(57)【要約】本発明は、放射線傷害の分野に関連する。より具体的には、本発明は、トロンボモジュリンの使用による、電離放射線によって引き起こされる疾患に対する保護／その予防およびその治療に関連する。本発明は、治療的に有効な量のトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリンアナログ、特に酸化抵抗性トロンボモジュリンアナログを含む、放射線傷害に苦しんでいるか、または放射線傷害に苦しんでいると考えられるか、または進行中のまたは将来の放射線療法またはあらゆる他の種類の電離放射線への曝露の対象である患者を治療するための薬物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線傷害の治療のための医薬の製造のためのトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリンアナログの使用。
【請求項２】
放射線傷害の予防のための医薬の製造のためのトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリンアナログの使用。
【請求項３】
癌に対する放射線療法に供される患者の治療のための医薬の製造のためのトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリンアナログの使用。
【請求項４】
癌生存者の治療のための医薬の製造のためのトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリンアナログの使用。
【請求項５】
治療的に有効な量のトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリンアナログから選択される成分Ａ、および酸化能力を示す細胞傷害性薬剤の群から選択される成分Ｂを含む、医薬品組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用、または請求項５に記載の医薬品組成物であって、前記トロンボモジュリンアナログは、成熟可溶性トロンボモジュリンのアミノ酸配列である、配列番号１に対応するアミノ酸配列を有し、かつ以下の修飾：
アミノ酸１〜３の除去、
Ｍ３８８Ｌ、
Ｒ４５６Ｇ、
Ｈ４５７Ｑ、
Ｓ４７４ＡおよびＰ４９０における終止
のうちの一つ以上を含む、使用または医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線傷害の分野に関連する。より具体的には、本発明は電離放射線によって引き起こされる疾患に対する保護／その予防および治療に関連する。
【背景技術】
【０００２】
電離放射線は、１つの原子または分子から、少なくとも１つの電子を分離（電離）し得る、高エネルギー性の粒子または波から成る。電離能力は、個々の粒子または波のエネルギーに依存し、そしてその数に依存しない。
【０００３】
電離放射線は、放射性減衰、核分裂および核融合によって、および例えば高速電子または陽子を産生し得る粒子加速装置、またはシンクロトロン放射によって産生される。電離放射線に対する過剰な曝露は、「放射線障害」または「放射線宿酔」と定義される、器官組織の損傷を引き起こす。臨床像は、「急性放射線症候群」として要約される。持続性の高レベルの曝露はまた、慢性放射線症候群を引き起こし得る。
【０００４】
哺乳類（例えばヒト）の、電離放射線に対する過剰な曝露の典型的な症状は、曝露後数時間以内の、一過性および不定の紅斑（そう痒を伴う）を含む。次いで、数日から最大数週間まで続く潜伏期が続き得、そのときに曝露した組織の強い発赤、水疱形成、および潰瘍またはネクローシスが起こり得る。大量の皮膚線量は、曝露組織の永久的な毛髪の喪失、脂腺および汗腺の損傷、萎縮、線維症、皮膚色素沈着の減少または増加、および潰瘍またはネクローシスを引き起こし得る。
【０００５】
電離放射線に対する過剰な曝露を引き起こす状況は、核兵器または放射性降下物による、しかし典型的には、特に癌治療の過程における放射線療法による放射能汚染を含む。
【０００６】
現在米国において１０００万人超の癌生存者が存在する。癌生存者の数の指数関数的増加は、治療に関連する副作用の抑制により強く焦点をあて、従って治療に関連する副作用の分子的および細胞的基礎のより良い理解の獲得、および癌治療の長期毒性を改善または予防するための介入の開発を目的とした、より先を見越したアプローチを促した。
【０００７】
全ての癌患者の約７０％が、治療の過程のどこかの時点で放射線療法を受ける；そして従って放射線傷害は、全ての癌治療の２５％において決定的な役割を果たす（非特許文献１）。線量変更技術（ｄｏｓｅ  ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）の開発のような、治療送達の最近の進歩は、放射線療法の間の健康な組織の曝露の全体的な減少を引き起こした。それにもかかわらず、健康な組織の放射線毒性は、これまで、放射線傷害における最も重要な線量制限因子のままであり、かつ放射線療法の主な障害のままである。
【０００８】
骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ）、急性および慢性放射線皮膚炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒａｄｉｏｄｅｒｍｉｔｉｓ）、粘膜炎、口内乾燥、腸炎、急性および慢性直腸炎、肝炎、肺症（ｐｎｅｕｍｏｐａｔｈｙ）、心膜炎、心筋症、急性糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｏｌｕｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）および慢性糸球体硬化症を含む、重症の副作用が、現在の放射線療法に伴う。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｄｅ  Ｖｉｔａら、「Ｃａｎｃｅｒ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在、１つのみの放射線防護の薬剤が利用可能である；すなわちラジカルスカベンジャーＡｍｉｆｏｓｔｉｎｅ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）である。他の治療薬は、症状の治療のみに焦点をあてる。
【００１１】
従って、組織放射線毒性の予防または治療のための方法の開発に対する積年の必要性にも関わらず、進歩は遅く、そして安全および有効な方法は依然として利用可能でない（Ｈａｕｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎら、「Ｂｏｗｅｌ  ｉｎｊｕｒｙ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」  Ｓｅｍｉｎ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３；１３：１８９−２０２）。
【００１２】
従って、放射線傷害の前または後のいずれか、または両方で利用可能であり得る、放射線防護薬剤に対する大きなニーズが依然として存在する。
【００１３】
従って、本発明の目的は、放射線傷害の治療のための新規手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的は、治療的に有効な量のトロンボモジュリンまたはトロンボモジュリンアナログ、特に酸化抵抗性トロンボモジュリンアナログを含む、放射線傷害に苦しんでいるか、または放射線傷害に苦しんでいると考えられるか、または進行中のまたは将来の放射線療法またはあらゆる他の種類の電離放射線への曝露の対象である患者を治療するための薬物を提供することによって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、マウスの体全体の照射である。Ｖｅｈ．、ビヒクルコントロール；Ｓｏｌ．、ｓｏｌｕｌｉｎ処置
【図２】図２は、組換えヒトＴＭ（２．５ｎＭ）の照射、単回線量である。
【図３】図３は、組換えヒトＴＭ（２．５ｎＭ）の照射、分割線量である。
【図４】図４は、ｓｏｌｕｌｉｎ（２．５ｎＭ）の照射、単回線量である。
【図５】図５は、ｓｏｌｕｌｉｎ（２．５ｎＭ）の照射、分割線量である。
【図６】図６は、ｓｏｌｕｌｉｎ（５．０ｎＭ）の照射、単回線量である。
【図７】図７は、ｓｏｌｕｌｉｎ（５．０ｎＭ）の照射、分割線量である。
【図８】図８は、単回線量照射に曝露したＴＭの機能的活性である。
【００１６】
プロテインＣ活性化アッセイによって測定されたように、高度に統計的に有意な放射線量依存性のＴＭの補助因子機能の阻害が存在する（ｐ＝６×１０−６）。データポイントは、３つの独立したサンプルの平均値および標準誤差を示す。
【図９】図９は、分割照射に曝露したＴＭの機能的活性である。
【００１７】
ＴＭのプロテインＣを活性化する能力は、１．７７Ｇｙの６回分割後（ｐ＝０．００１）、および１．７７Ｇｙの１２回分割後（ｐ＝０．０００１）の両方で、高度に有意に低減される。１０．６２Ｇｙの線量が、単回の分割または６回の分割として送達されたかに関わらず、ＴＭ活性に差はない（ｐ＝０．１１）が、１２回分割として送達された２１．２４Ｇｙは、単回線量として投与した場合よりも、プロテインＣ活性化において有意により大きな低減と関連していた（ｐ＝０．００３）。データポイントは、３つの独立したサンプルの平均値および標準誤差を示す。
【図１０ａ】図１０ａおよび１０ｂは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析である。
【００１８】
パネルＡ：異なる線量の放射線に曝露されたＴＭのＳＰＲ反応をどのように比較し得るかを示す、４つの異なるセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）のオーバーレイ。
【００１９】
パネルＢ：放射線量の関数としての、平均ＴＭ−トロンビン複合体形成（偽照射コントロールのパーセントとして、センソグラムから得られた反応ユニット［ＲＵ］の平均値および標準誤差）。ＴＭおよびトロンビンの間の結合において、高度に統計的に有意な放射線量依存性の減少がある（ｐ＝０．００００６）。３つの別々の実験の平均および標準誤差。
【図１０ｂ】図１０ａおよび１０ｂは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析である。
【００２０】
パネルＡ：異なる線量の放射線に曝露されたＴＭのＳＰＲ反応をどのように比較し得るかを示す、４つの異なるセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）のオーバーレイ。
【００２１】
パネルＢ：放射線量の関数としての、平均ＴＭ−トロンビン複合体形成（偽照射コントロールのパーセントとして、センソグラムから得られた反応ユニット［ＲＵ］の平均値および標準誤差）。ＴＭおよびトロンビンの間の結合において、高度に統計的に有意な放射線量依存性の減少がある（ｐ＝０．００００６）。３つの別々の実験の平均および標準誤差。
【図１１ａ】図１１ａおよび１１ｂは、放射線量の関数としてのメチオニン３８８（Ｍｅｔ３８８）の酸化である。
【００２２】
パネルＡ：放射線量の関数としての、合成ペプチドにおけるＭｅｔ３８８酸化。
【００２３】
パネルＢ：放射線量の関数としての、組換えＴＭＥ４５６断片におけるＭｅｔ３８８酸化。データポイントは、少なくとも３つの別々のサンプル由来の平均値および標準偏差である。合成ペプチドおよびＴＭＥ４５６の両方のＭｅｔ３８８酸化において、高度に統計的に有意な放射線量依存性の増加がある（それぞれｐ＝０．０００１およびｐ＝４×１０−９）。
【図１１ｂ】図１１ａおよび１１ｂは、放射線量の関数としてのメチオニン３８８（Ｍｅｔ３８８）の酸化である。
【００２４】
パネルＡ：放射線量の関数としての、合成ペプチドにおけるＭｅｔ３８８酸化。
【００２５】
パネルＢ：放射線量の関数としての、組換えＴＭＥ４５６断片におけるＭｅｔ３８８酸化。データポイントは、少なくとも３つの別々のサンプル由来の平均値および標準偏差である。合成ペプチドおよびＴＭＥ４５６の両方のＭｅｔ３８８酸化において、高度に統計的に有意な放射線量依存性の増加がある（それぞれｐ＝０．０００１およびｐ＝４×１０−９）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「放射線傷害」という用語は、電離放射線への曝露によって引き起こされる傷害または損傷を指す。放射線傷害は、放射線障害、放射線宿酔、急性放射線症候群、または慢性放射線症候群を含むがこれに限らない。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「電離放射線」という用語は、１つの原子または分子から、１つまたは複数の軌道電子を駆出するのに十分なエネルギーを有する放射線を指す（例えば、α粒子、β粒子、γ線、ｘ線、中性子、プロトン、および物質内にイオン対を産生するために十分なエネルギーを有する他の粒子）。
【００２８】
「治療的に有効な量」は、放射線傷害に関連する症状を抑制する、または電離放射線への引き続く曝露後の放射線傷害の症状を予防または軽減する、活性成分の量として定義される。「治療的に有効な」はまた、治療無しと比較して、障害の発生、発生（ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ）の重症度、頻度または期間における任意の改善を指す。「治療」という用語は、他に明確に述べなければ、治癒（ｃｕｒｉｎｇ）または治癒（ｈｅａｌｉｎｇ）のいずれか、ならびに軽減、寛解、または予防を含む。
【００２９】
天然の環境において、トロンボモジュリンは血管を裏打ちする内皮細胞上のトロンビン受容体として作用する膜タンパク質である。トロンビンは、凝固カスケードの中心酵素であり、それはフィブリノーゲンをフィブリンへ変換し、フィブリンにより血餅がつくられる。最初に、局所の損傷は、その不活性な前駆体であるプロトロンビンから、少量のトロンビンの産生を引き起こす。トロンビンは次に、血小板を、そして２番目に、第ＶおよびＶＩＩＩ因子を含むある特定の凝固因子を活性化する。後者の作用は、さらなるトロンビン分子の大量の活性化、いわゆるトロンビンバーストを生じ、それは最後に安定な血餅の形成を引き起こす。
【００３０】
しかし、トロンボモジュリンに結合する場合、トロンビンの活性は以下のように変化する：トロンビン−トロンボモジュリン複合体の主な特徴は、そのプロテインＣを活性化する能力であり、それは次いで重要な補助因子である第Ｖａ因子および第ＶＩＩＩａ因子をタンパク分解性に不活性化することによって、凝固カスケードをダウンレギュレートし（Ｅｓｍｏｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９１）、６１４：３０−４３）、従って抗凝固活性を提供する。トロンビン−トロンボモジュリン複合体はまた、トロンビン活性化線溶阻害因子（ＴＡＦＩ）を活性化し得、それは次いで線維素溶解に拮抗する。さらに、活性化プロテインＣは、抗炎症性性質を示すことが公知である。
【００３１】
成熟ＴＭは、５つのドメインから成る：Ｎ末端レクチン様結合ドメイン、６つのＥＧＦ様リピートから成る上皮増殖因子（ＥＧＦ）ドメイン、Ｓｅｒ／Ｔｈｒリッチ領域（Ｏ結合型糖鎖付加ドメイン）、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン。
【００３２】
ドメインは３次元の、タンパク質分子のアミノ酸の自己集合配列（ａｒｒａｙ）であり、それはそのタンパク質の特異的生物学的活性に必要な構造エレメントを含む。トロンビン結合特性は、ＥＧＦドメインと関係していると考えられるが、レクチン様ドメインは、ＴＭの直接的な抗炎症性特性に関与すると考えられる（ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｏｕｗｅｒら、Ｔｈｅ  ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ４、１８１３−１８２４、２００６）。
【００３３】
【表１】
2011527992.tif 000002
（Ｃ．Ｓ．Ｙｏｓｔら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３４：７５９−７６６およびＤ．Ｗｅｎら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：４３５０−４３５７を参照のこと、どちらも本明細書中で参考文献に組み込まれる）
「天然の」トロンボモジュリンという用語は、天然タンパク質および膜結合型または界面活性剤可溶化（天然）トロンボモジュリンの実質的に同じ特徴的な生物学的活性を有するその可溶性形態の両方を指す。これらの可溶性ペプチドはまた、「野生型」または「非変異体」ペプチドとも呼ばれる。その生物学的活性は、トロンビンの受容体として作用し、およびそれによってプロテインＣの活性化を増加させる能力、および天然トロンボモジュリンに関連する他の生物学的活性、特に補体系の抑制のような抗炎症性活性を含む。ＴＭアナログの抗血栓（ａｎｔｔｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）特性の評価は、当業者に公知である。補体系の抑制の評価が、例えば上記のｖａｎ  ｄｅ  Ｗｏｕｗｅｒらの刊行物において開示される。
【００３４】
対照的に「トロンボモジュリンアナログ」という用語は、アミノ酸の欠失、置換、誘導体化または追加のいずれか、または任意の他の種類の修飾によって、少なくとも１つのアミノ酸により、天然ＴＭと異なり、ここで、その活性は、プロテインＣの活性化に関してまたは抗炎症性過程の活性化、特に補体系の抑制に関して、天然ＴＭの生物学的に活性と実質的に対応するタンパク質を指す。１つの実施態様において、本発明のＴＭアナログは、両方に関して、すなわちプロテインＣの活性化および抗炎症性過程の誘導に関して、天然ＴＭと実質的に同じ性質を示す。
【００３５】
本発明によって適用可能なＴＭアナログは、天然ＴＭの１つまたは複数のドメインを含み得る。１つの実施態様において、ＥＧＦおよびレクチン様ドメインのみから成るＴＭアナログを使用し得る。しかし、ＥＧＦドメインのみから成るＴＭアナログも使用し得る。そのようなＴＭアナログは、ＷＯ２００８／０７３８８４Ａ１において開示される。
【００３６】
上記で概略を述べたように、本発明の１つの実施態様において、ＴＭアナログは、１つまたは複数のアミノ酸が除去された、または１つまたは複数の異なるアミノ酸で置換された、天然配列のアミノ酸配列またはその一部を有する。具体的には、除去または置換されるアミノ酸は、天然ＴＭタンパク質配列（配列番号第１番）の位置２９１または３８８のいずれか１つまたは両方のメチオニン残基である。これらのメチオニンを、アミノ酸アラニン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、またはバリンと置換し得る。最も好ましいのは、ロイシンとの置換である。
【００３７】
これらのメチオニンの置換は、オキシダントに対する曝露後にその活性、特にプロテインＣの活性化を保持する、酸化抵抗性ＴＭアナログを生じる。その抗炎症性活性は影響を受けない。それはまた、アミノ酸置換を有さない等価なペプチドと比較した場合、増加した特異的活性を示し得る。従って「酸化抵抗性ＴＭアナログ」は、酸素ラジカルのようなオキシダントによる不活性化に対して抵抗性であるペプチドである。好ましくは、これらのＴＭアナログは可溶性である。
【００３８】
従って本発明の１つの実施態様において、天然トロンボモジュリンの特徴的な抗血栓および抗炎症性活性を有するが、水性溶液中で可溶性であり、そしてオキシダントへ曝露された後に不活性化されない、トロンボモジュリンアナログを使用し得る。本発明のこの実施態様によって、そのペプチドは、少なくとも天然トロンボモジュリンの膜貫通および細胞質ドメインを欠く。
【００３９】
可溶性トロンボモジュリンまたはトロンボモジュリンアナログの様々な形態、例えばＡｓａｈｉ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によって開発されたいわゆるＡＲＴ−１２３、または現在ＰＡＩＯＮ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ、Ａａｃｈｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって開発中の、ｓｏｌｕｌｉｎとして公知の、組換え可溶性ヒトトロンボモジュリンが、当業者に公知である。組換え可溶性トロンボモジュリン、すなわち天然のアミノ酸配列のいかなる修飾も有さない可溶性トロンボモジュリンが、ＥＰ０３１２５９８の主題である。ＡＲＴ−１２３およびｓｏｌｕｌｉｎの両方を、本発明によって使用し得る。
【００４０】
Ｓｏｌｕｌｉｎは、可溶性であり、ならびにプロテアーゼおよびオキシダント抵抗性のヒトトロンボモジュリンアナログであり、そして従ってインビボで長い寿命を示す。Ｓｏｌｕｌｉｎはもっぱらトロンビンを阻害するのみではないので、Ｓｏｌｕｌｉｎの主な特徴は、その広い作用メカニズムにある。それはまた天然のプロテインＣ経路を活性化し、そして従ってトロンビンのさらなる産生を停止させる。
【００４１】
Ｓｏｌｕｌｉｎは、とりわけ欧州特許０６４１２１５Ｂ１、ＥＰ０５４４８２６Ｂ１およびＥＰ０５２７８２１Ｂ１の主題である。Ｓｏｌｕｌｉｎは、以下の位置において、天然ヒトトロンボモジュリンの配列（配列番号第１番）と比較して修飾を含む：Ｇ−３Ｖ、アミノ酸１−３の除去、Ｍ３８８Ｌ、Ｒ４５６Ｇ、Ｈ４５７Ｑ、Ｓ４７４ＡおよびＰ４９０における終止。このナンバリングシステムは、配列番号第１番の天然トロンボモジュリンによる。本発明の好ましい実施態様としてのｓｏｌｕｌｉｎの配列を、配列番号第２番において示す。
【００４２】
しかし、特に、本発明によってまた、上記で述べた性質の１つまたは複数、または上記で述べた欧州特許文書ＥＰ０５４４８２６Ｂ１、ＥＰ０６４１２１５Ｂ１およびＥＰ０５２７８２１Ｂ１において概略を述べた性質の１つまたは複数のみを含む、トロンボモジュリンアナログを利用し得る。
【００４３】
他のＴＭアナログは、例えば、プロテインＣを活性化する能力を低下させるよう修飾されている、ＷＯ２００８／０７３８８４Ａ２から公知である。本発明の１つの実施態様においてまた、これらのアナログを、ＩＢＤを治療するために使用し得る。
【００４４】
本発明によって適用可能な、特に好ましいトロンボモジュリンアナログは、以下の特徴の１つまたは複数を有するものである：
（ｉ）酸化抵抗性
（ｉｉ）プロテアーゼ抵抗性
（ｉｉｉ）均一なＮまたはＣ末端
（ｉｖ）例えば、天然トロンボモジュリン（配列番号第１番）の糖鎖付加部位の少なくともいくつかの糖鎖付加による、翻訳後修飾
（ｖ）線状二重逆数のトロンビン結合特性
（ｖｉ）比較的少量の界面活性剤を含む水性溶液における溶解性および典型的に膜貫通配列の欠如
（ｖｉｉ）グリコサミノグリカン鎖の欠如
最も好ましいのは、例えばｓｏｌｕｌｉｎによって示されるような、これらの修飾の全てを含む分子である。これらのアナログの製造が、上記で述べた欧州特許文書において開示される。
【００４５】
本発明のさらなる実施態様において、ＷＯ０１／９８３５２Ａ２またはＵＳ６，６３２，７９１から公知であるトロンボモジュリンアナログを使用し得る。ウサギ由来のトロンボモジュリンも使用し得る。ｓｏｌｕｌｉｎの６個のＥＧＦ断片が、ヒトプロテインＣを活性化する能力を有する、トロンビンとの複合体の形成に関して実質的に同じ生物学的活性を有するトロンボモジュリン断片の例である。この断片は実質的に、天然トロンボモジュリンの６個の上皮（ｅｐｉｔｈｅｒｍａｌ）増殖因子ドメインから成る。
【００４６】
本発明の基礎となる効果は、体全体のＸ線照射への曝露後に、試験動物の死亡率を評価したときに見出された。マウスに、Ｘ線の線量を増加させて照射すると、それによりコントロール動物の死亡率の増加を引き起こされた。しかし、可溶性ＴＭで処置したマウスは、未処置のコントロール群と比較して、死亡率の減少を示した。これらのデータはさらに、ＴＭの電離放射線照射は、ＴＭの抗血栓活性の不活性化を引き起こしたことを示す実験によって確認された。これを、ＥＧＦドメイン４および５の間のリンカーであり、そしてＴＭ機能に決定的であることが公知である（Ｃｌａｒｋｅら、Ｔｈｅ  ｓｈｏｒｔ  ｌｏｏｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ４  ａｎｄ  ５  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６８、６３０９−６３１５（１９９３））、ＴＭのＥＧＦドメインのＭｅｔ３８８の酸化によって説明し得る（下記の実施例を参照のこと）。
【００４７】
さらなる実験において、本発明者らは、ＴＭアナログのｓｏｌｕｌｉｎは、電離放射線によって不活性化されないことを示した。従って、酸化抵抗性ＴＭを、放射線傷害を治療するため、または予防するために使用し得る。
【００４８】
長い間、−フリーラジカルによるＤＮＡ損傷によるアポトーシスの誘導の他に−微小血管系の損傷が、多くの正常組織における初期および遅延性放射線反応において中心的な役割を果たすことが知られてきた。放射線は、アポトーシス、基底膜からの剥離、および内皮透過性の増加を含む、内皮細胞におけるおびただしい量の形態的および機能的変化を誘発し、間質腔にフィブリンの沈着を生じるので、微小血管系の高い放射線感受性は、内皮細胞に大部分起因し得る。
【００４９】
さらに、臨床試験および前臨床試験から、放射線療法が内皮ＴＭレベルの著明な減少を引き起こすこと、および化学的酸化がＴＭの不活性化をもたらし得ることが公知である（例えばＲｉｃｈｔｅｒら：Ｉｓ  ｔｈｅ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｌａｔｅ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ？、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ  １９９７、４４：６５−７１；Ｇｌａｓｅｒら：Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｌｏｃｋｓ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９０、２５６５−２５７３（１９９２））。従って、「トロンボモジュリン−プロテインＣ経路の復旧は、癌の放射線治療に伴う正常組織傷害性を予防または治療する、魅力的な戦略である」ことが示唆された（より詳細には、Ｈａｕｅｒ−Ｊｅｎｓｅｎら：Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｐａｔｈｗａｙ、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００４、３２（Ｓｕｐｐｌ．５）、Ｓ３２５−Ｓ３３０を参照のこと）。
【００５０】
しかし、今までのところ、インビボにおいてこの仮説の妥当性に関するいかなる証拠または実験的裏づけもない。特に、インビボにおける状況の複雑さのために、インビトロまたは細胞を含まないデータからのみ得られた、臨床実践場面のためのいかなる推定または仮定も除外される。さらに、血液凝固の多くの他の阻害剤が、正常組織放射線毒性を改善させる試みにおいて過去に試験された。しかし、否定的な結果または一致しない結果しか得られなかった。例えば、照射時に投与された抗凝固薬ヘパリンは、放射線誘発組織損傷を増悪しさえした（Ｗａｎｇら、「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｈｅｐａｒｉｎｓ」Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００５；９４：１０５４−１０５９）。従って、研究者らは潜在的な「ＴＭ−プロテインＣ経路の復旧」の治療的成功に関して懐疑的なままであった。
【００５１】
しかし、下記に示すインビボ実験によって実証されたように、本発明者らは今や、まさにＴＭおよびＴＭアナログ、特に酸化抵抗性ＴＭアナログを、放射線傷害の治療および予防のために使用し得ることを見出した。
【００５２】
本発明によって、ＴＭまたはＴＭアナログを、治療のために、特にまた急性または慢性放射線傷害の予防のために投与し得る。「急性治療」は、特に癌のために、実施中の放射線治療の間、ＴＭまたはＴＭアナログの投与を意味し、一方慣例による「慢性治療」は、治療の終了の約３か月以上後に起こると考えられる。従って、さらなる実施態様において、ＴＭまたはＴＭアナログを、癌生存者が以前に受けた放射線療法の慢性作用を治療するために彼らに投与し得るか、または放射線療法と同時の治療として癌患者に投与し得る。
【００５３】
さらに、ＴＭまたはＴＭアナログを、引き続く放射線療法の対象である患者に、または任意の他の電離放射線への曝露の対象である患者に投与し得る。本発明のこの局面において、ＴＭまたはＴＭアナログを、放射線傷害の予防のために使用する。完全な予防が可能ではないとしても、照射開始前のＴＭまたはＴＭアナログの投与は、後の放射線傷害を軽減する。
【００５４】
本発明の特定の実施態様において、ＴＭまたはＴＭアナログ、例えば酸化抵抗性ＴＭアナログを、−その作用機序のために−フリー酸素ラジカルのようなオキシダントの産生を直接または間接的に引き起こす、治療的に有効な量の細胞傷害性薬剤を受ける患者に投与する。都合のよいことに、酸化抵抗性ＴＭアナログは、そのような「酸化（ｏｘｉｄｉｓｉｎｇ）」抗癌剤との併用投与を可能にし、それによって、オキシダントの産生を誘発し得る細胞傷害性薬剤の存在下でも、放射線傷害作用の低減を可能にする。
【００５５】
本発明による併用療法は、ＴＭまたはＴＭアナログと、直接または間接的な酸化能力を有する細胞傷害性薬剤（抗癌剤）との、同時または連続的な投与であり得る。従って、本発明の１つの実施態様によって、治療的に有効な量のＴＭまたはＴＭアナログ（例えば酸化抵抗性ＴＭアナログ）および細胞傷害性薬剤を含む医薬品組成物が提供される。可能性のある細胞傷害性薬剤は、ドキソルビシンまたはダクチノマイシンである。
【００５６】
本発明の１つの実施態様において、トロンボモジュリンおよびＴＭアナログを、以下の状況に基づいて規定される、「急性放射線症候群」（ＡＲＳ）（放射線毒性または放射線宿酔として知られることもある）を有する患者を治療するために使用し得る：
・放射線は大量でなければならない（すなわち、０．７Ｇｙより多い）。０．３Ｇｙの低い線量で、軽度の症状が観察され得る。
【００５７】
・その線量は通常、外部でなければならない（すなわち、放射線源は、患者の体の外側である）。
【００５８】
・その放射線は、透過性でなければならない（すなわち、内部器官に達し得る）。
【００５９】
・体全体またはそのうちの重要な部分が、その線量を受けなければならない。
【００６０】
・その線量は、短時間に送達されなければならない（通常、約数分）。
【００６１】
放射線療法では多くの場合分割された線量を使用する。これらの大量の全体線量は、ある期間にわたって、少量の１日量で送達される。分割された線量は、同じ大きさの単回線量よりもＡＲＳを誘発する傾向が少ない（ｌｅｓ  ｐｒｏｎｅ）。
【００６２】
本発明のさらなる実施態様において、トロンボモジュリンおよびＴＭアナログを、骨髄症候群（造血性症候群と呼ばれることもある）を有する患者を治療するために使用し得、それによって、０．３Ｇｙの低さで軽度の症状が起こり得るが、完全な症候群は通常約０．７Ｇｙよりも多い線量で起こるであろう。
【００６３】
本発明の別の実施態様において、トロンボモジュリンおよびＴＭアナログを、心血管（ＣＶ）／中枢神経系（ＣＮＳ）症候群を有する患者を治療するために使用し得、それによって、２０Ｇｙの低さで軽度の症状が起こり得るがｍ完全な症候群は通常約５０Ｇｙよりも多い線量で起こるであろう。循環系の崩壊、ならびに浮腫、血管炎、および髄膜炎によって引き起こされる体液量の増加の結果としての限定した頭蓋円蓋部における圧の増加のために、３日以内に死亡する。
【００６４】
本発明のさらなる実施態様において、トロンボモジュリンおよびＴＭアナログを、皮膚の放射線への急性曝露によって生じる複雑な病理学的症候群を含む、皮膚放射線症候群を有する患者を治療するために使用し得る。基底層の損傷が、炎症、紅斑、および乾燥または湿潤剥離を引き起こす。
【００６５】
本発明の好ましい実施態様において、トロンボモジュリンおよびＴＭアナログを、胃腸症候群を有する患者を治療するために使用し得、それによって、６Ｇｙの低い線量でいくらかの症状が起こり得るが、完全な症候群は通常約１０Ｇｙよりも多い線量で起こるであろう。この症候群に関して、生存はきわめて可能性が低い。胃腸管および骨髄における破壊的および回復不能（ｉｒｒｅｐｅｒａｂｌｅ）な変化は通常感染、脱水および電解質の不均衡を引き起こす。通常２週間以内に死亡する。
【００６６】
本発明のさらなる実施態様において、トロンボモジュリンを、アルキル化剤（例えばシクロホスファミド）、白金を含む薬剤（例えばシスプラチン）、または挿入剤（例えばドキソルビシン）を含む、化学療法剤と組み合わせて治療的に使用し得る。
【００６７】
本発明をさらに、電離放射線が細胞損傷を引き起こす可能性を有する全ての状況において、例えば日射に対する保護剤として、または原子力発電所施設または放射性廃棄物廃棄場所における労働者のような、または事故または最後に、軍事的またはテロ攻撃の発生において、電離放射線に曝露される可能性のあるヒトのために使用し得る保護剤として、適用し得る。
【００６８】
トロンボモジュリンまたはＴＭアナログ、特にＳｏｌｕｌｉｎを、好ましくは非経口、例えば静脈内または皮下適用によって、非経口的に投与する。静脈内ボーラス適用が可能である。それを複数回投与量で投与し得る。トロンボモジュリンまたはＴＭアナログの複数回または慢性投与が可能である。
【実施例】
【００６９】
Ｉ．マウスにおける体全体の照射モデル
体全体の照射モデルを使用して、可溶性トロンボモジュリン（ｓｏｌｕｌｉｎ）の放射線誘発死亡率を減少させる能力を試験した。その薬剤を、照射の３０分または２４時間後に加えた。
【００７０】
１．材料および方法
本研究を、雄性マウス、ＣＤ２Ｆ１系統で行った。８匹の動物から成る２群の動物に、８．５Ｇｙの体全体の照射を行い、そして２群の同じサイズに、９Ｇｙの線量（ｄｏｓｉｓ）を与えた。Ｃｓ１３７γ線源を、放射線実験のために使用した。照射の３０分または２４時間後、コントロール群に、１００μｌのビヒクル（ＰＢＳ  ｐＨ７．０および５％マンニトール緩衝液）を尾静脈に注射し、一方ｓｏｌｕｌｉｎ群に、１００μｌのｓｏｌｕｌｉｎ（ビヒクル緩衝液に溶解した４ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈に注射した。マウスを１日２回チェックし（８：３０および５：００ｐ．ｍ．）、そして生存マウスの数を記録した。
【００７１】
２．結果
８．５Ｇｙの照射：
照射の３０分後のｓｏｌｕｌｉｎ投与の効果を評価する場合、コントロール群の２５％のマウスが死亡し、一方ｓｏｌｕｌｉｎ治療後、約１０％のマウスのみが死亡した。ｓｏｌｕｌｉｎを照射の２４時間後に投与した場合、ｓｏｌｕｌｉｎ群およびコントロール群の間で差はなかった。
【００７２】
９Ｇｙの照射：
９Ｇｙのより高い放射線レベルにおいて、より大きなｓｏｌｕｌｉｎの効果が観察された。照射の３０分後にｓｏｌｕｌｉｎで治療した場合、２５％のマウスのみが死亡し、一方コントロール群は、６０％超の死亡率を示した。２４時間の間隔で投与した場合、ｓｏｌｕｌｉｎの効果は得られなかった。
【００７３】
ｓｏｌｕｌｉｎは、一般的に耐容性がよかった。
【００７４】
図１：Ｓｏｌｕｌｉｎは、マウスにおける体全体の照射後の死亡率を減少させる。
【００７５】
ＩＩ．ｓｏｌｕｌｉｎ対組換えヒトトロンボモジュリンのインビトロにおける照射
全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｈｔ）組換えヒトトロンボモジュリンおよびｓｏｌｕｌｉｎを、細胞を含まない系において、γ線照射に曝露した。機能的活性に対する放射線の影響を、プロテインＣ活性化アッセイによって評価した。
【００７６】
１．材料および方法
照射：組換え全長ヒトＴＭを、プロテインＣ活性化アッセイのために、５０ｎＭの最終濃度まで緩衝液に溶解した。そのアッセイのために使用する緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、および０．１％のポリエチレングリコールを、ｐＨ８．０で含んでいた。
【００７７】
サンプルに、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  １０００  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ（Ｎｏｒｄｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｋａｎａｔａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、０、１０、または２０Ｇｙの単回または分割線量で照射した。サンプルを１３７Ｃｓ線源に曝露し、そして５．９０Ｇｙ／分を与えた。各線量に関して３つのバイアルを使用し、そしてプロテインＣ活性化アッセイを、３組で行った。
【００７８】
プロテインＣ活性化アッセイ。プロテインＣ活性化を測定することによって、ＴＭの機能的活性の変化を評価した。照射後、サンプルを１．０ｎｍｏｌ／ｌのＴＭの最終濃度まで希釈し、そして９６穴プレートで、２００ｎｍｏｌ／ｌのプロテインＣおよび１．４ｎｍｏｌ／ｌのトロンビンとともにインキュベートして（３７℃で１８０分、１．２ｍｌの全容量）、活性化プロテインＣを生成させた。生成した活性化プロテインＣの量を、発色性基質Ｓ−３３７の加水分解を、最初の６０分間は５分間隔で、そして適用可能な場合はその後３０分間隔で、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−ＴＥＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、Ｖｅｒｍｏｎｔ、ＵＳＡ）において４０５ｎｍでモニターすることによって測定した。その結果を、平均ＯＤ勾配値（ΔＯＤ／Δｔ）として、または６０分で生成したプロテインＣとして表した。
【００７９】
３．結果
その結果は、ｓｏｌｕｌｉｎの活性は、単回線量においても、分割線量においても、照射によって低下しないことを明らかに示す。
【００８０】
ＩＩＩ．電離放射線によるトロンボモジュリンの不活性化
背景：正常組織放射線傷害は、特に内皮トロンボモジュリン（ＴＭ）の欠乏レベルのために、血管血栓抵抗の喪失を伴う。ＴＭは、ほとんどの内皮細胞の管腔表面にあり、そして重要な抗凝固および抗炎症性機能を果たす。ＴＭにおけるトロンビン結合部位の特定のメチオニン残基（Ｍｅｔ３８８）の化学的酸化は、その主な機能的活性、すなわち、プロテインＣを活性化する能力を低下させる。本発明者らは、電離放射線への曝露が、同様の方式でＴＭに影響を与えるかどうかを調査した。
【００８１】
方法：全長組換えヒトＴＭ、プロテインＣの活性化に関わる上皮増殖因子様ドメイン４−６の構築物、および目的のメチオニンを含む合成ペプチドを、細胞を含まない系（すなわち系はＴＭの代謝回転または外部ドメインの脱落によって混乱しない）において、γ線に曝露した。機能的活性に対する放射線の影響を、プロテインＣ活性化アッセイによって評価し；ＴＭ−トロンビン複合体の形成を、表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって評価し、そしてＭｅｔ３８８の酸化を、ＨＰＬＣで評価し、そして質量分析によって確認した。
【００８２】
結果：放射線への曝露は、全て放射線量依存性の方式で、プロテインＣ活性化の線量依存性の低減、ＴＭ−トロンビン複合体形成の障害、およびＭｅｔ３８８の酸化を引き起こした。
【００８３】
結論：これらのデータは、電離放射線は、ＴＭ分子に有害に影響を与えることを実証する。本発明者らの発見は、臨床的放射線療法における正常組織毒性、および非治療的な放射線曝露状況における放射線症候群の発生と関連があり得る。
【００８４】
材料および方法
全ての実験を、細胞を含まない系、すなわち転写調節またはＴＭの外部ドメインの脱落によって混乱しない系において行った。ＴＭの機能的活性を、プロテインＣ活性化アッセイによって評価し、ＴＭおよびトロンビンの間の相互作用を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いてモニターし、そしてＭｅｔ３８８の酸化を、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で評価して質量分析（ＭＳ）で確認した。
【００８５】
照射
全てのサンプルを緩衝液（下記を参照のこと）に溶解し、そして、５００μＬの全容量を含む１ｍｌのポリプロピレン微量遠心分離チューブ（Ｃａｔ＃０２−６８１−３７４、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）中で照射した。そのＴＭサンプルを、最適な長期安定性のために供給業者によって推奨されるように、４℃で保存した。照射前に、サンプルを室温に１時間置いて、安定でかつ等しいサンプル温度を保証した。照射後、サンプルを２０分以内に、しかし照射後１５分より後に４℃へ戻した。このプロトコールは、実験内および実験間の変動を最小限にし、そして放射線への曝露（または偽照射）が全ての実験を通じて唯一の変数であることを保証した。
【００８６】
Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  １０００、モデルＢ（２つのセシウムカプセルを有する）Ｃｓ−１３７照射装置（Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ．、Ｋａｎａｔａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）において、５．９０Ｇｙ／分の線量率で照射を行った。サンプルを、８本のチューブが収容でき、２５ｍｍの高さで、そして４ｒｐｍのターンテーブル回転の中心におかれた、円形のプラスチックラックに、環状の配置で置くことによって、照射装置における９５％等線量領域内におけるサンプルの一定の配置を保証した。
【００８７】
サンプルを、段階的な（ｇｒａｄｅｄ）単回または分割放射線量に曝露し、最も低い放射線量（１．７７Ｇｙ）は、臨床的放射線療法で通常使用される１．８−２Ｇｙの分割サイズに近かった。全ての実験に関して、最適化試験および確認試験を含まずに、各線量レベルにおいて、少なくとも３つの独立したＴＭサンプルを照射し、そして別のセットのサンプルを、３つのエンドポイント（プロテインＣ活性化アッセイ、ＳＰＲ、ＨＰＬＣ／ＭＳ）のそれぞれのために照射した。
【００８８】
ＴＭ活性
ＴＭの機能的活性に対する、単回線量照射の影響を、０、１．７７（０．３分の放射線曝露）、１０（１．７分）、２０（３．４分）、４０（６．８分）、および８０Ｇｙ（１３．６分）への曝露後に、プロテインＣ活性化アッセイによって評価した。照射装置のタイマーが０．１分の増加単位で操作されるので、実際的な理由のために、線量１．７７Ｇｙを使用した。
【００８９】
膜貫通および細胞内ドメインを有さない、そして重要なことに、コンドロイチン硫酸部分を有さない、ＴＭの細胞外部分（Ｎ末端レクチン結合ドメイン、６個の上皮増殖因子［ＥＧＦ］様リピート、およびセリン／スレオニンリッチドメイン）から成る組換えヒトＴＭ分子（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて研究を行った。ＴＭを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、および０．１％のポリエチレングリコール、ｐＨ８．０を含む緩衝液中で、５０ｎＭの最終濃度に希釈した（１）。
【００９０】
１．７７Ｇｙの６回または１２回分割の放射線量に曝露された組換えＴＭの活性を、単回曝露として投与した同じ総放射線量に曝露されたＴＭの活性と比較することによって、分割照射への反応を調査した（それぞれ１０．６２Ｇｙ［６×０．３分］または２１．２４［１２×０．３分］Ｇｙ）。分割照射を、６時間離した１日２回の分割で行い、そして最後の分割とプロテインＣアッセイの実施の間の時間を、全てのサンプルで一定に維持するよう実験をデザインした。全てのサンプルが、同じ数の照射／偽照射手順を受けた（すなわち、それぞれ１２回照射または偽照射された）。各実験（分割および単回線量照射）の全てのサンプルを、各回１つのバッチとして一緒に照射装置へ入れ、そして照射を１時間の均一な時間後開始した。偽照射するサンプルを、同一の方式で処理し、照射するサンプルと同じ時間照射装置のチャンバーに置いたが、線源の活性化はしなかった。
【００９１】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の存在下における、ＴＭの放射線反応も調査した。ＭＰＯは、好中球および単球に存在し、そして例えば照射後炎症の状況において、炎症に関連する酸化バーストに関与する。ＭＰＯは、Ｈ２Ｏ２およびＣｌから、強力な酸化剤である次亜塩素酸の形成を触媒する。照射の直前に１．０μＭのＭＰＯ（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｕｗａｎｅｅ、ＧＡ）を加えたＴＭサンプルを、０Ｇｙ、１．７７Ｇｙ、２０Ｇｙ、または８０Ｇｙに曝露し、そして続いてプロテインＣアッセイによって分析して、化学的酸化に関して報告されたものと同様の（１５）、放射線誘発Ｍｅｔ３８８酸化に対するＭＰＯの相加的または相乗的効果の可能性を調査した。本研究において使用したＭＰＯの濃度は、Ｇｌａｓｅｒら（１）によって使用されたものと同じであった。
【００９２】
プロテインＣ活性化アッセイを、以下のように行った。照射および偽照射サンプルを、２．５ｎｍｏｌ／ＬのＴＭの最終濃度まで希釈し、そして９６穴プレートで、２００ｎＭのプロテインＣおよび１．４ｎＭのトロンビンとともにインキュベートして（３７℃で６０分間、１．２ｍＬの全容量）、活性化プロテインＣを生成させた。生成した活性化プロテインＣの量を、５分間隔で６０分間、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−ＴＥＫ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で、４０５ｎｍにおいて、発色性基質、Ｓ−３３７の加水分解をモニターすることによって測定した。その結果を、６０分における平均ＯＤとして表した。全てのアッセイを、３組で行い、そして統計的目的のために平均値を単一の値と考えた。
【００９３】
トロンビン−ＴＭ複合体形成
トロンビンとトロンボモジュリン（ＴＭ）の間の相互作用を、ＢＩＡＣｏｒｅ  ３０００装置（Ｂｉａｃｏａｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ＳＰＲによってモニターした。組換え全長ヒトＴＭを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、および０．００５％のＰ２０（界面活性剤）をｐＨ７．４で含むＨＢＳ緩衝液中で、５０ｎＭまたは１００ｎＭの最終濃度に溶解した。それらを、上記で記載したように、０Ｇｙ、１．７７Ｇｙ、２０Ｇｙ、または８０Ｇｙで照射し、そして続いてＳＰＲを用いて分析した。
【００９４】
ＳＰＲにおいて、光源は分極し、そして金フィルムのチップへ向けられ、光線は光学的検出ユニットへ反射される。チップ表面へ結合した質量の量は、反射の角度を変化させ、そして次に、センサーチップの表面近傍の屈折率を変化させる。検出ユニットは、共鳴角度と呼ばれる、角度の変化を検出する。Ｂｉａｃｏｒｅ用語で、共鳴角度の変化は、Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ（ＲＵ）で表され、１０００ＲＵは、チップ表面１ｍｍ２あたり約１ｎｇの結合タンパク質に相当する。センソグラムは、秒での時間に対するＲＵの連続的表示である、すなわち、チップの表面における結合および／または解離している質量のリアルタイムの表示である（１６）。
【００９５】
トロンビンを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、６０ｎｇ／μＬで溶解し、そしてＣＭ−５センサーチップ（ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｇｒａｄｅ、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ）の１つのチャネルに固定化した。トロンビンのアミン基を、製造会社の指示に従って、そしてＫｉｓｈｉｄａら（２）によって記載された方法によって、Ｂｉａｃｏｒｅアミンカップリングキットを用いて、センサーチップの活性化カルボキシル基へ共有結合した。トロンビンの固定化は、チップ表面へ結合した約４０００ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｉｔｓ（ＲＵ）を生じた。別のチャネルを、トロンビンの結合無しのブランクとして使用するために、活性化およびｐＨ８．５の１．０Ｍのエタノールアミンで、５μＬ／分で６分間ブロックした。リシンのフリーアミン基の利用可能性が、トロンビン−ＴＭ複合体形成に重要であるが、アミンカップリングの無作為な性質、トロンビンに多くのリシンが存在すること、およびチップに結合したトロンビン分子の数の多いことから、十分な数のトロンビン分子がＴＭを結合するために利用可能であることが保証される。
【００９６】
ＨＢＳ緩衝液中１５μＬの５０ｎＭのＴＭを、５μＬ／分の速度で、固定化トロンビン上を通過させた。トロンビンを含むチャネルの結合とブランク参照チャネルの非特異的結合の間の差として、センソグラムをリアルタイムで集めた、すなわち、マトリックスへのＴＭの非特異的結合を説明するために、ブランクチャネルのＲＵ値を、トロンビンを含むチャネルのものから引いた。結合反応の会合相は、５μＬ／分の速度におけるＴＭの３分の注入、続いてＴＭの解離をモニターするための、１分あたり５μＬで４分間の、ＨＢＳ緩衝液による洗浄から成る。１．５ＭのＮａＣｌで１分間洗浄することによって、チップ表面を再生した。次のサンプルの注入前に、ベースラインを５分間安定化させた。ベースラインからの反応の変化を、各サンプルに関して測定し、そして比較した。ＳＰＲ手順の最適化後、ＳＰＲを各放射線量レベルで３回（別の日に）行った。
【００９７】
Ｍｅｔ３８８の酸化
ＴＭ分子の他の場所にあるメチオニンによる混乱を避けるために、Ｍｅｔ３８８を含む合成１３アミノ酸ペプチド（ＡＰＩＰＨＥＰＨＲＣＱＭＦ）、およびＴＭのＥＧＦ様ドメイン４、５、および６から成るＴＭ断片（ＴＭＥＧＦ４５６）、Ｍｅｔ３８８を含み、そしてプロテインＣ活性化に関与する領域を使用して、ＨＰＬＣ／ＭＳによってＭｅｔ３８８の酸化を決定した。
【００９８】
放射線量レベルあたり、３つの別々のサンプルを分析した。各回（ｒｕｎ）において、各サンプルを３から４回の注入に使用し、再び平均値を単一の値と考えた。
【００９９】
ペプチドの調製。５ｍｇのペプチドＡＰＩＰＨＥＰＨＲＣＱＭＦ（ＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓによって合成された）を、５００μＬの１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（１．４６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、９．９ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍＭのＫＣｌ、０．１３７ＭのＮａＣｌ）中に溶解し、次いで７５０ｍＭの三塩基性リン酸カリウムによってｐＨ７．０へ緩衝化した、２５μＬのＴＣＥＰの１Ｍのストックを加えることによって、５０ｍＭのｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の最終濃度にした。酸化ペプチドおよび酸化していないペプチドを分離しながら、さらなる精製を、還元条件下でＨＰＬＣによって行った。サンプルを、照射まで１ｍＬのホウケイ酸ガラスチューブ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）に入れた。
【０１００】
ＴＭＥＧＦ４５６の精製。残基３６５から４８１の範囲であり、そしてさらなるＮ末端Ｈｉｓ−Ｍｅｔ配列を有する、トロンボモジュリン上皮増殖因子様ドメイン４、５、および６（ＴＭＥＧＦ４５６）の組換え形態を、Ｗｏｏｄら（３）によって記載されたように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現した。その発現システムは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＤｒ．Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｋｏｍｉｖｅｓの親切な寄贈であった。増殖の完了のときに、遠心分離によって細胞を増殖培地から分離し、そして上清を細胞ペレットからデカントし、そして合わせた。１．８ｇ／ＬのＥＤＴＡ二ナトリウム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）を加えた後、その上清を、１０×１００ｍｍのカラムに詰め、あらかじめ４ベッド容積の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．１で平衡化しておいた、１０ｍＬのベッド容積のＱ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上に、ＦＭＩ  Ｑモデル回転ピストンポンプ（Ｆｌｕｉｄ  Ｍｅｔｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｓｙｏｓｓｅｔ、ＮＹ）を用いて、５ｍＬ／分で送った。段階的な勾配のために、３つの溶出緩衝液を調製した：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．１、０．６２５ＭのＮａＣｌから成る溶出液Ａ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．１、１．２５ＭのＮａＣｌから成る溶出液Ｂ、および５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．１、２ＭのＮａＣｌから成る溶出液Ｃ。その３つの緩衝液を、それぞれ５ｍＬ／分で１０分間、連続してカラムにポンプで送り、そして別々に回収した。通常ＴＭＥＧＦ４５６を含む溶出液Ｂを、ＳＨ−３０００ローターで、４℃で３０分間、３０００ｒｐｍ（１８６８ＲＣＦ）で遠心分離することによる、Ｂｉｏｍａｘ−５膜を有するＡｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ中で４ｍｌに濃縮した。その残留物を、６０℃に維持したＧｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ  ３μｍカラム（Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）を用る、逆相クロマトグラフィーによって精製した。そのカラムを、１ｍＬ／分の流速で、９０％のＨ２Ｏ／０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および１０％のアセトニトリル（ＭｅＣＮ）／０．１％のＴＦＡの開始条件で、少なくとも１２分間（４カラム容量）平衡化した。４ｍＬのサンプルを、Ｗａｔｅｒｓ７１７＋Ａｕｔｏ−ｓａｍｐｌｅｒを用いて注入した。最後の注入後、溶媒を９分間で１０％から２６％のＭｅＣＮ／０．１％のＴＦＡへ変化させた。次いで、２１分間で２６から４０％のＭｅＣＮ／０．１％のＴＦＡへ変化させることで勾配をゆるやかにした。２１４ｎｍにおける吸光度によってモニターするとおり、ＴＭＥＧＦ４５６は１８分から２１分の間の広い範囲で溶出する。Ｇｉｌｓｏｎ  ＦＣ−２０４  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒを用いて、画分を１ｍＬのアリコートで採取し、そして２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を１００μＬ用いて、各画分のｐＨを７．０に調整した。次いでサンプルを高真空ラインで１１００μｌのアリコートに凍結乾燥し、そして−８０℃で保存した。その乾燥��末を、少容量の１×ＰＢＳに溶解した。２８０ｎｍにおける吸光度、およびＰａｃｅら（１８）の方法によって計算した６７２０Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸収係数によって濃度を決定した。サンプルを１０μｇ／ｍＬ（７５ｎＭ）に希釈し、そして５００μＬのアリコートを照射まで凍結した。
【０１０１】
酸化および非酸化（ｕｎｏｘｉｄｉｚｅｄ）メチオニンを含むペプチドのＨＰＬＣ分離。単回線量照射（０、１．７７、１０、２０、４０、または８０Ｇｙ）の前に、サンプルを、蒸留水で１００μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。サンプルを、１Ｍストック溶液からのさらなる５０ｍＭの新しいＴＣＥＰ、ｐＨ７．０で還元し、そして室温で５分間混合し、そして次いで酸化に関して分析するために注入した。そのＨＰＬＣ法を最適化して、６５℃に加熱した、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｔｉｓ  ４．６×２５０ｍｍ  ｄＣ１８  ５μｍ逆相カラムを用いて、２０ｐｍｏｌのペプチドを観察した。一定の１ｍＬ／分の流速で、勾配を１０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡで開始し、そして８分かけて２０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡへ増加させ、次いでさらに２０分かけて３０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡへ変化させる。
【０１０２】
ｒＴＭＥＧＦ４５６サンプルの消化および分析。それぞれ５μｇのＴＭＥＧＦ４５６サンプルを、１．５ｍＬの微量遠心分離チューブへ移し、そして凍結乾燥した。次いでサンプルを、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．０、および２００ＵのＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を含む、４０μＬの還元緩衝液にとかした。サンプルを、３７℃で３０分間、同時に還元および脱グリコシル化した。キモトリプシン（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、ＮＪ）を、２５μＬの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中１μｇ／μＬにして、製造業者の仕様書の通りに調製した。１ｍＭのＣａＣｌ２、２．５μｇのキモトリプシンを各チューブに加え、そしてサンプルを３０℃で４時間、振とう機に置いた。インキュベーション後、サンプルを４５秒間沸騰させてキモトリプシンを不活性化し、そしてＨＰＬＣによる分析まで−８０℃で保存した。各消化物を３組で、上記で記載したＨＰＬＣ分析にかけた。
【０１０３】
質量分析による確認。より複雑なペプチド消化混合物におけるピーク位置およびアイデンティティーを、合成ペプチドのＨＰＬＣ同時注入を用いて、そして質量分析によって確認した。酸化および還元形態に対応すると考えられるピークの画分を取った。確認のために、これらの溶液を、ジヒドロキシ安息香酸と混合し、標的プレートへスポットし、そして乾燥させてから、Ｂｒｕｋｅｒ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＩＩ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に挿入した。
【０１０４】
統計分析
それぞれのパラメーター（プロテインＣ活性化、ＳＰＲ  ＲＵ、およびＭｅｔ３８８酸化）に関して、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｒｓｔｒａテストを用いて、正確なノンパラメトリック（ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｉｃ）な推側のための、ＣｙｔｅｌＳｔｕｄｉｏ／ＳｔａｔＸａｃｔ８ソフトウェアパッケージを用いて（Ｃｙｔｅｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、放射線量依存性の増加／減少があるかどうかを決定した。Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｒｓｔｒａテストは、Ｋｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓテスト（ノンパラメトリック一元分散分析）と同様であるが、その集団は無作為ではなく、傾向（この場合放射線量依存性の傾向）を示すというさらなる仮説を作る。個々の差異の、選択された単変量比較を、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テストで行った。全てのテストに関して、０．０５のアルファレベルを、有意性のレベルとして確立した。
【０１０５】
結果
ＴＭ活性
組換えヒトＴＭの放射線曝露は、プロテインＣ活性化アッセイ（ｐ＝６×１０−８、図８）によって評価されたように、ＴＭ機能的活性の、強力な、高度に統計的に有意な線量依存性の減少を引き起こした。１．７７Ｇｙでは、ＴＭ活性の減少は無かったが、１０Ｇｙでは、その減少は既に有意であった（ｐ＝０．０３）。
【０１０６】
分割された放射線への曝露は、１．７７Ｇｙの６回の分割後（ｐ＝０．００１）および１２回の分割後（ｐ＝０．０００１）の両方で、ＴＭのプロテインＣを活性化する能力において、高度に統計的に有意な低減を明らかにした（図９）。１０．６２Ｇｙの線量が、単一の分割としてまたは６回の分割として送達されたかに関わらず、ＴＭ活性において差はなかった（ｐ＝０．１１）。重要なことに、１２回の分割として送達された２１．２４Ｇｙは、その放射線量が単回の曝露として投与された場合よりも、プロテインＣ活性において有意により大きな低減を伴った（ｐ＝０．００３）。
【０１０７】
ＭＰＯは、調査した全ての線量レベルにおいて、プロテインＣ活性化における放射線量依存性低減を増強した（全ての線量レベルにおいてｐ＜０．０５）。例えば、ＭＰＯ無しの１．７７Ｇｙへの曝露は、この実験において１２％のプロテインＣ活性化の平均低減を引き起こしたが、ＭＰＯの存在下で、同じ放射線量により、プロテインＣ活性化を４０％低減した。
【０１０８】
トロンビン−ＴＭ複合体形成
センソグラム（例を図１０ａに示す）を、各実験に関して記録した。図１０ｂにおいて示された棒グラフは、３つの独立した実験からの放射線曝露後の平均ＲＵ値（０Ｇｙサンプルと比較した）を示す。電離放射線への曝露は、トロンビンとトロンボモジュリンの間の相互作用の、高度に統計的に有意な線量依存性の減少を引き起こした（ｐ＝０．００００６）。ベースライン（０Ｇｙ）と比較して、平均ＲＵ値は、１．７７Ｇｙへの曝露後に１３．２±１．０％、２０Ｇｙ後に１８．９±１．７％、そして８０Ｇｙ後に２１．６±１．８％減少した。
【０１０９】
Ｍｅｔ３８８の酸化
ＴＭＥＧＦ４５６のキモトリプシン消化後、生じたペプチドは合成ペプチドと構造的に同一であった。合成ペプチドおよび消化ＴＭＥＧＦ４５６の両方における酸化ピークは、１４．７分に溶出され、そして非酸化ピークは約１８．３分から１８．４分に溶出された。これらのピークは、消化物の他のピークから離れたベースラインであった。
【０１１０】
合成ペプチドのＭｅｔ３８８酸化において、高度に統計的に有意な放射線量依存性の増加があった（ｐ＝０．０００１、図１１ａ）が、より低レベルの放射線曝露では酸化にほとんど変化はなかった。
【０１１１】
組換えタンパク質断片ＴＭＥＧＦ４５６のサンプルを、約３０％のＭｅｔ３８８が既にスルホキシド形態である状態で開始した。合成ペプチドとは対照的に、ＴＭＥＧＦ４５６は、より低い放射線量の後でさえ、酸化の増加を示し、そして放射線曝露の増加と共に、Ｍｅｔ３８８の酸化において高度に統計的に有意な増加を示した（ｐ＝４×１０−９、図１１ｂ）。
【０１１２】
質量分析により、分子イオンが各例において予測された質量のものであることが確認された。
【数１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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