(57)【要約】本開示は、細菌の抗生物質耐性プロフィールを決定する方法、および治療上有効な抗生物質で患者を処置する方法に関する。上記方法は、上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを比較する工程、および上記核酸の領域を、上記データベースにおける対応する領域にマッチさせることによって、上記細菌の抗生物質耐性を決定する工程を包含する。詳細な制限マップデータベースを使用すると、上記生物は、属レベルおよび種レベルでのみならず、亜種レベル（株、亜株、および／もしくは単離物レベル）でも、同定かつ分類され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質耐性を決定する方法であって、該方法は、
（ａ）核酸を細菌から得る工程；
（ｂ）該核酸を画像化する工程；
（ｃ）該核酸の制限マップを得る工程；
（ｄ）該核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを比較する工程；および
（ｅ）該核酸の領域を、該データベース中の対応する領域にマッチさせることによって、該細菌の抗生物質耐性を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記核酸を直線化する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓからなる群より選択される少なくとも１つの種である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの市中感染型メチシリン耐性株である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの院内感染型メチシリン耐性株である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸は、前記細菌の実質的に全てのゲノムＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸は、前記細菌のトランスクリプトームを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸は、デオキシリボ核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸は、リボ核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記画像化工程の前に、１種以上の酵素で前記核酸を消化する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素は、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記画像化工程は、前記核酸を標識する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗生物質は、メチシリン、オキサシリン、シプロフラキシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、トリメトプリム／スルファ、バンコマイシン、ペニシリンＧ、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、リファンピシン、リネゾリド、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、ゲンタマイシン、およびニトロフラントインからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記制限データベースは、制限マップ類似性クラスターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記制限データベースは、前記生物のクレードの少なくとも１種のメンバーからの制限マップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記制限データベースは、前記生物の少なくとも１つの亜種からの制限マップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記制限データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物からの制限マップを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項１８】
前記データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物に共通するモチーフを含む制限マップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記モチーフは、ｍｅｃカセットである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細菌の抗生物質耐性プロフィールを決定する方法であって、該方法は、
核酸を細菌から得る工程；
該核酸の光学的マップを調製する工程；
細菌耐性を示す、該核酸に存在する少なくとも１つのモチーフを同定する工程；および
該少なくとも１つのモチーフと、１種以上の抗生物質に対する耐性とを相関させて、それによって、該細菌の抗生物質耐性プロフィールを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記調製する工程は、前記核酸を直線化する工程、該核酸を、１種以上の制限酵素で消化する工程、画像化するために該核酸を標識する工程を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記モチーフは、ｍｅｃカセットおよびｐｓｉＳＡ２プロファージからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
患者を処置するために、治療上有効な抗生物質を決定する方法であって、該方法は、
（ａ）サンプルを患者から得る工程であって、ここで該サンプルは、感染性生物を含むと疑われている、工程；
（ｂ）核酸を該生物から得る工程；
（ｃ）該核酸の光学的マップを調製する工程；
（ｄ）該光学的マップと、抗生物質耐性データを含む少なくとも１つのデータベースとを比較することによって、該生物の抗生物質耐性プロフィールを決定する工程；および
（ｅ）該患者を処置するために、治療上有効な抗生物質を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記生物を同定する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルは、食品、ヒト組織、体液、空気、水、土壌、植物物質、および未知の物質からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記体液は、血液、痰、唾液、尿、身体部分からの排出物、および膿瘍からの排出物からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物は、微生物、細菌、ウイルス、および真菌からなる群より選択される少なくとも１つのタイプである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓからなる群より選択される少なくとも１つの種である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの市中感染型メチシリン耐性株である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの院内感染型メチシリン耐性株である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記データベースは、制限マップ類似性クラスターを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記制限データベースは、前記生物のクレードの少なくとも１つのメンバーからの制限マップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記制限データベースは、前記生物の少なくとも１つの亜種からの制限マップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記制限データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物からの制限マップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記データベースは、前記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物に共通するモチーフを含む制限マップを含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、米国特許商標庁に、２００８年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／０２９，８１６号および２００８年５月１４日に出願された米国本出願第１２／１２０，５９２号（これらは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、抗生物質耐性を決定する方法、細菌の抗生物質耐性プロフィールを決定する方法、および治療上有効な抗生物質で患者を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
感染を引き起こす細菌および他の微生物は、回復が早く（ｒｅｓｉｌｉｅｎｔ）、これらを死滅させるかもしくは弱らせることが意図される薬物から生き延びる方法（すなわち、抗生物質耐性、抗菌薬耐性、もしくは薬物耐性）を進化させ得る。いくつかの研究は、抗生物質使用のパターンが、発生する耐性生物の数に大きく影響を及ぼすことを実証した。耐性に対して寄与する他の要因としては、不正確な診断、不要な処方箋、患者による抗生物質の不適切な使用、および成長促進のための家畜用飼料添加物としての抗生物質の使用が挙げられる。
【０００４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、流行している抗生物質耐性病原体である。広域スペクトル抗生物質（例えば、第２世代および第３世代のセファロスポリン）の濫用は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）（米国の病院において見いだされる、非常に頻繁に同定される抗菌薬耐性病原体）の発生を大きく促進する。ＭＲＳＡは、上記細菌による感染の環境に依存して、市中獲得型（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）もしくは病院獲得型（ｈｏｓｐｉｔａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ＭＲＳＡ（ＨＡ−ＭＲＳＡ）として下位分類される。なぜなら、上記下位分類は、上記細菌種の異なる単離物を表すからである。ＭＲＳＡ単離物は、β−ラクタム抗生物質（例えば、ペニシリン、メチシリン、およびセファロスポリン）での処置を生き延びる能力を進化させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗生物質耐性の問題が対処されなければ、抗生物質の投与によって以前に処置可能であった疾患は、これら以前に有効であった薬物に対する耐性を発生させる。抗生物質耐性を決定する方法、細菌の抗生物質耐性プロフィールを決定する方法、および治療上有効な抗生物質で患者を処置する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明は、抗生物質耐性を決定する方法を提供する。上記方法は、核酸の制限マップを生物から得る工程、および上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを相関させる工程、および上記核酸の領域を、上記データベース中の対応する領域にマッチさせることによって、上記細菌の抗生物質耐性を決定する工程を包含する。詳細な制限マップデータベースを使用すると、上記生物は、属レベルおよび種レベルでのみならず、亜種レベル（株、亜株、および／もしくは単離物レベル）でも、同定かつ分類され得る。上記特色のある方法は、抗生物質耐性についての迅速で、正確かつ詳細な情報を提供する。上記方法は、臨床状況（例えば、ヒトもしくは獣医学の状況）において；または環境的状況もしくは産業的状況（例えば、臨床微生物学もしくは工業的微生物学、食品安全性試験、地下水試験、大気試験、汚染試験など）において使用され得る。本質的には、本発明は、微生物の抗生物質耐性の検出および／もしくは同定が必要であるかもしくは所望される任意の状況において有用である。
【０００７】
別の局面において、本発明は、抗生物質耐性を決定する方法を特徴とし、上記方法は、（ａ）核酸を細菌から得る工程；（ｂ）上記核酸を画像化する工程；（ｃ）上記核酸の制限マップを得る工程；（ｄ）上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを比較する工程；および（ｅ）上記核酸の領域を、上記データベース中の対応する領域にマッチさせることによって、上記細菌の抗生物質耐性を決定する工程、を包含する。特定の関連する実施形態において、上記方法は、上記核酸を直線化する工程をさらに包含する。
【０００８】
別の局面において、本発明は、細菌の抗生物質耐性プロフィールを決定する方法を提供し、上記方法は、核酸を細菌から得る工程；上記核酸の光学的マップを調製する工程；細菌耐性を示す、上記核酸に存在する少なくとも１つのモチーフを同定する工程；および上記少なくとも１つのモチーフと、１種以上の抗生物質に対する耐性とを相関させて、それによって、上記細菌の抗生物質耐性プロフィールを決定する工程、を包含する。上記方法の関連する実施形態において、上記調製する工程は、上記核酸を直線化する工程、上記核酸を１種以上の制限酵素で消化する工程、画像化のために、上記核酸を標識する工程を包含する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、被験体を処置するために、治療上有効な抗生物質を決定する方法を提供し、上記方法は、（ａ）サンプルを患者から得る工程であって、ここで上記サンプルは、感染性生物を含むと疑われている、工程；（ｂ）核酸を上記生物から得る工程；（ｃ）上記核酸の光学的マップを調製する工程；（ｄ）上記光学的マップと、抗生物質耐性データを含む少なくとも１つのデータベースとを比較することによって、上記生物の抗生物質耐性プロフィールを決定する工程；および（ｅ）上記患者を処置するために、治療上有効な抗生物質を選択する工程、を包含する。関連する実施形態において、上記方法は、上記生物を同定する工程をさらに包含する。
【００１０】
上記検出される物質は、微生物、細菌、原生生物、ウイルス、真菌、もしくは疾患原因生物（微生物（例えば、原生動物および多細胞寄生生物）を含む）であり得る。例えば、上記生物は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓであり得る。他の実施形態において、上記生物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの市中感染型（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ）メチシリン耐性株である。あるいは、上記生物は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ院内感染型（ｈｏｓｐｉｔａｌ−ａｃｑｕｉｒｅｄ）メチシリン耐性株である。
【００１１】
上記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはサンプルから得られたＲＮＡのｃＤＮＡコピーであり得る。上記核酸サンプルとしては、任意の組織もしくは体液サンプル（例えば、血液、痰、唾液、尿、身体部分からの排出物、および膿瘍からの排出物）、環境サンプル（例えば、水、空気、塵埃（ｄｉｒｔ）、岩、植物物質など）、およびそれらから得られる全てのサンプルが挙げられる。
【００１２】
本発明の方法は、画像化する前に、核酸を１種以上の酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩ）で消化する工程をさらに包含し得る。好ましい制限酵素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ＡｆｌＩＩ      ＡｐａＬＩ      ＢｇｌＩＩ
ＡｆｌＩＩ      ＢｇｌＩＩ      ＮｃｏＩ
ＡｐａＬＩ      ＢｇｌＩＩ      ＮｄｅＩ
ＡｆｌＩＩ      ＢｇｌＩＩ      ＭｌｕＩ
ＡｆｌＩＩ      ＢｇｌＩＩ      ＰａｃＩ
ＡｆｌＩＩ      ＭｌｕＩ      ＮｄｅＩ
ＢｇｌＩＩ      ＮｃｏＩ      ＮｄｅＩ
ＡｆｌＩＩ      ＡｐａＬＩ      ＭｌｕＩ
ＡｐａＬＩ      ＢｇｌＩＩ      ＮｃｏＩ
ＡｆｌＩＩ      ＡｐａＬＩ      ＢａｍＨＩ
ＢｇｌＩＩ      ＥｃｏＲＩ      ＮｃｏＩ
ＢｇｌＩＩ      ＮｄｅＩ      ＰａｃＩ
ＢｇｌＩＩ      Ｂｓｕ３６Ｉ      ＮｃｏＩ
ＡｐａＬＩ      ＢｇｌＩＩ      ＸｂａＩ
ＡｐａＬＩ      ＭｌｕＩ      ＮｄｅＩ
ＡｐａＬＩ      ＢａｍＨＩ      ＮｄｅＩ
ＢｇｌＩＩ      ＮｃｏＩ      ＸｂａＩ
ＢｇｌＩＩ      ＭｌｕＩ      ＮｃｏＩ
ＢｇｌＩＩ      ＮｃｏＩ      ＰａｃＩ
ＭｌｕＩ      ＮｃｏＩ      ＮｄｅＩ
ＢａｍＨＩ      ＮｃｏＩ      ＮｄｅＩ
ＢｇｌＩＩ      ＰａｃＩ      ＸｂａＩ
ＭｌｕＩ      ＮｄｅＩ      ＰａｃＩ
Ｂｓｕ３６Ｉ      ＭｌｕＩ      ＮｃｏＩ
ＡｐａＬＩ      ＢｇｌＩＩ      ＮｈｅＩ
ＢａｍＨＩ      ＮｄｅＩ      ＰａｃＩ
ＢａｍＨＩ      Ｂｓｕ３６Ｉ      ＮｃｏＩ
ＢｇｌＩＩ      ＮｃｏＩ      ＰｖｕＩＩ
ＢｇｌＩＩ      ＮｃｏＩ      ＮｈｅＩ
ＢｇｌＩＩ      ＮｈｅＩ      ＰａｃＩ  。
【００１３】
画像化は、理想的には、上記核酸を標識する工程を包含する。標識法は、当該分野で公知であり、任意の公知の標識を含み得る。しかし、好ましい標識は、光学的に検出可能な標識（例えば、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（Ｃｏｕｍａｒａｎ  １５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ，ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体；エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレン；ブチレート量子ドット（ｂｕｔｙｒａｔｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）；Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、ローダミンＢ  スルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ  ７００；ＩＲＤ  ８００；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；ナフタロシアニン、ＢＯＢＯ、ＰＯＰＯ、ＹＯＹＯ、ＴＯＴＯおよびＪＯＪＯ）である。
【００１４】
本発明において使用するためのデータベースは、制限マップ類似性クラスターを含み得る。上記データベースは、上記生物のクレードの少なくとも１つのメンバーからの制限マップを含み得る。上記データベースは、上記生物の少なくとも１つの亜種からの制限マップを含み得る。上記データベースは、上記生物の属、種、株、亜株、もしくは単離物からの制限マップを含み得る。上記データベースは、上記生物の属（例えば、ｍｅｃカセット）、種、株、亜株、もしくは単離物に共通するモチーフを伴う制限マップを含み得る。
【００１５】
本発明の別のデータベースは、抗生物質耐性データを含む。例えば、上記データベースは、抗生物質（例えば、メチシリン、オキサシリン、シプロフラキシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、トリメトプリム／スルファ、バンコマイシン、ペニシリンＧ、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、リファンピシン、リネゾリド、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、ゲンタマイシン、およびニトロフラントイン）に対する生物の耐性データを含む。
【００１６】
一実施形態において、単一のＤＮＡ分子から得られた制限マップは、公知の抗生物質耐性を有する公知の生物からの制限マップのデータベースに対して、上記データベースに存在する制限フラグメントパターンに最もマッチするものを同定するために、比較される。このプロセスは、十分なマッチが、所定の信頼レベルで生物を同定するために得られるまで、反復して行われ得る。本発明の方法によれば、サンプルから核酸が調製され、本明細書で記載されるように画像化される。制限マップが調製され、その制限パターンが、公知の生物についての制限パターンのデータベースと相関させられる。好ましい実施形態において、生物は、生物の混合物を含むサンプルから同定される。非常に好ましい実施形態において、本発明の方法は、１つより多い生物を含むと疑われるサンプルに存在する種々の生物の比率を決定するために使用される。さらに、本発明の方法の使用は、連続してもしくは同時に、同じサンプルから複数の微生物の検出を可能にする。
【００１７】
使用時に、本発明は、環境サンプル中の汚染物質を構成する微生物の抗生物質耐性プロフィールを同定するために適用され得る。例えば、本発明の方法は、空気、水、土壌、衣服、旅行携帯品（ｌｕｇｇａｇｅ）、唾液、尿、血液、痰、食品、飲料などのサンプル中の潜在的に抗生物質耐性の生物学的ハザードを同定するために有用である。好ましい実施形態において、本発明の方法は、未知の供給源から得られたサンプル中の生物における抗生物質耐性プロフィールを検出および同定するために使用される。
【００１８】
本発明のさらなる局面および特徴は、以下のその詳細な説明を見れば、明らかである。
【００１９】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および参考文献は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップを示す模式図である。
【図２】図２は、３群にクラスター化されたＥ．ｃｏｌｉの６つの単離物：Ｏ１５７（Ｏ１５７：Ｈ７および５３６を含む）、ＣＦＴ（ＣＦＴ０７３および１３８１を含む）、およびＫ１２（Ｋ１２および７１８を含む）の制限マップを示す模式図である。
【図３】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップの中の共通するモチーフを示す模式図である。
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップと、Ｅ．ｃｏｌｉに共通する領域を示すボックスとを示す模式図である。
【図５】図５は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップと、特定の株（すなわち、Ｏ１５７、ＣＦＴ、もしくはＫ１２）に特有の領域を示すボックスとを示す模式図である。
【図６】図６は、Ｅ．ｃｏｌｉの６つの単離物の制限マップと、各単離物に特有の領域を示すボックスとを示す模式図である。
【図７】図７は、Ｅ．ｃｏｌｉを同定すると考えられるレベルを示す、ツリー図である。
【図８】図８は、サンプルの制限マップ（中央のマップ）およびデータベースからの関連する制限マップを示す模式図である。
【図９−１】図９は、種々の抗生物質に対する上記単離物の耐性と相関する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの単離物のゲノム類似性を示すクラスター化マップである。
【図９−２】図９は、種々の抗生物質に対する上記単離物の耐性と相関する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの単離物のゲノム類似性を示すクラスター化マップである。
【図９−３】図９は、種々の抗生物質に対する上記単離物の耐性と相関する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの単離物のゲノム類似性を示すクラスター化マップである。
【図９−４】図９は、種々の抗生物質に対する上記単離物の耐性と相関する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの単離物のゲノム類似性を示すクラスター化マップである。
【図９−５】図９は、種々の抗生物質に対する上記単離物の耐性と相関する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの単離物のゲノム類似性を示すクラスター化マップである。
【図９−６】図９は、種々の抗生物質に対する上記単離物の耐性と相関する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの単離物のゲノム類似性を示すクラスター化マップである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（詳細な説明）
本開示は、生物（例えば、微生物）の抗生物質耐性プロフィールを決定する方法を特徴とする。上記方法は、核酸を細菌から得る工程；上記核酸を画像化する工程；生物から上記核酸（例えば、ＤＮＡ）の制限マップを得る工程；上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを比較する工程；および上記核酸の領域を、上記データベース中の対応する領域にマッチさせることによって、上記細菌の抗生物質耐性を決定する工程を包含する。
【００２２】
ゲノムの物理的マッピング（例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用して、制限マップを作り出す）は、種々の生物の核酸配列についての正確な情報を提供し得る。例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の制限マップは、光学的マッピングによって生成され得る。光学的マッピングは、蛍光顕微鏡を使用して、個々の標識されたＤＮＡ分子上の制限エンドヌクレアーゼ切断事象を可視化することによって、整然とした制限マップを生成し得る。
【００２３】
種々の群および亜群に共通するモチーフを含む詳細な制限マップデータベースを使用すると、上記生物は、属および種のレベルでのみならず、亜種（株）、亜株、および／もしくは単離物レベルでも同定および分類され得る。例えば、細菌は、属レベル（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属）、種レベル（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ種）、株レベル（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ１５７、ＣＦＴ、およびＫ１２株）、ならびに単離物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ１５７：Ｈ７単離物）（以下の実験３Ｂにおいて記載されるように）において同定および分類され得る。上記特色のある方法は、生物の抗生物質耐性についての迅速で、正確かつ詳細な情報を提供する。これら方法は、種々の臨床状況において（例えば、被験体（例えば、ヒトもしくは動物被験体）における抗生物質耐性生物の同定のために）使用され得る。
【００２４】
本発明の方法はまた、食品もしくは環境的状況において生物の抗生物質耐性を同定および／もしくは検出するために有用である。例えば、本発明の方法は、飲料水、空気、土壌、および他の環境供給源中の環境的脅威を評価するために使用され得る。本発明の方法はまた、食品中の生物を同定するために、ならびに時間でもしくは地理的に分離される複数のサンプル、および同じもしくは類似のバッチに由来するサンプルにおける食中毒の共通する供給源を決定するために有用である。
【００２５】
本発明はまた、抗生物質耐性を決定する方法、細菌の抗生物質耐性プロフィールを決定する方法、および特に、上記核酸の制限マップと制限マップデータベースとの比較を介して、生物の抗生物質耐性を決定することによって、被験体を処置するために、治療上有効な抗生物質を決定する方法；ならびに上記核酸の領域を上記データベース中の対応する領域にマッチさせることによって、上記細菌の抗生物質耐性を決定する方法を特徴とする。これら方法は、臨床状況、例えば、ヒトおよび獣医学の状況において使用され得る。
【００２６】
（制限マッピング）
本明細書で特色のある方法は、データベースの生成および上記生物の抗生物質耐性プロフィールを決定するための生物の処理の両方の間の制限マッピングを利用する。使用され得る制限マッピングの１つのタイプは、光学的マッピングである。光学的マッピングは、単一のＤＮＡ分子から整然とした制限マップを生成するための単一分子技術である（Ｓａｍａｄら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．５：１−４，１９９５）。この方法の間に、個々の蛍光標識されたＤＮＡ分子は、カバースリップと顕微鏡スライドとの間のアガロースの流れ（第１世代の方法において）において延ばされる（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）か、もしくはポリリジン処理ガラス表面上で固定される（第２世代の方法において）。同書。上記添加されたエンドヌクレアーゼは、特定の点において上記ＤＮＡを切断し、そのフラグメントが画像化される。同書。制限マップは、上記消化から生じるフラグメントの数に基づいて、構築され得る。同書。一般に、最終的なマップは、類似の分子から得られるフラグメントサイズの平均である。同書。従って、本発明の一実施形態において、同定されるべき生物の制限マップは、上記生物を含むサンプルから生成される多くのマップの平均である。
【００２７】
光学的マッピングおよび関連する方法は、米国特許第５，４０５，５１９号、同第５，５９９，６６４号、同第６，１５０，０８９号、同第６，１４７，１９８号、同第５，７２０，９２８号、同第６，１７４，６７１号、同第６，２９４，１３６号、同第６，３４０，５６７号、同第６，４４８，０１２号、同第６，５０９，１５８号、同第６，６１０，２５６号、および同第６，７１３，２６３号（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）に記載されている。光学的マップは、Ｒｅｓｌｅｗｉｃら，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ｓｅｐ；７１（９）：５５１１−２２（本明細書に参考として援用される）に記載されるように、構築される。簡潔には、試験生物由来の個々の染色体フラグメントが、負に荷電したＤＮＡと正に荷電した表面との間の静電的相互作用によって、誘導体化ガラス上に固定され、１種以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、インターカレーター色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｙｅ）（例えば、ＹＯＹＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で染色され、そして画像分析のために自動化蛍光顕微鏡に配置される。上記染色体フラグメントは固定化されるので、上記制限エンドヌクレアーゼでの消化によって生成された上記制限フラグメントは、上記ガラスに結合したままであり、上記インターカレーター色素での染色後に、蛍光顕微鏡法によって可視化され得る。染色体ＤＮＡ分子における各制限フラグメントのサイズは、画像分析ソフトウェアを使用して測定され、異なる分子における同一の制限フラグメントパターンは、染色体全体を網羅する、整然とした制限マップを組み立てるために使用される。
【００２８】
（制限マップデータベース）
本明細書で記載される方法とともに使用されるデータベースは、前出で議論される光学的マッピング技術によって生成され得る。上記データベースは、多数の単離物（例えば、約２００個、約３００個、約４００個、約５００個、約６００個、約７００個、約８００個、約９００個、約１，０００個、約１，５００個、約２，０００個、約３，０００個、約５，０００個、約１０，０００個もしくはこれ以上の単離物）についての情報を含み得る。さらに、上記データベースの制限マップは、種々の生物の属、種、亜種（株）、亜株、および／もしくは単離物に共通するモチーフに関して注釈付きの情報（類似性クラスター）を含む。多数の上記単離物および特定のモチーフに関する情報は、生物の正確かつ迅速な同定を可能にする。
【００２９】
上記データベースの制限マップは、種々の単離物に由来する核酸を特定の制限エンドヌクレアーゼ酵素で消化（切断）することによって、生成され得る。いくつかのマップは、１種のエンドヌクレアーゼでの消化の結果であり得る。いくつかのマップは、エンドヌクレアーゼの組み合わせ（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種もしくはこれ以上のエンドヌクレアーゼ）での消化の結果であり得る。上記データベースおよび／もしくは上記同定されるべき生物についての制限マップを生成するために使用され得る例示的エンドヌクレアーゼとしては、以下が挙げられる：ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、およびＢａｍＨＩ。使用され得る他のエンドヌクレアーゼの非網羅的な例としては、以下が挙げられる：ＡｌｕＩ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、およびＳｍａＩ。さらに他の制限エンドヌクレアーゼは、当該分野で公知である。
【００３０】
異なる株間でのマップアラインメントは、フラグメントサイジングエラー、誤った切断および切断の欠失（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｃｕｔ）、ならびに欠失した小さなフラグメント（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を組み込むスコアリングモデルに従って、２つの制限マップの光学的アラインメントを見いだすダイナミックプログラミングアルゴリズムで生成される（Ｍｙｅｒｓら，Ｂｕｌｌ  Ｍａｔｈ  Ｂｉｏｌ  ５４：５９９−６１８（１９９２）；Ｔａｎｇら，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｒｏｂａｂ  ３８：３３５−３５６（２００１）；およびＷａｔｅｒｍａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２：２３７−２４２を参照のこと）。所定のアラインメントに関して、上記スコアは、より長い、より良好なアラインメントがより高いスコアを有するように、上記２つのマップの間の差異によってペナルティーを科されるアラインメントの長さの対数に比例する。
【００３１】
類似性クラスターを生成するために、各マップは、あらゆる他のマップに対して整列される。これらアラインメントから、対様式のアラインメント分析は、両方のゲノム中のマッチしていない領域の全長を、両方のゲノムの全体のサイズで除算することによって、上記対のメンバーの間で「パーセント非類似性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｄｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」を決定するために行われる。これら非類似性測定値は、統計学的パッケージ「Ｒ」において実行されるように、凝集性クラスター化法（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｖｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）「Ａｇｎｅｓ」への入力として使用される。簡潔には、このクラスター化法は、それ自体のクラスターにおいて各エントリーを最初に配置し、次いで、２つの最も近いクラスターを反復して連結することによって機能する。ここで上記２つのクラスター間の距離は、一方のクラスター中の点と、他方のクラスター中の点との間の最小の非類似性である。
【００３２】
（生物）
種々の生物（例えば、ウイルス）および種々の微生物（例えば、細菌、原生生物、および真菌）における抗生物質耐性は、本明細書で特色のある方法で同定され得る。一実施形態において、上記生物の遺伝情報は、ＤＮＡの形態において保存される。上記遺伝情報はまた、ＲＮＡとして保存され得る。
【００３３】
上記生物を含むサンプルは、ヒトサンプル（例えば、組織サンプル（例えば、上皮組織（例えば、皮膚）、結合組織（例えば、血液および骨）、筋肉組織、および神経組織、または分泌サンプル（例えば、唾液、尿、涙液、および糞便サンプル））であり得る。上記サンプルはまた、非ヒトサンプル（例えば、馬、ラクダ、ラマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、イタチ、齧歯類、鳥、は虫類、および昆虫サンプル）であり得る。上記サンプルはまた、植物、水源、食品、空気、土壌、植物、または他の環境供給源もしくは産業的供給源に由来し得る。
【００３４】
（生物における抗生物質耐性の同定）
本明細書で記載される方法（すなわち、生物の抗生物質耐性を決定する、細菌の抗生物質耐性プロフィールを決定する、および被験体に投与するための治療上有効な抗生物質を決定する）は、上記核酸の制限マップと、制限マップデータベースとを比較する工程、上記核酸の領域を上記データベース中の対応する領域にマッチさせることによって、上記細菌の抗生物質耐性を決定することを介して、生物の抗生物質耐性を決定する工程を包含する。上記方法は、未知のサンプル（もしくは上記サンプルの平均制限マップ）からの生の単一分子マップの各々を、上記データベース中の実態の各々に対して比較する工程、次いで、異なる分子にわたるマッチ可能性を組み合わせて、全体のマッチ可能性を作り出す工程を包含する。
【００３５】
上記方法の一実施形態において、上記同定されるべき生物の全ゲノムは、上記データベースに対して比較され得る。別の実施形態において、上記ゲノムに由来する共有エレメントを抽出するためのいくつかの方法が、上記マッチングアルゴリズム（例えば、Ｍｅｃカセット）のための参照点としてなお働き得る上記生物のゲノムの領域の減少したセットを生成するために作り出され得る。
【００３６】
上記でおよび以下の実施例において議論されるように、上記データベースの制限マップは、種々の生物の属、種、亜種（株）、亜株、および／もしくは単離物に共通するモチーフに関する注釈付きの情報（類似性クラスター）を含み得る。このような詳細な情報は、亜種レベルで生物の同定を可能にし、続いて、上記生物を有する被験体のより正確な診断および／もしくは処置を可能にする。
【００３７】
別の実施形態において、本発明の方法は、生物、株、もしくは状態を示す遺伝的モチーフを同定するために使用される。例えば、本発明の方法は、単離物において、抗生物質耐性を付与する少なくとも１つのモチーフを同定するために使用される。このことは、さらなるクラスター分析なしで、処置の適切な選択を可能にする。
【００３８】
（適用）
本明細書に記載される方法は、種々の状況（例えば、ヒトもしくは非ヒト被験体において、食品において、環境供給源（例えば、食品、水、空気）において、および産業的状況において、生物における抗生物質耐性を決定するために）において使用され得る。上記特色のある方法はまた、疾患に罹患した被験体（例えば、ヒトもしくは非ヒト被験体）を処置するために、および上記生物の抗生物質耐性プロフィールに基づいて上記被験体を処置するために、治療上有効な抗生物質を決定する工程を包含する。
【００３９】
例えば、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）は、ヒトにおける感染の原因である細菌である。ＭＲＳＡは、細菌による感染の環境に依存して、市中獲得型ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）もしくは病院獲得型ＭＲＳＡ（ＨＡ−ＭＲＳＡ）として下位分類される。なぜなら、上記下位分類は、上記細菌種の別個の単離物を表すからである。
【００４０】
ＭＲＳＡ単離物は、β−ラクタム抗生物質（例えば、ペニシリン、メチシリン、およびセファロスポリン）での処置を生き延びる能力を進化させた。いかなる理論によっても作用機構によっても限定されないが、メチシリンに対する耐性は、Ｍｅｃ遺伝子の獲得によって発生し、このＭｅｃ遺伝子は、β−ラクタム（例えば、ペニシリン、セファロスポリンおよびカルバペネム）の結合に対して低い親和性を有する，改変ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）をコードする。上記Ｍｅｃ遺伝子は、β−ラクタム抗生物質に対する耐性を付与し、ＭＲＳＡ単離物に感染した被験体に対するこれら薬物の臨床的使用が未然に防がれる。
【００４１】
本発明の方法は、本明細書において、患者が抗生物質耐性プロフィールを含むＳ．ａｕｒｅｕｓの単離物に感染しているか否か、そしてさらに、上記プロフィールが、ＣＡ−ＭＲＳＡもしくはＨＡ−ＭＲＳＡのものとマッチしているか否かを決定するために使用され得る（実施例５を参照のこと）。いったん上記単離物の耐性プロフィールが決定されると、治療上有効な抗生物質で上記被験体を処置することに関する決定が、例えば、医療提供者によってなされ得る。上記抗生物質耐性プロフィールが、上記単離物がメチシリンに感受性であることを明らかすると、上記医療提供者は、上記被験体をメチシリンで処置し得る。上記抗生物質耐性プロフィールが、上記単離物がメチシリンに対して耐性であることを明らかにすると、上記医療提供者は、上記被験体を異なる抗生物質（例えば、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、トリメトプリム／スルファ、バンコマイシン、ペニシリンＧ、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、リファンピシン、リネゾリド、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、ゲンタマイシン、もしくはニトロフラントイン）で処置し得る。
【００４２】
抗生物質耐性プロフィールが、本明細書において、本発明の方法によって決定され得る他の生物としては、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ（ペニシリン、バンコマイシン、およびリネゾリドに対して耐性である、病院において見いだされる細菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（マクロライド抗生物質に対して耐性である細菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ペニシリンおよび他のβ−ラクタムに対して耐性である細菌）、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（アンピシリンおよびセファロスポリンに対して感受性である細菌）、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（アンピシリンおよびセファロスポリンに対して耐性である細菌）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（フルオロキノロン改変体に対して耐性である細菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（イソニアジドおよびリファンピンに対して耐性である細菌）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（低い抗生物質感受性を示した細菌）が挙げられる。
【００４３】
いくつかの抗生物質耐性を示す他の細菌としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉが挙げられ、これらのうちの各々から、抗生物質耐性プロフィールが、本明細書において、本発明の方法によって決定され得る。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例は、本発明の方法の例示的実施形態を提供し、限定として扱われるべきではない。
【００４５】
（実施例１．光学的マッピングを使用する微生物の同定）
微生物同定（ＩＤ）は、一般に、２つの相を有する。第１において、多くの生物に由来するＤＮＡを、マッピングし、互いに対して比較する。これら比較から、重要な表現型および分類法が、マップ特徴と関係づけられる。第２の相において、単一分子制限マップを、最良のマッチを見いだすために、上記データベースに対して比較する。
【００４６】
（データベース構築および注釈）
生物の多様性を表すに十分なマップを、上記マップが種々の生物を識別することが可能であることに基づいて、生成する。上記データベースにおける上記生物の多様性が大きいほど、未知の生物を同定する能力は、より正確になる。理想的には、データベースは、医療的もしくは産業的状況において有用であるように十分な種々の微生物について、種および亜種のレベルで公知の生物の配列マップを含む。しかし、任意の所定のデータベースにマッピングされる生物の正確な数は、上記データベースが投入されるべき望ましい使用に基づいて、上記ユーザーの都合のよいときに決定される。
【００４７】
十分な数の微生物がマッピングされた後、マップ類似性クラスターを生成する。第１に、マップのツリーを生成する。上記ツリー構築の後、種々の表現型および分類データをオーバーレイし、上記集団の残りから個々のクレードを特有に区別するマップの領域を、同定する。この目的は、目的の表現型／分類と相関する特定のクレードを見いだすことである。これは、上記クラスター化法に対する改善を介して一部引き起こされる。
【００４８】
いったん上記クラスターおよびツリーが注釈をつけられたら、上記注釈は、個々のマップに戻って適用される。さらに、必要であれば、上記データベースを、区別の重要な領域のみを含むようにトリミングし、これは、時間効率（ｔｉｍｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を増大させ得る。
【００４９】
（未知のものの予想（ｃａｌｌｉｎｇ）（同定））
未知のものを試験する一実施形態は、上記未知のサンプルに由来する生の単一分子マップの各々を、上記データベース中のエントリーの各々に対して比較する工程、次いで、異なる分子にわたるマッチ可能性を組み合わせて、全体のマッチ可能性を作り出す工程を包含する。
【００５０】
近縁の生物の間の識別を、上記生物から得られたデータと、上記データベース中のデータと比較することによって、最大のヒットもしくは最良のマッチ可能性を単純に選び出すことによって行い得る。より正確な比較を、何がその特定のゲノムの識別的特徴であるのか  対  何が、同じ種のいくつかの単離物の中で共有される共通するモチーフであるのかについて、各ゲノムに対する詳細な注釈を有することによって行い得る。従って、マッチスコアが統合される場合、分類のレベル（単一ゲノムよりむしろ）に、一定の可能性が認められる（ｒｅｃｅｉｖｅ  ａ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）。従って、何か明確な特徴であるのか、および何が共有されるのかに関して、上記ゲノムの広範囲の注釈が必要とされる。
【００５１】
上記方法の一実施形態において、全ゲノムを、全ての分子に対して比較する。種内のマップの多くの重なり合いが一般に存在するので、別の実施形態が使用され得る。第２の実施形態において、上記ゲノムから共有されるエレメントを抽出するためのいくつかの方法を、上記マッチングアルゴリズムについての参照点としてもなお働き得る領域の減少したセットを生成するために、作り出す。上記第２の実施形態は、システム性能を増大させるために、参照データベースを合理化すること（ｓｔｒｅａｍｌｉｎｉｎｇ）を可能にする。
【００５２】
（実施例２．微生物同定のための複数酵素の使用）
一実施形態において、上記酵素の各々からの単一分子制限マップを、実施例１に記載されるデータベースに対して独立して比較し、有望な同定を、各酵素から独立して予想する（ｃａｌｌ）。次いで、その最後のマッチ可能性を、独立した実験として組み合わせる。この実施形態は、いくつかの組み込まれた余剰分を提供し、従って、上記プロセスの正確性を提供する。
【００５３】
（緒言）
一般に、光学的マッピングを、平均フラグメントサイズの特定の範囲内で使用し得、任意の所定の酵素については、異なるゲノムにわたって、平均フラグメントサイズにおけるかなりの変動が存在する。これら理由から、光学的マッピングは、代表的には、臨床的に関連する微生物の同定のために単一酵素を選択するには最適でない。代わりに、目的のあらゆる生物について、マッピングに適したデータベース中に少なくとも１つの酵素が存在する可能性を最適化するために、小さなセットの酵素を選択する。
【００５４】
（選択基準）
酵素選択の第１の工程は、目的の細菌の同定であった。これら細菌を２つの群に分類した：（ａ）最も共通する臨床的に興味深い生物、および（ｂ）人の健康に関与する他の細菌。選択されたセットの酵素は、上記共通する臨床的に興味深い細菌の各々を、近縁のゲノムの詳細な比較に適した平均フラグメントサイズ（約６〜１３ｋｂ）の範囲内で切断する少なくとも１種の酵素を有さなければならない。さらに、残りの生物については、各フラグメントは、光学的マッピングのための機能的範囲（約４〜２０ｋｂ）内になければならない。これらの制限を、数学的モデリング、管理された（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）実験、および顧客指示を伴う実験を通じて決定した。最後に、光学的マッピングに既に使用された酵素を選択した。
【００５５】
（示唆されるセット）
上記基準に基づいて、予備セットは、酵素ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ、およびＸｂａＩからなり、これら酵素を、光学的マッピングのために使用した。公知の酵素とともに、重要な生物を網羅する２８個のさらなるセットが存在するので、このセットが適切でない事象においては、代わりのものが利用される（データ示さず）。
【００５６】
（最終工程）
実験２における分析は、配列決定されたゲノムに焦点が当てられているので、完全なデータベース生成の前に、このセットの酵素を他の臨床的に重要なゲノムに対して試験する。これは、原理研究の証明の第１相の一部である。
【００５７】
（実施例３．Ｅ．ｃｏｌｉの同定）
微生物同定法の一実施形態において、約５００〜約１，０００個の単離物の間の核酸を、光学的にマッピングする。次いで、特有のモチーフを、属、種、株、亜株、および単離物にわたって同定する。サンプルを同定するために、上記サンプルの単一核酸分子を、上記モチーフに対して整列させ、ｐ値を各モチーフマッチについて割り当てる。上記ｐ値を組み合わせて、モチーフの尤度を見いだす。最も特異的なモチーフに同定を与える。
【００５８】
以下の実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉを単離物レベルへ下げて同定する方法を例示する。６つのＥ．ｃｏｌｉ単離物の制限マップを、これら単離物の核酸をＢａｍＨＩ制限酵素で消化することによって得た。図１は、これら６つのＥ．ｃｏｌｉ単離物：５３６、Ｏ１５７：Ｈ７（完全ゲノム）、ＣＦＴ０７３（完全ゲノム）、１３８１、Ｋ１２（完全ゲノム）、および７１８の制限マップを示す。図２に示されるように、上記単離物を３つの亜群（株）にクラスター化した：Ｏ１５７（Ｏ１５７：Ｈ７および５３６を含む）、ＣＦＴ（ＣＦＴ０７３および１３８１を含む）、Ｋ１２（Ｋ１２および７１８を含む）。
【００５９】
これら制限マップは、これら６つの単離物の関係に関して複数レベルの情報を提供した（例えば、上記３つ亜群の全てに共通するモチーフ（図３を参照のこと）およびＥ．ｃｏｌｉに特異的な領域（図４中のボックスで囲んだ領域を参照のこと）を示した）。上記マップはまた、各株に特有の領域（図５中のボックスで囲んだ領域を参照のこと）および各単離物に対して特異的な領域（図６中のボックスで囲んだ領域を参照のこと）を示すことができた。
【００６０】
この情報および類似の情報を、データベース中で保存し得、目的の細菌を同定するために使用し得る。例えば、同定されるべき生物の制限マップを、上記生物の上記核酸をＢａｍＨＩで消化することによって、獲得し得る。この制限マップを、上記データベース中のマップと比較し得る。上記同定されるべき生物のマップが、Ｅ．ｃｏｌｉに対して、亜群のうちの１つに対して、上記株のうちの１つに対して、および／もしくは特定の単離物に対して、特異的なモチーフを含む場合、上記生物の正体は、上記特定のモチーフを相関させることによって、得られ得る。図６は、類似性ツリーの種々の長さを横断する可能性を図示するために、模式図を示す。
【００６１】
以下の実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌としてサンプルを同定することを例示する。サンプル（サンプル２８）を、ＢａｍＨＩで消化し、その制限マップを得た（図８、真ん中の制限マップを参照のこと）。このサンプルを、種々のＥ．ｃｏｌｉ単離物を含むデータベースに対して整列させた。上記サンプルは、４つのＥ．ｃｏｌｉ単離物：ＮＣ  ００２６９５、ＡＣ  ００００９１、ＮＣ  ０００９１３、およびＮＣ  ００２６５５に類似であることが分かった。従って、上記サンプルを、上記ＡＣ  ００００９１単離物に最も近縁であるＥ．ｃｏｌｉ細菌として同定した。
【００６２】
（実施例４．メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓの臨床的単離物におけるゲノム差異）
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、重要な臨床チャレンジを示す急速に進化するゲノムを有する、主要な院内感染および市中感染型病原体である。いくつかのブドウ球菌単離物の完全ゲノム配列が、毒性に関与する遺伝子の多くが移動性の遺伝的島（ＧＩ）上に主に保持されることを示したことを、本明細書中のデータは示す。
【００６３】
光学的マッピングを使用して、５つの配列決定されていないメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）単離物（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ株ＷＩ−２３、ＷＩ−３３、ＷＩ−３４、ＷＩ−９９、ＷＩ−５９１）の全ゲノムマップを特徴付けた。次いで、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ株のゲノムマップを、５つの配列決定したゲノム（Ｎ３１５、ＭＷ２、ＣＯＬ、Ｍｕ５０、ＵＳＡ３００−ＦＰＲ３７５７）と比較した。本明細書におけるデータは、特有のゲノム島（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｓｌａｎｄ）の存在を含む、配列決定されていない単離物において同定された種々のゲノム差異を示す。マップデータは、上記Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ株の大部分が、配列決定された株ＭＷ２とクラスター化する一方で、株ＷＩ−２３は、５つの特有のゲノム島の存在に起因して、このクラスターの外側に出現したことを示す。
【００６４】
（光学的マッピング）
光学的マップを、Ｒｅｓｌｅｗｉｃら（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ｓｅｐ；７１（９）：５５１１−２２）に従って、ＭＲＳＡ単離物であるＷＩ−２３、ＷＩ−３３、ＷＩ−９９、ＷＩ−５９１、ＵＳＡ３００−１１４、ＵＳＡ３００−ＦＰＲ３７５７およびＭＷ２について構築した。簡潔には、各単離物（Ｓａｎｊａｙ  Ｓｈｕｋｌａ，Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）からの高分子量ＤＮＡ分子を、光学的チップの上に個々の分子として固定化した。上記固定化した分子を、制限酵素、ＸｂａＩ（ＮＥＢ）で消化し、ＹＯＹＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で蛍光染色し、画像獲得および単一分子標識（ｍａｒｋｕｐ）（Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ）のために自動化蛍光顕微鏡に配置した。ソフトウェアを使用して、各分子についての制限フラグメントのサイズおよび順番を記録したところ、高解像度単一分子制限マップを得た。次いで、単一分子制限マップの集まりを、重なり合うフラグメントパターンに従って組み立てて（Ｇｅｎｔｉｇ）、全ゲノムの整然とした制限マップを生成した。
【００６５】
（マップアラインメント）
異なる株間のマップアラインメントを、フラグメントサイジングエラー、誤った切断および切断の欠失、ならびに欠失した小さなフラグメントを組み込むスコアリングモデルに従って、２つの制限マップの光学的アラインメントを決定するダイナミックプログラミングアルゴリズムを使用して生成した（Ｍｙｅｒｓら，Ｂｕｌｌ  Ｍａｔｈ  Ｂｉｏｌ  ５４：５９９−６１８（１９９２）；Ｔａｎｇら，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｒｏｂａｂ  ３８：３３５−３５６（２００１）；およびＷａｔｅｒｍａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２：２３７−２４２を参照のこと）。所定のアラインメントに関して、上記スコアは、より長い、より良好なマッチングアラインメントがより高いスコアを有するように、上記２つのマップの間の差異によってペナルティーを科されるアラインメントの長さの対数に比例する。
【００６６】
（マップクラスター化）
類似性クラスターを生成するために、各マップを、他のマップに対して整列させた。これらアラインメントから、対様式のパーセント非類似性を、両方のゲノム中のマッチしていない領域の全長を、両方のゲノムの全体のサイズで除算することによって、計算した。これら非類似性測定値を、統計学的パッケージ「Ｒ」において実行されるように、凝集性クラスター化法ａｇｎｅｓへの入力として使用した。このクラスター化法は、それ自体のクラスターにおいて各エントリーを最初に配置し、次いで、２つの最も近いクラスターを反復して連結することによって機能し、その結果、２つのクラスター間の距離は、一方のクラスター中の点と、別のクラスター中の点との間の最小の非類似性である。
【００６７】
（結果）
光学的マップを、配列決定された株ＭＷ２から調製し、次いで、その対応するインシリコ（配列から得られる）制限マップと直接比較した。上記光学的マップゲノムサイズを、配列から計算された２，８２２，１７４ｂｐ、上記光学的マップにおいて０．８２％過小評価の差異と比較して、２，７９８，９９１ｂｐであると決定した。フラグメントは、２％サイジング内でマッチし、上記２つのマップ間のフラグメントの相対的順序は、完全に一致した。
【００６８】
光学的マップをまた、配列決定されていないＳ．ａｕｒｅｕｓ株であるＷＩ−２３、ＷＩ−３３、ＷＩ−３４、ＷＩ−９９、ＷＩ−５９１およびＵＳＡ３００−０１１４から調製し、次いで、配列決定されたＳ．ａｕｒｅｕｓ株であるＮ３１５、Ｍｕ５０、ＭＷ２、ＣＯＬ、およびＵＳＡ３００−ＦＰＲ３７５７のインシリコ制限マップと比較した。次いで、全ゲノムのマップベースのクラスター化を行った。上記Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ単離物のうちの４つ（ＷＩ−９９、ＷＩ−３４、ＷＩ−３３、およびＷＩ−５９１）を、代表的な市中感染型ＭＲＳＡ  ＭＷ２（ＵＳＡ  ４００）と非常に近くでクラスター化した。マップベースの対様式の比較を使用するさらなる分析は、ＭＷ２に対してＷＩ−３３において、新規な４２ｋｂ挿入物を正確に指摘した。
【００６９】
Ｐａｎｔｏｎ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅロイコシジン（ＰＶＬ）コード遺伝子（ＣＡ−ＭＲＳＡ株の中で優勢）を有するＭＷ２ファージは、上記ＷＩ−５９１単離物中に存在しなかったのに対して、ＷＩ−９９、ＷＩ−３４およびＷＩ−３３は、この島を含むようであった。ＭＷ２と比較した場合、上記ＷＩ−９９およびＷＩ−３４単離物においてマップベースの有意差は同定されなかった。
【００７０】
マップベースのゲノムクラスター化は、上記ＷＩ−２３単離物が、研究した他のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ単離物よりも類似していないことを示した。この単離物と上記５つの配列決定された株との間の対様式の比較によるさらなる調査は、ＷＩ−２３が、この単離物に特有の、合計２５７Ｋｂである５つのゲノム島を含むことを示した。
【００７１】
（結論）
上記のデータは、ＣＡ−ＭＲＳＡ株であるＷＩ−３３、ＷＩ−３４、ＷＩ−９９、およびＷＩ−５９１が、配列決定された株ＭＷ２に遺伝子含有量において非常に類似していたことを示す。上記データはさらに、ＣＡ−ＭＲＳＡ株ＷＩ−３３が、新規な４２Ｋｂゲノム島を含み、そしてＣＡ−ＭＲＳＡ株ＷＩ−２３が、合計２５７Ｋｂの５つの新規なゲノム島を含むことを示す。
【００７２】
（実施例５．Ｓ．ａｕｒｅｕｓの単離物のメチシリン耐性プロフィール）
メチシリン耐性、およびＰＶＬ毒素遺伝子（メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）感染の重篤な臨床的症状（例えば、せつ腫症、重篤な壊死性肺炎、ならびに皮膚および軟組織の壊死性病変）の多くの原因である）の存在は、２つの臨床的に重要な表現型形質である。メチシリン耐性プロフィールを同定するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの６９個の異なる単離物を分析した。
【００７３】
光学的マッピングを使用して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの６９個の異なる単離物のゲノムマップを特徴付けした。上記単離物のゲノムマップを、Ｍｅｃ遺伝子およびＰＶＬ毒素遺伝子についての挿入部位における、さらなるＤＮＡの挿入について評価した。本明細書中のデータは、両方の遺伝子座において挿入されたモチーフの存在とメチシリン耐性との間の相関を示す（図９）。
【００７４】
（光学的マッピング）
光学的マップを、Ｒｅｓｌｅｗｉｃら（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５  Ｓｅｐ；７１（９）：５５１１−２２）に従って、上記６９個の単離物について構築した。簡潔には、各単離物（Ｓａｎｊａｙ  Ｓｈｕｋｌａ，Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）からの高分子量ＤＮＡ分子を、光学的チップの上に個々の分子として固定化した。上記固定化した分子を、制限酵素、ＸｂａＩ（ＮＥＢ）で消化し、ＹＯＹＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で蛍光染色し、画像獲得および単一分子標識（Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ）のために自動化蛍光顕微鏡に配置した。ソフトウェアを使用して、各分子についての制限フラグメントのサイズおよび順番を記録したところ、高解像度単一分子制限マップを得た。次いで、単一分子制限マップの集まりを、重なり合うフラグメントパターンに従って組み立てて（Ｇｅｎｔｉｇ）、整然とした制限マップを生成した。
【００７５】
（マップアラインメント）
異なる単離物間のマップアラインメントを、フラグメントサイジングエラー、誤った切断および切断の欠失、ならびに欠失した小さなフラグメントを組み込むスコアリングモデルに従って、２つの制限マップの光学的アラインメントを決定するダイナミックプログラミングアルゴリズムを使用して生成した（Ｍｙｅｒｓら，Ｂｕｌｌ  Ｍａｔｈ  Ｂｉｏｌ  ５４：５９９−６１８（１９９２）；Ｔａｎｇら，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｒｏｂａｂ  ３８：３３５−３５６（２００１）；およびＷａｔｅｒｍａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １２：２３７−２４２を参照のこと）。所定のアラインメントに関して、上記スコアは、より長い、より良好なマッチングアラインメントがより高いスコアを有するように、上記２つのマップの間の差異によってペナルティーを科されるアラインメントの長さの対数に比例する。
【００７６】
（マップクラスター化）
類似性クラスターを生成するために、各マップを、他のマップに対して整列させた。これらアラインメントから、対様式のパーセント非類似性を、両方のゲノム中のマッチしていない領域の全長を、両方のゲノムの全体のサイズで除算することによって、計算した。これら非類似性測定値を、統計学的パッケージ「Ｒ」において実行されるように、凝集性クラスター化法ａｇｎｅｓへの入力として使用した。このクラスター化法は、それ自体のクラスターにおいて各エントリーを最初に配置し、次いで、２つの最も近いクラスターを反復して連結することによって機能し、その結果、２つのクラスター間の距離は、一方のクラスター中の点と、別のクラスター中の点との間の最小の非類似性である。
【００７７】
（結果）
本明細書中のデータは、マップ類似性によるＳ．ａｕｒｅｕｓ株のクラスター化、および抗生物質耐性表現型がクラスター化する傾向にあることを示す（図９）。上記マップデータに基づいて、両方の遺伝子座に挿入されたモチーフの存在と、メチシリン耐性との間の相関が認められた。すなわち、上記Ｍｅｃ遺伝子の挿入部位におけるさらなるＤＮＡの挿入を有することが見いだされたＳ．ａｕｒｅｕｓの単離物はまた、メチシリンに対する耐性を有することが分かった（図９）。
【００７８】
従って、本発明の方法は、本明細書において、上記ＭｅｃモチーフおよびＰＶＬプラスもしくはマイナスの検出によって確認されるように、上記ＰＶＬ毒素遺伝子を有するｐｈｉＳＡ２プロファージに対応するモチーフの検出に基づいて、ＭＲＳＡとしてＳ．ａｕｒｅｕｓの単離物を同定するために、迅速でかつ正確な試験を提供する（図９）。
【００７９】
本開示の実施形態は、本開示の趣旨および範囲を逸脱することなく、本明細書で記載されるもの以外の方法において行われ得る。従って、上記実施形態は、例示であって、限定ではないと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【国際調査報告】
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