(57)【要約】本発明は、１つ以上のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原を組換えによりコードおよび発現する細菌を使用して、かかる抗原を送達するための組成物および方法を提供する。ある実施形態では、細菌プラットフォームは、リステリア・モノサイトゲネスの弱毒化および不活化されるが代謝的に活性な形態の使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するＴ細胞応答を誘発するための方法であって、前記方法は、
前記対象における前記Ｔ細胞応答を誘発するように選択される条件下で、１つ以上の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドを発現する細菌を含む組成物を、前記対象に投与することを含み、前記アミノ酸配列は、
（ｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂからなる群から選択される、１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質、
（ｉｉ）（ｉ）からの１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質に由来する、１つ以上の免疫原性アミノ酸配列、または、
（ｉ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質と（ｉｉ）の１つ以上のアミノ酸配列との組み合わせ
を含む、方法。
【請求項２】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、全長ＮＳ３、全長ＮＳ５ｂ、ＮＳ３に由来するアミノ酸配列、およびＮＳ５ｂに由来するアミノ酸配列からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、およびＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、およびＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、および８３からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌は、前記細菌のゲノムに組み込まれる前記１つ以上の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、リステリア・モノサイトゲネスである、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌は、ａｃｔＡ欠失突然変異体もしくはａｃｔＡ挿入突然変異体、ｉｎｌＢ欠失突然変異体もしくはｉｎｌＢ挿入突然変異体、またはａｃｔＡ欠失もしくはａｃｔＡ挿入およびｉｎｌＢ欠失もしくはｉｎｌＢ挿入の両方を含むΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドのうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドは、前記細菌の病原性遺伝子に組み込まれており、前記ポリヌクレオチドの前記組み込みが、前記病原性遺伝子の発現を破壊するか、または前記病原性遺伝子のコード配列を破壊する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記病原性遺伝子は、ａｃｔＡまたはｉｎｌＢである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌は、弱毒化リステリア・モノサイトゲネスである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌は、Ｌｍ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌は、前記細菌の核酸を修復する能力を減弱する遺伝子突然変異をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子突然変異は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、およびｒｅｃＡから選択される１つ以上の遺伝子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌は、リステリア・モノサイトゲネスｐｒｆＡ突然変異体であり、そのゲノムは、構成的に活性であるｐｒｆＡタンパク質をコードする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌は、不活化されるが代謝的に活性なリステリア・モノサイトゲネスである、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌は、リステリア・モノサイトゲネスｐｒｆＡ突然変異体であり、そのゲノムは、構成的に活性であるｐｒｆＡタンパク質をコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸配列は、リステリア・モノサイトゲネスによる発現のためにコドン最適化される、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象における前記Ｔ細胞応答を誘発するように選択される前記条件は、前記対象に、経口、筋肉内、静脈内、皮内、および皮下からなる群から選択される１つ以上の投与経路によって、前記リステリア・モノサイトゲネスを投与することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、分泌シグナル配列を含む融合タンパク質として発現される、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記分泌シグナル配列は、リステリア・モノサイトゲネスＡｃｔＡシグナル配列である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０からなる群から選択されるインフレームのＡｃｔＡ−Ｎ１００配列、または前記ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質として発現される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法は、
（ａ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０からなる群から選択されるＡｃｔＡ−Ｎ１００配列、または前記ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
（ｂ）ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、またはＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
（ｃ）ＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、またはＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
を含む融合タンパク質を発現するリステリア・モノサイトゲネスを投与することを含み、前記融合タンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスＡｃｔＡプロモーターに機能可能に結合される核酸配列から発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リステリア・モノサイトゲネスは、配列番号１８もしくは配列番号１９の配列を有するＮＳ５ｂのアミノ酸１〜３４２、またはその突然変異誘導体であって、前記突然変異は、ＮＳ５ｂのＲＮＡポリメラーゼ活性を不活性化させる突然変異誘導体と、配列番号１３もしくは配列番号１４の配列を有するＮＳ３のアミノ酸１７２〜４８４、またはその突然変異誘導体であって、前記突然変異は、ＮＳ３のヘリカーゼ活性を不活性化させる突然変異誘導体と、を含む融合タンパク質を発現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、
（ａ）配列番号７〜２３からなる群から選択されるＨＣＶコンセンサス配列に記載される配列を有する、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂからなる群から選択される１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質、
（ｂ）（ａ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質に由来する１つ以上のアミノ酸配列、または、
（ａ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質および（ｂ）の１つ以上のアミノ酸配列の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、リステリアＡｃｔＡ−Ｎ１００のピーク疎水性を越える疎水性の領域を有さない、１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、１つ以上のＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることが予測される、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードすることが予測されるコア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、１つ以上のＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることが予測される、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂｓのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列と、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードすることが予測される、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列と、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象は、慢性ＨＣＶ感染を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物は、前記対象に送達されると、前記送達の２４時間後に、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、およびＭＣＰ−１からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の血清中濃度の増加を誘発し、前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドのうちの１つ以上に対するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋抗原に特異的なＴ細胞応答を誘発する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
核酸分子を含み、その配列が１つ以上の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドをコードし、そのアミノ酸配列は、
（ｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂからなる群から選択される１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質、
（ｉｉ）（ｉ）からの１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質に由来する１つ以上の免疫原性アミノ酸配列、または、
（ｉ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質および（ｉｉ）の１つ以上のアミノ酸配列の組み合わせを含む、細菌を含む、組成物。
【請求項３２】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、全長ＮＳ３、全長ＮＳ５ｂ、ＮＳ３に由来するアミノ酸配列、およびＮＳ５ｂに由来するアミノ酸配列からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、およびＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、およびＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、および８３からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記細菌は、前記細菌のゲノムに組み込まれる前記核酸配列を含む、リステリア・モノサイトゲネスである請求項３１〜３５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記細菌は、ａｃｔＡ欠失突然変異体もしくはａｃｔＡ挿入突然変異体、ｉｎｌＢ欠失突然変異体もしくはｉｎｌＢ挿入突然変異体、またはａｃｔＡ欠失もしくはａｃｔＡ挿入およびｉｎｌＢ欠失もしくはｉｎｌＢ挿入の両方を含むΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドのうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドは、前記細菌の病原性遺伝子に組み込まれており、前記ポリヌクレオチドの前記組み込みが、前記病原性遺伝子の発現を破壊するか、または前記病原性遺伝子のコード配列を破壊する、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記病原性遺伝子は、ａｃｔＡまたはｉｎｌＢである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記細菌は、弱毒化リステリア・モノサイトゲネスである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４１】
前記細菌は、Ｌｍ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記細菌は、前記細菌の核酸を修復する能力を減弱する遺伝子突然変異をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４３】
前記遺伝子突然変異は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、およびｒｅｃＡから選択される１つ以上の遺伝子である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記細菌は、リステリア・モノサイトゲネスｐｒｆＡ突然変異体であり、そのゲノムは、構成的に活性であるｐｒｆＡタンパク質をコードする、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４５】
前記細菌は、不活化されるが代謝的に活性なリステリア・モノサイトゲネスである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４６】
前記細菌は、リステリア・モノサイトゲネスｐｒｆＡ突然変異体であり、そのゲノムは、構成的に活性であるｐｒｆＡタンパク質をコードする、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記核酸配列は、リステリア・モノサイトゲネスによる発現のためにコドン最適化される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記組成物は、医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項４９】
前記核酸分子は、前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドを、分泌シグナル配列を含む融合タンパク質としてコードする、請求項３１〜３５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記分泌シグナル配列は、リステリア・モノサイトゲネスＡｃｔＡシグナル配列である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記核酸分子は、前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドを、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０からなる群から選択されるインフレームのＡｃｔＡ−Ｎ１００配列、または前記ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質としてコードされる、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記組成物は、核酸分子を含むリステリア・モノサイトゲネスを含み、その配列は、
（ａ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０からなる群から選択されるＡｃｔＡ−Ｎ１００配列、または前記ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
（ｂ）ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、またはＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
（ｃ）ＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、またはＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
を含む融合タンパク質をエンコードし、前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子は、リステリア・モノサイトゲネスＡｃｔＡプロモーターに機能可能に結合される、請求項３１の組成物。
【請求項５３】
前記リステリア・モノサイトゲネスは、核酸分子を含み、その配列は、配列番号１８もしくは配列番号１９の配列を有するＮＳ５ｂのアミノ酸１〜３４２、またはその突然変異誘導体であって、前記突然変異は、ＮＳ５ｂのＲＮＡポリメラーゼ活性を不活性化させる突然変異誘導体と、配列番号１３もしくは配列番号１４の配列を有するＮＳ３のアミノ酸１７２〜４８４、またはその突然変異誘導体であって、前記突然変異は、ＮＳ３のヘリカーゼ活性を不活性化させる突然変異誘導体と、を含む融合タンパク質をコードする、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、
（ａ）配列番号７〜２３からなる群から選択されるＨＣＶコンセンサス配列に記載される配列を有する、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂからなる群から選択される１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質、
（ｂ）（ａ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質に由来する１つ以上のアミノ酸配列、または、
（ａ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質および（ｂ）の１つ以上のアミノ酸配列の組み合わせを含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項５５】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、リステリアＡｃｔＡ−Ｎ１００のピーク疎水性を越える疎水性の領域を有さない、１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項５６】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、１つ以上のＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることが予測される、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項５７】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードすることが予測される、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項５８】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、１つ以上のＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることが予測される、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂｓのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列と、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードすることが予測される、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列と、を含む、請求項３１に記載の組織物。
【請求項５９】
対象におけるＨＣＶ予防または慢性ＨＣＶ感染を治療する方法であって、前記方法は、
前記対象における前記Ｔ細胞応答を誘発するように選択される条件下で、１つ以上の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドを発現する細菌を含む組成物を、前記対象に投与することを含み、そのアミノ酸配列は、
（ｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂからなる群から選択される１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質、
（ｉｉ）（ｉ）からの１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質に由来する１つ以上の免疫原性アミノ酸配列、または、
（ｉ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質と（ｉｉ）の１つ以上のアミノ酸配列との組み合わせ
を含む、方法。
【請求項６０】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、全長ＮＳ３、全長ＮＳ５ｂ、ＮＳ３に由来するアミノ酸配列、およびＮＳ５ｂに由来するアミノ酸配列からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、およびＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６２】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、およびＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、および８３からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記細菌は、前記細菌のゲノムに組み込まれる前記１つ以上の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、リステリア・モノサイトゲネスである、請求項５９〜６３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記細菌は、ａｃｔＡ欠失突然変異体もしくはａｃｔＡ挿入突然変異体、ｉｎｌＢ欠失突然変異体もしくはｉｎｌＢ挿入突然変異体、またはａｃｔＡ欠失もしくはａｃｔＡ挿入およびｉｎｌＢ欠失もしくはｉｎｌＢ挿入の両方を含むΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドのうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドは、前記細菌の病原性遺伝子に組み込まれており、前記ポリヌクレオチドの前記組み込みが、前記病原性遺伝子の発現を破壊するか、または前記病原性遺伝子のコード配列を破壊する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記病原性遺伝子は、ａｃｔＡまたはｉｎｌＢである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記細菌は、弱毒化リステリア・モノサイトゲネスである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記細菌は、Ｌｍ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記細菌は、前記細菌の核酸を修復する能力を減弱する遺伝子突然変異をさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記遺伝子突然変異は、ｐｈｒＢ、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、およびｒｅｃＡから選択される１つ以上の遺伝子である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記細菌は、リステリア・モノサイトゲネスｐｒｆＡ突然変異体であり、そのゲノムは、構成的に活性であるｐｒｆＡタンパク質をコードする、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記細菌は、不活化されるが代謝的に活性なリステリア・モノサイトゲネスである、請求項６４に記載の方法。
【請求項７４】
前記細菌は、リステリア・モノサイトゲネスｐｒｆＡ突然変異体であり、そのゲノムは、構成的に活性であるｐｒｆＡタンパク質をコードする、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記核酸配列は、リステリア・モノサイトゲネスによる発現のためにコドン最適化される、請求項６４に記載の方法。
【請求項７６】
前記対象における前記Ｔ細胞応答を誘発するように選択される前記条件は、前記対象に、経口、筋肉内、静脈内、皮内、および皮下からなる群から選択される１つ以上の投与経路によって、前記リステリア・モノサイトゲネスを投与することを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７７】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、分泌シグナル配列を含む融合タンパク質として発現される、請求項５９〜６３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記分泌シグナル配列は、リステリア・モノサイトゲネスＡｃｔＡシグナル配列である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０からなる群から選択されるインフレームのＡｃｔＡ−Ｎ１００配列、または前記ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質として発現される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記方法は、
（ａ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０からなる群から選択されるＡｃｔＡ−Ｎ１００配列、または前記ＡｃｔＡ−Ｎ１００配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
（ｂ）ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、またはＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
（ｃ）ＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、またはＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
を含む融合タンパク質を発現するリステリア・モノサイトゲネスを投与することを含み、前記融合タンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスＡｃｔＡプロモーターに機能可能に結合される核酸配列から発現される、請求項５９に記載の方法。
【請求項８１】
前記リステリア・モノサイトゲネスは、配列番号１８もしくは配列番号１９の配列を有するＮＳ５ｂのアミノ酸１〜３４２、またはその突然変異誘導体であって、前記突然変異は、ＮＳ５ｂのＲＮＡポリメラーゼ活性を不活性化させる突然変異誘導体と、配列番号１３もしくは配列番号１４の配列を有するＮＳ３のアミノ酸１７２〜４８４、またはその突然変異誘導体であって、前記突然変異は、ＮＳ３のヘリカーゼ活性を不活性化させる突然変異誘導体と、を含む融合タンパク質を発現する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、
（ａ）配列番号７〜２３からなる群から選択されるＨＣＶコンセンサス配列に記載される配列を有する、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂからなる群から選択される１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質、
（ｂ）（ａ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質に由来する１つ以上のアミノ酸配列、または、
（ａ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質および（ｂ）の１つ以上のアミノ酸配列の組み合わせを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項８３】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、リステリアＡｃｔＡ−Ｎ１００のピーク疎水性を越える疎水性の領域を有さない、１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項８４】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、１つ以上のＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることが予測される、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項８５】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードすることが予測される、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項８６】
前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、１つ以上のＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることが予測される、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列と、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードすることが予測される、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂのうちの１つ以上のコンセンサス配列からの１つ以上の連続するＨＣＶアミノ酸配列と、を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項８７】
前記方法は、対象における慢性ＨＣＶ感染の治療する方法である、請求項５９に記載の方法。
【請求項８８】
前記組成物は、前記対象に送達されると、前記送達の２４時間後に、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、およびＭＣＰ−１からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の血清中濃度の増加を誘発し、前記免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドのうちの１つ以上に対するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋抗原に特異的なＴ細胞応答を誘発する、請求項５９に記載の方法。
【請求項８９】
前記方法は、慢性ＨＣＶ感染に罹患していない対象におけるＨＣＶ予防の方法である、請求項５９に記載の方法。
【請求項９０】
請求項３１〜５８のうちのいずれか１項に記載の組成物と、
医薬的に許容される賦形剤医薬組成物と、を含む、医薬組成物。
【請求項９１】
前記細菌は、リステリア・モノサイトゲネスｐｒｆＡ突然変異体であり、ｐｒｆＡ＊突然変異体である、請求項１４または１６に記載の方法。
【請求項９２】
前記細菌は、リステリア・モノサイトゲネスｐｒｆＡ突然変異体であり、ｐｒｆＡ＊突然変異体である、請求項４４または４６に記載の組成物。
【請求項９３】
前記細菌は、リステリア・モノサイトゲネスｐｒｆＡ突然変異体であり、ｐｒｆＡ＊突然変異体である、請求項７２または７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦支援の研究または開発に関する声明）
本発明は、一部分において、国立衛生研究所によって授与された助成金第１  Ｕ０１  ＡＩ０７０８３４−０１号の下、アメリカ合衆国政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、一般に、Ｃ型肝炎感染に罹患する、または罹患する恐れのある対象の治療に関する。より具体的には、本発明は、１つ以上のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原を組換えによりコードし、発現する細菌を使用した、かかる抗原の送達のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の背景技術の説明は、単に、読者の本発明の理解を補助するために提供され、本発明の先行技術を説明するか、または構成することは認められない。
【０００３】
Ｃ型肝炎は、世界中で罹患および死亡の主要な原因である。世界的には、推計一億７千万人がＨＣＶに感染しており、米国ではほぼ４百万人が、慢性的に感染しており、ヨーロッパでは９百万に及ぶ人々が、慢性的に感染している。急性疾患は、回復、劇症肝炎、通常の肝機能の介在期間を伴う再発性肝炎、不顕性慢性感染、慢性活動性肝炎、および硬変を引き起こす可能性がある。ＨＣＶに暴露された者の内、８０％は慢性的に感染し、キャリアの少なくとも３０％は、硬変および肝細胞癌を含む、慢性肝疾患を発症する。
【０００４】
先進国における慢性的ＨＣＶ感染患者に対する現在の標準治療であるインターフェロンα（ＩＮＦ−α）およびリバビリンは、最も一般的なＨＣＶ遺伝子型１〜３の間で、差別的な有効性を示している。約８０％のＨＣＶ遺伝子型２および３の患者に有効であるのに対して、ＨＣＶ遺伝子型１に慢性的に感染した患者の約５０％のみが、ＩＮＦ−α／リバビリンでの治療後に、持続的ウイルス応答を示す。米国における慢性ＨＣＶ感染の７０〜８０％は、遺伝子型１である。さらに、ＩＮＦ−αおよびリバビリンの毒性および耐性プロファイルが、ＨＣＶ治療におけるそれらの使用を限定している。
【０００５】
多くの治験薬が臨床開発中であるが、免疫系の治療およびウイルスプロテイナーゼ（ＮＳ３）およびウイルスポリメラーゼ（ＮＳ５Ｂ）等の特定のＨＣＶ遺伝子産物の機能を標的とする小分子が含まれる。例えば、ＩＣ４１は、７つの関連するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｔ細胞エピトープおよびヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）１／Ｔｃ１アジュバントポリ‐Ｌ‐アルギニンを含有する合成ペプチドワクチンである。ＩＣ４１は、報告によると、健康人においてＨＣＶに特異的なインターフェロン（ＩＮＦ）−ガンマ分泌ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発した。また、報告によると、Ｍ−ＩＳＡ７２０およびＣｐＧジヌクレオチドを含むアジュバント混合物と共に組換え型ＨＣＶ  ＮＳ３およびＮＳ５Ｂタンパク質は、ＣＤ４（＋）およびＣＤ８（＋）Ｔ細胞応答を誘発した。これらの方法のいずれも、依然として、慢性的なＨＣＶ環境において、現在の標準治療を越える優れた効果および耐性を確立していない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、抗原等の組換えによりコードおよび発現する細菌を使用し、１つ以上のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原の送達のための組成物および方法を提供する。
【０００７】
本発明の第１様態では、本発明は、対象における、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するＴ細胞応答を誘発する方法に関する。これらの方法は、１つ以上の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドを発現する細菌を含む組成物を、対象に投与することを含み、アミノ酸配列は、
（ｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂからなる群から選択される、１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質、
（ｉｉ）（ｉ）からの１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質に由来する、１つ以上の免疫原性アミノ酸配列、または、
（ｉ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質と（ｉｉ）の１つ以上のアミノ酸配列との組み合わせを含む。
【０００８】
本明細書に記載されるとおり、そのような方法は、該対象において、組換え発現した免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドに対して、抗原に特異的なＴ細胞（ＣＤ４＋および／またはＣＤ５＋）応答を活性化させることができる。好ましくは、対象に送達されると、本発明の組成物は、送達の２４時間後に、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、およびＭＣＰ−１からなる群から選択される１つ以上の、および好ましくはそれぞれの、タンパク質の血清中濃度の増加を誘発し、細菌によって発現された、免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドのうちの１つ以上に対するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋抗原に特異的なＴ細胞応答を誘発する。
【０００９】
本発明の関連する様態では、本発明は、対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対するＴ細胞応答を誘発するために有用な組成物に関する。そのような組成物は、核酸分子を含み、その配列が１つ以上の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドをコードし、そのアミノ酸配列は、
（ｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂからなる群から選択される、１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質、
（ｉｉ）（ｉ）からの１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質に由来する１つ以上の免疫原性アミノ酸配列、または、
（ｉ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質および（ｉｉ）の１つ以上のアミノ酸配列の組み合わせを含む、細菌を含む。
【００１０】
そして、他の関する様態では、本発明は、単離された核酸分子に関し、その配列が１つ以上の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドをコードし、そのアミノ酸配列は、
（ｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂからなる群から選択される、１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質、
（ｉｉ）（ｉ）からの１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質に由来する１つ以上の免疫原性アミノ酸配列、または、
（ｉ）の１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質および（ｉｉ）の１つ以上のアミノ酸配列の組み合わせを含む。
【００１１】
適切な免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチド配列を選択する方法を、以下に詳細を記載し、代表的な免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチド配列を、提供する。選択方法は、リステリアＡｃｔＡ−Ｎ１００のピーク疎水性を超える疎水性の領域を有さない、隣接ＨＣＶアミノ酸配列の１つ以上の選択と、１つ以上のＭＨＣクラスエピトープをコードすることが予測される隣接ＨＣＶアミノ酸配列の１つ以上の選択、および／または１つ以上のＭＨＣクラスＩエピトープをコードすることが予測される隣接ＨＣＶアミノ酸配列の１つ以上の選択と、を含むことができる。そのようなポリペプチドのＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋のＴ細胞応答を生成する能力は、本明細書で詳細が記載された様々な方法によって確認することができ、当技術分野でよく知られている。
【００１２】
ある実施形態では、免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、全長コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂからなる群と、そのような全長ＨＣＶ抗原に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂの断片と、そのような断片に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列から独立して選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
好ましい実施形態においては、免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、全長ＮＳ３，全長ＮＳ５ｂ、ＮＳ３に由来するアミノ酸配列、およびＮＳ５ｂに由来するアミノ酸配列からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、派生アミノ酸配列は、ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、ＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、およびＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群から独立して選択することができる。
【００１４】
前述のアミノ酸配列の原料物質となることができる数々のＨＣＶ分離株は、当技術分野で知られている。好ましい実施形態においては、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、および／またはＮＳ５ｂのアミノ酸配列は、好ましくは、遺伝子型１ＨＣＶ共通配列から、最も好ましくは、遺伝子型１ａまたは１ｂの共通配列からの共通配列である。代表的な共通配列を、以下に提供する。タンパク質の配列を、１つ以上の挿入、欠失、および／または代替によって、変更することができる。
【００１５】
特に好ましいＨＣＶ抗原ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、および８３からなる群から選択される、１つ以上、および好ましくはそれぞれのアミノ酸配列を含む。
【００１６】
シゲラ・フレックスネリ、大腸菌、リステリア・モノサイトゲネス、エンテロコリチカ菌、ネズミチフス菌、チフス菌、またはマイクロバクテリア菌種を含むがこれに限定されるものではない多くの細菌種は、ワクチンとして使用するために開発されており、本発明でのワクチンプラットフォームとして使用することができる。このリストは、限定を意味するものではない。本発明は、ワクチンプラットフォームとして弱毒化、共生、および／または不活化されるが代謝的に活性な菌種の使用を熟慮する。好ましい実施形態においては、細菌は、１つ以上の本発明の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチド、細菌による発現のためにコードする核酸配列を含むリステリア・モノサイトゲネスである。この核酸は、最も好ましくは、細菌のゲノムに組み込まれる。リステリア・モノサイトゲネスの弱毒化および不活化されるが代謝的に活性な形態が特に好ましく、ａｃｔＡおよび／またはｉｎｌＢにおいて弱毒突然変異を宿すむリステリア・モノサイトゲネスが、好ましい実施形態において以下に記載される。
【００１７】
本明細書に記載されているワクチン組成物は、ＨＣＶ感染に対して適切な免疫応答を誘発するために十分な量において、単独または薬剤的に許容される賦形剤と組み合わせて、宿主に投与することができる。対象におけるＴ細胞応答を誘発するために選択される好ましい条件は、対象に対してワクチンプラットフォームの静脈内投与を含むが、投与は、経口、静脈内、皮下、経皮、皮内、筋肉内、粘膜、非経口、臓器内、病巣内、鼻腔内、吸入、眼内、血管内、結節内で、表面剥離、直腸、腹腔内、または様々な既知の投与方法のいずれか１つまたは組み合わせによってであり得る。
【００１８】
ある好ましい実施形態においては、免疫応答を刺激するために対象に免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドを含有する有効量のワクチンを投与した後、第２のワクチンを投与する。これは、当技術分野では、「プライムブースト」療法と呼ばれる。そのような療法では、本発明の組成物および方法は、「プライム」送達として、「ブースト」送達として、または「プライム」および「ブースト」の両方として使用することができる。そのような療法の例を以下に記載する。
【００１９】
本発明で用いる好ましいリステリア・モノサイトゲネスは、発現したｐｒｆＡ転写因子を構成的に活性な状態に固定するｐｒｆＡ遺伝子において突然変異を含む。例えば、ＰｒｆＡ＊突然変異体（Ｇ１５５Ｓ）は、プライムブースト静脈内または筋肉内免疫療法後の機能細胞性免疫を高めるために示される。
【００２０】
ある実施形態では、免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、インフレーム分泌シグナル配列を含む１つ以上の融合タンパク質として発現される、したがって、細菌による可溶性ＨＣＶ抗原ポリペプチドの分泌をもたらす。多数の代表的なシグナル配列は、細菌発現系で用いることを、当技術分野で知られている。細菌がリステリア・モノサイトゲネスの場合、分泌シグナル配列が、リステリア・モノサイトゲネスシグナル配列であることが好ましく、最も好ましくはＡｃｔＡシグナル配列である。追加のＡｃｔＡまたは他のリンカーアミノ酸は、免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドに融合して発現することができる。好ましい実施形態においては、１つ以上の免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドは、（例えば、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０からなる群から選択される）インフレームのＡｃｔＡ−Ｎ１００配列、またはＡｃｔＡ−Ｎ１００配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質として発現される。
【００２１】
好ましい実施形態においては、ワクチン組成物は、
（ａ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０からなる群から選択されるＡｃｔＡ−Ｎ１００配列、またはＡｃｔＡ−Ｎ１００配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
（ｂ）ＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、またはＮＳ３からの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
（ｃ）ＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列、またはＮＳ５ｂからの少なくとも１００個の連続する残基を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列と、
を含む融合タンパク質を発現するリステリア・モノサイトゲネスを含み、融合タンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスＡｃｔＡプロモーターに機能可能に結合される核酸配列から発現される。特に好ましい実施形態においては、（ｃ）のアミノ酸配列は、ＮＳ５ｂのアミノ酸１−３４２（および好ましくは、配列番号１８もしくは配列番号１９のアミノ酸１−３４２を含む）またはその突然変異誘導体を含み、該突然変異は、ＮＳ５ｂのＲＮＡポリメラーゼ活性を不活性化し（および好ましくは、配列番号２２もしくは配列番号２３に描写された突然変異）、（ｂ）のアミノ酸配列は、ＮＳ３のアミノ酸１７２−４８４（および好ましくは配列番号１３もしくは配列番号１４のアミノ酸１７２−４８４を含む）またはその突然変異誘導体を含み、該突然変異は、ＮＳ３のヘリカーゼ活性（および好ましくは配列番号２０もしくは配列番号２１に描写される突然変異）を不活性化する。
リステリア・モノサイトゲネス細菌からの発現の場合、ある実施形態では、ＨＣＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸配列は、リステリア・モノサイトゲネスによる発現に対してコドン最適化される。本明細書で以下に記載するように、異なる生物は、しばしば「コドンバイアス」を表示する、つまり、特定のアミノ酸をコードする所定のコドンが、遺伝コードに見られる程度は、生物間で大きく変化する。一般的に、遺伝子がより珍しいコドンを含有すれば、異種タンパク質が、特定のホストシステム内で妥当な水準で発現されることは少なくなる。これらの水準は、珍しいコドンが集中してまたはタンパク質のＮ末端部分に出現する場合、さらに低くなる。珍しいコドンとアミノ酸配列を修正せずにホストシステムのコドンバイアスをより密接に反映する他のものと差し替えることで、機能的なタンパク質の発現の水準を増加することができる。コドン最適化の方法を以下に記載する。
【００２２】
本発明の方法および組成物は、予防薬としてまたはＨＣＶ治療ワクチンとしての療法の使用を見出すことができる。好ましい実施形態においては、事前に診断された慢性ＨＣＶ感染を基に、本発明の組成物を受けるために、対象を選択する。
【００２３】
本発明は、その応用において、以下の説明に記載されるか、または図面に図示される構成の詳細およびコンポーネントの配置に限定されないと理解されるべきである。本発明は、記載された実施形態に加えて、様々な方法で実践および実施され得る。また、本明細書、ならびに要約で用いられる表現および専門用語は、説明を目的としており、限定として見なされるべきではないことを理解すべきである。
【００２４】
したがって、当業者は、本開示の基となる概念が、本発明のいくつかの目的を実施するための他の構造、方法、およびシステムの設計の基盤として、容易に利用され得ることを理解するであろう。それ故、特許請求の範囲は、本発明の精神およびから逸脱しない限り、そのような等価物の構成を含んでいると見なすことが重要である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本発明および各種特性およびその有利な詳細は、添付図面に図示されたならびに以下の記載に詳述された実施形態に関して、より十分に説明される。図面に図示されている特性は、必ずしも縮尺通りではないことに注意すべきである。既知のコンポーネントおよび加工技術の記載は、本発明を不必要に分かりづらくしないために省略される。本明細書で使用されている例は、当業者が本発明を実施すことをさらに可能にするために、単に、本発明が実践することができる方法の理解を容易にすることを目的としている。したがって、例は、本発明の範囲を限定していると解釈されるべきではない。図面では、参照番号のように、いくつかの図に亘って対応する部分を指定する。
【００２６】
【図１】は、リステリア・モノサイトゲネスワクチン株ＡＮＺ−５２１の派生を描写する概略図である。
【００２７】
【図２】は、リステリア・モノサイトゲネスＡＮＺ１００の中心のｉｎｌＢに挿入されたＨＣＶＮＳ５Ｂ−ＮＳ３の抗原発現カセットを描写した概略図である。
【００２８】
【図３】は、リステリア・モノサイトゲネスＡＮＺ−５２１の構成において使用される様々な構成を描写する。
【００２９】
【図４】は、ＨＣＶＮＳ５ＡおよびＮＳ３の免疫原性エピトープをマップするために使用されるペプチドを描写する。
【００３０】
【図５】は、ＨＣＶＮＳ５ＡおよびＮＳ３の免疫原性エピトープのペプチドマッピングを描写する。
【００３１】
【図６】は、マウスにおける、ＮＳ３およびＮＳ５ｂ特有のＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞免疫を描写する。
【００３２】
【図７】は、遺伝子型１共通配列を基にしてＨＣＶコア、ＮＳ３、およびＮＳ５ｂ抗原と融合したＡｃｔＡ−Ｎ１００のために描画したカイト・ドーリトル水治療法を描写する。
【００３３】
【図８】は、各種のＡｃｔＡ−Ｎ１００ＨＣＶ抗原融合のリステリアによる抗原発現を描写する。パネルＡは、５の区分にコア配列１‐１９０、１‐１８０、および１‐１７７を示す。パネルＢは、３‐１０の区分にＮＳ３配列１‐６３１、１‐４８４、２２‐６３１、２２‐４８４、２２‐２８０、１７２‐４８４、１７２‐６３１、および４１６‐６３１を示す。パネルＣは、３〜７の区分にＮＳ５配列１‐５７４、１‐３４２、３２０‐５９１、および３２０‐５７４を示す。各パネルの区分１および２は、リステリア・モノサイトゲネスＣＲＳ−２０７による抗原挿入およびメソテリン発現を示さない陰性および陽性対照である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、１つ以上のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原をコードし発現するバクテリアを使用した、能動免疫療法の送達のための組成物および方法に関する。
【００３５】
本発明は、以下の記載または図面における図示に掲げる構成の詳細およびコンポーネントの配置の応用に、限定されないと理解されるべきである。本発明は、記載された実施形態に加えて、様々な方法で実践および実施され得る。また、本明細書ならびに要約で用いられている表現および専門用語は、説明を目的としており、限定として見なされるべきではないことを理解すべきである。
【００３６】
このように、当業者は、本開示の基となる概念が、本発明のいくつかの目的を実施するための他の構造、方法、およびシステムの設計の基盤として、容易に利用することができることに感謝するであろう。それ故、本発明の精神と範囲を逸脱しない限り、そのような均等の構成を請求項が含んでいると見なすことが重要である。
【００３７】
１．定義
【００３８】
遺伝子における突然変異、または該遺伝子を含む細菌における突然変異を表すために使用される略語は、以下のとおりである。一例として、略語「リステリア・モノサイトゲネスΔＡｃｔＡ」は、ＡｃｔＡ遺伝子の一部またはすべてが欠失されたことを意味する。デルタ記号（Δ）は、欠失を意味する。上付きのマイナス記号（リステリアＡｃｔＡ−）を含む略語は、例えば、欠失、点変異、またはフレームシフト変異として、ＡｃｔＡ遺伝子が、突然変異したことを意味する。
【００３９】
人間、哺乳動物、哺乳類の対象、動物、獣医学の対象、プラセボの対象、研究対象、実験対象、細胞、組織、臓器、または生物液に適用する「投与」は、限定されないが、対象、細胞、組織、臓器、または生物液等に対する外因性リガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬品、治療薬、診断用薬、または組成物の接触を指す。「投与」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、プラセボ、および実験方法を指すことができる。細胞の治療は、細胞の試薬との接触、ならびに液体が細胞と接触している場合、液体と試薬との接触を包含する。また、「投与」は、試薬、診断、結合組成物による、または別の細胞による、例えば、細胞のインビトロおよびエクスビボ治療も包含する。
【００４０】
リガンドおよび受容体と関係する「作用薬」は、受容体を刺激する分子、分子の組み合わせ、複合体、または試薬の組み合わせを含む。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の作用薬は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦの変異タンパク質もしくは誘導体、ＧＭ−ＣＳＦのペプチド模倣薬、ＧＭ−ＣＳＦの生物学的機能を模倣する小分子、またはＧＭ−ＣＳＦ受容体を刺激する抗体を包含することができる。
【００４１】
リガンドおよび受容体に関係する「拮抗薬」は、受容体を阻害、対抗、下方調節、および／または除感作する分子、分子の組み合わせ、または複合体を含む。「拮抗薬」は、受容体の構成的活性を阻害する任意の試薬を包含する。構成的活性は、リガンド／受容体相互作用がない場合に現れるものである。また、「拮抗薬」は、受容体の刺激（または調節）による活性を阻害または阻止する任意の試薬を包含する。一例として、ＧＭ−ＣＦＳ受容体の拮抗薬には、いかなる限定も示唆するものではないが、リガンド（ＧＭ−ＣＦＳ）に結合しそれが受容体と結合することを阻止する抗体、または受容体と結合しリガンドが受容体と結合することを阻止する抗体、あるいは抗体が、不活性構造に受容体を固定する場合が含まれる。
【００４２】
本明細書で使用されるように、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に関する「類似体」は、元のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と同様または同一の機能を有する別のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指すが、同様または同一のアミノ酸配列または元のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の構造を必ずしも含むとは限らない。類似体は、好ましくは以下のうち少なくとも１つを満たす。（ａ）元のアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するタンパク剤、（ｂ）厳しい条件下で元のアミノ酸配列をコードする核酸配列とハイブリッド形成する核酸配列によってコードされたタンパク剤、および（ｃ）元のアミノ酸配列をコードする核酸配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一の核酸配列によってコードされたタンパク剤。
【００４３】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞に抗原を提示するために使用する免疫系の細胞である。ＡＰＣは、樹枝状細胞、単球、マクロファージ、辺縁帯クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞を含む。樹枝状細胞は、少なくとも２つの分化系列に発生する。第１の分化系列は、前ＤＣ１、骨髄ＤＣ１、および成熟ＤＣ１を包含する。だ第２の分化系列は、ＣＤ３４＋＋ＣＤ４５ＲＡ−初期前駆多能性細胞、ＣＤ３４＋＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ３４＋＋ＣＤ４５ＲＡ＋＋ＣＤ４＋ＩＬ−３Ｒα＋＋プロＤＣ２細胞、ＣＤ４＋ＣＤ１１ｃ−形質細胞様前ＤＣ２細胞、リンパ性ヒトＤＣ２形質細胞様由来ＤＣ２、および成熟ＤＣ２を包含する。
【００４４】
「弱毒化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）」および「弱毒化（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）」は、宿主に対する毒性を軽減するように修正された、細菌、ウイルス、寄生物、感染生物、プリオン、腫瘍細胞、感染生物内の遺伝子等を包含する。宿主は、ヒトもしくは動物の宿主、または臓器、組織、もしくは細胞であり得る。非限定的な例を挙げると、細菌は、宿主細胞との結合を軽減するため、ある宿主細胞から別の宿主細胞への伝播を軽減するため、細胞外増殖を軽減するため、または宿主細胞内の細胞内増殖を軽減するために弱毒化することができる。弱毒化は、例えば、毒性の兆候、ＬＤ５０、臓器からのクリアランス率、または競合的指標を測定することによって判断することができる（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６９：５９５３−５９５７を参照）。弱毒化は、一般的に少なくとも２５％、より一般的には少なくとも５０％、最も一般的には少なくとも１００％（２倍）、標準的に少なくとも５倍、より標準的には少なくとも１０倍、最も標準的には少なくとも５０倍、多くの場合は少なくとも１００倍、より多くの場合は少なくとも５００倍、最も多くの場合は少なくとも１０００倍、大抵は少なくとも５０００倍、より大抵は少なくとも１０，０００倍、最も大抵は少なくとも５０，０００倍、および最も多くの場合は少なくとも１００，０００倍のＬＤ５０の増加および／またはクリアランス率の増加という結果をもたらす。
【００４５】
「弱毒化遺伝子」は、遺伝子が、和らげる、軽減する、または排除する方法で突然変異した場合、毒性、病理、または病原性を宿主に仲介する遺伝子、宿主内での増殖、または宿主内での生存を包含する。軽減または排除は、突然変異しなかった（または親）遺伝子によって仲介された病原性または毒性と突然変異遺伝子によって仲介された病原性または毒性を比較することによって査定することができる。「突然変異遺伝子」は、遺伝子の調節領域、遺伝子のコーディング領域、遺伝子の非コード領域、またはその組み合わせ内の欠失、点変異、フレームシフト突然変異、を包含する。
【００４６】
「保存的に修正された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に修正された変異体とは、同一アミノ酸配列をコードする核酸、または１つ以上の同類置換を有するアミノ酸配列を指す。同類置換の例は、以下のグループのうちの１つにおけるアミノ酸と同グループの別のアミノ酸の交換である（Ｌｅｅらに発行された米国特許第５，７６７，０６３号、Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５‐１３２）。
（１）疎水性：ノルロイシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、システイン、メチオニン、
（２）中性親水性：システイン、セリン、スレオニン、
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸、
（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：グリシン、プロリン、
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、および
（７）小さなアミノ酸：グリシン、アラニン、セリン。
【００４７】
「有効量」は、限定されないが、病状または疾患の症状または兆候を改善、反転、緩和、阻止、または診断することができる量を包含する。明確なまたは文脈によって指示がない限り、「有効量」は、症状を改善するために十分な最低限の量に限定されない。
【００４８】
「細胞外液」は、例えば、血清、血漿、血液、間質液、脳脊髄液、分泌液、リンパ液、胆液、汗、糞便、および尿を包含する。「細胞外液」は、例えば全血または凝固血液等、コロイドまたは懸濁液を含むことができる。
【００４９】
ポリペプチドとの関連で「断片」という用語は、より大きいポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５連続するアミノ酸残基、少なくとも１０連続するアミノ酸残基、少なくとも１５連続するアミノ酸残基、少なくとも２０連続するアミノ酸残基、少なくとも２５連続するアミノ酸残基、少なくとも４０連続するアミノ酸残基、少なくとも５０連続するアミノ酸残基、少なくとも６０連続するアミノ酸残基、少なくとも７０連続するアミノ酸残基、少なくとも８０連続するアミノ酸残基、少なくとも９０連続するアミノ酸残基、少なくとも１００連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５連続するアミノ酸残基、少なくとも２００連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを含む。
【００５０】
「遺伝子」とは、オリゴペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を指す。オリゴペプチドまたはポリペプチドは、生物学的に活性、抗原的に活性、生物学的に不活性、または抗原的に不活性等であり得る。遺伝子という用語は、例えば、特定のオリゴペプチドまたはポリペプチドをコードする読み取り枠の和（ＯＲＦ）、イントロンをコードするＯＲＦの和プラス核酸、ＯＲＦの和および機能可能に結合されるプロモーター、ＯＲＦの和および機能可能に結合されるプロモーターおよび任意のイントロン、ＯＲＦの和および機能可能に結合されるプロモーター、イントロン、およびプロモーター、ならびにエンハンサー等の他の調節要素を包含する。ある実施形態では、「遺伝子」は、遺伝子の発現を調節するためにシス内に必要な任意の配列を包含する。遺伝子という用語は、同様に抗原またはペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の抗原的に活性な断片を包含するペプチドをコードする核酸を指す。遺伝子という用語は、コードされたペプチドもしくはタンパク質が、任意の生物学的活動を有すること、またはペプチドまたはタンパク質は抗原的に活性であることを必ずしも示唆しているわけではない。非発現配列をコードする核酸配列は、一般的に偽遺伝子と考えられる。遺伝子という用語は、同様に、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、またはリボザイム等の、リボ核酸をコードする核酸配列を包含する。
【００５１】
リステリア等の細菌の「増殖」は、限定なしに、細菌生理学およびコロニー形成に関する遺伝子の機能、複製、タンパク質含有量の増加、および／または脂質含量の増加を包含する。明確にまたは文脈によって特定されない限り、リステリアの増殖は、宿主細胞の外側の細菌の増殖、および宿主細胞の内側の増殖を含む。遺伝子に関係する増殖は、いかなる限定も示唆するものではないが、エネルギー生産を仲介するもの（例えば、解糖、クレブス回路、シトクロム）、アミノ酸、糖類、脂質、ミネラル、プリン類、およびピリミジンの同化および／または異化、栄養素輸送、転写、翻訳、および／または複製を含む。一部の実施形態では、リステリア細菌の「増殖」は、リステリア細菌の細胞内増殖、すなわち、哺乳類細胞のような、宿主細胞内部の増殖を指す。リステリア細菌の細胞内増殖は、光学顕微鏡検査またはコロニー形成単位アッセイ（ＣＦＵ）で測定することができるが、増殖は、測定のいかなる技術にも限定されない。リステリア抗原、リステリア核酸配列、またはリステリア細菌特有の資質の量等の生化学的パラメーターは、増殖を査定するために使用され得る。一部の実施形態では、増殖を仲介する遺伝子は、特に細胞内増殖を仲介するものである。一部の実施形態では、特に細胞内増殖を仲介する遺伝子は、遺伝子の不活性化が細胞内増殖率を軽減するが、検出可能な程度に、実質的に、感知できるほどに細胞外増殖率を軽減しない（例、肉汁内に増殖）遺伝子、または遺伝子の不活性化が、細胞外増殖率を軽減するよりも大きく細胞内増殖率を軽減する遺伝子を包含するが、限定されない。限定されない例を提供すると、一部の実施形態では、不活性化は、細胞外増殖よりも大きく細胞内増殖率を軽減する遺伝子は、不活性化を、細胞内増殖を正常または最大値の５０％未満に軽減するが、細胞外増殖を最大値のたった１〜５％、５〜１０％、または１０〜１５％に軽減する状況を包含する。本発明は、ある様態において、細胞内増殖内で弱毒化されたが細胞外増殖内で弱毒化されないリステリア、細胞内増殖内で弱毒化されず細胞外増殖内で弱毒化されないリステリア、ならびに細胞内増殖内で弱毒化されないが細胞外増殖で弱毒化されるリステリアを包含する。
【００５２】
「疎水性解析」とは、「Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」のＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法によるポリペプチド配列の解析を指す。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１９８２）１０５−１３２．この方法では、それぞれのアミノ酸は、４．６と‐４．６との間の疎水性スコアを与えられる。４．６スコアは、最も疎水性であり、−４．６スコアは、最も親水性である。その後、ウィンドウサイズが設定される。ウィンドウサイズは、疎水性スコアがウィンドウ内の第１のアミノ酸に平均され割り当てられるアミノ酸の数である。アミノ酸の第１のウィンドウから計算を開始し、疎水性スコアの平均をそのウィンドウで計算する。その後、ウィンドウは、１つのアミノ酸を下へ動かし、すべての疎水性スコアの平均を第２のウィンドウで計算する。このパターンは、各ウィンドウの平均スコアを計算し、それをウィンドウ内の第１のアミノ酸に割り当て、タンパク質の最後まで継続する。平均は、グラフに描画される。Ｙ軸は、疎水性スコアを表し、Ｘ軸は、ウィンドウ番号を表す。以下の疎水性スコアは、２０の一般的なアミノ酸に使用される。
【表１】
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【００５３】
「標識」された組成物は、分光、光化学、生化学、免疫化学、同位体、または化学方法によって、直接または間接に検出可能である。例えば、有用な標識は、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、安定同位体、エピトープ標識、蛍光染料、電子密度の高い試薬、基質、または例えば酵素免疫測定法で使用されるような酵素、またはフルオレット（例えば、ＲｏｚｉｎｏｖとＮｏｌａｎ（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：７１３−７２８を参照）を含む。
【００５４】
「リガンド」とは、受容体の作用薬または拮抗薬である小分子、ペプチド、ポリペプチド、または膜結合性のまたは膜結合型の分子を指す。「リガンド」は、同様に作用薬または拮抗薬でない結合剤を包含し、作用薬または拮抗薬の性質を決して有しない。慣例により、「リガンド」が第１の細胞で膜結合型の場合、受容体は、通常第２の細胞に発生する。第２の細胞は、第１の細胞と同じ同一性（同じ名前）を有することができる、または異なる同一性（異なる名前）を有することができる。リガンドまたは受容体は、完全に細胞内であることができる、すなわち、シトソル、細胞核、またはその他の細胞内区画のいくつかに、存在することができる。リガンドまたは受容体は、例えば、細胞内区画から原形質膜の外層へ、場所を変更することができる。リガンドおよび受容体の複合体は、「リガンド受容体複合体」と称される。リガンドおよび受容体が、シグナル経路に関与する場合、リガンドは、上流位置に発生し、受容体は、シグナル経路の下流位置に発生する。
【００５５】
「核酸」とは、一本鎖、二本鎖形態、または複数鎖形態である、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。核酸の限定されない例は、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドである。特定の核酸配列は、同様に黙示的に「対立遺伝子多型」および「スプライス変異」を包含することができる。
【００５６】
プロモーターおよびｍＲＮＡをコードする核酸においての「機能可能に結合される」とは、プロモーターが、核酸の転写を始めるために使用することができることを意味する。
【００５７】
「配列同一性パーセント」および「配列同一性％」という用語は、２つ以上のアミノ酸または核酸配列の比較もしくはアライメントによって見つけられる配列同一性の割合を意味する。同一性パーセントは、配列を並べ、２つの整列配列間の一致の正確な数を計算し、短配列の長さで割り、その結果に１００をかけることによって２つの分子間の配列情報の直接比較によって決定され得る。同一性パーセントの計算のためのアルゴリズムは、スミス―ウォーターマン相同性検索アルゴリズムである（例えば、Ｋａｎｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４８：３６７−３７６；Ａｒｓｌａｎ，  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７：３２７−３３７を参照）。
【００５８】
「精製された」および「単離された」とは、ポリペプチドについて言及する際、そのポリペプチドが、本来関連する他の生物高分子が実質的に不在の場合に存在することを意味する。本明細書で使用される「精製された」という用語は、存在するポリペプチドの重量またはそれ以上によって、同定されたポリペプチドは、多くの場合少なくとも５０％の割合を占め、より多くの場合少なくとも６０％の割合を占め、典型的には少なくとも７０％の割合を占め、より典型的に少なくとも７５％の割合を占め、最も典型的に少なくとも８０％の割合を占め、大抵は少なくとも８５％の割合を占め、より大抵は少なくとも９０％の割合を占め、最も大抵は少なくとも９５％の割合を占め、慣習的に少なくとも９８％の割合を占めることを意味する。水、緩衝液、塩、洗剤、還元剤、プロテアーゼ阻害薬、安定剤（アルブミン等の添加タンパク質を含む）、および賦形剤、および１０００未満の分子量を有する分子は、一般的にポリペプチド純度決定に使用されない。例えば、Ｃｏｖａｃｃｉらに発行された米国特許第６，０９０，６１１号の純度の説明を参照されたい。
【００５９】
「ペプチド」とは、ペプチド結合によってアミノ酸が相互に結合された場合、アミノ酸の短配列を指す。ペプチドは、自由にまたは高分子、脂質、オリゴまたは多糖、および／またはポリペプチド等の、別の部分と結合して発生することができる。ペプチドがポリペプチド鎖に組み込まれる場合、「ペプチド」という用語は、特にアミノ酸の短配列を指すためにさらに使用することができる。「ペプチド」は、ペプチド結合または他の種類の連鎖として、別の部分と結合することができる。ペプチドは、最大の長さが慣習または前後関係の機能である場合、少なくとも２つのアミノ酸の長さおよび一般的に約２５のアミノ酸未満の長さである。「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、交互に使用することができる。
【００６０】
「タンパク質」とは、一般的にポリペプチド鎖を含むアミノ酸の配列を指す。タンパク質は、同様に、ポリペプチドの３次元構造を指すことができる。「変性タンパク質」とは、残基３次元構造のいくつかを有する部分的に変性した、または代わりに、本質的に無作為の３次元構造、すなわち完全に変性したポリペプチドを指す。本発明は、例えばグリコシル化、リン酸化応答、硫酸化、ジスルフィド結合生成、アミド分解、異性化、シグナルまたはリーダー配列処理における切断点、共有結合性のおよび非共有結合した共同因子、酸化変異体等を伴う、ポリペプチド変異体の試薬、およびをポリペプチド変異体使用する方法、を包含する。ジスルフィド結合タンパク質の形成は、記載される（例えば、Ｗｏｙｃｅｃｈｏｗｓｋｙ  ａｎｄ  Ｒａｉｎｅｓ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：５３３−５３９；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１８−２３を参照）。
【００６１】
例えば核酸、細胞、動物、ウイルス、プラスミド、もしくはベクター等に関して使用された場合、「組換え」は、外因性、非天然核酸の導入、天然核酸の変更による、または組換え核酸、細胞、ウイルス、プラスミド、もしくはベクターから全体的もしくは部分的な派生による修正を示す。組換えタンパク質とは、組換え核酸、ウイルス、プラスミド、またはベクター等から派生したタンパク質を指す。「組換え細菌」は、例えば、突然変異、欠失、挿入、および／または再配列のために組換え方法でゲノムが設計された場合、細菌を包含する。「組換え細菌」は、同様に、例えば、プラスミドまたは第２染色体、またはゲノム外核酸が変更された細菌等の、組換えゲノム外核酸を含むように修正された細菌を包含する。
【００６２】
「試料」とは、例えば、細胞、組織、臓器、液体、ガス、エアロゾル、スラリー、コロイド、または凝固物質等の、人間、動物、プラセボ、または研究試料からの試料を指す。「試料」は、例えば人間もしくは動物から取り除かずにインビボで試験することができる、またはインビトロで試験することができる。試料は、例えば組織学的方法によって、処理後に試験することができる。「試料」は、同様に、例えば液体を含む細胞または組織試料または液体から分離された細胞または組織試料を指す。「試料」は、同様に、人間または動物から採取された細胞、組織、臓器、もしくは、液体、または処理されたもしくは保存された細胞、組織、臓器、もしくは液体を指す。
【００６３】
「選択可能なマーカー」は、選択可能なマーカーを含む細胞をまたは、それに対して選択することを許す核酸を包含する。選択可能なマーカーの例は、限定なしに、例えば、（１）本来なら毒性である化合物（例えば、抗生物質）に対して抵抗を提供する産物をコードする、または本来なら無害である化合物（例えば、ショ糖）に対して感受性をコードする核酸、（２）本来なら受容細胞で不足している産物をコードする核酸（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）、（３）遺伝子産物の活動を抑制する産物をコードする核酸、（４）容易に同定することができる産物をコードする核酸（例えば、ベータガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、細胞表面タンパク質、エピトープ標識、フラッグタグ等の表現型マーカー）、（５）例えば、ＰＣＲまたは分子指標のハイブリッド形成法で同定することができる核酸を、含む。
【００６４】
リガンド／受容体、核酸／相補的核酸、抗体／抗原、または他の結合対（例えば、サイトカインとサイトカイン受容体）を言及する際、「特異的に」または「選択的に」結合するとは、タンパク質および他の生物製剤の不均一集団における、タンパク質の存在の決定をする結合応答を示す。したがって、指定された条件下では、指定のリガンドは、特定の受容体と結合し、相当量において、試料に存在する他のタンパク質に結合しない。特異結合は、同様に、を意味することができる。例えば、意図した方法の結合化合物、核酸リガンド、抗体、または抗体の抗原結合部位に由来する結合組成物は、その標的と他の結合化合物との親和性よりも、多くの場合少なくとも２５％大きい、より多くの場合少なくとも５０％大きい、最も多くの場合少なくとも１００％（２倍）大きい、典型的には少なくとも１０倍大きい、もっと典型的には少なくとも２０倍大きい、最典型的には、少なくとも１００倍大きい親和性と、を結合する。
【００６５】
典型的な実施形態では、抗体は、スキャチャード解析によって決定したとおり、約１０９リットル／モルよりも大きい親和性を有するだろう（Ｍｕｎｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７：２２０−２３９）。ある結合化合物は、１つ以上の標的と特異的に結合することができることが、当業者によって認識される、例えば、抗体が、抗体のオリゴ糖として抗原、レクチンに、ならびに／または抗体のＦｃ領域としてＦｃ受容体に、特異的に結合する。
【００６６】
細菌の「伝播」は、「細胞から細胞への伝播」、すなわち、例えば、小胞によって仲介されるように、第１の宿主細胞から第２の宿主細胞への細菌の感染を包含する。伝播に関係する機能は、例えば、アクチンの尾の形成、偽足のような伸展の形成、および二重膜の空胞の形成を含むが限定されない
【００６７】
本明細書で使用される「対象」という用語は、人体またはヒト以外の生物を指す。したがって、本明細書に記載される方法および組成物は、人間および動物の疾患に適用できる。ある実施形態では、対象は、「患者」、すなわち、疾患または健康状態に対する医療ケアを受けて生きている人間である。これは、病理学的兆候を調査されている定義された病気のない人を含む。好ましくは、既存のＨＣＶ感染、最も好ましくは慢性感染を有する対象である。
【００６８】
リコンビナーゼの「標的部位」は、リコンビナーゼによって認識された、結合された、ならびに／または作用された核酸配列または領域である（例えば、Ｇｒａｈａｍらに発行された米国特許第６，３７９，９４３号、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２９９−３０７、Ｇｒｏｔｈ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７−６７８、Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：３９１−４０６を参照）。
【００６９】
「治療に有効な量」は、患者に利点を十分に示す、すなわち、治療されている病気の症状の減少、防止、または改善をもたらす、試薬または医薬組成物の量として定義されている。薬剤または医薬組成物が、診断用薬を含む場合、「診断上有効な量」は、信号、映像、または他の診断パラメーターを十分に産出する量として定義される。製剤処方の有効な量は、個人の感受性度、年齢、性別、および個人の体重、および個人の特異な応答等の要素によって変化するであろう（例えば、Ｎｅｔｔらに発行された米国特許第５，８８８，５３０号を参照）。
【００７０】
（病気または疾患に関して）「治療」または「処理」は、好ましくは臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るための方法である。本発明の目的として、疾患に関しての有益なまたは所望の結果は、以下の１つ以上を含むが限定されない。疾患に関連する状態の改善、疾患の治療、疾患の重症度の軽減、疾患の進行の妨げ、１つ以上の疾患に関連する症状の緩和、疾患に悩んでいる者の生活の質の向上、および／または生存期間の延長。同様に、本発明の目的として、状態に関しての有益なまたは所望の結果は、以下の１つ以上を含むが限定されない。病気の改善、病気の治療、病気の重症度の軽減、病気の進行の妨げ、１つ以上の病気に関連する症状の緩和、病気に悩んでいる者の生活の質の向上、および／または生存期間の延長。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、癌治療に使用され、有益なまたは所望の結果は、以下の１つ以上を含むが限定されない。新生または癌性細胞の蔓延の軽減（または破壊）、癌に含まれる新生細胞の転移の軽減、腫瘍の大きさの縮小、癌による症状の減少、癌に悩む者の生活の質の向上、疾患を治療するために必要な他の投薬量の減少、癌の進行の妨げ、および／または癌を有する患者の生存期間の延長。状況次第によって、例えば、対象が試薬の投与によって改善されることが期待される疾患を含むような状況において、対象の「治療」は、対象が治療を必要としていることを示唆することができる。
【００７１】
「ワクチン」は、予防接種を包含する。ワクチンは、同様に、治療ワクチン、例えば、ワクチンによって提供される抗原またはエピトープに関連する病気または疾患を含む哺乳動物に投与されるワクチン、を包含する。
【００７２】
２．Ｃ型肝炎抗原
【００７３】
ＨＣＶは、約３，０００のアミノ酸の前駆体ポリタンパク質をコードする大きな読み取り枠を含むプラス鎖ＲＮＡゲノムを有する。このポリタンパク質は、宿主およびウイルスプロテアーゼによってコア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂ抗原と呼ばれる１０ウイルスタンパクに分割される。以下の例は、コア、ＮＳ５ｂ、およびＮＳ３の使用を扱うが、これらのＨＣＶ抗原配列のいずれかまたはそれ以上は、本明細書に記載されるワクチン組成物および方法で使用することができる。
【００７４】
本明細書で使用されているように、「ＨＣＶ抗原」という用語は、（ｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、および／またはＮＳ５ｂからなる群から選択された１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質、および／または（ｉｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、および／またはＮＳ５ｂからなる群から別々に選択された１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質に由来する１つ以上のポリペプチド配列、を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドを指す本明細書に記載されているＨＣＶ抗原は、個々に使用することができるが、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、および／またはＮＳ５ｂからなる群から選択された少なくとも２，３，４，５、またはそれ以上のＨＣＶタンパク質からのポリペプチド配列を含む組み合わせで使用されることが好ましい。以下に記載されるとおり、好ましいＨＣＶ抗原は、ＮＳ３および／またはＮＳ５ｂポリペプチド配列またはそれらから派生した配列を含む。
【００７５】
述べたとおり、本発明で使用されるＨＣＶ抗原は、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、および／もしくはＮＳ５ｂ抗原の全長バージョンを含むことができる、または１つ以上のそのような全長ＨＣＶ抗原「に由来する」配列を含むことができる。本明細書で使用される「に由来する」とは、指定のＨＣＶ抗原または抗原と比較して、１つ以上の保存アミノ酸の変化を有するポリペプチド、指定のＨＣＶ抗原または抗原から１つ以上の単離エピトープを含むポリペプチド、または指定のＨＣＶ抗原または抗原と免疫学的交差応答するペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【００７６】
一部の実施形態では、ＨＣＶ抗原「に由来する」抗原は、１つ以上の全長ＨＣＶ抗原の部分列（「断片」）を含む。したがって、「ＨＣＶ抗原」とは、ｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、および／またはＮＳ５ｂからなる群から選択された１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質、および／または（ｉｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、および／またはＮＳ５ｂからなる群から別々に選択された１つ以上のＨＣＶタンパク質の１つ以上のポリペプチド部分列、を含むポリペプチドを指すことができる。様々な実施形態において、派生ＨＣＶ抗原は、全長ＨＣＶ抗原から得た少なくとも８のアミノ酸、少なくとも１２のアミノ酸、少なくとも２０のアミノ酸、少なくとも５０のアミノ酸、少なくとも７５のアミノ酸、少なくとも１００のアミノ酸、または少なくとも２００のアミノ酸またはそれ以上の断片を含む。
【００７７】
抗原は、元の（全長）ＨＣＶ抗原から得られる少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープおよび／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードする配列を含むことができる。公表されているアルゴリズムは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩの分子を結合するエピトープを選択するために使用することができる。例えば、予測アルゴリズム「ＢＩＭＡＳ」は、ペプチド／ＨＬＡ複合体の予測ハーフタイム分離によって起こりえるエピトープを結合するＨＬＡを順位付けする。「ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ」アルゴリズムは、ペプチドを一次および二次アンカー残基ＨＬＡ結合の存在から成るスコアによって順位付けする。両方のコンピュータアルゴリズムは、事前に発行したＨＬＡ結合エピトープと同様の結合モチーフ有する所定のタンパク質内のアミノ酸配列を基にした対象エピトープを採点する。他のアルゴリズムも同様に、さらなる生物学的試験のための対象を同定するために使用することができる。
【００７８】
抗原の誘導体は、同様に、派生されたＨＣＶ抗原の部分に対して少なくとも約８０％の配列相同性、少なくとも約８５％の配列相同性、少なくとも約９０％の配列相同性、少なくとも約９５％の配列相同性、または少なくとも約９８％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ワクチン構成によって発現したＨＣＶ抗原は、野生型とは異なるため、抗原は、それぞれのタンパク質の１つ以上の機能にとって重要であるモチーフに設計された１つ以上の突然変異を含む。例えば、遺伝子型１の共通配列のＮＳ５ｂの場合、ＧＤＤからＧＮＨ（ＮＳ５ｂのアミノ酸３１７の始め）の不活性化二重突然変異は、完全にＲＮＡポリメラーゼ活性を不活性化する。同様に、遺伝子型１共通配列のＮＳ３の場合、アミノ酸２９０から開始のモチーフＩＩからＡＡＳＨへの突然変異（ＤＥＣＨ）は、ヘリカーゼ活性を無効にする。
【００７９】
少なくとも６つの遺伝子型および５０を超えるＨＣＶのサブタイプが知られている。以下の例は、遺伝子型１抗原の使用を扱うが、本明細書に記載する方法および組成物は、すべてのＨＣＶ遺伝子型およびサブタイプに適用できる。したがって、本発明での１つ以上の抗原配列の使用は、どの特定のＨＣＶ遺伝子型／サブタイプからも得ることができる。
【００８０】
予防または治療ＨＣＶワクチンは、現在入手不可能であり、ワクチンの開発の重大な課題は、ウイルスに潜在する多様性である。擬似種、または密接に関係したが特異的な遺伝子配列の群れとして各感染者に存在するため、ＨＣＶは、人々間および内の両方で多様性に富んでいる。したがって、効果的なＨＣＶワクチンの開発の戦略の１つは、個々のサブタイプからではなく、所定の抗原に対するそれぞれの位置によく見られるアミノ酸を基にした特定の遺伝子型の共通配列から１つ以上の抗原を得ることである。例えば、国際公開第０６／０８６１８８号を参照されたく、これは、すべての表、図、および特許請求の範囲を含んで、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。共通配列の論理的利点の１つは、ワクチン株と現代の分離株との遺伝的差異を最小限にすることであり、多様性を半分までに効果的に減らす、したがって交差応答を誘発することの可能性を強めた可能性がある。共通配列ワクチンはまた、共通部分が地理的領域で変化する可能性は低いため、産生がより効率的であるだろう。
【００８１】
したがって、好ましい実施形態においては、使用されるＨＣＶ抗原は、ＨＣＶ共通配列を基づいている。例えば、ＨＣＶ抗原は、（ｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、および／またはＮＳ５ｂからなる群から選択された１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質の共通配列、および／または（ｉｉ）コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、および／またはＮＳ５ｂからなる群から別々に選択された１つ以上の全長ＨＣＶタンパク質の共通配列に由来する１つ以上のポリペプチド配列を含むアミノ酸配列をコードするポリペプチドであり得る。以下の表は、様々なＨＣＶ分離体に対するスイスプロット入力データを提供する。
【表２】
2011529077.tif 000003
2011529077.tif 000004
2011529077.tif 000005
2011529077.tif 000006
2011529077.tif 000007
2011529077.tif 000008
2011529077.tif 000009
2011529077.tif 000010
2011529077.tif 000011
2011529077.tif 000012
2011529077.tif 000013
【００８２】
以下の共通配列は、好ましいが、本質的には代表的であり、限定されると見なされるべきではない。
コア、共通遺伝子型１ａ（配列番号７）
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫ  ＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱ  ＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩ  ＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲ  ＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲ     ５０
ＫＴＳＥＲＳＱＰＲＧ  ＲＲＱＰＩＰＫＡＲＲ  ＰＥＧＲＴＷＡＱＰＧ  ＹＰＷＰＬＹＧＮＥＧ  ＣＧＷＡＧＷＬＬＳＰ  １００
ＲＧＳＲＰＳＷＧＰＴ  ＤＰＲＲＲＳＲＮＬＧ  ＫＶＩＤＴＬＴＣＧＦ  ＡＤＬＭＧＹＩＰＬＶ  ＧＡＰＬＧＧＡＡＲＡ  １５０
ＬＡＨＧＶＲＶＬＥＤ  ＧＶＮＹＡＴＧＮＬＰ  ＧＣＳＦＳＩＦＬＬＡ  ＬＬＳＣＬＴＶＰＡＳ  Ａ          １９１
コア、共通遺伝子型１ｂ（配列番号８）
ＭＳＴＮＰＫＰＱＲＫ  ＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱ  ＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩ  ＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲ  ＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲ  ５０
ＫＴＳＥＲＳＱＰＲＧ  ＲＲＱＰＩＰＫＡＲＲ  ＰＥＧＲＡＷＡＱＰＧ  ＹＰＷＰＬＹＧＮＥＧ  ＭＧＷＡＧＷＬＬＳＰ     １００  ＲＧＳＲＰＳＷＧＰＴ  ＤＰＲＲＲＳＲＮＬＧ  ＫＶＩＤＴＬＴＣＧＦ  ＡＤＬＭＧＹＩＰＬＶ  ＧＡＰＬＧＧＡＡＲＡ       １５０  ＬＡＨＧＶＲＶＬＥＤ  ＧＶＮＹＡＴＧＮＬＰ  ＧＣＳＦＳＩＦＬＬＡ  ＬＬＳＣＬＴＩＰＡＳ  Ａ         １９１
Ｅ１、共通遺伝子型１ａ（配列番号９）
ＹＱＶＲＮＳＳＧＬＹ  ＨＶＴＮＤＣＰＮＳＳ  ＶＶＹＥＡＡＤＡＩＬ  ＨＴＰＧＣＶＰＣＶＲ  ＥＧＮＡＳＲＣＷＶＡ     ５０
ＶＴＰＴＶＡＴＲＤＧ  ＫＬＰＴＴＱＬＲＲＨ  ＩＤＬＬＶＧＳＡＴＬ  ＣＳＡＬＹＶＧＤＬＣ  ＧＳＶＦＬＶＧＱＬＦ     １００
ＴＦＳＰＲＨＨＷＴＴ  ＱＤＣＮＣＳＩＹＰＧ  ＨＩＴＧＨＲＭＡＷＮ  ＭＭＭＮＷＳＰＴＡＡ  ＬＶＶＡＱＬＬＲＩＰ     １５０
ＱＡＩＭＤＭＩＡＧＡ  ＨＷＧＶＬＡＧＩＫＹ  ＦＳＭＶＧＮＷＡＫＶ  ＬＶＶＬＬＬＦＡＧＶ  ＤＡ               １９２
Ｅ２、共通遺伝子型１ａ（配列番号１０）
ＥＴＨＶＴＧＧＮＡＧ  ＲＴＴＡＧＬＶＧＬＬ  ＴＰＧＡＫＱＮＩＱＬ  ＩＮＴＮＧＳＷＨＩＮ  ＳＴＡＬＮＣＮＥＳＬ     ５０
ＮＴＧＷＬＡＧＬＦＹ  ＱＨＫＦＮＳＳＧＣＰ  ＥＲＬＡＳＣＲＲＬＴ  ＤＦＡＱＧＷＧＰＩＳ  ＹＡＮＧＳＧＬＤＥＲ     １００
ＰＹＣＷＨＹＰＰＲＰ  ＣＧＩＶＰＡＫＳＶＣ  ＧＰＶＹＣＦＴＰＳＰ  ＶＶＶＧＴＴＤＲＳＧ  ＡＰＴＹＳＷＧＡＮＤ     １５０
ＴＤＶＦＶＬＮＮＴＲ  ＰＰＬＧＮＷＦＧＣＴ  ＷＭＮＳＴＧＦＴＫＶ  ＣＧＡＰＰＣＶＩＧＧ  ＶＧＮＮＴＬＬＣＰＴ     ２００
ＤＣＦＲＫＹＰＥＡＴ  ＹＳＲＣＧＳＧＰＲＩ  ＴＰＲＣＭＶＤＹＰＹ  ＲＬＷＨＹＰＣＴＩＮ  ＹＴＩＦＫＶＲＭＹＶ     ２５０
ＧＧＶＥＨＲＬＥＡＡ  ＣＮＷＴＲＧＥＲＣＤ  ＬＥＤＲＤＲＳＥＬＳ  ＰＬＬＬＳＴＴＱＷＱ  ＶＬＰＣＳＦＴＴＬＰ     ３００
ＡＬＳＴＧＬＩＨＬＨ  ＱＮＩＶＤＶＱＹＬＹ  ＧＶＧＳＳＩＡＳＷＡ  ＩＫＷＥＹＶＶＬＬＦ  ＬＬＬＡＤＡＲＶＣＳ     ３５０
ＣＬＷＭＭＬＬＩＳＱ  ＡＥＡ                                                               ３６３
ｐ７、共通遺伝子型１ａ（配列番号１１）
ＡＬＥＮＬＶＩＬＮＡ  ＡＳＬＡＧＴＨＧＬＶ  ＳＦＬＶＦＦＣＦＡＷ  ＹＬＫＧＲＷＶＰＧＡ  ＶＹＡＬＹＧＭＷＰＬ     ５０
ＬＬＬＬＬＡＬＰＱＲ  ＡＹＡ                                                               ６３
ＮＳ２、共通遺伝子型１ａ（配列番号１２）
ＬＤＴＥＶＡＡＳＣＧ  ＧＶＶＬＶＧＬＭＡＬ  ＴＬＳＰＹＹＫＲＹＩ  ＳＷＣＭＷＷＬＱＹＦ  ＬＴＲＶＥＡＱＬＨＶ     ５０
ＷＶＰＰＬＮＶＲＧＧ  ＲＤＡＶＩＬＬＴＣＶ  ＶＨＰＡＬＶＦＤＩＴ  ＫＬＬＬＡＩＦＧＰＬ  ＷＩＬＱＡＳＬＬＫＶ     １００
ＰＹＦＶＲＶＱＧＬＬ  ＲＩＣＡＬＡＲＫＩＡ  ＧＧＨＹＶＱＭＡＩＩ  ＫＬＧＡＬＴＧＴＣＶ  ＹＮＨＬＡＰＬＲＤＷ     １５０
ＡＨＮＧＬＲＤＬＡＶ  ＡＶＥＰＶＶＦＳＲＭ  ＥＴＫＬＩＴＷＧＡＤ  ＴＡＡＣＧＤＩＩＮＧ  ＬＰＶＳＡＲＲＧＱＥ     ２００
ＩＬＬＧＰＡＤＧＭＶ  ＳＫＧＷＲＬＬ                                                       ２１７
ＮＳ３、共通遺伝子型１ａ（配列番号１３）
ＡＰＩＴＡＹＡＱＱＴ  ＲＧＬＬＧＣＩＩＴＳ  ＬＴＧＲＤＫＮＱＶＥ  ＧＥＶＱＩＶＳＴＡＡ  ＱＴＦＬＡＴＣＩＮＧ     ５０
ＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ  ＴＲＴＩＡＳＳＫＧＰ  ＶＩＱＭＹＴＮＶＤＱ  ＤＬＶＧＷＰＡＰＱＧ  ＡＲＳＬＴＰＣＴＣＧ     １００
ＳＳＤＬＹＬＶＴＲＨ  ＡＤＶＩＰＶＲＲＲＧ  ＤＳＲＧＳＬＬＳＰＲ  ＰＩＳＹＬＫＧＳＳＧ  ＧＰＬＬＣＰＡＧＨＡ     １５０
ＶＧＩＦＲＡＡＶＣＴ  ＲＧＶＡＫＡＶＤＦＩ  ＰＶＥＮＬＥＴＴＭＲ  ＳＰＶＦＴＤＮＳＳＰ  ＰＡＶＰＱＳＦＱＶＡ     ２００
ＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫ  ＳＴＫＶＰＡＡＹＡＡ  ＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰ  ＳＶＡＡＴＬＧＦＧＡ  ＹＭＳＫＡＨＧＩＤＰ     ２５０
ＮＩＲＴＧＶＲＴＩＴ  ＴＧＳＰＩＴＹＳＴＹ  ＧＫＦＬＡＤＧＧＣＳ  ＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤ  ＥＣＨＳＴＤＡＴＳＩ     ３００
ＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡ  ＥＴＡＧＡＲＬＶＶＬ  ＡＴＡＴＰＰＧＳＶＴ  ＶＰＨＰＮＩＥＥＶＡ  ＬＳＴＴＧＥＩＰＦＹ     ３５０
ＧＫＡＩＰＬＥＶＩＫ  ＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳ  ＫＫＫＣＤＥＬＡＡＫ  ＬＶＡＬＧＩＮＡＶＡ  ＹＹＲＧＬＤＶＳＶＩ     ４００
ＰＴＳＧＤＶＶＶＶＡ  ＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧ  ＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴ  ＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬ  ＤＰＴＦＴＩＥＴＴＴ     ４５０
ＬＰＱＤＡＶＳＲＴＱ  ＲＲＧＲＴＧＲＧＫＰ  ＧＩＹＲＦＶＡＰＧＥ  ＲＰＳＧＭＦＤＳＳＶ  ＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡ     ５００
ＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴ  ＶＲＬＲＡＹＭＮＴＰ  ＧＬＰＶＣＱＤＨＬＥ  ＦＷＥＧＶＦＴＧＬＴ  ＨＩＤＡＨＦＬＳＱＴ     ５５０
ＫＱＳＧＥＮＦＰＹＬ  ＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲ  ＡＱＡＰＰＰＳＷＤＱ  ＭＷＫＣＬＩＲＬＫＰ  ＴＬＨＧＰＴＰＬＬＹ     ６００
ＲＬＧＡＶＱＮＥＶＴ  ＬＴＨＰＶＴＫＹＩＭ  ＴＣＭＳＡＤＬＥＶＶ  Ｔ                                ６３１
ＮＳ３、共通遺伝子型１ｂ（配列番号１４）
ＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴ  ＲＧＬＬＧＣＩＩＴＳ  ＬＴＧＲＤＫＮＱＶＥ  ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴ  ＱＳＦＬＡＴＣＶＮＧ     ５０
ＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ  ＳＫＴＬＡＧＰＫＧＰ  ＩＴＱＭＹＴＮＶＤＱ  ＤＬＶＧＷＱＡＰＰＧ  ＡＲＳＬＴＰＣＴＣＧ     １００
ＳＳＤＬＹＬＶＴＲＨ  ＡＤＶＩＰＶＲＲＲＧ  ＤＳＲＧＳＬＬＳＰＲ  ＰＶＳＹＬＫＧＳＳＧ  ＧＰＬＬＣＰＳＧＨＡ     １５０
ＶＧＩＦＲＡＡＶＣＴ  ＲＧＶＡＫＡＶＤＦＶ  ＰＶＥＳＭＥＴＴＭＲ  ＳＰＶＦＴＤＮＳＳＰ  ＰＡＶＰＱＴＦＱＶＡ     ２００
ＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫ  ＳＴＫＶＰＡＡＹＡＡ  ＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰ  ＳＶＡＡＴＬＧＦＧＡ  ＹＭＳＫＡＨＧＶＤＰ     ２５０
ＮＩＲＴＧＶＲＴＩＴ  ＴＧＡＰＩＴＹＳＴＹ  ＧＫＦＬＡＤＧＧＣＳ  ＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤ  ＥＣＨＳＴＤＳＴＴＩ     ３００
ＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡ  ＥＴＡＧＡＲＬＶＶＬ  ＡＴＡＴＰＰＧＳＶＴ  ＶＰＨＰＮＩＥＥＶＡ  ＬＳＮＴＧＥＩＰＦＹ     ３５０
ＧＫＡＩＰＩＥＴＩＫ  ＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳ  ＫＫＫＣＤＥＬＡＡＫ  ＬＳＧＬＧＬＮＡＶＡ  ＹＹＲＧＬＤＶＳＶＩ     ４００
ＰＴＳＧＤＶＶＶＶＡ  ＴＤＡＬＭＴＧＦＴＧ  ＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴ  ＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬ  ＤＰＴＦＴＩＥＴＴＴ     ４５０
ＶＰＱＤＡＶＳＲＳＱ  ＲＲＧＲＴＧＲＧＲＲ  ＧＩＹＲＦＶＴＰＧＥ  ＲＰＳＧＭＦＤＳＳＶ  ＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡ     ５００
ＷＹＥＬＴＰＡＥＴＳ  ＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰ  ＧＬＰＶＣＱＤＨＬＥ  ＦＷＥＳＶＦＴＧＬＴ  ＨＩＤＡＨＦＬＳＱＴ     ５５０
ＫＱＡＧＤＮＦＰＹＬ  ＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲ  ＡＱＡＰＰＰＳＷＤＱ  ＭＷＫＣＬＩＲＬＫＰ  ＴＬＨＧＰＴＰＬＬＹ     ６００
ＲＬＧＡＶＱＮＥＶＴ  ＬＴＨＰＩＴＫＹＩＭ  ＡＣＭＳＡＤＬＥＶＶ  Ｔ                                ６３１
ＮＳ４ａ、共通遺伝子型１ａ（配列番号１５）
ＳＴＷＶＬＶＧＧＶＬ  ＡＡＬＡＡＹＣＬＳＴ  ＧＣＶＶＩＶＧＲＩＶ  ＬＳＧＫＰＡＩＩＰＤ  ＲＥＶＬＹＱＥＦＤＥ     ５０
ＭＥＥＣ                                                                     ５４
ＮＳ４ｂ、共通遺伝子型１ａ（配列番号１６）
ＳＱＨＬＰＹＩＥＱＧ  ＭＭＬＡＥＱＦＫＱＫ  ＡＬＧＬＬＱＴＡＳＲ  ＨＡＥＶＩＴＰＡＶＱ  ＴＮＷＱＫＬＥＶＦＷ     ５０
ＡＫＨＭＷＮＦＩＳＧ  ＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬ  ＰＧＮＰＡＩＡＳＬＭ  ＡＦＴＡＡＶＴＳＰＬ  ＴＴＧＱＴＬＬＦＮＩ     １００
ＬＧＧＷＶＡＡＱＬＡ  ＡＰＧＡＡＴＡＦＶＧ  ＡＧＬＡＧＡＡＬＤＳ  ＶＧＬＧＫＶＬＶＤＩ  ＬＡＧＹＧＡＧＶＡＧ     １５０
ＡＬＶＡＦＫＩＭＳＧ  ＥＶＰＳＴＥＤＬＶＮ  ＬＬＰＡＩＬＳＰＧＡ  ＬＡＶＧＶＶＦＡＳＩ  ＬＲＲＲＶＧＰＧＥＧ     ２００
ＡＶＱＷＭＮＲＬＩＡ  ＦＡＳＲＧＮＨＶＳＰ  ＴＨＹＶＰＥＳＤＡＡ  ＡＲＶＴＡＩＬＳＳＬ  ＴＶＴＱＬＬＲＲＬＨ     ２５０
ＱＷＩＳＳＥＣＴＴＰ  Ｃ                                                                   ２６１
ＮＳ５ａ、共通遺伝子型１ａ（配列番号１７）
ＳＧＳＷＬＲＤＩＷＤ  ＷＩＣＥＶＬＳＤＦＫ  ＴＷＬＫＡＫＬＭＰＱ  ＬＰＧＩＰＦＶＳＣＱ  ＲＧＹＲＧＶＷＲＧＤ     ５０
ＧＩＭＨＴＲＣＨＣＧ  ＡＥＩＴＧＨＶＫＮＧ  ＴＭＲＩＶＧＰＲＴＣ  ＫＮＭＷＳＧＴＦＦＩ  ＮＡＹＴＴＧＰＣＴＰ     １００
ＬＰＡＰＮＹＫＦＡＬ  ＷＲＶＳＡＥＥＹＶＥ  ＩＲＲＶＧＤＦＨＹＶ  ＳＧＭＴＴＤＮＬＫＣ  ＰＣＱＩＰＳＰＥＦＦ     １５０
ＴＥＬＤＧＶＲＬＨＲ  ＦＡＰＰＣＫＰＬＬＲ  ＥＥＶＳＦＲＶＧＬＨ  ＥＹＰＶＧＳＱＬＰＣ  ＥＰＥＰＤＶＡＶＬＴ     ２００
ＳＭＬＴＤＰＳＨＩＴ  ＡＥＡＡＧＲＲＬＡＲ  ＧＳＰＰＳＭＡＳＳＳ  ＡＳＱＬＳＡＰＳＬＫ  ＡＴＣＴＡＮＨＤＳＰ     ２５０
ＤＡＥＬＩＥＡＮＬＬ  ＷＲＱＥＭＧＧＮＩＴ  ＲＶＥＳＥＮＫＶＶＩ  ＬＤＳＦＤＰＬＶＡＥ  ＥＤＥＲＥＶＳＶＰＡ     ３００
ＥＩＬＲＫＳＲＲＦＡ  ＰＡＬＰＶＷＡＲＰＤ  ＹＮＰＬＬＶＥＴＷＫ  ＫＰＤＹＥＰＰＶＶＨ  ＧＣＰＬＰＰＰＲＳＰ     ３５０
ＰＶＰＰＰＲＫＫＲＴ  ＶＶＬＴＥＳＴＬＰＴ  ＡＬＡＥＬＡＴＫＳＦ  ＧＳＳＳＴＳＧＩＴＧ  ＤＮＴＴＴＳＳＥＰＡ     ４００
ＰＳＧＣＰＰＤＳＤＶ  ＥＳＹＳＳＭＰＰＬＥ  ＧＥＰＧＤＰＤＬＳＤ  ＧＳＷＳＴＶＳＳＧＡ  ＤＴＥＤＶＶＣＣ   ４４８
ＮＳ５ｂ、共通遺伝子型１ａ（配列番号１８）
ＳＭＳＹＳＷＴＧＡＬ  ＶＴＰＣＡＡＥＥＱＫ  ＬＰＩＮＡＬＳＮＳＬ  ＬＲＨＨＮＬＶＹＳＴ  ＴＳＲＳＡＣＱＲＱＫ     ５０
ＫＶＴＦＤＲＬＱＶＬ  ＤＳＨＹＱＤＶＬＫＥ  ＶＫＡＡＡＳＫＶＫＡ  ＮＬＬＳＶＥＥＡＣＳ  ＬＴＰＰＨＳＡＫＳＫ     １００
ＦＧＹＧＡＫＤＶＲＣ  ＨＡＲＫＡＶＮＨＩＮ  ＳＶＷＫＤＬＬＥＤＳ  ＶＴＰＩＤＴＴＩＭＡ  ＫＮＥＶＦＣＶＱＰＥ     １５０
ＫＧＧＲＫＰＡＲＬＩ  ＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣ  ＥＫＭＡＬＹＤＶＶＳ  ＫＬＰＬＡＶＭＧＳＳ  ＹＧＦＱＹＳＰＧＱＲ     ２００
ＶＥＦＬＶＱＡＷＫＳ  ＫＫＴＰＭＧＦＳＹＤ  ＴＲＣＦＤＳＴＶＴＥ  ＳＤＩＲＴＥＥＡＩＹ  ＱＣＣＤＬＤＰＱＡＲ     ２５０
ＶＡＩＫＳＬＴＥＲＬ  ＹＶＧＧＰＬＴＮＳＲ  ＧＥＮＣＧＹＲＲＣＲ  ＡＳＧＶＬＴＴＳＣＧ  ＮＴＬＴＣＹＩＫＡＱ     ３００
ＡＡＣＲＡＡＧＬＲＤ  ＣＴＭＬＶＣＧＤＤＬ  ＶＶＩＣＥＳＡＧＶＱ  ＥＤＡＡＳＬＲＡＦＴ  ＥＡＭＴＲＹＳＡＰＰ     ３５０
ＧＤＰＰＱＰＥＹＤＬ  ＥＬＩＴＳＣＳＳＮＶ  ＳＶＡＨＤＧＡＧＫＲ  ＶＹＹＬＴＲＤＰＴＴ  ＰＬＡＲＡＡＷＥＴＡ     ４００
ＲＨＴＰＶＮＳＷＬＧ  ＮＩＩＭＦＡＰＴＬＷ  ＡＲＭＩＬＭＴＨＦＦ  ＳＶＬＩＡＲＤＱＬＥ  ＱＡＬＤＣＥＩＹＧＡ     ４５０
ＣＹＳＩＥＰＬＤＬＰ  ＰＩＩＱＲＬＨＧＬＳ  ＡＦＳＬＨＳＹＳＰＧ  ＥＩＮＲＶＡＡＣＬＲ  ＫＬＧＶＰＰＬＲＡＷ     ５００
ＲＨＲＡＲＳＶＲＡＲ  ＬＬＳＲＧＧＲＡＡＩ  ＣＧＫＹＬＦＮＷＡＶ  ＲＴＫＬＫＬＴＰＩＡ  ＡＡＧＱＬＤＬＳＧＷ     ５５０
ＦＴＡＧＹＳＧＧＤＩ  ＹＨＳＶＳＲＡＲＰＲ  ＷＦＷＦＣＬＬＬＬＡ  ＡＧＶＧＩＹＬＬＰＮ  Ｒ          ５９１
ＮＳ５ｂ、共通遺伝子型１ｂ（配列番号１９）
ＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬ  ＩＴＰＣＡＡＥＥＳＫ  ＬＰＩＮＡＬＳＮＳＬ  ＬＲＨＨＮＭＶＹＡＴ  ＴＳＲＳＡＳＱＲＱＫ     ５０
ＫＶＴＦＤＲＬＱＶＬ  ＤＤＨＹＲＤＶＬＫＥ  ＭＫＡＫＡＳＴＶＫＡ  ＫＬＬＳＶＥＥＡＣＫ  ＬＴＰＰＨＳＡＫＳＫ     １００
ＦＧＹＧＡＫＤＶＲＮ  ＬＳＳＫＡＶＮＨＩＲ  ＳＶＷＫＤＬＬＥＤＴ  ＥＴＰＩＤＴＴＩＭＡ  ＫＮＥＶＦＣＶＱＰＥ     １５０
ＫＧＧＲＫＰＡＲＬＩ  ＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣ  ＥＫＭＡＬＹＤＶＶＳ  ＴＬＰＱＡＶＭＧＳＳ  ＹＧＦＱＹＳＰＧＱＲ     ２００
ＶＥＦＬＶＮＡＷＫＳ  ＫＫＮＰＭＧＦＡＹＤ  ＴＲＣＦＤＳＴＶＴＥ  ＮＤＩＲＶＥＥＳＩＹ  ＱＣＣＤＬＡＰＥＡＲ     ２５０
ＱＡＩＲＳＬＴＥＲＬ  ＹＩＧＧＰＬＴＮＳＫ  ＧＱＮＣＧＹＲＲＣＲ  ＡＳＧＶＬＴＴＳＣＧ  ＮＴＬＴＣＹＬＫＡＳ     ３００
ＡＡＣＲＡＡＫＬＱＤ  ＣＴＭＬＶＣＧＤＤＬ  ＶＶＩＣＥＳＡＧＴＱ  ＥＤＡＡＳＬＲＶＦＴ  ＥＡＭＴＲＹＳＡＰＰ     ３５０
ＧＤＰＰＱＰＥＹＤＬ  ＥＬＩＴＳＣＳＳＮＶ  ＳＶＡＨＤＡＳＧＫＲ  ＶＹＹＬＴＲＤＰＴＴ  ＰＬＡＲＡＡＷＥＴＡ     ４００
ＲＨＴＰＶＮＳＷＬＧ  ＮＩＩＭＹＡＰＴＬＷ  ＡＲＭＩＬＭＴＨＦＦ  ＳＩＬＬＡＱＥＱＬＥ  ＫＡＬＤＣＱＩＹＧＡ     ４５０
ＣＹＳＩＥＰＬＤＬＰ  ＱＩＩＱＲＬＨＧＬＳ  ＡＦＳＬＨＳＹＳＰＧ  ＥＩＮＲＶＡＳＣＬＲ  ＫＬＧＶＰＰＬＲＶＷ     ５００
ＲＨＲＡＲＳＶＲＡＫ  ＬＬＳＱＧＧＲＡＡＴ  ＣＧＫＹＬＦＮＷＡＶ  ＲＴＫＬＫＬＴＰＩＰ  ＡＡＳＱＬＤＬＳＧＷ     ５５０
ＦＶＡＧＹＳＧＧＤＩ  ＹＨＳＬＳＲＡＲＰＲ  ＷＦＭＬＣＬＬＬＬＳ  ＶＧＶＧＩＹＬＬＰＮ  Ｒ          ５９１
ＮＳ３、遺伝子型１ａＤＥＣＨ−＞ＡＡＳＨ突然変異体（配列番号２０）
ＡＰＩＴＡＹＡＱＱＴ  ＲＧＬＬＧＣＩＩＴＳ  ＬＴＧＲＤＫＮＱＶＥ  ＧＥＶＱＩＶＳＴＡＡ  ＱＴＦＬＡＴＣＩＮＧ     ５０
ＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ  ＴＲＴＩＡＳＳＫＧＰ  ＶＩＱＭＹＴＮＶＤＱ  ＤＬＶＧＷＰＡＰＱＧ  ＡＲＳＬＴＰＣＴＣＧ     １００
ＳＳＤＬＹＬＶＴＲＨ  ＡＤＶＩＰＶＲＲＲＧ  ＤＳＲＧＳＬＬＳＰＲ  ＰＩＳＹＬＫＧＳＳＧ  ＧＰＬＬＣＰＡＧＨＡ     １５０
ＶＧＩＦＲＡＡＶＣＴ  ＲＧＶＡＫＡＶＤＦＩ  ＰＶＥＮＬＥＴＴＭＲ  ＳＰＶＦＴＤＮＳＳＰ  ＰＡＶＰＱＳＦＱＶＡ     ２００
ＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫ  ＳＴＫＶＰＡＡＹＡＡ  ＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰ  ＳＶＡＡＴＬＧＦＧＡ  ＹＭＳＫＡＨＧＩＤＰ     ２５０
ＮＩＲＴＧＶＲＴＩＴ  ＴＧＳＰＩＴＹＳＴＹ  ＧＫＦＬＡＤＧＧＣＳ  ＧＧＡＹＤＩＩＩＣＡ  ＡＳＨＳＴＤＡＴＳＩ     ３００
ＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡ  ＥＴＡＧＡＲＬＶＶＬ  ＡＴＡＴＰＰＧＳＶＴ  ＶＰＨＰＮＩＥＥＶＡ  ＬＳＴＴＧＥＩＰＦＹ     ３５０
ＧＫＡＩＰＬＥＶＩＫ  ＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳ  ＫＫＫＣＤＥＬＡＡＫ  ＬＶＡＬＧＩＮＡＶＡ  ＹＹＲＧＬＤＶＳＶＩ     ４００
ＰＴＳＧＤＶＶＶＶＡ  ＴＤＡＬＭＴＧＹＴＧ  ＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴ  ＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬ  ＤＰＴＦＴＩＥＴＴＴ     ４５０
ＬＰＱＤＡＶＳＲＴＱ  ＲＲＧＲＴＧＲＧＫＰ  ＧＩＹＲＦＶＡＰＧＥ  ＲＰＳＧＭＦＤＳＳＶ  ＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡ     ５００
ＷＹＥＬＴＰＡＥＴＴ  ＶＲＬＲＡＹＭＮＴＰ  ＧＬＰＶＣＱＤＨＬＥ  ＦＷＥＧＶＦＴＧＬＴ  ＨＩＤＡＨＦＬＳＱＴ     ５５０
ＫＱＳＧＥＮＦＰＹＬ  ＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲ  ＡＱＡＰＰＰＳＷＤＱ  ＭＷＫＣＬＩＲＬＫＰ  ＴＬＨＧＰＴＰＬＬＹ     ６００
ＲＬＧＡＶＱＮＥＶＴ  ＬＴＨＰＶＴＫＹＩＭ  ＴＣＭＳＡＤＬＥＶＶ  Ｔ                                ６３１
ＮＳ３、遺伝子型１ｂＤＥＣＨ−＞ＡＡＳＨ突然変異体（配列番号２１）
ＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴ  ＲＧＬＬＧＣＩＩＴＳ  ＬＴＧＲＤＫＮＱＶＥ  ＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴ  ＱＳＦＬＡＴＣＶＮＧ     ５０
ＶＣＷＴＶＹＨＧＡＧ  ＳＫＴＬＡＧＰＫＧＰ  ＩＴＱＭＹＴＮＶＤＱ  ＤＬＶＧＷＱＡＰＰＧ  ＡＲＳＬＴＰＣＴＣＧ     １００
ＳＳＤＬＹＬＶＴＲＨ  ＡＤＶＩＰＶＲＲＲＧ  ＤＳＲＧＳＬＬＳＰＲ  ＰＶＳＹＬＫＧＳＳＧ  ＧＰＬＬＣＰＳＧＨＡ     １５０
ＶＧＩＦＲＡＡＶＣＴ  ＲＧＶＡＫＡＶＤＦＶ  ＰＶＥＳＭＥＴＴＭＲ  ＳＰＶＦＴＤＮＳＳＰ  ＰＡＶＰＱＴＦＱＶＡ     ２００
ＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫ  ＳＴＫＶＰＡＡＹＡＡ  ＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰ  ＳＶＡＡＴＬＧＦＧＡ  ＹＭＳＫＡＨＧＶＤＰ     ２５０
ＮＩＲＴＧＶＲＴＩＴ  ＴＧＡＰＩＴＹＳＴＹ  ＧＫＦＬＡＤＧＧＣＳ  ＧＧＡＹＤＩＩＩＣＡ  ＡＳＨＳＴＤＳＴＴＩ     ３００
ＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡ  ＥＴＡＧＡＲＬＶＶＬ  ＡＴＡＴＰＰＧＳＶＴ  ＶＰＨＰＮＩＥＥＶＡ  ＬＳＮＴＧＥＩＰＦＹ     ３５０
ＧＫＡＩＰＩＥＴＩＫ  ＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳ  ＫＫＫＣＤＥＬＡＡＫ  ＬＳＧＬＧＬＮＡＶＡ  ＹＹＲＧＬＤＶＳＶＩ     ４００
ＰＴＳＧＤＶＶＶＶＡ  ＴＤＡＬＭＴＧＦＴＧ  ＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴ  ＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬ  ＤＰＴＦＴＩＥＴＴＴ     ４５０
ＶＰＱＤＡＶＳＲＳＱ  ＲＲＧＲＴＧＲＧＲＲ  ＧＩＹＲＦＶＴＰＧＥ  ＲＰＳＧＭＦＤＳＳＶ  ＬＣＥＣＹＤＡＧＣＡ     ５００
ＷＹＥＬＴＰＡＥＴＳ  ＶＲＬＲＡＹＬＮＴＰ  ＧＬＰＶＣＱＤＨＬＥ  ＦＷＥＳＶＦＴＧＬＴ  ＨＩＤＡＨＦＬＳＱＴ     ５５０
ＫＱＡＧＤＮＦＰＹＬ  ＶＡＹＱＡＴＶＣＡＲ  ＡＱＡＰＰＰＳＷＤＱ  ＭＷＫＣＬＩＲＬＫＰ  ＴＬＨＧＰＴＰＬＬＹ     ６００
ＲＬＧＡＶＱＮＥＶＴ  ＬＴＨＰＩＴＫＹＩＭ  ＡＣＭＳＡＤＬＥＶＶ  Ｔ                                ６３１
ＮＳ５ｂ、遺伝子型１ａＧＤＤ−＞ＧＮＨ突然変異体（配列番号２２）
ＳＭＳＹＳＷＴＧＡＬ  ＶＴＰＣＡＡＥＥＱＫ  ＬＰＩＮＡＬＳＮＳＬ  ＬＲＨＨＮＬＶＹＳＴ  ＴＳＲＳＡＣＱＲＱＫ     ５０
ＫＶＴＦＤＲＬＱＶＬ  ＤＳＨＹＱＤＶＬＫＥ  ＶＫＡＡＡＳＫＶＫＡ  ＮＬＬＳＶＥＥＡＣＳ  ＬＴＰＰＨＳＡＫＳＫ     １００
ＦＧＹＧＡＫＤＶＲＣ  ＨＡＲＫＡＶＮＨＩＮ  ＳＶＷＫＤＬＬＥＤＳ  ＶＴＰＩＤＴＴＩＭＡ  ＫＮＥＶＦＣＶＱＰＥ     １５０
ＫＧＧＲＫＰＡＲＬＩ  ＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣ  ＥＫＭＡＬＹＤＶＶＳ  ＫＬＰＬＡＶＭＧＳＳ  ＹＧＦＱＹＳＰＧＱＲ     ２００
ＶＥＦＬＶＱＡＷＫＳ  ＫＫＴＰＭＧＦＳＹＤ  ＴＲＣＦＤＳＴＶＴＥ  ＳＤＩＲＴＥＥＡＩＹ  ＱＣＣＤＬＤＰＱＡＲ     ２５０
ＶＡＩＫＳＬＴＥＲＬ  ＹＶＧＧＰＬＴＮＳＲ  ＧＥＮＣＧＹＲＲＣＲ  ＡＳＧＶＬＴＴＳＣＧ  ＮＴＬＴＣＹＩＫＡＱ     ３００
ＡＡＣＲＡＡＧＬＲＤ  ＣＴＭＬＶＣＧＮＬＬ  ＶＶＩＣＥＳＡＧＶＱ  ＥＤＡＡＳＬＲＡＦＴ  ＥＡＭＴＲＹＳＡＰＰ     ３５０
ＧＤＰＰＱＰＥＹＤＬ  ＥＬＩＴＳＣＳＳＮＶ  ＳＶＡＨＤＧＡＧＫＲ  ＶＹＹＬＴＲＤＰＴＴ  ＰＬＡＲＡＡＷＥＴＡ     ４００
ＲＨＴＰＶＮＳＷＬＧ  ＮＩＩＭＦＡＰＴＬＷ  ＡＲＭＩＬＭＴＨＦＦ  ＳＶＬＩＡＲＤＱＬＥ  ＱＡＬＤＣＥＩＹＧＡ     ４５０
ＣＹＳＩＥＰＬＤＬＰ  ＰＩＩＱＲＬＨＧＬＳ  ＡＦＳＬＨＳＹＳＰＧ  ＥＩＮＲＶＡＡＣＬＲ  ＫＬＧＶＰＰＬＲＡＷ     ５００
ＲＨＲＡＲＳＶＲＡＲ  ＬＬＳＲＧＧＲＡＡＩ  ＣＧＫＹＬＦＮＷＡＶ  ＲＴＫＬＫＬＴＰＩＡ  ＡＡＧＱＬＤＬＳＧＷ     ５５０
ＦＴＡＧＹＳＧＧＤＩ  ＹＨＳＶＳＲＡＲＰＲ  ＷＦＷＦＣＬＬＬＬＡ  ＡＧＶＧＩＹＬＬＰＮ  Ｒ          ５９１
ＮＳ５ｂ、遺伝子型１ｂＧＤＤ−＞ＧＮＨ突然変異体（配列番号２３）
ＳＭＳＹＴＷＴＧＡＬ  ＩＴＰＣＡＡＥＥＳＫ  ＬＰＩＮＡＬＳＮＳＬ  ＬＲＨＨＮＭＶＹＡＴ  ＴＳＲＳＡＳＱＲＱＫ     ５０
ＫＶＴＦＤＲＬＱＶＬ  ＤＤＨＹＲＤＶＬＫＥ  ＭＫＡＫＡＳＴＶＫＡ  ＫＬＬＳＶＥＥＡＣＫ  ＬＴＰＰＨＳＡＫＳＫ     １００
ＦＧＹＧＡＫＤＶＲＮ  ＬＳＳＫＡＶＮＨＩＲ  ＳＶＷＫＤＬＬＥＤＴ  ＥＴＰＩＤＴＴＩＭＡ  ＫＮＥＶＦＣＶＱＰＥ     １５０
ＫＧＧＲＫＰＡＲＬＩ  ＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣ  ＥＫＭＡＬＹＤＶＶＳ  ＴＬＰＱＡＶＭＧＳＳ  ＹＧＦＱＹＳＰＧＱＲ     ２００
ＶＥＦＬＶＮＡＷＫＳ  ＫＫＮＰＭＧＦＡＹＤ  ＴＲＣＦＤＳＴＶＴＥ  ＮＤＩＲＶＥＥＳＩＹ  ＱＣＣＤＬＡＰＥＡＲ     ２５０
ＱＡＩＲＳＬＴＥＲＬ  ＹＩＧＧＰＬＴＮＳＫ  ＧＱＮＣＧＹＲＲＣＲ  ＡＳＧＶＬＴＴＳＣＧ  ＮＴＬＴＣＹＬＫＡＳ     ３００
ＡＡＣＲＡＡＫＬＱＤ  ＣＴＭＬＶＣＧＮＬＬ  ＶＶＩＣＥＳＡＧＴＱ  ＥＤＡＡＳＬＲＶＦＴ  ＥＡＭＴＲＹＳＡＰＰ     ３５０
ＧＤＰＰＱＰＥＹＤＬ  ＥＬＩＴＳＣＳＳＮＶ  ＳＶＡＨＤＡＳＧＫＲ  ＶＹＹＬＴＲＤＰＴＴ  ＰＬＡＲＡＡＷＥＴＡ     ４００
ＲＨＴＰＶＮＳＷＬＧ  ＮＩＩＭＹＡＰＴＬＷ  ＡＲＭＩＬＭＴＨＦＦ  ＳＩＬＬＡＱＥＱＬＥ  ＫＡＬＤＣＱＩＹＧＡ     ４５０
ＣＹＳＩＥＰＬＤＬＰ  ＱＩＩＱＲＬＨＧＬＳ  ＡＦＳＬＨＳＹＳＰＧ  ＥＩＮＲＶＡＳＣＬＲ  ＫＬＧＶＰＰＬＲＶＷ     ５００
ＲＨＲＡＲＳＶＲＡＫ  ＬＬＳＱＧＧＲＡＡＴ  ＣＧＫＹＬＦＮＷＡＶ  ＲＴＫＬＫＬＴＰＩＰ  ＡＡＳＱＬＤＬＳＧＷ     ５５０
ＦＶＡＧＹＳＧＧＤＩ  ＹＨＳＬＳＲＡＲＰＲ  ＷＦＭＬＣＬＬＬＬＳ  ＶＧＶＧＩＹＬＬＰＮ  Ｒ          ５９１
【００８３】
本発明のワクチン組成物における１つ以上の抗原またはその誘導体の使用の選択は、組換え抗原をうまく発現し、分泌するために最適な細菌の能力および／または抗原特有のＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を開始するための組換え抗原の能力の査定を含む、様々な方法で実施することができる。以下に記載があるとおり、特定の細菌送達手段で使用するための抗原の最終選択に達するためには、組換え抗原のこれらの属性は、先天性免疫応答ならびに組換え発現したＨＣＶ抗原に対する抗原特有のＴ細胞応答の両方を開始するため、好ましくは完全なワクチンプラットフォームの能力と結び付けられる（ＨＣＶ抗原に対して選択された細菌発現システムを意味する）。
【００８４】
適切な抗原の仮決定は、選択した細菌宿主（例、リステリア）によってうまく組換え発現され免疫原性である抗原または抗原断片を選択することによって行うことができる。本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、抗原が、抗原特有のＴ細胞応答（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋）を誘導することが可能であることを意味している。好ましいＨＣＶ抗原またはその誘導体は、１つ以上の以下のポリペプチド配列を含む。ＩＰＶＥＮＬＥＴＴＭＲＳＰＶＦ（配列番号１）、ＮＬＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳ（配列番号２）、ＰＰＡＶＰＱＳＦＱＶＡＨＬＨＡ（配列番号３）、ＰＱＳＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧＳ（配列番号４）、ＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫＳ（配列番号５）．他の好ましいＨＣＶ抗原またはその誘導体は、ＮＳ３から１つ以上の以下のポリペプチド配列を含む。
ＬＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳＳＰＰＶＶＰ（配列番号４２）：
ＳＰＶＦＴＤＮＳＳＰＰＡＶＰＱ（配列番号４３）：
ＶＰＱＳＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧ（配列番号４４）：
ＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫＳ（配列番号４５）：
ＫＶＰＡＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶ（配列番号４６）：
ＰＡＡＹＡＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡ（配列番号４７）：
ＡＡＫＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡ（配列番号４８）：
ＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡ（配列番号４９）：
ＡＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡ（配列番号５０）：
ＱＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡ（配列番号５１）：
ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ（配列番号５２）：
ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴＬＧＦＧＡＹ（配列番号５３）：
ＧＶＲＴＩＴＴＧＳＰＩＴＹＳＴＹＧＫＦＬ（配列番号５４）：
ＩＴＹＳＴＹＧＫＦＬＡＤＧＧＣＳＧＧＡＹ（配列番号５５）：
ＬＡＤＡＧＣＳＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥ（配列番号５６）：
ＧＧＡＹＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴ（配列番号５７）：
ＤＩＩＩＣＤＥＣＨＳＴＤＡＴＳ（配列番号５８）：
ＴＤＡＴＳＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥＴＡＧ（配列番号５９）：
ＡＴＳＩＬＧＩＧＴＶＬＤＱＡＥ（配列番号６０）：
ＶＩＫＧＧＲＨＬＩＦＣＨＳＫＫＫＣＤ（配列番号６１）：
ＧＲＨＬＩＦＣＨＳＫＲ（配列番号６２）：
ＫＣＤＥＬＡＡＫＬＶＡＬＧＩＮ（配列番号６３）：
ＧＩＮＡＶＡＹＹＲＧＬＤＶＳＶＩＰＴＳＧ（配列番号６４）：
ＩＰＴＮＧＤＶＶＶＶＳＴＤＡＬＭＴＧ（配列番号６５）：
ＡＬＭＴＧＹＴＧＤＦＤＳＶＩＤ（配列番号６６）：
ＤＦＤＳＶＩＤＣＮＴＣＶＴＱＴＶＤＦ（配列番号６７）：
ＳＶＩＤＣＮＴＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬＤＰＴ（配列番号６８）：
ＣＮＴＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬＤＰＴＦＴ（配列番号６９）：
ＮＴＣＶＴＱＴＶＤＦＳＬＤＰＴ（配列番号７０）：
ＰＴＦＴＩＥＴＴＴＬＰＱＤＡＶＳＲＴ（配列番号７１）：
ＴＱＴＶＤＦＳＬＤＰＴＦＴＩＥ（配列番号７２）：
ＥＱＹＶＤＦＳＬＤＰＴＦＳＩＥ（配列番号７３）：
および／またはＮＳ５ｂから１つ以上の以下のポリペプチド配列。
ＬＲＨＨＮＬＶＹＳＴＴＳＲＳＡＣＱＲＱＫ（配列番号７４）：
ＫＶＴＦＤＲＬＱＶＬＤＳＨＹＱＤＶＬＫＥ（配列番号７５）：
ＳＶＷＫＤＬＬＥＤＮＶＴＰＩＤＴＴＩＭＡ（配列番号７６）：
ＫＧＧＲＫＰＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣ（配列番号７７）：
ＫＰＡＲＬＩＶＦＰＤＬＧＶＲＶＣＥＫ（配列番号７８）：
ＫＬＰＬＡＶＭＧＳＳＹＧＦＱＹＳＰＧＱＲ（配列番号７９）：
ＶＥＦＬＶＱＡＷＫＳＫＫＴＰＭＧＦＳＹＤ（配列番号８０）：
ＳＤＩＲＴＥＥＡＩＹＱＣＣＤＬＤＰＱＡＲ（配列番号８１）：
ＱＣＣＤＬＤＰＱＡＲＶＡＩＫＳＬＴＥＲＬ（配列番号８２）：
ＧＹＲＲＣＲＡＳＧＶＬＴ（配列番号８３）。
【００８５】
組換え抗原を発現し分泌するために選択した細菌の能力は、以下に記載するように、疎水性プロットによって推測することができ／または直接ウエスタンブロット分析によって測定することができる。
【００８６】
ある実施形態では、ＨＣＶ抗原は、目的のＨＣＶ抗原と構成される融合の一部として使用されるリステリアＡｃｔＡタンパク質またはその断片のピーク疎水性を超える疎水性の領域を有さないように選択される。最も好ましくは、ＨＣＶ抗原は、リステリアＡｃｔＡ−Ｎ１００のピーク疎水性を超える疎水性の領域を有さないように選択される。
【００８７】
ウエスタンブロットにおいて、組換え抗原の発現の直接観測は、組換えによって産生されるＨＣＶ抗原配列を検出する抗体を使用してまたは融合タンパク質としてＨＣＶ抗原と発現する非ＣＨＶ配列（「タグ」）を検出する抗体を使用して行うことができる。以下に記載した例において、抗原は、リステリアＡｃｔＡタンパク質のＮ末端部分との融合として発現され、成熟Ｎ末端１８ＡｃｔＡのアミノ酸に対応する合成ペプチドに反して起きた抗ＡｃｔＡ抗体（ＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫ（配列番号２４））は、タンパク質産物の出現を検出するために使用することができる。
【００８８】
抗原の免疫原性を検査するための分析は、本明細書に記載され、よく当技術分野で知られている。例として、選択した細菌によって組換えにより産生された抗原は、抗原のカルボキシル末端でインフレームに位置する８アミノＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２５）ペプチド（別名ＳＬ８およびｏｖａｌｂｕｍｉｎ２５７−２６４）をコードする核酸配列を含むために、随意に構成され得る。Ｃ末端ＳＬ８エピトープ等の組成物は、（ｉ）組換え抗原がＮ末端からＣ末端まで全体において発現されることを証明するため、そして（ｉｉ）インビトロ抗原提示分析を使用してＭＨＣクラスＩ経路を介して組換え抗原を提示するための抗原提示細胞の能力を証明するために、代理として機能する。そのような提示分析は、以下に記載するＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマ細胞株と一緒にクローン化したＣ５７ＢＬ／６派生の樹状細胞株ＤＣ２．４を使用して、行うことができる。
【００８９】
あるいは、またはさらに、免疫原性は、以下に記載されるＥＬＩＳＰＯＴ分析を使用して検査することができる。ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、本来は抗原特有の抗体を分泌するＢ細胞を列挙するために開発されたが、その後各種タスク、特に単一細胞レベルでのサイトカイン産生細胞の同定および列挙に適合された。脾臓は、適切な細菌ワクチン、およびを接種した動物、および細胞ワクチンで発現する１つ以上のＨＣＶ抗原に由来するペプチドでまたはペプチドなしで一晩培養した単離脾細胞から採取することができる。固定化抗体は、どの分泌されたＩＦＮ−γも捕らえる、したがって分泌されたＩＦＮ−γおよびワクチンに対する免疫応答の査定の事後測定を可能にする。
【００９０】
３．細菌発現系−「ワクチンプラットフォーム」
【００９１】
共通配列抗原の送達のためのワクチンプラットフォームの選択は、効果的なワクチンのための別の重要な要素である。シゲラ・フレックスネリ、大腸菌、リステリア・モノサイトゲネス、エンテロコリチカ菌、ネズミチフス菌、チフス菌、またはマイクロバクテリア菌種を含むがこれに限定されるものではない．多くの細菌種は、ワクチンとして使用するために開発されており、本発明で使用することができる。このリストは、限定されるものではありません。例えば、国際公開第０４／００６８３７号、国際公開第０７／１０３２２５号、および国際公開第０７／１１７３７１号のそれぞれを参照されたく、それぞれ、すべての表、図、および請求項を含んで、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ワクチン組成物に使用される細菌ベクターは、通性の細胞内細菌ベクターであり得る。細菌は、本明細書で記載されるポリペプチドを宿主生物における、抗原提示細胞へ送達するために使用することができる。本明細書で記載されるとおり、リステリア・モノサイトゲネスは、ＨＣＶ抗原の発現のために好ましいワクチンプラットフォームを提供する。
【００９２】
弱毒化および共生の両方の微生物は、ワクチン抗原のキャリアとしての使用に成功しているが、ＨＣＶ抗原の細菌キャリアまたはその誘導体は、随意に弱毒化または不活化されるが代謝的に活発（ＫＢＭＡ）である。製剤に使用されているキャリア株の遺伝的背景、弱化に成功するために選択された突然変異の種類、および免疫原の固有特性は、誘発された免疫応答の範囲および質を最適化するために調節することができる。細菌キャリアによって刺激される免疫応答を最適化するために考慮される一般的な要因は、キャリアの選択、特定背景の株、突然変異の弱毒化および弱毒化のレベル、弱毒化表現型の安定化および最適用量の確立を含む。考慮するべき他の抗原に関連した要因は、抗原の固有特性、発現系、抗原表示形態および組換え表示型の安定化、分子の調節およびワクチン接種スケジュールの同時発現を含む。
【００９３】
ワクチンプラットフォームの好ましい特性は、組換え発現したＨＣＶ抗原に対する先天性免疫応答ならびに抗原特有のＴ細胞応答の両方を開始する。例えば、本明細書に記載されるＨＣＶ抗原を発現するリステリア・モノサイトゲネスは、肝内のタイプ１インターフェロン（ＩＮＦ−α／β）およびケモカインおよびサイトカインの下流縦列を誘発する。この肝内の免疫刺激の応答において、ＮＫ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、肝臓に補充される。これらの細胞は、Ｔ細胞応答がＬｍを全滅するために開始するように活性化される、同時にリステリア・モノサイトゲネスワクチンプラットフォームによって発現するＨＣＶ抗原に対するＴ細胞応答も同様に開始する。ある実施形態では、本発明のワクチンプラットフォームは、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、およびＭＣＰ−１からなる群から選択されたサイトカインおよびケモカインの１つ以上、および好ましくはすべての血清濃度で対象にワクチンプラットフォームを送達後２４時間にて増加を誘発し、ワクチンプラットフォームによって発現される１つ以上のＨＣＶ抗原に対するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋抗原特有のＴ細胞応答を誘発する。他の実施形態において、本発明のワクチンプラットフォームは、同様に、マウスモデル系において、ＤＸ５、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ４３等の活性化マーカーの上方調節によってまたは、標的細胞として使用された５１Ｃｒ−ラベル付のＹＡＣ−１細胞を使用して測定されたＮＫ細胞媒介の細胞溶解活性によって証明された常在未成熟肝臓ＮＫ細胞の成熟を誘発する。
【００９４】
各種の実施形態にて、本発明のワクチンおよび免疫原性組成物は、所望のＨＣＶ抗原を発現するように構成されるリステリア・モノサイトゲネスを含むことができる。ワクチンベクターとして機能するリステリア・モノサイトゲネスの能力は、Ｗｅｓｉｋｉｒｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １５８：１５９−１６９  （１９９７）で論評されている。リステリア・モノサイトゲネスの自然生物学の所望の特性の多くは、それをＨＣＶ治療ワクチンの用途に対して誘引プラットフォームにする。中心的な論理的根拠は、リステリア・モノサイトゲネスの細菌内のライフサイクルが、ＨＣＶ感染の消散に必要であるとして知られているＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の効果的な刺激を可能にすることである。ＴＬＲ（ＴＬＲ２、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９）およびヌクレオチド結合オリゴマー化領域（ＮＯＤ）を含む複数の病原体特異的分子パターン（ＰＡＭＰ）受容体は、感染時にリステリア・モノサイトゲネス高分子との相互作用に応じて誘発され、ＨＣＶ共通配列抗原に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の開発に深刻な影響を与える、先天性免疫エフェクターの全活性化およびＴｈ−１偏光サイトカインの放出という結果をもたらす。強力な肝内免疫応答を引き起こす肝臓に常在するＡＰＣの向性のため、Ｌｍは、特にＨＣＶワクチンによく適している。
【００９５】
リステリア・モノサイトゲネス株は、近年、癌およびＨＩＶ等の病原体の注入を認めない臨床症状への免疫応答を誘発するために抗原の送達を免疫系へ提供する異種タンパク質の効果的な細菌内送達手段として開発されている。米国特許第６，０５１，２３７号、Ｇｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６７：６４７１−６４７９（２００１）、Ｌｉａｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６２：２２８７−２２９３（２００２）、米国特許第６，０９９，８４８号、国際公開第９９／２５３７６号、国際公開第９６／１４０８７号、および米国特許第５，８３０，７０２号）のそれぞれを参照されたく、これらはそれぞれ、すべての表、図、および特許請求の範囲を含んで、その全体が参照として組み込まれる。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）抗原を発現する組換えリステリア・モノサイトゲネスワクチンは、同様に抗原に保護細胞を仲介する免疫を誘発するように示されている（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２：３９８７−３９９１（１９９５）。
【００９６】
弱毒化および不活化されるが代謝的に活性な免疫原性組成物に有用なリステリア・モノサイトゲネスの形態が産生されている（国際公開第０７／１０３２２５号、および国際公開第０７／１１７３７１号、それぞれ、すべての表、図、および特許請求の範囲を含んで、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。リステリア・モノサイトゲネスのＡｃｔＡタンパク質は、細菌内移動の原因であるアクチン補充および重合現象促進するために十分である。人間の安全性試験は、リステリア・モノサイトゲネスのａｃｔＡ／ｐｌｃＢ除去弱毒化形態の経口投与が、成人において深刻な続発症を引き起こすことがないことを報告している（Ａｎｇｅｌａｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７０：３５９２−３６０１（２００２））。  他のリステリア・モノサイトゲネスの弱毒化形態の種類も同様に、記載されている（例えば、栄養要求、異種抗原を発現するリステリア弱毒化株を記載する、国際公開第９９／２５３７６号および米国特許第６，０９９，８４８号を参照）。
【００９７】
ある実施形態では、本発明のワクチン組成物に使用されるリステリア・モノサイトゲネスは、ａｃｔＡおよび／またはｉｎｌＢにおける弱毒突然変異を含む弱毒生株であり、好ましくは、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢのすべてまたは一部の欠失（本明細書では「ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ」と称される）であり、目的のＨＣＶ抗原の発現をコードする組換えを含む。最も好ましくは、これらの抗原は、ＮＳ５Ｂ、ＮＳ３共通配列抗原の内１つまたは両方に由来する１つ以上の免疫原性配列を含む。ＨＣＶ抗原は、好ましくは、細胞発現配列の支配下にあり、安定的にリステリア・モノサイトゲネスゲノムに組み込まれている。そのようなリステリア・モノサイトゲネスワクチン株は、したがって真核生物転写または翻訳要素を用いない。
【００９８】
本発明は、同様に少なくとも１つの限定因子、例えばプロモーターまたは転写因子におけるリステリア弱毒化を検討する。以下は、プロモーターに関する。ＡｃｔＡ発現は、２つの異なるプロモーターによって調節される（Ｌａｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４１７７−４１８６）。同時に、ｉｎｌＡおよびｉｎｌＢ発現は、５つのプロモーターによって調節される（Ｌｉｎｇｎａｕ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．６３：３８９６−３９０３）。転写因子ｐｒｆＡは、多くのリステリア・モノサイトゲネス遺伝子の転写、例えばｈｌｙ、ｐｌｃＡ，ＡｃｔＡ、ｍｐｌ、ｐｒｆＡおよびｉａｐに必要である。ＰｒｆＡの調節性質は、例えばＰｒｆＡ依存プロモーター（ＰｉｎｌＣ）およびＰｒｆＡ−ｂｏｘによって仲介される。本発明は、ある実施形態では、少なくとも１つのＡｃｔＡプロモーター、ｉｎｌＢプロモーター、ＰｒｆＡ、ＰｉｎｌＣ、ＰｒｆＡボックス等において不活性化、突然変異、または欠失したものをコードする核酸を提供する（例えば、Ｌａｌｉｃ  Ｍｕｌｌｔｈａｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１１１−１２０、Ｓｈｅｔｒｏｎ−Ｒａｍａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：１５３７‐１５５１、Ｌｕｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：３９‐５２を参照）。ＰｒｆＡは、Ｇｌｙ１４５Ｓｅｒ突然変異、Ｇｌｙ１５５Ｓｅｒ突然変異、またはＧｌｕ７７Ｌｙｓ突然変異によって構成的活性型にすることができる。（例えば、Ｍｕｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｔａｇ（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：１９１７−１９２６、Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｔａｇ（２００４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｉｏｌ．１８６：６２６５‐６２７６、Ｒｉｐｉｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：１５３３−１５４０を参照）。
【００９９】
弱毒化は、例えば加熱処理または化学修飾によって生じることができる。弱毒化は、同様に、例えば、代謝、細胞外増殖、または細胞内増殖、リステリアｐｒｆＡ、ＡｃｔＡ、リステリオリシン（ＬＬＯ）および接着仲介因子（例えば、ｉｎｌＡまたはｉｎｌＢ等のインターナリン）、ｍｐｌ、ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣ（ＰＣ−ＰＬＣ）、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ  ＰＬＣ、ｐｌｃＡ遺伝子）、上記のいずれかの組み合わせ等の毒性因子をコードする核酸の遺伝子組み換えを調節する核酸の遺伝子組み換えによって生じることができる。弱毒化は、対応する適切な親リステリアによって示された生物学的機能と弱毒化リステリアの生物学的機能を比較することによって査定することができる。
【０１００】
本発明は、他の実施形態にて、架橋剤、ソラレン、ナイトロジェンマスタード、シスプラチン、かさ高い付加物、紫外線、γ線照射、それらのいずれかの組み合わせ等の核酸対象薬剤で治療することによって弱毒化するリステリアを提供する。通常、架橋剤の１つの分子によって産出される障害は、二重らせんの両方の構造の架橋結合に関与する。本発明のリステリアは、同様に、例えば、ｕｖｒＡ、ｕｖｒＢ、ｕｖｒＡＢ、ｕｖｒＣ、ｕｖｒＤ、ｕｖｒＡＢ、ｐｈｒＡ、および／または例えばｒｅｃＡ等、組換え修復を仲介する遺伝子の核酸修復遺伝子の少なくとも１つを、突然変異することによって弱毒化することができる。さらに、本発明は、核酸対象薬剤および核酸修復遺伝子を仲介することの両方によってリステリア弱毒化を提供する。また、本発明は、ソラレン等の核酸対象薬剤、および／またはソラレン等の感光性核酸架橋剤での治療、その後に紫外線への暴露を包含する。
【０１０１】
本発明において有用な弱毒化リステリアは、例えば、米国特許公開第２００４／０２２８８７７号および第２００４／０１９７３４３号に記載され、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。リステリアの特定の株が所望の弱毒化を提供するかを査定するための各種の分析は、例えば、米国特許第２００４／０２２８８７７号、第２００４／０１９７３４３号、および第２００５／０２４９７４８号において提供され、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
他の実施形態において、本発明のワクチン組成物に使用されるリステリア・モノサイトゲネスは、ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢに由来する不活化されるが代謝的に活性な（ＫＢＭＡ）プラットフォームであり、同様にヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路のＤＮＡ回復酵素をコードする遺伝子、ｕｖｒＡおよびｕｖｒＢの両方が失欠され、目的のＨＣＶ抗原の発現をコードする組換えＤＮＡを含む。これらの抗原は、最も好ましくは、取得したＮＳ５Ｂ、ＮＳ３共通配列抗原の１つまたは両方に由来する１つ以上の免疫原性配列を含む。ＨＣＶ抗原は、好ましくは、細胞発現配列の支配下にあり、安定的にリステリア・モノサイトゲネスゲノムに組み込まれている。ＫＢＭＡプラットフォームは、合成ソラレン、Ｓ−５９、および長波長紫外線光線での併用治療による光化学不活性化に対して非常に敏感である。不活化であるが、ＫＢＭＡ  Ｌｍワクチンは、過度的に、遺伝子産物を発現することができ、ファゴリソソームから逸脱することならびに機能細胞性免疫および野生型ＷＴ  Ｌｍおよびワクシニアウイルス攻撃に対する予防を誘発することを可能にする。
【０１０３】
ある実施形態では、弱毒化またはＫＢＭＡリステリア・モノサイトゲネスワクチン株は、（本明細書で、ＰｒｆＡ＊突然変異体として称される）構成的に活性なＰｒｆＡ遺伝子を含む。ＰｒｆＡは、病原性遺伝子の発現を誘発し、適切に設計されたワクチン株において異種抗原（Ａｇｓ）をコードした細菌内で活性化した転写因子である。上記に記載されたように、ＡｃｔＡ遺伝子の発現は、ｐｒｆＡに応答し、ＡｃｔＡプロモーターは、ｐｒｆＡ応答調節要素である。ｐｒｆＡ  Ｇ１５５Ｓ対立遺伝子の封入は、重大な弱毒生またはＫＢＭＡワクチンの増強されたワクチン効能を与えることができる。好ましいＰｒｆＡ突然変異体は、２００８年５月１９日に出願されたＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧ  ＰＲＦＡ＊  ＭＵＴＡＮＴ  ＬＩＳＴＥＲＩＡ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦと題された米国仮特許仮出願第６１／０５４，４５４号に記載され、これは、すべての表、図、および特許請求の範囲を含んで、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
残基１５５のグリシンを含むリステリア・モノサイトゲネスＰｒｆＡの配列は、以下のとおりである。（配列番号２６）
ＭＮＡＱＡＥＥＦＫＫ  ＹＬＥＴＮＧＩＫＰＫ  ＱＦＨＫＫＥＬＩＦＮ  ＱＷＤＰＱＥＹＣＩＦ  ＬＹＤＧＩＴＫＬＴＳ     ５０
ＩＳＥＮＧＴＩＭＮＬ  ＱＹＹＫＧＡＦＶＩＭ  ＳＧＦＩＤＴＥＴＳＶ  ＧＹＹＮＬＥＶＩＳＥ  ＱＡＴＡＹＶＩＫＩＮ     １００
ＥＬＫＥＬＬＳＫＮＬ  ＴＨＦＦＹＶＦＱＴＬ  ＱＫＱＶＳＹＳＬＡＫ  ＦＮＤＦＳＩＮＧＫＬ  ＧＳＩＣＧＱＬＬＩＬ     １５０
ＴＹＶＹＧＫＥＴＰＤ  ＧＩＫＩＴＬＤＮＬＴ  ＭＱＥＬＧＹＳＳＧＩ  ＡＨＳＳＡＶＳＲＩＩ  ＳＫＬＫＱＥＫＶＩＶ     ２００
ＹＫＮＳＣＦＹＶＱＮ  ＬＤＹＬＫＲＹＡＰＫ  ＬＤＥＷＦＹＬＡＣＰ  ＡＴＷＧＫＬＮ                    ２３７
【０１０５】
残基１５５のグリシンを含むリステリア・モノサイトゲネスＰｒｆＡの配列は、以下のとおりである。（配列番号２７）
ＭＮＡＱＡＥＥＦＫＫ  ＹＬＥＴＮＧＩＫＰＫ  ＱＦＨＫＫＥＬＩＦＮ  ＱＷＤＰＱＥＹＣＩＦ  ＬＹＤＧＩＴＫＬＴＳ     ５０
ＩＳＥＮＧＴＩＭＮＬ  ＱＹＹＫＧＡＦＶＩＭ  ＳＧＦＩＤＴＥＴＳＶ  ＧＹＹＮＬＥＶＩＳＥ  ＱＡＴＡＹＶＩＫＩＮ     １００
ＥＬＫＥＬＬＳＫＮＬ  ＴＨＦＦＹＶＦＱＴＬ  ＱＫＱＶＳＹＳＬＡＫ  ＦＮＤＦＳＩＮＧＫＬ  ＧＳＩＣＧＱＬＬＩＬ     １５０
ＴＹＶＹＳＫＥＴＰＤ  ＧＩＫＩＴＬＤＮＬＴ  ＭＱＥＬＧＹＳＳＧＩ  ＡＨＳＳＡＶＳＲＩＩ  ＳＫＬＫＱＥＫＶＩＶ     ２００
ＹＫＮＳＣＦＹＶＱＮ  ＬＤＹＬＫＲＹＡＰＫ  ＬＤＥＷＦＹＬＡＣＰ  ＡＴＷＧＫＬＮ                    ２３７
【０１０６】
４．抗原性コンストラクト
【０１０７】
本発明の細胞ワクチン株によって発現された抗原性コンストラクトは、少なくとも発現されるべきＨＣＶ抗原と融合した、分泌を支援するため細胞ワクチンプラットフォーム内で動作可能な分泌配列をコードする核酸を含み、そこで結果として生じた融合タンパク質は、細胞ワクチンプラットフォームによる融合タンパク質の発現に必要な調節塩基配列（例えば、プロモーター）に機能可能に結合される。本発明は、分泌されたポリペプチドおよびペプチド抗原に限定しないが、同様にリステリアまたは他の細菌から分泌されなかった、または分泌され得なかったポリペプチドおよびペプチドを包含する。しかし、好ましくは、ＨＣＶ抗原は、株が受け手に接種された場合、細菌ワクチン株によって可溶性、分泌型で発現される。
【０１０８】
表１は、異種抗原等の融合タンパク質パートナー配列と融合するために使用されるシグナルペプチドの多くの非限定例を開示する。シグナルペプチドは、３つの領域を含有する傾向がある。正電気を帯びたＮ末端（１〜５残基長）、疎水性領域（７〜１５残基長）、および中性だが極性Ｃ末端領域。
【表３】
2011529077.tif 000014
【０１０９】
以下に記載される代表的な実施形態では、ＨＣＶエピトープ配列は、ワクチンを接種した宿主内の細菌からＨＣＶ融合タンパク質の発現および分泌を許可するリステリア・モノサイトゲネス  ＡｃｔＡタンパク質のアミノ末端部分と融合したシグナルポリペプチドとして発現することができる。これらの実施形態では、抗原性コンストラクトは、融合タンパク質をコードする核酸配列と機能可能に結合されるプロモーターを含むポリヌクレオチドであることができ、そこで、融合タンパク質は、（ａ）修正されたＡｃｔＡおよび（ｂ）修正されたＡｃｔＡ配列の後に融合タンパク質として発現される１つ以上のＨＣＶエピトープを含む。
【０１１０】
「修正されたＡｃｔＡ」とは、少なくともＡｃｔＡシグナル配列を含むが、ＡｃｔＡ配列の全体を含まない、またはそのようなＡｃｔＡ配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性、少なくとも約８５％の配列相同性、少なくとも約９０％の配列相同性、少なくとも約９５％の配列相同性、または少なくとも約９８％の配列相同性を有するリステリア・モノサイトゲネスＡｃｔＡタンパク質の連続する部分を意味する。ＡｃｔＡシグナル配列は、ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡ（配列番号４１）である。一部の実施形態では、プロモーターは、国際公開第０７／１０３２２５号、および国際公開第０７／１１７３７１号からのＡｃｔＡプロモーターであり、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
一例として、修正されたＡｃｔＡは、少なくともＡｃｔＡの最初の５９のアミノ酸、または少なくともＡｃｔＡの最初の５９のアミノ酸に対して少なくとも約８０％の配列相同性、少なくとも約８５％の配列相同性、少なくとも約９０％の配列相同性、少なくとも約９５％の配列相同性、または少なくとも約９８％の配列相同性を有する配列を含むことができる。一部の実施形態では、修正されたＡｃｔＡは、少なくともＡｃｔＡの最初の１００のアミノ酸、またはＡｃｔＡの最初の１００のアミノ酸に対する少なくとも約８０％の配列相同性、少なくとも約８５％の配列相同性、少なくとも約９０％の配列相同性、少なくとも約９５％の配列相同性、または少なくとも約９８％の配列相同性を有する配列を含む。言い換えれば、一部の実施形態では、修正されたＡｃｔＡ配列は、残基１００またはそれ以降で切断された（ＡｃｔＡシグナル配列を含む）ＡｃｔＡのＮ末端断片に対応する。
【０１１２】
ＡｃｔＡ−Ｎ１００は、以下の配列（配列番号３７）を有する。
ＶＧＬＮＲＦＭＲＡＭ  ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ  ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ  ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ  ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ     ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ  ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ  ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ  ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ  ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ     １００
この配列では、第１の残基は、バリンとして描写され、ポリペプチドは、メチオニンとこの位置にリステリアによって合成される。したがって、ＡｃｔＡ−Ｎ１００も同様に、以下の配列（配列番号３８）を有する。
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭ  ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ  ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ  ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ  ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ     ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ  ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ  ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ  ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ  ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ     １００
ＡｃｔＡ−Ｎ１００も同様に、修正されたＡｃｔＡおよびＨＣＶ抗原配列のＣ末端残基の間にある１つ以上の追加残基を含む。以下の配列において、ＡｃｔＡ−Ｎ１００は、ＢａｎＨ１部分に含まれることによって追加された２つの残基によって延長される。
ＶＧＬＮＲＦＭＲＡＭ  ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ  ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ  ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ  ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ     ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ  ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ  ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ  ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ  ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ     １００
ＧＳ                                                                         １０２
第１の残基と合成された場合、メチオニンは、配列を有する（配列番号３９）。
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭ  ＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩ  ＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡ  ＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴ  ＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥ     ５０
ＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ  ＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲ  ＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫ  ＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩ  ＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧ     １００
ＧＳ                                                                         １０２
（配列番号４０）。
【０１１３】
代表的なコンストラクトは、以下および国際公開第０７／１０３２２５号に記載され、当該公開は、参照により本明細書に組み込まれる。（以前は、ＣＲＳ−１００、ＢＢ‐ＩＮＤ１２８８４およびｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ００３２７６５２として知られていた）ＡＮＺ−１００は、いずれの外来性抗原の発現配列もなしに、リステリア・モノサイトゲネスΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢプラットフォームからなる。国際公開第０７／１０３２２５号に記載される代表的なコンストラクトにおいて、このプラットフォームは、ＡｃｔＡ−Ｎ１００との融合としてヒトメソテリンを発現するために設計されている。メソテリン発現ワクチンは、メソテリンを過剰に発現することで知られる進行癌のある対象における第１相治験において現在評価されている、ＣＲＳ‐２０７（ＢＢ‐ＩＮＤ  １３３８９およびｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ００５８５８４５）を使用して、肝転移の進行癌のある対象において、評価されている。本発明は、メソテリン配列をＨＣＶ抗原配列で置き換えることによって、このワクチンの修正を検討する。
【０１１４】
１つの生物によってコードされた配列は、選択されたワクチンプラットフォーム細菌株における最適発現のために必ずしもコドン最適化されないが、本発明も同様に、リステリア・モノサイトゲネス等の細菌によって発現するためのコドン最適化によって変化する核酸を提供する。
【０１１５】
各種の実施形態において、少なくとも任意の非最適なコドンの１パーセントは、最適なコドンを提供するために変化される、より標準的には少なくとも５パーセント変化される、最も標準的には少なくとも１０パーセント変化される、多くの場合は少なくとも２０％変化される、より多くの場合は少なくとも３０％変化される、最も多くの場合は少なくとも４０％変化される、大抵は少なくとも５０％変化される、より大抵は少なくとも６０％変化される、最も大抵は少なくとも７０％変化される、至適に少なくとも８０％変化される、より至適に少なくとも９０％変化される、最も至適に少なくとも９５％変化され、慣習的に任意の非最適なコドンの１００％は、リステリア発現（表２）に対してコドン最適化される。
【表４】
2011529077.tif 000015
【０１１６】
本発明は、本発明のワクチンプラットフォームを作製または設計するリステリア種および株の多くを供給する。本発明のリステリアは、表３に開示された種および株に限定されない。
【表５】
2011529077.tif 000016
2011529077.tif 000017
2011529077.tif 000018
【０１１７】
４．治療組成物。
【０１１８】
本明細書に記載されるワクチン組成物は、単独または医薬的に許容される賦形剤と組み合わせてのいずれかで、ＨＣＶ感染に対する適切な免疫応答を十分に誘発する量で、宿主に投与することができる。免疫応答は、限定なしに、特異的免疫応答、非特異的免疫応答、特異的および非特異的応答の両方、先天性応答、一次免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化、およびサイトカイン発現を含むことができる。本発明のワクチンは、例えば、冷凍、凍結乾燥、懸濁液として、細胞ペーストとして、または固体マトリクスまたはゲルマトリクスと複合体を形成して保存することができる。
【０１１９】
ある実施形態においては、免疫応答を刺激するために対象に免疫原性ＨＣＶ抗原ポリペプチドを含有する有効量のワクチンを投与した後、第２のワクチンを投与する。これは、当技術分野では、「プライムブースト」療法と呼ぶ。そのような療法では、本発明の組成物および方法は、「プライム」送達として、「ブースト」送達として、または「プライム」および「ブースト」の両方として使用することができる。
【０１２０】
例として、抗原ポリペプチドをコードし発現する不活化されるが代謝的に活性なリステリアを含む第１のワクチンは、「プライム」として、送達することができ、抗原ポリペプチドをコードする弱毒化されたが代謝的に活性なリステリアを含む第２のワクチンは、「ブースト」として送達することができる。しかし、プライムおよびブーストの両方が、本発明の方法および組成物を利用する必要がないことを理解すべきである。むしろ、本発明は、本発明の細菌ワクチン方法および組成物と一緒に他のワクチンの様式を検討する。以下は、適切な混合プライムブースト療法の例である。ＤＮＡ（例、プラスミド）ワクチンプライム／細菌ワクチンブースト、ウイルスワクチンプライム／細菌ワクチンブースト、タンパク質ワクチンプライム／細菌ワクチンブースト、ＤＮＡプライム／細菌ワクチンブーストプラスタンパク質ワクチンブースト、細菌ワクチンプライム／ＤＮＡワクチンブースト、細菌ワクチンプライム／ウイルスワクチンブースト、細菌ワクチンプライム／タンパク質ワクチンブースト、細菌ワクチンプライム／細菌ワクチンブーストプラスタンパク質ワクチンブースト等。このリストは、限定されるものではない。
【０１２１】
プライムワクチンおよびブーストワクチンは、同じ経路または異なる経路で投与することができる。「異なる経路」という用語は、例えば、口腔、非口腔、腸内、非経口、直腸、結節内（リンパ節）、静脈内、動脈、皮下、筋肉内、腫瘍周辺、腫瘍内、注入、粘膜、鼻、脳脊髄腔内または脳脊髄液等の部位等の、体の異なる部位、ならびに、例えば、経口、静脈、および筋肉内等の、異なる様式により包含するが限定されない。
【０１２２】
有効量のプライムまたはブーストワクチンは、一回量が投与され得るが、一回量に限定されない。したがって、投与は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上のワクチンの投与であり得る。本方法のワクチンが１回より多く投与される場合、投与は、１分、２分、３、４、５、６、７、８、９、１０分以上の時間間隔で、約１時間、２時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間等の間隔で、間隔を置くことができる。時間との関連で、「約」という用語は、任意の時間間隔の３０分以内の付加または差し引きを意味する。投与は、同様に、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、およびそれらの組み合わせの時間間隔で間隔を置くことができる。本発明は、時間を同等にあけた投与間隔に限定されず、限定しない例を提供すると、１日、４日、７日、および２５日での投与からなるプライミングスケジュール等の、等しくない間隔での投与を包含する。
【０１２３】
ある実施形態では、ブーストワクチン接種の投与は、プライムワクチン接種の開始後約５日、プライムワクチン接種の開始後約１０日、約１５日、約２０日、約２５日、約３０日、約３５日、約４０日、約４５日、約５０日、約５５日、約６０日、約６５日、約７０日、約７５日、約８０日、約６ヶ月、プライムワクチン接種の開始後約１年に開始することができる。好ましくは、プライムおよびブーストワクチン接種の１つまたは両方が、本発明の組成物の送達を含む。
【０１２４】
「医薬的に許容される賦形剤」または「診断的に許容される賦形剤」は、滅菌蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液、アミノ酸を基にした緩衝液、または重炭酸緩衝液を含むが限定されない。選択する賦形剤および使用する賦形剤の量は、投与方法に依存するであろう。経口、静脈内、皮下、皮膚、皮内、粘膜、非経口、臓器内、病巣内、鼻腔内、吸入、眼内、血管内、結節内で、表面剥離、直腸、腹腔内、または様々な投与方法のいずれか１つまたは組み合わせによって投与することができる。投与は、注射、注入、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１２５】
非口腔経路による本発明のワクチンの投与は、耐性を避けることができる。方法は、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経口、粘膜、尿路経由、生殖路経由、消化管経由、または吸入での投与のための当技術分野で知られている。
【０１２６】
特定の患者に対する有効量は、治療されている病気の症状、患者の全体的な健康状態、投与方法および投与量、ならびに副作用の重症度等の要因によって変化し得る。治療および診断の方法に対する指針は、入手可能である（例えば、Ｍａｙｎａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ：  Ｄｅｎｔ  （２００１）  Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫを参照）。
【０１２７】
本発明のワクチンは、それぞれの１回分が、少なくとも１０００細菌性細胞／ｋｇ体重、標準的に少なくとも１０，０００細胞、より標準的には少なくとも１００，０００細胞、最も標準的には少なくとも１００万細胞、多くの場合少なくとも１０００万細胞、より多くの場合は少なくとも１億細胞、典型的に少なくとも１０億細胞、大抵は少なくとも１００億細胞、慣習的に少なくとも１０００億細胞、時々少なくとも１兆細胞／ｋｇ体重を含む場合、１回分または用量で投与することができる。本発明は、ソラレン治療前のＣＦＵと同等の、細菌投与の単位がコロニー形成単位（ＣＦＵ）である場合、または単位が細菌性細胞数である場合、上記の投与量を提供する。
【０１２８】
本発明のワクチンは、各投与量が、湿重量で、７０ｋｇの体重につき１０７から１０８の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇの体重につき２ｘ１０７から２ｘ１０８の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇの体重につき５ｘ１０７から５ｘ１０８の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇの体重につき１０８から１０９の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき２．０ｘ１０８から２．０ｘ１０９の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき５．０ｘ１０８から５．０ｘ１０９の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき１０９から１０１０の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき２ｘ１０９から２ｘ１０１０の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき５ｘ１０９から５ｘ１０１０の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき１０１１から１０１２の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき２ｘ１０１１から２ｘ１０１２の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき５ｘ１０１１から５ｘ１０１２の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき１０１２から１０１３の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき２ｘ１０１２から２ｘ１０１３の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき５ｘ１０１２から５ｘ１０１３の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき１０１３から１０１４の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき２ｘ１０１３から２ｘ１０１４の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき５ｘ１０１３から５ｘ１０１４の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき１０１４から１０１５の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）、７０ｋｇにつき２ｘ１０１４から２ｘ１０１５の細菌（または１．７平方メートル表面積につき、または１．５ｋｇの肝重量につき）等を含む場合、１回分または用量で投与することができる。
【０１２９】
投与量が、毎日注射１回、２日おきに注射１回、３日おきに注射１回、４日おきに注射１回、５日おきに注射１回、６日おきに注射１回、または７日おきに注射１回で投与された場合、例えば、１日のみ、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週間、３週間、４週間、５週間、またはそれ以上の間、注射スケジュールが維持される場合、上記の投与量の１回以上も同様に提供される。本発明も同様に、例えば、比較的に大きな最初の細菌投与量の後比較的小さな次投与量、または比較的小さな最初の投与量の後大きな投与量等、上記の投与およびスケジュールの組み合わせを含む。
【０１３０】
例えば、１回／週、２回／週、３回／週、４回／週、５回／週、６回／週、７回／週、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回等の服薬スケジュールは、本発明に使用可能である。服薬スケジュールは、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、および１２ヶ月等の合計期間の投薬を包含する。
【０１３１】
上記の服薬スケジュールのサイクルを提供する。サイクルは、例えば、約７日おき、１４日おき、２１日おき、２８日おき、３５日おき、４２日おき、４９日おき、５６日おき、６３日おき、７０日おき等、繰り返すことができる。非服薬間隔は、例えば、約７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、７０日等であり得る場合、サイクル間に生じることができる。これに関して、「約」という用語は、１日増減する、２日増減する、３日増減する、４日増減する、５日増減する、６日増減する、または７日増減することを意味する。
【０１３２】
本発明は、経口のリステリア投与方法を包含する。また、静脈内リステリア投与方法も提供する。さらに、提供されたものは、経口、筋肉内、静脈内、皮内、および／または皮下のリステリア投与方法である。本発明は、肉ベース、または、肉または畜産物に由来するポリペプチドを含む培地において栽培することによって調製される、リステリア細菌、または培養もしくはリステリア細菌の懸濁液を供給する。また、本発明は、肉もしくは畜産物を含有しない培地において栽培することによって調製される、植物ポリペプチドを含有する培地において栽培することによって調製される、酵母産物を基にしていない培地上で栽培することによって調製される、または酵母ポリペプチドを含有する培地上で栽培することによって調製される、リステリア細菌、または培養またはリステリア細菌の懸濁液を、を供給する。
【０１３３】
追加の治療薬と同時投与する方法は、当技術分野でよく知られている（Ｈａｒｄｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （２００１）  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  １０ｔｈ  ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ‐Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ：  Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  （ｅｄｓ．）  （２００１）  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａ．，  ＰＡ：  Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ  （ｅｄｓ．）  （２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａ．，  ＰＡ）。
【０１３４】
本発明は、本発明のワクチン組成物と共に投与するための試薬を提供する。これらの試薬は、ＩＮＦ−α、リバビリン、レボビリン（ｌｅｖｏｖｉｒｉｎ）、ビラミジン（ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）、テラプレビル（ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒ）、ボセプレビル（ｂｏｃｅｐｒｅｖｉｒ）、ＰＥＧ‐ＩＮＦ−α、および他の免疫療法を含む他のＨＣＶ療法、を含む。このリストは、限定されるものではない。試薬は、本発明のワクチン組成物と同時にまたは単独で（前または後に）投与されることができる。例えば、試薬は、本発明のワクチン組成物の直前（もしくは直後）に、同日に、１日前（もしくは後）に、１週間前（もしくは後）に、１ヶ月前（もしくは後）に、または本発明のワクチン組成物の２ヶ月前（もしくは後）等に、投与することができる。
【０１３５】
細胞傷害性Ｔ細胞応答起こすために有益な追加薬剤も、同様に使用できる。そのような薬剤は、本明細書では、キャリアと称される。これらは、限定なしに、Ｂ７共刺激分子、インターロイキン‐２、インターフェロン‐γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＴＬＡ‐４拮抗薬、ＯＸ‐４０／ＯＸ‐４０リガンド、ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド、サルグラモスチム、レバミソール、ワクシニアウイルス、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、リポソーム、ミョウバン、完全または不完全フロインドアジュバント、解毒エンドトキシン、鉱油、リポレシチン（ｌｉｐｏｌｅｃｉｔｈｉｎ）、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌｓ）、ポリアニオン、ペプチド、および油乳剤または炭化水素乳剤等の界面活性物質を含む。細胞傷害性Ｔ細胞応答に対して抗体応答を優先的に刺激するＴ細胞免疫応答を誘発するためのキャリアが好ましいが、両方の種類の応答を刺激するものも、同様に使用することができる。薬剤がポリペプチドである場合、ポリペプチド自身またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、投与することができる。キャリアは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または樹枝状細胞等の細胞であり得る。抗原提示細胞は、マクロファージ、樹枝状細胞、およびＢ細胞等の細胞型を含む。他のプロフェッショナル抗原提示細胞は、単球、辺縁帯クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、相互に入り込んだ樹枝状細胞、濾胞樹状細胞、およびＴ細胞を含む。通性抗原提示細胞も、同様に使用することができる。通性抗原提示細胞の例は、星状膠細胞、濾胞上皮細胞、内皮、および線維芽細胞を含む。キャリアは、ポリペプチドを発現するため、または後にワクチン接種した個人の細胞に発現するポリヌクレオチドを送達するために変換される細菌細胞であり得る。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム等のアジュバントは、免疫応答を誘発する、強める、または延長するために、ワクチンの能力を増加するために、追加され得る。サイトカイン、ケモカイン、およびＣｐＧのような細菌核酸配列、トール様受容体（ＴＬＲ）９作用薬、ならびにリポタンパク質、ＬＰＳ、モノホスホリル脂質Ａ、リポタイコ酸、イミキモド、レシキモド、および別々に使用されるまたは記載される組成物と併用される他の免疫変調成分のようなものを含むＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９のための追加作用薬等の追加材料も、同様に潜在的なアジュバントである。アジュバントの他の代表例は、キラヤサポナリアおよびコリネバクテリウム・パルバムの皮から精製された均質サポニンを含む合成アジュバントＱＳ‐２１を含む（ＭｃＣｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ，  １９７９：  ４３：１６１９）。アジュバントが、最適化の対象であることを理解されるであろう。つまり、当業者は、使用するための最高のアジュバントを決定するために日常の実験に、従事することができる。
【０１３６】
治療薬の有効量は、標準的には少なくとも１０％、より標準的には少なくとも２０％、最も標準的には少なくとも３０％、典型的に少なくとも４０％、より典型的に少なくとも５０％、最も典型的に少なくとも６０％、多くの場合は少なくとも７０％、より多くの場合は少なくとも８０％、および最も多くの場合は少なくとも９０％、慣習的に少なくとも９５％、より慣習的に少なくとも９９％、および最も慣習的に少なくとも９９．９％症状を和らげるまたは改善する量である。
【０１３７】
本発明の試薬および方法は、１回のみのワクチン接種を含む、または第１のワクチン接種を含む、または少なくとも１つのブースターワクチン接種を含む、少なくとも２つのブースターワクチン接種を含む、または少なくとも３つのブースター接種を含むワクチンを提供する。ブースターワクチン接種に対するパラメーターの指針は、入手可能である。例えば、Ｍａｒｔｈ  （１９９７）  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２５：１９９‐２０３：  Ｒａｍｓａｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７５：３８２‐３８８：  Ｇｈｅｒａｒｄｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｈｉｓｔｏｌ．  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．  １６：６５５‐６６７：  Ｌｅｒｏｕｘ‐Ｒｏｅｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  ＡｃｔＡ  Ｃｌｉｎ．  Ｂｅｌｇ．  ５６：２０９‐２１９：  Ｇｒｅｉｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２：６９４４‐６９５１：  Ｓｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ３８‐Ｓ４１：  Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ‐Ａｍｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：２７９０‐２７９５を参照）。
【０１３８】
治療薬の処方は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、または懸濁液の形態における、生理学的に許容されるキャリア、賦形剤、または安定剤と混合することによって保存のために調製することができる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ＭｃＧｒａｗ‐Ｈｉｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ：  Ｇｅｎｎａｒｏ  （２０００）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ：  Ａｖｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （１９９３）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ：  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｔａｂｌｅｔｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ：  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （１９９０）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ：  Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ  （２０００）  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹを参照）。
【０１３９】
実施例
【０１４０】
以下の実施例は、本発明を説明するために用いる。これらの実施例は、本発明の範囲を限定することを目的としない。
【０１４１】
実施例１．ＡＮＺ１００の開発
【０１４２】
リステリア・モノサイトゲネスＡＮＺ１００ワクチンプラットフォーム株は、野生型リステリア・モノサイトゲネス株１０４０３のストレプトマイシン耐性変異体である、リステリア・モノサイトゲネス株１０４０３Ｓのプロファージなしの誘導体である、リステリア・モノサイトゲネス株ＤＰ  Ｌ４０５６に由来する。Ｌｍ１０４０３株は、先ずヒト皮膚障害から分離され（Ｅｄｍａｎ  １９６８）、ストレプトマイシン耐性株１０４０３Ｓは、ＢｉｓｈｏｐおよびＨｉｎｒｉｃｈｓによって最初に説明された（Ｂｉｓｈｏｐ  １９８７）。１０４０３Ｓにおけるストレプトマイシン耐性は、ＴからＣの核酸置換が５６の位置におけるＫ（ｔ（Ａｒｇ）アミノ酸の代わりにＲ（Ｌｙｓ）を挿入するリボソームタンパク質遺伝子ｒｐｓＬのコドン５６において単一突然変異に位置し、Ｌｍ１０４０３ＳからＤＰ  Ｌ４０５６株を分離するために使用するプロセスは、これまでに詳しく説明されている（Ｌａｕｅｒ  ２００２）。
【０１４３】
ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ病原性遺伝子の除去、相同的組み換えによって遂行した。各遺伝子の欠失は、３つのステップを必要とする：（１）欠失対立遺伝子を含む組換えプラスミドの構成、（２）プラスミドの宿主染色体との一体化、および（３）プラスミドベクター配列および野生型の対立遺伝子の切除。ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ株ＣＥＲＳ３８２．２０を、マウスにおける病原性および免疫原性を基にした２つのＰＣＲ陽性の候補から選択した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける病原性を、競争指標分析を使用して評価した。両方の候補を、同等に弱毒化し、非ファージ処理したΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ研究株と同じレベルの弱毒化を観察した。次に、候補の、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて、免疫優勢のＫｄ限定ＬＬＯエピトープに対して特異的なＴ細胞を刺激するためのそれらの能力を検査した。候補または非ファージ処理されたΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ株間の、免疫効能における識別可能な差はなかった。両方の候補は、弱毒化および免疫効能を基にした非ファージ処理された研究株に相当したため、１つの候補（ＣＥＲＳ３８２．２０）を、さらなる性質決定のために選択した。
【０１４４】
ａｃｔＡおよびｉｎｌＢの両方の遺伝子座を包含する重複ＰＣＲ産物を、Ｌｍ株ＣＥＲＳ３８２．２０およびＤＰ  Ｌ４０５６の新鮮なコロニー懸濁液から増幅した。ＰＣＲ産物を、配列し、それぞれの遺伝子座の単一連続するＤＮＡ配列を構築した、したがってＣＥＲＳ３８２．２０におけるａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の両方の正確な開始から終止コドン欠失を確認した。１０４０３Ｓにおいて記載されたコドン５６におけるｒｐｓＬ突然変異を、ＣＥＲＳ３８２．２０に保存し、染色体ＤＮＡから直接増幅したＰＣＲ産物の配列分析によって文書化した。ＣＥＲＳ３８２．２０のストレプトマイシン耐性表現型を、選択培地上の増殖によって証明した。ストレプトマイシン耐性表現型を、臨床株の同定を容易にするために使用し、他のリステリアおよび非リステリア種と区別する。
【０１４５】
実施例２．ＨＣＶ抗原の評価
【０１４６】
カイト・ドーリトル水治療法を、タンパク質の疎水性を描写するための基準として広く利用する。疎水性を、個々のアミノ酸残基に対し、および５から７のアミノ酸の引窓を超えた値を合計するため、溶媒和エンタルピーから計算する。０を超える値の領域は、疎水性である。ＨＣＶコア、ＮＳ３、およびＮＳ５ｂ抗原の最初のカイト・ドーリトル評価は、ＡｃｔＡ−Ｎ１００から得たピーク疎水性値以下の領域を同定するためであった。これを超える値は、リステリアにおいてよく発現しないポリペプチド配列を表すことができる。これらの結果を、図７に描写する。
【０１４７】
図８は、ウエスタンブロットで測定されるように、様々なＡｃｔＡ−Ｎ１００ＨＣＶ抗原融合のリステリアによる抗原組換え発現を描写する。個々のＨＣＶ配列（コア配列１‐１９０、１‐１８０、および１‐１７７、ＮＳ３配列１‐６３１、１‐４８４、２２‐６３１、２２‐４８４、２２‐２８０、１７２‐４８４、１７２‐６３１、および４１６‐６３１、ならびにＮＳ５配列１‐５７４、１‐３４２、３２０‐５９１、および３２０‐５７４）を、細菌プロモーター（リステリア・モノサイトゲネスＡｃｔＡプロモーター）の制御の下抗原発現カセットからＡｃｔＡ−Ｎ１００融合として発現する。発現カセットは、安定的にリステリア・モノサイトゲネスゲノムに組み込まれる。宿主細胞において大いに誘発するため、リステリア・モノサイトゲネスａｃｔＡプロモーターを、選択した。
【０１４８】
肉汁培養からのウエスタンブロットを、０．７（ｌａｔｅ  ｌｏｇ）のＯＤ６００へ酵母エキス培地において増殖した細菌培養のＴＣＡ沈殿浮遊物の当量で実施した。Ｌｍ感染宿主細胞からのウエスタンブロットに関して、Ｊ７７４細胞またはＤＣ２．４細胞は、５０または１００の感染の多重度（ＭＯＩ）を１時間接種し、細胞を、リン酸緩衝食塩水および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンが補充されたダルベッコ変法イーグル培地で３ｘ洗浄した。早い時点では、ＤＣ２．４を、感染後１．５または２．５時間で収穫した。遅い時点では、Ｊ７７４細胞を、７時間で収穫した。細胞を、ＳＤＳ試料緩衝液で溶解し、収集し、４〜１２％ポリアクリルアミドゲルで実施し、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜へ伝播した。すべてのウエスタンブロットは、ＡｃｔＡタンパク質の成熟Ｎ末端に反して起きたポリクローナル抗体を利用した。
【０１４９】
図において、リそれぞれのパネルにおける１および２の区分は、ステリア株ＣＲＳ‐２０７による抗原挿入およびメソテリン発現を示さない負および正の対照である。パネルＡは、３、４、および５の区分における、コア配列１‐１９０、１‐１８０、および１‐１７７を示す。パネルＢは、３‐１０の区分における、ＮＳ３配列１‐６３１、１‐４８４、２２‐６３１、２２‐４８４、２２‐２８０、１７２‐４８４、１７２‐６３１、および４１６‐６３１を示す。パネルＣは、３‐７の区分における、ＮＳ５配列１‐５７４、１‐３４２、３２０‐５９１、および３２０‐５７４を示す。これらの図に見られるように、ＮＳ３１７２‐４８４は、ＮＳ５ｂ１‐３４２も同様に、強発現を示す。図８の矢印は、発現配列から予測されたものより実質的に低い分子量である、産出されているタンパク質産物を示す。
【０１５０】
組換えリステリア・モノサイトゲネスからのこれらの様々なＡｃｔＡ−Ｎ１００ＨＣＶ抗原融合の組換え発現も、同様に無傷のＣ末端ＳＬ８マウスＴ細胞エピトープの存在を評価するために使用した。ＳＬ８エピトープは、組換え抗原がＮ末端からＣ末端まで全体において発現していることを証明するため、ならびにＭＨＣクラスＩ経路を介して組換え抗原を提示するための抗原提示細胞の能力を証明するために、タグとして機能する。各リステリア・モノサイトゲネスを、ＤＣ２．４細胞を感染するために使用した。感染で、組換えリステリア・モノサイトゲネスは、ＤＣ２．４細胞内で融合ポリペプチドを発現し、分泌した。ＤＣ２．４細胞が、ペプチドを適切に提示する場合、これを、レポーターＴ細胞ハイブリドーマライン（Ｂ３Ｚ  Ｔ細胞ハイブリドーマ）として検出することができる。結果を、以下の表に提示する。
【表６】
2011529077.tif 000019
【０１５１】
カイト・ドーリトル疎水性解析を基に、タンパク質の発現結果、抗原提示データ、ＮＳ５Ｂタンパク質のアミノ酸１‐３４２、およびＮＳ３のアミノ酸１７２‐４８４を、ワクチンコンストラクトにおける使用のために選択した。
【０１５２】
実施例３．ＡＮＺ５２１の開発
【０１５３】
リステリア・モノサイトゲネス株ＡＮＺ５２１は、ＡＮＺ１００ワクチンプラットフォームを基にしたリステリアワクチン株である。ＡＮＺ５２１の起源および派生を描写する概略図を、図１に提供する。
【０１５４】
ＡＮＺ５２１を開発するためには、抗原発現カセット（図２Ａ）を、ＨＣＶ遺伝子産物、ＮＳ５ｂおよびＮＳ３の一部を、細菌プロモーター（リステリア・モノサイトゲネスＡｃｔＡプロモーター）の制御の下コードするように構成した。発現カセットを、リステリア・モノサイトゲネスゲノム（図２Ｂ）に、安定的に組み込んだ。宿主細胞において大いに誘発するため、リステリア・モノサイトゲネスａｃｔＡプロモーターを、選択した。ＮＳ５ｂおよびＮＳ３配列を含むＨＣＶ抗原を、ワクチン接種した宿主における、感染ＡＰＣにおいて細菌からＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ‐ＮＳ３融合タンパク質の発現および分泌を最大限にする、ＡｃｔＡタンパク質（「ＡｃｔＡ−Ｎ１００」）のアミノ末端１００アミノ酸と融合した単一ポリペプチドとして、発現する。
【０１５５】
発現した成熟ＡｃｔＡ−Ｎ１００‐ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ‐ＮＳ３融合タンパク質は、７３０のアミノ酸の長さで７８．５ｋＤａの予測した分子量である。ＮＳ５ｂ‐ＮＳ３抗原発現カセットは、ＮＳ５ｂタンパク質（全長ＮＳ５ｂは、５９１ａａである）のアミノ酸１‐３４２、およびＮＳ３（全長ＮＳ３は、６３１ａａである）のアミノ酸１７２‐４８４をコードする。ＨＣＶ  ＮＳ５ｂ‐ＮＳ３アミノ酸配列は、ＨＣＶ  ＮＳ５ｂおよびＮＳ３共通配列（Ｃｏｘ  ２００５、Ｒａｙ  ２００５）に由来し、ＤＮＡ配列のコードを、リステリア・モノサイトゲネスにおける発現のために最適なコドンを利用するために、再合成した。融合タンパク質としてリステリア・モノサイトゲネスから抗原を切断し、合成し、分泌するため、それらの天然構造または活性を有することはあり得ないが、タンパク質がそれらの内因性活性を有さないことを保証するために、部位特異的突然変異を、それぞれのタンパク質の活性のために重要であるモチーフに設計する。ＮＳ５Ｂポリメラーゼが、機能しないことを保証するために、アミノ酸配列を、二重突然変異を不活性化するＧＤＤからＧＮＨ（ＮＳ５ｂのアミノ酸３１９から開始）を含有するために変更し、そこでそれぞれの変化が、ＲＮＡポリメラーゼ活性を完全に不活性化する（Ｌｏｈｍａｎｎ  １９９７）。ＮＳ３ヘリカーゼ活性を不活性化するために、モチーフＩＩ（ＤＥＣＨ）を、ＮＳ３のアミノ酸２９２から開始して、ＡＡＳＨへ突然変異した（Ｗａｒｄｅｌｌ  １９９９）。解媒セリンが、このコンストラクトにおいて提示されないため、ＮＳ３は、プロテアーゼ活性を有することはあり得ない。（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  １９９３）。
【０１５６】
ＡｃｔＡ−Ｎ１００‐ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ‐ＮＳ３共通配列抗原発現カセットを、ＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ「親」株の染色体の（Δ）ｉｎｌＢ遺伝子座で、標準的な対立遺伝子交換法を使用して挿入した。遺伝子交換ベクターを、直接相同的組み換えを、株３８２．２０（図３Ａ）の染色体のｉｎｌＢ遺伝子座へ方向付けるために、構成した。先ず、重複拡張によるスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，  ＳＯＥ）ＰＣＲを、ｉｎｌＢ遺伝子座の相同性上流の１３１５ｂｐからｉｎｌＢ遺伝子座の相同性下流の１２６５ｂｐを誘発するために使用した。一意的なＫｐｎＩおよびＳａｃＩ限定酵素部位を、ベクターにＨＣＶ  ＮＳ５ｂ‐ＮＳ３抗原カセットを挿入するために使用した上流および下流相同の接合部で、追加した。結果の２６０６ｂｐのＰＣＲ産物を、接合を容易にするために、伝達起点（ｏｒｉＴ）を含有するように修正された遺伝子交換ベクターｐＫＳＶ７（Ｓｍｉｔｈ  １９９２）の誘導体である温度感受性遺伝子交換ベクターｐＢＨＥ２６１にクローン化し、「ｐＢＨＥ１１５１のｉｎｌＢ遺伝子交換ベクター」プラスミドを生じる。次に、ａｃｔＡプロモーター、ａｃｔＡ遺伝子（ＡｃｔＡ−Ｎ１００断片をコードする）のアミノ末端３００ｂｐからなる発現カセット、およびコドン最適化ＨＣＶ  ＮＳ５ｂ‐ＮＳ３共通配列抗原融合は、ｐＢＨＥ１１５１のｉｎｌＢ遺伝子交換ベクターにクローン化され、プラスミドｐＢＨＥ１３６６（図３Ｂ）を生じる。
【０１５７】
プラスミドｐＢＨＥ１３６６を、接合によって株ＣＥＲＳ３８２．２０に移し、接合完了体を、クロラムフェニコール（Ｃｍ）が補充されたプレートで選択する。個々のプラスミドを含有するコロニーを、採取し、肉汁培養において４２℃で２回継代し、ｉｎｌＢ遺伝子座でプラスミドの一体化のための選択するために、事前に温めたＣｍプレートに蒔いた。単一コロニーを、高温プレートから採取し、肉汁において３０℃で５〜１０回、非選択的に継代し、３０℃で単一コロニーに対して蒔いた。ＨＣＶ  ＮＳ５ｂ‐ＮＳ３共通配列発現カセットを含有するクローンを、以下の基準を基に選択した。ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性、ＨＣＶ  ＮＳ５ｂ‐ＮＳ３配列に対するＰＣＲ陽性、ｐＫＳＶ７ベクター配列に対するＰＣＲ陰性、およびＮＳ５ｂコードされた配列の挿入内にアニールするプライマー、および相同的組み換えを方向付けるために使用する１．３ｋｂ外の第２のプライマー付のＰＣＲによるゲノム遺伝子座の確認。
【０１５８】
クローンを、Ｌｍ感染ＤＣ２．４組織培養細胞において、ＡｃｔＡの成熟Ｎ末端に対して向けられた抗体を使用するウエスタンブロットによって、ＡｃｔＡ−Ｎ１００‐ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ‐ＮＳ３融合タンパク質の発現のために選別した。最終クローン（ＢＨ２０６４）を、発現カセットの正確な挿入を確認したｉｎｌＢ遺伝子座で完全に配列し、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞応答の誘発、および感染のマウスモデルにおける生物内分布に対して検査した。
【０１５９】
実用的なＡＮＺ‐５２１ワクチン産物は、ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）リン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）および９％ｖ／ｖグリセロールにおいて１ｘ１０１０ｃｆｕ／ｍＬの微量力価で弱毒化リステリア・モノサイトゲネス株ＢＨ２０６４の１．５ｍＬを含む。産物は、−６０℃以下で冷凍保存することができる。
【０１６０】
実施例４．細菌で発現されたＨＣＶ抗原の免疫原性
【０１６１】
組換えリステリア・モノサイトゲネスを、マウスにおけるコードされた異種抗原に対して、強力なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を誘発するために示している。ＮＳ５ｂおよびＮＳ３特異的Ｔ細胞免疫を誘発するためのＨＣＶ  ＮＳ５ｂ‐Ｎ３を発現するＬｍΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢの能力を、単一の予防接種後に、様々なマウス株において測定した。最初は、ＨＣＶ抗原配列のＣ末端で追加ＳＬ８マウスＴ細胞エピトープを含有するコンストラクトを、免疫原性を確立するために使用した。これは、ＳＬ８エピトープが不足しているＡＮＺ５２１を使用して、後に確認された。
【０１６２】
ＮＳ５ｂおよびＮＳ３特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、１１のアミノ酸によって重なる入れ子状態にした１５のアミノ酸ペプチドを含むペプチドライブラリーを使用してＥＬＩＳＰＯＴまたは細菌内サイトカイン解析分析によって測定した。ライブラリーは、ＨＣＶ  ＮＳ５ｂおよびＮＳ３の完全な配列に及ぶ。ＮＳ５ｂペプチドライブラリーのプール１および２は、ＮＳ５ｂ断片を覆う、ＮＳ３ペプチドライブラリーのプール２および３は、ＡＮＺ‐５２１（図４）によって発現するＮＳ３断片を覆う。最初の実験を、ＳＬ８タグコンストラクトで実施した。このコンストラクトは、ＳＪＬマウスにおけるＮＳ３特異的免疫、およびすべての評価されたマウス株における、ＮＳ５ｂ特異的免疫を誘発した：Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＦＶＢ／ｎ、Ｃ３ＨおよびＳＪＬマウス（図５Ａ）。
【０１６３】
ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質の２つの領域に位置したＳＪＬにおけるＮＳ３特異的Ｔ細胞応答：ペプチド４４／４５およびペプチド４９から５１によって覆われたアミノ酸（図５Ｂ）。これらは、以下の配列に対応する：ＩＰＶＥＮＬＥＴＴＭＲＳＰＶＦ（配列番号１）、ＮＬＥＴＴＭＲＳＰＶＦＴＤＮＳ（配列番号２）、ＰＰＡＶＰＱＳＦＱＶＡＨＬＨＡ（配列番号３）、ＰＱＳＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧＳ（配列番号４）、およびＦＱＶＡＨＬＨＡＰＴＧＳＧＫＳ（配列番号５）。後の実験は、これらの領域をそれぞれＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープとして同定した（データ表示なし）。
【０１６４】
ＮＳ３およびＮＳ５ｂ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫も同様に、ＡＮＺ‐５２１の単一静脈内投与後、マウスにおける細菌内サイトカイン解析によって証明した（図６）。免疫のあるマウスの脾細胞を、細菌内サイトカイン染色のためのブレフェルジンＡの存在下で、関連するペプチドで５時間刺激した。刺激された細胞を、ＣＤ４およびＣＤ８に対して表面染色し、サイトフィックス／サイトパーム（ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ）キットを使用して修理し透過処理した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）。細胞を、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦαおよび／またはＩＬ‐２に対して染色した。試料を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターを使用して（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）入手した。データを、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のイベントを排他的に含むために開閉し、ＩＦＮ−γを発現しているこれらの細胞の割合を測定した。
【０１６５】
本発明を、当業者が作製および使用するために、十分詳細に説明および例証したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な代替、修正、および改善が明白であるはずである。本明細書で提供した実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、模範的なものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。その中の修正および他の用途が当業者には思い浮かぶであろう。これらの修正は、本発明の精神内に包含され、特許請求の範囲によって定義される。
【０１６６】
当業者には、様々な置換および修正を、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して行い得ることが、容易に明らかとなるであろう。
【０１６７】
明細書で言及されたすべての特許および刊行物は、本発明に関する当業者の水準を示す。すべての特許および刊行物は、それぞれ個々の刊行物が、参照によって組み込まれると具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６８】
本明細書で図示的に説明された本発明は、本明細書に具体的に開示されていないいかなる要素、限定がない場合にも好適に実践することができる。したがって、例えば、本明細書の各事例において、「含む」、「本質的になる」、および「なる」という表現のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。採用されている用語および表現は、限定ではなく説明のための用語として使用され、そのような用語および表現の使用において、示され、記載された特性のいずれの同等物またはその一部も除くことを意図するものではなく、様々な修正が、特許請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意の特性によって具体的に開示されたが、当業者は、本明細書に開示された概念の修正および変形を用いることが可能であり、そのような修正および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０１６９】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に記載される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
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