(57)【要約】本発明は、高リスクＨＰＶの存在，ＨＰＶ遺伝子型同定、マーカー分析および／または細胞診についての試験の組合せに基づき、頸部ガンまたは高グレード前悪性頸部病変についてのスクリーニングの為の新規プロトコルを記載する。これらのプロトコルにより、フォローアップ診断試験および／または臨床的検査を受ける必要がある女性の数が減少するであろう。さらに、偽陽性および偽陰性の数が減少するであろう。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
女性の頸部スクリーニングの方法であって、
ａ）頸部試料、頸膣部試料または膣部試料における高リスクヒトパピローマウィルス（ｈｒＨＰＶ）の検出；
ｂ）ａ）において陽性の女性をマーカー分析に付すこと；
ｃ）ｂ）において陽性の女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｄ）ａ）においてヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）１６、１８、３１、３３および／または４５型について陽性であり且つｂ）において陰性である女性を厳重観察下におくこと；
ｅ）ａ）において陰性でありまたはａ）においてＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５と異なるＨＰＶ型について陽性であり且つｂ）において陰性である女性を、次のスクリーニングラウンドに差し向けること
を含む前記方法。
【請求項２】
女性の頸部スクリーニングの方法であって、
ａ）頸部試料、頸膣部試料または膣部試料におけるｈｒＨＰＶの検出；
ｂ）ａ）において陽性の女性を細胞診に付すこと；
ｃ）異常細胞診を有する女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｄ）正常細胞診を有する女性をマーカー分析に付すこと；
ｅ）ｄ）において陽性の女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｆ）ａ）においてＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５について陽性であり且つｂ）において陰性である正常細胞診を有する女性を厳重観察下におくこと；
ｇ）ａ）において陰性である女性、および、ａ）においてＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５と異なるＨＰＶ型について陽性であるがｄ）において陰性である正常細胞診を有する女性を次のスクリーニングラウンドに差し向けること
を含む前記方法。
【請求項３】
女性の頸部スクリーニングの方法であって、
ａ）頸部試料、頸膣部試料または膣部試料におけるマーカー分析；
ｂ）ａ）において陽性の女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｃ）ａ）において陰性の女性をｈｒＨＰＶの試験および分類に付すこと；
ｄ）ｃ）においてＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５について陽性の女性を厳重観察下におくこと；
ｅ）ｃ）において陰性の女性、および、ｃ）においてＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５と異なるＨＰＶ型について陽性の女性を次のスクリーニングラウンドに差し向けること
を含む前記方法。
【請求項４】
女性の頸部スクリーニングの方法であって、
ａ）頸部試料、頸膣部試料または膣部試料におけるマーカー分析；
ｂ）ａ）において陽性の女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｃ）ａ）において陰性の女性を細胞診に付すこと；
ｄ）異常細胞診を有する女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｅ）正常細胞診を有する女性を次のスクリーニングラウンドに差し向けること
を含む前記方法。
【請求項５】
女性の頸部スクリーニングの方法であって、
ａ）頸部試料、頸膣部試料または膣部試料におけるマーカー分析；
ｂ）ａ）において陽性の女性を膣鏡検査に差し向けること：
ｃ）ａ）において陰性の女性を次のスクリーニングラウンドに付すこと
を含む前記方法。
【請求項６】
該マーカー分析が、発現マーカーおよび／またはメチル化マーカーからなるマーカーパネルによる試験を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該発現マーカーが、ATP2C1(Genbank  ID:  NM_014382),  SLC25A36(Genbank  ID:    NM_018155),  DTX3L(Genbank  ID:  AK025135),  CCDC14(Genbank  ID:  AL122079),  FLJ21291(Genbank  ID:  AK024944),  ITGAV(Genbank  ID:  NM_002210),  PIK3R4(Genbank  ID:  Y08991),  およびMAL(Genbank  ID:  NM_022438)の群から選ばれ、且つ、該メチル化マーカーがMAL(Genbank  ID:  NM_022438)およびCADM1(Genbank  ID  NM_014333)の群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該メチル化マーカーが、MAL(Genbank  ID:  NM_022438)およびCADM1(Genbank  ID  NM_014333)の組合せを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
該メチル化マーカーが、MAL(Genbank ID: NM_022438)を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
細胞、組織または流体が、頸部、頸膣部または膣部の領域から、綿棒、ブラシ、洗浄により、または、タンポンおよびＰａｎｔａｒｈｅｉ（商標）サンプラを含む他の種類の（自己）サンプラにより得られる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５と異なるＨＰＶ型について陽性である、前記マーカー分析から試験陰性の女性が、最大で３年の時間間隔後にフォローアップ試験を受けて、間の高グレード病変のリスクを最小化する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ｃ）において陰性の女性がＨＰＶの試験および分類を受け、そして、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５のＨＰＶ型について陽性の女性が厳重観察下におかれ、且つ、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５と異なるＨＰＶ型について陽性の女性が次のスクリーニングラウンドに差し向けるられまたは代わりに最大で３年の時間間隔後にフォローアップ試験を受けて、間の高グレード病変のリスクを最小化し、一方でＨＰＶについて陰性の女性が次のスクリーニングラウンドに差し向けられる、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５型について陽性の女性が膣鏡検査に差し向けられ、一方で、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５と異なるＨＰＶ型について陽性の女性が次のスクリーニングラウンドに差し向けられまたは代わりに最大で３年の時間間隔後にフォローアップ試験を受ける、請求項１〜３および１１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を実施することにより、いずれかの種類の一次試験後のフォローアップ試験に付される女性の数を減少する方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を実施することにより、頸部組織スクリーニングからの偽陽性結果および偽陰性結果の数を減少する方法。
【請求項１６】
他のＨＰＶ関連粘膜（前駆）ガンについての個体のスクリーニングの必要が示される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、ガン予防および医学的診断の分野、より具体的にはガンおよび前ガン病変の診断、特には子宮頸癌およびその前ガン病変の診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
子宮頸部のガンは、世界中の女性において二番目に最もよくみられるガンであり、一年に約２５０，０００のガン死亡の原因である。
【０００３】
頸部ガン発達は、一連の前ガン病変（いわゆる頸部上皮内新生物（ＣＩＮ）病変、これは１〜３にグレード付けされ、軽度異形成（ＣＩＮ１）、中等度異形成（ＣＩＮ２）および高度異形成／癌  ｉｎ  ｓｉｔｕでの（ＣＩＮ３））により特徴付けられる。病変がより高度であればあるほど自然退縮の可能性はより低くなるが、原則としてこれらの前悪性病変は可逆的である。子宮頸ガンは予防可能な疾患であると考えられており、なぜなら前ガンステージが剥離細胞診により検出されることができ、そして、軽度の副作用だけをともない、必要なときに比較的容易に処置されることができるからである。頸部スクリーニングは、前悪性且つ処置可能なガン病変を早期に診断することを目的とし、それにより浸潤性頸部ガンの死亡率を減少する。一般的な医療実務は、頸部ガンの発達を防ぐ為に、形態学的に確認されたＣＩＮ２およびＣＩＮ３を有するすべての女性の処置を含む。
【０００４】
細胞学的検査（すなわちパパニコロー又はパップテスト）を使用する、現在の集団に基づく頸部スクリーニングプログラムが有する問題は、この試験が、頸部ガンおよび最も近い前駆病変（すなわち病変≧ＣＩＮ２／３）についての最適以下の感度（最高で７０％）および再現性に悩まされていることであり、これは実際に相当な数の偽陰性および偽陽性の試験結果をもたらす。さらに、細胞診は、家で採取されうる自己採取された頸膣部標本（specimens）についての選択肢でなく、なぜならこれらは子宮頸部の細胞学的状態について代表しないからである（Brink  et  al.,  2006,  J.  Clin.  Microbiol.  44:2518-2523）。それ故に、代替的なスクリーニングツールが評価されている。
【０００５】
過去十年を超えて、頸部発ガンが高リスクヒトパピローマウィルス（ｈｒＨＰＶ）の感染により開始されることがよく確立されてきた。この因果関係は、疫学的研究および機能的研究から明らかになる（zur  Hausen,  Nat  Rev  Cancer  2002;  2:342-350;  Bosch  et  al.,  J  Clin  Pathol.  2002;  55:  244-265）。ｈｒＨＰＶのＤＮＡは、子宮頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）の最大で９９．７％に検出されており（Walboomers  et  al.,  J.  Pathol.  1999:  189:  12-19）および子宮頸部の腺癌および腺扁平上皮癌の少なくとも９４％に検出されている（Zielinski  et  al.,  J  Pathol  2003:  201:  535-543）。ウィルスの癌遺伝子Ｅ６およびＥ７の発現（これはｐ５３およびｐＲｂ腫瘍抑制経路を妨害する）はそれぞれ、腫瘍形成の開始および悪性表現型の維持の両方にとって必須であることが示されている。それ故に、ｈｒＨＰＶについて試験することは魅力的であり、代替的な一次スクリーニングツールである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、発ガンの多段階のプロセスと一致して、宿主細胞ゲノム中の追加的変化が、ｈｒＨＰＶ感染細胞の浸潤性ガンへの進行にとって要求される。ｈｒＨＰＶに感染した女性の少しの割合だけがＣＩＮ２／３（ＣＩＮ２〜３）又は子宮頸部ガンを発症するであろうという観察、および低いグレードの前悪性頸部病変を有する多くの女性において該病変は自然に逆戻りするとの観察は、頸部発ガンの基礎をなす複数のイベントに一致する。集団に基づくスクリーニングに参加した女性のうち、約５〜６％が陽性のｈｒＨＰＶ試験を有する（Bulkmans  et  al.,  Int  J  Cancer  2004,110:94-101）。しかしながら、それらのうち最高で２０％（参加した女性の１％）だけが≧ＣＩＮ２／３を有する。それ故に、ＣＩＮ≧２／３のリスクについてのｈｒＨＰＶ陽性女性の層別化を許すマーカーが適用されることができない限り、ｈｒＨＰＶ試験による一次スクリーニングは、女性のあいだに相当な数の余分なフォローアップ手順および不必要な不安をともなうであろう。多くのチャレンジは、試験陽性の女性のパーセンテージを臨床的に意味ある病変を有するものに減少することである。一つのやり方は、ｈｒＨＰＶ陽性の女性についての二次（いわゆるトリアージ）試験として細胞診を使うことである。それでもやはり、これは正常細胞診を有するｈｒＨＰＶ陽性女性の相当な数（スクリーニング集団における女性の３．５％）を残し、このうち１０％が≧ＣＩＮ３を有し又は獲得する。加えて、いくつかの状況、例えばセルフサンプリングなど、では、細胞診は選択肢でない。
【０００７】
それ故に、ｈｒＨＰＶ陽性の女性を≧ＣＩＮ２／３を有するものおよび有さないものへと層別化する補足的または代替的なトリアージ手段についてのニーズがある。我々の研究室において実施された研究から得られた頸部発ガンへの新規洞察が今、マーカーの独特なセットをもたらし、これに基づき、新規スクリーニングアルゴリズムが設計されることができる。マーカーアッセイは、ｈｒＨＰＶタイプの情報を補われたまたは補われていない、宿主細胞遺伝子／タンパク質のセットの過剰発現／過少発現（すなわち、ＤＮＡコピー数、ｍＲＮＡ発現またはタンパク質発現のレベルで）および／または宿主細胞遺伝子および／またはそのプロモーター領域の高度メチル化（それぞれ、発現マーカーおよびメチル化マーカーと呼ばれる）を分析する試験を含む。該スクリーニングアルゴリズムは、ｈｒＨＰＶの試験および分類を含み、そして、ｈｒＨＰＶ陽性の女性のさらなるトリアージの為の細胞診を伴わない分子試験が続き、または、反射細胞診（reflex  cytology）そして次の分子試験による正常細胞診を有するｈｒＨＰＶ陽性女性のさらなるトリアージが続く。試験の順序が、アウトカムに対する大きな影響を及ぼすことの無い変更に付されることは当技術分野の当業者に明白であり、たとえばマーカー分析が最初に実施されることができ、ｈｒＨＰＶ試験および分類および／または細胞診が続いてよくまたは続かなくてもよい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明者らは今、スクリーニングプロトコルを開発し、これらは頸部ガンおよびその前駆物についての女性のスクリーニングにとって独特である。それらは、高い特異性とともに、前駆物ＣＩＮ２／３を有する高いリスクの故に膣鏡検査に差し向けられるべき女性の同定を許す。
【０００９】
すなわち、本発明に、女性の頸部スクリーニングの方法が含まれ、該方法は、
ａ）頸部、頸腟部または膣部の試料（すなわち細胞、組織、またはそれらの流体）におけるｈｒＨＰＶの検出；
ｂ）ａ）において陽性の女性をマーカー分析に付すこと；
ｃ）ｂ）において陽性の女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｄ）ａ）においてＨＰＶ１６、１８および／または４５について陽性であり且つｂ）において陰性である女性を厳重観察下におくこと；
ｅ）ａ）において陰性、またはａ）においてＨＰＶ１６、１８および／または４５と異なるＨＰＶタイプについて陽性であり且つｂ）において陰性の女性を、次のスクリーニングラウンドに差し向けること
を含む。
【００１０】
代わりに、該方法において、ａ）においてＨＰＶ１６、１８および／または４５と異なるＨＰＶタイプについて陽性であり且つｂ）において陰性である女性が、フォローアップ試験を、最大で３年の時間間隔後に受けて、間の高グレード病変のリスクを最小化する。
【００１１】
代わりに、ｈｒＨＰＶ陽性女性のすべてが、細胞診に最初に付され、そして、細胞学的に正常なスメアを有する女性だけが次に、ＨＰＶタイプおよびマーカー試験結果に基づき扱われる。すなわち、本発明に、女性の頸部スクリーニングの方法が含まれ、該方法は、
ａ）頸部、頸腟部または膣部の試料（すなわち細胞、組織、またはそれらの流体）におけるｈｒＨＰＶの検出；
ｂ）ａ）において陽性の女性を細胞診に付すこと；
ｃ）異常細胞診を有する女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｄ）正常細胞診を有する女性をマーカー分析に付すこと；
ｅ）ｄ）において陽性の女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｆ）ａ）においてＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５について陽性の正常細胞診を有し且つｂ）において陰性の女性とを厳重観察下におくこと；
ｇ）ａ）において陰性である女性、および、ａ）においてＨＰＶ１６、１８および／または４５と異なるＨＰＶタイプについて陽性であり且つｄ）において陰性である正常細胞診を有する女性を、次のスクリーニングラウンドに差し向けること
を含む。
【００１２】
代わりに、該方法において、ａ）においてＨＰＶ１６、１８および／または４５と異なるＨＰＶタイプについて陽性であり且つｄ）において陰性である正常細胞診を有する女性が、最大で３年の時間間隔後にフォローアップ試験を受けて、間の高グレード病変のリスクを最小化する。
【００１３】
代わりに、女性は、マーカー分析に最初に付され、そして、マーカー陰性試験結果を有する女性だけが次にｈｒＨＰＶの試験及び分類に付される。すなわち、本発明に、女性の頸部スクリーニングの方法が含まれ、該方法は、
ａ）女性をマーカー分析に付すこと；
ｂ）ａ）において陽性の女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｃ）ａ）において陰性の女性をｈｒＨＰＶの試験および分類に付すこと；
ｄ）ｃ）においてＨＰＶ１６、１８および／または４５について陽性の女性を厳重観察下におくこと；
ｅ）ｃ）において陰性の女性と、ｃ）においてＨＰＶ１６、１８、および／または４５と異なるＨＰＶタイプについて陽性の女性とを、次のスクリーニングラウンドに差し向けること
を含む。
【００１４】
該方法において代わりに、ｃ）においてＨＰＶ１６、１８、および／または４５と異なるＨＰＶタイプについて陽性である女性が、最大で３年の時間間隔後にフォローアップ試験を受けて、間の高グレード病変のリスクを最小化する。
【００１５】
代わりに、女性は、マーカー分析に最初に付され、そして、マーカー陰性試験結果を有する女性だけが次に細胞診に付される。すなわち、本発明に、女性の頸部スクリーニングの方法が含まれ、該方法は、
ａ）女性をマーカー分析に付すこと；
ｂ）ａ）において陽性の女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｃ）ａ）において陰性の女性を細胞診に付すこと；
ｄ）異常細胞診を有する女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｅ）正常細胞診を有する女性を次にスクリーニングラウンドに差し向けること
を含む。
【００１６】
該方法において代わりに、ｃ）において陰性の女性が、ＨＰＶの試験および分類を受ける。ＨＰＶについて陰性の女性が、次のスクリーニングラウンドに差し向けられるであろう。ＨＰＶ１６、１８および／または４５のＨＰＶタイプについて陽性の女性が厳重観察下におかれ、且つ、ＨＰＶ１６、１８および／または４５と異なるＨＰＶタイプについて陽性の女性が次のスクリーニングラウンドに差し向けられ、または、代わりに、最大で３年の時間間隔後にフォローアップ試験を受けて、間の高グレード病変のリスクを最小化するであろう。
【００１７】
加えて、上記方法において、ＨＰＶタイプ３１および３３について陽性の女性が、ＨＰＶタイプ１６、１８および／または４５について陽性の女性と同様に診断されおよび処理される。
【００１８】
代わりに、女性は、マーカー分析だけに付され、そしてマーカー陽性試験結果を有する女性が膣鏡検査に差し向けられる。すなわち、本発明に、女性の頸部スクリーニングの方法が含まれ、該方法は、
ａ）女性をマーカー分析に付すこと；
ｂ）ａ）において陽性の女性を膣鏡検査に差し向けること；
ｃ）ａ）において院生の女性を次のスクリーニングラウンドに付すこと
を含む。
【００１９】
すべての方法において、マーカー分析は、発現マーカーおよび／またはメチル化マーカーからなるマーカーパネルにより試験することを含み、ここでそれぞれ、該発現マーカーは、欧州特許出願第07114580号の表１において与えられたマーカーから選ばれ、例えばATP2C1  (Genbank  ID:  NM_014382),  SLC25A36  (Genbank  ID:  NM_018155),  DTX3L  (Genbank  ID:  AK025135),  CCDC14  (Genbank  ID:  AL122079),  FLJ21291  (Genbank  ID:  AK024944),  ITGAV  (Genbank  ID:  NM_002210),  PIK3R4  (Genbank  ID:  Y08991),  およびMAL  (Genbank  ID:  NM_022438)の群から選ばれ、及び、該メチル化マーカーは  CADM1  (以前にTSLC1と命名された;  Genbank  ID  NM_014333;  国際公開第2004/087962号パンフレットを参照されたい)およびMAL  (Genbank  ID:  NM_022438)から選ばれる。本発明に従う好ましい実施態様は、CADM1  (Genbank  ID  NM_014333)およびMAL  (Genbank  ID:  NM_022438)のメチル化分析の組合せを用いる。あるいは、該メチル化マーカーは、MAL  (Genbank  ID:  NM_022438)を含む。好ましくは、該マーカー分析について試験陽性である（すなわち発現マーカーの異常発現または１またはそれより多いメチル化マーカー遺伝子のメチル化）女性、が膣鏡検査に差し向けられる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の全体の結果は、頸部ガン又は高グレード前駆病変を有するまたは発症する最も高いリスクにある女性を上記で記載された方法のいずれかを実施することにより同定する為、および、付随して、余分なまたは過剰なフォローアップまたは膣鏡検査に付される女性の数を減少する為の方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の方法に従う代替的スクリーニングプロトコルを示す図である。
【図２】本発明の方法に従う代替的スクリーニングプロトコルを示す図である。
【図３】本発明の方法に従う代替的スクリーニングプロトコルを示す図である。
【図４】本発明の方法に従う代替的スクリーニングプロトコルを示す図である。
【図５】本発明の方法に従う代替的スクリーニングプロトコルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
頸部ガンについての試験は、最近はしばしば、大規模集団に基づく一次スクリーニング設定において行われ、これは標準的な細胞診試験（ＰＡＰテスト）に基づく。同時に、いくつかの分子生物学的試験アッセイ、例えばＨＰＶ（ヒトパピローマウィルス）の検出および分類のためのＰＣＲアッセイ、および、（遺伝子）発現マーカーおよび／またはメチル化マーカーを用いるマーカー分析など、が利用可能となった。これらの方法のすべてが、頸部ガンの（早期）段階およびその高グレード前駆物段階を示しうるが、この疾患の最終的な決定は、膣鏡検査に向けられたバイオプシーによって行われることができるのみである。しかしながら、これは、労働集約的で高価なスクリーニング方法であり、これは患者の視点からも望ましくなく、特に、そのような侵襲的診断方法に付される女性の身体のおよび、より重要には、心理の両方の健全性にとって望ましくない。
【００２３】
今、本発明に従い、いくつかのスクリーニングプロトコルが開発され、これは、余分な膣鏡検査を受けるだろう女性の数を最小化する。この次に、本発明の方法は、偽陽性及び／又は偽陰性の結果の数が、従来方法により得られるものよりもはるかに低いことにおいて信頼できる。さらに、本発明の方法は、段階的な診断スクリーニングを可能とし、これは、すべてのステップにおいて、前のステップにおいて（部分的に）陽性とスコア化された患者だけが関与すること示す。これは、本方法の後のステップにおいて試験されるべき患者の数が減少することを自動的に示し、これは、試験の量およびその経済的な結果に関して有益である。さらに、患者にとっても有益である：偽陽性結果および／または偽陰性結果のより低い数の故に、より信頼性のある診断が与えられ、結局のところ健康であるとわかる女性への心理学的圧力を防ぎ、および、最初の「有利な」予後診断後、後になって、該疾患を発症したとわかる女性におけるショック効果を回避する。
【００２４】
本発明のすべての実施態様において、マーカー分析は、頸部ガン（の前駆病変）の存在を診断する為のステップの一つである。マーカー分析は、頸部擦過物（a  cervical  scrape）におけるいくつかの遺伝子／タンパク質の発現の分析またはいくつかの遺伝子（のプロモーター領域）のメチル化状態の分析を伴いうる。一連の宿主細胞遺伝子の下方制御および／または過剰発現は、頸部細胞のＨＰＶ媒介の発ガンを伴う。実験の部において詳述されるとおり、本発明者らは、欧州特許出願第０７１１４５８０号の表１において与えられた、頸部ガンおよび／または高グレードＣＩＮ病変において高度に発現され且つ頸部ガンおよび／または高グレードＣＩＮ病変と見事に相関する一連の遺伝子（このうち、ATP2C1 (Genbank  ID:  NM_014382),SLC25A36  (Genbank  ID:  NM_018155),  DTX3L  (Genbank  ID:  AK025135),CCDC14  (Genbank  ID:  AL122079),FLJ21291  (Genbank  ID:  AK024944),ITGAV  (Genbank  ID:  NM_002210),  PIK3R4  (Genbank  ID:  Y08991)）、および、これらの症例において下方制御される一つの遺伝子（すなわち、MAL  (Genbank  ID:  NM_022438)）を発見した。上記で言及された遺伝子の過剰発現または下方制御の測定は、標準的な方法論、たとえば（マイクロ流体アレイプラットフォームを用いるまたは用いない）リアルタイムＰＣＲ（インプット材料の限られた量を用いて一つの試料における複数の標的の同時検出を許す）など、を用いて実施されうる。上記言及された遺伝子によりコードされるタンパク質の濃度を、たとえばイムノ−およびフローサイトメトリーアッセイによって、測定することにより、タンパク質レベルで過剰発現または下方制御を検出することも可能である。
【００２５】
過剰発現または下方制御の次に、プロモーター過剰メチル化がしばしば、腫瘍を発達する組織（頸部組織を含む）において発見される。本発明者らは、TSLC1  (tumor  suppressor  in  lung  cancer  1)（最近はCADM1  (cell  adhesion  molecule  1)と名前が改められた、またIGSF4,  NECL2またはSYNCAMとしても知られている、および染色体11q23.2  に置かれている(Genbank  ID  NM_014333)）のサイレンシングが、頸部ガン細胞株における頻繁な現象であることを確立した（Steenbergen  et  al.,  JNCI:  2004,  96:294-305、および国際公開第2004/087962号パンフレットを参照されたい）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、頸部ガン細胞の足場非依存性増殖および腫瘍形成能の両方におけるＣＡＤＭ１不活性化の機能的関与を明らかにし、一方で、不死化及び増殖は影響されなかった。これは、ＣＡＤＭ１の不活性化が、前駆腫瘍病変において浸潤性になるために重要な役割を果たしうることを示唆する。ＣＡＤＭ１のプロモーター領域の最近の総合的なバイサルファイトシークエンシング分析および広範なメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）分析は、特に密なメチル化が、遺伝子サイレンシングにとって重要であり、減少したタンパク質発現およびその表現型の結果をもたらすことを明らかにした。加えて、密なメチル化（分析された３つのプロモーター領域の≧２における陽性のＭＳＰシグナルとして定義される）は、≧ＣＩＮ３の病変と有意に関連した。すなわち、該ＣＡＤＭ１プロモーターのメチル化状態は、臨床的に非常に有用なメチル化マーカーを提供する。
【００２６】
（特にはＣＡＤＭ１、Genbank  ID  NM_014333、についての）過剰メチル化を決定する為の方法は、国際公開第２００４／０８７９６２号パンフレットに与えられており、および、代替的な方法は当技術分野の当業者に知られている。
【００２７】
本発明に従う好ましいアルゴリズムは、粘膜型ｈｒＨＰＶ（高リスクヒトパピローマウィルス）の存在を決定する為の試験を含む。パピローマウィルスは、一般に、組織指向性に従い分類されうる。すべての既知のヒトパピローマウィルスは厳密には、上皮起源の細胞（ケラチノサイト）に感染しそして“上皮の増殖”を誘発するが、それらは、それらの組織指向性に従い、粘膜のＨＰＶ型または皮膚のＨＰＶ型のいずれかへと分類されうる。粘膜型（例えばＨＰＶ６およびＨＰＶ１６）は、生殖管および気道の粘膜に感染するＨＰＶを包含する。皮膚型（上皮型、例えばＨＰＶ１およびＨＰＶ８）は、外側の皮膚に一般に感染するＨＰＶを包含し、皮膚のいぼを引き起こすものおよび疣贅状表皮発育異常症を患う患者において皮膚癌を引き起こすものを包含する。
【００２８】
加えて、粘膜型ＨＰＶは、感染した細胞において良性の上皮増殖をもたらすそれらの能力または悪性の変化を誘発するそれらの能力に基づき、低リスク型および高リスク型へと大まかにそれぞれ分類される。低リスクＨＰＶ型、例えば6,  11,  および32  など、は良性病変または尋常性疣贅に主に関連する一方で、高リスク型、例えば16,  18,  31,  33,  35,  39,  45,  51,  52,  56,  58,  および59など、は前悪性上皮病変および悪性上皮病変に主に関連する。これらの高リスク型のＨＰＶは、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１などの低リスク型により引き起こされるいぼと比べて、通常は平らであり且つほとんど不可視である増殖を引き起こす。
【００２９】
最近、大規模な疫学的な症例対照研究に基づき、少なくとも１２の粘膜型ＨＰＶタイプが、ヒトに対して高リスク（発ガン性）であると分類された（すなわち、ＨＰＶ16,  18,  31,  33,  35,  39,  45,  51,  52,  56,  58,  および59）。ＨＰＶ26,  53,  66,  67,  68,  73,  および82を含む一連の可能性のあるまたは候補の高リスク型についての議論は継続している。１２のＨＰＶの型（ＨＰＶ6,  11,  40,  42,  43,  44,  54,  61,  70,  72,  81,  およびCP6108）が低リスクと示されたが、６および１１はヒトに対してもしかすると発ガン性であるとも示唆されている。
【００３０】
現在最も広く適用されているＨＰＶ試験は、ｈｒＨＰＶ型の集団のプールとしての検出に基づき、続いて遺伝子型同定が行われ又は行われない。ｈｒＨＰＶの存在を決定する方法はＰＣＴ／ＮＬ２００７／０５０５２６において与えられている。
【００３１】
本発明の実施態様のいくつかにおいて、該ｈｒＨＰＶ試験において陽性であると分かった患者（ここで、「陽性」は、ｈｃ２反応がＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを与えたこと、または、ＰＣＲ反応が用いられたプライマーによりフラグメントを増幅したことを意味し、そしてすなわち、上記で示されたｈｒＨＰＶの１又はより多くが該試料中に存在することを意味する）が次に、又は前に、細胞学的検査（細胞診）および／またはマーカー評価に付される。
【００３２】
細胞学的検査は、典型的な、スメア（標本）又は液体に基づく細胞診標本について実施されうる。陽性のｈｒＨＰＶ試験結果と一緒に、陽性の細胞診結果（すなわち、ボーダーラインの核異型またはより悪い核異型のスコア）は、高グレード前悪性病変または頸部ガンの高い可能性を示し、そして、結果として、これらの女性は膣鏡検査に差し向けられるべきである。しかしながら、細胞診の異常の不在は、特には陽性のマーカー試験の場合またはＨＰＶ１６、１８および／または４５の存在の場合、該マーカー試験が陰性であるときでさえ、高グレード前悪性病変の存在を排除しない。それ故に、ＨＰＶ遺伝子型同定、マーカー遺伝子情報またはそれらの組合せが、ｈｒＨＰＶ陽性である細胞診陰性女性にとっての、理想的なトリアージ手段を提供する。ＨＰＶ３１および３３について、前悪性病変についての増大したリスクがあると思われるが、ガンが該前悪性病変から発展するだろうというリスクの減少があると見える。すなわち、ＨＰＶ１６、１８および／または４５についての試験が本発明の方法にとって要求される一方で、ＨＰＶ３１および３３についての試験は任意的でありうる。
【００３３】
該マーカー評価は、頸部の擦過物中のいくつかの遺伝子／たんぱく質の発現の分析および／またはいくつかの遺伝子（のプロモーター領域）のメチル化状態の分析を伴いうる。陽性のマーカー結果は、高グレード前悪性病変または頸部ガンの高い可能性を示し、そして、次に、これらの女性は膣鏡検査に差し向けられるべきである。
【００３４】
本発明において、ＨＰＶ分類情報は、マーカー分析を補う為に用いられる。６５０００超の女性を含む大規模コホート（集団に基づく頸部スクリーニングに参加している女性およびｈｒＨＰＶ試験について自己サンプリングを申し出された無回答者女性を含む）を研究することにより、我々は、ＨＰＶタイプ１６、１８、（３１、３３）、および／または４５が、頸部ガンおよび高グレード前悪性病変の有意に増大したリスクを与えることを発見した。とりわけ、特にはＨＰＶ１６、１８、３１及び／または３３と異なる型のｈｒＨＰＶの単独感染を有する、正常細胞診を有するｈｒＨＰＶ陽性女性において、≧ＣＩＮ２の病変は極めてまれであった。これは、或る程度で、≧ＣＩＮ２病変の細胞学的兆候は型依存的である。同様に、我々は、CADM1  (Genbank  ID  NM_014333)およびMAL  (Genbank  ID:  NM_022438)メチル化マーカー陰性であった、≧ＣＩＮ２の病変を有する女性の大半が、ＨＰＶ１６、１８および／または３１型を有したことの証拠を集めた。
【００３５】
本発明において、試験のアウトカムが知られた後にどのさらなるステップがとられる必要があるかが示される（図１〜５も参照されたい）。該アルゴリズムアウトカムの一つが、該女性を、該スクリーニングプールに（すなわち、次のスクリーニングラウンドに）差し戻す。これは基本的に、現在のところ、スクリーニング間隔内に頸部ガンを有することまたは発症することのリスクが無いことまたは当該リスクを無視できることを意味する。これは、問題の該女性が、該集団に基づくスクリーニングに、これらが行われる時間間隔で、標準的に参加しうることを意味し、これは現在のところ最大で５年である。
【００３６】
他の可能なアルゴリズムアウトカムは、該特定の女性が、厳重観察（close  surveillance）されるべきであるか又は次のスクリーニングラウンドよりも短い時間間隔の後にフォローアップ試験を受けるべきであるかのいずれかであることである。実際には、該最初の選択肢は、６〜１２月後に行われる繰り返しの頸部擦過物についての試験を意味し、一方で、該第２の選択肢は、最大で３年後に行われる繰り返しの頸部擦過物についての試験を示す。これらの繰り返しのスメアについての試験結果によって、該女性は、次のスクリーニングラウンドにまたは膣鏡検査に差し向けられるであろう。
【００３７】
最後に、最悪のアルゴリズムアウトカム（すなわち≧ＣＩＮ２／３の非常に高い可能性）は、該女性が膣鏡検査に差し向けられるだろうことを意味する。該頸部の膣鏡検査評価のあいだに、最もありそうなバイオプシーは、近接の顕微鏡観察（close  microscopical  observation）のために採られるであろう。組織学的に確認されたＣＩＮ２／３またはそれより悪いものを有するすべての女性が、標準的なプロトコルに従い、（侵襲的な）頸部ガンの発症を防ぐ為に処置される。
【００３８】
すなわち、本発明は、≧ＣＩＮ２／３を有するまたは発症するリスクについての女性の効率的且つ信頼性あるスクリーニングの為のいくつかの代替的なアルゴリズムを提供する。該提案されたスキャニングは、大規模な基礎について実施されることができ、そして、該スキャニングプロトコルの多段階の性質により、不必要な試験が防がれ、これにより、本発明は、資源および人材の節約的な消費も提供する。最後に、試験される女性が、不必要な試験に付されず、およびさらに、偽陽性の数における減少により、本発明の方法は、そのような偽陽性アウトカムの心理学的効果も減少するであろう。
【００３９】
実施例
１．ＨＰＶ試験
我々は、前向き無作為化試験を、ｈｒＨＰＶ試験の有効性を評価するために、大規模集団に基づく一次スクリーニング設定における補助スクリーニングツールとして開始した。このＰＯＢＡＳＣＡＭ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）試験は、細胞診試験単独（対照群）または細胞診およびＨＰＶ試験（介入群）のいずれかによる一次スクリーニングプログラムにおける４４，１０２の女性のうちの≧ＣＩＮ２／３（≧ＣＩＮ２〜３）の収量（yield）を、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲ酵素イムノアッセイを用いて比較する。ベースラインデータは発行されており（Bulkmans  et  al.,  Int  J  Cancer  2004,  110:94-101）そしてすべての女性の５年フォローアップの完了は２００８年と予測される。中間分析は、≧ＣＩＮ２／３についてのＨＰＶ試験の感度および陰性適中度が細胞診のそれよりも明白にすぐれていることを明らかにした。すでに第二のスクリーニングラウンド（５年後）に達した約１８，０００の女性からのデータは、次のスクリーニングラウンドまでに蓄積した及び当該ラウンドを含む両群における≧ＣＩＮ２／３病変の総数がほとんど同じであることを示した（Bulkmans  et  al.  Lancet:  2007,  370:1764-1772）。しかしながら、該介入群における≧ＣＩＮ３病変の７３％対該対照群におけるそれらの４７％だけが、次のスクリーニングラウンドに先立ち検出された。結果として、該次のスクリーニングラウンドにおける≧ＣＩＮ２／３病変の４７％の減少が、補助ＨＰＶ試験により得られた。これらのデータは、補助ｈｒＨＰＶ試験により検出された追加の≧ＣＩＮ２／３病変が、退縮せず、そしてそれゆえに臨床的に関連することを示し、これは、ＨＰＶ試験が、臨床的に関連のある病変のより早期の検出をもたらし及び、検出されないでおかれたときに自然に退縮するだろうＣＩＮ２／３病変の過剰診断を結果しないことを示す。
【００４０】
さらに、我々は、≧ＣＩＮ２／３のリスクにおいてＨＰＶの型に特異的な差異が存在することを発見した。実際に、１６、１８、３１、３３および／または４５型と異なる型を有するｈｒＨＰＶ陽性女性は、高グレードＣＩＮの比較的低いリスクを有した。一部分において、これはこれらの型のより低いクリアランス率（clearance  rates）を反映する。ベースラインの正常細胞診を有する女性のうちの１６、１８、３１、３３および／または４５型の重要性を説明するために、ＨＰＶ１６／１８陽性女性は、複数（ｎ＝３）の正常スメア後でさえ、高グレードＣＩＮの増大したリスクを示した。これは、他のｈｒＨＰＶ型を有する女性と比べて、正常細胞診を有するＨＰＶ１６／１８陽性女性のより積極的な管理（すなわちより徹底的なフォローアップ）を正当とすると思われる。実際に、単独の非ＨＰＶ１６、１８、３１、３３および３５ｈｒＨＰＶ感染を有するｈｒＨＰＶ陽性正常スメアを有する女性において、≧ＣＩＮ３は検出されず、これらの型による臨床的に関連する感染が、細胞学的な異常をほとんど例外なく伴うことを示唆する。
【００４１】
これらのデータを前提とすると、特には検出可能な表現型（すなわち細胞学的な）変化または分子の（すなわち遺伝子的（エピジェネティカルな））変化をそれらの頸部擦過物中に示さないｈｒＨＰＶ陽性女性を層別化するために、ＨＰＶ分類情報が含まれるスクリーニングシナリオが考えられうる。
【００４２】
２．頸部ガンおよびＨＰＶにより形質転換した上皮細胞において異なって発現される遺伝子
ＨＰＶにより媒介される発ガンは、一連の宿主細胞遺伝子の下方制御および過剰発現の両方により特徴づけられる。多数のこれら遺伝子は、我々自身の設定において、組み合わせられたマイクロアレイ発現およびマイクロアレイＣＧＨ（ｍａＣＧＨ）の分析の統合的アプローチが続くまたは続かないマイクロアレイ発現分析により発見された。我々は、ゲノムのプロファイリングが、頸部ＳＣＣおよび進行したＣＩＮ病変を非常に感度良く且つ特異的な様式で表す染色体シグネチャーをもたらしうること、および、新規マーカーがこのアプローチから推定されうることを推論した。該統合的アプローチは、頸部ガンおよび前ガン病変におけるリカレントゲインまたはロス（recurrent  gains  or  losses）を示す染色体位置で存在する異なって発現される遺伝子の同定を許した。非ランダムの染色体異常は頸部ガンにおける重要な遺伝子的現象を表しそうであるので、変化した発現を示すこれらの座位での遺伝子は、発ガンプロセスについて関連し、そしてそれ故に、候補マーカーとして特に可能性を有しうる。
【００４３】
５Ｋ  ＢＡＣアレイを用いたｍａＣＧＨは、1q12-32、3q25-29、および20q11-13で、特に非ランダムのゲイン（non-rancom  gains）を示し、該頸部ＳＣＣの７８％（１ｑ）〜１００％（３ｑ）で発見された。同じセットの腫瘍のマイクロアレイ発現分析は、２４の上方制御された遺伝子、（もっとも顕著なもの、ITGAV(Genbank  ID:  NM_002210,  gene  location:  2q32.1),  およびSYCP2(Genbank  ID:  NM_014258,  gene  location:  20q13.33),を含む）、および１５の下方制御された遺伝子（MAL  (Genbank  ID:  NM_022438,  gene  location:  q11.1)  を含む）をもたらした。加えて、ゲノム規模での染色体および転写の分析の統合は、増加した発現を有する一連の遺伝子（FLJ21291  (Genbank  ID:  AK024944,  gene  location:  1q32.1),  DTX3L  (Genbank  ID:  AK025135,  gene  location:  3q21.1),  CCDC14    (Genbank  ID:  AL122079    gen    location:  3q21.1),  PIK3R4  (Genbank  ID:  Y08991,  gene  location:  3q21.3),  ATP2C1  (Genbank  ID:  NM_014382,  gene  location:  3q21.3),  SLC25A36  (Genbank  ID:    NM_018155,  gene  location:  3q23),  およびITGAV  (Genban    ID:  NM_002210,  gene  location:  2q32.1)を含む）を明らかにした。これら遺伝子は、非ランダムゲインの領域内にたいていは配置される（欧州特許出願第07114580号の表１および２も参照されたい）。
【００４４】
興味深いことに、以下の遺伝子、DTX3L  (Genbank  ID:  AK025135),  CCDC14  (Genbank  ID:  AL122079),  FLJ21291  (Genbank  ID:  AK024944)およびPIK3R4  (Genbank  ID:  Y08991)、の少なくとも１つの２倍超の過剰発現が、試験されたすべての頸部ガンにおいて発見され、これらの４つの遺伝子からなるマーカーパネルが、頸部ガンについての１００％感度を有しうることを示す。
【００４５】
４６の高グレードＣＩＮ病変のクロスセクショナル（cross-sectional）ｍａＣＧＨ分析は、正常またはほとんど正常（＜５の異常；症例の約５０％）から、＞１０の領域での変化（症例の３０％）への染色体シグネチャーを明らかにした。興味深いことに、後者のシグネチャーは、ＳＣＣのそれら（前述のゲインを含む）、および、ＳＣＣと一緒にクラスター化されたこれらの病変と類似していた。
【００４６】
顕微解剖された正常頸部上皮試料、顕微解剖された高グレードＣＩＮ病変およびＳＣＣから単離されたＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、正常頸部対照試料と比較して、高グレードＣＩＮ病変およびガンにおける、ITGAV  (Genbank  ID:  NM_002210),  ATP2C1  (Genbank  ID:  NM_014382),  SLC25A36  (Genbank  ID:    NM_018155)  およびPIK3R4  (Genbank  ID:  Y08991)の有意な過剰発現を明らかにした。DTX3L  (Genbank  ID:  AK025135)の有意な過剰発現はＳＣＣに限定された。MAL  (Genbank  ID:  NM_022438)は、正常な対照と比較して、高グレードＣＩＮ病変およびＳＣＣの両方において有意に下方制御されることが発見された。
【００４７】
我々のデータは、有用なマーカーパネルが宿主細胞遺伝子のサブセットの発現分析を組み合わせることにより構成されうることを示すだけでなく、頸部ガンにおける共通のゲインを有する場所（すなわち1q,  3q  および20q）でのＤＮＡコピー数ゲインの分析が、頸部ガンおよび高グレード前駆病変についても同様に診断能力および予後能力（diagnostic  and  prognostic  power）を有しうることを示す。
【００４８】
３．プロモーター過剰メチル化を有する遺伝子
遺伝子のサブセットの下方制御もまた、頸部発ガンに関連する。遺伝子サイレンシングの１つの共通の様式は、プロモーター領域の過剰メチル化を含む。ＤＮＡ過剰メチル化がメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）のような方法に基づく感度の良いＰＣＲを用いて頸部擦過物において容易に検出されうるので、ＤＮＡ過剰メチル化に基づく分子マーカー（メチル化マーカーとも呼ばれる）は興味深い。さらに、頸部スメアにおける陽性のＭＳＰ結果は、対応するバイオプシーにおけるそれぞれの遺伝子のメチル化状態を表すことが発見された（Feng  et  al.,  JNCI:  2005,  282,  273-297）。
【００４９】
ＨＰＶ不死化細胞株、頸部ガン細胞株および頸部試料についての我々の最近の研究は、頸部スクリーニングアルゴリズムにおいて価値のありうる一連の候補メチル化マーカーをもたらした。
【００５０】
我々が研究した第一のメチル化マーカーの一つは、CADM1遺伝子(Genbank  ID  NM_014333)を含んだ。プロモーター過剰メチル化によるCADM1遺伝子(Genbank  ID  NM_014333)の不活性化が、ＨＰＶにより形質転換された細胞の足場維持および腫瘍原性表現型にとって必須であることを、我々は当初に示した（Steenbergen  et  al.,  JNCI:  2004,  96:  294-305;国際公開第2004/087962号パンフレット）。プロモーターメチル化の結果として第一に、この遺伝子は、頸部ガン細胞株の９１％（９／１０）において発現停止された（silenced）。該ＣＡＤＭ１プロモーターの次の総合的なメチル化分析は、ＣＡＤＭ１プロモーター過剰メチル化の頻度および密度の両方が、（前）新生物頸部疾患の重度と比例して増加することを示した。さらに、密な過剰メチル化（すなわち、ＭＳＰにより分析された３つのプロモーター領域のうち少なくとも２つの過剰メチル化）が、免疫組織化学により決定されたときに、ＣＡＤＭ１（Genbank  ID  NM_014333）の減少したタンパク質発現と関連した。評価された密な過剰メチル化は、正常頸部における５％から、ＣＩＮ３病変における３０％および頸部ＳＣＣにおける８３％へと増加した。しかしながら、密なＣＡＤＭ１メチル化は、頸部ＳＣＣについてより特異的であった。なぜなら、その頻度が、腺ガンと比べて、ＳＣＣにおいて有意により高かったからである（８３％ｖｓ２３％；ｐ＝０．００２）。
【００５１】
頸部腺ガンおよびその前駆物の検出も許す補足的なメチル化マーカーについての我々の研究において、さらに、マイクロアレイ発現およびＣＧＨ研究が実施された。これらの研究から、MAL(Genbank  ID:  NM_022438)遺伝子が、正常上皮対照試料と比較して、頸部ガンにおいて最も有意に下方制御される遺伝子の一つであると同定された。MAL(Genbank  ID:  NM_022438) が2q11-13（我々が頸部ガンにおいて反復性染色体欠失（recurrent  chromosomal  deletions）を発見しなかった染色体領域）に配置されているという事実は、我々に、転写の潜在的なエピジェネティックな調節障害について調査させた。頸部ガン細胞株およびＨＰＶ不死化細胞株のメチル化インヒビターによる処理が、MAL(Genbank  ID:  NM_022438)ｍＲＮＡ発現の強力な上方制御を結果した。プロモーターメチル化分析は次に、該ＭＡＬプロモーター領域がこれらの細胞株においてメチル化されることを確認した。
【００５２】
加えて、機能的分析は、ＭＡＬが、抗増殖特性を有するだけでなく、ＳｉＨａ細胞の細胞遊走および足場独立性増殖も抑制することを明らかにした。よって、MAL(Genbank  ID:  NM_022438)は、頸部ガン発達において機能的にも関与する。次に、我々は、臨床材料におけるMAL(Genbank  ID:  NM_022438)の過剰メチル化を、MAL(Genbank  ID:  NM_022438)のプロモーター内の２つの領域についての定量的ＭＳＰ分析を用いて評価した。１又は両方の領域のメチル化が、正常頸部試料の４．６％（１／２２）において、低グレードＣＩＮ病変の２０．％（８／４０）において、高グレードＣＩＮ病変の８２％（４５／５８）において、およびＳＣＣの９９％（９３／９４）において、並びに腺ガンの１００％（２４／２４）において発見された。
【００５３】
MAL(Genbank  ID:  NM_022438)のこれら２つのプロモーター領域とCADM1(Genbank  ID  NM_014333)の一つの新たに選択されたプロモーター領域のメチル化分析を組み合わせることにより、メチル化陽性高グレードＣＩＮ病変の数が９１％（５１／５８）へ増した（陽性は、これらの領域の少なくとも１つについて陽性結果の場合にスコア化された）。反対に、このＣＡＤＭ１領域の分析を加えることにより、正常頸部、低グレードＣＩＮ病変および頸部ガンにおける陽性は影響されなかった。他の遺伝子のメチル化データを加えることは、これらの感度数値を顕著に増加しなかった。それ故に、我々は、この組合せが、≧ＣＩＮ２／３についての最適なマーカーパネルを提供すると結論付けた。
【００５４】
４．頸部擦過物のマーカー遺伝子分析
メチル化分析が、集団に基づく頸部スクリーニング（≧ＣＩＮ２がフォローアップの１８月内に診断された）に参加しているｈｒＨＰＶ  ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲ陽性女性の大規模な一連の頸部擦過物について実施された。これらは、異常細胞診（すなわち、ボーダーラインの細胞核異常またはそれより悪い）を有する女性およびベースラインでの正常細胞診を有する女性を含み、その後者は、もっぱら陽性ｈｒＨＰＶ試験により発見された。加えて、１８月のフォローアップ期間内に正常細胞診を有するｈｒＨＰＶ陽性対照女性およびＣＩＮ１またはそれより良いものを有するｈｒＨＰＶ陽性が含まれた。これらの女性のベースライン頸部擦過物は、上記言及されたCADM1(Genbank  ID  NM_014333)領域および２つのMAL(Genbank  ID:  NM_022438)領域についてのメチル化マーカーを含む種々のメチル化マーカーに定量的ＭＳＰを用いて付された。
【００５５】
１つまたは両方のMAL(Genbank  ID:  NM_022438)領域でのメチル化は、正常細胞診を有するｈｒＨＰＶ陽性対照女性における３１％から、ベースラインでの正常細胞診および異常細胞診を有する≧ＣＩＮ２を有する女性における６５％および８４％へとそれぞれ変化した。後者の２つのグループを一緒にすることにより、ＭＡＬメチル化は、≧ＣＩＮ２を有する女性の７９％において発見された。CADM1  (Genbank  ID  NM_014333)メチル化結果を加えることにより、５％より多い≧ＣＩＮ２病変が、異常細胞診を有する女性において検出され、８３％の全体の≧ＣＩＮ２検出割合を結果した。これらのデータは、MAL  (Genbank  ID:  NM_022438)メチル化マーカーおよびCADM1  (Genbank  ID  NM_014333)メチル化マーカーの両方を組み合わせることにより、≧ＣＩＮ２についての高い感度が達成されることを示す。これまで、他のメチル化マーカーの追加は、この感度値を改善しなかった。それ故に、我々は、正常細胞診を有する女性において特に、≧ＣＩＮ２病変のサブセットの存在が、おそらくこれらの病変がより早期のステージを表すので、検出可能な遺伝子の変化またはエピジェネティックな変化の不在を伴うと推論した。それらの場合について、（特には正常細胞診を有する女性において）ＨＰＶ型ＨＰＶ１６、１８、３１、３３および／または４５により与えられる、前に言及された、≧ＣＩＮ２の増大したリスクを考慮すると、ＨＰＶ型情報を追加することが、該感度を増す為に価値がありうる。実際に、ＨＰＶ型情報を追加することにより、より良い感度値が得られた。CADM1(Genbank  ID  NM_014333)のメチル化、MAL(Genbank  ID:  NM_022438)のメチル化の存在、および／またはＨＰＶ１６の存在の組合せが、異常細胞診を有する女性における≧ＣＩＮ２についての９５％の感度をもたらした。さらに、このマーカーの組合せは、正常細胞診を有するｈｒＨＰＶ陽性対照女性の４９％における陽性を明らかにした。それ故に、このマーカーの組合せの使用は、正常細胞診を有するｈｒＨＰＶ陽性女性の半分超を不要なフォローアップから防ぐだろう。可能なマネジメントアルゴリズムは、CADM1(Genbank  ID  NM_014333)のメチル化および／またはMAL(Genbank  ID:  NM_022438)のメチル化を有するすべてのｈｒＨＰＶ陽性女性の膣鏡検査への差し向け（referral  for  colposcopy）を含むだろう。この状況において、≧ＣＩＮ２を有するすべての女性の８３％が差し向けられるだろう。ＨＰＶ１６について陽性だがメチル化を有さない女性は、他方で、≧ＣＩＮ２のそれらの増大したリスクを考慮すると、観察下におかれうる。
【００５６】
ＨＰＶ陰性の正常Ｐａｐスメア、ＨＰＶ陽性の正常頸部擦過物および異常細胞診（中等度の細胞核異常またはそれより悪いもの）を有する女性の擦過物についての定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた他の研究において、我々は、１８月以内に≧ＣＩＮ２を発症した女性が、高グレードＣＩＮまたはそれより悪いものを発症しなかった女性と比較したときに、DTX3L(Genbank  ID:  AK025135)、PIK3R4(Genbank  ID:  Y08991)、ITGAV(Genbank  ID:  NM_002210)、ATP2C1(Genbank  ID:  NM_014382)またはSLC25A36(Genbank  ID:  NM_018155)対MAL(Genbank  ID:  NM_022438)のｍＲＮＡ発現比における有意な増加を示したことを発見した（ｐ＝０．００６）。それ故に、これらの遺伝子の１又はそれより多くのｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルでの差次的発現分析（differential  expression  analysis）が、ｈｒＨＰＶ遺伝子型同定との組合せにおいて、代替的なまたは追加的なマーカーパネルを提供しうる。
【００５７】
５．自己採取された試料（specimens）のマーカー分析
上で概説されたとおりのメチル化マーカーについての同様の結果が、自己採取された頸膣部試料の分析を含む研究から得られた。これらの自己試料は、定期的な頸部スクリーニングについての招待に、第２のリマインダーの後でさえ、応答しなかった女性により、Rovers（商標）  VibaBrush(Rovers  Medical  Devices,  Oss,  the  Netherlands)またはPantarhei（商標）サンプラ(Pantarhei  Devices,  Zeist,  The  Netherlands)のいずれかを用いて集められた。これらの女性の約三分の一が、本研究室に自己採取された試料を返した。これらの試料は、ＨＰＶ  ＰＣＲ分析に適しており（すなわちβグロビンＰＣＲ陽性）、そして、ｈｒＨＰＶ  ＧＰ５＋／６＋  ＰＣＲによる試験は、この集団においてレスポンダー女性のマッチング集団における定期的なスクリーニングにより見られたのと少なくとも同じ多さの≧ＣＩＮ２病変をもたらす（Bais  et  al.,  Int  J  Cancer:  2007,  120:1505-1510）。実際には、我々が、種々の自己採取装置をそれらの性能について比較するパイロット研究において発見したとおり、ブラシ、綿棒、タンポン、洗浄（lavage）またはＰａｎｔａｒｈｅｉのサンプラーを含む任意の種類の自己サンプラが、頸部試料、膣部試料または頸膣部試料を集めるために適するだろう。
【００５８】
CADM1  (Genbank  ID  NM_014333;  １のプロモーター領域)およびMAL  (Genbank  ID:  NM_022438;  ２の領域)についての定量的ＭＳＰによるメチル化分析が、後で≧ＣＩＮ２と診断されたｈｒＨＰＶ陽性女性およびフォローアップにおいて臨床的に意味ある疾患の証拠の無いｈｒＨＰＶ陽性女性の自己試料について実施された。第一の女性集団のうち、６９％がＣＡＤＭ１および／またはＭＡＬのメチル化を示した。反対に、≧ＣＩＮ２を有さないｈｒＨＰＶ陽性女性の約三分の一だけが、マーカーのいずれか又は両方についてメチル化を示した。メチル化データとｈｒＨＰＶ遺伝子型同定データとを一緒にした後、≧ＣＩＮ２と診断された女性の８４％が、ＣＡＤＭ１メチル化、ＭＡＬメチル化および／またはＨＰＶ１６の存在を有し、一方で、フォローアップにおける臨床的に意味ある疾患の証拠の無いマーカー陽性ｈｒＨＰＶ陽性女性の数は顕著に変化しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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