔｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｋｙｎｅ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：１５２１−１５２４；Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）“Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ−Ａｚｉｄｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２４：９０２６−９０２７；及び国際公開番号ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月２０日）も参照。これらの文献は各々その開示内容全体を本明細書に援用する。直交翻訳系のその他の詳細については、米国特許第７，０４５，３３７号、第７，０８３，９７０号、第７，２３８，５１０号、第７，１２９，３３３号、第７，２６２，０４０号、第７，１８３，０８２号、第７，１９９，２２２号、及び第７，２１７，８０９号に記載されている。
【０１６２】
上記に加え、本明細書で使用する非天然アミノ酸とは（構築されたものであるが）セレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種類の遺伝的にコードされるαアミノ酸以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。２０種類の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。各種態様において、非天然アミノ酸は任意免疫原性アミノ酸（例えば標準アミノ酸の免疫原性類似体）である。本発明の非天然アミノ酸は側鎖基が天然アミノ酸と異なるが、非天然アミノ酸は蛋白質を構成する２０種類のαアミノ酸以外の天然化合物でもよい。本発明の免疫原で使用することができる非天然アミノ酸の非限定的な例としては、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光架橋基をもつアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基をもつアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖をもつアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；並びにプロリン以外の環状アミノ酸が挙げられる。
【０１６３】
特定態様において、非天然ＴＮＦα又は他の任意非天然免疫原等の本発明の非天然免疫原はｐ−ニトロフェニルアラニン、ｏ−ニトロフェニルアラニン、ｍ−ニトロフェニルアラニン、ｐ−ボロニルＰｈｅ、ｏ−ボロニルＰｈｅ、ｍ−ボロニルＰｈｅ、ｐ−アミノＰｈｅ、ｏ−アミノＰｈｅ、ｍ−アミノＰｈｅ、ｐ−アシルＰｈｅ、ｏ−アシルＰｈｅ、ｍ−アシルＰｈｅ、ｐ−ＯＭｅＰｈｅ、ｏ−ＯＭｅＰｈｅ、ｍ−ＯＭｅＰｈｅ、ｐ−スルホＰｈｅ、ｏ−スルホＰｈｅ、ｍ−スルホＰｈｅ、５−ニトロＨｉｓ、３−ニトロＴｙｒ、２−ニトロＴｙｒ、ニトロ置換Ｌｅｕ、ニトロ置換Ｈｉｓ、ニトロ置換Ｉｌｅ、ニトロ置換Ｔｒｐ、２−ニトロＴｒｐ、４−ニトロＴｒｐ、５−ニトロＴｒｐ、６−ニトロＴｒｐ、７−ニトロＴｒｐ、３−アミノチロシン、２−アミノチロシン、Ｏ−スルホチロシン、２−スルホオキシフェニルアラニン、３−スルホオキシオキシフェニルアラニン又はｐ−カルボキシフェニルアラニン、ｏ−カルボキシフェニルアラニン、及びｍ−カルボキシフェニルアラニンの１種以上を含むことができる。この場合も、当然のことながら、特定非天然アミノ酸の列挙は本発明を限定するものとみなすべきではなく、本発明では他の非天然アミノ酸（例えば他の免疫原性非天然アミノ酸）も使用することができる。
【０１６４】
直交翻訳系
直交翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸（例えばパラニトロフェニルアラニン（ｐＮＯ２Ｐｈｅ）、パラカルボキシフェニルアラニン、スルホチロシン等）（上記参照）を含む細胞（例えば大腸菌等の原核細胞）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）と、コグネイトＯ−ＲＳを含むことができる。本発明の非天然蛋白質を生産するために使用することができ、一般にＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含む直交系は細胞又は無細胞環境を含むことができる。
【０１６５】
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを「抑圧」すると言う。即ち、翻訳系（例えば大腸菌細胞）の内在機構により認識されないセレクターコドンは通常負荷されないため、そうでなければ核酸から翻訳されるはずのポリペプチドの生産が阻止される。直交対系では、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを特定非天然アミノ酸、例えば本明細書の実施例で使用するようにパラニトロフェニルアラニン（ｐＮＯ２Ｐｈｅ）でアミノアシル化する。負荷されたＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに起因する翻訳阻止を抑圧する。
【０１６６】
翻訳系（例えば大腸菌細胞）は例えば該当ポリペプチド（例えば対象に存在しているか又は存在することが可能な標的部分に対応する非天然免疫原等）をコードするポリヌクレオチドを介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用し、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。所定の系において、細胞は１個以上の付加的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、付加的なＯ−ｔＲＮＡは付加的なＯ−ＲＳにより別の非天然アミノ酸を負荷される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの一方は４塩基コドンを認識することができ、他方のＯ−ｔＲＮＡは終止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる終止コドン、複数の異なる４塩基コドン、複数の異なるレアコドン及び／又は複数の異なる非コーディングコドンを同一のコーディング核酸で使用することができる。従って、単一ポリペプチド（例えば非天然免疫原）が複数の非天然アミノ酸を含むことができ、及び／又はシステムで作製された異なるポリペプチドは異なる非天然アミノ酸を含むことができる。利用可能なＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡコグネイト対とその使用に関する更に詳細については、例えば本明細書の他の箇所に引用する参考文献参照。
【０１６７】
従って、所定の翻訳系は複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、２個以上の非天然アミノ酸をポリペプチドに組込むことができる。例えば、翻訳系は更に別のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、この別のＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この別のＯ−ＲＳはこの別のＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含み、Ｏ−ｔＲＮＡが例えばアンバーセレクターコドンを認識する細胞は、更に第２の直交対を含むことができ、第２のＯ−ｔＲＮＡは別のセレクターコドン（例えばオパールコドン、オーカーコドン、４塩基コドン、レアコドン、非コーディングコドン等）を認識する。所定の系において、異なる直交対は異なる起源に由来し、異なるセレクターコドンの認識を容易にすることができる。
【０１６８】
所定の翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチド（例えば対象の自己蛋白質標的に対応する非天然免疫原）をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞（例えば大腸菌細胞）を含むことができ、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。直交翻訳系は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するために培養宿主細胞を利用することができるが、本発明の直交翻訳系は無傷の生存宿主細胞を必要とするものではない。例えば、直交翻訳系は細胞抽出液の存在下で無細胞系を利用することができる。実際に、蛋白質生産に無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を使用することは定着技術である。本明細書に記載する直交翻訳系成分を使用して非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するようにこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を適応させることは十分に本発明の範囲に含まれる。
【０１６９】
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するｔＲＮＡのライブラリー及び／又はＲＳのライブラリーを作製するか及び／又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導することもできる。例えば、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための１つのストラテジーは対が機能する系に対して異種であり、ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用する翻訳系以外の起源又は多重起源に由来するｔＲＮＡ／シンテターゼ対を導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。直交対を作製するための第２のストラテジーはＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
【０１７０】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドへの非天然アミノ酸の例えばｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組込みを媒介することが望ましい。
【０１７１】
従って、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ｔＲＮＡを含むこのような組成物は更に例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に導入することができる。
【０１７２】
組換え直交ｔＲＮＡの作製方法と、セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸をポリペプチドに組込むことに関するその効率のスクリーニング方法は例えば国際出願公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝子コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；及びＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）“Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００：５６７６−５６８１も参照。その他の詳細は米国特許第７，０４５，３３７号、第７，０８３，９７０号、第７，２３８，５１０号、第７，１２９，３３３号、第７，２６２，０４０号、第７，１８３，０８２号、第７，１９９，２２２号、及び第７，２１７，８０９号に記載されている。
【０１７３】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
本発明で使用する非天然ポリペプチドを作製するために使用されるシステムのＯ−ＲＳはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳもしくはその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば大腸菌細胞）に提供することができる。
【０１７４】
Ｏ−ＲＳの作製、そのアミノアシル化効率のアッセイ、及び／又はその基質特異性の改変に関する一般的な詳細については国際公開番号ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝子コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」に記載されている。その開示内容全体を本願に援用するＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４４：３４−６６（２００５）；及びＨｏｂｅｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｌ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １１３：５５−５９も参照。このようなシステムに関するその他の詳細は米国特許第７，０４５，３３７号、第７，０８３，９７０号、第７，２３８，５１０号、第７，１２９，３３３号、第７，２６２，０４０号、第７，１８３，０８２号、第７，１９９，２２２号、及び第７，２１７，８０９号に記載されている。
【０１７５】
資源及び宿主生物
本発明の非天然免疫原を作製するために場合により使用することができる直交翻訳成分（Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ成分と宿主系が直交に作用する限り、他の任意種に由来する宿主翻訳系で使用するために任意生物、又は生物組み合わせに由来することができる。直交対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは同一生物に由来する必要はない。例えば、直交成分は真正細菌宿主系で使用するために古細菌遺伝子に由来することができる。
【０１７６】
更に、直交Ｏ−ｔＲＮＡはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは生物又は生物組み合わせ、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。他の態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの資源として使用することができる。更に、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。
【０１７７】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択又はスクリーニングすることができ、及び／又は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞（例えば真正細菌細胞）で使用することができる。使用される真正細菌細胞は限定されず、例えば大腸菌、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等が挙げられる。
【０１７８】
セレクターコドン
各種セレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、４個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。従来の部位特異的突然変異誘発法を使用して該当ポリペプチド（例えば対象の自己抗原等）をコードするポリヌクレオチドの該当部位にセレクターコドンを導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）“５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １６：７９１−８０２参照。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して（例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む）複数の非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。
【０１７９】
非天然アミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔＲＮＡＡｌａ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｃｏｄｏｎｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：７９３９−７９４５参照。このような場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。更に、生物によっては全トリプレットコドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に利用されている。例えばＫｏｗａｌ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ，（１９９７）“Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  ｆｏｒ  ｔＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２５：４６８５−４６８９参照。
【０１８０】
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）も含むことができる。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。非天然アミノ酸を蛋白質（例えば下記非天然ＴＮＦαのいずれか、又は実際には任意該当標的部分等の非天然免疫原）に組込む特定方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含むことができる。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸を同一蛋白質に挿入することができる。他の例において、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種類が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：２３７−２４４；Ｍａｇｌｉｅｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  “Ｓｈｉｆｔｙ”  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０７：７５５−７６９；Ｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔＲＮＡＡｌａ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｃｏｄｏｎｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：７９３９；Ｈｏｈｓａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｌａｒｇｅ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎｔｏ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｉｎ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２１：３４−４０；及びＭｏｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）“Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ  Ｃｏｄｏｎｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｄｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｔｅｐ  Ｓｉｚｅ”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９８：１９５−２０９も参照。４塩基コドンは各種直交システムでセレクターコドンとして使用されている。例えばＷＯ２００５／０１９４１５；ＷＯ２００５／００７８７０；及びＷＯ２００５／０７６２４参照。Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４４：３４−６６も参照。
【０１８１】
所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）。例えば、このような系としては、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
【０１８２】
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。本発明の方法と組成物で使用するために適応可能な非天然塩基対に関する記載としては、例えばＨｉｒａｏ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）“Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：１７７−１８２が挙げられる。Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ”Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２４：１４６２６−１４６３０も参照。
【０１８３】
上記のように、本発明の各種態様では、（対象に免疫応答を誘発するため、又は対象に投与することができる交差反応性抗体を作製するために）非天然免疫原を各種方法で構築することができる。例えば、非天然免疫原は一般に直交翻訳系やｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系又は固相合成法等の直接組込み法により構築することができる。但し、直交翻訳系法又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系法と併用（又は追加使用）する場合、あるいは直交又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系により付加されたアミノ酸（又はこのような既に構築された分子中の非天然アミノ酸）を修飾する場合には、化学修飾や翻訳後修飾等の間接組込みを実施することができる。当然のことながら、本発明の各種態様は多数の利用可能な方法により構築された非天然免疫原を包含することができる。
【０１８４】
免疫原への非天然アミノ酸の非直交組込み法
上記に加え、各種非直交ストラテジーを利用して非天然アミノ酸を本発明の部分に導入（又は直交法により標的部分（例えば疾患関連部分）に組込まれた非天然アミノ酸を修飾）し、（例えば上記直交法と併用して）非天然免疫原を作製することもできる。当然のことながら、本発明の典型的な態様では、免疫原の構築中（例えば免疫原が翻訳、作製／合成されているとき等）に非天然アミノ酸を免疫原に組込み、その後の化学修飾又は翻訳後修飾では付加しない。従って、所定態様では、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ及びＴｙｒ等の反応性側鎖をもつアミノ酸の誘導体化、例えばリジンからＮ２−アセチルリジンへの変換を直交法又は他の直接組込み法と併用及び／又は追加使用することができる。化学的合成も非天然アミノ酸を組込むための方法を提供することができる。例えばＤａｗｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：９２３（２０００）参照。
【０１８５】
別の例では、１００種類を上回る非天然アミノ酸をほぼ任意寸法の各種蛋白質に部位特異的に組込むために使用されているような、所望の非天然アミノ酸で化学的にアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを蛋白質生合成に対応することが可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ抽出液に添加する一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然免疫原を作製することができる。例えばＣｏｒｎｉｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５，３４：６２１（１９９５）；Ｎｏｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４  １８２−１８８（１９８９）；及びＢａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１  ８０１３−８０１４（１９８９）参照。
【０１８６】
選択圧組込み法と呼ばれるｉｎ  ｖｉｖｏ法を使用し、多様な野生型シンテターゼを利用して本発明の非天然免疫原を作製することもできる。例えばＢｕｄｉｓａ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１３：４１（１９９９）参照。このような栄養要求株では、細胞に特定天然アミノ酸を供給する該当する代謝経路を遮断し、標的遺伝子の転写を抑圧しながら、低濃度の天然アミノ酸を添加した最少培地で株を増殖させる。定常増殖期の開始時に、天然アミノ酸は欠乏し、非天然アミノ酸類似体で置換される。組換え蛋白質の発現誘導の結果、非天然類似体を含む蛋白質が蓄積する。例えばＭｉｎｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８４：２９（２０００）；Ｄｕｅｗｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：３４０４（１９９７）；及びＴａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４０：１４９４（２００１）参照。他の例については、例えばＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９：１６６５（１９９０）；Ｂｏｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２８３（１９９４）；Ｂｕｄｉｓａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３０：７８８（１９９５）；Ｂｕｄｉｓａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０：６１６（１９９７）；ｖａｎＨｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２８：６８（１９９８）；ｖａｎ  Ｈｅｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１２８２（２０００）；及びＫｉｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５６：９４８７（２０００）参照。
【０１８７】
本発明の免疫原に非天然アミノ酸を組込むための更に別の非必須／付加的ストラテジーはプルーフリーディングメカニズムをもつシンテターゼを修飾する方法である。これらのシンテターゼは区別できないため、ｔＲＮＡに通常負荷されるコグネイト天然アミノ酸と構造的に類似するアミノ酸をｔＲＮＡに負荷する。シンテターゼの別の部位でこのエラーを補正し、誤って負荷されたアミノ酸をｔＲＮＡから脱アシル化して蛋白質翻訳の忠実性を維持する。シンテターゼのプルーフリーディング活性が無効な場合には、通常負荷されるアミノ酸の構造類似体を負荷されたｔＲＮＡは編集機能から逃れ、成長中のポリペプチド鎖に構造アミノ酸類似体を組込むことができる。Ｄｏｒｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：５０１（２００１）参照。
【０１８８】
本発明の非天然アミノ酸を組込んだ免疫原の合成には固相合成法及び半合成法も使用することができる。例えば、以下の刊行物：Ｃｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ，５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ，４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１５１−１５７（１９８７）；及びＪａｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３（１９９４）とその引用文献参照。
【０１８９】
本発明の各種態様では、補因子、スピンラベル及びオリゴヌクレオチドを含む各種非天然側鎖を本発明の非天然免疫原に導入するために化学修飾を使用することができる。この場合も、化学修飾及び他の翻訳後修飾は使用するとしても、一般に直交翻訳等の直接組込み法の追加として使用する。従って、直交法により組込まれた非天然アミノ酸を修飾するため等に化学修飾を場合により上記直交又は他の方法と併用することができる。例えばＣｏｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，３１５３−３１５４（１９６６）；及びＰｏｌｌａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０３８−１０４０（１９８８）参照。
【０１９０】
あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した蛋白質に数個の生物物理学的プローブを組込むために使用されているような化学的に修飾されたアミノアシルｔＲＮＡを利用する生合成法を本発明で使用し、非天然免疫原を作製することもできる。以下の刊行物：Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，４８３−５１４（１９９３）；及びＫｒｉｅｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８６０４−８６０８（１９８６）とその引用文献参照。
【０１９１】
所望のアンバーナンセンス突然変異を含む遺伝子でプログラムされた蛋白質合成反応に化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを付加することにより、非天然アミノ酸を本発明の非天然免疫原に部位特異的に組込むこともできる。これらのアプローチを使用すると、特定アミノ酸に栄養要求性の株を使用して多数の２０種類の標準アミノ酸を近縁構造ホモログ（例えばフェニルアラニンをフルオロフェニルアラニン）で置換することができる。例えばＮｏｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｎｏｗａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｂｕｄｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．，３０１−３３６（１９９２）；及びＭｅｎｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．，２４，４３５−６２（１９９５）参照。
【０１９２】
マイクロインジェクション技術を使用して本発明の非天然免疫原に非天然アミノ酸を組込むこともできる。例えばＮｏｗａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：４３９（１９９５）；及びＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５（２０００）参照。例えばＴｕｒｃａｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９９９１（１９９６）；Ｇａｌｌｉｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：７３９（１９９７）；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２０：６１９（１９９８）；Ｅｎｇｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９６：８９（１９９９）；及びＬｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２３９（２００１）も参照。
【０１９３】
固相ペプチド合成法は非天然アミノ酸を組込んだペプチド及び小蛋白質を化学的に合成するために広く使用されており（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ．”ＪＡＣＳ  ８５：２１４９−２１５４参照）、本発明の非天然免疫原を作製するために応用することができる別の方法である。この技術は一般に２段階を含み、ＳＰＰＳの第１段階はカップリング−脱保護の反復サイクルによりポリマー支持体上の保護アミノ酸誘導体を使用してペプチド鎖を組み立てる段階を含むことができる。次に、固相に結合したペプチドの遊離Ｎ末端アミンを単一のＮ保護アミノ酸単位とカップリングすることができる。この単位を次に脱保護し、別のアミノ酸を結合することができる新規Ｎ末端アミンを露出させる。ＳＰＰＳの第２段階では、ペプチドを支持体から開裂させ、側鎖保護基を除去してペプチド（例えば１個以上の非天然アミノ酸を組込んだペプチド）を生成する。塩基不安定αアミノ保護基を使用するＦｍｏｃ（Ｃａｒｐｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９７２）“９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ａｍｉｎｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ．”Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ３７：３４０４−３４０９）と、酸不安定保護基を使用するｔ−Ｂｏｃの主に２種類の固相ペプチド合成法が使用されている。各方法は異なる樹脂と、アミノ酸側鎖保護工程及びその後の開裂／脱保護工程を使用する。
【０１９４】
蛋白質半合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込み、本発明の非天然免疫原を作製することもできる。蛋白質半合成法は分割されたインテインを使用することが多く、これは蛋白質の一部分であり、自動的に切除され、残りの部分（例えばエクステイン）と再結合して新たに活性になった蛋白質（スプライシング産物と言う）を生じることができる。例えば、非天然アミノ酸を含まない第１の蛋白質ドメインを、非天然アミノ酸を含む第２の蛋白質ドメインと併用し、非天然免疫原を作製することができる。このストラテジーはｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質発現システムで発現させることが困難な非天然免疫原を作製するために有利に使用できる。
【０１９５】
各種ケミカルライゲーション技術を使用して例えば蛋白質半合成中に本発明の蛋白質に非天然アミノ酸を組込み、非天然免疫原を作製することもできる。例えば、ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）反応において、Ｎ末端システインを含むペプチドは外来チオール触媒の存在下で例えばα−チオエステル基（例えばＣ末端チオエステル）を含む非天然アミノ酸と反応し、ライゲーション部位に天然ペプチド結合を形成する（Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。発現蛋白質ライゲーション（ＥＰＬ）は組換え及び合成ポリペプチドを化学選択的及び位置選択的に相互に結合させる蛋白質工学アプローチである。このアプローチは大半の蛋白質の一次構造を合成有機化学のツールに接触可能にし、非天然免疫原を作製するために蛋白質に組込むべき各種非天然アミノ酸の任意のものを付加できるようにする。これら及び他の蛋白質ケミカルライゲーション技術の更に詳細については、例えばＨｏｗｌ，ｅｄ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔｏｗａ  ＮＪ，２００５等に記載されている。
【０１９６】
技術に関するその他の詳細
ＲＳ及びｔＲＮＡ突然変異の作製と、各種組換え及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸操作方法（クローニング、発現、ＰＣＲ等を含む）に有用な他の参考文献としては、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｃｅｓｋｅ（ｅｄ）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（Ｋａｕｆｍａｎ）；Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｒａｌｐｈ  Ｒａｐｌｅｙ（ｅｄ）（２０００）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ（Ｒａｐｌｅｙ）；Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  １９２）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；及びＶｉｌｊｏｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＰＣＲ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＩＳＢＮ  １４０２０３４０３２が挙げられる。
【０１９７】
種々の蛋白質処理方法が知られており、例えば本発明の任意非天然免疫原を発現する細胞の組換え培養から本発明に従って産生された蛋白質を単離、検出、操作又は他の方法で処理するために使用することができる。種々の蛋白質単離検出法が当分野で周知であり、例えばＲ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ＣＤ−ＲＯＭ版  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；とその引用文献に記載されている方法が挙げられる。蛋白質精製検出法に関するその他の詳細はＳａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ  ｅｄ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）に記載されている。例えば処置、ワクチン、又は本発明の他の側面で使用するための免疫原を作製するために、本発明の各種方法により（例えば直交翻訳法により）作製した非天然免疫原を単離及び／又は精製するためにこれらの利用可能な方法を（場合により他の蛋白質精製法と併用して）使用することができる。
【０１９８】
抗体及び抗体産生
所定態様において、本発明は免疫原（即ち１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ非天然疾患関連部分）に対する１種以上の抗体を含み、前記抗体は対象に投与することができる。上記に詳述したように、このような抗体は一般に対象の体内に存在するか又は対象の体内に存在することが可能な対応する標的部分に対して交差反応性であり、前記天然標的部分は非天然アミノ酸を含まず、「非天然」免疫原が由来又は免疫原が対応する部分である。
【０１９９】
上記のように、抗体とは免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にコードされる１個以上のポリペプチドから構成される蛋白質を意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子としてはκ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子と、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκ又はλとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεとして分類され、夫々免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを規定する。
【０２００】
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体から成ることが分かっている。各四量体は各々「軽鎖」（約２５ｋＤ）１本と「重鎖」（約５０〜７０ｋＤ）１本をもつ同一のポリペプチド鎖２対から構成される。各鎖のＮ末端は主に抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。「可変領域軽鎖（ＶＬ）」及び「可変領域重鎖（ＶＨ）」なる用語は夫々これらの軽鎖と重鎖を意味する。
【０２０１】
抗体は例えば無傷の免疫グロブリン又は各種ペプチダーゼによる消化により生成された多数の十分に特性決定されたフラグメントとして存在することができる。従って、例えば、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合下の抗体を消化し、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１と結合した軽鎖であるＦａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’２を生成する。Ｆ（ａｂ）’２を穏和な条件下で還元すると、ヒンジ領域のジスルフィド結合が切断され、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は本質的にヒンジ領域の部分をもつＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）参照）。各種抗体フラグメントが無傷の抗体の消化により表されるが、当業者に自明の通り、このようなＦａｂ’フラグメントは化学的方法又は組換えＤＮＡ法の使用によりｄｅ  ｎｏｖｏ合成することができる。従って、本明細書で使用する抗体なる用語は無傷の抗体の修飾により生成された抗体フラグメント又は組換えＤＮＡ法を使用してｄｅ  ｎｏｖｏ合成された抗体フラグメントも含む。特定抗体としては１本鎖抗体（１本のポリペプチド鎖として存在する抗体）、又は（直接又はペプチドリンカーを介して）可変領域重鎖と可変領域軽鎖を結合して連続ポリペプチドを形成する１本鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）が挙げられる。１本鎖Ｆｖ抗体は共有結合したＶＨ−ＶＬヘテロダイマーであり、直接結合又はペプチドをコードするリンカーにより結合したＶＨとＶＬをコードする配列を含む核酸から発現させることができる。Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：５８７９−５８８３参照。ＶＨとＶＬは１本のポリペプチド鎖として相互に結合しているが、ＶＨ領域とＶＬ領域は非共有的に結合する。抗体Ｖ領域に由来し、天然では凝集しているが、化学的に分離した軽鎖及び重鎖ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に同様の三次元構造に折畳まれる分子に変換するｓｃＦｖ抗体と多数の他の構造が当業者に公知である（例えば米国特許第５，０９１，５１３号、５，１３２，４０５号、及び４，９５６，７７８号参照）。本発明で有用な抗体としては、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体が挙げられる。
【０２０２】
本発明の非天然免疫原、又はそのフラグメントを使用して本発明の抗体を作製することができる。本発明の非天然免疫原を使用してポリクローナル抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、又は抗体フラグメントを作製することができる。抗体を標準方法により精製すると、その反応性を悪化させる恐れのある望ましくない汚染物質（例えば血清蛋白質）を実質的に含まない抗体製剤が得られる。ポリクローナル抗体では、選択した哺乳動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）に本発明の非天然免疫原を免疫することができる。免疫した動物からの血清を次に採取し、当業者に周知の手順に従って処理することができる。更に、同様に当業者に周知の手順を使用してポリクローナル抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【０２０３】
代替的又は付加的に、本発明の非天然免疫原に対するモノクローナル抗体を作製することができる。ハイブリドーマ技術によるモノクローナル抗体の作製は当業者に周知である。例えば、細胞融合法又は他の技術（例えば発癌性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、エプスタイン・バール・ウイルスのトランスフェクション等）により本発明の抗体を産生する不死細胞株を作製することができる。例えばＳｃｈｒｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９８０）；米国特許第４，３４１，７６１号；４，３９９，１２１号；４，４２７，７８３号；４，４４４，８８７号；４，４５２，５７０号；４，４６６，９１７号；４，４７２，５００号；４，４９１，６３２号；及び４，４９３，８９０号等参照。
【０２０４】
当業者に容易に理解される通り、抗体（例えばモノクローナル、ポリクローナル、ヒト化等）の設計と作製の手引きとして他の多数の周知プロトコールが存在する。多数の商業的サービス（例えばＢｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｎａｗａ，Ｅｕｒｏｇｅｎｅｔｅｃ等）のいずれかにより抗体を作製することもできる。
【０２０５】
抗体に接触可能なｐ−ニトロフェニルアラニンを組込んだ非天然ＴＮＦα免疫  
原に基づく抗ＴＮＦα免疫療法
下記実施例に更に詳細に記載する１特定態様において、本発明はＴＮＦαの活性に関連する疾病の治療及び／又は予防に有用であると思われる組成物と方法を提供する。
【０２０６】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）はクローン病、内毒素ショック、脳マラリア、関節リウマチ等を含む多数の慢性炎症性疾患の発病に重要な役割を果たす。これらの疾患の治療及び／又は予防における大きな課題の１つはＴＮＦα中和抗体の産生を刺激するために免疫系に内在ＴＮＦαに対する寛容を選択的に克服させる方法の開発であった。
【０２０７】
ＴＮＦαを中和すると、このような疾患の症状を緩和することができる。例えば、抗ＴＮＦα抗血清はその治療可能性を調べるために多数の実験で使用されている（Ｖｅｒｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）“Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７：１８６９−１８８０；Ａｃｋｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ８：２５５３−６８，Ｋｎｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＴＮＦ  ａｎｔｉｂｏｄｙ”Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：１４４３−１４５３；Ｐｒｅｓｅｎｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｉｓｔｕｌａｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ”Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４０：１３９８−１４０５に報告されている）。可溶性キメラＴＮＦα受容体も関節炎、敗血症ショック、及びクローン病に関連する症状を最小限にするその効力について検討されている（Ｐｅｐｐｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ａ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ＴＮＦ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７４：１４８３−１４８９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）“Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ＩｇＧ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＤ４”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８４：４３３−４３９；Ｈｏｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  Ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”Ｄｒｕｇｓ  ６７：２６０９−２６３３；Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｅｐｔｉｃ  Ｓｈｏｃｋ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｆｃ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ”Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３４：１６９７−１７０２；Ｋｏｒｚｅｎｉｋ（２００４）“Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｆｕｔｕｒｅ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｂｅｙｏｎｄ  ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ”Ｇａｓｔｒｏ  Ｃｌｉｎ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ３３：２８５−３０１）。自己ＴＮＦαに対する対象の免疫寛容の解除はＴＮＦα関連疾患を治療及び／又は予防することができる１つのストラテジーである。
【０２０８】
免疫寛容を解除するという課題は本明細書の他の箇所に記載及び言及する多数のストラテジーにより検討されている。本発明の所定態様は非天然ＴＮＦα、即ち非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を含み、対象に投与すると、内在ＴＮＦα（例えば疾患状態に相当する血清濃度及び／又は発現レベルで対象に存在していてもよいし、存在していなくてもよいＴＮＦα）に対する免疫応答を刺激又は強化するＴＮＦαを提供する。更に、本発明は、ＴＮＦα関連疾患状態に関連する症状を緩和又は予防するために天然ＴＮＦαに対して交差反応性の抗非天然ＴＮＦα抗体の投与を必要とする疾患状態（例えばＴＮＦαの存在又は存在レベルに関連する本明細書に列挙する疾患状態）に対する処置とワクチンも提供する。
【０２０９】
一般に、血清ＴＮＦα濃度の上昇は各種疾患状態に結び付けられる。しかし、当然のことながら、免疫応答を誘発させる対象及び／又は予防的処置を施す対象等は疾患状態に相当する血清ＴＮＦα濃度を示さなくてもよい。従って、当然のことながら、本発明の抗体及び／又は非天然免疫原はＴＮＦα関連疾患を示す個体と示さない個体のいずれにも投与することができる。
【０２１０】
本明細書の「非天然免疫原」及び「非天然免疫原作製」の項と実施例には、任意非天然アミノ酸を組込んだ非天然ＴＮＦα（例えば本明細書に記載する非天然ＴＮＦαのいずれか）の作製方法を詳細に記載する。下記実施例に記載する非天然ＴＮＦαは直交翻訳系を使用して作製したが、当然のことながら、化学修飾又は翻訳後修飾以外の本明細書に詳述する非直交法のいずれか１種以上（例えば選択圧組込み法、固相合成法、蛋白質半合成法等）を使用して非天然ＴＮＦαを作製することもできる。
【０２１１】
本明細書に記載する１態様において、非天然ＴＮＦαは高度に免疫原性（Ｅ．Ｋｅｉｎａｎ，Ｅｄ．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００５）ｐｐ．１−２８）且つ高度に保存可能で抗体に接触可能なｐ−ニトロフェニルアラニン（ｐＮＯ２Ｐｈｅ，図１Ａ）残基をアミノ酸８６位に含む（例えばｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ＴＮＦα）。本態様では、置換突然変異により自己ＴＮＦαと実質的に同様の三次及び四次蛋白質構造を非天然ＴＮＦα（例えばｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα）に維持することができ、従って、非天然ＴＮＦα（例えばｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα）に対して産生された中和抗体が天然ｍＴＮＦα（例えばマウスＴＮＦα）上の対応するエピトープと交差反応する確率を増すことができる。上記に詳述したように、非天然アミノ酸の置換及び／又は付加は場合により内在天然ＴＮＦαに対して非天然ＴＮＦαの立体配座構造を変化させない（又は有意に変化させない）。マウス対象における治療的及び／又は予防的処置に利用することができる（例えばＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０３８７２１の）その他の非天然ｍＴＮＦα誘導体としては、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４−ｍＴＮＦα、又はｐＮＯ２Ｐｈｅ１１３−ｍＴＮＦαが挙げられる。ヒト対象における治療的及び／又は予防的処置に利用することができる（例えばＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＡ６１２００の）非天然ｈＴＮＦα誘導体としては、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８７−ｈＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０５−ｈＴＮＦα、又はｐＮＯ２Ｐｈｅ１１４−ｈＴＮＦαが挙げられる。
【０２１２】
一般に、血清ＴＮＦα濃度の上昇は各種疾患状態に結び付けられる。しかし、この場合も当然のことながら、免疫応答を誘発させる対象及び／又は予防的処置を施す対象等は疾患状態に相当する血清ＴＮＦα濃度を示さなくてもよい。従って、当然のことながら、本発明のワクチン、抗体及び／又は非天然免疫原はＴＮＦα関連疾患を示す個体と示さない個体のいずれにも投与することができる。
【０２１３】
抗体に接触可能なｐ−ニトロフェニルアラニンを組込んだ非天然ＲＢＰ免疫原に基づく抗ＲＢＰ４免疫療法
実施例２に記載する態様では、ＲＢＰ４関連疾患を治療及び／又は予防するために本発明の方法と組成物を有利に使用することができる。
【０２１４】
低分子量血清蛋白質であるＲＢＰ４は肝及び脂肪組織から分泌され、血清ビタミンＡの９０％の主要輸送蛋白質である。過剰濃度のＲＢＰ４は特にマシュー・ウッド症候群、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、及びシュタルガルト病等の視覚障害の原因となる。更に、血清ＲＢＰ４濃度の上昇はインスリン抵抗性及び／又は糖尿病の発病の原因となることも知られている。本発明の所定態様は例えば対応する天然ＲＢＰ４に対する抗体、Ｂ細胞、又はＴ細胞応答を刺激することにより、これらの疾患を治療及び／又は予防するために対象に投与することができる非天然ＲＢＰ４（即ち非天然アミノ酸を組込んだＲＢＰ４）を提供する。しかし、当然のことながら、この場合も、免疫応答を誘発させる対象及び／又は予防的処置を施す対象等は疾患状態に相当する血清ＲＢＰ４濃度を示さなくてもよい。従って、当然のことながら、本発明のワクチン、抗体及び／又は非天然免疫原はＲＢＰ４関連疾患を示す個体と示さない個体のいずれにも投与することができる。
【０２１５】
本明細書に詳述する非天然ＴＮＦαを作製するために使用することができる方法を使用して非天然ＲＢＰ４を作製することもできる。非天然ＲＢＰ４は、翻訳後修飾又は化学修飾以外の方法で非天然ＲＢＰ４に組込まれる本明細書に記載する任意非天然アミノ酸を含むことができる。非天然ＲＢＰ４を作製するために任意天然ＲＢＰ４を任意非天然アミノ酸で置換することができる。置換は天然アミノ酸を構造保存的非天然アミノ酸で置換する必要はない。代替的又は付加的に、１個以上の付加的な非天然アミノ酸をＲＢＰ４ポリペプチドに付加し、非天然ＲＢＰ４を作製することもできる。非天然ＲＢＰ４は場合により天然ＲＢＰ４と実質的に同様の構造を含むことができ、従って、非天然ＲＢＰ４に対して産生された中和抗体が天然ＲＢＰ４上の対応するエピトープと交差反応する確率を増すことができる。対象における治療的及び／又は予防的処置に利用することができる非天然ＲＢＰ４としては、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４と、対応するヒト構築物等が挙げられる。
【０２１６】
投与及び製剤
抗体及び／又は免疫原製剤
標的部分（例えばＴＮＦα又は本明細書に記載するその他の無数の可能な標的のいずれか）に対する免疫応答を誘発又は強化するために、本発明の処置方法は免疫原（例えば１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ標的部分の誘導体）に対する抗体を利用することができ、及び／又は免疫原自体（例えば非天然ＴＮＦα）を利用することができる。一般に、使用する用量でレシピエント（例えば対象）に非毒性の生理的に許容可能なアジュバント、賦形剤、及び／又は安定化剤とこのような抗体及び／又は免疫原を併用する。しかし、当然のことながら、本発明は必ずしも抗体及び／又は免疫原製剤の特定処方により限定されない。
【０２１７】
抗体及び／又は免疫原（即ち１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ標的部分の誘導体）の製剤には生理的に許容可能なアジュバント、賦形剤、及び／又は安定化剤を添加することができる。当分野で公知の賦形剤としては、例えば植物及び動物油脂が挙げられる。安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変化させるための塩類、望ましいｐＨを維持するための緩衝剤、及び／又は皮膚浸透促進剤も各種製剤で助剤（即ち賦形剤）として使用することができる。各種慣用剤形の製造方法は当業者に公知であるか又は自明であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照されたい。製剤には更にミョウバン、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、スクアレン、ビロソーム、ＭＳＰ１，ＱＳ２１等の１種以上のアジュバントを添加することができる。更に、製剤は、ポリペプチドキャリヤー、糖質キャリヤー（例えばマンノース等の単糖１単位以上、ムチン１単位以上等）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン、鶏卵アルブミン、破傷風毒素又はジフテリア毒素等のキャリヤーに免疫原を融合したものでもよい。場合により本発明で使用することができる多数のアジュバント、キャリヤー、賦形剤、安定化剤等は当業者に理解されよう。
【０２１８】
更に、抗体及び／又は免疫原製剤に使用することができる一般的な賦形剤の例としては、緩衝液（例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、及び他の有機酸からなる緩衝液）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、他の蛋白質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、及び免疫グロブリン）、疎水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、及びリジン）、単糖類、二糖類、及び他の糖質（グルコース、マンノース及びデキストリンを含む）、キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］）、糖アルコール（例えばマンニトールやソルビトール）、塩形成対イオン（例えばナトリウム）、及び／又はアニオン性界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、及びＰＥＧ）が挙げられる。
【０２１９】
当然のことながら、使用する特定アジュバント、賦形剤、又は安定化剤と製剤は例えば製剤が本発明の抗体又は非天然免疫原のどちらを含有するか、特定投与経路、他の投与薬剤、使用する用量等により変えることができる。例えば、静脈内、筋肉内又は皮下投与では、抗体又は免疫原を医薬的に許容可能で注射可能な賦形剤に添加することができる。一般に、賦形剤は滅菌水、食塩水溶液、緩衝塩類水溶液、デキトロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、又はその組合せ等である。無菌性、適正なｐＨ、等張性、及び安定性等を確保するこのような溶液の製造は抗体又は抗原蛋白質の投与分野で定着しているプロトコールに従って実施される。一般に、賦形剤はアレルギー及び他の望ましくない作用を最小限にすると共に、例えば皮下、筋肉内等の特定投与経路に適合するように選択される。
【０２２０】
所定態様において、製剤は経口投与用に製造することができ、例えば飲食物に添加したり、チュアブル又は嚥下錠又はカプセル剤等に製剤化することができる。従って、このような製剤は迅速な血流取込みと生体の各種区画への分配を可能にする。一般に経口投与では、賦形剤として医薬グレードのラクトース、マンニトール、澱粉、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム等が挙げられる。組成物を経口投与用固体製剤として使用する場合には、製剤は錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とすることができる。
【０２２１】
所定態様において、本発明は抗体及び／又は非天然免疫原を送達するために徐放医薬製剤を利用する。典型的な徐放製剤は本発明の抗体及び／又は非天然免疫原を結合又は封入した固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスから構成される。適切なポリマーの例としてはポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とＴ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。このようなマトリックスはフィルム、又はマイクロカプセル等の成形品形態とすることができる。
【０２２２】
本発明の各種方法では、免疫原（例えば非天然ＴＮＦαのいずれか又は本明細書に記載する他の任意免疫原）又は標的部分と交差反応する抗免疫原抗体を対象に経皮投与する製剤として製造することもできる。経皮投与では、抗体及び／又は非天然免疫原を親油性キャリヤーに添加し、局所クリームもしくは軟膏又は粘着パッチとして製剤化することができる。各種慣用剤形の製造方法は当業者に公知であるか又は自明であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照されたい。従って、徐放製剤としては、リポソームに封入した活性剤が挙げられる。リポソームは各種脂質、リン脂質、及び／又は界面活性剤から構成される小胞である。これらの成分は一般に生体膜の脂質構成と同様の二重層として配置されている。抗体／非天然免疫原を含有するリポソームは例えばＥｐｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８２：３６８８−９２、及びＨｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，７７：４０３０−３４に記載されている方法等の公知方法により製造することができる。例えばホスファチジルコリン、コレステロール、ＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）等の脂質製剤を使用して逆相蒸発法により有用なリポソームを作製することができる。必要に応じて、規定細孔寸法のフィルターからリポソームを押出し、特定直径のリポソームを得ることができる。
【０２２３】
更に他の態様では、本明細書の随所に記載するもの等の本発明の抗体及び／又は非天然免疫原を粘膜投与用製剤として製造することができる。粘膜投与としては、口腔、気管内、吸入、鼻孔内、咽頭、直腸、舌下、膣等の経路が挙げられる。粘膜投与には、エマルション、ガム、ロゼンジ、スプレー、錠剤等として抗体及び／又は非天然免疫原を製剤化することができる。鼻孔内投与は粉末又はスプレー製剤により実施することができる。直腸又は膣投与用製剤としては、クリーム、灌水、浣腸剤又は座剤等が挙げられる。
【０２２４】
所定態様では、眼内施用に適した溶液又は懸濁液に配合することにより抗体及び／又は非天然免疫原を眼内投与用製剤（例えば滴剤又はスプレー）として製造することができる。
【０２２５】
本発明で利用される医薬製剤としては、国際公開ＷＯ９１／０４０１４に記載されているような移植可能な膜（例えばシラスティック膜）に吸着させた抗体及び／又は非天然免疫原も挙げられる。
【０２２６】
本発明で利用される医薬製剤は例えば水溶液や凍結乾燥ケーキ等の任意標準形態で保存することができる。このような製剤は一般に対象に投与時に無菌である。水溶液の滅菌は無菌濾過膜で濾過することにより容易に実施される。製剤を凍結乾燥形態で保存する場合には、凍結乾燥及び再構成前又は後に製剤を濾過することができる。
【０２２７】
抗体及び／又は非天然免疫原の投与
本明細書に記載するように、本発明は非天然標的部分（非天然免疫原）に対する抗体でありながら標的部分（例えばＴＮＦα等の自己部分）に対して交差反応性の抗体の投与、及び／又は非天然標的部分自体の投与により、標的部分に対する免疫応答を対象で誘発又は強化するための組成物と方法に関する。このような標的部分としては、例えば下記実施例に記載する非天然ＴＮＦαのいずれかと、例えば本明細書に記載するような他の無数の分子が挙げられる。一般に、多数の病態／疾患状態の１種以上を治療的及び／又は予防的に処置するために特定製剤を単独投与又は他の処置もしくは投薬と併用（例えば併用投与）する。当然のことながら、非天然免疫原に対する抗体を投与するか、非天然免疫原を投与するか、投与する抗体及び／又は非天然免疫原の特定製剤等に応じて、投与／処置レジメンは変えることができる。従って、所定態様において、本発明の抗体の投与は本発明の非天然免疫原の投与と（例えば用量、時間コース等が）異なる。同様に当然のことながら、特定製剤及び／又は投与レジメンの列挙は必ずしも限定的とみなすべきではない。
【０２２８】
本発明の組成物を投与すべき対象及び／又は方法を実施すべき対象の選択を容易にするための多数の医学／生理学／心理学検査及び測定が当業者に自明である。例えば、ウイルス又は細菌感染症等（例えばＨＩＶ感染症）の検出は当業者に周知であり、広く実施されている。同様に、（例えば症状及び／又は特定感染物質の存在等に基づく）多数の診断検査を他の病態（例えば癌、自己免疫疾患（例えばＳＬＥ）等）に利用可能である。非天然免疫原及び／又はその抗体を投与すべき本発明の対象を選択し易くするためにこのような試験を使用することができる。更に、場合により、その家族暦、環境暴露等に基づいて場合により対象を選択する。例えば、疾患状態（例えばアルツハイマー病、乳癌等）の家族暦又は家族素因に基づいて対象を選択することができる。また、場合により感染物質又は他の疾患原因物質への暴露又は暴露の可能性／危険（例えば性労働者のＨＩＶ暴露又は暴露の可能性、医療労働者の肝炎暴露又は暴露の可能性、シリカ肺線維症を生じる可能性のあるシリカ化合物への労働者の暴露等）に基づいて対象を選択することもできる。他の例も当業者に自明である。
【０２２９】
抗体投与
本発明の抗体は治療及び／又は予防に有用である。従って、各種態様では、例えば１個以上の特定標的部分に対する免疫応答を誘発又は強化するために使用することができる。従って、本発明は本発明の抗体を使用することによりこのような標的部分に関係又は関連する１種以上の疾患状態（例えば癌、自己免疫疾患、病原体感染症等）を処置する方法を提供する。随所に説明するように、本発明の抗体は多数の疾患及び／又は障害を治療及び／又は予防するために使用することができる。例えば、本発明を利用することにより、内毒素ショック、脳マラリア、自己免疫疾患、多臓器不全、多発性硬化症、心機能障害、アテローム性動脈硬化症、虚血再潅流傷害、インスリン抵抗性、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸疾患、悪液質、敗血症ショック、エイズ、移植片対宿主病、細菌感染防御性肉芽腫、成人呼吸窮迫症候群、及び／又はシリカ肺線維症等の疾患／障害、並びに多数の他の疾患を処置することができる。上記に説明したように、本発明の抗体は非天然免疫原（非天然ＴＮＦα等の非天然疾患関連部分）に特異的であるが、非天然アミノ酸を含まない対応する標的部分（例えば天然ＴＮＦα）に対して交差反応性である。当然のことながら、抗体投与を含む本発明の各種方法は場合により他の治療的／予防的処置（例えば化学療法、抗生物質及び／又は抗ウイルス治療、外科手術等）と併用することができる。
【０２３０】
本発明の抗体は注射（例えば静脈内、腹腔内、皮下、又は筋肉内注射）、又は他の方法（例えば輸液）により対象に投与することができる。前記抗体は腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、又は病巣周囲経路で投与することもでき、従って、局所及び全身作用を発揮することができる。
【０２３１】
本発明の抗体を投与するための有効用量、時間コース、スケジュール等は経験的に決定することができる。多数の病態に合わせて抗体処置をこのように調整することは当業者に自明である。対象の抗体処置に関連するパラメーター（例えば用量、時間コース等）は例えば抗体を投与する個々の対象（例えば対象の種、疾患状態、総合健康状態等）、投与経路、使用する抗体の特定型、及び予防的処置であるか治療的処置であるかに関係なく投与中の他の薬剤等により変えることができる。抗体処置プログラムの作成のその他の指針については、文献（例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄａｔａ，ＣＲＣ，１９９９）の随所に記載されている。
【０２３２】
非天然免疫原投与
他の態様では、予防的及び／又は治療的処置のために本発明の非天然免疫原（即ち限定されないが、下記非天然ＴＮＦα又はＲＢＰ４のいずれかのように標的部分に１個以上の非天然アミノ酸を組込んだもの）を対象に投与することができる。本明細書に詳細に記載するように、このような非天然免疫原を投与すると、非天然免疫原に対する抗体応答である免疫応答を対象に誘発する。更に、一方では、対象により非天然免疫原に対して産生される抗体は、対象の体内に存在するか又は対象の体内に存在することが可能な（非天然免疫原に対応する）天然型の標的部分（即ち病原体感染症、癌、自己免疫疾患等のいずれに由来するかに関係なく、非天然アミノ酸を含まない疾患関連部分）に対して交差反応性であることが好ましい。
【０２３３】
本発明の方法では、非天然ＴＮＦα又は本明細書に列挙する他の無数の可能な標的のいずれか等の非天然免疫原を医薬組成物の投与に一般に許容されている方法のいずれかで投与することができる。この場合も、このような経路及び送達プロトコールは当業者に周知である。例えば、非天然免疫原の投与経路としては、限定されないが、経口、脳内、髄腔内、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、粘膜（例えば座薬又は鼻孔内又は経口腔粘膜投与）又は眼内投与等が挙げられる。従って、投与経路に応じて、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、制御放出製剤、懸濁液剤、乳剤、座薬、クリーム、軟膏、ローション、又はエアゾール等の各種剤形で非天然免疫原を提供することができる。上記参照。特定態様は厳密な用量の簡単な投与に適した剤形を利用する。
【０２３４】
１日最大用量までを送達してもよいし、少なくとも１日平均用量とするために有効な量の非天然免疫原を長期間（例えば３〜１０日間）かけて送達してもよい。
【０２３５】
対象における（一般には非天然アミノ酸を含まない対応する天然標的部分に対する）抗体応答が弱い場合又は所望レベルよりも低い場合には、（例えば所望抗体の力価が十分に増加するまで）更に非天然免疫原の投与を実施することができる。更に、非天然免疫原の投与後に、血清サンプルを対象から採取し、所望抗体の産生について試験することができる。
【０２３６】
抗体及び／又は非天然免疫原と他の組成物の併用投与
必要に応じて、１種以上の他の薬剤又は処置の施用と共に本発明の抗体及び／又は非天然免疫原の投与を実施してもよい。抗体／非天然免疫原を別の薬剤と同一製剤で投与してもよいし、（例えば別の時点、別個の製剤、別のスケジュール、別の基準等で）別個に投与してもよい。更に、各種態様では、複数の抗体種及び／又は複数の非天然免疫原を対象に投与してもよく、この場合も、場合により他の薬剤（又は処置）と共に、同時又は順次投与することができる。
【０２３７】
本発明の抗体及び／又は非天然免疫原は外科手術、放射線療法等の各種処置と共に同時又は順次投与することもできる。
【０２３８】
本発明の抗体及び／又は非天然免疫原を場合により併用投与することができる他の薬剤／処置は本発明の抗体／非天然免疫原と同一の特定側面の病態の処置（例えば対象の体内の特定標的部分の減少）でもよいし、対象における他の又は関連する（又は無関係の）病態の処置でもよい。従って、併用投与薬剤／処置は基礎病態（疾患状態）の他の側面の処置とすることができる。例えば、各種処置では、場合により発熱、関節痛及び炎症等に一般的な多数の処置（例えばアスピリン、サリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、スリンダク（例えばＣｌｉｎｏｒｉｌ（登録商標））、オキサプロジン及びトルメチン等）のいずれかと本発明の抗体及び／又は非天然免疫原を併用投与する。所定態様では、マラリア又は他の病態（例えばＳＬＥ）に関連する各種皮膚異常の処置用として、ヒドロキシクロロキン、クロロキン及びキナクリン等の抗マラリア薬を指定することができる。コルチコステロイド、一般にはプレドニゾンを臓器炎症用等に投与することができる。免疫血小板減少症や重度溶血性貧血の抑制には所定のアンドロゲン化合物、例えばダナゾール（例えばＤａｎｏｃｒｉｎｅ（登録商標））を使用することができる。
【０２３９】
更に、基礎病態に起因するか又は基礎病態の処置に起因する二次病態に有効な薬剤と共に本発明の抗体／非天然免疫原を投与することもできる。例えば、所定態様では、プレドニゾン、メトトレキセート、免疫抑制剤、抗炎症薬等の使用に起因し得る各種副作用の処置により生じる骨密度低下の処置を補うために本発明の処置を処置プログラムでカルシトニンと共に施用することができる。
【０２４０】
抗体及び／又は非天然免疫原の用量の時間コース及び調節
上記のように、対象において所望の転帰（及び、従って、場合により病態／疾患状態の有効な処置）を達成するために有効な抗体／非天然免疫原用量及び比用量の範囲は標準産業プラクティスに従って決定することができる。これらの範囲は所望応答が病態（例えば癌、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、細菌感染症、ウイルス感染症、強皮症、アレルギー性疾患、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ等）の予防、治療又は治癒処置のいずれであるか、症状の種類又は重篤度、施用中の他の投薬、処置対象の年齢、性別、病歴及び他の個体パラメーター等による異なると予想することができる。所定態様において、用量は標的部分の特定濃度を測定した場合に生じる変化（例えばＥＬＩＳＡ等により測定した場合の変化）に基づいて決定することができる。対象におけるこのような濃度を測定するために、本発明の典型的な態様は生体組織、末梢血、血清、血漿、尿、膣液、精液、唾液、腹腔液、リンパ液、房水もしくは硝子体液、涙液、肺滲出液又は漿膜液のいずれか１種以上における前記部分の濃度を測定することができる。
【０２４１】
各種対象で所望の転帰を得るように処置レジメンを個体毎に調整することは当業者に自明である。従って、多くの態様では、特定用量の抗体及び／又は非天然免疫原を出発点又は目標レベルとして使用するが、場合により、処置する対象の特定因子に基づいてこのような用量を調節する。例えば、標的部分の所望濃度に到達しない場合には、用量を増加することができる。代替的又は付加的に、所望濃度に到達する場合／ときには、所望濃度で安定を達成する最低濃度を求めるように用量を漸減させることができる。
【０２４２】
処置する基礎病態の症状に基づいて抗体／非天然免疫原用量を調節することもできる。例えば、特定病態について対象を処置している場合には、場合によりこの特定病態の症状を用量（量及び時間コース）の指針又は指標として使用する。従って、所定態様では、例えば症状勃発間の時間間隔等により測定した病態の重篤度の評価を処置進行の間接測定として使用することができ、従って、相応に投与を調整することができる。病態の症状をモニターするために使用することができる他の検査／診断スケールも当業者に認識されよう。
【０２４３】
抗体及び／又は非天然免疫原を投与することができる対象
本発明により提供されるワクチン、治療的処置、及び／又は予防的処置は各種動物に有効である。このような動物としては限定されないが、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、及び／又は他の一般的な農場動物等の家畜が挙げられる。例えばネコ、イヌ、オウム、インコ等の一般的な家庭用ペット類も非天然免疫原に対する交差反応性抗体及び／又は免疫原自体を有効に投与することができる。
【０２４４】
生物医学試験及び獣医学処置における動物モデル及び動物対象の使用に関する更に詳細については、例えばＮｇ，Ｃｈｏｗ，ａｎｄ  Ｏｇｄｅｎ，ｅｄｓ．Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ａ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ．Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ：Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２００８；Ｃｏｎｎ，ｅｄ．Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００８；Ｗｏｏｄｈｅａｄ，ｅｄ．Ｎｏｎｍａｍｍａｌｉａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｖｏｌ  １）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０に記載されている。例えばＡｄａｍｓ，ｅｄ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳＡ：Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２００１；Ｋａｈｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｅ，Ｅｄｓ．Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳＡ：Ｍｅｒｃｋ，２００５；及びその引用文献も参照。
【０２４５】
本発明により提供される抗体及び／又は非天然免疫原は対象（例えばヒト）における疾患状態を処置するためだけでなく、処置効力試験と共に、代謝試験、毒性試験、並びに生殖機能もしくは胎児毒性に及ぼす抗体及び／もしくは非天然免疫原の影響を調べるため、又はその発癌性を調べるための特定試験を実施するためにも投与することができる。このような観測試験を実施するには、本発明の抗体及び／又は非天然免疫原を各種動物対象に投与する必要がある。本発明の組成物を投与すべき動物対象及び／又は方法を実施すべき対象の選択を容易にする多数の医学検査及び測定が当業者に自明である。このような動物対象としては限定されないが、例えばヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウシ、ブタ、ウサギ、ウマ、ハムスター、非ヒト霊長類（カニクイザル、ヒヒ、旧世界ザル、及びチンパンジーを含むサル）、モルモット、ラット、マウス、及び／又はネコ等の哺乳動物が挙げられる。例えば家禽類（ニワトリ、シチメンチョウ）、オカメインコ、オウム・インコ類、並びに小型鳥類及び／又は大型鳥類等の鳥類と、トリ胚も本発明により提供される抗体及び／又は非天然免疫原の研究開発、生産、品質管理、又は安全性検査に使用することができる。
【０２４６】
ゼブラフィッシュ、プラティ、及びソードテール等の魚類；例えばカエルやサラマンダー等の両生類；並びに爬虫類（ヘビ、トカゲ、及びカメ）も本明細書に記載する組成物及び／又はその投与方法の安全性、有効用量も及び／又は毒性を調べるための多様な検査で使用することができる。例えばＢａｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｔｉｌｅｓ，Ａｍｐｈｉｂｉａｎｓ，Ｆｉｓｈ，ａｎｄ  Ｃｅｐｈａｌｏｐｏｄｓ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．”Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒとその引用文献参照。
【０２４７】
キット及び製品
所定態様において、本発明は本明細書に記載する方法及び組成物に有用な材料を含むキットないし製品を提供する。このようなキットは場合により１個以上の容器、ラベル、及び説明書と、抗体及び／又は非天然免疫原の構築用成分及び／又は実際の抗体及び／又は非天然免疫原（例えば非天然ＴＮＦα又は本明細書に挙げる他の無数の例のいずれか）を含むことができる。
【０２４８】
キットは更に場合により１種以上の抗体（即ち非天然免疫原に対する抗体でありながら対象の体内の天然標的部分に対して交差反応性の抗体）及び／又は１種以上の非天然免疫原と、場合により他の成分（例えば各種抗生物質、各種抗真菌剤等）を含むことができる。このような非天然免疫原としては限定されないが、本発明により提供される非天然ＴＮＦαの任意１種以上が挙げられる。キットは場合により成分を保存するため又は成分を混合／調製するための（例えばガラス、プラスチック、ナイロン、綿、ポリエステル、金属等の）チューブ又は他の容器と、前記成分を対象（例えば処置を必要とするヒト等）に投与するために使用する１個以上の器具を含む。所定態様において、成分を対象に投与するために使用する器具は成分を保存及び／又は混合／調製する容器を含む。
【０２４９】
キットは更に場合により本発明の抗体／非天然免疫原成分以外の他のコンポーネント（例えば緩衝液、希釈剤、フィルター、創傷被覆材、包帯、アプリケータ、ガーゼ、バリヤー、半透性バリヤー、舌圧子、針、及びシリンジ等）を含むことができる。
【０２５０】
多くの態様において、キットは１種以上の病態／疾患状態について対象を処置するためのキットの使用に関する説明書（例えば一般に書面の説明書）を含む。所定態様において、キットは使用者が使用方法又は詳細な使用方法について問合せするためのＵＲＬアドレス又は電話番号等を含む。キットはユニットドーズ、バルクパッケージ（例えばマルチドーズパッケージ）、又はサブユニットドーズとすることができる。
【０２５１】
以下、実施例により本発明を例証するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証のみを目的とし、実施例及び態様に照らして種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【実施例１】
【０２５２】
遺伝的にコードされる非天然アミノ酸による免疫寛容解除
自己蛋白質に対する強い免疫応答を選択的に誘導できること、又は外来抗原の特定エピトープの免疫原性を強化できることは癌、蛋白質ミスフォールディング病、及び感染症用のワクチンの製造に大きな効果があると思われる。本実施例では、免疫原性非天然アミノ酸を該当蛋白質に部位特異的に組込むと、ＷＴ蛋白質と交差反応する高力価抗体が産生されることを示す。具体的に説明すると、マウス腫瘍壊死因子α（ｍＴＮＦα）の１個のチロシン残基（Ｔｙｒ８６）をｐ−ニトロフェニルアラニン（ｐＮＯ２Ｐｈｅ）に突然変異させると、マウスに高力価抗体応答が誘導されたが、Ｔｙｒ８６→Ｐｈｅ突然変異体では有意抗体応答は観測されなかった。ｐＮＯ２Ｐｈｅに対して産生された抗体は野生型ｍＴＮＦαに対して高度に交差反応性であり、リポ多糖（ＬＰＳ）により誘導した死からマウスを防御する。このアプローチは中和免疫応答を生じる自己及び外来抗原の特定エピトープに対して抗体応答を誘導するための一般方法になると思われる。
【０２５３】
現代ワクチン学の大きな課題の１つは自己蛋白質に対する強力な免疫応答を選択的に誘導するため、又は中和抗体を誘起することができるが、免疫ドミナントではない外来抗原の特定エピトープの免疫原性を強化するための堅牢な方法の開発である。この課題に対処するために、改良型アジュバントの開発、キメラ抗原への外来ヘルパーペプチドの導入、及びＤＮＡワクチンの使用を含む多数のストラテジーが推進されている（Ｄａｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ．”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：６６６−６６９；Ｍａｋｅｌａ，ｅｔ  ａｌ（２００２）“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １：３９９−４１０；Ｒｅｓｔｉｆｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｅｌｉｃｉｔ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，８：６５８−６６３；Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．Ｃ．Ｊ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｈａｒｎ，Ｄ．Ａ．，Ｊｒ．，Ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００６），ｐｐ２３５−２５５）。興味深いことに、ほぼ５０年前に、Ｗｅｉｇｌｅ（Ｗｅｉｇｌｅ（１９６５）“Ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｎ  ｒａｂｂｉｔｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｏｒ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １２１：２８９−３０８）はジアゾニウム誘導体で非特異的に標識したウサギサイログロブリンを免疫したウサギが天然サイログロブリンに対する交差反応性抗体を産生したと報告している。これらの初期の実験では非常に不均質な抗原が生じたが、化学修飾の結果として高力価交差反応性抗体を誘導する免疫原性エピトープが得られると解釈することもできる。同様に、自己抗原と１アミノ酸又は数個のアミノ酸しか相違しない交差反応性外来抗原の免疫により容易に誘起される自己反応性Ｂ細胞によりＴ細胞寛容を解除できるという事例証拠もある（Ｍａｍｕｌａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｒｅａｋｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ  ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ．Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４９：７８９−７９５）。
【０２５４】
蛋白質の化学的修飾方法が比較的非選択的であることとは対照的に、今日では遺伝的にコードされる非天然アミノ酸により非常に精密な「化学的突然変異」を蛋白質構造に加えることが可能である。金属結合性アミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸、蛍光アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、光反応性アミノ酸及び化学反応性アミノ酸を含む５０種類を越える非天然アミノ酸が細菌、酵母、又は哺乳動物細胞でコードされている（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）“Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−９６７；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００６）“Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．”Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：７７５−７８２）。より具体的には、フェニルアラニン誘導体であるｐ−ニトロフェニルアラニン（ｐＮＯ２Ｐｈｅ，図１Ａ）が分光距離プローブ用として高い忠実度と良好な効率でアンバーナンセンスコドンに応答して細菌の蛋白質に組込まれている（Ｔｓａｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｂｅ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２８：４５７２−４５７３）。恐らくπ電子不足系は抗体結合部位と共通のＴｙｒ及びＴｒｐ側鎖と相互作用する傾向があるという理由から、ニトロアリール基は高度に免疫原性のハプテンとして従来から使用されている（Ｋｅｉｎａｎ，Ｅｄ．，Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００５））。その密接な構造類似性により、Ｐｈｅ→ｐＮＯ２Ｐｈｅ又はＴｙｒ→ｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異を含む蛋白質は野生型蛋白質に対して交差反応性の強靭な免疫応答を生じるのではないかと予想した。本実施例では、マウス腫瘍壊死因子α（ｍＴＮＦα）のＴｙｒ８６→ｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異体をマウスに免疫すると、ＷＴ  ｍＴＮＦαに対する高力価抗体応答を生じ、マウスをリポ多糖（ＬＰＳ）攻撃に対して効果的に防御することを示す。
【０２５５】
ｍＴＮＦαをこの試験の標的蛋白質として選択したのは、（ｉ）感染、炎症及び自己免疫現象の調節に関与する十分に特性決定されたサイトカインであり（Ｖａｓｓａｌｌｉ（１９９２）“Ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒｓ．”Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：４１１−４５２）；（ｉｉ）その発現、構造、機能、及びシグナル伝達メカニズムを含むこの蛋白質の生物学的性質は広く研究されており（Ｖａｓｓａｌｌｉ（１９９２）“Ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒｓ．”Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：４１１−４５２；Ｂａｅｙｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｕｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔ  １．４  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｔｏｗａｒｄｓ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５５：７７２−７７８；Ｐｅｎｎｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：６０６０−６０６４：Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ＴＮＦ  ａｌｐｈａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ：ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＴＮＦ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ，ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒｓ，ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：１３９７−１４１１；Ｂａｅｙｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）“Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５３：３２９−３３０；Ｂ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｖｉｌｅｃｋ，Ｊ．，Ｅｄ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ．（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２），ｐｐ．１−５８７）；（ｉｉｉ）ｍＴＮＦαノックアウトマウスは生存可能であり、明白な表現型異常を示さず（Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ＴＮＦ  ａｌｐｈａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ：ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＴＮＦ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ，ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒｓ，ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：１３９７−１４１１）、マウスはＴＮＦに対する中和免疫応答に耐えると考えられるためである。更に、抗ＴＮＦα抗体（Ｋｎｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＴＮＦ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．”Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：１４４３−１４５３；Ｐｒｅｓｅｎｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｉｓｔｕｌａｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４０：１３９８−１４０５）と可溶性キメラＴＮＦα受容体（Ｐｅｐｐｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ａ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ＴＮＦ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７４：１４８３−１４８９；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）“Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ＩｇＧ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＤ４．”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８４：４３３−４３９）は自己免疫疾患の処置で広く使用されており、臨床用のＴＮＦα特異的ワクチンを開発するために多数のアプローチが進められている。このようなワクチンとしては、外来免疫ドミナントＴヘルパーエピトープを含む組換えＴＮＦα分子、バクテリオファージＱβのウイルス様粒子とのＴＮＦα融合体、キーホールリンペットヘモシアニン−ＴＮＦαヘテロ複合体が挙げられる（Ｄａｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ．”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：６６６−６６９，Ｓｐｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ａ  Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＴＮＦα  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｔｅｎｔ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：７４５０−７４５７；Ｌｅ  Ｂｕａｎｅｃ，ｅｔ  ａｌ．“ＴＮＦα  ｋｉｎｏｉｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ＴＮＦα  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＴＮＦα−ｄｒｉｖｅｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．”Ｐ��ｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１９４４２−１９４４７）。
【０２５６】
三量体ｍＴＮＦαのＸ線結晶構造（Ｂａｅｙｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）“Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５３：３２９−３３０；Ｂａｅｙｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｕｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔ  １．４  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｔｏｗａｒｄｓ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５５：７７２−７７８）に基づき、１個のＴｙｒ８６→ｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異体ｍＴＮＦα（ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα）を本発明の初期試験の免疫原として選択した（図１Ｂ）。Ｔｙｒ８６は各種哺乳動物ＴＮＦ間で高度に保存されており、この部位の突然変異は蛋白質フォールディングと三量体形成に影響を与えないが、（ワクチン接種目的で有利である）細胞毒性の有意低下（Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒｓ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：５−２２；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ（ＴＮＦ  ａｌｐｈａ）ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ５５−ｋＤａ  ｏｒ  ７５−ｋＤａ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２６３５０−７；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：２４０６９−７５）をもたらすことが分かっている。
【０２５７】
本実施例では、非天然アミノ酸ｐ−ニトロフェニルアラニン（ｐＮＯ２Ｐｈｅ）をマウス腫瘍壊死因子α（ｍＴＮＦα）に遺伝子導入し、残基Ｔｙｒ８６に置換した。このｐＮＯ２Ｐｈｅ含有蛋白質を免疫したマウスは野生型ｍＴＮＦαと有効に交差反応する強い中和性の抗体応答を生じることが判明した。更に、この免疫はリポ多糖（ＬＰＳ）により誘導した致死に対してマウスを効果的に防御することが判明した。これらの結果から明らかなように、天然蛋白質に存在しない高度に免疫原性の部分であるユニークなＮＯ２基を付加した自己蛋白質は免疫系に外来抗原として認識される。ユニークなＮＯ２基を含む蛋白質と天然蛋白質の密接な構造類似性により、修飾蛋白質に対して誘発された抗体は対応する自己蛋白質と交差反応した。従って、このアプローチは自己蛋白質の免疫寛容の解除とワクチン製造の一般方法となる。
【０２５８】
本実験では、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＢＬ２１（ＤＥ３）を夫々クローニング及び発現用宿主として使用した。ベクターｐＥＴ２６ｂはＮｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から入手した。特に指定しない限り、１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを添加した最少培地（ＧＭＭＬ培地）又は２×ＹＴ培地で大腸菌株を増殖させた。制限酵素、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ｄＮＴＰ、及び第Ｘａ因子プロテアーゼはＮＥＢ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用のＩＰＴＧと４−１２％  Ｂｉｓ−ＴｒｉｓゲルはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ｐＮＯ２−ＰｈｅはＡｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ，ＵＳＡ）から購入した。プライマーはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＤＮＡポリメラーゼはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。抗ＴＮＦα抗体はＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から入手し、組換えｍＴＮＦαはＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。ＱＩＡＧＥＮプラスミド精製キットを使用してプラスミドＤＮＡを単離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ又はゲル精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して制限消化後のＤＮＡ精製を実施した。
【０２５９】
ｍＴＮＦα発現ベクターの構築
大腸菌でｍＴＮＦαを発現させるために、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグと、第Ｘａ因子開裂部位と、Ｔ７−ｌａｃプロモーターの下流のｍＴＮＦα遺伝子から構成されるプラスミドｐＥＴ２６−ｍＴＮＦαを構築し、使用した。このプラスミドは次のように構築した。以下のプライマー：５’−ＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＡＴＴＣＧ及び５’−ＡＡＣＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧＴＡＧＡＣＣによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してマウスｔｎｆα遺伝子をプラスミドｐＭｕＴＮＦα（ＡＴＣＣ＃６３１６９）から増幅した。得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ｐＥＴ２６ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。次に成熟ＷＴ  ｍＴＮＦαの最初のコドンの直前の第Ｘａ因子の蛋白分解部位の手前にＮ末端ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６タグ）を付けるように組換えベクターを修飾した。Ｔｙｒ８６、Ｌｙｓ１１、又はＡｓｐ４２のコドンをプラスミドｐＥＴ２６−ｍＴＮＦαではＴＡＧアンバーコドンで突然変異させることによりｍＴＮＦα突然変異体へのｐＮＯ２Ｐｈｅの部位特異的組込みを実施し、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してこれらの置換を作製した。ｍＴＮＦα突然変異体Ａｌａ８６ｍＴＮＦα、Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα及びＰｈｅ４２ｍＴＮＦαを作製するためにも同一キットを使用した。Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）のゲノミクス研究所でＤＮＡ配列分析を実施し、全ｍＴＮＦα構築物の配列を確認した。
【０２６０】
大腸菌におけるｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαの発現
次にアンバーコドンに応答してｐＮＯ２Ｐｈｅ（構造を図１Ａに示す）を大腸菌の蛋白質に特異的に挿入するＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交アンバーサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対の存在下でｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα突然変異体を発現させた（Ｔｓａｏ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）“Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｂｅ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２８：４５７２−４５７３）。突然変異体蛋白質（ＧＭＭＬ最少培地中〜１ｍｇ／Ｌ）を変性条件下又は非変性条件下でＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製後、Ｈｉｓ６タグを開裂し、サイズ排除クロマトグラフィーに付した。ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα突然変異体を発現させるために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をｍｕｔＮＯ２ＰｈｅＲＳ、ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ及び各突然変異体ｍＴＮＦα遺伝子で同時形質転換した。形質転換細胞をＧＭＭＬ培地中で３７℃にて１ｍＭ  ｐＮＯ２Ｐｈｅの存在下に増殖させ、ＯＤ６００ｎｍが０．５に達したら１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。次に細胞を引き続き３７℃で１２〜１６時間振盪した後、回収した。細胞ペレットを使用時まで−８０℃で保存した。原則的に同一手順によりＷＴ  ｍＴＮＦα、Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα、及びＰｈｅ４２ｍＴＮＦαを発現させた。他方、ｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＴＮＦα突然変異体とは異なり、これらの蛋白質はリッチ培地（２×ＹＴ培地）でｐＮＯ２Ｐｈｅの不在下に発現させた。
【０２６１】
変性条件下のＷＴ  ｍＴＮＦα及びｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαの精製
全精製工程は室温で実施した。細胞ペレットを１５分間氷上で解凍し、細胞ペーストを湿潤重量グラム当たり５ｍｌの溶解バッファー（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ＝８．０，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，８Ｍ尿素）に再懸濁した。細胞懸濁液を氷上で３分間超音波処理した。１０，０００×ｇで２５分間遠心後、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）１０ｍｌを上清に加え、ロータリーシェーカーで６０分間混合した。
【０２６２】
溶解液−樹脂混合物を５ｍｌポリプロピレンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）にロードし、洗浄バッファーＡ（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ＝６．３，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，８Ｍ尿素）４０ｍｌで２回洗浄した。洗浄バッファーＢ（１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ＝５．９，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，８Ｍ尿素）１０ｍｌで更に２回の洗浄工程後、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ＝４．５，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，８Ｍ尿素で溶出を実施した。蛋白質混合物を１０Ｋ分子量カットオフＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）で濃縮し、第Ｘａ因子開裂バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ＝７．４）で予め平衡化しておいたＨｉＰｒｅｐ（登録商標）２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）にロードした。第Ｘａ因子（５％  ｗ／ｗ）の添加前に１０Ｋ分子量カットオフＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルター装置を使用して数ラウンド透析濾過することにより封入体を含む濁ったフラクションを濃縮した。
【０２６３】
室温で〜３日以内にＮ末端Ｈｉｓ６タグの定量的除去が達せられたことをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。プロテアーゼ消化後、可溶性第Ｘａ因子プロテアーゼとＨｉｓ６タグペプチドを遠心により封入体から分離した。次に蛋白質を可溶化バッファー（８Ｍ尿素，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０，１０ｍＭ  ＤＴＴ）〜１ｍｌに溶解し、可溶化バッファーで予め平衡化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。ＡＫＴＡ精製機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で流速０．３ｍｌ／分にてサイズ排除クロマトグラフィー２ラウンドを実施した。リフォールディングのために、１０Ｋ分子量カットオフＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して蛋白質サンプルを再生バッファー（２４０ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭ  ＫＣｌ；０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ＝８．０）で透析した。リフォールディングしたｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で透析した。
【０２６４】
非変性条件下のＷＴ及び突然変異体ｍＴＮＦαの精製
非変性条件下の全精製工程は４℃で実施した。細胞ペレットを１５分間氷上で解凍後、細胞ペーストを湿潤重量グラム当たり５ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ＝８．０；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）に再懸濁した。コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）の添加後、細胞懸濁液１０ｍＬをリゾチーム（１００ｍｇ／ｍＬ；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）１５０μＬ、ＤＮａｓｅ  Ｉ（５ｍｇ／ｍＬ；Ｒｏｃｈｅ）５０μＬ、ＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）５μＬ、及びベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）１２５Ｕで処理した。細胞懸濁液を室温で２０分間撹拌し、溶解させた。予め溶解させた細胞を次に液体窒素で瞬間凍結し、３７℃水浴で解凍した。この凍結−解凍サイクルを１回繰返した。その後、氷上で２分間超音波処理により完全な溶解を達成した。
【０２６５】
１８，０００×ｇで２０分間遠心後、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ）１ｍｌを上清に加え、ロータリーシェーカーで３０分間混合した。溶解液−樹脂混合物を５ｍｌポリプロピレンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）にロードし、溶解バッファー２０ｍｌで２回洗浄した。蛋白質を溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．０；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２５０ｍＭイミダゾール，１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）２ｍＬで溶出させ、１０Ｋ分子量カットオフＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、ＰＢＳで予め平衡化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（流速０．３ｍｌ／分）により更に精製した。Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）にてシナピン酸をマトリックスとしてＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＳＴＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）で実施したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により全蛋白質を特性決定した。非変性条件下で精製した全ｍＴＮＦα蛋白質は２５℃のＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．５）に＞１０ｍｇ／ｍＬで完全に可溶性であった。
【０２６６】
ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαの組成及び均質性の分析
次に突然変異体蛋白質の組成と均質性をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１Ｃ）と質量分析法（図１Ｄ）により分析した。ｐＮＯ２Ｐｈｅ特異的ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対と共に１ｍＭ  ｐＮＯ２Ｐｈｅの不在下（レーン２）と存在下（レーン３）でｍＴＮＦαのＴｙｒ８６アンバー突然変異体の発現を図１Ｃに示す。蛋白質サンプルをＮｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムにより精製し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（登録商標）染色を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。レーン４は野生型ｍＴＮＦαを示し、レーン１は分子量標準である。図１Ｃに示す結果から明らかなように、変性条件下で精製したｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαはＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度がＷＴ  ｍＴＮＦαと同様であり、ｐＮＯ２Ｐｈｅの不在下で突然変異体遺伝子を発現させた場合に全長ｍＴＮＦαは認められず、８６位に内在アミノ酸の検出可能な組込みは存在しないことが分かった。
【０２６７】
突然変異体蛋白質の組成と均質性をそのトリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳシーケンシング分析により分析した（図１Ｄ）。この手順の蛋白質サンプルを作製するために、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを含むゲルスライスを切出し、賽の目状に細かく切り、２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３／５０％アセトニトリル１００μＬと混合した。１０分間ボルテックス後に上清を捨てた。この工程を２回繰返した後、ゲル片をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃで約２０分間乾燥した。２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中１０ｍＭ  ＤＴＴ  ２５μｌを加えることにより蛋白質サンプルを還元した。反応を５６℃で１時間進行させた。上清の除去後、ゲル片を５５ｍＭヨードアセトアミド２５μｌと混合した。暗所で４５分間室温にてインキュベーション後、刊行物の手順に記載されているようにゲル片をゲル内トリプシン消化した（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）“Ｉｎ−ｇｅｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｏｎｅ−  ｏｒ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．”Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０３：１７３−１７９；Ｈｅｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ‘Ｉｎ−Ｇｅｌ’ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．”Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２４：４５１−４５５）。得られたペプチド混合物をＣ１８  ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製し、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）にてナノスプレー源を使用してＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ，ＵＳＡ）を陽イオンモードで稼働させてＭＳ／ＭＳ断片化を行った。上記のように作製した８量体トリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳ分析は残基８６へのｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みのパターンと厳密に一致する（図１Ｄ，図１２）。８量体フラグメントＦＡＩＳＸＱＥＫ（ここでＸはｐＮＯ２Ｐｈｅを表す）の部分配列を図１Ｄの注釈付きｂ又はｙイオン系列から読み取ることができる。図１２では、ｐＮＯ２−Ｐｈｅを含有するトリプシン処理フラグメントの配列を１文字コードで示す（Ｘ，ｐＮＯ２−Ｐｈｅ）。ｙ及びｂ系列のフラグメントイオン実測値を示す。ｐＮＯ２−Ｐｈｅの組込みを証明する主要なｙ及びｂイオンを赤で示す。全質量はモノアイソトピック質量として報告する。
【０２６８】
Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）にてシナピン酸をマトリックスとしてＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＳＴＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）で実施したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により全蛋白質を特性決定した（図２、３、及び表１）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトル（表１，図２）も全長ｍＴＮＦαを含むｐＮＯ２Ｐｈｅの予想分子量（［Ｍ−Ｈ］＋：１７２８６）に一致するピーク（［Ｍ−Ｈ］＋：１７２８７）を示す。これらの結果は突然変異体ｍＴＮＦαへのｐＮＯ２Ｐｈｅの選択的組込みを実証するものである。
【表２】
2011514322.tif 000008
【０２６９】
ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαの三次構造の分析
ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα、Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα、Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦαの三次／四次構造に及ぼすｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異の影響を調べるために、ＷＴ  ｍＴＮＦα及び突然変異体ｍＴＮＦαの両方のサンプルを高速蛋白質液体クロマトグラフィーにより分析した（表２）。Ｔｙｒ−８６、Ａｓｐ４２、及びＬｙｓ−１１を組込んだｍＴＮＦα三量体（ＰＤＢ  ＩＤコード２ＴＮＦ）のＸ線結晶構造を図１Ｂに示す。全蛋白質サンプルをＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＬＰＣ）により分析した。２５℃のＰＢＳバッファー中で流速０．３ｍｌ／分を使用してサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。ＷＴ  ｍＴＮＦαとｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαはいずれも２５℃のＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．５）に＞１０ｍｇ／ｍｌで完全に可溶性であった。サイログロブリン（６７０ｋＤａ）、ガンマグロブリン（１５８ｋＤａ）、オボアルブミン（４４．０ｋＤａ）、ミオグロブリン（１７．０ｋＤａ）、及びビタミンＢ−１２（１．３５ｋＤａ）を含むＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）製品の分子量ゲル濾過標準でカラムを校正した。蛋白質溶出後に溶出画分の２８０ｎｍの吸光度を測定した。
【０２７０】
ＷＴ  ｍＴＮＦαとｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαはいずれもその三量体に一致する分子量に対応する同様の保持時間を示した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬゲル濾過カラムでの保持時間に対する蛋白質標準の分子量の対数のプロットを図４に示す。サイログロブリン（６７０ｋＤａ）は分子量がＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラムの分離範囲（３ｋＤａ〜７０ｋＤａ）から大きくずれるため、計算から除外した。図４に示すプロットに基づき、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα、ＷＴ  ｍＴＮＦα、ｍＴＮＦαＦ８６、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα、ｍＴＮＦαＦ４２、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦαの四次構造の分子量を測定し、表２（下記）に示す。単量体ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαは保持時間４１．４７分で溶出したと思われる。
【表３】
2011514322.tif 000009
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬゲル濾過カラムでの保持時間に対する蛋白質標準の分子量の対数のプロットに基づき、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ＴＮＦα、Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα、Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα、及びＷＴ  ｍＴＮＦαの四次構造を決定した。
【０２７１】
ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαの生物活性の分析
ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞株でｍＴＮＦαにより誘導されるＮＦκＢ経路の活性化を測定することにより蛋白質の生物活性をアッセイした。ＮＦκＢ−Ｌｕｃを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞をレポーター遺伝子アッセイで使用した（Ｙｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）“ＥＲ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｂｏｕｎｄ  ＡＴＦ６  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｔｈａｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ＳＲＥＢＰｓ”Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：１３５５−１３６４）。安定な細胞をトリプシンで解離させ、１０％  ＦＢＳを添加したＤＭＥＭに細胞５×１０５個／ｍｌの割合で再懸濁し、３８４ウェル白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｌｏｎｇｗｏｏｄ，ＦＬ）に２０μｌ／ウェルで撒いた。３７℃組織培養インキュベーターで５％  ＣＯ２下に２時間インキュベーション後にＴＮＦα  ２０μｌを細胞に加えた。細胞を２４時間連続的にインキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）２０μｌの添加によりルシフェラーゼ活性を測定し、発光プレートリーダーを使用してプレートを読み取った。アッセイの結果によると、ＷＴ  ｍＴＮＦαはＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター細胞株でＮＦκＢシグナル伝達を活性化した。これに対して、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６突然変異体（図５）はこのアッセイでＷＴ  ｍＴＮＦαの活性の２％に過ぎず、受容体結合にはＴｙｒ８６が不可欠であり、残基８６の各種突然変異が活性の有意低下につながるという従来の報告に一致した（Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒｓ”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：５−２２；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）“Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ（ＴＮＦ  ａｌｐｈａ）ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ５５−ｋＤａ  ｏｒ  ７５−ｋＤａ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２６３５０−７；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：２４０６９−７５）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルには、第Ｘａ因子蛋白分解開裂工程中の過剰消化によると予想されるｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαの最初の２個のアミノ酸の欠失（表１，図２）に対応する１個の付加的なピークも認められた。この短縮型蛋白質を全長蛋白質から分離することは困難であり、最初から２個のＮ末端アミノ酸の欠失はＴＮＦ活性にほんの僅かしか影響を与えなかった（Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒｓ”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：５−２２）ので、突然変異体ｍＴＮＦαとＷＴ対照のどちらについても混合物を直接使用してマウスに免疫した。
【０２７２】
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグの有無が免疫結果に影響を与えないことを示すために更に実験を実施した（図１３）。Ｂｃｌ２マウス５匹（例えば＃３２６２，＃３２６３，＃３２６４，＃３３３１，＃３３５１）をランダムに２群に分け、ＲＩＭＭＳ（複数部位の反復免疫）プロトコール（下記）を使用して夫々Ｈｉｓ６−Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（ＷＴ）又はＨｉｓ６−ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを注射した。要約すると、マウスに１８日間かけて８回注射した。各回の注射毎に蛋白質５μｇをＰＢＳ  ２００μｌに溶かし、初回注射では完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、２回目以降は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と１：１で混合し、末梢リンパ節に近接する６カ所の特定部位に注射した。２１日目に、ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）によりｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα及びＰｈｅ８６ｍＴＮＦαに対する抗体力価を測定した。図１３参照。図中、免疫前にマウス血清を１００倍（１：１００  ｐｒｅ）に希釈し、免疫後にマウス血清を１，０００倍（１：１Ｋ  ｐｏｓｔ）又は１０，０００倍（１：１０Ｋ  ｐｏｓｔ）に希釈し、ＥＬＩＳＡに付した。ＥＬＩＳＡプレートをＷＴ  ｍＴＮＦα（ＷＴ，前半３本の棒）又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（ｍｏｄ，後半３本の棒）で被覆した。
【０２７３】
ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスにおけるｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαに対する血清力価の分析
ｍＴＮＦαノックアウトマウスは生存可能であり、明白な表現型異常を示さない（Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ＴＮＦ  ａｌｐｈａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ：ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＴＮＦ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ，ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒｓ，ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：１３９７−１４１１）ので、マウスはＴＮＦαに対する中和免疫応答に耐え、ワクチン接種したマウスを抗ＴＮＦα抗体産生と生物活性について分析できると考えられる。ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα突然変異体の免疫原性を判定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス３２匹を３群に分け、ＲＩＭＭＳ（複数部位の反復免疫）プロトコール（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）“Ｒａｐｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＩＭＭＳ”Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３８１−３８９）に従い、夫々ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα、ＷＴ  ｍＴＮＦα、及びＰＢＳバッファーを注射した。ｍＴＮＦαの細胞毒性による有害な影響を避けるために、本試験全体を通して注射１回当たり５μｇの用量のｍＴＮＦαを使用した（Ｌｉｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｄｉｓｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １２  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｅｔｈａｌ  ｓｈｏｃｋ”Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５５：２８４−２８９）。図６はＰＢＳ（６Ａ）、ＷＴ  ｍＴＮＦα（６Ｂ）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（６Ｃ）、又はＰｈｅ８６ｍＴＮＦα（６Ｄ）を免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの血清力価を示す。要約すると、マウスに１７日間かけて８回注射した。各回の注射毎に蛋白質５μｇをＰＢＳ  ２００μｌに溶かし、初回注射では完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、２回目以降は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と１：１で混合し、末梢リンパ節に近接する６カ所の特定部位に注射した。２１日目に、ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）によりｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα及びＷＴ  ｍＴＮＦαに対する抗体力価を測定した。
【０２７４】
ＥＬＩＳＡを実施するために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に０．５μｇ／ｍｌ蛋白質３０μｌを一晩４℃で被覆した。被覆したプレートをＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、１％  ＢＳＡのＰＢＳ溶液８０μｌでブロッキングし、再びＰＢＳＴで洗浄した。１％  ＢＳＡのＰＢＳ溶液で希釈した一次抗体又は血清２０μｌ、ＨＲＰ修飾ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）２０μｌ、及びＴＭＢ基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）２０μｌをプレートに順次加えてインキュベートし、６５０ｎｍの吸光度を読み取った。インキュベーション間にプレートをＰＢＳＴで洗浄した。
【０２７５】
ＷＴ  ｍＴＮＦα（図６Ａ及び６Ｂ，左側の棒）又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（図６Ａ及び６Ｂ，右側の棒）に対してＥＬＩＳＡを測定した。Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスでは、ＷＴ  ｍＴＮＦα（図６Ｃ及び６Ｄ，左側の棒）又はＰｈｅ８６ｍＴＮＦα（図６Ｃ及び６Ｄ，右側の棒）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１０００倍に希釈した。ＷＴ  ｍＴＮＦα又はＰＢＳバッファー単独を免疫したマウスはｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαとＷＴ  ｍＴＮＦαの両方に対する血清ＩｇＧ力価が低かった（図６）。ＷＴ  ｍＴＮＦαは自己蛋白質であり、マウス免疫系が寛容を示すはずであるので、これは予想通りである。これに対して、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスはｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（図６Ｃ，各棒対の右側の棒）とＷＴ  ｍＴＮＦα（図６Ｃ，各棒対の左側の棒）の両方に対して著しく高い血清力価を示すことが判明した。従って、（単量体分子量を２９ダルトン変化させた）１カ所のｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異は強い免疫応答を誘導し、ＷＴ  ｍＴＮＦαに対して高度に交差反応性の抗体を生じた。Ｂｃｌ−２マウスでも同様の結果が得られ、この結果は系統依存性ではないことが分かった（図７）。この場合も、ＲＩＭＭＳプロトコールは、初回注射ではＣＦＡの存在下、残りの７回の注射ではＩＦＡの存在下で１７日間かけて８回注射するものとした（蛋白質５μｇ／回）。ＷＴ  ｍＴＮＦα（４本ずつの各棒群の２本目と１本目）又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（４本ずつの各棒群の４本目と３本目）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１００倍又は１０００倍に希釈した。
【０２７６】
強力な免疫増強剤の不在下の免疫原性についても試験した処、アジュバントの不在下でＢｃｌ−２マウスにｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫した場合にも有意な抗ＴＮＦα力価を生じる（図８）ことを見出し、このアプローチは強力なアジュバントが望ましくない治療状況に適用可能であると思われた。ＣＦＡ又はＩＦＡの不在下で１７日間かけて８回注射（蛋白質５μｇ／回）して（ａ）ＷＴ  ｍＴＮＦα、又は（ｂ）ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ−２マウスの血清力価を測定した。ＷＴ  ｍＴＮＦα（各棒対の左側の棒）又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（各棒対の右側の棒）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１０００倍に希釈した。
【０２７７】
更に、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを８回１組の免疫後の抗体応答の持続性は１９週間後も非常に強靭であることが判明した（図１４）。現在のストラテジーでは免疫が停止すると自己抗体力価が急速に低下することが多いので、臨床用途にはこのような長期持続性が非常に望ましい。図１４は血清力価持続性の測定結果を示す。実験を実施するために、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス３匹にｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫した。８回１組の免疫後に、規定時点でｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαに対するＥＬＩＳＡ分析用に採血した。各測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１００倍に希釈した。△ｔは最終免疫から採血までの時間に対応する。
【０２７８】
免疫応答が非天然アミノ酸の免疫原性ニトロアリール基の結果であることを検証するために、Ｔｙｒ８６→Ｐｈｅ突然変異体であるｍＴＮＦα（Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα）を作製した。サイズ排除クロマトグラフィーによりその三量体四次構造を確認後、ＣＦＡ／ＩＦＡの存在下又は不在下でこの突然変異体をＢｃｌ２マウスに免疫した。アジュバントの不在下で免疫したマウスでは、ＲＩＭＭＳプロトコールは、１７日間かけて８回注射するものとした（蛋白質５μｇ／回）。アジュバントの存在下で免疫したマウスでは、初回注射にＣＦＡを使用し、残りの７回の注射にＩＦＡを使用した。ＷＴ  ｍＴＮＦα（図９，４本ずつの各棒群の２本目と１本目）又はＰｈｅ８６ｍＴＮＦα（図９，４本ずつの各棒群の４本目と３本目）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１００倍又は１０００倍に希釈した。どちらの場合（例えばアジュバントの存在下又は不在下）も、有意な抗ＴＮＦα力価は生じず、免疫寛容を解除するためにはＮＯ２基が必要であることが分かった（図６Ｄ及び９）。更に、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞が誘発されたのは、マウスにこの突然変異体蛋白質を免疫した場合のみであり、マウスにＷＴ  ｍＴＮＦα又はＰｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫した場合には誘発されなかった（図１５Ａ）。これに対して、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ−２マウスに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞をＷＴ  ｍＴＮＦαでｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激した場合には、有意増殖は認められなかった（図１５Ｂ）。Ｔ細胞増殖アッセイを実施するために、免疫したマウスに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）による磁気ディプリーションによりリンパ節から分離した。次に野生型Ｂｃｌ−２マウスに由来する照射後の脾細胞と共にＴ細胞を培養液に加え、量を増加しながら抗原を加えた。培養液を４８時間インキュベートした後、［３Ｈ］チミジンを一晩パルスした。培養プレートをフィルターマットに回収し、ＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で放射能を定量した。
【０２７９】
ｍＴＮＦα突然変異体とＷＴ  ｍＴＮＦαのペプチドフラグメントによる予備エピトープマッピング実験によると、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαに対するポリクローナル応答は複数の蛋白質エピトープに関連することが分かる。これらの結果をまとめると、ｐＮＯ２ＰｈｅをｍＴＮＦαの配列に挿入するとＴ細胞エピトープが形成され、この疾患関連自己蛋白質に対する有効な免疫応答を誘発し易くするようにＴ細胞を強化すると考えられる。他の免疫プロトコール（例えば突然変異体及びＷＴ  ＴＮＦαの順次免疫）でも高力価交差反応性抗体が得られる。これらの結果は免疫寛容を解除するために免疫ドミナントＴヘルパー細胞エピトープをｍＴＮＦαに組込んだＤａｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ．”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：６６６−６６９の結果と一致する。しかし、このストラテジーでは蛋白質に生じる摂動が軽微であり、その三次元折畳みを妨害したり、発現、溶解度、又は安定性を激変させないと思われる。
【０２８０】
Ｔｙｒ８６の周囲のポリペプチド配列はＴＮＦαにおける潜在的ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲエピトープのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ配列分析によると、Ｔ細胞エピトープであるとは予想されない（Ｓｔｅｅｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）“Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＴＮＦ  Ｖａｒｉａｎｔｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１８９５−１８９８）。だが、このアプローチの普遍性を検討するに当たり、他の部位のｐＮＯ２Ｐｈｅの置換が同様の効果をもつか否かを先ず判定した。従って、三量化又は受容体結合に関与しない表面露出残基Ａｓｐ４２をｐＮＯ２Ｐｈｅに突然変異させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと質量分析法により突然変異を確認後、２群のＣ５７ＢＬ／６マウスにｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα又はＰｈｅ４２ｍＴＮＦα突然変異体を免疫した（図１０）。ＲＩＭＭＳプロトコールは、アジュバントの不在下で１７日間かけて８回注射するものとした（蛋白質５μｇ／回）。ＷＴ  ｍＴＮＦα（図１０Ａ，３本ずつの各棒群の１本目；図１０Ｂ，各棒対の１本目）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα／ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα（図１０Ａ，３本ずつの各棒群の２本目；図１０Ｂ，各棒対７、８及び９の２本目）、又はＰｈｅ４２ｍＴＮＦα（図１０Ａ，各棒群の３本目）又はＰＢＳ（図１０Ｂ，各棒対５及び６の２本目）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１００倍（図１０Ａ）又は８００倍（図１０Ｂ）に希釈した。この場合も、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦαを免疫した場合のみに有意抗ＴＮＦα力価が誘発され、免疫したマウスは有意抗ＴＮＦα力価を生じた。この結果から、ｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異誘発は特定の自己又は外来抗原を高度に免疫原性にするためのかなり一般的なアプローチとなることが分かった。
【０２８１】
別の表面露出残基Ｌｙｓ１１をｐＮＯ２Ｐｈｅに突然変異させた場合にも同様の結果が得られた。これらの結果から、ｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異誘発は自己又は外来抗原を高度に免疫原性にするためのかなり一般的なアプローチになり得ると考えられ、表面露出Ｔｙｒ又はＰｈｅ残基の置換に限定されないと思われる。しかし、予備試験によると、ｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みは１０４位と１９位ではあまり有効でないことが分かっている。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにｐＮＯ２Ｐｈｅ１０４ｍＴＮＦαを免疫すると、野生型ｍＴＮＦαに対して有意な交差反応性をもたない抗体が産生された。従って、コンテクスト効果が免疫応答の性質を決定するのに役割を果たす。最後に、他の遺伝的にコードされる免疫原性アミノ酸も有利に使用でき、あるいは、小型の抗原では、半合成法又は全ペプチド合成法により免疫原性非天然アミノ酸を組込むことができると思われる。
【０２８２】
ＬＰＳ攻撃に対するｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα免疫マウスの応答の分析
次に、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ＴＮＦαをマウスにワクチン接種した場合に重度内毒素血症マウスモデルでリポ多糖（ＬＰＳ）攻撃に対して防御できるか否かを検討した（Ｆ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ＰＡＲ−Ｓ１Ｐ３  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．”Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：６５４−６５８）。このモデルでＬＰＳにより誘導した敗血症ショックがＴＮＦαの産生と放出を伴うことは知られていた。マウス内毒素血症を試験するための全実験は米国国立衛生研究所動物保護ガイドラインに従って実施し、Ｓｃｒｉｐｐｓ研究所動物飼育・使用委員会により承認された。２分間の超音波処理の前後に３０秒間ボルテックスすることによりリポ多糖（ＬＰＳ，大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を３７℃正規食塩水（０．９％  ｗ／ｖ  ＮａＣｌ）に溶解した。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から入手した雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２％イソフルラン下で受動免疫用として９週齢で７．５ｍｇ／ｋｇ  ＬＰＳ又は能動免疫用として１５週齢で８．５ｍｇ／ｋｇ  ＬＰＳを腹腔内注射した。全実験は室内で安定した温度（２０〜２２℃）及び相対湿度（４０〜６０％）条件下に１２時間交互明暗サイクルで実施した。能動又は受動免疫したマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを図１１に示す。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線をプロットし、対数順位検定を使用して生存率の差を分析した。
【０２８３】
ＰＢＳ、ＷＴ  ｍＴＮＦα及びｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαをＣ５７ＢＬ／６マウスに免疫した。次に上記免疫レジメンの完了から３日後にこれらのマウスにＬＰＳ（８．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、その生存率を調べた。図１１Ａでは、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したマウス（８匹／群）をシャム免疫マウス７匹と比較した。野生型に対してｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスの生存率優位性（ｐ＜０．０１）を示す。図１１Ｂでは、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又は野生型免疫マウスに由来する精製ＩｇＧ  １００μｇを注射したマウス（８匹／群）を、食塩水を注射した対照と比較した。野生型に対してｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスの生存率優位性（ｐ＜０．０１）を示す。図１１Ｃでは、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又は野生型ｍＴＮＦαを免疫したマウスからの血清プール１００μｌをマウス（６匹／群）に投与した。野生型に対してｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスの生存率優位性（ｐ＜０．０１）を示す。対照マウスには等容量の生理食塩水を注射した。
【０２８４】
図１１Ａに示すように、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα突然変異体を免疫したマウスはＰＢＳ及びＷＴ  ｍＴＮＦα（生存率１２．５％）を免疫したマウスに比較して有意に高い生存率優位性（８７．５％）を示した。同様に、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを予め免疫したＢｃｌ−２マウスから採取した血清プール（１００ｕＬ）又は精製ＩｇＧ抗体（４ｍｇ／ｋｇ）を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスはＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ−２マウスからの血清プール又はＩｇＧを投与したマウス（１６．７〜２５．０％）に比較して有意に高い生存率（８３．３〜８７．５％）を示した（図１１Ｂ，１１Ｃ）。従って、これらの結果は自己蛋白質の単一のＮＯ２Ｐｈｅ突然変異体が疾患モデルで防御性の野生型蛋白質に対して強靭な交差反応性抗体応答を誘導することを実証している。本発明者らは現在、コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）モデルとＫＲＮトランスジェニックマウス（Ｋ／ＢｘＮ）モデルを含む他のＴＮＦα依存性モデルにこれらの試験を拡大中である（Ｄｉｔｚｅｌ（２００４）“Ｔｈｅ  Ｋ／ＢｘＮ  ｍｏｕｓｅ：Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １０：４０−４５）。
【０２８５】
上記注射で使用したＩｇＧ抗体はマウス血清を１０ｍｌセファロース固定化蛋白質Ｇアフィニティーカラム（ＧａｍｍａＢｉｎｄ  Ｐｌｕｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）にロードすることにより作製した。カラムを３カラム容量のＰＢＳ（ｐＨ７＝４）で洗浄した。２カラム容量の０．１Ｍ酢酸（ｐＨ３＝０）を使用して溶出を実施した。次に溶出液を１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ＝９．０）で中和し、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で透析した。
【０２８６】
内毒素攻撃の２４時間前にマウスを受動免疫した。第１の実験では、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したマウスに由来する血清プール１００μＬをマウスに腹腔内注射した。第２群にはｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したマウスの血清から精製したＩｇＧ  ４ｍｇ／ｋｇを投与した。対照マウスには等容量の生理食塩水を注射した。
【０２８７】
上記知見から明らかなように、Ｔｙｒ８６をｐＮＯ２Ｐｈｅに１カ所突然変異させる（ＷＴ蛋白質との唯一の相違は溶媒露出部位の−ＯＨ基を−ＮＯ２基に置換したことであった）だけで蛋白質の免疫原性が劇的に増加し、ＴＮＦα依存性マウスモデルに中和抗体応答を生じた。残基８６とすぐ近傍の残基８５をＡｌａに突然変異誘発させても、ｐＮＯ２Ｐｈｅ又はＷＴ蛋白質に対する抗体力価には殆ど影響がなく、抗体は不連続なエピトープを認識することが分かった。この結果によると、天然蛋白質に存在しない高度に免疫原性の部分であるユニークなＮＯ２基を付加した蛋白質は免疫系に外来抗原として認識される。密接な構造類似性により、誘発された抗体は対応する自己蛋白質と交差反応し、免疫寛容を解除した。
【０２８８】
本実施例はｐＮＯ２Ｐｈｅを蛋白質エピトープ（例えば標的自己蛋白質）に部位特異的に組込むことにより、例えばワクチン製造のために、免疫自己寛容を解除することが可能であることを示す。蛋白質改変により自己抗体を誘導できることは以前から知られていたが、蛋白質を免疫原性にする変異の種類が曖昧なため、その産生と治療効用は複雑である（Ｌｅｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９６８）“Ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｕｒｉｎｅ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １００：１２７７−１２８７）。例えば、Ｗｅｉｇｌｅの研究で使用されたアルサニル−スルファニル−サイログロブリン製剤はサイログロブリン１分子当たり〜５０個のアゾ結合を含んでいた（Ｗｅｉｇｌｅ（１９６５）“Ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎａｌｔｅｒｅｄ  ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎｔｏ  ｒａｂｂｉｔｓ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １２２：１０４９−１０６２）ため、非常に不均質で場合によっては凝集又は部分的に折畳まれない抗原となった。同様に、Ｔ細胞エピトープを抗原の各種位置に挿入すると、野生型蛋白質に対して三次構造、溶解度及び安定性の変化した蛋白質を作製することができる。他方、この場合に導入される変異は化学的に明確であり、残基１個に限定される。更に、これらの突然変異は蛋白質の全体的な四次構造にもその溶解度にも影響を与えないと思われる。従って、得られる抗体は野生型蛋白質における対応するエピトープを認識する可能性が高い。最後に、ｐＮＯ２Ｐｈｅを組込んだＴＮＦα突然変異体は強力なアジュバントを必要とすることなしに交差反応性防御免疫応答を誘導し、少なくとも４カ月間高力価を生じたため、この手法の治療応用を容易にできると思われる。
【０２８９】
このストラテジーは蛋白質フォールディング病（例えばアミロイドβ４２ペプチド）や癌に関連するものを含めた他の自己蛋白質にも適用可能であると思われる。更に、ｐＮＯ２Ｐｈｅ基を低免疫原性又は他のサイレントなエピトープに導入することにより、このアプローチはウイルス、細菌又は寄生虫感染症に対する中和抗体を生じると予想される病原体の領域（例えばマラリアのＣＳｌ蛋白質やＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＥ４１０エピトープ）に対して強い抗体応答を誘発できると思われる。更に、免疫原性アミノ酸を蛋白質に選択的に導入することにより、強い抗体応答を誘発することが従来困難であったＧ蛋白質共役型受容体及び他の膜結合受容体の機能的抗体（例えばアゴニスト又はアンタゴニスト）の作製を容易にすることができる。この現象の構造基礎とヒト疾患へのその応用の調査は現在解明中である。
【０２９０】
実施例１の図面に示した結果の説明
図１はｍＴＮＦαへのｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みを確認するために実施した実験の結果を示す。図１Ａは非天然アミノ酸ｐＮＯ２Ｐｈｅの構造を示す。図１ＢはｍＴＮＦα三量体のＸ線結晶構造を示し、Ｔｙｒ−８６、Ａｓｐ−４２、及びＬｙｓ−１１を示す（ＰＤＢ  ＩＤコード２ＴＮＦ）。図１ＣはｍＴＮＦαのＴｙｒ８６アンバー突然変異体の発現がｐＮＯ２Ｐｈｅ特異的ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対と共に１ｍＭ  ｐＮＯ２Ｐｈｅの存在下（レーン３）では生じるが、不在下（レーン２）では生じないことを確認するために実施した実験の結果を示す。図１Ｃの蛋白質サンプルは変性条件下でＮｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムにより精製し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ染色を使用してＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分析した。レーン４はＷＴ  ｍＴＮＦαを含み、レーン１は分子量標準である。ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα突然変異体の特性を図１Ｄに示す。８量体フラグメントＦＡＩＳＸＱＥＫのタンデム質量スペクトルを示し、ここでＸはｐＮＯ２Ｐｈｅを表す。８量体フラグメントはｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαのトリプシン消化により作製した。ｐＮＯ２Ｐｈｅを含有する８量体の部分配列を注釈付きｂ又はｙイオン系列から読み取ることができる。
【０２９１】
ｍＴＮＦαへのｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みを確認し、ｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みが非天然ＴＮＦαの四次構造に影響を与えないことを示すために数種類の実験を実施した。図２はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示し、図３はＷＴ  ｍＴＮＦαのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。図２のピークから確認されるように、非天然ＴＮＦαの質量はｐＮＯ２Ｐｈｅ残基が組込まれたことを示す。図４は突然変異体ｍＴＮＦα蛋白質の三次構造に及ぼすＴｙｒ８６→ｐＮＯ２Ｐｈｅ置換の影響を調べるために実施したＦＰＬＣ実験の結果を示す。突然変異体は突然変異体が三量化することを示す時点で溶出した。
【０２９２】
突然変異体ＴＮＦαで活性アッセイも実施した。図５はＷＴ  ｍＴＮＦα（四角）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（三角形）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα（逆三角形）、Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（菱形）、及びＰｈｅ４２ｍＴＮＦα（丸）のＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性分析の結果を示す。非天然ＴＮＦαの活性はＷＴ  ＴＮＦαに比較して低下する。
【０２９３】
ＰＢＳを免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスの血清力価を図６Ａに示し、ＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したマウスの血清力価を図６Ｂに示し、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスの血清力価を図６Ｃに示し、Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスの血清力価を図６Ｄに示す。ＷＴ  ｍＴＮＦα又はＰＢＳバッファー単独を免疫したマウスはｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαとＷＴ  ｍＴＮＦαの両方に対する血清ＩｇＧ力価が低かった。ＷＴ  ｍＴＮＦαは自己蛋白質であり、マウス免疫系が寛容を示すはずなので、これは予想通りである。これに対して、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスはｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαとＷＴ  ｍＴＮＦαの両方に対して著しく高い血清力価を示すことが判明した。
【０２９４】
プロトコールは、初回注射では完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の存在下、２回目以降は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）の存在下で１７日間かけて８回注射するものとした（蛋白質５μｇ／回）。ＷＴ  ｍＴＮＦα（各棒対１〜３２の左側の棒）又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（各棒対１〜３２の右側の棒）に対してＥＬＩＳＡを測定した。Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（図６Ｄ）を免疫したマウスでは、ＷＴ  ｍＴＮＦα（各棒対３３〜３６の左側の棒）又はＰｈｅ８６ｍＴＮＦα（各棒対３３〜３６の右側の棒）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１，０００倍に希釈した。
【０２９５】
Ｂｃｌ−２マウスでも上記と同様の結果が得られ、この結果は系統依存性ではないことが分かった。図７はＷＴ  ｍＴＮＦα又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ２マウスのＷＴ  ｍＴＮＦαとｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαに対する血清力価レベルを示す。ＲＩＭＭＳプロトコールは、初回注射ではＣＦＡの存在下、残りの７回の注射ではＩＦＡの存在下で１７日間かけて８回注射するものとした（蛋白質５μｇ／回）。ＷＴ  ｍＴＮＦα（４本ずつの各棒群の２本目と１本目）又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（４本ずつの各棒群の４本目と３本目）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１００倍又は１，０００倍に希釈した。
【０２９６】
図８はアジュバントの不在下でｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスの血清力価測定の結果を示す。この免疫も有意な抗ＴＮＦα力価を生じ、このアプローチは強力なアジュバントが望ましくない治療状況に適用可能であると思われた。ＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ−２マウスの血清力価を図８Ａに示し、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスの力価を図８Ｂに示す。免疫は以下のように実施した。ＣＦＡ又はＩＦＡの不在下で１７日間かけて８回注射した（蛋白質５μｇ／回）。ＷＴ  ｍＴＮＦα（各棒対の左側の棒）又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（各棒対の右側の棒）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１，０００倍に希釈した。
【０２９７】
免疫応答が非天然アミノ酸の免疫原性ニトロアリール基の結果であることを検証するために、Ｔｙｒ８６→Ｐｈｅ突然変異体であるｍＴＮＦα（Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα）を作製し、ＣＦＡ／ＩＦＡの存在下又は不在下でこの突然変異体をＢｃｌ２マウスに免疫した。図９はアジュバントの不在下又は存在下でＰｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ２マウスのＷＴ  ｍＴＮＦα及びＰｈｅ８６ｍＴＮＦαに対する血清力価測定値を示す。どちらの場合（例えばアジュバントの存在下又は不在下）も、有意な抗ＴＮＦα力価は生じず、免疫寛容を解除するためにはＮＯ２基が必要であることが分かった。
【０２９８】
アジュバントの不在下で免疫したマウスでは、ＲＩＭＭＳプロトコールは、１７日間かけて８回注射するものとした（蛋白質５μｇ／回）。アジュバントの存在下で免疫したマウスでは、初回注射にＣＦＡを使用し、残りの７回の注射にＩＦＡを使用した。ＷＴ  ｍＴＮＦα（４本ずつの各棒群の２本目と１本目）又はＰｈｅ８６ｍＴＮＦα（４本ずつの各棒群の４本目と３本目）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１００倍又は１，０００倍に希釈した。
【０２９９】
図１０はＴＮＦα上の他の表面部位の免疫原性を判定するために実施した実験の結果を示す。図１０Ａには、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα又はＰｈｅ４２ｍＴＮＦαを免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのＷＴ  ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα、及びＰｈｅ４２ｍＴＮＦαに対する血清力価を示す。図１０Ｂには、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのＷＴ  ｍＴＮＦα、ＰＢＳ、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦαに対する血清力価を示す。ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦαを免疫した場合のみに有意な抗ＴＮＦα力価が誘発され、免疫したマウスは有意な抗ＴＮＦα力価を生じた。この結果から、ｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異誘発は特定の自己又は外来抗原を高度に免疫原性にするためのかなり一般的なアプローチとなることが分かった。
【０３００】
実験のＲＩＭＭＳプロトコールは、アジュバントの存在下で１７日間かけて８回注射するものとした（蛋白質５μｇ／回）。ＷＴ  ｍＴＮＦα（１０Ａの３本ずつの各棒群の１本目；１０Ｂの各棒対の左側の棒）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα／ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα（１０Ａの３本ずつの各棒群の２本目；１０Ｂの各棒対７、８及び９の右側の棒）、Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα（１０Ａの３本ずつの各棒群の３本目）、又はＰＢＳ（１０Ｂの各棒対５及び６の右側の棒）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１００倍（１０Ａ）又は８００倍（１０Ｂ）に希釈した。
【０３０１】
このモデルでＬＰＳにより誘導した敗血症ショックがＴＮＦαの産生と放出を伴うことは知られていた。従って、次にｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ＴＮＦαをマウスにワクチン接種した場合に重度内毒素血症マウスモデルでリポ多糖（ＬＰＳ）攻撃に対して防御できるか否かを検討した（Ｆ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ＰＡＲ−Ｓ１Ｐ３  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．”Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：６５４−６５８）。図１１はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαの免疫がＴＮＦα依存性重度内毒素血症モデルでマウスの生存率を改善するか否かを調べるために実施した実験の結果を示す。能動又は受動免疫したマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを示す。図１１Ａでは、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したマウス（８匹／群）をシャム免疫マウス７匹と比較する。ＷＴに対してｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスの生存率優位性（Ｐ＜０．０１）を示す。図１１Ｂでは、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又はＷＴ免疫マウスに由来する精製ＩｇＧ  １００μｇを注射したマウス（８匹／群）を、食塩水を注射した対照と比較した。ＷＴに対してｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスの生存率優位性（Ｐ＜０．０１）を示す。図１１Ｃでは、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したマウスからの血清プール１００μｌをマウス（６匹／群）に投与した。ＷＴに対してｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスの生存率優位性（Ｐ＜０．０１）を示す。
【０３０２】
図１２はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαに由来する８量体トリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す。ｐＮＯ２Ｐｈｅを含有するトリプシン処理フラグメントの配列を１文字コードで示す（Ｘ＝ｐＮＯ２Ｐｈｅ）。ｙ及びｂ系列のフラグメントイオン実測値を示す。ｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みを証明する主要なｙ及びｂイオンはｂ５、ｂ６、ｂ７、ｙ７、ｙ６、ｙ５、及びｙ４である。全質量はモノアイソトピック質量として報告する。ＭＳ／ＭＳ分析は残基８６へのｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みのパターンと厳密に一致する。
【０３０３】
図１３はＨｉｓ６−Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（ＷＴ）又はＨｉｓ６−ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα上のＮ末端Ｈｉｓ６タグの存在がその後の免疫実験の結果に影響を与えないことを示すために実施した実験の結果を示す。
【０３０４】
現在のストラテジーでは免疫が停止すると自己抗体力価が急速に低下することが多いので、臨床用途には血清抗体力価の長期持続性が非常に望ましい。図１４はＴＮＦαに対する免疫応答の血清力価持続性を判定するために実施した実験の結果を示す。Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウス３匹にｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫した。８回１組の免疫後に、規定時点でｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαに対するＥＬＩＳＡ分析用に採血した。各測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１００倍に希釈した。△ｔは最終免疫から採血までの時間に対応する。６本ずつの各棒群の１本目は採血前であり、２本目は△ｔ＝１週間であり、３本目は△ｔ＝８週間であり、４本目は△ｔ＝１２週間であり、５本目は△ｔ＝１６週間であり、６本目は△ｔ＝１９週間である。
【０３０５】
図１５はＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。図１５Ａには、ＷＴ  ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα、及びＰｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫し、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαの希釈系列でｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激したＢｃｌ−２トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示す。図１５Ｂには、ＷＴ  ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα、及びＰｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫し、ＷＴ  ｍＴＮＦαの希釈系列でｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激したＢｃｌ−２トランスジェニックマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示す。ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞が誘発されたのは、マウスにこの突然変異体蛋白質を免疫した場合のみであり、マウスにＷＴ  ｍＴＮＦα又はＰｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫した場合には誘発されなかった。これに対して、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ−２マウスに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞をＷＴ  ｍＴＮＰαでｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激した場合には、有意増殖は認められなかった。
【実施例２】
【０３０６】
非天然アミノ酸による免疫化学的寛容解除の機序試験
実施例２はＴＮＦαへの非天然アミノ酸の組込みにより生じたポリクローナルＩｇＧ抗体応答の性質と持続性を特性決定し、非天然アミノ酸により誘導される（例えばｐＮＯ２Ｐｈｅにより誘導される）自己寛容低下の普遍性を更に裏付ける。実施例２はマウス腫瘍壊死因子α（ｍＴＮＦα）の数個の表面残基を独立してｐ−ニトロフェニルアラニン（ｐＮＯ２Ｐｈｅ）に突然変異させると、少なくとも４０週間持続するＴ細胞依存性で持続性のポリクローナル抗ｍＴＮＦα  ＩｇＧ自己抗体応答が得られることを示す。本実施例は抗体がｍＴＮＦα上の複数のエピトープと結合し、リポ多糖（ＬＰＳ）攻撃により誘導した重度内毒素血症からマウスを防御したことを示す。マウスにマウスレチノール結合蛋白質（ＲＢＰ４）のｐＮＯ２Ｐｈｅ４３突然変異体を免疫すると、野生型ｍＲＢＰ４に対して交差反応性の高力価ＩｇＧ抗体応答を生じることも分かった。従って、実施例２は本発明が癌関連又は他の低免疫原性抗原に対して有効な免疫治療薬を作製するための一般的なアプローチになり得ることを更に裏付ける。
【０３０７】
２世紀以上にわたり、能動免疫療法が感染症予防の最前線であった（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．（２００３）“Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：２６９−２７７）。しかし、免疫系が自己抗原に対して強靭な免疫応答を生じる能力の低下に伴い、癌や慢性変性疾患に対する治療用ワクチンを作製することは困難になっている。最近、本発明者らは、自己蛋白質への免疫原性非天然アミノ酸の特異的組込みが自己寛容を克服するための簡単で有効なアプローチとなることを報告した（Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：１１２７６−１１２８０及び実施例１参照）。本実施例では、ポリクローナルＩｇＧ抗体応答の性質と持続性を特性決定し、ｐＮＯ２Ｐｈｅにより誘導される自己寛容低下の普遍性の立証に着手する。マウス腫瘍壊死因子α（ｍＴＮＦα）の数個の表面残基を独立してｐ−ニトロフェニルアラニン（ｐＮＯ２Ｐｈｅ）に突然変異させると、少なくとも４０週間持続するＴ細胞依存性で持続性のポリクローナル抗ｍＴＮＦα  ＩｇＧ自己抗体応答が得られる。抗体はｍＴＮＦα上の複数のエピトープと結合し、リポ多糖（ＬＰＳ）攻撃により誘発した重度内毒素血症からマウスを防御する。マウスにマウスレチノール結合蛋白質（ＲＢＰ４）のｐＮＯ２Ｐｈｅ４３突然変異体を免疫した場合も、野生型ｍＲＢＰ４に対して交差反応性の高力価ＩｇＧ抗体応答を生じた。これらの知見から、これは癌関連抗原又は他の低免疫原性抗原に対して有効な免疫治療薬を作製するための比較的一般的なアプローチになり得ると考えられる。
【０３０８】
免疫学的非自己判別プロセスで重要なのは自己寛容（Ｇｏｏｄｎｏｗ（２００７）“Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｃｅｌｌ  １３０：２５−３５）であり、哺乳動物の免疫系は主に自己反応性Ｂ又はＴ細胞の不在又は不活性化による自己免疫疾患を避けるために自己蛋白質に対して「寛容」になる。他方、自己蛋白質を攻撃するように免疫系を誘導できることも以前から知られている。例えば、キメラ抗原への外来Ｔヘルパー細胞エピトープの導入（Ｄａｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：６６６−６６９，Ｚｕａｎｙ−Ａｍｏｒｉｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＡｕｔｏＶａｃ  ＴＮＦ１０６：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：１５４−１６３）、自己抗原の広範な化学的誘導体化（Ｗｅｉｇｌｅ，Ｗ．Ｏ．（１９６５）“Ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｏｒ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １２１：２８９−３０８）、及びＤＮＡワクチン（Ｌｅｉｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）“Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｔｈｗａｙｓ”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：３３−３９）により、自己蛋白質に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる。更に、自己寛容に関与し、破壊されると寛容解除と自己免疫疾患を生じる多数の特定遺伝子及び細胞メカニズムが同定されている（Ｇｏｏｄｎｏｗ（２００７）“Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｃｅｌｌ  １３０：２５−３５；Ｈｉｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｒｅｃｅｎｔ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３：４８３８−４８５１）。これらの進歩にも拘わらず、ごく少数の癌処置用ワクチンしか後期臨床開発に達していないという事実から明らかなように、有効な免疫治療薬の設計は進展していない（Ｓｍａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｐｌａｃｅｂｏ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（ＡＰＣ８０１５）  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ，ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏ���ｃｏｌ  ２４：３０８９−３０９４；Ｓｃｈｌｏｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ”Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  １４：２３８−２４５）。
【０３０９】
ニトロアリール基は恐らく強いスタッキング及びファン・デル・ワールス相互作用を形成することができるため、高度に免疫原性である。実際に、自己癌細胞をジニトロフェニル基で非特異的に誘導体化する方法がメラノーマ患者のワクチンとして利用されており（Ｂｅｒｄ，Ｄ．（２００４）“Ｍ−Ｖａｘ：ａｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ，ｈａｐｔｅｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ３：５２１−５２７）、生理的３’−ニトロチロシン形成は多数の自己免疫疾患の病理に関係があるとされている（Ａｕｌａｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｎｉｔｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８：１２０５６−１２０６１；Ｐａｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８７：３１５−４２４；Ｈａｒｄｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎａｌｏｇ  ３’−ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｔ  ｅｉｔｈｅｒ  ＴＣＲ−  ｏｒ  ＭＨＣ−ｃｏｎｔａｃｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｃａｎ  ｐｒｏｆｏｕｎｄｌｙ  ａｆｆｅｃｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ３３  ｂｙ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８０：５９５６−５９６２）。特定自己蛋白質に対する寛容を解除するためにこの免疫原性基を使用できるか否かを試験するために、本発明者らは先にｐ−ニトロフェニルアラニン（ｐＮＯ２Ｐｈｅ）残基をマウスＴＮＦαの単一部位に導入した。ｍＴＮＦαのＴｙｒ８６をｐＮＯ２Ｐｈｅで遺伝子置換してＴ細胞エピトープを作製すると、Ｔ細胞ヘルパーが強化され、この疾患関連自己蛋白質に対する強い交差反応性抗体応答を誘発した（Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：１１２７６−１１２８０）。本実施例では、自己寛容の免疫化学的解除がマウスをリポ多糖（ＬＰＳ）攻撃に対して有効に防御する持続的高力価抗体応答をもたらすことを示す。更に、免疫機能に無関係の自己蛋白質、即ちレチノール結合蛋白質４（ＲＢＰ４）にこの手法を一般化できることを実証する。
【０３１０】
ｐＮＣ２Ｐｈｅにより誘導される自己寛容解除の機序試験
先に、本発明者らはｍＴＮＦαでＴｙｒ８６をｐＮＯ２Ｐｈｅで置換すると、野生型（ＷＴ）蛋白質に対する高力価交差反応性抗体応答を生じたことを報告した。突然変異体蛋白質は免疫動物にＴ細胞増殖を誘導するが、ＷＴ蛋白質は誘導しないことが判明した（Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：１１２７６−１１２８０）。ｐＮＯ２ＰｈｅＴＮＦαに対するＴ細胞依存性免疫応答を更に裏付けるために、抗マウスＩｇＭ又は抗マウスＩｇＧ二次抗体でｍＴＮＦα自己抗体のＥＬＩＳＡ分析を実施した。ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ−２マウスに由来する血清中の抗ｍＴＮＦα自己抗体の大半はＩｇＧサブタイプであり、Ｔ細胞介在性免疫グロブリンクラススイッチが判明した（図１６Ａ）。ｐＮＯ２Ｐｈｅの存在が免疫プロセス全体で重要であるか否かを調べるために、先ずｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に加えてマウス４匹に注射した後に、ＷＴ  ｍＴＮＦα又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）に加えて７回注射した。図２０に示す結果は、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαとは対照的に、ＷＴ  ｍＴＮＦαが交差反応性抗ｍＴＮＦα抗体の有意力価を持続できないことを明白に実証している。この結果はｐＮＯ２Ｐｈｅにより誘導される自己寛容解除にはニトロフェニル基に介在されるＴ細胞応答が必要であるという見解を裏付けるものであり、Ｔｙｒ８６ＰｈｅＴＮＦα突然変異体が強力な免疫応答を誘発できないことを示した従来の報告と一致する。
【０３１１】
ｐＮＯ２Ｐｈｅにより誘導される自己寛容解除のメカニズムに関する１つの問題は、抗体応答がｐＮＯ２Ｐｈｅを含むエピトープに特異的であるのか、あるいはエピトープスプレディングが生じ、標的蛋白質の複数のエピトープに対するポリクローナルＩｇＧ応答が生じるのかという点にある。この問題を検討するために、Ｂｃｌ−２マウスにｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫して５０Ｂ細胞ハイブリドーマを作製し、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、ＷＴ  ｍＴＮＦαに対する抗体を産生するクローンを同定した。次に、大腸菌で発現させたＮ末端フラグメント（ａａ１−６０）、内部フラグメント（ａａ６１−１００）、及びＣ末端フラグメント（ａａ１０１−１５６）の３個１組のｍＴＮＦαフラグメントとこれらのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結合を評価し、その分子量をＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ（図２１）により確認した。このアッセイは主に直線状（恐らく連続性の）Ｂ細胞エピトープに対する特異性を検出するが、Ｎ末端フラグメントに結合した５個のｍＡｂ（３Ｌ２４，５Ｋ１９，６Ｊ２２，７Ｏ１，及び７Ｆ２３）と、Ｃ末端フラグメントに結合した１個のｍＡｂ（１Ｐ１９）を同定した（図２２）。特筆すべき点として、元の免疫原のｐＮＯ２Ｐｈｅ８６をコードする内部フラグメントと結合するｍＡｂは皆無であった。従って、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα免疫により２個以上のエピトープと結合する抗体が産生され、これらのエピトープは必ずしも免疫原のｐＮＯ２Ｐｈｅ残基を含まない。ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスに由来するポリクローナルＩｇＧはナノモル範囲のＫｄ値で野生型ｍＴＮＦαと交差反応する（図１６Ｂ）。これらの結果をまとめると、ｐＮＯ２Ｐｈｅ残基をその配列に挿入するだけで自己蛋白質に対する交差反応性中和抗体応答を生じることができるという仮説が更に裏付けられる。
【０３１２】
ｐＮＯ２Ｐｈｅにより誘導される抗体応答の持続性
抗ｍＴＮＦα  ＩｇＧ抗体力価の持続性を調べるために、Ｂｃｌ−２マウス３匹にｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫した。最後のブースト注射後に、規定時点で採血し、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαに対するＥＬＩＳＡにより分析した。注目すべき点として、抗体濃度は少なくとも４０週間にわたってその初期濃度の８０％を上回るレベルに維持され（図１６Ｃ）、その後、マウスを屠殺した。これに対して、鶏卵白リゾチームＴ細胞エピトープを含むｍＴＮＦα突然変異体の免疫に基づく従来の抗ｍＴＮＦαワクチン接種試験では、最後のブーストから４週間後に力価が低下し、２６週間後にｍＴＮＦα抗体力価は８０〜８７％低下した（Ｄａｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ．”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：６６６−６６９）。従って、ｐＮＯ２Ｐｈｅに基づく本発明者らのワクチンストラテジーは疾患関連自己抗原としてのＴＮＦαに対する持続的免疫と長期防御を誘導するのに有効である。
【０３１３】
ｍＴＮＦα内の他の表面部位の突然変異への拡大
ｐＮＯ２Ｐｈｅにより誘導される自己寛容解除の普遍性を試験するために、ｍＴＮＦαの他の４個の表面露出残基Ｌｙｓ１１、Ｇｌｎ２１、Ａｓｐ４２、及びＶａｌ４９をｐＮＯ２Ｐｈｅに突然変異させた（図２３Ａ）。これらの残基もｐ−ニトロフェニルアラニンと構造的に異なる。ＰＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ４９ｍＴＮＦαの組成と均一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥと質量分析法（図２３Ｂ及び表３）により確認後、これらの突然変異体蛋白質の四次構造は三量体であることがサイズ排除クロマトグラフィーにより判明した（表４）。更に、ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦαはＷＴ  ｍＴＮＦαの活性の９％、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１ｍＴＮＦαは２２％、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦαは２２％、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９ｍＴＮＦαは１０％であることが判明した（表４及び図２３Ｃ）。従って、先に特性決定したｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαがこのアッセイで野生型蛋白質の僅か２％に過ぎないことに比較すると、全突然変異体は著しく活性である。これらのｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＴＮＦα突然変異体の免疫原性を判定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス１４匹をランダムに５群に分け、ＲＩＭＭＳ（複数部位の反復免疫）プロトコール（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）“Ｒａｐｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＩＭＭＳ．”Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３８１−３８９）によりこれらの突然変異体又はＷＴ  ｍＴＮＦαを注射した。ＥＬＩＳＡ分析の結果、ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるｍＴＮＦα活性と抗体応答誘導能の間に相関はないことが分かったので、免疫系に直接的な影響はないと判断された。図１７に示すように、１１位のｐＮＯ２ＰｈｅはｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα免疫原に対する応答と等価の高力価ＩｇＧ応答をＷＴ  ｍＴＮＦαに対して誘導した。これに対して、２１、４２及び４９位の突然変異もｐＮＯ２Ｐｈｅ含有免疫原に対して高力価ＩｇＧ応答を生じたが、ＩｇＧ抗体はＷＴ  ｍＴＮＦαに対する交差反応性が中程度に止まった。次に全４種の突然変異体ＴＮＦαに対して作製した抗体をＣ５７ＢＬ／６マウス４０匹の受動免疫に使用し、マウスをランダムに５群に分け、抗ｐＮＯ２Ｐｈｅ又は抗ＷＴ  ｍＴＮＦα  ＩｇＧを注射した。受動免疫から２４時間後に、動物を従来記載されているようにＬＰＳで攻撃した（Ｎｉｅｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ＰＡＲ１−Ｓ１Ｐ３  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．”Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：６５４−６５８）。抗ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα  ＩｇＧを投与した全マウスは致死性ＬＰＳ攻撃に耐えた（図１８）。中程度の交差反応性の抗ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１ｍＴＮＦα  ＩｇＧ、抗ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα  ＩｇＧ、及び抗ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９ｍＴＮＦα  ＩｇＧを投与した他の群も少なくとも７５％の生存率であったが、抗ＷＴ  ｍＴＮＦα  ＩｇＧを注射し���マウスは１３％の生存率に止まった。従って、少なくとも５個の位置（８６位を含む）が中和交差反応性抗ｍＴＮＦα  ＩｇＧ応答をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導できることを立証したので、ｐＮＯ２Ｐｈｅを使用して自己寛容を解除する能力は単一のアミノ酸位置に依存しない。更に、置換部位はｐ−ニトロフェニルアラニンと構造的に類似する必要はない。
【表４】
2011514322.tif 000010
【表５】
2011514322.tif 000011
【０３１４】
突然変異体ｍＲＢＰ４蛋白質の発現と特性決定
ｐＮＯ２Ｐｈｅに突然変異させると、ｍＴＮＦα内の複数の位置が自己寛容の解除を生じるので、次にこの手法を他の自己蛋白質にも一般化できるか否かを検討した。具体的には、ｐＮＯ２Ｐｈｅが血清に存在する別のモデル自己蛋白質であるＲＢＰ４に対する自己寛容を解除する能力を試験した（Ｚａｎｏｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）“Ｐｌａｓｍａ  ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｔｉｎｏｌ，ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ．”  Ｖｉｔａｍ  Ｈｏｒｍ  ６９：２７１−２９５；Ｒａｇｈｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇｓｔ  ｐｌａｓｍａ  ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｌｉｇａｎｄｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．”Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７０３：１−９）。ＴＮＦαとは対照的に、これは高度に可溶性で比較的低分子量（２０ｋＤａ）の単量体蛋白質である。ＲＢＰ４ノックアウトマウスは視覚欠損以外に明白な表現型異常を示さない（Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｖｉｓｉｏｎ．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１５３６０−１５３６８）ので、マウスは自己ＲＢＰ４に対する中和免疫応答に耐えると考えられる。単量体ヒトＲＢＰ４のｘ線結晶構造（Ｃｏｗａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）“Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｔｉｎｏｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔ  ２Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８：４４−６１）に基づき、表面露出残基Ｔｙｒ４３及びＴｙｒ１０８をｐＮＯ２Ｐｈｅへの突然変異に選択した（図２４）。これらの残基はマウスＲＢＰ４（ｍＲＢＰ４）を含む各種哺乳動物ＲＢＰ４間で高度に保存されている。これらのｍＲＢＰ４突然変異体とＷＴ  ｍＲＢＰ４を大腸菌でＮ末端Ｈｉｓ６タグ付き蛋白質として発現させ、変性条件下でＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、従来記載されているプロトコールに従ってリフォールディングさせた（Ｇｒｅｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １０：２３０１−２３１６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と非天然アミノ酸を含有するトリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳ断片化によりｍＲＢＰ４の４３位及び１０８位へのｐＮＯ２Ｐｈｅの部位特異的組込みを確認した（図２４、２５及び２７）。分析用サイズ排除クロマトグラフィーはヒトＲＢＰ４の公表四次構造と一致する単量体構造を全ｍＲＢＰ４蛋白質に示した（表５）（Ｃｏｗａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）“Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｔｉｎｏｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔ  ２Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８：４４−６１）。更に、レチノール置換アッセイによると、全ｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＲＢＰ４突然変異体はナノモル範囲のＫｄ値でレチノールと結合し、ＷＴ  ｍＲＢＰ４と良好に一致する（表５）。
【表６】
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Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラムでの保持時間に対する蛋白質標準の分子量の対数のプロットに基づき、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４、及びＷＴ  ｍＲＢＰ４の四次構造を決定した。ＴＲ−ＦＲＥＴレチノール結合アッセイによりｍＲＢＰ４蛋白質の結合親和性を測定した。
【０３１５】
ｐＮＯ２Ｐｈｅにより誘導される自己寛容解除の普遍性
ｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＲＢＰ４突然変異体の免疫原性を判定するために、Ｂｃｌ２マウス１２匹をランダムに４群に分け、ＲＩＭＭＳプロトコールによりｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４、及びＷＴ  ｍＲＢＰ４を注射した（例えばＫｉｌｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）“Ｒａｐｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＩＭＭＳ．”Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３８１−３８９参照）。ＥＬＩＳＡ分析によると、ＷＴ  ｍＲＢＰ４又はｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４を免疫したマウスはＷＴ  ｍＲＢＰ４に対する血清ＩｇＧ力価が低かった（図１９Ａ）。これに対して、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４を免疫したマウスは著しく高い血清ＩｇＧ力価（１：１００，０００まで）を示し、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４免疫原と野生型蛋白質の両方に結合することが判明した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでも同様の結果が得られた（図２６）。更に、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαによる先の知見と一致し、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４蛋白質を免疫すると、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞が誘導され、成熟Ｔ細胞依存性免疫応答を示した（図１９Ｂ）。これらの結果をまとめると、ｐＮＯ２Ｐｈｅを蛋白質配列に導入すると強力なＴ細胞エピトープを形成することができ、その結果、持続的交差反応性ＩｇＧ抗体応答を開始するという仮説が更に裏付けられる。全部位が強い交差反応性免疫応答を生じる訳ではないが、全部位が潜在的Ｔ細胞エピトープに対応するとは思われないので、これは意外ではない。
【０３１６】
本発明者らはｐＮＯ２Ｐｈｅの遺伝子導入が自己蛋白質ｍＴＮＦα及びｍＲＢＰ４に対する持続的ＩｇＧ抗体応答を生じることを示した。メカニズムの観点では、ｐ−ニトロフェニル基を１カ所に組込む結果、ｐＮＯ２Ｐｈｅ突然変異体のみにより刺激することができ且つＷＴ蛋白質では刺激できないＴ細胞が得られる。このｐＮＯ２Ｐｈｅにより誘導されるＴ細胞依存性応答は最終的に自己反応性Ｂ細胞の活性化と、野生型自己蛋白質に対して高度に交差反応性のポリクローナル抗体の産生をもたらす。これらの結果は翻訳後修飾された蛋白質がＴ細胞応答性を強化できることを示した最近の報告と似ている（Ｃａｎｔａｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｃｒｕｃｉａｌ．．．ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ！”Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５４：３３８１−３３８９；Ｂａｃｋｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｅｐｉｔｏｐｅ  （２６３−２７０）  ｉｎ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９：９９６０−９９６５；Ｄｚｈａｍｂａｚｏｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）“Ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｓ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｂｕｔ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：３５７−３６６）。例えば、シトルリン化とグリコシル化はＴ細胞依存性自己免疫疾患に関与する翻訳後修飾である（Ｃａｎｔａｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｃｒｕｃｉａｌ．．．ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ！”Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５４：３３８１−３３８９；Ｂａｃｋｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｅｐｉｔｏｐｅ  （２６３−２７０）  ｉｎ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９：９９６０−９９６５；Ｄｚｈａｍｂａｚｏｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）“Ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｓ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｂｕｔ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：３５７−３６６；Ｋｌａｒｅｓｋｏｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６：６５１−６７５；Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．（２０００）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：５３−８１）。同様に、皮膚抗原のジニトロフルオロベンゼン修飾が接触過敏症におけるＴ細胞応答のモデルとして数十年来使用されている（Ｔｏｅｗｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）“Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｗｈｅｔｈｅｒ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｒ  ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｆｏｌｌｏｗｓ  ｓｋｉｎ  ｐａｉｎｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＤＮＦＢ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２４：４４５−４５３）。従って、自己蛋白質へのｐＮＯ２Ｐｈｅの部位特異的組込みは翻訳後又は化学修飾による自己寛容低下を生化学的に模倣するための単純なモデルシステムとなる。従って、この手法は免疫系が自己免疫中に化学修飾抗原にどのように応答するかを理解するのにも役立つはずである。更に、ｐＮＯ２Ｐｈｅにより誘導される自己寛容解除は癌又は変性疾患に関連する病原性自己蛋白質に対する中和抗体を産生させるための堅牢な方法を提供するのみならず、感染物質の低免疫原性外来抗原にも適用可能であると思われる。
【０３１７】
細菌株及び試薬
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＸＬ１０−Ｇｏｌｄをクローニング用宿主として使用し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を発現株として使用した。制限酵素Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ｄＮＴＰ、及び第Ｘａ因子プロテアーゼはＮＥＢ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。プライマーはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。プラスミドＤＮＡ作製はＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施し、制限消化後のＤＮＡ精製はＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＰＣＲ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。
【０３１８】
ｐＮＯ２Ｐｈｅを組込んだｍＴＮＦαとＷＴ  ｍＴＮＦαの作製
先に記載したようにＷＴ  ｍＴＮＦαとｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＴＮＦα突然変異体を作製した（Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：１１２７６−１１２８０）。要約すると、標準ＰＣＲ突然変異誘発法を使用してＴＡＧアンバーコドンを導入することによりマウスＴＮＦα遺伝子へのｐＮＯ２Ｐｈｅの部位特異的組込みを実施した。ｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＴＮＦα突然変異体を発現させるために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をｍｕｔＮＯ２ＰｈｅＲＳ、ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ及び突然変異ｍＴＮＦα遺伝子で同時形質転換した。次に１％グリセロールと０．３ｍＭロイシンを添加した最少培地（ＧＭＭＬ培地）で１ｍＭ  ｐＮＯ２Ｐｈｅ（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）の存在下に３７℃にて形質転換細胞を増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧに添加により蛋白質発現を開始した。２×ＹＴ培地でｐＮＯ２Ｐｈｅの不在下にＷＴ  ｍＴＮＦαを発現させた。非変性又は変性条件下で固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）とサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により蛋白質精製を実施した。全蛋白質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ又はＥＳＩ質量分析法により特性決定した。ゲル内トリプシン消化後にこの非天然アミノ酸を含有する各トリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳ断片化により突然変異体蛋白質へのｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みの成功も検証した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）製品の分子量ゲル濾過標準により校正したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬゲル濾過カラムで分析用ＳＥＣにより蛋白質四次構造を分析した。先に記載したようにＮＦκＢ−ルシフェラーゼを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を使用してＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによりｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＴＮＦα突然変異体の活性を測定した（Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：１１２７６−１１２８０）。
【０３１９】
ｍＲＢＰ４発現ベクターｐＳｐｅｅｄＥＴ−ｍＲＢＰ４の構築
ポリメラーゼ不完全プライマー伸長（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＰＩＰＥ）クローニング法（Ｋｌｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｏ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｅｆｆｏｒｔｓ．”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７１：９８２−９９４）用に特別に設計した２個のプライマー：５’−ＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＧＧ（５’インサートフォワードプライマー）及び５’−ＡＡＴＴＡＡＧＴＣＧＣＧＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＡＧＧＧＣＣ（３’インサートリバースプライマー）を使用してマウスＲＢＰ４（ａａ１９−２０１）をコードするｃＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）をＰＣＲ増幅した。５’ベクターリバースプライマー５’−ＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＡＣＡＧＧＴＴＴＴＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧと３’ベクターフォワードプライマー５’−ＴＡＡＣＧＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣを使用してｐＳｐｅｅｄＥＴベクターを増幅した。下線とイタリックで示した塩基はアニールが生じるプライマー間の２個の別個の相補領域を明示する。ｐＳｐｅｅｄＥＴベクターはｍＲＢＰ４の１９番目のコドンの直前のＴＥＶプロテアーゼ部位（ＥＮＬＹＦＱＧ）の手前にＮ末端Ｈｉｓ６タグ配列（ＭＧＳＤＫＩＨＨＨＨＨＨ）を付加する。未精製ｍＲＢＰ４（ａａ１９−２０１）インサートＰＣＲ産物を未精製ｐＳｐｅｅｄＥＴベクターＰＣＲ産物と１：１（ｖ／ｖ）で混合した。混合後、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞を反応混合物２μＬで形質転換した。Ｔｙｒ４３又はＴｙｒ１０８のコドンをＴＡＧアンバーコドンに突然変異させることにより、ｍＲＢＰ４（ａａ１９−２０１）へのｐＮＯ２Ｐｈｅの部位特異的組込みを実施した。全ｐＳｐｅｅｄＥＴ−ｍＲＢＰ４構築物の配列をＤＮＡ配列分析により確認した。
【０３２０】
ｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＲＢＰ４及びＷＴ  ｍＲＢＰ４の蛋白質発現と精製
ｐＮＯＰｈｅ  ｍＲＢＰ４突然変異体を発現させるために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をｍｕｔＮＯ２ＰｈｅＲＳ、ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ、及び各突然変異体ｍＲＢＰ４遺伝子で同時形質転換した。形質転換株をＧＭＭＬ培地で３７℃にて１ｍＭ  ｐＮＯ２Ｐｈｅの存在下に増殖させ、ＯＤ６００ｎｍが０．５に達したら０．２％（ｗ／ｖ）アラビノースで誘導し、１２〜１６時間後に回収した。ｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＲＢＰ４突然変異体と異なり、ＷＴ  ｍＲＢＰ４は２×ＹＴ培地でｐＮＯ２Ｐｈｅの不在下に３時間発現させた。１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓを添加した８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に細胞ペレットを懸濁し、氷上で３分間超音波処理により溶解させた。細胞破片を４０，０００×ｇで２５分間遠心により除去した。５０％  Ｎｉ−ＮＴＡスラリー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）５ｍｌを上清に加え、６０分間振盪することにより温和に混合した。Ｎｉ−ＮＴＡビーズを８Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、及び１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．３）で洗浄した。１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４と１０ｍＭ  Ｔｒｉｓを添加した８Ｍ尿素（ｐＨ４．５）で溶出を行った。１０Ｋ分子量カットオフＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で蛋白質を濃縮した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で透析することによりｍＲＢＰ４蛋白質を沈降させ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓと２０ｍＭジチオスレイトールを添加した８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に再溶解した。Ｇｒｅｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １０：２３０１−２３１６に従い、ｍＲＢＰ４蛋白質のＩｎ  ｖｉｔｒｏフォールディングを実施した。要約すると、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ２−ヒドロキシエチルジスルフィド、及び１％グリセロールを添加したフォールディングバッファー（ｐＨ８．５）に変性材料の８Ｍ尿素溶液を〜３０滴／分の割合で滴下することにより野生型蛋白質を作製した。フォールディングを１６時間４℃で進行させた後、１０Ｋ分子量カットオフＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して蛋白質溶液を濃縮した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で流速０．３ｍｌ／分にてＳＥＣにより蛋白質を更に精製した。
【０３２１】
重度全身性炎症のマウスモデル
全実験は米国国立衛生研究所動物保護ガイドラインに従って実施し、Ｓｃｒｉｐｐｓ研究所動物飼育・使用委員会により承認された。動物実験は室内で安定した温度（２０〜２２℃）及び相対湿度（４０〜６０％）条件下に１２時間交互明暗サイクルで実施した（Ｎｉｅｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ＰＡＲ１−Ｓ１Ｐ３  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．”Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：６５４−６５８）。ＬＰＳ攻撃の２４時間前に、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１ｍＴＮＦα、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ４９ｍＴＮＦαを免疫したマウスの血清から精製したＩｇＧ  ４ｍｇ／ｋｇを腹腔の左半分に注射することにより、９週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に受動免疫した。非免疫野生型マウスに由来するＩｇＧを陰性対照として使用した。次にマウスの腹腔の右半分に２％イソフルラン下で７．５ｍｇ／ｋｇリポ多糖（ＬＰＳ，大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を注射した。統計分析のために、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線をプロットし、ボンフェローニ補正を加えた対数順位検定を使用して生存率の差を分析した。
【０３２２】
ＥＬＩＳＡ
０．５μｇ／ｍｌ蛋白質３０μｌを使用してＭａｘｉｓｏｒｐ  ３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）のウェルを一晩４℃で被覆した。ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄後、被覆したプレートを１％  ＢＳＡのＰＢＳ溶液８０μｌでブロッキングし、再びＰＢＳＴで洗浄した。１％  ＢＳＡのＰＢＳ溶液で希釈した一次抗体又は血清２０μｌ、ＨＲＰ修飾ヤギ抗マウスＩｇＧ又は抗マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）２０μｌ、及びＴＭＢ基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）２０μｌをプレートに順次加えてインキュベートし、６５０ｎｍの吸光度を読み取った。インキュベーション間にプレートをＰＢＳＴで少なくとも６回洗浄した。
【０３２３】
Ｔ細胞増殖アッセイ
免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのリンパ節からＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）による磁気ディプリーションによりＣＤ４＋Ｔ細胞の分離を行った。次に野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する照射後の脾細胞と共にＴ細胞を培養液に加え、量を増加しながら抗原を加えた。４８時間インキュベーション後、３Ｈ−チミジンを加えて培養液を一晩インキュベートした。培養プレートをフィルターマットに回収後、ＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で放射能を定量した。
【０３２４】
マウスＲＢＰ４活性アッセイ
スルホ−ＮＨＳ−ビオチンキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を製造業者の指示に従って使用してＷＴ及びｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＲＢＰ４突然変異体蛋白質をビオチンで標識した。レチノール結合活性を測定するために、１０ｎＭビオチン標識ＲＢＰ４を１ｎＭストレプトアビジン−ユーロピウムキレート（ＬＡＮＣＥ（登録商標）Ｅｕ−Ｗ８０４４  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と混合した。濃度を増加しながらＣｙ５標識レチノールを反応混合物に加え、均一時分割蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）によりレチノール結合を評価した。
【０３２５】
免疫とモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製
精製ＷＴ又はｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＴＮＦαを免疫原として使用し、抗ｍＴＮＦα抗体を作製した。ＲＩＭＭＳプロトコールを使用してＢｃｌ−２トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＢＣＬ２）２２Ｗｅｈｉ）又はＣ５７ＢＬ／６マウスに免疫した。例えばＫｉｌｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）“Ｒａｐｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＩＭＭＳ．”Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３８１−３８９参照。Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウスはＢ細胞生存延長とリンパ濾胞増殖を示すため、免疫に特に適している。要約すると、マウスに１８日間かけて８回注射した。各回に、蛋白質５μｇをＰＢＳ  ２００μｌに溶かした溶液を完全フロイントアジュバント（初回注射）又は不完全フロイントアジュバント（２回目以降）と１：１で混合した。末梢リンパ節（ＰＬＮ）の近傍の６カ所の特定部位に免疫原を注射した。８回目の注射当日に、試験用に採血し、血清抗体力価をＥＬＩＳＡにより分析した。高血清力価マウスからのＰＬＮを採取し、解離させた。５０％  ＰＥＧ  １５００を使用して、分離したリンパ球をＦ０マウスミエローマ細胞と融合した。融合した細胞を３８４ウェル組織培養プレートに撒いた。ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地でハイブリドーマを選択し、ＷＴ  ｍＴＮＦαに対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。
【０３２６】
実施例２の図面に示した結果の説明
図１６はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα免疫がＩｇＧ応答へのクラススイッチを促進するか否かを調べるために実施した実験の結果を示す。検出されたＩｇＧ応答はＷＴ  ｍＴＮＦαに対する有意な交差反応性を示し、マウスで少なくとも４０週間持続する。図１６Ａでは、初回注射は完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の存在下、２回目以降は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）の存在下にｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ−２マウスの血清力価を１７日間測定した。二次抗体として抗マウスＩｇＭ（４本ずつの各棒群の１本目と２本目）又は抗マウスＩｇＧ（４本ずつの各棒群の３本目と４本目）を使用してＷＴ  ｍＴＮＦαに対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１００倍（１本目と３本目）又は１０００倍（２本目と４本目）に希釈した。図１６ＢはｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαに対するポリクローナル抗ＷＴ  ｍＴＮＦα  ＩｇＧ（逆三角形）とポリクローナル抗ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα  ＩｇＧ（菱形）の親和性を定量するために実施したＥＬＩＳＡ力価試験を示す。図１６ＣはｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したＢｃｌ−２マウス３匹の血清力価持続性試験を示す。８回１組の免疫後に、規定時点でｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαに対するＥＬＩＳＡ分析用に採血した（△ｔは最終免疫から採血までの時間に対応する）。各測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１００倍に希釈した。７本ずつの各棒群の１本目は採血前であり、２本目は△１９週間であり、３本目は△２３週間であり、４本目は△２８週間であり、５本目は△３２週間であり、６本目は△３６週間であり、７本目は△４０週間である。
【０３２７】
ｍＴＮＦα上の他の表面露出部位も有意に免疫原性である。図１７Ａには、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのＷＴ  ｍＴＮＦα（各棒対の左側の棒）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα（対３、４及び５の右側の棒）、及びＰＢＳ（対１及び２の右側の棒）に対する血清力価を示す。図１７Ｂには、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのＷＴ  ｍＴＮＦα（各棒対の左側の棒）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１ｍＴＮＦα（対６、７及び８の右側の棒）、及びＰＢＳ（対１及び２の右側の棒）に対する血清力価を示す。図１７Ｃには、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのＷＴ  ｍＴＮＦα（各棒対の左側の棒）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα（対９、１０及び１１の右側の棒）、及びＰＢＳ（対１及び２の右側の棒）に対する血清力価を示す。図１７Ｄには、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９ｍＴＮＦα又はＷＴ  ｍＴＮＦαを免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのＷＴ  ｍＴＮＦα（各棒対の左側の棒）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９ｍＴＮＦα（対１２、１３及び１４の右側の棒）、及びＰＢＳ（対１及び２の右側の棒）に対する血清力価を示す。各免疫前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で８００倍（１７Ａ）、２００倍（１７Ｂ）、２００倍（１７Ｃ）、又は２００倍（１７Ｄ）に希釈した。
【０３２８】
その結果、１１位のｐＮＯ２ＰｈｅはｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα免疫原に対する応答と等価の高力価ＩｇＧ応答をＷＴ  ｍＴＮＦαに対して誘導した。これに対して、２１、４２、及び４９位の突然変異もｐＮＯ２Ｐｈｅ含有免疫原に対して高力価ＩｇＧ応答を生じたが、ＩｇＧ抗体はＷＴ  ｍＴＮＦαに対する交差反応性が中程度に止まった。
【０３２９】
図１８は各種ｐＮＯ２Ｐｈｅ  ｍＴＮＦα突然変異体を免疫したマウスではリポ多糖（ＬＰＳ）攻撃後に有意な生存率利得が存在することを示す。図１８Ａでは、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦαとｐＮＯ２Ｐｈｅ４９ｍＴＮＦαを免疫したマウスに由来する精製ＩｇＧ  ４ｍｇ／ｋｇをＬＰＳ攻撃の１日前に雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内注射した。図１８Ｂでは、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１ｍＴＮＦαとｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦαを免疫したマウスに由来する精製ＩｇＧ  ４ｍｇ／ｋｇをＬＰＳ攻撃の１日前にマウスに腹腔内投与した。これらのマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを、対照ＩｇＧを注射したマウスと比較した（ｎ＝８匹／群）。ボンフェローニ補正を加えた対数順位検定によると、各修飾ＴＮＦを免疫したマウスは対照に対してｐ＜０．０１で生存率優位性を示した。
【０３３０】
抗ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα  ＩｇＧを投与した全マウスは致死性ＬＰＳ攻撃に耐えた。中程度の交差反応性の抗ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１ｍＴＮＦα  ＩｇＧ、抗ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα  ＩｇＧ、及び抗ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９ｍＴＮＦα  ＩｇＧを投与した他の群も少なくとも７５％の生存率であったが、抗ＷＴ  ｍＴＮＦα  ＩｇＧを注射したマウスの生存率は１３％の生存率に止まった。従って、ｐＮＯ２Ｐｈｅを使用して自己寛容を解除する能力は単一のアミノ酸位置に依存しない。
【０３３１】
図１９は第２の自己抗原であるｍＲＢＰ４に対する寛容低下を示す実験の結果を示す。ＷＴ  ｍＲＢＰ４（１９Ａ）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４（１９Ｂ）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４（１９Ｃ）を免疫したＢｃｌ−２マウスの血清力価を示す。ＷＴ  ｍＲＢＰ４（１、２、３、７、８及び９の各棒；各棒対４、５及び６の左側の棒）及びｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４（各棒対４、５及び６の右側の棒）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１，０００倍に希釈した。図１９ＢはｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４を免疫し、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４の希釈系列でｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激したＣ５７ＢＬ／６マウスに由来するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示す結果を示す。
【０３３２】
図１９のＥＬＩＳＡ分析によると、ＷＴ  ｍＲＢＰ４又はｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４を免疫したマウスはＷＴ  ｍＲＢＰ４に対する血清ＩｇＧ力価が低かった。これに対して、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４を免疫したマウスは著しく高い血清ＩｇＧ力価（１：１００，０００まで）を示し、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４免疫原と野生型蛋白質の両方に結合することが判明した。
【０３３３】
図２０はＷＴ  ｍＴＮＦαがｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαにより誘導される寛容低下を持続できないことを示す。ＲＩＭＭＳプロトコールによりＷＴ  ｍＴＮＦα（２０Ａ）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（２０Ｂ）、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα後にＷＴ  ｍＴＮＦα（２０Ｃ）を免疫したＢｃｌ−２マウスの血清力価を示す。（２０Ｃ）では、ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαをＣＦＡに加えて１回初回注射した後に、ＷＴ  ｍＴＮＦαをＩＦＡに加えて７回注射することにより免疫した。ＥＬＩＳＡ測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１，０００倍に希釈した。ＷＴ  ｍＴＮＦα（各棒対の左側の棒）又はｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（各棒対の右側の棒）に対してＥＬＩＳＡを測定した。ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαとは対照的に、ＷＴ  ｍＴＮＦαは交差反応性抗ｍＴＮＦα抗体の高力価を持続できない。この結果はｐＮＯ２Ｐｈｅにより誘導される自己寛容解除にはニトロフェニル基に介在されるＴ細胞応答が必要であるという見解を裏付けるものである。
【０３３４】
図２１は３個のｍＴＮＦαフラグメントの質量分析の結果を示す。図２１ＡはＮ末端フラグメントｍＴＮＦα（ａａ１−６０；質量計算値７７７６．５１）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を示す。図２１Ｂは内部フラグメントｍＴＮＦα（ａａ６１−１００；質量計算値５５９７．３６）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を示す。図２１ＣはＣ末端フラグメントｍＴＮＦα（ａａ１０１−１５６；質量計算値７３８８．１８）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を示す。図２１の各パネルのピークから、各ＴＮＦαフラグメントは予想質量であることが確認される。
【０３３５】
抗ｍＴＮＦα  ｍＡｂと３個のｍＴＮＦαフラグメントの結合を調べるために実験を実施した。図２２では、ＷＴ  ｍＴＮＦα  ａａ１−１５６（４本ずつの各棒群の１本目）又はＷＴ  ｍＴＮＦα  ａａ１−６０（４本ずつの各棒群の２本目）、ＷＴ  ｍＴＮＦα  ａａ６１−１００（４本ずつの各棒群の３本目）、及びＷＴ  ｍＴＮＦα  ａａ１０１−１５６（４本ずつの各棒群の４本目）に対してＥＬＩＳＡを測定した。ｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαを免疫したマウスから抗ｍＴＮＦα  ＩｇＧを分泌する５０個のハイブリドーマを作製した。ｍＴＮＦαの３個のフラグメント、即ちＮ末端フラグメント（ａａ１−６０）、内部フラグメント（ａａ６１−１００）、及びＣ末端フラグメント（ａａ１０１−１５６）を大腸菌から発現・精製した。なお、ｐＮＯ２Ｐｈｅは元の免疫原では８６位（内部フラグメント）でコードされる。各フラグメントと対照としてＷＴ  ｍＴＮＦαを使用してＥＬＩＳＡ分析を実施した。フラグメントの１個と結合する抗体に印を付ける（四角，Ｎ末端フラグメント；星印，Ｃ末端フラグメント）。６個のｍＡｂのみが１個のフラグメントを明白に認識することが判明した。１個のｍＡｂ（６Ｇ７）は全３個を認識し、非特異的結合活性を示すようである。なお、５０個のｍＡｂのうちで突然変異体ＴＮＦαのｐＮＯ２Ｐｈｅを含有する領域である中間フラグメントに対応する直線状エピトープを認識するものは皆無である。
【０３３６】
図２３はｐＮＯ２ＰｈｅがｍＴＮＦαの表面露出部位に組込まれたか否かを判定するために実施した実験の結果を示す。図２３ＡはｍＴＮＦα三量体のＸ線結晶構造の模式図を示し、Ｌｙｓ１１、Ｇｌｎ２１、Ａｓｐ４２、Ｖａｌ４９、及びＴｙｒ８６を示す（ＰＤＢ  ＩＤコード２ＴＮＦ）３０。Ｂａｅｙｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｕｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔ  １．４  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｔｏｗａｒｄｓ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５５：７７２−８参照。図２３ＢはｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα（レーン１）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１９ｍＴＮＦα（レーン２）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１ｍＴＮＦα（レーン３）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα（レーン４）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９ｍＴＮＦα（レーン５）、及びＷＴ  ｍＴＮＦα（レーン６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す。蛋白質サンプルを非変性条件下でＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、クーマシーＧ−２５０染色を使用してＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。図２３ＣはＷＴ  ｍＴＮＦα（小さい四角）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ１１ｍＴＮＦα（三角形）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ２１ｍＴＮＦα（白菱形）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４２ｍＴＮＦα（黒菱形）、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４９ｍＴＮＦα（丸）、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦα（大きい四角）のＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性分析の結果を示す。従って、先に特性決定したｐＮＯ２Ｐｈｅ８６ｍＴＮＦαがこのアッセイで野生型蛋白質の僅か２％に過ぎないことに比較すると、全突然変異体は著しく活性である。
【０３３７】
図２４はｍＲＢＰ４の表面部位へのｐＮＯ２Ｐｈｅの部位特異的挿入を確認するために実施した実験の結果を示す。図２４ＡはヒトＲＢＰ４のＸ線結晶構造の模式図を示し、Ｔｙｒ４３とＴｙｒ１０８を示す（ＰＤＢ  ＩＤコード１ＲＢＰ）２１。Ｃｏｗａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｔｉｎｏｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔ  ２Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８：４４−６１参照。レチノール補因子を黄色で示す。図２４ＢはＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィー後のＷＴ  ｍＲＢＰ４、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４、及びｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、各突然変異体が三量化することを示す。図２４Ｃは１ｍＭ  ｐＮＯ２Ｐｈｅの不在下（レーン１）及び存在下（レーン２）におけるｍＲＢＰ４のＴｙｒ４３アンバー突然変異体と、１ｍＭ  ｐＮＯ２Ｐｈｅの不在下（レーン３）及び存在下（レーン４）におけるｍＲＢＰ４のＴｙｒ１０８アンバー突然変異体の発現を示す。これらの結果から、ｐＮＯ２ＰｈｅはｍＲＢＰ突然変異体に高い特異性で組込まれることが分かる。変性条件下でＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより蛋白質サンプルを精製し、クーマシーＧ−２５０染色を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。レーン５はＷＴ  ｍＲＢＰ４を含む。
【０３３８】
図２５において、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４とｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４のトリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳ分析はｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みのパターンと一致する。図２５Ａは１１量体フラグメントＦＳＧＬＷＸＡＩＡＫＫのタンデム質量スペクトルを示し、ここでＸはｐＮＯ２Ｐｈｅを表す。このフラグメントはｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４のトリプシン消化により作製した。図２５Ｂは１２量体フラグメントＭＫＸＷＧＶＡＳＦＬＱＲのタンデム質量スペクトルを示し、ここでＸはｐＮＯ２Ｐｈｅを表す。このフラグメントはｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４のトリプシン消化により作製した。ｐＮＯ２Ｐｈｅを含むペプチドオリゴマーの部分配列を注釈付きｂ又はｙイオン系列から読み取ることができる。
【０３３９】
図２６はＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４の免疫原性を判定するために実施した実験の結果を示す。図２６ＡはＷＴ  ｍＲＢＰ４を免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのＷＴ  ｍＲＢＰ４とｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４に対する血清力価を示す。図２６ＢはｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４を免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスのＷＴ  ｍＲＢＰ４とｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４に対する血清力価を示す。ＷＴ  ｍＲＢＰ４（１〜１０群の２本目と１本目の棒）又はｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４（６〜１０群の４本目と３本目の棒）に対してＥＬＩＳＡを測定した。測定前に、血清サンプルを１％  ＢＳＡのＰＢＳバッファー溶液で１００倍又は１，０００倍に希釈した。
【０３４０】
これらのＥＬＩＳＡ分析によると、ＷＴ  ｍＲＢＰ４又はｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４を免疫したマウスはＷＴ  ｍＲＢＰ４に対する血清ＩｇＧ力価が低かった。これに対して、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４を免疫したマウスは著しく高い血清ＩｇＧ力価（１：１００，０００まで）を示し、ｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４免疫原と野生型蛋白質の両方に結合することが判明した。
【０３４１】
図２７ＡはｐＮＯ２Ｐｈｅ４３ｍＲＢＰ４のｐＮＯ２Ｐｈｅ含有トリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳシーケンシングの結果を示す。ｐＮＯ２Ｐｈｅを含有するトリプシン処理フラグメントの配列を１文字コードで示す（Ｘ，ｐＮＯ２Ｐｈｅ）。ｙ及びｂ系列のフラグメントイオン実測値を示す。ｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みを証明する主要なｙ及びｂイオンを赤で示す。全質量はモノアイソトピック質量として報告する。図２７ＢはｐＮＯ２Ｐｈｅ１０８ｍＲＢＰ４のｐＮＯ２Ｐｈｅ含有トリプシン処理フラグメントのＭＳ／ＭＳシーケンシングの結果を示す。ｐＮＯ２Ｐｈｅを含有するトリプシン処理フラグメントの配列を１文字コードで示す（Ｘ，ｐＮＯ２Ｐｈｅ）。ｙ及びｂ系列のフラグメントイオン実測値を示す。ｐＮＯ２Ｐｈｅの組込みを証明する主要なｙ及びｂイオンはｂ９、ｂ１０、ｙ１０、ｙ９、ｙ８、ｙ７、及びｙ６である。全質量はモノアイソトピック質量として報告する。
【０３４２】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用する全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で本明細書に援用し、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で本明細書に援用すると個々に記載しているものとみなす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０３４３】
【特許文献１】米国仮特許出願第６１／０６５，１４８号
【特許文献２】米国仮特許出願第６１／０６５，５１５号
【特許文献３】米国仮特許出願第６１／１３５，９４７号
【特許文献４】米国仮特許出願第６１／１３７，６７６号
【特許文献５】米国仮特許出願第６１／２０３，９４８号
【特許文献６】米国仮特許出願第６１／０６５，１４７号
【特許文献７】米国仮特許出願第６１／０６５，５９０号
【特許文献８】米国仮特許出願第６１／１３５，９６９号
【特許文献９】米国仮特許出願第６１／１３７，６３５号
【特許文献１０】米国仮特許出願６１／２０３，９４７号
【特許文献１１】ＷＯ２００２／０８５９２３
【特許文献１２】ＷＯ２００４／０５８９４６
【特許文献１３】ＷＯ００／４６３４４
【特許文献１４】ＷＯ２００２／０８６０７５
【特許文献１５】ＷＯ２００４／０９４５９３
【特許文献１６】ＷＯ２００５／０１９４１５
【特許文献１７】ＷＯ２００５／００７８７０
【特許文献１８】ＷＯ２００５／００７６２４
【特許文献１９】ＷＯ２００６／１１０１８２
【特許文献２０】ＷＯ２００７／１０３４９０
【特許文献２１】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１８６８
【特許文献２２】ＷＯ２００７／０４７３０１
【特許文献２３】ＷＯ２００６／０３４３３２
【特許文献２４】米国特許第７，０４５，３３７号
【特許文献２５】米国特許第７，０８３，９７０号
【特許文献２６】米国特許第７，２３８，５１０号
【特許文献２７】米国特許第７，１２９，３３３号
【特許文献２８】米国特許第７，２６２，０４０号
【特許文献２９】米国特許第７，１８３，０８２号
【特許文献３０】米国特許第７，１９９，２２２号
【特許文献３１】米国特許第７，２１７，８０９号
【特許文献３２】米国特許第５，０９１，５１３号
【特許文献３３】米国特許第５，１３２，４０５号
【特許文献３４】米国特許第４，９５６，７７８号
【特許文献３５】米国特許第４，３４１，７６１号
【特許文献３６】米国特許第４，３９９，１２１号
【特許文献３７】米国特許第４，４２７，７８３号
【特許文献３８】米国特許第４，４４４，８８７号
【特許文献３９】米国特許第４，４５２，５７０号
【特許文献４０】米国特許第４，４６６，９１７号
【特許文献４１】米国特許第４，４７２，５００号
【特許文献４２】米国特許第４，４９１，６３２号
【特許文献４３】米国特許第４，４９３，８９０号
【特許文献４４】ＷＯ９１／０４０１４
【非特許文献】
【０３４４】
【非特許文献１】Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．Ｃ．Ｊ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｈａｍ，Ｄ．Ａ．Ｊｒ．，Ｅｄｓ．（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００６），ｐｐ．２３５−２５５
【非特許文献２】Ｍａｋｅｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１（３）：３９９−４１０（２００２）
【非特許文献３】Ｄａｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：６６６−６６９（１９９９）
【非特許文献４】Ｚｕａｎｙ−Ａｍｏｒｉｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｕｔｏ  Ｖａｃ  ＴＮＦ１０６：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：１５４−１６３
【非特許文献５】Ｂｅｒｄ，Ｄ．（２００４）“Ｍ−Ｖａｘ：ａｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ，ｈａｐｔｅｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ３：５２１−５２７
【非特許文献６】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１：７５６６（２００４）
【非特許文献７】Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｖｉｌｃｅｋ，Ｊ．，Ｅｄ．，Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２），１−５８７頁
【非特許文献８】Ｃａｐｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：３１４４（２００４）
【非特許文献９】“Ｔｕｍｏｒ−Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ｂｙ  Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，”Ｂｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２：３３７−３６５，１９９４
【非特許文献１０】“Ａ  ｌｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，”Ｒｅｎｋｖｉｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ５０：（１）３−１５  ＭＡＲ  ２００１
【非特許文献１１】Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２３９−２４４
【非特許文献１２】Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ３５：２２５−２４９
【非特許文献１３】Ｘｉｅ  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００６）“Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ”Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：７７５−７８２
【非特許文献１４】Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）“Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−９６７
【非特許文献１５】Ｖ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５，３４：６２１（１９９５）
【非特許文献１６】Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，“Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４  １８２−１８８（１９８９）
【非特許文献１７】Ｊ．Ｄ．Ｂａｉｎ，Ｃ．Ｇ．Ｇｌａｂｅ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ，Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ，“Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１  ８０１３−８０１４（１９８９）
【非特許文献１８】Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献１９】Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）
【非特許文献２０】Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）
【非特許文献２１】ＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）
【非特許文献２２】Ｍａｔｓｏｕｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９
【非特許文献２３】Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｄｄ，（１９４９）“Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９
【非特許文献２４】Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ（１９５９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２
【非特許文献２５】Ｃｒａｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）“Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ），”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０
【非特許文献２６】Ａｚｏｕｌａｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５
【非特許文献２７】Ｋｏｓｋｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ（１９８９）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６
【非特許文献２８】Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ（１９８５）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６
【非特許文献２９】Ｂａｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−ａ−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８
【非特許文献３０】Ｓｕｂａｓｉｎｇｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）“Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７
【非特許文献３１】Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ（１９９９）“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ”，ＰＮＡＳ  ９６：４７８０−４７８５
【非特許文献３２】Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）“Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１
【非特許文献３３】Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１
【非特許文献３４】Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１
【非特許文献３５】Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）“Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１２０５
【非特許文献３６】Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７
【非特許文献３７】Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９），“Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４
【非特許文献３８】Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１５４８−１５５２
【非特許文献３９】Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９７−３００
【非特許文献４０】Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６
【非特許文献４１】Ｐａｔｎａｉｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｃｉｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７−７１２
【非特許文献４２】Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒａｐｉｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ７，４１５（６８７２）：６４４−６４６
【非特許文献４３】Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（２００３）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３  ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９
【非特許文献４４】Ｂｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｉｇｏ”Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：１２７−１３３
【非特許文献４５】Ｂａｎｔａ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０），６２２６−３６
【非特許文献４６】Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｒａｐｉｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５
【非特許文献４７】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４４：３４−６６
【非特許文献４８】Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２２７−２３８
【非特許文献４９】Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）“Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：５４８−５５４
【非特許文献５０】Ｄｅｉｔｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｋｙｎｅ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：１５２１−１５２４
【非特許文献５１】Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）“Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ−Ａｚｉｄｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２４：９０２６−９０２７
【非特許文献５２】Ｆｏｒｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）“Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００：６３５３−６３５７
【非特許文献５３】Ｆｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００：５６７６−５６８１
【非特許文献５４】Ｈｏｂｅｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｌ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １１３：５５−５９
【非特許文献５５】Ｓａｙｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）“５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １６：７９１−８０２
【非特許文献５６】Ｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔＲＮＡＡｌａ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｃｏｄｏｎｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：７９３９−７９４５
【非特許文献５７】Ｋｏｗａｌ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ，（１９９７）“Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  ｆｏｒ  ｔＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２５：４６８５−４６８９
【非特許文献５８】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：２３７−２４４
【非特許文献５９】Ｍａｇｌｉｅｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  “Ｓｈｉｆｔｙ”  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０７：７５５−７６９
【非特許文献６０】Ｈｏｈｓａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｌａｒｇｅ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎｔｏ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｉｎ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２１：３４−４０
【非特許文献６１】Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）“Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ  Ｃｏｄｏｎｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｄｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｔｅｐ  Ｓｉｚｅ”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９８：１９５−２０９
【非特許文献６２】Ｈｉｒａｏ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）“Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：１７７−１８２
【非特許文献６３】Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ”Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２４：１４６２６−１４６３０
【非特許文献６４】Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：９２３（２０００）
【非特許文献６５】Ｍｉｎｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８４：２９（２０００）
【非特許文献６６】Ｄｕｅｗｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：３４０４（１９９７）
【非特許文献６７】Ｔａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４０：１４９４（２００１）
【非特許文献６８】Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９：１６６５（１９９０）
【非特許文献６９】Ｂｏｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２８３（１９９４）
【非特許文献７０】Ｂｕｄｉｓａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３０：７８８（１９９５）
【非特許文献７１】Ｂｕｄｉｓａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０：６１６（１９９７）
【非特許文献７２】ｖａｎ  Ｈｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２８：６８（１９９８）
【非特許文献７３】ｖａｎ  Ｈｅｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１２８２（２０００）
【非特許文献７４】Ｋｉｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５６：９４８７（２０００）
【非特許文献７５】Ｄｏｒｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：５０１（２００１）
【非特許文献７６】Ｃｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１２２７−１２３２（１９６１）
【非特許文献７７】Ｈｏｆｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ，５９１４−５９１９（１９６６）
【非特許文献７８】Ｋａｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ，４７−５４（１９８９）
【非特許文献７９】Ｎａｋａｔｓｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，３８０８−３８１０（１９８７）
【非特許文献８０】Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１−２２５（１９９２）
【非特許文献８１】Ｃｈａｉｋｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２５５−３０１（１９８１）
【非特許文献８２】Ｏｆｆｏｒｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１５１−１５７（１９８７）
【非特許文献８３】Ｊａｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３（１９９４）
【非特許文献８４】Ｃｏｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４０１−１４０３（１９８７）
【非特許文献８５】Ｋａｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５６５−５９５（１９８５）
【非特許文献８６】Ｋａｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，５０５−５１１（１９８４）
【非特許文献８７】Ｎｅｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，６３９２−６４０１（１９６８）
【非特許文献８８】Ｐｏｌｇａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，３１５３−３１５４（１９６６）
【非特許文献８９】Ｐｏｌｌａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０３８−１０４０（１９８８）
【非特許文献９０】Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，４８３−５１４（１９９３）
【非特許文献９１】Ｋｒｉｅｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８６０４−８６０８（１９８６）
【非特許文献９２】Ｎｏｗａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：４３９−４２（１９９５）
【非特許文献９３】Ｂｕｄｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１３：４１−５１（１９９９）
【非特許文献９４】Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．，３０１−３３６（１９９２）
【非特許文献９５】Ｍｅｎｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．，２４，４３５−６２（１９９５）
【非特許文献９６】Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５（２０００）
【非特許文献９７】Ｔｕｒｃａｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９９９１（１９９６）
【非特許文献９８】Ｇａｌｌｉｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：７３９（１９９７）
【非特許文献９９】Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２０：６１９（１９９８）
【非特許文献１００】Ｅｎｇｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９６：８９（１９９９）
【非特許文献１０１】Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２３９（２００１）
【非特許文献１０２】Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ．”ＪＡＣＳ  ８５：２１４９−２１５４
【非特許文献１０３】Ｃａｒｐｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９７２）“９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ａｍｉｎｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ．”Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ３７：３４０４−３４０９
【非特許文献１０４】Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９
【非特許文献１０５】Ｈｏｗｌ，ｅｄ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔｏｗａ  ＮＪ，２００５
【非特許文献１０６】Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ
【非特許文献１０７】Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｃｅｓｋｅ（ｅｄ）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１０８】Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｒａｌｐｈ  Ｒａｐｌｅｙ（ｅｄ）（２０００）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ（Ｒａｐｌｅｙ）
【非特許文献１０９】Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  １９２）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１１０】Ｖｉｌｊｏｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＰＣＲ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＩＳＢＮ  １４０２０３４０３２
【非特許文献１１１】Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）
【非特許文献１１２】Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）
【非特許文献１１３】Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．
【非特許文献１１４】Ｂｏｌｌａｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ
【非特許文献１１５】Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ
【非特許文献１１６】Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ
【非特許文献１１７】Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ
【非特許文献１１８】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ
【非特許文献１１９】Ｗａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ＣＤ−ＲＯＭ版  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ
【非特許文献１２０】Ｓａｔｉｎｄｅｒ  Ａｈｕｊａ  ｅｄ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）
【非特許文献１２１】Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）
【非特許文献１２２】Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：５８７９−５８８３
【非特許文献１２３】Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８０）
【非特許文献１２４】Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９８１）
【非特許文献１２５】Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９８０）
【非特許文献１２６】Ｖｅｒｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）“Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７：１８６９−１８８０
【非特許文献１２７】Ａｃｋｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ８：２５５３−６８
【非特許文献１２８】Ｋｎｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＴＮＦ  ａｎｔｉｂｏｄｙ”Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：１４４３−１４５３
【非特許文献１２９】Ｐｒｅｓｅｎｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｉｓｔｕｌａｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ”Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４０：１３９８−１４０５
【非特許文献１３０】Ｐｅｐｐｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）“Ａ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ＴＮＦ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７４：１４８３−１４８９
【非特許文献１３１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）“Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ＩｇＧ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＤ４”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８４：４３３−４３９
【非特許文献１３２】Ｈｏｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  Ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”Ｄｒｕｇｓ  ６７：２６０９−２６３３
【非特許文献１３３】Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｅｐｔｉｃ  Ｓｈｏｃｋ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｆｃ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ”Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３４：１６９７−１７０２
【非特許文献１３４】Ｋｏｒｚｅｎｉｋ（２００４）“Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｆｕｔｕｒｅ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｂｅｙｏｎｄ  ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ”Ｇａｓｔｒｏ  Ｃｌｉｎ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ３３：２８５−３０１
【非特許文献１３５】Ｅ．Ｋｅｉｎａｎ，Ｅｄ．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００５）ｐｐ．１−２８
【非特許文献１３６】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）
【非特許文献１３７】Ｅｐｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８２：３６８８−９２
【非特許文献１３８】Ｈｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，７７：４０３０−３４
【非特許文献１３９】Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．（１９８５）
【非特許文献１４０】Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄａｔａ，ＣＲＣ，１９９９
【非特許文献１４１】Ｎｇ，Ｃｈｏｗ，ａｎｄ  Ｏｇｄｅｎ，ｅｄｓ．Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ａ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ．Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ：Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２００８
【非特許文献１４２】Ｃｏｎｎ，ｅｄ．Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００８
【非特許文献１４３】Ｗｏｏｄｈｅａｄ，ｅｄ．Ｎｏｎｍａｍｍａｌｉａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｖｏｌ  １）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０
【非特許文献１４４】Ａｄａｍｓ，ｅｄ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳＡ：Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２００１
【非特許文献１４５】Ｋａｈｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｅ，Ｅｄｓ．Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳＡ：Ｍｅｒｃｋ，２００５
【非特許文献１４６】Ｂａｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｔｉｌｅｓ，Ａｍｐｈｉｂｉａｎｓ，Ｆｉｓｈ，ａｎｄ  Ｃｅｐｈａｌｏｐｏｄｓ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．”Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ
【非特許文献１４７】Ｒｅｓｔｉｆｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｅｌｉｃｉｔ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，８：６５８−６６３
【非特許文献１４８】Ｍａｍｕｌａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｒｅａｋｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ  ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ．Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４９：７８９−７９５
【非特許文献１４９】Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００
【非特許文献１５０】Ｔｓａｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｂｅ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２８：４５７２−４５７３
【非特許文献１５１】Ｖａｓｓａｌｌｉ（１９９２）“Ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒｓ．”Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：４１１−４５２
【非特許文献１５２】Ｂａｅｙｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｕｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔ  １．４  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：ｔｏｗａｒｄｓ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５５：７７２−７７８
【非特許文献１５３】Ｐｅｎｎｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：６０６０−６０６４
【非特許文献１５４】Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ＴＮＦ  ａｌｐｈａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ：ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＴＮＦ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ，ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒｓ，ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：１３９７−１４１１
【非特許文献１５５】Ｓｐｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ａ  Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＴＮＦα  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｔｅｎｔ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：７４５０−７４５７
【非特許文献１５６】Ｌｅ  Ｂｕａｎｅｃ，ｅｔ  ａｌ．“ＴＮＦα  ｋｉｎｏｉｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ＴＮＦα  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＴＮＦα−ｄｒｉｖｅｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１９４４２−１９４４７
【非特許文献１５７】Ｂａｅｙｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）“Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．”Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５３：３２９−３３０
【非特許文献１５８】Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒｓ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：５−２２
【非特許文献１５９】Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ（ＴＮＦ  ａｌｐｈａ）ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ５５−ｋＤａ  ｏｒ  ７５−ｋＤａ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２６３５０−７
【非特許文献１６０】Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：２４０６９−７５
【非特許文献１６１】Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）“Ｉｎ−ｇｅｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｏｎｅ−  ｏｒ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．”Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０３：１７３−１７９
【非特許文献１６２】Ｈｅｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ‘Ｉｎ−Ｇｅｌ’ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．”Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２４：４５１−４５５
【非特許文献１６３】Ｙｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）“ＥＲ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｂｏｕｎｄ  ＡＴＦ６  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｔｈａｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ＳＲＥＢＰｓ”Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：１３５５−１３６４
【非特許文献１６４】Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）“Ｒａｐｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＩＭＭＳ”Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３８１−３８９
【非特許文献１６５】Ｌｉｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｄｉｓｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １２  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｅｔｈａｌ  ｓｈｏｃｋ”Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５５：２８４−２８９
【非特許文献１６６】Ｓｔｅｅｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）“Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＮＦ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＴＮＦ  Ｖａｒｉａｎｔｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１８９５−１８９８
【非特許文献１６７】Ｆ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ＰＡＲ−Ｓ１Ｐ３  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．”Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：６５４−６５８
【非特許文献１６８】Ｄｉｔｚｅｌ（２００４）“Ｔｈｅ  Ｋ／ＢｘＮ  ｍｏｕｓｅ：Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １０：４０−４５
【非特許文献１６９】Ｌｅｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９６８）“Ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｕｒｉｎｅ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １００：１２７７−１２８７
【非特許文献１７０】Ｗｅｉｇｌｅ（１９６５）“Ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎａｌｔｅｒｅｄ  ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎｔｏ  ｒａｂｂｉｔｓ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １２２：１０４９−１０６２
【非特許文献１７１】Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．（２００３）“Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：２６９−２７７
【非特許文献１７２】Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：１１２７６−１１２８０
【非特許文献１７３】Ｇｏｏｄｎｏｗ（２００７）“Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｃｅｌｌ  １３０：２５−３５
【非特許文献１７４】Ｗｅｉｇｌｅ，Ｗ．Ｏ．（１９６５）“Ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｏｒ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １２１：２８９−３０８
【非特許文献１７５】Ｌｅｉｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）“Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｔｈｗａｙｓ”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：３３−３９
【非特許文献１７６】Ｈｉｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｒｅｃｅｎｔ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３：４８３８−４８５１
【非特許文献１７７】Ｓｍａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｐｌａｃｅｂｏ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（ＡＰＣ８０１５）  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ，ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：３０８９−３０９４
【非特許文献１７８】Ｓｃｈｌｏｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ”Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  １４：２３８−２４５
【非特許文献１７９】Ａｕｌａｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｎｉｔｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８：１２０５６−１２０６１
【非特許文献１８０】Ｐａｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８７：３１５−４２４
【非特許文献１８１】Ｈａｒｄｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎａｌｏｇ  ３’−ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｔ  ｅｉｔｈｅｒ  ＴＣＲ−  ｏｒ  ＭＨＣ−ｃｏｎｔａｃｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｃａｎ  ｐｒｏｆｏｕｎｄｌｙ  ａｆｆｅｃｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ３３  ｂｙ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８０：５９５６−５９６２
【非特許文献１８２】Ｚａｎｏｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）“Ｐｌａｓｍａ  ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｔｉｎｏｌ，ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ．”  Ｖｉｔａｍ  Ｈｏｒｍ  ６９：２７１−２９５
【非特許文献１８３】Ｒａｇｈｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇｓｔ  ｐｌａｓｍａ  ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｌｉｇａｎｄｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．”Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７０３：１−９
【非特許文献１８４】Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｖｉｓｉｏｎ．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１５３６０−１５３６８
【非特許文献１８５】Ｃｏｗａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）“Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｔｉｎｏｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔ  ２Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８：４４−６１
【非特許文献１８６】Ｇｒｅｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｔｉｎｏｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １０：２３０１−２３１６
【非特許文献１８７】Ｃａｎｔａｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｃｒｕｃｉａｌ．．．ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ！”Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５４：３３８１−３３８９
【非特許文献１８８】Ｂａｃｋｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｅｐｉｔｏｐｅ  （２６３−２７０）  ｉｎ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９：９９６０−９９６５
【非特許文献１８９】Ｄｚｈａｍｂａｚｏｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）“Ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｓ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｂｕｔ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：３５７−３６６
【非特許文献１９０】Ｋｌａｒｅｓｋｏｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６：６５１−６７５；Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．（２０００）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：５３−８１
【非特許文献１９１】Ｔｏｅｗｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）“Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｗｈｅｔｈｅｒ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｒ  ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｆｏｌｌｏｗｓ  ｓｋｉｎ  ｐａｉｎｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＤＮＦＢ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２４：４４５−４５３
【非特許文献１９２】Ｋｌｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｏ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｅｆｆｏｒｔｓ．”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７１：９８２−９９４
【図１】
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【図１−Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−Ａ】
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【図１６−Ｂ】
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【図１６−Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２１−Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−Ａ】
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【図２５−Ｂ】
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【図２６】
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【図２７−Ａ】
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【図２７−Ｂ】
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【国際調査報告】
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2011514322.tif 000053
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