(57)【要約】  本出願は、マイクロ流体チャネル内で実行されるアッセイ内の汚染を防止するためのシステムおよび方法を開示する。一実施形態では、投入ポートからのフローが停止される時間などの間に、投入ポートとその中でアッセイが実行されるマイクロチャネルとの間に非反応性流体の緩衝が提供される。通常、ある量の非反応性流体が停止された投入ポートをマイクロチャネルに接続しているチャネル内に引き入れられる。これにより、停止された投入ポートをマイクロチャネルに接続しているチャネルからの任意の液滴、もしくは拡散は、試薬、または投入ポートを介して導入されるその他の潜在的な汚染流体ではなく、非反応性流体のものになる。一実施形態では、マイクロ弁および負圧差源が、マイクロチャネル内への試薬のフローと、入口導管内への非反応性流体のフローとを制御する。
2011527012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを介して流体がマイクロ流体回路内に導入される、少なくとも１つの入口ポートと、それを介して非反応性流体が前記回路内に導入される非反応性流体ポートと、前記入口ポートおよび前記非反応性流体ポートと流体連通する流体フローに関する少なくとも１つのマイクロチャネルと、それを介して前記マイクロチャネルから前記流体が収集される、前記マイクロチャネルと流体連通する出力ポートと、前記入口ポートを前記マイクロチャネルに接続する入口チャネルとを含む前記流体回路内の汚染を防止するための方法であって、
ａ．非反応性流体が前記非反応性流体ポートから流れることを実質的に防止すると同時に、前記出口ポートと前記入口ポートとの間に負圧差を加えることによって、前記入口ポートから前記マイクロチャネル内への流体フローを引き起こすステップと、
ｂ．前記出口ポートと前記入口ポートとの間の前記負圧差を除去することによって、前記入口ポートから前記マイクロチャネル内への流体フローを実質的に停止させるステップと、
ｃ．前記入口ポートと前記非反応性流体ポートとの間に負圧差を加えることによって、前記非反応性流体ポートから前記入口チャネル内への非反応性流体フローを引き起こすステップとを備える方法。
【請求項２】
前記入口ポートから前記マイクロチャネル内への流体フローを引き起こす前記ステップが、前記出口ポートと前記入口ポートとの間の前記負圧差を生み出すために、第１の圧力を前記出口ポートに加えて、前記第１の圧力よりも高い第２の圧力を前記入口ポートに加えることを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の圧力が負圧であり、前記第２の圧力が大気圧である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
非反応性流体が前記非反応性流体ポートから流れることを防止する前記ステップが、ステップａの間に、大気に対して前記非反応性流体ポートを閉鎖することを備える、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
停止させる前記ステップが、前記出口ポートと前記入口ポートとの間の前記圧力差を除去するために、大気に対して前記入口ポートを閉鎖することを備える、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
停止させる前記ステップが、所定の期間にわたって実質的に同じ圧力を前記出口ポートと前記入口ポートとに加え、次いで、確立された負圧を維持するために、前記弁を遮断することを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記非反応性流体ポートから前記入口チャネル内への非反応性流体フローを引き起こす前記ステップが、第１の圧力を前記入口ポートに加えて、前記第１の圧力よりも高い第２の圧力を前記非反応性流体ポートに加えることを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の圧力が負圧であり、前記第２の圧力が大気圧である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記所定の期間の後で、前記出口ポートと前記入口ポートとの間に前記負圧差を加えることによって、前記入口ポートから前記マイクロチャネル内への流体フローを再び引き起こすことをさらに備える、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記マイクロ流体回路が複数の入口ポートを備え、前記少なくとも１つのマイクロチャネルが、それぞれの入口ポートを前記マイクロチャネルに接続する関連する入口チャネルを経由して、前記入力ポートのそれぞれと流体連通しており、前記方法が、ステップａの間に、前記出口ポートとその他のポートとの間の負圧差を防止することによって、すべての前記その他の入口ポートから流体フローを実質的に防止することをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ｄ．前記出口ポートと前記その他のポートとの間の負圧差を防止することによって、すべてのその他の入口ポートからの流体フローを実質的に防止すると同時に、前記出口ポートと前記第２の入口ポートとの間に負圧差を加えることによって、第２の入口ポートから前記マイクロチャネル内への流体フローを引き起こすことと、次いで、
ｅ．前記出口ポートと前記第２の入口ポートとの間の前記負圧差を除去することによって、前記第２の入口ポートからの前記流体を実質的に停止させることと、
ｆ．前記第２の入口ポートと前記非反応性流体ポートとの間に負圧差を加えることによって、前記非反応性流体ポートから前記第２の入口チャネル内への非反応性流体フローを引き起こすことと
をさらに備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記入口ポートのそれぞれに関して、ステップａからｃを繰り返すことをさらに備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記入口ポートから導入された前記流体が、生体サンプル物質、試薬、またはマーカ物質を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記入口ポートから前記マイクロチャネル内への所定の量の流体の前記フローに対応するステップａの所定の存続期間の後に、ステップｂを開始することによって、前記入口ポートから前記マイクロチャネル内に流れる流体の量を制御するためにステップａの前記存続期間を制御することをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
所定の量の流体フローに対応するステップａの所定の存続期間を指定することと、
前記所定の期間の間に前記出力ポートと前記入力ポートとの間に前記負圧差を加えることおよび除去することを交互に行うことによって、前記所定の量よりも少ない、前記入口ポートから前記マイクロチャネル内への流体フロー量を測定することと
をさらに備える、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記測定するステップが、前記出口ポートに負圧を加えることと、（１）前記入口ポートを大気に開放すること、および（２）前記所定の存続期間の間に、大気に対して前記入口ポートを閉鎖することを交互に行うこととを備える、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
非反応性流体が緩衝溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｃの間に、前記入口チャネル内へ流された前記量の非反応性流体が、前記入口チャネルを２００ミクロンから５ｍｍの長さに満たす、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップａに先立って、前記入口ポートと前記非反応性流体ポートとの間に負圧を加えることによって、ある量の非反応性流体を前記非反応性流体ポートから前記入口チャネル内に流させることをさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
マイクロ流体回路内の汚染を防止するためのシステムであって、
ｉ．それを介して流体が前記回路内に導入される少なくとも１つの入口ポートと、
ｉｉ．それを介して非反応性流体が前記回路内に導入される非反応性流体ポートと、
ｉｉｉ．前記入口ポートおよび前記非反応性流体ポートと流体連通する流体フローに関する少なくとも１つのマイクロチャネルと、
ｉｖ．それを介して前記流体と前記非反応性流体とが前記マイクロチャネルから収集される、前記マイクロチャネルと流体連通する出力ポートと、
ｖ．前記入口ポートを前記マイクロチャネルに接続する入口チャネルとを備える
ａ．マイクロ流体回路と、
ｂ． 前記出口ポートおよび前記少なくとも１つの入口ポートと選択連通するように構築され、構成された少なくとも１つの圧力源と、
ｃ．前記出口ポートと動作可能に関連付けられ、前記圧力源と連通する出口弁機構であって、（１）前記出口ポートを前記圧力源によって生み出された第１の圧力に選択的に開放するように、または（２）前記第１の圧力に対して前記出口ポートを閉鎖するように構築され、構成されている出口弁機構と、
ｄ．それぞれの入口ポートと動作可能に関連付けられ、前記圧力源と連通する入口弁機構であって、（１）前記入口ポートを、前記第１の圧力よりも高い第２の圧力に選択的に開放するように、または（２）前記入口ポートを前記第１の圧力に開放するように、もしくは確立された圧力を維持するために遮断されるように構築され、構成されている入口弁機構と、
ｅ．前記非反応性流体ポートと動作可能に関連付けられ、（１）前記非反応性流体ポートを前記第２の圧力に選択的に開放するように、または（２）前記第２の圧力に対して前記非反応性流体ポートを閉鎖するように、もしくは確立された圧力を維持するために遮断されるように構築され、構成された非反応性流体弁機構とを備えるシステム。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの圧力源が真空ポンプを備え、前記第１の圧力が、前記真空ポンプによって生み出された負圧を備え、前記第２の圧力が大気圧を備える、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの圧力源が、前記第１の圧力を生み出すための第１のポンプと、前記第２の圧力を生み出すための第２のポンプとを備える、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２３】
前記出口弁機構、前記入口弁機構、および前記非反応性流体弁機構の動作を制御するように、かつ前記出口弁機構に前記出口ポートを前記第１の圧力に開放させること、前記出口ポートと前記入口ポートとの間に負圧差を生み出して、前記非反応性流体ポートからの非反応性流体フローを実質的に防止するために、前記入口弁機構に前記入口弁を前記第２の圧力に開放させること、および前記非反応性流体弁機構に前記第２の圧力に対して前記非反応性流体ポートを閉鎖させることによって、流体を前記入口ポートから前記マイクロチャネル内に流させるように構成されたコントローラをさらに備える、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２４】
前記コントローラが、前記入口弁機構に前記第２の圧力に対して前記入口ポートを閉鎖させ、前記入口ポートを前記第１の圧力に開放させて、確立された圧力を維持するために遮断させることによって、前記入口ポートから前記マイクロチャネル内への流体フローを停止するようにさらに構成された、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記コントローラが、（１）前記非反応性流体弁機構に前記非反応性流体ポートを前記第２の圧力に開放させること、（２）前記出力弁機構に前記第１の圧力に対して前記出口ポートを閉鎖させること、（３）前記入口弁機構に前記第２の圧力に対して前記入口ポートを閉鎖させて、前記入口ポートを前記第１の圧力に開放させることによって、前記入口チャネル内への非反応性流体フローを引き起こすようにさらに構成された、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２６】
前記マイクロ流体回路が、
複数の入口ポートと、
それぞれの入口ポートに関連し、それぞれの関連する入口ポートを前記マイクロチャネルに接続する入口チャネルと、
それぞれの入口ポートに関連する入口弁機構とを備える、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２７】
マイクロ流体デバイス内で流体を制御する方法であって、
少なくとも１つの反応性流体を少なくとも１つのマイクロ流体フィーダチャネルに通過させるステップと、
少なくとも１つの緩衝流体を少なくとも１つのマイクロ流体緩衝チャネルに通過させるステップであって、前記少なくとも１つのマイクロ流体フィーダチャネルおよび前記少なくとも１つのマイクロ流体緩衝チャネルが、互いに、かつ主なマイクロ流体チャネルと流体連通している、通過させるステップと、
前記フィーダチャネルと前記緩衝チャネルとの間の負圧差を使用して、前記少なくとも１つのマイクロ流体フィーダチャネルのフローの方向を反転させるステップと、
前記負圧差を使用して、前記ある緩衝流体を前記少なくとも１つのマイクロ流体フィーダチャネル内に引き入れるステップとを備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体アッセイを実行するためのシステムおよび方法に関する。より詳細には、本発明は、所望されない物質がマイクロ流体チャネル内で実行されるアッセイを汚染することを防止するためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の検出は、医学分野、法科学分野、工業処理分野、農作物育種および家畜育種分野、ならびに多くのその他の分野の要である。疾病状態（例えば、癌）、感染性生物（例えば、ＨＩＶ）、遺伝子連鎖、遺伝子マーカなどを検出する能力は、疾病診断および疾病予後、マーカ利用選抜、事件現場の特徴の正確な識別、産業用有機体（ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）を増殖する能力、ならびに多くのその他の技法に関するユビキタス技術である。当該核酸の完全性の決定は、伝染病または癌の病状に関連し得る。少量の核酸を検出するための最も強力かつ基本的な技術のうちの１つは、核酸配列の一部またはすべてを何度も複製し、次いで、増幅産物を解析することである。ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、いくつかの異なる増幅技法のうち、おそらく最もよく知られている技法である。
【０００３】
ＰＣＲは、ＤＮＡの短いセクションを増幅するための強力な技法である。ＰＣＲを用いると、単一のテンプレートＤＮＡ分子から始めて、ＤＮＡの何百万もの複製を迅速に作成することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡを一本鎖に変性すること、プライマを変性された鎖にアニーリングすること、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によってプライマを延長させることの３段階の温度サイクルを含む。このサイクルは、検出されて解析されるのに十分な複製が存在するように繰り返される。原則として、ＰＣＲのそれぞれのサイクルは、複製の数を２倍にすることが可能である。実際には、それぞれのサイクルの後に達成される増殖は、常に２未満である。さらに、ＰＣＲサイクルが継続すると、要求される反応物質の濃縮が減少するにつれて、最終的に、増幅されたＤＮＡ産物の蓄積は消滅する。ＰＣＲに関する一般的な詳細については、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｖｏｌｓ．１〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合弁事業、（２００５年を通して補足）、およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ他編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を参照されたい。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲは、反応が進むにつれて、増幅されたＤＮＡ産物の蓄積を、通常、ＰＣＲサイクルごとに一度、測定する技法の増大するセットを指す。産物の蓄積を経時的に監視することは、反応の効率を決定すること、ならびに、ＤＮＡテンプレート分子の初期の濃縮を推定することを可能にする。リアルタイムＰＣＲに関する一般的な詳細については、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：Ａｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓ他編、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４）を参照されたい。
【０００５】
現在、増幅されたＤＮＡの存在を示すためのいくつかの異なるリアルタイム検出化学が存在する。これらの化学の大部分は、ＰＣＲプロセスの結果として属性を変化させる蛍光指示薬に依存する。これらの検出化学の中に、結合時に蛍光収率を増大させて、鎖状のＤＮＡを倍にする（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなど）ＤＮＡ結合色素がある。その他のリアルタイム検出化学は、色素の蛍光収率が、別の光吸収部位または消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）に対するその近接性に強く依存する現象であるフェルスター共鳴エネルギー移動（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）を利用する。これらの色素および消光剤は、通常、ＤＮＡ配列特異的プローブまたはＤＮＡ配列特異的プライマに付着される。ＦＲＥＴベースの検出化学の中に、加水分解プローブおよび構造プローブがある。（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブなど）加水分解プローブは、オリゴヌクレオチドプローブに付着した消光剤色素分子からレポータ色素分子を分裂させるためにポリメラーゼ酵素を使用する。（分子ビーコンなど）構造プローブは、その蛍光発光が、目標ＤＮＡにハイブリダイズしている（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）オリゴヌクレオチドの構造変化に基づいて変化する、オリゴヌクレオチドに付着した色素を利用する。
【０００６】
その開示が参照により本明細書に組み込まれている「Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ−Ｃｈａｎｎｅｌｓ」という表題の、本発明の譲受人に譲渡された同時係属米国出願第１１／５０５，３５８号は、マイクロチャネルを介して流れ、フローマーカとして知られる、緩衝溶液など、非反応性流体の液滴によって互いから分離された離散液滴内でＰＣＲを実行するためのプロセスを記述する。
【０００７】
チップ内に１つまたは複数のマイクロチャネルを形成させたマイクロ流体チップを含むマイクロチャネル内で、ＰＣＲなど、インラインアッセイを実行するためのデバイスが当技術分野で知られている。これらのチップは、試薬とサンプル物質（例えば、ＤＮＡ）とを受け取って、チップ内のマイクロチャネルに供給するために、チップ上側上でサンプルシッピングチューブ（ｓｉｐｐｅｒ  ｔｕｂｅ）と開口ポートとを利用する。チッププラットフォームは、通常、チップトップ上でピペッターによって施与された試薬を開口ポートで受け取るように設計され、試薬は、通常、それぞれのマイクロチャネルの反対端に加えられた真空化の影響を受けて、開口ポートからマイクロチャネル内に流れる。ＤＮＡサンプルは、チップの下方に延び、かつそれを介して、マイクロチャネルに加えられた真空化により、サンプル物質がポートから引き入れられるシッピングチューブを経由して、マイクロポートプレートのポートからマイクロチャネルに供給される。
【０００８】
いくつかの応用例では、上側開口ポートのすべてからの流体はマイクロチャネル内に流れることが望ましいことになり、その他の応用例では、流体は、上位開口ポートの決してすべてではなく、上位開口ポートの１つまたは複数から流れることが望ましいことになる。また、通常、マイクロチップの下方に延びるシッピングチューブを経由して、異なる試薬をマイクロチャネルに導入するために、試薬をマイクロチャネルに導入するために所望される順序に対応する順序で、シッピングチューブを試薬容器から試薬容器に移動させる必要がある。これは、マイクロチップのマイクロ流体チャネル内でインラインアッセイを実行するための処理器具が、シッピングチューブと異なる試薬容器との間で相対的な移動をもたらすための手段を含むことを必要とする。加えて、マイクロチャネルから側面に沿って突き出たシッピングチューブは非常に脆弱であり、それによって、特別な処理、梱包、および発送を必要とする。
【０００９】
さらに、マイクロチップは、２つ以上の流体導入ポートが、その中でアッセイ手順が実行されることになる共通のマイクロチャネルと連通するように構成されることが可能である。２つ以上の流体導入ポートがマイクロチャネルと連通し、ポートをマイクロチャネルから物理的に封鎖するための弁またはその他のデバイスがマイクロチップ内に存在しない場合、通常「遮断された」ポートからの流体は、マイクロチャネル内に滴下（または拡散）する可能性がある。この滴下または拡散は、マイクロチャネル内で実行される１つまたは複数のアッセイを潜在的に汚染する可能性がある。したがって、マイクロチャネルに関するフロー調整機構が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】同時係属米国出願第１１／５０５，３５８号
【特許文献２】米国特許出願第１１／８５０，２２９号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｖｏｌｓ．１〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）
【非特許文献２】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合弁事業、（２００５年を通して補足）
【非特許文献３】ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ他編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）
【非特許文献４】Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：Ａｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓ他編、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、投入ポートからのフローが停止される時間などの間にアッセイが実行される、投入（ｉｎｐｕｔ）ポートとマイクロチャネルとの間に非反応性流体の緩衝を提供するためのシステムおよび方法を含む。通常、ある量の非反応性流体が、停止された投入ポートをマイクロチャネルに接続しているチャネル内に引き入れられる。これにより、停止された投入ポートをマイクロチャネルに接続しているチャネルからのいずれの滴下、もしくは拡散も、試薬、または投入ポートを介して導入されたその他の潜在的な汚染流体ではなく、非反応性流体のものになる。
【００１３】
本発明の態様は、それを介して流体がマイクロ流体回路内に導入される、少なくとも１つの入口ポートと、それを介して非反応性流体がその回路内に導入される非反応性流体ポートと、入口ポートおよび非反応性流体ポートと流体連通する少なくとも１つのマイクロチャネルと、マイクロチャネルと流体連通する出口ポートと、入口ポートをマイクロチャネルに接続している入口チャネルとを含むマイクロ流体回路内の汚染を防止するための方法の形で実施される。入口ポートからマイクロチャネル内への流体フローは、負圧差を出口ポートに加えて、入口ポートを、大気圧など、第２のより高い圧力に開放することによって引き起こされ、マイクロチャネル内への非反応性流体フローは、第２の圧力に対して非反応性流体ポートを閉鎖することによって防止される。次に、入口ポートからの流体フローは、第２の圧力に対して入口ポートを閉鎖して、入口ポートとマイクロチャネルの入口との間の圧力を等化するための期間にわたって負圧差を入口ポートに加え、次いで、その入口ポートを遮断することによって実質的に停止される。最終的に、非反応性流体ポートから入口チャネル内への非反応性流体フローは、非反応性流体ポートを第２の圧力に開放して、負圧差を出口ポートから除去し、入口ポートとマイクロチャネルの入口との間の圧力を等化するための期間にわたって負圧差を入口ポートに加え、次いで、その入口ポートを遮断することによって引き起こされる。
【００１４】
本発明のその他の態様は、マイクロ流体回路内の汚染を防止するためのシステムの形で実施される。このシステムは、それを介して流体が回路内に導入される少なくとも１つの入口ポートと、それを介して非反応性流体が回路内に導入される非反応性流体ポートと、入口ポートおよび非反応性流体ポートと流体通信する流体フローに関する少なくとも１つのマイクロチャネルと、マイクロチャネルと流体連通する出口ポートと、入口ポートをマイクロチャネルに接続している入口チャネルとを含むマイクロ流体回路を備える。このシステムは、出口ポートおよび入口ポートと選択連通するように構築され、構成された、少なくとも１つの負圧差源をさらに含む。入口弁機構は、それぞれの入口ポートと動作可能に関連付けられ、負圧差源と連通している。この入口弁機構は、（１）負圧差源から入口ポートを閉鎖すると同時に、入口ポートを、大気圧など、第２のより高い圧力に選択的に開放するように、もしくは（２）第２の圧力に対して入口ポートを閉鎖すると同時に、入口ポートを負圧差源に開放するように、または（３）確立された均衡圧力を維持するために、入口ポートを遮断するように構築され、構成される。出口弁機構は、出口ポートと動作可能に関連付けられ、負圧差源と連通している。この出口弁機構は、（１）出口ポートを負圧差源に選択的に開放するように、もしくは（２）負圧差源に対して出口ポートを閉鎖するように、または（３）確立された均衡圧力を維持するために、出口ポートを遮断するように構築され、構成される。非反応性流体弁機構は、非反応性流体ポートと動作可能に関連付けられ、（１）非反応性流体ポートを、大気圧、もしくは第２の圧力に選択的に開放するように、または（２）大気圧、もしくは第２の圧力に対して反応性流体ポートを閉鎖するように、あるいは（３）達成された均衡を維持するために、非反応性流体ポートを遮断するように構築され、構成される。
【００１５】
本発明のその他の態様によれば、このシステムは、（１）出口弁機構に出口ポートを負圧差源に開放させること、（２）入口弁機構に、入口弁を大気に開放させること、および（３）非反応性流体弁機構に、大気に対して非反応性流体ポートを閉鎖させることによって、流体を入口ポートからマイクロチャネルに流させるように構成されたコントローラを含む。
【００１６】
本発明のその他の態様によれば、このコントローラは、（１）非反応性流体弁機構に非反応性流体ポートを大気に開放させること、（２）出口弁機構に負圧差源に対して前記出口ポートを閉鎖させること、および（３）入口弁機構に大気に対して入口ポートを閉鎖させて、入口ポートを負圧差源に開放することによって、非反応性流体を入口チャネル内に流させるようにさらに構成される。
【００１７】
本発明の上記のおよびその他の態様ならびに実施形態は、添付の図面を参照して下で説明される。
【００１８】
本明細書に組み込まれ、明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明の様々な実施形態を例示する。図面において、類似の参照番号は、同一の要素または機能的に類似した要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の態様を実施するマイクロ流体チップおよびフロー制御システムを概略的に表す図である。
【図２】本発明の態様を実施するマイクロ流体チップおよびフロー制御システムのもう１つの実施形態を概略的に表す図である。
【図３】本発明の態様を実施するマイクロ流体チップおよびフロー制御システムの第２の代替実施形態の概略図である。
【図４】本発明の態様に従って、マイクロチャネル内で順次マルチプレックスアッセイを実行するステップを例示する流れ図である。
【図５】マイクロチャネル内のＤＮＡ、ポリメラーゼ、アッセイプライマ、および結果として生じるサンプルテストストリームのフローの時刻履歴プロファイルを示す図である。
【図６】フロー測定を達成するために、マイクロ流体チップの流体投入ウェル（ｗｅｌｌ）に負圧および大気圧を断続的に加えることの時刻履歴プロファイルを示す図である。
【図７】フローが入口導管のうちの１つからマイクロチャネル内に流れ、フローがその他の入口導管内で停止される、マイクロチャネルに相互接続された流体入口導管を概略的に表す図である。
【図８】本発明の態様を実施する非反応性流体入口ウェルおよびフロー制御システムを有するマイクロ流体チップを概略的に表す図である。
【図９】ある量の非反応性流体がマイクロチャネルとのそのインターフェースにおけるそれぞれの導管内にある、マイクロチャネルと相互接続された流体入口導管および非反応性流体入口導管を概略的に表す図である。
【図１０】ある量の非反応性流体が、マイクロチャネルとそれぞれの導管とのインターフェースにおける導管のうちの１つを除くすべての導管内にあり、流体フローが入口導管のうちの１つからマイクロチャネル内に流れる、マイクロチャネルと相互接続された流体入口導管および非反応性流体入口導管を概略的に表す図である。
【図１１】非反応性流体入口ウェルから反応性流体入口導管内に非反応性流体を引き入れるためのステップを示す流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書で使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という語は、「１つまたは複数」を意味する。さらに、その他の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明される方法および物質と類似のまたは均等の任意の方法ならびに任意の物質が、本発明を実施する際に使用されることが可能であるが、好ましい物質および方法が本明細書で説明される。
【００２１】
本発明の態様を実装するマイクロ流体フローに関するシステムが図１に示される。このシステムは、例示される実施形態において、マイクロ流体チップ１０上で実行されるマイクロ流体回路を含む。マイクロ流体チップ１０は、入口ポート１２、１４、１６と、入口ポート１２、１４、１６と流体連通しているマイクロチャネル２０と、やはりマイクロチャネル２０と流体連通している出口ポート１８とを含む。図１に示す実施形態は例示的であり、マイクロ流体回路は、４つ以上の入口ポートを含んでよく、入口ポートの一部またはすべてと連通する２つ以上のマイクロチャネルを含んでよい。このマイクロ流体回路は、２つ以上の出口ポートを含んでもよい。流体は、流体入口ポート１２、１４、および１６を介して回路内に導入される。流体は、当技術分野で知られている任意の適切な形で流体入口ポートに提供され得る。あるいは、その代わりに、流体は、その開示が参照によって本明細書に組み込まれている、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第１１／８５０，２２９号「Ｃｈｉｐ  ａｎｄ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  ｍｉｃｒｏ−ｆｌｕｉｄｉｃ  ａｓｓａｙｓ」に記述されるように、流体連通するようにそれぞれのポートに結合された流体含有カートリッジによって流体入口ポートに提供されることも可能である。
【００２２】
流体は、流体出口１８を介してマイクロチャネル２０から収集され、例えば、本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願１１／８５０，２２９号に記述されたチップなど、任意の適切な廃棄物貯蔵所内に入れられてよい。
【００２３】
マイクロ流体チップ１０は、ガラス、二酸化珪素、石英、もしくはプラスチック、または任意のその他の適切な物質から形成され得る。
【００２４】
回路を介した流体移動が生み出されて、出口ポート１８と入口ポート１２、１４、１６のうちの１つまたは複数との間に負圧差を加えることによって制御される。出口ポート１８と入口ポート１２、１４、１６のうちの１つまたは複数との間に負圧差を加えることは、マイクロチャネル２０を介した出口ポート１８に対する（１つまたは複数の）入口ポートからの流体フローを引き起こすことになる。圧力差は、一実施形態では、真空ポンプを備え得る、負圧源２２など、１つまたは複数の圧力源によって生み出されることが可能である。例示される実施形態では、出口ポート１８と入口ポート１２、１４、１６との間の圧力差は、入口ポート１２、１４、１６のそれぞれ、および出口ポート１８において圧力を制御する圧力制御弁によって制御される。
【００２５】
より詳細には、圧力制御弁３０は、圧力源２２および出口ポート１８と連通するように構成される。同様に、圧力制御弁２４は、入口ポート１２と連通するように構成され、圧力制御弁２６は、入口ポート１４と連通するように構成され、圧力制御弁２８は、入口ポート１６と連通するように構成される。４つ以上の入口ポートを有する構成は、好ましくは、それぞれの入口ポートに関連する圧力制御弁を有することになる。図１の例示される実施形態では、弁２４、２６、２８は、それぞれの関連する入口ポート１２、１４、１６を、それぞれ、円で囲まれた文字「Ａ」によって表される大気圧、またはその代わりに、負圧源２２であり得る圧力源に選択的に接続することが可能な３元弁である。すなわち、例示される実施形態では、弁２４は、圧力線３２を経由して圧力源２２と連通しており、圧力線３４を経由して入口ポート１２と連通している。弁２６は、圧力線３６を経由して圧力源２２と連通しており、圧力線３８を経由して入口ポート１４と連通している。弁２８は、圧力線４０を経由して圧力源２２と連通しており、圧力線４２を経由して入口ポート１６と連通している。弁３０は、圧力線４４を経由して圧力源２２に接続され、圧力線４６によって出口ポート１８に接続される。例示される実施形態では、弁３０も、出口ポート１８を円で囲まれた「Ａ」によって示される大気圧、または圧力源２２に選択的に接続するための３元弁である。
【００２６】
圧力源２２および弁２４、２６、２８、３０は、コントローラ５０によって制御され得る。コントローラ５０は、制御線５２を経由して圧力源２２に接続され、制御線５４を経由して弁２４に接続され、制御線５６を経由して弁２６に接続され、制御線５８を経由して弁２８に接続され、制御線６０を経由して弁３０に接続される。コントローラ５０は、無線で、または当業者に知られているその他の手段によって、様々な構成要素のうちの１つもしくは複数に接続されることも可能である。コントローラ５０は、プログラムされたコンピュータまたはマイクロプロセッサを備え得る。
【００２７】
前述のように、マイクロチャネル２０を介した出口ポート１８への入口ポート１２、１４、および／または１６からの流体フローは、出口ポート１８と１つまたは複数の入口ポートとの間に負圧差を加えることによって生み出される。より詳細には、入口ポート１２から流体フローを生み出すために、負圧源２２を制御弁３０と圧力線４４および４６とを経由して出口ポート１８に接続することによって、負圧が出口ポート１８に加えられる。入口ポート１２は、弁２４によって大気圧に開放される。これは、出口ポート１８と入口ポート１２との間に負圧差を生み出す。流体が入口ポート１２から流れる間に、その他の入口ポートから流体が流れることが所望されないと仮定すると、入口ポート１４は、弁２６によって大気圧に対して閉鎖され、入口ポート１６は、弁２８によって大気圧に対して閉鎖される。入口ポート１２からの流体フローを停止する目的で、大気圧に対して入口ポート１２を閉鎖するために、（例えば、コントローラ５０を経由して）弁２４がアクティブ化される。入口ポート１２からの流体のフローを迅速に停止させる目的で、入口ポート１２とマイクロチャネルの入口との間の圧力を等化するために十分な期間にわたって制御弁２４を経由して入口ポート１２を負圧源２２に接続し、次いで、制御弁２４を遮断することが望ましい場合がある。
【００２８】
出口ポート１８と適用可能な入口ポートとの間の圧力差によって生み出されるフローレートが知られていると仮定すると、所定の量の流体は、生み出されたフローレートに関して、所望される量の流体をマイクロチャネル２０内に導入することになる期間にわたって圧力差を維持することによって、入口ポート１２、１４、および１６のいずれかからマイクロチャネル２０内に導入されることが可能である。圧力差を維持することは、入口ポートおよび出口ポートに関連する圧力制御弁の適切な制御によって達成され得る。
【００２９】
制御弁２４のアクティブ化およびタイミングは、コントローラ５０によって制御され得る。
【００３０】
次いで、入口ポート１４から流体フローを生み出す目的で、負圧が出口ポート１８に加えられると同時に、入口ポート１４を大気圧に開放するために、（例えば、コントローラ５０によって）弁２６がアクティブ化され、これにより、出口ポート１８と入口ポート１４との間に負圧差が生み出される。入口ポート１４からの流体フローは、大気圧に対して入口ポート１４を閉鎖して、弁２６をアクティブ化することによって停止され、入口ポート１４からのフローを迅速に停止させるために、弁２６は、マイクロチャネルの入口と入口ポート１４との間の圧力を等化するのに十分な期間にわたって入口ポート１４を負圧源２２に開放し、次いで、遮断される。
【００３１】
同様に、入口ポート１６から流体フローを生み出す目的で、負圧が出口ポート１８に加えられると同時に、入口ポート１６を大気圧に開放するために、（例えば、コントローラ５０によって）弁２８がアクティブ化され、これにより、出口ポート１８と入口ポート１６との間に負圧差を生み出す。入口ポート１６からの流体フローは、大気圧に対して入口ポート１６を閉鎖するために、弁２８をアクティブ化することによって停止され、入口ポート１６からのフローを迅速に停止させるために、弁２８は、マイクロチャネルの入口と入口ポート１６との間の圧力を等化するのに十分な期間にわたって入口ポート１６を負圧源２２に開放し、次いで、遮断される。
【００３２】
図２および３は、マイクロ流体回路の出口ポートと１つまたは複数の入口ポートとの間の圧力差を制御するための代替の構成を示す。図２は、それぞれの入口ポート１２、１４、１６が、単一の３元弁ではなく、２つの２元弁に結合される点を除いて、図１に示された図に類似するシステムを示す。より詳細には、入口ポート１２は、圧力線３２および６２を経由して入口ポート１２を圧力源２２に選択的に接続するために、第１の２元弁２４ａに結合される。入口ポート１２は、圧力線６４を経由して入口ポート１２を大気圧「Ａ」に選択的に接続するために、第２の２元弁２４ｂにも結合される。
【００３３】
同様に、入口ポート１４は、圧力線３６および６６を経由してポート１４を圧力源２２に選択的に接続するために、第１の２元弁２６ａに結合され、入口ポート１４を、圧力線６８を経由して大気圧に選択的に接続するために、第２の２元弁２６ｂに結合される。入口ポート１６は、圧力線４０および７０を経由して入口ポート１６を圧力源２２に選択的に接続するために、第１の２元弁２８ａに結合され、圧力線７２を経由して入口ポート１６を大気圧に選択的に接続するために、第２の２元弁２８ｂに結合される。
【００３４】
図２に示すシステムでは、出口ポート１８は、圧力線４４および４６を経由して出口ポート１８を圧力源２２に選択的に接続するために、２元弁７６に結合される。
【００３５】
コントローラ５０は、制御線５２を経由して負圧源２２を制御し、制御線６０を経由して２元弁７６を制御し、制御線７２を経由して２元弁２４ａを制御し、制御線７４を経由して２元弁２４ｂを制御する。コントローラ５０は、弁２６ａ、２６ｂ、２８ａ、および２８ｂを制御するために、それらの弁にも連結されるが、図面を不必要に混乱させるのを防ぐために、コントローラ５０とそれぞれの弁との間の制御接続は図２に示されない。
【００３６】
図３は、本発明の態様を実施するシステムの代替の構成を示す。図３の実施形態では、それぞれの入口ポート１２、１４、１６は、ポートを圧力源＃１  ２２、または圧力源＃２  ８０に選択的に接続するために、３元弁に結合される。より詳細には、入口ポート１２は、圧力線８８、９０、および１００を経由して入口ポート１２を圧力源＃１  ２２に、または圧力線９６、９８、および１００を経由して圧力源＃２  ８０に選択的に接続するように構成された弁８２に結合される。入口ポート１４は、圧力線９０および１０２を経由して入口ポート１４を圧力源＃１  ２２に、または圧力線９６および１０２を経由して圧力源＃２  ８０に選択的に接続するように構成された弁８４に結合される。入口ポート１６は、圧力線９０、９２、および１０４を経由して圧力源＃１  ２２に、または圧力線９６、９４、および１０４を経由して圧力源＃２  ８０に選択的に接続するように構成された圧力弁８６に結合される。出口ポート１８は、圧力線１０６および４６を経由して出口ポート１８を圧力源＃１  ２２に選択的に接続するために弁１２０に結合される。
【００３７】
コントローラ５０は、制御線５２を経由して圧力源＃１  ２２を制御し、制御線１１０を経由して圧力源＃２  ８０を制御する。コントローラ５０は、制御線１１８を経由して圧力制御弁１２０を、制御線１１６を経由して圧力弁８２を、制御線１１４を経由して圧力弁８４を、そして制御線１１２を経由して圧力弁８６をやはり制御する。
【００３８】
入口ポート１２から流体フローを生み出す目的で、出口ポート１８を圧力源＃１  ２２に接続するために、（例えば、コントローラ５０によって）制御弁１２０がアクティブ化され、入口ポート１２を圧力源＃２  ８０に接続するために、制御弁８２がアクティブ化される。圧力源＃２  ８０によって生み出された圧力は、圧力源＃１  ２２によって生み出された圧力より大きいことが好ましい。これにより、出口ポート１８と入口ポート１２との間に負圧差が生み出される。入口ポート１４および１６は、当初、それぞれ、弁８４および８６によって、圧力源＃１  ２２に接続され、したがって、入口ポート１４および１６とマイクロチャネルの入口との間に圧力差は存在せず、これにより、入口ポート１４および１６から出口ポート１８への流体フローは存在しない。弁８４および８６は、確立された均衡圧力を維持するために、遮断され得る。入口ポート１２からの流体フローを停止させる目的で、マイクロチャネルの入口と入口ポート１２との間の圧力を等化する目的で、入口ポート１２を圧力源＃１  ２２に接続するために、制御弁８２がアクティブ化され、次いで、遮断される。
【００３９】
入口ポート１４から流体フローを生み出すために、出口ポート１８と入口ポート１４との間に負圧差を生み出す目的で、入口ポート１４を圧力源＃２  ８０に接続するために、制御弁８４がアクティブ化される。入口ポート１２および１６に対する弁８２ならびに８６は、確立された圧力を維持するために遮断され、したがって、入口ポート１２および１６とマイクロチャネルの入口との間に圧力差が存在せず、これにより、入口ポート１２および１６から出口ポート１８への流体フローは存在しない。入口ポート１４からの流体フローを停止させるために、マイクロチャネルの入口と入口ポート１４との間の圧力を等化する目的で、入口ポート１４を圧力源＃１  ２２に接続するために、制御弁８４がアクティブ化され、次いで、遮断される。
【００４０】
入口ポート１６から流体フローを生み出す目的で、出口ポート１８と入口ポート１６との間に負圧差を生み出すために入口ポート１６を圧力源＃２  ８０に接続する目的で、制御弁８６がアクティブ化される。入口ポート１２および１４に対する弁８２ならびに８８は、確立された圧力を維持するために遮断され、したがって、入口ポート１２および１４とマイクロチャネルの入口との間に圧力差は存在せず、これにより、入口ポート１２および１４から出口ポート１８への流体フローは存在しない。入口ポート１６からの流体フローを停止させる目的で、マイクロチャネルの入口と入口ポート１６との間の圧力を等化するために入口ポート１６を圧力源＃１  ２２に接続する目的で、制御弁８６がアクティブ化され、次いで、遮断される。
【００４１】
代替の構成として、３元弁８２、８４、８６は、それぞれ、それぞれの関連する入口ポートを圧力源＃１  ２２または圧力源＃２  ８０と選択的に接続するために、２つの２元弁によって置き換えられることが可能である。
【００４２】
本発明において使用するのに適した弁は、フロリダ州、メルボルンのＩＱ  Ｖａｌｖｅｓ  Ｃｏ．，およびコネチカット州、ウェストブルックのＴｈｅ  Ｌｅｅ  Ｃｏｍｐａｎｙによる２元ソレノイド弁および３元ソレノイド弁を含む。
【００４３】
図１、２および３に示されるシステムは、本発明の譲受人に譲渡された同時係属米国出願第１１／５０５，３５８号に記述されるように、マイクロチャネルを介して流れ、緩衝溶液など、非反応性流体の液滴によって互いから分離された、アッセイ試薬の離散液滴内でＰＣＲを実行するためのプロセスにおいて利用され得る。このプロセスは、図４および５を参照して説明される。
【００４４】
図４は、マイクロチャネルを介して流れる離散液滴内でＰＣＲを実行するためのステップを例示する流れ図であり、図５は、チャネルを介した様々な物質のフローを表す時間履歴曲線を示す。このプロセスは、図１に示されたシステムを参照して説明される。しかし、このプロセスは、図２もしくは３のシステム、または図１、２、および３のシステムの混成組合せを用いて実行されることも可能である点を理解されたい。
【００４５】
図４を参照すると、ステップ１３０において、関連する弁を経由して、ポートを負圧源２２に接続することによって、出口ポート１８および入口ポート１２、１４、１６のすべてなどに負圧が加えられる。すべての入口弁はこの時点で遮断されている。廃棄ポートと任意の入口ポートとの間に圧力差は存在せず、したがって、マイクロチャネル２０内への流体フローが存在しないため、これは停止状態として知られている。
【００４６】
ステップ１３２において、ＤＮＡ／緩衝入口ポートに結合された弁（例えば、入口ポート１２に関連する弁２４）は、図５の曲線１６２によって示されるように、サンプルフロー状態（すなわち、出口ポート１８と入口ポート１２との間の負圧差）を生み出すために、負圧から大気圧に切り替えられる。図４に示されないが、図５の曲線１６４によって示されるように、ポリメラーゼフローを生み出すために、ポリメラーゼ入口ポートに結合された弁も負圧から大気圧に切り替えられることが可能である。ＤＮＡ／緩衝の混合物は、組み合わされて、マイクロチャネル２０を介した共通フローになる。
【００４７】
ステップ１３４において、ＤＮＡ／緩衝（および、オプションで、ポリメラーゼ）の混合物を用いてチャネルを満たすために、タイマ遅延が実装される。
【００４８】
ステップ１３６において、プライマ１入口ポートに結合された弁（例えば、入口ポート１４に関連する弁２６）は、サンプルフローストリームと混合されることになる、マイクロチャネル２０内へのプライマフロー状態を生み出すために、負圧から大気圧に切り替えられる。その混合物内に流れるプライマ１の量を制御するために、所望されるタイマ注入量に比例するタイマ遅延がステップ１３８において実装される。ステップ１４０において、プライマ１入口ポートに結合された弁は、プライマのフローを停止されるために、元の状態、すなわち、弁を遮断した状態の負圧に切り替えられ、それによって、図５の（クロック間隔４を介した）フロー曲線１６６の第１の部分を生み出す。
【００４９】
所望されるスペーサインタリーブに比例するタイマ遅延がステップ１４２で実装される。これは、プライマのフローが伴わない、サンプルフロー状態である。
【００５０】
ステップ１４４において、プライマ２入口ポートに結合された弁（例えば、入口ポート１６に関連する弁２８）は、サンプルフローストリームと混合させることになる、マイクロチャネル２０内へのプライマフロー状態を生み出すために、負圧から大気圧に変更される。プライマ２の所望される注入量に比例するタイマ遅延がステップ１４６において実装される。そして、ステップ１４８において、プライマ２入口ポートに結合された弁は、弁がプライマ２のフローを停止するために遮断状態にある、元の負圧に切替復帰される。ステップ１４４、１４６、および１４８は、図５に示される（クロック間隔５を介した）フロー曲線１６８の第１の部分を生み出す。
【００５１】
ステップ１５０において、完全なアッセイ状態が生み出され、これによりフロー曲線１７０を生み出すまで、追加のプライマおよび予め注入されたプライマの追加の離散注入のために、プライマ注入順序が繰り返される。結果として生じるサンプルテストストリームフロー曲線は、曲線内のそれぞれの「突出部」がサンプルフローストリーム内に混合されたプライマの離散量を表す、図５の曲線１７２によって指定される。別個のＰＣＲ（または、その他の）アッセイは、サンプル／プライマの混合物のそれぞれの離散量（すなわち、ボーラス（ｂｏｌｕｓ））内で実行され得る。
【００５２】
ステップ１５２において、流れているマイクロ流体ストリーム上でＰＣＲ熱サイクルが実行され、それによって、それぞれのテストボーラス内でＰＣＲ増幅反応を引き起こす。ステップ１５４において、流れているマイクロ流体ストリーム上でＤＮＡ熱溶解解析が実行される。そして、ステップ１５６において、マイクロチャネル２０内で実行されたマルチプレックスアッセイに関するそれぞれのテストボーラスに関して、一続きのアッセイ熱溶解データが生成される。
【００５３】
図６に示すように、入口ポートに結合された任意の弁は、入口ポートにおいて注入された流体の量を調整するために、パルス幅変調された形で操作されることが可能である。例えば、上で説明されたように、入口ポートに結合された弁は、マイクロチャネルに注入されることになる所望される量の流体に対応する所定の期間にわたってフロー状態に設定されることが可能である。入口ポートに結合された弁をより短い期間にわたってフロー状態に設定することによって、より少ない量の流体が注入され得る。しかし、指定された物理サイズの反応液滴を生み出すことが望ましい場合があり、したがって、（より少ない量に対応するより短い時間ではなく）指定された期間にわたって入口ポートから流体フローを有することが望ましい場合がある。指定された期間にわたってポートからのフローを維持すると同時に、入口ポートからより少量の流体フローを生み出すために、ポートに結合された弁は、図６の曲線１７４および１７６に示すように、所望されるフロー期間にわたって負圧と大気圧（または、その他のより高い圧力）との間で調節されることが可能である。入口ポートにおいて結果として生じる圧力は、図６の曲線１８０によって示される。図６の曲線１７８に示すように、結果として生じる試薬フローは、通常、入口弁がフロー期間の全体にわたって大気圧に開放され続けた場合よりも、結果として、より少量の流体が注入されることになるフローレートで、フロー期間の全体にわたって一定フローである。
【００５４】
上で説明されたシステムおよび方法は、投入ポートからマイクロ流体チャネルへの流体フローを迅速に開始および停止するための手段を提供し、流体フローの正確な容量制御とタイミングとを可能にする。特定の投入ポートからの流体フローが停止されたとき、そのポートにおいて導入された流体と、マイクロチャネル内に含まれた流体との間にインターフェースが生み出される。停止された投入ポートからの少量の流体は、マイクロチャネル内に拡散する可能性があり、所望されない流体がテスト量に混合された場合、これは汚染を引き起こす可能性がある。
【００５５】
これは、それぞれ、投入チャネル１３、１５，１７を経由して、マイクロチャネル２０と連通する投入ポート１２、１４、１６を示す図７に概略的に例示される。図７に示すように、流体は、図において斜交平行線によって表されるように、投入ポート１４から投入チャネル１５を介してマイクロチャネル２０内に流れ、一方、入口ポート１２および１６からの流体フローは、図７において点描によって表されるように停止される。この状態は、それぞれ、入口ポート１２および１６をマイクロチャネル２０に接続している入口チャネル１３および１７内の流体と、マイクロチャネル２０内の流体との間に流体インターフェースを生み出す。入口チャネル１３および１７からのある量の流体は、図７の流体インターフェースにわたって延びるギザギザ線によって表されるように、マイクロチャネル２０内に拡散される可能性がある。
【００５６】
図８は、マイクロチャネル内へのフローが停止されている、入力ポートからの流体拡散の問題を緩和するためのシステムを例示する。図８に示すシステムは、マイクロチャネル２１０と連通する出力ポート２０８と、それぞれ、入口チャネル２１２、２１４、２１６、および２２０を経由して、マイクロチャネル２１０と連通する入口ポート２０２、２０４、２０６、および２１８とを有するマイクロ流体チップ２００を含む。このシステムは、負圧源２２２と、出口ポート２０８に関連する弁２３０と、入口ポート２０２に関連する弁２２４と、入口ポート２０４に関連する弁２２６と、入口ポート２０６に関連する弁２２８と、入口ポート２１８に関連する弁２３２とをさらに含む。
【００５７】
このシステムは、出口ポート２０８が、弁２３０を経由して、負圧源２２２、または大気圧「Ａ」に選択的に結合され得るように構成される。入口ポート２０２は、弁２２４を経由して、負圧源２２２、もしくは大気圧、または弁を遮断した状態の負圧に選択的に結合され得る。入口ポート２０４は、弁２２６を経由して、負圧源２２２、もしくは大気圧、または弁を遮断した状態の負圧に選択的に結合され得る。入口ポート２０６は、弁２２８を経由して、負圧源２２２、もしくは大気圧、または弁を遮断した状態の負圧に選択的に結合され得る。
【００５８】
例示された実施形態において、弁２３０、２２４、２２６、２２８のそれぞれは、関連するポートを負圧源２２２、もしくは大気圧、または弁を遮断した状態の負圧に選択的に接続するための３元弁である。あるいは、このシステムは、それぞれのポートに関連する２つの２元弁、すなわち、例えば、上の図２に関して示され、説明されたような、関連するポートを負圧源に選択的に接続するための１つの弁と、関連するポートを大気圧に選択的に接続するためのもう１つの弁とを用いて構成されることが可能である。さらなる代替形態として、このシステムは、負圧源２２２の圧力よりも高い圧力を生み出すように構成された第２の圧力源を含んでよく、それぞれのポートは、関連する１つの弁または複数の弁を経由して、例えば、図３に関して上で示されたような、圧力源のいずれかに選択的に結合されることが可能である。
【００５９】
入口ポート２１８に関連する制御弁２３２は、入口ポート２１８と大気圧との間の接続を閉鎖するために、入口ポート２１８を大気圧に選択的に接続するための２元弁であってよい。
【００６０】
図８に示されないが、制御弁のそれぞれ、および負圧源は、コントローラによって制御されることが好ましい。
【００６１】
非反応性流体（例えば、緩衝溶液）の源は、入口ポート２１８に結合される。（それを介して、反応性流体（例えば、試薬）が導入される）入口ポート２０２、２０４、２０６は、そのそれぞれの弁によって負圧源２２２に結合され、一方、入口ポート２１８は、弁２３２によって大気圧に開放される。これは、試薬入口ポート２０２、２０４、２０６と緩衝入口ポート２１８との間に負圧差を生み出し、これにより、ある量の緩衝溶液（または、その他の非反応性流体）を入口ポート２１８から入口チャネル２１２、２１４、２１６内に引き入れる。これは、緩衝入口ポート２１８を部分的に試薬入口チャネル２１２、２１４、２１６のそれぞれの中に接続している入口チャネル２２０から引き入れられた、斜交平行線によって示される緩衝溶液量を示す図９に概略的に表される。したがって、試薬入口チャネル２１２、２１４、２１６のそれぞれと、マイクロチャネル２１０との間の流体インターフェースは、非反応性緩衝溶液とのインターフェースに過ぎず、これにより、反応性流体が流体インターフェースにおいてマイクロチャネル内に拡散する問題を回避する。
【００６２】
図１０および１１は、本発明のこの態様による、拡散によって引き起こされる汚染を回避すると同時に、試薬フローを生み出すためのプロセスを例示する。
【００６３】
図１１のステップ２４０において、図９に示すように、ある量の緩衝溶液が入口チャネル２１２、２１４、２１６のそれぞれの中に引き入れられた後で、弁２３０を経由して出力ポート２０８を負圧源２２２に接続することによって、出口ポート２０８に負圧が加えられる。試薬入口ポート２０４は、弁２２６によって大気圧に開放され、これにより、試薬を試薬入口ポート２０４から入口チャネル２１４を介してマイクロチャネル２１０内に流す。ステップ２４２において、所定の量の試薬流体を入口ポート２０４から注入した後で、すべての弁は閉鎖され、これにより、入口ポート２０４からの任意のさらなるフローを停止する。
【００６４】
ステップ２４４において、試薬入口ポート２０４は、弁２２６によって負圧源２２２に開放され、緩衝入口ポート２１８は、弁２３２によって大気圧に開放され、これにより、緩衝を入口ポート２１８から入口チャネル２２０を介して入口チャネル２１４内に流す。これは、図９に示すように、やはり、入口チャネル２１４とマイクロチャネル２１０との間に非反応性流体インターフェースを生み出すことになる。
【００６５】
ステップ２４６において、所定の量の緩衝溶液を入口チャネル２１４に引き入れた後で、任意のさらなるフローを停止するために、すべての弁が閉鎖される。ステップ２４８において、出口ポート２０８は、やはり、弁２３０によって負圧源２２２に接続され、すべてのその他の弁が閉鎖されると同時に、試薬入口ポート２０２は弁２２４によって大気圧に開放され、これにより、試薬を入口ポート２０２からマイクロチャネル２１０内に流す。
【００６６】
図１０に表すように、反応性流体が入口ポート２０４および入口チャネル２１４からマイクロチャネル２１０内に流れる間、その他の入口チャネル２１２、２１６、２２０からのマイクロチャネル２１０内への任意の拡散は、それぞれの入口チャネル内の流体とマイクロチャネル２１０との間のインターフェースにおける緩衝溶液の拡散を伴うに過ぎない。したがって、流れていない入口チャネルからの拡散は、入口ポート２１４において導入されたテスト量の反応性流体の汚染を引き起こさない。
【００６７】
試薬入口チャネル内に引き入れられた緩衝溶液量は、その間にそのチャネルからのフローが停止されることになる期間に依存することになる。例えば、特定の試薬入口チャネルからのフローが、比較的長い期間にわたって停止されることになる場合、試薬流体が緩衝インターフェースを介してマイクロチャネル内に拡散するためにより多い時間が存在することになり、一方、試薬入口チャネルからのフローが比較的短い期間にわたって停止されることになる場合、かかる拡散が発生するためにより短い時間が存在することになる。したがって、試薬流体とマイクロチャネルとの間の緩衝インターフェースのサイズは、そのフローがその試薬入口チャネルから停止される時間量に依存し得る。緩衝インターフェースの長さは、好ましくは、およそ１ｍｍであるが、０．２ｍｍから最高で５ｍｍに及んでよい。特定の入口チャネルからのフローが２分間だけ停止されることになる場合、０．２ｍｍの緩衝インターフェースは十分である可能性があり、一方、試薬入口チャネルからのフローが１時間にわたって停止されることになる場合、３〜５ｍｍの緩衝インターフェースが望ましい可能性がある。同様に、より長い緩衝インターフェースまたはより短い緩衝インターフェースが選択され得る。
【００６８】
ある好ましい実施形態に対する開示を用いて、本発明がかなり詳細に説明され、示されているが、当業者は、本発明のその他の実施形態を容易に理解されよう。したがって、本発明は、以下の添付の特許請求の範囲の趣旨内および範囲内に含まれるすべての修正形態および改変形態を含むと見なされる。
【００６９】
加えて、上で説明され、図面で例示されたプロセスは、一続きのステップとして示されるが、これは例示のためだけに行われた。したがって、いくつかのステップが追加されてよく、いくつかのステップが省略されてよく、ステップの順序が再構成されてよいことが企図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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