(57)【要約】【課題】過剰増殖性細胞によって引き起こされる疾病の治療に用いることができ、また、健全な組織を電離放射線から保護する銅有機複合体及びそれを含む医薬組成物を提供する。【解決手段】銅有機複合体は、銅(II)アシレートと4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-D,L-フェニルアラニン(サルコリシン)、その塩酸塩、N-(2-フラニジル)-5-フルオロウラシル(テガフール)及びアミノカルボニルアジリジン(レアカジン)より選ばれる有機化合物とをクロロホルム/メタノール混合物中で酸性pH〜中性pHにおいて反応させることによって調製される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
銅(II)アシレートと4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-D,L-フェニルアラニン(サルコリシン)、その塩酸塩、N-(2-フラニジル)-5-フルオロウラシル(テガフール)及びアミノカルボニルアジリジン(レアカジン)より選ばれる有機化合物とをクロロホルム/メタノール混合物中で酸性pH〜中性pHにおいて反応させることによって得られる銅有機複合体。
【請求項２】
酢酸銅(II)又はプロピオン酸銅(II)が、銅(II)アシレートとして用いられることを特徴とする、請求項1に記載の銅有機複合体。
【請求項３】
クロロホルム/メタノール混合物が、1:1〜3:1の比で用いられることを特徴とする、請求項1又は2に記載の銅有機複合体。
【請求項４】
融点が147℃の銅サルコリシン塩酸塩複合体であり、この複合体が、Cu: 15.0%、C: 37.3% H: 4.43%、Cl: 24.4%、N: 6.74%及び酸素を含み、サルコリシン塩酸塩と酢酸銅(II)とを約2〜約3のpHで反応させることによって調製され、炭素、窒素及び塩素の提示した分析値の偏差が平均して3%未満であり、水素及び銅の提示した分析値の偏差が平均して4.5%までであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の銅有機複合体。
【請求項５】
融点が177℃の銅サルコリシン複合体であり、この複合体が、Cu: 9.2%、C: 45.3%、H: 5.4%、Cl: 20.6%、N: 8.1%及び酸素を含み、サルコリシンと酢酸銅(II)とを約6〜約7のpHで反応させることによって調製され、炭素、窒素及び塩素の提示した分析値の偏差が平均して3%未満であり、水素及び銅の提示した分析値の偏差が平均して4.5%までであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の銅有機複合体。
【請求項６】
融点が127℃の銅テガフール複合体であり、この複合体が、Cu 26.8%、C: 炭素18.16%、水素3.08%、塩素25.3%、窒素3.39%、酸素及びフッ素を含み、テガフールと酢酸銅(II)をpH約1で反応させることによって調製され、炭素、窒素及び塩素の提示した分析値の偏差が平均して3%未満であり、水素及び銅の提示した分析値の偏差が平均して4.5%までであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の銅有機複合体。
【請求項７】
請求項1〜6いずれか1項に記載の少なくとも1つの銅有機複合体を含み、必要により医薬補助剤及び/又は賦形剤を含んでいてもよい医薬組成物。
【請求項８】
請求項1〜6いずれか1項に記載の少なくとも1つの銅有機複合体及び少なくとも1つのそれ自体では既知の細胞増殖抑制剤を含み、必要により医薬補助剤及び/又は賦形剤を含んでいてもよい組み合わせ製剤。
【請求項９】
腫瘍疾患の治療及び/又は電離放射線から健全な組織の保護のための請求項1〜6のいずれか1項に記載の銅有機複合体。
【請求項１０】
放射線治療で使用するための請求項9に記載の銅有機複合体。
【請求項１１】
悪性細胞の生体内検出のための請求項1〜6のいずれか1項に記載の銅有機複合体。
【請求項１２】
腫瘍疾患の治療及び/又は電離放射線から健全な組織の保護のための請求項8に記載の組み合わせ製剤。
【請求項１３】
銅有機複合体の調製方法であって、銅(II)アシレートを4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-D,L-フェニルアラニン(サルコリシン)、その塩酸塩、N-(2-フラニジル)-5-フルオロウラシル(テガフール)及びアミノカルボニルアジリジン(レアカジン)より選ばれる有機化合物とクロロホルム/メタノール混合物中で酸性pH〜中性pHにおいて反応させることを特徴とする、前記方法。
【請求項１４】
銅(II)アシレート及び4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-D,L-フェニルアラニン(サルコリシン)、その塩酸塩、N-(2-フラニジル)-5-フルオロウラシル(テガフール)及びアミノカルボニルアジリジン(レアカジン)より選ばれる有機化合物を各々クロロホルム/メタノール混合物に溶解し、合わせ、必要な場合には酸性にし、少なくとも50℃の温度に加熱し、必要な場合には冷却後に得られた沈澱を洗浄し、乾燥することを特徴とする、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
クロロホルム/メタノール混合物が1:1〜3:1の比で用いられることを特徴とする、請求項13又は14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銅有機複合体（copper-organic complex）及びそれを含有する医薬組成物に関する。これらは、過剰増殖性細胞によって引き起こされる疾病の治療に用いることができ、また、健全な組織を電離放射線から保護する。これらは、銅(II)アシレートと4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-D,L-フェニルアラニン(サルコリシン)、その塩酸塩、N-(2-フラニジル)-5-フルオロウラシル(テガフール)及びアミノカルボニルアジリジン(レアカジン、leacadin)より選ばれる有機化合物とをクロロホルム/メタノール混合物中で酸性pH〜中性pHにおいて反応させることによって調製される。
【背景技術】
【０００２】
過剰増殖性細胞は、様々な疾病、しばしば致命的な結果を有する、特に“癌”という用語でまとめられる臨床パターンの原因である。過剰増殖は、組織の新しい成長と組織構造における細胞の制御された死との間に平衡異常を生じる。自然ホメオスタシスが妨害される。組織形成と分解との間のこの微妙な均衡は、アポトーシスプロセスによって調節される。アポトーシスは、いかなる細胞によっても行われ得るプログラム細胞死を意味する。特定のシグナルに対する応答として、炎症プロセスを引き起こさずに細胞の自己崩壊を生じる細胞内プロセスが引き金となる。このようにして、細胞や組織の過剰な増殖が防止される。
過剰に増殖する細胞によって引き起こされる疾病の治療において、臨床診療において−局在性腫瘍の外科切除とは別に−腫瘍細胞を破壊し且つ化学療法、放射線治療、温熱療法のような細胞毒性手段によって平衡を取り戻す試みがなされている。しかしながら、幾度となく、悪性腫瘍の一部が非常に早期の段階で放射線抵抗性又は化学抵抗性を生じるか又はそもそも治療に難治性でさえあることが分かった。一次腫瘍や一次転移は、具体的な治療法に対するそれらの応答挙動がしばしば非常に異なる。このような抵抗性の結果として、多くの癌治療は、不充分なままであった。特に、これは、小児急性リンパ性白血病(ALL)の再発の治療にあてはまる。ALLを再発している小児の約60%は、積極的な細胞毒性治療にもかかわらず死亡する。治療が難しい他の腫瘍疾患は、例えば、乳癌、気管支癌、甲状腺癌、前立腺癌だけでなく、メラノーマ、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、グリア芽細胞腫である。同様に、過剰増殖性細胞から生じる良性の疾患は、なお治療効力の実質的な改善が必要である細胞増殖抑制剤で治療されている。
WO 03/004014 A1には、抗腫瘍薬として使用し得るメルファラン、テガフール及びレアカジンの単結晶ジケトン銅複合体がすでに記載されている。また、メルファラン、テガフール及びレアカジン自体は、細胞増殖抑制剤としても知られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、治療上の成功や生存の可能性を改善することができる他の物質の開発に強い関心と大きな要求がある。それ故、本発明は、過剰に増殖性の薬剤耐性細胞に対して高度に選択的な有効性を有し且つ健全な細胞を過度に損傷することなく腫瘍疾患や白血病の治療に適切である化合物を見いだす目的に基づいたものである。本発明の他の目的は、疾病を治療するか又はその進行を遅らせるためにヒトに対する電離放射線の医学的な使用の間、健全な組織を保護する化合物を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の目的は、銅(II)アシレートと有機化合物とをクロロホルム/メタノール混合物中で酸性pH〜中性pHにおいて反応させることによって得ることができる新規な銅有機複合体によって達成される。本発明によれば、有機化合物は、4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-D,L-フェニルアラニン(D,L-メルファラン、サルコリシン)、その塩酸塩、N-(2-フラニジル)-5-フルオロウラシル(テガフール)及びアミノカルボニルアジリジン(2-カルバモイルアジリジン、レアカジン)より選ばれる。好ましい方法において、酢酸銅(II)又はプロピオン酸銅(II)が銅のアシレートとして用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】複合体Aの回折分析。
【図２】複合体AのUV/VISスペクトル。
【図３】複合体AのIRスペクトル。
【図４】複合体AのEPRスペクトル。
【図５】複合体BのUV/VISスペクトル。
【図６】複合体BのIRスペクトル。
【図７】複合体BのEPRスペクトル。
【図８】複合体CのUV/VISスペクトル。
【図９】複合体CのIRスペクトル。
【図１０】複合体CのEPRスペクトル。
【図１１】BJABモックについて複合体AによるDNA断片化。
【図１２】複合体Aと他の細胞増殖抑制剤との間で比較した初代リンパ芽球のDNA断片化。
【図１３】複合体Aによる治療後のBJAB細胞におけるミトコンドリア膜電位の変化。
【図１４】リンパ腫細胞における複合体Aとシタラビンとの相乗効果。
【図１５】経口投与のマウスにおけるヒトリンパ腫細胞(BJAB)に対する複合体Aの効果。
【図１６】複合体Aで治療した場合のウォーカー癌肉腫のEPRスペクトル。
【図１７】ラットにおけるエールリッヒ腹水癌の胸腺リンパ球のNADH状態及びカルシウムホメオスタシスに対する複合体A及び複合体Cの影響。
【図１８】一例としてマウスの脾臓を用いた電離放射線の効果に対する複合体A及び複合体Cの影響。
【図１９】複合体A及び複合体Cの抗酸化剤特性。
【図２０】サルコリシンと比較した複合体AによるシクロスポリンAセンサ孔の誘導。
【図２１】ヒト喉頭癌Hep-2の細胞培養に対する複合体Aの効果(核磁気共鳴)。
【図２２】ヒト乳癌細胞に対する複合体Aの試験管内効果(写真1: 4分間のインキュベーション後; 写真4: 18分間のインキュベーション後; 写真9: 43分間のインキュベーション後)。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の銅有機複合体が過剰に増殖する薬剤耐性細胞に対して高度に選択的であり且つ腫瘍疾患や白血病の治療用に適切であることがわかった。驚くべきことに、これらは、また、放射線損傷から、例えば、腫瘍切除後の放射線治療の間又は照射による腫瘍治療において健全な組織を保護することができるので、放射線治療に使用し得る。更にまた、それ自体では既知の細胞増殖抑制剤と組み合わせた場合に本発明の銅有機複合体が癌の治療の相乗効果を示すことがわかった。更に、本発明の銅有機複合体は、顕著な抗酸化活性を示すので、また、例えば、腫瘍疾患に伴うことがあり得る炎症性疾患の治療において抗酸化剤として使用し得る。
本発明の銅複合体は、好ましくは、出発材料の溶液を混合し且つ加熱することによって調製される。複合体は、冷却時に沈殿し、溶媒としてクロロホルム/メタノール混合物で反復洗浄することによって精製し、その後乾燥される。成功した反応については、酸性から中性環境における狭いpH範囲が維持されなければならない。複合体は、銅が正方晶構造であり且つ有機化合物が酸素及び/又は窒素原子を介して銅に結合されるミクロクリスタリン化合物である。
本発明の方法は、好ましくは、銅(II)アシレート及び4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-D,L-フェニルアラニン(D,L-メルファラン、サルコリシン)、その塩酸塩、N-(2-フラニジル)-5-フルオロウラシル(テガフール)及びアミノカルボニルアジリジン(2-カルバモイルアジリジン、レアカジン)より選ばれる有機化合物が各々クロロホルム/メタノール混合物に溶解されることを特徴とする。合わせた後、この溶液を、必要な場合には酸性にし、50℃の好ましい温度に加熱され、必要により沸騰するまで加熱されてもよい。冷却した後に生じる沈澱を、必要な場合には洗浄し、好ましくは空気中で、乾燥する。クロロホルム/メタノール混合物は、好ましくは1:1〜3:1の比で用いられる。
【０００７】
本発明によれば、好ましくは、下記の銅有機複合体が提供される:
a) 147℃の融点を有する銅サルコリシン塩酸塩複合体(複合体A)、この複合体は、Cu: 15.0%、C: 37.3%、H: 4.43%、Cl: 24.4%、N 6.74%及び酸素を含み、例えば、サルコリシン塩酸塩と酢酸銅(II)をpH約2〜約3で反応させることによって調製される。
b) 177℃の融点を有する銅サルコリシン複合体(複合体B)、この複合体は、Cu: 9.2% C: 45.3% H 5.4% Cl: 20.6% N: 8.1%及び酸素を含み、例えば、サルコリシンと酢酸銅(II)をpH約6〜約7で反応させることによって調製される。
c) 127℃の融点を有する銅テガフール複合体(複合体C)、この複合体は、Cu 26.8%、炭素18.16%、水素3.08%、塩素25.3%、窒素3.39%並びに酸素及びフッ素を含み、例えば、テガフールと酢酸銅(II)を約1のpH値で反応させることによって調製される。
炭素、窒素及び塩素に対して提示した（quoted）分析値の偏差は平均して3%未満であり、水素及び銅に対して提示した分析値の偏差は平均して4.5%までである。
本発明は、また、少なくとも1つの新規な銅有機複合体を含み、必要により医薬補助剤（pharmaceutical adjuvant）及び/又は賦形剤を含んでいてもよい医薬組成物に関する。
医薬組成物は、それ自体では既知の方法に従って調製され、本発明の複合体化合物は、好ましくは、適切な医薬賦形剤と組み合わせて供給される。本組成物における活性物質の含量は、合計混合物の通常は0.1〜99.5wt.%、好ましくは0.5〜95wt.%である。
本発明の医薬組成物は、異なる投与方式で供給され得る。通例、本発明の少なくとも1つの複合体化合物及び混合物又は希釈剤として、例えば、固体、半固体又は液体形態で、又はコーティング剤として、例えば、カプセル、錠剤コーティング、バッグ又は治療的に活性な成分のための他の容器の形で用いられる非毒性の医薬的に許容され得る賦形剤からなる。賦形剤は、例えば、体内の薬剤吸収のための化学伝達物質として、製剤補助剤、甘味剤、風味矯正剤、色素又は防腐剤として使用し得る。
【０００８】
本発明の医薬組成物の投与は、主に、経口、腹腔内、気管内、腹内、静脈内、経皮又は筋肉内又は微小注腸を用いた投与形態である。経肺投与も可能である。
滅菌注射用水性液剤、等張食塩液剤又は他の液剤が医薬組成物の非経口適用に用いられる。
水性懸濁剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム又はアラビアゴム、分散剤や湿潤剤、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート又はレシチン; 防腐剤、例えば、メチルヒドロキシベンゾエート又はプロピルヒドロキシベンゾエート; 香味剤、甘味剤、例えば、サッカロース、シクラミン酸ナトリウム、グルコース、転化糖シロップを含有することができる。
油性懸濁剤は、例えば、ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、ココナツ油又はパラフィン油、増粘剤、例えば、蜜ろう、固形パラフィン又はセチルアルコール、甘味剤、香味剤、又は抗酸化剤も含有することができる。
水分散性散剤や顆粒剤は、本発明の複合体化合物を分散剤、湿潤剤及び懸濁化剤、例えば、上で述べたものとの混合物で含有することができ、必要により、甘味剤、香味剤及び色素と一緒に含有してもよい。
乳剤は、例えば、ピーナッツ油、オリーブ油又はパラフィン油を、乳化剤、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートだけでなく、香味剤や甘味剤に加えて含有することができる。
水性液剤は、防腐剤、例えば、メチルヒドロキシベンゾエート又はプロピルヒドロキシベンゾエート; 増粘剤、香味剤、甘味剤、例えば、サッカロース、シクラミン酸ナトリウム、グルコース、転化糖シロップだけでなく、色素も含有することができる。
【０００９】
オリーブ油、DMSO、トゥイーン60、トゥイーン80、又は生理食塩水は、好ましくは希釈剤や溶媒として用いられる。
例えば、錠剤、コーティング錠剤、カプセル剤、例えば、ゼラチンのもの、分散性散剤、顆粒剤、水性懸濁剤、油性懸濁剤、乳剤、液剤又はシロップ剤は、経口適用に使用し得る。錠剤は、不活性充填剤、例えば、デンプン、ラクトース、ミクロクリスタリンセルロース、グルコース、炭酸カルシウム又は塩化ナトリウム; 結合剤、例えば、デンプンPEG、PVP、ゼラチン、セルロース誘導体、アルギン酸塩又はアラビアゴム; 滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、グリセロールモノステアレート、ステアリン酸、シリコーン油又はタルク; 崩壊剤、風味矯正剤又は色素を含有することができる。
経口適用に対して、医薬組成物は、好ましくは、油中微細分散の形で、又は静注液又は輸液として、又は錠剤の形で用いられる。驚くべきことに、銅有機複合体は経口投与でさえそれらの最大効果を生じ、これは患者にとって取扱いと緩和にかなりの利点を意味する。
有利には、活性物質の医薬製剤は、望ましい投与に調整された単位投与量の形である。例えば、単位投与量は、錠剤、カプセル、坐剤又は適切な容積量の粉末、顆粒、溶液、エマルジョン又は懸濁液又は分散液であり得る。
一般に、本発明の複合体は、0.01〜10mg/kg体重の一日量で投与され、必要により、望ましい結果を達成する複数の単回投与の形で投与されてもよい。単回投与は、1つ又は複数の複合体を0.01〜10mg/kg体重の量で含有する。
本発明の銅複合体は、ほとんど腫瘍組織にのみ蓄積し、更に、脳血液関門を横切ることができることがわかった。その結果として、新規な銅有機複合体は、好ましくは、多くの腫瘍疾患の治療に用いられる。本発明の化合物は、様々な異なる疾患、特に高度に増殖性の細胞から生じる疾患の治療に、例えば、骨髄や他の造血臓器の悪性疾患、白血病、固形腫瘍、上皮性腫瘍、肉腫、皮膚の悪性疾患、やや悪性の疾患の治療に使用し得る。本発明の複合体は癌細胞のアポトーシスを、これらの細胞が従来の治療剤に抵抗しても、強く誘導する。悪性細胞において、これらは、p53タンパク質の発現及びシクロスポリンAポアの開口を誘導する。
【００１０】
例えば、ダウノルビシンやドキソルビシンに抵抗する白血病細胞において、本発明の銅有機複合体は、従来の細胞毒性物質に比べて2〜6倍だけアポトーシスの誘導を増加させる(実施例5及び図12を参照のこと)。
他の好ましい使用は、主に健全な組織を電離放射線から保護する、放射線治療である。放射線治療(放射線医学、放射線療法、放射線腫瘍学とも呼ばれる)は、疾患を治療するか又はその進行を遅らせるためにヒト及び動物に電離放射線の医学的応用を扱う医療分野である。放射線治療の目的は、腫瘍細胞の直接破壊である。放射線治療の分野は、また、放射線増感と腫瘍に対する照射効果を増幅するための薬剤性で物理的な方法を含み(化学放射線療法)、健全な組織の保護基準が考慮される。ガンマ線、Ｘ線制動放射及び電子は、主に電離性高エネルギー放射線として用いられる。また、中性子、プロトン及び重イオンによる治療のための機器が近年構成された。本発明によれば、銅有機複合体は、健全な組織を保護するために用いられ、必要により、周知の放射線治療基準及び手段と組み合わせて用いられてもよい。そのために、本発明の複合体は、上記の投与の形態と用量に従って用いられる。
本発明の他の実施態様において、銅有機複合体は、少なくとも1つの追加細胞増殖抑制剤(腫瘍治療剤)と組み合わせて使用し得る。
より詳しくは、本発明の銅有機複合体化合物は、下記の腫瘍疾患の治療に適切であり、そのために単独で又は放射線治療基準/手段と組み合わせて及び/又は従来の腫瘍物質と組み合わせて用いられる: 腸癌、脳腫瘍、眼腫瘍、膵臓癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、卵巣腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、睾丸癌、腎臓腫瘍、胚細胞腫瘍、肝癌、白血病、悪性リンパ腫、神経腫瘍、神経芽細胞腫、前立腺癌、軟部組織腫瘍、食道癌、不明な原発腫瘍による癌。
【００１１】
好ましい方法において、腫瘍疾患をもつ患者は、医薬組成物によってそれぞれの腫瘍の治療を達成するのに充分な量で投与される。投与される医薬組成物の量は、多くの因子、例えば、個々の銅複合体の選択、必要により他の同時に投与されてもよい医薬品の選択、投与方法(経口、注入、注射等)、腫瘍疾患の種類及び重症度、患者の年齢、体重及び全身状態に左右される。量は、腫瘍疾患の分野における当業者によって容易に決定され、上述の因子が考慮される。通例、銅複合体は、治療の経過で、好ましくは0.01mg/kg患者体重から10mg/kg患者体重まで、より好ましくは0.5〜5mg/kgの範囲にある単回投与で、特に好ましくは0.5〜1.5mg/kg患者体重の用量で投与される。
本明細書に用いられる用語“腫瘍”は、通常は個々の細胞及び組織の機能の異なる顕著な低下と関連がある、組織容積のいかなる局部的増加も、また、正常な増殖調節がもはや適用せず且つ制御されない細胞分裂が起こる細胞、即ち、組織の新生物(例えば、腫れ、芽細胞腫、新生組織形成)もオートロガス組織の自発的で、多様に抑制されず、自律的で且つ不可逆的な過剰増殖の形で包含する。
本明細書に用いられる用語“腫瘍の治療”は、下記の特徴の少なくとも1つを含む: 腫瘍疾患と関連がある症状を緩和すること、腫瘍疾患の重症度を下げること(例えば、腫瘍成長の低下)、腫瘍疾病の状態を安定化すること(例えば、腫瘍成長の阻止)、腫瘍疾患が更に拡散することを防止すること(例えば、転移)、腫瘍疾患の発症又は再発を防止すること、腫瘍疾患の進行を遅らせること(例えば、腫瘍成長の減退)、又は腫瘍疾患の状態を改善すること(例えば、腫瘍のサイズを縮小させること)。
本発明の物質は、調製法、元素分析、融点、UV/VIS、IR、EPR及びNMRのスペクトルによって明確に確認することができる。本発明の複合体は、多くの顕著な特性に注目すべきものであるので、従来の化学療法剤より明らかに優れている。
【００１２】
本発明の銅複合体はほとんど腫瘍組織にのみ蓄積するので、本発明の複合体による治療の副作用は比較的少ない。更に、このことにより、悪性細胞を検出するための本発明の複合体を用いることの可能性が広がる。このように、本発明の複合体と従来法、例えば、蛍光顕微鏡検査法を用いて、当業者に周知の適切な蛍光色素で標識した本発明の複合体を適用する場合に悪性細胞が組織に検出され得る。同様に、悪性細胞は、本発明の複合体を用いて抽出された組織に試験管内に検出され得る。
本発明の複合体は、脳血液関門を横切ることができるので、脳腫瘍の治療にも使用し得る。更にまた、本発明の銅有機複合体の使用により、腫瘍が封入されるので、その外科切除が容易である。
本発明は、また、本発明の銅複合体及びそれ自体では既知の細胞増殖抑制剤、例えば、シタラビン、クラドリビン、エトポシド、フルダラビン又はイダルビシンを含む組み合わせ製剤（combination preparation）に関する。本発明の銅有機複合体の他の利点は、他の従来の細胞増殖抑制剤と組み合わせて用いられる場合、単一製剤を用いたものと比べて有効性の著しい相乗的増加が見られることである。それ故、本発明によれば、銅有機複合体は、従来の細胞増殖抑制剤と組み合わせて用いられる。組み合わせた製剤の2つの成分は、同時に又は順次投与され得る。従来の細胞毒性物質は、好ましくは、アルキル化や架橋している化合物、例えば、ナイトロジェンマスタード誘導体、N-ニトロソ化合物、エチレンイミン(アジリジン)誘導体、白金複合体、細胞増殖抑制抗生物質、例えば、アントラサイクリン、ブレオマイシン及びマイトマイシン; 代謝拮抗薬、例えば、葉酸拮抗薬、ピリミジン類似体やプリン類似体、抗有糸分裂物質、例えば、ビンカアルカロイドやタキサン; ホルモン及び抗ホルモンより選ばれる。
従って、例えば、銅サルコリシン塩酸塩(複合体A)と代謝拮抗薬、即ち、シタラビン(AraC)の組み合わせにより129%だけ有効性が増加することがわかった。この相乗効果が本発明の複合体Aの治療量未満の投与量ですでに生じていることは注目に値する(実施例7及び図14を参照のこと)。
その結果として、本発明の組み合わせ製剤は、腫瘍疾患の治療に理想的に適している。製剤における本発明の複合体の存在のために、放射線治療の間、健全な組織を保護するためにも使用し得る。
図に関連した下記の実施例は、本発明を更に詳細に説明することを意図している。
【実施例】
【００１３】
実施例1
4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-D,L-フェニルアラニン塩酸塩(= サルコリシン塩酸塩)の銅有機複合体(複合体A)の調製
0.0125モルのサルコリシン塩酸塩を1部のメタノールと3部のクロロホルムの50mlの混合物に溶解する(溶液A)。同様に、0.01モルの酢酸銅(II)を50mlの上記溶媒混合物に溶解する(溶液B)。
溶液Bを連続撹拌し且つ沸点まで加熱しながら溶液Aに添加する。この混合物を撹拌しながらもう30分間沸点に保ち、その後室温に冷却する。この混合物のpH値は、2〜3である。
緑色のミクロクリスタリン沈澱が数時間以内に沈降し、これをガラスフリットを用いたろ過によって分離し、上記溶媒混合物で数回洗浄し、65〜70℃で風乾させる。
得られた銅複合体(複合体A)は、ミクロクリスタリン粉末であり、147℃の融点を有する。元素分析により以下の組成が得られる: Cu: 15.0%、C: 37.3%、H: 4.43%、Cl: 24.4%、N: 6.74%、O: 10.3%。
複合体Aの他の物理的性質を図1〜4に示す。
複合体Aは、水及びほとんどの有機溶媒に不溶である。これは、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、植物油に及び適切な乳化剤(トゥイーン60やトゥイーン80)を用いて水性媒体に乳化され得る。これは、酸素にさらされる場合でさえ室温に安定である。
【００１４】
実施例2
4-[ビス(2-クロロエチル)アミノ]-D,L-フェニルアラニン(= サルコリシン)の銅有機複合体(複合体B)の調製
0.0125モルのサルコリシンを3部のクロロホルムと1部のメタノールの50mlの混合物に溶解する(溶液A)。0.01モルの酢酸銅(II)を50mlの上記溶媒混合物に溶解する(溶液B)。
溶液Bを連続撹拌し且つ沸点まで加熱しながら溶液Aに添加する。この混合物を撹拌しながら50℃に約20分間保ち、その後室温に冷却する。この混合物のpH値は、6〜7である。
青色のミクロクリスタリン沈澱が数時間以内に沈降し、これをガラスフリットを用いてろ過し、溶媒で数回洗浄し、65〜70℃で風乾させる。
得られた銅複合体(複合体B)は、ミクロクリスタリン粉末であり、177℃の融点を有する。元素分析により以下の組成が得られる: Cu: 9.2%、C: 45.3%、H: 5.4%、Cl: 20.6%、N: 8.1%、O: 11.6%。
複合体Bの他の物理的性質を図5〜7に示す。
複合体Bは、水及びほとんどの有機溶媒に不溶である。これは、DMSOに溶解し、油に、また、適切な乳化剤(トゥイーン60やトゥイーン80)を用いて水性媒体に分散され得る。
【００１５】
実施例3
5-フルオロ-1-(テトラヒドロ-2-フリル)ウラシル(=テガフール)の銅複合体(複合体C)の調製
変形例1
0.01モルの酢酸銅(II)を50mlのクロロホルムに溶解する(溶液A)。0.02モルのテガフールを1:1の容積比のクロロホルムとメタノールの50mlの混合物に溶解する(溶液B)。
溶液A及びBを水浴中で加熱沸騰させ、連続撹拌しながら合わせ、塩酸で酸性にする。この混合物を溶媒が蒸発するまで開放容器に暗所で放置する。残留物をクロロホルムで洗浄することによって出発材料が含まれず、残りの緑色結晶を風乾させる。
得られた銅複合体(複合体C)は、ミクロクリスタリン粉末であり、127℃の融点を有する。
変形例2
0.01モルの酢酸銅(II)を1:1の容積比の50mlのクロロホルム/メタノールに溶解する(溶液A)。
0.02モルのテガフールを50mlの上記溶媒に溶解する(溶液B)。
この2つの溶液を加熱沸騰させ、溶液Aを連続撹拌しながら溶液Bに添加する。この混合物を沸点にもう30分間保ち、濃HClを計量することによってpH値を1に保持する。反応混合物を室温で蒸発させ、乾燥残留物をメタノールでガラスフリットにより-18℃で3〜4回洗浄する。洗液は本発明の複合体Cを含有し、これはメタノールを蒸発した後に残留物として残っている。
【００１６】
複合体Cの元素分析により、以下の組成が得られる: Cu: 26.8%, C: 18.16%, H: 3.08%, Cl: 25.3%, N: 3.39%。酸素とフッ素は、それぞれ18.2%と2.09%であると定量された。しかしながら、フッ素の分析値は強い変動を受けやすく、酸素の分析値はより低い値の方へ歪められ得る。
複合体Cの他の物理的性質を図8〜10に示す。
複合体Cは、水、生理食塩水、メタノール、エタノール、DMSO、トゥイーン80に易溶である。これは、エーテル及びクロロホルムに不溶である。これは、乾燥空気中室温で安定である。
実施例1、2及び3で指定された分析値は、以下の手順を用いて求められる:
C、H及びNの分析は、FlashEA 1112 CHNS/O 自動元素分析器を用いて同時に行われる。酸素値は、同じ機器で別々に求められ、定量において試料が酸素の不在下に高温で分解され、得られたCOが測定される。有意量の銅が存在すると、酸化物形成の結果として酸素値の歪みが生じることになる。
Cuの定量については、試料を硝酸で分解し、パーキンエルマー製のICP Optima 2100 DV発光分光計を用いた発光分光法によって溶液中でCuを定量する。
塩素は、シュレーディンガーの分解によって得られる溶液中で電位差滴定によって定量する。
フッ素定量については、同様に、物質をシュレーディンガーの分解に供し、その後、溶液をMetrohm製の761 Compact IC Autosamplerイオンクロマトグラフを用いたアニオンクロマトグラフィによって分析する。
提示された分析値の各々は、多くの測定の平均値を表す。C、N及びClの個々の値の偏差は、平均して実測値の3%未満であり、水素及びCuの偏差は、平均して実測値の4.5%までである。フッ素の分析値は、強く変動し、確実な変動範囲を特定することは難しい。
【００１７】
実施例4
アポトーシスの誘導に対する複合体Aの影響 
1×105/mlの濃度のBJAB細胞(リンパ腫細胞系)をDMSOに溶解した複合体Aの増加濃度で処理し、37℃及び5% CO2で72時間インキューベートした。ヨウ化プロピジウム染色後、DNA断片をフローサイトメトリー(FACS分析)を用いて検出した。K0(未処理細胞懸濁液)とDMSOを等価な処理で共に行った。結果を図11に示す。図に示すように、複合体Aは、0.1ミリモルの複合体Aにおいて細胞の43.5%の値に達するアポトーシスの濃度依存的誘導を引き起こしている。
【００１８】
実施例5
一次リンパ芽球における複合体Aの生体外効果 
ALL患者から抽出した後、リンパ芽球を最初に分離し、その後、市販の細胞増殖抑制剤と複合体Aで処理した。NALM-6白血病細胞系を用いた場合常にLC50範囲にあるように濃度を選択した。その後、細胞を37℃及び5% CO2で60時間インキューベートし、その後、ヨウ化プロピジウムで染色し、FACSにおけるフローサイトメトリーを用いて定量した。結果を図12に示す。印象的に示されるように、ダウノルビシン(dauno)とドキソルビシン(doxo)に抵抗する白血病細胞のアポトーシスが誘導されている。約26%であれば、リンパ芽球における複合体Aによるアポトーシスの誘導は、従来の細胞増殖抑制剤シタラビン(ARA-C)、クラドリビン(Cla)、エトポシド(Etop)、フルダラビン(Flu)及びイダルビシン(Ida)と比べて著しく高い。
【００１９】
実施例6
複合体Aによるアポトーシスのシグナルカスケードのミトコンドリア媒介の検出
BJAB細胞を異なる濃度の複合体Aで処理し、ゼロ対照と溶媒対照を共に行った後、細胞を37℃の温度及び5% CO2で48時間インキューベートした。図13は、ミトコンドリア特異的色素JC-1による染色及び色の変化のフローサイトメトリー検出による試験の評価を示す図である。複合体Aによって誘導されるミトコンドリアの膜電位の濃度依存的変化は、細胞の30%を超えて見られる。
【００２０】
実施例7
複合体Aとシタラビン細胞増殖抑制剤の併用投与
組み合わせた製剤は、リンパ腫細胞(BJAB)において従来のシタラビン細胞増殖抑制剤と著しい試験管内相乗効果を示す。インキュベーションは37℃及び5% CO2で48時間行い、ゼロ対照及び溶媒対照も共に行われた。DNA断片化は、ヨウ化プロピジウムで細胞を染色した後にフローサイトメトリーによって求められる。図14は、3回の測定の平均値を示す図である。図に示されるように、アポトーシスの+129%誘導の複合体Aとシタラビンとの有意な相乗効果がある。
【００２１】
実施例8
複合体Aを用いたマウスにおける腫瘍成長の生体内阻止
6匹のSCIDマウスにヒトリンパ腫細胞(BJAB)を植え込んだ。直径5mmの腫瘍が形成した後、マウスをオリーブ油に懸濁された10mg/kgの投与量の複合体Aで経口処理に供した。対照グループは、オリーブ油のみで処理した10匹のマウスからなるものであった。腫瘍成長の著しい阻止は、複合体Aの投与後に見られた。結果を図15に示す。
*は、マン-ホイットニーU検定の有意性(p≦0.05)を示す。
【００２２】
実施例9
マウスにおけるB16メラノーマに対する複合体Aの効果
メラノーマB 16を系C 57Blの20匹のマウスに右側大腿へ皮下注射によって植え込んだ。マウスを各々5匹のマウスの4つのグループに分けた。グループIは、複合体AをDMSOに溶解した7mg/kgの用量で投与し、これは生理食塩水中4%懸濁液で腹内に投与した。腫瘍の移植の行われた3、5、7及び9日後に各投与を行った。
グループIIは、5mg/kgの用量を用いた以外はグループIとして処理した。
グループIIIは、グループIとして処理したが、複合体Aの代わりに5mg/kgの塩酸メルファランを投与した。
グループIVは、未処理のままにした。
表1は、4つのグループの各々における腫瘍の平均質量と容積、腫瘍成長の阻止、平均分裂指数、アポトーシス指数及び骨髄の分裂指数を示すものである。
表1が複合体Aの優れた抗腫瘍作用と骨髄生産の著しく低い阻止を示すことは明らかである。
【００２３】
表1
2011512387.tif 000002
【００２４】
実施例10
経口投与と腹内注射におけるマウスB 16メラノーマに対する複合体Aの効果の比較
メラノーマB 16を系C 57Blの23匹のマウスに右側大腿に皮下注射によって植え込んだ。マウスを各々4〜5匹のマウスの5つのグループに分けた。
グループIは、7mg/kgの用量でオリーブ油中の懸濁液として複合体Aを投与し、これは腫瘍の移植の3、5、7及び9日後に経口投与した。
グループIIは、10mg/kgの用量を用いて3、4、5、6、7、8、9及び10日目に投与された以外はグループIとして処理した。
グループIIIは、15mg/kgの用量を用いた以外はグループIIとして処理した。
グループIVは、複合体AをDMSOに溶解した7mg/kgの用量で腫瘍の移植の3、5、7及び9日後に投与し、そのために溶液を生理食塩水中の4%懸濁液の形で注射によって投与した。
グループVは、処理をしなかった。
実験の16日目にマウスを犠牲にし、調べた。
実験結果を表2にまとめる。図に見られるように、抗腫瘍効果は投与方法から独立している。腫瘍は、グループ3においてさえ完全に消失した。
【００２５】
表2
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【００２６】
実施例11
腹内注射における移植された結腸腺癌腫瘍(AKATOL)に対する複合体Aの効果 
腫瘍細胞の懸濁液をBALB系の15匹のマウスの大腿へ注入した。マウスは、複合体A製剤を5mg/kgの投与量で植込みの4、6、8及び11日後に投与した。
グループIは、DMSOに溶解し且つ生理食塩水中の4%懸濁液に分散した製剤を投与した。
グループIIは、トゥイーン60中の製剤を投与した。
グループIIIは、未処理のままにした。
実験の21日目に、マウスを犠牲にし、調べた。
表3は、結果を示すものである。トゥイーン60における投与は、著しく改善された効果を示している。不活性清浄剤が生物体において複合体Aの改善された分配を生じることは明らかである。
【００２７】
表3
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【００２８】
実施例12
経口投与における移植された結腸腺癌腫瘍(AKATOL)に対する複合体Aの効果
腫瘍細胞を大腿への注射によってBALB系のマウスに移植した。4つのグループの3つは、腫瘍移植の3、4、5、6、7、8、9及び10日後に経口経路でそれぞれの製剤を投与した。
グループI: オリーブ油に懸濁した10mg/kgの複合体A。
グループII: オリーブ油に懸濁した5mg/kgの複合体A。
グループIII: オリーブ油に懸濁した10mg/kgのサルコリシン。
グループIV: 処理しない。
実験の21日目にマウスを犠牲にし、調べた。結果を表4にまとめる。複合体Aは、同様に経口投与のサルコリシン(メルファラン)と比べて著しく増加した有効性を示す。
【００２９】
表4
2011512387.tif 000005
【００３０】
実施例13
エールリッヒ腹水腺癌に対する複合体Aの効果
腫瘍を特定の血統でない白色マウスに腹内に植え込んだ。
グループIは、複合体Aを10mg/kgの用量で腫瘍植込みの3、4、5、6、7、8、9及び10日後にオリーブ油中の懸濁液として経口投与した。
グループIIは、複合体Aの代わりにサルコリシンを用いる以外は同じ処理をした。
グループIIIは、処理をしなかった。
マウスを犠牲にし、腫瘍植込み後の11日目に調べた。
結果を表5にまとめる。
複合体Aは、サルコリシンより著しく良好に腫瘍細胞の増殖を阻止し且つ赤色骨髄細胞の生産を抑制しない。
【００３１】
表5
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【００３２】
実施例14
一例としてウォーカー癌肉腫を用いたヘム鉄のニトロシル複合体の形成に対する複合体Aの影響
悪性細胞の酸素代謝は、これらの細胞におけるNO生産増加によってNOのヘム鉄への結合増加が得られ、それによってその正常機能が妨害されるような方法で影響を受ける。このようなNO結合の形成は、一重線の上に横たわっている特徴的な三重線としてEPRスペクトルに顕在する。
Fe-NO結合の濃度に対する複合体Aの効果は、ラットを用いた実験で調べた。ウォーカー癌肉腫をラットにおいて移植した。移植の17日後、ラットに複合体Aを卵レシチンからのリポソームに懸濁した30mg/kgの用量で腹内に投与した。ラットの一部は、また、グルコース又はグルコースと超音波を投与した。結果を図16にまとめる。図に示されるように、特に高血糖症、特に高血糖症プラス超音波と組み合わせた複合体Aは、Fe-NO結合の濃度を著しく低下させる。
【００３３】
実施例15
ラットにおけるNADH及びカルシウムホメオスタシスに対する及びエールリッヒ腹水癌における胸腺リンパ球及び胸腺に対する複合体Aの効果 
エールリッヒ腹水癌(EACを血統MNRIの白色の雄マウスから、胸腺リンパ球をウィスター系のラットの胸腺から得た。細胞の生命力は、トリパンブルーを用いた生体染色と実験によって試験し、すべての実験において95%以上であると決定された。EAC細胞におけるNADH状態を、それらの蛍光強度に関して評価した。細胞内カルシウム濃度の測定を、クロルテトラサイクリンを用いた標準蛍光方法論に従って行った。蛍光色素No. 1104を用いて膜電位を測定した。NADHは、酸化的リン酸化プロセスにおける電子の供給源である。複合体Aと複合体CがNADH状態及びカルシウム濃度に対して効果を有することがわかった。これらは、20%を超えるまで内因性NADHの量を増加させ、オリゴマイシンに対する応答を低下させる(図17a、17b)。これらの効果は、NAD依存的デヒドロゲナーゼを阻止することに向けられる。結果として、腫瘍細胞の呼吸鎖が阻止される。
更にまた、投与量に左右される複合体A及び複合体Cが、EAC細胞及び胸腺リンパ球におけるサイトゾルカルシウムの濃度を増加させることを証明することは可能である。細胞内カルシウムの濃度は、多くの細胞内プロセスの引き金となる(図17c、17d)。
更に、複合体A及び複合体Cは、胸腺リンパ球の膜電位に対する影響を有する。細胞膜(図17e、17f)の過分極がカルシウムチャネルの開口とミトコンドリア膜の脱分極を誘導することがわかった。
【００３４】
実施例16
複合体A及び複合体Cの放射線防護効果
特定の血統のない白色マウスを、6グレイの致死未満量で照射した。照射2時間前と照射の3日後、マウスの部分を各回5mg/kgの投与量の複合体A及び複合体Cで処理した。照射後9日目にマウスを犠牲にし、脾臓における造血細胞の数を求めた。造血細胞は、未処理マウスの脾臓には検出されなかった。処理マウスは、約40コロニーの正常な数の造血細胞を有した。
図18は、未処理マウスの脾臓と処理されたマウスの脾臓の比較を示す図である。
【００３５】
実施例17
複合体A及び複合体Bの抗酸化剤特性
複合体A及び複合体Cは、反応性酸素種(ROS)の過剰を有する環境における抗酸化剤として顕著な効果を示す。このように、NMRI系の雄マウスから得られる好中球のROS形成は、以下の2つの活性化剤が引き金となった: ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)及びN-ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニン(fMLF)。図19a及び図19bに示されるように、複合体A及び複合体Cの添加は、用量によっては、好中球におけるROSの形成を低下させることができるか又は完全に抑制することができる。図19cは、サルコリシン及びテガフールを用いる場合にこの効果がほとんど達成されないことを示す図である。
【００３６】
実施例18
サルコリシンと比較したラットの肝細胞のミトコンドリア膜の透過性に対する複合体A及び複合体Cの影響 
細胞懸濁液の光学濃度を透過性の指標として測定した。複合体A及び複合体Cが透過性に対して強い影響を有し、シクロスポリンAを添加した場合に停止され、更に複合体の添加時に回復されることがわかった(図20a)。図20bは、サルコリシンがこのような影響を有しないことを示す図である。
複合体A及び複合体Cがミトコンドリア膜の透過性に対して強い影響を有することが求められた。これらは、高透過性まで(1500ダルトンまで)シクロスポリンAセンサ孔を開口する。これらは、不可逆的に膜電位を低下させる。これらは、ミトコンドリアマトリックスの浸透圧浸潤を生じる。これらは、ミトコンドリア膜の破壊に関与する。明らかに、この効果の主な要因は、複合体の中心原子としての銅である。これは、サルコリシン及びテガフールの特性を変えるだけでなく、明らかに単独で生物学的効果も生じる。
【００３７】
実施例19
ヒト喉頭癌のHep-2腫瘍細胞に対する複合体Aの効果
トゥイーン80に溶解した複合体Aをレシチンからのリポソームと混合した。この混合物にHep-2細胞の培養物を添加し、EPRスペクトルを経時記録した。複合体A製剤のない培養物を比較のために測定した。EPRスペクトルは、腫瘍細胞における銅分の定量を可能にする。Hep-2細胞が銅を4.5×1013スピン/グラムの量で吸収することがわかった。これは、細胞において10銅含有分子の取り込みに対応する。細胞のこの飽和値は、1.5〜2時間以内に到達する(図21)。更に、細胞懸濁液はろ過によって精製され、細胞成分を含有するろ液は遠心分離機を用いて分別した。銅のEPRシグナルを測定することによって求められるように、銅複合体が核クロマチンにほとんど完全に蓄積したことがわかった。
【００３８】
実施例20
ヒト乳腺腫瘍細胞に対する複合体Aの試験管内効果 
乳癌がすでに衰退の徴候を示している女性患者から、術後材料を集め、腫瘍細胞をそこから分離した。これらの腫瘍細胞の懸濁液にトリパンブルー色素及び複合体Aを添加した。試験の過程で、互い(A、B及びC)に密接に位置する3つの細胞を写真で記録した(図22a、22b及び22c)。18分間インキューベートした後、細胞Aの膜のしわと細胞Bの膜の陥入が認識され得る。28分間のインキュベーションの後、細胞断片はトリパンブルーで染色される、アポトーシスが開始した徴候。43分のインキュベーション後、膜成分とその内容物が細胞から離れている。
【００３９】
実施例21
サルコリシン(Src)及び未処理対照の作用と比較したヒト乳腺腫瘍細胞に対する複合体A及び複合体Bの試験管内効果
乳癌に罹患している女性患者の手術材料から2つの異なる段階で腫瘍細胞を集めた。腫瘍組織に0.25%トリプシン滅菌溶液を添加し、1500毎分回転数で15分間RPMI-1640栄養培養液中で繰り返し遠心分離した。得られた細胞の量を計数し、腫瘍細胞の懸濁液を等しく5つのグループに分けた。RPMI-1640栄養培養液に12%ウシ胎児血清を添加した。細胞を5% CO2流れの中で37℃において48時間インキューベートした。
これらの製剤を4% DMSOと生理食塩水に溶解し、HClで酸性にした。
異なる段階の腫瘍から誘導される癌細胞を用いて2つの実験を行った。癌の種々の段階を識別するために、腫瘍サイズ(T)、リンパ節作用(N = 結節状態)及び転移の程度(M)を考慮するTNM分類が国際的に用いられている。
実験1: T2N1M0病期
(T2: 5cmまでの腫瘍; N1; 3つのリンパ節に転移; M0:遠隔転移なし)。40,000,000個の細胞を含む懸濁液に50μlの各製剤を添加した。
実験2: T4N2M0病期
(T3:乳房を取り囲む組織へ広がっている大きな腫瘍; N2: 9つまでの腋窩リンパ節転移、M0:遠隔転移なし)。40,000,000個の細胞を含む懸濁液に50μlの各製剤を添加した。
癌細胞をもつ5つのグループは、以下を投与した:
グループI: Scr
グループII: 複合体B
グループIII: 複合体A
グループIV: 対照
製剤を60分間のフローインキュベーションに供した後、トリパンブルー染色細胞が生じ、死細胞とアポトーシスを求めることができた; 死細胞とアポトーシス細胞を時間と形態学的知見の特定の単位で決定した。
【００４０】
実験1
2011512387.tif 000007
【００４１】
実験2
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2011512387.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ−ｂ】
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【図１７ｃ−ｄ】
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【図１７ｅ−ｆ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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2011512387.tif 000034
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