(57)【要約】  本発明は、一般には、異種置換遺伝子配列を宿主胚性幹細胞に導入して内在性宿主遺伝子標的配列と置換するための方法に関する。詳細には、本発明は、先ず、内在性宿主遺伝子標的配列を欠失させ、次に、２種の近くに配置された部位特異的リコンビナーゼ標的（ＲＴ）部位を用いて異種置換遺伝子配列を宿主染色体に挿入することによって、大きいＤＮＡ断片を胚性幹細胞に効率良く挿入するための方法に関する。
2011515098.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種置換遺伝子配列を宿主細胞に導入して内在性宿主遺伝子標的配列と置換する方法であって、
ａ）一対の同一のＩ型部位特異的リコンビナーゼ標的（ＲＴ）部位を別々の相同組換え段階によって宿主染色体の同一対立遺伝子に組み込み、置換対象の内在性宿主遺伝子標的配列が各々の端で前記同一のＩ型ＲＴ部位に隣接するようにすることと、
ここにおいて、同一のＩ型ＲＴ部位の一方は該Ｉ型ＲＴ部位の近くに配置されるＩＩ型ＲＴ部位に隣接し、ＩＩ型ＲＴ部位はＩ型ＲＴ部位とは違って異種特異的であって、Ｉ型ＲＴ部位とは相互作用できないようになっており、
ｂ）内在性宿主遺伝子標的配列が除去されるように前記一対のＩ型部位特異的組換え部位間で組換えを行って、残存Ｉ型ＲＴ部位を染色体内の除去位置に残すことと、
ｃ）異種置換遺伝子配列を宿主染色体に接触させて異種置換遺伝子配列が一端でＩ型ＲＴ部位に隣接すると共に、他端でＩＩ型ＲＴ部位に隣接するようにし、適切な条件下、異種置換遺伝子配列に隣接し、宿主染色体内に配置された対応するＩ型及びＩＩ型部位特異的組換え部位間で組換えを行うことによって異種置換遺伝子配列の宿主染色体への標的部位特異的リコンビナーゼ介在挿入を行い、宿主標的遺伝子が先に占めていた宿主染色体内の位置において異種遺伝子配列が導入されるようにすること
とを含む方法。
【請求項２】
段階ａ）において前記宿主染色体に組み込まれた前記Ｉ型ＲＴ部位の各々は一以上の選択可能マーカーと連続するように構築されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一以上の選択可能マーカーは前記マウス標的配列と前記Ｉ型ＲＴ部位との間にあるように配置される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
異種置換遺伝子配列は一以上の選択可能マーカーと連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記一以上の選択可能マーカーは、前記Ｉ型ＲＴ部位と前記異種置換遺伝子配列との間、及び／又は前記ＩＩ型ＲＴ部位と前記異種置換遺伝子配列との間に配置される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記異種置換遺伝子配列のどちらか一方の端に少なくとも１種の選択可能マーカーが配置される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記選択可能マーカーは、ネオマイシン発現カセット、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びプロモーターを持たないＡＴＧ欠損ネオマイシンカセット（５’ΔＮｅｏ）から選択される、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記選択可能マーカーの少なくとも１種はＡＴＧ欠損ネオマイシンカセット（５’ΔＮｅｏ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｉ型ＲＴ部位間の組換え後に内在性宿主遺伝子標的配列プロモーターとＡＴＧが宿主染色体内に残り、ベクターの挿入時に前記５’ΔＮｅｏが前記プロモーターとＡＴＧに作用的に連結するようになってネオマイシン耐性が発現するようになる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
宿主染色体に組み込んだ前記ＩＩ型ＲＴ部位はＩＩＩ型ＲＴ部位に隣接し、前記ＩＩ型ＲＴ部位が前記Ｉ型ＲＴ部位と前記ＩＩＩ型ＲＴ部位との間に配置されるようになると共に、宿主染色体内に存在してＩＩ型ＲＴ部位の近くに隣接しない前記Ｉ型ＲＴ部位はＩＶ型ＲＴ部位に隣接し、Ｉ型ＲＴ部位が内在性宿主遺伝子標的配列とＩＶ型ＲＴ部位との間に配置されるようになる、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＶ型ＲＴ部位は前記Ｉ型ＲＴ部位と前記異種置換遺伝子配列との間に配置され、ＩＩＩ型ＲＴ部位は前記ＩＩ型ＲＴ部位と前記異種置換遺伝子配列との間に配置されるように、前記ベクターは前記ＩＩＩ型ＲＴ部位と前記ＩＶ型ＲＴ部位を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ベクター上及び宿主染色体内に配置された対応するＩ型ＲＴ部位とＩＩ型ＲＴ部位との間で組換えを行い、宿主染色体への異種置換遺伝子配列のリコンビナーゼ介在挿入を行うことによって、前記異種置換遺伝子配列の一端に存在する前記一以上の選択マーカーと２個のＩＩＩ型ＲＴ部位間の残存Ｉ型ＲＴ部位の位置が定まると共に、前記異種置換遺伝子配列の他端に存在する前記一以上の選択マーカーと２個のＩＶ型ＲＴ部位間の残存ＩＩ型ＲＴ部位の位置が定まる、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記２個のＩＩＩ型ＲＴ部位間及び前記２個のＩＶ型ＲＴ部位間で組換えを行うことによって、前記異種置換遺伝子配列の各々の端で前記一以上の選択可能マーカーと前記残存Ｉ型ＲＴ部位又はＩＩ型ＲＴ部位が除去されて、残存ＩＩＩ型ＲＴ部位と残存ＩＶ型ＲＴ部位が染色体内の除去位置に残る、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｉ型ＲＴ部位、前記ＩＩ型ＲＴ部位、前記ＩＩＩ型ＲＴ部位及び前記ＩＶ型ＲＴ部位はいずれも同じではなく、各型のＲＴ部位は他の型のＲＴ部位の各々に対して異種特異的であって、ＲＴ部位のいずれも型の異なる他のＲＴ部位とは相互作用できないようになっている、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
部位特異的組換え部位は、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１７１、Ｆ３及びＦＲＴから選択される、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｉ型ＲＴ部位はｌｏｘＰである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＩＩ型ＲＴ部位はｌｏｘ５１７１である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＩＩＩ型ＲＴ部位はＦＲＴである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＩＶ型ＲＴ部位はＦ３である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記異種置換遺伝子配列はベクター上に配置されている、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ベクターはクローニングベクター、ＢＡＣ及びＹＡＣから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えはインビボで行う、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
組換えは、発現プラスミドからの対応する部位特異的リコンビナーゼの発現によって行う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
宿主細胞は胚性幹細胞等の幹細胞である、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記胚性幹細胞は哺乳動物胚性幹細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記胚性幹細胞は続いて胚盤胞に挿入される、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記胚盤胞は偽妊娠哺乳動物に移植される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記偽妊娠哺乳動物は偽妊娠マウスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組換え段階はインビトロで行う、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記異種置換遺伝子配列は哺乳動物遺伝子配列である、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物置換遺伝子配列はヒト置換遺伝子配列である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
先の請求項のいずれか１項に記載の方法によって着目遺伝子に関してヒト化されたトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３４】
トランスジェニックマウスである、請求項３３に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、異種置換遺伝子配列を宿主胚性幹細胞に導入して内在性宿主遺伝子標的配列と置換するための方法に関する。より詳細には、本発明は、先ず、内在性宿主遺伝子標的配列を欠失させ、次に、２種の近くに配置された部位特異的リコンビナーゼ標的（ＲＴ）部位を用いて異種置換遺伝子配列を宿主染色体に挿入することによって、大きいＤＮＡ断片を胚性幹細胞に効率良く挿入するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
長年に亘り、細胞内の内在性遺伝子配列を異種置換遺伝子配列で置換することが注目されている。特に、この技術はヒト化マウスモデルの作出に用いられている。マウスモデルはヒト疾患を調べるための非常に有益なツールであり、多くの疾患の進行の研究や、潜在的な治療法の試験、薬物候補の前臨床研究、毒物学の検討に広く用いられている。従来、トランスジェニックマウスは外因性ＤＮＡの前核注入によって作出されている。つい最近では、例えば、ＷＯ９４／０２６０２に記載のように、対象となる外因性遺伝子及び選択可能マーカーを含有するバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む細胞と胚性幹細胞を融合させてマウスを作出し、外因性ＤＮＡセグメントの胚細胞ゲノムへの組込みについて評価している。このような方法は、相同組換えプロセスによるＢＡＣ又はＹＡＣの胚性幹細胞ゲノムへの組込みに依存する。この方法による遺伝子組換えは、ＢＡＣやＹＡＣの取扱いに関与する技術的要求や、大きなＤＮＡ構築物を用いる際のＥＳ細胞の低トランスフェクション率のため、時間が掛かり、非効率的で不正確である。
【０００３】
ＵＳ２００７／００６１９００には、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン可変領域遺伝子座に関してヒト化するための方法が記載されている。この方法は、ヒト免疫グロブリン可変領域の一部に連続するように配置された部位特異的組換え部位を２種類のベクター（ＬＴＶＥＣと称する）の各々に挿入することを伴う。その後、これらのＬＴＶＥＣを直線化し、相同組換えによってマウス細胞のゲノムに導入し、部位特異的組換え部位がマウス免疫グロブリン可変領域配列に隣接するようにし、また、部分ヒト免疫グロブリン可変領域配列が部位特異的組換え部位に隣接するようにする。部位特異的組換えを行うことによって、マウス免疫グロブリン可変領域配列が除去され、その内部に含まれる残存部位特異的組換え部位が２個の部分ヒト免疫グロブリン可変領域配列と連結する。得られたマウスは、ヒト可変領域とマウス定常領域を含有するハイブリッド抗体を産生するが、純粋なヒト抗体を産生させるにはその後に形質転換段階が必要である。しかし、このアプローチは、非常に大きい異種ＤＮＡ配列を有するベクターを用いた相同組換えの頻度が低いため非効率的である。また、免疫グロブリン可変領域の分節性によって、不都合な作用を殆ど生じさせることなく、残存部位特異的組換え部位を核酸配列内に残すことができる。非分節遺伝子内に残存部位特異的組換え部位をコードする核酸配列が存在することによってその転写能力が低下し得る場合には、該遺伝子のヒト化に対してこの種の技術を用い得ることは示されていない。
【０００４】
Wallaceら（Cell 128, 197-209 2007）は最近、リコンビナーゼ介在ゲノム置換（ＲＭＧＲ）（即ち、内在性遺伝子配列を異種置換物と交換するためのより一般に適用可能なシステム）として知られる方法について記載している。この方法では、部位特異的組換えも用いてマウス対立遺伝子をオルソロガス遺伝子のヒト対立遺伝子で置換する。相同組換えによって、２種の非相互作用部位特異的組換え部位（ｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１１）を標的遺伝子に隣接するマウス染色体に挿入する。非相互作用部位特異的組換え部位の同一対をＢＡＣに挿入し、標的遺伝子のヒト対立遺伝子に隣接するようにする。マウス細胞にＢＡＣを導入した後、部位特異的リコンビナーゼを発現させることによって、ＢＡＣとマウス染色体の適合性部位特異的組換え部位間（ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１１／ｌｏｘ５１１）で２種の部位特異的組換え反応が生じ、ヒト遺伝子配列とマウス配列の相互交換が生じる。
【０００５】
しかし、マウス染色体上及びＢＡＣ内に存在する非相互作用部位特異的組換え部位間の距離が大きいため、この方法は大きいＤＮＡ断片の挿入には非効率的である。組換え時にマウス染色体内にマウス対立遺伝子が存在することや組換え交換の相互特性のため、この距離は不可避である。また、このようなクローンのより詳細な解析から、その一部はＢＡＣのＤＮＡ内で再編成し、その結果、正しく標的化されたクローンの頻度が更に低下することが分かる。これに加えて、Wallaceらは、正しく標的化されたクローンを選択するため、５’−３’成分由来の機能性ヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈｐｒｔ）ミニ遺伝子の再構成を用いている。従って、このアプローチはＨＰＲＴ欠損（ｈｐｒｔ-）胚性幹細胞株においてのみ可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、上述の非効率に関する問題を克服するであろう、細胞内の内在性遺伝子配列を異種置換遺伝子配列で置換するためのより効率的な方法は依然として必要である。
【０００７】
また、本発明は、正しく標的化されたクローンを選択するためのより一般に適用可能な方法を提供することを意図する。このようなクローンを選択する一般的な改良方法を提供することによって、ＨＰＲＴ欠損（ｈｐｒｔ-）胚性幹細胞株以外の細胞においても組換え交換を行うことが可能となるであろう。一般的な選択方法によって、このような手続きが如何なる胚性幹細胞においても実行可能となるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明によると、異種置換遺伝子配列を宿主細胞に導入して内在性宿主遺伝子標的配列と置換する方法であって、
ａ）一対の同一のＩ型部位特異的リコンビナーゼ標的（ＲＴ）部位を別々の相同組換え段階によって宿主染色体の同一対立遺伝子に組み込み、置換対象の内在性宿主遺伝子標的配列が各々の端で前記同一のＩ型ＲＴ部位に隣接するようにすることと、
ここにおいて、同一のＩ型ＲＴ部位の一方は該Ｉ型ＲＴ部位の近くに配置されるＩＩ型ＲＴ部位に隣接し、ＩＩ型ＲＴ部位はＩ型ＲＴ部位とは違って異種特異的であって、Ｉ型ＲＴ部位とは相互作用できないようになっており、
ｂ）内在性宿主遺伝子標的配列が除去されるように前記一対のＩ型部位特異的組換え部位間で組換えを行って、残存Ｉ型ＲＴ部位を染色体内の除去位置に残すことと、
ｃ）異種置換遺伝子配列を宿主染色体に接触させて異種置換遺伝子配列が一端でＩ型ＲＴ部位に隣接すると共に、他端でＩＩ型ＲＴ部位に隣接するようにし、適切な条件下、異種置換遺伝子配列に隣接し、宿主染色体内に配置された対応するＩ型及びＩＩ型部位特異的組換え部位間で組換えを行うことによって異種置換遺伝子配列の宿主染色体への標的部位特異的リコンビナーゼ介在挿入を行い、宿主標的遺伝子が先に占めていた宿主染色体内の位置において異種遺伝子配列が導入されるようにすること
とを含む方法が提供される。
【０００９】
本発明のメカニズムの概要を簡単に図１に示す。即ち、２種の別個の従来の相同組換え反応によって、宿主細胞の内在性宿主細胞染色体に２個のＩ型ＲＴ部位を組込む。相同組換えは本技術分野ではよく知られた現象であるが、理解を容易とするため、相同組換えのメカニズムの概略を図２に示す。２種の組換え反応は、内在性宿主細胞染色体とＩ型ＲＴ部位を含む置換核酸配列との間の短い相同領域によって促進される。これらの相同領域によって鎖侵入とその後の塩基対形成が促進され、鎖伸長によって各組換え部位が宿主細胞染色体に挿入される。
【００１０】
内在性宿主遺伝子標的配列の両端に挿入されるＩ型ＲＴ部位に加えて、内在性宿主遺伝子標的配列の一端においては、ＩＩ型ＲＴ部位も内在性宿主細胞染色体に組み込まれ、Ｉ型ＲＴ部位の近くに隣接する。内在性宿主細胞染色体に２個のＩ型ＲＴ部位と１個のＩＩ型ＲＴ部位を挿入することによって、図１に示す構成が得られる。両方の組換え反応が一旦終了すると、Ｉ型ＲＴ部位は内在性宿主遺伝子標的配列に隣接するが、Ｉ型ＲＴ部位の一方は更にＩＩ型ＲＴ部位に隣接し、このＩ型ＲＴ部位はＩＩ型ＲＴ部位と内在性宿主遺伝子標的配列との間に配置されるようになる。図１に示すように、両方のＩ型ＲＴ部位を同じ方向に整列させ、その組換えがやがて一緒になるようにする必要がある。部位特異的リコンビナーゼを用いて特定の染色体位置を相同組換えの標的にできることが本技術分野で知られている（Jessenら、1997参照）。このような部位特異的リコンビナーゼを用いる場合、必要に応じて、該部位特異的リコンビナーゼを添加して組換えを開始させることができる。
【００１１】
内在性宿主遺伝子標的配列を除去するため、宿主細胞内の２個のＩ型ＲＴ部位間で部位特異的組換えを行うことができる。理解を容易にするため、部位特異的組換えのメカニズムを図３に示す。これらの組換えイベントによって、内在性宿主遺伝子標的配列が除去され、残存Ｉ型ＲＴ部位は宿主細胞染色体内のＩＩ型ＲＴ部位の近くに配置されるようになる。この中間段階は、内在性遺伝子がノックアウトされた宿主細胞（ノックアウトＥＳ細胞）の作出を示す。
【００１２】
本発明の方法の次の段階は異種置換遺伝子配列を提供することである。異種置換遺伝子配列は隣接Ｉ型ＲＴ部位と隣接ＩＩ型ＲＴ部位との間に配置する。これらのＲＴ部位は宿主細胞染色体内の対応するＲＴ部位と同じ方向に整列させ、その組換えがやがて一緒になるようにする。異種置換遺伝子配列はベクター内に配置してもよく、直線核酸配列であってもよい。異種置換遺伝子配列はベクター内に配置することが好ましい。
【００１３】
異種置換遺伝子配列を宿主細胞染色体に挿入するため、宿主細胞染色体上に存在し、異種置換遺伝子配列に隣接した対応するＲＴ部位間で部位特異的組換えを行う。組換えのメカニズムは図３に示す通りである。これらの組換えイベントによって、内在性宿主遺伝子標的配列が先に占めていた宿主細胞染色体内の位置において異種置換遺伝子配列が挿入され、一端では残存Ｉ型ＲＴ部位に隣接し、他端では残存ＩＩ型ＲＴ部位に隣接する。
【００１４】
本発明の方法は多くの利点を有する。先ず、部位特異的組換えを用いて異種置換遺伝子配列を宿主細胞染色体に挿入することにより、相同組換えに比べ効率を大きく改善させることができる。ＵＳ２００７／００６１９００に記載の方法では、相同組換えを用いて、直線化されたＬＴＶＥＣ内に含まれるヒト免疫グロブリン可変領域の一部を挿入する。大きいサイズの置換配列の場合、宿主細胞染色体と異種置換遺伝子配列との間で相同組換えを促進するには長いＤＮＡ相同アームが必要となり、それに応じて効率が悪くなる。これに対し、本発明の方法では部位特異的組換えを用いるが、この場合、組換えを行う際に長いＤＮＡ相同アームを必要としないため、効率が大きく改善される。また、部位特異的組換えを用いて異種置換遺伝子配列を挿入する場合、大きいサイズの相同アームを必要とせず、正しく標的化された細胞クローンをサザンブロット解析によって確認することができる。
【００１５】
本発明のように、部位特異的組換えのメカニズムを用いて異種ＤＮＡ配列を挿入すれば、効率が大きく改善されるのは明らかである。本発明の方法によって、宿主細胞内における僅か数ラウンドのターゲティングで内在性宿主遺伝子標的配列を異種置換遺伝子配列で完全に置換することができる。
【００１６】
更に、内在性宿主遺伝子標的配列の除去によってノックアウト細胞が得られるが、該細胞は、本発明の方法においては中間体として作用する。これは、異種遺伝子配列の導入を成功させるという最終目的とは別に有効に利用することができ、除去された内在性宿主遺伝子標的配列の機能をその欠失の影響を見ることによって解析することができる。異種置換遺伝子配列の最終的な挿入によって、置換遺伝子配列の機能を内在性遺伝子配列や完全ノックアウトの機能と比較することができる。
【００１７】
本発明の更なる利点は、内在性遺伝子配列を除去後に宿主細胞染色体内でＩ型ＲＴ部位とＩＩ型ＲＴ部位が近くに配置されることに関係する。Wallaceが記載したように、ＲＴ部位が異なる要素上で離れている宿主染色体における正しいターゲティングの頻度は１×１０-8未満である。本発明の方法によると、内在性宿主遺伝子標的配列の除去後に、残存Ｉ型ＲＴ配列とＩＩ型ＲＴ配列は近くに配置される。「近い」位置は、互いが１００ヌクレオチド以内にあることが好ましいが、５０ヌクレオチド以内にあることが好ましく、４０、３０、２０、１５、１０又は５ヌクレオチド以内にあることがより好ましい。この配置によって異種置換遺伝子配列の挿入の効率が大きく高まり、本発明の方法によるターゲティング効率は１×１０-6程にも高くなり得る。これは重要な利点となるが、それは、正しく標的化された胚性幹細胞を得ることは通常、内在性宿主遺伝子標的配列を異種置換遺伝子配列で置換した胚性幹細胞を作出する際の律速段階であるためである。
【００１８】
また、Wallaceが用いるＤＮＡは非常に長い（２００ｋｂのオーダー）ため、分子内転位や望ましくない相同組換えイベントが生じる機会が増加し、非機能的又は不正確なＤＮＡ構造が生成する機会が増加する。本発明の方法は、効率が大きく向上しており、当業者が異種配列の完全性や忠実度が維持されたクローンを同定するためにより多くのクローンで開始することができるため、Wallaceの方法から見ると有利である。
【００１９】
導入された異種置換遺伝子配列は、それ自身の調節配列の制御下で組込むことができる。或いは、挿入された異種置換遺伝子配列の上流に等価な宿主細胞調節配列が配置され、その場所で用いられるように遺伝的組換えイベントを設定することができる。異種置換遺伝子配列の転写を支配すると考えられる調節配列を組込むのではなく、宿主細胞調節配列を保持する方が望ましい場合もある。例えば、異種置換遺伝子配列に関連する調節配列によって、宿主細胞における異種置換遺伝子配列の発現を制御できない場合がある。これについてはCheungら（Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316, 1328-1334 2006）が示しており、ＣＹＰ３Ａ４タンパク質のヒトプロモーターを有し、ＣＹＰ３Ａ４に関してヒト化したマウスの場合、該タンパク質が成体雄において発現しないことが分かっている。従って、用いる構築物からプロモーターエレメントの一部や他の因子が欠損しているに違いないことが推定される。これに対し、マウス調節配列を保持し、これをヒト配列の代わりに調節に用いることによって、導入遺伝子の忠実な調節が保持され、上述のような問題が回避されることが保証され得る。
【００２０】
従来の技法（即ち、宿主細胞染色体への異種置換遺伝子配列の組込みが多少ランダムである）に対する本発明の方法の一利点は、等価な宿主細胞遺伝子配列の部位での組込みによって遺伝子配置のゲノムコンテクストが確実に保持されることである。このような部位で組込むことによって、転写が生じるのに必要な転写因子や他のタンパク質に対して染色体ＤＮＡへのアクセスが可能であるという意味において、染色体構造が局所的に「オープン」になると思われる。これだけでなく、内在性宿主遺伝子配列に対しても同じ染色体コンテクストが保持され、染色体三次構造レベルでのＤＮＡ転写の調節がヒストン結合及び染色体の局所的フォールディング／アンフォールディングによって保持されるようになる。これによって、遺伝子転写の全体論的な調節が確実に保持され、その後、内在性宿主遺伝子配列に見られるのと同様の遺伝子調節の組織分布が、導入された異種置換遺伝子配列でも生じるようになる。遺伝子転写レベルでのこのような生理学的調節メカニズムの完全な保持は先行技術の技法と共通するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の方法の概要。この方法は、異種置換遺伝子配列を宿主胚性幹細胞に導入して内在性宿主遺伝子標的配列と置換するメカニズムであって、内在性宿主遺伝子標的配列に隣接するように２個のＩ型ＲＴ部位を挿入する（その内の一方はＩＩ型ＲＴ配列に隣接する）ことと、Ｉ型ＲＴ部位間で部位特異的組換えを行って内在性宿主遺伝子標的配列を除去することと、Ｉ型ＲＴ部位とＩＩ型ＲＴ部位に隣接する異種置換遺伝子配列を含むベクターを提供することと、宿主細胞染色体上及びベクター上に存在する対応ＲＴ部位間で組換えを行って、宿主標的遺伝子が先に占めていた宿主染色体内の位置において異種遺伝子配列が導入されるようにすることとを含むメカニズムを提供する。
【図２】相同組換えのメカニズム。相同組換えは二本鎖染色体の切断後に生じる。５’−３’エクソヌクレアーゼ活性によって３’オーバーハングが産生し、鎖侵入が生じる。ＤＮＡ合成では無傷の鎖を鋳型として用い、連結によって染色体切断が修復され、ホリデイジャンクションが生じる。その後の分岐点移動と回復によって組換え産物が産生する。
【図３】Ａ）ＬｏｘＰ部位特異的組換え部位。Ｂ）部位特異的組換えのメカニズム。相補的塩基対形成によって２個のＬｏｘＰ部位が整列し、Ｃｒｅリコンビナーゼによって２個の部位間の組換えが触媒され、内在性宿主遺伝子標的配列が除去される。
【図４】トランスジェニックマウスを作出するための方法。トランスジェニックマウスは、発育胚盤胞に一以上の変化した胚性幹細胞を挿入することによって作出する。その後、胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し、発育させてキメラを作出する。
【図５】マウスＣｙｐ３ａクラスターを欠失させるための戦略。（Ａ）マウスＣｙｐ３ａクラスター内の機能性遺伝子の染色体の構成及び方向の概略図（出典：Nelsonら、２００４年）。偽遺伝子は示されていない。（Ｂ）Ｃｙｐ３ａ５７及びＣｙｐ３ａ５９のエクソン／イントロン構造。エクソンは黒い棒で示し、ＡＴＧは両遺伝子の翻訳開始部位を示す。相同組換えのターゲティングアームの位置をそれぞれ、薄灰色線（Ｃｙｐ３ａ５７）及び濃灰色線（Ｃｙｐ３ａ５９）でハイライトする。（Ｃ）相同組換えによりＣｙｐ３ａ５７（左）及びＣｙｐ３ａ５９（右）のターゲティングに用いたベクター。ＬｏｘＰ部位、ｌｏｘ５１７１部位、ｆｒｔ部位及びｆ３部位をそれぞれ、白い三角、縞模様の三角、黒い三角、及び灰色の三角で示す。（Ｄ）Ｃｙｐ３ａ５７及びＣｙｐ３ａ５９遺伝子座における同一対立遺伝子上での相同組換え後の二重標的化ＥＳ細胞内のＣｙｐ３ａクラスターのゲノム構成。（Ｅ）ｌｏｘＰ部位におけるＣｒｅ介在組換え後のマウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失。Ｃｙｐ３ａ５７、Ｃｙｐ３ａ１６、Ｃｙｐ３ａ４１、Ｃｙｐ３ａ４４、Ｃｙｐ３ａ１１及びＣｙｐ３ａ２５由来の全てのエクソンとイントロンは完全に欠失し、エクソン１〜４及びＣｙｐ３ａ５９のプロモーターも欠失する。従って、Ｃｒｅ介在欠失後に残存する唯一の機能性Ｃｙｐ３ａ遺伝子はＣｙｐ３ａ１３であり、これは、＞７メガベース（Ｍｂ）のゲノムＤＮＡやＣｙｐと無関係の多数の機能性遺伝子によってクラスターの残りから離れている。マウスＣｙｐ３ａクラスターの欠失の成功を実証するために用いたプライマーを黒い矢印で示す。  分かり易くするため、配列は一定の縮尺率では示していない。ＴＫ＝チミジンキナーゼ発現カセット、Ｈｙｇｒｏ＝ハイグロマイシン発現カセット、ＺｓＧｒｅｅｎ＝ＺｓＧｒｅｅｎ発現カセット、Ｐ＝ネオマイシンの発現を促進するプロモーター、５’ΔＮｅｏ＝ＡＴＧ欠損ネオマイシン。
【図６】マウスＣｙｐ３ａクラスターをヒト化するための戦略。（Ａ）Ｃｙｐ３ａクラスターのＣｒｅ介在欠失後の最初の構成は図５Ｅで既に示した通りである。（Ｂ）欠失したマウスＣｙｐ３ａクラスターへのＣｒｅ介在挿入に用いるヒトＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７遺伝子を含む改変ヒトＢＡＣ。（Ｃ）ヒトＢＡＣのＣｒｅ介在挿入後の正しく標的化されたＥＳ細胞におけるＣｙｐ３ａクラスターのゲノム構成。（Ｄ）ｆｒｔ部位及びｆ３部位でのＦｌｐ介在組換え後のハイグロマイシン選択カセット及びネオマイシン選択カセットの欠失。  分かり易くするため、配列は一定の縮尺率では示していない。Ｈｙｇｒｏ＝ハイグロマイシン発現カセット、Ｐ＝ネオマイシンの発現を促進するプロモーター、５’ΔＮｅｏ＝ＡＴＧ欠損ネオマイシン。
【図７】３種類のＧ４１８耐性クローンのＰＣＲ解析。（Ａ）図６Ｃに示す、ヒトＢＡＣのＣｒｅ介在挿入後の正しく標的化されたＥＳ細胞におけるＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターのゲノム構成。ＰＣＲ解析に用いたＰＣＲプライマーを黒い矢印で示し、予想されるＰＣＲ断片を灰色のボックスで示す。（Ｂ）３種類のクローン全てにおいてヒトＢＡＣが正しく挿入されたことを示すＰＣＲ結果。
【図８】３種類のＧ４１８耐性クローンのサザン解析。（Ａ）図６Ｃに示す、ヒトＢＡＣのＣｒｅ介在挿入後の正しく標的化されたＥＳ細胞におけるＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターのゲノム構成。サザンブロット解析に用いたサザンプローブを黒い線で示すと共に、予想される制限断片を示す。（Ｂ）全てのクローンにおいてヒトＢＡＣが正しく挿入されたことを示すと共に、クローン３では更なる挿入が生じたことを示すサザンブロット結果。
【図９】ヒト化ＣＹＰ３Ａ４マウス株における肝ＣＹＰ３Ａ４タンパク質。Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの肝臓にヒトＣＹＰ３Ａ４が存在することを示すサザンブロット結果。
【図１０】ヒト化ＣＹＰ３Ａ４マウス株における腸ＣＹＰ３Ａ４タンパク質。Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの腸にヒトＣＹＰ３Ａ４が存在することを示すサザンブロット結果。
【図１１】ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７ヒト化マウスのＤＮＡ解析。最終構築物におけるＣＹＰ３Ａ４ｃＤＮＡによる配列アラインメントから、ヒト化マウス株（ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯ及びｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯ）からクローン化されたＣＹＰ３Ａ４ｃＤＮＡは全長転写物であり、配列内では変異が無かったことが分かった。ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯにおいてはＣＹＰ３Ａ７転写物は検出されなかった。
【図１２】ヒト胎児、小児及び成人におけるデヒドロエピアンドロステロン代謝。ＣＹＰ３Ａ７はヒト胎児肝臓で発現する主なＣＹＰ３Ａアイソフォームであり、出生後の第１週に発達スイッチを経て、ＣＹＰ３Ａ７はＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写活性化と共にほぼ消失する。同様の発達スイッチがマウス（Ｃｙｐ３ａ１６〜Ｃｙｐ３ａ１１）でも見られた。本発明者らの実験に用いたマウスは９週齢超であったため、ＣＹＰ３Ａ７の発現はＣＹＰ３Ａ４へスイッチしたと思われる。
【図１３】ヒト化ＣＹＰ３Ａ４マウス株における肝ＣＹＰ３Ａ４及びＣｙｐ３ａタンパク質の発現。Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの肝臓にヒトＣＹＰ３Ａ４が存在することを示すサザンブロット結果。
【図１４】ヒト化ＣＹＰ３Ａ４マウス株における腸ＣＹＰ３Ａ４及びＣｙｐ３ａタンパク質の発現。Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの腸にヒトＣＹＰ３Ａ４が存在することを示すサザンブロット結果。
【図１５】トリアゾラム酸化によって示されるように、ＣＹＰ３Ａ４はＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスにおいて触媒的に活性である。Ｃｙｐ３ａＫＯマウスと比較して、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスにおいては、ＣＹＰ３Ａ４の高い触媒活性に起因してＴＲＩ代謝が増加する。ＣＹＰ３Ａ４は肝臓でのＴＲＩ代謝において重要な役割を果たすが、ＴＲＩはマウスにおいても広範に代謝され得る。
【図１６】トリアゾラム酸化によって示されるように、ＣＹＰ３Ａ４はＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスにおいて触媒的に活性である。Ａ．ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７  Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４の触媒活性を示すトリアゾラム酸化結果。Ｂ．ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７  Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの十二指腸におけるＣＹＰ３Ａ４の触媒活性を示すトリアゾラム酸化結果。
【図１７】ＤＢＦ酸化によって示されるように、ＣＹＰ３Ａ４はＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスにおいて触媒的に活性である。Ａ．ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７  Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４の触媒活性を示すＤＢＦ酸化結果。Ｂ．ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７  Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの十二指腸におけるＣＹＰ３Ａ４の触媒活性を示すＤＢＦ酸化結果。
【図１８】ＢＱ酸化によって示されるように、ＣＹＰ３Ａ４はＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスにおいて触媒的に活性である。Ａ．ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７  Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４の触媒活性を示すＢＱ酸化結果。Ｂ．ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７  Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの十二指腸におけるＣＹＰ３Ａ４の触媒活性を示すＢＱ酸化結果。
【図１９】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びＣｙｐ３ａＫＯマウスの血漿の臨床化学解析。（Ａ）トリグリセリド、（Ｂ）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、（Ｃ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、（Ｄ）コレステロール（ＣＨＯＬ）。データは平均±Ｓ．Ｄ．で示す（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）、全てのＰＣＮ処理トランスジェニックマウス（ｎ＝２））。処理グループから得たデータを対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して有意差有り（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図２０】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びＣｙｐ３ａＫＯマウスの血漿の臨床化学解析：（Ａ）総ビリルビン（ＢＩＬ−Ｔ）、（Ｂ）直接ビリルビン（ＢＩＬ−Ｄ）、（Ｃ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、（Ｄ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）。データは平均±Ｓ．Ｄ．で示す（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）、全てのＰＣＮ処理トランスジェニックマウス（ｎ＝２））。処理グループから得たデータを対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して有意差有り（＊：Ｐ＜０．０５）。
【図２１】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びＣｙｐ３ａＫＯマウスの血漿の臨床化学解析：（Ａ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、（Ｂ）アルブミン（ＡＬＢ）。データは平均±Ｓ．Ｄ．で示す（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝３）、全てのＰＣＮ処理トランスジェニックマウス（ｎ＝２））。処理グループから得たデータを対応のないｔ検定（両側Ｐ値）で比較した。＊：処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して有意差有り（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図２２】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びＣｙｐ３ａＫＯマウスの（Ａ）肝ミクロソーム及び（Ｂ）腸ミクロソームにおけるＣＹＰ３Ａ４タンパク質の発現。（＋）：ＰＣＮで処理（１００ｍｇ／ｋｇ／２日／ＩＰ）、（−）：媒体（コーン油）で処理した対照マウス。各レーンは一匹のマウスから得たサンプルである。１０μｇの肝ミクロソームタンパク質又は２０μｇの腸ミクロソームタンパク質をロードした。ブロットはポリクローナルウサギ抗ＣＹＰ３Ａ４（ゲンテスト、カタログ番号：４５８２３４）にてインキュベートした。標準品：ＨＬＭ：プールした男性ヒト肝ミクロソーム（１０μｇ）（ゲンテスト、カタログ番号：４５２１７２）、３ａ１１：マウスＣｙｐ３ａ１１組換えタンパク質（０．１ｐｍｏｌ）（ヘンダーソン博士、ダンディー大学、英国）、３Ａ４：ヒトＣＹＰ３Ａ４バキュロソーム（０．１ｐｍｏｌ）（インビトロジェン、カタログ番号：Ｐ２３７７）。
【図２３】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びＣｙｐ３ａＫＯマウスの（Ａ）肝ミクロソーム及び（Ｂ）腸ミクロソームにおけるＣＹＰ３Ａ／Ｃｙｐ３ａタンパク質の発現。（＋）：ＰＣＮで処理（１００ｍｇ／ｋｇ／２日／ＩＰ）、（−）：媒体（コーン油）で処理した対照マウス。各レーンは一匹のマウスから得たサンプルである。１０μｇの肝ミクロソームタンパク質又は２０μｇの腸ミクロソームタンパク質をロードした。ブロットはポリクローナルウサギ抗ラットＣＹＰ３Ａ２（ヘンダーソン博士、ダンディー大学、英国）にてインキュベートした。標準品：ＨＬＭ：プールした男性ヒト肝ミクロソーム（１０μｇ）（ゲンテスト、カタログ番号：４５２１７２）、３ａ１１：マウスＣｙｐ３ａ１１組換えタンパク質（０．１ｐｍｏｌ）（ヘンダーソン博士、ダンディー大学、英国）、３Ａ４：ヒトＣＹＰ３Ａ４バキュロソーム（０．１ｐｍｏｌ）（インビトロジェン、カタログ番号：Ｐ２３７７）。Ｃｙｐ３ａ１１の対照バンドは５０ｋＤ未満の電気泳動移動度を示したが、これは、該タンパク質にヒスチジンのタグが付加したという事実に起因する。
【図２４】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びＣｙｐ３ａＫＯマウスの（Ａ）肝ミクロソーム及び（Ｂ）腸ミクロソームによる７−ＢＱ酸化。データはＣＸＲ承認Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｓｈｅｅｔ  Ｆｌｕｏｒ−０００５に従って作成した。未処理トランスジェニック／ノックアウトマウスの棒（単一の測定値を示す）以外、データは平均±ＳＤ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのミクロソーム（ｎ＝３）、ＰＣＮ処理トランスジェニック株のミクロソーム及びヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）（ｎ＝２））。処理ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス由来サンプルの活性は、対応のないｔ検定（両側Ｐ値）によってＣｙｐ３ａＫＯ株由来サンプルと比較した。
【図２５】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びＣｙｐ３ａＫＯマウスの（Ａ）肝ミクロソーム及び（Ｂ）腸ミクロソームによるＤＢＦ酸化。未処理トランスジェニック／ノックアウトマウス及びヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）の棒（単一の測定値を示す）以外、データは平均±ＳＤ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのミクロソーム（ｎ＝３）、ＰＣＮ処理トランスジェニック株のミクロソーム（ｎ＝２））。処理ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス由来サンプルの活性は、対応のないｔ検定（両側Ｐ値）によってＣｙｐ３ａＫＯ株由来サンプルと比較した。＊：有意差有り（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図２６】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びＣｙｐ３ａＫＯマウスの（Ａ）肝ミクロソーム及び（Ｂ）腸ミクロソームによるトリアゾラムのαヒドロキシル化。パートＡにおいて、媒体処理マウス由来サンプルの活性は左側のＹ軸スケールを参照し、ＰＣＮ処理マウスのミクロソームの活性は右側のＹ軸スケールを参照のこと。未処理トランスジェニック／ノックアウトマウスの棒（単一の測定値を示す）以外、データは平均±ＳＤ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのミクロソーム（ｎ＝３）、ＰＣＮ処理トランスジェニック株のミクロソーム及びヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）（ｎ＝２））。処理ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス由来サンプルの活性は、対応のないｔ検定（両側Ｐ値）によってＣｙｐ３ａＫＯ株由来サンプルと比較した。＊：有意差有り（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図２７】ＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動。反応にはＣＹＰ３Ａ４特異的プライマー（ライン１〜５）、ＣＹＰ３Ａ７特異的プライマー（ライン７〜９）及び全肝臓ＲＮＡを用いた。（１）：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、（２〜３）：ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯ、（４〜５）：ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯ、（６）：分子量マーカー（１ｋｂラダー）、（７）：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、（８〜９）：ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、異種置換遺伝子配列を宿主細胞に導入して内在性宿主遺伝子標的配列と置換する方法であって、
ａ）一対の同一のＩ型部位特異的リコンビナーゼ標的（ＲＴ）部位を別々の相同組換え段階によって宿主染色体の同一対立遺伝子に組み込み、置換対象の内在性宿主遺伝子標的配列が各々の端で前記同一のＩ型ＲＴ部位に隣接するようにすることと、
ここにおいて、同一のＩ型ＲＴ部位の一方は該Ｉ型ＲＴ部位の近くに配置されるＩＩ型ＲＴ部位に隣接し、ＩＩ型ＲＴ部位はＩ型ＲＴ部位とは違って異種特異的であって、Ｉ型ＲＴ部位とは相互作用できないようになっており、
ｂ）内在性宿主遺伝子標的配列が除去されるように前記一対のＩ型部位特異的組換え部位間で組換えを行って、残存Ｉ型ＲＴ部位を染色体内の除去位置に残すことと、
ｃ）異種置換遺伝子配列を宿主染色体に接触させて異種置換遺伝子配列が一端でＩ型ＲＴ部位に隣接すると共に、他端でＩＩ型ＲＴ部位に隣接するようにし、適切な条件下、異種置換遺伝子配列に隣接し、宿主染色体内に配置された対応するＩ型及びＩＩ型部位特異的組換え部位間で組換えを行うことによって異種置換遺伝子配列の宿主染色体への標的部位特異的リコンビナーゼ介在挿入を行い、宿主標的遺伝子が先に占めていた宿主染色体内の位置において異種遺伝子配列が導入されるようにすること
とを含む方法を提供する。
【００２３】
本発明によると、異種置換遺伝子配列を宿主細胞の染色体に挿入する際、内在性宿主遺伝子標的配列が自然に生じる染色体内の場所で行う。これは、遺伝子座のコンテクストが保持される、即ち、この部位からの転写の忠実度が野生型の系で生じる転写レベルにできるだけ近くなるという点で有利である。
【００２４】
方法
本発明の方法の第１の段階は、一対の同一のＩ型ＲＴ部位を宿主細胞染色体に組込むことである。ＲＴ部位を染色体に組込むための方法は当業者には公知であろうが、相同組換えプロセスを用いて行うことが好ましい。相同組換えは、核酸配列を宿主細胞染色体に挿入させるのに用いることのできる遺伝的メカニズムに関する。このメカニズムは、二本鎖の宿主細胞及び外因性核酸配列を整列させることによって開始する。宿主細胞配列内での二本鎖切断と５’−３’エクソヌクレアーゼ活性によって鎖侵入が促進され、その結果、短い相同領域によって相同的な宿主細胞及び外因性配列の塩基対形成が生じる。その後の宿主細胞配列の鎖伸長では外因性配列を鋳型として用い、回復によって、外因性配列が内部に配置された宿主細胞ゲノム配列が生成するが、外因性配列は無傷のまま残る。
【００２５】
相同組換えを行うための方法は本技術分野においては公知であり、外部から供給されたＤＮＡ分子と標的染色体との間で相同領域を用いてＲＴ部位を導入する。好適な標的送達系は当業者には明らかであろうが、その例としては、注入又は標的ネイキッドＤＮＡや、ＤＮＡを封入及び／又はＤＮＡと複合体を形成した標的リポソーム、標的レトロウイルス系、プロタミン及びポリリジン凝縮ＤＮＡ等の標的凝縮ＤＮＡ、電気穿孔（エレクトロポレーション）の使用が挙げられる。また、他の送達方法を用いることもでき、例えば、核酸発現ベクターやポリカチオン凝縮ＤＮＡ、リガンド連結ＤＮＡを用いる方法（Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154; Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987参照）、及び遺伝子導入粒子銃の使用（米国特許第５，１４９，６５５号に記載）が挙げられる。また、国際特許公開ＷＯ９０／１１０９２に詳述のように、ネイキッドＤＮＡを用いることもできる。このリストはほんの一例として挙げたに過ぎず、これらに限定されない。
【００２６】
組換え段階は、本技術分野でよく知られており、以下に更に説明する方法に従って宿主細胞内で行う。宿主細胞は幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞や胚性幹細胞）が好ましい。胚性幹（ＥＳ）細胞は全能性細胞の培養細胞株であり、該細胞を初期胚に導入すると発育して生体の全組織に定着するようになる。ＥＳ細胞は本発明において好ましい宿主細胞である。
【００２７】
本発明の方法においては、上述のように、Ｉ型ＲＴ部位の各々は、別々の相同組換え段階によって宿主細胞染色体に組み込むことが好ましい。別々の相同組換え反応の各々は、宿主細胞染色体、及びＩ型ＲＴ部位と相同組換えを生じさせる宿主細胞染色体領域に相同な領域とを含む外因性ＤＮＡによって始める。相同領域は１〜６ｋｂであることが好ましく、相同領域は１〜４ｋｂであることがより好ましく、相同領域の一方の長さが１ｋｂで、他方の長さが３ｋｂ又は４ｋｂであることが最も好ましい。
【００２８】
本発明の方法においては、異種置換遺伝子配列によって置換される内在性宿主遺伝子標的配列が各々の端でＩ型ＲＴ部位に隣接するように２個のＩ型ＲＴ部位を宿主細胞染色体に組み込む。２個のＩ型ＲＴ部位を内在性宿主遺伝子標的配列に挿入する際、該部位を宿主遺伝子標的配列から５ｍｂ未満離れて配置するように行うことが好ましく、２個のＩ型ＲＴ部位を内在性宿主遺伝子標的配列に挿入する際、該部位を宿主遺伝子標的配列から３ｍｂ未満離れて配置するように行うことがより好ましく、２個のＩ型ＲＴ部位を内在性宿主遺伝子標的配列に挿入する際、該部位を宿主遺伝子標的配列から２ｍｂ未満離れて配置するように行うことが最も好ましい。また、本発明の方法においては、２個のＩ型ＲＴ部位を互いに同じ方向に配置し、やがてその間で組換えを生じさせる。
【００２９】
本発明の方法においては、宿主細胞染色体に組み込まれたＩ型ＲＴ部位の一方はＩＩ型ＲＴ部位に隣接し、該Ｉ型ＲＴ部位が内在性宿主遺伝子標的配列とＩＩ型ＲＴ部位との間に配置されるようになる。ＩＩ型ＲＴ部位は、それに近いＩ型ＲＴ部位と同じ組換え段階によって宿主細胞染色体に組み込むことが好ましい。このため、相同組換え段階で用いる外因性ＤＮＡ配列は、Ｉ型ＲＴ部位とＩＩ型ＲＴ部位が一緒に導入し得るようにこれらの部位のＤＮＡ配列を含んでいることが好ましい。
【００３０】
本発明の方法においては、Ｉ型ＲＴ部位とＩＩ型ＲＴ部位を互いに近くに配置する。本明細書において「近い」とは、ＲＴ部位が染色体上で互いにごく接近し、隣接して配置されることを意味する。「近い」位置は、互いが１００ヌクレオチド以内にあることが好ましいが、５０ヌクレオチド以内にあることが好ましく、４０、３０、２０、１５、１０又は５ヌクレオチド以内にあることがより好ましい。以下に更に詳細に説明するように、Ｉ型ＲＴ部位はＩＩ型ＲＴ部位とは違って異種特異的であって、Ｉ型ＲＴ部位とは相互作用できないようになっている。
【００３１】
本発明の方法の次の段階は内在性宿主遺伝子標的配列の除去である。この除去は、内在性宿主遺伝子標的配列に隣接する２個のＩ型ＲＴ部位間での組換えによって行う。ＲＴ部位間で組換えを行うためには、Ｉ型ＲＴ部位を認識する部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）酵素形態のＳＳＲ活性にゲノムを曝露する必要がある。ＳＳＲ酵素活性に曝露することによって、ＲＴ部位の配置で確認されるＤＮＡ再構成が生じ、その結果、直線ＤＮＡ分子内で介在配列が除去又は切除される。「ＳＳＲ」とは、特定のＤＮＡ遺伝子座におけるＤＮＡ再構成を仲介する組換え系の如何なるタンパク質成分をも意味し、例えば、インテグラーゼ又はレゾルバーゼ／インベルターゼクラスのＳＳＲ（Abremski, K.E. and Hoess, R.H. (1992) Protein Engineering 5, 87-91; Khanら、(1991) Nucleic acids Res. 19, 851-860; Nunes-Dubyら、(1998) Nucleic Acids Res 26 391-406; Thorpe and Smith, (1998) P.N.A.S USA 95 5505-10）及びイントロンコード化エンドヌクレアーゼによって仲介される部位特異的組換え（Perrin ら、, (1993) EMBO J. 12, 2939-2947）が挙げられる。部位特異的組換えが進行するメカニズムを図３ｂに示す。
【００３２】
２個のＩ型ＲＴ部位間でのＳＳＲ介在組換え後、残存Ｉ型ＲＴ部位は、宿主細胞染色体内の内在性宿主遺伝子標的配列が先に占めていた位置に残り、内在性宿主遺伝子標的配列は除去される。内在性宿主遺伝子標的配列はこの段階では細胞内で遊離直線ＤＮＡ分子として存在するが、細胞エクソヌクレアーゼによって急速に分解されるであろう。
【００３３】
本発明の方法の次の段階は異種置換遺伝子配列の提供であり、直線核酸分子として提供することも可能であるが、ある種のベクター（例えば、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）や酵母人工染色体（ＹＡＣ）等）内に含有させることが好ましい。好適なベクターの例は本技術分野において広く知られている。
【００３４】
異種置換遺伝子配列は一端でＩ型ＲＴ部位に隣接し、他端でＩＩ型ＲＴ部位に隣接するが、該Ｉ型ＲＴ部位は、宿主細胞染色体に挿入されたＩ型ＲＴ部位と同じ種類であり、該ＩＩ型ＲＴ部位は、宿主細胞染色体に挿入されたＩＩ型ＲＴ部位と同じ種類である。重要なことには、Ｉ型ＲＴ部位はＩＩ型ＲＴ部位とは違って異種特異的であって、Ｉ型ＲＴ部位とは相互作用できないようになっている。異種置換遺伝子配列に隣接するＩ型ＲＴ部位は宿主細胞染色体上のＩ型ＲＴ部位と同じ方向に配置され、異種配列に他端で隣接するＩＩ型ＲＴ部位は宿主細胞染色体上のＩＩ型ＲＴ部位と同じ方向に配置されて、やがて対応するＲＴ部位対間で効果的な組換えが行われるようになる。
【００３５】
異種置換遺伝子配列を含む核酸と宿主細胞染色体との間でＳＳＲ介在組換えを生じさせるためには、この配列を宿主細胞染色体にごく近くで接触させる必要がある。好適な標的送達系は当業者には明らかであろうが、その例としては上述のものが挙げられる。
【００３６】
適切な条件下、異種置換遺伝子配列を含む核酸内及び宿主細胞染色体内において対応するＲＴ部位間で組換えを行う。これらの組換え段階は同時に行うことが好ましく、これによって、宿主細胞染色体内の内在性宿主遺伝子標的配列が先に占めていた位置への異種置換遺伝子配列の導入が促進される。宿主細胞染色体上でＩ型ＲＴ部位とＩＩ型ＲＴ部位を近くに配置することによって、先行技術で先に記載されている方法と比較して異種置換遺伝子配列挿入の効率が高まる。
【００３７】
選択可能マーカー
宿主染色体に組み込んだＩ型ＲＴ部位の各々は、一以上の選択可能マーカーと連結させる（好ましくは、連続させる）必要がある。これらの選択可能マーカーは、外因性ＤＮＡがうまく組み込まれた宿主細胞（例えば、胚性幹細胞）をモニターすることができるように機能する。本発明の更なる様相によると、各Ｉ型ＲＴ部位は一以上の選択可能マーカーと連続してもよい。各Ｉ型ＲＴ部位は２種の選択可能マーカーと連続することが好ましい。各Ｉ型ＲＴ部位は少なくとも１種の正の選択カセットと連続し、正の選択カセットによって、核酸配列をうまく組み込んだ細胞の検出を可能にすることが好ましい。正の選択カセットによって、核酸配列を含む細胞のみが成長培地で生存し得ることを確実にして選択を可能にすることがより好ましい。各Ｉ型ＲＴ部位は少なくとも１種の負の選択カセットと連続し、負の選択カセットによって、核酸配列がうまく除去された細胞の検出を可能にすることが好ましい。負の選択カセットによって、核酸配列を含まない細胞のみが成長培地で生存し得ることを確実にして選択を可能にすることがより好ましい。各Ｉ型ＲＴ部位は１種の正の選択カセット及び１種の負の選択カセットと連続することが最も好ましい。
【００３８】
一以上の選択可能マーカーは、内在性宿主遺伝子標的配列とＩ型ＲＴ部位との間にあるように配置し、やがて宿主遺伝子配列と共に除去されるようにすることが好ましい。
【００３９】
正の選択カセットは、成長宿主細胞が曝露され得る化学化合物（例えば、抗生物質）に対するある種の耐性をコードする遺伝子であることが好ましい。その例としては、細胞成長培地に添加される抗生物質に対する耐性を付与する選択可能マーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はピューロマイシンに対する耐性を付与するネオマイシン耐性マーカー）の使用が挙げられる。更なる例としては、本発明の上述の様相における核酸配列に相補的であり、それに対してハイブリダイズする核酸配列を用いた検出が挙げられる。例えば、サザンブロット解析やノーザンブロット解析、ＰＣＲが挙げられる。
【００４０】
負の選択カセットは化学化合物に対する感受性を付与する遺伝子であることが好ましい。例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を用いることができ、これによってガンシクロビルに対する感受性が付与されるであろう。
【００４１】
本発明の更なる様相においては、選択可能マーカーは、チミジンキナーゼ発現カセット、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びプロモーターを持たないＡＴＧ欠損ネオマイシンカセット（５’ΔＮｅｏ）（Seiblerら、2005, Nucl Acids Res. 33(7) e67参照）から選択される。
【００４２】
本発明の更なる様相においては、Ｉ型ＲＴ部位の一方はチミジンキナーゼ発現カセット及び５’ΔＮｅｏと連続し、他方のＩ型ＲＴ部位はチミジンキナーゼ発現カセット及びハイグロマイシン耐性遺伝子と連続する。
【００４３】
宿主細胞染色体内のＩ型ＲＴ部位の一方に連結するように配置された５’ΔＮｅｏ配列は、宿主染色体内のプロモーター及びＡＴＧの存在に起因して細胞の選択を促進することが好ましい。この概念の基本は、プロモーターを持たないＡＴＧ欠損ネオマイシンカセットを組み込み用マーカーとして用いることである。このようなカセットをゲノムにランダムに組み込んだ場合、該カセットは不活性となり、Ｇ４１８耐性を付与しない。プロモーターとＡＴＧを含む既に用意された遺伝子座に正確に挿入することによってのみ活性化され得る。こうして、染色体内の正しい位置にうまく組み込むための厳密な選択プロセスが提供される。
【００４４】
一実施形態においては、染色体に欠損配列を挿入した後、ＡＴＧをｌｏｘＰ部位によってネオマイシンから分離する。こうして、相補発現ネオマイシン配列によって、ｌｏｘＰ部位及びネオマイシンカセットの３’半分によってコードされるアミノ酸の融合タンパク質が形成される。
【００４５】
本発明の一様相においては、異種置換遺伝子配列はベクター上に有り、このベクターは一以上の選択可能マーカーを含むことが好ましい。ベクターは２種の選択可能マーカー（好ましくは、ネオマイシン発現カセット及びハイグロマイシン耐性遺伝子から選択される）を含むことが好ましい。ベクター上に含まれる一以上の選択可能マーカーは、Ｉ型ＲＴ部位と異種置換遺伝子配列との間、及び／又はＩＩ型ＲＴ部位と異種置換遺伝子配列との間に配置されることが好ましい。異種置換遺伝子配列のどちらか一方の端に少なくとも１種の選択可能マーカーが配置されることが好ましい。異種置換遺伝子配列の各々の端に１種の選択可能マーカーが配置されることがより好ましい。
【００４６】
この選択システムは、実験者が構築物に導入した選択マーカー遺伝子によって完全に管理される点で有利である。従って、本発明の方法は、最初の選択圧を必要とせず、如何なる胚性幹細胞にも用いることができる。これは、ＨＰＲＴ欠損（ｈｐｒｔ-）胚性幹細胞株においてのみ実施可能なWallaceらの方法とは異なる。
【００４７】
更なるＲＴ部位
本発明の更なる様相においては、一対のＩ型ＲＴ部位及びＩＩ型ＲＴ部位に加えて一以上の更なるＲＴ部位を含むように宿主染色体を改変する。図１に示すように、宿主染色体は２種の更なるＲＴ部位を含むことが好ましい。宿主染色体は１個のＩＩＩ型ＲＴ部位と１個のＩＶ型ＲＴ部位を含むことがより好ましい。これらの更なるＲＴ部位は、Ｉ型ＲＴ部位及びＩＩ型ＲＴ部位について上述したのと同様に相同組換えによって宿主細胞染色体に組み込む。更なるＲＴ部位は、Ｉ型ＲＴ部位及びＩＩ型ＲＴ部位と同時に組み込むことが好ましい。
【００４８】
この更なる実施形態においては、宿主染色体に組み込んだＩＩ型ＲＴ部位はＩＩＩ型ＲＴ部位に隣接し、ＩＩ型ＲＴ部位がＩ型ＲＴ部位とＩＩＩ型ＲＴ部位との間に配置されるようになっている。
【００４９】
更なる実施形態においては、宿主染色体内でＩＩ型ＲＴ部位の近くに隣接しないＩ型ＲＴ部位はＩＶ型ＲＴ部位に隣接し、Ｉ型ＲＴ部位が内在性宿主遺伝子標的配列とＩＶ型ＲＴ部位との間に配置されるようになっている。
【００５０】
本発明の他の様相においては、ベクターは、Ｉ型ＲＴ部位及びＩＩ型ＲＴ部位に加えて一以上の更なるＲＴ部位を含む。ベクターは２種の更なるＲＴ部位を含むことが好ましい。ベクターは１個のＩＩＩ型ＲＴ部位と１個のＩＶ型ＲＴ部位を含むことがより好ましい。
【００５１】
更なる実施形態においては、更なるＲＴ部位は、Ｉ型ＲＴ部位又はＩＩ型ＲＴ部位に隣接するようにベクター内に配置される。ベクター内のＩＩＩ型ＲＴ部位は、ＩＩ型ＲＴ部位と異種置換遺伝子配列との間に配置されるようにすることが好ましい。ＩＩＩ型ＲＴ部位は異種置換遺伝子配列と一以上の選択可能マーカーとの間に配置して、一以上の選択可能マーカーがＩＩ型ＲＴ部位とＩＩＩ型ＲＴ部位との間に配置されるようにすることがより好ましい。
【００５２】
ベクター内のＩＶ型ＲＴ部位は、Ｉ型ＲＴ部位と異種置換遺伝子配列との間に配置されるようにすることが好ましい。ＩＶ型ＲＴ部位は異種置換遺伝子配列と一以上の選択可能マーカーとの間に配置して、一以上の選択可能マーカーがＩ型ＲＴ部位とＩＶ型ＲＴ部位との間に配置されるようにすることがより好ましい。
【００５３】
また、ベクター上に存在する更なるＲＴ部位を宿主細胞染色体内の対応するＲＴ部位と同じ方向に整列させて、やがてその組換えを一緒に生じさせるようにする。上述のように、ＳＳＲ介在組換えによる宿主細胞染色体への異種置換遺伝子配列の挿入を、ベクター及び宿主細胞染色体上に配置された対応するＩ型ＲＴ部位及びＩＩ型ＲＴ部位において行うことによって、更なるＲＴ部位が宿主細胞染色体に同時に挿入される。
【００５４】
ベクター上及び宿主染色体内に配置された対応するＩ型ＲＴ部位とＩＩ型ＲＴ部位との間で組換えを行い、異種置換遺伝子配列を宿主染色体に挿入することによって、異種置換遺伝子配列の一端に存在する一以上の選択マーカーと２個のＩＩＩ型ＲＴ部位間の残存Ｉ型ＲＴ部位の位置が定まると共に、異種置換遺伝子配列の他端に存在する一以上の選択マーカーと２個のＩＶ型ＲＴ部位間の残存ＩＩ型ＲＴ部位の位置が定まる。
【００５５】
次に、宿主染色体に組み込まれた、対応する更なるＩＩＩ型ＲＴ部位とＩＶ型ＲＴ部位との間で２段階の別々の組換えを行うことができる。この更なる２段階の組換えによって、選択カセットを含んでいた宿主細胞染色体からＤＮＡの一部が除去される。
【００５６】
これは、選択可能マーカーが宿主細胞染色体内に残る際に悪影響を及ぼす可能性をなくす点で有利である。このような悪影響の例としては、選択可能マーカーの近くにある遺伝子の発現の変化や、選択可能マーカーの抗生物質耐性への寄与が挙げられる。また、２段階の更なる組換えによって、染色体内のその間にある残存Ｉ型ＲＴ部位及びＩＩ型ＲＴ部位を除去することができる。
【００５７】
こうして、２段階の更なる組換えによって、異種置換遺伝子配列及び２個の残存ＲＴ部位を除く全ての非外因性ＤＮＡの欠失が促進される。２個の残存ＲＴ部位は残存ＩＩＩ型ＲＴ部位と残存ＶＩ型ＲＴ部位であることが好ましい。
【００５８】
ＲＴ部位
ＲＴ部位間で組換えを行うためには、部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）酵素形態のＳＳＲ活性にゲノムを曝露する必要がある。ＳＳＲ酵素活性に曝露することによって、ＲＴ部位の配置で確認されるＤＮＡ再構成が生じ、その結果、直線ＤＮＡ分子内で介在配列が除去又は切除される。「ＳＳＲ」とは、特定のＤＮＡ遺伝子座におけるＤＮＡ再構成を仲介する組換え系の如何なるタンパク質成分をも意味し、例えば、インテグラーゼ又はレゾルバーゼ／インベルターゼクラスのＳＳＲ（Abremski, K.E. and Hoess, R.H. (1992) Protein Engineering 5, 87-91; Khanら、(1991) Nucleic acids Res. 19, 851-860; Nunes-Dubyら、(1998) Nucleic Acids Res 26 391-406; Thorpe and Smith, (1998) P.N.A.S USA 95 5505-10）及びイントロンコード化エンドヌクレアーゼによって仲介される部位特異的組換え（Perrinら、(1993) EMBO J. 12, 2939-2947）が挙げられる。
【００５９】
大きいＤＮＡ断片（２００ｋｂ〜数メガベース）の欠失に適したＣｒｅ／ｌｏｘ介在欠失を仲介するための方法は以下の論文に記載されている（Li ZW, Stark G, Gotz J, Rulicke T, Gschwind M, Huber G, Muller U, Weissmann C. Generation of mice with a 200-kb amyloid precursor protein gene deletion by Cre recombinase-mediated site-specific recombination in embryonic stem cells Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Jun 11;93(12):6158-62. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Oct 15;93(21):12052; in Su H, Wang X, Bradley A. Nested chromosomal deletions induced with retroviral vectors in mice. Nat Genet. 2000 Jan;24(l):92-5）; Call LM, Moore CS, Stetten G, Gearhart JD. A cre-lox recombination system for the targeted integration of circular yeast artificial chromosomes into embryonic stem cells. Hum Mol Genet. 2000 Jul 22;9(12):1745-51）。
【００６０】
本発明の部位特異的組換え段階がインビボ又はインビトロで実行可能であることは理解されよう。
【００６１】
インビトロ組換えの場合、ＲＴ部位に対応するＳＳＲを変化した宿主細胞に導入する必要がある。このような導入は、ＳＳＲタンパク質を細胞に直接導入するか、又はＳＳＲをコードする外因性遺伝子（これはその後発現する）を導入することによって行うことができる。ＳＳＲをコードする遺伝子を送達するための好適な標的送達系は当業者には明らかであろうが、その例としては上述の系が挙げられる。
【００６２】
後述のように、トランスジェニック生物を作出する場合には、インビボ組換えが望ましいこともある。部位特異的組換えは、トランスジェニック生物内でＳＳＲの活性を誘導することによって行うことができる。生体系で遺伝子型を変化させるために部位特異的組換えをうまく利用するには通常、組換えイベントを調節するための戦略が必要である。これは、得られる発現パターンが上述の組織特異的な要素が活性となる時間及び場所に制限されるように、リコンビナーゼｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を制御することによって行うことができる（Baubonis and Sauer (1993) Nucl Acids Res. 21, 2025-2029; Sauer B, (1994) Curr Opin Biotechnol 5:521-7; Rajewskyら、(1996) J Clin Invest 98, 600-3; Metzger and Feil, (1999) Curr. Opinions Biotechnology 10, 470-476）。組織特異的なパターン（例えば、肝臓におけるアルブミン−Ｃｒｅ）で発現を制御することができる。
【００６３】
研究者らは、ＳＳＲ酵素を発現させるために、直接トランスフェクションや組換えウイルスによる感染、ＳＳＲタンパク質をコードするＤＮＡやｍＲＮＡ又は該タンパク質自身の注入を用いてきた（Konsolakiら、(1992) New Biol. 4: 551-557）。このようなＳＳＲ酵素の発現ではなく活性を調節することによって、より正確に制御することができる。一戦略においては、ＳＳＲ酵素をステロイド受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に融合させた融合タンパク質を用いてＳＳＲ−ＬＢＤタンパク質を得る（EP-B-0 707 599；Logie and Stewart (1995) P.N.A.S. USA 92: 5940-5944; Brocardら、(1997) P.N.A.S. USA 94: 14559-14563; Akagiら、(1997) Nucleic Acids Res 25, 1766-73)参照）。この戦略は、ＳＳＲ活性を活性化するステロイド受容体のリガンドをリガンドが受容体部分に結合している場合のみ用いることに依存している。該受容体のＬＢＤは、同族リガンドの非存在下ではＳＳＲの活性を抑制する。同族リガンドの送達によってＳＳＲの抑制を軽減し、ＲＴ部位間での組換えを行うことができる。
【００６４】
このように、誘導については、前記ＳＳＲの転写を誘導するか、ＳＳＲの翻訳を誘導するか、又はＳＳＲから阻害剤を除去することによって行うことができる。或いは、ＳＳＲをトランスジェニック生物に人工的に導入することができる。本発明の方法の一要素は、トランスジェニック生物内で部位特異的組換えを行うことによって内在性宿主遺伝子標的配列の除去が可能であると共に、内在性宿主遺伝子標的配列に代わって異種置換遺伝子配列を含むトランスジェニック生物の作出が可能であることである。
【００６５】
トランスジェニックマウスを欠失株マウスと交雑させることによって部位特異的組換えをインビボで実施し得ることが好ましい。本明細書において「欠失株」とは、その生殖系列で部位特異的リコンビナーゼを発現するマウスに関するが、これを、トランスジェニックマウスと交雑させてマウス標的遺伝子配列を除去することができる。このように、インビボ組換えによって着目遺伝子に対してヘテロ接合性の子孫が産生する。こうして、トランスジェニックマウスを欠失株マウスと交雑させることによって、後代が産生すると共に、ヒト置換遺伝子配列と部位特異的リコンビナーゼを含有するように変化したマウス染色体を含む細胞が産生し、その結果、マウス標的遺伝子が除去され、細胞の機能的ヒト化が生じる。従って、このようなトランスジェニックマウスは、特定の遺伝子又は遺伝子クラスターに関するヒト化に対してヘテロ接合性となる。
【００６６】
ある実施形態においては、部位特異的リコンビナーゼがリコンビナーゼ株マウスのある組織でのみ発現することが望ましい場合がある。ある遺伝子又は遺伝子クラスターの欠失が致死的であるか又は亜致死性の表現型作用をもたらし得ることは、本技術分野で知られている。また、このような遺伝子をそのヒト等価物で置換しても致死を防止できない場合がある。このような状況下では、部位特異的リコンビナーゼをある組織（例えば、肝臓）でのみ発現させることによって、致死に関する如何なるこのような問題をも克服し得る。これは、特定の遺伝子がある組織において必須である場合、このように部位特異的リコンビナーゼを発現させることによってマウス遺伝子が該組織において存続し得るため、特に有利となる。
【００６７】
本発明のこの様相においては、ＳＳＲはアルブミン−Ｃｒｅであり得る。アルブミン−Ｃｒｅは、ＲＴ部位ＬｏｘＰに作用するＳＳＲ  Ｃｒｅの特定のバリアントである。アルブミン−Ｃｒｅは肝臓においてのみ発現するため、マウス標的配列を肝臓以外の全ての組織で存続させることができ、致死に関する潜在的な問題を克服する一方、機能的にヒト化された肝臓が得られる。
【００６８】
最終的には、上述の方法によって作出した２種のヘテロ接合体マウスを交雑させて、着目遺伝子のヒト対立遺伝子に対してホモ接合性のトランスジェニックマウスを作出することができる。２種のヘテロ接合体トランスジェニックマウスの交雑によって、ヒト化対立遺伝子に対してホモ接合性の後代の一部が産生するであろう。
【００６９】
本発明の更なる実施形態においては、以降に開示の方法によって、トランスジェニック非ヒト動物を上述の特徴を全て有するように新しく作出する。
【００７０】
また、部位特異的組換えイベントを体細胞において行うことも可能であり、その後、該細胞をＷＯ００／５１４２４の方法におけるクローン化マウス又はそのバリアントのコロニーを形成するために核移植ドナーとして用いることができる。
【００７１】
本発明の他の実施形態においては、本発明に係るトランスジェニック動物は交雑によって作出する。例えば、不要な配列をＲＴ部位間に未だに含むマウスをＳＳＲ酵素を発現するマウスと交雑させることができる。
【００７２】
本発明の更なる実施形態においては、以降に開示の方法によって、トランスジェニックマウスを上述の特徴を全て有するように新しく作出する。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態においては、Ｉ型ＲＴ部位、ＩＩ型ＲＴ部位、ＩＩＩ型ＲＴ部位及びＩＶ型ＲＴ部位はいずれも同じではなく、各型のＲＴ部位は他の型のＲＴ部位の各々に対して異種特異的であって、ＲＴ部位のいずれも型の異なる他のＲＴ部位とは相互作用できないようになっている。
【００７４】
好ましいリコンビナーゼタンパク質は、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｄｒｅリコンビナーゼ、ジゴサッカロマイセス・ルキシープラスミドｐＳＲｌ由来のＲリコンビナーゼ、クルイベロマイセス・ドロソフィラリウムプラスミドｐＫＤ１由来のリコンビナーゼ、クルイベロマイセス・ワルティープラスミドｐＫＷ１由来のリコンビナーゼ、バチルストランスポゾンＴｎ４４３０由来のＴｒｐＩ、λＩｎｔ組換え系のいずれかの成分、ｐｈｉＣ３１、Ｇｉｎ組換え系のいずれかの成分、及びこれらのバリアントから成る群から選択される。このリストはほんの一例として挙げたに過ぎず、これらに限定されない。
【００７５】
部位特異的組換え部位は、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ５１１、Ｆ３及びＦＲＴから選択されることが好ましい。
【００７６】
本発明の一様相においては、Ｉ型ＲＴ部位はｌｏｘＰである。本発明の他の様相においては、ＩＩ型ＲＴ部位はｌｏｘ５１７１である。本発明の他の様相においては、ＩＩＩ型ＲＴ部位はＦＲＴである。本発明の更なる様相においては、ＩＶ型ＲＴ部位はＦ３である。当業者であれば、これらのＲＴ部位は互いに交換可能であり、ｌｏｘ１５１７がＩ型、ｌｏｘＰがＩＩ型等となり得ることは理解されよう。また、いずれのＲＴ部位の如何なる他の異種特異的変異体も用いることができる。例えば、ｌｏｘＰの如何なる異種特異的変異体（例えば、ｌｏｘ５１１）も用いることができる。
【００７７】
ベクター
異種置換遺伝子配列はベクター上の宿主細胞に導入することが好ましい。上述のように、ベクターは通常のクローニングベクター、バクテリア人工染色体又は酵母人工染色体であることが好ましい。ベクターはＢＡＣであることが好ましい。
【００７８】
上述のように、必要に応じてベクターは異種置換遺伝子配列を含むが、これは一以上の遺伝子又は遺伝子セグメントを含み得る。また、異種置換遺伝子配列は一以上の遺伝子又は遺伝子セグメントに関連する調節領域も含み得る。また、ベクターは、一以上の選択可能マーカーと異種置換遺伝子配列に隣接するＩ型ＲＴ部位及びＩＩ型ＲＴ部位も含む。
【００７９】
内在性宿主遺伝子標的配列
本発明の宿主細胞は、相同組換えが生じ得る如何なる原核細胞又は真核細胞（例えば、細菌や酵母、動物細胞、植物細胞）であってもよい。しかし、宿主細胞は真核細胞であることが好ましく、幹細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）であることがより好ましい（Takahashiら、Nat Protoc. 2007; 2(12): 3081-9; Yamanaka, Cell Prolif. 2008 Feb;41 Suppl 1: 51-6参照）。本発明の一様相においては、宿主胚性幹細胞は哺乳動物幹細胞（例えば、哺乳動物ＥＳ細胞）である。本発明の更なる様相においては、哺乳動物胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞である。
【００８０】
本発明は、当業者には明らかであろう多数の遺伝子の如何なる１種を用いても実施することができる。宿主細胞標的と異種置換との間で交換し得る遺伝子の種類に対しては技術的な制限はない。本明細書においては、本発明をＰ４５０遺伝子クラスターを用いて説明するが、ここではマウスＣｙｐ３Ａ、Ｃｙｐ２Ｃ又はＣｙｐ２Ｄクラスターをヒト等価クラスターで置換する。Ｐ４５０遺伝子はヒト化（特にヌルバックグラウンド上）に関する興味深い候補であるが、それは、このような系によって、薬物分子に対するヒト代謝応答を競合するマウス系からの干渉無しに評価することができるためである。遺伝子は非常に大きいことが多いが、通常、同様の機能を有するファミリーにおいて一緒にクラスターを形成している。よって、本発明の方法は、このようなヒト化系の研究に対して特に十分に役立つ。
【００８１】
従って、宿主細胞標的遺伝子の発現産物は、異種置換遺伝子と同様、同等、等価又は同一の機能を保持していることが好ましい。これらの遺伝子は機能的に等価、及び／又は構造的に相同であり得る。例えば、宿主細胞標的遺伝子と異種置換遺伝子は相同度（a degree of homology）を有し得る。このような相同性は、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は９５％超であることが好ましい。
【００８２】
当業者には明らかであろうが、宿主細胞染色体から除去された内在性宿主遺伝子標的配列は、Ｉ型ＲＴ部位（これは組換えてその間に含まれるＤＮＡセグメントを除去する）の位置によって定められる。Ｉ型ＲＴ部位の位置は、宿主細胞染色体とＩ型ＲＴ部位を含む外因性ＤＮＡセグメントとの間の相同領域の位置に依存する。従って、如何なる数の遺伝子又は遺伝子セグメントであっても、本発明の方法を用いて宿主細胞染色体から除去し得ることは当業者には明らかであろう。
【００８３】
また、Ｉ型ＲＴ部位の位置に応じて、内在性宿主遺伝子標的配列に関連する調節領域は除去され得るか、又は宿主細胞染色体内に残存し得る。内在性宿主遺伝子標的配列に関連する調節領域が宿主細胞染色体内に残存する場合、該領域は異種置換遺伝子配列と作用的に連結する（operatively linked）ようになることがある。このアプローチの利点は、内在性遺伝子の発現パターンが見られ、遺伝子発現が未改変宿主細胞内と同様に制御されることである。これは、宿主細胞内で通常発現しない遺伝子にとっては重要な意味を持つ。
【００８４】
異種置換遺伝子配列
異種置換遺伝子配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれら２種の混合物を含むことが好ましい。ゲノムＤＮＡは、スプライシングの忠実度が保持されるため、多くの状況下で有利である。しかし、配列の残部がｃＤＮＡであり得るように、大半のスプライスイベントが生じるイントロンを保持することのみが必要とされ得る。これによって、特にゲノムＤＮＡが大きなイントロンを含む場合には、クローニングプロセスを簡単にすることができるが、このような場合、スプライスアイソフォームがゲノムＤＮＡのこの領域でコードされなければ、より大きなイントロンは含まれ得ない。
【００８５】
異種置換遺伝子配列がベクター内に存在するＩ型ＲＴ部位及びＩＩ型ＲＴ部位の位置によって定められることは理解されようが、これら２種のＲＴ部位間の全核酸配列は、宿主細胞染色体内に存在する対応ＲＴ部位との組換えの際に宿主細胞染色体に挿入される。従って、異種置換遺伝子配列は、遺伝子セグメント、全遺伝子又は多数の遺伝子に対応し得る。
【００８６】
異種置換遺伝子配列は遺伝子又は遺伝子セグメントに関連する調節配列を含み得る。従って、このような調節配列は異種置換遺伝子配列の一部として宿主細胞染色体に挿入される。調節配列は、異種遺伝子又は遺伝子セグメントに通常関連する調節配列であり得るが、該遺伝子又は遺伝子セグメントは、該遺伝子又は遺伝子セグメントを通常制御する調節配列の制御下のままである。これは、異種置換遺伝子配列が通常発現するのと同様に宿主細胞内で発現することができるため、有利となり得る。しかし、上述のように、発現上の問題を生じることもあり得る。
【００８７】
他の実施形態においては、遺伝子又は遺伝子セグメントに関連する調節配列は、異種置換遺伝子配列内に含まれる遺伝子又は遺伝子セグメントとは通常関連しない異種配列であり得る。この実施形態においては、調節配列は組織特異的調節配列（例えば、アルブミンプロモーター、アポＥプロモーター又はビリンプロモーターを含む調節配列が挙げられるが、これに限定されない）であり得る。
【００８８】
本発明の一様相においては、異種置換遺伝子配列は哺乳動物遺伝子配列である。
【００８９】
本発明の更なる様相においては、哺乳動物置換遺伝子配列はヒト置換遺伝子配列である。
【００９０】
ノックアウト株の提供
本発明の方法においては、特定の内在性遺伝子又は遺伝子クラスターのノックアウトを含む細胞株を作出することができる。一実施形態においては、内在性遺伝子又は遺伝子クラスターはシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーである。その例としては、Ｃｙｐ３ａ、Ｃｙｐ２ｃ及びＣｙｐ２ｄクラスターが挙げられる。
【００９１】
ノックアウト細胞株は安定であることが好ましい。「安定」とは、ノックアウト細胞株が細胞培養において生存可能な形態で最低でも１週間は維持され得ることを意味する。他の実施形態においては、ノックアウト細胞株は、生存可能な形態で最低でも２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間又はそれ以上維持され得る。別の見方をすれば、安定な細胞株とは、生存可能なままで少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも５０回、少なくとも１００回、少なくとも２００回又はそれ以上継代され得る細胞株である。
【００９２】
一実施形態においては、ノックアウト細胞株の作出に用いる細胞株は哺乳動物細胞株である。他の実施形態においては、哺乳動物細胞株はマウス細胞株である。更なる実施形態においては、マウス細胞株はマウス幹細胞株である。更なる実施形態においては、マウス幹細胞株はマウスＥＳ細胞株である。
【００９３】
安定なノックアウト細胞株の作出は、上述の方法による異種置換遺伝子配列の挿入にこのような予備調製ノックアウト細胞株を用いることができるため有利である。この予備調製ノックアウト細胞株によって、異種置換遺伝子配列の挿入時にＥＳ細胞で行う段階を少なくすることができるため、形質転換の効率が上昇すると共に、正しく標的化されるクローンの頻度が増加する。
【００９４】
ノックアウト細胞株からのヒト化細胞株の作出
上述のノックアウト細胞株は、上述の方法によって異種置換遺伝子配列又は遺伝子クラスターを挿入するための宿主細胞株として用いることができる。一実施形態においては、異種置換遺伝子配列は哺乳動物異種置換遺伝子配列又は遺伝子クラスターである。他の実施形態においては、哺乳動物異種置換遺伝子配列はヒト異種置換遺伝子配列又は遺伝子クラスターである。更なる実施形態においては、ヒト異種置換遺伝子配列はシトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーをコードする。シトクロムＰ４５０ファミリーのメンバーは、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ２Ｃ又はＣＹＰ２Ｄ遺伝子又は遺伝子クラスターであり得る。ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ２Ｃ及びＣＹＰ２Ｄ遺伝子の例としては、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９又はＣＹＰ２Ｄ６が挙げられる。
【００９５】
好ましい実施形態においては、異種置換遺伝子配列を挿入するために宿主細胞株として用いるノックアウト細胞株は、異種置換遺伝子配列内に含まれる遺伝子又は遺伝子クラスターに対応する遺伝子又は遺伝子クラスターのノックアウトを含む。
【００９６】
ノックアウト細胞株への挿入に用いる異種置換遺伝子配列は、上述の異種置換遺伝子配列と同じであり得る。一実施形態においては、異種置換遺伝子配列は、遺伝子又は遺伝子クラスターに関連する調節要素を含み得る。一実施形態においては、このような調節要素は、異種置換遺伝子配列内に含まれる遺伝子又は遺伝子クラスターに対して内在的である。他の実施形態においては、調節要素は組織特異的な調節要素であり得る。組織特異的な調節要素の例としては、アルブミン、アポＥ及びビリンプロモーターが挙げられる。
【００９７】
トランスジェニック生物
本発明の他の様相においては、上述の本発明の実施形態のいずれか一の方法によって作出されたトランスジェニック生物が提供される。このような生物は、異種置換遺伝子配列を内在性宿主遺伝子標的配列が先に占めていた位置において含み、対応する内在性宿主遺伝子標的配列が欠失されている。
【００９８】
本発明の更なる様相においては、トランスジェニック生物はトランスジェニック哺乳動物であり、欠失された内在性宿主遺伝子標的配列は哺乳動物遺伝子標的配列である。
【００９９】
本発明の更なる様相においては、トランスジェニック哺乳動物はトランスジェニックマウスであり、欠失された内在性宿主遺伝子標的配列はマウス遺伝子標的配列である。
【０１００】
本発明の更なる様相においては、異種置換遺伝子配列は哺乳動物異種置換遺伝子配列であり、本発明の更なる様相においては、異種置換遺伝子配列はヒト置換遺伝子配列である。
【０１０１】
本発明の更なる様相においては、変化した幹細胞（例えば、異種置換遺伝子配列を含む本発明のＥＳ細胞）を胚盤胞に挿入することができる。従来、胚盤胞は胚性幹細胞に対応した種の雌性哺乳動物から交配の約３日後に単離している。最大２０個の変化した胚性幹細胞（好ましくは、約１６個）をそのような胚盤胞に同時に挿入し得ることは理解されよう。変化した胚性幹細胞を胚盤胞に挿入することにより、好ましくは、妊娠哺乳動物の特性を反映するように誘導された偽妊娠哺乳動物に移植することによって、胚性幹細胞は発育初期胚に組込まれるようになる。この方法によると、変化した胚性幹細胞を含む胚盤胞は偽妊娠哺乳動物の子宮壁内に移植され、妊娠期間が終了するまで該哺乳動物内で発育し続ける。変化した胚性幹細胞は増殖し、分裂して発育トランスジェニック哺乳動物の全組織（生殖系列を含む）に定着するようになる。
【０１０２】
本発明の方法の一様相においては、作出したトランスジェニック哺乳動物は、各体細胞組織内及び生殖系列内に変化した細胞と未変化の細胞を含むキメラとなり得る。図４に示すように、偽妊娠哺乳動物は偽妊娠マウスであり、変化した細胞はマウス胚性幹細胞であることが好ましい。
【０１０３】
本発明の方法の更なる様相においては、上述の方法によって作出したキメラトランスジェニック哺乳動物を上述の方法によって作出した他のキメラトランスジェニック哺乳動物と交雑させることができ、得られた後代を試験して、挿入された異種遺伝子置換配列に関してホモ接合性の哺乳動物を同定することができる。挿入された異種置換遺伝子配列に関してホモ接合性の哺乳動物を同定するのに用いることのできる方法は、当業者には明らかであろう。例として、ホモ接合体の同定は、哺乳動物の尾端を採取し、着目ゲノムの部分をＰＣＲ増幅し、着目遺伝子クラスターの配列を決定して行うことができるが、これに限定されない。或いは、異種遺伝子置換配列に特異的なプローブを用いてホモ接合体を同定することもできる。
【０１０４】
哺乳動物ノックアウト細胞株から得た細胞株を用いた単一又は多重ヒト化哺乳動物株の作出
本発明の他の実施形態においては、上述のように宿主細胞が哺乳動物ノックアウト細胞株である、上述の方法のいずれかによって作出された単一又は多重ヒト化哺乳動物株が提供される。このような生物は、ノックアウト細胞株が作出される前に内在性宿主遺伝子標的配列が先に占めていた位置に異種置換遺伝子配列を含む。
【０１０５】
一実施形態においては、ヒト化哺乳動物はマウスである。
【０１０６】
本発明の更なる様相においては、ヒト化幹細胞（例えば、本発明によって作出したノックアウト細胞株から得た、異種置換遺伝子配列を含むＥＳ細胞）を胚盤胞に挿入することができる。従来、胚盤胞は雌性哺乳動物から交配の約３日後に単離している。最大２０個の変化した胚性幹細胞（好ましくは、約１６個）をそのような胚盤胞に同時に挿入し得ることは理解されよう。変化した胚性幹細胞を胚盤胞に挿入することにより、好ましくは、妊娠哺乳動物の特性を反映するように誘導された偽妊娠哺乳動物に移植することによって、胚性幹細胞は発育初期胚に組込まれるようになる。この方法によると、変化した胚性幹細胞を含む胚盤胞は偽妊娠哺乳動物の子宮壁内に移植され、妊娠期間が終了するまで該哺乳動物内で発育し続ける。変化した胚性幹細胞は増殖し、分裂して発育トランスジェニック哺乳動物の全組織（生殖系列を含む）に定着するようになる。
【０１０７】
本発明の方法の一様相においては、作出したトランスジェニック哺乳動物は、各体細胞組織内及び生殖系列内に変化した細胞と未変化の細胞を含むキメラとなり得る。
【０１０８】
本発明の一様相においては、キメラトランスジェニック哺乳動物は、シトクロムＰ４５０ファミリーに属する遺伝子又は遺伝子クラスターに関してヒト化することができる。他の様相においては、シトクロムＰ４５０ファミリーはＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ２Ｃ又はＣＹＰ２Ｄ遺伝子又は遺伝子クラスターであり得る。更なる様相においては、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ２Ｃ又はＣＹＰ２Ｄ遺伝子はＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９又はＣＹＰ２Ｄ６であり得る。他の様相においては、キメラトランスジェニック哺乳動物は、組織特異的プロモーターの制御下でヒトＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９又はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子クラスターを含み得る。更なる様相においては、組織特異的プロモーターはアルブミン、アポＥ又はビリンプロモーターであり得る。上で詳述したように、これは、ある組織においてその欠失が致死的であるか又は亜致死性の表現型作用をもたらし得る遺伝子又は遺伝子クラスターにとっては有利となり得る。
【０１０９】
本発明の方法の更なる様相においては、上述の方法によって作出したキメラトランスジェニック哺乳動物を上述の方法によって作出した他のキメラトランスジェニック哺乳動物と交雑させることができ、得られた後代を試験して、挿入された異種遺伝子置換配列に関してホモ接合性の哺乳動物を同定することができる。挿入された異種置換遺伝子配列に関してホモ接合性の哺乳動物を同定するのに用いることのできる方法は、当業者には明らかであろう。例として、ホモ接合体の同定は、哺乳動物から組織サンプル（例えば、尾端）を採取し、着目ゲノムの部分をＰＣＲ増幅し、着目遺伝子クラスターの配列を決定して行うことができるが、これに限定されない。或いは、異種遺伝子置換配列に特異的なプローブを用いてホモ接合体を同定することもできる。
【０１１０】
更なる実施形態においては、種々の遺伝子又は遺伝子クラスターに関してヒト化したキメラ又はヒト化哺乳動物同士を交雑させて多重ヒト化哺乳動物株を作出することができる。一実施形態においては、ＣＹＰ３Ａ４に関してヒト化したＣｙｐ３ａノックアウト、ＣＹＰ３Ａ５に関してヒト化したＣｙｐ３ａノックアウト、ＣＹＰ２Ｃ９に関してヒト化したＣｙｐ２ｃノックアウト、ＣＹＰ２Ｃ１９に関してヒト化したＣｙｐ２ｃノックアウト又はＣＹＰ２Ｄ６に関してヒト化したＣｙｐ２ｄノックアウトの１種以上を交雑させることができる。他の実施形態においては、ヒト化哺乳動物の２種、３種、４種又は５種を交雑させることができる。更なる実施形態においては、ヒト遺伝子クラスターの１種以上は組織特異的プロモーターの制御下にあり得る。更なる実施形態においては、ヒト遺伝子クラスターの２種、３種、４種又は５種は組織特異的プロモーターの制御下にあり得る。更に他の実施形態においては、ヒト遺伝子クラスターの１種以上はアルブミン、アポＥ又はビリンプロモーターの制御下にあり得る。更なる実施形態においては、ヒト遺伝子クラスターの２種、３種、４種又は５種はアルブミン、アポＥ又はビリンプロモーターの制御下にあり得る。
【０１１１】
本発明の更なる様相においては、種々の遺伝子又は遺伝子クラスターに関してヒト化したキメラ又はホモ接合ヒト化哺乳動物の１種以上を交雑させて二重、三重、四重又は五重ヒト化哺乳動物株を作出することができる。単一ヒト化哺乳動物株の作出について上述したように、二重、三重、四重又は五重ヒト化に関してホモ接合性の哺乳動物株を作出するには更なる交雑と試験が必要となり得る。
【０１１２】
更なる実施形態においては、内在性Ｃｙｐ３ａ及びＣｙｐ２ｃ遺伝子クラスターがノックアウトされ、ヒトＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子が挿入された四重ヒト化哺乳動物株が作出される。他の実施形態においては、上述のヒト遺伝子の１種以上は組織特異的プロモーターの制御下にある。更なる実施形態においては、ヒト遺伝子の２種、３種又は４種は組織特異的プロモーターの制御下にあり得る。更に他の実施形態においては、ヒト遺伝子の１種以上はアルブミン、アポＥ又はビリンプロモーターの制御下にあり得る。更なる実施形態においては、ヒト遺伝子の２種、３種又は４種はアルブミン、アポＥ又はビリンプロモーターの制御下にあり得る。
【０１１３】
この哺乳動物ヒト化に対するアプローチは、予備調製したノックアウト哺乳動物ＥＳ細胞を用いた四重ヒト化哺乳動物株の作出が可能となるため、四重ヒト化哺乳動物株の作出に用いる先の方法と比較して必要とする労力が実質的に少なくなるので有利である。実際、本発明の方法を用いて四重ヒト化哺乳動物株を作出するのに必要な段階の数は、従来の方法を用いて二重ヒト化哺乳動物株を作出するのに必要な段階の数と同等である。この段階数の削減によってヒト化哺乳動物株の作出の効率が上昇する。
【０１１４】
また、このアプローチをヒトＣｙｐ遺伝子クラスターの種々のポリマーバリアントと共に用いて、ヒト個体群に存在するＣｙｐ遺伝子クラスターの対立遺伝子全てを網羅することができる。
【０１１５】
また、このアプローチを用いて、シトクロムＰ４５０遺伝子ファミリーの遺伝子とは異なる遺伝子又は遺伝子クラスターに関してヒト化した多重ヒト化哺乳動物株を作出することができる。このような遺伝子の例としては、ＰＸＲやＣＸＲが挙げられる。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：Ｃｙｐ３ａクラスターノックアウト
Ｃｙｐ３ａクラスターターゲティングベクターの構築
ハイグロマイシン、チミジンキナーゼ（ＴＫ）及びＺｓＧｒｅｅｎ発現カセットとｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１７１及びｆｒｔ部位を含む第１のベーシックターゲティングベクター（Ｃｙｐ３ａ５７）をｐブルースクリプト（ｐＢＳ）内に構築した。マウスＣｙｐ３ａ５７遺伝子の翻訳開始部位のすぐ上流の５．５ｋｂのゲノム配列とＣｙｐ３ａ５７のイントロン２内に位置する３．３ｋｂの断片（両方とも相同組換え用ターゲティングアームとして用いた）は、Zhangらが１９９８年に示したように（Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J.P., and Stewart, A.F. 1998. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat Genet 20:123-128.）ＥＴクローニングによって得た後、図５Ｃに示すようにベーシックターゲティングベクターにサブクローン化した。
【０１１７】
ＡＴＧ欠損ネオマイシン（５’ΔＮｅｏ）と、ＴＫ及びＺｓＧｒｅｅｎ発現カセットと、ｌｏｘＰ及びｆ３部位とを含む第２のベーシックターゲティングベクター（Ｃｙｐ３ａ５９）をｐブルースクリプト（ｐＢＳ）内に構築した。翻訳開始ＡＴＧ及び対応するプロモーターはフレーム内で５’ΔＮｅｏカセットからｌｏｘＰ部位によって分離しており、ｌｏｘＰ部位によってコードされる更なるアミノ酸がネオマイシンのＮ末端に融合して機能性タンパク質を生じさせ、発現の際にＧ４１８耐性がもたらされるようにする。マウスＣｙｐ３ａ５９遺伝子のエクソン４を含む４．３ｋｂのゲノム配列とＣｙｐ３ａ５９のエクソン５〜８を含む５．８ｋｂの断片（両方とも相同組換え用ターゲティングアームとして用いた）はZhangらが１９９８年に示したようにＥＴクローニングによって得た後、図５Ｃに示すようにベーシックターゲティングベクターにサブクローン化した。
【０１１８】
標的化ＥＳ細胞の作出及び分子キャラクタリゼーション
ＥＳ細胞の培養と標的変異誘発は、Hoganらが１９９４年に先述したように（Hogan, B.L.M., Beddington, R.S.P., Costantini, F., and Lacy, E. 1994. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbour Press.）行った。
【０１１９】
ターゲティングベクター（Ｃｙｐ３ａ５７）をＮｏｔＩで直線化し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスＥＳ細胞株に電気穿孔した。標準的なサザンブロット解析でスクリーニングした３６０個のハイグロマイシン耐性を有する蛍光陰性ＥＳ細胞コロニーの内、１個の正しく標的化されたクローン（Ｂ−Ｇ１２）を同定し、拡大させ、種々の好適な制限酵素と、５’及び３’外部プローブと、内部ハイグロマイシンプローブとを用いたサザンブロット解析によって更に解析した。このクローンは両方の相同アームで正しく標的化され、更なるランダムな組み込みがないことが確認された（データは示さず）。
【０１２０】
第２のターゲティングベクター（Ｃｙｐ３ａ５９）をＮｏｔＩで直線化し、上述の正しく標的化されたＣｙｐ３ａ５７ＥＳクローンＢ−Ｇ１２に電気穿孔した。標準的なサザンブロット解析でスクリーニングした２７１個のＧ４１８耐性を有する蛍光陰性ＥＳ細胞コロニーの内、１個の正しく標的化されたクローン（Ａ−Ｂ５）を同定し、拡大させ、上述のサザンブロット解析によって更に解析した。このクローンは両方の相同アームで正しく標的化され、更なるランダムな組み込みがないことが確認された（データは示さず）。
【０１２１】
図５Ｄに示すように、これらのターゲティング反応によって、Ｃｙｐ３ａ遺伝子クラスターは一端でＣｙｐ３ａ５７ターゲティングベクター配列に隣接し、他端でｙｐ３ａ５９ターゲティングベクター配列に隣接した。
【０１２２】
二重標的化ＥＳ細胞におけるＣｙｐ３ａクラスターのＣｒｅ介在インビトロ欠失
二重標的化ＥＳ細胞におけるＣｙｐ３ａクラスターのＣｒｅ介在欠失を行うため、クローンＡ−Ｂ５（上述参照）由来の１×１０7個のＥＳ細胞を、Seiblerらが２００５年に先述したように（Seibler J, Kuter-Luks B, Kern H, Streu S, Plum L, Mauer J, Kuhn R, Bruning JC and Schwenk F (2005) Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res 33(7):e67.）Ｃｒｅ発現プラスミドｐＣＡＧＧＳｃｒｅｐＡで電気穿孔し、１０ｃｍのディッシュ上に１×１０5個の細胞及び５×１０5個の細胞をそれぞれ蒔き、２μＭのガンシクロビル（カルバイオケム、ドイツ）を用いて選択した。この選択後に約１００種のクローンが生存したが、これは、クローンＡ−Ｂ５内の同一対立遺伝子上でのＣｙｐ３ａ５７及びＣｙｐ３ａ５９のターゲティングを示すと共に、ガンシクロビルに対する耐性を付与するＴＫ発現カセットの欠損によって分かるようにマウスクラスターの欠失が成功したことを示す。耐性クローンを９６ウェルプレートの個々のウェルに移し、拡大させ、プライマー５’−ＧＡＣＡＴＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣ−３’及び５’−ＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＣＴＴＧＧＡＧＧ−３’を用いたＰＣＲによってＣｙｐ３ａ遺伝子クラスターの欠失に関して更に解析した。両方のプライマーを図５Ｅに黒い矢印で示すが、Ｃｙｐ３ａクラスターのＣｒｅ介在欠失によってのみ該プライマーが染色体上で十分近くにもたらされ、ＰＣＲで検出される３１９ｂｐの断片が生じる。ＰＣＲによって解析された８種のガンシクロビル耐性ＥＳ細胞クローンの内の７種が予想された３１９ｂｐのバンドを示し、これらのクローンにおいてはＣｙｐ３ａクラスターの欠失が成功したことが確認された。Ｃｙｐ３ａクラスター欠失マウス染色体の概略構造を図５Ｅに示す。
【０１２３】
実施例２：Ｃｙｐ３ａクラスターヒト化
改変ヒトＢＡＣの構築
改変ヒトバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）は、２段階の別々のＥＴクローニングによって作出したが、これによって、必要な選択カセットと部位特異的組換え部位がＢＡＣ内に導入された。
【０１２４】
ヒト化ＥＳ細胞の作出及び分子キャラクタリゼーション
ＥＳ細胞の培養と標的変異誘発は、実施例１に記載したように行った。改変ヒトＢＡＣと実施例１に記載のＣｒｅ発現プラスミドｐＣＡＧＧＳｃｒｅｐＡを、実施例１に記載の親クローンＡ−Ｂ５由来の１×１０7個のＣｒｅ欠失ＥＳ細胞に電気穿孔した。次に、１０ｃｍのディッシュ上に１×１０5個及び５×１０5個の電気穿孔ＥＳ細胞をそれぞれ蒔き、Ｇ４１８を用いて選択した。この選択後に７種のクローンが生存したが、これは、ｌｏｘＰ部位において組換えが成功したことを示す。ヒトＢＡＣにおけるネオマイシンカセットはプロモーターを持たず、５’末端において切断されているため、Ｇ４１８耐性はｌｏｘＰ部位による塩基対の正確な組み込みによってのみ得ることができる。７種のＧ４１８耐性クローンの内、３種を拡大させ、ＰＣＲ及びサザンブロット解析による解析を更に行った。図７Ｂに示すように、３種のクローンは全てヒトＢＡＣの両端で正しく標的化されていることが確認され、また、図８Ｂに示すように、３種のクローンの内の１種においては更なる組み込みが見られた。
【０１２５】
実施例３：ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスの解析
本実施例においては、Ｃｙｐａ３ａノックアウトマウス株と本発明の方法によって作出したｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７  Ｃｙｐ３ａノックアウトマウス株との比較を行う。ｈＣＹＰ３Ａ４  Ｃｙｐ３ａノックアウトマウス株に関するデータは「２段階のクラスター欠失及びヒト化」戦略によって作出するが、これは比較のみに用いる。この方法は本発明の一部を構成しない。
【０１２６】
ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７  Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの作出
マウスＣｙｐ３ａをヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子でゲノム交換してＥＳ細胞クローンを作出するため、ＢＡＣクローンＲＰ１１−７５７Ａ１３（ＩｍａＧｅｎｅｓ  ＧｍｂＨ、ロベルト−レッスル通１０、１３１２５、ドイツ、ベルリン、ＩｍａＧｅｎｅｓクローンＩＤ：ＲＰＣＩＢ７５３Ａ１３７５７Ｑ）をｒｅｄ／ＥＴ組換え工学（recombineering）によって改変し、ＢＡＣ内の既存のｌｏｘ部位が適切に配置されたｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１７１部位によって置換され、ハイグロマイシン及び５’欠損ネオマイシン選択カセットが導入されるようにした。これによって、上述のように、Ｃｒｅ介在組換えによる改変ＢＡＣを調製済Ｃｙｐ３ａ欠失ＥＳ細胞クローンの対応するｌｏｘ部位において挿入すると共に、プロモーターとＡＴＧを欠失Ｃｙｐ３ａ遺伝子座に残したまま欠損ネオマイシンカセットを補完することによって、正しく標的化されたクローンを高い厳密性で選択することができた。更に、異種特異的フリッパーゼリコンビナーゼ（Ｆｌｐ）認識部位であるｆｒｔとｆ３をＢＡＣに導入して、続くＦｌｐ介在組換えによるインビボでのハイグロマイシン及びネオマイシン選択カセットの除去を可能とし、また、ポリＡモチーフを用いて、欠失していない内在性マウスＣｙｐ３ａ５７プロモーターから開始する如何なる潜在的な転写をも終了させた。
【０１２７】
親クローンＡ−Ｂ５に由来するＣｙｐ３ａ欠失サブクローンを用い、Ｃｒｅ介在組換えによってヒトＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７を有する改変ＢＡＣを挿入した。この目的のため、１×１０7個の細胞を標準的な条件下、約３０μｇのスーパーコイルＢＡＣ  ＤＮＡと１２μｇの上述（４０）のＣｒｅ発現プラスミドｐＣＡＧＧＳｃｒｅｐＡによって電気穿孔し、Ｇ４１８を用いて選択した。この電気穿孔手続き後に７種のＧ４１８耐性ＥＳ細胞クローンを得た。これらのクローンの内の３種を拡大し、種々の好適な制限酵素、５’及び３’外部プローブ及び内部ネオマイシンプローブを用い、ＰＣＲとサザンブロットによって更に解析した。３種のクローンは全て、両方のｌｏｘ部位で正しく組換えられており、更なるランダムな組み込みを有しないことが確認された（データは示さず）。また、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７  Ｃｙｐ３ａノックアウトマウスの作出に用いたＥＳ細胞クローン内のＣＹＰ３Ａ４エクソンの配列を決定し、コード領域が承認された参照配列（http://www.cypalleles.ki.se/cyp3a4.htm）と一致するのを確認した。
【０１２８】
触媒活性アッセイ
一株当たり３匹の雄性ホモ接合体マウスを通して用いた。２匹のマウスには５−プレグネン−３β−オール−２０−オン−１６α−カルボニトリル（ＰＣＮ）を投与し（１００ｍｇ／ｋｇ／２日間投与／ＩＰ）、１匹のマウスには媒体（コーン油）を投与した。触媒活性はトリアゾラム酸化、ＤＢＦ酸化及びＢＱ酸化を用いて評価した。野生型（ＷＴ）及びＣｙｐ３ａＫＯマウスを対照として用いた（ＷＴ、プール（ｎ＝３）、Ｃｙｐ３ａＫＯ（ｎ＝１〜２））。最終投与から２４時間後にマウスを殺した。肝ミクロソーム及び十二指腸ミクロソームをＣＹＰ３Ａ４発現及び触媒活性について解析した。この研究の結果を表１及び図１５〜１８に示す。
【０１２９】
ＣＹＰ３Ａ４ヒト化マウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによる７−ベンジルオキシキノリン（７−ＢＱ）のインビトロ酸化からは、Ｃｙｐ３ａノックアウトマウス由来のミクロソームと比較して有意差は見られなかった。これはウェスタンブロッティングデータとは一致せず、ヒト化株の肝臓及び小腸の両方（特にＰＣＮ処理マウス由来のサンプル）におけるＣＹＰ３Ａ４タンパク質の発現を示唆した。また、プールされたヒト肝ミクロソームによる７−ＢＱ酸化の速度は、対照Ｃ５７ＢＬ１６Ｊマウスの肝ミクロソームによって触媒される反応速度に比べ顕著に低かった。従って、７−ＢＱに加えて、他のＣＹＰ３Ａ４特異的蛍光基質ＤＢＦについて検討した。
【０１３０】
【表１】
2011515098.tif 000003
【０１３１】
低レベルの基礎ＣＹＰ３Ａ４ｍＲＮＡが確認されたが、これはタンパク質に翻訳されなかった。この株においてＰＣＮ誘導ＣＹＰ３Ａ４タンパク質発現が確認されたが、これはヒトと同程度であった。ＣＹＰ３Ａ４は、Ｃｙｐ３ａＫＯマウスと比較して、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスにおいて触媒的に活性である。これらの結果から、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス株で発現するＣＹＰ３Ａ４タンパク質は機能的であることが分かる。ＣＹＰ３Ａ４タンパク質／ｍＲＮＡは確認されたがＣＹＰ３Ａ７は確認されなかったことから、ＣＹＰ３Ａの発育調節におけるこのモデルの新しい有用性が示唆される。ＣＹＰ３Ａ４の触媒活性は、Ｃｙｐ３ａＫＯマウスと比較して、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスにおいて高い。インビトロ代謝研究から、マウスのＣｙｐ３ａタンパク質によって、ヒトと比較してマウス特異的代謝のレベルが遙かに高くなり、これは好ましくない毒物学的意味を有することが分かった。これらの結果から、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス株は機能的であることが分かる。
【０１３２】
体重及び肝臓重量
６匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ハーラン（英国）から入手）、３匹のｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス、３匹のｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及び３匹のＣｙｐ３ａＫＯマウス（タコニク・アルテミス（ドイツ）より供給）を用いて更なる研究を行った。用いたマウスは全て雄性であった。到着時には、マウスは底の硬いポリプロピレンケージ内のおがくず上に収容されていた。処理時には環境性を高める材料は用いなかった。
【０１３３】
動物飼育室においては、げっ歯動物の収容及び管理のためにホームオフィスで必要な条件がもたらされるように環境を管理した。温度は１９〜２３℃の範囲内に維持し、相対湿度は４０〜７０％の範囲内に維持した。計画通りに１時間当り１４〜１５回換気を行った。１２時間の点灯と１２時間の消灯とを繰り返した。この研究においては、特別なケージ構成は用いなかった。試験施設に到着後最低５日間はマウスを環境に慣化させた。
【０１３４】
マウスには耳に穴をあけ、尾部にマーキングをして独自に番号を付け、表２に示すように各グループに割り当てた。実験カードを各ケージに付け、計画ライセンスコード、実施した処理、研究番号、性別及びケージ内のマウスの個々の番号を記載した。
【０１３５】
【表２】
2011515098.tif 000004
【０１３６】
研究開始前に全てのマウスを観察し、身体的に正常であると共に正常な活性を示すことを保証した。正常な挙動を示すマウスのみを研究に用いた。個々のマウスにおける如何なる臨床的異常も研究日誌に記録した。通常の状態評価を研究日誌に記録した。
【０１３７】
表３に記載の実験デザインに従い、マウスにはコーン油（媒体）又はＰＣＮ（１００ｍｇ／ｋｇ）を毎日２日間、腹腔内（ＩＰ）注射によって投与した。投与溶液の調製はＣＸＲバイオサイエンシーズにて投与日に必要量のＰＣＮに媒体（コーン油）を添加して行った。ＰＣＮの濃度は供給化学物質の濃度とし、純度の補正は行わなかった。余分な投与溶液は約２〜８℃で保存し、今後行う予定の解析に備えた。投与溶液の量は１０ｍＬ／ｋｇ体重とした。２回目の投与から約２４時間後に、ＣＯ2濃度を上昇させてマウスを安楽死させた。死亡時に心穿刺によって血液を血漿調製用リチウム／ヘパリンコートチューブ内に採取した。
【０１３８】
【表３】
2011515098.tif 000005
【０１３９】
各マウスの体重は研究開始時と終了直前に記録した。体重は電子的に又は手作業で記録し、その重量の記録は研究ファイルに保存した。
【０１４０】
肝臓を計量するため、胆嚢を除去した後、肝臓を摘出して計量した。２個の肝臓サンプル（約５ｍｍ3）を直ちにクライオバイアル内で液体窒素にて急速冷凍した後、約−７０℃で保存してＲＮＡ解析に備えた。残りの肝臓を計量し、直ちに用いて細胞成分分画を行い、ホモジネートとミクロソームを得た。
【０１４１】
表４に示すように、ＰＣＮ投与によってＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓／身体重量比は有意に（Ｐ＜０．００１）増加した。対照マウス及び処理トランスジェニックマウスの肝臓／身体重量比については、各対照グループにトランスジェニックマウスが１匹しかいなかったため、統計的な比較ができなかった。Ｃｙｐ３ａＫＯグループにおいてのみ、この低下に関して統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）が、処理トランスジェニックマウスは全て処理野生型と比較して肝臓／身体重量比の低下を示した。
【０１４２】
【表４】
2011515098.tif 000006
【０１４３】
血漿臨床化学
血漿サンプルは、遠心分離（２０００〜３０００ｒｐｍ、１０分間、８〜１０℃）によって赤血球を除去して得た。上清（血漿）を氷上で保存した後、臨床化学解析を行った。ペレットは廃棄した。全てのマウスの血漿サンプルは、トリグリセリド、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、コレステロール、ビリルビン（総ビリルビン及び直接ビリルビン）、高密度リポタンパク質及び低密度リポタンパク質についてＣＯＢＡＳ  Ｉｎｔｅｇｒａ４００＋（ロシュ）を用いて解析したが、その結果を図１９〜２１に示す。ＰＣＮ処理ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスの血漿サンプルは、処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのサンプルと比較して、コレステロール、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、アラニントランスフェラーゼ及びアルカリホスファターゼのレベルにおいて統計的に有意な上昇を示した。この上昇の生物学的意義については、より大きいグループサイズを用いて調べる必要があろう。他の全てのサンプルの血漿臨床化学パラメータの値は、未処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの公知の正常範囲内であった。未処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血漿臨床化学パラメータの範囲を表５に示す。
【０１４４】
マウス１（対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）及びマウス４（対照ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯ）の血漿はコレステロール解析を行うには不十分であった。
【０１４５】
マウス５（対照ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯ）、マウス８（ＰＣＮ処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）及びマウス１４（ＰＣＮ処理Ｃｙｐ３ａＫＯ）以外の全てのマウスにおける直接ビリルビンは定量限界未満であった。
【０１４６】
【表５】
2011515098.tif 000007
【０１４７】
ＣＹＰ３Ａ４の肝ミクロソーム及び腸ミクロソームのウェスタンブロット解析
十二指腸（胃の底部から最初の１０ｃｍ）を摘出し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ）を含む氷冷ＰＢＳで洗い流した。最初の２ｃｍを１ｍＬのトリゾール（シグマ）を含む２ｍＬのクライオバイアルに入れ、直ちに急速冷凍した後、約−７０℃で保存してＴａｑｍａｎ（登録商標）解析に備えた。残りの十二指腸を１ｍＬのクライオバイアルに入れ、直ちに急速冷凍した後、約−７０°で保存した。
【０１４８】
肝ミクロソームは、新鮮な肝臓から細胞成分画分を調製して得た。上述のように肝臓を処理してホモジネートとミクロソームを得た。肝臓サンプルのアリコートを約−７０°で保存した後に解析を行った。
【０１４９】
冷凍した小腸は、ポリトロンホモジナイザーを用い、プロテアーゼカクテル阻害剤（ロシュ）及びＰＭＳＦ（ｍＭ）を含むＳＥＴにてホモジナイズした。上述のようにホモジネートを細胞成分分画に付した。ミクロソーム画分を約−７０°で保存した後に解析を行った。
【０１５０】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びＣｙｐ３ａＫＯマウスの肝ミクロソームは、ＣＹＰ３Ａ４に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングによって解析したが、その結果を図２２に示す。媒体処理ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームのウェスタンブロット上にＣＹＰ３Ａ４の明確なタンパク質バンドが見られた。対照ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスの肝ミクロソームにおいては、ＣＹＰ３Ａ４のタンパク質レベルは検出限界未満であった。しかし、このマウス株の腸ミクロソームのイムノブロット上には低強度のＣＹＰ３Ａ４タンパク質バンドが見られた。ＰＣＮの投与によって、ヒト化マウスにおいては肝臓ＣＹＰ３Ａ４の強いアップレギュレーションがもたらされた。腸サンプルにおいては、このアップレギュレーションはあまり顕著ではなかった。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＣｙｐ３ａＫＯマウスのミクロソームにおけるＣＹＰ３Ａ４タンパク質のレベルは検出限界未満であった。
【０１５１】
ＣＹＰ３Ａ及びＣｙｐ３ａの肝ミクロソーム及び腸ミクロソームのウェスタンブロット解析
ヒトＣＹＰ３ＡとマウスＣｙｐ３ａアイソフォームの両方に対して親和性を有する抗体を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びＣｙｐ３ａＫＯマウスの肝ミクロソームのウェスタンブロットを解析したが、その結果を図２３に示す。両方のヒト化トランスジェニック株由来のマウス肝臓で検出されたタンパク質発現のレベルは、野生型と比較して有意に低かった。ヒト化トランスジェニックマウスはＣｙｐ３ａファミリーに対してヌルであるため、該マウスの肝臓で見られた低強度のバンドはＣＹＰ３Ａ４の発現のみを示す。この差はＰＣＮ処理後にあまり顕著ではなく、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスのサンプルにおいては、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスのサンプルと比較してＣＹＰ３Ａ／Ｃｙｐ３ａタンパク質の発現が高かった。腸ミクロソームにおいては、野生型マウス及びｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスの両方においてＣＹＰ３Ａ／Ｃｙｐ３ａタンパク質のレベルは同等であった。ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスの腸サンプルにおいては、Ｃｙｐ３ａＫＯマウスのサンプルと同様にバンドの強度は非常に低かった。
【０１５２】
肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによる７−ベンジルオキシキノリン（７−ＢＱ）のインビトロ酸化
図２４に示すように、Ｃｙｐ３ａＫＯマウスのミクロソームによる７−ＢＱ酸化は野生型マウスと比較して顕著に抑制された。ヒト化株はＣｙｐ３ａＫＯ株と比較して多少の活性の回復を示したが、この活性化は低く、統計的に有意ではなかった。また、プールしたヒト肝臓も低い反応速度を示したが、これは、７−ＢＱがヒトＣＹＰ３Ａ４よりも、マウスＣｙｐ３ａに対して良好な基質であることを示唆する。
【０１５３】
肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるインビトロＤＢＦ酸化
５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）（１５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）にて３７℃で約５０秒間、ＤＢＦ（２μＭ）を５μＬの肝ミクロソーム又は２５μＬの腸ミクロソームと共にインキュベートした後、２０μＬのＮＡＤＰＨ（４２ｍｇ／ｍＬ）を添加して反応を開始した。総反応体積を１ｍＬとした。Ｆ−４５００蛍光分光光度計（日立）（励起：４８５ｎｍ、発光：５３８ｎｍ）を用いてフルオレセイン蛍光を記録した。ＮＡＤＰＨの添加から約１５０秒後にフルオレセイン標準品（１０μＬ、２５μＭ）を反応キュベットに注入した。経時的な生成物蓄積の勾配はＦＬ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２．０（日立）を用いて計算した。
【０１５４】
未処理ヒト化マウスの肝臓サンプル及び腸サンプルの両方においては、Ｃｙｐ３ａＫＯと比較してＤＢＦ酸化活性は殆ど増加しなかった。しかし、図２５に示すように、ＰＣＮ処理グループのサンプルにおいては有意差がより顕著であった。反応速度は、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯのミクロソームにおいてはｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスのミクロソームと比較して高かった。これはウェスタンブロッティングデータと関連付けられた。
【０１５５】
肝ミクロソーム及び腸ミクロソームによるＣＹＰ３Ａ４の臨床的関連基質のインビトロ酸化
ＣＹＰ３Ａ４の臨床的関連基質としてトリアゾラムを選択した。トリアゾラムは現在、不眠症の治療に用いられている（米国病院薬剤師会のウェブサイト）。また、トリアゾラムは、ヒトＣＹＰ３Ａ４に対してだけでなく、Ｃｙｐ３ａサブファミリー由来のマウスシトクロムＰ４５０に対しても選択的基質となることが分かった（Perloff ら、2000）。
【０１５６】
５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）（１５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）にて３７℃で、トリアゾラム（５０μＭ）をミクロソーム（２．５μＬの肝ミクロソーム又は６μＬの腸ミクロソーム）及びＮＡＤＰＨ（１．３ｍＭ）と共にインキュベートした。総反応体積を２００μＬとした。１５分後、反応混合物のアリコート（８０μＬ）を採取し、等体積の氷冷アセトニトリルを添加して反応を停止させた。サンプルを約１３，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清のα−ヒドロキシトリアゾラム濃度をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって求めた（表６〜７）。２０μＬの上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。
【０１５７】
【表６】
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【０１５８】
【表７】
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【０１５９】
図２６に示すように、ＤＢＦと同様、対照ヒト化マウスのミクロソームにおけるトリアゾラムの酸化速度はＣｙｐ３ａＫＯ株と比較して僅かに高かった。誘導ヒト化マウスのミクロソームは有意に高い活性を示したが、ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス由来サンプルの活性はｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯ株由来サンプルに比較して高かった。
【０１６０】
ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７のＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定
ＲＴ−ＰＣＲ反応時にＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７に特異的な次のオリゴヌクレオチドを用いた。
３Ａ４＿Ｆ＿Ｂ  gct gaa agg aag act cag agg  Ｔｍ：５９．８
３Ａ４＿Ｒ＿Ｂ  ggc aca gat ttc ttg aag agc  Ｔｍ：５７．９
３Ａ７＿Ｆ  gac tca gag gag aga gat aag g     Ｔｍ：６０．３
３Ａ７＿Ｒ  gca aac cag aag tcc tta ggg       Ｔｍ：５９．８
【０１６１】
ＲＮｅａｓｙキット（QIAGEN、カタログ番号：７４１０４）を用い、製造業者の指示に従って、ヒト化マウス（ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯ（マウス４）及びｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯ（マウス５））及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（マウス１）の肝臓組織から全ＲＮＡを調製し、ＲＮｅａｓｙキット（QIAGEN）を用いて精製した。
【０１６２】
Superscript III One-Step RT-PCR Platinum Taq HiFi Kit（インビトロジェン社、カタログ番号：１２５７４−０３０）を用い、製造業者のプロトコルに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、アガロースゲル上の電気泳動によって分離した。予測サイズのＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出した後、配列決定用ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社、カタログ番号：Ｋ４５７５−０１）を用いてベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯ内にクローン化した。
一段階ＲＴ−ＰＣＲの設定（ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７の両方）：
ｃＤＮＡ合成：
４８℃、３０分間
９４℃、２分間
ＰＣＲ増幅：
９４℃、３０秒間
５４℃、３０秒間
６８℃、２分間
を４０サイクル
最終伸長：
６８℃、５分間
【０１６３】
配列解析は、Lark Technologies社、A Genaissance社（エセックス州、テイクリー、ホープエンドＣＭ２２  ６ＴＡ）によって行った。
【０１６４】
アラインメントは、VectorNTI 8ソフトウェアを用い、Contig express、Align-X及びT-COFFEE（http://www.ch.embnet.org/software/TCoffee.html）を利用して行った。
【０１６５】
ヒトＣＹＰ３Ａ４転写物の特性化
媒体処理野生型マウス（マウス１）及びヒト化マウス（マウス４〜５）から単離した全肝臓ＲＮＡサンプルを、プライマー３Ａ４＿Ｆ＿Ｂ及び３Ａ４＿Ｒ＿Ｂを用いたＲＴ−ＰＣＲによって解析した。図２７に示すように、予測サイズ（〜１．６Ｋｂ）のＤＮＡ断片が見られた。マウス４及び５由来のＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出し、別々にｐＣＲ４／ＴＯＰＯベクター内にクローン化した。
【０１６６】
２種の選択されたクローンを配列決定によって解析した。ターゲティングベクター（タコニク・アルテミス）に用いたＣＹＰ３Ａ４ｃＤＮＡによるこれらのクローンの配列アラインメントによって、クローン化されたＣＹＰ３Ａ４は全長転写物に由来したことが分かった。
【０１６７】
ヒトＣＹＰ３Ａ７転写物の特性化
ヒト化マウス４（ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯ）から単離した全肝臓ＲＮＡサンプルを、プライマー３Ａ７＿Ｆ及び３Ａ７＿Ｒを用いたＲＴ−ＰＣＲによって解析した。図２７に示すように、野生型マウス（マウス１）及びヒト化マウス（マウス４）のいずれにおいてもＤＮＡ産物は見られなかった。
【０１６８】
ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７及びＣｙｐ３ａ１１ｍＲＮＡ発現のＴａｑＭａｎ（登録商標）解析
ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７のｍＲＮＡレベルの推定は、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７に特異的なプライマーを用いたＱ−ＰＣＲによって行った。β−アクチンを参照遺伝子として用いた。肝臓サンプル及び腸サンプルのＱ−ＰＣＲ解析については表８にまとめる。
【０１６９】
【表８】
2011515098.tif 000010
【０１７０】
各標的遺伝子に関して、ｄＣｔ値が最小の反応を確認し、該ｄＣｔ値を他の全てのｄＣｔ値から差し引いて、いわゆるｄｄＣｔ（ｄＣｔ値が最小のサンプルのｄｄＣｔ（内在性参照）は０と等しくなる）を得た。最後に、表９に示すように、標的遺伝子の標準化相対量（ＲＱ）を次式：ＲＱ＝（２＾（−ｄｄＣｔ））＊１００を用いて算出した。
【０１７１】
【表９】
2011515098.tif 000011
【０１７２】
ＣＹＰ３Ａ４ｍＲＮＡは、対照及び処理ヒト化マウスの肝臓及び小腸の両方において確実に検出された。ＣＹＰ３Ａ７ｍＲＮＡレベルは、対照ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスの肝臓において検出限界未満であった。このデータは、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ７のＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定から得た結果と一致した。しかし、処理ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスの肝臓のＱ−ＰＣＲ解析から、ＰＣＮの投与によってＣＹＰ３Ａ７が誘導される可能性があることが分かった。ＣＹＰ３Ａ７ｍＲＮＡは腸サンプルにおいては検出できなかった。トランスジェニックマウス間でＣｙｐ３ａ１１ｍＲＮＡのレベルに差は無かった（データは示さず）。Ｑ−ＰＣＲデータを相対定量（ＲＱ）として示すことによってＰＣＮの誘導作用が確認された。
【０１７３】
ＣＹＰ３Ａ４タンパク質の構成的発現は、ＣＹＰ３Ａ４特異的抗体を用いて雄性ｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７マウスの肝ミクロソームで検出された。しかし、この酵素の発現レベルは、ＣＹＰ３Ａ／Ｃｙｐ３ａタンパク質のイムノブロットの結果によると、マウスＣｙｐ３ａの発現レベルよりも顕著に低かった。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス株及びｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス株の腸ミクロソームは、同様のＣＹＰ３Ａ／Ｃｙｐ３ａタンパク質の発現を示した。ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスにおける肝ＣＹＰ３Ａ４の構成的発現はウェスタンブロッティングの検出限界未満であり、この株由来の腸サンプルにおいてはＣＹＰ３Ａ４のバンドの強度が非常に低かった。イムノブロットデータはＣＹＰ３Ａ４特異的基質の酸化における活性とほぼ一致したが、各トランスジェニック株で利用し得るマウスは１匹のみであったため如何なる統計的な比較もできなかった。
【０１７４】
ＰＣＮを用いた処理によって、両方のヒト化株において肝ＣＹＰ３Ａ４及び腸ＣＹＰ３Ａ４が強く誘導された。処理Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びｈＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスにおけるＣＹＰ３Ａ／Ｃｙｐ３ａの発現は同程度であったが、ｈＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスにおけるその発現は顕著に低かった。これは、ＤＢＦ及びトリアゾラムを用いて測定したＣＹＰ３Ａ４特異的酵素活性と一致した。しかし、７−ＢＱを基質として用いた場合、ＰＣＮに呼応する活性の増加はＣＹＰ３Ａ４＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウス及びＣＹＰ３Ａ４／３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスの肝臓では見られなかった。この結果に対する可能な一説明は、特にプールしたヒト肝臓も低い反応速度を示したことを考慮すると、７−ＢＱがヒトＣＹＰ３Ａ４よりも、マウスＣｙｐ３ａに対して良好な基質であるということである。
【０１７５】
ＣＹＰ３Ａ４ｍＲＮＡは両方のヒト化株の肝臓及び小腸で検出された。逆転写とその後の配列決定によって、ｃＤＮＡが全長ＣＹＰ３Ａ４転写物に由来したことが分かった。
【０１７６】
ＣＹＰ３Ａ７ｍＲＮＡは対照マウス由来サンプルでは検出できなかった。ＣＹＰ３Ａ７はヒト胎児肝臓で発現する主なＣＹＰ３Ａアイソフォームであり、出生後の第１週に発達スイッチを経て、ＣＹＰ３Ａ７はＣＹＰ３Ａ４遺伝子の転写活性化と共にほぼ消失する（Stevensら、2003; Hines, 2008）。同様の発達スイッチがマウス（Ｃｙｐ３ａ１６〜Ｃｙｐ３ａ１１）でも見られた（Stevensら、2003）。本実験に用いたマウスは９〜１５週齢であったため、ＣＹＰ３Ａ７の発現はＣＹＰ３Ａ４の発現へスイッチしたと思われる。興味深いことには、ＣＹＰ３Ａ７ｍＲＮＡの一部がＰＣＮ処理ｈＣＹＰ３Ａ４／ＣＹＰ３Ａ７＿Ｃｙｐ３ａＫＯマウスの肝臓で検出された。これは以前には見られなかった。実際、ＣＹＰ３Ａ４誘導剤を用いた処理によるＣＹＰ３Ａ７のダウンレギュレーションが報告されている（Krusekopfら、2003; Haraら、2004）。
【０１７７】
実施例４：Ｃｙｐ２ｃクラスターノックアウト細胞株の作出
Ｃｙｐ２ｃクラスターターゲティングベクターの構築
Ｃｙｐ２ｃクラスターターゲティングベクターは、Ｃｙｐ３ａクラスターターゲティングベクターに関して実施例１に記載したように作出した。
【０１７８】
二重標的化ＥＳ細胞におけるＣｙｐ２ｃクラスターのＣｒｅ介在インビトロ欠失
二重標的化ＥＳ細胞におけるＣｙｐ２ｃクラスターのＣｒｅ介在欠失は、Ｃｒｅ介在Ｃｙｐ３ａクラスター欠失に関して実施例１に記載したように行った。
【図５】
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【図６】
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【図２７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
2011515098.tif 000019
【図８】
2011515098.tif 000020
【図９】
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【図１０】
2011515098.tif 000022
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2011515098.tif 000027
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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