(57)【要約】  微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）をバイオマスに添加してなるバイオマス処理方法について記載する。
2011514246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスに微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を添加することを特徴とするバイオマスの処理方法。
【請求項２】
バイオマスの液状化方法であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
バイオマスからバイオガスを製造する方法であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が微生物培養物の形で添加され、かつ微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、該培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０-4％を占めることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物培養物中の前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、該培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０％を占めることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記微生物培養物中の前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、該培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも５０％を占めることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記微生物培養物中の前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、該培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも９０％を占めることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の純粋培養物を添加することを特徴とする請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、微生物の少なくとも１つの固定化培養物の成分として、バイオマスに添加されることを特徴とする請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の添加とほぼ同時に、バイオマスを発酵槽に追加することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
バイオマスを連続的に加えて発酵槽の容積負荷を連続的に高めることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
バイオマスからのバイオガスの製造が、容積負荷０．５ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日以上、そして好ましくは４．０ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日以上、そして特に好ましくは８．０ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日以上で行われることを特徴とする請求項３〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
基質の添加および微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の添加を連続的に行うことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、添加後の該微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の割合が、発酵基質中に存在する微生物の総数の１０-8％と５０％との間になる量で添加されることを特徴とする請求項１〜１３項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、添加後の該微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の割合が、発酵基質中に存在する微生物の総数の１０-3％と１％との間になる量で添加されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
微生物種クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）をさらに添加することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物種クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）が、微生物クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
微生物種パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）をさらに添加することを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物種パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）が、微生物パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２株であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、微生物クロストリジウムｓｐ．クローン１０９９９８２２４８０７２株であることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
バイオマスの処理における微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の使用。
【請求項２２】
バイオマスの液状化における微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の使用。
【請求項２３】
発酵による、バイオマスからバイオガスの製造における微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の使用。
【請求項２４】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、微生物クロストリジウムｓｐ．クローン１０９９９８２２４８０７２株であることを特徴とする請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法によって得られる液状化バイオマスのバイオ燃料の製造における使用。
【請求項２６】
前記液状化バイオマスがバイオエタノールの製造に使用することを特徴とする請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
ＤＳＭＺにＮｏ．２２５７７で寄託されている微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株。
【請求項２８】
ＤＳＭＺにＮｏ．２２５７８で寄託されている微生物クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株。
【請求項２９】
ヌクレオチド配列を有する核酸を含む微生物であって、該ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９６．５７％を超える配列領域を含むことを特徴とする微生物。
【請求項３０】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９７．０％を超える配列領域を含むことを特徴とする請求項２９記載の微生物。
【請求項３１】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９８．０％を超える配列領域を含むことを特徴とする請求項３０記載の微生物。
【請求項３２】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９９．０％を超える配列領域を含むことを特徴とする請求項３１記載の微生物。
【請求項３３】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９９．５％を超える配列領域を含むことを特徴とする請求項３２記載の微生物。
【請求項３４】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列と一致する配列領域を含むことを特徴とする請求項３３記載の微生物。
【請求項３５】
バイオマスの処理方法に使用するのに好適な微生物培養物であって、該微生物培養物中に請求項２９〜３４に記載の微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が存在し、かつ該微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、該培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０-4％を占めることを特徴とする微生物培養物。
【請求項３６】
前記微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、前記培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１％を占めることを特徴とする請求項３５記載の微生物培養物。
【請求項３７】
前記微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、前記培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも２５％を占めることを特徴とする請求項３６記載の微生物培養物。
【請求項３８】
前記微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、前記培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも５０％を占めることを特徴とする請求項３７記載の微生物培養物。
【請求項３９】
前記微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、前記培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも９０％を占めることを特徴とする請求項３８記載の微生物培養物。
【請求項４０】
微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の純粋培養物であることを特徴とする請求項３９記載の微生物培養物。
【請求項４１】
微生物固定化培養物であることを特徴とする請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の微生物培養物。
【請求項４２】
バイオマスの処理における、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の微生物の使用。
【請求項４３】
前記バイオマスの処理が、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のバイオマスの処理方法であることを特徴とする請求項４２記載の使用。
【請求項４４】
バイオマスの液状化における、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の微生物の使用。
【請求項４５】
前記バイオマスの液状化が、請求項２〜２０のいずれか１項に記載のバイオマスの液状化方法であることを特徴とする請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造における請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の微生物の使用。
【請求項４７】
前記発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造が、請求項３〜２０のいずれか１項に記載の発酵によるバイオマスからのバイオガス製造方法であることを特徴とする請求項４６記載の使用。
【請求項４８】
バイオマスの処理における、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の微生物培養物の使用。
【請求項４９】
前記バイオマスの処理が、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のバイオマスの処理方法であることを特徴とする請求項４８記載の使用。
【請求項５０】
バイオマスの液状化における、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の微生物培養物の使用。
【請求項５１】
前記バイオマスの液状化が、請求項２〜２０のいずれか１項に記載のバイオマスの液状化方法であることを特徴とする請求項５０記載の使用。
【請求項５２】
発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造における、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の微生物培養物の使用。
【請求項５３】
前記発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造が、請求項３〜２０のいずれか１項に記載の発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造方法であることを特徴とする請求項５２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を使用してバイオマスを処理する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ燃料は、主として、植物基質を酵母、細菌または真菌類の助けをかりて発酵させることにより得られる。このようにして製造される液体エネルギー源、特にバイオエタノールは、適合する燃焼設備の燃料として、または自動車エンジンもしくは発電用および発熱用原動機の燃料もしくは燃料添加剤として使用することができる。このように、バイオマスは、容易に輸送可能な比較的エネルギー密度の高い液体エネルギー源に変換することができ、きわめて広範囲に使用することができる。
【０００３】
液体バイオ燃料の製造原料としては、ショ糖またはデンプン含有量の高いその土地で入手可能なほとんどの植物が使用の対象となる。ヨーロッパでは主にトウモロコシ、穀物および甜菜が使用され、北米ではトウモロコシ、そしてラテンアメリカではサトウキビの茎または糖蜜が使用される。しかしサトウキビ（モロコシ類）、ライコムギあるいはキャッサバ（マニオカ）といった、上記以外のエネルギー植物も原料の対象となる。現在、バイオマスの液状化の出発原料としては、特にトウモロコシおよび穀物が使用されている。人間および動物の食糧として使用されるほか、エネルギーの確保、ＣＯ2バランスの改善および資源保護などにも役立つ植物をめぐって、原料不足の深刻化、原料価格の上昇、競合状態が発生している中、単にトウモロコシおよび穀物の穀粒だけを使用するにとどまらず、むしろ植物全体をエネルギー源として導入しようとする試みや、農業的な管理を必要としない野性キビ（Rutenhirse）やチャイナ葦（Chinaschilf）といった植物を使用しようとする試みが強まっている。これらの原料から製造されるバイオ燃料は「第二世代」燃料と呼ばれるものである。さらに、藁や木材業あるいは庭園や景観の維持管理に伴って排出される植物性廃棄物など、有効活用に有望な植物残渣の利用にも努力がはらわれている。
【０００４】
バイオマスを効率よく発酵させるためには、原料として使用される植物材料およびその中に含まれる乾燥有機物質質（ｏＴＳ）を資源化するまえに、まずそれを解きほぐす必要がある。それは乾燥有機物質質を加水分解することによって行われ、乾燥有機物質の液状化に相当する。次に、液状化したバイオマス基質を発酵させると、エタノールまたは別のバイオ燃料が製造される。しかし既存の技術では高いエネルギー効率は得られない。その主たる原因は、液状化が不十分なために原料の資源化が十分に行われないことにある。
【０００５】
バイオエタノールの製造では、グルコースをエタノールに変換する酵母を添加して、まずエタノール発酵が行われる。基質によって、糖の割合が比較的高い場合もあるし（たとえば糖蜜の場合）、デンプン、セルロースまたはヘミセルロースのように、まず高分子基質を酵素的または化学的に分解しなければならず、そうすることによってはじめてアルコール発酵が可能になる場合もある（たとえば穀物、わら、植物全体の使用）。液状化に相当するこの基質の加水分解は、一義的に微生物、具体的には細菌が関与している。
【０００６】
有機原料を液体バイオ燃料に変換しないで、エネルギーガスに変換する必要があるときは、バイオガスプラントを使用することになる。バイオガスプラントでは、メタンは有機物質の微生物分解プロセスによって製造される。この場合、バイオガスは、多段階発酵プロセスまたは腐敗プロセスで、空気の遮断下に、嫌気性菌または微好気性菌の活動によって生成する。
【０００７】
基質として使用される有機物は、化学的な視点から見ると、高分子構造を有しており、その構造はバイオガスプラントの各工程における微生物の代謝活性によって、低分子量ビルディングブロックに分解される。しかし、有機発酵基質の発酵に活性な微生物集団の特徴は、未だ十分解明されていない。
【０００８】
現在の知識水準によれば、逐次的にも、並行的にも進行し、互いに相互作用する４つの生物化学的代謝プロセス、すなわち加水分解、酸生成、酢酸生成およびメタン生成が認められ、有機発酵基質を最終生成物であるメタンと二酸化炭素に分解することができる。
【０００９】
加水分解においては、しばしば粒子状で存在する高分子有機化合物は、発酵細菌の細胞外酵素（たとえばセルラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ）によって可溶性分解生成物に変換される。すなわち、たとえば脂肪は脂肪酸に、そして炭水化物たとえば多糖類は、オリゴ糖類および単糖類に、そしてタンパク質はオリゴペプチドまたはアミノ酸に分解される。これらと一緒に発生する気体生成物は、主に二酸化炭素からなる。
【００１０】
通性嫌気性細菌および偏性嫌気性細菌は、しばしば加水分解細菌と同じ細菌であって、酸生成過程で加水分解生成物（たとえば単糖類、二糖類、ジペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸、グリセリン、長鎖脂肪酸）を細胞内で短鎖脂肪酸またはカルボン酸、たとえば酪酸、プロピオン酸および酢酸、そして短鎖アルコール、たとえばエタノール、および気体生成物である水素および二酸化炭素に代謝する。
【００１１】
続く酢酸生成過程では、酸生成過程で生成した短鎖脂肪酸およびカルボン酸ならびに短鎖アルコールを酢酸生成細菌が取り込み、β酸化後、酢酸として再び分泌する。酢酸生成の副生成物はＣＯ2および水素分子（Ｈ2）である。
【００１２】
酢酸という酢酸生成の生成物のみならず、メタノールおよびギ酸エステルといった別の基質も、偏性嫌気的に進行するメタン生成過程でメタン生成生物によってメタンおよびＣＯ2に変換される。ここで生成するＣＯ2のほか、別のプロセス工程、たとえば加水分解で生成するＣＯ2も同様に、Ｈ2とともに微生物によってメタンに変換される。
【００１３】
所定量の出発物質からの最終生成物の収率を向上させることは、バイオマスの液状化およびバイオガスの製造においても、あらゆる化学反応と同様、プロセスを実施する上で不可欠な目標である。所定量のバイオマスからできるだけ多くの液体有機化合物、すなわちできるだけ多くのメタンが生成するようにすべきである。
【００１４】
再生可能資源協会は、２００５年にバイオガス測定プログラムの成果を発表した（"Ergebnisse des Biogas-Messprogramms", 2005, Hrsgb. Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V., Guelzow）。そしてその中で様々なバイオガスプラントの比較が行われている。この測定プログラムは、様々な既存プラントの代表的な断面を紹介しており、デザイン、メーカー、使用原料が異なるプラントを理解するのに役立った。調査した総容積負荷の実測値は０．４５ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日（多段式プラント）から５．７ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日（単段式）の範囲にあった。単段式も多段式もほとんどのプラントで、容積負荷は１および３ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日の間であった。
【００１５】
発酵槽の容積負荷とは、発酵槽の１立方メートル当たり、そして１日当たりの乾燥有機物質のキログラム数で表わされる発酵槽に供給される基質の量である。バイオガスの生産量は発酵槽の容積負荷に大きく依存し、容積負荷が大きくなるほど多量のバイオガスが製造される。容積負荷が高いとそのバイオガス製造プロセスの経済性は高くなるが、その一方で発酵の生物学的プロセスの不安定性も増加する。
【００１６】
容積負荷を上げることは、バイオプラントを効率的に運転するための１つの可能性である。その場合、一日あたりのｏＴＳの供給量を徐々に増加させることによってバイオガス生産量が上昇する。実際には６ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日を超える高い容積負荷はこれまで使用されていない。プラント運転の目標はプラントを経済的に運転することである。その場合、プラントが故障するとコストがきわめて高くなってしまうため、生物学的プロセスの安定性が最優先される。
【００１７】
プロセスの安定性を確保するには既存のプラントを低い容積負荷で運転することであるが、これは、効率的な運転を行うために適切な大きさの発酵容積を必要とする。その結果、追加的な建設コストによって初期投資が上昇する。容積負荷が高い場合、有機物質、特に固体の形の有機物室によって発酵槽内に存在する生物群の負荷が上昇するため、発酵内容物は濃密化しつづけることになる。その原因は、乾燥物質含有量が高くなり、バイオマスからバイオガスへの変換が不完全なことにある。
【００１８】
バイオガスの製造に使用される基質に含まれる乾燥物質の割合は５％から９０％の範囲にある。基質をポンプ輸送する必要がある湿式法の場合、乾燥物質の割合が約３５％まで、最高でも４０％までの基質が使用できる。乾燥物質の割合が高い基質ほど、そして特に乾燥有機物質の割合が高いほど、多くの場合エネルギー含量が高いため、これは使用に有利と考えられる。しかし粘性が高く乾燥物質の含有量が高い場合、ポンプ輸送および撹拌時のエネルギー消費量が高いうえに、ポンプや撹拌装置などの摩耗あるいは修繕に伴う費用が高くつく。乾燥物質含有量が高く基質の希釈が必要な場合、水供給および排水の追加的費用に加えて、水の供給、再循環あるいは排水処理に伴う設備の追加が必要となる。
【００１９】
連続運転で乾燥物質の割合が高くなるにつれて、発酵内容物の撹拌および輸送に関する問題が増えてくる。さらに乾燥物質の割合が高くなると生物群は不安定になり、その結果、生物学的プロセスは完全な機能停止に陥り、ひいてはガスの生産も完全に止まってしまう。この現象は「発酵槽の機能停止（Fermenterabsturz）」と呼ばれる。濃密化するのを防止するため、液体物質、たとえば水または液肥を加えて、発酵槽内容物を液状化することが可能である。その場合、法的な制限（ＥＥＧ）があって、乾式発酵−ボーナスを受け取ろうとする場合、乾燥物質の割合が平均３０％を下回る物質の添加は認められていない。したがって、液体を追加する形で供給して、発酵物を液状化することはほとんど適用不可能である。
【００２０】
上で考察したこと以外に、資源である淡水の不足を考えると、水を添加して発酵内容物を液状化することは除外される。液体物質としての液肥は、一方で、技術的な点でコスト高を伴い、他方で、どこででも入手できるわけではないうえに、品質が一定しないことも問題である。加えて、液肥を使用する場合、各州の法律的な理由により、発酵プロセスによっては、発酵残渣を再度農地に散布しようとするとき、衛生的な処理工程が必要になる。
【００２１】
それゆえ、バイオマスを処理する方法、具体的にはバイオ燃料を製造するためにバイオマスを液状化する効率的な方法、および従来法と比べてバイオガスの収量が高いバイオガス製造方法を必要としている。
【００２２】
用語の定義
本発明で使用する「バイオ燃料」という用語は、バイオマスから製造される液体もしくは気体燃料またはエネルギー源を意味する。バイオ燃料は、移動性燃焼機関（たとえば自動車）および固定燃焼機関（たとえば地域暖房施設における発電および熱エネルギーの発生）に使用される。バイオ燃料には、バイオディーゼル、バイオエタノール、バイオメタノール、バイオケロシン、バイオ水素またはバイオガスなどがある。
【００２３】
本明細書で使用する「バイオエタノール」という用語は、再生可能な炭素源または廃棄物のうちの生分解性部分としてのバイオマスから、アルコール発酵によって製造されたエタノールを意味する。バイオエタノールは、添加物として鉱物油燃料、たとえばバイオディーゼルまたはバイオ燃料に、様々な濃度で添加して使用される。
【００２４】
本発明で使用する「バイオガス」という用語は、有機基質を嫌気的に生物分解して得られるガス状生成物を意味する。通常、バイオガスはメタンを約４５〜７０％、二酸化炭素を３０〜５５％、ならびに窒素、硫化水素およびその他のガスを少量含んでいる。
【００２５】
本発明で使用する「発酵（fermentation）」または「発酵すること（fermentierung）」という用語は、嫌気性および好気性物質代謝プロセスを包含し、工業プロセスにおいて、供給基質から、微生物の働きによって生成物、たとえばバイオガスが製造される。「発酵（Gaerung）」という用語は、嫌気性過程のみが対象となるという点で限界が設けられる。
【００２６】
本発明で使用する「発酵槽」という用語は、その中で基質を微生物によって分解すると同時にバイオガスの生成が行われる容器を意味する。「反応槽」、「発酵容器」および「腐敗容器」という用語は同義に使用される。
【００２７】
本発明で使用する「発酵基質」または「基質」という用語は、有機的および生分解可能な物質を意味し、発酵させるために発酵槽に添加される。基質としては再生可能な原料、有機肥料（Wirtschaftsduenger）、再加工農産業（agrarindustrie）からの基質、地域共同体から排出される有機残渣、屠殺残渣または伐採剪定植物片からの基質が対象となりうる。このような基質の例として、サイロ貯蔵トウモロコシ、サイロ貯蔵ライムギ、甜菜残渣、糖蜜、サイロ貯蔵干し草、牛または豚の液肥、牛、豚、家禽または馬の糞尿、ビールの絞りかす、リンゴ、果物またはブドウの絞りかす、穀類、馬鈴薯または果物の残渣、有機廃棄物容器からの有機廃棄物、調理廃棄物、市場廃棄物、脂肪切断機からの脂肪、瘤胃内容物、豚の胃内容物などを挙げることができる。「発酵基質」および「基質」という用語は同義に使用される。
【００２８】
「発酵残渣」または「発酵物（Gaergut）」という用語は、発酵槽から排出され、しばしば適当な容器に貯められるバイオガス製造残渣を意味する。
【００２９】
本発明で使用する「容積負荷」という用語は、１日当たり、作業空間１立方メートル当たりの発酵槽に供給される乾燥有機物質（ｏＴＳ）のｋｇ量を意味する。
【００３０】
本発明で使用する「乾燥有機物質（ｏＴＳ）」という用語は、無機物質を除去し１０５℃で乾燥した混合物の無水有機部分を意味する。通常、乾燥物質の割合は基質に対する％で表示される。
【００３１】
本明細書で使用する「滞留時間」という用語は、基質が発酵槽内に滞留する平均時間を意味する。
【００３２】
本発明で使用する「バイオガス比収量（spezifische Biogasausbeute）」または「メタンの比収量」という用語は、発生したバイオガスまたはメタンの量（発生したガスを標準立方メートル単位Ｎｍ3で表示）を、使用した乾燥有機物質または基質で除した値（通常トンｔ当たり）を意味する。
【００３３】
「空間時間収量」という用語は、バイオガス生産量を１リットルの発酵容積に規格化して表示したものである。この測定量を使用すれば異なるプラント間のガス生産高の比較が改善される。
【００３４】
「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ配列およびそれに対応するＲＮＡ配列を包含する。本発明に記載されている、塩基Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇを使用したＲＮＡ配列は、たとえば塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇを使用した対応ＤＮＡ配列に関連しており、またその逆も成立する。
【００３５】
微生物のヌクレオチド配列の決定は標準化した手順で行われる。これによって微生物のＤＮＡまたはＲＮＡの各ヌクレオチドは高い確度で同定できる。配列決定法の確度は高いにもかかわらず、配列中の個々の位置は繰り返し存在する可能性があるため、その特定の位置に存在するヌクレオチドを十分な確度で決定することはできなかった。このような場合、本発明ではヌクレオチド配列中にＮの文字で表示してある。以下の記載において、ヌクレオチド配列中にＮの文字が使用されている場合、それは、すべての考えられるヌクレオチドを表しており、したがって、リボ核酸の場合はＡ、Ｕ、ＧまたはＣを表わし、デオキシリボ核酸の場合はＡ、Ｔ、ＧまたはＣを表わす。
【００３６】
本発明中で使用する「ヌクレオチド突然変異」という用語は、最初のヌクレオチド配列が変化することを意味する。その場合、個々のヌクレオチドあるいはいくつかの直接前後につづくヌクレオチド配列もしくは変化していないヌクレオチドによってさえぎられたヌクレオチド配列が除去されるか（欠失）、付加されるか（挿入または付加）または他のものと置換される（置換）。この用語は、上に挙げた個々の変化の考えられるあらゆる組み合わせも包含する。
【００３７】
本発明で使用する「欠失」という用語は、それぞれ最初の配列から１個、２個またはそれより多くのヌクレオチドが除去されることを意味する。
【００３８】
本発明で使用する「挿入」または「付加」という用語は、それぞれ最初の配列に１個、２個またはそれより多くのヌクレオチドを付け加えることを意味する。
【００３９】
本発明で使用する「置換」という用語は、ある決まった位置に存在するヌクレオチドを別のヌクレオチドと交換することを意味する。
【００４０】
「微生物」という用語は顕微鏡的に小さい生物を意味し、その生物は通常単細胞生物であるが、多細胞生物であってもよい。微生物の例としては細菌、顕微鏡的な大きさの藻類、真菌類または原生動物を挙げることができる。
【００４１】
本発明で使用する微生物の「属」、微生物の「種」、微生物の「株」という名称は、生物分類学で使用される分類カテゴリー、具体的には系統学的な分類わけを意味する。微生物の属、種および株は、そのＲＮＡ配列に基づいて同定され識別される。ある決められた属、ある決められた種またはある決められた株には完全に決められたＲＮＡ配列を有する微生物だけでなく、ある一定の範囲内のその遺伝子的変異体も入り、遺伝子的変異体は、株、種、属の順に多くなる。
【００４２】
細菌の「種」の定義は学問的に変化しており、決着していないし、様々な考え方には議論の余地がある。本発明において、「種」という用語は、ゲノム解析および系統学的解析に基づき、staleyによる総説（Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 2006, 361, 1899-1909）に記載されている種の概念であると解釈する。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションが７０％を超え、ヌクレオチドの平均同一性（ＡＮＩ）が９４％を超えている２種類の細菌が、同じ種に属するとされ、あるいは１６Ｓ  ｒＲＮＡの同一性が９７％未満である２種は、異なる２つの種に帰属されていることは広く知られている。
【００４３】
これと関連して「培養物」という用語は、微生物の増殖または少なくとも生存を保証する作られた条件下における微生物の蓄積物を意味する。細菌に適する培養物としては、たとえば増菌培養物または純粋培養物、液体培養物、および培養培地のような固体培地培養物のほか、さらに冷凍グリセリン培養物のような維持培養物、ゲル培養物のような固定化培養物、あるいは細胞ペレットのような高濃縮培養物がある。
【００４４】
微生物の「純粋培養物」という用語は、ただ１つの細胞の子孫を意味する。これは異なる微生物の混合物から多段階プロセスにより単離される。多段階プロセスには細胞集団からただ１つの細胞を分離することを包含し、該細胞から成長と細胞分裂とによって形成されるコロニーが、別の個々の細胞やコロニーから分離された状態にあることが必要である。１つのコロニーを注意深く分離して、それを再び液体中に懸濁させそして塗抹することをくり返すことによって所望する微生物の純粋培養物を得ることができる。出発材料中の所望微生物が数の上で優位にある限り、純粋培養物の単離は、液体栄養培地でも行うことができる。栄養液の懸濁液を連続希釈して、最終希釈段階でただ一つの細胞しかない状態にする。そこではじめてこの細胞が純粋培養物の基礎となる。「純粋培養物」という用語の解説とこれを作るための方法は、Hans G. Schlegel著、“Allgemeine Mikrobiologie”、第７版、１９９２年、Georg Thieme Verlag、２０５頁に記載されている。引用することによりその全文をここに組み込む。
【００４５】
「混合培養物」という用語は、様々な微生物の混合物を意味する。天然の微生物集団は、通常混合培養物である。しかし混合培養物は、たとえば複数の純粋培養物を混合して人工的に作ることもできる。
【発明の概要】
【００４６】
本発明の課題は、従来技術と比較して利用可能なバイオ燃料の収量を高める、バイオマスの処理方法を提供することにある。
【００４７】
本発明によれば、この課題は請求項１に記載のバイオマスの処理方法によって解決される。本発明のさらなる利点の詳細、実施態様および実施形態は、従属項、発明の詳細な説明および実施例によって明らかとなろう。
【００４８】
本発明はバイオマスの処理方法を提供する。バイオマスに微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を添加する。
【００４９】
バイオマスの処理方法は、好ましくはバイオマスの液状化方法が対象となる。バイオマスの処理またはバイオガスの生成に微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を使用することはもちろん、この微生物が存在することすらこれまで未知であった。しかし意外なことに、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）をバイオマス基質に添加することにより、基質の粘性を著しく低下できることが見出された。微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を使用すると、バイオマスのいちじるしい液状化が起こり、そのためバイオ燃料生成プラントの性能および効率が著しく改善される。
【００５０】
さらに、バイオマスの処理方法は、好ましくはバイオマスからのバイオガスの生成方法でもある。驚くべきことに、発酵基質に微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を添加することにより、発酵槽の容積負荷を高めることができると共に、生成されるバイオガスの量も著しく増加させることできることが見出された。実験から明らかにすることができたように、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の添加により、発酵プロセスの不安定化を招くことなく、発酵槽の容積負荷を５０％を超えて高めることができる。容積負荷の増加と並行して、生成されるバイオガスの量も顕著に増加する。加えて、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を添加しない場合と比べて、乾燥有機物質の分解が著しく向上するため、バイオガスの比収量も向上する。分解率の高まりにより、基質利用率が向上し、ガスの比収量を大きく改善することができる。さらに、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を添加することにより、ガスの収量を一定に維持しつつ発酵基質の発酵槽内滞留時間を大きく短縮することができ、その結果、容積負荷を高めることが可能になる。それゆえ、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の使用は、バイオガスプラントの性能および効率の飛躍的な改善をもたらす。
【００５１】
微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が好ましい特性を発揮する理由は、その代謝活性によって加水分解速度が高まり、そのため、代謝活性の成果として、存在する分解困難な有機物質（たとえばセルロース、ヘミセルロース）の一部が、可溶性の酸およびＣＯ2に変換されることにあるものと考えられる。セルロースは水および水性溶液に不溶であり、それゆえ、発酵プロセスでセルロースが分解されると液状化が起こる。乾燥物質の含有量はもはやそれ以上増加しないため、基質の撹拌性およびポンプ輸送性はそのまま維持される。かくして基質の撹拌は一定に維持することができ、プロセスからのガスの取り出しを改善することができる。
【００５２】
加水分解工程における微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）による分解効率および代謝効率を高めることにより、酸性化させず、あるいは生成するバイオガス中のメタン含有量を低下させないで、発酵原料の液状化が導かれる。容積負荷は明らかに向上し、プロセスの安定性は改善される。
【００５３】
このように、本発明により、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を添加することにより、発酵プロセスの改善された安定性を確保しながら発酵基質を液状化する方法が提供される。不溶性成分を分解することで基質を液状化することは、バイオマスからバイオ燃料を製造するためにも使用できる。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態によれば、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、主として微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）からなる微生物培養物の形で添加される。微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、バイオガスプラントの発酵基質中では、存在している微生物の総数に対して１０-4％を下回るごく僅かな痕跡量しか検出できなかった。この微生物を添加するには、通常自然界から単離される微生物量では十分でないため、培養物として増やすのが普通である。実際には、微生物を添加するには、微生物を培養物の形で発酵槽の発酵基質に直接添加するのが最も簡単である。
【００５５】
クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の培養物の添加は、懸濁培養物の形、乾燥、凍結乾燥もしくは湿潤細胞ペレットの形で行うか、あるいは胞子懸濁液、胞子調製物、または乾燥、凍結乾燥もしくは湿潤胞子ペレットの形で行うことができる。
【００５６】
すでに言及した発酵プロセスに対する様々な好ましい効果は、微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）と結びついているため、この微生物種は、添加培養物中に自然界に存在するよりも多量に存在していなければならない。言うまでもなく、任意の組成の混合培養物が添加に使用できる。ただし、その前提はクロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）種が自然界に存在するより多量に存在しているという点だけである。
【００５７】
好ましい培養物は、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）と微生物種クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）および／またはパエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）との混合培養物である。特に好ましい培養物は、微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株と微生物クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株および／またはパエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２株との混合培養物である。微生物種クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）および微生物種パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）は、バイオマスの処理に関して、似た特性を示すので、両者はバイオマスの処理での使用が想定される。したがって、微生物種クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）および微生物種パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）は、本明細書に記載するバイオマスの処理のための方法および応用にも使用可能である。
【００５８】
微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、好ましくは、主として微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）からなる、微生物の培養物の形で発酵基質に添加される。微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の数を決定するのと平行して微生物の総数も決定すれば、培養物中の微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の割合を百分率の形で表示することができる。微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、混合培養物中に存在する各種微生物種の中で最も高い百分率を占めていれば、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、混合培養物中に存在する主要微生物種である。
【００５９】
各種発酵基質における微生物集団の組成および発酵プロセスが進行中の生物組成はほとんどわからないが、非常に大きく変動し、かつ複雑な動的過程の下にあり、その過程はそのときそのときのプロセス条件によって影響される。微生物組成および発酵基質中の微生物の総数を決定する方法も、そして発酵基質中の各種微生物のそれぞれの割合を決定する方法も、当業者によく知られており、それらはたとえばAmannらの総説（Microbiol. Review. 59, 143-169, 1995）に記述されている。
【００６０】
微生物をあらかじめ培養するかいなかに関係なく微生物の組成を決定するための好ましい方法は、たとえば、核酸を抽出してＰＣＲにかけたのちｒＤＮＡクローンライブラリー（たとえば、１６Ｓ  ｒＲＮＡに基づく）を作成することであり、あとで配列を決定することが可能である。このクローンライブラリーを使って、たとえば、特異的蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとのインサイチュハイブリダイゼーションによって発酵基質における微生物集団の組成を突き止めることができる。好適なｒＲＮＡベースオリゴヌクレオチドプローブは、上記総説からわかっており、たとえば、ｐｒｏｂｅＢＡＳＥ（Loyら、2003, Nucleic Acids Res. 31, 514-516. Loyら、2007, Nucleic Acids Res. 35, D800-D804.）またはＡＲＢプログラムパッケージ（Ludwigら、Nucleic Acids Research. 2004, 32, 1363-1371）によって見出すことができる。集団全体に対する個々の微生物の割合の定量的決定は、定量的ドットブロット法、インサイチュハイブリダイゼーションまたは全細胞ハイブリダイゼーションによって適切に行うことができる。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態によれば、微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、発酵基質に添加される培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０-4％を占める。特に好ましくは、微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０-2％を占め、さらに好ましくは、微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１％を占める。
【００６２】
さらに別の好ましい実施形態によれば、微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０％を占め、好ましくは微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも５０％を占め、そしてさらに好ましくは、微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも９０％を占める。
【００６３】
全く好ましい実施形態によれば、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）種微生物の純粋培養物が添加される。純粋培養物は、生物化学的に特異的な代謝プロセスおよび代謝活性、ならびに特殊な増殖条件により特徴付けられる。特異的な代謝プロセスおよび代謝活性の点で、発酵微生物の純粋培養物の添加は、複雑なバイオガス生産プロセスのより良い制御に大きく貢献することができる。
【００６４】
本発明のさらに別の特に好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの微生物固定化培養物の成分として微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が添加される。自然界に存在する微生物から単離した微生物の量では微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の添加には十分でないため、通常は培養物の形で増菌がはかられる。実際場面では、発酵槽の発酵基質に微生物を添加するには、微生物を固定化した培養物の形で添加するのが最も簡単であることは明らかである。
【００６５】
すでに言及した発酵プロセスに対する様々な好ましい効果は、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が関係しているので、添加する固定化培養物中に存在するこの微生物種は、自然界に存在する量より増菌された量で存在すべきである。言うまでもなく、任意の組成の固定化混合培養物が添加に使用できる。その前提は、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が自然界に存在するより多量に存在しているという点だけである。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態によれば、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、発酵基質に添加される固定化培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０-4％を占める。特に好ましくは、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、固定化培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０-2％を占め、さらに好ましくは、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、固定化培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１％を占める。
【００６７】
さらに別の好ましい実施形態によれば、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、固定化培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０％を占め、好ましくは微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、固定化培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも５０％を占め、そしてさらに好ましくは、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、固定化培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも９０％を占める。
【００６８】
全く好ましい実施形態によれば、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の少なくとも１つの固体化純粋培養物が添加される。
【００６９】
微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を固定化する担体材料としては、天然または合成ポリマーが使用可能である。好ましくはゲル形成ポリマーが使用される。これらのポリマーは、ゲル構造の内部に細菌を取り込むか、あるいは沈着層を形成し得るという利点がある。このような材料は、水にゆっくり溶解するか分解され、その結果、比較的長時間にわたって微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を放出するため、有利に使用される。
【００７０】
好適なポリマーとしてば、たとえばポリアニリン、ポリピロール、ポリビニルピロリドン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、エポキシ樹脂、ポリエチレンイミン、アガロース、アルギン酸塩またはセルロースなどの多糖類、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸セルロース、硫酸アルカリセルロース、ポリスチレンと無水マレイン酸とのコポリマー、スチレンとメタクリル酸メチルとのコポリマー、ポリスチレンスルホネート、ポリアクリレートおよびポリメタクリレート、ポリカーボネート、ポリエステル、シリコーン、セルロースフタレート、ゼラチン、アラビアゴム、アルブミンまたはフィブリノーゲンなどのタンパク質、ゼラチンと水ガラスの混合物、ゼラチンとポリホスフェートの混合物、ゼラチンと、無水マレイン酸とメチルビニルエーテルとのコポリマーの混合物、セルロースアセテートブチレート、キトサン、ポリジアルキルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアクリル酸とポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとの混合物、ならびにそれらの混合物を挙げることができる。高分子材料は通常の架橋剤、たとえばグルタルアルデヒド、尿素／ホルムアルデヒド樹脂、またはタンニン化合物で架橋してもよい。
【００７１】
アルギン酸塩は、一方でクロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）微生物の活性に何ら負の影響を及ぼすことはないし、他方で微生物によって徐々に分解されるため、固定化材として特に有利である。アルギン酸塩固定化材がゆっくり分解すると内部に包み込まれた微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は徐々に放出される。
【００７２】
固定化するには、微生物とポリマーゲルとを混合し、それから適当な硬化剤溶液で硬化させる。それには、まずゲル溶液と混合し、それから適当な高さから硬化剤溶液中に滴下する。固定化の正確な実施方法は当業者にとって既知である。
【００７３】
さらに別の好ましい実施形態によれば、下記微生物の添加とおおよそ同じ時間に、追加バイオマスが発酵槽に添加される。追加バイオマスは、微生物を添加したのち１秒から３日までの時間間隔で添加してもよいし、微生物の添加と同時に添加してもよい。その際、発酵槽の容積負荷は新しい基質を連続的に転化することによって連続的に上げることができるか、またはほぼ一定に保つことができ、そして発酵はあらゆる容積負荷で実施することが可能であるが、好ましくは１ｍ3当たり、１日当たりの乾燥有機物質（organischer Trockensubstanz）０．５ｋｇの容積負荷［ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日］以上で、そして、さらに好ましくは容積負荷４．０ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日以上で、そして、特に好ましくは容積負荷８．０ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日以上で実施することが可能であり、現在の技術水準と比べて、容積負荷の増加は２倍を超える。
【００７４】
特に、使用される発酵基質は、固形成分の割合を高くすることができる。加水分解活性を有する発酵微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を添加すれば、これらの固形成分は少なくとも部分的に液状化する。微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を添加して発酵基質を液状化すれば、発酵槽基質の農密化を防止し、適切に対処することができる。さらに水または液肥の形で液体を発酵基質に導入すれば回避できる。このように淡水資源の節約という形でさらに別の利点がある。さらに、基質の撹拌とポンプ輸送の維持が可能であることも利点である。上記液状化によって撹拌装置およびポンプの損傷は防止され、撹拌に要するエネルギーは大幅に少なくてすむ。
【００７５】
微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、バイオ燃料の製造を目的とするアルコール発酵におけるバイオマスの液状化に使用することもできる。
【００７６】
さらに別の実施形態では、バイオマスの処理は、発酵基質を絶えず撹拌しながら行われる。発酵基質を絶えず撹拌することで、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の培養物は、発酵基質内によく分散する。バイオガスを製造する場合、生成したバイオガスを発酵プロセスからより良好に取り出すことが可能である。
【００７７】
また、発酵基質を絶えず撹拌すれば発酵槽内の熱分布は一様になる。一定の間隔をおいて連続的に行った発酵槽内の温度測定から、発酵基質の発酵は、２０℃から８０℃の温度範囲、好ましくは約３５℃から６０℃の温度範囲、特に好ましくは４０℃から５０℃の温度範囲で行うと効率がよいことが示された。したがって本発明においては、これらの温度範囲が好ましい。加水分解とならんで、発酵プロセスの特に最終工程、すなわちメタン生成微生物によるメタンの生成は、昇温温度で特に効率よく行われる。多段階バイオガスプラントの場合、異なる反応槽で異なる温度で運転することが重要である。たとえば、第一工程は中温条件で行われ、それにつづく工程、特にメタン生成は好熱条件で行われる。これに対する好適な条件は現在の技術水準から既知である（たとえば、ＤＥ１０ ２００５ ０１２３６７  Ａ１）。
【００７８】
本発明の全実施形態は、一段式バイオガス製造法に限定されるものではない。二段式または多段式製造法でも微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を使用して行うことができる。同様に、液体バイオ燃料の製造法でも、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を使用することができる。
さらに別の実施形態によれば、発酵基質および微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は連続的に添加される。微生物群が安定していれば、発酵槽を連続運転してバイオガスを連続的に製造すべきであり、プロセスの不調によって発酵のための基質供給が中断されることは避けなければならない。
【００７９】
同様に、非連続運転、たとえば「バッチ式」の発酵によって、この発酵法およびそれと関連するプロセスを実施することも考えられる。そこで別の実施形態によれば、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の発酵中に、たとえば一定の時間間隔で発酵基質を添加してもよい。微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を一定の時間間隔で添加すると生細胞の数が多くなるため、発酵プロセス、たとえば加水分解の進行が向上し、同時に発酵に対する発酵基質の利用率が高まる。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態によれば、添加後の微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の割合が、発酵基質中に存在する微生物の総数の１０-8％から５０％を占める量で発酵基質に微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を加える。所望の効果を得るには、特に発酵槽の大きさに依存して、したがって発酵基質の量に依存して、きわめて大きく異なる量の微生物を添加する必要がある。
【００８１】
発酵基質中の微生物の総数を決定することと発酵基質中の異なる微生物種の割合を決定することは、当業者にとっては何ら問題ではない。すなわち、たとえば蛍光標識オリゴプローブを使えば、発酵基質中の各種微生物の割合は、上に記述した方法によって、同定できる。
【００８２】
特に好ましくは、添加後の微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の割合が、発酵基質中に存在する微生物の総数の１０-6から２５％を占める量で、発酵基質に微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を加える。そして特に好ましくは、添加後の微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の割合が、発酵基質中に存在する微生物の総数の１０-4から１０％を占める量で、発酵基質に微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を加える。全く好ましくは、添加後の微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の割合が、発酵基質に存在する微生物の総数の１０-3ないし１％を占める量で、発酵基質に微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を加える。
【００８３】
微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の添加は、基本的には発酵プロセスのあらゆる任意の時点に添加でき、特に、発酵槽の最初の運転開始時または運転再開時の発酵基質の接種にも微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を使用することができる。微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は培養物の形で１回、または一定の時間間隔もしくは不定の時間間隔で複数回、好ましくは週に１回または月に１回、特に好ましくは日に１回または週に２回から５回ほど適当な濃度で適当な量を添加することができる。微生物の好適な濃度および添加量はすでに知られており、また実施例にも記述されている。
【００８４】
発酵プロセスに不調が生じた場合、発酵を安定させるために微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を添加することができる。このような不調は、所定の発酵特性パラメータを監視することで早期に認識可能である。特性パラメータはバイオガスを製造するための稼動する発酵プロセスの質に関する情報を提供する。このような特性パラメータは、発生ガスの量および発生バイオガス中のメタン含有量だけではなく、たとえば発生バイオガス中の水素含有量、発酵基質のｐＨ値、発酵基質の酸化還元電位、発酵基質のカルボン酸含有量、発酵基質中に含まれる各種カルボン酸の割合、発酵基質の水素含有量、発酵基質における乾燥物質の割合、発酵基質における乾燥有機物質の割合、基質の粘性および発酵槽の容積負荷も含む。
【００８５】
本発明は、バイオマスの処理のための微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の使用も包含する。
【００８６】
本発明は、バイオマスの液状化のための微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の使用も包含する。
【００８７】
本発明は、発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造のための微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の使用も包含する。
【００８８】
本発明は、バイオ燃料の製造のための、記載した方法の１つによって得られる液状バイオマスの使用も包含する。好ましくは、記載した方法の１つによって得られる液状化バイオマスがバイオエタノールの製造のために使用される。
【００８９】
同じく、本発明は、Ｎｏ．ＤＳＭ  ２２５７７の下に寄託されている微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株を包含する。微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３は、ブダペスト条約に基づいてブラウンシュバイクにあるDeutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkluturen GmbHに純粋培養物として寄託した。その名称はクロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３、寄託番号はＤＳＭ２２５７７。
【００９０】
同じく、本発明は、Ｎｏ．ＤＳＭ  ２２５７８の下に寄託されている微生物クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株も包含する。微生物クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａは、ブダペスト条約に基づいてブラウンシュバイクにあるDeutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkluturen GmbHに純粋培養物として寄託した。その名称はクロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ、寄託番号はＤＳＭ２２５７８。
【００９１】
細菌種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、当業者に知られている方法によって、発酵基質または発酵槽の残渣から単離可能である。単離する場合、発酵槽から採取した適当な基質を選択培地に移し、比較的長時間培養し、最後に選択培地から微生物の個々のコロニーを単離する。これから得られた微生物ＤＮＡをＰＣＲによって増幅したのち、ＤＮＡに基づいて微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を選び出すことができる。
【００９２】
細菌クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３は二次発酵槽の発酵基質から単離した。それには、液体選択培地に窒素および二酸化炭素を通気し、それからＮａ2Ｓを選択培地に添加し、オートクレーブ処理（１２１℃で２０分間）した。つづいて、二次発酵槽の発酵基質から得られたバイオマスを選択培地に移し、少なくとも１週間、少なくとも３０℃の温度で培養した。液体選択培地から得られた試料を固体選択培地に移し、それから固体選択培地上で生育した微生物コロニーを選び出した。得られた微生物ＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅したのち、既知のＤＮＡ配列と比較した。
【００９３】
二次発酵槽の発酵基質から細菌クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３を単離することに成功したのち、これらの微生物は配列分析に付された。１６Ｓ  ｒＲＮＡの部分配列を決定し、それを対応するＤＮＡ配列に転換した。ＤＮＡ配列（配列番号１）は１４０９個のヌクレオチドを含む。最も近い類縁種として乳児の糞便試料に由来する微生物クロストリジウムｓｐ．クローン１０９９９８２２４８０７２を同定したが、バイオ燃料の製造とは全く関係がなかった（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＥＦ４３４３５２、配列の長さは１３４０ヌクレオチド）。配列の比較から、クロストリジウムｓｐ．クローン１０９９９８２２４８０７２の配列には、配列番号１と比較して、ヌクレオチドの置換またはギャップが４６あることがわかった。ヌクレオチドが１３４０個のクロストリジウムｓｐ．クローン１０９９９８２２４８０７２の配列長では、同一性９６．５７％の結果が得られた。
【００９４】
本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９６．５７％を超える配列領域を含むヌクレオチド配列を有する核酸を有する微生物も包含する。特に好ましくは、ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９６．５８％を超えるか、または９６．５９％を超えるか、または９６．６０％を超えるか、または９６．６５％を超えるか、または９６．７０％を超えるか、または９６．７５％を超えるか、または９６．８０％を超えるか、または９６．９０％を超えるか、または９７．０％を超えるか、または９７．１％を超えるか、または９７．２％を超えるか、または９７．３％を超えるか、または９７．４％を超えるか、または９７．５％を超えるか、または９７．６％を超えるか、または９７．７％を超えるか、または９７．８％を超えるか、または９７．９％を超える配列領域を含む。
【００９５】
特に好ましくは、ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９８．０％を超える配列領域を含む。さらに好ましくは、ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９８．１％を超えるか、または９８．２％を超えるか、または９８．３％を超えるか、または９８．４％を超えるか、または９８．５％を超えるか、または９８．６％を超えるか、または９８．７％を超えるか、または９８．８％を超えるか、または９８．９％を超える配列領域を含み、さらに好ましくはヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９９％を超える配列領域を含む。
【００９６】
さらに別の好ましい実施形態によれば、前記微生物は、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９９．５％を超える配列領域を含むヌクレオチド配列を有し、特に好ましくは、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９９．８％を超える配列領域を含む。
【００９７】
全く好ましい実施形態によれば、前記ヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列と一致する配列領域を含む。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態において、出発ヌクレオチド配列の配列番号１に対して、１ヵ所、または２ヵ所、または３ヵ所、または４ヵ所、または５ヵ所、または６ヵ所、または７ヵ所、または８ヵ所、または９ヵ所、または１０ヵ所、または１１ヵ所、または１２ヵ所、または１３ヵ所、または１４ヵ所、または１５ヵ所、または１６ヵ所、または１７ヵ所、または１８ヵ所、または１９ヵ所、または２０ヵ所、または２１ヵ所、または２２ヵ所、または２３ヵ所、または２４ヵ所、または２５ヵ所、または２６ヵ所、または２７ヵ所、または２８ヵ所、または２９ヵ所、または３０ヵ所、または３１ヵ所、または３２ヵ所、または３３ヵ所、または３４ヵ所、または３５ヵ所、または３６ヵ所、または３７ヵ所、または３８ヵ所、または３９ヵ所、または４０ヵ所、または４１ヵ所、または４２ヵ所、または４３ヵ所、または４４ヵ所、または４５ヵ所、または４６ヵ所にヌクレオチドの突然変異が存在する。「ヌクレオチドの突然変異」という用語の意味は、本明細書の「定義」の項で説明されている。
【００９９】
本発明は、バイオマスの処理方法、具体的にはバイオマスの液状化の方法および／または発酵法によってバイオマスからバイオガスを製造する方法に使用するのに適する微生物の培養物も包含し、微生物の前記培養物には配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が少なくとも９６．５７％のヌクレオチド配列を有する配列領域を含む微生物が存在し、そして該微生物は、培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０-4％を占める。
【０１００】
バイオマスの処理方法、具体的にはバイオマスの液状化の方法および／またはバイオマスから発酵法によるバイオガス製造方法の中での使用に適する微生物の培養物は、好ましくはその中に、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９６．５７％を超える配列領域を有するヌクレオチド配列を有する微生物が含む。特に好ましくは、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９６．５８％を超えるか、または９６．５９％を超えるか、または９６．６０％を超えるか、または９６．６５％を超えるか、または９６．７０％を超えるか、または９６．７５％を超えるか、または９６．８０％を超えるか、または９６．９０％を超えるか、または９７．０％を超えるか、または９７．１％を超えるか、または９７．２％を超えるか、または９７．３％を超えるか、または９７．４％を超えるか、または９７．５％を超えるか、または９７．６％を超えるか、または９７．７％を超えるか、または９７．８％を超えるか、または９７．９％を超える配列領域を含む。
【０１０１】
さらに好ましくは、バイオマスの処理方法、具体的にはバイオマスの液状化法および／または発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造方法への使用に適する微生物の培養物中に、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９８％を超えるヌクレオチド配列を持つ配列領域を有する微生物が存在する。特に好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９８．１％を超えるか、または９８．２％を超えるか、または９８．３％を超えるか、または９８．４％を超えるか、または９８．５％を超えるか、または９８．６％を超えるか、または９８．７％を超えるか、または９８．８％を超えるか、または９８．９％を超える配列領域を含み、さらに好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９９．０％を超える配列領域を含む。
【０１０２】
さらに別の好ましい実施形態によれば、バイオマスの処理方法、具体的にはバイオマスの液状化法および／または発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造方法への使用に適する微生物の培養物中には、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９９．５％を超えるヌクレオチド領域を有するヌクレオチド配列を持つ微生物が存在する。全く好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９９．８％を超える配列領域を含む。
【０１０３】
全く好ましい実施形態によれば、バイオマスの処理方法、具体的にはバイオマスの液状化法および／または発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造方法への使用に適する微生物の培養物中には、前記ヌクレオチドが配列番号１のヌクレオチド配列と一致する配列領域を含むヌクレオチド配列を有する微生物が存在する。
【０１０４】
さらに別の好ましい実施形態によれば、微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０-2％、好ましくは少なくとも１％を占める。特に好ましくは、微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２５％を占める。
【０１０５】
全く好ましくは、微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）は、培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも９０％を占める。特に好ましくは、バイオマスの処理方法、具体的にはバイオマスの液状化法および／または発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造方法への使用に適する微生物の純粋培養物が対象となり、該微生物は、そのヌクレオチド配列について、上で特徴づけしたように微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３の純粋培養物が対象となる。
【０１０６】
特に好ましくは、上記の場合、微生物の固定化培養物が対象となる。
【０１０７】
本発明は、バイオマスの処理方法、具体的にはバイオマスの液状化法および／または発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造方法への使用に適する微生物の固定化培養物も包含し、該微生物の固定化培養物中には、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が少なくとも９６．５７％の配列領域を含むヌクレオチド配列を有する微生物が存在する。
【０１０８】
好ましくは、バイオマスの処理方法、具体的にはバイオマスの液状化法および／または発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造方法への使用に適する微生物の固定化培養物中には、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が少なくとも９６．５７％を超える配列領域を含むヌクレオチド配列を有する微生物が存在する。特に好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９６．５８％を超えるか、または９６．５９％を超えるか、または９６．６０％を超えるか、または９６．６５％を超えるか、または９６．７０％を超えるか、または９６．７５％を超えるか、または９６．８０％を超えるか、または９６．９０％を超えるか、または９７．０％を超えるか、または９７．１％を超えるか、または９７．２％を超えるか、または９７．３％を超えるか、または９７．４％を超えるか、または９７．５％を超えるか、または９７．６％を超えるか、または９７．７％を超えるか、または９７．８％を超えるか、または９７．９％を超えるか、９８．０％を超えるか、９８．１％を超えるか、または９８．２％を超えるか、または９８．３％を超えるか、または９８．４％を超えるか、または９８．５％を超えるか、または９８．６％を超えるか、または９８．７％を超えるか、または９８．８％を超えるか、または９８．９％を超える配列領域を含む。さらに好ましくは、前記ヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９９．０％を超える配列領域を含む。
【０１０９】
さらに別の好ましい実施形態によれば、バイオマスの処理方法、具体的にはバイオマスの液状化法および／または発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造方法への使用に適する微生物の固定化培養物中には、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が少なくとも９９．５％を超える配列領域を有するヌクレオチド配列を持つ微生物が存在する。全く好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９９．８％を超える配列領域を含む。
【０１１０】
全く好ましい実施形態によれば、バイオマスの処理方法、具体的にはバイオマスの液状化法および／または発酵によるバイオマスからのバイオガスの製造方法への使用に適する微生物の固定化培養物中には、配列番号１のヌクレオチド配列と一致する配列領域を含むヌクレオチド配列を有する微生物が存在する。
【０１１１】
本発明は、ヌクレオチド配列に関して上で特徴づけした微生物をバイオマスの処理方法に使用することも包含する。好ましくは、これらの微生物は、上で詳しく説明したバイオマスの処理方法の１つに使用される。
【０１１２】
本発明は、ヌクレオチド配列について上で特徴づけした微生物をバイオマスの液状化方法に使用することも包含する。好ましくは、この微生物は、上で詳しく説明したバイオマスの液状化方法の１つに使用される。
【０１１３】
本発明は、ヌクレオチド配列について上で特徴づけした微生物をバイオマスから発酵によってバイオガスを製造する方法に使用することも包含する。好ましくは、この微生物は、上で詳しく説明したバイオマスから発酵によってバイオガスを製造する方法の１つに使用される。
【０１１４】
本発明は、ヌクレオチド配列について上で特徴づけした微生物の培養物をバイオマスの処理方法に使用することも包含する。好ましくは、微生物のこの培養物は上で詳しく説明したバイオマスの処理方法の１つに使用される。
【０１１５】
本発明は、ヌクレオチド配列について上で特徴づけした微生物の培養物をバイオマスの液状化方法に使用することも包含する。好ましくは、微生物のこの培養物は上で詳しく説明したバイオマスの液状化方法の１つに使用される。
【０１１６】
本発明は、ヌクレオチド配列について上で特徴づけした微生物の培養物をバイオマスから発酵によってバイオガスを製造する方法に使用することも包含する。好ましくは、微生物のこの培養物は、上で詳しく説明したバイオマスから発酵によってバイオガスを製造する方法の１つに使用される。
【０１１７】
本発明を図解してその長所を明らかにするため、実施例を挙げて説明する。実施例は図１ないし図４を参照しながらくわしく説明する。実施例と関連して記述する内容が本発明の範囲を限定するものでないことは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】発酵基質の液状化の程度を調べるための基質流動試験。
【図２】発酵の測定結果：ガス生産量を空間時間収量（ＮＬ／Ｌ）として、また発酵槽の容積負荷を時間的変化としてプロットしたものである。
【図３】さらに別の発酵の測定結果：ガスの収量を空間時間収率（ＮＬ／Ｌ）として、また発酵槽の容積負荷を時間的変化としてプロットしたものである。
【図４】さらに別の発酵の測定結果：ガスの収量を空間時間収率（ＮＬ／Ｌ）として、また発酵槽の容積負荷を時間的変化としてプロットしたものである。
【発明を実施するための形態】
【０１１９】
細菌クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３は、二次発酵槽の発酵基質から単離することに成功した。この微生物はブダペスト条約に基づいてブラウンシュバイクにあるDeutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkluturen GmbHに純粋培養物として寄託した（クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３、寄託番号ＤＳＭ２２５７７）。
【０１２０】
細菌クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａも二次発酵槽の発酵基質から単離することに成功した（クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ、寄託番号ＤＳＭ２２５７８）。
【０１２１】
以下に挙げる実施例からわかるように、細菌クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株は混合培養物でも、また純粋培養物でも、本発明にしたがう特性、たとえばバイオガスプロセスにおける容積負荷の増大、ガス収率の向上および安定化ならびにバイオマスの液状化能力といった特性に関して、細菌クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株と似た特性を示す。
【０１２２】
以下では特にことわらない限り、たとえば、Sambrookら、1989，Molecular cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記述されているような、分子生物学の標準的な方法を使用した。
【０１２３】
微生物の単離および濃縮
細菌クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株は、二次発酵槽の発酵基質から単離することに成功した。微生物の単離は、唯一の炭素源としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む選択培地を使って行った。カルボキシセルロースは、バイオガスプラントの発酵基質に含まれるセルロースと非常に大きな類似性を有することに加え、ヒドロキシル基とカルボキシメチル基（−ＣＨ2−ＣＯＯＨ−）との結合によって水性培地に対して良好な溶解性を呈する。クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３を選抜するために使用した培地（ＤＳＭＺ培地５２０プラス１％ＣＭＣおよび０．２％酵母抽出物）にはＮ2を通じた。これによって、嫌気性条件下で選抜を行うことができた。そこに含まれる残留酸素は、０．５ｇ／Ｌ  Ｎａ2Ｓによって還元された。
【０１２４】
次に、選択培地に二次発酵槽から採取した上澄み（１：２０００希釈）を播種した。４０℃で１週間培養したのち顕微鏡観察で個々の桿菌を認めた。液体培養物をさらに選択し、嫌気カルボキシメチルセルロースプレート上に塗布し、純粋培養物として単離した。
【０１２５】
比較的多量の細菌クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株を得るには（たとえばタイプ３の発酵槽に添加するための）、１ｍ3発酵槽に前培養物１００ｍＬを播種し、嫌気条件下で培養した。約２時間の倍加時間でかなりの速さで増殖するため、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３は生物工学的応用に特に適しているように思われる。細菌が比較的少量の場合は（たとえばタイプ１、２および４の発酵槽に添加するための）、５００ｍＬから１Ｌ規模で培養した。発酵プロセスに添加するための培養は１から２日間行った。得られた細胞密度は培養培地１ｍＬ当たり細胞１０8個ないし１０10個であった。遠心分離にかけて菌体を集め、最少量の培地に取り上げたのち、発酵プロセスに使用した。一時的に保管する場合は細胞を凍結させた。
【０１２６】
微生物種クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）および微生物種パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）は、たとえば、上記３種類の微生物がほぼ等しい割合からなる混合培養物を使用する場合、同じ条件で培養することができた。
【０１２７】
ＤＮＡの分離およびヌクレオチド配列決定
単離した増殖コロニーの細胞材料は、標準プログラムによるコロニーＰＣＲ法を使った微生物ＤＮＡの増幅に使用した。
【０１２８】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を決定するため、ＰＣＲ法によって細胞ＤＮＡから１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。それには、ＧＲＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧおよびＡＣＧＧＨＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴの配列（５’→３’方向に記載してある。Ｈは、Ｃ、ＴまたはＡを意味する。）を有するプライマーを使用した。ＰＣＲ産物として得られたＤＮＡ断片をクローニングベクターにクローニングし（ベクターｐ−Ｄｒｉｖｅを使用し、ＱＩＡＧＥＮ／Ｈｉｌｄｅｎ社のＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲクローニングキットでライゲーション）、大腸菌に形質転換し（ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ−クローニングハンドブックに従って）、コロニー−ＰＣＲで検査した。好適なクローンを選抜するため、得られたコロニー−ＰＣＲ産物を制限酵素断片長多形（ＲＦＬＰ）分析にかけた。それぞれのクローンから相当するプラスミドＤＮＡを分離し、鎖切断法（Sangerら、1977）によって配列を決定した。
【０１２９】
配列分析
コロニーの配列分析を行ったのち、プログラムパッケージＡＲＢ（Ludwigら、Nucleic Acids Research. 2004. 32, 1363-1371）を使って１６Ｓ  ｒＤＮＡまたはその対応する１６Ｓ  ｒＲＮＡへの変換を系統分類学的に分析し、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）種の微生物であると分類できた。データベースwww.ncbi.nlm.nih.govからのＢＬＡＳＴプログラム（Basic local alignment search tool）を使ったクローン化１６Ｓ  ｒＤＮＡまたは対応する１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列分析に基づいて、クロストリジウムｓｐ．クローン１０９９９８２２４８０７２が最も近い近縁体であると決定した。
【０１３０】
セルロース含有培地の液状化
加水分解活性を有する発酵微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３の純粋培養物を使った試験から、非常に粘稠なカルボキシメチルセルロースを含有する選択培地を加えると、培地は、細菌が増殖するにつれて次第に水に近い粘性にまで液状化が誘導できることが証明された。このことは培養フラスコを振盪しながら目で検査すればはっきりと観察できる。
【０１３１】
発酵基質の液状化−基質流動試験
湿式法の場合、高い乾燥物質含有量の発酵基質を液状化すること、あるいは液状−かゆ状の粘性を維持することは、摩擦による損傷を抑えながらコスト的に有利に工業プロセスを進めるために不可欠である。連続運転すると、発酵内容物が「粘性を増す」事態が発生することがあり、そのこともバイオガス生成プロセスにとって、好ましくない影響を及ぼす。そこで、試験を実施し微生物の添加が発酵基質の粘性に及ぼす効果を決定した。試験では、斜めに傾けた平面上で基質試料の流動性を測定した（基質流動試験）。
【０１３２】
流動試験の出発物質には、約８〜１２％の乾燥物質の割合有するバイオガスプラントから採取した物質を使用した。それぞれ発酵槽から採取した物質５００ｍＬを１ＬのＳｃｈｏｔｔフラスコに入れ、４０℃で１日間インキュベートした。次に、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３、クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ、パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２または３種の細菌を同じ割合で混合したものの前培養物５００ｍＬから採取した細菌細胞塊（約４×１０11個の細胞に相当する）をそれぞれ培地１ｍＬに再懸濁し、添加し、さらに５日間４０℃で振盪しながらインキュベートした。比較対照用試料には培地１ｍＬのみを添加した。それぞれ試料１．３ｇを、斜めに傾けた金属製平面の出発点に置き、各試料の流動速度（１０分間当たりに移動距離）をｃｍ目盛のスケールで読み取り、それを発酵基質の流動度または粘性の形で表示する。流動試験結果を図１に示す。
【０１３３】
図１に示すスポットは次のとおりである：スポット１：微生物無添加の対照試料（比較例）；スポット２：クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ（比較例）；スポット３：クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３；スポット４：パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２（比較例）；スポット５：クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３およびパエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２を同じ割合で混合した混合物。図１のＡは試料を付けた直後のスポット、図１のＢは２分後のスポット、そして図１のＣは１８分後のスポットを表わす。
【０１３４】
クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の生きた細菌を添加すると、発酵槽内容物の粘性は、非常に大きく低下するのに対して、クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａおよびパエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２を添加した場合は、効果は明らかであるが、前者ほど顕著ではないことがわかる。３種類の微生物の混合物を添加することによっても、基質の顕著な液状化を達成することができた。さらにもう一つの試験では、死細胞（滅菌オートクレーブ）を加えた場合は実質的に効果のないことが確認された。試料の目視検査でも、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の生細胞を加えると粘性物質の割合が低下することがわかった。すでに発酵槽を通過し、その結果微生物による発酵プロセスを終えた基質に対しても添加細菌はさらなる液状化をもたらすということは、予想外の驚くべきことであった。このことは、発酵プロセスでは、基質は、微生物を追加しないと完全に分解せず、追加的エネルギーを残しており、本発明による微生物を添加することによって、初めてその利用が可能になることを意味する。
【０１３５】
細胞密度の決定
生細胞の細胞密度を測定するため、それぞれ細菌試料１０μＬ（たとえば前培養物、細菌培養物、発酵試料の上澄み、）とＢａｃＬｉｇｈｔTM色素（Invitrogen）２μＬとを混合し、１０００倍の倍率で顕微鏡観察した（AXIO Imager A1, Zeiss, Jena）。ＵＶ光の下、２種類のフィルターを使用し、ＢａｃＬｉｇｈｔTMシステムで試料中の生細胞の割合を決定することができる。全細胞数はトーマ血球計算盤で算出した。前培養物中の生細胞の割合は、おおむね９０％を超えた。
【０１３６】
試料中のクロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３またはパエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２またはクロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ細胞の割合の決定−「フィッシング」
細菌種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３またはパエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２またはクロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａの割合は、Amannらが記載する方法（1995, Microbiol. Rev. 59, 143-169）にしたがい、「全細胞ハイブリダイゼーション法」によって決定した。「フィッシング」のプローブとして、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３に対しては、Ｃｙ３−ｃｃａｃａｇｃｔｃｔｃａｃｇｃｃｃｇ（５’→３’の方向に記述）の配列の標識オリゴヌクレオチドを使用し、パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２に対しては、Ｃｙ３−ｇｃａａｃｃｃｇａａｃＴｇａｇａｃｃ（５’→３’の方向に記述）の配列の標識オリゴヌクレオチドを使用し、クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａに対しては、Ｃｙ３−ＣＴＴＣＡＴＧＣＧＡＡＡＡＴＧＴＡＡ（５’→３’の方向に記述）の配列の標識オリゴヌクレオチドを使用した。これらのオリゴヌクレオチドは標識としてそれぞれ５’末端にインドカルボシアニン（Ｃｙ３）色素を結合していた。
【０１３７】
発酵槽のタイプ
試験は、タイプの異なる発酵槽を使用し、パイロットプラント規模で実施した。発酵槽の運転は約４０℃の運転温度で行った。基質には主として乾燥有機物質（ｏＴＳ）の割合が３０〜３５％のサイロ貯蔵トウモロコシを使った。発酵に関係する代謝活性微生物に必要な微量元素を供給するため、通常は市販の微量元素混合物（たとえばＮｏｖｏｄｙｎ（登録商標））を添加した。
【０１３８】
タイプ１発酵槽：横型長方形のプラグフロー発酵槽、内容量１５０Ｌ、この発酵槽は内側に入り込むように作られた壁によって構造的に分割され、基質が流れる通路は面積が小さくしてあり、発酵空間は基質投入口のすぐうしろ１／４と、開口部（Lochblende）のうしろ３／４とに分割された二段式プラント。
【０１３９】
タイプ２発酵槽：第一段として横型長方形のプラグフロー発酵槽、内容量１５０Ｌ、プラス第二段として全撹拌式球形発酵槽、内容量２００Ｌ；球形発酵槽とプラグフロー発酵槽の間を再循環する、総容量３５０Ｌの二段式プラント。
【０１４０】
タイプ３発酵槽：横置円筒型プラグフロー発酵槽、内容量３０ｍ3、一段式プラント。
【０１４１】
タイプ４発酵槽：横型長方形のプラグフロー発酵槽、内容量１５０Ｌ、発酵槽の空間は構造的に分割されていない一段式プラント。再循環は場合に応じて選択。
【０１４２】
発酵槽内部の微生物の分布−「トレーサー試験」
発酵槽内の粘稠な基質、そしてそれゆえその他の添加物も、完全に混合するにはかなりの時間がかかり、加えて、その時間は使用する撹拌装置にも依存するため、発酵槽内添加微生物が均一に分布するまでの時間を決定できる試験を確立した。この「トレーサー試験」では、微生物の代わりに、ＬｉＣｌの粉末を１０ｍｇリチウム／ｋｇ出発基質の農度で（タイプ２の発酵槽に対しては２倍量）、基質添加場所から添加した。それから異なる時間（添加は１日目に行う）に、発酵槽の異なる場所で基質試料を採取し（基質投入後に発酵槽を始動し、残った基質が排出される前に終了で）、そのＬｉ含有量を、ＤＩＮ  ＥＮ  ＩＳＯ  １３３４６（Ｓ７ａ）およびＤＩＮ  ＥＮ  ＩＳＯ  １１８８５（Ｅ２２）に記載の方法により、誘導結合型プラズマ原子発光分光法で分析した。発酵槽の内容物が完全に混合したら、発酵槽前端部と発酵槽の後端部のＬｉ含有量測定値が同じにならなければならないし、約１０ｍｇ／ｋｇ出発基質の値（タイプ２発酵槽の場合は約２０ｍｇ／ｋｇ出発基質）を示さなければならない。３種類の異なるタイプの発酵槽に対するこのような「トレーサー試験」の結果を表１に示す。
【０１４３】
【表１】
2011514246.tif 000003
【０１４４】
タイプ２およびタイプ３の発酵槽の場合、発酵槽の内容物の完全な混合およびそれと並行する「トレーサー」の均一な分布は、「トレーサー」を添加してから５日間で達成されるのに対して、タイプ１の発酵槽では８日後にはじめて達成されることがわかった。添加微生物の均一な分布必要とされる時間も数日であることが推測される。
【０１４５】
本発明による微生物を添加した場合と添加しなかった場合の長期間発酵によるバイオガスの製造
実際の実施経験で知られている平均容積負荷に対して、これをパイロットプラント規模で少なくとも２倍に引き上げることができた。容積負荷が８ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日の場合、１ｍ3当たり、１週間当たり２×１０13個の細胞を添加することによって安定した運転が実現できた。その際、温度（４０℃）およびｐＨ値（６〜９）または緩衝能など、実際の運転における通常のプロセスパラメータは変化しなかった。
【０１４６】
内容量１５０Ｌから３００００Ｌまでの異なる試験発酵槽を使用して、現実的な条件下（Ｔ  〜４０℃、ｐＨ６〜８、連続的仕込み、連続撹拌）で行った発酵プロセス中に、１立方メートル当たり、１日当たりの乾燥有機物（ｋｇ）の容積負荷（ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日）および生成するバイオガスの時間的変化を数ヶ月の期間に渡り測定した。異なる試験プラント間の比較がしやすいように、ガスの収量として、バイオガスの比収量の代わりに空間時間収量（発酵体積１Ｌ当たり生成したバイオガスの標準リットル数［単位：ＮＬ／Ｌ］）で表示した。すなわち、生成したバイオガスの量をそのときの発酵体積で規格化した。さらに、理論的に期待されるガス発生量の時間的変化も計算した。
【０１４７】
農業技術・土木機構（Kuratorium fuer Technik und Bauwesen in der Landwirtschaft  e.V.）（ＫＴＢＬ）ならびに州農業研究所（Bundesforschungsanstalt fuer Landwirtschaft）および再生可能資源協会（Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe）は、安定した発酵時に基質使用量に応じておおよそどれほどの量のバイオガスを見込むことができるかを示す基準値を公表している。したがって、これらの基準値は理論的に生成可能なバイオガス量を反映することができる。またこれに代えて、その他の州のその他の研究機関によって公表された基準値も使用することが可能である。ｏＴＳの割合が２２％から４０％までの間にあるサイロ貯蔵トウモロコシの場合、期待されるガスの収量は５３３Ｎｌ／ｋｇ  ｏＴＳから６５０Ｎｌ／ｋｇ  ｏＴＳまでの範囲にあると言われている（"Handreichung Biogasgewinnung und -nutzung", 2006, Hrsgb. Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V., Guelzow およびＫＴＢＬホームページ www.ktbl.de）。このような基準値によって、理論的ガス生成量［ＮＬ／日］の時間的変化を計算した。その際、すべての試験に対して、ガスの理論的収量として６６３ＮＬ／ｋｇ  ｏＴＳという非常に高い値を仮定した。使用したサイロ貯蔵トウモロコシについて実際に測定したｏＴＳの割合の値は、仕込みによって３０および４０％ｏＴＳの間で変動した。
【０１４８】
ガスの収量および容積負荷以外に、発酵内容物の乾燥物質含有量、ｐＨ、酸濃度（たとえば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、酢酸当量）、温度、ガス比収量、バイオガスの組成、粘性、導電性、酸化還元電位、ならびに栄養物および微量元素の濃度など、発酵プロセスの一連の特性パラメータも測定した。
【０１４９】
微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３の添加でのタイプ４発酵槽による長期間発酵
ここではパイロットプラントとして容積１５０Ｌの横型プラグフロー発酵槽が対象となる。この発酵槽は一段式プラントとして運転された。
【０１５０】
図２は、微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株を添加した場合と添加しなかった場合について、試験発酵槽で発酵プロセス時に測定した各特性パラメータの値を示す。符号１０で示す曲線は、１立方メートル当たり、１日当たりの乾燥有機物質のキログラム数で表わされる発酵槽の容積負荷（ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日）の時間的変化を表わし、符号２０で示す曲線はそれぞれ５日間の平均空間時間収量測定値（ＮＬ／Ｌ）の時間的変化を表わす。符号３０で示す曲線は、理論的ガス生産量の時間的変化を表わす。
【０１５１】
前記プラントは運転日２４６日まで微生物を添加しないで運転した。発酵が安定した状態にあるこのプラントでは６ないし７ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日の高い容積負荷を達成することができた。このときの実際のガスの収量はそれぞれ理論値よりやや低い状態であった。
【０１５２】
容積負荷を１０ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日まで引き上げる試験を２３２日（星印で表示）から行ったが、ガスの生成は直ちに崩壊した。容積負荷が再び約６ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日まで戻ったあと、２４６日からは１週間に２回微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の培養物を添加した（３０ｍＬから２００ｍＬの体積で１回の添加当たり５×１０10個および２×１０11細胞個のあいだ）。クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３の添加時点はＸ軸上にひし形の符号４０で示してある。
【０１５３】
その後、ガスの実際の収量は理論計算値を超えて上昇しつづけた。発酵プロセスが安定していると、容積負荷は上昇しつづけることができ、３６０日まで９ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日という高い値で推移した。その結果、空間時間収量も最初の４ＮＬ／Ｌから６ＮＬ／Ｌまで上昇した。３６０日が経過した時点で（矢印）、運転を休止するため基質の供給を停止し、それ以上微生物の添加は行わなかった。ガス生成は完全に停止した。
【０１５４】
３８４日から、プラントの容積負荷は、新たに微生物を添加しなくても１日以内に５ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日に向かって上昇した。約４１５日まで容積負荷は７ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日の値に向かって上昇し、さらにその後７および８ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日の間の高い値にとどまった。このあと、ガスの生成は再び高効率で始まり、検討した全期間にわたって理論的に期待されるガス生産量あるいはそれを上回る生産量がつづいた。
【０１５５】
数週間の休止後もこのようにプラントの運転が問題なくつづけられることはきわめて異例であることは当業者のよく知るところである。クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３に対するオリゴヌクレオチドプローブを取り付けたプラントを再度高負荷運転した後の「フィッシング」実験によれば、発酵槽の中の微生物は定着し、発酵槽内容物から検出される細菌の総数の約０．５％の濃度で存在することが確認された。このことは高い容積負荷およびガス収量ならびに発酵プロセスの安定性に対する好ましい効果も説明しており、こうした効果は、すでに微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３を定期的に添加したときにも認められた。
【０１５６】
クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３ならびにクロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株、クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株およびパエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２株混合物の添加でのタイプ１発酵槽による長期間発酵
ここでは、パイロットプラントとして容積１５０Ｌの横型長方形プラグフロー発酵槽が対象となる。この発酵槽は、内部に入り込むように作られた壁によって構造的に分割され、基質が流れる通路は面積が小さくしてあるため、二段式プラントとして運転された。この発酵槽は発酵空間が擬似的に２つの反応室に分割されており、その容積比は１：３になっている。小さい方の室は基質投入口のすぐうしろにあり、大きい方の室は開口部のうしろにある。発酵特性パラメータの測定から、両反応室で部分的に異なる値が生じることが判明した。その結果、種々の基質反応が、好ましくは、どちらかの反応室で行なわれると推定することができる。
【０１５７】
図３は、微生物の混合物または微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の添加下にタイプ１試験発酵槽で発酵プロセスを行う間に得た各特性パラメータの測定結果を示す。符号１０で示す曲線は、１立方メートル当たり、１日当たりの乾燥有機物質のキログラム数で表わされる発酵槽の容積負荷（ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日）の時間的変化を表わし、符号２０で示す曲線はそれぞれ５日間の平均空間時間収量測定値（ＮＬ／Ｌ）の時間的変化を表わす。符号３０は、理論的ガス生産量（ＮＬ／Ｌ）の時間的変化を表わす。
【０１５８】
プラントは、原料の投入を完全に新しくやりなおした。すでに１週間後には、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株、クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株およびパエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２株をほぼ同じ割合で混合した混合物を１週間に２から５回添加した。添加時点は符号５０で示してある。約１０12個の細胞からなる細胞ペレット約３ｇを添加した。発酵プロセスが安定している場合、容積負荷は、約６ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日に達するまで徐々に上昇させることができる。得られたガスの収量は、おおむね理論的に期待される収量か、僅かに低い収量であった。
【０１５９】
１０６日からは混合培養物の代わりにクロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３の純粋培養物を週に５回添加した（同じく、約１０12個の細胞からなる細胞ペレット約３ｇ）。添加時点は符号６０で示してある。容積負荷は、観察期間の終わりまで、ずっと６および７ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日という高い水準を維持し続け、測定酸濃度は、臨界領域に達することはなかった。発酵内容物中の乾燥有機物質の測定した割合は、１２％ｏＴＳの値を決して超えることはなく、それゆえ、容積負荷が高くても発酵槽の内容物は撹拌性がよく、粘性が高すぎることはなかった。微生物を添加しない比較対照実験では容積負荷が５ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日を超えると運転不能であった。
【０１６０】
クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の純粋培養物を添加した場合、混合培養物を添加した期間と比べて、実際に測定したガスの収量は明らかに上昇した。混合培養物を週に５回添加した期間に測定した平均ガス収量は４．１ＮＬ／Ｌであったのに対して、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３の純粋培養物を添加したあとの平均ガス収量は４．６ＮＬ／Ｌであった。これは１２％の増加に相当し、経済的に非常に大きな意味を持つ。この実施例からも、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の純粋培養物を添加すると、バイオガスの比収量（Ｎｍ3／ｔ）は向上し、容積負荷を同じにした場合、ガスの収量は上昇し、添加される基質が、より効率的に使用されたことを示している。
【０１６１】
微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３の添加でのタイプ３発酵槽による長期間発酵
この試験プラントについては、横型円筒形のプラグフロー発酵槽として製作された、容積が３０ｍ3のパイロットプラント規模の大型試験プラントが対象となる。この発酵槽は一段式プラントとして運転された。
【０１６２】
図４は、微生物クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株または微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の添加下にタイプ３試験発酵槽で発酵プロセスを行う間に得た各特性パラメータの測定結果を示す。符号１０で示す曲線は、１立方メートル当たり、１日当たりの乾燥有機物質のキログラム数で表わされる発酵槽の容積負荷（ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日）の時間的変化を表わし、符号２０で示す曲線は、測定した空間時間収量の時間的変化を表わす。それぞれ５日間にわたる空間時間収量（ＮＬ／Ｌ）は符号７０で示してある。符号３０は、理論的ガス生産量［ＮＬ／Ｌ］の時間的変化を表わす。
【０１６３】
微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株を添加した時点は符号９０で示してある。微生物クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株を添加した時点は符号８０で示してある。矢印は発酵槽の機能の「急激な低下」（Absturz）が始まったことを示す。
【０１６４】
運転１８４日目から、バイオガスプラントは４から５ｋ  ｇｏＴＳ／ｍ3・日の容積負荷で運転した。図４を見ればわかるように、この試験で得られたバイオガスの空間時間収量は理論的に期待される値を明らかに上回った。プロセスの水準をこの高さで維持するために、２０７日から微生物クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株の純粋培養物を添加した（１００から２００Ｌバッチから得た湿潤細胞ペレットそれぞれ約１００ｇを１週間に４から５回添加。これは約４から８×１０13個の細胞に相当）。このようにして、プロセスを２週間を超える期間、この高い水準に維持することができた（空間時間収量３．５から４ＮＬ／Ｌ、理論的に期待されるガス収量を約１５％から３０％上回る）。しかし、２２７日から、「発酵槽の機能の急激な低下」ともいうべき、わずか１ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日を多少上まわる程度まで容積負荷の急速な低下と平行してガス生成の突然の低下が起こった。ｐＨ値（２２９日に約７．７〜７．８から６．０へ低下）や遊離脂肪酸の蓄積を表わす測定値（酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸および酢酸当量に対する値の急激な上昇）など、別の測定パラメータからも、発酵プロセスの平衡が破れたことを観察することができた。発酵プロセスを再度安定化するためには、運転日２２８日から、それぞれ微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の純粋培養物を添加した（１００ないし２００Ｌバッチから得た湿潤細胞ペレットそれぞれ約１００ｇを１週間に４から５回添加）。機能が急激に低下したときに得られたガス収量は、理論的に期待される値にかろうじて達したに過ぎなかったが（符号２０および３０で表示された測定シリーズを参照）、すでに２３０日からは、すなわち微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の最初の培養物を添加してから２日後には、測定されたガス収量は理論的に期待されるガス収量を再び上回る。ガス収量が連続して上昇するのと平行して容量負荷の上昇も２３８日から可能であった。２５７日まで微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の添加を続けた。この時点で容積負荷は約４ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日に達し、得られたガス収量は理論的に計算される値を終始大きく上回ったが、効率は急激な機能低下に陥る前よりいくらか低い状態がつづいた。こうした結果をふまえて微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の添加を中止し、２６０日からは新たに微生物クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株を添加した（１００ないし２００Ｌのバッチから得た湿潤細胞ペレットそれぞれ約１００ｇを１週間に４から５回添加）。これによって容積負荷は、４．５および５ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日のあいだまで再度容易に上昇することができ、再びガスの増収が観察され、発酵槽の急激な機能低下に陥る前の水準に達した。かくして、本発明による微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株の添加は、機能の急激な低下状態にある発酵槽を安定化するのに好適であることが明らかに���った。
【０１６５】
発酵に際して、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３の純粋培養物を添加することにより、容積負荷を最大値約９ｋ  ｇｏＴＳ／ｍ3・日まで引き上げることができた。
【０１６６】
容積負荷の上昇と平行してバイオガス収量の向上が観察できた。その際、生成されたバイオガスの量（標準リットル／日［ＮＬ／日］）とガスの理論生産量（標準リットル／日［ＮＬ／日］）とは一致するか、ガスの理論生産量と比べて高いガス生産量が観察された。
【０１６７】
クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３を添加することにより、プラントの容積負荷をさらに引き上げることができた。そのとき、乾燥物質または乾燥有機物質の含有量（％）はほとんど変わらず一定であった。この観察から、発酵基質を発酵させる間、非発酵乾燥有機物質は蓄積しないという考えに至った。したがって、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３の純粋培養物を添加することは、発酵基質に含まれる乾燥物質の連続的な変換反応に貢献し、その変換反応は乾燥物質の蓄積を減らすため、そのことによっても連続発酵が可能になる。
【０１６８】
バイオガスプラントが一定の容積負荷で運転されている期間は、乾燥物質の減少が観察され、そしてそのことは、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３微生物が、その加水分解物質代謝選択性によって乾燥物質が発酵槽に蓄積するのを引き下げるだけでなく、乾燥物質の加水分解も助長することを暗示する。
【０１６９】
ここまで述べてきた実施例では、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の純粋培養物だけでなく、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を含む混合培養物も使用した。具体的には、パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）、クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）およびクロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）からなる群から選択される２ないし３種類の微生物からなる混合培養物を添加することが可能である。
【０１７０】
加水分解活性を有する発酵微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３の添加は、乾燥有機物質の加水分解に対して好ましい効果を示す。微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を添加することにより、それ以外は同じ条件で、発酵槽の容積負荷を約４〜５ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日から約６〜９ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日まで引き上げることができる。容積負荷の上昇と平行して、生成バイオガス量も増加する。そしてさらに、微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を添加しない場合と比べて、明らかに多量の乾燥有機物質が分解されるため、バイオガスの比収量も向上する。微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の使用は、バイオガスプラントの効率と有効性を劇的に改善する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年8月20日(2010.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスに微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）を微生物培養物の形で、かつ該微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、該培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１％を占めるよう添加することを特徴とするバイオマスの処理方法。
【請求項２】
バイオマスの液状化方法であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
バイオマスからバイオガスを製造する方法であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記微生物培養物中の前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、該培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０％を占めることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の純粋培養物を添加することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、微生物の少なくとも１つの固定化培養物の成分として、バイオマスに添加されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の添加とほぼ同時に、バイオマスを発酵槽に追加し、発酵槽の容積負荷をバイオマスを連続的に加えて連続的に高めることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
バイオマスからのバイオガスの製造が、容積負荷０．５ｋｇ  ｏＴＳ／ｍ3・日以上で行われることを特徴とする請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、添加後の該微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の割合が、発酵基質中に存在する微生物の総数の１０-4％と１０％との間になる量で添加されることを特徴とする請求項１〜８項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、添加後の該微生物種クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の割合が、発酵基質中に存在する微生物の総数の１０-3％と１％との間になる量で添加されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
微生物種クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）をさらに添加することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物種クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）が、微生物クロストリジウム・サルタゴフォルマム（Clostridium sartagoformum）ＳＢＧ１ａ株であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
微生物種パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）をさらに添加することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物種パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）が、微生物パエニバチルス・マセランズ（Paenibacillus macerans）ＳＢＧ２株であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＤＳＭＺにＮｏ．２２５７７で寄託されている微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）ＳＢＧ３株。
【請求項１６】
ヌクレオチド配列を有する核酸を含む微生物であって、該ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が９８．５％を超える配列領域を含むことを特徴とする微生物。
【請求項１７】
バイオマスの処理方法に使用するのに好適な微生物培養物であって、該微生物培養物中に請求項１５または１６記載の微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が存在し、かつ該微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、該培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１％を占めることを特徴とする微生物培養物。
【請求項１８】
前記微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）が、前記培養物中に存在する微生物の総数の少なくとも１０％を占めることを特徴とする請求項１７記載の微生物培養物。
【請求項１９】
微生物クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）の純粋培養物であることを特徴とする請求項１８記載の微生物培養物。
【請求項２０】
微生物固定化培養物であることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の微生物培養物。
【国際調査報告】
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