(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞を分化させる方法を目的とする。具体的には、本発明は、多能性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させるための方法及び組成物を目的とする。本発明はまた、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと多能性幹細胞を分化させ得る剤を、生成及び精製する方法も、提供する。
2011526784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させるのに十分な時間にわたって、少なくとも１箇所に点変異を有するアクチビンＡのアミノ酸配列を含むペプチドを含有している培地で、前記多能性幹細胞を処理することを含む、多能性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させるための方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１箇所の点変異が、アクチビンＡのアミノ酸配列内の、１０Ｉ、１６Ｆ、３９Ｙ、４１Ｅ、４３Ｅ、７４Ｆ、７５Ａ、７６Ｎ、７７Ｌ、７８Ｋ、７９Ｓ、及び８２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１箇所の点変異が、欠失、挿入及び置換からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１箇所の点変異が、アクチビンＡのアミノ酸配列内の、１６Ｆ、１８Ｖ、１９Ｓ、２０Ｆ、３７Ａ、３８Ｎ、３９Ｙ、４１Ｅ、７４Ｆ、８２Ｖ、１０７Ｎ、１０９Ｉ、１１０Ｖ、及び１１６Ｓからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１箇所の点変異が、欠失、挿入及び置換からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１箇所に点変異を含有するアクチビンＡのアミノ酸配列を含む前記ペプチドを、アフィニティー精製カラム中の固体基材上のリガンドに特異的に結合する能力を有する、少なくとも１つの領域を含有させるために更に改質する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アフィニティー精製カラム中の固体基材上のリガンドに特異的に結合する能力を有する、前記少なくとも１つの領域が、金属結合部位である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記金属結合部位が１対のヒスチジン残基を含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本発明は、米国特許公開番号第６１／０７６，８８９号（２００８年６月３０日出願）に対する優先権を請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、多能性幹細胞を分化させる方法を目的とする。具体的には、本発明は、多能性幹細胞を胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させるための方法及び組成物を目的とする。本発明はまた、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと多能性幹細胞を分化させ得る剤を、生成及び精製する方法も、提供する。
【背景技術】
【０００３】
１型糖尿病の細胞置換療法における進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足のため、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法は、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成させることである。
【０００４】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、例えばＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７などの多くのマーカーを発現する。
【０００５】
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程となっている。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含有する。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００６】
島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１３８９、２００１年）は、マウスの胚性幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１５７、２０００年）は、ストレプトゾトシン糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正常化することを報告している。
【０００７】
一例において、ホリ（Hori）ら（ＰＮＡＳ  ９９：１６１０５、２００２年）は、ホスホイノシチド３−キナーゼの阻害剤（ＬＹ２９４００２）でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。
【０００８】
他の例では、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ１００：９９８、２００３年）が、Ｐａｘ４を構成的に発現しているマウス胚性幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。
【０００９】
Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸が、胚性幹細胞のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を制御できることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に対応する期間中の、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加されると、ＰＤＸ１発現の誘発に最も効果的である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：３０１、２００５年）。
【００１０】
Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｐｄｘ１を過剰発現しているマウス胚性幹細胞株を報告している。Ｍｉｙａｚａｋｉらの結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨＮＦ６遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１０３０、２００４年）。
【００１１】
Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。
【００１２】
最大の効果は、１ｎＭアクチビンＡを使用しときに観察された。Ｓｋｏｕｄｙらはまた、インスリン及びＰｄｘ１  ｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸により影響されなかったが、３ｎＭ  ＦＧＦ７での処理によりＰｄｘ１の転写産物のレベルが増大したことも観察している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９、２００４年）。
【００１３】
Ｓｈｉｒａｋｉらは、胚性幹細胞のＰＤＸ１陽性細胞への分化を特異的に増大させる増殖因子の効果を研究した。Ｓｈｉｒａｋｉらは、ＴＧＦβ２が、ＰＤＸ１陽性細胞のより高い割合を再現性よく生み出すことを観察した（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２００５年６月、１０（６）：５０３〜１６）。
【００１４】
Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の非存在下、及びアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下での、マウス胚性幹細胞からの短尾奇形［陽性］／ＨＮＦ−３β［陽性］内胚葉細胞の誘導を示した（米国特許第２００６／０００３４４６（Ａ１）号）。
【００１５】
Ｇｏｒｄｏｎら（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ  １０３，ｐａｇｅ  １６８０６，２００６）は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンシグナル伝達は、前側の原始線条の生成のために同時に必要である」と述べている。
【００１６】
しかしながら、胚性幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒト等のより高等な哺乳動物における発達プログラムを正確には模倣しない恐れがある。
【００１７】
Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚性幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４、１９９８年）。同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児性腺組織から、ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６、１９９８年）。白血病抑制因子（ＬＩＦ）と共に培養するのみでも分化を阻止し得るマウス胚性幹細胞とは異なり、ヒト胚性幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号、国際公開第９９／２０７４１号；同第０１／５１６１６号）。
【００１８】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下でのヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮培地の生成を記載している（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  Ｋ  Ａら、２００５年）。これらの細胞を、マウスの腎臓被膜下に移植することにより、一部の内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が得られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。
【００１９】
Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４、１３９２〜１４０１（２００６年））は、「我々はヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、膵臓ホルモンインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンを合成できる内分泌細胞へと変換する分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆細胞に似たステージを経て、内分泌ホルモンを発現する細胞に細胞を誘導することによりインビボで膵臓の器官形成を模倣するものである。」と述べている。
【００２０】
別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（米国特許出願公開第２００６／００４０３８７Ａ１号）。この場合、分化経路は３つのステージに分割された。最初に、ｎ−ブチレートとアクチビンＡとの組み合わせを使用して、ヒト胚性幹細胞を内胚葉に分化させた。次に細胞をノギンなどのＴＧＦβアンタゴニストと共に、ＥＧＦ又はベータセルリンの組み合わせて培養してＰＤＸ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。
【００２１】
１つの例において、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙらは、「我々は、ＰＤＸ１の過剰発現が、膵臓に多く見られる遺伝子の発現を増加させたことを結論付けた。すなわちインスリン発現の誘導は、インビボでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００６；２４：１９２３〜１９３０）。
【００２２】
アクチビンＡは、細胞増殖及び分化の制御、並びに神経生存の促進を含む、広範な生物活性を呈するＴＧＦ−βファミリーのメンバーである。アクチビンＡはホモ二量体であり、インヒビンＡ遺伝子でコードされる２つのアクチビンβＡサブユニットからなる。その他のアクチビンがβＡ  βＣ、βＤ及びβＥサブユニットのホモ又はヘテロ二量体からなることは既知である。例えば、アクチビンＢは２つのβＢサブユニットのホモ二量体からなる。βＡサブユニットとβＢサブユニットを含むペプチドは６３％相同性であり、どちらのペプチド配列中にも８個のシステインの位置が保存されている。
【００２３】
アクチビンＡは受容体に結合することで細胞に対して効果を発揮する。受容体は、それぞれ細胞内セリン／スレオニンキナーゼドメインを含有する２種類の受容体、すなわちＩ型（ＡｃｔＲ−Ｉ）及びＩＩ型（ＡｃｔＲ−ＩＩ）の受容体からなる、受容体ヘテロ複合体（heteromeric receptor complex）からなる。これらの受容体は、システインリッチ細胞外領域及びキナーゼドメインからなる細胞内領域により、構造的に類似している。ＡｃｔＲ−Ｉは（ＡｃｔＲ−ＩＩは異なる）、膜近傍ドメイン中に、グリシン残基及びセリン残基がリッチな領域（ＧＳドメイン）を有する。まず、アクチビンＡがＡｃｔＲ−ＩＩ（常時活性型キナーゼのオリゴマー形態として細胞膜に存在）に結合する。オリゴマー型としても存在するＡｃｔＲ−Ｉは、ＡｃｔＲ−ＩＩの非存在下ではアクチビンＡに結合できない。ＡｃｔＲ−ＩはアクチビンＡが結合した後のＡｃｔＲ−ＩＩ複合体に取り込まれる。次いでＡｃｔＲ−ＩＩはＡｃｔＲ−ＩのＧＳドメインをリン酸化し、対応するキナーゼを活性化する。
【００２４】
アクチビンＡの単離及び精製は、多くの場合複雑であり、しばしば乏しい収率をもたらし得る。例えば、Ｐａｎｇａｓ，Ｓ．Ａ．及びＷｏｏｄｒｕｆｆ，Ｔ．Ｋは、「インヒビン及びアクチビンは、下垂体ＦＳＨ分泌の制御を含む多様な生理的役割を有するタンパク質ホルモンである。トランスフォーミング増殖因子−β遺伝子ファミリーの他のメンバーと同様、それらはより大きな前駆体分子の状態でプロセシングを受け、そして機能的二量体へとアセンブリされる。天然源からのインヒビン及びアクチビンの単離では、限られた量の生理活性タンパク質しか生成されない。」と記載している（Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７２（２００２）１９９〜２１０）。
【００２５】
他の実施例では、Ａｒａｉ，Ｋ．Ｙ．らが「アクチビンはトランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーに属する多機能性増殖因子である。天然源からのアクチビンの単離は多工程を必要とし、限られた量しか生成されない。近年の研究で用いられている組み換え体調製法でさえも、アクチビン組み換え体の精製には未だに多工程を必要とする。」と記載している（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ４９（２００６）７８〜８２）。
【００２６】
アクチビンＡよりも強力な又はより安い代替物を開発するためのこれまでの努力は多大なものである。例えば米国特許第５２１５８９３号は、インヒビンのα鎖又はβ鎖を含有するタンパク質を、遺伝子組換え細胞の培養物中に産生するための方法を開示する。この方法は、具体的にはインヒビンをコードするＤＮＡを得て使用する方法、並びに天然の動物又はヒトインヒビンのアミノ酸配列から離れた、及び天然の動物又はヒトインヒビンの自然に生じる対立遺伝子から離れたインヒビン変異体を製造する方法に関する。
【００２７】
他の例では、米国特許第５７１６８１０号は、インヒビンα又はβ鎖を含有するタンパク質を遺伝子組換え細胞の培養物中に製造するための方法を開示する。この方法は、具体的にはインヒビンをコードするＤＮＡを得て使用する方法、並びに天然の動物又はヒトインヒビンのアミノ酸配列から離れた、及び天然の動物又はヒトインヒビンの自然に生じる対立遺伝子から離れたインヒビン変異体を製造する方法に関する。
【００２８】
他の例では、米国特許第５５２５４８８号は、インヒビンα又はβ鎖を含有するタンパク質を、遺伝子組換え細胞の培養物中に製造するための方法を開示する。この方法は、具体的にはインヒビンをコードするＤＮＡを得て使用する方法、並びに天然の動物又はヒトインヒビンのアミノ酸配列から離れた、及び天然の動物又はヒトインヒビンの自然に生じる対立遺伝子から離れたインヒビン変異体を製造する方法に関する。
【００２９】
他の例では、米国特許第５６６５５６８号は、インヒビンα又はβ鎖を含有するタンパク質を遺伝子組換え細胞の培養物中に製造するための方法を開示する。この方法は、具体的にはインヒビンをコードするＤＮＡを得て使用する方法、並びに天然の動物又はヒトインヒビンのアミノ酸配列から離れた、及び天然の動物又はヒトインヒビンの自然に生じる対立遺伝子から離れたインヒビン変異体を製造する方法に関する。
【００３０】
他の例では、米国特許第４７３７５７８号は、インヒビン活性を有し、約３２，０００ダルトンの重量を有するタンパク質を開示する。この分子は、それぞれ約１８，０００ダルトンの分子量及び約１４，０００ダルトンの分子量を有する２本鎖からなり、この鎖はジスルフィド結合により互いに結合している。１８Ｋ鎖はヒトインヒビン遺伝子より得られ、以下の式を有する：Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｒ．置換６５（R.sub.65）−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−ＯＨ、ここでＲ．置換６５は、Ｉｌｅ又はＡｒｇである。１８Ｋ鎖は、ジスルフィド結合により１４Ｋ鎖と連結している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
したがって、多能性幹細胞の分化を促進するための、より安価でより強力なアクチビンＡ代替物に対して、有意な必要性が未だに存在している。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと多能性幹細胞を分化させ得る化合物を提供する。一実施形態では、多能性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させ得る化合物は、少なくとも１箇所に点変異を有する、アクチビンＡのアミノ酸配列を含むペプチドである。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させるのに十分な時間にわたって、少なくとも１箇所に点変異を有するアクチビンＡのアミノ酸配列を含むペプチドを含有している培地で、多能性幹細胞を処理することを含む、多能性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させるための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ペプチドＡＣＴＮ  ２〜ＡＣＴＮ  ４８の系統樹を示す。
【図２】ペプチドＡＣＴＮ  ４９〜ＡＣＴＮ  ９４の系統樹を示す。
【図３】ｐｃＤＮＡ３．１（−）中にクローン化された野生型アクチビンＡのプロ領域（pro-region）の核酸配列を示す。
【図４】ｐｃＤＮＡ３．１（−）中にクローン化されたＡＣＴＮ  １の成熟領域（mature region）の核酸配列を示す。
【図５】ｐｃＤＮＡ３．１（−）中にクローン化した、プロ領域及び成熟領域を含有しているＡＣＴＮ  １の完全長遺伝子の核酸配列を示す。
【図６】ＡＣＴＮ  １（◆ＡＣＴＮ  １野生型）及び対照アクチビンＡ（■及び▲ＯｒｉＧｅｎｅ野生型）が、ヒト胚性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる能力を示す。それぞれの代表的な哺乳類細胞用発現ベクター中にクローン化したＡＣＴＮ  １（◆ＡＣＴＮ  １野生型）及び野生型対照アクチビンＡ（■ＯｒｉＧｅｎｅ野生型）をＨＥＫ２９３−Ｅ細胞にトランスフェクトし、得られたそのままの上清を（未濃縮）、又は得られた上清の濃縮物（濃縮）を、記載のアッセイ希釈率でヒト胚性幹細胞に加えた。未処理対照細胞と比較してＳＯＸ１７発現強度を測定することで分化を判定した。
【図７】本発明のペプチドを得るために使用した発現コンストラクトを示す。パネルＡは、ｐＵＮＤＥＲ中にクローン化した、プロ領域及び成熟領域を含有しているＡＣＴＮ  １完全長遺伝子の、核酸配列を示す。発現ベクターの図的記述をパネルＢに示す。
【図８】それぞれの代表的な哺乳類細胞用発現ベクター中にクローン化したＡＣＴＮ  １及び野生型アクチビンＡ対照の、ヒト胚性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる能力を示す。パネルＡは、アッセイ細胞数に対する上清の効果を示す。ｐＵＮＤＥＲ中にクローン化したＡＣＴＮ  １及びｐＣＭＶ６−ＸＬ４中にクローン化した野生型アクチビンＡ対照（ＯｒｉＧｅｎｅ）をＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（白色バー）及びＣＨＯ−Ｓ細胞（黒色バー）にトランスフェクトし、回収したままの上清を、又は１０倍濃縮した上清を、胚体内胚葉バイオアッセイに記載の希釈率で試験した。データは未処理細胞と比較して表わされる変化を示す。パネルＢは、ＳＯＸ１７発現に対する上清の効果を示す。ｐＵＮＤＥＲ中にクローン化したＡＣＴＮ  １及びｐＣＭＶ６−ＸＬ４中にクローン化した野生型アクチビンＡ対照（ＯｒｉＧｅｎｅ）をＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（白色バー）及びＣＨＯ−Ｓ細胞（黒色バー）にトランスフェクトし、回収したままの上清を、又は１０倍濃縮した上清を、胚体内胚葉バイオアッセイに記載の希釈率で試験した。データは未処理細胞と比較して表わされる変化を示す。
【図９】記載の完全長のペプチド（ＡＣＴＮ  ２、ＡＣＴＮ  ４、ＡＣＴＮ  ５、ＡＣＴＮ  ６、ＡＣＴＮ  ７、及びＡＣＴＮ  ８）をコードする遺伝子を含有しているｐＵＮＤＥＲベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞の上清中の、本発明のペプチドの発現量を示す。上清を得て、ウェスタンブロットにより解析した。メンブレンは抗アクチビンＡ抗体で探索した。
【図１０】記載の完全長のペプチド（ＡＣＴＮ  ９、ＡＣＴＮ  １０、ＡＣＴＮ  １１、ＡＣＴＮ  １２、ＡＣＴＮ  １４、ＡＣＴＮ  １６、ＡＣＴＮ  １７、ＡＣＴＮ  １８、ＡＣＴＮ  １９、ＡＣＴＮ  ２０、ＡＣＴＮ  ２１、ＡＣＴＮ  ２２及びＡＣＴＮ  ２３）をコードする遺伝子を含有しているｐＵＮＤＥＲベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞の上清中の、本発明のペプチドの発現量を示す。上清を得て、ウェスタンブロットにより解析した。メンブレンは抗アクチビンＡ抗体で探索した。
【図１１】ヒスチジン置換を含有するよう更に改質させた本発明のペプチドの、発現量を示す。ＡＣＴＤ  １７、ＡＣＴＤ  １８、ＡＣＴＤ  １９、ＡＣＴＤ  ２０、ＡＣＴＤ  ２１、及びＡＣＴＤ  ２２をコードする遺伝子を含有しているｐＵＮＤＥＲベクターで、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞にトランスフェクトした。上清を得て、ウェスタンブロットにより解析した。抗アクチビンＡ抗体（Ｍａｂ  ３３８１−左側）又は抗前駆体抗体（Ｍａｂ  １２０３−右側）でメンブレンを探索した。
【図１２】ＡＣＴＤ  ２０を目的とした典型的なＩＭＡＣ精製のプロファイルを示す。充填後にカラムを洗浄し、カラム用量の２０倍以上にわたって、イミダゾールの直線濃度勾配（０〜５００ｍＭ）によりタンパク質を溶出させた。
【図１３】ＡＣＴＤ  １７、ＡＣＴＤ  １８、ＡＣＴＤ  １９、ＡＣＴＤ  ２０、ＡＣＴＤ  ２１、及びＡＣＴＤ  ２２についてのイミダゾール画分を対象とする、ウェスタンブロット溶出プロファイルを示す。
【図１４】フォリスタチン遺伝子のＡＣＴＡ  １を含むベクター、ＡＣＴＡ  ２を含むベクター及びＡＣＴＡ  ３を含むベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞の上清から得られるフォリスタチン変異体の発現量についての、典型的なウェスタンブロットを示す。メンブレンは記載の抗体で探索した。
【図１５】ＡＣＴＡ  ３についての、典型的なＩＭＡＣ精製プロファイルを示す（パネルＡ）。充填後にカラムを洗浄し、タンパク質をイミダゾールの段階的な濃度勾配（１０ｍＭ、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、２５０ｍＭ及び５００ｍＭ）で溶出させた。パネルＢはＩＭＡＣ精製の溶出プロファイルの銀染色ゲルを示す。
【図１６】ＡＣＴＡ  ３アフィニティーカラムを用いてのペプチド変異体ＡＣＴＮ  １の典型的な精製物の、ウェスタンブロットを示す（パネルＡ及びＢ）。メンブレンは記載の抗体で探索した。パネルＣは、ＡＣＴＡ  ３アフィニティーカラムを用いてのペプチド変異体ＡＣＴＮ  １の典型的な精製物の銀染色ゲルを示す。
【図１７】胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へのヒト胚性幹細胞の分化を示す。分化は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて細胞数（パネルＡ）とＳＯＸ１７強度（パネルＢ）を計測することで判定した。ヒト胚性幹細胞は、２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａに加え表示された濃度でアクチビンＡを含有する培地（黒色バー）、又はＷｎｔ３ａは不含だが表示された濃度でアクチビンＡを含有する培地（白色バー）で、４日間にわたって処理した。
【図１８】ＡＣＴＮ  １（白色バー）及び対照アクチビンＡ（斜線バー及び黒色バー）の、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へとヒト胚性幹細胞を分化させる能力を示す。ｐｃＤＮＡ３．１（−）中にクローン化したＡＣＴＮ  １（白色バー）及び対照アクチビンＡ（斜線バー）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｅ細胞から上清を得て濃縮し、次いで記載の希釈率でヒト胚性幹細胞に添加した。ＳＯＸ１７発現強度を測定することで分化を判定した。
【図１９】アクチビンＡを用いての、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へのヒト胚性幹細胞の分化を示す。パネルＡは、市販のヒト組換えアクチビンＡを使用し、ＳＯＸ１７強度を測定する、ヒト胚性幹細胞分化についての検量線を示す。記載の濃度のアクチビンＡで細胞を４日間にわたって処理した。データは、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出したＳＯＸ１７発現レベルの平均値を示す。パネルＢは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へのヒト胚性幹細胞の分化に対する、ＡＣＴＮ  １の能力を示す。ｐＵＮＤＥＲ（ｐＵＮＤＥＲ）中にクローン化したＡＣＴＮ  １でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（白色バー）及びＣＨＯ−Ｓ細胞（黒色バー）、並びにｐＣＭＶ６−ＸＬ４中にクローン化した野生型アクチビンＡ対照（ＯｒｉＧｅｎｅ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞及びＣＨＯ−Ｓ細胞から得られた上清を、記載の濃度でヒト胚性幹細胞に添加し、ＳＯＸ１７発現レベルを４日後に測定した。
【図２０】アクチビンＡ  ＥＬＩＳＡの製造者により提供された、ヒト組換えアクチビンＡの検量線を示す（パネルＡ）。パネルＢは、アクチビンＡ  ＥＬＩＳＡでの、２つの市販のヒト組換えアクチビンＡ標準品の検量線を比較し、白色の四角（□）は製造元（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）より提供のアクチビンＡを意味し、黒色三角（▲）はＰｅｐｒｏｔｅｃｈより購入したアクチビンＡを意味する。
【図２１】分化の第１工程時の様々な処理後のＣＸＣＲ４発現についての、フローサイトメトリー解析の結果を示す。ＣＸＣＲ４陽性細胞の百分率に関するヒストグラムを、アクチビンＡ、アクチビンＡ無し、又は非精製上清原液若しくはＩＭＡＣ精製物として試験した２種のヒスチジン変異ペプチド（ＡＣＴＤ３及びＡＣＴＤ８）での処理について示す。
【図２２】のパネルＡ〜Ｉは、所定のペプチド濃度の用量漸増に対する、ＳＯＸ１７の発現強度の相対％を示す。ペプチド濃度はＥＬＩＳＡの結果からあらかじめ算出した。各パネルの代表的な曲線は野生型アクチビンＡペプチド（ＡＣＴＮ１）と変異ペプチドとを比較する。代表的なＲ２値により、各曲線についての相対的な一致を示す。
【図２３】分化の第１工程の終了時に、胚体内胚葉に代表的な複数種のマーカーについての、フローサイトメトリー、ＰＣＲ、及びハイコンテンツな手法を用いて得られた結果を示す。パネルＡは、分化処理時に市販のアクチビンＡ又は野生型ＡＣＴＮ１ペプチドを用いた場合のＣＸＣＲ４発現についての、ＦＡＣＳ解析を示す。パネルＢは、２つの変異ペプチド（ＡＣＴＮ４及びＡＣＴＮ４８）に対するＣＸＣＲ４発現について、野生型ＡＣＴＮ１ペプチドに対するＣＸＣＲ４発現と比較して示す。パネルＣ〜Ｆは、野生型アクチビンＡ又は個別の変異ペプチドでの処理後の、分化の第１工程終了時の細胞数及びＳＯＸ１７発現についての、ハイコンテンツな解析を示す。パネルＧ及びＨは、野生型ＡＣＴＮ１又は変異ペプチドＡＣＴＮ４又はＡＣＴＮ４８での処理後の、分化の第１工程終了時の、ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２遺伝子発現についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。挿入した表に各遺伝子マーカーのＣＴ値を記す。
【図２４】分化の第１工程時の野生型ＡＣＴＮ１、又は変異ペプチドＡＣＴＮ４若しくはＡＣＴＮ４８での処理後に、分化の第３工程終了時に得られる結果を示す。結果は、細胞数についてのハイコンテンツな解析（パネルＡ及びＢ）、ＰＤＸ１タンパク質発現（パネルＣ及びＤ）、ＣＤＸ２タンパク質発現（パネルＥ及びＦ）、又はＰＤＸ１若しくはＣＤＸ２についてのＲＴ−ＰＣＲの結果（パネルＧ及びＨ）で表現する。挿入した表に各遺伝子マーカーのＣＴ値を記す。
【図２５】分化の第１工程時の野生型ＡＣＴＮ１、又は変異ペプチドＡＣＴＮ４若しくはＡＣＴＮ４８での処理後に、分化の第４工程終了時に得られるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。挿入した表に各遺伝子マーカーのＣＴ値を記す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
開示を明確にするために、本発明の「発明を実施するための形態」を、限定を目的とすることなく、本発明の特定の特徴、実施形態、又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【００３６】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００３７】
幹細胞は、発生上の能力によって、（１）全ての胚性又は胚体外細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化全能性、（２）全ての胚性細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化万能性、（３）細胞系のサブセットを生ずる能力を有するが、それらが全て特定の組織、臓器、又は生理学的システムのものであるような、分化多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生性）、血球限定的寡能性前駆細胞、及び、血液の通常の成分である全ての細胞種及び要素（例えば、血小板）を生じうる）、（４）多能性幹細胞よりも限定された細胞系のサブセットを生ずる能力を有することを意味する、分化寡能性、及び（５）単一の細胞系（例えば、精原幹細胞）を生ずる能力を有することを意味する、分化単一性に分類される。
【００３８】
分化は、非特殊化の（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞等の特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘発された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。
【００３９】
「β−細胞系」は、転写因子ＰＤＸ１、及び以下の転写因子、すなわちＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、又はＰＡＸ６の少なくとも１つについて遺伝子の発現が陽性である細胞を指す。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞を含む。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」、又は「ステージ１細胞」、又は「ステージ１」とは、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞を含む。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＰＤＸ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１α、ＨＮＦ６、又はＨＢ９の内の少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞」、又は「ステージ５細胞」、又は「ステージ５」とは、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４又はＰＴＦ−１αのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ細胞系の細胞が挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわちＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ケルベロス、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１を発現する。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、又はＳＰＡＲＣのうちの少なくとも１つを発現する細胞の集団を指す。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「中内胚葉細胞」は、以下のマーカー、すなわちＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、又はＧＡＴＡ６のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、又は膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す。
【００４８】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉細胞」、又は「ステージ４細胞」、又は「ステージ４」とは、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＰＡＸ４又はＮＫＸ２．２のうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。
【００４９】
本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン産生細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、又は膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを産生することが可能な細胞を指す。
【００５０】
本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン分泌細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、又は膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。
【００５１】
本明細書で使用するとき、「前腸後部細胞」、又は「ステージ３細胞」、又は「ステージ３」とは、以下のマーカー、すなわちＰＤＸ１、ＨＮＦ１、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。
【００５２】
本明細書で使用するとき、「前原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ノーダル（Nodal）、又はＦＧＦ８のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００５３】
本明細書で使用するとき、「原始腸管細胞」、又は「ステージ２細胞」、又は「ステージ２」とは、以下のマーカー、すなわちＨＮＦ１、ＨＮＦ４αのうちの少なくとも１つを分泌することができる細胞を指す。
【００５４】
本明細書で使用するとき、「原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、Ｂｒａｃｈｉｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。
【００５５】
本発明のペプチド
本発明は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと多能性幹細胞を分化させ得るペプチドを提供する。一実施形態では、本発明のペプチドは、少なくとも１箇所に点変異を有する、アクチビンＡのアミノ酸配列を含むペプチドである。少なくとも１箇所の点変異は、アクチビンＡの領域内に存在し、受容体への結合を促進し得る。あるいは少なくとも１箇所の点変異は、アクチビンＡホモ二量体のインターフェース内にあるアクチビンＡの領域に存在し得る。
【００５６】
本発明のペプチドは、１箇所の点変異を含有し得る。あるいは、本発明のペプチドは複数箇所の点変異を含有し得る。一実施形態では、アクチビンＡの結晶構造を解析することにより少なくとも１箇所の点変異が判定され、特定のアミノ酸残基が変異のために選択される。少なくとも１箇所の点変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されるという形態で存在し得る。あるいは少なくとも１箇所の点変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失しているという形態で存在し得る。あるいは少なくとも１箇所の点変異は、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されているという形態で存在し得る。
【００５７】
少なくとも１つのアミノ酸の置換は、特定の位置で少なくとも１つのランダムなアミノ酸が置換されているという形態で存在し得る。あるいは少なくとも１つのアミノ酸の置換は、特定の位置で少なくとも１つの特定のアミノ酸が置換されているという形態で存在し得る。一実施形態では、置換に用いられる少なくとも１つの特定のアミノ酸は、その少なくとも１つの特定のアミノ酸が、結果として得られるホモ二量体構造上に存在し得るように、計算予測して選択される。
【００５８】
一実施形態では、少なくとも１箇所の点変異は、アクチビンＡのアミノ酸配列内の、１０Ｉ、１６Ｆ、３９Ｙ、４１Ｅ、４３Ｅ、７４Ｆ、７５Ａ、７６Ｎ、７７Ｌ、７８Ｋ、７９Ｓ、及び８２Ｖからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に導入した。
【００５９】
一実施形態では、少なくとも１箇所の点変異は、アクチビンＡのアミノ酸配列内の、１６Ｆ、１８Ｖ、１９Ｓ、２０Ｆ、３７Ａ、３８Ｎ、３９Ｙ、４１Ｅ、７４Ｆ、８２Ｖ、１０７Ｎ、１０９Ｉ、１１０Ｖ、及び１１６Ｓからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に導入した。
【００６０】
本発明のペプチドのアミノ酸配列を、表１に見出すことができる。
【００６１】
一実施形態では、本発明のペプチドのアミノ酸配列は、核酸配列へと戻して翻訳（back translate）される。核酸配列を合成し、発現ベクターへと挿入することで、哺乳類細胞中で発現できるようしてもよい。核酸配列をｐｃＤＮＡ３．１（−）発現ベクター内に挿入してもよい。あるいは核酸配列をｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター変異体に挿入してもよく、ここでベクターには、挿入した核酸配列の、哺乳類細胞内での発現を増加させるような変更を加えてよい。一実施形態では、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターの変異体は、ｐＵＮＤＥＲとして既知である。
【００６２】
本発明のペプチドの核酸配列を、表２に見いだすことができる。
【００６３】
本発明のペプチドの核酸配列を含む発現ベクターは、哺乳類細胞中に一過性的にトランスフェクトすることができる。あるいは本発明のペプチドの核酸配列を含む発現ベクターは、哺乳類細胞中に安定的にトランスフェクトすることができる。任意のトランスフェクション法が本発明に好適である。例えばこのようなトランスフェクション法は、ＣａＣｌ2によるトランスフェクション、又はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）によるトランスフェクションである場合がある。好適なトランスフェクション法の例については、実施例２を参照されたい。
【００６４】
哺乳類細胞は、懸濁液の状態で、あるいは別の方法としては単層として培養することができる。本発明に採用され得る哺乳類細胞の例を実施例２に見出すことができ、本発明に採用され得る別の哺乳類細胞を実施例３に見出すことができる。
【００６５】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、例えばＫｒｏｎ，Ｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７２（１９９８）９〜１４）に記載の系などの、昆虫細胞発現系で発現させることもできる。
【００６６】
本発明のペプチドの精製
本発明のペプチドは、それらのペプチドを発現する哺乳類細胞から単離することができる。一実施形態では、哺乳類細胞を分画し、本発明のペプチドを含有するその上清を回収する。上清からペプチドを精製することができる。別の方法としては、上清を直接使用してもよい。上清を直接使用する場合、上清はヒト多能性幹細胞に直接適用する。一実施形態では、ヒト多能性幹細胞への適用に先立ち上清を濃縮する。
【００６７】
本発明のペプチドを上清から精製する場合、任意の好適なタンパク質精製技術（例えば、分子ふるいクロマトグラフィーなど）を用いてペプチドを精製することができる。一実施形態では、本発明のペプチドはアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。
【００６８】
一実施形態では、本発明のペプチドは、以下の工程を含む方法による、アフィニティークロマトグラフィーにより精製される。
ａ．本発明のペプチドをコードするベクターで、細胞にトランスフェクトする工程、
ｂ．細胞にペプチドを発現させる工程、
ｃ．細胞を分画し、ペプチドを含有している上清を採取する工程、
ｄ．上清に、ペプチドに特異的に結合することができるリガンドを含有する固体マトリックスで充填したアフィニティー精製カラムを通過させる工程、
ｅ．固体マトリックスに結合しているペプチドを溶出する工程（この工程でペプチドの精製物を得る）。
【００６９】
一実施形態では、本発明のペプチドに特異的に結合することができるリガンドはフォリスタチンである。
【００７０】
一実施形態では、本発明のペプチドは更に改質されて、アフィニティー精製カラム内の固体基材上のリガンドに特異的に結合することができる少なくとも１つの領域を含有する。一実施形態では、本発明のペプチドは更に改質されて、アミノ酸配列内に少なくとも１つの金属結合部位を含有する。更なる改質は、アミノ酸残基を欠失させることで、アフィニティー精製カラム内の固体基材上のリガンドに特異的に結合することができる領域を形成することから構成されてもよい。別の方法としては、更なる改質は、アミノ酸残基を挿入することで、アフィニティー精製カラム内の固体基材上のリガンドに特異的に結合することができる領域を形成することから構成されてもよい。別の方法としては、更なる改質は、アミノ酸残基を置換することで、アフィニティー精製カラム内の固体基材上のリガンドに特異的に結合することができる領域を形成することから構成されてもよい。一実施形態では、少なくとも１つの金属結合部位は２つのヒスチジン残基からなる。一実施形態では、ヒスチジン残基は、少なくとも１箇所に点変異を有する、アクチビンＡのアミノ酸配列を含有しているペプチドの、アミノ酸配列中に置換される。表３は、金属結合部位を含有するよう更に改質させた本発明のペプチドの一覧を示す。これらの実施形態では、ペプチドに特異的に結合することができるリガンドはニッケルである。
【００７１】
別の実施形態では、本発明のペプチドはＰａｎｇａｓ，Ｓ．Ａ．及びＷｏｏｄｒｕｆｆ（Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７２（２００２）１９９〜２１０）に記載の方法に従って精製される。
【００７２】
別の実施形態では、本発明のペプチドはＡｒａｉ，Ｋ．Ｙ．ら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４９（２００６）７８〜８２）に記載の方法に従って精製される。
【００７３】
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞の多能性は、例えば細胞を重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成された奇形腫を４％パラホルムアルデヒドを使用して固定した後、それらを３つの胚葉からの細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【００７４】
増殖した多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定することができ、確立された対応する霊長類種の核型と比較される。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、これは細胞が正倍数体であることを意味し、全ヒト染色体が存在し、かつ、著しく変更されてはいない。
【００７５】
多能性幹細胞の源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。
【００７６】
一実施形態において、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３  ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）に記載されているように調製される。
【００７７】
一実施形態では、多能性幹細胞はＴａｋａｈａｓｈｉら（Ｃｅｌｌ  １３１：１〜１２，２００７）により記載されているように調製する。
【００７８】
多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞は、一般にフィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。あるいは多能性幹細胞は、基本的にフィーダー細胞を含まないにもかかわらず多能性幹細胞の増殖を支持する培養系において、実質的に分化することなく培養される。フィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、あらかじめ他の細胞種を培養することにより条件づけした培地を使用して支持される。あるいはフィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、合成培地を使用して支持される。
【００７９】
多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。一実施形態では、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養基材はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞から得られる可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【００８０】
他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【００８１】
多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な分布にて播かれてもよい。これら全特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから利益を得、当業者は容易に決定することができる。
【００８２】
好適な培地は以下の構成要素、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １１９６５−０９２）、ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １０８２９−０１８）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２／５０％  ＤＭＥＭ基本培地、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １５０３９−０２７）、非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０）、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  ＃  Ｍ７５２２）、ヒト組換え塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １３２５６−０２９）から作製されてもよい。
【００８３】
多能性幹細胞からの膵臓ホルモン産生細胞の形成
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞を作製するための方法を提供し、かかる方法は、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、
ｄ．膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させる工程と、を含む。
【００８４】
本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン産生細胞である。別の態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤＸ１と、以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、又はＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞である。
【００８５】
本発明での使用に好適な多能性幹細胞としては、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨ  ｃｏｄｅ：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨ  ｃｏｄｅ：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨ  ｃｏｄｅ：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０又はＴｒａ１−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も本発明での使用に適している。
【００８６】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００８７】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、膵臓内胚葉系の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【００８８】
膵内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、及びＰＴＦ−１αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモンの少なくとも１つを発現することができる：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。本発明で使用するのに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。代替的に、膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【００８９】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
本発明の一態様では、多能性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができるように十分な時間にわたって、本発明のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理することで、多能性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００９０】
多能性幹細胞を、本発明のペプチドを含有している培地で約１日〜約７日間にわたって処理することもできる。別の方法としては、多能性幹細胞を、本発明のペプチドを含有している培地で約１日〜約６日間にわたって処理することもできる。別の方法としては、多能性幹細胞を、本発明のペプチドを含有している培地で約１日〜約５日間にわたって処理することもできる。別の方法としては、多能性幹細胞を、本発明のペプチドを含有している培地で約１日〜約４日間にわたって処理することもできる。別の方法としては、多能性幹細胞を、本発明のペプチドを含有している培地で約１日〜約３日間にわたって処理することもできる。別の方法としては、多能性幹細胞を、本発明のペプチドを含有している培地で約１日〜約２日間にわたって処理することもできる。別の方法としては、多能性幹細胞を、本発明のペプチドを含有している培地で約４日間にわたって処理することもできる。
【００９１】
多能性幹細胞は、フィーダー細胞層上で培養することもできる。別の方法としては、多能性幹細胞は細胞外マトリックス上で培養することもできる。
【００９２】
本発明の一態様では、多能性幹細胞は、細胞外マトリックスでコートした組織培養基材上で培養し、分化させる。細胞外マトリックスは、マウス肉腫細胞から抽出された可溶化基底膜製剤（商品名ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから販売されている）であってもよい。あるいは細胞外マトリックスは、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）であってもよい。あるいは細胞外マトリックスは、フィブロネクチンであってもよい。別の実施形態では、多能性幹細胞は、ヒト血清で被覆された組織培養基質上で培養され及び分化する。
【００９３】
細胞外マトリックスは、組織培養基質で被覆される前に希釈されてもよい。細胞外マトリックスの希釈と、組織培養基材のコートに関する好適な方法の例は、Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｈ．Ｋ．らＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：３１２（１９８６年）、又はＨａｄｌｅｙ，Ｍ．Ａ．らＪ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：１５１１（１９８５年）に見出すことができる。
【００９４】
一実施形態では、細胞外マトリックスは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）である。一実施形態では、組織培養基質は、１：１０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートする。別の実施形態では、組織培養基質は、１：１５希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートする。別の実施形態では、組織培養基質は、１：３０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートする。別の実施形態では、組織培養基質は、１：６０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートする。
【００９５】
一実施形態では、組織培養基質は、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）である。一実施形態では、組織培養基質は、１：１０希釈のｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートする。別の実施形態では、組織培養基質は、１：１５希釈のｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートする。別の実施形態では、組織培養基質は、１：３０希釈のｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートする。別の実施形態では、組織培養基質は、１：６０希釈のｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートする。
【００９６】
多能性幹細胞は、ペプチドが発現した細胞上清から精製された本発明のペプチドを含有している、培地で処理することもできる。別の方法としては、多能性幹細胞は、ペプチドが発現した細胞上清から得られた本発明のペプチドの未精製物を含有している、培地で処理することもできる。
【００９７】
多能性幹細胞を、ペプチドが発現した細胞上清から得られた本発明のペプチドの未精製物を含有している、培地で処理する場合、上清は希釈率約１：１０〜約１：１００の最終濃度で使用してもよい。一実施形態では、上清は希釈率約１：１０〜約１：５０の最終濃度で使用できる。一実施形態では、上清は希釈率約１：１０〜約１：４０の最終濃度で使用できる。一実施形態では、上清は希釈率約１：２０〜約１：５０の最終濃度で使用できる。
【００９８】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＩＣＣＫＫＱＦＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＹＣＥＧＥＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＮＬＫＳＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【００９９】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＮＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＥＣＴＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＬＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１００】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＮＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１０１】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＬＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＨＣＳＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＡＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１０２】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＮＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＥＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＮＬＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１０３】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＷＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＤＭＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１０４】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＨＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＳＣＳＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＱＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１０５】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＫＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＳＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１０６】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＫＣＴＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＤＬＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１０７】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＳＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＱＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１０８】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＬＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＨＣＳＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＱＭＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１０９】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＮＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＥＣＳＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＱＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１１０】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＫＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１１１】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＨＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＤＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＱＭＧＳＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１１２】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＳＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＮＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１１３】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＬＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＨＣＳＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＱＭＧＡＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１１４】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＫＣＧＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＡＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１１５】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＮＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＫＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１１６】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＫＣＧＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＮＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１１７】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＮＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＫＣＧＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＱＭＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１１８】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＷＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＫＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＮＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１１９】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＤＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＬＭＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１２０】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＫＣＤＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１２１】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＳＧＲＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＳＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１２２】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＮＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＥＣＳＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＱＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１２３】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＨＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＤＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＮＭＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１２４】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＬＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＨＣＤＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＮＲＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１２５】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＬＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＨＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＮＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１２６】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＬＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＨＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１２７】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＮＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＫＣＳＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＫＭＧＡＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１２８】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＴＣＣＫＫＱＬＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＨＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１２９】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＧＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＮＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１３０】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＮＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＥＣＭＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１３１】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＬＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＨＣＴＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＬＧＳＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１３２】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＳＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１３３】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＮＭＧＡＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１３４】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＲＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＬＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＨＣＡＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＮＭＧＳＣＣＶＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１３８】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＬＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＳＣＳＧＬＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＲＧＡＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１３９】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＹＣＣＫＫＱＤＦＶＳＦＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＡＮＫＣＳＧＫＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＳＤＭＧＳＣＣＩＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＩＶＥＥＣＧＣＳ。
【０１４０】
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【０１４５】
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一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＩＣＣＫＫＱＳＦＧＱＴＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＧＧＳＣＳＧＥＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＮＬＫＳＣＣＳＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＫＶＥＥＣＧＣＴ。
【０１８８】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＩＣＣＫＫＱＳＦＧＲＴＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＧＧＧＣＳＧＥＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＷＡＮＬＫＳＣＣＳＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＶＶＥＥＣＧＣＴ。
【０１８９】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＩＣＣＫＫＱＳＦＧＱＡＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＧＧＧＣＳＧＥＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＮＬＫＳＣＣＳＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＧＭＫＶＥＥＣＧＣＴ。
【０１９０】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＩＣＣＫＫＱＳＦＧＱＴＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＧＧＧＣＴＧＥＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＦＡＮＬＫＳＣＣＳＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＮＭＫＶＥＥＣＧＣＴ。
【０１９１】
一実施形態では、次のペプチドを含有している培地で多能性幹細胞を処理する：ＧＬＥＣＤＧＫＶＮＩＣＣＫＫＱＳＦＧＱＡＫＤＩＧＷＮＤＷＩＩＡＰＳＧＹＨＧＧＧＣＴＧＥＣＰＳＨＩＡＧＴＳＧＳＳＬＳＦＨＳＴＶＩＮＨＹＲＭＲＧＨＳＰＷＡＮＬＫＳＣＣＳＰＴＫＬＲＰＭＳＭＬＹＹＤＤＧＱＮＩＩＫＫＤＩＱＲＭＶＡＥＥＣＧＣＴ。
【０１９２】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にかかるマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
【０１９３】
分化効率は、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に曝露することにより測定することができる。
【０１９４】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）参照）が含まれる。
【０１９５】
例えば、多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の追加の特徴は、継続して同定されている。例えば多能性幹細胞マーカーとしては、以下のもののうちの一つ以上の発現が含まれる：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、又はＴｒａ１−８１。
【０１９６】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４等のタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に曝露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【０１９７】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１９８】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０１９９】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理した後、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に更に分化させられる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【０２００】
本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は更に、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に記載の方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で一定時間処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化する。
【０２０１】
本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は更に、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に記載の方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をレチノイン酸及び少なくとも１つの線維芽細胞増殖因子で一定時間処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化する。
【０２０２】
本発明の１つの態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を米国特許出願第６０／９９０，５２９号に記載の方法に従って処理することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を更に分化させる。
【０２０３】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成を促進させ得る少なくとも１つの他の追加の因子で処理されてもよい。代替的に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の増殖を促進させてもよい。更に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の、他の細胞型を形成する能力、又は任意の他の追加の分化工程の効率を改善する能力を向上させてもよい。
【０２０４】
例えば、少なくとも１つの追加の因子は、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２及び３を含むＴＧＦ−βファミリーメンバー、血清アルブミン、線維芽細胞増殖因子ファミリー、血小板由来増殖因子−ＡＡ及びＢＢ、多血小板血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１１など）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２ＭＩＭＥＴＯＢＯＤＹ（商標）、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ハイドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミンなどの銅キレート化剤、フォルスコリン、Ｎａ−酪酸、アクチビン、βセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起伸長因子、ｎｏｄａｌ、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン−１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ，ＣＡ）、Ｎ２及びＢ２７サプリメント類（Ｇｉｂｃｏ，ＣＡ）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ，ＣＡ）などのステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、膵島新生に関与するタンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤又はこれらの組み合わせであり得る。
【０２０５】
少なくとも１つの他の追加の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝臓細胞株、及び例えば、ＦＨｓ  ７４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞株から得られた条件培地により供給されてもよい。
【０２０６】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内胚葉系に特異的なマーカーには、例えば、Ｈｌｘｂ９、ＰＴＦ−１ａ、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−６、ＨＮＦ−１β等の１つ以上の転写因子の発現を含む。
【０２０７】
分化効率は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を曝露することにより測定することができる。
【０２０８】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）参照）が含まれる。
【０２０９】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【０２１０】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。
【０２１１】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。
【０２１２】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有する培地中で培養し、次にエキセンディン４を含有する培地を除去し、続いて細胞をエキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００６年に開示されている。
【０２１３】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をＤＡＰＴ及びエキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００６年に開示されている。
【０２１４】
例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞をエキセンディン４を含有する培地中で培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００６年に開示されている。
【０２１５】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０２１６】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０２１７】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第６０／９５３，１７８号に開示された方法に従って、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０２１８】
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０２１９】
本発明の一態様では、本発明は、膵内分泌系と関連付けられるマーカーの発現量を増加させる方法を提供し、この方法は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のＴＧＦ−β受容体作動剤を含む培地で処理することで、膵内分泌系に関連付けられるマーカーの発現量を増加させることを含む。
【０２２０】
ＴＧＦ−β受容体作動剤は、ＴＧＦ−β受容体に結合し、かつこの受容体を活性化することのできる、任意の剤であり得る。一実施形態では、ＴＧＦ−β受容体作動剤は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、及びアクチビンＣからなる群から選択される。
【０２２１】
別の実施形態では、ＴＧＦ−β受容体作動剤は、アクチビンＡのペプチド変異体であり得る。このようなペプチド変異体の例は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｒ＆Ｄ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第６１／０７６，８８９号に開示される。
【０２２２】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成を促進させ得る、少なくとも１つの他の追加の因子で処理してもよい。代替的に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の増殖を促進させてもよい。更に、この少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の、他の細胞種を形成する能力を増強するものであってもよく、あるいは他の任意の更なる分化段階の効率を高めるものであってもよい。
【０２２３】
例えば、少なくとも１つの追加の因子は、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２及び３を含むＴＧＦ−βファミリーメンバー、血清アルブミン、線維芽細胞増殖因子ファミリー、血小板由来増殖因子−ＡＡ及びＢＢ、多血小板血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１１など）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２  ＭＩＭＥＴＯＢＯＤＹ（商標）、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ハイドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミンなどの銅キレート化剤、フォルスコリン、Ｎａ−酪酸、アクチビン、βセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起伸長因子、ｎｏｄａｌ、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン−１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ，ＣＡ）、Ｎ２及びＢ２７サプリメント類（Ｇｉｂｃｏ，ＣＡ）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ，ＣＡ）などのステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、膵島新生に関与するタンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤又はこれらの組み合わせであり得る。
【０２２４】
少なくとも１つの他の追加の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝臓細胞株、及び例えば、ＦＨｓ  ７４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞株から得られた条件培地により供給されてもよい。
【０２２５】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の検出
膵内分泌系に特徴的なマーカーは当業者に周知であり、膵内分泌系の特徴を示す追加のマーカーが継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵内分泌系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵内分泌系に特異的なマーカーとしては、例えばＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ又はＩＳＬ１等の転写因子の１種以上の発現が挙げられる。
【０２２６】
β細胞系の細胞に特徴的なマーカーは当業者に周知であり、β細胞系の細胞の特徴を示す追加のマーカーが継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して、β−細胞系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用することができる。β細胞系に特異的な特徴としては、例えば、ＰＤＸ１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子１）、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ６、ＰＡＸ４、ＮＥＵＲＯＤ、ＨＮＦ１β、ＨＮＦ６、ＨＮＴ３β又はＭＡＦＡ等の１種以上の転写因子の発現が挙げられる。これらの転写因子は、内分泌細胞の同定について当該技術分野で十分に確立されている。例えば、Ｅｄｌｕｎｄ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：５２４〜６３２（２００２））を参照されたい。
【０２２７】
分化効率は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、被処理細胞集団を曝露することにより測定することができる。あるいは分化効率は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、被処理細胞集団を曝露することにより測定することができる。
【０２２８】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）参照）が含まれる。
【０２２９】
本発明の一態様では、分化効率は、処理後の所定の細胞培養物中のインスリン陽性細胞の百分率を測定することによって求められる。一実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約１００％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約９０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約８０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約７０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約６０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約５０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約４０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約３０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約２０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約１０％のインスリン陽性細胞を生成する。別の実施形態では、本発明の方法は、所定の培養物中で約５％のインスリン陽性細胞を生成する。
【０２３０】
本発明の一態様では、分化効率は、グルコース刺激によるインスリン分泌を、細胞が放出するＣ−ペプチドの量を測定することで検出し、測定することにより求められる。一実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約１０００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約９００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約８００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約７００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約６００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約３００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約２００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約１００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約９０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約８０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約７０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約６０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約５０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約４０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約３０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約２０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。別の実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ１ｐｇ当たり約１０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。
【０２３１】
治療
一態様では、本発明は、１型糖尿病に罹患しているかあるいは１型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、この多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系へと分化させ、β細胞系の細胞を患者に埋め込むことを含む。
【０２３２】
更に別の態様においては、本発明は、２型糖尿病に罹患しているかあるいは２型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系に分化させ、β細胞系の細胞を患者に埋め込むことを含む。
【０２３３】
適切であるならば、移植した細胞の生存及び機能を亢進する医薬品又は生理活性物質で患者を更に処置してもよい。それらの薬剤は、例えば特に、インスリン、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、繊維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１５）、血管内皮由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンを含んでもよい。他の医薬化合物としては、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及び２  ＭＩＭＥＴＯＢＯＤＹ（商標）、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、ＭＡＰＫ阻害剤、例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示されている化合物などが挙げられる。
【０２３４】
多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にインスリン産生細胞に分化させてもよい。具体的な実施形態では、多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にβ細胞へと完全に分化させる。あるいは多能性幹細胞は、未分化又は一部が分化した状態でレシピエントに移植してもよい。更なる分化はレシピエント内で行われ得る。
【０２３５】
胚体内胚葉細胞、又は代替的には膵臓内胚葉細胞、又は代替的にはβ細胞を、分散した細胞として埋め込んでもよく、又は肝門静脈内に注入され得るクラスターとして編成してもよい。あるいは細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に埋め込まれてもよい。埋め込み部位としては、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。
【０２３６】
埋め込まれた細胞の更なる分化、生存又は活性を向上するために、増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤等の追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与してもよい。所定の実施形態において、増殖因子は、インビボで、投与された細胞を分化させるよう使用される。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にその場で（in situ）で曝露されてもよい。埋め込まれた細胞には、当該技術分野で公知の内因性の及び外因性の増殖因子の任意の組み合わせにより、分化を誘発させることもできる。
【０２３７】
埋め込みに使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数の様々な要因に基づいて当業者により決定され得る。
【０２３８】
一態様では、本発明は糖尿病に罹患しているかあるいは糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をインビトロでβ細胞系に分化させ、この細胞を３次元支持体に埋め込むことを含む。細胞は、患者に埋め込む前に、インビトロでこの支持体上に維持してもよい。あるいは細胞を含む支持体を、インビトロで更に培養することなく直接患者に埋め込んでもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を亢進する少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。
【０２３９】
本発明の目的のために使用するのに好適な支持体材料は、組織修復に有用な組織鋳型、導管、バリア及び貯蔵所を含む。より詳細には、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、及び不織構造の形態を有する合成及び天然材料であって、インビトロ及びインビボで使用されて、生物組織を再構築又は再生し、また走化性薬剤を送達して組織増殖を誘発する材料が、本発明の方法の実施における使用に適切である。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、米国特許第６，０２２，７４３号、米国特許第５，５６７，６１２号、米国特許第５，７５９，８３０号、米国特許第６，６２６，９５０号、米国特許第６，５３４，０８４号、米国特許第６，３０６，４２４号、米国特許第６，３６５，１４９号、米国特許第６，５９９，３２３号、米国特許第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３  Ａ１号、米国特許第４，５５７，２６４号及び米国特許第６，３３３，０２９号に開示されている材料を参照されたい。
【０２４０】
支持体を形成するのに先立ち、薬剤をポリマー溶液と混合することで、医薬品が組み込まれた支持体を形成することもできる。あるいは加工された支持体上に、医薬品を好ましくは医薬担体の存在下で被覆してもよい。医薬品は、液体、超微粒子状固体、又は任意の他の適切な物理的形態として存在し得る。あるいは医薬品の放出速度を変更するために、支持体に賦形剤を加えてもよい。別の実施形態では、抗炎症性化合物である少なくとも１種の医薬化合物（例えば米国特許第６，５０９，３６９号に開示される化合物）を支持体に組み込む。
【０２４１】
支持体には、抗アポトーシス化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，７９３，９４５号に開示されている化合物を組み込んでもよい。
【０２４２】
支持体には、線維症阻害剤である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，３３１，２９８号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０２４３】
支持体には、血管新生を促進させることができる少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号及び同第２００４／０２０９９０１号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０２４４】
支持体には、免疫抑制化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１６２３号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０２４５】
例えば支持体には、特に、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、繊維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１５）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリン等の増殖因子である、少なくとも１種の医薬化合物も組み込まれ得る。他の医薬化合物は、例えばニコチンアミド、低酸素誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−Ｉ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２  ＭＩＭＥＴＯＢＯＤＹ（商標）、並びにＩＩ、エキセンディン−４、ｎｏｄａｌ、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、デフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチン等の接着性細胞外マトリックスタンパク質の細胞−及びヘパリン−結合ドメインを含む生物ペプチド、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示されている化合物等のＭＡＰＫ阻害剤を含んでもよい。
【０２４６】
スキャフォールド内への本発明の細胞の組み込みは、細胞をスキャフォールド上に単に沈着させることにより達成できる。単純拡散により細胞をスキャフォールド内に入れることもできる（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１  Ｐｔ２）：３〜９（１９８８））。細胞播種の効率を向上させるために、いくつかの他の手法が開発されている。例えば、軟骨細胞をポリグリコール酸スキャフォールド上に播種する際に、スピナーフラスコが使用されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３〜２０２（１９９８））。細胞播種のための他の手法は遠心法の使用であり、これは播種する細胞に与えるストレスを最小にし、かつ播種効率を高める。例えば、Ｙａｎｇらは、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＣＣＩ）と呼ばれる、細胞播種法を開発した（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９〜８６（２００１））。
【０２４７】
以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０２４８】
実施例１：本発明のペプチドの設計
この作業の目的は、リガンドについての、並びに既知のアクチビンペプチド及び他のＴＧＦ−βファミリーメンバーの各リガンド受容体相互作用についての、利用可能な構造情報に基づいて、アクチビンＡの変異ペプチドを設計することである。アクチビンＡの２つの結晶の構造解析（１ｎｙｕ及び１ｓ４Ｙ、タンパク質データバンクで検索：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）で、変異しているであろうアミノ酸残基の数を同定した。ホモ二量体インターフェースに配置される残基を、変異させるために選択した。二量体インターフェース残基の一部が共通であったとしても、結晶中のモノマーの相対的な配向は著しく異なる。したがって、各結晶構造体に基づき残基の２つの別個の残基セットを選択した。多くの場合タンパク質中で特徴的な構造的役割を果たすことから（例えば、システイン残基の場合にはジスルフィド結合の形成、あるいはグリシン及びプロリン残基の場合には他の残基からは接近不可能な特定の主鎖の角度の採用など）、システイン、グリシン及びプロリン残基は変化させなかった。
【０２４９】
ｐｄｂコード１ｎｙｕを有するアクチビンＡ複合体の結晶構造を用い、以下の部位を変異の標的にした：１０Ｉ、１６Ｆ、３９Ｙ、４１Ｅ、４３Ｅ、７４Ｆ、７５Ａ、７６Ｎ、７７Ｌ、７８Ｋ、７９Ｓ、８２Ｖ。ｐｄｂコード１ｓ４ｙを有するアクチビンＡ複合体の結晶構造を用い、以下の部位を変異の標的にした：１６Ｆ、１８Ｖ、１９Ｓ、２０Ｆ、３７Ａ、３８Ｎ、３９Ｙ、４１Ｅ、７４Ｆ、８２Ｖ、１０７Ｎ、１０９Ｉ、１１０Ｖ、１１６Ｓ。
【０２５０】
プログラムＲｏｓｅｔｔａ（例えば、Ｓｉｍｏｎｓら，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２６８，２０９〜２２５，１９９７、及びＳｉｍｏｎｓ，Ｋ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，３４，８２〜９５，１９９９を参照されたい）を使用して、アクチビンリガンドの単量体鎖の両方で選択された残基についてコンビナトリアル変異を生成させた。プログラムは、メトロポリス・モンテカルロ法を用いて各２０アミノ酸毎に側鎖立体構造の回転異性体を選択して、エネルギー的に望ましい立体構造を探索した。全９３の設計を、野生型アクチビンＡペプチド配列に沿って選択した。これらを本発明の方法に従って試験した。表１は、本発明のペプチドのアミノ酸配列の一覧である。ＡＣＴＮ１は野生型アクチビン分子である。ＡＣＴＮ  ２〜ＡＣＴＮ  ４８は、結晶構造１ｎｙｕを用いて計算した本発明のペプチド配列である。ＡＣＴＮ  ４９〜ＡＣＴＮ  ９４は、結晶構造１ｓ４ｙを用いて計算した本発明のペプチド配列である。２つとして同一のペプチド配列は無かった。ペプチド配列中の可変性を、ＡＣＴＮ  ２〜ＡＣＴＮ  ４８については図１に、及びＡＣＴＮ  ４９〜ＡＣＴＮ  ９４については図２に系統樹として示す。
【０２５１】
実施例２：本発明のペプチドのクローン化及び発現
発現ベクターにクローン化するために、表１に列挙されるペプチドをコードする遺伝子を設計した。アクチビンＡ及びＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーの前駆体のタンパク質プロセシングについての科学文献に基づき、アクチビンＡの完全な前駆体（プロ領域に加え成熟タンパク質）を含有するよう発現コンストラクトを設計した。野生型アクチビンＡ前駆体発現コンストラクトを生成させて、成熟タンパク質領域のみを含有するコード配列を野生型アクチビンＡコンストラクト内にクローン化することにより、続く全てのアクチビンＡ変異体発現コンストラクトの構成を可能にした。したがって全ての発現コンストラクトは同一のアクチビンＡプロ領域を有する。
【０２５２】
表１の野生型アクチビンＡ及び全９３種の設計した変異体のアミノ酸配列を、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｒ＆Ｄ  Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第６，６７０，１２７号及び同第６，５２１，４２７号に開示の方法を用い、ヒトコドンの優先度を使用してＤＮＡ配列へと戻し翻訳した。ＤＮＡ配列を表２に列挙する。野生型アクチビンＡのプロ領域についてのネイティブなアミノ酸配列及びネイティブなＤＮＡ配列は戻し翻訳することなく使用した。それぞれ表１及び表２に列挙する。次に、単一のプロドメインと９４種の成熟タンパク質ドメインとからなる各ＤＮＡ配列を、配列をより小さなフラグメントへと構文解析し、ＧＥＮＥＷＲＩＴＥＲ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｒ＆Ｄ，ＵＳ）を用いてオリゴヌクレオチドとしてこれらを合成することにより生成させ、次いでＲＰ  ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。次に、各ＤＮＡ配列のための精製済みオリゴヌクレオチドを、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｒ＆Ｄ  Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第６，６７０，１２７号及び同第６，５２１，４２７号に開示されている方法を用いて、完全長ＤＮＡフラグメントへと独立にアセンブリした。
【０２５３】
変異体の全ライブラリに移る前に、第１工程として、野生型アクチビンＡ（ＡＣＴＮ１）を含有している発現コンストラクトを作製し、発現系を評価した。ＸｂａＩ部位及びＮｏｔＩ部位を用い、アクチビンＡプロ領域ＤＮＡフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９５−２０）中にクローン化した（図３にイタリック体で記載）。次に、アクチビンＡ成熟タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを、ＳｇｒＡＩ部位（下線付き太字）及びＮｏｔＩ部位（図４）を用いてプロ領域コンストラクト内にクローン化し、プロ領域に対してインフレームで融合させて、完全長の前駆体発現コンストラクト（図５）を生成した。次に、変異体ＡＣＴＮ  ２〜ＡＣＴＮ  ８の成熟タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを、同様の方法でプロ領域コンストラクト内にクローン化し、これらの変異体の前駆体発現コンストラクトを生成させた。陽性対照として、市販のヒトアクチビンＡ発現コンストラクトをＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＴＣ１１８７７４）より得た。このクローンのヒトアクチビンＡのｍＲＮＡの受入番号はＮＭ＿００２１９２．２であり、哺乳類細胞用発現ベクターはｐＣＭＶ６−ＸＬ４である。
【０２５４】
遺伝子コンストラクトのトランスフェクション及び発現：ＡＣＴＮ  １及びＯｒｉＧｅｎｅ野生型アクチビンＡ前駆体コンストラクトの発現及び活性を比較し、ＡＣＴＮ  １コンストラクトが活性分子を生成するかを判定した。
【０２５５】
細胞維持：ＨＥＫ２９３−Ｅ細胞は２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １２３３８）で増殖させた。細胞濃度が１．５〜２．０×１０6個細胞／ｍＬ〜２．０×１０5個細胞／ｍＬである場合、細胞を希釈した。加湿したインキュベーター内で１２５ＲＰＭで振とうしながら、３７℃かつ８％  ＣＯ2で細胞を増殖させた。
【０２５６】
アクチビンＡ変異体のトランスフェクション：２０ｍＬ培地を含有している別個の１２５ｍＬ振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃａｔ  ＃  ４３１１４３）中でＨＥＫ２９３−Ｅ細胞内に変異体をトランスフェクトした。細胞は１．０×１０6個細胞／ｍＬに希釈した。トータルＤＮＡ（２５μｇ）を１．０ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １２３０９）に希釈し、２５μＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １６４４７）を１．０ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈した。希釈したＤＮＡを、希釈したＭａｘ  ｒｅａｇｅｎｔに加え、室温で１０分間にわたってインキュベートした。細胞の入ったフラスコにＤＮＡ  Ｍａｘコンプレックスの２ｍＬアリコートを加え、インキュベーター内に設置し、９６時間にわたって３７℃かつ８％  ＣＯ2下で１２５ＲＰＭで振とうした。
【０２５７】
５，０００×ｇでの１０分間にわたる遠心により細胞から上清を分離し、０．２μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃａｔ  ＃４３１１５３）により濾過し、次いでＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  １０Ｋ（Ｃａｔ  ＃ＵＦＣ９０１０９６）を用い、３，７５０×ｇで約１０分遠心して１０倍及び５０倍に濃縮した。
【０２５８】
濃縮上清と未濃縮上清を、細胞系アッセイでのアクチビンＡ活性について検査して、本発明のペプチドの、ヒト胚性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる能力を、読み出し情報としてのＳＯＸ１７強度により測定した（実施例６を参照されたい）。ＯｒｉＧｅｎｅ野生型コンストラクトからの濃縮上清と未濃縮上清のどちらもが、ＡＣＴＮ  １コンストラクトからの濃縮上清よりも活性（ＳＯＸ１７強度）が高かった（図６）。この結果は、ｐｃＤＮＡ３．１（−）発現ベクターからのＡＣＴＮ  １コンストラクトを、恐らくコアＣＭＶプロモーターの上流に完全なイントロンＡを包含することに起因してより良好な発現特性を一貫して有する、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ哺乳類細胞用発現ベクターｐＵｎｄｅｒへと変更するという結論を導いた。
【０２５９】
ＥｃｏＲＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位（灰色にハイライトしてある太字部分、図７Ａ及び７Ｂ）を用いて、完全長ＡＣＴＮ  １前駆体遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．１（−）からｐＵｎｄｅｒへとサブクローニングした。ＯｒｉＧｅｎｅコンストラクトと共にこの新しいＡＣＴＮ  １野生型アクチビンＡコンストラクトの両方を、別々にＣＨＯ−Ｓ細胞又はＨＥＫ２９３−Ｆ細胞にトランスフェクトした。上清を上記のように調製して、アクチビンＡ活性について試験した。ＯｒｉＧｅｎｅ野生型コンストラクトからの上清よりも、細胞数及びＳＯＸ１７強度の上昇率が高かったことから判断されるように、ＡＣＴＮ  １  ｐＵｎｄｅｒコンストラクトからの上清が、細胞系アッセイでより高い活性を有することが判明した（図８Ａ及び８Ｂ）。
【０２６０】
ｐＵｎｄｅｒコンストラクト由来のＡＣＴＮ  １の発現が、対応するｐｃＤＮＡ３．１（−）コンストラクトよりも高い活性レベルを備えて上清中に得られたので、次いでｐＵｎｄｅｒ中のアクチビンＡ変異体の完全ライブラリ用に、完全長の前駆体発現コンストラクトを生成させた。成熟タンパク質領域のみにまたがる変異体のＤＮＡフラグメントを、それぞれＳｇｒＡＩ及びＮｏｔＩクローニング部位（図７Ａ及び７Ｂで、下線付き太字のイタリック体で記載）を用いてｐＵｎｄｅｒ中にサブクローニングし、インタクトなプロ領域は残したままでＡＣＴＮ  １成熟タンパク質コード配列と交換した。
【０２６１】
アクチビンＡ変異体のトランスフェクション：ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を用いて、２０ｍＬ培地を含有する別個の１２５ｍＬ振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃａｔ  ＃  ４３１１４３）中で変異体をトランスフェクトした。細胞は１．０×１０6個細胞／ｍＬに希釈した。トータルＤＮＡ（２５μｇ）を１．０ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １２３０９）に希釈し、２５μＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １６４４７）を１．０ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈した。希釈したＤＮＡを、希釈したＭａｘ  ｒｅａｇｅｎｔに加え、室温で１０分間にわたってインキュベートした。細胞の入ったフラスコにＤＮＡ  Ｍａｘコンプレックスの２ｍＬアリコートを加え、インキュベーター内に設置し、９６時間にわたって３７℃かつ８％  ＣＯ2下で１２５ＲＰＭで振とうした。
【０２６２】
最初の７種のアクチビンＡ変異体（ＡＣＴＮ  ２〜ＡＣＴＮ  ８）のｐＵｎｄｅｒ発現コンストラクトを用いて生成した上清に対し、ウェスタンブロット解析を実施した。ＯｒｉＧｅｎｅ及びＡＣＴＮ  １のアクチビンＡ野生型対照を含めた。これら２つの対照タンパク質のみかけの分子量は同様であり、２６ｋＤと算出される分子量で一致した。変異体間で発現レベルは一致しないものの、いくつかの変異体から発現が観察された（図９）。この結果は、全体的に、変異体の一部中のアミノ酸置換が発現に影響を与えず、かつ更には前駆体タンパク質の適切なプロセシングも可能にしたことを示した。
【０２６３】
ｐＵｎｄｅｒ発現コンストラクトから得た上清の第２グループ（全３９種）を、同様にウェスタンブロットにより解析した。変異体のほとんどで発現を検出できなかった（データは非掲載）。検出可能なシグナルを有する変異体だけのウェスタンブロットを図１０に示す。残りの変異体はこの方法では発現について解析しなかった。
【０２６４】
実施例３及び４の背景技術
本発明のペプチドのアフィニティー精製
この節の目的は、アクチビンＡ変異体のためのアフィニティー精製方法を開発することであった。最初のアプローチはｂｉｓ−ｈｉｓと呼ばれ、本発明のペプチドのアミノ酸配列に金属結合部位を導入するものであり、各変異体を金属アフィニティーマトリックスに選択的に結合させる得るアプローチであった。ｂｉｓ−ｈｉｓ変異体が高親和性でマトリックスに結合し、かつ全てのアクチビンＡ変異体に応用可能なものであることが同定できた場合に、このｂｉｓ−ｈｉｓ部位は遺伝子アセンブリの一部に組み込むことができた。しかしながら、これらの変異体は、ポリヒスチジンタグを有するタンパク質よりも低い親和性で結合する場合があることから、同様の金属結合部位を有する他の内因性タンパク質からの混じりけのない分離が不確実であった。この問題に対処すべく、全てのアクチビンＡ変異体に特異的に結合し得るフォリスタチンアフィニティーマトリックスも採用した。このアプローチは、フォリスタチンの発現及び精製、並びに続くフォリスタチンアフィニティーマトリックスの生成を含むが、他のＴＧＦ−βファミリーメンバーの精製をも促進し得る。これらの２つのアプローチの概要を以下の実施例３及び４に記載する。
【０２６５】
実施例３：金属キレートによる本発明のペプチドの精製
最初のアプローチには、分子を金属アフィニティークロマトグラフィーマトリックスに選択的に結合させるための設計を行うことを含む。設計するタンパク質を、タンパク質の精製を高めるペプチド配列で標識することもできる。ペプチド配列への一連のヒスチジン残基の組み込みが一例であり、これにより対象とするタンパク質を固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で精製することができる。ＩＭＡＣは、コバルト、ニッケル、又は亜鉛などの金属に対するヒスチジン残基の配位共有結合に基づく。結合後に、対象とするタンパク質はｐＨの変化あるいはイミダゾールなどの競合分子の添加により溶出することができ、これによりある程度の精製がもたらされる。通常はヒスチジン残基はＮ末端又はＣ末端のいずれかに導入される。しかしながら、アクチビンＡは前駆体ペプチドとして発現されることから、Ｎ末端が開裂して、Ｎ末端タグは細胞内プロセシングの間に失われてしまう場合があると考えられる。更には、Ｃ末端タグの追加は、分子の適切な二量体形成及びプロセシングを妨げるのではないかと疑われる。例えば、Ｐａｎｇａｓ，Ｓ．及びＷｏｏｄｒｕｆｆ，Ｔ．；Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  １７２，ｐｇｓ  １９９〜２１０，２００２を参照されたい。したがって、ヒスチジン残基での置換のために成熟アクチビンＡ配列の内部位置を選択し、合成的な金属結合部位を作製した。このアプローチは、αヘリックスのシングルターン（Ｈｉｓ−Ｘ３−Ｈｉｓ）により別個に、又はβシート内（Ｈｉｓ−Ｘ−Ｈｉｓ）の離れた２か所で別個に、のいずれかで、２つの溶媒曝露ヒスチジン残基を誘導した。例えば、Ｓｕｈら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．４，ｎｏ．３，ｐｇｓ  ３０１〜３０５，１９９１を参照されたい。表３は、内部にヒスチジン置換を施した、選択したペプチドのアミノ酸配列を示す。
【０２６６】
ヒスチジン置換を含有させた本発明のペプチドのトランスフェクション：表３に列挙したペプチドをコードする遺伝子配列を、実施例２に記載の方法に従って生成し、ｐＵＮＤＥＲベクターに挿入した。ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を以下のように一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション１日目に、別個の２Ｌ振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃａｔ  ＃  ４３１２５５）（ベクターあたり１つ）内で、１．０×１０6個細胞／ｍＬになるよう細胞を７５０ｍＬ培地に希釈した。トータルＤＮＡ（９３７．５μｇ）を７．５ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １２３０９）に希釈し、９３７．５μＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １６４４７）を７．５ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈した。希釈したＤＮＡを、希釈したＭａｘ  ｒｅａｇｅｎｔに加え、室温で１０分間にわたってインキュベートした。細胞の入ったフラスコにＤＮＡ  Ｍａｘコンプレックスの１５ｍＬアリコートを加え、インキュベーター内に設置し、９６時間にわたって３７℃かつ８％  ＣＯ2下で１２５ＲＰＭで振とうした。
【０２６７】
ヒスチジン置換を含有させた本発明のペプチドの精製：固定化金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いる精製を、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＵｎｉｃｏｒｎ（商標）ソフトウェアを用いるＡＫＴＡ  ＦＰＬＣクロマトグラフィー系で実施した。
【０２６８】
簡潔に述べると、トランスフェクションの４日後に、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞由来の細胞上清を回収し、遠心により清澄化し（３０分、６０００ｒｐｍ）、濾過した（０．２μｍＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。特異的なタンパク質の相対量を、製造者による取扱説明書にしたがって、アクチビンＡ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ＤＹ３３８）を用いて測定した。サンプルは、ＬＶ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ（Ｐａｌｌ）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いて４倍に濃縮し、検出に抗アクチビンＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ３３８１）若しくは抗アクチビンＡ前駆体抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  １２０３）を使用するウェスタンブロットで検査した。図１１は各上清を４倍濃縮した後のいくつかのペプチド変異体についての代表的なプロファイルを示す。次いで濃縮サンプルを１ｘ  ＰＢＳの最終濃度になるよう１０ｘ  ＰＢＳで希釈して、再び０．２μｍで濾過した。希釈した上清を、平衡化した（２０ｍＭのＮａ−リン酸、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に約１０ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂の相対濃度で充填した。充填後にカラムを洗浄し、カラム用量の２０倍以上にわたって、イミダゾールの直線濃度勾配（０〜５００ｍＭ）によりタンパク質を溶出させた。図１２は、ペプチド変異体ＡＣＴＤ２０についての、典型的なＩＭＡＣ精製プロファイルを示す。ピーク画分をプールし、ＰＢＳ（ｐＨ  ７）に対して４℃で一晩透析した。タンパク質を透析から回収し、濾過し（０．２μｍ）、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、２８０ｎｍでの吸光度により総タンパク質濃度を測定した。特異的なタンパク質の濃度を、前述のようにアクチビンＡ  ＥＬＩＳＡを使用して測定した。必要である場合、精製済みタンパク質を１０Ｋの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）の遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濃縮した。精製したタンパク質の品質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、検出に抗アクチビンＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ３３８１）又は抗アクチビンＡ前駆体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  １２０３）を用いるウェスタンブロットとにより評価した。図１３は、６種の代表的なペプチド精製物由来のイミダゾール画分についてのウェスタンブロット溶出プロファイルを示す。精製したタンパク質は４℃で保存した。
【０２６９】
検査された全ての単一のｂｉｓ−ｈｉｓ対コンストラクトは、予測されたように金属アフィニティークロマトグラフィーマトリックス上で遅延した。しかしながら、これらの点変異が、マトリックスに非特異的に結合する単一の金属結合部位をもたらすことに起因して、変異体は同様の部位を含有している他の内因性タンパク質と共に共溶出した。特異的な結合及び保持を高めるために、追加のヒスチジン残基対を各Ｋ７Ｈ／Ｎ９Ｈ単一対コンストラクトに加えた（表４）。この場合もやはり、各２つのｂｉｓ−ｈｉｓコンストラクトは、金属アフィニティーマトリックス上で明らかに濃縮され、並びに非特異的な結合タンパク質から別個に分離されることを示した。非特異的に結合したタンパク質からの分離性を更に上昇させるために、これらのコンストラクト（ＡＣＴＮ  ３４からのＡＣＴＤ  ２３）の最も良好な分離物に同様にヒスチジン残基を３対加えた。しかしながらこの分子は、２つのｂｉｓ−ｈｉｓコンストラクトを上回る程の特異的な保持は示さなかった。
【０２７０】
実施例４：フォリスタチンによる本発明のペプチドの精製
アクチビンＡ変異体領域の精製に対する第２のアプローチには、フォリスタチン及びアクチビンＡ間の高親和性相互作用を利用した。フォリスタチンは天然のアクチビンＡ拮抗剤であり、Ｉ型受容体相互作用及びＩＩ型受容体相互作用の両方を阻害する。本発明の変異体には、受容体結合表面ではなく、二量体インターフェースにおける変化を包含することから、受容体結合表面に変化を生じさせないという理由で、フォリスタチンをアフィニティーマトリックス用に論理的に選択した。フォリスタチン２８８及び３１５（それぞれフォリスタチンの１〜２８８残基及び１〜３１５残基）が非常に高親和性にアクチビンＡに結合する（約３００ｐＭ）一方で、フォリスタチン１２及び１２３（それぞれフォリスタチンの６４〜２１２残基及び６４〜２８８残基）は中程度の親和性でアクチビンＡに結合する（約４００ｎＭ）。試験したフォリスタチンコンストラクトには、フォリスタチン１２（ＦＳ１２）、フォリスタチン２８８（ＦＳ２８８）及びフォリスタチン３１５（ＦＳ３１５）が挙げられる。表５を参照されたい。これらのコンストラクトのそれぞれは哺乳類細胞での発現用に設計し、金属アフィニティー精製のためにポリヒスチジンタグを含有させた。
【０２７１】
フォリスタチン変異体のクローン化：ポリヒスチジンタグをし、ＡＣＴＡ  １、ＡＣＴＡ２及びＡＣＴＡ  ３として設計した３つのフォリスタチン遺伝子変異体のタンパク質配列及び遺伝子配列を、それぞれ表６及び７に与える。実施例２でアクチビンＡ遺伝子変異体について記載のように、遺伝子を合成し、アセンブリした。アセンブリした遺伝子を、各遺伝子配列に先行する又は続くＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用い、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  ｐＵｎｄｅｒ哺乳類細胞用発現ベクター（実施例２に記載）中へとベクター固有のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を利用しながらクローン化した。
【０２７２】
フォリスタチン変異体の発現評価：７５０ｍＬの培地を用い、別個の２Ｌ振とうフラスコ（ベクター１種につき１つ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃａｔ  ＃  ４３１２５５）中で、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を用いて変異体（ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＡ２及びＡＣＴＡ３）をトランスフェクトした。細胞は１．０×１０6個細胞／ｍＬに希釈した。トータルＤＮＡ（９３７．５μｇ）を７．５ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １２３０９）に希釈し、９３７．５μＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １６４４７）を７．５ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈した。希釈したＤＮＡを、希釈したＭａｘ  ｒｅａｇｅｎｔに加え、室温で１０分間にわたってインキュベートした。細胞の入ったフラスコにＤＮＡ  Ｍａｘコンプレックスの１５ｍＬアリコートを加え、インキュベーター内に設置し、９６時間にわたって３７℃かつ８％  ＣＯ2下で１２５ＲＰＭで振とうした。トランスフェクションの４日後に、細胞上清を回収し、遠心により清澄化し（３０分、６０００ｒｐｍ）、濾過した（０．２μｍＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。フォリスタチン変異体の発現を、検出に抗フォリスタチン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ６６９）又は抗ペンタヒスチジン抗体（Ｑｉａｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  ３４６６０）を用いてウェスタンブロットで検査した。図１４は、培養上清由来のフォリスタチン変異体の発現量についての、典型的なウェスタンブロットを示す。１つの変異体（ＡＣＴＡ  ３）を、スケールアップさせた発現及び精製のために選択した。
【０２７３】
スケールアップさせたＡＣＴＡ  ３発現：Ａｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター内でＨＥＫ２９３−Ｆ細胞に一過性的にトランスフェクトした。バイオリアクターには、トランスフェクションの１日前に４．０×１０6個細胞／ｍＬで播種した。ヘッドスペース内の空気についてバイオリアクターを制御した。すなわちＯ2をモニターし、スパージにより５０％に制御した。ｐＨはＣＯ2と重炭酸ナトリウムにより制御した。細胞は１１５ＲＰＭで撹拌羽根により撹拌した。トランスフェクションに先立ちｐＨは７．２に維持し、続くトランスフェクション時に６．８に低下させた。
【０２７４】
トランスフェクション時の細胞濃度は１．０×１０6個細胞／ｍＬであった。トータルＤＮＡ（１．２５ｍｇ／Ｌ）を５０ｍＬ／ＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈し、１．２５ｍＬ／ＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを５０ｍｌ／ＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈した。希釈したＤＮＡを、希釈したＭａｘ  ｒｅａｇｅｎｔに加え、室温で１０分間にわたってインキュベートした。１００ｍＬ／ＬのアリコートのＤＮＡ  Ｍａｘコンプレックスをバイオリアクターに加え、９６時間にわたって増殖させた。
【０２７５】
金属キレートによるＡＣＴＡ３の精製：ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＵｎｉｃｏｒｎ（商標）ソフトウェアを用いてＡＫＴＡ  ＦＰＬＣクロマトグラフィー系で精製を実施した。
【０２７６】
トランスフェクションの４日後に細胞上清を回収し、遠心により清澄化し（３０分、６０００ｒｐｍ）、濾過し（０．２μｍ  ＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）、及びＣｅｎｔｒａｍａｔｅ（Ｐａｌｌ）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いて１Ｌ未満になるまで濃縮した。次いで濃縮サンプルを１ｘ  ＰＢＳの最終濃度になるよう１０ｘ  ＰＢＳで希釈して、再び０．２μｍで濾過した。希釈した上清を、平衡化した（２０ｍＭのＮａ−リン酸、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に約１０ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂の相対濃度で充填した。充填後にカラムを洗浄し、タンパク質をイミダゾールの段階的な濃度勾配（１０ｍＭ、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、２５０ｍＭ及び５００ｍＭ）で溶出させた。図１５Ａは、フォリスタチン変異体ＡＣＴＡ３についての、典型的なＩＭＡＣ精製プロファイルを示す。図１５Ｂは、上記の図に記載の、ＩＭＡＣ精製の溶出プロファイルのＳＤＳＰＡＧＥを示す。１５０ｍＭイミダゾールによる溶出のピーク画分をプールし、１０ＫのＭＷＣＯ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。濃縮した材料を、平衡化した（ＰＢＳ、ｐＨ７）２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填し、分子ふるいクロマトグラフィーで精製した。ＡＣＴＡ３を含有している画分をプールし、１０ＫのＭＷＣＯ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。精製したＡＣＴＡ３濃度を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、２８０ｎｍでの吸光度により測定した。精製したタンパク質の品質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。精製したタンパク質は４℃で保存した。
【０２７７】
ＡＣＴＡ  ３とＮＨＳ−セファロースのカップリング：樹脂について提供された、製造元からの取扱説明書に従い、ＮＨＳ−セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に対するカップリングを実施した。
【０２７８】
簡潔に述べると、精製したフォリスタチンをカップリングバッファ（０．２ＭのＮａＨＣＯ3、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．３））中へ４℃で一晩透析した。製造元からの取扱説明書に従いＮＨＳ−セファロースを調製し、透析したタンパク質に加えた。カップリング反応を４℃で一晩実施した。翌日、フォリスタチン−ＮＨＳ−セファロース樹脂を製造元からの取扱説明書に従って洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７）で平衡化した。
【０２７９】
ＡＣＴＡ  ３アフィニティークロマトグラフィーによる本発明のペプチドの精製：簡潔に述べると、トランスフェクションの４日後に、一過性的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞から得た細胞上清を回収し、遠心により清澄化し（３０分、６０００ｒｐｍ）、濾過した（０．２μｍ  ＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。特異的なタンパク質の相対量を、製造者による取扱説明書に従って、アクチビンＡ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ＤＹ３３８）により測定した。ＬＶ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ（Ｐａｌｌ）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いて、１００ｍＬ以下になるまでサンプルを濃縮した。次いで濃縮サンプルを１ｘ  ＰＢＳの最終濃度になるよう１０ｘ  ＰＢＳで希釈して、再び０．２μｍで濾過した。希釈した上清に、平衡化したＡＣＴＡ  ３親和性樹脂を加え、スラリーを４℃で一晩インキュベートした。翌日、カラムを洗浄し、タンパク質をカラム用量の１０倍の０．１Ｍグリシン（ｐＨ  ２．５）で溶出した。画分用量の１０％の１．０Ｍトリス（ｐＨ  ９）を含有しているチューブへと直接溶出させることで、溶出したタンパク質画分を中和した。すなわち、１ｍＬの溶出物を回収する場合には、チューブには予め０．１ｍＬのトリスバッファーを前充填しておいた。ピーク画分をプールし、ＰＢＳ（ｐＨ  ７）に対して４℃で一晩透析した。透析したタンパク質を回収し、濾過し（０．２μｍ）、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、２８０ｎｍでの吸光度によりタンパク質濃度を測定した。必要である場合、精製済みタンパク質を１０Ｋの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）の遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濃縮した。精製したタンパク質の品質をＳＤＳＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより評価した。図１６は、ペプチド変異体ＡＣＴＮ  １の典型的な精製物に対して、検出に抗アクチビンＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ３３８１）を用いたウェスタンブロットを図１６Ａに、若しくは検出に抗前駆体抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  １２０３）を用いたウェスタンブロットを図１６Ｂに示し、図１６Ｃには銀染色による検出を示す。精製したタンパク質は４℃で保存した。
【０２８０】
実施例５：ヒト胚性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９をＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得て、供給元の研究所により提供された取扱説明書に従って培養した。また、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃａｔ  ＃  ３５６２３１）を１：３０希釈してコートしたプレート上にヒト胚性幹細胞を播種し、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ２３３−ＦＢ）を添加したＭＥＦ馴化培地中で培養した。ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上で培養した細胞は、コラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ；Ｃａｔ  ＃  １７１０４−０１９）、ディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １７１０５−０４１）又はリベラーゼＣＩ酵素（Ｒｏｃｈｅ；Ｃａｔ  ＃  １１８１４４３５００１）を用いてルーチン的に継代した。
【０２８１】
実施例６：アクチビンＡバイオアッセイ
アクチビンＡは、広範な細胞型において分化の重要なメディエーターである。アクチビンＡとＷｎｔ３ａとの混合物でヒト胚性幹細胞を処理した場合、胚体内胚葉に代表的な様々な遺伝子の発現が増加する。このヒト胚性幹細胞の分化を測定するバイオアッセイは、スクリーニングのために９６ウェルプレートへと小型化させたフォーマットに適応させた。検証は、市販のアクチビンＡ組換えタンパク質及びＷｎｔ３ａ組換えタンパク質で処理し、胚体内胚葉の代表的なマーカーであると考えられる転写因子ＳＯＸ１７のタンパク質発現を測定することで実施した。
【０２８２】
細胞生存率アッセイ：簡潔に述べると、Ｈ１又はＨ９ヒト胚性幹細胞のクラスターを、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  ３５６２３１）をコートした組織培養プラスチック上で増殖させた。細胞を、コラゲナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １７１０４−０１９）処理及び穏やかなかき取りにより継代し、洗浄して残留酵素を除去し、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコートした９６ウェルプレート（黒、９６ウェル；Ｐａｃｋａｒｄ  ＶｉｅｗＰｌａｔｅｓ；Ｃａｔ  ＃６００５１８２）上に１：１（表面積）比で蒔いた。細胞をクラスター様に付着させ、次いで８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ２３３−ＦＢ）を添加したＭＥＦ馴化培地を毎日供給しながら１〜３日経過させ、対数増殖期を回復させた。
【０２８３】
アッセイは、各プレートのウェルをＰＢＳで２回洗浄することにより開始し、続いて、試験サンプルを含有しているＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １１３３０−０３２）のアリコート（１００μＬ）を各ウェルへと加えた。試験サンプルを含む各ウェルから一日おきに培地を吸引し及び交換して培地を供給しながら、三つ組複製で、全部で４日間のアッセイ期間にわたる試験条件を実施した。アッセイの初日及び二日目では、試験サンプルは０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ；Ｃａｔ  ＃  ＳＨ３００７０．０３）と２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  １３２４−ＷＮ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２に希釈してアッセイウェルに加えた。アッセイの三日目及び四日目では、アッセイウェルに加える試験サンプルは、２％  ＦＣＳは含有するがＷｎｔ３ａは不含のＤＭＥＭ：Ｆ１２に希釈した。ヒト組換えアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；Ｃａｔ  ＃  １２０−１４）からなる陽性対照サンプルを、１日目と２日目にはＷｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）を加えて、アッセイを通して１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えた。陰性対照サンプルでは、アクチビンＡ及びＷｎｔ３ａのどちらの処理も省いた。
【０２８４】
ハイコンテンツな解析：４日間の培養の最後に、アッセイプレートをＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間にわたって固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄し、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温で２０分間にわたって透過処理した。細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １６１１００８２）のＰＢＳ溶液で、室温で３０分間にわたってブロッキング処理した。一次抗体（ヤギ抗ヒトＳＯＸ１７；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ｃａｔ  ＃  ＡＦ１９２４）を４％ニワトリ血清に１：１００で希釈し、室温で１時間各ウェルに加えた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を結合させた２次抗体（ニワトリ抗ヤギＩｇＧ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｃａｔ  ＃）をＰＢＳに１：２００で希釈し、ＰＢＳで３回洗浄した各サンプルウェルに加えた。核を対比染色するために、４μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  Ｈ３５７０）を室温で１０分間加えた。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、撮像のために１００μＬ／ウェルのＰＢＳを残した。
【０２８５】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とで染色した細胞用に５１００８ｂｓダイクロイックを利用して、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像を実施した。曝露時間は陽性対照ウェル及び二次抗体単独で染色した未処理陰性対照ウェルから最適化した。１ウェルあたり１５視野の撮像を得て、バイオアッセイ及び続く染色手順の間の任意の細胞ロスを補正した。ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを用いて総細胞数及び総ＳＯＸ１７強度についての測定値を各ウェルから得た。核の分裂は、グレースケールレベル（ベースライン範囲１００〜３００）と核の大きさに基づいて判定した。各複製データセットについて平均及び標準偏差を算出した。総ＳＯＸ１７タンパク質発現は、細胞面積によって乗じた細胞の総蛍光値として定義される総強度又は積分強度として記録した。バックグラウンドは、２００〜３５００の間のグレースケール範囲の許容基準に基づいて除去した。総強度データは、各ウェルについての総強度を陽性対照についての平均総強度で除することにより正規化した。各複製セットについて、平均及び標準偏差用に正規化データを算出した。
【０２８６】
図１７は、アクチビンＡの市販品（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の２倍段階希釈曲線を試験し、細胞数（図１７Ａ）とＳＯＸ１７強度（図１７Ｂ）の両方を測定したスクリーニングアッセイについての検証を示す。ＳＯＸ１７発現誘導についてのアクチビンＡの最適な効果は、概して１００〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲で観察され、ＥＣ50は３０〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲であった。アッセイの１日目と２日目の処理からＷｎｔ３ａを除去すると、測定可能なＳＯＸ１７発現を生じさせることはできなかった。アクチビンＡの非存在も同様に、ＳＯＸ１７発現を生じさせることはできなかった。
【０２８７】
野生型アクチビンＡ標準の試験：２種の野生型アクチビンＡ遺伝子コンストラクトを発現させ、機能活性について試験した（ｐＣＭＶ６−ＸＬ４哺乳類細胞用発現ベクター（Ｃａｔ  ＃  ＳＣ１１８７７４）中のＯｒｉＧｅｎｅアクチビンＡ及びｐｃＤＮＡ３．１（−）哺乳類細胞用発現ベクター中のＡＣＴＮ１）。両方のコンストラクト共に各発現ベクター中のＣＭＶプロモーターを利用し、どちらもＨＥＫ２９３−Ｅ細胞で発現させた。９６時間後に培養上清を回収し、機能活性について試験した。１ｘ（そのままの）原液又は４ｘ濃縮原液として得た上清をＤＭＥＭ：Ｆ１２に１：４希釈して中間原液を生成し、続いて更に２倍段階希釈し、最終的には、細胞とアッセイ培地を含有している各ウェルに１：５希釈した（最終的なアッセイ希釈範囲は１：２０〜１：６４０）。ＳＯＸ１７発現レベルにより測定した、胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化について得られた結果を、図１８に示す。このアッセイでは、ＯｒｉＧｅｎｅ野生型アクチビンＡの発現系がＡＣＴＮ  １発現系に勝っていた。ＯｒｉＧｅｎｅ野生型の上清を濃縮すると、機能活性が約１．５倍向上した。
【０２８８】
発現系を改良するために、続いてＡＣＴＮ  １コンストラクトをｐＵｎｄｅｒ哺乳類細胞用発現ベクターに移した。実施例２に記載のＥｃｏＲＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて、完全長ＡＣＴＮ  １前駆体遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．１（−）からｐＵｎｄｅｒへとサブクローニングした。ＯｒｉＧｅｎｅコンストラクトと共にこの新しいＡＣＴＮ  １野生型アクチビンＡコンストラクトの両方を、別々にＣＨＯ−Ｓ細胞又はＨＥＫ２９３−Ｆ細胞にトランスフェクトした。９６時間の時点で回収した上清を、実施例２に記載のように調製し、アクチビンＡ活性について試験した。１ｘ（そのままの）原液又は１０ｘ濃縮原液として得た上清をＤＭＥＭ：Ｆ１２に１：４又は１：８希釈して中間希釈物を生成させ、続いて更に、細胞とアッセイ培地を含有している各アッセイウェルに１：５希釈した（最終的なアッセイ希釈範囲は１：２０又は１：４０）。本アッセイで市販のヒト組換えアクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いるヒト胚性幹細胞の分化についての検量線を図１９Ａに示す。ＳＯＸ１７発現レベルを胚体内胚葉分化のマーカーとして測定した。本アッセイで使用した様々な発現系でＯｒｉＧｅｎｅアクチビンＡとＡＣＴＮ  １を比較した結果を、図１９Ｂに示す。ｐＵｎｄｅｒ発現ベクターとＨＥＫ２９３Ｆ細胞を用いるとき、ＡＣＴＮ  １発現は大幅に改善され；ＣＨＯＳ細胞でのＡＣＴＮ  １発現は、上清を濃縮した後でさえも弱いか又は無視できるような結果を示した。
【０２８９】
実施例７：胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へヒト胚性幹細胞を分化させる本発明のペプチドの能力
アクチビンＡ配列中の特異的なアミノ酸残基の変更は、分子の機能特性に対して絶大な効果を有する可能性があり、それにより様々な生体反応が変更され得る。例えば変更は、ポジティブな様式又はネガティブな様式のいずれかで、受容体の結合親和性又は二量体安定性を改変する場合がある。バイオアッセイにおいて、発現した変異体の機能活性を測定し、特異的な残基の修正パターンが、野生型標準と比較して機能の増加又は減少と相関づけられるかどうかを判定することは重要であった。
【０２９０】
スクリーニング：ヒト胚性幹細胞株Ｈ１から得た細胞クラスターを蒔き、上記の実施例５及び６に記載のように解析した。簡潔に述べると、Ｈ１ヒト胚性幹細胞のクラスターを、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコートした組織培養プラスチック上で増殖させた。細胞を、コラゲナーゼ処理及び穏やかなかき取りにより継代し、洗浄して残留酵素を除去し、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコートした９６ウェルプレート上に１：１（表面積）比で蒔いた。細胞をクラスター様に付着させ、次いで８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ２３３−ＦＢ）を添加したＭＥＦ馴化培地を毎日供給しながら１〜３日経過させ、対数増殖期を回復させた。
【０２９１】
アッセイは、各プレートのウェルをＰＢＳで２回洗浄することにより開始し、続いて、試験サンプルを含有しているＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｔ  ＃  １１３３０−０３２）のアリコート（１００μＬ）を各ウェルへと加えた。試験サンプルを含む各ウェルから一日おきに培地を吸引し及び交換して培地供給しながら、三つ組複製で、全部で４日間のアッセイ期間にわたる試験条件を実施した。アッセイの初日及び二日目では、試験サンプルは０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ；Ｃａｔ  ＃  ＳＨ３００７０．０３）と２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  １３２４−ＷＮ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２に希釈してアッセイウェルに加えた。アッセイの三日目及び四日目では、アッセイウェルに加える試験サンプルは、２％  ＦＣＳは含有するがＷｎｔ３ａは不含のＤＭＥＭ：Ｆ１２に希釈した。ヒト組換えアクチビンＡからなる陽性対照サンプルを、１日目と２日目にはＷｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）を加えて、アッセイを通して１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えた。陰性対照サンプルでは、アクチビンＡ及びＷｎｔ３ａのどちらの処理も省いた。
【０２９２】
変異ペプチドを発現した各上清をそのままのもの、１０ｘ濃縮原液、又は５０ｘ濃縮原液として得た。試験上清をＤＭＥＭ：Ｆ１２に１：４又は１：８希釈して中間希釈物を生成させ、続いて更に、細胞とアッセイ培地を含有している各ウェルに１：５希釈した（最終的な希釈範囲は１：２０又は１：４０）。ＯｒｉＧｅｎｅ又はＡＣＴＮ  １（それぞれアクチビンＡ野生型に対応する）発現コンストラクト由来の上清をこれらのアッセイの陽性対照として供した。
【０２９３】
ハイコンテンツな解析：４日間の培養の最後に、アッセイプレートをＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間にわたって固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄し、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温で２０分間にわたって透過処理した。細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １６１１００８２）のＰＢＳ溶液で、室温で３０分間にわたってブロッキング処理した。一次抗体（ヤギ抗ヒトＳＯＸ１７；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ＡＦ１９２４）を４％ニワトリ血清に１：１００で希釈し、室温で１時間各ウェルに加えた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を結合させた２次抗体（ニワトリ抗ヤギＩｇＧ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｃａｔ  ＃）をＰＢＳに１：２００で希釈し、ＰＢＳで３回洗浄した各サンプルウェルに加えた。核を対比染色するために、４μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  Ｈ３５７０）を室温で１０分間加えた。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、撮像のために１００μＬ／ウェルのＰＢＳを残した。
【０２９４】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とで染色した細胞用に５１００８ｂｓダイクロイックを利用して、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像を実施した。曝露時間は陽性対照ウェル及び二次抗体単独で染色した未処理陰性対照ウェルから最適化した。１ウェルあたり１５視野の撮像を得て、バイオアッセイ及び続く染色手順の間の任意の細胞ロスを補正した。ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを用いて総細胞数及び総ＳＯＸ１７強度についての測定値を各ウェルから得た。核の分裂は、グレースケールレベル（ベースライン範囲１００〜３００）と核の大きさに基づいて判定した。各複製データセットについて平均及び標準偏差を算出した。総ＳＯＸ１７タンパク質発現は、細胞面積によって乗じた細胞の総蛍光値として定義される総強度又は積分強度として記録した。バックグラウンドは、２００〜３５００の間のグレースケール範囲の許容基準に基づいて除去した。総強度データは、各ウェルについての総強度を陽性対照についての平均総強度で除することにより正規化した。各複製セットについて、平均及び標準偏差用に正規化データを算出した。
【０２９５】
ＳＯＸ１７発現レベルにより測定した、胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化について得られた結果を、表８に示す。スクリーニングから、変異ペプチドのサブセットに対応する上清は、胚体内胚葉バイオアッセイにおいて有意な機能活性を有すると同定することができた。場合によっては、一部のペプチド変異体の機能活性は、そのままの未濃縮のサンプルと比較して、１０倍又は５０倍に濃縮した上清でより活性を有し、用量漸増性の効果を示した。例えば、対応する未濃縮の上清と比較して１０倍に濃縮した場合、ＡＣＴＮ  ４のサンプル上清は２．６倍高い効力を示し、ＡＣＴＮ  １６は４倍の向上を示した。一部のサンプルは任意の機能活性を示さず、あるいは陽性対照と比較してごくわずかな機能活性を有した。このことはタンパク質発現の差異を反映し得、あるいは適切な折り畳み、二量体形成、又は配向及びアクチビンＡペプチド変異体の各受容体への親和性に対する、変異の悪影響を反映し得る。しかしながらスクリーニング結果は、胚体内胚葉バイオアッセイにおいて、有意な機能を有する変異ペプチドのサブセットを同定する。表９にこのヒット化合物のサブセットを示す。これらの上清サンプル中のタンパク質発現レベルに関する追加情報は無く、リストは広範囲ではないだろうし、変異ペプチドの効力を互いに比較してあるいは野生型標準と比較して等級づけするために使用することができるものではない。
【０２９６】
実施例８：本発明のペプチドのタンパク質濃度の測定
細胞培養上清（そのまま又は濃縮済み）中の、並びに様々な精製ストラテジーにかけたサンプル中のアクチビンＡタンパク質の総量を測定できることは重要であった。これは変異ペプチドを互いに、並びに野生型対照又はアクチビンＡの市販品と比較できるようにするために必要な工程であった。これを受けて、ヒトアクチビンＡ用の市販のＥＬＳＩＡキットを、キットの標準と、上記のバイオアッセイに使用した異なるアクチビンＡ市販品との両方で検証した。後の工程で、発現させ及び精製したアクチビンＡサンプルに加えて本発明の変異ペプチドをＥＬＩＳＡアッセイで試験して、各サンプル中の総タンパク質の測定量を測定した。
【０２９７】
各推奨される工程で洗浄工程を４回実施したことは除き、製造者により提供された取扱説明書に従って、細胞培養上清（そのままのサンプル）、濃縮上清、及び精製品を、市販の、ヒトアクチビンＡ用ＤｕｏＳｅｔ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ  ＃  ＤＹ３３８）を用い総アクチビンＡタンパク質についてアッセイした。キットに含まれず、他の市販品を購入したという試薬としては、ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＶ（ＲＩＡ等級；Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ  ＃  Ａ７８８８）、ＴＭＢ溶液（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ  ＃  Ｔ０４４０）、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １４１９０）、Ｔｗｅｅｎ−２０（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ；Ｃａｔ  ＃  Ｘ２５１−０７）、硫酸（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ；Ｃａｔ  ＃  ９６８１−００）、及び尿素（ＢｉｏＲａｄ；Ｃａｔ  ＃  １６１−０７３１）が挙げられる。キット中に製造者により提供されたヒト組換えアクチビンＡを、ＥＬＩＳＡ検証のための参照標準として使用した。この材料を２倍段階希釈し、８ｎｇ／ｍＬの高度の基準で、図２０Ａに記載されるような７点の検量線を生成させた。他のヒト組換えアクチビンＡ市販品（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；Ｃａｔ  ＃  １２０−１４）も同様に、キット標準と並行して試験し、図２０Ｂに記載されるような、本アッセイの高度な再現性を示す同様の検量線を生成させた。細胞培養上清（そのまま又は濃縮品）と精製物（ＩＭＡＣ又はＡＣＴＡ  ３アフィニティー精製カラム由来）を、検量線の直線部から濃度を算出し得るように段階希釈した。全てのサンプルからのＥＬＩＳＡ結果を表１０に示す。
【０２９８】
一次スクリーニングから一連の変異ペプチドを追跡評価のために選択した。前述同様に、対応するｐＵｎｄｅｒベクター及びＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を用いて、変異体を振とうフラスコ内でトランスフェクトした。簡潔に述べると、細胞は１．０×１０6個細胞／ｍＬに希釈した。トータルＤＮＡのアリコートをＯｐｔｉ−Ｐｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃１２３０９）に希釈し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １６４４７）のアリコートをＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈した。希釈したＤＮＡを希釈したＭａｘ  ｒｅａｇｅｎｔに加え、室温で１０分間にわたってインキュベートした後、ＤＮＡ  Ｍａｘコンプレックスを細胞の入ったフラスコに加え、９６時間にわたって、１２５ｒｐｍ、３７℃かつ８％  ＣＯ2で振とうしながらインキュベートした。５，０００×ｇでの１０分間にわたる遠心により上清を細胞から分離し、０．２μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃａｔ  ＃４３１１５３）により濾過し、次いでＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  １０Ｋ（Ｃａｔ  ＃ＵＦＣ９０１０９６）を用い、３，７５０×ｇで約１０分遠心して１０倍に濃縮した。サンプルは４℃で保存した。
【０２９９】
細胞培養上清を、検量線の直線部から濃度を算出し得るように段階希釈した。全てのサンプルからのＥＬＩＳＡ結果を表１０及び１１に示す。表１０は、広範囲にわたってサンプル希釈し、検量線の直線部分内の、各サンプルについての適切な希釈率を見出すための最初の試みを示す。これはサンプル濃度の正確な算出を可能にするために重要であった。表１１は、各対応サンプルについての適切な段階希釈及び最終的な算出濃度を用いる二次実験を示す。
【０３００】
実施例９：本発明のペプチドのタンパク質濃度と機能活性の相関関係
精製し易さのためにヒスチジン残基での変更を有する本発明の変異ペプチドが、胚体内胚葉分化アッセイにおいても活性を有し、かつこの活性が特異的なタンパク質の相対量と相関するということを示すことは重要であった。上記の実施例５での一次スクリーニングから同定された、変異ペプチドのサブセットを、追加のｂｉｓ−ｈｉｓ変異のために選択した。対応する培養上清での発現及び対応する培養上清の濃縮後に、サンプルを総アクチビンＡタンパク質及び機能効果についてアッセイした。
【０３０１】
ヒスチジン挿入を含有している本発明のペプチドのトランスフェクション：表２に掲載されるようなｂｉｓ−ｈｉｓペプチドＡＣＴＤ  ２〜ＡＣＴＤ  １６をコードする遺伝子配列及びそれらのそれぞれの親配列（ＡＣＴＮ  １、ＡＣＴＮ  １６及びＡＣＴＮ  ３４）を生成させ、実施例２に記載の方法に従ってｐＵｎｄｅｒベクターに挿入した。ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を以下のように一過性的にトランスフェクトした。トランスフェクション１日目に、振とうフラスコ内の培地に１．０×１０6個細胞／ｍＬになるように細胞を希釈した。トータルＤＮＡをＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔをＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈した。希釈したＤＮＡを、希釈したＭａｘ  ｒｅａｇｅｎｔに加え、室温で１０分間にわたってインキュベートした。細胞の入ったフラスコにＤＮＡ  Ｍａｘコンプレックスのアリコートを加え、インキュベーター内に設置し、９６時間にわたって３７℃かつ８％  ＣＯ2下で１２５ＲＰＭで振とうした。
【０３０２】
トランスフェクションの４日後に、一過性的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞から得られる細胞上清を回収し、遠心により清澄化し（３０分、６０００ｒｐｍ）、濾過した（０．２μｍＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。ＬＶ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ（Ｐａｌｌ）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いてサンプルを４倍又は１０倍に濃縮し、４℃で保存した。
【０３０３】
ＥＬＩＳＡタンパク質精製：各推奨される工程で洗浄工程を４回実施したことは除き、製造者により提供された取扱説明書に従って、市販の、ヒトアクチビンＡ用ＤｕｏＳｅｔ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ  ＃  ＤＹ３３８）を用い総アクチビンＡタンパク質について、細胞培養上清を濃縮したものをアッセイした。キット製造者により提供されたヒト組換えアクチビンＡを、ＥＬＩＳＡ検証のための参照標準として使用した。各サンプルについて算出したＥＬＩＳＡアクチビンＡタンパク質濃度を表１２に示す。
【０３０４】
細胞生存率アッセイ：簡潔に述べると、Ｈ１ヒト胚性幹細胞のクラスターを、実施例５に記載の方法に従って、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃａｔ  ＃  ３５６２３１）をコートした組織培養プラスチック上で増殖させた。細胞を、コラゲナーゼ処理及び穏やかなかき取りにより継代し、洗浄して残留酵素を除去し、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコートした９６ウェルプレート上に１：１（表面積）比で蒔いた。細胞をクラスター様に付着させ、次いで８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ２３３−ＦＢ）を添加したＭＥＦ馴化培地を毎日供給しながら１〜３日経過させ、対数増殖期を回復させた。
【０３０５】
アッセイは、各プレートのウェルをＰＢＳで２回洗浄することにより開始し、続いて、試験サンプルを含有しているＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地のアリコート（１００μＬ）を各ウェルへと加えた。試験サンプルを含む各ウェルから一日おきに培地を吸引し及び交換して培地供給しながら、三つ組複製で、全部で４日間のアッセイ期間にわたる試験条件を実施した。アッセイの初日及び二日目では、試験サンプルは０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ；Ｃａｔ  ＃  ＳＨ３００７０．０３）と２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  １３２４−ＷＮ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２に希釈してアッセイウェルに加えた。アッセイの三日目及び四日目では、アッセイウェルに加える試験サンプルは、２％  ＦＣＳは含有するがＷｎｔ３ａは不含のＤＭＥＭ：Ｆ１２に希釈した。ヒト組換えアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；Ｃａｔ  ＃１２０−１４）からなる陽性対照サンプルを、１日目と２日目にはＷｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）を加えて、アッセイを通して１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えた。陰性対照サンプルでは、アクチビンＡ及びＷｎｔ３ａのどちらの処理も省いた。
【０３０６】
ハイコンテンツな解析：４日間の培養の最後に、アッセイプレートをＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間にわたって固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄し、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温で２０分間にわたって透過処理した。細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １６１１００８２）のＰＢＳ溶液で、室温で３０分間にわたってブロッキング処理した。一次抗体（ヤギ抗ヒトＳＯＸ１７；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ＡＦ１９２４）を４％ニワトリ血清に１：１００で希釈し、室温で１時間各ウェルに加えた。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を結合させた２次抗体（ニワトリ抗ヤギＩｇＧ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｃａｔ  ＃）をＰＢＳに１：２００で希釈し、ＰＢＳで３回洗浄した各サンプルウェルに加えた。核を対比染色するために、４μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  Ｈ３５７０）を室温で１０分間加えた。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、撮像のために１００μＬ／ウェルのＰＢＳを残した。
【０３０７】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とで染色した細胞用に５１００８ｂｓダイクロイックを利用して、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像を実施した。曝露時間は陽性対照ウェル及び二次抗体単独で染色した未処理陰性対照ウェルから最適化した。１ウェルあたり１５視野の撮像を得て、バイオアッセイ及び続く染色手順の間の任意の細胞ロスを補正した。ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを用いて総細胞数及び総ＳＯＸ１７強度についての測定値を各ウェルから得た。核の分裂は、グレースケールレベル（ベースライン範囲１００〜３００）と核の大きさに基づいて判定した。各複製データセットについて平均及び標準偏差を算出した。総ＳＯＸ１７タンパク質発現は、細胞面積によって乗じた細胞の総蛍光値として定義される総強度又は積分強度として記録した。バックグラウンドは、２００〜３５００の間のグレースケール範囲の許容基準に基づいて除去した。総強度データは、各ウェルについての総強度を陽性対照についての平均総強度で除することにより正規化した。各複製セットについて、平均及び標準偏差用に正規化データを算出した。
【０３０８】
表１２は、様々なアクチビンＡペプチド変異体について得られた活性を示し、ここでこのアッセイで胚体内胚葉形成後の細胞数及びＳＯＸ１７発現の両方について得られた結果は、ＥＬＩＳＡ結果からの推定アクチビンＡ濃度と関連付けられる。明らかに、ペプチド変異体の野生型ファミリー（ＡＣＴＮ１及びｂｉｓ−ｈｉｓ変異体ＡＣＴＤ２−６）について言えば、追加のヒスチジン置換は、胚体内胚葉形成に対する機能活性にほとんどあるいは全く影響を及ぼさなかった。同様のことが他のペプチド変異体ファミリー（ＡＣＴＮ１６及びＡＣＴＮ３４）及びその各ｂｉｓ−ｈｉｓ変異体（それぞれＡＣＴＤ７−１１及びＡＣＴＤ１２−１６）にもあてはまった。機能アッセイには十分な量のタンパク質を加えた。
【０３０９】
実施例１０：ヒト胚性幹細胞を本発明のペプチドで処理することにより形成された、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の、ＦＡＣＳ解析
本発明の変異ペプチドが、他のバイオマーカーにより示されるように胚体内胚葉分化を支持し得ることを示すことは重要なことであった。ＣＸＣＲ４は、胚体内胚葉に共通して関連付けられる表面タンパク質である。追加のヒスチジン置換を精製しやすさのために組み込まれた変異ペプチドが、アクチビンＡ分子の機能特性に影響を及ぼさなかったことを示すことも重要であった。この実施例では、天然の野生型及び２種の変異体分子の一連のｂｉｓ−ｈｉｓプロトタイプを用いて、ヒト胚性幹細胞を胚体内胚葉分化プロトコルにかけた。
【０３１０】
ヒスチジン挿入を含有させた本発明のペプチドのトランスフェクション：表３に列挙されるようなｂｉｓ−ｈｉｓペプチドＡＣＴＤ３及びＡＣＴＤ８をコードする遺伝子配列を、実施例２に記載の方法に従って生成させ、ｐＵｎｄｅｒベクターに挿入した。ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を以下のように一過性的にトランスフェクトした。トランスフェクション１日目に、別個の振とうフラスコ内の培地に１．０×１０6個細胞／ｍＬになるように細胞を希釈した。トータルＤＮＡをＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔをＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈した。希釈したＤＮＡを、希釈したＭａｘ  ｒｅａｇｅｎｔに加え、室温で１０分間にわたってインキュベートした。細胞の入ったフラスコにＤＮＡ  Ｍａｘコンプレックスのアリコートを加え、インキュベーター内に設置し、９６時間にわたって３７℃かつ８％  ＣＯ2下で１２５ＲＰＭで振とうした。
【０３１１】
ヒスチジン挿入を含有させたペプチドの精製：固定化金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いる精製を、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＵＮＩＣＯＲＮ（商標）ソフトウェアを用いるＡＫＴＡ  ＦＰＬＣクロマトグラフィー系で実施した。
【０３１２】
トランスフェクションの４日後に、一過性的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞から得られる細胞上清を回収し、遠心により清澄化し（３０分、６０００ｒｐｍ）、濾過した（０．２μｍＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。特異的なタンパク質の相対量を、実施例６に記載の方法を用いるＥＬＩＳＡにより測定した。サンプルは、ＬＶ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ（Ｐａｌｌ）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒにより４倍又は１０倍に濃縮し、検出に抗アクチビンＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ３３８１）若しくは抗アクチビンＡ前駆体抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃１２０３）を使用するウェスタンブロットで検査した。ＡＣＴＤ３及びＡＣＴＤ８の濃縮サンプルのアリコートを、細胞生存率アッセイのためにこの時点で更に精製することなく保存した。次いで濃縮サンプルを１ｘ  ＰＢＳの最終濃度になるよう１０ｘ  ＰＢＳで希釈して、再び０．２μで濾過した。希釈した上清を、平衡化した（２０ｍＭのＮａ−リン酸、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に約１０ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂の相対濃度で充填した。充填後にカラムを洗浄し、カラム用量の２０倍以上にわたって、イミダゾールの直線濃度勾配（０〜５００ｍＭ）によりタンパク質を溶出させた。ピーク画分をプールし、ＰＢＳ（ｐＨ  ７）に対して４℃で一晩透析した。透析したタンパク質を透析から回収し、濾過し（０．２μｍ）、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、２８０ｎｍでの吸光度により総タンパク質濃度を測定した。精製したタンパク質の品質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、検出に抗アクチビンＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ３３８１）又は抗アクチビンＡ前駆体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃１２０３）を用いるウェスタンブロットとにより評価した。必要である場合、精製済みタンパク質を１０Ｋの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）の遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濃縮した。サンプルは４℃で保存した。
【０３１３】
ＥＬＩＳＡアッセイ：ＡＣＴＤ３培養上清（４倍濃縮物）、ＡＣＴＤ８（１０倍濃縮物）、及びそれぞれのＩＭＡＣ精製物をＥＬＩＳＡで試験し、総タンパク質濃度を測定した。各推奨される工程で洗浄工程を４回実施したことは除き、製造者により提供された取扱説明書に従って、市販の、ヒトアクチビンＡ用ＤｕｏＳｅｔ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ  ＃  ＤＹ３３８）を用い、総アクチビンＡタンパク質についてサンプルをアッセイした。キット製造者により提供されたヒト組換えアクチビンＡを、ＥＬＩＳＡ検証のための参照標準として使用した。ＡＣＴＤ３の濃縮上清はＥＬＩＳＡにより測定するのに十分な量で存在した。残りのサンプルについて算出されたタンパク質濃度は以下のとおりである。ＡＣＴＤ８（１０倍上清濃縮物）３６１ｎｇ／ｍＬ；ＡＣＴＤ８（ＩＭＡＣ精製物）１，８９３ｎｇ／ｍＬ；ＡＣＴＤ３（ＩＭＡＣ精製物）５７，９５６ｎｇ／ｍＬ。
【０３１４】
細胞生存率アッセイ：簡潔に述べると、Ｈ１ヒト胚性幹細胞のクラスターを、実施例５に記載の方法に従って、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃａｔ  ＃  ３５６２３１）をコートした組織培養プラスチック上で増殖させた。細胞を、コラゲナーゼ処理及び穏やかなかき取りにより継代し、洗浄して残留酵素を除去し、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコートした９６ウェルプレート上に１：１（表面積）比で蒔いた。細胞をクラスター様に付着させ、次いで８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ２３３−ＦＢ）を添加したＭＥＦ馴化培地を毎日供給しながら１〜３日経過させ、対数増殖期を回復させた。
【０３１５】
アッセイは、各プレートのウェルをＰＢＳで２回洗浄することにより開始し、続いて、試験サンプルを含有しているＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地のアリコート（１００μＬ）を各ウェルへと加えた。試験サンプルを含む各ウェルから一日おきに培地を吸引し及び交換して培地供給しながら、９ウェルの複製セットで、全部で４日間のアッセイ期間にわたる試験条件を実施した。アッセイの初日及び二日目では、試験サンプルは０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ；Ｃａｔ  ＃  ＳＨ３００７０．０３）と２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  １３２４−ＷＮ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２に希釈してアッセイウェルに加えた。アッセイの三日目及び四日目では、アッセイウェルに加える試験サンプルは、２％  ＦＣＳは含有するがＷｎｔ３ａは不含のＤＭＥＭ：Ｆ１２に希釈した。ヒト組換えアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；Ｃａｔ  ＃  １２０−１４）からなる陽性対照サンプルを、１日目と２日目にはＷｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）を加えて、アッセイを通して１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えた。陰性対照サンプルでは、アクチビンＡ及びＷｎｔ３ａのどちらの処理も省いた。各濃縮上清又はＩＭＡＣ精製サンプルを、ＤＭＥＭ：Ｆ１２に１：１６希釈して中間希釈物を生成させ、続いて更に、細胞とアッセイ培地を含有している各ウェルに１：５希釈した（最終希釈率１：８０）。４日間の培養の最後に、アッセイウェルをＰＢＳで洗浄し、各処理条件についての９つ組複製ウェルからの細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １２６０４−０１３）での３〜５分にわたる簡単な処理により、単細胞懸濁液として回収した。ＦＡＣＳ解析に先立ち、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。
【０３１６】
ＦＡＣＳ解析：０．５％ヒトγ−グロブリン（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃  Ｇ−４３８６）のＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １４０４０−１３３）溶液とＢＤ  ＦＡＣＳ染色バッファ−ＢＳＡ（ＢＤ；Ｃａｔ  ＃５５４６５７）との１：５溶液で、ＦＡＣＳ解析用の細胞を４℃で１５分間にわたってブロッキングした。次いでＣＤ９ＰＥ（ＢＤ；Ｃａｔ  ＃  ５５５３７２）、ＣＤ９９ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ；Ｃａｔ  ＃  ＭＨＣＤ９９０４）及びＣＸＣＲ４  ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ＃  ＦＡＢ１７３Ａ）に対する抗体で、細胞を４℃で３０分間にわたって染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳ染色バッファでの一連の洗浄の後、生死判別のため細胞を７−ＡＡＤ（ＢＤ；Ｃａｔ  ＃  ５５９９２５）で染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳ解析を実施した。ＰＥ及びＡＰＣの両方に対するマウスＩｇＧ１Ｋアイソタイプ対照抗体を、陽性細胞パーセントを得る（gate）ために使用した。
【０３１７】
図２１に示す結果は、各ｂｉｓ−ｈｉｓコンストラクトからの精製物が機能活性を有し、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉形成を誘導し得るということを示唆する。
【０３１８】
実施例１１：本発明のペプチドの効力
各変異ペプチドの相対活性及び効力を、野生型アクチビンＡ分子（ＡＣＴＮ１）と比較して評価することは重要であった。この実施例では、１５の変異ペプチドを選択して発現させ、濃縮した培養上清のＥＬＩＳＡにより分泌産物をそれぞれ定量化した。次いで各ペプチドを用量漸増させて、ヒト胚性幹細胞を用いる胚体内胚葉分化プロトコルで、機能活性についてアッセイした。
【０３１９】
本発明のペプチドのトランスフェクション：表１３に列挙したｂｉｓペプチドをコードする遺伝子配列を、実施例２に記載の方法に従って生成させ、ｐＵｎｄｅｒベクターに挿入した。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｍａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １６４４７）を用いて、ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞を一過性的にトランスフェクトした。２０ｍＬのトランスフェクション用量でのトランスフェクションに先立ち、細胞を１．０×１０6個細胞／ｍＬに希釈した。トランスフェクション１日目に、１．２５μｇ／ｍＬのトランスフェクションサンプル（transfection）を１．０ｍＬのＯＰＴＩＰＲＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １２３０９）に希釈し、１．２５ｍＬのＭａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを１．０ｍＬのＯＰＴＩＰＲＯに希釈した。ＤＮＡとＭａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを一緒に加えて脂質コンプレックスを形成させ、室温で１０分間にわたってインキュベートした。細胞に脂質コンプレックスを加え、インキュベーター内に設置し、４日間にわたって３７℃かつ８％  ＣＯ2下で１２５ＲＰＭで振とうした。トランスフェクションの４日後に、細胞を回収し、遠心により清澄化し（３０分、６０００ｒｐｍ）、濾過した（０．２μｍＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。特異的なタンパク質の相対量を、実施例６に記載の方法を用いるＥＬＩＳＡにより測定した。必要である場合、タンパク質上清はＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｃａｔ  ＃  ＵＦＣ９００３９６）を用いて２０倍に濃縮し、３，５００ＲＣＦでおよそ４０分間にわたって遠心し、検出に抗アクチビンＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ３３８１）又は抗アクチビンＡ前駆体抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃１２０３）を用いるウェスタンブロットにより検査した。ＡＣＴＤ３及びＡＣＴＤ８の濃縮サンプルのアリコートを、この時点で細胞生存率アッセイのために更に精製することなく保存した。１ｘ  ＰＢＳの最終濃度になるように濃縮サンプルに１０ｘ  ＰＢＳを添加し、次いで０．２μフィルターを通過させた。必要である場合、タンパク質は２０倍に濃縮した。サンプルは４℃で保存した。
【０３２０】
トランスフェクション１日目に、別個の振とうフラスコ内の培地に１．０×１０6個細胞／ｍＬになるように細胞を希釈した。トータルＤＮＡをＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔをＯｐｔｉ−Ｐｒｏに希釈した。希釈したＤＮＡを、希釈したＭａｘ  ｒｅａｇｅｎｔに加え、室温で１０分間にわたってインキュベートした。細胞の入ったフラスコにＤＮＡ  Ｍａｘコンプレックスのアリコートを加え、インキュベーター内に設置し、９６時間にわたって３７℃かつ８％  ＣＯ2下で１２５ＲＰＭで振とうした。
【０３２１】
トランスフェクションの４日後に、一過性的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞から得られる細胞上清を回収し、遠心により清澄化し（３０分、６０００ｒｐｍ）、濾過した（０．２μｍＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。特異的なタンパク質の相対量を、実施例６に記載の方法を用いるＥＬＩＳＡにより測定した。サンプルは、ＬＶ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ（Ｐａｌｌ）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒにより４倍又は１０倍に濃縮し、検出に抗アクチビンＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ３３８１）若しくは抗アクチビンＡ前駆体抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃１２０３）を使用するウェスタンブロットで検査した。ＡＣＴＤ３及びＡＣＴＤ８の濃縮サンプルのアリコートを、細胞生存率アッセイのためにこの時点で更に精製することなく保存した。次いで濃縮サンプルを１ｘ  ＰＢＳの最終濃度になるよう１０ｘ  ＰＢＳで希釈して、再び０．２μで濾過した。希釈した上清を、平衡化した（２０ｍＭのＮａ−リン酸、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に約１０ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂の相対濃度で充填した。充填後にカラムを洗浄し、カラム用量の２０倍以上にわたって、イミダゾールの直線濃度勾配（０〜５００ｍＭ）によりタンパク質を溶出させた。ピーク画分をプールし、ＰＢＳ（ｐＨ  ７）に対して４℃で一晩透析した。透析したタンパク質を透析から回収し、濾過し（０．２μｍ）、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、２８０ｎｍでの吸光度により総タンパク質濃度を測定した。精製したタンパク質の品質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、検出に抗アクチビンＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ３３８１）又は抗アクチビンＡ前駆体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  １２０３）を用いるウェスタンブロットとにより評価した。必要である場合、精製済みタンパク質を１０Ｋの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）の遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により濃縮した。サンプルは４℃で保存した。
【０３２２】
ＥＬＩＳＡアッセイ：野生型ＡＣＴＮ１分子に加えて１５種の異なるＡＣＴＮペプチドの培養上清をＥＬＩＳＡで試験し、総タンパク質濃度を測定した。各推奨される工程で洗浄工程を４回実施したことは除き、製造者により提供された取扱説明書に従って、市販のヒトアクチビンＡ用ＤｕｏＳｅｔ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ  ＃  ＤＹ３３８）を用いサンプルをアッセイした。キット製造者により提供されたヒト組換えアクチビンＡを、ＥＬＩＳＡ検証のための参照標準として使用した。ＡＣＴＮ５６、ＡＣＴＮ６５、及びＡＣＴＮ６９の濃縮上清は、ＥＬＩＳＡで測定するのに十分な量では存在しなかった。残りのサンプルについて算出されたタンパク質濃度を表１３に示す。
【０３２３】
細胞生存率アッセイ：簡潔に述べると、Ｈ１ヒト胚性幹細胞のクラスターを、実施例５に記載の方法に従って、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃａｔ  ＃  ３５６２３１）をコートした組織培養プラスチック上で増殖させた。細胞を、コラゲナーゼ処理及び穏やかなかき取りにより継代し、洗浄して残留酵素を除去し、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコートした９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｃａｔ  ＃  ６００５１８２）上に０．１ｍＬ／ウェルの用量で１：１（表面積）比で蒔いた。細胞をクラスター様に付着させ、次いで８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ２３３−ＦＢ）を添加したＭＥＦ馴化培地を毎日供給しながら１〜３日経過させ、対数増殖期を回復させた。アッセイの間、プレートは３７℃、５％  ＣＯ2で維持した。
【０３２４】
アッセイは、各プレートのウェルをＰＢＳで２回洗浄することにより開始し、続いて、試験サンプルを含有しているアリコート（１００μＬ）を各ウェルへと加えた。１日目と３日目に各ウェルから培地を吸引し、新鮮な試験培地と交換することで培地供給しながら、３つ組複製で、全部で４日間のアッセイ期間にわたる試験条件を実施した。１日目及び３日目のアッセイに加えるために、各ＡＣＴＮ濃縮上清についてのＥＬＩＳＡ結果に基づいて、３．１ｎｇ／ｍＬ〜４００ｎｇ／ｍＬの範囲の２倍段階希釈を適切な培地で実施した。アッセイの初日及び二日目では、試験サンプルは０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ；Ｃａｔ  ＃  ＳＨ３００７０．０３）と２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  １３２４−ＷＮ）とを添加したＤＭＥＭ：Ｆ１２に希釈してアッセイウェルに加えた。アッセイの三日目及び四日目では、アッセイウェルに加える試験サンプルは、２％  ＦＣＳは添加したがＷｎｔ３ａは不含のＤＭＥＭ：Ｆ１２に希釈した。ヒト組換えアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；Ｃａｔ  ＃  １２０−１４）からなる陽性対照サンプルを、アッセイを通して１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加え、Ｗｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）は１日目と２日目のみに加えた。陰性対照サンプルは増殖因子を全く含まないアッセイ培地から構成された。
【０３２５】
ハイコンテンツな解析：培養の最後に、アッセイプレートをＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １４１９０）で１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｃａｔ  ＃  ＡＬＸ−３５０−０１１）で室温で２０分間にわたって固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄し、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ  ＃  Ｔ８７６０−２）で室温で２０分間にわたって透過処理した。細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １６１１００８２）のＰＢＳ溶液で、室温で３０分間にわたってブロッキング処理した。一次抗体（ヤギ抗ヒトＳＯＸ１７；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ＡＦ１９２４）を４％ニワトリ血清に１：１００で希釈し、室温で２時間各ウェルに加えた。ＰＢＳでの３回の洗浄のあと、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を結合させた二次抗体（ニワトリ抗ヤギＩｇＧ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃Ａ２１４６７）をＰＢＳに１：２００希釈したものを各ウェルに加えた。核を対比染色するために、５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  Ｈ３５７０）を室温で１５分間加えた。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、撮像のために１００μＬ／ウェルのＰＢＳを残した。
【０３２６】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とで染色した細胞用に５１００８ｂｓダイクロイックを利用して、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像を実施した。１ウェルあたり２５視野から撮像を得た。ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを用いて総強度についての測定値を各ウェルから得た。核の分裂は、グレースケールレベル（ベースライン範囲１００〜３００）と核の大きさに基づいて判定した。各複製データセットについて平均及び標準偏差を算出した。総タンパク質発現は、細胞面積によって乗じた細胞の総蛍光値として定義される総強度又は積分強度として記録した。バックグラウンドは、２００〜４５００の間のグレースケール範囲の許容基準に基づいて除去した。総強度データは、各ウェルについての総強度を陽性対照についての平均総強度で除することにより正規化した。
【０３２７】
図２２のパネルａ〜ｉを通して、アッセイ結果はＳＯＸ１７発現パーセント対ペプチド濃度を表す。それそれの変異型ＡＣＴＮペプチドについての用量漸増曲線を、野生型ＡＣＴＮ１ペプチドについての同様の曲線と比較して示す。曲線適合性（Ｒ2値）も記載する。全変異型ＡＣＴＮペプチドについての用量漸増結果は、野生型ＡＣＴＮ１ペプチドの用量漸増と密接に一致し、曲線シフトのばらつきはそれぞれの典型的な曲線の標準誤差範囲内である。これらのデータは、各変異体ＡＣＴＮペプチドの効力が、野生型ＡＣＴＮ１ペプチドと同様であるかあるいは等しいことを示唆する。
【０３２８】
実施例１２：ＡＣＴＮ変異ペプチドは下流の膵臓分化を媒介する
本発明のペプチドでヒト胚性幹細胞を処理しても、内胚葉及び内分泌腺系に向かう更なる分化が妨げられないことを示すのは重要であった。２つの代表的なＡＣＴＮペプチドを使用して、ヒト胚性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させた。したがって、処理細胞に段階的分化プロトコルを適用して、膵臓内胚葉及び内分泌腺系に向かう分化を促進させた。ＡＣＴＮ１野生型ペプチドで処理した細胞の並行対照サンプルを、段階的な分化プロセスにわたって比較するために使用した。分化の様々なステージの代表的なタンパク質及びｍＲＮＡバイオマーカーの状況を判定するために、分化の各ステージごとにサンプルを採取した。
【０３２９】
アッセイのための細胞の調製：ヒト胚性幹細胞（Ｈ１  ｈＥＳＣ系）の保存培養物を、ｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；Ｃａｔ  ＃  １００−１８Ｂ）を添加したＭＥＦ馴化培地を含有させた、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコートしたディッシュ上で、未分化の多能性状態のままで、平均して４日ごとに継代しながら維持した。継代は、細胞培養物を１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ  ＃  １７１０４−０１９）に３７℃で５〜７分間曝露して、続いて単層をＭＥＦ馴化培地ですすぎ、穏やかにかき取り、細胞クラスターを回収することにより実施した。クラスターを低速度で遠心して細胞ペレットを回収し、残留コラゲナーゼを除去した。細胞クラスターはルーチン的な維持培養については１：３比又は１：４比で、あるいは直接アッセイについては１：１比で継代した。全てのヒトＥＳ細胞株は５０未満の継代数で維持し、正常な核表現型について及びマイコプラズマ汚染の非存在について、ルーチン的に評価した。
【０３３０】
細胞クラスターは、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ馴化培地に均一に再懸濁して、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコートした２４ウェルのブラックウォール培養プレート（Ａｒｃｔｉｃ  Ｗｈｉｔｅ；Ｃａｔ  ＃  ＡＷＬＳ−３０３０１２）上に０．５ｍＬ／ウェルの用量で播種した。使用した培養培地を各ウェルから吸引し、等量の新鮮な培地と交換することで毎日の培地供給を実施した。アッセイの持続時間の間、プレートは３７℃、５％  ＣＯ2で維持した。
【０３３１】
アッセイ：各ウェルから培養培地を吸引し、試験培地のアリコート（０．５ｍＬ）を加えて戻すことでアッセイを開始した。培地を各ウェルから吸引し、新鮮な試験培地と交換することにより毎日培地供給しながら、分化の第１工程のための試験条件を３日間の期間にわたって実施した。ヒトアクチビンＡ用のＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ＤＹ３３８）を用いて、前述の実施例１１に記載のように、ＡＣＴＮペプチドの濃縮上清をタンパク質濃度について評価した。アッセイの初日に、２％ウシ血清アルブミンフラクションＶ、脂肪酸不含（ＦＡＦ  ＢＳＡ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ；Ｃａｔ  ＃  １５２４０１）、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  １３２４−ＷＮ／ＣＦ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃：２２４００）でＡＣＴＮペプチドを１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、次いでアッセイウェルに加えた。アッセイの２日目及び３日目に、２％脂肪酸不含ＢＳＡ及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加した、Ｗｎｔ３ａは不含のＲＰＭＩ  １６４０培地でＡＣＴＮペプチドを希釈し、次いでアッセイウェルに加えた。陽性対照サンプルには、市販のアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；Ｃａｔ  ＃１２０−１４）を、記載の増殖因子を添加した培養培地に希釈したものが含まれた。３日間の培養の最後に、細胞を一部のウェルからフローサイトメトリーによる解析のために回収し、胚体内胚葉形成のマーカーであるＣＸＣＲ４のレベルを評価した。追加のウェルを分化に関する他のマーカーのＲＴ−ＰＣＲ解析のために回収した。他の培養ウェルに対しては、ＳＯＸ１７のタンパク質発現レベルについて、ハイコンテンツな解析を実施した。
【０３３２】
分化プロトコルの第１工程の最後に、各処理群についての並行ウェルの複製セットに更なる段階的な分化を施した。最初の３日間の後に、全てのウェルが継続して培養され、同様の処理による分化を受けたことを注記しておく必要がある。この連続的な分化のためのプロトコルを以下に記載する。
【０３３３】
分化の第２工程時に、２％ウシ血清アルブミンフラクションＶ、脂肪酸不含（ＦＡＦ  ＢＳＡ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ；Ｃａｔ  ＃  １５２４０１）、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；Ｃａｔ  ＃  １００−１９）、及び２５０ｎＭシクロパミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；Ｃａｔ  ＃  ２３９８０４）を添加したＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １１３３０−０３２）で２日間にわたって培養物を増殖させた。両日共に各ウェル中の培地を吸引し、新鮮なアリコート（０．５ｍＬ）で交換した。
【０３３４】
分化プロトコルの工程３を四日間にわたって実施した。各ウェルから培地を吸引し、１％  Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ＃  １７５０４−０４４）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ３３４４−ＮＧ）、２５０ｎＭのＫＡＡＤ−シクロパミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；Ｃａｔ  ＃  ２３９８０４）、及び２μＭのオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃａｔ  ＃  Ｒ２６２５）を添加したＤＭＥＭ−高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １０５６９）の新鮮なアリコート（０．５ｍＬ）と交換することで、細胞に毎日培地供給した。分化の第３工程の最後に、ＲＴ−ＰＣＲによる解析のために一部のウェルから細胞を回収し、分化マーカーを測定した。他の培養ウェルでは、膵臓内胚葉分化に関連付けられる転写因子であるＰＤＸ１、及び腸管内胚葉に関連付けられる転写因子であるＣＤＸ２の、タンパク質発現レベルについて、ハイコンテンツな画像解析を実施した。
【０３３５】
分化プロトコルの工程４を三日間にわたって実施した。各ウェルから培地を吸引し、１％  Ｂ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン、１００ｎｇ／ｍＬのネトリン−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃）、１μＭのＤＡＰＴ、及び１μＭのＡｌｋ５インヒビター（Ａｘｘｏｒａ；Ｃａｔ  ＃  ＡＬＸ−２７０−４４５）を添加したＤＭＥＭ−高グルコースの新鮮なアリコート（０．５ｍＬ）と交換することで、細胞に培地供給した。分化の第４工程の終了時に、ＲＴ−ＰＣＲによる解析のために一部のウェルから細胞を回収し、分化マーカーを測定した。
【０３３６】
ＦＡＣＳ解析：０．５％ヒトγ−グロブリン（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ＃  Ｇ−４３８６）のＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １４０４０−１３３）溶液とＢＤ  ＦＡＣＳ染色バッファ−ＢＳＡ（ＢＤ；Ｃａｔ  ＃５５４６５７）との１：５溶液で、ＦＡＣＳ解析用の細胞を４℃で１５分間にわたってブロッキングした。次いでＣＸＣＲ４  ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ＃  ＦＡＢ１７３Ａ）に対する抗体で、細胞を４℃で３０分間にわたって染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳ染色バッファでの一連の洗浄の後、生死判別のため細胞を７−ＡＡＤ（ＢＤ；Ｃａｔ  ＃  ５５９９２５）で染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳ解析を実施した。ＡＰＣに対するマウスＩｇＧ１Ｋアイソタイプ対照抗体を、陽性細胞パーセントを得るために使用した。
【０３３７】
ＲＴ−ＰＣＲ解析：ＲＮＡサンプルを、エタノールを含有している高塩濃度緩衝液の存在下で、シリカゲル膜（Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）に結合させた後、洗浄して混入物を除去することにより精製した。ＲＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−フリーキット（Ａｍｂｉｏｎ，ＩＮＣ）を使用して更に精製し、次いで高品質ＲＮＡを水中に溶出させた。収率及び純度は分光光度計でのＡ２６０及びＡ２８０の測定値により評価した。ＡＢＩ（ＡＢＩ，ＣＡ）のｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ａｒｃｈｉｖｅ  ｋｉｔを使用して、精製したＲＮＡからＣＤＮＡコピーを作成した。
【０３３８】
特に記載のない限り、全試薬はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システムを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。２０ｎｇの逆転写ＲＮＡと共に、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸ（登録商標）（ＡＢＩ，ＣＡ）を、２０μＬの全反応容量で使用した。各ｃＤＮＡサンプルは２つ組複製で実施して、ピペッティング誤差を補正した。プライマー及びＦＡＭ−標識ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを２００ｎＭの濃度で使用した。各標的遺伝子に関する発現レベルを、以前にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより開発されたヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内在性対照を使用して正規化した。プライマーセットとプローブセットは以下の通りである。ＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦＯＸＡ２（Ｈｓ００２３２７６４＿ｍ１、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより提供）、ＳＯＸ１７（Ｈｓ００７５１７５２＿ｓ１、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより供給）、ＣＤＸ２（Ｈｓ００２３０９１９＿ｍ１、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより供給）、ＰＤＸ１（Ｈｓ００２３６８３０＿ｍ１、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより供給）、ＮＧＮ３（Ｈｓ００３６０７００＿ｇ１、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより供給）、ＮＫＸ６．１（Ｈｓ００２３２３５５＿ｍ１、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより供給）、及びＰＴＦ１  ａｌｐｈａ（Ｈｓ００６０３５８６＿ｇ１、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより供給）。最初に５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間インキュベーションした後、サンプルを、９５℃で１５秒間の変性工程と、その後の６０℃で１分間のアニーリング／伸長工程の２段階に４０サイクルかけた。ＧＥＮＥＡＭＰ（登録商標）７０００配列検出システムソフトウエアを使用して、データ解析を行った。各プライマー／プローブセットについて、増幅の指数関数領域の中央において蛍光強度が特定の値に到達したサイクル数としてのＣｔ値を決定した。比較Ｃｔ法を使用して、相対的な遺伝子発現レベルを算出した。簡潔に述べると、各ｃＤＮＡサンプルに関して、対象とする遺伝子のＣｔ値から内在性対照のＣｔ値を減算して、デルタＣｔ値（ΔＣｔ）を得た。増幅は１００％効率であると仮定し、正規化した標的量を２−ΔＣｔとして算出した。最終的なデータを、標準物質サンプルに関して表した。
【０３３９】
ハイコンテンツな解析：３日間の培養の最後に、アッセイプレートをＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １４１９０）で１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｃａｔ  ＃  ＡＬＸ−３５０−０１１）で室温で２０分間にわたって固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄し、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ  ＃  Ｔ８７６０−２）で室温で２０分間にわたって透過処理した。細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  １６１１００８２）のＰＢＳ溶液で、室温で３０分間にわたってブロッキング処理した。一次抗体（ヤギ抗ヒトＳＯＸ１７；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｃａｔ  ＃  ＡＦ１９２４）を４％ニワトリ血清に１：１００で希釈し、室温で２時間各ウェルに加えた。ＰＢＳでの３回の洗浄のあと、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を結合させた二次抗体（ニワトリ抗ヤギＩｇＧ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃Ａ２１４６７）をＰＢＳに１：２００希釈したものを各ウェルに加えた。核を対比染色するために、５μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  Ｈ３５７０）を室温で１５分間加えた。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、撮像のために１００μＬ／ウェルのＰＢＳを残した。解析のために使用した他の一次抗体には、１：１００希釈マウス抗ヒトＣＤＸ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  ３９７８００）、１：１００希釈ヤギ抗ヒトＰｄｘ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｃａｔ  ＃  ＳＣ−１４６６４）、１：２００希釈ウサギ抗ヒトインスリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；Ｃａｔ  ＃  Ｃ２７Ｃ９）、及び１：１５００希釈マウス抗ヒトグルカゴン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃａｔ  ＃  Ｇ２６５４）が含まれた。解析のために使用した二次抗体には、１：４００希釈Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ニワトリ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  Ａ−２１４６３）、１：２００希釈Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  Ａ１１０５５）、１：１０００希釈Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ニワトリ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  Ａ２１４４３）、及び１：１０００希釈Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ニワトリ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ  ＃  Ａ２１２００）が含まれた。
【０３４０】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８とで染色した細胞用に５１００８ｂｓダイクロイックを利用して、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像を実施した。１ウェルあたり２５視野から撮像を得た。ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを用いて総強度についての測定値を各ウェルから得た。核の分裂は、グレースケールレベル（ベースライン範囲１００〜３００）と核の大きさに基づいて判定した。各複製データセットについて平均及び標準偏差を算出した。総タンパク質発現は、細胞面積によって乗じた細胞の総蛍光値として定義される総強度又は積分強度として記録した。バックグラウンドは、２００〜４５００の間のグレースケール範囲の許容基準に基づいて除去した。総強度データは、各ウェルについての総強度を陽性対照についての平均総強度で除することにより正規化した。
【０３４１】
結果：図２３は、分化の第１工程の終了時に得られた結果を、胚体内胚葉に代表的な複数種のマーカーについての、フローサイトメトリー、ＰＣＲ、及びハイコンテンツな手法を用いて示す。図２３Ａは、市販のアクチビンＡでの処理と野生型ＡＣＴＮ１処理を比較している、ＣＸＣＲ４レベルについてのＦＡＣＳ解析を示す。どちらの処理についても、得られた結果は、同等の強いＣＸＣＲ４発現を示した。図２３Ｂは２つの変異ペプチド（ＡＣＴＮ４及びＡＣＴＮ４８）についてのＣＸＣＲ４発現を野生型ＡＣＴＮ１ペプチドと比較して示す。全ての処理について、得られた結果は同等であるかあるいは同程度のＣＸＣＲ４発現を示した。図２３Ｃ〜図２３Ｆは、分化の第１工程の終了時での細胞数及びＳＯＸ１７発現についてのハイコンテンツな解析を示す。市販のアクチビンＡでの処理及びＡＣＮＴ１野生型ペプチドでの処理について再度同等の結果を示し、また２つの変異ペプチドのそれぞれについて同程度の結果を示している。図２３Ｇ及び図２３Ｈは分化の第１工程の終了時でのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＡＣＴＮ１及び市販のアクチビンＡでの処理と比較して、ＡＣＴＮ４及びＡＣＴＮ４８変異ペプチドで処理したサンプルは、胚体内胚葉分化と関連づけられるマーカー類であるＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２について同様の発現レベルを有する。
【０３４２】
図２４は、分化の第３工程の終了時に得られた結果を、膵臓内胚葉に代表的な複数種のマーカーについてのＰＣＲ及びハイコンテンツな解析手法を用いて示す。ＡＣＴＮ４及びＡＣＴＮ４８変異ペプチドでの処理は同等の細胞数並びにＰＤＸ１及びＣＤＸ２の等価なタンパク質発現を生成させた。これは市販のアクチビンＡ又はＡＣＴＮ１野生型ペプチドを用いる処理で観察される結果と同程度であった。ＲＴ−ＰＣＲ結果は一致した。
【０３４３】
図２５は、分化の第４工程終了時に得られたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。前述同様に、ＡＣＴＮ４及びＡＣＴＮ４８変異ペプチドでの処理は、市販のアクチビンＡ又はＡＣＴＮ１野生型ペプチドでの処理と比較して、下流の膵臓分化マーカーに関して同程度の発現を生じた。
【０３４４】
これらの集積された結果は、ＡＣＴＮ４及びＡＣＴＮ４８変異ペプチドは、胚体内胚葉分化、並びにそれに続く膵臓内胚葉分化及び内分泌腺分化時にアクチビンＡと代替し得ることを立証する。
【０３４５】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【０３４６】
【表１−１】
2011526784.tif 000003
【０３４７】
【表１−２】
2011526784.tif 000004
【０３４８】
【表１−３】
2011526784.tif 000005
【０３４９】
【表１−４】
2011526784.tif 000006
【０３５０】
【表１−５】
2011526784.tif 000007
【０３５１】
【表１−６】
2011526784.tif 000008
【０３５２】
【表１−７】
2011526784.tif 000009
【０３５３】
【表１−８】
2011526784.tif 000010
【０３５４】
【表１−９】
2011526784.tif 000011
【０３５５】
【表１−１０】
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【０３５６】
【表１−１１】
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【０３５７】
【表１−１２】
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【０３５８】
【表１−１３】
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【０３５９】
【表１−１４】
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【０３６０】
【表１−１５】
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【０３６１】
【表１−１６】
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【０３６２】
【表１−１７】
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【０３６３】
【表１−１８】
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【０３６４】
【表１−１９】
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【０３６５】
【表２−１】
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【０３６６】
【表２−２】
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【０３６７】
【表２−３】
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【０３６８】
【表２−４】
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【０３６９】
【表２−５】
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【０３７０】
【表２−６】
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【０３７１】
【表２−７】
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【０３７２】
【表２−８】
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【０３７３】
【表２−９】
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【０３７４】
【表２−１０】
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【０３７５】
【表２−１１】
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【０３７６】
【表２−１２】
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【０３７７】
【表２−１３】
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【０３７８】
【表２−１４】
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【０３７９】
【表２−１５】
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【０３８０】
【表２−１６】
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【０３８１】
【表２−１７】
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【０３８２】
【表２−１８】
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【０３８３】
【表２−１９】
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【０３８４】
【表２−２０】
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【０３８５】
【表２−２１】
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【０３８６】
【表２−２２】
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【０３８７】
【表２−２３】
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【０３８８】
【表２−２４】
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【０３８９】
【表２−２５】
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【０３９０】
【表２−２６】
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【０３９１】
【表２−２７】
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【０３９２】
【表２−２８】
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【０３９３】
【表２−２９】
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【０３９４】
【表２−３０】
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【０３９５】
【表２−３１】
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【０３９６】
【表２−３２】
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【０３９７】
【表２−３３】
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【０３９８】
【表２−３４】
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【０３９９】
【表２−３５】
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【０４００】
【表２−３６】
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【０４０１】
【表２−３７】
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【０４０２】
【表２−３８】
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【０４０３】
【表２−３９】
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【０４０４】
【表２−４０】
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【０４０５】
【表２−４１】
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【０４０６】
【表２−４２】
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【０４０７】
【表２−４３】
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【０４０８】
【表２−４４】
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【０４０９】
【表２−４５】
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【０４１０】
【表２−４６】
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【０４１１】
【表２−４７】
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【０４１２】
【表２−４８】
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【０４１３】
【表３】
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【０４１４】
【表４】
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【０４１５】
【表５】
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【０４１６】
【表６】
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【０４１７】
【表７】
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【０４１８】
【表８−１】
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【０４１９】
【表８−２】
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【０４２０】
【表８−３】
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【０４２１】
【表８−４】
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【０４２２】
【表８−５】
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【０４２３】
【表８−６】
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【０４２４】
【表８−７】
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【０４２５】
【表９】
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【０４２６】
※このページは意図的に空白のまま
【０４２７】
【表１０】
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*ＮＤ：検出不可能
【０４２８】
【表１１】
2011526784.tif 000084
【０４２９】
【表１２】
2011526784.tif 000085
*ｎｄ：検出不可能
【０４３０】
【表１３】
2011526784.tif 000086
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2011526784.tif 000090
【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2011526784.tif 000093
【図７Ｂ】
2011526784.tif 000094
【図８Ａ】
2011526784.tif 000095
【図８Ｂ】
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【図９】
2011526784.tif 000097
【図１０】
2011526784.tif 000098
【図１１】
2011526784.tif 000099
【図１２】
2011526784.tif 000100
【図１３−１】
2011526784.tif 000101
【図１３−２】
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【図１４】
2011526784.tif 000103
【図１５Ａ】
2011526784.tif 000104
【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２２Ｉ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ】
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【図２３Ｈ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２４Ｈ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2011526784.tif 000145
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