(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質であって、
該タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２で表されるアミノ酸配列において以下に示すアミノ酸置換の表の１〜１３から選択される１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を備え、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質と比較して耐熱性が向上している、タンパク質。
【表１０】
0005771920.tif 000011
【請求項２】
前記タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において以下の表の１〜２２から選択される１又は２以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【表１１】
0005771920.tif 000012
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質を発現するように遺伝子組換えされた真核細胞の形質転換細胞によって生産された請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを含む発現用ＤＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項５記載のＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のタンパク質を表層提示又は細胞外分泌する、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
真核微生物である、請求項６又は７に記載の細胞。
【請求項９】
前記真核微生物は、非セルラーゼ生産微生物である、請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
酵母である、請求項８又は９に記載の細胞。
【請求項１１】
麹菌である、請求項８又は９に記載の細胞。
【請求項１２】
前記真核微生物は、セルラーゼ生産微生物である、請求項８記載の細胞。
【請求項１３】
前記セルラーゼ生産微生物は、Trichoderma reeseiである、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含むセルラーゼ組成物。
【請求項１５】
セルロースの分解産物の生産方法であって、
セルロースを含む材料と請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼとを接触させる工程を含む、生産方法。
【請求項１６】
有用物質の生産方法であって、
セルロースを含む炭素源を、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む２種以上のセルラーゼの存在下、微生物を培養する工程を含む、有用物質の生産方法。
【請求項１７】
前記微生物は、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をその細胞外に分泌又は細胞表層に提示する、請求項１６に記載の生産方法。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を含む、タンパク質複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスに含まれるセルロースを有効利用するためのセロビオヒドロラーゼ及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、糖であるグルコースがβ−１，４グリコシド結合によって縮合した高分子化合物であり、分子間水素結合により強固な結晶構造を構成している。セルロースを分解し、さらに、グルコースに糖化し発酵原料として用いるには、セルロースを単糖まで分解（糖化）するには、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼという、少なくとも３種類のセルラーゼ（セルロース分解酵素）の相乗効果が必要である。
【０００３】
セルロース分解活性に優れたセロビオヒドロラーゼとして、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）由来のセロビオヒドロラーゼII（ＧＨＦ６）が知られている（特許文献１、非特許文献１）。また、セルロースの分解反応は反応時の温度が高いほど分解効率がよいことが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−４１９９６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Uzcatsguiら、Ｊ．Biotechnol．19(2-3)：271-85
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIは、耐熱性が低く、高い分解効率の見込まれる高温でのセルロース分解反応には利用しにくかった。
【０００７】
そこで、本明細書の開示は、耐熱性に優れるセロビオヒドロラーゼII及びその利用を提供することを、目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの耐熱性向上を目的として、多数の改変体を作製したところ、野生型セロビオヒドロラーゼIIに比較して耐熱性に優れた改変体を見出すことができた。本明細書の開示は、これらの知見に基づいて提供される。
【０００９】
本明細書の開示によれば、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において以下に示すアミノ酸置換の表から選択される１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を備える、タンパク質が提供される。
【００１０】
【表１】
0005771920.tif 000002
【００１１】
さらに、本明細書の開示によれば、こうしたタンパク質のいずれかをコードするＤＮＡが提供され、当該ＤＮＡを含む発現用ＤＮＡコンストラクト、当該発明用ＤＮＡコンストラクトによって形質転換された細胞が提供される。さらに、本明細書の開示によれば、上記タンパク質を含むセルラーゼ組成物及びセルロースを含む材料と上記タンパク質とを接触させる工程を含む、セルロースの分解方法、セルロースを含む材料を、上記タンパク質を含む２種以上のセルラーゼの存在下、発酵用微生物を培養する工程を含む、有用物質の生産方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】PcCBH2のアミノ酸配列（上段）と耐熱化変異候補部位のアミノ酸置換（下段に表示）を示す図である。
【図２】耐熱化候補変異体とその耐熱温度を示す図である。
【図３】耐熱化候補変異体の耐熱温度と熱処理前のPSC分解活性との関係とを示す図であり、初期配列の変異体5−6（黒四角）と各耐熱性候補変異体（×）とを示す
【図４】52℃環境下での有利変異を持つ変異体の残存活性値を示す図である。
【図５】第２世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図６】第３世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図７】第４世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図８】第５世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図９】第６世代の有利変異の蓄積実験結果を示す図である。
【図１０】スクリーニング実験の耐熱試験結果を示す図である。
【図１１】スクリーニングで得られた変異体の耐熱性評価結果を示す図である。
【図１２】各世代の耐熱化変異体の耐熱試験結果を示す図である。
【図１３】５0℃環境下での耐久性評価結果を示す図である。
【図１４】有利変異の蓄積効果を示す図であり、初期配列を四角、Ｍａｌｌ４を三角、各世代の耐熱化変異体をダイヤで示す。
【図１５】酵母発現精製セルラーゼの比活性評価結果を示す図である。
【図１６】耐熱化変異体の耐熱性評価結果を示す図であり、試験管内合成した変異体を黒色、酵母で発現精製した変異体を灰色で示す。
【図１７】酵母発現精製変異体の50℃環境下での耐久性を示す図である。
【図１８】酵母発現精製変異体のｐH依存性を示す図である。
【図１９】酵母発現精製セルラーゼのエタノール濃度依存性を示す図である。
【図２０】酵母発現精製変異体の温度依存性を示す図である。
【図２１】野生型PcCBH2とMall4変異体に対してそれぞれ市販酵素製剤セルクラストを種々の比率で配合したときの相乗効果を、還元糖量で評価したグラフ図である。上段（Ａ）に野生型PcCBH2、下段（Ｂ）にMall4変異体の評価結果を示す。
【図２２】CBDを欠失させたMall4変異体の耐熱性評価結果を示す。
【図２３】異種生物由来のCBDに置換したMall4変異体の耐熱性評価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書の開示は、耐熱性に優れるPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質及びその利用に関する。本明細書に開示されるタンパク質は、P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの触媒ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）における１又は２以上のアミノ酸置換を有し、セロビオヒドロラーゼ活性を有している。かかるタンパク質は、その耐熱性が、元のタンパク質（配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又当該配列を含む全長タンパク質）よりも向上している。本タンパク質によれば、より高い温度におけるセルロース分解反応にP. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの高いセロビオヒドロラーゼ活性を利用できるようになり、高いセルロース分解効率を得ることができる。
【００１４】
以下、本明細書の開示に含まれる種々の実施形態について詳細に説明する。なお、本明細書において用いる「ＧＨＦ（Glycoside Hydrolase Family）」とは、ＣＡＺｙ（Carbohydrate active Enzymes）のホームページ（http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html）において提供される、グリコシド加水分解酵素の分類である。
【００１５】
（（P. chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼIIに由来するアミノ酸配列（配列番号２）に由来し、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質）
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、P. chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼIIの触媒ドメインのアミノ酸配列をコードしている（Appl. Environ.Microbaial. 60(12),4387-4393(1994)）。P. chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼIIは、配列番号２で表される触媒ドメインのＮ末端にリンカーを介してセルロース結合ドメインを有している。
【００１６】
本明細書に開示されるタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において所定のアミノ酸置換を有して、セロビオヒドロラーゼ活性を有している限り、別のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなっていてもよい。例えば、本タンパク質は、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を有していてもよい。ＣＢＤは、リンカーを介して連結されていてもよい。配列番号２で表されるアミノ酸配列の別のアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列として、配列番号４で表されるアミノ酸配列が挙げられる。このアミノ酸配列は、、P. chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼIIの全長アミノ酸配列であり、Ｎ末端から、ＣＢＤ、リンカー及びセロビオヒドロラーゼの触媒ドメイン（配列番号２で表されるアミノ酸配列）を有する。配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質であっても、当該タンパク質中の配列番号２で表されるアミノ酸配列において本明細書に開示されるアミノ酸置換を有することで、ＣＢＤ等が付加されていても、耐熱性は改善される。
【００１７】
本タンパク質は、P. chrysosporiumから取得したセロビオヒドロラーゼ IIの触媒ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）において、表１に示される１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備えることができる。「アミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備える」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に表１から選択される１又は２以上のアミノ酸置換を備えるほか、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定の関係を有するアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列と対比したときに、表１から選択される１又は２以上のアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備えていることをいう。なお、アミノ酸置換を備えるとは、当該位置において、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸とをそれぞれ特定して意味するほか、結果として「アミノ酸置換」によって特定されるアミノ酸を備えていればよいことを意味する。すなわち、「Ｍ１７６Ｌ」のアミノ酸置換を備えるとは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１７６位に相当する部位にＬ（ロイシン）を備えていることを意味する。以下、本タンパク質が備えることのできる変異であるアミノ酸置換について説明する。
【００１８】
本タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において表２の各欄に示す１又は２のアミノ酸置換を単位として組み合わせて有するアミノ酸配列を備えるものであってもよい。なかでも、第２のアミノ酸配列は、好ましくは、少なくとも、Ｔ２５９Ｈ、Ｑ２９８Ｓ＋Ｆ２９９Ｌから選択される１種又は２種以上に相当するアミノ酸置換を備えている。これらの各変異に組み合わせて、Ｔ４７Ｉ及びＳ５１Ｑの双方又はいずれかを含んでいることが好ましい。さらに、追加して、Ｍ１７６Ｉの変異を含んでいることが好ましい。さらにまた、好ましくは、Ａ１５８Ｅの変異を含んでいる。さらに追加して、好ましくは、Ｑ２２４Ｒ＋Ａ２２６Ｓの双方又はいずれかの変異を含んでいる。さらにまた、加えて、Ｓ１００Ｔの変異を含んでいることが好ましい。さらに追加して、Ｔ２９Ｓ、Ｎ４２Ｋ、Ｑ１２１Ｋ、Ｉ２８２Ｖ及びＦ１２３Ｙからなる群から選択される１又は２以上の変異を含んでいることが好ましく、より好ましくは３種以上であり、さらに好ましくは４種以上であり、一層好ましくは５種である。
【００１９】
【表２】
0005771920.tif 000003
【００２０】
以上のことから、好ましい本タンパク質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、たとえば、少なくとも以下の表３に示す組み合わせのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列が挙げられる。なかでも、第３世代以降が好ましく、より好ましくは第４世代以降、さらに好ましくは第５世代以降、一層好ましくは第６世代以降、最も好ましくは第７世代以降である。表３中、「２１」の組み合わせのアミノ酸置換を備え、さらに、Ｔ２９Ｓ、Ｎ４２Ｋ、Ｑ１２１Ｋ、Ｉ２８２Ｖ及びＦ１２３Ｙからなる群から選択される１又は２以上のアミノ酸置換を備えるタンパク質も好ましい。
【表３】
0005771920.tif 000004
【００２１】
本タンパク質のセロビオヒドロラーゼ活性は、本タンパク質の適当な濃度の溶液（たとえば５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を、リン酸膨潤セルロースの分解（反応条件、40℃、16時間)反応に供し、その反応溶液の遠心上清中の還元糖量をＴＺアッセイ法を用いて評価することにより得ることができる。
【００２２】
本タンパク質の耐熱性は、以下の方法で取得される耐熱温度で表すことができる。すなわち、変異体の適当な濃度の溶液（たとえば５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃及び５６℃等の適切な範囲の各温度で２時間保温後、当該熱処理後の残存活性をリン酸膨潤セルロースの分解（反応条件、40℃、16時間)後の、遠心上清中の還元糖量をＴＺアッセイ法を用いて評価することにより各温度でのセロビオヒドロラーゼ活性を測定し、当該活性を各温度での残存活性とする。残存活性は、熱処理前の活性に対する熱処理後の残存活性の割合（％）で表し、各温度における残存活性（％）から、残存活性が５０％となるときの温度を耐熱温度(℃)とする。
【００２３】
また、本タンパク質の耐熱性は、単に、所定温度（たとえば、５０℃以上の特定温度）で所定時間保存後の残存活性(％)を指標とすることができる。例えば、本タンパク質の緩衝液溶液を所定温度で２時間保持し、当該熱処理後において上記と同様（反応条件、40℃、16時間)にして残存活性（％）を得てもよい。
【００２４】
本タンパク質の耐熱性に関し、耐熱温度及び所定の温度における残存活性のいずれか又は双方を指標とすることができるが、好ましくは耐熱温度を指標とする。
【００２５】
本タンパク質は、その耐熱性が５０℃以上であることが好ましく、より好ましくは、５０．５℃以上であり、さらに好ましくは５１．０℃以上であり、より一層好ましくは５２．０℃以上であり、さらに一層好ましくは５２．５℃以上であり、一層このましくは、５３．０℃以上であり、さらにまた好ましくは５３．５℃以上である。なお一層好ましくは５４．０℃以上であり、より好ましくは、５４．５℃以上であり、さらに好ましくは５５．０℃以上である。
【００２６】
本タンパク質は、また、その５０℃における耐久性（残存活性）が２４時間で８０％以上であることが好ましく、より好ましくは９０％以上である。また、５０℃における耐久性は４８時間で８０％以上であることが好ましく、より好ましくは９０％以上である。さらに、５０℃における耐久性は７２時間で８０％以上であることが好ましく、より好ましくは９０％以上である。
【００２７】
本タンパク質において、表１に示すアミノ酸置換は、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは４個以上、一層好ましくは５個以上、より一層好ましくは６個以上、さらに一層好ましくは７個以上備えられる。さらには、８個以上であり、アミノ酸置換の数が多ければ耐熱性が向上することがわかっている。最も好ましくは１３個以上である。
【００２８】
本タンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、表１に示すアミノ酸置換から選択される１種又は２種以上のほか、表２に示すアミノ酸置換の組み合わせを備えていてもよい。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定の関係を有するアミノ酸配列において、表１に示すアミノ酸置換に相当するアミノ酸置換を備えるものであってもよい。表１に示すアミノ酸置換に相当するかどうかは、２以上のアミノ酸配列を後述する同一性及び類似性を決定する方法によってアラインメントすることにより決定される。配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定の関係を有するアミノ酸配列を有するタンパク質としては、以下に説明する。
【００２９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定の関係を有するアミノ酸配列の一態様としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。各アミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、すなわち、欠失、置換若しくは付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、好ましくは、１個以上２５個以下程度である。より好ましくは、１個以上２０個以下であり、さらに好ましくは１個以上１５個以下程度である。アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。
【００３０】
他の一態様としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するアミノ酸配列が挙げられる。同一性は好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは、９０％以上であり、一層好ましくは９５％以上である。最も好ましくは、９８％以上である。
【００３１】
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３２】
さらに他の一態様として、配列番号２で表される特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、セロビオヒドロラーゼ活性を有するアミノ酸配列が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、たとえば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち、所定の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましく９５％以上、一層このましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。なお、以上のことから、さらなる他の一態様として、所定の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましく９５％以上、一層好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによってコードされ、セロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００３３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定の関係を有するアミノ酸配列としては、例えば、Phanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIにおいて知られている他の変異（例えば、活性向上に関する変異）などが挙げられる。
【００３４】
また、改変を含む本タンパク質自体が、配列番号２で表されるアミノ酸配列において好ましくは２５個以下、より好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１５個以下程度のアミノ酸変異を含むことが好ましい。また、本タンパク質自体が、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。同一性は好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは、９０％以上であり、一層好ましくは９５％以上である。最も好ましくは、９８％以上であることが好ましい。さらに、本タンパク質自体が、配列番号２で表される特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、セロビオヒドロラーゼ活性を有することが好ましい。さらなる他の一態様として、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましく９５％以上、一層好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによってコードされ、セロビオヒドロラーゼ活性を有することが好ましい。
【００３５】
本タンパク質におけるアミノ酸置換は、各種の手法にて導入されうる。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列やこれと一定関係のあるアミノ酸配列をコードする配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ等の遺伝子情報を改変する方法を用いることができる。ＤＮＡに変異を導入して遺伝子情報を改変して本発明のタンパク質を得るには、変異を予め設計しておき、当該変異を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを取得する方法のほか、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A.L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A.,Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001、及び、Okuta, A., Ohnishi, A. and Harayama, S., PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes. Gene, 212, 221-228, 1998を参照することができる。なかでも、エラープローンＰＣＲ等によりランダム変異を導入する分子進化的手法を利用する無細胞タンパク質合成系を採用することが好ましい。エラープローンＰＣＲに適用する無細胞タンパク質合成系としては、公知のあるいは本出願人が出願した特開２００６−６１０８０号公報及び特開２００３−１１６５９０号公報に記載のタンパク質合成系を用いることができる。本出願人によるこれらの無細胞タンパク質合成系を用いることで活性型の酵素を容易に得ることができる。このため、これらのタンパク質合成系が適用されたエラープローンＰＣＲは、本発明のタンパク質を取得する手法として好ましく用いることができる。
【００３６】
本タンパク質は、上述のようにタンパク質の無細胞合成系による遺伝子工学的手法によって取得することができるほか、本タンパク質をコードするＤＮＡで適当な宿主細胞を形質転換し、当該形質転換細胞において本発明のタンパク質を生産させる遺伝子工学的手法により取得することができる。形質転換細胞を用いた遺伝子工学的なタンパク質の生産方法は、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３７】
なお、本タンパク質は、P. chrysosporium又は各種微生物を宿主とする形質転換細胞が産生するタンパク質であるときには、これらの菌を培養して培養上清を取得し、この培養上清から本タンパク質を分離・精製すればよい。分離や精製には公知のタンパク質の分離・精製法を適用すればよい。
【００３８】
本タンパク質は、糖鎖修飾が予想される酵母などの真核微生物の形質転換細胞において製造されるとき、糖鎖修飾により耐熱性が向上する。すなわち、本発明者らによれば、酵母で発現された本タンパク質は、無細胞合成系で合成した同じタンパク質よりも耐熱性が２℃程度向上することが観察された。本タンパク質においては、Ｎ型糖鎖修飾（配列番号２で表されるアミノ酸配列中のＮ１８９、Ｎ３１７に相当する部位）やＯ型糖鎖修飾が挙げられる。少なくともS. cerevisiaeなどの酵母において発現させた本タンパク質は、アミノ酸配列が同一であっても、他の微生物や試験管内合成や化学合成で得られた同一アミノ酸配列の本タンパク質よりも高い耐熱性を有している。したがって、糖鎖修飾が予想される真核微生物の形質転換細胞は、本タンパク質の製造媒体としてあるいはそのまま発酵用微生物として好適な態様である。
【００３９】
（本タンパク質をコードするＤＮＡ）
本明細書の開示によれば、本タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、化学合成法や各種ＰＣＲ法等により取得することができる。なお、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（二重鎖及び一重鎖のいずれであってもよい）、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリット等、いずれの形態であってもよい。上記した表１に含まれるアミノ酸変異の１種又は２種以上を有する各種改変体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡや上記した表２に記載の各改変体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００４０】
（ＤＮＡ構築物）
本発明のＤＮＡ構築物は、本タンパク質をコードするＤＮＡを含んでいる。より具体的には、上記した表１に含まれるアミノ酸変異の１種又は２種以上を有する各種改変体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡや上記した表２に記載の各変異の組み合わせや表３に示す改変体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでいる。本発明のＤＮＡ構築物は、主として適当な宿主細胞の形質転換を意図した発現ベクターとしての形態を採ることができる。形質転換の手法や宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの保持形態（染色体に導入する形態や染色体外に保持する形態等）に応じて、上記コード領域以外の構成要素が適宜決定される。また、ＤＮＡ構築物の形態は、使用形態に応じて様々な形態を採ることができる。例えば、ＤＮＡ断片の形態を採ることができるほか、プラスミドやコスミドなどの適当なベクターの形態を採ることもできる。
【００４１】
本ＤＮＡ構築物は、本タンパク質を、後述するタンパク質複合体を構成可能な形態で発現可能に構築されていてもよい。すなわち、本タンパク質に対してドックリンドメインを付加した融合タンパク質を発現可能に形成されていてもよい。さらに、タンパク質複合体を構成可能な発現用コンストラクトとして、コヘシンタンパク質をコードするＤＮＡを含む、コヘシンタンパク質の発現用コンストラクトを構築してもよい。こうした発現コンストラクトにおいて、融合タンパク質やコヘシンタンパク質のコード化ＤＮＡは、本タンパク質をコードするＤＮＡと同様、各種形態でコンストラクトに備えられる。
【００４２】
（形質転換細胞）
本発明の形質転換細胞の一態様は、本タンパク質を発現する形質転換細胞であり、上記した本発明のＤＮＡ構築物で適当な宿主細胞を形質転換することによって得ることができる。例えば、本タンパク質のみを細胞表層に保持し又は細胞外に分泌する形態で発現する形質転換細胞は、それ自体、本タンパク質として利用できる。また、こうした形質転換細胞を培養して得られる培養物は、本タンパク質の好ましい取得源として利用できる。
【００４３】
本形質転換細胞は、本タンパク質を発現可能な細胞であればよく、その種類を限定しないが、本タンパク質の生産及び回収を考慮すると、大腸菌などの細菌等が挙げられるが、好ましくは、本タンパク質によるセルロースの分解及び資化のための真核微生物である。真核微生物は、特に限定しないが、例えば、公知の各種酵母を利用できる。後述するエタノール発酵等を考慮すると、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性等の観点からサッカロマイセス属酵母が好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビジエが好ましい。また、真核微生物は、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus soya）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）等の麹菌であってもよい。異種タンパク質を大量に発現させるには、セルラーゼ非生産微生物がより好ましい。また、真核微生物としては、セルラーゼ生産微生物である、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）などのトリコデルマ属菌や、白色腐朽菌などを含む木材腐朽菌が挙げられる。セルラーゼ生産微生物を宿主とすることで、これらの微生物が生産うるセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等と同時に本タンパク質を生産できる。
【００４４】
本形質転換細胞は、本形質転換細胞のセルロースの分解への利用を考慮すると、本タンパク質を細胞外に分泌又は細胞表層に提示するものであることが好ましい。本タンパク質に細胞外分泌性や細胞表層提示性を付与するには、公知の分泌シグナルや表層提示用のシステムを用いることができる。例えば、分泌シグナルや凝集性タンパク質又はその一部のアミノ酸配列が付与される。分泌シグナルとしては、例えば、Rhizopus oryzaeやC. albicansのグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーなどが挙げられる。また、凝集性タンパク質としては、α−アグルチニンをコードするSAG1遺伝子の５’領域の３２０アミノ酸残基からなるペプチドが挙げられる。また、所望のタンパク質を細胞表層に提示するためのポリペプチドや手法は、ＷＯ０１／７９４８３号公報や、特開２００３−２３５５７９号公報、ＷＯ２００２／０４２４８３号パンフレット、ＷＯ２００３／０１６５２５号パンフレット、特開２００６−１３６２２３号公報、藤田らの文献（藤田ら，2004. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212および藤田ら, 2002. Appl Environ Microbiol 68:5136-5141.）、村井ら, 1998. Appl Environ Microbiol 64:4857-4861.に開示されている。
【００４５】
本形質転換細胞は、後述するように、セルロソーム生産微生物由来のコヘシンタンパク質を細胞表層提示し、ドッケリンを付加した本タンパク質を細胞外に分泌して、コヘシンタンパク質に本タンパク質をコヘシン−ドッケリン結合を介して保持させて、本タンパク質を細胞表層に提示するものであってもよい。
【００４６】
糖鎖修飾が可能な酵母であって、本タンパク質を発現する酵母は、試験管内合成した本タンパク質より耐熱性を向上させることができるため、好ましい形質転換細胞である。本タンパク質を発現する細胞、好ましく酵母などの真核微生物は、向上されたセロビオヒドロラーゼ活性及び増強された相乗効果により、セルロースの分解、糖化、及び糖化と発酵とを同時進行させるＣＢＰ（連結バイオプロセス（糖化発酵同時進行））において、セルロースの分解効率を高めて、セルロースの効率的利用を具現化することができる。
【００４７】
以上説明した本明細書に開示される形質転換細胞は、いずれも、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に準じて作製することができる。真核微生物などの宿主細胞の形質転換のためのベクター及びその構築方法は、当業者において周知であって、モレキュラークローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に開示されている。また、コヘシンタンパク質やドックリンドメインを有するタンパク質を真核微生物において発現させるためのベクター及びその構築方法も、同様に、当業者において周知である。また、形質転換にあたり、従来公知の各種方法、例えば、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法等を用いることも、同様に当業者において周知である。
【００４８】
（セルラーゼ組成物）
本明細書の開示によれば、本タンパク質と、さらに、他のセルラーゼ、たとえば、他のセロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群から選択される１種又は２種以上を組み合わせの組成物が提供される。本組成物によれば、本タンパク質の優れたセロビオヒドロラーゼ活性により高いセルロース分解活性を呈することができる。本組成物に含まれる本タンパク質以外のセルラーゼとしては、特に限定しないで、公知のセルラーゼから適宜選択される。例えば、Phanerochaete chrysosporium由来でない他起源のエンドグルカナーゼが挙げられる。他起源由来のエンドグルカナーゼとしては、公知の各種エンドグルカナーゼが挙げられ、これらを単独であるいは２種類以上を適宜組み合わせて用いることができる。たとえば、ＧＨＦ５に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼのなかでも、好ましくは、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。より好ましくはTrichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼAspergillus niger由来のエンドグルカナーゼである。ＧＨＦ５に分類されるエンドグルカナーゼは、こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。また、本セルラーゼ組成物は、β−グルコシダーゼを含んでいてもよい。
【００４９】
エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ１２に属するエンドグルカナーゼが挙げられる。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼ、Aspergillus niger由来のエンドグルカナーゼ及びAspergillus oryzae由来のエンドグルカナーゼが挙げられる。こうしたエンドグルカナーゼから選択される１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。エンドグルカナーゼとしては、ＧＨＦ７及びＧＨＦ４５に属するエンドグルカナーゼであってもよい。なかでも、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼを好ましく用いることができる。
【００５０】
本セルラーゼ組成物は、Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼを含んでいてもよい。Phanerochaete chrysosporium由来のエンドグルカナーゼは、セロビオヒドロラーゼII及びその改変体をPhanerochaete chrysosporiumの培養物等から取得した場合においてセロビオヒドロラーゼII及びその改変体とともに容易に取得できる。
【００５１】
本セルラーゼ組成物は、エンドグルカナーゼ以外の他のセルラーゼを含むことができる。例えば、ＧＨＦ７に属するセロビオヒドロラーゼＩを含有することができる。セロビオヒドロラーゼＩは、セロビオヒドロラーゼＩが、セロビオヒドロラーゼII等と協動することにより、一層セルロース分解の相乗効果が発揮される。セロビオヒドロラーゼＩは、Phanerochaete chrysosporium由来であってもよいし、他起源であってもよい。
【００５２】
本セルラーゼ組成物は、Phanerochaete chrysosporium以外の他起源のセルラーゼ生産菌の培養物（培養上清であってもよい）から取得された２種類以上のセルラーゼを含有していてもよい。セルラーゼ生産菌としては、特に限定されないで、適宜選択できるが、エンドグルカナーゼの起源としてTrichoderma reesei、Aspergillus aculeatus、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae等が好ましく挙げられる。より好ましくは、Trichoderma reeseiである。
【００５３】
本セルラーゼ組成物は、化学的あるいは遺伝子工学的に本タンパク質及び必要に応じて他のセルラーゼを生産し、組み合わせることによって得ることができる。本セルラーゼ組成物を構成する全てのセルラーゼを同一の宿主細胞で遺伝子工学的に生産し、その培養上清や培養菌体を回収することによって、本セルラーゼ組成物を得るようにしてもよい。
【００５４】
本セルラーゼ組成物は、本タンパク質及び他のセルラーゼを、それぞれ精製したものとして含有していてもよいし、未精製タンパク質として他タンパク質やその他の成分を含んでいてもよい。また、その製剤形態は、特に限定されず、固形製剤（粉末（凍結乾燥体等）、タブレット等、顆粒等）であってもよいし、溶液（流通時においては凍結体であることが好ましい。）であってもよい。
【００５５】
（本タンパク質複合体）
本明細書に開示されるタンパク質複合体は、本タンパク質と、本タンパク質をコヘシン−ドックリン結合によりコヘシンタンパク質上に備えている。ある種の細菌が、複数種類のセルラーゼを保持するタンパク質構造体を自己細胞表層に構築することが知られており、当該タンパク質構造体がセルロソームとして知られている。セルロソームは、セルラーゼが、スキャホールディンタンパク質に保持されて構成されており、セルロソームとスキャホールディンタンパク質とは、それぞれが備えるドックリンドメインとコヘシンドメインとの間の結合、すなわち、コヘシン−ドッケリン結合により結合されている。公知のセルロソームにおけるドックリンドメイン及びコヘシンドメインのアミノ酸配列は既にいくつか開示されている。コヘシン−ドックリン結合は、非共有結合性であって、そのアミノ酸配列に依存した水素結合等に基づくと考えられる。したがって、こうした開示に従い、ドックリンドメインを付加した本タンパク質と１又は２以上のコヘシンドメインを備えるスキャホールディンタンパク質（コヘシンタンパク質という。）とにより、人工的なセルロソーム、すなわち、タンパク質複合体を構築することができる。
【００５６】
本タンパク質複合体においては、本タンパク質には、ドックリンドメインが付加されてキメラ化（キメラタンパク質）されている。ドックリンドメインは、コヘシン−ドックリン結合により後述するコヘシンタンパク質に本タンパク質を結合させる部位である。ドックリンドメインは、例えば、公知のセルロソーム生産微生物のセルロソームを構成するセルラーゼの一部に備えられている。本セルラーゼ複合体に用いるドックリンドメインとしては、公知の各種のセルロソーム生産微生物のセルラーゼのドックリンドメインから選択される。例えば、C. thermocellumのエンドグルカナーゼのドックリンドメインを含むアミノ酸配列が挙げられる。ドックリンリンドメインは、活性ドメインのＮ末端側及びＣ末端側のいずれの側にあってもよいが、好ましくは、Ｃ末端側に配置される。
【００５７】
本タンパク質複合体は、既述の本セルラーゼ組成物が含みうる他のセルラーゼがコヘシンタンパク質に保持されていてもよい。他のセルラーゼに関しても、本タンパク質と同様に、ドックリンドメインが付加されてキメラ化されていてもよいし、本来的にドックリンドメインを有しているセルラーゼであってもよい。他のセルラーゼに付加されるドックリンドメインは、本タンパク質に付加されるドックリンドメインと同一であってもよいし異なっていてもよい。
【００５８】
コヘシンタンパク質は、コヘシンタンパク質は、本タンパク質が備えるドックリンドメインを結合する１又は２以上のコヘシンドメインを有している。これにより、コヘシンタンパク質は、本タンパク質をコヘシン−ドックリン結合で保持でき、本タンパク質複合体の骨格タンパク質として機能する。また、本タンパク質複合体は、他のセルラーゼを保持するための異なるコヘシンドメインの組み合わせあるいは配列を有するコヘシンタンパク質を備えていてもよい。
【００５９】
コヘシンタンパク質が備える、１又は２以上のコヘシンドメインは、セルロソームのスキャホールディンタンパク質が備えるコヘシンドメインに由来している。コヘシンドメインは、セルロソーム生産微生物の形成するセルロソームにおけるタイプＩ〜III骨格タンパク質に備えられる触媒活性のあるセルラーゼ等を非共有結合で結合するドメインとして知られている（粟冠ら、蛋白質核酸酵素、Vol.44、No.10（1999）、p41-p50、Demain, A. L., et al., Microbiol Mol. Biol Rev., 69(1), 124-54(2005), Doi, R. H., et al., J. Bacterol., 185(20), 5907-5914(2003)等）。すなわち、コヘシンドメインとしては、セルロソームのタイプＩ骨格タンパク質上のタイプＩコヘシンドメイン、同タイプII骨格タンパク質上のタイプIIコヘシンドメイン及びタイプIII骨格タンパク質上のタイプIIIコヘシンドメインが挙げられる。こうした各種タイプのコヘシンドメインとしては、各種セルロソーム生産微生物において多数その配列が決定されている。これらの各種のタイプのコヘシンのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、NCBIのHP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等を介してアクセス可能な各種のタンパク質データベースやDNA配列のデータベースにより容易に取得することができる。
【００６０】
コヘシンドメインは、こうしたコヘシンドメインに由来するドメインであって、キメラタンパク質のドックリンドメインと結合することができる。セルラーゼの活性ドメインへのドックリンドメインのキメラ化は活性ドメインの活性が意図せずに低下することなどにより困難な場合があることから、キメラタンパク質のドックリンドメインに応じてコヘシンドメインを選択することができる。また、コヘシン−ドックリン結合の強度等も考慮してコヘシンドメインを選択することができる。
【００６１】
本タンパク質複合体にあっては、例えば、キメラタンパク質のドックリンドメインが例えば、C. thermocellumのcelＡのドックリンドメインに対して、C. thermocellumのスキャホールディンタンパク質のコヘシンドメインが挙げられる。
【００６２】
本タンパク質複合体は、タンパク質の複合体として、それ自体独立した形態であってもよいし、適当なキャリアに固定化ないし保持されていてもよい。また、酵母等の微生物の表層に提示された状態であってもよい。本タンパク質複合体は、例えば、それぞれのタンパク質を公知のタンパク質製造方法により取得し、これらのタンパク質を接触させる条件下において、コヘシンタンパク質に対してキメラタンパク質を自己集合させることにより取得できる。本タンパク質複合体を細胞表層に提示する場合には、コヘシンタンパク質を細胞表層に提示させ、キメラタンパク質を細胞外に分泌するように発現させる。
【００６３】
また、本タンパク質複合体は、その構成タンパク質のうち１又は２以上を分泌発現する微生物の培養上清又はそのタンパク質精製物を混合してすべての構成タンパク質を接触させて自己集合させることによって取得できる。なお、構成タンパク質のすべてが微生物によって分泌発現されなくてもよく、必要に応じ微生物によって生産されない構成タンパク質を別途製造して混合してもよい。また、構成タンパク質のすべてを分泌発現する微生物の場合、この微生物の培養上清に、これらタンパク質が自己集合可能な状態で含まれるため、その培養上清に、本タンパク質複合体を取得できる。
【００６４】
（セルロースの分解産物の生産方法）
本明細書に開示されるセルロースの分解産物の生産方法は、セルロースを含む材料と本タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼを接触させる工程を備える、方法が提供される。本方法によれば、耐熱性が向上したセロビオヒドロラーゼである本タンパク質を用いることにより、より高温で効率的にセルロースを分解できる。セルロース系の分解のための温度としては、例えば、５０℃以上７０℃以下であり、より好ましくは５０℃以上６５℃以下であり、さらに好ましくは５０℃以上６０℃以下である。
【００６５】
この工程で用いる１種又は２種以上のセルラーゼとしては、本セルラーゼ組成物に含まれうる他のセルラーゼから適宜選択して用いることができる。分解工程においては、セルラーゼは、本セルラーゼ組成物として供給されてもよいし、本タンパク質複合体として提供されていてもよい。分解工程における処理温度や時間等の条件は、用いるセルラーゼの種類及びセルロースの供給形態によって適宜設定することができる。
【００６６】
本明細書において、セルロースとは、バイオマスから他の成分から分離工程を経たセルロースとして供給されてもよいし、リグニン、ヘミセルロース及び／又はペクチンが共存する未処理あるいは部分的な前処理を施したバイオマスなどセルロースを含有する材料として供給されてもよい。セルロースを含む材料としては、稲ワラ、麦ワラ、バガス、枯れ草等の廃棄資源のほか、未利用資源であってもよく、セルロースを含んでいれば特に限定されない。また、本明細書において、セルロース分解産物としては、セルロースの低分子化物であればよく、グルコース、そのオリゴマー、セロビオース等が挙げられる。
【００６７】
（有用物質の生産方法）
本明細書の開示によれば、有用物質を生産する方法であって、セルロースを含む材料と本タンパク質を含む１種又は２種以上のセルラーゼとを接触させる工程と、前記接触工程で得られた前記セルロースの分解産物を含む炭素源の存在下、微生物培養する工程を備える、方法が提供される。本生産方法によれば、本タンパク質を用い、向上したセロビオヒドロラーゼ活性がセルロースの分解に寄与するため、効率的にセルロースを分解することができる。本生産方法では、セルロースの分解工程と、微生物の培養工程を独立して実施できる。したがって、セルロースの分解工程は、本セルラーゼ組成物や本タンパク質複合体を、酵素製剤として用いてセルロースを分解し、その後、このセルロース分解産物を培養工程に供給して発酵してもよい。
【００６８】
また、本明細書の開示によれば、セルロースを含む炭素源を、本タンパク質を含む２種以上のセルラーゼの存在下、微生物を培養する工程を含む、有用物質の生産方法も提供される。この形態によれば、本タンパク質の向上したセロビオヒドロラーゼ活性に基づき、いわゆる糖化・発酵同時プロセス（ＣＢＰ）を効率的に行うことができる。本形態では、発酵用微生物が本タンパク質及びその他のセルラーゼを自己生産してもよいし、外部から供給してもよい。自己生産と外部供給とを組み合わせてもよい。微生物が本タンパク質を含む２種以上のタンパク質を自己生産するときには、本タンパク質等を細胞外に分泌する形態であってもよいし、細胞表層に提示する形態であってもよい。
【００６９】
培養工程で用いる微生物は、既に形質転換細胞について説明した宿主を初めとして酵母などのエタノール生産微生物や麹菌等の真核微生物を好ましく用いることができる。微生物は、人工的に取得された微生物であってもよい。例えば、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して得られる本来の代謝物でない化合物を産生可能に遺伝子工学的に改変したものであってもよい。このような微生物を用いることで、例えば、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリンの生産、プラスチック・化成品原料を生産するなどのバイオリファイナリー技術に適用できる。有用物質としては特に限定しないが、グルコースを利用して微生物が生成可能なものが好ましく、上記したように、バイオリファイナリー技術全般にわたる物質を対象とすることができる。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下に述べる遺伝子組換え操作は既出のMolecular Cloningに従い行った。
【実施例１】
【００７１】
（１）耐熱性候補変異の選定
P. chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼII（PcCBH2）は、触媒ドメインとセルロース結合ドメイン（CBD）がリンカーでつながった構造を持つ。以下の実施例では、触媒ドメイン内のアミノ酸置換による耐熱化を試みた。すなわち、5種類の耐熱カビ（Hypocrea koningii、Acremonium cellulolyticus Y-94、Agaricus bisporus、Talaromyces emersonii、Lentinula edodes L54）由来のセロビオヒドラーゼII及びPcCBH2の触媒ドメインのアミノ酸配列をホモロジー検索した。上記ホモロジー検索後のアミノ酸配列の各部位で、耐熱カビ由来セルラーゼ間での相同性が高く、かつPcCBH2とは異なるアミノ酸である部位を探した。その結果、上記条件を満たす45部位の51アミノ酸置換を耐熱性候補変異として選定した。それぞれの変異候補の部位とそのアミノ酸置換を図１に示す。
【００７２】
（２）耐熱性候補変異を含む変異体の構築
耐熱化への初期配列としてPcCBH2変異体5−6（配列番号５、配列番号６）を用いた。変異体5−6は、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、そのCBDのみに、アミノ酸置換（S22P置換（塩基配列上の変異：T64C））及び同義置換（塩基配列上の変異：G9A）をそれぞれ各一つ備えており、試験管内合成において野生型PcCBH2よりもタンパク質合成量が高い変異体であることがわかっている。耐熱性に対する上記耐熱化候補変異の寄与を評価するため、変異体5−6に変異候補（アミノ酸置換）を１つまたは2つ含む変異体（以後、耐熱化候補変異体と呼ぶ）を以下の表４に示すように合計43個作成することとした。これらの変異体に相当するアミノ酸配列をそれぞれコードするオリゴマーＤＮＡ及びその直近の相補鎖オリゴマーＤＮＡをプライマーとして用いてインバースＰＣＲ法でプラスミド鎖を増幅し、５’−末端をリン酸化後、ライゲーションによるプラスミドの環状化、大腸菌への形質転換を経て取得した。各変異体の変異導入は、シーケンスを行い確認した。なお、以下の実施例においては、これら４３個の変異位置は、PcCBH2の触媒ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）の最初のアミノ酸（Ｓ）を１としたときの変異位置で示す。
【００７３】
【表４】
0005771920.tif 000005
【００７４】
（３）セルラーゼの試験管内合成方法
４３種の変異体を試験管内で合成した。試験管内合成の鋳型として、（１）で取得したＤＮＡに対してプライマー（5’- ATCTCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’（配列番号７）、 5’- TCCGG ATATA GTTCC TCCTT TCAG-3’（配列番号８））を用いて増幅させたPCR産物を、PCR purification kit (Qiagen)で精製したものを用いた。なお、このPCR産物には、T7プロモーター配列、開始コドン、遺伝子配列、終始コドン、ターミネーター配列が含まれている。
【００７５】
変異体の試験管内合成は、表５に示す組成の反応液で、２６℃、３時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写翻訳共役反応として行った。無細胞蛋白質合成反応の促進剤として、ＡＴＰの枯渇を補うためにクレアチンキナーゼをＡＴＰ生成酵素（ＡＤＰ＋ホスホクレアチン→ＡＴＰ）として、リファンピシンはＲＮＡ合成開始阻害剤、フォリン酸はＲＮＡ転写阻害剤として添加した。また、タンパク質のフォールディングを助ける因子として、各種シャペロンを高発現した大腸菌Ａ１９株から抽出したＳ３０菌体抽出液（−ＤＴＴ）を用いた。更に、Ｓ−Ｓ結合形成促進因子である、カビ由来プロテインジスルフィドイソメラーゼも添加した。
【００７６】
【表５】
0005771920.tif 000006
【実施例２】
【００７７】
（１）変異体の耐熱試験方法
合成した変異体を、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で１００倍に希釈、４９，５０，５１，５２，５３及び５４℃の各温度で２時間保温する熱処理後、その残存活性をリン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）分解（反応条件：４０℃、１６時間）後の遠心上精の還元糖量をＴＺアッセイ法（Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115）を用いて評価した。残存活性は熱処理前の活性との比で表した。またセルラーゼの耐熱温度は上記残存活性が５０％となるときの温度と定義した。
【００７８】
（２）耐熱化候補変異体の耐熱試験
作製した４３個すべての変異体につき、上記の耐熱性評価を行った。結果を図２に示す。図２に示すように、初期配列の変異体５−６の耐熱温度は５０．３℃であったのに対し、耐熱性変異候補を含む変異体の耐熱温度は４８〜５１．５℃の間でばらついていた。また、熱処理前のセロビオヒドロラーゼ活性を評価したところ、図３に示すように、初期変異体５−６と比較して著しく減少している変異体はなかった。すなわち耐熱化候補のアミノ酸に置換しても、セルラーゼ活性への影響は見られないことが示された。
【００７９】
（３）有利変異の選定
以上の耐熱性評価の結果、１３個の耐熱性が向上した変異体が得られた。その耐熱性を向上させた変異を有利変異と呼ぶこととした。今回に実験で得られた有利変異を表６及び図４に示す。図４に示すように、これらの有利変異は、いずれも、５２℃環境下で２時間保温後において、氷冷保持条件と比較して１．３〜７倍残存活性を向上させるものであった。
【表６】
0005771920.tif 000007
【００８０】
（４）第１世代変異体の選択
有利変異を一つずつ親配列に加算したＤＮＡを合成し、当該ＤＮＡを鋳型として、各変異体を実施例１と同様にして試験管内合成して、既に実施した方法に準じて耐熱性評価を行ったところ、最も耐熱性が高かった有利変異Ｍ−１８による変異体第１世代とした。なお、以下に、世代毎の変異体における変異の組み合わせを示す。
【００８１】
【表７】
0005771920.tif 000008
【実施例３】
【００８２】
（第２世代の選択）
実施例２で得た変異体Ｔ２５９Ｈ（Ｍ１−１８）に有利変異Ｑ２９８Ｓ／Ｆ２９９Ｌ（Ｍ１−２０）を導入した変異体（Ｗ１８２０）を実施例１と同様にして合成し、実施例２と同様にして耐熱性を評価した。結果を図５に示す。図５に示すように、有利変異を蓄積したＷ１８２０の耐熱性はＭ１−１８及びＭ１−２０と比較して向上していた。この変異体を第２世代として選択した。
【実施例４】
【００８３】
（第３世代の選択）
実施例３で得られた変異体Ｗ１８＋２０に有利変異（Ｍ１−１，−２，−４，−１２）をそれぞれ導入し、その変異体を実施例１と同様にして合成し、実施例２と同様にして耐熱性を評価した。結果を図６に示す。図６に示すように、有利変異Ｔ４７Ｉ／Ｓ５１Ｑ（Ｍ１−４）を導入した変異体（Ｔｒｉ４）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第３世代として選択した。
【実施例５】
【００８４】
（第４世代の選択）
実施例４で得られた有利変異が３個導入された変異体Ｔｒｉ４に４つの有利変異（Ｍ１−１，−１１，−１２，−１４，−１５）をそれぞれ導入した変異体を、実施例１と同様にして合成し、実施例２と同様にして耐熱性を評価した。結果を図７に示す。図７に示すように、有利変異Ｍ１７６Ｉ（Ｍ１−１５）を導入した変異体（Ｑｕａｒｄ１５）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第４世代として選択した。
【実施例６】
【００８５】
（第５世代の選択）
実施例５で得られた有利変異が４個導入された変異体Ｑｕａｒｄ１５に４つの有利変異（Ｍ１−１，−１１，−１２，−２７）をそれぞれ導入し、その変異体を、実施例１と同様にして合成し、実施例２と同様にして耐熱性を評価した。結果を図８に示す。図８に示すように、耐熱評価した。その結果、有利変異Ａ１５８Ｅ（Ｍ１−１２）を導入した変異体（Ｑｕｉｎｔ１２）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第５世代として選択した。
【実施例７】
【００８６】
（第６世代の選択）
実施例６で得られた有利変異が５個導入された変異体Ｑｕｉｎｔ１２に耐熱性への寄与度が高かった有利変異Ｑ２２４Ｒ／Ａ２２６Ｓ（Ｍ１−３７）とその他の３つの有利変異（Ｍ１−１，−２１，−２５）をそれぞれ導入した変異体を、実施例１と同様にして合成し、実施例２と同様にして耐熱性を評価した。結果を図９に示す。図９に示すように、Ｑｕｉｎｔ１２にＱ２２４Ｒ／Ａ２２６Ｓ及び有利変異Ｓ１００Ｔ（Ｍ１−２５）を導入した変異体（Ｓｅｐｔ２５）の耐熱性が最も向上していた。この変異体を第６世代として選択した。
【実施例８】
【００８７】
（１）スクリーニングによる耐熱化変異体の取得
加算していない有利変異（Ｍ１−１，−２，−１１，−２１，−２７）を変異体Ｓｅｐｔ２５にばらつきを持って導入後、スクリーニングにより最も高い耐熱性を有する変異体の取得を試みた。具体的には、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて変異を導入し、その変異体９２個をクローニングした。実施例１と同様にして試験管内合成した変異体を56℃にて２時間の熱処理後、熱処理前に対する残存活性を指標にスクリーニングを行った。結果を図１０に示す。図１０に示すように、熱処理に対する残存活性がSept25と比較して約5倍向上した変異体が得られた。
【００８８】
（２）スクリーニングで得られた変異体の耐熱性評価
上記スクリーニングで、残存活性が高かった上位３個の変異体について、実施例２と同様に耐熱性を評価した。結果を図１１に示す。図１１に示すように、評価した３変異体は共にＳｅｐｔ２５と比較して耐熱温度が１℃向上していた。
【００８９】
（３）スクリーニングで得られた耐熱化変異体のアミノ酸配列の決定
上記で得られた耐熱化変異体のアミノ酸配列を塩基配列解析行うことで解析した。その結果、残りの有利変異（Ｍ１−１，−２，−１１，−２１，−２７）がすべて入っていることが分かった。この得られたクローンを耐熱化実験での最終変異体（Ｍａｌｌ４と呼ぶ）こととした。
【実施例９】
【００９０】
（各世代の耐熱化変異体を耐熱性評価）
これまでに得られた各世代の耐熱変異体につき、耐熱試験を行った。結果を図１２に示す。図１２に示すように、その結果、有利変異を加えるに従い耐熱温度が向上していることが確認できた。初期変異体５−６の耐熱温度が４９．９℃であるのに対し、耐熱化変異体Ｓｅｐｔ２５は４．４℃向上した５４．３℃、さらに最終変異体Ｍａｌｌ４では５．４℃向上した５４．３℃であった。
【実施例１０】
【００９１】
（試験管内合成セルラーゼの耐久性評価）
野生型ＰｃＣＢＨ２、変異体５−６及び耐熱化変異体Ｓｅｐｔ２５を用いて、５０℃環境下での耐久性を評価した。具体的には、各セルラーゼを試験管内合成後、５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で１００倍に希釈後、５０℃で保温した。０，３，６，９，２４，３２及び５２時間後にサンプリングし、その遠心上精の還元糖量を測定した。結果を図１３に示す。図１３に示すように、野生型ＰｃＣＢＨ２が２４時間でほぼ失活しているのに対し、Ｓｅｐｔ２５は５０℃環境下５２時間後でも９０％の活性が保たれていた。
【実施例１１】
【００９２】
（有利変異の効果の検証）
各耐熱化変異体の親配列を用いて、耐熱温度の理論値と実測値を比較した。耐熱温度の理論値は、各有利変異の耐熱性向上への寄与度（有利変異体の耐熱温度と変異体５−６の耐熱温度との差）をそれぞれ算出し、耐熱化変異体が持つ有利変異の寄与度の合計を変異体５−６の耐熱温度（４９．９℃）に足すことで算出した。結果を図１４に示す。図１４に示すように、耐熱温度の理論値と実測値では直線性が見られた。この結果は、今回のＰｃＣＢＨ２耐熱化実験において加算性がほぼ完全に成り立っていたことを示す。
【実施例１２】
【００９３】
（１）酵母での変異体発現及びその精製方法
野生型ＰｃＣＢＨ２と、上記で得られた耐熱化変異体Ｓｅｐｔ２５，Ｍａｌｌ４を酵母発現ベクターｐＲＳ４３６に導入し、S. cerevisiae BJ5465株でセルラーゼを分泌発現させた。精製は、硫酸アンモニウムを含む緩衝液（１Ｍ（ＮＨ４）３ＳＯ４，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０）で平衡化したアビセルカラムに酵素を吸着させ、上記緩衝液で洗浄後、ミリＱ水で溶出した。
【００９４】
（２）精製変異体の定量方法
酵母発現精製変異体につき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、ＣＢＢ染色したバンドの色の濃さを蛍光イメージアナライザー（ＦＬＡ９０００、富士フィルム株式会社）で検出、画像解析ソフトであるＭｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ（富士フィルム株式会社）で定量解析を行った。
【００９５】
（３）比活性評価
酵母発現精製セルラーゼの比活性を評価した。各セルラーゼの量は定量解析結果に基づき１０ｎｇに調整し、０．５％ＰＳＣ１００μlで４０℃にて３時間反応させた。遠心上精の還元糖量をＴＺアッセイ法で評価した。結果を図１５に示す。図１５に示すように、精製セルラーゼの比活性は野生型と比較して、Ｓｅｐｔ２５は約９０％、Ｍａｌｌ４はほぼ同じであった。
【実施例１３】
【００９６】
（１）酵母発現変異体の耐熱性評価
実施例１３で取得した酵母で発現させた変異体の耐熱性評価を行った。各サンプルを同じタンパク質濃度（１０ｎｇ／５０μｌ）に５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で希釈し、実施例２に準じた方法で耐熱評価を行った。なお、チューブへの非特異的吸着を防ぐために終濃度０．０１％となるように界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を酢酸緩衝液に添加し用いた。なお、同時に、実施例１に示す方法で試験管内合成したＷＴ、Ｓｅｐｔ２５、Ｍａｌｌ４の耐熱性も併せて評価した。耐熱性は４９，５１，５３，５５，５７，５９℃で２時間保温後の残存活性で評価した。結果を図１６に示す。図１６に示すように、酵母発現変異体でもＷＴ、Ｓｅｐｔ２５、Ｍａｌｌ４の順に耐熱性が向上し、試験管内合成での結果と同様に導入した耐熱性有利変異が多く持つほど耐熱性が向上していた。また、酵母発現変異体は、試験管内合成の変異体よりもいずれも耐熱温度が向上した。すなわち、酵母発現変異体のＭａｌｌ４の耐熱温度はＷＴと比較して、５．７℃耐熱温度が向上し、５８．１℃であった。試験管内合成酵素と酵母発現酵素との耐熱温度の差は、酵母発現によるタンパク質への糖鎖修飾による耐熱性向上の効果によるものであると考えられた。
【００９７】
（２）酵母発現変異体の耐久性評価
野生型ＰｃＣＢＨ２、耐熱化変異体Ｓｅｐｔ２５及びＭａｌｌ４を用いて、５０℃環境下での耐久性を評価した。具体的には、各タンパク質を同じタンパク質濃度（１０ｎｇ／５０ｕｌ）に５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で希釈後、５０℃で保温。０，６，２４，４０，５０，７２時間後にサンプリングし、その遠心上精の還元糖量を測定した。結果を図１７に示す。図１７に示すように、野生型ＰｃＣＢＨ２が７２時間後でほぼ失活しているのに対し、耐熱化変異体（Ｓｅｐｔ２５及びＭａｌｌ４）は、５０℃環境下７２時間後でも９０％以上の活性が保たれていた。
【００９８】
（３）酵母発現変異体のpH依存性評価
酵母発現変異体のｐＨ依存性を評価した。各タンパク質（野生型ＰｃＣＢＨ２、Ｓｅｐｔ２５、Ｍａｌｌ４）を０．５ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で同じタンパク質濃度（１０ｎｇ／５０μｌ）に希釈したものを用いた。ｐＨ３から９に２５ｍＭリン酸クエン酸緩衝液で調整した１％ＰＳＣに各タンパク質を同量加え、４０℃で１６時間分解反応させた後、遠心上精の還元糖量でＴＺアッセイ法にて評価した。結果を図１８に示す。図１８に示すように、耐熱化変異体も野生型ＰｃＣＢＨ２と同じ挙動を示し、ｐＨ４及び５をピークとしてなだらかに相対活性は落ちていた。
【００９９】
（４）酵母発現変異体のエタノール濃度依存性評価
酵母発現変異体のエタノール濃度に対する依存性を評価した。各タンパク質（野生型ＰｃＣＢＨ２、Ｓｅｐｔ２５、Ｍａｌｌ４）を５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０でセルラーゼ濃度（１０ｎｇ／５０ｕｌ）に希釈後、エタノール濃度を０，２，５，１０％に調整した各０．８％ＰＳＣに同量加え、４０℃で１６時間分解反応させ、遠心上精の還元糖量をＴＺアッセイ法にて評価した。結果を図１９に示す。図１９に示すように、耐熱化変異体も野生型ＰｃＣＢＨ２と同じ挙動を示し、エタノール濃度の増加とともにセルラーゼ活性は減少していた。
【０１００】
（５）温度依存性評価
酵母発現変異体の温度依存性を評価した。各タンパク質（野生型ＰｃＣＢＨ２およびＭａｌｌ４）を５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０でセルラーゼ濃度（１０ｎｇ／５０μｌ）に希釈、５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０で１００倍希釈後同量の１％ＰＳＣと混合し、２５℃、３０℃，３５℃，４０℃，４５℃，５０℃，５５℃，６０℃，６５℃及び７０℃で０，１，２，３及び５時間反応させた。分解活性の評価はそれぞれの遠心上精の還元糖量で行った。なお至適温度の評価は、経時変化の傾きが直線性に保たれている、２時間後のデータを用いた。結果を図２０に示す。図２０に示すように、高温側（５５〜７０℃）では耐熱化変異体Ｍａｌｌ４は野生型ＰｃＣＢＨ２よりも相対活性が向上していた。一方低温（２５〜５０℃）では、Ｍａｌｌ４の相対活性は野生型ＰｃＣＢＨ２とほぼ同じであった。
【実施例１４】
【０１０１】
（市販酵素セルクラストとの相乗効果）
野生型PcCBH2は市販酵素セルクラストへの添加により、単体での分解活性以上の効果を上げる、すなわち相乗効果を示すことが知られている。そこで耐熱性PcCBH2変異体Mall4においてもセルクラストへの添加効果を調べた。酵母発現させて精製した野生型PcCBH2及びMall4を、単独及び種々の比率で混合し、アビセルを基質として（最終濃度0.25%）40℃で16時間分解反応を行った後、遠心上精の還元糖量で評価した。結果を図２１に示す。図２１の上段に野生型PcCBH2の評価結果を示し、同下段にMall4変異体の評価結果を示す。各グラフの上辺にPcCBH2の添加量を示し、下辺にセルクラストの添加量を示す。セルクラスト及びPcCBH2の単独の活性をそれぞれダイヤ及び四角で表し、相加予測値を×で表し、実測された相乗効果を三角で表す。
【０１０２】
図２１に示すように、セルクラストの添加に対して野生型PcCBH2及びMall4はともに同じ挙動を示し、混合時の還元糖量は、いずれも、相加予測値を上回る値を示した。以上より、耐熱性変異体Mall4は、野生型PcCBH2と同様に、セルクラストとの相乗効果を持つことが示された。
【実施例１５】
【０１０３】
（CBD欠失PcCBH2変異体の耐熱性評価）
耐熱性変異体Mall4のCBD部位を削除した変異体を作製した。当該変異体は、pET23bのNdeI/HindIIIに当該変異体をコードするＤＮＡを挿入したプラスミドをテンプレートに、２種類のオリゴマー配列（5’-GGATCTGCGGTCACGACCACCTCCGTT -3’（配列番号９）, 5’- CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’（配列番号１０）をプライマーとしてインバースＰＣＲを行った。取得したＰＣＲ産物につき、アガロースゲル電気泳動、ゲル染色にて目的バンドを取り出し、ゲル中のＤＮＡをキット（Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-up System、Promega）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡ断片をポリヌクレオチドキナーゼ（New England BioLabs）で両5’- 末端をリン酸化後、ライゲーションキット(DNA Ligation kit、Takara)を用いてライゲーション反応をさせた。ライゲーション産物を大腸菌DH5α株に導入し、その形質転換体を培養後、プラスミド抽出精製キット（QIAprep Spin Miniprep Kit、Qiagen）で目的のＤＮＡ断片を含むプラスミドを取り出した。ＣＢＤ部位の欠失は、シーケンスにより確認した。
次いで、無細胞合成法により変異体タンパク質を取得した。すなわち、試験管内合成の鋳型として、作製したプラスミドに対して２本のプライマー（5’- ATCTC GATCC CGCGA AATTA ATAC-3’（配列番号７）、 5’- TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3’（配列番号８）で増幅、PCR purification kit (Qiagen)で精製したＰＣＲ産物を使用した。なおこのＰＣＲ産物には、T7プロモーター配列、開始コドン、遺伝子配列、終始コドン、ターミネーター配列が含まれている。
【０１０４】
試験管内合成は、表７に示す組成の反応液で、26℃、3時間、in vitroでの転写翻訳共役反応を行なった。無細胞蛋白質合成反応の促進剤として、ＡＴＰの枯渇を補うためにクレアチンキナーゼをＡＴＰ生成酵素（ＡＤＰ＋ホスホクレアチン→ＡＴＰ）として、リファンピシンはＲＮＡ合成開始阻害剤、フォリン酸はＲＮＡ転写阻害剤として添加した。また、タンパク質のフォールディングを助ける因子として、各種シャペロンを高発現した大腸菌Ａ１９株から抽出したＳ３０菌体抽出液（−ＤＴＴ）を用いた。更に、Ｓ−Ｓ結合形成促進因子であるカビ由来プロテインジスルフィドイソメラーゼも添加した。なお合成されたセルラーゼ量を評価するため、蛍光標識されたリジン（FluoroTect GreenLys in vitro Translation Labeling System：プロメガ）を混ぜて合成反応を行った。なお、併せて、変異体5-6及びMall4も試験管内合成した。
【０１０５】
【表８】
0005771920.tif 000009
【０１０６】
（ＣＢＤを欠失したPhanerochaete chrysosporium由来のセロビオヒドロラーゼIIの試験内合成のためのＤＮＡ断片の調製）
pET23bのNdeI/HindIIIにファネロケーテ由来セロビオヒドラーゼ遺伝子（配列番号３）を挿入したプラスミドpET23b_PcCBH2wtをテンプレートに、２種類のオリゴマー配列（5’-GGATCTGCGGTCACGACCACCTCCGTT -3’（配列番号９）, 5’- CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’（配列番号１０））をプライマーとしてインバースＰＣＲを行った。取得したＰＣＲ産物につき、アガロースゲル電気泳動、ゲル染色にて目的バンドを取り出し、ゲル中のＤＮＡをキット（Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-up System、Promega）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡ断片をポリヌクレオチドキナーゼ（New England BioLabs）で両5’- 末端をリン酸化後、ライゲーションキット(DNA Ligation kit、Takara)を用いてライゲーション反応をさせた。ライゲーション産物を大腸菌DH5α株に導入し、その形質転換体を培養後、プラスミド抽出精製キット（QIAprep Spin Miniprep Kit、Qiagen）で目的ノＤＮＡ断片を含むプラスミドを取り出した。ＣＢＤ部位の欠失は、シーケンスにより確認した。
【０１０７】
取得した各セルラーゼの耐熱性を評価した。その結果を図２２に示す。図２２に示すように、耐熱化変異体Mall4及びCBDを欠失させた耐熱化変異体Mall4は、いずれも変異体5-6（CBD保有）と比較して、初期配列と比較して良好な耐熱性を有していることがわかった。この結果から、本明細書に開示される変異体は、CBDの保有状態にかかわらず、触媒ドメインの変異に基づき、耐熱性を発揮できることがわかった。
【実施例１６】
【０１０８】
（異種生物由来のCBDに置換した変異体の耐熱性評価）
野生型および耐熱化変異体Mall4のCBD部位をトリコデルマ・ハージャナム(Trichoderma harsianum)由来エンドグルカナーゼ（EGII）のCBDに交換した変異体を作製した。これら２種類の変異体を、それぞれThCBD1-PcCD(W)、ThCBD1-Mall4(W)と標記する。
【０１０９】
これらの変異体のうち、ThCBD1-PcCD(W)は、T. harzianumのエンドグルカナーゼIIのＣＢＤ１由来のＣＢＤ１領域（リンカーを含む、以下ThCBD1＋リンカー部分という。配列番号１１、１２）とP. chrysosporiumのセロビオヒドロラーゼII（以下、PcCBH2全長という。（配列番号３，４））のＣＤ領域（PcCD、リンカー含む、配列番号１３，１４）とを融合した変異体である。この変異体をSaccharomyces cerevisiaeで分泌発現するための発現ベクターを以下のように作製した。
【０１１０】
変異体の基となるThCBD1＋リンカー部分とPcCBH2全長を酵母コドンに最適化された形で全合成をオペロンバイオテクノロジ株式会社に依託した。全合成されたＤＮＡ断片を基に、以下に示すプライマーを用いて、オーバーラッピングPCRを用いて、ThCBD1＋リンカー部分をPcCDに融合させた遺伝子断片（ThCBD1-PcCD(W)）を作製した。
【０１１１】
【表９】
0005771920.tif 000010
【０１１２】
S.cerevisiaeでの分泌発現にはpAUR112（タカラバイオ）のSmaIサイトにTDH3プロモーター-Rhizopus orizaeのグルコアミラーゼ由来シグナル配列（MQLFNLPLKVSFFLVLSYFSLLVSAA）-CYCターミネーターを挿入したpAUR112-GAPSSRGを用いた。pAUR112-GAPSSRGをSphI、ClaIで制限酵素処理し、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（タカラバイオ）を用いて、作製した4種類の遺伝子がRhizopus orizaeのグルコアミラーゼ由来シグナル配列の下流に来るようにサブクローニングし、分泌発現ベクターを構築した。構築したベクターをFrozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research）を用いてBJ5465株に形質転換し、プラスミドに準備された選択マーカーにより、各形質転換体を選択した。
【０１１３】
また、ThCBD1-Mall4(W)は、触媒ドメイン配列を酵母コドンに最適化されたMall4を用い、ThCBD1-PcCD（W）の取得時に用いたのと同じプライマーを用いて、オーバーラッピングPCRによりThCBD1-Mall4(W)（ThCBD1＋リンカー部分をMall4のCD（リンカー部分を含む）に融合した）遺伝子断片を作製した。その後、上記と同様にして作製した形質転換体からこの変異体を取得した。これらの変異体をそれぞれ分泌発現させた酵母の培養上精を用いて耐熱性評価を行った。結果を図２３に示す。
【０１１４】
図２３に示すように、耐熱化変異体Mall4の触媒ドメインを持つThCBD1-Mall4（W）は、野生型PcCBH2およびThCBS1-PcCD(W)と比較して、耐熱性が向上していることが示された。すなわち、CBDを異種生物由来のものに交換してもMall4の触媒ドメインを持つセルラーゼの耐熱性が向上した。以上の結果から、耐熱性変異を持つ触媒ドメインCBDの由来にかかわらず、セルラーゼの耐熱性向上に寄与していることを意味している。
【０１１５】
実施例１６及び１７の結果によれば、耐熱性変異を有する触媒ドメインを用いることで、ＣＢＤの有無や種類にかかわらず、耐熱性セルラーゼを提供できることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
配列番号５、６：変異体、配列番号７〜１０、１５〜１８:プライマー
【図１】
0005771920.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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