(57)【要約】  本発明は、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、それをコードする核酸配列、発現カセットおよびベクター、対応するコーティング核酸配列を含んでいる組換え微生物、前記１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの生産方法、前記酵素を用いる１２α−ヒドロキシステロイドの酵素酸化方法、前記酵素を用いる１２−ケトステロイドの酵素還元方法、前記１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いる１２−ケトステロイドおよび／または１２α−ヒドロキシステロイドの定性的または定量的測定方法、および前記１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いる酵素触媒コール酸酸化を含む、ウルソデオキシコール酸の生産方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約２７ないし３０ｋＤの範囲を有する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．から得られる精製した１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤＨ）。
【請求項２】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ株４８−５０（ＤＳＭ４０２９）から得られる請求項１の１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
約１０Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有する請求項１または２の１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
少なくとも以下の配列モチーフを有する１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ：
【化１９】
2011526481.tif 000025
【請求項５】
ａ）各自位置＋１または＋２から始まって、配列同定Ｎｏ．２または４に従ったアミノ酸配列の一つを含む；または
ｂ）少なくとも６０％の配列同一性パーセントを有する、ａ）に従った配列から誘導されたアミノ配列を含む；または
ｃ）上のａ）およびｂ）に従ったタンパクをコード化する核酸配列によってコードされる；または
ｄ）配列同定Ｎｏ．１または３に従ったコード化核酸配列によってコード化される；または
ｅ）少なくとも６０％の配列同一性パーセントを有する、配列同定Ｎｏ．１または３に従った核酸配列から誘導されるコード化配列によってコード化される、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
修飾された補基質利用および／または減少した生成物阻害を有する１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ突然変異体。
【請求項７】
ａ）配列レチーフＶＬＴＧＲＮＥ（配列同定Ｎｏ．１２）において補基質利用を修飾する少なくとも一つの突然変異；および／または
ｂ）酵素の配列結合ポケットを形成するアミノ酸残渣の領域中の生成物阻害を減少する少なくとも一つの突然変異を有する、請求項１ないし５のいずれかの１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼから誘導された請求項６の突然変異体。
【請求項８】
ａ）配列同定Ｎｏ．１２においてＧ→ＤおよびＲ→Ａのアミノ酸置換の少なくとも一つを含む；または
ｂ）配列同定Ｎｏ．４の位置９７に相当するアミノ酸Ｑの少なくとも一つの突然変異、特に配列同定Ｎｏ．４においてＱ９７Ｈに相当する突然変異を含む、請求項７の突然変異体。
【請求項９】
請求項５のｃ），ｄ）またはｅ）の１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼコード化核酸配列の異種コード化核酸配列によって得られる請求項１ないし８のいずれかの１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ。
【請求項１０】
非病原性微生物中に発現された請求項９の１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ。
【請求項１１】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌、特にＥ．ｃｏｌｉに発現された１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ。
【請求項１２】
請求項５のｃ），ｄ）またはｅ）の定義に従った核酸配列。
【請求項１３】
少なくとも一つの調節核酸配列の遺伝子制御のもとにある請求項１２の核酸配列を含んでいる発現カセット。
【請求項１４】
請求項１３の少なくとも一つの発現カセットを含んでいるベクター。
【請求項１５】
請求項１２の少なくとも一つの核酸配列、または請求項１３の少なくとも一つの発現カセットを持っているか、または請求項１４の少なくとも一つのベクターで形質転換された組換え微生物。
【請求項１６】
請求項１５の微生物が培養され、そして発現された１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが培養物から単離される、請求項１ないし１１のいずれかの１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの生産方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１１のいずれかの定義に従った１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下、ヒドロキシステロイドが反応させられ、そして生成した少なくとも一つの酸化生成物が反応バッチから任意に単離される、１２α−ヒドロキシステロイドの酵素酸化方法。
【請求項１８】
ヒドロキシステロイドは、コール酸（ＣＡ）、または塩、アミドまたはアルキルエステルのようなコール酸誘導体である請求項１７の方法。
【請求項１９】
コール酸またはその誘導体が１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）、または対応する誘導体を与えるように反応させられる請求項１８の方法。
【請求項２０】
反応はＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下で行われる請求項１７ないし１９のいずれかの方法。
【請求項２１】
請求項１ないし１１のいずれかの定義に従った１２α−ヒドロキシステロイドの存在下ケトステロイドが反応させられ、生成した還元生成物が任意に反応バッチから単離される、１２−ケトステロイドの酵素還元方法。
【請求項２２】
ケトステロイドは、１２−ケト−ＣＤＣＡ、またはその塩、アミドまたはアルキルエステルのような誘導体である請求項２１の方法。
【請求項２３】
ケトステロイドまたはその誘導体は対応する１２α−ヒドロキシステロイドまたはその誘導体へ還元される請求項２１または２２の方法。
【請求項２４】
反応はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下に行われる請求項２１ないし２３のいずれかの方法。
【請求項２５】
消費されたレドックス均等物は電気化学的または酵素的に再生される請求項１７ないし２４のいずれかの方法。
【請求項２６】
１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼとの反応は固定化した形で行われる請求項１７ないし２５のいずれかの方法。
【請求項２７】
固定化した形の１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含むバイオリアクター。
【請求項２８】
請求項１ないし１１のいずれかの１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによって触媒されるレドックス反応のステロイドがレドックス均等物の存在下に実施され、レドックス均等物の濃度の変化が決定され、そしてそれから１２−ケトステロイドまたは１２α−ヒドロキシステロイドの含有量が定性的または定量的に決定される、１２−ケトステロイドまたは１２α−ヒドロキシステロイドの定性的または定量的測定方法。
【請求項２９】
式（１）ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造方法であって、
【化２０】
2011526481.tif 000026
（式中、Ｒはアルキル、ＮＲ１Ｒ２，Ｈ，アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋を表し、基Ｒ３は同一または異なってＨまたはアルキルで表す）；
ａ）式（２）のコール酸（ＣＡ）、
【化２１】
2011526481.tif 000027
（式中、Ｒは上に示した意味を有し、基Ｒａは同一または異なるＨまたはアシルを表す。）を請求項１ないし１１のいずれかの１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下に対応する式（３）の１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）へ酸化し、（式中、ＲおよびＲａは上で示した意味を有する）；
【化２２】
2011526481.tif 000028
ｂ）式（３）の１２−ケト−ＣＤＣＡを式（４）のケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）を与えるように脱酸素化し（式中、ＲおよびＲａは上で示した意味を有する）；
【化２３】
2011526481.tif 000029
次に、
ｃ）式（４）のＣＤＣＡを式（５）の７−ケトリソコール酸（ＫＬＣＡ）へ位置７において化学的に酸化し、
【化２４】
2011526481.tif 000030
（式中、ＲおよびＲａは上で示した意味を有する。）；そして、
ｄ）式（５）のＫＬＣＡを還元し；そして
ｅ）任意に反応生成物をさらに精製することを特徴とする方法。
【請求項３０】
もしＲａがアシルを表すならば、このアシル基は任意に反応ステップｂ）またはｄ）の実施後除去される請求項２９の方法。
【請求項３１】
ステップａ）はＮＡＤ（Ｐ）+の存在下に行われる請求項２９または３０の方法。
【請求項３２】
消費されたＮＡＤ（Ｐ）+は電気化学的または酵素的に再生される請求項３１の方法。
【請求項３３】
ステップａ）は固定化した形の１２α−ヒドロキシステロイドヒドロゲナーゼの存在下に行われる請求項２９ないし３２のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ；それをコードする核酸配列、発現カセットおよびベクター；適切なコーディング核酸配列を含む組換え微生物；そのような１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲテーゼの生産方法；そのような酵素を用いる１２α−ヒドロキシステロイドの酵素酸化方法、そのような酵素を用いる１２−ケトステロイドの酵素還元方法、本発明に従った１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いる１２−ケトステロイドまたは１２α−ヒドロキシステロイドを定量的にまたは定性的に測定する方法；および本発明に従った１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いる酵素触媒コール酸酸化を含む、ウルソデオキシコール酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤＨ）（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１７６）は、例えばコール酸の酸化のようなステロイド特異性合成のための生触媒である。
【０００３】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ株４８−５０からの１２α−ＨＳＤＨおよびＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋セファロースクロマトグラフィーによるその部分的精製の研究が、Ｍａｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｌ，１９７７，３４（４）：ｐ．４１９−２３）およびＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ．ａｌ．（ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９７９，２０２３４−２３９）によって記載された。
【０００４】
ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍグループＰからの対応して調製された１２α−ＨＳＤＨ含有タンパク抽出物は、Ｓｕｔｈｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．によってコール酸からのウルソデオキシコール酸合成の異なる三ルートのコースに使用された。ここで合成ルートの一つは、コール酸の１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）への酵素触媒酸化を含んでいた（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８２，１２（４）：ｐ．３０７−２１）。ここではＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ株４８−５０ＤＳＭ４０２９から細胞溶解液が酵素調製物として使用された。反応は共因子ＮＡＤＰ＋の化学量論量を必要とする。
【０００５】
共因子の必要性は共因子再生性酵素との連結によって減らすことができる。このため先行技術は、例えば、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍグループＰからの１２α−ＨＳＤＨ含有タンパク抽出物と同時固定化したグルタメートデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）の使用を教えている（Ｃａｒｒｅａ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９８４，２６（５）：ｐ．５６０−５６３）。ＧＬＤＨは、α−ケトグルタメートをグルタメートへ還元すると同時にＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋へ再酸化する。これに代えて、アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ−Ｔｂ，ＡＤＨ−ＬｂおよびＡＤＨ−ｍｓも共因子再生のために提案されている。（Ｆｏｓｓａｔｉ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２００６，９３（６）：ｐ．１２１６−２０）。ＡＤＨはＮＡＤＰ＋の再生と共にアセトンを２−プロパノールへ変換する。１０ｍｌスケールの反応のため、純粋なタンパクでなく、商業的調製物（ＡＳＡ  Ｓｐｅｚｉａｌｅｎｚｙｍｅ，Ｗｏｌｆｅｎｂｕｔｔｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙから）からエンリッチされたタンパク比活性１２Ｕ／ｍｇを有する１２α−ＨＳＤＨ含有タンパク分画がそこでは使用された。
【０００６】
上に記載したすべての研究において、１２α−ＨＳＤＨの起源が病原性の嫌気性株であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループ株４８−５０である点で共通している。総タンパク中のこの酵素の少割合のため（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．の総タンパクの最大１％）、一方ではこの酵素の工業的に利用し得る量へのアクセスが困難である。他方では、病原生産株の培養および貯蔵全体をリスクグループ２の微生物学的作業のライセンスを有するプラント内で実施しなければならない（ＢｉｏＳｔｏｆｆ  Ｖを見よ）ため、工業的生産を複雑にそしてコスト高へ転ずる。
【０００７】
加えて、この生産株の病原性は、医薬品中間体の合成における１２α−ＨＳＤＨの使用を困難にする。ＧＭＰ規則要求に従った生産プロセスのライセンスのためには、非病原性酵素起源が必要である。
【０００８】
ラクテートデスドロゲナーゼ（ＬＤＨ；ＮＡＤ＋の再生と同時にピルベートのラクテートへの変換）による共因子再生を伴うＮＡＤ＋依存１２α−ＨＳＤＨによって触媒されるコール酸酸化がＥＰ−Ａ−１７３１６１８に記載されている。
【０００９】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ株４８−５０からの野生タイプ酵素のための染料カラムアフィニティクロマトグラフィーと、Ｎ−末端アミノ酸配列に基づく二段階精製戦略もさらに提案されている（Ｂｒａｕｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９１，１９６（２）：ｐ．４３９−５０）。発表されたＮ末端配列はアミノ酸残基２９を含み、そのＮ末端は以下のとおりである。
【００１０】
Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙｊ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ・・・・・
【００１１】
さらに、この研究グループによる精製のために商業的に得られるカラム材料が使用されなかった。
【００１２】
現在、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ株４８−５０からの１２α−ＨＳＤＨ含有抽出物は、ＡＳＡ  Ｓｐｅｚｉａｌｅｎｚｙｍｅ，Ｗｏｌｆｅｎｂｕｔｔｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙによって市場へ出品されている。しかしながら、研究は、この商業的調製物の低い比活性が高い総タンパク量を使用しなければならないため、反応生成物の抽出および後処理を複雑化する。
【００１３】
それ故本発明の目的は、工業的スケールでの薬学的に活性な成分の合成において、例えばコール酸の１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）への酵素触媒酸化において生産的使用に適した形において１２α−ＨＳＤＨ（特にＮＡＤＰ＋依存性酵素）を利用可能とすることである。
【発明の概要】
【００１４】
驚くべきことに上述の目的は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｇｒｏｕｐ  Ｐ株Ｃ４８−５０に存在する１２α−ＨＳＤＨ酵素のコーディング核酸配列をはじめて解明し、そしてその正確な完全アミノ酸配列の記述によって達成された。
【００１５】
驚くべきことに、文献に記載されたＮ末端アミノ酸配列は実際のＮ末端アミノ酸配列と一致しないこと、および加えて１２α−ＨＳＤＨは長鎖バージョン（ＨＳＤＨ−ｌｏｎｇ）とＮ−末端切断短鎖バージョン（ＨＳＤＨ−ｓｈｏｒｔ）で存在することが特に発見された。
【００１６】
前記目的の本発明に従った達成は、先行技術においては特に異なるＮ−末端を持った異なる長さの１２α−ＨＳＤＨ酵素が存在しないことが認識されなかったし、そして先行技術からの誤った配列情報は正しいプライマー合成およびそのためコーディング配列の位置および増幅を妨げたためすべて驚異的に見える。
【００１７】
さらに、前出のＢｒａｕｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．の研究に加え、中でも１２α−ＨＳＤＨも帰属する短鎖デヒドゲナーゼ／レダクターゼのクラスへ属する酵素のための発表された配列について一層系統的な研究が実施された。この酵素グループのための特徴的なＮ末端配列モチーフ、すなわちＴ−Ｇ−Ｘ３−Ｇ−Ｘ−Ｇは、Ｃｈｅｍｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，２００３，１４３−１４４，２４７−２５３においてＯｐｐｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．によって推定された。この配列は１９９１年からの発表された１２α−ＨＳＤＨ配列（Ｂｒａｕｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．前出）中には見られない。何となればと、１２α−ＨＳＤＨについて最初に開示された部分的配列情報は今日まで当業者には疑問視されているからである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図１は、本発明に従った１２α−ＨＳＤＨの長鎖バージョン（ＨＳＤＨ−ｌｏｎｇ）の遺伝子およびタンパク配列を示す。
図２は、本発明に従った１２α−ＨＳＤＨの短鎖バージョン（ＨＳＤＨ−ｓｈｏｒｔ）の遺伝子およびタンパク配列と、Ｂｒａｕｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，前出に従った発表された不完全部分的配列との比較を示す。
図３は、既知の微生物ＨＳＤＨおよび本発明に従ったＨＳＤＨの多数配列アラインメントのセクションを示す。高度に保存性位置は“＊”で、可変位置は“：”でマークされる。それらの機能がタンパクレベルで研究されたか、または密接に関連した種においてオルソロジーを有する微生物ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（左端カラムは関連するアクセッション番号および起源生物を示す）が本発明に従って決定された配列ＨＳＤＨ−ｓｈｏｒｔ（ＣＳＰ２５９４）と比較された。既知のＨＳＤＨ株はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＣＯＬＩ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ（ＢＵＲＭ），Ｂａｃｔｅｒｏｉｓｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＢＡＣＦＲ），Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ（ＣＬＯＳＯ），Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ＣＬＯＤ），Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．（ＥＵＢＳＰ），Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＹＣＴＵ）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ（ＳＴＲＥＸ）から起源する。
図４は、ＢＬ２１およびＲｏｓｅｔｔａＴＭ細胞の細胞溶解物中の４時間または２２時間後の本発明に従った１２α−ＨＳＤＨ酵素の発現を示す。その細胞は破壊され、２０μｇのタンパクが適用された。標的タンパク（１２α−ＨＳＤＨ）は２７ｋＤａに発見される。
図５は、５００ｍｌスケールで１２Ｋ−ＣＤＣＡの調製の間に３４０ｎｍにおける吸収のコースを示す。
図６は、１２α−ＨＳＤＨの位置選択性の確認のための反応バッチの薄層クロマトグラムを示す。ここではコール酸（１）および１２−ケトケノデオキシコール酸（２）が参照として使用された。反応バッチはそのためＨＳＤＨ−ｌｏｎｇ（３）およびＨＳＤＨ−ｓｈｏｒｔ（４）と比較された。
図７は、１２α−ＨＳＤＨ突然変異体３７Ｄ１２のタンパクおよび核酸配列を示す。
図８は、結合ＮＡＤＰＨ，結合基質および突然変異位置９７（Ｇｌｎ９７）を有する、Ｃｌｏｓｆｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＤＳＭ  ４０２９からの１２α−ＨＳＤＨの相同モデルを示す。
図９は、１２α−ＨＳＤＨおよび突然変異体３７Ｄ１２の活性の比較を示す。コール酸および１２−ケトケノデオキシコール酸（合計濃度５ｍＭ）の種々のパーセント比における１２α−ＨＳＤＨおよび突然変異体３７Ｄ１２の活性が示される。反応は０．２５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋でスタートした。吸収の変化が６０秒にわたって測定され、活性は最高の直線を有する３０秒の範囲にわたって（野生タイプ０〜３０秒、３７Ｄ１２  ３０〜６０秒）計算された。相対的ＨＳＤＨ活性は、その絶対的活性が１００％にセットされたコール酸５ｍＭ（０％変換）での活性を指称する。Ｎ＝３における活性測定の平均値および標準誤差が示される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．好ましい具体例
本発明の一次的な対象は、還元条件下ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決定し、約２６ｋＤ以上、特に約２７ないし３０ｋＤのような約２６．５ｋＤ以上の範囲の分子量と、そして約２９ｋＤ以上、特にＨＳＤＨ−ｌｏｎｇについて２９．３５９またはＨＳＤＨ−ｓｈｏｒｔについて約２７．８ｋＤのような約２９．１ないし２９．５ｋＤの計算した分子量を有する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．から得られる純粋な、特に組換え生産された１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤＨ）に関する。分子量の詳細は、ここでは該酵素のタンパクサブユニットの分子量に関し、限定なしで、天然タンパクは、特に大体等しいサイズのこのタイプの４サブユニットから構成される。
【００２０】
特に、そのようなタンパクはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ株４８−５０（ＤＳＭ４０２９）から得ることができる。この酵素は、例えば２０ないし１００Ｕ／ｍｇまたは２５ないし８０Ｕ／ｍｇのような、約１０，１５，２０または２５Ｕ／ｍｇ以上の範囲内の比活性において調製することができる。比活性の決定はここでは実験の部において規定した標準条件下に実施される。
【００２１】
本発明は特に、以下のアミノ酸配列モチーフの少なくとも一つを含む、純粋な、特に組換え生産されたこのタイプの１２α−ＨＳＤＨに関する。
【００２２】
ａ）ＬＩＮＮ（配列ＩＤ  Ｎｏ．５）
ｂ）ＲＭＧＩＦＤ（配列ＩＤ  Ｎｏ．１１）
ｃ）以下の配列から選ばれたＮ−末端配列
（１）ＭＤＦＩＤＦＫＥＭＧＲＭＧＩＦＤＧＫＶＡＩＩＴＧＧＧＫＡＫＳＩＧＹＧＩＶＶＡＹＡＫ（（配列ＩＤ  Ｎｏ．６）
（２）ＭＤＦＩＤＦＫＥＭＧＲＭＧＩ（配列ＩＤ  Ｎｏ．７）
（３）ＩＴＧＧＧＫＡＫＳＩＧＹＧＩＡ（配列ＩＤ  Ｎｏ．８）
（４）ＩＦＤＧＫ（配列ＩＤ  Ｎｏ．９）
（５）ＧＩＦＤＧＫ（配列ＩＤ  Ｎｏ．１０）
ｄ）ＦＤＧＰＥＬＤＩ（配列ＩＤ  Ｎｏ．１３）または例えば
ＧＤＤＥＬＤＩ，ＦＧＤＰＥＬＤ，ＤＰＥＬＤＩ，ＦＧＤＰＥＬ，ＧＤＰＥＬ．ＤＰＥＬＤ，ＧＤＰＥＬＤのようなそれから誘導される配列
【００２３】
さらに、本発明に従った酵素は、ＴＧＸ３ＧＸＧタイプのＮ−末端配列モチーフ（すなわち約１ないし３０のアミノ酸残基のＮ−末端の範囲の）を持たない。ここでＸは任意の望むアミノ酸残基を表わす。
【００２４】
本発明は特に、
ａ）各場合位置＋１または＋２で始まる、配列ＩＤ  Ｎｏ．２または４に従ったアミノ酸配列を含んでいる；または
ｂ）少なくとも６０％の配列同定パーセントを有するａ）に従った配列から誘導されたアミノ酸配列を含んでいる；または
ｃ）ａ）およびｂ）に従ったタンパクをコードする核酸配列によってコードされた；または
ｄ）配列ＩＤ  Ｎｏ．１または３に従ったエンコーディング核酸配列、または発現に使用された生物のそれぞれのコドン利用に適応化されたそれから誘導された配列によってコードされた；または
ｅ）配列ＩＤ  Ｎｏ．１または３に従った核酸配列から誘導されたエンコーディング配列によって少なくとも６０％の配列同定パーセントをもってコードされた、純粋な、特に組換え生産された１２α−ＨＳＤＨに関する。
【００２５】
コドン利用に対する核酸配列の適応化は、ここでは例えばｈｔｔｐ：／／ｓｌａｍ．ｂｓ．ｊｈｍｉ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｇｄ／ｇｄＲｅｖＴｒａｎｓ．ｃｇｉからアクセス可能な慣用方法によって実施することができる。
【００２６】
本発明はさらに、修飾した補基質利用および／または還元生成物阻害を有する１２α−ＨＳＤＨ突然変異体、そして特に配列モチーフＶＬＴＧＲＮＥ（配列ＩＤ  Ｎｏ．１２）において補基質利用を修飾する少なくとも一つの突然変異を有する、上の定義に従った１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼから誘導された突然変異体に関する。そのような突然変異の非限定例は、配列ＩＤ  Ｎｏ．１２においてＧ→ＤおよびＲ→Ａの少なくとも一つのアミノ酸置換を有する突然変異体、および酵素の基質結合ポケットを形成するアミノ酸残基の領域中の生成物阻害を減ずる少なくとも一つの突然変異、例えば少なくとも配列ＩＤ  Ｎｏ．４の位置９７および／または９９に相当する（配列ＩＤ  Ｎｏ．２２の位置９８または１００に相当）アミノ酸Ｑの突然変異を含む、特に配列ＩＤ  Ｎｏ．４においてＱ９７Ｈに相当する（配列ＩＤ  Ｎｏ．２２においてＱ９８Ｈに相当）突然変異を含む突然変異体を含む。
【００２７】
位置９８における（配列ＩＤ  Ｎｏ．２２に関して）さらなる可能性あるアミノ酸置換はＡ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｍ，Ｓ，Ｔ，Ｖを含む。本発明に従ったＨＳＤＨの相同性モデルに基づいて、ここでの置換は生成物のカルボキシル結合の弱化へ導くものと推定される。それ故隣接位置Ｓ１００（配列ＩＤ  Ｎｏ．２２を基にして）も以下のアミノ酸、Ａ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｍ，Ｔ，Ｖ，Ｋへ突然変異された。
【００２８】
このように本発明に従った突然変異体のグループは、
Ｑ→Ａ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｍ，Ｓ，Ｔ，Ｖ；
Ｓ→Ａ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｍ，Ｔ，Ｖ，Ｋ；
から選ばれた位置９７または９９における（配列ＩＤ  Ｎｏ．４に従って）、または位置９８または１００における（配列ＩＤ  Ｎｏ．２２に従って）一つまたは二つの突然変異を含む。
【００２９】
本発明は特に、上に記載した１２α−ＨＳＤＨをコードする核酸配列の少なくとも一つの異種発現によって得ることができる上の定義に従った１２α−ＨＳＤＨ、特に例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のバクテリア、特にＥ．ｃｏｌｉ種に発現されたような、非病原性微生物に発現された、特に組換え生産された１２α−ＨＳＤＨに関する。
【００３０】
さらに本発明は、上の定義に従った核酸配列；少なくとも一つの調節核酸配列の遺伝子コントロール下にある少なくとも一つのそのようなエンコーディング核酸配列を含んでいる発現カセット；少なくとも一つのそのような発現カセットを含んでいるベクター；および少なくとも一つのそのような核酸配列または発現カセットを担持している、または少なくとも一つのそのようなベクターで形質転換された微生物に関する。
【００３１】
加えて本発明は、本発明に従った微生物が培養され、そして発現された１２α−ＨＳＤＨが培養物から単離される、上の定義に従った１２α−ＨＳＤＨの製造方法に関する。
【００３２】
本発明はさらに、ヒドロキシステロイドが本発明に従った１２α−ＨＳＤＨの存在下で反応させられ、そして少なくとも一つの酸化生成物が任意に反応バッチから単離される、１２α−ヒドロキシステロイドの酵素酸化方法に関する。反応はここでは好気的に（すなわち酵素の存在下で）、または嫌気的に（すなわち本質的に酵素を排除して）、特に好気的に実施することができる。
【００３３】
特にここでは、コール酸（ＣＡ）、または塩、アミドまたはアルキルエステルのようなコール酸誘導体がヒドロキシステロイドであることができる。好ましくは、ＣＡまたはその誘導体は１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）を与えるように、または対応するその誘導体を与えるように反応させられる。特に反応はＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋の存在下そして化学量論的消費を伴って生起する。
【００３４】
さらに本発明は、ケトステロイドが本発明に従った１２α−ＨＳＤＨの存在下反応させられ、そして生成した還元生成物が反応バッチから任意に単離される、１２−ケトステロイドの酵素還元方法に関する。反応は好気的に、または嫌気的に、特に好気的に実施することができる。
【００３５】
ケトステロイドは、特に１２−ケト−ＣＤＣＡ、または塩、アミドまたはアルキルエステルのようなその誘導体である。ケトステロイドまたはその誘導体は、１２α−ヒドロキシステロイドまたはその誘導体へ還元される。反応は特にＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下に行われる。
【００３６】
上のレドックス反応の好ましい具体例において、消費されるレドックス均等物は電気化学的に、または酵素的に再生することができる。好適な酵素再生システムは始めに既に記載されている。これらの刊行物の開示が明示的に参照される。好適な酵素の非限定例はグルタメートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびラクテートデヒドロゲナーゼである。電気化学的再生方法は、例えば、ここに参照として取入れるＷＯ−Ａ−０１／８８１７２に記載されているヒドリドロジウムレドックス触媒に基づいている。
【００３７】
上のレドックス反応のさらなる具体例において、固定化した１２α−ＨＳＤＨで行うことができる。共因子再生のため任意に使用される酵素も同様に固定化することができる。
【００３８】
本発明は、さらに上のレドックス反応、または全合成プロセスのコース中の部分的反応ステップを実施するためのそのようなバイオリアクターに関する。
【００３９】
さらに本発明は、１２−ケトステロイドまたは１２−ヒドロキシステロイドの定量的または定性的検出方法に関し、そこでは本発明に従った１２α−ＨＳＤＨによって触媒されるステロイドのレドックス反応はレドックス均等物の存在下に実施され、レドックス均等物の濃度変化が決定され、そしてそれから１２−ケトステロイドまたは１２α−ヒドロキシステロイドの含量が定性的または定量的に決定される。
【００４０】
本発明はさらに、本発明に従った１２α−ＨＳＤＨによって触媒される少なくとも一つの反応ステップを含んでいる、コール酸からウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の合成方法に関する。この反応ステップは、好気的または嫌気的に、特に好気的に実施することができる。三つの好適な反応シーケンスが例えばＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．前出に記載されており、ここに参照として取入れる。以下の合成ルート１ないし３（ここではＵＣＡはウルソコール酸を表わし、ＣＤＣＡはケノデオシコール酸を表わす）が記載されている。
【００４１】
第１ルート
ＣＡ→１２−ケトＣＤＣＡ（１２α−ＨＳＤＨにより酵素的に）
１２−ケト−ＣＤＣＡ→１２−ケトＵＤＣＡ（７α−および７β−ＨＳＤＨにより酵素的に）
１２−ケトＵＤＣＡ→ＵＤＣＡ（化学的に、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元）
第２ルート
ＣＡ→ＵＣＡ（７α−および７β−ＨＳＤＨにより酵素的に）
ＵＣＡ→１２−ケトＵＣＡ（１２α−ＨＳＤＨにより酵素的に）
１２−ケトＵＣＡ→ＵＤＣＡ（化学的に、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元）
第３ルート
ＣＡ→１２−ケトＣＤＣＡ（１２α−ＨＳＤＨにより酵素的に）
１２−ケトＣＤＣＡ→１２−ＣＤＣＡ（化学的に、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元）
ＣＤＣＡ→ＵＤＣＡ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｂｓｏｎｕｍ全細胞）
【００４２】
しかしながら本発明は次の第４ルートに関する。
第４ルート
これは式（１）のウルソデオキシコール酸の製造に関する。
【００４３】
【化１】
2011526481.tif 000002
【００４４】
式中、
Ｒはアルキル、ＮＲ１Ｒ２，Ｈ，アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋を表わし、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は同一または異なって、Ｈまたはアルキルである。
【００４５】
該方法は、
ａ）式（２）のコール酸（ＣＡ）
【００４６】
【化２】
2011526481.tif 000003
【００４７】
が、本発明に従った１２α−ＨＳＤＨの存在下式（３）の１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケトＣＤＣＡ）へ酸化される。
【００４８】
【化３】
2011526481.tif 000004
【００４９】
式（２）および式（３）中、
Ｒは上と同じ意味を有し、Ｒａは同一または異なって、Ｈまたはアシールを表わす。
ｂ）次に式（３）の１２−ケトＣＤＣＡは、式（４）のケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）を与えるようにＷｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元のような脱酸素化反応にかけられる。
【００５０】
【化４】
2011526481.tif 000005
【００５１】
式中、ＲおよびＲａは上に示した意味を有する。
ｃ）次に式（４）のＣＤＣＡは式（５）の７−ケトリソコール酸（ＫＬＣＡ）へ位置７において化学的に酸化される。
【００５２】
【化５】
2011526481.tif 000006
【００５３】
式中、ＲおよびＲａは上と同じ意味を有する。
ｄ）式（５）のＫＬＣＡは還元され、そしてもしＲａがアシルを表わすならばこのアシル基が任意に除去され、
ｅ）反応生成物は任意にさらに精製される。
【００５４】
ここでもしＲａがアシルを表わすならば、このアシル基は反応ステップｂ）またはｄ）の後で任意に除去することができる。
【００５５】
さらにステップａ）の反応はＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下で実施することができる。
【００５６】
さらに、消費されたＮＡＤ（Ｐ）＋は自体公知の態様で電気化学的または酵素的に再生することができ、および／または使用する酵素は固定化した形を取ることができる。
【００５７】
２．一般的定義
もし他の詳細が与えられていなければ、用語“１２α−ＨＳＤＨ”は、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の化学量論的消費を伴って少なくともコール酸の１２−ケトケノデオキシコール酸への立体特異性酸化を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指示する。この酵素は天然または組換え生産された酵素であることができる。この酵素は原理的に例えばタンパク不純物のような細胞タンパクとの混合物中に存在し得るが、しかし好ましくは純粋な形で存在し得る。
【００５８】
“純粋形”または“純粋”または“本質的に純粋”な酵素とは、例えばビウレット法またはｌｏｗｒｅｙらの方法に従ったタンパク検出方法（Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｒｂｆｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８２）参照）のような慣用のタンパク検出方法に基づいて、重量で８０％以上、好ましくは９０％以上、特に９５％以上の純度を有する酵素を意味する。本発明に従った１２α−ＨＳＤＨ酵素の比活性は上に示した範囲内にある。
【００５９】
“レドックス均等物”とは、例えばＮＡＤ＋およびＮＡＤＨ＋またはそれらの還元形ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのような電子供与体または電子受容体として使用し得る低分子量有機化合物を意味する。“コール酸”または“ウルソデオキシコール酸”のような特定タイプの化合物は、出発化合物（例えばコール酸またはウルソデオキシコール酸のような）の誘導体をも意味するものと理解すべきである。
【００６０】
そのような誘導体は、化合物のリチウム、ナトリウムおよびカリウム塩、およびアンモニウム塩のような“塩”を含む。アンモニウム塩はＮＨ４＋塩または少なくとも１個の水素原子をＣ１−Ｃ６アルキル基で置換したアンモニウム塩を含む。典型的なアルキル基はメチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル、ｎ−，ｓｅｃ−，またはｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシル、およびそれらの単一または複数分岐類縁体を含む。
【００６１】
本発明に従った化合物の“アルキルエステル”は、特に例えばＣ１−Ｃ６−アルキルエステルのような低級アルキルエステルである。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル、ｎ−，ｓｅｃ−またはｔｅｒｔ−ブチル、およびｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシル、およびそれらの１回または多数回分岐類縁体である。
【００６２】
“アミド”は、本発明に従った酸とアンモニアまたは１級もしくは２級アミンとの反応生成物である。そのようなアミンは、例えば任意に独立してカルボキシル、ヒドロキシ、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、ニトロおよびスルホネートで置換されたモノ−またはジ−Ｃ１−Ｃ６−アルキルモノアミンである。
【００６３】
本発明に従った“アシル基”は、炭素原子２ないし４個を有する非芳香族基、例えばアセチル、プロピオニルおよびブチリルと、そして任意に置換された単核芳香族環を有する芳香族基、例えばベンゾイルまたはトルオイル基であり、適切な置換基はヒドロキシ、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、ニトロおよびＣ１−Ｃ６−アルキル基から選択される。
【００６４】
コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ウルソデオキシコール酸、１２−ケトケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸および７−ケトリソコール酸のような本発明に従って使用され、また生産されるヒドロキシステロイド化合物は、立体異性的に純粋な形で、または他の立体異性体との混合物の形で、本発明に従ったプロセスに使用することができ、またはそれから得ることができる。好ましくは、使用されるかまたは生産される化合物は、しかしながら実質的に立体異性的に純粋な形で使用され、および／または単離される。
【００６５】
“固定化”とは、例えば１２α−ＨＳＤＨのような本発明に従って使用される生触媒の固体担体材料、すなわち周囲の液媒に本質的に不溶性材料への共有または非共有結合の意味であると理解される。
【００６６】
１２α−ＨＳＤＨの“生成物阻害”とは、酵素によって触媒される酵素反応において生成物の存在下で酵素活性の低下を意味する。例えばＣＡを与える反応の場合、１２−ケト−ＣＤＣＡによる阻害が観察されるであろう。“生成物阻害の低下”とは、例えば天然ＨＳＤＨ酵素のような参照システムと比較した、各場合０％変換（５ｍＭ  ＣＡに相当）において決定した酵素活性を１００％酵素活性としたときの本発明に従った酵素突然変異体の酵素活性の低下パーセントを意味する。この低下は実験の部、または図の説明に記載したように決定することができる。本発明に従った生成物阻害の低下は、参照システムに対する突然変異体の残存活性の割合として表わすこともできる。この場合同じ変換パーセントにおいて決定される。このように本発明に従った突然変異体は、例えば１．５ないし２０または２ないし１０のような係数１．１ないし１００だけ増加した活性を持つことができる。
【００６７】
３．本発明のさらなる具体例
３．１タンパク
本発明とは、実際に開示された１２α−ＨＳＤＨ活性を有するタンパクおよび／または酵素に限定されず、反対にそれらの機能的均等物にも及ぶ。
【００６８】
本発明の文脈において、実際に開示された酵素の“機能的均等物”または類縁体は、例えば１２α−ＨＳＤＨ活性のような所望の生物学的活性を持っているそれとは異なるポリペプチドである。
【００６９】
このように、“機能的均等物”とは、例えば、１２α−ＨＳＤＨ活性のためにテストで使用した酵素が、ここに規定したアミノ酸配列を含む酵素の活性よりも少なくとも１％、例えば少なくとも１０％または２０％、例えば少なくとも５０％または７０％または９０％高いまたは低い活性を持つことを意味する。機能的均等物はその上、ｐＨ４ないし１１の間で安定であり、そして有利には、ｐＨ６ないし１０、特に８．５ないし９．５の範囲に最適ｐＨを有し、そして１５℃ないし８０℃または２０℃ないし７０℃、例えば約４５ないし６０℃または約５０℃ないし５５℃の範囲に最適温度を有する。
【００７０】
１２α−ＨＳＤＨ活性は種々の既知のテストの助けを借りて検出することができる。限定するものではないが、実験の部で規定した標準化した条件下で例えばコール酸のような参照物質を使用するテストを挙げることができる。
【００７１】
“機能的均等物”は、本発明に従って特に、前述のアミノ酸配列の少なくとも一つの配列位置において実際に述べた以外のアミノ酸を含み、しかしながら前述した生物学的活性の一つを有する“突然変異体”をも意味する。このように“機能性誘導体”は、一つ以上のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位を含み、この場合述べた変化は、それらが本発明に従った性質プロフィルを有する突然変異体へ導く限り、どの配列位置においても起こることができる。機能的均等物は特に、突然変異体と未変化ポリペプチドの間の反応性パターンが定性的に一致する場合に、例えば同じ基質が異なる速度で変換される場合にも可能である。好適なアミノ酸の例は以下の表に要約されている。
【００７２】
【表１】
2011526481.tif 000007
【００７３】
上の意味で“機能的均等物”は記載したポリペプチドおよび機能的均等物の“前駆体”および該ポリペプチドの“塩”でもある。
【００７４】
ここで“前駆体”は、所望の生物学的活性有り無しのポリペプチドの天然または合成前駆体である。
【００７５】
表現“塩”は、本発明に従ったタンパク分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は公知の態様で調製することができ、そして例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩のような無機塩、および例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン等のような有機塩基との塩を含む。同様に本発明は、塩酸または硫酸のような鉱酸との塩、および酢酸およびシュウ酸のような有機酸との塩のような酸付加塩にも関する。
【００７６】
本発明に従ったポリペプチドの“機能性誘導体”は、公知の技術によって機能性アミノ酸側鎖上またはそれらのＮ−またはＣ−末端に生成させることができる。そのような誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル；アンモニアまたは１級または２級アミンとの反応によって得られるカルボキシル基のアミド；アシル基との反応によって調製される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、またはアシル基との反応によって調製された遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体を含む。
【００７７】
“機能的均等物”は、勿論他の生物からアクセスし得るポリペプチドと、天然に存在する変種をも含む。例えば、相同性配列領域の範囲は配列比較によって確立することができ、均等酵素は本発明の詳細な説明によって決定することができる。
【００７８】
同様に“機能的均等物”は、例えば所望の生物学的機能を有する、本発明に従ったポリペプチドのフラグメント、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフを含む。
【００７９】
“機能的均等物”はさらに、前述したポリペプチド配列の一つまたはそれからの機能的均等物と、機能的Ｎ−またはＣ−末端結合において機能的に異なる少なくとも一つのさらなる非相同性配列を含む融合タンパク（すなわち融合タンパク部分の相互に有意な損傷なしの）である。そのような非相同配列の非限定例は、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素である。
【００８０】
本発明に従って付加的に含まれた“機能的均等物”は、実際に開示されたタンパクの相同体である。これらは、実際に開示されたアミノ酸例の一つに対して、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９８８，２４４４−２４４８のアルゴリズムに従って計算し、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の相同性（同一性）を持っている。本発明に従った相同ペプチドの相同性または同一性は、特にここに実際に記載されたアミノ酸配列の一つの全長に対する、同一アミノ酸残基のパーセンテージを意味する。
【００８１】
パーセンテージ同定値は、ＢＬＡＳＴアライメント、アルゴリズムｂｌａｓｔｐ（タンパク−タンパクＢＬＡＳＴ）により、または後で示すＣｌｕｓｔａｌアジャストメントの使用によって決定とすることができる。
【００８２】
可能性あるタンパクグリコシル化の場合、本発明に従った“機能的均等物”は、脱グリコシル化したまたはグリコシル化した形およびグリコシル化パターンの変化によって得られる修飾形において上で指定したタイプのタンパクを含む。
【００８３】
本発明に従ったタンパクまたはポリペプチドの相同体は、突然変異生成により、例えば点突然変異、タンパクの伸長またはトランケーションによって生成させることができる。
【００８４】
本発明に従ったタンパクの相同体は、例えばトランケーション突然変異体のようなコンビナトリアルバンクのスクリーニングによって同定することができる。例えば、タンパク変種の斑入りバンクは、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的リゲーションにより、核酸レベルにおけるコンビナトリアル突然変異生成によって生成させることができる。退化オリゴヌクレオチド配列から可能性ある相同体のバンクの生成のために使用できる多数のプロセスが存在する。退化遺伝子配列の化学合成はＤＮＡシンセサイザー中で実施することができ、そして次に合成遺伝子は好適な発現ベクター中へリゲートすることができる。遺伝子の退化セットの使用は、可能性あるタンパク配列の所望のセットをコードする混合物中にすべての配列の生成を可能にする。退化オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７）。
【００８５】
点突然変異またはトランケーションによって生成させたコンビナトリアルバンクの遺伝子生産物のスクリーニングのための、および選択された性質を有する遺伝子生産物のｃＤＮＡバンクのスクリーニングのためのいくつかの技術が先行技術において知られている。これらの技術は、本発明に従った相同体のコンビナトリアル突然変異生成によって生産された遺伝子バンクの急速スクリーニングに適応化させることができる。高いスループットで分析が行われる大きな遺伝子バンクのスクリーニングのために最も頻繁に使用される技術は、複製可能な発現ベクター中への遺伝子バンクのクローニング、生成したベクターバンクでの適当な細胞の形質転換、および所望の活性の検出がその生産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易化する条件下でコンビナトリアル遺伝子の発現を含む。バンク中の機能的突然変異体の頻度を増大させる技術である、Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ−ｅｍｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｉｓ（ＲＥＭ）をスクリーニングテストと組み合わせて相同体を同定するために使用することができる（Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【００８６】
３．２  核酸および構造体
３．２．１  核酸
本発明はまた、１２α−ＨＳＤＨ活性を有する酵素をコードする核酸配列に関する。
【００８７】
本発明はまた、ここに記載した実際の配列に対し一定の程度の同一性を有する核酸に関する。
【００８８】
二つの核酸間の“同一性”は、各場合核酸全長にわたってヌクレオチドの同一性を意味し、特に以下のパラメータで調節した、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄを使用するＩｎｆｏｒｍａｘ社（ＵＳＡ）のＶｏｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１ソフトウエア（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ，Ｓｈａｒｐ  ＰＭ．Ｆａｃｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ａｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．Ｃｏｍｐｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９８９  Ａｐｒ；５（２）：１５１−１）の助けによる比較によって計算した同一性を意味する。
【００８９】
マルチプルアライメントメータ：
ギャップオープニングペナルティ              １０
ギャップエキステンションペナルティ          １０
ギャップセパレーションペナルティ範囲８
ギャップセパレーションペナルティ            オフ
アライメント遅延のための％アイデンティティ  ４０
残基特異性ギャップ                          オフ
親水性残基ギャップ                          オフ
トランジション計量                            ０
対フライメントパラメータ：
ＦＡＳＴ  アルゴリズム                      オン
Ｋ−ｔｕｐｌｅ  サイズ                        １
ギャップペナルティ                            ３
ウインドウサイズ                              ５
ベストダイアゴナルの数                        ５
【００９０】
これに代って、同一性は以下のパラメータをもって、Ｃｈｅｎｎａ，Ｒａｍｕ，Ｓｕｇａｗａｒａ  Ｈｉｄｅａｋｉ，Ｋｏｉｋｅ  Ｔａｄａｓｈｉ，Ｌｏｐｅｚ，Ｒｏｄｏｒｉｇｏ，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔｏｂｙ  Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄｅｓｍｏｎｄ  Ｇ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊｕｌｉｅ  Ｄ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｃｌｕｓｔａｌ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｇａｍｓ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１（１３）：３４９７−５００；インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔｒａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ１＃に従って決定することができる。
【００９１】
ＤＮＡオープンペナルティ                    １５．０
ＤＮＡギャップエキステンションペナルティ      ６．６６
ＤＮＡマトリックスアイデンティティ
タンパクギャップオープンペナルティ          １０．０
タンパクギャップエキステンションペナルティ    ０．２
タンパクマトリックス                        Ｇｏｎｎｅｔ
タンパク／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ              −１
タンパク／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ              ４
【００９２】
ここで述べたすべての核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡのような１本鎖または２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、例えば二重らせんの個々の重複する相補的核酸構造単位のフラグメント縮合によるような、ヌクレオチド構造単位からの化学合成によってそれ自体公知の態様で生産することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホアミダイト法（Ｖｏｅｔ，Ｖｏｅｔ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．８９６−８９７）に従って公知の態様で実施することができる。合成オリゴヌクレオチドの付加と、ＤＮＡポリメラーゼおよびリゲーション反応のＫｌｅｎｏｗフラグメントによるギャップの充填、および一般クローニング方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００９３】
本発明は、上記ポリペプチドの一つ、および例えば合成ヌクレオチドアナログを用いてアクセス可能なそれらの機能的均等物をコードする核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡのような１本鎖および２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）に関する。
【００９４】
本発明は、本発明に従ったポリペプチドおよびタンパクまたは生物学的に活性なそれらのセクションをコードする単離された核酸分子と、例えば本発明に従ったコードする核酸の同定または増幅のためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用することができる核酸フラグメントの両方に関する。
【００９５】
本発明に従った核酸分子は、さらに暗号遺伝子領域の３’−および／または５’−端に翻訳されない配列を含むことができる。
【００９６】
さらに本発明は、実際に記載された核酸配列に対し相補的な核酸分子またはその部分を含む。
【００９７】
本発明に従ったヌクレオチド配列は、他の細胞タイプおよび生物中の相同性配列の同定および／またはクローニングに使用することができるプローブおよびプライマーの生産を可能にする。そのようなプローブまたはプライマーは、通常“厳格”な条件下、本発明に従った核酸配列のセンスストランドの、または対応するアンチセンスストランドの少なくとも約１２，好ましくは約２５，例えば４０，５０または７５の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含んでいる。
【００９８】
“単離”された核酸分子が核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離され、そしてもしそれが組換え技術によって生産されるならば他の細胞物質または倍地が実質上皆無にされるか、またはもしそれが化学的に合成されるならば化学的前駆体または他の化学品が実質上皆無にされることでできる。
【００９９】
本発明に従った核酸分子は、分子生物学的に標準技術によって単離されることができ、そして配列情報が本発明によって提供される。例えば、ｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして実際に開示した完成した配列の一つまたはその部分と、そして標準ハイブリダイゼーション技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｓｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｌｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ，ＮＹ．１９８９に記載されいるような）を使用することによって適当なｃＤＮＡバンクから単離することができる。さらに、開示した配列の一つまたはその部分を含んでいる核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができ、この配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。このようにして増幅された核酸は適当なベクターにクローンされ、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴化される。本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して標準合成プロセスによって生産されることができる。
【０１００】
本発明に従った核酸配列またはその誘導体、これらの配列の相同体およびその部分は、他の細菌から、例えばゲノムまたはｃＤＮＡバンクを用い、慣用のハイブリダイゼーションプロセスまたはＰＣＲ技術を使用して単離することができる。
【０１０１】
“ハイブリダイズ”とは、ポリマーまたはオリゴヌクレオチドが、標準条件下で大部分相補的な配列へ結合する能力を意味し、非相補的パートナー間の非特異性結合はこれら条件下では抑制される。このため、配列は９０〜１００％相補的であることができる。相互に特異的に結合し得る相補配列の性質は、例えばノーザンまたはサウザンブロット技術またはＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにおいてプライマー結合において使用される。
【０１０２】
ハイブリダイゼーションのため、保存された領域の短いオリゴヌクレオチドが有利に使用される。しかしながら、ハイブリダイゼーションのため、本発明に従った核酸のもっと長いフラグメントまたは完全な配列を使用することも可能である。これらの標準的条件は使用する核酸に従って（オリゴヌクレオチド、長いフラグメント、または完全な配列）変動し、またはどのタイプの核酸、ＤＮＡかＲＮＡが使用されるかによって変動する。このため、例えばＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのための溶融温度は、同じ長さのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのそれよりも約１０℃低い。
【０１０３】
標準的条件は、例えば、核酸に従い、０．１ないし５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の濃度を有する水性緩衝溶液中４２ないし５８℃の温度、または付加的に５０％ホルムアミドの存在下、例えば５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中４２℃の温度を意味する。有利には、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣと約３０℃ないし４５℃の温度である。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドについては、ハイブリダイゼーション条件は、有利には０．１×ＳＳＣと約３０℃ないし５５℃、好ましくは４５℃ないし５５℃の温度である。ハイブリダイゼーションのためのこれらの規定した温度は、例示であって、約１００ヌクレオチドの長さと、Ｇ+Ｃ含量５０％の核酸のためのホルムアミド不存在下の計算された溶融温度である。ＤＮＡハイブリダイゼーションのための実験条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９のような遺伝子学の教科書に記載されており、そして例えば核酸の長さ、ハイブリッドの性格またはＧ+Ｃ含量に応じて当業者に知られた式に従って計算することができる。当業者はさらにハイブリダイゼーションについての情報を以下の教科書から推論することができる。
【０１０４】
Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１９８５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（ｅｄｓ），１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙｈｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｒｏｗｎ（ｅｄ），１９９１，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｉｇｙ：ＡＡ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ
【０１０５】
“ハイブリダイゼーション”は特に、厳格な条件下で実施することができる。そのようなハイブリダイゼーション条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，９．３１−９．５またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載とされている。
【０１０６】
“厳格な”ハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ，７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄ+溶液、１０％デキストランサルフェートおよび変性したサケ精子ＤＮＡ２０ｇ／ｍｌ中４２℃でのインキュベーションと、６５℃において、０．１×ＳＳＣを使用けし、フィルター上の洗浄ステップを意味すると理解すべきである。
【０１０７】
本発明はまた、実際に開示された、または誘導し得る核酸配列の誘導体に関する。
【０１０８】
このように本発明に従った核酸配列のさらなる配列は、例えば配列同定Ｎｏ．１または３から、一以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失により、しかし所望の性質を有するポリペプチドをコードするように誘導することができる。
【０１０９】
本発明にはさらに、実際に述べた配列に比較して、“ブラント”突然変異を含む、または特別の起源または宿主生物のコドン利用に対応するように修飾された核酸配列と、例えばスプライス変種または対立変種のような天然に存在する変種が含まれる。
【０１１０】
同様に本発明は、保守的ヌクレオチド置換（すなわち関心あるアミノ酸の同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸による置換）によって得ることができる配列に関する。
【０１１１】
本発明はまた、実際に開示された核酸の配列多形によって誘導される分子に関する。これらの遺伝子多形は自然の変動のため集団中の個々の間に存在し得る。これらの自然の変動は遺伝子のヌクレオチド配列中通常１ないし５％の変動を生じさせる。
【０１１２】
配列同定Ｎｏ．１または３について本発明に従った核酸配列の誘導体とは、例えば、誘導されたアミノ酸レベルにおいて少なくとも６０％相同性、好ましくは少なくとも８０％相同性、非常に好ましくは少なくとも９０％相同性を全配列範囲に亘って有する変種を意味するものとして理解すべきである（アミノ酸レベルにおける相同性に関しては、ポリペプチドのための上述の備考を参照）。配列の部分的領域に亘っては、相同性は有利にはより高くなることができる。
【０１１３】
さらに誘導体は、特に配列同定Ｎｏ．１および３の本発明に従った核酸配列の相同体、例えばカビまたは細菌相同体、切端配列、コード化および非コード化ＤＮＡ配列の１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを意味するものと理解すべきである。このように、例えばＤＮＡレベルにおいて配列同定Ｎｏ．７の相同体は、配列同定Ｎｏ．７に示した全ＤＮＡ範囲にわたって少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、非常に好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する。
【０１１４】
さらに誘導体は、例えばプロモーターとの融合を意味するものと理解すべきである。示したタクレオチド配列の前へ付加されるプロモーターは、プロモーターの機能性または活性が悪影響されることなく、少なくとも１個のヌクレオチド交換、少なくとも１個の挿入、逆位および／または失欠によって修飾することができる。加えて、プロモーターはそれらの活性を、外来生物のもっと活性なプロモーターによってそれらの配列を修飾または完全に置換することによって増強することができる。
【０１１５】
機能的突然変異体の生産方法は当業者には知られている。
【０１１６】
使用した技術に従って、当業者は遺伝子へ、または代って非コード化核酸配列領域(例えば発現の調節のために重要な領域)へ完全にランダムなまたはもっと特異的な突然変異体を導入し、その後遺伝子バンクを調製することができる。このために必要な分子生物学的方法は当業者には既知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１に記載されている。
【０１１７】
遺伝子の修飾およびそれによってコード化されるタンパクの修飾方法は、例えば以下のとおり長年にわたって当業者には既知である。
【０１１８】
−遺伝子の単一または多数ヌクレオチドが特定的に置換される部位特異性突然変異生成（Ｔｒｏｗｅｒ  ＭＫ（ｅｄｉｔｏｒ）１９９６：Ｉｎｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｅｉ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｎ）；
−どんな所望アミノ酸のためのコドンも遺伝子のどんな部位に置換または付加されることができる飽和突然変異生成（Ｋｅｌｇｌｅｒ−Ｅｄｏ  ＤＭ  Ｄｏｃｋｔｏｒ  ＣＭ，Ｄｉｍａｉｏ  Ｄ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：１５９３；Ｂａｒｅｔｔｉｎｏ  Ｄ，Ｆｅｇｅｎｂｕｔｚ  Ｍ．Ｖｄｌｃａｒｅｌ  Ｒ，Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ  ＨＧ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：５４１；Ｂａｒｉｋｓ（１９９５）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：１）；
−タクレオシド配列が誤作動ＤＮＡポリメラーゼによって突然変異されるエラー発生ポリメラーゼ連鎖反応（エラー発生ＰＣＲ）（Ｅｃｋｅｒｔ  ＫＡ，Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：３７３９）；
−例えば、ヌクレオチド配列の増加した突然変異率が欠陥ＤＮＡ修復メカニズムのために発生する突然変異化株への遺伝子の通過（Ｇｒｅｅｎｅｒ  Ａ，Ｃａｌｌａｈａｎ  Ｍ．Ｊｅｒｐｓｅｔｈ  Ｂ（１９９６）Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒａｎｄｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｆｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔａｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ．Ｉｎ：Ｔｒｅｗｅｒ  ＭＫ（ｅｄｉｔｏｒ）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）；または
−密接に関連した遺伝子のプールが生成され、そして消化され、そしてフラグメントがポリメラーゼ連鎖反応において鋳型として使用され、その中で全長さのモザイク遺伝子が繰り返した鎖分離および再接近によって最終的に調製されるＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰＣ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰＣ（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１０７４７）
【０１１９】
“指向された進化”を使用して（特にＲｅｅｔｚ  ＭＴ  ａｎｄ  Ｊａｅｇｅｒ  Ｋ−Ｅ（１８９９），Ｔｏｐｉｃｓ  Ｃｕｒｒ  Ｃｈｅｍ  ２００：３１；２ｈａｏ  Ｈ，Ｍｏｏｒ  ＪＣ，Ｖｏｌｋｏｖ  ＡＡ，Ａｒｎｏｌｄ  ＦＨ（１９９９），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｏｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｉｎ：Ｄｅｍａｉｎ  ＡＬ，Ｄａｖｉｅｓ  ＪＥ（ｅｄｓ．）Ｍａｎｎｕａｌ  ｏｆ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｒｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｙｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙに記載されている）、当業者は選択した態様でそして大規模に機能的突然変異体を製造することができる。ここでは、最初のステップにおいてそれぞれのタンパクの遺伝子バンクが生産され、これには上で示した方法を使用することができる。遺伝子バンクは適当な態様で、例えばバクテリアよりまたはファージディスプレーシステムによって発現される。
【０１２０】
望む性質に大部分一致する性質を有する機能的突然変異体を発現する宿主生物の関心ある遺伝子は突然変異のさらなるラウンドへ服されることができる。突然変異および選択またはスクリーニングのステップは、現在の突然変異体が適切な測定において望む性質を持つまで繰り返されることができる。この反復操作の結果として突然変異の限られた数、例えば１ないし５の突然変異が段階的に実施され、関心ある酵素性質に対するそれらの影響を評価し、選択することができる。次に選択された突然変異体は同じやり方でさらなる突然変異ステップへ服させることができる。これによって検討すべき個々の突然変異体の数を有意に減らすことができる。
【０１２１】
本発明に従った結果は、所望の修飾した性質を有するさらなる酵素を発生させるために必要な、関心ある酵素の構造および配列に関する重要な情報を取得する。特に、“ホットスポット”、すなわち特異的突然変異の導入によって酵素性質の修飾のために潜在的に適した配列部分を規定することができる。
【０１２２】
本発明に従ったＨＳＤＨのそのようなホットスポット領域の非限定例が以下に要約される。３５−４０、特に３７−３８（各場合、ＨＳＤＨ−ショート（配列同定番号４）のアミノ酸配列に関して）。９０−１０５、９３−１００または９６−１００、特に９７および／または９８（各場合、ＨＳＤＨ−ショート（配列同定番号４）のアミノ酸配列に関して）。
【０１２３】
３．２．２  構造体
本発明はさらに、調節核酸配列の遺伝子コントロールのもとに本発明に従ったポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構造体、および少なくとも一つのこれらの発現構造体を含むベクターに関する。
【０１２４】
“発現ユニット”とは、本発明に従って、ここで規定し、そして発現すべき核酸または遺伝子へ機能的に連結された後、発現を調節する、すなわちこの核酸またはこの遺伝子の転写および翻訳を調節するプロモーターを含んでいる、発現活性を有している核酸を意味するものと理解すべきである。それ故これ“調節核酸配列”ということもできる。プロモーターに加え、例えばエンハンサーのようなさらなる調節エレメントが存在することができる。
【０１２５】
本発明に従えば、“発現カセット”または“発現構造体”とは、発現すべき核酸または発現すべき遺伝子へ機能的に連結された発現ユニットを意味するものと理解すべきである。発現ユニットと対照的に、発現カセットはこのため、転写および翻訳を調節する核酸配列のみならず、転写および翻訳の結果タンパクとして発現される核酸配列をも含む。
【０１２６】
本発明の文脈において、術語“発現”または“過発現”は、対応するＤＮＡによってコード化される微生物中の一以上の酵素の細胞内活性の生産および増加を記載する。この目的で、例えば遺伝子を生物へ導入することができ、存在する遺伝子を他の遺伝子で置換することができ、遺伝子のコピー数を増加することができ、強力なプロモーターを使用することができ、または高い活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子を使用することができ、そしてこれらの方策は任意に組み合わせることができる。
【０１２７】
好ましくは、本発明に従ったそのような構造体は、それぞれのコード化配列の５’−上流のプロモーターと、３’−下流のターミネーター配列と、そして任意に慣用の調節エレメント、すなわち各場合コード化配列へ作用的に連結された調節エレメントを含む。
【０１２８】
本発明に従えば、“プロモーター”、“プロモーター活性を有する核酸”、または“プロモーター配列”は、転写すべき核酸との機能的連鎖において核酸の転写を調節する核酸の意味であると理解すべきである。
【０１２９】
“機能的”または“作用的”連鎖は、例えば核酸の転写を保証する核酸配列と、そして例えばターミネーターのように、プロモーター活性を有する核酸の一つと、転写すべき核酸配列と、そして任意の調節エレメントの配列とが、調節エレメントの各自が核酸配列の転写においてその機能を充足するように配置された配列を意味するものと理解すべきである。この目的のため、化学的意味での直接連結は絶対的に必要ではない。例えばエンハンサー配列のような遺伝子制御配列は、標的配列においてさらに除去された位置において、または他のＤＮＡ分子からそれらの機能を発揮することができる。転写される核酸配列がプロモーター配列の後に（すなわち３’−末端側に）配置され、そのため両方の配列が共有結合で連結されることが好ましい。ここでは、プロモーター配列と、発現すべき核酸配列の間の距離は、２００塩基対未満、または１００塩基対以下、または５０塩基対以下であることができる。
【０１３０】
プロモーターおよびターミネーターに加え、挙げることができるさらなる調節エレメントの例は、標的化配列、エンハンサー、ポリアデニル化信号、選択できるマーカー、増幅信号、複製起源等を含む。好適な調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。
【０１３１】
特に本発明に従った核酸構造体は、配列同定Ｎｏ．１または３、またはその誘導体および相同体と、そして有利には遺伝子発現の制御、例えば増大のための一以上の調節信号と作用的または機能的に連結されたそれから誘導し得る核酸配列を含む。
【０１３２】
これらの調節配列に加え、これら配列の天然の調節が実際の構造遺伝子以前に存在することができ、そして天然調節がスイッチオフされ、遺伝子発現が増大されるように任意に遺伝子的に修飾されることができる。しかしながら核酸構造体は、もっと簡単に、すなわち追加の調節信号がコード化配列の前に挿入されず、そしてその調節を有する天然プロモーターが除去されずに構築することができる。これに代って、天然調節配列は、もはや調節が行われず、そして遺伝子発現が増大されるように突然変異される。
【０１３３】
好ましい核酸構造体は、有利には、核酸配列の増大した発現を可能にするプロモーターへ機能的に連結された既に述べた“エンハンサー”の一つ以上を含んでいる。さらなる調節エレメントまたはターミネーターのような、追加的有益配列をＤＮＡ配列の３’−末端へ挿入することもできる。本発明に従った核酸は、構造体中に１以上のコピーで存在することができる。構造体の任意の選択のため、抗生物質耐性または栄養補給性を補足する遺伝子のようなさらなるマーカーが構造体中に存在することができる。
【０１３４】
ｃｏｓ，ｔａｃ，ｔｒｐ，ｔｅｔ，ｔｒｐ−ｔｅｔ，ｌｐｐ，ｌａｃ，ｌｐｐ−ｌａｃ，ｌａｃｌｑ，Ｔ７，Ｔ５，Ｔ３，ｇａｌ，ｔｒｃ，ａｒａ，ｒｈａＰ，（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６，ラムダーＰＲのようなプロモーター中に、またはラムダーＰＬプロモーター中に好適な調節配列の例が存在する。これらはグラム陰性細菌に有利に使用される。さらなる有利な調節配列は、イーストまたはカビプロモーターＡＤＣｌ，ＭＦアルファ、ＡＣ，Ｐ−６０，ＣＹＣ１，ＧＡＰＤＨ，ＴＥＦ，ｒｐ２８およびＡＤＨ中のグラム陽性プロモーター中に存在する。人工プロモーターも調節のために使用し得る。
【０１３５】
宿主生物中に発現のため、核酸構造体は、有利には、例えば宿主中で遺伝子の最適で発現を可能にするプラスミドまたはファージのようなベクター中に挿入される。プラスミドおよびファージのほかに、ベクターは、当業者に知られたすべての他のベクター、例えばＳＶ４０，ＣＭＶ，バキュロウイルスおよびアデノウイルスのようなウイルス、トランスポソン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、および鎖状またはサークル状ＤＮＡを意味するものと理解すべきである。これらのベクターは宿主生物中で自発的に複製または染色体的に複製されることができる。これらのベクターは本発明のさらなる具体例を代表する。
【０１３６】
好適なプラスミドは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｐＬＧ３３８，ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＫＣ３０，ｐＲｅｐ４，ｐＨＳ１，ｐＫＫ２２３−３，ｐＤＨＥ１９．２，ｐＨＳ２，ｐＰＬｃ２３６，ｐＭＢＬ２４，ｐＬＧ２００，ｐＵＲ２９０，ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１，λｇｔ１１；ストレプトミセス中のｐＩＪ１０１，ｐＩＪ３６４，ｐＩＪ７０２またはｐＩＪ３６１；バチルス中のｐＵＢ１１０，ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム中のｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７；カビ中のｐＡＬＳ１またはｐＢＢ１１６；イースト中の２αＭ，ｐＡＧ１，ＹＥｐ６，ＹＥｐ１３またはｐＥＭＢＬＹｅ２３；または植物中のｐＬＧＶ２３，ｐＧＨＩａｃ＋，ｐＢＩＮ１９，ｐＡＫ２００４またはｐＤＨ５１である。言及したプラスミドは可能性あるプラスミドの小さな選択である。さらなるプラスミドは当業者には既知であり、そして例えば専門書Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｅｄｓ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ０４４４９０４０１８）から推論することができる。
【０１３７】
ベクターのさらなる具体例において、本発明に従った核酸構造体、または本発明に従った核酸は、直鎖状ＤＮＡの形で微生物に有利に導入され、そして同種または異種組み換えによって宿主生物中に集積されることができる。この直鎖状ＤＮＡはプラスミドのような直鎖状ベクターから、または単に本発明に従った核酸構造体または核酸のみから構成されることができる。
【０１３８】
生物中の異種遺伝子の最適発現のため、生物に使用される特異的“コドン利用”に対応して核酸を修飾するのが有利である。“コドン利用”は、関連する生物の既知の遺伝子のコンピューター分析によって容易に決定することができる。
【０１３９】
本発明に従った発現カセットの生産は、適当なコード化ヌクレオチド配列と、ターミネーターまたはポリアデニル化信号との適切なプロモーターの融合によって実施される。この目的のため、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｃｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されているような慣用の組み換えおよびクローニング技術が使用される。
【０１４０】
好適な宿主生物中の発現のため、組換え核酸構造体または遺伝子構造体が、宿主中に遺伝子の最適発現を可能にする宿主特異性ベクター中に有利に挿入されるベクターは当業者には良く知られ、そして例えば“Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）から推論することができる。
【０１４１】
３．３  微生物
文脈に応じて、用語“微生物”は出発微生物（野生タイプ）、または遺伝子的に修飾された組換え微生物、または両者を意味するとして理解できる。
【０１４２】
本発明に従ったベクターの助けにより、本発明に従った少なくとも一つのベクターで形質転換された組換え微生物が調製され、本発明に従ったポリペプチドの生産のために使用することができる。有利には、上に記載した本発明に従った組換え構造物が宿主システムに導入され、発現される。ここでは、例えば共沈澱、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等のような、当業者が熟知しているクローニングおよびトランスフェクション方法が前述した核酸をそれぞれの発現システム中に発現させるために好ましく使用される。好ましいシステムは、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９７またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。
【０１４３】
本発明に従った核酸または核酸構造物のための可能な組換え宿主生物は原則として原核または真核生物である。有利には、使用される宿主生物は、細菌、カビまたは酵母のような微生物である。グラム陽性またはグラム陰性細菌が有利に使用され、好ましい細菌はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ，Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅまたはＮｏｃａｒｄｉａｃｅａｅのファミリであり、特に好ましい細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ａｇｒｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ，ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍまたはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが非常に好ましい。さらに有利な細菌は、α−プロテオバクテリア、β−プロテオバクテリアまたはγ−プロテオバクテリアよりなる群の中に発見される。
【０１４４】
本発明に従った宿主生物は、上の定義に従った１２α−ＨＳＤＨ活性を有する酵素をコードする、本発明において記載した核酸配列、核酸構造物またはベクターの少なくとも一つを含む。
【０１４５】
本発明に従ったプロセスに使用される生物は、宿主生物に応じて当業者に知られた態様で発育または培養される。微生物は一般に、通常糖の形の炭素源、通常イースト抽出物のような有機窒素源または硫酸アンモニウムのような塩の形の窒素源、鉄、マンガンまたはマグネシウム塩のような微量元素、そして任意にビタミンを含んでいる液体培地中で、酸素曝露下０℃ないし１００℃、好ましくは１０℃ないし６０℃の温度において生育される。生育はバッチ式、半バッチ式または連続式に実施することができる。栄養発酵の出発時に、または半連続的または連続的に後で導入されることができる。
【０１４６】
３．４  ＵＤＣＡの生産
３．４．１  序論
活性物質ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）および関連するジアステレオマーであるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）は、胆石症の医学的処置のために長年使用されている。両方の化合物は７位の炭素原子上のヒドロキシル基の配置によって異なるのみである（ＵＤＣＡ：β−配置、ＣＤＣＡ：α−配置）。ＵＤＣＡの商業量の生産のために、これまで原料としてＣＤＣＡが使用される方法が好ましく使用されて来た。代ってＣＤＣＡはコール酸（ＣＡ）から好ましく生産される。
【０１４７】
【化６】
2011526481.tif 000008
【０１４８】
３．４．２  ＣＤＣＡの生産
ＣＡ（ＣＡＳ  ８１−２５−１４）はＣＤＣＡ（ＣＡＳ  ４７４−２５−９）の生産のための原料として使用される。古典的な化学的ルート１は、もっぱら化学的処理ステップを使用する。この場合ＣＡをＣＤＣＡへ変換するためには４ステップが必要である。代わりのルート２は酵素触媒反応を含む。この経路はＣＡからＣＤＣＡへたった２ステップで導く。
【０１４９】
３．４．２．１  ルート１（化学的経路）
この合成の第１ステップにおいては、ＣＡのカルボキシル基がメチルエステル（ＣＤＣＡ  Ｉ，ＣＡＳ  １４４８−３６−８）を与えるようにエステル化される。位置選択的に進行する３位および７位のヒドロキシル基のアセチル化が続く。アセチル化生成物である、３，７−ジ−Ｏ−アセチルコール酸メチル（ＣＤＣＡ  ＩＩ，ＣＡＳ  ３７４９−８７−９）が結晶として得られ、そして単離される。次のステージ（ステップ３）において、１２位の遊離ヒドロキシル基が酸化される。３，７−ジ−Ｏ−アセチル−１２−ケトコラン酸メチル（ＣＤＣＡ  ＩＩＩ，ＣＡＳ  ４６５１−６７−６）は、第４の最終ステップにおいてＷｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元でＣＤＣＡへ脱酸素化される。
【０１５０】
第１ステップ：エステル化
【化７】
2011526481.tif 000009
【０１５１】
第２ステップ：アセチル化
【化８】
2011526481.tif 000010
【０１５２】
第３ステップ：酸化
【化９】
2011526481.tif 000011
【０１５３】
第４ステップ：脱酸素化
【化１０】
2011526481.tif 000012
【０１５４】
詳しくは、このプロセスは以下のように実施される。
【０１５５】
ステージ１において、ＣＡはコール酸メチル（ＣＤＣＡＩ）を与えるように酸触媒のもとでメタノールと反応させられる。３位および７位における無水酢酸による位置選択性アセチル化が続く。この反応のため有機窒素塩基およびアセチル化触媒が任意に使用される。反応時間の最適化によって最大量のジアセチル化合物が得られる。この生成物は結晶化の後単離され、乾燥される。特に無水酢酸、トリエチルアミンおよびＤＭＡＰと組合せたアセチル化がＥＰＯ４２４２３２に記載されている。アセチル化の選択性は中間体ＣＤＣＡの品質を決定する。副生成物である３−０−モノアセチルコール酸メチルは合成の以後のコースにおいてリソコール酸へ誘導される。この化合物は有毒であり、そして最終生成物ＵＤＣＡの公定書において低い値（欧州局方０．１％、ＵＳＰ０．０５％）へ制限する。３，７，１２−トリ−０−アセチルコール酸メチルへの過度アセチル化は、後で得られたＣＤＣＡが不純物として比例的に多量のＣＡを含むようになる。
【０１５６】
ＣＤＣＡＩＩのＣＤＣＡＩＩＩへの酸化は、次亜塩素酸ナトリウム水溶液を用いて実施される。生成物は反応溶液から沈澱し、濾過し、乾燥する。この操作もＥＰＯ４２４２３２に記載されている。文献にはクロム酸のような他の酸化剤が代替品として見られる。
【０１５７】
ＣＤＣＡＩＩＩのＣＤＣＡへの脱酸素化については、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｒｅｒ還元の種々の変法が知られている。一方法において、ＣＤＥＣＡＩＩＩがトリエチレングリコール中２００℃においてヒドラジンおよび水酸化ナトリウムと反応させられる。塩酸で酸性化することによって反応溶液から沈澱させられ、濾過、乾燥される。ＥＰ０４２４２３２には他の方法が記載され、もっと低い温度で実施される。ＣＤＣＡＩＩＩは、ここではヒドラジンと２−ブタノール中の水酸化カリウムと反応させられる。生成物は変法１と同様に塩酸の添加によって沈澱させられる。
【０１５８】
この方法によって得られたＣＤＣＡは、後で記載する方法によって局方ＵＤＣＡを製造するために適した規定されそして指示した品質を有する。
【０１５９】
３．４．２．２（酵素経路）
もっぱら化学的なプロセスの代りに、本発明により、ＣＡが１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ，ＣＡＳ  ２４５８−０８−４）へ酵素触媒で酸化され、ＣＤＣＡを与えるように反応させられるプロセスが提供される。この合成経路はたった２ステップであり、そして純粋な化学的ルートに比較して明らかに簡単に実施される。
【０１６０】
第１ステップ：酵素酸化
【化１１】
2011526481.tif 000013
【０１６１】
第２ステップ：脱酸素化
【化１２】
2011526481.tif 000014
【０１６２】
ステップ１に従って、コール酸はＮＡＤＰ＋に依存して１２α−ＨＳＤＨによって１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）を与えるように酸化される。この反応は可逆的である。１２α−ＨＳＤＨは酵素クラス１．１．１．１７６へ属し、主にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌に発見されるＮＡＤＰ＋依存性（Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｈｙｙｅｍｏｎ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ５２８（１）：１４８−５７）と、ＮＡＤ＋依存性代表の両方が存在する（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．１９７６；Ｂｉｏｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４５０（２）：１４２−５３）。
【０１６３】
他のＨＳＤＨの存在なしで高い１２α−ＨＳＤＨ活性を発現する既知の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ株４８−５０  ＤＳＭ  ４０２９（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．１９７９  前出）である。それ故これまでこの微生物が１２α−ＨＳＤＨの生産者として使用され、コストのかかる媒地を必要とする好気性発酵を要していた（ＭｃＤｏｎａｌｄ  １９８１，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ３７（５）：４５１−１）。しかしながら後者はイースト自己分解物によって置き換えることが可能であった（Ｂｒａｕｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９１，前出）。
【０１６４】
酵素酸化は、本発明に従って好ましくは１２α−ＨＳＤＨ（長鎖または短鎖バージョン）と、例えばＡＤＨｍｓまたはＡＤＨｔのようなＡＤＨによる再生助因子によって実施される。
【０１６５】
ステップ２に従った脱酸素化は古典的な化学的Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元であり、上に記載したＣＤＣＡＩＩＩの脱酸素化と同様に実施される。このルートの本質的利点は、酵素の選択性の結果不純物リソコール酸が生成しないことである。
【０１６６】
３．４．３．３  ＵＤＣＡの生産
ＣＤＣＡはＵＤＣＡ（ＣＡＳ  １２８−１３−２）の原料として使用される。最初の合成ステップにおいて、ＣＤＣＡの２位のヒドロキシル基が対応するケトンを与えるように酸化される。７−ケトリソコール酸（３α−ヒドロキシ−７−ケトコラン酸、ＫＬＣＡ，ＣＡＳ  ４６５１−６７−６）が得られる。７位のケト基の立体選択性還元が第２ステップにおいて続く。この目的はできるだけ立体選択的にＵＤＣＡを得ることである。一般にＵＤＣＡは、還元直後は、ジアステレオマーＣＤＣＡの数パーセントをなお含んでいる。活性物質であるＵＤＣＡに到達するためには、粗製ＵＤＣＡを第３ステップにおいて精製しなければならない。
【０１６７】
第１ステップ：酸化
【化１３】
2011526481.tif 000015
【０１６８】
第２ステップ：還元
【化１４】
2011526481.tif 000016
ＫＬＣＡ              粗ＵＤＣＡ
（ＵＤＣＡとＣＤＣＡよりなる）
【０１６９】
第３ステップ：精製
粗ＵＤＣＡ  →  純ＵＤＣＡ
【０１７０】
ＣＤＣＡの酸化は慣用的に次亜塩素酸ナトリウム水溶液で実施される。文献では、代りにクロム酸酸化が見られる。ＫＬＣＡは固体として得られ、そして第２ステップにおいてさらに処理される。還元はアルコール中の金属ナトリウムによって実施される。ＵＤＣＡ：ＣＤＣＡ約８５：１５の組成を有する粗生成物が得られる。代替法においては、ＫＬＣＡは溶媒として（例えば脂肪族アルコールのような）アルコール中、カリウムｔ−ブトキサイドまたは水酸化カリウムのような塩基の存在下、ニッケル触媒（ラネ−ニッケル）上水素で還元される（ＥＰＡ−Ｏ  ２３００８５）。加えて、還元はカリウムおよびリチウム（ナトリウムより高い選択性、Ｃ．Ｇｉｏｒｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９８５，９７，５１０）、亜鉛（ＥＳ４８９６６１）および電気化学的（ＵＳ４５４７２７１）にも可能である。
【０１７１】
純ＵＤＣＡを与える粗ＵＤＣＡの精製は、ジアステレオマー塩の分離を含む。これはＵＤＣＡの適当な塩の調製、単離およびその後の分解を含む。文献には、対応するＵＤＣＡエステルの製造、再結晶および分解（ＥＰ−Ａ−Ｏ  ３８６５３８）、抽出（ＪＰ６０００６６９９）、およびクロマトグラフィー法（ＩＴ  ２０００ＭＩ１１７７）が代替精製方法として記載されている。
【０１７２】
３．５  １２α−ＨＳＤＨの組換え生産
さらに本発明は、ポリペプチド生産微生物が、培養され、ポリペプチドの発現が任意に誘発され、そして培養物からそれらが単離される、本発明に従ったポリペプチド、または機能的な、生物学的に活性なそのフラグメントの組換え生産方法に関する。このようにポリペプチドは、もし望むならば、工業的スケールで生産することもできる。
【０１７３】
本発明に従って調製される微生物はバッチプロセスで（バッチ式培養）において、または流加培養プロセスまたは反復流加培養プロセスにおいて連続的にまたは非連続的に培養することができる。公知の培養方法の要約はＣｈｅｍｉｅｌの教科書（Ｂｉｏｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １．Ｅｅｉｎｆｕｅｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｈ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））またはＳｔｏｒｈａｓの教科書（Ｂｉｏｒｅａｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））に見られる。
【０１７４】
使用すべき培養培地はそれぞれの株の要求を好適に満たさなければならない。種々の微生物の培地は、ハンドブック“Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，Ａｍｅｒｉａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．ＵＳＡ，１９８１）に含まれている。
【０１７５】
本発明に従って使用し得るこれらの培地は、通常一以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含んでいる。
【０１７６】
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類である。非常に良い炭素源は、例えばグルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖は、糖蜜または製糖の他の副産物のような複合化合物として媒地へ添加することもできる。種々の炭素源の混合物を添加することも有利である。他の可能性ある炭素源は、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油のような油脂、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノレイン酸のような脂肪酸、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノールのようなアルコールおよび例えば酢酸または乳酸のような有機酸である。
【０１７７】
窒素源は、通常有機または無機窒素化合物か、またはこれら化合物を含んでいる材料である。例示的窒素源は、アンモニアガスまたは硫酸アンモニウム、塩化エンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、またはコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク、イーストエキス、ミートエキス等の複合窒素源を含む。窒素源は個別にまたは混合物として使用することができる。
【０１７８】
媒地中に存在することができる無機塩は、塩化物、またはカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄のリン酸または硫酸塩である。
【０１７９】
イオウ源として、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、ジチオナイト、テトラチオネート、チオ硫酸塩、硫化物のような無機イオウ含有化合物を使用することができるが、メルカプタンおよびチオールのような有機イオウ化合物を使用することもできる。
【０１８０】
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウム、またはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を使用することができる。
【０１８１】
金属イオンを溶液中に保持するためキレート剤を媒地へ添加することができる。特に好適なキレート剤は、カテコールまたはプロトカテキュエートのようなジヒドロキシフェノール、クエン酸のような有機酸を含む。
【０１８２】
本発明に従って使用し得る発酵媒地は、ビタミンのような他の発育因子または発育プロモーターを慣用的に含み、これらは、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩およびピリドキシンを含む。発育因子および塩は、イーストエキス、糖蜜、コーンスチープリカー等のような複合媒地成分からしばしば誘導される。さらに培地へ好適な前駆体を添加することもできる。媒地配合物の正確な組成は、詳細な実験に強く依存し、そしてそれぞれの特定のケースのために個別的に決定される。媒地最適化のための情報は教科書“Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｅｄ．Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）ｐｐ．５３−７３，ＩＳＢＮ  ０  １９  ９６３５７７  ３）から得られる。発育培地は、スタンダード１（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＤＩＦＣＯ）等のような商業的サプライヤーからも得ることができる。
【０１８３】
すべての培地成分は熱（１．５バールおよび１２１℃において２０分）または無菌濾過によって滅菌される。成分は一所に、またはもし必要ならば別々に滅菌することができる。すべての媒地成分は発育のスタートから存在することができ、または場合によって連続的またはバッチ式に添加することができる。
【０１８４】
培養物の温度は通常１５℃ないし４５℃、好ましくは２５℃ないし４０℃の間であり、そして実験の間コンスタントに保つか、または変えることができる。媒地のｐＨは５ないし８．５の範囲内でなければならず、好ましくは７付近である。伝播のためのｐＨは、伝播の間、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水のような塩基性化合物の添加、またはリン酸または硫酸のような酸性化合物の添加によってコントロールすることができる。泡発生の制御のため、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用することができる。プラスミドの安定性の維持のため、例えば抗生物質のような好適な選択的に作用する物質を培地へ加えることができる。好気的条件を維持するため、酸素または環境空気のような酸素含有ガス混合物が培養物中に導入される。培養物の温度は通常２０℃ないし４５℃である。培養は所望の生成物が最大に生産されるまで継続される。この目的は通常１０時間ないし１６０時間で達成される。
【０１８５】
発酵ブロスはその後さらに処理される。要請に応じ、バイオマスは、例えば遠心、濾過、デカンテーションまたはこれらの組合せのような分離方法によって、または完全に放置することによって完全にまたは部分的に発酵ブロスから除去することができる。
【０１８６】
もしポリペプチドが培養培地中に分泌されないならば、細胞を破壊し、そして既知タンパク単離方法に従って溶解物から回収することもできる。代って細胞は、高周波数超音波により、例えばフレンチ圧力セル中のような高圧力により、オスモリシスにより、界面活性剤、分解酵素または有機溶媒の作用により、または言及したプロセスのいくつかの組合せによって破壊することができる。
【０１８７】
ポリペプチドの精製は、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーのような分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーのような既知のクロマトグラフィープロセスを使用し、および限外濾過、結晶化、塩析、透析および天然ゲル電気泳動のような他の慣用のプロセスを使用して達成することができる。好適プロセスは、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ，Ｖｅｒｌａｈ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋまたはＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【０１８８】
組換えタンパク単離のため、特異性ヌクレオチド配列を伸長し、そしてそのため例えばより簡単な精製のために役立つ修飾したポリペプチドまたは融合タンパクをコードするベクターシステムまたはオリゴヌクレオチドを使用することが組換えタンパクの単離のために有利であり得る。このタイプの好適な修飾は、例えば、ヘキサヒスチジンアンカーとして知られた修飾、または抗体によって抗原として認識されることができるエピトープのような（例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｂｄｉｅｓ：Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓに記載されているような）アンカーとして機能する“タグ”である。これらのアンカーは、例えばクロマトグラフィーカラムへ充填することができる、またはマイクロタイタープレート上または他のキャリア上に使用されるポリマーマトリックスのような固体担体へのタンパクの付着のために役立つことができる。
【０１８９】
同時に、これらアンカーはタンパクの認識のためにも使用することができる。タンパクの認識のため蛍光染料のような慣用なマーカー、基質との反応後検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー、または放射性マーカーが単独で、またはタンパクの誘導体化のアンカーと組合せて使用されることができる。
【０１９０】
３．６  酵素固定化
本発明に従った酵素は、ここに記載したプロセスにおいて遊離または固定形で使用することができる。固定化酵素とは、不活性担体へ固定される酵素の意味であると理解される。好適な担体材料およびその上に固定化された酵素は、ＥＰ−Ａ−１１４９８４９，ＥＰ−Ａ−１０６９１８３およびＤＥ−Ａ−１００１９３７７３およびそれらに引用された参照から知られている。この点に関し、これら明細書の開示全体が参照される。好適な担体材料は、例えばカオリナイト、ケイ藻土、パーライトのような粘土、粘土鉱物、シリカ、アルミナ、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉、アニオン交換材料、ポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタンおよびポリエチレンおよびポリプロピレンのような合成高分子を含む。担体材料は慣例的に固定された酵素のために微粉砕された粒子の形で使用され、多孔質形が好ましい。担体材料の粒子寸法は５ｍｍ以下、特に２ｍｍ以下（分布カーブ）である。同様に、全細胞触媒としてデヒドロゲナーゼの使用において、遊離または固定化形を選ぶことができる。担体材料は、例えばアルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。酵素それに細胞は、グルタルアルデヒドを用いて直接架橋する（ＣＬＥＡへの架橋）ことができる。対応してそしてさらなる固定化プロセスは、例えば、Ｊ．Ｌａｌｏｎｄｅ  ａｎｄ  Ａ．Ｍａｒｇｏｌｉｎ“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ｉｎ  Ｋ．Ｄｒａｕｚ  ａｎｄ  Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃａｌａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｏｒａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ２００２，ｖｏｌ．ＩＩＩ，９９１−１０３２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎ  ｈｅｉｍに記載されている。
【０１９１】
実験の部
他の情報が与えられなければ、例えば制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの精製、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレンへのＤＮＡの移動、ＤＮＡフラグメントの連結、微生物の形質転換、微生物の伝播、ファージの複製、および組換えＤＮＡの配列分析のような、本発明の文脈において実施されるクローニングステップは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）前出に記載されているように実施することができる。
【０１９２】
Ａ．一般的情報
材料
酵素および酵素緩衝液はＦｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−ＲｏｔまたはＮＥＢ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔから得た。
【０１９３】
ＬＢ媒地
Ｂａｃｔｏ  ｔｏｙｐｔｏｎｅ              １０ｇ
イーストエキス                              ５ｇ
塩基ナトリウム                              ５ｇ
二重蒸留水                          １０００ｍｌへ
【０１９４】
ＴＢ媒地
溶液Ｉ：
Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ              １２ｇ
イーストエキス                            ２４ｇ
グリセロール，無水                        ４ｍｌ
二重蒸留水                          ９００ｍｌへ
溶液ＩＩ：
リン酸二水素カリウム                  ０．１７Ｍ
リン酸水素カリウム                    ０．７２Ｍ
二重蒸留水                          １００ｍｌへ
二つの溶液はオートクレーブ滅菌後混合された。
【０１９５】
発現ベクター
１２α−ＨＳＤＨの発現のため、ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔが使用された。これはＴ７プロモーターと、転写スタートと、そしてＴ７ターミネーターのコントロール下にあるＭＣＳを含んでいる。発現はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシン（ＩＰＴＧ）によって誘発される。
【０１９６】
このため、１２α−ＨＳＤＨコード化配列がＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ生成物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ株４８−５０のゲノムＤＮＡを鋳型として、そして後でもっと詳細に記載するプライマーペアを使用して得られた。ＰＣＲ生成物はアガロースゲルへ適用され、分離され、これから切り取られた。その後それらはＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの助けにより制限され、同様にＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターとリゲートされた。
【０１９７】
微生物
株     ゲノタイプ  
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループ株４８−５０
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）
Ｆ−ｏｍｐＴｇａｌ  ｄｃｍ  Ｉｏｎ
ｈｓｄSＢ（ｒＢ−ｍＢ−）λ（ＤＥ３
〔ｌａｃＩ  ｌａｃＵＶＳ−Ｔ７  Gene
１  ｉｎｄ１  ｓａｍ７  ｎｉｎ５〕）、
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｏｓｅｔｔａＴＭ（ＤＥ３）
Ｆ−ｏｍｐＴｈｓｄＳＢ（ＲＥ−ｍｓ−）
ｇａｌ  ｄｃｍλ（ＤＥ３〔ｌａｃＩ
ｌａｃＵＶ５−Ｔ７  ｇｅｎｅ１
ｉｎｄ１  ｓａｍ７（ｎｉｎ５〕）
ＰＬｙｓＳ−ＲＡＲＥ（ＣａｍＲ）
【０１９８】
方法
１．  １２α−ＨＳＤＨ活性決定のための標準的条件
活性は以下のように定義される。リン酸カリウム緩衝液中（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）室温（すなわち約２０℃―２３℃）で５ｍＭコール酸溶液の１μｍｏｌ／ｍｉｎの反応を触媒する酵素の量に相当する酵素が１単位と定義される。
【０１９９】
活性決定のため、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０の７９０μｌと、コール酸１００μｍ（リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）中５０ｍＭ）と、そして測定すべき酵素溶液１０μｌをクベット中で混合した。反応のスタート時にＮＡＤＰ＋（２．５ｍＭ）の１００μｌが添加され、そして３４０ｎｍでの吸収の増加が光度計で決定された。室温で３０秒にわたって勾配が決定された。活性の決定はＬａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則に従って行われた。
【０２００】
２．  ＢＣＡアッセイによるタンパク濃度の決定
溶液のタンパク濃度は、例えば細胞溶解液希釈液または超音波破壊後の再懸濁細胞細片ペレットのＢｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｕｎｃｈｅｎの分析キットのＢＣＡ溶液（溶液Ａ：溶液Ｂ＝５０：１）２００μｌのタンパク溶液２０μｌの５６２ｎｍにおける吸収を測定することによって決定された。ここでは、ビシンコニン酸が生成し、タンパクによる二価銅イオンの還元によって定量的に生成される一価銅イオンと、吸収が５６２ｎｍにある紫色の錯塩を形成するからこれを光度計で測定することができる。濃度の決定はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）較正ラインによって実施される。
【０２０１】
Ｂ．遺伝子単離のための予備実験
すべての実験的研究の目的は、酵素１２α−ＨＳＤＨへの改良されたアクセスを発見することである。この目的を達成するため、１２α−ＨＳＤＨをコードする遺伝子の配列が本発明に従って解明された。
【０２０２】
１．１  最初に、これは変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって試みられた。使用されたオリゴヌクレオチドは、一方では１２α−ＨＳＤＨの発表されたＮ−末端アミノ酸配列（Ｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．前出）に基づいて構築された。変性の程度を低く保つため、プライマーはＮ−末端メチオニン（１コドンのみ）で開始して誘導された（プライマー配列は示さず）。他方、データバンク配列比較は、保存されたアミノ酸モチーフ“ＬＶＮＮ”がＨＳＤＨに存在することを示した。この領域が逆プライマーの構築のために用いられた。加えて、より強力でない保存された配列モチーフＰＥ（Ｑ）ＤＩＡＮが変性プライマーの設計にさらに用いられた（プライマー配列示さず）。さらに変性オリゴヌクレオチドは自由にアクセスし得るプログラムＣＵＤＥＨＯＰ（Ｒｏｓｅ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，２６（７），１６２８−１６３５）によって捨てられた。
【０２０３】
上で示した変性プライマー対のすべての組合せを用いて求めた遺伝子を増幅することはできなかった。
【０２０４】
１．２  １２α−ＨＳＤＨのさらなるペプチド配列フラグメントの決定のための実験において、二つのアフィニティクロマトグラフィーステップの組合せにより、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰの溶解物から酵素を精製することが試みられた。このプロセスはＢｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．前出によって記載されたが、しかし追試できなかった。
【０２０５】
Ｃ．  コード化１２α−ＨＳＤＨ配列の単離および１２α−ＨＳＤＨ酵素のキャラクタリゼーション
実施例１：配列相同性調査
１２α−ＨＳＤＨ配列へのアクセスを得るため、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ株  ４８−５０  ＤＳＭ４０２９のゲノムの配列が決定された。発表されたＮ−末端配列とモチーフ“ＬＶＮＮ”のすべての転写解読枠（ＯＲＦ）中の検索は１２α−ＨＳＤＨをコードする遺伝子の配列へ導かなかった。
【０２０６】
修飾された形において発表された部分的配列情報に含まれている遺伝子の同定は配列相同性比較によってのみ可能であった。比較はＴＢＬＡＳＴＸ（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｏｔｔ  １７２（２），２４７−２５０）を使用し、そして以下の条件で実施された。
【０２０７】
オープンギャップ：５
エキステンションギャップ：２
ｇａｐｚ−ｄｒｏｐｆｆ：５０
エキスペクト：１０．０
ワードサイズ：１１
標準条件
ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ＢＬＡＳＴ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＝Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＆ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｔｂｌａｔｘ＆ＢＬＡＳＴＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｔｂｌａｓｔｘ＆ＰＡＧＥ
ＴＹＰ＝Ｂｌａｓｔ
Ｓｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ  ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＃ｉ
が使用された。パラメータは“Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ”のもとにそこに見られる。
【０２０８】
発見された遺伝子（配列同定Ｎｏ．３）において、発表された部分配列中に示されたＮ−末端メチオニンが欠けており、さらに発表された部分配列はこのタンパクのＮ−末端に見られない（遺伝子のバイオインフォマティック予知はＧＬＩＭＭＥＲ，ＣＢＣＢ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）でスタートする）。保存されたモチーフ“ＬＶＮＮ”も１２α−ＨＳＤＨにおいて“ＬＩＮＮ”に修飾される（配列同定番号５）。
【０２０９】
これらの理由のため、変性オリゴヌクレオチドを用いた配列解明のために当初行ったアプローチを成功裡に実行することはできなかった。特にメチオニンは、たった一の塩基トリプレットによってコード化されるので、変性プライマーを誘導するために常に使用される。同様に、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．から計算された１２α−ＨＳＤＨが保存された配列“ＬＶＮＮ”に相違を示すとは予想されなかった。
【０２１０】
図３は、公知の微生物ＨＳＤＨと本発明に従ったＨＳＤＨの間の部分多数配列アラインメントを示す。
【０２１１】
実施例２：１２α−ＨＳＤＨの増幅と１２α−ＨＳＤＨの発現
１．増幅
以下のプライマーが用いられた。
【０２１２】
前方ロング（ロング酵素バージョン，ＮｄｅＩ切断部位）：
【化１５】
2011526481.tif 000017
【０２１３】
前方ショート（ショート酵素バージョン，ＮｄｅＩ切断部位）：
【化１６】
2011526481.tif 000018
【０２１４】
逆プライマー（ＢａｍＨＩ切断部位：）
【化１７】
2011526481.tif 000019
【０２１５】
標的遺伝子はＰｆｕポリメラーゼを使用し、ＰＣＲによって増幅された。
【０２１６】
鋳型として、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ株  ４８−５０  ＤＡＭ  ４０２９（２９．４ｎｇ／μｌ）の１μｌが使用された。増幅のためＰｆｕポリメラーゼ１μｌが使用された。使用された緩衝液はＰｆｕ緩衝液（１０×ＭｇＳＯ４で）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ）であった。各場合、前方および逆プライマーの１．５μｌ（１０μＭ）と、デオキシヌクレオチド三リン酸（２０μＭ）が使用された。バッチはＲＮアーゼ不含水で５０μｌへ調節された。反応はＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモサイクラー内で実施された。ＰＣＲバッチはＤＮＡを変性するため当初９５℃で５分間開始された。次に未知ＤＮＡ配列のクローニングにおいて、９５℃において３０秒の変性から始まって３０サイクル続いた。その後バッチは標的ＤＮＡ上で変性されたプライマーのアンニーリングを確実にするため（５３℃のコンスタントアンニーリング温度）温度勾配により各場合３０秒間２５〜４５℃へ冷却された。その時プライマー延長のため、使用したポリメラーゼの最適活性がそこにある７２℃の温度へ９０秒調節された。最後にバッチは７２℃で１０分間インキュベートされ、そして装置から除去されるまで４℃に冷却された。
【０２１７】
２．発現
ＰＣＲによる増幅の後、標的遺伝子は切断部位ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによって発現ベクターｐＥＴ２２ｂ＋中にクローンされ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ  ＤＥ３ＴＭおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＤＥ３  細胞に導入され、発現された。これらは非病原性株であり、酵素の多量生産（培養物の１５００００Ｕ／ｌまで）可能とする。
【０２１８】
発現のため、ＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ添加）の５ｍｌが、発現ベクターで１６時間形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ）またはＲｏｓｅｔｔａＴＭクローンと共に３７℃と１８０ｒｐｍｅでインキュベートされた。ＴＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ添加）の２００ｍｌがそれで接種され、３７℃と１８０ｒｐｍでインキュベートされた。１２α−ＨＳＤＨの発現は１ｍＭ  ＩＰＴＧの０．６−０．８のＯＤ６００において誘発された。種々の時間において、０．２５のＯＤ６００を有する細胞懸濁液１ｍｌが除去され、１３０００ｒｐｍにおいて１分間ペレット化され、使用まで−２０℃で貯蔵された。発現は、細胞を２７００ｇおよび４℃において１０分間ペレット化し、その後冷凍することによって４または２２時間後終わらせた。
【０２１９】
細胞は、最初リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）の４−１０ｍｌ中にペレットを再懸濁することによって超音波の助けによって破壊された。細胞は氷浴中Ｂｒａｎｓｏｎからの超音波ディスインテグレーターで３０％の強度において４回１分間、および各場合２分の休止で処理された。その後細胞細片が４２２０ｇおよび４℃で１時間の遠心によって除去された。
【０２２０】
図４は、本発明に従った酵素の４時間および２２時間発現後の細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％強度ゲル、β−メルカプトエタノール）の結果を示している。
【０２２１】
タンパク含量および酵素活性は前記したように決定した。
【０２２２】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の破壊後得られた酵素活性を次の表に要約する。
【０２２３】
【表２】
2011526481.tif 000020
【０２２４】
高い発現レベルのため、細胞破壊および遠心後の酵素調製物の体積および比活性は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ株４８−５０から由来するそれらよりもすでに著しく高い（培地の３６８００Ｕ／ｌ）。このため以前に記載されたプロセスと対照的に、タンパク精製を省略することができる。
【０２２５】
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞のタンパク総量中の標的タンパクの高い割合は上の表に示されている。
【０２２６】
【表３】
2011526481.tif 000021
【０２２７】
実施例３：コール酸からの１２−ケトケノデオキシコール酸の調製的合成
発現された酵素（ショートバージョン）をＡＤＨ  ｔ（Ｃｏｄｅｘｉｓ，Ｊｕｌｉｃｈ）と組合せて１２−ケトケノデオキシコール酸の調製的合成のために使用した。このため、コール酸（リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）、１０％アセトン）の５００ｍｌと、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋と、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）からの１２α−ＨＳＤＨショート（上の実施例２参照）の２０００単位と、そして助因子再生のためのＡＤＨ  ｔ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｇｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．から、Ｃｏｄｅｘｉｓ，Ｊｕｌｉｃｈ）の５５０単位が１Ｌ丸底フラスコ中で混合された。反応は連続的攪拌および還流冷却下室温において実施された。２７時間後、追加の１２α−ＨＳＤＨ５５０単位およびＡＤＨ  ｔの１３８単位が添加され、そして混合物は合計１１７時間インキュベートされた。反応の間、３４０ｎｍにおける光度計吸収が決定され、そしてサンプル１ｍｌが反応のコースをモニターするために除去された。塩酸（１Ｍ）１００μｌで停止され、そして蒸発または酢酸エチルとで抽出された。吸収コースを図５に示す。
【０２２８】
反応物は反応原料が完全に沈澱するまで濃塩酸（３７％）添加によって酸性化された。上清が除去され、毎回酢酸エチル５０ｍｌで３回抽出された。沈澱したコール酸誘導体は塩酸の添加と加温によってアセトン中に完全に溶解された。有機相を合し、溶媒がなくなるまで乾燥された。
【０２２９】
このように、ここではＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．グループＰ族と４８−５０からの直接の商業的製品（ＡＳＡ  Ｓｐｅｚｉａｌｅｎｚｙｍｅ）の使用よりも著しく簡単な生成物抽出が可能となる。その理由は同じＨＳＤＨ活性において著しく低い総タンパク含量である。
【０２３０】
実施例４：発現された酵素のキャラクタリゼーション
発現された酵素はそれらの酵素活性に関してキャラクタライズされた。それはコール酸の１２−ケトケノデオキシコール酸への選択的酸化を触媒することを示した。
【０２３１】
参照物質コール酸と１２−ケトケノデオキシコール酸および反応バッチ（実施例３）の抽出物がＴＬＣシリカゲル６０  Ｆ２５４アルミ箔（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）へガラス毛細管によって適用された。箔は溶離液としてジクロロメタン：アセトン：酢酸（濃）＝４０：４０：３の混合物を含んでいるクロマトグラフィーチャンバー中にできるだけ垂直に配置された。分離は溶離先端がプレートの上縁に殆ど到達するまで実施された。物質の着色は、リンモリブデン酸スプレー剤（リンモリブデン酸４０ｍＭ、９５．２％濃酢酸、４．８％濃硫酸）のスプレーと、その後の加熱によって実施された。
結果は図６に示されている。
【０２３２】
実施例５：ＮＡＤＰＨ結合に含まれるアミノ酸残基の位置
ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ−依存性“短鎖デヒドロゲナーゼ”（ＳＤＲ）との相同性比較により、部位指向突然変異生成（置換は発表（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５（２４）：７７１５−３０）および（Ｃａｒｕｇｏ  ａｎｄ  Ａｒｇｏｓ（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２８（１）：１０−２８）に基づいて調製された）によって助因子認識のため、そして多分将来の助因子識別のために重要な二つのアミノ酸側鎖を同定することができた。置換Ｇ３７ＤおよびＲ３８Ｌ（配列同定Ｎｏ．３に基づいて）が実施された。実験は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧｍｂＨのＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位指向突然変異生成キットのための実験詳細に従って実施された。
【０２３３】
部位指向突然変異生成のためのプライマー（以下の表を見よ）は、それらが所望のアミノ酸交換をもたらすように１２α−ＨＳＤＨ遺伝子配列を基にして選択された。突然変異（アンダーラインでマークされた）がプライマーの中央に位置するように、そして二つのプライマー対の溶融温度が同じ範囲に位置するように注意が払われた。以下の組合せが使用された。
【０２３４】
【化１８】
2011526481.tif 000022
【０２３５】
位置指向突然変異生成のためのプライマー
【表４】
2011526481.tif 000023
【０２３６】
得られたタンパク変種はもはやＮＡＤＰＨで活性を示さなかった。これは助因子結合のための同定された位置の重要性を裏づける。このようにこれまで調製された変種はＮＡＤＨで活性を示さなかった。しかしながらＮＡＤＨ依存性ＨＳＤＨ変種は記載した位置または他の位置における飽和突然変異生成によって得ることができた。
【０２３７】
実施例６：生成物阻害突然変異体３７Ｄ１２のキャラクタリゼーション
検討した１２α−ＨＳＤＨにおいて、生成物１２−ケトケノデオキシコール酸による阻害が観察されるべきである。これはプロセスの反応速度に負の効果を有し得る。１２α−ＨＳＤＨのこの生成物阻害を減らすため、４０００変異体を有する１２α−ＨＳＤＨのランダムのライブラリがエラープローンＰＣＲによって調製された。適した方法は原理的に知られ、そして例えば、Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｎｄａｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ＪＰＲ  Ｍｕｔｔａｇｅｎｅｓｉｓ：（１９９２）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２８−３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ａｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）３：５４−５９；またはＬｉｅｂｅｔｏｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２０００），７：７０９−７１８に記載されている。エラープローンＰＣＲのための標的ＤＮＡの出発量は、ｋｂあたり４．５突然変異の突然変異率が得られるように選ばれた。生成物のｐＥＴ２２（＋）ベクター中にリゲートされ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｎｏｖａ  Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）中で形質転換された。
【０２３８】
約４０００の突然変異体がマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に取られ、主培養に役立たせた。誘発、発現および細胞破壊のため、深い空胴を有するＭＴＰが使用された。４０００変異体の全部の細胞溶解液のスクリーニングが生成物の存在下マイクロタイタースケールで実施された。ここでいくつかの突然変異体が同定され、突然変異体３７Ｄ１２が以後使用された。
【０２３９】
１２α−ＨＳＤＨ相同モデル中の突然変異体３７Ｄ１２突然変異は図８に見るとことができる。グルタミンのヒスチジンへ変換（図７に従った配列参照）があり、そして基質と助因子結合ポケットの間の活性中心の領域とに位置している。
【０２４０】
突然変異体３７Ｄ１２は野生タイプに比較して修飾された運動を有したので、生成物阻害のさらなる分析のため、活性の最高の直線性が得られる、反応スタート後最初の１分内の３０秒の時間範囲が活性計算のために使用されるように規定された。金属アフィニティクロマトグラフィーにより野生タイプおよび突然変異体３７Ｄ１２が精製された後、生成物阻害がこれら条件を用いて再び検討された。図９に示すように、突然変異体は１％の変換においてさえも著しく減少した阻害を示す。５％変換においては、野生タイプ酵素は、突然変異体３７Ｄ１２の２０％と対照的に６０％のロスを示した。２５％変換における野生タイプと比較して、突然変異体３７Ｄ１２の場合は３倍の活性が維持された。
【０２４１】
精製後、突然変異体の比活性は１５．７１Ｕ／ｍｇであり、野生タイプの比活性は３０．８７Ｕ／ｍｇであると計算することができた。それ故突然変異は約５０％の活性ロスをもたらす。
【０２４２】
配列同定番号の帰属
【表５】
2011526481.tif 000024
ＡＳ＝アミノ酸配列
ＮＳ＝核酸配列
Ｌ＝ロングバージョン
Ｓ＝ショートバージョン
【０２４３】
ここで引用した発表の開示に対し参照が表明される。
【図１】
2011526481.tif 000031
【図２】
2011526481.tif 000032
【図３】
2011526481.tif 000033
【図４】
2011526481.tif 000034
【図５】
2011526481.tif 000035
【図６】
2011526481.tif 000036
【図７】
2011526481.tif 000037
【図８】
2011526481.tif 000038
【図９】
2011526481.tif 000039
【配列表】
2011526481000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月25日(2010.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のN−末端配列の一つを含む１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ：
【化２５】
2011526481.tif 000040
【請求項２】
Ｎ−末端配列モチーフＩＦＤＧＫ（配列同定Ｎｏ．９）を有し、そして配列モチーフＬＩＮＮ（配列同定Ｎｏ．５）を含んでいる１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゼケナーゼ。
【請求項３】
ａ）各場合位置＋１または２で始まる、配列同定Ｎｏ．２に従ったアミノ配列を含むか、
ｂ）位置＋１で始まる配列同定Ｎｏ．４に従ったアミノ酸配列を有するか、または
ｃ）配列同定Ｎｏ．１または３に従ったエンコーデング核酸配列によってコードされる、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ。
【請求項４】
ａ）配列モチーフＶＬＴＧＲＮＥ（配列同定Ｎｏ．１２）において補基質利用を修飾する少なくとも一つの突然変異、および／または
ｂ）この酵素の基質結合ポケットを形成するアミノ酸残基の領域において生成物阻害を減少する少なくとも一つの突然変異を有する、請求項１ないし３のいずれかの１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼから誘導された、修飾された補基質利用および／または減少した生成物阻害を有する１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ突然変異体。
【請求項５】
ａ）配列同定Ｎｏ．１２においてＧ→；Ｒ→Ａアミノ酸置換の少なくとも一つを含むか、または
ｂ）配列同定Ｎｏ．４の位置９７に相当するアミノ酸Ｑの少なくとも一つの突然変異を含む、請求項４の突然変異体。
【請求項６】
配列同定Ｎｏ．４中のＱ９７Ｈに相当する突然変異を含んでいる請求項５の突然変異体。
【請求項７】
非病原性微生物において１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ異種発現によって得られる、請求項１ないし６のいずれかの１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ。
【請求項８】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌、特にＥ．ｃｏｌｉ中に発現された請求項７の１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ。
【請求項９】
請求項１ないし６のいずもかの１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼをコード化する核酸配列。
【請求項１０】
少なくとも一つの調節核酸配列の遺伝子制御のもとにある、請求項９の核酸配列を含む発現カセット。
【請求項１１】
請求項１０の少なくとも一つの発現カセットを含むベクター。
【請求項１２】
請求項９の少なくとも一つの核酸配列、または請求項１０の少なくとも一つの発現カセットを担持しているか、または請求項１１の少なくとも一つのベクターで形質転換されている組換え微生物。
【請求項１３】
請求項１２の微生物が培養され、そして発現された１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが培養物から単離されることを特徴とする請求項１ないし８のいずれかの１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの生産方法。
【請求項１４】
請求項１ないし８のいずれかの定義に従った１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下１２−ヒドロキシステロイドが反応させられ、そして反応バッチから生成した少なくとも一つの酸化生成物が任意に単離されることを特徴とする１２α−ヒドロキシステロイドの酵素酸化方法。
【請求項１５】
ヒドロキシステロイドはコール酸（ＣＡ）か、または塩、アミドまたはアルキルエステルのようなコール酸誘導体である請求項１４の方法。
【請求項１６】
コール酸またはその誘導体は、１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）を与えるように、または対応する誘導体を与えるように反応させられる請求項１５の方法。
【請求項１７】
反応はＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下に行われる請求項１４ないし１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
請求項１ないし８のいずれかの定義に従った１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下１２−ケトステロイドが反応させられ、そして反応バッチから生成した還元生成物が任意に単離されることを特徴とする１２−ケトステロイドの酵素還元方法。
【請求項１９】
ケトステロイドは１２−ケト−ＣＤＣＡか、または塩、アミドまたはアルキルエステルのような誘導体である請求項１８の方法。
【請求項２０】
ケトステロイドまたはその誘導体は対応する１２α−ヒドロキシステロイドまたはその誘導体へ還元される請求項１８または１９の方法。
【請求項２１】
反応はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下に行われる請求項１８ないし２０のいずれかの方法。
【請求項２２】
消費されたレドックス均等物は電気化学的にまたは酵素的に再生される請求項１４ないし２１のいずれかの方法。
【請求項２３】
１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼとの反応は固定化した形で行われる請求項１４ないし２２のいずれかの方法。
【請求項２４】
１２−ケトステロイドまたは１２α−ヒドロキシステロイドの定性的または定量的検出方法であって、
請求項１ないし８の１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによって触媒されるステロイドのレドックス反応がレドックス均等物の存在下に実施され、レドックス均等物の濃度の変化が決定され、そしてそれから１２−ケトステロイドまたは１２α−ヒドロキシステロイドの含有量が決定されけることを特徴とする方法。
【請求項２５】
式（１）のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造方法であって、
【化２０】
2011526481.tif 000041
（式中、Ｒはアルキル、ＮＲ１Ｒ２，Ｈ，アルカル金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋を表し、基Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は同一または異なって、Ｈまたはアルキルを表す。以下同じ。）；
ａ）式（２）コール酸（ＣＡ）
【化２１】
2011526481.tif 000042
（式中、基Ｒａは同一または異なって、Ｈまたはアシルを表す。以下同じ。）を請求項１ないし８のいずれかの１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下、式（３）の対応する１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）へ酸化し、
【化２２】
2011526481.tif 000043
ｂ）式（３）の１２−ケト−ＣＤＣＡを式（４）のケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）を与えるように脱酸素化反応し、
【化２３】
2011526481.tif 000044
ｃ）式（４）のＣＤＣＡを式（５）の７−ケトリソコール酸（ＫＬＣＡ）の位置７において化学的に酸化し、
【化２４】
2011526481.tif 000045
ｄ）式（５）のＫＬＣＡを還元し、そして
ｅ）任意に反応生成物をさらに精製することを特徴とする方法。
【請求項２６】
もしＲａがアシルを表すならば、このアシル基を任意に反応ステップｂ）またはｄ）の実施後に除去する請求項２５の方法。
【請求項２７】
ステップａ）はＮＤＡ（Ｐ）＋の存在下に実施される請求項２５または２６の方法。
【請求項２８】
消費されたＮＤＡ（Ｐ）＋は電気化学的にまたは酵素的に再生される請求項２７の方法。
【請求項２９】
ステップａ）は、固定化された形の１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによって実施される請求項２５ないし２８のいずれかの方法。
【請求項３０】
請求項１ないし７のいずれかにおける定義に従った１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが使用され、Ｅ．ｃｏｌｉに発現させたこの酵素をさらなるタンパク精製なしで使用する請求項１４ないし２９のいずれかの方法。
【請求項３１】
Ｅ．ｃｏｌｉ株は、請求項１ないし７のいずれかの定義に従った１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ）から選ばれる請求項３０の方法。
【国際調査報告】
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