(57)【要約】  ナノ構造組成物を固体粉末から製造する方法が開示される。この方法は、（ａ）固体粉末を加熱し、それにより、加熱された固体粉末を提供すること、（ｂ）加熱された固体粉末を、加熱された粉末よりも冷たい液体にガス媒体の存在下で浸漬すること、および、（ｃ）冷たい液体、加熱された固体粉末およびガス媒体を、ナノ構造が固体粉末の粒子から形成され、かつ、安定な気相がガス媒体から形成されるように選択される電磁放射線によって照射することを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）固体粉末を加熱し、それにより、加熱された固体粉末を提供すること、
（ｂ）前記加熱された固体粉末を、前記加熱された粉末よりも冷たい液体にガス媒体の存在下で浸漬すること、および、
（ｃ）前記冷たい液体、前記加熱された固体粉末および前記ガス媒体を、ナノ構造が固体粉末の粒子から形成され、かつ、安定な気相がガス媒体から形成されるように選択される電磁放射線によって照射すること
を含む、ナノ構造組成物を固体粉末から製造する方法。
【請求項２】
前記加熱された固体粉末を、前記ガス媒体の前記存在を確立するように前記浸漬前に前記ガス媒体に通すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ガス媒体を、前記ガス媒体の前記存在を確立するように前記浸漬前に前記液体の中に導入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ガス媒体は疎水性ガスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ガス媒体が、二酸化炭素、酸素、窒素、二酸化イオウ、水素、フッ素、メタン、ヘキサン、ヘキサフルオロエタンおよび空気からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記固体粉末はミクロサイズの粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ミクロサイズの粒子は結晶性粒子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ナノ構造は結晶性ナノ構造である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記液体は水を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記固体粉末が、強誘電性物質および強磁性物質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
固体粉末が、ＢａＴｉＯ３、ＷＯ３、およびＢａ２Ｆ９Ｏ１２からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
固体粉末はヒドロキシアパタイトを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
固体粉末は、鉱物、セラミック物質、ガラス、金属および合成ポリマーからなる群から選択される物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記電磁放射線は無線周波数の範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記電磁放射線は連続波の電磁放射線である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記電磁放射線は、変調された電磁放射線である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
液体と、ナノ構造と、安定または準安定な気相とを含むナノ構造組成物であって、前記ナノ構造の少なくとも一部が、ナノメートルサイズのコア物質と、前記コア物質との定常的な物理的状態にある整列した流体分子のエンベロープとを含むナノ構造組成物。
【請求項１８】
前記ガスをナノ構造体組成物に加えられた励起エネルギーに応答して放出することができ、かつ、前記励起エネルギーが停止されたときには前記ガスを捕集することができる、請求項１７に記載のナノ構造組成物。
【請求項１９】
非大気条件で調製される、請求項１７または１８に記載のナノ構造組成物。
【請求項２０】
ガスジェットの存在下で調製される、請求項１７〜１９のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項２１】
ガスの存在下において、前記ガスの自然の大気濃度とは実質的に異なる濃度で調製される、請求項１７〜２０のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項２２】
ガスの存在下において、周囲温度よりも実質的に低い温度で調製される、請求項１７〜２１のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項２３】
前記液体分子のエンベロープは前記液体と識別可能である、請求項１７〜２２のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項２４】
前記コア物質は結晶性である、請求項１７〜２３のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項２５】
前記液体は水を含む、請求項１７〜２４のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項２６】
前記気相は疎水性ガスを含む、請求項１７〜２５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項２７】
前記気相が、二酸化炭素、酸素、窒素、二酸化イオウ、水素、フッ素、メタン、ヘキサン、ヘキサフルオロエタンおよび空気からなる群から選択される、請求項１７〜２６のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項２８】
前記気相が前記エンベロープの中に存在するか、または、前記エンベロープに付着して存在する、請求項１７〜２７のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項２９】
前記気相が前記コアの中に存在するか、または、前記コアに付着して存在する、請求項１７〜２８のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項３０】
前記気相が前記ナノ構造間の液体領域に存在する、請求項１７〜２７のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項３１】
ナノ構造組成物がまず表面と接触させられ、次いで、所定の洗浄プロトコルによって洗い流されるとき、組成物の電気化学的形跡が前記表面に保存される、請求項１７〜３０のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項３２】
ナノ構造組成物は、前記液体それ自体のゼータ電位よりも実質的に大きいゼータ電位によって特徴づけられる、請求項１７〜３１のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項３３】
前記ナノ構造は、前記液体の比重よりも小さい比重、または、前記液体の比重と等しい比重を有する、請求項１７〜３２のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項３４】
ナノ構造組成物が着色された溶液と混合されるとき、前記着色された溶液のスペクトル特性は実質的に変化される、請求項１７〜３３のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項３５】
ナノ構造組成物は、水と比較して、高まった超音波速度によって特徴づけられる、請求項１７〜３４のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項３６】
ナノ構造組成物は細菌コロニー拡大速度の増加を容易にすることができる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項３７】
ナノ構造組成物はファージ・細菌またはウイルス・細胞の相互作用の増加を容易にすることができる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項３８】
ナノ構造組成物は、固相マトリックスに対する高分子の結合を増強することができる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項３９】
ナノ構造組成物はＤＮＡ分子のフォールディングを少なくとも部分的に解くことができる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項４０】
ナノ構造組成物は酵素活性を安定化することができる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項４１】
ナノ構造組成物は、生体物質に対する細菌の付着を変化させることができる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項４２】
ナノ構造組成物は、樹脂に対する核酸の親和性結合を改善することができ、かつゲル電気泳動分離を改善することができる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項４３】
ナノ構造組成物はカラムの容量を増大させることができる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項４４】
ナノ構造組成物は、水と比較して、物質を溶解または分散する高まった能力によって特徴づけられる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項４５】
ナノ構造組成物は、水と比較して、高まった緩衝能によって特徴づけられる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項４６】
ナノ構造組成物は核酸増幅プロセスの効率を改善することができる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項４７】
別個の包装において、
（ａ）熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、および、
（ｂ）請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物
を含むポリメラーゼ連鎖反応のためのキット。
【請求項４８】
（ａ）請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物を提供すること、および、
（ｂ）前記ナノ構造組成物の存在下、ＤＮＡ配列に対する複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行し、それにより、ＤＮＡ配列を増幅すること
を含むＤＮＡ配列を増幅する方法。
【請求項４９】
ナノ構造組成物はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の効率を改善することができる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項５０】
（ａ）熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、
（ｂ）二本鎖ＤＮＡ検出分子、および、
（ｃ）請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物
を含むリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のためのキット。
【請求項５１】
ナノ構造組成物は、固体担体の存在下における少なくとも１つの高分子の操作を可能にすることができる、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物。
【請求項５２】
少なくとも１つの消毒剤と、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物とを含む消毒組成物。
【請求項５３】
請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物を含む組成物の消毒効果的量をその必要性のある個体に与え、それにより、個体の身体表面を消毒することを含む、個体の身体表面を消毒する方法。
【請求項５４】
物体を、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物を含む組成物と接触させ、それにより、物体を殺菌することを含む、物体を殺菌する方法。
【請求項５５】
請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物と、少なくとも１つの凍結保護剤とを含む、凍結保護組成物。
【請求項５６】
（ａ）細胞物を請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物と接触させること、および、
（ｂ）細胞物を凍結保存温度に供し、それにより、細胞物を凍結保存すること
を含む、細胞物を凍結保存する方法。
【請求項５７】
請求項５５に記載の凍結保護組成物を含む凍結保存容器。
【請求項５８】
（ａ）有効成分としての少なくとも１つの医薬剤と、
（ｂ）前記少なくとも１つの医薬剤のインビボ取り込みを高めるように配合される、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物と
を含む医薬組成物。
【請求項５９】
請求項５８に記載の医薬組成物を個体に投与し、それにより、細胞内への医薬剤のインビボ取り込みを高めることを含む、細胞内への医薬剤のインビボ取り込みを高める方法。
【請求項６０】
細胞を、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物を含む培地において融合し、それにより、細胞を融合することを含む、細胞融合方法。
【請求項６１】
細胞を、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物を含む培地においてインキュベーションし、それにより、真核生物細胞を培養することを含む、真核生物細胞を培養する方法。
【請求項６２】
真核生物培養培地と、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物とを含む細胞培養培地。
【請求項６３】
包装材と、前記包装材に含有されている、真核生物細胞を培養するために特定されるナノ構造組成物とを含む製造物であって、前記ナノ構造組成物が、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物を含む製造物。
【請求項６４】
包装材と、前記包装材に含有されている、モノクローナル抗体を作製するために特定されるナノ構造組成物とを含む製造物であって、前記ナノ構造組成物が、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物を含む製造物。
【請求項６５】
不死化細胞を、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物を含む培地において、抗体産生細胞と融合してハイブリドーマを得ることを含む、モノクローナル抗体を作製する方法。
【請求項６６】
セファロスポリンを、この物質の分散および溶解を可能にする条件下で、請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法。
【請求項６７】
（ａ）検出可能な作用因、および、
（ｂ）請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物
を含む、分析物を検出するためのキット。
【請求項６８】
包装材と、前記包装材に含有されている、検出可能な成分の検出を高めるために特定されるナノ構造組成物を含む製造物であって、前記組成物は請求項１７〜３５のいずれかに記載のナノ構造組成物を含む製造物。
【請求項６９】
ナノ構造組成物と、前記ナノ構造組成物を励起するための励起デバイスとを含む、ガスを再循環させるための装置であって、前記ナノ構造組成物は、前記励起デバイスが作動中であるときにはガスを放出することができ、かつ、前記励起デバイスが動作停止したときにはガスを捕集することができる装置。
【請求項７０】
請求項６９に記載の装置を含む、昆虫を誘引するための装置。
【請求項７１】
請求項６９に記載の装置を含む、植物成長を高めるための装置。
【請求項７２】
請求項６９に記載の装置の励起デバイスを作動させ、それにより、昆虫を誘引することを含む、昆虫を誘引する方法。
【請求項７３】
請求項６９に記載の装置の励起デバイスを日中の間作動させ、それにより、植物成長を高めることを含む、植物成長を高める方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ナノ構造に関し、特に、限定されないが、富化されたナノ構造組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノサイエンスは、物質の小さい粒子の科学であり、現代科学における最も重要な先端研究領域の１つである。これらの小さい粒子は、材料を構成する粒子がナノスケールになるとき、材料のすべての性質（例えば、その融点ならびにその電気的性質および光学的性質など）が変化するので、基礎的な観点から注目されている。
【０００３】
生物工学の領域では、例えば、ナノ粒子は、生物学的分子の実空間での構造および機能をプローブするためのナノメートルスケールの装置においてしばしば使用される。補助的なナノ粒子（例えば、アルギン酸カルシウムのナノ球体など）もまた、遺伝子トランスフェクションプロトコルを改善することを助けるために使用されている。
【０００４】
従来、様々なナノ粒子が、アーク放電、レーザー蒸発、熱分解プロセスの適用、プラズマの使用、ゾルゲルの使用などによって分子レベルから成長させて合成される。広く使用されているナノ粒子がフラーレンカーボンナノチューブであり、これは広義には、約１μｍ未満の直径を有する物体として定義される。この言葉のより狭い意味において、炭素からなる炭素の六角形の網の目シートを軸と平行に有する物質がカーボンナノチューブと呼ばれ、無定形炭素がカーボンナノチューブを取り囲んでいる物質もまた、カーボンナノチューブのカテゴリーに含まれる。
【０００５】
この技術分野においてもまた知られているものに、誘電性コアと、導電性シェル層とを有するナノ粒子であるナノシェルがある。カーボンナノチューブと同様に、ナノシェルもまた、例えば、金属の原子を誘電性基体に結合することによって分子レベルから成長させて製造される。ナノシェルは、上記で述べられた光学場増強現象を利用することが所望される適用において特に有用である。
【０００６】
国際特許出願公開番号ＷＯ２００３／０５３６４７および同ＷＯ２００５／０７９１５３（Ｇａｂｂａｉ）は、固体・流体組成物を調製するためのトップダウンプロセスを開示する。ミクロサイズ粒子の原料粉末が高い温度に加熱され、続いて、電磁無線周波数（ＲＦ）放射線の条件のもとで冷水の中に浸けられる。冷水およびＲＦ放射線の組合せは、粒子と、水との間の境界に影響を及ぼし、水分子および粒子の両方を破壊する。破壊された水分子はフリーラジカルの形態であり、このフリーラジカルにより、粒子の破片が包まれる。
【０００７】
Ｇａｂｂａｉの組成物は、多くの用途のために、特に、生命科学の分野において利用された。この目的のために、国際特許出願公開番号ＷＯ２００７／０７７５６２、同ＷＯ２００７／０７７５６０、同ＷＯ２００７／０７７５６１、同ＷＯ２００７／０７７５６３、同ＷＯ２００８／０８１４５６、および同ＷＯ２００８／０８１４５５を参照のこと（その内容は本明細書により参照によって組み込まれる）。
【０００８】
これまで、Ｇａｂｂａｉの組成物は、ＤＮＡ分子のフォールディングを解くこと、生体材料に対する細菌付着を変化させること、酵素活性を安定化すること、樹脂に対する核酸の親和性結合を改善すること、および、ゲル電気泳動分離を改善すること、カラムの容量を増大させること、核酸増幅プロセスの効率を改善すること、高分子を固体担体の存在下で操作すること、細胞内への医薬剤のインビボ取り込みを高めること、真核生物細胞を培養すること、ならびに、モノクローナル抗体を作製することのために利用されている。Ｇａｂｂａｉの組成物はまた、緩衝化、細胞融合、分析物検出、消毒、殺菌および凍結保護のためにも利用されている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ナノ構造組成物を固体粉末から製造する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）固体粉末を加熱し、それにより、加熱された固体粉末を提供すること、（ｂ）加熱された固体粉末を、加熱された粉末よりも冷たい液体にガス媒体の存在下で浸漬すること、および、（ｃ）冷たい液体、加熱された固体粉末およびガス媒体を、ナノ構造が固体粉末の粒子から形成され、かつ、安定な気相がガス媒体から形成されるように選択される電磁放射線によって照射することを含む。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法はさらに、加熱された固体粉末を、ガス媒体の存在を確立するように浸漬前にガス媒体に通すことを含む。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法はさらに、ガス媒体を、ガス媒体の存在を確立するように浸漬前に液体の中に導入することを含む。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ガス媒体は疎水性ガスを含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、ガス媒体が、二酸化炭素、酸素、窒素、二酸化イオウ、水素、フッ素、メタン、ヘキサン、ヘキサフルオロエタンおよび空気からなる群から選択される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、固体粉末はミクロサイズの粒子を含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、ミクロサイズの粒子は結晶性粒子である。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造は結晶性ナノ構造である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、液体は水を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、固体粉末が、強誘電性物質および強磁性物質からなる群から選択される。本発明のいくつかの実施形態によれば、固体粉末が、ＢａＴｉＯ３、ＷＯ３、Ｂａ２Ｆ９Ｏ１２およびＢａＳＯ４からなる群から選択される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、固体粉末はヒドロキシアパタイトを含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、固体粉末は、鉱物、セラミック物質、ガラス、金属および合成ポリマーからなる群から選択される物質を含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、電磁放射線は無線周波数の範囲にある。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、電磁放射線は連続波の電磁放射線である。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、電磁放射線は、変調された電磁放射線である。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ナノ構造組成物が提供される。このナノ構造組成物は、液体と、ナノ構造と、安定または準安定な気相とを含み、ただし、ナノ構造の少なくとも一部が、ナノメートルサイズのコア物質と、コア物質との定常的な物理的状態にある整列した流体分子のエンベロープとを含む。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、ガスをナノ構造体組成物に加えられた励起エネルギーに応答して放出することができ、かつ、励起エネルギーが停止されたときにはガスを捕集することができる。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は非大気条件で調製される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物はガスジェットの存在下で調製される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、ガスの存在下において、そのガスの自然の大気濃度とは実質的に異なる濃度で調製される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、ガスの存在下において、周囲温度よりも実質的に低い温度で調製される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、液体分子のエンベロープは液体と識別可能である。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、コア物質は結晶性である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、液体は水を含む。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、気相は疎水性ガスを含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、気相が、二酸化炭素、酸素、窒素、二酸化イオウ、水素、フッ素、メタン、ヘキサン、ヘキサフルオロエタンおよび空気からなる群から選択される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、気相がエンベロープの中に存在するか、または、エンベロープに付着して存在する。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、気相がコアの中に存在するか、または、コアに付着して存在する。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、気相がナノ構造間の液体領域に存在する。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、ナノ構造組成物が表面と接触させられ、その後、所定の洗浄プロトコルによって表面から洗い流されるとき、組成物の電気化学的形跡が表面に保存されるという性質を有する。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、液体それ自体のゼータ電位よりも実質的に大きいゼータ電位によって特徴づけられる。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造は、液体の比重よりも小さい比重、または、液体の比重と等しい比重を有する。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、着色された溶液のスペクトル特性を変化させることができる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、水と比較して、高まった超音波速度によって特徴づけられる。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は細菌コロニー拡大速度の増加を容易にすることができる。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物はファージ・細菌またはウイルス・細胞の相互作用の増加を容易にすることができる。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、固相マトリックスに対する高分子の結合を増強することができる。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物はＤＮＡ分子のフォールディングを少なくとも部分的に解くことができる。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は酵素活性を安定化することができる。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、生体物質に対する細菌の付着を変化させることができる。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、樹脂に対する核酸の親和性結合を改善することができ、かつゲル電気泳動分離を改善することができる。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物はカラムの容量を増大させることができる。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、水と比較して、物質を溶解または分散する高まった能力によって特徴づけられる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、水と比較して、高まった緩衝能によって特徴づけられる。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は核酸増幅プロセスの効率を改善することができる。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ポリメラーゼ連鎖反応のためのキットが提供される。このキットは、別個の包装において、（ａ）熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、および、（ｂ）本明細書中に記載されるナノ構造組成物を含む。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＤＮＡ配列を増幅する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）本明細書中に記載されるナノ構造組成物を提供すること、および、（ｂ）ナノ構造組成物の存在下、ＤＮＡ配列に対する複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実行し、それにより、ＤＮＡ配列を増幅することを含む。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の効率を改善することができる。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のためのキットが提供され、この場合、このキットは、（ａ）熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）二本鎖ＤＮＡ検出分子、および、（ｃ）本明細書中に記載されるナノ構造組成物を含む。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造組成物は、固体担体の存在下における少なくとも１つの高分子の操作を可能にすることができる。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、少なくとも１つの消毒剤と、本明細書中に記載される富化されたナノ構造組成物とを含む消毒組成物が提供される。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、個体の身体表面を消毒する方法が提供され、この場合、この方法は、本明細書中に記載されるナノ構造組成物を含む組成物の消毒効果的量をその必要性のある個体に与え、それにより、個体の身体表面を消毒することを含む。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、物体を殺菌する方法が提供され、この場合、この方法は、物体を、本明細書中に記載されるナノ構造組成物を含む組成物と接触させ、それにより、物体を殺菌することを含む。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に記載されるナノ構造組成物と、少なくとも１つの凍結保護剤とを含む凍結保護組成物が提供される。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、細胞物を凍結保存する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）細胞物を本明細書中に記載されるナノ構造組成物と接触させること、および、（ｂ）細胞物を凍結保存温度に供し、それにより、細胞物を凍結保存することを含む。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の凍結保護組成物を含む凍結保存容器が提供される。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、（ａ）有効成分としての少なくとも１つの医薬剤と、（ｂ）前記少なくとも１つの医薬剤のインビボ取り込みを高めるように配合される本明細書中に記載されるようなナノ構造組成物とを含む医薬組成物が提供される。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、細胞内への医薬剤のインビボ取り込みを高める方法が提供され、この場合、この方法は、本発明の医薬組成物を個体に投与し、それにより、細胞内への医薬剤のインビボ取り込みを高めることを含む。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、細胞融合方法が提供され、この場合、この方法は、細胞を、本明細書中に記載されるナノ構造組成物を含む培地において融合し、それにより、細胞を融合することを含む。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、真核生物細胞を培養する方法が提供され、この場合、この方法は、細胞を、本明細書中に記載されるナノ構造組成物を含む培地においてインキュベーションし、それにより、真核生物細胞を培養することを含む。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、真核生物培養培地と、本明細書中に記載されるナノ構造組成物とを含む細胞培養培地が提供される。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、包装材と、包装材に含有されている、真核生物細胞を培養するために特定されるナノ構造組成物とを含む製造物であって、ナノ構造組成物が、本明細書中に記載されるナノ構造組成物を含む製造物が提供される。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、包装材と、包装材に含有されている、モノクローナル抗体を作製するために特定されるナノ構造組成物とを含む製造物であって、ナノ構造組成物が、本明細書中に記載されるナノ構造組成物を含む製造物が提供される。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、モノクローナル抗体を作製する方法が提供され、この場合、この方法は、不死化細胞を、本明細書中に記載されるナノ構造組成物を含む培地において、抗体産生細胞と融合してハイブリドーマを得ることを含む。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、セファロスポリンを溶解または分散する方法が提供される。この方法は、セファロスポリンを、この物質の分散および溶解を可能にする条件のもと、本明細書中に記載されるナノ構造組成物と接触させることを含む。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、分析物を検出するためのキットが提供される。このキットは、（ａ）検出可能な作用因、および、（ｂ）本明細書中に記載されるナノ構造組成物を含む。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、製造物が提供される。この製造物は、包装材と、包装材に含有されている、検出可能な成分の検出を高めるために特定されるナノ構造組成物で、本明細書中に記載されるナノ構造組成物を含むナノ構造組成物とを含む。
【００７４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ガスを再循環させるための装置が提供される。この装置は、ナノ構造組成物と、ナノ構造組成物を励起するための励起デバイスとを含み、ただし、ナノ構造組成物は、励起デバイスが作動中であるときにはガスを放出することができ、かつ、励起デバイスが動作停止したときにはガスを捕集することができる。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、昆虫を誘引する方法が提供される。この方法は、本発明の装置の励起デバイスを作動させ、それにより、昆虫を誘引することを含む。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、植物成長を高める方法が提供される。この方法は、本発明の励起デバイスを日中の間作動させ、それにより、植物成長を高めることを含む。
【００７７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、二酸化炭素を再循環させるための装置が提供される。この装置は、組成物と、組成物を励起するための励起デバイスとを含む。本発明の様々な例示的実施形態において、組成物は、励起デバイスが作動中であるときには二酸化炭素を放出することができ、かつ、励起デバイスが動作停止したときには二酸化炭素を捕集することができる。
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、装置は、昆虫を誘引するための装置に組み込まれる。したがって、装置の励起デバイスは、昆虫を誘引するように作動させることができる。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、装置は、植物成長を高めるための装置に組み込まれる。したがって、装置の励起デバイスは、植物成長を高めるように作動させることができる。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、装置はさらに、組成物に接触するガスを、組成物から放出される二酸化炭素から分離するために設計および構築されるガス分離機構を含む。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、装置はさらに、ガス分離機構が、環境から組成物の中に伸びるスリーブを含む、組成物を保持するためのチャンバーを含む。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、装置はさらに、スリーブに設置され、かつ、環境への二酸化炭素の放出を制御するために構成される出口バルブを含む。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、装置はさらに、チャンバーの壁に設置され、かつ、組成物の表面と、環境との間における流体連絡を制御するために構成される入口バルブを含む。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、昆虫を捕獲するための装置が提供される。この装置は、安定状態と、励起状態とを少なくとも有する組成物を含有するチャンバーを含む。励起状態は、チャンバーの出口からの二酸化炭素の流出によって特徴づけられ、安定状態から励起状態への転移には、チャンバーの入口からの二酸化炭素の流入が伴う。本発明の様々な例示的実施形態において、この装置はさらに、組成物を励起するための励起デバイスと、出口の近くにいる昆虫を捕獲するために設計および構成される昆虫捕獲デバイスとを含む。
【００８５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、昆虫を捕獲する方法が提供される。この方法は、本発明の昆虫捕獲デバイスを働かせ、それにより、昆虫を捕獲することを含む。
【００８６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、励起デバイスは無線周波数送信機を含む。
【００８７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、装置における組成物は、上記で記載される富化されたナノ構造組成物である。
【００８８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、装置はさらに、出口から組成物の中に伸びるスリーブを含む。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、装置はさらに、スリーブに設置され、かつ、二酸化炭素の流出を制御するために構成される出口バルブを含む。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、装置はさらに、入口に設置され、かつ、流入を制御するために構成される入口バルブを含む。
【００９１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、装置はさらに、励起デバイスを作動および動作停止させるために構成される制御ユニットを含む。
【００９２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、制御ユニットは、励起デバイスを間欠的に作動させるために構成される。
【００９３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図１】図１は、本発明の様々な例示的実施形態によるガス富化ナノ構造組成物の概略的例示である。
【図２】図２は、本発明の様々な例示的実施形態によるガス再循環プロセスの概略的例示である。
【図３】図３は、本発明の様々な例示的実施形態による、富化された組成物を製造するための方法のフローチャート図である。
【図４】図４は、本発明の様々な例示的実施形態による、富化された組成物を製造するためのシステムの概略的例示である。
【図５】図５は、本発明の様々な例示的実施形態による、ガスを再循環させるための装置の概略的例示である。
【図６】図６は、本発明の様々な例示的実施形態による、昆虫を捕獲するための装置の概略的例示である。
【図７】図７は、本発明者によって行われた実験において使用された電気化学的堆積（ＥＣＤ）実験構成の概略的例示である。
【図８】図８は、本発明者によって行われた実験において得られるＥＣＤパターンを定義するために本発明のいくつかの実施形態に従って使用されたＥＣＤスコアを示す像である。
【図９】図９は、本発明者によって行われた実験において得られるような、電気伝導率を無機炭素（ＩＣ）含有量の関数として示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される二酸化炭素富化ナノ構造組成物を加熱する結果としての重量減少を示す。
【図１１】図１１は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される二酸化炭素富化ナノ構造組成物の加熱前、加熱直後、および、加熱後１週間で測定される際のＩＣ含有量を示す。
【図１２】図１２は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される二酸化炭素富化ナノ構造組成物の加熱前および加熱後１週間で得られるようなｐＨ値を示す。
【図１３】図１３は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される原型装置の画像である。
【図１４】図１４は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図１５】図１５は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図１６】図１６は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図１７】図１７は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図１８】図１８は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図１９】図１９は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図２０】図２０は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図２１】図２１は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図２２】図２２は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図２３】図２３は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図２４】図２４は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図２５】図２５は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図２６】図２６は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図２７】図２７は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図２８】図２８は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図２９】図２９は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図３０】図３０は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図３１】図３１は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図３２】図３２は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図３３】図３３は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図３４】図３４は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図３５】図３５は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図３６】図３６は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図３７】図３７は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図３８】図３８は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図３９】図３９は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図４０】図４０は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図４１】図４１は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図４２】図４２は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図４３】図４３は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図４４】図４４は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図４５】図４５は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図４６】図４６は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図４７】図４７は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図４８】図４８は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図４９】図４９は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図５０】図５０は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図５１】図５１は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図５２】図５２は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【図５３】図５３は、本発明の様々な例示的実施形態に従って製造される３つの原型装置について測定される際の、二酸化炭素濃度レベルを時間の関数とするプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ナノ構造に関し、特に、限定されないが、富化されたナノ構造組成物に関する。
【００９６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、および／または図面および／または実施例において例示される構成要素および／または方法の組み立ておよび構成の細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００９７】
本発明者は、ナノ構造を含有する組成物が、ガスが組成物に留まるようにガスにより富化され得ることを発見している。そのような組成物は本明細書中では、ＧＥＮＣと略記されるガス富化ナノ構造組成物として示される。本発明の実施形態のために好適な組成物は、安定または準安定な気相が存在するナノ構造組成物であり得る。
【００９８】
安定な気相は、本明細書中で使用される場合、環境に自発的に放出されることなく、（数日から数年までの）長時間（例えば、数ヶ月間）にわたって液体に留まる気相を示す。
【００９９】
準安定な気相は、（数分から数日までの）比較的短い期間（例えば、数時間）の後で液体から環境に自発的に放出される気相を示す。
【０１００】
ガスの自発的放出は、エネルギーを何ら加えることなく、液体が環境との熱的平衡状態にあるときに生じるガス放出を示す。
【０１０１】
下記の実施例の節において明らかにされるように、液体およびナノ構造を含むナノ構造組成物は安定な気相を含有する。特定の理論にとらわれることはないが、本発明者は、組成物の安定な気相がナノ構造の近くに存在し得るか、または、ナノ構造間に形成される空間に存在し得ることを仮定する。そのような安定な気相は典型的には、ナノ気泡の形態である。それにもかかわらず、気相がナノ構造の結晶性コアに捕捉されることは除外されない。
【０１０２】
図１は、本発明の様々な例示的実施形態によるガス富化ナノ構造組成物１８の概略的例示である。組成物１８は、ナノ構造１０と、液体１６（例えば、水性液体（例えば、水）など、しかし、これに限定されない）とを含む。
【０１０３】
本明細書中で使用される用語「ナノ構造」は、それぞれがナノメートル規模または１ナノメートル未満の規模であり、一般には「ナノ粒子」と略記される１個または複数個の粒子を含む、１マイクロメートル未満の規模での構造を示す。そのような構造の異なる要素（例えば、ナノ粒子、分子）の間における距離は数十ピコメートル以下の程度であることが可能であり、そのような場合には、ナノ構造は「連続するナノ構造」として示され、または、数百ピコメートル〜数百ナノメートルの間であることが可能であり、この場合には、ナノ構造は「不連続なナノ構造」として示される。したがって、本発明の実施形態のナノ構造は、１個のナノ粒子、あるいは、複数のナノ粒子からなる配置、あるいは、１個または複数個のナノ粒子および１個または複数個の分子からなる任意の配置を含むことができる。
【０１０４】
本発明の１つの実施形態によれば、ナノ構造１０は、典型的にはガス状状態にある整列した流体分子のエンベロープ１４によって取り囲まれるナノメートルサイズのコア物質１２を含む。コア物質１２およびエンベロープ１４は好ましくは、定常的な物理的状態にある。本発明の関連において、「定常的な物理的状態」は、コア物質およびエンベロープが、少なくとも局所的最小値を有する何らかのポテンシャルによって結合する状況を示す。
【０１０５】
本明細書中で使用される表現「整列した流体分子」は、相関がそれらの間にある流体分子の組織化された配置を示す。
【０１０６】
本発明の様々な例示的実施形態において、エンベロープ１４はコア１２から識別可能である。このことが、例えば、下記の実施例においてさらに詳述されるように、極低温透過電子顕微鏡観察を使用して確認され得る。
【０１０７】
組成物１８はさらに気相２０を含み、この場合、気相２０は、エンベロープ１４、コア１２および液体１６の少なくとも１つの中に存在するか、または、エンベロープ１４、コア１２および液体１６の少なくとも１つに付着して存在する。より具体的には、気相２０は、（ｉ）エンベロープ１４の中に存在することができ、そのような場合、整列した流体分子はまた、気相２０を包む；（ｉｉ）ナノ構造１０と、液体１６との間の境界部に存在することができ、そのような場合、気相２０はエンベロープ１４に付着し（例えば、結合し）、しかし、エンベロープ１４によって取り囲まれない；（ｉｉｉ）例えば、コア物質１２の固体構造（例えば、結晶性構造）の中に存在することができ、そのような場合、気相２０はコア物質１２の原子間もしくは分子間に捕捉される；および／または（ｉｖ）ナノ構造１０の間の液体領域に存在することができる。これらの関係のどのような組合せもまた意図される。
【０１０８】
気相２０はガス分子の形態が可能であるか、または、２つ以上のガス分子を含有するより大きい物体（例えば、ナノ気泡、しかし、これに限定されない）の形態が可能である。
【０１０９】
多くのタイプのガスが組成物１８にとって好適である。典型的には、ガスは疎水性である。好適なガスの代表的な例には、限定されないが、二酸化炭素（ＣＯ２）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、二酸化イオウ（ＳＯ２）、水素（Ｈ）、フッ素（Ｆ）、メタン（ＣＨ４）、ヘキサン（Ｈ６Ｈ１４）、ヘキサフルオロエタン（Ｃ２Ｆ６）および空気が含まれる。本発明の様々な例示的実施形態において、ガスは二酸化炭素（ＣＯ２）である。下記において明らかにされるように、ＣＯ２気相の場合、本発明の実施形態の富化された組成物は依然として、比較的高いｐＨ値を有する。このことは、気相が液体に溶解しないことを示している。
【０１１０】
本発明者は、ガスの流出が、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を励起状態に励起することによって生じ得ることを発見している。本発明者は、組成物が励起状態から安定状態への転移を受けるとき、組成物がガスのためのシンク物質として作用することを発見している。したがって、本発明者は、ガスの流入が、励起された組成物がその安定状態に戻ることを許容することによって生じ得ることを発見している。
【０１１１】
したがって、本発明の様々な例示的実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、少なくとも安定状態および励起状態によって特徴づけられる。励起状態が組成物からのガスの流出によって特徴づけられ、励起状態から安定状態への転移には、組成物へのガスの流入が伴う。これらの実施形態は、組成物がガス再循環のために使用されるとき、特に有用である。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物が、ＣＯ２を再循環させるために使用される。
【０１１２】
このガス再循環プロセスが図２に例示される。示されるように、本発明の実施形態の組成物は一般に、安定状態と、励起状態とを有する。本発明の関連における用語「一般に」は、組成物が３つ以上の状態を有し得ることを暗示する。例えば、組成物は、１つの安定状態と、複数の励起状態とを有することができる。組成物はまた、励起状態の連続体を有することができる。本発明の関連における用語「励起状態」は、組成物のエネルギーＥが、組成物がその安定状態にあるときのエネルギーよりも大きい状態を示す。
【０１１３】
本発明の関連における用語「安定状態」は、組成物が、別の状態への自発的な巨視的転移を実質的に経ることなく、長期間にわたって留まる状態を示す。典型的には、過酷な条件（例えば、組成物への膨大な量のエネルギーの送達など）がない場合、本発明の実施形態の組成物は、少なくとも１日間、より好ましくは少なくとも１週間、より好ましくは少なくとも１ヶ月間、より好ましくは少なくとも１年間、より好ましくは少なくとも数年間、その安定状態に留まることができる。
【０１１４】
好ましくは、しかし、絶対的ではないが、組成物の励起状態（１つまたは複数）は非安定または準安定である。励起状態が非安定であるとき、励起状態から安定状態への転移が自発的であり、そのような転移を達成するために、エネルギーを組成物に供給する必要がない。励起状態が準安定であるとき、励起状態から安定状態への転移を、組成物が安定状態に自発的に戻る非安定状態に至るように組成物に摂動を与えるための十分な量でエネルギーを供給することによって達成することができる。
【０１１５】
典型的には、組成物のガス含有量は、組成物が安定状態にあるときには十分に高く、組成物が励起状態にあるときには低下している。
【０１１６】
本発明の様々な例示的実施形態において、組成物は、通常の周囲濃度よりも十分に高いガスの局所的濃度を生じさせることができる。例えば、本発明者によって行われた実験（下記の実施例の節を参照のこと）において、ガスが二酸化炭素であるとき、富化されたナノ構造組成物は、体積比で１０００パーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）以上の程度の局所的濃度でＣＯ２を生じさせることができることが見出された。本発明の様々な例示的実施形態において、組成物はＣＯ２を体積比で少なくとも２０００ｐｐｍの局所的濃度で生じさせる。場合により、また、好ましくは、組成物はＣＯ２バーストを体積比で１００００ｐｐｍの程度の局所的濃度で生じさせる。
【０１１７】
組成物１８のコア物質１２は特定のタイプまたは集団の物質に限定されず、ナノ構造が設計される用途に従って選択することができる。代表的な例には、限定されないが、強誘電性物質、強磁性物質および圧電性物質が含まれる。同様に意図されるものが、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）から作製されるコアである。本発明のいくつかの実施形態において、コア物質１２は結晶性構造を有する。
【０１１８】
強誘電性物質は、電場を加えることによって反転または再配向し得る永続的な電気的分極を、ある温度範囲にわたって維持する物質である。強磁性物質は、磁場を加えることによって反転可能である永続的な磁化を維持する物質である。本発明のいくつかの実施形態によれば、コア物質１２が強誘電性または強磁性であるとき、ナノ構造１０はその強誘電性特性または強磁性特性を保持する。したがって、ナノ構造１０は、巨視的スケールの物理的特性がナノスケールの環境にもたらされる特定の特徴を有する。
【０１１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造１０は、少なくとも１つのナノ構造とクラスター形成することができる。より具体的には、特定濃度のナノ構造１０が液体（例えば、水）に混合されるとき、数個のナノ構造の間における引き合う静電力が、それらの間における付着を、ナノ構造のクラスターを形成させるように生じさせることができる。好ましくは、ナノ構造間の距離がクラスター形成を妨げるときでさえ、ナノ構造１０は他のナノ構造との遠距離相互作用（約０．５μｍ〜１μｍ）を維持することができる。
【０１２０】
本明細書中で使用される用語「約」は±１０％を示す。
【０１２１】
ナノ構造１０の独特の性質を、例えば、ナノ構造１０を、「トップダウン」プロセスを使用して製造することによって達成することができる。より具体的には、ナノ構造１０を、ナノメートルサイズの粒子を提供するための、制御された様式で壊されるミクロサイズの粒子（例えば、直径が約１μｍまたは１０μｍ超の粒子）の原料粉末から製造することができる。典型的には、そのようなプロセスは、電磁無線周波数（ＲＦ）放射線の条件のもと、高温の原料粉末が挿入される冷たい液体（好ましくは、しかし、絶対的ではないが、水）において行われる。
【０１２２】
下記は、述べられたように、ナノ構造を含む組成物において液体として役立ち得る水の物理的性質の総説である。
【０１２３】
水は、注目すべき物質の１つであり、そのため、これまで非常によく研究されている。水は、１個の酸素原子に結合した２個の水素原子からなる非常に単純な分子であると考えられるが、複雑な性質を有する。水は、水素結合に起因する特別な性質を数多く有している（例えば、大きい表面張力、大きい粘度、および、六角形、五角形または十二面体の整列した水配列を自身で、または他の物質のまわりで形成することができることなど）。
【０１２４】
水の融点は、類似する分子量を有する他の分子を検討したとき、予想されるよりも１００Ｋ以上も高い。水の六角形型の氷相（氷および雪の通常的な形態）において、すべての水分子が４つの水素結合（ドナーとしての２つおよびアクセプターとしての２つ）に関係しており、比較的静的に保持される。液体の水では、一部の水素結合が、分子が動き回ることを可能にするために破壊されるにちがいない。これらの結合を破壊するために要求される大きなエネルギーが融解プロセス時に供給されなければならず、比較的小さい量のエネルギーのみが体積の変化から取り戻されるだけである。自由エネルギーの変化は融点においてゼロでなければならない。温度が上昇されると、液体の水における水素結合の量が減少し、そのエントロピーが増大する。融解は、結合の破壊のために要求されるエネルギーを提供するための十分なエントロピー変化が存在するときに生じるだけである。液体の水の低いエントロピー（大きい組織化）はこの融点を高くさせる。
【０１２５】
水の性質のほとんどは、水素の原子が（１つの酸素原子とは対照的に）２つの酸素原子にかなり強い力によって引き寄せられるときに生じる上記の水素結合のためであり、その結果、そのような水素結合は、これら２つの原子の間での束縛として作用していると見なすことができる。
【０１２６】
水は大きい密度を有しており、その密度は、３．９８４℃の温度で存在する局所的な最大値にまで温度とともに増大する。この現象は水の密度異常性として知られている。液体の水の大きい密度は主に、水素結合した網目構造の結合性に起因する。これは自由体積を減少させ、比較的大きい密度を確実にし、これにより、水素結合した網目構造の部分的な空所性が補われる。水の異常な温度−密度挙動は、種々の程度の十二面体型のしわ形成を伴う全体的または部分的に形成されたクラスターの内部における様々な環境の範囲を利用して説明することができる。
【０１２７】
密度最大値（およびモル体積最小値）が、密度を増大させる構造的崩壊と、密度を低下させる熱膨張との両方を引き起こす、上昇する温度の対抗する作用によってもたらされる。より低い温度では、膨張した構造の濃度がより大きくなり、これに対して、より高い温度では、崩壊した構造およびフラグメントの濃度がより大きくなるが、それらが占める体積が温度とともに大きくなる。温度が上昇するときの、膨張した構造から崩壊した構造への変化には、あまり整列していない構造およびより大きい水素結合屈曲にそれぞれ起因するエントロピーおよびエンタルピーにおいて正の変化が伴う。
【０１２８】
一般に、水の水素結合は広範囲にわたる網目構造をもたらし、これにより、無数の六角形型、五角形型または十二面体型の水配列を形成することができる。水素結合した網目構造は大きな程度の秩序を有する。加えて、温度依存的な競合が、水素結合の秩序化作用と、無秩序化する速度論的作用との間に存在する。
【０１２９】
知られているように、水分子は、整列した構造および超構造を形成することができる。例えば、整列した水の殻が様々な生体分子（例えば、タンパク質および炭水化物など）の周りに形成される。これらの生体分子の周りにおけるこのような整列した水の環境は、例えば、受容体から細胞核へのシグナル伝達をはじめとする細胞内機能に関して生物学的機能に強く関与している。加えて、このような水構造は安定であり、分子の表面を保護することができる。
【０１３０】
液状化した水の整列した構造のほとんどが短距離のスケールである（典型的には約１ｎｍ）。長距離の秩序が、水がその液相で存在するときには原理的に存在し得るが、液体状態における水は絶えず熱運動しているので、そのような長距離の秩序は、自然に生じる確率が極めて低い。水素結合による相互作用および水素結合によらない相互作用のために、水分子は、特定かつ構造化されたクラスター形成を伴う無限の水素結合した網目構造を形成することができる。従って、水分子の小さいクラスターは、他のより小さいクラスターとさらにクラスター形成して、数百の水分子からなる二十面体の水クラスターを形成することができる水の八量体を形成することができる。従って、水分子は様々な整列した構造を形成することができる。
【０１３１】
他の水の性質には、高い沸点、高い臨界点、圧力による融点の低下（圧力異常性）、および、温度の上昇とともに低下し、約４６℃で最小値にまで低下する圧縮率などが含まれる。
【０１３２】
水のこれらの独特の性質が、組成物１８を製造するという目的のために本発明の発明者によって利用されている。
【０１３３】
本発明の様々な例示的実施形態において、富化されたナノ構造組成物は非大気条件で製造される。本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、自然の状態では大気中に存在しないガスの存在下において、および／あるいは、その濃度がその自然の濃度よりも実質的に高い（例えば、少なくとも２倍高い、または、少なくとも１０倍高い、または、少なくとも１００倍高い）か、または、その自然の濃度よりも実質的に低い（例えば、少なくとも２分の１、または、少なくとも１０分の１、または、少なくとも１００分の１である）ガスの存在下において製造される。
【０１３４】
例えば、本発明の富化されたナノ構造組成物は、二酸化炭素の大気濃度を超える濃度での二酸化炭素の存在下で製造することができる。二酸化炭素の大気濃度は典型的には、体積比で４００ｐｐｍ未満である。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、少なくとも４００ｐｐｍの濃度での二酸化炭素の存在下で、または、少なくとも６００ｐｐｍの濃度での二酸化炭素の存在下で、または、少なくとも８００ｐｐｍの濃度での二酸化炭素の存在下で製造される。
【０１３５】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物はガスジェットの存在下で製造される。本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、ガスの存在下において、好ましくは、ガスジェットの存在下において、周囲温度よりも実質的に低い温度で製造される。
【０１３６】
固体粉末（例えば、鉱物、セラミック粉末、ガラス粉末、金属粉末、合成ポリマーなど）を十分に高い温度（例えば、約７００℃以上、例えば、約８５０℃）に加熱することができ、続いて、ガス媒体の存在下において、冷たい液体に浸漬することができる。本発明のいくつかの実施形態において、液体は、その密度異常温度よりも低い水であり、例えば、３℃または２℃の水である。浸漬と実質的に同時に、冷たい液体、粉末およびガス媒体は、電磁無線周波数放射線（例えば、５００ＭＨｚ、７５０ＭＨｚまたはそれ以上）によって照射される。
【０１３７】
気相を２つ以上の方法で組成物に導入することができる。本発明のいくつかの実施形態において、加熱された粒子が、冷たい液体における粉末の浸漬の前にガス媒体（典型的には、ガス媒体の流れ）の中を通過する。本発明のいくつかの実施形態において、ガス媒体が、浸漬前に、または、浸漬と実質的に同時に、冷たい液体の中に導入される。ガス媒体は気泡の形態で液体に導入される。
【０１３８】
ガス媒体は好ましくは疎水性である。好適なガス媒体の代表的な例には、限定されないが、二酸化炭素（ＣＯ２）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、二酸化イオウ（ＳＯ２）、水素（Ｈ）、フッ素（Ｆ）、メタン（ＣＨ４）、ヘキサン（Ｈ６Ｈ１４）、ヘキサフルオロエタン（Ｃ２Ｆ６）および空気が含まれる。本発明の様々な例示的実施形態において、ガス媒体は二酸化炭素（ＣＯ２）である。
【０１３９】
上記で記載される製造プロセスの期間中において、原料粉末の大きい凝集物の一部が崩壊し、また、原料粉末の個々の粒子の一部がその形状を変化させ、球状のナノ構造になることが本発明者によって明らかにされている。製造プロセスの期間中において、ナノ気泡が無線周波数処理によって生じ、キャビテーションが、高温の粒子を異常温度よりも低い水の中に注入することに起因して生じることが仮定される［Ｋａｔｓｉｒ他、“電気化学的堆積およびナノ粒子ドーピングによるその安定化に対するｒｆ照射の影響”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１５４（４）、Ｄ２４９〜Ｄ２５９、２００７］。水が異常温度よりも低く保たれるので、高温の粒子は局所的な加熱を生じさせ、結果として、この局所的な加熱が、加熱された場所の比体積の局所的減少を生じさせ、これが結果として他の場所において加圧下で生じる。プロセスの期間中、および、プロセス後の数時間以下の時間間隔の期間中において、水が、外部大気とのガスの交換および周囲の電磁放射線の選択的吸収を含む自己組織化プロセスを経ることが仮定される。この自己組織化プロセスは、ナノ気泡およびナノ構造から構成される安定な構造化された分布の形成をもたらすことがさらに仮定される。
【０１４０】
本発明を実施に移しているとき、本発明者は予想外にも、上記の製造プロセスにより、安定または準安定な気相の生成が液体中で達成されることを発見している。ガス媒体を組成物を導入するための上記実施形態のいずれもにおいても、無線周波数処理がガス媒体のナノ気泡の形成をもたらすこと、および、これらのナノ気泡が上記の自己組織化プロセスによって安定化されることは驚嘆させられる。
【０１４１】
多くのタイプの物質を固体粉末として使用することができる。代表的な例には、限定されないが、チタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ３）、ＷＯ３、Ｂａ２Ｆ９Ｏ１２および硫酸バリウム（ＢａＳＯ４）が含まれる。本発明者らは予想外にも、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）もまた、組成物の形成において使用され得ることを見出した。ヒドロキシアパタイトは特に好ましい。これは、ヒドロキシアパタイトが無毒性（ｉｎｔｏｘｏｃｉｃｔｙ）によって特徴づけられ、かつ、ヒト治療のために一般にＦＤＡ承認されるからである。多くのヒドロキシアパタイト粉末が様々な製造者から入手可能であり、例えば、Ｓｉｇｍａ、ＡｌｄｒｉｃｈおよびＣｌａｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（例えば、カタログ番号１３０６−０６−５）などから入手可能であることが理解される。
【０１４２】
ナノ構造組成物におけるナノ構造の濃度は限定されない。好ましい濃度が１リットルあたり１０２０未満のナノ構造であり、より好ましくは、１リットルあたり１０１５未満のナノ構造である。当業者は、そのような濃度に関して、組成物におけるナノ構造間の平均距離がかなり大きく、数ミクロン程度であることを理解する。本発明のナノ構造組成物がナノ構造間の遠距離相互作用を容易にすることが本発明者によって明らかにされた。そのような相互作用は、ナノ構造間の空間における安定な気相の存在を可能にすることが仮定される。
【０１４３】
次に、本発明の様々な例示的実施形態による、富化された組成物を製造するための方法のフローチャート図である図３が参照される。この方法は、例えば、上記で記載される組成物１８を製造するために使用することができる。
【０１４４】
別途定義される場合を除き、本明細書中下記で記載される方法段階は同時に実行され得るか、あるいは、実行の多くの組合せまたは順序で連続して実行され得るかのどちらかであることを理解しなければならない。具体的には、フローチャート図の順序は、限定であると見なしてはならない。例えば、２つ以上の方法段階が下記の説明またはフローチャート図では特定の順序で現れるが、これらは異なる順序で（例えば、逆の順序で）実行することができ、または、実質的に同時に実行することができる。加えて、下記で記載されるいくつかの方法段階は任意であり、実行されないことがある。
【０１４５】
方法は１００で始まり、固体粉末（例えば、鉱物、セラミック粉末、ガラス粉末、金属粉末、合成ポリマーなど）が十分に高い温度（例えば、約７００℃以上、例えば、約８５０℃）に加熱され得る１０１に続く。
【０１４６】
場合により、方法は、加熱された粒子がガス媒体（例えば、上記の疎水性ガス媒体の１つ（これに限定されない）など）の中を通過させられる１０２に続く。好ましくは、加熱された粉末はガスのジェットの中を通過させられる。
【０１４７】
場合により、方法は、ガス媒体（例えば、上記の疎水性ガス媒体の１つ（これに限定されない）など）が冷たい液体の中に導入される１０３に続く。ガス媒体は、液体に浸透し、気泡をその中で生じさせるガスジェットの形態で液体の中に導入することができる。
【０１４８】
本発明の様々な例示的実施形態において、段階１０２および段階１０３の少なくとも一方が実行される。本発明のいくつかの実施形態において、段階１０２および段階１０３の両方が実行される。本発明の様々な例示的実施形態において、ガス媒体は、６℃未満または５℃未満である温度であり、例えば、約４℃以下である温度である。
【０１４９】
方法は、粉末が冷たい液体に浸けられる１０４に続く。方法の段階１０２が実行される実施形態において、粉末は、冷たい液体に浸けられている間に、ガス媒体の分子を粉末と一緒に運ぶ。方法の段階１０３が実行される実施形態において、ガス媒体を、段階１０４の前に、または、段階１０４の後で、または、段階１０４の期間中に導入することができる。
【０１５０】
本発明の様々な例示的実施形態において、液体は水である。これらの実施形態において、水はその密度異常温度よりも低い温度であり、例えば、３℃または２℃である温度である。
【０１５１】
１０５において、冷たい液体、ガス媒体および粉末は、電磁無線周波数放射線（例えば、５００ＭＨｚ、７５０ＭＨｚまたはそれ以上）によって照射される。
【０１５２】
方法は１０６で終わる。
【０１５３】
次に、本発明の様々な例示的実施形態による、富化された組成物を製造するためのシステム１４０の概略的例示である図４が参照される。システム１４０は、例えば、上記で記載される組成物１８を製造するために使用することができる。
【０１５４】
システム１４０は、固体粉末（例えば、鉱物、セラミック粉末、ガラス粉末、金属粉末、合成ポリマーなど）を十分に高い温度（例えば、約７００℃以上、例えば、約８５０℃）に加熱するために構成される炉１４２と、十分に低い温度にある液体（示されず）（例えば、その密度異常温度よりも低い温度での水）を保持するための容器１４４と、無線周波数放射線を発生および送信するための無線周波数ユニット１４６とを含む。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施形態において、システム１４０は、容器１４４における液体のレベルを測定するための液体レベル測定デバイス２０８を含む。本発明のいくつかの実施形態において、システム１４０は、容器１４４における液体の温度を測定するための温度測定デバイス２１０を含む。デバイス２０８および／またはデバイス２１０は、液体のレベルおよび／または温度をモニターすることができ、かつ、場合により表示することができる制御ユニット１６２と連絡することができる。
【０１５６】
炉１４２は、加熱された粉末（示されず）を炉１４２の出口ポート１５０において受け取り、かつ、それを、容器１４４の上部部分に形成される粉末入口ポート１５２を介して容器１４４の中に投下するために構成される突出スリーブ１４８を介して容器１４４につながれる。
【０１５７】
本発明の様々な例示的実施形態において、容器１４４は、液体を、液体導管１５６を介して容器１４４に供給する液体リザーバー１５４と流体連絡している。導管１５６は、１つまたは複数のコネクター１５８によって、リザーバー１５４と、容器１４４との間に置くことができる。導管１５６内の液体の流れを、導管１５６に取り付けられるバルブ１６０によって制御することができる。バルブ１６０は使用者によって手動で操作することができるか、または、様々な製造パラメーターがそれを介して選択され得るユーザーインターフェース１６４を有する制御ユニット１６２によって自動的に操作することができる。
【０１５８】
本発明のいくつかの実施形態において、システム１４０は、リザーバー１５４における液体のレベルを測定するためのさらなる液体レベル測定デバイス２１２を含む。本発明のいくつかの実施形態において、システム１４０は、リザーバー１５４の温度を測定するためのさらなる温度測定デバイス２１４を含む。デバイス２１２および／またはデバイス２１４は、液体のレベルおよび／または温度をモニターすることができ、かつ、場合により表示することができる制御ユニット１６２と連絡することができる。
【０１５９】
無線周波数ユニット１４６は、典型的には、無線周波数制御ユニット１６６（例えば、データプロセッサー）、無線周波数発生器・送信機１６８、および、無線周波数アンテナデバイス１７０を含む。ユニット１６６は、無線周波数放射線を発生し、無線周波数放射線の少なくとも一部が容器１４４に入るようにアンテナデバイス１７０を介して送信する発生器・送信機１６８を制御する。デバイス１７０は容器１４４内に配置することができるか、または、それに隣接して配置することができる。後者の場合、容器１４４は、無線周波数放射線の透過を可能にする材料から作製される。
【０１６０】
システム１４０はさらに、ガス媒体を、ガス導管１７４およびガス導管１７６を介してそれぞれ、突出スリーブ１４８および液体容器１４４の少なくとも１つに供給するために構成されるガスリザーバー１７２を含む。導管１７４および導管１７６を通るガスの流れを、それぞれが独立して使用者によって手動で操作され得るか、または、制御ユニット１６２によって自動的に操作され得るガスバルブ１７８およびガスバルブ１８０によってそれぞれ制御することができる。
【０１６１】
本発明の様々な例示的実施形態において、システム１４０は、液体容器１４４と流体連絡していることが可能である生成物容器１８２および廃棄物容器１８４の少なくとも１つを含む。生成物容器１８２は、生成物（例えば、組成物１８）を容器１４４の生成物出口ポート１９４において受け取り、かつ、それを、生成物容器１８２における生成物入口ポート１９６を介して導入するために構成される生成物導管１８６を介して液体容器１４４につなぐことができる。廃棄物容器１８４は、廃棄物（例えば、過剰な液体、粉末破片）を容器１４４の廃棄物出口ポート１９８において受け取り、かつ、それを、廃棄物容器１８４における廃棄物入口ポート２００を介して導入するために構成される廃棄物導管１８８を介して液体容器１４４につなぐことができる。
【０１６２】
廃棄物導管１８８を通過する廃棄物の流れを廃棄物バルブ１９０によって制御することができ、生成物導管１８６を通過する生成物の流れを生成物バルブ１９２によって制御することができる。バルブ１９０およびバルブ１９２のそれぞれが独立して使用者によって手動で操作され得るか、または、制御ユニット１６２によって自動的に操作され得る。
【０１６３】
さらなる廃棄物容器２０２を、未処理の液体をリザーバー１５４から排出するために導管２０４を介してリザーバー１５４につなぐことができる。導管２０４はコネクター１５８を介してリザーバー１５４につなぐことができ、導管２０４を通過する液体の流れを、使用者によって手動で操作され得るか、または、制御ユニット１６２によって自動的に操作され得るバルブ２０６によって制御することができる。
【０１６４】
操作において、固体粉末が炉１４２の中に導入され、十分に高い温度（例えば、約７００℃以上、例えば、約８５０℃）に加熱され、リザーバー１５４における液体が十分に低い温度（例えば、水の場合には２℃〜３℃）に冷却される。バルブ１６０が、冷たい液体が容器１４４に流れることを可能にするために開けられる。バルブ１７８および／またはバルブ１８０が開けられ、ガスリザーバー１７２からのガス媒体がスリーブ１４８および／または容器１４４に導入される。ユニット１６６が無線周波数発生器・送信機１６８を作動させ、容器１４４が、アンテナデバイス１７０から放射される無線周波数放射線によって照射される。スリーブ１４８は、加熱された粒子を容器１４４の中に投入する。
【０１６５】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のナノ構造間の相互作用（遠距離の相互作用および近距離の相互作用の両方）は、細菌コロニーの自己組織化と同様に、富化されたナノ構造組成物の自己組織化能を容易にする。細菌コロニーが成長するとき、自己組織化は、細菌コロニーが、不都合な外部条件に対処し、かつ、成長速度を改善するためにその環境から「集団的に学習する」ことを可能にする。同様に、遠距離の相互作用、および、従って、富化されたナノ構造組成物の遠距離の秩序は、富化されたナノ構造組成物が、種々の環境的条件（例えば、限定されないが、異なる温度、電流および放射線など）に順応するように自己組織化を行うことを可能にする。
【０１６６】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の遠距離の秩序は、富化されたナノ構造組成物が電気化学的析出（ＥＣＤ）実験に供されるときに最もよく認められる（下記の実施例の節もまた参照のこと）。
【０１６７】
ＥＣＤは、物質が（例えば、２つの電極を使用して）ある電位差に供され、その結果、電気化学的プロセスが開始されるプロセスである。ＥＣＤプロセスの特有の性質の１つが、それによって得られる物質分布である。電気化学的プロセスの期間中、所与の電流において電極間で測定される電位は、その物質における数タイプの過電圧および抵抗降下の和である。抵抗降下の大きさは物質の電気伝導率および電極間の距離に依存する。電極の特定の局所的領域の電流密度は反対側の電極までの距離の関数である。この効果は一次電流分布と呼ばれ、電極の幾何形状および物質の電気伝導率に依存する。
【０１６８】
電極間の電位差が、平衡電圧と比較して大きいとき、物質は非平衡状態への転移を受け、結果として、様々な異なる形態学の構造が形成される。非平衡状態における系は特定の形態学を選択し、かつ／または、２つの形態学（密集した枝分かれの形態学および樹枝状の形態学）の間で転移し得ることが見出されている［Ｅ．Ｂｅｎ−Ｊａｃｏｂ、「雪片形成から細菌コロニーの成長まで」、Ｃｏｎｔ．Ｐｈｙｓ．、１９９３、３４（５）］。
【０１６９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が電気化学的析出セルに置かれたとき、所定の形態学（例えば、密集した枝分かれおよび／または樹枝状）が形成される。好ましくは、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、異なる液体（例えば、水）によって置き換えられたときでさえ、電気化学的形跡をセルの表面に保つことができる。より具体的には、本発明のいくつかの実施形態によれば、富化されたナノ構造組成物が最初に電気化学的析出セルの表面と接触させられ、次いで、所定の洗浄プロトコルによって洗浄されるとき、組成物の電気化学的形跡がセルの表面に保たれる。
【０１７０】
ナノ構造の長距離相互作用もまた、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を新しい環境条件（例えば、温度変化）に供し、組成物におけるナノ構造間の相互作用に関係する１つまたは複数の物理量に対するその新しい環境条件の影響を調べることによって明らかにすることができる。１つのそのような物理量が超音波速度である。本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、水と比較して高まった超音波速度によって特徴づけられる。
【０１７１】
本発明のさらなる特徴は、富化されたナノ構造組成物と固体表面との間での小さい接触角である。好ましくは、富化されたナノ構造組成物と表面との間での接触角は、液体（ナノ構造を含まない）と表面との間での接触角よりも小さい。当業者は、小さい接触角は、富化されたナノ構造組成物がより大きな程度で表面を「濡らす」ことを可能にすることを理解する。本発明のこの特徴は、液体におけるナノ構造の大きな濃度に限定されず、反対に、ナノ構造間の上記の遠距離の相互作用の助けをかりて、低い濃度にも限定されないことを理解しなければならない。
【０１７２】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、ゼロにならない円偏光二色性シグナルによって特徴づけられる。円偏光二色性は、物質が特定の波長における平面偏光した光と相互作用するときに生じる光学現象である。円偏光二色性が、物質との１つの偏光した光成分の相互作用特性が、その物質との別の偏光した光成分の相互作用特性と異なるときに生じる。例えば、吸収バンドが、物質についての右円偏光成分および左円偏光成分の示差的な吸収に依存して負または正のどちらかであり得る。
【０１７３】
富化されたナノ構造組成物のゼロにならない円偏光二色性シグナルは、富化されたナノ構造組成物が光学活性媒体であることを示していることが認識される。したがって、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、光と相互作用しながら、光の偏光を変化させることができる。本発明者は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の光学活性が、ナノ気泡およびナノ構造の安定な構造化された分布の上記で述べられた形成によって現れる遠距離秩序の結果であることを仮定する。
【０１７４】
次に、本発明の様々な例示的実施形態による、ガスを再循環させるための装置３０の概略的例示である図５が参照される。本発明の様々な例示的実施形態において、装置３０は、組成物３２と、組成物３２を励起するための励起デバイス３４とを含む。組成物３２は典型的には、装置３０の本体またはその一部として場合により役立ち得るチャンバー４２に含有される。
【０１７５】
組成物３２は好ましくは、ガスを、励起デバイス３４が作動中であるときには放出することができ、また、そのガスを、励起デバイス３４が動作停止したときには捕集することができる。組成物３２は、液体、ナノ構造および気相を含むことができる。本発明の様々な例示的実施形態において、組成物３２におけるガスは疎水性である。好適なガス媒体の代表的な例には、限定されないが、二酸化炭素（ＣＯ２）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、二酸化イオウ（ＳＯ２）、水素（Ｈ）、フッ素（Ｆ）、メタン（ＣＨ４）、ヘキサン（Ｈ６Ｈ１４）、ヘキサフルオロエタン（Ｃ２Ｆ６）および空気が含まれる。本発明の様々な例示的実施形態において、ガス媒体は二酸化炭素（ＣＯ２）である。
【０１７６】
組成物３２は組成物１８と類似し得る。
【０１７７】
励起デバイス３４は、用いられている組成物に従って構成される。組成物が無線周波数放射線による照射に応答してガスを放出し得ることが、本発明者によって見出された。したがって、本発明の１つの実施形態によれば、デバイス３４は、組成物を励起状態に励起するような無線周波数放射線を組成物３２に照射する。無線周波数放射線が加えられる限り、組成物３２はその励起状態に留まり、ガスが組成物から放出される（図２を参照のこと）。デバイス３４が動作停止したとき、組成物３２はその安定状態への転移を受け、転移期間中に、ガスが組成物によって捕集される。この実施形態において、デバイス３４は無線周波数送信機を含む。典型的には、デバイス３４は、この技術分野において知られているような無線周波数アンテナ３６および無線周波数発生器３８を含む。
【０１７８】
組成物が上記のような「トップダウン」プロセスによって製造されるとき、放射線の周波数は、製造プロセスの期間中に用いられる周波数と同じにすることができる。それにもかかわらず、本発明の範囲を何らかの特定の周波数に限定することは意図されない。
【０１７９】
上記の実施形態が、無線周波数放射線を使用する励起を特に強調して記載されたが、無線周波数放射線に対するより詳細な参照は、いかなる点でも、本発明の範囲を限定するとして解釈してはならないことを理解しなければならない。励起デバイス３４は、組成物３２を励起することができる任意のデバイスが可能である。代表的な例には、限定されないが、熱による励起、縦波による励起（例えば、超音波励起）、および、衝撃波による励起が含まれる。
【０１８０】
装置３０は場合により、組成物３２と接触するガス４４を、組成物３２から放出されるガス（例えば、ＣＯ２ガス）から分離するために設計および構築されるガス分離機構４０を含む。図５に示されるように、ガス４４は典型的には、チャンバー４２の内部に閉じ込められ、組成物３２の表面４６に接触する。機構４０は、環境から組成物３２の中に伸びるスリーブ５０が可能である。この実施形態において、アンテナ３６がスリーブの内部に配置され、流体連絡が、アンテナの近くに集まるフリーの気体分子（例えば、ＣＯ２分子）と、スリーブの出口４８との間で確立され得る。加えて、組成物に接触する気体は、スリーブに入ることが実質的に妨げられる。出口バルブ５２が場合により、環境へのガスの放出を制御するようにスリーブ５０に配置される。出口バルブ５２は、所望に応じて、機械式または電気式が可能である。
【０１８１】
場合により、また、好ましくは、装置３０はさらに、環境と、組成物３２の表面４６との間における流体連絡を制御することを可能にするように入口６０においてチャンバー４２の壁に配置される入口バルブ５４を含む。装置３０はさらに、装置３０の運転を制御する制御ユニット５６を含むことができる。例えば、制御ユニット５６は、励起デバイス３４を作動および作動停止させるために、ならびに／または、出口バルブ５２を開閉するために、ならびに／または、入口バルブ５４を開閉するために構成され得る。
【０１８２】
操作において、励起デバイス３４が、組成物３２を励起させるために作動させられ、出口バルブ５２が好ましくは開いており、入口バルブ５４が好ましくは閉じている。組成物３２が励起されている間、ガス（例えば、ＣＯ２ガス）の流出が出口４８から出て行く。ガス放出期間の間、装置３０の近くにおけるガスの局所的濃度、特に、出口４８の近くにおけるガスの局所的濃度が比較的高い。例えば、ガスがＣＯ２であるとき、体積比で１０００ｐｐｍ程度の局所的ＣＯ２濃度が出口４８の近くで蓄積する。体積比で数千ｐｐｍから、体積比で数万ｐｐｍまでのバーストもまた意図される。
【０１８３】
ガスが放出される特定の期間の後、デバイス３４は作動停止させられ、入口バルブ５４がその開放位置にされる。組成物３２の再循環特性のために、ガス（環境ＣＯ２）の流入が入口６０からチャンバー４２の中に入り、組成物３２はその励起状態から低エネルギー状態への転移を受ける。
【０１８４】
本発明の様々な例示的実施形態において、制御ユニット５６は所定のシナリオに従って励起デバイス３４を間欠的に作動させる。そのような運転シナリオは作動／停止比率として表すことができる。典型的には、しかし、絶対的ではないが、励起デバイス３４の運転は、約１／２０〜約２／１である作動／停止比率に従う。本発明のいくつかの実施形態において、励起デバイス３４の運転は約１／１０の作動／停止比率に従う。この実施形態において、デバイス３４は装置３０の総運転時間の約１／１０において作動しており、約９／１０において停止している。
【０１８５】
制御ユニット５６はまた、励起デバイスが作動中である間に出口バルブ５２を制御することができる。出口バルブ５２が閉じられ、かつ、デバイス３４が作動中であるとき、スリーブ５０の内部におけるガスの濃度が増大する。これは最終的には、高いガス濃度のバーストを、バルブ５２が開けられたときにもたらすことができる。本発明の様々な例示的実施形態において、制御ユニット５６は、閉／開比率に換算して表すことができる所定のシナリオに従って出口バルブ５２を制御する。例えば、バルブ５２は３０／１の閉／開比率に従って操作することができ、それにより、バルブは約３０秒間閉じられ、約１秒間開けられる。多くの他の運転シナリオを用いることができる。下記の実施例の節において、ＣＯ２の十分に高い濃度が多くの運転シナリオについて達成され得ることが明らかにされる。
【０１８６】
装置３０は、昆虫（例えば、メスの蚊または他の刺咬性ハエ（双翅目）など、しかし、これらに限定されない）を誘引するために役立ち得る。この実施形態は、組成物３２の気相がＣＯ２であるとき、特に有用である。メスの蚊は、宿主（血液源）が吐き出すＣＯ２を宿主から約３０メートル離れてかぎつけることができる。ＣＯ２が大気中に存在するので、メスの蚊は、通常よりも高い濃度に応答する。装置３０が高い局所的濃度のＣＯ２を生じさせることができることは、動物の呼吸行動を模倣しており、したがって、昆虫を誘引する。
【０１８７】
次に、本発明の様々な例示的実施形態による、昆虫を捕獲するための装置７０の概略的例示である図６が参照される。装置７０は好ましくは、昆虫を誘引するための装置、例えば、装置３０と、装置３０の出口のそばにいる昆虫を捕獲するために設計および構成される昆虫捕獲デバイス７２とを含む。
【０１８８】
捕獲デバイスは、この技術分野で知られている任意の捕獲デバイスが可能である。例えば、捕獲デバイスは、網に対してらせん状に衝突する蚊を殺すためのファンインペラーの下に固定される円錐形状の網の中に昆虫を吸い込むために構成されるファンインペラーを含むことができる。場合により、捕獲デバイスは、昆虫を粘着性本体の少なくとも外側表面で捕獲するために粘着性表面を有する粘着性本体を含む。
【０１８９】
本特許の存続期間の期間中において、多くの関連した捕虫器が開発されることが予想され、したがって、昆虫捕獲デバイスの用語の範囲は、すべてのそのような新しい技術を演繹的に含むことが意図される。
【０１９０】
装置３０はまた、植物成長を高めるために使用することができる。この実施形態において、組成物３２の気相は好ましくはＣＯ２である。ＣＯ２は好ましくは、夜間時間の期間中に集められ、光合成が行われる昼間時間の期間中に放出される。昼間時間の期間中において、ＣＯ２を、ＣＯ２が植物地帯内の植物に散布され得る植物地帯に輸送することができる。散布は、直接的様式（例えば、植物の近くでの野外装置３０）であり得るか、または、散布システムを使用して可能であり、例えば、ＣＯ２を屋外条件下で散布することができる既存の局所的な潅注システムなどを使用して可能であるが、これらに限定されない。
【０１９１】
理想的には、ＣＯ２は、温度が、光合成のための最適な温度範囲である２０℃〜２７℃の間であるときに植物に送達される。ＣＯ２が他の温度において送達され得ることが理解される。この実施形態の利点は、この実施形態が植物成長を高め、そして、植物を成長させるために要求される肥料の少なくすることである。
【０１９２】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、水と比較したとき、物質を溶解または分散する高まった能力によって特徴づけられる。
【０１９３】
本明細書中で使用される用語「溶解する」は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が水性環境において可溶性またはより可溶性にすることができることを示す。
【０１９４】
本明細書中で使用される用語「分散する」は、物質の溶解性の程度に従った懸濁物にする操作を示す。
【０１９５】
従って、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、物質を、該物質の分散または溶解を可能にする条件下でナノ構造および液体と接触させることを含む、物質を溶解または分散する方法が提供される。
【０１９６】
本発明のナノ構造および液体は、医薬用薬剤（例えば、治療剤、化粧剤および診断剤など）を含めて、任意の物質（例えば、活性な薬剤）（例えば、タンパク質、核酸、小分子および炭水化物など）を溶解／分散するために使用することができる。
【０１９７】
治療剤は任意の生物学的な活性因子であってよく、例えば、薬物、核酸構築物、ワクチン、ホルモン、酵素、小分子（例えば、ヨウ素など）または抗体などであってよい。治療剤の例には、抗生物剤、フリーラジカル生成剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、非ステロイド系抗炎症性薬物、免疫抑制剤、抗ヒスタミン剤、レチノイド剤、ｔａｒ剤、止痒剤、ホルモン、ソラレンおよび殺疥癬虫剤が含まれるが、これらに限定されない。本発明によって送達可能である核酸構築物は、ポリペプチド（例えば、酵素、リガンドまたはペプチド薬物など）、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードすることができる。
【０１９８】
本発明の化粧剤は、例えば、しわ取り剤、ニキビ防止剤、ビタミン剤、表皮剥離剤、毛包刺激剤または毛包抑制剤が可能である。化粧剤の例には、レチノイン酸およびその誘導体、サリチル酸およびその誘導体、含硫Ｄ−アミノ酸および含硫Ｌ−アミノ酸およびそれらの誘導体およびそれらの塩、特に、Ｎ−アセチル誘導体、α−ヒドロキシ酸（例えば、グリコール酸および乳酸など）、フィチン酸、リポ酸、ならびに、この分野で知られている多くの他の薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９９】
本発明の診断剤は、疾患状態を示す分子について特異的な抗体、化学物質または色素であり得る。
【０２００】
他の治療剤、化粧剤および診断剤は、以下に記載される。
【０２０１】
この物質は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を加える前に、または、可溶化プロセスを助けるために本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を加えた後で溶媒に溶解することができる。本発明では、物質の溶解性をさらに増大させるために、極性溶媒、非極性溶媒、有機溶媒（例えば、エタノールまたはアセトンなど）または非有機溶媒を含めて、任意の溶媒の使用が意図されることが理解されよう。
【０２０２】
溶媒は、物質が本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に溶解／分散されたままであるように、可溶化プロセスの期間中の任意の時に（完全に、または部分的に）除くことができる。溶媒を除く様々な方法がこの分野では知られている（例えば、蒸発（すなわち、加熱するか、または、圧力を加えることによる蒸発）または任意の他の方法など）。
【０２０３】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のさらなる特徴が緩衝能である。本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、水と比較したとき、高まった緩衝能によって特徴づけられる。
【０２０４】
本明細書中で使用される表現「緩衝能」は、酸または塩基が加えられるとき、一定のｐＨを安定して維持する組成物の能力を示す。
【０２０５】
さらに、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のさらなる特徴がタンパク質安定性である。本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、タンパク質を安定化する高まった能力によって特徴づけられる。したがって、例えば、富化されたナノ構造組成物はタンパク質を熱の影響から保護し、安定化することができる。
【０２０６】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、富化されたナノ構造組成物を調製するために使用される固体粉末が細菌に対して毒性であるときでさえ、細菌コロニー拡大速度およびファージ・細菌相互作用またはウイルス・細胞相互作用の増加を容易にすることができる。富化されたナノ構造組成物が製造されるこの独特のプロセスは、言及されるように、コア物質を取り囲むエンベロープの形成を可能にするプロセスであり、細菌またはファージに対する、富化されたナノ構造組成物の何らかの毒性影響を著しく抑制する。
【０２０７】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のさらなる特徴は、いわゆるゼータ（ζ）電位に関連する。ζ電位は、粒子が、その中に存在する電場の影響のもとで液体中を移動することができる電気泳動および誘電泳動と呼ばれる物理的現象に関連する。ζ電位は、異なる挙動を有する液体の２つの領域の間での境界において定義される剪断平面での電気電位である。粒子の電気泳動移動度（電場強度に対する粒子の速度の比率）はζ電位に比例する。
【０２０８】
表面に関連づけられる量であるので、ζ電位は、粒子サイズが小さい系では特に重要である。そのような系では、粒子の総表面積が粒子の総体積に対して大きく、その結果、表面に関連づけられる現象により、粒子の挙動が決定されるからである。
【０２０９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、富化されたナノ構造組成物は、液体自体のζ電位よりも実質的に大きいζ電位によって特徴づけられる。大きいζ電位は、液体におけるナノ構造の高まった移動度に対応し、従って、例えば、電気化学的析出プロセスにおける特別な形態学の形成に寄与し得る。
【０２１０】
富化されたナノ構造組成物のζ電位を測定する多くの方法が存在し、これらには、限定されないが、マイクロ電気泳動、光散乱、光回折、音響学、電気音響学などが含まれる。例えば、ζ電位を測定する１つの方法が米国特許第６４４９５６３号に開示される（その内容は参考として本明細書により組み込まれる）。
【０２１１】
本発明の実施形態はまた、分子生物学研究および診断の分野に関連し、具体的には、核酸増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および自動継続（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（ＳＳＳＲ）など、これらに限定されない）に関連する。
【０２１２】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、核酸増幅プロセスの効率を改善できることが本発明の発明者によって見出されている。本明細書中で使用される、表現「核酸増幅プロセスの効率を改善すること」は、ＰＣＲ手法におけるＤＮＡポリメラーゼの触媒活性を高めること、反応に必要とされるタンパク質の安定性を増大すること、増幅プロセスの感度および／または信頼度を増大すること、および／または増幅反応の反応容積を低減することを意味する。本発明のいくつかの実施形態において、触媒活性の強化は、好ましくは、さらなる補因子（例えば、マグネシウムまたはマンガンなど、これらに限定されない）の使用を伴うことなく達成される。当業者によって理解されるように、マグネシウム非存在またはマンガン非存在のＰＣＲを用いることができることは非常に好都合である。これは、ＰＣＲ手法の効率が、反応に存在する補因子の濃度に対して非常に敏感であることが知られているからである。熟練した科学者は、多くの場合、補因子の濃度を事前に計算すること、または、所望する増幅効率を達成する前に、補因子の濃度を変えながら多くの試験を行うことが要求される。
【０２１３】
従って、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の使用は、使用者が、ＰＣＲミックスにおける補因子の濃度を計算するか、または変化させる必要なく、簡便かつ非常に効率的な多サイクルＰＣＲ手法を実行することを可能にする。
【０２１４】
本発明のいくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応が、何らかのさらなる緩衝液または液体を伴うことなく行われ得ることが本発明者によって見出されている。ＰＣＲを臨床診断に適用することに伴う大きな問題の１つは、持ち越し汚染に対するＰＣＲの感受性である。これらは、以前のＰＣＲにおいて増幅された分子がサンプルに混入することに起因する偽陽性である。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が唯一のＰＣＲミックスとして使用されることは、全手順を、何らかのさらなる緩衝液または液体を必要とすることなく行うことができ、従って、汚染の危険性を回避することができるので、持ち越し汚染の可能性を著しく低下させる。
【０２１５】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、リアルタイムＰＣＲ反応の感度を高め、かつ、リアルタイムＰＣＲ反応の反応体積を低下させる。本明細書中で使用されるように、リアルタイムＰＣＲ反応は、それぞれのＰＣＲサイクルの期間中において二本鎖ＤＮＡ検出分子（例えば、色素）の存在下で行われるＰＣＲ反応を示す。
【０２１６】
さらに、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は非常に少ない体積でのＰＣＲ反応（例えば、２μｌ）において使用され得る。本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、熱脱水された多重ＰＣＲ反応において使用される。
【０２１７】
従って、本発明のいくつかの実施形態によれば、ポリメラーゼ連鎖反応のためのキットが提供される。本発明のＰＣＲキットは、所望されるならば、本発明のキットの１つまたは複数の単位物を含有することができるパックで提供され得る。パックには、キットを使用するために説明書が伴い得る。パックはまた、研究室補助品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に関連する通知によって供給され得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態の当局による承認を反映する。
【０２１８】
本発明のいくつかの実施形態において、キットは、好ましくは別個のパッケージングで、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ（これに限定されない）など）と、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物とを含む。
【０２１９】
本発明のいくつかの実施形態において、キットはリアルタイムＰＣＲキットのために使用され、少なくとも１つのリアルタイムＰＣＲ試薬（例えば、二本鎖ＤＮＡ検出分子など）をさらに含む。キットの構成成分は、別々に、または、任意の組合せで包装することができる。
【０２２０】
本明細書中で使用される表現「二本鎖ＤＮＡ検出分子」は、定量可能なシグナル（例えば、蛍光シグナル）をもたらす二本鎖ＤＮＡ相互作用分子を示す。例えば、そのような二本鎖ＤＮＡ検出分子は、（１）ＤＮＡのフラグメントまたはアンプリコンと相互作用し、（２）二重鎖形成しているアンプリコンの存在下では、分離状態にあるアンプリコンの存在下とは異なる波長で発光する蛍光色素であってよい。二本鎖ＤＮＡ検出分子は、二本鎖ＤＮＡにインターカレーションする検出分子、または、プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子が可能である。
【０２２１】
二本鎖ＤＮＡにインターカレーションする検出分子は、プライマー、アンプリコンまたは核酸テンプレートに共有結合的に連結されない。このような検出分子は、二本鎖ＤＮＡの存在下でその発光を増大させ、二重鎖ＤＮＡが解きほぐれたときにはその発光を低下させる。例には、臭化エチジウム、ＹＯ−ＰＲＯ−１、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＳＹＢＲ  ＧｏｌｄおよびＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩが含まれるが、これらに限定されない。臭化エチジウムは、二本鎖ＤＮＡフラグメントにおいて塩基対間にインターカレーションし、ＤＮＡをゲル電気泳動後に検出するために一般に使用される蛍光化学物質である。２５４ｎｍ〜３６６ｎｍの間の紫外光によって励起されたとき、臭化エチジウムは５９０ｎｍにおける蛍光の光を放出する。このＤＮＡ−臭化エチジウム複合体は、一本鎖ＤＮＡの存在下での臭化エチジウムよりも約５０倍の蛍光をもたらす。ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩは４９７ｎｍで励起され、５２０ｎｍで発光する。ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩの蛍光強度は、一本鎖ＤＮＡに対して、二本鎖ＤＮＡに結合したとき、１００倍以上に増大する。ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩの代わりになるものが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．によって導入されたＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄである。ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩと同様に、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄの蛍光放出は二重鎖状態のＤＮＡの存在下で高まり、二本鎖ＤＮＡが解きほぐれたときには低下する。しかしながら、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄの励起ピークは４９５ｎｍにあり、発光ピークが５３７ｎｍにある。ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄは、報告によれば、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩよりも安定であるようである。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８は、二重鎖状態のＤＮＡのＡＴ富領域に結合する既知のビスベンズイミド系の二本鎖ＤＮＡ検出分子である。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８は３５０ｎｍで励起し、４５０ｎｍで発光する。ＹＯ−ＰＲＯ−１は４５０ｎｍで励起し、５５０ｎｍで発光し、二重鎖ＤＮＡ特異的な検出分子であることが報告されている。本発明の好ましい実施形態において、二本鎖ＤＮＡ検出分子はＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩである。
【０２２２】
プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子はプライマーに共有結合的に連結され、アンプリコンが二重鎖構造を形成するとき、蛍光放出の増大または低下のいずれかをもたらす。プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子がプライマーの３’末端の近くに結合し、プライマーの末端塩基がｄＧまたはｄＣのいずれかであるとき、増大した蛍光放出が観測される。この検出分子は、末端のｄＣ−ｄＧ塩基対およびｄＧ−ｄＣ塩基対の近傍では消光され、また、検出分子がプライマーの末端から少なくとも６ヌクレオチド離れて内部に存在するときにはアンプリコンの二重鎖形成の結果として脱消光される。脱消光は、蛍光放出における実質的な増大をもたらす。このタイプの検出分子の例には、フルオレセイン（４８８ｎｍで励起し、５３０ｎｍで発光する）、ＦＡＭ（４９４ｎｍで励起し、５１８ｎｍで発光する）、ＪＯＥ（５２７で励起し、５４８で発光する）、ＨＥＸ（５３５ｎｍで励起し、５５６ｎｍで発光する）、ＴＥＴ（５２１で励起され、５３６ｎｍで発光する）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（５９０ｎｍで励起し、６１５ｎｍで発光する）、ＲＯＸ（５７５ｎｍで励起し、６０２ｎｍで発光する）およびＴＡＭＲＡ（５５５ｎｍで励起し、５８０ｎｍで発光する）が含まれるが、これらに限定されない。対照的に、プライマーに基づく二本鎖ＤＮＡ検出分子のいくつかは、一本鎖ＤＮＡに対して二本鎖ＤＮＡの存在下でその発光を低下させる。例には、ローダミンおよびＢＯＤＩＰＹ−ＦＩ（５０４ｎｍで励起し、５１３ｎｍで発光する）が含まれるが、これらに限定されない。これらの検出分子は、通常、５’末端のｄＣまたはｄＧにおいてプライマーに共有結合によりコンジュゲート化され、アンプリコンが二重鎖であるときにはより小さい蛍光を発光する。二重鎖を形成したときの蛍光の低下は、検出分子の極近傍での相補鎖におけるグアノシンが消光するためであるか、または、末端のｄＣ−ｄＧ塩基対が消光するためであると考えられる。
【０２２３】
加えて、ＰＣＲキットおよびリアルタイムＰＣＲキットは、少なくとも１つのｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなど、これらに限定されない）を含むことができる。ｄＩＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰなどのアナログもまた意図される。
【０２２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、キットはさらに、使用者が少なくとも１つのコントロール試験を行って、ＰＣＲ成績を確保することを可能にするために、少なくとも１つのコントロールテンプレートＤＮＡおよび／または少なくとも１つのコントロールプライマーを含むことができる。
【０２２５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＤＮＡ配列を増幅する方法が提供される。この方法の第１の工程において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が提供され、第２の工程において、多数のＰＣＲサイクルが、富化されたナノ構造組成物の存在下、ＤＮＡ配列に対して実行される。
【０２２６】
ＰＣＲサイクルを、この分野で知られている任意の方法で行うことができ、例えば、米国特許第４６８３１９５号、同第４６８３２０２号、同第４８００１５９号、同第４９６５１８８号、同第５５１２４６２号、同第６００７２３１号、同第６１５００９４号、同第６２１４５５７号、同第６２３１８１２号、同第６３９１５５９号、同第６７４０５１０号および国際特許出願公開ＷＯ／９９１１８２３に開示されるＰＣＲサイクル（これらに限定されない）を行うことができる。
【０２２７】
好ましくは、それぞれのＰＣＲサイクルにおいて、ＤＮＡ配列は最初に、一本鎖の相補的な鎖を形成するために処理される。続いて、ＤＮＡ配列に対して特異的である対になったオリゴヌクレオチドプライマーが富化されたナノ構造組成物に加えられる。その後、プライマー対は、一本鎖の相補的な鎖における相補的な配列にアニーリングさせられる。適正な条件のもとで、アニーリングされたプライマーが伸張して、一本鎖のそれぞれに対して相補的である伸張生成物を合成する。
【０２２８】
ポリヌクレオチドを固体支持体（例えば、ガラスビーズなど）に固定することは、分子生物学研究および医学の分野ではこの上なく有益であり得る。
【０２２９】
本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」は、任意のサイズの鎖を形成するためにつながったＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子として定義される。
【０２３０】
ポリヌクレオチドは、研究および医学的適用の過程において多くの方法で操作することができ、これには、例えば、増幅、転写、逆転写、連結、制限消化、トランスフェクションおよび形質転換（これらに限定されない）が含まれる。
【０２３１】
本明細書中で使用される「連結」は、１つの核酸鎖の３’末端を別の核酸鎖の５’末端とつなぎ、これにより、連続した鎖を形成することとして定義される。「転写」は、ＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡの合成として定義される。「逆転写」は、ＲＮＡからのＤＮＡの合成として定義される。「制限消化」は、ＤＮＡ分子を、制限エンドヌクレアーゼと呼ばれる特別な酵素でより小さい小片に切断するプロセスとして定義される。「形質転換」は、細菌細胞が裸のＤＮＡ分子を取り込むプロセスである。「トランスフェクション」は、細胞がＤＮＡ分子を取り込むプロセスである。
【０２３２】
典型的には、ＤＮＡ操作は一連の反応を次々に含む。従って、典型的な一例として、ＤＮＡを最初に制限消化し、増幅し、次いで細菌に形質転換することができる。それぞれの反応が、好ましくは、それ自身の特有の緩衝液を必要とするそれ自身の好適な反応条件のもとで行われる。典型的には、それぞれの反応の間で、ＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルを沈殿させ、その後、その新しい適切な緩衝液において再構成しなければならない。繰り返される沈殿化および再構成は時間がかかり、また、より重要なことに、出発物質の喪失をもたらし、このことは、出発物質が希少であるときには最大の関心事であり得る。ポリヌクレオチドを固体支持体に固定することによって、これが回避される。
【０２３３】
従って、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、固体支持体の存在下での少なくとも１つの高分子の操作を可能にすることができ、それにより、ナノ構造のそれぞれが、整列した流体分子のエンベロープによって取り囲まれるナノメートルサイズのコア材料を含み、コア材料、および整列した流体分子のエンベロープは定常的な物理的状態にある。
【０２３４】
固体支持体は、ＤＮＡおよびＲＮＡと結合することができ、その一方で、他の分子が接近して結合し、また、上記で議論されたように、その後の反応においてそのＤＮＡおよびＲＮＡと相互作用することを可能にする任意の固体支持体であり得る。
【０２３５】
本発明のいくつかの実施形態において、ガラスビーズは、ポリヌクレオチドを固定することができる一方で、ポリヌクレオチドが無傷であり続けるために富化されたナノ構造組成物を要求する。本発明のいくつかの実施形態において、ガラスビーズの存在下でＰＣＲ増幅を受けているＤＮＡは、ＰＣＲ生成物が可視化されるために、富化されたナノ構造組成物の存在を要求する。
【０２３６】
核酸増幅のほかに、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、多くの化学的および生物学的なアッセイおよび反応を改善するために、緩衝液として、または既存の緩衝液への追加物として使用することができる。
【０２３７】
従って、１つの実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、ＤＮＡ分子を少なくとも部分的に解きほぐすために使用することができる。
【０２３８】
別の実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、ＤＮＡの単離および精製を容易にするために使用することができる。
【０２３９】
さらに別の実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、核酸のハイブリダイゼーションを高めるために使用することができる。核酸はＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子（すなわち、核酸配列またはその１個だけの塩基）であり得る。
【０２４０】
核酸の一方を固体支持体（例えば、ＤＮＡチップ）に結合することができる。ＤＮＡチップの例には、フォーカスアレイチップ、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップおよびＩｌｌｕｍｉｎａビーズアレイチップが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４１】
富化されたナノ構造組成物は、ハイブリダイゼーションを高めることが示されたので、本発明は、低い発現レベルを有する遺伝子を検出することにおいて特に有用であり得る。
【０２４２】
さらなる実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、結合型酵素または非結合型酵素のいずれかであっても、多くの酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼなど、これらに限定されない）の酵素活性を安定化させるために使用することができる。
【０２４３】
さらに別の実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、高分子が固相マトリックスに結合することを高めるために使用することができる。本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、親水性物質および疎水性物質の両方に対する結合を高めることができる。加えて、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、疎水性領域および親水性領域を有する物質に対する結合を高めることができる。上記物質に対する多くの高分子の結合を高めることができ、それらには、限定されないが、１つまたは複数の炭水化物親水性領域または炭水化物疎水性領域を有する高分子、抗体、ポリクローナル抗体、レクチン、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子などが含まれる。
【０２４４】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、カラムの容量、樹脂に対する核酸の結合を増大させるために、また、ゲル電気泳動分離を改善するために使用することができる。
【０２４５】
本発明の実施形態はまた、新規な消毒組成物、および、新規な消毒組成物を使用する方法を含む。具体的には、本発明の実施形態は、身体表面を殺菌するために（例えば、口腔洗浄剤として、口を殺菌するために）、または、物体を殺菌するために使用することができる。
【０２４６】
様々な消毒剤を、皮膚または粘膜が消毒されなければならないとき、手術介入前、注射前、穿刺前および中空器官の検査前の適用を含めて、無数の目的のために用いることができる。加えて、様々な消毒剤がまた、創傷処置のために、および、局所的な表面近くの皮膚感染症の治療（例えば、真菌感染症における治療）のために用いられる。消毒剤を含有する溶液を、口腔洗浄剤の形態で虫歯予防のために使用することができる。
【０２４７】
口腔洗浄剤は、歯垢、歯肉炎および口臭の原因である口腔内の細菌を殺すために有用である。口腔洗浄剤の大部分において、エタノールが溶媒として使用される。アルコールを含有する口腔洗浄剤は、使用者の口において灼熱作用または刺すような作用を引き起こすことがあるので不都合であり、加えて、口をガンに罹りやすくしていると考えられる。さらに、アルコールを含有する口腔洗浄剤は、生理学的理由（例えば、化学療法を受けている患者）、心理学的理由、社会的理由または仕事関連の理由のために、アルコールを使用することができないか、または、アルコールを使用してはならない人を含めて、一部の使用者については問題となり得る。したがって、上記の制限がない新規な消毒組成物を有することが非常に所望される。
【０２４８】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、それ自体であっても、または、消毒薬剤のためのキャリアとして使用されるときであっても、身体表面または物体を消毒するために使用される。
【０２４９】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、口腔洗浄剤有効成分（例えば、チモール、サリチル酸メチル、メントールおよびオイカリプトール）のための溶媒として効果的である。消毒活性薬剤は、逆浸透（ＲＯ）と比較して、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物ではより多くの分散を伴って、より細かいミセルを時間とともに生じさせる。消毒用口腔洗浄剤の効力および味覚はその有効成分（例えば、チモール、サリチル酸メチル、メントールおよびオイカリプトール）の有効性または溶解に起因するので、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、口腔洗浄剤に含有される有効成分のための効果的な溶媒となり得る。さらに、本発明の実施形態の組成物は、さらなるアルコールが分散のために要求されなかったので、アルコール非含有とすることができる。したがって、本発明の実施形態の組成物は、溶媒として、アルコールの代替物として使用することができる。
【０２５０】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物と、少なくとも１つの消毒薬剤とを含む消毒組成物が提供される。
【０２５１】
本明細書中で使用される表現「消毒組成物」は、病原体（例えば、細菌、真菌、アメーバ、原生動物および／またはウイルスなど）に対して細胞増殖抑制性および／または細胞毒性である固体組成物、半固体組成物または液体組成物を示す。好ましくは、本発明の実施形態の消毒組成物は、２０％を越えるアルコール（ｗ／ｖ）を含まず、一層より好ましくは、（本明細書中上記で記載された理由から）アルコールを含まない。
【０２５２】
好ましくは、富化されたナノ構造組成物は、著しい刺激を、生物の身体表面に適用されたときに生じさせず、また、溶解された消毒薬剤の生物学的な活性および性質をなくさない。
【０２５３】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、水よりも大きな程度に、一般には薬剤を、具体的にはストリップに存在する消毒薬剤を溶解または分散することができる。
【０２５４】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、疎水性膜を通過する消毒薬剤の浸透を高める。富化されたナノ構造組成物はまた、安定化環境を提供することによって（例えば、タンパク質を熱の影響から安定化することによって）、薬剤の殺菌特性を高めることができる。
【０２５５】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物の殺菌特性が、組成物が特定のものと接触するときに、特に、典型的には上部咽頭に存在する特定の生物学的物体（例えば、真核生物真菌、原生生物、メタン生成性古細菌または細菌）と接触するときに発現または上昇する。他方で、殺菌特性が、そのようなものが存在しない場合には認められなかった。したがって、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、特定の生物学的物体が殺菌プロセスに対する「プライマー」として働くという意味で、休眠的な殺菌特性を有する。
【０２５６】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の実施形態の消毒組成物は少なくとも１つの消毒薬剤を含む。
【０２５７】
本明細書中で使用される表現「消毒薬剤」は、病原体（例えば、細菌、真菌、アメーバ、原生動物および／またはウイルスなど）に対して細胞増殖抑制性および／または細胞毒性である薬剤を示す。
【０２５８】
本発明の実施形態の消毒組成物の消毒薬剤は、本発明の実施形態の消毒組成物の意図された使用に従って選択される。
【０２５９】
好ましくは、消毒薬剤は、適度に長い貯蔵寿命（例えば、２年）にわたって安定であり、好ましくは、持続性を有しなければならず、すなわち、薬剤と、薬剤がその効果を誘導することになる微生物との間における長期に及ぶ接触時間を有しなければならない。
【０２６０】
したがって、例えば、消毒組成物が動物投与のために使用されるとき、消毒薬剤は好ましくは、非毒性の消毒薬剤である。例えば、口腔洗浄剤として使用されるとき、本発明の実施形態の消毒薬剤は好ましくは、経口非毒性の消毒薬剤である。
【０２６１】
本明細書中で使用される表現「経口非毒性の消毒薬剤」は、その推奨される用量において、また、消毒薬剤が指示通りに投与されるとき、安全である（すなわち、望まれない副作用を引き起こさない）消毒薬剤を示す。例えば、口腔洗浄剤において使用されるならば、経口非毒性の消毒薬剤は、口の中ですすがれたとき、消毒薬剤の一部がたとえ、すすぎの間に飲み込まれる場合でさえ、非毒性でなければならない。本発明の実施形態の口腔消毒組成物は、口腔疾患（例えば、虫歯、歯肉炎、歯性感染症、膿瘍および歯周病など）の処置および／または防止のために使用することができる。
【０２６２】
経口非毒性の消毒薬剤の例には、チモール、サリチル酸メチル、メントール、塩化ナトリウム、過酸化水素、グルコン酸クロルヘキシジン、クロルブタノール半水和物、フェノールおよびオイカリプトールが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６３】
本発明の実施形態によって使用することができる他の消毒薬剤には、一価アルコール、金属化合物、第四級アンモニウム化合物、ヨウ素、ヨードフォアまたはフェノール系化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６４】
本発明の実施形態に従って使用することができる一価アルコールの例には、エタノールおよびイソプロパノールが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６５】
本発明の実施形態に従って使用することができる金属化合物の例には、硝酸銀および銀スルファジアジンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６６】
本発明の実施形態に従って使用することができる第四級アンモニウム化合物の例には、ジエチルベンジルアンモニウム塩化物、ベンザルコニウム塩化物、ジエチルドデシルベンジルアンモニウム塩化物、ジメチルジドデシルアンモニウム塩化物、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物、トリメチルテトラデシルアンモニウム塩化物、トリメチルオクタデシルアンモニウム塩化物、トリメチルヘキサデシルアンモニウム塩化物、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩化物、セチルピリジニウム臭化物、セチルピリジニウム塩化物、ドデシルピリジニウム塩化物およびベンジルドデシルビス（Ｂ−ヒドロキシエチル）アンモニウム塩化物が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６７】
本発明の実施形態に従って使用することができるフェノール系化合物の例には、フェノール、パラ−クロロメタキシレノール、クレゾールおよびヘキシルレゾルシノールが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６８】
消毒組成物はまた、対象のために有益であり得る他の薬剤を含むことができる。例えば、抗生物質、または、口すすぎ剤の場合には、組成物はまた、歯科治療のために有用な他の薬剤（例えば、塩化亜鉛誘導体およびフッ化亜鉛誘導体など）を含むことができる。
【０２６９】
上記で記載される富化されたナノ構造組成物および／または消毒組成物は、いくつかの実施形態において、殺菌特性によって特徴づけられ、そして、そのようなものとして、物体および身体表面を消毒または殺菌するために使用することができる。
【０２７０】
用語「殺菌する」および用語「消毒する」は交換可能に使用することができ、病原体（例えば、細菌、真菌、アメーバ、原生動物および／またはウイルスなど）を殺すこと、または、その成長を防止すること、または、その成長を遅らせることを示す。
【０２７１】
本発明の実施形態の組成物を使用して殺菌することができる物体の例には、カテーテル（例えば、血管カテーテル、尿道カテーテル、腹腔カテーテル、硬膜外カテーテルおよび中枢神経系カテーテル）、チューブ（例えば、腎フィステル形成術チューブおよび気管内チューブ）、ステント、整形外科デバイス、人工弁および医療用インプラントが含まれるが、これらに限定されない。他の例には、無機表面、例えば、床、テーブル面、カウンター上面、病院設備、車いす、ガーゼおよび綿などが含まれる。
【０２７２】
そのような物体は、所定の期間（例えば、室温で１分間）本発明の実施形態の組成物と接触させられる。しかしながら、本発明の実施形態の組成物は、必要な場合には、物体が消毒組成物の存在下で加熱され得るように、より高い温度（例えば、５０℃）において殺菌特性を保持しなければならない。
【０２７３】
殺菌効率を改善するために、他の薬剤、例えば、消毒薬剤または清浄化剤（例えば、光沢剤、界面活性剤または研磨剤など）などを使用することができる。消毒組成物が無生物使用のためであるとき、消毒薬剤は毒性の薬剤または非毒性の薬剤であり得る。毒性の消毒薬剤の例には、ホルムアルデヒド、塩素、塩化第二水銀およびエチレンオキシドが含まれるが、これらに限定されない。非毒性剤の例が本明細書中上記で詳述される。
【０２７４】
また、本明細書中の実施形態の組成物は、個体の身体表面を消毒するために使用することができる。これは、その必要性のある個体の身体表面に本発明の実施形態の組成物の所定量を与えることによって行うことができる。
【０２７５】
消毒を改善するために、本明細書中上記で詳述されるような他の薬剤（例えば、消毒薬剤）または他の治療薬剤を与えることができる。
【０２７６】
本明細書中で使用される表現「身体表面」は、皮膚、歯または粘膜（例えば、口を覆う粘膜）を示す。好ましくは、本発明の実施形態の組成物は、これらの身体表面を横断し、循環に入ることがない。
【０２７７】
本明細書中で使用される用語「個体」は、ヒト対象または動物対象（すなわち、死亡または生存している個体）を示す。
【０２７８】
本発明の実施形態の消毒組成物はまた、他の生理学的に許容されるキャリアを含むことができる。加えて、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物はまた、賦形剤または補助剤を含むことができる。
【０２７９】
本明細書において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２８０】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０２８１】
好ましくは、本発明の実施形態の消毒組成物は、局所的に適用され、例えば、皮膚上に載せられ、口においてゆすがれ、または喉においてうがいされる。
【０２８２】
本発明の実施形態の消毒組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の製造は、上記に記載される。
【０２８３】
従って、本発明の実施形態による使用のための消毒組成物は、従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、意図される用途に依存する。
【０２８４】
例えば、本発明の実施形態の消毒組成物は、口腔を消毒するために配合することができ、そのようなものとして、消毒組成物が故意に飲み込まれない限りは、任意の経口投薬形態物として配合することができる。経口投薬形態物の例には、口腔洗浄剤、ストリップ、フォーム、チューインガム、口腔スプレー、カプセルおよびトローチ剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８５】
本発明の実施形態の消毒組成物はまた、局所用または粘膜用の投薬形態物として配合することができる。局所用または粘膜用の投薬形態物の例には、クリーム、スプレー、ふき取るもの、フォーム、石けん、オイル、溶液、ローション、軟膏、ペーストおよびゲルが含まれる。
【０２８６】
消毒組成物は、少なくとも１体積％の富化されたナノ構造組成物を含む液体として配合することができる。また、消毒組成物は、最大でも０．２５８ｇｒ／１００ｍｌの富化されたナノ構造組成物を含む固体または半固体として配合することができる。
【０２８７】
経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０２８８】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【０２８９】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０２９０】
本発明の実施形態による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達されることができる。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０２９１】
本発明の実施形態に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、消毒に効果的である、有効成分（消毒剤）の量を意味する。
【０２９２】
治療有効量の決定は、特に、本明細書中に提供される詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２９３】
本発明の実施形態の方法において使用されるいかなる調製物についても、治療的に効果的な量または用量は、最初はインビトロの細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、所望の濃度または滴定量を達成するために、用量は動物モデルにおいて配合することが可能である。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０２９４】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０２９５】
投薬量および投薬間隔を、生物学的効果を誘導または抑制するために十分である活性成分の血漿中レベルまたは脳レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個々の特性および投与経路に依存する。血漿中濃度を決定するために、検出アッセイが使用されることができる。
【０２９６】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、局所投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０２９７】
局所的に投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０２９８】
本発明の実施形態の組成物は、もし望むなら、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態を含有しうるパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供されることができる。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随しうる。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きでありうるか、または、承認された製品添付文書でありうる。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の実施形態の調製物を含む組成物はまた、調製され、適切な容器に入れられ、かつ上記においてさらに詳述されるように、表示される状態の処置についてラベル書きされうる。
【０２９９】
本発明の実施形態はさらに、新規な凍結保護組成物、および、新規な凍結保護組成物を使用する方法を含む。具体的には、本発明の実施形態は、細胞物を凍結保護し、それにより、その貯蔵、輸送および取り扱いを容易にするために使用することができる。
【０３００】
低温生物学は広範囲の様々な適用を包含しており、多くのタイプの生物学的材料を長期間にわたって貯蔵するための解決策を提供する可能性を有する。しかしながら、適正に制御されないならば、凍結保存は、熱的、浸透圧的および／または機械的なショック、ならびに、細胞構造（特に原形質膜）に損傷を与え得る結晶の形成のために、細胞損傷および細胞生存性における低下を引き起こし得る。加えて、凍結および解凍のプロセスは、細胞損傷の潜在的可能性を有する細胞の脱水を引き起こす。凍結保護剤（すなわち、凍結保護薬剤）の使用が、これらの問題のいくつかを緩和することを助ける。一般に使用されている凍結保護剤には、グリセロール、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、エチレングリコールおよびＤＭＳＯが含まれる。凍結時および解凍時における細胞の傷害を軽減するために不可欠であるが、これらの凍結保護剤はまた、細胞に対して毒性である。例えば、精子細胞に対するグリセロールの毒性影響が２％未満の濃度においてさえ報告されている（ＴｕｌａｎｄｉおよびＭｃＩｎｎｅｓ、１９８４）。加えて、精子の運動性が、グリセロール濃度が増大するにつれて低下することが示されている（ＷｅｉｄｅｌおよびＰｒｉｎｓ、１９８７、Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ．、Ｊａｎ−Ｆｅｂ、８（１）：４１〜７；Ｃｒｉｓｔｅｒ他、１９８８、Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ、Ａｕｇ、５０（２）：３１４〜２０）。さらに、凍結保護薬剤の存在は、浸透圧ストレスに起因する精子細胞の傷害を引き起こすことが示された（Ｃｒｉｓｔｅｒ他、１９８８、Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ、Ａｕｇ、５０（２）：３１４〜２０）。
【０３０１】
したがって、上記の制限を有しない新規な凍結保護組成物を有することが非常に好都合である。
【０３０２】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物を、細胞物を効率的に凍結保護するために使用することができる。
【０３０３】
本発明のいくつかの実施形態において、凍結保護薬剤（グリセロール）を含む緩衝液の存在下における富化されたナノ構造組成物は、凍結保護後の精子細胞を保護すること、および、解凍後の精子の品質を増大させることの両方で、緩衝液単独よりも効果的である。したがって、本発明の実施形態の組成物を、凍結保護のために必要な毒性の凍結保護薬剤（例えば、グリセロールなど）の量を減らし、それにより、凍結保護薬剤の有害な影響を制限するために使用することができる。
【０３０４】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物と、場合により、少なくとも１つの凍結保護薬剤とを含む凍結保護組成物が提供される。
【０３０５】
本明細書中で使用される表現「凍結保護組成物」は、凍結時および解凍時における細胞の傷害（例えば、細胞内および細胞外の氷結晶形成によって引き起こされる機械的傷害；ならびに、細胞外の氷形成により引き起こされる変化する溶質条件により引き起こされる浸透圧力によって引き起こされる傷害）を軽減する液体組成物を示す。
【０３０６】
本明細書中で使用される表現「凍結保護薬剤」は、凍結時および解凍時における細胞の傷害を軽減することによって凍結保護のプロセスを容易にする化学物質または化学的溶液を示す。好ましくは、凍結保護薬剤は、凍結保護薬剤が使用される条件のもとで細胞物に対して（すなわち、特定の濃度で、特定の暴露時間にわたって、かつ、特定の容量オスモル濃度の媒体における細胞に対して）非毒性である。本発明の実施形態によれば、凍結保護薬剤は細胞透過性または細胞非透過性であり得る。凍結保護薬剤の例には、脱水剤、浸透圧剤およびガラス化溶質（すなわち、低温にさらされたとき、結晶性固体ではなく、ガラスへの溶液の変換を助ける溶質）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３０７】
理論にとらわれることはないが、非透過性の凍結保護薬剤は細胞内の水の流出を阻害し、それにより、その最小臨界容積を超える細胞縮小を防止することが考えられる。細胞収縮を低下させることによって、凍結保護薬剤は細胞内流体の過度の濃縮を弱め、それにより、タンパク質の沈殿化を阻害する。透過性の凍結保護薬剤は、その中で形成される氷の量を減らし、したがって、細胞膜およびオルガネラに対する物理的傷害の量を減らす。
【０３０８】
好ましくは、凍結保護薬剤およびその濃度は、それぞれの細胞がそのタイプおよび環境に従って特定の様式で個々の凍結保護薬剤に応答するので、経験に基づいて選択される。典型的には、組織は、細胞懸濁物よりも多い浸透性凍結保護薬剤を要求する。逆に、小さい細胞の凍結保護では、細胞膜に浸透する薬剤が要求されないことがある。加えて、凍結保護薬剤およびその濃度は、本明細書中下記でさらに記載されるように、凍結保護の方法および段階に従って選択される。
【０３０９】
本発明の実施形態に従って使用することができる凍結保護薬剤の例には、アセトアミド、アガロース、アルギン酸塩、１−アナリン（ａｎａｌｉｎｅ）、アルブミン、酢酸アンモニウム、ブタンジオール、コンドロイチン硫酸、クロロホルム、コリン、デキストラン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エリトリトール、エタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、グルコース、グリセロール、α−グリセロリン酸塩、モノ酢酸グリセロール、グリシン、ヒドロキシエチルデンプン、イノシトール、ラクトース、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、マルトース、マンニトール、マンノース、メタノール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、種々のメチルウレア、フェノール、プルロニックポリオール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、プロピレングリコール、ピリジンＮ−オキシド、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、スクロース、トレハロース、トリエチレングリコール、酢酸トリメチルアミン、ウレア、バリンおよびキシロースが含まれるが、これらに限定されない。
【０３１０】
好ましくは、本発明の実施形態の凍結保護組成物は２０％未満のグリセロールを含み、一層より好ましくは、（本明細書中上記で記載された理由から）グリセロールを有しない。
【０３１１】
ナノ構造の濃度は好ましくは、本明細書中下記で記載されるように、凍結保護の具体的な段階または方法に従って選択される。
【０３１２】
理論にとらわれることはないが、ナノ構造間の遠距離相互作用が凍結保護組成物の独特の特徴に役立っていることが考えられる。１つのそのような特徴が、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組は他の凍結保護薬剤（例えば、グリセロールなど）の凍結保護特性を高めることができることである。このことは、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組がより低い濃度のグリセロールの添加（またはグリセロールの非存在）を可能にし、その結果、潜在的な毒性副作用が軽減されるので、好都合である。別の特徴が、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、安定化環境を提供することによって凍結保護特性を高めることである。
【０３１３】
本発明の実施形態の凍結保護組成物は１つ以上の安定化剤をさらに含むことができる。本明細書中で使用される場合、語句「安定化剤」は、細胞の生存能力を増大させる薬剤を示す。本発明の実施形態の凍結保護組成物の安定化剤、および、その濃度は、細胞タイプおよび細胞環境に従って選択される。安定剤の濃度は一般に、約１μＭ〜約１ｍＭの間で使用されるか、または、好ましくは、約１０μＭ〜約１００μＭの間で使用される。
【０３１４】
１つの実施形態において、安定化剤は、有害な物質を培養培地から除くことによって細胞の生存能力を増大させる。安定化剤は、天然に存在する物質（すなわち、成長期間中の細胞または細胞死によって分泌される物質）および人為的に導入された物質の両方を培養培地から除くことができる。例えば、安定剤は、活性酸素種および他のフリーラジカルの存在に起因すると考えられる有害な作用を中和するラジカル捕捉剤化学物質または抗酸化剤であり得る。そのような物質は、細胞材料の冷凍保存および回復がひどく損なわれるように（内部または外部の両方で）細胞膜を損傷させ得る。これらの物質が除かれないならば、または、他の方法で無力化されないならば、生存能力に対するそれらの影響が時間とともに累積し、これにより、実用的な保管寿命がひどく制限される。そのうえ、細胞が死ぬとき、または、細胞がストレスを受けるとき、さらなる有害物質が放出され、これにより、隣接細胞の損傷および死を増大させる。
【０３１５】
本発明の実施形態に従って使用することができる酸素ラジカル捕捉剤および抗酸化剤の例には、還元型グルタチオン、１，１，３，３−テトラメチルウレア、１，１，３，３−テトラメチル−２−チオウレア、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸銀、ベタイン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン、β−メルカプトエチルアミン、セレノメチオニン、チオウレア、没食子酸プロピル、ジメルカプトプロパノール、アスコルビン酸、システイン、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム、スペルミン、スペルミジン、フェルラ酸、セサモール、レゾルシノール、没食子酸プロピル、ＭＤＬ−７１８９７、カダベリン、プトレシン、１，３−ジアミノプロパン、１，２−ジアミノプロパン、デオキシグルコース、尿酸、サリチル酸、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、４−アミノ−１，２，４−トリアゾール、安息香酸、ヒドロキシルアミン、ならびに、そのような薬剤の組合せおよび誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１６】
植物細胞の冷凍保護において有用であり得る安定化剤には、エチレン生合成および／またはエチレン作用を妨げるか、または、実質的に阻止する薬剤が含まれ得る。植物細胞は、ストレスを受けたとき、毒性のエチレンを放出することが広く知られている。従って、エチレンの生成またはエチレンの作用のいずれかを阻止することにより、細胞生存能力および冷凍保護プロセスからの細胞回復がさらに高まる。
【０３１７】
本発明の実施形態において使用することができるエチレン生合成阻害剤の例には、リゾビトキシン、メトキシルアミン塩酸、ヒドロキシルアミンアナログ、α−カナリン、ＤＮＰ（２，４−ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）ジニトロフェノール）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、スペルミン、スペルミジン、ＡＣＣアナログ、α−アミノイソ酪酸、没食子酸ｎ−プロピル、安息香酸、安息香酸誘導体、フェルラ酸、サリチル酸、サリチル酸誘導体、セサモール、カダバリン、ヒドロキノン、Ａｌａｒ  ＡＭＯ−１６１８、ＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）、フェニルエチルアミン、ブラシノステロイド、Ｐ−クロロメルクリベンゾエート、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセタート、塩化コバルトおよび他の塩、ビピリジル、アミノ（オキシ酢酸）、塩化第二水銀および他の酸塩、サリチルアルコール、サリシン、塩化ニッケルおよび他の塩、カテコール、フロログルシノール、１，２−ジアミノプロパン、デスフェリオキサミン、インドメタシン、１，３−ジアミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
【０３１８】
エチレン作用の阻害剤の例には、銀塩、ベンジルイソチオシアネート、硫酸８−ヒドロキシキノリン、クエン酸８−ヒドロキシキノリン、２，５−ノルボルナジエン、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン、Ｔｒａｎｓ−シクロオテン、７−ブロモ−５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、Ｃｉｓ−プロペニルホスホン酸、ジアゾシクロペンタジエン、メチルシクロプロパン、２−メチルシクロプロパン、カルボン酸、メチルシクロプロパンカルボキシレート、シクロオクタジエン、シクロオクトジン（クロロメチル）およびシクロプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
【０３１９】
銀イオンはまた、様々な植物における強力な抗エチレン剤であり、植物組織および細胞培養物の寿命を改善することが知られている。本発明の実施形態に従って使用することができる銀イオンの例には、チオ亜硫酸銀、硝酸銀、塩化銀、酢酸銀、リン酸銀、クエン酸の三銀塩、安息香酸銀、硫酸銀、酸化銀、亜硝酸銀、シアン酸銀、乳酸の銀塩、ならびに、ペンタフルオロプロピオン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩およびトルエンスルホン酸の銀塩が含まれるが、これらに限定されない。
【０３２０】
別の実施形態において、安定化剤は、例えば、脂質二重層内にインターカレーションすること（例えば、ステロール、リン脂質、糖脂質、糖タンパク質）、または、膜タンパク質を安定化すること（例えば、二価陽イオン）により細胞膜を安定化することによって細胞生存能力を増大させる。本発明の凍結保護組成物において使用することができる二価陽イオンの例には、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２およびＭｇＣｌ２が含まれるが、これらに限定されない。ナトリウムは、微量を超えた任意の濃度では、その毒性のためにそれほど好ましくない。好ましい濃度は約１ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲であり、より好ましくは約５ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲であり、さらにより好ましくは約１０ｍＭまたは１５ｍＭである。二価陽イオンもまた、凍結温度を下げ、また、細胞が凍結点をより迅速に通過することを可能にする。
【０３２１】
さらに別の実施形態において、安定化剤は、熱ショックを防止するか、または、最小限に抑えることによって細胞の生存能力を高める。従って、安定化剤は熱ショックタンパク質であり得るか、または、熱ショックタンパク質安定剤（例えば、上記されるように、二価陽イオン）であり得る。
【０３２２】
本発明の実施形態の凍結保護組成物はさらに、安定剤、例えば、増殖因子、卵黄、血清（例えば、ウシ胎児血清）および抗生物質（例えば、チロシン、ゲンタマイシン、リンコスペクチンおよび／またはスペクチノマイシン）などを含むことができる。
【０３２３】
加えて、本発明の実施形態の凍結保護組成物は増殖培地または緩衝剤を含むことができる。選択される培地または緩衝剤のタイプは、冷凍保護される細胞タイプに依存しており、複数の例がこの分野では広く知られている。許容され得る細胞緩衝剤の好適な例には、リン酸塩系緩衝剤（例えば、ＰＢＳなど）およびＴｒｉｓ系緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ  ＥＤＴＡなど）が含まれる。本発明の実施形態の凍結保護組成物に加えることができる増殖培地の一例がＤＭＥＭである。
【０３２４】
上述したように、本発明の実施形態の組成物は凍結保護特性によって特徴づけられ、そのようなものとして、細胞材料を冷凍保存するために使用することができる。
【０３２５】
従って、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、（ａ）細胞材料を、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物と接触させること、および、（ｂ）細胞材料を冷凍保存温度に供することを含む、細胞材料を冷凍保存する方法が提供される。
【０３２６】
本明細書中で使用される場合、用語「冷凍保存する」とは、非常に低い温度で保管することによって細胞材料の生存能力を維持または保存することを示す。典型的には、冷凍保存することは、凍結保護剤の存在下で行われる。好ましくは、細胞材料は、本発明の実施形態の教示に従って少なくとも５年間にわたって冷凍保存することができる。
【０３２７】
本明細書中で使用される場合、語句「細胞材料（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｔｅｒ）」とは、細胞を含む生物学的材料を示す。
【０３２８】
本発明の実施形態に従って冷凍保存することができる細胞材料の例には、原核生物および真核生物細胞材料（例えば、哺乳動物、植物、酵母）、細胞性体液（例えば、脊髄液、血液、羊水、唾液、滑液、膣分泌物および精液）、単離された細胞、細胞培養物（例えば、細胞株、初代細胞培養物、酵母または細菌の培養物）、細胞懸濁物、固定化細胞（例えば、足場結合細胞）、組織、器官または生物体が含まれるが、これらに限定されない。
【０３２９】
植物細胞材料の例には、新生の針葉、葉、根、樹皮、幹、根茎、カルス細胞、プロトプラスト、細胞懸濁物、器官、分裂組織、種子および胚、ならびに、それらの一部分が含まれるが、これらに限定されない。
【０３３０】
具体的な実施形態において、細胞材料は、幹細胞、精子細胞または卵子（すなわち、卵母細胞）を含むことができる。
【０３３１】
別の具体的な実施形態において、細胞材料はナイーブであり得るか、または、遺伝子改変され得る。
【０３３２】
細胞材料は、生物または死体から得ることができる。例えば、細胞材料を手術（例えば、生検）によって、または、射精液で得ることができる。あるいは、細胞材料を研究室の細胞培養物から得ることができる。
【０３３３】
下記には、例示的な細胞材料についての典型的な冷凍保存手順が要約される。
【０３３４】
精液
精液を、好ましくは提供によって、正常な男性、乏精子症の男性、奇形精子症の男性または精子無力症の男性から得ることができるが、外科的方法によってもまた得ることができる。精液は、典型的には、受精の現実的機会が回復後に予定されているならば、冷凍保存されることが要求されるサンプルの量を決定するために、機能的検査に供される。精液サンプルは典型的には、本発明の実施形態の凍結保護組成物と１：１の比率で混合され、静的な気相冷却を使用してストローにおいて０．５ｍｌのアリコートで凍結される。
【０３３５】
胚
胚は典型的には、体外受精後、着床前の段階（例えば、胚盤胞段階）で冷凍保存される。胚は、成功した冷凍保存を最適化するために、基準の範囲に従って選択される（例えば、１．胚盤胞の成長速度−５日目での成長速度は６日目での成長速度よりも大きくなければならず、このことは、結果として、７日目での成長速度よりも大きくなければならない；２．全体的な細胞数−数は（発達の日数に依存して）６０個以上の細胞でなければならない；３．栄養外胚葉：内部細胞塊に対する相対的な細胞配置；４．割球の規則性；５．単核化；および６．ＤＮＡ断片化）。
【０３３６】
標準的な胚冷凍保存技術では、胚を、単純なナトリウム系塩溶液中に希釈された本発明の実施形態の凍結保護組成物に５分間〜１５分間暴露して取り込みを可能としてもよい。その後、胚は、胚を播種することができる約７℃に急速冷却され（−２℃／分）、そして、約−３０℃以下にゆっくり冷却され（−０．３℃／分〜−０．５℃／分）、その後、液体窒素の中に直接投入することができる。プログラム可能な冷凍庫が典型的には、制御された速度での冷却のために必要となる。胚は、急速方法を使用して解凍することができる。胚はまた、胚が数分間超暴露されるとき、細胞に対して毒性である非常に高い凍結保護可能な濃度（２Ｍ〜６Ｍ）を使用する場合だけ、急速に凍結またはガラス化することができる。
【０３３７】
卵母細胞
好ましくは、冷凍保存のために使用される卵母細胞は成熟している。成熟した卵母細胞を、外科的手順を使用して取り出すことができる。取り出す前に卵母細胞を刺激することもまた必要となり得る。典型的には、卵母細胞は、下記の基準に基づいて冷凍保存のために選択される：半透明、形状、および、第１極体の排出。卵母細胞を冷凍保存するための典型的なプロトコルが米国特許第６５００６０８号および米国特許第５９８５５３８号に記載される。
【０３３８】
幹細胞
多能性幹細胞の保存では、細胞は依然として成長可能でなければならないだけでなく、その分化能もまた保持しなければならない（すなわち、未分化の状態で維持されなければならない）ので、さらなる課題が低温生物学には提起される。従って、ある特定のシグナル伝達経路は依然として適切に機能しなければならず、また、凍結および乾燥に伴うストレスにより、早すぎる分化または誤った分化が誘導されてはならない。細胞の非分化表現型を維持する安定剤を解凍後直ちに含めることができる。
【０３３９】
典型的には、幹細胞の冷凍保存プロトコルには、（１）接着性幹細胞コロニーに適用される従来の緩速冷却プロトコル、および（２）接着性幹細胞コロニーおよび自由懸濁された幹細胞塊の両方のためのガラス化プロトコルが含まれる。
【０３４０】
皮膚
皮膚は典型的には、死体または健康な個体から取り出される。動物の皮膚組織もまた、移植での使用のために冷凍保存することができる。皮膚は典型的には、組織型決定が冷凍保存前または解凍後に行われる。皮膚細胞は冷凍保存の前にインビトロで培養および拡大することができる。冷凍保存では、典型的には、高速解凍プロトコルが要求される。このプロトコルの成功または失敗が、創傷床への移植片生着によるか、または、細胞生存能アッセイによるかのいずれかによって測定される。
【０３４１】
卵巣組織
卵巣組織（卵巣全体またはその一部）を健康な女性または健康でない女性から取り出すことができる。卵巣組織を冷凍保存するために好都合であり得る疾患の例には、ガン、悪性疾患（例えば、サラセミアなど）、および、ある特定の自己免疫状態が含まれる。早期閉経の履歴を有する健康な女性もまた、卵巣組織の冷凍保存を望み得る。取り出しまたは解凍の後で、組織は悪性細胞についてスクリーニングされ、また、その後の自己移植のために安全性について評価され得る。
【０３４２】
細胞材料は、冷凍保存手順を容易にするために状態調節することができ、または、本発明の実施形態の組成物と直接に接触させることができる。本明細書中で使用される場合、用語「状態調節する」とは、細胞材料を、ナノ構造および／または凍結保護剤の毒性作用、ならびに／あるいは、低下させた温度の毒性作用から保護することを示す。例えば、細胞材料は安定剤により状態調節し、続いて、本発明の実施形態の組成物の存在下でインキュベーションすることができる。あるいは、本発明の実施形態の組成物を最初に細胞に適用し、その後、安定剤または他の凍結保護剤を加えることができる。
【０３４３】
安定剤の例が上記される。
【０３４４】
加えて、または、代替として、細胞材料は冷凍保護の前に低温順応させることができる。これは、安定剤による状態調節と同時に、または、安定剤による状態調節の後であっても、本発明の実施形態の組成物とインキュベーションする前またはインキュベーションするのと同時のいずれかで行うことができる。これにより、細胞は、細胞の代謝が著しく遅くなり、また、より重大な意味をもつ温度変化のいくつかを通り抜ける急速な温度移行のショックが軽減されることによって冷凍保存プロセスのために準備される。重大な意味をもつ温度範囲は、細胞損傷の危険性が最も高いそのような範囲であり、例えば、氷の結晶が形成する臨界温度の付近である。当業者には知られているように、これらの温度は、溶液の組成に依存して幾分か変化する（水、すなわち、ほとんどの細胞培養培地の主成分については、氷結晶の形成および再形成が約０℃〜約−５０℃で生じる）。
【０３４５】
順応は、細胞の脱水の程度を任意の所与の浸透圧ポテンシャルでも低下させ、また、極端な脱水の期間中におけるタンパク質および膜の安定化に寄与する内因性溶質の蓄積をもたらす。
【０３４６】
順応を段階的様式で行うことができ、または、徐々に行うことができる。工程を、損傷を引き起こすことなく、細胞がより低い温度に順応することを可能にするために十分な期間に約０．５℃〜約１０℃の低下率で行うことができる。温度勾配は、徐々にであっても、または、段階的であっても、細胞に凍結点をできる限り迅速に通過させるように設定される。好ましくは、順応温度は約１℃〜約１５℃の間であり、より好ましくは約２℃〜約１０℃の間であり、一層より好ましくは約４℃である。細胞は、そのような低下させた温度に、段階的もしくは連続的な様式であっても徐々に、または、急速に順応させることができる。順応のための技術が当業者には広く知られており、これらには、市販の順応化装置が含まれる。緩やかな順応は、インキュベーション温度を、目標温度に到達するまで約１℃毎時で下げることを含む。緩やかな順応は、感受性が最も大きく、冷凍保護することが困難であると考えられるそのような細胞には最も有用である。段階的な順応は、細胞を、所定の期間低下させた温度に置き、続いて、さらに所定の期間さらなる低下させた温度に置くことを含む。これらの工程を、必要に応じて繰り返すことができる。
【０３４７】
細胞材料の凍結乾燥もまた、冷凍保護の前に行うことができる。凍結乾燥は、細胞の水分含有量を真空蒸発によって低下させることに関する。真空蒸発では、細胞を、低下させた空気圧の環境に置くことを含む。所望される水分除去速度に依存して、約−３０℃〜−５０℃の間での温度で作用する低下した周囲圧力は、１００ｔｏｒｒ、１ｔｏｒｒ、０．０１ｔｏｒｒ以下であり得る。減圧条件下では、水の蒸発速度が、細胞内の水の６５％までが一晩で除かれ得るように増大する。最適な条件により、水の除去を数時間以内で達成することができる。蒸発期間中の熱喪失により、細胞が冷却状態で維持される。真空レベルを注意深く調節することによって、細胞を、真空蒸発プロセスの期間中、低い順応温度で維持することができる。強い真空は、迅速な水除去を可能にする一方で、細胞を凍結の危険性にさらす。
【０３４８】
凍結を、熱を細胞に直接加えることによって、または、真空レベルの調節によって抑制することができる。細胞が最初に蒸発チャンバーに置かれるとき、細胞内の残留熱が凍結を防止するので、高真空を加えることができる。脱水が進み、細胞の温度が低下するにつれ、真空度を下げるか、または、加熱することで凍結を防止することができる。半乾燥の細胞は、蒸発チャンバーに飛散する傾向を有し得る。この傾向は、処理が終了したとき、気流がチャンバー内に戻されるときに特に高い。空気の流れが半乾燥の細胞に近づくならば、気流は細胞を空中に浮遊させ、サンプルの相互汚染を引き起こし得る。そのような乱れを防止するために、蒸発冷却を、細胞が、乾燥しながら、遠心力によってチューブに閉じ込められる真空遠心分離器において行うことができる。このプロセスで除かれる水の量を、細胞の乾燥重量の測定を行うことによって定期的にモニタリングすることができる。
【０３４９】
熱ショック処理もまた、冷凍保護前の順応に対する代替として行うことができる。熱ショック処理は、ストレスに対する適合化に関与することが推測されるある種のタンパク質（熱ショックタンパク質）のデノボ合成を誘導することが知られている。加えて、熱ショック処理は、膜およびタンパク質を安定化させるように作用する。熱ショック処理は冷凍保存後の細胞の生存を約２０％〜約４０％改善する傾向がある。この手法では、細胞材料（状態調節された細胞材料または状態調節されていない細胞材料のいずれでも）を、約３１℃〜約４５℃の間で、好ましくは約３３℃〜約４０℃の間で、より好ましくは約３７℃で水浴振とう機においてインキュベーションすることを含む。培養が数分間〜数時間行われ、好ましくは約１時間〜約６時間、より好ましくは約２時間〜約４時間行われる。
【０３５０】
上述したように、本発明の実施形態の方法は、細胞材料を本発明の実施形態の組成物と接触させること（インキュベーションすること）によって行われる。好ましくは、接触させることは、ナノ構造の細胞内濃度および／または細胞外濃度を平衡化させるように作用する。本発明の実施形態の組成物を細胞材料に直接に加えることができ、または、細胞材料がインキュベーションされている培地に希釈することができる。平衡化のために要求される時間を最小限にするために、接触させることはおよそ室温で行うことができるが、最適な温度および負荷のための他の条件は、好ましくは、生存能力のある細胞を維持する条件（例えば、培地、光強度および酸素レベルなど）と一致する。
【０３５１】
本発明の実施形態の組成物は細胞材料に直接に適用することができ、または、培養培地などの培地をインキュベーションする細胞材料に希釈することができる。加えて、段階的なインキュベーション（接触）を行うことができる。従って、例えば、段階的に接触させることを、細胞材料がナノ構造の増大する濃度の存在下でインキュベーションされるように行うことができる。従って、例えば、細胞材料を、最初は、１リットルあたり１０１０個のナノ構造を含む組成物と接触させることができ、最後は、１リットルあたり１０１５個のナノ構造を含む組成物と接触させることができる。
【０３５２】
段階的に接触させることは単一用量負荷よりも幾分か穏和であるので、段階的に接触させることが時には、細胞へのナノ構造の送達を容易にするために所望される。段階的に負荷するための添加の間における時間増分または時間間隔は、数分から数時間以上に及んでもよいが、約１分〜約１０分が好ましく、より好ましくは約１分〜約５分であり、さらにより好ましくは約１分または約２分の間隔である。段階的に接触させる手法における添加の回数は、典型的には、実用的であればどれも可能であり、ほんの数回から非常に多数にまで及び得る。好ましくは約２０回未満の添加であり、より好ましくは約１０回未満のであり、一層より好ましくは約５回である。間隔期間および間隔の数は特定のタイプの細胞および負荷剤について当業者によって容易に決定される。インキュベーション時間は、実用的であるように数分から数時間に及ぶ。
【０３５３】
本発明の実施形態の組成物における凍結保護剤またはナノ構造は、接触させることにより、細胞材料のガラス化が誘発されるように、高い十分な濃度であり得る。
【０３５４】
ガラス化手法では、液体窒素でクエンチする前に、高濃度の溶液に直接にさらすことによる細胞材料の緩やかな浸透圧脱水または段階的な浸透圧脱水を含む。
【０３５５】
ガラス化する前に、細胞材料は、その濃度が、ガラス化をもたらすために十分に高くない本発明の組成物でインキュベーションすることができる。このことは主に、細胞膜およびおそらくはタンパク質の、脱水により誘導される脱安定化を防止するために役立つ。このような組成物は場合により、ガラス化の前に除去することができる。組成物が残留するならば、ナノ構造の濃度を、緩やかに、または、段階的な様式のいずれかで増大させ、ガラス化を容易にすることができる。細胞材料を最初に接触させるために使用される凍結保護剤以外に他の凍結保護剤を加えることができ、あるいは、同一の凍結保護剤もまた、より高い濃度ではあるが、上記で議論されたように段階的な様式または緩やかな様式で加えることができる。凍結保護剤の濃度は約４Ｍ〜約１０Ｍの範囲または約２５重量％〜約６０重量％の間であり得る。これにより、サンプル細胞の極度の脱水がもたらされる。７Ｍを越える溶液では典型的には、浸透圧活性な水の９０％超が細胞から除去される。しかしながら、それぞれの薬剤についての正確な濃度は経験的に決定することができる。ガラス化のために使用することができる凍結保護剤には、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ブタンジオール、ホルムアミド、プロパンジオール、および、これらの物質の混合物が含まれる。
【０３５６】
高濃度の凍結保護剤またはナノ構造にさらされることの傷害的結果を最小限に抑えるために、脱水を、できる限り短い暴露時間で約０℃〜約４℃で行うことができる。これらの条件のもとでは、細胞材料内へのさらなる凍結保護剤の流入が、水および溶質についての透過係数における違いのために認めることができない。結果として、細胞材料は収縮したままであり、ガラス化のために要求される細胞質ゾル濃度における増大が脱水によって達成される。
【０３５７】
本発明の実施形態の組成物と接触させられている細胞材料は、冷凍保存温度に凍結することによって冷凍保存される。凍結速度は、急速凍結中に機械的な力によって細胞に引き起こされる損傷と、緩速凍結中に浸透圧の力によって細胞に引き起こされる損傷との間でのバランスを取らなければならない。異なる最適な冷却速度が細胞毎に記載されている。そのような異なる最適な冷却速度は、細胞の氷核形成定数および細胞膜の相転移温度が細胞毎に違うことに起因することが示唆されている（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１４０５８；Ｋａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ  ６５：２５２４〜２５３６，１９９３）。−１℃毎分〜−１０℃毎分の間での凍結速度が当該分野では好ましい（Ｋａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ  ６５：２５２４〜２５３６，１９９３）。凍結は、十分に迅速で氷結晶の形成を阻害しなければならない。凍結時間は、およそ５分または４分、３分、２分または１分以下でなければならない。臨界凍結時間を１個の細胞の基準系から測定しなければならない。例えば、１０分を要して細胞の大きなサンプルを液体窒素の中に注いでもよいが、個々の細胞はこの方法によって急速に凍結される。
【０３５８】
上述したように、細胞材料をガラス化することができる。そのような条件のもとで、細胞材料は、細胞間または細胞内での氷形成を受けることなく、極めて速い速度で冷却することができる（過冷却することができる）。氷形成に影響を及ぼす要因のすべてを取り除くことと同様に、急速冷却によりまた、一部の細胞材料の低温感受性の問題が回避される。
【０３５９】
細胞材料を直接に凍結することができる。直接的な凍結方法では、細胞を極低温度の流体（例えば、液体窒素または液体ヘリウムなど）中に直接浸け、噴霧し、注入し、または注ぐことが含まれる。細胞材料はまた、冷却された固体（例えば、液体窒素により凍結されたスチール製ブロックなど）に直接に接触させることができる。極低温度の流体もまた、細胞材料に直接に注ぐことができる。直接的な方法はまた、細胞を、空気を含めて、ガスと極低温度で接触させることを包含する。窒素またはヘリウムの極低温のガス流を細胞懸濁物に直接に吹き付けることができ、または、細胞懸濁物の中に吹き込むことができる。間接的な方法では、細胞を容器に入れ、容器を極低温度での固体、液体またはガスと接触させることを含む。容器の例には、極低温度に耐えるように設計されたプラスチックバイアル、ガラスバイアル、アンプルが含まれる。間接的な凍結方法のための容器は、空気または液体に対して不透過性であってはならない。例えば、プラスチックバッグまたはアルミニウムホイルが適切である。そのうえ、容器は必ずしも極低温度に耐えることができなくてもよい。極低温度のもとで亀裂が生じるが実質的に無傷なままであるプラスチックバイアルもまた使用することができる。細胞はまた、細胞のサンプルを金属ホイルの一方の面に置き、一方、ホイルの反対側を極低温度の固体、液体またはガスと接触させることによって凍結することができる。
【０３６０】
本発明の実施形態の組成物は冷凍保存に好適な容器に含むことができる。制限するように設計された容器は、好ましくは、化学物質（例えば、ナノ構造および下記で議論されるさらなる凍結保護剤）に対して不浸透性である。容器は、好ましくは、極低温に耐えることができる材料から作製される。好ましくは、容器は、凍結／解凍サイクル中での様々な成分の体積変化を吸収することができるように柔軟である。一層より好ましくは、本発明の実施形態の容器は、口の開いたチューブを含む。
【０３６１】
冷凍保存された細胞材料は、低温保管のために適切である温度で維持することができる。最終的な保管温度は細胞タイプに依存しており、しかし、一般には、およそ−８０℃〜−１９６℃（ドライアイスおよび液体窒素の冷凍庫によってそれぞれ維持される温度）であることが当該分野では知られている。好ましくは、細胞は、液体窒素（約−１９６℃）、液体アルゴン、液体ヘリウムまたは液体水素において維持される。これらの温度は細胞の長期間の保管のために最も適切であり、さらには、温度変動を最小限に抑えることができる。長期間の保管は、回復した際の細胞の生存能力を著しく失うことなく数ヶ月間、好ましくは数年間であり得る。短期間の保管（２〜３ヶ月未満の保管）もまた、所望され得、この場合、−１５０℃、−１００℃、または、−５０℃の保管温度でさえ使用することができる。ドライアイス（二酸化炭素）および市販の冷凍庫を、そのような温度を維持するために使用することができる。
【０３６２】
好適な解凍および回復は、細胞が元々の凍結された状態と実質的に同じ状態における細胞の生存および細胞の回復には不可欠である。冷凍保護された細胞材料の温度が解凍中に上がるにつれ、小さい氷の結晶はまとまり、サイズを増大させる。細胞内の大きい氷結晶は一般に、細胞の生存にとって有害である。このことが起こらないようにするために、冷凍保護された細胞材料はできる限り急速に解凍しなければならない。加熱速度は少なくとも３０℃毎分〜６０℃毎分であり得る。９０℃毎分、１４０℃毎分〜２００℃毎分またはそれ以上のより急速な加熱速度もまた使用することができる。急速加熱が所望される一方で、ほとんどの細胞は、室温を著しく超えるインキュベーション温度で生存するための能力が低い。加熱しすぎることを防止するために、細胞の温度が好ましくはモニタリングされる。任意の加熱方法を用いることができ、これには、伝導、対流、放射、電磁放射線またはそれらの組合せが含まれる。伝導による方法では、水浴に浸漬すること、ヒートブロックに入れること、または、裸火の中に直接入れることを含む。対流による方法では、ヒートガンまたはオーブンの使用を含む。放射による方法では、例えば、加熱ランプまたはオーブン（例えば、対流式オーブンまたは放射式オーブンなど）を含む。電磁放射線では、電子レンジおよび類似したデバイスの使用を含む。いくつかのデバイスはこれらの組合せによって加熱することができる。例えば、オーブンは対流および放射によって加熱する。加熱は、好ましくは、細胞および周囲の溶液が液状になると直ちに終了されるが、これは０℃を越えなければならない。冷凍保護されている細胞材料は、凍結点を低下させるナノ構造およびおそらくは他の薬剤の存在下で凍結されるので、凍結された細胞は、０℃よりも低い温度（例えば、約−１０℃、−２０℃、−３０℃または−４０℃など）で液化し得る。冷凍保護された細胞の解凍は、これらの温度のいずれでも、または、０℃を越える温度で終了することができる。
【０３６３】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の希釈、ならびに、その後のその除去は、典型的には、冷凍保護された細胞材料を解凍した後できる限り迅速に、かつ、できる限り直ちに行われる。高濃度のナノ構造または凍結保護剤が組成物に存在するならば、浸透圧による膨張を最小限に抑えながら、懸濁媒体の希釈を行うことが好ましい。従って、懸濁媒体の希釈、および、細胞材料内からのナノ構造または他の凍結保護剤の流出を、高張性媒体での希釈によって、または、段階的な希釈によって達成することができる。
【０３６４】
解凍された細胞は、細胞が正常に機能することを可能にする条件に、または、細胞材料が解凍条件の後で成長させられることになるならば、成長を促す条件に徐々に順応させることができる。凍結保護剤は、細胞毒性、細胞増殖抑制性または変異誘発性であり得、好ましくは、解凍された細胞材料から、細胞を傷つけない速度で除去される。数多くの除去方法を使用することができる（例えば、再懸濁および遠心分離、透析、連続洗浄、バイオレメディエーション、ならびに、化学物質による中和、または、電磁放射線など）。ナノ構造および他の凍結保護剤の迅速な除去は細胞のストレスおよび死を増大させ得、従って、除去工程は徐々にでなければならない。除去速度は、より少ないナノ構造または凍結保護剤を含有する溶液による連続洗浄によって制御することができる。
【０３６５】
解凍および解凍後の処理を、（上記されるような）安定剤の存在下で行い、生存を保証し、かつ、遺伝子および細胞の損傷を最小限に抑えることができる。安定剤（例えば、二価陽イオンまたはエチレン阻害剤など）は、冷凍保存から生じる損傷性作用因を減らし、排除し、または中和する。そのような損傷性作用因には、フリーラジカル、酸化剤およびエチレンが含まれる。
【０３６６】
好ましくは、細胞材料は、解凍後も生存する細胞の割合を増大させるように、完全に機能する細胞を含む。妊娠の可能性が低かった異常な精子細胞は、本発明の実施形態の凍結保護組成物の存在下では、正常な精子細胞よりも低下した凍結ストレス後の生存率を有すると予想される。従って、機能する精子細胞材料および機能しない精子細胞材料の混合物を本発明の実施形態の組成物において冷凍保護することにより、機能する細胞：機能しない細胞の比率を増大させることができ、それにより、解凍後の受精の機会を改善することができる。
【０３６７】
好ましくは、細胞材料における細胞の少なくとも１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、一層より好ましくは９０％が完全に機能し、生存能力を有する（例えば、精子細胞は運動性で、卵母細胞と受精することができなければならず、かつ、断片化したＤＮＡを含んではならない）。
【０３６８】
解凍後、細胞材料は、場合により、生存能力についてアッセイすることができ、または、移植のために直ちに使用することができる。生存能力は組織学的方法および機能的方法によって求めることができる。細胞は、例えば、形態学的指数、生体染料の排除および細胞内ｐＨを含めて、当該分野で知られている組織学的方法によってアッセイされる。
【０３６９】
好ましくは、１つ以上のインビトロアッセイを使用して、細胞材料の機能性を明らかにする。当該分野では広く知られているアッセイまたは診断検査をこれらの目的のために使用することができる。例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｂｅｌｓｏｎ編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３を参照のこと。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、クロマトグラフィーアッセイまたは酵素アッセイ、あるいは、分泌された産物について特異的なバイオアッセイを使用することができる。
【０３７０】
具体的には、細胞材料が精子を含有するならば、その状態を、波動分析、運動性アッセイおよび生存能力カウント数によって分析することができる。例えば、精液の全体的な顕微鏡分析を、波動を低倍率（例えば、１０倍）のもとで分析し、動きについてのスコアを０〜５（０は波動が全くなく、５は渦を伴う迅速な波動である）で割り当てることによって行うことができる。次に、より高倍率（例えば、４０倍）のもとで、運動性精子の数を計数し、総精子の百分率としてスコア化することができる。この百分率に後で濃度／カウント数を乗じ、視覚的に生存可能な精子の数を求める。精子の濃度は様々な手法によって求めることができる；０．９％の生理的食塩水により１：１０で希釈された精液を含有するマイクロキュベットがＳｐｅｒｍａｃｕｅ光度計でアッセイされる；または、精子の一連の希釈物（１：１０００）が作製され、血球計を用いて計数される。
【０３７１】
生存可能な精子比率の割合を、精子の展開サンプルの１５μｌの液滴をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  Ｓｔａｉｎ，Ｌａｎｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｎｖｅｒ  Ｃｏｌｏ．）の１５μｌ液滴とともに顕微鏡スライドガラスに置くことによって求めることができる。薄い塗沫標本が、これら２滴を混合した後で調製される。サンプルは空気乾燥され、その後、２００個の精子が、１００倍の油浸レンズによる顕微鏡で、生体色素による染色によって計数される。
【０３７２】
精子の完全性を、Ｓｐｅｒｍａｃ染色液を使用する精子の先体帽および尾の形態学の観察によってアッセイすることができる。別の顕微鏡スライドが、精子の１５μｌ液滴を用いて調製され、風乾され、その後、製造者の仕様に従ってＳｐｅｒｍａｃにより染色される。サンプルの全体的な性状および形態学が、先体帽を無傷または非無傷としてスコア化することによって、また、２００の個々の精子あたりの正常な尾の数を計数することによって求められる。
【０３７３】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は医薬剤のインビボ取り込みを高める。
【０３７４】
低い生物学的利用能を有する多くの医薬剤（例えば、ペプチド、タンパク質および核酸など）の開発により、そのような高分子をそれらの適切な細胞標的に送達する新しい効果的な取り組み方法を開発する必要性が生じている。特定のポリペプチド増殖因子の使用、あるいは、欠けている遺伝子もしくは欠陥遺伝子に取って代わるための、または、そのような遺伝子を補うための特定の遺伝子の使用のどちらかに基づく治療剤は、そのような新しい送達システムを必要とする治療剤の例である。遺伝子の発現を調節するためにＤＮＡと相互作用するようなオリゴヌクレオチドを伴う治療剤もまた、細胞膜を横断するインビボ取り込みを高めることができる送達システムを必要とする場合がある。そのような治療法の臨床適用は、新しい送達システムの信頼性および効率に依存するだけでなく、それらの安全性、ならびに、これらのシステムの根底にある技術が、治療配合物の大規模な医薬製造、貯蔵および頒布のために適合化され得る容易さにも依存する。
【０３７５】
ナノ粒子技術は、適用が様々な研究分野において見出されているが、ほんのわずかな適用が薬理学および薬物送達において見出されているにすぎない。ナノ粒子が、抗ガン薬物および他の薬物のキャリアとして提案されている［Ｃｏｕｖｒｅｕｒ他（１９８２）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、７１：７９０〜９２］。他の試みでは、特定の障害を処置するためのナノ粒子の使用が推し進められている［Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ他（１９９７）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．、２４：６３〜８５］。典型的には、ナノ粒子には医薬剤が負荷される。
【０３７６】
ナノ粒子は、薬物送達システムのための有用なツールとして有望であることが示されているが、多くの問題が残されている。いくつかの未解決の問題が、粒子に治療剤を負荷することに関連する。加えて、ナノ粒子が細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞によって取り込まれるので、負荷されたナノ粒子の生物学的利用能が低下する。したがって、上記の制限を有しないナノ粒子送達システムを有することが非常に好都合である。
【０３７７】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、細胞膜を通過する治療剤のインビボ浸透を高める。例えば、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、皮膚を通過する治療剤の浸透を高めることができる。加えて、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、細菌細胞内への抗生物質薬剤の取り込みを高めることができ、それにより、その生物学的利用を増大させることができる。
【０３７８】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、有効成分としての少なくとも１つの医薬剤と、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物とを含む医薬組成物が提供される。
【０３７９】
本明細書中で使用される表現「有効成分としての医薬剤」は、医薬組成物の生物学的作用を説明することができる治療薬剤、化粧薬剤または診断薬剤を示す。
【０３８０】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、有効成分の１つまたは複数と、富化されたナノ構造組成物との調製物を示す（これらはともに本明細書中に記載される）。
【０３８１】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、医薬剤のインビボ取り込みを高めるために配合される。理論にとらわれることはないが、ナノ構造間の遠距離相互作用が本発明の実施形態の医薬組成物の独特な特徴に役立っていることが考えられる。１つのそのような特徴が、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が疎水性であり、したがって、細胞膜を通過する活性な薬剤の浸透を高めることができることである。例えば、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、細胞内へのヌクレオチド取り込み、細菌細胞内へのファージ取り込みおよび／または抗生物質取り込みを高めることができる。
【０３８２】
したがって、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、何らかの生物学的バリア（例えば、細胞膜、オルガネラ膜、血液関門または組織など）を通過する浸透を高めるために配合することができる。例えば、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、皮膚に浸透するために配合することができる。
【０３８３】
上記においてさらに詳述されるように、本発明の実施形態の医薬剤は、治療剤、化粧剤または診断剤であり得る。
【０３８４】
治療剤の構造的種類の例には、無機化合物または有機化合物；小さい分子（すなわち、１０００ダルトン未満）または大きい分子（すなわち、１０００ダルトンを越える）；生体分子（例えば、タンパク質性分子、これには、タンパク質（例えば、酵素またはホルモン）、ペプチド、ポリペプチド、翻訳後修飾タンパク質、抗体などが含まれる）、または、核酸分子（例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、または、三重らせん核酸分子）、または化学物質が含まれるが、これらに限定されない。治療剤は、任意の知られている生物（動物、植物、細菌、真菌、原生生物またはウイルスが含まれるが、これらに限定されない）に由来する細胞性薬剤であり得るか、または、合成分子のライブラリーに由来する。ウイルスの治療的細胞性薬剤の一例がバクテリオファージである。本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は細菌内への増大したバクテリオファージの取り込みを可能にした。
【０３８５】
脳の状態の処置において特に有用でありうる治療剤の例として、抗生物剤、抗新生物剤、抗炎症剤、駆虫剤、抗真菌剤、抗ミコバクテリア剤、抗ウイルス剤、抗凝固剤、放射線治療剤、化学療法剤、細胞毒性剤、血管拡張剤、抗酸化剤、蘇生剤、抗痙攣剤、抗ヒスタミン剤、神経栄養剤、精神療法剤、抗不安鎮静剤、刺激剤、鎮静剤、鎮痛剤、麻酔剤、受胎調節剤、神経伝達物質薬剤、神経伝達物質アナログ、除去剤および受胎能強化剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８６】
本発明に従って使用されうる神経伝達物質薬剤の例として、アセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン、セロトニン、ヒスタミン、エピネフリン、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グリシン、グルタミン酸、アデノシン、イノシンおよびアスパラギン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８７】
神経伝達物質アナログ薬剤には、神経伝達物質のアゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。本発明において使用することができる神経伝達物質アゴニストの例として、アルモトリプタン、アニラセタム、アトモキセチン、ベンセラジド、ブロモクリプチン、ブプロピオン、カベルゴリン、シタロプラム、クロミプラミン、デシプラミン、ジアゼパム、ジヒドロエルゴタミン、ドキセピン、デュロキセチン、エレトリプタン、エスシタロプラム、フルボキサミン、ガバペンチン、イミプラミン、モクロベミド、ナラトリプタン、ネファゾドン、ネフィラセタムアカンプロサート、ニセルゴリン、ノルトリプチリン、パロキセチン、ペルゴリド、プラミペキソール、リザトリプタン、ロピニロール、セルトラリン、シブトラミン、スマトリプタン、チアガビン、トラゾドン、ベンラファキシンおよびゾルミトリプタンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８８】
本発明において使用することができる神経伝達物質アンタゴニスト薬剤の例として、６−ヒドロキシドーパミン、フェントラミン、ラウオルフィアアルカロイド、エチクロプリド、スルピリド、アトロピン、プロマジン、スコポタミン、ガラニン、クロルフェニラミン、シプロヘプタジン、ジフェニルヒドラミン、メチルセルギド、オランザピン、シタロプラム、フルオキシチン、フルオキサミン、ケタンセリン、オリダンゼトロン、ｐ−クロロフェニルアラニン、パロキセチン、セルトラリン、およびベンラファキシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８９】
本発明の実施形態において特に有用なものは、身体において特異的な作用を有するが、通常の条件のもとでは細胞膜または血液関門を良好に浸透しない治療剤（例えば、ペプチド（例えば、ニューロペプチド）など）である。加えて、細菌（例えば、グラム陰性細菌）は、その細胞膜をより透過性にしないことによって抗生物質（例えば、アミノグリコシド系、β−ラクタム系およびキノロン系など）に対する抵抗性を構築することがある。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を加えることは、これらの細菌の中へのインビボ取り込みを増大させることができ、それにより、抗生物質治療剤の有効性を高めることができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が特に有用であり得る別の一例が、高血圧、心不全およびアテローム性動脈硬化を処置するためのキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡなど）と一緒の場合である。キレート化剤は、カルシウムを動脈斑から除くことにかかわる。しかしながら、動脈の細胞膜はキレート化剤に対して比較的不浸透性である。従って、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物をキレート化剤と一緒に配合することによって、それらの生物学的利用能が大きく高められると考えられる。
【０３９０】
本明細書中で使用される用語「ニューロペプチド」は、ペプチドホルモン、ペプチド増殖因子および他のペプチドを含む。本発明に従って使用されることができるニューロペプチドの例としては、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ソマトスタチン成長ホルモン放出阻害ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、ニューロキニンα（サブスタンスＫ）、ニューロキニンβ、ニューロペプチドＫ、サブスタンスＰ、β−エンドルフィン、ダイノルフィン、Ｍｅｔ−エンケファリン、ｌｅｕ−エンケファリン、ニューロペプチドチロシン（ＮＰＹ）、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシン−チロシン（ＰＹＹ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ペプチドヒスチジンイソロイシン（ＰＨＩ）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、血管作用性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）（α型およびβ型）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガラニン、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）、メラノコルチン（ＡＣＴＨ、α−ＭＳＨなど）、ニューロペプチドＦＦ、ニューロテンシン、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、アグーチ遺伝子関連タンパク質（ＡＧＲＰ）、コカインおよびアンフェタミン調節転写物（ＣＡＲＴ）／ペプチド、エンドモルフィン−１、エンドモルフィン−２、５−ＨＴ−モジュリン、ヒポクレチン／オレキシン類、ノシセプチン／オルファニンＦＱ、ノシスタチン、プロラクチン放出ペプチド、セクレトニューリンおよびウロコルチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９１】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、診断剤のインビボ送達を高めるために使用することができる。本発明の実施形態に従って使用することができる診断剤の例には、Ｘ線画像化剤、蛍光画像化剤および造影剤が含まれる。Ｘ線画像化剤の例として、ＷＩＮ−８８８３（３，５−ジアセトアミド−２，４，６−トリヨード安息香酸エチル）（これはまた、ジアトラゾ酸（ｄｉａｔｒａｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）のエチルエステル（ＥＥＤＡ）としても知られている）、ＷＩＮ６７７２２、すなわち、（６−エトキシ−６−オキソヘキシル−３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾアート；２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ）酪酸エチル（ＷＩＮ１６３１８）；ジアトリゾキシ酢酸エチル（ＷＩＮ１２９０１）；２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ）プロピオン酸エチル（ＷＩＮ１６９２３）；Ｎ−エチル−２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ）アセトアミド（ＷＩＮ６５３１２）；イソプロピル−２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ）アセトアミド（ＷＩＮ１２８５５）；２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ）マロン酸ジエチル（ＷＩＮ６７７２１）；２−（３，５−ビス（アセトアミド）−２，４，６−トリヨードベンゾイルオキシ）フェニル酢酸エチル（ＷＩＮ６７５８５）；プロパン二酸，［［３，５−ビス（アセチルアミノ）−２，４，５−トリヨードベンゾイル］オキシ］ビス（１−メチル）エステル（ＷＩＮ６８１６５）；および、安息香酸，３，５−ビス（アセチルアミノ）−２，４，６−トリヨード−４−（３−エトキシ−２−ブテン酸エチル）エステル（ＷＩＮ６８２０９）が挙げられる。他の造影剤には、磁気共鳴画像化補助剤、例えば、ガドリニウムキレートまたは他の常磁性造影剤などが含まれるが、これらに限定されない。そのような化合物の例には、ガドペンテタートジメグルミン（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標））およびガドテリドール（Ｐｒｏｈａｎｃｅ（登録商標））がある。米国特許出願公開第２００１０００１２７９号は、超音波造影剤として使用することができる微小泡を含むリポソームを記載する。従って、診断用造影剤はまた、脳の超音波画像化を助けるために本発明と共同して使用することができる。
【０３９２】
標識された抗体もまた、本発明の種々の例示的実施形態に従った診断剤として使用することができる。標識された抗体の使用は、特定のタンパク質（例えば、β−アミロイドタンパク質）の存在が疾患を示す場合、アルツハイマー病などの疾患を診断するために特に重要である。
【０３９３】
治療剤および診断剤の種類の記載、ならびに、それぞれの種類に含まれる種の列挙が、Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ、Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（第２９版、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８９）（これは本明細書により参考として組み込まれ、本明細書の一部を構成する）に見出され得る。そのような治療剤および診断剤は市販されており、および／または、この分野で知られている技術によって調製することができる。
【０３９４】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物はまた、化粧剤の浸透を高めるために使用される。本発明の化粧剤は、例えば、しわ取り剤、ニキビ防止剤、ビタミン剤、表皮剥離剤、毛包刺激剤または毛包抑制剤が可能である。化粧剤の例として、レチノイン酸およびその誘導体、サリチル酸およびその誘導体、イオウを含有するＤ型およびＬ型のアミノ酸ならびにそれらの誘導体および塩（特に、Ｎ−アセチル誘導体）、α−ヒドロキシ酸（例えば、グリコール酸および乳酸など）、フィチン酸、リポ酸、コラーゲン、また、この分野で知られている多くの他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９５】
本発明の実施形態の医薬剤は、任意の病状または状態を処置または診断するために選択することができる。本発明の実施形態の医薬組成物は、物理的バリアによって保護されるそのような組織に対して特に好都合であり得る。例えば、皮膚は表皮の外側の層によって保護される。これは、脂質ドメインによって隔てられる緻密な角化した細胞残存物の複雑な構造体（タンパク質に基づく強靱な構造体）である。口または胃の粘膜と比較した場合、角質層は、身体に対して外部または内部のいずれかであっても、分子に対する透過性がはるかに小さい。
【０３９６】
本発明の実施形態の医薬組成物によって処置または診断することができる皮膚病変の例として、ざ瘡、乾癬、白斑、ケロイド、火傷、瘢痕、しわ、乾燥症、魚鱗癬、角化症、角皮症、皮膚炎、かゆみ症、湿疹、皮膚ガン、痔および皮膚肥厚が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９７】
本発明の実施形態の医薬剤は、血液関門によって保護される組織（例えば、脳）を処置するために選択することができる。本発明の実施形態の薬剤によって処置または診断することができる脳の状態の例として、脳腫瘍、神経障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、外傷性神経傷害、多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、髄鞘発育不全疾患、ミトコンドリア疾患、片頭痛障害、細菌感染、真菌感染、卒中、老化、認知症、統合失調症、うつ病、躁うつ病、不安、恐慌性障害、対人恐怖症、睡眠障害、注意欠陥、行為障害、多動性、人格障害、薬物乱用、不妊症および頭部傷害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９８】
本発明の実施形態の医薬組成物はまた、個体に対する化合物の投与を改善する他の生理学的に許容され得る担体（すなわち、上記の富化されたナノ構造組成物に加えて）および賦形剤を含むことができる。
【０３９９】
以降、交換可能に使用されうる表現「医薬的に許容され得る担体」および表現「生理学的に許容され得る担体」は、生物に対する著しい刺激を生じさせず、投与された化合物の生物学的な活性および性質を阻害しない担体または希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に含まれる。
【０４００】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０４０１】
薬物の配合および投与のための様々な技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出され得る（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０４０２】
本発明の実施形態の医薬組成物は、種々の投与経路を使用して個体（例えば、ヒトのような哺乳動物）に投与されることができる。投与経路の例は、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。
【０４０３】
あるいは、例えば、患者の身体の特定部位に直接的に調製物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に調製物を投与しうる。
【０４０４】
本発明の実施形態の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。ナノ構造および液体の製造は、本明細書中の上に記載される。
【０４０５】
本発明の実施形態に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む他の生理学的に許容され得る担体の存在下または非存在下で本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を使用して従来の様式で配合することできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０４０６】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０４０７】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物を本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物と組み合わせることによって容易に配合され得る。富化されたナノ構造組成物は、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０４０８】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０４０９】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０４１０】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０４１１】
鼻吸入による投与の場合、本発明の実施形態による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０４１２】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、また、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０４１３】
非経口投与の場合、有効成分は、他の溶媒の存在下または非存在下で本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物と組合せられることができる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０４１４】
本発明の実施形態の医薬組成物は、局所投与のために配合されることができる。局所配合物の例には、クリーム、軟膏、ペースト、ローション、乳状物、懸濁物、エアロゾル、スプレー、フォームおよび漿液が含まれるが、これらに限定されない。
【０４１５】
あるいは、有効成分は、使用前に本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物と共に構成するために粉末形態であってもよい。
【０４１６】
本発明の実施形態の医薬組成物はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０４１７】
本発明の実施形態の文脈で使用される好適な医薬組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、処置されている対象の疾患の症状（例えば、虚血）を予防または緩和または改善するために効果的であるか、あるいは、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（核酸構築物）の量を意味する。
【０４１８】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０４１９】
本発明の実施形態の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量は、最初はインビトロでのアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は所望の濃度または滴定量を得るために動物モデルにおいて配合することが可能である。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０４２０】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、インビトロ、細胞培養、および実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらのインビトロでのアッセイおよび細胞培養アッセイ、および動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用される投薬量範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１章、１頁を参照のこと）。
【０４２１】
投薬量および投薬間隔は、生物学的効果を誘導または抑制するために十分な、有効成分の血漿レベルまたは脳レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）をもたらすために個々に調節することができる。ＭＥＣは、それぞれの調製物について変化するが、場合により、インビトロのデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個体の特性および投与経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿中濃度を測定することができる。
【０４２２】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、服用は、数日から数週間まで続く処置の経過とともに、あるいは、治癒が達成されるか、または、疾患状態の縮小が達成されるまで、単回投与または複数回の投与が可能である。
【０４２３】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦しみの重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０４２４】
本発明の実施形態はさらに、細胞成長および細胞融合の両方を高めることができる新規な組成物を含む。具体的には、本発明は、モノクローナル抗体製造を高めるために使用することができる。
【０４２５】
ヒトモノクローナル抗体の製造では、骨髄起源のパートナー細胞株との融合によるヒトＢリンパ球の不死化が要求される。しかしながら、モノクローナル抗体製造のために利用可能である唯一のヒトＢ細胞が、末梢血において循環するＢ細胞であるので、モノクローナル抗体製造のための細胞の供給源は限定される。
【０４２６】
加えて、分泌されたモノクローナル抗体の量が典型的には高くないので、高レベルの単離されたモノクローナル抗体をハイブリドーマ細胞培養から製造することが困難であることが判明している。
【０４２７】
モノクローナル抗体製造の理論的結果と、実際の結果との橋渡しのためには、融合プロセスの効率は、末梢血から得られるＢ細胞の少なさを克服し、したがって、Ｂ細胞の不死化の可能性をより高くするために、非常に高いことが必要である。加えて、方法では、ハイブリドーマの安定性およびハイブリドーマからのモノクローナル抗体の分泌の両方を高めようと努めることが必要である。
【０４２８】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は細胞融合および細胞安定性の両方を促進させる。
【０４２９】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、融合パートナー（ＭＦＰ−２）細胞との融合を促進させ、また、それらから得られるハイブリドーマの安定性をも促進させる。本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物はハイブリドーマからの抗体分泌を増大させる。したがって、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物はモノクローナル抗体の単離および製造を助けることができる。
【０４３０】
本発明の実施形態は、モノクローナル抗体製造を促進させるだけでなく、他の真核生物細胞との間での融合を高める新規な組成物を提供するために、同様にまた、一般には細胞の成長を高めるために、具体的には間葉系幹細胞の成長を高めるために、この発見を利用する。
【０４３１】
したがって、本発明の実施形態の１つの局面によれば、細胞を、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含む培地において融合し、それにより、細胞融合を実施することを含む、細胞融合の方法が提供される。
【０４３２】
本明細書中で使用される表現「細胞融合」は、２つ以上の生細胞を（エクスビボまたはインビボのどちらかで）合体させることを示す。
【０４３３】
細胞融合を、細胞を融合性条件のもとで一緒にする任意の方法によって達成することができる。例えば、細胞を融合刺激物の存在下で融合することができ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはセンダイウイルスなどの存在下で融合することができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。また、細胞を適切な電気的条件のもとで融合することができる。
【０４３４】
理論にとらわれることはないが、ナノ構造間の遠距離相互作用が、富化されたナノ構造組成物の独特の特徴に役立っていることが考えられる。１つのそのような特徴が、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、２つの細胞タイプの間における融合プロセスを高めることができることである。
【０４３５】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は細胞融合のプロセスを助けることができる。細胞の例には、初代細胞および不死化細胞、同一細胞および非同一細胞、ヒト細胞および非ヒト細胞が含まれる。
【０４３６】
表現「不死化（された）細胞」は、数世代にわたって、または、無限に細胞培養において継代培養することができる細胞または細胞株を示す。不死化細胞の一例が腫瘍細胞である。
【０４３７】
したがって、例えば、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、ハイブリドーマを作製するための、腫瘍細胞と、抗体産生細胞（例えば、Ｂリンパ球）との間でのエクスビボ融合を助けるために使用することができる。
【０４３８】
本明細書中で使用される用語「ハイブリドーマ」は、２つの細胞、すなわち、免疫系由来の分泌細胞（例えば、Ｂ細胞）および不死性細胞（例えば、ミエローマなど）を１つのメンブランの中で融合することによって作り出される細胞を示す。得られるハイブリッド細胞はクローン化することができ、これにより、同一の娘細胞を作製することができる。これらの娘クローンのそれぞれが免疫細胞の細胞生成物を数世代にわたって分泌することができる。
【０４３９】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｂリンパ球はヒトのＢリンパ球である。本発明のいくつかの実施形態において、Ｂリンパ球は、末梢血において循環するリンパ球であり、例えば、ＰＭＢＣである。
【０４４０】
ハイブリドーマを本発明の実施形態に従って作製するために使用することができる腫瘍細胞の例には、マウスのミエローマ細胞およびミエローマ細胞株、ラットのミエローマ細胞株、および、ヒトのミエローマ細胞株が含まれる。
【０４４１】
好ましくは、ミエローマ細胞株はマーカーを含み、したがって、選抜手法を確立することができる。例えば、ミエローマ細胞株はＨＧＰＲＴ陰性（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ陰性）である場合がある。その具体的な例には、Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−Ａｇ４／１（ＮＳ−１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．ＵＩ（Ｐ３ＵＩ）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ．ＢＵ．１（これらはマウスに由来する）、２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）（これはラットに由来する）、ならびに、Ｕ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）およびＭＦＰ−２（これらはヒトに由来する）が含まれる。
【０４４２】
本発明の実施形態によれば、腫瘍細胞および／またはＢリンパ球が、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含む培地（例えば、培養培地）においてインキュベーションされる。
【０４４３】
本明細書中で使用される表現「培養培地」は、真核生物細胞が少なくとも１２時間にわたって生存性を保ち続けること、好ましくは、複製するために生存性を保ち続けることを可能にする培地を示す。
【０４４４】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物におけるインキュベーションを、ハイブリドーマの数を増大させるために、融合手順の前から、融合手順の期間中および／または融合手順の後まで行うことができる。融合プロセスに先立つ本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物におけるインキュベーションを、ハイブリドーマの生成を高めるように任意の長さの時間にわたって行うことができる。好ましくは、インキュベーションは１日を超える。
【０４４５】
培養用培地の液体部分は、本明細書中下記においてさらに記載されるように、全体または一部を、本発明の組成物の富化されたナノ構造組成物に交換することができる。
【０４４６】
培養培地は、本発明のいくつかの実施形態によれば、典型的には、経験に基づいて選択される。これは、それぞれの細胞が特定の様式で異なる培養培地に応答するからである。培養培地の様々な例が本明細書中下記においてさらに記載される。
【０４４７】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、他の細胞（例えば、腫瘍細胞および樹状細胞など）の間でのエクスビボ融合を助けるために使用することができる。そのような融合された細胞は抗ガンワクチンとして効果的であり得ることが示されている［Ｚｈａｎｇ  Ｋ他、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２００６（Ｊｕｎ  ７）；１２（２１）：３４３８〜４１］。
【０４４８】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、体細胞と、幹細胞との間でのインビボ融合を助けるために使用することができる。その強力な増殖能力および再生能力のために、幹細胞を、骨髄における損傷を修復するために、また、様々な器官（例えば、肝臓、脳および心臓など）を分化させるために使用することができる。幹細胞の修復特性の一部が、幹細胞が修復している器官に元々存在する細胞と融合するその能力に由来することが示されている［Ｗａｎｇ他、２００３、Ｎａｔｕｒｅ、４２２、８９７〜９０１］。それに従えば、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、幹細胞と、体細胞（例えば、骨細胞および筋細胞など）との間での融合を高めるために使用することができる。したがって、幹細胞を本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物により処理し、その結果、幹細胞が、標的部位に対して、より迅速に、また、より効果的に融合し、それにより、幹細胞修復プロセスを行わせるようにすることができる。
【０４４９】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物はまた、核酸を、細胞融合を介してインビボ移入するために使用することができる。例えば、Ｈｏｐｐｅ  ＵＣ、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．、１９９９（Ａｐｒ  ３０）；８４（８）：９６４〜７２を参照のこと。
【０４５０】
本発明の実施形態の組成物が役立ち得る別のエクスビボ融合プロセスが、胚性幹細胞と、ヒト細胞と間での融合である。そのような融合は、胚性幹細胞と類似する様式で挙動するハイブリッドを生じさせること、したがって、移植片のための遺伝子的に一致した幹細胞を生じさせることが示された。具体的には、ヒトの胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）がヒトの線維芽細胞と融合させられ、これにより、安定な四倍体ＤＮＡ含有量を維持し、かつ、ｈＥＳ細胞に特徴的な形態学、増殖速度および抗原発現パターンを有するハイブリッド細胞が得られた［Ｃｏｗａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５（Ａｕｇ  ２６）；３０９（５７３９）：１３６９〜７３］。
【０４５１】
本発明の実施形態の組成物によって促進され得るさらに別のエクスビボ融合プロセスが、体細胞核移入である。これは、体細胞が除核卵母細胞と融合させられるプロセスである。体細胞の核が遺伝情報を提供し、一方、卵母細胞は、胚が発達するために必要である栄養分および他のエネルギー産生物質を提供する。この手法は胚性幹細胞のクローン化および作製のために使用される。
【０４５２】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、融合プロセス、融合プロセスによって作製されたハイブリドーマのクローン化、および、ハイブリドーマからの抗体の分泌を含めて、モノクローナル抗体作製の全プロセスを高めることができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下で作製されたクローン化されているハイブリドーマが、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の非存在下で作製されたクローン化されているハイブリドーマよりも安定であると予想される。
【０４５３】
したがって、本発明のいくつかの実施形態によれば、モノクローナル抗体を作製する方法が提供され、この場合、この方法は、不死化している細胞を、富化されたナノ構造組成物を含む培地において抗体産生細胞と融合してハイブリドーマを得ることを含む。
【０４５４】
本明細書中で使用される表現「モノクローナル抗体」は、免疫分子が免疫反応するいずれかの抗原に対する単一の結合親和性を含む免疫分子を示す。
【０４５５】
本発明の実施形態によれば、モノクローナル抗体が、不死化している細胞を、本明細書中上記で記載されるような本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物においてハイブリドーマを作製するために抗体産生細胞と融合することによって作製される。その後、作製されたハイブリドーマはクローン化することができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、クローン化が、単一のハイブリドーマを、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含む培地においてインキュベーションすることによって行われる。
【０４５６】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下で作製されたクローン化されているハイブリドーマは、その非存在下で作製されたクローン化されているハイブリドーマよりも安定であるので、クローン化手法は典型的には、安定化因子（例えば、ＨＣＦなど）の添加を必要としない。
【０４５７】
ハイブリドーマの作製、および、必要な場合に行われるそのクローン化の後で、モノクローナル抗体をスクリーニングすることができ、様々なモノクローナル抗体を集めることができる。多くのスクリーニング方法がこの技術分野では知られており、これらには、機能的アッセイおよび構造的アッセイが含まれる。ハイブリドーマをスクリーニングするための１つの例示的な方法が、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用する本明細書中下記の実施例２において記載される。
【０４５８】
モノクローナル抗体を集めるための技術もまた、この技術分野では広く知られており、そのような技術には、典型的には、標準的なタンパク質精製方法が含まれる。
【０４５９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、包装材に包装され、本明細書中に記載されるような、モノクローナル抗体の作製における使用のために包装材の中または表面において印刷で特定される、本明細書中上記で記載されるような本発明の実施形態の組成物を含む製造物が提供される。
【０４６０】
本発明の実施形態の組成物は、真核生物細胞物（例えば、本明細書中上記で記載されるハイブリドーマなど）の安定化を高めることができるので、本発明者らは、本発明の実施形態の組成物が、他の真核生物細胞物の安定化を高めるために利用され得ることを認識している。
【０４６１】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、真核生物細胞を培養する方法が提供される。この方法は、細胞を、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含む培地においてインキュベーションすることを含む。
【０４６２】
理論にとらわれることはないが、本発明者らは、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が、いくつかの理由で、培養培地における使用のために特に適していると考える。
【０４６３】
第１に、本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、それにおいて培養される細胞の増殖速度を増大させることができる。
【０４６４】
第２に、本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は薬剤の溶解度を高める。このことは、培養培地に添加される必要がある水不溶性薬剤の溶解度を高めることについては特に関連する場合がある。
【０４６５】
第３に、本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、高まった緩衝能を含み、すなわち、水よりも大きい緩衝能を含む。このことは、特にｐＨ感受性である細胞については関連する場合がある。
【０４６６】
第４に、本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は、タンパク質を安定化することができる。このことは、安定でないペプチド薬剤が培養培地に添加される必要があるならば、または、細胞から分泌されるペプチド薬剤を安定化することについては特に関連する場合がある。
【０４６７】
本発明の実施形態によれば、細胞が、任意の目的のために、例えば、成長、維持および／またはクローン化など（これらに限定されない）のために培養され得ることを理解しなければならない。加えて、インキュベーション時間は決して制限されず、また、要求される限り、細胞が本発明の実施形態の組成物において培養され得ることを理解しなければならない。
【０４６８】
本発明の実施形態の組成物は、低い濃度で典型的には存在する因子のオートクリン分泌を必要とする細胞を培養するために特に有用であり得る。例えば、間葉系幹細胞は、増殖を高めるＤＫＫ１を分泌することが示された。本発明の実施形態の組成物の整列した構造は、ＤＫＫ１の濃度を効果的に増大させ、それにより、その増殖を高めるために役立ち得る。
【０４６９】
本発明の実施形態の組成物はまた、非安定である傾向を有する細胞を培養するために特に有用であり得る。そのような細胞の例には、ハイブリドーマ、凍結後に再培養されている細胞、および、低い濃度で存在する細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０４７０】
本発明者らは、いずれかの真核生物細胞培養培地の水分含有量のすべてまたは一部を本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物で交換することを意図する。培地の水分含有量の除去を、凍結乾燥、風乾およびオーブン乾燥などの技術を使用して行うことができる。したがって、培養用培地の液体部分は５％（より好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは４０％、より好ましくは６０％、より好ましくは８０％、一層より好ましくは１００％）の本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含むことができる。
【０４７１】
多くの培地がまた、乾燥された成分として市販されている。そのようなものとして、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、培地の水成分を除くことを事前に必要とすることなく加えることができる。
【０４７２】
真核生物細胞培養培地の例には、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ａｍｅｓ  Ｍｅｄｉａ、ＣＨＯ細胞培地、ＨａｍのＦ−１０培地、ＨａｍのＦ−１２培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔａ  Ｌ−１５培地、ＭｃＣｏｙ培地、ＭＥＭ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍが含まれる。そのような培地が、様々な会社から、例えば、Ｓｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどから広範囲に入手可能である。
【０４７３】
培地は、様々な他の成分、例えば、増殖因子、血清および抗生物質などを含み得ることが理解される。そのような成分が、例えば、Ｓｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。
【０４７４】
好ましくは、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、細胞を富化されたナノ構造組成物においてインキュベーションする前に（例えば、ろ過滅菌によって）滅菌される。
【０４７５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、包装材に包装され、本明細書中に記載されるように真核生物細胞を培養することのために包装材の中または表面において印刷で特定される、本明細書中上記で記載されるような本発明の実施形態の組成物を含む製造物が提供される。
【０４７６】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の実施形態の組成物は調製済みの培養培地として製造することができる。それに従えば、真核生物細胞培養培地と、本明細書中上記で記載されるような本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物とを含む細胞培養培地が提供される。
【０４７７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、セファロスポリンを、この物質を分散または溶解することを可能にする条件のもとでナノ構造および液体と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法が提供され、この場合、ナノ構造は、流体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【０４７８】
セファロスポリンは、可溶化プロセスを助けるために本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を加える前の溶媒、または、加えた後の溶媒に溶解することができる。本発明の実施形態では、この物質の溶解性をさらに増大させるために、極性、非極性、有機（例えば、エタノールまたはアセトンなど）または非有機を含む任意の溶媒の使用が意図されることが理解される。
【０４７９】
溶媒は、物質が本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に溶解／分散されたままであるように可溶化プロセスの期間中の任意のときに（完全または部分的に）除くことができる。溶媒を除く様々な方法がこの技術分野では知られている（例えば、蒸発（すなわち、加熱、または、圧力を加えることによる蒸発）、または、任意の他の方法など）。
【０４８０】
本発明の実施形態はさらに、分析物の検出を高めるために使用することができるキットおよび製造物を含む。
【０４８１】
医療産業および診断試験産業は、生体分子を検出するためのより高感度な方法を絶えず探し求めている。例えば、医学は、ウイルスを検出する非常に高感度な方法を明らかに必要としている。化学物質または他の物質を検出するためのより高感度なアッセイはまた、早期検出が、災害を阻止するための十分に早い是正措置の引き金になり得る広範囲の様々な環境分野において有用であり得る。非常に高感度な検出技術はまた、半導体製造の最適化された制御のために有用であり得る。
【０４８２】
本発明のいくつかの実施形態において、富化されたナノ構造組成物は分析物の検出を高める。本発明の様々な例示的実施形態において、富化されたナノ構造組成物はＥＣＬタンパク質検出システムの感度を増大させる。
【０４８３】
したがって、本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、包装材と、包装材に含有されている、検出可能な成分の検出を高めるために特定される組成物とを含む製造物が提供され、ただし、富化されたナノ構造組成物は、本明細書中に記載される富化されたナノ構造組成物である。
【０４８４】
理論にとらわれることはないが、ナノ構造間の遠距離相互作用は、富化されたナノ構造組成物が検出システムの感度を高めるような富化されたナノ構造組成物の独特な特徴に役立っていることが考えられる。例えば、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物はタンパク質を熱の影響から保護し、安定化することができ、および／または、高まった緩衝能を含むことができる。これらの要因の両方が検出システムにおけるタンパク質の状態に寄与することができ、これにより、検出システムの全体的な感度を高めることができる。
【０４８５】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が作用因の溶解度を高めることができることは、検出システムの高まった感度をもたらすことができる。
【０４８６】
本明細書中上記で記載される本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物はキットの一部を形成し得ることが理解される。
【０４８７】
したがって、本明細書中のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、（ｉ）検出可能な作用因、および、（ｉｉ）本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含む、分析物を検出するためのキットが提供される。
【０４８８】
本発明の実施形態のキットは、所望されるならば、本発明の実施形態のキットの１つまたは複数のユニットを含有し得るパックで提示され得る。そのようなパックには、キットを使用するための説明書が付随し得る。パックはまた、実験室補助品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められる形式で容器に関連する通知によって適用させられることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態の当局による承認を反映する。
【０４８９】
本明細書中で使用される用語「分析物」は、検出されるべき分子または化合物を示す。好適な分析物には、生体分子を含めて、様々な有機分子および無機分子が含まれる。分析物は、環境または臨床での化学物質または汚染物質または生体分子である場合があり、これらには、農薬、殺虫剤、毒素、治療用薬物および乱用薬物、ホルモン、抗生物質、有機物および溶媒が含まれるが、これらに限定されない。好適な生体分子には、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、ステロイド、細胞そのもの［原核生物細胞（例えば、病原性細菌など）および真核生物細胞（哺乳動物の腫瘍細胞を含む）を含む］、ウイルス、胞子などが含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい分析物は、タンパク質（酵素を含む）；薬物、抗体；抗原；細胞膜抗原および受容体（神経受容体、ホルモン受容体、栄養素受容体および細胞表面受容体）またはそのリガンドである。
【０４９０】
本発明の実施形態の検出キットは、液体およびナノ構造を含む液体組成物に基づく高まった感度を示す。
【０４９１】
本発明の実施形態では、液体およびナノ構造を含む組成物における検出のために、および／または、検出アッセイを行うために要求される少なくとも１つの成分を可溶化することが想定され、この場合、水成分は、少なくとも一部が、液体およびナノ構造を含む組成物に交換される。検出アッセイの液体部分は、５％、より好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは４０％、より好ましくは６０％、より好ましくは８０％、一層より好ましくは１００％の本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含むことができる。
【０４９２】
液体およびナノ構造を含む組成物を含むのと同様に、本発明の実施形態のキットはまた、検出可能な作用因を含む。
【０４９３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、検出可能な作用因は、典型的には特定の波長の放射線を放出することに基づいて直接的に検出可能である（例えば、蛍光性作用因、リン光性作用因または化学発光性作用因である）。
【０４９４】
特定の分析物を検出するために、典型的には、そのような検出可能な作用因は、標的分析物に結合する親和性認識成分を含む。親和性認識成分の例には、アビジン誘導体（例えば、アビジン、ストレプトアビジンおよびヌトラビジン）、抗体およびポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０４９５】
アビジンは、等電点が約１０．５である多カチオン性の６６０００ダルトンの糖タンパク質である。ストレプトアビジンは、ほぼ中性の等電点を有するグリコシル化されていない５２８００ダルトンのタンパク質である。ヌトラビジンはアビジンの脱グリコシル化形態である。これらのタンパク質のすべてが、ビオチンに対する非常に大きい親和性および選択性を有しており、それぞれが分子あたり４個のビオチンと結合することができる。アビジン認識成分を含む検出可能な作用因を、天然に存在するビオチン化された生体分子、または、ビオチンを含むように人為的に操作されている生体分子を検出するために使用することができる。
【０４９６】
この実施形態において使用される用語「抗体」は、特定のタンパク質またはポリペプチドに結合することができる無傷の分子、ならびに、その機能的フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなど）を包含する。
【０４９７】
本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣体の一本鎖または二本鎖のオリゴマーまたはポリマーを示す。この用語には、天然に存在する塩基、糖および共有結合のヌクレオチド間連結（例えば、骨格）から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、天然に存在するそれぞれの部分と類似して機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。標識されたポリヌクレオチドを、標識されたポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションすることができるサンプル中のポリヌクレオチドを検出するために使用することができる。
【０４９８】
本明細書中で使用される表現「ハイブリダイゼーションすることができる」は、塩基対形成することを示し、この場合、核酸作用因の少なくとも一方の鎖は少なくとも一部が、Ｈ１９  ｍＲＮＡに対して相同的である。
【０４９９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の実施形態のキットの検出可能な作用因はまた、非直接的に検出可能である。例えば、検出可能な作用因は、検出可能な生成物を生じさせることができる酵素反応のための基質である場合がある。
【０５００】
蛍光性の生成物を生じさせることができる基質は典型的には、蛍光団を含む。そのような蛍光団は、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、レゾルフィンおよびＤＤＡＯ（これらに限定されない）を含めて、多くの分子に由来することができる。
【０５０１】
蛍光性の生成物を生じさせることができる基質の例には、可溶性の蛍光性生成物を生じさせる基質（例えば、水溶性のクマリン系化合物に由来する基質、緑色〜黄色の水溶性蛍光団に由来する基質、水溶性の赤色蛍光団に由来する基質、チオール反応性の蛍光発生基質、親油性蛍光団、ペンタフルオロベンゾイル蛍光発生酵素基質）、不溶性の蛍光性生成物を生じさせる基質、励起状態のエネルギー転移に基づく基質、および、不連続な酵素アッセイのための蛍光性の誘導体化試薬が含まれるが、これらに限定されない。そのような基質に関する詳細をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのウエブサイト（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｂｅｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｓｅｃｔｉｏｎｓ／１００１．ｈｔｍｌ）において見出すことができる。
【０５０２】
蛍光性の生成物を生じさせることができる基質の具体的な例には、フルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ）、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＤＤＡＯガラクトシド、β−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−カルボキシウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＥＬＦ９７ホスファート、５−クロロメチルフルオレセインジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＭＦＤＧ）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、フルオレセインジ−β−Ｄ−グルクロニド、ＰＦＢアミノフルオレセインジグルクロニド、ＥＬＦ９７−β−Ｄ−グルクロニド、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬクロラムフェニコール基質（商標）および１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンが含まれが、これらに限定されない。
【０５０３】
化学発光性生成物を生じさせることができる基質の例には、ルシフェリン、ルミノール、イソルミノール、アクリダン、フェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、２，４，６−トリクロロフェニル−１０−メチルアクリダン−９−カルボキシラート、ピロガロール、フロログルシノールおよびレゾルシノールが含まれが、これらに限定されない。
【０５０４】
発色性生成物を生じさせることができる基質の例には、ＢＣＩＰ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ＧｌｃＵ）および５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）が含まれが、これらに限定されない。
【０５０５】
キットは、種々の検出アッセイにおいて有用でありうる。
【０５０６】
下記は、本発明の実施形態のキットを使用して行うことができる、ポリヌクレオチドを検出するためのアッセイの列挙である。
【０５０７】
ノーザンブロット分析：この方法は、ＲＮＡの混合物において特定のＲＮＡを検出することを伴う。ＲＮＡサンプルが、塩基対間の水素結合の形成を妨げ、これにより、ＲＮＡ分子のすべてが、折り畳まれていない線状の立体配座を有することを保証する作用因（例えば、ホルムアルデヒド）による処理によって変性させられる。その後、個々のＲＮＡ分子がゲル電気泳動によってサイズに従って分離され、変性したＲＮＡが付着するニトロセルロースメンブランまたはナイロン系メンブランに転写される。その後、メンブランは、標識されたＤＮＡプローブにさらされる。プローブを、酵素連結されたヌクレオチドを使用して標識することができる。検出を、比色反応または化学発光を使用して行うことができる。この方法は、特定のＲＮＡ分子の量を定量すること、および、電気泳動期間中のゲルにおける移動距離を示すメンブラン上での相対的な位置によってその同一性を明らかにすることの両方を可能にする。
【０５０８】
ＲＮＡインシトゥーハイブリダイゼーション染色：この方法では、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブが、細胞に存在するＲＮＡ分子に結合させられる。一般には、細胞が最初に、細胞構造を失わないようにするために、また、ＲＮＡ分子が分解されないようにするために顕微鏡スライドガラスに固定され、その後、標識されたプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液に供される。ハイブリダイゼーション緩衝液には、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブが、プローブの非特異的な結合を避けながら、その標的ｍＲＮＡ分子とその場において特異的にハイブリダイゼーションすることを可能にするホルムアミドおよび塩（例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム）などの試薬が含まれる。当業者は、ハイブリダイゼーション条件（すなわち、温度、塩およびホルムアミドの濃度およびその他）を特定のプローブおよび細胞タイプに対して調節することができる。ハイブリダイゼーション後、何らかの結合していないプローブが洗い流され、スライドガラスが、化学発光を伴うプローブを使用して生じさせられるシグナルを明らかにする写真乳剤、または、酵素連結の標識されたプローブを使用して生じさせられるシグナルを明らかにする比色反応のいずれかに供される。
【０５０９】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ：この方法では、本発明の実施形態のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーションすることができるオリゴヌクレオチドプローブが固体表面（例えば、ガラスウエハー）に結合させられる。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは長さがおよそ２０個〜２５個の核酸である。特定の細胞サンプル（例えば、血液細胞）における本発明の実施形態のポリヌクレオチドの発現パターンを検出するために、ＲＮＡが、この技術分野で知られている方法を使用して（例えば、ＴＲＩＺＯＬ溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、米国）を使用して）細胞サンプルから抽出される。ハイブリダイゼーションを、標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、５’−ビオチン化プローブ）、または、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）もしくは相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の標識されたフラグメントのいずれかを使用して行うことができる。簡単に記載すると、二本鎖のｃＤＮＡが、逆転写酵素（ＲＴ）（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ）、ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩを使用してＲＮＡから調製される（すべてが製造者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、米国）に従って使用される）。標識されたｃＲＮＡを調製するために、二本鎖ｃＤＮＡが、例えば、ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｆｆｙｍｅｔｉｘ  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用してビオチン化ヌクレオチドの存在下でのインビトロ転写反応に供される。効率的なハイブリダイゼーションのために、標識されたｃＲＮＡは、ＲＮＡを、４０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸塩（ｐＨ８．１）、１００ｍＭの酢酸カリウムおよび３０ｍＭの酢酸マグネシウムにおいて９４℃で３５分間インキュベーションすることによってフラグメント化することができる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイは洗浄され、ハイブリダイゼーションシグナルが、プローブアレイに結合した標識されているｃＲＮＡによって放出される蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光スキャナを使用して走査される。
【０５１０】
例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）では、アレイ上のそれぞれの遺伝子が一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによって表される。この場合、オリゴヌクレオチドプローブの各プローブ対が完全一致のオリゴヌクレオチドおよびミスマッチのオリゴヌクレオチドからなる。完全一致のプローブは、特定の遺伝子に対して正確に相補的な配列を有しており、したがって、特定の遺伝子の発現レベルの測定を可能にする一方で、ミスマッチのプローブは、中心の塩基位置での一塩基置換によって完全一致のプローブとは異なる。ハイブリダイゼーションシグナルが、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナを使用して走査され、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウエアにより、ミスマッチのプローブに由来する非特異的なシグナルが、完全一致のプローブに由来するシグナルから引かれる。
【０５１１】
下記は、本発明の実施形態のキットを使用して行うことができる、ポリペプチドを検出するためのアッセイの列挙である。
【０５１２】
ウエスタンブロット：この方法は、基質をアクリルアミドゲルによって他のタンパク質から分離すること、その後、基質をメンブラン（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）に転写することを伴う。その後、基質の存在が、基質に対して特異的な抗体によって検出され、次に、この抗体が抗体結合試薬によって検出される。抗体結合試薬は、例えば、プロテインＡまたは他の抗体であり得る。抗体結合試薬は、本明細書中上記で記載されるように放射能標識することができ、または、酵素連結することができる。検出を、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によって行うことができる。この方法は、基質の量を定量すること、および、電気泳動期間中のアクリルアミドゲルにおける移動距離を示すメンブラン上での相対的な位置によってその同一性を明らかにすることの両方を可能にする。
【０５１３】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）：この方法は、基質を基質特異的な抗体によって細胞においてその場で検出することを伴う。基質特異的な抗体が蛍光団に連結される。検出が、細胞が光ビームを通過するときにそれぞれの細胞から放出される光の波長を読み取る細胞分取装置によって行われる。この方法は２つ以上の抗体を同時に用いることができる。
【０５１４】
免疫組織化学分析：この方法は、基質を、基質特異的な抗体によって、固定処理された細胞においてその場で検出することを伴う。基質特異的な抗体は酵素に連結され得るか、または、蛍光団に連結され得る。検出が、顕微鏡、および、主観的評価または自動的評価によって行われる。酵素連結抗体が用いられるならば、比色反応が必要とされる場合がある。免疫組織化学では、多くの場合、細胞の核を、例えば、ヘマトキシリン染色またはギムザ染色を使用して対比染色することが続いて行われることが理解される。
【０５１５】
インシトゥー活性アッセイ：この方法によれば、発色性基質が、活性な酵素を含有する細胞に適用され、その酵素により、基質が分解されて、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡によって視認され得る発色性生成物を生じさせる反応が触媒される。
【０５１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、キットは、固定化されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、化学発光検出アッセイを使用して検出するために使用することができる。
【０５１７】
このアッセイでは、標的分析物が、化学発光性基質の酸化を酸化作用因の存在下で触媒することができる酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）に直接的または間接的のいずれかで結合させられる。酸化後、基質は励起状態にあり、検出可能な光波を放出する。光放出の強い強化をエンハンサーによって生じさせることができる。
【０５１８】
したがって、そのようなキットは、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物および検出可能な作用因（すなわち、化学発光性化合物、例えば、ルミノール、および、本明細書中上記で記載される化学発光性化合物など）に加えて、化学発光性基質を酸化することができる酵素を含むことができる。典型的には、酵素は、抗体またはアビジン誘導体（例えば、ストレプトアビジンなど）にコンジュゲート化される。そのような酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびカタラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０５１９】
本発明の実施形態によるキットはまた、酸化剤を含むことができる。例示的な酸化作用因には、過酸化水素、尿素過酸化水素、炭酸ナトリウム過酸化水素または過ホウ酸塩が含まれる。当業者に知られている他の酸化剤または酸化作用因を本明細書中で使用することができる。好ましい酸化剤は、過酸化水素または尿素過酸化水素のいずれか、および、それらの混合物である。
【０５２０】
上述されるように、本発明の実施形態のキットはまた、化学発光エンハンサーを含むことができる。一般に、本明細書中で使用されるエンハンサーは、有機溶媒または緩衝液に可溶性である有機化合物で、化学発光性有機化合物と、酸化剤と、酵素または他の生物学的分子との間における発光反応を強化する有機化合物を含む。好適なエンハンサーには、例えば、ハロゲン化フェノール類（例えば、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、４−ブロモ−２−クロロフェノール、３，４−ジクロロフェノールなど）、アルキル化フェノール類（例えば、４−メチルフェノールおよび４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノールなど）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオナートおよび同様な化合物、４−ベンジルフェノール、４−（２’，４’−ジニトロスチリル）フェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、ｐ−フルオロケイ皮酸、ｐ−ニトロケイ皮酸、ｐ−アミノケイ皮酸、ｍ−ヒドロキシケイ皮酸、ｏ−ヒドロキシケイ皮酸、４−フェノキシフェノール、４−（４−ヒドロキシフェノキシ）フェノール、ｐ−フェニルフェノール、２−クロロ−４−フェニルフェノール、４’−（４’−ヒドロキシフェニル）ベンゾフェノン、４−（フェニルアゾ）フェノール、４−（２’−カルボキシフェニルアゾ）フェノール、１，６−ジブロモナフト−２−オール、１−ブロモナフト−２−オール、２−ナフトール、６−ブロモナフト−２−オール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−アミノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２，６−ジヒドロキシベンゾチアゾール、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール、デヒドロルシフェリン、ホタルルシフェリン、フェノールインドフェノール、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，６−ジクロロフェノール−ｏ−クレゾール、フェノールインドアニリン、Ｎ−アルキルフェノキサジンまたは置換Ｎ−アルキルフェノキサジン、Ｎ−アルキルフェノチアジンまたは置換Ｎ−アルキルフェノチアジン、Ｎ−アルキルピリミジルフェノキサジンまたは置換Ｎ−アルキルピリミジルフェノキサジン、Ｎ−アルキルピリジルフェノキサジン、２−ヒドロキシ−９−フルオレノンまたは置換２−ヒドロキシ−９−フルオレノン、６−ヒドロキシベンゾオキサゾールまたは置換６−ヒドロキシベンゾオキサゾールが含まれる。さらに他の有用な化合物には、酵素によって切断され得る保護されたエンハンサー、例えば、ｐ−フェニルフェノールホスファートまたはｐ−ヨードフェノールホスファート、あるいは、他の酵素切断可能な基を有する他のフェノールホスファート、ならびに、ｐ−フェニレンジアミンおよびテトラメチルベンジジンなどが含まれる。他の有用なエンハンサーには、フルオレセイン、例えば、５−（ｎ−テトラデカニル）アミノフルオレセインなどが含まれる。
【０５２１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、キットは、固定化されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、蛍光または発色による検出アッセイを使用して検出するために使用することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼまたはその誘導体を含む代わりに、そのようなキットは、典型的には、アルカリホスファターゼと、蛍光性基質または発色性基質とを含む。発色性生成物を生じさせるための酸化作用因もまた、キットに含めることができる（例えば、フェリシアン化カリウムおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）など）。
【０５２２】
本発明の実施形態のキットはまた、細胞および細胞抽出物におけるいくつかの一般的なレポーター遺伝子の発現を検出するために使用することができる。したがって、キットは、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよびルシフェラーゼのための基質を含むことができる。
【０５２３】
本発明の実施形態のキットはさらに、酵素反応のための阻害剤を含むことができる。そのような阻害剤の例には、レバミゾール、Ｌ−ｐ−ブロモテトラミゾール、テトラミゾールおよび５，６−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ−［２，１−ｂ］チアゾールが含まれるが、これらに限定されない。
【０５２４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、セファロスポリンを、この物質を分散または溶解することを可能にする条件のもとでナノ構造および液体と接触させることを含む、セファロスポリンを溶解または分散する方法が提供され、この場合、ナノ構造は、液体の整列した流体分子によって包まれるナノメートルサイズのコア物質を含み、コア物質と、整列した流体分子のエンベロープとが定常的な物理的状態にある。
【０５２５】
セファロスポリンは、可溶化プロセスを助けるために本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を加える前の溶媒、または、加えた後の溶媒に溶解することができる。本発明の実施形態では、この物質の溶解性をさらに増大させるために、極性、非極性、有機（例えば、エタノールまたはアセトンなど）または非有機を含む任意の溶媒の使用が意図されることが理解される。
【０５２６】
溶媒は、物質が本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に溶解／分散されたままであるように可溶化プロセスの期間中の任意のときに（完全または部分的に）除くことができる。溶媒を除く様々な方法がこの技術分野では知られている（例えば、エバポレーション（すなわち、加熱、または、圧力を加えることによるエバポレーション）、または、任意の他の方法など）。
【０５２７】
本発明の組成物は、もし望むなら、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態を含有しうるパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供されることができる。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随しうる。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きでありうるか、または、承認された製品添付文書でありうる。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、調製され、適切な容器に入れられ、かつ上記においてさらに詳述されるように、表示される状態の処置についてラベル書きされうる。
【０５２８】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０５２９】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０５３０】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０５３１】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０５３２】
本明細書で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０５３３】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０５３４】
数値範囲が本明細書で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０５３５】
本明細書で使用される場合、用語「方法」は、与えられたタスクを達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、限定されないが、化学、薬理学、生物学、生物化学、および医学の分野の当業者に知られているかまたはその当業者が既知の様式、手段、技術および手順から容易に開発する方式、手段、技術および手順を含んでいる。
【０５３６】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０５３７】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０５３８】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０５３９】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明のいくつかの実施形態を非限定様式で例示する。
【０５４０】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａ��ｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は参照によって本明細書中に援用される。
【０５４１】
（実施例１）
炭素測定
本発明の様々な例示的実施形態に従って調製される、水、ナノ構造およびＣＯ２相を含有する二酸化炭素富化組成物を、総炭素（ＴＣ）、総有機炭素（ＴＯＣ）および無機炭素（ＩＣ）の測定に供した。類似する測定をＲＯ水について行った。すべての測定を、Ｓｉｅｖｅｒｓ  Ｃａｒｂｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して行った。
【０５４２】
表１には、ＲＯ水および本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物について、ＴＯＣ、ＩＣ、および、ＴＣ＝ＴＯＣ＋ＩＣの結果がまとめられる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、本実施例では、「ＧＥＮＣ」と略記される「ガス富化ナノ構造組成物」として交換可能に示される。
【０５４３】
2011501686.tif 000002
【０５４４】
表１は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が、ＲＯ水と比較して、より多量の炭素を含有することを明らかにする。ＲＯ水については、平均ＴＣ値が２６１．７ｐｐｂ（バイアル番号１）および２３１．３ｐｐｂ（バイアル番号２）であった。ＥＮＰＤ液体については、平均ＴＣ値が１．５１ｐｐｍ（バイアル番号３）および４１２ｐｐｂ（バイアル番号４）であった。したがって、ＧＥＮＣについての平均ＴＣ値は、ＲＯ水についての平均ＴＣ値よりも約１．５倍〜約６．５倍大きい。
【０５４５】
（実施例２）
初期炭素含有量の影響
様々なバッチの富化されたナノ構造組成物を本発明の様々な例示的実施形態に従って調製した。炭素含有量をそれぞれのバッチの製造直後に測定した。さらなる測定には、電気化学的堆積（ＥＣＤ）、ζ電位、ｐＨおよび電気伝導率が含まれた。
【０５４６】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、本実施例では、「ＧＥＮＣ」と略記される「ガス富化ナノ構造組成物」として交換可能に示される。
【０５４７】
方法
ＧＥＮＣの調製
ＧＥＮＣを、システム１４０（図４を参照のこと）を使用して調製した。固体粉末がチタン酸バリウム（ＢＴ）またはヒドロキシアパタイト（ＨＡ）であった。液体が注射用水（ＷＦＩ）規格であった。ガスがＣＯ２（少なくとも９９．９％純粋）であり、これが水またはスリーブ１４８のどちらかに直接に導入された。
【０５４８】
リザーバー１５４が、約２℃の温度にされた１０ＬのＷＦＩで満たされた。約０．４５ｇの固体粉末を、約８５０℃の温度に加熱された炉１４２に入れた。
【０５４９】
ζ電位
ζ電位を、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ（モデルＺＥＮ３６００、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を使用して測定した。
【０５５０】
電気化学的堆積
実験構成が図７に例示される。擬二次元セル２２０（直径、１２５ｍｍ）はＰｌｅｘｉｇｌａｓベース２２２およびＰｌｅｘｉｇｌａｓカバー２２４を含んでいた。カバー２２４がベース２２２の上に配置されたとき、擬二次元の空洞（高さ、約１ｍｍ）が形成された。２つの同心状の電極２２６（外側）および電極２２８（内側）がセル２２０に配置され、１２．４±０．１Ｖの電圧源２３０に接続された。外側電極２２６はリング（直径、９０ｍｍ）として形状化され、０．５ｍｍの銅線から作製された。内側電極２２８は、０．１ｍの厚さおよび２８ｍｍの直径を有する円板として形状化された。外側電極を電圧源の正極に接続し、内側電極をその負極に接続した。
【０５５１】
得られたＥＣＤパターンを０〜１０のスケールでスコア化した。典型的には、８個の整数値の数字がスコアとして使用された：０、１、３、６、７、８、９および１０。これらのスコアが図８の代表的な像で示される。０および１のスコアが「負」の結果として表され、８、９および１０を越えるスコアが「正」の結果として表された。
【０５５２】
下記のプロトコルを用いた：
（ａ）試験溶液調製
５００ｍｌのメスフラスコにおいて、０．２ＭのＺｎＳＯ４溶液を、２８．７５ｇのＺｎＳＯ４（ＭＷ＝２８７．５）をＲＯ水に計り取り、所定の体積に満たすことによって調製する。
（ｂ）システム好適性
（ｉ）ＥＣＤセルをＲＯ水により徹底的に洗浄する。
（ｉｉ）約１２ｍｌの０．２Ｍ  ＺｎＳＯ４溶液をベースの上に注ぐ。
（ｉｉｉ）内側電極をベースの中央に置く。
（ｉｖ）気泡を避けながら、カバーをベースの上部に置き、重りをカバーの上に載せる：
（ｖ）約１０分待つ。
（ｖｉ）電圧源を作動させる。
（ｖｉｉ）（ｂ）（ｉ）から（ｂ）（ｖｉ）までを、負のＥＣＤパターンが発達するまで繰り返す。
（ｃ）ＥＣＤ試験
（ｉ）負のパターンが発達すると、ＥＣＤセルをＲＯ水により洗浄する。
（ｉｉ）約１２ｍｌのＧＥＮＣをＥＣＤセルのカバーおよびベースの両方に一様に広げ、約３０分待ち、ＧＥＮＣをカバーおよびベースから排出する。
（ｉｉｉ）ＲＯ水をカバーおよびベースの上に注ぎ、５分待って、排出し、この段階を１回繰り返す。
（ｉｖ）０．２Ｍ  ＺｎＳＯ４溶液をベースの上に注ぎ、気泡を避けながら、カバーをベースの上部に置く。
（ｖ）約３０分待つ。
（ｖｉ）電圧源を作動させる。
（ｖｉｉ）発達したＥＣＤパターンを観察し、スコア化する。
【０５５３】
ｐＨ試験
ｐＨ測定を、ともにＵＳＰモノグラフに従ったエタノール性溶液でのブロモチモールブルー（ｐＨ６．０〜７．６）およびフェノールレッド（ｐＨ６．８〜８．４）を使用して行った。
【０５５４】
電気伝導率
電気伝導率指示計は、１４１３μＳ、１１１．８μＳおよび１２．８８μＳであった。測定を、校正を調べた後で行った。測定前に、ＧＥＮＣのサンプルをクラスＡのバイアルに取り、プローブを超純水により洗浄する。
【０５５５】
結果
下記の表２は、本発明の実施形態のＣＯ２富化ナノ構造組成物のいくつかのサンプルについて、ＥＣＤスコア、ｐｐｍでのＩＣ含有量、ｐＨ値、μＳでの電気伝導率、および、ζ電位を示す。表２はさらに、それぞれのサンプルの調製において使用され、富化されたナノ構造組成物のナノ構造のコアを形成する固体粉末を示す。コア物質はチタン酸バリウム（ＢＴ）およびヒドロキシアパタイト（ＨＡ）であった。
【０５５６】
一部のサンプルがすべての試験を受けなかった。そのため、これらのサンプルについてのそれぞれの項目が空白である。サンプル番号１５については、固体粉末のタイプが記録されなかった。そのため、サンプル番号１５についての「コア」項目が空白である。
【０５５７】
表２は、ｐＨ、電気伝導率およびζ電位が一般に、ＩＣ含有量とともに大きくなることを明らかにする。表２はさらに、より高いＩＣ含有量は一般に、より大きいＥＣＤスコアをもたらすことを明らかにする。
【０５５８】
図９は、電気伝導率をＩＣ含有量の関数として示すグラフである。電気伝導率がＩＣ含有量とともに大きくなることを明らかにする線形回帰直線もまた示される。
【０５５９】
2011501686.tif 000003
【０５６０】
（実施例３）
加熱の影響
本発明の様々な例示的実施形態に従って調製される、水、ナノ構造およびＣＯ２相を含有する二酸化炭素富化組成物を、組成物のＩＣ含有量に対するプレート加熱の影響を調べるように加熱試験に供した。
【０５６１】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、本実施例では、「ＧＥＮＣ」と略記される「ガス富化ナノ構造組成物」として交換可能に示される。
【０５６２】
材料および方法
本明細書中下記において１〜５の番号が付けられる５個のＧＥＮＣサンプルを上記の実施例２において記載されるように調製した。サンプル番号１およびサンプル番号４において、コア物質がＨＡであり、実験前のＩＣが約０．７ｐｐｍであった；サンプル番号２およびサンプル番号３において、コア物質がＨＡであり、実験前のＩＣが約１．５ｐｐｍであった；サンプル番号５において、コア物質がＢＴであり、実験前のＩＣが約１．９ｐｐｍのＩＣであった。超純水（ＵＰＷ）をコントロールとして使用した。
【０５６３】
各サンプルを、それぞれが５０ｍＬの２つの複製物で調製した。
【０５６４】
すべてのサンプルを、６０℃に事前に設定されたホットプレートで２時間加熱した。
【０５６５】
２時間後、すべてのサンプルをホットプレートから除いた。各サンプルの１つの複製物のＩＣ含有量を、ＴＯＣ装置のオートサンプラーモードを使用して測定した。各サンプルの第２の複製物を室温および光からの非保護において卓上で密閉して１週間貯蔵した。貯蔵されたサンプルのＩＣを、ＴＯＣ装置のオートサンプラーモードを使用して１週間後に測定した。
【０５６６】
１週間貯蔵された複製物のＩＣ結果のために、ｐＨ測定を、ＣＯ２の溶解およびイオン化を除外するために行った。
【０５６７】
結果
表３および図１０は２時間のプレート加熱の後での重量減少を示す。
【０５６８】
2011501686.tif 000004
【０５６９】
表４および図１１はプレート加熱直前およびプレート加熱後１週間でのＩＣ含有量を示す。
【０５７０】
2011501686.tif 000005
【０５７１】
表５および図１２はプレート加熱後１週間でのｐＨ値を示す。
【０５７２】
2011501686.tif 000006
【０５７３】
表３〜表５および図１０〜図１２は下記のことを明らかにする：
比較的低い初期ＩＣ含有量を有したサンプル番号１およびサンプル番号４は、コントロールサンプルの重量減少およびＩＣ含有量変化に対して同様に類似する同一の重量減少および類似したＩＣ含有量変化を有した。
【０５７４】
より高い初期ＩＣ含有量を有したサンプル番号２、サンプル番号３およびサンプル番号５は、他のサンプルおよびコントロールの重量減少とは異なった類似する重量減少を有した。
【０５７５】
プレートでの２時間の６０℃加熱の後で測定されたＩＣ含有量変化に関して、サンプル番号２を除くすべてのサンプルが、ＩＣ含有量の値における穏やかな変化の同じ挙動を有した。
【０５７６】
プレートでの２時間の６０℃加熱の後、および、室温での１週間の貯蔵の後で測定されたサンプル番号１およびサンプル番号４ならびにコントロールのＩＣ含有量変化は類似していた（０．１ｐｐｍ〜０．２ｐｐｍの増加）。
【０５７７】
室温での１週間の貯蔵の後で測定されたサンプル番号２、サンプル番号３およびサンプル番号５のＩＣ含有量変化もまた類似していた。これらのサンプルのそれぞれにおいて、ＩＣ含有量における大きな増大が、初期値および２時間の加熱の後で測定された値と比較して認められた。
【０５７８】
この実験は、より高いＩＣ含有量を有する組成物が、低いＩＣ含有量を有する組成物と比較して、より大きい重量を加熱期間中に失い、したがって、より多くの水を加熱期間中に蒸発させることを明らかにする。加熱処理後、高い初期ＩＣ含有量を有する組成物のＩＣ含有量が貯蔵後では上昇した。この上昇は、これらのサンプルのｐＨ値もまた上昇したので、大気ＣＯ２の溶解のためではなかった。このことは、本発明の実施形態の組成物が安定または準安定な気相を有することを示している。ＩＣ含有量における上昇は、１ｐｐｍを越えている初期ＩＣ含有量を有する組成物ではより顕著である。したがって、ホットプレートの技術は、本発明の実施形態の富化された組成物を濃縮および再生するための好適な方法である。
【０５７９】
（実施例４）
原型のＣＯ２再循環装置
ＣＯ２を再循環させるために使用することができる３つの原型装置が本発明の実施形態に従って製造されている。これらの装置は、本発明のいくつかの実施形態に従って調製されるＣＯ２富化ナノ構造組成物を含んでいた。装置はさらに、励起デバイスを無線周波数発生器およびアンテナの形態で含んでいた。アンテナが、上記で記載されるように、出口を有するスリーブの中に配置された。出口バルブおよび入口バルブが、上記で記載されるように、ＣＯ２の放出および捕集を制御するために使用された。これら３つの原型装置はそれらの容量において異なる。第１、第２および第３の装置についての液体チャンバー（図５における４２を参照のこと）の体積がそれぞれ、５０ｍｌ、１００ｍｌおよび２００ｍｌであった。第２の原型装置の画像が図１３に示される。
【０５８０】
これらの原型装置をＣＯ２濃度レベル試験に供した。それぞれの装置について、ＣＯ２の濃度レベルを装置の出口で３０秒間隔で測定し、記録した。試験が、出口バルブがいくつかのシナリオに従って間欠的に操作されながら行われた。操作シナリオが下記では閉／開比率で示される。Ｘ／Ｙの表記は、バルブがＸ秒間にわたって閉じられ、Ｙ秒間にわたって開けられる操作シナリオを示す。実験のすべてにおいて、励起デバイスの操作シナリオは１／１０の作動／停止比率に従った。
【０５８１】
結果が、時間の関数としてのＣＯ２濃度レベルのプロットとして図１４〜図５３に示される。図において、ＣＯ２レベルが体積比によるｐｐｍで示され、時間が分で示される。実験のすべてがｔ＝０で開始される。
【０５８２】
図１４〜図２３は第１の装置についての実験結果を示す。図１４〜図２３に示される結果は、３０／１、２０／１、１５＼１、１０＼１、５＼２、３＼２、２＼２、１＼３、１＼３および１＼４の操作シナリオにそれぞれ対応する。
【０５８３】
図２４〜図３９は第２の装置についての実験結果を示す。図２４〜図２６に示される結果は３０＼１の操作シナリオに対応する；図２７〜図２９に示される結果は２０＼１の操作シナリオに対応する；図３０〜図３１に示される結果は１５＼１の操作シナリオに対応する；図３２〜図３９に示される結果は、１２＼１、１０＼１、８＼１、５＼２、３＼２、２＼２、１＼２および１＼３の操作シナリオにそれぞれ対応する。
【０５８４】
図４０〜図５３は第３の装置についての実験結果を示す。図４０に示される結果は３０＼１の操作シナリオに対応する；図４１〜図４２に示される結果は２０＼１の操作シナリオに対応する；図４３〜図４９に示される結果は１５＼１の操作シナリオに対応する；図５０に示される結果は１０＼１の操作シナリオに対応する；図５１に示される結果は５／２の操作シナリオに対応する；図５２〜図５３に示される結果は１／３の操作シナリオに対応する。
【０５８５】
上記で示される結果は、十分に高い濃度のＣＯ２が多くの操作シナリオについて達成され得ることを明らかにする。示されるように、これらの原型装置の出口におけるＣＯ２濃度レベルは、体積比でおよそ３００ｐｐｍ未満である周囲レベルをかなり上回っている。一般に、これらの原型装置は、体積比で１０００ｐｐｍの程度である局所的濃度を生じさせる。いくつかの実験において、（体積比で１００００ｐｐｍを越える）極めて高いレベルの瞬間的バーストが観測された。
【０５８６】
（実施例５）
固体−流体のカップリング
本実施例は、取り囲む流体分子がコア物質にカップリングすることを調べるための予言的実験を記載する。極低温透過電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）、これは構造的流体システムの現代技術である。分析では、下記の工程を伴うことができる。最初の工程において、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を超急速で冷却することができ、その結果、ガラス状サンプルがもたらされた。第２の工程において、ガラス状サンプルを極低温でＴＥＭにより調べることができる。ナノ構造を取り囲む条線はその結晶性構造を示唆し得るし、暗いコロナは、ナノ構造全体が定常的な物理的状態にあるように、コアを取り囲む流体分子の整列した構造を示し得る。
【０５８７】
（実施例６）
光学活性
本実施例は、誘導された遠距離秩序の形跡を調べるための予言的実験を記載する。この目的を達成するために、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の光学活性（円偏光の光および楕円偏光の光に関して）を、円二色性（ＣＤ）法を使用して測定することができる。
【０５８８】
ＣＤ分光法は、水溶液を通過した左回り偏光および右回り偏光（ＬおよびＲ）の光の間における吸収差を検出することを目的とする。そのような差が、水に沈められた光学活性（キラル）分子から、すなわち、水または溶液における分子またはナノ粒子または何らかの他の誘導された整列構造の分布から生じ得る。測定を、室温においてＪａｓｃｏ  Ｋ８５１ＣＤ偏光計を使用して行うことができる。ＤＤＷをベースラインとして使用することができる。
【０５８９】
スペクトルを、１ｎｍおよび１０秒の増分を使用して、１９０ｎｍ〜２８０ｎｍの間で走査することができる。感度および分解能を増大させるために、非常に長い光路を、（日常的な操作様式での１ｍｍ以下と比較して）１０ｃｍの石英キュベットを使用して確保することができる。
【０５９０】
ゼロになることがないシグナルが本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のＣＤスペクトルに存在することは、それにおける遠距離の配向性秩序の形成を示し得る。そのような遠距離秩序がナノ粒子およびナノ気泡の網状構造によって形成され得る。
【０５９１】
（実施例７）
色素の影響
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物と、色素との相互作用を調べるための予言的実験を記載する。上記でさらに詳述されるように製造される富化されたナノ構造組成物を、エタノールに溶解されたＲｕ系色素（Ｎ３）により着色することができる。
【０５９２】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含有する１つのキュベットを色素溶液に２４時間さらすことができる。富化されたナノ構造組成物を含有する第２のキュベットを下記のプロトコルにさらすことができる：（ｉ）撹拌、（ｉｉ）空気流による乾燥、および、（ｉｉｉ）乾燥。純水を含有する２つのさらなるキュベットをコントロール群として上記試験に供することができる。
【０５９３】
純水の場合と対比して、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物における色素の色の変化は、電子構造を変化させることによるか、または、色素の酸化によるかのどちらかによって色素のスペクトルに影響を及ぼすナノ構造との相互作用を示し得る。
【０５９４】
（実施例８）
高ｇでの遠心分離
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物での高ｇ遠心分離に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０５９５】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含有するチューブを高ｇ値（約３０ｇ）で遠心分離することができる。その後、遠心分離後における本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の積分光散乱（ＩＬＳ）測定を行うことができる。チューブの下部部分および上部部分における異なる記録は、ナノ構造が、母液（水）の比重よりも小さい比重を有することを示し得る。
【０５９６】
（実施例９）
バクテリオファージ反応
本実施例は、バクテリオファージの型分類に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）のファージ型分類のための標準的な国際キットのバクテリオファージを調べることができる（例えば、バクテリオファージＮｏ．６およびバクテリオファージＮｏ．８３Ａ）。寒天平板用培地は、栄養寒天Ｏｘｏｉｄ  Ｎｏ２（カタログ番号ＣＭ６７、Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ．）＋ＣａＣｌ２が可能である。オートクレーブ殺菌後、２０ｍｌのＣａＣｌ２を各１リットルの培地について加えることができる。液体培養用培地は、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ  Ｎｏ２  Ｏｘｏｉｄ（２８ｇ／リットル）が可能である。
【０５９７】
それぞれのバクテリオファージを１および１００のＲＴＤ（通常検査希釈）で試験することができる。それぞれのファージを、コントロールおよび本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に基づく被試験培地において平行して増殖させることができる。溶菌表面を、表面積測定のためのコンピューター処理“Ｓｋｅｔｃｈ”ソフトウエアを使用して測定することができる。反復測定に関する分散分析（ＡＮＯＶＡ）を光学的濃度分析について使用することができ、２元配置ＡＮＯＶＡを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＰＳＳ（商標）ソフトウエアを使用して溶解表面積測定について使用することができる。
【０５９８】
コントロールと比較して、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物によるファージ反応面積における増大は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物がファージに対する影響の同一傾向を有することを明らかにし得る。
【０５９９】
ＲＴＤ試験において、コントロールと、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物との間での時間における異なる傾向は、ファージ反応に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を明らかにし得る。
【０６００】
（実施例１０）
ファージ・細菌の相互作用
本実施例は、ラムダ（λ）ファージに対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。λファージが、生物のゲノムＤＮＡを表すために分子生物学では使用される。実験は標準的なλファージ相互作用適用に依ることができる。試験群における材料を、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を溶媒として用いて調製することができる。コントロール群における材料を本明細書中下記で記載されるように調製することができる。コントロール群のｐＨを、７．２〜７．４の間であった本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のｐＨに調節することができる。
【０６０１】
１）ＬＢ培地
１０ｇのＢａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌを１０００ｍｌの蒸留水に溶解し、その後、オートクレーブによって殺菌することができる（１２１℃、１．５ａｔｍ、４５分間）。
【０６０２】
２）ＬＢ平板
１５ｇのＢａｃｔｏ寒天を１０００ｍｌのＬＢ培地に加え、混合し、上記で記載されるようにオートクレーブ処理することができる。５０℃に冷えた後、培地を無菌のプラスチックプレートに注ぐことができる。平板は使用前に２日間プレインキュベーションすることができる。
【０６０３】
３）上層アガロース  ０．７％
１００ｍｌのＬＢ培地を０．７ｇの化学的純粋な電気泳動規格アガロース（Ｄｉｆｃｏまたは他の供給者から得られる）と混合し、その後、オートクレーブによって殺菌することができる（１２１℃、１．５ａｔｍ、４５分間）。
【０６０４】
４）ＭｇＳＯ４−１０ｍＭ
１．２ｇのＭｇＳＯ４を１０００ｍｌの蒸留水に溶解し、オートクレーブ処理によって殺菌することができる。
【０６０５】
５）マルトース  ２０％（ｗ／ｗ）
２００ｇのマルトースを１０００ｍｌの蒸留水に溶解し、２０μｍのフィルターによるろ過によって滅菌することができる。
【０６０６】
６）ＭｇＳＯ４−１Ｍ
１２０．３７ｇのＭｇＳＯ４を１０００ｍｌの蒸留水に溶解し、オートクレーブ処理によって殺菌することができる。
【０６０７】
７）１０ｍＭのＭｇＳＯ４および０．２％のマルトースを伴うＬＢ
１００μｌのＭａＳＯ４（１Ｍ）および１００μｌのマルトース（２０％）を９９．８ｍｌのＬＢ培地に加えることができる。
【０６０８】
８）ＳＭ緩衝液（ファージ貯蔵緩衝液）
５．８ｇのＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ４、５０ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍｌの２％（ｗ／ｗ）ゼラチンを蒸留水に溶解し、１０００ｍｌの最終体積にし、その後、オートクレーブ処理によって殺菌することができる。
【０６０９】
９）細菌株（宿主）
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
【０６１０】
１０）ファージ：
λＧＥＭ１１（Ｐｒｏｍｅｇａ）
【０６１１】
１１）ＬＢ平板での細菌培養
ＸＬ１細胞を細菌接種の一般的な手順に従って細菌学ループによりＬＢ平板に分散させることができる。平板を３７℃で１６時間インキュベーションすることができる。
【０６１２】
１２）ＬＢ液体培地における細菌培養
１つの単一コロニーのＸＬ１細胞をＬＢ平板から選ぶことができ、ＬＢ液体培地に接種し、その後、２００ｒｐｍでの振とうとともに３７℃で１６時間（一晩）インキュベーションすることができる。
【０６１３】
１３）ファージによる宿主細菌株の感染
ＸＬ１細胞を、１０ｍＭのＭｇＳＯ４および０．２％のマルトースが補充されたＬＢ培地に接種することができる。２００ｒｐｍでの振とうを伴う３７℃でのインキュベーションを、６００ｎｍの波長における０．６の濁度が達成されるまで続けることができる（４時間〜５時間が推定される）。成長させた培養物を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することができる。上清は捨てることができ、細菌を、６００ｎｍの波長における０．６の濁度が達成されるまで１０ｍＭのＭｇＳＯ４に再懸濁することができる。ファージを含有するＳＭ緩衝液の必要体積量を２００ｍｌの再懸濁された細菌に加えることができる。３７℃での１５分間のインキュベーションの後、２つの代替手順を行うことができる：
（ｉ）溶解物調製のために、適量のＬＢ培地を宿主−ファージ混合物に加え、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間（一晩）インキュベーションすることができる。
（ｉｉ）固体培地におけるファージ出現（プラーク）のために、融解された上層アガロース（５０℃）を宿主−ファージ混合物に注ぎ、素早く混合し、事前に加温されたＬＢ平板に広げることができる。アガロース固化後、インキュベーションを３７℃で１６時間（一晩）行うことができる。
【０６１４】
１４）ファージＤＮＡの抽出
細菌溶解物を、細菌破片を沈降させるために６０００ｒｐｍで５分間〜１０分間遠心分離することができる。上清を集め、ファージ粒子を沈降させるために１４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することができる。上清は捨てることができ、ファージペレットを、ゼラチンを含まないＳＭ緩衝液に再懸濁した。ヌクレアーゼ（任意の供給者から得られるＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ）の混合物を、ファージ懸濁物の１μｌあたり５Ｗｅｉｓｓユニット〜１０Ｗｅｉｓｓユニットの最終的濃度のために、再懸濁されたファージに加えることができる。３７℃での３０分間のインキュベーションの後、ファージのＤＮＡを下記の手順によって抽出することができる：
（ｉ）フェノール：クロロホルム：ｉｓｏ−アミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）による抽出；
（ｉｉ）クロロホルムによるフェノール混入の除去；
（ｉｉｉ）０．３Ｍ酢酸カリウムおよび１体積のイソプロパノールの最終的濃度への沈殿化；
（ｉｖ）７０％エタノールによる洗浄；および
（ｖ）乾燥、および、さらなる分析のための蒸留水での再懸濁。
【０６１５】
コントロールと比較して、低いファージ希釈（１０−３および１０−４）でのＰＦＵにおける増大は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が、その宿主に感染するファージの能力に影響を及ぼすこと、および、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が、細菌受容体と、ファージ粒子との間における親和性を増大させることを示し得る。
【０６１６】
（実施例１１）
マイクロタイタープレートへの付着
本実施例は、マイクロタイタープレートへのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の付着に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０６１７】
粘液多糖の産生はバイオフィルムの生成および維持にとって非常に重要であり、細菌における毒性因子としての大きな部分を果たす［Ｇｏｔｚ  Ｆ．、「ブドウ球菌およびバイオフィルム」、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００２、４３（６）：１３６７〜７８］。粘液は、多層化したクラスターを形成するために、表面への細菌の付着およびそれらの蓄積を容易にする。粘液はまた、宿主の免疫防御および抗生物質処置から保護する［Ｋｏｌａｒｉ  Ｍ．他、「抄紙機バイオフィルムにおける有色中程度好熱性細菌」、これは、Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００３に載る予定である］。細菌によって産生されるバイオフィルムは、産業界でもまた問題を引き起こし得る。
【０６１８】
粘液を防止するための現在の考えのほとんどが、バイオフィルムにおいて活性な新しい感染防止剤、および、バイオフィルムを困難にする新しい生体適合性材料の探索に関連する。
【０６１９】
シリコーンへのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の付着がＭＩＣ未満の抗菌剤によって緩和され得ることが明らかにされている［Ｂｅｓｎｉｅｒ  ＪＭ他、「シリコーンへの付着およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の疎水性に対する抗菌剤の亜阻害的濃度の影響」、Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ、１９９６、１（４）：２４４〜２４８］。この影響は粘液産生菌株および粘液非産生菌株において異なっており、これらの抗菌剤の阻害作用の機構、または、疎水性に関与しないいくつかの表面成分がインビトロ付着において役割を果たし得ることを示唆する疎水性の緩和と相関しなかった。
【０６２０】
表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、すなわち、インプラントに関連づけられる感染症の重大な病原菌の、抗菌剤に対する細菌抵抗性が、抗生物質の接近を妨げるグリコカリックス粘液の産生、および、宿主防御機構による殺傷に関連づけられる［Ｋｏｎｉｇ  ＤＰ他、「４つの異なる骨セメントにおける表皮ブドウ球菌ＲＰ６２Ａおよび表皮ブドウ球菌Ｍ７のインビトロ付着および蓄積」、Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋｓ  Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ、２００１、３８６（５）：３２８〜３２］。生体材料関連感染症の防止のために開発された、抗生物質を含有する種々の骨セメントのインビトロ研究では、生体材料付着性細菌の完全な根絶を必ずしも常に明らかにすることができなかった。さらなる努力が、粘液付着からのより良好な保護を見出すために行われる。
【０６２１】
加えて、表面相互作用は粘液付着を緩和することができる。例えば、Ｆａｒｏｏｑ他［Ｆａｒｏｏｑ  Ｍ他、「ゼラチン封入ポリエステルは表皮ブドウ球菌バイオフィルム感染を阻止する」、Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ、１９９９、８７（１）：５７〜６１］は、ゼラチン含浸ポリエステル移植片が大動脈移植片間置のイヌモデルにおける表皮ブドウ球菌バイオフィルム感染を阻害することを明らかにした。ゼラチン含浸ポリエステル移植片は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌バイオフィルム感染に対するインビボ抵抗性を明らかにした。
【０６２２】
本実施例における予言的実験の目的は、粘液を産生する表皮ブドウ球菌のプラスチックへの付着に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べることである。
【０６２３】
粘液付着を、下記のように、分光光度計による光学的濃度（ＯＤ）技術により定量的に調べることができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物によるＴＳＢ、および、通常の水によるＴＳＢにおける一晩の培養物を、対応する培地により１：２．５で希釈し、それぞれ２５０μｌの総体積で無菌マイクロタイター組織培養プレートに入れ、３７℃でインキュベーションすることができる。プレートを水道水により３回洗浄し、クリスタルバイオレットにより染色し、水道水によりさらに３回洗浄することができる。乾燥後、染色された付着性細菌フィルムのＯＤを、５５０ｎｍの波長を使用して、ＭｉｃｒｏＥｌｉｓａ  Ａｕｔｏリーダーにより測定することができる。細菌培養物のＯＤを、４５０ｎｍおよび６３０ｎｍの二重フィルターを使用して、それぞれの染色の前に測定することができる。それぞれの細菌株の試験を四連で行うことができる。
【０６２４】
実験を、粘液付着を様々な間隔で評価するために設計することができる。速度論的評価のためのタイムテーブルは、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間および４３時間が可能である。様々な菌株を同じプレートで評価することができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は標準的な培地調製のために使用することができ、また、標準的なオートクレーブ殺菌を受けることができる。
【０６２５】
付着の値を、同じプレート試験についての反復測定に関してＡＮＯＶＡを使用して比較することができる；グループ化要因がプレートおよび菌株であった。３元配置ＡＮＯＶＡを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＳＰＳＳ（商標）１１．０を使用して、異なるプレート試験について使用することができる。
【０６２６】
コントロールと比較して、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下での付着がより大きい、付着における差は、水の疎水的能力における変化を引き起こす、ナノ構造により誘導される新しい秩序を示し得る。
【０６２７】
（実施例１２）
細菌コロニーの成長
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のコロニー成長を本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下で調べることができる。コントロール群は、逆浸透（ＲＯ）によって精製された水の存在下で同じ細菌を含むことができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下でのコロニー成長の加速が予想される。
【０６２８】
（実施例１３）
固相マトリックスに対する高分子の結合
無数の生物学的処理および生物学的反応を固相マトリックス（例えば、マイクロタイトレーションプレート、メンブラン、ビーズおよびチップなど）において行うことができる。様々な固相マトリックスが、例えば、疎水性、親水性、電気的性質（例えば、荷電、極性）および親和性特性を含めて、異なる物理的性質および化学的性質を有することができる。
【０６２９】
この予言的実験の目的は、異なる物理的性質および化学的性質を有するマイクロタイトレーションプレートおよびメンブランへの生物学的物質の結合に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べることである。
【０６３０】
７つのタイプのマイクロタイトレーションプレートを使用することができる（例えば、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）、これは、混合した親水性／疎水性領域を含有し、ＩｇＧおよび他の分子の高い結合能およびそれらに対する高い親和性によって特徴づけられる；ＰｏｌｙＳｏｒｐ（商標）、これは疎水性表面を有し、脂質の高い結合能およびそれに対する高い親和性によって特徴づけられる；ＭｅｄｉｍＳｏｒｐ（商標）、これは、ＰｏｌｙＳｏｒｐ（商標）と、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）との間の表面化学を有し、タンパク質の高い結合能およびそれに対する高い親和性によって特徴づけられる；Ｎｏｎ−Ｓｏｒｐ（商標）、これは、生体分子の低い結合能およびそれに対する低い親和性によって特徴づけられる非処理のマイクロタイトレーションプレートである；ＭｕｌｔｉＳｏｒ（商標）、これは親水性表面を有し、グリカンの高い結合能およびそれに対する高い親和性によって特徴づけられる；中程度の結合性のマイクロタイトレーションプレート、これは親水性表面および２５０ｎｇ／ｃｍ２のＩｇＧに対する結合能を有する；炭素結合性マイクロタイトレーションプレート、これは炭水化物に対して共有結合的にカップリングする；高結合性マイクロタイトレーションプレート、これは高い吸着能を有する；および、高結合性のブランクマイクロタイトレーションプレート、これもまた、高い吸着能を有する）。
【０６３１】
これらのマイクロタイトレーションプレートへの生体分子の結合効率を、イオン強度、緩衝液ｐＨ、温度および時間の４つのカテゴリーで試験することができる。
【０６３２】
結合実験を、マイクロタイトレーションプレートを、蛍光標識された生体分子により、または、同じタイプの標識された生体分子および標識されていない生体分子の混合物により被覆し、結合していない分子を洗浄によって除き、プレート上に残留する蛍光シグナルを測定することによって行うことができる。
【０６３３】
下記のプロトコルを用いることができる：
１）蛍光標識された生体分子を結合緩衝液における異なる濃度（典型的には０．４μｇ／ｍｌ〜０．０２μｇ／ｍｌ）に事前に希釈する。それぞれの組の希釈を、２つの結合緩衝液において、すなわち、（ｉ）本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物、および、（ｉｉ）逆浸透によって精製されたコントロールの水において行うことができる。
２）それぞれの濃度からの１００μｌのサンプルをマイクロタイトレーションプレートに（三連で）分注し、初期蛍光レベルを測定する。
３）プレートを４℃で一晩または３７℃で２時間インキュベーションする。
４）被覆用溶液を捨てる。
５）１５０μｌの洗浄溶液を各ウエルに加え、室温で５分間振とうする。この洗浄工程を３回繰り返すことができる。典型的な洗浄溶液は、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（商標）および０．０６ＭのＮａＣｌを含む。
６）０．０１Ｍの水酸化ナトリウムを含む２００μｌの蛍光読み取り溶液を加え、室温で１８０分間または一晩インキュベーションする。
７）蛍光を、４８５ｎｍの励起波長、５３５ｎｍの放射波長および１０フラッシュの最適ゲインにより蛍光ボトムモードを使用して読み取る。
【０６３４】
上記で記載されたプレートへの糖タンパク質（フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＸ）標識または非標識のどちらかでの１５００００ＤのＩｇＧ）の結合効率に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べることができる。ＩｇＧは、主に親水性分子の混合物から構成されるポリクローナル抗体である。この分子は炭水化物の親水性領域を共通領域において有し、可変領域においてわずかに疎水性である。そのようなタイプの分子は、非常に高い効率（６５０ｎｇ／ｃｍ２）でＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートに結合することが知られている。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物はＩｇＧの結合効率を高めることが予想される。
【０６３５】
ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）アグルチニン（ＰＮＡ）の結合効率に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートおよびＮｏｎ−Ｓｏｒｐ（商標）で調べることができる。ＰＮＡは、それぞれがおよそ２７０００ダルトンである４つの同一の糖タンパク質サブユニットから構成される１１００００ダルトンのレクチンである。ＰＮＡレクチンは、親水性領域を介して、糖残基の特定の立体配置を有する糖タンパク質および糖脂質と結合する。ＰＮＡはまた、疎水性領域を有する。アッセイは、（ｉ）炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）、（ｉｉ）酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．６）、および、（ｉｉｉ）リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）の３つの被覆用緩衝液の使用を含むことができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物はＰＮＡの結合を阻害することが予想される。
【０６３６】
核酸の結合効率に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート、Ｐｏｌｙｓｏｒｐ（商標）プレートおよびＮｏｎ−Ｓｏｒｐ（商標）で調べることができる。一般に、ＤＮＡ分子はポリスチレンプレートには良好に結合しない。一層より問題となることが、数千ダルトンの分子量を有する小さい一本鎖ＤＮＡ分子であるオリゴヌクレオチドの結合である。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、被覆用緩衝液への塩の添加の有無にかかわらず、結合効率を高めることが予想される。
【０６３７】
（実施例１４）
ＤＮＡの単離および精製
ＰＣＲ生成物の精製に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響をＰＣＲキットの再構築によって研究することができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の使用は核酸増幅プロセスの効率を改善することが予想される。下記の予言的実験では、Ｐｒｏｍｅｇａ社のキット“Ｗｉｚａｒｄ−ＰＣＲ  ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ精製システム”（Ａ７１７０）の再構築が記載される。
【０６３８】
Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ（商標）キットの使用は下記の工程を伴う：
１）精製緩衝液をＰＣＲサンプルと混合して、ＤＮＡを樹脂に結合させるための条件を作製する；
２）樹脂懸濁物を、ＤＮＡを樹脂に結合させるためにＰＣＲ混合物を混合し、樹脂サンプルをシリンジに加え、真空を生じさせる；
３）イソプロパノールを加え、溶液を真空によって吸引して、結合していないＤＮＡを除く；
４）結合したＤＮＡを水により溶出する；および
５）ゲル電気泳動を本明細書中下記でさらに詳述されるように行う。
【０６３９】
キットの再構築を、キットとともに供給される元々の水（本明細書中以降、コントロール）を用いて、あるいは、キットの水溶液を、工程１、工程２および工程４について、ＲＯ水または本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のどちらかで置き換えることによって行うことができる。工程３において、キットに見出されるのと同一の８０％イソプロパノール溶液をすべての実験において使用することができる。
【０６４０】
下記のプロトコルをゲル電気泳動のために使用することができる：
（ａ）ゲル溶液：８％ＰＡＧＥ（＋尿素）を、ＲＯ水または本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のどちらかを用いて調製することができる；
（ｂ）４０５μｌの１０％ＡＰＳおよび５５μｌのＴＥＭＥＤ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ−７０２４）を含有する重合試薬を５０ｍｌのゲル溶液に加える；
（ｃ）ゲル溶液をゲルカセット（Ｒｈｅｎｉｕｍ  Ｌｔｄ、Ｎｏｖｅｘ  ＮＣ２０１５、０９−０１５０５−Ｃ２）に注ぎ、プラスチックコームを置き、室温で３０分間、重合させる；
（ｄ）コームを除き、テープを剥がして、１つのデバイスの２つの向き合う側での２つのゲルの組立てを可能にする；
（ｅ）泳動緩衝液（ＲＯ水または本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のどちらかでのＴＢＥｘ１）により、内側チャンバーをゲルの上部まで、外側チャンバーをゲル高さの約１／５まで満たす；
（ｆ）サンプルを、ＴＢＥ  Ｆｉｃｏｌｌ、ブロモフェノールブルーおよび尿素を含有するサンプル緩衝液（ＳＢＵ）でサンプルを希釈することによって調製し、ＤＮＡサンプルと１：１で混合する；
（ｇ）ミックスの８μｌ〜１０μｌを各ウエルに負荷する；および
（ｈ）電源を１００Ｖに設定し、ＤＮＡを移動させ、着色色素（ブロモフェノールブルー）が底部から１ｃｍに達するまで続ける。
【０６４１】
下記のプロトコルをゲル染色可視化の写真撮影および分析のために使用することができる：
（ａ）ゲルを、振とうしながら、１Ｕ／μｌのＧｅｌＳｔａｒ（商標）を１ＸＴＢＥに含有する染色液に１５分間入れる；
（ｂ）ゲルを、３０分間、１ＸＴＢＥ緩衝液において脱染色する；
（ｃ）ゲルをＵ．Ｖ．台に置く；ＤＮＡを認めるように３６５ｎｍの光を使用する；および
（ｄ）ＤＣ１２０（商標）デジタルカメラを使用して、ゲルを写真撮影し、デジタル情報をさらなる分析のために保存する。
【０６４２】
ＰＣＲを、下記のプロトコル（１００反応分）に従って、ＡｐｏＥ遺伝子特異的プライマーを使用してヒトＤＮＡから調製することができる（フラグメントサイズ、２６５ｂｐ）：
（ａ）０．２μｌのＰＣＲチューブに、適切な認識番号を付ける；
（ｂ）２．５μｌの４０μｇ／ｍｌ  ヒトＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ３０４１）または水を関連チューブに加える；
（ｃ）１４．５μｌのＤＤＷにより１７μｌに調節する；
（ｄ）３６３０μｌのＰＣＲミックスを調製する；
（ｅ）３３μｌのミックスを各チューブに加える；
（ｆ）サンプルをＰＣＲ装置に入れる；
（ｇ）ＰＣＲプログラムを作動させる；
（ｈ）５μｌの各生成物を８％ＰＡＧＥで分析する；および
（ｉ）反応液を−２０℃で保存する。
【０６４３】
（実施例１５）
カラム容量
本実施例は、カラム容量に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。複数（例えば、１００以上）のＰＣＲ反応液（それぞれが実施例１４のプロトコルに従う）を調製し、一緒にして、５ｍｌのストック溶液を作製することができる。実験は２つの工程を含むことができ、この場合、予備工程（本明細書中以降、工程Ａ）を、結合および溶出に対する、カラムに加えられる体積の影響を調べることに向けることができ、主工程（本明細書中以降、工程Ｂ）を、カラム容量に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べることに向けることができる。
【０６４４】
工程Ａにおいて、４本のカラム（例えば、カラム１〜カラム４）に、５０μｌ、１５０μｌ、３００μｌまたは６００μｌのストックＰＣＲ生成物溶液を加えることができ、また、１３本のカラム（例えば、５〜１７）に３００μｌのストックＰＣＲ溶液を加えることができる。すべてのカラムは５０μｌの水により溶出することができる。溶出された溶液を下記の順でレーン７〜レーン１０に負荷することができる：レーン７（ＰＣＲ原液、ｘ１の濃度係数）、レーン８（原液、ｘ３）、レーン９（ｘ６）およびレーン１０（ｘ１２）。カラム５〜カラム１７からのすべての溶出液の「ミックス」（ｘ６）をレーン１１において負荷することができる。レーン１〜レーン５には、カラム１〜カラム４からの溶出液、および、カラム５〜カラム１７の「ミックス」（これは原液濃度（ｘ１）に事前に希釈される）を負荷することができる。レーン６はラダーマーカーが可能である。
【０６４５】
下記のプロトコルを工程Ａにおいて用いることができる：
１）それぞれのサンプルのためにＷｉｚａｒｄ（商標）ミニカラムおよびシリンジに印を付け、それらを真空マニホールドに挿入する；
２）１００μｌのそれぞれの直接的ＰＣＲ精製緩衝液溶液をマイクロチューブに分注する；
３）軽くボルテックス撹拌する；
４）１ｍｌのそれぞれの樹脂溶液を加え、１分間にわたって３回、軽くボルテックス撹拌する；
５）樹脂／ＤＮＡミックスをシリンジに加え、真空を加える；
６）２ｍｌの８０％イソプロパノール溶液をそれぞれのシリンジに加え、真空を加えることによって洗浄する；
７）真空を３０秒間維持することによって樹脂を乾燥する；
８）ミニカラムを１．５ｍｌの微量遠心分離器チューブに移す；
９）１００００ｇで２分間遠心分離する；
１０）ミニカラムを清浄な１．５ｍｌチューブに移す；
１１）５０μｌの関連した水（ヌクレアーゼ非含有または本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物）を加える；
１２）１００００ｇで２０秒間遠心分離する；
１３）５０μｌの貯蔵用マイクロチューブに移し、−２０℃で保存する；
１４）工程９〜工程１１を第２の溶出サイクルのために繰り返す；
可視化工程：
１５）６μｌのそれぞれのサンプルを６μｌの負荷緩衝液と混合する；
１６）１０μｌのそれぞれのミックスをアクリルアミド尿素ゲル（ＡＡＵ）に負荷し、ゲルを７０Ｖ、１０ｍＡｍｐで泳動する；
１７）ゲルをＧｅｌＳｔａｒ（商標）溶液（５０ｍｌのＴＢＥにおける５μｌの１００００ｕ溶液）により染色し、室温で１５分間振とうする；
１８）ＴＢＥ緩衝液において室温で３０分間振とうして、ゲルを脱染色する；および
１９）ゲルを写真撮影する。
【０６４６】
工程Ｂにおいて、工程Ａの「混合」溶出液を「濃縮ＰＣＲ溶液」として使用し、１２本のカラム加えることができる。カラム１〜カラム５には、キット試薬を使用して、８．３μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌおよび１００μｌをそれぞれ加えることができる。カラムは５０μｌのキットの水によって溶出することができ、それぞれの溶出液の５μｌをゲルにおける対応するレーンに加えることができる。カラム７〜カラム１１はカラム１〜カラム５のように処理することができるが、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が結合緩衝液および溶出緩衝液として用いられる。サンプルを、対応するゲルレーンに加えることができる。カラム１３は、工程Ａのカラム５〜カラム１７の「ミックス」によるコントロールとして役立ち得る。
【０６４７】
下記のプロトコルを工程Ｂにおいて用いることができる：
１）それぞれのサンプルについて使用されるためのＷｉｚａｒｄ（商標）ミニカラムおよびシリンジに印を付け、それらを真空マニホールドに挿入する；
２）１００μｌのそれぞれの直接的ＰＣＲ精製緩衝液溶液をマイクロチューブに分注する；
３）軽くボルテックス撹拌する；
４）１ｍｌのそれぞれの樹脂溶液を加え、１分間にわたって３回、軽くボルテックス撹拌する；
５）樹脂／ＤＮＡミックスをシリンジに加え、真空を加える；
６）２ｍｌの８０％イソプロパノール溶液をそれぞれのシリンジに加え、真空を加えることによって洗浄する；
７）真空を３０秒間加え続けることによって樹脂を乾燥する；
８）ミニカラムを１．５ｍｌの微量遠心分離器チューブに移す；
９）１００００ｇで２分間遠心分離する；
１０）ミニカラムを清浄な１．５ｍｌチューブに移す；
１１）５０μｌのヌクレアーゼ非含有または本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を加える；
１２）１００００ｇで２０秒間遠心分離する；
１３）５０μｌの貯蔵用マイクロチューブに移し、−２０℃で保存する；
１４）工程１１〜工程１３を第２の溶出サイクルのために繰り返す；
【０６４８】
可視化工程は、工程Ａの場合と同じであることが可能である。
【０６４９】
レーン１〜レーン５およびレーン７〜レーン１１と比較して、レーン７〜レーン１１でのより大きい強度は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物がキットの試薬よりも多くのＤＮＡと結合することができることを示し得る。
【０６５０】
（実施例１６）
ゲル電気泳動によるＤＮＡの単離
ゲル電気泳動は、サイズおよび形状に基づくＤＮＡ分子の決定および単離のために日常的に使用されている方法である。ＤＮＡサンプルが、ＤＮＡ分子を取り囲む泳動緩衝液として役立つゲルの上部部分に加えられる。ゲルは正に荷電しており、電流が加えられたとき、負荷電のＤＮＡフラグメントをゲルの下流側に移動させる。移動速度が、より小さいコイル状分子または折り畳まれた分子についてはより早く、大きい折り畳まれていない分子についてはより遅い。移動が完了すると、ＤＮＡは蛍光標識によって標識することができ、ＵＶ照明のもとで可視化される。ＤＮＡはまた、メンブランに転写し、酵素的着色法によって高感度で可視化される。ＤＮＡが、ゲルにおけるその位置およびバンド強度に従って評価される。
【０６５１】
下記は、ゲル電気泳動によるＤＮＡ移動に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験の記載である。
【０６５２】
２つのタイプのＤＮＡを使用することができる：（ｉ）ＰＣＲ生成物（２８０塩基対）、および、（ｉｉ）下記サイズの１１個のＤＮＡフラグメントから構成されるラダーＤＮＡ：８０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐおよび１０３０ｂｐ。ゲルを実施例１４のプロトコルに従って調製することができる。
【０６５３】
ＲＯ水の存在下での移動速度が、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下での移動速度よりも大きいことが予想される。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、ＲＯ水と比較して、ＤＮＡ移動の遅れを生じさせることが予想される。そのような結果は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響下では、ＤＮＡの立体配置が、ＤＮＡのフォールディングが低下する（解かれる）ような様式で変化させられることを示し得る。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物においてＤＮＡのフォールディングが解けることは、より強い水素結合相互作用が、ＲＯ水との比較において、ＤＮＡ分子と、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物との間に存在することを示しているかもしれない。
【０６５４】
（実施例１７）
酵素の活性および安定性
酵素の活性および安定性の両方を増大させることが、酵素を利用する何らかのプロセスの効率を高めるために、また、そのコストを下げるために重要である。長期間の貯蔵、長期に及ぶ活性の期間中に、および、同様に、過度に希釈されたとき、酵素は典型的には、安定性を失わせる一因となり得る、したがって、最終的には活性を失わせる一因となり得るストレスにさらされる。
【０６５５】
本実施例は、酵素の活性および安定性に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。この予言的研究は、生物工学産業における２つの一般に使用されている酵素、すなわち、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）およびβ−ガラクトシダーゼに関連する。ＡＰの２つの形態を使用することができる：非結合型形態、および、ＡＰがＳｔｒｅｐｔ−Ａｖｉｄｉｎに結合された結合型形態（ＳＴ−ＡＰ）。
【０６５６】
下記は、希釈された酵素に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べることができる予言的実験の記載である。希釈を、添加剤を伴うことなく、かつ、中性ｐＨ（７．４）において、ＲＯ水または本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のどちらかで行うことができる。
【０６５７】
アルカリホスファターゼの非結合型形態
アルカリホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩＮＣ）をＲＯ水または本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のどちらかにおいて連続希釈することができる。１：１０００および１：１００００の希釈サンプルをチューブにおいて室温でインキュベーションすることができる。
【０６５８】
種々の時間間隔で、酵素活性を、１０μｌの酵素を９０μｌのｐＮＰＰ溶液（ＡＰ特異的な比色測定基質）と混合することによって求めることができる。このアッセイをマイクロタイトレーションプレートにおいて行うことができる（それぞれの試験点について４つ以上の反復）。色の強度を４０５ｎｍの波長でＥＬＩＳＡリーダーによって求めることができる。
【０６５９】
酵素活性を、ＲＯ水および本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の両方で、それぞれの希釈について時間ｔ＝０において求めることができる。安定性を、ｔ＝０における活性によって除される２２時間（ｔ＝２２）後の活性および４８時間（ｔ＝４８）後の活性として求めることができる。
【０６６０】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下での活性がＲＯ水の存在下での活性よりも高いことが予想される。
【０６６１】
アルカリホスファターゼの結合型形態
酵素を別の分子に結合することにより、典型的には、その安定性が増大する。酵素は典型的には、高い濃度で貯蔵され、所望される希釈物に使用前に希釈されるだけである。下記は、高濃度で長期間貯蔵される酵素に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の安定化作用を調べるための予言的実験の記載である。
【０６６２】
Ｓｔｒｅｐｔ−Ａｖｉｄｉｎアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）をＲＯ水および本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物において１：１０および１：１００００で希釈することができる。希釈されたサンプルを、チューブにおいて、室温で５日間インキュベーションすることができる。すべてのサンプルを１：１００００の最終的な酵素濃度に希釈することができ、活性を本明細書中上記でさらに詳述されるように求めることができる。酵素活性を時間ｔ＝０および５日後において求めることができる。
【０６６３】
酵素は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物において、ＲＯ水の場合よりも実質的に活性であることが予想される。
【０６６４】
β−ガラクトシダーゼ
β−ガラクトシダーゼを用いた実験を、酵素タイプ、濃度およびインキュベーション時間を除いて、上記で記載されるアルカリホスファターゼの予言的実験のために使用される同じプロトコルに従って行うことができる。β−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）をＲＯ水および本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物において連続希釈することができる。サンプルを１：３３０および１：１０００に希釈することができ、室温でインキュベーションすることができる。
【０６６５】
酵素活性を、１０μｌの酵素を１００μｌのＯＮＰＧ溶液（β−Ｇａｌ特異的な比色測定基質）と３７℃で１５分間混合し、５０μｌの停止溶液（１Ｍ  Ｎａ２Ｈｃｏ３）を加えることによって、０、２４時間、４８時間、７２時間および１２０時間の時間間隔で求めることができる。アッセイをマイクロタイトレーションプレートにおいて行うことができる（それぞれの試験点に由来する約８個以上の反復）。４０５ｎｍの波長におけるＥＬＩＳＡリーダーを、色の強度を求めるために使用することができる。
【０６６６】
酵素活性を、ＲＯ水および本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物について、それぞれの希釈について時間ｔ＝０において求めることができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下での活性がＲＯ水の存在下での活性よりも高いことが予想される。
【０６６７】
乾燥アルカリホスファターゼの活性および安定性
多くの酵素が貯蔵前に乾燥される。乾燥プロセス、および、長期間にわたる乾燥状態でのその後の貯蔵は、酵素活性をもたらすことが知られている。下記は、乾燥アルカリホスファターゼの活性および安定性に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の安定化作用を調べるための予言的実験の記載である。
【０６６８】
アルカリホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩＮＣ）を、本明細書中上記でさらに詳述されるように、ＲＯ水および本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物において１：５０００で希釈することができる。
【０６６９】
数枚（例えば、９枚）のマイクロタイトレーションプレートを５μｌの溶液のアリコートにより満たすことができる。１つのプレートを、本明細書中上記でさらに詳述されるように時間ｔ＝０における酵素活性について試験することができ、残りのプレートを３７℃で一晩乾燥することができる。乾燥プロセスを、乾燥した環境において１６時間行うことができる。
【０６７０】
これらのプレートのうちの２つを、最初に室温に冷却し、その後、１００μｌのｐＮＰＰ溶液を室温で加えることによって酵素活性について試験することができる。色の強度を４０５ｎｍの波長でＥＬＩＳＡリーダーによって求めることができ、安定性を、本明細書中上記でさらに詳述されるように計算することができる。他のプレートを６０℃に３０分間移すことができ、酵素活性をその後で求めることができる。これらの乾燥処理および熱処理の目的は、酵素に損傷を与えることである。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は酵素の活性を少なくとも部分的に安定化することが予想される。
【０６７１】
（実施例１８）
ＤＮＡの固定化
本実施例は、ＤＮＡを本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下または非存在下でガラスビーズに固定することの影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０６７２】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、本実施例では、「ＧＥＮＣ」と略記される「ガス富化ナノ構造組成物」として交換可能に示される。
【０６７３】
ポリヌクレオチドを固体担体（例えば、ガラスビーズなど）に固定することは、分子生物学研究および医学の分野では最も有益であり得る。典型的には、ＤＮＡ操作は、ＰＣＲ、連結、制限および形質転換を含めて、１つの反応の後に他の反応が続く一連の反応を含む。それぞれの反応が好ましくは、それ自身の特定の緩衝液を要求するそれ自身の最適な反応条件のもとで行われる。典型的には、それぞれの反応との間において、ＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルは沈殿させなければならず、その後、その新しい適切な緩衝液において再構成されなければならない。繰り返される沈殿化および再構成は時間を要し、また、より重要なことには、出発物質の喪失をもたらす。このことは、その物質が希であるときには最も関連があり得る。
【０６７４】
下記は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が、どのような影響を、ＰＣＲ反応の期間中にガラスビーズの存在下でＤＮＡに対して有するかを調べるための予言的実験の記載である。
【０６７５】
ＰＣＲを、得られるフラグメントサイズが７５０ｂｐであるようにＴ７フォワードプライマー（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ）（配列番号１）およびＭ１３リバースプライマー（ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ）（配列番号２）を使用して、７５０塩基対の遺伝子がクローン化されているｐＢＳプラスミドから調製することができる。プライマーを２００μＭ（２００ｐｍｏｌ／μｌ）の濃度でＰＣＲ規格の水において構成することができる。これらはその後、混合ミックスを作製するために、それぞれが１０μＭの作業濃度に本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物において１：２０で希釈することができる。例えば、１μｌのそれぞれのプライマー（２００μＭのストックから）を一緒にし、１８μｌの本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物により希釈し、混合し、スピンダウンすることができる。高濃度のＤＮＡを２ｐｇ／μｌの作業濃度に本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物により１：５００で希釈することができる。ＰＣＲをＢｉｏｍｅｔｒａ  Ｔ−Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ＰＣＲ装置において行うことができる。酵素は、緩衝液ＹにおけるＳＡＷＡＤＹ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｑＬａｂ、０１−１０２０）が可能である。
【０６７６】
ＰＣＲミックスを下記のように調製することができる：
2011501686.tif 000007
【０６７７】
サンプルを、好ましくは渦を形成させることなく混合することができる。サンプルを、９４℃で１分間、ＰＣＲ装置に入れることができ、その後、取り出すことができる。その後、４．５μｌのＰＣＲミックスを清浄なチューブに小分けすることができ、このチューブに０．５μｌのプライマーミックスおよび５μｌの希釈されたＤＮＡをその順で加えることができる。混合後、サンプルをＰＣＲ装置に入れることができ、下記のＰＣＲプログラムを使用することができる。
【０６７８】
2011501686.tif 000008
【０６７９】
ＰＣＲ反応の生成物を、本明細書中上記で記載されるように、分析のために８％ＰＡＧＥゲルで泳動することができる。
【０６８０】
ＰＣＲ生成物が可視化されるためには、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物がガラスビーズの存在下でのＰＣＲ反応の期間中に要求されることが予想される。
【０６８１】
（実施例１９）
リアルタイムＰＣＲ
ＤＮＡ核酸配列およびｃＤＮＡ核酸配列の検出および定量化は、法廷科学、医学、薬物開発および分子生物学研究を含む広範囲の様々な適用のために重要である。リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲ反応の期間中に放射される蛍光が、アガロースゲルにおける臭化エチジウムの可視化に依拠する従来型ＰＣＲの終点検出とは対照的に、それぞれのＰＣＲサイクルの期間中におけるアンプリコン生成の指標として（すなわち、リアルタイムで）モニターされる。
【０６８２】
その高感度のために、リアルタイムＰＣＲは、非常に少量のＤＮＡまたはｃＤＮＡを検出および定量するために特に関連がある。感度および再現性を改善すること、ならびに、リアルタイムＰＣＲのために要求される反応体積を少なくすることが、貴重なサンプルを残しておくことを助ける。
【０６８３】
本実施例は、リアルタイムＰＣＲ反応の感度および反応体積に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０６８４】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、本実施例では、「ＧＥＮＣ」と略記される「ガス富化ナノ構造組成物」として交換可能に示される。
【０６８５】
感度試験
リアルタイムＰＣＲ反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ７３００  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍで、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法を使用して行うことができる。反応を９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）で行うことができる。プライマー配列は下記の通りであり得る：
フォワードプライマー：ＣＡＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＴＣＣＴＣＡＴＴ（配列番号３）
リバースプライマー：ＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＣＡＴＡＴＴＣＣ（配列番号４）
【０６８６】
それぞれが１２サンプルの２組を、本明細書中下記で詳述されるように調製することができ、一方を、ヌクレアーゼ非含有水を用いて調製することができ、他方を、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を用いて調製することができる。それぞれの組について、１３Ｘミックスを調製することができる。サンプルを下記のプロトコルに従って調製することができる。
【０６８７】
2011501686.tif 000009
【０６８８】
ｃＤＮＡサンプルを、１：５から始まり、１：２５６０で終わる連続希釈で水またはＧＥＮＣにおいて希釈することができる（合計で１０個の希釈物）。１：５の希釈を、３μｌのｃＤＮＡ原液＋１２μｌのＨ２ＯまたはＧＥＮＣを使用して調製することができる。それに続く希釈を、７．５μｌのサンプルおよび７．５μｌのＨ２ＯまたはＧＥＮＣを採取することによって調製した。
【０６８９】
１７μｌのミックスを３μｌのｃＤＮＡサンプルに加えることができる。それぞれの組における最初の反応が非希釈のｃＤＮＡサンプルであり得る。
【０６９０】
蛍光が、選ばれたレベルを越えるために必要とされるＰＣＲサイクルの数（閾値サイクル（Ｃｔ））の、それらの対応するＬｏｇ（希釈サンプルについてのｃＤＮＡ濃度）に対する標準曲線をプロットすることができる。この標準曲線は、プロセスの直線性、反応効率の尺度である。
【０６９１】
解離曲線を希釈サンプルについてのそれぞれの標準曲線の反応についてプロットすることができる。
【０６９２】
標準曲線および解離曲線の両方を、自動ベースライン決定を使用してプロットすることができる。標準曲線だけは、０．２の手作業でのバックグラウンドカットオフで、また、同一または非同一の外れ値をそれぞれの組から除いた後でプロットすることができる。
【０６９３】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物については、水と比較して、回帰値がより大きいことが予想される。そのような結果は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在が濃度のより広いダイナミックレンジについて量のより正確な評価を提供することを示し得る。増幅のダイナミックレンジおよび効率が本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下ではより大きいことがさらに予想される。
【０６９４】
体積試験
下記は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を水の代わりに使用するリアルタイムＰＣＲの実行が、感度を保持しながら、より少ない反応体積を可能にするという可能性を調べるための予言的実験の記載である。
【０６９５】
すべての材料が、感度を求めるために上記で使用された材料と同一であり得る。ｃＤＮＡサンプルを１：８０で希釈することができる。
【０６９６】
下記の反応体積を試験することができる：５ｕｌ、１０ｕｌおよび１５ｕｌ。３つの体積組のそれぞれが、８反応からなる反応列を含むことができる：ＧＥＮＣの存在下および非存在下での反応の三連、ならびに、１つの陰性コントロール（テンプレート非含有）。低下した反応体積に加えて、ＳＹＢＲグリーン溶液と、溶媒（水またはＧＥＮＣのどちらか）との間における比率を、下記でさらに詳述されるように変化させることができる。
【０６９７】
2011501686.tif 000010
【０６９８】
それぞれの体積試験のためのプールを、示されたように水またはＧＥＮＣにおいて調製することができ、その後、所望される体積で反応ウエルに小分けすることができる。すべての結果を０．２のバックグラウンドカットオフ値で読み取ることができる。
【０６９９】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下で行われる反応は再現性がより大きいことが予想される。
【０７００】
（実施例２０）
超音波試験
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を超音波共鳴器における一連の超音波試験に供するための予言的実験を記載する。
【０７０１】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物および２回蒸留水における超音波速度の測定を、ＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）研究システム（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を使用して行うことができる。
【０７０２】
校正
ＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）研究システムの両方のセルを、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０が補充された標準水で満たすことができ、２０℃での等温測定の期間中に測定することができる。両セルの間での超音波速度における差を、本明細書中下記でさらに詳述されるように、等温測定におけるゼロ値として使用することができる。
【０７０３】
等温測定
ＲｅｓｏＳｃａｎ（登録商標）研究システムのセル１を参照として使用することができ、蒸留水で満たすことができる。セル２を本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物で満たすことができる。絶対的超音波速度を２０℃で測定することができる。実験値の比較を可能にするために、超音波速度を２０．０００℃に対して補正することができる。
【０７０４】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物について測定される際の絶対的超音波速度は、蒸留水について測定される際の絶対的超音波速度より大きいことが予想される。
【０７０５】
（実施例２１）
チップに対するＲＮＡのハイブリダイゼーション
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下および非存在下でのＤＮＡチップに対するＲＮＡサンプルとの間でのハイブリダイゼーションの強さを調べるための予言的実験を記載する。
【０７０６】
ＧＥＡｒｒａｙ  Ｑ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ＰａｔｈｗａｙＦｉｎｄｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｒｒａｙ：ＨＳ−００８を使用することができる。
【０７０７】
ＲＮＡを、Ｒｎｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してヒトリンパ球から抽出することができる。ＲＮＡを、ＧＥＡｒｒａｙ  ＡｍｐｏＬａｂｅｌｉｎｇ−ＬＰＲキット（カタログ番号Ｌ−０３）を製造者のプロトコルに従って使用して標識することができる。
【０７０８】
アレイに対するＲＮＡサンプルのハイブリダイゼーションを製造者のプロトコルに従って行うことができる。本質的には、メンブランを脱イオン水において５分間、事前に湿らすことができ、その後、メンブランを、予め加温されたＧＥＡｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（ＧＥＡｒｒａｙ）において６０℃で２時間インキュベーションすることができる。標識されたＲＮＡをハイブリダイゼーション溶液に加えることができ、メンブランと６０℃で一晩ハイブリダイゼーションさせることができる。洗浄後、メンブランを２秒または１０秒の感光時間にわたってオートラジオグラフィー用Ｘ線フィルムにさらすことができる。
【０７０９】
ハイブリダイゼーションが、ＤＮＡチップに対しては本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下で増大することが予想される。このことが、シグナル強度を同一感光時間の後で観測することによって明らかにされ得る。
【０７１０】
（実施例２２）
緩衝能
本実施例は、緩衝能に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０７１１】
水酸化ナトリウムおよび塩酸を、下記のプロトコルに従って、５０ｍｌのＲＯ水または本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のどちらかに加えることができ、ｐＨを測定することができる：
水酸化ナトリウム滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを加える。
塩酸滴定：１μｌ〜１５μｌの１Ｍ塩酸を加える。
【０７１２】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物については、より多くの量の水酸化ナトリウムまたは塩酸が、ＲＯ水について必要とされる同じｐＨレベルに達するために要求されることが予想される。そのような結果は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が緩衝能を有することを示し得る。
【０７１３】
（実施例２２）
溶媒能
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が、ダイゼイン−ダウノマイシンコンジュゲート（ＣＤ−Ｄａｕ）、ダウノルビシン（塩酸セルビジン）、および、ダイゼインのｔ−ｂｏｃ誘導体（ｔｂｏｃ−Ｄａｉｄ）（これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている）を溶解することができることを調べるための様々な予言的実験を記載する。
【０７１４】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、本実施例では、「ＧＥＮＣ」と略記される「ガス富化ナノ構造組成物」として交換可能に示される。
【０７１５】
ＣＤ−Ｄａｕの可溶化
所要濃度：３ｍｇ／ｍｌ  ＧＥＮＣ。
性状：この物質は、ＤＭＳＯ、アセトン、アセトニトリルに溶解する。
性状：この物質はＥｔＯＨに溶解する。
５つの異なるガラスバイアルを準備することができる：
（ｉ）５ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋１．２ｍｌのＧＥＮＣ。
（ｉｉ）１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌのアセトン。
（ｉｉｉ）１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋１５０μｌのアセトン＋４５０μｌのＧＥＮＣ（２５％アセトン）。
（ｉｖ）１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌの１０％＊ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）。
（ｖ）１．８ｍｇのＣＤ−Ｄａｕ＋６００μｌのアセトン＋６００μｌのＧＥＮＣ。
【０７１６】
これらのサンプルはボルテックス撹拌することができ、分光光度計による測定を行うことができる。バイアル（ｉｉ）、バイアル（ｉｉｉ）およびバイアル（ｖ）は、アセトンを蒸発させるために開けたままにすることができる。ＣＤ−Ｄａｕの溶媒としての作用（ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｔ）を、ＣＤ−Ｄａｕを溶解する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の能力を評価するために比較することができる。
【０７１７】
ダウノルビシン（塩酸セルビジン）の可溶化
所要濃度：２ｍｇ／ｍｌ
２ｍｇのダウノルビシン＋１ｍｌのＧＥＮＣを１つのバイアルにおいて調製することができ、２ｍｇのダウノルビシン＋１ｍｌのＲＯ水を第２のバイアルにおいて調製することができる。この物質が本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物およびＲＯ水の両方に容易に溶解されることが予想される。
【０７１８】
ｔ−ｂｏｃの可溶化
所要濃度：４ｍｇ／ｍｌ
１．１４ｍｌのＥｔＯＨを、１８．５ｍｇのｔ−ｂｏｃ（油状物）を含有する１つのバイアルに加えることができる。その後、これは２つのバイアルに分けることができ、１．７４ｍｌのＧＥＮＣまたはＲＯ水を、溶液が２５％のＥｔＯＨを含むようにこれらのバイアルに加えることができる。分光光度計による測定の後、溶媒を溶液から蒸発させることができ、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を両方のバイアルに加え、それぞれのバイアルにおいて２．３１ｍｌの最終体積にすることができる。これら２つのバイアルにおける溶液を１つの清浄なバイアルにまとめることができ、真空条件下での輸送のために包装することができる。
【０７１９】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の添加、および、それに続く、熱による溶媒の蒸発の後、この物質が本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に溶解されることが予想される。
【０７２０】
（実施例２３）
溶媒能
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が２つの薬草物質（ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂ、これらの両方が、２５ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解しないことが知られている）を溶解することができることを調べるための２つの予言的実験を記載する。
【０７２１】
パート１
２．５ｍｇのそれぞれの物質（ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂ）を、４つのチューブのそれぞれにおける粉末の最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌであるように、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物だけ、または、７５％の本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物および２５％のエタノールを含む溶液のどちらかにおいて希釈することができる。チューブをボルテックス撹拌し、エタノールを蒸発させるように５０℃に加熱することができる。
【０７２２】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物におけるＡＧ−１４Ｂの懸濁物は、ＡＧ−１４Ｂが凝集するＲＯ水に反して、凝集しないことが予想される。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物はＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂを溶解しないことがさらに予想される。
【０７２３】
パート２
５ｍｇのＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂを、６２．５μｌのＥｔＯＨ＋１８７．５μｌの本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物において希釈することができる。さらなる６２．５μｌの本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を加えることができる。チューブをボルテックス撹拌し、エタノールを蒸発させるように５０℃に加熱することができる。
【０７２４】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が加えられる前にＥｔＯＨに懸濁し、その後、ＥｔＯＨを蒸発させることにより、ＡＧ−１４ＡおよびＡＧ−１４Ｂが溶解することが予想される。
【０７２５】
（実施例２４）
溶媒能
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が細胞毒性ペプチドを溶解することができることを調べるための２つの予言的実験を記載する。加えて、本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物がペプチドの細胞毒性活性に影響を及ぼしたかどうかを確認するために、Ｓｋｏｖ−３細胞に対するペプチドを影響を測定するための予言的実験を記載する。
【０７２６】
下記のペプチドを使用することができる：ペプチドＸ、Ｘ−５ＦＵ、ＮＬＳ−Ｅ、Ｐａｌｍ−ＰＦＰＳＹＫ（ＣＭＦＵ）、ＰＦＰＳＹＫＬＲＰＧ−ＮＨ２、ＮＬＳ−ｐ２−ＬＨＲＨおよびＦ−ＬＨ−ＲＨ−ｐａｌｍｋＧＦＰＳＫ、これらのすべてが、水に溶解しないことが知られている。７つすべてのペプチドを０．５ｍＭで本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に溶解することができる。その後、分光光度法による測定を行うことができる。
【０７２７】
Ｓｋｏｖ−３細胞をマッコイ５Ａ培地で成長させ、９６ウエルプレートにおいてウエルあたり１５００細胞の濃度に希釈することができる。２４時間後、２μｌ（０．５ｍＭ、０．０５ｍＭおよび０．００５ｍＭ）のペプチド溶液を、１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍの最終濃度のためにそれぞれ、１ｍｌのマッコイ５Ａ培地において希釈することができる。数回の反復実験（例えば、９回）をそれぞれの処置について行うことができる。それぞれのプレートは、３つの濃度での２つのペプチドと、コントロール処理の６つのウエルとを含有することができる。９０μｌのマッコイ５Ａ培地＋ペプチドを細胞に加えることができる。１時間後、１０μｌのＦＢＳを（競合を防止するために）加えることができる。細胞を、クリスタルバイオレットに基づく生存性アッセイで２４時間後および４８時間後に定量することができる。この色素はＤＮＡを染色する。可溶化されたとき、単層によって取り込まれた色素の量をプレートリーダーで定量することができる。
【０７２８】
これらのペプチドが本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に希釈されること、および、溶解されたペプチドが細胞毒性活性を含むことが予想される。
【０７２９】
（実施例２５）
溶媒能
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物がレチノールを溶解することができることを調べるための２つの予言的実験を記載する。
【０７３０】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、本実施例では、「ＧＥＮＣ」と略記される「ガス富化ナノ構造組成物」として交換可能に示される。
【０７３１】
レチノールを、下記の条件のもと、ＧＥＮＣに可溶化することができる：
ＥｔＯＨおよびＧＥＮＣにおける１％レチノール（０．０１ｇｒを１ｍｌに）。
ＥｔＯＨおよびＧＥＮＣにおける０．５％レチノール（０．００５ｇｒを１ｍｌに）。
ＥｔＯＨおよびＧＥＮＣにおける０．５％レチノール（０．１２５ｇｒを２５ｍｌに）。
ＥｔＯＨおよびＧＥＮＣにおける０．２５％レチノール（０．０６２５ｇｒを２５ｍｌに）。最終的なＥｔＯＨ濃度：１．５％
【０７３２】
レチノールが、酸性の富化されたナノ構造組成物ではなくむしろ、アルカリ性の富化されたナノ構造組成物において容易に可溶化されることが予想される。
【０７３３】
（実施例２６）
溶媒能
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が物質Ｘを４０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解することができることを調べるための予言的実験を記載する。
【０７３４】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、本実施例では、「ＧＥＮＣ」と略記される「ガス富化ナノ構造組成物」として交換可能に示される。
【０７３５】
パート１
本編は、ＧＥＮＣおよびＤＭＳＯにおける溶解性に関し得る。第１の試験チューブにおいて、２５μｌのＧＥＮＣを１ｍｇの物質「Ｘ」に加えることができる。第２の試験チューブにおいて、２５μｌのＤＭＳＯを１ｍｇの物質「Ｘ」に加えることができる。両方の試験チューブをボルテックス撹拌し、６０℃に加熱し、振とう機で１時間振とうすることができる。これらのバイアルにおける物質「Ｘ」の溶媒としての作用を評価および比較することができる。
【０７３６】
パート２
本編は、ＤＭＳＯの削減、および、時間の経過を通しての異なる溶媒における物質の安定性／速度論の試験に関し得る。
【０７３７】
それぞれが２５μｌの総反応体積を含有する６つの異なる試験チューブを分析することができる：
（ｉ）１ｍｇの「Ｘ」＋２５μｌのＧＥＮＣ（１００％）。
（ｉｉ）１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ＋１２．５μｌのＧＥＮＣ（５０％）。
（ｉｉｉ）１ｍｇの「Ｘ」＋１２．５μｌのＤＭＳＯ＋１２．５μｌのＧＥＮＣ（５０％）。
（ｉｖ）１ｍｇの「Ｘ」＋６．２５μｌのＤＭＳＯ＋１８．７５μｌのＧＥＮＣ（２５％）。
（ｖ）１ｍｇの「Ｘ」＋２５μｌのＧＥＮＣ＋スクロース（１０％）。後者は０．１ｇのスクロース＋１ｍｌのＧＥＮＣである。
（ｖｉ）１ｍｇ＋１２．５μｌのＤＭＳＯ＋１２．５μｌの脱水された本発明の様々な例示的実施形態による富化されたナノ構造組成物（５０％）。後者は、ＧＥＮＣを６０℃で９０分間脱水することによって達成することができる。
【０７３８】
すべての試験チューブをボルテックス撹拌し、６０℃に加熱し、１時間振とうすることができる。
【０７３９】
これらのバイアルにおける物質「Ｘ」の溶媒としての作用を評価および比較することができる。
【０７４０】
パート３
本編は、ＤＭＳＯのさらなる削減、および、時間の経過を通しての異なる溶媒における物質の安定性／速度論の試験に関し得る。
【０７４１】
１ｍｇの物質「Ｘ」＋５０μｌのＤＭＳＯをガラスチューブに入れることができる。５０μｌのＧＥＮＣをチューブに（数秒毎に５μｌずつ）加えることができ、その後、５００μｌのＧＥＮＣ溶液（９％のＤＭＳＯ＋９１％のＧＥＮＣ）を加えることができる。
【０７４２】
第２のガラスチューブにおいて、１ｍｇの物質「Ｘ」＋５０μｌのＤＭＳＯを加えることができる。５０μｌのＲＯ水をチューブに（数秒毎に５μｌずつ）加えることができ、その後、５００μｌのＲＯ溶液（９％のＤＭＳＯ＋９１％のＲＯ）を加えることができる。
【０７４３】
これらのバイアルにおける物質「Ｘ」の溶媒としての作用を評価および比較することができる。
【０７４４】
（実施例２７）
溶媒能
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物がＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７を３０ｍｇ／ｍｌの最終濃度で溶解することができることを調べるための予言的実験を記載する。
【０７４５】
ＳＰＬ２１０１をその最適な溶媒（エタノール）に溶解することができ、ＳＰＬ５２１７をその最適な溶媒（アセトン）に溶解することができる。これら２つの化合物はガラスバイアルに入れることができ、冷暗所の環境で保つことができる。溶媒の蒸発をデシケーターにおいて長期間にわたって行うことができ、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を、微量の溶媒がすべて消失するまで溶液に加えることができる。
【０７４６】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物がＳＰＬ２１０１およびＳＰＬ５２１７を溶解することが予想される。
【０７４７】
（実施例２８）
溶媒能
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物がタキソール（パクリタキセル）を０．５ｍＭの最終濃度で溶解することができることを調べるための予言的実験を記載する。
【０７４８】
０．５ｍＭのタキソール溶液を、ＤＭＳＯ、または、１７％のＥｔＯＨを伴う本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のどちらかにおいて調製することができる（０．００１７ｇｒを４ｍｌに）。吸光度を分光光度計により検出することができる。
【０７４９】
約１５００００個の２９３Ｔ細胞を６ウエルプレートに３ｍｌのＤＭＥＭ培地とともに播種することができる。それぞれの処理物を、ＲＯまたは本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に基づくＤＭＥＭ培地において成長させることができる。タキソール（本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはＤＭＳＯに溶解される）を１．６６６μＭの最終濃度で加えることができる（１０μｌの０．５ｍＭタキソールを３ｍｌの培地に）。細胞をタキソールによる２４時間の処理の後で集め、死細胞を検出するためにトリパンブルー溶液を使用して計数することができる。
【０７５０】
タキソールがＤＭＳＯおよび本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の両方に溶解されること、ならびに、タキソールが、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に溶解された後、細胞毒性作用を含むことが予想される。
【０７５１】
（実施例２９）
溶媒能
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物がタキソールを０．０８％のエタノールの存在下において０．５ｍＭの最終濃度で溶解することができることを調べるための別の予言的実験を記載する。
【０７５２】
０．５ｍＭのタキソール溶液を調製することができる（０．００１７ｇｒを４ｍｌに）。タキソールをエタノールに溶解することができ、４０％未満のエタノールが溶液に残るまで延ばすことができるＲＴ緩速交換手順を使用して本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に交換することができる。溶液を、０．２μｍのフィルターを使用して滅菌することができる。タキソールは別途、ＤＭＳＯにおいて調製することができる（０．５ｍＭ）。両方の溶液は−２０℃で保存することができる。吸光度を分光光度計により検出することができる。
【０７５３】
約２０００個のＰＣ３細胞を、１０％のＦＣＳを伴う１００μｌのＲＰＭＩ基礎培地とともに９６ウエルプレートにおいてウエルあたり播種することができる。播種後２４時間で、２μｌ、１μｌおよび０．５μｌの０．５ｍＭタキソールを１ｍｌのＲＰＭＩ培地で希釈し、これにより、それぞれ、１μＭ、０．５μＭおよび０．２５μＭの最終濃度にすることができる。いくつか（例えば、８以上）の反復実験を処理あたり行うことができる。細胞増殖を、タキソール添加後２４時間で、クリスタルバイオレット比色測定アッセイを使用して細胞密度を定量することによって評価することができる。
【０７５４】
処理後２４時間において、細胞をＰＢＳとともに保ち、４％パラホルムアルデヒドにより固定処理することができる。クリスタルバイオレットを加え、室温で１０分間インキュベーションすることができる。細胞を数回（例えば、３回）洗浄した後、５０％エタノールにおける１００ｍＭクエン酸ナトリウムの溶液を使用して、色を細胞から溶出することができる。光学的濃度における変化を、分光光度法プレートリーダーを使用して５７０ｎｍで読み取ることができる。細胞生存性を、ブランクを引いた後で１００％と見なされるコントロールの光学的濃度の百分率として表すことができる。
【０７５５】
タキソールが本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に溶解されること、および、そのタキソールが、ＤＭＳＯに溶解されたタキソールと類似する、ヒト前立腺ガン細胞株に対するインビトロ細胞生存性／細胞毒性を示すことが予想される。
【０７５６】
（実施例３０）
溶媒能
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が、緩速溶媒交換手順を使用して、不溶性セファロスポリンを３．６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することができることを調べるための、また、アンピシリン（Ａｍｐ）抵抗性を運ぶｐＵＣ１９プラスミドにより形質転換された大腸菌ＤＨ５α菌株に対するその生物活性を評価するための予言的実験を記載する。
【０７５７】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、本実施例中では、「ＧＥＮＣ」として略記される「ガス富化ナノ構造組成物」として交換可能に示される。
【０７５８】
２５ｍｇのセファロスポリンを５ｍｌの有機溶媒（アセトン）に溶解することができる（５ｍｇ／ｍｌ）。有機溶媒をＧＥＮＣと交換する手順を、３０℃で設定することができるマルチブロックヒーターで、また、デシケーターおよびフードの中で行うことができる。有機溶媒の濃度を下記の式に従って計算することができる：
分析天秤
％アセトンｍｌ  １−０．１７３９Ｘ＝重量測定値
％エタノールｍｌ  １−０．２１５５Ｘ＝重量測定値
屈折計
％アセトンｍｌ  ０．０００６Ｘ＋１．３３２８＝屈折率（ＲＩ）値
％エタノールｍｌ  ０．０００６Ｘ＋１．３３２７＝屈折率（ＲＩ）値
【０７５９】
溶液を、０．４５μｍのフィルターを使用して首尾良くろ過することができる。溶液の分光光度計読み取りをろ過手順の前後で行うことができる。
【０７６０】
ｐＵＣ１９プラスミド（アンピシリン抵抗性）を保有するＤＨ５α大腸菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充された液体ＬＢ培地において、３７℃および２２０回転／分（ｒｐｍ）で一晩成長させることができる。１００μＬの一晩（ＯＮ）開始物を、下記のように、新鮮な液体ＬＢに再接種することができる：
（ｉ）１００μｌのＧＥＮＣ（２番目の実験のみ）および抗生物質（両方の実験）を含む３本のチューブ。
（ｉｉ）１０μｌのセファロスポリンストック溶液（５０ｕｇ／ｍｌ）を含む３本のチューブ。
（ｉｉｉ）１００μｌのセファロスポリンストック溶液（５ｕｇ／ｍｌ）を含む３本のチューブ。
【０７６１】
細菌を３７℃および２２０ｒｐｍでインキュベーションすることができる。逐次的ＯＤ読み取りを、ＴＥＣＡＮ  ＳＰＥＣＴＲＡＦｌｏｕｒ  Ｐｌｕｓを使用して、９６ウエル透明プレートを５９０ｎｍのフィルターとともに使用して１時間毎に行うことができる。
【０７６２】
セファロスポリンが、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物における実質的な希釈の後でさえ、細菌成長阻害剤として生物学的利用可能かつ生物活性であることが予想される。
【０７６３】
（実施例３１）
安定化作用
本実施例は、タンパク質の安定性に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０７６４】
市販されているＴａｑポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂ）を、ｄｄＨ２Ｏ（ＲＯ）および本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物におけるそれらの活性を求めるためにＰＣＲ反応において調べることができる。酵素を、１時間から２．５時間までの異なる期間にわたって９５℃に加熱することができる。
【０７６５】
２つのタイプの反応を行うことができる：酵素および水だけが煮沸される「水のみ」；および、反応成分のすべて（酵素、液体、緩衝液、ｄＮＴＰ類、ゲノムＤＮＡおよびプライマー）が煮沸される「すべてが内部に」。
【０７６６】
煮沸後、要求される何らかのさらなる反応成分をＰＣＲチューブに加えることができ、通常のＰＣＲプログラムを約３０サイクルにより設定することができる。
【０７６７】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、成分のすべてが熱ストレスにさらされる条件、および、酵素のみが熱ストレスにさらされる条件の両方において、酵素を加熱から保護することが予想される。
【０７６８】
（実施例３２）
安定化作用
本実施例は、タンパク質の安定性に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための別の予言的実験を記載する。この目的を達成するために、Ｐｅｑ−ｌａｂおよびＢｉｏ−ｌａｂを用いた実験が記載される。
【０７６９】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、本実施例中では、「ＧＥＮＣ」と略記される「ガス富化ナノ構造組成物」として交換可能に示される。
【０７７０】
ＰＣＲ反応を下記のように設定することができる：
Ｐｅｑ−ｌａｂサンプル
２０．４μｌのＧＥＮＣまたは蒸留水（逆浸透、ＲＯ）のどちらか
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｑ−ｌａｂ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
【０７７１】
サンプルを組み立て、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れることができる。インキュベーション時間は、６０分、７５分または９０分が可能である。３つのサンプルを調製することができる（それぞれのインキュベーション時間について１つ）。
【０７７２】
Ｔａｑ酵素を煮沸した後、下記の成分を加えることができる：
２．５μｌの１０Ｘ反応緩衝液Ｙ（Ｐｅｑ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰｓ  １０ｍＭ（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマーＧＡＰＤＨミックス  １０ｐｍｏｌ／μｌ
０．５μｌのゲノムＤＮＡ  ３５μｇ／μｌ
【０７７３】
Ｂｉｏｌａｂサンプル
１８．９μｌのＧＥＮＣまたはＲＯ水のどちらか
０．１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏ−ｌａｂ、Ｔａｑポリメラーゼ、５Ｕ／μｌ）
【０７７４】
サンプルを組み立て、９５℃の一定温度でのＰＣＲ装置に入れることができる。インキュベーション時間は、６０分、７５分、９０分、１２０分および１５０分が可能である。５つのサンプルを調製することができる（それぞれのインキュベーション時間について１つ）。
【０７７５】
Ｔａｑ酵素を煮沸した後、下記の成分を加えることができる：
２．５μｌのＴＡＱ１０Ｘ緩衝液  Ｍｇ非含有（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１．５μｌのＭｇＣｌ２  ２５ｍＭ（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
０．５μｌのｄＮＴＰｓ  １０ｍＭ（Ｂｉｏ−ｌａｂ）
１μｌのプライマーＧＡＰＤＨミックス（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
０．５μｌのゲノムＤＮＡ（３５μｇ／μｌ）
【０７７６】
それぞれの処理（ＲＯ水またはＧＥＮＣ）について、陽性コントロールおよび陰性コントロールを作製することができる。陽性コントロールは、酵素の煮沸を行わないものが可能であり、陰性コントロールは、酵素の煮沸がなく、かつ、反応にＤＮＡが存在しないもとが可能である。ＰＣＲミックスを、煮沸ｔａｑアッセイのために、同様に、コントロール反応のために作製することができる。
【０７７７】
ＰＣＲプログラム
（ｉ）９４℃、２分間の変性
（ｉｉ）９４℃、３０秒間の変性
（ｉｉｉ）６０℃、３０秒間のアニーリング
（ｉｖ）７２℃、３０秒間の伸長
工程（ｉｉ）〜工程（ｉｖ）を３０回繰り返す
（ｖ）７２℃、１０分間の伸長
【０７７８】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は両方の酵素を熱ストレスから保護することが予想される。
【０７７９】
（実施例３３）
熱脱水された多重ＰＣＲミックス
本実施例は、多重ＰＣＲシステムにおける本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の適用可能性を調べるための予言的実験を記載する。
【０７８０】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、本実施例中では、「ＧＥＮＣ」と略記される「ガス富化ナノ構造組成物」として交換可能に示される。
【０７８１】
下記の成分もまた含むことができる標準的なＰＣＲ混合物（例えば、ＫＣｌ緩衝液、ｄＮＴＰ類、Ｔａｑ、ＢＰＢ）を調製することができる：
添加物（最終濃度）：スクロース（１５０ｍＭ、２００ｍＭ）
Ｔａｑ酵素：Ｂｉｏｌａｂ
ヒトインスリン遺伝子（内部コントロール）に対するプライマー
ヒトゲノムＤＮＡ（内部コントロール）
【０７８２】
サンプルを、ＧＥＮＣまたはＲＯ水が蒸発するまでオーブンにおいて熱脱水することができる。
【０７８３】
再水和を、（Ａ）ＤＤＷのみ（ＲＯ水またはＧＥＮＣについて）、および、（Ｂ）ＰＢＦＤＶ  ＤＮＡセグメントのＥＧＤ−プライマーミックス（ＲＯ水またはＧＥＮＣ（多重）について）により行うことができる。
【０７８４】
完全なＰＣＲミックスを熱脱水し、それを、反応の忠実性を維持しながら、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を使用して再水和することが可能であることが予想される。この方法は、多目的ＰＣＲ反応のための内部コントロールとして使用することができ、これは、ＰＣＲ反応がサンプル毎に正しく行われることを保証し（これにより、偽陰性の結果を排除する）性質である。
【０７８５】
（実施例３４）
微小体積ＰＣＲ
本実施例は、小体積のＰＣＲ反応における本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の適用可能性を調べるための予言的実験を記載する。
【０７８６】
ＭＶＰを２μｌの最終体積で行うことができる。標的ＤＮＡは、例えば、ＰＤＸ遺伝子を含むプラスミドが可能である。ミックスを調製することができ、２μｌの完全ミックス（ＤＮＡ、プライマーおよび本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物をともに含有する）をチューブに小分けすることができ、ＰＣＲを行うことができる。
【０７８７】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物がＰＣＲにおいて微量反応体積に加わることが予想される。
【０７８８】
（実施例３５）
定量的ＰＣＲ
本実施例は、定量的ＰＣＲ反応（ＱＰＣＲ）における本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の適用可能性を調べるための予言的実験を記載する。ＱＰＣＲを、いくつかのＤＮＡ標的（プラスミドおよびゲノム）および遺伝子標的（βアクチン、ＰＤＸ、ＰＣＴなど）に対して、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎとともに行うことができる。
【０７８９】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を用いたＰＤＸプラスミドのＱＰＣＲは優れており、プライマーダイマーの形成を伴うことなく、指数関数的様式（１０１％の効率、指数関数的傾き）で増幅を利用することが予想される。
【０７９０】
（実施例３６）
消毒活性薬剤の分散
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物における消毒活性薬剤の分散を調べるための予言的実験を記載する。
【０７９１】
消毒組成物（チモール、サリチル酸メチル、メントールおよびオイカリプトールを含む）を含むストリップを、それらの溶媒特性を比較するために、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物および逆浸透水の両方に溶解することができる。
【０７９２】
材料
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物、ＲＯ水、Ｌｉｓｔｅｒｉｎｅ（商標）（ポケットパック）ストリップ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｃｏｎｓｕｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）。
【０７９３】
方法
消毒組成物を含むストリップを包装から取り出し、半分に切ることができる。それぞれの半分を５ｍｌの本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはＲＯ水のどちらかとともにバイアルに入れることができる。両方のバイアルを数秒間振とうし、数分間放置することができる。これらの瓶を、ストリップの半分物が完全に溶解していることを保証するために目視検査することができる。ＯＤを、ＵＳＢ２０００分光光度計（１８０ｎｍ〜８５０ｎｍの走査）を使用して、ｔ＝０およびｔ＝２時間で測定することができる。
【０７９４】
インキュベーション後、ストリップに存在する消毒組成物が、ＲＯ水と比較して、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物では、より多くの分散を伴って、より微細なミセルを時間とともに生じさせたことが予想される。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の場合、相分離が全く認められないか、または少ないことがさらに予想される。
【０７９５】
（実施例３７）
疎水性
本実施例は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の疎水性を調べるための予言的実験を記載する。
【０７９６】
材料
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物、着色剤（例えば、フェノールブロミドブルー）およびプラスチック装置（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２００７／０７７５６２（その内容は本明細書により参照によって組み込まれる）に記載されるプラスチック装置など）。装置は、疎水性プラスチック樹脂から作製される上部チャンバーおよび下部チャンバーを含む。上部チャンバーおよび下部チャンバーは、疎水性の毛細管流路として作用する非常に狭い流路が４つの上部チャンバーを１つだけの下部チャンバーと相互に連絡させるように成形される。これらの疎水性毛細管流路は典型的な膜または他の生物学的バリアをシミュレーションする。
【０７９７】
方法
色ミックスを本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物または水により１：１の希釈で希釈することができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の１０マイクロリットルの液滴＋色組成物を第１のプラスチック装置の４つの上部チャンバーに入れることができる。並行して、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の５００マイクロリットルの液滴を上部チャンバーの真上においてプラスチック装置の下部チャンバーに入れることができる。
【０７９８】
同様に、水の１０マイクロリットルの液滴＋色組成物を、（第１の装置と類似する）第２のプラスチック装置の４つの上部チャンバーに入れることができ、同時に、並行して、水の５００マイクロリットルの液滴を上部チャンバーの真上においてプラスチック装置の下部チャンバーに入れることができる。それぞれのプラスチック装置における色素の場所を、液滴を置いた１５分後に分析することができる。
【０７９９】
水および色ミックスを含むプラスチック装置の下部チャンバーが透明であること、ならびに、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物および色ミックスを含むプラスチック装置の下部チャンバーが色を示すことが予想される。そのような結果は、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が疎水性毛細管を通って流れることができるように、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が疎水性を含むことを示し得る。
【０８００】
（実施例３８）
凍結保護
本実施例は、凍結および解凍の後での精子の性状に対する、標準的な凍結保護溶液を伴う本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０８０１】
精子の運動性を、運動性精子細胞の数を計数することによって、Ｈｅｌｂｅｒ小カメラの助けをかりて光学顕微鏡で測定することができる。精子の生存性を、染色によって、例えば、エオシン・ニグロシン染色によって測定することができる。精子ＤＮＡ断片化を精子クロマチン構造アッセイ（ＳＣＳＡ）によって測定することができる。精子が卵子と受精する能力を、運動性精子オルガネラ形態学検査（ＭＳＯＭ）によって測定することができる。ＭＳＯＭでは、特定の正常な形態学および前進運動性（それぞれが、受精能のある細胞についてのマーカーとして作用することが文献において示される）を有する精子細胞の数が検査される。
【０８０２】
凍結保護緩衝液は、ＴＲＩＳ緩衝液、卵黄およびグリセロールを含む標準的な凍結保護緩衝液（例えば、ＴＥＳ緩衝液）が可能である。そのような凍結保護緩衝液が、Ｉｒｖｉｎｅ  ｓｃｉｅｎｆｉｃ（Ｓａｎｔａ  Ａｎｎａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されている。
【０８０３】
精子サンプルを、生殖能力が正常よりも低い男性志願者から得ることができ、例えば、徐々に温度が下がるプログラムを使用して、ＰＬＡＮＥＲ  ＫＲＹＯ−１０装置において凍結することができる。試料を、ＴＥＳの存在下（５０％の精子、５０％のＴＥＳ）、または、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下（５０％の精子、２５％のＴＥＳおよび２５％の本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物）のどちらかにおいて凍結することができる。凍結された精子を、分析のために、約２日後に解凍することができる。精子の性状に対する凍結後のこれら２つの緩衝液の保護作用を、同じ精液の凍結されていない自然のままの精子と比較することができる。実験を複数回（例えば、３回以上）繰り返すことができる。
【０８０４】
生存している正常な細胞の割合がより大きくなる、精子の運動性、生存性およびＤＮＡ断片化における改善が、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含有する凍結用カクテルについては予想される。
【０８０５】
（実施例３９）
エレクトロコンピテント細胞における形質転換効率
本実施例は、エレクトロコンピテント細胞における形質転換効率に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０８０６】
エレクトロコンピテント細胞を、水成分（Ｈ２Ｏ）が、種々の工程において、また、種々の組合せで本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物により置換される標準的プロトコルに従って調製することができる。
【０８０７】
大腸菌細胞を対数期まで富栄養培地で成長させることができ、その後、遠心分離によって集めることができる。この富栄養培地は、アミノ酸、ビタミン、無機ミネラルおよび微量ミネラルをＬＢブロスの場合よりも高いレベルで提供する富栄養基剤を有する。培地は、ｐＨにおける低下を防止するために、また、リン酸源を提供するために、リン酸カリウムによりｐＨ７．２±０．２で緩衝化することができる。これらの改変は、ＬＢにより達成され得るよりも高い細胞収量を可能にする。
【０８０８】
ペレットを標準的な冷水で数回（例えば、３回）洗浄し、１０％のグリセロールを含む水（標準）、あるいは、２％、５％または１０％のグリセロールを含有する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のどちらかにおいて再懸濁することができ、その後、−８０℃で凍結することができる。
【０８０９】
エレクトロポレーションを、水で希釈されたｐＵＣプラスミドＤＮＡを使用して標準的な条件のもとで行うことができ、細菌を、コロニー計数のために抗生物質を含むＬＢ平板に置床することができる。コロニーを翌日に計数することができ、形質転換効率を求めることができる。
【０８１０】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の希釈物におけるエレクトロコンピテント細菌の再懸濁は形質転換効率を増大させることが予想される。
【０８１１】
（実施例４０）
化学的コンピテント細胞におけるＤＮＡ取り込み
本実施例は、研究された種々の化学的コンピテント細胞によるＤＮＡ取り込みに対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０８１２】
ｐＵＣプラスミドＤＮＡを水または本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のどちらかにおいて１：１０で希釈することができ、例えば、熱ショック法を使用して、細菌株ＸＬ１  Ｂｌｕｅの形質転換のために使用することができる。氷上での１０分間のインキュベーションの後、細菌と一緒にＤＮＡを４２℃で３０秒間インキュベーションすることができ、コロニー計数のために抗生物質を含むＬＢ平板に置床することができる。コロニーを翌日に計数することができ、形質転換効率を求めることができる。
【０８１３】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物におけるＤＮＡの希釈はコンピテント細胞によるＤＮＡ取り込みを改善することが予想される。
【０８１４】
（実施例４１）
ヒト細胞におけるＤＮＡ取り込み
本実施例は、初代ヒト細胞培養物におけるｄｎａ取り込みに対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０８１５】
ヒト骨髄初代細胞をＭｅｍ−α／２０％ウシ胎児血清において成長させることができ、細胞培養の約２４時間前に８０％のコンフルエンスになるように置床することができる。細胞を、標準的なＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））トランスフェクション手順を使用して緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）構築物によりトランスフェクションすることができる。トランスフェクションを、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物と、コントロール実験のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の量の１２．５％とのミックスを使用して繰り返すことができる。
【０８１６】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物と、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００との組合せが初代細胞におけるトランスフェクション効率を増大させることが予想される。
【０８１７】
（実施例４２）
抗生物質の取り込み
本実施例は、抗生物質のコロニー取り込みに対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０８１８】
細菌コロニーを、抗生物質の存在下および非存在下、ペプトン／寒天平板において成長させることができる。この目的を達成するために、枯草菌の細菌コロニーを本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下および非存在下で事前に成長させることができ、その後、１０ｇ／ｌのペプトンを含む０．５％寒天に置床することができる。細菌コロニーはまた、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の調製で使用された原料粉末と同じ原料粉末と混合された逆浸透水の存在下で事前に成長させることができ、その後、１０ｇ／ｌのペプトンを含む０．５％寒天に置床することができる。Ｔ株細菌コロニーを本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下および非存在下で事前に成長させることができ、その後、同じ最小阻害濃度（ＭＩＣ）でのストレプトマイシンの存在下および非存在下の両方で、（本発明のナノ構造組成物を使用して調製される）５ｇ／ｌのペプトンを含む１．７５％寒天に置床することができる。
【０８１９】
細菌コロニーは、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下ではより大きいことが予想される。コロニーが、コントロールの平板と比較して、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下では異なるパターンを示すこともまた予想される。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、逆浸透水と比較して、より速い細菌成長をもたらすこと、および、粉末が補充された逆浸透水はより遅い成長を示すこともまた予想される。ストレプトマイシンおよび本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の組合せはコロニーのサイズを低下させることもまた予想される。
【０８２０】
（実施例４３）
細菌成長およびルミネセンス
本実施例は、細菌の成長およびフォトルミネセンスに対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０８２１】
生物発光性ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  Ｈａｒｖｅｙｉ）細菌（例えば、ＢＢ１２０株）を、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含む培地、または、蒸留水を含む培地のどちらかにおいて成長させることができる。ルミネセンスおよび濁度の測定を、標準的なＥＬＩＳＡリーダーを使用して行うことができる。
【０８２２】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物がビブリオ細菌の成長およびルミネセンス遺伝子の発現を増大させることが予想される。
【０８２３】
（実施例４４）
皮膚クリームの取り込み
本実施例は、インビボでの皮膚クリーム取り込みに対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０８２４】
ざ瘡に苦しむ患者に、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下および非存在下、市販の皮膚クリーム（例えば、Ｃｌｅａｒａｓｉｌ、Ａｌｌｅｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）を局所投与することができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物によるクリームの希釈は１：１の比率において可能である。
【０８２５】
皮膚クリームに対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の治療的利点を、ＵＶ光Ｆａｃｉａｌ  Ｓｔａｇｅ（Ｍｏｒｉｔｅｘ（日本）から市販されている）によって測定することができる。皮膚クリームは、数日間（例えば、３日間）にわたって１日に１回、患者に塗布することができる。
【０８２６】
ざ瘡箇所の数が、皮膚クリームおよび本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の組合せによる処置の後では急速に減少することが予想される。
【０８２７】
（実施例４５）
ヒトハイブリドーマの単離
本実施例は、モノクローナル抗体製造の第１段階、すなわち、ハイブリドーマの単離に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０８２８】
細胞成長のための試薬
ＲＰＭＩ１６４０（Ｂｅｉｔ−ＨａＥｍｅｋ（イスラエル）から粉末として市販されている）を、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物、または、逆浸透によって精製されたコントロール水のどちらかにおいて再構成することができる。再構成後、重炭酸ナトリウムを製造者の勧めに従って培地に加えることができ、ｐＨを７．４に調節することができる。培養培地には、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＭＥＭ−ビタミン（０．１ｍＭ）、非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）およびピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を補充することができる（すべてが、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている）。ＨＣＦがＯｒｉＧｅｎから市販されている。補充物のすべてを、液体の、水に基づく形態で導入することができ、試験培地およびコントロール培地に希釈することができる。８−アザグアニン、ＨＴおよびＨＡＴ（これらはＳｉｇｍａから市販されている）を、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはコントロールＲＰＭＩのどちらかを用いて粉末形態から再構成することができる。
【０８２９】
化学試薬
粉末化ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている）を、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはコントロール水のどちらかを用いて再構成することができる。フレーク化ＰＥＧ−１５００（Ｓｉｇｍａから市販されている）を、無菌ＰＢＳ（５０％ｗ／ｖ）の両方の形態を用いて再構成することができる；液体ＰＥＧのｐＨを約７に調節することができ、これをフィルター滅菌することができる。ハンクス平衡塩溶液がＢｅｉｔ−ＨａＥｍｅｋから市販されている。ＥＬＩＳＡプレート被覆のための炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ＝９．６）、ＯＰＤ（これは０．４ｍｇ／ｍＬで使用することができる）およびリン酸塩−クエン酸塩緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ＝５．０）がＳｉｇｍａから市販されている。
【０８３０】
抗体
ヤギ抗ヒトＩｇＭおよびＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＭがＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから市販されており、標準ヒトＩｇＭがＳｉｇｍａから市販されている。
【０８３１】
融合
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および融合パートナー（ＭＦＰ−２）細胞を、混合およびペレット化の前に、血清非含有培地で数回（例えば、４回）洗浄することができる。３７℃に事前に加温された３００μｌのＰＥＧ−１５００を細胞混合物（約１０ｘ１０６個〜２００ｘ１０６個の細胞）に加えることができ、一定の振とうとともに３分間インキュベーションすることができる。その後、ＰＥＧをハンクス平衡塩溶液および完全ＲＰＭＩにより希釈して細胞混合物から範囲外にすることができる。ウシ胎児血清（１０％）およびＨＴ（ｘ２）を、得られた細胞懸濁物に加えることができる。このプロセスの期間中に生じるハイブリドーマを、ＨＡＴ選抜とともに、完全ＲＰＭＩで９６ウエルプレートにおいて培養することができる。抗体についての上清のスクリーニングを、ハイブリドーマ細胞がウエルのおよそ１／４を占めるときに開始することができる。
【０８３２】
サンドイッチＥＬＩＳＡ
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ハイブリドーマ上清をＩｇＭについてスクリーニングすることができる。捕獲抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＭ）を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液において調製し、１００ｎｇ／１００μｌ／ウエルの濃度で９６ウエルプレートに加えることができる。プレートを４℃で一晩インキュベーションすることができる。
【０８３３】
その後の工程は室温で行うことができる。ＰＢＳにおける０．３％乾燥乳による１時間のブロッキング処理の後、ハイブリドーマ由来の上清を１．５時間の持続期間にわたって加えることができる。ＰＢＳにおいて１：５００で希釈されたヒト血清を陽性コントロールとして使用することができる。ハイブリドーマ成長培地を陰性コントロールとして使用することができる。二次抗体（例えば、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＭ）を１：５０００の濃度でブロッキング溶液において調製し、１時間インキュベーションすることができる。比色測定反応を生じさせるために、プレートを、０．０３％のＨ２Ｏ２を含有するリン酸塩−クエン酸塩緩衝液におけるＯＰＤとインキュベーションすることができる。色反応を１５分後に１０％塩酸により停止させることができる。反応の読み取りおよび記録を、４９２ｎｍの波長フィルターを使用してＭｕｌｔｉｓｃａｎ−Ａｓｃｅｎｔで行うことができる。
【０８３４】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、安定化影響のために、コントロールと比較して、ハイブリドーマの作製におけるより大きい一貫性を可能にすることが予想される。ヒトモノクローナル抗体を分泌する安定なハイブリドーマクローンを作出および単離するプロセスが本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物では強化されることもまた予想される。
【０８３５】
（実施例４６）
ヒトハイブリドーマのクローン化
関連したハイブリドーマを単離した後におけるモノクローナル抗体製造における次の工程が、その関連したハイブリドーマをクローン化によって安定化することである。本実施例は、ヒトハイブリドーマのクローン化に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０８３６】
クローン化
ハイブリドーマのクローン化を標準的プロトコルに従って行うことができる。限定された数（およそ１０４個）の細胞を９６ウエルディッシュの上段列にわたって連続希釈することができ、その後、第１列の内容物を残る８列において下方向に連続希釈することができる。このようにして、プレートの右下隅に向かうウエルが、単一細胞を有する傾向になる。
【０８３７】
ＩｇＭ含有量についてのスクリーニング
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ハイブリドーマ上清をＩｇＭについてスクリーニングすることができる。捕獲抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＭ）を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液において調製し、１００ｎｇ／１００μＬ／ウエルの濃度で９６ウエルプレートに加えることができる。プレートを＋４℃で一晩インキュベーションすることができる。
【０８３８】
その後の工程は好ましくは、室温で行われる。ＰＢＳにおける０．３％乾燥乳による１時間のブロッキング処理の後、ハイブリドーマ由来の上清を１．５時間加えることができる。ＰＢＳにおいて１：５００で希釈されたヒト血清を陽性コントロールとして使用することができる。バックグラウンドのために、また、陰性コントロールとして、ハイブリドーマ成長培地を使用することができる。二次抗体（例えば、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＭ）を１：５０００の濃度でブロッキング溶液において調製し、１時間インキュベーションすることができる。比色測定反応を生じさせるために、プレートを、０．０３％のＨ２Ｏ２を含有するリン酸塩−クエン酸塩緩衝液におけるＯＰＤとインキュベーションすることができる。色反応を１５分後に１０％塩酸により停止させることができる。反応の読み取りおよび記録を、４９２ｎｍの波長フィルターを使用してＭｕｌｔｉｓｃａｎ−Ａｓｃｅｎｔで行うことができる。
【０８３９】
統計学的有意差がＩｇＭ産生クローンの頻度の間にないか、または、それぞれのプレートで産生される抗体量の分布の間にないことにより、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物におけるハイブリドーマクローンが、ＨＣＦを伴うコントロール培地の場合と同様であることが示され得る。クローン化が、ＨＣＦの添加がないコントロール培地において行われないことは、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が、不安定なハイブリドーマのクローン化性を高める環境をもたらすことを示し得る。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物における融合後のハイブリドーマ回収の高まった頻度はまた、高まったクローン化性を示し得る。
【０８４０】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物は、物理的な細胞融合の効率を高めることによって、または、融合プロセスで作製されるハイブリドーマを安定化することによって融合プロセスを改善することが予想される。
【０８４１】
（実施例４７）
増殖
本実施例は、増殖に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。この予言的実験はヒト間葉系細胞に対して行うことができる。
【０８４２】
ヒト間葉系幹細胞の増殖を、ＲＯ水または本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に基づく培地において調べることができる。
【０８４３】
培地調製
２５０ｍｌのＭＥＭα培地を、２．５ｇのＭＥＭおよび０．５５ｇのＮａＨＣＯ３をＲＯ水または本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のどちらかに加えることによって調製することができる。
【０８４４】
細胞培養
細胞を、２０％ウシ胎児血清、１００ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充されたＭＥＭαにおいて維持することができる（例えば、Ｃｏｌｔｅｒ他、２００１、ＰＮＡＳ、９８：７８４１〜７８４５を参照のこと）。細胞を計数し、２つのタイプのＭＥＭα培地（一方がＲＯ水に基づき、他方が本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に基づく）で１ｍｌあたり５００細胞の濃度に希釈することができる。細胞を９６ウエルプレートにおいて成長させることができる（各ウエルにおいて５０個の細胞を有する１００μｌの培地）。８日後、細胞増殖をクリスタルバイオレット生存性アッセイによって推定することができる。このアッセイにおける色素により、ＤＮＡが染色される。可溶化したとき、単層によって取り込まれた色素の量を５９０ｎｍにおいてプレートリーダーで定量することができる。
【０８４５】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物が細胞の増幅を増大させることが予想される。
【０８４６】
（実施例４８）
ヒトハイブリドーマの単離
本実施例は、ヒトハイブリドーマの単離に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための別の予言的実験を記載する。
【０８４７】
材料
細胞成長のための試薬
細胞成長のための培地および補充物が、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。ＲＰＭＩ１６４０およびＤＭＥＭを粉末形態で得ることができ、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはＤＩ水のどちらかにおいて再構成することができる。再構成後、重炭酸ナトリウムを製造者の勧めに従って培地に加えることができ、ｐＨのさらなる調節は不要であり得る。使用前に、培地は０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通してフィルター滅菌することができる。ハイブリドーマ細胞の成長のために、ＲＰＭＩには、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ＭＥＭ−ビタミン（０．１ｍＭ）、非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）およびピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を補充することができる。上記の補充物のすべてが液体形態で提供され、これらは、製造者から得られたままで使用することができる。したがって、それらは本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはコントロール水に希釈することができる。コントロール水は、ＤＩに基づく培地、すなわち、１８．２メガオームの超純粋脱イオン化水（ＤＩ水、ＵＨＱ  ＰＳ、ＥＬＧＡ  Ｌａｂｗａｔｅｒ）が可能である。８−アザグアニン、ＨＴおよびＨＡＴ（これらはＳｉｇｍａから市販されている）を本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはＤＩのＲＰＭＩにより粉末形態から再構成することができる。ヒト初代線維芽細胞およびＣＨＯ細胞の成長のために使用されるＤＭＥＭには、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を補充することができる。ハイブリドーマクローン化因子がＢｉｏＶｅｒｉｓから市販されている。
【０８４８】
化学試薬
粉末化ＰＢＳが、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。ＰＥＧ−１４５０（Ｐ５４０２）がＳｉｇｍａから市販されており、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはコントロール水に基づく無菌ＰＢＳにより再構成することができる（５０％ｗ／ｖ）。調製物はｐＨ７．２に調節することができる。ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａから市販されている）を１０％に加えることができ、その後、ＰＥＧ溶液を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されている）に通して無菌ろ過することができる。ハンクス平衡塩溶液が、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｂｅｉｔ−ＨａＥｍｅｋ  ＬＴＤ（イスラエル）から市販されており、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物およびコントロールの場合のように使用することができる。ＥＬＩＳＡプレート被覆のための炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ＝９．６）、ＯＰＤ（これは０．４ｍｇ／ｍＬで使用される）およびリン酸塩−クエン酸塩緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ＝５．０）がＳｉｇｍａから市販されている。
【０８４９】
抗体
ヤギ抗ヒトＩｇＭ／ＩｇＧおよびＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＭ／ＩｇＧがＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから市販されている。標準ヒトＩｇＭ／ＩｇＧがＳｉｇｍａから市販されている。
【０８５０】
細胞
ＭＦＰ−２、ＣＨＯおよび初代ヒト線維芽細胞を、細胞が実験前に培地に順応し得るように、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を含有する培地、および、コントロール培地において１週間維持することができる。加えて、融合パートナー細胞株のＭＦＰ−２は、ウシ胎児血清および添加物が、ＨＧＰＲＴ陰性の表現型を維持するための８−アザグアニンと一緒に加えられるＲＰＭＩ１６４０において維持することができる。初代ヒト線維芽細胞をＡＴＣＣから得ることができ、ＤＭＥＭにおいて維持することができる。ＣＨＯ細胞株はＤＭＥＭにおいて維持することができる。すべての細胞培養を、ウシ胎児血清、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンが添加された培養培地からなる完全培地において行うことができる。ＭＦＰ−２細胞株については、ビタミン、非必須アミノ酸およびピルビン酸塩を完全培地において加えることができる。
【０８５１】
方法
細胞融合
ヒト末梢血リンパ球とのハイブリドーマの作製のための融合剤（ｆｕｓｏｇｅｎ）として作用するＰＥＧ１４５０を用いる化学的融合技術［Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７］を用いることができる。ＰＥＧ１４５０が典型的には、１０％のＤＭＳＯが添加されるＰＢＳにおいて調製される。これらの実験のために、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を、ＰＥＧ／ＤＭＳＯ溶液を作製するために使用され得るＰＢＳを調製するために使用することができる；コントロール調製物として、ＰＧＥを、コントロール水に基づくＰＢＳにおいて調製することができる。本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物をコントロール水と比較する融合実験のために、試薬を、ウシ胎児血清および補充物の高濃度物を除いて、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはコントロール水のどちらかにおいて調製することができる。加えて、ＰＥＧ−１４５０による融合の後、ハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）での細胞の希釈（下記を参照のこと）を、製造者から得られたままで使用される液体形態のＨＢＳＳ（Ｂｅｉｔ  ＨａＥｍｅｋ（イスラエル）から市販されている）により行うことができる。
【０８５２】
ハイブリドーマの作製のために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を４０ｍＬの新鮮な採血された全血から単離し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Ｓｉｇｍａから市販されている）により精製し、コントロール水に基づく血清非含有の培養培地で４回洗浄することができる。ＭＦＰ−２融合パートナー細胞を、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に基づく培地、または、コントロール水に基づく培地のどちらかにおいて成長させることができ、その後、血清を含まないそれぞれの培地により数回（例えば、４回）洗浄することができ、それぞれの実験のために、単一バッチのＰＢＭＣを２つの等量の分画物に分けることができる；それらの一方が本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物のために使用され、他方がコントロール水での融合のために使用される。次いで、ＭＦＰ−２およびＰＢＭＣを、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物に基づく血清非含有の培地、または、コントロール水に基づく血清非含有の培地において混合し、ペレット化することができる。その後、３７℃に予め加温されたＰＥＧ−１４５０を１０ｘ１０６個〜２００ｘ１０６個の混合細胞について３００μＬで加えることができる。細胞混合物を一定の振とうとともに数分間（例えば、３分間）ＰＥＧとインキュベーションすることができる。ＰＥＧを、ハンクス平衡塩溶液および完全ＲＰＭＩ（本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはコントロール水のどちらかにおいて調製される）により希釈して細胞混合物から範囲外にすることができる。得られた細胞懸濁物に、ウシ胎児血清（１０％）およびＨＴ（Ｘ２）を加えることができる。このプロセスで作製されるハイブリドーマを、ＨＡＴ選抜とともに、完全ＲＰＭＩで９６ウエルプレートにおいて培養することができる（細胞密度−ウエルあたり２ｘ１０６個のリンパ球）。免疫グロブリン産生についての上清のスクリーニングを、ハイブリドーマ細胞がウエルのおよそ１／４を占めた後で行うことができる。
【０８５３】
サンドイッチＥＬＩＳＡ
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ハイブリドーマ上清をＩｇＭ／ＩｇＧについてスクリーニングすることができる。捕獲抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＭ／ＩｇＧ）を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液において調製し、１００ｎｇ／１００μＬ／ウエルの濃度で９６ウエルプレートに加えることができる。プレートを４℃で一晩インキュベーションすることができる。
【０８５４】
その後の工程は好ましくは、室温で行われる。
【０８５５】
ＰＢＳにおける０．３％乾燥乳による１時間のブロッキング処理の後、ハイブリドーマ由来の上清を１．５時間加えることができる。ＰＢＳにおいて１：５００で希釈されたヒト血清を陽性コントロールとして使用することができる。バックグランドのために、また、陰性コントロールとして、ハイブリドーマ成長培地を使用することができる。二次抗体（例えば、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＭ／ＩｇＧ）を１：５０００の濃度でブロッキング溶液において調製し、１時間インキュベーションすることができる。比色測定反応を生じさせるために、プレートを、０．０３％のＨ２Ｏ２を含有するリン酸塩−クエン酸塩緩衝液におけるＯＰＤとインキュベーションすることができる。色反応を１５分後に１０％ＨＣｌにより停止させることができる。反応の読み取りおよび記録を、４９２ｎｍの波長フィルターを使用して、（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている）Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ−Ａｓｃｅｎｔ  ＥＬＩＳＡリーダーを用いて行うことができる。すべての試薬が、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはＤＩ水に基づくハイブリドーマ上清から好ましくはなるサンドイッチ層を除いて、標準的であり得る。
【０８５６】
クローン化
選ばれたクローンの２００個の細胞を培地の１０ｍＬの体積で希釈し、平均してウエルが１個〜２個の細胞を含有したように９６ウエルプレートに播種することができる（１００μＬ／ウエル）。細胞をインキュベーションし、定期的に養分補給し、クローン成長について顕微鏡でモニターすることができる。クローンがウエルの１／４〜１／２を占めると、クローンの上清を分析することができる。クローン化の効率を、プレートあたりの生存クローンの数で表すことができる。１０パーセントのＨＣＦ（ハイブリドーマクローン化因子）を実験設計に従って加えることができる。
【０８５７】
細胞成長アッセイ
初代細胞株および不死化細胞株の成長をクリスタルバイオレット色素保持アッセイによりモニターすることができる。一定数の細胞を多数の反復で９６ウエルプレートに播種することができる。細胞成長を４％ホルムアルデヒドでの固定処理によって停止させることができる。固定処理された細胞を０．５％クリスタルバイオレットにより染色することができ、その後、水による徹底した洗浄を行うことができる。保持された色素を、５０％エタノール（ｖ／ｖ）における０．１Ｍクエン酸ナトリウムの１００μＬ／ウエルに抽出することができる。ウエルの吸光度を、例えば、Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ−Ａｓｃｅｎｔマイクロプレートリーダーおよび適切なフィルターを使用して、５５０ｎｍで読み取ることができる。
【０８５８】
初代ヒト線維芽細胞の培養
約２０代目の継代から出発して、ヒト線維芽細胞を、細胞が典型的な線維芽細胞形態学を示し、かつ、その数が、最初に播種された量よりも少なく低下しない限り、毎週、培養および継代培養することができる。継代培養の回数、および、集団倍加の計算の数字を記録することができる。細胞の形態学および生存性を顕微鏡でモニターすることができる。
【０８５９】
データ分析
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物を用いた実験と、コントロール実験との間での融合およびクローン化の効率における差の統計学的有意性をχ二乗検定によって決定することができる。初代ヒト線維芽細胞を用いた成長試験の結果をアンペアードスチューデントｔ検定によって分析することができる。０．０５未満の統計学的ｐ値が有意であると見なされ得る。
【０８６０】
下記の結果が、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下において予想される：ヒトモノクローナル抗体の製造のためのハイブリドーマ形成の高まった効率、ハイブリドーマサブクローンの増大した収量、ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の増大した分泌、高まった細胞増殖、不死性細胞株のより速い成長、および、初代ヒト線維芽細胞のより遅い成長。
【０８６１】
（実施例４９）
幹細胞の成長
ＭＳＣは、自身およびその回りの細胞に影響を及ぼす様々な因子を分泌することが知られているオートクリン／パラクリン細胞である［ＣａｐｌａｎおよびＤｅｎｎｉｓ、２００６、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、９８（５）：１０７６〜８４］。Ｇｒｅｇｏｒｙ他［Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｓｉｎｇｈ他、２００３、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００３（７月２５日）：２７８（３０）：２８０６７〜７８。Ｅｐｕｂ、２００３年５月９日］は、１ｃｍ２あたり５個の細胞での培養ＭＳＣが、それらの増殖を高めるＷｎｔシグナル伝達経路のｄｉｃｋｋｐｏｆ１（ＤＫＫ１）を分泌することを示している。類似する効果を、非常に低い密度で播種された非常に増殖している細胞から得られる培地を２０％加えることによって達成することができる。
【０８６２】
本実施例は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の成長に対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。
【０８６３】
細胞培養
ヒト骨髄（ＢＭ）細胞を、承認されたプロトコルのもと、成人ドナーから得ることができる。ヒト骨髄細胞は下記のように培養することができる。培養培地成分が、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｔｈ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）から市販されている。
【０８６４】
１０ｍｌのＢＭ吸引物を、年齢が１９歳〜７０歳の間の男性ドナーおよび女性ドナーの腸骨稜から採取することができる。単核細胞を、密度勾配（ｆｉｃｏｌｌ／ｐａｑｕｅ、Ｓｉｇｍａから市販されている）を使用して単離することができ、２５ｍＭのグルコースを含有し、かつ、１６％のＦＢＳ（ロット番号ＣＰＢ０１８３、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、Ｕｈａｈ）から市販されている）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたαＭＥＭ培地に再懸濁することができる。細胞を１０ｃｍの培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（ＮＹ）から市販されている）に置床し、５％の加湿ＣＯ２とともに３７℃でインキュベーションすることができる。２４時間後、非接着性細胞は捨てることができ、接着性細胞を、ＰＢＳにより２回、徹底的に洗浄することができる。細胞を５日間〜７日間インキュベーションし、０．２５％のトリプシンおよび１ｍＭのＥＤＴＡによる３７℃での５分間の処理によって集め、１ｃｍ２あたり５０個〜１００個の細胞で播種し、コンフルエンスにまで培養することができる。
【０８６５】
上記継代培養の後、細胞を１ｃｍ２あたり５０細胞〜１００細胞の密度で２４ウエルプレートに播種することができ、粉末化培地（例えば、０１−０５５−１Ａ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｔｈ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）から市販されている）から調製することができる、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物またはＲＯ水に基づく培地において培養することができる。細胞生存性を、合計で２０日間にわたって５日毎に１回、クリスタルバイオレットアッセイによりアッセイすることができる。ドナーの１名に由来する細胞を上記密度で６ウエルプレートに播種することができ（三連）、細胞を、血球計を使用して計数することができる。
【０８６６】
本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物におけるＭＳＣの成長速度が、少なくとも低い細胞密度では高まることが予想される。
【０８６７】
（実施例５０）
電気化学発光反応
本実施例は、電気化学発光（ＥＣＬ）検出システムに対する本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の影響を調べるための予言的実験を記載する。この手順は、免疫ペルオキシダーゼＥＣＬ検出システムを本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物の存在下および非存在下で使用するＨＲＰコンジュゲート化二次抗体の検出を含むことができる。
【０８６８】
ＥＣＬ試薬の調製：
ストックＡ
（ｉ）５０μｌの、ＤＭＳＯ（Ｆｌｕｃａ、０−９２５３）における２５０ｍＭルミノール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ−９００８）。
（ｉｉ）２２μｌの、ＤＭＳＯにおける９０ｍＭ  ｐ−クマリン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｃ−９００８）。
（ｉｉｉ）０．５ｍｌのＴｒｉｓ（１Ｍ、ｐＨ８．５）。
（ｉｖ）４．４２８ｍｌのＨ２Ｏ（合計で５ｍｌ）。
ストックＢ
（ｉ）３μｌのＨ２Ｏ２。
（ｉｉ）０．５ｍｌのＴｒｉｓ（１Ｍ、ｐＨ８．５）。
（ｉｉｉ）４．５ｍｌのＨ２Ｏ（合計で５ｍｌ）。
【０８６９】
ＥＣＬ試薬の下記供給源を使用することができる。
【０８７０】
標準物；Ｖｅｒ１．０、この場合、ｄＨ２Ｏが、試薬および緩衝液のすべてについて、本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物により置き換えられる；および、Ｖｅｒ１．１、この場合、反応体積のｄＨ２Ｏが本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物により置き換えられる。
【０８７１】
全細胞タンパク質抽出をＪｕｒｋａｔ細胞から作製することができる。タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することができ、その後、ニトロセルロースメンブランへのタンパク質ブロッティングを行うことができる。ＺＡＰ７０タンパク質について特異的な抗体（自家製ポリクローナル血清Ａｂ）を１：３００００の希釈度（通常の作業希釈度、１：３０００）でメンブランとインキュベーションすることができる。抗体と免疫反応し得るタンパク質のバンドを、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体との反応、その後、免疫ペルオキシダーゼＥＣＬ検出システムによる現像によって可視化することができる。等体積のストックＡおよびストックＢを一緒にすることができ、検出ミックスを５分間平衡化することができる。検出ミックスを（タンパク質側を上にした）ブロットに直接に加え、室温で約３分間インキュベーションすることができる。ｘ線フィルムを、１分間、５分間および１０分間、ニトロセルロースメンブランにさらすことができる。
【０８７２】
水を本発明の実施形態の富化されたナノ構造組成物により置き換えることにより、ＥＣＬ反応の感度が増大することが予想される。
【０８７３】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０８７４】
本書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【０８７５】
国際特許公開番号ＷＯ２００７／０７７５６２、同ＷＯ２００７／０７７５６０、同ＷＯ２００７／０７７５６１、同ＷＯ２００７／０７７５６３、同ＷＯ２００８／０８１４５６、および同ＷＯ２００８／０８１４５５の教示は、本発明のいくつかの実施形態の範囲から除外される。
【配列表フリーテキスト】
【０８７６】
配列番号１〜４は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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