(57)【要約】  生体適合性ポリマーおよびオールトランスレチノイン酸（ATRA）またはその誘導体を含む徐放性血管インプラント（例えば血管移植片、ステント、ラップ、およびゲル）を使用して、他の人工移植で起こりうる血栓形成および／または新生内膜過形成を治療、予防、または阻害することができる。特に、本明細書に記載するインプラントは、平滑筋細胞の増殖、新生内膜過形成を阻害し、血管系における抗血栓遺伝子および一酸化窒素生成をアップレギュレートすることができる。更にインプラントは、制御された予測可能な局所濃度のATRAを送達する能力を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管インプラント移植後の新生内膜過形成および／または血栓形成の発生を低減または予防するための方法であり、該方法が以下：
血管インプラントをオールトランスレチノイン酸（ATRA）と接触させること；および、
必要とする患者に血管インプラントを移植すること
を含み、血管インプラントが生体適合性ポリマー・マトリクスを含有し；そして血管インプラントが患者に移植されると新生内膜過形成および／または血栓形成を阻害または予防するのに十分な治療的有効量のATRAを放出する、上記方法。
【請求項２】
血管インプラントが血管移植片、血管ステント、またはラップもしくはゲルである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血管インプラントが血管ステントまたは移植片およびラップまたはゲルを含有し、ラップまたはゲルが生体適合性ポリマー・マトリクスおよびATRAを含有し、ラップまたはゲルを血管ステントまたは移植片の少なくとも一部の周囲に配置する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
血管インプラントが約0.001から5 mg/生体適合性ポリマー・マトリクス（g）/日の速度でATRAを放出する、請求項１から３のいずれか一項に記載される方法。
【請求項５】
血管インプラントが生体適合性ポリマー・マトリクスに対して約0.001から15重量％のATRAを含有する、請求項１から４のいずれか一項に記載される方法。
【請求項６】
治療的有効量のATRAが約1日から約12週間の期間放出される、請求項１から５のいずれか一項に記載される方法。
【請求項７】
生体適合性ポリマー・マトリクスがポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリリン酸エステル、またはそれらの混合物である、請求項１から６のいずれか一項に記載される方法。
【請求項８】
生体適合性ポリマー・マトリクスがポリ（クエン酸−ジオール）またはポリ（グリセロール−ジアシド）である、請求項１から７のいずれか一項に記載される方法。
【請求項９】
生体適合性ポリマー・マトリクスがエラストマーまたはゲルである、請求項１から８のいずれか一項に記載される方法。
【請求項１０】
ミクロ粒子またはナノ粒子がATRAを含有し、ミクロ粒子またはナノ粒子が生体適合性ポリマー・マトリクス中に包埋される、請求項１から９のいずれか一項に記載される方法。
【請求項１１】
ATRAがミセルまたはリポソームに封入され、ミセルまたはリポソームが生体適合性ポリマー・マトリクス中に包埋される、請求項１から９のいずれか一項に記載される方法。
【請求項１２】
ATRAが生体適合性ポリマー・マトリクス中に吸収される、請求項１から９のいずれか一項に記載される方法。
【請求項１３】
ATRAが生体適合性ポリマー・マトリクス中に懸濁または溶解される、請求項１から９のいずれか一項に記載される方法。
【請求項１４】
改変された血管インプラントを調製する方法であり、以下：
血管インプラントを提供すること；および、
血管インプラントをオールトランスレチノイン酸（ATRA）と接触させて改変された血管インプラントを作製すること
を含み、改変された血管インプラントが生体適合性ポリマー・マトリクスを含有し；そして、改変された血管インプラントが患者に移植されると新生内膜過形成および／または血栓形成を阻害するのに十分な治療的有効量のATRAを放出する、上記方法。
【請求項１５】
接触が生体適合性ポリマー・プレポリマーおよびATRAを含有するナノ粒子、ミクロ粒子、ミセル、またはリポソームを含有する混合物で血管インプラントをコーティングすることを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
生体適合性ポリマー・プレポリマーがポリエステル・プレポリマーである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
接触がATRAを含有する溶液に血管インプラントを浸漬することを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
接触が血管インプラントを生体適合性ポリマー・プレポリマーでコーティングすること；コーティングした血管インプラントを固化すること（setting）；およびコーティングした血管インプラントをATRAを含有する溶液に浸漬することを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
溶液によって生体適合性ポリマー・マトリクスの膨潤が起こる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
接触がATRAおよび生体適合性ポリマー・マトリクスを含有する混合物で血管インプラントをコーティングすることを含み、生体適合性ポリマー・マトリクスが生体適合性熱可塑性ポリマーである、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許仮出願第61/077,949号（2008年7月3日出願。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の属する分野
本開示は、オールトランスレチノイン酸またはその誘導体を導入してインプラント術後の血栓形成および／または新生内膜過形成を低減する血管インプラントに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アテローム性動脈硬化症は全ての先進国で蔓延しており、米国においては主要な死亡および身体障害の原因である。アテローム性動脈硬化症の衰弱および障害を引き起こす続発症は末梢動脈障害（PAD）である。PAD患者は多くの場合、症状に限らず、機能障害およびクオリティー・オブ・ライフの低下を有する。重度のPAD患者では、多くの場合、依然として下肢バイパス移植が患肢救済の唯一の選択肢である。
【０００４】
鼠径下部バイパス移植のための代表的な導管は自家静脈である。鼠径下部静脈移植の開存性は５年で約７０％であるが、約３分の１の患者では、内因性静脈疾患または過去の静脈採取のために、静脈を使用することができない。これらの症例では、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）移植片が代替のバイパス管として最も一般的に使用される。しかしながら、膝窩下部ePTFEバイパス移植片の一次開存率は非常に低い。人工バイパス移植片の不全によるアテローム性疾患の進行、血栓形成、または新生内膜過形成が二次的に起こる。
【０００５】
人工移植片の使用に伴う問題は非常に深刻で、心臓外科医は冠動脈バイパス移植（CABG）にはそれらを使用しない。処置を行うための健常な静脈または動脈が無い場合にいつでも使用できる既製の人工移植片があれば、CABGが必要な患者には非常に有益である。ePTFE移植片は現在の人工鼠径下部バイパス移植片の標準的なものであるが、特に直径の小さい膝下の血管再建術に使用する場合、血栓を形成する可能性がある。新生内膜過形成による狭窄が、長期の有効性のための課題として残っている。
【０００６】
いくつかのタイプの表面改変法が、血液および人工移植片間の相互作用の性質を変化させるために使用されてきた。これらの戦略のほとんどでは、抗血栓化合物を永久的に固定化すること、またはタンパク質耐性表面の作製に焦点が当てられてきたが、結果は種々であった。例えば、血栓形成および新生内膜過形成を低減するため、血管移植片の表面を改変する抗血栓剤および抗増殖剤としてヘパリンが広く使用されてきた。動物モデルでは、ヘパリン修飾したePTFE移植片により、急性血栓形成および吻合部新生内膜過形成が有意に低減された。しかしながら、抗血小板抗体産生の可能性およびそれに伴うヘパリン起因性血小板減少症による致死的転帰が起こりうる。
【０００７】
従って、全身の、または毒性を有する副作用を回避しつつ、新生内膜過形成の処置または阻害を可能にする、改善された移植片改変法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
生体適合性ポリマーおよびオールトランスレチノイン酸（ATRA）またはその誘導体を含有する徐放性血管インプラント（例えば血管移植片、ステント、ゲル、およびラップ（wrap））を使用して、他の人工インプランテーションで起こりうる血栓形成および新生内膜過形成を治療、予防、または阻害することができる。特に、本明細書に記載するインプラントにより、平滑筋細胞の増殖、新生内膜過形成を阻害し、血管系における抗血栓遺伝子および一酸化窒素生成をアップレギュレートすることができる。更にインプラントは、制御された予測可能な局所濃度のATRAを送達する能力を有する。
【０００９】
ある観点では、本開示は血管インプラント移植後の新生内膜過形成および／または血栓形成の発生を低減または予防するための方法を提供し、該方法は以下：血管インプラントをオールトランスレチノイン酸（ATRA）と接触させること；および、必要とする患者に血管インプラントを移植することを含み、血管インプラントは生体適合性ポリマー・マトリクスを含み；そして、血管インプラントは患者に移植されると新生内膜過形成を阻害または予防するのに十分な治療的有効量のATRAを放出する。
【００１０】
第二の観点では、本開示は改変された血管インプラントを調製する方法を提供し、方法は以下：血管インプラントを提供すること；および血管インプラントをオールトランスレチノイン酸（ATRA）と接触させて改変された血管インプラントを作製することを含み、改変された血管インプラントは生体適合性ポリマー・マトリクスを含み；そして、改変された血管インプラントは患者に移植されると新生内膜過形成および／または血栓形成を阻害するのに十分な治療的有効量のATRAを放出する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
第一の観点では、本開示は血管インプラント移植後の新生内膜過形成の発生を低減または予防するための方法を提供し、該方法は、血管インプラントをオールトランスレチノイン酸（ATRA）と接触させること；および、必要とする患者に血管インプラントを移植することを含む。
【００１２】
本明細書で使用する「治療的有効量」とは、組織、系、動物、個体、またはヒトにおいて研究者、獣医師、医師、または他の臨床家が所望する生物学的または医学的反応を惹起する活性化合物または医薬品の量をいい、それらの反応には以下の１つまたはそれ以上が含まれる：
【００１３】
（１）疾病の予防；例えば、疾病、症状、または障害の素因があるが未だ疾病の病状または徴候を経験していない、または示していない個体において疾病、症状、または障害を予防すること；
【００１４】
（２）疾病の阻害；例えば、疾病、症状、または障害の病状または徴候を経験している、または示している個体において疾病、症状、または障害を阻害すること；および
【００１５】
（３）疾病の寛解；例えば、疾病、症状、または障害の病状または徴候を経験している、または示している個体において疾病、症状、または障害を寛解すること（すなわち病状および／または兆候を逆行させること）、例えば疾病の重篤度を低減すること。
【００１６】
本明細書で使用する「生体適合性」とは、in vivoにおいて実質的に有害な反応を惹起しない材料を表すことを意図する。
【００１７】
本明細書で使用する「生分解性」ポリマーは、生理学的またはエンドソーム的条件下で完全に分解されるポリマーである。好ましい態様では、ポリマーおよびポリマー生分解副産物は生体適合性である。生分解性ポリマーは加水分解可能である必要はなく、完全に分解するために酵素作用を必要としてもよい。
【００１８】
本明細書で使用する「エンドソーム的条件」というフレーズは、エンドソーム小胞内で遭遇すると考えられる化学的（例えばpH、イオン強度）および生化学的（例えば酵素濃度）条件の範囲に関する。ほとんどのエンドソーム小胞では、エンドソームpHは約5.0から6.5の範囲である。
【００１９】
本明細書で使用する「生理学的条件」というフレーズは、組織の細胞内および細胞外液中で遭遇すると考えられる化学的（例えばpH、イオン強度）および生化学的（例えば酵素濃度）条件の範囲に関する。ほとんどの組織では、生理学的pHは約7.0から7.4の範囲である。
【００２０】
本明細書で使用する「患者」という用語は、動物（哺乳動物を含む）、好ましくはヒトを指す。
【００２１】
いくつかの態様では、上記の血管インプラントは血管移植片、血管ステント、ラップ、またはゲルである。特定の態様では、血管インプラントは血管移植片である。別の特定の態様では、血管インプラントは血管ステントである。別の特定の態様では、血管インプラントはラップ、例えば吻合ラップである。別の特定の態様では、血管インプラントはゲルである。それらのラップおよびゲルを、移植のための血管移植片またはステントの少なくとも一部の周囲に配置してもよい。従って、血管インプラントは生体適合性ポリマー・マトリクスおよびATRAを含有するラップまたはゲルおよび血管ステントまたは移植片を含み、ラップまたはゲルが血管ステントまたは移植片の少なくとも一部の周囲に配置されてもよい。
【００２２】
別の態様では、当業者に公知の方法に従って必要とする患者に血管移植片を移植し、その後、生体適合性ポリマー・マトリクスおよびATRAを含有するラップまたはゲルを、移植した血管移植片の少なくとも一部および移植片の移植を行った血管の少なくとも一部の周囲に配置してもよい。そのようにして、新生内膜過形成を予防および／または阻害することができるため、ATRAが血管移植片および移植片が移植された血管を通じて拡散される。
【００２３】
別の態様では、外表面の少なくとも一部を生体適合性ポリマー・マトリクスおよびATRAを含有するラップまたはゲルでコーティングした血管移植片を、当業者に公知の方法に従って必要とする患者に移植してもよい。
【００２４】
別の態様では、当業者に公知の方法に従って必要とする患者に血管ステントを移植し、その後、生体適合性ポリマー・マトリクスおよびATRAを含有するラップまたはゲルを移植されたステントの内表面の少なくとも一部に配置してもよい。
【００２５】
別の態様では、生体適合性ポリマー・マトリクスおよびATRAを含有するラップまたはゲルを外表面の少なくとも一部にコーティングした血管ステントを、当業者に公知の方法に従って、必要とする患者に移植してもよい。そのようにして、血管ステントの外表面とステントを移植した血管の内表面との間にラップまたはゲルを封入してもよい。
【００２６】
血管インプラントは一般に、生体適合性ポリマー・マトリクスを含有する。例えば生体適合性ポリマー・マトリクスはポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリリン酸エステル、またはそれらの混合物を含んでもよい。生体適合性ポリマー・マトリクスはエラストマーであってもよい；または生体適合性ポリマー・マトリクスはゲルであってもよい。
【００２７】
本明細書で使用するエラストマーとは、弱い圧力で実質的に変形された後、元とほぼ同じ外形（the approximate shape）に迅速に戻ることができる高分子材料である。例えばゴムはよく知られるエラストマーである。
【００２８】
本明細書で使用する「ゲル」という用語は、連続的な３次元架橋構造ポリマー網状組織で、その網状組織の空隙内に液体が取り込まれたものをいう。架橋ポリマー網状組織がゲルの構造を提供する。その構造の程度によって、ゲルは、水よりわずかに粘性が高い流動性ゲルから非常に硬質な非流動性ゲルまで、広範な特性を有しうる。本明細書で使用する「流動性ゲル」という用語は、環境大気条件下で拘束されない状態に置くと、重力によって流動するゲルをいう。「非流動性ゲル」はこれらの条件下で流動しない。
【００２９】
いくつかの態様では、生体適合性ポリマー・マトリクスはポリエステル、例えばポリ（クエン酸ジオール）またはポリ（グリセロール−ジアシド）である。
【００３０】
本明細書で使用するポリ（クエン酸ジオール）は、クエン酸（トリカルボン酸モノマー）および２つのアルコール官能基を有する第２のモノマー（「ジオール」）から当業者に公知の方法に従って調製されるポリエステルである。例えば、好適なポリ（クエン酸ジオール）は、米国特許出願第2005/0063939号および第2007/0208420号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように調製することができる。ジオールの例には、それに制限されるわけではないが、芳香族ジオール（例えばヒドロキノン、カテコール、レゾルシノール）、C2-C20アルキルジオール、C2-C20アルケニルジオール（例えばテトラデカ-2,12-ジエン-1,14-ジオール）、およびそれらの混合物がある。ジオールは置換基を含んでもよい。アミンおよびカルボン酸のような反応基によって、架橋に使用できる部位の数が増加する。アミノ酸および他の生体分子はポリマーの生物学的特性を変化させる。芳香族基、脂肪族基、およびハロゲン原子はポリマー内の鎖間相互作用を変化させる。ジオールには更に、マクロモノマージオール、例えばポリエチレンオキシド、およびN-メチルジエタノアミン（MDEA）も含まれる。
【００３１】
いくつかの態様では、ジオールはC2-C20アルキルジオール、C2-C20アルケニルジオール、またはそれらの混合物を１つまたはそれ以上含有する。他のいくつかの態様では、ジオールはC2-C20アルキルジオール、例えばC6-C20アルキルジオール、またはC6-C14アルキルジオール、またはC6-C12アルキルジオールを１つまたはそれ以上含有する。例えばジオールはα,ω-C2-C20アルカンジオール、例えば1,12-ドデカンジオール、1,10-デカンジオール、1,8-オクタンジオール、またはそれらの混合物を含んでもよい。別の例では、ジオールは1,10-デカンジオール、1,8-オクタンジオール、またはそれらの混合物を含んでもよい。別の例では、ジオールは1,8-オクタンジオールを含んでもよい（例えばポリエステルはポリ（1,8-オクタンジオールシトレート）である）。
【００３２】
ポリ（クエン酸ジオール）を、その分解を制御するため、例えば任意に１つまたはそれ以上の超分枝モノマー（例えば３つのアルコール官能基を含むモノマー（「トリオール」））を含むことによって架橋してもよい。例えば、クエン酸およびジオールモノマーの他に、グリセロールを加えてもよい（３つのモノマー中のカルボキシルおよびヒドロキシル基のモル比が1/1に保持される場合、0-3 mol%）。グリセロールは親水性成分であり、これを添加することによって網状構造フィルム中への水の浸透が促進され、その結果、分解速度が速くなる。グリセロールの量が増加するほど、得られるポリエステルの破壊強度およびヤング係数は増加する。例えばヤング係数は1から16 MPaの範囲であってもよく、破壊における強度およびゆがみ（strain）はそれぞれ10 MPa以下および500％以下である。合成条件により、総分解時間は数ヶ月から数年の範囲であってもよい。6から12ヶ月以内に分解されるのが好ましい。
【００３３】
本明細書で使用するポリ（グリセロール−ジアシド）は、トリオール・モノマー、グリセロールおよび２つのカルボン酸官能基を有する第２のモノマー（「ジアシド」）から当業者に公知の方法に従って調製されるポリエステルである。例えば、好適なポリ（グリセロール−ジアシド）は米国特許出願第2003/0118692号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように調製することができる。ジアシドの例には、それに制限されるわけではないが、芳香族−ジアシド（例えばテレフタル酸およびカルボキシフェノキシプロパン）、C2-C20アルキル−ジアシド、C2-C20アルケニル−ジアシド、およびそれらの混合物がある。ジアシドは置換基を含んでもよい。アミンおよびヒドロキシルのような反応基によって、架橋に使用できる部位の数が増加する。アミノ酸および他の生体分子はポリマーの生物学的特性を変化させる。芳香族基、脂肪族基、およびハロゲン原子はポリマー内の鎖間相互作用を変化させる。
【００３４】
いくつかの態様では、ジアシドはC2-C20アルキル−ジアシド、C2-C20アルケニル−ジアシド、またはそれらの混合物を１つまたはそれ以上含有する。他のいくつかの態様では、ジアシドはC2-C20アルキル−ジアシドを１つまたはそれ以上含有する。例えば、ジアシドはα,ω-C2-C20アルカンジアシド、例えばセバシン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、またはそれらの混合物を含んでもよい。別の例では、ジアシドはセバシン酸を含んでもよい（例えばポリエステルはポリ（グリセロール−セバセート（sebacate））である）。
【００３５】
ポリ（グリセロール−ジアシド）を、その分解を制御するため、例えば１つまたはそれ以上の超分枝モノマー（例えば３つのカルボン酸官能基を含むモノマー（「トリアシド」））を含有させることによって架橋してもよく、ポリ（グリセロール−ジアシド）に任意に含有させてもよい。例えば、グリセロールおよびジアシドモノマーの他にクエン酸を加えてもよい（３つのモノマー中のカルボキシルおよびヒドロキシル基のモル比が1/1に保持される場合、0-3 mol%）。
【００３６】
ポリマーの弾性係数および分解速度は、架橋密度を変化させることによって容易に調整される。いくつかの態様では、本発明に従って生成されるエラストマー・ポリマーの架橋密度は40%以下、30％未満、20％未満、10％未満、または5％未満であってもよい。ポリマーの架橋密度は40％以下、30％未満、20％未満、20％未満、5％未満、1％未満、0.5％未満、または0.05%未満であってもよい。
【００３７】
ある態様では、本発明のグリセロール−ジアシド・コポリマーの引張弾性係数は5 MPa以下である。当業者に認識されるように、ポリマーの係数はその適用によって調整してもよい。例えばポリマーの係数は3 MPa未満、1 MPa未満、0.5 MPa未満、0.3 MPa未満、または0.1 MPa未満であってもよい。ポリマーの最大伸長は250％より大きくてもよい。
【００３８】
触媒を使用して、上記のポリエステルを調製するための反応温度を低下させ、反応時間を短縮し、個々の鎖長を増加させてもよい。しかしながら、触媒は生体適合性であるか、または除去が容易であるべきである。FDAが認可している代表的な触媒はオクタン酸スズ（stannous octoate）（ビス（2-エチルヘキサノエート）スズ（II)）である。
【００３９】
ATRAを、例えば生体適合性ポリマー・マトリクス内に包埋できるATRA含有ミクロ粒子またはナノ粒子として、生体適合性ポリマー・マトリクス内に組み込んでもよい。別の態様では、ATRAをATRAのミクロ粒子および／またはナノ粒子として生体適合性ポリマー・マトリクスに組み込んでもよい。
【００４０】
あるいはまた、ミセルまたはリポソーム中に封入し、ミセルまたはリポソームを生体適合性ポリマー・マトリクス内に包埋することによって、ATRAを生体適合性ポリマー・マトリクス内に組み込んでもよい。別の態様では、ATRAを生体適合性ポリマー・マトリクスに吸収、懸濁、または溶解させてもよい。いくつかの態様では、ATRAを生体適合性ポリマー・マトリクスに懸濁または溶解させる。他のいくつかの態様では、ATRAを生体適合性ポリマー・マトリクスに吸収させる。
【００４１】
上記の態様のいずれかに従って記載した血管インプラントは、患者に移植すると、新生内膜過形成および／または血栓形成を阻害または予防するのに十分な治療的有効量のATRAを放出することができる。
【００４２】
ある態様では、ATRAは、高速液体クロマトグラフィー（in vitro）での測定で、約0.001-5 mg/ポリマー（g）/日の速度で血管インプラントから放出されうる。いくつかの態様では、ATRAは約0.001-1.2 mg/ポリマー（g）/日；または約0.001-0.78 mg/ポリマー（g）/日；または約0.001-0.58 mg/ポリマー（g）/日の速度で血管インプラントから放出される。特定の態様では、ATRAは約0.001-0.39 mg/ポリマー（g）/日の速度で血管インプラントから放出される。
【００４３】
別の態様では、上記の態様のいずれかに記載される血管インプラントは生体適合性ポリマー・マトリクスに対して約0.001-15重量％のATRAを含有することができる。いくつかの態様では、血管インプラントは生体適合性ポリマー・マトリクスに対して約0.001-10重量％；または約0.001-7.5重量％；または約0.001-5重量％のATRAを含有する。特定の態様では、血管インプラントは生体適合性ポリマー・マトリクスに対して約0.001-3重量％のATRAを含有する。
【００４４】
更に別の態様では、上記の態様のいずれかに記載される血管インプラントによって、治療的有効量のATRAが約1日から約12週間にわたって放出されうる。特に、上記の態様のいずれかに記載される血管インプラントによって、治療的有効量のATRAが約1日から10週間；または約1日から8週間；または約1日から6週間にわたって放出されうる。いくつかの態様では、上記の態様のいずれかに記載される血管インプラントによって、治療的有効量のATRAが約1日から4週間にわたって放出されうる。
【００４５】
更に、上記の態様のいずれかに記載されるATRAを含有する生体適合性ポリマー・マトリクス・コーティングの厚さは約0.01から3mm；または約0.1から3mmの範囲であってもよい。いくつかの態様では、上記の態様のいずれかに記載されるATRAを含有する生体適合性ポリマー・マトリクス・コーティングの厚さは約1から10μmまたは2から5μmの範囲であってもよい。
【００４６】
第１の観点のある態様では、本開示は、上記の態様のいずれかに従って記載する血管インプラントの移植後の新生内膜過形成の発生を低減または予防するための方法を提供する。
【００４７】
ATRA
オールトランスレチノイン酸（ATRA）は疎水性の脂質およびエタノール可溶性化合物であり、in vitroにおいて、多くの血管保護性（例えば血管平滑筋細胞（VSMC）の遊走、VSMC増殖、および細胞外マトリクス生成の抑制）を有することが明らかになっている（例えばMianoら Circulation 1996 May 15; 93(10): 1886-95；およびJohst U.ら J Cardiovasc Pharmacol 2003 Apr; 41(4):526-35参照）。ATRAはVSMCのアポトーシスを刺激する（例えばOrlandi, A.ら Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005 Feb；25(2):348-53；およびOrlandi, A.ら, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001 Jul; 21(7): 1118-23参照）。内皮細胞の観点からは、ATRAは内皮細胞増殖および表現型を調節することが明らかになっている（例えばBraunhut, SJ.ら,Microvasc Res 1991 Jan;41(l):47-62；およびGaetano, C.ら,Circ Res 2001 Mar 2;88(4):E38-E47参照）。更に、ATRAは内皮細胞からの一酸化窒素合成およびトロンボモジュリン放出を増加させることが明らかになっている（例えばAchan, V.ら, Circ Res 2002 Apr 19;90(7):764-9；およびHorie, S.ら, Biochem J 1992 Jan 1;281 ( Pt 1): 149-54参照）。他のATRAの血管保護作用にはエンドセリン-1の阻害、プラスミノーゲン活性化因子合成の刺激、およびβ1インテグリンの発現増加がある（例えばYokota, J.ら Atherosclerosis 2001 Dec;159(2):491-6；Kooistra,T.ら, Thromb Haemost 1991 May 6;65(5):565-72；およびMedhora, M.M., Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000 Jul;279(l):H382-H387参照）。ATRAは、バルーン障害げっ歯動物およびウサギにin vivoで全身または局所投与すると血管系に作用を及ぼすことが明らかにされており、それらには、アテローム性動脈硬化ウサギにおける新生内膜過形成の阻害、血管リモデリングの阻害、再内皮化の促進、および再狭窄の抑制がある（例えばMiano, J.M.ら, Circulation 1998 Sep 22;98(12): 1219-27；DeRoseJr., J.J.ら. Cardiovasc Surg 1999 Oct;7(6):633-9；Lee, CW.ら, J Korean Med Sci 2000 Feb;15(l):31-6；Wiegman, PJ.ら, Arterioscler Thromb Vase Biol 2000 Jan;20(l):89-95；Herdeg, C.ら, Cardiovasc Res 2003 Feb;57(2):544-53；Leville, CD.ら, J Surg Res 2000 May 15;90(2):183-90；およびLeville, CD.ら,Surgery 2000 Aug;128(2):178-84参照）。有望ではあるが、これらの研究ではin vivoにおけるATRAの局所的または持続的送達は行われていない。更に重要なことは、ATRAを用いた、人工移植片における新生内膜過形成の阻害に関する研究は行われていないことである。
【００４８】
インプラントの調製
上記の血管インプラントは以下を含む方法に従って調製できる：血管インプラントを提供すること；および血管インプラントをオールトランスレチノイン酸（ATRA）と接触させて改変された血管インプラントを作製すること。一般に、改変された血管インプラントは上記の生体適合性ポリマー・マトリクスを含有し、患者に移植されると新生内膜過形成を阻害するのに十分な治療的有効量のATRAを放出する。
【００４９】
いくつかの態様では、血管インプラントは血管移植片、血管ステント、ラップ、またはゲルである。特定の態様では、血管インプラントは血管移植片である。別の特定の態様では、血管インプラントは血管ステントである。別の特定の態様では、血管インプラントはラップである。別の特定の態様では、血管インプラントはゲルである。
【００５０】
血管インプラントそのものは、当業者に公知の生体適合性材料から生成できる。例えば、血管移植片はポリ（エチレンテレフタレート）（PETE、DacronTM）またはポリ（テトラフルオロエチレン）、例えば延伸ポリ（テトラフルオロエチレン）（ePTFE）から生成できる。血管ステントはステンレス鋼またはコバルト-クロム合金またはニチノール（nitnol）から生成できる。
【００５１】
ある態様では、血管インプラントとオールトランスレチノイン酸（ATRA）との接触は、生体適合性ポリマー・プレポリマーおよびATRAを含有するナノ粒子、ミクロ粒子、ミセル、またはリポソームを含有する混合物で血管インプラントをコーティングすることを含んでもよい。ATRAは、当業者に公知の標準的な方法を用いて容易にミクロおよびナノ粒子、ミセル、および／またはリポソームに導入することができる。その後、ナノ粒子、ミクロ粒子、ミセル、および／またはリポソームを上記のコーティングした血管インプラントの生体適合性マトリクス中に包埋してもよい。ある態様では、コーティングしたインプラントを固化することができ、例えば真空下で加熱することにより、インプラントの表面上に生体適合性ポリマーおよびATRAを含有するナノ粒子、ミクロ粒子、ミセル、またはリポソームを含有する粘着フィルムを形成させてもよい。インプラントを加熱する際は、包埋されたATRAの分解が起こらないような好適な温度に保持すべきである。例えばインプラントを約40から60℃の温度で約4日間加熱してもよい。
【００５２】
本明細書で使用する「プレポリマー」という用語は、加工して一般にプレポリマーより高い分子量または高い架橋密度を有する粘着ポリマーフィルムまたはマトリクスを形成することができる材料をいう。プレポリマーは、例えば液体、油、シロップとして、または溶液から目的物にコーティングし、更に加工して、例えばコーティングした目的物を重合触媒と加熱または接触させることによって、粘着ポリマーフィルムまたはマトリクスを形成してもよい。プレポリマーの例として、それに限定される訳ではないが、ポリエステル・プレポリマーがある。例えば、ポリエステル・プレポリマーを目的物にコーティングし、加熱によって固化してプレポリマーより高い分子量または高い架橋密度を有する粘着ポリエステルフィルムまたはマトリクスを形成してもよい。
【００５３】
別の態様では、血管インプラントとオールトランスレチノイン酸（ATRA）との接触は、血管インプラントをATRAを含有する溶液に浸漬することを含んでもよい。ATRAは水に易溶ではないが、エタノールには一部溶解し（3 mg/ml）、ジメチルスルホキシド（DMSO）には可溶である。クロロホルムおよびジクロロメタン、生物医学的応用に用いられる生分解性熱可塑性ポリエステルの加工に一般的に使用される溶媒にも可溶である。
【００５４】
別の態様では、血管インプラントとオールトランスレチノイン酸（ATRA）との接触は、血管インプラントを生体適合性ポリマー・プレポリマーでコーティングすること；コーティングした血管インプラントを固化すること；そしてコーティングした血管インプラントをATRAを含有する溶液に浸漬することを含んでもよい。コーティングした血管インプラントの固化は、血管インプラントを（必要により静的または動的真空下で）加熱し、フィルムの架橋または粘着フィルムへの変換（これが血管インプラントの所望の部分を実質的に被覆する）を促進することを含んでもよい。いくつかの態様では、コーティングした血管インプラントをATRAを含有する溶液に浸漬する際、溶液によって生体適合性ポリマー・マトリクスが膨潤する。
【００５５】
別の態様では、血管インプラントとオールトランスレチノイン酸（ATRA）との接触はATRAおよび生体適合性ポリマー・マトリクスを含有する混合物で血管インプラントをコーティングすることを含み、ここで、生体適合性ポリマー・マトリクスは生体適合性熱可塑性ポリマーである。
【００５６】
別の態様では、ATRAおよび生体適合性ポリマーを含有するラップまたはゲルを、上記のようにそれを必要とする患者に移植するための標準的な血管移植片またはステントの少なくとも一部の周囲に配置してもよい。それらのラップおよびゲルは上記のように調製できる。例えば上記のプレポリマーを重合化してラップまたはゲルを提供し、これをATRAを含有する溶液と接触させてATRA含有ラップまたはゲルを得てもよい。あるいはまた、ATRAを含有するプレポリマーを重合化し、ATRA含有ラップまたはゲルを提供してもよい。ラップもしくはゲルをATRAを含有する溶液と接触させた後、血管移植片もしくはステントの少なくとも一部の周囲に配置するか；または、ラップもしくはゲルを血管移植片もしくはステントの少なくとも一部の周囲に配置し、その後、コーティングした血管移植片もしくはステントをATRAを含有する溶液と接触させてもよい。
【００５７】
実施例
実施例１  ポリ（1,8-オクタンジオール-コ-シトレート）（poly(1,8 octanediol-co-citrate)；POC）プレポリマーの合成
等モル量のクエン酸および1,8-オクタンジオールを160℃で撹拌しながら15分間、共融解させる。次いで温度を140℃まで低下させ、混合物を１時間撹拌する。その後、エタノールに溶解してプレポリマーを精製し、水中で沈殿させ、凍結乾燥する。ePTFE移植片の表面を改変するために、POCプレポリマーをエタノールまたは1,3-ジオキソランに10％（w/v）の濃度で溶解する。例えばYang J, Webb AR, Pickerill SJ, Hageman G, Ameer GA. Synthesis and evaluation of poly(diol citrate) biodegradable elastomers. Biomaterials 2006 Mar; 27(9): 1889-98；およびYang J, Webb AR, Ameer GA. Novel citric acid-based biodegradable elastomers for tissue engineering. Adv Mater 2004; 16(6) :511-6（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）参照。
【００５８】
前述のエラストマーの機械的性質は、合成条件（例えば架橋の温度および時間、真空、ジオールの選択、および開始時点のモノマーのモル比）を制御することによって調節できる。ヤング係数は1から16 MPaの範囲であり、破壊における強度およびゆがみはそれぞれ10 MPa以下および500％以下である。合成条件により、総分解時間は数ヶ月から数年の範囲であってもよい。
【００５９】
クエン酸のモル比が増加するほど、その初期の引張強度を犠牲にすることなく、コポリマーの分解速度は増大する。同様に、グリセロール（2.5モル％）を含有させることによって分解を調節することができる。リン酸緩衝液（PBS）中、37℃でのこのグリセロール含有エラストマーの分解は、4ヶ月のインキュベーション後、ほぼ2倍改善された。
【００６０】
実施例２  in vitroにおけるPOCの凝固および炎症特性の評価
再石灰化凝固アッセイ（re-calcification clotting assays）を行って、組織培養ポリスチレンおよびPLGAに対するPOCの凝固速度論を評価した。簡潔に記載すると、96ウェルプレート中の試験およびコントロールポリマーサンプルを、クエン酸デキストロース（ACD）で抗凝固処理したヒトまたはブタ乏血小板血漿（PPP）中でインキュベートした。吸光度測定の直前にCaCl2（0.025 M）を各ウェルに添加し、凝固を開始させた。各ウェルの吸光度を30秒毎に30分間、405nmでモニタリングした。血餅生成速度は、他の物質と比較して、POCに暴露した血漿では一貫して低い（直線領域の傾きはTCP、PLGA、およびPOCでそれぞれ、0.088±0.027、0.089±0.013、および0.025±0.019 A.U./分）。この知見は、POC内のヒドロキシル、カルボキシル、およびキレートする可能性があるクエン酸官能基の存在によって説明しうる。
【００６１】
炎症の可能性を評価するために、ヒト単球THP-1細胞の懸濁液をPOC、TCP、PLGA、およびePTFEフィルムに暴露した。その後、組織因子、IL-6、およびTNF-αの発現をELISAで測定した。リポ多糖（LPS）を細胞に添加して、陽性コントロールとして用いた。結果を表１に示す。
【００６２】
【表１】
2011526818.tif 000002
POCでは、他の物質に比較してこれらのマーカーの有意なアップレギュレーションが惹起されなかった。実際に、POCは組織因子およびIL-6発現に関して、ePTFEより反応性が低かった。
【００６３】
実施例３  POCによるePTFE移植片の改変
改変に先立ち、超音波処理しながら無水エタノール、アセトン中に浸漬し、真空乾燥することにより、標準壁の非伸縮性ePTFE移植片を洗浄した。回転-せん断（spin-shearing）法によってePTFE移植片の内腔をPOC層で機械的にコーティングすることにより改変した。簡潔に記載すると、直径5mmのガラスロッドを1,4-ジオキサン中の10% POCプレポリマー（プレPOC。実施例１）溶液に浸漬し、機械的撹拌機のモーター内に水平に挿入した。プレPOCがコーティングされたガラスロッドを時計回りに300rpmで2分間回転させ、6cm長のePTFE移植片断片を、回転しているロッド上に、同心円状に配した。移植片を手動で反時計回りに2分回転させることにより、移植片の内腔を回転するロッドに対してせん断した。上記の操作が１回のコーティングである。移植片上に堆積するPOCの量（すなわちコーティングの厚さ）を変化させるために上記の操作を３回および６回繰り返し（３回コーティングおよび６回コーティングと記載する）、ポリマー含量の増加に伴うPOC被覆率および移植片コンプライアンスへの影響を評価した。空気乾燥後、プレPOCがコーティングされたePTFE移植片を80℃のオーブンに入れて2日間おき、POC-ePTFE移植片を得た。
【００６４】
キャラクタリゼーションのために、サンプルを1 cm2の断片とした。POC修飾したePTFEサンプルの表面特性の変化を、SEM、液滴（water-in-air）接触角測定、フーリエ変換赤外分光（FTIR）分析、およびX線光電子分光（XPS）分析によって評価した。改変した移植片のコンプライアンスも測定した。移植片のいくつかの部位からサンプリングすることによって、PTFE原線維および結節が均一にコーティングされていることを確認した。POCコーティングの厚さは約2-5ミクロンである。POC-ePTFE対未修飾ePTFEの平衡液滴接触角はそれぞれ36°および120°であった。FTIRおよびXPSにより、移植片内腔にカルボキシルおよびヒドロキシル基が存在することが確認された。POCでの３回コーティングまたは処理では、元の移植片のコンプライアンスへの影響は無かった。６回コーティングではコンプライアンスがわずかに低下したが、これは移植片の原線維-結節微細構造が重度に崩壊されていることで説明しうる。
【００６５】
実施例４  POCによるePTFE移植片の表面改変および薬剤負荷
改変に先立ち、超音波処理しながら無水エタノール中に浸漬し、真空乾燥することにより、標準壁の非伸縮性ePTFE移植片を洗浄した。薬剤を負荷できるPOCを多量にするために、POC注入法を用いた。血管壁を通じたPOCの注入は、移植片の一端をクランプし、POCプレポリマー溶液（実施例１）を血管壁を通して移植片内にポンプ注入して行う。移植片壁を通じてポリマーを注入し、乾燥した後、ePTFE移植片の内腔を回転-せん断法によってPOC層で機械的にコーティングして改変した。
【００６６】
直径5mmのガラスロッドを1,3-ジオキソラン中の10% POCプレポリマー溶液に浸漬し、機械的撹拌機のモーター内に水平に挿入する。プレPOCがコーティングされたガラスロッドを時計回りに300rpmで2分間回転させ、8cm長のePTFE移植片断片を、回転しているロッド上に、同心円状に配置する。移植片を手動で反時計回りに2分間回転させることにより、移植片の内腔を回転するロッドに対してせん断した。上記の操作が１回のコーティングである。３回のコーティングまではコンプライアンスに有意な影響を与えないことが明らかになっているので、合計３回のコーティングを移植片に適用した。コーティングは均一であり、in vivoでの移植の１ヶ月後まで無傷のままである。空気乾燥後、プレPOCコーティングされたePTFE移植片をオーブンに入れて重合化後処理に施与した。
【００６７】
レチノイン酸（ATRA）の用量は薬剤放出速度によって制御されるが、この速度はPOC重合化条件を変化させて水性媒質中での膨潤の程度を変化させることによって制御できる。放出速度を速くするためには、コーティングした移植片を80℃で２日間、重合化する。放出速度を遅くするためには、80℃で更に2日間、重合化させる。あるいはまた、1,12-ドデカンジオールを添加してコーティングを疎水性にすることができる。コーティングした移植片をレチノイン酸／エタノール溶液（3mg/ml）に、暗所において室温で24時間浸漬させることによって、ATRAの負荷と滅菌を同時に行う。移植片をATRA溶液から除去した後、滅菌容器内で凍結乾燥し、ポリマーを崩壊させ、ATRAを取り込ませる。ポリマーフィルムに負荷されたATRAの量は、浸漬後にエタノール溶液中に残存するATRAの濃度を測定することによって、間接的に得られる。溶液中のATRA濃度は350nmで分光光度測定を行い、標準曲線と比較して得られる。
【００６８】
実施例５  ATRAの放出速度論およびPOCの安定性
POCからのレチノイン酸の放出、異性体化、および分解を測定するために、ディスク（直径10mm、厚さ1mm）およびATRAを負荷したPOC-ePTFE移植片断片（長さ1cm、直径6mm）を培養液中に配し、６ヶ月にわたって薬剤放出およびPOC分解をモニタリングした。POCの分解は質量の減少およびSEMによって評価できる。ディスクまたは移植片断片から上清を除去し、フレッシュの培養液で置換する。簡潔に記載すると、種々の時点で培養液から350μLを採取し、50μLの１M 酢酸ナトリウムおよび600μLのアセトニトリルを添加する。ボルテックスおよび遠心分離の後、720μLの上清を2mLのガラス・オートサンプラー・バイアルに240μLの水と共に注入する。反転混合後、バイアルを4℃でオートサンプラーに配し、逆相HPLC（UV-Vis検出器、340nm）を用いて薬剤含量を測定する。
【００６９】
レチノイドは4-オキソ-トランス-レチノイン酸、4-オキソ-シス-レチノイン酸、13-シス-レチノイン酸、およびATRAを外部標準として用いて同定できる。上清のATRA活性を評価してもよい。薬剤を負荷していないPOC-ePTFE移植片およびコーティングしていないePTFE移植片をコントロールとして用いてもよい。また、ATRAを負荷したPOC-ePTFE移植片（長さ9cm、直径6mm）を拍動流回路（１Hz）に配し、in vivoでの動的条件を再現してもよい。細胞培養液を単一パスでかん流させ（200および300ｍL/分；頸動脈および中型の動脈の一般的な流速）、移植片の下流からサンプルを回収する。サンプルのATRA濃度および活性（およびPOC断片化）を評価する。これらの実験により、遠位吻合での（at the distal anastomosis）バルク血流中のATRA濃度、および内皮および平滑筋細胞への影響に関するいくつかの知見が得られる。
【００７０】
実施例６  放出されたATRAの細胞応答
放出されたATRAの活性を、上記のようにブタおよびヒト大動脈平滑筋および内皮細胞を用いて評価する。ヒト大動脈平滑筋細胞（HASMC）および内皮細胞（HAEC）はLonza社（ニュージャージー州アレンデール市）から購入できる。ブタ大動脈平滑筋細胞（PASMC）および内皮細胞（PAEC）はCell Applications社（カリフォルニア州サンディエゴ市）から購入できる。静的（static）および流動薬剤放出実験から回収したサンプルを直接ウェルに添加し、放出されたATRAの細胞への影響（すなわちATRA活性）を評価する。陽性コントロールはDMSOまたはエタノールに溶解したATRAを細胞に添加して行う。これらの実験は、ウェルに直接配したATRA負荷POC-ePTFE移植片断片で行ってもよい（長さ1cm、直径6mm）。
【００７１】
細胞増殖：HASMC、PASMC、HAEC、およびPAECを６ウェルプレートに、5000細胞／cm2の密度で播種する。翌日、細胞をトリプシン処理および遠沈させた後、Picogreen DNAアッセイキット（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド市）を用いて、無傷細胞のベースライン数を測定する。移植片断片をトランスウェル・インサート中の細胞上に配し、Picogreen DNAアッセイを用いて種々の時点で細胞数を測定する。
【００７２】
細胞遊走：平滑筋細胞の遊走を、単独および内皮細胞の存在下で試験する。内皮細胞の非存在下での遊走を試験するために、平滑筋細胞を5000細胞／cm2の密度で６ウェルプレートに播種する。細胞が集密（confluence）になった後、シリコンコーティングしたスティックで培養物を掻き取って0.8mm幅のin vitroの創傷（wound）を得、光度計（CoolSNAP HQ。メリーランド州シルバースプリング市）を搭載したNikon顕微鏡（Nikon Eclipse、TE2000- U）で撮影する。その後、移植片断片を各ウェルに配する。24時間後、移植片を除去し、細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、空隙に侵入した遊走細胞を計数する。空隙から少なくとも６枚の映像を使用し、結果は領域毎の遊走細胞の総数として計数する。内皮細胞存在下での平滑筋細胞の遊走を試験するために、前述のようにトランスフィルター系を調製する。簡潔に記載すると、Nucleoporeポリカーボネート・フィルター（孔径5μm）を内側および外側のポリカーボネート・フレーム間に挿入する。このようにして２つの分離された部分ができ、そこに内皮細胞および平滑筋細胞を播種する。5μmの孔径では、平滑筋細胞は前記のように上部チャンバーから下部チャンバーに移動できる。内皮細胞を5000細胞／cm2の密度でフィルターの下側に播種する。24時間後、平滑筋細胞をフィルターの上側に播種し、下側の部分に移植片断片を添加する。14日間培養後、フィルターの両側の総細胞数を、トリプシン／EDTAで解離させた後にPicogreen DNAアッセイを用いて測定する。細胞の増殖および遊走を全ての実験群間で比較する。上記の実験で示したように、内皮細胞は一度集密に達すると増殖を停止するので、細胞数の増加は平滑筋細胞の増殖および遊走によるものであるはずである。
【００７３】
一酸化窒素放出：内皮細胞を、ATRAに反応して放出される一酸化窒素について試験する。細胞内一酸化窒素を、一酸化窒素生成酵素検出キットを用いて、製造者（Cell Technology社、カリフォルニア州マウンテンビュー市）の説明書に従って測定する。一酸化窒素生成は蛍光強度（励起波長495nm、蛍光波長510nm）で測定することにより判定する。細胞外一酸化窒素生成は酸化窒素分析器（Apollo 4000, World Precision Instruments社、フロリダ州サラソタ市）を用いて評価する。
【００７４】
タンパク質の発現および合成：タンパク質の発現および合成は細胞増殖と同時に測定する。免疫組織化学およびウェスタンブロッティングによって平滑筋α−アクチンおよびミオシン重鎖を分析し、平滑筋細胞の分化を評価する。細胞が細胞外マトリクスをリモデルする能力は、マトリクス・メタロプロテイナーゼ-２およびマトリクス・メタロプロテイナーゼ-９を染色することによって評価する。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼが結合した２次抗体およびUVP Biochemi gel documentation system（UVP社、カリフォルニア州アップランド市）による化学発光検出を用いて検出を行う。コラーゲンおよびエラスチンの合成は、SircolコラーゲンおよびFastinエラスチンアッセイキット（Accurate Chemical社、ニューヨーク州ウェストバリー市）を用いて測定する。
【００７５】
実施例７  外科的移植およびin vivoにおける移植片の評価
移植片は、エタノールに混合したレチノイン酸に浸漬することによる負荷の工程中に滅菌され、滅菌容器に配して凍結乾燥する。通常飼育ブタは、手術前に一晩絶食させるが、水道水は常時摂取可能とする。手術前に動物をブプレノルフィン（0.01mg/kg IM）で鎮痛させ、アセプロマジン（0.15mg/kg IM）およびケタミン（20mg/kg IM）で鎮静させる。挿管後、イソフルラン（0.5-2.0%）を100％酸素と共に送気して維持麻酔を行う。
【００７６】
手順１（頸動脈バイパス移植片）：オスのブタ（30-35kg）の頸動脈に血管移植片移植を行う。頸部正中線切開によって両側の総頸動脈（CCA）を露出させる。CCAを閉塞させる5分前に、ヘパリン（150 U/kg）を静脈内投与する。移植片（6mmの薄壁非伸縮性非環状ePTFE。POCでコーティング。薬剤負荷または未処理）の6cm長の断片を、6-0プリプロピレン縫合糸（stures）を用いて標準的な端側配置において近位および遠位CCAに吻合する。頸動脈を結紮して動脈閉塞をシミュレートする。吻合完了前に、血管をバックブリードさせ（back-bled）、ヘパリン化生理食塩水で洗浄する。吻合完了後、血流を再開し、触診で確認する。頸部切開部を吸収性縫合糸で閉じる。手術後、ヘパリンは投与しない。ブプレネックス（0.005-0.01mg/kg IM）を12時間毎に48時間投与して、術後鎮痛を行う。この処置を左右のCCAで行い、動物毎に２つの移植片を移植する。術前および術後の抗血小板療法として、アスピリン（毎日325mg）を投与する。
【００７７】
手順２（2D血管造影法）：透視下で右側総大腿動脈に経皮挿入し、近位CCAに誘導した6Fシース（sheath）を介して血管造影を行う。10ccの非ヨウ素化造影剤（ビジパークまたはオムニパーク）を用いて両方の頸動脈バイパス移植片の選択的血管造影図を得る。血管造影終了後、ガイドワイヤーおよびカテーテルを除去する。
【００７８】
手順３（MRA）：血管造影の代わりに、核磁気共鳴画像分析（MRA）を用いて移植片の開存性および流動性を評価してもよい。上記のように動物に全身麻酔を行い、ガドリニウムを主成分とする造影剤を静脈内投与してMRA画像を得る。
【００７９】
手順４（超音波断層法）：開存性を評価するために移植片を回収する前に、複式超音波断層法によっても評価し、移植片全体にわたって速度測定（最大収縮期速度（PSV）および拡張終期速度（EDV））を行い、狭窄部位を評価する。PSVが正常な動脈流入速度の２倍を超える場合を有意な狭窄と定義する。移植片の回収後、ペントバルビタールの過剰投与と両側の開胸によって動物を安楽死させる。
【００８０】
実施例８  移植片の加工および分析
各吻合の移植片および隣接する本来の血管の3cm切片を回収し、中央から２つに切断する（遠位および近位標本）。特定の動物では、移植片の切片を縦方向に切開し、撮影し、血栓が存在しない表面積％を測定する。SEMによって形態的評価を行うため、遠位および近位標本からの0.5cm長の移植片切片を2.5%グルタルアルデヒド溶液中で固定する。残りの標本は10%中性緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、切断して5ミクロンの切片とする。
【００８１】
全ての移植片を以下について評価する：ａ）新生内膜過形成（H&E）、細胞増殖（H&E染色、抗Ki67）、および分化（αアクチンおよびミオシン重鎖）；ｂ）コラーゲンおよびエラスチン（それぞれ、マッソン・トリクローム（Masson's trichrome）および改変エラスチン・ワンギーソン（van Gieson）染色）；ｃ）内皮細胞の存在（フォン・ウィルブランド（von Willebrand）およびVE-カドヘリン）；およびｄ）炎症（マクロファージではMAC387抗体、白血球には抗CD45抗体）。また、全ての移植片の切片でSEMを行い、血小板または白血球の接着／活性化および内皮細胞およびPOCの存在／不存在の形態的評価を行う。
【００８２】
組織形態計測的分析：新生内膜過形成の程度を定量するために、各吻合の全体を区分し、各吻合の５つの等間隔の切片で新生内膜過形成を定量評価する。各切片を画像化し、新生内膜領域、中間（medial）領域、内腔領域、および外周をImageJソフトウェア（NIH）で測定する。細胞増殖、炎症、および内皮細胞化を定量するために、切片毎に４つの異なる高倍率視野で、染色陽性の細胞の核を計数する。マクロファージはほとんどが内腔／移植片接合部分に観察されるので、接合部を参照ポイントとして採用する。接合部プラス内腔への250μmおよび移植片の壁への250μmを目的の領域とする。結果の客観的解釈をするために、全ての評価は盲検法で行う。各ブタに移植したPOC移植片およびコントロールePTFE移植片から得たデータを相互に比較する。スチューデントt-検定を用いて統計学的比較を行う。
【００８３】
開存性：移植片の開存性および狭窄の程度を、MRAまたは血管造影、および複式超音波断層法によって非侵襲的に評価し、その後、安楽死および移植片回収を行う。
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月24日(2011.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性ポリマー・マトリクスとオールトランスレチノイン酸（ATRA）とを含有する、新生内膜過形成および／または血栓形成の発生を低減または予防するための血管インプラントであって、血管インプラントが患者に移植されると新生内膜過形成および／または血栓形成を阻害または予防するのに十分な治療的有効量のATRAを放出する、上記血管インプラント。
【請求項２】
血管移植片、血管ステント、またはラップもしくはゲルである、請求項１記載の血管インプラント。
【請求項３】
血管ステントまたは移植片およびラップまたはゲルを含有し、ラップまたはゲルが生体適合性ポリマー・マトリクスおよびATRAを含有し、ラップまたはゲルを血管ステントまたは移植片の少なくとも一部の周囲に配置する、請求項１記載の血管インプラント。
【請求項４】
約0.001から5 mg/生体適合性ポリマー・マトリクス（g）/日の速度でATRAを放出する、請求項１から３のいずれか一項に記載される血管インプラント。
【請求項５】
生体適合性ポリマー・マトリクスに対して約0.001から15重量％のATRAを含有する、請求項１から４のいずれか一項に記載される血管インプラント。
【請求項６】
治療的有効量のATRAが約1日から約12週間の期間放出される、請求項１から５のいずれか一項に記載される血管インプラント。
【請求項７】
生体適合性ポリマー・マトリクスがポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリリン酸エステル、またはそれらの混合物である、請求項１から６のいずれか一項に記載される血管インプラント。
【請求項８】
生体適合性ポリマー・マトリクスがポリ（クエン酸−ジオール）またはポリ（グリセロール−ジアシド）である、請求項１から７のいずれか一項に記載される血管インプラント。
【請求項９】
生体適合性ポリマー・マトリクスがエラストマーまたはゲルである、請求項１から８のいずれか一項に記載される血管インプラント。
【請求項１０】
ミクロ粒子またはナノ粒子がATRAを含有し、ミクロ粒子またはナノ粒子が生体適合性ポリマー・マトリクス中に包埋される、請求項１から９のいずれか一項に記載される血管インプラント。
【請求項１１】
ATRAがミセルまたはリポソームに封入され、ミセルまたはリポソームが生体適合性ポリマー・マトリクス中に包埋される、請求項１から９のいずれか一項に記載される血管インプラント。
【請求項１２】
ATRAが生体適合性ポリマー・マトリクス中に吸収される、請求項１から９のいずれか一項に記載される血管インプラント。
【請求項１３】
ATRAが生体適合性ポリマー・マトリクス中に懸濁または溶解される、請求項１から９のいずれか一項に記載される血管インプラント。
【請求項１４】
改変された血管インプラントを調製する方法であり、以下：
血管インプラントを提供すること；および、
血管インプラントをオールトランスレチノイン酸（ATRA）と接触させて改変された血管インプラントを作製すること
を含み、改変された血管インプラントが生体適合性ポリマー・マトリクスを含有し；そして、改変された血管インプラントが患者に移植されると新生内膜過形成および／または血栓形成を阻害するのに十分な治療的有効量のATRAを放出する、上記方法。
【請求項１５】
接触が生体適合性ポリマー・プレポリマーおよびATRAを含有するナノ粒子、ミクロ粒子、ミセル、またはリポソームを含有する混合物で血管インプラントをコーティングすることを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
生体適合性ポリマー・プレポリマーがポリエステル・プレポリマーである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
接触がATRAを含有する溶液に血管インプラントを浸漬することを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
接触が血管インプラントを生体適合性ポリマー・プレポリマーでコーティングすること；コーティングした血管インプラントを固化すること（setting）；およびコーティングした血管インプラントをATRAを含有する溶液に浸漬することを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
溶液によって生体適合性ポリマー・マトリクスの膨潤が起こる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
接触がATRAおよび生体適合性ポリマー・マトリクスを含有する混合物で血管インプラントをコーティングすることを含み、生体適合性ポリマー・マトリクスが生体適合性熱可塑性ポリマーである、請求項１４記載の方法。
【国際調査報告】
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