(57)【要約】  アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスから単離および／または精製された、ポリペプチドおよびアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス由来ポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。さらに、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスから単離および／または精製された、ポリペプチドおよび核酸配列を使用して、細胞膜を通過して糖類を輸送するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離または精製核酸配列。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で活性を有する、請求項１に記載の単離または精製核酸配列。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で活性を有する、請求項１に記載の単離または精製核酸配列。
【請求項４】
前記核酸配列が、ベクター中に存在する、請求項１に記載の単離または精製核酸配列。
【請求項５】
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、単離または精製ポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で活性を有する、請求項５に記載の単離または精製ポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で活性を有する、請求項５に記載の単離または精製ポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項５に記載の単離または精製ポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、ＡＢＣ型糖輸送パーミアーゼ成分としての活性を有する、請求項５に記載の単離または精製ポリペプチド。
【請求項１０】
約３５℃以上の温度、または約８以下のｐＨで細胞膜を通過して糖を輸送する方法であって、
細胞に、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列、または配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドを提供するステップと、
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドまたはタンパク質を前記細胞膜に組み込む、あるいは会合させるステップと、
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドまたは前記タンパク質を利用して、前記膜を通過して糖を輸送するステップと、
を含む上記方法。
【請求項１１】
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドまたは前記タンパク質を利用して、前記膜を通過して糖を輸送するステップが、約ｐＨ８以下で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドまたは前記タンパク質を利用して、前記膜を通過して糖を輸送するステップが、約３５℃以上の温度で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドもしくは前記タンパク質が、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドまたは前記タンパク質が、ＡＢＣ型糖輸送パーミアーゼ成分としての活性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離または精製核酸配列。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で活性を有する、請求項１５に記載の単離または精製核酸配列。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で活性を有する、請求項１５に記載の単離または精製核酸配列。
【請求項１８】
前記核酸配列が、ベクター中に存在する、請求項１５に記載の単離または精製核酸配列。
【請求項１９】
配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドを含む、単離または精製ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、約ｐＨ８以下で活性を有する、請求項１９に記載の単離または精製ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、摂氏約３５度以上の温度で活性を有する、請求項１９に記載の単離または精製ポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項１９に記載の単離または精製ポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、ＡＢＣ型糖輸送系パーミアーゼ成分、マルトース結合ペリプラズムタンパク質／ドメイン、シクロデキストリン結合タンパク質、アラビノース／キシロース／ガラクトースパーミアーゼ、ナトリウム−グルコース／ガラクトース共輸送体、ＡＢＣ型糖輸送系ＡＴＰアーゼ成分、Ｎａ＋／メリビオース共輸送体および関連輸送体、ＡＢＣ型糖輸送系ペリプラズム成分、アラビノース／キシロース／ガラクトースパーミアーゼ、糖結合タンパク質／輸送、ＡＢＣ型多糖類／ポリオールリン酸輸送系パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型多糖類／ポリオールリン酸輸送系ＡＴＰアーゼ成分、ＡＢＣ型オリゴガラクツロン酸輸送系パーミアーゼタンパク質ＯｇｔＢ、ＡＢＣ型オリゴガラクツロン酸輸送系パーミアーゼタンパク質ＯｇｔＡ、ＡＢＣ型オリゴガラクツロン酸結合タンパク質ＯｇｔＤペリプラズム成分、グルカ酸／ガラクタル酸輸送体、リボース輸送系パーミアーゼタンパク質ｒｂｓＣ、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型糖輸送系／細胞外糖結合タンパク質ペリプラズム成分、セロビオース輸送または調節因子、糖結合タンパク質、オリゴ糖結合タンパク質、ＡＢＣオリゴ糖輸送、ＡＢＣオリゴ糖パーミアーゼ／輸送、ＡＢＣキトオリゴ糖輸送、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型糖輸送系ペリプラズム成分、ラクトース結合タンパク質、ラクトース輸送系パーミアーゼタンパク質ｌａｃＦ、Ｄ−リボース結合タンパク質、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型キシロース輸送系ペリプラズム成分、Ｄ−キシロース結合タンパク質、Ｄ−キシロース輸送ＡＴＰ結合タンパク質ｘｙｌＧ、ＡＢＣ型キシロース輸送系パーミアーゼ成分、ｘｙｌＨ、Ｄ−キシロースプロトン共輸送体、ならびに糖キナーゼ活性から成る群より選択される活性を有する、請求項１９に記載の単離または精製ポリペプチド。
【請求項２４】
約３５℃以上の温度、または約８以下のｐＨで細胞膜を通過して糖を輸送する方法であって、
細胞に、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列、または配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される、組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドを提供するステップと、
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドまたはタンパク質を前記細胞膜に組み込む、あるいは会合させるステップと、
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドまたは前記タンパク質を利用して、前記膜を通過して糖を輸送するステップと、
を含む上記方法。
【請求項２５】
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドまたは前記タンパク質を利用して、前記膜を通過して糖を輸送するステップが、約ｐＨ８以下で行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドまたは前記タンパク質を利用して、前記膜を通過して糖を輸送するステップが、約３５℃以上の温度で行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドまたは前記タンパク質が、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記組み換え、精製、もしくは単離ヌクレオチド配列によってコードされる前記組み換え、精製、もしくは単離ポリペプチドまたは前記タンパク質が、ＡＢＣ型糖輸送系パーミアーゼ成分、マルトース結合ペリプラズムタンパク質／ドメイン、シクロデキストリン結合タンパク質、アラビノース／キシロース／ガラクトースパーミアーゼ、ナトリウム−グルコース／ガラクトース共輸送体、ＡＢＣ型糖輸送系ＡＴＰアーゼ成分、Ｎａ＋／メリビオース共輸送体および関連輸送体、ＡＢＣ型糖輸送系ペリプラズム成分、アラビノース／キシロース／ガラクトースパーミアーゼ、糖結合タンパク質／輸送、ＡＢＣ型多糖類／ポリオールリン酸輸送系，パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型多糖類／ポリオールリン酸輸送系ＡＴＰアーゼ成分、ＡＢＣ型オリゴガラクツロン酸輸送系パーミアーゼタンパク質ＯｇｔＢ、ＡＢＣ型オリゴガラクツロン酸輸送系パーミアーゼタンパク質ＯｇｔＡ、ＡＢＣ型オリゴガラクツロン酸結合タンパク質ＯｇｔＤペリプラズム成分、グルカ酸／ガラクタル酸輸送体、リボース輸送系パーミアーゼタンパク質ｒｂｓＣ、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型糖輸送系／細胞外糖結合タンパク質ペリプラズム成分、セロビオース輸送または調節因子、糖結合タンパク質、オリゴ糖結合タンパク質、ＡＢＣオリゴ糖輸送、ＡＢＣオリゴ糖パーミアーゼ／輸送、ＡＢＣキトオリゴ糖輸送、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型糖輸送系ペリプラズム成分、ラクトース結合タンパク質、ラクトース輸送系パーミアーゼタンパク質ｌａｃＦ、Ｄ−リボース結合タンパク質、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型キシロース輸送系ペリプラズム成分、Ｄ−キシロース結合タンパク質、Ｄ−キシロース輸送ＡＴＰ結合タンパク質ｘｙｌＧ、ＡＢＣ型キシロース輸送系パーミアーゼ成分、ｘｙｌＨ、Ｄ−キシロースプロトン共輸送体、ならびに糖キナーゼ活性から成る群より選択される活性を有する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本願は、「ＴＨＥＲＭＯＰＨＩＬＩＣ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＭＯＡＣＩＤＯＰＨＩＬＩＣ  ＳＵＧＡＲ  ＴＲＡＮＳＰＯＲＴＥＲ  ＧＥＮＥＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＦＲＯＭ  ＡＬＩＣＹＣＬＯＢＡＣＩＬＬＵＳ  ＡＣＩＤＯＣＡＬＤＡＲＩＵＳ  ＡＮＤ  ＲＥＬＡＴＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＳＭＳ，  ＭＥＴＨＯＤＳ」と題する２００８年２月２６日出願の米国仮特許出願第６１／０３１，５９３号の出願日の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利
米国政府は、米国エネルギー省（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ）とＢａｔｔｅｌｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ａｌｌｉａｎｃｅ、ＬＬＣとの間の契約番号ＤＥ−ＡＣ０７−９９ＩＤ１３７２７および契約番号ＤＥ−ＡＣ０７−０５ＩＤ１４５１７に従って、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、概して、バイオテクノロジーに関する。より具体的には、本発明は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスから単離および／または精製された、ポリペプチドおよびアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス由来ポリペプチドをコードする核酸配列、ならびにそれらの使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
リグノセルロース物質からヘミセルロースを除去するための希酸加水分解は、リグノセルロースのための最も発展した前処理技術の１つであって、かなり高収率のキシロース（７５〜９０％）をもたらすため、現在、好まれている（Ｈｅｍｅｌｉｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。典型的に使用される条件は、０．１乃至１．５％硫酸および１６０℃を超える温度である。高温の使用は、その後の微生物発酵を抑制する有意水準の熱分解産物をもたらす（Ｌａｖａｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。高温加水分解は、昇温時に酸の腐食性が高まるため、化学反応炉構造内に加圧システム、蒸気発生、および耐食性物質を必要とする。
【０００５】
低温酸加水分解が上述の欠点のいくつかを克服する潜在性を有するため、低温酸加水分解が着目されている（Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。９０％ヘミセルロースは、８０〜１００℃の温度範囲における酸処理の数時間以内に、オリゴマーとして溶解可能であることが示されている。また、低温酸加水分解において産生された糖が、フルフラール分解産物への検出可能分解を伴わずに、少なくとも２４時間の間、同条件下、安定することも示されている。最終的に、前処理で典型的に使用される硫酸は、より低温においてそれほど腐食性ではない。より低温での酸前処理の使用は、容認可能レベルの加水分解を達成するために、はるかに長い反応時間を必要とする。９０％ヘミセルロースの可溶化が明らかにされているが（Ｔｓａｏ，１９８７）、糖の大部分は、オリゴマーの形態であって、モノマーの形態ではない。その後の発酵ステップで現在好まれる生物体は、糖オリゴマーを利用不可能であって（Ｇａｒｒｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、オリゴマー含有加水分解物は、通常、第２の酸またはアルカリ加水分解ステップとして、モノマーに対してさらなる処理を必要とする（Ｇａｒｒｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００６】
他の酸性前処理方法として、自動加水分解および温水洗浄を含む。自動加水分解では、バイオマスは、高温（約２４０℃）の蒸気で処理され、その高温の蒸気が、酸加水分解における硫酸と類似の様式で機能する酢酸を産生するために、ヘミセルロースに付随するアセチル側鎖を開裂する。酢酸は硫酸よりもはるかに弱性であるため、希酸加水分解と比較してより高い前処理温度が必要とされる。摂氏２４０度を下回ると、ヘミセルロースは、糖モノマーに完全に加水分解されず、高レベルのオリゴマーを有する（Ｇａｒｒｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。温水洗浄では、バイオマスは、昇温１６０〜２２０℃の水（圧力下）と接触する。本プロセスは、９０％を超えて存在するヘミセルロースを効果的に加水分解可能であって、可溶化ヘミセルロースは、典型的には、オリゴマーの形態で９５％を上回る（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｗｙｍａｎ，２００３）。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の実施形態は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの精製および／または単離ヌクレオチド配列、またはその相同体、あるいは断片に関する。本発明の一実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７、またはそれらの相同体もしくは断片のうちの少なくとも１つから選択される。本発明の別の実施形態では、該相同体は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択される。
【０００８】
さらに、本発明の実施形態は、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離および／または精製核酸配列に関してもよい。
【０００９】
また、本発明の実施形態は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムのヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる単離および／または精製ポリペプチド、またはその相同体、あるいは断片に関する。一実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
本発明の別の実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７、またはその相同体もしくは断片のうちの少なくとも１つから選択される、ヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される、アミノ酸配列を含む。
【００１１】
本発明の実施形態では、該ポリペプチドは、好酸性および／または好熱性であってもよい。さらなる実施形態では、該ポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、または別様に翻訳後に修飾されてもよい。
【００１２】
方法の実施形態は、細胞膜内の、または細胞膜に関連する、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される組み換え、精製、および／または単離ポリペプチドを提供するステップと、他の細胞成分と併せて組み換え、精製、および／または単離ポリペプチドを使用して該細胞膜を通過して糖を輸送するステップとを含む。
【００１３】
方法のさらなる実施形態は、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／もしくは９５℃以上の温度、ならびに／または８、７、６、５、４、３、２、１、および／もしくは０以下および／もしくは以上のｐＨを含む環境に、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組み換え、精製、および／もしくは単離ヌクレオチド配列、ならびに／または配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される、組み換え、精製、および／もしくは単離ポリペプチドを産生またはコードする細胞を配置するステップを含む。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の態様は、本明細書に含有される教示に照らして、当業者に明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】配列番号１（ＲＡＡＣ００５７２）と、ｅｍｂ｜ＣＡＢ６５６５２．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２３４１７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６２８１２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１７９２５７．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿６９９６０２．１｜（配列番号３〜７）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２Ａ】配列番号１８（ＲＡＡＣ００５７３）と、ｅｍｂ｜ＣＡＢ６５６５１．１｜、ｐｄｂ｜１ＵＲＧ｜Ａ、ｐｄｂ｜１ＵＲＤ｜Ａ、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６２８１１．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿６２３４１８．１｜（配列番号２０〜２４）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１８に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２Ｂ】配列番号１８（ＲＡＡＣ００５７３）と、ｅｍｂ｜ＣＡＢ６５６５１．１｜、ｐｄｂ｜１ＵＲＧ｜Ａ、ｐｄｂ｜１ＵＲＤ｜Ａ、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６２８１１．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿６２３４１８．１｜（配列番号２０〜２４）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１８に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３Ａ】配列番号３５（ＲＡＡＣ００６０８）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３９１２７６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４２２６９４．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３４７９６７．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８８６７６５．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿８０４５５３．１｜（配列番号３７〜４１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３５に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３Ｂ】配列番号３５（ＲＡＡＣ００６０８）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３９１２７６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４２２６９４．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３４７９６７．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８８６７６５．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿８０４５５３．１｜（配列番号３７〜４１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３５に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４Ａ】配列番号５２（ＲＡＡＣ００６２６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１０８３５９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６２０４５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４７９７６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２６１１９．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４０９９７２．１｜（配列番号５４〜５８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号５２に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４Ｂ】配列番号５２（ＲＡＡＣ００６２６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１０８３５９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６２０４５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４７９７６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２６１１９．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４０９９７２．１｜（配列番号５４〜５８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号５２に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図５】配列番号６９（ＲＡＡＣ００６２７）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１０８３６０．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１７３０３０２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６２０４４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１７１３０３．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿９２２０８０．１｜（配列番号７１〜７５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号６９に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図６】配列番号８６（ＲＡＡＣ００６２８）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１０８３６１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６２０４３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４７９７４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２６１１７．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿６９４３９４．１｜（配列番号８８〜９２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号８９に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図７Ａ】配列番号１０３（ＲＡＡＣ００６６２）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿６４４８０５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿５８９４０３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８２２５１２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８２５０９７．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１０８３５０．１｜（配列番号１０５〜１０９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１０３に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図７Ｂ】配列番号１０３（ＲＡＡＣ００６６２）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿６４４８０５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿５８９４０３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８２２５１２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８２５０９７．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１０８３５０．１｜（配列番号１０５〜１０９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１０３に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図８】配列番号１２０（ＲＡＡＣ００７３２）と、ｅｍｂ｜ＣＡＥ４５６９８．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２３２９０５１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１８１１１５．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２３５５４．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６４５６１．１｜（配列番号１２２〜１２６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１２０に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図９Ａ】配列番号１３７（ＲＡＡＣ００８０４）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２３５０７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４６９６８２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４５２７５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００６２０４．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４３２２９２．１｜（配列番号１３９〜１４３）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１３７に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図９Ｂ】配列番号１３７（ＲＡＡＣ００８０４）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２３５０７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４６９６８２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４５２７５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００６２０４．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４３２２９２．１｜（配列番号１３９〜１４３）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１３７に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１０Ａ】配列番号１５４（ＲＡＡＣ００８２４）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２１２８９０３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２４３９２７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３９０８６２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２５４０２８．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿２２８４０５．１｜（配列番号１５６〜１６０）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１５４に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１０Ｂ】配列番号１５４（ＲＡＡＣ００８２４）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２１２８９０３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２４３９２７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３９０８６２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２５４０２８．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿２２８４０５．１｜（配列番号１５６〜１６０）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１５４に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１１Ａ】配列番号１７１（ＲＡＡＣ０１０７３）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８０４５５３．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３９１２７６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４２２６９４．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３４７９６７．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿９７８５２６．１｜（配列番号１７３〜１７７）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１７１に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１１Ｂ】配列番号１７１（ＲＡＡＣ０１０７３）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８０４５５３．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３９１２７６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４２２６９４．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３４７９６７．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿９７８５２６．１｜（配列番号１７３〜１７７）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１７１に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１２Ａ】配列番号１８８（ＲＡＡＣ０１１２０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０８９９３４．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８０１５７３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１７３０００．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿０７６００８．１｜、およびｇｂ｜ＡＢＰ５７７８３．１｜（配列番号１９０〜１９４）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１８８に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１２Ｂ】配列番号１８８（ＲＡＡＣ０１１２０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０８９９３４．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８０１５７３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１７３０００．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿０７６００８．１｜、およびｇｂ｜ＡＢＰ５７７８３．１｜（配列番号１９０〜１９４）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号１８８に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１３】配列番号２０５（ＲＡＡＣ０１１２２）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５２７６５９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿３２１０８２．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿４８４８３２．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１６３１４８５．１｜、およびｇｂ｜ＡＡＤ３３６６５．１｜ＡＦ１３５３９８＿２（配列番号２０７〜２１１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２０５に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１４】配列番号２２２（ＲＡＡＣ０１１６８）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２０８３８８１．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２０７５２６４．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１４６１９６２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿６３２７９１．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿３４８９４５．１｜（配列番号２２４〜２２８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２２２に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１５】配列番号２３９（ＲＡＡＣ０１１６９）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２０７５２６５．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２０８３８７８．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２０８５００２．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１９７８９９７．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０２０４５１６４．１｜（配列番号２４１〜２４５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２３９に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１６】配列番号２５６（ＲＡＡＣ０１２７６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１７３８９９．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿２４１９８５．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１６８６８２．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２０８７１３２．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿１７３８９０．１｜（配列番号２５８〜２６２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２５６に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１７】配列番号２７３（ＲＡＡＣ０１２７７）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿９４９００９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１７３８８９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３６１８９１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８３２８０３．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１６８６８１．１｜（配列番号２７５〜２７９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２７３に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１８Ａ】配列番号２９０（ＲＡＡＣ０１２７８）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿２８９７６０．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿２４１９８３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１７３８９７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１７３８８８．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿３５７４８４．２｜（配列番号２９２〜２９６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２９０に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１８Ｂ】配列番号２９０（ＲＡＡＣ０１２７８）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿２８９７６０．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿２４１９８３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１７３８９７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１７３８８８．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿３５７４８４．２｜（配列番号２９２〜２９６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号２９０に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図１９】配列番号３０７（ＲＡＡＣ０１２７９）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６９３０１６．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１９２４０７５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１７４６４６．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８５４９６７．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１０８８８９８．１｜（配列番号３０９〜３１３）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３０７に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２０Ａ】配列番号３２４（ＲＡＡＣ０１３１６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５２３０２３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１７４６０１２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４７９７８９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５８５３３０．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿８４５５６５．１｜（配列番号３２６〜３３０）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３２４に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２０Ｂ】配列番号３２４（ＲＡＡＣ０１３１６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５２３０２３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１７４６０１２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４７９７８９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５８５３３０．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿８４５５６５．１｜（配列番号３２６〜３３０）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３２４に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２１】配列番号３４１（ＲＡＡＣ０１５０２）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１１３８５８．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２１７１１１１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４８８４８０．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８７８６６７．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿６９３４９４．１｜（配列番号３４３〜３４７）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３４１に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２２】配列番号３５８（ＲＡＡＣ０１５９９）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１１４３７５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５６８０００．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２５４０２６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３９０８６０．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２７５７０７．１｜（配列番号３６０〜３６４）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３５８に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２３Ａ】配列番号３７５（ＲＡＡＣ０１６００）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿０７６００８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６２４１７０．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０８９９３４．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８０１５７３．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８５０５０９．１｜（配列番号３７７〜３８１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３７５に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２３Ｂ】配列番号３７５（ＲＡＡＣ０１６００）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿０７６００８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６２４１７０．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０８９９３４．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８０１５７３．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１８５０５０９．１｜（配列番号３７７〜３８１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３７５に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２４】配列番号３９２（ＲＡＡＣ０１６２５）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５２７６５８．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１８９６２１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３２７９８０．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿４３６７６４．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿４６３７１１．１｜（配列番号３９４〜３９８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号３９２に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２５Ａ】配列番号４０９（ＲＡＡＣ０１６２６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６２４８５３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８３２８６２．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿７３３４９６．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿９６１０２６．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿８８１３０３．１｜（配列番号４１１〜４１５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号４０９に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２５Ｂ】配列番号４０９（ＲＡＡＣ０１６２６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６２４８５３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８３２８６２．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿７３３４９６．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿９６１０２６．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿８８１３０３．１｜（配列番号４１１〜４１５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号４０９に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２６】配列番号４２６（ＲＡＡＣ０１６２７）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１１５２６２．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿８１５８９４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１７３８２０．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２４６０１．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿３３６８５８．１｜（配列番号４２８〜４３２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号４２６に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２７Ａ】配列番号４４３（ＲＡＡＣ０１７５４）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１７２３４１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６５５０５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６３８１１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２４９４５．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿６２２４５０．１｜（配列番号４４５〜４４９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号４４３に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２７Ｂ】配列番号４４３（ＲＡＡＣ０１７５４）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１７２３４１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６５５０５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６３８１１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２４９４５．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿６２２４５０．１｜（配列番号４４５〜４４９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号４４３に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２８Ａ】配列番号４６０（ＲＡＡＣ０１７５６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６５５０３．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２２４５２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１７９２６９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２４９４７．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿２４４５５７．１｜（配列番号４６２〜４６６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号４６０に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２８Ｂ】配列番号４６０（ＲＡＡＣ０１７５６）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６５５０３．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２２４５２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１７９２６９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２４９４７．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿２４４５５７．１｜（配列番号４６２〜４６６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号４６０に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図２９】配列番号４７７（ＲＡＡＣ０１７５７）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６５５０２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６３８０８．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２２４５３．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１７２３４４．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１７９２７０．１｜（配列番号４７９〜４８３）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号４７７に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３０】配列番号４９４（ＲＡＡＣ０１７５８）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿６２２４５４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６５５０１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６６３８０７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１７９２７１．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２４９４９．１｜（配列番号４９６〜５００）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号４９４に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３１Ａ】配列番号５１１（ＲＡＡＣ０１９８９）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６１４９４５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６１９０７４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６１８１９７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４７１６４４．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６１３９９９．１｜（配列番号５１３〜５１７）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号５１１に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３１Ｂ】配列番号５１１（ＲＡＡＣ０１９８９）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６１４９４５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６１９０７４．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６１８１９７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４７１６４４．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６１３９９９．１｜（配列番号５１３〜５１７）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号５１１に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３２】配列番号５２８（ＲＡＡＣ０１９９０）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿８２９９００．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿９４７６９９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０３２７５０．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６１４９４４．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５４５１６４．１｜（配列番号５３０〜５３４）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号５２８に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３３】配列番号５４５（ＲＡＡＣ０１９９１）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０３２７４９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５６７５３９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿６１４７３７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１４７１６４２．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿０６３０７０．１｜（配列番号５４７〜５５１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号５４５に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３４】配列番号５６２（ＲＡＡＣ０１９９２）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１６１４９４２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５４５１６２．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１４７３６８７．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿７９８８６１．１｜、およびｒｅｆ｜ＺＰ＿０１２６２２４２．１｜（配列番号５６４〜５６８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号５６２に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３５】配列番号５７９（ＲＡＡＣ０２１７５）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿６４４４５４．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿００１３３６３９．２｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３３７１６６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５９１１７５．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿３５５００５．１｜（配列番号５８１〜５８５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号５７９に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３６】配列番号５９６（ＲＡＡＣ０２１７６）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１４４０４７９．１｜、ｇｂ｜ＥＤＲ９５５１５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿０３７０３８．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２６００５０．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿０２９０２２．１｜（配列番号５９８〜６０２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号５９６に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３７】配列番号６１３（ＲＡＡＣ０２１７７）と、ｒｅｆ｜ＮＰ＿８３２７０９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５６５５９４．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿００２３９４７９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１７８２４４．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３３７１６８．１｜（配列番号６１５〜６１９）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号６１３に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３８Ａ】配列番号６３０（ＲＡＡＣ０２６１３）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５４６４０５．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２１７１４３６．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２９５５５９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿７６５５７２．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿１０６９４７．１｜（配列番号６３２〜６３６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号６３０に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３８Ｂ】配列番号６３０（ＲＡＡＣ０２６１３）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５４６４０５．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２１７１４３６．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２２９５５５９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿７６５５７２．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿１０６９４７．１｜（配列番号６３２〜６３６）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号６３０に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図３９】配列番号６４７（ＲＡＡＣ０２６１４）と、ｇｂ｜ＡＡＤ３３６６５．１｜ＡＦ１３５３９８＿２、ｄｂｊ｜ＢＡＡ２８３６０．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２０１６９６３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿７６５５７１．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿３５７４５１．２｜（配列番号６４９〜６５３）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号６４７に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４０】配列番号６６４（ＲＡＡＣ０２６１５）と、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２１７１４３８．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０２０１６９６４．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１１８８２３７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１７６７９３．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５４６４０３．１｜（配列番号６６６〜６７０）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号６６４に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４１】配列番号６８１（ＲＡＡＣ０２７３３）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１７９０８０．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿２４４３１５．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿１４７７６６．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１２５９０９．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿０７７６７７．１｜（配列番号６８３〜６８７）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号６８１に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４２】配列番号６９８（ＲＡＡＣ０２７３４）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１７９０７９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１０３６８２３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１３１２３５２．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿４３７０２４．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿４７１８４５．１｜（配列番号７００〜７０４）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号９６８に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４３】配列番号７１５（ＲＡＡＣ０４０５３）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２３５０９３．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５４７１００．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１４６４２３７．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５０９４５１．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿４３０８６１．１｜（配列番号７１７〜７２１）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号７１５に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４４】配列番号７３２（ＲＡＡＣ０４０５４）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５４７０９９．１｜、ｇｂ｜ＡＡＫ０１２９５．１｜ＡＦ３３２５８５＿１、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２３５０９２．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿２８９９７７．１｜、およびｒｅｆ｜ＮＰ＿８２３４２２．１｜（配列番号７３４〜７３８）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号７３２に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４５】配列番号７４９（ＲＡＡＣ０４０５５）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５４７０９８．１｜、ｒｅｆ｜ＺＰ＿０１４６４２１８．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１５０９４４９．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２３５０９１．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿２８９９７６．１｜（配列番号７５１〜７５５）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号７４９に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４６Ａ】配列番号７６６（ＲＡＡＣ０３００４）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２３４２１４．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３４３４５１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿２５６３８１．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３７６６１２．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１９１８５１．１｜（配列番号７６８〜７７２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号７６６に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【図４６Ｂ】配列番号７６６（ＲＡＡＣ０３００４）と、ｒｅｆ｜ＹＰ＿００１２３４２１４．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３４３４５１．１｜、ｒｅｆ｜ＹＰ＿２５６３８１．１｜、ｒｅｆ｜ＮＰ＿３７６６１２．１｜、およびｒｅｆ｜ＹＰ＿００１１９１８５１．１｜（配列番号７６８〜７７２）のそれぞれとの間の配列整合を表し、それらは全て、表１中の配列番号７６６に割り当てられた作用を有する。全ての配列の中で保存されるアミノ酸は、「＊」で示され、概して保存されたアミノ酸は、「：」で示される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
リグノセルロースは、主に、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンから構成される高度に不均質な３次元マトリクスである。多くの燃料および化学物質は、これらのリグノセルロース物質から作ることが可能である。発酵プロセスを介して、燃料および化学物質の産生のためのリグノセルロース系バイオマスを利用するために、植物性多糖類類を糖モノマーに変換し、その後、種々の微生物を使用して、産物に発酵される必要がある。鉱酸によるリグノセルロースのモノマーへの直接加水分解は、高温および高圧下で可能であるが、糖の熱分解のため、不可避の収率損失を伴う。既存の市販される酵素を使用して、これらの収率損失を低減するための第１の戦略は、可溶性オリゴマーを産生するために低過酷度で前処理を実行し、続いて、セルラーゼおよびヘミセルラーゼを使用して、適温で多糖類を脱重合することである。第２の方法において、前処理の際、セルラーゼ、キシラナーゼ、および他のヘミセルラーゼを含む酸安定性熱耐性加水分解酵素のバイオマススラリーへの添加は、前処理の際にさらなる低温および低圧ならびにより安価な構成物質の使用を可能にし、資本およびエネルギーの両方を減少させる。この第２の方法の拡大は、酵素を用いた低過酷度前処理を同一条件下での発酵と組み合わせることであり、さらにコストを低減させる。
【００１７】
どの方法を使用するかにかかわらず、該方法によって生成される糖は、非制限的な例として有用な燃料および化学物質を生成するために細胞によって使用されてもよい。したがって、低ｐＨおよび／または高温度で機能する輸送体は、対象となる材料への二次処理のために、生成された糖を細胞外培地から細胞に輸送するのに有用である。
【００１８】
本発明の実施形態は、好熱好酸菌であるアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの代謝および糖輸送に関連する遺伝子および関連タンパク質を含む。これらのプロセスに関連する遺伝子のコード配列は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの配列決定から生成される配列情報から決定した。これらの遺伝子およびタンパク質は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスまたは他の生物体の代謝工学の標的を表し得る。糖輸送に関連する、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノム内に見られるヌクレオチド配列、およびそれによってコードされるアミノ酸の非制限的な例を、表１に記載する。糖輸送体および関連分子は、以下のクラスに属してもよいがこれらに限定されない。グルコース、ガラクトース、キシロース、マンノース、アラビノース、マルトース、ラクトース、リボース、これらの糖から形成されるウロン酸、上記のクラスからのアセチル化糖、単独および組み合わせの両方での糖のダイマー、トリマー、およびより大きいオリゴマーを含む、これらの糖の可溶性糖類、輸送体および関連分子、単糖類輸送体および関連分子、多糖類および／またはオリゴ糖輸送体および関連分子、シクロデキストリン、メリビオース、セロビオース、ガラクツロン酸、オリゴガラクツロン酸、グルカ酸、ポリオール、キトオリゴ糖，輸送体および関連分子、ポリＡＢＣ型糖輸送系パーミアーゼ成分、マルトース結合ペリプラズムタンパク質／ドメイン、シクロデキストリン結合タンパク質、アラビノース／キシロース／ガラクトースパーミアーゼ、ナトリウム−グルコース／ガラクトース共輸送体、ＡＢＣ型糖輸送系ＡＴＰアーゼ成分、Ｎａ＋／メリビオース共輸送体および関連輸送体、ＡＢＣ型糖輸送系ペリプラズム成分、アラビノース／キシロース／ガラクトースパーミアーゼ、糖結合タンパク質／輸送体、ＡＢＣ型多糖類／ポリオールリン酸輸送系パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型多糖類／ポリオールリン酸輸送系ＡＴＰアーゼ成分、ＡＢＣ型オリゴガラクツロン酸輸送系パーミアーゼタンパク質ＯｇｔＢ、ＡＢＣ型オリゴガラクツロン酸輸送系パーミアーゼタンパク質ＯｇｔＡ、ＡＢＣ型オリゴガラクツロン酸結合タンパク質ＯｇｔＤ、ペリプラズム成分、グルカ酸／ガラクタル酸輸送体、リボース輸送系パーミアーゼタンパク質ｒｂｓＣ、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型糖輸送系／細胞外糖結合タンパク質ペリプラズム成分、セロビオース輸送体または調節因子、糖結合タンパク質、オリゴ糖結合タンパク質、ＡＢＣオリゴ糖輸送体、ＡＢＣオリゴ糖パーミアーゼ／輸送体、ＡＢＣキトオリゴ糖輸送体、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型糖輸送系ペリプラズム成分、ラクトース結合タンパク質、ラクトース輸送系パーミアーゼタンパク質ｌａｃＦ、Ｄ−リボース結合タンパク質、リボース／キシロース／アラビノース／ガラクトシドＡＢＣ型輸送系パーミアーゼ成分、ＡＢＣ型キシロース輸送系、ペリプラズム成分、Ｄ−キシロース結合タンパク質、Ｄ−キシロース輸送ＡＴＰ結合タンパク質ｘｙｌＧ、ＡＢＣ型キシロース輸送系パーミアーゼ成分、ｘｙｌＨ、Ｄ−キシロースプロトン共輸送体、ならびに糖キナーゼ活性等。
【００１９】
本発明の実施形態は、部分的に、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの遺伝子および／またはタンパク質を含む遺伝子配列および／またはタンパク質配列に関する。含まれる遺伝子およびタンパク質は、糖輸送に関与するものである。細胞内酵素活性は、本質的に好熱性および／または好酸性であり得、同様の遺伝子の一般的な例を本文献に記載する。遺伝子、配列、酵素、および因子の種類としては、表１に記載するものが挙げられるがこれに限定されない。
【００２０】
【表１−１】
2011512802.tif 000002
【００２１】
【表１−２】
2011512802.tif 000003
【００２２】
本発明は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７、ならびに２８５８、またはそれらの断片のうちの１つの配列から選択されるアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの単離および／もしくは精製ヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列に関する。
【００２３】
同様に、本発明は、単離および／または精製ヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列が、ａ）配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７の配列のうちの少なくとも１つ、またはそれらの断片のうちの１つのヌクレオチド配列、ｂ）ａ）に定義されるヌクレオチド配列と相同のヌクレオチド配列、ｃ）ａ）またはｂ）に定義されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、およびそれらの対応するＲＮＡのヌクレオチド配列、ｄ）ストリンジェント条件下でａ）、ｂ）、またはｃ）に定義される配列とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）に定義される配列を含むクレオチド配列、ならびにｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、またはｅ）に定義されるヌクレオチド配列によって修飾されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする。
【００２４】
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸配列は、本発明に従って、モノマーおよびダイマー（いわゆる、タンデム）形態における二本鎖または一本鎖ＤＮＡと該ＤＮＡの転写産物の両方を意味するものと理解されたい。
【００２５】
本発明の態様は、単離、精製、または部分的に精製可能なヌクレオチド配列に関し、例えば、分子サイズに基づく除外クロマトグラフィーによる、または親和性によるイオン交換クロマトグラフィー、あるいは代替として、異なる溶媒中の溶解度に基づく分画技術等の分離方法から開始するか、もしくは本発明の配列は、ベクターによって運ぶことが可能であるので、増幅、クローニング、およびサブクローニング等の遺伝子工学の方法から開始する。
【００２６】
本発明に従った単離および／または精製ヌクレオチド配列断片は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの任意のヌクレオチド断片を指すものとして理解され、非制限的な例として、その由来する配列の少なくとも８、１２、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００以上の連続的ヌクレオチド長が含まれる場合がある。
【００２７】
本発明による単離および／または精製ヌクレオチド配列の特異的断片は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノム配列の対応する断片と整合および比較後、少なくとも１つの異なる性質のヌクレオチドつまり異なる性質の塩基を有するアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの任意のヌクレオチド断片を指すものと理解されたい。
【００２８】
本発明の意味において、相同単離および／または精製ヌクレオチド配列は、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％の本発明によるヌクレオチド配列の塩基と少なくとも同一率を有する単離および／または精製ヌクレオチド配列を意味するものと理解され、本パーセンテージは、純粋に統計的であって、２つのヌクレオチド配列間の差異を無作為におよびそれらの長さ全体にわたって、分布させる可能性がある。
【００２９】
本発明の意味において、特異的相同ヌクレオチド配列は、上述のような特異的断片の少なくとも１つのヌクレオチド配列を有する相同ヌクレオチド配列を意味するものと理解される。該「特異的」相同配列は、例えば、該ゲノム配列、またはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのゲノムの変異体を表すその断片の配列に対応する配列を含むことが可能である。したがって、これらの特異的相同配列は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの株内の突然変異体に関連する変型に対応し、特に、少なくとも１つのヌクレオチドの切断、置換、欠失および／または付加に対応し得る。同様に、該相同配列は、遺伝子コードの縮退に関連する変型に対応し得る。
【００３０】
用語「配列相同性の程度つまりパーセンテージ」は、本願に定義されるように、「最適整合後の２つの配列間の配列同一性の程度つまりパーセンテージ」を指す。
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列は、後述のように、最大一致のために整合されると、アミノ酸またはヌクレオチド残基の配列が、２つの配列内において、同じである場合、「同一である」と言える。２つ（以上）のペプチドまたはポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、セグメントまたは「比較域」にわたる２つの最適に整合された配列の配列を比較し、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行なわれる。比較のための配列の最適整合は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄ．  Ａｐｐ．  Ｍａｔｈ  ２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３（１９７０）の相同性整合アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似方法の検索によって、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ，  ＦＡＳＴＡ，  ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ソフトウェア  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）によって、または目視検査によって、行なわれてもよい。
【００３１】
「配列同一性のパーセンテージ」（つまり、同一性の程度）は、配列比較用ウインドウにわたる２つの最適に整合された配列を比較することによって決定され、配列比較用ウインドウ内のペプチドまたはポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適整合のための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。該パーセンテージは、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両配列内で生じる位置の数を判断し、整合位置の数を求め、整合位置の数を配列比較用ウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛け、配列同一性のパーセンテージを求めることによって計算される。
【００３２】
上述の配列同一性の定義は、当業者によって使用される可能性のある定義である。定義自体は、任意のアルゴリズムの支援を必要とせず、該アルゴリズムは、配列同一性の計算ではなく、配列の最適整合を達成するためにのみ有用である。
【００３３】
上述の定義から、２つの比較される配列間の配列同一性に対し、明確かつ１つのみの値が存在し、その値は、最善つまり最適整合のために求められた値に対応するということになる。
【００３４】
ウェブサイト（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）から利用可能であって、２つの配列間の同一性を比較および判断するのに、発明者と、概して、当業者によって、習慣的に使用されるソフトウェアであるＢＬＡＳＴ  ＮまたはＢＬＡＳＴ  Ｐ「ＢＬＡＳＴ  ２配列」では、比較される配列長に応じるギャップコストは、ソフトウェアによって直接選択される（すなわち、長さ＞８５の場合、置換マトリクスＢＬＯＳＵＭ−６２に対して１１．２）。
【００３５】
本発明の配列の相補的ヌクレオチド配列は、任意のＤＮＡを意味するものと理解され、そのヌクレオチドは、本発明の配列のものに相補的であって、その配向は、逆転される（アンチセンス配列）。
【００３６】
本発明によるヌクレオチド配列とのストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションは、相補的ＤＮＡの２つの断片間のハイブリダイゼーションを維持可能なように選択される、温度およびイオン強度条件下のハイブリダイゼーションを意味するものとして理解される。
【００３７】
例示目的で、上述のヌクレオチド断片を定義する目的としての混成ステップの高ストリンジェント条件は、有利には、以下である。
該ハイブリダイゼーションは、ＳＳＣ緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５Ｍクエン酸ナトリウムに対応する１ｘＳＳＣ）の存在下、６５℃の選択的温度で実行される。洗浄ステップは、例えば、以下であり得る。周囲温度の２ｘＳＳＣに続いて、それぞれ１０分間、６５℃の２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳと、６５℃の２ｘ０．５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる２回の洗浄を行なう。
【００３８】
例えば、２ｘＳＳＣ緩衝液の存在下における４２℃の温度の中度のストリンジェンシー、または例えば、２ｘＳＳＣ緩衝液の存在下における３７℃の温度の低度のストリンジェンシーの条件は、それぞれ、２つの配列間のハイブリダイゼーションのために、全体的相補性をほとんど必要としない。
【００３９】
あるサイズが約３５０の塩基のポリヌクレオチドのための上述のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９の教示に従って、当業者によって、より大きいまたは小さいサイズのオリゴヌクレオチドに適合される。
【００４０】
本発明による単離および／または精製ヌクレオチド配列の中には、本発明による相同配列を得ることを可能にする方法において、プライマーまたはプローブとして使用可能なものが含まれ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸クローニング、およびシークエンシング等のこれらの方法は、当業者に周知である。
【００４１】
本発明による該単離および／または精製ヌクレオチド配列のうち、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８，３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７，６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７、それらの断片のうちの１つ、または以下に定義するそれらの変異体のうちの１つの存在を診断可能にする方法において、プライマーまたはプローブとして使用可能なものが同様に好ましい。
【００４２】
本発明によるヌクレオチド配列断片は、例えば、ＰＣＲ等の特異的増幅によって、または本発明によるヌクレオチド配列の適切な制限酵素による消化後、得ることが可能であって、これらの方法は、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９の研究に記載されている。同様に、そのような代表的断片は、当業者に周知の方法に従って、化学合成によって得ることが可能である。
【００４３】
修飾ヌクレオチド配列は、当業者に周知の技術に従って、突然変異生成によって得られ、本発明による正常配列に対する修飾、例えば、特に、該ポリペプチドの発現率の修飾または複製サイクルの変調につながるポリペプチド発現の調節配列および／またはプロモーター配列における突然変異体を含有する任意のヌクレオチド配列を意味するものとして理解されたい。
【００４４】
同様に、修飾ヌクレオチド配列は、後述のような修飾ポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を意味するものとして理解されたい。
本発明は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの単離および／または精製ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列が、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７、またはそれらの断片のうちの１つから選択されることを特徴とする。
【００４５】
同様に、本発明の実施形態は、単離および／または精製ヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列が、ａ）配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７、またはそれらの断片のうちの１つのヌクレオチド配列、ｂ）ａ）に定義される配列の特異的断片のヌクレオチド配列、ｃ）ａ）またはｂ）に定義される配列と少なくとも８０％の同一性を有する、相同ヌクレオチド配列、ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に定義される配列に対応する相補的ヌクレオチド配列、またはＲＮＡの配列、ならびにｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）に定義される配列によって修飾されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
【００４６】
本発明による単離および／または精製ヌクレオチド配列の中には、配列番号１３〜１７、３０〜３４、４７〜５１、６４〜６８、８１〜８５、９８〜１０２、１１５〜１１９、１３２〜１３６、１４９〜１５３、１６６〜１７０、１８３〜１８７、２００〜２０４、２１７〜２２１、２３４〜２３８、２５１〜２５５、２６８〜２７２、２８５〜２８９、３０２〜３０６、３１９〜３２３、３３６〜３４０、３５３〜３５７、３７０〜３７４、３８７〜３９１、４０４〜４０８、４２１〜４２５、４３８〜４４２、４５５〜４５９、４７２〜４７６、４８９〜４９３、５０６〜５１０、５２３〜５２７、５４０〜５４４、５５７〜５６１、５７４〜５７８、５９１〜５９５、６０８〜６１２、６２５〜６２９、６４２〜６４６、６５９〜６６３、６７６〜６８０、６９３〜６９７、７１０〜７１４、７２７〜７３１、７４４〜７４８、７６１〜７６５、および７７８〜７８２、またはそれらの断片のヌクレオチド配列、ならびに配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７、またはそれらの断片の配列のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％の同一性の相同性を有する任意の単離および／または精製ヌクレオチド配列が含まれる。該相同配列は、例えば、ゲノム配列アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスに対応する配列を含むことが可能である。同様に、これらの特異的相同配列は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの株内の突然変異体と関連した変型に対応し、特に、少なくとも１つのヌクレオチドの切断、置換、欠失および／または付加に対応し得る。当業者には明らかであるように、そのような相同体は、標準的な技術およびＢＬＡＳＴ等の公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用して、容易に作製及び同定される。したがって、上記で言及された各相同体は、本明細書に記載され、十分に説明されたものとみなされるべきである。
【００４７】
本発明の実施形態は、本発明によるヌクレオチド配列あるいはその断片によってコードされる単離および／または精製ポリペプチドあるいはそれらの断片を含み、それらの配列は、断片（のヌクレオチド配列）によって表される。アミノ酸配列は、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７の配列のうちの少なくとも１つの３つの可能な読み枠のうちの１つに従ってコード可能な単離および／または精製ポリペプチドに対応する。
【００４８】
同様に、本発明の実施形態は、単離および／または精製ポリペプチドに関し、該ポリペプチドが、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、またはそれらの断片のうちの１つから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする。
【００４９】
本発明の実施形態によると、単離および／または精製ポリペプチドの中には、アミノ酸配列番号８〜１２、２５〜２９、４２〜４６、５９〜６３、７６〜８０、９３〜９７、１１０〜１１４、１２７〜１３１、１４４〜１４８、１６１〜１６５、１７８〜１８２、１９５〜１９９、２１２〜２１６、２２９〜２３３、２４６〜２５０、２６３〜２６７、２８０〜２８４、２９７〜３０１、３１４〜３１８、３３１〜３３５、３４８〜３５２、３６５〜３６９、３８２〜３８６、３９９〜４０３、４１６〜４２０、４３３〜４３７、４５０〜４５４、４６７〜４７１、４８４〜４８８、５０１〜５０５、５１８〜５２２、５３５〜５３９、５５２〜５５６、５６９〜５７３、５８６〜５９０、６０３〜６０７、６２０〜６２４、６３７〜６４１、６５４〜６５８、６７１〜６７５、６８８〜６９２、７０５〜７０９、７２２〜７２６、７３９〜７４３、７５６〜７６０、および７７３〜７７７、またはそれらの断片の単離および／または精製ポリペプチド、あるいは配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６の配列、またはそれらの断片のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、または９９．７％の同一性の相同性を有する任意の他の単離および／または精製ポリペプチドが含まれる。当業者には明らかであるように、そのような相同体は、標準的な技術およびＢＬＡＳＴ等の公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用して、容易に作製及び同定される。したがって、上記で言及された各相同体は、本明細書に記載され、十分に説明されたものとみなされるべきである。
【００５０】
また、本発明の実施形態は、該ポリペプチドに関し、ａ）本発明によるアミノ酸配列のポリペプチドの少なくとも５アミノ酸の特異的断片、ｂ）ａ）に定義されるポリペプチドと相同のポリペプチド、ｃ）ａ）またはｂ）に定義されるポリペプチドの特異的生物活性断片、およびｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）に定義されるポリペプチドによって修飾されるポリペプチドから選択されるポリペプチドを含むことを特徴とする。
【００５１】
本説明では、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質という用語は、同義的に使用される。
本発明の実施形態では、本発明による単離および／または精製ポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化、および／または別様に翻訳後に修飾されてもよい。さらなる実施形態では、グリコシル化、ペグ化、および／または他の翻訳後修飾は、生体内または生体外で生じてもよく、化学的技術を使用して行なわれてもよい。付加的実施形態では、任意のグリコシル化、ベグ化、および／または他の翻訳後修飾は、Ｎ結合型またはＯ結合型であってもよい。
【００５２】
本発明の実施形態では、本発明による単離および／または精製ポリペプチドのいずれか１つは、摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度で酵素的に活性であり得、ならびに／あるいは８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下ならびに／あるいは以上のｐＨで酵素的に活性であり得る。本発明のさらなる実施形態では、グリコシル化、ベグ化、または他の翻訳後修飾は、８、７、６、５、４、３、２、１、および／または０以下のｐＨ、もしくは摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／または９５度以上の温度で、可溶性ならびに／あるいは酵素的に活性である本発明による単離および／または精製ポリペプチドのために必要とされ得る。
【００５３】
本発明の態様は、天然源から精製によって単離される、または得られるか、あるいは遺伝子組み換えによって、または代替として化学合成によって得られ、したがって、後述のように、非天然アミノ酸を含有し得る、ポリペプチドに関する。
【００５４】
本発明の実施形態による「ポリペプチド断片」は、少なくとも５つの連続的アミノ酸、好ましくは、１０の連続的アミノ酸または１５の連続的アミノ酸を含有するポリペプチドを指すものとして理解される。
【００５５】
本発明では、特異的ポリペプチド断片は、本発明による特異的断片ヌクレオチド配列によってコードされる連続的ポリペプチド断片を指すものとして理解される。
「相同ポリペプチド」は、天然ポリペプチドに対して、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加、あるいは置換、切断、延長、キメラ融合、および／または突然変異等のある修飾を有するポリペプチドを指すものとして理解されたい。相同ポリペプチドのうち、そのアミノ酸配列が、本発明によるポリペプチドのアミノ酸の配列と少なくとも８０％または９０％の相同性を有するものが好ましい。
【００５６】
「特異的相同ポリペプチド」は、上述のような、本発明によるポリペプチドの特異的断片を有する相同ポリペプチドを指すものと理解されたい。
置換の場合、１つもしくは複数の連続的または非連続的アミノ酸が、「等価」アミノ酸に置き換えられる。「等価」アミノ酸という表現は、塩基構造のアミノ酸の１つによって置換可能であるが、本質的に、対応するペプチドの生物活性を変更せず、以下によって定義されるような任意のアミノ酸を指すものとして指図される。当業者には明らかであるように、そのような置換は、標準的な分子生物学技術およびＢＬＡＳＴ等の公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用して、容易に作製及び同定される。したがって、上記で言及された各置換は、本明細書に記載され、十分に説明されたものとみなされるべきである。配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６におけるそのような置換の例として、アミノ酸配列番号８〜１２、２５〜２９、４２〜４６、５９〜６３、７６〜８０、９３〜９７、１１０〜１１４、１２７〜１３１、１４４〜１４８、１６１〜１６５、１７８〜１８２、１９５〜１９９、２１２〜２１６、２２９〜２３３、２４６〜２５０、２６３〜２６７、２８０〜２８４、２９７〜３０１、３１４〜３１８、３３１〜３３５、３４８〜３５２、３６５〜３６９、３８２〜３８６、３９９〜４０３、４１６〜４２０、４３３〜４３７、４５０〜４５４、４６７〜４７１、４８４〜４８８、５０１〜５０５、５１８〜５２２、５３５〜５３９、５５２〜５５６、５６９〜５７３、５８６〜５９０、６０３〜６０７、６２０〜６２４、６３７〜６４１、６５４〜６５８、６７１〜６７５、６８８〜６９２、７０５〜７０９、７２２〜７２６、７３９〜７４３、７５６〜７６０、および７７３〜７７７の単離および／または精製ポリペプチドが含まれる場合がある。これらの等価アミノ酸は、置換アミノ酸とのその構造的相同性、または実行可能な異なるポリペプチド間の生物活性の比較試験の結果に応じて、決定可能である。
【００５７】
非制限的な例として、対応する修飾ポリペプチドの生物活性の広範囲にわたる修飾をもたらすことなく実行可能な置換の可能性として、例えば、バリンまたはイソロイシンによるロイシン、グルタミン酸によるアスパラギン酸、アスパラギンによるグルタミン、リジンによるアルギニン等の置き換えが挙げられるが、当然ながら、反転置換も、同条件下で想定可能である。
【００５８】
さらなる実施形態では、置換は、類似同定酵素活性を有する他のタンパク質の中に保存されないアミノ酸の置換に制限される。例えば、当業者は、同様の生物体において同一機能のタンパク質を整合し、どのアミノ酸が該機能のタンパク質の間で概して保存されるかを決定することができる。そのような整合を生成するために使用し得るプログラムの一例は、ＮＣＢＩによって提供されるデータベースと併せたｗｏｒｄｌｗｉｄｅｗｅｂ．ｃｈａｒｉｔｅ．ｄｅ／ｂｉｏｉｎｆ／ｓｔｒａｐ／である。そのようなポリペプチドの例として、アミノ酸配列番号８〜１２、２５〜２９、４２〜４６、５９〜６３、７６〜８０、９３〜９７、１１０〜１１４、１２７〜１３１、１４４〜１４８、１６１〜１６５、１７８〜１８２、１９５〜１９９、２１２〜２１６、２２９〜２３３、２４６〜２５０、２６３〜２６７、２８０〜２８４、２９７〜３０１、３１４〜３１８、３３１〜３３５、３４８〜３５２、３６５〜３６９、３８２〜３８６、３９９〜４０３、４１６〜４２０、４３３〜４３７、４５０〜４５４、４６７〜４７１、４８４〜４８８、５０１〜５０５、５１８〜５２２、５３５〜５３９、５５２〜５５６、５６９〜５７３、５８６〜５９０、６０３〜６０７、６２０〜６２４、６３７〜６４１、６５４〜６５８、６７１〜６７５、６８８〜６９２、７０５〜７０９、７２２〜７２６、７３９〜７４３、７５６〜７６０、および７７３〜７７７に見られるものが含まれ得るが、それらに限定されない。
【００５９】
したがって、本発明の一実施形態によると、置換または突然変異は、該機能のタンパク質の間で概して保存される位置で成される場合がある。さらなる実施形態では、核酸配列は、それらがコードするアミノ酸が変化しない（縮重置換および突然変異）しないように突然変異または置換される、および／または任意の結果として生じるアミノ酸置換または突然変異が、概してその機能のタンパク質の中に保存される位置で成されるように突然変異または置換される場合がある。そのような核酸配列の例として、配列番号１３〜１７、３０〜３４、４７〜５１、６４〜６８、８１〜８５、９８〜１０２、１１５〜１１９、１３２〜１３６、１４９〜１５３、１６６〜１７０、１８３〜１８７、２００〜２０４、２１７〜２２１、２３４〜２３８、２５１〜２５５、２６８〜２７２、２８５〜２８９、３０２〜３０６、３１９〜３２３、３３６〜３４０、３５３〜３５７、３７０〜３７４、３８７〜３９１、４０４〜４０８、４２１〜４２５、４３８〜４４２、４５５〜４５９、４７２〜４７６、４８９〜４９３、５０６〜５１０、５２３〜５２７、５４０〜５４４、５５７〜５６１、５７４〜５７８、５９１〜５９５、６０８〜６１２、６２５〜６２９、６４２〜６４６、６５９〜６６３、６７６〜６８０、６９３〜６９７、７１０〜７１４、７２７〜７３１、７４４〜７４８、７６１〜７６５、７７８〜７８２、またはそれらの断片のヌクレオチド配列に見られるものが含まれ得るが、それらに限定されない。
【００６０】
同様に、特異的相同ポリペプチドは、上述のような特異的相同ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対応し、したがって、本定義では、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス内に存在可能な変異体に突然変異または対応し、特に、少なくとも１つのアミノ酸残基の切断、置換、欠失、および／または付加に対応するポリペプチドを含む。
【００６１】
本発明の実施形態による「ポリペプチドの特異的生物活性断片」は、特に、本発明によるポリペプチドの特徴の少なくとも１つを有する上述のような特異的ポリペプチド断片を指すものとして理解されたい。ある実施形態では、該ペプチドは、表１に概説されるタンパク質の種類のうちの少なくとも１つとして作用可能である。
【００６２】
本発明の実施形態によるポリペプチド断片は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス内に必然的に存在する単離または精製断片に対応する、またはトリプシン、もしくはキモトリプシンもしくはコラゲナーゼ等のタンパク質酵素による、あるいは臭化シアン（ＣＮＢｒ）等の化学試薬による、該ポリペプチドの開裂によって得ることが可能な断片に対応し得る。同様に、そのようなポリペプチド断片は、適切な調節要素および／または発現要素の制御下で配置される該断片の発現を可能にする核酸を含有する、本発明による発現ベクターによって形質転換される宿主から、化学合成によってごく容易に調製可能である。
【００６３】
本発明の実施形態によるポリペプチドの「修飾ポリペプチド」は、正常配列に対して少なくとも１つの修飾を有する、後述のように、遺伝子組み換えまたは化学合成によって得られるポリペプチドを指すものとして理解される。これらの修飾は、特異性および／または活性の起点において、あるいは本発明によるポリペプチドの構造的立体配座、局所化、おおび膜内挿入能の起点において、アミノ酸に影響を及ぼすことが可能または不可能である場合がある。したがって、活性が等価、増加、または減少し、特異性が等価、より狭小、またはより広大なポリペプチドを生成することが可能になる。修飾ポリペプチドの中には、最大で５以上のアミノ酸が修飾、ＮまたはＣ末端において切断、またはさらに欠失もしくは付加可能であるポリペプチドに言及することが必要である。
【００６４】
実証される真核または原核細胞に対する該変調を可能にする方法は、当業者には周知である。同様に、本発明による、および後述のベクターを通して、該変調のための該修飾ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を使用可能であることが周知である。
【００６５】
上述の修飾ポリペプチドは、コンビナトリアルケミストリーを使用することによって得ることが可能であって、例えば、複数のモデル、複数の細胞培養、または複数の生物体に対して試験し、最も活発なまたは求めた特性を有する化合物を選択する前に、ポリペプチドの一部を体系的に変更することが可能である。
【００６６】
同様に、化学合成は、非天然アミノ酸または非ペプチド結合を使用可能であるという利点を有する。
したがって、本発明によるポリペプチドの寿命を改良するために、非天然アミノ酸（例えば、Ｄ型）またはアミノ酸類似体（例えば、特に、含硫型）の使用に着目してもよい。
【００６７】
最終的に、本発明によるポリペプチド、その特異的、または修飾相同形態の構造をポリペプチド型または他の化学構造に統合することが可能になる。したがって、ＮおよびＣ末端において、プロテアーゼによって認識されない分子の提供に着目してもよい。
【００６８】
同様に、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も、本発明の一部である。
同様に、本発明は、プライマーまたはプローブとして利用可能なヌクレオチド配列に関し、該配列が、本発明によるヌクレオチド配列から選択されることを特徴とする。
【００６９】
同様に、本発明は、種々の実施形態において、当業者に周知であって、特に、後述のような手順による遺伝子組み換えまたは化学合成によって、天然ポリペプチドから精製して得ることが可能な、ヌクレオチド配列によってコードされるアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの特異的ポリペプチドに関することは十分理解されている。同様に、該ヌクレオチド配列によってコードされる該特異的ポリペプチドに対する識または非標識モノあるいはポリクローナル抗体も、本発明によって包含される。
【００７０】
加えて、本発明の実施形態は、核酸配列の検出および／または増幅のためのプライマーまたはプローブとしての本発明によるヌクレオチド配列の使用に関する。
したがって、本発明の実施形態によるヌクレオチド配列を使用して、特に、ＰＣＲ技術（ポリメラーゼ連鎖反応）（Ｅｒｌｉｃｈ，１９８９；  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｒｏｌｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、およびＷｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）によって、ヌクレオチド配列を増幅可能である。
【００７１】
これらのオリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドプライマーは、有利には、少なくとも８つのヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１２のヌクレオチド、さらにより好ましくは、少なくとも２０のヌクレオチドの長さを有する。
【００７２】
標的核酸の他の増幅技術は、有利には、ＰＣＲの代替として採用可能である。
同様に、本発明のヌクレオチド配列、特に本発明によるプライマーは、ＴＡＳ技術（転写増幅システム）（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、３ＳＲ技術（自家持続配列複製）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、ＮＡＳＢＡ技術（核酸配列増幅）（Ｋｉｅｖｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、ＳＤＡ技術（鎖置換増幅）（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、ＴＭＡ技術（転写媒介性増幅）等、標的核酸の増幅の他の手順において採用可能である。
【００７３】
また、本発明のポリヌクレオチドは、熱安定性リガーゼを採用するＬＣＲ技術（リガーゼ連鎖反応）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８（Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１によって改良））、ＲＣＲ技術（修復連鎖反応）（Ｓｅｇｅｖ，１９９２）、ＣＰＲ技術（サイクリングプローブ反応）（Ｄｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、Ｑ−βレプリカーゼによる増幅技術（Ｍｉｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３（特に、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６、Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、その後、Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．ならびにＳｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６によって改良））等、プローブとしての役割を果たす核酸の増幅または修飾技術において作用可能である。
【００７４】
検出される標的ポリヌクレオチドが、可能性として、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである場合、生物学的試料内に含有されるＲＮＡからｃＤＮＡを得るために、本発明による少なくとも１つのプライマーの支援による増幅反応の採用、または本発明の少なくとも１つのプローブの支援による検出手順の採用に先立って、逆転写型の酵素を使用することが可能になる。したがって、得られるｃＤＮＡは、本発明による増幅または検出手順において採用されるプライマーまたはプローブの標的としての役割を果たすであろう。
【００７５】
該検出プローブは、標的配列または標的配列から生成されるアンプリコンとハイブリダイズするように選択される。配列のために、そのようなプローブは、有利には、少なくとも１２のヌクレオチド、特に、少なくとも２０のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１００のヌクレオチドの配列を有する。
【００７６】
また、本発明の実施形態は、本発明によるプローブまたはプライマーとして利用可能なヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、放射性化合物または非放射性化合物によって標識されることを特徴とする。
【００７７】
非標識ヌクレオチド配列は、プローブまたはプライマーとして直接使用可能であるが、配列は、概して、放射性要素（３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ）または非放射性分子（ビオチン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン、５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン）によって標識され、多くの用途のために利用可能なプローブを得る。
【００７８】
ヌクレオチド配列の非放射性標識の例は、例えば、フランス特許第７８．１０９７５号、またはＵｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．、あるいはＳａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）に記載されている。
【００７９】
後者の場合、特許第ＦＲ−２  ４２２  ９５６号および第ＦＲ−２  ５１８  ７５５号に記載される標識方法の１つを使用することも可能になる。
該ハイブリダイゼーション技術は、種々の方法で実行可能である（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８）。ほとんどの一般的方法は、支持体（ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン等）上に細胞の核酸抽出物を固定し、特定の条件下、プローブとともに固定された標的核酸をインキュベートするステップから成る。ハイブリダイゼーション後、過剰プローブは、排除され、形成されるハイブリッド分子は、適切な方法（プローブに連鎖する放射能、蛍光発光、または酵素活性の測定）によって検出される。
【００８０】
同様に、本発明は、種々の実施形態では、本発明によるヌクレオチド配列を含み、共有結合的にまたは非共有結合的に支持体上に固定されることを特徴とする。
本発明によるヌクレオチド配列を採用する別の有益な形態によると、後者は、支持体上に固定された状態で使用可能であって、したがって、特異的ハイブリダイゼーションによって、試験される生物学的試料から得られる標的核酸を捕捉する役割を果たすことが可能である。必要に応じて、固体支持体は、試料から分離され、その後、該捕捉プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリダイゼーション複合体は、第２のプローブ（容易に検出可能な要素によって標識される、いわゆる検出プローブ）の支援によって検出される。
【００８１】
本発明の別の態様は、配列のクローニングおよび／または発現のためのベクターであって、該ベクターが、本発明によるヌクレオチド配列を含有することを特徴とする。
同様に、所定の宿主細胞内の該ヌクレオチド配列の統合、発現、および／または分泌を可能にする要素を含有することを特徴とする本発明によるベクターも、本発明の一部である。
【００８２】
したがって、該ベクターは、プロモーター、翻訳の開始および終止信号、ならびに適切な転写調節領域を含有する場合がある。該ベクターは、宿主細胞内で安定的に維持可能であって、任意に、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定の信号を有し得る。これらの異なる要素は、使用される宿主細胞に応じて選択されてもよい。本目的のために、本発明によるヌクレオチド配列は、選択された宿主内の自己複製ベクター内に挿入されてもよく、または選択された宿主の統合ベクターであってもよい。
【００８３】
そのようなベクターは、当業者によって現在使用されている方法に従って調製され、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、および熱衝撃等の標準的方法によって、そこから生じるクローンを適切な宿主内に導入することが可能になる。
【００８４】
本発明によるベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。本発明のポリペプチドの発現のためのベクターの一例は、バキュロウイルスである。
これらのベクターは、本発明のヌクレオチド配列をクローンまたは発現するために、宿主細胞の形質転換に有用である。
【００８５】
同様に、本発明は、本発明によるベクターによって形質転換される宿主細胞を含む。
これらの細胞は、上述のようなベクター内に挿入されるヌクレオチド配列の宿主細胞内に導入し、その後、トランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製および／または発現を可能にする条件下、該細胞を培養することによって得ることが可能である。
【００８６】
該宿主細胞は、例えば、細菌性細胞（Ｏｌｉｎｓ  ａｎｄ  Ｌｅｅ、１９９３）であるが、同様に、酵母細胞（Ｂｕｃｋｈｏｌｚ、１９９３）およびアラビドプシス種等の植物細胞等の原核または真核細胞系、ならびに動物細胞、特に、哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）の培養物（Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ、１９９３）、同様に、例えば、バキュロウイルス、ｓｆ９昆虫細胞を採用する手順を使用可能な昆虫の細胞（Ｌｕｃｋｏｗ、１９９３）から選択可能である。
【００８７】
同様に、本発明の実施形態は、本発明による該形質転換細胞の１つを含む、生物体に関する。
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの遺伝子の１つもしくは複数または該遺伝子の一部を発現する本発明による遺伝子組み換え生物体の取得は、ウイルス性または非ウイルス性トランスフェクション等の、当業者に周知の方法に従って、例えば、ラット、マウス、またはウサギにおいて実行されてもよい。遍在的性質の強力なプロモーターまたは一種類の組織のために選択可能なプロモーターの制御下、該遺伝子の複数のコピーのトランスフェクションによって、またはある種類の組織のために選択可能な該遺伝子の１つもしくは複数を発現する遺伝子組み換え生物体を得ることが可能になる。同様に、胚細胞株内の相同的組み換え、これらの細胞株の胚への転移、生殖系レベルにおいて影響を受けるキメラの選択、および該キメラの成長によって、遺伝子組み換え生物体を得ることが可能になる。
【００８８】
形質転換細胞ならびに本発明による遺伝子組み換え生物体は、組み換えポリペプチドの調製のための手順において利用可能である。
今日、本発明による発現ベクターによる細胞形質転換を使用する、または本発明による遺伝子組み換え生物体を使用する遺伝子工学によって、比較的大量の組み換えポリペプチドを産生することが可能である。
【００８９】
ベクター、および／または本発明によるベクターによって形質転換された細胞、ならびに／あるいは本発明による該形質転換細胞の１つを含む遺伝子組み換え生物体を採用することを特徴とする組み換え形態における本発明のポリペプチドの調製のための手順はそれ自体、本発明内に含まれる。
【００９０】
本明細書で使用される、「形質転換」および「形質転換される」とは、原核または真核細胞にかかわらず細胞への核酸の導入に関する。さらに、本明細書で使用される「形質転換」および「形質転換される」とは、必ずしも増殖制御または増殖脱制御に関しない。
【００９１】
組み換え形態における本発明のポリペプチドの調製のための該手順には、ベクター、および／または該ベクターによって形質転換された細胞、ならびに／あるいはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのポリペプチドをコードする本発明によるヌクレオチド配列を含有する該形質転換細胞の１つを含む、遺伝子組み換え生物体を採用する調製手順が含まれる。
【００９２】
本発明による変異体は、「担体」タンパク質（キメラタンパク質）に融合される組み換えポリペプチドの産生から成る場合がある。本システムの利点は、組み換え産物の安定化および／またはそのタンパク質分解の減少、生体外再生の過程における溶解度の増加、ならびに／あるいは融合パートナーが特異的リガンドに対して親和性を有する場合の精製の単純化を可能にし得ることである。
【００９３】
より具体的には、本発明は、本発明のポリペプチドの調製のための手順に関し、ａ）本発明によるヌクレオチド配列の組み換えポリペプチドの発現を可能にする条件下、形質転換細胞を培養し、ｂ）必要に応じて、該組み換えポリペプチドを回収するステップを含む。
【００９４】
本発明のポリペプチドの調製のための手順が、本発明による遺伝子組み換え生物体を採用する場合、該組み換えポリペプチドが、次いで、該生物体から抽出される。
また、本発明は、上述のような本発明の手順によって得ることが可能なポリペプチドに関する。
【００９５】
また、本発明は、合成ポリペプチドの調製のための手順を含み、本発明によるポリペプチドのアミノ酸の配列を使用することを特徴とする。
同様に、本発明は、本発明による手順によって得られる合成ポリペプチドに関する。
【００９６】
同様に、本発明によるポリペプチドは、ペプチドの合成の分野において慣習的技術によって調製可能である。本合成は、均一溶液または固体相中で実行可能である。
例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ（１９７４）による均一溶液中の合成の技術を用いることが可能である。
【００９７】
本合成方法は、２つずつ、連続的アミノ酸を必要な順番で連続的に縮合する、あるいは前もって形成され、適切な順番でいくつかのアミノ酸を既に含有するアミノ酸および断片、または代替として、このように前もって調製されたいくつかの断片を縮合するステップから成り、ペプチドの合成において周知の方法に従って、特に、カルボキシル官能基の活性化後、通常、ペプチド結合の形成に伴うはずである、一方のアミン官能基および他方のカルボキシルまたはその反対を除き、これらのアミノ酸または断片によって担持される全反応性官能基をあらかじめ保護することが必要であることが理解されている。
【００９８】
また、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を用いてもよい。
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの手順に従って、ペプチド鎖を生成するために、非常に多孔性の高分子樹脂が用いられ、その上に鎖の第１のＣ末端アミノ酸が固定される。本アミノ酸は、そのカルボキシル基を介して、樹脂上に固定され、そのアミン官能基が、保護される。したがって、ペプチド鎖を形成しようとするアミノ酸は、次々と、既に形成されたペプチド鎖の一部のアミノ基（毎回、あらかじめ脱保護される）上に固定され、樹脂に付着される。所望のペプチド鎖全体が形成されると、ペプチド鎖を形成する異なるアミノ酸の保護基は、排除され、ペプチドは、酸の支援によって、樹脂から分離される。
【００９９】
加えて、本発明は、本発明による少なくとも１つのポリペプチドを有するハイブリッドポリペプチドと、ヒトまたは動物内の免疫反応を誘発可能なポリペプチドの配列に関する。
【０１００】
有利には、抗原決定基は、体液および／または細胞反応を誘発可能なものである。
そのような決定基は、複数のエピトープに対する抗体の合成を誘発可能な免疫原性組成を得ることを目的として使用される、グリコシル化、ペグ化、および／または別様に翻訳後に修飾された形態における本発明によるポリペプチドを含むことが可能になる。
【０１０１】
これらのハイブリッド分子は、一部には、本発明によるポリペプチド担体分子またはその断片から形成可能であって、可能性としては、免疫原性部分、特に、ジフテリア毒素、破傷風毒素、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（特許第ＦＲ  ７９  ２１８１１号）、ポリオウイルスのＶＰ１抗原、または任意の他のウイルス性もしくは細菌性毒素あるいは抗原のエピトープに付随する。
【０１０２】
ハイブリッド分子の合成のための手順は、求めたポリペプチド配列をコードするハイブリッドヌクレオチド配列を構築するために、遺伝子工学で使用される方法を包含する。例えば、有利には、Ｍｉｎｔｏｎ（１９８４）による融合タンパク質をコードする遺伝子の取得のための技術を参照することが可能になる。
【０１０３】
同様に、ハイブリッドポリペプチド、ならびに該ハイブリッドヌクレオチド配列の発現によって得られる組み換えポリペプチドであることを特徴とする本発明によるハイブリッドポリペプチドをコードする該ハイブリッドヌクレオチド配列も、本発明の一部である。
【０１０４】
同様に、本発明は、該ハイブリッドヌクレオチド配列の１つを含有することを特徴とするベクターを含む。同様に、ベクターが、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該形質転換細胞の１つを含む遺伝子組み換え生物体、ならびに該ベクター、該形質転換細胞および／または該遺伝子組み換え生物体を使用する組み換えポリペプチドの調製のための手順も、当然ながら、本発明の一部である。
【０１０５】
本発明によるポリペプチド、後述の本発明による抗体、および本発明によるヌクレオチド配列は、有利には、それらを含有可能な試料中において、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順において採用可能である。ポリペプチドの特異性、使用される本発明による抗体、ヌクレオチド配列に従う、これらの手順は、特に、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを検出および／または同定することが可能になる。
【０１０６】
本発明によるポリペプチドは、有利には、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスを含有可能な試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順において採用可能であって、該手順が、ａ）本発明によるポリペプチドまたはその断片の１つと接触させるステップ（該ポリペプチドと、可能性として生物学的試料内に存在する抗体との間の免疫反応を可能にする条件下）と、ｂ）可能性として形成される抗原−抗体複合体を実証するステップと、を含むことを特徴とする。
【０１０７】
従来のあらゆる手順が、可能性として形成される抗原−抗体複合体のそのような検出を実行するために採用可能である。
一例として、好ましい方法は、ＥＬＩＳＡ技術、免疫蛍光法、または放射性免疫分析プロセス（ＲＩＡ）、あるいはそれらの同等物による、免疫酵素プロセスを利用する。
【０１０８】
したがって、同様に、本発明は、酵素、蛍光、または放射性型等の適切な標識の支援によって標識される、本発明によるポリペプチドに関する。
そのような方法は、例えば、本発明による所定量のポリペプチド組成をマイクロタイタープレートのウェル内に堆積させ、分析される増加希釈度の血清または上で定義されたもの以外の生物学的試料を該ウェル内に導入し、マイクロプレートをインキュベートし、ブタ免疫グロブリンに対する標識抗体をマイクロタイタープレートのウェル内に導入し、これらの抗体の標識化が、少なくとも、所定の波長、例えば、５５０ｎｍにおいて、後者の放射線の吸収を調節することによって、基質を加水分解可能なものから選択される酵素の支援によって実行され、対照試験と比較することによって、加水分解された基質の量を検出するステップを含む。
【０１０９】
本発明によるポリペプチドは、本発明によるポリペプチドを特異的に認識することを特徴とするモノクローナルまたはポリクローナル抗体を調製可能である。有利には、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）による技術に従って、ハイブリドーマからモノクローナル抗体を調製することが可能になる。例えば、本発明に従って、免疫反応のアジュバントに付随するポリペプチドまたはＤＮＡを動物、特に、マウスに免疫付与し、その後、抗原としての役割を果たすポリペプチドがあらかじめ固定されている親和性カラムで免疫動物の血清内に含有される特異的抗体を精製することによって、ポリクローナル抗体を調製することが可能になる。また、本発明によるポリクローナル抗体は、本発明に従って、本発明によるポリペプチドがあらかじめ固定された親和性カラム上で、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、またはポリペプチド、あるいは断片によって免疫的に攻撃誘発された動物の血清内に含有される抗体を精製することによって、調製可能である。
【０１１０】
同様に、本発明は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、あるいはそれらの断片、あるいはキメラ抗体に関し、これらが、本発明によるポリペプチドを特異的に認識可能であることを特徴とする。
【０１１１】
同様に、本発明の抗体は、酵素、蛍光、または放射性型の標識等、本発明の該プローブに関する上述と同様に標識することが可能になる。
加えて、本発明は、試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順を対象とし、該手順が、ａ）本発明によるモノクローナルまたはポリクローナル抗体と試料を接触させ（該抗体と、生物学的試料中に可能性として存在するアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスのポリペプチドとの間の免疫反応を可能にする条件下）、ｂ）可能性として形成される抗原−抗体複合体を実証するステップを含むことを特徴とする。
【０１１２】
同様に、本発明は、試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順に関し、該手順が、本発明によるヌクレオチド配列を採用することを特徴とする。
【０１１３】
より具体的には、本発明は、試料中のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスの検出および／または同定のための手順に関し、該手順が、ａ）必要に応じて、分析される試料からＤＮＡを単離し、ｂ）本発明による少なくとも１つのプライマーまたはプライマー対の支援によって、試料のＤＮＡを特異的に増幅し、ｃ）増幅産物を実証するステップを含むことを特徴とする。
【０１１４】
これらは、例えば、本発明による核プローブを利用する分子ハイブリダイゼーションの技術によって、検出可能である。本プローブは、有利には、非放射性（コールドプローブ）または放射性同位体によって標識される。
【０１１５】
本発明の目的において、「生物学的試料のＤＮＡ」つまり「生物学的試料内に含有されるＤＮＡ」は、検討される生物学的試料中に存在するＤＮＡ、あるいは可能性として、該生物学的試料中に存在するＲＮＡに対する逆転写型の酵素の作用後に得られるｃＤＮＡを意味するものとして理解されたい。
【０１１６】
本発明のさらなる実施形態は、一方法を含み、該方法が、ａ）必要に応じて、あらかじめハイブリダイゼーションに感受性をもたせた生物学的試料（生物学的試料中に含有されるＤＮＡ）と、プローブを試料のＤＮＡとハイブリダイゼーション可能な条件下、本発明によるヌクレオチドプローブを接触させ、ｂ）該ヌクレオチドプローブと該生物学的試料のＤＮＡとの間に形成されるハイブリッドを実証するステップを含むことを特徴とする。
【０１１７】
また、本発明は、本発明による手順に関し、該手順が、ａ）本発明に従って、必要に応じて、あらかじめハイブリダイゼーションに感受性をもたせた生物学的試料（試料のＤＮＡ）と、該試料のＤＮＡとプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下、支持体上に固定されたヌクレオチドプローブを接触させ、ｂ）必要に応じて、該プローブとハイブリダイズされていない生物学的試料のＤＮＡの排除後、支持体上に固定されたヌクレオチドプローブと、生物学的試料内に含有されるＤＮＡとの間に形成されるハイブリッドを、本発明に従って標識されたヌクレオチドプローブと接触させ、ｃ）ステップｂ）で形成された新規ハイブリッドを実証するステップを含むことを特徴とする。
【０１１８】
上述で定義された検出および／または同定のための手順の有利な実施形態によると、これは、ステップａ）に先立って、まず、生物学的試料のＤＮＡが、本発明による少なくとも１つのプライマーの支援によって増幅されることを特徴とする。
【０１１９】
方法の実施形態は、細胞膜内の、または細胞膜に関連する、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される組み換え、精製、および／または単離ポリペプチドを提供するステップと、他の細胞成分と併せて組み換え、精製、および／または単離ポリペプチドを使用して細胞膜を通過して糖を輸送するステップとを含む。
【０１２０】
方法のさらなる実施形態は、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／もしくは９５℃以上の温度、ならびに／または８、７、６、５、４、３、２、１、および／もしくは０以下および／もしくは以上のｐＨを含む環境に、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組み換え、精製、および／もしくは単離ヌクレオチド配列、ならびに／または配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される、組み換え、精製、および／または単離ポリペプチドを産生またはコードする細胞を配置するステップを含む。
【０１２１】
本発明は、発現タンパク質を産生する変化した能力を有するように遺伝子操作された細胞を提供する。特に、本発明は、対象となるタンパク質の増強された発現を有するバシラス属等のグラム陽性微生物に関し、１つもしくは複数の染色体性遺伝子は不活性化されている、および／または１つもしくは複数の染色体性遺伝子は、バシラス染色体から欠失している。いくつかのさらなる実施形態では、１つもしくは複数の常在染色体領域は、対応する野生型バシラス宿主染色体から欠失している。さらなる実施形態では、バシラスは、アリシクロバシラス属またはアリサイクロバチルス・アシドカルダリウスである。
【０１２２】
さらなる実施形態では、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組み換え、精製、および／もしくは単離ヌクレオチド配列、ならびに／または配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６の配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される、組み換え、精製、および／もしくは単離ポリペプチドを介して、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／もしくは９５℃以上の温度、ならびに／または８、７、６、５、４、３、２、１、および／もしくは０以下および／または以上のｐＨで糖を輸送する方法が含まれる。
【０１２３】
本発明の実施形態では、本発明による単離および／または精製ポリペプチドのいずれか１つが、摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／もしく９５度以上の温度で酵素的に活性であってもよく、ならびに／または８、７、６、５、４、３、２、１、および／もしくは０以下および／もしくは以上のｐＨで酵素的に活性であってもよい。本発明のさらなる実施形態では、グリコシル化、ベグ化、または他の翻訳後修飾は、８、７、６、５、４、３、２、１、および／もしくは０以下のｐＨ、または摂氏約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および／もしくは９５度以上の温度で、可溶性ならびに／または酵素的に活性である本発明による単離および／または精製ポリペプチドのために必要とされてもよい。
【０１２４】
本発明は、以下の例示的実施例において、さらに詳細に記載される。実施例は、本発明の選択された実施形態のみを表し得るが、以下の実施例は、例示的なものであって、それらに制限されないことを理解されたい。
【実施例１】
【０１２５】
アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を使用した糖輸送
配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７で提供されるのは、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスから単離され、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６のそれぞれのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７のヌクレオチド配列は、当該分野における標準的な技術を使用して、発現ベクター内に配置される。その後、該ベクターは、細菌性細胞等の細胞、あるいはＳｆ９細胞またはＣＨＯ細胞等の真核細胞に提供される。細胞内に存在する正常機構と連動して、配列番号２、１９、３６、５３、７０、８７、１０４、１２１、１３８、１５５、１７２、１８９、２０６、２２３、２４０、２５７、２７４、２９１、３０８、３２５、３４２、３５９、３７６、３９３、４１０、４２７、４４４、４６１、４７８、４９５、５１２、５２９、５４６、５６３、５８０、５９７、６１４、６３１、６４８、６６５、６８２、６９９、７１６、７３３、７５０、および７６７を含むベクターは、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６のポリペプチドを産生する。その後、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６のポリペプチドは、単離および／または精製される。その後、配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６の単離および／または精製ポリペプチドは各々、表１に示す活性のうちの１つもしくは複数を有することが示される。
【０１２６】
配列番号１、１８、３５、５２、６９、８６、１０３、１２０、１３７、１５４、１７１、１８８、２０５、２２２、２３９、２５６、２７３、２９０、３０７、３２４、３４１、３５８、３７５、３９２、４０９、４２６、４４３、４６０、４７７、４９４、５１１、５２８、５４５、５６２、５７９、５９６、６１３、６３０、６４７、６６４、６８１、６９８、７１５、７３２、７４９、および７６６の単離および／もしく精製ポリペプチドは、細胞膜内に配置または輸送され、他のタンパク質または細胞成分と併せて、膜を通過して糖を輸送する際に活性を有することが示される。
【０１２７】
本発明は、ある実施形態において説明されたが、本発明は、本開示の精神および範囲内でさらに修正可能である。したがって、本願は、その一般原則を使用する本発明の任意の変種、用途、または適合を網羅することを意図する。さらに、本願は、本発明が関連する当該分野における周知または慣例的実践内にあり、かつ添付の請求項およびそれらの法的同等物の制限内にあるような本開示からの逸脱も網羅することを意図する。
【０１２８】
【表２−１】
2011512802.tif 000004
【０１２９】
【表２−２】
2011512802.tif 000005
【図１】
2011512802.tif 000006
2011512802.tif 000007
【図２Ａ】
2011512802.tif 000008
2011512802.tif 000009
【図２Ｂ】
2011512802.tif 000010
【図３Ａ】
2011512802.tif 000011
2011512802.tif 000012
【図３Ｂ】
2011512802.tif 000013
【図４Ａ】
2011512802.tif 000014
2011512802.tif 000015
【図４Ｂ】
2011512802.tif 000016
【図５】
2011512802.tif 000017
2011512802.tif 000018
【図６】
2011512802.tif 000019
2011512802.tif 000020
【図７Ａ】
2011512802.tif 000021
2011512802.tif 000022
【図７Ｂ】
2011512802.tif 000023
【図８】
2011512802.tif 000024
2011512802.tif 000025
【図９Ａ】
2011512802.tif 000026
2011512802.tif 000027
【図９Ｂ】
2011512802.tif 000028
【図１０Ａ】
2011512802.tif 000029
2011512802.tif 000030
【図１０Ｂ】
2011512802.tif 000031
【図１１Ａ】
2011512802.tif 000032
2011512802.tif 000033
【図１１Ｂ】
2011512802.tif 000034
【図１２Ａ】
2011512802.tif 000035
2011512802.tif 000036
【図１２Ｂ】
2011512802.tif 000037
【図１３】
2011512802.tif 000038
【図１４】
2011512802.tif 000039
2011512802.tif 000040
【図１５】
2011512802.tif 000041
2011512802.tif 000042
【図１６】
2011512802.tif 000043
2011512802.tif 000044
【図１７】
2011512802.tif 000045
2011512802.tif 000046
【図１８Ａ】
2011512802.tif 000047
【図１８Ｂ】
2011512802.tif 000048
【図１９】
2011512802.tif 000049
2011512802.tif 000050
【図２０Ａ】
2011512802.tif 000051
2011512802.tif 000052
【図２０Ｂ】
2011512802.tif 000053
【図２１】
2011512802.tif 000054
2011512802.tif 000055
【図２２】
2011512802.tif 000056
2011512802.tif 000057
【図２３Ａ】
2011512802.tif 000058
2011512802.tif 000059
【図２３Ｂ】
2011512802.tif 000060
【図２４】
2011512802.tif 000061
2011512802.tif 000062
【図２５Ａ】
2011512802.tif 000063
2011512802.tif 000064
【図２５Ｂ】
2011512802.tif 000065
【図２６】
2011512802.tif 000066
2011512802.tif 000067
【図２７Ａ】
2011512802.tif 000068
2011512802.tif 000069
【図２７Ｂ】
2011512802.tif 000070
【図２８Ａ】
2011512802.tif 000071
2011512802.tif 000072
【図２８Ｂ】
2011512802.tif 000073
【図２９】
2011512802.tif 000074
2011512802.tif 000075
【図３０】
2011512802.tif 000076
2011512802.tif 000077
【図３１Ａ】
2011512802.tif 000078
2011512802.tif 000079
【図３１Ｂ】
2011512802.tif 000080
【図３２】
2011512802.tif 000081
2011512802.tif 000082
【図３３】
2011512802.tif 000083
2011512802.tif 000084
【図３４】
2011512802.tif 000085
2011512802.tif 000086
【図３５】
2011512802.tif 000087
2011512802.tif 000088
【図３６】
2011512802.tif 000089
2011512802.tif 000090
【図３７】
2011512802.tif 000091
2011512802.tif 000092
【図３８Ａ】
2011512802.tif 000093
2011512802.tif 000094
【図３８Ｂ】
2011512802.tif 000095
【図３９】
2011512802.tif 000096
【図４０】
2011512802.tif 000097
2011512802.tif 000098
【図４１】
2011512802.tif 000099
2011512802.tif 000100
【図４２】
2011512802.tif 000101
2011512802.tif 000102
【図４３】
2011512802.tif 000103
2011512802.tif 000104
【図４４】
2011512802.tif 000105
【図４５】
2011512802.tif 000106
2011512802.tif 000107
【図４６Ａ】
2011512802.tif 000108
2011512802.tif 000109
【図４６Ｂ】
2011512802.tif 000110
【国際調査報告】
2011512802.tif 000111
2011512802.tif 000112
2011512802.tif 000113