(57)【要約】  本発明は、変異ハンチンチンタンパク質を阻害でき、ポリグルタミン誘導性タンパク質凝集を阻害若しくは低減でき、及び／又はハンチンチンタンパク質高次構造を変更できる作用物質を同定するための方法及びアッセイに関し、該阻害は、神経変性疾患、及びより一般的にはタンパク質凝集病の予防、寛解及び／又は治療に有用である。特に、本発明は、ハンチントン病の予防及び／又は治療における使用のための作用物質を同定するための方法及びアッセイを提供する。本発明は、ポリペプチド及び核酸TARGET、並びにこれらのTARGETに基づくsiRNA配列を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異ハンチンチンタンパク質の異常な高次構造又は凝集又は発現を変調させる化合物を同定するための方法であって：
a)化合物を、配列番号27〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること；
b)該ポリペプチドに対する該化合物の結合親和性を測定すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
c)前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、少なくとも10マイクロモラーの結合親和性を呈する化合物と接触させる工程；及び、
d)変異ハンチンチンタンパク質の発現を変調させる化合物を同定する工程；
を追加的に含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリグルタミン高次構造を変調させる化合物を同定するための方法であって：
a)化合物を、配列番号27〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること；
b)該ポリペプチドに対する該化合物の結合親和性を測定すること；
を含む、前記方法。
【請求項４】
c)前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、少なくとも10マイクロモラーの結合親和性を呈する化合物と接触させる工程；及び、
d)ポリグルタミン高次構造を変調させる化合物を同定する工程；
を追加的に含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
変異ハンチンチンタンパク質の発現又は活性を変調させる化合物を同定するための方法であって：
a)化合物を、配列番号27〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること；
b)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害する該化合物の能力を測定すること；
を含む、前記方法。
【請求項６】
c)前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、該ポリペプチドの発現又は活性を著しく阻害する化合物と接触させる工程；及び、
d)変異ハンチンチンタンパク質の発現を変調させる化合物を同定する工程；
を追加的に含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ポリグルタミン高次構造を変調させる化合物を同定するための方法であって：
a)化合物を、配列番号27〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること；
b)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害する該化合物の能力を測定すること；
を含む、前記方法。
【請求項８】
c)前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、該ポリペプチドの発現又は活性を著しく阻害する化合物と接触させる工程；及び
d)ポリグルタミン高次構造を変調させる化合物を同定する工程；
を追加的に含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、インビトロ無細胞調製物にある、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが細胞に存在する、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、前記ポリペプチドを天然に発現する、請求項10又は11記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、該標的を発現するように設計されている、請求項10又は11記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリの化合物、及び配列番号27〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合親和性を有する化合物からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が、ファージディスプレイライブラリ又は抗体断片ライブラリにおけるペプチドである、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１６】
ポリグルタミン高次構造又はハンチンチンタンパク質発現を変調することに効果的な作用物質であって、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉RNA（siRNA）からなる群から選択され、前記作用物質が配列番号1〜26からなる群から選択される核酸配列の約17〜約30の連続するヌクレオチドの天然存在型ポリヌクレオチド配列に相補な又は該配列から設計された核酸配列を含む、前記作用物質。
【請求項１７】
哺乳動物細胞中のベクターが前記作用物質を発現する、請求項16記載の作用物質。
【請求項１８】
ポリグルタミン高次構造アッセイにおいてポリグルタミン確認（confirmation）を変調することに効果的である、請求項16記載の作用物質。
【請求項１９】
前記ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純疱疹ウイルスベクター又はセンダイウイルスベクターである、請求項17記載の作用物質。
【請求項２０】
前記アンチセンスポリヌクレオチド及び前記siRNAがセンス鎖に相補的な17〜25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が配列番号1〜26からなる群から選択される核酸配列の17〜25の連続するヌクレオチドから選択される、請求項16記載の作用物質。
【請求項２１】
前記siRNAが前記センス鎖をさらに含む、請求項20記載の作用物質。
【請求項２２】
前記センス鎖が配列番号53〜78からなる群から選択される、請求項21記載の作用物質。
【請求項２３】
前記siRNAが前記センス及び前記アンチセンス鎖を連結しているループ領域をさらに含む、請求項22記載の作用物質。
【請求項２４】
前記ループ領域が
【化１】
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からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項23記載の作用物質。
【請求項２５】
前記作用物質が、配列番号53〜78からなる群から選択される核酸配列に相補的な核酸配列を含むアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム又はsiRNAである、請求項23記載の作用物質。
【請求項２６】
治療上有効量の請求項16記載の作用物質を、医薬として許容し得る担体との混合物で含む、ハンチンチンタンパク質変調医薬組成物。
【請求項２７】
治療上有効量の請求項16記載の作用物質を、医薬として許容し得る担体との混合物で含む、ポリグルタミン高次構造変調医薬組成物。
【請求項２８】
神経変性を伴う疾患を治療及び／又は予防する方法であって、前記対象に請求項26又は27記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２９】
前記疾患がポリグルタミン病である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患がハンチントン病である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
神経変性を伴う疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における請求項16〜25記載の作用物質の使用。
【請求項３２】
前記疾患がポリグルタミン病である、請求項31記載の使用。
【請求項３３】
前記疾患がハンチントン病である、請求項31又は32記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の背景）
本発明は、ハンチントン病（HD）病理をもたらす過程に関与するタンパク質の発現又は活性を調節できる作用物質を同定するための方法に関する。これらの過程の阻害は、ハンチントン病及び神経変性が関与する他の疾患の予防及び／又は治療に有用である。特に、本発明は、HDの予防及び／又は治療における使用のための作用物質を同定するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の分野)
ハンチントン病（HD）は、常染色体優性遺伝的神経変性疾患であり、線条体及び皮質における神経病理学によって特徴づけられる。HDは、舞踏病様運動及び認知症と関連している進行性の選択的（局所的）神経細胞死を引き起こす。HDのための治療は存在せず、この疾患は通常、臨床徴候の発症から10年以内で早死に至る。HDの再検討のため、出願人は、以下を引用する(Batesの文献, 2005; Tobin及びSignerの文献, 2000; Vonsattelらの文献, 1985; Zoghbi及びOrrの文献, 2000)。
【０００３】
HD患者の脳の神経病理学的分析は、神経変性過程に関係する脳の領域を明らかに証明する（Vonsattelらの文献、1985）。線条体（尾状核）及び皮質は最も深刻に影響を受け、これは、該疾患過程の間に観察される運動及び認識の欠損を説明する。
【０００４】
HDは、「ハンチンチン」又はHDと呼ばれ、染色体4p16.3に位置する遺伝子に存在するCAGトリプレットリピートの長さの増大と関連している。ハンチントン病共同研究グループ（ハンチントン病共同研究グループ、1993）は、IT15（重要な転写産物15）と命名され、後にハンチンチンと呼ばれた「新規な」遺伝子を発見した。該遺伝子は標的領域からクローン化したトラップエキソンを使用して単離され、HD染色体に拡散しかつ不安定である多形トリヌクレオチドリピートを含んだ。正常範囲より長い(CAG)nリピートは、調査した全75の疾患ファミリーからのHD染色体において観測された。該ファミリーは、様々な民族背景に由来し、様々な4p16.3ハプロタイプを示した。 (CAG)nリピートは、広く発現される約348kDの予測されたタンパク質のコード配列の範囲内に位置するが、任意の既知の遺伝子とは無関係であるようである。従って、HD突然変異が、脆弱X症候群、ケネディ症候群及び筋緊張性ジストロフィーを含むいくつかの障害において以前に観察されたものと類似する不安定なDNAセグメントを含むことがわかった。HDの表現型が完全に優位であるという事実は、該障害が、mRNA生成物又は該疾患対立遺伝子のタンパク質生成物がいくつかの新しい特性を有するか又は不適当に発現される機能獲得突然変異から生じることを示唆する。
【０００５】
DiFigliaら（DiFigliaらの文献、1997）は、HDにおける神経変性の機構の理解に寄与した。彼らは、変異ハンチンチンのアミノ末端断片がHDにおいて影響を受けるHD皮質及び線条体の神経核内封入体（NII）及びジストロフィ神経突起（DN）に局在すること、及び、ポリグルタミン長がこれらの構造におけるハンチンチン蓄積の程度に影響することを実証した。細胞内タンパク質分解による処理のためにタンパク質をラベルすることに関与していると考えられるユビキチンもNII及びDNで発見されており、これは、異常なハンチンチンがタンパク質分解の標的とされるが、除去には抵抗性であることを示唆した（DiFigliaらの文献、1997）。変異ハンチンチンの凝集は、HDにおける病原性機構の一部であり得る。
【０００６】
Saudouら（Saudouらの文献、1998）は、変異ハンチンチンが、ハンチントン病に示される神経変性の特徴を再現する細胞モデルの使用により神経変性を誘導することによる機構を調査した。培養線条体ニューロンにトランスフェクトした場合、変異ハンチンチンはアポトーシス機構により神経変性を誘導した。抗アポトーシス化合物又は神経栄養因子は、ニューロンを変異ハンチンチンに対して保護した。変異ハンチンチンの核局在を妨害することは、核内封入体を形成し、神経変性を誘導するその能力を抑制した。しかしながら、封入体の存在は、ハンチンチンにより誘導された死と相関しなかった。封入体の形成を抑制する状態に対する変異ハンチンチントランスフェクト線条体ニューロンの曝露は、変異ハンチンチンにより誘導された死の増加をもたらした。これらの知見は、変異ハンチンチンが神経変性を誘導するために核中で作用することを示唆した。要するに、核内封入体は、ハンチンチン誘導性細胞死に対して保護する細胞機構を反映し得る。
【０００７】
HDにおいて観察される線条体及び皮質におけるニューロンの細胞死のレベルを低下させる方法は、HD患者に臨床的な利益を与える見込みがある。
【０００８】
注目に値する閾値が存在し、HD遺伝子における35リピート以上のポリグルタミンストレッチはHDを引き起こすのに対し、35未満のポリグルタミンリピートのストレッチは疾患を引き起こさない。疾患の閾値とインビトロで凝集するハンチンチンタンパク質の傾向との間の強い相関は、凝集体が病因に関連することを示唆する（Daviesらの文献, 1997; Scherzingerらの文献, 1999）。
【０００９】
タンパク質凝集は、タンパク質の異常な形態、球状中間体、プロト原線維、線維及び顕微鏡封入体を含む、一連の中間段階を付随する（Ross及びPoirierの文献, 2004）。一般的には、1以上のこれらの分子種がHDにおいて毒性を付与すると考えられている。
【００１０】
変異体HDタンパク質の有毒な中間体の発現濃度を低下させる方法は、HD患者に臨床的な利益を与える見込みがあり得る。
【００１１】
（報告された開発）
神経及び幹細胞移植、例えば、成体脳に対する特定の委任（committed）神経芽細胞（胎児性ニューロン）の移植は、神経変性疾患の潜在的治療である。動物実験に励まされ、ハンチントン病の治療のためのヒト胎児性線条体組織移植の臨床試験が、南フロリダ大学ではじめて行われた。この連続試験において、1人の患者が、移植の18ヵ月後に手術とは無関係な原因により死亡した。
【００１２】
細胞死を媒介する機構の活性化が神経学的疾患に関与し得るという事実は、アポトーシス及びカスパーゼを魅力的な治療標的とさせる。HDについてのアポトーシス阻害剤（ミノサイクリン）の臨床試験が進行中である。
【００１３】
様々な成長因子が細胞増殖及び神経発生を誘導することが示されており、これはHDにおける細胞損失を中和し得る（Strandらの文献、2007）。
【００１４】
ポリグルタミン誘導性タンパク質凝集の阻害は、HDなどのポリグルタミン病に対する治療オプションを提供できる。Tanakaらの文献 (Tanakaらの文献, 2004)は、インビトロスクリーニング研究で、様々な二糖類がポリグルタミン媒介性タンパク質凝集を阻害できることを示した。彼らはまた、様々な二糖類がポリグルタミン凝集を減らし、HDの細胞モデルにおいて生存を増加させることを発見した。これらの二糖類で最も有効なトレハロースの経口投与は、大脳及び肝臓のポリグルタミン凝集を減少させ、運動機能不全を改善し、HDのトランスジェニックマウスモデルの寿命を延長させた。Tanakaらの文献 (Tanakaらの文献, 2004)は、これらの有益な影響が、伸長したポリグルタミンに結合し、部分的に開いたポリグルタミン含有タンパク質を安定させるトレハロースの結果であることを示唆した。毒性及び高い可溶性の欠如は、経口投与の有効性と相まって、トレハロースをポリグルタミン病の治療のための治療薬又はリード化合物として有望なものにした。Tanakaらの文献 (Tanakaらの文献、2004)により同定された糖-ポリグルタミン相互作用はそれゆえ、ポリグルタミン病に対する可能的な新しい治療戦略を提供した。
【００１５】
Ravikumarらの文献（Ravikumarらの文献、2004）は、オートファジーを誘導してHDを治療する可能性についての原理の証明を提供するデータを提示した。彼らは、ラパマイシンの哺乳動物標的（mTOR）が、細胞モデル、トランスジェニックマウス及びヒト脳においてポリグルタミン凝集体に隔離されることを示した。このような隔離は、mTORのキナーゼ活性を損ない、変異ハンチンチン断片の主要なクリアランス経路であるオートファジーを誘導する。これは、ポリグルタミン毒性に対し保護する。
【００１６】
ポリグルタミン誘導性タンパク質凝集を含む、タンパク質の高次構造変化に関連する又はそれにより増悪する、症状の寛解、ハンチントン病及び他の疾患の予防及び治療のための化合物並びに作用物質についての必要性が、当該技術分野においてなおも存在する。
【発明の概要】
【００１７】
（本発明の要旨）
本発明は、本明細書中に開示されるTARGETの発現及び／若しくは活性を阻害又は強化する作用物質が、神経細胞において変異（伸長）ハンチンチンタンパク質の毒性高次構造の発現レベルを変調し得るという発見に基づく。特定の態様において、本作用物質は、本明細書中に開示されるTARGETの発現及び／又は活性を阻害する。従って、本発明は、HD病因に関与する経路に関与しているTARGETS、TARGETSの発現及び／又は活性を阻害し得る作用物質のスクリーニング方法、並びにHDなどの神経変性疾患の予防及び／又は治療におけるこれらの作用物質の使用を提供する。本発明は、ポリグルタミン誘導性タンパク質高次構造及び凝集及びハンチンチンタンパク質高次構造に関与しているか又はそうでなければ関連しているTARGETSを提供する。本発明のTARGETSの変調は、特にポリグルタミン誘導性タンパク質凝集及びハンチンチンタンパク質高次構造を含む、タンパク質凝集の変調を提供する。
【００１８】
本発明は、神経細胞において変異ハンチンチンタンパク質の発現又は活性を変調し得る化合物を同定するための方法であって、化合物と配列番号27〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（以下、「TARGETS」）若しくはそれらの断片とを、前記ポリペプチドが前記化合物に結合し得る条件下で接触させること、並びに、ハンチンチンの発現又は活性に関連した化合物-ポリペプチド特性を測定することを含む、前記方法に関する。特定の実施態様において、測定される化合物-ポリペプチド特性は、ハンチンチンタンパク質の発現レベルである。特定の実施態様において、測定される特性は、ポリグルタミンリピートにより媒介されるハンチンチンタンパク質の高次構造及び凝集である。さらに一般的には、本方法は、特にポリグルタミンリピートと関連する、タンパク質高次構造及びタンパク質凝集を変調させる化合物を同定することに関する。
【００１９】
本方法の態様には、TARGET又は配列番号27〜52に記載されるアミノ酸配列であるその断片に対応するポリペプチドを使用する化合物のインビトロアッセイ、並びに、TARGETの阻害後に、例えばTARGETの発現レベル、TARGETの酵素活性及び／又はハンチンチンタンパク質レベルを含む有効性の指標を観測することによる細胞アッセイを含む。
【００２０】
本発明は、以下にも関する：
(1)アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉RNA（siRNA）からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む発現阻害作用物質であって、前記ポリヌクレオチドが、TARGETポリペプチドをコードする天然存在型ポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は該配列から操作された核酸配列を含み、前記ポリヌクレオチド配列が配列番号1〜26からなる群から選択される配列を含む、前記発現阻害作用物質、及び、
(2)ハンチントン病などの神経変性疾患の治療又は予防に有用な前記作用物質を含む医薬組成物。
【００２１】
本発明の別の態様は、神経変性に関連した状態の治療又は予防の方法であって、該状態に苦しむ又はその疑いのある対象に、有効なTARGET-発現阻害量の発現阻害作用物質又は有効なTARGET活性阻害量の活性阻害作用物質を含む医薬組成物を投与することによる、前記方法である。
【００２２】
本発明の別の態様は、神経変性が関与する疾患の治療に有用な治療法、医薬組成物及びそのような組成物の製造における、本明細書中に開示されるTARGETを阻害する作用物質の使用に関する。特に、本方法は、神経細胞死によって特徴づけられる疾患、及び特にハンチンチンタンパク質の異常な凝集によって特徴づけられる疾患の治療におけるTARGETを阻害する作用物質の使用に関する。本作用物質は、神経変性状態、具体的にはタンパク質凝集、特にハンチンチン凝集を減らすか又は制御することが望まれる状態の寛解又は治療に有用である。適切な神経変性状態には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症及び脊髄小脳失調症を含むが、これらに限定されるものではない。具体的実施態様において、疾患は、ポリグルタミン病、例えば限定されるものではないが、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症（SBMA）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPLA）、脊髄小脳失調症1（SCA1）、脊髄小脳失調症2（SCA2）、脊髄小脳失調症3（SCA3）、脊髄小脳失調症7（SCA7）及び脊髄小脳失調症17（SCA17）である。特に、疾患は、ハンチントン病である。他の目的及び利点は、以下に図示する図面と併せて得られる次なる記載を考慮することにより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ad-siRNAハンチンチン高次構造アッセイにおけるプレートの例
【００２４】
【図２】ハンチンチン高次構造アッセイにおける11584のAd-siRNAの一次スクリーニングデータ
【発明を実施するための形態】
【００２５】
(詳細な説明)
下記の用語は、それとともに以下で提示される意味を有することを意図し、本発明の説明及び意図される範囲を理解することに有用である。
【００２６】
用語「作用物質」は、任意の分子を意味し、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、化合物及び小分子を含む。特に、用語作用物質は、試験化合物又は薬剤候補化合物などの化合物を含む。
【００２７】
用語「アゴニスト」は、最も広い意味で、リガンドが結合する受容体を刺激するリガンドをいう。
【００２８】
本明細書中で使用するように、用語「アンタゴニスト」は、受容体に結合すると同時に生物学的応答そのものを引き起こさないが、アゴニスト媒介性応答を遮断若しくは弱め、又はアゴニスト結合を阻止若しくは減少させ、それによりアゴニスト媒介性応答を阻止若しくは減少させる化合物を記載するのに使用される。
【００２９】
用語「アッセイ」は、化合物を含む作用物質の特定の特性を測定するために使用される全ての方法を意味する。「スクリーニングアッセイ」は、化合物のコレクションからそれらの活性に基づいて化合物を特徴づけ又は選択するために使用される方法を意味する。
【００３０】
用語「結合親和性」は、2以上の化合物が非共有結合関係で互いにどれくらい強く会合するかについてを記載する特性である。結合親和性は、質的に（例えば「強い」、「弱い」、「高い」又は「低い」）、又は量的に（KDを測定することなど）特徴づけることができる。
【００３１】
用語「担体」は、医薬組成物の製剤において、医薬組成物に媒質、体積及び／又は使用可能な形態を与えるために使用される非毒性の材料を意味する。担体は、賦形剤、安定剤又は水性pH緩衝液などのそのような材料の1以上を含むことができる。生理的に許容し得る担体の例には、リン酸、クエン酸及び他の有機酸を含む水性若しくは固体緩衝成分；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；EDTAなどのキレート薬；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又は、TWEEN（登録商標）、ポリエチレングリコール（PEG）及びPLURONICS（登録商標）などの非イオン性界面活性剤；を含む。
【００３２】
用語「複合体」は、2つ以上の化合物が互いに結合し、接触し又は会合する場合に作られる実体を意味する。
【００３３】
用語「化合物」は、本発明のアッセイに関連して記載される「試験化合物」又は「薬剤候補化合物」の文脈で、本明細書中において使用される。そのようなものとして、これらの化合物は、有機又は無機化合物を含み、合成又は天然の供給源に由来する。化合物には、ポリヌクレオチド（例えばsiRNA又はcDNA）、脂質又はホルモン類似体などの無機又は有機化合物を含む。他の生体高分子的有機試験化合物には、約2〜約40アミノ酸を含むペプチド、及び約40〜約500アミノ酸を含むより大きなポリペプチドを含み、ポリペプチドリガンド、酵素、受容体、チャネル、抗体又は抗体抱合体を含む。
【００３４】
用語「状態」又は「疾患」は、症状（すなわち、疾病）の顕在化、又は異常な臨床指標（例えば、生化学的指標）の現れを意味する。あるいは、用語「疾患」とは、そのような症状又は異常な臨床指標を発症する遺伝子的若しくは環境的リスク又はその傾向をいう。
【００３５】
用語「接触」又は「接触させること」は、インビトロ系又はインビボ系にかかわらず、少なくとも2つの部分を合わせることを意味する。
【００３６】
用語「ポリペプチドの誘導体」とは、ポリペプチドの隣接アミノ酸残基のストレッチを含み、かつ、タンパク質の生物学的活性を保持するそれらのペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素に関し、例えば、該ポリペプチドの天然存在型形態のアミノ酸配列と比較してアミノ酸突然変異を有するポリペプチドに関する。誘導体は、ポリペプチドの天然存在型形態のアミノ酸配列と比較して、追加的な天然存在型、変更型、グリコシル化、アシル化、若しくは非天然存在型アミノ酸残基をさらに含むことができる。また、誘導体は、ポリペプチドの天然存在型形態のアミノ酸配列と比較して、1以上の非アミノ酸置換基又は異種アミノ酸置換基を含むこともでき、例えば共有結合的若しくは非共有結合的に該アミノ酸配列に結合したレポーター分子又は他のリガンドを含み得る。
【００３７】
用語「ポリヌクレオチドの誘導体」は、ポリヌクレオチドの核酸残基のストレッチを含むDNA分子、RNA分子及びオリゴヌクレオチドに関し、例えば、天然存在型形態のポリヌクレオチドの核酸配列と比較して、核酸突然変異を有し得るポリヌクレオチドに関する。誘導体は、PNA、ポリシロキサン及び2'-O-（2-メトキシ）エチル-ホスホロチオエート、非天然存在型核酸残基などの修飾骨格、又は1以上のメチル-、チオ-、サルフェート、ベンゾイル-、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-及びメタノカルバヌクレオシドなどの核酸置換基又はその検出を容易にするためのレポーター分子をさらに含み得る。
【００３８】
用語「内在性」は、哺乳動物が天然に産生する物質を意味するものとする。用語「酵素」、「プロテアーゼ」、「キナーゼ」又はGタンパク質共役受容体（「GPCR」）に関連しての内在性とは、哺乳動物（例えば、限定ではなく、ヒト）により天然に産生されるものを意味するものとする。対照的に、この文脈における用語非内在性とは、哺乳類（例えば、限定ではないが、ヒト）によって天然に産生されないものを意味するものとする。両方の用語は、インビトロ及びインビボの系の両方を記載するのに利用できる。例えば、限定されるものではないが、スクリーニングアプローチにおいて、内在性又は非内在性のTARGETは、インビトロスクリーニング系に関し得る。さらなる例として、かつ限定としてではなく、哺乳動物のゲノムが非内在性TARGETを含むように操作された場合、インビボ系の手段による候補化合物のスクリーニングは実行可能である。
【００３９】
用語「発現可能な核酸」は、タンパク性分子をコードする核酸、RNA分子又はDNA分子を意味する。
【００４０】
用語「発現」は、内在性発現及び非内在性発現の両方を含み、形質導入による過剰発現を含む。
【００４１】
用語「発現阻害作用物質」は、細胞内で通常発現する特定のポリペプチド又はタンパク質の転写、翻訳及び／又は発現に選択的に干渉するように設計されたポリヌクレオチドを意味する。より具体的には、「発現阻害作用物質」は、特定のポリペプチド又はタンパク質をコードするポリリボヌクレオチド配列内の連続的なヌクレオチドのうち少なくとも約15〜30、特に少なくとも17に同一又は相補的なヌクレオチド配列を含むDNA又はRNA分子を含む。例示的な発現阻害分子には、リボザイム、二本鎖siRNA分子、自己相補一本鎖siRNA分子、遺伝的アンチセンス構築物、及び修飾された安定化骨格を有する合成RNAアンチセンス分子を含む。
【００４２】
用語「ポリヌクレオチドの断片」とは、完全な配列に類似するが必ずしも同一ではない活性を実質的に示す連続的な核酸残基のストレッチを含むオリゴヌクレオチドに関する。特定の態様において、「断片」は、前記完全な配列の核酸配列のうち少なくとも5核酸残基（好ましくは、少なくとも10核酸残基、少なくとも15核酸残基、少なくとも20核酸残基、少なくとも25核酸残基、少なくとも40核酸残基、少なくとも50核酸残基、少なくとも60核酸残基、少なくとも70核酸残基、少なくとも80核酸残基、少なくとも90核酸残基、少なくとも100核酸残基、少なくとも125核酸残基、少なくとも150核酸残基、少なくとも175核酸残基、少なくとも200核酸残基、又は少なくとも250核酸残基）の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドをいうことができる。
【００４３】
用語「ポリペプチドの断片」は、連続するアミノ酸残基のストレッチを含み、かつ完全な配列と類似するが必ずしも同一ではない機能的又は発現活性を実質的に示す、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノマー、サブユニット及び酵素に関する。特定の態様において、「断片」は、前記完全な配列のアミノ酸配列のうち少なくとも5アミノ酸残基（好ましくは、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも15アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、少なくとも25アミノ酸残基、少なくとも40アミノ酸残基、少なくとも50アミノ酸残基、少なくとも60のアミノ残基、少なくとも70アミノ酸残基、少なくとも80アミノ酸残基、少なくとも90アミノ酸残基、少なくとも100アミノ酸残基、少なくとも125アミノ酸残基、少なくとも150アミノ酸残基、少なくとも175アミノ酸残基、少なくとも200アミノ酸残基、又は少なくとも250アミノ酸残基）のアミノ酸配列を含む、ペプチド又はポリペプチドをいうことができる。
【００４４】
用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖と結合する全ての方法を意味する。用語「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的塩基間の水素結合の形成により2つの核酸配列間に形成される複合体をいう。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液において形成でき（例えば、COt又はROt解析）、又は、溶液に存在する1の核酸配列と固相支持体（例えば、紙、膜、フィルタ、チップ、ピン若しくはガラススライド、又は細胞若しくはそれらの核酸が固定された任意の他の適切な基体）に固定される別の核酸配列との間で形成できる。用語「ストリンジェント条件」とは、ポリヌクレオチドと特許請求の範囲に記載のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを許容する条件をいう。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度、温度、及び当該技術分野で周知の他の条件によって規定できる。特に、塩の濃度を低下させること、ホルムアミドの濃度を増加させること、又はハイブリダイゼーション温度を上げることは、ストリンジェンシーを増加させ得る。用語「標準ハイブリダイゼーション条件」とは、ハイブリダイゼーション及び洗浄の両方について5×SSC及び65℃に実質的に等しい塩及び温度条件をいう。しかしながら、当業者は、そのような「標準ハイブリダイゼーション条件」が、緩衝液中のナトリウム及びマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列長及び濃度、ミスマッチ割合、ホルムアミド割合などを含む具体的な条件に依存していることを理解するであろう。また、「標準ハイブリダイゼーション条件」の決定において重要なのは、ハイブリダイズしている2つの配列がRNA-RNA、DNA-DNA又はRNA-DNAのいずれかである。そのような標準ハイブリダイゼーション条件は、周知の公式に従って当業者において容易に決定され、該ハイブリダイゼーションは、典型的には予測又は決定されたTmより10〜20℃低く、必要に応じて、より高いストリンジェンシーの洗浄を伴う。
【００４５】
用語「応答」との関連における用語「阻害」又は「阻害すること」は、応答が、ある化合物の存在下において、該化合物の非存在下とは対照的に、減少するか又は妨げられることを意味する。
【００４６】
用語「阻害」とは、プロセスの減少、下方制御、又はプロセスについての刺激の除去をいい、これはタンパク質若しくはポリペプチドの発現の不在又は最小化をもたらす。
【００４７】
用語「誘導」とは、プロセスの誘導、上方制御又は刺激をいい、これはタンパク質若しくはポリペプチドの発現をもたらす。
【００４８】
用語「リガンド」は、内在性の天然存在型受容体に特異的な内在性の天然存在型分子を意味する。
【００４９】
用語「医薬として許容し得る塩」とは、本明細書中に開示されるTARGETSの発現又は活性を阻害する化合物のうち、非毒性の無機及び有機酸付加塩並びに塩基付加塩をいう。これらの塩は、本発明に有用な化合物の最終的な単離及び精製の間、インサイチュウで調製できる。
【００５０】
用語「ポリペプチド」は、タンパク質（TARGETSなど）、タンパク性分子、タンパク質の断片、重合性タンパク質のモノマー若しくは部分、ペプチド、オリゴペプチド及び酵素（キナーゼ、プロテアーゼ、GPCRのもの、その他など）に関する。
【００５１】
用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖形態の、及びセンス又はアンチセンス方向のポリ核酸、ストリンジェント条件下において特定のポリ核酸にハイブリダイズする相補的ポリ核酸、並びに、その塩基対のうち少なくとも約60パーセントで相同であり、より具体的にはその塩基対の70パーセント、最も具体的には90パーセント、及び特別な実施態様においてはその塩基対の100パーセントが共通であるポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドには、ポリリボ核酸、ポリデオキシリボ核酸及びその合成類似体を含む。また、ペプチド核酸（PNA）、ポリシロキサン、及び2'-O-（2-メトキシ）エチルホスホロチオエートなどの修飾骨格を有する核酸も含む。ポリヌクレオチドは、約10〜約5000塩基、具体的には約100〜約4000塩基、より具体的には約250〜約2500塩基の範囲の長さで変化する配列により記載される。1つのポリヌクレオチドの実施態様には、約10〜約30塩基長を含む。ポリヌクレオチドの特別な実施態様は、約17〜約22ヌクレオチドのポリリボヌクレオチドであり、より一般的には小分子干渉RNA（siRNAs）として記載される（siRNA−二本鎖siRNA分子又は自己相補的一本鎖siRNA分子（shRNA））。別の具体的実施態様は、ペプチド核酸（PNA）、ポリシロキサン、及び2'-O-（2-メトキシ）エチルホスホロチオエートなどの修飾骨格を有する核酸、又は非天然存在型核酸残基、若しくはメチル-、チオ-、サルフェート、ベンゾイル-、フェニル-、アミノ-、プロピル-、クロロ-及びメタノカルバヌクレオシドなどの1以上の核酸置換基、若しくはその検出を容易にするレポーター分子を含む核酸である。本明細書においてポリヌクレオチドは、特定の標的DNA配列とは別の鎖と「実質的に」相補的であるように選択される。これは、該ポリヌクレオチドが、それらそれぞれの鎖とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、該ポリヌクレオチド配列は、該標的配列の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片は、前記ポリヌクレオチドの5'端に付着するとともに、該ポリヌクレオチド配列の残りは該鎖に相補的であることができる。あるいは、非相補的塩基又はより長い配列がポリヌクレオチドに散在できるが、但し、該ポリヌクレオチド配列は、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするか、又は伸長産物の合成用テンプレートを形成する鎖の配列と十分な相補性を有することを条件とする。
【００５２】
用語「予防すること（preventing）」又は「予防（prevention）」とは、病原性作用物質に曝され得る、又は疾患の発病に先立って疾患傾向であり得る対象において、疾患又は障害を発症するか又は発現する危険の低減（すなわち、疾患の臨床症状のうち少なくとも1を発現させない）をいう。
【００５３】
用語「予防（prophylaxis）」は「予防（prevention）」に関連し、疾患を治療し又は治癒させるというよりむしろ予防する（prevent）目的での測定又は手順をいう。予防的測定の非限定的な例には、ワクチンの投与；例えば、不動化による血栓症の危険のある入院患者に対する低分子量ヘパリンの投与；及び、マラリアが風土性である、又はマラリアになる危険が高い地理的領域への訪問に先立つ、クロロキンなどの抗マラリア剤の投与；を含み得る。
【００５４】
用語「溶媒和物」は、本発明に有用な化合物と1以上の溶媒分子との物理的会合を意味する。この物理的会合には、水素結合を含む。特定の場合において、溶媒和物は、例えば1以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に取り込まれる場合に、単離できる。「溶媒和物」は、溶液相及び単離可能な溶媒和物の両方を含む。代表的な溶媒和物には、水和物、エタノラート及びメタノラートを含む。
【００５５】
用語「対象」には、ヒト及び他の哺乳動物を含む。
【００５６】
用語「TARGET」又は「TARGETS」は、本明細書に記載されているアッセイに従って同定され、ハンチントン病表現型の変調に関与していることが決定されたタンパク質を意味する。
【００５７】
「治療上有効量」又は「有効量」は、医師又は他の臨床従事者により探索されている対象の生物学的若しくは医学的応答を誘発する化合物又は作用物質の量を意味する。
【００５８】
用語「治療する」は、障害、疾患又は状態の発現を予防し、又は病理を変化させることにより、そのような障害若しくは状態の1以上の症状を含む障害、疾患又は状態を改善させる意図を持って実施される介入を意味する。従って、「治療する」とは、治療的処置及び予防的（prophylactic）若しくは予防的（preventative）測定をいう。治療することを必要とするものには、既に該障害であるもの、並びに、該障害が予防されるべきものを含む。本明細書に使用される関連用語「治療」とは、先に用語「治療する」で定義したように、障害、症状、疾患又は状態を治療する行為をいう。
【００５９】
任意の疾患若しくは障害の用語「治療する」又は「治療」とは、一実施態様において、疾患又は障害を改善すること（すなわち、疾患を抑えること、又はその臨床症状のうちの少なくとも1つの徴候、範囲又は重篤性を低減すること）をいう。別の実施態様において、「治療する」又は「治療」とは、少なくとも1つの物理的パラメータを改善することをいい、これは対象によっては識別可能でなくてもよい。さらに別の実施態様において、「治療する」又は「治療」とは、物理的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメータの安定化）、又はその両方のいずれかで、疾患又は障害を変調することをいう。さらなる態様において、「治療する」又は「治療」は、疾患の進行を減速させることに関する。
【００６０】
また、用語「ベクター」は、プラスミド、並びに組換えウイルスなどのウイルスベクター、又は組換えウイルスをコード化している核酸に関する。
【００６１】
用語「脊椎動物細胞」は、魚、鳥、爬虫類、両生類、有袋類、及び哺乳動物種を含む、バーテラ（vertera）構造を有する動物由来の細胞を意味する。好ましい細胞は、哺乳動物種由来のものであり、もっとも好ましい細胞は、ヒト細胞である。哺乳動物細胞には、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、マウス及びラットなどのブタマウス（porcine murine）、並びにウサギを含む。
【００６２】
用語「TARGET」又は「TARGETS」は、本明細書に記載されているアッセイに従って同定され、マスト細胞活性化の変調に関与していることが決定されたタンパク質を意味する。用語TARGET又はTARGETSには、選択的種形態、アイソフォーム及びバリアント、例えばスプライスバリアント、対立遺伝子バリアント、フレームエキソンの選択物、及び表1に示されるものなどの公知の若しくは認識されたそのアイソフォーム又はバリアントを含む選択的若しくは中途の終止又は開始部位を含み、かつ意図する。
【００６３】
用語「神経変性状態」又は「神経変性疾患」とは、ニューロンの劣化によって引き起こされる障害をいう。失われるニューロンの正確な位置及び型は、状態間で変化し得る。それは、これらの細胞を異常に機能させ、最終的に該細胞を死に至らしめる当該細胞における変化である。神経変性疾患には、ハンチントン病及び他のポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症 、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症及び血管性認知症を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
用語「ポリグルタミン病」とは、遺伝子内のCAGトリプレットリピート伸長によって引き起こされる優性遺伝的神経変性状態のファミリーをいう。CAGはアミノ酸グルタミンをコードし、その影響を受けたタンパク質はこのアミノ酸トラクト（tract）が増大する。このファミリーには、（限定されるものではないが）ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症（SBMA）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（DRPLA）、脊髄小脳失調症1（SCA1）、脊髄小脳失調症2（SCA2）、脊髄小脳失調症3（SCA3）、脊髄小脳失調症7（SCA7）及び脊髄小脳失調症17（SCA17）を含む。
【００６５】
（TARGETS）
出願人による発明は、神経変性、神経細胞死の治療、予防及び軽減に関し、当該疾患には、例えばハンチントン病、並びに他のポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症 、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症及び血管性認知症を含む。出願人の発明は、さらに、及び特にポリグルタミン誘導性タンパク質凝集及び細胞死の阻害に関する。また本発明は、ハンチンチンタンパク質の発現、高次構造及び／又は凝集の変調に関する。出願人の発明は、ポリグルタミン誘導性タンパク質凝集及びハンチンチンタンパク質高次構造に対するTARGETの関係に部分的に基づく。TARGETは、特に、神経変性及びHDに関連する。
【００６６】
本発明は、特にポリグルタミン誘導性タンパク質凝集又は異常な高次構造を含むタンパク質凝集を変調する薬剤候補化合物をアッセイする方法を提供し、該方法には、化合物を、変異ハンチンチンタンパク質若しくはポリグルタミンを含むそのような他のタンパク質などのタンパク質の凝集形態を発現する細胞と接触させること、及び、該化合物の存在下若しくは不在下における凝集の程度、範囲若しくは量又は凝集媒介性活性若しくは異常な高次構造などの現象を測定することを含む。このような方法を使用してタンパク質凝集において役割を果たし得る標的タンパク質を同定することができ、あるいは、このような方法を使用してタンパク質凝集又は異常な高次構造を変調し得る化合物を同定することができる。例示的な当該方法は、当業者により設計され、測定されることができる。具体的な当該例示的方法は本明細書中に提供される。
【００６７】
本発明は、以下に実施例で記載する選別の結果として同定されるTARGETポリペプチド及びそれらのコード核酸が、ポリグルタミン誘導性タンパク質凝集及びハンチンチンタンパク質高次構造における因子であるという発明者の発見に基づく。TARGETポリペプチド及び／又はそれらのコードポリヌクレオチドの活性若しくは発現の減少は、ポリグルタミン誘導性タンパク質凝集の減少若しくは阻害、並びにハンチンチンタンパク質凝集及びポリグルタミン誘導性の変化したハンチンチンタンパク質高次構造の減少の原因であり、相関し、又は関連する。あるいは、TARGETポリペプチド及び／又はそれらのコードポリヌクレオチドの活性若しくは発現の減少は、ポリグルタミン誘導性タンパク質凝集の強化、並びにハンチンチンタンパク質凝集及びポリグルタミン誘導性の変化したハンチンチンタンパク質高次構造の増加の原因であり、相関し、又は関連する。
【００６８】
本発明の具体的実施態様において、TARGETポリペプチドには、表1に収載される配列番号27〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６９】
【表１】
2011517339.tif 000003
2011517339.tif 000004
2011517339.tif 000005
【００７０】
本発明の特定の実施態様には、配列番号27及び41として同定される輸送体TARGETを含む。本発明の特定の実施態様には、配列番号20として同定されるTARGETを含む。さらなる本発明の特定の実施態様には、配列番号28、31、32、37、45及び50として同定される酵素TARGETを含む。さらなる本発明の特定の実施態様には、配列番号29、30、36、40及び43として同定されるプロテアーゼTARGETを含む。さらなる本発明の特定の実施態様には、配列番号33、47及び51として同定されるキナーゼTARGETを含む。さらなる本発明の特定の実施態様には、配列番号34及び42として同定されるGPCRのTARGETを含む。さらなる本発明の特定の実施態様には、配列番号35、44及び48として同定される受容体TARGETを含む。さらなる本発明の特定の実施態様には、配列番号38として同定されるホスホジエステラーゼ（PDE）TARGETを含む。さらなる本発明の特定の実施態様には、配列番号52として同定される分泌型TARGETを含む。さらなる本発明の特定の実施態様には、配列番号39として同定される交換因子TARGETを含む。さらなる本発明の特定の実施態様には、配列番号49として同定される転写因子TARGETを含む。
【００７１】
一態様において、本発明は、ポリグルタミン誘導性タンパク質凝集又はハンチンチンタンパク質高次構造変化を阻害する薬剤候補化合物をアッセイする方法であって、該化合物を配列番号27〜52のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその断片と、前記ポリペプチドが該化合物と結合し得る条件下で接触させること、及び該ポリペプチドと該化合物との間の複合体の形成を検出することを含む、前記方法に関する。該複合体形成を測定する1つの具体的手段は、前記ポリペプチドに対する前記化合物の結合親和性を決定することである。
【００７２】
より詳細には、本発明は、ポリグルタミン誘導性タンパク質凝集又はハンチンチンタンパク質高次構造変化を阻害する作用物質を同定するための方法であって、(a)哺乳動物細胞集団をTARGETポリペプチド又はその断片に結合親和性を呈する1以上の化合物と接触させること、及び(b) ポリグルタミン誘導性タンパク質凝集又はハンチンチン（huntngtin）タンパク質高次構造変化に関連する化合物-ポリペプチド特性を測定することをさらに含む、前記方法に関する。
【００７３】
さらなる態様において、本発明は、ポリグルタミン誘導性タンパク質凝集又はハンチンチンタンパク質高次構造変化を阻害する薬剤候補化合物をアッセイする方法であって、該化合物を配列番号27〜52のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその断片と、前記化合物が該ポリペプチドの活性若しくは発現を変調し得る条件下で接触させること、及び該ポリペプチドの活性若しくは発現を測定することを含む、前記方法に関する。ポリペプチドの活性又は発現を測定する1つの具体的手段は、抗体などのポリペプチド結合性作用物質を使用して前記ポリペプチドの量を測定すること、又は生物学的若しくは生化学的測定で前記ポリペプチドの活性を測定すること、例えばキナーゼポリペプチドの標的のリン酸化の量を測定することである。
【００７４】
先に言及した化合物-ポリペプチド特性は、TARGETの発現又は活性に関し、当業者により選択される測定可能な現象である。測定可能な特性は、例えば、ポリペプチドTARGETのペプチドドメインに対する結合親和性、又はポリペプチドTARGETの酵素活性、又はポリグルタミン誘導性タンパク質凝集若しくはハンチンチンタンパク質高次構造変化を含む多数の生化学的マーカーの任意の1つのレベルであってよい。
【００７５】
当業者の選択に応じて、本アッセイ法は、一連の測定として機能するように設計でき、そのそれぞれは、薬剤候補化合物が実際に該ポリペプチドの活性若しくは発現に作用し又は媒介しているかどうかを測定し、これによりHD表現型を変調するように設計されている。例えば、ポリペプチド又はその断片に対する化合物の結合親和性を測定するように設計されたアッセイは、必要であり得るが、対象に投与される場合、該試験化合物が、具体的にはポリグルタミン媒介性タンパク質凝集及びHD表現型を含むタンパク質凝集を変調するのに有用であり得るかどうかを確定させる1つの例示的アッセイ又は付加的な若しくはより具体的かつ特異的なアッセイのうちの1つのアッセイであり得る。
【００７６】
適切なコントロールは、偽陽性の読み取りに対する保証として常におくべきである。本発明の具体的実施態様において、スクリーニング方法は、化合物を適切なコントロールに比較する追加的工程を含む。一実施態様において、コントロールは、試験化合物と接触してなかった細胞又はサンプルであり得る。代替的実施態様において、コントロールは、TARGETを発現しない細胞であり得；例えばそのような実施態様の一態様において、試験細胞は天然にTARGETを発現でき、コントロール細胞はTARGETの発現を阻害又は阻止する作用物質（例えばsiRNA）と接触したものであり得る。あるいは、このような実施態様の別の態様において、その天然状態の細胞はTARGETを発現せず、試験細胞はTARGETを発現するように設計されており、その結果この実施態様において、コントロールは形質転換していない天然細胞であり得る。また、コントロールは、神経変性及び／又はタンパク質凝集の公知のメディエータを利用でき、若しくは代替的に利用できる。例示的なコントロールが本明細書に記載されているが、これは限定として捉えられるべきではなく；使用される実験条件について適切なコントロールを選択することは、当業者の範囲内である。
【００７７】
これらの測定をする順序は本発明の実施に重大であると考えられてはおらず、任意の順序で実施できる。例えば、ポリペプチドに対する化合物の結合親和性についての情報が知られていない化合物のセットのスクリーニングアッセイを最初に実施できる。あるいは、ポリペプチドドメインに対し結合親和性を有すると同定された化合物のセット、又はポリペプチドの阻害作用物質であると同定された化合物のクラスを選別できる。しかしながら、薬剤候補化合物の最終的な使用に意味がある本アッセイについては、特にポリグルタミン媒介性タンパク質凝集及び異常な高次構造及びHD表現型を含むタンパク質凝集の変調の測定が好ましい。タンパク質凝集及びHD表現型を測定し、評価し又は決定するための手段は、当業者により選択されることができ、又は決定されることができる。ポリペプチドに結合親和性のコントロール及び測定値、又は本発明のポリペプチドの活性又発現の変調を含む検証研究は、それでもなお、任意の治療的若しくは診断的用途に有用な化合物を同定することに有用である。
【００７８】
技術的に認識された方法及びアッセイに基づく類似のアプローチは、特に異常なタンパク質凝集による神経変性及び／又は神経細胞死により特徴づけられる様々な疾患のいずれかにおけるTARGETS及び化合物に関して適用可能であり得る。アッセイは、TARGETに対し結合親和性を有する試験化合物が、神経変性及び／又は神経細胞死及び／又はポリグルタミン誘導性タンパク質凝集及び／又はハンチンチンタンパク質高次構造変化を阻害することを同定するように設計されていてもよい。そのような方法において、ポリグルタミン高次構造は測定される。
【００７９】
本アッセイ法は、モノマー、重合タンパク質の部分又はサブユニット、ペプチド、オリゴペプチド及びその酵素的に活性な部分を含む、TARGETタンパク質又はその断片の1以上を使用して、インビトロで実施できる。
【００８０】
化合物のポリペプチドTARGETとの結合親和性は、公知技術の方法、例えば、表面プラスモン共鳴バイオセンサ（Biacore（登録商標））を使用すること、標識化合物を用いる飽和結合分析（例えば、スキャッチャード及びリンドモ分析）により、差動UV分光光度計、蛍光分極化アッセイ、蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR（登録商標））システム、蛍光共鳴エネルギー転移及び生体発光共鳴エネルギー転移により測定できる。また、化合物の結合親和性は、解離定数（Kd）で、又はIC50若しくはEC50として表現することもできる。IC50は、該ポリペプチドへの別のリガンドの結合を50%阻害するために要求される化合物の濃度を表す。EC50は、TARGET機能を測定する任意のアッセイにおいて最大効果の50%を得るために必要とされる濃度を表す。解離定数（Kd）は、リガンドがどれくらいよくポリペプチドに結合するかの基準であり、ポリペプチド上の結合部位を正確に半分を飽和させるのに必要とされるリガンド濃度に等しい。高親和性結合を有する化合物は、低いKd、IC50及びEC50値、例えば100nM 〜1pMの範囲を有し；中程度〜低い親和性結合は、高いKd、IC50及びEC50値、例えばマイクロモラーの範囲に関する。
【００８１】
本アッセイ法は、細胞アッセイにおいて実施することもできる。TARGET又はその断片を発現している宿主細胞は、内在性発現を有する細胞、又は例えば形質導入によってTARGETを発現若しくは過剰発現するよう改変された細胞であり得る。ポリペプチドの内在性発現が、容易に測定し得る基線を決定するのに十分でない場合、TARGETを過剰発現する宿主細胞を使用できる。過剰発現は、TARGET基質最終生成物のレベルが内在性発現によって活性レベルよりも高いという利点を有する。したがって、現在利用可能な技術を使用してこのようなレベルを測定することは、より容易である。あるいは、TARGETの非内在性形態を、細胞において発現若しくは過剰発現させることができ、又はスクリーニングにおいて利用できる。
【００８２】
本アッセイ法は、酵素活性を含むがこれに限定されるものではないTARGETポリペプチドの特定の発現又は活性に基づくことができる。従って、配列番号28、31、32、37、45及び50として同定された酵素TARGETについてのアッセイは、酵素活性又は酵素発現に基づくことができる。配列番号29、30、36、40及び43として同定されたプロテアーゼTARGETについてのアッセイは、プロテアーゼ活性又は発現に基づくことができる。配列番号33、47及び51として同定されたキナーゼTARGETについてのアッセイは、プロテアーゼ標的の開裂又は変化を含むがこれらに限定されるものではないプロテアーゼ活性又は発現に基づくことができる。配列番号34及び42として同定されたGPCRのTARGETについてのアッセイは、下流のメディエータ若しくは活性化因子を含むGPCR活性又は発現に基づくことができる。配列番号35、44及び48として同定された受容体TARGETの場合において、アッセイは、受容体結合又は活性に基づくことができる。配列番号38として同定されたホスホジエステラーゼ（PDE）TARGETについてのアッセイは、PDE活性又は発現に基づくことができる。配列番号49として同定された転写因子TARGETについてのアッセイは、転写レポーター活性又はTARGETの発現を利用できる。配列番号39として同定されたヌクレオチド交換因子についてのアッセイは、交換活性を利用できる。配列番号52として同定された分泌型TARGETについてのアッセイは、可溶培地中の活性若しくは発現又は分泌活性を利用できる。測定可能な現象、活性又は特性は、当業者により選択され又は選ばれることができる。当業者は、当該技術分野における知識及び専門知識を使用して、多くのアッセイ様式、システム又は設計のいずれかから選択できる。
【００８３】
本発明者は、本明細書において「Ad-siRNA」と記載するshRNAのライブラリの発現を媒介する組換えアデノウイルスをスクリーニングすることによって、特定の標的タンパク質及びそれらをコードする核酸を同定した。このタイプのライブラリは、siRNA分子が組換えアデノウイルスによって細胞に形質導入されたことの選別であり、そのsiRNA分子は、特定の遺伝子の発現、並びに細胞における対応遺伝子産物の発現及び活性を阻害するか又は抑制する。ウイルスベクターの各siRNAは、特定の天然遺伝子に対応する。変異ハンチンチン高次構造を制御するsiRNA又はshRNAを同定することによって、特定のハンチンチン高次構造を認識する抗体を使用して測定されるように、例えば本明細書実施例に説明するように、直接的な相関を、特異的遺伝子発現と変異ハンチンチン高次構造を変調するための経路との間に描くことができる。ノックダウンライブラリ（本明細書において「TARGET」ポリペプチドとして言及されるそのタンパク質発現生成物）を使用して同定されたTARGET遺伝子は、それから、異常なタンパク質凝集と関連している疾患の治療において使用できる化合物を同定する本発明の方法に使用される。ノックダウン（KD）標的配列、より具体的には本明細書に記載されるAd-siRNA選別において同定された配列は、表2において以下に記載される配列（配列番号53〜78）を含み、表2に収載される配列を含むshRNA化合物は、これらのTARGET遺伝子の発現及び／又は活性を阻害することが本明細書に示されており、本明細書の実施例は、ハンチンチンを含む変異体タンパク質の異常な高次構造又は凝集又は発現を変調する経路におけるTARGETSの役割を確認する。
【００８４】
【表２】
2011517339.tif 000006
【００８５】
表1は、同定されたポリペプチドのクラスを含めて、本明細書の実施例に記載されるアッセイで出願人のノックダウンライブラリを使用して同定されたTARGETSを収載する。TARGETSは、例えば、輸送体、キナーゼ、プロテアーゼ、酵素、受容体、GPCR（受容体のサブクラスとして）、ホスホジエステラーゼ及び薬剤可能な（drugable）／分泌型タンパク質を含むポリペプチドクラスに同定された。
【００８６】
化合物の存在下又は不在下において実施される、キナーゼによる基質のリン酸化を測定することによる、配列番号33、47及び51により表されるTARGETなどのキナーゼの活性を測定する特定の方法は、周知技術である。
【００８７】
ポリペプチド（プロテアーゼ）による基質の開裂を測定することによる、化合物により阻害を測定する特定の方法は、周知技術である。配列番号29、30、36、40及び43により表されるTARGETSは、プロテアーゼである。古典的に、基質は、蛍光基が、標的プロテアーゼにより切断できる基質であるペプチド配列を介してクエンチャに連結されて使用される。リンカーの開裂は、蛍光基及びクエンチャを分離し、蛍光の増加を引き起こす。
【００８８】
Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、エフェクタータンパク質を活性化させることができ、該細胞においてセカンドメッセンジャーレベルの変化を結果的に生じる。配列番号34及び42により表されるTARGETは、GPCRである。GPCRの活性は、当該セカンドメッセンジャーの活性レベルを測定することにより測定できる。細胞における2つの重要かつ有用なセカンドメッセンジャーは、サイクリックAMP（cAMP）及びCa2+である。活性レベルは、ELISA若しくは放射性技術によって又はCa2+と接触した場合に蛍光若しくは発光シグナルを生成する基質を使用することによって直接的に、あるいはレポーター遺伝子アッセイによって間接的に、当業者に公知の方法で測定できる。1以上のセカンドメッセンジャーの活性レベルは、典型的には、該セカンドメッセンジャーに応答するプロモータによって制御されるレポーター遺伝子で測定できる。そのような目的のために当該技術分野で知られかつ使用されるプロモータは、細胞においてサイクリックAMPレベルに応答性であるサイクリックAMP応答性プロモータ、及び細胞の細胞質Ca2+レベルに感受性のNF-AT応答性プロモータである。レポーター遺伝子は、典型的には、容易に検出可能である遺伝子産物を有する。レポーター遺伝子は、宿主細胞において、安定的に感染できるか又は一過性にトランスフェクトできる。有用なレポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、強化型緑色蛍光タンパク質、不安定化緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ及びβ-ガラクトシダーゼである。
【００８９】
上記のように、ポリペプチドを発現している細胞が天然に該ポリペプチドを発現している細胞でもよいこと、又は該細胞が該ポリペプチドを発現するようにトランスフェクトされていてもよいことは理解すべきである。また、細胞は、ポリペプチドを過剰発現させるために形質導入されることができ、又は該ポリペプチドの非内在性形態を発現するようにトランスフェクションされることができ、これを示差的にアッセイ又は評価できる。1つの具体的実施態様において、本発明の方法は、細胞の集団をポリペプチドのアゴニストと接触させる工程をさらに含む。これは、特定の選ばれた細胞集団におけるポリペプチドの発現がその活性の適切な検出に対して低すぎる方法において有用である。アゴニストを使用することにより、ポリペプチドを誘発でき、化合物が該ポリペプチドを阻害するか否かの適切な読み出しを可能にする。
【００９０】
細胞の集団は、異なる手段を介して、例えば培地中で直接インキュベーションすることによって、又は細胞への核酸移送によって、化合物又は化合物の混合物に曝露できる。このような移送は、多種多様な手段によって、例えば裸の単離DNA又はRNAの直接的なトランスフェクションによって、又は組換えベクターなどの送達系によって、達成できる。リポソーム又は他の脂質に基づくベクターなどの他の送達手段を使用することもできる。特に、核酸化合物は、組換えウイルスなどの（組換え）ベクターにより送達される。
【００９１】
ハイスループット目的のために、抗体断片ライブラリ、ペプチドファージディスプレイライブラリ、ペプチドライブラリ（例えば、LOPAP（商標）、Sigma Aldrich）、脂質ライブラリ（BioMol）、合成化合物ライブラリ（例えば、LOPAC（商標）、Sigma Aldrich；BioFocus DPI）又は天然化合物ライブラリ（Specs、TimTec、Bio-Focus DPI）などの化合物のライブラリを使用できる。
【００９２】
特定の薬剤候補化合物は、低分子量の化合物である。例えば500ダルトン以下の分子量を有する低分子量の化合物は、生体システムにおいて良好な吸収及び浸透性を有するようであり、従って500ダルトン超の分子量を有する化合物よりもより成功的な薬剤候補である可能性がある（Lipinskiらの文献、(2001)）。ペプチドには、薬剤候補化合物の別の特定のクラスを含む。ペプチドは優れた薬剤候補であり得、受胎能ホルモン及び血小板凝集阻害剤などの商業的に価値のある複数のペプチドの例がある。天然化合物は、薬剤候補化合物の別の特定のクラスである。当該化合物は天然源において見出されて抽出され、これらはその後、合成できる。脂質は、薬剤候補化合物の別の特定のクラスである。
【００９３】
薬剤候補化合物の別の特定のクラスは、抗体である。本発明は、TARGETに対して指示される抗体を提供する。これらの抗体は、内因的に産生されて細胞内でTARGETに結合でき、又は組織に添加されて細胞外に存在するTARGETポリペプチドに結合できる。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。本発明には、キメラ抗体、単鎖抗体及びヒト化抗体、並びにFabフラグメント及びFab発現ライブラリの製品並びにFv断片及びFv発現ライブラリの産物を含む。別の実施態様において、化合物は、ナノボディ、すなわち天然存在型シングルドメイン抗体の最も小さな機能的断片でもよい（Cortez-Retamozoらの文献、2004）。
【００９４】
ある種の実施態様において、ポリクローナル抗体が、本発明の実施において使用できる。当業者は、ポリクローナル抗体を調製する方法を知っている。ポリクローナル抗体は、哺乳動物において、例えば、1以上の免疫剤、及び必要に応じてアジュバントの注入によって産生できる。典型的には、免疫剤又はアジュバントは、哺乳動物において、複数回の皮下又は腹膜内注射によって注入される。抗体は、完全なTARGETタンパク質若しくはポリペプチドに対して、又は断片、抱合体を含む誘導体、又は細胞膜に埋め込まれているTARGETなどのTARGETタンパク質若しくはポリペプチドの他のエピトープ、又はファージディスプレイライブラリーなどの抗体可変領域のライブラリーに対しても産生できる。
【００９５】
免疫を受ける哺乳動物において免疫原性であることが公知のタンパク質に免疫剤を抱合することは有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及び大豆トリプシン阻害剤を含むが、これらに限定されるものではない。利用できるアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント（一リン酸化リピドA、合成トレハロースジコリノマイコレート（dicorynomycolate））を含む。当業者は、過度の実験なく、免疫プロトコルを選択できる。
【００９６】
いくつかの実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の方法を使用して調製できる。本発明のモノクローナル抗体は、宿主を該抗体に対する免疫応答から回避させるために「ヒト化」できる。「ヒト化抗体」は、相補性決定領域（CDR）及び／又は軽鎖若しくは重鎖可変ドメインフレームワークの他の部分が非ヒト免疫グロブリンに由来するが、該分子の残りの部分は1以上のヒト免疫グロブリンに由来するものである。ヒト化抗体は、ドナー若しくはアクセプタの無修飾軽鎖又はキメラ軽鎖に会合したヒト化重鎖によって特徴づけられる抗体も含み、又はその逆もまた同じである。抗体のヒト化は、当該技術分野において公知の方法により達成できる（例えば、Mark及びPadlan（1994）「第4章．モノクローナル抗体のヒト化」、実験薬学ハンドブック第113巻、Springer-Verlag, New Yorkを参照されたい。）。トランスジェニック動物は、ヒト化抗体を発現させるために使用することができる。
【００９７】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む公知技術のさまざまな技術を使用して産生できる（Hoogenboom及びWinterの文献（1991）J. Mol Biol. 227:381-8；Marksらの文献 (1991) 222:581-97）。Coleら及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる（コールらの文献（1985）モノクローナル抗体及び癌治療「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」、Alan R. Liss、77ページ；Boernerらの文献(1991). J. Immunol., 147(l):86-95）。
【００９８】
単鎖抗体の生産における公知技術は、本発明のTARGETポリペプチド及びタンパク質に対する単鎖抗体を生産するのに適合し得る。抗体は、一価の抗体であり得る。一価の抗体を調製する方法は周知技術である。例えば、1つの方法には、免疫グロブリン軽鎖及び修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、一般に、重鎖架橋結合を予防するために、Fc領域における任意の点で短くされる。あるいは、関連するシステイン残基は、別のアミノ酸残基により置換されるか、又は架橋結合を予防するように削除される。
【００９９】
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に、及び特に細胞表面タンパク質若しくは受容体若しくは受容体サブユニットに結合特異性を有するモノクローナル抗体、特にヒトの又はヒト化されたモノクローナル抗体である。この場合、結合特性のうちの1つは、TARGETの1つのドメインに対するものであり、他の1つは、同じ又は異なるTARGETの別のドメインに対するものである。
【０１００】
二重特異性抗体の生産方法は、公知技術である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の共発現に基づいており、該2つの重鎖は、異なる特異性を有する（Milstein及びCuelloの文献, (1983) Nature 305:537-9）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな取り合わせ（random assortment）のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、10の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じ、そのうちの1つのみが正しい二重特異性構造を備えている。親和性クロマトグラフィ工程は、通常、正しい分子の精製を達成する。同様の手順は、Trauneekerらの文献（1991）EMBO J. 10：3655-9において開示される。
【０１０１】
従って、さらなる実施態様において、本発明は、変異ハンチンチンタンパク質の発現を変調させる化合物を同定するための方法であって：
a)化合物を、配列番号27〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること：
b)該ポリペプチドに対する該化合物の結合親和性を測定すること；
c)前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、少なくとも10マイクロモラーの結合親和性を呈する化合物と接触させること；及び、
d)変異ハンチンチンタンパク質の発現を変調させる化合物を同定すること；
を含む、前記方法に関する。
【０１０２】
一実施態様において、本方法は、ハンチンチンタンパク質の凝集を変調し得る化合物を同定するための手段に関する。
【０１０３】
本発明はさらに、ポリグルタミン高次構造を変調させる化合物を同定するための方法であって：
a)化合物を、配列番号27〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること：
b)該ポリペプチドに対する該化合物の結合親和性を測定すること；
c)前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、少なくとも10マイクロモラーの結合親和性を呈する化合物と接触させること；及び、
d)ポリグルタミン高次構造を変調させる化合物を同定すること；
を含む、前記方法に関する。
【０１０４】
本発明はさらに、変異ハンチンチンタンパク質の発現を変調させる化合物を同定するための方法であって：
a)化合物を、配列番号27〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること：
b)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害する該化合物の能力を測定すること；
c)前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、該ポリペプチドの発現又は活性を著しく阻害する化合物と接触させること；及び、
d)変異ハンチンチンタンパク質の発現を変調させる化合物を同定すること；
を含む、前記方法に関する。
【０１０５】
本発明はさらに、ポリグルタミン高次構造を変調させる化合物を同定するための方法であって：
a)化合物を、配列番号27〜52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること：
b)該ポリペプチドの発現又は活性を阻害する該化合物の能力を測定すること；
c)前記ポリペプチドを発現している哺乳動物細胞の集団を、該ポリペプチドの発現又は活性を著しく阻害する化合物と接触させること；及び、
d)ポリグルタミン高次構造を変調させる化合物を同定すること；
を含む、前記方法に関する。
【０１０６】
本発明の特定の態様において、変異ハンチンチンタンパク質の発現は、ポリグルタミンストレッチの外側の領域に結合することによって該タンパク質を認識する抗体を使用して測定できる。例示的なそのような抗体は、周知技術でありかつ一般公開されており、N18（Santa Cruz, USA）、MW7（Koらの文献、2001）及び4C8（Trottierらの文献、1995a）を含む。
【０１０７】
本発明の特定の態様において、変異ハンチンチンタンパク質の発現は、ポリグルタミンリピートを結合することによって該タンパク質を認識する抗体を使用して測定できる。例示的なそのような抗体は、周知技術でありかつ一般公開されており、3B5H10、EM48（Liらの文献、1999）、MW1、MW2、MW3、MW4及びMW5（Koらの文献、2001）及び1C2（Trottierらの文献、1995b）を含む。
【０１０８】
本発明の特定の態様において、変異ハンチンチンタンパク質高次構造は、ポリグルタミンリピートを結合することによって該タンパク質を認識する抗体を使用して測定できる。本発明の特定の態様において、使用する抗体は、異常な高次構造のポリグルタミンリピートを認識できる。適切な抗体は当業者に公知であり、US 6,291,652に記載されている3B5H10抗体、WO 97/17445に記載されている1C2抗体（該抗体はハンチンチンタンパク質ポリグルタミンリピートに対して指示される。）を含むが、これらに限定されるものではない。ハンチンチン抗体に関するさらなる情報が提供されており、Brooksらの文献, 2004; Imbertらの文献, 1996; Trottierらの文献, 1995bなどの引用文献において詳述されている。
【０１０９】
あるいは、タンパク質凝集の指標である封入体は、凝集が試験されている標識化ハンチンチンタンパク質又は他のタンパク質を使用して同定でき、かつ該封入体は、顕微鏡又は他のそのようなシステムにおける視覚的なスキャンにより認識される。
【０１１０】
別の特定の実施態様によれば、本アッセイ方法は、TARGETに対し結合親和性を有するとして同定され、及び／又は1以上のTARGETに対しアンタゴニスト活性などの活性を下方制御することを有するものとして既に同定されている薬剤候補化合物を使用する。
【０１１１】
候補化合物又は作用物質は、ハンチンチンタンパク質高次構造アッセイにおいて検証又は再選別できる。HD又は他の神経変性疾患を改善し、予防し又は治療する活性を確認する他のアッセイには、神経細胞死アッセイ、アポトーシスについてのアッセイ、及びR6/2（Mangiariniらの文献、1996）及びYAC128（Slowらの文献、2003）などのHD又は神経変性疾患のための動物モデルを含む。
【０１１２】
さらに、本発明は、ハンチントン病表現型を変調させる方法であって、哺乳動物細胞を、配列番号53〜78からなる群から選択されるヌクレオチド配列のうち少なくとも約15〜約30、特に具体的には少なくとも17〜約30、最も具体的には少なくとも17〜約25の連続するヌクレオチドに相補的なポリリボヌクレオチド配列を含む発現阻害作用物質と接触させることを含む、前記方法に関する。
【０１１３】
本発明の別の態様は、ハンチントン病表現型を変調させる方法であって、哺乳動物細胞を、TARGETポリペプチドをコードしているポリリボヌクレオチドの該細胞における翻訳を阻害する発現阻害作用物質と接触させることによることを含む、前記方法に関する。特定の実施態様は、作用物質をTARGET mRNAと対合させ、これによりTARGETポリペプチドの発現を下方制御又は遮断するように機能する、少なくとも1つのアンチセンス鎖を含むポリヌクレオチドを含む組成物に関する。阻害作用物質には特に、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム及び低分子干渉RNA（siRNA）を含み、ここで前記作用物質には、配列番号53〜78からなる群から選択される天然存在型ポリヌクレオチド配列に相補的な、又は該配列から設計される核酸配列を含む。
【０１１４】
本発明の特別な実施態様は、発現阻害作用物質が、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）、配列番号27〜52にコードされるポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号1〜26に対応するポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同な低分子干渉RNA（siRNA、特にshRNA）からなる群から選択され、当該アンチセンスRNA、ODN、リボザイム、特にsiRNA、特にshRNAが、TARGETポリリボヌクレオチドのTARGETポリペプチドへの翻訳に干渉できる方法に関する。
【０１１５】
一実施態様において、TARGETは輸送体であり、従って、該リボザイムは配列番号27又は41をコードするポリヌクレオチドを切断でき、又は該siRNA若しくはshRNAは配列番号1又は15に対応するポリリボヌクレオチドの一部に相同であり、例示的なオリゴヌクレオチド配列には配列番号53及び67を含む。さらなる態様において、TARGETは酵素であり、従って、該リボザイムは配列番号28、31、32、37、45又は50をコードするポリヌクレオチドを切断でき、又はsiRNA若しくはshRNAは配列番号2、5、6、11、19、又は24に対応するポリリボヌクレオチドの一部に相同であり、例示的なオリゴヌクレオチド配列には配列番号54、57、58、63、71及び76を含む。さらなる態様において、TARGETはプロテアーゼであり、従って、該リボザイムは配列番号29、30、36、40又は43をコードするポリヌクレオチドを切断でき、又はsiRNA若しくはshRNAは配列番号3、4、10、14又は17に対応するポリリボヌクレオチドの一部に相同であり、例示的なオリゴヌクレオチド配列には配列番号55、56、62、66及び69を含む。さらなる態様において、TARGETはキナーゼであり、従って、該リボザイムは配列番号33、47又は51をコードするポリヌクレオチドを切断でき、又はsiRNA若しくはshRNAは配列番号7、21又は25に対応するポリリボヌクレオチドの一部に相同であり、例示的なオリゴヌクレオチド配列には配列番号59、73又は77を含む。さらなる態様において、TARGETはGPCRであり、従って、該リボザイムは配列番号34又は42をコードするポリヌクレオチドを切断でき、又はsiRNA若しくはshRNAは配列番号8又は16に対応するポリリボヌクレオチドの一部に相同であり、例示的なオリゴヌクレオチド配列には配列番号60及び68を含む。さらなる態様において、TARGETは受容体であり、従って、該リボザイムは配列番号35、44又は48をコードするポリヌクレオチドを切断でき、又はsiRNA若しくはshRNAは配列番号9、18又は22に対応するポリリボヌクレオチドの一部に相同であり、例示的なオリゴヌクレオチド配列には配列番号61、70及び74を含む。さらなる態様において、TARGETはホスホジエステラーゼ（PDE）であり、従って、該リボザイムは配列番号38をコードするポリヌクレオチドを切断でき、又はsiRNA若しくはshRNAは配列番号12に対応するポリリボヌクレオチドの一部に相同であり、例示的なオリゴヌクレオチド配列には配列番号64を含む。さらなる態様において、TARGETは薬剤可能なタンパク質であり、従って、該リボザイムは配列番号39又は52をコードするポリヌクレオチドを切断でき、又はsiRNA若しくはshRNAは配列番号13又は26に対応するポリリボヌクレオチドの一部に相同であり、例示的なオリゴヌクレオチド配列には配列番号65及び78を含む。さらなる態様において、TARGETは転写因子であり、従って、該リボザイムは配列番号49をコードするポリヌクレオチドを切断でき、又はsiRNA若しくはshRNAは配列番号23に対応するポリリボヌクレオチドの一部に相同であり、例示的なオリゴヌクレオチド配列には配列番号75を含む。
【０１１６】
本発明の別の実施態様は、発現阻害作用物質が、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）、配列番号53〜78に対応するポリリボヌクレオチドを切断するリボザイム、配列番号1〜26に対応するポリリボヌクレオチドの一部に十分に相補的な低分子干渉RNA（siRNA、特にshRNA）を発現する核酸であり、当該アンチセンスRNA、ODN、リボザイム、特にsiRNA、特にshRNAが、TARGETポリペプチドに対するTARGETポリリボヌクレオチドの翻訳に干渉できる方法に関する。具体的には、発現阻害作用物質は、アンチセンスRNA、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド又はsiRNA、特にshRNAであり、配列番号1〜26からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも約17〜約30の連続するヌクレオチドに相補的であるポリリボヌクレオチド配列を含む。より具体的には、発現阻害作用物質は、アンチセンスRNA、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド又はsiRNA、特にshRNAであり、配列番号1〜26からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも15〜約30、具体的には少なくとも17〜約30、最も具体的には少なくとも17〜約25の連続するヌクレオチドに相補的であるポリリボヌクレオチド配列を含む。特別な実施態様には、配列番号53〜78からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に相補的であるポリリボヌクレオチド配列を含む。
【０１１７】
アンチセンス核酸を使用する遺伝子発現の下方制御は、翻訳又は転写レベルで達成し得る。本発明のアンチセンス核酸は、特に、TARGETポリペプチド又はその対応するメッセンジャーRNAをコードしている核酸の全部又は一部とハイブリダイズし得る核酸断片である。加えて、その一次転写産物のスプライシングを阻害することによって、TARGETポリペプチドをコードすることができる核酸配列の発現を減少させるアンチセンス核酸を設計できる。TARGETをコードする核酸の発現を下方制御又は妨害し得る限り、任意の長さのアンチセンス配列が本発明の実施に適している。特に、アンチセンス配列は、少なくとも約15〜30、及び特に少なくとも17ヌクレオチドの長さである。アンチセンス核酸、アンチセンスRNAをコードするDNAの調製及び使用、並びにオリゴ及び遺伝的アンチセンスの使用は公知技術である。
【０１１８】
発現阻害作用物質の一実施態様は、配列番号1〜26を含む核酸に対するアンチセンスである核酸であり、例えば、アンチセンス核酸（例えばDNA）は、インビトロで細胞へと導入でき、又はインビボで配列番号1〜26を含む核酸の細胞性発現を阻害するための遺伝子療法として対象に投与できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約15〜約100ヌクレオチド、より具体的には約15〜約30ヌクレオチド、及び最も具体的には約17〜約25ヌクレオチドを含む配列を含み得る。アンチセンス核酸は、配列番号1〜26の配列から選択され、逆の方向で発現される約15〜約30の連続するヌクレオチドから調製できる。
【０１１９】
当業者は、TARGET及び／又はハンチントン病表現型変調の阻害に有効なアンチセンス核酸及びオリゴヌクレオチドのための選択プロセスを促進及び単純化するためのいくつかの戦略のいずれかを容易に利用できる。mRNA分子におけるオリゴヌクレオチドと相補配列との間の結合エネルギーの予測又は熱力学的指数の計算が利用できる（Chiangらの文献(1991) J. Biol. Chem. 266:18162-18171；Stull らの文献 (1992) Nucl. Acids Res. 20:3501-3508）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、二次構造を基礎として選択できる（Wickstromらの文献(1991) 癌及びAIDSのアンチセンス核酸療法の展望（Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS）中, Wickstrom編, Wiley-Liss社, New York, 7-24頁；Limaらの文献(1992) Biochem. 31:12055-12061）。Schmidt及びThompsonの文献（米国特許6416,951）は、機能的アンチセンス作用物質の同定方法であって、RNAをオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること、並びに、挿入色素の存在下でハイブリダイズさせること若しくは標識を取り込ませること、及び非標識オリゴヌクレオチドの存在下における色素若しくは標識のシグナルの分光特性を測定することによりハイブリダイゼーションの反応速度をリアルタイムで測定することを含む、前記方法を記載する。加えて、当業者により認識される様々な基準を利用する適切なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチセンス標的を予測する様々なコンピュータプログラムのいずれかを利用でき、該基準には例えば、自己相補性の不存在、ヘアピンループの不存在、安定的なホモ二量体及び二量体形成の不存在（kcal/molで予測されたエネルギーにより評価される安定性）を含む。このようなコンピュータプログラムの例は、当業者に容易に利用可能でありかつ知られており、OLIGO 4又はOLIGO 6プログラム(Molecular Biology Insights社, Cascade, CO)並びにOligo Techプログラム(Oligo Therapeutics社, Wilsonville, OR)を含む。加えて、本発明において適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドライブラリ又は核酸分子のライブラリをスクリーニングすること、及び標的RNA又は核酸にハイブリダイズするものについて選択することにより同定できる（例えば米国特許6,500,615を参照）。また、Mishra及びToulmeは、標的を結合するオリゴヌクレオチドの選択的増幅に基づく選択手順を開発した(Mishraらの文献(1994) Life Sciences 317:977-982)。オリゴヌクレオチドは、開裂断片の選択及び特徴づけによって、RNAse Hによる標的RNAの開裂を媒介するそれらの能力により選択することもできる（Hoらの文献(1996) Nucl Acids Res 24:1901-1907；Hoらの文献(1998) Nature Biotechnology 16:59-630）。RNA分子のGGGAモチーフに対するオリゴヌクレオチドの生成及び標的化も記載されている（米国特許6,277,981）。
【０１２０】
アンチセンス核酸は、具体的にはオリゴヌクレオチドであり、完全にデオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、又はある程度の両方の組合せからなることができる。アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、安定性及び／又は選択性を改善するために化学的に修飾できる。本発明について描かれるいくつかの特定のオリゴヌクレオチドの具体的実施態様には、例えば、修飾骨格、例えばホスホロチオエート、リン酸トリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合、又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環糖間結合を含むものを含む。オリゴヌクレオチドは細胞内ヌクレアーゼによって分解されやすいので、該修飾には、例えば、リン酸ジエステル結合の遊離酸素を置き換えるための硫黄基の使用を含むことができる。この修飾は、ホスホロチオエート結合と呼ばれている。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、水溶性、ポリアニオン性で、かつ内在性ヌクレアーゼに耐性である。加えて、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドがそのTARGET部位にハイブリダイズする場合、RNA-DNA二本鎖は内在性酵素リボヌクレアーゼ（RNase）Hを活性化させ、これがハイブリッド分子のmRNA構成要素を切断する。オリゴヌクレオチドは、1以上の置換された糖部分を含むこともできる。特定のオリゴヌクレオチドは、2'位で以下のうちの1つを含む：OH、SH、SCH3、F、OCN、ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；RNA切断基；レポーター基;介在物質（intercalator）；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基；又は、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基及び類似の特性を有する他の置換基。同様の修飾は、オリゴヌクレオチド上の別の部位、特に3'末端ヌクレオチド上の糖の3'位及び5'末端ヌクレオチドの5'位でなすこともできる。
【０１２１】
加えて、ホスホラミダイト及びポリアミド（ペプチド）結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成できる。これらの分子は、ヌクレアーゼ分解に非常に抵抗性であるべきである。さらにまた、化学基を糖部分の2'炭素及びピリミジンの5炭素（C-5）に付加して安定性を強化し、そのTARGET部位へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合を促進することができる。修飾は、2'-デオキシ、O-ペントキシ、O-プロポキシ、O-メトキシ、フルオロ、メトキシエトキシホスホロチオエート、修飾塩基、並びに当業者に公知の別の修飾を含むことができる。
【０１２２】
TARGETSのレベルを低下させる別の種類の発現阻害作用物質は、リボザイムである。リボザイムは、別々の触媒及び基質結合ドメインを有する触媒RNA分子（RNA酵素）である。基質結合配列は、ヌクレオチド相補性、及びおそらくはそのTARGET配列との非水素結合相互作用により結合する。触媒部分は、特定の部位でTARGET RNAを切断する。リボザイムの基質ドメインは、特定のmRNA配列にそれを方向付けるように設計できる。リボザイムは、相補的塩基対を介してTARGET mRNAを認識し、それから結合する。いったん正しいTARGET部位に結合すると、リボザイムは酵素的に作用してTARGET mRNAを切断する。リボザイムによるmRNAの開裂は、対応するポリペプチドの合成を指示するその能力を破壊する。いったんリボザイムがそのTARGET配列を切断すると、リボザイムは放出され、繰り返し他のmRNAに結合して切断することができる。
【０１２３】
リボザイム形態には、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、デルタ型肝炎ウイルス、I型イントロン又はRNaseP RNA（RNAガイド配列を伴う）モチーフ又はアカパンカビ属（Neurospora）VS RNAモチーフを含む。ハンマーヘッド又はヘアピン構造を備えているリボザイムは、これらの触媒RNA分子が細胞内で真核生物プロモータから発現されることができるので、容易に調製される(Chenらの文献(1992) Nucleic Acids Res. 20:4581-9)。本発明のリボザイムは、真核生物細胞において適切なDNAベクターから発現できる。必要に応じて、リボザイムの活性は、第2のリボザイムによる、一次転写産物からのその放出により増大できる（Venturaらの文献(1993) Nucleic Acids Res 21:3249-55）。
【０１２４】
リボザイムは、オリゴデオキシリボヌクレオチドを、転写後にTARGET mRNAにハイブリダイズする配列に隣接するリボザイム触媒ドメイン（20ヌクレオチド）と組み合わせることによって、化学的に合成できる。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、プライマーとして基質結合配列を使用することにより増幅される。増幅産物は、真核生物発現ベクターにクローン化される。
【０１２５】
リボザイムは、DNA、RNA又はウイルスベクターに挿入される転写単位から発現される。リボザイム配列の転写は、真核生物RNAポリメラーゼI（pol(I)、RNAポリメラーゼII（pol II）又はRNAポリメラーゼIII（pol III）のためのプロモータから駆動される。pol II又はpol IIIプロモータからの転写産物は、全ての細胞において高レベルで発現され；所与の細胞種における所与のpol IIプロモータのレベルは、近くの遺伝子制御配列に依存する。原核生物RNAポリメラーゼ酵素が適切な細胞において発現されることを条件として、原核生物RNAポリメラーゼプロモータも使用される（Gao及びHuangの文献 (1993) Nucleic Acids Res. 21:2867-72）。これらのプロモータから発現されるリボザイムが哺乳動物細胞において機能できることが実証された（Kashani-Sabetらの文献(1992) Antisense Res. Dev. 2:3-15)。
【０１２６】
特定の阻害作用物質は、低分子干渉RNA（siRNA、特に低分子ヘアピンRNA「shRNA」）である。siRNA（特にshRNA）は、サイレンスRNA（silenced RNA）に対する配列に相同的な二本鎖RNA（dsRNA）によって、遺伝子サイレンシングの転写後プロセスを媒介する。本発明によるsiRNAは、配列番号1〜26に記載される配列からなる群から選択される配列の連続する17〜25ヌクレオチド配列に相補的な又は相同な15〜30、具体的には17〜30、最も具体的には17〜25ヌクレオチドのセンス鎖、特に配列番号53〜78に記載される配列からなる群から選択される配列、並びに、該センス鎖に相補的な15〜30、具体的には17〜30、最も具体的には17〜25ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含む。最も具体的なsiRNAは、互いに及びTARGETポリヌクレオチド配列に100％相補的であるセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。特に、該siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を連結するループ領域をさらに含む。
【０１２７】
本発明による自己相補一本鎖shRNA分子ポリヌクレオチドには、ループ領域リンカーによって連結されるセンス部分及びアンチセンス部分を含む。特に、ループ領域配列は、4〜30ヌクレオチド長、より具体的には5〜15ヌクレオチド長、及び最も具体的には8又は12ヌクレオチド長である。最も具体的な実施態様において、リンカー配列は
【化１】
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である。自己相補一本鎖siRNAはヘアピンループを形成し、通常のdsRNAより安定である。加えて、それらは、ベクターからより容易に産生される。
【０１２８】
アンチセンスRNAと同様に、siRNAを修飾して核酸分解に対する耐性を確認し、又は活性を強化し、又は細胞分布を強化し、又は細胞取り込みを強化することができ、当該修飾は、修飾されたヌクレオシド結合、修飾された核酸塩基、修飾された糖、及び／又は1以上の部分若しくは抱合体に対するsiRNAの化学結合からなることができる。ヌクレオチド配列は、これらのsiRNA設計規則に従わないヌクレオチド配列に比較してTARGET配列の強化された減少を与えるsiRNA設計規則に従って選択できる（これらの規則に関する議論及びsiRNAの製剤の例については、WO 2004/094636及びUS 2003/0198627が引用により本明細書に組み込まれる。）。
【０１２９】
本発明は、ハンチントン病表現型を変調できるポリヌクレオチドを発現できるDNA発現ベクター、及び発現阻害作用物質として本明細書に先に記載したものを含む組成物及び前記組成物を使用する方法にも関する。
【０１３０】
これらの組成物及び方法の特定の態様は、TARGETポリペプチドと選択的に相互作用し得る細胞内結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの誘導された発現による、TARGETポリペプチドの発現の下方制御又は遮断に関する。細胞内結合タンパク質には、それが発現され、ポリペプチドの機能を中和している細胞において、ポリペプチドと選択的に相互作用又は結合し得る任意のタンパク質を含む。具体的には、細胞内結合タンパク質は、配列番号27〜52のTARGETポリペプチドのエピトープに結合親和性を有する中和抗体又は中和抗体の断片である。より具体的には、細胞内結合タンパク質は単鎖抗体である。
【０１３１】
この組成物の特別な実施態様には、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）、配列番号27〜52をコードするポリリボヌクレオチドを開裂するリボザイム、並びに、siRNAがTARGETポリリボヌクレオチドのTARGETポリペプチドへの翻訳に干渉するように、配列番号1〜26に対応するポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同性である低分子干渉RNA（siRNA）からなる群から選択される発現阻害作用物質を含む。 
【０１３２】
発現阻害作用物質を発現するポリヌクレオチド、又は細胞内でTARGETポリペプチドを発現するポリヌクレオチドは、具体的にはベクターに含まれる。ポリ核酸は、該核酸配列の発現を可能にするシグナルに動作可能的に連結され、特に組換えベクター構築物を利用している細胞に導入され、いったんベクターが該細胞に導入されると該構築物は該核酸又はアンチセンス核酸を発現する。様々なウイルスに基づく系が利用可能であり、該系には、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純疱疹ウイルス又はセンダイウイルスのベクター系を含む。この全ては、TARGET細胞における発現阻害作用物質のためのポリヌクレオチド配列を導入し、発現させるために使用することができる。
【０１３３】
特に、本発明の方法で使用するウイルスベクターは、複製欠損体である。当該複製欠損ベクターは、通常、感染細胞におけるウイルスの複製のために必要である少なくとも1つの領域を含む。これらの領域は、（全体又は一部）除去できるか、又は当業者に公知の任意の技術によっても非機能的にすることができる。これらの技術には、（複製についての）不可欠領域への1以上の塩基の完全な除去、置換、部分的削除又は付加を含む。当該技術は、遺伝子操作技術を使用して、又は突然変異誘導性薬剤での処理により、インビトロで（単離されたDNAで）又はインサイチュウで実行できる。特に、複製欠損ウイルスはそのゲノムの配列を保持し、これはカプシド化、すなわちウイルス粒子のために必要である。
【０１３４】
特定の実施態様において、ウイルス性構成要素は、アデノウイルスに由来する。具体的には、ビヒクルには、アデノウイルスカプシド又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体にパッケージされるアデノウイルスベクターを含む。アデノウイルス生物学は、分子レベルでも比較的周知である。アデノウイルスベクターのための多くのツールが開発されかつ開発され続けており、それゆえアデノウイルスカプシドを本発明のライブラリに組み込むための特定のビヒクルとさせている。アデノウイルスは、多種多様な細胞に感染できる。しかしながら、異なるアデノウイルス血清型は、細胞に対し異なる優先傾向を有する。具体的実施態様において本発明のアデノウイルスカプシドが入ることができるTARGET細胞集団を混合し拡張するために、ビヒクルは、少なくとも2種のアデノウイルス由来のアデノウイルス線維タンパク質を含む。特定のアデノウイルス線維タンパク質配列は、血清型17、45及び51である。これらのキメラベクターの技術又は構築及び発現は、US2003/0180258及びUS2004/0071660において開示され、これらは引用により本明細書に組み込まれる。
【０１３５】
特定の実施態様において、アデノウイルスに由来する核酸には、アデノウイルス後期タンパク質又はその機能的部分、誘導体若しくは類似体をコードしている核酸を含む。アデノウイルス後期タンパク質、例えばアデノウイルス線維タンパク質を好ましく使用して、特定の細胞にビヒクルをTARGETさせることができ、又は該細胞への該ビヒクルの送達の強化を誘導することができる。特に、アデノウイルスに由来する核酸は、基本的に全てのアデノウイルス後期タンパク質をコードし、完全なアデノウイルスカプシド又はその機能的部分、類似体及び／又は誘導体の形成を可能にする。特に、アデノウイルスに由来する核酸には、アデノウイルスE2A又はその機能的部分、誘導体若しくは類似体をコードしている核酸を含む。特に、アデノウイルスに由来する核酸には、少なくとも1つのE4-領域タンパク質又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体をコードしている核酸を含み、それは、少なくとも部分的には、細胞においてアデノウイルス由来核酸の複製を促進する。この用途の例において使用するアデノウイルスベクターは、本発明の治療方法に有用なベクターの典型である。
【０１３６】
本発明の特定の実施態様は、レトロウイルスベクター系を使用する。レトロウイルスは、分裂細胞に感染する組込みウイルス（integrating virus）であり、それらの構造は当該技術分野に公知である。レトロウイルスベクターは、異なる種類のレトロウイルス、例えば、MoMuLV（「マウスモロニー白血病ウイルス」MSV（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、HaSV（「ハービー肉腫ウイルス」）；SNV（「脾臓壊死ウイルス」）；RSV（「ラウス肉腫ウイルス」）及びフレンドウイルスから構築できる。レンチウイルスベクター系を、本発明の実施に使用することもできる。レトロウイルス系及びヘルペスウイルス系は、神経細胞のトランスフェクションのための特定のビヒクルであり得る。
【０１３７】
本発明の他の実施態様において、アデノ随伴ウイルス（「AAV」）が利用される。AAVウイルスは、安定かつ特異的な様式で感染細胞のゲノムに組み込まれる、比較的小さなサイズのDNAウイルスである。該ウイルスは、細胞増殖、形態又は分化に何ら影響を生じさせずに多種多様な細胞に感染することができ、かつヒトの病状に関与していないようである。
【０１３８】
ベクター構築物において、本発明のポリヌクレオチド作用物質は、1以上の調節領域に連結できる。適切な制御領域又は領域の選択は、当業者のレベルの範囲内で日常的事項である。制御領域は、プロモータを含み、かつエンハンサー、サプレッサーなどを含むことができる。
【０１３９】
本発明の発現ベクターにおいて使用できるプロモータは、構成的プロモータ及び制御（誘導可能）プロモータの両方を含む。プロモータは、宿主に応じて原核生物性又は真核生物性であり得る。原核生物（バクテリオファージを含む）プロモータのうち本発明の実施に有用なのは、lac、lacZ、T3、T7、ラムダPr、Pl及びtrpプロモータである。真核生物（ウイルスを含む）プロモータのうち本発明の実施に有用なのは、遍在プロモータ（例えば、HPRT、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、中間径フィラメントプロモータ（例えば、デスミン、神経フィラメント、ケラチン、GFAP）、治療的遺伝子プロモータ（例えば、MDR型、CFTR、第VIII因子）、組織特異的プロモータ（例えば、平滑筋細胞のアクチンプロモータ、又は内皮細胞において活性なFlt及びFlkプロモータ）であり、動物の転写制御領域を含み、該プロモータは組織特異性を呈し、かつトランスジェニック動物において利用されている：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼI遺伝子制御領域（Swiftらの文献(1984) Cell 38:639-46；Ornitzらの文献(1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409；MacDonaldの文献, (1987) Hepatology 7:425-515）；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahanの文献、（1985）Nature 315: 115-22）、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlらの文献(1984) Cell 38:647-58；Adamesらの文献(1985) Nature 318:533-8；Alexanderらの文献(1987) Mol. Cell. Biol. 7:1436-44）、睾丸、乳房、リンパ系及びマスト細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域、（Lederらの文献(1986) Cell 45:485-95）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkertらの文献(1987) Genes and Devel. 1:268-76）、肝臓において活性なα‐フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufらの文献(1985) Mol. Cell. Biol., 5:1639-48；Hammerらの文献(1987) Science 235:53-8）、肝臓において活性なアルファ1-アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyらの文献(1987) Genes and Devel., 1: 161-71）、骨髄細胞において活性なβグロビン遺伝子制御領域（Mogramらの文献(1985) Nature 315:338-40；Kolliasらの文献(1986) Cell 46:89-94）、脳におけるオリゴデンドロサイトにおいて活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadらの文献(1987) Cell 48:703-12）、骨格筋において活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域（Saniの文献, (1985) Nature 314.283-6）、及び、視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Masonらの文献(1986) Science 234:1372-8）。
【０１４０】
本発明の実施において使用できる他のプロモータには、分裂細胞において優先して活性化されるプロモータ、刺激（例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）に応答するプロモータ、テトラサイクリン制御性転写モジュレータ、サイトメガロウイルス最初期プロモータ、レトロウイルスLTRプロモータ、メタロチオネインプロモータ、SV-40プロモータ、E1aプロモータ、及びMLPプロモータを含む。
【０１４１】
さらなるベクター系には、患者へのポリヌクレオチド作用物質の導入を促進する非ウイルス系を含み、例えば、所望の配列をコードしているDNAベクターをリポフェクションによりインビボで導入できる。リポソーム媒介型トランスフェクションによって遭遇する問題点を制限するように設計された合成カチオン脂質を使用して、マーカーをコードしている遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製できる(Felgnerらの文献(1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:7413-7)；Mackeyらの文献 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31；Ulmerらの文献(1993) Science 259:1745-8を参照されたい。）。カチオン脂質の使用は、負に帯電する核酸の封入を促進でき、負に帯電する細胞膜との融合も促進できる（Felgner及びRingoldの文献, (1989) Nature 337:387-8）。核酸の移送のために特に有用な脂質化合物及び組成物は、国際出願公開公報WO 95/18863及びWO 96/17823において、並びに米国特許第5,459,127号において記載されている。インビボにおいて外因性遺伝子を特定の器官に導入するリポフェクションの使用は、特定の実際的利点があり、特定の細胞型にトランスフェクションを指示することは、細胞異質性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に有利である。脂質は、標的化の目的で他の分子に化学的に連結できる。標的化されたペプチド、例えば、ホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、例えば抗体、又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに連結できる。他の分子、例えば、カチオン性オリゴペプチド（例えば、国際出願公開WO 95/21931）、DNA結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際出願公開WO 96/25508）又はカチオン性ポリマー（例えば、国際出願公開WO 95/21931）は、インビボにおいて、核酸のトランスフェクションを促進することに有用である。
【０１４２】
インビボでDNAベクターを裸のDNAプラスミドとして導入することも可能である（米国特許番号5,693,622；5,589,466；及び5,580,859を参照されたい。）。治療目的のための裸のDNAベクターは、当該技術分野において公知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はDNAベクター輸送体の使用により所望の宿主細胞に導入できる（例えば、Wilsonらの文献(1992) J. Biol. Chem. 267:963- 7；Wu及びWuの文献, (1988) J. Biol. Chem. 263:14621-4；1990年3月15日に出願されたHartmutらのカナダ国特許出願番号2,012,311；Williamsらの文献(1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-30を参照されたい。）。受容体媒介型DNA送達アプローチも使用できる（Curielらの文献(1992) Hum. Gene Ther. 3:147-54；Wu及びWuの文献, (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-32）。
【０１４３】
生体適合性組成物は、固体、液体、ゲル又は他の形態であってよい組成物であり、該組成物において本発明の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター又は抗体は、活性型形態、例えば生物活性に影響を及ぼし得る形態で維持される。例えば、本発明の化合物は、TARGETにおけるインバースアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有することができ；核酸は、複製し、メッセージを翻訳し、又はTARGETの相補mRNAにハイブリダイズすることができ；ベクターは、前述のようにTARGET細胞にトランスフェクトして、アンチセンス、抗体、リボザイム又はsiRNAを発現することが可能であり；抗体は、TARGETポリペプチドドメインを結合し得る。
【０１４４】
特定の生体適合性組成物は、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液又はHEPES緩衝液を使用して緩衝化され、塩イオンを含む水溶液である。通常、塩イオンの濃度は、生理的レベルに近い。生体適合性溶液は、安定剤及び防腐剤を含み得る。より具体的な実施態様において、生物学的適合性組成物は、医薬として許容し得る組成物である。当該組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、皮下、及び眼内経路による投与用に製剤できる。非経口投与は、静注、筋内注射、動脈内注射又は注入技術を含むことを意味する。組成物は、要望に応じ、標準的で周知の無毒の生理的に許容し得る担体、アジュバント及びビヒクルを含む用量単位製剤で非経口的に投与できる。
【０１４５】
本組成物発明の具体的実施態様は、ハンチントン病表現型の変調を阻害する医薬組成物であって、前述の発現阻害作用物質の治療上有効量を、医薬として許容し得る担体との混合物で含む、前記医薬組成物である。別の具体的実施態様は、神経変性が関与する状態若しくはその状態への易罹患性の治療又は予防のための医薬組成物であって、有効なポリグルタミン誘導性タンパク質凝集及び／又は変異ハンチンチンタンパク質発現／活性阻害量のTARGETアンタゴニスト若しくはインバースアゴニスト、その医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物又はプロドラッグを、医薬として許容し得る担体との混合物で含む、前記医薬組成物である。本組成物の別の実施態様には、治療上有効量の2以上の発現阻害作用物質又は2以上のポリグルタミン誘導性タンパク質凝集及び／若しくは変異ハンチンチンタンパク質発現／活性阻害作用物質を組合せで含む組成物を含む。
【０１４６】
経口投与のための医薬組成物は、経口投与に適している投与量で、周知の医薬として許容し得る担体を使用して製剤できる。そのような担体は、医薬組成物が、患者による摂取のために、錠剤、ピル、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤されることを可能にする。経口使用のための医薬組成物は、活性化合物を固体の賦形剤と混合すること、結果として生じる混合物を任意に顆粒化すること、及び必要に応じて、適切な助剤を加えた後に顆粒混合物を加工して錠剤又は糖衣錠コアを得ることにより製造できる。適切な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質充填剤であり、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ又は他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴム及びトラガカントゴムなどのゴム；及び、ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質；などである。所望であれば、崩壊剤又は可溶化剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどのその塩を添加してもよい。糖衣錠コアは濃縮砂糖溶液などの適切なコーティングと併せて使うことができ、これはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含むこともできる。染料又は色素は、製品識別のために、又は活性化合物の量（すなわち、投与量）を特徴づけるために、錠剤又は糖衣剤コーティングに添加できる。
【０１４７】
経口的に使用できる医薬製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル、並びにゼラチン、及びグリセロール又はソルビトールなどのコーティングからなる軟らかい密封カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース若しくはデンプンなどの充填剤又は結合剤、タルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、及び任意に安定剤と混合した活性成分を含み得る。軟カプセルにおいて、活性化合物は、安定剤を伴い又は伴わずに、脂肪油、液体又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解又は懸濁できる。
【０１４８】
特定の無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容し得る溶媒又は希釈剤中の溶液又は懸濁液であり得る。医薬として許容し得る担体の例は、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、等張性生理食塩水（例えば、リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム；塩化カルシウム又は塩化マグネシウム、又は当該塩類の混合物）、リンガー溶液、デキストロース、水、滅菌水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせであり、1,3-ブタンジオール及び無菌の不揮発性油が溶媒として又は懸濁媒体として都合に合わせて利用される。合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無刺激不揮発性油を利用できる。オレイン酸などの脂肪酸も、注射可能薬物の製造における使用を見出す。
【０１４９】
本発明の化合物又は組成物は、重合担体、生体分解性又は生体模倣のマトリクス又はスキャフォールド（scaffold）での投与用に組合せることができ又はその中に埋め込むことができる。担体、マトリクス又はスキャフォールドは、組成物が組み込まれかつ発現することを可能にし、細胞の添加によって又は細胞の存在下で適合性である任意の材料であり得る。特に、担体マトリクス又はスキャフォールドは優性的に非免疫原性で、かつ生体分解性である。生体分解性物質の例には、ポリグリコール酸（PGA）、ポリ乳酸（PLA）、ヒアルロン酸、腸線縫合糸材料、ゼラチン、セルロース、ニトロセルロース、コラーゲン、アルブミン、フィブリン、アルギン酸塩、綿、又は他の天然存在型生体分解性材料を含むが、これらに限定されない。投与又は移植の前に、例えば、酸化エチレンで処理することによって、又はγ照射又は電子線での照射によって、マトリクス又はスキャフォールド材料を殺菌することが好ましい場合がある。加えて、多くの他の材料を使用して、スキャフォールド又はフレームワーク構造を形成することができ、以下を含むが、これに限定されるものではない：ナイロン（ポリアミド）、ダクロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物（例えば、ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート（PVC）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE、テフロン）、サーマノックス(thermanox)（TPX）、ポリ乳酸（PLA）、ポリグリコール酸（PGA）及びポリ乳酸-グリコール酸（PLGA）などのヒドロキシ酸のポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、及び様々なポリヒドロキシアルカノエート、並びにこれらの組み合わせ。適切なマトリクスには、重合メッシュ又はスポンジ及び重合ヒドロゲルを含む。具体的実施態様において、マトリクスは、1年未満、より具体的には6ヵ月未満、最も具体的には2〜10週の期間に渡って生体分解性である。ポリマー組成物、並びに製造方法は、分解速度を決定するために使用することができる。例えば、増加量のポリ乳酸とポリグリコール酸とを混合することは、分解時間を減少させる。使用できるポリグリコール酸のメッシュは、例えば外科用品供給会社（例えば、Ethicon、N.J.）から、商業的に得ることができる。一般に、これらのポリマーは、水、緩衝塩溶液又は水性アルコール溶液などの水溶液に少なくとも部分的に溶解性であり、帯電側鎖又はその一価のイオン塩を有する。
【０１５０】
組成物媒体はヒドロゲルでもあり得、これは、薬剤吸収スポンジとして作用し得る親水性ポリアクリル酸ポリマーなどの任意の生物学的適合性若しくは非細胞傷害性ホモポリマー又はヘテロポリマーから調製される。前記の特定のもの、特に、エチレン及び／又は酸化プロピレンから得られるものなどは市販されている。ヒドロゲルは、例えば外科的介入の間、治療される組織の表面上に直接的に堆積できる。
【０１５１】
本発明の医薬組成物の実施態様には、本発明の作用物質をコードする複製欠損組換えウイルスベクター、及びポロクサマーなどのトランスフェクションエンハンサーを含む。ポロクサマーの例はPoloxamer 407であり、これは市販されており（BASF、Parsippany、N.J.）、無毒性の生体適合性ポリオールである。組換えウイルスを含浸したポロクサマーは、例えば外科的介入の間、治療される組織の表面に直接的に堆積することができる。ポロクサマーは、基本的に、ヒドロゲル同じ効果を有すると同時に、より低い粘性を有する。
【０１５２】
活性作用物質は、例えば、界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンにより調製されるマイクロカプセルに取り込むこともできる。当該技術は、レミントンの薬学（1980）第16版、Osol、A編に開示されている。
【０１５３】
徐放製剤を調製できる。徐放製剤の適切な例には、抗体を含んでいる固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、該マトリクスは、成形物品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート）又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸及びγ-エチル-L-グルタミン酸塩の共重合体、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解可能な乳酸-グリコール酸共重合体（例えばLUPRON DEPOT（商標））（乳酸-グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球体）、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーが100日超の間、分子の放出を可能にする一方、特定のヒドロゲルはより短時間の間タンパク質を放出する。カプセル化された抗体が長期間該本体のままの場合、それらは37℃で水分に曝される結果として変性又は凝集する可能性があり、生物活性の損失及び免疫原性の変化の可能性を生じる。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な戦略が考案できる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換を介する分子間S-S結合形成であることを発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾することにより、酸性溶液から凍結乾燥することにより、含水量を制御することにより、適切な添加物を使用することにより、及び特定のポリマーマトリクス組成物を開発することにより成し遂げることが可能である。
【０１５４】
先に定義したように、治療的に有効な用量は、タンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド、又はその抗体、アゴニスト若しくはアンタゴニストのその量を意味し、該症状又は状態を改善する。当該化合物の治療有効性及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬的手順、例えばED50（集団の50%に治療的に有効な用量）及びLD50（集団の50%に致命的な用量）により測定できる。治療効果に対する毒性の用量比は治療指数であり、これは比率LD50/ED50として表現できる。大きな治療指数を示す医薬組成物は特異的である。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータが、ヒト使用のための投与量の範囲を策定する際に使用される。当該化合物の用量は、具体的には、ほとんど又は全く毒性を含まないED50を含む循環濃度の範囲の中にある。投与量は、利用される剤形、患者の感受性及び投与経路により、この範囲の中で変化する。
【０１５５】
任意の化合物について、治療的有効量は、細胞培養アッセイにおいて、又は動物モデル、通常ではマウス、ウサギ、イヌ若しくはブタのいずれかで最初に推定できる。また、動物モデルを使用して、望ましい濃度範囲及び投与経路を達成できる。それから、当該情報を使用して、ヒトでの投与について有用な用量及び経路を決定することができる。正確な投与量は、治療される患者からみて、個々の医師によって選ばれる。投与量及び投与は、十分なレベルの活性成分を提供するか又は所望の効果を維持するように調節される。考慮できる更なる因子には、患者の疾患状態の重篤性、年齢、体重及び性別；食事、治療の所望の継続、投与方法、時間及び投与頻度、薬剤の組合せ、反応感受性及び療法への許容度/応答を含む。長時間作用する医薬組成物は、具体的製剤の半減期及びクリアランス速度に応じて、3〜4日毎に、毎週又は2週に1回投与できる。
【０１５６】
本発明による医薬組成物は、様々な方法によって、対象に投与できる。該医薬組成物は、標的とされた組織に直接的に添加でき、カチオン脂質と複合体を形成でき、リポソーム内に梱包でき、又は、公知技術の他の方法によって標的細胞に送達できる。所望の組織に対する局所的な投与は、直接注入、経皮吸収、カテーテル、注入ポンプ又はステントによってなし得る。DNA、DNA/ビヒクル複合体、又は組換えウイルス粒子は、治療部位に、局所的に投与される。送達の代替的経路には、静注、筋内注射、皮下注入、エアロゾル吸入、経口送達（錠剤又はピル形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹膜内送達及び／又はクモ膜下腔内送達を含むが、これに限定されるものではない。リボザイム送達及び投与の例は、Sullivanらの文献WO 94/02595に提供されている。
【０１５７】
本発明による抗体は、大量瞬時投与のみとして送達でき、長期注入でき、又は大量瞬時投与及び長期注入として両方投与できる。当業者は、タンパク質についてよりも、ポリヌクレオチドについて異なる製剤を利用できる。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、具体的な細胞、条件、位置などに特異的である。
【０１５８】
先に記載したように、組換えウイルスを使用して、本発明に有用なポリヌクレオチド作用物質をコードしているDNAを導入することができる。本発明による組換えウイルスは、通常、約104〜約1014pfuの用量の形態で製剤化され、投与される。AAV及びアデノウイルスの場合、約106〜約1011pfuの用量が特に使用される。用語pfu（「プラーク形成単位」）は、ビリオンの懸濁液の感染力に対応し、適切な細胞培養に感染すること、及びプラーク形成数を測定することにより決定される。ウイルス溶液のpfu力価を測定する技術は、従来技術で十分に文書化されている。
【０１５９】
対象患者に対する本発明の発現阻害作用物質の投与は、自己投与及び別の人による投与の両方を含む。患者は、既存の疾患若しくは医学的状態についての治療を必要としてもよいか、又は骨代謝の障害に影響を受ける疾患及び医学的状態のためのリスクを予防若しくは低下させる予防治療を望んでもよい。本発明の発現阻害作用物質は、対象患者に、経口的に、経皮的に、吸入、注入を介して、経鼻的に、直腸的に、又は徐放製剤を介して送達できる。
【０１６０】
本明細書に記載されている本発明の実施に有用なポリペプチド及びポリヌクレオチドは、溶液において遊離し、固相支持体に固定され、細胞表面に支持され、又は細胞内に位置することができる。本方法を実行するために、TARGETポリペプチド又は化合物のいずれかを固定して、非複合体化形態のポリペプチドからの複合体の分離を促進すること、並びに本アッセイの自動化に適応させることは、実現可能である。TARGETポリペプチドの化合物との相互作用（例えば、結合）は、反応物を含むのに適しているいかなる容器においても達成できる。当該容器の例には、マイクロタイタプレート、試験管及びマイクロ遠心管を含む。一実施態様において、ポリペプチドがマトリクスに結合することを可能にするドメインを付加された融合タンパク質を提供できる。例えば、TARGETポリペプチドは、「His」タグ化され、その後Ni-NTAマイクロタイタプレート上へ吸着されることができ、又は、TARGETポリペプチドを有するProtA融合体をIgGに吸着させ、これをそれから（例えば、35S標識された）細胞可溶化液及び候補化合物と混合し、該混合物を複合体形成に適した条件下（例えば、塩及びpHにつき生理的条件）でインキュベートできる。インキュベーション後、プレートを洗浄して全ての結合していない標識を除去し、マトリクスを固定する。放射能の量は、直接的に測定でき、又は複合体解離後の上清で測定できる。あるいは、複合体はマトリクスから解離でき、SDS-PAGEによって分離され、標準電気泳動的な技術を使用してTARGETタンパク質に結合するタンパク質のレベルがゲルから定量化される。
【０１６１】
マトリクス上のタンパク質を固定する他の技術は、化合物を同定するための方法にも使用できる。例えば、TARGET又は化合物は、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を利用して固定できる。ビオチン化されたTARGETタンパク質分子は、周知技術を使用してビオチン-NHS（N-ヒドロキシ-スクシンイミド）から調製でき（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.）、ストレプトアビジンコートした96ウエルプレート（Pierce Chemical）のウエルに固定できる。あるいは、TARGETSに反応性であるが、TARGETの化合物への結合には干渉しない抗体をプレートのウエルに誘導体化し、TARGETを抗体抱合体によってウエルに捕捉することができる。上述のように、標識化された候補化合物の調製物を、TARGETSを表すプレートのウエルでインキュベートし、該ウエルに捕捉された複合体の量を定量化できる。
【０１６２】
本発明は、以下の図面及び実施例においてさらに実証される。
【実施例】
【０１６３】
緒言において記載したように、変異ハンチンチンの発現及び伸長したハンチンチンタンパク質の異常な高次構造によって引き起こされる細胞死は、HD及び同様の神経変性疾患において観察される神経変性を予防し又は停止させる薬剤の開発のためのエントリポイントとして有用な表現型である。以下のアッセイは、配列されたアデノウイルスshRNA（小さなヘアピンRNA）、アデノウイルスcDNA発現ライブラリ（WO99/64582に記載されている生産及び使用）と組み合わせて使用される場合、化合物又は合成ライブラリは、神経タンパク質の凝集、及び神経変性疾患のニューロンの残存を変調する因子の発見に有用である。
【０１６４】
実施例1には、変異ハンチンチン高次構造の制御因子又は変調因子の同定ためのハイスループットスクリーニング方法の設計及び準備を記載し、かつ本明細書において「ハンチンチン高次構造アッセイ」という。
【０１６５】
実施例2には、ハンチンチン高次構造アッセイにおける11584の「Ad-siRNA」のスクリーニング及びその結果を記載する。このアッセイは、Ad-cDNAなどの過剰発現するタンパク質に基づくアッセイのために容易に利用でき、ここで変異ハンチンチン高次構造又はポリグルタミン誘導性凝集の制御因子又は変調因子は過剰発現するTARGETポリペプチドとして同定された。あるいは、及び、加えて、本発明のTARGETSに基づくアッセイ方法で同定された化合物/作用物質は、ハンチンチン高次構造アッセイにおいて、任意の当該化合物/作用物質の検証において、さらに選別及び評価できる。
【０１６６】
実施例3には、独立に再増殖させた材料を使用する一次ヒットの再選別を記載する。
【０１６７】
実施例4には、TARGETSの遺伝子発現解析を記載する。
【０１６８】
実施例5には、さらにヒットを検証するために使用できる、さらなる「オンターゲット解析」を記載する。
【０１６９】
実施例6には、該ヒットのさらなる確認のために使用できる細胞に基づくアッセイを記載する。
【０１７０】
（実施例１）変異ハンチンチン高次構造の制御因子の同定のためのハイスループットスクリーニング方法の設計及び準備
（ポリグルタミン高次構造アッセイの背景及び原理）
HD遺伝子におけるポリグルタミントラクトの病理学的伸長（35個超のグルタミン）は、異常な高次構造を有するハンチンチンタンパク質を結果的に生じる。変異ハンチンチンに対する様々な異常高次構造-特異抗体が存在しており、変異ハンチンチンの異常高次構造のレベルの変化を検出するために使用できる。
【０１７１】
3B5H10抗体は、US 6,291,652に記載されている。1C2抗体は、WO 97/17445に記載されている。4C8抗体は、（Trottierらの文献、1995a）に記載されている。これらの抗体についての関連文献は、以下のものである：(Brooksらの文献, 2004; Imbertらの文献, 1996; Trottierらの文献, 1995b)。
【０１７２】
3B5H10免疫反応変異ハンチンチンタンパク質のレベルの特定の変化の検出は、変異ハンチンチン高次構造の変調因子を同定するために使用される。
【０１７３】
SilenceSelect（登録商標）コレクションのスクリーニングのために開発されたポリグルタミン高次構造アッセイは、以下の示差的特徴を有する：
1)本アッセイ法は、神経分化するSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞（Biedlerらの文献、1973）で実行するが、任意の他の供給源の初代神経細胞について使用できる。
2)本アッセイは、機能的な遺伝的目的のために配列されたアデノウイルスコレクションを用いての使用のために最適化されている。
3)本アッセイは、化合物又は合成コレクションを選別するための使用に適合させることもできる。
4)本アッセイは、ハイスループットモードで実行できる。
5)本アッセイは、機能的な遺伝的目的のために他のRNA又はDNAコレクション、例えば限定されるものではないが、ドミナントネガティブ（DN）、cDNA又はRNAiコレクションを選別するために適合化することもできる。
【０１７４】
（ポリグルタミン高次構造アッセイのための読み出しの選択）
抗体に基づく検出方法は、ハイスループットスクリーニング（HTS）開発に受け入れられ得る。従って、出願人は、3B5H10抗体を使用する変異ハンチンチンについてのcELISA検出方法を評価することを意図した。
【０１７５】
ヒト神経芽細胞腫細胞株SH-SY5Yは、ATCCから得られる。SH-SY5Y細胞は、細胞培養等級のプラスチックで培養される。SH-SY5Y細胞は、熱不活化し濾過した10%FBS、100単位/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシン及び10mM Hepes緩衝液を含んでいるグルタマックス（glutamax）添加DMEM中、加湿チャンバにおいて37℃、5% CO2で培養する。ハイスループットスクリーニングのために、96ウエルプレートは、100μL/ウエルで、ウエル当たり10,000細胞で播種する。
【０１７６】
翌日、細胞を10μMレチノイン酸で分化させ、4時間後に4μL/ウエルのshRNAライブラリウイルスで形質導入する。
【０１７７】
細胞を終夜培養し、10μMのオールトランスレチノイン酸（tRA）を含む培地で交換した。培地交換の4時間後、該細胞は、4μLの SilenceSelect（登録商標）ライブラリ(BioFocus DPI)で形質導入した。
【０１７８】
毒性高次構造は、伸長したハンチンチンタンパク質Q100-HTT-3kb（Kimらの文献, 1999）を使用して測定される。SH-SY5Y細胞においてQ100-HTT-3kbタンパク質を効率的に発現させるために、レポーターcDNAを合成し、アデノウイルスアダプタプラスミドdE1/dE2A（アデノウイルス遺伝子E1及びE2Aを欠失）にクローン化する。アデノウイルスは、WO99/64582に記載されるように、PERC6.E2Aパッケージ細胞においてヘルパープラスミドpWEAd5AflII-rITR.dE2Aのコトランスフェクションによって、これらのアダプタプラスミドから生じる。
【０１７９】
アデノウイルス形質導入の最適状態を測定するために、Q100-HTT-3kbタンパク質の発現のいくつかの状態が試験される。実験は、細胞当たりウイルス粒子（VPU）により定義されるアデノウイルスベクターの増加した量を使用してSH-SY5Y細胞を形質導入する場合に、実施される。VPUは定量的PCRで測定され、(Maらの文献, 2001)に従い、mL当たりのアデノウイルス粒子として定義される。該細胞のQ100-HTT-3kbタンパク質での形質導入の4日後に、形質導入効率は、本明細書に記載されているアッセイに従って試験される。
【０１８０】
該細胞のライブラリウイルスでのshRNA形質導入の3日後に培地を除去し、SH-SY5Y細胞はハンチンチンウイルス（Q100-HTT-3kb、VPU 2000）で形質導入される。該ウイルスは、10μMレチノイン酸を補充した新鮮培地に懸濁される。
【０１８１】
該アッセイで全てのハンチンチンタンパク質高次構造を捕捉するため、ノックインハンチンチンウイルス形質導入の3日後に、ハンチンチンN18抗体（サンタクルス、米国）を使用してプレートを被覆する。白いマキシソープ（maxisorp）ヌンクプレートは、50μL/ウエルハンチンチンN18抗体溶液（リン酸緩衝食塩水で400ng/mLに希釈された抗体（PBS：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4、pH 7.4）で被覆し、該プレートは封止して16時間、+4℃で保存した。
【０１８２】
プレートのコーティングの1日後に、該プレートは、100μL/ウエルのリン酸緩衝食塩水（PBS：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4、pH 7.4）で1回洗浄し、100μL/ウエルブロッキング溶液（リン酸緩衝食塩水（PBS：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4、pH 7.4）、1% 無脂肪粉ミルク、3% ウシ血清アルブミン、及び0.2% Tween-20）を用いて室温で1時間ブロッキングする。同時に、細胞は、100μL/ウエル溶解緩衝液（0.2% EDTA、10mM トリス-HCl、100mM NaCl及び1% NP40をプロテアーゼ阻害剤（0.03mg/mL 膵臓抽出物、0.003mg/mL プロナーゼ、0.0008mg/mL サーモリシン、0.0015mg/mL ケモトリプシン、0.0002mg/mL トリプシン、1.0mg/mL パパイン）とともに含むリン酸緩衝食塩水（PBS：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4、pH 7.4））で溶解させる。プレートを封止し、+4℃で30分間インキュベートする。
【０１８３】
30分後、ブロッキング溶液をプレートから除去し、溶解した細胞の全てをプレートに転写する。プレートをそれから封止し、+4℃で16時間インキュベートする。
【０１８４】
その後、プレートを3回洗浄する：100μL/ウェルのリン酸緩衝食塩水（PBS：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4、pH 7.4）、インキュベーション時間の後15分間。特定の毒性ハンチンチン高次構造は、ブロッキング溶液（リン酸緩衝食塩水（PBS：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4、pH 7.4）、1% 無脂肪粉ミルク、3% ウシ血清アルブミン及び0.2% Tween-20）に400ng/mLまで希釈された抗ポリグルタミンクローン3B5H10抗体を使用することにより検出する。プレートは、50μL/ウエルの3B5H10抗体溶液を用い、1時間室温にてインキュベートする。
【０１８５】
このアッセイについて、セイヨウワサビペルオキシドで標識した抗マウス二次抗体が、検出系のために使用される。プレートは、100μL/ウエルのリン酸緩衝食塩水（PBS：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4、pH 7.4）15分間で3回洗浄する。ヤギ抗マウスIgG/IgM HRP標識抗体は、ブロッキング溶液（リン酸緩衝食塩水（PBS：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4、pH 7.4）、1% 無脂肪粉ミルク、3% ウシ血清アルブミン及び0.2% Tween-20）で800ng/mLに希釈される。抗体とのインキュベーションは、50μL/ウエルを使用して室温で実施する。1時間のインキュベーションの後、該プレートは、100μL/ウエルのリン酸緩衝食塩水（PBS：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4、pH 7.4）で15分間洗浄する。
【０１８６】
BM化学発光ELISA基質［POD、ロシュ］（ルミノール）が、ELISA読み出しのための検出試薬として使用される。予め15分前に試薬Bを試薬Aで100倍希釈し、さらなる使用まで混合する。基質をプレートに添加し（50μL/ウエル）、2分のインキュベーション後、発光をマルチラベルプレートリーダー（Perkin-Elmer Envision 2102）で測定する。各ウエルは、発光フィルタを使用して400〜700nmで1秒間読み込まれる。
【０１８７】
（実施例２）ハンチンチン高次構造アッセイにおける11584の「Ad-siRNA」のスクリーニング
その開発が実施例1に記載されているハンチンチン高次構造アッセイを使用して、レチノイン酸で分化させた神経芽細胞腫細胞におけるshRNAの発現を媒介している11584の異なる組換えアデノウイルスの配列されたコレクションに対して選別することができる。これらのshRNAは、RNA干渉（RNAi）として公知の機構によって、相同配列を含む遺伝子の発現レベルの減少を引き起こす。配列されたコレクションに含まれる11584のAd-siRNAは、5119の異なる転写産物を標的とする。平均して、全ての転写産物は、2〜3の独立したAd-siRNAによって標的とされる。
【０１８８】
全てのAd-siRNAプレートは、SilenceSelect（登録商標）アデノウイルスコレクションと同じ条件下で産生されるコントロールウイルスを含む。該ウイルスには、3セットのネガティブコントロールウイルス(N1 (Ad5-empty_KD))、N2 (Ad5-Luc_v13_KD)、N3 (Ad5-mmSrc_v2_KD))を、ポジティブコントロールウイルス(P1 (Ad5-AHSA2_v2_KD)、P2 (Ad5-NOS2A_v1_KD)、P3 (Ad5- HIF1A_v2_KD)、P4 (Ad5-HSPCB_v15_KD)及びP5 (Ad5-HDAC9_v3_KD))と共に含む。ウイルスプレートの全ウエルは、150μLのウイルス粗溶解物を含む。上記のスクリーニングプロトコルで試験されるプレートの性能の代表例は、図1に示される。この図において、プレート上の組換えアデノウイルスごとにアッセイを実施することで検出される3B5H10 ELISAシグナルは、該サンプルの中央値上に、該サンプルの四分位範囲の倍数で示される。四分位範囲（IQR）の使用は、非常に大きいダイナミックレンジ（約100倍）を有するアッセイで二回反復サンプルのより良好な比較を許容するために、標準偏差上で選択される。3B5H10 ELISAシグナルの値がカットオフ値（Ad-siRNA抑制因子のサンプルの中央値上のサンプルの四分位範囲の1.5倍として定義され、Ad-siRNA活性化因子について+3）を超える場合、Ad-siRNAウイルスはヒットとして記される。合計222のAd-siRNAヒットは、抑制因子の閾値未満のスコアで単離された。合計331のAd-siRNAヒットは、活性化因子の閾値を上回るスコアで単離された。
【０１８９】
図2では、ポリグルタミン高次構造アッセイにおけるSilenceSelect（登録商標）コレクションのスクリーニングで得られた全てのデータ点が示される（Ad-siRNA）。
【０１９０】
（実施例３）独立的再増殖材料を使用する一次ヒットの再選別
ポリグルタミン高次構造アッセイにおいて同定されたAd-siRNAの結果を確認するために、以下のアプローチをとることができる：Ad-siRNAヒットは、96ウエルプレートレベルのPerC6細胞（Crucell, Leiden, The Netherlands）を使用して再増殖させ、その後にポリグルタミン高次構造アッセイで再試験する。はじめに、同定されたヒットAd-siRNAのサンプルの粗溶解物を含んでいる管をSilenceSelect（登録商標）コレクションから取り、ネガティブ/ポジティブコントロールと共に96ウエルプレートにおいて再編成する。管はバーコードでラベルされ（Screenmates（商標）、Matrix technologies）、品質チェックは再編成されたプレートで実施される。再編成されたヒットウイルスを増殖させるために、非熱不活性化された10%FBSを含む200μLのDMEM中の40.000個のPerC6.E2A細胞を96ウエルプレートの各々に播種し、10% CO2の加湿インキュベータ内で39℃で終夜インキュベートする。その後、上記のように96ウエルプレートに再編成されたヒットAd-siRNA由来の2μLの粗溶解物は、96ウエルディスペンサを使用してPerC6.E2A細胞に加えられる。該プレートは、それから5〜10日間、10% CO2の加湿インキュベータにおいて34℃でインキュベートできる。この期間の後、該再増殖プレートを-80℃で凍結させるが、但し、完全なCPE（細胞変性効果）がみられ得ることを条件とする。増殖したAd-siRNAは、ハンチンチン高次構造アッセイにおいて、再選別される。
【０１９１】
再選別のためのデータ分析は、以下の通りに実施される。プレートごとに、平均及び標準偏差がネガティブコントロールについて算出され、これを使用して各データポイントを、該サンプルと全てのネガティブの標準偏差に関して全てのネガティブの平均との間の差を示す「カットオフ値」へと変換することができる。ハンチンチン高次構造抑制因子再選別の閾値設定は、-3であった。このカットオフで、228のAd-siRNAは、ハンチンチン高次構造アッセイにおいてポジティブである。
【０１９２】
ハンチンチン高次構造活性化因子再選別の閾値設定は、Ad-siRNAについて、2を上回るカットオフであった。このカットオフで、208のAd-siRNAは、ハンチンチン高次構造アッセイにおいてポジティブである。
【０１９３】
標的Ad-siRNAの品質管理は、以下の通りに実施した：標的Ad-siRNAは、96ウエルプレートにおいてPER.C6（著作権）細胞（Crucell, Leiden, The Netherlands）の誘導体を使用して増殖させ、その後、該標的Ad-siRNAウイルスによりコードされるsiRNAの塩基配列決定をする。PERC6.E2A細胞を、180μLのPERC6.E2A培地中40,000細胞/ウエルの密度で96ウエルプレートに播種する。細胞をそれから10% CO2加湿インキュベータにおいて39℃で終夜インキュベートする。翌日、細胞を、標的Ad-siRNAを含んでいるSilenceSelect（登録商標）ストックからの1μLの粗細胞抽出液で感染させる。細胞を、細胞変性効果の顕在化まで（細胞の腫脹及び丸まりにより現され、典型的には感染後7日）、34℃、10% CO2で、さらにインキュベートする。上清を回収し、該ウイルス粗溶解物は、無菌のPCRチューブにおいて4μLの溶解緩衝液（1mg/mLのプロテイナーゼK（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号745 723）及び0.45%のTween-20（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号1335465）を補充したMgCl2含有４×Expand High Fidelity緩衝液（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号1332465））を12μLの粗溶解物に添加することにより、プロテイナーゼK処理する。これらのチューブは、55℃で2時間インキュベートした後、95℃で15分の不活化工程に供する。PCR反応のために、1μLの溶解物を、MgCl2、0.5μLのdNTPミックス(各dNTPにつき10 mM)、1μL の「フォワードプライマー」(10 mMストック、配列：
【化２】
2011517339.tif 000008
(配列番号80)、1μL の「リバースプライマー」(10 mMストック、配列：
【化３】
2011517339.tif 000009
(配列番号81)、0.2μL のExpand High Fidelity DNAポリメラーゼ(3.5 U/μL, Roche Molecular Biochemicals)及び41.3μL のH2Oを含む5 μLの10×Expand High Fidelity緩衝液からなるPCRマスターミックスに添加する。PCRは、以下の通りにPE Biosystems GeneAmp PCRシステム9700で実施される：PCR混合物（全体で50μL）を95℃で5分間インキュベートし；各サイクルは、95℃で15秒間、55℃で30秒間、68℃で4分間実行し、35サイクル繰り返す。68℃での最終インキュベーションは、7分間実施される。塩基配列解析のために、標的アデノウイルスにより発現されるsiRNA構築物を、pIPspAdapt6-U6プラスミドのSapI部位に隣接しているベクター配列と相補的なプライマを使用するPCRにより増幅する。PCR断片の配列を決定し、予想される配列と比較する。全ての配列が、予想される配列と同一であることがわかる。
【０１９４】
表4
【０１９５】
全てのハンチンチン高次構造ヒットの再選別のために得られたデータの要約。各ヒットの活性は、96ウエルプレートの3B5H10シグナルの平均から、96ウエルプレートの3B5H10シグナルの標準偏差の倍数で示される。一次選別において、標準偏差及び平均は、ライブラリウイルスで算出した。再選別において、標準偏差及び平均は、ネガティブコントロールウイルスで算出した。
【表３】
2011517339.tif 000010
【０１９６】
（実施例４）遺伝子発現解析
HDにおいて影響を受けるヒト脳の領域、特に線条体及び皮質（Vonsattelらの文献、1985）において活発に発現されるものとしてこれらの標的を検証するために、ヒト脳において該ヒットウイルスにより表される転写産物の遺伝子発現は、2つの方法のいずれか1つで測定できる。
【０１９７】
（4.1）
公的に（Hodgesらの文献、2006）利用できるマイクロアレイデータセットを分析できる（NCBI Gene Expression OmnibusエントリGSE3790）。良質のRNAを有するアレイが使用される（表5）。
【表４】
2011517339.tif 000011
【０１９８】
ハイブリダイゼーションレベルは、p値（該遺伝子がp=0.05でのカットオフにより発現される統計的有意性）として報告する。該アレイの50%超に発現される遺伝子は、発現された遺伝子と位置づける。線条体及び皮質にわたる発現の正中p値を表7に表す。さらにまた、フォンサッテル（Vonsattel）等級1又は2を有するHD患者の線条体からの正中p値の-logと、コントロール対象の線条体からの正中p値の-logとの間の比率は、疾患特異的な発現を示すために使用してもよい。
【０１９９】
（4.2）
このデータセット（Hodgesらの文献, 2006）において解析されない遺伝子について、RNAは、コントロール対象及びHD患者からの新しい冷凍された脳組織から、線条体及び皮質の両方から単離できる。遺伝子発現は、遺伝子発現mRNA発現データ（定量的RT-PCR）のリアルタイムTaqMan解析を使用して解析する。
【０２００】
全RNAはQiagen RNAeasyキットを使用してこれらのサンプルから単離でき、該RNAの品質はAgilent 2100 Bioanalyzer Picoチップを使用して評価できる。RNAは、品質（28S及び18SのピークrRNA）に基づき選択する。cDNAをRNAから調製し、適切である場合、cDNAのプールを作成する（表6）。
【表５】
2011517339.tif 000012
[#N/A = 適用不可−CAGリピートなし]
【０２０１】
各サンプルは、異なるプレートで2回反復で測定する。遺伝子発現は、サイクル閾値（Ct）（Applied Biosystemsマニュアル）で算出する。低いサイクル閾値は高発現を示し、35以上のCtは発現を示さない。フォンサッテル等級1又は2を有するHD患者の線条体、及び、コントロール対象の線条体からの示差的遺伝子発現は、2^（ΔCt）により算出する。1より大きい比率を示している標的は、HD 線条体において過剰発現しており、従って、薬剤標的として増加した値である。
【表６】
2011517339.tif 000013
【０２０２】
（実施例５）KDウイルスを使用する「オンターゲット解析」
ヒットの確証を強化するために、異なる配列を介して同じ標的遺伝子を標的とする完全に独立なsiRNAを使用してその効果を再現することは、有用である。この解析は、「オンターゲット解析」とよばれる。実際には、これは、WO 03/020931に従い、以前に記載された専門アルゴリズムを使用して標的に対して複数の新規なshRNAオリゴヌクレオチドを設計し、それらをアデノウイルスに組み込むことによりなされる。ウイルス産生後、ポジティブ及びネガティブコントロールウイルスと共に、これらのウイルスを96ウエルプレートに配列する。平均して、6つの新規な独立したAd-siRNAのものが、標的セットについて生成される。これらのウイルスプレートの1つの独立な再増殖は、それから、実施例3での再選別のために上記の通りに実施される。この再増殖において生成されるプレートは、記載されているプロトコルに従っての3MOIでの一次スクリーニングアッセイの生物学的複製で試験する（実施例1）。少なくとも1MOIで設定されたカットオフ値を上回る機能効果を媒介するAd-siRNAのものが、「オンターゲット解析」においてスコア化されるヒットとして指名される。これらの実験におけるカットオフ値は、ネガティブコントロールを超える平均＋2倍のネガティブコントロールを超える標準偏差として定義する。これらのヒットは「オンターゲット」とみなされ、次なる検証実験に進む。
【０２０３】
（実施例６）初代細胞に基づくアッセイ確認
ハンチントン病についての増加した臨床関連性を有する細胞モデルは、ハンチントン病において最も深刻に影響を受けるニューロン集団に類似の表現型を有する。HD患者の脳の神経病理学的解析は、神経変性過程に関係する脳の部位を明確に証明する（Vonsattelらの文献、1985）。線条体（尾状核）及び皮質は最も深刻に影響を受け、これは該疾患過程の間に観察される運動及び認識欠損を説明する。ヒト胎児線条体に由来する条件的に不死化された細胞株は、実施例1に記載されているアッセイを反復するために使用する。当該細胞株は、活発な増殖を可能にする条件下で培養できるが、c-mycなどの不死化遺伝子をオフにすると、細胞は線条体ニューロン表現型に最終分化する。実施例1に記載されるアッセイに対する当該ニューロンの応答は、HD患者の線条体ニューロン集団の感受性に、より関連する。ヒト線条体ニューロンアッセイにおけるヒットAd-siRNA活性は、ヒト線条体ニューロンアッセイにおける効果を示すことができないAd-siRNAと比較して、薬剤標的として高い妥当性を有する遺伝子を表す。ヒト線条体神経細胞株の例は、米国特許出願20060067918（Sindenらの文献、ReNeuron社）に記載されているSTROC05細胞株である。
【０２０４】
(引用文献)
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【０２０５】
上記記載から、本発明の組成物及び方法における様々な修飾及び変更が当業者に生じるであろう。添付の特許請求の範囲の範囲内にある全てのそのような修飾は、特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【０２０６】
本明細書において引用した特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない全ての刊行物は、あたかも個々の刊行物が具体的にかつ個々に示され、あたかも完全に記載されて本明細書に引用されているように、引用により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
2011517339000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月26日(2011.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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