(57)【要約】  本開示は、免疫増強および／または免疫抑制のための組成物および方法に関する。ある実施形態において、本開示は、免疫増強に（例えば、ワクチンアジュバントとして）、敗血症の治療に、または免疫低下状態の対象の治療にＴＡＭ受容体阻害剤を使用する方法に関する。免疫増強剤をスクリーニングする方法も開示される。他の実施形態において、本開示は、免疫抑制に（例えば、自己免疫障害の治療として）、アレルギーの治療に、または対象の移植片対宿主病の治療に、ＴＡＭ受容体作動薬を使用する方法に関する。免疫抑制剤をスクリーニングする方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の免疫応答を増強する方法であって、
免疫増強を必要とする対象に治療的有効量のＴＡＭ受容体阻害剤を投与し、それによって前記対象の前記免疫応答を増強する工程
を含む方法。
【請求項２】
対象の免疫応答を抑制する方法であって、
免疫抑制を必要とする対象に治療的有効量のＴＡＭ受容体作動薬を投与し、それによって前記対象の前記免疫応答を抑制する工程
を含む方法。
【請求項３】
前記ＴＡＭ受容体が、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＡＭ受容体阻害剤が約５０μＭ未満のＩＣ５０を有するか、または前記ＴＡＭ作動薬が約５０μＭ未満のＥＣ５０を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＡＭ受容体阻害剤が約1ｐＭ〜約５μＭのＩＣ５０を有するか、または前記ＴＡＭ作動薬が約1ｐＭ〜約５μＭのＥＣ５０を有する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＡＭ受容体阻害剤が、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒの細胞内ＡＴＰ結合部位に結合する、請求項１または３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＡＭ受容体阻害剤が、ＭＰ４７０、ＳＧＩ-ＡＸＬ-２７７、ＡＸＬ-１、ＡＸＬ-２、ＡＸＬ-３、ＡＸＬ-４、ＡＸＬ-５、ＡＸＬ-６、ＡＸＬ-７、ＡＸＬ-８、ＡＸＬ-９、またはこれらの誘導体である、請求項１または３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＡＭ受容体阻害剤が、以下の化学構造を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法：
【化１】
2011514881.tif 000006
（ここで、Ｒは水素またはメチル基である。）
【請求項９】
前記ＴＡＭ受容体阻害剤が、前記ＴＡＭ受容体の細胞外ドメインまたはＴＡＭ受容体リガンドに結合する、請求項１または３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＡＭ受容体阻害剤が、小分子阻害剤、モノクローナル抗体、またはｓｉＲＮＡである、請求項１、３〜６、または８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＡＭ受容体阻害剤がＧａｓ６またはプロテインＳに結合し、Ｇａｓ６もしくはプロテインＳの前記ＴＡＭ受容体の前記細胞外ドメインへの結合および／または前記ＴＡＭ受容体の活性化を妨害する、請求項１、３〜５、または９〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、
対象に治療的有効量のワクチンを投与し、それによって前記ワクチンに対する免疫応答を増強する工程をさらに含む
請求項１または３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＡＭ受容体阻害剤が、前記ワクチンと実質的に同時に前記対象に投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ワクチンが、前記対象の腫瘍に対して活性化された樹状細胞（ＤＣ）を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記対象の腫瘍を治療する方法、免疫抑制の疾患を治療する方法、または敗血症を治療する方法である、請求項１または３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、重症敗血症、敗血症性ショック、ＳＩＲＳ、または重症ＳＩＲＳを有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、感染症の治療を必要とする対象の感染症を治療する方法である、請求項１、３〜１３、または１５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、免疫低下状態または免疫抑制状態である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＴＡＭ受容体作動薬が、ＧＡＳ６、プロテインＳ、アミノ末端切断型ＧＡＳ６、アミノ末端切断型プロテインＳ、前記ＴＡＭ受容体の細胞外ドメインに結合し、前記ＴＡＭ受容体を架橋し、ＴＡＭ受容体二量体となって前記ＴＡＭ受容体を活性化することができる抗体、または前記ＴＡＭ受容体の細胞外ドメインに結合し、前記ＴＡＭ受容体を活性化することができる小分子である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＡＭ受容体作動薬が、１つのＧｌａドメインまたはＥＧＦドメインも有さず、前記ＴＡＭ受容体を活性化することができるＧａｓ６タンパク質またはプロテインＳタンパク質である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、
前記対象に治療的有効量の免疫抑制剤を投与し、それによって前記対象の前記免疫応答を抑制する工程をさらに含む
請求項２〜５または１９〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＴＡＭ受容体作動薬が、前記免疫抑制剤と実質的に同時に前記対象に投与される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、自己免疫疾患、アレルギー、移植片対宿主（ＧＶＨ）病、または移植片拒絶反応を治療または予防する方法である、請求項２〜５または１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、腎線維症、肺線維症、肝線維症、アジソン病、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、またはグレーブス病である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
免疫調整剤をスクリーニングする方法であって、
ＴＡＭ受容体を発現する細胞を試験薬剤と接触させる工程、および
（ａ）前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を変化させるかどうか、または
（ｂ）前記試験薬剤がリガンドのＴＡＭ受容体への結合を阻害するかどうか
を決定する工程であって、ＴＡＭ受容体活性を増大させるかまたはリガンドのＴＡＭ受容体への結合を増強する試験薬剤が免疫抑制剤として同定され、かつＴＡＭ受容体活性を阻害するかまたはリガンドのＴＡＭ受容体への結合を低下させるもしくは阻害する試験薬剤が免疫増強剤として同定される工程
を含む方法。
【請求項２６】
前記ＴＡＭ受容体が、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
さらなる解析のために免疫増強剤または免疫抑制剤であることが示される試験薬剤を選択する工程をさらに含む、請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞が実験用哺乳動物のものであり、前記細胞を前記試験薬剤と接触させる工程が前記試験薬剤を前記哺乳動物に投与する工程を含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、免疫増強剤をスクリーニングする方法であり、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害するかどうかを決定する工程が
前記細胞を前記試験薬剤と接触させる工程、ならびに
前記細胞を前記試験薬剤と接触させる工程が
ｉ．対照と比較した場合にＴＡＭ自己リン酸化を変化させるかどうか（ここで前記対照と比較して、前記試験薬剤の存在下でのＴＡＭ自己リン酸化の低下は、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害することを示す）、
ｉｉ．対照と比較した場合にＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生を変化させるかどうか（ここで対照と比較して、前記試験薬剤の存在下での前記ＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の増大は、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害することを示す）、
ｉｉｉ．対照と比較した場合にＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激を変化させるかどうか（ここで前記対照と比較して、前記試験薬剤の存在下でのＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激の増大は、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害することを示す）、および／または
ｉｖ．対照と比較した場合にＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化を変化させるかどうか（ここで前記対照と比較して、前記試験薬剤の存在下でのＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の増大は、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害することを示す）
を決定する工程を含む
請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、免疫抑制剤をスクリーニングする方法であり、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させるかどうかを決定する工程が
前記細胞を前記試験薬剤と接触させる工程、ならびに
前記細胞を前記試験薬剤と接触させる工程が
ｉ．ＴＡＭ自己リン酸化の対照レベルと比較した場合にＴＡＭ自己リン酸化を変化させるかどうか（ここで前記対照と比較して、前記試験薬剤の存在下でのＴＡＭ自己リン酸化の増大は、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させることを示す）、
ｉｉ．対照と比較した場合にＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生を変化させるかどうか（ここで前記対照と比較して、前記試験薬剤の存在下でのＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の減少は、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させることを示す）、
ｉｉｉ．対照と比較した場合にＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激を変化させるかどうか（ここで前記対照と比較して、前記試験薬剤の存在下でのＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激の減少は、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させることを示す）、および／または
ｉｖ．対照と比較した場合にＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化を変化させるかどうか（ここで前記対照と比較して、前記試験薬剤の存在下でのＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の減少は、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させることを示す）
を決定する工程を含む
請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対照が、前記試験薬剤と接触していない細胞について得られる値であるかまたは参照値である、請求項２９〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を変化させるかどうかを決定する工程が
（ａ）前記細胞を前記試験薬剤と接触させる前にＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の対照レベルを測定する工程、
（ｂ）前記細胞を前記試験薬剤と接触させる工程、および
（ｃ）前記細胞を前記試験薬剤と接触させる工程が、ＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の前記対照レベルと比較した場合にＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現を変化させるかどうかを決定する工程であって、前記対照レベルと比較して、前記試験薬剤の存在下でのＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の低下が、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害し、このような試験薬剤が免疫増強剤として同定されるということを示し、前記対照レベルと比較して、前記試験薬剤の存在下でのＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の増大が、前記試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させ、このような試験薬剤が免疫抑制剤として同定されるということを示す工程を含む
請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、免疫抑制剤をスクリーニングする方法であり、前記ＴＡＭ受容体を発現する細胞を前記試験薬剤と接触させる工程が、前記細胞をＴＡＭ受容体作動薬の存在下で前記試験薬剤と接触させる工程を含む、請求項２５〜２８、または３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＴＡＭ受容体作動薬が、Ｇａｓ６、アミノ末端切断型Ｇａｓ６、プロテインＳ、またはアミノ末端切断型プロテインＳである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記ＴＡＭ受容体作動薬が、前記ＴＡＭ受容体の前記細胞外ドメインに結合し、前記ＴＡＭ受容体を架橋し、ＴＡＭ受容体二量体となって前記ＴＡＭ受容体を活性化する抗体である、請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６０／９８６，９８４号（２００７年１１月９日出願）、米国仮特許出願第６１／０１３，５９８号（２００７年１２月１３日出願）、および同第６１／０８３，４６２号（２００８年７月２４日出願）の恩典を主張し、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本開示は、免疫増強および免疫抑制のための組成物および方法に関する。ある実施形態において、本開示は、免疫増強に（例えば、ワクチンアジュバントとして）、または敗血症もしくは免疫増強が所望される他の障害の治療に、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒ（ＴＡＭ）受容体阻害剤を用いる方法に関する。他の実施形態において、本開示は、免疫抑制に（例えば、自己免疫疾患の治療に）、移植後の免疫抑制に、または免疫抑制が所望される他の障害の治療に、ＴＡＭ受容体作動薬を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫増強が望ましいと考えられる多くの疾患および病気がある。例えば、非対称戦争とテロ攻撃の両方における生物兵器の脅威が高まっていることにより、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、ならびにエボラウイルスおよびラッサウイルスをはじめとする、疾患および病的状態を急速に発症させる病原体に対する有効な対抗策が必要とされている。これらの生物学的作用因子の性質を考えると、有効なワクチン接種には、できる限り少ない用量で迅速かつ強力な応答を誘導することが要求される。現在承認されているワクチン、および開発中のワクチンは主に、「吸着炭疽ワクチン」抗原のような、無細胞濾過液、組換え抗原、および合成ペプチドに依存している。そのため、これらは、伝統的なワクチンで使用される死滅病原体全体の免疫原性を欠いている。組換えアプローチを有効なワクチン接種プロトコルに転換するために、組換え抗原に基づく応答を安全に増大させる強力な免疫アジュバントを開発する必要がある。
【０００４】
同様に、重症敗血症を、効果的な免疫増強によって治療することができる。敗血症は、感染に対する全身炎症応答を指し（例えば、非特許文献１参照）、重症敗血症、敗血症性ショック、多臓器機能不全へと進行し、最終的には死に至ることもある。重症敗血症は、低血圧、播種性血管内凝固、および、乳酸アシドーシス、乏尿、および精神状態の変化を含む、低灌流異常を伴う。重症敗血症の患者は免疫抑制を示すことも多く、そのために、一次感染を排除する能力が低下し、二次的な日和見感染および／または院内感染にかかりやすくなる。毎年、何十万人もの人々が敗血症を患って死亡する。
【０００５】
さらに、免疫不全（感染性疾患と戦う免疫系の能力が低下しているかまたは完全になくなっている状態）を免疫増強によって治療することができる。免疫不全は、先天性または後天性のどちらかの可能性があるが、免疫低下状態の人は日和見感染に非常にかかりやすい。ＨＩＶ感染は免疫不全の主な原因であり、２００６年には世界で推定３，９５０万人がＨＩＶに感染していた。世界の多くの地域で抗レトロウイルスの治療と介護が受けられるように近年、改善されているにもかかわらず、ＡＩＤＳの流行によって２００５年に推定２８０万人の命が奪われ、そのうち子供が５０万人を上回った。
【０００６】
さらに、免疫増強は、ワクチン（例えば、樹状細胞ベースの癌ワクチン）とともに使用されるのが望ましいと考えられる。この樹状細胞ベースの癌ワクチンでは、患者の癌に対する自然の反応性または遺伝的に改変された反応性を有する樹状細胞が、種々の手段を用いてインビトロで拡大され、その後、癌患者に養子導入される。樹状細胞ベースのワクチンは、宿主生物の免疫応答を高める薬剤と併用した場合、顕著により効果的であると考えられる。
【０００７】
また、免疫抑制が望ましいと考えられる多くの疾患および病気がある。例えば、特に、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、シェーグレン症候群、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、乾癬、腎線維症、肺線維症、および肝線維症、Ｉ型糖尿病、ならびに多発性硬化症を含む、多くのヒト疾患および疾患症候群は、免疫系の慢性炎症が原因で起こる。さらに、移植後の臓器拒絶反応は、免疫炎症に端を発することが多い。このような状況では、ほとんどの場合、細菌感染とウイルス感染によって炎症性症状と疾患が悪化する。それゆえに、免疫炎症の急性阻害は、臨床的な優先事項となっている。
【０００８】
現在の治療選択肢は、（ａ）アスピリンおよび他の非ステロイド性の抗炎症薬の場合のように、効き目が弱い治療か、または（ｂ）グルココルチコイドおよび他のステロイド、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン）、ならびに抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体（例えば、インフリキシマブ（レミケード（商標）））およびＴＮＦ受容体デコイ（例えば、エタナセプト（エンブレル（商標）））の場合のように、かなりの有害副作用で悩まされる治療かのどちらかである。上記を考慮すると、例えば、ワクチンアジュバント、敗血症の治療、および免疫不全の治療として使用するための改良された免疫増強剤を有することが望ましいと考えられる。さらに、例えば、自己免疫疾患の治療で使用するための、移植後の免疫抑制を誘導するための、および免疫抑制が所望される他の障害を治療するための改良された免疫抑制剤を有することも望ましいと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｓｔ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）  Ｃｈｅｓｔ，１０１：１６４４-５５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒ）受容体阻害剤が免疫増強に有効であり、ＴＡＭ受容体作動薬が免疫抑制に有効であるという驚くべき発見を本明細書で開示する。対象の免疫応答を増強する方法を提供する。いくつかの例において、本方法は、免疫増強を必要とする対象に治療有効量のＴＡＭ受容体阻害剤を投与し、それによって対象の免疫応答を増強する工程を含む。免疫増強剤をスクリーニングする方法も提供する。これらの方法は、ＴＡＭ受容体を発現する細胞を試験薬剤と接触させる工程、およびこの試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を顕著に低下させるかどうかまたは阻害するかどうかを決定する工程を含むことができる。
【００１１】
対象の免疫応答を抑制する方法も提供する。いくつかの例において、本方法は、免疫抑制を必要とする対象に治療有効量のＴＡＭ受容体作動薬を投与し、それによって対象の免疫応答を抑制する工程を含む。免疫抑制剤をスクリーニングする方法も提供する。これらの方法は、ＴＡＭ受容体を発現する細胞を試験薬剤と接触させる工程、およびこの試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を顕著に増大させるかどうかまたは増強するかどうかを決定する工程を含むことができる。
【００１２】
上記および他の特徴は、添付図面を参照して進められるいくつかの実施例に関する以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、ＴＡＭ変異体マウスにおける樹状細胞（ＤＣ）の活性化過剰とＴＡＭによるＴＬＲ誘導性サイトカイン産生の阻害を示すパネルであり、野生型（ＷＴ）マウスおよびＴＡＭ三重ノックアウト（ＴＫＯ）マウスに由来するＣＤ１１ｃ＋脾細胞の代表的なＦＡＣＳ解析を示す。ＮＫ１．１、ＣＤ１９、およびＣＤ３が陰性の細胞にＣＤ１１ｃについてゲートをかけた。囲んだ領域内の数は、ゲート内の細胞のパーセンテージを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＴＡＭ変異体マウスにおける樹状細胞（ＤＣ）の活性化過剰とＴＡＭによるＴＬＲ誘導性サイトカイン産生の阻害を示すパネルであり、独立に繰り返した、図１Ａで示したのと同じプロトコルを示し、データを棒グラフとして表す。ＷＴマウスおよびＴＡＭ  ＴＫＯマウスの脾臓におけるＣＤ１１ｃ＋細胞のパーセンテージ（左）と総数（右）を示す。エラーバー：平均±標準偏差（１つの群あたりｎ＝６マウス、ｐ＜０．０１）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＴＡＭ変異体マウスにおける樹状細胞（ＤＣ）の活性化過剰とＴＡＭによるＴＬＲ誘導性サイトカイン産生の阻害を示すパネルであり、ＷＴマウスおよびＴＡＭ  ＴＫＯマウスの脾臓に由来するＣＤ１１ｃ＋細胞でのＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ発現のＦＡＣＳヒストグラムを示す。表示した結果は、３回の独立した実験の結果を表す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＴＡＭ変異体マウスにおける樹状細胞（ＤＣ）の活性化過剰とＴＡＭによるＴＬＲ誘導性サイトカイン産生の阻害を示すパネルであり、定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）で測定される、ＷＴに対して正規化された、脾臓から急性単離されたＴＡＭ  ＴＫＯ  ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＢＡＦＦ  ｍＲＮＡ発現の相対的レベルを示す。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝３、ｐ＜０．０１）を表す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＴＡＭ変異体マウスにおける樹状細胞（ＤＣ）の活性化過剰とＴＡＭによるＴＬＲ誘導性サイトカイン産生の阻害を示すパネルであり、ＥＬＩＳＡで測定される、表示したＴＬＲ作動薬で刺激してから１５時間後のＷＴ、Ａｘｌ-／-、Ｍｅｒ-／-、およびＴＡＭ  ＴＫＯ脾臓由来ＣＤ１１ｃ＋細胞によって産生されるＩＬ６およびＴＮＦαのレベルを示す。表示した結果は、３回の独立した試験の結果を表す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＴＡＭ変異体マウスにおける樹状細胞（ＤＣ）の活性化過剰とＴＡＭによるＴＬＲ誘導性サイトカイン産生の阻害を示すパネルであり、ＥＬＩＳＡで測定される、表示したＴＬＲ作動薬で刺激してから１５時間後のＷＴ、Ａｘｌ-／-、Ｍｅｒ-／-、およびＴＡＭ  ＴＫＯ脾臓由来ＣＤ１１ｃ＋細胞によって産生されるＩＬ６およびＴＮＦαのレベルを示す。表示した結果は、３回の独立した試験の結果を表す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ＴＡＭ変異体マウスにおける樹状細胞（ＤＣ）の活性化過剰とＴＡＭによるＴＬＲ誘導性サイトカイン産生の阻害を示すパネルであり、Ａｘｌとチューブリンの抗体（上のブロット）およびＭｅｒとアクチンの抗体（下のブロット）でプローブした骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）細胞ライセートのウェスタンブロットを示す。脾臓から急性単離されたＣＤ１１ｃ＋細胞から調製されたライセートで同じ結果が得られた。
【図１Ｈ】図１Ｈは、ＴＡＭ変異体マウスにおける樹状細胞（ＤＣ）の活性化過剰とＴＡＭによるＴＬＲ誘導性サイトカイン産生の阻害を示すパネルであり、単独で（）または５０ｎＭ  Ｇａｓ６とともに（＋）、１０ｎＭ  ＣｐＧでＤＣを刺激してから１５時間後の表示したサイトカインの相対的な産生を示す。サイトカイン産生は、下記の実施例１で記載されているように測定した。結果は、ＴＬＲリガンドのみの存在下での対応するサイトカイン産生に対して正規化した。エラーバー：平均±標準偏差（１つの群あたりｎ≧３、ｐ＜０．０１）。
【図１Ｉ】図１Ｉは、ＴＡＭ変異体マウスにおける樹状細胞（ＤＣ）の活性化過剰とＴＡＭによるＴＬＲ誘導性サイトカイン産生の阻害を示すパネルであり、単独で（）または５０ｎＭ  Ｇａｓ６とともに（＋）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳでＤＣを刺激してから１５時間後の表示したサイトカインの相対的な産生を示す。サイトカイン産生は、下記の実施例１で記載されているように測定した。結果は、ＴＬＲリガンドのみの存在下での対応するサイトカイン産生に対して正規化した。エラーバー：平均±標準偏差（１つの群あたりｎ≧３、ｐ＜０．０１）。
【図１Ｊ】図１Ｊは、ＴＡＭ変異体マウスにおける樹状細胞（ＤＣ）の活性化過剰とＴＡＭによるＴＬＲ誘導性サイトカイン産生の阻害を示すパネルであり、単独で（）または５０ｎＭ  Ｇａｓ６とともに（＋）、１０μｇ／ｍｌ  ポリＩ：Ｃ（図１Ｊ）でＤＣを刺激してから１５時間後の表示したサイトカインの相対的な産生を示す。サイトカイン産生は、下記の実施例１で記載されているように測定した。結果は、ＴＬＲリガンドのみの存在下での対応するサイトカイン産生に対して正規化した。エラーバー：平均±標準偏差（１つの群あたりｎ≧３、ｐ＜０．０１）。
【図２Ａ】図２Ａは、ＴＡＭ受容体活性化がＴＬＲ９シグナル伝達経路の保存された構成要素を阻害することを示すパネルであり、表示した分間、ＣｐＧのみで、または５０ｎＭ  Ｇａｓ６と２時間プレインキュベーションした後にＣｐＧで活性化された骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）から全細胞ライセートを調製し、活性化された、ホスホｐ３８  Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２（上のブロット）とトータルｐ３８（下のブロット）についてプローブしたウェスタンブロットを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＴＡＭ受容体活性化がＴＬＲ９シグナル伝達経路の保存された構成要素を阻害することを示すパネルであり、表示した分間、ＣｐＧのみで、または５０ｎＭ  Ｇａｓ６と２時間プレインキュベーションした後にＣｐＧで活性化された骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）から全細胞ライセートを調製し、活性化された、ホスホＥＲＫ１／２  Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５（上のブロット）とトータルＥＲＫ１／２（下のブロット）についてプローブしたウェスタンブロットを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＴＡＭ受容体活性化がＴＬＲ９シグナル伝達経路の保存された構成要素を阻害することを示すパネルであり、表示した分間、ＣｐＧのみで、または５０ｎＭ  Ｇａｓ６と２時間プレインキュベーションした後にＣｐＧで活性化された骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）から全細胞ライセートを調製し、ＩκＢα、ＩκＢβ、およびチューブリンについてプローブした定量的Ｌｉ-Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙウェスタンブロット（左）、ならびに測定されたＩκＢα／チューブリンおよびＩκＢβ／チューブリンのシグナル比（右、平均±標準偏差；ｎ＝３）を示す。記載の通りにＤＣを活性化した。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＴＡＭ受容体活性化がＴＬＲ９シグナル伝達経路の保存された構成要素を阻害することを示すパネルであり、表示した分間、ＣｐＧのみで、または５０ｎＭ  Ｇａｓ６と２時間プレインキュベーションした後にＣｐＧで活性化された骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）から全細胞ライセートを調製し、ＩκＢα、ＩκＢβ、およびチューブリンについてプローブした定量的Ｌｉ-Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙウェスタンブロット（左）、ならびに測定されたＩκＢα／チューブリンおよびＩκＢβ／チューブリンのシグナル比（右、平均±標準偏差；ｎ＝３）を示す。記載の通りにＤＣを活性化した。さらに、Ｇａｓ６を添加する前に３０分間、１０μｇ／ｍｌ  シクロヘキシミド（図２Ｄ）でＤＣを前処理した。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＴＡＭ受容体活性化がＴＬＲ９シグナル伝達経路の保存された構成要素を阻害することを示すパネルであり、表示した分間、ＣｐＧのみで、または５０ｎＭ  Ｇａｓ６と２時間プレインキュベーションした後にＣｐＧで活性化された骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）から全細胞ライセートを調製し、ＩκＢα、ＩκＢβ、およびチューブリンについてプローブした定量的Ｌｉ-Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙウェスタンブロット（左）、ならびに測定されたＩκＢα／チューブリンおよびＩκＢβ／チューブリンのシグナル比（右、平均±標準偏差；ｎ＝３）を示す。記載の通りにＤＣを活性化した。さらに、Ｇａｓ６を添加する前に３０分間、１μｇ／ｍｌ  アクチノマイシンＤ（図２Ｅ）でＤＣを前処理した。
【図３Ａ】図３Ａは、ＴＡＭ活性化がＳＯＣＳ１／３を誘導し、ＴＬＲ４誘導性のＴＲＡＦ３／６のユビキチン化を阻害することを示すパネルであり、表示した時間、５０ｎＭ  Ｇａｓ６でＢＭ-ＤＣを活性化し、その後、ＳＯＣＳ１とＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの発現をＱ-ＰＣＲでアッセイした結果を示す棒グラフである。β-アクチンに対するＳＯＣＳ１／３  ｍＲＮＡレベルを、刺激していない細胞のβ-アクチンに対するＳＯＣＳ１／３  ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。エラーバー：平均±標準偏差（ＳＯＣＳ１について、ｎ＝４；ＳＯＣＳ３について、ｎ＝３）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＴＡＭ活性化がＳＯＣＳ１／３を誘導し、ＴＬＲ４誘導性のＴＲＡＦ３／６のユビキチン化を阻害することを示すパネルであり、図３Ａと同様に細胞を処理し、その後、表示した阻害因子のｍＲＮＡの発現をＱ-ＰＣＲでアッセイした結果を示す。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝２）を表す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＴＡＭ活性化がＳＯＣＳ１／３を誘導し、ＴＬＲ４誘導性のＴＲＡＦ３／６のユビキチン化を阻害することを示すパネルであり、ＢＭＤＣを、１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳのみと０分間もしくは３０分間、または５０ｎＭ  Ｇａｓ６と２時間プレインキュベートした後にＬＰＳと３０分間、インキュベートした。全細胞ライセートからＴＲＡＦ６を免疫沈降し、免疫沈降物をユビキチン抗体（上のブロット）およびＴＲＡＦ６抗体（下のパネル）を用いた免疫ブロッティングで解析した。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＴＡＭ活性化がＳＯＣＳ１／３を誘導し、ＴＬＲ４誘導性のＴＲＡＦ３／６のユビキチン化を阻害することを示すパネルであり、ＴＡＭ活性化がＳＯＣＳ１／３を誘導し、ＴＬＲ４誘導性のＴＲＡＦ３／６のユビキチン化を阻害することを示すパネルであり、図３Ｃと同様に細胞を処理した。全細胞ライセートからＴＲＡＦ３を免疫沈降し、そのユビキチン化をユビキチン抗体（上のブロット）およびＴＲＡＦ３抗体（下のパネル）を用いた免疫ブロッティングで解析した。
【図４Ａ】図４Ａでは、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達がＴＡＭ受容体活性化によって活性化され、ＴＡＭによるＳＯＣＳ遺伝子の誘導とサイトカイン産生の阻害に必要とされることを示すパネルであり、脾臓ＤＣを、表示した時間、５０ｎＭ  Ｇａｓ６とインキュベートし、その後、全細胞ライセートを、活性化されたホスホＳＴＡＴ１  Ｔｙｒ７０１（上のブロット）およびトータルＳＴＡＴ１（下のブロット）についてのイムノブロッティングで解析した。
【図４Ｂ】図４Ｂでは、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達がＴＡＭ受容体活性化によって活性化され、ＴＡＭによるＳＯＣＳ遺伝子の誘導とサイトカイン産生の阻害に必要とされることを示すパネルであり、ＢＭＤＣを、５０ｎＭ  Ｇａｓ６のみと、または１００ｎＭ  ＡｘｌＦＣと１０分間プレインキュベーションした後に５０ｎＭ  Ｇａｓ６とインキュベートした。その後、図４Ａと同様に、全細胞ライセートを解析した。
【図４Ｃ】図４ＣはＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達がＴＡＭ受容体活性化によって活性化され、ＴＡＭによるＳＯＣＳ遺伝子の誘導とサイトカイン産生の阻害に必要とされることを示すパネルであり、ＷＴマウスおよびＳＴＡＴ１ノックアウトマウスに由来するＢＭＤＣを、表示した時間、５０ｎＭ  Ｇａｓ６とインキュベートし、ＳＯＣＳ１のｍＲＮＡの発現をＱＰＣＲで測定した。β-アクチン発現に対するｍＲＮＡレベルを、刺激していない細胞に対して正規化した。エラーバーは、平均±標準偏差、ｎ＝２を表す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達がＴＡＭ受容体活性化によって活性化され、ＴＡＭによるＳＯＣＳ遺伝子の誘導とサイトカイン産生の阻害に必要とされることを示すパネルであり、ＷＴマウスおよびＳＴＡＴ１ノックアウトマウスに由来するＢＭＤＣを、表示した時間、５０ｎＭ  Ｇａｓ６とインキュベートし、ＳＯＣＳ３（図４Ｄ）のｍＲＮＡの発現をＱＰＣＲで測定した。β-アクチン発現に対するｍＲＮＡレベルを、刺激していない細胞に対して正規化した。エラーバーは、平均±標準偏差、ｎ＝２を表す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達がＴＡＭ受容体活性化によって活性化され、ＴＡＭによるＳＯＣＳ遺伝子の誘導とサイトカイン産生の阻害に必要とされることを示すパネルであり、ＷＴマウスおよびＳＴＡＴ１-／-マウスに由来するＢＭ-ＤＣを、単独で（）または５０ｎＭ  Ｇａｓ６とともに（＋）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで刺激した。１５時間後、分泌されたＩＬ６のレベルをＥＬＩＳＡ（検出限界は約４ｐｇ／ｍｌである）で測定した。図４ＥのＳＴＡＴ１-／-の測定値についてｙ軸が拡大されていることに留意されたい。
【図４Ｆ】図４Ｆは、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達がＴＡＭ受容体活性化によって活性化され、ＴＡＭによるＳＯＣＳ遺伝子の誘導とサイトカイン産生の阻害に必要とされることを示すパネルであり、ＷＴマウスおよびＳＴＡＴ１-／-マウスに由来するＢＭ-ＤＣを、単独で（）または５０ｎＭ  Ｇａｓ６とともに（＋）、３ｎＭ  ＣｐＧで刺激した。１５時間後、分泌されたＩＬ６のレベルをＥＬＩＳＡ（検出限界は約４ｐｇ／ｍｌである）で測定した。図４ＦのＳＴＡＴ１-／-の測定値についてｙ軸が拡大されていることに留意されたい。
【図４Ｇ】図４Ｇは、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達がＴＡＭ受容体活性化によって活性化され、ＴＡＭによるＳＯＣＳ遺伝子の誘導とサイトカイン産生の阻害に必要とされることを示すパネルであり、未処理（）または６０分間、５０ｎＭ  Ｇａｓ６で処理した（＋）、ＷＴ（左）またはＩＦＮＡ受容体ノックアウト体（Ｉｆｎａｒ１-／-；右）に由来するＢＭＤＣの全細胞ライセートを、活性化されたホスホ-ＳＴＡＴ１（上のブロット）およびトータルＳＴＡＴ１（下のブロット）についてのイムノブロッティングで解析した。
【図４Ｈ】図４ＨはＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達がＴＡＭ受容体活性化によって活性化され、ＴＡＭによるＳＯＣＳ遺伝子の誘導とサイトカイン産生の阻害に必要とされることを示すパネルであり、、ＷＴマウスまたはＩｆｎａｒ１-／-マウスに由来するＢＭ-ＤＣを、表示した分間、５０ｎＭ  Ｇａｓ６とインキュベートし、ＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡの発現をＱＰＣＲで測定した。β-アクチン発現に対するｍＲＮＡレベルを、刺激していない細胞に対して正規化した。エラーバーは、平均±標準偏差、ｎ＝２を表す。
【図４Ｉ】図４Ｉは、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達がＴＡＭ受容体活性化によって活性化され、ＴＡＭによるＳＯＣＳ遺伝子の誘導とサイトカイン産生の阻害に必要とされることを示すパネルであり、ＷＴマウスおよびＩｆｎａｒ１-／-マウスに由来するＢＭ-ＤＣを、単独で（）または５０ｎＭ  Ｇａｓ６とともに（＋）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで刺激した。１５時間後、分泌されたＩＬ６のレベルをＥＬＩＳＡで測定した。
【図４Ｊ】図４Ｊは、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達がＴＡＭ受容体活性化によって活性化され、ＴＡＭによるＳＯＣＳ遺伝子の誘導とサイトカイン産生の阻害に必要とされることを示すパネルであり、未処理（）または２０分間、５０ｎＭ  Ｇａｓ６で処理した（＋）、全細胞ＢＭＤＣライセートを、Ｉ型ＩＦＮ受容体のＲ１鎖（左のブロット）またはＲ２鎖（右のブロット）に対する抗体で免疫沈降した。これらの免疫沈降物をＳＤＳゲルで分離し、その後、Ａｘｌに対する抗体（上のブロット）、ＩＦＮ受容体Ｒ１鎖に対する抗体（中央、左のブロット）、ＩＦＮ受容体Ｒ２鎖に対する抗体（中央、右のブロット）、またはＳＴＡＴ１に対する抗体（下のブロット）でイムノブロッティングした。Ａｘｌの免疫沈降物を抗ＩＦＮＡＲ１でブロッティングした場合にも、ＡｘｌとＩＦＮ受容体のＲ１鎖との同等の会合が認められた。
【図５Ａ】図５Ａは、ＴＬＲによるＴＡＭシグナル伝達の誘導が、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１依存的に活性化されることを示すパネルであり、ＢＭＤＣを、表示した時間、３０μｇ／ｍｌ  ポリＩ：Ｃまたは１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳとインキュベートし、その後、Ａｘｌ  ｍＲＮＡの発現をＱ-ＰＣＲで測定した。β-アクチン発現に対するｍＲＮＡレベルを、刺激していない細胞に対して正規化した。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝２）を表す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＴＬＲによるＴＡＭシグナル伝達の誘導が、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１依存的に活性化されることを示すパネルであり、刺激していないＷＴ  ＣＤ１１ｃ＋細胞、３０μｇ／ｍｌ  ポリＩ：Ｃで１２時間刺激したＣＤ１１ｃ＋細胞、またはＴＡＭ  ＴＫＯ対照のＣＤ１１ｃ＋細胞上でのＡｘｌ発現の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＴＬＲによるＴＡＭシグナル伝達の誘導が、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１依存的に活性化されることを示すパネルであり、野生型マウス、ＳＴＡＴ１-／-マウス、およびＩＦＮＡＲ-／-マウスから調製されたＢＭＤＣを、表示した時間、３０μｇ／ｍｌ  ポリＩ：Ｃとインキュベートし、その後、Ａｘｌ発現（上のブロット）およびチューブリン発現（下のブロット）についてのイムノブロッティングで全細胞ライセートを解析した。野生型対照は、１２９系統マウス由来である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＴＬＲによるＴＡＭシグナル伝達の誘導が、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１依存的に活性化されることを示すパネルであり、野生型マウス、ＳＴＡＴ１-／-マウス、およびＩＦＮＡＲ-／-マウスから調製されたＢＭＤＣを、表示した時間、３０００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮαとインキュベートし、その後、Ａｘｌ発現（上のブロット）およびチューブリン発現（下のブロット）についてのイムノブロッティングで全細胞ライセートを解析した。野生型対照は、図５Ｄについては１２９系統マウス由来である。
【図５Ｅ】図５Ｅは、ＴＬＲによるＴＡＭシグナル伝達の誘導が、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１依存的に活性化されることを示すパネルであり、野生型マウス、ＳＴＡＴ１-／-マウス、およびＩＦＮＡＲ-／-マウスから調製されたＢＭＤＣを、表示した時間、３０μｇ／ｍｌ  ポリＩ：Ｃとインキュベートし、その後、Ａｘｌ発現（上のブロット）およびチューブリン発現（下のブロット）についてのイムノブロッティングで全細胞ライセートを解析した。野生型対照は、Ｃ５７Ｂｌ／６由来である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＴＡＭ受容体シグナル伝達とＩＦＮ受容体シグナル伝達の統合を示すいくつかのパネルであり、ＷＴマウスおよびＴＡＭ  ＴＫＯマウスに由来する脾臓ＣＤ１１ｃ＋細胞を、表示した時間、３００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮαとインキュベートし、その後、ＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡの発現をＱ-ＰＣＲで測定した。β-アクチンに対するｍＲＮＡレベルを、刺激していない細胞に対して正規化した。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝４）を表す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＴＡＭ受容体シグナル伝達とＩＦＮ受容体シグナル伝達の統合を示すいくつかのパネルであり、図６Ａで使用したのと同じｍＲＮＡ試料を、ＩＲＦ-７  ｍＲＮＡの発現についてＱ-ＰＣＲで解析した。β-アクチンに対するｍＲＮＡレベルを、刺激していない細胞に対して正規化した。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝４）を表す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＴＡＭ受容体シグナル伝達とＩＦＮ受容体シグナル伝達の統合を示すいくつかのパネルであり、図６Ａで使用したのと同じｍＲＮＡ試料を、ＩＦＩ-２０４  ｍＲＮＡの発現についてＱ-ＰＣＲで解析した。β-アクチンに対するｍＲＮＡレベルを、刺激していない細胞に対して正規化した。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝４）を表す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＴＡＭ受容体シグナル伝達とＩＦＮ受容体シグナル伝達の統合を示すいくつかのパネルであり、５０ｎＭ  Ｇａｓ６、３０Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮα、またはＧａｓ６＋ＩＦＮαと２時間インキュベートしたＢＭＤＣから調製したＲＮＡ試料を、ＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡ（左）、ＩＲＦ-７  ｍＲＮＡ（中央）、およびＩＦＩ-２０４  ｍＲＮＡ（右）の発現についてＱ-ＰＣＲで解析した。β-アクチンに対するｍＲＮＡレベルを、刺激していない細胞に対して正規化した。
【図７Ａ】図７Ａは、ＴＡＭ受容体シグナル伝達によって調節される、炎症と阻害のサイクルを示すパネルであり、ＤＣにおけるＴＬＲシグナル伝達経路、サイトカイン受容体シグナル伝達経路、およびＴＡＭ受容体シグナル伝達経路の連続的な関与を模式的に示すものである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＴＡＭ受容体シグナル伝達によって調節される、炎症と阻害のサイクルを示すパネルであり、ＴＬＲライゲーションによって開始される炎症サイクルを模式的に示すものである。ＴＬＲの活性化が、初期のサイトカインバーストを引き起こす。その後、このバーストは、第二段階で、サイトカイン受容体を介するフィードフォワードループによって増幅される。同時に、サイトカイン受容体の活性化は、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１依存的なＡｘｌの誘導を引き起こす。炎症サイクルの最後の段階は、ＴＡＭシグナル伝達の関与、ＳＯＣＳ遺伝子の転写、およびサイトカイン受容体シグナル伝達経路とＴＬＲシグナル伝達経路の両方の多面的な阻害を伴う。ＴＡＭによって促進される、このサイクルのこの最後の阻害段階もＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達カセットに依存し、これは、ＴＡＭ受容体と物理的に関連する。
【図８Ａ】図８Ａは、プロテインＳによるＴＡＭ受容体活性化が、サイトカイン産生とＴＬＲ９シグナル伝達経路の保存された構成要素とを阻害することを示すパネルであり、単独で（）または３ｎＭ  ＰｒｏＳとともに（＋）、１０ｎＭ  ＣｐＧで刺激してから１５時間後のＤＣからのＩＦＮαの相対的な産生の定量的表示を示す。実施例１で詳細に記載しているようにサイトカイン産生を測定した。ＣｐＧのみが存在するときのＩＦＮα産生に対して結果を正規化した。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝３、ｐ＜０．０１）を表す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、プロテインＳによるＴＡＭ受容体活性化が、サイトカイン産生とＴＬＲ９シグナル伝達経路の保存された構成要素とを阻害することを示すパネルであり、表示した分間、ＣｐＧのみでまたはＰｒｏＳと２時間プレインキュベーションした後にＣｐＧで活性化されたＢＭＤＣ由来の全細胞ライセートにおけるホスホ-ｐ３８  Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２（上のブロット）、ホスホ-ＥＲＫ１／２  Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５（中央のブロット）、およびチューブリン（下のブロット）の発現のウェスタンブロット解析を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、プロテインＳによるＴＡＭ受容体活性化が、サイトカイン産生とＴＬＲ９シグナル伝達経路の保存された構成要素とを阻害することを示すパネルであり、図８Ｂに記載した全細胞ライセートにおけるＩκＢα（上のブロット）、ＩκＢβ（中央のブロット）、およびチューブリン（下のブロット）の発現の定量的Ｌｉ-Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙウェスタンブロット解析を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、プロテインＳによるＴＡＭ受容体活性化が、サイトカイン産生とＴＬＲ９シグナル伝達経路の保存された構成要素とを阻害することを示すパネルであり、図８Ｃに示したウェスタンブロット解析から得られる表示した分間でのＩκＢα／チューブリンおよびＩκＢβ／チューブリンのシグナル比を示す棒グラフを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＴＡＭ受容体活性化が、ＴＬＲ３シグナル伝達経路とＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害することを示すパネルであり、表示した分間、ポリＩ：ＣのみでまたはＧａｓ６と２時間プレインキュベーションした後にポリＩ：Ｃで活性化されたＢＭＤＣ由来の全細胞ライセートにおけるホスホ-ｐ３８  Ｔｈｒ１８０／Ｔｈｒ１８２（上のパネル）およびトータルｐ３８（下のパネル）の発現のウェスタンブロット解析を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＴＡＭ受容体活性化が、ＴＬＲ３シグナル伝達経路とＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害することを示すパネルであり、図９Ａで記載したように調製された全細胞ライセートにおける、ＩκＢαおよびチューブリンの発現の定量的Ｌｉ-Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙウェスタンブロット解析を示す。右の棒グラフは、表示した時間でのＩκＢα／チューブリンのシグナル比を示す。（エラーバーは、平均±標準偏差；ｎ＝３を表す。）
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＴＡＭ受容体活性化が、ＴＬＲ３シグナル伝達経路とＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害することを示すパネルであり、表示した時間、ＬＰＳのみでまたはＧａｓ６と２時間プレインキュベーションした後にＬＰＳで活性化された、ＢＭＤＣ由来の全細胞ライセートにおけるホスホ-ｐ３８  Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２（上のブロット）、およびトータルｐ３８（下のブロット）の発現のウェスタンブロット解析を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＴＡＭ受容体活性化が、ＴＬＲ３シグナル伝達経路とＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害することを示すパネルであり、表示した時間、ＬＰＳのみでまたはＧａｓ６と２時間プレインキュベーションした後にＬＰＳで活性化された、ＢＭＤＣ由来の全細胞ライセートにおけるホスホ-ＥＲＫ１／２  Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５（上のブロット）、およびトータルＥＲＫ２（下のブロット）の発現のウェスタンブロット解析を示す。
【図１０Ａ】は、ＴＬＲシグナル伝達経路における受容体近接点のＴＡＭ受容体阻害はＳＴＡＴ１を必要とするが、ＳＴＡＴ２またはＳＴＡＴ３を活性化しないことを示すパネルであり、野生型マウス（左のブロット）またはＴＡＭ  ＴＫＯマウス（右のブロット）から調製されたＢＭＤＣを、５０ｎＭ  Ｇａｓ６なしで（）または５０ｎＭ  Ｇａｓ６とともに（＋）６０分間インキュベートし、その後、これらの細胞のライセートを、ホスホ-ＳＴＡＴ１（上のブロット）およびトータルＳＴＡＴ１（下のブロット）の発現についてのイムノブロッティングで解析した。
【図１０Ｂ】は、ＴＬＲシグナル伝達経路における受容体近接点のＴＡＭ受容体阻害はＳＴＡＴ１を必要とするが、ＳＴＡＴ２またはＳＴＡＴ３を活性化しないことを示すパネルであり、脾臓ＤＣを、表示した時間、５０ｎＭ  Ｇａｓ６とインキュベートし、その後、全細胞ライセートを、ホスホ-ＳＴＡＴ２（上のブロット）、トータルＳＴＡＴ２（二番目のブロット）、ホスホ-ＳＴＡＴ３（三番目のブロット）、およびトータルＳＴＡＴ３（下のブロット）についてのイムノブロッティングで解析した。
【図１０Ｃ】は、ＴＬＲシグナル伝達経路における受容体近接点のＴＡＭ受容体阻害はＳＴＡＴ１を必要とするが、ＳＴＡＴ２またはＳＴＡＴ３を活性化しないことを示すパネルであり、ＳＴＡＴ１-／-マウス（左のブロット）またはＴＡＭ  ＴＫＯマウス（右のブロット）から調製されたＢＭＤＣを、１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳのみと３０分間、または５０ｎＭ  Ｇａｓ６と２時間プレインキュベーションした後にＬＰＳと３０分間、インキュベートした。全細胞ライセートからＴＲＡＦ６を免疫沈降し、免疫沈降物をユビキチン抗体（上のブロット）およびＴＲＡＦ６抗体（下のパネル）を用いたイムノブロッティングで解析した。
【図１０Ｄ】は、ＴＬＲシグナル伝達経路における受容体近接点のＴＡＭ受容体阻害はＳＴＡＴ１を必要とするが、ＳＴＡＴ２またはＳＴＡＴ３を活性化しないことを示すパネルであり、野生型（左のブロット）またはＳＴＡＴ１-／-（右のブロット）のいずれかのＢＭＤＣから調製され、表示した分間、ＬＰＳのみで、または５０ｎＭ  Ｇａｓ６で２時間プレインキュベーションした後にＬＰＳで活性化された、全細胞ライセートを、ＩκＢα（上のブロット）およびチューブリン（下のブロット）についてプローブしたＬｉ-Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙウェスタンブロットで解析した。
【図１１】図１１は、ＴＡＭ三重変異体マウス（Ｔｙｒｏ３-／-ＡＸＬ-／-Ｍｅｒ-／-）が、免疫化した後、２週間で、野生型（ＷＴ）マウスよりも約３．５倍高い抗体力価を産生することを示す棒グラフである。ＷＴマウスならびに様々なＴＡＭ単一変異体マウス、ＴＡＭ二重変異体マウス、およびＴＡＭ三重変異体マウス（図示）を、アラムとともに、炭疽ワクチンにおける主な免疫原である組換え防御抗原（ｒＰＡ）で免疫化した。初回免疫化した２週間後に、ｒＰＡに対する血清抗体をＥＬＩＳＡで測定した。（平均抗体力価を示す；各コホートにおいてｎ＞５マウス；エラーバーは標準偏差を表す。）
【図１２】図１２は、ＴＡＭ三重変異体マウス（Ｔｙｒｏ３-／-ＡＸＬ-／-Ｍｅｒ-／-）が、２０ｕｇの炭疽防御抗原で免疫化した２週間後に、ＷＴマウスよりも約４倍高いトータルのＩｇＧ応答（κ）を産生することを示す棒グラフである。
【００１４】
配列表
添付の配列表に記載された核酸配列は、米国特許法第１条８２２項に定義されている、ヌクレオチド塩基についての標準的な文字の略号を用いて示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、提示された鎖を参照することにより相補鎖が含まれるものと理解される。添付の配列表は以下の通りである。
配列番号１は、アクチン用のＱＰＣＲフォワードプライマーを示す。
配列番号２は、アクチン用のＱＰＣＲリバースプライマーを示す。
配列番号３は、ＡＸＬ用のＱＰＣＲフォワードプライマーを示す。
配列番号４は、ＡＸＬ用のＱＰＣＲリバースプライマーを示す。
配列番号５は、ＢＡＦＦ（Ｂｌｙｓｓ）用のＱＰＣＲフォワードプライマーを示す。
配列番号６は、ＢＡＦＦ（Ｂｌｙｓｓ）用のＱＰＣＲリバースプライマーを示す。
配列番号７は、ＧＡＰＤＨ用のＱＰＣＲフォワードプライマーを示す。
配列番号８は、ＧＡＰＤＨ用のＱＰＣＲリバースプライマーを示す。
配列番号９は、ＩＦＮβ用のＱＰＣＲフォワードプライマーを示す。
配列番号１０は、ＩＦＮβ用のＱＰＣＲリバースプライマーを示す。
配列番号１１は、ＩＲＡＫ-Ｍ用のＱＰＣＲフォワードプライマーを示す。
配列番号１２は、ＩＲＡＫ-Ｍ用のＱＰＣＲリバースプライマーを示す。
配列番号１３は、ＳＨＩＰ用のＱＰＣＲフォワードプライマーを示す。
配列番号１４は、ＳＨＩＰ用のＱＰＣＲリバースプライマーを示す。
配列番号１５は、ＳＯＣＳ１用のＱＰＣＲフォワードプライマーを示す。
配列番号１６は、ＳＯＣＳ１用のＱＰＣＲリバースプライマーを示す。
配列番号１７は、ＳＯＣＳ３用のＱＰＣＲフォワードプライマーを示す。
配列番号１８は、ＳＯＣＳ３用のＱＰＣＲリバースプライマーを示す。
配列番号１９は、ＣｐＧ-ＯＤＮ  １６６８の核酸配列を示す。
配列番号２０は、ヒトＧａｓ６のＧｌａドメインを示す。
配列番号２１は、ヒトプロテインＳのＧｌａドメインを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．いくつかの実施形態の概説
ＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒ）受容体阻害剤が免疫増強に有効であるという驚くべき発見を利用する方法を本明細書で開示する。１つの実施形態において、対象の免疫応答を増強するための方法を提供する。本方法は、免疫増強を必要とする対象に治療的有効量のＴＡＭ受容体阻害剤を投与し、それによって対象の免疫応答を増強する工程を含むことができる。本方法のある例において、ＴＡＭ受容体は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒである。特定の例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、この受容体の生物学的活性を大幅にまたは完全に低下させる（例えば、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の低下）。ある例において、ＴＡＭ受容体阻害剤（例えば、小分子阻害剤）は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒの細胞内ドメイン（例えば、ＡＴＰ結合部位）に結合する。別の例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、ＴＡＭ受容体の細胞外ドメインに結合する。このような例において、阻害剤は、ＴＡＭ受容体リガンドが受容体に結合するのを妨害するか、さもなければ受容体の完全な活性化を妨げることができる。同様に、ＴＡＭ受容体阻害剤は、ＴＡＭ受容体リガンド（例えば、Ｇａｓ６またはプロテインＳ）に結合し、それによってこのリガンドがＴＡＭ受容体の細胞外ドメインに結合することおよび／またはＴＡＭ受容体を活性化することを妨害することができる。さらに別の例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、ＴＡＭ受容体またはそのリガンドの発現を減少させるかまたは阻害するもの（例えば、ＲＮＡｉ分子）である。例示的なＴＡＭ受容体阻害剤としては、小分子阻害剤、抗体、およびｓｉＲＮＡが挙げられる。さらにより特別な例において、ＴＡＭ阻害剤は、ＭＰ４７０、ＳＧＩ-ＡＸＬ-２７７、ＡＸＬ-１、ＡＸＬ-２、ＡＸＬ-３、ＡＸＬ-４、ＡＸＬ-５、ＡＸＬ-６、ＡＸＬ-７、ＡＸＬ-８、もしくはＡＸＬ-９またはこれらの誘導体である。ある例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、約５０μＭ未満のＩＣ５０を有し、さらにより特別な例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、約１ｐＭ〜約５μＭのＩＣ５０を有する。
【００１６】
開示される免疫増強法のいくつかの実施形態は、対象に治療的有効量のワクチンを投与し、それによってこのワクチンに対する免疫応答を増強する工程も含む。いくつかの例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、ワクチンと実質的に同時に対象に投与され、特定の例において、ワクチンは、対象の腫瘍に対して活性化された樹状細胞（ＤＣ）を含む。
【００１７】
開示される免疫増強法の他の実施形態は、対象の腫瘍を治療する方法、免疫抑制の疾患を治療する方法、および敗血症（例えば、敗血症性ショック、重度の炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）、または重度のＳＩＲＳ）を治療する方法である。いくつかの例において、本方法は、感染症の治療を必要とする対象の感染症を治療する方法であり、特定の例において、対象は、免疫低下状態または免疫抑制状態である。
【００１８】
ＴＡＭ受容体作動薬が、例えば、自己免疫疾患、アレルギー、移植片対宿主病、または移植片拒絶反応の治療または予防のための、免疫抑制に有用であるという驚くべき発見も本明細書で開示する。本開示の１つの実施形態は、対象の免疫応答を抑制する方法である。本方法は、免疫抑制を必要とする対象に治療的有効量のＴＡＭ受容体作動薬を投与し、それによってこの対象の免疫応答を抑制する工程を含む。特定の例において、ＴＡＭ受容体作動薬は、この受容体の生物学的活性を大幅に増大させる（例えば、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％の増大）。ある例において、ＴＡＭ受容体は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒである。例示的なＴＡＭ受容体作動薬としては、ＧＡＳ６およびプロテインＳなどのＴＡＭリガンド、ならびにアミノ末端切断型のＧＡＳ６およびプロテインＳ（例えば、ＧｌａドメインもしくはＥＧＦドメインを有さないものまたは部分的なＧｌａドメインもしくはＥＧＦドメインを有するもの）が挙げられる。他の例示的なＴＡＭ受容体作動薬としては、ＴＡＭ受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、例えば、この受容体を架橋してＴＡＭ受容体二量体にすることによって、この受容体を活性化することができる薬剤が挙げられる。ある例において、ＴＡＭ作動薬は、約５０μＭ未満（例えば、約１ｐＭ〜約５μＭ）のＥＣ５０を有する。
【００１９】
開示される免疫抑制法の他の例は、対象に治療的有効量の追加の免疫抑制剤を投与し、それによって対象の免疫応答を抑制する工程をさらに含む。いくつかの例において、ＴＡＭ受容体作動薬は、免疫抑制剤と実質的に同時に対象に投与される。ある例において、対象は免疫低下状態である。
【００２０】
開示される免疫抑制法のある実施形態は、対象の自己免疫疾患を治療する方法、アレルギーを治療する方法、移植片対宿主病を治療する方法、または移植片拒絶反応を治療もしくは予防する方法である。いくつかの例において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、腎線維症、肺線維症、肝線維症、アジソン病、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、またはグレーブス病である。さらに他の例において、本方法は、移植片対宿主病の治療を必要とする対象の移植片対宿主病を治療する方法または移植片を拒絶する危険性がある対象の移植片拒絶反応を治療する方法である。
【００２１】
免疫調整剤をスクリーニングする方法も開示する。本方法のいくつかの例は、ＴＡＭ受容体を発現する細胞を試験薬剤と接触させる工程、およびこの試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を変化させるかどうかまたはこの試験薬剤がリガンドのＴＡＭ受容体への結合を阻害するかどうかを決定する工程を含む。ＴＡＭ受容体活性を増大させるかまたはリガンドのＴＡＭ受容体への結合を増強する試験薬剤を免疫抑制剤と同定し、ＴＡＭ受容体活性を阻害するかまたはリガンドのＴＡＭ受容体への結合を低下させるもしくは阻害する試験薬剤を免疫増強剤と同定する。ある例において、ＴＡＭ受容体は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒである。いくつかの例において、本方法は、さらなる解析のために免疫増強剤または免疫抑制剤であることが示される試験薬剤を選択する工程を含むことができる。特定の例において、細胞は実験用哺乳動物のものであり、この細胞を試験薬剤と接触させることには、この試験薬剤をこの哺乳動物に投与することが含まれる。
【００２２】
いくつかの例において、本方法は、免疫増強剤をスクリーニングし、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を顕著に低下させるかどうかまたは阻害するかどうかを決定する方法である。本方法は、細胞を試験薬剤と接触させる工程、ならびにこの試験薬剤が：ｉ．対照（例えば、この試験薬剤と接触していない細胞）と比較してＴＡＭ自己リン酸化を変化させるかどうか（ここで、この試験薬剤の存在下での対照と比べたＴＡＭ自己リン酸化の顕著な低下は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を顕著に低下させるかもしくは阻害することを示す）、ｉｉ．対照と比較してＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生を変化させるかどうか（ここで、この試験薬剤の存在下での対照と比べたＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の増大は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害することを示す）、ｉｉｉ．対照（例えば、この試験薬剤と接触していない細胞）と比較してＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激を変化させるかどうか（ここで、この試験薬剤の存在下での対照と比べたＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激の増大は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を顕著に低下させるかもしくは阻害することを示す）、および／またはｉｖ．対照（例えば、この試験薬剤と接触していない細胞）と比較してＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化を変化させるかどうか（ここで、この試験薬剤の存在下での対照と比べたＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を顕著に低下させるかもしくは阻害することを示す）を決定する工程を含むことができる。いくつかの例において、対照は、試験薬剤と接触していない細胞について得られる値であるか、またはＴＡＭ受容体活性が増大するか、減少するか、もしくは変化しない場合に期待される参照値（もしくは値の範囲）である。
【００２３】
さらに他の例において、本方法は、免疫抑制剤をスクリーニングし、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させるかどうかを決定する方法である。本方法は、細胞を試験薬剤と接触させる工程ならびにこの試験薬剤が：ｉ．ＴＡＭ自己リン酸化の対照レベルと比較してＴＡＭ自己リン酸化を変化させるかどうか（ここで、この試験薬剤の存在下での対照と比べたＴＡＭ自己リン酸化の増大は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させることを示す）、ｉｉ．対照と比較してＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生を変化させるかどうか（ここで、この試験薬剤の存在下での対照と比べたＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の減少は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させることを示す）、ｉｉｉ．対照と比較してＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激を変化させるかどうか（ここで、この試験薬剤の存在下での対照と比べたＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激の減少は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させることを示す）、および／またはｉｖ．対照と比較してＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化を変化させるかどうか（ここで、この試験薬剤の存在下での対照と比べたＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の減少は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させることを示す）を決定する工程を含むことができる。いくつかの例において、対照は、試験薬剤と接触していない細胞について得られる値であるか、またはＴＡＭ受容体活性が増大するか、減少するか、もしくは変化しない場合に期待される参照値（もしくは値の範囲）である。
【００２４】
またさらなる例において、本方法は、（ａ）細胞を試験薬剤と接触させる前にＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の対照レベルを測定し、（ｂ）この細胞をこの試験薬剤と接触させ、（ｃ）この細胞をこの試験薬剤と接触させることが、ＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の対照レベルと比較してＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現を変化させるかどうかを決定することによって、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を変化させるかどうかを決定する工程を含むことができる。この試験薬剤の存在下での対照レベルと比べたＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の低下は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害し、このような試験薬剤が免疫増強剤として同定されることを示す。この試験薬剤の存在下での対照レベルと比べたＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の増大は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させ、このような試験薬剤が免疫抑制剤として同定されることを示す。
【００２５】
ある例において、本方法は、免疫抑制剤をスクリーニングする方法であり、ＴＡＭ受容体を発現する細胞を試験薬剤と接触させる工程は、この細胞をＴＡＭ受容体作動薬の存在下でこの試験薬剤と接触させる工程を含む。例えば、ＴＡＭ受容体リガンド（例えば、Ｇａｓ６もしくはプロテインＳ）などのＴＡＭ受容体作動薬、アミノ末端切断型のリガンド（例えば、完全なＧｌａドメインもしくはＥＧＦドメインを有さないかもしくは部分的なＧｌａドメインもしくはＥＧＦドメインしか有さないＧａｓ６もしくはプロテインＳ）、またはＴＡＭ受容体の細胞外ドメインに結合し、ＴＡＭ受容体を架橋し、ＴＡＭ受容体二量体となってＴＡＭ受容体を活性化することができる抗体を使用することができる。
【００２６】
ＩＩ．略語
ＡＩＤＳ        後天性免疫不全症候群
ＡＰＣ          抗原提示細胞
ＢＭ            骨髄
ＢＳＡ          ウシ血清アルブミン
ＣＭＶ          サイトメガロウイルス
ＤＣ            樹状細胞
ＤＴＴ          ジチオスレイトール
ＥＬＩＳＡ      酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＡＣＳ        蛍光活性化細胞選別
ＦＩＶ          ネコ免疫不全ウイルス
ＧＡＳ６        増殖停止特異的タンパク質６
ＨＩＢ          Ｂ型インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）
ＨＩＶ          ヒト免疫不全ウイルス
ＨＰＶ          ヒトパピローマウイルス
ＨＳＶ          単純ヘルペスウイルス
ＨＺＶ          帯状疱疹
ＩＦＮ          インターフェロン
ＩＬ            インターロイキン
ＩＲＦ          インターフェロン応答因子
ＬＤＳ          ドデシル硫酸リチウム
ＮＨＬ          非ホジキンリンパ腫
ＯＨＬ          口腔毛状白板症
ＰＣＰ          ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  Ｃａｒｉｎｉｉ）肺炎
ＰＭＬ          進行性多巣性白質脳症
ＰＳ            ホスファチジルセリン
ＰＴＫ          タンパク質-チロシンキナーゼ
ＰＶＤＦ        ポリビニルジフルオライド
Ｑ-ＰＣＲ       定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＩＡ          ラジオイムノアッセイ
ｒＰＡ          組換え防御抗原
ＳＣＩＤ        重症複合免疫不全症
ＳＤＳ          ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＨＢＧ        性ホルモン結合グロブリン
ＳＩＲＳ        重度の炎症応答症候群  
ＳＩＶ          サル免疫不全ウイルス
ＳＬＥ          全身性エリテマトーデス
ＳＯＣＳ        サイトカインシグナル伝達の抑制因子
ＴＡＭ          Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒ
ＴＡＭ ＴＫＯ   ＴＡＭ三重変異体
ＴＢＳ          ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水
ＴＬＲ          Ｔｏｌｌ様受容体
ＴＮＦ          腫瘍壊死因子
ＴＲＡＦ        ＴＮＦ受容体関連因子
ＷＴ            野生型
【００２７】
ＩＩＩ．用語
本開示の様々な実施形態を概説しやすくするために、特定の用語に関する以下の説明を提供する。
【００２８】
アジュバント：例えば、抗原性を増強するのに使用されるビヒクルまたはビヒクルの成分を投与される対象において抗原性を増強するのに使用されるビヒクルまたはビヒクルの成分。アジュバントの具体的で非限定的な例としては、抗原が吸着するミネラル（例えば、アラム、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液；抗原溶液がミネラルオイル中で乳化されている油中水乳濁液（例えば、フロイントの不完全アジュバント）、抗原性をさらに増強する（抗原の分解を大幅に低下させるかもしくは阻害するおよび／またはマクロファージの流入を引き起こす）ために、死滅したマイコバクテリウムを含むこともある（例えば、フロイントの完全アジュバント）；ならびに免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えば、ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号、米国特許第６，２０７，６４６号、米国特許第６，２１４，８０６号、米国特許第６，２１８，３７１号、米国特許第６，２３９，１１６号、米国特許第６，３３９，０６８号、米国特許第６，４０６，７０５号、および米国特許第６，４２９，１９９号参照）が挙げられる。アジュバントの他の非限定的な例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）、インターロイキン-２（ＩＬ-２）、顆粒球単球-コロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、ＱＳ２１、モンタニドＩＳＡ-５１、および本明細書で記載される、ＴＡＭ受容体阻害剤が挙げられる。
【００２９】
投与：経口投与と非経口投与の両方、および膣投与と直腸投与を含む。一般に、非経口製剤とは、経口摂取以外の任意の可能な様式で投与される製剤である。この用語は、例えば、静脈内投与、髄腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、関節内投与、または皮下投与を問わない注射、ならびに鼻腔内適用、吸入による適用、皮内適用、および局所適用を含む様々な表面適用も指す。
【００３０】
アレルギー：ほとんどの人では免疫応答を誘発しない物質に対する過剰な免疫応答または免疫反応によって引き起こされる一群の症状であり、したがって免疫介在性障害の一例である。「アレルギー」という用語は、Ｉ型過敏症（ＩｇＥ介在性アレルギー）と同義語になっている。多くの抗原によって引き起こされる可能性がある異なる免疫反応への理解を高めるための教育的手段として、ＣｏｏｍｂとＧｅｌｌにより、４つの異なるタイプの過敏症が記載された（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型）。実際には、これらのタイプは、必ずしも互いに孤立して生じるわけではない。
【００３１】
アレルギー性疾患は、通常、小児期に始まるが、年齢を問わず発症する場合がある。アレルギー性疾患の発症は、遺伝に起因するアレルギー体質と環境要因および健康要因に起因するアレルギー体質と関連する。アレルギー応答は、アレルゲン特異的なＩｇＥ抗体の産生の増大を伴い、それによって、鼻炎、喘息、湿疹、疝痛、または下痢などの臨床症状が生じることがある。過敏症状態は、アレルギー反応を伴うことが多い。この過敏症が気道で起こると、ほこり、たばこの煙、冷気、および香水のようなありふれた刺激によって、アレルギー様の症状が生じることがある。
【００３２】
抗感染症剤：対象の感染症を治療する際に有用な物質（例えば、化学的化合物、タンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または他の分子）。抗感染症剤としては、抗真菌化合物、抗ウイルス化合物、および抗生物質が挙げられるが、これらに限定されない。抗生物質としては、アモキシシリン、クラリスロマイシン、セフロキシム、セファレキシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、メトロニダゾール、テルビナフィン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、テトラサイクリン、およびアジスロマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。抗真菌化合物としては、クロトリマゾール、ブテナフィン、ブトコナゾール、シクロピロクス、クリオキノール、クリオキノール、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナフチフィン、ナイスタチン、オキシコナゾール、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チオコナゾール、およびトルナフテートが挙げられるが、これらに限定されない。抗ウイルス化合物としては、ジドブジン、ディダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、テノホビル、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、サキナビル、アンプレナビル、およびロピナビルが挙げられるが、これらに限定されない。抗感染症剤として、高力価免疫グロブリンも挙げられる。高力価免疫グロブリンは、対象となる物質で免疫化されたドナーから、またはドナーのプールから単離されるγグロブリンである。具体的には、高力価免疫グロブリンは、病原体に対するワクチン接種を繰り返し受けたドナーから精製される抗体である。
【００３３】
関節炎：体の１つ以上の関節滑膜を冒す炎症性疾患。これは、最も一般的なタイプの関節疾患であり、関節の炎症を特徴とする。この疾患は、通常、小関節性である（少数の関節を冒す）が、全身化することもある。よく罹患する関節としては、股関節、膝、下部腰椎および下部頸椎、指の近位指節間関節および遠位指節間関節、第一手根中手関節、ならびに足の第一足根中足関節が挙げられる。
【００３４】
１つのタイプの関節炎は反応性関節炎であり、これは、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、およびカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）を含む、種々の微生物の尿路感染または胃腸感染に続発する急性の非化膿性関節炎である。微生物成分は、患部の関節中に見られる。この関節炎は、突然現れ、膝および足首を冒す傾向にあるが、時に、手首、手指、および／または足指を冒すこともある。治療しなければ、この関節炎は１年ほど持続し、その後、通常は弱まるが、ごく稀に強直性脊椎炎を伴う。疾患が細菌感染によって引き起こされているという証拠があるにもかかわらず、生菌が患部の関節中に存在することは滅多になく、抗生物質による治療で寛解することはほとんどない。
【００３５】
別のタイプの関節炎は関節リウマチである。関節リウマチは、体の複数の関節滑膜を冒す慢性全身性炎症性疾患である。この疾患は全身性であるために、関節外の疾患特性も多い。例えば、神経障害、強膜炎、リンパ節症、心膜炎、脾腫、動脈炎、およびリウマチ結節は、この疾患の頻出要素である。関節リウマチのほとんどの症例において、対象は、症状の寛解と増悪を繰り返す。関節リウマチは、後天性であり、遺伝的要因が一因であるように思われる自己免疫疾患と考えられる。
【００３６】
自己免疫障害：免疫系が内在性抗原に対する免疫応答（例えば、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答）を産生し、結果として組織を傷害する障害。例えば、特に、関節リウマチは自己免疫傷害であり、また、橋本甲状腺炎、悪性貧血、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、乾癬、腎線維症、肺線維症、および肝線維症、アジソン病、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、およびグレーブス病も同様である。
【００３７】
生物テロ薬剤：意図的に撒き散らしてヒトまたは動物に疾患または死をもたらすことができる任意の病原体（例えば、細菌およびウイルス）または毒素。生物テロ薬剤の例としては、炭疽の原因となる炭疽菌、ペストの原因となるペスト菌、および天然痘の原因となる大痘瘡（Ｖａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒ）、ダニ媒介脳炎の原因となるダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、エボラの原因となるエボラウイルスが挙げられる。生物テロ薬剤の例としては、特定の生物によって産生される毒素である生物毒素も挙げられる。例示的な生物毒素は、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）という細菌によって産生されるボツリヌス毒素、およびヒマシ油種子から単離することができるリシンである。欧米の拡散防止機関によって、現在、２３種類の細菌、４３種類のウイルス、および１４種類の生物毒素が潜在的な生物テロ薬剤と認められている。
【００３８】
生物テロ薬剤の他の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌、コブラ毒、貝毒、ボツリヌス毒素、サキシトキシン、リシン毒素、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（シゲラ・バチルス（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌｕｓ））、サルモネラ菌、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、トリコテセンのマイコトキシン、アフラトキシンが挙げられるが、これらに限定されない。生物テロ薬剤は、クリプトコッカス症、ブルセラ症（波状熱）、コクシジオイデス症（サン・ホアキン渓谷熱または砂漠熱）、オウム病（オウム熱）、腺ペスト、ツラレミア（野兎病）、マラリア、コレラ、腸チフス、出血熱、ダニ媒介脳炎、ベネズエラウマ脳炎、肺ペスト、ロッキー山発疹熱、デング熱、リフトバレー熱、ジフテリア、類鼻疽、鼻疽、結核、感染性肝炎、脳炎、ブラストミセス症、ノカルジア症、黄熱病、発疹チフス、およびＱ熱を引き起こし得る。
【００３９】
癌：分化の喪失、増殖速度の増大、周囲組織への浸潤を伴う特徴的な退形成を経て、転移能を有する悪性新生物。例えば、甲状腺癌は、甲状腺組織にまたは甲状腺組織から発生する悪性新生物であり、乳癌は、乳房組織にまたは乳房組織から発生する悪性新生物（例えば、腺管癌）である。残存癌は、甲状腺癌を縮小または根絶するために対象に施される任意の形態の治療の後に対象に残る癌である。転移癌は、転移癌が派生するもとの（原発の）癌の発生部位以外の体の１つ以上の部位にある癌である。
【００４０】
化学療法；化学療法剤：本明細書で使用する場合、異常な細胞増殖を特徴とする疾患の治療において治療的有用性を有する薬剤（例えば、抗新生物剤）が含まれる。このような疾患としては、腫瘍、新生物、および癌、ならびに乾癬などの過形成性増殖を特徴とする疾患が含まれる。１つの実施形態において、化学療法剤は、固形腫瘍などの新生物を治療するのに有用な薬剤である。１つの実施形態において、化学療法剤は放射性分子である。当業者は、化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ'ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１４版、第８６章、ＳｌａｐａｋおよびＫｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ；Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  第２版（著作権）、２０００  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ社、第１７章、Ｐｅｒｒｙら，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ；Ｂａｌｔｚｅｒ  Ｌ，Ｂｅｒｋｅｒｙ  Ｒ（編）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，第２版．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ-Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＤＳ，Ｋｎｏｂｆ  ＭＦ，Ｄｕｒｉｖａｇｅ  ＨＪ（編）：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第４版．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ-Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，１９９３参照）。
【００４１】
対照：参照標準。いくつかの例において、対照は、試験薬剤で処理されていない試料における分子の活性（例えば、ＴＡＭ受容体活性またはＴＡＭリガンド結合活性）を示す既知の値（または値の範囲）であることができる。試験試料と対照の間の差は、増大かまたは逆に減少であり得る。この差は、定性的な差または定量的な差、例えば、統計的に有意な差であり得る。いくつかの例において、差は、対照と比べた、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、または５００％超の増大または減少である。
【００４２】
いくつかの例において、検出されるリン酸化タンパク質および／または非リン酸化タンパク質の量を対照と比較することができる。いくつかの実施形態において、対照は、タンパク質（例えば、ＴＡＭ受容体）の基礎リン酸化から形成される、リン酸化タンパク質の量（例えば、ＴＡＭ受容体リン酸化）を示す既知の値である。他の実施形態において、対照は、既知量のＴＡＭ受容体リガンドの存在下での活性の量（例えば、リン酸化または生物学的活性）を示す値である。さらに他の実施形態において、対照は、試験薬剤と接触していない試料において形成されるリン酸化ペプチドの量である。当業者は、使用されるペプチドの総量と検出されるリン酸化ペプチドの量の差から非リン酸化ペプチドの量を決定することができることを理解するであろう。対照と比較した、試験薬剤の存在下での活性の量の差は、この試験薬剤が、（例えば、免疫増強用の）ＴＡＭ受容体阻害剤または（例えば、免疫抑制用の）ＴＡＭ受容体作動薬として有用であり得るということを示し得る。
【００４３】
樹状細胞（ＤＣ）：一次免疫応答に関与する主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）。樹状細胞には、形質細胞様樹状細胞と従来型樹状細胞が含まれる。これら細胞の主な機能は、組織で抗原を得て、リンパ様器官に移動し、Ｔ細胞を活性化するために抗原を提示することである。未成熟な樹状細胞は骨髄で発生し、未成熟細胞として末梢に存在する。
【００４４】
ＥＣ５０：薬理学で使用される濃度の単位。ＥＣ５０（半最大有効濃度）は、基準値と最大値の中間の応答を誘導する薬剤（例えば、リガンドまたは抗体）の濃度を指す。これは、薬効の尺度としてよく使用される。したがって、段階的な用量応答曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が観察される化合物の濃度を表す。悉無用量応答曲線のＥＣ５０は、母集団の５０％が応答を示す化合物の濃度を表す。
【００４５】
移植片対宿主病：移植片対宿主病とも呼ばれる、組織拒絶反応は、移植された臓器／組織に対する移植レシピエント（宿主）の免疫応答によって引き起こされる臓器移植または組織移植の結果であり、これは、移植された臓器／組織を損傷または破壊することもある。通常、免疫応答は、微生物、毒素、および癌細胞などの有害な恐れのある物質（抗原）から体を守る。免疫系は、細胞表面のタンパク質に反応することによって、「自己」と「異物」を識別する。免疫系は、異物と認めた物質（抗原）に対して反応する。体内に異質な血液または組織が存在すると、免疫応答が誘発され、それによって、移植材料または輸血材料上の異質な抗原に対して抗体が生成された場合に、血液輸血反応および移植片拒絶反応が結果的に生じることがある。
【００４６】
ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）：ヒトにおける免疫抑制（ＨＩＶ疾患）を引き起こし、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）として知られる症候群をもたらすレトロウイルス。「ＨＩＶ疾患」は、例えば、抗体またはウェスタンブロットによる検査で決定されるような、ＨＩＶウイルス（例えば、ＨＩＶ１またはＨＩＶ２）に感染した人における一連のよく知られた兆候または症状（日和見感染の発症を含む）を指す。この疾患と関連する検査所見としては、Ｔヘルパー細胞の漸進的な減少が挙げられる。
【００４７】
ＩＣ５０：薬理学で使用される濃度の単位。ＩＣ５０、すなわち、半最大阻害濃度は、阻害剤の標的（例えば、酵素、細胞、受容体、または微生物）の５０％阻害に必要とされる阻害剤の濃度を表す。一般に、ＩＣ５０値は、何らかの生物学的プロセスを５０％だけ阻害するのに特定の組成物がどのくらい必要とされるかという尺度である。ＩＣ５０は、薬物親和性の尺度としてよく使用され、インビボで最大効果の５０％を得るのに必要とされる組成物の濃度を表す。
【００４８】
免疫介在性障害：望ましくない免疫応答を伴う障害。「非自己」タンパク質の免疫認識は、感染を回避および排除するのに不可欠であるが、時には、この免疫応答が望ましくないこともある。自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、またはインスリン依存性糖尿病）は、自己抗原に対する病的な免疫応答の結果であり、Ｔ細胞が自己免疫の主なメディエーターである。
【００４９】
移植臓器および移植組織の拒絶は、免疫介在性障害のさらなる例であり、結果として移植片に損傷を与えることおよび／または移植片を拒絶することがよくある。移植片対宿主病とも呼ばれる、組織拒絶反応は、移植された臓器／組織に対する移植レシピエント（宿主）の免疫応答によって引き起こされる臓器移植または組織移植の結果であり、これは、移植された臓器／組織を損傷または破壊することもある。（一卵性双生児を除き）同一の組織抗原を有する者は二人としていない。それゆえに、免疫抑制薬がない場合、臓器移植および組織移植は、異質な組織に対する免疫応答（拒絶反応）をほぼ必ず引き起こすと考えられ、それによって、移植片が破壊されると考えられる。組織タイピングにより、臓器または組織がレシピエントの組織と可能な限り似ていることが保証されるが、ドナーが一卵性双生児でない限り、完全に一致することはなく、臓器／組織拒絶の可能性は残る。免疫抑制療法は、臓器拒絶反応を防ぐために用いられる。アレルギーは、免疫介在性障害の別の例である。
【００５０】
免疫応答：刺激に対する免疫系の細胞（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）の応答。１つの実施形態において、この応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。「免疫応答のパラメータ」とは、免疫応答の任意の特定の測定可能な態様のことであり、これには、サイトカイン分泌（ＩＬ-６、ＩＬ-１０、ＩＦＮ-αなど）、免疫グロブリン産生、樹状細胞成熟、および免疫系の細胞の増殖が含まれるが、これらに限定されない。「免疫応答の増強」には、これらのパラメータのいずれかを増大させる任意の組成物または方法の使用が含まれる。当業者は、公知の実験的アッセイを用いてこれらのパラメータのいずれか１つの増大を容易に測定することができる。１つの具体的で非限定的な例において、３Ｈ-チミジンの取込みを測定して細胞増殖を評価することができる。免疫応答のパラメータの「大幅な」増大とは、対照と比較した場合のこのパラメータの著しい増大である。大幅な増大の具体的で非限定的な例は、少なくとも約５０％増大、少なくとも約７５％増大、少なくとも約９０％増大、少なくとも約１００％増大、少なくとも約２００％増大、少なくとも約３００％増大、および少なくとも約５００％増大である。
【００５１】
当業者は、公知の統計的方法を用いて著しい増大を容易に確認することができる。大幅な増大を評価するための１つの具体的で非限定的な統計的検定の例は、ＴＡＭ受容体阻害剤とともに投与されるワクチンを用いて応答する試料のパーセントと比較した場合のワクチンのみに応答する試料のパーセントを比較するためのＺ検定の使用である。ノンパラメトリックＡＮＯＶＡを用いて、ＴＡＭ受容体阻害剤とともに投与されるワクチンを用いて応答する試料のパーセントと比較した場合のワクチンのみで誘導される応答の大きさの違いを比較することができる。この例では、ｐ≦０．０５が有意であり、免疫応答のパラメータの大幅な増大を示す。当業者は、有用な他の統計的アッセイを容易に特定することができる。
【００５２】
「免疫防御応答」とは、感染による症状を減少させるかまたは感染と関連する疾患を遅延させるか、改善するか、もしくは予防する免疫応答である。「ワクチンの免疫原性の増強」は、免疫応答の増大の例である。
【００５３】
「免疫応答の阻害」には、これらのパラメータのいずれかを減少させる任意の組成物または方法の使用が含まれる。当業者は、公知の実験的アッセイを用いてこれらのパラメータのいずれか１つの減少を容易に測定することができる。１つの具体的で非限定的な例において、３Ｈ-チミジンの取込みを測定して細胞増殖を評価することができる。免疫応答のパラメータの「大幅な」減少とは、対照と比較した場合のこのパラメータの著しい減少である。大幅な減少の具体的で非限定的な例は、少なくとも約５％減少、少なくとも約１０％減少、少なくとも約２０％減少、少なくとも約３０％減少、少なくとも約４０％減少、少なくとも約５０％減少、少なくとも約６０％減少、少なくとも約７０％減少、少なくとも約８０％減少、および少なくとも約９０％減少である。
【００５４】
当業者は、公知の統計的方法を用いて著しい減少を容易に確認することができる。大幅な減少を評価するための１つの具体的で非限定的な統計的検定の例は、ＴＡＭ受容体作動薬の非存在下で応答する試料のパーセントと比較した場合のＴＡＭ受容体作動薬に応答する試料のパーセントを比較するためのＺ検定の使用である。例えば、応答は、ＴＡＭ受容体作動薬を受容するまたは受容しない対象における１つ以上の循環炎症性サイトカインのレベルであることができる。ノンパラメトリックＡＮＯＶＡを用いて、ＴＡＭ受容体作動薬を用いないで応答する試料のパーセントと比較した場合のＴＡＭ受容体作動薬によって誘導される応答の大きさの違いを比較することができる。この例では、ｐ≦０．０５が有意であり、免疫応答のパラメータの大幅な減少を示す。当業者は、有用な他の統計的アッセイを容易に特定することができる。
【００５５】
免疫抑制のアッセイは、対象となる疾患適用に応じて様々に異なる。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および関節リウマチ（ＲＡ）の潜在的治療のような、いくつかの適用については、ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイなどの常法を用いて、循環炎症性サイトカインの血清レベルを測定する。これらの炎症性サイトカインとしては、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）（例えば、ＩＦＮαおよびＩＦＮβ）が挙げられる。例えば、ＴＡＭ受容体活性化剤による治療後にＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイによって測定される１つ以上のこれらの炎症性サイトカインの循環レベルの顕著な減少は、免疫抑制治療の成功を示す。例えば、ＴＡＭ受容体活性化剤の投与の前後に１つ以上のＴＮＦα、ＩＦＮα、およびＩＦＮβの循環レベルを測定することができる。その後、これらの循環レベルを比較して、免疫抑制が起こっているかどうかを決定することができる。他の例において、ＴＡＭ受容体活性化剤による治療後のこれらのサイトカインのレベルを、参照値（例えば、免疫抑制を必要とする対象に存在することが過去に明らかにされている値）と比較することができる。
【００５６】
免疫系不全：対象の免疫系が通常の能力で機能しないか、または対象の免疫応答を増強することが有用であると考えられる疾患または障害。免疫系不全には、免疫系が通常の能力で機能しないか、または免疫応答を増強することが有用であると考えられる疾患または障害が含まれる。
【００５７】
免疫低下状態：免疫低下状態の対象とは、通常、疾患（例えば、感染症）、栄養失調、または免疫抑制療法の結果として、強い免疫応答を発達させることができないかまたは発達させる可能性が低い対象である。免疫低下状態の免疫系とは、正常に満たないレベルで機能している免疫系である。免疫低下状態の対象は、日和見感染（例えば、ウイルス感染、真菌感染、原虫感染、または細菌感染、およびある種の新生物）によりかかりやすい。免疫低下状態であると考えることができる者としては、ＡＩＤＳ（またはＨＩＶ陽性）を有する対象、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を有する対象、糖尿病患者、過去に移植を受け、免疫抑制薬を服用している対象、および癌の化学療法を受けている者が挙げられる。「免疫低下状態の個体」という用語には、（皮膚癌以外の）ほとんどの形態の癌、鎌形赤血球貧血、嚢胞性線維症を有する対象、脾臓のない者、末期腎疾患を有する（透析を受けている）対象、および過去１年間にピルまたは注射でコルチコステロイドを頻繁に服用している者も含まれる。重度の肝疾患、肺疾患、または心疾患を有する対象も免疫低下状態である可能性がある。
【００５８】
免疫調整剤：免疫応答を調整することができる分子（例えば、化学的化合物、小分子、ステロイド、核酸分子、または他の生物剤）。いくつかの例において、免疫調整剤は、免疫応答を増大させ、免疫増強活性を有する。さらなる例において、免疫調整剤は、免疫応答を減少させるかまたは抑制し、免疫抑制活性を有する。免疫調整剤の具体的で非限定的な例は、例えば、免疫調整剤が存在しない場合の対照と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％だけ免疫応答を減少または増大させる分子である。
【００５９】
免疫抑制剤：炎症反応などの免疫応答を減少させることができる分子（例えば、化学的化合物、小分子、ステロイド、核酸分子、または他の生物剤）。免疫抑制剤の具体的で非限定的な例は、非ステロイド性の抗炎症剤、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、および抗ＣＤ４である。さらなる例において、この薬剤は、生物応答修飾物質（例えば、キネレット（登録商標）（アナキンラ）、エンブレル（登録商標）（エタネルセプト）、またはレミケード（登録商標）（インフリキシマブ））、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（例えば、アラバ（登録商標）（レフルノミド）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、特に、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ-２）阻害剤（例えば、セレブレックス（登録商標）（セレコキシブ）およびバイオックス（登録商標）（ロフェコキシブ））、または別の製品（例えば、ヒアルガン（登録商標）（ヒアルロナン）およびシンビスク（登録商標）（ハイラン  Ｇ-Ｆ２０）である。
【００６０】
感染性因子：対象に感染することができる因子。ウイルス、細菌、および真菌が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
感染性ウイルスの例としては、以下のウイルスファミリーのメンバー、すなわち、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ１およびＨＩＶ２）、ＭＬＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１および２、ＸＭＲＶ、ならびにコルチウイルス（例えば、ＣＴＦＶまたはバンナウイルス））；トガウイルス科（例えば、アルファウイルス（例えば、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、オニョンニョンウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）または風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス（例えば、西ナイルウイルスまたは日本脳炎ウイルス）、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳウイルスまたはトロウイルス））；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、センダイウイルス、およびメトニューモ（ｍｅｔｏｐｎｅｕｍｏ）ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンターンウイルス、ブニヤウイルス（例えば、ラクロスウイルス）、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１およびＨＳＶ-２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＨＶ-８、ＨＨＶ-６、ＨＨＶ-７、および仮性狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（エボラウイルスおよびマールブルグウイルスを含むフィロウイルス）ならびにポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス（例えば、天然痘、サル痘、および伝染性軟属腫ウイルス）、ヤタボックス（ｙａｔａｂｏｘ）ウイルス（例えば、タナポックスおよびヤバポックス））などのエンベロープウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。感染性の非エンベロープウイルスとしては、例えば、以下のファミリーのメンバー、すなわち、カリシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス（例えば、ＬＣＭＶ、ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、およびグアナリトウイルス））；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科；パルボウイルス科（パルボウイルス（例えば、ヒトボカウイルス、アデノ随伴ウイルス））；パピローマウイルス科（例えば、パピローマウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（アデノウイルス）；ピコルナウイルス科（エンテロウイルス、腸内ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ヘパトウイルス、カルジオウイルス、アプトウイルス、エコーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびライノウイルス）ならびにイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚熱ウイルス） が挙げられる。他の感染性ウイルスとしては、未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎���因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損付随体と考えられている）、非Ａ非Ｂ型肝炎（クラス１＝内部で伝染する；クラス２＝非経口で伝染する（例えば、Ｃ型肝炎））；カルシウイルス（ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓｅｓ）（例えば、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、および関連ウイルス）；ヘペウイルス（例えば、Ｅ型肝炎ウイルス、ＪＣウイルス、およびＢＫ  ウイルス）、ならびにアストロウイルス）の因子）が挙げられる。
【００６２】
本明細書で提供された方法によって治療することができる感染性細菌の例としては、任意のタイプのグラム陽性細菌（例えば、連鎖球菌、ブドウ球菌、コリネバクテリウム、リステリア、バチルス、およびクロストリジウム）またはグラム陰性細菌（例えば、サルモネラ菌、赤痢菌、腸内細菌、シュードモナス、モラクセラ、ヘリコバクター、ステノトロフォモナス、ブデロビブリオ、酢酸菌、およびアルファプロテオバクテリア）、大腸菌、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、インフルエンザ菌、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ミラビリス変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）が挙げられる。例示的な感染性細菌としては、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）、ライム病ボレリア菌（Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリウム種（例えば、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（ビリダンス（ｖｉｒｉｄａｎｓ）群）、大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター種、腸球菌種、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、クロストリジウム・ペルフリンゲルス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラス・モニ��フォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネマ・パリジウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネマ・パルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、およびアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
感染性真菌の例としては、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア・トラコマチス、およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
感染性生物（例えば、寄生虫）の例としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびトキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
炎症：組織損傷が生じた時、通常、この損傷に対する体の応答は炎症である。損傷は、外傷、血液供給の不足、出血、自己免疫発作、移植された外来組織、または感染が原因であり得る。この体による全身性応答としては、免疫系の多くの構成要素（例えば、ＩＬ-１およびＴＮＦ）の放出、損傷部位への細胞の誘引、体液の放出による組織の腫脹、および他のプロセスが挙げられる。
【００６６】
単離された：「単離された」生物学的要素（例えば、核酸分子、ペプチド、または細胞）は、混合試料（例えば、細胞抽出液）中の他の生物学的構成要素から精製されている。例えば、「単離された」ペプチドまたは核酸分子は、そのペプチドまたは核酸分子が存在していた細胞（例えば、組換えペプチドまたは組換え核酸分子の発現宿主細胞）の他の構成要素から分離されているペプチドまたは核酸分子である。
【００６７】
日和見感染：免疫低下状態の対象に起こる感染。日和見感染は、医学的処置または免疫系の変化が原因で起こり得る。日和見感染としては、特に、細菌感染（例えば、サルモネラ症、梅毒、および神経梅毒、結核症（ＴＢ）、非定型抗酸菌感染症、ならびに細菌性血管腫症（ネコ引っ掻き病））、真菌感染（例えば、アスペルギルス症、カンジダ症（鵝口瘡、イースト菌感染症）、コクシジオイデス症、クリプトコックス髄膜炎、およびヒストプラスマ症）、原虫感染（例えば、クリプトスポリジウム症、イソスポーラ症、微胞子虫症、ニューモシスチス・カリニ肺炎（ＰＣＰ）、およびトキソプラズマ症）、ウイルス感染（例えば、サイトメガロウイルス症（ＣＭＶ）、肝炎、単純ヘルペス症（ＨＳＶ、性器ヘルペス）、帯状疱疹（ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅｒｐｅｓ）（ＨＺＶ、帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ））、ヒトパピローマウイルス症（ＨＰＶ、性器疣贅、子宮頸癌）、伝染性軟属腫、口腔毛状白板症（ＯＨＬ）、および進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ））、ならびに新生物（例えば、カポジ肉腫、全身性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、および原発性ＣＮＳリンパ腫）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６８】
非経口的：腸の外側に（例えば、消化管を介さずに）投与されること。一般に、非経口製剤とは、経口摂取を以外の任意の可能な様式で投与される製剤である。この用語は、例えば、静脈内投与、髄腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、関節内投与、または皮下投与を問わない注射、ならびに鼻腔内適用、皮内適用、および局所適用を含む様々な表面適用を指す。
【００６９】
薬学的薬剤または薬学的薬物：対象に適切に投与された場合に、所望の治療効果または予防効果を誘導することができる化学的化合物または組成物。薬学的薬剤としては、ＴＡＭ受容体阻害剤、ＴＡＭ受容体作動薬、抗感染症剤（例えば、抗生物質、抗真菌化合物、抗ウイルス化合物、および高力価免疫グロブリン）、抗癌剤（例えば、化学療法剤）、免疫抑制剤（例えば、非ステロイド性抗炎症剤、生物応答修飾物質、および疾患修飾抗リウマチ薬）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
薬学的に許容される担体：本開示で有用な薬学的に許容される担体は従来型のものである。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，第１５版（１９７５）には、本明細書で開示されている阻害剤の薬学的送達に好適な組成物および製剤が記載されている。
【００７１】
一般に、担体の性質は、利用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的かつ生理学的に許容される液体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどをビヒクルとして含む注射可能液を含む。固体組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセルの形態）については、従来型の非毒性固体担体として、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性の担体に加えて、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝化剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含有することができる。
【００７２】
レトロウイルス：ウイルスゲノムがＲＮＡであるＲＮＡウイルス。宿主細胞がレトロウイルスに感染した場合、そのゲノムＲＮＡが逆転写されてＤＮＡ中間体になり、これが感染細胞の染色体ＤＮＡに非常に効率的に組み込まれる。この組み込まれたＤＮＡ中間体は、プロウイルスと呼ばれる。「レンチウイルス」という用語は、逆転写酵素を含有するウイルスの属を説明するように従来的な意味で使用される。レンチウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型および２型（ＨＩＶ-１およびＨＩＶ-２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ならびにネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）を含む「免疫不全ウイルス」が挙げられる。
【００７３】
ＨＩＶは、ヒトでの免疫抑制（ＨＩＶ疾患）を引き起こし、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）として知られる症候群をもたらすレトロウイルスである。「ＨＩＶ疾患」は、例えば、抗体またはウェスタンブロットによる検査で決定されるような、ＨＩＶウイルスに感染した人における一連のよく知られた兆候または症状（日和見感染の発症を含む）を指す。この疾患と関連する検査所見としては、Ｔヘルパー細胞の漸進的な減少が挙げられる。
【００７４】
敗血症：感染によって引き起こされる全身の炎症状態を特徴とする重度の医学的状態。本明細書で使用する場合、「感染」という用語は、微生物によって誘導される病理学的プロセスを意味する。このような感染は、病原性のグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌、嫌気性細菌、真菌、酵母、または多菌性生物によって引き起こされ得る。このような感染の例示的で非限定的な部位は、気道感染、腹膜炎、秘尿生殖器感染、および腹腔内感染である。本明細書で使用する場合、「敗血症」は、敗血症の発症、重症敗血症、敗血症性ショック、および末期敗血症に伴う多臓器機能不全を含むが、これらに限定されない、敗血症の全ての段階を含む。
【００７５】
「敗血症の発症」とは、例えば、従来的な臨床兆候によって敗血症の臨床的な疑いが十分に裏付けられる段階よりも前の、敗血症の初期段階を指す。「重症敗血症」とは、臓器機能不全、低灌流異常、または敗血症誘導性低血圧を伴う敗血症を指す。低灌流異常としては、乳酸アシドーシス、乏尿、精神状態の急性変化が挙げられるが、これらに限定されない。大人における「敗血症性ショック」とは、他の原因では説明がつかない持続性の動脈低血圧を特徴とする急性循環不全の状態を指す。低血圧は、他に低血圧となる原因がない場合に、適切な輸液負荷にもかかわらず、収縮期動脈圧が９０ｍｍ Ｈｇ未満（もしくは子供で、年齢相応の正常未満）になるか、平均動脈圧（ＭＡＰ）が６０未満になるか、または収縮期血圧がベースラインから４０ｍｍ Ｈｇよりも大きく低下することによって定義される。
【００７６】
敗血症の症状は、根底にある感染プロセスと関連することが多い。感染が敗血症に移行した場合、結果として現れる症状は、全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）の症状、すなわち、全身の炎症、発熱、白血球数の上昇（白血球増加症）、および心拍数（頻拍）と呼吸数（頻呼吸）の増加である。敗血症を引き起こす免疫学的応答は、炎症経路と凝固経路の広範囲に及ぶ活性化を引き起こす全身性炎症応答である。これは、循環器系機能不全へと進行することがあり、最適な治療を施しても、多臓器機能不全症候群を引き起こし、最終的には死に至ることがある。
【００７７】
米国では、敗血症は、冠状動脈症でない集中治療室（ＩＣＵ）患者の死亡の主な原因であり、全体で１０番目に多い死因である。敗血症は、高齢で、免疫低下状態の、重病患者によく見られ、また、このような患者でより危険となる。敗血症は、入院患者全体の１％〜２％に見られ、ＩＣＵベッド使用の２５％もの割合を占める。敗血症は、世界中の集中治療室での死亡の主な原因であり、死亡率は、敗血症の場合には２０％、重症敗血症の場合には４０％、敗血症性ショックの場合には６０％超にまで及ぶ。敗血症に加えて全身性低血圧の兆候があり、末端臓器機能不全が生じているかまたは血清乳酸が４ｍｍｏｌ／ｄＬを上回っているかのいずれかである場合、患者は「重症敗血症」を有すると定義される。
【００７８】
現在の敗血症治療としては、抗生物質、溜まった感染体液の外科的ドレナージ、体液交換、および臓器機能不全に対する適切なサポートが挙げられる。このサポートとしては、腎不全における血液透析、肺機能不全における機械的人工換気、血液製剤の輸血、ならびに循環不全に対する薬物療法および輸液療法を挙げることができる。必要な場合に非経口的栄養摂取によって十分な栄養を確保することが、長引く病気で重要となることがある。
【００７９】
ｓｉＲＮＡ：無脊椎動物種および脊椎動物種における遺伝子特異的な発現の阻害を誘導することができる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が提供されている。これらのＲＮＡは、標的遺伝子（例えば、ＴＡＭ受容体またはそのリガンド）の発現の干渉または阻害に好適であり、各鎖に長さが０〜約５ヌクレオチドの３'突出および／または５'突出を含有する約１５〜４０ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを含むが、そこでは、この二本鎖ＲＮＡの配列は、発現の干渉または阻害が所望される標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写産物の一部と実質的に同一である。二本鎖ＲＮＡは、相補的なｓｓＲＮＡによるか、またはヘアピンを形成する一本鎖ＲＮＡによるか、またはＤＮＡベクターからの発現によって形成することができる。
【００８０】
天然ＲＮＡ分子に加えて、標的配列の発現を阻害または干渉するのに好適なＲＮＡには、ＲＮＡ誘導体およびＲＮＡ類似体が含まれる。例えば、ヌクレオチド残基間の非天然結合（例えば、ホスホロチオエート結合）を用いることができる。ＲＮＡ鎖は、反応性官能基またはレポーター基（例えば、フルオロフォア）で誘導体化することができる。特に有用な誘導体は、ＲＮＡ鎖の一方の末端または両方の末端、典型的には、センス鎖の３'末端で修飾される。例えば、３'末端の２'-水酸基を種々の基で容易にかつ選択的に誘導体化することができる。
【００８１】
他の有用なＲＮＡ誘導体は、修飾された炭水化物部分（例えば、２'-Ｏ-アルキル化残基または２'-デオキシ-２'-ハロゲン化誘導体）を有するヌクレオチドを組み込んでいる。このような炭水化物部分の特定の例としては、２'-Ｏ-メチルリボシル誘導体および２'-Ｏ-フルオロリボシル誘導体が挙げられる。
【００８２】
ＲＮＡ塩基を修飾してもよい。標的配列の発現を阻害または干渉するのに有用な任意の修飾塩基を使用することができる。例えば、ハロゲン化塩基（例えば、５-ブロモウラシルおよび５-ヨードウラシル）を組み込むことができる。塩基をアルキル化することもでき、例えば、７メチルグアノシンをグアノシン残基の代わりに組み込むことができる。阻害の成功をもたらす非天然塩基を組み込むこともできる。
【００８３】
対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれるカテゴリーである、生きた多細胞脊椎生物。本明細書で開示される方法および組成物は、医学的状況および獣医学的状況において同等に適用される。したがって、「対象」という一般用語には、ヒトまたは獣医学的対象（例えば、他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシ）を含むが、これらに限定されない、全ての動物が含まれることが理解される。
【００８４】
ＴＡＭ受容体：ＴＡＭファミリー（Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒ）は、最初、他とは異なる受容体タンパク質-チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ファミリーとして同定された（Ｌａｉ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（１９９１）  Ｎｅｕｒｏｎ．６（５）：６９１-７０４）。その時はＴｙｒｏ３、Ｔｙｒｏ７、およびＴｙｒｏ１２と命名されたが、これらのタンパク質のキナーゼドメインは、配列保存に基づいて、他とは異なるファミリーへと明瞭に分けられた（Ｌａｉ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（１９９１）  Ｎｅｕｒｏｎ．６（５）：６９１-７０４）。その後、複数のグループが全長ｃＤＮＡを単離したことで、このように分けられることが確定され、これらの受容体に複数の名前が与えられることにもなった。現在、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒが、合意されている指定遺伝子名である。マウスとヒトの「キノーム（ｋｉｎｏｍｅ）」の解析から、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒで完全なＴＡＭファミリーが構成されることが示された。（ヒトとマウスのゲノム中には５８個の受容体ＰＴＫ遺伝子がある）。Ａｘｌ受容体アミノ酸配列の具体的な例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１６９０（不変異体ＡＴＰ結合リジン（Ｋ）５５８）およびＮＰ＿０６８７１３（２００７年１１月９日現在）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔｙｒｏ３受容体アミノ酸配列の具体的な例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６２８４（不変異体ＡＴＰ結合リジン（Ｋ）５５０）、ＥＡＷ９２５０６、およびＥＡＷ９２５０７（２００７年１１月９日現在）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍｅｒ受容体アミノ酸配列の具体的な例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＫ５４１２１、ＡＡＩ１４９１８（不変異体ＡＴＰ結合リジン（Ｋ）４４３）、およびＡＡＩ１４９１８（２００７年１１月９日現在）が挙げられるが、これらに限定されない。不変異体ＡＴＰ結合部位リジン（Ｋ）は、ＶＡＶＫＴＭという配列中にある。
【００８５】
ＴＡＭ受容体は、細胞外領域の配列モチーフの配置を共有しており、このモチーフ内では、タンデムに並んだ２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）関連ドメインの直後に２つのＩＩＩ型フィブロネクチン（ＦＮＩＩＩ）関連リピートがある。これらの受容体は、この特殊なＩｇドメインとＦＮＩＩＩドメインの配置を示す唯一の受容体ＰＴＫである。Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒの細胞外ドメインは全て、近くに、１回膜貫通ドメイン、比較的大きい細胞質膜近傍領域、およびスプリットチロシンキナーゼドメインがある。例えば、ヒトＡｘｌ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６８７１３．２、２００８年１１月７日現在）の細胞外ドメインは、位置１周辺から位置４４５アミノ周辺のアミノ酸位置にまで及び、２つのＩｇドメインと２つのＦＮＩＩＩドメインを含有する。本明細書でＩｇＩと表される、第一のＩｇドメインには、位置３３周辺から位置１３７周辺までが含まれる。本明細書でＩｇ２と表される、第二のＩｇドメインには、配列番号２の位置１３９周辺から位置２２２周辺までが含まれる。本明細書でＦＮＩＩＩ（ａ）と表される、第一のＦＮＩＩＩドメインには、位置２２５周辺から位置３２８周辺までが含まれる。本明細書でＦＮＩＩＩ（ｂ）と表される、第二のＦＮＩＩＩドメインには、位置３３７周辺から位置４１８周辺までが含まれる。さらに、Ｍｅｒの細胞内ドメイン（例えば、Ｍｅｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３２６１３．１、２００８年１１月７日現在）のアミノ酸配列）などの、細胞内ドメインは、位置５２１周辺から位置９９４周辺のアミノ酸位置にまで及ぶ。
【００８６】
各ＴＡＭ受容体の各ドメインの位置は、それらのリガンド結合ドメイン、ならびにタンパク質-チロシンキナーゼドメインのＡＴＰ結合部位および基質結合部位を含めて、当技術分野で公知であり、公開されているＮＣＢＩおよび国立医学図書館（ＮＬＭ）のデータベースで容易に利用することができる。例えば、ヒトＴｙｒｏ３タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＡＷ９２５０８、２００８年１１月７日現在）の細胞外ドメインは、第一のＩｇドメイン（位置４１周辺から位置１２０周辺）、第二のＩｇドメイン（位置１３０周辺から位置２０５周辺）、第一のＦＮＩＩＩドメイン（位置２１５周辺から位置３０５周辺）、および第二のＦＮＩＩＩドメイン（位置３１５周辺から位置３９７周辺）を含有する。Ｔｙｒｏ３タンパク質-チロシンキナーゼドメインは、位置５１０周辺から位置７３０周辺にまで及ぶ。ヒトｃＭｅｒタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＡＷ５２０９７、２００８年１１月７日現在）の細胞外ドメインは、第一のＩｇドメイン（位置１１５周辺から位置１８７周辺）、第二のＩｇドメイン（位置１９５周辺から位置２８０周辺）、第一のＦＮＩＩＩドメイン（位置２８５周辺から位置３７５周辺）、および第二のＦＮＩＩＩドメイン（位置３８７周辺から位置４７８周辺）を含有する。ｃＭｅｒの基質結合部位は、位置７２５周辺から位置７５０周辺にまで及ぶ。 
【００８７】
ＴＡＭ受容体リガンドとしては、プロテインＳおよびＧａｓ６が挙げられる。「ＴＡＭ受容体活性」には、ＴＡＭ受容体の任意の生物学的活性、例えば、ＴＡＭ受容体リガンド（例えば、Ｇａｓ６またはプロテインＳ）が受容体に結合することによって増強または誘導される活性が含まれる。「ＴＡＭ受容体活性の増強因子」には、ＴＡＭ受容体活性を増大させる任意の組成物が含まれる。ＴＡＭ受容体活性の増大の例としては、ＴＡＭ自己リン酸化の増大、ＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の減少、ＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激の減少、ＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の減少、ならびにＳＯＣＳ１発現および／またはＳＯＣＳ３発現の増大が挙げられるが、これらに限定されない。「ＴＡＭ受容体活性の阻害因子」には、ＴＡＭ受容体活性を減少させる任意の組成物が含まれる。ＴＡＭ受容体活性の減少の例としては、ＴＡＭ自己リン酸化の減少、ＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の増大、ＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激の増大、ＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の増大、ＳＯＣＳ１発現および／またはＳＯＣＳ３発現の減少が挙げられるが、これらに限定されない。このような活性を測定する例示的な方法が本明細書で提供されている。
【００８８】
治療有効量：疾患の進行を防ぎ、疾患の退行を引き起こすのに十分であるか、または疾患によって引き起こされる症状（例えば、発熱、呼吸器症状、痛み、もしくは腫れ）を軽減することができる、単独または他の薬剤（例えば、ワクチンまたは樹状細胞または免疫抑制剤）と組み合わせた、治療剤（例えば、ＴＡＭ受容体阻害剤またはＴＡＭ受容体作動薬）の量。
【００８９】
疾患の治療：「治療」とは、疾患または病的状態（例えば、自己免疫障害、敗血症、または他の感染症）が発症し始めた後に、その兆候または症状を改善する治療的介入を指す。本明細書で使用する場合、「治療」という用語は「予防」も包含し、「予防」とは、例えば、疾患にかかりやすいことが分かっている人（例えば、感染性因子に曝露されているかもしくは曝露される危険性がある人または自己免疫疾患を発症しているかもしくは発症する危険性がある人）において、疾患が完全に発症するのを阻止することを指す。感染性因子に曝露される危険性がある人の例としては、軍関係者、医療関係者、旅行者、および大人や子供を介護する人、ならびに免疫系が低下した人（例えば、高齢者、免疫抑制薬を服用している人、癌を有する対象、ＨＩＶに感染している対象）が挙げられるが、これらに限定されない。敗血症の治療について、１つの実施形態において、治療は、重症敗血症、敗血症性ショックに対するもの、またはＳＯＣＳ阻害因子レベルが高いか、もしくは場合によっては、最大となる敗血症の治療である。このような治療は、（ＴＡＭシグナル伝達によって上昇する）ＳＯＣＳ阻害因子レベルがまだ最大ではない感染初期にはあまり効果がない。いくつかの実施形態において、血漿中のＧａｓ６の測定値は、敗血症のバイオマーカーである（例えば、Ｇｉｂｏｔら（２００７）  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ；１１（１）：Ｒ８；Ｂｏｒｇｅｌら（２００６）  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．３４（１）：２１９-２２参照）。自己免疫疾患を発症する危険性がある人の例としては、１つ以上の自己免疫疾患の家族歴がある人、特定の環境誘因に曝露される危険性がある人、自己抗原に対する抗体を産生する対象、および移植を受けたことがある対象が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
ワクチン：疾患（例えば、癌）、または感染性疾患の予防、改善、または治療のために投与される、抗原、ＤＮＡ、タンパク質サブユニット、ペプチド、弱毒化した微生物（細菌およびウイルスを含むが、これらに限定されない）、腫瘍（例えば、癌）に対して活性化された樹状細胞、生きた微生物、または死滅した微生物の調合剤。
【００９１】
一般に、ワクチンを作る時の最初の工程は、完全に症状が出る疾患を引き起こすことはできないが、宿主の免疫応答を誘導する原因となる抗原を依然として保持している生物、またはその一部を単離することまたは作出することである。これは、多くの方法で行なうことができる。１つの方法は、熱またはホルマリンを用いて生物を死滅させることである。この方法で産生されるワクチンは、「不活性化」ワクチンまたは「死滅」ワクチンと呼ばれる。今日よく用いられる死滅ワクチンの例は、腸チフスワクチンおよびソークポリオワクチンである。
【００９２】
ワクチンを産生する別の方法は、疾患を引き起こす生物の抗原性部分、例えば、莢膜、鞭毛、またはタンパク質細胞壁の部分のみを使用することである。これらのタイプのワクチンは、「無細胞性ワクチン」と呼ばれる。無細胞性ワクチンの例は、Ｂ型インフルエンザ（ＨＩＢ）ワクチンである。無細胞性ワクチンは、死滅ワクチンといくつかの類似性を示す。すなわち、通常、死滅ワクチンも無細胞性ワクチンも、最も強い免疫応答を誘導することがなく、そのため、それらの有効性の継続を確保するために、数年おきに「追加免疫」を必要し得る。さらに、死滅ワクチンも無細胞性ワクチンも、疾患を引き起こすことができず、そのため、免疫低下状態の個体で使用するのに安全であると考えられる。
【００９３】
ワクチンを作る第三の方法は、生物を変異させてその増殖能を改変することによって、生きた微生物を「弱毒化」または弱体化することである。１つの実施形態において、弱毒化ワクチンには、複製能がないかまたは必須タンパク質が欠けている。弱毒化ワクチンの例は、麻疹、流行性耳下腺炎、および風疹を防ぐワクチンである。弱毒化ワクチンを用いると、一生免疫が続くことが多く、追加免疫を施す必要がない。
【００９４】
ワクチンを毒素から産生することもできる。これらの場合、毒素を、アルミニウムで処理するかまたはアルミニウム塩に吸着させて、「トキソイド」を形成させることが多い。トキソイドの例は、ジフテリアワクチンと破傷風ワクチンである。トキソイドから作られるワクチンは、低レベルの免疫応答を誘導することが多く、そのため、アジュバントともに投与されることもある。例えば、ジフテリア・破傷風ワクチンは、百日咳ワクチンと組み合わされて、ＤＰＴ予防接種として一緒に投与されることが多い。このワクチンでは、百日咳菌がアジュバントとして作用する。２つ以上のワクチンが一緒に投与される場合、そのワクチンは、「混合ワクチン」と呼ばれる。
【００９５】
ワクチンを作る別の方法は、強い病原性を持つ生物と類似しているが、重度の疾患を引き起こさない生物を用いること（例えば、天然痘ウイルスに感染するのを防ぐために牛痘ウイルスを用いること、またはヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）から身を守るためにウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）の弱毒化株であるＢＣＧワクチンを用いること）である。
【００９６】
「サブユニットワクチン」とは、強い免疫応答を刺激するために感染性生物由来のポリペプチドを用いているワクチンである。「抗原ワクチン」は、防御免疫応答を誘導するためにポリペプチドの免疫原性エピトープを用いている。「ＤＮＡワクチン」は、防御免疫応答を誘導するために抗原をコードする核酸を用いている。 
【００９７】
本開示のＴＡＭ受容体阻害剤および方法とともに使用することができるワクチンの具体的で例示的な例としては、現在米軍で使用されているＢｉｏＴｈｒａｘ炭疽ワクチン、ならびにＤＰＴ（ジフテリア・破傷風・百日咳）ワクチン、ＨＩＢ（Ｂ型インフルエンザ）ワクチン、肺炎球菌コンジュゲート、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン、および狂犬病ワクチンが挙げられる。
【００９８】
本明細書で記載される方法に従って使用することができる他のワクチンは、樹状細胞（ＤＣ）をベースにしたワクチン（例えば、癌ワクチン）である。一般に、樹状細胞をベースにしたワクチンは、白血球除去法によって対象の血液から樹状細胞を取得することを含む。その後、ＤＣをエクスビボで抗原（例えば、対象自身の癌抗原）によって刺激し、培養し、対象に再投与（例えば、皮下投与）する。投与されるとすぐに、ＤＣワクチンは免疫系のＴ細胞を活性化する。ＤＣによる活性化によって、Ｔ細胞が増殖し、抗原を発現する腫瘍細胞を攻撃する。ＤＣをベースにしたワクチンは、以下でさらに詳細に考察する。
【００９９】
別様に説明しない限り、本明細書で使用される専門用語および科学用語は全て、本開示が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓによって刊行されている、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，１９９４（ＩＳＢＮ ０-１９-８５４２８７-９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社よって刊行されている、Ｋｅｎｄｒｅｗら（編），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４（ＩＳＢＮ  ０-６３２-０２１８２-９）；およびＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社によって刊行されている、Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９５（ＩＳＢＮ  １-５６０８１-５６９-８）に見出すことができる。本明細書で参照されているＧｅｎＢａｎｋ番号は全て、参照により組み入れられる（すなわち、２００７年１１月９日または本明細書で特定されている他の日付における各ＧｅｎＢａｎｋ番号と関連する配列は、参照により組み入れられる）。
【０１００】
文脈により特に明示されない限り、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数形の指示対象を含む。「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。「ＡまたはＢを含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」は、「Ａを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ａ）」、「Ｂを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｂ）」、または「ＡとＢとを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」を意味する。核酸またはペプチドに与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子量値または分子質量値は、おおよそのものであり、説明のために提供されるということがさらに理解されるべきである。
【０１０１】
本開示の実施または検討に好適な方法および材料が以下に記載される。しかしながら、提供された材料、方法、および実施例は、例示であるに過ぎず、限定することを意図するものではない。したがって、別記される場合を除き、本開示の方法および技術は、当技術分野で記載されている方法および材料と同様もしくは同等の方法および材料に従ってならびに／または当技術分野で周知の従来法に従って、本明細書の全体を通じて引用および考察されている様々な一般的な参考文献およびより具体的な参考文献で記載されているように実施することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９２（および補遺２０００年版）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９参照）。
【０１０２】
ＩＶ．免疫増強剤としてのＴＡＭ受容体阻害剤の使用および免疫抑制剤としてのＴＡＭ受容体作動薬の使用
Ａ．概説
病原体に対する自然免疫応答は、感染性疾患に対する防御の最前線に相当する。この応答の最も強力なメディエーターの中には、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）があるが、これは、局所炎症、エフェクター細胞の動員、および自然免疫応答と適応免疫応答の両方を仲介するサイトカインの分泌に関与する宿主防御を活性化する一群の受容体である（Ａｋｉｒａ（２００６）  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１１，１-１６；Ｂｅｕｔｌｅｒら（２００６）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４，３５３-３８９）。哺乳動物のゲノム中にコードされる１２個のＴＬＲは「パターン認識受容体」であり、これは、侵入病原体によって提示される大部分は変化しない多様な分子シグネチャー群を検出する。例えば、ＴＬＲ-４は、細菌のリポ多糖（ＬＰＳ；Ｐｏｌｔｏｒａｋら（１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，２０８５-２０８８）を認識する。同様に、ＴＬＲ-９は、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含有する細菌ＤＮＡを認識し（Ｈｅｍｍｉら（２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，７４０-７４５）、ＴＬＲ-３とＴＬＲ-７は、それぞれ、二本鎖ＲＮＡと一本鎖ＲＮＡによって活性化される（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，７３２-７３；Ｈｅｉｌら（２００４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１５２６-１５２９）。
【０１０３】
ＴＬＲは、自然免疫応答を促進するセンチネル細胞（例えば、ＤＣおよびマクロファージ）で主に発現している（Ｉｗａｓａｋｉ  ＆  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ（２００４）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５，９８７-９９５）。ＴＬＲの活性化は、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、およびＴＲＡＦ６をはじめとする、複数の細胞内アダプタータンパク質および細胞内シグナル伝達タンパク質を関与させる（Ａｋｉｒａ（２００６）  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１１，１-１６）。その後、ＭＡＰキナーゼ経路ならびにＮＦ-κＢ転写因子およびインターフェロン応答因子（ＩＲＦ）転写因子を中心とする、進化的に古いシグナル伝達カスケードが活性化され、炎症促進性サイトカイン（例えば、インターロイキン６（ＩＬ-６）、ＩＬ-１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、およびＩ型インターフェロン（ＩＦＮ））が誘導されることになる。さらに、ＤＣは、自然免疫応答と適応免疫応答とを橋渡しするプロフェッショナルな抗原提示細胞である（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＆  Ｈｅｍｍｉ（２００６）  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１１，１７-５８）。ＤＣにおけるＴＬＲ活性化は、サイトカインの分泌と共刺激分子の上方調節を誘導し、これらによって後に適応応答が調整される（Ｉｗａｓａｋｉ  ＆  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ（２００４）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５，９８７-９９５）。
【０１０４】
自然免疫は生物の防御に不可欠であるが、無制限のＤＣ活性化とその結果として生じる炎症環境によって、慢性炎症の発症と自己に対する応答が生じる可能性があるので、自然免疫は適切に調節されなければならない（Ｍａｒｓｈａｋ-Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ（２００６）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，８２３-８３５）。Ｉ型ＩＦＮおよび他の炎症促進性サイトカインのレベルの上昇によって引き起こされるＤＣ成熟の刺激の持続は、例えば、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ＆  Ｐａｓｃｕａｌ（２００６）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５，３８３-３９２）、シェーグレン症候群（Ｇｏｔｔｅｎｂｅｒｇら（２００６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３，２７７０-２７７５）、および乾癬（Ｌｏｗｅｓら（２００５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２，１９０５７-１９０６２））の発症と関連している。炎症応答を最終的に阻害する必要性と一致して、ＤＣにおけるＴＬＲ活性化が、この活性化に対してフィードバックして、この活性化を阻害する負の調節因子の産生を促進し、かつそれ自体このような負の調節因子の産生によって調節されるということが今日次第に明らかとなっている（Ｌｉｅｗら（２００５）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５，４４６-４５８）。このようなＴＬＲ促進性阻害因子の中でよく知られているのは、ＳＯＣＳタンパク質であるが、免疫恒常性を維持する際のこのタンパク質の重要性は、ＤＣの過剰活性化を示し、ループス様疾患を発症するＳＯＣＳ１欠損マウスの表現型によって浮き彫りになる（Ｈａｎａｄａら（２００３）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９，４３７-４５０）。その重要性にもかかわらず、負の調節因子の誘導がＴＬＲによって活性化される炎症応答といかに統合されるかということが本開示より前には解明されていなかった。
【０１０５】
Ｔｙｒｏ３/ＴＡＭファミリーの受容体チロシンキナーゼ（Ｌａｉ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（１９９１）  Ｎｅｕｒｏｎ．６（５）：６９１-７０４）によって促進される新規の負の調節経路が本明細書で記載されており、それによって、ＴＬＲ促進性の免疫応答とサイトカイン誘導性の免疫応答の両方の多面的阻害因子としての役割が確立されている。これまでに、３つのＴＡＭ受容体（Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒ）の機能喪失によって、深刻な免疫応答の調節異常が生じることが示された（Ｃａｒａｕｘら（２００６）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７，７４７-７５４；Ｌｅｍｋｅ  ＆  Ｌｕ（２００３）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５，３１-３６；Ｌｕ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３，３０６-３１１）。Ｔｙｒｏ３-／-Ａｘｌ-／-Ｍｅｒ-／-三重変異体マウス（ＴＡＭ  ＴＫＯ）は、重度の脾腫およびリンパ節腫張、本質的に全ての組織へのリンパ球浸潤、（リン脂質、コラーゲン、リボヌクレオタンパク質、および二本鎖ＤＮＡに対する）循環自己抗体の高い力価、ならびに広範囲の自己免疫疾患を示す（Ｌｕ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３，３０６-３１１）。Ｍｅｒ-／-単一変異体でさえも、感知できるほどの脾腫を発症し、ＬＰＳ誘導性の内毒素性ショックに対して感受性が高い（Ｃａｍｅｎｉｓｃｈら（１９９９）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２，３４９８-３５０３）。 これらの表現型は、リンパ球に関して細胞非自律的であり、理論に束縛されるわけではないが、抗原提示細胞（ＡＰＣ；Ｌｕ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３，３０６-３１１；Ｌｅｍｋｅ  ＆  Ｌｕ（２００３）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５，３１-３６）におけるＴＡＭシグナル伝達の喪失によって生じると考えられる。ＡＰＣのＤＣサブセットにおけるＴＡＭ機能の包括的な解析が、本明細書で記載される。これらの細胞におけるＴＬＲ活性化とサイトカイン産生の両方のＴＡＭが介在する負の調節についてこれまでに知られていない経路も開示される。この経路は、ＤＣ活性化の段階的な減衰を制御する。
【０１０６】
本明細書で記載されるように、ＴＡＭ受容体阻害剤を、免疫増強剤として（例えば、ワクチンアジュバントとして）、敗血症の治療で、および免疫不全の治療で使用することができる。本開示の１つの実施形態は、対象の免疫応答を増強する方法であり、この方法は、免疫増強を必要とする対象（例えば、重症敗血症の対象、免疫低下状態の対象、またはワクチンを投与する対象）に１つ以上のＴＡＭ受容体阻害剤を投与する工程を含むことができる。この方法は、免疫増強を必要とする対象に治療的有効量のＴＡＭ受容体阻害剤を投与し、それによって対象の免疫応答を増強することによって達成することができる。ＴＡＭ受容体阻害剤に対する免疫応答は、常法を用いて測定することができる。例えば、ワクチンアジュバントと関連して、ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイなどの常法によって測定されるように、ワクチン標的（免疫原）に対する循環血清ＩｇＧ抗体を測定することによって、患者応答をモニタリングすることができる。液性（循環抗体）免疫は、ワクチン中の免疫原に対する抗体の存在と関連する。例えば、ＴＡＭ阻害剤が炭疽菌に対するワクチンとして使用される、特定の例において、炭疽菌の組換え防御抗原（ｒＰＡ）に対する抗体をモニタリングすることができる。
【０１０７】
本明細書で記載される他の実施形態には、免疫増強剤をスクリーニングする方法が含まれる。いくつかの実施形態において、これらの方法は、ＴＡＭ受容体を発現する細胞を試験薬剤と接触させる工程、およびこの試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害するかどうかを決定する工程を含む。これらの方法は、以下でさらに詳細に記載される。
【０１０８】
また、本明細書で記載されるように、ＴＡＭ受容体作動薬を、例えば、移植片拒絶反応を予防するために、または移植後の移植片対宿主病を治療もしくは予防するために、自己免疫障害の治療で、免疫抑制剤として使用することができる。本開示の１つの実施形態は、対象の免疫応答を抑制する方法であり、この方法は、免疫抑制を必要とする対象（例えば、自己免疫疾患を有する対象、アレルギーを有する対象、または臓器移植もしくは組織移植を受けたことがある（もしくはこれから受ける）対象）にＴＡＭ受容体作動薬を投与する工程を含むことができる。この方法は、免疫抑制を必要とする対象に治療的有効量のＴＡＭ受容体作動薬を投与し、それによって対象の免疫応答を抑制することによって達成することができる。ＴＡＭ受容体作動薬に対する免疫応答は、常法を用いて測定することができる。例えば、自己免疫疾患の治療において、ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイなどの常法によって測定されるように、例えば、ＴＮＦαならびに／またはＩＦＮ（ＩＦＮαおよびＩＦＮβを含む）などの炎症促進性サイトカインの循環レベルを測定することによって、患者応答をモニタリングすることができる。免疫抑制に対する応答の成功は、１つ以上のこれらのサイトカインのレベルの低下として示される。体温をはじめとする、よく記載され、よく利用されるいくつかの代替法のいずれかによって、患者応答をモニタリングすることもできる。これは、炎症が体温の上昇と関連し、免疫抑制が体温を正常レベル（ヒトでは約３７℃）にまで回復させるからである。
【０１０９】
本明細書で記載される他の実施形態には、免疫抑制剤をスクリーニングする方法が含まれる。いくつかの実施形態において、この方法は、ＴＡＭ受容体を発現する細胞を試験薬剤と接触させる工程、およびこの試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を増大させるかどうかを決定する工程を含む。これらの方法も、以下でさらに詳細に記載される。 
【０１１０】
Ｂ．ＴＡＭ受容体およびリガンド
ＴＡＭ受容体は、受容体チロシンキナーゼである。これらの細胞表面受容体タンパク質は、細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、Ｇａｓ６リガンドまたはプロテインＳリガンドに結合するドメイン）、膜貫通ドメイン、およびキナーゼ活性に関与する細胞内ドメインを含む。ＴＡＭ受容体は、細胞外領域の配列モチーフの配置を共有しており、このモチーフ内では、タンデムに並んだ２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）関連ドメインの直後に２つのＩＩＩ型フィブロネクチン（ＦＮＩＩＩ）関連リピートがある。これらの受容体は、この特殊なＩｇドメインとＦＮＩＩＩドメインの配置を示す唯一の受容体ＰＴＫである。Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒの細胞外ドメインは全て、近くに、１回膜貫通ドメイン、比較的大きい細胞質膜近傍領域、およびスプリットチロシンキナーゼドメインがある。Ａｘｌ受容体アミノ酸配列の具体的な例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１６９０およびＮＰ＿０６８７１３（２００７年１１月９日現在）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔｙｒｏ３受容体アミノ酸配列の具体的な例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６２８４、ＥＡＷ９２５０６、およびＥＡＷ９２５０７（２００７年１１月９日現在）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍｅｒ受容体アミノ酸配列の具体的な例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＫ５４１２１、ＡＡＩ１４９１８、およびＡＡＩ１４９１８（２００７年１１月９日現在）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
ヒトＡｘｌ（ＮＰ＿０６８７１３．２）の細胞外ドメインは、位置１周辺から位置４４５アミノ周辺のアミノ酸位置にまで及び、２つのＩｇドメインと２つのＦＮＩＩＩドメインを含有する。本明細書でＩｇＩと表される、第一のＩｇドメインには、位置３３周辺から位置１３７周辺までが含まれる。本明細書でＩｇ２と表される、第二のＩｇドメインには、配列番号２の位置１３９周辺から位置２２２周辺までが含まれる。本明細書でＦＮＩＩＩ（ａ）と表される、第一のＦＮＩＩＩドメインには、位置２２５周辺から位置３２８周辺までが含まれる。本明細書でＦＮＩＩＩ（ｂ）と表される、第二のＦＮＩＩＩドメインには、位置３３７周辺から位置４１８周辺までが含まれる。さらに、Ｍｅｒの細胞内ドメイン（例えば、Ｍｅｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３２６１３．１、２００８年１１月７日現在）のアミノ酸配列）などの、細胞内ドメインは、位置５２１周辺から位置９９４周辺のアミノ酸位置にまで及ぶ。
【０１１２】
各ＴＡＭ受容体の各ドメインの位置は公知である。例えば、ヒトＴｙｒｏ３タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＡＷ９２５０８、２００８年１１月７日現在）の細胞外ドメインは、第一のＩｇドメイン（位置４１周辺から位置１２０周辺）、第二のＩｇドメイン（位置１３０周辺から位置２０５周辺）、第一のＦＮＩＩＩドメイン（位置２１５周辺から位置３０５周辺）、および第二のＦＮＩＩＩドメイン（位置３１５周辺から位置３９７周辺）を含有する。Ｔｙｒｏ３タンパク質-チロシンキナーゼドメインは、位置５１０周辺から位置７３０周辺にまで及ぶ。ヒトｃＭｅｒタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＡＷ５２０９７、２００８年１１月７日現在）の細胞外ドメインは、第一のＩｇドメイン（位置１１５周辺から位置１８７周辺）、第二のＩｇドメイン（位置１９５周辺から位置２８０周辺）、第一のＦＮＩＩＩドメイン（位置２８５周辺から位置３７５周辺）、および第二のＦＮＩＩＩドメイン（位置３８７周辺から位置４７８周辺）を含有する。ｃＭｅｒの基質結合部位は、位置７２５周辺から位置７５０周辺にまで及ぶ。
【０１１３】
ＴＡＭ受容体リガンドとしては、プロテインＳおよびＧａｓ６が挙げられる。プロテインＳ（ＰｒｏＳ）は、血液凝固カスケードの抗凝固因子である。プロテインＳは、活性化されたプロテインＣ（第Ｖ因子と第ＶＩＩＩ因子を分解するプロテアーゼ）の補因子として作用し、それによって血液凝固を阻害する。Ｇａｓ６は、増殖停止特異的タンパク質６（ｇｒｏｗｔｈ-ａｒｒｅｓｔ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６）の頭文字を取ったものであるが、もともとこれは、線維芽細胞を培養下で増殖停止させた時に誘導されるｍＲＮＡのスクリーニングで同定された。Ｇａｓ６は、種々の成体組織の散在した細胞位置で発現しており、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒを発現する細胞と並んでいるかまたはこのような細胞と混ざり合っている細胞層で発現していることが非常に多い（Ｌｕ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９３（５５２８）：３０６-１１）。多くの細胞型がＧａｓ６とプロテインＳの両方を共発現しており、同時に、１つ以上のＴＡＭ受容体も発現している（Ｌｕ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９３（５５２８）：３０６-１１）。 
【０１１４】
Ｇａｓ６とプロテインＳは、全体で４４％のアミノ酸配列同一性を示し、同じ複雑な多ドメイン構造を共有し、かつマウスとヒトのゲノム中にコードされているもので、このドメイン構成を示すたった２つのタンパク質である。両タンパク質のアミノ末端セグメントは、長く連なるグルタミン酸残基を含有し、これらのグルタミン酸残基は、そのγ炭素が、ゴルジ体でのビタミンＫ依存的な反応でカルボキシル化される。これらのいわゆる「Ｇｌａ-ドメイン」は、γカルボキシル化されることが、Ｃａ＋２結合と完全な生物学的活性の両方にとって不可欠であるが、これらのドメインは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）などの極性のあるリン脂質に結合する多くのタンパク質に共通している。細胞外に提示されたＰＳは、アポトーシス細胞のシグネチャーである。Ｇａｓ６およびＰｒｏＳにおいて、Ｇｌａドメイン（例えば、Ｇａｓ６のアミノ酸４９〜９０）は、近くに、ループドメイン（例えば、ヒトＧａｓ６のアミノ酸９１〜１１７）があり、次いでタンデムに並んだ４つのＥＧＦ関連ドメイン（例えば、ヒトＧａｓ６のアミノ酸１１８〜２７８）がある。これらに次いで、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）のラミニンＧリピートと構造的に関連している２つのラミニンＧリピート（例えば、ヒトＧａｓ６のアミノ酸２７９〜６７８）を含有するカルボキシ末端がある。Ｇａｓ６およびＰｒｏＳのＳＨＢＧ関連ドメインは、リガンド結合と受容体活性化の両方の原因となるものであり、Ｇｌａドメインおよび／またはＥＧＦドメインがない場合にＴＡＭ受容体を完全に活性化すると考えられる。
【０１１５】
Ｃ．ＴＡＭ受容体阻害剤
ＴＡＭ受容体阻害剤には、細胞のＴＡＭ受容体の生物学的活性を顕著に低下させるかまたは阻害さえする薬剤が含まれる。このような薬剤は、ＴＡＭ受容体活性を１００％阻害する必要はなく、本明細書で提供される方法において、より少ない量で有効であり得る。例えば、ＴＡＭ受容体阻害剤は、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％さえも、生物学的活性を減少させることができる。このような活性を測定する方法は、当技術分野で公知である。いくつかの例において、生物学的活性の減少は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒ、またはこれらの組合せの（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルでの）発現の減少によって示される 。他の例において、生物学的活性の減少は、ＴＡＭ自己リン酸化の低下、ＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の増大、ＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激の増大、ＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の増大、またはＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の低下のような、下流効果の変化によって示される。（いくつかの例では定量化される）発現または活性のこのような変化を検出する方法は、日常的なものであり、これらの方法としては、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ、ＲＴ-ＰＣＲなどを挙げることができる。
【０１１６】
いくつかの例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、ＴＡＭ受容体細胞外ドメインまたはＴｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒリガンドに極めて特異的に結合する。そのため、このような薬剤は、リガンドと受容体の相互作用を大幅に減少させるかまたは阻止し、例えば、受容体からのシグナル伝達を阻止し、下流の生物学的効果を低下させるかまたは阻害することによって、例えば、受容体活性化を顕著に低下させるかまたは阻害することができる。このような阻害剤の例としては、抗体（例えば、モノクローナル抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体））、またはＴｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒリガンド、もしくはＴｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒ受容体に結合し、リガンド結合が受容体に結合する相互作用を阻止するかもしくは顕著に低下させる他の小分子を挙げることができる。
【０１１７】
別の例において、このような阻害剤は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒ細胞内ドメイン（例えば、キナーゼドメインまたはＡＴＰ結合部位）を標的とし、それによって、例えば、受容体からのシグナル伝達を阻止し、下流の生物学的効果を低下させるかまたは阻害することによって、例えば、受容体活性化を顕著に低下させるかまたは阻害する。このような阻害剤の例としては、小分子阻害剤、例えば、膜透過性の小分子阻害剤（例えば、ＡＸＬ-１、ＡＸＬ-２、ＡＸＬ-３、ＡＸＬ-４、ＡＸＬ-５、ＡＸＬ-６、ＡＸＬ-７、ＡＸＬ-８、ＡＸＬ-９、ＭＰ４７０、およびＳＧＩ-ＡＸＬ-２７７）を挙げることができる。いくつかの例において、ＡＸＬ阻害剤は、トリアゾール誘導体である。ＡＸＬ阻害剤の例は、２００７年９月１３日に出願された米国特許公開第２００７／０２１３３７５号に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。ある例において、ＡＸＬ阻害剤は、以下の一般構造のうちの１つを有するトリアゾール誘導体である：
【化１】
2011514881.tif 000002
（ここで、Ｒは、ＨまたはＣＨ３であることができる）。当業者は、他の誘導体を作製することができるということを理解するであろう。
【０１１８】
さらに別の例において、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒの発現を顕著に減少させるかまたは阻害するＲＮＡｉ分子などの、ＴＡＭ受容体阻害剤は、ＴＡＭ受容体の発現を大幅に減少させるかまたは阻害する。さらに他の例において、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒリガンドの発現を顕著に減少させるかまたは阻害し、それによって、ＴＡＭ受容体を活性化するのに利用することができるリガンドの量を減少させるＲＮＡｉ分子などの、ＴＡＭ受容体阻害剤は、ＴＡＭ受容体リガンドの発現を大幅に減少させるかまたは阻害する。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、約５０μＭ未満、例えば、約５０ｎＭ未満、または１ｐＭ未満のＩＣ５０を有する。特定の実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、約１０μＭもしくは２０μＭ、０．０５μＭ〜約５μＭ、０．１ｎＭ〜２０ｎＭ、１ｐＭ〜約１０μＭ、または０．１ｐＭ〜５０ｐＭのＩＣ５０を有し、特定の実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、約０．００５ｎＭ〜約５０ｎＭ未満または約０．０５ｎＭ〜約５０ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。既知のＴＡＭ受容体阻害剤に加えて、既存の阻害剤を化学修飾することによって、より強力な阻害剤を生成してもよい。例えば、既知の化合物は、通常、低マイクロモル範囲または低ナノモル範囲で作用するが、いくつかの実施形態では、化学修飾によって、これらの化合物がより強力かつより特異的になる（例えば、低ピコモル範囲で作用する）。１つの実施形態において、解かれているＭＥＲＴＫのキナーゼドメイン結晶構造を用いて、ＱＳＡＲ解析を実施する。この結晶構造に基づいてＡｘｌキナーゼとＴｙｒｏ３キナーゼをモデリングすることもできる（例えば、Ｗａｌｋｅｒ，Ｈｕａｎｇ，Ｆｉｎｅｒｔｙ  Ｊｒ．，Ｗｅｉｇｅｌｔ，Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈ，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｂｏｃｈｋａｒｅｖ，Ｄｈｅ-Ｐａｇａｎｏｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｏ-ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ-ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  ＭＥＲ；ＰＤＢ（タンパク質データベース）２Ｐ０Ｃ参照）。これらのより強力な組成物は、より低いＩＣ５０値を有すると考えられる。
【０１２０】
いくつかの例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、試料中の他の分子に対する結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ-１大きいか、１０４Ｍ-１大きいか、または１０５Ｍ-１大きい結合定数で、標的（例えば、Ｔｙｒｏ、Ａｘｌ、またはＭｅｒの細胞外結合ドメイン、リガンド、または細胞内キナーゼドメイン）に特異的に結合することができる。いくつかの例において、ＴＡＭ受容体阻害剤（例えば、アプタマー、抗体（例えば、モノクローナル抗体）またはその断片）は、１ｎＭ以下の平衡定数（Ｋｄ）を有する。例えば、少なくとも約０．１×１０-８Ｍ、少なくとも約０．３×１０-８Ｍ、少なくとも約０．５×１０-８Ｍ、少なくとも約０．７５×１０-８Ｍ、少なくとも約１．０×１０-８Ｍ、少なくとも約１．３×１０-８Ｍ、少なくとも約１．５×１０-８Ｍ、または少なくとも約２．０×１０-８Ｍの結合親和性で、ＴＡＭ受容体（例えば、Ｔｙｒｏ、Ａｘｌ、またはＭｅｒの細胞外結合ドメイン、リガンド、または細胞内キナーゼドメイン）に結合するＴＡＭ受容体阻害剤が提供される。Ｋｄ値は、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によってまたは表面プラズモン共鳴装置（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ社，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００）を用いて測定することができる。
【０１２１】
本明細書で記載されている方法を用いて、免疫増強剤として機能するＴＡＭ受容体阻害剤（例えば、ＲＮＡｉ、アプタマー、抗体、または膜透過性小分子）の能力を実施することができる。例えば、可能性のあるＴＡＭ受容体阻害剤を、免疫増強剤として機能する能力についてスクリーニングすることができる。いくつかの例において、ワクチンに対する対象の応答を増強するかまたは免疫抑制の疾患もしくは敗血症を治療する可能性のあるＴＡＭ受容体阻害剤の能力を検査する。
【０１２２】
１．膜透過性小分子
いくつかの実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒのＡＴＰ結合部位に結合する小分子阻害剤である。Ａｘｌ受容体アミノ酸配列の具体的な例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１６９０（不変異体ＡＴＰ結合リジン（Ｋ）５５８）およびＮＰ＿０６８７１３（２００７年１１月９日現在）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔｙｒｏ３受容体アミノ酸配列の具体的な例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６２８４（不変異体ＡＴＰ結合リジン（Ｋ）５５０）、ＥＡＷ９２５０６、およびＥＡＷ９２５０７（２００７年１１月９日現在）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍｅｒ受容体アミノ酸配列の具体的な例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＫ５４１２１、ＡＡＩ１４９１８（不変異体ＡＴＰ結合リジン（Ｋ）４４３）、およびＡＡＩ１４９１８（２００７年１１月９日現在）が挙げられるが、これらに限定されない。不変異体ＡＴＰ結合部位リジン（Ｋ）は、ＶＡＶＫＴＭという配列中にある。
【０１２３】
いくつかの例において、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒの細胞内キナーゼドメイン（例えば、ＡＴＰ結合部位）に結合する小分子阻害剤を用いて、細胞のＴＡＭ受容体の生物学的活性を減少させることができる。特定の例において、小分子阻害剤は膜透過性である。いくつかの例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、Ａｘｌ触媒活性の阻害剤のような、トリアゾール化合物またはその誘導体である（特定の例は、米国特許公開第２００７０２１３３７５号および同第２００８０１５３８１５号に見出すことができ、これらはともに参照により本明細書に組み入れられる）。例えば、ＡＸＬ-１、ＡＸＬ-２、ＡＸＬ-３、ＡＸＬ-４、ＡＸＬ-５、ＡＸＬ-６、ＡＸＬ-７、ＡＸＬ-８、ＡＸＬ-９、ＭＰ４７０、およびＳＧＩ-ＡＸＬ-２７７などの、いくつかの小分子ＴＡＭ受容体阻害剤が公知である。他の小分子ＴＡＭ受容体阻害剤は、例えば、Ｒｉｇｅｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡおよびＳｕｐｅｒＧｅｎ社，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡから入手することができる。ＴＡＭ受容体阻害剤の他の具体的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ第０７０３０６８０Ａ３号、同ＷＯ第０６０５２９３６Ａ３号、同ＷＯ第０４０９２７３５Ａ３号、同ＷＯ第０７０５６１５１Ａ２号、および米国特許公開第２００７０１４２４０２号（全て参照により本明細書に組み入れられる）に見出すことができる。いくつかの例において、ＡＸＬ阻害剤は、トリアゾール誘導体である。ＡＸＬ阻害剤の例は、２００７年９月１３日に出願された米国特許公開第２００７／０２１３３７５号に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。ある例において、ＡＸＬ阻害剤は、以下の一般構造のうちの１つを有するトリアゾール誘導体である：
【化２】
2011514881.tif 000003
（ここで、Ｒは、ＨまたはＣＨ３であることができる）。
【０１２４】
既知のＴＡＭ受容体阻害剤に加えて、既存の阻害剤を化学修飾することによって、より強力な阻害剤を生成することができる。例えば、既知の化合物は、通常、低マイクロモル範囲で作用するが、いくつかの実施形態では、化学修飾によってこれらの化合物がより強力かつより特異的になる。１つの実施形態において、解かれているＭＥＲＴＫのキナーゼドメイン結晶構造を用いて、ＱＳＡＲ解析を実施する。この結晶構造に基づいてＡｘｌキナーゼとＴｙｒｏ３キナーゼをモデリングすることもできる（例えば、Ｗａｌｋｅｒ，Ｈｕａｎｇ，Ｆｉｎｅｒｔｙ  Ｊｒ．，Ｗｅｉｇｅｌｔ，Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈ，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｂｏｃｈｋａｒｅｖ，Ｄｈｅ-Ｐａｇａｎｏｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｏ-ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ-ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  ＭＥＲ（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ  ａｔ  ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｅｘｐｌｏｒｅ．ｄｏ？ｓｔｒｕｃｔｕｒｅＩｄ＝３ＢＲＢ-で入手できる）；ＰＤＢ（タンパク質データベース）２Ｐ０Ｃ参照）。これらのより強力な組成物は、より低いＩＣ５０値を有すると考えられる。
【０１２５】
２．抗体
いくつかの実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、抗Ｍｅｒ抗体、抗Ｔｙｒｏ３抗体、または抗Ａｘｌ抗体（例えば、抗ヒトＭｅｒモノクローナル抗体、抗ヒトＴｙｒｏ３モノクローナル抗体、または抗ヒトＡｘｌモノクローナル抗体）である。抗ＴＡＭ受容体抗体の例は、例えば、Ｖａｒｎｕｍら（１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ，３７３：６２３-６２６、およびＧａｌｌｉｃｃｈｉｏら（２００５）  Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．１０５，Ｎｏ．５，ｐｐ．１９７０-１９７６に見出すことができる。抗ＴＡＭ受容体抗体は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手することができる。本開示により包含される抗体には、 Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒタンパク質の保存された結合表面もしくはエピトープ（例えば、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒタンパク質の細胞外ドメイン中の保存された結合表面もしくはエピトープ）に選択的に結合する任意の抗体、またはＴＡＭ受容体リガンド（例えば、Ｇａｓ６またはプロテインＳ）に結合し、リガンドとＴＡＭ受容体の相互作用を害することができる抗体が含まれる。所与のタンパク質またはペプチドまたは他の分子の「エピトープ」とは、抗体またはその抗原結合断片が結合し、それに対する抗体が産生されるより大きい分子のある部分またはある部位のことである。エピトープは、抗体結合に関与するアミノ酸残基とそれらの３次元空間における立体構造（例えば、立体構造エピトープまたは保存された結合表面）の両方によって規定することができる。エピトープは、わずか約４〜６アミノ酸残基ほどのペプチドに含めることができ、またはより大きいタンパク質セグメント（例えば、７〜１２アミノ酸）に含めることもできるが、エピトープの３次元構造に関する場合、特に、抗体結合エピトープに関しては、連続するアミノ酸残基から構成される必要はない。例えば、ＴＡＭ受容体またはＴＡＭリガンドの細胞外ドメインのエピトープを用いて、開示された方法に有用な抗体を作製することができる。抗体結合エピトープは、連続的エピトープではなく、立体構造エピトープ、すなわち、換言すれば、抗体が結合するタンパク質またはポリペプチドの表面上で３次元的に配置されたアミノ酸残基によって規定されるエピトープであることの方が多い。
【０１２６】
開示されるＴＡＭ受容体阻害剤には、抗体が含まれる。「抗体」という用語は、特定の抗原に特異的に結合するか、または特定の抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン分子（またはその組合せ）を指し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子改変された形態の抗体、または他の方法で修飾された形態の抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ）、単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、ポリペプチドに対する特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチド、ならびに抗体の抗原結合断片を含むが、これらに限定されない）を含む。抗体断片としては、タンパク質分解による抗体断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’-ＳＨ断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ、およびｒＩｇＧ］、組換え抗体断片（例えば、ｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性ｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、ダイアボディ、およびトリアボディ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ラクダ科抗体（例えば、米国特許第６，０１５，６９５号、同第６，００５，０７９号、同第５，８７４，５４１号、同第５，８４０，５２６号、同第５，８００，９８８号、および同第５，７５９，８０８号参照）、ならびに軟骨魚類および硬骨魚類によって産生された抗体ならびに単離されたそれらの結合ドメイン（例えば、国際特許出願ＷＯ第０３０１４１６１号参照）が挙げられる。
【０１２７】
Ｆａｂ断片は、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であり、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ジスルフィド架橋によってヒンジ領域で連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であり、Ｆｄ断片は、ＶＨドメインとＣＨＩドメインからなり、Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬドメインとＶＨドメインからなり、ｄＡｂ断片は、１つのＶＨドメインからなる（例えば、Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４-５４６，１９８９参照）。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）とは、１つのＶＬ領域と１つのＶＨ領域が１組になって、これらの領域が１本のタンパク質鎖として作られるようにする合成リンカーを介して一価分子を形成している抗体である（例えば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３-４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９-５８８３，１９８８参照）。ダイアボディとは、ＶＨドメインとＶＬドメインは１本のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成するには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインが強制的に別の鎖の相補的ドメインと対形成させられ、２つの抗原結合部位が生成されている、二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４-６４４８，１９９３；Ｐｏｌｊａｋら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：１１２１-１１２３，１９９４参照）。キメラ抗体とは、１つの抗体に由来する１つ以上の領域と１つ以上の他の抗体に由来する１つ以上の領域を含有する抗体である。抗体は、１つ以上の結合部位を有してもよい。２つ以上の結合部位がある場合、これらの結合部位は互いに同一のものであってもよく、または異なるものであってもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンが２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片が１つの結合部位を有しているのに対し、「二重特異性」抗体または「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「選択的に結合する」という用語は、あるタンパク質が別のタンパク質に（例えば、抗体、その断片、または結合パートナーが抗原に）特異的に結合することを指し、任意の標準的なアッセイ（例えば、イムノアッセイ）によって測定されるその結合レベルは、このアッセイのバックグラウンド対照よりも統計的に有意に高い。例えば、イムノアッセイを実施する場合、対照として、典型的には、抗体または抗原結合断片のみを含有する（例えば、抗原が存在しない）反応ウェル／チューブが挙げられるが、この場合、抗原の非存在下での抗体またはその抗原結合断片による反応性（例えば、ウェルに対する非特異的結合）の量がバックグラウンドであると考えられる。
【０１２９】
いくつかの例において、抗体は、試料中の他の分子に対する結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ-１大きいか、１０４Ｍ-１大きいか、または１０５Ｍ-１大きい結合定数で、ＴＡＭ受容体（例えば、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒ）の細胞外ドメインまたはＴＡＭ受容体リガンド（例えば、Ｇａｓ６もしくはプロテインＳ）に特異的に結合する。いくつかの例において、このような抗体（例えば、モノクローナル抗体）またはその断片は、１ｎＭ以下の平衡定数（Ｋｄ）を有する。例えば、少なくとも約０．１×１０-８Ｍ、少なくとも約０．３×１０-８Ｍ、少なくとも約０．５×１０-８Ｍ、少なくとも約０．７５×１０-８Ｍ、少なくとも約１．０×１０-８Ｍ、少なくとも約１．３×１０-８Ｍ、少なくとも約１．５×１０-８Ｍ、または少なくとも約２．０×１０-８Ｍの結合親和性で、ＴＡＭ受容体またはそのリガンドに結合する抗体。Ｋｄ値は、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によってまたは表面プラズモン共鳴装置（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ社，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００）を用いて測定することができる。
【０１３０】
結合は、ウェスタンブロット、イムノブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴、化学発光、蛍光偏光、リン光、免疫組織化学的解析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析、マイクロサイトメトリー、マイクロアレイ、顕微鏡法、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、およびフローサイトメトリーを含むが、これらに限定されない、当技術分野で標準的な種々の方法を用いて決定することができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、抗ＴＡＭ受容体抗体またはその抗原結合断片は、Ｔｙｒｏ３リガンド、Ａｘｌリガンド、またはＭｅｒリガンド（例えば、Ｇａｓ６またはプロテインＳ）の結合の競合的阻害剤である。競合的阻害剤とは、細胞によって発現されるＴｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒに結合し、Ｔｙｒｏ３リガンド、Ａｘｌリガンド、またはＭｅｒリガンド（例えば、Ｇａｓ６、プロテインＳ、アミノ末端切断型のＧａｓ６、またはアミノ末端切断型のプロテインＳ）が、細胞によって発現されたＴｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒに結合するのを顕著に低下させるかまたは阻害する阻害剤（例えば、小分子阻害剤、抗体、または抗原結合断片もしくはポリペプチド）である。競合的阻害剤は、Ｔｙｒｏ３リガンド、Ａｘｌリガンド、またはＭｅｒリガンドを上回る標的に対する親和性で、標的に結合することができる。競合アッセイは、当技術分野の標準的な技術（例えば、競合的ＥＬＩＳＡまたは他の結合アッセイ）を用いて実施することができる。例えば、競合的阻害剤は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒが、別の標識された抗Ｔｙｒｏ３抗体、抗Ａｘｌ抗体、もしくは抗Ｍｅｒ抗体、またはＴｙｒｏ３リガンド、Ａｘｌリガンド、もしくはＭｅｒリガンドに結合するのを阻害する能力によって検出および定量することができる。
【０１３２】
単離された抗体としては、そのような抗体を含有する血清、または様々な程度まで精製された抗体を挙げることができる。全抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができる。あるいは、全抗体の機能的等価物、例えば、１つ以上の抗体ドメインが切断されているかまたは欠如している抗原結合断片（例えば、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、またはＦ（ａｂ）２断片）、および遺伝子改変抗体またはその抗原結合断片（単鎖抗体、ヒト化抗体、２つ以上のエピトープに結合することができる抗体（例えば、二重特異性抗体）、または１つ以上の異なる抗原に結合することができる抗体（例えば、二重特異性抗体または多重特異性抗体）を含む）を使用することもできる。
【０１３３】
１つの実施形態において、抗Ｔｙｒｏ３抗体、抗Ａｘｌ抗体、もしくは抗Ｍｅｒ抗体（またはこれらのリガンドに対する抗体）はヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、ヒト以外の種の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有する分子のことであって、この分子の残りの免疫グロブリン由来部分は、ヒトの免疫グロブリンに由来している。抗原結合部位は、ヒト定常ドメインに融合された完全な可変領域かまたは可変ドメイン中の適当なヒトフレームワーク領域に接合された相補性決定領域（ＣＤＲ５）のみかのいずれかを含むことができる。ヒト化抗体は、例えば、抗体可変ドメインをモデリングし、ＣＤＲ接合などの遺伝子改変技術を用いて抗体を産生することによって産生することができる。ヒト化抗体を産生するための様々な技術の記載は、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１-５５；Ｗｈｉｔｔｌｅら（１９８７）  Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１：４９９-５０５；Ｃｏら（１９９０）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９-１１５４；Ｃｏら（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２８６９-２８７３；Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：４２８５-４２８９；Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら（１９９１）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２７１７-２７２５、ならびにＰＣＴ特許公開ＷＯ第９１／０９９６７号；同ＷＯ第９１／０９９６８号および同ＷＯ第９２／１１３８３１号に見出すことができる。
【０１３４】
他の実施形態としては、完全ヒト抗体が挙げられる。特定の結合特異性を有するこのような抗体を産生する１つの方法として、（例えば、Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換を用いて、またはＰＣＲクローニングおよびファージディスプレイによって）免疫ドナーからヒト抗体を取得することが挙げられる。さらに、かつより典型的には、合成されたヒト抗体Ｖ領域のランダムに選ばれた組合せを用いる合成ファージライブラリーが作製されている。抗原上で選択することによって、Ｖ領域が非常にヒトに似た性質を有する完全ヒト抗体を作製することができる。最後に、完全ヒト抗体は、トランスジェニックマウスから産生することができる。具体的には、ヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子セグメントのレパートリーを有するトランスジェニックマウスが作製されている。したがって、免疫化された時に、これらのマウスは、ヒト様の抗体を産生する。これらの方法は全て、当技術分野で公知である。
【０１３５】
遺伝子改変抗体には、抗体の可変領域および／または定常領域をコードするＤＮＡの操作および再発現を伴う標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生されるものが含まれる。特定の例としては、抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインが、抗体の残りの部分と比較した場合に、異なる源に由来しているキメラ抗体、ならびに少なくとも１つのＣＤＲ配列および任意で少なくとも１つの可変領域フレームワークアミノ酸が１つの源に由来し、（必要に応じて）可変領域および定常領域の残りの部分が異なる源に由来しているＣＤＲ接合抗体（およびその抗原結合断片）が挙げられる。キメラ抗体およびＣＤＲ接合抗体の構築は、例えば、欧州特許出願ＥＰ-Ａ０１９４２７６、ＥＰ-Ａ０２３９４００、ＥＰ-Ａ０４５１２１６、およびＢＰ-Ａ０４６０６１７に記載されている。１つの実施形態において、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒに結合する抗体可変ドメインを含むキメラ抗体が産生され、第二のターゲッティング部分としての役割を果たすタンパク質がこれらのドメインに融合する。例えば、ターゲッティング部分としては、ターゲッティングされる細胞もしくは組織と関連するかまたは動物の特定のシステムと関連するタンパク質を挙げることができる。
【０１３６】
抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）を作製する方法は、当技術分野で十分に確立されている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８参照）。一般に、ポリクローナル抗体の産生においては、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、マウス、ラット、またはニワトリなどの好適な実験動物を、（例えば、細胞外ＴＡＭ受容体ドメインまたはそのリガンドに対する）抗体が所望される抗原に曝露させる。典型的には、動物は、動物に注射される抗原の有効量で免疫化される。抗原の有効量とは、動物による抗体産生を誘導するのに必要な量を指す。その後、所定の時間、動物の免疫系に応答させる。免疫系が抗原に対する抗体を産生していることが認められるまで、免疫化プロセスを繰り返すことができる。抗原に特異的なポリクローナル抗体を得るために、所望の抗体を含有する動物から血清を採取する（またはニワトリの場合、抗体を卵から採取することができる）。このような血清は、試薬として有用である。ポリクローナル抗体はさらに、例えば、血清を硫安で処理することによって血清（または卵）から精製することができる。
【０１３７】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５-４９７，１９７５）の方法論に従うか、またはヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１-６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を用いて産生することができる。例えば、Ｂリンパ球を、免疫化した動物の脾臓（または任意の好適な組織）から回収し、その後、骨髄腫細胞と融合して、好適な培養培地中で連続的に増殖することができるハイブリドーマ細胞の集団を得る。所望の抗体を産生するハイブリドーマを、これらのハイブリドーマによって産生される抗体が所望の抗原に結合する能力を検査することによって選択する。ハイブリドーマをクローニングすることができ、また、抗体を、これらのハイブリドーマにより産生し、その後、これらのハイブリドーマから単離することができる。モノクローナルＴＡＭ受容体（またはＴＡＭ受容体リガンド）抗体を産生する例示的な方法は、（ａ）動物に有効量のタンパク質またはペプチド（例えば、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒの細胞外ドメイン、またはＴｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒのリガンド）を投与して抗体を産生する工程、および（ｂ）これらの抗体を回収する工程を含む。本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語には、キメラ形態、ヒト化形態、およびヒト形態のモノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、単一クローン（集団）の細胞によって純粋な形態として実験室で合成されることが多い。これらの抗体は大量に作製することができ、また、細胞の表面に見られる特定の標的抗原に対する特異的親和性を有することができる。
【０１３８】
１つの例において、ＴＡＭ受容体（例えば、細胞外ドメインのエピトープ）またはＴＡＭ受容体リガンド（もしくはこのリガンドのエピトープ）に対するモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５）の古典的な方法またはその派生法に従ってマウスハイブリドーマから調製することができる。１つの例示的な方法において、免疫化されるマウス（例えば、６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃ）に、数μｇの選択されたペプチドまたはその担体コンジュゲートを数週間にわたって繰り返し（例えば、３〜６回）接種する。いくつかの例において、０日目、１０日目、および２０日目に、２８ゲージの針が付いたインスリン用注射器を用いて、マウスの尾の基部に３回皮内注射することができる。抗血清力価を評価するために、３０日目および４５日目に、血清を採取することができる。その後、マウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。細胞融合のために最後に細胞追加免疫をしてから約８０〜９０時間後に、脾臓を摘出することができる。脾臓細胞を、ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫細胞と融合させ、アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）でこの系を増殖させることによって、余分の未融合細胞を殺す。例えば、脾細胞の細胞融合は、ＯｉおよびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０）のプロトコルに従って実施することができる。脾細胞とＳＰ２／０細胞は、例えば、４：１の比率で混合する。混合した細胞を遠心分離し、細胞ペレットをポリエチレングリコール（例えば、４０％〜５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール）と適当な培地に再懸濁する。得られる懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットをＨＡＴ培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェル（２．５×１０５細胞／ウェル）で播種し、ＣＯ２インキュベーター中で培養する。融合の１日後、５００μｇ／ｍｌ  ジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１００μｌの新鮮なＨＡＴ培地を添加する。４日目および７日目に、使用済み培地の半分を、２５０μｇ／ｍｌ  ジェネティシンを含有する新鮮なＨＡＴ培地に置き換える。８日目に、各ウェルのハイブリドーマの増殖を顕微鏡下で調べる。融合に成功した細胞を希釈し、希釈液のアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに入れ、そこで培養物の増殖を続けさせる。抗体産生クローンは、イムノアッセイ、例えば、Ｅｎｇｖａｌｌ（Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０：４１９，１９８０）によって最初に記載されたような、ＥＬＩＳＡ、およびその派生法で、ウェルの上清液中の抗体を検出することによって同定される。例えば、培養上清中のｍＡｂ産生は、ＥＬＩＳＡアッセイで１０日目にまたはＦＡＣＳソーターで９日目および１０日目にアッセイすることができる。陽性クローンを拡大し、特定のハイブリドーマを限界希釈法でクローニングすることができる。選択された陽性クローンを拡大し、それらのモノクローナル抗体産物を、使用するために収穫することができる。
【０１３９】
別の例において、抗Ｔｙｒｏ３モノクローナル抗体、抗Ａｘｌモノクローナル抗体、もしくは抗Ｍｅｒモノクローナル抗体（またはこれらのリガンドのモノクローナル抗体）を、組換えによって産生する。例えば、ひとたび抗体を発現する細胞株（例えば、ハイブリドーマ）が得られれば、そこからcＤＮＡをクローニングし、所望の抗体をコードする可変領域遺伝子（ＣＤＲをコードする配列を含む）を同定することが可能である。その後、少なくとも抗体の重鎖または軽鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列と、任意で所望されるような重鎖および／または軽鎖の残りの部分をコードする他のＤＮＡ配列とを含有する１つ以上の複製可能な発現ベクターを調製し、抗体の産生が起こる適当な宿主細胞に形質転換／トランスフェクトすることによって、抗体および抗原結合断片を得ることができる。好適な発現宿主としては、細菌（例えば、大腸菌株）、真菌（特に、酵母（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｖｃｅｓ）属、またはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｒｎｙｃｅｓ）属のメンバー））、および哺乳動物細胞株（例えば、非産生型骨髄腫細胞株（例えば、マウスＮＳＯ株）、またはＣＨＯ細胞）が挙げられる。効率的な転写および翻訳を得るために、各ベクターのＤＮＡ配列は、適当な調節配列、特に、可変ドメイン配列に機能的に連結されたプロモーターおよびリーダー配列を含む。この方法で抗体を産生する特定の方法は公知であり、日常的に使用されている。例えば、基本的な分子生物学の手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）によって記載されており、ＤＮＡシークエンシングは、Ｓａｎｇｅｒら（ＰＮＡＳ  ７４，５４６３，（１９７７））およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃシークエンシングハンドブックに記載の通りに実施することができ、部位特異的変異生成は、Ｋｒａｍｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１：９４４１，（１９８４））の方法およびＡｎｇｌｉａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のハンドブックに従って実行することができる。さらに、例えば、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ＆  Ａｄａｉｒにより、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（Ｔｏｍｂｓ，Ｍ  Ｐ編，１０，第１章，１９９２，Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）において、および前述の欧州特許出願において概説されているように、ＤＮＡの操作による抗体の調製に好適な技術、発現ベクターの作製、および適当な細胞の形質転換について詳しく述べている多くの刊行物（特許明細書を含む）がある。
【０１４０】
別の例において、ＴＡＭ受容体（例えば、細胞外ドメインのエピトープ）またはＴＡＭ受容体リガンドに対するモノクローナル抗体は、米国特許第７，１４８，３３２号、同第５，６７５，０６３号、または同第４，８５９，５９５号に記載されているようなウサギハイブリドーマから調製することができる。
【０１４１】
さらに別の例において、ＴＡＭ受容体（例えば、細胞外ドメインのエピトープ）またはＴＡＭ受容体リガンドに対するモノクローナル抗体は、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウスまたはウサギ）にＴＡＭ受容体（例えば、細胞外ドメインのエピトープ）またはＴＡＭ受容体リガンド（もしくはその断片）をコードする１つ以上のプラスミドを繰り返し接種することによって調製することができる。例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはそれから派生したベクターを、標準的な分子生物学の方法を用いて操作し、ＴＡＭ受容体（例えば、細胞外ドメインのエピトープ）またはＴＡＭ受容体リガンドのペプチド断片のコード配列を含むようにすることができる。１つの例示的な方法において、Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）を、適当なプラスミド（リン酸緩衝化生理食塩水中に２０μｇ）で３回免疫化し、融合前に細胞を用いて１回の追加免疫を与えることができる。０日目、１０日目、および２０日目に、２８ゲージの針が付いたインスリン用注射器を用いて、マウスの尾の基部に３回皮内注射することができる。抗血清力価を評価するために、３０日目および４５日目に、血清を採取することができる。免疫化したマウスを追加免疫するために、所望のプラスミドを発現する細胞を（例えば、少なくとも５０日目に）注射する。これらの注射は、静脈内および腹腔内へのものであることができる。細胞融合のために最後に細胞追加免疫をしてから約８０〜９０時間後に、脾臓を摘出する。脾細胞の細胞融合は、ＯｉおよびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０）のプロトコルに従って実施することができる。脾細胞とＳＰ２／０細胞は、例えば、４：１の比率で混合する。混合した細胞を遠心分離し、細胞ペレットをポリエチレングリコール（例えば、４０％〜５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール）と適当な培地に再懸濁する。得られた懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットをＨＡＴ培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェル（２．５×１０５細胞／ウェル）で播種し、ＣＯ２インキュベーター中で培養する。融合の翌日、５００μｇ／ｍｌ  ジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１００μｌの新鮮なＨＡＴ培地を添加する。４日目および７日目に、使用済み培地の半分を、２５０μｇ／ｍｌ  ジェネティシンを含有する新鮮なＨＡＴ培地に置き換える。８日目に、各ウェルのハイブリドーマの増殖を顕微鏡下で調べる。培養上清中のｍＡｂ産生は、ＥＬＩＳＡアッセイで１０日目にまたはＦＡＣＳソーターで９日目および１０日目にアッセイすることができる。陽性クローンを拡大し、特定のハイブリドーマを限界希釈法でクローニングすることができる。
【０１４２】
さらに、ヒト化形態のモノクローナル抗体およびモノクローナル抗体の断片を産生するプロトコルが当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，０５４，２９７号、同第６，４０７，２１３号、同第６，６３９，０５５号、同第６，８００，７３８号、および同第６，７１９，９７１号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００３３０３１号、および同第２００４／０２３６０７８号参照）。同様に、単鎖抗体を産生する方法が記載されており、ＴＡＭ受容体阻害剤を作製するのに有用であり得る（Ｂｕｃｈｎｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３-２７０，１９９２；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５，１９９１；Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５，１９８９、およびＷａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４，１９８９参照）。
【０１４３】
当業者に公知の方法（例えば、セクションＪを含む、本明細書で詳細に記載されている方法）を用いて、このような抗体をスクリーニングし、ＴＡＭ受容体作動薬となる抗体ではなく、ＴＡＭ受容体阻害剤となる抗体を同定することができる。
【０１４４】
３．抑制性ＲＮＡ分子（ＲＮＡｉ）
さらに別の例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、例えば、ＴＡＭ受容体またはそのリガンドの翻訳を減少させることによって、ＴＡＭ受容体の生物学的活性を減少させるかまたは消失させることができるｓｉＲＮＡまたは他の抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。当業者は、ＴＡＭ受容体（例えば、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒ）またはそのリガンド（例えば、Ｇａｓ６もしくはプロテインＳ）をコードする核酸に特異的に結合するｓｉＲＮＡを容易に作製することができる。１つの例において、市販のキット（例えば、ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）またはＡＭＢＩＯＮ（登録商標）（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）製のｓｉＲＮＡ分子合成キット）を用いて、ｓｉＲＮＡ分子を合成してもよい。別の例において、ｓｉＲＮＡは、市販源、例えば、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）社（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＡＭＢＩＯＮ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ（登録商標）（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、ＳＩＧＭＡ-ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＯＰＥＮＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標）（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から入手される。
【０１４５】
遺伝子特異的な発現の阻害を誘導することができる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であるｓｉＲＮＡが提供される。これらのＲＮＡは、標的ＴＡＭ受容体の発現の干渉または阻害に好適であり、各鎖に長さが０〜約５ヌクレオチドの３'突出および／または５'突出を含有する約１５〜約４０ヌクレオチド（例えば、１９〜２３ヌクレオチド）の二本鎖ＲＮＡを含み、この二本鎖ＲＮＡの配列は、発現の干渉または阻害が所望される標的ＴＡＭ受容体またはそのリガンドのｍＲＮＡまたは転写産物の一部と実質的に同一である。例えば、当技術分野で公知のＴＡＭ受容体核酸配列（例えば、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒについて、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６２９３．２、ＮＭ＿０２１９１３．３、およびＮＭ＿００６３４３．２を参照されたく、これらの配列は、参照により本明細書に組み入れられる）を用いるか、または当技術分野で公知のＧａｓ６もしくはプロテインＳ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）番号：ＮＭ＿０００８２０．１ <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NM_000820.1>（Ｇａｓ６について）およびＮＭ＿０００３１３．１ <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NM_000313.1>（プロテインＳについて））を用いて、このような配列に特異的なｓｉＲＮＡ配列を、常法を用いて作製することができる。二本鎖ＲＮＡは、相補的なｓｓＲＮＡによるか、またはヘアピンを形成する一本鎖ＲＮＡによるか、またはＤＮＡベクターからの発現によって形成することができる。
【０１４６】
天然ＲＮＡ分子に加えて、ＴＡＭ受容体またはそのリガンドの発現を阻害または干渉するのに好適なＲＮＡとしては、ＲＮＡ誘導体およびＲＮＡ類似体が挙げられる。例えば、ヌクレオチド残基間の非天然結合（例えば、ホスホロチオエート結合）を用いることができる。ＲＮＡ鎖は、反応性官能基またはレポーター基（例えば、フルオロフォア）で誘導体化することができる。特に有用な誘導体は、ＲＮＡ鎖の一方の末端または両方の末端、典型的には、センス鎖の３'末端で修飾される。例えば、３'末端の２'-水酸基を種々の基で容易にかつ選択的に誘導体化することができる。他の有用なＲＮＡ誘導体は、修飾された炭水化物部分（例えば、２'-Ｏ-アルキル化残基または２'-デオキシ-２'-ハロゲン化誘導体）を有するヌクレオチドを組み込んでいる。このような炭水化物部分の特定の例としては、２'-Ｏ-メチルリボシル誘導体および２'-Ｏ-フルオロリボシル誘導体が挙げられる。ＲＮＡ塩基を修飾してもよい。ＴＡＭ受容体またはＴＡＭ受容体リガンドの発現を阻害または干渉するのに有用な任意の修飾塩基を使用することができる。例えば、ハロゲン化塩基（例えば、５-ブロモウラシルおよび５-ヨードウラシル）を組み込むことができる。塩基をアルキル化することもでき、例えば、７メチルグアノシンをグアノシン残基の代わりに組み込むことができる。阻害の成功をもたらす非天然塩基を組み込むこともできる。
【０１４７】
ある例において、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子を発現する発現ベクターを利用する。例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞内で真核性プロモーターから発現させることができる。当業者は、適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターを用いて真核細胞で任意の核酸を発現させることができるということを理解するであろう。このような核酸の活性は、それらを酵素的核酸によって一次転写産物から放出することにより強化することができる（例えば、Ｄｒａｐｅｒら，ＰＣＴ  ＷＯ第９３／２３５６９号、およびＳｕｌｌｉｖａｎら，ＰＣＴ  ＷＯ第９４／０２５９５号参照）。
【０１４８】
いくつかの例において、ｓｉＲＮＡ分子を、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅら，１９９６，ＴＩＧ  １２：５１０参照）から発現させる。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであることができる。ｓｉＲＮＡを発現するウイルスベクターを、例えば、限定されるわけではないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、またはアルファウイルスをベースにして構築することができる。別の例において、ｐｏｌ  ＩＩＩベースのコンストラクトを用いて、ｓｉＲＮＡ核酸分子を発現させる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，米国特許第５，９０２，８８０号および同第６，１４６，８８６号参照）。
【０１４９】
別の例において、発現ベクターは、ＴＡＭ受容体またはＴＡＭ受容体リガンドを阻害するように特異的に設計された少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。特定の例において、ベクターは、二重鎖を含むｓｉＲＮＡ分子の両方の鎖をコードする配列を含有する。別の例において、ベクターは、自己相補的であるがゆえにｓｉＲＮＡ分子を形成する単一の核酸分子をコードする配列も含有する。ひとたび送達されると、ｓｉＲＮＡ分子を発現することができる組換えベクターは、標的細胞内にとどまる。あるいは、核酸分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを用いることができる。このようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。ひとたび発現すれば、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡと相互作用し、ＲＮＡｉ応答を生成する。
【０１５０】
４．アプタマー
さらに別の例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、ＴＡＭ受容体の生物学的活性を減少させるかまたは消失させることができるアプタマーである。当業者は、ＴＡＭ受容体（例えば、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、またはＭｅｒ）に特異的なアプタマーを容易に作製することができる。
【０１５１】
アプタマーには、特異的で、配列依存的な形状を取り、高い親和性および特異性でＴＡＭ受容体に結合する一本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が含まれる。アプタマーは、通常、１００未満のヌクレオチド、７５未満のヌクレオチド、または５０未満のヌクレオチド（例えば、１０〜１００または１０〜５０ヌクレオチド）を含む。別の実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、鏡像アプタマー（ＳＰＩＥＧＥＬＭＥＲ（商標）とも呼ばれる）である。鏡像アプタマーとは、Ｄ-オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）と比較して酵素による分解に高い抵抗性を示す高親和性のＬ-鏡像異性体核酸（例えば、Ｌ-リボース単位またはＬ-２’-デオキシリボース単位）のことである。アプタマーおよび鏡像アプタマーの標的結合特性は、例えば、Ｗｌｏｔｚｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９（１３）：８８９８-９０２，２００２に記載されているように、オリゴヌクレオチドのランダムなプールから始まるインビトロ選択プロセスによって設計される。
【０１５２】
別の例において、アプタマーは、高い親和性および特異性でＴＡＭ受容体に結合するペプチドアプタマーである。ペプチドアプタマーは、両末端でタンパク質スキャフォールドに付着した（例えば、ＴＡＭ受容体に特異的な）ペプチドループを含む。この二重の構造的拘束性によって、ペプチドアプタマーの結合親和性は、抗体の結合親和性に匹敵するレベル（ナノモル範囲）にまで大いに増大する。可変ループの長さは、典型的には、８〜２０アミノ酸（例えば、８〜１２アミノ酸）であり、スキャフォールドは、安定で、可溶性で、小さくて、かつ毒性のない任意のタンパク質（例えば、チオレドキシンＡ、ステフィンＡ三重変異体、緑色蛍光タンパク質、エグリンＣ、および細胞性転写因子Ｓｐ１）であってもよい。酵母ツーハイブリッド系（例えばＧａｌ４酵母ツーハイブリッド系）またはＬｅｘＡ相互作用トラップ系などの異なる系を用いて、ペプチドアプタマーの選択を行なうことができる。
【０１５３】
Ｄ．ＴＡＭ受容体作動薬
ＴＡＭ受容体作動薬には、細胞のＴＡＭ受容体の生物学的活性を顕著に増大させる薬剤、例えば、ＴＡＭ受容体に特異的に結合し、ＴＡＭ受容体を活性化する薬剤が含まれる。例えば、ＴＡＭ受容体作動薬は、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％さえも、生物学的なＴＡＭ受容体活性を増大させることができる。このような活性を測定する方法は、当技術分野で公知である。いくつかの例において、生物学的活性の増大は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、もしくはＭｅｒ、またはこれらの組合せの（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルでの）発現の増大によって示される。他の例において、生物学的活性の増大は、ＴＡＭ自己リン酸化の増大、ＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の低下、ＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激の低下、ＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の低下、またはＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の増大のような、下流効果の変化によって示される。（いくつかの例では定量化される）発現または活性のこのような変化を検出する方法は、日常的に行なわれているものであり、この方法としては、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ、ＲＴ-ＰＣＲなどを挙げることができる。
【０１５４】
いくつかの例において、ＴＡＭ受容体作動薬は、Ｔｙｒｏ３リガンド、Ａｘｌリガンド、またはＭｅｒリガンド（例えば、Ｇａｓ６およびプロテインＳ）、ならびにＴＡＭ受容体を活性化することができるこのようなリガンドの模倣体である。したがって、このような薬剤は、リガンドと受容体の相互作用を大幅に増大させ、例えば、受容体からのシグナル伝達を増大させ、下流の生物学的効果を増大させることによって、例えば、受容体活性化を顕著に増大させることができる。このようなＴＡＭ受容体作動薬の例としては、組換え型のＧａｓ６またはプロテインＳ、例えば、ＴＡＭ受容体作動薬活性を保持するこのようなタンパク質の挿入、欠失、および切断を含む変異体配列が挙げられる。例えば、Ｇａｓ６は、ＴＡＭ受容体を活性化することができるペプチドであり、自然源から精製されたか、化学合成されたか、または組換えによって産生されたかのいずれかの、成熟型、プレ型、プレプロ型、およびプロ型のＧａｓ６ポリペプチドを包含する。
【０１５５】
Ｇａｓ６ポリペプチドまたはプロテインＳポリペプチドが、自然で見られるプロテインＳポリペプチドまたはＧａｓ６ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、ヒトＧａｓ６配列またはヒトプロテインＳ配列、それぞれ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）番号ＮＰ＿０００８１１．１ <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NP_000811.1>およびＮＰ＿０００３０４．２、２００７年１１月７日現在）を有する場合、それは、産生された方法を問わず（例えば、それは内在性の分子源から単離することができ、または合成技術によって産生することができる）、本明細書では「天然」と表す。
【０１５６】
いくつかの例において、プロテインＳリガンドおよびＧａｓ６リガンドは、このような分子が機能的に活性を有する（例えば、ＴＡＭ受容体を活性化することができる）限りにおいて、天然配列の変異体を包含する。このような変異体には、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が配列のＮ末端もしくはＣ末端で、または配列の内部で付加され、１つ以上のアミノ酸残基が欠失し、かつ任意で１つ以上のアミノ酸残基で置換されているヒトＧａｓ６またはヒトプロテインＳのアミノ酸配列のような断片、および上記のタンパク質、ポリペプチド、またはその断片の誘導体を挙げることができるが、この場合、アミノ酸残基は共有結合的に修飾されているので、得られる産物は天然に存在しないアミノ酸である。いくつかの例において、１〜５０、１〜２０、または１〜１０アミノ酸残基を変化させる。このような変異体は、合成的に、例えば、部位特異的変異生成もしくはＰＣＲによる変異生成によって、作製されることもあるし、または対立遺伝子型ならびにヒトおよび他の動物種で生じ得る翻訳されたアミノ酸配列の他の天然に存在する変異体の場合のように、天然に存在することもある。ある例において、プロテインＳ変異体またはＧａｓ６変異体は、例えば、Ｆｉｔｃｈら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８０：１３８２-１３８６（１９８３）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３-４５３（１９７０）によって記載されたアルゴリズムを改変したもの）によって決定されるように、最大の相同性を与えるように配列を配置した後に、天然プロテインＳもしくはＧａｓ６のアミノ酸または核酸コード配列と少なくとも約７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）の配列同一性を共有する。
【０１５７】
このようなＴＡＭ受容体作動薬の例は、組換え型のＧａｓ６またはプロテインＳ、例えば、アミノ末端が切断されたＧａｓ６またはプロテインＳである。特定の例において、組換え作動薬は、ヒトＧａｓ６配列（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）番号：ＮＭ＿０００８２０．１；ＮＰ＿０００８１１．１）の残基３９〜９２（配列番号２０）およびヒトＰｒｏＳ１配列（Ｇｅｎｂａｎｋ（商標）番号：ＮＭ＿０００３１３．１；ＮＰ＿０００３０４．１）の残基２３〜８５（配列番号２１）に対応する「Ｇｌａ」ドメインを欠くアミノ末端切断を有する。しかしながら、Ｇｌａドメインは、ＴＡＭ受容体の結合および活性化に必須ではなく、そのため、このドメインを欠く組換え型のＧａｓ６およびＰｒｏＳは、強力なＴＡＭ活性化因子であるが、血液凝固と関連する副作用がない。Ｇａｓ６断片またはＰｒｏＳ切断の追加の例としては、Ｇａｓ６またはＰｒｏＳのいずれかのＥＧＦドメインの１つ、２つ、３つ、または４つ全ての完全欠失または部分欠失が挙げられる。いくつかの例において、ＴＡＭ受容体作動薬は、Ｇｌａドメインも１つのＥＧＦドメインも含まないＧａｓ６リガンドまたはプロテインＳリガンドである。ＴＡＭ受容体作動薬として使用することができる他の例示的なＧａｓ６変異体は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，２５５，０６８号に提供されている。
【０１５８】
いくつかの例において、ＴＡＭ受容体作動薬は、極めて特異的にＴＡＭ受容体細胞外ドメインに結合する。このような薬剤は、ＴＡＭ受容体リガンドと受容体の相互作用を大幅に増大させ、かつ／または例えば、受容体からのシグナル伝達を増強し、下流の生物学的効果を増大させることによって、受容体活性化を刺激するかもしくは増大させることができる。このような阻害剤の例としては、ＴＡＭ受容体を架橋するためにＴＡＭ受容体エピトープに結合し、それによって受容体の二量体化と交差リン酸化を通じて活性化するように設計された抗体（例えば、モノクローナル抗体（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）、ならびに上記の他の抗体およびその断片）を挙げることができ、これをＴＡＭ作動薬として使用する。このような抗体（およびその断片）は、市販源から入手することができ、または受容体を阻害するのではなく受容体を刺激する抗体を選択することを除いては、ＴＡＭ受容体阻害剤について上で記載されているように作製することができる。当業者に公知の方法（例えば、セクションＪを含む、本明細書で詳細に記載されている方法）を用いて、このような抗体をスクリーニングし、ＴＡＭ受容体作動薬となる抗体ではなく、ＴＡＭ受容体阻害剤となる抗体を同定することができる。
【０１５９】
他の実施形態において、ホスファチジルセリン（ＰＳ）で誘導体化されたポリマービーズ、または主にＰＳから構成されたリポソームを、治療的なＴＡＭ受容体作動薬として使用する。これらのＰＳを含有する薬剤は、マクロファージ、ＤＣ、および体内の他の細胞によって通常作られる、内在性に産生されるＴＡＭリガンドのＧｌａドメインに結合し、それによってこれらの内在性リガンドを安定化させ、これらの内在性リガンドの結合親和性を増大させる。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、ＴＡＭ受容体作動薬は、約５０μＭ未満、例えば、約５０ｎＭ未満、または１ｐＭ未満のＥＣ５０を有する。特定の実施形態において、ＴＡＭ受容体作動薬は、約１０μＭもしくは２０μＭ、０．０５μＭ〜約５μＭ、０．１ｎＭ〜２０ｎＭ、１ｐＭ〜約１０μＭ、または０．１ｐＭ〜５０ｐＭのＥＣ５０を有し、特定の実施形態において、ＴＡＭ受容体作動薬は、約０．００５ｎＭ〜約５０ｎＭ未満または約０．０５ｎＭ〜約５０ｎＭ未満（例えば、約５０ｐＭ〜約１ｎＭ、または約１ｎＭ〜約５０ｎＭ）のＥＣ５０を有する。例えば、マウス組換えＧａｓ６および全長マウスプロテインＳをはじめとする、ＴＡＭ受容体作動薬は、およそ５０ｐＭ〜約５０ｎＭ（例えば、約５０ｐＭ〜約１ｎＭまたは約１ｎＭ〜約５０ｎＭ）のＥＣ５０を有する。既知のＴＡＭ受容体作動薬に加えて、既存の作動薬を化学修飾することによって、より強力な作動薬が生成される。例えば、既知の化合物は、通常、低マイクロモル範囲で作用するが、いくつかの実施形態では、化学修飾によってこれらの化合物がより強力かつより特異的になる。１つの実施形態において、解かれているＭＥＲＴＫのキナーゼドメイン結晶構造を用いて、ＱＳＡＲ解析を実施する。この結晶構造に基づいてＡｘｌキナーゼとＴｙｒｏ３キナーゼをモデリングすることもできる（例えば、Ｗａｌｋｅｒ，Ｈｕａｎｇ，Ｆｉｎｅｒｔｙ  Ｊｒ．，Ｗｅｉｇｅｌｔ，Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈ，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｂｏｃｈｋａｒｅｖ，Ｄｈｅ-Ｐａｇａｎｏｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｏ-ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ-ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  ＭＥＲ（近刊）；ＰＤＢ（タンパク質データベース）２Ｐ０Ｃ参照）。これらのより強力な組成物は、より低いＥＣ５０値を有すると考えられる。
【０１６１】
Ｄ．ＴＡＭ受容体阻害剤またはＴＡＭ受容体作動薬を含む薬学的組成物
本明細書で記載される方法で使用されるＴＡＭ受容体阻害剤およびＴＡＭ受容体作動薬は、治療または予防される疾患の位置および種類に応じて、種々の方法で処方することができる。したがって、局部（例えば、局所または吸入）使用と全身使用の両方のための薬学的組成物を提供する。したがって、本開示は、人間医学または獣医学で使用するために処方される少なくとも１つのＴＡＭ受容体阻害剤（例えば、１つ、２つ、もしくは３つのＴＡＭ受容体阻害剤）または少なくとも１つのＴＡＭ受容体作動薬（例えば、１つ、２つ、もしくは３つのＴＡＭ受容体作動薬）を含む薬学的組成物をその範囲内に含む。ＴＡＭ受容体阻害剤またはＴＡＭ受容体作動薬は、典型的には、ヒト対象を治療するために使用されるが、これらは、他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシのような他の脊椎動物における同様または同一の疾患を治療するために使用することもできる。
【０１６２】
本明細書で記載されるような少なくとも１つのＴＡＭ受容体阻害剤を活性成分として含むか、またはＴＡＭ受容体阻害剤と追加の抗感染症剤、ワクチン、もしくは抗癌剤の両方を活性成分として含む薬学的組成物を、選択される特定の投与の様式に応じて、適当な固体担体または液体担体とともに処方することができる。さらに、本明細書で記載されるような少なくとも１つのＴＡＭ受容体作動薬を活性成分として含むか、またはＴＡＭ受容体作動薬と追加の免疫抑制剤の両方を活性成分として含む薬学的組成物を、選択される特定の投与の様式に応じて、適当な固体または液体の担体とともに処方することができる。好適な投与形式については、医師が各対象について個別的に最善のものを決定することができる。様々な薬学的に許容される担体およびそれらの製剤は、標準的な処方の専門書、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。Ｗａｎｇ  ＆  Ｈａｎｓｏｎ（１９８８）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．１０，Ｓｕｐｐ．４２：２Ｓも参照されたい。
【０１６３】
薬学的組成物の投薬形態は、選択される投与の様式によって決定される。例えば、注射可能液に加えて、吸入製剤、経皮製剤、直腸製剤、膣製剤、および経口製剤を利用することができる。吸入調合剤としては、エアロゾル、微粒子などを挙げることができる。一般に、吸入用の粒子サイズの目安は、医薬品が吸収されるために肺の肺胞領域に達するように、約１μｍ以下である。経口製剤は、液体（例えば、シロップ、溶液、もしくは懸濁液）、または固体（例えば、粉末、ピル、錠剤、もしくはカプセル）であることができる。固体組成物については、従来の非毒性固体担体として、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。このような投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明白であると考えられる。
【０１６４】
１つの実施形態において、少なくとも１つのＴＡＭ受容体阻害剤またはＴＡＭ受容体作動薬と薬理学的に許容される担体とを含む薬理学的組成物を提供する。薬理学的に許容される担体（例えば、生理学的または薬学的に許容される担体）は、当技術分野で周知である。好適な薬理学的組成物は、ＴＡＭ受容体阻害剤またはＴＡＭ受容体作動薬をインビボで使用しやすくするように処方することができる。このような組成物は、任意の好適な宿主（例えば、医療適用される患者）に活性成分を送達するのに好適であることができ、それ自体公知の方法で、例えば、従来の混合、溶解、粒状化、糖衣錠作製、粉末化、乳化、カプセル化、封入化、または凍結乾燥のプロセスによって、製造することができる。
【０１６５】
組成物または薬学的組成物は、非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、もしくは関節内への注射もしくは注入）、または舌下、経口、局所、鼻腔内、もしくは経粘膜への投与によるもの、または肺への吸入によるものを含む、任意の経路で投与することができる。ＴＡＭ受容体阻害剤またはＴＡＭ受容体作動薬が、例えば、注射用または注入用の非経口組成物として提供される場合、それらは、通常、例えば、ｐＨ約３．０〜約８．０（例えば、ｐＨ約３．５〜約７．４、ｐＨ３．５〜６．０、またはｐＨ３．５〜約５．０）の等張緩衝溶液中の水性担体に懸濁される。有用な緩衝液としては、クエン酸ナトリウムクエン酸緩衝液、およびリン酸ナトリウムリン酸緩衝液、ならびに酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液が挙げられる。
【０１６６】
経口投与について、ＴＡＭ受容体阻害剤またはＴＡＭ受容体作動薬を含む薬学的組成物は、例えば、薬学的に許容される賦形剤（例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（例えば、ラクトース、ミクロクリスタリンセルロース、もしくはリン酸水素カルシウム）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはグリコール酸デンプンナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム））とともに従来の手段によって調製された錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。経口投与用の液体調合剤は、例えば、溶液、シロップ、もしくは懸濁液の形態を取ることができ、またはそれらは、使用前に水または他の好適なビヒクルで構成される乾燥製品として提示することができる。このような液体調合剤は、薬学的に許容される添加剤（例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画された植物油）、および防腐剤（例えば、ｐヒドロキシ安息香酸メチル、ｐヒドロキシ安息香酸プロピル、またはソルビン酸））とともに従来の手段によって調製することができる。調合剤は、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含有することもできる。
【０１６７】
吸入による投与について、本開示に従って使用されるＴＡＭ受容体阻害剤またはＴＡＭ受容体作動薬は、好適な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガス）を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するためにバルブを備えることによって、投薬単位を決定することができる。化合物と好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）の粉末混合物を含有する、吸入器または散布器で使用されるカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
【０１６８】
本明細書で記載されているような少なくとも１つのＴＡＭ受容体阻害剤またはＴＡＭ受容体作動薬を活性成分として含む薬学的組成物は、通常、選択される特定の投与の様式に応じて、適当な固体担体または液体担体とともに処方される。本開示で有用な薬学的に許容される担体および賦形剤は、従来からのものである。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的かつ生理学的に許容される液体ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、他の平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）である注射可能液を含む。含めることができる賦形剤は、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿製剤）である。所望される場合、投与される薬学的組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝化剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含有することもできる。このような投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明白であると考えられる。
【０１６９】
Ｆ．アジュバントとしてのＴＡＭ受容体阻害剤の使用
一般に、本明細書で記載されるＴＡＭ受容体阻害剤は、任意のワクチン、例えば、完全に防御的であるとは言えないワクチン、１回以上の追加免疫の投与を必要とするワクチン、または完全に有効であるとは言えないかもしくは安全性についての懸念があるアジュバントを使用しているワクチンと併用することができる。例えば、現在の炭疽ワクチン（ＢｉｏＴｈｒａｘ）は、アルミニウムをベースにしたアジュバントを使用しているが、このアジュバント対しては、副作用についての複数の懸念がある。安全性についての懸念があるアジュバントを使用している他のワクチンの具体的で非限定的な例としては、ＤＴＰ（ジフテリア・破傷風・百日咳）ワクチン、Ｂ型インフルエンザワクチン、肺炎球菌コンジュゲートワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン、および狂犬病ワクチンが挙げられる。
【０１７０】
本開示のいくつかの実施形態は、ワクチンの免疫原性を増強する方法である。特定の実施形態において、ワクチンは、生物テロ薬剤に対するワクチンである。本方法は、生物テロ薬剤に対するワクチンと組み合わせて治療的有効量のＴＡＭ受容体阻害剤を対象に投与し、それによってワクチンの有効性を増強する工程を含む。ワクチンは、疾患の予防、改善、または治療のために投与される、抗原、ＤＮＡ、タンパク質サブユニット、ペプチド、弱毒化した微生物（細菌およびウイルスを含むが、これらに限定されない）、生きた微生物、または死滅した微生物の調合剤であることができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、熱またはホルマリンで死滅させたワクチンである。今日よく用いられる熱で死滅させたワクチンの例は、腸チフスワクチンおよびソークポリオワクチンである。
【０１７２】
他の実施形態において、ワクチンは、無細胞性ワクチンである。無細胞性ワクチンは、疾患を引き起こす生物の抗原性部分、例えば、莢膜、鞭毛、またはタンパク質細胞壁の部分のみを用いて作製される。さらに他の実施形態において、ワクチンは、弱毒化ワクチンである。弱毒化ワクチンは、生きた微生物を老化させるかまたは生きた微生物の増殖状態を変化させることで、生きた微生物を「弱毒化」または弱体化することによって作製される。またさらなる実施形態において、ワクチンはトキソイドである。
【０１７３】
他の実施形態において、ワクチンは、毒性があまり強くない関連病原体から作製される。関連病原体は、重度の疾患を引き起こさないが、より毒性の強い病原体からの防御を提供する。例えば、よく似ているが、多くの場合、致死性である天然痘ウイルスを防ぐために、比較的軽度の牛痘ウイルスが用いられる。 またさらなる実施形態において、ワクチンは、サブユニットワクチンまたはＤＮＡワクチンである。
【０１７４】
このように、１つ以上のＴＡＭ受容体阻害剤は、生物テロ薬剤を防御するワクチンを含むが、これらに限定されない、多種多様なワクチンと併用することができる。このようなワクチンの具体的で非限定的な例としては、炭疽菌、ペスト菌、大痘瘡、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、エボラウイルス、大腸菌、インフルエンザ菌、コブラ毒、貝毒、ボツリヌス毒素、サキシトキシン、リシン毒素、フレクスナー赤痢菌、志賀赤痢菌（シゲラ・バチルス）、サルモネラ菌、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、ヒストプラスマ・カプスラーツム、トリコテセンのマイコトキシン、アフラトキシンに対する熱もしくはホルマリンで死滅させたワクチン、弱毒化ワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、抗原ワクチン、ＤＮＡワクチン、無細胞性ワクチン、またはトキソイドワクチンが挙げられる。ワクチンは、クリプトコッカス症、ブルセラ症（波状熱）、コクシジオイデス症（サン・ホアキン渓谷熱または砂漠熱）、オウム病（オウム熱）、腺ペスト、ツラレミア（野兎病）、マラリア、コレラ、腸チフス、出血熱、ダニ媒介脳炎、ベネズエラウマ脳炎、肺ペスト、ロッキー山発疹熱、デング熱、リフトバレー熱、ジフテリア、類鼻疽、鼻疽、結核、感染性肝炎、脳炎、ブラストミセス症、ノカルジア症、黄熱病、発疹チフス、およびＱ熱に対するものであることもできる。いくつかの実施形態において、ワクチンは、炭疽菌、エボラウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、ペスト菌、大痘瘡、ヒストプラスマ・カプスラーツム、インフルエンザ菌、大腸菌、フレクスナー赤痢菌、志賀赤痢菌（シゲラ・バチルス）、サルモネラ菌、またはブドウ球菌に由来する抗原である。
【０１７５】
ある実施形態の特定の例において、ワクチンは、炭疽ワクチン（例えば、ＡＶＡ、ただし、これに限定されない）、または炭疽抗原（例えば、防御抗原（ＰＡ）もしくは組換え防御抗原（ｒＰＡ）、ただし、これらに限定されない）である。ＡＶＡによる初回ワクチン接種は、通常、０週、２週、および４週での３回の皮下注射と、６か月、１２か月、および１８か月での３回の追加免疫ワクチン接種からなる。免疫を維持するために、製造業者は、年１回の追加免疫注射を推奨している。６回分の初回ワクチン接種のスケジュールが複雑であり、局所の注射部位反応が頻発することから、投与回数を減らしたスケジュールが望ましいと考えられる。ＡＶＡをＴＡＭ受容体阻害剤と併用して投与すれば、ワクチンのみを使用するよりも良好なワクチンに対する免疫応答が得られ、免疫防御応答を獲得するのに必要な免疫化の頻度を減少させることができる。
【０１７６】
特定の非限定的な例において、ワクチンは、炭疽菌由来の非毒性防御抗原（ＰＡ）またはその免疫原性断片をコードするＤＮＡ配列である。ＰＡの配列は決定されており、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号Ｍ２２５８９で寄託されている。有用な他の抗原としては、炭疽菌致死因子またはその免疫原性断片（米国特許公開第２００２／００５１７９１Ａ１号に開示）、ハンタウイルス抗原（例えば、米国特許第５，６１４，１９３号に開示されているもの）、天然痘抗原（例えば、米国特許第４，５６７，１４７号に開示されているもの）、ペスト抗原（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第９８２４９１２Ａ２号に開示されているもの）、エボラウイルス抗原（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第００００６１７Ａ２に開示されているもの）、ダニ媒介脳炎抗原（例えば、米国特許第６，３７２，２２１号および欧州特許公開ＥＰ第０６９１４０４Ｂ１号に開示されているもの）、ヒストプラスマ・カプスラーツム抗原（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第９９５５８７４Ａ２号および米国特許第６，３９１，３１３号に開示されているもの）、インフルエンザ抗原（例えば、米国特許第６，３４２，２３２号、および欧州特許公開ＥＰ第０４３２２２０Ｂ１号に開示されているもの）、大腸菌抗原（例えば、米国特許第５，３７０，８７２号、同第６，０７７，５１６号、および同第３，９７５，５１７号に開示されているもの）、赤痢菌抗原（例えば、米国特許第５，０７７，０４４号、同第５，６８６，５８０号、および同第５，６８１，７３６号に開示されているもの）、サルモネラ抗原（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第０１７０２４７Ａ２号、米国特許公開ＵＳ第２００１００２１３８６Ａ１号、および欧州特許公開ＥＰ第１１１２７４７Ａ１号に開示されているもの）、ならびにブドウ球菌抗原（例えば、欧州特許公開ＥＰ第０６９４３０９Ａ３号および米国特許第６，３９１，３１５号に開示されているもの）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
本方法は、治療的有効量のＴＡＭ受容体阻害剤をワクチン（例えば、生物テロ薬剤に対するワクチン）とともに対象に投与し、それによってワクチンの免疫原性を増強する工程を含む。１つの実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、局部に（例えば、局所にまたは吸入によって）投与される。別の実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、全身性に（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、または皮下注射によって）投与される。
【０１７８】
有効量のＴＡＭ受容体阻害剤を、ワクチンと組み合わせて、単回用量または複数回用量で投与することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ワクチンとＴＡＭ受容体阻害剤の追加免疫を、初回投与後に定期的に、例えば、初回投与してから１か月後、２か月後、または３か月後に投与することができる。具体的で非限定的な例において、ワクチンと組み合わせたＴＡＭ受容体阻害剤のパルス用量を、初回ボーラス投与してから２週間後、４週間後、６か月後、１２か月後、１８か月後に、または毎年投与する。
【０１７９】
他の実施形態において、感染性因子に曝露された可能性が高い対象は、ＴＡＭ受容体阻害剤およ抗感染症剤とともに感染性因子に対するワクチンを受けることができる。例えば、感染性因子に曝露された、またはその可能性が高い対象の治療中に、ワクチンとＴＡＭ受容体阻害剤を、１日に１回、週に１回、または２週間に１回、投与することができる。
【０１８０】
ＴＡＭ受容体阻害剤は、ワクチン投与の前に、ワクチン投与と同時に、またはワクチン投与の後に投与することができる。例えば、ＴＡＭ受容体阻害剤は、ワクチンを投与する前に、例えば、ワクチンを対象に投与する２週間前、１週間前、１日前、または１時間前に投与することができる。あるいは、ＴＡＭ受容体阻害剤は、ワクチンを投与するのと同時に、または例えば、ワクチンを対象に投与してから２週間後、１週間後、１日後、もしくは１時間後に投与することができる。
【０１８１】
このように、本明細書で記載されているＴＡＭ受容体阻害剤は、ワクチンの免疫原性を増強するために、ワクチンと組み合わせて対象に投与することができる。ＴＡＭ受容体阻害剤投与の有効性は、当業者に公知の方法で、ワクチン力価または抗体応答の強さ（ａｖｉｄｉｔｙ）、または細胞傷害性Ｔ細胞応答をモニタリングすることによって測定することができる。例えば、経時的なワクチン力価または抗体応答の強さの増大は、ＴＡＭ受容体阻害剤治療の効力の指標である。
【０１８２】
別の実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、例えば、得られる免疫応答を高めて、腫瘍関連ＤＣの特徴的な免疫抑制を克服するために、樹状細胞をベースにしたワクチン（例えば、腫瘍ワクチン）と併用される。腫瘍ワクチンは、黒色腫ならびにリンパ増殖性障害（例えば、様々なタイプの白血病、リンパ腫、および骨髄腫）をはじめとする、様々な癌を治療するために使用される。腫瘍に対する強いＴ細胞介在性免疫を誘導する有効なＤＣワクチンの開発における大きな課題は、免疫能のある（ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔ）ＤＣの作製に頼っている。ＴＡＭ阻害剤を使用すれば、免疫をベースにした戦略の効果の増強を達成することが可能である。
【０１８３】
簡潔に述べると、樹状細胞をベースにしたワクチンプロトコルにおいては、腫瘍を有する対象からＤＣを単離し、これらの細胞を腫瘍関連抗原と接触させるか、またはこれらの細胞にエクスビボでベクターをトランスフェクトする。その後、これらの細胞を対象の体に再導入すると、体内でこれらの細胞が体内で腫瘍に対する免疫応答を開始する。悪性腫瘍および慢性感染性疾患を有する患者に対する治療としてＤＣワクチンを使用することはよく知られている（Ｐａｃｚｅｓｎｙら（２００３）  Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１３：４３９；  Ｇａｎｄｈｉら（２００２）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５３：１４９）。炎症性サイトカインまたは微生物産物によって活性化された後、ＤＣは、腫瘍特異的Ｔリンパ球の効率的な刺激と関係するいくつかの特徴を有するが、これらの特徴としては、リンパ様組織へのホーミングの増強、共刺激分子とＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の高レベル発現、ならびに免疫刺激性サイトカインの分泌が挙げられる（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５）。ＤＣが腫瘍特異的Ｔ細胞応答をプライミングする能力については、様々な動物で示されている（Ｆｌａｍａｎｄら（１９９４）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６０５；Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら（１９９５）  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１２９７；Ｃｅｌｌｕｚｚｉら（１９９６）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２８３）。これらの研究は、癌患者における防御免疫応答を開始させるためにエクスビボで腫瘍関連抗原をロードしたＤＣの効力を評価するいくつかの臨床試験につながった（Ｓｔｉｆｔら（２００３）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：１３５；Ｋｏｎｏら（２００２）  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：３３９４；Ｍｕｒｐｈｙら（１９９９）  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３８：３７；Ｆｏｎｇら（２００１）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：４２５４；Ｄｅｅｓら（２００４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５３：７７７；Ｃｈａｎｇら（２００２）  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８：１０２１；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら（２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：６４５１）。
【０１８４】
樹状細胞は、対象（例えば、癌患者または癌の危険性がある人）から得ることができ、その後、ＤＣにエクスビボで腫瘍関連抗原をロードし、その後、ＤＣを対象に再導入する。あるいは、ＤＣを生じることができる細胞（例えば、単球またはＣＤ３４＋骨髄前駆細胞）を対象から得て、それらからＤＣを生じさせ、その後、抗原をロードすることによって修飾し、上記のような対象に投与する。あるいは、細胞（ＤＣ細胞またはその先駆細胞）をドナー対象から得て、修飾し、その後、レシピエント対象に導入することができる。ＤＣがレシピエントに由来する（またはレシピエントから生じた）ものでない場合、ＤＣは、レシピエントとＨＬＡが適合することが望ましい。
【０１８５】
ヒトＤＣを得る１つの特定の方法は、単球から得ることである。血液をヒト対象から得て、末梢血単核細胞を単離し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、および／またはインターロイキン４（ＩＬ４）を含有する培地中で、好適な時間、培養することができる。例えば、細胞を、約４〜１４日後に未成熟ＤＣとして採取することができ、または例えば、リポ多糖および／もしくは腫瘍壊死因子αの存在下で、約１２時間もしくは２４時間から約１日間、２日間、３日間、もしくは４日間さらにインキュベートした後に誘導して、成熟させることができる。 
【０１８６】
ＤＣに腫瘍関連抗原をロードするために複数の技術が利用されており、これらの技術としては、ＭＨＣクラスＩ制限ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ制限ペプチドによるパルス（Ｔｈｕｒｎｅｒら（１９９９）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１６６９；Ｎｅｓｔｌｅら（１９９８）  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３２８；Ｓｃｈｕｌｅｒ-Ｔｈｕｒｎｅｒら（２００２）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１２７９）、腫瘍細胞ライセートとのインキュベーション（Ｎｅｓｔｌｅら（１９９８）  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３２８）、ならびに腫瘍細胞ＲＮＡのエレクトロポレーション（Ｈｅｉｓｅｒら（２００２）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：４０９）が挙げられる。１つの実施形態において、ＤＣへの腫瘍関連抗原のロードは、ＴＡＭ受容体阻害剤の存在下でロード工程を実行することによって増強される。例えば、１つの具体的な例において、有効量のＴＡＭ受容体阻害剤は、ＤＣを抗原に曝露する前に、曝露している間に、または曝露した後に、ＤＣ培養培地に添加される。
【０１８７】
別の実施形態において、ＤＣを対象に再導入した時に対象の免疫応答を増強するために、ＴＡＭ受容体阻害剤を用いる。１つの実施形態において、その場合、これらの細胞を有効量のＴＡＭ受容体阻害剤とともに対象に再導入する。他のタイプのワクチンについて上で記載されているように、ＴＡＭ受容体阻害剤は、局所にまたは全身に（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、もしくは皮下注射によって）投与することができる。ＴＡＭ受容体阻害剤は、単回用量または複数回用量で投与することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、初回投与後に定期的に、例えば、初回投与してから数日後、数週間後、または数か月後に、投与することができる。ＴＡＭ受容体阻害剤の投与は、ＤＣを再導入する前に、ＤＣを再導入するのと実質的に同時に、またはＤＣを再導入した後に起こることができる。
【０１８８】
さらに、腫瘍は、腫瘍関連ＤＣの抑制を誘導する様々な因子を産生することが示されている。ＴＡＭ受容体およびそれらのリガンドは、腫瘍試料で高発現していることが多い。理論に束縛されるわけではないが、ＴＡＭシグナル伝達の増大は、このＲＴＫファミリーの内因性の発癌性に起因する腫瘍進行、およびＤＣの阻害による病的腫瘍寛容を引き起こし得ると考えられている。この状況でのＴＡＭ阻害剤の使用は、癌治療に対する新規の治療アプローチを成す。
【０１８９】
Ｇ．ＴＡＭ受容体阻害剤を用いて敗血症を治療する方法
本明細書で記載されるように、ＴＡＭ受容体阻害剤は、敗血症の治療に有用である。敗血症は、感染症によって引き起こされる全身の炎症状態を特徴とする重度の医学的状態である。このような感染症は、病原性のグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌、嫌気性細菌、真菌、酵母、または多菌性生物によって引き起こされ得る。敗血症は、敗血症の発症、重症敗血症、敗血症性ショック、および末期敗血症と関連する多臓器機能不全を含むが、これらに限定されない、いくつかの異なる段階によって特徴付けられる。ＴＡＭ受容体阻害剤は、通常、初期段階の敗血症の後に（例えば、対象の状態が「重症敗血症」またはその先へと進行する時に）最も有効である。重症敗血症の兆候および症状は、微かなものであることがある。感染と関連臓器機能不全は、重症敗血症の診断の２つの要件であるが、他の臨床指標も重症敗血症の発症を示すことができる。例えば、重症敗血症が疑われるべき対象としては、抗感染薬を受けているＩＣＵ患者、重度の市中肺炎を有する対象、腹腔内手術を受けた患者、髄膜炎を有する対象、慢性疾患（糖尿病、心不全、慢性腎不全、および肝炎を含む）を有する対象、低下した免疫状態（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、細胞傷害性かつ免疫抑制性の薬剤の使用、悪性新生物、およびアルコール依存症）を有する対象、蜂巣炎を有する対象、腹膜炎を有する対象、ならびに尿路感染を有する対象が挙げられる。子供において、敗血症は、骨の感染症（骨髄炎）を併発することがある。入院患者において、感染症の好発部位としては、静脈路、外科的創傷、外科用ドレーン、および褥瘡性潰瘍または床擦れとして知られる皮膚の損傷部位が挙げられる。
【０１９０】
感染症は、血液培養が陽性であることによって確認されることが多いが、血液培養は抗生物質を受けている個体では陰性となることがある。いくつかの例において、精神状態の変化と過呼吸が、差し迫った敗血症の最も早期の兆候となることがある。差し迫った敗血症の他の兆候としては、発熱または低体温症、過呼吸、悪寒、震え、温かい肌、皮膚の発疹、急速な心拍、精神錯乱またはせん妄、および尿排出量の減少が挙げられる。敗血症を示す検査結果としては、低白血球数または高白血球数、低血小板数、細菌陽性である血液培養、アシドーシスを示す血液ガス、（疾患経過の初期の）異常腎機能検査、低血小板数および赤血球の破裂を示す末梢スメア、フィブリン分解産物の上昇、ならびに未成熟白血球に関する血液差が挙げられる。
【０１９１】
末期の敗血症は、臓器機能不全、低灌流異常、および敗血症誘導性の低血圧症を特徴とする。低灌流異常としては、乳酸アシドーシス、乏尿、または精神状態の急性変化が挙げられるが、これらに限定されない。低血圧は、他に低血圧となる原因がない時に、適切な輸液負荷にもかかわらず、収縮期動脈圧が９０ｍｍ Ｈｇ未満（もしくは子供で、年齢相応の正常未満）になるか、平均動脈圧（ＭＡＰ）が６０未満になるか、または収縮期血圧がベースラインから４０ｍｍ Ｈｇよりも大きく低下することによって定義される。
【０１９２】
伝統的な敗血症治療としては、抗生物質、溜まった感染体液の外科的ドレナージ、体液交換、および臓器機能不全に対する適切なサポート（例えば、腎不全における血液透析、肺機能不全における機械的人工換気、血液製剤の輸血、ならびに循環不全に対する薬物療法および輸液療法を含む）が挙げられる。敗血症で死ぬ患者は、典型的には、敗血症の末期（例えば、 重症敗血症およびそれ以降）に起こる免疫抑制が原因で死ぬ。過去にグラム陰性細菌のＬＰＳに曝露されていると、例えば、次の刺激に応答する能力が減少し、最終的には、感染に直面して免疫系が活動を停止する（Ｃｏｏｋら（２００４）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（１０）：９７５-９）。多臓器機能不全は、少なくとも一部は、敗血症の炎症性段階から抗炎症性表現型への移行によって引き起こされ得る。進行した敗血症では、活性化されたヘルパー細胞が、炎症促進性サイトカインを産生するＴｈ１表現型から抗炎症性サイトカインを産生するＴｈ２表現型へと進化する。さらに、循環リンパ球および組織リンパ球（Ｂ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞）のアポトーシスが免疫抑制の一因となる（Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００６）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５５：１６）。さらに、進行した敗血症では、ＳＯＣＳレベルが最大となる。ＴＡＭ受容体阻害剤の投与が最も有益なのは、敗血症の進行におけるこの時点である。
【０１９３】
したがって、免疫増強を必要とする対象（例えば、進行した敗血症を有する対象）に治療的有効量のＴＡＭ受容体阻害剤を投与し、それによって敗血症を治療する工程を含む敗血症の治療方法が、１つの実施形態において開示される。１つの実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、全身に（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、または皮下注射によって）投与される。いくつかの例において、ＴＡＭ受容体阻害剤を投与する前に、対象をスクリーニングして、対象が敗血症を有するかどうかを決定する。
【０１９４】
有効量のＴＡＭ受容体阻害剤は、単回用量または複数回用量で投与することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤を初回投与の後に定期的に（例えば、１日に２回またはそれより多く）投与する。他の実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤を連続注入として投与する。さらに他の実施形態において、進行した敗血症に苦しむ対象のために、ＴＡＭ受容体阻害剤を１つ以上の抗感染症剤とともに投与する。好適な抗感染症剤の具体的で非限定的な例としては、抗真菌化合物、抗ウイルス化合物、および抗生物質が挙げられる。抗生物質としては、アモキシシリン、クラリスロマイシン、セフロキシム、セファレキシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、メトロニダゾール、テルビナフィン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、テトラサイクリン、およびアジスロマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。抗真菌化合物としては、クロトリマゾール、ブテナフィン、ブトコナゾール、シクロピロクス、クリオキノール、クリオキノール、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナフチフィン、ナイスタチン、オキシコナゾール、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チオコナゾール、およびトルナフテートが挙げられるが、これらに限定されない。抗ウイルス化合物としては、ジドブジン、ディダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、テノホビル、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、サキナビル、アンプレナビル、およびロピナビルが挙げられるが、これらに限定されない。抗感染症剤としては、高力価免疫グロブリンも挙げられる。高力価免疫グロブリンは、対象となる物質で免疫化されたドナーから、またはドナーのプールから単離されるγグロブリンである。具体的には、高力価免疫グロブリンは、病原体に対するワクチン接種を繰り返し受けたドナーから精製される抗体である。ＴＡＭ受容体阻害剤は、抗感染症剤を投与する前に、抗感染症剤を投与するのと同時に、または抗感染症剤を投与した後に、投与することができる。
【０１９５】
Ｈ．免疫低下状態の対象におけるＴＡＭ受容体阻害剤の使用
本明細書で開示される別の方法は、免疫低下状態の対象における日和見感染に対する免疫応答を増大させるために１つ以上のＴＡＭ受容体阻害剤を用いる方法である。いくつかの例において、治療用量でのＴＡＭ受容体阻害剤の投与によって、日和見感染が治療される。免疫低下状態の対象は、日和見感染（例えば、ウイルス感染、真菌感染、原虫感染、または細菌感染、プリオン病、およびある種の新生物）によりかかりやすい。免疫低下状態であると考えることができる者としては、ＡＩＤＳ（またはＨＩＶ陽性）を有する対象、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を有する対象、糖尿病患者、過去に移植を受け、免疫抑制薬を服用している対象、および癌の化学療法を受けている者が挙げられる。免疫低下状態の個体としては、（皮膚癌以外の）ほとんどの形態の癌、鎌形赤血球貧血、嚢胞性線維症を有する対象、脾臓のない者、末期腎疾患を有する（透析を受けている）対象、および過去１年間にピルまたは注射でコルチコステロイドを頻繁に服用している者も挙げられる。重度の肝疾患、肺疾患、または心疾患を有する対象も免疫低下状態である可能性がある。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、免疫低下状態の対象は、レンチウイルスに感染している。レンチウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ-１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ-２）、サル免疫不全ウイルスａｇｍ（ＳＩＶａｇｍ）、サル免疫不全ウイルスｍｎｄ（ＳＩＶｍｎｄ）、サル免疫不全ウイルスｓｙｋ（ＳＩＶｓｙｋ）、サル免疫不全ウイルスｃｏｌ（ＳＩＶｃｏｌ）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ-１）である。いくつかの実施形態において、レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ-２）である。 
【０１９７】
いくつかの実施形態において、日和見感染は、大形リューシマニアの感染である。他の実施形態において、日和見感染は、特に、細菌感染（例えば、サルモネラ症、梅毒、神経梅毒、結核症、非定型抗酸菌感染症、もしくは細菌性血管腫症（ネコ引っ掻き病））、真菌感染（例えば、アスペルギルス症、カンジダ症（鵝口瘡、イースト菌感染症）、コクシジオイデス症、クリプトコックス髄膜炎、もしくはヒストプラスマ症）、原虫感染（例えば、クリプトスポリジウム症、イソスポーラ症、微胞子虫症、ニューモシスチス・カリニ肺炎（ＰＣＰ）、もしくはトキソプラズマ症）、ウイルス感染（例えば、サイトメガロウイルス症（ＣＭＶ）、肝炎、単純ヘルペス症（ＨＳＶ、性器ヘルペス）、帯状疱疹（ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅｒｐｅｓ）（ＨＺＶ、帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ））、ヒトパピローマウイルス症（ＨＰＶ、性器疣贅、子宮頸癌）、伝染性軟属腫、口腔毛状白板症（ＯＨＬ）、もしくは進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ））、または新生物（例えば、カポジ肉腫、全身性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、および原発性ＣＮＳリンパ腫）である。
【０１９８】
対象における日和見感染に対する免疫応答を増大させるために、治療的有効量のＴＡＭ受容体阻害剤を対象に投与する。１つの実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤を、局部に、例えば、局所適用または皮内投与によって、投与することができる。ＴＡＭ受容体阻害剤を、例えば、１回注射することができ、またはＴＡＭ受容体阻害剤を、２回以上（例えば、月に１回、週に１回、１日に１回、または１日に２回〜４回もしくはそれより多く）の分割用量として投与することができる。他の実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤の投与は、全身性である。経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、吸入による投与、および直腸投与さえも企図される。
【０１９９】
本発明は、本明細書で開示されているＴＡＭ受容体阻害剤と日和見感染の治療で有用な１つ以上の薬物との組合せも含む。例えば、本明細書で開示されているＴＡＭ受容体阻害剤を、ウイルスへの曝露の前後を問わず、有効用量の他の抗ウイルス薬、免疫調整剤、抗感染薬、またはワクチンと組み合わせて投与することができる。「投与」という用語は、活性薬剤の同時投与と連続投与の両方を指す。
【０２００】
１つの実施形態において、ＴＡＭ受容体阻害剤とレンチウイルス疾患の治療で有効な１つ以上の薬剤との組合せを提供する。１つの具体的で非限定的な例において、レンチウイルス疾患は、ＨＩＶ１誘導性疾患、ＨＩＶ２誘導性疾患、ＳＩＶ誘導性疾患、またはＦＩＶ誘導性疾患である。抗ウイルス薬の具体的で非限定的な例としては、ＡＬ-７２１（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡのＥｔｈｉｇｅｎ製）、組換えヒトインターフェロンβ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡのＴｒｉｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）、エースマンナン（Ｉｒｖｉｎｇ，ＴＸのＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｌａｂｓ製）、ガンギクロビル（ｇａｎｇｉｃｌｏｖｉｒ）（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡのＳｙｎｔｅｘ製）、ジデヒドロデオキシチミジンまたはｄ４Ｔ（Ｂｒｉｓｔｏｌ-Ｍｙｅｒｓ-Ｓｑｕｉｂｂ製）、ＥＬ１０（Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，ＧＡのＥｌａｎ社製）、ジデオキシシチジンまたはｄｄＣ（Ｈｏｆｆｍａｎ-ＬａＲｏｃｈｅ製）、ノバプレン（Ａｋｒｏｎ，ＯＨのＮｏｖａｆｅｒｏｎ  Ｌａｂｓ社製）、ジドブジンまたはＡＺＴ（Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ製）、リバビリン（Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡのＶｉｒａｔｅｋ）、αインターフェロンおよびアシクロビル（Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ製）、インジナビル（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．製）、３ＴＣ（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ製）、リトナビル（Ａｂｂｏｔｔ製）、サキナビル（Ｈｏｆｆｍａｎｎ-ＬａＲｏｃｈｅ製）、ならびに他のものが挙げられる。
【０２０１】
免疫調整剤の具体的で非限定的な例は、ＡＳ-１０１（Ｗｙｅｔｈ-Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、プロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、γインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ-ＣＳＦ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ-２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ-ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡのＩｍｒｅｇ製）、ＳＫ＆Ｆ１０６５２８、ＴＮＦ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、および可溶性ＴＮＦ受容体（Ｉｍｍｕｎｅｘ）である。
【０２０２】
使用されるいくつかの抗感染症剤の具体的で非限定的な例としては、上記のような、クリンダマイシン＋プリマキン（Ｕｐｊｏｈｎ製、ニューモシスチス肺炎の治療用）、フルコナゾロン（ｆｌｕｃｏｎａｚｌｏｎｅ）（Ｐｆｉｚｅｒ製、クリプトコッカス髄膜炎またはカンジダ症の治療用）、ナイスタチン、ペンタミジン、トリメタプリム・スルファメトキサゾール（ｔｒｉｍｅｔｈａｐｒｉｍ-ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、および他の多くのものが挙げられる。
【０２０３】
「高活性抗レトロウイルス療法」または「ＨＡＡＲＴ」とは、組み合わせて投与した場合に、いずれかの薬物を個別的に投与した場合よりも良好にレトロウイルスの複製またはレトロウイルスの細胞への感染を阻害する薬物の組合せを指す。１つの実施形態において、レトロウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスである。１つの例において、ＴＡＭ受容体阻害剤は、他の薬剤と組み合わせた３’アキシド（ａｘｉｄｏ）-３-デオキシ-チミジン（ＡＺＴ）の投与を含む高活性レトロウイルス療法とともに投与する。ヒト免疫不全ウイルスに対してＨＡＡＲＴと組み合わせて使用することができる薬剤の具体的で非限定的な例は、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤薬物（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤薬物（ＮＮＲＴＩ）、ウイルス侵入阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、成熟阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤薬物（ＰＩ）である。ＨＩＶ感染を抑制するのに使用されるＨＡＡＲＴの１つの具体的で非限定的な例は、インジナビルと、ＮＮＲＴＩであるエファビレンツとの組合せである。
【０２０４】
１つの実施形態において、ＨＡＡＲＴは、ＨＩＶ感染の治療に使用される３つの薬物（例えば、下記の表２に示す薬物）の組合せである。ＨＩＶ感染の治療用の３薬ＨＡＡＲＴの例としては、表１のＡ欄の１つのプロテアーゼ阻害剤＋Ｂ欄の２つのヌクレオシド類似体が挙げられる。さらに、リトナビルおよびサキナビルを、１つまたは２つのヌクレオシド類似体と組み合わせて使用することができる。本明細書で開示されているように、これらの療法は全て、ＴＡＭ受容体阻害剤の投与と組み合わせることによって増強される。
【０２０５】
【表１】
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【０２０６】
さらに、他の３薬組合せおよび４薬組合せによって、持続した期間、非常に低いレベルまでＨＩＶを低下させることができる。ＴＡＭ受容体阻害剤投与によって増強される組合せ療法は上記の例に限定されるわけではなく、（ＡＩＤＳの治療を含む）ＨＩＶ疾患の治療用の薬剤の任意の有効な組合せを含む。
【０２０７】
Ｉ．ＴＡＭ受容体作動薬の治療的使用
対象の免疫介在性障害を治療または予防する方法を本明細書で開示する。１つの具体的で非限定的な例において、免疫介在性障害は自己免疫疾患である。別の具体的で非限定的な例において、免疫介在性障害は、アレルギー反応である。さらなる具体的で非限定的な例において、免疫介在性障害は、移植片拒絶反応（例えば、移植片対宿主病）である。自己免疫疾患としては、特に、炎症性関節炎（関節リウマチ）、橋本甲状腺炎、悪性貧血、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、乾癬、腎線維症、肺線維症、および肝線維症、アジソン病、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、ならびにグレーブス病が挙げられるが、これらに限定されない。応答の臨床的尺度は、これらの疾患の各々について測定することができる。例えば、痛みの低下、組織（例えば、関節）の炎症の低下、組織（腎臓）機能の改善、食物を消化する能力の改善は、免疫抑制の成功の指標としての役割を果たすことができる。
【０２０８】
特定の例において、本方法は、免疫介在性の炎症性障害を有するかまたはそれを発症する危険性がある対象に治療的有効量のＴＡＭ受容体作動薬を投与し、それによって免疫介在性障害を治療または予防する工程を含む。１つの実施形態において、ＴＡＭ受容体作動薬を局部に（例えば、関節リウマチに対して関節内注射でまたは乾癬に対して局所投与で）投与する。別の実施形態において、ＴＡＭ受容体作動薬を全身に投与する。１つの実施形態において、免疫介在性障害は、自己免疫疾患、アレルギー、移植片対宿主病、または移植片拒絶反応と関連する障害である。特定の実施形態において、免疫介在性障害は、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、乾癬、腎線維症、肺線維症、もしくは肝線維症、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、または多発性硬化症である。
【０２０９】
ＴＡＭ受容体作動薬投与は、全身性または局部的であることができる。作動薬の局部投与は、当業者に周知の方法で実施される。例として、関節リウマチの治療のために、個体の膝、股関節、および／または肩に投与する１つの方法は、関節内注射によるものである。あるいは、別の例において、乾癬の治療のために、ＴＡＭ受容体作動薬を軟膏またはクリームとして局所に適用する。他の実施形態において、ＴＡＭ受容体作動薬の投与は、全身性である。経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、および直腸投与または膣投与さえも企図される。
【０２１０】
他の実施形態において、本方法は、対象の自己免疫疾患を治療または予防する方法であって、免疫細胞をエクスビボでＴＡＭ受容体作動薬と接触させる工程、およびこれらの免疫細胞を、自己免疫疾患を有するかまたはそれを発症する危険性がある対象に移入し、それによって、自己免疫疾患を治療または予防する工程を含む方法である。理論に束縛されるわけではないが、これらの免疫細胞は、対象における免疫活性化を抑制するように作用する。１つの具体的で非限定的な例は、樹状細胞である。特定の例において、本方法は、移植片対宿主病または移植片拒絶反応を治療する方法である。移植片拒絶反応を治療する方法は、移植片を拒絶する危険性がある対象における移植片拒絶反応を予防すること、および移植片拒絶反応の治療を必要とする対象における移植片拒絶反応を治療することを含む。他の例において、ＴＡＭ受容体作動薬は、例えば、移植後の１日以内に、インビボで投与され、その後、可能性としては、長時間、例えば、移植片拒絶反応の任意の指標の関数として少なくとも３日、少なくとも７日、少なくとも１４日、少なくとも３０日継続されると考えられる。
【０２１１】
ある例において、免疫細胞（例えば、樹状細胞）をＴＡＭ受容体作動薬と接触させ、その後、対象に投与する。免疫細胞を、単独で、ＴＡＭ受容体作動薬とともに、および／または追加の免疫抑制剤とともに送達することができる。免疫細胞を全身または局部のいずれかに送達することができる。具体的で非限定的な例において、細胞を、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、皮下に、または関節内に送達する。正確で有効な細胞の数量は、当業者が容易に決定することができ、治療される状態および利用される療法によって決まると考えられる。他の薬剤（例えば、増殖因子または免疫抑制剤）を免疫細胞とともに投与することができる。
【０２１２】
別の実施形態において、追加の抗炎症剤または免疫抑制剤をＴＡＭ受容体作動薬とともに投与する。抗炎症剤または免疫抑制剤とＴＡＭ受容体作動薬の投与は、順次または同時であることができる。特定の例において、免疫抑制剤は、非ステロイド性の抗炎症剤（例えば、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、セレコキシブ、もしくはロフェコキシブ）、ステロイド（例えば、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニソロン、プレドニソロン、プレドニソン、もしくはトリアムシノロン）、または免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸、もしくはシロリムス）である。
【０２１３】
特定の例において、免疫抑制剤は、生物応答修飾物質（例えば、キネレット（登録商標）（アナキンラ）、エンブレル（登録商標）（エタネルセプト）、もしくはレミケード（登録商標）（インフリキシマブ））、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（例えば、アラバ（登録商標）（レフルノミド））、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、特に、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ-２）阻害剤（例えば、セレブレックス（登録商標）（セレコキシブ）およびバイオックス（登録商標）（ロフェコキシブ））、または別の製品（例えば、ヒアルガン（登録商標）（ヒアルロナン）およびシンビスク（登録商標）（ハイラン  Ｇ-Ｆ２０））である。
【０２１４】
Ｊ．免疫調整剤の同定方法
他の実施形態は、免疫調整剤（例えば、ＴＡＭ受容体阻害剤およびＴＡＭ受容体作動薬）をスクリーニングする方法を含む。１つの実施形態において、本方法は、ＴＡＭ受容体（または１つ以上の受容体結合ドメイン、例えば、リガンドのＳＨＢＧドメインおよび受容体のＩｇＧドメイン）を発現する細胞を試験薬剤と接触する工程、ならびにこの試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を変化させるかどうかを決定する工程を含む。ＴＡＭ受容体阻害剤およびＴＡＭ受容体作動薬の例示的活性を表２に示す。
【０２１５】
【表２】
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【０２１６】
いくつかの例において、本方法は、免疫増強剤をスクリーニングし、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を大幅に低下させるかどうかまたは阻害するかどうかを決定する方法である。他の例において、本方法は、免疫抑制剤をスクリーニングし、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を大幅に増大させるかどうかを決定する方法である。本方法は、細胞を試験薬剤と接触させる工程、ならびに対照と比較した場合に、細胞を試験薬剤と接触させることによって、ＴＡＭ自己リン酸化、ＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生、ＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激、および／またはＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化が変化するかどうかを決定する工程を含むことができる。この例において、対照レベルと比較して、試験薬剤の存在下でのＴＡＭ自己リン酸化の低下、またはＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の増大、ＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激の増大、もしくはＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の増大は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害し、それゆえに、免疫増強剤であるということを示す。他の例において、対照レベルと比較して、試験薬剤の存在下でのＴＡＭ自己リン酸化の増大、またはＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の減少、ＴＬＲ誘導性のＭＡＰキナーゼ活性化刺激の減少、もしくはＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の減少は、この試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を刺激し、それゆえに、免疫抑制剤であるということを示す。
【０２１７】
自己リン酸化アッセイは当技術分野で周知である。１つの例において、ＴＡＭ受容体を発現する細胞を培養し、試験培地で、例えば、３７℃で２０分間処理する。培地を吸引除去し、各試料に冷えた溶解緩衝液を添加する。この試料を遠心分離して、細胞核をスピンダウンし、上清をプロテインＡアガロースビーズおよび親和性精製した抗ＴＡＭ受容体抗体と混合した後、インキュベートする。プロテインＡビーズをペレット化し、洗浄し、Ｔｒｉｓグリシンゲルで分離し、（ウェスタンブロッティング用に）ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写する。このブロットを、抗ホスホチロシンを一次抗体として用いてプローブする。対照と比較したホスホチロシン標識の大幅な減少は、試験薬剤がＴＡＭ受容体阻害剤であるということを示す。対照は、試料（例えば、試験薬剤で処理していない細胞）中のホスホチロシン標識を示す既知の値であることができる。例えば、このような対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％のホスホチロシンの減少は、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害し、それゆえに、この試験薬剤が免疫増強剤であるということを示す。一方、対照と比較したホスホチロシン標識の大幅な増大は、試験薬剤がＴＡＭ受容体作動薬であるということを示す。例えば、このような対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または少なくとも約２００％のＴＡＭホスホチロシンの増大は、試験薬剤がＴＡＭ受容体を活性化し、それゆえに、免疫抑制剤であるということを示す。
【０２１８】
サイトカインアッセイも当技術分野で周知である。例えば、サイトカインアッセイは、Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ；ＡｓｓａｙＧａｔｅ社，Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；およびＰａｎｏｍｉｃｓ社，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡによって製造されている。対照レベルと比較して、試験薬剤の存在下でのＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の増大は、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害するということを示す。対照レベルは、試験薬剤の非存在下でのＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の量を示す参照値または試験薬剤の非存在下（例えば、担体のみと接触させた細胞）でのＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の量であることができる。例えば、このような対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または少なくとも約２００％のＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の大幅な増大は、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害し、それゆえに、試験薬剤が免疫増強剤であるということを示す。一方、対照と比較したＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の大幅な減少は、試験薬剤がＴＡＭ受容体作動薬であるということを示す。例えば、このような対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％のＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生の減少は、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を活性化し、それゆえに、この試験薬剤が免疫抑制剤であるということを示す。
【０２１９】
さらに、ＭＡＰキナーゼ活性を、例えば、ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；およびＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡによって製造されているキットを用いて、ＭＡＰキナーゼアッセイを実施することによって測定することができる。ＭＡＰキナーゼ活性の対照レベル（例えば、ＭＡＰキナーゼ活性の基礎レベル）と比較して、試験薬剤の存在下でのＭＡＰキナーゼ活性化の大幅な増大（例えば、ｐ３８のリン酸化の増大によって示されるもの）は、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害するということを示す。例えば、このような対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または少なくとも約２００％のＭＡＰキナーゼ活性化の増大は、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害し、それゆえに、試験薬剤が免疫増強剤であるということを示す。一方、対照と比較したＭＡＰキナーゼ活性の減少は、試験薬剤がＴＡＭ受容体作動薬であるということを示す。例えば、このような対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％のＭＡＰキナーゼ活性の大幅な減少は、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を活性化し、それゆえに、この試験薬剤が免疫抑制剤であるということを示す。
【０２２０】
さらに別の実施形態において、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を調整するかどうかを決定する工程は、ＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化を測定する工程を含む。この例において、対照レベルと比較して、試験薬剤の存在下でのＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の大幅な増大（例えば、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害するということを示す対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または少なくとも約２００％のＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の増大）は、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害するということを示す。一方、対照と比較したＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の大幅な減少は、試験薬剤がＴＡＭ受容体作動薬であり、それゆえに、試験薬剤が免疫増強剤であるということを示す。例えば、このような対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％のＴＬＲ誘導性のＮＦκＢ活性化の大幅な減少は、試験薬剤がＴＡＭ受容体を活性化し、それゆえに、試験薬剤が免疫抑制剤であるということを示す。ＮＦκＢ活性化を測定するためのアッセイは当技術分野で公知である。例えば、ＮＦκＢ活性化を測定するためのキットは、Ｐａｎｏｍｉｃｓ社，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ、およびＴｅｂｕ-Ｂｉｏ社，Ｂｏｅｃｈｏｕｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍによって作製されている。
【０２２１】
またさらに別の例において、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害するかどうかを決定する工程は、細胞を試験薬剤と接触させる前にＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の対照レベルを測定する工程、およびこのＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の対照レベルと比較した場合に、細胞を試験薬剤と接触させることが、ＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現を低下させるかどうかを決定する工程を含む。この例において、対照レベルと比較して、試験薬剤の存在下でのＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の低下（例えば、対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％のＳＯＣＳ１発現および／またはＳＯＣＳ３発現の減少）は、試験薬剤がＴＡＭ受容体活性を阻害するということ、および試験薬剤が免疫増強剤であるということを示す。
【０２２２】
またさらに別の例において、試験薬剤がＴＡＭ受容体を活性化するかどうかを決定する工程は、細胞を試験薬剤と接触させる前にＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の対照レベルを測定する工程、細胞を試験薬剤と接触させる工程、およびこのＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の対照レベルと比較した場合に、細胞を試験薬剤と接触させることが、ＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現を増大させるかどうかを決定する工程を含む。この例において、対照レベルと比較して、試験薬剤の存在下でのＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現の増大（例えば、対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または少なくとも約２００％のＳＯＣＳ１発現および／またはＳＯＣＳ３発現の増大）は、試験薬剤がＴＡＭ受容体作動薬であり、それゆえに、免疫抑制剤であるということを示す。ＳＯＣＳ１／３発現レベルを測定するための方法は公知である。例えば、Ａｓｓａｙｓ-ｏｎ-Ｄｅｍａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、製造元のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを調製する。製造元のプロトコルに従って、Ｈｉｇｈ-Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてｃＤＮＡ合成を行ない、一本鎖ｃＤＮＡを合成する。内在性対照（例えば、真核性１８Ｓ  ｒＲＮＡ）を一緒に用いてＰＣＲを実施する。標的遺伝子シグナルを１８Ｓ内在性対照で正規化することによって、ＳＯＣＳ１／３の発現の相対定量を行なう。
【０２２３】
別の実施形態において、免疫調整剤を同定するためのスクリーニングは、試験薬剤がＴＡＭリガンドのＴＡＭ受容体への結合を変化させるかどうかを決定する工程を含む。例えば、本方法は、ＴＡＭ受容体を発現する細胞を試験薬剤と接触させる工程、およびこの試験薬剤がリガンド（例えば、Ｇａｓ６またはプロテインＳ）のＴＡＭ受容体への結合を阻害するかどうかを決定する工程を含むことができる。例えば、リガンドを（例えば、フルオロフォアまたは他の検出可能な標識）で標識し、ＴＡＭ受容体を発現する細胞とともにインキュベートすることができる。結合したリガンドは、当技術分野の常法（例えば、フローサイトメトリー、分光法、および蛍光顕微鏡法）を用いて検出することができる。このアッセイは、いくつかの実施形態では、細胞ベースのものであるが、他の実施形態では、無細胞のもの（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎによって製造されているアッセイ）である。対照と比べたリガンド結合の大幅な減少は、試験薬剤がＴＡＭ受容体阻害剤であることを示す。対照は、試料中のリガンド結合（例えば、試験薬剤で処理していない細胞に対するリガンド結合）を示す既知の値であることができる。例えば、このような対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％のリガンド結合の減少は、試験薬剤がＴＡＭ受容体阻害剤であり、それゆえに、試験薬剤が免疫増強剤であるということを示す。一方、対照と比較したリガンド結合の大幅な増大は、試験薬剤がＴＡＭ受容体作動薬であるということを示す。例えば、このような対照と比較した場合の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または少なくとも約２００％のＴＡＭ受容体に対するリガンド結合の増大は、試験薬剤がＴＡＭ受容体作動薬であり、それゆえに、試験薬剤が免疫抑制剤であるということを示す。
【０２２４】
以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例説するために提供される。これらの実施例は、本開示を記載されている特定の特徴または実施形態に限定するものとみなされるべきではない。
【０２２５】
実施例
実施例１：材料および方法
本実施例では、実施例２〜９を実施する際に使用された材料および方法を記載する。特定の方法が記載されているが、当業者は他の類似の方法も使用可能であるということを理解するであろう。
【０２２６】
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、ＳＴＡＴ１ノックアウトマウスおよび遺伝的に一致する対照は、Ｔａｃｏｎｉｃから購入した。Ｔｙｒｏ３-／-マウス、Ａｘｌ-／-マウス、Ｍｅｒ-／-マウス、およびＩｆｎａｒ１マウスにおける変異は、以前に、Ｌｕら（１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９８，７２３-７２８；Ｍｕｌｌｅｒら（１９９４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４，１９１８-１９２１に記載されている。
【０２２７】
抗体
Ａｘｌ（Ｍ-２０）抗体、ＩκＢβ（Ｃ-２０）抗体、ＴＲＡＦ６抗体、ＴＲＡＦ３抗体、ＩＦＮＡＲ１抗体、およびＩＦＮＡＲ２抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手し、ホスホ-ＳＴＡＴ１  Ｔｙｒ７０１抗体、ホスホ-ＳＴＡＴ２  Ｔｙｒ６９０抗体、ＳＴＡＴ３  Ｔｙｒ７０５抗体、ＳＴＡＴ１抗体、ＳＴＡＴ２抗体、ＳＴＡＴ３抗体、ＩκＢα抗体、ホスホ-Ｐ３８  Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２抗体、β-アクチン抗体、およびＥＲＫ１／２抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手し、ホスホ-ＥＲＫ１／２  Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５抗体、β-チューブリン抗体、およびユビキチン抗体は、Ｓｉｇｍａから入手し、ｐ３８αおよびＩＦＮＡＲ１は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。ウサギ抗マウスＭｅｒおよびウサギ抗マウスＴｙｒｏ３は、本質的にＬａｉら（１９９４）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９，２５６７-２５７８およびＰｒａｓａｄら（２００６）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３３，９６-１０８に記載の通りに作製した。ペルオキシダーゼ標識２次抗体は、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手し、抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０および抗マウスＩＲＤｙｅ  ８００  ＣＷは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手した。
【０２２８】
脾臓ＤＣの単離および骨髄（ＢＭ）の培養
脾臓を摘出し、コラゲナーゼＤ（１ｍｇ／ｍｌ；  Ｒｏｃｈｅ）と３７℃で２０分間インキュベートした。１００μｍ組織濾過器を通して均一化することによって脾細胞を回収した。細胞をＴｒｉｓ-ＮＨ４Ｃｌ緩衝液に３分間再懸濁し、赤血球細胞を溶解させた。抗マウスＣＤ１１ｃをコーティングした磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、脾臓ＤＣを単離した。
【０２２９】
ＢＭ細胞を大腿骨および脛骨から単離し、１ｍｌ当たり２×１０６細胞で、１００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ（Ａｍｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ完全培地（１０％胎仔ウシ血清、２ｍＭ  Ｌ-グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および５０ｎＭ  β-メルカプトエタノール）中で８〜１０日間インキュベートした。８日目に、約９０％の細胞がＣＤ１１ｃ＋であったが、これらのＣＤ１１ｃ＋細胞のうちの約６０％が、脾臓のＣＤ１１ｂ＋の従来型ＤＣサブセットの表現型を示したのに対し、約２０％は、Ｂ２２０＋の形質細胞様ＤＣの表現型を示した。
【０２３０】
ＤＣ活性化アッセイ
脾臓ＤＣまたはＢＭ-ＤＣ（１×１０６細胞／ｍｌ）を、単独で、またはマウス組換えＧａｓ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）もしくはマウス組換えプロテインＳ（Ｐｒａｓａｄら（２００６）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３３：９６-１０８に記載の通りに産生した）の存在下で、表示した濃度のサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５  Ｒｅ（Ａｌｅｘｉｓ）由来のＬＰＳ、ＣｐＧ-ＯＤＮ  １６６８（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＧＡＴＧＣＴ；配列番号１９；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはポリＩ：Ｃ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）の存在下で、無血清培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ，ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で一晩培養した。ＥＬＩＳＡ（ＩＬ-１２、ＩＬ-６、およびＴＮＦαについてはｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＦＮαについてはＰＢＬ-ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）によって、またはＩ型ＩＦＮについてのＩＳＲＥ応答エレメント・ルシフェラーゼレポーターコンストラクト（Ｊｉａｎｇら（２００５）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：５６５-５７０）を含有する細胞株を用いたルシフェラーゼアッセイによって、無細胞上清中でサイトカイン産生を定量化した。
【０２３１】
脾臓ＤＣ（１×１０６細胞／ｍｌ）またはＢＭ-ＤＣ（５×１０６細胞／ｍｌ）を無血清培地中で培養し、表示した濃度のマウス組換えＧａｓ６、マウス組換えプロテインＳ、上で示したＴＬＲリガンド、組換えマウスＩＦＮα（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、組換えマウスＡｘｌ-ＦＣキメラ（Ｒ＆Ｄ）、シクロヘキサミド（Ｓｉｇｍａ）、またはアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ）で処理した。全細胞ライセートとＲＮＡの抽出を下で示すように実施した。
【０２３２】
イムノブロットおよび免疫沈降
ＤＣをＰＢＳ中で洗浄し、１００μＭ  ＤＴＴを含むＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に採取した。全細胞ライセートを電気泳動で分離し、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、３％ＢＳＡ／ＴＢＳ-Ｔｗｅｅｎ-２０中でブロッキングし、表示した抗体でプローブした。Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを用いた蛍光ウェスタンブロッティングのために、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ-ＦＬ  ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、２つの１次抗体とともに０．１％カゼイン／ＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ-２０中でインキュベートした。蛍光標識２次抗体とともにインキュベートした後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ画像化システム（ＬＩ-ＣＯＲ）でスキャンした。
【０２３３】
ユビキチン化アッセイのために、１つの条件につき５×１０６個のＢＭ-ＤＣを、１％ＳＤＳを含有するＰＢＳ中に採取し、５分間煮沸した。１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５ｍＭ  ＮａＦ、およびプロテアーゼ阻害剤（コンプリート，Ｒｏｃｈｅ）を含有するＰＢＳを添加し、混合物を超音波処理した。固定化ｒプロテインＡ（ＲｅｐｌｉＧｅｎ）とともに１時間インキュベートすることによってライセートをプレクリアーし、１次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。固定化ｒプロテインＡを最後の２時間添加した。免疫沈降物を、０．２％ＮＰ-４０および０．５Ｍ  ＬｉＣｌを含有するＰＢＳ中で洗浄し、１００μＭ  ＤＴＴを含むＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁し、煮沸した。
【０２３４】
共免疫沈降アッセイのために、ＤＣを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、６ｍＭ  β-メルカプトエタノール、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００、およびプロテアーゼ阻害剤（コンプリート）、ならびにＳｉｇｍａ製のチロシンホスファターゼ阻害剤中で溶解させた。
【０２３５】
ＲＮＡ抽出、逆転写、およびリアルタイムＰＣＲ解析
刺激後、細胞を採取し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを単離した。逆転写は、製造元の取扱説明書に従ってＲＴ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行なった。ＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで行なった。βアクチンまたはＧＡＰＤＨの発現に対して各反応を正規化した。非特異的増幅がないことを保証するために、ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解離曲線の解析を行なった。本明細書で使用されたＱ-ＰＣＲプライマーは、以下に記載されている。
【０２３６】
フローサイトメトリーによる解析
Ｆｃ受容体をブロッキングするために、細胞を、ＣＤ１６／３２に対するラットｍＡｂとともに１５分間インキュベートし、その後、１次抗体とともに氷上で２０分間インキュベートした。マウスの分子に対する以下のｍＡｂを使用した：アロフィコシアニン結合抗ＣＤ１１ｃおよびフィコエリスリン結合抗ＣＤ１１ｃ、ＦＩＴＣ結合抗ＭＨＣクラスＩ（Ｈ-２Ｋｂ）および抗ＭＨＣクラスＩＩ（ＩＡｂ）、ＰｅｒＣＰ-Ｃｙ５．５結合抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９、ならびに抗ＮＫ１．１（全てＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）。Ａｘｌ染色のために、細胞を記載の通りに処理し、１０％パラホルムアルデヒドで固定し、サポニン（０．１％，Ｓｉｇｍａ）で透過処理し、Ａｘｌ（Ｍ-２０）抗体とともに３０分間インキュベートし、その後、抗ヤギＣｙ５抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートした。蛍光細胞を、ＦａｃｓＳｏｒｔフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）ソフトウェアを用いて解析した。
【０２３７】
統計解析
両側（ｔｗｏ-ｔａｉｌｅｄ）スチューデントのｔ検定を用いて、実験群の平均の間の差を解析した。ｐ値０．０５以下の差を有意とみなした。
【０２３８】
実施例２：ＴＡＭ三重ノックアウト体における樹状細胞の過剰活性化および拡大
本実施例は、ＴＡＭ三重ノックアウト体における樹状細胞の過剰活性化および拡大を示す。ＴＡＭ  ＴＫＯの免疫系の表現型から、それらの自己免疫症候群がＡＰＣの生理機能の異常が原因で生じている可能性があるということが示された（Ｌｕ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：３０６-３１１）。したがって、プロフェッショナルＡＰＣのＤＣサブセットの状態を、ＴＡＭ  ＴＫＯ脾臓で評価した。脾臓ＣＤ１１ｃ＋細胞のパーセンテージは、ＣＤ１１ｃ＋細胞の絶対数と同様に、野生型（ＷＴ）と比べてＴＡＭ  ＴＫＯで著しく上昇していた（図１Ａ、１Ｂ）。また、脾臓ＤＣは、三重変異体で過剰活性化されていた。ＴＡＭ  ＴＫＯのＣＤ１１ｃ＋  ＤＣは、より高レベルのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ（図１Ｃ）、ならびにＢＡＦＦ／ＢｌｙＳ（図１Ｄ）を発現していたが、ＢＡＦＦ／ＢｌｙＳは、自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥ）を有する患者で上昇している（Ｃｏｌｌｉｎｓら（２００６）  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ８：Ｒ６）。
【０２３９】
ＴＡＭ  ＴＫＯのＣＤ１１ｃ＋  ＤＣは、ＬＰＳの腹腔内注射に応答して、超上昇したレベルのＭＨＣクラスＩＩおよびＢ７．２を発現する（Ｌｕ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：３０６-３１１）。これらのおよび他の免疫活性化の指標（例えば、自己抗体力価および脾腫）は、一連のＴＡＭ変異体を通して遺伝子量効果を示す。すなわち、これらの指標は、どの単一変異体よりも、Ｔｙｒｏ３-／-Ａｘｌ-／-二重変異体、Ａｘｌ-／-Ｍｅｒ-／-二重変異体、およびＴｙｒｏ３-／-Ｍｅｒ-／-二重変異体で重度であり、ＴＡＭ三重変異体で最も重度である（Ｌｕ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：３０６-３１１）。これらの以前の観察と一致して、ＷＴマウス、Ａｘｌ-／-マウス、Ｍｅｒ-／-マウス、またはＴＡＭ  ＴＫＯマウスから単離された脾臓ＤＣは、ＴＬＲ活性化に対する漸進的な過剰応答性を示し、多くの細胞型で実証されているＴＡＭ受容体の共発現（Ｌｕら（１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：７２３-７２８；Ｐｒａｓａｄら（２００６）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３３：９６-１０８）と一致する相加的な遺伝子量効果を示している。ＣｐＧによるＴＬＲ９の活性化、またはＬＰＳによるＴＬＲ４の活性化に応答して、Ａｘｌ-／-のＤＣ、Ｍｅｒ-／-のＤＣ、およびＴＡＭ  ＴＫＯのＤＣは、ＷＴのＤＣと比べて上昇したレベルのＩＬ-６およびＴＮＦ-αを産生したが、三重変異体のＤＣによって産生されたレベルが最も高い（図１Ｅ、１Ｆ）。ポリＩ：ＣによるＴＬＲ３の活性化は、同様の結果をもたらした。従来型のＣＤ１１ｃ＋細胞と形質細胞様ＣＤ１１ｃ＋細胞のパーセンテージは、ＷＴの脾臓ＤＣ培養と変異体の脾臓ＤＣ培養で同程度であったので、変異体のＤＣにおけるサイトカイン産生の増大を、変異によって誘導されたＤＣ亜集団の変化に帰することはできない。
【０２４０】
実施例３：ＴＡＭ受容体活性化はＤＣにおけるＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生を阻害する
本実施例は、ＴＡＭ受容体作動薬が、ＷＴのＤＣにおけるＴＬＲ促進性のサイトカイン産生を阻害するということを示す。実施例２に記載された結果を考慮して、ＴＡＭ受容体作動薬による処理が、ＷＴのＤＣにおけるＴＬＲ促進性のサイトカイン産生を阻害し得るかどうかを決定した。脾臓のＣＤ１１ｃ＋  ＤＣと、ＦＬＴ-３リガンドの存在下でマウス骨髄（ＢＭ）から分化させたＤＣ（Ｇｉｌｌｉｅｔら（２００２）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９５：９５３-９５８）の両方で解析を行なった。
【０２４１】
両方のＤＣ集団において、発現された主なＴＡＭ受容体は、ＡｘｌとＭｅｒであり（図１Ｇ）、Ｔｙｒｏ３は検出されなかった。ＴＡＭ受容体は、２つの密接に関連する可溶性リガンドである、Ｇａｓ６およびプロテイン（ＰｒｏＳ；Ｐｒａｓａｄら（２００６）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３３：９６-１０８；Ｓｔｉｔｔら（１９９５）  Ｃｅｌｌ  ８０：６６１-６７０）の結合によって活性化される。組換えＧａｓ６をＣｐＧと一晩（１５時間）共インキュベーションすると、野生型のＤＣにおけるＴＬＲ９誘導性のＩ型ＩＦＮ、ＩＬ６、およびＴＮＦαの産生が大幅に阻害された（図１Ｈ）。ＴＡＭ阻害はＴＬＲ９に限定されなかった。ＴＬＲ４はＬＰＳによって活性化され、ＴＬＲ３はポリＩ：Ｃによって活性化されたが、Ｇａｓ６によって仲介される同程度のＬＰＳ誘導性のＩＬ６とＴＮＦαの産生（図１Ｉ）、およびＧａｓ６によって仲介される同程度のポリＩ：Ｃ誘導性のＩ型ＩＦＮの阻害も観察された（図１Ｊ）。ＤＣの生存率は、Ｇａｓ６処理によって影響されず、Ｇａｓ６の阻害的効果が脾臓から急性単離されたＢＭ-ＤＣとＤＣの両方で見られた。最後に、ＰｒｏＳ（ＴＡＭ受容体の第二の作動薬）は、ＷＴのＤＣにおけるＴＬＲ誘導性のサイトカイン産生を阻害するのに等しく有効であった（図８Ａ）。このように、ＴＡＭ活性化は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ９のライゲーションによって誘導されるサイトカインの産生を広範に阻害する。
【０２４２】
実施例４：ＴＡＭ介在性阻害はＴＬＲシグナル伝達経路の保存された構成要素に作用し、新たな遺伝子発現を必要とする
本実施例は、ＴＡＭ介在性阻害がＴＬＲシグナル伝達経路の保存された構成要素に作用し、新しい遺伝子発現を必要とするということを示す。ＴＬＲ活性化は、複数の下流のシグナル伝達カスケードの関与をもたらす。ＥＲＫ１／２およびｐ３８  ＭＡＰキナーゼは、例えば、ＴＬＲライゲーションによって活性化（リン酸化）される十分に特徴解析されたエフェクターである（Ｄｏｎｇら（２００２）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：５５-７２）。ＤＣを１μＭ  ＣｐＧで処理することによって、ｐ３８（図２Ａ）とＥＲＫ１／２（図２Ｂ）の両方のリン酸化が６０分以内に引き起こされ、これらの活性化リン酸化は、Ｇａｓ６との２時間の事前インキュベーションによって完全に阻止された（図２Ａ、２Ｂ）。ＴＬＲシグナル伝達は、ＮＦ-κＢ阻害因子ＩκＢα／βの分解、および結果として生じるＮＦ-κＢ促進性転写の活性化も引き起こす（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ＆  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（２００６）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２１０：１７１-１８６）。ＢＭ-ＤＣをＣｐＧで処理することによって、６０分後からＩκＢαとＩκＢβの両方の分解が引き起こされ（図２Ｃ）、この分解は、Ｇａｓ６との事前インキュベーションによって再び完全に阻止された（図２Ｃ）。他のＴＡＭリガンドであるＰｒｏＳは、ＣｐＧ誘導性のｐ３８リン酸化とＥＲＫ１／２リン酸化（図８Ｂ）、およびＣｐＧ誘導性のＩκＢα分解とＩκＢβ分解（図８Ｃ、８Ｄ）を阻害するのに同様の効果を示した。このように、ＴＡＭ活性化は、ＤＣにおけるＴＬＲシグナル伝達経路の保存された構成要素を阻害する。
【０２４３】
これらの経路のＴＡＭ阻害は、複数のＴＬＲの下流で働く。ＴＬＲ３によるＭＡＰキナーゼ経路とＮＦ-κＢ経路の活性化も、例えば、Ｇａｓ６による事前処理によって阻害された（図９Ａ、９Ｂ）。同様に、ＴＬＲ４ライゲーションの結果としての、ｐ３８とＥＲＫ１／２の活性化も、Ｇａｓ６との事前インキュベーションによって阻害された（図９Ｃ、９Ｄ）。ＴＬＲ９経路とＴＬＲ３経路は、それぞれ、ＭｙＤ８８依存性／ＴＲＩＦ依存性経路とＭｙＤ８８非依存性／ＴＲＩＦ依存性経路の古典的な例であり、これらの経路は両方とも、ＴＡＭシグナル伝達によって阻害される。
【０２４４】
ＴＬＲシグナル伝達のＴＡＭ阻害は急性のプロセスではなく、むしろ新たな遺伝子発現とタンパク質合成を必要とする。タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキサミドまたはＲＮＡ合成阻害剤であるアクチノマイシンＤのいずれかの存在下では、ＣｐＧ誘導性のＩκＢα分解とＩκＢβ分解の反応速度と大きさはともに、Ｇａｓ６の有無にかかわらず、同じであった（図９Ｄ、９Ｅ）。これらの観察は、ＴＡＭ受容体の活性化が、ＴＬＲシグナル伝達を負に調節する１つ以上の遺伝子およびタンパク質の誘導を引き起こすということを示す。
【０２４５】
実施例５：ＴＡＭ受容体活性化はＳＯＣＳ１とＳＯＣＳ３を誘導し、ＴＬＲ受容体近接エレメントＴＲＡＦ３／６のユビキチン化を阻害する
本実施例は、ＴＡＭ受容体活性化がＳＯＣＳ１とＳＯＣＳ３を誘導し、ＴＬＲ受容体近接エレメントＴＲＡＦ３／６のユビキチン化を阻害するということを示す。いくつかのＴＬＲ阻害剤が記載されている（Ｌｉｅｗら（２００５）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５：４４６-４５８）。これらの負の調節因子がＴＡＭ受容体活性化に応答して誘導され得るかということを検証するために、候補に基づくアプローチを採用した。サイトカインシグナル伝達の抑制因子（ＳＯＣＳ）タンパク質は、ＴＬＲシグナル伝達とサイトカイン受容体シグナル伝達の両方の阻害因子として免疫細胞で広範に機能し（Ｆｒｏｂｏｓｅら（２００６）  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２０：１５８７-１５９６；Ｍａｎｓｅｌｌら（２００６）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：１４８-１５５；Ｗｏｒｍａｌｄ  ＆  Ｈｉｌｔｏｎ（２００７）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １４：９-１５；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら（２００５）  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ７：１００-１１０）、ＴＬＲライゲーションの後に起こるサイトカイン受容体活性化によってＤＣで誘導される。特に興味深いのはＳＯＣＳ１であるが、それは、リンパ球でのＳＯＣＳ１発現について再構成されているＳＯＣＳ１ノックアウトマウスがＴＡＭ  ＴＫＯと同じ自己免疫表現型の多くを示すからである（Ｈａｎａｄａら（２００３）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：４３７-４５０）。ＳＯＣＳ１とＳＯＣＳ３は両方とも、ＴＡＭ受容体活性化の直接的な結果としてＢＭ-ＤＣで誘導されることが分かった（図３Ａ）。ＳＯＣＳ３  ｍＲＮＡ発現は、Ｇａｓ６の添加３０分後までに増大し、最大発現（約１０倍）は９０分前後に生じた。ＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡ発現は、１２０分で約１０倍増加した。ＴＬＲシグナル伝達の他の６つの負の調節因子、すなわち、ＩＲＡＫ-Ｍ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（２００２）  Ｃｅｌｌ  １１０：１９１-２０２）、イノシトールホスファターゼＳＨＩＰ（Ｓｌｙら（２００４）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２１：２２７-２３９）、ＡＴＦ-３（Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔら（２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：１７３-１７８）、ＩＲＦ-４（Ｎｅｇｉｓｈｉら（２００５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２：１５９８９-１５９９４）、Ｔｒｉａｄ３Ａ（Ｃｈｕａｎｇ  ＆  Ｕｌｅｖｉｔｃｈ（２００４）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５：４９５-５０２）、およびＴｏｌｌｉｐ（Ｚｈａｎｇ  ＆  Ｇｈｏｓｈ（２００２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７：７０５９-７０６５）をコードするｍＲＮＡも調べた。ＳＯＣＳ１とは対照的に、これらのｍＲＮＡはどれも、ＴＡＭ受容体活性化後の顕著な誘導を示さなかった（図３Ｂ）。したがって、ＳＯＣＳ１遺伝子とＳＯＣＳ３遺伝子は、ＴＡＭシグナル伝達の下流で特異的に誘導される。
【０２４６】
ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーとＩＬ-１Ｒ／ＴＬＲスーパーファミリーの両方の主な初期シグナル伝達因子であるが、これらのタンパク質のうちの２つであるＴＲＡＦ３とＴＲＡＦ６は、ＴＬＲシグナル伝達に極めて重要であり、これらは、ＤＣにおけるＭＡＰＫシグナル伝達経路とＮＦ-κＢシグナル伝達経路を活性化する（Ｈａｃｋｅｒら（２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：２０４-２０７）。ＴＲＡＦ６はユビキチンリガーゼとして機能し、ユビキチン化によってそれ自体が活性化され（Ｄｅｎｇら（２０００）  Ｃｅｌｌ  １０３：３５１-３６１）、一方、ＴＲＡＦ３はＴＲＡＦ６と広範囲に及ぶ相同性を共有し、ＲＩＮＧフィンガードメインも含有する。ＴＲＡＦ６とＴＲＡＦ３の両方のポリユビキチン化形態は、ＬＰＳによるＴＬＲ４活性化後３０分以内にＢＭ-ＤＣで容易に検出されたが、このポリユビキチン化は、Ｇａｓ６との２時間の事前インキュベーションによって強く阻害される（図３Ｃ、３Ｄ）。このように、ＴＡＭ介在性阻害は、ＴＬＲカスケードにおける受容体近接点で働き、ＴＬＲによって活性化されるシグナル伝達の多面的な下方調節を引き起こす。
【０２４７】
実施例６：ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達カセットはＴＡＭ介在性阻害の必須エフェクターである
本実施例は、ＳＴＡＴ１が、ＴＡＭが介在するＴＬＲ阻害のエフェクターであるということを示す。本実施例では、ＳＴＡＴ１がＳＯＣＳ１／３および他のＴＡＭ依存性遺伝子の誘導を仲介するということを示す方法を記載する。不活性なＳＴＡＴタンパク質は、古典的には、インターフェロン、インターロイキン、および種々の他の細胞外シグナルに応答して、多くの場合、ＪＡＫファミリーのチロシンキナーゼによる、チロシンリン酸化によって活性化される（Ｌｅｖｙ  ＆  Ｄａｒｎｅｌｌ（２００２）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：６５１-６６２）。この活性化によって、リン酸化されたＳＴＡＴ二量体の細胞質から核への転移が起こり、核内でこの二量体は下流遺伝子の発現を促進する。ＳＴＡＴ１による転写活性化には、Ｙ７０１でのＳＴＡＴ１のリン酸化が必要である（Ｓｈｕａｉら（１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１７４４-１７４６）。
【０２４８】
ホスホＳＴＡＴ１（Ｙ７０１）に特異的な抗体を用いて、Ｇａｓ６とのインキュベーション後に、ＳＴＡＴ１がＤＣで活性化されることが観察された（図４Ａ）。この活性化は、ＴＡＭとＧａｓ６結合を競合する可溶性のＡｘｌ-Ｆｃによる処理によって阻害され（図４Ｂ）、ＴＡＭ三重変異体のＤＣでは見られなかった（図１０Ａ）。これらの観察は、構成的に活性のある、発癌型のニワトリＭｅｒ（ｖ-Ｅｙｋと命名された）が、ＳＴＡＴ１の構成的チロシンリン酸化を刺激し、この刺激がＥｙｋキナーゼ活性を必要とするという報告（Ｚｏｎｇら（１９９６）  Ｅｍｂｏ  Ｊ  １５４５１５-４５２５）と一致している。ＳＴＡＴファミリーの他の２つのメンバーであるＳＴＡＴ２とＳＴＡＴ３も、ＤＣ培養へのＧａｓ６の添加に応答する活性化についてアッセイした。特異的なホスホＳＴＡＴ２抗体およびホスホＳＴＡＴ３抗体によるウェスタンブロッティングを用いて、ＴＡＭによって仲介されるこれらのＳＴＡＴの活性化が検出されなかった（図１０Ｂ）。
【０２４９】
ＳＴＡＴ１がＴＡＭによるＴＬＲシグナル伝達の阻害に必要かどうかを評価するために、Ｇａｓ６がＳＯＣＳ１発現とＳＯＣＳ３発現を上方調節する能力を、ＳＴＡＴ１ノックアウト体から調製したＢＭ-ＤＣでアッセイした。ＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡのＧａｓ６介在性誘導は、典型的には、ＷＴのＤＣで１２０分後に約１０倍となるが、この誘導は、これらのＳＴＡＴ１-／-のＤＣでは完全に消滅していた（図４Ｃ）。ＳＯＣＳ３  ｍＲＮＡのＧａｓ６誘導は、完全には消失していなかったが、それでも大幅に低下していた（図４Ｄ）。ＤＣにおけるＴＡＭ構成要素であるＡｘｌについてのタンパク質とｍＲＮＡの基礎レベルは、ＷＴのＤＣとＳＴＡＴ１-／-のＤＣの間で同程度であった（下記の図５Ｃ、５Ｄ参照）。Ｇａｓ６がＴＬＲ活性化に応答したサイトカインのパネルの発現を阻害する能力についても、内在性ＳＴＡＴ１の存在下または非存在下でアッセイした。しかしながら、ＩＦＮ-αおよびＩＬ-１２をはじめとする、これらのサイトカインの大部分は、ＳＴＡＴ１依存性で、サイトカイン受容体介在性の増幅段階を必要とするので、それら自体、ＴＬＲ誘導性の活性化をＳＴＡＴ１にほぼ完全に依存している（Ｇａｕｔｉｅｒら（２００５）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１：１４３５-１４４６；Ｈｏｎｄａら（２００６）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５：３４９-３６０）。このため、ＬＰＳとＣｐＧの適用に応答した、ＩＦＮαとＩＬ１２の分泌は、ＳＴＡＴ１-／-のＤＣでは検出されなかった。しかしながら、ＬＰＳとＣｐＧによって誘発されるＩＬ-６の発現はともに、低下してはいたが、依然としてＳＴＡＴ１欠損ＤＣで容易に検出された（図４Ｅ、４Ｆ）。
【０２５０】
野生型のＤＣとは対照的に、ＬＰＳ（図４Ｅ）またはＣｐＧ（図４Ｆ）によって誘発されるＩＬ６の発現は、ＳＴＡＴ１-／-のＤＣではＧａｓ６によって阻害されなかった。実際、サイトカイン産生は、Ｇａｓ６処理によってＳＴＡＴ１-／-のＤＣでわずかに上昇していることが多かった（図４Ｅ、４Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＳＴＡＴ１が、ＤＣにおけるＴＡＭが介在するＳＯＣＳ遺伝子の誘導とＴＬＲ促進性サイトカイン産生の阻害の両方に必須であるということを示している。意外なことではないが、ＳＴＡＴ１依存性のＳＯＣＳ発現もＴＬＲカスケードの受容体近接段階の阻害に極めて重要である。ＴＡＭによるＬＰＳ誘導性ＴＲＡＦ６ユビキチン化の阻害とＴＡＭによるＬＰＳ誘導性ＩκＢα分解の阻害は、両方とも、ＳＴＡＴ１-／-マウスから調製されたＢＭ-ＤＣで失われていた（図１０Ｃ、１０Ｄ）。
【０２５１】
上で記載されたように、ＳＴＡＴ１を含む、ＳＴＡＴタンパク質は、典型的には、サイトカイン受容体、中でも、Ｉ型ＩＦＮ受容体の下流にあるＤＣシグナル伝達カスケードと関連している。したがって、上で記載したＳＴＡＴ１依存性で、ＴＡＭが介在する炎症阻害が、Ｉ型ＩＦＮ受容体（ＩＦＮＡＲ）によるシグナル伝達に対するより広範な必要性を反映し得るかどうかを決定した。α／β受容体のＲ１サブユニットの変異体であり、全てのＩ型シグナル伝達を欠くＩｆｎａｒノックアウト体からＢＭ-ＤＣを調製し、これらの変異体細胞を、Ｇａｓ６適用に応答するＳＴＡＴ１チロシンリン酸化についてアッセイした。野生型のＢＭ-ＤＣとは対照的に、Ｉｆｎａｒ-／-細胞は、ＴＡＭ受容体活性化によってＳＴＡＴ１を活性化することができなかった（図４Ｇ）。［この結果は、この変異体細胞でＡｘｌとＭｅｒが依然として検出されたので、ＩＦＮＡＲ欠損ＤＣにおけるＴＡＭ受容体発現の欠如が原因ではなく、野生型細胞でＧａｓ６による型ＩＦＮ産生の誘導が全く観察されなかったので、野生型細胞におけるＧａｓ６による型ＩＦＮ産生の誘導が原因でもなかった。］Ｇａｓ６誘導性のＳＴＡＴ１リン酸化が喪失していることと一致して、Ｇａｓ６は、Ｉｆｎａｒ-／-のＤＣで、ＳＯＣＳ１発現を上方調節することができず（図４Ｈ）、ＬＰＳ誘導性のＩＬ-６産生を阻害することができなかった（図４Ｉ）。これらの結果と一致して、Ｉ型ＩＦＮ受容体のＲ１鎖とＡｘｌは、ＢＭ-ＤＣにおいて、ＴＡＭリガンド依存的に、物理的に会合し、相互に共免疫沈降することができる（図４Ｊ）。これらの結果は、ＤＣにおけるＴＡＭによる炎症阻害が、Ｉ型ＩＦＮ受容体の存在に依存することを示している。このように、ＴＡＭ受容体は、最初は炎症を誘発するのに用いられ、後に炎症を阻害するのに用いられるＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達カセットを利用している。
【０２５２】
実施例７：ＴＡＭ受容体シグナル伝達の調節は、それ自体、自然免疫応答のＳＴＡＴ１依存性の特徴である
本実施例は、ＴＡＭ受容体シグナル伝達の調節が、それ自体、自然免疫応答のＳＴＡＴ１依存性の特徴であるということを示す。上記の結果は、ＴＡＭ受容体シグナル伝達がＴＬＲおよびサイトカイン受容体の活性化によって促進される炎症応答を広範に阻害するということを示している。これは、ＴＡＭシステムが自然免疫応答の始めから完全には関与していないということ、さらに、このシステムのある特徴（例えば、ＴＡＭ受容体またはリガンドの発現）が、ＴＬＲおよびサイトカイン受容体の活性化の後に上方調節されるということを示している。
【０２５３】
したがって、Ａｘｌ、Ｍｅｒ、Ｇａｓ６、およびＰｒｏＳのｍＲＮＡとタンパク質の発現をＢＭ-ＤＣでアッセイした。ＢＭ-ＤＣを、ＬＰＳ、ＣｐＧ、またはポリＩ：Ｃとともに様々な時間インキュベートし、それぞれのＴＬＲを活性化した。ＡｘｌのｍＲＮＡとタンパク質のレベルは、複数のＴＬＲ作動薬による処理によって著しく上昇した（図５Ａ、５Ｂ）。一方、ＴＬＲ活性化の後、ＢＭ-ＤＣにおけるＭｅｒ、Ｇａｓ６、またはＰｒｏＳのｍＲＮＡ発現には、顕著な変化が全く検出されなかった。［内在性ＴＡＭリガンドの添加によって、本発明者らのＤＣ培養ではＴＡＭシグナル伝達が常に活性化されたが、内在性Ｇａｓ６と内在性ＰｒｏＳのｍＲＮＡはともに培養物中で検出されており、ＢＭ-ＤＣでは、他の多くの細胞型と同様に、ＴＡＭシグナル伝達が、少なくとも部分的には、自己分泌／傍分泌であるということを示している（Ｌｕら（１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：７２３-７２８；Ｌｕ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：３０６-３１１；Ｐｒａｓａｄら（２００６）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３３：９６-１０８）。］
【０２５４】
Ｉ型ＩＦＮは、それ自体、ＴＬＲ活性化の下流で誘導され、特定の状況では免疫抑制性でもあり得るが、このＩ型ＩＦＮによって、マクロファージにおけるＡｘｌ発現も著しく上方調節される（Ｓｈａｒｉｆら（２００６）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：１８９１-１９０１）という実証を考慮すると、ＴＬＲ促進性のＡｘｌの上方調節についてのこの発見は興味深い。Ａｘｌ-／-のマクロファージでは抑制が観察されない（Ｓｈａｒｉｆら（２００６）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：１８９１-１９０１）ので、ＩＦＮによるＡｘｌの誘導は、ＩＦＮによるＴＬＲ免疫複合体促進性またはＩｇＧ免疫複合体促進性のＴＮＦα産生の抑制に必要である。これらの発見と図５Ａおよび５Ｂに示した結果を踏まえて、ＴＬＲライゲーションまたはＩ型ＩＦＮ処理のいずれかに応答するＡｘｌの上方調節が、それ自体、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達カセットに依存するかどうかを決定した。これは、実際、両方の形態のＤＣ刺激について事実である。野生型マウス、ＳＴＡＴ１-／-マウス、またはＩｆｎａｒ-／-マウスのいずれかから脾臓のＤＣを単離し、これらの細胞をポリＩ：ＣまたはＩＦＮαのいずれかで様々な時間処理し、その後、Ａｘｌ発現についてウェスタンブロットでアッセイした。ポリＩ：ＣとＩＦＮαはともに、ＷＴのＤＣでＡｘｌの大幅な上方調節を誘導した（図５Ｃ〜５Ｅ）。著しく対照的に、ポリＩ：ＣまたはＩＦＮαのいずれかによる処理後のＡｘｌ誘導は、ＳＴＡＴ１-／-のＤＣでは失われていた（図５Ｃ、５Ｄ）。同時に、ポリＩ：ＣによるＡｘｌの誘導は、Ｉｆｎａｒ-／-のＤＣでも失われていた（図５Ｅ）。
【０２５５】
まとめると、これらの結果は、ＴＬＲライゲーションに応答して検出されるＡｘｌの上方調節が、ＴＬＲ活性化後のＩ型ＩＦＮの誘導によるものであるということ、およびその後、Ａｘｌを誘導するのはこれらのサイトカインであるということを示している。このように、自然免疫応答の炎症促進性の活性化は、下流の抗炎症性ＴＡＭシグナル伝達の活性化を引き起こす。
【０２５６】
実施例８：ＴＬＲシグナル伝達、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達、およびＴＡＭシグナル伝達は周期的な自然免疫応答に統合される
本実施例は、ＴＬＲシグナル伝達、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達、およびＴＡＭシグナル伝達が周期的な自然免疫応答に統合されるということを示す。上記の結果とＴＡＭ活性化がＳＯＣＳ遺伝子を直接的に誘導するという観察（図３Ａ）の両方を考慮して、よく記載されているＩ型ＩＦＮおよび他のサイトカインに応答したこれらの遺伝子の誘導（Ｗｏｒｍａｌｄ  ＆  Ｈｉｌｔｏｎ（２００７）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １４：９-１５；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら（２００５）  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ７：１００-１１０）が、ＴＡＭシグナル伝達に依存するかどうかを決定した。
【０２５７】
ＩＦＮαがＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡの発現を上昇させる能力を、ＷＴまたはＴＡＭ  ＴＫＯの脾臓のＤＣでアッセイした。３００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮαは、２時間後にＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡの強い誘導を刺激し、ＷＴのＤＣで最大６時間まで上方調節を持続させたが、ＳＯＣＳ１誘導はＴＡＭ  ＴＫＯ細胞では顕著に鈍化していた（図６Ａ）。この結果は、ＩＦＮαを添加して２時間後に既に明白であったが、より後の時点でより一層著明になり、野生型ＤＣにおけるＩＦＮαによるＡｘｌの上方調節と一致した（図５Ｄ；Ｓｈａｒｉｆら（２００６）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：１８９１-１９０１）。６時間の経時変化についてまとめると（図６Ａ）、ＩＦＮ処理したＴＡＭ  ＴＫＯのＤＣは、ＩＦＮ処理したＷＴのＤＣによって発現されたＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡの約２４％しか発現しなかった。ＩＦＮシグナル伝達の２つの正のエフェクターであるＩＲＦ-７とＩＦＩ-２０４のｍＲＮＡレベルも同じＲＮＡ試料でアッセイした。ＳＯＣＳ１阻害因子のｍＲＮＡとは対照的に、ＩＦＮシグナル伝達のこれらの刺激因子のＩＦＮα誘導性のｍＲＮＡレベルは、ＷＴのＤＣとＴＡＭ  ＴＫＯのＤＣの間で区別がつかなかった（図６Ｂ、６Ｃ）。
【０２５８】
これらの観察から、ＩＦＮ受容体シグナル伝達とＴＡＭ受容体シグナル伝達の相互作用の可能性をより詳細に調べることとなった。上記の結果と一致し、かつＳＯＣＳ阻害因子とは対照的に、正のエフェクターであるＩＲＦ-７とＩＦＩ-２０４は、直接的なＴＡＭ活性化（Ｇａｓ６のみの添加；図６Ｄ）によってＢＭ-ＤＣで誘導されなかった。さらに言うと、Ｇａｓ６とＩＦＮαを組み合わせて添加することによって、どちらかのリガンドのみで見られるよりも高いＳＯＣＳ１  ｍＲＮＡレベルの誘導が起こったのに対し（図６Ｄ、左の棒）、ＩＲＦ-７とＩＦＩ-２０４の両方のｍＲＮＡ発現は、ＩＦＮαのみで処理した細胞よりもＧａｓ６とＩＦＮαを組み合わせて処理したＢＭ-ＤＣで著しく低かった（図６Ｄ、中央の棒と右の棒）。このように、ＴＡＭとＩＦＮ受容体は、サイトカインシグナル伝達阻害因子の発現を誘導するように正に相互作用するが、サイトカインシグナル伝達刺激因子の発現を阻害するように負に相互作用する。
【０２５９】
まとめると、図４、図５、および図６の結果は、ＴＡＭシグナル伝達が、最初のＴＬＲ活性化とその後のサイトカイン受容体活性化の後に、順次の、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１に依存する様態で誘導されるということを示している。サイトカインシグナル伝達ではなく、この誘導されたＴＡＭシグナル伝達が、サイトカイン受容体活性化の結果として見られるＳＯＣＳタンパク質上昇の大部分の主な原因となる。このＳＯＣＳ上昇は、ＴＡＭ介在性阻害の主要構成要素であるように思われるが、これは、ＴＡＭ受容体が炎症促進性のＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達カセットを乗っ取って、炎症を阻害する能力に依存する。これらの結果は、ＴＡＭ経路が、最初の炎症、次のサイトカイン増幅、およびその後の回復させる、ＴＡＭ介在性阻害から構成される、３つの部分からなる炎症サイクルの最後の構成要素として働くということを示している（図７）。
【０２６０】
実施例９：まとめ
本実施例では、上記の実施例２〜８に記載された結果をまとめる。
【０２６１】
上で詳細に述べた結果は、ＤＣにおけるＴＡＭ活性化が、ひと揃いのＴＬＲ促進性サイトカインおよびサイトカイン受容体促進性サイトカインの分泌を阻害するということを示している。したがって、ＴＡＭの関与とＴＡＭの作用は両方とも、ＴＬＲライゲーションによって開始される炎症のサイクルの構成要素として統合される（図７Ｂ）。このサイクルの第一段階の出力は、初期のサイトカインバーストである。その後、このバーストは、ＳＴＡＴタンパク質（特に、ＳＴＡＴ１）にほぼ完全に依存するプロセスであるサイトカイン受容体によるフィードフォワードループを介して増幅される（Ｇａｕｔｉｅｒら（２００５）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１，１４３５-１４４６；Ｈｏｎｄａら（２００６）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５，３４９-３６０）。これらのデータにより、サイトカインレベルの上昇に加えて、この炎症の第二段階からの重要な出力はＡｘｌの誘導であるということが示されている（図５Ｄ；Ｓｈａｒｉｆら（２００６）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：１８９１-１９０１）。これらのデータにより、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達（図５Ｄ、５Ｅ）とＴＬＲｌライゲーション（図５Ｃ）の両方によるＡｘｌの誘導が、このフィードフォワードサイトカイン経路のＴＬＲ活性化によって主に起こるということがさらに示されている。提案される炎症サイクルの最後の段階は、ＴＡＭシグナル伝達の関与、ＳＯＣＳ遺伝子の転写、およびサイトカイン受容体シグナル伝達経路とＴＬＲシグナル伝達経路の両方の多面的阻害を含む。ＴＡＭ活性化と協調して、この最後の阻害段階は、再度ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達カセットを利用する（図４Ｃ〜４Ｊ、１０Ｃ、１０Ｄ）。以下で考察するように、これらのデータ、および図７のサイクルでこれらのデータを総合したものは、過去に記載されているが、完全には理解されていないＤＣにおけるいくつかの応答現象を説明するものであり、ヒト免疫系障害の理解と治療にも影響を与える。
【０２６２】
ＴＡＭ阻害の制御点
ＴＡＭによるＴＬＲシグナル伝達の阻害は、複数の読み取りで見られ、ＴＬＲシグナル伝達カスケードにおける受容体近接点で作用する。ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ９によって誘導されるＭＡＰキナーゼとＮＦ-κＢの活性化は全て、ＴＡＭ関与によって著しく低下するが（図２、８、９）、ＴＬＲによって誘導されるＴＲＡＦ６のユビキチン化と活性化も同様である（図３Ｃ、図７Ａ）。ＴＲＡＦ３は、ＴＬＲ３とＴＬＲ４の活性化に対する応答にも必要とされ（Ｈａｃｋｅｒら（２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：２０４-２０７）、ＴＲＡＦ３がＴＲＡＦ６との広範囲に及ぶ相同性を共有し、リングフィンガードメインを含有するので、ＬＰＳ処理後にＴＲＡＦ３のユビキチン化をアッセイした。ＴＲＡＦ３はまた、ＴＬＲ４活性化によってポリユビキチン化されるが、これは本開示より前には証明されておらず、しかも、このユビキチン化はＴＡＭ活性化によっても阻害される（図３Ｄ）。ＴＲＡＦ６とＴＲＡＦ３は、複数のＴＬＲのすぐ下流にあるシグナル伝達経路の集合地点で機能する（Ｂｅｕｔｌｅｒら（２００６）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：３５３-３８９；Ｓａｈａ  ＆  Ｃｈｅｎｇ（２００６）  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ５：８０４-８０７）。
【０２６３】
同時に、ＴＡＭ活性化は、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１に依存するＳＯＣＳ１とＳＯＣＳ３の出現をもたらす（図４Ｃ、４Ｄ、４Ｈ）。ＳＯＣＳ１は、ＴＬＲ４アダプタータンパク質であるＭＡＬの分解を促進することが最近示され（Ｍａｎｓｅｌｌら（２００６）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７，１４８-１５５）、ＳＯＣＳ３過剰発現がＴＲＡＦ６ユビキチン化を阻害することも報告されている（Ｆｒｏｂｏｓｅら（２００６）  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２０：１５８７-１５９６）。このように、ＳＯＣＳ１とＳＯＣＳ３は、ＴＬＲシグナル伝達の正真正銘の負の調節因子である。
【０２６４】
ＴＡＭ依存性阻害は、炎症の第二段階でも働く。この後からの阻害活性は、ＳＯＣＳ１とＳＯＣＳ３がＪＡＫ-ＳＴＡＴ経路の阻害とサイトカイン受容体シグナル伝達の減衰で果たすよく記載されている役割を反映している（図７の赤色の阻害；Ｗｏｒｍａｌｄ  ＆  Ｈｉｌｔｏｎ（２００７）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １４：９-１５；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら（２００５）  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ７：１００-１１０）。この時点でのＳＯＣＳ活性も、サイトカイン受容体に近接している。このように、ＴＡＭ介在性で、ＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１に依存するＳＯＣＳ１とＳＯＣＳ３の上方調節は、ＴＬＲに近接したシグナル伝達事象（ＴＲＡＦ３／６ユビキチン化、ＭＡＰキナーゼ、およびＮＦ-κＢシグナル伝達）、ならびにサイトカイン受容体／ＪＡＫ-ＳＴＡＴカスケードを介したサイトカイン産生のフィードフォワード増幅の両方の阻害を可能にする。この２つの活性は、炎症経路の第一段階と第二段階の両方の効率的で多面的な阻害をもたらす。
【０２６５】
ＳＴＡＴ１の再考察
ＳＴＡＴ１がＤＣおよび他のＡＰＣにおける複数のサイトカイン受容体（例えば、インターフェロン（α／β／γ）受容体およびインターロイキン受容体）のトランスデューサーとしての役割を果たすことが知られていた（Ｌｅｖｙ  ＆  Ｄａｒｎｅｌｌ（２００２）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：６５１-６６２）。サイトカイン受容体および関連するＪＡＫキナーゼの活性化の後、ＳＴＡＴ１はリン酸化されるようになり、核に移行し、核内で複数の炎症促進性標的遺伝子の転写を促進する。炎症サイクルの第二段階のこれらの標的のうちで最も著明なものの中には、サイトカイン遺伝子それ自体が含まれる（Ｇａｕｔｉｅｒら（２００５）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１：１４３５-１４４６；Ｈｏｎｄａら（２００６）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５：３４９-３６０）。本明細書で開示されるデータは、この段階でのＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達の追加の標的がＡｘｌ遺伝子であるということを示している（図５Ｃ〜Ｅ）。ＩＦＮαシグナル伝達カスケードが、ＳＴＡＴ１を用いて、ＴＬＲによって促進される炎症の第一段階の最後に産生されるサイトカインバーストを増幅しているのと同時に、このカスケードは、同じ転写因子を用いて、Ａｘｌレベルも上昇させている。すなわち、サイトカインレベルが増幅されているのと同時に、サイトカイン産生を最終的に阻害することになる経路の種が播かれており、ＳＴＡＴ１は、これらの事象の両方に用いられる。
【０２６６】
しかしながら、炎症におけるＳＴＡＴ１は、これで終わりではない。本明細書で開示されるデータ（図４Ａ、４Ｂ）とＺｏｎｇらの以前の研究（（１９９６）  Ｅｍｂｏ  Ｊ  １５：４５１５-４５２５）はともに、ＳＴＡＴ１がＴＡＭ受容体活性化の結果として特異的に活性化される（チロシンリン酸化される）ということも示している。より重要なことに、ＳＴＡＴ１は、Ｉ型ＩＦＮ受容体とともに、ＴＡＭ介在が介在するＳＯＣＳ１とＳＯＣＳ３の誘導に必要とされることが本明細書で示されている（図４Ｃ、４Ｄ、４Ｈ）。本明細書で記載されるＳＴＡＴ１-／-のＤＣにおけるＧａｓ６刺激性のＳＯＣＳ１誘導の喪失は、変異体細胞におけるＡｘｌの基礎レベルがより低いことによって説明することができないが、それは、これらのレベルが、ＳＴＡＴ１-／-の細胞と野生型の細胞で実際に同程度であった（図５Ｃ、５Ｄ）からである。このように、ＳＴＡＴ１活性化は、ＴＡＭが介在するＳＯＣＳ１とＳＯＣＳ３の上方調節に関与する。
【０２６７】
おそらくもっと注目すべきことは、ＴＡＭが介在するＳＯＣＳ１の上方調節が、過去に報告されたＩ型ＩＦＮに応答するこのタンパク質の大部分の上方調節（Ｗｏｒｍａｌｄ  ＆  Ｈｉｌｔｏｎ（２００７）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １４：９-１５）を説明するように思われるという観察である。これらの以前の観察は、ＩＦＮ（および他のサイトカイン）受容体が、これらの受容体が活性化するＳＴＡＴ１によって誘導されるＳＯＣＳタンパク質によって阻害される直接的な、負のフィードバックループに起因すると考えられてきたが、これらの観察は、そうではなく、ＩＦＮαの顕著な間接的効果を反映するように思われる。すなわち、このサイトカインがＡｘｌを誘導し、その後、ＳＯＣＳを誘導するのはＴＡＭ受容体である。ＴＡＭは、ＩＦＮ受容体-ＳＴＡＴ１シグナル伝達カセットを用いてこれを行なっており、したがって、炎症促進性経路を乗っ取って、炎症を阻害している。本明細書で開示されるデータ（図４Ｊ）は、ＴＡＭが、Ｒ２サブユニット（この細胞質ドメインがＳＴＡＴ１に結合する）と関連するＩＦＮ受容体のＲ１サブユニットに結合することによってこれが達成されることを示している。まとめると、これらの結果は、ＴＡＭが介在するＳＴＡＴ１転写因子の転覆、すなわち、炎症を促進する免疫活性化因子からＳＯＣＳ阻害因子の発現を促進する免疫抑制因子への転換と一致している。
【０２６８】
ＴＡＭ受容体／サイトカイン受容体関与の下流で活性化されるＳＴＡＴ１とサイトカイン受容体のみによって活性化されるＳＴＡＴ１の違いは何か。理論に束縛されるわけではないが、ＳＴＡＴ１の別の翻訳後修飾、または別のコファクター／リプレッサー（例えば、Ｔｗｉｓｔタンパク質）の動員／隔離（Ｓｈａｒｉｆら（２００６）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：１８９１-１９０１）によって、この「青いＳＴＡＴ／赤いＳＴＡＴ」の相違およびＴＡＭ受容体（例えば、ＳＯＣＳ１）と対比したサイトカイン受容体（例えば、ＩＲＦ-７）の活性化後のＳＴＡＴ１標的遺伝子の示差的な活性化が説明されるということが提案される。この文脈において、本明細書で開示するデータにより、ＴＡＭシステムとＩ型ＩＦＮ受容体が、生理的に（図６Ａ〜６Ｄ）、かつ物理的に（図４Ｊ）、密接に相互作用することが示されるということに留意するのは重要である。同様に、Ａｘｌと別のサイトカイン受容体（ＩＬ-１５受容体）の間の同等の生理的および物理的相互作用が記載されている（Ｃａｒａｕｘ  ら（２００６）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：７４７-７５４；Ｂｕｄａｇｉａｎら（２００５）  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２４：４２６０-４２７０）。理論に束縛されるわけではないが、最初にサイトカイン受容体のみが活性化され、次に、後からＴＡＭ受容体／サイトカイン受容体複合体が活性化されるならば、ＳＴＡＴ１修飾とＳＴＡＴ１転写因子パートナーの誘導の両方に対して異なる結果をもたらすことができるであろう。
【０２６９】
炎症サイクルの生理的影響
上で概説されているように、ＴＡＭシグナル伝達の活性化は自然免疫応答を効果的に阻害する。このことは、ひいては、ＴＬＲ活性化の継続とその後のサイトカインシグナル伝達がない場合、炎症サイクルの間にその発現または活性化が上方調節されるＴＡＭ経路の構成要素（例えば、Ａｘｌ）は、応答細胞がベースライン（図７Ｂの灰色の細胞）に戻ることができる半減期で代謝回転しなければならないということを示している。この代謝回転は、実際、このサイクルに不可欠なものであるべきであるが、それは、Ａｘｌの上方調節が、それ自体、ＴＡＭシグナル伝達によって阻害されるサイトカイン産生とＩＦＮＡＲ／ＳＴＡＴ１シグナル伝達に依存するからである（Ｓｈａｒｉｆら（２００６）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：１８９１-１９０１；図５Ｃ〜５Ｅ）。樹状細胞が、その後の新しい病原体とのいかなる遭遇に対しても完全に応答しようとするならば、ＴＡＭシグナル伝達の活性化解除が必要である。同時に、本明細書で記載される炎症応答の周期的な性質は、ＴＡＭシステムが終息しないうちにこの遭遇が起こるならば、新しい病原体に対するＴＬＲ応答が鈍化するはずであるということを意味する。したがって、このサイクルは、エンドトキシン寛容と免疫抑制（事前のＴＬＲ活性化によってＴＬＲ関与に対する低応答性が誘導される現象（Ｂｒｏａｄら（２００６）  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １３：２４８７-２５０２））を説明する。さらに、本明細書で開示されるデータによって、つい最近記載された交差寛容という現象（１つのＴＬＲリガンド（例えば、ＴＬＲ４に対するＬＰＳ）に曝露されることによって、無関係なリガンド（例えば、ＴＬＲ９に対するＣｐＧ）に対するその後の応答が抑制されること（Ｄａｌｐｋｅら（２００５）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１６：２０３-２１２））も説明される。これは、どのＴＬＲを活性化しても、ＴＡＭシグナル伝達の上方調節がもたらされ（図７Ａ、７Ｂ）、それによって今度は、多くのまたは全てのＴＬＲが阻害されることになるからである。
【０２７０】
炎症サイクルからのＴＡＭ経路の除去は、ＴＬＲ活性化に対する過剰応答の持続を引き起こすと予測されており、これは、ＴＡＭ受容体ノックアウト体で観察されたことである。炎症サイクルの間にインビボでＴＡＭ受容体のリガンドを活性化する源が注目されている。Ｇａｓ６とＰｒｏＳはともに、ＤＣ培養物中に検出されるので、理論に束縛されるわけではないが、これらの細胞におけるＴＡＭシグナル伝達の少なくとも一部は自己分泌／傍分泌である可能性がある。同時に、ＴＡＭリガンドは、Ｔ細胞によって、特にサプレッサーＴ細胞または調節性Ｔ細胞［Ｔ（ｒｅｇ）］によってＤＣに送達される可能性もある。ＤＣ／Ｔ細胞相互作用は相互的であり、ＤＣの活性化状態はＴ（ｒｅｇ）による調整を受ける（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ＆  Ｔａｎｇ（２００５）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：６３８-６４２）。これらのサプレッサーＴ細胞は、末梢Ｔ細胞寛容の維持に極めて重要な役割を果たし、ＤＣに対する免疫抑制活性を働かせ得る（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ＆  Ｔａｎｇ（２００５）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：６３８-６４２）。プライマリーＴ細胞はＰｒｏＳを発現しており、プライマリーＴ細胞によるこのＴＡＭリガンドの分泌はＩＬ-４によって誘導される（Ｓｍｉｌｅｙら（１９９７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１１４８４-１１４８９）。同時に、Ｔ（ｒｅｇ）はＩＬ-４受容体を発現しており、免疫抑制活性の増大に伴ってインビトロでＩＬ-４に応答する（Ｍａｅｒｔｅｎら（２００５）  Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  ２５：１１２-１２０）。
【０２７１】
ヒトの生物学および疾患におけるＴＡＭシグナル伝達
マウスでは、ＴＡＭ受容体レベルの低下が自己免疫疾患を引き起こす（Ｌｕ  ＆  Ｌｅｍｋｅ（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：３０６-３１１）。自己免疫は、ＴＡＭシグナル伝達の非存在下でのＡＰＣ過剰活性化の持続（Ｌｕ  ＆  Ｌｅｍｋｅ  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：３０６-３１１；本明細書にも記載されている）からも、ＴＡＭシグナル伝達も重要な役割を果たしているプロセスである、食作用によるアポトーシス細胞のクリアランスの遅延（Ｓｃｏｔｔら（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：２０７-２１１；Ｌｅｍｋｅ  ＆  Ｌｕ（２００３）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：３１-３６）からも生じる。［アポトーシス細胞によるＴＡＭ活性化に伴うシグナル伝達事象（Ｓｅｎら（２００７）  Ｂｌｏｏｄ  １０９：６５３-６６０）は、本明細書に記載のシグナル伝達事象と関係している。］自己免疫に関しては、ＳＬＥ患者中の遊離のプロテインＳの低循環レベルが報告されている（Ｂｒｏｕｗｅｒら（２００４）  Ｂｌｏｏｄ  １０４：１４３-１４８；Ｍｅｅｓｔｅｒｓら（２００７）  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  １８：２１-２８；Ｓｏｎｇら（２０００）  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４３：５５７-５６０）。理論に束縛されるわけではないが、ＰｒｏＳはＴＡＭリガンドであるので、低いＰｒｏＳレベルは、ＴＡＭシグナル伝達の低下を引き起こし、結果として、無制限の免疫活性化を引き起こすはずである。この点において、ＳＬＥ患者が血栓性脳卒中を起こしやすいということ（Ｒｕｉｚ-Ｉｒａｓｔｏｒｚａら（２００１）  Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１０２７-１０３２）、およびＰｒｏＳが、ＴＡＭリガンドとしての役割に加えて、血液抗凝固剤でもあるということは興味深い。
【０２７２】
ＴＡＭシグナル伝達の上昇は、疾患を引き起こすこともある。例えば、高活性のＴＡＭシグナル伝達は、急性敗血症の一因となり得る。循環Ｇａｓ６レベルは、感染と関係がない臓器不全の患者と、年齢と性別が一致する健康対象の両方と比べて、重症敗血症患者で一貫して上昇している（Ｂｏｒｇｅｌら（２００６）  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ３４：２１９-２２２）。Ｇａｓ６の上昇は、患者の臓器機能不全および感染（ＯＤＩＮ）スコア、ならびに敗血症性ショックの発生と相関する。敗血症になる患者は、上で考察した免疫抑制現象の影響を受けやすく、この免疫抑制現象によって、患者が一次感染を排除する能力が低下し、院内感染にかかりやすくもなる。過去にグラム陰性細菌のＬＰＳに曝露されていると、例えば、後の細菌刺激に応答する能力が減少し、免疫寛容患者の自然免疫系は、最終的には、感染に直面して活動を停止する（Ｃｏｏｋら（２００４）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５：９７５-９７９）。免疫寛容と免疫崩壊は、敗血症でよく記載されている現象であるが、完全には理解されていない。自然免疫応答を阻害する高レベルのＴＡＭリガンド（例えば、Ｇａｓ６）であれば、まさにそうした崩壊を促進するであろうということに留意するのは興味深いことである。
【０２７３】
高活性ＴＡＭが役割を果たし得る別の状況は癌である。ＴＡＭ受容体およびＴＡＭリガンドは、多くの悪性腫瘍で過剰発現していることが分かっている（Ｇｒｅｅｎら（２００６）  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９４  １４４６-１４５１；Ｓｈｉｅｈら（２００５）  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ７：１０５８-１０６４；Ｓｕｎら（２００３）  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １４：８９８-９０６）。理論に束縛されるわけではないが、ＴＡＭシグナル伝達の上昇は、この受容体タンパク質チロシンキナーゼファミリーの内因性の発癌性に起因して腫瘍進行を引き起こし得る（Ｌａｉら（１９９４）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：２５６７-２５７８；Ｚｏｎｇら（１９９６）  Ｅｍｂｏ  Ｊ  １５：４５１５-４５２５）。しかし、本明細書で記載される結果は、ＴＡＭシグナル伝達の上昇が、腫瘍関連ＤＣの阻害を介した腫瘍寛容の誘導をもたらす可能性もあるということを示している。
【０２７４】
最後に、本明細書で記載されている結果の中で、１つすぐに治療に応用できることが、免疫化のためのアジュバントの改良の分野にある。多くの組換え抗原ベースのワクチンおよび合成ペプチドベースのワクチンの効力は、免疫原性が限られていることと、免疫化を繰り返す必要があることの両方によって弱められている。免疫応答の正の刺激に基づくいくつかのアプローチが試みられているが（Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ  ＆  Ａｈｍｅｄ（２００６）  Ｃｅｌｌ  １２４：８４９-８６３）、活性化経路の刺激は、一般に、本明細書で記載するような強制的な負のフィードバック機構によって相殺される可能性が高い。ＴＡＭ経路を標的する小分子阻害剤、すなわち、これらの阻害因子の阻害剤は、このような代償経路をうまく避けることができ、今日、改良されたアジュバントとして有用である。
【０２７５】
結論
ＴＡＭシグナル伝達ネットワークは、ＤＣにおける炎症を阻害するための、これまで知られていなかったが、強力でかつ広範に作用する経路を表す。この経路を上流のＴＬＲシグナル伝達ネットワークおよびサイトカインシグナル伝達ネットワークによって順次誘導し、この経路をこれらのネットワークと統合することによって、自然免疫系の恒常性を制御する炎症のサイクルの範囲が定められる。このサイクルとその調節機構は、ヒトの免疫系障害における治療的介入に重要な用途がある。
【０２７６】
実施例１０：ＢｉｏＴｈｒａｘワクチンと併用するアジュバントとしてのＴＡＭ受容体阻害剤の使用
本実施例は、ＢｉｏＴｈｒａｘワクチンと併用するアジュバントとしてのＴＡＭ受容体阻害剤の使用を示す。当業者は、他のワクチンを用いて同様の方法を使用し得るということを理解するであろう。
【０２７７】
野生型マウスとＴＡＭ変異体マウスをＢｉｏＴｈｒａｘで免疫化する。ソーク研究所で作製され、維持されているＴＡＭ変異体シリーズの全てにわたり、６〜８週齢のオスとメス両方の１０匹のマウスの群を、希釈していないＢｉｏＴｈｒａｘワクチン（０．５ｍｌ）または１／１０希釈のＢｉｏＴｈｒａｘワクチンを皮下注射することによって免疫化する。マウスは、Ｃ５７／Ｂｌ６×１２９ｓｖ混合バックグラウンドのものである。
【０２７８】
ＢｉｏＴｈｒａｘワクチン（吸着炭疽ワクチン；米国薬局方．第２７版，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＰ，２００４：ｐ．３０４２-４）を、非病原性炭疽菌Ｖ７７０-ＮＰ１-Ｒ株から滅菌培養濾過液として調製する。このワクチンは、アルハイドロゲル（登録商標）でアジュバント化され、０．５ｍＬ用量当たり約６００μｇのアルミニウムを含有する。カルシウムまたはマグネシウムを含まない、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水を希釈剤として用いて、ＢｉｏＴｈｒａｘの希釈液を調製する。
【０２７９】
免疫化後、血清を採取し、抗ＰＡのＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡでアッセイする。免疫化して２、４、６、および８週間後に、マウスに対して後眼窩試験採血を行ない、抗ＰＡ（防御抗原）ＩｇＧ濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価する。このアッセイの作業標準は、Ｇｕら（２００７）（Ｖａｃｃｉｎｅ．２５（３）：５２６-３４）によって記載されているとおりである。ＥＬＩＳＡでは、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）プレートを、１μｇ／ｍｌのｒＰＡ  １００μｌで、ＰＢＳ中、４℃で一晩コーティングする。このプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、５％のインスタントの脱脂粉乳（Ｇｉａｎｔ  Ｆｏｏｄ）を含有するＰＢＳＴに３つひと組で連続希釈したマウス血清試料を添加する。このアッセイの標準の範囲は、特異的ｒＰＡ抗体（ＩｇＧ）  １６ｎｇ／ｍｌ〜０．２５ｎｇ／ｍＬであり、Ｇｕら（２００７）（Ｖａｃｃｉｎｅ．２５（３）：５２６-３４）によって記載されているとおりに調製される。４℃で一晩インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１：５０００希釈のＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加し、その後、プレートを３７℃で１時間インキュベートする。ＰＢＳＴで洗浄した後、２，２’-アジノ-ジ（３-エチルベンズチアゾリン-６-スルホネート）（ＡＢＴＳ）基質（ＫＰＬ）を添加する。吸光度値を４０５ｎｍで読み取る。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて４パラメータ曲線の標準曲線フィットから、抗ＰＡ  ＩｇＧ濃度を推定する。このマウス抗ＰＡ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡの検出限界は、約２ｎｇ／ｍｌである。異なるＴＡＭ変異体遺伝子型間の血清抗ＰＡ  ＩｇＧの濃度を比較する。
【０２８０】
次に、抗ＰＡ液性応答の中和能力をインビトロでアッセイする。ＴＡＭ変異体シリーズ全体の炭疽致死毒素に対する抗ＰＡ液性免疫応答の中和能力を、インビトロで、マクロファージに基づく炭疽毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）で調べる。ＴＮＡで使用されるマウス抗ＰＡ標準は、上で概説したＥＬＩＳＡで使用される標準と同じである。Ｊ７７４．１マクロファージ細胞株（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）由来の細胞を、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  ｌ-グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で９６ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルで播く。別々のプレート上で、マウス血清を培地中に連続的に希釈し、３つひと組で１５０ｎｇ／ｍＬのｒＰＡおよび２５０ｎｇ／ｍＬの組換え致死因子（ｒＬＦ）とともに３７℃で１時間、インキュベートする。その後、この混合物を細胞に３７℃で３．５時間添加する。その後、２５μｌの５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ（３-（４，５-ジメチル-２-チアゾリル）-２，５-ジフェニル-２Ｈ臭化テトラゾリウム；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を２時間添加して、細胞死をモニタリングし、その後、溶解緩衝液（２０％ＳＤＳを含む５０％Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ｐＨ４．７；Ｓｉｇｍａ）を添加する。プレートを５７０ｎｍで読み取り、血清試料の中和活性を、５０％の細胞を保護する試験血清の有効希釈（ＥＤ５０）を参照標準のＥＤ５０で割ったものとして計算される、ＮＦ５０（中和ファクター５０％）として表す。このアッセイの定量限界未満の値をもたらす血清試料には、得られる最小の値の半分の値を任意に割り当てる。マウスのＴＮＡについて、Ｇｕら（２００７）（Ｖａｃｃｉｎｅ．２５（３）：５２６-３４）によって報告されている検出限界は、０．０６μｇ／ｍＬ  抗ＰＡ  ＩｇＧまたは０．３  ＥＤ５０単位であった。
【０２８１】
以下のプロトコルによって、キナーゼドメインに基づく小分子型のＴＡＭ受容体シグナル伝達阻害剤が、改良された炭疽ワクチン接種レジメン用の強力な免疫アジュバントとして有効であるかどうかを確認する。ワクチン接種に対する炎症応答のＴＡＭ介在性阻害を阻害することによって、これらの小分子はＢｉｏＴｈｒａｘに対する液性免疫応答を大幅に高める。
【０２８２】
１０匹の野生型マウスの群を、ＢｉｏＴｈｒａｘのみ（１：１および１：１０）、または増加用量のＴＡＭ小分子阻害剤（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）を補ったＢｉｏＴｈｒａｘのいずれかで免疫化する。ＤＢＡ系統のマウスにおけるＢｉｏＴｈｒａｘと組換えＰＡの両方による免疫化に対する応答プロファイルについての先行文献が豊富にあるので、このマウス系統をこれらの野生型の検討で使用する。ＴＡＭ阻害剤は、その作用様式において、癌療法で使用される経口活性薬物と関連があり、水溶性である。このため、これらの阻害剤は、ＢｉｏＴｈｒａｘワクチンに直接添加することができる。１０匹の野生型マウスの群を、ＢｉｏＴｈｒａｘワクチンのみ、または増加用量のＡｘｌ（ＴＡＭ）阻害剤を補ったＢｉｏＴｈｒａｘで免疫化する。
【０２８３】
上記のように、ＳｕｐｅｒＧｅｎおよびＲｉｇｅｌから現在入手可能な阻害剤（例えば、ＡＸＬ-９およびＳＧＬ-ＡＸＬ-２７７）は、低い（１〜５）μＭ範囲のＩＣ５０で作用する。しかしながら、ＴＡＭ受容体自己リン酸化を阻害する、より低いＩＣ５０値を有する次世代型の阻害剤が単離されるであろう。したがって、１つの実施形態において、ＴＡＭ阻害剤は、他のチロシンキナーゼと比べてＴＡＭ受容体に対する特異性を示すが、同時に、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、およびＭｅｒを区別しない阻害剤である。（異なるサブセットのＡＰＣは、これらの受容体の様々な組合せを発現しているが、必ず２つ以上を発現していることが観察されている。）しかしながら、単一のＴＡＭ受容体（例えば、Ａｘｌ）に極めて特異的な阻害剤でさえも、アジュバントとして有用である。１回目のシリーズの免疫化を、（例えば、培養下のＡｘｌ発現ＭＥＦにおいて１０ｎＭの組換えＧａｓ６に応答するＡｘｌ自己リン酸化の阻害について測定される）阻害剤のＩＣ５０で行ない、このＩＣ５０よりも１０倍低いまたは１０倍高い濃度で第二および第三のシリーズを行なう。
【０２８４】
免疫化後、血清を採取し、抗ＰＡのＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡでアッセイする。様々な濃度のＴＡＭ阻害剤の存在下または非存在下においてＢｉｏＴｈｒａｘで免疫化してから２、４、６、および８週間後に、マウスに対して後眼窩試験採血を行ない、抗ＰＡ（防御抗原）ＩｇＧ濃度を、上記のように、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価する。ＰＡに対する液性抗体応答の増強に最適な阻害剤用量が決定されれば、Ｇｕおよび同僚（２００７）  Ｖａｃｃｉｎｅ．２５（３）：５２６-３４）によって報告されているのと同様の希釈解析を行なう。すなわち、一定の最適濃度の抗ＴＡＭをベースにしたアジュバントの存在下または非存在下でのワクチンの希釈によって、アジュバントの有効性を評価する。１０匹のマウスの組を、希釈していないＢｉｏＴｈｒａｘか、またはＴＡＭ阻害剤の存在下もしくは非存在下で１：５、１：１０、もしくは１：３０に希釈したワクチンのいずれかで皮下に免疫化する。６週間（４２日）で採取した血清に対して、抗ＰＡ  ＩｇＧアッセイを行なう。
【０２８５】
次に、抗ＰＡ液性応答の中和能力をインビトロでアッセイする。様々な濃度のＴＡＭ阻害剤（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）とともに、またはこの阻害剤なしで、ＢｉｏＴｈｒａｘをワクチン接種したマウスにおける抗ＰＡ液性免疫応答の炭疽致死毒素中和能力を、インビトロで、上記のようなマクロファージに基づく炭疽毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）で調べる。
【０２８６】
これらの結果は、モルモットで確認することができる。モルモットで行なわれる免疫原性の検討は、上記のＤＢＡマウスで行なわれる検討と同様である。１０匹の動物の群を、ＢｉｏＴｈｒａｘ（１：１および１：１０）またはＢｉｏＴｈｒａｘ＋３つの異なる濃度のＴＡＭ阻害剤（ＩＣ５０、０．１倍のＩＣ５０、および１０倍のＩＣ５０）で皮下に免疫化する。モルモット抗ＰＡ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡプロトコルは、モルモット抗ｒＰＡ  ＩｇＧ標準を使用することと、ＨＲＰ標識ヤギ抗モルモットＩｇＧ二次抗体を検出用に使用することを除き、マウスＥＬＩＳＡと大きくは違わない。マウスおよびモルモットの抗ＰＡ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡの検出限界は、それぞれ、２ｎｇ／ｍＬおよび３０ｎｇ／ｍＬと報告されている。
【０２８７】
実施例１１：ＤＣをベースにしたワクチンと併用するアジュバントとしてのＴＡＭ受容体阻害剤の使用
本実施例では、ＤＣをベースにしたワクチン（例えば、腫瘍ワクチン）と併用するアジュバントとしてのＴＡＭ受容体阻害剤の使用を記載する。簡潔に述べると、樹状細胞をベースにしたワクチンプロトコルでは、樹状細胞を、腫瘍を有する対象から単離し、これらの細胞を腫瘍関連抗原と接触させるかまたはこれらの細胞にエクスビボでベクターをトランスフェクトする。その後、これらの細胞を対象の体に再導入すると、体内でこれらの細胞が腫瘍に対する免疫応答を開始する。
【０２８８】
樹状細胞（またはＤＣを生じることができる細胞（例えば、単球もしくはＣＤ３４＋骨髄前駆細胞））を、ドナーから、または対象（例えば、癌患者もしくは癌の危険性がある人）から得る。簡潔に述べると、血液をヒト対象から得て、末梢血単核細胞を単離し、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子およびインターロイキン４（ＩＬ-４）、または単球馴化培地模倣物としても知られる、ＴＮＦ、ＩＬ-１β、ＩＬ-６、および／もしくはＰＧＥ２の組合せ、またはサイトカインカクテル（例えば、モノホスホリル脂質Ａ＋ＩＦＮγ）を含有する培地で、約４〜１４日間、成熟ＤＣとして培養する。その後、成熟ＤＣを誘導すると、リポ多糖および／または腫瘍壊死因子-αの存在下で約２４〜４８時間さらにインキュベートした後に成熟する。
【０２８９】
Ｎｅｓｔｌｅら（（１９９８）  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３２８）の方法による腫瘍細胞ライセートとのインキュベーションによって、ＤＣに腫瘍関連抗原をロードする。簡潔に述べると、６日目のＢＭＤＣを、ｍＧＭ-ＣＳＦ／ｍＩＬ-４とポリブレン（８μｇ／ｍｌ）が補充された２００μｌの培地を含有する２４ウェルプレートにプレーティングする。その後、濃縮した腫瘍ライセートを細胞に添加し、これらの細胞を、３０分毎に穏やかに振盪させながら、３７℃で３時間インキュベートする。その後、ＤＣを回収するために、細胞をＰＢＳで３回洗浄する。抗原に曝露してから２日後に、抗原に曝露されたＤＣを回収し、以下で記載するようにすぐに対象に注射する。
【０２９０】
いくつかの例において、ＴＡＭ受容体阻害剤（例えば、約１μＭ〜約１ｍＭ）を、ＤＣを抗原に曝露するのと同時にＤＣ培養培地に添加する。その後、約５×１０５個〜５×１０１０個の細胞を、有効量のＴＡＭ受容体阻害剤（例えば、約１μＭ〜約１ｍＭ）とともに対象に再導入する。ＴＡＭ受容体阻害剤を、ＤＣ（静脈内注入によって再導入される）を対象に再導入するのと実質的に同時に、単回用量として皮下投与するかまたは静脈内注入によって投与する。任意で、ワクチンの投与後、ワクチンの効力を評価するために、実施例１に記載の通りに定期的に力価を得る。さらに、通常、効力についての他の尺度（例えば、増殖または退行について腫瘍サイズをモニタリングすること）を用いる。
【０２９１】
実施例１２：ワクチン接種期間中のアジュバントとしてのＴＡＭ受容体阻害剤の使用
本実施例は、ワクチン接種期間中のアジュバントとしてのＴＡＭ受容体阻害剤の使用を示す。
【０２９２】
正常（ＷＴ）マウスおよびＴｙｒｏ３を欠くマウス、またはＡｘｌを欠くマウス、またはＭｅｒを欠くマウス、またはＡｘｌとＭｅｒを欠くマウス、またはＴｙｒｏ３とＡｘｌとＭｅｒを欠くマウスを、試験免疫原としての炭疽菌由来の組換え防御抗原（ｒＰＡ）で免疫化した。免疫してから２週間後に、ｒＰＡに対する血清抗体力価をＥＬＩＳＡで解析した。簡潔に述べると、免疫化の前に、ヘパリン化キャピラリーを用いて後眼窩採血によって全てのマウスから血液試料を採取した。採取した血液を所望のラベルされたチューブに分注し、室温で凝固させた。その後、試料を遠心分離（室温、１５００ｒｐｍで１０分）にかけた。この試料の上の層（血清）を新しいチューブに移し、-８０℃で保存した。１日目に、アラム中に（１：１で）吸着させた２０ｕｇの炭疽防御抗原でマウスを免疫化した。７日おきに（免疫化後、１４日目、２１日目、２８日目、および３５日目に）後眼窩採血によって血液試料を採取した。前免疫血清について行なったように、血清を調製し、保存した。４２日目に、後眼窩採血によって血清を採取し、マウスに第二の用量の２０ｕｇの炭疽防御抗原（単独、アラムなし）を投与した。この２回目の追加免疫の後、再度７日おきに（免疫化後、４９日目、５６日目、６３日目、および７０日目に）後眼窩採血によって血液試料を採取した。
【０２９３】
図１１および１２に示すように、より高い抗体力価が、受容体単一変異体で検出され、全ての中で最も高い抗体力価が、３つ全てのＴＡＭ受容体を欠くマウスで検出された。これらの結果は、ＴＡＭシグナル伝達の阻害が、免疫化に対する抗体応答を増強する方法であることを示している。
【０２９４】
本開示は、特定の実施形態を強調して記載されているが、これらの特定の実施形態の変形が使用可能であることが当業者には明白であり、本明細書で具体的に記載されていること以外の方法で本開示を実施することができるということが意図される。したがって、本開示は、以下の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲の範囲内に包含される全ての修正を含む。
【図１Ａ】
2011514881.tif 000007
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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