(57)【要約】  ヒトを含む温血動物のミトコンドリア内のピルベートデヒドロゲナーゼ（ＰＤ）複合体などの酵素複合体の構造、活性又は発現レベルの薬学的に許容可能な調節因子及びその使用方法は、有効量の少なくとも１つのリポ酸誘導体と、少なくとも１つの薬学的に許容可能なその担体とを含む。この調節因子は、ＰＤ複合体Ｅ１αサブユニットの活性の阻害を介して嫌気的解糖の有毒な代謝産物の解毒を阻害することによって、ＰＤキナーゼ活性を上昇させ、付随的にＰＤホスファターゼ活性を低下させて、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化反応活性を上昇させる。過剰増殖を特徴とした腫瘍細胞などの細胞は、ＰＤ複合体のＥ２サブユニットの作用を阻害することにおけるこの調節因子の作用によって、アセチルＣｏＡ及びＮＡＤＨを生成することができず、ミトコンドリア膜分極が失われて、細胞死が容易になる。【選択図】図９
2011513395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む温血動物の異常細胞のミトコンドリア内の変性されたピルベートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）複合体などの少なくとも１つの酵素複合体の構造及び／又は活性の薬学的に許容可能な調節因子。
【請求項２】
請求項１に記載の調節因子において、少なくとも１つのリポ酸誘導体と少なくとも１つの薬学的に許容可能なその担体とを含むことを特徴とする調節因子。
【請求項３】
請求項１に記載の調節因子において、前記酵素複合体が、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性及び／又はデヒドロゲナーゼ活性を有することを特徴とする調節因子。
【請求項４】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子がキナーゼ活性を促進又は抑制することを特徴とする調節因子。
【請求項５】
請求項４に記載の調節因子において、前記キナーゼが、ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４及びそれぞれのアイソフォームを含む群から選択されることを特徴とする調節因子。
【請求項６】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子がホスファターゼ活性を促進又は抑制することを特徴とする調節因子。
【請求項７】
請求項６に記載の調節因子において、前記ホスファターゼが、ピルベートデヒドロゲナーゼホスファターゼ（ＰＤＰ）１、ＰＤＰ２及びそれぞれのアイソフォームを含む群から選択されることを特徴とする調節因子。
【請求項８】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、デヒドロゲナーゼ活性を促進又は抑制することを特徴とする調節因子。
【請求項９】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＨ複合体のリン酸化状態の変化によって達成されることを特徴とする調節因子。
【請求項１０】
請求項９に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＨ複合体のＥ１αサブユニットに対して生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＰ及びそのアイソフォーム並びにこれらの突然変異体の不活性化よって生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１２】
請求項１０に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＫ及びそのアイソフォーム並びにこれらの突然変異体の活性化よって生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１３】
請求項９に記載の調節因子において、前記調節因子が、嫌気性エネルギー代謝の有毒な代謝産物の解毒を阻害することを特徴とする調節因子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の調節因子において、前記代謝産物が、アセトアルデヒド、超酸化物、過酸化水素及びヒドロキシラジカルからなる群より選択されることを特徴とする調節因子。
【請求項１５】
請求項１３に記載の調節因子において、前記調節の効果が、アセトイン生成の減少によって観察されることを特徴とする調節因子。
【請求項１６】
請求項９に記載の調節因子において、前記リン酸化又は脱リン酸化が不可逆的であることを特徴とする調節因子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の調節因子において、前記リン酸化又は脱リン酸化の効果によってアポトーシスが生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の調節因子において、前記効果がアポトーシスであることを特徴とする調節因子。
【請求項１９】
請求項１７に記載の調節因子において、前記効果がネクローシスであることを特徴とする調節因子。
【請求項２０】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、ＰＤＫ及びそのアイソフォーム並びにれらの突然変異体の発現レベルに作用することを特徴とする調節因子。
【請求項２１】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、ＰＤＰ及びそのアイソフォーム並びにこれらの突然変異体の発現レベルに作用することを特徴とする調節因子。
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載の調節因子において、前記発現レベルが、転写、翻訳、又は、翻訳後のレベルで変化することを特徴とする調節因子。
【請求項２３】
請求項２２に記載の調節因子において、前記変化が後成的であることを特徴とする調節因子。
【請求項２４】
請求項２に記載の調節因子において、
前記リポ酸誘導体が：
2011513395.tif 000015
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、アルケンＣｎＨ２ｎ、アルケニルＣｎＨ２ｎ−１、アルキンＣｎＨ２ｎ−２、アルキニルＣｎＨ２ｎ−３、硫化アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキルＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル（ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、及び、セミチオアセタールＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、ここで、前記ｎは１〜１０であり、前記ｔは０〜９である；芳香族；Ｒ３Ｃ−（Ｏ）−として定義されるアシル；ヘテロアリール；Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル；有機金属アリール；アルキル有機金属アリール；及び、セミアセタールＲ５ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−からなる群より独立して選択され；
前記Ｒ１及びＲ２は置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；
前記Ｒ３は、水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール及び有機金属アリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ４は、水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びアルキルヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ５は、ＣＣｌ３、ＣＦ３又はＣＯＯＨであり；
ここで、前記ｘは０〜１６である、
式を有するか又はその塩であることを特徴とする調節因子。
【請求項２５】
請求項２に記載の調節因子において、
前記リポ酸誘導体が：
2011513395.tif 000016
前記Ｍは、共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、又は、金属キレート若しくは他の金属複合物であって、金属がパラジウムでないものであり；
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アシルＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｎＨ２ｎ−１として定義されるアルケニル、ＣｎＨ２ｎ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ３Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、及び、Ｒ４ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタールからなる群より選択される群より独立して選択され；
前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；
前記Ｒ３及びＲ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ５は、−ＣＣｌ３、−ＣＦ３又は−ＣＯＯＨからなる群より選択され；
前記ｘは０〜１６であり、前記ｚは０〜５であり、前記ｎは０〜１０である、
式を有するか又はその塩であることを特徴とする調節因子。
【請求項２６】
請求項２に記載の調節因子において、
前記リポ酸誘導体が：
2011513395.tif 000017
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、アルケンＣｎＨ２ｎ、アルケニルＣｎＨ２ｎ−１、アルキンＣｎＨ２ｎ−２、アルキニルＣｎＨ２ｎ−３、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキルＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル（ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、及び、セミチオアセタールＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、（ここで、前記ｎは１〜１０であり、前記ｔは０〜９である）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されたアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル有機金属アリール、セミアセタールＲ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、及び、多量体、並びに、これらの組み合わせからなる群より独立して選択され；
前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；
前記Ｒ３は、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質及びこれらの多量体からなる群より選択され；
前記Ｒ４は、水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール及び有機金属アリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ５は、水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びアルキルヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ６は、ＣＣｌ３、ＣＦ３又はＣＯＯＨであり；
前記ｘが０〜１６である、
式を有するか又はその塩であることを特徴とする調節因子。
【請求項２７】
請求項２に記載の調節因子において、
前記リポ酸誘導体が：
2011513395.tif 000018
前記Ｍは、共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、又は、金属キレート若しくは他の金属複合物であって、金属がパラジウムでないものであり；
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アシルＲ４Ｃ（Ｏ）−、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、及び、多量体、並びに、これらの組み合わせからなる群より独立して選択され；
前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；
前記Ｒ３は、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質及びこれらの多量体からなる群より選択され；
前記Ｒ４及びＲ５は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ５は、ＣＣｌ３、ＣＦ３又はＣＯＯＨからなる群より選択され；
前記ｘは０〜１６であり、前記ｚは０〜５であり、前記ｎは０〜１０であり、前記ｍは２〜１０である；
式を有するか又はその塩であることを特徴とする調節因子。
【請求項２８】
請求項２４、２５、２６又は２７に記載の調節因子において、前記リポ酸誘導体が、（Ｒ）異性体としてのみ存在することを特徴とする調節因子。
【請求項２９】
請求項２４、２５、２６又は２７に記載の調節因子において、前記リポ酸誘導体が、（Ｒ）異性体と（Ｓ）異性体との混合物として存在することを特徴とする調節因子。
【請求項３０】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、ＰＤＨ複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とする疾病、病状又は症候群の治療及び診断に有用であることを特徴とする調節因子。
【請求項３１】
請求項３０に記載の調節因子において、前記疾病、病状、又は症候群が、細胞過剰増殖によってさらに特徴付けられることを特徴とする調節因子。
【請求項３２】
請求項３１に記載の調節因子において、前記疾病、病状又は症候群が癌であることを特徴とする調節因子。
【請求項３３】
ＰＤＨ複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とした疾病、病状又は症候群を呈する患者においてＰＤＨ複合体を調節する方法において、請求項１に記載の調節因子の有効量を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法において、前記疾病、病状又は症候群が細胞過剰増殖によってさらに特徴付けられることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、前記疾病、病状又は症候群が癌であることを特徴とする方法。
【請求項３６】
ＰＤＨ複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とした疾病、病状又は症候群を呈する患者における有益性を診断及び予測する方法において、前記患者から細胞サンプルを得るステップと、請求項１に記載の調節因子の有効量をインビトロにおいて細胞に投与するステップと、そこから結果を得るステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法において、前記疾病、病状又は症候群が細胞過剰増殖によってさらに特徴付けられることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法において、前記疾病、病状又は症候群が癌であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用及び診断用組成物に関し、より詳細には、癌細胞を含む過剰増殖を特徴とする細胞内への選択的取り込みを実現し、酵素の構造、活性、及び／又は、発現レベルを制御し、これによってこれらの細胞の破壊を容易にする、より詳細には、ほとんどの癌に伴う修飾されたミトコンドリアピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）複合体を特異的にターゲットにする医薬品組成物及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
増殖が速い腫瘍細胞の大部分は、その組織が由来したものと比べて顕著に変化したエネルギー代謝を含む、非形質転換細胞と比較して重大な遺伝的、生化学的及び組織学的相違を示す。腫瘍細胞の最も悪名が高くかつ最も知られたエネルギー代謝変化は、高濃度のＯ２の存在下でさえも強い解糖能力であり、その現象は、ワールブルク効果として知られている。
【０００３】
ワールブルクは、腫瘍細胞の強力な解糖の原動力が、ミトコンドリア機能の不可逆的損傷によって引き起こされたエネルギー欠乏であり、嫌気性筋肉と同様に、グルコースが、解糖によって後で分泌される乳酸に変換されることを初めて提唱した。腫瘍細胞における解糖流量のこの増加は、ほとんど酸素が送り込まれない固形腫瘍においてみられる部分的低酸素などの、Ｏ２濃度が低い環境における生存及び増殖を保証するための代謝戦略であることが提唱されている。特に、多くのヒト低酸素性腫瘍におけるＯ２の濃度は２０μＭ未満であるので、その腫瘍における酸化的リン酸化は限定されている。従って、解糖は、固形腫瘍（例えば、増殖が遅い黒色腫及び乳房腺癌）における主要なエネルギー経路であると考えられる。
【０００４】
細胞増殖速度とＡＴＰ供給速度との比例関係は、増殖が速い腫瘍細胞について確立されている。何人かの著者は、解糖活性が腫瘍悪性度と関連しており、その結果、解糖速度は、増殖が遅い腫瘍又は正常細胞よりも、高度に脱分化した増殖が速い腫瘍においてさらに速いことを提唱した。実際に、高濃度の乳酸は、悪性度の予測因子として提案されている。
【０００５】
図１に示すように、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルは、長年に渡って、生命体のエネルギー源としてＡＴＰの生成における役割のみが生物学的に重要であると考えられていた。しかしながら、最近の研究は、トリカルボン酸サイクル活性が、細胞増殖及びアポトーシスの決定を含む信号伝達経路機能にも作用すること、及び、適切な解糖及びトリカルボン酸サイクル酵素がアップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされ得ることを示した。また、腫瘍発達と、増殖が速い腫瘍細胞において大幅に増加する解糖酵素ヘキソキナーゼ及びホスホフクルトキナーゼ（ＰＦＫ）１の活性との間には直接的相関がある。従って、酸化能力を欠く腫瘍細胞は、活性酸化的リン酸化が生じている細胞よりも悪性であることが提唱された。低酸素性条件下又は有酸素条件下であっても、癌組織の解糖への依存は、悪性度の上昇に関連している。
【０００６】
ＰＤＨ複合体におけるリポ酸の役割は充分に研究されている。ＰＤＨ複合体は、３つのセントラルサブユニットであるＥ１、Ｅ２及びＥ３（それぞれ、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼと、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼと、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ）を有する。これらの複合体は、セントラルＥ２コアを、このコアを囲む他のサブユニットと共に有することによって形成されている。これらの２つのサブユニット間のギャップにおいて、リポイルドメインは、活性部位間で中間体を輸送する。リポイルドメイン自体は、フレキシブルなリンカーによってＥ２コアに結びついている。ピルビン酸塩とチアミンピロリン酸の反応によるヘミチオアセタールの形成に際して、この陰イオンは、リジン残基に結びついた酸化されたリポエート種のＳ１を攻撃する。従って、リポエートＳ２がスルフィド部位又はメルカプト部位として排出され、四面体ヘミチオアセタールの次の崩壊によってチアゾールが排出され、ＴＰＰコファクターを放出し、リポエートのＳ１にチオアセテートを生成する。この点では、リポエート−チオエステル官能性は、Ｅ２活性部位内に移動する。前記アシル基転移反応は、リポエートの「スイングアーム」からアセチルをコエンザイムＡのチオールに移す。これによってアセチルＣｏＡが生産され、アセチルＣｏＡは、酵素複合体から放出され、次いで、トリカルボン酸サイクルに入る。その後、複合体のリジン残基に結合しているジヒドロリポエートがＥ３活性部位に移動する。前記ジヒドロリポエートは、フラビンによって媒介される酸化を受けてリポエート休止状態に戻り、ＦＡＤＨ２（究極的にはＮＡＤＨ）を生じ、リポエートを能力のあるアシル受容体に再生する。このリポエート種が遮られると、ＦＡＤＨ２への電子流がなくなるか又はアセチルＣｏＡの生成が生じ、また、結果として細胞内においてピルビン酸塩の有毒な蓄積が生じるであろう。
【０００７】
ミトコンドリア内のＰＤＨ複合体の活性は、様々なアロステリックエフェクター及び共有結合性修飾によって高度に制御されている。ＰＤＨ活性は、リン酸化の状態によって制御されており、脱リンされた状態において最も活性である。ＰＤＨリン酸化反応は、ＰＤＨキナーゼ（ＰＤＫ）によって触媒される。ＰＤＫ活性は、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及びアセチルＣｏＡの濃度の上昇によって強まる。ＰＤＫのネガティブエフェクターは、ＡＤＰ、ＮＡＤ＋、ＣｏＡ−ＳＨ及びピルビン酸塩であり、ＡＴＰ濃度が上昇するときに、これらの濃度が上昇する。脱リン酸化によってＰＤＨを活性化する酵素であるＰＤＨホスファターゼ（ＰＤＰ）の制御については完全には解明されていないが、Ｍｇ＋２及びＣａ＋２がＰＤＰを活性化することはわかっている。
【０００８】
複合体の２つの生成物であるＮＡＤＨとアセチルＣｏＡは、ＰＤＨの脱リンされた活性体であるＰＤＨ−ａのネガティブアロステリックエフェクターである。これらのエフェクターは、ピルビン酸塩に対する酵素の親和性を低下させることによって、ＰＤＨ複合体を経由した炭素の流れを制限する。さらに、ＮＡＤＨ及びアセチルＣｏＡは、ＰＤＫの強力なポジティブエフェクターであり、ＰＤＨを、リン酸化されたＰＤＨ−ｂ形態に変換することによって不活性化する酵素である。細胞エネルギー充足率が高いときにＮＡＤＨ及びアセチルＣｏＡが蓄積されるので、高濃度のＡＴＰがＰＤＫ活性をアップレギュレートし、エネルギーが豊富に有する細胞のＰＤＨ活性のダウンレギュレートを補強するのは驚くべきことではない。しかしながら、ピルビン酸塩は、ＰＤＫの強力なネガティブエフェクターであるので、ピルビン酸塩の濃度が上昇すると、高濃度のＮＡＤＨとアセチルＣｏＡが存在していてもＰＤＨ−ａが優先的に働く。
【０００９】
ＰＤＨ−ａを維持するピルビン酸の濃度は、ＡＴＰが多い細胞においてアロステリックにダウンレギュレートされたＫｍが高い形態のＰＤＨが、なおピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換することができる程度に、充分に高い。高濃度のＡＴＰ及びＮＡＤＨを有する細胞内の多量のピルベートと共に、ピルベート炭素は、アセチルＣｏＡが主要な炭素ドナーである炭素の２つの主要な貯蔵形態（糖新生によるグリコーゲン及び脂肪酸合成による脂肪生産）に誘導される。ＰＤＰ−ｂの制御についてはよくわかっていないが、ＰＤＰ−ｂは、ＡＴＰ濃度が低いときにピルビン酸の酸化を最大化し、ＡＴＰ濃度が高いときにＰＤＨ活性を最小化するように制御されている可能性が高い。
【００１０】
腫瘍細胞は、ピルビン酸塩、並びに、超酸化物、過酸化水素及びヒドロキシラジカルなどの、関連アセトアルデヒド及びラジカルを無期限に蓄積することができない。これらの分子は、細胞内ｐＨを劇的に低下させるような機構によって高濃度になると細胞毒性だからである。ＡＳ−３０Ｄ及びエールリッヒ肝癌に関しては、ミトコンドリアのピルビン酸のかなりの割合が、ＰＤＨ複合体のＥ１成分によって、結合したβ−ヒドロキシエチルチアミンピロリン酸を介して、活性アセトアルデヒドに脱カルボキシル化されることが記載されている。この活性アセトアルデヒドは、次いで、第２のアセトアルデヒドと縮合し、アミノ酸であるグルタミン又はリポ酸のいずれかを用いることによって、究極的には、オリジナルのピルビン酸を脱酸するか又は還元し、競合的にＰＤＨを抑制し、かつ、そのピルビン酸塩前駆物質よりも（例えば細胞内ｐＨ恒常性を維持することによって）細胞に対する毒性が小さい化合物であるアセトイン（３−ヒドロキシブタノン）を生成する。腫瘍細胞がＡＴＰ生産源として解糖に依存することに起因したピルビン酸塩の蓄積の結果として、腫瘍細胞解毒作用の経路におけるアセトインの重要性にもかかわらず、先行技術文献において、アセトインの生成をブロックすることによる腫瘍細胞生存率に対する効果に関しては、ほとんど言及されていない。
【００１１】
最近の研究は、癌細胞をさらに好気的代謝に強制することによって腫瘍増殖が抑制されることを示唆する。従って、ワールブルク代謝への移行は、ＰＤＨ複合体を停止させることを必要とする。この移行においては、図２に示すように、グルコースの代謝における驚くべきことではないＨＩＦの既知の重要な役割である、癌細胞において低酸素誘導因子（ＨＩＦ）によって増強されたシグナリングが存在する。ＨＩＦシグナリングを直接的に又は間接的に生じさせる突然変異は、実際に、癌の進行に共通の機構であると考えられる。ＨＩＦがＰＤＫ１の過剰発現を誘導し、ＰＤＫ１がＰＤＨ複合体の活性を低下させるように作用する。このアイソフォームが、ＰＤＨ複合体の第１のサブユニットであるＥ１のアルファサブユニット中の３個のセリン残基を特異的にリン酸化するので、ＰＤＫ１によるリン酸化は、不活性のＰＤＨ複合を保持するのに特に有効であり得る。Ｅ１の再活性化は、３個のリン酸基のすべてを除去することが必要である。更に、ＰＤＨ複合体活性化は活性酸素種の生成を増やす可能性があり、それによってアポトーシスに至る可能性がある。しかしながら、癌においてみられるＰＤＫ１の変化は、濃度の変化のみによるものではなく、１つの腫瘍種又は１人の患者の間におけるその活性及びおそらくそのアミノ酸配列の変化によるものである可能性がある。さらに、ＰＤＫ１は、腫瘍タイプに応じて、腫瘍に関連した様々な分子との様々な複合体を形成している可能性がある。従って、ＰＤＫの阻害は、腫瘍においてアポトーシスを生じさせるための潜在的ターゲットである可能性がある。しかしながら、現在までに、知られているＰＤＫ１阻害剤は、このイソザイムの最大でも６０％しか阻害を生じさないことが実証されている。
【００１２】
従来の化学療法は、分化する増殖性細胞をターゲットにしているが、臨床的に許可されたすべての化学療法的処置は、正常な増殖性宿主細胞に対しても深刻なダメージを与える多量の薬剤量を用いる。従って、癌の治療にはより選択的なターゲティングが必要である。化学療法に伴う他の問題は、多くの腫瘍種において、抗悪性腫瘍剤に対する先天的又は後天的耐性があるということである。全体として、従来の化学療法は、現在のところ、大部分の悪性腫瘍に対して長期的な恩恵をほとんど提供できず、多くの場合、寿命を短くするか又は生活の質を低下させる不利益な副作用を伴う。従って、まともな生活の質を可能にしながら、腫瘍を長期的に管理することができる根本的な新しい方法が必要である。
【００１３】
確かに、薬剤効能、送達及び副作用は、新しい化学療法を開発する際に解決する必要がある問題である。固形腫瘍において、薬剤が様々な細胞層を容易に透過しなければ、低酸素性領域への送達が困難である。これらの不確実性をなくすために、少なくともマイクロモルよりも小さい範囲の代謝阻害定数を有する抗癌剤を設計することが妥当であると考えられる。癌細胞が株ごとに遺伝的に及び表現型的に異なることが議論されるかもしれない。しかしながら、すべての腫瘍細胞株は、ＡＴＰ供給のために解糖及び酸化的リン酸化反応に依存している。ワールブルク効果に注目することは、腫瘍細胞と正常細胞と間の物理的及び生化学的エネルギーの相違に基づいて薬剤を設計することを可能にし、健康な宿主組織及び器官機能性に作用することなく、選択的に腫瘍代謝及び増殖のみに作用する送達及び治療的戦略の設計を容易にする。
【００１４】
Ｂｉｎｇｈａｍらに付与された米国特許第６３３１５５９号及び第６９５１８８７号並びにＢｉｎｇｈａｍらによる米国仮出願第６０／９１２５９８号は、ここで言及することによって組み込まれており、腫瘍細胞及び特定の他の種類の異常細胞の両方を選択的に対象として殺傷する新規なクラスのリポ酸誘導体治療薬を開示する。これらの特許は、そのようなリポ酸誘導体の有効量を、薬学的に許容可能な担体と共に含む医薬品組成物、及び、その使用方法をさらに開示する。これらの特許には、これらのリポ酸誘導体の構造及び一般的な使用が記載されているが、これらの誘導体がＰＤＨ複合体の構造、発現レベル及び／又は活性を調製及び／又は制御することに有用であることは、いずれの特許にも開示されていない。
【００１５】
ＰＤＨ複合体の構造及び／又は活性が腫瘍活性の重要な決定要因であることが証明されているので、ＰＤＨ複合体の構造及び／又は活性、又は、発現レベルの薬学的に許容可能な制御因子及びその使用方法を提供することが有益であろう。
【００１６】
本発明の目的及び産業適用可能性
従って、本発明の目的は、細胞過剰増殖によって特徴付けられる、癌などの、疾病、病状又は症候群の治療又は診断において用いる医薬品組成物であって、腫瘍細胞において選択的活性を示す医薬品組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のもう１つの目的は、前記疾病、病状又は症候群の治療又は診断において用いるための医薬品組成物であって、投与によって生じる副作用が最小限である医薬品組成物を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、前記疾病、病状又は症候群の治療又は診断において用いるための医薬品組成物であって、最小限の費用で容易に製造することができ、可能な限り長期間に渡って貯蔵することができる医薬品組成物を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、前記疾病、病状又は症候群の治療又は診断において用いるための医薬品組成物であって、腫瘍細胞のミトコンドリア内においてＰＤＨ複合体の構造、活性、及び／又は、発現レベルを調製する医薬品組成物を提供することである。
【発明の概要】
【００２０】
前述の目的に従って、本発明は、広くは、癌又はその症状などのヒトを含む温血動物における細胞過剰増殖を特徴とするものを含む、ＰＤＨ複合体などの少なくとも１つの酵素複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とする病気、病状又は症候群を治療するか、分析するか、又は、予防するのに有用な医薬品組成物であって、少なくとも１つのリポ酸誘導体を有効な量で含む医薬品組成物を提供する。これには米国特許第６３３１５５９号及び第６９５１８８７号並びに米国仮出願第６０／９１２５９８号（ここで言及することによってこれらのすべてが組み込まれている）に記載されているもの、及び、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体が含まれる。
【００２１】
本発明のリポ酸誘導体は、ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害することによってミトコンドリア膜電位及び病変細胞の他のミトコンドリア事象の損失を引き起こし、アポトーシスの不可逆的開始を生じさせる。本発明のリポ酸誘導体は、ＰＤＫ活性化及び／又はＰＤＰ阻害によって、又は、ＰＤＨ複合体のＥ１サブユニットの活性の阻害してピルビン酸から有毒が比較的低い分子であるアセトインへの変換を阻害することによって、ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害する可能性もある。アセトイン合成の阻害は、酸化還元反応バランスを含む他のプロセスを歪め、アセトアルデヒド、超酸化物、過酸化水素及びヒドロキシラジカルを含む有毒副産物の生成も引き起こし、結果的に、これらの副産物自身が病変細胞のミトコンドリアに不可逆的ダメージを与える。
【００２２】
本発明の医薬品組成物は、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４、及び、これらそれぞれの突然変異体又はアイソフォームの効果を調節し得る。この医薬品化合物は、ＰＤＰ１、ＰＤＰ２及びこれらそれぞれのアイソフォームの効果も調節し得る。
【００２３】
本発明の医薬品組成物は、ホスホリラーゼ、キナーゼ、及び、ＰＤＨ複合体中にみられるデヒドロゲナーゼ酵素成分の発現レベルを制御することもできる。この制御は、転写段階、翻訳段階、翻訳後段階において生じ得るものであり、適切な遺伝子の後成的サイレンシングを含む。
【００２４】
トリカルボン酸サイクルに根本的に関連し、伸展解糖による分子に由来する化合物として、本発明の医薬品組成物は、腫瘍細胞内への選択的な取り込みを実現する。更に、そのような選択的な腫瘍細胞取り込みは、この医薬品組成物の投与が健康な非形質転換細胞及び組織に対して与える副作用を最小限にする。
【００２５】
本発明の第１の実施形態において、リポ酸誘導体は：
2011513395.tif 000003
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、アルケンＣｎＨ２ｎ、アルケニルＣｎＨ２ｎ−１、アルキンＣｎＨ２ｎ−２、アルキニルＣｎＨ２ｎ−３、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキルＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル（ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、及び、セミチオアセタールＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−からなる群より独立して選択され、ここで前記ｎは１〜１０であり、ｔは０〜９であり；芳香族；Ｒ３Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル；ヘテロアリール；Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル；有機金属アリール；アルキル−有機金属アリール；及び、セミアセタールＲ５ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−であり；上に定義されている前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし、置換されていてもよく；前記Ｒ３は、水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール及び有機金属アリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていても置換されていなくてもよく；前記Ｒ４は、水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びアルキルヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていても置換されていなくてもよく；前記Ｒ５は、ＣＣｌ３、ＣＦ３又はＣＯＯＨであり；ここで、ｘは０〜１６である；一般式（Ｉ）を有するか又はこれらの塩である。
【００２６】
本発明の第２の実施形態において、リポ酸誘導体は：
2011513395.tif 000004
前記Ｍは、共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、又は、金属キレート若しくは他の金属複合物であって、金属がパラジウムでないものであり；前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アシルＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ３Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、及び、Ｒ４ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタールからなる群より独立して選択され；上に定義されている前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；前記Ｒ３及びＲ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；前記Ｒ５は、ＣＣｌ３、ＣＦ３又はＣＯＯＨからなる群より選択され；ここで、ｘは０〜１６であり、ｚは０〜５であり、ｎは０〜１０であり、ｍは２〜１０である；第２の一般式（ＩＩ）によって定義されるか又はこれらの塩である。
【００２７】
本発明の第３の実施形態において、リポ酸誘導体は：
2011513395.tif 000005
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、アルケンＣｎＨ２ｎ、アルケニルＣｎＨ２ｎ−１、アルキンＣｎＨ２ｎ−２、アルキニルＣｎＨ２ｎ−３、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキルＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル（ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、及び、セミチオアセタールＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（ここで前記ｎは１〜１０であり、ｔは０〜９である）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル−有機金属アリール、セミアセタールＲ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、及び、多量体並びにこれらの組み合わせからなる群より独立して選択され；上に定義されている前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；前記Ｒ３は、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質及びその多量体からなる群より選択され；前記Ｒ４は、水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール及び有機金属のアリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；前記Ｒ５は、水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びアルキルヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；前記Ｒ６は、ＣＣｌ３、ＣＦ３又はＣＯＯＨであり；前記ｘは０〜１６である；第３の一般式（ＩＩＩ）を有するか又はこれらの塩である。
【００２８】
本発明の第４の実施形態において、リポ酸誘導体は：
2011513395.tif 000006
前記Ｍは、共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、又は、金属キレート若しくは他の金属複合物であって、金属がパラジウムでないものであり；前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アシルＲ４Ｃ（Ｏ）−、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、及び、多量体並びにこれらの組み合わせからなる群より独立して選択され；上に定義されている前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；前記Ｒ３は、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質及びその多量体からなる群より選択され；前記Ｒ４及びＲ５は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；前記Ｒ５は、ＣＣｌ３、ＣＦ３又はＣＯＯＨからなる群より選択され；前記ｘは０〜１６であり、ｚは０〜５であり、ｎは０〜１０であり、ｍは２〜１０である；第４の一般式（ＩＶ）で表されるか又はこれらの塩である。
【００２９】
各一般式において、それぞれの特定のリポ酸誘導体の（Ｒ）異性体は、（Ｓ）異性体よりも高い生理活性を有する。従って、リポ酸誘導体は、（Ｒ）異性体形態のみで又は（Ｒ）異性体と（Ｓ）異性体との混合物で存在すべきである。
【００３０】
本発明の更なる一態様において、ＰＤＨ複合体などの少なくとも１つの酵素複合体の構造又は機能の変化を特徴とし、ヒトを含む温血動物における癌などの細胞過剰増殖を特徴とするものを含む病気、病状、症候群又はその症状を診断、治療又は予防する方法であって、そのような動物にここで開示されている医薬品組成物の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００３１】
本発明のまた更なる態様において、ＰＤＨ複合体などの少なくとも１つの酵素複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とする、癌などの細胞過剰増殖を特徴とするものを含む病気、病状又は症候群の兆候を示す患者における有益性を分析及び予測する方法であって、患者から細胞サンプルを得るステップと、インビトロにおいて本発明の医薬品組成物の有効量をその細胞に投与するステップと、そこから結果を得るステップと、を具える方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ピルビン酸の解糖生成における基質及び生成物の構造を示し、また、ＡＴＰ及びＮＡＤＨ生成並びに関連酵素を示している。
【図２】図２は、ＨＩＦ−１によるグルコース代謝の制御を示している。
【図３Ａ】図３Ａは、インビボにおける正常組織と癌組織との間のエネルギー代謝の相違を説明する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＰＤＨ複合体中のリポ酸の生体形態と、本発明の医薬品組成物の一部を形成するリポ酸誘導体との間の相違を示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、リポイル残基がＰＤＫに作用することによるＰＤＨ複合体の制御を示している。
【図４】図４は、異種移植片腫瘍成長に対する本発明の医薬品組成物の効果を示している。
【図５】図５は、３種の腫瘍細胞及び１種の非形質転換細胞に対する本発明の医薬品組成物による治療効果を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、致死限界値又はそれを超える本発明の医薬品組成物で治療した後の肺癌細胞中のＡＴＰ濃度を示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の医薬品組成物によるＡＴＰ合成の阻害を、ピルビン酸を含む媒体中とグルコースを含む媒体中とで比較している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明の医薬品組成物によるＡＴＰ合成の阻害を、乳癌細胞と正常な乳腺細胞とで比較している。
【図６Ｄ】図６Ｄは、肺癌細胞における本発明の医薬品組成物によるＡＴＰ合成の阻害を、リポ酸によるものと、本発明の不活性形態によるものとで比較する。
【図７】図７は、本発明の医薬品組成物によるＰＤＨ複合体の腫瘍細胞ミトコンドリア内濃度及びα−ケトグルタル酸（αＫＤＨ）デヒドロゲナーゼ酵素活性に対する効果を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明の医薬品組成物で処理された又は疑似処理された肺癌細胞からの抽出物の二次元ゲルのウェスタンブロット分析を示している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本発明の医薬品組成物で処理されたものと疑似処理された対になった二次元ゲルサンプルの拡大を示している。
【図９Ａ】図９Ａは、ＰＤＨ複合体のＥ２サブユニットに共有結合している内因性リポエートによって調節されるときのＰＤＫの制御的役割を表す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、本発明の医薬品組成物による腫瘍細胞ＰＤＨ複合体の分化不活性化について考えられる機構を表す。
【図１０】図１０は、Ｈ４６０肺癌細胞のミトコンドリア膜電位に対する本発明の医薬品組成物の効果を示している。
【図１１】図１１は、ウエスタンブロット解析結果であって、本発明の医薬品組成物による種々の腫瘍細胞タイプにおけるアポトーシス経路を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、広くは、温血動物における癌など又はその症状の細胞過剰増殖を特徴とするものを含む、ＰＤＨ複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とする病気、病状又は症候群を治療、分析又は予防するための医薬品組成物に関する。そのような動物は、細胞過剰増殖を特徴とする、癌を含む、疾病、他の病的状態及び症候群に罹患している、ヒト、ウマ、ウシ、イヌ及びネコを含む家畜などの哺乳類クラスを含む。本発明の医薬品組成物は、チオクタンとしても知られている米国特許第６３３１５５９号及び第６９５１８８７号並びに米国仮出願第６０／９１２５９８号に記載されているものを含む、少なくとも１つのリポ酸誘導体の有効量と、該誘導体のためのための薬学的に許容可能な担体又は添加剤とを含む。ミトコンドリア内で通常みられるものの誘導体であるだけでなく、ワールブルク効果においてみられるように腫瘍細胞の高まった解糖活性に対して有益なものでもある分子として、本発明のリポ酸誘導体は、腫瘍状のものなどの過剰増殖を特徴とする細胞及び組織への選択的な送達、及び、これらの細胞及び組織のミトコンドリア内の有効濃度に特に好適であり、それによって、正常な細胞及び組織を組成物の効果から免れさせる。
【００３４】
本発明の医薬品組成物は、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４、及び、これらそれぞれのアイソフォームの効果を調節し得る。この医薬品化合物は、ＰＤＰ１、ＰＤＰ２及びこれらそれぞれのアイソフォーム及び／又は突然変異体の効果も調節し得る。そのような調節は、キナーゼ又はホスファターゼ活性の促進又は阻害のいずれかによって生じ得る。
【００３５】
本発明のリポ酸誘導体は、ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害することによってミトコンドリア膜電位及び病変細胞の他のミトコンドリア事象の損失を引き起こし、アポトーシスの不可逆的開始を生じさせる。本発明のリポ酸誘導体は、ＰＤＫ活性化及び／又はＰＤＰ阻害によって、又は、ＰＤＨ複合体のＥ１サブユニットの活性の阻害してピルビン酸から有毒が比較的低い分子であるアセトインへの変換を阻害することによって、ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害する可能性もある。アセトイン合成の阻害は、酸化還元反応バランスを含む他のプロセスを歪め、アセトアルデヒド、超酸化物、過酸化水素及びヒドロキシラジカルを含む有毒副産物の生成も引き起こし、結果的に、これらの副産物自身が病変細胞のミトコンドリアに不可逆的ダメージを与える。
【００３６】
本発明の第１の実施形態において、リポ酸誘導体は、第１の一般式（Ｉ）によって定義される。
2011513395.tif 000007
前記ｘは０〜１６である。Ｒ１及びＲ２は、独立して：
（１）限定されるものではないが、アセチル及びブタリルを含み、特別な例がビスアセチルリポエートである、チオエステル結合を介して連結された、アシル基Ｒ３Ｃ（Ｏ）−（Ｒ３はアルキル、アリール、又は、有機金属アリール）；
（２）限定されるものではないが、ベンゾイル又はベンゾイル誘導体を含み、特別な例がビスベンゾイルリポエートである、チオエステル結合を介して連結された芳香族基；
（３）限定されるものではないが、メチル、エチル、ブチル、デカニル及び６，８−ビスカルバモイルメチルリポエートを含む、チオエーテル結合を介して連結されたアルキル基ＣｎＨ２ｎ＋１（ｎは１〜１０）と、例えば−ＯＨ、−Ｃｌ又は−ＮＨ２などの他の部位で置換されたそのようなアルキル基；
（４）限定されるものではないが、プロピレン、２，３−ジメチル−２−ブテン、及び、ヘプテンを含む、チオエーテル結合を介して連結されたアルケニル基ＣｎＨ２ｎ−１（ｎは２〜１０）；
（５）限定されるものではないが、アセチレン、プロピン及びオクチンを含む、チオエーテル結合を介して連結されたアルキニル基ＣｎＨ２ｎ−２（ｎは２−１０）；
（６）限定されるものではないが、シクロプロパン、シクロペンテン、及び、６，８−メチル−スクシンイミドリポエートを含む、開鎖、又は、いずれかの炭素に付加若しくは置換基を有してヘテロ環式を形成する脂環式であり得るアルキル基、アルケニル基、及び、アルキニル基；
（７）限定されるものではないが、水酸基及びアミンを含む、いずれの炭素に付加基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基；
（８）限定されるものではないが、トルエン及びアニリンを含む、ベンゼン又はベンゼン誘導体であり得るチオエーテル結合を介して連結された芳香族基又はアリール基；
（９）ジスルフィド結合を介して連結されたアルキルスルフィド基ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−（ｎは限定されるものではないが０〜９であり得る）；
（１０）チオアミド結合を介して連結されたイミドイル基ＣＨＲ４Ｃ（＝ＮＨ）−（ｎは限定されるものではないが０〜９であり得る）；及び、
（１１）限定されるものではないが、トリクロロアセトアルデヒド及びピルビン酸を含む、セミアセタール基Ｒ５ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（Ｒ５は強い電子求引性置換基を有する化合物に限定される）；又は、これらの塩である。
上に定義されているＲ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく、酸化させて、例えば、それぞれＣ−Ｓ（Ｏ）−Ｒ及びＣ−Ｓ（Ｏ）２−Ｒといったスルホキシド又はスルホンを生じさせ得るチオエステルを含んでいてもよい。
Ｒ１及びＲ２は、例えば、それぞれＣ−Ｓ（Ｏ）−Ｓ−Ｒ及びＣ−Ｓ（Ｏ）２−Ｓ−Ｒといった、チオスルフィン酸又はチオスルフォン酸に酸化することができるジスルフィドをさらに含んでいてもよい。
Ｒ３は、水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール及び有機金属アリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよい。同様に、Ｒ４は、水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びアルキルヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよい。
Ｒ５は、−ＣＣｌ３、−ＣＦ３又は−ＣＯＯＨである。
【００３７】
本発明の第２実施形態において、リポ酸誘導体は：
2011513395.tif 000008
前記Ｍは、共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、又は、金属キレート若しくは他の金属複合物であって、金属がパラジウムでないものであり；
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アシルＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｎＨ２ｎ−１として定義されるアルケニル、ＣｎＨ２ｎ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ３Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、及び、Ｒ４ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタールからなる群より独立して選択され；上に定義されている前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；
前記Ｒ３及びＲ４は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ５は、−ＣＣｌ３、−ＣＦ３又は−ＣＯＯＨからなる群より選択され；
前記ｘは０〜１６であり、ｚは０〜５であり、ｎは０〜１０である；
第２の一般式（ＩＩ）によって定義されるか又はこれらの塩である。
【００３８】
本発明の第３の実施形態において、リポ酸誘導体は：
2011513395.tif 000009
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、アルケンＣｎＨ２ｎ、アルケニルＣｎＨ２ｎ−１、アルキンＣｎＨ２ｎ−２、アルキニルＣｎＨ２ｎ−３、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキルＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル（ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−及びセミチオアセタールＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（ここで、ｎは１−１０であり、ｔは０−９である）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル有機金属アリール、セミアセタールＲ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、及び、多量体、並びに、これらの組み合わせからなる群より独立して選択され；
上に定義されている前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；
前記Ｒ３は、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質及びこれらの多量体からなる群より選択され；
前記Ｒ４は、水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール及び有機金属アリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ５は、水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びアルキルヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ６は、ＣＣｌ３、ＣＦ３又はＣＯＯＨであり；
前記ｘは０〜１６である；
第３の一般式（ＩＩＩ）によって定義されるか又はこれらの塩である。
【００３９】
本発明の第４の実施形態において、リポ酸誘導体は：
2011513395.tif 000010
前記Ｍは、共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、又は、金属キレート若しくは他の金属複合物であって、金属がパラジウムでないものであり；
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アシルＲ４Ｃ（Ｏ）−、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、及び、多量体、並びに、これらの組み合わせからなる群より独立して選択され；
上に定義されている前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；
前記Ｒ３は、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質及びその多量体からなる群より選択され；
前記Ｒ４及びＲ５は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ５は、ＣＣｌ３、ＣＦ３又はＣＯＯＨからなる群より選択され；
前記ｘは０〜１６であり、ｚは０〜５であり、ｎは０〜１０であり、ｍは２〜１０である；第４の一般式（ＩＶ）によって定義されるか又はこれらの塩である。
【００４０】
第１の一般式及び第２の一般式の両方において、それぞれの特定のリポ酸誘導体の（Ｒ）異性体が（Ｓ）異性体よりも高い生理活性を有することが観察された。従って、本発明においてはいずれの異性体を用いることも意図しているが、特に好ましい実施形態においては、（Ｒ）異性体を優先的に用いるか、又は、（Ｒ）異性体が（Ｓ）異性体との混合物として存在することを特に意図している。
【００４１】
本発明の医薬品組成物は、ホスファターゼ、キナーゼ、及び、ＰＤＨ複合体中にみられるデヒドロゲナーゼ酵素成分の発現レベルをも調節し得る。この調節は、適切な遺伝子の後成的サイレンシングを含む転写段階、翻訳段階、又は、翻訳後段階において生じ得る。
【００４２】
本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体又は添加剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容可能な担体の例は、当業界で広く知られており、限定されるものではないが、酸化防止剤、緩衝剤、キレート剤、香味料、着色剤、保存剤、生体有用性を高める吸収促進剤、抗菌物質及びこれらの組み合わせといった、医薬品組成物において従来用いられるものを含む。そのような添加剤の量は、所望の特性に依存し、当業者が容易に決定することができる。
【００４３】
本発明の医薬品組成物は、通常、塩、緩衝剤、保存剤、及び、適合する担体を、選択的に他の治療的成分と組み合わせて、含んでいてもよい。医薬品に用いるとき、塩は、薬学的に許容可能でなければならないが、薬学的に許容可能でない塩を簡便に用いて薬学的に許容可能な塩を調製してもよく、薬学的に許容可能でない塩は本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的及び薬学的に許容可能な塩は、限定されるものではないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタン、スルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン、及びスルホン酸ベンゼンから調製されたものを含む。薬学的に許容可能な塩を、カルボン酸基のナトリウム、カリウム又はカルシウム塩などのアルカリ金属塩又はアルカリ土類塩として調製することもできる。
【００４４】
本発明は、少なくとも１つの治療用又は診断用薬剤の有効量を細胞に送達することによって治療用又は診断用薬剤を用いて患者を治療又は診断する方法であって、細胞過剰増殖を特徴とするもの又はその症状を含む少なくとも１つの酵素複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とする疾病、病状又は症候群の予防、診断又は治療を実行するための方法をさらに提供する。改良された癌の治療法としてＰＤＨ複合体を調節することは、腫瘍細胞増殖、血管形成、転移性の増殖、アポトーシスの制御による原発腫瘍の治療、及び、外科的切除の後又は同時の微小癌組織の転移の進行の治療；及び原発腫瘍の放射線治療又はその他の化学療法的処置を含むように、特に意図されている。本発明の医薬品組成物は、原発性黒色腫又は転移性黒色腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頚部癌、膀胱癌、腎臓癌、結腸癌、及び、腺癌（乳癌、前立腺癌、卵巣癌及び膵癌など）といった癌種に有用である。
【００４５】
治療的用途及び診断的用途においては、医薬品組成物を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、医薬品組成物を患者に直接投与することができる。この方法は、治療用又は診断用薬剤を単独で、又は、有効量のその他の治療用又は診断用薬剤と組み合わせて投与することによって実施してもよい。その他の治療用又は診断用薬剤は、限定されるものではないが、解糖阻止剤、微小管相互作用薬剤（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、細胞静止剤、葉酸阻害剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ポドフィロトキシン又はその誘導体、抗腫瘍抗生物質、化学療法剤、アポトーシス誘導剤、抗血管形成剤、ナイトロジェンマスタード、核酸挿入剤及びこれらの組み合わせであってもよい。そのような治療薬は、他の代謝阻害剤をさらに含んでいてもよい。当業界においてそのような治療薬は数多く知られている。この併用療法は、治療方法に対する患者の反応を増幅又は確実にすることが求められるようなそのような病状の治療において、同時並行的、連続的、又は、独立した使用を提供する。
【００４６】
本発明の方法は、医学的に許容可能なあらゆる様式の投与を用いて実施してもよく、臨床的に容認できない副作用を生じさせずに、活性体を有効な濃度にする。非経口投与に特に適した製剤が好ましいが、本発明の組成物は、吸入、経口、局所的、経皮的、鼻腔、眼球、肺、直腸、口腔粘膜、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、胸内、胸膜内、子宮内、腫瘍内、又は、点滴の方法若しくは投与のために、エアゾール、スプレー、粉末、ゲル剤、ローション剤、クリーム剤、坐薬、軟膏剤などの形態で調剤することができる。そのような製剤が望まれる場合は、当業界において広く知られたその他の添加剤を含むことによって、製剤に所望の濃度及びその他の特性を付与してもよい。
【００４７】
当業者は、治療用又は診断用薬剤を投与する特定の様式は、選択した特定の薬剤；その投与が、疾病、病状、症候群又はその症状の治療、診断又は予防のためであるか；治療又は診断する医学的疾患の重症度；及び、治療的有効性のために必要となる投薬量に依存することを理解するであろう。例えば、白血病治療のために抗癌剤を投与する好ましい様式には静脈内投与が含まれるが、皮膚癌を治療する好ましい方法には、局所的投与又は皮内投与が含まれる。
【００４８】
ここで用いられているように、「有効量」は、望ましい治療的効果又は診断的効果が達成される治療用又は診断用薬剤の投薬量又は複数の投薬量を意味する。治療用又は診断用薬剤の有効量は、通常、使用された特定薬剤の活性；その薬剤の代謝安定性及び作用時間；被検体の種類、年齢、体重、健康状態、摂食状況、性別及び食事；投与の様式及び時間；排出速度；もし含まれていれば薬剤組み合わせ；及び、組成の範囲及び／又は治療する特定病状の重症度に応じて変化することもある。当業者は、不必要な実験を行わずに、１日１回又は複数回の投薬において正確な投薬量を決定して、望ましい結果を生じさせることができる。また、それぞれ実施者は、望ましい治療効果を達成するために又はあらゆる合併症の場合には、投薬量を調整することができる。癌治療に用いるときは、用いる治療薬の投薬量を、正常細胞を実質的に損なわれないようにする一方で、腫瘍細胞を阻害又は殺傷するのに充分にすることが重要である。
【００４９】
本発明の医薬品組成物に含まれる治療用又は診断用薬剤を、患者に安全に投与することができる最高量までの望ましいあらゆる用量で調製することができる。診断用又は治療用薬剤の量は、０．０１ｍｇ／ｍＬ未満から１０００ｍｇ／ｍＬ以上まで変動してもよく、好ましくは約５０ｍｇ／ｍＬである。
【００５０】
本発明の医薬品組成物は、通常、ＰＤＨ複合体の構造及び／又は活性を調節するのに有効な量を患者に投与するのに充分な方法で送達されるであろう。従って、投薬量は、約０．３ｍｇ／ｍ２〜２０００ｍｇ／ｍ２であってもよく、好ましくは約６０ｍｇ／ｍ２である。投薬量は、単回投与によって投与してもよいし、又は、１日につき１回〜４回若しくはそれ以上などのようにそれぞれの分割用量の形態で投与してもよい。被検体の反応がある用量において不十分な場合、さらに高用量（又は、異なるより局所的な送達経路によるさらに有効な高用量）を、患者が耐えられる程度まで用いてもよい。治療用又は診断用薬剤の適切な全身濃度又はターゲット濃度を達成するために１日につき複数回の投与が意図される。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態においては、本発明のリポ酸誘導体を、診断用及び予測的薬剤としてインビトロで用いてもよい。前述したように、問題になっている特定の腫瘍細胞又は細胞種に依存して、異なるリポ酸誘導体は、ＰＤＨ複合体の調節によって別の腫瘍種を阻害することにおいて程度の差はあっても有効であり得る。従って、例えば、適切な化学療法的戦略の診断又は選択が困難な場合、特定の腫瘍細胞種をターゲットにすることが知られているリポ酸誘導体を用いてインビトロで腫瘍細胞の培養を試験することは、腫瘍種及び有効な治療を確認するための代替的アプローチを提供する。
【００５２】
図面を参照すると、図３Ａは、インビボにおける正常組織と腫瘍細胞との、エネルギー代謝における数多くの可能性の高い相違の１つを図示している。腫瘍細胞は、多くの場合、同一条件下の正常細胞よりも、ＡＴＰ生成のためのミトコンドリア内エネルギー代謝に比べて細胞質解糖に極度に依存している。見たところ、ＰＤＨ複合体の発現及び制御の変化は、この腫瘍に特異的な順応の一部である。ＰＤＨの触媒成分の濃度低下及び／又はこれらの効果を生じさせる阻害ＰＤＫの濃度上昇は、ＰＤＨ複合体を攻撃する薬剤に対して、正常細胞よりも腫瘍細胞をはるかに脆弱にし得る。
【００５３】
図３Ｂは、ＰＤＨ複合体におけるピルビン酸からのアセチルＣｏＡの合成に関与する正常な反応を触媒するリポ酸の構造を示している。インビボにおいて、リポ酸は、非ペプチドアミド結合中のカルボキシル末端を介して、Ｅ２リポイルドメイン活性部位中のリジンのイプシロンアミノ基に結合している。ＰＤＨ  Ｅ２に結合したリポエートの酸化／還元／アセチル化状態が、Ｅ１αＰＤＨサブユニットのリン酸化不活性化を制御することによってＰＤＨ活性を制御するキナーゼ及びホスファターゼによってモニターされることにも注目されたい。この図は、本発明で用いることができる３つの代表的なリポ酸誘導体の構造も示している。ＣＰＩ−６１３及びＣＰＩ−０４５は、高い抗癌性効能を有しているが、ＣＰＩ−１５７は、細胞培養においてほとんど活性がないか又は全く活性がなく、いくつかの試験におけるコントロールとして有用である。
【００５４】
図３Ｃは、その結合したリポエートＥ１と共にＥ２を含むＰＤＨ複合体成分と調整ＰＤＫとの関係を示している。高濃度のアセチルリポエート又はジヒドロリポエート（図示せず）は、ＰＤＫを活性化し、次に、ＰＤＫは、Ｅ１α、ＰＤＨ複合体触媒作用の第１ステップを触媒するサブユニットを不活性化することによってＰＤＨ複合体を介したさらなる流量を抑制する。このプロセスは、ＰＤＨ複合体を介して炭素／エネルギー流のための調節器として働き、図３Ａにみられるように、この調節プロセスは、明らかに腫瘍細胞の異なるエネルギー代謝をサポートするように実質的に変化する。
【００５５】
図４は、異種移植片腫瘍増殖に対する本発明の医薬品組成物の効果を示している。実施例２に記載されているように細胞を背面側腹部の皮下に注入した。その後、図に示した日に始めるように、マウスの腹膜内にその薬剤（又は溶媒のみ；「疑似」）を注入した。左のパネルは、本発明の組成物を１ｍｇ／ｋｇ又は溶媒コントロールを週３回注入した膵臓の腫瘍モデルを示している。この試験は、ＢｘＰＣ−３細胞を用いて行った２つとＡｓＰＣ−１細胞をを用いて行った２つの代表である。右の３つのパネルは、示されている濃度で、週１回（円形）、週３回（逆三角形）、又は、週５回（溶媒処理は三角形、薬物療法は正方形）注入したＨ４６０肺腫瘍モデルを示している。この試験は、Ｈ４６０細胞を用いて行った４つの代表である。
【００５６】
図５は、２００〜３００μＭ（「処理した」）又は疑似処理（「疑似処理した」）の本発明の医薬品組成物による処理の、３つのタイプの腫瘍細胞及び１つの非形質転換細胞タイプ（ＭＤＣＫ）に対する効果を示している。１０％血清を含む適切な組織培養媒体中で細胞を４８時間処理した。３つの癌細胞株におけるアポトーシス又はアポトーシス様経路（図１１参照）による広範囲な細胞死は、実施例２に記載されている方法によって観察される。対照的に、形質転換していないＭＤＣＫ細胞は、見かけ上は、この用量の薬剤処理によって作用されない。
【００５７】
図６Ａは、致死限界値（１０％血清中に２００μＭ）又はその限界値を超える濃度における本発明の医薬品組成物による処理後のＨ４６０肺癌細胞におけるＡＴＰ濃度を示している。破線は、示されている濃度における処理を表す。対応する組織の実線は、示されている時間に渡る処理を表しており、次いで、薬剤除去と、薬剤を含まない媒体中で６０分間の回復(recovery)を行った。ブロック矢印によってＡＴＰ回復の間隔を示した。
【００５８】
図６Ｂは、ピルビン酸（ピルビン酸メチルの形態）が主たる炭素源（破線）であり、グルコースが主たる炭素源（実線）である媒体中におけるＡＴＰ合成の阻害を比較する。本発明の医薬品組成物は、いずれの媒体中で同じ限界濃度において、最終的にアポトーシスを生じさせることに注目されたい；しかしながら、全細胞ＡＴＰ濃度の初期の枯渇は、ピルビン酸を含む媒体中で顕著であったが、グルコースを含む媒体中にはみられなかった。また、アポトーシスの開始は、２００μＭの薬剤濃度よりも、３００μＭにおいてより迅速である。
【００５９】
図６Ｃは、本発明の医薬品組成物によるＡＴＰ合成の阻害をＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞とＨＭＥＣ正常乳腺細胞とで比較している。図６Ａ及び図６Ｂに結果が示されている試験とは対照的に、これらの試験は、無血清培地（ＭＥＢＭ）中で行った。その結果、薬剤の致死限界値は、より低く、約５０μＭである。２２時間の正常細胞サンプルにおけるＡＴＰ濃度のわずかな枯渇は、薬剤用量に関連しない正常な実験変動を反映していることに注意されたい。
【００６０】
図６Ｄは、Ｈ４６０肺癌細胞におけるＡＴＰ合成の阻害を、本発明の医薬品組成物（左のグラフ）と、リポ酸（中央のグラフ）と、本発明の不活性の形態（右のグラフ）とによって比較している。図６Ｃに示すように、これらの試験を無血清培地中で行って、薬剤の致死限界値が約５０μＭとなるようにした。
【００６１】
図７は、本発明の医薬品組成物（１０％血清を含むＤＭＥＭ中に４００μＭ）によるＰＤＨ（ＰＤＣ）の腫瘍細胞ミトコンドリア内濃度及び（αＫＤＨ）酵素活性に対する効果を示している。ＰＤＨは強く阻害されているが、αＫＤＨがそうではないことに注目されたい。実施例２に記載されているように、酵素活性レベルは、追加炭素源に反応したリザズリン還元を用いて精製したミトコンドリアの抽出物中において測定する。背景線は、追加炭素源の非存在下におけるリザズリン還元に対応する。
【００６２】
次いで、図８Ａにおいて、本発明の医薬品組成物で（１０％血清を含むＲＰＭＩ媒体中で４００μＭにおいて１２０分間）処理したＨ４６０肺癌細胞（＋）、又は、疑似処理したＨ４６０肺癌細胞（−）から得た抽出物の二次元ゲルのウエスタン分析を行った。ウエスタントランスファーを、ＰＤＨ複合体のＥ１αサブユニット及びＥ２サブユニットに対するモノクローナル抗体の混合溶液でプローブした。ウエスタントランスファーは、Ｅ２に並んでいる。薬剤処理を行ったサンプル中において、Ｅ１の高リン酸化された形態の実質的に高い濃度と、Ｅ１の低リン酸化された形態の低い濃度に注目されたい。左の縦の白い線は、ゲルを一線にするための基準の１つ、Ｅ２サブユニットの移動度を示している。右の縦の白い線は、比較的リン酸化されていないＥ１α形態、おそらく酵素的に活性な成分を通過する。
【００６３】
図８Ｂは、本発明の医薬品組成物による処理又は疑似処理を行った一対の二次元ゲルサンプルの拡大を示している。構成要素Ａは、図８Ａの一部の拡大である。構成要素Ｂは、ＭＥＢＭ無血清乳房上皮細胞媒体中において疑似処理を行った（−）又は８０μＭの組成物で１８０分間処理した（＋）ＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞である。構成要素Ｃは、ＭＥＢＭ無血清乳房上皮細胞媒体中において疑似処理を行った（−）又は８０μＭの組成物で２４０分間処理した（＋）ＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞である。構成要素Ｄは、ＭＥＢＭ無血清乳房上皮細胞媒体中において８０μＭの組成物で２４０分間処理した（＋）又は疑似処理を行った（−）ＨＭＥＣ正常乳房上皮細胞である。縦の白い線は、比較的リン酸化されていないＥｌα形態、おそらく酵素的に活性な成分を通過する。
【００６４】
図９Ａ及び９Ｂは、インビボにおける本発明の医薬品組成物による強力で選択的な抗癌性効果についての作業仮説を表す。図９Ａは、例えば、ＰＤＣ  Ｅ２サブユニットに共有結合している内因性リポエートによって調節されるようなＰＤＫ制御的役割を示す。ＰＤＫは、通常、還元された及び／又はアセチル化されたリポエートの高濃度、明らかに腫瘍細胞において実質的に変化するプロセスに反応してＰＤＣを不活性化する。
【００６５】
付随的に、図９Ｂは、ＰＤＣ中のその基質ＰＤＣ−Ｅ１に対するＰＤＫの比率の巨大な量的差異を示しており、インビボにおいて正常細胞と腫瘍細胞とを区別すると考えられる。正常細胞において、ＰＤＫの低濃度は、ＰＤＨ複合体周辺を（その２つの二量体サブユニットを経て）交互に「歩き」、Ｅ１を徐々にリン酸化させると考えられている。このリン酸化は、ＰＤＰ脱リン酸化と安定状態均衡にある（図示せず）。ここに図示されている作業仮説において、チオクタンは、通常はアセチルリポエート及び／又はジヒドロリポエートに結合する同じ部位を介してＰＤＫを促進し、それによって人工的に１つ以上のＰＤＫアイソフォームを不活性Ｅ１αに促進する。癌細胞においては、はるかに高い濃度のＰＤＫが、ＰＤＣ酵素活性及びミトコンドリア内エネルギー代謝を停止させることにおいてはるかに有効なチオクタンによって、この刺激を生じさせ得る。
【００６６】
本発明の医薬品組成物の理解を容易にするために以下の実施例を提供する。
【００６７】
実施例１
チオクタンの化学合成
リポ酸誘導体（すなわち、チオクタン）ＣＰＩ−６１３及びＣＰＩ−１５７は、出発物質として６，８−ビスメルカプトオクタン酸を用いて、米国特許第６３３１５５９Ｂ１号及び米国特許第６９５１８８７Ｂ２号に記載されている手順を変更したものを用いることによって合成した。チオクタンＣＰＩ−０４５を米国特許第６３３１５５９号に記載されているように合成した。
【００６８】
３つのチオクタンについての構造分析を以下に示す。ＣＰＩ−０４５とＣＰＩ−６１３の複数回の独立した合成は、それらの癌抗特性において識別不能であった。異種移植片（図４）及びＡＴＰ測定（図６）において用いたＣＰＩ−６１３の純度は、９９％を越えていた。他のすべての薬剤は、純度が９８％以上であった。
【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
実施例２
チオクタン癌抗効果を決定するために用いた方法
細胞：ヒト腫瘍細胞株をＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣ推奨に従って増殖させた。ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）、小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）及び正常ヒト表皮ケラチン細胞（ＮＨＥＫ）初代細胞は、ＬＯＮＺＡ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。各細胞株を、供給者の説明書に従って、供給者によって開発され、供給者から購入した適切な媒地中で保持し、増殖させた。ここで報告する試験においては、３〜６継代の正常細胞を用いた。
【００７３】
腫瘍成長阻害研究：オスのＣＤ１−Ｎｕ／Ｎｕマウスに、皮下注入（ＳＣ）によって、ヒトＢｘＰＣ−３若しくはＡｓＰＣ−１膵臓腫瘍細胞又はＨ４６０  ＮＳＣＬＣを注入した。約８〜１２日後に、図説明文に示されている用量及びスケジュールでマウスの腹腔内（ＩＰ）注入した。体重２５ｇｍ当たり約２ｍｌで薬剤又は媒質を注入した。薬剤濃度は、１．２５ｍｇ／ｍｌ（約３．１ｍＭ）以下であった。媒質／溶媒は、２５ｍＭ以下のトリエタノールアミンを含む水溶液からなっていた。疑似処理した動物に注入した溶媒は、この試験のために最高用量の薬剤を注入した溶媒と常に同一であった。健康状態及び死亡率についてマウスを毎日モニターした。体重及び腫瘍容積を、処理前には毎日、治療中及び治療後には約週３回評価した。マウスは、１２時間の明／暗サイクルに保持して、飼料を無制限に与えた。このマウスを施設ガイドラインに従ってＳｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ大学動物施設に収容した。
【００７４】
細胞死分析：
大部分の細胞生存率の評価のために、セルチタ−グロアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＡＴＰ合成の初期のチオクタン阻害によって乱されない十分に長い回数で用いた（図６）。典型的な試験においては、透明な底部を有する黒色の９６ウェルプレートに１ウェル当たり５０００個の細胞となるように細胞を被覆させた。１８〜２５時間後に、溶媒を、薬剤溶媒（血清含有培地中において２．８ｍＭ、無血清培養中において０．７ｍＭのトリエタノールアミン水溶液）又は同じ溶媒中のチオクタンＣＰＩ−６１３を含む新しい溶媒に交換した。メーカーの説明に従って、薬剤用量に応じて、薬剤添加の２４時間又は４８時間後に分析を行った。
【００７５】
ある場合においては、１ウェル当たり１０，０００個の細胞となるように４８ウェルプレートに細胞を被覆させ、１８時間〜２５時間後に溶媒を、薬剤溶媒（＞＞１％ＥｔＯＨ最終濃度）、又は、同じ溶媒中の異なる濃度のチオクタンＣＰＩ−０４５を含む新しい溶媒に交換した。細胞は、その試験の残りの溶媒又は薬剤含有溶媒中に残留していた。薬剤添加の２４時間後、４８時間後及び７２時間後にプレートを検査した。また、細胞数をコンフルエンスパーセンテージとして評価した。これらの条件下において、チオクタンで誘導されたアポトーシスは、限界用量近くにおいて高度にアポトーシス性であり、細胞数評価は、死の非常に信頼できる標識である（図７）。７２時間後に残存する細胞の完全性を（もしあれば）トリパンブルー排除によって調べた。
【００７６】
表１は、腫瘍細胞に対するインビトロにおけるチオクタンの作用に関するデータを与える。一覧されているのは、ＣＰＩ−６１３及び／又はＣＰＩ−０４５殺傷に対する感受性について調査したヒト腫瘍及び初代ヒト細胞である。「＋」は、細胞が無血清培地において約２００μＭ〜３００μＭの用量（１０％血清の存在下で）及び約５０μＭの用量において、アポトーシス又はネクローシス様細胞死を受けたことを示す（図５及び図６）。「−」は、これらの細胞が、対応溶媒中において細胞死を誘導するのに約５倍も多い薬剤量を必要とすることを示す。「未試験」は、試験していない組合せを示す。図５のＭＤＣＫ正常細胞のように、すべての腫瘍株を１０％血清を含む適切な溶媒中で分析した。さらに、ＨＭＥＣ、ＳＡＥＣ、ＮＨＫＣ初代ヒト細胞、並びに、ＳＫ−Ｂｒ−３、Ａ５４９及びＨ４６０の腫瘍株を適切な無血清培養において分析した。初代細胞は接触阻止されており、形質転換細胞が同程度の密度で存在していた。
【００７７】
ＡＴＰ分析：１ウェル当たり５，０００個の細胞となるように透明な底部を有する黒色の９６ウェルプレートに細胞を被覆させた。１８〜２５時間後に、溶媒を、示されている時間的間隔及び薬剤濃度で、薬剤溶媒（トリエタノールアミン）又はチオクタン（ＣＰＩ−６１３又はＣＰＩ−１５７）又はリポ酸を含む新しい溶媒に交換した。トリパンブルー排除による投薬中止の後の回収によって細胞の生存率及び完全性を評価した。製造社の説明に従って、セルチタ−グロ蛍光分析（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＡＴＰを測定した。すべての測定を重複して行い、高い一貫性が示された。標準誤差は測定値の０．１％〜２％であった。結果として、誤差バーを図６から省略した。図６中のピルビン酸メチル溶媒は、１０％の透析ウシ胎児血清が追加された（グルコースを含まない）ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）と、１０ｍＭピルビン酸メチル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とからなっていた。対抗させたグルコース溶媒は、従来のＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。
【００７８】
ＰＤＨ及びαＫＤＨ酵素分析：腫瘍細胞を１５ｃｍのプレート中において８０％コンフルエンスまで培養し、示されているＣＰＩ−６１３で処理した。ミトコンドリアをモレアディス及びフィスクムの方法によって分離した。１ミトコンドリアを０．４％のラウリルマルトース配糖体中に溶解させた。５０μｌのミトコンドリア溶解産物を９６ウェルプレートに加えた。５０μｌの反応混合物（５０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．５、２ｍＭのβ−ＮＡＤ＋、２２５ｕＭｖ  ＴＰＰ、２ｍＭ  ピルビン酸塩又はα−ケトグルタル酸塩、１５０μＭ  補酵素Ａ、２．６ｍＭ  システイン、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）をミトコンドリア溶解産物に加えた。また、この混合物を３７℃で４５分間インキュベート（定温放置）した。この時に、１５μＭのリザズリンと０．５Ｕ／ｍｌのジアホラーゼをこの混合物に加え、さらに５分間インキュベートした。ＮＡＤＨ生成は、マイクロプレートリーダ（Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒ）において、５３０ｎｍの励起波長と５９０ｎｍの放射波長とを用いて、螢光を測定することによってモニターした。すべての測定を重複して行い、高い一貫性が示された。標準誤差は、測定値の０．３％〜４％であった。結果として、誤差バーを図７から省略した。
【００７９】
Ｅ１αリン酸化：
二次元ゲルのための細胞溶解産物：細胞を６０ｍｍディッシュ中に９５％コンフルエンスまで増殖させ、示されている薬剤又は溶媒で処理した。自然にある位置において（ｉｎ  ｓｉｔｕ）細胞を４５０μｌの溶解バッファＡ［４５５μｌのＺｏｏｍ  ２Ｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ  １（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５μｌ  １Ｍ  トリス塩基、５μｌ  １００×プロテアーゼ阻害剤混合液（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎ、ＥＤＴＡを含まない、Ｒｏｃｈｅ）；５μｌ  ２Ｍ  ＤＴＴ］を用いて溶解させた。細胞溶解産物を１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、氷上で５０％のパワーで１５回に渡って超音波処理した。室温で１０分間インキューベーションした後に、２．５μｌのジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、溶解産物をさらに１０分間インキュベートした。５μｌの２Ｍ  ＤＴＴを加えて過剰なＤＭＡを中和した。溶解産物を１６，０００ｇで１５分間遠心分離した。
【００８０】
２−Ｄゲル：製造者の説明に従って、Ｚｏｏｍ  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。簡潔に言うと、３０μｌ〜５０μｌの溶解産物を、０．８μｌ  ｐＨ３〜１０の両性電解質、０．７５μｌ  ２Ｍ  ＤＴＴと混合し、Ｚｏｏｍ  ２Ｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ  １を用いて１５０μｌにした。１５０μｌのサンプルをＩＰＧランナーにロードし、ｐＨ３−１０ＮＬ  ＩＰＧ小片を加えた。小片を室温において一晩浸した。等電点電気泳動法（２５０Ｖ、２０分間；４５０Ｖ、１５分間；７５０Ｖ、１５分間；２０００Ｖ、３０分間）のためにステッププロトコルを用いた。一片を１Ｘローディングバッファ中において１５分間処理し、次いで、１６０ｍＭヨード酢酸を加えた１Ｘローディングバッファ中において１５分間処理した。小片をＮｕＰＡＧＥ４％〜１２％のビストリスズームゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動した。
【００８１】
表１：インビトロにおける腫瘍細胞及び初代細胞に対するチオクタンの効果
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【００８２】
ウェスタン：タンパクを４．５μｍのＰＶＤＦ膜上にブロットした。ＰＤＨ  Ｅ１α及びＥ２をモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて検出した。
【００８３】
カスパーゼ−３及びＰＡＲＰ開裂：
開裂されたカスパーゼ−３は、ＲｏｙとＮｉｃｈｏｌｓｏｎに従ってウェスタンブロットによって検出された。４３簡潔に言えば、薬剤又は溶媒処理の後に、細胞をすくい取り、溶媒／細胞／アポトーシス小体混合物を６０００Ｇで遠心分離した。溶解バッファーＣ（４Ｍ  尿素、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００３％  ＢＰＢ；５％  ２−メルカプトエタノール）を用いてペレットを溶解させた。１ウェルにつき３０μｇの全細胞溶解産物タンパクを１２％ビストリスゲルにロードした。タンパクを４．５μｍのＰＶＤＦ膜上にブロットした。前駆体及び活性カスパーゼ３を、抗カスパーゼ３モノクローナル抗体（マウスモノクローナル［３１Ａ１０６７］；ａｂｃａｍ）を用いて検出した。ＰＡＲＰ開裂を、モノクローナル抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ抗体、クローンＣ−２−１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて検出した。
【００８４】
ミトコンドリア内Ｃａ＋２検出：３×１０５個の細胞を３５ｍｍガラスボトムプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にまいて、一晩増殖させ、示されている薬剤又は溶媒で処理した。その後、細胞に、フェノールレッドなしの溶媒にカルシウム染料Ｆｌｕｏ−４、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１又はＲｈｏｄ−２（４μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をロードし、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、ＦＩＴＣフィルターを用い、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ（Ｚｅｉｓｓ）デコンボリューション顕微鏡を用いて固定露光時間で画像を取得した。螢光の定量化は、製造社によって提供されるソフトウェアを用いて行った。Ｘ−Ｒｈｏｄ−１とＲｈｏｄ−２は、同様の結果を与え（図１０）、これらの染料がミトコンドリア内Ｃａ２＋シグナルを評価していたことを示している。３−４
【００８５】
参考文献：
１．Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ  ＲＷ  ａｎｄ  Ｆｉｓｋｕｍ  Ｇ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ｆｒｏｍ  Ａｓｃｉｔｅｓ  Ｔｕｍｏｕｒ−Ｃｅｌｌｓ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３７，３６０−３６７（１９８４）．
２．Ｒｏｙ  Ｓ  ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＤＷ．Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｕｔｈｅｎｔｉｃ  ｃａｓｐａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ３２２，１１０−１２５（２０００）．
３．Ｇｅｒｅｎｃｓｅｒ  ＡＡ  ａｎｄ  Ａｄａｍ−Ｖｉｚｉ  Ｖ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ｈｉｇｈ−  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｃａ２＋  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ３０，３１１−３２１（２００１）．
４．Ｇｙｏｒｇｙ  Ｈ，Ｇｙｏｒｇｙ  Ｃ，Ｄａｓ  Ｓ，Ｇａｒｃｉａ−Ｐｅｒｅｚ  Ｃ，Ｓａｏｔｏｍｅ  Ｍ，Ｒｏｙ  ＳＳ，ａｎｄ  Ｙｉ  ＭＱ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｃａ２＋  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ４０，５５３−５６０（２００６）．
【００８６】
実施例３
チオクタンによるミトコンドリア膜電位及びＣａ２＋取り込みの攪乱
基質がＡＴＰ合成のチオクタン阻害に対して作用しているということ（図６）は、この薬剤がミトコンドリアマトリクス中のトリカルボン酸サイクルを阻害していることを示している。この場合、致死限界用量及びそれ以上において、ミトコンドリア膜電位が損なわれている可能性があると予想される１。電位感受性色素ＴＭＲＥを用いて予想される効果を観察している。（図１０）ミトコンドリア膜電位は、薬物療法の開始と共に急速に低下している。膜電位低下の動態は、ミトコンドリア基質の存在下におけるＡＴＰ合成の欠損に非常に似ている。（図６）
【００８７】
ミトコンドリアにおけるＡＴＰ枯渇は、小胞体を含む細胞質貯蔵から放出されたＣａ２＋の取り込みを含むホメオスタシス的反応を誘発することが知られている。さらに、Ｃａ２＋のミトコンドリアマトリクス内へのこの取り込みは、ミトコンドリア膜電位を必要とすると考えられている。従って、致死限界値又はそれ以上のチオクタン処理は、次第に損なわれる膜電位を背景に、Ｃａ２＋の持続的な細胞質放出とイオンの一時的なミトコンドリア取り込みを生じさせる可能性があると予想される。ミトコンドリアＣａ２＋を測定するためにＸ−Ｒｈｏｄ−１及びＲｈｏｄ−２を用い、細胞質Ｃａ２＋を測定するためにＦｌｕｏ−４を用いて、これらの予想される効果を観察している。（図１０）
【００８８】
２時間後頃までに、致死限界をわずかに超えるＣＰＩ用量において、ミトコンドリア膜電位が低下するにつれて、この第１のミトコンドリアＣａ２＋が一時的に減衰する（図６と図１０とを比較されたい）。その後に、４時間〜６時間において、カルシウムに依存した細胞死経路の開始におそらく関連している第２の大きいミトコンドリアＣａ２＋ピークが続いた。３
【００８９】
参考文献：
１．Ｇａｒｒｅｔｔ  Ｒ  ａｎｄ  Ｇｒｉｓｈａｍ  ＣＭ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ，  Ｓｏｕｔｈｂａｎｋ，Ｖｉｃ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ；Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ．（２００７）．
２．Ｇｒａｉｅｒ  ＷＦ，Ｆｒｉｅｄｅｎ  Ｍ，ａｎｄ  Ｍａｌｌｉ  Ｒ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  Ｃａ２＋  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｏｌｄ  ｇｕｅｓｔｓ，ｎｅｗ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈｉｖ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ４５５，３７５−３９６（２００７）．
３．Ｇｙｏｒｇｙ  Ｈ，Ｇｙｏｒｇｙ  Ｃ，Ｄａｓ  Ｓ，Ｇａｒｃｉａ−Ｐｅｒｅｚ  Ｃ，  Ｓａｏｔｏｍｅ  Ｍ，Ｒｏｙ  ＳＳ，ａｎｄ  Ｙｉ  ＭＱ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｃａ２＋  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ４０，５５３−５６０（２００６）．
【００９０】
実施例４
チオクタンによる種々のアポトーシスプログラムの誘導
ミトコンドリアのエネルギー代謝における低下は、詳細な機構は完全にわかっていないが、ある状況において細胞死経路に入る決定と関連していることが知られている。１−３  限界値を超えるが最小致死用量の２倍以内であるチオクタン用量においては、試験を行ったすべての癌細胞種において、形態学的に顕著にアポトーシスに似た細胞死が生じた。（図５）アポトーシス性の死は、従来のアネキシン免疫染色及びＴＵＮＥＬ  ＤＮＡ末端標識分析によってこれらの条件下で確認された（結果を示していない）。
【００９１】
さらに高い薬剤用量（限界値の２倍超）において、活性チオクタンは、アポトーシスの形態的関連を伴わない細胞死（リプレーティング生存率測定及びトリパンブルー又はプロピジウム排除によって評価される）を誘導しており、ネクローシス様経路が示唆される（結果を示していない）。
【００９２】
これらのデータは、チオクタンＣＰＩ−６１３阻害ミトコンドリアエネルギー代謝が細胞死の誘導とまさに関連していることを確かにしている。
【００９３】
独特で多様な細胞死経路４に対する不活性化突然変異を含むことが知られているか又は推定される多様な腫瘍細胞が、非常に近似したチオクタン用量においてすべて死滅したことが観察された（図５及び表１）ことは、印象的である。この観察は、これらの薬剤が潜在的に重複する複数の末梢細胞死実行経路に関与し得るマスターシグナルを誘導することを示唆している。５
【００９４】
この可能性と一致して、一般的カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、チオクタン処理された細胞における細胞死の形態を微妙に変化させるが、薬剤の致死限界用量に対して認識できる程度の影響を与えないことがわかった。
【００９５】
チオクタンに誘導される細胞死が複数の末端実行機構を介して進行する可能性についてさらに試験するために、独特な細胞死経路の指標となるカスパーゼ−３及びＰＡＲＰ−１開裂５を調べた。チオクタンＣＰＩ−６１３及びＣＰＩ−０４５のいずれもが、種々の細胞において高度に可変なレベルのこれらの２つの開裂現象を誘導することがわかった。（図１１）
【００９６】
まとめると、これらの結果は、チオクタンが、薬剤用量及び細胞種に応じて、その決定の最終的な戦術的実行については不明な戦略的コミットメントを誘導することができることを示している。
【００９７】
参考文献：
１．Ｗａｔａｂｅ  Ｍ  ａｎｄ  Ｎａｋａｋｉ  Ｔ．ＡＴＰ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ａｃｃｏｕｎｔ  ｆｏｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｃｈａｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５２，５３６−５４１（２００７）．
２．Ｙｕｎｅｖａ  Ｍ，Ｚａｍｂｏｎｉ  Ｎ，Ｏｅｆｎｅｒ  Ｐ，Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ  Ｒ，ａｎｄ  Ｌａｚｅｂｎｉｋ  Ｙ．Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＭＹＣ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８，９３−１０５（２００７）．
３．Ｓｋｕｌａｃｈｅｖ  ＶＰ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  １１，４７３−４８５（２００６）．
４．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ＲＷ，Ｒｕｅｆｌｉ  ＡＡ，ａｎｄ  Ｌｏｗｅ  ＳＷ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ａ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ  １０８，１５３−１６４（２００２）．
５．Ｃｒｅｇａｎ  ＳＰ，Ｄａｗｓｏｎ  ＶＬ，ａｎｄ  Ｓｌａｃｋ  ＲＳ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＡＩＦ  ｉｎ  ｃａｓｐａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，２７８５−２７９６（２００４）．
【００９８】
前述の議論は、本発明の例示的実施形態を単に開示及び説明するものである。当業者は、特許請求の範囲に定義されている本発明の精神及び範囲から外れずに、そのような議論及び添付した特許請求の範囲から、様々な変更、修飾及び変形を行ってもよいことを容易に理解するであろう。更に、例示的実施形態が本明細書に記載されているが、他の当業者は、本発明のその他の設計又は使用に気づく可能性もある。従って、本発明はその例示的実施形態に関して説明されているが、デザイン及び使用の両者における多数の変形が当業者に明らかであり、また、本出願がそのあらゆる修正又は変形を包含するように意図されていることを理解されるであろう。従って、本発明が特許請求の範囲及びその等価物のみによって限定されていることを明確に意図する。
【図１】
2011513395.tif 000019
【図２】
2011513395.tif 000020
【図３】
2011513395.tif 000021
【図４】
2011513395.tif 000022
【図５】
2011513395.tif 000023
【図６】
2011513395.tif 000024
【図７】
2011513395.tif 000025
【図８】
2011513395.tif 000026
【図９】
2011513395.tif 000027
【図１０】
2011513395.tif 000028
【図１１】
2011513395.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月15日(2009.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
前述の目的に従って、本発明は、広くは、癌又はその症状などのヒトを含む温血動物における細胞過剰増殖を特徴とするものを含む、ＰＤＨ複合体などのデヒドロゲナーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とする病気、病状又は症候群を治療するか、分析するか、又は、予防するのに有用な医薬品組成物であって、少なくとも１つのリポ酸誘導体を有効な量で含む医薬品組成物を提供する。米国特許第６３３１５５９号及び第６９５１８８７号並びに米国仮出願第６０／９１２５９８号（ここで言及することによってこれらのすべてが組み込まれている）に記載されているもの、及び、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体が含まれる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の調節因子は、ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害することによってミトコンドリア膜電位及び病変細胞の他のミトコンドリア事象の損失を引き起こし、アポトーシスの不可逆的開始を生じさせる。本発明の調節因子は、ＰＤＫ活性化及び／又はＰＤＰ阻害によって、又は、ＰＤＨ複合体のＥ１サブユニットの活性の阻害してピルビン酸から有毒が比較的低い分子であるアセトインへの変換を阻害することによって、ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害する可能性もある。アセトイン合成の阻害は、酸化還元反応バランスを含む他のプロセスを歪め、アセトアルデヒド、超酸化物、過酸化水素及びヒドロキシラジカルを含む有毒副産物の生成も引き起こし、結果的に、これらの副産物自身が病変細胞のミトコンドリアに不可逆的ダメージを与える。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明の第１の実施形態において、調節因子は：
2011513395.tif 000030
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、アルケンＣｎＨ２ｎ、アルケニルＣｎＨ２ｎ−１、アルキンＣｎＨ２ｎ−２、アルキニルＣｎＨ２ｎ−３、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキルＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル（ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、及び、セミチオアセタールＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−からなる群より独立して選択され（ここで前記ｎは１〜１０であり、ｔは０〜９であり）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル−有機金属アリール、セミアセタールＲ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、並びに、これらの多量体及び組み合わせであり；上に定義されている前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし、置換されていてもよく；前記Ｒ３は、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、及び、これらの多量体からなる群より選択され；前記Ｒ４は、水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール及び有機金属アリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていても置換されていなくてもよく；前記Ｒ５は、水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びアルキルヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていても置換されていなくてもよく；前記Ｒ６は、ＣＣｌ３、ＣＦ３又はＣＯＯＨであり；ここで、ｘは０〜１６である；一般式（Ｉ）を有するか又はこれらの塩である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明の第２の実施形態において、調節因子は：
2011513395.tif 000031
前記Ｍは、共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、又は、金属キレート若しくは他の金属複合物であって、金属がパラジウムでないものであり、前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アシルＲ４Ｃ（Ｏ）−、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、並びに、これらの多量体及び組み合わせからなる群より独立して選択され、前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく、前記Ｒ３は、ＣＣｌ３、ＣＦ３、ＣＯＯＨ、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、これらの多量体、並びに、これらのアミノ酸、炭水化物及び脂質の組み合わせからなる群より選択され、前記Ｒ４及びＲ５は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく、ここで、ｘは０〜１６であり、ｚは０〜５であり、ｎは０〜１０であり、ｍは２〜１０である；第２の一般式（ＩＩ）によって定義されるか又はこれらの代謝産物である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
各一般式において、それぞれの特定の調節因子の（Ｒ）異性体は、（Ｓ）異性体よりも高い生理活性を有する。従って、調節因子は、（Ｒ）異性体形態のみで又は（Ｒ）異性体と（Ｓ）異性体との混合物で存在すべきである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明は、広くは、温血動物における癌など又はその症状の細胞過剰増殖を特徴とするものを含む、ＰＤＨ複合体などのデヒドロゲナーゼ活性を有する少なくとも一つの酵素複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とする病気、病状又は症候群を治療、分析又は予防するための医薬品組成物に関する。そのような動物は、細胞過剰増殖を特徴とする、癌を含む、疾病、他の病的状態及び症候群に罹患している、ヒト、ウマ、ウシ、イヌ及びネコを含む家畜などの哺乳類クラスを含む。本発明の医薬品組成物は、チオクタンとしても知られている米国特許第６３３１５５９号及び第６９５１８８７号並びに米国仮出願第６０／９１２５９８号に記載されているものを含む、少なくとも１つのリポ酸誘導体の有効量と、該誘導体のためのための薬学的に許容可能な担体又は添加剤とを含む。ミトコンドリア内で通常みられるものの誘導体であるだけでなく、ワールブルク効果においてみられるように腫瘍細胞の高まった解糖活性に対して有益なものでもある分子として、本発明の調節因子は、腫瘍状のものなどの過剰増殖を特徴とする細胞及び組織への選択的な送達、及び、これらの細胞及び組織のミトコンドリア内の有効濃度に特に好適であり、それによって、正常な細胞及び組織を組成物の効果から免れさせる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本発明の調節因子は、ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害することによってミトコンドリア膜電位及び病変細胞の他のミトコンドリア事象の損失を引き起こし、アポトーシスの不可逆的開始を生じさせる。本発明の調節因子は、ＰＤＫ活性化及び／又はＰＤＰ阻害によって、又は、ＰＤＨ複合体のＥ１サブユニットの活性の阻害してピルビン酸から有毒が比較的低い分子であるアセトインへの変換を阻害することによって、ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害する可能性もある。アセトイン合成の阻害は、酸化還元反応バランスを含む他のプロセスを歪め、アセトアルデヒド、超酸化物、過酸化水素及びヒドロキシラジカルを含む有毒副産物の生成も引き起こし、結果的に、これらの副産物自身が病変細胞のミトコンドリアに不可逆的ダメージを与える。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
本発明の第１の実施形態において、調節因子は、第１の一般式（Ｉ）を有する。
2011513395.tif 000032
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、アルケンＣｎＨ２ｎ、アルケニルＣｎＨ２ｎ−１、アルキンＣｎＨ２ｎ−２、アルキニルＣｎＨ２ｎ−３、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキルＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル（ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−及びセミチオアセタールＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（ここで、ｎは１−１０であり、ｔは０−９である）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル有機金属アリール、セミアセタールＲ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、及び、多量体、並びに、これらの組み合わせからなる群より独立して選択され；
上に定義されている前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく；
前記Ｒ３は、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質及びこれらの多量体からなる群より選択され；
前記Ｒ４は、水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール及び有機金属アリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ５は、水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びアルキルヘテロアリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく；
前記Ｒ６は、ＣＣｌ３、ＣＦ３又はＣＯＯＨであり；
前記ｘは０〜１６である；
によって定義されるか又はこれらの塩である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明の第２の実施形態において、調節因子は、第２の一般式（ＩＩ）：
2011513395.tif 000033
前記Ｍは、共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、又は、金属キレート若しくは他の金属複合物であって、金属がパラジウムでないものであり、
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アシルＲ４Ｃ（Ｏ）−、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、及び、多量体、並びに、これらの組み合わせからなる群より独立して選択され、
前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく、
前記Ｒ３は、ＣＣｌ３、ＣＦ３、ＣＯＯＨ、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、並びに、これらの多量体及びこれらのアミノ酸、炭水化物、核酸の組み合わせからなる群より選択され、
前記Ｒ４及びＲ５は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく、
前記ｘは０〜１６であり、ｚは０〜５であり、ｎは０〜１０であり、ｍは２〜１０である；によって定義されるか、又は、これらの代謝産物である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
カスパーゼ−３及びＰＡＲＰ開裂：
開裂されたカスパーゼ−３は、ＲｏｙとＮｉｃｈｏｌｓｏｎに従ってウェスタンブロットによって検出された。２簡潔に言えば、薬剤又は溶媒処理の後に、細胞をすくい取り、溶媒／細胞／アポトーシス小体混合物を６０００Ｇで遠心分離した。溶解バッファーＣ（４Ｍ  尿素、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００３％  ＢＰＢ；５％  ２−メルカプトエタノール）を用いてペレットを溶解させた。１ウェルにつき３０μｇの全細胞溶解産物タンパクを１２％ビストリスゲルにロードした。タンパクを４．５μｍのＰＶＤＦ膜上にブロットした。前駆体及び活性カスパーゼ３を、抗カスパーゼ３モノクローナル抗体（マウスモノクローナル［３１Ａ１０６７］；ａｂｃａｍ）を用いて検出した。ＰＡＲＰ開裂を、モノクローナル抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ抗体、クローンＣ−２−１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて検出した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
ミトコンドリア内Ｃａ＋２検出：３×１０５個の細胞を３５ｍｍガラスボトムプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にまいて、一晩増殖させ、示されている薬剤又は溶媒で処理した。その後、細胞に、フェノールレッドなしの溶媒にカルシウム染料Ｆｌｕｏ−４、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１又はＲｈｏｄ−２（４μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をロードし、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、ＦＩＴＣフィルターを用い、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ（Ｚｅｉｓｓ）デコンボリューション顕微鏡を用いて固定露光時間で画像を取得した。螢光の定量化は、製造社によって提供されるソフトウェアを用いて行った。Ｘ−Ｒｈｏｄ−１とＲｈｏｄ−２は、同様の結果を与え（図１０）、これらの染料がミトコンドリアＣａ２＋シグナルを評価していたことを示している。３−４
表１：インビトロにおける腫瘍細胞及び初代細胞に対するチオクタンの効果
2011513395.tif 000034
【手続補正１７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む温血動物の異常細胞のミトコンドリア内のピルベートデヒドロゲナーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素複合体のリン酸化状態の調節因子。
【請求項２】
請求項１に記載の調節因子において、前記酵素複合体が、ピルベートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）複合体であることを特徴とする調節因子。
【請求項３】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子がキナーゼ活性を促進又は抑制することを特徴とする調節因子。
【請求項４】
請求項３に記載の調節因子において、前記キナーゼが、ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４及びそれぞれのアイソフォームを含む群から選択されることを特徴とする調節因子。
【請求項５】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子がホスファターゼ活性を促進又は抑制することを特徴とする調節因子。
【請求項６】
請求項５に記載の調節因子において、前記ホスファターゼが、ピルベートデヒドロゲナーゼホスファターゼ（ＰＤＰ）１、ＰＤＰ２及びそれぞれのアイソフォームを含む群から選択されることを特徴とする調節因子。
【請求項７】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、デヒドロゲナーゼ活性を促進又は抑制することを特徴とする調節因子。
【請求項８】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＨ複合体のリン酸化状態の変化によって達成されることを特徴とする調節因子。
【請求項９】
請求項８に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＨ複合体のＥ１αサブユニットに対して生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１０】
請求項９に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＰ及びそのアイソフォーム並びにこれらの突然変異体の不活性化よって生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１１】
請求項９に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＫ及びそのアイソフォーム並びにこれらの突然変異体の活性化よって生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１２】
請求項８に記載の調節因子において、前記調節因子が、嫌気性エネルギー代謝の有毒な代謝産物の解毒を阻害することを特徴とする調節因子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の調節因子において、前記代謝産物が、アセトアルデヒド、超酸化物、過酸化水素及びヒドロキシラジカルからなる群より選択されることを特徴とする調節因子。
【請求項１４】
請求項１２に記載の調節因子において、前記調節の効果が、アセトイン生成の減少によって観察されることを特徴とする調節因子。
【請求項１５】
請求項８に記載の調節因子において、前記リン酸化又は脱リン酸化が不可逆的であることを特徴とする調節因子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の調節因子において、前記リン酸化又は脱リン酸化の効果によってアポトーシスが生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の調節因子において、前記効果がアポトーシスであることを特徴とする調節因子。
【請求項１８】
請求項１６に記載の調節因子において、前記効果がネクローシスであることを特徴とする調節因子。
【請求項１９】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、ＰＤＫ及びそのアイソフォーム並びにれらの突然変異体の発現レベルに作用することを特徴とする調節因子。
【請求項２０】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、ＰＤＰ及びそのアイソフォーム並びにこれらの突然変異体の発現レベルに作用することを特徴とする調節因子。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載の調節因子において、前記発現レベルが、転写、翻訳、又は、翻訳後のレベルで変化することを特徴とする調節因子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の調節因子において、前記変化が後成的であることを特徴とする調節因子。
【請求項２３】
請求項１に記載の調節因子において、
前記調節因子が：
2011513395.tif 000035
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、アルケンＣｎＨ２ｎ、アルケニルＣｎＨ２ｎ−１、アルキンＣｎＨ２ｎ−２、アルキニルＣｎＨ２ｎ−３、硫化アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキルＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバメート（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２、及び、セミチオアセタールＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、ここで、前記ｎは１〜１０であり、前記ｔは０〜９である）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されたアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル有機金属アリール、セミアセタールＲ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、並びに、これらの多量体、及び、これらのアミノ酸、炭水化物、脂質の組み合わせからなる群より独立して選択され、
前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく、
前記Ｒ３は、ＣＣｌ３、ＣＦ３、ＣＯＯＨ、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、並びに、これらの多量体、及び、これらのアミノ酸、炭水化物、脂質の組み合わせからなる群より選択され、
前記Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール及び有機金属アリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく、前記ｘが０〜１６である、
式を有するか又はその代謝産物であることを特徴とする調節因子。
【請求項２４】
請求項１に記載の調節因子において、
前記調節因子が：
2011513395.tif 000036
前記Ｍは、共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、又は、金属キレート若しくは他の金属複合物であって、金属がパラジウムでないものであり；
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アシルＲ４Ｃ（Ｏ）−、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、及び、多量体、並びに、これらの組み合わせからなる群より独立して選択され、
前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく、
前記Ｒ３は、ＣＣｌ３、ＣＦ３、ＣＯＯＨ、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、並びに、これらの多量体、及び、これらのアミノ酸、炭水化物、脂質の組み合わせからなる群より選択され、
前記Ｒ４及びＲ５は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく、
前記ｘは０〜１６であり、前記ｚは０〜５であり、前記ｎは０〜１０であり、前記ｍは２〜１０である式を有するか又はその代謝産物であることを特徴とする調節因子。
【請求項２５】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、（Ｒ）異性体としてのみ存在することを特徴とする調節因子。
【請求項２６】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、（Ｒ）異性体と（Ｓ）異性体との混合物として存在することを特徴とする調節因子。
【請求項２７】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、ＰＤＨ複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とする疾病、病状又は症候群の治療及び診断に有用であることを特徴とする調節因子。
【請求項２８】
請求項２７に記載の調節因子において、前記疾病、病状、又は症候群が、細胞過剰増殖によってさらに特徴付けられることを特徴とする調節因子。
【請求項２９】
請求項２８に記載の調節因子において、前記疾病、病状又は症候群が癌であることを特徴とする調節因子。
【請求項３０】
ＰＤＨ複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とした疾病、病状又は症候群を呈する患者においてＰＤＨ複合体を調節する方法において、請求項１に記載の調節因子の有効量を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、前記疾病、病状又は症候群が細胞過剰増殖によってさらに特徴付けられることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法において、前記疾病、病状又は症候群が癌であることを特徴とする方法。
【請求項３３】
ＰＤＨ複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とした疾病、病状又は症候群を呈する患者における有益性を診断及び予測する方法において、前記患者から細胞サンプルを得るステップと、請求項１に記載の調節因子の有効量をインビトロにおいて細胞に投与するステップと、そこから結果を得るステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法において、前記疾病、病状又は症候群が細胞過剰増殖によってさらに特徴付けられることを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、前記疾病、病状又は症候群が癌であることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３０に記載の方法において、前記調節因子が、前記調節因子のための薬学的に許容可能な少なくとも１つの単体と組み合わされることを特徴とする方法。
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月16日(2011.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む温血動物の異常細胞のミトコンドリア内のピルベートデヒドロゲナーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素複合体のリン酸化状態の調節因子。
【請求項２】
請求項１に記載の調節因子において、前記酵素複合体が、ピルベートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）複合体であることを特徴とする調節因子。
【請求項３】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子がキナーゼ活性を促進又は抑制することを特徴とする調節因子。
【請求項４】
請求項３に記載の調節因子において、前記キナーゼが、ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４及びそれぞれのアイソフォームを含む群から選択されることを特徴とする調節因子。
【請求項５】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子がホスファターゼ活性を促進又は抑制することを特徴とする調節因子。
【請求項６】
請求項５に記載の調節因子において、前記ホスファターゼが、ピルベートデヒドロゲナーゼホスファターゼ（ＰＤＰ）１、ＰＤＰ２及びそれぞれのアイソフォームを含む群から選択されることを特徴とする調節因子。
【請求項７】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、デヒドロゲナーゼ活性を促進又は抑制することを特徴とする調節因子。
【請求項８】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＨ複合体のリン酸化状態の変化によって達成されることを特徴とする調節因子。
【請求項９】
請求項８に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＨ複合体のＥ１αサブユニットに対して生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１０】
請求項９に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＰ及びそのアイソフォーム並びにこれらの突然変異体の不活性化よって生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１１】
請求項９に記載の調節因子において、前記調節が、ＰＤＫ及びそのアイソフォーム並びにこれらの突然変異体の活性化よって生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１２】
請求項８に記載の調節因子において、前記調節因子が、嫌気性エネルギー代謝の有毒な代謝産物の解毒を阻害することを特徴とする調節因子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の調節因子において、前記代謝産物が、アセトアルデヒド、超酸化物、過酸化水素及びヒドロキシラジカルからなる群より選択されることを特徴とする調節因子。
【請求項１４】
請求項１２に記載の調節因子において、前記調節の効果が、アセトイン生成の減少によって観察されることを特徴とする調節因子。
【請求項１５】
請求項８に記載の調節因子において、前記リン酸化又は脱リン酸化が不可逆的であることを特徴とする調節因子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の調節因子において、前記リン酸化又は脱リン酸化の効果によってアポトーシスが生じることを特徴とする調節因子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の調節因子において、前記効果がアポトーシスであることを特徴とする調節因子。
【請求項１８】
請求項１６に記載の調節因子において、前記効果がネクローシスであることを特徴とする調節因子。
【請求項１９】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、ＰＤＫ及びそのアイソフォーム並びにれらの突然変異体の発現レベルに作用することを特徴とする調節因子。
【請求項２０】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、ＰＤＰ及びそのアイソフォーム並びにこれらの突然変異体の発現レベルに作用することを特徴とする調節因子。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載の調節因子において、前記発現レベルが、転写、翻訳、又は、翻訳後のレベルで変化することを特徴とする調節因子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の調節因子において、前記変化が後成的であることを特徴とする調節因子。
【請求項２３】
請求項１に記載の調節因子において、
前記調節因子が：
2011513395.tif 000037
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、アルケンＣｎＨ２ｎ、アルケニルＣｎＨ２ｎ−１、アルキンＣｎＨ２ｎ−２、アルキニルＣｎＨ２ｎ−３、硫化アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキルＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバメート（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２、及び、セミチオアセタールＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、ここで、前記ｎは１〜１０であり、前記ｔは０〜９である）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されたアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル有機金属アリール、セミアセタールＲ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、並びに、これらの多量体、及び、これらのアミノ酸、炭水化物、脂質の組み合わせからなる群より独立して選択され、
前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく、
前記Ｒ３は、ＣＣｌ３、ＣＦ３、ＣＯＯＨ、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、並びに、これらの多量体、及び、これらのアミノ酸、炭水化物、脂質の組み合わせからなる群より選択され、
前記Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール及び有機金属アリールからなる群より選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく、前記ｘが０〜１６である、
式を有するか又はその代謝産物であることを特徴とする調節因子。
【請求項２４】
請求項１に記載の調節因子において、
前記調節因子が：
2011513395.tif 000038
前記Ｍは、共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、又は、金属キレート若しくは他の金属複合物であって、金属がパラジウムでないものであり；
前記Ｒ１及びＲ２は、水素、アシルＲ４Ｃ（Ｏ）−、アルキルＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルスルフィドＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、及び、多量体、並びに、これらの組み合わせからなる群より独立して選択され、
前記Ｒ１及びＲ２は、置換されていなくてもよいし置換されていてもよく、
前記Ｒ３は、ＣＣｌ３、ＣＦ３、ＣＯＯＨ、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、並びに、これらの多量体、及び、これらのアミノ酸、炭水化物、脂質の組み合わせからなる群より選択され、
前記Ｒ４及びＲ５は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルからなる群より独立して選択され、これらのいずれもが置換されていてもよいし置換されていなくてもよく、
前記ｘは０〜１６であり、前記ｚは０〜５であり、前記ｎは０〜１０であり、前記ｍは２〜１０である式を有するか又はその代謝産物であることを特徴とする調節因子。
【請求項２５】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、（Ｒ）異性体としてのみ存在することを特徴とする調節因子。
【請求項２６】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、（Ｒ）異性体と（Ｓ）異性体との混合物として存在することを特徴とする調節因子。
【請求項２７】
請求項１に記載の調節因子において、前記調節因子が、ＰＤＨ複合体の構造及び／又は活性の変化を特徴とする疾病、病状又は症候群の治療及び診断に有用であることを特徴とする調節因子。
【請求項２８】
請求項２７に記載の調節因子において、前記疾病、病状、又は症候群が、細胞過剰増殖によってさらに特徴付けられることを特徴とする調節因子。
【請求項２９】
請求項２８に記載の調節因子において、前記疾病、病状又は症候群が癌であることを特徴とする調節因子。
【国際調査報告】
2011513395.tif 000039
2011513395.tif 000040