(57)【要約】  血液試料のヘマトクリットの測定方法が提供され、この方法は、１）被分析試料を静止状態に保つように構成された分析チャンバ（１０）に試料を入れるステップであって、チャンバが、第１及び第２のパネル（１２、１６）の内表面（１４、１８）であって、それらの間に高さ（２０）が延在する内表面（１４、１８）により画定され、双方のパネルとも透明であり、高さは、試料中の赤血球（２２）の少なくとも一部がパネルの双方の内表面に接触し、且つ静止状態の試料中の１つ又は複数のラクナ（２４）が内表面間に延在するような高さである、ステップと；２）静止状態の試料の少なくとも一部分であって、赤血球と１つ又は複数のラクナとを含む試料部分を撮像するステップであって、それにより試料の撮像された部分の光学濃度を画像ユニット毎ベースで決定するステップと；３）内表面に接触している赤血球と整列する画像ユニットの光学濃度値を選択して平均値を求め、それらの画像ユニットの平均光学濃度値に１００％の上限値を割り当てるステップと；４）１つ又は複数のラクナと整列する画像ユニットの光学濃度値を選択し、それらの画像ユニットの光学濃度値に０％の下限値を割り当てるステップと；５）撮像された試料部分の各画像の光学濃度値に対し、上限値及び下限値の関数としての相対値を割り当て、それらの相対値の平均値を求めることにより、試料のヘマトクリットを決定するステップとを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料のヘマトクリットの測定方法であって、
被分析試料を静止状態に保つように構成された分析チャンバに前記試料を入れるステップであって、前記チャンバが第１のパネルの内表面と第２のパネルの内表面とにより画定され、双方のパネルとも透明であり、及び前記チャンバが、前記パネルの前記内表面間に延在する高さであって、前記試料中の少なくとも一部の赤血球が前記パネルの前記内表面の双方に接触し、且つ前記静止状態の試料中において赤血球が含まれない１つ又は複数の領域が前記内表面間に延在するような高さを有する、ステップと、
前記静止状態の試料の少なくとも一部分であって、前記内表面に接触している赤血球と１つ又は複数の赤血球間隙領域とを含む試料部分を撮像するステップであって、それにより前記試料の撮像された部分の光学濃度値を画像ユニット毎ベースで決定するステップと、
前記内表面に接触している赤血球と光学的に整列する画像ユニットの光学濃度値を選択して平均値を求め、それらの画像ユニットの平均光学濃度値に１００％の上限値を割り当てるステップと、
前記１つ又は複数の赤血球間隙領域と光学的に整列する画像ユニットの光学濃度値を選択して平均値を求め、それらの画像ユニットの光学濃度値に０％の下限値を割り当てるステップと、
前記撮像された試料部分の各画像ユニットの光学濃度値に対し、前記上限値及び前記下限値の関数としての相対値を割り当て、前記相対値の平均値を求めることにより、前記試料のヘマトクリットを決定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記画像ユニットが画素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記内表面の双方に接触している前記試料中の少なくとも一部の赤血球が、前記パネルの前記内表面の双方に個々に接触している赤血球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料の少なくとも一部分を凝集剤と混和するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記内表面の双方に接触している前記試料中の少なくとも一部の赤血球が、凝集した赤血球であって、前記パネルの前記内表面の双方に接触している凝集塊を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記静止状態の試料の少なくとも一部分を撮像するステップが、１つ又は複数の所定波長の光を試料に透過させ、前記透過光を、それが試料を通過した後に捕捉することを含み、前記光学濃度値が、前記試料に送り込まれ、そこを通過した光に関係する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試料の少なくとも一部分を等積球形化剤と混和するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記等積球形化剤が両性イオン界面活性剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試料全体が撮像される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記分析チャンバが平行である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記内表面の双方に接触している赤血球と光学的に整列する画素の光学濃度値を選択して平均値を求めるステップが、前記双方の内表面に接触している赤血球の少なくとも一部分の平均最大光学濃度を決定し、前記赤血球の少なくとも一部分における光学濃度の標準偏差を決定し、前記標準偏差が所定の値以下のとき、前記平均最大光学濃度を、前記内表面に接触している赤血球と光学的に整列する画素の平均光学濃度値として使用するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記双方の内表面に接触している赤血球の少なくとも一部分の平均最大光学濃度を決定するステップが、前記双方の内表面に接触している赤血球の種々の群を用いて、前記平均最大光学濃度の標準偏差が所定の値以下となるまで反復して実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記パネルの前記内表面が実質的に平行であり、前記高さが約２μｍ〜６μｍの範囲内である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料に抗凝固剤が添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記赤血球間隙領域がラクナである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記血液試料が実質的に無希釈である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記血液試料が全血である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
血液試料のヘマトクリットを測定するための装置であって、
被分析試料を静止状態に保つように構成された分析チャンバであって、前記チャンバが第１のパネルの内表面と第２のパネルの内表面とにより画定され、双方のパネルとも透明であり、及び前記チャンバが、前記パネルの前記内表面間に延在する高さであって、前記試料中の少なくとも一部の赤血球が前記パネルの前記内表面の双方に接触し、且つ前記静止状態の試料中において赤血球が含まれない１つ又は複数の領域が前記内表面間に延在するような高さを有する、チャンバと、
照明器と解像装置とを含む撮像ユニットであって、前記チャンバ内に静止状態で存在する前記試料のうち、少なくとも前記内表面に接触している赤血球と１つ又は複数の赤血球間隙領域とを含む一部分を撮像して、かかる撮像された試料部分を表す画像信号を生成するように機能するユニットと、
前記画像信号を用いて、前記試料の撮像された部分の光学濃度値を画素毎ベースで決定し、及び前記内表面に接触している赤血球と光学的に整列する画素の光学濃度値を選択して平均値を求め、それらの画素の前記平均光学濃度値に１００％の上限値を割り当て、及び前記１つ又は複数の赤血球間隙領域と光学的に整列する画素の光学濃度値を選択し、それらの画素の前記光学濃度値に０％の下限値を割り当て、及び前記撮像された試料部分の各画素の光学濃度値に対し、前記上限値及び前記下限値の関数としての相対値を割り当て、前記相対値の平均値を求めることにより、前記試料のヘマトクリットを決定するように構成されたプログラム可能分析器と、
を含む、装置。
【請求項１９】
前記プログラム可能分析器が、前記分析チャンバを撮像するよう前記撮像ユニットを制御するように構成される、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
画素の光学濃度値を選択して平均値を求めるように構成された前記プログラム可能分析器が、前記内表面の双方に接触している赤血球の少なくとも一部分の平均最大光学濃度を決定し、前記赤血球の少なくとも一部分における光学濃度の標準偏差を決定し、前記標準偏差が所定の値以下のとき、前記平均最大光学濃度を、前記内表面に接触している赤血球と光学的に整列する画素の平均光学濃度値として使用するようにさらに構成される、請求項１８に記載の装置。
【請求項２１】
赤血球の少なくとも一部分の平均最大光学濃度を決定するように構成された前記プログラム可能分析器が、前記双方の内表面に接触している赤血球の種々の群を用いて、前記平均最大光学濃度の標準偏差が所定の値以下となるまでかかる決定を反復して実施するようにさらに構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記パネルの前記内表面が実質的に平行であり、前記高さが約２μｍ〜６μｍの範囲内である、請求項１８に記載の装置。
【請求項２３】
一対の透明パネルにより画定される分析チャンバであって、前記パネルの内表面間に延在する高さであって、試料中の少なくとも一部の赤血球が前記内表面の双方に接触し、且つ静止状態の前記試料中において赤血球が含まれない１つ又は複数の領域が前記内表面間に延在するような高さを有する、分析チャンバ内に静止状態で存在する血液試料のヘマトクリットを測定するための装置であって、
照明器と解像装置とを含む撮像ユニットであって、前記チャンバ内に静止状態で存在する前記試料のうち、少なくとも前記内表面に接触している赤血球と１つ又は複数の赤血球間隙領域とを含む一部分を撮像し、かかる撮像された試料部分を表す画像信号を生成するように機能するユニットと、
前記画像信号を用いて、前記試料の撮像された部分の光学濃度値を画素毎ベースで決定し、及び前記内表面に接触している赤血球と光学的に整列する画素の光学濃度値を選択して平均値を求め、それらの画素の前記平均光学濃度値に１００％の上限値を割り当て、及び前記１つ又は複数の赤血球間隙領域と光学的に整列する画素の光学濃度値を選択し、それらの画素の前記光学濃度値に０％の下限値を割り当て、及び前記撮像された試料部分の各画素の光学濃度値に対し、前記上限値及び前記下限値の関数としての相対値を割り当て、前記相対値の平均値を求めることにより、前記試料のヘマトクリットを決定するように構成されたプログラム可能分析器と、
を含む、装置。
【請求項２４】
血液試料のヘマトクリットの測定方法であって、
被分析試料を静止状態に保つように構成された分析チャンバに前記試料を入れるステップであって、前記チャンバが第１のパネルの内表面と第２のパネルの内表面とにより画定され、双方のパネルとも透明であり、及び前記チャンバが前記パネルの前記内表面間に延在する高さであって、前記パネル間に赤血球の単層が配置され、それらの赤血球のうちの複数が双方のパネルに接触し、且つ前記赤血球の間に配置された１つ又は複数の赤血球が含まれない領域を含むような高さを有する、ステップと、
前記赤血球の単層と前記１つ又は複数の赤血球間隙領域とを含む前記静止状態の試料の少なくとも一部分を撮像するステップであって、それにより前記試料の撮像された部分の光学濃度値を画像ユニット毎ベースで決定するステップと、
前記撮像された試料の画像ユニット毎に決定された光学濃度値を合計し、それを、前記撮像された試料と整列する画像ユニットの総数で除算することにより、前記撮像された試料の画像ユニット毎の平均ヘモグロビン光学濃度を決定するステップと、
赤血球と光学的に整列する画像ユニットの画像ユニット毎の平均光学濃度値を決定するステップと、
前記撮像された試料の画像ユニット毎の平均ヘモグロビン光学濃度を、前記赤血球と光学的に整列する画像ユニットの画像ユニット毎の平均光学濃度値で除算することにより、ヘマトクリットを決定するステップと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／０３８，５５７号明細書、及び２００８年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／０３８，５７４号明細書に開示される本質的主題の利益を享受し、それを参照により援用する。
【０００２】
本発明は、概して血液試料を分析するための、特に、血液試料のヘマトクリットを決定するための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
医師、獣医師及び科学者は、構成粒状物質の量を決定し、さらに健常な被験体には見られない異常な粒状物質の存在を同定するため、ヒト及び動物の生体体液、特に血液を調べている。一般に計測、定量及び同定される粒状物質としては、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、及び血小板が挙げられる。ＲＢＣ分析には、ＲＢＣの数、大きさ、容積、形状、ヘモグロビン含有量及び濃度、並びにヘマトクリット（血中血球容積とも称される）の測定が含まれ得る。ＲＢＣ分析にはまた、ＲＢＣにおける住血原虫（例えば、マラリア原虫）か、又はＷＢＣにおける細胞外の、若しくはリーシュマニア症の病原生物であるトリパノソーマ、並びに他の多くの住血原虫の存在の検出及び／又は計数を含め、赤血球細胞中の特定の成分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡの存在及び／又は濃度の決定も関わり得る。ＷＢＣ分析には、一般にはＷＢＣ分画と称されるＷＢＣサブタイプの集団内頻度の決定、並びに健常な被験体には見られない任意の異常な細胞タイプの報告が含まれ得る。血小板（又は、鳥類、爬虫類及び魚類を含む特定の動物においては栓球、これは、哺乳類における血小板の機能と同様だが、１０倍程大きく有核である）の分析には、試料中の血小板又は栓球の凝集塊の存在についての決定を含め、血小板の数、大きさ、形状・構造、及び容積の決定が含まれ得る。
【０００４】
「Ｗｉｎｔｒｏｂｅ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ」第１２版などの医学テキストに詳細に記載されている公知の血液検査手法では、概して検査方法は、手動、遠心、及びインピーダンスを用いるタイプの方法に分けられる。細胞計数を手動で行う方法には、典型的には、正確に測定された容積の血液又は体液試料を作成し、それを定量的に希釈して、計数チャンバにおいて目視で数をカウントすることが関わる。手動での検査方法には、末梢血スメアを調べることが含まれ、そこでは目視検査により各粒状物質タイプの相対量が決定される。遠心による検査方法には、試料を遠心し、試料を構成成分の相対密度に従う構成成分層に分離させることが関わる。各成分層は染色して、可視性又は検出を高めることができる。インピーダンスによる方法には、計測対象の粒状物質に従い処理された血液の正確な量を調べることが関わる；例えば、有核細胞を計数するためＲＢＣを溶解し、容積測定に基づき試料を導電性流体中に希釈する。この過程には、典型的には、狭小な通路を通る試料に印加される電流又は電圧をモニタすることにより、粒子が一列で通過するときの電流／電圧に対する粒子の影響を決定することが関わる。他の手法では、光線の中を一列に通過する粒状物質に入射する光の散乱の強度及び角度を分析することが関わる。フローサイトメトリーによる方法もまた用いることができ、これには、フルオロフォアにより懸濁液中の対象の粒状物質を染色し、染色した粒状物質を適切な波長の光で励起して、個々の粒状物質／細胞の発光を分析することが関わる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述の方法は全て、末梢血スメア又は遠心分離を除き、正確な容積の試料を計量分配する必要がある。試料容積が不正確であると、関連する分析において同じ規模の定量誤差が生じ得る。遠心による方法を除き、前述の方法は全て、試料を１つ又は複数の液体試薬又は希釈剤と混合することも必要で、且つ正確な結果を得るために器具のキャリブレーションも必要となる。末梢血スメアの場合、スメアを正しく検査するには高度な訓練が必要とされる。前述の方法の多くは、処理費用が高額な大量の汚染廃棄物が発生する。加えて、鳥類、爬虫類、魚類、及び赤血球の大きさが極めて小さい特定の哺乳類では、上述の方法は全血球計算値（ＣＢＣ）の決定には好適でない。
【０００６】
全血球計算により複合的な血液学的情報量が得られるにもかかわらず、ほとんどの場合に、ある検査、すなわちヘマトクリットが必要となる。ヘマトクリットにより、医師は患者の貧血の原因が、成長期の小児及び性成熟年齢の女性において比較的一般的な鉄欠乏症などの出血若しくは栄養上の理由か、慢性感染症などの関連疾患過程か、尿毒症などの代謝疾患か、又は腫瘍性の疾病か、さらには薬理作用であるのかが分かる。ヘマトクリットの上昇は、血液が濃縮される脱水症などの疾患過程に起因して赤血球の存在量が高過ぎることを示す。ヘマトクリットの上昇はまた、赤血球増加症などの疾患過程、又はアナボリックステロイドの過剰投与などの薬理作用、又は肺疾患若しくは特定の種類の先天性心疾患に起因する慢性低酸素症の結果として起こる赤血球量の真の増加の指標ともなり得る。ヘマトクリットは、その重要性及び有用性により、血液に対して行われる検査のなかで最も要求頻度が高い一つとなっている。従って、簡易、正確、安価で、且つ即座に利用可能なヘマトクリット測定が極めて望ましく、患者の利益となるであろう。使い捨ての分析チャンバを使用することのできる器具、毛管流以外の内部流動体はなしに動作することのできるもの（すなわち、重力及び向きとは無関係に動作可能なもの）、及び手持ち型機器として利用することのできるものであれば、極めて有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のある態様に従えば、血液試料のヘマトクリットの測定方法が提供される。この方法は、１）実質的に無希釈の血液試料を提供するステップと；２）被分析試料を静止状態に保つように構成された分析チャンバに試料を入れるステップであって、チャンバが第１のパネルの内表面と第２のパネルの内表面とにより画定され、双方のパネルとも透明であり、及びチャンバが、パネルの内表面間に延在する高さであって、試料中のＲＢＣの少なくとも一部が、個々に、又は凝集塊としてパネルの内表面の双方に接触し、且つ静止状態の試料中の１つ又は複数のＲＢＣ間隙領域が内表面間に延在するような高さを有する、ステップと；３）静止状態の試料の少なくとも一部分であって、内表面に接触しているＲＢＣと１つ又は複数のＲＢＣ間隙領域とを含む試料部分を撮像するステップであって、それにより撮像された試料の部分の光学濃度をユニット毎ベースで決定するステップと；４）双方の内表面に接触している個々のＲＢＣ又はＲＢＣ凝集塊の一部と整列する画像ユニットの光学濃度値を選択して平均値を求め、それらの画像ユニットの平均光学濃度値に１００％の上限値を割り当てるステップと；５）１つ又は複数のＲＢＣ間隙領域と整列する画像ユニットの光学濃度値を選択し、それらの画像ユニットの光学濃度値に０％の下限値を割り当てるステップと；６）チャンバ部分に含まれる撮像された試料の各画像ユニットの光学濃度値に対し、上限値及び下限値の関数としての相対値を割り当て、それらの相対値の平均値を求めることにより、試料のヘマトクリットを決定するステップとを含む。
【０００８】
本発明の別の態様に従えば、分析チャンバ内に静止状態で存在する実質的に無希釈の血液試料のヘマトクリットを測定するための装置が提供される。チャンバは一対の透明パネルにより画定され、パネルの内表面間に延在する高さを有する。このチャンバ高さは、試料中の少なくとも一部のＲＢＣが、個々に、又は凝集塊として内表面の双方に接触し、且つ静止状態の試料中の１つ又は複数のＲＢＣ間隙領域が内表面間に延在するような高さである。この装置は、撮像ユニットとプログラム可能分析器とを含む。撮像ユニットは、照明器と解像装置とを含み、チャンバ内に静止状態で存在する試料のうち、少なくとも内表面に接触しているＲＢＣ又はＲＢＣ凝集塊と１つ又は複数のＲＢＣ間隙領域とを含む一部分を撮像して、かかる撮像された試料部分を表す画像信号を生成するように機能する。プログラム可能分析器は、それらの画像信号を用いて、試料の撮像された部分の光学濃度値を画像ユニット毎ベースで決定するように構成される。分析器はさらに、内表面に接触している少なくとも一部のＲＢＣ及び／又はＲＢＣ凝集塊と光学的に整列する画像ユニットの光学濃度値を選択して平均値を求め、それらの画像ユニットの平均光学濃度値に１００％の上限値を割り当てるように構成される。分析器はさらに、１つ又は複数のＲＢＣ間隙領域と光学的に整列する画像ユニットの光学濃度値を選択し、それらの画像ユニットの光学濃度値に０％の下限値を割り当て、撮像された試料部分の各画像ユニットの光学濃度値に対し、上限値及び下限値の関数としての相対値を割り当て、それらの相対値の平均値を求めることにより、試料のヘマトクリットを決定するように構成される。
【０００９】
本発明の利点は、毛細血管を穿刺することにより患者から直接採取され得るか（これは、ポイント・オブ・ケア用途に一層有用となる）、又は必要に応じて静脈血試料から得ることのできる極めて少量の試料容積を使用したヘマトクリット値の決定に用い得ることである。
【００１０】
本発明の別の利点は、器具の拡大倍率（画像／画像ユニットのサイズ）が既知かどうかにかかわらず、且つチャンバの高さを知らなくとも、ヘマトクリット値を決定できることである。結果的に、本方法は、使用することのできる分析器具及びチャンバのタイプに関して高い汎用性を有する。
【００１１】
本発明の別の利点は、ヘモグロビンの固有色素のみを用いて血液試料のヘマトクリットを決定するように機能するため、いかなる色素又は染色剤も添加する必要がないことである。ヘモグロビンはいくつかの異なる波長においてモル吸光係数が高いため、数マイクロメートル程の極めて小さい光路距離においても、その相対又は絶対濃度の決定が可能となる。
【００１２】
本方法の別の利点は、外部及び内部流動体なしに、且つ重力又は向きとは無関係に機能するため、手持ち型機器として微小重力条件下での使用に適応可能なことである。
【００１３】
本方法及びそれに関連する利点が、添付の図面を含め、以下に提供される詳細な説明を考慮することでさらに容易に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本方法で使用し得る分析チャンバの図式的な断面表示である。
【図２】本方法で使用し得る分析チャンバの図式的な断面表示である。
【図３】本方法で使用し得る分析チャンバの図式的な断面表示である。
【図４】本方法で使用し得る分析チャンバの図式的な断面表示である。
【図５】複数の分析チャンバを有するテープの図式的な平面図である。
【図６】分析チャンバを有する使い捨て容器の図式的な平面図である。
【図７】分析チャンバを有する使い捨て容器の図式的な断面図である。
【図８】本方法で使用し得る分析機器の図式的な略図である。
【図９】本発明のある態様に従う方法を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
血液試料のヘマトクリットを測定するための本方法及び装置により、試料に対して色素、試薬（いくつかの実施形態における抗凝固薬は除く）又は希釈剤を添加することも、試料の容積又は分析チャンバの高さ若しくは容積を正確に知る必要もなく、ヘマトクリットを測定することが可能となる。いくつかの実施形態において、本方法及び装置は、ＲＢＣを凝集させる作用剤の添加を含む。ポリブレン、抗グリコホリン抗体などの作用剤は、試料中のＲＢＣをほぼ瞬時に凝集させる。これらのＲＢＣ凝集塊の少なくとも一部は、チャンバの対向する内表面と接触することになる。表面間に延在するＲＢＣ凝集塊の光学濃度は、単一の細胞についての光学濃度と同じ方法でヘマトクリットの計算に用いることができる。
【００１６】
本方法は、実質的に無希釈の全血の被分析試料を静止状態に保つように機能する分析チャンバを利用する。このチャンバは、典型的には約０．２〜１．０μｌの試料を保持するサイズであるが、チャンバはいかなる特定の容積容量にも限定されず、容量は分析用途に合わせて変更することができる。語句「実質的に無希釈の」は、本明細書で使用されるとき、全く希釈されていないか、又は意図的に希釈されたわけではないが、分析のためにそこに何らかの試薬が添加されている血液試料を指す。試薬の添加により試料が希釈される程度では、あったとしても、かかる希釈は実施される分析に対して何ら臨床的に有意な影響をもたない。典型的には、本方法の実施に使用され得る試薬は、抗凝固薬（例えば、ＥＤＴＡ、ヘパリン）及び場合によって等積球形化剤、又は凝集剤のみであり、これらは試料の希釈を目的とするものではない。ある状況下では（例えば、超高速分析）、抗凝固剤の添加は必要でないこともあるが、試料が分析に適した形態であることを確実にするため、ほとんどの場合には添加することが好ましい。用語「静止状態」は、試料が分析用チャンバの中に入れられ、分析中、その試料がチャンバに対して意図的に動かされることがない；すなわち、試料がチャンバ内に静止状態で存在することを表すために用いられる。血液試料中に存在する運動の程度では、それは主に血液試料の有形の構成成分のブラウン運動によるもので、そうした運動によってこの発明の機器が使用不能になることはない。
【００１７】
ここで図１を参照すると、分析チャンバ１０は、内表面１４を有する第１のパネル１２と、内表面１８を有する第２のパネル１６とにより画定される。パネル１２、１６は双方とも十分に透明なため、以下に記載される光学濃度分析の実施に十分な量の所定波長に従う光を、それらのパネルに透過させることが可能である。パネル１２、１６の少なくとも一部分は互いに平行であり、その部分の範囲内で内表面１４、１８は高さ２０だけ互いに隔たり、これは、以下にさらに詳細に考察されるとおり、試料中の少なくとも一部の個々のＲＢＣ２２が、各々、内表面１４、１８の双方に個々に接触し、及び／又は試料中の１つ又は複数のＲＢＣ凝集塊２３が、各々、チャンバパネル１２、１６の内表面１４、１８の双方に接触し、且つ静止状態の試料中の１つ又は複数のＲＢＣ間隙領域（例えば、ラクナ）２４が内表面間に延在するような高さである。本方法は、前記特徴を有する様々な異なる分析チャンバタイプを利用することができ、従っていかなる特定のタイプの分析チャンバにも限定されることはない。平行なパネル１２、１６を有する分析チャンバは、それにより分析が簡略化されるため好ましいが、本発明に必須ではない；例えば、一方のパネルが他方のパネルに対して既知の非平行な角度で配置されたチャンバを使用してもよい。
【００１８】
ここで図２〜５を参照すると、許容可能なチャンバ１０の例が示され、これは、第１のパネル１２と、第２のパネル１６と、パネル１２、１６の間に配置された少なくとも３つのセパレータ２６とを含む。セパレータ２６は、パネル１２、１６の間に配置可能な、パネル１２、１６を互いに離間させるように機能する任意の構造であってよい。パネル１２、１６間に延在するセパレータ２６の寸法２８は、本明細書ではセパレータ２６の高さ２８と称される。セパレータ２６の高さ２８は、典型的には互いに正確に等しいわけではないが（例えば、製造公差）、同様の分析装置に使用される間隔保持手段についての商業的に許容可能な公差の範囲内である。球形ビーズは許容可能なセパレータ２６の一例であり、例えば、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｆｉｓｈｅｒｓ、米国Ｉｎｄｉａｎａから市販されている。
【００１９】
図３に示されるチャンバの実施形態では、セパレータ２６は、第１のパネル１２及び第２のパネル１６の一方又は双方と比べて可撓性が高い材料からなる。図３で分かるとおり、より大きいセパレータ２６は、ほとんどのセパレータ２６がパネル１２、１６の内表面１４、１８に接触している点まで圧縮され、そのためチャンバ高さはセパレータ２６の平均直径よりほんの僅かに小さくなる。図４に示されるチャンバの実施形態では、セパレータ２６は、第１のパネル１２及び第２のパネル１６の一方又は双方と比べて可撓性が低い材料からなる。図４では、第１のパネル１２は球形セパレータ２６及び第２のパネル１６より可撓性の高い材料によって形成され、テントのような形でセパレータ２６に被さる。この実施形態において、チャンバ１０の局所的な小さい領域は所望のチャンバ高さ２０から逸脱し得るが、チャンバ１０の平均高さ２０は、セパレータ２６の平均直径の高さに極めて近似する。分析では、平均チャンバ高さ２０は、この実施形態を使用する４μｍ未満のチャンバ高さにおいて１パーセント（１％）又はそれ以上まで制御され得ることが示されている。上記の可撓性を有するという特性（並びにセパレータの分布密度などの他の要因）を前提として、セパレータ２６及びパネル１２、１６は様々な材料で作製することができ、但しパネル１２、１６は十分に透明であるものとする。アクリル又はポリスチレンからなる透明プラスチックフィルムが、許容可能なパネル１２、１６の例であり、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコーンなどから作製される球形ビーズが、許容可能なセパレータ２６である。許容可能なセパレータの具体例は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｏｆ  Ｆｒｅｍｏｎｔ、米国Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから、カタログ番号４２０４Ａ、直径４ミクロン（４μｍ）で市販されているポリスチレン製の球体である。図５を参照すると、他方の上側に垂直方向に配置されるパネル１２が、等間隔に配置された複数のポート３０（例えば、通気孔として働く）を含み、パネル１２、１６は所定箇所で互いに結合される。いくつかの実施形態では、結合材料３２がチャンバ外壁を形成し、試料３４を分析チャンバ１０内に横方向に収容するように機能する。許容可能な分析チャンバのこの例は、米国特許出願公開第２００７／０２４３１１７号明細書、米国特許出願公開第２００７／００８７４４２号明細書、及び２００８年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４１，７８３号明細書；及び２００８年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／１１０，３４１号明細書（これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）にさらに詳細に記載されている。
【００２０】
許容可能なチャンバ１０の別の例は、図６及び図７に示されるとおりの使い捨て容器３６に配置される。チャンバ１０は、第１のパネル１２と第２のパネル１６との間に形成される。第１のパネル１２及び第２のパネル１６の双方とも透明なため、チャンバ１０に光を通過させることができる。第１のパネル１２及び第２のパネル１６の少なくとも一部分は互いに平行であり、その部分の範囲内で内表面１４、１８は高さ２０だけ互いに隔たっている。このチャンバ１０の実施形態は、米国特許第６，７２３，２９０号明細書にさらに詳細に記載されており、この特許は、全体として参照により本明細書に援用される。図２〜図７に示される分析チャンバは、本方法における使用に適したチャンバに相当する。しかしながら、本方法はそれらの特定の実施形態に限定されるものではない。
【００２１】
許容可能なチャンバ高さは、試料中のＲＢＣの少なくとも一部がチャンバパネルの双方の内表面に個々に接触し、及び／又は１つ又は複数のＲＢＣ凝集塊がチャンバパネルの双方の内表面に接触し、且つ静止状態の試料中においてＲＢＣが含まれない１つ又は複数の領域（例えば、ラクナ）が内表面間に延在する高さである。血液試料中のＲＢＣの大きさは、分析される血液試料のタイプ（例えば、ヒト、サル、ウマ、ヤギ、魚類、鳥類等）に従い異なるため、許容可能なチャンバ高さは被験体によって変わり得る。典型的なＲＢＣの大きさと、ＲＢＣはある程度変形し得る（例えば、上記で考察される部分的に圧縮された球形）という事実とに基づくと、約２〜６ミクロン（２〜６μｍ）のチャンバ高さが、ほとんどの動物種についての個々のＲＢＣに適している。ヒトＲＢＣより実質的に大きい、又は小さいＲＢＣを有する動物種のヘマトクリット分析は、それぞれ、チャンバ高さがより高い、又はより低いそれぞれのチャンバで実施することができる。加えて、ＲＢＣ凝集塊を利用するヘマトクリット分析では、ＲＢＣ凝集塊の高さによって決まるチャンバ高さとなり得る。
【００２２】
用途によっては、ＲＢＣの少なくとも一部が実質的に球形の幾何形状をとるよう、試料の少なくとも一部分と等積球形化剤（例えば、両性イオン界面活性剤又は同様の機能性試薬）が混和される。球形化剤の具体例はＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６界面活性剤であり、これは、米国Ｎｅｗ  ＪｅｒｓｅｙのＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．の事業体であるＣａｌｉｂｒｉｏｃｈｅｍによって製造される両性イオン界面活性剤である。試料に添加される球形化剤の量は、少なくとも本ヘマトクリット分析の実施に必要な数のＲＢＣを球形化するのに十分な量である。具体的な量は特定の作用剤及び検査環境に依存し、当業者は必要以上に実験を行うことなくそれを決定することができる。ＲＢＣは、その自然の形態では、球形状４０よりむしろ両凹円盤（ｂｉｏｃｏｎｃａｖｅ  ｄｉｓｃ）形状３８（図１を参照）であることのほうが多い。結果として、等積球形化剤の作用がない限り、円盤形状のＲＢＣのいくらかは、チャンバパネルの双方には接触しないことになる。実質的に球形の幾何形状を有するＲＢＣの数が増加すると、本来は球形でありながらチャンバパネルに抑え込まれる一部の細胞４２を含め、パネルの双方と接触するＲＢＣの数が増加する。
【００２３】
チャンバ１０内に静止状態で配置された試料の分析は、試料の少なくとも一部分を撮像し、画像に対して分析を実施するように機能する分析機器を使用して実施される。画像は、試料の光学濃度をユニット毎ベースで決定することが可能な形で生成される。用語「ユニット毎ベース」又は「画像ユニット」とは、試料の画像を解像することのできる定義された増分単位を意味する。画素は、特定の撮像システムにおいて個々に処理することのできる画像の最小要素として一般に定義され、画像ユニットの一例であり、また画像ユニットとしては、集合的な単位としての少数の画素も含まれ得る。しかしながら、本方法はいかなる特定の分析機器での使用にも限定されない。
【００２４】
ここで図８を参照すると、本方法での使用向けに構成することのできる分析機器４４の例であり、これは、試料照明器４６と、解像装置４８と、プログラム可能分析器５０とを含む。試料照明器４６は光源を含み、この光源は、ヘマトクリット分析に有用な十分に広い波長範囲にわたり光を選択的に発生し（例えば、約４００〜６７０ｎｍ；ヒトの血液試料中のＲＢＣの光学濃度（ＯＤ）の決定には、約４１３ｎｍ及び約５４０ｎｍの光が特に有効である。）、典型的には光を操作するための光学素子を含む。試料照明器４６は、画像を生成するために透過率を利用する。試料の光透過特性は、例えば、チャンバ１０内に存在する試料の片側に光源を位置決めし、チャンバパネル間に静止状態で配置された試料に光を送り込み、その後解像装置を使用してその光を捕捉することにより計測することができる。許容可能な解像装置４８の一例は、試料を通過する光の像を電子データ形式に変換する電荷結合素子（ＣＣＤ）型画像センサである。相補型金属酸化膜半導体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ｍｅｔａｌ  ｏｘｉｄｅ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）（「ＣＭＯＳ」）型画像センサは、使用することのできる画像センサの別の例であり、本発明はこれらの例のいずれにも限定されない。プログラム可能分析器５０は中央演算処理装置（ＣＰＵ）を含み、試料照明器４６及び解像装置４８に接続される。ＣＰＵは、本方法の実施に必要な機能を選択的に実行するように構成される（例えば、プログラムされる）。プログラム可能分析器５０の機能は、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、又はそれらの組み合わせを用いて実装され得ることに留意しなければならない。当業者であれば、必要以上に実験を行うことなく、本明細書に記載される機能を実行させるように処理装置をプログラムすることができるであろう。全体として参照により本明細書に援用される、「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｆｌｕｉｄｓ」と題される２００５年８月１５日に発行された米国特許第６，８６６，８２３号明細書が、かかる分析機器４４を開示している。
【００２５】
分析機器は、試料の撮像された部分について、検出された光信号に関連するＯＤ値をユニット毎ベースで決定するように構成される。検出された光信号（すなわち、ＯＤ値）をエッジ抽出アルゴリズムで用いることにより、ＲＢＣの位置と境界とを特定することができる。チャンバの双方の内表面に接触するＲＢＣは、部分的に圧縮された球形と同様のＯＤプロファイルを有する。表面と接触していない細胞の側方エッジのＯＤは、（相対的に見て）ゼロにほぼ等しいと見なすことができる。決定されるＯＤ値は、１）ＲＢＣの中心に近付く方向に進むほど（例えば、細胞を通じた光透過路が長くなるに従い）増加し；２）ＲＢＣが上と下の表面と接触するところで（すなわち、ＲＢＣを通じた透過光路が一定になったとき）最大値に達し、実質的に一定のままとなり；及び３）ＲＢＣの中心から離れる方向に進むほど（例えば、細胞を通じた光透過路が短くなるに従い）減少する。ＲＢＣのＯＤプロファイルのこの特徴は、球形状のＲＢＣについては特に一様である。
【００２６】
分析機器は、さらに、双方の内表面と接触しているＲＢＣ及び／又はＲＢＣ凝集塊２３の一群の平均最大ＯＤ値を決定するように構成される。内表面と接触しているＲＢＣ及び／又はＲＢＣ凝集塊の許容可能な群の大きさとはどのようなものかについての決定は、試料分析毎ベースで行われてもよく、又は「ｎ」回の同じタイプ、例えばヒト血液試料の試料分析に対して定期的に行われてもよい。例えば、双方の内表面と接触していると特定された一群のＲＢＣを比較評価して、平均最大ＯＤ及び群内のＯＤの統計的偏差を決定することができる。特定の試料内であっても、細胞内のヘモグロビンのＯＤは細胞ごとに異なり得るため、平均最大ＯＤを決定することが望ましい。標準偏差が所定の閾値より大きい場合、前記分析によって許容可能な標準偏差の平均最大ＯＤを有するＲＢＣの群が確立されるまで、双方のパネルと接触しているＲＢＣの新しい群を選択してもよく、又は既存の群を拡大させてもよい。例えば、群内のＲＢＣの平均最大ＯＤが、試料中における双方の表面に接触する全ＲＢＣの平均最大ＯＤの±約１パーセント（１％）であれば、許容可能な標準偏差値の範囲内である。しかしながら、許容可能な標準偏差値とはどのようなものかについては、当面の用途及び具体的な統計分析（例えば、標準誤差等）に応じて変わり得る。ＲＢＣのＯＤに関する既存の統計データが利用可能であり、許容可能なＯＤ統計値の決定に用いることができる。特定の群内のＲＢＣが、臨床的に許容可能な標準偏差の範囲内にある平均最大ＯＤを有するかどうかの決定もまた、適応できる。これは、上記に指摘されるとおり、個体内のＲＢＣ集団のヘモグロビン濃度のばらつきは典型的には小さく、実行時の結果の標準偏差を使用して、許容可能な精度の平均値を得るまでにいくつの細胞を検査しなければならないかを決定することができることが知られているためである；例えば、正常な血液特性を有する被験体からの試料について、許容可能な群の大きさは１００ＲＢＣほどの少なさであり、一方、異常な血液特性を有する被験体からの試料では、１０００個以上のＲＢＣの分析が必要となり得る。許容可能な平均最大ＯＤを確立するために、双方の内表面と接触しているＲＢＣを具体的にいくつ使用するかは、試料中のＲＢＣのいかなる特定の数にも、又は割合にも限定されることはなく、双方の表面と接触している全ての（例えば、数千個の）ＲＢＣを含み得る。
【００２７】
本発明に係る生体試料のヘマトクリットの測定方法に従い（この方法のステップは図９のブロック図に示される）、上記のとおり実質的に無希釈の全血の試料がチャンバに入れられる。試料のチャンバへの導入前か、又はチャンバへの導入時に、抗凝固剤、及び場合により等積球形化剤及び／又は凝集剤が試料と混合される。例えば表面コーティングを介して乾燥又は半乾燥形態で添加される試薬が、特に簡便である。しかしながら、本発明は乾燥形態の試薬に限定されるものではなく、例えば、試料を著しく希釈することのない液体試薬を使用することもできる。試料は、チャンバ内に静止状態で存在する。ある状況下では（例えば、超高速分析）、抗凝固剤の添加は必要でないこともあるが、試料が分析に適した形態であることを確実にするため、ほとんどの場合には添加することが好ましい。
【００２８】
分析機器を使用して、試料に光を透過させ、その透過光を検出することにより、チャンバ内に静止状態で存在する試料の少なくとも一部分が撮像される。撮像された試料部分は、各チャンバパネルの内表面に接触している複数のＲＢＣ及び／又はＲＢＣ凝集塊と、チャンバパネルの内表面間に延在する、試料のうちＲＢＣが一切含まれない少なくとも１つの領域（ＲＢＣ間隙領域）とを含む。チャンバ内に存在する試料の全体を撮像することは必須ではないが、実質的に無希釈の全血の試料はＲＢＣ及びラクネのチャンバ内における分布が典型的には不均質なため、全体を撮像することで、典型的には試料（及びそのあらゆる構成成分）のより完全な分析が提供され、それに伴い精度が増すため、好ましい。
【００２９】
内表面と接触している個々のＲＢＣ又はＲＢＣ凝集塊の一群が、分析器により試料部分の画像を用いて決定され、その一群から許容可能な標準偏差を有する平均最大ＯＤが決定される。上記に指摘されるとおり、群の大きさは分析に応じて異なり得るとともに、前記の許容可能な標準偏差を有する平均最大ＯＤを決定するための反復を伴い得る。内表面と接触している個々のＲＢＣ及び／又はＲＢＣ凝集塊の平均最大ＯＤとして決定された値に対し、１００パーセント（１００％）の任意上限値が割り当てられる。
【００３０】
同様に、分析機器は、チャンバ内において双方のチャンバ内表面の間に延在する１つ又は複数のＲＢＣ間隙領域（例えば、ラクナ）が存在するところを同定するように構成される。１つ又は複数のＲＢＣ間隙領域のＯＤ値が決定され、又は２つ以上のＲＢＣ間隙領域が存在して、それらを分析する場合には、ＲＢＣ間隙領域のＯＤの平均値が決定され得る。１つ又は複数のＲＢＣ間隙領域のＯＤ値に対し、０パーセント（０％）の任意下限値が割り当てられる。
【００３１】
試料のヘマトクリットの決定は、撮像された試料部分の各ユニットのＯＤ値に対し、上限値及び下限値の関数としての（すなわち、ＲＢＣがチャンバの高さ全体にわたり延在する領域と、ＲＢＣがない領域との関数としての）相対値を割り当てることにより行われる。各ユニットについてのパーセント相対値の平均値が決定される。平均相対値は、１００％（すなわち、全てＲＢＣ）〜０％（ＲＢＣなし）の、試料のＲＢＣ容積の百分率である。この百分率は定義上、試料のヘマトクリット、すなわち試料の血中赤血球容積に等しい。
【００３２】
本方法の利点は、試料中の全てのＲＢＣが各チャンバパネルに接触していなくともよいことである。この方法は、ＲＢＣ及び／又はＲＢＣ凝集塊の一部のみがチャンバの双方の内表面と接触しているだけで実施することができる。より小さいＲＢＣ及びＲＢＣ断片は、分析のキャリブレーションには用いられないが、ヘマトクリットに対するそれらの寄与は計測に含まれる。加えて、本方法に従えば、チャンバ内の試料の総面積又は総容積を知らなくとも、試料のヘマトクリットを測定することができる。従って、高さが厳密に定義されたチャンバを使用する必要がなく、チャンバの製造費が抑えられる。
【００３３】
本発明は、その詳細な実施形態に関して図示及び説明されているが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な形態及び詳細の変更が行われ得ることを理解するであろう。例えば、本発明は、実質的に無希釈の血液試料についてのヘマトクリットの測定に関して上記に記載される。実際のところ、本発明の利点の１つは、希釈剤の必要なしに血液を分析できることである。しかしながら、代替的実施形態においては、本発明は様々な理由で希釈された血液に対して用いることができ、但しその場合、試料の希釈倍率は既知であるか、又は特定可能であるものとする。
【００３４】
特許請求の範囲は以下のとおりである。
【図１】
2011515681.tif 000003
【図２】
2011515681.tif 000004
【図３】
2011515681.tif 000005
【図４】
2011515681.tif 000006
【図６】
2011515681.tif 000007
【図７】
2011515681.tif 000008
【図８】
2011515681.tif 000009
【図９】
2011515681.tif 000010
【図５】
2011515681.tif 000011
【国際調査報告】
2011515681.tif 000012
2011515681.tif 000013
2011515681.tif 000014