(57)【要約】  本発明は、細菌クロストリジウム・ｄｉｆｆｉｃｉｌの内生胞子に結合する抗体、このような抗体の製造方法及びこのような抗体の使用方法を提供し、これはクロストリジウム・ディフィシル内生胞子の検出方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子に結合する、単離された抗体。
【請求項２】
前記胞子が未発芽胞子である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
前記胞子が発芽胞子である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項４】
前記抗体がクロストリジウム・ディフィシル栄養細胞に結合しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記単離された抗体がクロストリジウム・ディフィシル毒素に結合しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項６】
配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上の（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）タンパク質ＣＤ１０２１又は前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する、単離された抗体。
【請求項７】
前記単離された抗体が、アミノ酸残基５０５〜６０４を含む前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する、請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列に結合する、単離された抗体。
【請求項９】
前記単離された抗体が、アミノ酸残基３０〜１２０を含む前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する、請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
配列番号９のアミノ酸配列に結合する、単離された抗体。
【請求項１１】
前記単離された抗体が、アミノ酸残基１９４〜２９３を含む前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する、請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
配列番号１０のアミノ酸配列に結合する、単離された抗体。
【請求項１３】
前記単離された抗体が、アミノ酸残基２０３〜２１７を含む前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する、請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
前記単離された抗体が、アミノ酸残基３３３〜３４７を含む前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する、請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
アミノ酸配列ＥＧＳＳＬＱＹＫＧＤＤＰＥＳＹ（配列番号３）に結合する、単離された抗体。
【請求項１６】
アミノ酸配列ＬＫＮＥＴＹＫＴＫＹＨＫＹＬＥ（配列番号４）に結合する、単離された抗体。
【請求項１７】
配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する、単離された抗体。
【請求項１８】
前記単離された抗体が、アミノ酸残基２９４〜３９３を含む前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する、請求項１７に記載の単離された抗体。
【請求項１９】
配列番号６のアミノ酸配列に結合する、単離された抗体。
【請求項２０】
前記単離された抗体が、アミノ酸残基５８２〜５９６を含む前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する、請求項１７に記載の単離された抗体。
【請求項２１】
前記単離された抗体が、アミノ酸残基６４〜７８を含む前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する、請求項１７に記載の単離された抗体。
【請求項２２】
アミノ酸配列ＹＫＬＫＤＫＮＧＧＴＴＫＴＶＡ（配列番号７）に結合する、単離された抗体。
【請求項２３】
アミノ酸配列ＫＦＫＥＫＰＤＡＤＳＩＫＬＫＹ（配列番号８）に結合する、単離された抗体。
【請求項２４】
前記単離された抗体がポリクローナル抗体である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２５】
前記単離された抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、請求項２５に記載のモノクローナル抗体によるその抗原標的への結合を抑制する、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項２７】
前記単離された抗体がバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子又はクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）胞子に結合しない、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の単離された抗体の抗原結合性断片。
【請求項２９】
前記単離された抗体又は前記抗原結合性断片が標識されている、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の単離された抗体又は請求項２８に記載の抗原結合性断片。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離された抗体の１つ以上を含む組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離された抗体の１つ以上を含むキット。
【請求項３２】
請求項２５又は２６に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又は形質転換されたＢ細胞株。
【請求項３３】
請求項２５又は２６に記載のモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域又は１つ以上の相補性決定領域をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３４】
請求項３３に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３６】
抗クロストリジウム・ディフィシル抗体を調製する方法であって、ポリペプチドに対する抗体反応を生じるのに有効な量でクロストリジウム・ディフィシルゲノムによりコードされたタンパク質の少なくとも一部を含む前記ポリペプチドで宿主生物を免疫化するステップを含む、方法。
【請求項３７】
前記クロストリジウム・ディフィシルゲノムによりコードされたタンパク質の少なくとも一部を含む前記ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗クロストリジウム・ディフィシル抗体を調製する方法であって、
免疫適格性宿主生物において前記クロストリジウム・ディフィシルゲノムによりコードされたタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列を発現するステップを含む、方法。
【請求項３９】
前記クロストリジウム・ディフィシルゲノムによりコードされたタンパク質の少なくとも一部をコードする前記核酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体調製物を精製することを更に含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも２つの単離された抗体又はこれらの抗原結合性断片を含む組成物であって、各単離された前記抗体がクロストリジウム・ディフィシル胞子の異なる抗原エピトープに結合する、組成物。
【請求項４２】
少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
第１の単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合し、第２の単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４５】
前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の前記ポリペプチド断片が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項４２又は４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の前記ポリペプチド断片が、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項４３又は４５に記載の組成物。
【請求項４７】
少なくとも２つの単離された抗体又はこれらの抗原結合性断片を含むキットであって、各単離された抗体が前記クロストリジウム・ディフィシル胞子の異なる抗原エピトープに結合する、キット。
【請求項４８】
少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合する、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
第１の単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合し、第２の単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の前記ポリペプチド断片が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項４８又は５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の前記ポリペプチド断片が、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項４９又は５０に記載のキット。
【請求項５３】
サンプル中のクロストリジウム・ディフィシル胞子の存在を検出する方法であって、前記サンプルを請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離された抗体に接触させるステップを含む、方法。
【請求項５４】
サンプル中のクロストリジウム・ディフィシル胞子の存在を検出する方法であって、前記サンプルを少なくとも２つの単離された抗体又はこれらの抗原結合性断片に接触させるステップを含み、各単離された抗体が、前記クロストリジウム・ディフィシル胞子の異なる抗原エピトープに結合する、方法。
【請求項５５】
サンプル中のクロストリジウム・ディフィシル胞子の存在を検出する方法であって、
前記サンプルを第１の単離された抗体又はその抗原結合性断片に接触させるステップであって、前記第１の単離された抗体が前記クロストリジウム・ディフィシル胞子の第１の抗原エピトープに結合するステップ、及び
前記サンプルを第２の単離された抗体又はその抗原結合性断片に接触させるステップであって、前記第２の単離された抗体が前記クロストリジウム・ディフィシル胞子の第２の抗原エピトープに結合するステップ、
を含む、方法。
【請求項５６】
少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合する、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５８】
第１の単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合し、第２の単離された抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の前記ポリペプチド断片が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項５６又は５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の前記ポリペプチド断片が、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項５７又は５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年２月２８日に出願された米国仮出願第６１／０３２，２７０号の利益を主張するものであり、この仮出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
【背景技術】
【０００２】
嫌気性胞子を形成するグラム陽性細菌であるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、ヒトにおける偽膜性大腸炎及び抗生物質起因性下痢の主要な原因であり、病院で感染する院内感染症に関与する最も一般的に見られる細菌の１つである（例えば、Ｗｒｅｎ，２００６，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ；１（３）：２４３〜２４５を参照されたい）。Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）によると、クロストリジウム・ディフィシルは、米国において毎年数万もの下痢の症例及び少なくとも５，０００件の死亡に関与している。クロストリジウム・ディフィシル感染症の数は、１９９３年から２００３年の間に倍増し、２０００年以後に最大の増加が生じた。
【０００３】
クロストリジウム・ディフィシル起因性の病気を有する人は、糞便に胞子を排出する。クロストリジウム・ディフィシル感染症はしばしば入院患者間で伝染し、この生物は多くの場合、病院職員の手に存在する（例えば、ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ；３２０：２０４〜２１０を参照されたい）。クロストリジウム・ディフィシル感染症に感染した患者は隔離され、集団発生を避けるために予防措置が取られる。無症状保菌者は胞子を排出することができ、隔離目的のためにスクリーニングを行う必要がある（例えば、Ｋｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ；３４２：３９０〜３９７を参照されたい）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
クロストリジウム・ディフィシル胞子は、熱、乾燥及び洗浄剤に対して耐性であり、カートのハンドル、ベッドの横板、病人用便器、トイレ、浴槽、床、備品、リネン、電話、聴診器、温度計及びリモコン装置などの環境表面上で最長７０日間生存できる。それゆえに、環境表面は、容易に感染しやすい経路である。入院中の患者の部屋の徹底した洗浄が必要とされる。
【０００５】
洗浄の有効性をモニターし、患者の部屋及び環境表面にクロストリジウム・ディフィシル胞子がないことを検証する明瞭な必要性がある。現在、環境及び患者サンプルでクロストリジウム・ディフィシル胞子を検出するための、使用しやすく迅速な方法は存在しない。クロストリジウム・ディフィシル毒素の検出のためのキット（イムノアッセイ及び分子アッセイの両方）は現在市販されているが、これらのキットはクロストリジウム・ディフィシル胞子を検出しない。それゆえに、迅速で使用しやすいクロストリジウム・ディフィシル胞子検出用システムに対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合する、単離された抗体を包含する。いくつかの実施形態では、胞子は未発芽胞子である。いくつかの実施形態では、胞子は発芽胞子である。いくつかの実施形態では、抗体は、クロストリジウム・ディフィシル栄養細胞に結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、クロストリジウム・ディフィシル毒素に結合しない。
【０００７】
本発明は、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上の（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）タンパク質ＣＤ１０２１又は仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する、単離された抗体を包含する。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、アミノ酸残基５０５〜６０４を含む仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、アミノ酸残基３０〜１２０を含む仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、アミノ酸残基１９４〜２９３を含む仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、アミノ酸残基２０３〜２１７を含む仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、アミノ酸残基３３３〜３４７を含む仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の断片に結合する。
【０００８】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に結合する、単離された抗体を包含する。
【０００９】
本発明は、配列番号９のアミノ酸配列に結合する、単離された抗体を包含する。
【００１０】
本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列に結合する、単離された抗体を包含する。
【００１１】
本発明は、アミノ酸配列ＥＧＳＳＬＱＹＫＧＤＤＰＥＳＹ（配列番号３）に結合する、単離された抗体を包含する。
【００１２】
本発明は、アミノ酸配列ＬＫＮＥＴＹＫＴＫＹＨＫＹＬＥ（配列番号４）に結合する、単離された抗体を包含する。
【００１３】
本発明は、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する、単離された抗体を包含する。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、アミノ酸残基２９４〜３９３を含む推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、アミノ酸残基５８２〜５９６を含む推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する。いくつかの実施形態では、単離された抗体は、アミノ酸残基６４〜７８を含む推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する。
【００１４】
本発明は、配列番号６のアミノ酸配列に結合する、単離された抗体を包含する。
【００１５】
本発明は、アミノ酸配列ＹＫＬＫＤＫＮＧＧＴＴＫＴＶＡ（配列番号７）に結合する、単離された抗体を包含する。
【００１６】
本発明は、アミノ酸配列ＫＦＫＥＫＰＤＡＤＳＩＫＬＫＹ（配列番号８）に結合する、単離された抗体を包含する。
【００１７】
本発明は、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を包含し、モノクローナル抗体又は抗原結合性断片は本発明の抗体によるその抗原標的への結合を抑制する。
【００１８】
本発明は、本発明の単離された抗体の抗原結合性断片を包含する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明の単離された抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、本発明の単離された抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、本発明の単離された抗体は、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子又はクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）胞子に結合しない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合性断片が標識されている。
【００２０】
本発明は、本発明の単離された抗体の１つ以上、又はその抗原結合性断片を含む組成物を包含する。
【００２１】
本発明は、本発明の単離された抗体の１つ以上、又はその抗原結合性断片を含むキットを包含する。
【００２２】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又は形質転換されたＢ細胞株を包含する。
【００２３】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又は１つ以上の相補性決定領域をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド配列を包含する。本発明は、このような単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを包含する。本発明は、このような発現ベクターを含む宿主細胞を包含する。
【００２４】
本発明は、抗クロストリジウム・ディフィシル抗体を調製する方法を包含し、この方法は、ポリペプチドに対する抗体反応を生じるのに有効な量でクロストリジウム・ディフィシルゲノムによりコードされたタンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチドで宿主生物を免疫化するステップを含む。いくつかの実施形態では、クロストリジウム・ディフィシルゲノムによりコードされたタンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、抗体調製物の精製を更に含む。
【００２５】
本発明は、抗クロストリジウム・ディフィシル抗体を調製する方法を包含し、この方法は、免疫適格性宿主生物においてクロストリジウム・ディフィシルゲノムによりコードされたタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列を発現するステップを含む。いくつかの実施形態では、クロストリジウム・ディフィシルゲノムによりコードされたタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片から選択されるアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、方法は、抗体調製物の精製を更に含む。
【００２６】
本発明は、少なくとも２つの単離された抗体又はこれらの抗原結合性断片を含む組成物を包含し、各単離された抗体はクロストリジウム・ディフィシル胞子の異なる抗原エピトープに結合する。
【００２７】
組成物のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合する。いくつかの実施形態では、仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片から選択される。
【００２８】
組成物のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する。いくつかの実施形態では、推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質のポリペプチド断片は、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びこれらの断片からなる群から選択される。
【００２９】
組成物のいくつかの実施形態では、第１の単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合し、第２の単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する。いくつかの実施形態では、仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片から選択される。いくつかの実施形態では、推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質のポリペプチド断片は、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びこれらの断片からなる群から選択される。
【００３０】
本発明は、少なくとも２つの単離された抗体又はこれらの抗原結合性断片を含むキットを包含し、各単離された抗体はクロストリジウム・ディフィシル胞子の異なる抗原エピトープに結合する。
【００３１】
キットのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合する。いくつかの実施形態では、仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片から選択される。
【００３２】
キットのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する。いくつかの実施形態では、推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質のポリペプチド断片は、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びこれらの断片から選択される。
【００３３】
キットのいくつかの実施形態では、第１の単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合し、第２の単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する。いくつかの実施形態では、仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片から選択される。いくつかの実施形態では、推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質のポリペプチド断片は、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びこれらの断片から選択される。
【００３４】
本発明は、サンプル中のクロストリジウム・ディフィシル胞子の存在の検出方法を包含し、この方法は、サンプルを本発明の１つ以上の単離された抗体に接触させるステップを含む。
【００３５】
本発明は、サンプル中のクロストリジウム・ディフィシル胞子の存在の検出方法を包含し、この方法は、サンプルを少なくとも２つの単離された抗体又はこれらの抗原結合性断片に接触させるステップを含み、各単離された抗体は、クロストリジウム・ディフィシル胞子の異なる抗原エピトープに結合する。
【００３６】
本発明は、サンプル中のクロストリジウム・ディフィシル胞子の存在の検出方法を包含し、この方法は、サンプルを第１の単離された抗体又はその抗原結合性断片に接触させるステップであって、第１の単離された抗体は、クロストリジウム・ディフィシル胞子の第１の抗原エピトープに結合するステップ、及び、サンプルを第２の単離された抗体又はその抗原結合性断片に接触させるステップであって、第２の単離された抗体は、クロストリジウム・ディフィシル胞子の第２の抗原エピトープに結合するステップを含む。
【００３７】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合する。いくつかの実施形態では、仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片から選択される。
【００３８】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する。いくつかの実施形態では、推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質のポリペプチド断片は、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びこれらの断片から選択される。
【００３９】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、第１の単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１又は仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合し、第２の単離された抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質又は推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質の断片に結合する。いくつかの実施形態では、仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０及びこれらの断片から選択される。いくつかの実施形態では、推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質のポリペプチド断片は、配列番号６、配列番号７、配列番号８及びこれらの断片から選択される。
【００４０】
特に指定されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は、互換的に使用され、「１つ以上」を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１−１】クロストリジウム・ディフィシル株６３０（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＹＰ＿００１０８７５０２に対応）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８（配列番号１１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＺＰ＿０１８０４８４０に対応）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８（配列番号１２、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＺＰ＿０１８０４８４１に対応）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８（配列番号２１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＺ＿ＡＡＭＬ０４０００００７のヌクレオチド４６１８２７〜４６２８２５に対応する領域から翻訳）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８（配列番号２２、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＺ＿ＡＡＭＬ０４０００００７のヌクレオチド４６２８２４〜４６３７３２に対応する領域から翻訳）、及びクロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−６６ｃ２６（配列番号２３、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＺ＿ＡＢＦＤ０１００００３７のヌクレオチド１５６９０〜１７５９７に対応する領域の補体からの翻訳）からの仮想上のＣＤ１０２１タンパク質についてのアミノ酸配列間の相同性を表す。配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｕｓｔａｌｗ／で公的に利用可能である複数配列位置合わせプログラムＣｕｓｔａｌＷを使用して位置合わせされた。示されているようなコンセンサス配列は、配列番号３８である。６つの仮想上のタンパク質のうちの少なくとも４つで同一であるアミノ酸残基が、コンセンサス配列中に示されている。コンセンサス配列中の「Ｘ」残基は、２つ以上の位置合わせされた配列が各残基において非同一性を示したことを表し、又は、「Ｘ」残基は、３つ以上の位置合わせされた配列で各残基についての配列情報が欠けていたことを表す。位置合わせされた配列の１つにおける任意の所与の位置に配置された記号「・」は、対応するＧｅｎＢａｎｋ登録にアミノ酸位置が報告されていなかったことを表す。
【図１−２】クロストリジウム・ディフィシル株６３０（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＹＰ＿００１０８７５０２に対応）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８（配列番号１１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＺＰ＿０１８０４８４０に対応）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８（配列番号１２、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＺＰ＿０１８０４８４１に対応）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８（配列番号２１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＺ＿ＡＡＭＬ０４０００００７のヌクレオチド４６１８２７〜４６２８２５に対応する領域から翻訳）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８（配列番号２２、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＺ＿ＡＡＭＬ０４０００００７のヌクレオチド４６２８２４〜４６３７３２に対応する領域から翻訳）、及びクロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−６６ｃ２６（配列番号２３、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＺ＿ＡＢＦＤ０１００００３７のヌクレオチド１５６９０〜１７５９７に対応する領域の補体からの翻訳）からの仮想上のＣＤ１０２１タンパク質についてのアミノ酸配列間の相同性を表す。配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｕｓｔａｌｗ／で公的に利用可能である複数配列位置合わせプログラムＣｕｓｔａｌＷを使用して位置合わせされた。示されているようなコンセンサス配列は、配列番号３８である。６つの仮想上のタンパク質のうちの少なくとも４つで同一であるアミノ酸残基が、コンセンサス配列中に示されている。コンセンサス配列中の「Ｘ」残基は、２つ以上の位置合わせされた配列が各残基において非同一性を示したことを表し、又は、「Ｘ」残基は、３つ以上の位置合わせされた配列で各残基についての配列情報が欠けていたことを表す。位置合わせされた配列の１つにおける任意の所与の位置に配置された記号「・」は、対応するＧｅｎＢａｎｋ登録にアミノ酸位置が報告されていなかったことを表す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、細菌クロストリジウム・ディフィシル（本明細書では「Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ」、「Ｃ．ｄｉｆｆ」、「ｃ．ｄｉｆｆ」、「Ｃ−ｄｉｆｆ」又は「Ｃ．Ｄ」とも表す）の内生胞子に結合する抗体に関する。このような胞子特異性抗体は、例えば、環境、生体及び食品サンプル中のクロストリジウム・ディフィシル内生胞子の検出に、有用である。例えば、バチルス及びクロストリジウムのようなごく少数の細菌属は、内生胞子を形成することができる。細菌性内生胞子は、劣悪な物理的及び化学的条件に対して高度に耐性であり、自然界に見られる細胞のうちでも最も耐久性のある種類のうちの１つであることが証明されている。これらは、高熱、乾燥、放射線及び多くの有害化学物質下でも生存することができ、不十分な環境条件を生存できるようにする細菌の休眠形態である。内生胞子は、非常に長期間にわたって生存して、その後、発芽と呼ばれるプロセスである成長状態に戻ることができる。内生胞子は熱、放射線、消毒剤及び乾燥に耐性であるので、これらは、医学的及び薬学的物質から除去するのが困難であり、しばしば汚染の原因となる。
【００４３】
本発明の抗体は、細菌クロストリジウム・ディフィシルの内生胞子（本明細書では「胞子」とも呼ぶ）に結合する。本明細書で使用するとき、用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、同じ意味で使用される。本発明の抗体は、成育可能な胞子及び不活性化クロストリジウム・ディフィシル胞子の両方に結合し得る。胞子は、例えば、ホルマリン、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、化学的消毒剤、オートクレーブ処理及び紫外線放射が挙げられるがこれらに限定されない種々の方法のいずれかにより不活性化され得る。本発明の抗体は、発芽及び未発芽クロストリジウム・ディフィシル胞子の両方に結合し得る。本発明の抗体は、未発芽クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合し得、かつ発芽クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合し得ない。本発明の抗体は、発芽クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合し得、かつ未発芽クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合し得ない。未発芽胞子及び発芽胞子を調製する方法は、当事者に周知である。簡潔には、細菌胞子は、ほとんどの細胞が胞子に転換するまでトリプチックソイ寒天培地などの媒体上又はトリプチックソイブロス中で細菌を生育させることにより、一般的に、調製される。胞子は遠心分離により採取され、ＰＢＳなどの緩衝液で数回洗浄される。懸濁液をアルコールで処理して、栄養細胞を殺し、洗浄して胞子を採取することができる（例えば、Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９５８，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ：７６：３３２、及び、Ｐｏｗｅｒｓ，１９６８，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ；１６：１８０〜１８１を参照されたい）。種々の方法により、胞子発芽を誘発することができる。例えば、Ｇｏｕｌｄ，１９７０，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ；３３：３４〜４９；Ｆｏｅｒｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，１９６６，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ；９１：１１６８〜１１７７；Ｍｏｉｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ；４４：５３１〜５５３；及び米国特許出願公開第２００３／０１７５３１８（Ａ１）号を参照されたい。
【００４４】
本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合し得、かつ他の内生胞子形成細菌の胞子に結合し得ない。本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合し得、かつ、例えば、クロストリジウム又はバチルス属の様々な種のいずれかにより産生される内生胞子などの、ファーミキュート（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）門の他の内生胞子形成細菌の胞子に結合し得ない。細菌のクロストリジウム及びバチルス属の種には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｎｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｈａｕｖｏｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｅｒｖｉｄｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｅｌｃｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｒｂｏｎｉｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｒｋｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｄａｐｈｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｈｉｍｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌｅｘｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｍａｒｉｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｍａｐａｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｏｒｔｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｆｅｒｎｏｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉ��ｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｉａｃｉｎｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｌｅｒｏｎｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｒａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃｌｏａｃｅａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｕｓｃｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｅｄｄｅｒｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｕｌｃａｎｉ、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合し得、かつ、例えば、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、及びＴｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓなどの他の細菌の胞子に結合し得ない。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合し、かつバチルス・ズブチリス（本明細書ではＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓとも表す）及びクロストリジウム・スポロゲネス（本明細書ではＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓとも表す）の胞子に結合しない。
【００４７】
本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合し得、かつクロストリジウム・ディフィシル栄養細胞に結合し得ない。本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合し得、かつ本明細書に記載されているもののいずれかを含む他の内生胞子形成細菌の栄養細胞に結合し得ない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル、バチルス・ズブチリス及びクロストリジウム・スポロゲネスの栄養細胞に結合しない。クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・スポロゲネス及びバチルス・ズブチリスが挙げられるがこれらに限定されない非常に様々なクロストリジウム及びバチルス種の栄養細胞の培養方法は、当事者には周知である。例えば、Ｍａｄｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｒｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ；及びＣａｐｐｕｃｉｎｏ，２００５，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓを参照されたい。
【００４８】
病原性クロストリジウム・ディフィシル株は、様々な毒素を産生する。最も特徴的なのは、エンテロトキシン（毒素Ａ）及び細胞毒素（毒素Ｂ）であり、これら２つの毒素は感染患者に見られる下痢及び炎症の原因である（例えば、Ｇｉａｎｆｒｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ；７：３７５−９を参照されたい）。本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合し得、かつ、クロストリジウム・ディフィシルにより産生される毒素に結合し得ず、例えば、この抗体は毒素Ａ及び／又は毒素Ｂに結合し得ない。クロストリジウム・ディフィシルの毒素Ａ及び毒素Ｂを調製するための方法、並びに、抗体がクロストリジウム・ディフィシルの毒素Ａ及び／又は毒素Ｂに結合するかどうかを判定するための方法は、当事者には周知である。例えば、米国特許第４，５３０，８３３号、同第４，５３３，６３０号、同第４，８６３，８５２号、同第４，８７９，２１８号、同第５，２３１，００３号、同第５，６１０，０２３号、同第５，９６５，３７５号、同第６，５０３，７２２号、同第６，９３９，５４８号及び同第７，１７９，６１１号を参照されたい。
【００４９】
クロストリジウム・ディフィシル内生胞子などの細菌内生胞子は、多くのポリペプチドの秩序だった集合体により形成される多層タンパク質構造内に入っている。内生胞子は、４つの保護層、コア、コルテックス、コート及びエクソスポリウムを含有する。胞子の最も外側の層は、タンパク質から作られる薄い被膜であるエクソスポリウムである。この内側は胞子コートであり、これは高度に架橋されたケラチン及び胞子特異性タンパク質の層から形成される。胞子コートは多くの毒性分子に対して不透過性であり、発芽に関与する酵素も含有し得る。コルテックスは、胞子コートの下に位置し、ペプチドグリカンを含む。コアの壁はコルテックスの下に位置し、プロトプラスト又は内生胞子のコアを囲む。コアは、ＤＮＡ及びリボソームなどの通常の細胞構造であるが、代謝的に不活性である。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態は、例えば、クロストリジウム・ディフィシルのエクソスポリウムタンパク質、胞子コートタンパク質、胞子コルテックスタンパク質、胞子内膜タンパク質又は胞子コアタンパク質などの胞子特異性タンパク質に結合する抗体を包含する。このような抗体は、本明細書で記載されているファーミキュート門の１つ以上の内生胞子形成細菌上に見られる胞子特異性タンパク質に結合し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、クロストリジウム・ディフィシル中で見られる胞子特異性タンパク質に結合するが、例えば、バチルス・ズブチリス及びクロストリジウム・スポロゲネスなどのファーミキュート門の他の胞子形成細菌の内生胞子特異性タンパク質に結合しない。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態は、クロストリジウム・ディフィシルの胞子コート集合体タンパク質に結合する抗体を包含する。１つのこのような胞子コート集合体タンパク質は、ＣｏｔＨタンパク質（本明細書では「ｃｏｔＨ」とも呼ぶ）である。ＣｏｔＨタンパク質は胞子コートの構造的構成要素であり、バチルス・ズブチリス中でよく特徴付けられている。これは、コートタンパク質の集合体の方向付け及びコートタンパク質の安定化に関与する。例えば、Ｎａｃｌｅｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ；１７８（１５）：４３７５〜４３８０、及び、Ｚｉｌｈａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ；１８１：２６３１〜２６３３を参照されたい。本発明は、クロストリジウム・ディフィシル中の推定ＣｏｔＨタンパク質に結合する抗体を包含する。
【００５２】
クロストリジウム・ディフィシル株６３０の完全ゲノム配列は特定されており、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）、米国国立医学図書館（ＮＬＭ）、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）により保持されているＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースで入手可能である。Ｓｅｂａｉｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ；３８（７）：７７９〜７８６も参照されたい。株６３０は、多剤耐性であり、１９８２年にスイスのチューリッヒの同一の病棟で多数の他の患者に広がった重篤な偽膜性大腸炎を有する患者から単離された（Ｗｒｅｎ，２００６，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ；１（３）：２４３〜２４５）。それゆえに、株６３０は、完全に毒性で高度に伝染性の薬剤耐性株の遺伝的特性を有する。
【００５３】
現在、他のクロストリジウム・ディフィシル株の完全なゲノム配列を得るための努力がなされている。Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ（Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））は、クロストリジウム・ディフィシル株Ｒ２０２９１のゲノムを配列解析している。クロストリジウム・ディフィシル株Ｒ２０２９１は、Ｓｔｏｋｅ  Ｍａｎｄｅｖｉｌｌｅ（ＵＫ）で単離されており、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ  ＢＩ株に密接に関連する（ｆｔｐサイトｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｐａｔｈｏｇｅｎｓ／ｃｄ／Ｃ＿ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ＿Ｂｉ＿４５４．ｄｂｓを参照されたい）。Ｓｔ．ＬｏｕｉｓのＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８のゲノムを配列解析している（ｃｍｒ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＣＭＲ／ＧｅｎｏｍｅＰａｇｅ．ｃｇｉ？ｏｒｇ＝ｎｔｃｄ０３のｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂを参照されたい）。
【００５４】
クロストリジウム・ディフィシル株６３０についての全てのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録の徹底的な検索は、仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１（ＹＰ＿００１０８７５０２）を同定したが、これは、バチルス・ズブチリスの胞子コート集合体タンパク質Ｈ（ｃｏｔＨ）に相同である保存ドメイン（アミノ酸残基９０〜３９３）を示す。ＮＣＢＩから入手可能な及びｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍｌのｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂで利用可能な保存ドメイン検索ツールを使用して、分析を行った。クロストリジウム・ディフィシル６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＹＰ＿００１０８７５０２）は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。Ｓｅｂａｉｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ；３８（７）：７７９〜７８６、及び、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｉｄ＝１２６６９８６０５のｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂを参照されたい。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態は、クロストリジウム・ディフィシルの仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１及びその断片に結合する抗体を包含する。本発明の抗体は、本明細書で述べた任意のクロストリジウム・ディフィシル株が挙げられるがこれらに限定されない様々なクロストリジウム・ディフィシル株中の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１に結合し得る。例えば、本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル株６３０、クロストリジウム・ディフィシル株Ｒ２０２９１、クロストリジウム・ディフィシル株ＱＣＤ−３２ｑ５８、クロストリジウム・ディフィシル株ＱＣＤ−６６ｃ２６、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３２５５、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３５９３、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３５９４、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３５９６、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３５９７、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３５９８、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３６０３、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９及び／又はクロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ７００７９２の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１に結合し得る。本発明の抗体は、配列番号１を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１に結合する抗体を包含する。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態は、クロストリジウム・ディフィシルの仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のポリペプチド断片に結合する抗体を包含する。ポリペプチド断片は、例えば、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００又は約６００のアミノ酸長であり得る。ポリペプチド断片は、例えば、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０又は約４５のアミノ酸長であり得る。ポリペプチド断片は、約８〜２０、約１２〜１５又は約１０〜２０のアミノ酸長であり得る。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態は、クロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１（配列番号１）のポリペプチド断片に結合する抗体を包含する。例えば、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の残基５０５〜６０４（配列番号２）を含むポリペプチドに結合する抗体、クロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の残基３０〜１２０（配列番号９）を含むポリペプチドに結合する抗体、クロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の残基１９４〜２９３（配列番号１０）を含むポリペプチドに結合する抗体、クロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の残基２０３〜２１７（配列番号３）を含むポリペプチドに結合する抗体、及び、クロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の残基３３３〜３４７（配列番号４）を含むポリペプチドに結合する抗体を包含する。
【００５８】
ペプチドグリカンの厚い層である胞子コルテックスは、胞子の高度に脱水された状態を維持する役割を果たし、極度の休眠及び胞子の耐熱性に貢献する。細菌胞子発芽は、胞子休眠の不可逆的な喪失及びコアの再水和を導く一連の分解現象を含む。胞子は、発芽に関与する酵素を含有する。それゆえに、発芽に関与する胞子特異性タンパク質に結合する抗体は、発芽している胞子を同定するために使用され得る。本発明は、発芽に関与する胞子特異性タンパク質に結合する抗体を包含する。このような抗体は、発芽胞子に結合し得るが、未発芽胞子に結合し得ない。このような抗体は、未発芽胞子に結合し得るが、発芽胞子に結合し得ない。
【００５９】
Ｎ−アセチルムラモイルＬ−アラニンアミダーゼのようなアミダーゼなどのコルテックス溶菌酵素は、発芽において重要な役割を果たし、コルテックスの加水分解を生じる（例えば、Ｍｏｒｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ；１８１：２３７３〜２３７８を参照されたい）。本発明は、クロストリジウム・ディフィシルアミダーゼに結合する抗体を包含し、クロストリジウム・ディフィシルのＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼに結合する抗体を包含する。
【００６０】
クロストリジウム・ディフィシル株６３０についての全てのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録の徹底的な検索は、細胞表面タンパク質（推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、ＹＰ＿００１０８７５１７、本明細書では「ＣＤ１０３６」とも呼ぶ）を同定したが、これは、保存ドメインＣＷ＿ｂｉｎｄｉｎｇ＿２（推定細胞壁結合リピート２；１７４〜２６５、２７５〜３６８、３８１〜４６１）及びＡｍｉｄａｓｅ＿３（Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、４９３〜６７３）を有する。クロストリジウム・ディフィシル６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ細胞表面タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＹＰ＿００１０８７５１７）は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。Ｓｅｂａｉｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ；３８（７）：７７９〜７８６、及び、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｉｄのｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂを参照されたい。
【００６１】
本発明は、クロストリジウム・ディフィシルの推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ及びその断片に結合する抗体を包含する。本発明の抗体は、本明細書で述べた任意のクロストリジウム・ディフィシル株が挙げられるがこれらに限定されない様々なクロストリジウム・ディフィシル株中の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼに結合し得る。例えば、本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル株６３０、クロストリジウム・ディフィシル株Ｒ２０２９１、クロストリジウム・ディフィシル株ＱＣＤ−３２ｑ５８、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３２５５、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３５９３、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３５９４、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３５９６、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３５９７、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ４３５９８、クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９及び／又はクロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ７００７９２の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼに結合し得る。本発明の抗体は、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼに結合する抗体を包含する。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態は、推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼのポリペプチド断片に結合する抗体を包含する。ポリペプチド断片は、例えば、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００又は約６００のアミノ酸長であり得る。ポリペプチド断片は、例えば、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０又は約４５のアミノ酸長であり得る。ポリペプチド断片は、約８〜２０、約１２〜１５又は約１０〜２０のアミノ酸長であり得る。本発明は、配列番号５を有するクロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼのポリペプチド断片に結合する抗体を包含する。例えば、本発明は、クロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼの残基２９４〜３９３（配列番号６）を含むポリペプチドに結合する抗体、クロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼの残基５８２〜５９６（配列番号７）を含むポリペプチドに結合する抗体、及び、クロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼの残基６４〜７８（配列番号８）を含むポリペプチドに結合する抗体を包含する。
【００６３】
本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される直鎖抗体断片、ＶＬ又はＶＨドメインのいずれかを含む断片、細胞内で産生された抗体（すなわち、細胞内抗体）、及びこれらの抗原結合性抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体を産生するために、クロストリジウム・ディフィシル細胞、胞子又は毒素、タンパク質、ペプチド、炭水化物及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない非常に様々な標的抗原のいずれかが使用され得る。タンパク質及びペプチドは、例えば、自然に生じるもの、化学合成されたもの、又は組み換え産生されたものであり得る。抗原は、キャリアに結合され得る。
【００６４】
本発明にはまた種々の抗体断片が含まれるが、これはまた抗原結合断片とも呼ばれ、インタクト抗体の一部分のみを含み、一般にインタクト抗体の抗原結合部位を含み、それゆえに抗原を結合する能力を維持する。インタクト又は完全な抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処理によって、断片を得ることができる。組み換え手段によって、断片を得ることもできる。抗体断片の例には、例えば、タンパク質分解及び／又はジスルフィド架橋を還元して産生されるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、ｄＡＢ及びＦ（ａｂ’）２断片、並びに、Ｆａｂ発現ライブラリーから産生される断片が挙げられる。そのような抗体断片は、当該技術分野において周知の技術により作られることができる。本発明の抗体は、可変領域（１つ又は複数）を単独で、又はヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及び／又はＦｃドメインの全て又は一部と組み合わせて含むことができる。用語「抗原結合性断片」は、抗原に結合する、又は抗原結合においてインタクト抗体と競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を意味する。
【００６５】
本発明の抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹなど）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２など）又はサブクラスに属すことができる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧである。免疫グロブリンは、重鎖と軽鎖の両方を有することができる。ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ重鎖のアレイは、κ又はλ形状の軽鎖と対になることができる。
【００６６】
本発明の抗体は、鳥類及び哺乳類などを含む任意の動物由来であることができる。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト、マウス、ラット、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、ラマ、ラクダ又はニワトリ抗体である。本明細書で使用するとき、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、並びに、ヒト免疫グロブリンライブラリーから又は１つ以上のヒト免疫グロブリンについての遺伝子導入動物から単離された抗体を包含する。
【００６７】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であり得る。用語「ポリクローナル抗体」は、形質細胞の単一クローン１つ超から産生される抗体を意味する。対照的に、「モノクローナル抗体」は、形質細胞の単一クローン１つから産生される抗体を意味する。ポリクローナル抗体の調製は周知である。
【００６８】
標的抗原に対するポリクローナル抗体は、免疫原を有する様々な宿主動物のいずれかを免疫化することにより入手され得る。広範囲の免疫化プロトコルのいずれかを使用してよい。宿主動物は任意の動物であり得、例えば、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、スイギュウ、バイソン、ラクダ又はラマが挙げられる。宿主動物は鳥類であってもよく、例えば、ニワトリ又はシチメンチョウが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗体調製物は、血液サンプルから得られるものよりもむしろ、別の流体源、例えば、乳、初乳、卵白又は卵黄、から得られる。いくつかの実施形態では、抗体調製物は、標的抗原を有する宿主動物の免疫化によるのではなく、むしろ、抗原に予め曝露した個体から、又は、プール血清、例えば、プールヒト血清、から得られる。
【００６９】
免疫化された哺乳類で免疫原性であることが既知であるタンパク質に免疫化剤を接合することが有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。採用され得るアジュバントの例には、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコラート）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫化プロトコルは、過度の実験なしに当業者により選択され得る。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態は、クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合する抗血清を包含する。本明細書に用いられる、抗血清とは、免疫化されたホスト動物からの血液から凝固タンパク質及び赤血球（ＲＢＣ）を除去したものを指す。抗血清（本明細書では「抗血清調製物」、「粗抗血清」又は「原抗血清」とも呼ぶ）は依然として、他の種々の血清タンパク質と同様に、全てのクラスの免疫グロブリンを保有する。それゆえに、標的抗原を認識する抗体に加えて、抗血清はまた、時々免疫学的アッセイにおいて非特異的に反応することができる種々の非標的抗原に対する抗体を含有する。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態では、抗体は富化され得る。このような富化は、調製物から非免疫グロブリンタンパク質を除去し、及び／又は、サンプル内の免疫グロブリンの１つ以上のクラス（例えば、ＩｇＧなど）を富化し得る。種々の方法のいずれかを使用して、本明細書に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されないこのような富化抗体を入手し得る。抗体調製物からの非免疫グロブリン血清タンパク質の除去方法及びＩｇＧ画分の富化方法は、当該技術分野において周知である。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、タンパク質Ａ結合、タンパク質Ｇ結合又はカプリル酸調製物を使用して、ＩｇＧクラスの抗体を富化し得る。
【００７２】
本発明の抗体は、標的抗原に対する結合活性が強化された抗体を包含する。このような抗体は、抗原親和性免疫吸着により調製され得る。抗原親和性免疫吸着は、様々な手段のいずれかにより遂行され得る。例えば、抗原親和性免疫吸着は、抗原親和性カラムクロマトグラフィーにより遂行され得る。カラムクロマトグラフィーは任意の機械的手段により遂行され得、例えば、圧力下で若しくは圧力無しで実行されるカラムで遂行され、上から下へ若しくは下から上へ実行されるカラムで遂行され、又は、カラム内の流体の流れの方向はクロマトグラフィーのプロセス中に逆転され得る。あるいは、抗原親和性免疫吸着は、カラムクロマトグラフィー以外の手段により遂行され得る。例えば、親和性免疫吸着は、重力、遠心分離又は濾過などの任意の好適な手段によりサンプルを装填、洗浄又は溶出するために使用される液体から固体支持体が分離されるバッチプロセスを使用して遂行され得る。親和性免疫吸着はまた、他よりも強力にサンプル中のいくつかの分子を吸着又は保持するフィルターにサンプルを接触させることにより、遂行され得る。抗原親和性カラムは、本明細書に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない様々な方法のいずれかにより、調製され得る。抗原親和性カラムへの抗体調製物の結合は、本明細書に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されない非常に様々な免疫吸着方法のいずれかにより遂行され得る。抗原親和性カラムへの抗体調製物の結合は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、塩化物、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、トリス緩衝液、及び／又は、中性に近い緩衝能を有する有機緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない様々な緩衝液又は塩の中で生じ得る。このような緩衝液及び塩の具体例には、例えば、トリス、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム又は酢酸アンモニウムが挙げられる。
【００７３】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体を包含する。モノクローナル抗体の集団は均質である。調製物中の全てのモノクローナル抗体は標的分子の同一のエピトープを認識し、全てのモノクローナル抗体は同一の親和性を有する。本明細書で使用するとき、「親和性」は、モノクローナル抗体がその抗原エピトープと相互作用する結合力である。本明細書で使用するとき、「エピトープ」は抗体により結合される抗原の部分である。親和性が高いほど、抗原と抗体の間の結合はより緊密になり、抗原は結合部位を保持しやすくなる。
【００７４】
本発明のモノクローナル抗体には、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される直鎖抗体断片、ＶＬ又はＶＨドメインのいずれかを含む断片、細胞内で産生された抗体（すなわち、細胞内抗体）及びこれらの抗原結合性抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明のモノクローナル抗体は、動物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ウマ、ニワトリ、又はシチメンチョウが挙げられるが、これらに限定されない）により産生すること、化学合成すること又は組み換え発現させることができる。本発明のモノクローナル抗体を、当該技術分野において既知の免疫グロブリン分子の精製法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、又は任意のその他の標準的なタンパク質精製技術により精製することができる。更に、本発明の抗体又はその断片を、本明細書に記載する異種ポリペプチド配列と融合し、ないしは当該技術分野において既知の別の方法で、精製を容易にすることができる。
【００７６】
本発明のモノクローナル抗体は、任意のアイソタイプであることができる。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥであってもよい。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥであってもよい。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体はマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ３であってよい。本発明について、所与の重鎖は、κ又はλ形状のいずれかの軽鎖と対になっていてよい。
【００７７】
モノクローナル抗体は、当業者には精通される様々な手法で得ることができる。例えば、所望の抗原で免疫化された動物からの脾臓細胞は、通常、骨髄腫細胞との融合により、不死化される（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７６，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；６：５１１〜５１９；Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ  Ｉｎ「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ５９〜１０３（１９８６）；及び、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐａｇｅ  ７２６（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂ．（１９８８）を参照されたい）。モノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の手法で、ハイブリドーマから単離及び精製することができる。モノクローナル抗体を産生する形質転換Ｂ細胞株を作るその他既知の方法を利用してもよい。本発明のモノクローナル抗体を、組み換えＤＮＡ技術により生成、例えば、ファージディスプレイ法又はコンビナトリアルな方法で生成してもよい。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、国際公開ＷＯ  ９２／１８６１９号、同ＷＯ  ９１／１７２７１号、同ＷＯ  ９２／２０７９１号、同ＷＯ  ９２／１５６７９号、同ＷＯ  ９３／０１２８８号、同ＷＯ  ９２／０１０４７号、同ＷＯ  ９２／０９６９０号又は同ＷＯ  ９０／０２８０９号を参照されたい。このような方法を、ヒトモノクローナル抗体の産生に使用できる。
【００７８】
本発明のモノクローナル抗体にはキメラ抗体を含む。キメラ抗体は、異なる動物種由来の異なる部分を持つ。例えば、キメラ抗体は、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子の遺伝子を、適切な生物学的特異性を有するヒト抗体分子の遺伝子と継ぎ合わせることにより得られる。例えば、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ；３１４：５４４〜５４６を参照されたい。
【００７９】
治療的に有用な抗体は、「ヒト化」モノクローナル抗体由来であってもよい。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス（又は他の種の）免疫グロブリンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域から１つ以上のＣＤＲをヒト可変ドメイン内に導入し、ヒト残基をマウスの相当するフレームワーク領域に置換することにより産生される。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分の使用により、マウス定常部の免疫原性に付随する問題の可能性を排除する。ヒト化モノクローナル抗体の作製技術は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ；３２１：５２２、及び、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ：１５０：２８４４に見ることができる。本発明のヒト化モノクローナル抗体の定常部は、任意のアイソタイプに属するヒト免疫グロブリンの定常部とすることができる。例えば、ヒトＩｇＧの定常部としてもよい。ヒト免疫グロブリン由来の定常部のフレームワーク領域は、特に限定されない。
【００８０】
完全な抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）を有する。ＶＨ及びＶＬ領域は「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができ、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在している。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は正確に画定されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、及び、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６：９０１〜９１７を参照されたい）。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。本発明は、本発明のモノクローナル抗体の重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、及び／又は、１つ以上の相補性決定領域を有する抗体を包含する。
【００８１】
本発明は、二重特異性又は二機能性抗体を包含する。二重特異性又は二機能性抗体は、２本の異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦ（ａｂ’）断片の連結などの様々な方法で産生できる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；７９：３１５〜３２１、及び、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；１４８：１５４７〜１５５３を参照されたい。更に、二重特異性抗体は「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ：９０：６４４４〜６４４８）又は「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ；１０：３６５５〜３６５９、及び、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ；７：５１〜５２）のように作製することができる。
【００８２】
更に本発明に包含されるのは、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、形質転換Ｂ細胞株、及び宿主細胞；これらハイブリドーマ、形質転換Ｂ細胞株、及び宿主細胞の子孫又は類縁細胞；並びに同じ又は類似するハイブリドーマ、形質転換Ｂ細胞株、及び宿主細胞である。これらの子孫又は類縁細胞は、親系統により産生される抗体の、例えば、アイソタイプ及び抗原特異性といった、同定特性の１つ以上を有する抗体を産生し得る。
【００８３】
本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明は更に、本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を持つヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド分子に関する。本発明はまた、本発明の抗体、又はその補体をコードするヌクレオチド配列と高い厳密性でハイブリッド形成するポリヌクレオチドも含む。本明細書で使用するとき、「厳密な条件」は、第１のポリヌクレオチド分子が、フィルターに結合した第２のポリヌクレオチド分子と、６５℃において、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１ｍＭのＥＤＴＡの中でハイブリッド形成し、その後、４２℃において０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの中で洗浄しても結合し続ける能力を意味する（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ａｔ  ｐ．２．１０．３（１９８９）を参照されたい）。更に本発明に包含されるのは、本発明のモノクローナル抗体の１つ以上のＣＤＲ領域又は重鎖及び／若しくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドである。免疫グロブリン可変ドメイン及び定常部のクローニングと配列解析の一般的手法はよく知られている。例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ；８６：３８３３を参照されたい。
【００８４】
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む組み換えベクターも包含する。ベクターを、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、又はファージ形状とすることができる。適切なＤＮＡ配列を、様々な方法でベクター内に挿入できる。一般的には、ベクター内の適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（１個所又は複数個所）に、当該技術分野において既知の方法でＤＮＡ配列を挿入する。このような方法は、当業者の目的の範囲内とみなされる。多くの好適なベクター及びプロモーターが当業者に周知であり、市販されている。一例として、以下のベクターを示す。細菌ベクターとして、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｓｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５が挙げられる。真核生物ベクターとして、例えば、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬが挙げられる。しかし、その他の任意のプラスミド又はベクターを使用できる。
【００８５】
本発明のいくつかの実施形態はまた、上記ベクターを含有する宿主細胞を包含する。宿主細胞を、哺乳類若しくは昆虫類の細胞などの高等真核細胞、又は酵母細胞などの下等真核細胞とすることができる。あるいは、宿主細胞を、細菌細胞、又は植物細胞などの原核細胞とすることができる。宿主細胞へのベクター作製物の導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション又は電気穿孔法などの任意の好適な方法により、もたらすことができる（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【００８６】
本発明のモノクローナル抗体は、適切なプロモーターの制御下において、哺乳類細胞、酵母、細菌、又はその他の細胞内で発現させることができる。無細胞翻訳系を、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いるこれらタンパク質の産生に利用することもできる。原核生物宿主及び真核生物宿主と用いるのに適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されている。
【００８７】
更に本発明に包含されるのは、本発明のモノクローナル抗体由来の１つ以上の超可変領域を発現するファージディスプレイライブラリー、及びこのようなファージディスプレイライブラリーから得られるクローンである。ファージディスプレイライブラリーは、抗体由来分子の産生に用いられる。抗体の抗原結合可変ドメインをコードする遺伝子部分を、バクテリオファージのコートタンパク質をコードする遺伝子に融合する。このような遺伝子融合体を含むバクテリオファージを用いて細菌に感染させると、生じたファージ粒子は、抗原結合ドメインがバクテリオファージ外部に提示される状態で、抗体融合タンパク質を発現する外殻を有する。ファージディスプレイライブラリーを、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から入手可能なＰｈ．Ｄ．（商標）−７  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｅ８１００Ｓ）又はＰｈ．Ｄ．（商標）−１２  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｅ８１１０Ｓ）を用いて調製できる。Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｅｎｋｏ，１９９７，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ；９７：３９１〜４１０も参照されたい。
【００８８】
本発明の抗体は、当該技術分野において周知の手法により、直接的又は間接的に、基材又は検出可能なマーカーに結合され得る。検出可能なマーカーは、例えば、分光的（例えば、紫外線、赤外線、可視光線、ラマン、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）、質量分光）、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段により、検出可能な作用剤である。有用な検出可能なマーカーとして、蛍光染料、化学発光化合物、放射性同位元素、高電子密度試薬、酵素、着色粒子、ビオチン、又はジゴキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）が挙げられるがこれらには限定されない。多くの場合、検出可能なマーカーは、放射活性、蛍光、色、又は酵素活性などの測定可能な信号を発する。検出可能な作用剤を結合した抗体を、診断又は治療目的で用いてもよい。検出可能な作用剤の例には、種々の酵素、自然に生じる胞子関連生体分子（例えば、ジピコリン酸、ジピコリン酸カルシウム）、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性物質、種々のポジトロン放出断層撮影を使用するポジトロン放出金属、非放射活性常磁性金属イオン、ラマン標識及びＳＥＲＳ標識が挙げられる。検出可能な物質は、直接的に、又は例えば、当該技術分野において既知のリンカーなどの仲介物を介して間接的に、当該技術分野において既知の手法を用いて抗体に共役又は結合できる。例えば、診断利用のための抗体への金属イオンの結合を記載している米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光性物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド及びフィリコエリトリンが挙げられ、発光性物質の例として、ルミノールが挙げられる。生物発光性物質の例として、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、及び好適な放射性物質の例として、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、及び９７Ｒｕが挙げられる。このような部分を抗体に結合する手法は周知である。
【００８９】
本発明の抗体は、任意の種類の分子と抗体との共有結合により修飾又は複合化された、抗体誘導体を包含する。このような抗体誘導体として、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的開裂、又は細胞内配位子又は他のタンパク質への結合により修飾されている抗体が挙げられる。特異的な化学開裂、アセチル化、ホルミル化、及びツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない、既知の手法により任意の多くの化学修飾を実施可能である。更に、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含有できる。
【００９０】
本発明の抗体は、免疫特異的結合について、本明細書に記載する方法及び任意の好適な当該技術分野において既知の方法により評価することができる。利用可能なイムノアッセイには、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析、免疫蛍光法、免疫細胞化学法、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びタンパク質Ａイムノアッセイなどの手法を用いた、競合的及び非競合的アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣行法であり、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４）を参照されたい）。
【００９１】
更に本発明に包含されるのは、本明細書に記載される抗体の１つ以上を含む組成物である。組成物はまた、例えば、ｐＨを許容範囲に保つのに役立つ緩衝剤、又は微生物の増殖を抑制する防腐剤を含んでもよい。組成物は、例えば、キャリア、賦形剤、安定剤、キレート化剤、塩、又は抗菌剤を含んでもよい。許容可能なキャリア、賦形剤、安定剤、キレート化剤、塩、防腐剤、緩衝剤、若しくは抗菌剤として、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤；アジ化ナトリウム、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライドなどの防腐剤；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール：メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール；ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは非特異的免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドン（ｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）などの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンなどの単糖類、二糖類、及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらには限定されない。本明細書で記載するとき、組成物はポリクローナル抗血清ではない。
【００９２】
本発明はまた、本発明の１つ以上の抗体を含むキット又は検出システムを提供する。キットは、１つ以上の本発明の抗体で満たされる、１つ以上の容器を含み得る。更に、キットは、緩衝液及び溶液など、本発明の実施に必要なその他の試薬を含むことができる。このような容器（１つ又は複数）に任意に付属するものとして、注意事項や説明書が挙げられる。キットは、梱包材料を含むことができる。本明細書で使用するとき、「梱包材料」という用語は、キットの内容物を収容するのに用いる１つ以上の物理的構造体を意味する。梱包材料は、無菌の、汚染物質を含まない環境を提供できる周知の方法で組み立てられる。
【００９３】
本発明は、単離された抗体を包含する。本明細書で開示されている種々の抗体を説明するのに使用するとき、「単離された」は、同定され、その自然環境の構成成分から分離及び／又は回収された抗体を意味する。その自然環境の汚染物質構成成分は、ポリペプチドについての診断又は治療的使用を典型的に妨害する物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含み得る。
【００９４】
本発明の抗体は、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに、「特異的に結合し」得るか又は「特異的であり」得る。このような抗体は、あらゆる他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合するものである。
【００９５】
本発明の抗体は、動物により産生すること、化学合成すること又は組み換え発現することができる。本発明の抗体は、当該技術分野において既知の免疫グロブリン分子の任意の精製法、例えば、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない）、遠心分離、溶解度差、又は任意のその他の標準的なタンパク質精製技術により精製することができる。更に、本発明の抗体又はその断片は、本明細書に記載されている異種ポリペプチド配列と融合して、あるいは当該技術分野において既知の別の方法で、精製又は検出を容易にすることができる。
【００９６】
本発明の抗体は、クロストリジウム・ディフィシル胞子及びそのポリペプチド断片の検出方法、並びに、クロストリジウム・ディフィシル胞子又はそのポリペプチド断片の単離又は精製方法が挙げられるがこれらに限定されない非常に様々な診断又は治療方法に使用され得る。
【００９７】
本発明の抗体は、サンプル中でのクロストリジウム・ディフィシル胞子の存在又は不在を判定するために、当該技術分野において既知の非常に様々なイムノアッセイ技術のいずれかに使用され得る。本明細書で使用するとき、イムノアッセイは、抗体がその抗原標的に対して反応することを用いて、サンプル中でのクロストリジウム・ディフィシル胞子などの検体の存在を同定する試験である。アッセイは、抗体がその抗原に特異的に結合することを利用する。本発明にはまた、このような検出方法も包含される。
【００９８】
イムノアッセイでは、サンプルは１つ以上の抗体に接触させられ、抗体は、サンプル中に存在する場合にはその抗原標的に結合可能である。次に、１つ以上の抗体のそれらの抗原標的への結合は、抗原標的に結合した抗体を検出することにより、判定される。このような検出は、例えば、比色的に、蛍光定量的に、酵素的に、又は放射性同位体で、達成され得る。アッセイの形式に依存して、検出可能な標識を抗原又は抗体に結合することができる。検出可能部分は、直接的又は間接的のいずれかで検出可能な信号を産生することができるべきである。例えば、検出可能部分は、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉなどの放射性同位体、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリンなどの蛍光若しくは化学発光化合物、あるいは、例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素、ラマン標識又はＳＥＲＳ標識であり得る。検出可能部分に抗体又は抗原を結合するための当該技術分野において既知の任意の方法が、採用され得る。検出可能部分（本明細書では検出可能標識とも呼ぶ）は、「標識された」抗体を生成するように、直接的又は間接的に抗体に結合され得る。標識はそれ自体で検出可能であり得るか（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、又は、酵素標識の場合には、検出可能である基質化合物若しくは組成物の化学変性を触媒し得る。
【００９９】
本発明のイムノアッセイには、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析、免疫蛍光法、免疫細胞化学法、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びタンパク質Ａイムノアッセイなどの手法を用いた、競合的及び非競合的アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣行法であり、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４）を参照されたい）。
【０１００】
本発明のイムノアッセイは、均質又は不均質であり得る。不均質イムノアッセイは、通常、固相試薬を使用して、サンプルから結合していない抗体又は抗原を除去する工程を必要とする。均質アッセイはこの工程を必要としないので、均質アッセイは典型的に、行うのにより迅速で容易である。分離方法には、例えば、コーティングされた試験管、コーティングされたビーズ、コーティングされたウェル、磁気粒子又はガラス粒子の上での沈殿（例えば、二次抗体を用いて）及び除去が挙げられる。
【０１０１】
本発明のイムノアッセイは、例えば、競合的結合アッセイであり得る。競合的イムノアッセイでは、サンプル中の抗原は、抗体と結合するために、標識された抗原と競合する。次に、抗体部位に結合した標識された抗原の量を測定する。この方法では、反応は、未知のものの中の抗原の濃度に反比例する。これは、反応が大きいほど、標識された抗原との競合に利用可能なサンプル中の抗原がより少なくなるからである。競合的イムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。
【０１０２】
本発明のイムノアッセイは、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり得る。ＥＬＩＳＡでは、未知量の抗原が表面上に固定され、次に特異的な抗体は表面全体を洗浄され、その結果、抗体は抗原に結合することができる。この抗体は酵素に結合し、最終工程では、酵素がある程度の検出可能な信号に転換できかつサンプル中の抗原の量が測定できる物質が加えられる。ＥＬＩＳＡの実行は、特定の抗原に対して特異性を有する少なくとも１つの抗体を伴う。未知量の抗原を有するサンプルは、非特異的に（表面への吸着を介して）又は特異的に（「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡでは、同一の抗原に対して特異的な別の抗体による捕捉を介して）のいずれかで固体支持体（例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレート）上に固定化される。抗原が固定化された後、検出抗体が加えられ、抗原と複合体を形成する。検出抗体は酵素と共有結合することができるか、又は、生物共役化を通して酵素に結合される二次抗体により検出抗体自体を検出することができる。各工程間で、プレートは、典型的にはマイルドな洗剤溶液で洗浄して、特異的に結合しないあらゆるタンパク質又は抗体を除去する。最終洗浄工程後、サンプル中の抗原の量を示す可視信号を産生する酵素基質を加えることにより、プレートを顕色させる。ＥＬＩＳＡは、発色、発光又は蛍光基質を利用し得る。
【０１０３】
本発明のイムノアッセイは、サンドイッチアッセイであり得る。サンドイッチアッセイでは、検体は、標的検体上の異なる抗原エピトープに結合する２つの抗体間の「サンドイッチ」である。一方の抗体は捕捉抗体として働き、二次抗体は検出抗体として働く。捕捉抗体は試験管又はウェルなどの固相にコーティングされ得、検出抗体は検出可能に標識され得る。
【０１０４】
本発明のイムノアッセイは、例えば、イムノクロマトグラフィー側方流動アッセイ（本明細書では、側方流動アッセイ、側方流動試験又はイムノクロマトグラフィック・ストリップ試験とも呼ぶ）であり得る。側方流動アッセイは、単純な装置を使用して、サンプル中の標的検体の存在（又は不在）を迅速に検出する。これらの試験は通常、家庭検査、診療現場臨床検査又は実験での使用のいずれかのための医学的診断に使用される。計量棒形式で多くの場合製造される側方流動試験は、水溶液中に懸濁され得る試験サンプルが吸収パッドに向かって毛管作用又は吸上作用を介して多孔質基材（例えば、ニトロセルロース膜）を通って流れるイムノアッセイの形式である。サンプルが基材に適用された後、サンプルと混合し、サンプル中に存在する場合には検体に結合する色付き試薬（例えば、金又はラテックス粒子）と基材が接触する。混合物は基材を通過し、検体を結合できる抗体を固定化するために予め処理されたライン又は領域に接触する。検体がサンプル中に存在する場合、色付き試薬は試験ライン又は領域で結合していくことができる。代替的な実施形態では、側方流動アッセイを使用して、サンプル中に存在する特異的な抗体を検出することができる。これらの実施形態では、色付き試薬は抗原コーティングされた粒子であることができ、検出ライン又は領域は抗原で予め処理することができる。例えば、米国特許第５，７５３，５１７号、同第６，４８５，９８２号、同第６，５０９，１９６号、同第７，１８９，５２２号及び米国再発行特許第３９６６４号、米国特許出願第２００６／０２７５９２０号、並びに、Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ；７：８９〜９２を参照されたい。
【０１０５】
本明細書に記載されている１つ以上の抗体を使用して、サンプル中に存在する場合には、クロストリジウム・ディフィシル胞子を基材に結合し、次に胞子の存在を様々な方法のいずれかにより検出及び／又は計量する検出方法もまた、本発明に包含される。胞子の存在は、例えば、顕微鏡、培養、酵素活性抗体結合（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるような）、カルシウム分子蛍光若しくは発光、又はランタニド金属媒介発光により、判定され得る。カルシウムイオンとの１：１複合体中のジピコリン酸は、細菌胞子に高濃度で存在し、他のあらゆる生命体では観察されていない。例えば、テルビウム又はユーロピウムなどのランタニド金属は、サンプル中の任意の細菌胞子内に存在するジピコリン酸（ＤＰＡ）と結合して、例えば、ジピコリン酸テルビウム又はジピコリン酸ユーロピウムなどのランタネートキレートを生成する。このようなランタネートキレートは、光ルミネセンス検査を使用して検出できる識別可能な吸光度及び発光スペクトルを有する。ランタニド金属媒介発光はまた、例えば、側方流動アッセイにおいて、本明細書に記載されている種々のイムノアッセイ方法のいずれかで、検出信号として利用され得る。胞子発芽において、Ｃａ−ＤＰＡが放出され、カルシウムは多くの手段で検出することができる。感知のための分子蛍光又は発光の使用によるカルシウムの蛍光検出は、高感度を提供する。カルシウム指標染料は、２つの群に分類することができる：第１群はカルシウム存在時にこれらの蛍光を増加する染料であり、一方、第２群はカルシウムの不在時にこれらが有するのとは異なる励起及び／又は発光波長をカルシウム存在時に有する染料である。カルシウム指標染料、カルシウムグリーン−１、カルシウムグリーン−２、及びＦｌｕｏ−４は、波長を変化させることなくカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の存在時にこれらの蛍光を増加する染料の代表である。Ｆｕｒａ−２及びＩｎｄｏ−１は、ほとんどの実験で互換可能であると通常考えられるレシオメトリックＣａ２＋指標である。Ｆｕｒａ−２は、Ｃａ２＋に結合すると、その吸光又は発光ピークの３３８ｎｍから３６６ｎｍへの移行を呈する。一方、Ｉｎｄｏ−１は、カルシウム存在時に、発光の４８５ｎｍから４０５ｎｍへの移行を有する。カルシウムはまた、イクオリン及びオベリンなどのカルシウム活性化発光タンパク質を使用して検出することができる。生物発光の放出のために外部照射からの励起に対する必要性はないので、生成された信号は、実質上バックグラウンドを有さない。これにより、検出を非常に低いレベルに制限し、これらの発光タンパク質を分析用途について魅力的な標識にする。カルシウム媒介信号発信はまた、例えば、側方流動アッセイにおいて、本明細書に記載されている種々のイムノアッセイ方法のいずれかで、検出信号として利用され得る。このような方法及び本明細書に記載されている他の方法はまた、サンプル中に存在する胞子の計量を可能にする。例えば、米国特許第５，８７６，９６０号、同第６，４９８，０４１号、同第６，８１５，１７８号及び同第７，３０６，９４２号、米国特許出願第２００３／０１３８８７６号、同第２００４／００１４１５４号及び同第２００５／０１３６５０８号、並びに、Ｐｏｎｃｅ，２００３，ＮＡＳＡ  Ｔｅｃｈ  Ｂｒｉｅｆ；２７（３）：ｐｐ．ｉ〜ｉｉ，１〜３を参照されたい。
【０１０６】
本発明の検出方法で、クロストリジウム・ディフィシル胞子に結合する本明細書に記載されている抗体の１つ以上を含む、１つ以上の抗体が使用され得る。更に、既知の特異性の１つ以上の追加的な抗体が使用され得、例えば、クロストリジウム・ディフィシル栄養細胞に結合する、異なる細菌種（例えば、Ｃ．クロストリジウム若しくはバチルス・ズブチリスなど）の栄養細胞に結合する、又は、異なる細菌種の胞子（例えば、Ｃ．クロストリジウム若しくはバチルス・ズブチリスの胞子など）に結合する、１つ以上の抗体が使用され得る。
【０１０７】
サンプルは、非常に様々な供給源から入手され得、これらには環境又は食品サンプル及び医学若しくは獣医学的サンプルが挙げられるがこれらに限定されない。環境サンプルの例には、水サンプル、土壌サンプル、植物サンプル及び空気サンプルが挙げられるがこれらに限定されない。食品の例には、肉、家禽、卵、魚、魚介類、野菜、果物、加工食品（例えば、スープ、ソース、ペースト）、穀物製品（例えば、小麦粉、穀物、パン）、缶詰、乳、その他の乳製品（例えば、チーズ、ヨーグルト、サワークリーム）、油脂、油、デザート、香辛料、薬味、パスタ、飲料、水、動物用飼料が挙げられるが、これらに限定されない。医学又は獣医学的サンプルには、臨床サンプル、細胞可溶化物、全血又はその部分（例えば、血清）、他の体液又は分泌物（例えば、唾液、痰、汗、皮脂、尿、脳脊髄液）、糞便、細胞、組織、臓器、生検及び異なる種類のスワブが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
サンプルは、感染媒介物から入手され得る。用語「感染媒介物」は、感染性生物を運搬、及び／又は移動することが可能な無生物又は基質を指すものとして一般的に用いられる。感染媒介物は、人から人へクロストリジウム・ディフィシルなどの病原菌を移す役割を果たす。感染媒介物としては、これらに限定されるものではないが、布巾、モップヘッド、タオル、スポンジ、雑巾、食器、硬貨、紙幣、携帯電話、衣類（靴を含む）、ドアノブ、女性用品、おむつなど、これらの部分、及びこれらの組み合わせが挙げられる。医療関係では感染媒介物の多くの例が存在する；使用間に適切に消毒されていない喉頭鏡などの器具、汚れたタオル、食器、並びに床、壁及び机などの表面は全て、病気を拡大する役割を果たし得る。対象とする表面には、これらに限定されるものではないが、壁（ドアを含む）、床、天井、排水管、冷蔵システム、ダクト（例、エアダクト）、通気口、トイレの便座、ハンドル、ドアノブ、手すり、ベッドレール（例えば、病院における）、カウンタートップ、テーブルトップ、食事用表面（例、トレイ、皿など）、作業面、機器表面、衣類など、及びこれらの組み合わせを含む様々な表面の少なくとも一部が含まれる。
【０１０９】
サンプルは、液体、固体又は半固体であり得る。サンプルは、固体表面のスワブであり得る。サンプルは、調製又は希釈なしで、本発明の検出方法に直接使用され得る。例えば、液体サンプルは、直接アッセイにかけられ得る。サンプルは、緩衝溶液又は細菌培養培地が挙げられ得るがこれらに限定されない溶液中に、希釈又は懸濁され得る。固体又は半固体であるサンプルは、液体中で固体を刻む、混合する又は浸軟することにより、液体中に懸濁され得る。サンプルは、更に、濃縮又は富化され得る。
【０１１０】
本発明のイムノアッセイは、種々の適切な対照サンプルを包含し得る。例えば、細菌胞子、細胞若しくは毒素を含有しない陰性対照サンプル、又は、細菌細胞、胞子若しくは毒素を含有する陽性対照サンプルが、アッセイにかけられ得る。本発明のイムノアッセイは、顕色にほんの数分かかり得、サンプル又は試薬調製をほとんど又は全く必要とし得ない。本発明のイムノアッセイは、定性的又は定量的形式で行われ得る。定性的結果は、サンプルについて単純に陽性又は陰性の結果を提供する。陽性と陰性との境界は分析者により判定され、統計的であり得る。多くの場合、標準偏差の２又は３倍が使用されて、陽性サンプルと陰性サンプルとを識別する。定量的形式では、結果は、標準曲線に内挿され得、これは典型的には標的の連続希釈である。
【０１１１】
本発明を以下の実施例によって例示する。特定の実施例、物質、量及び手順が本明細書で記載された本発明の範囲及び趣旨により広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
クロストリジウム・ディフィシル胞子の産生
Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（ＢＨＩ）の入った１本の試験管にクロストリジウム・ディフィシル（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．７００７９２、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））を接種し、嫌気性条件下において３５〜３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。インキュベート後、ブロス培養物のアリコート１ミリリットル（ｍＬ）を最低でも４本のＢＨＩブロス含有試験管に移し、次に、嫌気性条件下において３５〜３７℃で１２日間にわたってインキュベートした。ブロス培養物を１０，０００回転毎分（ｒｐｍ）で１０分間（ｍｉｎ）にわたって遠心分離し、細胞ペレットを室温で１時間にわたって１０ｍＬの無水エタノールに再懸濁して、栄養細胞を殺した。１時間後、懸濁液を１０，０００ＲＰＭで１０分間にわたって遠心分離し、細胞ペレットを無菌Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液で少なくとも２回洗浄した。ペレットを無菌Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液に再懸濁し、嫌気性血液寒天上で連続希釈物をプレーティングすることにより、１ミリリットル当たりの胞子数を決定した。以下の実施例では、失活胞子に対するポリクローナル抗体の産生における免疫原として、及び、抗胞子抗体の結合特異性を判定するためのＥＬＩＳＡアッセイにおける抗原標的としての両方で、再懸濁胞子を使用した。
【０１１３】
（実施例２）
失活クロストリジウム・ディフィシル胞子に対するポリクローナル抗体の産生
１ｍＬ当たり約１０６個の胞子の濃度のクロストリジウム・ディフィシル胞子を５％ホルマリンで１０分間にわたって処理して、胞子を失活させた。失活胞子を無菌Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液で２回洗浄し、次に無菌Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液に再懸濁した。標準的なプロトコル（Ａｎｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ））を使用して、ウサギにおいて、ポリクローナル抗体を失活胞子に対して産生する。簡潔には、ニュージーランドシロウサギ（２個体のウサギ）に免疫付与毎に１×１０６／ｍＬ等量の不活性胞子を免疫付与した。無菌生理食塩水で免疫原を１ｍＬに希釈し、１ｍＬの適切なアジュバントと組み合わせた。抗原とアジュバントを混合して、安定なエマルションを形成し、これを皮下注射した。第１日には完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）中の抗原をウサギに免疫付与し、続いて第２０日、第４０日及び第６０日には、全てのそれに続く注射のために不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）中の抗原を免疫付与した。
【０１１４】
最後の免疫付与の１０日後に、ウサギから血液を採取し、３７℃で一晩にわたって凝固及び退縮させた。次に、凝固した血液を２４時間にわたって冷蔵し、血清をデカントし、２５００ｒｐｍで２０分間にわたって遠心分離することにより清澄化した。免疫前及び免疫血清を失活胞子に対してＥＬＩＳＡにより試験した。ＥＬＩＳＡプロトコルのために、クロストリジウム・ディフィシルの失活胞子をコーティング緩衝液（無菌蒸留水１リットル当たり１．５９グラム（ｇ）のＮａ２ＣＯ３及び２．９３ｇのＮａＨＣＯ３の、０．１Ｍの重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６）１ミリリットル（ｍＬ）当たり１０５個の胞子に希釈した。１００マイクロリットル（μＬ）の胞子溶液をＥＬＩＳＡプレート（ＥＬＩＳＡ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｔｅ）（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））のウェルに加えた。対照ウェルに１００μＬのコーティング緩衝液を加えた。プレートをＰＡＲＡＦＩＬＭで覆い、４℃で１５〜１６時間にわたってインキュベートした。プレートを空にし、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有するリン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄した。室温（ＲＴ）で振盪しながら、１００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、１％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で２時間にわたって、プレートをブロックした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＲＴで振盪しながら１〜２時間にわたってブロッキング緩衝液中の一次抗体１００μＬをインキュベートした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＲＴで振盪しながら１時間にわたってＨＲＰ標識を有する二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰ複合体；１：１０，０００希釈（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）））１００μＬをインキュベートした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で４回洗浄した。５０μＬの基質溶液（１−ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）））を各ウェルに加え、ＲＴで１５〜３０分間にわたって振盪しながらインキュベートした。５０μＬの反応停止液（１．５Ｍのリン酸）を加えることにより着色を停止させ、各プレートの吸光度を４５０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｐｌｕｓ  ３８４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））で読み取った。吸光度を比較して、標的について信号が何倍増加したかを判定した。免疫化血清は、免疫前血清で得られたもののおよそ１３〜１５倍という、失活胞子に対する良好な応答を示した（表１）。
【０１１５】
【表１】
2011512817.tif 000002
【０１１６】
硫酸アンモニウム沈殿、続いてタンパク質Ａカラムクロマトグラフィーにより、抗体を精製した。簡潔には、氷冷飽和硫酸アンモニウムを最終比１：１（５０％の飽和硫酸アンモニウム）まで滴加することにより、抗血清を沈殿させた。この手順を一定攪拌を行いながら氷冷ビーカー内で行った。上清を５０ｍＬ遠心管に移し、４℃で一晩にわたって往復運動ミキサー上に配置した。２℃において１０，０００×ｇで３０分間にわたって、懸濁液を遠心分離した。上清を除去し、ペレットを同容量の脱イオン水に再懸濁した。再懸濁タンパク質を２リットル（Ｌ）のＰＢＳに対して透析した（１２，０００〜１４，０００ＭＷカットオフ透析管）。透析緩衝液を除去し、約２時間後に交換し、かつ約２４時間後に再び交換した。透析の約４８時間後、タンパク質透析物を除去し、０．２２μｍフィルターで濾過した。
【０１１７】
製造者の取扱説明にしたがって、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）からのタンパク質Ａ親和性カラムを使用して、クロマトグラフィーにより、ＩｇＧ画分を濾液から回収した。簡潔には、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｄｅｌ  ＳＣＬ−１０ＡＶＰ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）））を全ての分取クロマトグラフィーの実行に使用した。下記に列挙される抗体の結合及び溶出に使用される溶媒は、結合緩衝液Ａ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．３）及び溶出緩衝液Ｂ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．５）であった。ＭＩＬＬＩ  Ｑ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））を使用して全ての緩衝液を脱イオン水で調製し、０．２２μｍ（孔径）膜フィルターを通して濾過した。サンプル注入に先立ってカラムを結合緩衝液Ａで予め平衡化した。Ｔ＝０分において、サンプル注入ループを介して、抗血清サンプルを手動でカラムに注入した。サンプル注入後、溶媒を以下のようにカラムを通して流した：結合緩衝液ＢをＴ＝０において流速０．６ｍＬ／分で開始；溶出緩衝液ＢをＴ＝２０分において流速１．０ｍＬ／分で開始；及び結合緩衝液ＢをＴ＝６０分において流速１．０ｍＬ／分で開始。各移動相溶媒からのカラム溶出の一部を採取した。精製された抗クロストリジウム・ディフィシル抗体タンパク質が５１分周辺で溶出した。各実行は７０分間の長さであり、その後、ｐＨを変化させるための緩衝液の３回の交換により、第２のピークが透析に現れた。次に、分留を濾過し、貯留し、ＯＤ測定した。２０分で緩衝液を溶出緩衝液に交換した。精製された抗体をＰＢＳに対して透析し、４℃で緩衝液を３回交換した。透析された抗体は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルター（１０，０００分子量カットオフ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））を使用して、濃縮した。
【０１１８】
精製された抗体を、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・スポロゲネス（ＡＴＣＣ  ３５８４）及びバチルス・ズブチリス（ＡＴＣＣ  １９６５９）胞子に対するＥＬＩＳＡにより試験した。クロストリジウム・スポロゲネス及びバチルス・ズブチリス胞子は、Ｐｒｅｓｑｕｅ  Ｉｓｌｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｅｒｉｅ，ＰＡ）から入手した。胞子をコーティング緩衝液で希釈した。種々の胞子濃度（１ｍＬ当たり１０３〜１０５個）のバチルス・ズブチリス、クロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ディフィシルをコーティングし、上記のように行われるＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗体を用いて試験した。抗ウサギＨＲＰ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を使用して、抗原抗体相互作用を検出し、胞子抗体は１ｍＬ当たり１０５個の胞子において、バックグラウンドの約２０倍の応答という、クロストリジウム・ディフィシルとの良好な反応を示し、クロストリジウム・スポロゲネスについてはおよそ２倍という弱い応答を示し、バチルス・ズブチリス胞子についてはバックグラウンドを超える反応を示さなかった（表２を参照されたい）。表２に提示されているデータは、実験の１つからの３つのウェルからの読み取り値の平均であり、少なくとも３つの別個の実験の代表である。
【０１１９】
【表２】
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【０１２０】
（実施例３）
抗体の産生のためのクロストリジウム・ディフィシル胞子特異性タンパク質の選択
クロストリジウム・ディフィシル株６３０の完全ゲノム配列は特定されており、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）、米国国立医学図書館（ＮＬＭ）、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）により保持されているＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースで入手可能である。Ｓｅｂａｉｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ；３８（７）：７７９〜７８６も参照されたい。クロストリジウム・ディフィシルについての全てのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録の徹底的な検索を行い、２つの胞子特異的タンパク質を抗体産生のために採用した。選択されたタンパク質の１つは、仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１（ＹＰ＿００１０８７５０２）であり、これは胞子コート集合体タンパク質Ｈ（ｃｏｔＨ）に対する保存ドメイン（アミノ酸残基９０〜３９３）を示す。もう一方の選択されたタンパク質は、細胞表面タンパク質（推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、ＹＰ＿００１０８７５１７であり、これは、保存ドメインＣＷ＿ｂｉｎｄｉｎｇ＿２（推定細胞壁結合リピート２；１７４〜２６５、２７５〜３６８、３８１〜４６１）及びＡｍｉｄａｓｅ＿３（Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、４９３〜６７３）を有する。ＮＣＢＩから入手可能な及びｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｃｄｄ．ｓｈｔｍｌのｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂで利用可能な保存ドメイン検索ツールを使用して、分析を行った。
【０１２１】
クロストリジウム・ディフィシル６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＹＰ＿００１０８７５０２）は、以下のアミノ酸配列を有する：
【表３】
2011512817.tif 000004
【０１２２】
Ｓｅｂａｉｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ；３８（７）：７７９〜７８６、及び、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｉｄ＝１２６６９８６０５のｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂも参照されたい。
【０１２３】
クロストリジウム・ディフィシル６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ細胞表面タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＹＰ＿００１０８７５１７）は、以下のアミノ酸配列を有する：
【表４】
2011512817.tif 000005
【０１２４】
Ｓｅｂａｉｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ；３８（７）：７７９〜７８６、及び、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｉｄのｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｗｅｂも参照されたい。
【０１２５】
（実施例４）
仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１に対するＧＡＴポリクローナル抗体
Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（ＳＤＩ）（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）が商標を有するＧｅｎｏｍｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（ＧＡＴ）を使用して、仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１に対するポリクローナル抗体を産生した。このタンパク質からの独自のアミノ酸配列を同定し、この配列情報をＳＤＩが商標を有するプラスミドベクターに配置した。このベクターをマウスに導入した。この技術を用いると、宿主動物の細胞はプラスミドを取り込む。これらの細胞中で免疫原を合成し、宿主細胞により分泌させ、免疫系により直ちに認識させ、発現タンパク質配列に対するポリクローナル抗体の産生を導く。ＧＡＴを使用すると、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を顕色させることができる。自然のタンパク質合成機序を使用して、タンパク質免疫原を宿主動物内で産生する。免疫原は実験室では合成も精製も行われないので、変性又は劣化の機会を有さない。天然免疫原が免疫系に直ちに提供され、成熟した抗体反応が生じる。
【０１２６】
ポリクローナル抗体産生に使用される仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のタンパク質配列は残基５０５〜６０４であり、以下のアミノ酸配列を有した：
【表５】
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【０１２７】
２匹の免疫化マウスからの血清を貯留し、ウエスタンブロットにより免疫原に対して試験して抗体の特異性を判定した。その後、実施例２に記載のように、硫酸アンモニウム沈殿、続いてタンパク質Ａカラムクロマトグラフィーにより、抗体を精製した。
【０１２８】
まず、種々の胞子濃度（１ｍＬ当たり１０３〜１０５個）のバチルス・ズブチリス、クロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ディフィシルをコーティングし、抗体を用いて試験した。抗マウスＨＲＰ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を使用して、抗原抗体相互作用を検出した。仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１（配列番号２）に対するマウス抗体は、１ｍＬ当たり１０５個の胞子において、バックグラウンドの約１０倍増加した応答を示し、クロストリジウム・スポロゲネス胞子については弱い応答（約２倍）を示し、バチルス・ズブチリス胞子についてはバックグラウンドを超える反応を示さなかった（表３を参照されたい）。表３に提示されたデータは、３つのウェルの読み取り値の平均であり、２つの別個の実験の代表である。
【０１２９】
【表６】
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【０１３０】
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、抗体を更に試験した。プレートをポリクローナルＣＤ１０２１抗体でコーティングし、その後、胞子（バチルス・ズブチリス、クロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ディフィシル）を結合させた。上記実施例２からの抗クロストリジウム・ディフィシル失活胞子抗体を二次抗体として、その後、抗ウサギＨＲＰ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、抗原抗体相互作用を検出した。バチルス・ズブチリス、クロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ディフィシルの胞子を種々の濃度で使用したが、抗体はクロストリジウム・ディフィシル胞子の検出に特異的である。それらの結果を下記の表４に示す。
【０１３１】
サンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルにおいて、精製されたマウスＣＤ１０２１抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で抗原コーティング緩衝液に希釈した。１００μＬの抗体溶液をＥＬＩＳＡプレート（ＥＬＩＳＡ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｔｅ）（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））のウェルに加えた。プレートをＰａｒａｆｉｌｍで覆い、４℃で１５〜１６時間にわたってインキュベートした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で４回洗浄した。室温（ＲＴ）で振盪しながら２時間にわたって１００μＬのブロッキング緩衝液でプレートをブロックした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で４回洗浄し、ブロッキング緩衝液中のクロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・スポロゲネス及びバチルス・ズブチリス（１ｍＬ当たり１０３個、１０４個及び１０５個の胞子を１００μＬ）の胞子溶液を加えた。対照ウェル用に、１００μＬのブロッキング緩衝液を加えた。ＲＴで２時間にわたってインキュベートした後、プレートを空にし、洗浄緩衝液で４回洗浄し、ＲＴで振盪しながら１時間にわたってブロッキング緩衝液中の二次抗体（抗ウサギクロストリジウム・ディフィシル胞子抗体、実施例２に記載）１００μＬでインキュベートした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で４回洗浄し、ＲＴで振盪しながら１時間にわたってＨＲＰ標識を有する二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰ複合体；１：１０，０００希釈（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））１００μＬをインキュベートした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。５０μＬの基質溶液（１−ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ））を各ウェルに加え、ＲＴで１５〜３０分間にわたって振盪しながらインキュベートした。５０μＬの反応停止液（１．５Ｍのリン酸）を加えることにより着色を停止させ、各プレートの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。吸光度を対照に対して比較し、標的について信号が何倍増加したかを判定した（表４を参照されたい）。表４に提示されたデータは、３つのウェルの読み取り値の平均であり、２つの別個の実験の代表である。
【０１３２】
【表７】
2011512817.tif 000008
【０１３３】
（実施例５）
仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１ペプチドに対するポリクローナル抗体
２つの独自のアミノ酸配列を仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１から同定した。タンパク質及びＤＮＡデータベース両方の検索は、両方の配列がクロストリジウム・ディフィシルに特異的であり、バチルスなどの他の細菌と相同性を有さないことを示した。これらの２つの配列は以下のものである：
【表８】
2011512817.tif 000009
【０１３４】
これらのペプチドは、Ｎ末端に遊離システインを有して合成され、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合されて、高い力価の抗体を誘発した。Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）による抗原を用いる標準的なプロトコルにしたがって、２つのＫＬＨ結合ペプチドの各々を別々に使用して、２個体のウサギを免疫化した。簡潔には、１ｍＬのＣＦＡと共にＫＬＨ結合ペプチド（０．５ｍｇ／ｍＬ）を最初に注射し、その後、１ｍＬのＩＦＡと共にＫＬＨ結合ペプチド（０．２５ｍｇ／ｍＬ）を４回追加した。
【０１３５】
各免疫付加後に血液を採取し、各ペプチドを使用してＥＬＩＳＡにより血清を試験した。出血３及び４は、免疫前血清のおよそ５〜７倍の応答の、ペプチドに対する良好な応答を示した（表５）。
【０１３６】
【表９】
2011512817.tif 000010
【０１３７】
実施例２に記載のように、硫酸アンモニウム沈殿、続いてタンパク質Ａカラムクロマトグラフィーにより、出血３及び４からの血清を精製した。精製した抗体をＥＬＩＳＡによりプレート結合ペプチドへの結合について試験した。
【０１３８】
１μｇ／ｍＬの濃度で抗原コーティング緩衝液にペプチドを希釈した。１００μＬのペプチド溶液をＥＬＩＳＡプレート（ＥＬＩＳＡ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｔｅ）（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））のウェルに加えた。対照ウェルに１００μＬのコーティング緩衝液を加えた。プレートをＰａｒａｆｉｌｍで覆い、４℃で１５〜１６時間にわたってインキュベートした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。室温（ＲＴ）で振盪しながら２時間にわたって１００μＬのブロッキング緩衝液でプレートをブロックした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＲＴで振盪しながら１〜２時間にわたってブロッキング緩衝液中の一次抗体１００μＬをインキュベートした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＲＴで振盪しながら１時間にわたってＨＲＰ標識を有する二次抗体（１：１０，０００希釈）１００μＬをインキュベートした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。５０μＬの基質溶液（１−ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ））を各ウェルに加え、ＲＴで１５〜３０分間にわたって振盪しながらインキュベートした。５０μＬの反応停止液（１．５Ｍのリン酸）を加えることにより着色を停止させ、各プレートの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。吸光度を対照に対して比較して、標的について信号が何倍増加したかを判定した。
【０１３９】
種々の胞子濃度（１ｍＬ当たり１０３〜１０５個）のバチルス・ズブチリス、クロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ディフィシルをコーティングし、抗体を用いて試験した。抗ウサギＨＲＰ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を使用して抗原抗体相互作用を検出し、抗体はクロストリジウム・ディフィシル胞子の検出に特異的であり、クロストリジウム・ディフィシル胞子についてバックグラウンドの６〜１０倍の応答を示した（表６を参照されたい）。表６に提示されたデータは、３つのウェルの読み取り値の平均であり、少なくとも３つの別個の実験の代表である。
【０１４０】
【表１０】
2011512817.tif 000011
【０１４１】
（実施例６）
推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ細胞表面タンパク質に対するＧＡＴポリクローナル抗体
Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）が商標を有するＧｅｎｏｍｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（ＧＡＴ）を使用して、推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼタンパク質である細胞表面タンパク質に対するポリクローナル抗体を産生した。実施例４に記載のように、このタンパク質からの独自の配列を同定し、この免疫原をマウス内でｉｎ  ｖｉｖｏで発現させた。発現された免疫原を宿主免疫系により認識させ、発現タンパク質に対するポリクローナル抗体の産生を導く。抗体産生に使用される細胞表面タンパク質（推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）のタンパク質配列は、残基２９４〜３９３であり、以下のアミノ酸配列を有した：ＤＫＮＨＤＶＥＫＶ  ＹＩＴＮＡＮＧＧＥＶ  ＤＡＬＴＩＡＡＫＡＧ  ＱＤＫＱＰＩＩＬＴＤ  ＫＤＳＩＴＤＮＹＫＷ  ＬＫＳＥＤＬＱＮＡＹ  ＦＩＧＧＰＱＭＩＳＴ  ＮＶＩＮＫＶＮＧＩＴ  ＫＤＳＶＴＮＮＲＶＹ  ＧＡＤＲＨＥＴＮＡＮ（配列番号６）。
【０１４２】
血清を免疫化動物から貯留し、ウエスタンブロットにより免疫原に対して試験して抗体の特異性を判定した。その後、硫酸アンモニウム沈殿、続いてタンパク質Ａカラムクロマトグラフィーにより、抗体を精製した。
【０１４３】
まず、種々の未発芽胞子濃度（１ｍＬ当たり１０３〜１０５個）のバチルス・ズブチリス、クロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ディフィシルをコーティングし、抗体を用いて試験した。抗マウスＨＲＰ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を使用して、抗原抗体相互作用を検出した。細胞表面タンパク質（推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）に対する抗体は、クロストリジウム・ディフィシル又は他の胞子といかなる反応も示さなかった。
【０１４４】
種々の発芽溶液を使用して、バチルス・ズブチリス、クロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ディフィシルの胞子を発芽させた。発芽胞子（１ｍＬ当たり１０３〜１０５個）をコーティングし、抗体を用いて試験した。抗マウスＨＲＰ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を使用して、抗原抗体相互作用を検出した。この抗体は発芽クロストリジウム・ディフィシル胞子を検出することができ、バックグラウンドの約６倍の応答を示すが、発芽バチルス・ズブチリス又はクロストリジウム・スポロゲネス胞子を検出できなかった（表７を参照されたい）。表７に提示されたデータは、３つのウェルの読み取り値の平均であり、２つの別個の実験の代表である。
【０１４５】
胞子の発芽は、バチルス・ズブチリス胞子について詳しく研究されてきており、これはＬ−アラニン並びにアスパラギンとグルコースとフルクトースとカリウムイオンとの組み合わせ（「ＡＧＦＫ」）などの特定の発芽因子により発芽するように誘導することができる（Ｍｏｉｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ；４４：５３１〜５５３）。クロストリジウム・ディフィシル胞子を発芽させる最初の試みは、種々の発芽因子（ＡＧＦＫとアラニン及びイノシンとの組み合わせ）を使用することであったが、胞子発芽は効率的ではなかった。クロストリジウム・ディフィシル胞子は、１％のタウロコール酸ナトリウムを添加した栄養培地内で発芽するが（Ｓｏｒｇ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，２００８，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（２００８年２月１日に印刷に先立って公開）ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．０１７６５−０７）、これらの胞子は、酵母抽出物（５ｍｇ／ｍＬ）、Ｌ−システイン（０．１％）及び１％のタウロコール酸ナトリウムを補填したＢｒａｉｎ  Ｂｒａｉｎ−Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎブロス内で発芽した。胞子の発芽に続いて、胞子培養物のＯＤ６００の測定（発芽時にＯＤ６００は減少する）及び位相差顕微鏡検査を行った。前述のようにクロストリジウム・スポロゲネス及びバチルス・ズブチリスの胞子を発芽させた（Ｂｒｏｕｓｓｏｌｌｅ  ｅｔ．ａｌ．，２００２，Ａｎａｅｒｏｂｅ；８：８９〜１００；Ｍｏｉｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ；４４，５３１〜５５３）。
【０１４６】
【表１１】
2011512817.tif 000012
【０１４７】
（実施例７）
細胞表面タンパク質（推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）ペプチドに対するポリクローナル抗体
２つの独自の配列をクロストリジウム・ディフィシルＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼのタンパク質配列から同定し、タンパク質及びＤＮＡデータベースの両方でのＢＬＡＳＴ検索で、これらの配列は、クロストリジウム・ディフィシルに特異的であり、バチルスなどの他の細菌と相同性を有さなかった。
ペプチド１  ＹＫＬＫＤＫＮＧＧＴＴＫＴＶＡ（配列番号７）（アミノ酸残基５８２〜５９６）
ペプチド２  ＫＦＫＥＫＰＤＡＤＳＩＫＬＫＹ（配列番号８）（アミノ酸残基６４〜７８）
これらのペプチドは、Ｎ末端に遊離システインを有して合成され、ＫＬＨに結合されて、高い力価の抗体を誘発した。両方のＫＬＨ結合ペプチドを組み合わせ、共に使用して、Ａｎｔａｇｅｎｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）による標準的なプロトコルにしたがって、２個体のウサギを免疫化した。最後の免疫付与の１０日後に、ウサギから血液を採取し、３７℃で一晩にわたって凝固及び退縮させた。次に、凝固した血液を２４時間にわたって冷蔵し、血清をデカントし、２５００ｒｐｍで２０分間にわたって遠心分離することにより清澄化した。これらのペプチドに対して免疫前の及び免疫化した血清を用いて、最初のＥＬＩＳＡを行った。これらのペプチドに対して免疫化した血清はペプチドに対して良好な応答を示し、免疫前の血清の約７〜１０倍の応答を示した（表８）。
【０１４８】
【表１２】
2011512817.tif 000013
【０１４９】
実施例２に記載のように、硫酸アンモニウム沈殿、続いてタンパク質Ａカラムクロマトグラフィーにより、抗体を精製した。精製された抗体をＥＬＩＳＡにより試験した。まず、種々の未発芽胞子濃度（１ｍＬ当たり１０３〜１０５個）のバチルス・ズブチリス、クロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ディフィシルをコーティングし、抗体を用いて試験した。抗ウサギＨＲＰ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を使用して、抗原抗体相互作用を検出した。細胞表面タンパク質（推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）に対する抗体は、クロストリジウム・ディフィシル又は他の胞子といかなる反応も示さなかった。種々の発芽溶液を使用して、バチルス・ズブチリス、クロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ディフィシルの胞子を発芽させた。発芽胞子（１ｍＬ当たり１０３〜１０５個）をコーティングし、抗体を用いて試験した。抗ウサギＨＲＰ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を使用して、抗原抗体相互作用を検出した。この抗体は発芽クロストリジウム・ディフィシル胞子を検出することができ、バックグラウンドの約６倍の応答を示すが、バチルス・ズブチリス又はクロストリジウム・スポロゲネス発芽胞子を検出できなかった（表９を参照されたい）。表９に提示されたデータは、３つのウェルの読み取り値の平均であり、２つの別個の実験の代表である。
【０１５０】
【表１３】
2011512817.tif 000014
【０１５１】
（実施例８）
クロストリジウム・ディフィシル胞子の検出のためのクロストリジウム・ディフィシル共通抗原に対するポリクローナル抗体
市販のウサギクロストリジウム・ディフィシル共通抗原（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｃｏ，ＭＥ））は、毒素産生性及び非毒素産生性株の両方と反応し、クロストリジウム・ディフィシルの栄養細胞を検出するのに使用される。この実施例では、市販のウサギクロストリジウム・ディフィシル共通抗原抗体をＥＬＩＳＡによるクロストリジウム・ディフィシル胞子の検出のために試験した。硫酸アンモニウム沈殿、続いてタンパク質Ａカラムクロマトグラフィーにより、抗体を精製した。種々の胞子濃度（１ｍＬ当たり１０３〜１０５個）のバチルス・ズブチリス、クロストリジウム・スポロゲネス及びクロストリジウム・ディフィシルをプレートにコーティングし、抗体を用いて試験した。抗ウサギＨＲＰ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を使用して、抗原抗体相互作用を検出した。共通抗原抗体はクロストリジウム・ディフィシル胞子と良好な反応を示し（１ｍＬ当たり１０４個の胞子においてバックグラウンドの約１０倍の応答、及び１ｍＬ当たり１０５個の胞子においてバックグラウンドの約１８倍の応答）、クロストリジウム・スポロゲネス胞子については弱い応答を示し（バックグラウンドの約２倍の応答）、バチルス・ズブチリス胞子についてはバックグラウンドを超える反応を示さなかった（表１０を参照されたい）。表１０に提示されたデータは、３つのウェルの読み取り値の平均であり、少なくとも３つの別個の実験の代表である。この抗体は、サンドイッチＥＬＩＺＡアッセイにおける捕捉抗体として使用され得る。
【０１５２】
【表１４】
2011512817.tif 000015
【０１５３】
（実施例９）
栄養細胞に対するクロストリジウム・ディフィシル抗体の結合
失活胞子に対するウサギポリクローナル抗体（実施例２により詳細に記載）、ＣＤ１０２１配列配列番号３に対するウサギポリクローナル抗体（実施例５により詳細に記載）、２つのアミダーゼペプチド配列番号７及び配列番号８に対するウサギポリクローナル抗体（実施例７により詳細に記載）、及び、市販の抗ＧＤＨ抗体（実施例８により詳細に記載）をクロストリジウム・ディフィシルの栄養細胞への結合についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。嫌気性条件下で１６〜１８時間にわたってクロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ株４３５９４、４３５９６及び４３６０３をチオグリコレート培地内で成育させた。これらの細胞を抗原コーティング緩衝液で系列希釈し、１００μＬの種々の希釈物をＥＬＩＳＡプレートに加え、プレートを嫌気性条件下において３７℃で１時間にわたってインキュベートして、胞子形成を防止した。プレートを空にし、洗浄緩衝液で３回洗浄し、嫌気性条件下において３７℃で１時間にわたってブロッキング緩衝液でブロックした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＲＴで１時間にわたって一次抗体をインキュベートした。プレートを空にし、洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＲＴで１時間にわたってＨＲＰ標識を有する二次抗体（１：１０，０００）をインキュベートした。プレートを洗浄し、基質を加えて顕色させ、反応停止液を加えた後でプレートを４５０ｎｍで読み取った。失活胞子、ＣＤ１０２１（配列番号３）及びアミダーゼ（配列番号７及び配列番号８）に対するウサギポリクローナル抗体は、栄養細胞（１ｍＬ当たり約１０３〜１０７個の細胞）とのいかなる結合も示さなかった。しかしながら、市販の抗ＧＤＨ抗体は、１ｍＬ当たり約１０７個の細胞において、対照の４倍の信号増加という、良好な結合を示した（表１１を参照されたい）。表１１に提示されたデータは、３つのウェルの読み取り値の平均であり、２つの別個の実験の代表である。
【０１５４】
【表１５】
2011512817.tif 000016
【０１５５】
（実施例１０）
クロストリジウム・ディフィシル胞子検出のための側方流動装置における抗体の使用
上記実施例に記載の種々の抗体をＣｙ３（Ｃｙ３Ａｂ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））で標識し、クロストリジウム・ディフィシル胞子検出能力について試験した。特に、失活胞子に対するウサギポリクローナル抗体（実施例２により詳細に記され、表１２では「胞子」抗体と呼ぶ）、ＣＤ１０２１配列配列番号３に対するウサギポリクローナル抗体（実施例５により詳細に記され、表１２ではＣＤ１０２１ペプチド１Ａｂと呼ぶ）、２つのアミダーゼペプチド配列番号７及び配列番号８の混合物に対するウサギポリクローナル抗体（実施例７により詳細に記され、表１２ではアミダーゼペプチドＡｂと呼ぶ）、並びにクロストリジウム・ディフィシル・グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ共通抗原に対する市販のウサギ抗体（実施例８により詳細に記され、表１２では「ＧＤＨ」抗体と呼ぶ）を標識し、試験した。
結合パッドとニトロセルロース膜と吸収パッドとを有する典型的な側方流動ストリップを調製した。ニトロセルロース上に抗体をスポッティングし、乾燥させた。クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・スポロゲネス及びバチルス・ズブチリスの発芽及び未発芽胞子（１ｍＬ当たり１０５個）を各々、標識された抗体（１０μｇ／ｍＬのＣｙ３標識抗体５０μＬ）で別個に混合し、結合パッドに適用した。抗体胞子混合物を１０分間にわたって吸い上げさせた。リン酸緩衝生理食塩水を対照として使用した。１０分後、マイクロアレイスキャナー（Ｔｅｃａｎ（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ））を使用して、ストリップをスキャンした。
【０１５６】
クロストリジウム・ディフィシル胞子抗体、アミダーゼ抗体又はＣＤ１０２１抗体を使用する側方流動ストリップは、抗体がクロストリジウム・ディフィシル胞子の検出に特異的であることを示した。アミダーゼ抗体は未発芽胞子を検出しなかったが、発芽胞子を検出することができた。これらの観察に基づき、クロストリジウム・ディフィシル胞子検出のための側方流動ストリップを設計することができる。例えば、標識されたＧＤＨ抗体は検出試薬として、胞子抗体又はＣＤ１０２１抗体は未発芽胞子を検出するための捕捉試薬として、及びアミダーゼ抗体は発芽抗体を検出するための捕捉試薬として使用され得る。
【０１５７】
表１２に概要が示されているように、抗体の種々の対を、クロストリジウム・ディフィシル胞子を検出するために、胞子又は発芽胞子を検出するために使用することができる。
【０１５８】
【表１６】
2011512817.tif 000017
【０１５９】
（実施例１１）
表面上でのクロストリジウム・ディフィシル胞子の検出
１ｍＬ当たり１０６個のクロストリジウム・ディフィシル胞子１００μＬを無菌アルミニウム試験片（２．５４ｃｍ×７．６２ｃｍ（１”×３”））上に広げ、ＲＴで約１時間にわたって乾燥させた。約５０μＬの無菌ＰＢＳで湿らせた無菌スワブで５〜１０秒間にわたって激しく擦ることにより胞子を回収した。胞子を含有するスワブを１ｍＬのコーティング緩衝液中に浸漬させ、１〜２分間にわたって激しくボルテックス混合した。綿棒を溶液から除去し、胞子の回収をＥＬＩＳＡにより判定した。対照のために、試験片を無菌ＰＢＳを用いて広げ、同様に処理した。表１３に見られるように、クロストリジウム・ディフィシル胞子抗体及びＣＤ１０２１ペプチド１Ａｂは、表面上の胞子の存在を検出することができる。
【０１６０】
【表１７】
2011512817.tif 000018
【０１６１】
（実施例１２）
抗体の抗原アフィニティー精製
特定の抗原に特異的で、他の免疫グロブリンからの架橋反応物質を有さない、抗体の精製は、多くの場合有益である。上記実施例に記載のポリクローナル抗体のいずれかは、ＮＨ２連鎖を介しての親和性マトリックスへのペプチド又はタンパク質抗原共有結合を使用する親和性クロマトグラフィーにより精製され得る。精製は、カラム中でＡｆｆｙｇｅｌ（Ｂｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））、ＡｍｉｎｏＬｉｎｋ樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））又はＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））などのペプチド／タンパク質結合親和性マトリックスを使用して達成することができる。抗原に特異的である抗体は、カラムに対して結合する。結合しない抗体及び他の血清タンパク質は、カラムを通過する。次に、抗原に結合した抗体をカラムから溶出させる。得られる精製された抗体は、高度に特異的である。
【０１６２】
（実施例１３）
クロストリジウム・ディフィシル仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の追加的領域に対する抗体
実施例４により詳細に記載されている手順にしたがって、マウスポリクローナル及びモノクローナル抗体は、仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１クロストリジウム・ディフィシル株６３０の追加的ポリペプチド配列に対して顕色させることができる。例えば、ＫＳＶＤＬＹＳＤＶＹ  ＩＥＫＹＦＮＲＤＫＶ  ＭＥＶＮＩＥＩＤＥＳ  ＤＬＫＤＭＮＥＮＡＩ  ＫＥＥＦＫＶＡＫＶＴ  ＶＤＧＤＴＹＧＮＶＧ  ＩＲＴＫＧＮＳＳＬＩ  ＳＶＡＮＳＤＳＤＲＹ  ＳＹＫＩＮＦＤＫＹＮ  Ｔ（配列番号９）のアミノ酸配列を有する仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１クロストリジウム・ディフィシル株６３０の残基３０〜１２０を有するポリペプチド、又は、ＶＴＧＤＬＹＫＳＤＥ  ＧＳＳＬＱＹＫＧＤＤ  ＰＥＳＹＳＮＬＩＶＥ  ＳＤＫＫＴＡＤＷＳＫ  ＩＴＫＬＬＫＳＬＤＴ  ＧＥＤＩＥＫＹＬＤＶ  ＤＳＶＬＫＮＩＡＩＮ  ＴＡＬＬＮＬＤＳＹＱ  ＧＳＦＡＨＮＹＹＬＹ  ＥＱＤＧＶＦＳＭＬＰ（配列番号１０）のアミノ酸配列を有する仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１クロストリジウム・ディフィシル株６３０の残基１９４〜２９３を有するポリペプチドを免疫原として使用することができる。ポリクローナル及びモノクローナル抗体はまた、例えば、配列番号９及び配列番号１０の約１０〜２０個のアミノ酸及び約１４個のアミノ酸の断片などの、これらの断片に対して顕色させることができる。
【０１６３】
（実施例１４）
モノクローナル抗体
クロストリジウム・ディフィシル内生胞子に結合するモノクローナル抗体は、様々な既知の方法により産生され得る。モノクローナル抗体は、配列番号１〜１２、１６〜２３、３８及び４５〜５０、並びにこれらの断片のいずれかを抗原として使用して、産生され得る。例えば、実施例４に記載のような仮想上のＣＤ１０２１タンパク質配列配列番号２で、又は、実施例６に記載のような推定アミダーゼタンパク質配列配列番号６で、免疫化されたマウスは、マウスモノクローナル抗体の産生に使用され得る。更に、実施例５に記載のような仮想上のＣＤ１０２１ペプチド配列番号３若しくは配列番号４で、又は、実施例７に記載のような推定アミダーゼペプチド配列配列番号７若しくは配列番号８で、免疫化されたウサギは、ウサギモノクローナル抗体の産生に使用され得る。マウスで開始する従来方法よりもむしろ、Ｅｐｉｔｏｍｉｃが商標を有する、ウサギからモノクローナル抗体を製造するための方法が、使用され得る。抗体製造のための基本原理は、マウスモノクローナルと同一である。ウサギＢ細胞に融合してウサギハイブリドーマ細胞を作ることができる、商標を有するウサギ融合パートナーを使用する。次に、ハイブリドーマをスクリーニングして、特異的及び感応性抗原認識を有するクローンを選択し、抗体を様々な方法を使用して特徴付ける。
【０１６４】
（実施例１５）
Ｂｌａｓｔ解析
仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１のためのクロストリジウム・ディフィシル株６３０タンパク質配列（ＹＰ＿００１０８７５０２）（配列番号１）及び推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ細胞表面タンパク質（ＹＰ＿００１０８７５１７）（配列番号５）をＧｅｎＢａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＰＤＢ配列（ＨＴＧＳ０，１，２、ＥＳＴ、ＧＳＳ、ＳＴＳ、ＰＡＴ、ＷＧＳを除く）で入手可能なおよそ９８８の微生物ゲノム配列に対する相同性について検索した。クロストリジウム・ディフィシル株６３０、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−６６ｃ２６及びクロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８についてのゲノム配列データベースでのみ配列作製における有意な位置合わせ（Ｅ  ｖａｌｕｅは０．０）が発見された。
【０１６５】
クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１。
クロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１（配列番号１）について、有意な相同性（Ｅ  Ｖａｌｕｅは０．０）を有する以下の配列がクロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８で発見された。
【０１６６】
以下のアミノ酸配列を有する、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＺＰ＿０１８０４８４０、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８の仮想上のタンパク質ＣｄｉｆＱ＿０４００１０４８：
【表１８】
2011512817.tif 000019
【０１６７】
以下のアミノ酸配列を有する、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＺＰ＿０１８０４８４１、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８の仮想上のタンパク質ＣｄｉｆＱ＿０４００１０４９：
【表１９】
2011512817.tif 000020
【０１６８】
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＺ＿ＡＡＭＬ０４０００００７の領域４６１８２７〜４６２８２５；以下のヌクレオチド配列を有するクロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８Ｃ＿ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ＿ｂｌｄ４＿ｃｏｎｔ００００７：
【表２０】
2011512817.tif 000021
【０１６９】
ヌクレオチド配列配列番号１３によりコードされたアミノ酸配列は以下である：
【表２１】
2011512817.tif 000022
【０１７０】
並びに、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＺ＿ＡＡＭＬ０４０００００７の領域４６２８２４〜４６３７３２；以下のヌクレオチド配列を有するクロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８＿ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ＿ｂｌｄ４＿ｃｏｎｔ００００７：
【表２２】
2011512817.tif 000023
【０１７１】
ヌクレオチド配列配列番号１４によりコードされたアミノ酸配列は以下である：
【表２３】
2011512817.tif 000024
【０１７２】
クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−６６ｃ２６の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１
クロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１（配列番号１）について、有意な相同性（Ｅ  Ｖａｌｕｅは０．０）を有する１つの配列がクロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−６６ｃ２６で発見された。
【０１７３】
ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＺ＿ＡＢＦＤ０１００００３７の領域１５６９０〜１７５９７の補体；以下のヌクレオチド配列を有するクロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−６６ｃ２６ｃｏｎｔｉｇ００１２２：
【表２４】
2011512817.tif 000025
【０１７４】
ヌクレオチド配列配列番号１５によりコードされたアミノ酸配列は以下である：
【表２５】
2011512817.tif 000026
【０１７５】
図１は、クロストリジウム・ディフィシル株６３０からの仮想上のＣＤ１０２１タンパク質ＹＰ＿００１０８７５０２（配列番号１）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８からのＺＰ＿０１８０４８４０（配列番号１１）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８からのＺＰ＿０１８０４８４１（配列番号１２）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８からのＮＺ＿ＡＡＭＬ０４０００００７の領域４６１８２７〜４６２８２５（配列番号２１）、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８からのＮＺ＿ＡＡＭＬ０４０００００７の領域４６２８２４〜４６３７３２（配列番号２２）及びクロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−６６ｃ２６からのＮＺ−ＡＢＦＤ０１００００３７の領域１５６９０〜１７５９７の補体（配列番号２３）についてのアミノ酸配列間の高度の相同性を示す。コンセンサス配列は、配列番号３８として示される。
【０１７６】
推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ細胞表面タンパク質
クロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ細胞表面タンパク質（配列番号５）について、クロストリジウム・ディフィシル株６３０において有意な相同性（Ｅ  ｖａｌｕｅは０．０）を有する以下の追加的配列が発見された。
【０１７７】
以下のアミノ酸配列を有する、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＹＰ＿００１０８７５１６、クロストリジウム・ディフィシル株６３０の細胞表面タンパク質推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ：
【表２６】
2011512817.tif 000027
【０１７８】
並びに、以下のアミノ酸配列を有するＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＹＰ＿００１０８９２９７（クロストリジウム・ディフィシル６３０の細胞表面タンパク質）：
【表２７】
2011512817.tif 000028
【０１７９】
クロストリジウム・ディフィシル株６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ細胞表面タンパク質（配列番号５）について、クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８において有意な相同性（Ｅ  ｖａｌｕｅは０．０）を有する以下の配列が発見された。
【０１８０】
以下のアミノ酸配列を有する、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＺＰ＿０１８０４３５０（仮想上のタンパク質ＣｄｉｆＱ＿０４００１１３３；クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８）：
【表２８】
2011512817.tif 000029
【０１８１】
以下のアミノ酸配列を有する、ＧＥＮＥＢＡＮＫ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＺＰ＿０１８０４３５１（仮想上のタンパク質ＣｄｉｆＱ＿０４００１１３４；クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８）：
【表２９】
2011512817.tif 000030
【０１８２】
並びに、以下のアミノ酸配列を有する、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＺＰ＿０１８０２２７３（仮想上のタンパク質ＣｄｉｆＱ＿０４００３２４７；クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８）：
【表３０】
2011512817.tif 000031
【０１８３】
本明細書に記載の抗体は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３、並びにこれらの断片のアミノ酸配列の１つ以上に結合し得る。本明細書に記載の抗体は、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５、並びにこれらのポリペプチド断片のゲノムヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の１つ以上に結合し得る。
本明細書に記載のもののいずれかが挙げられるがこれらに限定されない種々の方法のいずれかにより、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３、並びにこれらの断片のアミノ酸配列の１つ以上に結合する抗体は産生され得る。本明細書に記載の種々の方法のいずれかにより、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５、並びにこれらのポリペプチド断片のゲノムヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の１つ以上に結合する抗体は産生され得る。このような任意の抗体は、サンプル中のクロストリジウム・ディフィシル胞子を検出する方法で使用され得る。
【０１８４】
（実施例１６）
クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９からのＣＤ１０２１のクローニング及び配列解析
ＮｈｅＩ部位を有する順方向プライマー（５’−ＴＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＣ−３’）（配列番号２４）、ＸｈｏＩ部位を有する逆方向プライマー（５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＡＴＡＡＡＴＣＴＴＣＴ−３’）（配列番号２５）及び鋳型としてＡＴＣＣ株９６８９からのゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより、ＣＤ１０２１コード配列を増幅した。終止コドンを逆方向プライマーから除去して、配列の末端への６−ＨＩＳタグの付加を促進した。得られた断片寸法は、１９２３塩基対（ｂｐ）であった。
【０１８５】
同様に、ＮｈｅＩ部位を有する順方向プライマー（５’−ＡＣＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＴＴＡＴＡＴＡＧＴ−３’）（配列番号２６）及びＸｈｏＩ部位を有する逆方向プライマー（５’−ＡＣＴＣＴＣＧＡＧＡＧＴＡＴＴＡＴＡＣ  ＴＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡ−３’）（配列番号２７）を用い、鋳型としてＡＴＣＣ株９６８９からゲノムＤＮＡを使用して、クロストリジウム・ディフィシル株６３０におけるＣＤ１０２１のアミノ酸残基３０〜１２０（配列番号９）（本明細書では「断片１」とも呼ぶ）に対応する領域を増幅した。得られた断片寸法は２９４ｂｐであり、ＡＴＧ開始コドンを含んだ。
【０１８６】
ＮｈｅＩ部位を有する順方向プライマー（５’−ＡＡＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＡＣＴＧＧＡＧ  ＡＣＴＴＡＴＡＴＡＡＧＴＣＡ−３’）（配列番号２８）及びＸｈｏＩ部位を有する逆方向プライマー（５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＧＧ  ＴＡＡＣＡ  ＴＡＧＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＡＴ−３’）（配列番号２９）を用い、鋳型としてＡＴＣＣ株９６８９からゲノムＤＮＡを使用して、クロストリジウム・ディフィシル株６３０におけるＣＤ１０２１のアミノ酸残基１９４〜２９３（配列番号１０）（本明細書では「断片２」とも呼ぶ）に対応する領域を増幅した。得られた断片寸法は３２１ｂｐであり、ＡＴＧ開始コドンを含んだ。
【０１８７】
並びに、ＮｈｅＩ部位を有する順方向プライマー（５’−ＧＣＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＧＴＡＡＡＡＣＴＡＴＡＡＡＡＴＣＴＣＡＡ−３’）（配列番号３０）及びＸｈｏＩ部位を有する逆方向プライマー（５’−ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＧＴＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＡＣＴ  ＣＡＣ−３’）（配列番号３１）を用い、鋳型としてＡＴＣＣ株９６８９からゲノムＤＮＡを使用して、クロストリジウム・ディフィシル株６３０におけるＣＤ１０２１のアミノ酸残基５０５〜６０４（配列番号２）（本明細書では「断片３」とも呼ぶ）に対応する領域を増幅した。得られた断片寸法は３２１ｂｐであり、ＡＴＧ開始コドンを含んだ。
【０１８８】
得られたＰＣＲ反応物をアガロースゲル（０．８％）上で泳動させ、期待された寸法の生成物を観察した。製造者の取扱説明にしたがってＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して、ＰＣＲ断片をクローニングした。形質転換したコロニーを採取し、３７℃で１６時間にわたってカナマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を有するＬＢ内で成育させた。Ｑｉａｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用して、これらの培養物からプラスミドを単離し、このプラスミドをＥｃｏＲＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で切断し、アガロースゲルにより分析した。Ｍ１３順方向−２０プライマー（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’）（配列番号３２）及びＭ１３逆方向−２７プライマー（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）（配列番号３３）を用い、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を使用して、挿入物を有するクローンを配列解析した。適切な内部プライマーを使用して、１９２３ｂｐのＣＤ１０２１コード配列の完全配列を入手した。４つのクローニング反応各々についての更なる特徴付けのために３つのクローンを選択した。１９２３ｂｐのＣＤ１０２１コード配列については、３つのクローンは、ｐＣＤ１０２１−１、ｐＣＤ１０２１−２及びｐＣＤ１０２１−３であった。断片１については、３つのクローンは、ｐＣＤ１０２１−Ｆｒ１−１、ｐＣＤ１０２１−Ｆｒ１−２及びｐＣＤ１０２１−Ｆｒ１−３であった。断片２については、３つのクローンは、ｐＣＤ１０２１−Ｆｒ２−１、ｐＣＤ１０２１−Ｆｒ２−２及びｐＣＤ１０２１−Ｆｒ２−３であった。断片３については、３つのクローンは、ｐＣＤ１０２１−Ｆ３−１、ｐＣＤ１０２１−Ｆｒ３−２及びｐＣＤ１０２１−Ｆｒ３−３であった。
【０１８９】
プラスミドｐＣＤ１０２１−２におけるクロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９ＣＤ１０２１断片のヌクレオチド配列は、以下である：
【表３１】
2011512817.tif 000032
【０１９０】
プラスミドｐＣＤ１０２１−２におけるＣＤ１０２１断片の翻訳されたアミノ酸配列は、以下である：
ＭＫＤＫＫＦＴＬＬＩＳＩＭＩＩＦＬＣＡＶＶＧＶＹＳＴＳＳＮＫＳＶＤＬＹＳＤＶＹＩＥＫＹＦＮＲＤＫＶＭＥＶＮＩＥＩＤＥＳＤＬＫＤＭＮＥＮＡＩＫＥＥＦＫＶＡＫＶＴＶＤＧＤＴＹＧＮＶＧＩＲＴＫＧＮＳＳＬＩＳＶＡＮＳＤＳＤＲＹＳＹＫＩＮＦＤＫＹＮＴＳＱＳＭＥＧＬＴＱＬＮＬＮＮＣＹＳＤＰＳＹＭＲＥＦＬＴＹＳＩＣＥＥＭＧＬＡＴＰＥＦＡＹＡＫＶＳＩＮＧＥＹＨＧＬＹＬＡＶＥＧＬＫＥＳＹＬＥＮＮＦＧＮＶＴＧＤＬＹＫＳＤＥＧＳＳＬＱＹＫＧＤＤＰＥＳＹＳＮＬＩＶＥＳＤＫＫＴＡＤＷＳＫＩＴＫＬＬＫＳＬＤＴＧＥＤＩＥＫＹＬＤＶＤＳＶＬＫＮＩＡＩＮＴＡＬＬＮＬＤＳＹＱＧＳＦＡＨＮＹＹＬＹＥＱＤＧＶＦＳＭＬＰＷＤＦＮＭＳＦＧＧＦＳＧＦＧＧＧＳＱＳＩＡＩＤＥＰＴＴＧＮＬＥＤＲＰＬＩＳＳＬＬＫＮＥＴＹＫＴＫＹＨＫＹＬＥＥＩＶＴＫＹＬＤＳＤＹＬＥＮＭＴＴＫＬＨＤＭＩＡＳＹＶＫＥＤＰＴＡＦＹＴＹＥＥＦＥＫＮＩＴＳＳＩＥＤＳＳＤＮＫＧＦＧＮＫＧＦＤＮＮＮＳＮＮＳＤＳＮＮＮＳＮＳＥＮＫＲＳＧＮＱＳＤＥＫＥＶＮＡＥＬＴＳＳＶＶＫＡＮＴＤＮＥＴＫＮＫＴＴＮＤＳＥＳＫＮＮＴＤＫＤＫＳＧＮＤＮＮＱＫＬＥＧＰＭＧＫＧＧＫＳＩＰＧＶＬＥＶＡＥＤＭＳＫＴＩＫＳＱＬＳＧＥＴＳＳＴＫＱＮＳＧＤＥＳＳＳＧＩＫＧＳＥＫＦＤＥＤＭＳＧＭＰＥＰＰＥＧＭＤＧＫＭＰＰＧＭＧＮＭＤＫＧＤＭＮＧＫＮＧＮＭＮＭＤＲＮＱＤＮＰＲＥＡＧＧＦＧＮＲＧＧＧＳＶＳＫＴＴＴＹＦＫＬＩＬＧＧＡＳＭＩＩＭＳＩＭＬＶＧＶＳＲＶＫＲＲＲＦＩＫＳＫ（配列番号４５）。
【０１９１】
プラスミドｐＣＤ１０２１−Ｆｒ１−１におけるクロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９  ＣＤ１０２１断片（３０〜１２０アミノ酸残基）のヌクレオチド配列は、以下である：
【表３２】
2011512817.tif 000033
【０１９２】
プラスミドｐＣＤ１０２１−Ｆｒ１−１におけるＣＤ１０２１断片（３０〜１２０アミノ酸残基）の翻訳されたアミノ酸配列は、以下である：
ＭＫＳＶＤＬＹＳＤＶＹＩＥＫＹＦＮＲＤＫＶＭＥＶＮＩＥＩＤＥＳＤＬＫＤＭＮＥＮＡＩＫＥＥＦＫＶＡＫＶＴＶＤＧＤＴＹＧＮＶＧＩＲＴＫＧＮＳＳＬＩＳＶＡＮＳＤＳＤＲＹＳＹＫＩＮＦＤＫＹＮＴ（配列番号４６）。
【０１９３】
プラスミドｐＣＤ１０２１−Ｆｒ２−１におけるクロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９ＣＤ１０２１断片（１９４〜２９３アミノ酸残基）のヌクレオチド配列は、以下である：
【表３３】
2011512817.tif 000034
【０１９４】
プラスミドｐＣＤ１０２１−Ｆｒ２−１におけるＣＤ１０２１断片（１９４〜２９３アミノ酸残基）の翻訳されたアミノ酸配列は、以下である：
ＭＶＴＧＤＬＹＫＳＤＥＧＳＳＬＱＹＫＧＤＤＰＥＳＹＳＮＬＩＶＥＳＤＫＫＴＡＤＷＳＫＩＴＫＬＬＫＳＬＤＴＧＥＤＩＥＫＹＬＤＶＤＳＶＬＫＮＩＡＩＮＴＡＬＬＮＬＤＳＹＱＧＳＦＡＨＮＹＹＬＹＥＱＤＧＶＦＳＭＬＰ（配列番号４７）。
【０１９５】
プラスミドｐＣＤ１０２１−Ｆｒ３−１におけるクロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９ＣＤ１０２１断片（５０５〜６０４アミノ酸残基）のヌクレオチド配列は、以下である：
【表３４】
2011512817.tif 000035
【０１９６】
プラスミドｐＣＤ１０２１−Ｆｒ３−１におけるＣＤ１０２１断片（５０５〜６０４アミノ酸残基）の翻訳されたアミノ酸配列は、以下である：
ＭＳＫＴＩＫＳＱＬＳＧＥＴＳＳＴＫＱＮＳＧＤＥＳＳＳＧＩＫＧＳＥＫＦＤＥＤＭＳＧＭＰＥＰＰＥＧＭＤＧＫＭＰＰＧＭＧＮＭＤＫＧＤＭＮＧＫＮＧＮＭＮＭＤＲＮＱＤＮＰＲＥＡＧＧＦＧＮＲＧＧＧＳＶＳＫＴＴＴＹＦ（配列番号４８）。
【０１９７】
（実施例１７）
クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９  ＣＤ１０２１クローンの発現
製造者の取扱説明にしたがって制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））を用いて、実施例１６で得られた組み換えプラスミドｐＣＤ１０２１−２と発現ベクターｐＥＴ２１−ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））とを別々に切断した。制限酵素消化ｐＣＤ１０２１−２ＤＮＡをアガロースゲル（０．８％）上で泳動させ、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して完全長ＣＤ１０２１断片をこのゲルから精製した。製造者の取扱説明にしたがってＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、得られた断片（１９１７ｂｐ）を制限酵素消化発現ベクターｐＥＴ２１−ａ（＋）に結合した。
【０１９８】
結合混合物を使用して、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を有するＬＢ寒天培地上にプレーティングした。これらのプレートを３７℃で１２〜１６時間にわたってインキュベートし、組み換えクローンを採取し、３７℃において１６時間にわたってアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を有するＬＢ内で成育させた。アルカリ溶菌プロトコル（Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ））を使用するミニプレップ精製により、これらの培養物からプラスミドを単離し、このプラスミドをＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで切断し、アガロースゲルにより分析した。完全長ＣＤ１０２１挿入物を有するクローンを選択し、製造者の取扱説明にしたがってタンパク質の発現について試験した。
【０１９９】
同様に、実施例１６で得られたクローンＣＤ１０２１−Ｆｒ１−１、ＣＤ１０２１−Ｆｒ２−２及びＣＤ１０２１−Ｆｒ３−１の断片１、断片２及び断片３をＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで制限消化し、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ制限ｐＥＴ２１ａ＋にクローニングした。組み換えクローンを上記のように採取及び分析した。挿入物を有するクローンを選択し、製造者の取扱説明にしたがってタンパク質の発現について試験した。
【０２００】
組み換えクローンをＢＬＲ（ＤＥ３）のコンピテント細胞に形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を有するＬＢ寒天培地上にプレーティングした。このプレートを３７℃で１２〜１６時間にわたってインキュベートした。複数のコロニーを採取し、３７℃で１６時間にわたってアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を有する５ｍＬのＬＢ内で成育した。一晩成育させたクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を有する５ｍＬのＬＢ中に、１：１００に希釈し、０．６〜０．７のＯＤ６００に成育させた。Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ  ＭａｘＱ  ４０００  Ｉｎｃｕｂａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ｓｈａｋｅｒｓ（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｄｕｂｕｑｕｅ，Ｉｏｗａ））を使用して、３７℃又は１５℃のいずれかで３時間にわたって、クローンを０．４ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））で誘導した。
【０２０１】
誘導された細胞を４℃において１０分間にわたって５０００ｒｐｍで回転し、１ｍＬの０．１ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０に再懸濁した。Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ｍｏｄｅｌ  Ｓ−２５０Ｄ（Ｂｒａｎｓｏｎ（Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ））を使用して、０．３１７５ｃｍ（１／８インチ）のテーパ形状のマイクロチップを１０秒間にわたって用いて、細胞を超音波処理し、細胞を溶解させた。細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ゲルをクマシーブルーで染色し、誘導された細胞は、３７℃よりも１５℃において期待分子量の組み換えタンパク質の良好な発現を示した。
【０２０２】
（実施例１８）
クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９からのアミダーゼ（ＣＤ１０３６）のクローニング及び配列解析
ＮｃｏＩ部位を有する順方向プライマー（５’−ＡＡＴＣＣＡＴＧ  Ｇ  ＴＡＡＧＴＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＡＴＡＴＧ−３’）（配列番号３４）、ＸｈｏＩ部位を有する逆方向プライマー（５’−ＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＴＣＣ−３’）（配列番号３５）及び鋳型としてクロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ株９６８９からのゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲにより、推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ細胞表面タンパク質コード配列を増幅した。終止コドンを逆方向プライマーから除去して、配列の末端への６−ＨＩＳタグの付加を促進した。得られた断片寸法は、２０４５ｂｐであった。
【０２０３】
同様に、ＮｃｏＩ部位を有する順方向プライマー（５’−ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＡ−３’）（配列番号３６）及びＸｈｏＩ部位を有する逆方向プライマー（５’−ＴＴＴＣＴＣＧＡＧＧＴＴＴＧＣＡＴＴＴＧ  ＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴ−３’）（配列番号３７）を用い、鋳型としてＡＴＣＣ株９６８９からのゲノムＤＮＡを使用して、クロストリジウム・ディフィシル６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ細胞表面タンパク質のアミノ酸残基２９４〜３９３（配列番号６）に対応する領域を増幅した。得られた断片寸法は３１７ｂｐであり、ＡＴＧ開始コドンを含んだ。
【０２０４】
Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を使用して、得られたＰＣＲ断片をクローニングし、実施例１６に記載の手順を使用して組み換えクローンを配列解析した。２つのクローニング反応について各々３つのクローンを特徴付けた。２０４５ｂｐのＣＤ１０３６コード配列については、３つのクローンは、ｐＣＤ１０３６−１、ｐＣＤ１０３６−２及びｐＣＤ１０３６−３であった。断片１については、３つのクローンは、ｐＣＤ１０３６−Ｆｒ１−１、ｐＣＤ１０３６−Ｆｒ１−２及びｐＣＤ１０３６−Ｆｒ１−３であった。
【０２０５】
プラスミドｐＣＤ１０３６−２におけるクロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９  ＣＤ１０３６断片のヌクレオチド配列は、以下である：
【表３５】
2011512817.tif 000036
【０２０６】
プラスミドｐＣＤ１０３６−２におけるＣＤ１０３６断片の翻訳されたアミノ酸配列は、以下である：
ＭＶＳＫＥＩＮＭＲＲＮＴＫＬＬＴＴＧＩＬＳＭＡＩＶＡＰＴＭＡＦＡＴＥＳＮＡＭＥＮＮＡＤＬＮＩＮＬＥＫＫＳＩＶＬＧＳＫＳＫＶＳＶＫＦＫＥＫＰＤＡＤＳＩＴＬＫＹＫＣＹＤＭＰＬＮＴＴＬＮＹＮＱＳＴＧＡＹＥＧＴＩＮＹＮＱＤＰＥＹＬＮＶＷＥＬＱＧＩＴＩＮＳＫＮＮＨＫＴＬＮＲＱＤＬＥＫＬＧＬＮＬＫＤＹＮＶＴＱＥＣＩＩＥＤＩＴＳＲＫＤＶＮＫＹＬＲＫＴＳＳＰＩＴＥＬＴＧＳＤＲＹＥＴＡＶＫＩＳＫＥＧＷＫＮＧＳＤＫＶＶＩＩＮＧＤＶＳＩＤＧＩＩＳＴＰＬＡＴＴＹＮＡＰＩＬＬＶＥＫＮＮＶＰＮＳＶＫＳＥＬＫＲＬＮＰＫＤＩＩＩＩＧＤＥＮＡＩＳＫＴＴＡＮＱＩＫＳＴＶＮＡＳＱＴＲＬＮＧＳＮＲＹＥＴＳＬＬＩＡＫＥＩＤＫＮＨＤＶＥＫＶＹＩＴＮＡＮＧＧＥＶＤＡＬＴＩＡＡＫＡＧＱＤＫＱＰＩＩＬＴＤＫＤＳＩＴＤＮＴＹＫＷＬＫＳＥＤＬＱＮＡＹＦＩＧＧＰＱＭＩＳＴＮＶＩＮＫＶＮＧＩＴＫＤＳＶＴＮＮＲＶＹＧＡＤＲＨＥＴＮＡＮＶＩＫＫＦＹＴＤＤＥＬＥＡＶＬＶＡＫＳＤＶＬＶＤＡＬＡＡＧＰＬＡＡＮＬＫＳＰＩＬＩＴＰＫＴＹＶＳＡＹＨＫＤＮＬＥＡＫＳＡＮＫＶＹＫＩＧＧＧＬＴＳＫＶＭＳＳＩＡＳＳＬＳＫＨＮＴＴＰＴＥＰＧＮＳＧＧＫＴＶＭＩＤＰＧＨＧＧＳＡＰＧＮＳＳＧＧＭＩＥＫＤＹＮＬＮＴＳＬＡＴＴＥＹＬＲＳＫＧＦＮＶＩＭＴＲＤＴＤＫＴＬＳＬＧＮＲＴＡＬＳＮＳＬＫＰＤＬＦＴＳＩＨＹＮＧＳＴＮＫＱＧＨＧＶＥＶＦＹＫＬＫＤＫＮＧＧＴＴＫＴＶＡＴＮＩＬＮＲＩＬＥＫＦＫＬＴＮＲＧＩＫＴＲＶＬＰＳＤＳＴＫＤＹＬＹＶＬＲＳＮＤＭＰＡＶＬＶＥＣＡＦＬＤＮＥＮＤＭＳＬＩＮＳＳＡＫＶＫＥＭＧＴＱＩＧＫＧＩＥＤＳＬＫ（配列番号４９）。
【０２０７】
プラスミドｐＣＤ１０３６−Ｆｒ１−１におけるクロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９  ＣＤ１０３６断片（２９４〜３９３アミノ酸残基）のヌクレオチド配列は、以下である：
【表３６】
2011512817.tif 000037
【０２０８】
プラスミドｐＣＤ１０３６−Ｆｒ１−１における９６８９  ＣＤ１０３６断片（２９４〜３９３アミノ酸残基）の翻訳されたアミノ酸配列は、以下である：
ＭＤＫＮＨＤＶＥＫＶＹＩＴＮＡＮＧＧＥＶＤＡＬＴＩＡＡＫＡＧＱＤＫＱＰＩＩＬＴＤＫＤＳＩＴＤＮＴＹＫＷＬＫＳＥＤＬＱＮＡＹＦＩＧＧＰＱＭＩＳＴＮＶＩＮＫＶＮＧＩＴＫＤＳＶＴＮＮＲＶＹＧＡＤＲＨＥＴＮＡＮ（配列番号５０）。
【０２０９】
（実施例１９）
クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９アミダーゼクローンの発現
実施例１８で得られた、組み換えプラスミドｐＣＤ１０３６−２からの推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ細胞表面タンパク質の全コード配列及び発現ベクターｐＥＴ２１−ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、実施例１７に記載の手順を使用して、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））で切断し、ｐＥＴ２１−ｄ（＋）にクローニングした。同様に、組み換えプラスミドｐＣＤ１０３６−Ｆｒ−１からのクロストリジウム・ディフィシル６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ細胞表面タンパク質アミノ酸残基２９４〜３９３（配列番号６）に対応する断片を、実施例１７に記載の手順にしたがって、制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｐＥＴ２１−ｄ（＋）にクローニングした。実施例１７に記載のように、組み換えクローンを採取し、分析した。挿入物を有するクローンを選択し、製造者の取扱説明にしたがってタンパク質の発現について試験した。
【０２１０】
組み換えクローンをＢＬＲ（ＤＥ３）のコンピテント細胞に形質転換し、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を有するＬＢ寒天培地上にプレーティングした。実施例１７に記載のように、複数のコロニーを採取し、タンパク質発現について分析した。誘導された細胞は、３７℃よりも１５℃において期待分子量の組み換えタンパク質の良好な発現を示した。
【０２１１】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願及び出版物、並びに電子的に入手可能なマテリアル（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑなどにおけるヌクレオチド配列サブミッション、並びに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどに登録されているアミノ酸配列サブミッション、並びに、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈つきコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、参考として組み込まれる。本出願の開示と本明細書に参考として組み込まれる任意の文書の開示（複数可）との間にいずれかの不一致が認められる場合にも、本出願の開示が優先される。前述の詳細な説明及び実施例は理解を明確化するためにのみ提示されている。それらから無用の限定を解するべきでない。本発明は、示され記載された厳密な詳細事項に限定されるべきではないが、それは当業者に対して明らかな変形が、特許請求の範囲において規定された本発明の範囲に包含されるからである。
【０２１２】
特に指示がない限り、明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される成分の量、分子量を表す全ての数は、全ての例において、「約」という用語により修正されることを理解されたい。したがって特に指示がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明が実現しようとする所望の性質に応じて変化し得るおおよその値である。最低限でも、また特許請求の範囲と等価物の原則を制限しようとするものではないが、それぞれの数値パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数値を考慮して、通常の数値のまるめ方を適用することによって解釈されるべきである。
【０２１３】
本発明の広範囲で示す数値的範囲及びパラメータは概算値であるが、具体例に記載の数値は可能な限り正確に報告する。しかしながら、全ての数値は、それらの試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じる一定の範囲を本質的に含有するものである。
【０２１４】
全ての見出しは読者の利便性のためであって、特に指示がない限り、見出しの後に続く文面の意味を制限するために使用しているのではない。
【配列表フリーテキスト】
【０２１５】
配列番号１  クロストリジウム・ディフィシル株６３０の仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１
配列番号２  仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の残基５０５〜６０４
配列番号３  仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の残基２０３〜２１７
配列番号４  仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の残基３３３〜３４７
配列番号５  クロストリジウム・ディフィシル６３０の推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ
配列番号６  推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼの残基２９４〜３９３
配列番号７  推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼの残基５８２〜５９６
配列番号８  推定Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼの残基６４〜７８
配列番号９  仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の残基３０〜１２０
配列番号１０  仮想上のタンパク質ＣＤ１０２１の残基１９４〜２９３
配列番号１１〜１２  クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８のゲノムのコードされたアミノ酸配列
配列番号１３〜１４  クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８からのゲノム配列
配列番号１５  クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−６６ｃ２６からのゲノム配列
配列番号１６〜１７  クロストリジウム・ディフィシル株６３０のゲノムのコードされたアミノ酸配列
配列番号１８〜２０  クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８のゲノムのコードされたアミノ酸配列
配列番号２１  クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８の翻訳されたアミノ酸配列
配列番号２２  クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−３２ｇ５８ゲノム配列の翻訳されたアミノ酸配列
配列番号２３  クロストリジウム・ディフィシルＱＣＤ−６６ｃ２６の翻訳されたアミノ酸配列
配列番号２４〜３７  合成オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８  コンセンサス配列
配列番号３９〜４４  クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９からのゲノム配列
配列番号４５〜５０  クロストリジウム・ディフィシルＡＴＣＣ  ９６８９の翻訳されたアミノ酸配列
【図１−１】
2011512817.tif 000038
【図１−２】
2011512817.tif 000039
【配列表】
2011512817000001.app
【国際調査報告】
2011512817.tif 000040
2011512817.tif 000041