(57)【要約】  ワクチン抗原を、抗原提示細胞へと方向付ける融合タンパク質と、その応用。この発明は、有効に結合した、少なくとも１つの、抗原提示細胞の表面に存在しているクラスＩＩ  ＤＲ抗原のβ鎖を認識する領域を有している、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ａ）と、興味あるワクチン抗原をコードする、１のヌクレオチド配列（Ｂ）と、を備えている遺伝子コンストラクトに関するものである。更に、この発明は、発明の遺伝子コンストラクトの発現に役に立つ組換えベクターと、前記ベクターによって形質転換又は形質移入された遺伝子組換え細胞と植物と、発明の遺伝子コンストラクトによってコードされた融合タンパク質と、前記融合タンパク質を備えているワクチンと、に関するものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子コンストラクトであって、有効に結合された、少なくとも、
ａ）抗原提示細胞の表面に存在しているクラスＩＩ  ＤＲ抗原のβ鎖を認識する領域を有している、ＳＥＱＩＤ  Ｎｏ．１のポリペプチドをコードする１のヌクレオチド配列（Ａ）と、
ｂ）導入された宿主内の免疫応答を誘導しやすい興味あるワクチン抗原を、コードする１のヌクレオチド配列（Ｂ）と、
を備えていることを特徴とする遺伝子コンストラクト。
【請求項２】
興味あるワクチン抗原が、イヌパルボウィルスからのペプチド２Ｌ２１と、ラビット出血性疾患ウィルスからのタンパク質ＶＰ６０と、ロタウィルスからのタンパク質ＶＰ６と、ウシウィルス性下痢症ウィルスからのタンパク質Ｅ２又はＥ２Ｔと、インフルエンザウィルスからの赤血球凝集素タンパク質のグループから選択されたものである、
ことを特徴とする請求項１記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  １をコードするヌクレオチド配列（Ａ）と、イヌパルドウィルスのワクチン抗原に対応するＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１をコードするヌクレオチド配列（Ｂ）と、
を備えていることを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コンストラクトｐＢＩＡＰＣＨ１−２Ｌ２１。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１をコードするヌクレオチド配列（Ａ）と、ウシウィルス性下痢症ウィルスのワクチン抗原Ｅ２Ｔに対応するＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３をコードするヌクレオチド配列（Ｂ）と、
を備えていることを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コンストラクトｐｃＤＮＡＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ。
【請求項５】
スペーサーペプチドをコードする核酸配列（Ｃ）を、
更に、備えていることを特徴とする、請求項１乃至４の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項６】
スペーサーペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３から選択されたものである、
ことを特徴とする請求項５記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項７】
ヌクレオチド配列（Ｂ）の３’末端から下流に配置された、分離又は精製のために使用されやすいペプチドを、コードする核酸配列（Ｄ）を、
更に、備えていることを特徴とする、請求項１乃至６の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項８】
プロモーター配列、転写制御因子をコードする配列、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）、及び／又は、転写終結配列、の内の１つを更に備えている、
ことを特徴とする請求項１乃至７の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項９】
抗生物質耐性遺伝子から選択されたマーカー、及び／又は、毒性化合物に耐性を与える遺伝子、を更に備えている、
ことを特徴とする請求項１乃至８の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１０】
一般の植物又は動物細胞と、特にヒト細胞と、を形質転換するのに役立つ、組換え発現ベクターであって、請求項１乃至９の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクトを含んでいることを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項１１】
アグロバクテリウム  ツメファシエンスのものであることを特徴とする、請求項１０記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２】
好ましくは、バキュロウィルスであることを特徴とする、
請求項１０記載の組換え発現ベクター。
【請求項１３】
ゲノム内に請求項１乃至９の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクトを備えている、
ことを特徴とする請求項１０乃至１２のベクターによって形質転換又は形質移入された細胞。
【請求項１４】
ゲノム内に請求項１乃至９の何れか１つに記載の遺伝子コンストラクトを備えている、
ことを特徴とする請求項１０又は１１のベクターによって形質転換又は形質移入された細胞。
【請求項１５】
ゲノム内に請求項１乃至９の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクトを備えている、
ことを特徴とする請求項１０又は１２のベクターによって形質転換又は形質移入された細胞。
【請求項１６】
導入された宿主内で免疫応答を生成する能力のある、請求項１乃至９の何れか１つに記載の遺伝子コンストラクトによってコードされた融合タンパク質。
【請求項１７】
アミノ段配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１（Ａ）と、イヌパルボウィルスのワクチン抗原２Ｌ２１に対応する、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１（Ｂ）と、
を備えていることを特徴とする請求項１６記載の融合タンパク質ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１。
【請求項１８】
アミノ酸配列ＤＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１（Ａ）と、ウシウィルス性下痢症ウィルスのワクチン抗原Ｅ２Ｔに対応する、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３（Ｂ）と、
を備えていることを特徴とする請求項１６記載の融合タンパク質ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ。
【請求項１９】
請求項１６乃至１８の何れか1つに記載の融合タンパク質と、随意に、薬学的に許容される賦形剤と、
を備えていることを特徴とするワクチン。
【請求項２０】
個人又は動物に対し薬学的に許容される量の請求項１９記載のワクチンの投与を含んでいる、
疾患の処置又は予防のために設計された方法。
【請求項２１】
投与が、口、筋肉内、皮下、腹腔内、又は、静脈内のルートを経由することによって行なわれる、
ことを特徴とする請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質の合成に基づいて、抗原提示細胞へとワクチン抗原を向かわせる方法に関するものである。前記融合タンパク質は、抗原提示細胞の表面上にあるエピトープを認識する領域を有しているポリペプチドと、興味のあるワクチン抗原である他のポリペプチドと、を備えている。
【背景技術】
【０００２】
細菌、カビ、酵母、植物、昆虫細胞、幼虫、哺乳類の細胞等、異なる発現システム内での、興味あるワクチンの組換え生成物の獲得が、以前より知られていた。これらのシステム内で、植物は、他の発現システムに比べて、多くの利点を示す。というのは、一般に、植物は、経済的で、安全で、そして、高価な発酵システムを用いることなく、例えば、組換え型サブユニットワクチンといった、興味ある製剤としての可能性のあるタンパク質を獲得する方法を得やすい、ということを示すものだからである。
【０００３】
しかし、全てのシステムにおいて、病原体の組換えサブユニットからワクチンを得る際の主な欠点は、得られた組換え生成物の低い免疫原性であり、結果、非常に高い、繰り返しワクチン投与量が、通常、従来の免疫原（完全に非活性化された病原体）によって得られた免疫応答に等しいだけ求められる。この状況は、従来のワクチンに比べ、組換えサブユニットワクチンの生成コストを非常に高いものにし、それ故、それらの多くのものが、現在市場に届けられていない。
【０００４】
異なるオルタナティブが、組換えサブユニットワクチンの免疫原性を改善するために、次に行なわれた。それらの内の１つは、マウス内の抗原提示細胞へワクチン抗原を向かわせるために、ＣＴＬＡ４型分子とＬセレクション型分子との使用に基づくものである（下記、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｏｙｌｅ Ｊ．Ｓ．等による論文、“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ａ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｔｈａｔ ｉｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ”、 Ｎａｔｕｒｅ． １９９８年３月２６日; ３９２ （６６７４）： ４０８−４１１
【発明の概要】
【０００６】
しかし、これらの方策は、マウス以外の種で同じ効果を証明しなかった。このことは、他の種、特にヒトにおける抗原提示を受け持つ細胞へワクチン抗原を向かわせることに基づく、他のオルタナティブを調べることを必要にした。
【０００７】
本発明は、従来のそれら提示されているものに変わる、方法に関するものであり、一般に動物、特にヒト、の双方の、種々の種に適用されたときに、組換えサブユニットワクチンの効果を増加するものである。それらの提示細胞へと抗原を向けることに基づく、本発明の方法を使用することによって、ワクチン適用量を少なくしたにもかかわらず、従来のワクチンの適用によって得られる免疫応答と等しいか又はそれを超えるように、宿主媒介免疫応答を強化することができた。
【０００８】
故に、この発明によって提示された、抗原提示細胞へとワクチン抗原を向けるためのシステムは、融合タンパク質で構成されている。該融合タンパク質は、抗原提示細胞表面にエピトープが存在していることが認識される領域を有している、少なくとも１つのポリペプチド（Ａ）と、宿主内の免疫応答をトリガする原因である、興味あるワクチン抗体である、他のポリペプチド（Ｂ）と、を備えている。
【０００９】
本発明の特別な実施例では、ポリペプチド（Ａ）は、クラスＩＩ  ＤＲ抗原（領域Ｄ）のβ鎖を認識する領域を備えている。前記ポリペプチドは、モノクローナル抗体１Ｆ１２から得られた、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１によって特徴付けされている、単鎖（ｓｃＦｖ）組換えＡＰＣＨ１（“抗原提示細胞ホーミング１”）抗体である。故に、ポリペプチド（Ａ）は、フレキシブルなペプチドを介して、モノクローナル抗体１Ｆ１２の軽鎖（ＶＬ）の可変領域へと、融合された、モノクローナル抗体１Ｆ１２の重鎖（ＶＨ）の可変領域によって、形成されている。モノクローナル抗体１Ｆ１２は、多くの種にあるクラスＩＩ  ＤＲ抗原のβ鎖を認識するものであり、結果的に、ヒトを含む、多くの種に適用されるだろう。
【００１０】
本発明の他の特別な実施例において、ペプチド（Ｂ）（興味あるワクチン抗原）は、２Ｌ２１と呼ばれているイヌパルボウィルス（ＣＰＶ）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）、ウシウィルス性下痢ウィルスからのタンパク質Ｅ２Ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３）又はＥ２、ラビット出血性疾患ウィルスからのタンパク質ＶＰ６０、ロタウィルスからのタンパク質ＶＰ６、又は、インフルエンザウィルスからの赤血球凝集素タンパク質、に抗するペプチドである。
【００１１】
２Ｌ２１は、ＣＰＶカプシドからのタンパク質ＶＰ２のアミノ末端領域から離れた２つの抗原性のサブサイトによって形成され、かつ、第１合成ワクチンペプチド
【００１２】
2011512857.tif 000002
【００１３】
として、以前に公表されている。ＡＰＣＨ１に融合された、ペプチド２Ｌ２１は、植物内で発現された。更に、前記ペプチド２Ｌ２１は、植物内で融合していない、又は、免疫原性の観点（βグルコニターゼ、ＧＵＳ）から無関係のタンパク質に融合された、発現をおこなうものであり、該発現は、この発明者の研究室内でこれよりも前に成功裏に実行されている
【００１４】
2011512857.tif 000003
【００１５】
。融合タンパク質２Ｌ２１−ＧＵＳは、低い分解率で、好ましくは、植物内で発現するようになっている、非常に安定したタンパク質である。
【００１６】
故に、本発明は、提示細胞へとワクチン抗原を向ける方法を示すものであり、それぞれ、ワクチンペプチド２Ｌ２１又はＥ２Ｔに融合されたＡＰＣＨ１を備えている、例えばＡＰＣＨ１−２Ｌ２１又はＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ等の、融合タンパク質からなっている。以下に説明するように、融合タンパク質ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１は、遺伝子組換えのシロイヌナズナ植物につながる、植物内で発現され、かつ、融合タンパク質ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔは、哺乳類細胞内で発現された。
【００１７】
更に、融合タンパク質ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１が、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下経由の場合と同様に、経口によって免疫化された動物のグループ内で特異的抗原の高い力価であって、合成ペプチド２Ｌ２１だけ、又は、ＧＵＳ（２Ｌ２１−ＧＵＳ）へと融合させたものによって誘発されるものよりも、はるかに大きな値のもの、を誘発するペプチド２Ｌ２１の抗原と免疫特性とを維持していたことが、証明された。これらの結果は、融合タンパク質ＰＡＣＨ１−２Ｌ２１が、動物内の免疫応答を強化することを示しており、このことは、抗原提示細胞の表面に存在しているエピトープを認識する領域（Ａ）を備えているポリペプチドを用いることによって、抗原提示細胞へと向けることによってワクチン抗原の免疫原性を増加するという仮説を、確認するものである。
【００１８】
この発明によって与えられたワクチン抗原を方向付けるシステムは、融合されたワクチン抗原を抗原提示細胞へと向けることができ、これによって、ワクチン抗原の捕獲を促し、免疫応答を強化するという理由で、多数の利点を示した。このことは、動物とヒトとの双方において、無傷の病原体からの従来のワクチンによって得られるものよりも、同じか又は高い免疫応答を得るために、投与されるべき病原体からの組換えサブユニットワクチンの投与量を減少するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、プラスミドｐＢＩ  ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１の遺伝子発現コンストラクトの概略図である。  ・図１Ａは、シロイヌナズナの不明なゲノム内に組み込まれている遺伝子発現コンストラクトを、概略的に示している。該シロイヌナズナの不明なゲノムは、ＡＰＣＨ１のヌクレオチド配列を備えている。該配列は、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ構造プロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）を先頭としており、ＬＢが左端、ＲＢが右端、ＡＰＣＨ１−ペプチド２Ｌ２１が融合タンパク質ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１をコードする融合物であり、ＮＯＳ−Ｔｅｒがノパリンシンターゼプロモーター（ＮＯＳ−Ｐｒｏ）の制御下にあるポリアデニル化配列であり、ＮＰＴ  ＩＩ（Ｋａｎ Ｒ）がカナマイシン抵抗性遺伝子である。  ・図１Ｂは、２つの独立した折り畳み球状ドメイン（ＶＨとＶＬ）が得られる“スイス・タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ）”、から得られた融合タンパク質ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１の予想される３次元構造を示している。
【図２】図２は、幾つかの株で前記融合タンパク質（ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１）を発現する、ｓｃＦｖＡＰＣＨ１へと融合された抗原２Ｌ２１の発現の解析を示している。  ・図２Ａは、プローブとして３２Ｐとラベル付けされたＡＰＣＨ１−２Ｌ２１融合の完全なＤＮＡ配列を用いることによってハイブリダイズされた、１プラント種類あたりの総ＲＮＡが５μｇを超える遺伝子組換えのシロイヌナズナ内の融合遺伝子（ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１）の、転写のノーザンブロット解析の結果を示している。  ・図２Ｂは、ノーザンブロット法によって解析されたシロイヌナズナの異なる遺伝子組換え種類の新葉から抽出されたタンパク質抽出物（総可溶性タンパク質４０μｇ）のウェスタンブロット解析の結果を示している。
【図３】図３は、ペルオキシダーゼ（Ｉ）と、蛍光ラベリング（ＩＩ）と、を伴うブタの肺胞のマクロファージの表面の特定ラベリングの結果を示している。  ・（Ｉ）は、（ａ）植物抽出物を伴うマクロファージ（負の対照）と、（ｂ）抗体１Ｆ１２によって得られたマクロファージの細胞表面のラベリングと、（ｃ）融合プロテインＡＰＣＨ１−２Ｌ２１を含んでいる、総可溶性タンパク質の抽出によって得られたラベル化と、を示している。  ・（ＩＩ）は、（１）対照抽出によってインキュベートされた細胞の詳細と、（２）抗体１Ｆ１２と、（３）融合タンパク質ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１を発現する植物抽出物と、をそれぞれ低倍率で示している。（ｂとｃ）は、それぞれ、モノクローナル抗体１Ｆ１２と融合タンパク質ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１とによって得られた細胞ラベルを高倍率で詳しく示すものである。
【図４】図４は、ＣＰＶからのペプチド２Ｌ２１の種々の調合によって得られた免疫応答、特に、それ自身（２Ｌ２１）を抗体ＡＰＣＨ１（ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１）へと融合することによって、又は、β-ＧＵＳ（２Ｌ２１-ＧＵＳ）タンパク質へと融合することによって、ペプチド２Ｌ２１で免疫化することによりマウス内に得られた特定の抗体の免疫応答、の解析の結果を示す棒グラフである。
【図５】図５は、ＡＰＣＨ１−Ｅ２ＴとＥ２Ｔを発現するＣＨＯＫ１（哺乳類の卵巣細胞）の安定株の生成を示している。この図のより詳細な説明は、実例２の２．４位置に見出すことができる。
【図６】図６は、発育された細胞株の上清の内の組換えタンパク質の生成の評価を示している。アッセイは、ＤＭＳＯを伴い、又は、伴なわない、培養フラスコ（Ｔ７５）内において、そして、ＤＭＳＯを伴い、又は、伴なわない、（ローラ）ボトル内において、各グループ用の複製内で実行された。０時点で、Ｔ７５の場合、３×１０６の細胞がまかれたのに対し、ローラボトルでは、１６×１０６の細胞で始められており、その結果、両方の間の体積当たりの率は、維持できるようになっている。２４時間毎に１ｍｌが抽出され、それらは、ＥＬＩＳＡが実行されるまでの間、−２０℃で保存された。この図のより詳細な説明は、実例２の２．８位置に見出すことができる。  ・図６Ａは、組織培養フラスコ（Ｔ７５）内で育てられた細胞株である。  ・図６Ｂは、“ローラ”ボトル内で育てられた細胞株である。
【図７】図７は、ＡＰＣＨ１−Ｅ２ＴとＥ２Ｔとの、クマシーとウェスタンブロット法とによる染色を示している。この図のより詳細な説明は、実例２の２．９位置に見出すことができる。
【図８】図８は、単核細胞のＭＨＣII（主要組織適合性複合体）に対するＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔの認識を示している。ＭＨＣIIは、免疫学的な応答に関連している、サイトカインと補体系タンパク質と同様に、Ｔリンパ球に対する抗原提示と抗原プロセシングとの機構に伴う、ある膜細胞タンパク質をコードする遺伝子ファミリーのものである。
【図９】図９は、実験用の分子によって免疫化されたモルモットの免疫応答を示している。Ｌａｃ−ｚ遺伝子は、βガラクトシダーゼと、ラクトースをグルコースとガラクトースとに変換する酵素と、をコードするものであり、負の対照として用いられた。図中に位置決めされているＤＰＶという用語は、ワクチン接種後の日数を示している。
【図１０】図１０は、タンパク質ＡＰＣＨ１−Ｅ２ＴとＥ２Ｔを発現する培養上清によって免疫化されたウシ内の免疫応答を示している。図１０Ａは、ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ又はＥ２Ｔの１μｇによって免疫化されたウシのものである。図１０Ｂは、ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ又はＥ２Ｔの０．２μｇによって免疫化されたウシのものである。
【図１１】図１１は、ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ又はＥ２Ｔの０．２μｇによってワクチン接種されたウシ内の抗原の力価を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、ＤＮＡコンストラクトに関するものであり、ここで、発明のＤＮＡコンストラクトは、直接又は間接的に、有効に結合されたものであって、少なくとも、
ａ）抗原提示細胞の表面上にあるエピトープを認識する領域を備えている、ポリペプチドをコードする、ある１つの核酸配列（Ａ）と、
ｂ）宿主内の免疫応答をトリガするため応答可能な、興味あるワクチン抗原をコードするヌクレオチド配列を備えている、ある１つの核酸配列（Ｂ）と、
を備えている。
【００２１】
核酸配列（Ａ）は、抗原提示細胞の表面上にあるエピトープを認識する領域を備えているポリペプチドをコードする。実験的に、抗原提示細胞の表面上にあるエピトープを認識する領域を備えている任意のポリペプチドが、この発明に使用できる。例えば、その単鎖（ｓｃＦｖ）、二機能（二特異的抗体）又は完全な（ＦａｂＦｃ）形態における、モノクローナル抗体、又は、そのフラグメントである。しかしながら、発明のある実施例では、核酸配列（Ａ）は、クラスII  ＤＲ抗原のエピトープ（鎖β）を認識する領域を備えている、ＡＰＣＨ１ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）をコードする。クラスIIは、表面ポリペプチドとして、免疫システム細胞内に発現されており、ＨＬＡＤ抗原（ヒト白血球抗原Ｄ）と、ＤＲへとサブクラス化されたもの（ＤＲＡとＤＲＢ）と、ＤＱと、ＤＰと、を備えている。前記ポリペプチドは、モノクローナル抗体１Ｆ１２から得られた、単鎖組換え抗体であり、（リンカー又はヒンジの）フレキシブルなペプチドを経由して、モノクローナル抗体１Ｆ１２の軽鎖（ＶＬ）の可変領域へと融合されたモノクローナル抗体１Ｆ１２の重鎖（ＶＨ）の可変領域で、できている。ＶＬコード配列の３’末端は、前記リンカー用のコード配列の５’末端へと結合され、前記リンカーをコードするヌクレオチド配列の３’末端は、ＶＬコード配列の５’末端へと結合されている。ｓｃＦｖ  ＡＰＣＨ１は、１又はそれ以上の制限配列が、アッセイされるべき抗原によって、異なる融合を実行できるように、ＶＬの３’末端で、加えられ得るものであり、かつ、それらが配置されており、かつ、それらを植物形質転換プラスミドへと運ぶ、プラスミドから融合を容易に獲得できるように、ＶＨの５’末端で制限配列（ＸｂａＩ）を含んでいる、となるように設計されている。
【００２２】
モノクローナル抗体１Ｆ１２は、多くの動物種内のクラスII  ＤＲ抗原のβ鎖を認識しており、それ故、ヒトを含む多くの種に用いることができる。その特定に起因して、前記抗体は、任意のその形態（ｓｃＦｖ、二機能性又は完全体）で、それに融合したワクチンペプチドを、抗原提示細部へと、向かわせることができる。前記抗原提示細胞は、表面にこのタイプの分子を示すものであり、それゆえ、ほとんどの発現されたタンパク質が、分解される前にその目的地にたどり着くため、抗原の捕獲を誘導し、応答性を高める。故に、遺伝子組換え植物又は動物によって発現された、異種タンパク質の低い蓄積レベル（病原体の組換えサブユニットワクチン）を補償すること、又は、他のシステムでの生成コストを補償すること、ができる。
【００２３】
核酸配列（Ｂ）は、興味あるワクチン抗原をコードする。該ワクチン抗原は、そのオリジン（真核生物、原核生物、ウィルス、等）によらず、特に、一般の動物又はヒトによらず、組換え型において発現されやすく、宿主内の免疫応答を誘導しやすい、事実上、任意のペプチド又はタンパク質でもよい。以下、幾つかのサンプルを提示する。該サンプルは、興味あるワクチン抗原の機能を果たすものであり、ＣＰＶからのペプチド２Ｌ２１と、ラビット出血性疾患ウィルス（ＲＨＤＶ）からのタンパク質ＶＰ６０と、ロタウィルスからのタンパク質ＶＰ６と、ウシウィルス性下痢症ウィルスからのタンパク質Ｅ２又はＥ２Ｔと、腫瘍又は腫瘍細胞に対するワクチン抗原と、等である。
【００２４】
好ましい実施例において、核酸配列（Ａ）は、核酸配列（Ｂ）へと直接融合するものではないが、代わりに、核酸配列（Ａ）の３’末端と、核酸配列（Ｂ）の５’末端と、の間のスペーサーペプチド（リンカー）を導入するのに有利である。故に、所望される場合、発明のＤＮＡコンストラクトは、核酸配列（Ｃ）を更に含むものでも良い。該核酸配列（Ｃ）は、前記核酸配列（Ａ）と（Ｂ）との間に位置しているスペーサーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいる。核酸配列（Ｃ）の５’末端は、前記核酸配列（Ａ）の３’末端に結合されており、前記核酸配列（Ｃ）の３’末端は、前記核酸配列（Ｂ）の５’末端に結合されている。有利なことに、前記スペーサーペプチド（Ｃ）は、構成上フレキシブルなペプチドである。実際、構造上フレキシブルな任意のペプチドは、使用され得るものである。説明する目的で、前記フレキシブルなペプチドは、アミノ酸残基、特にグリシン残基とセリン残基、又は、他の適切な、アミノ酸残基の反復、を含んでいる。特別な実施例では、前記フレキシブルなスペーサーペプチドは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、又は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３から選択されたものである。
【００２５】
この発明によって得られた、融合ペプチド又はタンパク質の、分離と精製とを促すため、本発明のＤＮＡコンストラクトは、所望される場合には、融合ペプチド又は融合タンパク質を分離又は精製する目的に、使用されやすいぺプチドをコードする核酸配列を含むものでも良い。故に、特別な実施例において、本発明のＤＮＡコンストラクトは、所望される場合には、ヌクレオチド配列を含んでいる核酸配列（Ｄ）を、含む。前記核酸配列（Ｄ）は、分離又は精製のために使用されやすいペプチドをコードするものである。前記核酸配列（Ｄ）は、興味ある、抗原提示細胞又はポリペプチドの表面上にあるエピトープを認識する領域を備えているポリペプチド官能性を変えない、任意の位置に、配置できる。説明する目的で、前記核酸配列（Ｄ）は、前記核酸配列（Ｂ）の３’末端から下流側に配置されても良い。
【００２６】
実際、融合ペプチド又はタンパク質の分離又は精製を可能にする、任意のペプチド又はペプチド配列は、使用することができる。例えば、タグペプチド等のような、免疫アフィニティクロマトグラフィによって結果として生じる融合タンパク質を精製するように働くことのできる、モノクローナル抗体によって認識されやすい、ポリヒスチジン配列、ペプチド配列、例えば、インフルエンザウィルス又はｃ−ｍｙｃエピトープ等の赤血球凝集素タンパク質から得られたエピトープ、である。
【００２７】
本発明のＤＮＡコンストラクトは、周知技術[Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による論文、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ, ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 出版、 Ｎ．Ｙ．, １９８９年, Ｖｏｌ.１−３]を用いて得られる。本発明の前記ＤＮＡコンストラクトは、有効に結合されており、遺伝子発現コンストラクトを構成している、興味ある１または複数の生成物をコードするヌクレオチド配列の発現調節配列を、組み込むことができる。この記載に用いられているように、“有効に結合された”の語は、興味ある１または複数の生成物が、発現調節又は制御配列の制御下において、正しいリーディングフレーム内において発現される、ことを意味している。
【００２８】
故に、好ましい実施例において、本発明の遺伝子コンストラクトは、有効に結合された、本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現制御配列を含んでいる。制御配列は、転写を、該当する場合、前記融合タンパク質の翻訳を、制御し、調節する配列であり、プロモーター配列、転写調節をコードする配列、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）、及び／又は、転写終結配列を、含んでいる。特別な実施例において、前記発現制御配列は、原核細胞内と、例えば、バクテリア等の生物と、において機能するものである、一方で、他の特別な実施例において、前記発現制御配列は、真核細胞と、例えば、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞等の生物と、において機能するものである。本発明によって与えられた遺伝子発現コンストラクト内に提示されているプロモーターの説明に役立つ実例は、植物用のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、バキュロウィルスシステム用のポリヘドリンプロモーター又はｐ１０タンパク質、ＤＮＡワクチン用のサイトメガロウィルスプロモーター、合成初期／後期ポックスウィルスプロモーター等、を含んでいる。
【００２９】
有利なことに、前記遺伝子発現コンストラクトは、更に、前記遺伝子発現コンストラクトによって形質転換された宿主細胞の選択を可能にするモチーフ又は表現型をコードするマーカー又は遺伝子を含んでいる。本発明の遺伝子発現コンストラクト内に提示され得る前記マーカーの説明に役立つ実例は、抗生物質耐性遺伝子と、毒性化合物に耐性を与える遺伝子と、一般に、遺伝的に形質転換された植物を選択することを可能にする全てのものと、を含む。
【００３０】
本発明のＤＮＡコンストラクト、又は、この発明によって与えられる遺伝子発現コンストラクトは、適切なベクター内に挿入されても良い。故に、本発明のもう１つの観点は、前記ＤＮＡコンストラクトを備えている、発現ベクター等の、ベクターに関するものである。ベクターの選択は、後に挿入されるであろう、宿主細胞に依存している。説明目的で、ベクターは、前記ＤＮＡ配列が挿入されているところで、プラスミド、又は、ベクターでも良い。前記ベクターは、宿主細胞へと挿入されている時に前記細胞のゲノムへと組み込まれた、又は、組み込まれていないものである。前記ベクターは、当業者に周知な従来方法[Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等による論文、１９８９年、“ｓｕｐｒａ”に引用された]によって得られるものでも良い。特別な実施例において、前記組換えベクターは、植物細胞又は動物細胞へと形質転換し又は挿入されるのに役立つベクターである。故に、本発明のベクターは、例えば、アグロバクテリウム  ツメファシエンス、又は、（例えば、哺乳類又は昆虫細胞等の）動物細胞又は植物細胞に感染し又は発現する能力を有しているウィルスベクター、であっても良い。本発明の特別な実施例において、ウィルスベクターは、バキュロウィルスが用いられる。
【００３１】
前記ベクターは、形質転換、形質移入、又は、それによって感染されやすい、形質転換細胞、形質移入細胞、又は、感染細胞に用いることができる。その結果、発明のもう１つの観点は、この発明によって与えられるウィルスベクターに感染した細胞に、関係するものである。特別な実施例において、前記感染した細胞は、適切なウィルスベクターに感染した植物細胞であり、前記感染した植物細胞は、この発明によって与えられた融合タンパク質を発現する能力のあるものである。組換えウィルスベクターに感染した植物細胞は、前記組換えウィルスベクターを備えている植物の感染後に得られるものである。故に、植物感染性ウィルスベクターは、前記病原体又は腫瘍細胞に抗する食用ワクチンを生成するため、動物病原体又は植物内の腫瘍細胞のエピトープの発現用に用いることができる。
【００３２】
更に、この発明によって与えられた組換えベクターは、形質転換又は形質移入する、真核生物又は原核生物の細胞に用いることができる。故に、本発明のもう１つの観点では、前記組換えベクターを備えている形質転換又は形質移入された細胞、又は、この発明によって与えられた前記ＤＮＡコンストラクト、又は、本発明によって与えられた遺伝子発現コンストラクト、に関する。形質転換又は形質移入された細胞は、当業者に周知の従来の方法[Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等による論文、1989年、“ｓｕｐｒａ”に引用された]によって得られるものであっても良い。
【００３３】
特別な実施例において、前記組換えベクターは、ウィルスベクターである。本発明の組換えベクターは、植物細胞、藻細胞、又は、動物細胞に、好ましくは、昆虫細胞又は昆虫の幼虫細胞内に、感染し、発現する能力を有している。
【００３４】
その結果、本発明のもう１つの観点では、少なくとも本発明のＤＮＡコンストラクト又は、この発明によって与えられた組換えベクター、又は、この発明によって与えられた遺伝子発現コンストラクト、を備えている、形質転換又は形質移入された細胞に関する。
【００３５】
本発明のもう１つの観点では、そのゲノムに挿入された、本発明の少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトを備えている遺伝子組換え細胞に関する。特別な実施例において、前記遺伝子組換え細胞は、植物細胞由来のものであり、そのゲノムに挿入された、又は、葉緑体ゲノムに挿入された、本発明の少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトを備えている。遺伝子組換え植物は、前記遺伝子組換え植物細胞、又は、遺伝子組換え植物材から、得るものでも良い。故に、本発明のもう１つの観点では、この発明によって得られた、少なくとも１つの植物遺伝子組換え細胞を備えている遺伝子組換え植物に関する。周知のように、遺伝子組換え植物の潜在的に興味ある適用は、前記病原体又は腫瘍細胞に抗する食用ワクチンを生成するための、植物内の動物病原体又は腫瘍細胞の、タンパク質又はエピトープの発現である。
【００３６】
本発明の異なる特別な実施例において、前記遺伝子組換え細胞は、好ましくは哺乳類、又は昆虫、より好ましくは、昆虫の幼虫からの、動物細胞である。故に、発明は、また、高い歩留まりで、興味あるペプチド又はタンパク質を発現する、遺伝子組換え非ヒト動物、特に、遺伝子組換え哺乳類、昆虫、又は、昆虫の幼虫に関する。
【００３７】
本発明のＤＮＡコンストラクトは、この発明に記載された融合タンパク質を生成するのに用いることができる。故に、本発明のもう１つの観点では、前記融合タンパク質を生成する方法に関する。該方法は、前記融合タンパク質の生成を可能にする条件下で、この発明によって与えられた細胞又は生物を育てる工程を、含んでいる。前記細胞又は生物の培養を最適化する条件は、使用する細胞又は生物に依存する。所望される場合には、この発明によって与えられた興味ある生成物を生成する方法は、更に、前記融合タンパク質の分離と精製とを行なう工程を、含んでいる。
【００３８】
本発明のもう１つの観点では、また、この発明によって与えられた少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトによって前記植物を形質転換する工程を含んでいる、植物内で、この発明によって与えられた融合タンパク質をコードする遺伝子を発現する方法を、与えるものである。植物組織からの細胞の形質転換は、従来の方法によって実行することができる。ベクターを含んでいる、植物への遺伝子移動、ＤＮＡ移動方法等の再検討は、例えば、
【００３９】
2011512857.tif 000004
【００４０】
を参照。
【００４１】
本発明のもう１つの観点では、この発明によって与えられたＤＮＡコンストラクト内に含まれている核酸配列の発現によって得られる融合タンパク質に関する。特に、本発明は、
（Ａ）抗原提示細胞の表面にあるエピトープを認識する領域を備えているペプチドと、
（Ｂ）興味あるワクチン抗原と、
を備えている融合タンパク質を与える。
【００４２】
特別な実施例において、本発明は、
（Ａ）インタクトモノクローナル抗体１Ｆ１２、クラスII  ＤＲ抗原のβ鎖を認識する領域を含んでいるモノクローナル抗体１Ｆ１２のフラグメント、二機能形態
のモノクローナル抗体１Ｆ１２と、フレキシブルなペプチドを介して、モノクローナル抗体１Ｆ１２（ＡＰＣＨ１）の軽鎖（ＶＬ）の種々の領域へと、融合されたモノクローナル抗体１Ｆ１２の重鎖（ＶＨ）の種々の領域を含んでいる組換えｓｃＦｖ、によって形成されたグループから選択されたポリペプチドと、
（Ｂ）興味あるワクチン抗原と、
を備えている融合タンパク質を与える。
【００４３】
この発明によって与えられる融合タンパク質は、所望される場合には、更に、抗原提示細胞の表面にあるエピトープを認識する領域を含んでいるポリペプチドと、興味あるポリペプチドとの間にスペーサーペプチドと、及び／又は、融合タンパク質の分離又は精製を促すように設計されたペプチドと、を含む。
【００４４】
一般に、この発明によって与えられる融合タンパク質は、特に、抗原提示細胞の表面にあるエピトープを認識する領域を含んでいるポリペプチドがｓｃＦｖであるとき、比較的小さな分子で、一般に、元の抗原の結合特異性を維持し、そこから、抗原提示細胞の表面にあるエピトープを認識する領域を備えているポリペプチドが得られるものであり、完全抗体のために複雑な組み立て工程を必要としないものである。換言すれば、それらの小さなサイズに起因して、それらは、大きな組織透過性を有している。
【００４５】
本発明のもう１つの観点では、この発明によって与えられた融合タンパク質と、随意に、薬学的に許容される賦形剤と、を備えている。
【００４６】
（実例を参照）実行されたアッセイは、ワクチンペプチド自身によって得られ、又は、無関係のタンパク質に融合された、ものよりもはるかに高い抗体の力価を誘導しており、これによって、ｓｃＦｖＡＰＣＨ１等の抗原提示細胞の表面にあるエピトープを認識する領域を備えている、ポリペプチドによる、抗原提示細胞への方向付けによる、ワクチンペプチドの免疫原性の増加の仮説を確認する、ということによって、この発明によって与えられた融合タンパク質が、動物内での免疫応答性を、高めるということを示している。
【００４７】
故に、その表面の対応するエピトープを呈する抗原提示細胞へと融合ワクチン抗原を方向付けることで、この発明によって与えられたワクチン抗原を方向付けるシステムは、ワクチン抗原の捕獲を促し、免疫応答は、大半の発現されたタンパク質が、分解され始める前にその目的地に達するように、強化され、更に、このことは、ワクチン抗原が、免疫システムへ提示することを受け持つ細胞によって処理される前に、血流から除去されることを防ぎ、それ故、防御免疫応答を生じるものである。ワクチン抗原を抗原提示細胞へと方向付けることによって、その大部分が、免疫システムに正確に提示され、結果として、強力な免疫応答が生じる。該免疫応答は、特別な場合、ワクチン抗原自身によって得られる場合によりも、（特別な実施例の力価の範囲で）少なくとも５０倍である。故に、この発明は、任意のシステムで生成された組換えサブユニットワクチンを、免疫学的に改善するものである。
【００４８】
生物由来物質の蓄積
プラスミドｐＢＩＡＰＣＨ１−２Ｌ２１は、アクセス番号ＣＥＣＴ：５８５７が割り当てられており、２００３年１２月１２日、ＢｕｒｊａｓｓｏｔとＶａｌｅｎｃｉａが、スペインタイプカルチャーコレクション（ＣＥＣＴ）によって蓄積したものである。
【００４９】
プラスミドｐｃＤＮＡＡＰＣＨ１−E２Tは、アクセス番号ＣＥＣＴ：７３８７が割り当てられており、２００８年０５月０３日、ＢｕｒｊａｓｓｏｔとＶａｌｅｎｃｉａが、スペインタイプカルチャーコレクション（ＣＥＣＴ）によって蓄積したものである。
【００５０】
実例は、発明を説明するために以下に供されるが、その範囲を限定するものとみなすものではない。
【００５１】
実例
実例１．動物内の免疫応答性を高めるため、ワクチン抗原を抗原提示細胞へと方向付ける。単鎖組換え抗体ＡＰＣＨ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）をペプチド２Ｌ２１へと融合させることと、遺伝子組換え植物内でのその発現
１．１植物材料
使用されるモデル植物は、シロイヌナズナ、コロンビア生態型であった。シロイヌナズナ属は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ又はＣｒｕｃｉｆｅｒａｅ）のファミリーに属している。
【００５２】
１．２使用したバクテリアの種類
１．２．１大腸菌
以下の特性を示す、大腸菌（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＤＨ５−α株とＴＯＰ−１０株とが、プラスミドの形質転換と増加とに使用された。
【００５３】
2011512857.tif 000005
【００５４】
１．２．２アグロバクテリウム・ツメファシエンス
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ｈｅｌｌｅｎｓ R． ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ P． A ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｎａｒｙ Ｔｉ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５：４４６−４５１，２０００）のＣ５８Ｃ１株とＡＧＬ０  ５−α株とが、シロイヌナズナ花の浸潤のために使用された。
【００５５】
１．３使用されたプラスミド
１．３．１市販プラスミド
アッセイされた異なるペプチドを発現する異なるコンストラクトを得るために、種々の市販プラスミドが使用された。プラスミドｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙは、ＰＣＲのクローン化と、配列決定と、のために用いられた。一方、バイナリーのプラスミドｐＢＩ−１２１と、その誘導体とが、アグロバクテリウムの形質転換と、それに続く、シロイヌナズナの浸潤と、に用いられた。
【００５６】
ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
このプラスミドは、ＰＣＲ生成物のクローン化と、配列決定と、のために特別に設計されたものである。多数の制限部位（ポリリンカー）を備えた領域を含んでいる。ポリリンカは、ＥｃｏＲＶによって事前消化され、次に、３’チミジンが、ＰＣＲ生成物のクローン化を促すために、両端に加えられた。更に、ＬａｃＺ遺伝子を用いて組換えを選択できるようにする。
【００５７】
ｐＢＩ−１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔ．６０１８−１）
プラスミドｐＢＩ−１０１から得られた。それは、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）の３５Ｓプロモーターを含んでおり、ＧＵＳ遺伝子の発現と、シロイヌナズナのプラスミドＴｉのノパリンシターゼ（ＮＯＳ−ｔｅｒ）遺伝子のポリアデニル化配列を含む、２６０−ｂｐ（塩基対）フラグメント発現とを、指揮するものである。また、それは、（少ない複製を伴う）ＲＫ２複製オリジンと、カナマイシン抵抗性遺伝子（Ｎｐｔ２）とを含んでいる。
【００５８】
また、市販のプラスミドに加え、Ｄｒ．  Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ's  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ［ＩＮＩＡ］)で生成され、ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＢＩ１２１  ［Ｄｒ．  Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ's  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＩＮＩＡ）]から得られた、プラスミドｐ３５Ｓ−ＴＥＶ（４，０５１ｂｐ）が使用された。該プラスミドｐ３５Ｓ−ＴＥＶ（４，０５１ｂｐ）は、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）の３５Ｓプロモーターと、タバコ斑点ウィルスの転写強化配列（ＴＥＶ）と、を含んでおり、その後に、多重クローン化領域とＶｓｐポリアデニル化シグナルが現れるものである。このプラスミドは、バイナリーのプラスミド内において、それがクローン化される前の工程として、幾つかのコンストラクトのサブクローン化で再使用された。これらの２つのプラスミドは、発明者の研究室で一般に使用されているものであり、請求されている発明の一部分ではない。
【００５９】
１．３．２本発明の実行中に生じる植物形質転換プラスミド
この例の実施例のために、ｐＢＩ ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１と同定されているプラスミドが、生成された。該プラスミドは、植物の遺伝子形質転換に用いられた。前記プラスミドｐＢＩ ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１内で発現した抗原は、イヌパルボウィルス（ＣＰＶ）からのペプチド２Ｌ２１に対するＡＰＣＨ１の融合である。
【００６０】
配列は、前記抗原をコードし、そのそれぞれの、その融合は、ＰＣＲ増幅を用いて得られた。２つのタイプの市販のポリメラーゼが使用された。１つは、コロニー解析に主に用いられるＥＣＯＴＡＱ（Ｅｃｏｇｅｎ）であり、もう１つは、補正活性を呈し、導入遺伝子配列を増幅するのに用いられた、Ｐｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）である。使用されたプライマーが表１に示されている。配列ＩＤ  Ｎｏ．４の位置１乃至６、配列ＩＤ  Ｎｏ．５の位置１乃至６、配列ＩＤ  Ｎｏ．６の位置２乃至７、配列ＩＤ  Ｎｏ．９の位置１乃至１８は、制限対象である。配列ＩＤ  Ｎｏ．７の位置１乃至３５と、配列ＩＤ  Ｎｏ．８の位置１乃至３２とは、ｓｃＦＶ（ＡＰＣＨ１）内での結合に役立つ人工のフレキシブルな配列を示す。
【００６１】
【表１】
2011512857.tif 000006
【００６２】
１．４抗体
植物内に生成された、異なる組換え抗原を、検出するために、異なる市販のマウスモノクローナル抗体と、ラビットポリクローナル抗体と、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び／又はペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した、それぞれの第２抗体とが、用いられた。
【００６３】
【表２】
2011512857.tif 000007
【００６４】
前記表において、ＷＢは、ウェスタンブロットを意味する。
【００６５】
１．５ハイブリドーマ１Ｆ１２
ＡＰＣＨ１として同定されたｓｃＦＶを展開させるため、我々は、ハイブリドーマ１Ｆ１２から開始した。該ハイブリドーマ１Ｆ１２は、
【００６６】
2011512857.tif 000008
【００６７】
によって与えられ、クラスＩＩ  ＤＲ抗原のβ鎖を認識する１Ｆ１２モノクローナル抗体を発現するものである。ハイブリドーマ１Ｆ１２は、ＲＰＭＩ−１６４０倍地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）内で培養状態に置かれ、０．０１ｍＭのピルビン酸と、２ｍＭのＬグルタミン（Ｓｉｇｍａ）と、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと、２０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）によって補われた。ハイブリドーマ１Ｆ１２は、ＩＮＩＡ研究所で一般に使用されているものであり、請求されている発明の一部分ではない。
【００６８】
１．６市販ＥＬＩＳＡＳ
ＩＮＧＥＺＩＭ  ＰＡＲＶＯ  ＣＡＮＩＮＯ  １．５．ＣＰＶ．Ｋ．１  （Ｉｎｇｅｎａｓａ）、イヌ血清内のイヌパルボウィルスに抗する特定の抗体の検出と定量化と、のための間接型免疫酵素アッセイである。
【００６９】
１．７シロイヌナズナの成長
使用されたモデル植物は、シロイヌナズナ、コロンビア生態型であった。シロイヌナズナ属は、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ又はＣｒｕｃｉｆｅｒａｅ）のファミリーに属している。
【００７０】
１．７．１土壌上において
土壌内にシロイヌナズナを育成するため、種が、一般的な生息環境とバーミキュライトとの（3：1の）混合物を含んでいる、植木鉢又はプラスチックセルの、表面に植えられた。混合物は、予め蒸留水に浸されており、１２０℃、２０分の間、１０１ｋＰａ（１気圧）でオートクレーブ減菌された。植木鉢又はセルは、適切な湿気を維持し、発芽期間中の汚染を防ぐため、後にプラスチックによって被われるトレイ内に置かれた。トレイは、種の均一な発芽を助けるため、４８時間、４℃の暗室に保たれた。次に、トレイは、蛍光灯下で１６時間、暗室内で８時間、の光周期で、２２℃の培養容器に入れられた。植えてから１週間後、プラスチックは取り除かれ、トレイは常に水を保もっている。植物は、一般的な最小培地（ＨａｕｇｈｎとＳｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅとによる論文、“Ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ”、  Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０４：４３０−４３４、１９８６年）によって、週に一度給水された。植物は、浸潤のための理想的な時間である（６乃至７週）で咲き始めるまでの間、これらの環境下に保たれた。時には、浸透率を高めるため、幾つかの花は、より数多く、育っている、２番目の花房のところまで、切除される。
【００７１】
１．７．２ペトリ皿内において
プレート内の種の発芽のため、ＭＳ媒体（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｔ．とＦ．Ｓｋｏｏｇ．による論文、“Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．”  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．  １５：４７３−４９７、１９６２年）には、１％スクロースが補われ、０．８％の寒天によって固められ、対応する抗生物質が使用された。種は、次亜塩素酸塩ナトリウム３０％と０．０１％のトリトンＸ１００との溶液内に１０分間減菌され、次に、滅菌水内で５回洗浄された。種は、４８時間暗室で４℃にされた、ペトリ皿に蒔かれた。続いて、２２℃で、明るい部屋に１６時間、次に、暗室内で８時間の状態にされる培養チャンバーへと置かれた。２週間後、苗木は、土壌へと移植され、前述の状態で育成された。
【００７２】
１．８細菌培地とコンピテント細胞の取得
Ｅ．ｃｏｌｉの培養が、３７℃、１４乃至１６時間の間、対応する選択剤（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による、１９８９年）のある、ＬＢ媒体（Ｓｉｇｍａ）内で実行された。コンピテント細胞の提示は、Ｈａｎａｈａｎによって記載された、塩化ルビジウム法(“Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄｓ”、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、１６６：５５７−５８０、１９８３年)を用いて実行された。
【００７３】
アグロバクテリウムの異なる菌株の培養は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと、５０μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による、１９８９年）とを補い、液状ＬＢ又は皿の中で実行され、２８℃で３６乃至４８時間維持された。
【００７４】
バクテリア培養の長期保存は、−８０℃で６％の最終濃度で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）内で実行された。
【００７５】
１．９バクテリア形質転換法
１．９．１Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換
ＤＨ−５α株とＴＰＯ−１０株とは、プラスミドを維持し、新しいプラスミドを生成するのに用いられた。双方のコンピテント株は、次の、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ  ａｎｄ  Ｄｏｌｌｙによるプロトコル（Ｂｉｒｎｂｏｉｎ  Ｈ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｄｏｌｌｙ  Ｊ．等による論文、“Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ”、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．7：１５１３−１５１６、１９７９年)によって形質転換された。短時間、プラスミドＤＮＡ又はリンケージ生成物が、回答コンピテント細胞の一定分量１００μｌに加えられ、３０分間、４℃に保たれる。次に、細孔浸透性を増加する、４２度の熱衝撃が起こされ、６００μｌのＬＢが加えられ、１乃至１．５時間、撹拌されながら、３７℃でインキュベートされた。バクテリア細胞は、３分間に３，５００ｒｐｍの遠心分離法によって沈降され、必要な選択抗生物質が事前に加えられた固形培地に置かれた。プレートは、一晩、３７℃の恒温室内でインキュベートされた。
【００７６】
１．９．２アグロバクテリウム  ツメファシエンスの形質転換
Ｃ５８Ｃ１株とＡＧＬ０株とは、バイナリープラスミドで形質転換された。短時間、ＤＮＡ（バイナリープラスミド）の１μｇは、解凍を伴わない、前記コンピテント細胞の２００μｌの一定分量に加えられ、３７℃で５分間インキュベートされ、直ちに、３０分間４℃でインキュベートされた。次に、１ｍｌのＬＢが加えられ、３乃至４時間、２８℃で培養された。次の遠心分離法では、カナマイシンリファンピシンを備えているＬＢ媒体内に置かれた。プレートは、２８℃でインキュベートされ、コロニーが約４８時間後に現れた。次に、培養され、シロイヌナズナ植物の浸潤に用いられた。
【００７７】
１．１０ハイブリドーマ１Ｆ１２からのｓｃＦｖ（ＡＰＣＨ１）の獲得
ｓｃＦｖ（ＡＰＣＨ１）に対応する配列を獲得するため（セクション１．５で、物質、内に示されているように）、ハイブリドーマ１Ｆ１２から始めた。ハイブリドーマ細胞内の総ＲＮＡは、Ｒｏｃｈｅの市販キットである“Ｔｒｉｐｕｒｅ”を用いて分離され、モノクローナル抗体１Ｆ１２を発現したハイブリドーマのｃＤＮＡは、ＡＭＶ−ＲＴポリメラーゼ[Ｐｒｏｍｅｇａ]を用いるＲＴ−ＰＣＲを利用することによって獲得された。次に、第１ＰＣＲが、免疫グロブリンの異なる可変ドメイン用の特異的プライマーによって実行された。ＰＣＲ増幅は、重鎖と軽鎖との可変領域の末端に対し特異的にハイブリダイズされた２つのプライマーを用いて、個々に実行された。
【００７８】
次のプライマーが、第１ＰＣＲ内で使用された。
【００７９】
2011512857.tif 000009
【００８０】
前記表において、ＶＨとＶＬとは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖との可変ドメイン用の特異的なプライマーである。
【００８１】
３ＰＣＲｓは、重鎖（ＶＨ）（３’ＶＨ１を伴う５’ＶＨ１ａ．１ｂ．１ｃ）の可変領域を得るために実行され、４ＰＣＲｓは、軽鎖（ＶＬ）の可変領域を得るために実行された。異なるドメインの配列は、各ドメインに対するＰＣＲ混合物の１つにおいて、予定通り、増幅された。これらの増幅配列（ＶＨとＶＬ）は、その配列が第２ＰＣＲにおいて、テンプレートとして用いられた後に、ＰＣＲ生成物用のｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙクローニングプラスミド内で直接クローン化され、サブクローニングプラスミドｐＧＥＭ  ＶＨとｐＧＥＭＶＬとが得られた。第２ＰＣＲ内において、それらは、双方のドメインが人工のフレキシブルな配列（リンカー）に結合されている、前に設計されたプライマーによって増幅された。故に、ＶＨは、その３’領域でリンカーに結合されており、ＶＬは、その５’領域（ＶＨ３’リンカーとＶＬ５’リンカー）（表１）でこの配列に結合されている。故に、双方のドメインは、双方の配列の幾つかの増幅サイクルの後に、重複した人工配列を有しているため、三番目のＰＣＲは、人工のフレキシブルな配列に結合された双方のドメインを得るために、実行された。故に、ＡＰＣＨ１は、モノクローナル抗体１Ｆ１２の軽鎖の可変領域に、フレキシブルなペプチドを用いることによって、融合された重鎖の可変領域を含んでいる。一度、ＡＰＣＨ１配列が特異的プライマー（ＶＨ５’ｘｂａＩとＶＬ３’）（表１）を伴うＰＣＲによって増幅されると、それは、ＰＣＲ生成物用のクローニングプラスミド、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ内でクローン化され、サブクローン化プラスミドｐＧＥＭ−ＡＰＣＨ１が得られた。ＡＰＣＨ１は、アッセイされるべき抗原への異なる融合を実行できるように、ＶＬ３’末端で幾つかの制限配列を加えるように、設計されたものであり、ｐＧＥｍから融合を容易に抽出し、植物形質転換プラスミドへと運べるようにする、ＶＨ−５’末端でＸｂａＩ配列を含んでいる。
【００８２】
１．１１プラスミドｐＢＩ  ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１の獲得
プラスミドｐＧＥＭ−ＡＰＣＨ１を配列決定し、その完全性を確認した後、ｓｃＦＶＡＰＣＨ１の３’領域に融合されたＣＰＶの抗原２Ｌ２１は、クローン化された。結果、ペプチド２Ｌ２１の配列は、プライマー２Ｌ２１ＸｈｏＩと２Ｌ２１ＳｍａＩ（表１）と共に、ＰＣＲによって増幅され、その配列決定を行うためにｐＧＥＭ内でクローン化された。配列を確認した後、それは、ＸｈｏＩとＳｍａＩ酵素で消化されることによって抽出され、間接的手法で、これら同じ酵素によって事前に消化されている、プラスミドｐＧＥＭ−ＡＰＣＨ１へと導入された。幾つかのリンケージと形質転換の後に、プラスミドｐＧＥＭ  ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１は、最終的に得られ、融合リーディングフレームを正確に維持していることの確認のために配列決定された。次に、このプラスミドは、融合ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１を抽出するために、ＸｂａＩとＳｍａＩ酵素によって消化され、これらと同じ酵素によって事前に消化されている、プラスミドｐＢＩ−１２１へと導入された。
【００８３】
プラスミドｐＢＩ−１２１は、βグルコニターゼ遺伝子を含んでおり、この理由で、ＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩ酵素によって消化され、同じ酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ）によってプラスミドｐ３５Ｓ  ＴＥＶ内でクローン化された。次に、新たなベクターが
生成された（ｐ３５Ｓ−ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１）。該ベクターは、３５ＳｃａＭＶプロモーターと、融合ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１と、ポリリンカー（ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ）の部分と、Ｖｓｐ−ｔｅｒポリアデニル化配列と、を含んでおり、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ酵素によって消化され、この結果、前記融合ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１を、これらと同じ酵素によって事前に消化されているｐＢＩ−１２１バイナリープラスミドへと導入し、そして、プラスミドｐＢＩ  ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１が得られた。
【００８４】
１．１２アグロバクテリウム  ツメファシエンスによって薬物治療された植物の遺伝的形質転換
異なる植物形質転換プラスミドによって事前に形質転換されているアグロバクテリウム細胞は、２８℃で４８時間、カナマイシンとリファンピシン（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による、１９８９年）の補われた、５００ｍｌのＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ）内で育成された。２０分間、３,０００ｒｐｍの遠心分離の後、（バクテリアを含む）沈降物は、２．３５ｇ／ｌのＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇとによる、１９６２年）と、５％のスクロースと、１０ｇ／ｌの６−ベンジルアミノプリンと、０．０２％のＳｉｌｗｅｅｔ  Ｌ−７７（Ｌｅｈｌｅ  Ｓｅｅｄｓ，カタログＮｏ．ＶＩＳ−０１）で構成されている２００ｍｌの湿潤培地で再懸濁された。
【００８５】
１．１２．１花の湿潤
湿潤を行なうため、花序できる数の最も多い６乃至７週齢の植物が、使用された。花序は、真空チャンバー内でアグロバクテリウムを含んでいる湿潤培地内で浸され、１０分間、５ｋＰａ（５０ｍｂａｒ）の圧力に晒された（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ  Ｎ．とＰｅｌｌｅｔｉｅｒ Ｇ．等による論文、“Ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  ｖａｃｕｕｍ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ”、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．８２：２５９−２６６、１９９８年）。一度時間が経過すると、真空は、できるだけ速やかに解放され、植物は、水洗され、プラスチックで被われ、その結果、乾燥することと、異なる湿潤された植物間での考えうる汚染と、が防がれた。時折、植物は、真空でないところで湿潤された（Ｃｌｏｕｇｈ  Ｓ．Ｊ．とＢｅｎｔ  Ａ．Ｆ．による“Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法:ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ”、 Ｐｌａｎｔ．  Ｊ．  16：７３５−７４３、１９９８年）。それらは、培養チャンバー内に保持され、長角果が発育し成熟するまで、明さ、湿度、温度について制御環境下に置かれた。
【００８６】
１．１２．２培地と遺伝子組換え植物の選択
事前に湿潤されたシロイヌナズナからの種は、３０％の灰汁と、１０％のトリトンＸ１００と、を含んでいる溶液内で減菌され、そして、アンピシリンとカナマイシン（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による、１９８９年）の補われた、（４．７ｇ／lのＭＳ、１％のスクロース、０．５ｇ／ｌのモルフォリンエタンスルホン酸(ＭＥＳ)と、８ｇ／ｌの寒天と、を含み、ｐＨ５．７の）ＧＭ培地内のペトリ皿に蒔かれた。
【００８７】
Ｔ１種は、４８時間、４℃の暗室に置かれ、次に、インビトロの培養チャンバー内で、（２２℃で、１６時間明るく、８時間暗くする）制御環境下に置かれた。１２乃至１５日後、（カナマイシンのあるところで正常に育つ能力のある）遺伝子組換え苗木は、土壌に移植され、その成長と発育のために、培養チャンバーに移された。
【００８８】
１．１３遺伝子組換え植物の解析
１．１３．１膜に対する、総ＲＮＡ、定量化、電気泳動、移動、の分離
総ＲＮＡは、Ｌｏｇｅｍａｎｎ等によって記載された塩酸グアニシン法(Ｌｏｇｅｍａｎｎ  Ｊ．、Ｓｃｈｅｌｌ  Ｊ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ  Ｌによる論文、“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅｓ”、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６３：１６−２０、１９８７年)の後に、精製された。ＲＮＡの定量化は、分光光度法によって実行された。
【００８９】
膜への移動のために、ＲＮＡは、ホルムアルデヒド／ホルムアミド（Ｓａｍｂｒｏｏｌ等による、１９８９年）の存在下で、１．５％の水平方向のアガロースゲルで分割された。ＲＮＡサンプルは、エチジウムブロマイドによってロードされ、結果、花序によって可視化され、それによって、その完全性が確認された。次に、ＲＮＡは、従来の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による、１９８９年）によって、０．０５Ｍの水酸化ナトリウムを使用するＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）へと移された。
【００９０】
１．１３．２プローブの放射性標識化と核酸のハイブリダイゼーション
全ＤＮＡプローブは、オリゴラベル化キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用する、ランダムプライマー伸張法を用いることによって、５０μＣｉのα３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ又はＩＣＮ）でラベル化された。組み込みまれていないヌクレオチドは、製造者の指示に従って、Ｓ−２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）内での分子排除クロマトグラフィによって評価された。異なるＤＮＡフラグメントは、後に詳しく説明するように、それらを得るために使用された方法と同様に、（融合遺伝子の全配列の）プローブとして用いられた。
【００９１】
2011512857.tif 000010
【００９２】
前記表において、Ｎは、ノーザンブロット法、Ｓは、サザンブロット法である。
【００９３】
核酸ハイブリダイゼーションは、事前ハイブリダイゼーション溶液の１０乃至１５ｍｌを含んでいるガラス管内で実行された。膜は、ハイブリダイゼーション温度で、少なくとも２時間の間、事前ハイブリダイズドされた。一度、この時間が経過すると、変性した放射性標識プローブは、加えられ、膜は、１６乃至２０時間の間この溶液内に保たれる。
【００９４】
厳密でない、サザンタイプハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＰＥ（０．１５Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）と、１０ｍＭのリン酸二水素一ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）と、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のジナトリウム塩（ＥＤＴＡ  Ｎａ２）とを含む）、５×デンハルト溶液（０．０２％のポリビニルピロリドンと、０．０２％のウシ血清アルブミンと、０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と、０．５ｍｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡとを含む）と、を伴う、事前ハイブリダイゼーション溶液内で実行された。ハイブリダイゼーションは、６５℃で実行された。ハイブリダイゼーションの後、膜は、洗浄毎に塩分濃度を低くして、５×ＳＳＰＥと０．５％ＳＤＳとによって連続的な洗浄に晒された。
【００９５】
ノーザンタイプハイブリダイゼーションは、４２℃の、ｐＨ７．２、０．２５Ｍのリン酸緩衝液であって、０．２５Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）と、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と、７％のＳＤＳと、１０％のＰＥＧ６０００と、４０％のホルムアミドと、０．２ｍｇ／ｍｌの変性ニシン精子ＤＮＡと、を含むものの中で実行された。ハイブリダイゼーションの後、膜は、６５℃で、５×ＳＳＰＥと０．５％ＳＤＳによって連続的な洗浄に晒された。各洗浄は、約２０分続いた。時折、０．５％ＳＤＳで洗浄することが必要である。
【００９６】
膜は、ハイブリダイゼーションバンドを可視化するのに要する時間だけ、−８０℃で、オートラジオグラフィーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）と、強化スクリーンと、に曝された。膜を再利用するため、これらのものは、溶液がさめるまで、撹拌を伴いながら、沸騰している５％のＳＤＳ用溶液によって、脱ハイブリダイゼーションが行なわれた。膜内に放射性物質が残っていないことを確認するため、フィルターは、数日間、オートラジオグラフィーフィルムに曝された。
【００９７】
１．１４遺伝子組換え植物内に生成された組換えタンパク質の解析
１．１４．１全可溶性タンパク質の獲得
通常、植物の根元から伸びているロゼットリーブから得られた、新鮮な植物は、切断され、１．５ｍｌのエッペンドルフ管に導入され、氷内（４℃）に置かれた後、タンパク質抽出緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭのトリスと、５００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）と、０．１％のトリトンＸ−１００と、１％のβ−メルカプトエタノールと、プロテアーゼ阻害剤として１ｍＭのＰＭＦＳと、を含むものの）内において、均質化された。均質化の後、１３，０００ｒｐｍで１０乃至１５分の間、遠心分離され、上清が集められた。幾つかの場合において、凍った物質が用いられた。幾つかの沈殿されたタンパク質の可溶化することと、抽出収率を改善することと、のために、尿素を含んでいる緩衝液が、使用された。タンパク質解析は、ＳＤＳ存在下のアクリルアミド−ビスアクリルアミド電気泳動ゲル（３０：１）内において、実行された。
【００９８】
１．１４．２ＳＤＳ存在下のポリアクリルアミド−グリシンゲル内での電気泳動
変性状態の下のタンパク質電気泳動が、従来の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による、１９８９年）の後、ＳＤＳ存在下の不連続アクリルアミド−ビスアクリルアミドゲル内で実行された。アクリルアミド−ビスアクリルアミド分離ゲルが、アクリルアミド−ビスアクリルアミド（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等による、１９８９年）の３．５％濃度の濃くしたゲルと共同で、処理されるべきタンパク質の気体分子量に依存する、７％乃至１５％間の種々の濃度で、用意された（Ｂｉｏｒａｄ又はＳｅｒｖａ）。電気泳動は、ミニゲル（７×８ｃｍ）の場合、１００乃至１４０Ｖの間の定電圧で展開された。
【００９９】
全サンプルは、Ｂｒａｄｆｏｒｄ−Ｌｏｗｒｙ法（Ｂｉｏｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ）によって、電気泳動による分離後に定量化された。タンパク質解離緩衝液（ｐＨ８．０、０．５Ｍトリス、１０％ＳＤＳ、グリセロール、β−メルカプトエタノール、０．０２％ブロモフェノール・ブルー）内で可溶化され、１００℃、５分間加熱され、次に、ゲルにアプライされた。
【０１００】
１．１４．３タンパク質のニトロセルロースフィルターへの転写
タンパク質のニトロセルロースフィルター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ２）への転写は、１時間、１００Ｖ定電圧で、湿潤なキュベット内で、又は、２０Ｖ、２５分間、セミドライトランスファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって、実行された。何れの場合も、同じ移動緩衝液（２５ｍＭトリス、１５１．８ｍＭグリシン、２０％メタノール（ｖ／ｖ））が用いられた。
【０１０１】
１．１４．４ニトロセルロースへと転写されたタンパク質のＰｏｎｃｅａｕ  Ｒｅｄ染色
一度、タンパク質がニトロセルロースフィルターへと転写されると、該フィルターは、その完全性をチェックするために、３０％のトリクロロ酢酸（ｐ・ｖ）と３０％のスルホサリチル酸（ｐ／ｖ）との内の０．２％Ｐｏｎｃｅａｕ溶液（Ｓｉｇｍａ）によって、１分間浸漬によって、染色された。次に、それらは、過剰な着色剤を除去するために、蒸留水で洗浄された。
【０１０２】
１．１４．５免疫ブロット法又はウェスタンブロット法によるタンパク質解析
一度タンパク質がニトロセルロースフィルターへと運ばれ、固定化されると、前記ニトロセルロースフィルターは、ＰＢＳ内で２％の脱脂粉乳（ｐ／ｖ）によって１時間３７度でブロックされ、又は、同じブロッキング溶液によって、撹拌されながら、４℃で一晩おかれた。次に、フィルターは、各アッセイに適切な濃度で、０．０５％のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）内で希釈された特異的抗体と共に１時間インキュベートされた。フィルターは、そのつど、洗浄緩衝液（ＰＢＳ１Ｘ−Ｔｗｅｅｎ）内で１０分間３度洗浄され、１時間、室温で、対応する第２抗体によって、同じ希釈液内で、インキュベートされた。洗浄を繰り返した後、展開は、第２抗体（ＮＢＴ−ＢＣＩＰ（Ｒｏｃｈｅ）、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の結合に基づく、適切な基質を用いて実行された。
【０１０３】
１．１５植物内で発現したタンパク質の免疫原性解析
１．１５．１血清の獲得
血清は、３０分間、３７℃で血液培養され、その後、４℃で１４時間のインキュベーションが施されることによって得られた。血餅は、分離され、血清は、１０分間、１，５００ｒｐｍで遠心分離によって浄化された。
【０１０４】
１．１５．２ＥＬＩＳＡによる抗体の検出
ＥＬＩＳＡウェルプレートは、４℃で１２時間、結合バッファ（炭酸塩／炭酸水素塩）内で希釈され、ウェル毎にペプチド２Ｌ２１の０．２μｇによって並べられた。それは、撹拌されながら、１時間、３７℃で、０．０５％のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）と５％のウシ胎仔血清又はＢＳＡとの溶液でブロックされた。０．０５％のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液によって３回洗浄した後、測定される血清は、撹拌されながら、１時間、３７℃で、０．０５％のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０の異なる希釈液でインキュベートされた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した後、ウェルは、撹拌しながら、１時間、３７℃、１／５００の希釈で、ペルオキシダーゼ共役抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０でインキュベートされた。プレートは、０．１％過酸化水素を含んでいる水に用意された、基質としてＯ-フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、洗浄、展開された。反応は、３Ｎ硫酸によって止められ、次に、各ウェルプレートの吸収は、４９２ｎｍ波長のＥＬＩＳＡリーダー内で読み取られた。
【０１０５】
イヌパルボウィルスカプシドに抗して抗体を検出するために、ＩＮＧＥＺＩＭ  ＰＡＲＶＯ  ＣＡＮＩＮＯ  １．５ＣＰＶ．Ｋ．１  Ｋｉｔ（Ｉｎｇｅｎａｓａ）が、使用された。これは、イヌ血清内のイヌパルボウィルスに抗する特異的抗体の検出と、定量化と、のために設計されたものである。
【０１０６】
ＥＬＩＳＡによって解析された血清内の抗体の力価を測定するため、滴定されるべき血清の段階希釈が、実行された。前記血清の最大希釈の逆数として、各血清の力価を発現している、４９８ｎｍでの吸収度は、負の対照のものに比べ、かなり大きな値（２倍以上）となった。
【０１０７】
１．１５．３免疫ブロット法による抗体の特徴付け
免疫化された動物から得られた抗体の抗原特異性は、免疫ブロット法によって測定された。バキュロウィルス（Ｉｎｇｅｎａｓａ）内に生成されたＶＰ２カプシドのタンパク質は、タンパク質解離緩衝液内で再懸濁され、５分間煮沸され、ＳＤＳの存在下でポリアクリルアミド−グリシン内にロードされ、そして、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ）へと転写された。マウス血清は、１／１０からの限られた希釈で試験され、抗マウス第２抗体は、アルカリフォスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）によって結合された。反応に用いられた基質は、ニトロブルー−テトラゾリウム−４−クロロ−３−インドールリン酸（ＮＢＴ−ＢＣＩＰ、Ｒｏｃｈｅ）である。
【０１０８】
１．１６実験モデルと免疫化
１．１６．１腹腔内経路による、植物抽出物によるマウスの予防接種
１１週齢のＳｗｉｓｓ  ｓｔｏｃｋのメスのマウスが、腹腔内経路で、０、７、１４日目に、（ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１）研究下、組換えタンパク質を発現した植物抽出物（１投与量が、３ｍｇの全可溶タンパク質）によって免疫化された。
【０１０９】
Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバンド（Ｓｉｇｍａ）が、第１接種に用いられ、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバンド（Ｓｉｇｍａ）が、残りの接種に用いられた。
【０１１０】
対照マウスは、形質転換されていない植物抽出物、又は、導入遺伝子を伴わないベクターによって形質転換された植物抽出物、によって同じ手順を用いて、免疫化された。最後に免疫化してから１０日後、マウスは採血され、研究のために血清が得られた。
【０１１１】
１．１７ペプチド２Ｌ２１へと融合される単鎖組換えＡＰＣＨ１抗体の獲得と、遺伝子組換え植物内での、その発現
ここに記載されている、ＡＰＣＨ１と呼ばれている、単鎖組換え抗体（ｓｃＦｖ）の獲得は、“物質と方法”のセクションに記載されているように、ハイブリドーマ１Ｆ１２から始め、次に分子クローン化を行ない、ｍＲＮＡｓからのＰＣＲ増幅を用いることによって実行された。最終生成物は、抗体１Ｆ１２の天然のシグナルペプチドを伴う重鎖（ＶＨ）の種々のドメインと、該シグナルペプチドからの軽鎖（ＶＬ）の種々のドメインと、それらを結合する人工のフレキシブルなぺプチドであって除去されたものと、で構成されている。結果として生じているキメラ遺伝子を配列することと、その完全性の確認と、を行なった後、ＡＰＣＨ１の３’領域に融合されたＣＰＶの抗原２Ｌ２１は、クローン化された。この結果、抗原２Ｌ２１の配列は、融合リーディングフレームを開放し続けるようにする、特異的プライマーを伴う、ＰＣＲによって増幅された。幾つかのサブクローン化の後、このフラグメントは、３５Ｓ構成プロモーターを含んでいる、プラスミドｐＢＩ  ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１へと導く、バイナリープラスミドｐＢＩ  １２１へと導入された。プラスミドｐＢＩ  ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１は、融合タンパク質に対応する配列と、アグロバクテリウムの一酸化窒素合成酵素（図１）のポリアデニル化配列と、の発現を指揮するものである。このプラスミドは、アグロバクテリウム  ツメファシエンスへと導入され、それによって、シロイヌナズナは、花の湿潤を用いることによって形質転換された（Ｃｌｏｕｇｈ，S．J．とＢｅｎｔ，Ａ．Ｆ．による論文、１９９８年、Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ：  ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １６：７３５−７４３）。
【０１１２】
１．１８得られた遺伝子組換え植物内の融合抗原（ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１）の発現の解析
植物の形質転換後、野草と同様の表現型を備えている、多くの遺伝子組換え株が、得られた。次に、約３０の個々の遺伝子組換え株が、導入遺伝子の発現と、融合タンパク質（ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１）の蓄積と、を測定するために解析された。事前に、異なるｓｃＦｖが、異なる目的によって、植物内に発現され、発現とこれら分子の蓄積レベルの非常に多くの変形例が、得られた（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｕ．とＣｏｎｒａｄ，Ｕ．による論文、１９９５年、“Ｈｉｇｈ−Level  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｅｅｄｓ”、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｎ．Ｙ．）１３：１０９０−１０９３)。故に、第１工程は、融合タンパク質の蓄積レベルを、次々と解析するために、導入遺伝子の正しい転写を研究するためのものである。
【０１１３】
異なる株の全ＲＮＡは、このコンストラクトによって形質転換され、アガロースホルムアミドゲル内の異なるＲＮＡｓを分離し、そして、次に、解析のために後者のアガロースホルムアミドをニトロセルロースフィルターへと転写する、植物の新しい葉から得られた。ノーザンブロット法は、プローブとして、完全な融合配列（ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１）を使用する、これらのフィルター上で実行された。これらのプローブは、幾つかの遺伝子組換え株が、融合タンパク質（図２）に対応するｍＲＮＡ用に予期されたサイズの非常に強いハイブリダイゼーションバンドを示した。
【０１１４】
次に、植物細胞内の組換えタンパク質の正確な翻訳と蓄積との確認のため、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが、これらのラインからの総可溶性タンパク質抽出物によって実行された。結果、ペプチド２Ｌ２１に特異的な、モノクローナル抗体３Ｃ９（Ｉｎｇｅｎａｓａ）が、ウェスタンブロット解析に使用された。これらの解析は、最高のメッセンジャー蓄積レベルを示したラインからの抽出物中に、ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１に対応する、約３２ｋＤａのバンドの存在することを示した。
【０１１５】
図２に認められるように、解析されたライン内の検出された転写レベルとタンパク質との間の正の相関が存在し、この結果、最高のｍＲＮＡレベルを有する植物が、このタンパク質のより大きな蓄積を示した。予想されたＡＰＣＨ１−２Ｌ２１の３次元構造が、球状タンパク質であり、多量体のものではない（図１Ｃ）、ということを示している。これらの結果は、シロイヌナズナ細胞の細胞質内のこの融合タンパク質の転写と翻訳のために、何の障害も無いことを示している。
【０１１６】
１．１９ワクチンペプチド（ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１）へと融合された組換え抗体の抗原提示細胞内の標的抗体への結合能力の解析
オリジナル１Ｆ１２抗体の抗原認識特性を維持していた植物内で生成された融合タンパク質ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１を確認するため、蛍光の、そして、免疫組織化学的な、アッセイが、これらのレセプター（クラスＩＩ  ＳＬＡ−ＤＲ）の大半を有している、ブタ肺胞マクロファージを使用して実行された。
【０１１７】
これらのアッセイのために、ブタマクロファージは、プラスミドｐＢＩ  ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１によって形質転換された植物から新たに抽出された、１μｇの可溶性タンパク質に事前に固定されており、４℃で一晩インキュベートされた。次に、非特異的結合を除去するためにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎによってマクロファージを洗浄した後に、第２インキュベーションは、エピトープ２Ｌ２１に対する特異的抗体３Ｃ９によって実行された。次に、免疫複合体は、２つの異なる方法で展開された。免疫蛍光のために、緑にラベル付けされた、Ａｌｅｘａ−ＦｌｕｏｒＴＭ４８８共役ヤギ抗マウス抗体（分子プローブ）が、使用された。ペルオキシダーゼをラベル付けした場合、ブラウンにラベル付けされた、ペルオキシダーゼ共役ヒツジ抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が、使用された。負の対照として、複数のマクロファージが、同じ条件下で、プラスミドｐＢＩ−ＴＥＶ  Ｖｐ６０によって形質転換された植物抽出物によって並行にインキュベートされ、そして、抗体１Ｆ１２を発現しているハイブリドーマの上清（１０μｇ）が、正の対照として使用された。
【０１１８】
この実験の結果、ラベル化は、ハイブリドーマ１Ｆ１２の上清によってインキュベーションされたマクロファージ内と、ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１を発現した植物抽出物内と、のみに得られた。負の対照内には、何のシグナルも現れなかった。特異的ラベル付けしたパターンは、ハイブリドーマの上清によって処置された細胞内と、ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１（図３）を発現した植物抽出物内と、において酷似している、双方の結合（共役）を備えているマクロファージの表面上に見出された。
【０１１９】
これらの結果は、ブタ肺胞マクロファージのクラスＩＩ  ＳＬＡ−ＤＲ分子に対する特異性を維持している、植物内に発現した融合タンパク質ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１の機能と活性とを確認する。
【０１２０】
１．２０抗体ＡＰＣＨ１によってペプチド２Ｌ２１に与えられた免疫原性の増加の研究
この発明によって与えられた免疫応答強化分子の効果を評価するため、１１週齢の、Ｓｗｉｓｓ  ｓｔｏｃｋの５匹のメスのマウスが、腹腔内経路によって、０、７、１４日目に、研究下の組換えタンパク質、無関係なタンパク質（βガラクトシターゼ）に融合された同じペプチド２Ｌ２１、を発現した、（一投与当たり、３ｍｇの総可溶性タンパク質の）植物抽出物によって、又は、１００μｇの合成のペプチド２Ｌ２１によって、免疫原によって免疫化された。Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバンド（Ｓｉｇｍａ）が、第１接種に用いられ、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバンド（Ｓｉｇｍａ）が、残りの接種に用いられた。最後に予防接種してから１０日後、マウスは、採血され、研究のために血清がとられた。
【０１２１】
この研究の結果、抗体に融合されたペプチドは、マウス内で、次のような力価を誘導した。即ち、該力価は、ペプチドのみで得られたものに比べて６００倍多く、無関係なタンパク質（図４）に融合されたペプチドによって得られたものに比べて５０倍以上多いものであった。これらのデータは、抗体ＡＰＣＨ１を用いることによって抗原提示細胞へと向けられたペプチドの免疫原の増加の仮説を確認するものである。更に、ペプチドワクチン用の常用担体である、タンパク質ＫＬＨに融合された、そして、抗体ＡＰＣＨ１に融合された、このペプチドの免疫原の比較実験は、２６倍多い、ペプチド分子当たりの抗体分子の数を生成した抗体への抗原の方向付けを示した。
【０１２２】
実例２．動物内での免疫応答強化のための抗原提示細胞へとワクチン抗原を方向付けること。ウシウィルス性下痢ウィルスのタンパク質Ｅ２Ｔに対する単鎖組換えＡＰＣＨ１抗体の融合と、動物細胞内でのその発現。
２．１細胞
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＰＶＡ７６／０４）の細胞培養セクションから得られる、外来性ウィルスフリーの哺乳類のＣＨＯ−Ｋ細胞（卵巣細胞）が、使用された。哺乳類のＣＨＯＫ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞）が、使用された。
【０１２３】
２．２使用された大腸菌の株
大腸菌（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＤＨ５−α株は、下記特性を提示するものであり、プラスミドの形質転換と増加と、に用いられた。
・菌種：ＤＨ５−α
・遺伝子型：ｓｕｐＥ４４  ｈｓｄ  Ｒ１７  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−１  ｒｅｌＡ１
・リマーカブル・ユニット：プラスミドのプレーティングと増加とに用いられた、組換えの欠失株
【０１２４】
２．３使用されたプラスミド
２．３．１市販のプラスミド
アッセイされた異なるペプチドを発現した異なるコンストラクトを得るため、種々の市販のプラスミドが使用された。プラスミドｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙは、ＰＣＲ生成物のクローン化と配列決定を行なうのに使用された。一方で、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１は、安定した哺乳類細胞株の生成のために使用された。
・ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）：このプラスミドは、ＰＣＲ生成物のクローン化と配列決定を行なうために特に設計された。多重制限部位（ポリリンカー）を備えている領域を含んでいる。ポリリンカーは、ＥｃｏＲＶによって事前に消化されており、次に、３’チミジンが、ＰＣＲ生成物のクローン化を促すために、双方の末端で加えられた。更に、ＬａｃＺ遺伝子を用いることによって組換えを選択できるようになっている。
・ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）：このプラスミドは、ｐｃＤＮＡ３から得られたものであり、一過性の、哺乳類細胞内での安定発現のために設計されたものである。
【０１２５】
２．３．２この発明の実施中に発育された哺乳類細胞形質転換プラスミド
この例の実施例のために、ｐｃＤＮＡ  ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔと認定されたプラスミドが、生成された。該プラスミドは、ＣＨＯＫ−１細胞の形質転換に用いられた。前記プラスミドに発現した抗原は、ウシウィルス性下痢ウィルス（ＶＢＶＤ）である。ベクターは、下記構成要素を含んでいる。
【０１２６】
前記抗原をコードする配列と、それぞれのその融合とは、ＰＣＲ増幅によって得られた。使用されたプライマーは、下記の表に列挙されている。
【０１２７】
2011512857.tif 000011
【０１２８】
前記表において、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９の位置２乃至７は、制限標的である。
【０１２９】
哺乳類細胞の上清内に生成された組換えタンパク質を検知するために、この目的のために特に開発された、市販のマウスモノクローナル抗体とラビットポリクローナル血清とが、そして、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）及び／又はペルオキシダーゼに結合された、それぞれの第２抗体が、用いられた。
【０１３０】
2011512857.tif 000012
【０１３１】
２．４ＣＨＯＫ１細胞株の形質転換
安定した細胞株を得るため、研究室内で事前に標準化された形質移入方法が、使用された。
【０１３２】
安定した手法で形質移入された細胞株が、得られた。結果、ＣＨＯ−Ｋ１の単層のＴ−７５フラスコが、８０％コンフルーエンスにあるリポフェクタミンで形質移入された。安定細胞株の改良発展をより簡単にチェックするのに、この細胞株を用いるために、ＬａｃＺ遺伝子を含む、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と同じシリーズのベクターを伴う、ｐｃＤＮＡ  Ｅ２ＴとｐｃＤＮＡＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔとによって、細胞の単層が形質移入された。形質移入して２４時間後、形質移入された細胞の継代培養は、４つのＴ−７５内で実行され、選択工程が、培地に濃度７００μｇ／ｍｌの抗生物質ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることによって、開始された。培養から１４日目、選択した抗生物質に耐性を持つ病巣細胞の存在が明らかになった。そのとき、細胞の新しい継代培養が、実行され、限界希釈によって個々の細胞の第１分離回診が、９６ウェルプレート内で開始された。培養から２１日目、病巣は、もう一度観察され、そして、限界希釈の新たな回診が、個々のクローンを分離するために始められた。限界希釈工程は、各回診用に２度繰り返された。組換えタンパク質の発現のために、ウェスタンブロットによって正の与えられた最大希釈は、第２限界希釈工程中で使用された。最後に、正のクローンは、増幅され、そして、貯蔵用に液体窒素で凍結された（図５）。
【０１３３】
２．５開発された細胞株内の組換えタンパク質の検出
２．５．１ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）内の電気泳動
変性状態下のポリアクリルアミド内の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ機器（ＢｉｏＲａｄ））内で非連続ゲルシステムを用いる、Ｌａｅｍｍｉｌｉ  Ｕ．Ｋによって記載された方法に従って、実行された。後者のものは、１．７％濃度のポリアクリルアミド（ｍ／ｖ）を伴う濃縮用ゲルと、８％濃度のポリアクリルアミド（ｍ／ｖ）を伴う分離ゲルと、でできている。サンプルは、水を沸騰させる浴槽内で５分間（１２．５％、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液ｖ／ｖ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール  ｖ／ｖ、２％ＳＤＳ  ｍ／ｖ、５％βメルカプトエタノール  ｖ／ｖ、０．２％ブロモフェノールブルー  ｍ／ｖ）緩衝液をシーディングすることによって事前にインキュベートされた。一度、シーディングされると、電気泳動的な分離が、４時間、１００Ｖの定電圧を印加する、１×ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５×ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：１．５％Ｔｒｉｓベース  ｍ／ｖ、７．２％グリシン  ｍ／ｖ、０．５ＳＤＦＳ  ｍ／ｖ）内で実行された。
【０１３４】
２．５．２ウェスタンブロット
一度、電気泳動による分離が完了すると、０．４５μｍ孔サイズを有する、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎａ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で電子転写が実行された。１×トランスファー溶液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓベース、１９２ｍＭ  グリシン、０．１５％  ＳＤＳ  ｖ／ｖ、２０％  メタノール  ｖ／ｖ）を含んでいるＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）内で、２０Ｖ、６０分間実行された。一度、転写が完了すると、膜表面は、ブロッキング溶液（０．０５％のＰＢＳ  １×Ｔｗｅｅｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｖ／ｖ内で３％の脱脂粉乳（Ｍｏｌｉｃｏ）ｍ／ｖ）によって、３７℃、１時間、ブロックされる。次に、便宜上、ブロッキング溶液に希釈されている抗Ｅ２モノクローナル抗体（ＣＡ３−Ｂｏｍｍｅｌｌｉ）によって４℃で一晩インキュベートされた。次に、１時間、室温で、便宜上、ブロッキング溶液に希釈されているペルオキシダーゼ共役マウス抗ＩｇＧモノクローナル抗体（ＫＰＬ）によって］インキュベートされた。インキュベートを行なった後、０．０５％、ＰＢＳ  １×Ｔｗｅｅｎ  ｖ／ｖ内で３回洗浄が、各１０分間行なわれた。
【０１３５】
膜は、ペルオキシダーゼ酵素の基質によってインキュベートされ、市販のＷｅｓｔｅｒ  Ｌｉｇｈｔｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＡＳ，  Ｉｎｃ）が、生産者の説明に従って、使用された。
【０１３６】
最後に、膜は、感光プレート（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｓｃｉｅｎｃｅｓ）内で曝され、次に、Ｘ線写真の現像液（Ｇ１５０  Ａｇｆａ）内で現像され、後に、２％の酢酸内でリンスされ、最後は、Ｘ線写真の定着液（Ｇ３３４  Ａｇｆａ）によって定着された。
【０１３７】
２．５．３クマシーによる染色
一度、電気泳動実行が完了すると、ゲルは、メタノール、酢酸、水（４０：１０：５０）の混合液内の０．１％ｍ／ｖクマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｓｉｇｍａ）による染色に晒された。ゲルから汚れを除去するため、脱染溶液（メタノール：酢酸：水が、それぞれ５．０：７．５：８７．５）が、用いられた。脱染色は、室温で撹拌しながら行なわれた。
【０１３８】
２．５．４細胞培養上清からＡＰＣＨ１−Ｅ２ＴとＥ２Ｔとの検出のためのＥＬＩＳＡサンドイッチ
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  プレート（ＮＵＮＣ）は、モノクローナル抗体２．９Ｈによって増感され、４℃で、一晩中、炭酸塩―炭酸水素塩緩衝液（１．５９ｇ／ｌ  炭酸ナトリウム、２．９３ｇ／ｌ  炭酸水素ナトリウム）内で、適切に希釈された。次に、プレートは、１時間、３７℃で、インキュベートする、ブロッキング溶液（０．１％  ＰＢＳ  １×Ｔｗｅｅｎ  ２０ｖ／ｖ、１％の脱脂粉乳ｍ／ｖ）によってブロックされた。次に、解析されるべきサンプルは、１時間、３７℃で、プレートをインキュベートするもの（ＣＨＯ−Ｋ１−ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ又はＥ２Ｔ細胞の上清）に組み込まれた。５回洗浄され、適切な希釈液内で、糖タンパク質Ｅ２に抗する、ラビットポリクローナル血清によって、１時間、３７℃でインキュベートされた。もう一度、５回洗浄され、最後に、ペルオキシダーゼ共役ラビット抗ＩｇＧモノクローナル抗体（ＫＰＬ）が、適切な希釈液内で、４０分間、３７℃でインキュベートするものに、組み込まれた。それは、５回洗浄され、ペルオキシダーゼ基質（０．５５ｍｇ／ｍｌ  ＡＢＴＳ、０．０１５％  Ｈ２Ｏ２、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５））が、取り付けられた。応答は、５％のＳＤＳｍ／ｖで止められた。プレートの読み取りは、４０５ｎｍ（ＥＬＩＳＡリーダー、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ）で実行された。希釈は、ブロッキング溶液内で実行され、洗浄は、ＰＢＳ  １×  によって行なわれ、５０μｌウェルの容量が用いられた。
【０１３９】
２．６ＣＨＯＫ１  ＡＰＣＨ１−Ｅ２ＴとＣＨＯＫ１  Ｅ２Ｔ細胞上清からのＥ２Ｔの精製
一度単層が形成（通常、７２時間）されると、上清は収集され、１ｍＭの最終濃度でＰＭＳＦが加えられ、そして、使用されるまでの間に−２０℃で保存される。
【０１４０】
上清は解凍され、そのイオン強度は１０×  結合・洗浄溶液（３Ｍの塩化ナトリウム、０．５ＭのＮａＨＰＯ４）によって増加された。２０ｍＭのイミダゾールが加えられ、ｐＨは１０Ｎの水酸化ナトリウムによって８にされた。
【０１４１】
他方、ニッケルは、２０ｍＭのイミダゾールを伴う、１×  結合・洗浄溶液（０．３Ｍの塩化ナトリウム、０．０５ＭのＮａＨＰＯ４）によって平衡にされ、４℃、３０分間、撹拌されながら、インキュベートされた。５分間、２５００ｇで遠心分離され、上清は処分され、そして、ニッケルは、撹拌されながら４℃で一晩、該上清によってインキュベートされた。
【０１４２】
３分間２５００ｇで遠心分離され、上清は処分され、２８０ｎｍでの上清の吸収度が低くかつ定数となるまで、１５分間、４℃で、１３ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのロイペプチンを加えた、１×  結合・洗浄溶液によって洗浄された。
【０１４３】
最後に、溶出が、撹拌されながら、１５分間、４℃でインキュベートを行なう、（２００ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのロイペプチンを伴う１×  結合・洗浄溶液）溶出溶液によって実行された。３分間、２５００ｇで遠心分離され、上清が回収された。
【０１４４】
２．７植物内で発現されたタンパク質の免疫原性解析
２．７．１モルモットの免疫原性
ＡＬ  ＩＩ株からの２００乃至３００ｇのモルモットが、Ｂｉｏｔｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｉｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｎｄ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ＣＩＣＶｙＡ）と、ＩＮＴＡ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）  Ｃａｓｔｅｌａｒとによって与えられた。２回の、１ｍｌの油性ワクチンの用量（水溶性：油性が４０％：６０％）が、筋肉内経路で０日と３０日とに接種された（各後肢に５００μｌ）。
【０１４５】
各接種の前に、動物は、心臓穿刺によって、動物毎に、３ｍｌの血を抽出する採血が行なわれた。それは、１時間、３７度でインキュベートされ、かつ、３０分間、４℃でインキュベートされた。血清は、１５分間、１０００ｇで遠心分離され、定量化され、使用されるまで、定量化され、−２０℃で保存された。
【０１４６】
実験中、動物は、１ｍ２の容器内に４つにグループ化され、外部から分離された囲いの中に保持され、換気された環境下におかれた。ケージベッドと水とは、周期的に交換された。
【０１４７】
２．７．２ウシの予防接種
ＩＮＴＡからの、血清陰性で非感染のウシが使用され、事前にＥＬＩＳＡと、ＳＮと、ＰＣＲと、を用いて健康状態を確認するテストが行なわれた。
【０１４８】
ウシは、解析されるべきワクチンの２回の投与によって免疫化された。一度目は、最初の時に、他のものは、前に予防接種してから３０日に行なった。予防接種は、筋肉内経路によって実行された。摂取量は、５ｍｌであった。血のサンプルは、７日間毎に、次の血清内の抗体の解析のために採られた。
【０１４９】
２．７．３血清の獲得
血清は、３０分間３７℃で血のインキュベーションによって得られ、次に、４℃で１４時間インキュベートされた。血餅は分離され、血清は１０分間１５００ｒｐｍで遠心分離によって浄化された。
【０１５０】
２．７．４ウィルス血清中和（ＳＮ）
抗体を中和させる（ＮＡ）レベルは、以下のＨｏｗａｒｄ等による手順（１９８７年）によって測定された。
【０１５１】
２．７．５ＥＬＩＳＡによる抗体の検出
抗体のレベルは、Ｍａｒｚｏｃｃａ等（２００７年）によって発展されたＥＬＩＳＡに基づく僅かに修正されたアッセイを用いて測定された。
【０１５２】
２．８ＣＨＯＫ１細胞内のタンパク質ＡＰＣＨ１  Ｅ２ＴとＥ２Ｔとの生成
選択されたクローンが、１０％のＳＦＢ（Ｑｕｉｒｏｇａ）と１％抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン）とを含んでいる、ＭＥＭ−Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）内で増加された。開発された細胞株の上清内の組換えタンパク質の生成を評価するため、後者のものは、Ｔ７５フラスコ（図６Ａ）内に、かつ、ローラー（図６Ｂ）内に、増殖された。各培養内で、組換えタンパク質の動物学的な分泌物が研究された。アッセイは、Ｔ７５グループで、ＤＭＳＯを備えているものと、備えていないものと、ローラーグループで、ＤＭＳＯを備えているものと、備えていないものと、の各々の２つの組内で、実行された。２つの間の、体積あたりの細胞の比率を保つため、Ｔ７５の場合、３×１０６の細胞が、０時にシーディングされ、一方、ローラーは、１６×１０６の細胞によって開始された。１ｍｌが２４時間毎に抽出され、ＥＬＩＳＡを実行するまで、−２０℃で保存された。
【０１５３】
２．９メタルキレートクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によるＡＰＣＨ１  Ｅ２ＴとＥ２Ｔとの精製
２．３欄に記載した手順を用いて、タンパク質ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔは、高次元の精製を得、Ｅ２Ｔ用の単バンドの出現と、ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ用の３つのバンドの出現と、が記録された。３つのバンドの内、最も重いバンドは、融合タンパク質に関係し、中位のバンドは、ＢＳＡのトレースに関係し、最も軽いバンドは、（ウェスタンブロット法によって確認された）ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔのタンパク質分解の生成物である。全工程の近似量は、上清１リットルあたり、１００μｇオーダーの精製されたタンパク質であった。
【０１５４】
２．１０異なる種からのＭＨＣクラスＩＩ末梢血単核の細胞（ＰＢＭＣｓ）に向かうＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔの認識
ＰＢＭＣｓは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって、異なる動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）からのヘパリン化された血から精製された。この手法によって得られた細胞は、次に、ＰＢＳ（アイソタイプ対照）、Ｅ２Ｔ又はＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔによってインキュベートされ、後者のものは、マウス抗Ｅ２モノクローナル抗体（ＶＤＶＢ、ＮＡＤＬ系）と、フィコエリトリン結合マウス抗ＩｇＧモノクローナル抗体とによってラベル化された。ラベル化された細胞は、フローサイトメーター内で解析され、結果は、陽性細胞のパーセンテージとして、報告され、該陽性細胞は、アイソタイプ対照に関係するラベルの外側の輝度範囲内にある蛍光強度を有している。全種の解析において、ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔの結合は、Ｅ２Ｔに得られたものよりもかなり強かった。
【０１５５】
２．１１抗体ＡＰＣＨ１によってタンパク質Ｅ２Ｔに与えられた免疫原性の増加の研究
この発明によって与えられた免疫応答強化分子の効果を評価するため、アッセイは、（融合分子ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔが発育されるための最終標的の）実験モデル（モルモット）と、ウシと、について実行された。
【０１５６】
２．１１．１モルモット内のアッセイ
ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ分子を評価するのに用いられた実験グループは、表２内に示されている。認識されたように、タンパク質Ｅ２Ｔは、モルモット（図９）内のタンパク質Ｅ２Ｔによって得られたこものよりも多くの中和抗体の力価を含む抗体へと、融合された。実験グループは、下記の表に示す。
【０１５７】
2011512857.tif 000013
【０１５８】
２．１１．２ウシ内でのアッセイ
一度、モルモットの実験モデル内の免疫応答の強化が得られると、ウシ内のＡＰＣＨ１分子の強化容量が評価された。表３は、アッセイされた実験グループを示している。最も多い投与量（１μｇ）では、実験グループ（図１０Ａ）の間には違いは検出されなかった。しかし、０．２μｇ投与量では、タンパク質ＡＰＣＨ１―Ｅ２Ｔは、特異的抗体応答（図１０Ｂ）を可能にした理由で、それ自体のタンパク質よりも高い効果を示すことが分かった。同様に、０．２μｇ投与量のために得られた抗体の力価が計算されたとき、ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ分子のみが特異的抗体（図１０Ｃ）を含む能力があることが認識された。実験グループは、下記の表に示す。
【０１５９】
2011512857.tif 000014
【０１６０】
以下、配列表を示す。
【０１６１】
2011512857.tif 000015
【０１６２】
2011512857.tif 000016
【０１６３】
2011512857.tif 000017
【０１６４】
2011512857.tif 000018
【０１６５】
2011512857.tif 000019
【０１６６】
2011512857.tif 000020
【０１６７】
2011512857.tif 000021
【０１６８】
2011512857.tif 000022
【０１６９】
2011512857.tif 000023
【０１７０】
2011512857.tif 000024
【図１】
2011512857.tif 000025
【図２Ａ）】
2011512857.tif 000026
【図２Ｂ）】
2011512857.tif 000027
【図３】
2011512857.tif 000028
【図４】
2011512857.tif 000029
【図５】
2011512857.tif 000030
【図６】
2011512857.tif 000031
【図７】
2011512857.tif 000032
【図８】
2011512857.tif 000033
【図９】
2011512857.tif 000034
【図１０】
2011512857.tif 000035
【図１１】
2011512857.tif 000036
【配列表】
2011512857000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月11日(2010.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子コンストラクトであって、有効に結合された、少なくとも、
ａ）抗原提示細胞の表面に存在しているクラスＩＩ  ＤＲ抗原のβ鎖を認識する領域を有している、ＳＥＱＩＤ  Ｎｏ．１のポリペプチドをコードする１のヌクレオチド配列（Ａ）と、
ｂ）導入された宿主内の免疫応答を誘導しやすい興味あるワクチン抗原を、コードする１のヌクレオチド配列（Ｂ）と、
を備えていることを特徴とする遺伝子コンストラクト。
【請求項２】
興味あるワクチン抗原が、イヌパルボウィルスからのペプチド２Ｌ２１と、ラビット出血性疾患ウィルスからのタンパク質ＶＰ６０と、ロタウィルスからのタンパク質ＶＰ６と、ウシウィルス性下痢症ウィルスからのタンパク質Ｅ２又はＥ２Ｔと、インフルエンザウィルスからの赤血球凝集素タンパク質と、のグループから選択されたものである、
ことを特徴とする請求項１記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．  １をコードするヌクレオチド配列（Ａ）と、イヌパルドウィルスのワクチン抗原に対応するＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１をコードするヌクレオチド配列（Ｂ）と、
を備えていることを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コンストラクトｐＢＩＡＰＣＨ１−２Ｌ２１。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１をコードするヌクレオチド配列（Ａ）と、ウシウィルス性下痢症ウィルスのワクチン抗原Ｅ２Ｔに対応するＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３をコードするヌクレオチド配列（Ｂ）と、
を備えていることを特徴とする請求項１又は２に記載の遺伝子コンストラクトｐｃＤＮＡＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ。
【請求項５】
スペーサーペプチドをコードする核酸配列（Ｃ）を、
更に、備えていることを特徴とする、請求項１乃至４の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項６】
スペーサーペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３から選択されたものである、
ことを特徴とする請求項５記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項７】
ヌクレオチド配列（Ｂ）の３’末端から下流に配置された、分離又は精製のために使用されやすいペプチドを、コードする核酸配列（Ｄ）を、
更に、備えていることを特徴とする、請求項１乃至６の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項８】
プロモーター配列、転写制御因子をコードする配列、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）、又は、転写終結配列、の内の１つを更に備えている、
ことを特徴とする請求項１乃至７の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項９】
抗生物質耐性遺伝子から選択されたマーカー、又は、毒性化合物に耐性を与える遺伝子、を更に備えている、
ことを特徴とする請求項１乃至８の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１０】
一般の植物又は動物細胞と、特にヒト細胞と、を形質転換するのに役立つ、組換え発現ベクターであって、請求項１乃至９の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクトを含んでいることを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項１１】
アグロバクテリウム  ツメファシエンスのものであることを特徴とする、請求項１０記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２】
好ましくは、バキュロウィルスであることを特徴とする、
請求項１０記載の組換え発現ベクター。
【請求項１３】
ゲノム内に請求項１乃至９の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクトを備えている、
ことを特徴とする請求項１０乃至１２のベクターによって形質転換又は形質移入された細胞。
【請求項１４】
ゲノム内に請求項１乃至９の何れか１つに記載の遺伝子コンストラクトを備えている、
ことを特徴とする請求項１０又は１１のベクターによって形質転換又は形質移入された細胞。
【請求項１５】
ゲノム内に請求項１乃至９の何れか1つに記載の遺伝子コンストラクトを備えている、
ことを特徴とする請求項１０又は１２のベクターによって形質転換又は形質移入された細胞。
【請求項１６】
導入された宿主内で免疫応答を生成する能力のある、請求項１乃至９の何れか１つに記載の遺伝子コンストラクトによってコードされた融合タンパク質。
【請求項１７】
アミノ段配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１（Ａ）と、イヌパルボウィルスのワクチン抗原２Ｌ２１に対応する、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１（Ｂ）と、
を備えていることを特徴とする請求項１６記載の融合タンパク質ＡＰＣＨ１−２Ｌ２１。
【請求項１８】
アミノ酸配列ＤＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１（Ａ）と、ウシウィルス性下痢症ウィルスのワクチン抗原Ｅ２Ｔに対応する、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３（Ｂ）と、
を備えていることを特徴とする請求項１６記載の融合タンパク質ＡＰＣＨ１−Ｅ２Ｔ。
【請求項１９】
請求項１６乃至１８の何れか1つに記載の融合タンパク質と、随意に、薬学的に許容される賦形剤と、
を備えていることを特徴とするワクチン。
【国際調査報告】
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