(57)【要約】ＩｇＧ抗体またはＦｃフラグメントとの結合を示す哺乳類のＣ型レクチン受容体型が識別され、それゆえ、様々な免疫疾患に関連する炎症の軽減に関連するＩＶＩＧを誘導する。ＩｇＧと相互作用し、免疫疾患に関連する炎症を低減する生物学的反応を促進するＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の識別は、ＤＣ−ＳＩＧＮ１＋１細胞を調節し、二次エフェクターマクロファージに信号を送る役割を果たすこと、ＦｃγＲＩＩＢ受容体の発現の増加をもたらすこと、および次々と細胞媒介炎症反応を阻害することによる、様々な免疫疾患の治療に有用でありうる化合物をスクリーニングするおよび選択するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質の存在下で試験化合物を結合すること；および、
（ｂ）前記ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質の存在下で前記試験化合物の効果を、適当なコントロールと比較して、測定することおよび比較すること；
を含む、ＩｇＧ自己抗体媒介炎症に関連する抗炎症活性を活性化するまたは抑制するのに有用な試験化合物を識別する方法。
【請求項２】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質は、ＳＩＧＮ−Ｒ、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮＲからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
工程（ａ）は、Ｃａ＋＋の存在下で行われる、請求項１および２の方法。
【請求項４】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質は、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞として与えられる、請求項１の方法。
【請求項５】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質は、ＳＩＧＮ−Ｒ、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮＲからなる群から選択される、請求項４の方法。
【請求項６】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞は、ＳＩＧＮ−Ｒ、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮＲからなる群から選択されるレクチン領域を組み換え技術によりエンコードする核酸分子がトランスフェクションされた培養細胞として与えられる、請求項４の方法。
【請求項７】
工程（ａ）は、無細胞環境下で行われる、請求項１の方法。
【請求項８】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質は、ＳＩＧＮ−Ｒ、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮＲからなる群から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
工程（ａ）は、Ｃａ＋＋の存在下で行われる、請求項４〜８の方法。
【請求項１０】
（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞を準備すること；
（ｂ）前記ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞を試験化合物に曝すこと；および、
（ｃ）前記ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞内の細胞成分の増加または減少を、前記試験化合物に曝していないＤＣ−ＳＩＧＮ（−）細胞またはＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞と比較して、測定すること；
を含み、前記細胞成分の増加または減少は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の調節に関連する、ＩｇＧ自己抗体媒介炎症に関連する抗炎症活性を活性化するまたは抑制するのに有用な試験化合物を識別する方法。
【請求項１１】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞は、ＳＩＧＮ−Ｒ、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮＲからなる群から選択されるレクチン領域を組み換え技術によりエンコードする核酸分子がトランスフェクションされた培養細胞として与えられる、請求項１０の方法。
【請求項１２】
Ｃａ＋＋の存在下、工程（ａ）を行う、請求項１０および１１の方法。
【請求項１３】
（ａ）少なくともレクチン領域を含むＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型またはフラグメントを含むアミノ酸配列を準備すること；
（ｂ）前記工程（ａ）のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型またはフラグメントを前記試験化合物に接触すること；および、
（ｃ）前記レクチン領域への前記試験化合物の結合の程度を測定すること；
を含む、ＩｇＧ自己抗体媒介炎症に関連する抗炎症活性を活性化するまたは抑制するのに有用な試験化合物を識別する方法。
【請求項１４】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質は、ＳＩＧＮ−Ｒ、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮＲからなる群から選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）は、無細胞環境下で行われる、請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質は、ＳＩＧＮ−Ｒ、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮＲからなる群から選択される、請求項１３の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）は、Ｃａ＋＋の存在下で行われる、請求項１３〜１６の方法。
【請求項１８】
（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のレクチン領域を含む第一のアミノ酸配列を準備すること；
（ｂ）前記工程（ａ）のレクチン領域をコントロール抗体またはその変異体と接触させること；
（ｃ）基準結合値を決定するために、前記レクチン領域への前記コントロール抗体の結合の程度を測定すること；
（ｄ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のレクチン領域を含む第二のアミノ酸配列を準備すること；
（ｅ）前記工程（ｄ）のレクチン領域を試験化合物と接触させること；
（ｆ）前記レクチン領域への前記試験化合物の結合の程度を測定すること；および、（ｇ）工程（ｃ）の基準結合値を工程（ｆ）で測定された化合物の結合の程度と比較すること；
を含む、ＩｇＧ自己抗体媒介炎症に関連する抗炎症活性を活性化するまたは抑制するのに有用な試験化合物を識別する方法。
【請求項１９】
工程（ｂ）および（ｅ）は、無細胞環境下で行われる、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記コントロール抗体は、炭水化物鎖を含むＩｇＧ抗体であり、ここで、当該炭水化物鎖は、ガラクトース部分がα２，６シアリル化を経て、末端シアル酸部分へと結合される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記コントロール抗体または変異体は、炭水化物鎖を含むＦｃフラグメントであり、ここで、当該炭水化物鎖は、ガラクトース部分がα２，６シアリル化を経て、末端シアル酸部分へと結合される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｅ）は、前記リガンド領域を前記試験化合物およびＦｃフラグメントと接触することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）および工程（ｄ）のアミノ酸配列は、ＳＩＧＮ−Ｒ、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＤＣ−ＳＩＧＮＲからなる群から選択される、レクチン領域を発現する培養細胞によって与えられるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
Ｃａ＋＋の存在下、工程（ｂ）および工程（ｅ）を行う、請求項１８〜２３の方法。
【請求項２５】
ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型またはその信号変換経路の１つに結合する、またはそれを活性化する、および免疫疾患に関連する抗炎症活性を媒介する化合物（ただし、当該化合物は、ＩＶＩＧではない）を、患者に投与することを含む、免疫疾患の治療方法。
【請求項２６】
前記ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型はヒトＤＣ−ＳＩＧＮ受容体である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記免疫疾患は、免疫性血小板減少症、自己免疫性溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、川崎病、強皮症、関節炎関節リウマチ、慢性炎症性脱髄性多発神経炎，Ｐｈｅｍｉｇｕｓ、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病  または、自己抗体媒介炎症に関連する疾患からなる免疫疾患群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型またはその信号変換経路の１つに結合する、およびそれを活性化する、および抗炎症性疾患に関連する抗炎症活性を媒介する化合物（ただし、当該化合物は、ＩＶＩＧではない）を、患者に投与することを含む、免疫疾患の治療方法。
【請求項２９】
（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に結合するおよびそれを活性化する化合物であり、免疫疾患に関連する抗炎症活性の促進をもたらす化合物；および、
（ｂ）少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤；
を含み、ある結果を達成するために調剤される、医薬組成物。
【請求項３０】
前記化合物は、抗体である、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記化合物は、Ｆｃフラグメントである、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記化合物は、炭水化物鎖を含むＦｃフラグメントであり、ここで、当該炭水化物鎖は、ガラクトース部分が、α２，６シアリル化を経て、末端シアル酸部分へと結合される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記試験化合物は、ＩＶＩＧ抗体製剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記試験化合物は、Ｆｃフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記試験化合物は、α２，６シアリル化を経て末端シアル酸部分へと結合される、ガラクトース部分を含む、炭化水素鎖を含む抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記試験化合物は、α２，６シアリル化を経て末端シアル酸部分へと結合される、ガラクトース部分を含む、炭化水素鎖を含むＦｃフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記試験化合物は、前記試験化合物の非存在下でのコントロール試験と比較して、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質への試験化合物の結合親和性の測定可能な増加に基づく、ＩｇＧ自己抗体媒介炎症に関連する抗炎症活性を活性化するのに有用な化合物として選択される、請求項１〜９および３〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記試験化合物は、前記試験化合物の非存在下でのコントロール試験と比較して、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質への試験化合物の結合親和性の測定可能なぞうか減少に基づく、ＩｇＧ自己抗体媒介炎症に関連する抗炎症活性を抑制するのに有用な化合物として選択される、請求項１〜９および３〜３６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４６，８４７、および２００８年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／０９７，３４４の優先権を主張するものであり、それら全て参考として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本明細書に記載される本発明は、全部または一部において、国立衛生研究所からの助成金（助成金番号ＡＩ０３４６６２）により支援された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、自己免疫疾患の治療に有効な化合物の識別方法に関する。特に、本発明は、化合物（例えば、ＩｇＧ抗体またはその生物学的に関連のあるフラグメントなど）をスクリーニングするまたは選択する様々な方法に関し、当該化合物は、免疫系障害に苦しむ患者の治療に有効である。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
抗体および抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、食作用（ファゴサイトーシス）、炎症性メディエーター放出、抗原の除去、ならびに抗体半減期を含む、様々な応答に影響する。抗原定常領域は、抗原に対する抗体の結合に直接的には関わらないが、様々なエフェクター機能を示す。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によると、抗体または免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、それらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ、例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４；ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２）に分類されうる。抗体のパパイン分解は、フラグメントに結合する２つの異なる抗原（Ｆａｂフラグメントと称される）（それぞれの単独の抗原結合部位を有する）および残りの“Ｆｃ”フラグメント（この名称は、その容易に結晶化する能力を反映する）を生じる。Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能の中核となる。
【０００５】
静脈ＩｇＧ（ＩＶＩＧ）の投与が、そのＦｃフラグメントにより媒介される相互作用を通じて、炎症誘導性活性および抗炎症活性の両方を調節することが知られている。それゆえ、ＩＶＩＧは、他の自己免疫疾患と同様に、免疫媒介血小板減少症、慢性炎症性脱髄性多発神経障害およびギラン・バレー症候群を含む多くの自己免疫疾患に苦しむ患者の治療として認可された治療用製剤として知られる。
【０００６】
ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８３９６（ＷＯ２００７／１１７５０５）は、ＩＶＩＧの抗炎症活性は、Ｆｃフラグメントおよびその結合グリカンの特性（末端のα２，６シアル酸結合を必須とすること、免疫抑制のための特異的なポリペプチド骨格およびグリカン構造への複合的な要求を示すこと）であることを開示する。
【０００７】
ＮｉｍｍｅｒｊａｈｎおよびＲａｖｅｔｃｈ（２００７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：１１−１５）は様々な免疫疾患の治療のためのＩＶＩＧの大量使用に関する技術を検討および開示する。当該筆者らは、静脈の（ＩＶＩＧ）が病原性炎症反応を抑制する手段を説明しうるいくつかの関連モデルを示す。この目的を達成するために、当該筆者らにより検討された２つの細胞モデルが、シアリル化されたＩｇＧが、制御細胞（例えば、マクロファージなど）上の推定ＩｇＧ受容体と相互作用し、当該制御細胞が次々とエフェクターマクロファージ上の阻害性ＦｃγＲ発現の発現を上方制御しうることを示唆する。しかしながら、特異的受容体は識別されない。
【０００８】
様々な免疫疾患に関連する炎症の治療に有効な新規な化合物を識別することが望まれる。そのような手法は、このＩＶＩＧに関連した抗炎症活性と相互作用するおよびこれを促進する受容体の識別に続いて、より望まれうる。この目的を達成するために、本発明は、ＩＶＩＧ治療に関連するシアリル化されたＩｇＧ抗体またはＦｃフラグメントと相互作用する受容体型を識別し、それゆえ従来の自己免疫疾患のＩＶＩＧに基づいた治療を補完するまたはそれに取って代わる新規な薬物の識別に有用な方法および試験を考慮することにより、この要求に対処および対応したものである。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明は、ＩｇＧ抗体またはＦｃフラグメントと結合する受容体型の識別に係り、それゆえ、様々な免疫疾患に関連する炎症のＩＶＩＧに関連した軽減を誘導する。本明細書で開示する、ＩｇＧ抗体またはＦｃフラグメントに結合するそのような受容体は、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）−３（ＣＤ５０）（ＤＣ−ＳＩＧＮ（樹枝状細胞上に見られる、ヒト樹枝状細胞−特異的接着受容体［ＣＤ２０９］）、ＳＩＧＮ−Ｒｌ（ＤＣ−ＳＩＧＮのマウス相同体、辺縁帯脾性マクロファージ上で発現することで知られる）、ならびに関連する相同体およびそのアイソフォームを含むが、これに限定されるものではない）に結合することで知られる哺乳類のＣ型レクチン型である。“ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型”（免疫疾患に関連する炎症を低減する生物学的反応を促進するＩｇＧと相互作用する）の識別は、本発明のさらに他の態様を実施する際に、次々と有用で不可欠な構成（様々な免疫疾患の治療のための方法、様々な免疫疾患の治療のための組成物の使用および識別を含むが、必須の限定ではない）を提供する。
【００１０】
本発明は、“ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型”（本明細書で開示する受容体型は、公知のＩＶＩＧ治療方法に関連する抗炎症作用を促進するＩｇＧ抗体またはＦｃフラグメントに相互作用する）の調節因子を識別する方法に係る。特に興味のある調節因子は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に対するアゴニストとして機能する化合物である。理論により拘束されないが、推定上、そのような化合物はＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞（例えば、樹枝状細胞など）からエフェクターマクロファージへの信号を媒介する能力を示し、ＦｃγＲＩＩＢ受容体（関連する自己抗体への応答において、これらのマクロファージから通常生じる細胞媒介炎症反応を次々と阻害する）の発現増加をもたらす。本発明の本形態の実施に使用される試験方法は、当業者に現在利用可能な任意の方法であってもよく、単離されたＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を含む単離された膜画分を用いる結合試験、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞を用いる結合または細胞に基づいた活性試験、センサー細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を発現する）を刺激して、エフェクター細胞中のＦｃγＲＩＩＢ受容体の上方制御を媒介する、試験化合物の能力を測定する機能性センサー／エフェクター細胞試験を含むが、これに限定されるものではない。本明細書全体にわたって完全長受容体について述べるが、そのような言及は限定を意味しない。代わりに、そのような完全長受容体または生物学的に関連のある受容体のフラグメント（例えば、“レクチン領域”または“糖認識領域”（以下、“レクチン領域”と称する）を少なくとも含むフラグメント）が本発明の手法を実施する際に用いられうる。それゆえ、本発明は（ｉ）測定可能な細胞成分（二次マクロファージにおいて、ＦｃγＲＩＩＢ受容体の発現の増加に作用しうる）の発現の増加を促進するために、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の活性を調節する（すなわち、刺激する）；（ｉｉ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質をエンコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する；または、（ｉｉｉ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に結合する２，６Ｆｃにより開始される下流シグナル伝達経路に関連するレポーター遺伝子を刺激する；化合物をスクリーニングする方法に係る。それゆえ、化合物は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型をエンコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（二次エフェクターマクロファージにおけるＦｃγＲＩＩＢ受容体の増大されたインビボ発現を促進する）の発現を増加するまたは弱めることにより、および／またはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型受容体タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能することにより、調節しうる。
【００１１】
この目的を達成するために、本願発明は、試験化合物（自己抗体媒介炎症に関連する抗炎症活性を活性化するまたは抑制するために、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型細胞受容体を調節する）の識別方法に係る。そのような方法は、少なくともＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のレクチン領域を含むアミノ酸配列を与えること；当該ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を試験化合物と接触すること；および受容体への試験化合物の結合の程度を測定すること；を含む。そのような受容体（本明細書において、患者の炎症の静脈ＩＶＩＧ緩和の過程に関わる受容体として識別される）への測定可能な親和性を有しうる試験化合物は、様々な免疫疾患の治療に使用される可能性がある化合物としてのさらなる追加試験の候補である。
【００１２】
本発明は、また、試験化合物（自己抗体媒介炎症に関連する抗炎症活性を活性化するためのＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節する）を識別する方法に係る。そのような試験化合物は、それぞれのＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のアゴニストとして働く。それゆえ、そのような手法はＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のレクチン領域を含むアミノ酸配列を与えること；当該ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／当該受容体のレクチン領域を試験化合物と接触すること；および当該レクチン領域への試験化合物の結合の程度を測定すること；を含む。さらに、そのようなＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型への測定可能な親和性を示すそのような試験化合物はいずれも、静脈ＩＶＩＧ型産物と同様の、抗炎症活性を促進する化合物としての追加試験の候補となる。本発明のそのような方法は、無細胞ハイスループット方法でありうる。そのような方法は、特に、試験化合物がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域を結合できること、または、試験化合物がコントロール抗体のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域への結合に作用することを示す第一段階のスクリーニング方法として有利である。これらのことは試験化合物のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（例えば、リガンド結合領域など）への結合、または他の形態によると、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型またはその機能性フラグメントを発現する細胞の応答、を測定する。本発明の本形態の方法は、候補化合物（α２，６Ｆｃフラグメントを含むグリコシル化ポリペプチドの代替物として使用されうる（そのようなポリペプチドの抗炎症活性の増強剤よりもむしろ））の識別に特に有益である。他の形態によると、候補化合物および受容体／レクチン領域間の複合体の存在または量は、本明細書中に記載の通りに測定される。他の形態（例えば、細胞に基づいた試験）によると、完全長ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型またはその機能性フラグメントを発現する細胞の応答もまた測定されうる。
【００１３】
本発明は、さらに、試験化合物（ＩｇＧ媒介炎症に関連する抗炎症活性を活性化するまたは抑制するためにＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節する）の識別方法に係る（ここで、そのような方法は、少なくともＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のレクチン領域を含む第一のアミノ酸配列を与えること；当該受容体をコントロール抗体またはその変異体と接触すること、および、基準結合値を決定するために、当該受容体および／または関連のあるレクチン領域へのコントロール抗体の結合の程度を測定すること；を含む）に係る。この基準結合値は試験化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を含む第二のアミノ酸配列を与えること；当該受容体および／またはこの第二のアミノ酸配列に関連するレクチン領域を当該試験化合物と接触することおよび当該受容体／レクチン領域への当該試験化合物の結合の程度を測定することに関連する）の結合と比較するために使用されうる。それゆえ、当該基準結合値は、次に、当該試験化合物の結合の程度と比較される。
【００１４】
本発明の方法は、また、細胞に基づくものでありうる。細胞に基づいた試験が使用される場合、例えば、細胞分類のような技術は、関心のある複合体（例えば、試験化合物およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域間の複合体のような）の量を決定するのに使用されうる。それゆえ、本明細書にわたって記載される試験は、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞（（ｉ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型または生物学的に関連のあるフラグメント（例えば、レクチン領域、または、ことによるとＦｃ−ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型融合（少なくとも一部の細胞外領域（レクチン領域を含む）を発現する））を発現する）を含む発現ベクターとトランスフェクションされたまたはトランスフォームされた宿主細胞；（ｉｉ）宿主のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を過剰に発現するように遺伝子組み換えされた宿主細胞株（好ましくは、選ばれた“野生型”宿主細胞（そのような過剰発現の改良は、当該技術分野で現在知られている任意の手法（コード領域を損傷させないまま、相同的組み換えによってプロモーターを導入することを含むが、これに限定されない）によってももたらされうる）において少なくとも５倍の発現増加をもたらすことが好ましい）；および／または（ｉｉｉ）どんな生物学的理由であれＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を高いレベルで発現する宿主細胞（例えば、樹枝状細胞を含むが、これに限定されない）を利用しうる。また、本明細書で記載される方法は、関心のある試験がＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞からの膜標本の存在下で行われる、というような改変がなされうる、あるいは、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（または生物学的に関連のあるフラグメント）は、試験化合物（受容体に対する親和性を示す）をスクリーニングするのに利用されうる。
【００１５】
本明細書に記載される方法により識別される化合物は、好ましくは、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のアゴニストとして働き、そして、抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃフラグメントなど）、ペプチド、タンパク質、非タンパク性有機分子、リボゾーム、および／またはアンチセンス分子、静脈ＩＶＩＧに基づく治療に関連する抗炎症活性を促進するのに有用でありうるいずれかでありうる。
【００１６】
本発明は、化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（例えば、受容体のアゴニストのような）を調節する役割を果たす（ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞からエフェクターマクロファージ（ＦｃγＲＩＩＢ受容体（関連する自己抗体への応答において、これらのマクロファージから通常生じる細胞媒介炎症反応を次々と阻害する）への治療効果のある信号を媒介するために、当該化合物はＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節するというような））の発現の増加をもたらす）に係る。この目的を達成するために、本発明は、さらに、医薬組成物（少なくとも一つの医薬的に有効な賦形剤と組み合わせた前記化合物を含む（この医薬組成物は哺乳類（ヒトを含むがこれに限定されない）への投与のための治療効果のある濃度で存在するように））に係る。
【００１７】
本発明は、また、一または複数の免疫疾患の治療方法（本明細書に記載するように、調節因子（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型アゴニストなど）の哺乳類宿主（ヒトを含むがこれに限定されない）（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（例えばヒトＤＣ−ＳＩＧＮ受容体など）を活性化する）への投与を通じた）に係る。そのようなＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型アゴニストは本明細書に記載される方法を通じて識別されうり、そして免疫疾患（免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、自己免疫性溶血性貧血（ＡＨＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、川崎病（急性血管炎症候群）、強皮症、関節炎関節リウマチ（ＲＡ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、天疱瘡およびその他の自己抗体媒介炎症に関連する疾患を含むがこれに限定されない）の治療に有用となるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の簡単な説明
【図１】図１はＩＶＩＧにより標的とされる非−Ｂ、非−Ｔ脾臓個体数を示す。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、野生型における辺縁帯辺縁帯脾性マクロファージ（Ａ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞欠損マウス（ＣＤ４−／−，Ｂ）、Ｂ細胞欠損マウス（ＪＨＤ−／−，Ｃ）、およびＢおよびＴ細胞のいずれも欠損したマウス（Ｒａｇｌ−／−，Ｄ）の、ＭＡＲＣＯ＋（ｙ軸）およびＣＤ１６９＋（ｘ軸）細胞のためのフローサイトメトリーによる分析を示す。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、細胞を発現するＳＩＧＮ−Ｒ１が、α２，６Ｆｃフラグメントと特異的に結合することを示す。（Ａ）ＣＨＯおよびＣＨＯ−ＳＩＧＮ−Ｒ１細胞が様々なラベル化されたＦｃおよびフェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）製剤によりパルスされ、フローサイトメトリーにより分析された。４つの別の実験を代表する、ＣＨＯ細胞に対するＣＨＯ−ＳＩＧＮ−Ｒ１細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）がプロットされる。（Ｂ）同時に、Ｒａｗ−ＳＩＧＮ−Ｒ１細胞と結合するα２，６結合は、ＳＩＧＮ−Ｒ１特異的抗体（ＥＲＴＲ−９）によりブロックされ、アイソタイプコントロール（Ｒａｔ  ＩｇＭ）ではないが、そしてＥＤＴＡによる処理は全ての結合を無効にした。（Ｃ）レクチンＳＩＧＮ−Ｒｌ、ＳＩＧＮ−Ｒ３、ｍＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、およびｈＤＥＣ−２０５を発現する細胞株は、蛍光ラベル化されたＦｃ製剤によりパルスかされ、ＦＡＣＳにより分析された。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、シグレック（Ｓｉｇｌｅｃｓ）へのα２，６Ｆｃ結合を示す。（Ａ）細胞によりトランスフェクションされたＳＩＧＮ−Ｒ１は、Ｒａｗ−２４７細胞（黒色ヒストグラム）上のＳＩＧＮ−Ｒ１発現を評価することにより確認され、安定的にトランスフェクションされたＲａｗ−２４７細胞（Ｒａｗ−ＳＩＧＮ−Ｒ１、白色ヒストグラム）は、フローサイトメトリーにより確認された。（Ｂ）Ｒａｗ−２４７およびＲａｗ−２４７細胞を発現するＳＩＧＮ−Ｒ１は、蛍光ラベル化されたα２，６Ｆｃによりパルス化された。媒体に添加されたＣＩｑ存在下または非存在下で、結合解析は、ＦＡＣＳを用いて結合を解析した。３実験を代表するＲａｗ細胞に対するＲａｗ−ＳＩＧＮ−Ｒ１細胞のＭＦＩ比がプロットされる。平面ウェルプレートは、マウスシアロアドヘシン（Ｓｉｇｌｅｄ−１）細胞内領域（ｍＳＮＤ１−３）ののＳｉｇｌｅｃ−Ｆｃキメラ、結合欠損シアロアドヘシン（ｍＳＮＤｌ−３Ｒ９７Ａ４）、ヒトＣＤ２２（ｈＣＤ２２）、ヒトＣＤ３３（ｈＣＤ３３）、マウスＭＡＧ（ｍＭＡＧ）、ヒト  シグレック（Ｓｉｇｌｅｃｓ）５−１０（ｈＳｉｇｌｅｃ−５−１０）、およびフェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）でコートされた。その後、キメラは（Ｃ）α２，６Ｆｃまたは（Ｄ）ＳＡ  ｔｘ  Ｆｃ免疫複合体を用いて精査され、開発され、そして分析された。
【図５】図５は、ＳＩＧＮ−Ｒ１遮断が、誘導された関節炎のＩＶＩＧ保護を無効にすることを示す実験結果を示す。Ｃ５７ＢＩ／６マウスは、ＩＶＩＧおよびＫ／ＢｘＮで処理され、そのいくつかは、ＳＩＧＮ−Ｒ１（α−ＳＩＧＮＲ１）またはＭａｒｃｏ（α−Ｍａｒｃｏ）への遮断抗体を投与され、ＳＩＧＮ−Ｒ１表面発現（ＫＯ−ＳＩＧＮ−Ｒ１）を下方制御することを誘導され、そして、フットパッド・スウェリングがその後数日間モニターされた。第５日のグループ当たり５マウスの臨床スコアの平均および標準偏差がプロットされる；＊ｐ＜０．００１は、チューキー・ポストｈｏｃ試験により決定される。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、ＣＩｑがＳＩＧＮ−Ｒ１へのα２，６Ｆｃ結合に含まれないこと、またはその抗炎症活性に必要でないことを示す。マウスは、Ｋ／ＢｘＮ血清およびＩＶＩＧにより処理され、そのいくつかは、ＳＩＧＮ−Ｒ１遮断抗体ＥＲＴＲ−９（α−ＳＩＧＮ−Ｒ１）、もしくはＳＩＧＮ−Ｒ１下方制御抗体２２Ｄ１（ＴＫＯ−ＳＩＧＮ−Ｒｌ）、または適当なアイソタイプコントロール（それぞれ、ラットＩｇＭおよびハムスターＩｇＧ）を受けた。フットパッド・スウェリングは、その後７日間モニターされた。第６日のグループ当たり５マウスの臨床スコアを平均および標準偏差の観点からプロットした。Ｂ．野生型およびＣＩｑ−／−Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、Ｋ／ＢｘＮ血清を注射され、そのいくつかは、α２，６Ｆｃを受け、フットパッド・スウェリングは、臨床スコアの観点からその後数日間モニターされた。
【図７】図７は、α２，６ＦｃがＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マウスにおける誘導された関節炎を抑制しないことを示す。Ｃ５７Ｂ１／６およびＳＩＧＮ−Ｒｌ−／−マウスは、Ｋ／ＢｘＮ血清（黒色バー）を注射され、そのいくつかは、α２，６Ｆｃを１時間早く受けた（α２，６Ｆｃ＋Ｋ／ＢｘＮ、灰色バー）。フットパット・スウェリングは臨床スコアの観点から、その後数日間モニターされた。グループにつき３〜４マウスの平均および標準偏差がプロットされる。＊ｐ＜０．０５は続くチューキー・ポストｈｏｃによるＡＮＯＶＡにより決定される。
【図８】図８は、Ｃ５７ＢＬ／６（左カラム）、ＦｃＲγ／ＩＩｂ（真ん中カラム）、ＳＩＧＮ−Ｒ−／−（右カラム）マウスから単離された常在腹腔マクロファージが２，６−シアリル化Ｆｃ（上列）またはシアリル化されていないＦｃ（下列）の増加する濃度にともないパルスされたことを示す。結合されたＦｃの量は、決定され、フリーの、非結合のＦｃに対してプロットされ、そして、２つの別の実験を代表する。
【図９】図９は、ＳＩＧＮ−Ｒ１（左カラム）、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ（真ん中カラム）、またはｈＦｃＲγｌｌｂ（右カラム）を発現するＣＨＯ細胞が２，６−Ｆｃ（上列）によりパルスされ、フィブリノゲン（下列）によりパルスされたことを示す。結合された糖タンパク質の量は、フリーの、非結合タンパク質に対してプロットされる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明の方法は、本明細書中の受容体型（ＩｇＧ抗体または免疫疾患のＩＶＩＧに基づく治療を促進することが知られているフラグメントに結合する）の識別方法に一部基づいている。そのような受容体は、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）−３（ＣＤ５０）（ＤＣ−ＳＩＧＮ（樹枝状細胞上で見られるヒト樹枝状細胞−特異的接着受容体受容体［ＣＤ２０９］、ＳＩＧＮ−Ｒｌ（ＤＣ−ＳＩＧＮのマウス相同体（辺縁帯脾性マクロファージ常で発現されることが知られる））、ならびにいずれかの関連する哺乳類の相同体またはそのアイソフォームを含むが、これに限定されるものではない）を結合することが知られる哺乳類のＣ型レクチン受容体型である。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ受容体（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋらにより識別された（２０００，Ｃｅｌｌ  １００：５７５−５８５；米国特許第６，３９１，５０７号明細書も参照））は、Ｃ型レクチン（カルシウム依存性の）受容体（少なくとも樹枝状細胞、マクロファージおよび活性化されたＢ細胞上で発現される）である。この受容体は四量体として動作し、糖認識領域（ＣＲＤ）、繰り返し領域、膜貫通領域、および細胞内細胞質領域（３つの内在性モチーフ（見直しのために、ＷｕおよびＫｅｗａｌＲａｍａｎｉ，２００６，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（１１）：８５９−８６８を参照）を含む）を含む。ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体は様々なウイルス、細菌、菌および病原体寄生性病原体（ヒト免疫不全ウイルス（“ＨＩＶ”、例えば、米国特許第６，３９１，５６７号明細書、Ｇａｒｃｉａら，２００５，Ｔｒａｆｆｉｃ  ６：４８８−５０１；Ｈｏｄｇｅｓら，２００７，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（６）：５６９−５７７を参照）、Ｃ型肝炎ウイルス（“ＨＣＶ”、例えば、米国特許第７，０２２，３２３号明細書を参照）、ウシ型結核菌（ＥＰ１４０７９６５Ａｌ）、エボラウイルス（Ｍａｒｚｉら，２００６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（１３）：６３０５−６３１７）、麻疹ウイルス（Ｌｏｔ  ｄｅ  Ｗｉｔｔｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（７）：３４７７−３４８６）、およびデング熱ウイルス（ＷＯ２００４／０４１２９９））を結合することが実証されている。この目的を達成するために、このＣ型レクチン受容体が、受容体（例えば、マンノース、フコース、植物レクチン、抗体、糖、タンパク質または受容体に対する抗体（例えば、米国特許第７，１４８，３２９号明細書を参照））を調節しうる化合物の標的となりうることが示唆されている。本発明者らの知識のうちの最高のものによると、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を、ＩＶＩＧに基づく治療法による自己免疫疾患の治療で得られる治療的価値に直接結び付ける発見はこれまでにない。それゆえ、本明細書でさらに記載されるように、本発明は化合物（ＩＶＩＧ投与と共に歴史的に示される同様の抗炎症反応を促進するために、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節する（および好ましくはアゴニストとして働く））をスクリーニングするおよび選択する方法に係る。したがって、この受容体型（ＩｇＧと相互作用し、様々な自己免疫疾患における抗炎症状態を促進する生物化学的反応を活性化する）の識別は、付加化合物（様々な免疫疾患（今までＩＶＩＧに基づく技術によって治療可能であった）の治療に有���でありうる）のスクリーニングおよび選択を可能とする、有用でかつ不可欠な成分を与える。
【００２０】
この目的を達成するために、本発明は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の機能の調節因子を識別する方法に係る。そのような方法は、当業者に利用可能ないかなる試験（候補試験化合物の大規模なライブラリのスクリーニングから、関連する一部化合物または化合物群（例えば、抗体または関連するＦｃフラグメントなど）に焦点を合わせうる試験、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の機能を調節する可能性が高い特異的構造特性（高められたＦｃ抗体フラグメント（例えば、α２，６シアリル化されたＦｃフラグメントなど）の選択を提供しうる）に焦点を合わせ、それゆえ、ＦｃγＲＩＩＢ受容体の増加されたインビボ発現を促進するシグナル伝達経路を媒介する試験）をともなってもよい。化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節する（すなわち、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のアミノ酸配列の少なくとも一部との相互作用を介した受容体の結合および／または調節を経て））を識別するのに利用されうる様々な試験は、無細胞系で操作される（例えば、単利されたＤＣ−ＳＩＧＮ受容体、レクチン領域を含む融合構築［例えば、Ｆｃ−ＬＢＤ融合構築］、またはレクチン領域を含むフラグメントなど）、もしくは一または複数の単離された細胞型（結合または機能試験のいずれかにおいて）によって操作される、もしくは生物（例えば、トランスジェニック動物）における膜分画に関連した試験、またはその組み合わせを含むが、これに限定されない。これらは開発候補化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に対する親和性、および二次性エフェクター細胞中のＦｃγＲＩＩＢ受容体の発現の増加に作用するためにＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を活性化する）を識別しうる。調節因子（例えば、化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を活性化し、二次性エフェクター細胞中のＦｃγＲＩＩＢ受容体の発現を増加する）など）は化合物（標的受容体（試験化合物の存在下または非存在下における受容体の結合および／または機能により決定される）の機能を変える）でありうる。
【００２１】
任意のポリヌクレオチド配列（それぞれのＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の生物学的に関連のあるアミノ酸配列の適切な発現に影響を与えるために、機能性ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（または、それぞれの受容体からの少なくとも生物学的に有効な結合領域）をエンコードする）は組み換え細胞または本明細書で議論する膜に基づく試験中で利用されうる。例として、限定として示すものではないが、ポリヌクレオチド（適当なＤＮＡ発現ベクターの構築に利用されうる）はＤＮＡ分子（哺乳類のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のためのオープン・リーディング・フレームを含む）（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＤＣ−ＳＩＧＮ；登録番号ＮＭ＿０２１１５５、ヌクレオチド１０−１２２４からのオープン・リーディングを含み、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ受容体をエンコードする［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を参照］）およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０：３（ＳＩＧＮＲｌ；登録番号ＳＦ３７３３４０９，ヌクレオチド２８−１００５からのオープン・リーディングを含み、マウスＳＩＧＮＲ−Ｉ受容体をエンコードする［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を参照］）に記載されるポリヌクレオチド配列、ならびに様々な相同体、スプライス変異体および／またはアイソフォーム（例えば、ＵＳ２００５／０２２１２９１Ａｌ（Ａｈｕｈａら）に記載された）などを含む）である。
【００２２】
本明細書全体にわたって記載される試験は、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞（（ｉ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型または生物学的に関連のあるフラグメント（例えば、レクチン領域または可能性のあるＦｃ−ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型融合（少なくとも細胞外領域（レクチン領域を含む）の少なくとも一部を発現する））を含む発現ベクターによってトランスフェクションされたまたはトランスフォームされた宿主細胞；（ｉｉ）宿主細胞株（宿主ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を過剰に発現するように遺伝子組み換えされた）（好ましくは、選ばれた“野生型”宿主細胞（そのような過剰発現の改良は、当該技術分野で現在知られている任意の手法（コード領域を損傷させないまま、相同的組み換えによってプロモーターを導入することを含むが、これに限定されない）によってもたらされうる）において少なくとも５倍の発現増加をもたらすことが好ましい））；および（ｉｉｉ）どんな生物学的理由であれＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を高いレベルで発現する宿主細胞（例えば、樹枝状細胞を含むが、これに限定されない）が、現在ＩＶＩＧ投与による治療が可能な様々な免疫疾患の治療に有用な調節因子をスクリーニングするおよび／または選択するのに利用されうる。それゆえ、そのような（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の細胞またはその他の細胞型（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の生物学的に関連のある量を示す）のいずれも、本明細書で“ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞”と称されうり、そして、本明細書で開示される一または複数の方法に有用でありうる。さらに本明細書に記載の通り、本発明は、細胞または膜に基づく、哺乳類のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の選択的なアゴニストおよび／またはアンタゴニストを識別方法に係る。本発明の具体的な目的は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に基づく、この受容体タンパク質（エフェクター細胞におけるＦｃγＲＩＩＢ受容体のインビボ発現を調節する）の選択的なアゴニストをスクリーニングするための試験を提供する。さらに、それらの試験は、細胞に基づく試験であってもよく；それによりＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型をエンコードするＤＮＡ分子は、宿主細胞内へトランスフェクションされるまたはトランスフォームされ、そして、この組み換え宿主細胞は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体を発現するのに十分な一定の時間培養されてもよい。あるいは、“非組み換え型の”細胞株（ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞である）のいずれも、また様々な免疫疾患の治療に有用なＤＣ−ＳＩＧＮの調節因子をスクリーニングするおよび／または選択するのに利用されうる。加えて、そのようなＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞からの実質的に精製された膜画分は、二次性エフェクター細胞におけるＦｃγＲＩＩＢ受容体の情報制御を経るインビボでの抗炎症作用の促進に関与する哺乳類のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節するためにスクリーニングするおよび／または選択するっための試験に使用されうる。
【００２３】
そのような上述のポリヌクレオチドの全て、または本来の目的と同じで当業者が利用可能な生物学的に等価なポリヌクレオチドは、適当な発現ベクターの中に導入され、他のＤＮＡ分子（すなわち、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型が天然には結合せず、この受容体を発現する“遺伝子組み換えＤＮＡ分子”を形成する、ＤＮＡ分子）と連結されうる。それらのベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡからなってもよく；たいていのクローニング目的ＤＮＡベクターが好ましい。典型的なベクターは、プラスミド、改変ウイルス、バクテリオファージおよびコスミド、酵母人工染色体および他のエピソーム性のまたは統合されたＤＮＡ（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型をエンコード可能な）を含む。当業者は本発明の範囲内で特定の使用のために適当なベクターを選択することが可能である。
【００２４】
様々な哺乳類の発現ベクターは、哺乳類の細胞において組み換えＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を発現するのに使用されうる。上述の通り、発現ベクターは本明細書において、ＤＮＡ配列（クローン化したＤＮＡの転写産物および適当な宿主中のそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要な）として規定される。そのようなベクターは、様々な宿主（例えば、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞）において真核生物のＤＮＡを発現するのに使用されてもよい。特別に設計されたベクターは宿主間（例えば、細菌−酵母または細菌−動物細胞）のＤＮＡの輸送を可能にする。適当に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自己複製のための複製起点、選択可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数のための潜在能力、および活性プロモーターを含まなくてはならない。プロモーターはＤＮＡ配列（ＲＮＡポリメラーゼにＤＮＡと結合するように命令し、ＲＮＡ合成を開始する）として定義される。強力なプロモーターは高頻度で開始されるｍＲＮＡをもたらすものである。発現ベクターはクローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスを含みうるが、これに限定されない。市販の哺乳類の発現ベクター（組み換えＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型発現に適しうる）は、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣｌｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３  ４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）、およびＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）を含むが、これに限定されない。
【００２５】
また、様々な細菌発現ベクターは、細菌細胞における組み換えＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の発現に使用されうる。市販の細菌発現ベクター（組み換えＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型発現に適しうる）は、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴｌｌａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｌａｍｂｄａ  ｇｔｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むが、これに限定されない。加えて、様々な菌細胞発現ベクターは菌細胞における組み換えＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の発現に使用されうる。市販の菌細胞発現ベクター（組み換えＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型発現に適しうる）は、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むが、これに限定されない。また、様々な昆虫細胞発現ベクターは、昆虫細胞における組み換え受容体の発現に使用されうる。市販の昆虫細胞発現ベクター（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の組み換え発現に適しうる）は、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩおよびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含むが、これに限定されない。
【００２６】
ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型ｃＤＮＡ配列（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の最適レベルをもたらす）を決定するために、ｃＤＮＡ分子（以下を含むがこれに限定されるものではない：ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の完全長オープン・リーディング・フレームならびに様々な構築（タンパク質の特異的領域またはタンパク質の再編領域のみをエンコードするｃＤＮＡの一部を含む）（少なくともＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（例えば、Ｆｃ−ＬＢＤ融合構築）のレクチン領域をエンコードするｃＤＮＡの一部を含むがこれに限定されない）。全ての構築は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の５’および／または３’非翻訳領域を含まないか、全て含むか、一部含むように設計されうる。ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の発現レベルおよび活性は、以下の、適当な宿主細胞へのこれらの構築の導入を決定しうる。トランジェントアッセイにおいて最適な発現を生じさせるＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型カセットの決定に続いて、このＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型ｃＤＮＡ構築は様々な発現ベクター（組み換えウイルスを含む）（哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌、および酵母細胞の発現ベクターを含むが、これに限定されない）に移される。
【００２７】
ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型をエンコードするＤＮＡ配列を含むおよび／または発現するように設計された宿主細胞は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型または生物学的に等価な形態を生産するのに適した条件下で培養されうる。これらの組み換え宿主ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞は、原核生物のまたは真核生物（Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、酵母などの菌細胞、哺乳類細胞（ヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯動物類を含むがこれに限定されない）、ならびに昆虫細胞（細胞株由来のショウジョウバエおよびカイコを含むがこれに限定されない）でありうる。例えば、ある昆虫発現系は、バキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と並行して、ヨウトガ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用する。また、哺乳類細胞株（適しうる、および、市販されている）は、Ｌ  ｃｅｌｌｓ  Ｌ−Ｍ（商品名）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １．３）、Ｌ  ｃｅｌｌｓ  Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １．２）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８５）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８６）、ＣＶ−Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋｌ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、ＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２０９）、およびＨＯＳ細胞（ヒト骨肉腫；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４３）を含むが、これに限定されない。発現ベクターは、多数の技術（トランスフォーメーション、トランスフェクション、プロトプラスト融合、およびエレクトロポレーションを含むがこれに限定されない）のうちのいずれか一つによって、宿主細胞へと導入されうる。トランスフォーメーションはＤＮＡの取り込みによりもたらされる標的細胞の遺伝子変化を含む概念である。トランスフェクションは、当該技術分野で知られるテスト細胞へのＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の導入方法のいずれをも含む概念である。例えば、トランスフェクションは、トランスフェクション、リポフェクション、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を含むレトロウイルス構築物の感染、およびエレクトロポレーションを調節するリン酸カルシウムまたは塩化カルシウムを含む。細胞を含む発現ベクターは、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質を生産するか否かを決定するために個別に分析される。細胞を発現するＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の識別は、いくつかの手段（抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型抗体免疫学的反応性、ラベル化されたレクチン結合および宿主細胞関連ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型活性の存在を含むがこれに限定されない）によって行われうる。本発明のこれらの方法の実施において特に使用されうる宿主細胞は、特に制限されないが、さらにＭＡＲＣＯ（＋）辺縁帯マクロファージを含む。
【００２８】
それゆえ、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に対する親和性を示す化合物の結合の選択性は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型、そのような細胞からの膜標本、または受容体（またはレクチン領域を含む少なくとも一部；例えば、Ｆｃ−ＬＢＤ融合構築など）（スクリーニングの目的で固定化されうる）を発現する細胞への化合物の親和性を測定することによって示される。クローン化された受容体の発現および化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型と結合するまたはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の公知のリガンド（例えば、α２，６−結合シアル酸を含むＦｃフラグメントなど）のこれらの細胞への結合を阻害する）のスクリーニング、またはそれらの細胞から調製された膜は、様々な免疫疾患の治療に使用されうるＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に対する高い親和性を有する化合物の迅速な選択のために有効な方法を提供する。そのようなリガンドは必ずしもラベル化されることを要しないが、非同位体の化合物（機能試験において活性剤として使用されうる）がであってもよい。本明細書に記載される方法により識別される化合物は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のアゴニストまたはアンタゴニストである可能性が高いが、また、本明細書で言及するように、抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃフラグメントおよび／またはα２，６結合シアル酸を含むＦｃフラグメントなど）、他の型のペプチド、タンパク質、ならびに非タンパク性有機分子であってもよく、それら全ては様々な免疫疾患の治療に使用されうり、そして少なくともＩＶＩＧ技術により治療可能であるそのような免疫疾患の一つである。
【００２９】
本明細書は化合物（（ｉ）測定可能な細胞成分（二次マクロファージにおけるＦｃγＲＩＩＢ受容体の発現の増加に影響を与えうる）の発現の増加を促進を増加するために、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の活性を調節する（すなわち、刺激する）；（ｉｉ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質をエンコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する；（ｉｉｉ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型への２，６Ｆｃ結合により開始される下流シグナル伝達経路に関連したレポーター遺伝子を刺激する）のスクリーニング方法に係る。それゆえ、化合物はＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型をエンコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を増加させることまたは弱めることによって調節されうる（二次性エフェクターマクロファージにおけるＦｃγＲＩＩＢ受容体の増加されたインビボ発現を促進しうる、および／またはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型受容体タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能することにより）。これらの化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型またはその受容体の生物学的機能をエンコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する）は、様々な試験により検出されうる。試験は、発現または機能における変化の有無を決定するための単純な“あり／なし（ＹＥＳ／ＮＯ）”試験でありうる。試験は、テストサンプルの発現または機能を標準サンプルにおける発現または機能のレベルと比較することにより定量的に行われうる。ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に対する抗体、または修飾されたＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を含むキットはそのような使用のための公知の方法により調製されうる。他の受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを識別する方法は、当該技術分野で周知であり、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のアゴニストおよびアンタゴニストを識別するのに採用されうる。例えば、Ｃａｓｃｉｅｒｉら（１９９２，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：１０９６−１０９９）は、試験化合物（ラットニューロキニン受容体に結合するアゴニストを阻害し、それゆえ潜在的なニューロキニン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである）の識別方法を記載する。当該方法は、ＣＯＳ細胞をラットニューロキニン受容体を含む発現ベクターによってトランスフェクションすること、トランスフェクションされた細胞を、ニューロキニン受容体を発現させるのに十分な時間、成長させること、トランスフェクションされた細胞を採取することおよび細胞を公知の放射性物質でラベルしたニューロキニン受容体のアゴニストを含む試験緩衝液中で試験化合物の存在下または非存在下のいずれかで再懸濁すること、ならびにその後、放射活性物質でラベルした公知のニューロキニン受容体のアゴニストの、ニューロキニン受容体への結合を測定すること、を含む。公知のアゴニストの結合量が、試験化合物の存在下、試験化合物の非存在下よりも少ないと、その時は、試験化合物はニューロキニン受容体の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストである。試験化合物（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のアゴニストまたはアンタゴニストなど）の結合が測定される場合には、そのような結合はラベル化された試験化合物またはアゴニストを採用することにより測定されうる。試験化合物またはアゴニストは、当該技��分野で公知の都合の良い方法のいずれによってもラベル化されうる（例えば、傾向的に、酵素的に、放射活性的に）。調節因子（標的受容体（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型など）に拮抗する）をスクリーニングする場合、細胞に基づいた試験は、試験化合物の機能的能力を測定するために試験化合物を刺激するまたは拮抗する受容体活性と組み合わせた公知のリガンド（例えば、α２，６結合シアル酸を含むＦｃフラグメントなど）の封入に依存しうる。したがって、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に対する親和性を有する化合物の結合の選択性は、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞上のこの受容体への化合物の親和性を測定することにより示される。化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型と結合する、または公知のラベル化された、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のリガンドの、それらの細胞に対する結合を阻害する）をスクリーニングするためのＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞の使用は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に対する高い親和性を有する化合物の迅速な選択のために有用な方法を提供する。しかしながら、そのようなリガンドは必ずしもラベル化されることを要しないが、結合ラベル化合物を置換するのに使用されうる、または、機能試験における促進剤として使用されうる化合物でもありうる。上記方法により識別された化合物は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のアゴニストまたはアンタゴニストである可能性が高く、さらに、抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃフラグメント、ペプチド、タンパク質、または非タンパク性有機分子）（様々な免疫に関連した疾患（自己免疫疾患（例えば、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、自己免疫性溶血性貧血（ＡＨＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、川崎病（急性血管炎症候群）、強皮症、関節炎関節リウマチ（ＲＡ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＰＤ）、ｐｈｅｍｉｇｕｓおよび自己抗体媒介炎症に関連するその他の疾患）を含むがこれに制限されない）の治療のためにヒト投与に有用でありうる）でありうる。
【００３０】
ある程度、本明細書に記載される方法は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（および、完全長ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を含むまで）のレクチン領域を少なくとも含むアミノ酸配列を準備すること；受容体を接触すること／受容体の領域を試験化合物と結合させること；および受容体／結合領域への試験化合物の結合の程度を測定することを必要とする。受容体／結合領域への測定可能な親和性を有することを示す試験化合物は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の調節因子（すなわちアゴニストまたはアンタゴニスト）として、さらなる追加試験の候補であり、そして、それゆえ、これまでに静脈ＩＶＩＧによる治療が可能であることを示す様々な自己免疫疾患を少なくとも治療する可能性がある化合物である。
【００３１】
本発明の他の形態は、試験化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節する）を識別する方法（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型から選択される、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（レクチン領域を含むがこれに限定されない）の生物学的に関連のある結合領域を含む第一のアミノ酸配列を準備すること；受容体／結合領域をコントロール抗体（例えば、α２，６結合シアル酸を含むＦｃフラグメントなど）またはその変異体と接触すること；基準結合値を決定するために受容体／結合領域へのコントロール抗体の結合の程度を測定すること含む）を含む。この基準結合値は、試験化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型またはそのフラグメントから選択される第二のアミノ酸配列を提供すること；この第二のアミノ酸配列からの受容体／結合領域を試験化合物と接触すること；および受容体／試験化合物への試験化合物の結合の程度を測定することを含む）の結合と比較するために使用されうる。それゆえ、基準結合値は、続いて、試験化合物の結合の程度と比較されうる。
【００３２】
本発明の他の形態は、試験化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型受容体活性を調節する）の識別方法に係り、（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列を含むＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型タンパク質を含むが、これに限定されない）存在下または非存在下で試験化合物を結合すること；および、（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型受容体タンパク質の存在下または非存在下で試験化合物の効果を測定することおよび比較すること；を含む。
【００３３】
いくつかの付加的な形態は、特に制限はないが、さまざまなスクリーニングまたは選択試験（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型受容体タンパク質の発現を命令する発現ベクターと並行して当業者に利用されうる）を示すために、本明細書で開示される。さらに、他の受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの識別方法は、当該技術分野で周知であり、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のアゴニストおよびアンタゴニストを識別するために採用されうる。したがって、それらの形態は例として存在するのであって、制限として存在するのではない。この目的を達成するために、本発明は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型調節因子（例えば、アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニスト）が識別されることによる試験を含む。よって、本発明の一形態は、試験化合物がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の潜在的なアゴニストであるか否かを決定する方法を含み、それゆえ、宿主抗炎症反応を促進する役割による免疫疾患の治療に有用であり、（細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞をもたらす）においてＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の発現を命令する発現ベクターによってトランスフェクションすることまたはトランスフォームすること；（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞をＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を発現させるのに十分な時間生育させること；（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）をラベル化されたリガンド（インビボにおいて抗炎症反応を促進することが知られているコントロール抗体を含むがこれに限定されない）に曝すこと；および（ｄ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型へのラベル化されたリガンドの結合を測定すること；を含み、試験化合物の存在下におけるラベル化されたリガンドの結合量が、試験化合物の非存在下よりも少ない場合には、試験化合物はＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の潜在的なアゴニストである。
【００３４】
ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞（組み換えＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞のみならず）のいずれのタイプも、試験化合物を可能な開発候補（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を活性化する能力を有する）のためにスクリーニング時のような結合試験の工程（ａ）および（ｂ）において利用されうる。本明細書で言及するように、好ましい“非組み換え型の”ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞は樹枝状細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ発現を刺激する条件下で培養された）でありうる（例えば、Ｈｏｄｇｅｓら，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８（６）：５６９−５７０を参照）。また、工程（ｃ）の方法が実施される条件は、当該技術分野でタンパク質−リガンド相互作用を研究するために典型的に使用される条件（例えば、生理的ｐＨ、塩条件（例えば、ＰＢＳのような一般的に用いられる緩衝液または組織培地中で見受けられるような）；約４℃から約５５℃の温度、ならびに適度なカルシウム濃度（Ｃ型レクチン受容体（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型など）の活性に作用することが知られる））である。テスト細胞は、採取され、試験化合物およびラベル化されたリガンドの存在下、再懸濁されうる。上記方法の改変において、工程（ｃ）は、細胞が採取および再懸濁される代わりに、細胞が底質（すなわち、組織培養皿）に取り付けられている間、ラベル化された公知のアゴニスト（例えば、α２，６結合シアル酸を含むＦｃフラグメントなど）および試験化合物が細胞と接触される、改変がなされる。
【００３５】
本発明は、また、試験化合物が、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型、または関連する細胞外領域、またはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の関連する突然変異体（もはや機能性を有しないが、それでもなおレクチン結合を含む）と結合可能か否か（すなわち、試験化合物がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の潜在的なアゴニスト、インバースアゴニスト、またはアンタゴニストであるか否か）、判定方法を含み、この場合、当該方法は、（ａ）細胞中でＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の発現を命令する発現ベクターによって細胞をトランスフェクションまたはトランスフォームし、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞をもたらすこと；（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞を試験化合物に曝すこと；（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型への試験化合物の結合量を測定すること；（ｄ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞におけるＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型への試験化合物の結合量をコントロール細胞（すなわち、ＤＣ−ＳＩＧＮ（−）細胞）（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型によりトランスフェクションされた）または（実質的に、例えば、樹枝状細胞よりも少ないＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）受容体を有することが知られている）への試験化合物の結合量と比較すること；ここで、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞（すなわち、テスト細胞）における試験化合物の結合量がコントロール細胞と比較して多い場合は、試験化合物はＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型と結合可能である。試験化合物が実際にアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かの決定は、続いて機能試験を用いることによってなされうる。
【００３６】
さらに、可能な開発候補（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を活性化する能力を有する）のための試験化合物をスクリーニングする場合に、いずれのＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞もそのような結合試験に利用されうる。それゆえ、本明細書で記載される方法において、工程（ａ）“組み換え”ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞は、“非組み換え”ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞（樹枝状細胞を含むが、これに限定されない）と置き換えられうる。工程（Ｂ）の方法が行われる条件は、当該技術分野でタンパク質−リガンド相互作用を研究するために典型的に使用される条件である：例えば、生理的ｐＨ；塩条件（例えば、ＰＢＳのような一般的に用いられる緩衝液または組織培地中で見受けられるような）；約４℃から約５５℃の温度、ならびに適度なカルシウム濃度（Ｃ型レクチン受容体（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型など）の活性に作用することが知られる））である。テスト細胞は、通常、採取され、その後、試験化合物の存在下で再懸濁される。
【００３７】
本明細書で記載される、およびさらに当業者に知られたそのような細胞に基づく手法は、また、機能試験（細胞の応答を測定する）として構成されるのに適している。方法の使用者が細胞の応答を測定することを選択する場合、完全長ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（またはそれらの分子の機能性フラグメント）を発現する細胞の場合、有益である。一般に、機能性フラグメントはレクチン領域だけでなく、膜貫通領域も含み、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の変換領域に信号を送る。この目的を達成するために、本発明の他の態様はＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型と結合するおよび調節することができる試験化合物をスクリーニングするおよび選択する方法に係る。特に興味深いのは、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（すなわち、受容体のアゴニストとしての役割を果たす）を活性化するために試験化合物の能力を測定するのに有効な試験である。そのような機能試験は、開発のための標的とされる試験化合物（候補である（または化合物の候補類を示しうる））を識別するために、単独で、または他の手法（例えば、結合試験、トランスジェニック動物モデル研究、など）と組み合わせて利用可能だろう。したがって、機能試験が意図しうること（ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）の受容体調節の定量的なおよび／または定性的な決定のために提供される）が当業者にとって明らかであろう。例えば、Ｃａｐａｒｒｏｓら（２００６，Ｂｌｏｏｄ  １０７（１０）：３９５０−３９５８）は、ヒトＤＣ−ＳＩＮＧ（＋）受容体の抗体媒介刺激が、樹枝状細胞、およびヒトＤＣ−ＳＩＧＮ発現ベクターによりトランスフェクションされた細胞を活性化させたいずれにおいても、ＭＡＰキナーゼＥｒｋ１およびＥｒｋ２、ホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３Ｋ）（インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を含む）、ならびに一時的な細胞内カルシウムの増加を活性化させることを開示する。また、Ｈｏｄｇｅｓら（２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８（６）：５６９−５７０）は、ＤＣ−ＳＩＧＮレセプターの活性化が下方制御（ＭＨＣ  ＩＩ，Ｊａｇｇｅｄ  １およびインターフェロン応答性転写産物）および特異的樹枝状細胞の上方制御（転写産物因子、ＡＴＦ３）をもたらすことを開示する。この目的を達成するために、本発明は、さらに試験化合物（公知のＩＶＩＧに基づく治療に適しうる様々な免疫疾患に関連する抗炎症活性を活性化するまたは抑制するためにＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節する）の識別方法に係り、そのような方法は、（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞（例えば樹枝状細胞またはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型をエンコードする発現ベクターによってトランスフェクションされたまたはトランスダクションされた細胞など）を準備すること；（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞を試験化合物に曝すこと；および（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞内の細胞成分の増加または減少を測定すること、ここで、細胞成分（例えば、Ｅｒｋ１および／またはＥｒｋ２、ＰＩ３Ｋ、ＩＬ−１０、細胞内カルシウム、ＡＴＦ３またはＭＨＣ  ＩＩに関連するｍＲＮＡ転写産物の減少、Ｊａｄｄｅｄ  １および／またはインターフェロン応答性転写産物）の、テスト化合物（または、試験化合物に接触されたＤＣ−ＳＩＧＮ（−）細���も）により接触されない細胞中のそれぞれの細胞成分のレベルと比較した増加のレベルは、試験化合物がそれぞれのＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のアゴニストであることを示す。ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞はＤＣ−ＳＩＧＮレセプター型の発現を可能とさせる適当なバーファー系において十分な時間培養されうる、および任意に採取され、適当なバッファー中で再懸濁されうる（本明細書で記載されるように、および／または当該技術分野で公知のように、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞を試験化合物に曝す前に）。
【００３８】
機能試験のこれらのタイプは、また、組み換えＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞内のレポーター遺伝子またはエピトープラベルの導入および発現の測定に基づきうる。当該技術分野は、現在、当業者が利用可能な、様々なレポーター遺伝子およびエピトープラベルポリペプチド（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節する試験化合物の能力を測定するのに適するであろう）が豊富にある。当業者は、過度な実験をすることなく、これらの様々な研究ツールを組み合わせることおよび適合させること可能だろう。例えば、様々なレポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質（“ＧＦＰ”）またはそれに由来する機能性タンパク質／ポリペプチドを含むが、これに限定されない）。ＧＦＰ遺伝子および様々な突然変異体（異なる波長およびスペクトル特性で発光しうる）は、ヒドロ虫門、刺胞動物門、花虫綱、有櫛動物門の様々な生物中で識別されている。厳選したＧＦＰ変異体は、青色蛍光タンパク質（“ＢＰＦ”）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、およびシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を含む。追加の適した蛍光タンパク質については、Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：９６９−９７３を参照。他の適したレポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（“ＣＡＴ”）および他の酵素検出システム（例えば、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）；蛍光ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、または分泌型アルカリ性リン酸塩（“ＳＥＡＰ”））を含む。他の適したレポータ遺伝子の例は、薬を付与する／宿主哺乳類細胞への抗生物質耐性なタンパク質をエンコードするものを含む。レポーター遺伝子からの転写産物の量は、当該技術分野で公知の適したいずれかの方法を使用して測定されうる（ノーザンブロットによるＲＮＡ発現検出、そのタンパク質（例えば、特徴のある染色または内活性（例えば、酵素活性、または上記のように蛍光、色、または発光に基づく検出信号を生じさせることなど）など）により知られるいずれかの検出方法によるタンパク質発現を含む）。活性化されたレポーター遺伝子は発現タンパク質（細胞のための成長利点を与える）（例えば、細胞の生存を高めること、細胞栄養所要量を軽減すること、および／または薬剤耐性を提供すること）を与えるだろう。他のレポーター遺伝子は、細胞表面タンパク質（抗体またはリガンドが利用可能な）をエンコードしうる。レポーター遺伝子の発現は、表面タンパク質の存在により、細胞を検出することまたはアフィニティー精製することを可能とする。あるいは、融合されたポリペプチドは、エピトープラベル（例えば、Ｍｙｃ  ｔａｇ、Ｆｌａｇ  ｔａｇ、Ｈｉｓ  ｔａｇ、ロイシンｔａｇ、ＩｇＧ  ｔａｇ、ビオチン化配列サイト（“ＢＳＳ”すなわち、ストレプトアビジンｔａｇ）など）である。
【００３９】
それゆえ、上記の、そのような遺伝子レポーター試験は当該技術分野で周知であり、コントロール抗体（例えば、α２，６Ｆｃ）がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節するのと同様の方法で、試験化合物によりＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の定量的なおよび／または定性的なシグナリング効果を測定するために当業者によって採用されうる。例えば、Ｃｈｅｎら（１９９５，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２６：３４９−３５４）は、Ｇ−タンパク質共役受容体をエンコードする発現ベクター、プロモーターを含む第二の発現ベクター、ＬａｃＺ遺伝子と融合するｃＡＭＰ応答配列によりトランスフェクションされた発現ベクターを利用する比色試験を記載する。過剰に発現されたＧ−タンパク質共役受容体の活性はβ−Ｇａｌの発現およびＯＤ測定として測定される。
【００４０】
したがって、本発明のこのタンパク質の他の態様は、試験化合物がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節するか否かを決定する非放射性の方法を含む。ＤＣ−ＳＩＧＮ調節からのいかなる下流シグナルも実質的には、以下を含むＭＣ−３Ｒの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストでありうる：（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型をエンコードする発現ベクターによって細胞をトランスフェクションすることまたはトランスフォームすること、組み換えＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞をもたらすこと；（ｂ）レポーター遺伝子と融合するプロモーターを含む発現ベクターによって工程（ａ）のテスト細胞をトランスフェクションすることまたはトランスフォームすること；（ｃ）トランスフェクションされた細胞を採取することおよび試験化合物の存在下または非存在下の双方においてＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（例えば、コントロール抗体）の公知のアゴニストの存在下、細胞を再懸濁すること；および、（ｄ）公知のアゴニスト、およびプロモーター配列から離れたレポーター遺伝子の発現を測定する試験によってＭＣ−３Ｒを過剰に発現する試験化合物の結合を測定すること、および公知のアゴニストの存在下で、ならびに、試験化合物がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストのいずれとしての役割を果たすかを決定するための試験化合物の存在下および非存在下で、発現レベルを比較することを含む。
【００４１】
工程（ａ）は、また、非組み換え型のＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞を利用しうる。測定可能なレポーター遺伝子の発現の増加は、シグナル伝達分子がＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞を保つことが知られているという効果に相互に関係があるだろうことから、また、一度標準コントロールがセットされたら、例えば、コントロール抗体または他のコントロール化合物の使用なしにそのようなことを行うことが可能である；ヒトＤＣ−ＳＩＧＮの調節により見られるように、上述されるように、細胞成分（例えば、Ｅｒｋ１および／またはＥｒｋ２、ＰＩ３Ｋ、ＩＬ−１０、細胞内カルシウム、ＡＴＦ３またはＭＨＣ  ＩＩに関連するｍＲＮＡ転写産物の減少、Ｊａｄｄｅｄ  １および／またはインターフェロン応答性転写産物））のレベルの増加を含むがこれに限定されない。
【００４２】
上述の方法は、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞（すなわち、テスト細胞）を試験化合物に曝すことよりもむしろ、膜がテスト細胞によって調製されることおよびそれらの膜が試験化合物に曝されうることにおいて改変されうる。細胞よりもむしろそのような膜を利用する改変は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｈｅｓｓら、１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８４：２６０−２６８において記載される。したがって、本発明の他の形態は、試験化合物が結合するか否かおよび／またはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する方法を含み、ここで、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞からの膜標本はＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞全体の変わりに利用される。そのような方法は、以下を含み、上述のような生理的条件が利用されうる：（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞（例えば、樹枝状細胞またはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型をエンコードする発現ベクターによってトランスフェクションされたまたはトランスダクションされた）を準備すること；（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞からＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を含む膜を調製することおよび膜中のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型へリガンドが結合する条件下で膜をＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のリガンドに曝すこと；（ｃ）工程（ｂ）の後、または工程（ｂ）と同時に、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞からの膜を試験化合物に曝すこと；（ｄ）試験化合物の存在下または非存在下で膜中のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型へのリガンドの結合量を測定すること；および、（ｅ）試験化合物の存在下または非存在下で、膜中のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型へのリガンドの結合量を比較すること、ここで試験化合物の存在下での膜中のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型へのリガンドの結合量の減少は、試験化合物がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に結合可能であることを表す。
【００４３】
本発明は、また、試験化合物がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型に結合可能か否かを決定する方法に係り：（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞（例えば、樹枝状細胞またはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型をエンコードする発現ベクターをトランスフェクションされたまたはトランスダクションされた細胞）を準備すること；（ｂ）テスト細胞からのＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を含む膜を調製することおよびテスト細胞からの膜を試験化合物に曝すこと；（ｃ）テスト細胞からの膜中のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型への試験化合物の結合量を測定すること；および（ｄ）試験化合物の、テスト細胞からの膜中のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型への結合量を、試験化合物のコントロール細胞（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ（−）細胞）からの膜への結合量を用いて比較すること、ここで、試験化合物の、テスト細胞からの膜中のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型への結合量が、試験化合物の、コントロール細胞からの幕への結合量よりも大きい場合は、試験化合物がＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型へ結合可能である；を含む。
【００４４】
他の試験化合物（開発候補でありうる）の選択方法は、二つの細胞型（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞およびエフェクターマクロファージ（またはＦｃγＲＩＩＢを有効に発現するいずれかのまたはいずれか他の））を利用するインビトロでの機能試験であろう、ここでそれはこの第二の細胞型におけるＦｃγＲＩＩＢ発現の増加を測定しうる。それゆえ、インビトロ試験におけるそのような機能性は（ａ）ＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞である第一の細胞を準備すること；（ｂ）血液由来のまたはこの系統（ＴＨＰ−Ｉ、Ｕ９３７またはＨＬ−６０細胞を含むがこれに限定されない）の不死化細胞株由来の単球／マクロファージを含む第二の細胞型を準備すること；（ｃ）試験化合物の存在下または非存在下の双方において、第一および第二の細胞型を共培養することまたは再懸濁、およびこれらの細胞型を共にインキュベートすること；および（ｄ）ＦｃγＲＩＩＢ受容体の発現に作用する試験化合物の能力を測定すること、ここで、ＦｃγＲＩＩＢの発現の増加は、自己抗体媒介炎症に関連する抗炎症反応を促進する潜在的なアゴニストを示す；を含む。
【００４５】
この二細胞機能試験のテーマの多くのバリエーションは当業者に利用されるだろう（試験化合物と併せて、コントロール化合物の使用を含むがこれに限定されない（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型［例えば、α２，６−結合シアル酸を含むＦｃフラグメントなど］のアゴニストであるコントロール化合物））。このタイプの試験は、公知の方法によりＦｃγＲＩＩＢ発現をモニターされうる、細胞表面染色を含む（抗体を使用する（例えば、２Ｂ６など、高親和性モノクローナル抗体（ＦｃγＩＩＲＢ受容体と交差反応しない［Ｒａｎｋｉｎら，２００６，Ｂｌｏｏｄ  １０８（７）：２３８４−２３９１を参照］）））またはＦｃＲＩＩＢに基づくレポーター試験により（本明細書に記載される成分および方法を利用する）。また、これらの細胞型の培養は、追加の補助細胞（例えば、生物学的反応を促進するための細胞由来の骨髄または脾臓細胞など）が追加されうる。
【００４６】
スクリーニングされた化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のインビボ分析（好ましくは、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型受容体上の化合物のインビボ効果を測定するためおよび非ヒト動物への化合物投与の生物学的および生理学的効果をさらに測定するためのトランスジェニック動物または野生型動物のいずれかに、関心のある化合物を投与することによる。これらのインビボにおける研究は、単独でまたは公知のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型リガンド（例えば、α２，６シアル酸結合ＩｇＧ  Ｆｃフラグメント）と組み合わせて行われうる。一または複数の候補試験化合物は、動物に投与されうる（および候補試験化合物の一または複数の特徴を変える能力は、候補試験化合物により処理されない同様の動物と比較して、調節因子（例えばＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のアゴニストなど）を識別する）。それゆえ、そのようなことは、開発検討のための化合物の識別における次工程として有利である。例えば、様々なＫＯモデルおよび野生型マウスは、いくつかの免疫疾患へのそれらの効果のための候補化合物のインビボ試験のために使用されうる（本明細書の実施例セクション内で開示するトランスジェニックおよびノックアウトモデルを含むがこれに限定されない）。試験化合物は、動物（例えば、マウス）へ投与され、そして、その応答（例えば、Ｋ／ＢｘＮ血清の注入に関連するフットパッド炎症など）を低減する能力に基いて評価される。公知のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型リガンド（例えば、α２，６シアル酸結合ＩｇＧ  Ｆｃフラグメント）は、また、モニターすることまたは試験化合物のインビボ効果を比較することにおいて使用されうる。試験化合物は、様々な方法により投与されうる（静脈注射を含むが制限はない）。それゆえ、インビボ試験は、様々な動物モデルの使用を含む（特異的欠損を有するように設計されたトランスジェニック動物、または生物内の異なる細胞に達するおよび影響する候補試験化合物の能力を測定するのに使用されうるキャリーマーカーを含む）。サイズ、操作のしやすさ、およびそれらの生理学的ならびに遺伝子的構造上の上方により、マウスが好ましい形態であり、特にトランスジェニックが好ましい形態である。しかしながら、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、アレチネズミ、ウッドチャック、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、およびサル（チンパンジー、テナガザルおよびヒヒを含む）を含む他の動物も同様に適している。調節因子のための試験は、それらの種のいずれかに由来する動物モデルを使用して行われうる。
【００４７】
コントロール抗体（例えば、ラベル化されたα２，６シアル酸結合ＩｇＧ  Ｆｃフラグメント）およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域間の複合体、もしくは試験化合物およびＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域間の複合体の、量または存在を検出する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、複合体の存在または量は、例えば、競合またはサンドイッチＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ドットプロットアッセイ、蛍光偏光アッセイ、シンチレーション近接アッセイ、ホモジアス時間分解蛍光アッセイ、共振ミラーバイオセンサー分析および表面プラズモン共鳴分析などの方法により決定されうる。
【００４８】
それゆえ、一形態によると、コントロール抗体、試験化合物および／またはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域は、検出可能なラベルにより直接ラベル化され、直接検出されうる。他の形態によると、それらの分子のいずれもラベル化されない。その代わり、二次抗体または他の分子（試験化合物またはコントロール抗体または受容体／結合領域を結合可能な）がラベル化される。複合体の量は、ラベル化された二次抗体の存在を検出することにより検出されうる。他の分子（抗体と結合可能な）は、制限なく、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｇを含む（いずれも市販されている、（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．）から））。
【００４９】
適したラベルは、当該技術分野で広く知られ、そして、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、磁性物質および放射活性物質を含む。適した候補の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む；適した補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンを含む；適した蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン、イソシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン、フルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリトリンを含む；発光物質の例は、ルミノール、ルシフェリン、ピロガロール、またはイソルミノールを含む；磁性物質の例はガドリニウムを含む；および適した放射活性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈを含む。
【００５０】
上述の通り、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域への試験化合物および／またはコントロール抗体の結合は競合ＥＬＩＳＡにより測定されうる。この方法において、試験化合物（ラベル化された）との反応のために、コントロール基質（例えば、ラベル化されたα２，６シアル酸結合ＩｇＧ  Ｆｃフラグメント）として、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域への公知の親和性を備えるコントロール抗体を使用すること、および競合相手として試験化合物を使用することは有利である。コントロール抗体および／または試験化合物は、直接ラベル化されうる。他の形態によると、コントロール抗体および試験化合物はラベル化されずに、ラベル化された二次抗体が第二の工程における反応に添加されうる。
【００５１】
サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型および／またはレクチン領域は、固体担体上に固定化され、試験化合物および／またはコントロール抗体を含む液体に接触されうる。続いて、結合された試験化合物の量は、二次抗体（検出可能なラベル（例えば、放射活性原子、蛍光もしくは発光基、または特に酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））など）によりラベル化された）を添加することにより決定される。試験化合物がヒトＩｇＧである場合は、二次抗体は、抗−ヒト−ＩｇＧ抗体でありうる。結合された二次抗体の量は、次に、活性（例えば、ラベルの酵素活性）を測定することにより決定される。
【００５２】
この活性は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域への試験化合物の結合の尺度である。あるいは、試験化合物は、固定化されうり、受容体／結合領域および／またはコントロール抗体を含む混合物が混合される。本形態によると、二次抗体は、受容体／結合領域に対して使用されるだろう。二次抗体がその標的（試験化合物およびレクチン領域の結合に影響を与えない）のエピトープを結合することは重要である。ラジオイムノアッセイは、また、試験化合物および／またはコントロール抗体へのＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域の結合の程度を決定において使用されうる。本方法の第一の工程において、放射活性的にラベル化された試験化合物は、レクチン領域と混合される。試験化合物は、例えば、水素、硫黄、炭素などの放射活性同位体によりラベル化されうる。第二の工程において、ラベル化されていない試験化合物が混合物中に既知量添加され、そして、試験化合物−受容体／レクチン領域複合体が、例えば，沈殿によって、混合物から除かれる。ラベル化された非結合試験化合物の量が続いて決定される。
【００５３】
本分析のために、また、ドット・ブロット手法が使用されうる。ドット・ブロット手法の使用は、電気泳動を行う必要性を取り除き、そして、多数のサンプルの迅速な分析を可能とする。本方法の一形態によると、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域の異なる希釈物が膜（例えば、ニトロセルロース膜）上に置かれ、放射活性的にまたは蛍光ラベル化された試験化合物により接触されうる。
【００５４】
当業者は、試験化合物はラベル化されなくてもよいことを理解するだろう。この場合において、膜結合ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域を試験化合物と共にインキュベートした後、二次抗体（ラベル化された）が反応に加えられる。ラベル（放射活性、光、色など）により生じるシグナル量は、次に、定量化される。
【００５５】
蛍光偏光アッセイは、固定波長の平面偏極された偏光により励起された際に、蛍光トレーサーが他の固定波長（すなわち、蛍光）（入射刺激光に関連する偏光（ある媒体中におけるトレーサーの回転率に逆相関した）の角度を保有する）で発光するだろうという原理に基づく。この特性の結果として、強制回転（例えば、粘性溶液相中、または、他の溶液成分（例えば、より低い回転率を有する抗体）に結合された場合など）をともなうトレーサー試験化合物は、自由溶液中の場合よりも、より大きい発光の偏光角を保有するだろう。それゆえ、当業者は、適当なラベルを用いてＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域をラベルし、ラベル化されたこの受容体／結合領域を、試験化合物および／またはコントロール抗体と接触させる。蛍光偏光アッセイは、市販の自動機器（例えば、ＩＭｘ（登録商標）、ＴＤｘ（登録商標）、およびＴＤｘＦＬｘ（商品名）、（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ））中で行われうる。ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域は、シンチレーション近接アッセイにおいて、シンチレーション充填ビーズと連結されうる。放射性ラベル化された、試験化合物および／またはコントロール抗体の結合は、発光（シンチレーションカウンター上で定量化可能な）をもたらしうる。シンチレーション近接アッセイのための市販キットが、現在利用可能であり、そして、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入されうる。
【００５６】
均一特異的結合アッセイにおいて、接合は、結合する試験化合物（すなわち、試験化合物、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域またはコントロール抗体）間で形成され、そして、ラベル（結合する試験化合物が結合されるか否かにより、異なる振る舞いをするように選択される）と連結される。それゆえ、本方法の一形態において、既知量のラベル化された試験化合物および／またはコントロールを含む、液体培地中の異なるサンプルは、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域でコートされたまたはしみこませた固体マトリックスと接触されうる。他の形態によると、試験化合物および／またはコントロール抗体は固体担体上に置かれ、そして既知量の異なるラベル化されたＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域を含む異なる液体サンプルと接触されうる。本方法に適したラベルの例は、上述の化学発光化合物および酵素である。化学発光の変化は測定されうり、それゆえ、結合された修飾された抗体候補の相対量に反映される。
【００５７】
表面プラズモン鏡面分析は、電磁波（表面プラズモン波とも称される）（金属および誘電体間の境界に存在しうる）の強度を定量することに基づく。そのような波は、光（入射平面（すなわち、垂直偏波（ＴＭ））に対して平行に偏極した電場を有する）により励起されうる。この方法において、試薬（すなわち、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域、試験化合物、または任意にコントロール抗体）の一つは、センサーチップのデキストラン層（金属膜を覆う）と結合され、そして、異なる濃度の他の試薬（すなわち、試験化合物および／またはコントロール抗体、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域がデキストラン層と結合された一形態において）を含む溶液は、チップを横切るように流される。結合（会合および解離）は質量高感度検出によりモニターされる。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）機器は本方法に使用されうる。本願で開示されないそれら試験の他の改変は、当業者にとって明らかであろう。本発明の特許請求の範囲は、そのような改変全てを含む。
【００５８】
本明細書で開示されるアッセイのために、当業者はある特定の状況で、関心のある複合体（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域および試験化合物間の複合体）の量が間接的に測定されうることを理解するだろう。例えば、試験化合物または受容体／レクチン領域の総量が既知の場合、非結合の試験化合物または非結合のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型／レクチン領域の量が決定されうる。非結合化合物の量は、複合体内の化合物の量の間接的な測定である。
【００５９】
本発明は、また、一または複数の免疫疾患（本明細書で開示するような）の治療方法（調節因子（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型アゴニスト）（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型、それら細胞または膜に基づくスクリーニングを経て、および／または、本明細書で開示する適当なトランスジェニック動物を利用した試験を経て初めて識別される調節因子に直接作用する）の投与を経る）に係る。そのようなＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型アゴニストは、本明細書に記載の方法を経て識別されうり、そして、免疫疾患（免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、自己免疫性溶血性貧血（ＡＨＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、川崎病（急性血管炎症候群）、強皮症、関節炎関節リウマチ（ＲＡ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＰＤ），ｐｈｅｍｉｇｕｓおよび自己抗体媒介炎症状態を含むがこれに制限されない）の治療のためにヒト投与に有用でありうる）でありうる。本発明は、化合物（ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型（例えば、受容体のアゴニストなど）を調節する役割を果たす（化合物は、第二のエフェクターマクロファージ（ＦｃγＲＩＩＢ受容体の発現の増加をもたらす）（自己抗体に関連する応答において、それらのマクロファージから通常生じる細胞媒介炎症反応を次々と阻害する）へのＤＣ−ＳＩＧＮ（＋）細胞からの治療効果のあるシグナルを媒介するためのＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を調節する））に係る。この目的を達成するために、本発明は、さらに、医薬組成物（少なくとも一つの医薬的に有効な賦形剤と組み合わせた前記化合物を含む（この医薬組成物は治療効果のある濃度で存在するように））に係る。
【００６０】
本明細書で記載される組成物はいずれもキット中に含まれうる。非限定的な例によると、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型、コントロール抗体および／または追加の薬剤、がキット中に含まれうる。キットは、それゆえ、適した容器手段で、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型を含む。キットの構成成分は、水媒体中または凍結乾燥状態のいずれかでパッケージされうる。キットの容器手段は、一般に、少なくとも一つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含みうり、その中に、構成成分が配置され、そして好ましくは、適切に等分される。キット中に一以上の構成成分がある場合、当該キットは、一般に、追加の構成成分を分けて配置しうる、第二の、第三の、または他の追加の容器を含みうる。しかしながら、構成成分の様々な組み合わせが一つのバイアルに含まれてもよい。本発明のキットは、また、典型的に、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型、コントロール抗体および／または追加の薬剤、ならびにその他の試薬容器を、商業的販売のため厳重な管理下で包含するための手段を含む。そのような容器は、望ましいバイアルが内部に保持されるインジェクションまたはブロー成形されたプラスチック容器を含みうる。
【００６１】
本明細書で使用されるように、“ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型”は細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）−３（ＣＤ５０）（ＤＣ−ＳＩＧＮ（樹枝状細胞上に見られる、ヒト樹枝状細胞−特異的接着受容体［ＣＤ２０９］）、ＳＩＧＮ−Ｒｌ（ＤＣ−ＳＩＧＮのマウス相同体、辺縁帯辺縁帯脾性マクロファージ上で発現することで知られる）、およびＤＣ−ＳＩＧＮＲ（“ＤＣ−ＳＩＧＮ関連の”、類洞内皮肝細胞およびリンパ節組織中の内皮細胞常で発現するＤＣ−ＳＩＧＮのヒト相同体）、ならびに関連する哺乳類の相同体またはそのアイソフォーム（例えば、ウイルス相同体、スプライス変異体および／またはアイソフォームなど（例えば、ＵＳ２００５／０２２１２９１Ａ１（Ａｈｕｈａら）））を含むが、これに限定されるものではない）と結合することが知られる哺乳類のＣ型レクチン受容体のいずれであってもよい。
【００６２】
本明細書で使用される“試験化合物”または“化合物”との用語は、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の活性を潜在的に高めうる（すなわち、受容体のアゴニストとしての役割を果たす）、またはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の活性を潜在的に阻害しうる（すなわち、受容体のアンタゴニストとしての役割を果たす）分子のいずれであってもよい。そのような試験化合物は、タンパク質またはそのフラグメント、有機分子などの低分子、またはさらに核酸分子など）でありうる。ＩＶＩＧ投与による自己免疫疾患の治療における技術水準を仮定すれば、本明細書で記載するアッセイによる最も効果的な試験化合物は、二次性エフェクター細胞（ＦｃγＲＩＩＢ受容体の発現の増加をもたらす）と結合、媒介、および刺激するためにＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型と”相互作用する”抗体であろう。問題の抗体は、Ｆｃフラグメントとしてより有用であり、そして、シアル酸を含有するＦｃフラグメントである可能性が高い、ＷＯ２００７／１１７５０５に記載されるように、本明細書に全て参考として本明細書に組み入れられる。改良化合物の開発を助けるためのリード化合物の使用は、”合理的薬物設計”として知られ、公知の受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとの比較のみならず、標的分子の構造に関する予測を含む。一方、あるものは、様々な商業的供給源、有用化合物の識別を“しらみつぶし”に行う目的における有用な薬剤のための基礎的基準に合うと考えられる低分子ライブラリから単純に取得されうる。そのようなライブラリ（コンビナトリアル的に生み出されたライブラリ（例えば、ペプチドライブラリ））のスクリーニングは、迅速であり、多数の活性に関連する（および関連しない）多数の化合物をスクリーニングするのに十分な方法である。コンビナトリアルなアプローチは、それ自身が、第二、第三、第四の、活性の原型となる生成化合物（一方で、望ましくない化合物も）の生成により潜在的な薬剤の開発を迅速にするのに寄与する。試験化合物は、天然に存在する化合物のフラグメントまたは一部を含んでもよく、また、公知の化合物（または、活性を有しない）の活性を有する組み合わせとして見出されてもよい。そのような試験化合物は、天然源（例えば、動物、細菌、菌、植物源（葉および樹皮）、海洋サンプル）ら分離され、識別され、潜在的に有用な医薬品の存在のための候補化合物として試験されうる。潜在的な医薬品としてスクリーニングされる試験化合物は、化学化合物または人口の化合物から由来する、または合成されてもよい。それゆえ、本明細書の全体にわたって言及されるように、本発明により規定される候補試験化合物は、抗体（Ｆｃフラグメントまたは一本鎖抗体ｗ服務がこれに限定されない）、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス抗体、リボゾームまたは他の化合物（公知の阻害剤または促進剤から出発する合理的薬物設計により設計されうる）でありうることが理解される。
【００６３】
本明細書で使用されるように、“Ｆｃフラグメント”または“Ｆｃ領域”との用語は、免疫グロブリン中差のＣ−末端領域を規定するのに用いられる。“Ｆｃ領域”は天然配列Ｆｃ領域または変異体Ｆｃ領域でありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、変わりうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常Ｃｙｓ２２６の位置の、またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端までのアミノ酸残基からの伸長により規定される。
【００６４】
本明細書で使用されるように、“結合領域”との用語は、他の分子と結合するポリペプチドの領域を意味する。ＦｃＲの場合、結合領域は、Ｆｃ領域の稀有号に関与するその一部のポリペプチド鎖（例えば、そのα鎖）を含みうる。典型的な結合領域は、ＦｃＲ鎖の細胞外領域である。
【００６５】
本明細書で使用されるように、“レクチン領域”または“ＬＢＤ”との語は、レクチン領域の一部を意味し、さらに、Ｃ型レクチン領域（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら，２０００，Ｃｅｌｌ  １００：５７５−５８５を参照）またはＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型の糖質認識領域［ＣＲＤ；ＷｕおよびＫｅｗａｌＲａｍａｎｉ，２００６，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．６（１１）：８５９−８６８を参照］（例えば、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮのアミノ酸２４１−４０４近くの）を意味する。本明細書で有用なＬＢＤは、公知の調節因子または試験化合物に対する親和性を有するＬＢＤでありうる。
【００６６】
本明細書で使用されるように、“コントロール抗体”とは、受容体への稀有号の基準値として使用するのに有用であるためにＤＣ−ＳＩＧＮ受容体型のレクチン領域への測定可能な親和性を有する、抗体またはＦｃフラグメントなどを意味する。限定として与えられないが、コントロール抗体の例は、抗体またはフラグメント（例えば、Ｆｃフラグメント）（α２，６シアル酸結合２，６Ｆｃを含む）である。そのようなコントロール抗体は、本明細書で記載されるようなインビボでも抗炎症反応を促進する能力を有しうる（しかしながら有することは必須ではない）。
【００６７】
本明細書で使用されるように、“抗体”とは広義の意味で使用され、所望の生物活性を示す限りにおいては、特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異的な抗体（例えば、二重特異的抗体）、および抗体フラグメントを包含する。
【００６８】
本明細書で使用されるように“抗体フラグメント”は無傷な抗体の一部を含みうる（一般に抗原結合または無傷な抗体の可変領域または抗体のＦｃ領域（Ｆｃ結合能力を保有する）を含む）。抗体フラグメントの例は、直鎖抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成される多特異的抗体を含む。抗体フラグメントは、好ましくは、少なくともヒンジ部分および任意にＩｇＧ重鎖のＣＨｌ領域を保有する。より好ましくは、抗体フラグメントは、ＩｇＧ重鎖の完全な定常領域を保有し、ＩｇＧ軽鎖を含む。
【００６９】
当業者は、本明細書で開示される技術が、本発明の実施において十分に機能する技術を意味すること、そして、その実施の好ましい形態を構成するために考慮されうることを認めなくてはならない。しかしながら、本明細書の開示を考慮すると、当業者は、開示された、および同様のまたは類似の結果を得る特定の形態において、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、多くの変更がなされうることを理解すべきである本発明をより詳細に記載するために、いくつかの非制限的な実施例を以下に挙げる。
【実施例】
【００７０】
実施例
原料および方法−以下の原料および方法は、特に断りのない限り、全ての実施例に適用される。
【００７１】
マウス−Ｃ５７ＢＬ／６、ＮＯＤ、ＪＨＤ−／−、ＣＤ４−／−、およびＲａｇｌ−／−マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）より購入した。ＫＲＮ  ＴＣＲ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｄ．ＭａｔｈｉｓおよびＣ．Ｂｅｎｏｉｓｔ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）より譲り受け、ＮＯＤマウスを、Ｋ／ＢｘＮマウスを産生するために育てた。ＳＩＧＮ−Ｒｌ−／−マウスは、Ａ．ＭｃＫｅｎｚｉｅおよびＣ．Ｇ．Ｐａｒｋ，およびより提供され、Ｍ．ＣａｒｒｏｌｌおよびＭ．ＢｏｔｔｏはＣＩｑ−／−マウスを提供した。５〜８週齢の年齢適合雌マウスは全ての実験で使用され、ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ動物施設で維持された。全ての実験は、連邦法および研究ガイドラインを遵守して行われ、ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）により承認されている。Ｋ／ＢｘＮ血清は、従前の（Ｂｒｕｈｎｓら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８，５７３（Ａｐｒ，２００３））の記載により調製された。ＩＶＩＧまたはα２，６（それぞれ、ｌｇ／ｋｇまたは０．０３３ｇ／ｋｇ）は、Ｋ／ＢｘＮ血清注射の１時間後に注射した。それぞれの手足の炎症は、０−３（０、腫れなし；３、全体的に腫れた）で評価し、そして、総臨床スコアに加えた。外科的手術については、マウスは、麻酔され、滅菌条件下で脾臓を焼灼し、吻合された創傷を吻合し、そして、マウスを１週間回復させた。ブロッキング抗体処理を受けたマウスは、ＩＶＩＧの前、１時間（α−ＳＩＧＮ−Ｒｌおよびα−ＭＡＲＣＯ）または２４時間（ＴＫＯ−ＳＩＧＮ−Ｒｌ）、抗体１００μｇを注入された。
【００７２】
ＩＶＩＧ  Ｆｃ調製−ＩＶＩＧからのＦｃフラグメントは従前の記載（Ｋａｎｅｋｏ，Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，およびＲａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３，６７０（Ａｕｇ  ４，２００６）；Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔｏｗｅｒｓ，およびＲａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１，４８４（Ｊａｎ  １９，２００１））と同様に調製した。調製は、α２，６シアル酸のためのＳＮＡ−ビオチン（ベクター）を使用したレクチン・ブロッティングにより行った。Ｆｃ調製はノイラミニダーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）または、ＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて処理し、メーカーの使用説明書にしたがい、シアル酸またはＮ−結合グリカンを除去した。いくつかのノイラミニダーゼ処理Ｆｃは、インビトロにおいて、α２，３位シアリルトランスフェラーゼを用いて、α２，３Ｆｃを生成した。タンパク質はＡｌｅｘａ−６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、メーカーの使用説明書にしたがいラベル化された。
【００７３】
ＦＡＣＳ分類−マウス脾臓を取り出し、Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ  ３（Ｒｏｃｈｅ）を用いて消化し、そして、単個細胞浮遊液を作製した。次に赤血球を消化し、そして、ＦｃＲｓを２．４Ｇ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてブロックした。細胞は，次に，ＰｅｒＣＰ−ストレプトアビジン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に続いて、α−ＭＡＲＣＯ−ＰＥ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、α−ＣＤ１６９−ＦＩＴＣ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、およびα−Ｆ４／８０−ビオチン（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）を用いて染色され、そして、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分類された。分類された個体群は、その後、１μｇのＡｌｅｘａ６４７ラベルＦｃをパルスし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて再分析された。
【００７４】
α２，６Ｆｃ結合−ウェル当たり、１×１０５細胞を２４ウェルプレートに配置し、一晩インキュベートした。次の日、細胞を２．４Ｇ２で処理し、その後、３７℃で、１μｇ／ウェルのＡｌｅｘａ−６４７ラベルタンパク質を１時間かけてパルスした。細胞は、機械的に除去され、そして、フローサイトメトリーにより分析された。免疫組織化学のために、同じ数の細胞を２４ウェルプレート中に配置された円形カバースリップ上に配置し、これらの細胞に同様にパルスした、ＤＡＰＩで染色し、そして、カバースリップをスライドに移動し、そして、Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて分析した。蛍光強度および露光時間を全てのサンプルに対して規格化した。
【００７５】
組織構造−脾臓を取り出し、ＯＣＴ凍結媒体中（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｊａｐａｎ）で凍らせ、そして、４μｍ辺にカットし、冷アセトン中で固定化し、α−ＳＩＧＮ−Ｒｌ−Ａｌｅｘａ６４７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、α−ＭＡＲＣＯ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、α−ＣＤ１６９（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、α−ＣＤｌｌｃ−ＦＩＴＣ、Ｆ４／８０−ＰＥを用いて染色し、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡を用いて撮影した。足関節の組織構造は、従前の記載（Ｂｒｕｈｎｓら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８，５７３（Ａｐｒ，２００３））のように前もって成形され、そして、Ａｘｉｏｖｅｒｔ光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて１００倍で撮影した。
【００７６】
脾臓中のＩＶＩＧ蓄積の動態−マウスにＩＶＩＧを投与し、０分、１０分、６０分、および１日後に殺処分した。ＣＤ１６９＋メタル好性辺縁帯マクロファージ、ＭＡＲＣＯ＋辺縁帯マクロファージ、またはＣＤｌＩｃ＋樹枝状細胞および赤脾髄Ｆ４／８０＋マクロファージを用いて、脾臓片をＩＶＩＧ局在（α−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ）のために調査した。２００倍の蛍光像を、露光時間およびに強度ついて規格化した。
【００７７】
ＳＩＧＮ−Ｒ１発現細胞株およびシグレック（Ｓｉｇｌｅｃｓ）へのα２，６Ｆｃ結合の確認−ＳＩＧＮ−Ｒ１トランスフェクションされた細胞は、Ｒａｗ−２４７細胞上のＳＩＧＮ−Ｒ１発現を評価することによって確認し、そして、フローサイトメトリーによりＲａｗ−２４７細胞を安定的にトランスフェクションした（図４Ａ）。次にＲａｗ−２４７細胞またはＳＩＧＮ−Ｒ１発現細胞をＦＩＴＣ−デキストランを用いてパルスし、ＤＡＰＩで染色し、撮影した。露光時間および強度は４００倍画像のために規格化された。
【００７８】
Ｒａｗ−２４７およびＳＩＧＮ−Ｒ１発現Ｒａｗ−２４７細胞は、蛍光色素ラベル化されたα２，６Ｆｃを用いてパルス化され、媒体に添加されたＣＩｑ存在または非存在で、ＦＡＣＳによる結合を分析した。３実験を代表して、Ｒａｗ細胞に対するＲａｗ−ＳＩＧＮ−Ｒ１のＭＦＩ比をプロットした。マウスシアロアドヘシン（Ｓｉｇｌｅｃ−１）ｅｘｔ細胞外領域（ｍＳＮＤｌ−３）、結合欠損シアロアドヘシン（ｍＳＮＤｌ−３Ｒ９７Ａ４）、ヒトＣＤ２２（ｈＣＤ２２）、ヒトＣＤ３３（ｈＣＤ３３）、マウスＭＡＧ（ｍＭＡＧ）、ヒト  シグレック（Ｓｉｇｌｅｃｓ）５−１０（ｈＳｉｇｌｅｃ−５−１０）、およびフェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）のＳｉｇｌｅｃ−Ｆｃキメラを平面ウェルプレートにコートした。キメラを、α２，６ＦｃまたはＳＡ  ｔｘ  Ｆｃ免疫複合体を用いて調査し、展開し、そして、分析した。
【００７９】
実施例１：マクロファージは、ＩＶＩＧの抗炎症作用に必要である
ＩＶＩＧ媒介免疫抑制に必要な制御マクロファージ群の特性を調査するために、特異的免疫細胞群を欠損したマウス株の規定のパネルをＩＶＩＧと結合する血清（Ｋ／ＢｘＮ）を含む関節炎により処理した（図１）。従前の結果と一致して、野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスはＩＶＩＧにより炎症から保護された（Ｂ細胞（ＪＨＤ−／−）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４−／−）における欠損マウスのように）。しかしながら、ＩＶＩＧは、Ｂ細胞およびＴ細胞の両方における欠損Ｒａｇ−／−１マウスにおいては有効ではなかった（脾臓切除マウスにおいても、あるいは、従前に規定された遺伝子的菌株ｏｐ／ｏｐにおいても（Ｂｒｕｈｎｓら，２００３  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：５７３））。
【００８０】
実施例２：脾臓の非−Ｂ、非−Ｔ固体分および辺縁帯構造が、ＩＶＩＧ免疫抑制に必要である
それらのマウス株の脾臓構造を、辺縁帯マクロファージマーカー（コラーゲン様領域（ＭＡＲＣＯ）（Ｅｌｏｍａａら，Ｃｅｌｌ  ８０，６０３（Ｆｅｂ  ２４，１９９５）），シアル酸結合Ｉｇ様レクチン−１（Ｓｉｇｌｅｃ−１，ＣＤ１６９）（Ｃｒｏｃｋｅｒら，Ｅｍｂｏ  Ｊ  １０，１６６１（ＪｕＩ，１９９１）；Ｃｒｏｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｐａｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｖａｒｋｉ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７  ，２５５（Ａｐｒ，２００７）），およびＳＩＧＮ−Ｒｌ（ＣＤ２０９ｂ）（  Ｒａｎｇら，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５，１７７（Ｆｅｂ，２００３）；  Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋら．，Ｂｌｏｏｄ  １００，２９０８（Ｏｃｔ  １５，２００２））を有するマクロファージ受容体を含む）のアレイを用いて調査した。
【００８１】
野生型Ｂ１／６マウスの辺縁帯は、特徴的な、ＣＤ１６９＋辺縁帯メタル好性マクロファージの内輪を示した（ＭＡＲＣＯ＋辺縁帯マクロファージに囲まれた；そのうちのいくつかは、ＳＩＧＮ−Ｒｌを発現し、そして、フローサイトメトリーにより検出可能なＭＡＲＣＯ＋ならびにＣＤ１６９＋細胞を有する（図２Ａ））。規定された構造は、Ｂ細胞欠損マウスおよびＣＤ４＋Ｔ細胞欠損マウスの両方を破壊するが、それらのマクロファージ群の全てはそれでもなお存在した（図２Ｂおよび２Ｃ）。一方、Ｒａｇ１−／−マウス（図２Ｄ）はひどく破壊された辺縁帯構造を示した、（著しいＣＤ１６９＋細胞およびＭＡＲＣＯ＋細胞数の減少、および検出不可能なＳＩＧＮ−Ｒ１染色ともなう）。総合すれば、これらの結果は、脾臓の非−Ｂ、非−Ｔ個体群および辺縁帯構造は、ＩＶＩＧ免疫抑制に必要であることを示す。
【００８２】
実施例３：ＩＶＩＧの抗炎症作用は、ＭＡＲＣＯ＋辺縁帯マクロファージにより調節される
脾臓マクロファージ個体群がＩＶＩＧの生物学的な活性成分と相互作用することを決定するために、α２，６Ｆｃ、Ｆ４／８０＋赤脾髄マクロファージ、ＣＤ１６９＋メタル好性マクロファージ、およびＭＡＲＣＯ＋辺縁帯マクロファージをＣ５７Ｂ１／６野生型マウスから分類した。細胞群は、インビトロにおいて蛍光的にラベル化されたＩＶＩＧ  Ｆｃ剤を用いてパルスされ（α２，６シアル酸（α２，６Ｆｃ）の末端となるグリカン、シアル酸を持っていないＦｃ（シアリダーゼ（ＳＡ）ｔｘ  Ｆｃ）を用いて、または酵素学的に脱グリコシル化されたＦｃ（ＰＮＧａｓｅＦ  ｔｘ  Ｆｃ）を用いて）、そして、フローサイトメトリーを用いて再分析した。ＭＡＲＣＯ＋マクロファージは、特異的にα２，６Ｆｃと結合するが、Ｆ４／８０＋赤脾髄マクロファージは、Ｆｃ調剤のいずれにも結合しなかった。これらの結果は、ＩＶＩＧがＭＡＲＣＯ＋辺縁帯マクロファージに局在化することを示す、静脈注射ＩＶＩＧのインビボでの試験と一致する。これらの試験において、マウスは、ＩＶＩＧを投与され、０分、１０分、６０分、および１日後に殺処分される。ＣＤ１６９＋メタル好性辺縁帯マクロファージ、ＭＡＲＣＯ＋辺縁帯マクロファージ、またはＣＤｌＩｃ＋樹枝状細胞および赤脾髄Ｆ４／８０＋マクロファージを用いて、脾臓片をＩＶＩＧ局在のために試験した。２００倍の蛍光像を、露光時間およびに強度について規格化した。
【００８３】
実施例４：ＩＶＩＧの抗炎症作用は、ＳＩＧＮ−Ｒ１により調節される
ＭＡＲＣＯ＋辺縁帯マクロファージはＩＶＩＧにより特異的に標的とされるため、それらの際棒状で発現されるある受容体がα２，６シアリル化Ｆｃとの結合に関与するか否かを決定するための試験が行われる。それらのマクロファージは、多くのパターンの認識受容体（スカベンジャー受容体ＭＡＲＣＯ（Ｅｌｏｍａａら，Ｃｅｌｌ  ８０，６０３（Ｆｅｂ  ２４，１９９５）），およびＳＩＧＮ−Ｒｌ，循環肺炎連鎖球菌の結合中に含有されるＣ型レクチンおよびデキストラン（Ｋａｎｇら．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，２１５（Ｊａｎ  ６  ，２００４）；  Ｌａｎｏｕｅら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００，１３８３（Ｄｅｃ  ６  ，２００４））．）を発現する。したがって、結合研究は、マクロファージ（ＲＡＷ−２４７）およびＳＩＧＮ−Ｒ１によりトランスフェクションされたＣＨＯ細胞株、またはコントロールレクチン（例えば、ＳＩＧＮ−Ｒ３およびｍＤＣ−ＳＩＧＮ（図３Ａ〜Ｃおよび図４Ａ〜Ｄ参照）上で行われうる。ＳＩＧＮ−Ｒ１のみ、α２，６Ｆｃと顕著に高められた結合を示す。一方、α２，３シアル酸結合にグリカン末端を有するＦｃ（α２，３Ｆｃ）、シアリル化されていないＦｃ（ＳＡ  ｔｘ  Ｆｃ）、グリコシル化されていないＦｃ（ＰＮＧａｓｅＦ  ｔｘ  Ｆｃ）、またはＩｇＧＦｃ上で見られるのと同様の、複合シアリル化グリカン（図３Ａ）は特異的結合を示さなかった。また、α２，６Ｆｃの結合は、ＳＩＧＮ−Ｒ１のレクチン結合サイトを認識する抗体によりブロックされた（Ｒａｎｇら，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５，１７７（Ｆｅｂ，２００３））（図３Ｂ）、カルシウムキレート剤ＥＤＴＡの添加と同様に、結合はレクチンにより媒介されることを示す。この結合反応の選択性は、他のレクチン（ＳＩＧＮ−Ｒ３、ヒトＤＥＣ−２０５（ｈＤＥＣ−２０５）およびマウスおよびヒト  シグレック（Ｓｉｇｌｅｃｓ））に対するα２，６Ｆｃの結合が存在しないことをしめすことによりさらに確認されうる（図３Ｃおよび図４Ｃ、Ｄ）。ＳＩＧＮ−Ｒ１、ＤＣ−ＳＩＧＮのヒトホモログは、ＳＩＧＮ−Ｒ１と同様の結合プロファイルを示した（図３Ｃ）。ｍＤＣ−ＳＩＧＮは、一方、α２，６Ｆｃに対する選択性を示した。
【００８４】
実施例５：古典的な補体経路は、ＩＶＩＧの抗炎症作用に含まれない
これまでの研究は、ＣＩｑ（古典的な補体経路の開始剤）がＳＩＧＮ−Ｒ１と結合可能であると報告した（Ｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２５，４  ７（Ａｐｒ  ７  ，２００６））。この分子は、また、ＩｇＧ  Ｆｃ部分と相互作用するため、ＣＩｑが、α２，６ＦｃとＳＩＧＮ−Ｒ１との相互作用に関与する可能性が研究された。ＲＡＷ−２４７細胞を発現するＳＩＧＮ−Ｒ１への、シアリル化されたα２，６Ｆｃの結合反応にＣＩｑの添加は、ＳＩＧＮ−Ｒ１に結合するα２，６Ｆｃの減少をもたらす（図４Ｂ）（ＣＩｑがＳＩＧＮ−Ｒ１に結合するα２，６Ｆｃに必要でなく、結合相互作用を妨げる可能性があることを示す）。それゆえ、ＳＩＧＮ−Ｒ１は、ＩＶＩＧの活性成分（いわばＦｃフラグメント、その抗炎症活性に必要な特異的な炭化水素結合、ならびにＣ型レクチン結合に必要なカルシウムイオンに依存した）を結合した。
【００８５】
実施例６：ＳＩＧＮ−Ｒ１がインビボにおけるＩＶＩＧの抗炎症活性を媒介する
次に、その抗炎症活性を媒介するための、インビボにおけるＩＶＩＧによるＳＩＧＮ−Ｒ１結合への要求を試験した。関節の炎症を、Ｋ／ＢｘＮを有する野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウス中で誘導し、組織病理学を減ずるＩＶＩＧの能力を、抗体（ＳＩＧＮ−Ｒ１発現（ＴＫＯ−ＳＩＧＮ−Ｒ１）またはそのレクチン領域（α−ＳＩＧＮ−Ｒ１）のいずれかを破壊する（Ｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，２１５（Ｊａｎ  ６  ，２００４））の存在下で調べた。マウスは、Ｋ／ＢｘＮ血清およびＩＶＩＧにより処理し、そのいくつかは、ＳＩＧＮ−Ｒ１遮断抗体ＥＲＴＲ−９（α−ＳＩＧＮ−Ｒｌ）、ＳＩＧＮ−Ｒ１下方制御抗体２２Ｄｌ（ＴＫＯ−ＳＩＧＮ−Ｒｌ）、または適当なアイソタイプコントロール（それぞれ、Ｒａｔ  ＩｇＭおよびＨａｍｓｔｅｒ  ＩｇＧ）を受けた。その後５日間、フットパッド・スウェリングをモニターした。グループあたり５マウスの第６日の臨床スコアを、平均および標準偏差の観点からプロットした。いずれの抗体も、ＩＶＩＧの抗炎症活性を無効にした（図５）。一方、α−ＭＡＲＣＯ抗体（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２，９３９（Ｊａｎ  １５，１９９９））またはＳＩＧＮ−Ｒ１抗体のアイソタイプコントロールのいずれも、ＩＶＩＧに効果を有しなかった（図５および図６Ａ）。それらの結果は、発明者らの従前の知見（ｏｐ／ｏｐマウスがＩＶＩＧ抗炎症活性を媒介できない（Ｂｒｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８，５７３（Ａｐｒ，２００３）））と一致した（蛍光免疫組織化学において検出可能なｏｐ／ｏｐマウスはＳＩＧＮ−Ｒ１発現を有しないという）。同様に、ＳＩＧＮ−Ｒ１発現はＴＫＯ−ＳＩＧＮ−Ｒｌ処理において検出不可能である（この処理は、有効にＳＩＧＮ−Ｒ１を下方制御したが、辺縁帯構造をもたらさなかったことを示す）、（同時に、α−ＳＩＧＮ−Ｒ１アイソタイプコントロール抗体は、ＳＩＧＮ−Ｒ１発現をもたらさない）。それゆえ、マウスにおけるＳＩＧＮ−Ｒ１発現の相関関係は、ＩＶＩＧ（ＳＩＧＮ−Ｒ１へのα２，６Ｆｃの結合）によって保護され、そして、この受容体の閉塞によるインビボにおける炎症モデルのＩＶＩＧ保護を調節する能力は、ＩＶＩＧの抗炎症活性におけるこのＣ型レクチン受容体の役割を強く支持した。
【００８６】
実施例７：ＩＶＩＧ抗炎症活性がＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マウス中で無効とされる
ＩＶＩＧの抗炎症活性のためのＳＩＧＮ−Ｒ１発現の必要性の最終的な確認は、ＳＩＧＮ−Ｒ１ノックアウトマウス（ＳＩＧＮ−Ｒｌ−／−、図７）におけるＩＶＩＧ保護の欠損により明らかにされる（Ｌａｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００，１３８３（Ｄｅｃ  ６  ，２００４））。野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて、α２，６ＦｃがＫ／ＢｘＮ誘導関節炎を阻害する間、それらの防御能は、ＳＩＧＮ−Ｒ１欠損マウス（ＳＩＧＮ−Ｒｌ−／−）において無効とされた。一方、ＣＩｑ−／−は、Ｋ・ＢｘＮ誘導関節炎（α２，６Ｆｃにより保護される）を示した（図６Ｂ）（ＣＩｑは、ＳＩＧＮ−Ｒ１へのα２，６Ｆｃ結合に含まれず、または、その抗炎症活性を要求しないことを示すデータと一致する）。それらのインビボにおけるデータを表１にまとめた。
【００８７】
【表１】
2011517960.tif 000002
【００８８】
この実施例セクションで示した結果は、ＩＶＩＧの抗炎症活性に必要な受容体としてのＳＩＧＮ−Ｒ１およびα２，６Ｆｃならびにシアリル化されたＩｇＧが抗炎症状態を促進することによる新規経路の識別を確立する。この経路は、α２，６Ｆｃへのレクチン結合の選択性に基づいて、マウスおよびヒトのいずれにおいても保存される、たとえ、異なる標的細胞によっても。ＳＩＧＮ−Ｒ１、ＤＣ−ＳＩＧＮのヒト相同体は、樹枝状細胞上で発現され、ｍＳＩＧＮ−Ｒ１（その辺縁帯脾性マクロファージ上での発現は、ＩＶＩＧの活性に必要である）よりも広く分布される。解剖学的要求におけるこの差異は、マウス中の刺激との比較において、臨床的観察（ＩＶＩＧが脾摘患者における抗炎症に有効である）と一致する。ＳＩＧＮ−Ｒ１およびｈＤＣ−ＳＩＧＮがウイルス性病原体または細菌病原体と相互作用することを示すという事実は、また、定常状態から活性状態、炎症状態へ応答を転換をしうる、それらの生物によるシアリル化Ｆｃの置換によって、メカニズムを示唆する。いくつかの病原体によるこの経路の破壊は、こう炎症状態を不適切に維持しうり、それゆえ、有効な免疫が確立されるのを妨げる。
【００８９】
実施例８：２，６シアリル化Ｆｃと結合するＳＩＧＮ−Ｒ１
ＳＩＧＮ−Ｒ１がそのシアリル化糖タンパク質リガンドと結合するか否かを決定するために。トランスフェクションされたマクロファージ細胞株（ＳＩＧＮ−Ｒ１（ＲＡＷ−ＳＩＧＮ−Ｒ１）を選択的に発現した）は、トランスフェクションされていない細胞と比較して、シアリル化Ｆｃを結合した（図８）。２，６シアリル化Ｆｃおよびシアリル化されていないＦｃが、特異的にマクロファージ上の非オーバーラップ受容体と結合したことを示すために、我々は、定量的な結合試験のために、常在腹膜、野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウス由来の、全てのＩｇＧＦｃ受容体（Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｃｅｌｌ  ７６：５１９−５２９；  Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：３４６−３４９）（ＦｃＲ  γ  ／ＩＩｂ  ７  ）を欠くマウス由来の、またはＳＩＧＮ−Ｒ１欠損マウス（Ｌａｎｏｕｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００：１３８３−１３９３）（ＳＩＧＮ−Ｒｌ−／−）由来の、ＳＩＧＮ−Ｒ１−／−マクロファージを採取した。ＳＩＧＮ−Ｒｌ−／−マクロファージは、シアリル化されていないＦｃを特異的に結合するのと同時に、Ｆｃγ受容体欠損マクロファージ（ＦｃＲγ／ＲＩＩｂ−／−）は、α２，６−Ｆｃと結合した（図８）。それらの結果は、我々の従前の結果（標準ＩｇＧ  Ｆｃ受容体が、シアリル化されていないＦｃよりも１０倍低い親和性で結合する）と一致する（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０４：１１−１５，Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：６７０−６７３，Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：３７３−３７６）。それゆえ、ＩｇＧ  Ｆｃグリカンの２，６−シアリル化は、ＦｃγＲｓに有効に関与し、炎症反応を媒介するものから、レクチンを発現するマクロファージに関与する能力を取得し、抗炎症反応を媒介するが、ＦｃγＲ結合を減少させる種へと、分子を変換する。
【００９０】
実施例９：ＤＣ−ＳＩＧＮが２，６シアリル化されたＦｃと結合する
ＣＨＯ細胞を発現するＳＩＧＮ−Ｒ１と比較したトランスフェクションされたＣＨＯ細胞のＤＣ−ＳＩＧＮの結合選択性を調べた。ＣＨＯを発現する、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＳＩＧＮ−Ｒ１のいずれも２，６−シアリル化されたＦｃと結合した（図９および表２）。線形回帰分析により決定されるＫａ値を表に示す。満難、公知のＤＣ−ＳＩＧＮのリガンドは、そのトランスフェクションされたＣＨＯ細胞（ＣＲＤ上のそれらの二つのリガンドのための結合部位が、オーバーラッピングする可能性があることを示す）への結合のために、２，６−シアリル化されたＦｃと競合することが可能であった。フィブリノゲン、ＩｇＧ  Ｆｃ上で見られるのと同様のシアリル化された二分岐のグリカン組成物を伴う豊富な血清糖タンパク質のための結合は観察されなかったが、高い秩序構造の欠如はＦｃ結合グリカン（２，６−シアリル化されたＦｃおよびそれらのレクチン間の相互作用が、それらの選択性のためにグリカンおよびアミノ酸骨格の両方を必要とすることを示す）で見られた（図９）。
【００９１】
【表２】
2011517960.tif 000003
【００９２】
本開示中で引用する全ての特許文献および非特許文献は、それらの特許文献および非特許文献のそれぞれが本明細書に全体として参照により組み込まれたのと同程度に本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書の本願発明は、特定の実施例および実施形態の参照を用いて記載されてはいるが、それらの実施例および実施形態は本発明の原理および適用を説明したに過ぎないものとして理解される。したがって、以下の特許請求の範囲により規定されるように、本発明の精神と範囲から逸脱しない限りにおいて、それら具体例に対して多くの修飾が成されてもよく、他の改変が工夫されてもよいことが理解される。
【図１】
2011517960.tif 000004
【図２】
2011517960.tif 000005
【図３】
2011517960.tif 000006
【図４】
2011517960.tif 000007
【図５】
2011517960.tif 000008
【図６】
2011517960.tif 000009
【図７】
2011517960.tif 000010
【図８】
2011517960.tif 000011
【図９】
2011517960.tif 000012
【配列表】
2011517960000001.app
【国際調査報告】
2011517960.tif 000013
2011517960.tif 000014
2011517960.tif 000015