(57)【要約】  本発明は、結腸癌を検出し、診断しまたは予測する方法であって、個体から得た血液、血漿または血清サンプル中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度を測定し、(b)健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の標準値とステップ(a)で測定した濃度を比較し、ここで健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の標準値と比較して上昇したテネイシン−Ｗタンパク質濃度が結腸癌が存在する可能性の指標である、方法を提供する。したがってキットおよび抗体も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸癌を検出し、診断しまたは予測する方法であって：
(a)個体から得た血液、血漿または血清サンプル中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度を測定し、
(b)健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の標準値とステップ(a)で測定した濃度を比較することを含み、
ここで健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の標準値と比較して上昇したテネイシン−Ｗタンパク質濃度が結腸癌が存在する可能性の指標である、方法。
【請求項２】
健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の標準値と比較して少なくとも２倍のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の上昇が結腸癌の再発の高い可能性の指標である、請求項１の方法。
【請求項３】
さらに下記ステップ：
(c)個体から得た血液、血漿または血清サンプル中のテネイシン−Ｃタンパク質濃度を測定し、
(d)健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｃタンパク質濃度の標準値とステップ(c)で測定した濃度を比較する、
ステップを含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
テネイシン−Ｗおよび／またはテネイシン−Ｃタンパク質濃度がテネイシン−Ｗおよび／またはテネイシン−Ｃに特異的な抗体またはそのフラグメントを用いて測定される、請求項１、２または３の方法。
【請求項５】
テネイシン−Ｗおよび／またはテネイシン−Ｃタンパク質濃度がＥＬＩＳＡによって測定される、請求項４の方法。
【請求項６】
テネイシン−Ｗに特異的な抗体またはそのフラグメントを含む、血液、血漿または血清サンプルにおいて結腸癌を検出し、診断しまたは予測するためのキット。
【請求項７】
さらにテネイシン−Ｃに特異的な抗体またはそのフラグメントを含む、請求項６のキット。
【請求項８】
結腸癌のバイオマーカーとしての、テネイシン−Ｗタンパク質の血液、血漿または血清中濃度の使用。
【請求項９】
テネイシンＷタンパク質の血液、血漿または血清中濃度を測定することによって結腸癌の診断に使用するための、テネイシン−Ｗに特異的な抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
結腸癌の血液、血漿または血清バイオマーカーとしてのテネイシン−Ｗ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、結腸癌のための新規な血液、血漿または血清バイオマーカーを提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍発生および進行は、がん細胞における遺伝子変化を導く変異の獲得および蓄積だけでなく（1、2参照）、多様な細胞タイプ（例えば活性化線維芽細胞、血管形成内皮細胞、浸潤性炎症性細胞）および修飾された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）から成る形質転換上皮と腫瘍間質の間のクロストークに依存する3、4。近年、十分な新生物発生に必要な増殖を許容する微小環境の形成を促進する可溶性因子を分泌することによって、がん細胞がそれらに隣接する間質を変化させ、活性化することができると判明した5-7。
【０００３】
接着調節ＥＣＭ分子であるテネイシン−Ｃは、多くの固形腫瘍において活性化された線維芽細胞によってデノボ発現される7-9。テネイシン−Ｃの腫瘍促進活性にはシンデカン−４の阻止を介するフィブロネクチンに拡がるがん細胞の廃絶10、11、がん細胞増殖の促進10、血管形成の誘導12およびＭＭＰ−１２の上方制御による促進された細胞侵襲13が含まれる。さらに、テネイシン−ＣはＥＧＦＲ14、15、ＥＲＫ／ＭＡＰＫおよびＷｎｔ16のような発がんシグナル伝達経路の引き金を引き得る。重要なことに、テネイシン−Ｃは肺に優先的に転移する転移性乳癌細胞を同定する遺伝子発現シグネチャの一部である。テネイシン−Ｃは成体において存在しないか、あるいは極めて低いレベルで発現されるが、腫瘍において再発現されるため18、多くのがんにおける上昇したテネイシン−Ｃ発現が体液中テネイシン−Ｃ濃度の上昇に反映され得ると推測することは合理的であった。事実、多様ながんのタイプ、例えば神経膠腫、前立腺癌または結直腸癌、転移性黒色腫、頭頸部の扁平上皮癌および非小細胞性肺癌を有する患者の血清において上昇したテネイシン−Ｃ濃度が報告されている19-25。しかし、がん患者の血清中テネイシン−Ｃの値は広範に分布しており、顕著な割合のこれらの患者が通常の濃度を有していたため、がんを検出するためにはテネイシン−Ｃ測定の感度が低いと結論づけられた。さらに、高い血清テネイシン−Ｃ濃度はＡ型肝炎および肝硬変を含む非がん性肝臓疾患26-29ならびに感染、組織損傷または他の炎症性状態の結果として発現される急性期タンパク質であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）21の高い濃度30、31と明確に相関していた。したがって、がんのための信頼できる血液または血清バイオマーカーがなおも必要とされている。
【０００４】
テネイシン−Ｗは当初、ゼブラフィッシュにおいて同定され、神経堤細胞および中胚葉にてテネイシン−Ｃと共発現されることが示された32。より最近では、マウス33およびニワトリ34テネイシン−Ｗが開示され、これらの動物の両方においてテネイシン−Ｗが発生中および成体平滑筋細胞および骨において発現されている。ニワトリテネイシン−Ｗ機能は、頭蓋骨細胞接着の調節およびインビトロでの拡散を含む。腫瘍の存在とテネイシン−Ｗ発現の関係に関する最初の研究はマウスで実施された。発がん誘導性哺乳類腫瘍モデルを用いて、テネイシン−Ｗがその顕著な発現をテネイシン−Ｃと共にする腫瘍間質において顕著に発現されることが示された35（WO-A-03/080663も参照)。機能的研究によって、マウステネイシン−Ｗを哺乳類がん細胞の移動を促進する分子として同定した。近年、本発明者らはヒト乳癌組織の間質におけるテネイシン−Ｗの存在を確認した36。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要約
本発明者らは、驚くべきことに、テネイシン−Ｗの存在ががん間質に限られないこと、そしてテネイシン−Ｗが結腸癌の血液または血清バイオマーカーとして使用できることを見出した。さらに、テネイシン−Ｗの血液または血清中濃度は、結腸癌の再発リスクが高い患者においてより高い。
【０００６】
したがって本発明は、結腸癌を検出し、診断しまたは予測する方法であって、個体から得た血液、血漿または血清サンプル中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度を測定し、(b)ステップ(a)で測定した濃度と健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の標準値と比較することを含み、ここで健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の標準値と比較して上昇したテネイシン−Ｗタンパク質濃度が結腸癌の存在の指標である方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、テネイシン−Ｗに特異的な抗体またはそのフラグメントを含む、血液、血漿または血清サンプルにおいて結腸癌を検出し、診断しまたは予測するためのキットを含む。
【０００８】
したがって、本発明の一つの態様は、結腸癌のバイオマーカーとしての血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の使用である。
【０００９】
本発明の別の態様は、血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度を測定することによって結腸癌の診断に使用するための、テネイシン−Ｗに特異的な抗体またはそのフラグメントを含む。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、結腸癌の血液、血漿または血清バイオマーカーとしてのテネイシン−Ｗである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】テネイシン−Ｗに対する抗体の概略。(a) ヒトＴＮＷのドメイン構造の略図。組み換え全長ＴＮＷならびにポリクローナルおよびモノクローナル抗体に対する抗原として使用されるそのフラグメントが線で示されている。構造ドメインを同定するために次の記号を用いている：７回反復（波線）、ＥＧＦ様反復（菱形）、ＦＮＩＩＩドメイン（四角）、重複により生じたＦＮＩＩＩ（黒四角）、フィブリノーゲン球（丸）。（ｂ）クーマシー染色ゲル（レーン１〜５）およびウェスタンブロット（レーン６〜１０）。（１、６）ＴＮＷ調整培地１０μｌ、（２、７）フィブロネクチン２．５μｇ、（３、８）フィブリノーゲン２．５μｇ、（４、９）精製ＴＮＣ  ２．５μｇ、（５）精製ＴＮＷ  ２．５μｇおよび（１０）精製ｈＴＮＷ  ５００ｎｇ。イムノブロット分析は検出抗体ｐＡｂ（ＦＬ）がＴＮＷを特異的に認識し、他の試験タンパク質と交叉反応しないことを示す。（ｃ）ｐＡｂ（ＦＬ）の精製テネイシン−Ｗ（Ｗ）との反応性は１０μｇ／ｍｌの精製テネイシン−Ｗ（ＦＬｈＴＮＷ）とのインキュベーションによって阻止されるが、細菌で発現されたＦＮＩＩＩ  ３Ｆ／４フラグメント１０μｇ／ｍｌでは阻止しえず、ｐＡｂ（３Ｆ／４）の反応性は両方のテネイシン−Ｗ調製物（ｄ）によって阻止し得る。捕捉抗体としてｍＡｂ  ２９Ａを、検出抗体としてｐＡｂ（ＦＬ）を、そして精製ＴＮＷの連続希釈を用いる典型的な標準曲線の対数−対数表示を示す。ＴＮＷ濃度約０．００５ｍｇ／ｌで検出限界に達した。
【図２】テネイシン−Ｗ血清濃度。(a)健常ボランティア（ｎ＝２５、平均：０．３８９±０．１４５ｍｇ／ｌ）および非転移性結直腸癌患者（ｎ＝１７、平均：０．７９４±０．３８ｍｇ／ｌ）の血清ＴＮＷ濃度を示す。ボランティアと比較して結直腸癌患者において、平均テネイシン−Ｗ濃度（バー）の統計的に有意な上昇が見られる。(b)健常個体および結直腸癌患者の血清ＴＮＣ濃度を示す。健常個体（ｎ＝１３、平均：０．７９８±０．２４ｍｇ／ｌ）と比較して平均ＴＮＣ濃度の上昇（ｎ＝１７、平均：０．９８±０．２４ｍｇ／ｌ）が見られる。(c)非転移性乳癌患者（ｎ＝１６、平均：０．６８２±０．４４ｍｇ／ｌ）および健常ボランティア（ｎ＝２５、平均：０．３８９±０．１４５ｍｇ／ｌ）の血清ＴＮＷ濃度を示す。バーは平均テネイシン値を示す。
【図３】結直腸癌におけるテネイシン−Ｗ発現。(a)１１種の結直腸癌抽出物（Ｔ）と３種の正常結腸組織（Ｎ）をＴＮＷおよびＴＮＣの存在についてイムノブロットで試験した。分析によって、正常粘膜におけるＴＮＣの低分子量アイソフォームの定常的発現と、腫瘍組織におけるより大きなＴＮＣ変異体の上方制御が示された。比較のために負荷された組み換え高分子量ＴＮＣアイソフォームの位置を示す（矢印）。ＴＮＷは腫瘍組織の大部分で検出可能であるが、正常結腸粘膜では検出されない。(b)患者Ｌの凍結切片を免疫組織化学的に分析してイムノブロットの結果を確認し、腫瘍間質において両テネイシンについての強い染色が見られた。正常組織はＴＮＷについての染色が検出されなかったが、筋筋粘膜においてＴＮＣの強い染色が観察された。検定バー:２５０μｍ。Ｎ：正常；Ｔ：腫瘍。
【図４】凍結結腸組織マイクロアレイ。指示した患者の凍結結腸ＴＭＡの、ＴＮＣに対してｍＡｂ、ＴＮＷに対してｐＡｂ（３Ｆ／４）ならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色切片（Ｈ＆Ｅ）での免疫組織化学を示す（表３参照）。正常結腸粘膜（患者３７）はＴＮＷ陰性であるが、ＴＮＣ陽性である。ＴＮＣは結腸平滑筋（患者３６）においても強く発現されている。患者２６は主用途隣接正常組織の境界の例を示す。分析した腫瘍患者１〜３２（表３）において、ＴＮＷは腫瘍間質において排他的に局在することが見出された。幾人かの患者において、ＴＮＷ陽性面積がＴＮＣ陽性領域のサブセットであると思われた（患者１２）患者１５および５は大きなテネイシン陽性面積を示す(+++)。患者４および１３はテネイシン−Ｗ染色の中程度(++)乃至小さな(+)面積を示す。一般に、染色は存在する腫瘍間質の量と関係する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
近年、本発明者らはヒト乳癌組織の間質におけるテネイシン−Ｗの存在を評価した36。これらの研究を実施していくうち、本発明者らは、驚くべきことに、テネイシン−Ｗの存在ががん間質に限られず、テネイシン−Ｗが結腸癌の血液または血清バイオマーカーとして用いることができることを見出した。さらに、本発明者らは、テネイシン−Ｗの血液または血清中濃度は、結腸癌の再発リスクが高い患者においてより高いことを見出した。
【００１３】
したがって本発明は、結腸癌を検出し、診断しまたは予測する方法であって、個体から得た血液、血漿または血清サンプル中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度を測定し、(b) ステップ(a)で測定した濃度と健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の標準値と比較することを含み、ここで健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の標準値と比較して上昇したテネイシン−Ｗタンパク質濃度が結腸癌が存在する可能性の指標である方法を提供する。
【００１４】
「血液、血漿または血清サンプル」は分析し、または測定する物質であって、必要ではないが、アッセイ可能な形態のテネイシン−Ｗを得るために前処理を行ってもよい。これは当該技術分野において既知の方法を含む（例えば、Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y., 1987)を参照されたい）。本発明のより広い局面において、一貫性が維持される限り、血液、血漿または血清サンプルの採取および操作に関する限定は存在しない。サンプルは当該技術分野において既知の方法で得られる。
【００１５】
血液、血漿または血清サンプル中のテネイシン−Ｗまたはテネイシン−Ｗ活性の測定の一貫性は、多様な技術を用いて確認することができる。例えば、各サンプルの質を制御するため、アルカリホスファターゼのような別の酵素活性を内部標準として用いることができる。さらに、アッセイ条件での対照として、サンプルのテネイシン−Ｗと同時に内部標準を測定してもよい。したがって、分析または測定ステップは、サンプルの対照タンパク質を検出し、所望により対照タンパク質で得られたシグナルによってテネイシン−Ｗについて得られた値を正規化するステップを含んでいてもよい。
【００１６】
血液、血漿または血清サンプル中のテネイシン−Ｗの存在は、当該技術分野において既知の方法を用いてテネイシン−Ｗタンパク質を検出することによって決定することができる。本発明において、テネイシン−Ｗまたはテネイシン−Ｗ活性を測定するために用いるアッセイのタイプに関する限定は存在しない。例えば、テネイシン−Ｗはテネイシン−Ｗに特異的な抗体を用いたイムノアッセイによって検出してもよい。該抗体は、例えば、全細胞タンパク質または部分的に精製したタンパク質の酵素結合イムノアッセイまたはドットブロット（抗体サンドイッチ）アッセイによってタンパク質を同定する二次元ゲルのウェスタンプロットに使用することができる。好ましくは、血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗ濃度は当該技術分野において周知の方法のＥＬＩＳＡで測定する。
【００１７】
サンプル濃縮およびタンパク質精製のための方法は文献に記載されている（Scopes, 1987参照）。例えば、所望により、血液、血漿または血清サンプル中に存在するテネイシン−Ｗは、硫酸アンモニウムで沈殿させて、あるいは血液、血漿または血清サンプルを商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore限外濾過装置を通過させて濃縮することができる。血液、血漿または血清サンプルはアニオンもしくはカチオン交換樹脂またはゲル濾過マトリックスのような好適な精製マトリックスに適用することができ、あるいは分取ゲル電気泳動に付すことができる。このような場合、各精製ステップの後のテネイシン−Ｗおよびタンパク質収率をサンプル中のテネイシン−Ｗの量の決定に考慮する必要がある。
【００１８】
本発明の方法において、健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度の標準値と比較して、ステップ(a)で測定したテネイシン−Ｗ濃度の少なくとも約２倍の上昇が、結腸癌の再発の可能性が高いことの指標である。当業者は、閾値が状況に従って上昇し得ることを理解する。したがって、上昇が例えば少なくとも約２．５、３、３．５、４、４．５または５倍であってもよい。本発明の目的について、「約」は±１０％を意味する。
【００１９】
本発明の方法のいくつかの態様において、個体から得た血液、血漿または血清サンプル中のテネイシン−Ｃタンパク質濃度も測定して、健常個体の血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｃタンパク質濃度の標準値と比較してもよい。
【００２０】
テネイシン−Ｃタンパク質濃度はテネイシン−Ｗについて本明細書に記載のとおりに測定することができる。テネイシン−Ｃ濃度はテネイシン−Ｗのものに準じて測定することができる。あるいは、あるいは、別の方法を用いて血液、血漿または血清サンプル中の両タンパク質を測定してもよい。
【００２１】
本発明の方法において、テネイシン−Ｗおよび／またはテネイシン−Ｃタンパク質濃度は、テネイシン−Ｗおよび／またはテネイシン−Ｃに特異的な抗体またはそのフラグメントを用いて測定することができる。例えば、テネイシン−Ｗはテネイシン−Ｗに特異的な抗体を用いて検出することができ、対照アッセイは別のテネイシン分子に特異的な抗体を用いて実施することができる。
【００２２】
本発明はまた、血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度を測定することによる結腸癌の診断に使用するための、テネイシン−Ｗに特異的な抗体またはそのフラグメントを提供する。抗体を調製する方法は当該技術分野において周知である。テネイシン−Ｗに特異的な抗体は、免疫原性量のポリペプチドで動物を免疫化することによって容易に得られる。したがって、本発明の抗体は、動物を免疫化して得られるポリクローナル抗体および抗血清を含み、これがウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色または当該技術分野において既知の他の方法によってテネイシン−Ｗを特異的に認識することを確認することができる。
【００２３】
ポリクローナル抗体が感作によって得られるとき、ハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体が感作動物のリンパ球から得られることが周知である（Chapter 6, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988）。したがって、血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度を測定することによる結腸癌の診断に使用するための、テネイシン−Ｗに特異的なモノクローナル抗体またはそのフラグメントも本発明によって提供される。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製する方法は当該技術分野において周知であり、科学文献および特許文献に記載されている（例えばColigan, Current Protocols in Immunology, Wiley/Green, NY (1991); Stites (eds.) Basic and Clinical Immunology (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CAおよびそれに記載されている文献(Stites); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed.) Academic Press, New York, NY (1986); および Kohler (1975) Nature 256: 495参照）。かかる技術は、ファージまたは同様に細胞で示される組み換え抗体のライブラリーから抗体を選択することを含む。Huse (1989) Science 246: 1275 and Ward (1989) Nature 341: 544を参照されたい。組み換え抗体は、Norderhaug (1997) J. Immunol. Methods 204: 77-87のように、哺乳類細胞において一時的または安定的発現ベクターによって発現され得る。
【００２４】
本発明の目的のため、血液、血漿または血清中のテネイシン−Ｗタンパク質濃度を測定することによる結腸癌の診断に使用するためのテネイシン−Ｗに特異的な抗体は、その活性フラグメントを含んでいてもよい。活性フラグメントは、抗原−抗体反応の活性を有する抗体のフラグメントを意味する。特に命名されたものとして、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦｖのような活性フラグメントが存在する。例えば、Ｆ（ａｂ’）２は本発明の抗体をペプシンで消化して得て、Ｆａｂはパパインで消化して得る。Ｆａｂ’はＦ（ａｂ’）２を２−メルカプトエタノールのような反応剤で還元して、モノヨード酢酸でアルキル化して得る。Ｆｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域がリンカーで結合している単一活性フラグメントである。キメラ抗体は、これらの活性フラグメントを保存し、これらの活性フラグメント以外のフラグメントを別の動物のフラグメントで置換して得られる。特に、ヒト化抗体も意図される。本発明の目的のため、用語「抗体」はテネイシン−Ｗと特異的に結合し得るｓｃＦｖおよび抗体様分子、例えば別の足場に移植されたＣＤＲのアプタマーも含み、これらは当業者に周知である。
【００２５】
テネイシン−Ｗを検出する方法は、例えば所望により酵素反応の使用を伴う、上記抗体の使用を含む。テネイシン−Ｗを認識する抗体は、例えばテネイシン−Ｗ抗体に特異的であり、所望により放射線標識、酵素、アビジンもしくはビオチンまたは蛍光物質（ＦＩＴＣまたはローダミン）で標識されていてもよい二次抗体を用いて検出することができる。別の態様において、テネイシン−Ｗを認識する抗体またはそのフラグメントそれ自体が標識されている。標識は検出可能な任意の組成物であってよく、したがって検出は分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、物理的または化学的であってよい。例えば、有用な標識には３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、蛍光色素（例えばＦＩＴＣ、ローダミンおよびランタノイド系蛍光体）、電子密度試薬、酵素、例えばＥＬＩＳＡで通常使用されるもの（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ・ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼ）、ビオチン、ジオキシゲニンまたはハプテンおよび抗血清またはモノクローナル抗体として使用可能なタンパク質が含まれる。標識は検出する標的化合物に直接導入してもよく、あるいは該標的に結合するプローブまたは抗体に結合させてもよい。
【００２６】
免疫結合アッセイは当該技術分野において周知である。概説について、Methods in Cell Biology Vol. 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, (Ed.) Academic Press, Inc. New York (1993)を参照されたい。
【００２７】
本発明のアッセイを通じて、各反応剤の適用または複数の反応剤の混合物のインキュベーションの後に、インキュベーションおよび／または洗浄ステップが必要とされ得る。インキュベーションステップは約５分〜数時間、例えば約３０分〜約６時間で変化し得る。しかし、インキュベーション時間は通常、アッセイ形式、検体、溶液の体積、濃度等に依存する。通常、アッセイは周囲温度で実施するべきであるが、例えば４℃〜４０℃の範囲で実施してもよい。
【００２８】
特に好ましいアッセイ形式は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。しかし、該方法および本発明の使用は、インビトロ、例えばＥＬＩＳＡで実施することができ、そしてエクスビボまたはインビボで、例えば支持体に固定された抗体を用いてオンラインモニタリングして実施することができる。
【００２９】
ある態様において、本発明は、テネイシン−Ｗに特異的な抗体またはそのフラグメントを含む、血液、血漿または血清サンプルにおいて結腸癌を検出し、診断しまたは予測するためのキットを提供する。本発明のキットはさらに、テネイシン−Ｃに特異的な抗体またはそのフラグメントを含んでいてもよい。かかるキットは、本発明の方法を実施するために有用な試薬、例えばテネイシン−Ｗおよびテネイシン−Ｃに特異的な１以上の種に由来する抗体を含んでいてもよい。かかる一次抗テネイシン抗体の何れかまたは両方を認識する二次抗体も、サンプルと結合した一次抗体の認識または検出のために含んでいてもよい。かかる二次抗体は、例えば蛍光色素、酵素、放射活性標識または他のもので、検出のために標識化されていてもよい。他の検出標識は当業者に既知である。あるいは、一次抗テネイシン抗体が直接検出のために標識されていてもよい。
【００３０】
異なる定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載の物と類似または等しい方法および物質を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および物質は次に記載されている。本明細書に記載した全ての公報、特許出願、特許および他の文献は、それらの全体において参照により包含される。相反する場合、定義を含め、本明細書が優先する。さらに、物質、方法および例示は単なる説明であり、限定されることを意図しない。
【実施例】
【００３１】
実施例
試料と方法
組み換えタンパク質
既報のとおりヒトテネイシン−Ｗおよびテネイシン−Ｃをクローン化し、発現させ、精製した36, 37。ゼラチン−アガロースカラムを用いてフィルター滅菌したウマ血清からフィブロネクチンを精製した。ＰＢＳでカラムを洗浄した後、フィブロネクチンを４Ｍの尿素で溶出させ、最終的にＰＢＳで透析した。ヒトフィブロネクチンはSigmaから購入した(Sigma, Buchs, Switzerland)。
【００３２】
抗テネイシン−Ｗ抗体作成
ヒトテネイシン−Ｗを認識する２種のポリクローナル抗血清を作成した。ｐＡｂ（ＦＬ）と称する、精製した全長ヒトテネイシン−Ｗに対する第１の抗血清は、ウサギで産生させた36（図１ａ、長い線で示される）。二次ポリクローナル抗血清をウサギで産生するために、ヒトテネイシン−Ｗの組み換えフラグメントをクローン化し、細菌で発現させ、精製した。組み換えフラグメントをクローン化するために、特異的プライマーを設計してExpand High Fidelity PCR System (Roche, Rotkreuz, Switzerland)で最後の２個のフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインをコードする配列を増幅した。全長ヒトテネイシン−Ｗ（上記）のｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、プライマーセット5’-GAGGATCCGAAATTGACGGCCCCAAAAACC-3’/ 5’-ATAAGCTTATGTGGAGAGGGTGGTGGA-3’でＰＣＲを実施した。フォワードプライマーはＢａｍＨＩ制限部位を含み、リバースプライマーは、細菌発現ベクターｐＱＥ３０(Qiagen, Hilden, Germany)に方向性クローニングできるようにＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の直後に停止コドンを含み、組み換えフラグメントの精製のためのＣ末端Ｈｉｓタグを提供する。フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン３Ｆ／４に対応する組み換えフラグメント（図１ａ、分子の下の短い線）を発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡマトリックス(Qiagen, Hilden, Germany)へのアフィニティークロマトグラフィーによって、製造業者の指示書に従って精製した。非編制条件下で精製を実施し、２５０ｍＭのイミダゾール(pH 6.9)で溶出させた。次いで、細菌で発現したテネイシン−Ｗのフラグメントを用いて、標準的な免疫方法を用いてウサギでポリクローナル抗血清（ｐＡｂ（３Ｆ／４））を得た。
【００３３】
マウスでモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生するために、最後の３個のフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインを含むヒトテネイシン−Ｗの組み換えフラグメント（図１ａ、分子の上の短い線）をクローン化し、細菌で発現させ、上記のとおり精製した。組み換えフラグメントをクローン化するため、Ｔｒｉｚｏｌ（商標）試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)でＳａｏｓ−２細胞(ATCC # HTB-85)から抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。テンプレートとしてＳａｏｓ−２  ｃＤＮＡを用いるExpand High Fidelity System (Roche, Rotkreuz, Switzerland)でのネステッドＰＣＲのために、最後の３個のＦＮタイプＩＩＩドメインを増幅するプライマーを用いた。第１の反応はプラマーセット5’-GGGAAGGAGCAGAGTAGCACTG-3’/ 5’-CCGCCTCTGGAAGACAATCC-3’で実施し、第２の反応はプライマー5’-AGGGATCCGACATTGACAGCCCCCAAAACC-3’/ 5’-CTAAGCTTTCATGTGGAGAGGGTGGTGGATAC-3’で実施した。２回目のＰＣＲのフォワードプライマーはＢａｍＨＩ制限部位を含み、リバースプライマーは、細菌発現ベクターｐＱＥ３０(Qiagen, Hilden, Germany)に方向性クローニングできるようにＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の直後に停止コドンを含み、組み換えフラグメントの精製のためのＣ末端Ｈｉｓタグを提供する。ｍＡｂは、ＳＴＩＭＵＮＥ(ID-Lelystad, Institute for Animal Sciences and Health, Lelystad, NL)で乳化した精製組み換えテネイシン−Ｗフラグメント３４．６μｇでメスＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫して得た。増進するため、テネイシン−Ｗフラグメント２５μｇを４週間隔で２回マウスに注射した。脾臓リンパ球を骨髄腫細胞系Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３(ATTC # CRL-1580)と融合させ、標準的なプロトコルに従って培養した。分泌シグナルを含むニワトリテネイシン−ＣのＮ末端フラグメントに融合したテネイシン−Ｗの最後の３個のＦＮ  ＩＩＩドメインの配列と、十分に特徴付けられた抗ニワトリテネイシン−Ｃ抗体ｍＡｂ６０38に対するエピトープを含む構築物を用いてＨＥＫ２９３細胞で発現させたテネイシン−ＷフラグメントのＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析でハイブリドーマ上清を分析した。２個のｍＡｂハイブリドーマクローン由来のＩｇＧ（ｍＡｂ  ２９ＡおよびｍＡｂ  ５６Ｏ）を調整培地からプロテインＧセファロース(Amersham, Otelfingen, CH)で精製して、この試験に用いた。
【００３４】
サンドイッチＥＬＩＳＡ
Immunolon 1 平底96ウェルプレート(Dynatech Laboratories, Chantilly, VA, USA)を１時間、３７℃で５０μｌのｍＡｂ  ２９Ａ（捕捉抗体、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ)でコーティングし、さらに１時間、室温でＰＢＳ中４％ミルク（ブロッキング液および洗浄液）でブロックした。プレートを２回洗浄した後、いずれもブロッキング液で希釈した５０μｌの血清サンプルまたは標準（精製ヒトテネイシン−Ｗ）を３７℃で１時間インキュベートした。１：２〜１：８の２倍希釈シリーズで各血清をアッセイした。サンプルを捨て、プレートを洗浄バッファーで４回、徹底的に洗浄した。５０μｌのｐＡｂ（ＦＬ）（検出抗体、ブロッキング液中１：５００、３７℃で１時間）と共にインキュベーションした後、該プレートを再度４回洗浄し、ペルオキシダーゼ−標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ブロッキング液中１：２０００、３７℃で１時間）と共にインキュベーションした。該プレートを洗浄バッファーで４回、ＰＢＳで２回洗浄した後、反応バッファー（０．１Ｍのクエン酸、０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４、４ｍＭの１，２−フェニレンジアミン、０．００３％のＨ２Ｏ２）１００μｌを加えて酵素的呈色反応を実施した。４ＭのＨ２ＳＯ４  ５０μｌで反応を停止させ、VERSAMAX Microplate リーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)で、６２０ｎｍに対して４９０ｎｍでプレートを読み取った。
【００３５】
血清テネイシン−Ｃをモニターするため、捕捉抗体として抗ヒトテネイシン−Ｃ  ｍＡｂ  Ｂ２８．１３を、検出抗体としてポリクローナルニワトリ抗ヒトテネイシン−Ｃ（１：５００）を、そしてペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ニワトリＩｇＧ（１：１５，０００）を用い、標準として精製ヒトテネイシン−Ｃを用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを既報のとおり実施した21。
【００３６】
患者集団および血清調製
患者は非転移性結直腸癌（ＣＲＣ）を有し、腫瘍切除が予定されている４８〜９４歳（平均７０．３歳）であった。除外基準は、１０ｇ／ｄｌのヘモグロビン、白血球減少、血小板減少、直近３ヶ月での深部静脈血栓症、長期血管カテーテル、慢性血管または炎症性疾患、それぞれ直近４ヶ月および６ヶ月での外科手術および化学療法を含めた。
【００３７】
健常ボランティアは、性別混合で、がん、慢性疾患またはホルモン避妊以外の投薬歴のない、３０〜７０歳であった。平均年齢４３歳はがん患者のものよりも低かったが、年齢によるテネイシン−Ｗ濃度の上昇の指標は見られなかった。Lausanne University Hospitalのローカル倫理委員会で倫理的および科学的許可を得た。全患者および健常ボランティアから書面による同意書を得た。
【００３８】
血清調製のため、抗凝血剤なしで試験管に血液を採取した。１，０００ｇで１０分間遠心分離した後、血清を抽出し、使用するまで−８０℃で凍結した。
WHO Classification of Tumors 39に従って、１人の病理学者（ＳＷ）によって全腫瘍の組織学的診断およびグレードを再検討した。腫瘍ステージはInternational Union Against Cancer（悪性腫瘍のＴＮＭ分類）40を用いて決定した。
【００３９】
ヒト組織抽出物およびウェスタンブロット分析
外科手術後速やかに新鮮なヒト組織をドライアイスで凍結した。該組織の処理のため、氷上で解凍し、細分化し、溶解バッファー（１００ｍＭのリン酸バッファーｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、８Ｍのウレア、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１０ｍＭのベータ−メルカプトエタノール、５０ｍＭの塩酸グアニジウムおよび完全プロテアーゼ阻害カクテル(Roche, Rotkreuz, Switzerland)）中でホモジナイズした。不溶性の物質をペレット化し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを上清に加え、９５℃で５分間煮沸した。６％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、半乾燥ブロッティング装置(Millipore, Bedford, MA, USA)を用いてポリビニルジフルオライド膜(Millipore, Bedford, MA, USA)にタンパク質を電気的に移した。移動後、同等のタンパク質負荷を確認するため、アミドブラックで膜を染色した。０．０５％のＴｗｅｅｎおよび５％のスキムミルク粉末を含むＴＢＳ中、室温で１時間ブロッキングした後、ポリクローナルテネイシン−Ｗ抗血清（ｐＡｂ（３Ｆ／４）；１：７５０）、テネイシン−Ｗに対して産生したｍＡｂ  ５６Ｏ（１：１０００）、テネイシン−Ｃに対して産生したｍＡｂ  Ｂ２８−１３（１：１００）21またはビンクリンに対するｍＡｂ(１：２０００；Sigma, Buchs, Switzerland)の何れかと共に膜を一夜インキュベートし、次いでそれぞれホースラッディッシュペルオキシダーゼと結合した抗ウサギＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧ（１：１０，０００）と共に１時間インキュベーションした。Super Signal (Pierce, Rockford, IL, USA)を用いてブロットを展開し、Kodak BioMax MR フィルムに曝露した。
【００４０】
免疫組織化学および凍結組織マイクロアレイ
凍結組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を３２種の結腸癌および６種の正常結腸粘膜のサンプルから構成した。これらのサンプルの病理学的特徴を表ＩＩＩ（患者１〜３８）にまとめる。ＴＭＡは既報41のとおり、凍結Tissue-Tek OCT 化合物(Miles Laboratories, Naperville, IL, USA)中で構成した。本発明者らは、通常の中空針の代わりとなる受容穴を０．６ｍｍのドリルを用いて設けて、市販のマイクロアレイデバイス(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI, USA)を最適化した。
【００４１】
全ての免疫染色は、Discovery XT 自動染色装置(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA)を用いて、DAB Map検出キット(Ventana)で実施した。凍結組織スライドを室温で１時間乾燥させ、アセトン中４℃で１０分間固定し、次いで自動装置に導入した。染色のための前処理は必要ではなかった。最初にAB Block剤(Ventana)で１２分間、スライドを２回ブロックした。次いでこれらをテネイシン−Ｃに対してｍＡｂ  Ｂ２８−１３（１：２５００）、そしてテネイシン−Ｗに対してｍＡｂ  ５６Ｏ（１：８００）で、３７℃で１時間インキュベートした。その後、スライドをビオチニル化ユニバーサル二次抗体（Ventana）で、３７℃で３２分間処理し、ヘマトキシリンおよび青味剤(Ventana)で対比染色した。
【００４２】
結果
サンドイッチＥＬＩＳＡの精度および感度
捕捉抗体としてｍＡｂ  ２９Ａ、検出抗体としてｐＡｂ（ＦＬ）を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡで血清テネイシン−Ｗ濃度を分析した（図１ａ）。検出抗体の特異性は、テネイシン−Ｗ調整培地、精製フィブロネクチン、フィブリノーゲン、テネイシン−Ｃおよびテネイシン−Ｗのウェスタンブロット分析で評価した（図１ｂ）。抗テネイシン−Ｗ抗血清ｐＡｂ（ＦＬ）はヒトテネイシン−Ｗ調整培地および精製テネイシン−Ｗと特異的に反応するが、テネイシン−Ｃまたは血清中に存在すると知られている他の試験した関連タンパク質と交叉反応性を全く示さなかった（図１ｂ）。
【００４３】
さらに潜在的にテネイシン−Ｗと結合する血清混入物質をそれらの検出抗体が認識することを除外するため、本発明者らはテネイシン−Ｗ検出のために２種の異なるポリクローナル抗ヒトテネイシン−Ｗ抗体ｐＡｂ（ＦＬ）およびｐＡｂ（３Ｆ／４）を使用した。表Ｉａは、両ポリクローナル検出抗体が同じ血清サンプルにおいて同様のテネイシン−Ｗ濃度を測定することを示し、これはテネイシン−Ｗと結合する可能性のある血清混入タンパク質とそれらが交叉反応する可能性が極めて低いことを示している。さらにまた、ｐＡｂ（３Ｆ／４）とは対照的に、ｐＡｂ（３Ｆ／４）を産生するために使用された細菌発現フラグメントを加えてもテネイシン−Ｗとの反応性が阻止されない可能性があるため、ｐＡｂ（ＦＬ）はｐＡｂ（３Ｆ／４）よりもテネイシン−Ｗの別のエピトープを認識する（図１ｃ）。
【００４４】
精製テネイシン−Ｗの連続希釈物を試験して、本発明者らは、新たに確立したサンドイッチＥＬＩＳＡによって最低０．００５ｍｇ／ｌの血清テネイシン−Ｗ濃度が測定できると結論づけた。テネイシン−Ｗの典型的な標準曲線は図１ｄに対数−対数表示で示す。本発明者らが別の捕捉抗体（ｍＡｂ  ５６Ｏ）で試験すると、ｍＡｂ  ２９Ａと同じ結果が得られ（データは示さず）、全てのさらなるサンドイッチＥＬＩＳＡについてｍＡｂ  ２９Ａを用いると決定した。該アッセイの精度は、１回のアッセイで３回（実行内(within-run)、表Ｉｂ）または２連の２回連続アッセイで（実行間(between-run)、表Ｉｃ）、４種の血清サンプルを試験して評価した。変動係数（ＣＶ）は実行内で５．６±１．３％、実行間で６．５２±４．９％であった。したがって、本発明者らは、ヒト血清サンプルのテネイシン−Ｗを検出する感度のよい、特異的な、そして正確なサンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。
【００４５】
【表１】
2011501147.tif 000002
【００４６】
テネイシン−Ｗは結直腸癌および乳癌患者の血清で上方制御される
テネイシン−Ｃは結直腸癌患者の血清サンプル中で上昇することが示された20、25。しかし、テネイシン−Ｗについても同じことが言えるという示唆は存在しなかった。にもかかわらず、本発明者らは、１７人の非転移性（診断時点で）結直腸癌患者の血清においてテネイシン−Ｗ濃度を測定し、それを２５人の健常ボランティアの血清中でモニターされた濃度と比較した。対照血清中の平均テネイシン−Ｗ濃度は０．３８９±０．１４ｍｇ／ｌであった（図２ａ）。これは健常個体の公表されている平均血清テネイシン−Ｃ濃度の約半分である21、42。結直腸癌患者の血清テネイシン−Ｗ濃度は平均濃度０．７９４±０．３８ｍｇ／ｌと、健常個体のものと比較して有意に（ｐ＜０．０１）上昇していた（図２ａ）。これは健常ボランティアと比較して２倍の上昇に対応する。血清サンプルの免疫沈降（ＩＰ）、次いでイムノブロット分析によって、精製全長テネイシン−Ｗのサイズに対応する単独のテネイシン−Ｗ特異的バンドが検出された（データは示さず）。これは本発明者らが血清中の成熟テネイシン−Ｗタンパク質を測定していたことを示している。本発明者らはまた、テネイシン−Ｃについて同じ血清をアッセイして、健常ボランティアの平均テネイシン−Ｃ濃度０．７７５±０．２５ｍｇ／ｌを得た（図２ｂ）。これは文献に記載の範囲とよくマッチしている21、42。結直腸癌血清中の平均テネイシン−Ｃ濃度は０．９８±０．２４ｍｇ／ｌであり、対照血清と比較して１．２倍の増加に対応している（図２ｂ）。試験に利用可能な結直腸癌患者の臨床病理学的特徴と個々に測定したテネイシン−Ｗおよびテネイシン−Ｃ濃度を表ＩＩに示す。両テネイシンが結直腸癌患者における濃度の上昇という同じ傾向を示したが、ボランティアと比較した癌血清の平均値の差はテネイシン−Ｗでより顕著であった。しかし、高い血清テネイシン−Ｃ濃度を有する全ての患者が高いテネイシン−Ｗ濃度も含むわけではなく（表ＩＩ）、これは結直腸癌患者において２種のテネイシンの血清濃度間に厳密な相関関係が存在しないことを示している。上昇した血清テネイシン−Ｗ濃度と結直腸腫瘍のステージの間に明白な相関関係は存在しないが、外科手術後に腫瘍が再発した５人の患者の内４人が高いテネイシン−Ｗ濃度を有していたことには注目する価値がある。再発患者（ｎ＝５）の平均血清テネイシン−Ｗ濃度は１．０２±０．３４ｍｇ／ｌであり、非再発結直腸癌患者（ｎ＝１２、平均＝０．７００±０．３７ｍｇ／ｌ）と比較して１．５倍、健常ボランティアと比較して２．６倍の上昇に対応する（表ＩＩ）。
【００４７】
【表２】
2011501147.tif 000003
n.a.: 該当なし；ステージ：WHO Classification of Tumors, 2000による腫瘍グレード; ＴＮＭ（腫瘍、結節、転移）＝UICC Classification, 2002による腫瘍ステージ; ＴＮＷ，ＴＮＣ:サンドイッチＥＬＩＳＡで推定した血清中タンパク質濃度。
a ネオアジュバント放射線療法（25/11/02-12/12/02）
b ５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）によるアジュバント放射線化学療法（23/09/03-31/10/03）。
【００４８】
テネイシン−Ｗが結直腸癌に特異的な血清マーカーであり得るか、あるいはテネイシン−Ｗがより広い適用スペクトルを有するかを試験するため、本発明者らは、１６人の非転移性（診断時点で）乳癌患者の血清中のテネイシン−Ｗを分析し、健常ボランティアでモニターした濃度とそれを比較した。乳癌群の血清テネイシン−Ｗ平均値は０．６８２±０．４３ｍｇ／ｌであった。これは健常ボランティアと比較して統計的に有意な（ｐ＜０．０２）１．７５倍の上昇に対応する（図２ｃ）。これらのデータから、本発明者らは、血清中テネイシン−Ｗ濃度が、健常個体と比較して、非転移性乳癌および結腸癌患者において最初の治療目的の外科手術の時点で上昇していると結論づけた。
【００４９】
正常結腸およびがん組織におけるテネイシン−Ｗ発現
腫瘍組織におけるテネイシン−Ｗの上昇した発現が結直腸癌患者における上昇した血漿濃度を説明し得るか決定するため、本発明者らは、１１種の結直腸腫瘍組織抽出物においてイムノブロットを実施した。図３ａに示すとおり、腫瘍組織サンプルの大部分が検出可能な濃度のテネイシン−Ｃを含む（９／１１；８２％）。さらに、テネイシン−Ｗもこれらの腫瘍抽出物中で高度に発現されていた（９／１１；８２％）。２つの症例（患者ＥおよびＦ）において、テネイシン−Ｗとテネイシン−Ｃは存在しないかほとんど検出不可能であったが、試験した他の全てのサンプルは２つのテネイシンの共発現を示した（図３ａ）。腫瘍組織に加え、対応する正常粘膜が患者ＫおよびＬで利用可能であり、患者Ｊについて本発明者らは正常組織のみを得た。全ての正常結腸粘膜において、テネイシン−Ｗは検出不可能であったが、同じ患者の腫瘍組織抽出物は強いテネイシン−Ｗ発現を示した（患者ＫおよびＬ）。これは対応する腫瘍サンプルと比較してかなり低い濃度であったが正常結腸粘膜でも検出可能であったテネイシン−Ｃとは対照的である。テネイシン−Ｃについて、本発明者らは異なるアイソフォームを検出したが、テネイシン−Ｗについては、抽出物試験においてほとんど１個のバンドが観察された。しかし、患者ＢおよびＩの腫瘍抽出物中に、検出可能なかすかな二次低級テネイシン−Ｗバンドが存在していた。この小さなバンドはテネイシン−Ｗの分解産物を示す可能性があるが、本発明者らは、これが低いレベルの別のスプライシングによることを除外できない。テネイシン−Ｃアイソフォーム発現は腫瘍と正常組織間で異なる。正常結腸粘膜では、低分子量のアイソフォームのみが観察され得るが、腫瘍抽出物では低および高分子量のアイソフォームが検出可能である。要するに、多くのヒト結直腸腫瘍は両方のテネイシンを発現するが、それらの相対的量は患者間で大きく異なる。
【００５０】
腫瘍組織中のテネイシン−Ｗおよびテネイシン−Ｃの発現を確認し、組織中でそれらの存在を局在化するため、本発明者らは患者ＫおよびＬの正常結腸粘膜および腫瘍組織の凍結切片を免疫組織化学で染色した。染色パターンは両患者で同じであった。患者Ｌについて示されるとおり（図３ｂ）、がん細胞の周囲の特定の結合組織である腫瘍間質においてテネイシン−Ｃおよびテネイシン−Ｗ染色が強く示された。正常結腸粘膜はテネイシン−Ｃについては陽性であったがテネイシン−Ｗについてはそうではなく、イムノブロットの知見と一致していた。筋層粘膜におけるテネイシン−Ｃ発現は強く、腺の周辺にも存在していた。総合すると、凍結切片の免疫組織化学的染色によって、同じ結直腸腫瘍抽出物のイムノブロッティングで得た結果が確認され、テネイシン−Ｗが結直腸癌の活性化された腫瘍間質の新規なマーカーであることが示された。
【００５１】
この分析を多数のサンプルに拡大するため、本発明者らは、３２個のがんスポットおよび６個の正常結腸のスポットを含む凍結結腸組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を染色した。例外なく全てのがん組織切片がテネイシン−Ｗおよびテネイシン−Ｃについて染色されたが、全ての正常組織はテネイシン−Ｗについて陰性であり、テネイシン−Ｃについて陽性であった（表ＩＩＩ）。観察された異なる染色パターンの例を図４に示す。正常結腸組織においてほとんどでテネイシン−Ｃ陽性が平滑筋で見られる（図４、患者３６）。いくつかの腫瘍において、テネイシン−Ｗおよびテネイシン−Ｃ染色の完全な重複が見られたが（図４、患者４、５）、他のものではテネイシン−Ｗ陽性領域はテネイシン−Ｃ陽性領域のサブセットであった（図４、患者１２）。図４において観察されるとおり（患者１５）、腫瘍におけるテネイシン−Ｃ陽性かつテネイシン−Ｗ陰性領域はまた、より広い腫瘍および正常組織で見られるとおり、平滑筋の存在が原因であり得る（図４、患者２６）。Ｈ＆Ｅ染色切片から判断されるとおり、染色の程度は常に腫瘍の間質部分で重複していた（図４）。表ＩＩＩに患者データを要約し、染色パターンを観察された染色面積に従って分類する。これはテネイシン−Ｗよりもテネイシン−Ｃがわずかに広い分布を有することを示している。テネイシン−Ｃは結腸平滑筋で強く発現されるため、これはがん間質内の平滑筋細胞の存在を反映している可能性がある。
【００５２】
【表３】
2011501147.tif 000004
ステージ＝WHO Classification of Tumors, 2000による腫瘍グレード; ＴＮＭ（腫瘍、結節、転移）＝UICC Classification, 2002による腫瘍ステージ；カテゴリーの分類：＋＋＋  ＞６０％の腫瘍面積が染色されている；＋＋  ＞２０％の腫瘍面積が染色されている；＋  ＜２０％の腫瘍面積が染色されている。各カテゴリーの例は図４を参照されたい。
【００５３】
考察
２００６年において、結直腸癌はヨーロッパにおけるがん死亡の２番目の主要な原因であり死亡者数２０７，４００人に上る（全てのがんによる死亡の１２．２％）43。結直腸癌は数年にわたって所定のステージに進行する44。結直腸癌による死亡は多くの場合、腫瘍が初期ステージ（ポリープまたは非侵襲性癌腫）で検出され、内視鏡的ポリープ切除または外科手術で除去されたとき、予防することができる。このため、有効なスクリーニングツールが最も重要である。常套の糞便潜血試験の正確さおよび感度が低いため、数年にわたって結直腸癌のスクリーニングのための様々な生化学的マーカー、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）血清濃度45、ガラクトース−Ｎアセチルガラクトサミン糞便濃度46およびヒト糞便のＫ−Ｒａｓ変異47が開発され、探索されているが、初期のがん検出に十分感受性であり、特異性であるものは存在しない。近年、糖化経路の最後の反応を触媒する酵素の２量体形態である腫瘍M2-Pyruvateキナーゼが、結直腸癌を含む消化器癌を有する患者の血漿および糞便サンプルの両方で上方制御されることが見出された49-53。にもかかわらず、結直腸癌を予防し、検出するための今日最も有効な利用可能な方法は大腸内視鏡検査である。しかし、この検査は侵襲性であり、時間がかかり、不快であり、そして相対的に高価である54。さらに、大腸内視鏡検査の頻度はこれらの要因のため３〜５年毎に限られ、２回の大腸内視鏡検査の間にがんの発生が観察されることも稀ではない。したがって、血液で検出可能な結腸癌の代理マーカーは、初期のがんスクリーニングおよび検出のための簡便な方法であり得る。
【００５４】
新規な診断または予後腫瘍マーカーの研究において、癌患者の血清中のテネイシン−Ｃ濃度はしばしば分析されており、バイオマーカーとしてのその潜在的な値が評価されている21-23、55、56。上昇した血清テネイシン−Ｃ濃度はあるがんにおいて見られるが、これはなおも疑問の残る腫瘍マーカーである21。多くのがん患者が正常なテネイシン−Ｃ濃度を有するように、そのレベルは広い範囲でばらつき、その発現は炎症または感染部位と強く関係している18。
【００５５】
この実施例において、本発明者らは、結直腸癌のバイオマーカーとして使用するための能力について、テネイシン−Ｗを評価した。異なる抗テネイシン−Ｗ抗体および標準として精製タンパク質を用いて、感度がよく、正確なテネイシン−Ｗ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。本発明者らは健常ボランティアと結直腸癌患者の血清中のテネイシン−Ｗを検出し、測定することができた。健常個体の平均血清テネイシン−Ｗ濃度は０．３８９±０．１４５ｍｇ／ｌであった。対照集団において均一的に低いレベルは、がんバイオマーカーにおいて厳しく要求される。比較として、対照における血清テネイシン−Ｗ濃度は２倍高く、広い範囲でばらついた。興味深いことに、本発明者らは結直腸がん血清における平均テネイシン−Ｗ濃度の明確な上昇を観察した（０．７９４±０．３８ｍｇ／ｌ）。図２ａ（右）のヒストグラムは、結直腸癌患者群において、２つの亜集団が存在し：一方は上昇したテネイシン濃度を有し（平均対照値の約２．５倍）、他方は対照と同等の濃度を有することを示す。これらの群は血清中テネイシン−Ｗ上昇の異なる動力学を意味し得て、それによって正常レベルが疾患進行のより後に上昇する。別の重要な問題は、テネイシン−Ｗ濃度がより好ましくない疾患進行と関連しているかどうかである。これに関して、結直腸癌患者の追跡調査が、処置後腫瘍が再発した患者５人の内４人が高い血清中テネイシン−Ｗ濃度を有していた（すなわち平均濃度以上）ことは注目に値する（表２）。これはさらに、血清中テネイシン−Ｗ濃度の値が潜在的に再発または進行を予測していることを示唆している。
【００５６】
また、血清中のテネイシン−Ｗまたは他の何れかのバイオマーカーの存在が何らかの共に存在する疾病（例えば心臓血管疾患、炎症性疾患）によって、または他の臓器（例えば骨髄、肝臓）の腫瘍の間接的な効果を介して影響され得るかを考慮することも重要である。例えば、テネイシン−Ｃ血清濃度は腫瘍発生よりもむしろ炎症と関連していることが示されているが21、テネイシン−Ｗと感染または炎症の存在との相関関係は見出されなかった（発明者らの未公表の発見）。
【００５７】
本発明者らは、結直腸癌患者の血清中にテネイシン−Ｃが高い濃度で存在する傾向を確認したが（０．９８±０．２４ｍｇ／ｌ）、テネイシン−Ｗよりも上昇が緩やかであった。本発明者らは２種のテネイシンの濃度間にも、原発性腫瘍の分類およびステージにも相関関係を見出すことができなかった。本発明者らはまた、健常個体と比較して、非転移性乳癌患者において平均血清テネイシン−Ｗ濃度が明白に上昇すること（１．７５倍）を見出した。これはテネイシン−Ｗが結腸の腺癌に特異的なバイオマーカーではなく、適用可能なより広いスペクトルを有し得ることを示している。
【００５８】
腫瘍におけるテネイシン−Ｗの発現を試験するため、本発明者らは、１１人の結直腸癌患者の腫瘍抽出物を、そのいくつかについては対応する正常組織をイムノブロットで試験した。本発明者らは、テネイシン−Ｗおよびテネイシン−Ｃが８２％の患者の腫瘍組織において検出可能であることを示すことができた。腫瘍組織のイムノブロッティング分析を異なる結直腸癌患者で実施したため、本発明者らは腫瘍における局所的テネイシン−Ｗ発現と対応する血清中濃度との相関関係を直接得ることができなかった。しかし、テネイシン−Ｗは正常結腸粘膜には存在せず、逆にテネイシン−Ｃは正常組織でも（低い濃度で）発現されていた。興味深いことに、正常組織では、テネイシン−Ｃの低分子量アイソフォームのみが存在しているが、腫瘍組織では、低および高分子量アイソフォームが過剰発現されている。この結果は、正常および新生物性ヒト結腸組織でテネイシン−Ｃアイソフォーム発現が異なることを示唆している。これは、小さなアイソフォームの発現が正常安定組織において示されるが57、新生物、創傷治癒および炎症を含む疾患組織においてより大きな変異体が検出可能である58-61というこれまでの報告によって首肯される。同じ患者の凍結切片の免疫組織化学的分析によって、両テネイシンについて顕著な間質染色が示された。テネイシン−Ｃおよびテネイシン−Ｗの間質染色は、３２種の異なる結腸癌切片を含む凍結ＴＭＡで確認された。この試験は全ての腫瘍が両テネイシンについて染色されること、そして染色は存在する腫瘍間質の量と関係することを示した。同様の観察はヒト乳癌においても行われた。テネイシン−Ｗおよびテネイシン−Ｃが大部分のヒト乳癌において高度に発現されていることが示された。テネイシン−Ｃを発現する正常結腸粘膜とは対照的に、正常乳房柔組織は両方のテネイシンについて陰性であった36。
【００５９】
当業者には自明であるが、上記方法の変形は同じ目的に到達するために容易に導入することができる。多様なインキュベーション条件、標識、装置および物質を個々の優先度に従って選択することができる。本明細書に記載した全ての文献は、各々が個々に参照されているかの如くそれらの全体について参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
文献
1.  Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2000;100:57-70.
2.  Vogelstein B, Kinzler KW. Cancer genes and the pathways they control. Nat Med 2004;10:789-99.
3.  Bissell MJ, Radisky D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer 2001;1:46-54.
4.  Mueller MM, Fusenig NE. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat Rev Cancer 2004;4:839-49.
5.  Beacham DA, Cukierman E. Stromagenesis: the changing face of fibroblastic microenvironments during tumor progression. Semin Cancer Biol 2005;15:329-41.
6.  Bhowmick NA, Moses HL. Tumor-stroma interactions. Curr Opin Genet Dev 2005;15:97-101.
7.  Kalluri R, Zeisberg M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer 2006;6:392-401.
8.  Chiquet-Ehrismann R, Mackie EJ, Pearson CA, Sakakura T. Tenascin: an extracellular matrix protein involved in tissue interactions during fetal development and oncogenesis. Cell 1986;47:131-9.
9.  Orend G. Potential oncogenic action of tenascin-C in tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol 2005;37:1066-83. Epub 2005 Jan 18.
10.  Huang W, Chiquet-Ehrismann R, Moyano JV, Garcia-Pardo A, Orend G. Interference of tenascin-C with syndecan-4 binding to fibronectin blocks cell adhesion and stimulates tumor cell proliferation. Cancer Res 2001;61:8586-94.
11.  Midwood KS, Valenick LV, Hsia HC, Schwarzbauer JE. Coregulation of fibronectin signaling and matrix contraction by tenascin-C and syndecan-4. Mol Biol Cell 2004;15:5670-7.
12.  Zagzag D, Shiff B, Jallo GI, Greco MA, Blanco C, Cohen H, Hukin J, Allen JC, Friedlander DR. Tenascin-C promotes microvascular cell migration and phosphorylation of focal adhesion kinase. Cancer Res 2002;62:2660-8.
13.  Sarkar S, Nuttall RK, Liu S, Edwards DR, Yong VW. Tenascin-C stimulates glioma cell invasion through matrix metalloproteinase-12. Cancer Res 2006;66:11771-80.
14.  Jones PL, Crack J, Rabinovitch M. Regulation of tenascin-C, a vascular smooth muscle cell survival factor that interacts with the alpha v beta 3 integrin to promote epidermal growth factor receptor phosphorylation and growth. J Cell Biol 1997;139:279-93.
15.  Swindle CS, Tran KT, Johnson TD, Banerjee P, Mayes AM, Griffith L, Wells A. Epidermal growth factor (EGF)-like repeats of human tenascin-C as ligands for EGF receptor. J Cell Biol 2001;154:459-68.
16.  Ruiz C, Huang W, Hegi ME, Lange K, Hamou MF, Fluri E, Oakeley EJ, Chiquet-Ehrismann R, Orend G. Growth promoting signaling by tenascin-C [corrected]. Cancer Res 2004;64:7377-85.
17.  Minn AJ, Gupta GP, Siegel PM, Bos PD, Shu W, Giri DD, Viale A, Olshen AB, Gerald WL, Massague J. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature 2005;436:518-24.
18.  Chiquet-Ehrismann R, Chiquet M. Tenascins: regulation and putative functions during pathological stress. J Pathol 2003;200:488-99.
19.  Herlyn M, Graeven U, Speicher D, Sela BA, Bennicelli JL, Kath R, Guerry D. Characterization of tenascin secreted by human melanoma cells. Cancer Res 1991;51:4853-8.
20.  Riedl S, Bodenmuller H, Hinz U, Holle R, Moller P, Schlag P, Herfarth C, Faissner A. Significance of tenascin serum level as tumor marker in primary colorectal carcinoma. Int J Cancer 1995;64:65-9.
21.  Schenk S, Muser J, Vollmer G, Chiquet-Ehrismann R. Tenascin-C in serum: a questionable tumor marker. Int J Cancer 1995;61:443-9.
22.  Pauli C, Stieber P, Schmitt UM, Andratschke M, Hoffmann K, Wollenberg B. The significance of Tenascin-C serum level as tumor marker in squamous cell carcinoma of the head and neck. Anticancer Res 2002;22:3093-7.
23.  Ishiwata T, Takahashi K, Shimanuki Y, Ohashi R, Cui R, Takahashi F, Shimizu K, Miura K, Fukuchi Y. Serum tenascin-C as a potential predictive marker of angiogenesis in non-small cell lung cancer. Anticancer Res 2005;25:489-95.
24.  Takeda A, Otani Y, Iseki H, Takeuchi H, Aikawa K, Tabuchi S, Shinozuka N, Saeki T, Okazaki Y, Koyama I. Clinical significance of large tenascin-C spliced variant as a potential biomarker for colorectal cancer. World J Surg 2007;31:388-94.
25.  Takeda A, Otani Y, Hirooka E, Okada K, Torii T, Shinozuka N, Koyama I. Plasma large Tenascin-C spliced variant as a possible biomarker for the prediction of hepatic recurrence in colorectal cancer. Surgery 2007;141:124-5.
26.  Yamauchi M, Mizuhara Y, Maezawa Y, Toda G. Serum tenascin levels in chronic liver disease. Liver 1994;14:148-53.
27.  Tanaka H, El-Karef A, Kaito M, Kinoshita N, Fujita N, Horiike S, Watanabe S, Yoshida T, Adachi Y. Circulating level of large splice variants of tenascin-C is a marker of piecemeal necrosis activity in patients with chronic hepatitis C. Liver Int 2006;26:311-8.
28.  Lebensztejn DM, Sobaniec-Lotowska ME, Kaczmarski M, Voelker M, Schuppan D. Matrix-derived serum markers in monitoring liver fibrosis in children with chronic hepatitis B treated with interferon alpha. World J Gastroenterol 2006;12:3338-43.
29.  El-Karef A, Kaito M, Tanaka H, Ikeda K, Nishioka T, Fujita N, Inada H, Adachi Y, Kawada N, Nakajima Y, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T. Expression of large tenascin-C splice variants by hepatic stellate cells/myofibroblasts in chronic hepatitis C. J Hepatol 2006;46:664-73.
30.  Szalai AJ, Agrawal A, Greenhough TJ, Volanakis JE. C-reactive protein: structural biology, gene expression, and host defense function. Immunol Res 1997;16:127-36.
31.  Vermeire S, Van Assche G, Rutgeerts P. The role of C-reactive protein as an inflammatory marker in gastrointestinal diseases. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2005;2:580-6.
32.  Weber P, Montag D, Schachner M, Bernhardt RR. Zebrafish tenascin-W, a new member of the tenascin family. J Neurobiol 1998;35:1-16.
33.  Scherberich A, Tucker RP, Samandari E, Brown-Luedi M, Martin D, Chiquet-Ehrismann R. Murine tenascin-W: a novel mammalian tenascin expressed in kidney and at sites of bone and smooth muscle development. J Cell Sci 2004;117:571-81.
34.  Meloty-Kapella CV, Degen M, Chiquet-Ehrismann R, Tucker RP. Avian tenascin-W: expression in smooth muscle and bone, and effects on calvarial cell spreading and adhesion in vitro. Dev Dyn 2006;235:1532-42.
35.  Scherberich A, Tucker RP, Degen M, Brown-Luedi M, Andres AC, Chiquet-Ehrismann R. Tenascin-W is found in malignant mammary tumors, promotes alpha8 integrin-dependent motility and requires p38MAPK activity for BMP-2 and TNF-alpha induced expression in vitro. Oncogene 2005;24:1525-32.
36.  Degen M, Brellier F, Kain R, Ruiz C, Terracciano L, Orend G, Chiquet-Ehrismann R. Tenascin-W Is a Novel Marker for Activated Tumor Stroma in Low-Grade Human Breast Cancer and Influences Cell Behavior. Cancer Res 2007;67:9169-79.
37.  Lange K, Kammerer, M., Hegi, M., Grotegut, S., Dittmann, A., Huang, W., Fluri, E., Yip, G.W., Goette, M., Ruiz, C., and Orend, G. Endothelin Receptor Type B Counteracts Tenascin-C-Induced Endothelin Receptor Type A-Dependent Focal Adhesion and Actin Stress Fiber Disorganization. Cancer Res 2007;67.
38.  Pearson CA, Pearson D, Shibahara S, Hofsteenge J, Chiquet-Ehrismann R. 
Tenascin: cDNA cloning and induction by TGF-beta. Embo J 1988;7:2977-82.
39.  Hamilton SR, Aaltonen LA. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive Systemed. Lyon, France: IARCPress, 2000.
40.  Sobin LH, Wittekind C, eds. TNM classification of malignant tumors, 6th ed. New York: Wiley-Liss, 2002.
41.  Schoenberg Fejzo M, Slamon DJ. Frozen tumor tissue microarray technology for analysis of tumor RNA, DNA, and proteins. Am J Pathol 2001;159:1645-50.
42.  Washizu K, Kimura S, Hiraiwa H, Matsunaga K, Kuwabara M, Ariyoshi Y, Kato K, Takeuchi K. Development and application of an enzyme immunoassay for tenascin. Clin Chim Acta 1993;219:15-22.
43.  Ferlay J, Autier P, Boniol M, Heanue M, Colombet M, Boyle P. Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2006. Ann Oncol 2007.
44.  Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 1990;61:759-67.
45.  Rosandic M, Skegro M, Paar V, Paar D, Scukanec-Spoljar M, Juricic M, Vucelic B, Pulanic R, Rustemovic N, Ostojic R, Ljubojevic N. Quantitative tissue carcinoembryonic antigen (T CEA) assay as a screening test for severe dysplasia in colorectal adenomas. Acta Med Austriaca 1999;26:89-92.
46.  Shamsuddin AM. A simple mucus test for cancer screening. Anticancer Res 1996;16:2193-9.
47.  Doolittle BR, Emanuel J, Tuttle C, Costa J. Detection of the mutated K-Ras biomarker in colorectal carcinoma. Exp Mol Pathol 2001;70:289-301.
48.  Rennert G, Kislitsin D, Brenner DE, Rennert HS, Lev Z. Detecting K-ras mutations in stool from fecal occult blood test cards in multiphasic screening for colorectal cancer. Cancer Lett 2007.
49.  Hardt PD, Ngoumou BK, Rupp J, Schnell-Kretschmer H, Kloer HU. Tumor M2-pyruvate kinase: a promising tumor marker in the diagnosis of gastro-intestinal cancer. Anticancer Res 2000;20:4965-8.
50.  Schulze G. The tumor marker tumor M2-PK: an application in the diagnosis of gastrointestinal cancer. Anticancer Res 2000;20:4961-4.
51.  Schneider J, Schulze G. Comparison of tumor M2-pyruvate kinase (tumor M2-PK), carcinoembryonic antigen (CEA), carbohydrate antigens CA 19-9 and CA 72-4 in the diagnosis of gastrointestinal cancer. Anticancer Res 2003;23:5089-93.
52.  Hardt PD, Toepler M, Ngoumou B, Rupp J, Kloer HU. Measurement of fecal pyruvate kinase type M2 (tumor M2-PK) concentrations in patients with gastric cancer, colorectal cancer, colorectal adenomas and controls. Anticancer Res 2003;23:851-3.
53.  Ewald N, Toepler M, Akinci A, Kloer HU, Bretzel RG, Hardt PD. [Pyruvate kinase M2 (tumor M2-PK) as a screening tool for colorectal cancer (CRC). A review of current published data]. Z Gastroenterol 2005;43:1313-7.
54.  Rennert G. Prevention and early detection of colorectal cancer--new horizons. Recent Results Cancer Res 2007;174:179-87.
55.  Schenk S, Muser J, Vollmer G, Chiquet-Ehrismann R. Tenascin-C in serum: an acute-phase protein or a carcinoma marker? [letter]. Int J Cancer 1995;60:145.
56.  Gazzaniga P, Nofroni I, Gandini O, Silvestri I, Frati L, Agliano AM, Gradilone A. Tenascin C and epidermal growth factor receptor as markers of circulating tumoral cells in bladder and colon cancer. Oncol Rep 2005;14:1199-202.
57.  Mackie EJ, Tucker RP. Tenascin in bone morphogenesis: expression by osteoblasts and cell type- specific expression of splice variants. J Cell Sci 1992;103:765-71.
58.  Borsi L, Carnemolla B, Nicolo G, Spina B, Tanara G, Zardi L. Expression of different tenascin isoforms in normal, hyperplastic and neoplastic human breast tissues. Int J Cancer 1992;52:688-92.
59.  Hindermann W, Berndt A, Borsi L, Luo X, Hyckel P, Katenkamp D, Kosmehl H. Synthesis and protein distribution of the unspliced large tenascin-C isoform in oral squamous cell carcinoma. J Pathol 1999;189:475-80.
60.  Matsumoto K, Hiraiwa N, Yoshiki A, Ohnishi M, Kusakabe M. Tenascin-C expression and splice variant in habu snake venom-induced glomerulonephritis. Exp Mol Pathol 2002;72:186-95.
61.  Tsunoda T, Inada H, Kalembeyi I, Imanaka-Yoshida K, Sakakibara M, Okada R, Katsuta K, Sakakura T, Majima Y, Yoshida T. Involvement of large tenascin-C splice variants in breast cancer progression. Am J Pathol 2003;162:1857-67.
【図１】
2011501147.tif 000005
【図２】
2011501147.tif 000006
【図３】
2011501147.tif 000007
【図４】
2011501147.tif 000008
【配列表】
2011501147000001.app
【国際調査報告】
2011501147.tif 000009
2011501147.tif 000010
2011501147.tif 000011