(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）セフィキシム、（ｂ）亜テルル酸塩、（ｃ）胆汁酸又はその塩、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質、（ｅ）乳糖０．０１〜２ｇ／Ｌ（検出時の濃度）、及び（ｆ）セロビオース５〜２０ｇ／Ｌ（検出時の濃度）を含有する腸管出血性大腸菌検出用培地。
【請求項２】
（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質が、青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトピラノシドである請求項１記載の腸管出血性大腸菌検出用培地。
【請求項３】
更に、ニュートラルレッドを検出時の濃度とし０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ含有する請求項１又は２記載の腸管出血性大腸菌検出用培地。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の培地に検体を接種し、培養後、青色のコロニーを検出することを特徴とする腸管出血性大腸菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒の原因となる腸管出血性大腸菌を他の大腸菌と区別して検出し得る培地及び腸管出血性大腸菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌Ｏ１５７をはじめとする腸管出血性大腸菌はベロ毒素を産生する大腸菌の血清型の一種であり、一般的に食中毒の原因となる細菌として知られており、また本食中毒は重篤化することがあることから、本細菌の制御は食品衛生及び安全の点からも重要である（非特許文献１）。
【０００３】
腸管出血性大腸菌の選択分離培地としてはセフィキシム及び亜テルル酸カリウムを添加したマッコンキー基礎寒天培地に特定の糖を加えた培地、すなわちＯ１５７の場合にはソルビトールを利用できないのでソルビトールを添加し、発育してきたコロニーのうち糖利用反応を認めない無色のコロニーを腸管出血性大腸菌Ｏ１５７として分離する、同様にＯ１１１及びＯ２６の場合にはソルボース、ラムノースをそれぞれ添加し同様に糖利用反応を認めないコロニーを分離するといったものが古くから用いられてきた。この場合には目的とする細菌のコロニーに検出可能な反応が見られず、目的以外のコロニーに検出可能な反応が発生するため目的菌のコロニーが見難くなる。
【０００４】
一方で近年では検出可能な色原体化合物を有する酵素基質により腸管出血性大腸菌に特異的な酵素を指標とし、腸管出血性大腸菌を検出できる培地が種々開発されている（非特許文献２、３及び特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０００−５０８１７６号公報
【特許文献２】特開２０１０−２３３５６５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】食品衛生検査指針  微生物編  厚生労働省監修  社団法人  日本食品衛生協会  １６８−１７９頁、２００４年６月３０日。
【非特許文献２】Ｄｉｆｃｏ  ＆  ＢＢＬ  Ｍａｎｕａｌ，Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ  ２００３，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ３４０−３４２頁。
【非特許文献３】極東製薬株式会社  ＣＩＸ寒天培地パンフレット。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの検出可能な色原体化合物を有する酵素基質の添加による腸管出血性大腸菌の培地ではＯ１５７、Ｏ１１１、Ｏ２６といった主要な腸管出血性大腸菌の血清型を推定的に鑑別することが出来る培地であるが、複数の色原体化合物を有する酵素基質を使用する必要があり、非常に高価である。更にこれらの培地において３種の菌の性状のうち２種は同系色のコロニーを形成するため一概にして３種を鑑別できるとは言い難い。また、食品を検体とする検出培地としては、血清型の鑑別は重要ではなく、検体食品中に食中毒を生じる可能性のある腸管出血性大腸菌が存在するか否かが最重要である。
従って、本発明の課題は、血清型によらず、腸管出血性大腸菌全般を選択的に検出できる培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、高価な色原体化合物を有する酵素基質を１種のみ使用して、腸管出血性大腸菌全般を他の大腸菌群と区別して検出可能な培地を開発すべく種々検討した結果、セフィキシム及び亜テルル酸塩を添加した栄養培地に、胆汁酸又はその塩、青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質、低濃度の乳糖、及び特定濃度のセロビオースを添加した培地を用いれば、血清型にかかわらず腸管出血性大腸菌を明瞭な青色のコロニーとして検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、（ａ）セフィキシム、（ｂ）亜テルル酸塩、（ｃ）胆汁酸又はその塩、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質、（ｅ）乳糖０．０１〜２ｇ／Ｌ（検出時の濃度）、及び（ｆ）セロビオース５〜２０ｇ／Ｌ（検出時の濃度）を含有する腸管出血性大腸菌検出用培地を提供するものである。
また、本発明は、上記の培地に検体を接種し、培養後青色のコロニーを検出することを特徴とする腸管出血性大腸菌の検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の培地を用いれば、食中毒の原因となる腸管出血性大腸菌が、血清型にかかわらず、他の大腸菌群と区別して、青色のコロニーとして明確に検出できる。従って、広範囲な飲食品中の腸管出血性大腸菌が簡便かつ速やかに検出可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の腸管出血性大腸菌検出用培地は、（ａ）セフィキシム、（ｂ）亜テルル酸塩、（ｃ）胆汁酸又はその塩、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質、（ｅ）乳糖０．０１〜２ｇ／Ｌ（検出時の濃度）、及び（ｆ）セロビオース５〜２０ｇ／Ｌ（検出時の濃度）を含有する。
【００１２】
（ａ）セフィキシムはプロテウスやモルガネラ等の発育を抑制し、（ｂ）亜テルル酸塩は腸管出血性大腸菌以外の大腸菌やアエロモナス等の発育を抑制するため、腸管出血性大腸菌の分離に重要である。亜テルル酸塩としては、亜テルル酸ナトリウム、亜テルル酸カリウム等の亜テルル酸アルカリ金属塩が好ましい。セフィキシムは本発明培地中の検出時の濃度として０．０１〜０．５ｍｇ／Ｌ含有するのが好ましく、０．０１〜０．１ｍｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。亜テルル酸塩は本発明培地中の検出時の濃度として０．１〜１０ｍｇ／Ｌ含有するのが好ましく、１〜８ｍｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１３】
（ｃ）胆汁酸又はその塩は、グラム陽性菌を抑制し、また形成したコロニーを赤色系にすることにより、腸管出血性大腸菌以外の細菌のコロニーを排除しやすくする作用を有する。胆汁酸としては、コール酸、デオキシコール酸が挙げられる。胆汁酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。（ｃ）胆汁酸又はその塩は、グラム陽性菌の抑制及び腸管出血性大腸菌以外の細菌のコロニーの呈色性の点から、本発明培地の検出時の濃度として０．５〜１０ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、１〜５ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１４】
（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質は、腸管出血性大腸菌を色原体化合物に依存する青色のコロニーを形成させるために用いる。腸管出血性大腸菌を含む大腸菌群はβ−ガラクトシダーゼを産生するので、検体中に腸管出血性大腸菌を含む大腸菌群が含まれれば基質が分解され、青色の色原体化合物が遊離する。これらの基質に含まれる青色の色原体化合物としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール、５−ブロモ−３−インドール、６−ブロモ−２−ナフトール、２−メチル−３−インドール、６−クロロ−３−インドール等が挙げられる。また、β−ガラクトシダーゼ基質としては、β−ガラクトピラノシドが好ましい。（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質の具体例として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１−メチル−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどが挙げられる。
（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質は腸管出血性大腸菌のコロニーの呈色性の点から、本発明培地の検出時の濃度として０．０１〜１ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、０．０５〜０．５ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１５】
（ｅ）乳糖は、腸管出血性大腸菌を含む大腸菌群が資化しうる糖であるが、腸管出血性大腸菌のみを青色の色原体化合物に由来した呈色コロニーを形成させ、更にその発色を増強させる作用を有する。本発明培地の検出時の濃度として０．０１〜２ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、０．５〜２ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１６】
（ｆ）セロビオースは大腸菌以外の菌により資化しうる糖である。腸管出血性大腸菌以外の菌のコロニーの呈色性の点から、本発明培地の検出時の濃度として５〜２０ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、７．５〜１５ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１７】
本発明培地において、十分量の（ｆ）セロビオースと低濃度の（ｅ）乳糖は、腸管出血性大腸菌を青色のコロニーとして検出する点で重要である。セフィキシム及び亜テルル酸カリウムを添加した栄養培地に腸管出血性大腸菌を含む大腸菌群に特異的であるβ−ガラクトシダーゼに対する青色の色原体化合物を有する酵素基質を加えるだけでは、セフィキシム及び亜テルル酸カリウムに耐性である腸管出血性大腸菌以外の一部の大腸菌群についても青色のコロニーを形成する。これを回避するために大腸菌が利用できずその他の大腸菌群が利用できる（ｆ）セロビオースを十分量加えることにより、セフィキシム及び亜テルル酸カリウムに耐性の腸管出血性大腸菌以外の菌は、青色以外の集落を形成するが、その結果目的菌である腸管出血性大腸菌の青色の発色が極端に弱くなり明瞭ではなくなることを認めた。これに低濃度の（ｅ）乳糖を加えると、通常全ての大腸菌群は乳糖を利用するため、β−ガラクトシダーゼに対する色原体化合物を加えてあっても発育した全ての大腸菌群はピンク色を帯びることが想定されるが、実際には腸管出血性大腸菌は血清型に拘らずピンク色の発色を認めないだけでなく、更に青色の発色が増強され明瞭な青色コロニーを形成することを認めた。また培地上に発育した腸管出血性大腸菌以外のコロニーは青色以外のコロニーを形成する、あるいは発育しないため、腸管出血性大腸菌を青色のコロニーとして容易に鑑別出来る。
【００１８】
本発明培地には、更にニュートラルレッドを加えても良い。ニュートラルレッドは胆汁酸又はその塩とともに形成したコロニーの色を赤色系にすることにより、腸管出血性大腸菌以外の細菌のコロニーを排除しやすくする。ニュートラルレッドを加えない場合でも腸管出血性大腸菌以外の菌はほぼ無色のコロニーあるいは黄緑色のコロニーを形成し青色の腸管出血性大腸菌のコロニーと鑑別可能であるが、検出時の濃度として０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ含有させたときに培地が無色透明で腸管出血性大腸菌以外のコロニーが明瞭なピンク色を呈するためよりコロニーの鑑別が容易になる。ニュートラルレッドは腸管出血性大腸菌以外の細菌のコロニーの呈色性の点から、本発明培地の検出時の濃度として０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。また一般的に培地に使用されている含有量である０．０２〜０．０３ｇ／Ｌの場合には培地全体が赤色系になってしまうため、コロニーの検出性が低下することがある。
【００１９】
本発明培地には上記成分の他、栄養成分、無機塩、ｐＨ調整剤等を配合することが出来る。
【００２０】
栄養成分としては、ペプトン、獣肉エキス、酵母エキス、魚肉エキス等が好ましい。無機塩類としては塩化ナトリウム等の無機酸金属塩、クエン酸ナトリウムなどの有機酸金属塩などが挙げられる。
【００２１】
また、本発明培地は、形成した腸管出血性大腸菌以外の細菌のコロニーの呈色性及び排除のしやすさの点から、検出時のｐＨが７．０以上であるのが好ましく、ｐＨ７．０〜８．０であるのがより好ましい。
【００２２】
また、本発明培地には、検出可能なβ−グルクロニダーゼ基質を加える事により、腸管出血性大腸菌の中で最も検出頻度が高いＯ１５７を推定的に検出することも可能である。
【００２３】
本発明培地を用いて、被検体中の腸管出血性大腸菌を検出するには、当該培地に検体を接種して２５〜４０℃、２４〜４８時間培養した後に、コロニーの呈色を観察すればよい。
【００２４】
本発明培地に適用される検体としては、肉類、魚介類などの生鮮食料品、便などの臨床検体、海水、調理場、病院などのふき取り検体等が挙げられるが、これらの検体を予めトリプトソーヤブイヨン培地で培養した培養液や更にこれを増菌用培地で培養した培養液も用いることができる。
【実施例】
【００２５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
（１）培地の作製
各培地組成を表１に示した。
本発明培地は１リットル使用量を１リットルの精製水に加え、１００℃、２０分間加温溶解し、約５０℃になるまで冷却後、セフィキシム及び亜テルル酸カリウムを加えよく混合した後プラスチックシャーレ（９０φｍｍ）に２０ｍｌずつ分注して培地が固まるまで静置し本発明の腸管出血性大腸菌検出用培地を作製した。また対照品として本発明培地より乳糖を抜いたもの及びセロビオースを抜いたものをそれぞれ同様に作製した。
陽性コントロールとしてトリプトソイ寒天培地（ＴＳＡ）は１リットル使用量を１リットルの精製水に加え、１２１℃、１５分間高圧蒸気滅菌し良く撹拌後、プラスチックシャーレ（９０φｍｍ）に２０ｍｌずつ分注して培地が固まるまで静置した。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
（２）菌株の供試
供試菌株はトリプトソイ寒天培地で２４時間前培養したものを供試菌として用い、これを白金線を用いて画線塗抹により接種し、３５℃、２４時間培養後のコロニー色調を確認した。
結果を表２〜表４に示す。表中、ＴＳＡはトリプケース・ソイブイヨン培地を示す。また、乳糖抜き、セロビオース抜き等は、本発明培地（表１）から、それらの成分を抜いた培地であることを示す。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
表１の培地を用いて、腸管出血性大腸菌を含む各供試菌株の発育を確認したところ、本発明培地は腸管出血性大腸菌のみを青色の有色コロニーとして検出でき、それ以外の発育した菌についてはピンク色のコロニーとして排除できることを認めた。一方、乳糖を含まない培地では腸管出血性大腸菌以外のピンク色の発色は十分であったが、腸管出血性大腸菌の発色が弱く鑑別が良好でないことを認めた。またセロビオースを含まない培地では腸管出血性大腸菌ではないＥ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉが腸管出血性大腸菌と鑑別できないことを認めた。
ここで乳糖は全ての大腸菌及びＥ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉの両方が利用できる糖であり、乳糖を加えた場合には全ての菌がピンク色の呈色をもたらす事が容易に推測できるにもかかわらず、低濃度の乳糖を加えた場合、腸管出血性大腸菌には全くピンク色の発色を認めず、青色の色原体化合物由来の発色のみが増強されたという事実は全く予測外であった。
【００３０】
【表３】
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【００３１】
本発明培地（表１）における乳糖の濃度を確認したところ、本発明培地における乳糖濃度は０ｇであればＸ−ＧＡＬによる発色が非常に悪く、０．０１〜２ｇ／Ｌ、特に０．５〜２ｇ／Ｌでは腸管出血性大腸菌の青色の発色が明瞭になり、３ｇ以上になると乳糖を利用する全ての菌のコロニーがピンク色を帯びるため腸管出血性大腸菌とそれ以外の菌の鑑別能が低下することを認めた。従って腸管出血性大腸菌とそれ以外の菌の鑑別能を良好にするために低濃度の乳糖として０．０１〜２ｇ／Ｌ、特に０．５〜２ｇ／Ｌ含有することが好ましいことを認めた。
【００３２】
【表４】
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【００３３】
本発明培地（表１）のニュートラルレッド濃度を検討したところ、ニュートラルレッドを加えない場合でも十分腸管出血性大腸菌とそれ以外の菌の鑑別は可能であるが、腸管出血性大腸菌以外の菌のコロニー色調が薄黄緑色で青色のコロニーと誤判定する可能性がある。また通常一般的に使用される濃度である０．０２ｇ／Ｌでは各発育菌株のコロニー性状は変わらないが、培地色調が赤色であるため、発育した菌のコロニー色調が見づらくなる。一方、その約１０分の１量である０．００２５ｇ／Ｌまで低下させると培地色が透明であるにも拘らず、腸管出血性大腸菌以外の明瞭な集落の着色が認められた。０．００１ｇ／Ｌまで濃度を低下させると腸管出血性大腸菌以外のコロニーの着色が薄くなりすぎることが認められた。従って、本発明培地にニュートラルレッドを加える場合には、ニュートラルレッド濃度を０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ、特に０．００２〜０．００６ｇ／Ｌにすることで培地が無色透明となり同時に着色集落が明瞭に確認できることを見出した。またニュートラルレッドは酸性ｐＨでは赤色を呈する性質があり、本培地における現象は培地ｐＨが７．０以上であることが重要であり、これを下回ると培地色が赤色を呈するようになってしまう。