(57)【要約】【課題】核酸を含み、核酸のための体内送達剤として利用するのに適したナノ粒子が提供される。【解決手段】このナノ粒子はポリエチレンイミンおよびホスホリピッドのごときポリカチオンの共有結合体を利用する。最終ＤＮＡ含有ナノ粒子はベシクル構造を備えており、ポリプレクス核は混合リピッド／ＰＥＧ−リピッド単層エンベロープによって包囲されており、作製が容易であり、可載重量が多く、体内での視認性が高い。これらナノ粒子は体内安定性が優れており、長時間の体内循環に対して耐久性があり、腫瘍のごとき生物標的に遺伝子を効果的に送達できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リピッド単層によって内包された核複合体を含んだナノ粒子であって、該核複合体は、カチオン性ポリマーの１以上の分子に静電気的に結合された１以上の核酸分子を含んでおり、該カチオン性ポリマーは前記リピッド単層に内在する第１リピッドに共有結合していることを特徴とするナノ粒子。
【請求項２】
カチオン性ポリマーは、直鎖状または分枝鎖状のポリエチレンイミン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリアリルアミン、アミノデクストラン、あるいはそれらの任意の組み合わせを含んでいることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
【請求項３】
第１リピッドは、天然または合成のホスホリピッド、グリコリピッド、アミノリピッド、スフィンゴリピッド、長鎖脂肪酸およびステロールで成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
【請求項４】
リピッド単層は１以上の非結合リピッドをさらに含んでいることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
【請求項５】
１以上の非結合ホスホリピッド分子は、天然または合成のホスホリピッド、グリコリピッド、アミノリピッド、スフィンゴリピッド、長鎖脂肪酸およびステロールで成る群から選択されることを特徴とする請求項４記載のナノ粒子。
【請求項６】
非結合ホスホリピッド分子の一部はペグ化（ＰＥＧｙ化）されていることを特徴とする請求項４記載のナノ粒子。
【請求項７】
リピッド単層はＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミンまたはｐＮＰ−ＰＥＧ−ＰＥを含んでいることを特徴とする請求項６記載のナノ粒子。
【請求項８】
リピッド単層はコレステロールをさらに含んでいることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
【請求項９】
リピッド単層は、結合第１リピッド、非結合リピッドおよびコレステロールを４：３：３のモル比で含んでいることを特徴とする請求項８記載のナノ粒子。
【請求項１０】
ＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミンをさらに含んでおり、リピッド単層は、結合第１リピッド、非結合リピッド、コレステロールおよびＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミンを４：３：３：０．３のモル比で含んでいることを特徴とする請求項８記載のナノ粒子。
【請求項１１】
１以上の核酸分子は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子あるいはそれらの任意の組み合わせを含んでいることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
【請求項１２】
１以上の核酸分子は、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを含んでいることを特徴とする請求項１１記載のナノ粒子。
【請求項１３】
１以上の核酸分子は治療遺伝子を含んでいることを特徴とする請求項１１記載のナノ粒子。
【請求項１４】
治療遺伝子は細胞毒性または自殺遺伝子であることを特徴とする請求項１３記載のナノ粒子。
【請求項１５】
１以上の核酸分子は該粒子の４０重量％までを含むことを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
【請求項１６】
１以上の核酸分子は該粒子の略２５重量％を含むことを特徴とする請求項１５記載のナノ粒子。
【請求項１７】
カチオン性ポリマーは第１リピッドのアルキル鎖またはアシル鎖の遠位端に共有結合していることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
【請求項１８】
粒子の粒径は略５０ｎｍであることを特徴とする請求項１記載のナノ粒子。
【請求項１９】
請求項１記載のナノ粒子を含んでいることを特徴とする非ウィルスベクター。
【請求項２０】
標的化剤をさらに含んでいることを特徴とする請求項１９記載のベクター。
【請求項２１】
標的化剤は、抗体、その抗原結合断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、細胞面受容体のリガンド、およびビオチンで成る群から選択されることを特徴とする請求項２０記載のベクター。
【請求項２２】
標的化剤は切断可能な結合によってベクターに結合されていることを特徴とする請求項２１記載のベクター。
【請求項２３】
切断可能結合は低ｐＨで切断されることを特徴とする請求項２２記載のベクター。
【請求項２４】
切断可能結合は、ヒドラジン結合であることを特徴とする請求項２３記載のベクター。
【請求項２５】
切断可能結合は、カチオン性ポリマーを第１リピッド分子に結合する結合であることを特徴とする請求項２２記載のベクター。
【請求項２６】
リピッド単層によって内包された核複合体を含んだ請求項１記載のナノ粒子の作製方法であって、
（ａ）核酸、カチオン性ポリマー−リピッド共有結合体および１以上の非結合リピッドを準備するステップと、
（ｂ）核複合体を形成するのに適した条件で前記核酸と前記カチオン性ポリマー−リピッド結合体とを接触させ、該核酸を該結合体のカチオン性ポリマー部分と静電気的に結合させるステップと、
（ｃ）前記核複合体と前記非結合リピッドとを接触させ、リピッド単層を形成するステップと、
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項２７】
核酸とカチオン性ポリマー−リピッド結合体はステップ（ｂ）において溶液内で接触され、核複合体を形成することを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
非結合リピッドは乾燥膜の形態で提供され、該乾燥膜はステップ（ｃ）の実行に先立って水和化されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
非結合リピッドは乾燥膜の形態で提供され、ステップ（ｂ）からの核複合体の水性縣濁液はステップ（ｃ）の最中に該乾燥膜の水和化に使用されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｃ）に先立って、非結合リピッドに対して、中性リピッド、グリコリピッド、ペグ化リピッド、ビオチン化リピッド、アシル化タンパク質またはグリコタンパク質、リピッドに結合されたタンパク質またがグリコタンパク質、抗体またはその抗原結合断片、単鎖抗体、ドメイン抗体、および細胞面受容体のリガンドで成る群から選択される成分を加えるステップをさらに含んでいることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
中性リピッドが加えられ、該中性リピッドはコレステロールであることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ペグ化リピッドが加えられ、該ペグ化リピッドはＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミンまたはｐＮＰ−ＰＥＧ−ＰＥであることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
中性リピッドが加えられ、該中性リピッドはコレステロールであり、ポリマー−リピッド結合体、非結合リピッド、コレステロールおよびＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミンのモル比は４：３：３：０．３であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
方法は細胞を請求項１９記載の非ウィルスベクターと接触させるステップを含んでおり、該ベクターの核酸分子が細胞内に導入されることを特徴とする方法。
【請求項３５】
細胞内での遺伝子の発現を抑制する方法であって、細胞を請求項１記載のナノ粒子と接触させるステップを含んでおり、該ナノ粒子はｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを含んでおり、該ｓｉＲＮＡまたは該ＲＮＡｉは細胞内に導入され、遺伝子の発現を抑制することを特徴とする方法。
【請求項３６】
患者の治療方法であって、疾患に罹患した患者に対して請求項１９記載の非ウィルスベクターを投与するステップを含んでおり、該ベクターの核酸分子は患者の細胞内に導入され、疾患を治療することを特徴とする方法。
【請求項２７】
疾患は癌であることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ベクターは腫瘍を標的としたものであることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
リピッドアシル鎖またはアルキル鎖の遠位端に共有結合したカチオン性ポリマーを含んでいることを特徴とする化学結合体。
【請求項４０】
ポリエチレンイミンを含んでいることを特徴とする請求項３９記載の結合体。
【請求項４１】
１−パルミトイル−２−アゼラオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを分枝鎖ポリエチレンイミンと反応させることで形成されることを特徴とする請求項４０記載の結合体。
【請求項４２】
請求項３９記載の結合体と核酸との複合体。
【請求項４３】
請求項３９記載の結合体を含んだミセル、リピッド単層またはリピッド二重層構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
プラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡのごとき核酸が付加された新規なミセル様ナノ粒子（ＭＮＰ）並びに遺伝子送達のためのナノ粒子の構築に対する新規な取り組みに関する。
【０００２】
[関連出願の説明]
本願は２００７年１１月９日に出願された米国仮特許願第６１／００２６２５号「遺伝子送達のためのナノ粒子」の優先権を主張する。
【０００３】
[連邦支援の研究又は開発に関する記述]
本発明に導いた研究は米国立衛生研究所の認可番号第ＲＯ１  ＨＬ５５５１９に基づく合衆国政府の支援により実行された。よって合衆国政府は本発明における権利の一部を所有する。
【背景技術】
【０００４】
体内遺伝子治療は、活性細胞部位へのオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）、ｓｉＲＮＡ）または遺伝子全体（プラスミドＤＮＡ）形態であるＤＮＡ（を活用した）薬剤の送達に依存する。数少ない例外は存在するが、局部投与が実行可能である場合には、遺伝子治療の幅広い臨床適用に向けた進歩には効果的な非侵襲的送達（搬送）方法の開発を必要とする。ＤＮＡベクターとしては非ウィルスシステムが望ましい。なぜなら非ウィルスベクターはウィルスベクターよりも安全で、取り扱いが容易であり、安価だからである。
【０００５】
非ウィルス遺伝子送達システムの中では、ポリマー系ポリプレクス(polyplex)およびリポプレクス(lipoplex)またはＤＮＡ混入リポソーム（リポゾーム）である脂質（“リピッド”）系のシステムが開拓されたが、臨床利用に関しては活用範囲が限定されていた。この理由は、主として体内での安定性の不足によるものであり、従って遺伝子治療剤を治療レベルで標的部位にまで送達ができないためである。ポリマー系システムとリピッド（脂質）系システムとを組み合わせたターシャリ（三次）リポポリプレクス(lipopolyplex)システムも開拓されている。その中で、ｂｉｏＰＳＬまたはｐＳＰＬＰのごときＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスを混入するリポソーム系ナノ粒子が提案され、体内で試験され、良好な結果をもたらしている。しかし、このような組み合わせシステムには複雑で、長時間を要する作製（調製）ステップが関与し、体内安定性、および長い循環時間をかけて標的部位に到達する能力があるにも拘わらず、搬送量が少ないという弱点を有している。
【０００６】
カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびその誘導体は遺伝子送達研究［非特許文献１、２、３、４、５］において幅広く研究されている。ＰＥＩは合成ポリカチオンの中で最高の正電荷（正帯電）密度であるという明確な利点を有している。この事実は、静電気的相互作用によるＤＮＡでの効果的な濃縮（縮合）を可能にする。ＰＥＩはまた、所謂“プロトンスポンジ”メカニズム［非特許文献１、２］および細胞内核局在化［非特許文献６］によって、高トランスフェクション効率を提供する“エンドソーム逃避”を媒介する固有メカニズムも備えている。約１ｋＤａから８００ｋＤａである幅広い分子量範囲と、直鎖形態または分枝鎖形態にて利用が可能である低分子量のＰＥＩは、低毒性であり、認容性に優れていることが示されている［非特許文献７］。
【０００７】
しかし、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体（錯体）の形態であるＰＥＩは、循環流からの急速な排除およびＲＥＳ（細網内皮システム）部位内での蓄積によって体内で十分な治療効果を発揮しなかった。この理由は、主として複合体の全体的な正電荷によるものである。この複合体の正電荷は、細胞膜の負電荷部分と相互作用し、複合体の細胞摂取を励起するが、複合体また血液成分と相互作用してオプソニン化を引き起こし、循環血液から急速に排除される。その結果、従来技術におけるＰＥＩ／ＤＮＡ複合体は数分で血液から排除され、主として肝臓や脾臓のごときＲＥＳ器官内で蓄積される［非特許文献８］。全身的に注入されると、これらＰＥＩ／ＤＮＡ複合体は生理学的環境においてＤＮＡの分離および凝集にも関与する［非特許文献８］。これら要素は知られているＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の体内利用を制限する。
【０００８】
ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体に改良体内安定性を提供するためにいくつかの取り組みが試行された［非特許文献３、５、９］。他のナノ粒子システム［非特許文献１０］の場合と同様に、そのような複合体に体内安定性を与え、循環時間を延長させるためにポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）が使用されてきた。この目的で、ＰＥＧは予備形成ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体に共有的に移植結合（接合）された［非特許文献１１］。あるいは、ＰＥＧ−移植結合ＰＥＩがＤＮＡとの複合体を形成するために使用されてきた［非特許文献１２］。加えて、予備形成ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体がアニオン性ペプチドおよびＰＥＧの共重合体を使用してＰＥＧでコーティングされた［非特許文献１３］。ＰＥＴをリポソーム技術で組み合わせることにより、セチル化ＰＥＩのごときリピッド移植結合ＰＥＩ［非特許文献１４］およびコレステロールＰＥＩ［非特許文献１５］が、ＤＮＡ付加ポリカチオン化リポソーム（ＰＣＬ）の作製に使用されてきた。予備形成ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体もＰＥＧ安定化リポソーム内に封入され、所謂“予備濃縮安定プラスミドリピッド粒子”（ｐＳＰＬＰ）［非特許文献１６］が得られた。しかしながら、体内遺伝子治療の成功率を高めるために他の選択肢も必要であることは明白である。
【０００９】
非ウィルス遺伝子送達システムのなかで、ポリマー系ポリプレクスと、リポプレクスまたはＤＮＡ混入リポソームであるリピッド系システムとが開発されたが、臨床での利用は限定的であった。これは主として体内での安定性の欠如、および治療レベルにおける標的部位への遺伝子治療剤の送達能力の欠如によるものである。ポリマー系システムとリピッド系システムとを組み合わせたターシャリリポポリプレクスシステムも開発された。その中で、ｂｉｏＰＳＬまたはｐＳＰＬＰのごときＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスを封入するリポソーム系ナノ粒子が提案され、体内利用のために試験され、良好な結果をもたらした。しかし、このような組み合わせシステムには複雑で時間を要する作製ステップが関与し、体内安定性および長時間循環による標的部位への到達能力は優れているにも拘わらず、その搬送性能は低い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】O. Boussif, F. Lezoualc’h, M.A. Zanta, M.S. Mergny, D. Scherman, B. Demeneix, J.P. Behr,「培養質及び生体内における細胞内への遺伝子及びオリゴヌクレオチドの多機能ベクターの導入：ポリエチレンイミン」Proc Natl Acad Sci USA 92(16)(1995)7297-7301
【非特許文献２】A. Akinc, M. Thomas, A.M. Klibanov, R. Langer,「ポリエチレンイミン仲介ＤＮＡトランスフェクション及びプロトンスポンジ仮説」J Gene Med 7(5)(2005)657-663
【非特許文献３】R. Kircheis, L. Wightman, E. Wagner,「修正ポリエチレンイミンの設計及び遺伝子送達活性」Adv Drug Deliv Rev 53(3)(2001)341-358
【非特許文献４】S.V. Vinogradov, E.V. Batrakova, A.V. Kabanov,「脳へのオリゴヌクレオチド送達ナノゲル」Bioconjug Chem 15(1)(2004)50-60
【非特許文献５】A. Kitcler,「修正ポリエチレンイミンでの遺伝子導入」J Gene Med 6 Suppl1(2004)S3-10
【非特許文献６】S. Brunner, E. Furtbauer, T. Sauer, M. Kursa, E. Wagner,「核バリアの克服：直鎖ポリエチレンイミン又は電気泳動による細胞サイクル独立非ウィルス遺伝子導入」Mol Ther 5(1)(2002)80-86
【非特許文献７】T. Merdan, J. Kopecek, T. Kissel,「ガンに対する遺伝子及びオリゴヌクレオチド治療におけるカチオン性ポリマーの展望」Adv Drug Deliv Rev 54(5)(2002)715-758
【非特許文献８】M. Neu, D. Fischer, T. Kissel,「ポリ（エチレンイミン）及びその誘導体を利用した合理的遺伝子導入ベクター設計の最新技術」J Gene Med 7(8)(2005)992-1009
【非特許文献９】D. Oupicky, M. Ogris, L.W. Seymour,「遺伝子の全身送達のための長時間循環性高分子電解質の開発」J Drug Target 10(2)(2002)93-98
【非特許文献１０】S.M. Moghimi, A.C. Hunter, J.C. Murray,「長時間循環及び標的特定ナノ粒子：実用理論」Pharmacol Rev 53(2)(2001)283-318
【非特許文献１１】M. Ogris, S. Brunner, S. Schuller, R. Kircheis, E. Wagner,「ペグ化ＤＮＡ／トランスフェリン−ＰＥＩ複合体：血液成分との減少相互作用、延長血液中循環、全身遺伝子送達の可能性」Gene Ther6(4)(1999)595-605
【非特許文献１２】H. Petersen, P.M. Fechner, A.L. Martin, K. Kunath, S. Stolnik, C.J. Roberts, D. Fischer, M.C. Davies, T. Kissel,「ポリエチレンイミン−グラフト−ポリ（エチレングリコール）コポリマー：遺伝子送達システムとしてのＤＮＡ複合化及び生物活性に対するコポリマーブロック構造の影響」Bioconjug Chem 13(4)(2002)845-854
【非特許文献１３】D. Finsinger, J.S. Remy, P. Erbacher, C. Koch, C. Plank,「非ウィルス遺伝子ベクターのための保護コポリマー：遺伝子送達における合成、ベクター特徴化及び利用」Gene Ther7(14)(2000)1183-1192
【非特許文献１４】Y. Yamazaki, M. Nango, M. Matsuura, Y. Hasegawa, M. Hasegawa, N. Oku,「ポリカチオン性リポソーム、セチル化ポリエチレンイミンから構築される新規な非ウィルス遺伝子移送システム」Gene Ther7(13)(2000)1148-1155
【非特許文献１５】D.A. Wang, A.S. Narang, M. Kotb, A.O. Gaber, D.D. Miller, S.W. Kim, R.I. Mahato,「遺伝子送達のための新規な分枝鎖ポリ（エチレンイミン）−コレステロール水溶性リポポリマー」Biomacromolecules 3(6)(2002)1197-1207
【非特許文献１６】J. Hayes, L. Palmer, K. Chan, C. Giesbrecht, L. Jeffs, I. Maclachlan,「リピッド包含はポリプレクスプラスミドＤＮＡの効果的全身送達を可能にする」Mol Ther15(4)(2007)713-720
【非特許文献１７】M. Nishikawa, T. Nakano, T. Okabe,N. Hamaguchi, Y. Yamasaki, Y. Takakura, F. Yamashita,「プラスミドＤＮＡのためのインジウム−１１１−放射線標識残留化及び組織分配研究への応用」Bioconjug Chem 14(5)(2003)955-961
【非特許文献１８】F.J. Hutchinson, S.E. Francis, I.G. Lyle, M.N. Jones,「共有的に結合されたタンパク質でのリポソーム特徴化」Biochim Biophys Acta 978(1)(1988)17-24
【非特許文献１９】C.B. Hansen, G.Y. Kao, E.H. Moase, S. Zalipsky, T.M. Allen,「立体的に安定化されたリポソームへの抗体結合：結合手法の評価、比較及び最良化」Biochimica et biophysica Acta 1239(2)(1995)133-144
【非特許文献２０】M.C. Woodle, D.D. Lasic,「立体安定リポソーム」Biochim Biophys Acta 1113(2)(1992)171-199
【非特許文献２１】T. Reschel, C. Konak, D. Oupicky, L.W. Seymour, K. Ulbrich,「合成ポリカチオンでのＤＮＡの複合体に基づいた遺伝子送達ベクターの物理的特性及び体外トランスフェクション効率」J Control Release 81(1-2)(2002)201-217
【非特許文献２２】D. Fischer, B. Osburg, H. Petersen, T. Kissel, U. Bickel,「マウスにおけるオリゴデオキシヌクレオチドでのポリプレクスの有機分配及び薬力学に関するポリ（エチレンイミン）分子量とペグ化の効果」Drug Metab Dispos 32(9)(2004)983-992
【非特許文献２３】K. Kunath, A. von Harpe, H. Petersen, D. Fischer, K. Voigt, T. Kissel, U. Bickel,「ＰＥＧ修正ポリ（エチレンイミン）の構造がマウス内でＮＦ−カッパＢデコイとの複合体の生物分配と薬力学に影響する」Pharm Res 19(6)(2002)810-817
【非特許文献２４】M. Neu. O. Germershaus, M. Behe, T. Kissel,「ＰＥＩの生物可逆架橋ポリプレクス及び高分子ＰＥＧが体内で延長循環時間を示す」J Control Release 124(1-2)(2007)69-80
【非特許文献２５】M. Johnsson, K. Edwards,「リポソーム、ディスク及び球状ミセル：ゲル相ホスファチジルコリン及びポリ（エチレングリコール）−ホスホリピッドの混合物内での凝集構造」Biophys J 85(6)(2003)3839-3847
【非特許文献２６】G. Montesano, R. Bartucci, S. Belsito, D. Marsh, L. Sportelli,「ポリマー結合リピッドによるリピッド膜膨張及びミセル形成：スピン標識電子スピン共鳴により研究されたポリマー長での計測」Biophys J 80(3)(2001)1372-1383
【非特許文献２７】K. Sou, T. Endo, S. Takeoka, E. Tsuchida,「ポリ（エチレングリコール）−リピッドのビシクルへの任意導入を利用したホスホリピッドベシクルのポリ（エチレングリコール）修正」Bioconjug Chem 11(3)(2000)372-379
【非特許文献２８】C.L. Gebhart, S. Sriadibhatla, S. Vingogradov, P. Lemieux, V. Alakhov, A.V. Kabanov,「遺伝子導入のためのプルロニック−ポリエチレンイミン複合体に基づくポリプレクスの設計及び形成」Bioconjug Chem 13(5)(2002)937-944
【非特許文献２９】A.V. Kabanov, E.V. Batrakova, V.Y. Alakhov,「薬剤及び遺伝子送達のための新規なポリマー治療剤としてのプルロニックブロックコポリマー」J Control Release 82(2-3)(2002)189-212
【非特許文献３０】R.J. Lee, L. Huang,「腫瘍特定遺伝子導入のための葉酸標的アニオン性リポソーム混合ポリリシン濃縮ＤＮＡ」Journal of Biological Chemistry 271(14)(1996)8481-8487
【非特許文献３１】K. Muller, T. Nahde, A. Fahr, R. Muller, S. Brusselbach,「標的人工ウィルス様粒子による内皮細胞の高効率形質導入」Cancer Gene Therapy 8(2)(2001)107-117
【非特許文献３２】P. Bandyopadhyay, X. Ma, C.L. Stieers, B.T. Kren, C.J. Steer,「ＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを利用したラット肝細胞のゲノムＤＮＡのヌクレオチド置換」Journal of Biological Chemistry 274(15)(1999)10163-10172
【非特許文献３３】J.J. Wheeler, L. Palmer, M. Ossanlou, I. MacLachlan, R.W. Graham, Y.P. Zhang, M.J. Hope, P. Scherrer, P.R. Cullis,「安定化プラスミド−リピッド粒子：構築及び特徴化」Gene Ther6(2)(1999)271-281
【非特許文献３４】I. MacLachlan, P. Cullis, R.W. Graham「全身遺伝子治療のための合成ウィルスへの技術進歩」Curr Opin Mol Ther1(2)(1999)252-259
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この要求を満たすため、プラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡのごとき核酸が付加された新規なミセル様ナノ粒子（ＭＮＰ）並びに遺伝子送達のためのナノ粒子の構築に対する新規な取り組みが開発された。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のごときカチオン性ポリマーがまず、ホスホリピッドアルキルまたはアシル鎖の先端に結合（共役）され、ホスホリピッド−ポリエチレンイミン（ＰＬＰＥＩ）結合体（共役体）が得られる。このＰＬＰＥＩはプラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド（例：アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ＲＮＡまたはリボザイムのごとき核酸と混合され、ナノメートル範囲のサイズを有し、ＰＥＩ／核酸（ＰＥＩ／ＮＡ）核複合体（錯体）とホスホリピッド単層エンベロープの構造を有した複合体を形成する。ＰＬＰＥＩのカチオン性ＰＥＩモイエティと、アニオン性核酸との間の静電相互作用は、ナノ粒子の形成に向けた活力を提供する。ＰＬＰＥＩ接合体のホスホリピッドモイエティは疎水性相互作用によって単層に整合される。ＰＯＰＣ、コレステロールのごとき非修正（すなわち非結合）ホスホリピッドがＰＬＰＥＩ／核酸複合体に追加され、ＰＥＩ／核酸核の周囲にリピッド単層を補充する。ＰＥＧ−ＰＥも追加され、ナノ粒子に立体安定性を提供する。非修正リピッドおよびＰＥＧ−ＰＥは疎水性相互作用によって単層内に組み入れられる。最終構造は、ＰＥＩ／ＮＡポリプレクス核とリピッド単層エンベロープとを有した立体的に安定したミセル様ナノ粒子となる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１好適実施態様によれば、本発明のナノ粒子は、ホスホリピッドと、ポリエチレンイミン（ＰＬＰＥＩ）、ＰＥＧ−ＰＥおよびリピッドとの間の共有結合的結合体の組み合わせに基づいている。ホスホリピッド−ポリエチレンイミン結合体は、プラスミドＤＮＡの存在下で非修正リピッドおよびＰＥＧ−ＰＥと共に単層−エンベロープハードコアミセル様ナノ粒子に自己構築することができる。得られたナノ粒子は体内利用に適した構造と特性を備えている。
【００１３】
遺伝子送達のための新規な構造物である本発明のナノ粒子は、無害で、長時間循環性であり、治療性核酸のＲＥＳ部位および他の器官の両方への体内トランスフェクションのために効果的である。本発明はポリマー系遺伝子送達システムをリピッド系遺伝子送達システムと組み合わせ、ホスホリピッドとポリマーの化学結合を利用するための新規な方法を提供する。ホスホリピッドアルキル鎖の先端におけるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の結合は、新規な化学エンティティであるホスホリピッド−ポリエチレンイミン（ＰＬＰＥＩ）結合体に導く。ＰＬＰＥＩは、それぞれＰＥＩとＰＬモイエティによる（ｉ）ＤＮＡ結合および（ｉｉ）膜形成のための２つの機能領域を有する。ＤＮＡの存在下でＰＬＰＥは、ポリアニオン性ＤＮＡとのポリカチオン性ＰＥＩの静電相互作用を介してナノ粒子に自己構築される。この自己構築プロセスはリピッドモイエティ間の疎水性相互反応によっても可能である。この自己構築ナノ粒子は独特な超分子構造を有しており、ここではＰＥＩ／ＮＡポリプレクス核およびリピッド単層エンベロープは化学結合によって連結されている。このナノ粒子は、例えばリポソーム型ナノ粒子とは異なるものである。ここではリピッドが単層ではなく２層を形成している。ナノ粒子はミセルとも異なる。これは疎水性相互作用でのみ構築され、“臨界ミセル濃縮（縮合）”の限定を受ける。
【００１４】
本発明は、ｂｉｏＰＳＬおよびｐＳＰＬＰのごときＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスを混入した他のリポソーム性ナノ粒子と較べて高い可搬容量と共に、単純で再現可能なワンステップ手法の利点を提供する。本発明のナノ粒子は、約２５％（ｗ／ｗ）である高ＤＮＡ可搬容量も提供する。これは、文献で報告されている他のシステムのほぼ１０倍に相当する。ここで使用する用語「ＤＮＡ可搬容量」または「核酸可搬容量」とは、本発明によるナノ粒子に組み込み可能なＤＮＡ量または他の核酸量のことである。
【００１５】
本発明の他の特徴と利点は添付の図面を利用した以下の好適実施例の説明および請求項から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ホスホリピッド単層によって包囲されたＰＥＩ／ＤＮＡ核を備えたミセル様ナノ粒子（ＭＮＰ）の自己構築プロセスを表す概略図である。ＭＮＰは、ホスホリピッド−ポリエチレンイミン配合体（ＰＬＰＥＩ）とのＤＮＡの複合化（錯体化）を介して水性媒体において自然に形成され、リピッド層によるその複合体のコーティングが続く。ＰＬＰＥＩからのＰＥＩモイエティはＤＮＡとの高濃縮複合体を形成し、疎水性核を提供する。一方、ＰＬＰＥＩのホスホリピッドモイエティは非修正リピッドおよびＰＥＧ−ＰＥと共に、ＰＥＩ／ＤＮＡ核を包囲するリピッド単層を形成する。リピッド単層は組み込まれたＰＥＧ−ＰＥと共に体内安定性をも提供する。
【図２ａ−２ｂ】図２ａと図２ｂはＭＮＰ形成の分析を示す。（図２ａ）変動Ｎ／Ｐ比におけるＰＥＩ／ＤＮＡ複合体に対するＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体のアガロースゲル電気泳動。ＤＮＡのゲル内への導入の不在は複合体形成を示す。ＤＮＡはＰＬＰＥＩによってＮ／Ｐ６以上で完全に複合化された。ＰＬＰＥＩは非修正ＰＥＩのものに比肩する複合化プロフィールを示した。（図２ｂ）ＭＮＰのフリーズフラクチャー（凍結破壊）電子顕微鏡（ｆｆＴＥＭ）分析。ＭＮＰは平均粒径５０ｎｍおよび狭範囲サイズ分布を有した、よく成長した球状粒子の形態を備えている。全粒子は構造体背後に陰影を示しており、ミセル様“ハードコア”および“単層”構造であることが確認される。右下隅の横線は５０ｎｍを示す。
【図３ａ−３ｂ】図３ａと図３ｂはＭＮＰの安定性分析を示す。（図３ａ）塩誘導凝集に対するＭＮＰのコロイド形態安定性。塩の添加（０．１５ＭのＮａＣｌ）前後に流体力学径がモニターされた。塩を添加した後にＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスは急速に凝集したが、ＭＮＰは安定状態を保った。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を表している。（図３ｂ）ＭＮＰに載荷されたＤＮＡの酵素分解からの保護。ＤＮＡとＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスが載荷されたＭＮＰは、ＤＮＡａｓｅ  Ｉでの処理後に０．８％プレキャストアガロースゲル上で分析された。ＭＮＰ内のＤＮＡは酵素分解から完全に保護された。レーン１、ＤＮＡ；レーン２、ＤＮＡ、ＤＮＡａｓｅ；レーン３、ＰＥＩ／ＤＮＡ；レーン４、ＰＥＩ／ＤＮＡ、ＤＮＡａｓｅ；レーン５、ＭＮＰ；レーン６、ＭＮＰ、ＤＮＡａｓｅ；レーン７、１００塩基ペアラダー。
【図４】図４はＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対するＭＮＰの細胞毒性を示す。線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３はＤＮＡ付加ＭＮＰまたはＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスにより異なるＰＥＩ濃度で処理された。相対的細胞生存率は媒質で処理された対照細胞の百分率として表示された。ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスとは異なり、４時間の処理に続くＭＮＰは２４時間の培養後に細胞毒性を示さなかった。
【図５ａ−５ｂ】図５ａと図５ｂはマウス内のＤＮＡ付加ＭＮＰとＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスの生体内挙動を示す：（ａ）血中濃度−時間曲線（対数スケール）および（ｂ）１１１Ｉｎ標識ＤＮＡを搬送する組成物の体内投与に続くＤＮＡの器官蓄積。注入後に血液が異なる時点で回収され、主要器官が最終サンプリング後に回収された。血液と器官サンプルの放射能がガンマカウンターで測定され、血液（ｍｌ）または組織（ｇ）に対する注入投与量の百分率（％ＩＤ／ｍｌ又は％ＩＤ／ｇ）で表された。ＭＮＰはＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスと較べて長時間である血液循環と、減少したＲＥＳ摂取を示す。ｐ値は変位度のツーウェイ分析（ＡＮＯＶＡ）および続くボンフェローニ事後検定から決定された。
【図６ａ−６ｂ】図６ａと図６ｂは、マウス異種移植モデルにおけるｐＧＦＰ付加ＭＮＰでの生体内トランスフェクションの結果を示す。ＬＬＣ腫瘍を有するマウスにｐＧＦＰ付加ＭＮＰが静脈内注射された。注射４８時間後に、腫瘍内のＧＦＰ発現が評価された。生体内成長ＬＬＣ腫瘍からの凍結腫瘍断面の蛍光顕微鏡写真が示されている。（ａ）未処理動物の腫瘍断面（背景パターン）；（ｂ）ｐＧＦＰ付加ＭＮＰが注射された動物の腫瘍断面。ｐＧＦＰ付加ＭＮＰの静脈内注射は遠位部腫瘍に輝蛍光を提供した。同一ＤＮＡ含有量（ｎ＝３）でのプレーンポリプレキシの注射後に動物が急死したため、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスが注射された動物からの腫瘍組織内でのＧＦＰ発現は評価されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者は全身利用に適した新規な遺伝子送達ベクターを開発した。このベクターは、アルキル鎖の遠位端にて、ホスホリピッドと、ポリエチレンイミン（ＰＬＰＥＩ）のごときポリカチオンとの化学結合を利用して構築可能である。ポリカチオン性ＰＥＩモイエティのＤＮＡとの静電相互作用は、高濃度ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクス核の形成を促す。一方、両親媒性ホスホリピッドモイエティは、オプションで加えられる遊離非修正ホスホリピッドおよびＰＥＧ−移植ホスホリピッド（例：ＰＥＧ−ＰＥ）と共に、ポリプレクス核の周囲にリピッド単層エンベロープを形成し、ＰＥＧ鎖の立体的バリアおよびリピッド単層エンベロープの膜様バリアによって安定化したＤＮＡ付加ミセル様ナノ粒子（ＭＮＰ）を形成する。
【００１８】
立体的に安定したリポソームでの驚くべき成功［非特許文献２０］とは対照的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によるポリプレクスの立体的安定は、循環時間の延長および生体内安定性の両方を成功裏には提供しなかった［非特許文献８］。本発明では、立体的安定が、ポリプレクスの表面を架橋処理することによる“横方向安定性”と組み合わされている［非特許文献９］。このことは、立体的安定性がポリプレクスの体内安定性に限定された役割を果たすだけであり、追加の安定化メカニズムが追加体内安定性をポリプレクスに付与するのに必要であること示している。
【００１９】
追加の安定性はリピッドバリア内でポリプレクスを包含することにより達成できる。なぜなら、リピッドバリアは塩類に対して不浸透性であり、ポリプレクス核が塩誘導不安定性となることを防御するからである。このようなシステムの体内所作はリピッドバリアによって統制されている。一方、ポリプレクス核は循環血液内の生物学的環境から防御される。リピッドバリアの立体的安定性は、載荷されたポリプレクスに延長循環時間を提供し、ＥＲＰメカニズムを利用してそのポリプレクスをＲＥＳ部位以外の標的器官に送達することを可能にする。さらに細胞摂取により、ＰＥＩは、ＤＮＡ分子の細胞内薬力学を改善させるために、エンドソーム溶解活性や、細胞質ヌクレアーゼからの防御のごとき好ましい機能の発揮が期待されている。
【００２０】
リピッド単層のエンベロープの存在によってミセル様ナノ粒子はさらに安定化される。リピッド単層モノマーは、遊離リピッドおよびＰＥＧ−リピッドと共にＰＬＰＥＩのリピッドモイエティ間の疎水性相互作用により促される自己構築プロセスによって形成される。塩誘導凝集と酵素消化に対抗するＭＮＰの強力な抵抗性はこのようなリピッド単層バリアの存在を確認するものである。生理学的条件における高塩含有量はＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスの乏しい体内安定性に関わるメカニズムの１つを提供する［非特許文献８］。これらのポリプレクスはポリカチオン性ＰＥＩとポリアニオン性ＤＮＡ分子との間の強力静電相互作用によって形成され、粒子間の静電反発によってコロイド状に安定化する。しかし、生理学的条件の下では、ポリカチオンとポリアニオン性ＤＮＡとの間での引力静電相互作用のスクリーニングのため、ポリプレクス粒子の同時的分離と共に、ポリプレクス粒子間で静電反発力のスクリーニングの結果として、増加した塩濃度がポリプレクス粒子の凝集の促す［非特許文献２１］。ＰＥＧ鎖による立体安定化は、塩誘導凝集へのＰＥＧ移植ＰＥＩのポリプレクスの感度低下をもたらしたが、ポリプレクスの穏やかな安定性は、立体安定化のみが限定された役割を演じ、追加の安定化メカニズムがポリプレクスの凝集を妨害するのに必要であることを暗示している［非特許文献１２、２２、２３、２４］。塩非浸透性リピッドバリアの存在は高塩状態であるＭＮＰの観察された安定性に貢献している。リポソームの場合と同様に、リピッド単層バリアは、外部環境からポリプレクス核への塩の到達を阻止し、そうでなければ不安定であるポリプレクスへの塩誘導凝集に対抗する防護を提供する。遊離リピッドが介在しない中間ＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体での適度な凝集は、ＰＬＰＥＩ複合体のホスホリピッドモイエティが単独では、結合ホスホリピッドに非結合リピッドが補充されたときほどには完全なリピッドバリアを提供しないことを示している。
【００２１】
ＰＥＧ−ＰＥのごときＰＥＧ−リピッドの量は、遊離リピッドを予備形成複合体に取り込ませ、最終構築物に立体安定性を提供するような量となるように選択される。混合物内のＰＥＧ−ＰＥ含有量が５モル％までのミセル形成の開始により増加するとき、ＰＥＧ−ＰＥとホスホリピッドとの混合物がミセル相からラメラ相に進化することを考えると［非特許文献２５、２６］、１０モル％のＰＥＧ−ＰＥ濃度での遊離リピッド混合物の水中縣濁物はラメラ相よりもミセル相へ移行する傾向にある。予備形成ＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体での培養によって、遊離および結合リピッドを含んだ全リピッドのＰＥＧ−ＰＥ含有量は４．３モル％に減少するが、そこではラメラ相となるであろう。ミセル相のＰＥＧ−ＰＥ分子は、所謂“ミセルトランスファー”［非特許文献２７］によって予備形成されたホスホリピッドベシクルの表面に自然に結合する。遊離リピッドはＰＬＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスの疎水性リピッド領域と相互作用し、モノマーへの分離に続いて、ＰＬＰＥＩ結合体からのホスホリピッドモイエティと共に、遊離リピッドを予備形成複合体のリピッド層に自然結合させ、ポリプレクス核を包囲するリピッド単層エンベロープを形成ことが期待される。最終構築物は、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクス核とリピッド単層エンベロープとを備えた立体的に安定したミセル様ハードコア粒子である。
【００２２】
プルロニックＰ１２３移植ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスシステム［非特許文献２８、２９］の実現可能な安定化メカニズムとして類似した疎水性相互作用が提案された。ここでは、プルロニックＰ１２３移植ＰＥＩの両親媒性プルロニックＰ１２３鎖がミセル様構築物をポリプレクス核の周囲に形成し、ミセル様構築物の安定性を最良化させるために、プルロニックＰ１２３移植ＰＥＩ結合物との疎水性相互作用によって非修正プルロニックＰ１２３がポリプレクスに取り込まれて充填された。
【００２３】
ある意味では、ミセル様ナノ粒子は、所謂、葉酸標的アニオン性リポソーム内にポリリシン／ＤＮＡを混入した“リポソーム混入ポリカチオン性濃縮ＤＮＡ粒子”（ＬＰＤ  ＩＩ）に似ている［非特許文献３０］。あるいは、予備形成アニオン性リポソーム内にＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスを混入することにより作製された“人工ウィルス様粒子”［非特許文献３１、３２、３３］、または外部ＰＥＧ層によって安定化されたリピッド二重層内にＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスを内包することで構築された“予備濃縮安定プラスミドリピッド粒子”（ｐＳＰＬＰ）［非特許文献１６］に類似する。特に、ｐＳＰＬＰは、ポリプレクスを安定リポソーム内に内包する利点を示す。すなわち、延長循環時間と、ＰＥＩのエンドソーム溶解活性による改善されたトランスフェクション能力のために、腫瘍へのＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスの効果的な全身送達を示す。しかしながらｐＳＰＬＰの作製には、エタノール（有機溶媒）内でのリピッドによる有害な予備形成ポリプレクスの培養が関与するため、濃縮と透析の複数ステップが必要となる。
【００２４】
ミセル様ナノ粒子はポリプレクスを（本例の場合には単層であるが）立体的に安定したリピッド膜と組み合わせる利点を提供する。ＰＬＰＥＩ結合は、同時進行的なＤＮＡ濃縮とリピッド膜形成によってＤＮＡ付加ＭＮＰの自己構築プロセスを可能にする。リポソーム包含ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体と較べて、ＭＮＰは、１００％の効率であるさらに便利なワンステップＤＮＡ載荷能力を提供し、加えて、リポソーム組成物へのＤＮＡ包含のためのいかなる方法よりも多い可載容量（〜５３０μｇＤＮＡ／μモルの全リピッド、または核酸として全粒子質量の３０％）を付与する［非特許文献３４］。
【００２５】
本発明のミセル様ナノ粒子１０はリピッド単層によって内包された核複合体を含む（図１参照）。この核複合体２０は、ＰＥＩ等のカチオン性ポリマー４０の１以上の分子に静電的に結合した１以上の核酸分子３０を含む。このカチオン性ポリマーは包含するリピッド単層内に存在するリピッド分子５０に共有結合する。一方、カチオン性ポリマーは核酸を結合してパッケージ化し、ナノ粒子の核複合体を形成する。一方、このカチオン性ポリマーは、リピッド分子（好適にはホスホリピッドの疎水性部分）に共有結合部６０を提供し、リピッド７０の単層による核複合体の内包を仲介し、安定性を向上させ、細胞膜との溶融能力を向上させる。
【００２６】
ミセル様ナノ粒子は平均粒径が一般的に約１０ｎｍから約１０００ｎｍの範囲である。好適には、それらの平均粒径は、約１０ｎｍから約５００ｎｍであり、さらに好適には約１０ｎｍから約２００ｎｍであり、さらに好適には約４ｎｍから約１００ｎｍであり、または約５０ｎｍから約７０ｎｍである。ＭＮＰのサイズは、細胞内に侵入し、細胞の細胞質内に核酸含有物を導入させる性能に見合ったものとする。
【００２７】
カチオン性ポリマーは、生理学的条件下（すなわち、身体内または細胞内のｐＨ条件と塩条件）にて核酸を結合できるように、分子あたりに少なくとも２個の正電荷を備え、十分な電荷密度と分子サイズとを有した任意の合成または天然ポリマーでよい。例えば、適したカチオン性ポリマーには、ポリエチレンイミン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリアリルアミン、およびアミノデクストランが含まれる。カチオン性ポリマーは直鎖あるいは分枝鎖のものでよく、ホモポリマーでもコポリマーでも構わず、アミノ酸を含んでいるときにはＬまたはＤ形態を有することができ、これらの特徴の任意組み合わせを有することができる。好適には、カチオン性ポリマー分子は十分に融通性を有したものであり、１以上の核酸分子とコンパクトな複合体を形成することができる。
【００２８】
カチオン性ポリマーに接合しているリピッド分子は、“第１リピッド”、“第１ホスホリピッド”、“結合リピッド”または“結合ホスホリピッド”と呼ばれる。適したリピッドには、他の両親媒性リピッドとの組み合わせでリピッド単層または二重層を安定的に形成あるいは組み入れ構成する天然または合成両親媒性リピッドが含まれる。リピッドの疎水性モイエティは単層または二重層の疎水性領域と接触しており、その極性ヘッド基モイエティは外部水性層に向いており、単層または二重層の極性表面はこの場合ナノ粒子の外側表面に向いている。両親媒性リピッドの親水性特徴は、炭化水素、燐酸塩、カルボン酸、硫酸、アミノ、スルヒドリル、ニトロ、ヒドロキシおよびそれらの類似基、等々の極性または帯電基の存在から誘導される。両親媒性リピッドの疎水性部分は、長鎖飽和および非飽和の脂肪族炭化水素基および１以上の芳香族、脂環族、あるいは複素環式基で置換されたそのような基を含む非極性基を含むことで得られる。両親媒性リピッドの例には、天然または合成ホスホリピッド、グリコリピッド、アミノリピッド、スフィンゴリピッド、長鎖脂肪酸およびステロール、等々が含まれる。ホスホリピッドの代表例には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリン、等々が含まれる。スフィンゴリピッド、グリコスフィンゴリピッド、ジアシルグリセロルおよびβアシルオキシ酸のごとき燐を含まない他の化合物も両親媒性リピッドとして使用できる。
【００２９】
実施態様によっては、本発明のナノ粒子はカチオン性ポリマーと結合していない追加リピッド（“非結合リピッド”または“非結合ホスホリピッド”）を含む。これら追加の非結合リピッドは内包リピッド単層を安定させて完成させるよう作用し、さらにモイエティ（例：ＰＥＧ）すなわち標的モイエティを安定させるための結合部位としても作用する。非結合リピッドはホスホリピッドのごとき任意の上記両親媒性リピッドで構わず、トリグリセリドおよびステロール（例：コレステロール）のごとき他のリピッドであっても構わない。ナノ粒子内の結合および非結合リピッドの少なくとも１つは、例えば、ホスホリピッドのごときリピッド形成二重層であるべきである。１好適実施形態では、ナノ粒子のリピッド単層は、第１部分である結合リピッド、第２部分である非結合リピッド、および第３部分であるコレステロールを含む。各部分の相対量は変動してもよいが、好適には、それぞれの結合および非結合リピッドに対して単層リピッドの約１０％から７０％のモル分率範囲であり、コレステロールの単層リピッドの約１％から３０％、あるいは約５％から２０％のモル分率範囲である。例えば、１実施態様では、リピッド単層は結合リピッド、非結合リピッドおよびコレステロールを４：３：３の割合で含む。
【００３０】
ＭＮＰのリピッド単層は、その目的が、例えば、粒子を安定化させるか、標識化するか、標的機能を付与する等である様々な追加分子構成要素を含むことができる。このような構成要素には、ペプチド、プロテイン、界面活性剤、リピッド誘導体および、特に、ジアルキルオキシプロピル、ジアシルグリセロル、ホスファチジルエタノールアミンおよびセラミドに結合されたＰＥＧのごときＰＥＧ−リピッド誘導体が含まれる（例：米国特許５８８５６１３参照）。実施態様によっては、ナノ粒子は本質的に界面活性剤を含まない。ＰＥＧリピッドが単層に加えられる場合には、好適には、単層リピッドの重量の約０．５％から２０％に対応する量、さらに好適には約１％から１０％に対応する量、さらに好適には約２％から５％に対応する量で存在する。１好適実施態様では、ナノ粒子のリピッド単層は、４：３：３：０．３の割合で結合リピッド、非結合リピッド、コレステロール、およびＰＥＧ−ＰＥを含んでいる。
【００３１】
ナノ粒子にペプチドまたはタンパク質を結合するのに利用できるリピッド誘導体はｐ−ニトロフェニルカルボニルＰＥＧ−ＰＥ（ｐＮＰ−ＰＥＧ−ＰＥ）である。例えば、抗体または他のタンパク質分子上の遊離アミノ基は、ｐＮＰ基と反応して、共有的に標的モイエティをナノ粒子に結合させることができる。例えば、「リポソーム：実用方法」（Ｖ．Ｐ．トリチェリンとＶ．ワイジグ、オクスフォード大学プレス２００３）参照。
【００３２】
ナノ粒子の中心核複合体は、カチオン性ポリマーに加えて、１以上の核酸分子を含む。これら核酸は、一般的に、生物学的作用を及ぼすことが期待される生細胞または組織に送達される。“核酸”とは、単ストランドまたは双ストランド形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のことである。この用語は、知られたヌクレオチド類似体または、合成あるいは天然発生的な修正バックボーン残基または連結体を含んだ核酸を包含する。このような類似体の例には、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスイホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）、等々が含まれる。ＤＮＡは、アンチセンス、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの部分、予備濃縮ＤＮＡ、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）生成物、ベクター（Ｐｌ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工クロモソーム）、発現カセット、キメラ配列、クロモソームＤＮＡ、またはこれらの誘導体が含まれる。核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、遺伝子コード化ｍＲＮＡ、および干渉ＲＮＡ分子と交換可能に使用されている。“遺伝子”とは、ポリペプチド、またはポリペプチド前駆物質を生成するのに必要な部分的または完全コード化配列を含んだ核酸（例：ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列のことである。
【００３３】
“ＲＮＡｉ”とは、干渉ＲＮＡが標的遺伝子と同一細胞内に存在するとき、干渉ＲＮＡの配列と相補的であるｍＲＮＡの分解を仲介することで標的遺伝子の発現を低下または阻害することができる双ストランドＲＮＡのことである。よってＲＮＡｉは、２つの相補ストランドまたは１つの自己補完ストランドによって形成された双ストランドＲＮＡである。ＲＮＡｉは典型的には、標的遺伝子と実質的に、または完全に同一性を有する。干渉ＲＮＡの配列は、完全長標的遺伝子またはそのサブ配列に対応する。ＲＮＡｉは小型干渉ＲＮＡまたは“ｓｉＲＮＡ”を含む。ｓｉＲＮＡは、長さで約１５〜６０、１５〜５０、１５〜５０または１５〜４０の塩基対を含む。さらに特徴的には、長さで約１５〜３０、１５〜２５または１９〜２５の塩基対を含み、好適には、約２０〜２４または約２１〜２２あるいは２１〜２３の塩基対を含む。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１〜４のヌクレオチド、好適には約２〜３のヌクレオチドの３’オーバハングを含み、さらに５’燐酸末端を含むことができる。ｓｉＲＮＡは化学的に合成でき、またはプラスミドによってコード化できる。ｓｉＲＮＡは長いｄｓＲＮＡの切断によって発生させることもできる。好適には、ｄｓＲＮＡは長さが少なくとも約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドである。ｄｓＲＮＡは１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチドの長さでも、さらに長くてもよい。ｄｓＲＮＡは遺伝子転写全体または遺伝子転写の一部のためにコード化することができる。
【００３４】
本発明のナノ粒子内にパッケージするためのカチオン性ポリマーと核酸分子との比は、全ての核酸を複合化させるように調整される。この目的を達成するゲル電気泳動法は以下の例において解説されている。一般的に、アミンと燐酸の比（Ｎ／Ｐ）は約１から２０の範囲が適している。約１０の比が好適である。個別のＭＮＰ内に載荷できる核酸の量は幅広く変動させることができる。完成ＭＮＰの核酸含有量は４０重量％まで可能であるが、この量は従来の核酸含有ナノ粒子の場合よりもずっと多い。技術の種類によっては、非常に少ない量の核酸で間に合うか、または全く核酸（例：対照粒子）が不要であるが、このような場合には、安定核を形成するためにカチオン性ポリマーの一部がアニオン性ポリマー（例：カルボキシメチルセルロース）と複合化できる。カチオン性ポリマー内の帯電基と核酸の割合は、そこでそれらが組み合わされる溶液のｐＨによって変動させることができる。このポリマーは、望む割合の可イオン化基が核酸との組み合わせのために帯電できるように設計できる。実施態様によっては、例えば、少なくとも約１０％の基が帯電される（例：正帯電）。好適実施態様では、ポリマーの約５０％から１００％の基が形成時および完成核複合体内で帯電されている。
【００３５】
一般的に、本発明のＭＮＰを、対象の遺伝子生成物の発現を抑制または制止させるように送達することが望まれる。あるいは、治療遺伝子は、欠陥遺伝子と置換するため、遺伝子生成物の発現を増強するため、あるいは他の遺伝子の発現を抑制するために細胞に送達される。本発明のＭＮＰの標的として適している多くの遺伝子生成物は専門家には知られている。これらには、ウィルス感染および生存に関わる遺伝子、代謝性病気と疾患に関わる遺伝子、ガン発現および細胞形質転換に関わる遺伝子、血管原性遺伝子、炎症および自己免疫反応に関わる免疫調整遺伝子、リガンド受容遺伝子、および神経変性疾患に関わる遺伝子、その他が含まれる。適したＲＮＡｉまたは治療遺伝子配列を決まった手順で選択することができるユーザによって、任意の適した標的が選択できる。
【００３６】
本発明はさらに、前述のナノ粒子を含んだ非ウィルスベクターを提供する。核酸−カチオン性ポリマー複合体を有した核複合体と、その遠位端（疎水性）でカチオン性ポリマーに結合している第１ホスホリピッドを含んだ内包リピッド単層を含むことに加えて、ベクターは核複合体からの核酸を細胞に導入するのに適している。これは、例えば、ベクターのリピッド単層の膜融合促進リピッドあるいはタンパク質を含ませること、あるいは、リガンドまたは抗体のごとき、標的細胞の表面に存在する受容体に結合する１以上の標的化剤を含ませるごとき様々なメカニズムのいずれかで達成が可能である。さらにこのベクターは、ベクターの別な核酸配列の発現または遺伝子同化を促進または抑制するように設計された核酸配列を含むことができる。
【００３７】
本発明に従って、その核酸内容物を導入させるためにナノ粒子および非ウィルスベクターを適した細胞に送達する目的で、形成時に標的化剤または標的化モイエティをナノ粒子の表面に加えることができる。標的化モイエティのリピッド誘導体を使用して簡単に達成可能である非結合リピッドの中に標的化剤を含ませることによってこれは容易に達成できる。例えば、多くの標的化剤はペプチドまたはタンパク質であり、利用できる化学側鎖（例：ｐＮＰ−ＰＥＧ−ＰＥと反応した標的化剤上のアミノ基）を介してリピッドに結合できる。適した標的化剤は、自然発生または人工抗体、あるいはそのアンチゲン結合断片、ドメインまたは単鎖抗体、細胞表面受容体のリガンド、ビオチン、等々である。
【００３８】
本発明の別の実施態様は、リピッド単層によって内包された核複合体を含むミセル様ナノ粒子の作製方法である。ナノ粒子の核を形成するであろう複合体を形成するのに適した条件下で、前述のカチオン性ポリマー−リピッド結合体に、１以上の核酸分子が接触される。負帯電核酸は静電気的に結合体のカチオン性ポリマー部分に結合し、適した核複合体を形成する。この核複合体には１以上の非結合リピッドが補充され、その核複合体を内包するリピッド単層が形成される。
【００３９】
本発明のさらに別な実施態様は、ミセル様ナノ粒子で細胞をトランスフェクトする方法である。細胞は、前述した非ウィルスベクターと、ベクターの核酸分子をその細胞内に導入するのに適した条件下で接触される。
【００４０】
本発明のナノ粒子および非ウィルスベクターは、単独で、または、投与ルートおよび標準薬剤利用法に従って選択された生理食塩水またはリン酸バッファのごとき薬剤担体と共にナノ粒子を含んだ薬剤組成物として投与できる。この薬剤担体は一般的に粒子形成後に加えられる。薬剤調合物における粒子の密度は非常に多様である。すなわち、約０．０５重量％以内または約２．５重量％以内から１０重量％や３０重量％まで幅広く調整できる。
【００４１】
本発明の薬剤組成物は、従来の良く知られている殺菌技術を利用して殺菌できる。水溶液は、使用のためにパッケージに入れられるか、無菌条件および親液条件下で濾過される。この親液化された製剤は投与に先立って無菌水溶液と組み合わされる。この薬剤組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムであるｐＨ調整剤およびバッファ剤、強壮調整剤等のごとき、生理学的条件に近似させるため、必要に応じて薬学的に利用できる補助物質を含むことができる。さらに、粒子縣濁液は、保管時に遊離基やリピッド−過酸化毀損からリピッドを防御するリピッド保護剤を含むことができる。例えば、アルファ−トコフェロールのごとき親油性遊離基クエンチャも利用できる。
【００４２】
本発明のナノ粒子と非ウィルスベクターは、例えば標的遺伝子の発現に関わる病気や疾患を治療または防止する目的で細胞内に核酸を導入するのに利用できる。従って、本発明は、核酸（例：ＲＮＡｉまたは治療遺伝子）を細胞内に導入する方法も提供する。病気または治療を必要とする症状を有した患者を治療および病気を予防する方法においては、本発明の非ウィルスベクターは、体内または体外で１以上の細胞と接触される。その細胞は患者の細胞またはドナーの細胞である。細胞をベクターと接触させた結果、ベクターの１以上の核酸分子が患者の細胞内に導入され、病気が治療または予防される。実施態様によっては、細胞は体外でベクターと接触される。その後に細胞は治療または予防の一環として患者に投与される。適したミセル様ナノ粒子は前述のように形成される。その後に粒子は適した標的細胞と、核の送達の完了に十分な時間だけ接触される。本発明のナノ粒子は、一緒に混合され、あるいは接触される、実質的にいかなる細胞にも吸収が可能である。吸収されると、粒子は取り込み現象によって内在化されるか、細胞表面膜でリピッドと置換されるか、標的細胞と融合する。それによって粒子の核酸の細胞への導入または取り込みが実行される。核酸の細胞内送達のために最も頻用される標的細胞は新生物細胞（腫瘍細胞）である。標的になり得る他の細胞には、造血前駆細胞または幹細胞、線維芽細胞、ケラチン細胞、肝細胞、内皮細胞、骨格および平滑筋細胞、骨芽細胞、神経細胞、休止リンパ球、最終分化細胞、リンパ球細胞、上皮細胞、骨細胞、等々がある。
【００４３】
体外での利用の場合には、本発明に従ったナノ粒子による核酸の送達は、植物由来であろうが、あるいは脊椎動物あるいは無脊椎動物の動物由来であろうが、どのような組織由来のものであろうが、培養基で成長したどのような細胞にも適用できる。体外で実行されるときには、細胞とナノ粒子との接触は生物学的に融和性である媒質内で行われる。粒子の密度は特定の利用形態に応じて変更することができる。ナノ粒子による体外での細胞の治療は一般的に、生理学的温度（約３７°）で、約１時間から４８時間、好適には約２時間から４時間実施される。
【００４４】
細胞内での遺伝子発現を抑制する方法が提供される。この方法は、細胞を、その核複合体がｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉを含むミセル様ナノ粒子、あるいは、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡを標的細胞内に発生させる核酸と接触させることを含む。このｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉは細胞内に導入され、対象遺伝子の発現を抑制する。このため、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列は知られた方法で特別に設計されたものである。
【００４５】
実施態様によっては、ナノ粒子は、ｓｉＲＮＡのごとき核酸、または治療遺伝子を、イヌ類、ネコ類、ウマ類、ウシ類、ヒツジ類、ヤギ類、げっ歯類、あるいはヒトを含んだ霊長類等の動物に体内送達する目的で利用できる。体内送達は対象部位に直接的に送達する局所的なものであって、全身的なものであってもよい。体内遺伝子治療のための全身的送達、すなわち、循環等の身体システムを利用した治療用核酸の遠位標的細胞への送達は、ＰＣＴ特許願ＷＯ９６／４０９６４、ＵＳ特許５７０５３８５、５９７６５６７、５９８１５０２１、および６４１０３２８において開示されてもののごとき核酸−リピッド粒子を利用して達成されている。
【００４６】
本発明はミセル様ナノ粒子をキット形態でも提供する。キットは典型的には容器と、１以上の本発明組成物とを含み、使用上の注意と投与法が記載されている。実施態様によっては、ナノ粒子はその表面に標的モイエティが既に取り付けられている。別の実施態様では、キットはユーザが選択した標的モイエティと反応することができるナノ粒子を含むであろう。標的モイエティ（例：抗体、タンパク質）を内包単層内のリピッドに取り付ける方法は当技術分野の専門家には知られており、キットはこのような方法を実施するための説明書を供給できる。
【００４７】
本発明の別な実施態様は、リピッドアシルまたはアルキル鎖の遠位端に共有的に結合されたカチオン性ポリマーを含む化学結合体（共役体）である。このような化学結合体はＭＮＰの作製に使用され、薬剤、化粧品、食品、診断ツール、医療器具、およびそれらのコーティング剤、並びにバイオセンサーのごとき商業製品に使用するためのミセル−、単層−または二重層−含有構築物の作製において利用される。この化学結合体は、両親媒性リピッド分子の遠位疎水性部分に化学的に結合されているポリエチレンイミンのごとき、１以上の前述したポリマー性カチオンを含む。この化学結合体は共有結合によるものであり、実施態様によっては、この結合は、酸性ｐＨまたは酵素の作用等の条件によっては切断が可能である。例えば、この結合体は１−パルミトイル−２−アゼラオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンをポリエチレンイミンと反応させて形成できる。この化学結合体は核酸−ポリカチオン−リピッド複合体を形成するために１以上の核酸分子に結合することができる。
【００４８】
以下の実施例は本発明の利点を説明し、当技術分野の専門家に本発明を実施させるために提供されている。これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００４９】
材料および方法
材料
特に説明がない限り、全ての材料はシグマ−アルドリッチ社から購入された。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコード化しているプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は、エリム・バイオファーマスーチカルズ社（カルフォルニア州ヘイワード）から１μｇ／μｌの最終濃度にて購入された。ローダミン標識されたｐＧＦＰ（ｐＧｅｎｅＧｒｉｐローダミン／ＧＦＰ）はジェンランティス社（カルフォルニア州サンディエゴ）から購入された。必要に応じ、前述の方法［１７］に従って、０．１μＣｉ／μｇのＤＮＡを得るために、ＤＮＡは１１１Ｉｎ（マサチューセッツ州のパーキンエルマー・ライフ＆アナリティカル・サイエンシズ社）で放射能標識化された。この濃度と純度は０．８％のアガロースゲル電気泳動によって測定された。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジスレアロイルーｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ−ＰＥ）、コレステロールおよび酸化ホソホリピッド、１−パルミトイル−２−アゼラオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＡｚＰＣエステル）がアバンチ・ポーラー・リピッド社（アラバマ州アラバスタ）から購入された。ＮＭ１．８ｋＤａを有した分枝鎖ＰＥＩ（ｂＰＥＩ）はポリサイエンシズ社（ペンシルベニア州ワォーリントン）から購入され、水中で溶解されて最終濃度１．０μｇ／μｌにされた。
【００５０】
ホスホリピッド−ポリエチレンイミン接合体（ＰＬＰＥＩ）の合成
１２ｍｇの分枝鎖ＰＥＩ（７μモル）が０．５ｍｌのクロロホルムに溶解され、１ｍｌのクロロホルムに溶解された５ｍｇの酸化ＰＣ（ＡｚＰＣエステル、７μモル）と混合された。ｂＰＥＩは１：２：１モル比である第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンを有しているとするなら、この反応混合物は１：１０の酸と第一級アミンのモル比に対応する。すなわち、余剰の反応性アミンを含む。イミダゾリド誘導体を形成することで酸を活性化させるために、０．５ｍｇのカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、３μモル）が上記溶液に加えられた。この反応混合物は１０μｌのＴＥＡ（トリエチルアミン）で室温にて４８時間撹拌しながら培養された。続いて窒素ガス流によってクロロホルムが除去され、残留物は２ｍｌのｄＨ２Ｏで縣濁された。生成物はｄＨ２Ｏ（ＭＷＣＯ、２，０００Ｄａ）に対して透析され、凍結乾燥され、構築物は１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３内、３００ＭＨｚ）で確認された。接合程度は、ＮＭＲスペクトルにて、ホスホリピッドヘッド（３．４ｐｐ）のＰＥＩ主鎖のエチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）信号（２．４〜２．８ｐｐｍ）とメチル（−ＣＨ３）信号との比からＰＥＩとリピッドが１：１モル比であると決定された（σ  ０．９：２．７  Ｈ、σ  １．３：１７・６  Ｈ、σ  １．６：５．４  Ｈ、σ  ２．４−２．８：９６．０  Ｈ、σ  ３．３：１２．８  Ｈ、σ  ３．６：１．５８  Ｈ、σ  ４．０−４．６：５．４３  Ｈ）。ＰＬＰＥＩ結合体は水に溶解され、１．５μｇ／μｌ（ＰＥＩでは１．０μｇ／μｌ）の濃度にされた。
【００５１】
ＰＬＰＥＩとのプラスミドＤＮＡ複合化
一定量のプラスミドＤＮＡ（１００μｇ）と変動量のＰＬＰＥＩがＨＢＧ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％ｄ−グルコース、ｐＨ７．４）で別々に希釈され、最終量２５０μｌにされた。その後、ＰＬＰＥＩ溶液は、急速添加によってＤＮＡ溶液に移され、渦流撹拌された。得られたポリプレクスは、Ｅゲル電気泳動システム（インビトロゲン・ライフ・テクノロジー社）を使用してアガロースゲル電気泳動により分析された。プレキャスト０．８％のＥゲルカートリッジが２分間６０Ｖおよび５００ｍＡで予備作動され、１μｇのｐＤＮＡの載荷が続いた。望ましいアミン／リン酸比（Ｎ／Ｐ）は、４３．１ｇ／モルが１アミンを含むＰＥＩのそれぞれの反復単位に対応し、３３０ｇ／モルが１リン酸を含むＤＮＡのそれぞれの反復単位に対応するという想定のもとで計算された。
【００５２】
プラスミドＤＮＡを内包するミセル様ナノ粒子（ＭＮＰ）の作製
ＭＮＰは、ＰＬＰＥＩ：ＰＯＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＰＥ（４：３：３：０．３、モル／モル）とｐＤＮＡとで構築された。まず、Ｎ／Ｐ比が１０であるＰＬＰＥＩ（ＰＥＩとして１３０μｇ）とプラスミドＤＮＡ（１００μｇ）とがＨＢＧで別々に希釈され、最終量２５０μｌにされた。ＰＬＰＥＩ溶液は急速添加ＤＮＡ溶液に移され、渦流撹拌された。ＰＯＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−ＰＥ（４２μｇ、２１μｇ、１５μｇ、３：３：０．３モル／モル）の混合物から乾燥リピッド膜が別個に作製され、５００μｌのＨＢＧで水和された。このリピッド縣濁液は予備形成ＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体で２４時間、室温にて培養された。あるいは、このＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体はリピッド膜に直接的に加えられた。得られたＭＮＰの縣濁液は使用時まで４℃で保管された。
【００５３】
サイズ及びゼータ電位
このＭＮＰはＨＢＧで希釈され、最良の拡散密度が得られた。流体力学径とゼータ電位とが、ゼータプラス粒子分析器（カルフォルニア州サンタバーバラのブルックヘィブン・インストルメンツ社）を使用して準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）によって測定された。散乱光は９０°の角度で２３℃において検出された。データ分析のために粘度０．９３３ｍＰａと屈折率１．３３３が使用された。機器は、ラテックス微小球縣濁液（０．０９μｍ、０．２６μｍ；カルフォルニア州パロ・アルトのデューク・サイエンティフィック社）を使用して定期的にキャリブレーションされた。
【００５４】
フリーズフラクチャー電子顕微鏡
ＭＮＰはサンドイッチ技術と液体窒素冷却プロパンを使用して急冷された。氷結晶形成を回避し、低温固定プロセスにより他の人工現象を回避するため１００００Ｋ／秒の冷却速度が採用された。フラクチャープロセスがＪＥＯＬ  ＪＥＤ−９０００フリーズエッチング装置で実行され、露出したフラクチャー平面はプラチナによって２５°から３５°の角度で３０秒間、および炭素によって３５秒間覆われた［２ｋＶ、６０ｍＡから７０ｍＡ、１ｘ１０−５トール（１トール＝１３３Ｐａ）］。複製物は燻蒸ＨＮＯ３によって２４時間から３６時間洗浄され、少なくとも５回、新鮮なクロロホルム／メタノール［１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）］による反復撹拌処理が続き、ＪＥＯＬ１００ＣＸ電子顕微鏡によって検査された。
【００５５】
塩誘導凝集に対抗する安定性
塩誘導凝集に対するＭＮＰ粒子のコロイド安定性がＭＮＰサイズ（流体力学径）のモニターによって確認された。前述のサイズを測定しながら、ＮａＣｌ（５Ｍ）が最終的に０．１５ＭとなるようにＨＢＧ内のＭＮＰに加えられた。
【００５６】
ヌクレアーゼ耐性度
サンプルを５０単位のＤＮａｓｅＩ（ウィスコンシン州マジソンのプロメガ社）により３０分間、３７℃で処理することで、ＭＮＰ粒子内のＤＮＡ分子のヌクレアーゼ耐性度が決定された。最終濃度５ｍＭにて反応はＥＧＴＡおよびＥＤＴＡを使用して決定された。ＤＮＡ分子はヘパリン（ＤＮＡの５０単位／μｇ）を３７℃で３０分使用して解離され、生成物は０．８％のプレキャストアガロースゲル上で分析された。
【００５７】
細胞毒性アッセイ
線維芽細胞であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞が、９６ウェルのプレートに１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたＤＭＥＭ内で育成された。細胞は、１００μｇ／ｍｌのＰＥＩまでそれぞれの処方物の連続的希釈物を含んだ無血清媒質（１００μｌ）と媒質を交換することで処理された。４時間の培養後、細胞はＰＢＳで２度洗浄され、完全媒質（１００μｌ）に戻された。２４時間の培養後、２０μｌのセルチター９６アクエアスワン溶液（ウィスコンシン州マジソンのプロメガ社）が各ウエルに加えられ、プレートは２時間、再培養された。４９０ｎｍでの吸収が、９６ウエルのプレートリーダ（フィッシャー・サイエンティフィック社のマルチスキャンＭＣＣ／３４０）を使用して各ウエルに対して測定された。対照として媒質のみで処理された細胞を使用して相対的細胞生存率が計算された。
【００５８】
薬物動態学（薬力学）及び生物内分布
雄のｂａｌｂ／ｃマウス（２０ｇ〜３０ｇ）がケタミン／キシラジン（１ｍｇ／０．２ｍｇ／動物）で麻酔状態にされ、ノースイースタン大学の動物管理使用委員会により承認されたプロトコルに従って、右側頚動脈を介して逆行方向にＰＥ−１０でカテーテルが挿入された。１１１Ｉｎ−ＤＮＡ（〜２μＣｉ  １１１Ｉｎ、２０μｇ  ＤＮＡ）が載荷されたＭＮＰが尻尾の静脈に注射された。静脈ボーラス注射の１分後、２分後、５分後、１０分後、３０分後および６０分後に血液サンプル（３０μｌ）が頚動脈のカテーテルを介して採取された。サンプルボリュームはヘパリンを含んだＰＢＳ（１０Ｕ／ｍｌ）と交換された。６０分後の最後の血液採取後に動物は頚椎脱臼により処分され、器官サンプル（肺臓、肝臓、脾臓、腎臓、筋肉、および皮膚）が採取された。血液と器官サンプルの放射能がγカウンターで測定された。放射能は注射投与量の百分率で表された（器官の場合％ＩＤ／ｇ、血液の場合％ＩＤ／ｍｌ）。器官配分値は対応する器官の血液量に関して補正された。血液の“濃度ｖｓ時間”データを２指数等式（Ｃ（ｔ）＝Ａ＊ｅ−αｔ＋Ｂ＊ｅ−βｔ）に当てはめることで薬力学パラメータが決定された。
【００５９】
体内遺伝子発現
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（チャールスリバー研究所）が、ノースイースタン大学の動物管理使用委員会により承認されたプロトコルに従って、処理の１４日前に１ｘ１０６ＬＬＣ腫瘍細胞を有した左側腹に皮下的に接種された。２００μｌの注射量に４０μｇのｐＧＦＰを含んだＭＮＰが尻尾の静脈注射により投与された。同じようなサイズの腫瘍を有した非注射マウスが陰性対照として使用された。麻酔マウスは頚椎脱臼によって４８時間後に処分され、切除された腫瘍は固定されることなくティシューテックＯＣＴ４５８３コンパウンド（カルフォルニア州サクラ・ファインテック社）内で直ちに冷凍され、８μｍ厚の断片がクライオスタットで準備された。蛍光顕微鏡（オリンパスＢＸ５１）によりＧＦＰ蛍光が可視化された。
【実施例１】
【００６０】
ミセル様ナノ粒子（ＭＮＰ）の作製
ミセル様ナノ粒子（ＭＮＰ）はプラスミドＤＮＡをＰＬＰＥＩと複合させ、続いてこの予備形成複合体を、ＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミン結合体（ＰＥＧ−ＰＥ）を含んだリピッド層を内包させて作製された（図１）。複合化に関して、アガロースゲル上へのＤＮＡの移動を完全に阻止するのに必要なアミンの量に基づいて、ＰＬＰＥＩとＤＮＡの最良比が決定された。なぜなら、複合体の形成はＤＮＡの移動を阻止し、ＤＮＡをウエル内に維持するからである。定量のプラスミドＤＮＡがＰＬＰＥＩと変動するアミン／リン酸比（Ｎ／Ｐ）で混合され、アガロースゲル電気泳動により分析された。Ｎ／Ｐ比が増加するに従ってＤＮＡの結合分画は増加し、ほとんどのＤＮＡは６を超える高いＮ／Ｐ比で結合された。ＰＬＰＥＩの複合特性は非修正ＰＥＩの複合特性に比肩し、ＤＮＡ複合化のためのＰＥＩ容量がリピッド結合によっては消滅しないことを示した（図２ａ）。全ＤＮＡが複合体に結合している場合にはＮ／Ｐ比１０が選択され、以下のステップで使用された。
【００６１】
ＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を内包するため、ＰＯＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＰＥ（３：３：０．３  モル／モル）を含む遊離リピッドの混合物が水性縣濁物として別個に準備された。このリピッド縣濁物は予備形成ＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体で培養され、ＰＬＰＥＩのリピッドモイエティと遊離リピッドとの間の疎水性相互作用によって促された（大抵は単層であるが）随意のエンベロープ形成に導いた（挿入後技術）。遊離リピッドの最良量は、予備形成ＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体に完成単層エンベロープを提供するであろうリピッド分子数から近似的に予測された。５０ｎｍ径の二重層リポソームが約２５０００リピッド分子を含むと想定し［１８］［１９］、ＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ核が質量／体積比１ｇ／ｍｌを有していると想定すると、粒径５０ｎｍで、全質量が２３０μｇの粒子核の全表面を覆うのに約０．２μモルの全リピッドが必要であると計算された。すなわち、全質量の１ｍｇの粒子核表面を完全に覆うには１μモルの全リピッドが必要である。よって、特に記載がないかぎり、１００μｇのＤＮＡが１３１μｇ（０．０８μモル）のＰＥＩと４９μｇ（０．０８μモル）のＰＬに対応する１８０μｇのＰＬＰＥＩと複合化され、続いて４２μｇ（０．００５μモル）のＰＯＰＣ、２１μｇ（０．０５５μモル）のコレステロールおよび１５μｇ（０．００５μモル）のＰＥＧ−ＰＥで培養された。
【００６２】
遊離リピッドのＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体との相互反応および組み込みは、蛍光標識ＤＮＡ（Ｒｈ−ＤＮＡ）と蛍光標識遊離リピッド（ＣＦ−ＰＥＧ−ＰＥ）とを同時局在させることで、蛍光顕微鏡（図示せず）により確認された。単層エンベロープを有した特徴的ハードコア構築物はフリーズフラクチャー伝達電子顕微鏡（ｆｆＴＥＭ）で明確に確認された。ｆｆＴＥＭは平均粒径５０ｎｍの良く成長した球状ナノ粒子を明示した（図２ｂ）。全粒子は構築物の背後に陰影を表示した。これは、ミセルを含む“ハードコア”粒子にとって典型的なことである。この現象は、凹状および凸状フラクチャー平面を表示する（それぞれ構造物の前方及び後方）リポソームのごとき二重層構築物のフラクチャー現象とは異なるものである。
【実施例２】
【００６３】
ＭＮＰの物理化学的特性
伝統的なＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスは高生理食塩水条件下で急速に凝集する［８］。塩誘導凝集化に対抗するリピッドエンベロープの安定化効果を示すため、ＮａＣｌが最終濃度０．１５Ｍとなるように、流体力学径をモニターしながら複合処方物に加えられた。予想通り、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスはＮａＣｌを加えた直後に凝集を開始し、２４時間でほぼ２０倍にまで流体力学径を継続的に増加した。遊離リピッドとＰＥＧ−ＰＥを有さない中間ＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体はＮａＣｌの添加直後に２倍の増加を示したが、２４時間にわたって比較的に一定であった。一方、ＭＮＰは安定状態を保ち、塩の追加による目立った凝集は２４時間発生しなかった（図３ａ）。
【００６４】
ゼータ電位測定によって、ＭＮＰが−２．１±０．８６ｍＶ（平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝５）である好適な中性表面電荷を有することが分った。一方、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスはさらに有害な高表面正電荷である２０．２±１．３８ｍＶ（平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝５）を有する。ＭＮＰの中性表面電荷はまた、さもなければ正電荷であるＰＥＩ／ＤＮＡ核の電荷シールドを提供するリピッド層の存在を暗示した。
【００６５】
リピッド層の存在は、載荷されたＤＮＡを酵素分解から完全防御したことによってさらに示された。酵素処理によって遊離ＤＮＡは完全に分解したが、ＰＥＩ／ＤＮＡまたはＭＮＰのＤＮＡには変化は見られなかった。酵素処理後に完全ＤＮＡの取り込みは少々阻害された。恐らくは酵素の干渉が原因であろう。完全ＤＮＡ（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ）の定量化は、７０％だけがＰＥＩ／ＤＮＡから回収されることに較べて、９３％もの付加ＤＮＡがＭＮＰから回収されたことを示した。このことはリピッド膜内のＤＮＡの完全内包化の概念を支持した（図３ｂ）。
【００６６】
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対するＭＮＰの細胞毒性も評価された。ＭＮＰは、４時間の処理に続いた２４時間の培養後に１００μｇ／ｍｌのＰＥＩ濃度では細胞毒性を一切示さなかった。このことはＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の場合とは驚くべき対比であった。ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体は１５μｇ／ｍｌのＰＥＩ濃度では非常に有毒性であった（図４）。この結果は、ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の表面の強力な正電荷に対してＭＮＰ上が中立表面電荷を示しているデータに鑑みて非常に明確であるように思われる。
【実施例３】
【００６７】
体内生物分布および遺伝子発現
血液中のＭＮＰの延長された循環時間、すなわち腫瘍のごとき標的組織へのそれらの増強された送達の実現可能性を証明するため、薬力学および体内分布研究が、マウスに１１１Ｉｎ−ＤＮＡが載荷されたＭＮＰを使用して実行された。１１１Ｉｎ−ＤＮＡが載荷されたＭＮＰの体内ボーラス投与後の放射能が測定され、対照ＰＥＩ／１１１Ｉｎ−ＤＮＡ複合体のものと比較された。１０分後に、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスに対する約１０％のＩＤ／ｍｌと較べて、ＭＮＰの３０％ものＩＤ／ｍｌが血液内に残った。注射の１時間後にも、ＭＮＰの約２０％のＩＤ／ｍｌが血液内に残り、たったＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスの５％のＩＤ／ｍｌが循環時に検出されただけであった（図５ａ）。
【００６８】
ＰＥＩ／ＤＮＡと較べて遅速であるＭＮＰ内のＤＮＡの除去、すなわち一層延長された循環時間も薬力学パラメータにより確認された。収集された血液濃度データを２隔室モデルに対する６０分に適応させることで半減期（ｔ１／２ベータ）が予測され、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレクスに対しては３３分であるのに対して約２３９分であることが分った。“濃度ｖｓ時間”曲線で得られた曲線（ＡＵＣ）の下側面積も、ＰＥＩのポリプレクスと比較してＭＮＰ内のプラスミドＤＮＡの全身利用性の相当な増加を示した（１４０４％ＩＤ・分／ｍｌｖｓ５３０％ＩＤ・分／ｍｌ）。延長循環時間はＲＥＳ取り込みによる低減した除去によるものであった。対照ポリプレクスのＤＮＡが主としてＲＥＳ器官で蓄積したが（４０％ＩＤ／ｇ肝臓および３０％ＩＤ／ｇ脾臓）、ＭＮＰのＤＮＡはＲＥＳ器官を非常に減少した蓄積（肝臓と脾臓の場合には５％ＩＤ／ｇ）のみで通過した（図５ｂ）。これらを考慮すると、ＲＥＳ部位での低蓄積と共に長い循環時間はＭＮＰを体内利用に適したものとしている。
【００６９】
長時間循環する薬剤ナノ担体の増強された透過性と保持性（ＥＰＲ）効果−仲介受動蓄積に適した、腫瘍のごとき標的の増強された遺伝子送達性および体内トランスフェクションの実現可能性が、ＬＬＣ腫瘍を有したマウスにおいて証明された。腫瘍組織での遺伝子発現が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のためのプラスミドＤＮＡコード化が付加されているＭＮＰの体内投与に続いて評価された。注射の４８時間後、ＭＮＰで処理された動物の腫瘍で発光するＧＦＰ蛍光が観測されたが、対照マウスの腫瘍には蛍光は見られなかった（図６）。動物の生存が短かったため、ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレキシを注射された動物の腫瘍組織のＧＦＰ発現が評価されなかった。対応する投与量でのＰＥＩ／ＤＮＡポリプレキシの静脈投与は、呼吸不全による３０分以内の動物の死をもたらした。これは大きく減少したＭＮＰの有毒性の追加的な確認である。
【００７０】
これらを考察すると、ＲＥＳ部位での低蓄積と共に血液中の長循環時間は腫瘍部位でのＭＮＰの多量の蓄積を可能にし、強力なレポータ遺伝子発現に導いた。ＭＮＰのこれら性質は、ＭＮＰを体内遺伝子治療に適したものとしている。
【実施例４】
【００７１】
ｓｉＲＮＡ−付加ＭＮＰの作製
ｓｉＲＮＡ付加ＭＮＰの作製には、ＤＮＡの場合と同様に、ｓｉＲＮＡはまず、ＤＮＡ含有ＭＮＰの作製と同じくＮ／Ｐ比１０でＰＬＰＥＩと複合化される。選択量のｓｉＲＮＡが、Ｎ／Ｐ比１０を提供するのに必要な量で使用されるＰＬＰＥＩと混合された。アンチセンス付加ＭＮＰを作製するために等量のアンチセンスオリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡと置換できる。そのように形成されたｓｉＲＮＡ／ＰＬＰＥＩ複合体は以下のステップで利用される。
【００７２】
別に、ＰＯＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（３：３：０．３モル／モル）を含んだ遊離リピッドの混合物が、水性縣濁物として調製される。この遊離リピッド縣濁物は予備形成ＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体で培養される。ｓｉＲＮＡ核が１ｇ／ｍｌの質量／体積比を有するなら、約０．２μモルの全リピッドが、５０ｎｍ径で全質量２３０μｇの粒子核の全表面を覆うのに必要である。すなわち、１ｍｇの全質量の粒子核の全表面を覆うには１μモルの全リピッドが必要である。
【００７３】
ＰＥＧ−ＰＥの量、すなわち、１０モル％が遊離であり、４．３モル％である全ホスホリピッドが、遊離リピッドを予備形成複合内に取り入れ、立体的安定性を最終構築物に提供するために選択される。予備形成ＰＬＰＥＩ／ＤＮＡ複合体での培養で、遊離および結合したリピッドを含む全リピッドのＰＥＧ−ＰＥ含有量は４．３モル％に減少する。ここではラメラ相が一般的である。最終構築物は、ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩポリプレクス核とリピッド単層エンベロープとを備えた立体安定したミセル様ハードコア粒子である。
【００７４】
遊離リピッドのｓｉＲＮＡ／ＰＬＰＥＩ複合体との相互作用および組み入れは、蛍光顕微鏡を使用して、蛍光標識化されたｓｉＲＮＡ（Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡ）と、蛍光標識化遊離リピッド（ＣＦ−ＰＥＧＨ２０００−ＤＳＰＥ）との共局在によって確認される。単層エンベロープを備えた特徴的なハードコア構築物はフリーズフラクチャトランスミッション電子顕微鏡（ｆｆＴＥＭ）によって確認される。
【００７５】
本発明を１好適実施態様により解説してきたが、専門家であれば、ここで解説されている組成物並びに方法の様々な変更、均等物による置換、および代替形態を着想するであろう。よって、本発明の範囲は「請求の範囲」およびその均等物によってのみ限定されるものである。
【図１】
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【図２ａ】
2011503070.tif 000004
【図２ｂ】
2011503070.tif 000005
【図３ａ】
2011503070.tif 000006
【図３ｂ】
2011503070.tif 000007
【図４】
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【図５ａ】
2011503070.tif 000009
【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【国際調査報告】
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