(57)【要約】ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、特にサキナビルは強い抗癌活性を示したが、その適用は非常に多くの副作用によって制限されていた。その毒性を解消するために、元の化合物をＮＯの共有結合によって修飾した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の硝酸エステル。
【請求項２】
前記ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤が、サキナビル、リトナビル、ネルフィナビル、インディナビル、ダウナビル、ラピナビル、アンプレバニル、アタザナビルから選択される、請求項１に記載の硝酸エステル。
【請求項３】
式Ｉの請求項１に記載のサキナビルの硝酸エステル、
【化１】
2011529864.tif 000010
その非毒性の塩、溶媒和物、多形または／および結晶形態。
【請求項４】
請求項１から３に記載の化合物を、適切な担体／賦形剤との混合物中に含む医薬組成物。
【請求項５】
腫瘍またはＨＩＶ感染の治療用の薬物を調製するための、請求項１から３に記載の化合物の使用。
【請求項６】
腫瘍および／またはＨＩＶ感染に罹患した患者を治療する方法であって、請求項１から３に記載の化合物の有効量を前記患者に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の硝酸エステル、特にサキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）の硝酸エステル、およびヒトの治療法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤（ＨＩＶ−ＰＩ）は、１９９３年以来ヒトへの使用が承認されている抗レトロウイルス剤である。ＨＩＶ−ＰＩは、ＨＩＶプロテアーゼの触媒部位に選択的に結合して、感染性のウイルス粒子の複製および産生を遮断するように設計されている（Ｄｅｅｋｓら  １９９７）。これらの薬剤が血管形成、炎症、抗原のプロセシングおよび提示、細胞の生存および組織修復等のいくつかの重要な細胞のプロセスに影響をおよぼすということが示された（Ｓｇａｄａｒｉら  ２００３、Ａｎｄｒｅら  １９９８、Ｇｒｕｂｅｒら  ２００１、Ｄｅｌｍｏｎｔｅら  ２００７）。最近の知見により、インビトロおよびインビボの両方においてＨＩＶ−ＰＩの強い抗癌能力が示された。様々な腫瘍細胞の成長の阻害に付随して、アポトーシス細胞死が誘導された（Ｃｈｏｗら  ２００６、Ｐａｊｏｎｋら  ２００２、Ｉｋｅｚｏｅら  ２００４、Ｉｋｅｚｏｅら  ２０００、Ｇｉｌｌｓら  ２００７）。これらの薬剤の作用機構は厳密には定義されていないが、それらの標的は、ＡＫＴ、細胞外シグナル調節キナーゼ、核因子ｋＢ、シグナル伝達兼転写活性化因子３、マトリックスメタロプロテイナーゼ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である可能性がある（Ｐａｊｏｎｋら  ２００２、Ｉｋｅｚｏｅら  ２００４、Ｓｇａｄａｒｉら  ２００２、Ｉｋｅｚｏｅら  ２００４、Ｇｕｐｔａら  ２００５、Ｃｕｎｅｏら  ２００７）。また、これらの薬剤が腫瘍細胞を放射線に対して増感させ、他の細胞増殖抑制性剤の抗癌性効果を増大させ、また、ヌードマウスにおいて血管原性の腫瘍細胞の成長および浸潤を阻害することが示されている（Ｉｋｅｚｏｅら  ２００４、Ｓｇａｄａｒｉら  ２００２、Ｇｕｐｔａら  ２００５）。
【０００３】
残念ながら、これらの薬剤の適用は、高脂血症または低脂血症(hypolipidaemia)、心臓血管疾患、糖尿病、体脂肪再分布、骨減少症および骨粗鬆症等の多くの予測外の有害作用を伴った（Ｆｌｅｘｎｅｒ、１９９８）。ＮＯ部分の付加は、毒性を低減し薬剤の効能を増大させるために現在使用される手法の１つである。この型の化学修飾は、非常に多くの非ステロイド系抗炎症薬に対して適用されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
現在では、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、特にサキナビルをＮＯの共有結合によって有利に修飾できることが見いだされている。
【０００５】
したがって本発明は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の硝酸エステルを提供する。
【０００６】
ＮＯ部分は、従来の方法、すなわち無水酢酸／ハロゲン化炭化水素中で０℃未満、好ましくは−１０℃未満の温度において濃硝酸と反応させることによって、既知のプロテアーゼ阻害剤上に存在するヒドロキシ基に導入される。
【０００７】
サキナビル以外に有利に硝酸エステル化することのできるプロテアーゼ阻害剤の例は、リトナビル、ネルフィナビル、インディナビル、ダウナビル（Ｄａｕｎａｖｉｒ）、ラピナビル（Ｌａｐｉｎａｖｉｒ）、アンプレバニル（Ａｍｐｒｅｖａｎｉｒ）、アタザナビルを含む。
【０００８】
式Ｉを有するサキナビルの硝酸エステル
【０００９】
【化１】
2011529864.tif 000002
【００１０】
およびその非毒性の塩、溶媒和物または結晶／多形形態が特に好ましい。
【００１１】
式Ｉの化合物は以下にＮＯ−サキナビルと称され、特許化合物サキナビルよりも効果が高く毒性が低いことが見いだされた。このことは以下に報告する実験部分において示される。
【００１２】
化合物Ｉの合成スキームを図Ｉ中に報告する。
【００１３】
本発明はまた、式Ｉの化合物または他のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の硝酸エステルを適切な担体／賦形剤との混合物中に含む医薬組成物をも提供する。本発明の組成物は、任意の既知のルート、特に経口、非経口、局所的、経皮、直腸内ルートによって投与してもよい。
【００１４】
投薬量は、熟練した開業医であれば、毒性学的、薬物動態学的および薬力学的特性に従って、ならびに患者の状態（疾患の重症度および進行の度合い）、体重、年齢および性別に応じて容易に決定するであろう。投薬量は一般的に、親化合物サキナビルに対するまたは対応する親プロテアーゼ阻害剤に対する臨床診療において既知の投薬量に類似するであろう。
【００１５】
上記組成物は、腫瘍およびＨＩＶ感染の治療に有用である。
【００１６】
したがって本発明は、腫瘍および／またはＨＩＶ感染に罹患した患者を治療する方法であって、請求項１に記載の化合物の有効量を上記患者に投与するステップを含む方法をも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｓａｑ−ＮＯの合成を示す図である。
【図２】Ｓａｑ−ＮＯとＳａｑとの細胞毒性を示すグラフである。
【図３】細胞培養上清中における亜硝酸塩の蓄積を検出したデータである。
【図４】ＬＤＨ放出アッセイの結果を示すグラフである（Ａ）。細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析したデータである（Ｂ）。細胞の増殖率、細胞生存率を示すグラフである（Ｄ）。
【図５】細胞の形態を示すデータである（Ａ）。メラニンおよびチロシナーゼ活性を決定した（Ｂ）。サイクリンＤおよびｐ５３の発現を評価したものである（Ｃ）。
【図６】Ａｋｔ活性を示すデータである。
【図７】腫瘍細胞の成長の阻害を示すグラフである。
【実施例】
【００１８】
以下の例によって本発明をより詳細に記載する。
【００１９】
例１  サキナビル−ＮＯの合成
ＣＨＣｌ3（１８ｍＬ）中のサキナビル（３ｇ、４．４８ｍｍｏｌ）を、発煙硝酸（≧９０％ＨＮＯ3、１ｍＬ、２３．６ｍｍｏｌ）およびＡｃ2Ｏ（３．５ｍＬ、３７．１ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌している中に−１０℃において添加し、次いで室温まで２時間かけて窒素下においてゆっくりと温めた。反応混合物を氷冷水で急冷し、ＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。抽出物を氷冷飽和ＮａＨＣＯ3および水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、ろ過した。溶媒を加圧下において蒸発させ、３：２〜３：３のＨｅｘ：アセトンを用いたＦＣＣ溶出によって粗生成物を精製した。得られた生成物をＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘから再結晶させることによってサキナビル−ＯＮＯ2（１．７ｇ、５３％）を白色固体として得、純度をＨＰＬＣおよびＭＳによって分析した。ＭＳ  ｍ／ｚ  ７１６．３３（Ｍ＋Ｈ+）。
【００２０】
ＨＰＬＣ：カラムの型：フェノメネクスプリメスフィア（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ｐｒｉｍｅｓｐｈｅｒｅ）５  Ｃ１８  ＭＣ  １１０Ａ  ２５０×４．６ｍｍ
検出波長：２７５ｎｍ（最大吸光度を示す波長）
流速：１ｍＬ／分、水（０．１％ＡｃＯＨ）：ＭｅＯＨ［９０：１０］〜水（０．１％ＡｃＯＨ）：ＭｅＯＨ［１０：９０］の直線勾配により３０分間。
【００２１】
例２−生物学的特徴の決定
材料と方法
試薬および細胞
アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎ  ｏｒａｎｇｅ）（ＡＯ）はＬａｂｏ−Ｍｏｄｅｒｎａ（Ｐａｒｉｓ、フランス）から入手した。カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、米国）からであった。阻害剤Ａｋｔ  ＶＩはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ドイツ）から入手した。他の化学物質はいずれも、特記しない限りＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）から購入した。サキナビル（Ｓａｑ、ＭＷ  ６７０ｇ／ｌ）およびサキナビル−ＮＯ（Ｓａｑ−ＮＯ、ＭＷ  ７１５ｇ／ｌ）を−２０℃において、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中の２５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）において濃度５ｍｇ／ｍｌで保存し、使用前に速やかに培養基中に希釈した。対照の細胞培養を、十分量のＤＭＳＯで処理した。
【００２２】
ラット神経膠腫Ｃ６およびヒト神経膠芽腫Ｕ２５１細胞株はＰｅｄｒｏ  Ｔｒａｎｑｕｅ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ  ｄｅ  Ｃａｓｔｉｌｌａ−Ｌａ  Ｍａｎｃｈａ、Ａｌｂａｃｅｔｅ、スペイン）の好意により寄贈され、マウス黒色腫Ｂ１６およびヒト腺癌ＨｅＬａはＳｉｎｉｓａ  Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ博士（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｓｅｒｂｉａ、Ｂｅｌｇｒａｄｅ、セルビア）の好意により寄贈され、マウス線維肉腫Ｌ９２９はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、英国）から入手した。ヒト乳房ＨＣＣ１４１９および前立腺ＰＣ−３細胞はＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ  ｓｒｌ（Ｖｅｎｅｚｉａ、イタリア）から購入した。初代マウス線維芽細胞およびラット星状細胞は記載通りに調製した（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃら  ２００４）。５％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、０．０１％ピルビン酸ナトリウム、５×１０-5Ｍ２−メルカプトエタノールおよび抗生物質（培養基）を添加したＨＥＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃において湿気のある５％ＣＯ2環境にて細胞を生育させた。従来のトリプシン処理後、細胞を９６ウェルプレート中に１×１０4／ウェル、６ウェルプレート中に２×１０5／ウェル、または４ウェルチャンバースライド中に３×１０4／ウェルとなるように播種し、一晩培養し、次いで薬剤に対して曝露した。２〜３か月齢の近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ「Ｓｉｎｉｓａ  Ｓｔａｎｋｏｖｉｃ」内の本発明者らの設備から入手して、標準的な実験室条件下（不特定の病原体を含まない）において飼育し、食物および水を自由に摂取させた。動物の取り扱いおよび研究プロトコールは国際的な指針に従ったものであり、地域の動物実験委員会により承認された。
【００２３】
ＭＴＴ、クリスタルバイオレットおよびＬＤＨ放出アッセイによる細胞生存性の決定
３−４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）のホルマザンへの還元は培養細胞のミトコンドリア活性に依存し、クリスタルバイオレット色素の吸収は付着性の生細胞の数と相関関係にあり、細胞質内乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出は壊死性細胞に特有の膜完全性の破壊を示す。細胞を、異なる剤を含有する最終体積２００μｌの培養基中において平底９６ウェルプレート中に播種し、以前の記載（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃら  ２００４、Ｄｅｃｋｅｒら、１９９８）に厳密に従って２４時間インキュベートした後にアッセイを実行した。ミトコンドリア（Ｍｉｔｏｈｏｎｄｒｉａｌ）依存性のホルマザンの生成、および付着性細胞により吸収されたクリスタルバイオレットの濃さを、自動マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍにおいて調べ、一方、ＬＤＨアッセイにおける２，４−ジニトロフェニルヒドラジンから視認可能なヒドラゾンの析出物への、ピルビン酸塩介在性の変換を、４９２ｎｍにおいて測定した。ＬＤＨ放出によって示された細胞毒性％を以下のように計算した。（Ｅ−Ｃ）／（Ｔ−Ｃ）×１００、式中、Ｅは細胞培養の実験での吸光度、Ｃは対照としての、細胞を含まない培養基における吸光度、ＴはＴｒｉｔｏｎによって溶解された細胞における最大（１００％）ＬＤＨ放出に対応する吸光度である。
【００２４】
細胞増殖の決定
細胞増殖率を、ＣＦＳＥ標識された細胞のフローサイトメトリー分析によって検証した（Ｋａｎｇら  ２００５）。ＣＦＳＥ色素は細胞質中において１５世代を超えて安定であり、分裂する度に蛍光の濃さが薄くなる。簡潔には、剥離した細胞を１．５μＭのＣＦＳＥで１５分間にわたり３７℃において染色し、２回洗浄し、６ウェルプレート中に２×１０5細胞／ウェルとなるように播種し、次いで薬剤に曝露した。２４および４８時間培養した後、細胞をトリプシン処理し、２回洗浄した。最後に、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。緑色の蛍光発光を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）によって測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアで分析した。
【００２５】
アポトーシスおよびオートファジー細胞死の決定
アポトーシス細胞死を、ＤＮＡ結合色素ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色された細胞におけるＤＮＡ断片化のフローサイトメトリー分析によって調べた。６ウェルプレート中で２４時間インキュベートした後、細胞（２×１０5／ウェル）をトリプシンで剥離し、洗浄し、７０％エタノール中で４℃において３０分間かけて固定した。ＰＢＳ中で洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅおよびヨウ化プロピジウム（４０μｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳ中で細胞を再懸濁し、３７℃において暗所で３０分間にわたって保持した。赤色の蛍光をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）で分析し、細胞の細胞周期状態における分布をＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ）で決定した。サブＧ0／Ｇ1分画における低二倍性細胞をアポトーシス性であると考えた。
【００２６】
生体染色色素アクリジンオレンジ（ＡＯ）をオートファジーの検出に使用した。赤色の蛍光の濃さは、存在するオートファジー性の細胞小器官の酸性度および体積と相関関係にある（Ｋａｎｚａｗａら  ２００４）。アッセイを以下のように実行した。細胞を６ウェルプレート（２×１０5／ウェル）中で薬剤の存在下において２４時間にわたり培養し、トリプシンで剥離し、ＲＰＭＩ中の１μｇ／ｍｌのＡＯで、フェノールレッドを用いずに１５分間にわたって室温において染色した。インキュベーション時間の終了後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。緑色および赤色の蛍光発光をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。
【００２７】
ＮＯの放出および亜硝酸塩の蓄積の測定
ＮＯの放出の間接的な指標としての亜硝酸塩の蓄積を、以前（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃら  ２００４）に記載されたグリース反応によって測定した。細胞内におけるＮＯを検出するため、細胞を１時間にわたって３７℃において、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０中のＮＯの指標であるＤＡＦ−ＦＭ二酢酸塩（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）２μＭで染色した。次いで、細胞を洗浄し、３７℃において新しいＲＰＭＩ１６４０中で更に１５分間インキュベートした後、薬物治療した。２時間後、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、最後にＰＢＳ中に再懸濁し、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによって分析した。
【００２８】
細胞ベースＥＬＩＳＡ
Ｖｅｒｓｔｅｅｇによる細胞ベースＥＬＩＳＡ（ｃＥＬＩＳＡ）（Ｖｅｒｓｔｅｅｄら、２０００）をわずかに改変した方法を使用して、ガラクトセレブロシド、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、サイクリンＤ３、ｐ５３およびｐ−ＡＫＴの発現を測定した。簡潔には、培養期間の最後に細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、内因性ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ）を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の１％Ｈ2Ｏ2でクエンチングし、抗体の非特異的結合を１０％ＦＣＳを含有するＰＢＳＴ溶液で遮断した。ラット／マウスｐ−Ａｋｔ（１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、ＧＦＡＰ（１：２００、ＢｉｏＹｅｄａ、イスラエル）、ガラクトセレブロシド（１：１００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、ＭＢＰ（１：１００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、サイクリンＤ３（１：７５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）およびｐ５３（１：２５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）に対して特異的な一次マウスモノクローナル抗体を、２％ウシ血清アルブミンを添加したＰＢＳＴ（ＰＢＳＴＢ）中に加えるのに続き、抗ＧＦＡＰおよびガラクトセレブロシドには二次ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＰＢＳＴＢ中に１：２５００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  英国）を、または抗ｐ−Ａｋｔ、抗サイクリンＤ３および抗ｐ５３には抗ウサギＩｇＧ（１：２５００、Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  英国）を加えた。インキュベーションはすべて、３７℃において１時間にわたって実行した。ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢとともにインキュベートした１５分後に、４５０ｎｍにおける吸光度を自動マイクロプレートリーダーにおいて測定し、続いて０．１ＭのＨＣｌを添加した。各治療の間で比較できるよう、元のプロトコール中に記載されるように、得られた吸光度をクリスタルバイオレット染色によって決定された細胞数に対して補正した。結果を、対照の値と比較して相対的に提示する。
【００２９】
チロシナーゼ活性アッセイおよびメラニン決定
チロシナーゼ活性を、Ｌ−ＤＯＰＡ34の酸化率を測定することによって決定した。簡潔には、６ウェルプレート中でサブコンフルエントになった培養物を１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むｐＨ６．８のリン酸緩衝液１００μｌ中に溶解し、次いで、１００００ｒｐｍにおいて５分間にわたって遠心分離した。各抽出物４０μｌをＬ−ＤＯＰＡ基質溶液（２ｍｇ／ｍｌ）１００μｌと混合した。酵素反応を３７℃において実施し、５７０ｎｍにおける吸光度を１０分毎に少なくとも１時間にわたって読み取った。最終活性を、ブラッドフォード法によって推定されたタンパク質総量によって補正した。メラニンを決定するため、細胞を６ウェルプレート中で２４時間にわたってインキュベートし、トリプシン処理し、カウントし、次いで１ＭのＮａＯＨ  １００μｌ中に溶解した。蒸留水４００μｌを添加し、試料を６０℃において１時間にわたってインキュベートした。その後、溶解した色素の吸光度を４９２ｎｍにおいて測定した。
【００３０】
免疫細胞化学的な検出
サイクリンＤ３の発現およびｐ５３の発現の検出を、以前に記載された免疫細胞化学的な手順によって実行した（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃら、２００５）。細胞をガラス製チャンバースライド（３×１０4細胞／ウェル）中で培養し、サイクリンＤ３およびｐ５３の発現を、サイクリンＤ３（１：１０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）およびｐ５３（１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）に対して特異的な抗体で検出した。一次抗体の認識を、ウサギエキストラビジン（ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ）−ペルオキシダーゼ染色キットで、製造元による指導書（Ｓｉｇｍａ）に従い、ジアミノベンジジン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を基質として使用して実行した。細胞をマイヤー（Ｍａｙｅｒ）ヘマトキシリンで対比染色し、スライドガラスをグリセルゲル（ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ）封入用媒体（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）で封入した。
【００３１】
ウェスタンブロット分析
細胞（１×１０6）をフラスコ（２５ｃｍ3）中に播種し、０．５％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ中で一晩インキュベートし、続いて薬剤で３０、６０および１２０分間にわたって治療した。全細胞溶解物を６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８、２５℃において）、２％ｗ／ｖのＳＤＳ、１０％グリセリン、５０ｍＭのＤＴＴ、０．０１％ｗ／ｖブロモフェノールブルーを含有する溶液中に調製し、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。試料を、ポリ二フッ化ビニリデン膜に、セミドライブロッティング装置（Ｆａｓｔｂｌｏｔ  Ｂ４３、Ｂｉｏｒａｄ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）を使用して５ｍＡ／ｃｍ2において電気的に転写した。ブロットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の５％ｗ／ｖ脱脂粉乳でブロッキングし、ｐ５３、ＣＤ３、Ａｋｔ、リン酸化Ａｋｔおよびアクチンに対して特異的な抗体で探索した（いずれも１：１０００で希釈、Ａｋｔおよびｐ−ＡｋｔはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡより、ＣＤ３、ｐ５３およびアクチンはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡより）のに続き、二次抗体（ＥＣＬロバ抗ウサギＨＲＰ結合、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）とともにインキュベートした。検出を化学発光（ＥＣＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって実行した。
【００３２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける黒色腫の誘導および薬剤治療
原発性腫瘍を誘導するために、２×１０5個のＢ１６黒色腫細胞を、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける背側右の腰仙部位に皮下(ｓ.ｃ)注射した。腫瘍の成長を毎日観察し、埋め込んで１０日後から薬物治療を開始した。ＳａｑおよびＳａｑ−ＮＯの新しい溶液を腹腔内(ｉ.ｐ.)に用量１０ｍｇ／ｋｇ体重において１５日間連続して注射した。３０日目にマウスを屠殺し、各マウスからの腫瘍の各々を三次元で測定することによって腫瘍の成長を決定した。以前に記載された（Ｍａｋｓｉｍｏｖｉｃ−Ｉｖａｎｉｃら  ２００８）ように［０．５２×ａ×ｂ2］、式中のａは最長、ｂは最短の直径、により腫瘍の体積を計算した。
【００３３】
急性毒性
ＳａｑおよびＳａｑＮＯの急性毒性を定義するために、試験化合物を２５０、５００、１０００および１５００ｍｇ／Ｋｇの単回投与によりＣＤ１マウスに腹腔内(ｉ.ｐ.)投与した。対照群を、ビヒクル（純粋なＤＭＳＯ、１００μｌ／マウス）のｉ.ｐ.投与により処理した。各群はマウス１０匹ずつとした。死亡率を、最初の４時間は１時間毎に、次いで投与後１４日目までは１０時間毎に評価した。
【００３４】
統計的分析
異なる治療の間の差異の有意性をＡＮＯＶＡで分析し、これに続き、多重比較をスチューデントニューマンクールズの検定(Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｔｅｓｔ)により行った。ｐ値が０．０５未満である場合に有意であると考えた。
【００３５】
結果
Ｓａｑ−ＮＯは腫瘍細胞の生存能を大幅に低下させたが、初代細胞の生存能は低下させなかった
ＳａｑおよびＳａｑ−ＮＯの効果を、形質転換されたヒト（ＨｅＬａ子宮頚部腺癌、ＢＴ２０およびＨＣＣ１４１９乳癌、ＰＣ−３前立腺癌）および齧歯類（Ｃ６ラット星状細胞腫およびＢ１６マウス黒色腫）細胞株、ならびに形質転換されていない初代細胞（ラット初代星状細胞およびマウス線維芽細胞）といった性質の異なる細胞の生存能に対して評価した。クリスタルバイオレットアッセイ（図２Ａ、２Ｂ）およびミトコンドリア呼吸（図示せず）によって評価したところ、両化合物は強い抗腫瘍能を呈する。ＮＯ修飾化合物はより効率が高く、ＩＣ５０値は親薬剤の１／２〜１／４であった。興味深いことに、Ｓａｑ−ＮＯ濃度を更に増加させても生存能が更に低下することはなかった。また、Ｓａｑ−ＮＯは形質転換されていない初代星状細胞および線維芽細胞の生存能には影響をおよぼさず、ＩＣ５０用量のＳａｑは毒性が高かった(図２Ｃ)。したがって、親化合物にＮＯが結合したことによりその殺腫瘍能が大幅に増大し、初代細胞に対するその毒性がほぼ完全になくなったということが明らかである。２つの異なるＳａｑ調製物の細胞毒性機構を詳細に記述するために、本発明者らはＣ６およびＢ１６齧歯類細胞株を代表として使用した。
【００３６】
Ｓａｑ−ＮＯは極微量のＮＯを放出する。Ｓａｑの殺腫瘍性作用がその化学修飾後に増大したことが観察されたが、これはＮＯの放出量および速度によるものである可能性がある。薬剤によるＮＯの放出の規模を調べるため、腫瘍細胞をインキュベートして２４時間後に、ＮＯの細胞内における蓄積および細胞培養上清中におけるその遊離をＳａｑ−ＮＯの存在下において測定した。驚くことに、他のＮＯ修飾された薬剤とは異なって、Ｓａｑ−ＮＯでの治療はＢ１６およびＣ６細胞の両方において細胞内における微量のＮＯの放出を誘導した（図３Ａ）。これと一致するように、極微量のＮＯの放出が細胞培養上清中において観察された（図３Ｂ）。これらのデータは、薬剤から遊離した微量のＮＯが悪性細胞に対する薬剤誘導性の毒性の直接的な原因ではない可能性があるということ、および親薬剤の化学構造をこのように修飾することによって、他のＮＯ供与性化合物とは全く異なる新しい性質の薬理学的特性を与えたということを示唆する。
【００３７】
Ｓａｑ−ＮＯの抗腫瘍活性は主として細胞増殖抑制活性に基づくものであった。以下の実験において、ＳａｑおよびＳａｑ−ＮＯが異なる型の細胞死を誘導する能力を比較した。最初に、壊死の存在をＬＤＨ放出アッセイによって分析した。試験は、壊死性細胞が細胞膜の損傷によりＬＤＨを細胞上清中に放出する特質に基づく。図４Ａから分かるように、Ｃ６およびＢ１６細胞をＳａｑで治療したことによって、両細胞株においてＬＤＨの放出が用量依存的に誘導され、このことは、薬剤作用の主要なまたは二次的な機構として壊死性細胞死が重要であったことを示唆した。しかし、有意なＣ６細胞毒性の割合はＳａｑ−ＮＯの最も高い用量で治療した場合においてのみ検出されたことから、壊死は新しい化合物で観察された抗神経膠腫活性の原因ではないということが示された。一方、黒色腫細胞において用量依存性のＬＤＨの放出が、Ｓａｑ−ＮＯでの治療において試験したいずれの用量に対しても検出された（図４Ａ）。また、Ｓａｑ−ＮＯは、試験された最も低い用量においても有意な細胞毒性(cytoxicity)を誘導したことから、Ｂ１６のＳａｑ−ＮＯに対する感受性がＳａｑに対する感受性よりも高いということが示された。更に、ＬＤＨの有意な放出は、薬剤（対照において２．３％、ＶＳ  Ｓａｑ−ＮＯで治療した培養物１８．８μＭにおいて６．２％）に対して１８時間曝露する前には検出できなかったことから、壊死が薬剤作用の主要な機構というよりもむしろその結果であるということが示された。更に調査するために、細胞生存性をＣ６において約５０％、Ｂ１６において７０％低下させた際のＳａｑ−ＮＯの用量１８．８μＭを選択し、同一の用量のＳａｑと比較した。Ｂ１６およびＣ６細胞がオートファジー傾向を有する細胞として知られることを考慮して、両薬剤の抗腫瘍効果におけるオーソファジー(authophagy)の寄与を評価した。Ｓａｑ−ＮＯおよびＳａｑのいずれによっても、両細胞株の細胞質中における酸性小胞の量が増加しなかったことから、死または救済プロセスのいずれとしてもオートファジア(autophagia)が存在しなかったということが指摘された（図４Ｂ）。
【００３８】
次いで、細胞周期分布に対する薬剤の影響を調べた。Ｓａｑで治療した細胞の分布は、対照である未処理の細胞の分布と大きく異なるものではなかった（図４Ｃ）。Ｃ６細胞培養において、Ｓａｑ−ＮＯにより、サブＧ分画における細胞の割合がわずかに増加し、Ｇ0／Ｇ1における特に著しい停止が誘導された（図４Ｃ、左のグラフ）。同時に、Ｂ１６細胞を同様に治療した結果、統計的に有意なアポトーシスおよび細胞周期のＧ2／Ｍ相における細胞の蓄積がみられた（図４Ｃ、右のグラフ）。神経膠腫細胞において、細胞周期の顕著な遮断に続き、アポトーシスが若干存在し、オートファジー性および壊死性の細胞死が存在しないことから、細胞死の誘導ではなくむしろ増殖の阻害がＳａｑ−ＮＯの抗腫瘍特性の原因となる機構であるという可能性が高まった。薬剤の細胞増殖抑制活性が顕著であるということは、ＣＦＳＥ染色によって更に確認された。対照細胞の約９０％が４８時間後に分裂するが、Ｓａｑ−ＮＯで治療した際には細胞の１０％未満しか増殖することができない（図４Ｄ、左のグラフ）。Ｓａｑ−ＮＯでの治療後に生存していたＢ１６細胞はＣ６細胞と比較して低い分裂能を示したことから、化合物の作用においてこの機構が優先しているということが示唆された。また、Ｓａｑの投与中止によって２４時間後における細胞の生存能が主として回復したが、同一の条件においてＳａｑ−ＮＯを除去した場合には回復が非常に穏やかとなったことから、増殖能力の喪失が永続的であったということが示唆された（図４Ｄ、右のグラフ）。以上のことを要約すると、これらの結果はＳａｑ−ＮＯの優れた細胞増殖抑制能力を強く示した。
【００３９】
Ｓａｑ−ＮＯは神経外胚葉Ｃ６およびＢ１６細胞の分化を誘導した。薬物治療の結果としての細胞増殖の阻害によって、試験した両腫瘍細胞株の形態変化が生じた（図５Ａ）。こうした形態学的な特質が表現型の変化と相関関係にあったか否かを更に探究するために、本発明者らはＣ６およびＢ１６細胞培養における分化マーカーの発現を分析した。希突起膠細胞のマーカーであるガラクトセレブロシドの発現が強く上方調節されたが、ＧＦＡＰの発現は減少したまたは変化しなかった（図５Ｂ、左のグラフ）ことを考慮すると、Ｓａｑおよび特にＳａｑ−ＮＯでの治療後のＣ６細胞が星状細胞ではなく希突起膠細胞の表現型を採っていたということのようであった。一方、Ｂ１６細胞において、Ｓａｑでの治療後にのみメラニン含有量およびチロシナーゼ活性が増加し（図５Ｂ、右のグラフ）、形態変化が観察された（図５Ａ、右のグラフ）ことから、細胞がメラノサイトの表現型を取っていたということが示された。その一方、Ｓａｑ−ＮＯによって誘発された明らかな形態変化に加えて、Ｂ１６細胞は、わずかではあるが有意なチロシナーゼ活性の減少と、変化しないメラニン量とを示した。同時に、これらの細胞はＭＢＰ発現における穏やかな上昇を示し（図５Ｂ、右のグラフ）、このことから、Ｂ１６細胞がいわゆる「シュワン様細胞（Ｓｃｈｗａｎｎ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ）」の表現型を採っていたということが示された。このプロセスは文献中に「分化転換(transdifferentiation)」（Ｒｅｅｄ  ＪＡ、１９９９）として記載され、メラノサイトの退化前の最終段階を提示した。
【００４０】
サイクリンＤ３および腫瘍抑制タンパク質ｐ５３の発現と希突起膠細胞の生育とが関連することから、次に、試験化合物によって誘発された分化プロセスにおけるそれらの関与をＣ６およびＢ１６細胞において調査した。ＳａｑおよびＳａｑＮＯの存在下において２４時間インキュベートした後、サイクリンＤ３およびｐ５３タンパク質の発現をｃＥＬＩＳＡ（図５Ｃ、上のグラフ）および免疫細胞化学（図５Ｃ、下のグラフ）のウェスタンブロット分析によって決定し、薬剤に対して曝露してわずか４時間後に同じ現象を確認した（図５Ｃ、中のグラフ）。細胞をＳａｑで治療することによりサイクリンＤ３およびｐ５３の活性が上方調節され、Ｓａｑ−ＮＯはｐ５３の発現に対してＳａｑよりも大幅に影響をおよぼしたが、両細胞株におけるサイクリンＤ３の発現はそれほど変化しなかった。（図５Ｃ）。総合すると、ＳａｑにＮＯが共有結合したことによって、細胞内レベルにおける薬剤活性に有意な差異が生じた。
【００４１】
ＳａｑおよびＳａｑ−ＮＯはＡＫＴシグナル伝達経路を反対方向に調節する。ＰＩ−３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路がＳａｑおよび他のＨＩＶ−ＰＩの最も重要な細胞内標的の１つであるということはよく記録に残されており、このことはその殺腫瘍特性に関連する可能性があり、またこの薬剤ファミリーについて観察された高い毒性の原因でもある可能性がある。修飾されたＨＩＶプロテアーゼ阻害剤Ｓａｑ−ＮＯにおいて抗腫瘍特性が保存されていたことおよび正常細胞に対して毒性がないことについての先のデータを念頭において、本発明者らは次に、Ａｋｔ介在性のシグナル伝達経路に対して薬剤がおよぼし得る影響を調査した。得られた結果から、Ｓａｑはこの全く効果のない用量においてもｐ−Ａｋｔの発現を排除したが、これとは完全に逆に、Ｓａｑ−ＮＯはＡＫＴの相当量の一過性のリン酸化を誘導したということが明瞭に示された。修飾された薬剤および元の化合物である薬剤はいずれもＢ１６およびＣ６細胞において類似する様式の作用を示し、ｃＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析によって得られた結果をＢ１６細胞を代表するものとして提示した（図６Ａ、６Ｂ）。また、上流のＰＩ−３キナーゼの特異的阻害剤である３−ＭＡ、またはＡｋｔ阻害剤であるＡＫＴ  ＶＩでの細胞の治療によって、腫瘍細胞の生存性が更に減少した（図６Ｂ）。この結果は、ＮＯ修飾された化合物について保存、更には増強されている抗腫瘍活性には、Ａｋｔ活性の阻害および上方調節のいずれが介在するものでもなかったということを明瞭に示した。また、Ａｋｔ活性の増強は、保護的な兆候を提示し、また、このＮＯ修飾された化合物に曝露された初代細胞において毒性がないことの主要な原因である可能性があった。
【００４２】
ＳａｑおよびＳａｑ−ＮＯは、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＢ１６黒色腫の成長を低下させた。親化合物および新たに生じた化合物のインビボにおける抗腫瘍特性を調査して比較するために、Ｂ１６腫瘍細胞を同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスのｓ.ｃ.に接種し、次いでＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯのいずれかのｉ.ｐ.投与によって治療した。腫瘍誘導して１０日後に薬物治療を開始し、１５日間連続して継続した。図７から分かるように、解剖（腫瘍攻撃して３０日後）において、対照動物のすべてが固形腫瘍を発病した。Ｓａｑで治療した群において、動物の３／９が腫瘍を発病したが、その体積は有意に減少していた。最後に、Ｓａｑ−ＮＯで治療した群においては、腫瘍は１つのみ観察された。同時に、Ｓａｑを受けた動物は際立った体重の減少（最初の体重から１０％）を示し、腫瘍のない動物のうち４匹は腹膜の強い炎症を示した。一方、Ｓａｑ−ＮＯでの治療において視認可能な毒性の兆候はみられず、また動物は体重が増加した（最初の体重の１３％）。
ＳａｑおよびＳａｑＮＯのインビボにおける毒性
Ｓａｑ−ＮＯでは試験された用量のいずれにおいても死亡は観察されなかったが、Ｓａｑは、用量１５００において投与後１８〜１４４時間で１００％（平均±ＳＤ＝６５±５８）、用量１０００ｍｇ／Ｋｇにおいて３０％、投与後２４時間以内において用量５００ｍｇ／Ｋｇにおいて２０％の致死率を誘導することができた。
【００４３】
考察
ＨＩＶ−ＰＩは、ＨＩＶプロテアーゼを阻害するその主な能力に加えて、強い抗腫瘍性の特質を保有しているということが近年示された。ＨＩＶ−ＰＩは、多発性骨髄腫、ＳＷ８７２脂肪肉腫、Ｔ２４膀胱癌、Ａ５４９肺癌、Ｕ３７３神経膠芽腫、ジャーカット白血病（Ｊｕｒｋａｔ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）細胞、ＤＵ−１４５およびＰＣ−３前立腺癌細胞、ＮＢ４およびＨＬ−６０ヒト骨髄性白血病細胞およびカポジ肉腫等の非常に多くの型の腫瘍細胞株の成長を阻害することができる（Ｃｈｏｗら  ２００６、Ｐａｊｏｎｋら  ２００２、Ｉｋｅｚｏｅら  ２００４、Ｉｋｅｚｏｅら  ２０００、Ｇｉｌｌｓら  ２００７）。また、この薬剤はカポジ肉腫の発病率を減少させ退縮を促進し、また、頭部、頚部、膀胱および前立腺癌に対する放射線および化学療法の治療的効能を増幅することができた（Ｐａｊｏｎｋら  ２００２、Ｉｋｅｚｏｅら  ２００４、Ｓｇａｄａｒｉら  ２００２、Ｉｋｅｚｏｅら  ２００４、Ｇｕｐｔａら  ２００５、Ｃｕｎｅｏら  ２００７）。しかし、この型の薬剤の長期投与は、高ビリルビン血症、高脂血症または低脂血症、インスリン抵抗性および糖尿病等の予測されない副作用を引き起こす（Ｓｇａｄａｒｉら  ２００３）。
【００４４】
本発明の化合物であるＳＡＱ−ＮＯによって、抗腫瘍特性が増強され、正常組織に対する毒性が排除された。より詳細には、新たに合成された薬剤の作用における別の様式は、いくつかの齧歯類およびヒト腫瘍細胞株の成長に対する高い抑制効力と関連があった。更に、初代細胞に対する毒性はほぼ完全に解消された。他のＮＯ供与性化合物からのＮＯの放出は直接または間接的にその細胞毒性の原因であると考えられるが（Ｒｉｇａｓら  ２００４）、Ｓａｑ−ＮＯは非常に少量のＮＯしか遊離せず、この量は細胞毒となるほど強くはないが非常に多くの細胞内事象を調節する可能性が実際にあった。腫瘍細胞の拡大の制限がＳａｑによって誘導されたが、このことは主としてアポトーシスが誘導された結果である（Ｉｋｅｚｏｅ  Ｔら  ２００４）。この型のプログラム細胞死は高用量のＳａｑに曝露されたＣ６およびＢ１６細胞の生存能における減少にとって非常に重要であるが、修飾された化合物とともに培養された際には腫瘍細胞の死（偶発的な死またはプログラム死）はあまり寄与しない。腫瘍細胞の生存性が明らかに低下したことと一致するように、細胞周期の停止が観察されたこととＣＦＳＥ染色とによって、Ｓａｑ−ＮＯの抗癌活性にとって増殖の阻害が非常に重要であるということが確認された。このことと一致して、薬剤の投与中止後でも細胞が分裂できなかったことから、増殖特性の喪失が永続的であったということが示唆された。同時に、薬剤がＣ６およびＢ１６細胞の有意な形態変化を促進したことから、悪性の前駆体の表現型における変化が示された。Ｃ６およびＢ１６細胞の分化能力はよく記録に残されている。刺激に応じて、Ｃ６細胞は二方向性分化能力を保有する。したがって、アントラキノン(ａｎｔｒａｑｕｉｎｏｎｅ)であるアロエエモジン(Ａｌｏｅ  ｅｍｏｄｉｎ)に対して、またシロバナチョウセンアサガオ凝集素および効力が高いＰＫＣ阻害剤であるスタウロスポリンに対して曝露されると、Ｃ６細胞は星状細胞の(astocytic)系譜に向かって分化したが、Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ  Ｒａｄｉｘから単離されたサイコサポニン(saicosaponins)ＡおよびＤ等の他の剤によっては希突起膠細胞への成熟が促進されたということが示された（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃら  ２００５、Ｔｓａｉら  ２００４、Ｓａｓａｋｉら  ２００２、Ｋｒｏｎｆｅｌｄ  Ｉら  １９９５）。Ｃ６と同じ胚前駆体に由来し、α−メラノサイト刺激ホルモン、紫外線ＡおよびＢ照射、ならびにフォルスコリン、コレラ毒素、イソブチルメチルキサンチン（ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｉｎｅ）、レチノイン酸、およびマンノシルエリスリトールリピッド等の薬剤によって誘発されたＢ１６細胞は、初代メラノサイトの特徴を得た（Ｂｕｓｃａら  １９９６、Ｂｕｓｃａら  １９９８、Ｖａｌｖｅｒｄｅら  １９９３、Ｂｅｎｎｅｔら  １９９４、Ｏｈｇｕｃｈｉら  ２００４、Ｇｒｕｂｅｒら  １９９２、Ｚｈａｕら  １９９９）。これより、親またはＮＯ修飾化合物の両方で治療した際の関連する分化マーカーの発現の決定から、Ｃ６細胞が希突起膠細胞への分化のプロセスに入ったということが明らかになった。ＨＩＶ−ＰＩの中には前駆脂肪細胞およびヒト骨髄性白血病細胞の分化を誘導するものがあるということが以前に記載されている（Ｉｋｅｚｏｅら  ２０００、Ｃｈｏｗら  ２００６、Ｎｇｕｙｅｎら  ２０００）。一方、ＳａｑはＢ１６細胞のメラノサイトへの分化を誘導したが、Ｓａｑ−ＮＯはメラニン合成およびチロシナーゼ活性に対して逆の効果を示した。ある状況において、「分化転換」として知られているプロセスへとＢ１６が促され、シュワン(Ｓｃｈｗａｎ)様の表現型となるということが見いだされた（Ｓｌｕｔｓｋｙら  ２００３）。この細胞特性は天然のメラノサイトの退化ルートにおける実際の終点であると考えられた（Ｒｅｅｄ  ＪＡら  １９９９）。Ｓａｑ−ＮＯに対する曝露後にメラノサイトのマーカーが下方調節されたことに続いてＭＢＰの発現が増加したことから、この治療によってＢ１６細胞がメラノサイトのライフスパイン(life spine)の最終段階に直接進んだということが示唆された。
【００４５】
Ｔｏｋｏｍｏｎｔｏら（Ｙａｓｕｈｉｔｏ  Ｍ．Ｔｏｋｕｍｏｔｏ、Ｂｅ’ａｔｒｉｃｅ  Ｄｕｒａｎｄ，１およびＭａｒｔｉｎ  Ｃ．Ｒａｆｆ、１９９９）は以前に、ＰＤＧＦの投与中止または甲状腺ホルモン治療によって促進されるサイクリンＤ３の発現と希突起膠細胞の生育との間の関連を確立している。サイクリンＤファミリーの中で哺乳動物において最も広く発現しているサイクリンＤ３の上方調節（Ｂａｒｔｋｏｖａら、１９９８）が筋芽細胞の細胞株のいくつか（Ｊａｈｎら、１９９４；Ｋｉｅｓｓら、１９９５；ＲａｏおよびＫｏｈｔｚ、１９９５）およびヒト前骨髄球性白血病株ＨＬ６０（Ｂａｒｔｋｏｖａら、１９９８）の分化プロセスにおいて観察された。更に、甲状腺ホルモンによって誘導された、多分化能幹細胞の希突起膠細胞への成熟（Ｊｏｈｅら、１９９６  Ａｈｌｇｒｅｎら、１９９７；Ｂａｒｒｅｓら、１９９４；Ｉｂａｒｏｌｌａら、１９９６）が、サイクリンＤ３の上方調節およびｐ５３の発現レベルの増加に密接に関連していた。前者は文献中に、前駆体細胞を希突起膠細胞の系譜に導く主要な分子として記載されている。Ｓａｑによって誘発されるＣ６およびＢ１６細胞の分化は、恐らくその２６Ｓプロテソーム(protesome)阻害特性によるサイクリンＤ３の蓄積の増加と相関関係にあった（Ｐａｊｏｎｋ、２００２）。一方、サイクリンＤ３のレベルはＳａｑ−ＮＯによる影響を受けなかった。２つの薬剤によるｐ５３およびサイクリンＤ３の調節には差異があるがＣ６腫瘍細胞の成熟という結果が類似していることから、このプロセスにおいてサイクリンＤ３が優先しているということに関しての論議が提議される。また、親化合物で治療した培養物と比較して試験した際に、Ｓａｑ−ＮＯに対して曝露した後で両細胞株においてｐ５３タンパク質の量が有意に高かったことは、神経組織細胞の分化におけるｐ５３タンパク質の中心的な役割についてのデータと適合する（Ｂｉｌｌｏｎら  ２００４）。このことから、ｐ５３の活性の上方調節は、Ｓａｑ、特にＳａｑ−ＮＯによって促進されたＣ６およびＢ１６細胞の分化が観察されたことと、その結果として生じた、希突起膠細胞およびシュワン様細胞（Ｓｈｗａｎｎ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ）という識別可能な表現型を有する非悪性で非分裂性の細胞が生育したこととの原因である可能性がある。
【００４６】
ＨＩＶ−ＰＩの活性がＰＩ−３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路を妨げたということがよく記録に残されている。例えば、ネルフィナビル、アンプレナビルおよびサキナビルは非常に多くの細胞株においてＡｋｔ活性を阻害することができたが、これらの薬剤がこの経路を妨害した機構は未だ明らかではない（Ｇｕｐｔａら  ２００５）。先のデータと一致するように、ＳａｑはＣ６およびＢ１６の両細胞においてＡｋｔのリン酸化を下方調節し、その結果としてこのキナーゼの活性が減少した。Ａｋｔの阻害率と腫瘍細胞の生存性の下方調節とが相関関係にあったことから、このシグナル伝達経路と薬剤の殺腫瘍活性とが関連することが示された。このことに加えて、Ａｋｔの活性の減少は、黒色腫細胞のメラノサイトへの分化を促進するＳａｑの能力に関与する可能性がある。ｃＡＭＰを増加させる剤であるフォルスコリンが、この経路を阻害することによってＢ１６細胞の分化を誘導するということが示された（Ｂｕｓｃａら  １９９６）。反対に、Ｓａｑ−ＮＯでのＢ１６の治療はＡｋｔの一過性の活性化を誘導した。これと類似するＡｋｔの活性化が、内皮細胞、骨芽細胞および筋芽細胞の分化の間に観察された（Ｍａｒｃｈｅｔｔｉら、２００６、Ｒａｕｃｃｉ  Ａら  ２００８、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  ＪＣら  ２００７）。興味深いことに、特異的なＡｋｔ阻害剤または上流のＰＩ−３Ｋの阻害剤によるＡｋｔの中和は、細胞生存性を更に低下させた。データから、ＮＯ修飾化合物における抗腫瘍特性の保存はＡｋｔのリン酸化をモジュレートするその能力によるものではなかったということが示唆される。このことは、Ｓａｑが殺腫瘍活性を発揮するための主要な標的の１つがこのシグナルであるという考えとは全く反対であった。また、Ｓａｑ−ＮＯが、Ａｋｔを一時的にではあるが強く刺激することにより細胞に保護的なシグナルを送達し、初代細胞における薬剤毒性の欠如の原因を引き起こす可能性があった。元の化合物であるＳａｑの、ＰＩ−３Ｋ−Ａｋｔ経路を下方調節する特質は、インスリン受容体の連結反応によって誘発されたシグナルの伝達に対して非常に大きな影響をおよぼし、このプロセスを妨害してインスリン抵抗性を引き起こした（Ｇｕｐｔａら、１９９５）。これは、この化合物の最も重大な副作用の１つの原因である可能性のある、基本的な事象である。抗腫瘍性の特質を保存しながらこの有害なシグナルを有さないということは、新たに合成した薬剤の親化合物との比較における大きな利点である。また、Ｓａｑ−ＮＯがインビボにおいて強い抗黒色腫能を有し、インビボにおいて毒性が全く確認されなかったことは、Ｓａｑ−ＮＯが抗癌性薬剤として見込みがあるか否かを調べる強い動因となる。
【００４７】
また、Ｓａｑ−ＮＯの、ｅＣＸＣＲ４株のＣＣＲ％に対するインビトロにおける抗ＨＩＶ活性は、サキナビルのもつ活性と少なくとも同等に高いことを示す。
【００４８】
サキナビルと構造上類似する他のプロテアーゼ阻害剤（例えばリトナビル、ネルフィナビル、インディナビル、ダウナビル、ラピナビル、アンプレバニル、アタザナビル等）へのＮＯ部分の付加は、Ｓａｑ−ＮＯに関して上述した特性に類似する好適な特性を付与する。
【００４９】
図面の説明
図１は、Ｓａｑ−ＮＯの合成を示す。
【００５０】
図２は、Ｓａｑ−ＮＯとＳａｑとの細胞毒性を示す。Ｓａｑ−ＮＯは腫瘍の生存能を下方調節するが、初代細胞の生存能は下方調節しない。ヒト（Ａ）および齧歯類（Ｂ）の腫瘍細胞株（１×１０4細胞／ウェル）ならびに形質転換されていない齧歯類の初代細胞（３×１０4細胞／ウェル）（Ｃ）を、多様な濃度のＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯのいずれかに対して２４時間にわたって曝露した。次いで、細胞生存性をＣＶ試験によって評価した。データは、３回の独立した実験の代表からの平均±ＳＤとして提示する。*ｐ＜０．０５、未処理の培養物を基準とする。
【００５１】
図３において、腫瘍細胞のＳａｑ−ＮＯでの治療に続いて、極微量のＮＯが放出された。（Ａ）ＤＡＦ−ＦＭ二酢酸塩で染色された細胞をＳａｑ−ＮＯ（１８．８μＭ）なしで（対照）またはＳａｑ−ＮＯ（１８．８μＭ）とともに２４時間インキュベートした後、フローサイトメトリーによって細胞内におけるＮＯを検出した。ＧＩＴ−２７ＮＯ（７５μＭ）で治療した細胞を陽性対照として使用した。（Ｂ）示された濃度のＳａｑ−ＮＯとともに細胞を２４時間インキュベートした後、細胞培養上清中における亜硝酸塩の蓄積を検出した。データは、３回の独立した実験の代表からの平均±ＳＤとして提示する。*ｐ＜０．０５、未処理の培養物を基準とする。
【００５２】
図４において、Ｓａｑ−ＮＯは細胞増殖を強く阻害し、細胞死もこれにわずかに寄与した。（Ａ）腫瘍細胞を異なる用量のＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯとともに２４時間にわたってインキュベートし、ＬＤＨ放出アッセイを実行した。結果を、材料と方法に示される通りに計算し、３回の独立した実験の代表からの平均±ＳＤとして提示する（*ｐ＜０．０５）。腫瘍細胞を１８．８μＭのＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯとともにインキュベートした。薬剤なしでまたは薬剤とともに２４時間培養した後、細胞をＡＯオレンジ（Ｂ）またはＰＩ（Ｃ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。データは、３回の独立した実験からの平均±ＳＤとして提示する。*ｐ＜０．０５、未処理の培養物を基準とする。（Ｄ）細胞をＣＦＳＥで染色し、１８．８μＭのＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯとともに４８時間にわたってインキュベートし、増殖率をフローサイトメトリーによって決定した（左のグラフ）。細胞を１８．８μＭのＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯとともに２４時間にわたってインキュベートした。その後、薬剤を細胞から除去し、または除去せず、更に２４時間にわたってインキュベートした。２４および４８時間インキュベートした後、細胞生存性をＣＶ試験によって決定した（右のグラフ）。データは、３回の独立した実験からの平均±ＳＤとして提示する。*ｐ＜０．０５、未処理の培養物を基準とする。
【００５３】
図５において、ＳａｑおよびＳａｑ−ＮＯはＣ６およびＢ１６細胞の分化を誘導する。Ｃ６およびＢ１６細胞を１８．８μＭのＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯとともに２４時間にわたってインキュベートした。細胞の形態を光学顕微鏡検査法によって調べた（Ａ）。Ｃ６およびＢ１６細胞の細胞分化のマーカーであるガラクトセレブロシド、ＧＦＡＰおよびＭＢＰをｃＥＬＩＳＡによって決定し、メラニンおよびチロシナーゼ活性を材料と方法中に記載されるように決定した（Ｂ）。サイクリンＤ３およびｐ５３の発現をｃＥＬＩＳＡ（Ｃ、上のグラフ）、免疫細胞化学（Ｃ、中のグラフ）およびウェスタンブロット（Ｃ、下のグラフ）によって評価した。結果は、３回の独立した実験からの平均±ＳＤとして提示した。*ｐ＜０．０５、未処理の培養物を基準とする。
【００５４】
図６において、ＳａｑおよびＳａｑ−ＮＯはＡｋｔ活性を反対方向に調節する。（Ａ）Ｂ１６細胞を１８．８μＭのＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯとともにインキュベートし、Ａｋｔ活性をｃＥＬＩＳＡによって調べ、未処理の対照培養物において得られた値に対して何倍増加したかとしてデータを提示する（*ｐ＜０．０５）。Ｓａｑ−ＮＯの効果を示された時間点においてウェスタンブロット（Ｂ）によって確認した。（Ｃ）Ｂ１６細胞（１×１０4細胞／ウェル）を１８．８μＭのＳａｑ−ＮＯとともに、そしてＡｋｔ  ＶＩ（５０□ｇ／ｍｌ）または３−ＭＡ（１ｍＭ）とともにまたはこれなしで２４時間にわたってインキュベートし、細胞生存性をＭＴＴによって調べた。データは、３回の独立した実験からの平均±ＳＤとして提示する。*ｐ＜０．０５、未処理の培養物を基準とする。
【００５５】
図７において、ＳａｑおよびＳａｑ−ＮＯはＣ５７ＢＬ／６マウスにおける黒色腫の成長を阻害した。Ｂ１６黒色腫細胞２．５×１０5個をｓ.ｃ.に埋め込むことによって腫瘍が誘導され、腫瘍を埋め込んで１０日後にＳａｑまたはＳａｑ−ＮＯのｉ.ｐ.注射を開始し、１５日間連続して注射した。腫瘍を埋め込んで３０日後に腫瘍の体積を材料と方法に示される通りに決定した。
【００５６】
参考文献
【００５７】
【表１−１】
2011529864.tif 000003
【００５８】
【表１−２】
2011529864.tif 000004
【００５９】
【表１−３】
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【００６０】
【表１−４】
2011529864.tif 000006
【００６１】
【表１−５】
2011529864.tif 000007
【００６２】
【表１−６】
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【００６３】
【表１−７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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