(57)【要約】  本発明は、ヒトタンパク質ＣＤ１５１と特異的に結合し得る新規な抗体、特に、ネズミ起源のモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、ならびに該抗体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。本発明は、癌の予防的および／または治療的処置のための薬剤としての、また、タンパク質ＣＤ１５１の過剰発現に関連する疾患を診断するための方法またはキットにおける、該抗体の使用に関する。本発明はさらに、抗癌性の抗体および／または薬剤と組み合わせた、または毒素および／または放射性元素とコンジュゲートさせたこのような抗体を含んでなる製品および／または組成物、ならびにある種の癌の予防および／または治療のためのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１もしくは５９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１もしくは５９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号２もしくは６０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２もしくは６０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号３の配列または最適なアライメントの後に配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列である）；および／または
ｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４もしくは６１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４もしくは６１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５もしくは６２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号５もしくは６２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号６もしくは６３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６もしくは６３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択される）
を含んでなる、ＣＤ１５１タンパク質と結合し得る、単離された抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項２】
配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる配列を有する軽鎖、および／または配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる配列を有する重鎖を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
２００８年２月２２日に、ＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)、パスツール研究所、パリ（フランス）に番号Ｉ−３９２０として寄託された、ネズミハイブリドーマ。
【請求項４】
ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１７もしくは６９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１７もしくは６９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号１８もしくは７０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１８もしくは７０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号１９の配列または最適なアライメントの後に配列番号１９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列である）；および／または
ｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号２０もしくは７１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２０もしくは７１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号２１もしくは７２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２１もしくは７２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号２２もしくは７３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２２もしくは７３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択される）
を含んでなる、ＣＤ１５１タンパク質と結合し得る、単離された抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項５】
配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなる配列を有する軽鎖、および／または配列番号２４のアミノ酸配列を含んでなる配列を有する重鎖を含んでなる、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
２００８年２月２２日に、ＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)、パスツール研究所、パリ（フランス）に番号Ｉ−３９２１として寄託された、ネズミハイブリドーマ。
【請求項７】
ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号３３もしくは７９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３３もしくは７９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号２もしくは６０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２もしくは６０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号３の配列または最適なアライメントの後に配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列である）；および／または
ｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４もしくは６１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４もしくは６１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号３４もしくは８０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３４もしくは８０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号３５もしくは８１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３５もしくは８１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択される）
を含んでなる、ＣＤ１５１タンパク質と結合し得る、単離された抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項８】
配列番号３６のアミノ酸配列を含んでなる配列を有する軽鎖、および／または配列番号３７のアミノ酸配列を含んでなる配列を有する重鎖を含んでなる、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
２００８年２月２１日に、ＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)、パスツール研究所、パリ（フランス）に番号Ｉ−３９１８として寄託された、ネズミハイブリドーマ。
【請求項１０】
ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号４３もしくは８５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４３もしくは８５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号４４もしくは８６の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４４もしくは８６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号４５の配列または最適なアライメントの後に配列番号４５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列である）；および／または
ｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４６もしくは８７の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４６もしくは８７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号４７もしくは８８の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４７もしくは８８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号４８もしくは８９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４８もしくは８９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択される）
を含んでなる、ＣＤ１５１タンパク質と結合し得る、単離された抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１１】
配列番号４９のアミノ酸配列を含んでなる配列を有する軽鎖、および／または配列番号５０のアミノ酸配列を含んでなる配列を有する重鎖を含んでなる、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
２００８年２月２１日に、ＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)、パスツール研究所、パリ（フランス）に番号Ｉ−３９１９として寄託された、ネズミハイブリドーマ。
【請求項１３】
以下の核酸：
ａ）請求項１、２、４、５、７、８、１０および１１のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ核酸；
ｂ）ａ）として定義される核酸と相補的な核酸；
ｃ）高ストリンジェンシー条件下で、配列番号９〜１６、２５〜３２、３８〜４２、５１〜５８、６４〜６８、７４〜７８、８２〜８４、９０〜９４、９８〜１００もしくは１０４〜１０６の核酸配列の少なくとも１つ、または最適なアライメントの後にこれらの配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列とハイブリダイズし得る少なくとも１８個のヌクレオチドの核酸
から選択される、単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の細胞を含んでなる、ヒトを除くトランスジェニック動物。
【請求項１７】
請求項１、２、４、５、７、８、１０および１１のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを製造する方法であって、以下の工程：
ａ）請求項１５に記載の細胞を、好適な培養培地中、好適な培養条件下で培養する工程；および
ｂ）それにより産生された前記抗体またはその機能的フラグメントを、培養培地から、または前記培養細胞から回収する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法により得ることができる、抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント。
【請求項１９】
請求項１、２、４、５、７、８、１０、１１および１８のいずれか一項に記載されているか、または請求項３、６、９もしくは１２に記載のハイブリドーマにより産生される抗体またはその機能的フラグメントからなる化合物を有効成分として含んでなる、組成物。
【請求項２０】
同時使用、個別使用または時間差使用のための組合せ製品として、抗体、細胞傷害性／細胞増殖抑制剤、細胞毒または放射性元素をさらに含んでなる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
薬剤としての、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
癌の予防または処置を意図した薬剤の製造における、請求項１、２、４、５、７、８、１０、１１および１８のいずれか一項に記載されているか、または請求項３、６、９もしくは１２に記載のハイブリドーマにより産生される抗体またはその機能的フラグメント、および／または請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２３】
前記癌が前立腺癌、肺癌、結腸癌、乳癌または膵臓癌から選択される癌である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
ＣＤ１５１タンパク質の異常な存在が疑われる生体サンプルから始める、ＣＤ１５１タンパク質の過剰発現または過少発現を有する疾患のin vitro診断のための方法であって、該生体サンプルを、請求項１、２、４、５、７、８、１０、１１および１８のいずれか一項に記載されているか、または請求項３、６、９もしくは１２に記載のハイブリドーマにより産生される抗体と接触させることを特徴とし、適当であれば、該抗体が標識されていてもよい、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、キメラであり、ヒト化されており、腫瘍の成長を阻害することができるネズミ起源の新規な抗体、特にモノクローナル抗体に関し、また、これらの抗体をコードするアミノ酸および核酸配列に関する。特定の態様によれば、本発明は、腫瘍細胞の成長を阻害することができる新規な抗体、誘導化合物または機能的フラグメントに関する。本発明はまた、癌の予防的処置および／または治療的処置のための薬剤としての、また、癌の診断方法もしくはキットにおけるこれらの抗体の使用を含む。最後に、本発明は、このような抗体を、例えば、抗癌剤および／または抗体と組み合わせて、または毒素と結合して含んでなる製品および／または組成物、ならびにある種の癌の予防および／または治療におけるその使用を含む。
【発明の背景】
【０００２】
ＣＤ１５１は、ＰＥＴＡ−３またはＳＦＡ−１とも呼ばれ、テトラスパニンファミリーに属する膜タンパク質である(Boucheix and Rubinstein, 2001, Cell Mol. Life Sci. 58, 1189-1205; Hemler, 2001, J. Cell Biol. 155, 1103-1107)。ヒトにおいて、ＣＤ１５１は２５３個のアミノ酸を有し、４つの膜断片と、細胞外ループとも呼ばれる２つの細胞外ドメインＥＣ１（１８個のアミノ酸、配列［４０〜５７］）およびＥＣ２（１０９個のアミノ酸、配列［１１３〜２２１］）を含む。しかしながら、ヌクレオチド配列では、これまでのＣＤ１５１の２つの変異体（すなわち、一方は３９５位と４０９位にそれぞれヌクレオチドＡとＣを有し[Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355]、もう一方は同じ位置にヌクレオチドＡとＣの代わりにヌクレオチドＧとＴを有する[Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263]）が同定されていることに留意すべきである。結果として、ペプチド配列において突然変異、すなわち、それぞれ１３２位と１３７位にある残基Ｋ（Ｌｙｓ）およびＰ（Ｐｒｏ）の、残基Ｒ（Ａｒｇ）およびＳ（Ｓｅｒ）への突然変異が観察されることがある[Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355/Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263]。
【０００３】
ＣＤ１５１は、例えば肺癌[Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114]、結腸癌[Hashida et al., 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167]、前立腺癌[Ang et al., 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.13, 1717-1721]または膵臓癌[Gesierich et al.,2005,Clin.Cancer Res.11, 2840-2852]などの多くの癌で過剰発現する。
【０００４】
様々なタイプの細胞におけるＣＤ１５１の機能と発現をin vitroで阻害するための、ＣＤ１５１を発現しないノックアウトマウス、抗ＣＤ１５１抗体、およびｓｉＲＮＡの利用によって、ＣＤ１５１が、細胞接着(Nishiuchi et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1939-1944; Winterwood et al., 2006, Mol. Biol. Cell 17, 2707-2721)、細胞運動(Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343)、細胞移動(Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765; Testa et al., 1999, Cancer Res.59, 3812-3820; Penas et al., 2000, J. Invest. Dermatol. 114, 1126-1135; Klosek et al., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416)、細胞浸潤(Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343; Shiomi et al., 2005, Lab. Invest. 85, 1489-1506; Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292)、および血管新生(Yanez-Mo et al., 1998, J. Cell Biol. 141, 791-804; Sincock et al., 1999, J. Cell Sci. 112, 833-844; Takeda et al., 2006, Blood 109, 1524-1532)といった、癌に関わるいくつかの現象に関与していることが示されている。
【０００５】
テトラスパニンの注目すべき特性の１つは、それら自体で結合し、また、その他多数の表面分子とも結合することで、構造化された高分子複合体を形成することができることである。これらの複合体の内部において、各テトラスパニンは１以上の表面分子と特異的に結合し、それより、１つのテトラスパニンと１つのパートナー分子からなる基本複合体を形成する。テトラスパニンは原形質膜に特徴的な特定のミクロドメインを組織することができ、そのミクロドメインから、機能的に結合可能なパートナー分子を動員することができる。テトラスパニンが関与する相互作用のセットは「テトラスパニン・ネットワーク」または「テトラスパニン・ウェブ」と呼ばれている。
【０００６】
ＣＤ１５１は細胞の表面で様々な膜タンパク質と相互作用する。特に、ある種の洗浄剤の作用に抵抗性を有する極めて安定な複合体が、ラミニン受容体インテグリンを伴うこと、より詳しくは、好ましいリガンドがラミニン５であるインテグリンα３β１またはα６β４を伴うことが確認されている(Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765; Lammerding et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100, 7616-7621)。この結合には、ＣＤ１５１の細胞外ドメインとインテグリンが関与する。ＥＣ２ループ内にあるＣＤ１５１の配列ＱＲＤ［１９４〜１９６］はこの結合において極めて重要であるが、それはこの部位の突然変異によりある種のインテグリンとの相互作用の損失が起こるからである(Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309)。さらに、ＣＤ１５１／インテグリα６β４／ｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体）の機能的三元複合体が腫瘍細胞で確認されている(Klosek et al., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416)。細胞を干渉ＲＮＡで処理した結果としてのＣＤ１５１発現の阻害は、ＨＧＦにより引き起こされる細胞成長と細胞移動の阻害がもたらされる。
【０００７】
ＥＣ２ループの欠損はＣＤ１５１とその他のテトラスパニンの結合を断たないことが示されていることから、テトラスパニン・ネットワークの形成に必要な、特定の細胞内のＣＤ１５１とその他のテトラスパニンの相互作用はＣＤ１５１の膜および原形質領域に依存すると考えられる(Berditchevski, 2001, J. Cell Sci. 114, 4143-4151)。
【０００８】
ＣＤ１５１は、例えばＰＩ４−キナーゼとの結合を介したホスホイノシチド経路(Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765)、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ｐ３８−ＭＡＰＫおよびＪＮＫのリン酸化を介したｃ−Ｊｕｎシグナル伝達経路(Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292)、ＰＫＣによるインテグリンのリン酸化(Zhang et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 25005-25013)、ＲｈｏファミリーのＧＴＰアーゼの活性化(Shigeta et al., 2003, J. Cell Biol. 163, 165-176)などの様々なシグナル伝達経路の調節により、細胞の接着、移動および浸潤の現象を調節することができる。
【０００９】
また、細胞間の同種親和性型の相互作用も、細胞運動およびメタロプロテイナーゼＭＭＰ−９の発現の増大の一因である(Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292)。これらのＣＤ１５１−ＣＤ１５１細胞間相互作用は、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ｐ３８−ＭＡＰＫおよびＪＮＫのリン酸化を介したｃ−Ｊｕｎの活性化を引き起こす。
【００１０】
このＣＤ１５１タンパク質の利点にも関わらず、これまでに作製されている治療目的の抗体はモノクローナル抗体５０−６とＳＦＡ１．２Ｂ４の２つである。これら２つの抗体は匹敵する活性を持つ。それらは動物モデルにおいてin vivoで転移の形成を阻害するが、in vivoにおいて腫瘍成長における効果は確認されていない。
【００１１】
ＣＤ１５１に対するモノクローナル抗体５０−６（ＩｇＧ１イソ型）は、マウスにおいて、ヒト扁平上皮癌ＨＥｐ−３細胞を用いたサブトラクティブ免疫法(Subtractive immunization)によって作製されている(Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820)。
【００１２】
抗体５０−６は、ＣＤ１５１を過剰発現するようにトランスフェクトされたヒト子宮頸癌ＨｅＬａ細胞およびＨＥｐ−３細胞の移動、ならびにｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）によって誘発される絨毛尿膜血管新生モデルにおける脈管形成をin vitroで阻害することができる。この抗体はin vivoにおいて、２つのニワトリ胚モデルにおいて、ＨＥｐ−３細胞の接種によって誘発される転移を阻害する(Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820)。これらのモデルにおいて、抗体５０−６の阻害活性は、肺抽出物中のタンパク質ｈｕＰＡ（ヒトウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子）の活性を測定することで判定される。筆者らによると、このアッセイは肺におけるヒト細胞の存在を反映するものである。アッセイの後、細胞の接種の後に抗体を注入する、いわゆる「自然転移」モデルにおいて、抗体５０−６によって誘発される転移（ニワトリ胚の肺へのＨＥｐ−３細胞の播種）が、対照抗体と比較して７４％に減少すると推定され、細胞と抗体が一緒に接種される、いわゆる「実験的転移」モデルでは５７％に減少すると推定される。筆者らによると、この抗体はＨＥｐ−３細胞のin vitro増殖に対しては作用を全く示さなかったことから、in vivoで見られる抗体５０−６の抗腫瘍特性は細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用とは関係していないようである。
【００１３】
抗体５０−６を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣにおいて参照番号ＣＲＬ−２６９６で入手可能である（当初、ハイブリドーマは参照番号５０−６［ＰＴＡ−２２７］として寄託）。
【００１４】
抗ＣＤ１５１モノクローナル抗体ＳＦＡ１．２Ｂ４（ＩｇＧ１イソ型）は、マウスにおいて、ヒトＣＤ１５１遺伝子でトランスフェクトされたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を用いた腹腔内経路による免疫後に生成された(Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70, 3258-3263)。抗体ＳＦＡ１．２Ｂ４は、in vitroにおいて、様々なヒト腫瘍系統の細胞浸潤および運動を阻害することができる(Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343)。この抗体はin vivoにおいて、ＣＤ１５１を過剰発現するようにトランスフェクトされた結腸癌ＲＰＭＩ１４７８８および繊維肉腫ＨＴ１０８０系統により誘発された肺転移を阻害する(Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343)。
【００１５】
他のネズミ抗ＣＤ１５１抗体は、例えば、モノクローナル抗体１４Ａ２Ｈ１(Ashman et al., 1991, Br. J. Haematol. 79, 263-270; Roberts et al, 1995, Br. J. Haematol. 89, 853-860)、ＴＳ１５１およびＴＳ１５１Ｒ(Serru et al., 1999, Biochem. J. 340, 103-111; Geary et al., 2001, Tissue Antigens 58, 141-153; Charrin et al., J. Biol. Chem. 276, 14329-14337; Chometon et al., 2006, Exp. Cell Res. 312, 983-985)など、文献に記載されている。これらの様々抗体でin vivo抗腫瘍活性が記載されているものは無い。
【００１６】
いくつかの実験的研究によって、転移のサプレッサーまたはプロモーターのいずれかとして作用することによる、転移形成におけるテトラスパニンの主要な役割が示されている。つまり、ＣＤ９、ＣＤ６３またはＣＤ８２などのテトラスパニンのトランスフェクションによって癌系統の転移能が低下する。これに対し、テトラスパニンＣＤ１５１およびＣｏ−０２９の発現は逆の効果を生じさせるようである。従って、これらの２つのテトラスパニンは転移のプロモーターであると考えられる。これらの結果は、多くの癌（乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、前立腺癌、黒色腫など）において、ＣＤ９およびＣＤ８２が、転移が存在する場合の原発腫瘍ではあまり発現しないこと、およびそれらの発現の低下は生存率の低さの予測因子であることを示した、様々な臨床研究と一致している。肺癌において、ＣＤ９およびＣＤ８２の発現の減少の組合せは、これら２つの抗原の一方だけの発現が低下する場合よりも転移能が大きいことと相関している。
【００１７】
いくつかの後向き研究によって、ＣＤ１５１の過剰発現が、肺癌、結腸癌および前立腺癌などのある種の癌の攻撃性に関連しており、予後の悪さの因子であると考えられ得ることが示されている(Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114; Hashida et al., 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167; Ang et al., 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721)。これらの場合、実際、平均生存率は、ＣＤ１５１を発現していない患者と比べてＣＤ１５１を発現する腫瘍を有する患者で低い。
【００１８】
様々なヒト腫瘍系統（ＨｅＬａ、ＲＰＭＩ１４７８８、Ａ１７２、ＨＴ１０８０）において対応する遺伝子のトランスフェクションによって誘発されたＣＤ１５１の過剰発現は、トランスフェクト細胞の運動、移動および浸潤の増大を引き起こす(Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820; Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343)。これらの現象は抗ＣＤ１５１抗体の存在下では阻害される。
【発明の開示】
【００１９】
第一の態様によれば、本発明は、配列番号１〜６、１７〜２２、３３〜３５、４３〜４８、５９〜６３、６９〜７３、７９〜８１もしくは８５〜８９の配列のＣＤＲから選択される少なくとも１つのＣＤＲ、またはその配列が最適なアライメントの後に配列番号１〜６、１７〜２２、３３〜３５、４３〜４８、５９〜６３、６９〜７３、７９〜８１もしくは８５〜８９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでなることを特徴とする、ＣＤ１５１タンパク質と結合し得る、単離された抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【００２０】
本発明による抗体の「機能的フラグメント」とは、特に、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは「単鎖」を示す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’もしくはｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディー、またはその半減期が延長されている任意のフラグメントといった抗体フラグメントに関するものと理解される。このような機能的フラグメントは本明細書において以下に詳しく記載する。
【００２１】
本発明による抗体の「誘導化合物」とは、特に、ペプチドフレームワークまたは「スキャフォールド」とその認識能を保存するために元の抗体のＣＤＲの少なくとも１つを含んでなる結合タンパク質を表すものと理解される。このような誘導化合物は当業者によく知られており、本明細書において以下にさらに詳しく記載する。
【００２２】
より好ましくは、本発明は、遺伝子組換えまたは化学合成によって得られる、特にキメラであるか、またはヒト化された、本発明による抗体、それらの誘導化合物またはそれらの機能的フラグメントを含む。
【００２３】
好ましい実施態様によれば、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、モノクローナル抗体からなることを特徴とする。
【００２４】
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団に由来する抗体として理解される。より詳しくは、ある集団の個々の抗体は、自然に起こり得る、最少量で存在し得る、可能性のある２、３の突然変異以外には同一である。言い換えれば、モノクローナル抗体は、ただ１つの細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核生物宿主細胞、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた原核生物宿主細胞など）の増殖から得られ、かつ、通常は、１つの同じクラスおよびサブクラスの重鎖とただ１つのタイプの軽鎖を特徴とする、均質な抗体からなる。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原に対するものである。さらに、異なる決定因子、またはエピトープに対する異なる抗体を通常含んでなるポリクローナル抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、その抗原の単一のエピトープに対するものである。
【００２５】
本明細書において、本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわち、それらはそれらの天然環境から採取されたものではなく、天然源から出発して精製することによりそれらを単離または取得すること、あるいはまた、遺伝子組換えもしくは化学合成によりそれらを取得することが可能であり、従って、本明細書の下記に記載されるように、それらが非天然アミノ酸を含み得ると理解すべきである。
【００２６】
より詳しくは、本発明の第一の実施態様によれば、
ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１もしくは５９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１もしくは５９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号２もしくは６０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２もしくは６０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号３の配列または最適なアライメントの後に配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列である）；および／または
ｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４もしくは６１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４もしくは６１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５もしくは６２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号５もしくは６２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号６もしくは６３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６もしくは６３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択される）
を含んでなることを特徴とする第一の抗体が記載される。
【００２７】
本発明の第二の実施態様によれば、
ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号１７もしくは６９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１７もしくは６９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号１８もしくは７０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１８もしくは７０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号１９の配列または最適なアライメントの後に配列番号１９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列である）；および／または
ｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号２０もしくは７１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２０もしくは７１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号２１もしくは７２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２１もしくは７２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号２２もしくは７３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２２もしくは７３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択される）
を含んでなることを特徴とする第二の抗体が記載される。
【００２８】
本発明のさらなる第三の実施態様によれば、
ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号３３もしくは７９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３３もしくは７９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号２もしくは６０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２もしくは６０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号３の配列または最適なアライメントの後に配列番号３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列である）；および／または
ｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４もしくは６１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４もしくは６１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号３４もしくは８０の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３４もしくは８０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号３５もしくは８１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３５もしくは８１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択される）
を含んでなることを特徴とする第三の抗体が記載される。
【００２９】
最後に、本発明の最後の実施態様によれば、
ｉ）ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号４３もしくは８５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４３もしくは８５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号４４もしくは８６の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４４もしくは８６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号４５の配列または最適なアライメントの後に配列番号４５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列である）；および／または
ｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖（ここで、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４６もしくは８７の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４６もしくは８７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号４７もしくは８８の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４７もしくは８８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択され；
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号４８もしくは８９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４８もしくは８９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１つの配列のＣＤＲから選択される）
を含んでなることを特徴とする第四の抗体が記載される。
【００３０】
一般的には、ＣＤＲ領域またはＣＤＲは免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を表すと理解されることが思い出される。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲがある。ＣＤＲとは、本明細書において、場合に応じて、抗体が認識する抗原もしくはエピトープに対する抗体の結合親和性を担うアミノ酸残基の大多数を含む領域のうちの１つまたは複数、または実際には全部を表すのに用いられる。
【００３１】
第一のアプローチによれば、ＣＤＲはＩＭＧＴシステムに従って定義することができる。ＩＭＧＴの独自のナンバリングシステムは、抗原、鎖のタイプまたは種に関わらず、可変ドメインを比較するために定義されたものである[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]。このナンバリングシステムでは、保存されているアミノ酸は、システイン２３（１番目のＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ  ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２番目のＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＴＲＰ）など、常に同じ位置を保持する。よって、このＩＭＧＴの独自のナンバリングシステムは、スキャフォールド領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）の、また、相補性決定領域、すなわちＣＤＲ（ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番）の標準化された定義を提供する。「穴」または「空白」は占められていない場所を示し、ＩＭＧＴに従うＣＤＲの長さは極めて重要な情報となる。ＩＭＧＴシステムは二次元グラフに用いられ（ＩＭＧＴパールネックレスと呼ばれる）[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinforrnatics, 2, 21-30 (2007)]、また、ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢと呼ばれる三次元構造にも用いられる[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]。
【００３２】
この第一のアプローチによれば、本発明による第一の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、それぞれ配列番号１、２および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖；および／またはそれぞれ配列番号４、５および６の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００３３】
より明解には、記載のタンパク質配列は次の通りである。
配列番号１：  ＡＳＶＥＹＹＧＴＳＬ
配列番号２：  ＥＡＳ
配列番号３：  ＱＱＳＲＫＡＰＹＴ
配列番号４：  ＧＦＴＦＳＴＹＴ
配列番号５：  ＩＳＳＧＧＧＴＴ
配列番号６：  ＡＴＰＲＩＧＴＧＦＡＹ
【００３４】
より詳しくは、好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号１、２および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００３５】
同様に好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号４、５および６の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００３６】
この同じアプローチによれば、本発明の第二の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、それぞれ配列番号１７、１８および１９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１７、１８および１９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖；および／またはそれぞれ配列番号２０、２１および２２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２０、２１および２２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００３７】
より明解には、記載のタンパク質配列は以下の通りである。
配列番号１７：  ＡＴＰＲＩＧＴＧＦＡＹ
配列番号１８：  ＳＡＳ
配列番号１９：  ＱＱＹＳＳＮＰＴ
配列番号２０：  ＧＦＴＬＳＴＳＧＭＧ
配列番号２１：  ＩＹＷＤＤＤＫ
配列番号２２：  ＡＲＲＤＨＹＧＤＹＳＹＡＭＤＹ
【００３８】
より詳しくは、好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号１７、１８および１８の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１７、１８および１９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００３９】
同様の好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号２０、２１および２２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２０、２１および２２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００４０】
さらにこの同様のアプローチによれば、本発明による第三の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、それぞれ配列番号３３、２および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３３、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖；および／またはそれぞれ配列番号４、３４および３５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４、３４および３５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００４１】
より明解には、記載のタンパク質配列は次の通りである。
配列番号３３：  ＡＳＶＤＹＹＧＴＳＬ
配列番号３４：  ＩＳＳＧＧＶＴＴ
配列番号３５：  ＴＳＰＲＴＧＴＧＦＡＹ
【００４２】
より詳しくは、好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号３３、２および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３３、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００４３】
同様の好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号４、３４および３５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４、３４および３５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００４４】
最後に、さらにこの同様のアプローチによれば、本発明による第四にして最後の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、それぞれ配列番号４３、４４および４５の配列、または配列番号４３、４４および４５の配列と最適なアライメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖；および／またはそれぞれ配列番号４６、４７および４８の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４６、４７および４８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、を含んでなる重鎖を含んでなる。
【００４５】
より明解には、記載のタンパク質配列は次の通りである。
配列番号４３：  ＥＮＶＧＴＹ
配列番号４４：  ＧＡＳ
配列番号４５：  ＧＱＴＹＳＦＰＹＴ
配列番号４６：  ＧＹＴＦＴＳＳＳ
配列番号４７：  ＩＨＰＮＳＧＮＴ
配列番号４８：  ＡＲＡＲＳＦＹＹＡＭＤＣ
【００４６】
より詳しくは、好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号４３、４４および４５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４３、４４および４５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の、３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００４７】
同様の好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号４６、４７および４８の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４６、４７および４８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００４８】
第二のアプローチによれば、これらのＣＤＲは、Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991およびその後続版)の慣例のアプローチに従って定義することができる。
【００４９】
この第一のアプローチによれば、本発明による第一の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、それぞれ配列番号５９、６０および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号５９、６０および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３、から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖；および／またはそれぞれ配列番号６１、６２および６３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６１、６２および６３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される、少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００５０】
より明解には、記載のタンパク質配列は次の通りである。
配列番号５９：  ＲＡＳＡＳＶＥＹＹＧＴＳＬＭＨ
配列番号６０：  ＥＡＳＮＶＥＳ
配列番号６１：  ＳＴＹＴＭＳ
配列番号６２：  ＹＩＳＳＧＧＧＴＴＹＹＰＤＴＶＫＧ
配列番号６３：  ＰＲＩＧＴＧＦＡＹ
【００５１】
より詳しくは、好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号５９、６０および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号５９、６０および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００５２】
同様の好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号６１、６２および６３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６１、６２および６３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００５３】
この同じアプローチによれば、本発明による第二の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、それぞれ配列番号６９、７０および１９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６９、７０および１９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖；および／またはそれぞれ配列番号７１、７２および７３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号７１、７２および７３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００５４】
より明解には、記載のタンパク質配列は次の通りである。
配列番号６９：  ＫＡＳＱＮＶＧＩＡＶＡ
配列番号７０：  ＳＡＳＮＲＹＴ
配列番号７１：  ＳＴＳＧＭＧＶＳ
配列番号７２：  ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳ
配列番号７３：  ＲＤＨＹＧＤＹＳＹＡＭＤＹ
【００５５】
より詳しくは、好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号６９、７０および１９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６９、７０および１９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００５６】
同様の好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号７１、７２および７３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号７１、７２および７３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００５７】
さらにこの同様のアプローチによれば、本発明による第三の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、それぞれ配列番号７９、６０および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号７９、６０および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖；および／またはそれぞれ配列番号６１、８０および８１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１００、１０１および１０２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００５８】
より明解には、記載のタンパク質配列は次の通りである。
配列番号７９：  ＡＳＶＤＹＹＧＴＳＬ
配列番号８０：  ＹＩＳＳＧＧＶＴＴＹＹＰＤＴＩＫＧ
配列番号８１：  ＰＲＴＧＴＧＦＡＹ
【００５９】
より詳しくは、好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号７９、６０および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号７９、６０および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖、を含んでなる。
【００６０】
同様の好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号６１、８０および８１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６１、８０および８１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００６１】
最後に、さらにこの同じアプローチによれば、第四にして最後の本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、それぞれ配列番号８５、８６および４５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号８５、８６および４５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖；および／またはそれぞれ配列番号８７、８８および８９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号８７、８８および８９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなる。
【００６２】
より明解には、記載のタンパク質配列は次の通りである。
配列番号８５：  ＫＡＳＥＮＶＧＴＹＶＳ
配列番号８６：  ＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤ
配列番号８７：  ＴＳＳＳＭＨ
配列番号８８：  ＥＩＨＰＮＳＧＮＴＮＮＮＥＫＦＫＧ
配列番号８９：  ＡＲＳＦＹＹＡＭＤＣ
【００６３】
より詳しくは、好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号８５、８６および４５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号８５、８６および４５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる。
【００６４】
同様の好ましい様式において、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号８７、８８および８９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号８７、８８および８９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖、を含んでなる。
【００６５】
本明細書において、抗体化合物またはそれらの配列に関して「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド」および「タンパク質」は互換的である。
【００６６】
本明細書において、本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわち、それらはそれらの天然環境から採取されたものではなく、天然源から出発して精製することにより単離または取得すること、あるいはまた、遺伝子組換えもしくは化学合成により取得することが可能であった、従って、本明細書の下記に記載されるように、それらが非天然アミノ酸を含み得ると理解すべきである。
【００６７】
２つの核酸またはアミノ酸配列間の「同一性パーセンテージ」とは、本発明では、最良のアライメント（最適なアライメント）の後に得られる、比較する２配列間で同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを表すと理解され、このパーセンテージは純粋に統計学的なものであり、２配列間の違いはその配列に沿ってランダムに分布している。２つの核酸またはアミノ酸配列間の配列比較は通常、それらを最適にアラインした後にそれらの配列を比較することによって行われ、この比較はセグメントごとに、すなわち、「比較ウインドウ」によって行うことができる。比較のための最適な配列アライメントは、手作業で行われる他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカル・ホモロジー・アルゴリズム、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]のローカル・ホモロジー・アルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]、またはこれらのアルゴリズムを利用したコンピューターソフトウエア（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐ）によって行われる。
【００６８】
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、２つの最適にアラインされた配列を比較することにより決定され、ここで、比較される核酸またはアミノ酸配列は、これらの２配列間の最適なアライメントに対する参照配列に関して付加または削除を含み得る。同一性パーセンテージは、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が２配列間で同一である同一の位置を求め、その同一の位置の数を比較ウインドウの位置の総数で割り、得られた結果に１００を掛けて２配列間の同一性パーセンテージを得ることによって算出される。
【００６９】
例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにて入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) を使用することができ、使用するパラメーターはデフォルトとして与えられており（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」は５、「エクステンションギャップペナルティー」は２、選択されるマトリックスは例えばプログラムにより示唆されている「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリックスである）、比較する２配列間の同一性パーセンテージはプログラムにより直接算出される。
【００７０】
アミノ酸配列が参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する場合、参照配列に対してある種の修飾、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を有するものに対して参照が与えられる。１以上の連続する、または不連続のアミノ酸の置換の場合、置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸に置き換えられている置換に対して参照が与えられる。本明細書において「等価な」アミノ酸は、本明細書の以下、特に実施例で定義されるものなど、相当する抗体の生物活性を基本的に改変することなく、基本構造のアミノ酸の１つを置換することができる任意のアミノ酸を示すものとする。
【００７１】
これらの等価なアミノ酸は、置換されるアミノ酸との構造的相同性に基づくか、または生成され得る種々の抗体間の生物活性比較試験の結果に基づいて決定することができる。
【００７２】
非限定例を挙げれば、下表１は、対応する改変抗体の生物活性に基本的な改変をもたらすことなく行うことができる置換の可能性を示し、当然のことながら、同じ条件で逆の置換も実現可能ある。
【００７３】
【表１】
2011517565.tif 000002
【００７４】
先行技術に通り、当業者には、６つのＣＤＲ間の最大変動（長さおよび組成）は重鎖の３つのＣＤＲ、より詳しくは重鎖のＣＤＲ−Ｈ３に存在していることが認識されている。その結果、本発明による抗体の、好ましい特徴的なＣＤＲは、重鎖の３つのＣＤＲ、いっそうより好ましくはＣＤＲ−Ｈ３に相当するＣＤＲである。
【００７５】
特定の実施態様では、本発明は、本発明によるネズミ抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【００７６】
本発明の別の実施態様によれば、前記の第一の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号１、２および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖と、よびそれぞれ配列番号４、５および６の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４、５および６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖とを含んでなる。
【００７７】
本発明のさらに別の実施態様によれば、前記の第一の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号５９、６０および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号５９、６０および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖と、それぞれ配列番号６１、６２および６３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６１、６２および６３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖とを含んでなる。
【００７８】
さらに別の実施態様によれば、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる、または最適なアライメントの後に配列番号７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列を有する軽鎖を含んでなり、かつ／またはそれは配列番号８のアミノ酸配列を含んでなるか、または最適なアライメントの後に配列番号８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列を有する重鎖を含んでなる。
【００７９】
より明解には、記載のタンパク質配列は次の通りである。
配列番号７：
ＤＩＶＬＳＱＳＰＡＳＬＡＬＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＡＳＶＥＹＹＧＴＳＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＥＡＳＮＶＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＮＩＨＰＶＥＥＤＤＬＡＩＹＦＣＱＱＳＲＫＡＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号８：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＧＧＴＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＴＰＲＩＧＴＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
【００８０】
本発明の別の実施態様によれば、前記の第二の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号１７、１８および１９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号１７、１８および１９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖と、それぞれ配列番号２０、２１および２２の配列、または最適なアライメントの後に配列番号２０、２１および２２の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖とを含んでなる。
【００８１】
本発明のさらなる実施態様によれば、前記の第二の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号６９、７０および１９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６９、７０および１９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖と、それぞれ配列番号７１、７２および７３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号７１、７２および７３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖とを含んでなる。
【００８２】
さらに別の実施態様によれば、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなるか、または最適なアライメントの後に配列番号２３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列を有する軽鎖、および／または配列番号２４のアミノ酸配列を含んでなるか、または最適なアライメントの後に配列番号２４の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列を有する重鎖を含んでなる。
【００８３】
より明解には、記載のタンパク質配列は次の通りである。
配列番号２３：
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＥＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＭＱＳＥＤＬＡＤＹＦＣＱＱＹＳＳＮＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
配列番号２４：
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＴＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＲＮＱＶＦＬＫＩＴＳＶＤＴＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲＲＤＨＹＧＤＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
【００８４】
本発明の別の実施態様によれば、前記の第三の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号３３、２および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号３３、２および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖と、それぞれ配列番号４、３４および３５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４、３４および３５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖とを含んでなる。
【００８５】
本発明のさらに別の実施態様によれば、前記の第三の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号７９、６０および３の配列、または最適なアライメントの後に配列番号７９、６０および３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖と、それぞれ配列番号６１、８０および８１の配列、または最適なアライメントの後に配列番号６１、８０および８１の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖とを含んでなる。
【００８６】
さらに別の実施態様によれば、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号３６のアミノ酸配列を含んでなるか、または最適なアライメントの後に配列番号３６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列を有する軽鎖を含んでなり、かつ／または配列番号３７のアミノ酸配列を含んでなるか、または最適なアライメントの後に配列番号３７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列を有する重鎖を含んでなる。
【００８７】
より明解には、記載のタンパク質配列は次の通りである。
配列番号３６：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＬＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＡＳＶＤＹＹＧＴＳＬＭＱＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＥＡＳＮＶＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＮＩＨＰＶＥＥＤＤＬＡＩＹＦＣＱＱＳＲＫＡＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３７：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＤＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＴＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＧＶＴＴＹＹＰＤＴＩＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＳＰＲＴＧＴＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
【００８８】
本発明の別の実施態様によれば、前記の第四の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ＩＭＧＴによって定義されるように、それぞれ配列番号４３、４４および４５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４３、４４および４５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖と、それぞれ配列番号４６、４７および４８の配列、または最適なアライメントの後に配列番号４６、４７および４８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖とを含んでなる。
【００８９】
本発明のさらに別の実施態様によれば、前記の第四の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、Ｋａｂａｔによって定義されるように、それぞれ配列番号８５、８６および４５の配列、または最適なアライメントの後に配列番号８５、８６および４５の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の、３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖と、それぞれ配列番号８７、８８および８９の配列、または最適なアライメントの後に配列番号８７、８８および８９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖とを含んでなる。
【００９０】
さらに別の実施態様によれば、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、配列番号４９のアミノ酸配列を含んでなるか、または最適なアライメントの後に配列番号４９の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列を有する軽鎖を含んでなり、かつ／または配列番号５０のアミノ酸配列を含んでなるか、または最適なアライメントの後に配列番号５０の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列を有する重鎖を含んでなる。
【００９１】
より明解には、記載のタンパク質配列は次の通りである。
配列番号４９：
ＮＩＶＭＴＱＳＰＫＳＭＳＭＳＶＧＥＲＶＴＬＳＣＫＡＳＥＮＶＧＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＥＱＳＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＡＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＤＹＨＣＧＱＴＹＳＦＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５０：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＳＶＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＳＳＭＨＷＡＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＨＰＮＳＧＮＴＮＮＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＶＤＬＳＳＬＳＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＡＲＳＦＹＹＡＭＤＣＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
【００９２】
以上に示されるように、本発明は同様に、本発明による抗体から誘導されたいずれの化合物も対象とする。
【００９３】
より詳しくは、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、その誘導化合物が、最初の抗体の特性を総て、または部分的に保存するように少なくとも１つのＣＤＲがグラフトされたペプチドスキャフォールドを含んでなる結合タンパク質からなることを特徴とする。
【００９４】
本発明に記載されているＣＤＲの配列のうち１以上の配列もまた、免疫グロブリンの種々のタンパク質スキャフォールド、すなわちフレームワークに提供することができる。この場合、タンパク質配列はグラフトされた１つのＣＤＲまたは複数のＣＤＲの折りたたみに好適なペプチド骨格を再創出することを可能とし、それ／それらはそれらの抗原認識のパラトピック特性の保存を可能とする。
【００９５】
一般的な様式では、当業者ならば、元の抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲをグラフトするためのタンパク質スキャフォールドのタイプをどのように決定すればよいかが分かるであろう。より詳しくは、選択のために、このようなスキャフォールドは以下に挙げられる最大数の判定基準を満たさなければならないことが知られている(Skerra A., J. Mol. Recogn. 13, 2000, 167-187)。
・系統発生的保存が良いこと
・三次元構造が既知であること（例えば、結晶学、ＮＭＲ分光法または当業者に公知の他のいずれかの技術になどから）
・サイズが小さいこと
・転写後修飾が少ない、または無いこと、および／または
・産生、発現および精製が容易なこと
【００９６】
このようなタンパク質スキャフォールドの起源は、限定されるものではないが、フィブロネクチンおよび好ましくは３型フィブロネクチンの１０番目のドメイン、リポカリン、アンチカリン(Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4) :257-75)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のＡタンパク質のＢドメインに由来するＺタンパク質、チオレドキシンＡおよびまた、「アンキリンリピート」(Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705)、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」または「テトラトリコペプチドリピート」型の反復モチーフを有するタンパク質から選択される構造であり得る。
【００９７】
また、例えば、以下の、例えば、サソリ、昆虫、植物、軟体動物などに由来する毒素、またはニューロンＮＯシンターゼ（ＰＩＮ）のタンパク質阻害剤といった毒素に由来するスキャフォールドも挙げられる。
【００９８】
何ら限定されるものではないが、このようなハイブリッド構造の例としては、ＰＩＮのループの１つへの抗ＣＤ４抗体、すなわち１３Ｂ８．２のＣＤＲ−Ｈ１（重鎖）の挿入が挙げられ、それにより得られる新規な結合タンパク質は元の抗体と同様の結合特性を保持する(Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344)。また、何ら限定されるものではないが、ネオカルジノスタチンのループの１つへの抗リゾチームＶＨＨ抗体のＣＤＲ−Ｈ３（重鎖）のグラフトも挙げられる(Nicaise et al., 2004)。
【００９９】
最後に、以上に記載されるように、このようなペプチドスキャフォールドは元の抗体に由来する１〜６個のＣＤＲを含んでなり得る。必ずしも必要ではないが、好ましくは、当業者は、重鎖に由来する少なくとも１つのＣＤＲを選択し、これは抗体の特異性を主に担うことが知られている。適切なＣＤＲの選択は当業者には自明であり、その目的のために既知の技術を用いる(Bes et al., FEBS letters 508, 2001 67-74)。
【０１００】
明らかに、これらの例は何ら限定ではなく、当業者に既知または自明の他の構造も、本特許出願により与えられる保護の範囲内に含まれると考えられなければならない。
【０１０１】
よって、本発明は、そのペプチドスキャフォールドが、ａ）系統発生的に十分保存されており、ｂ）ロバストな構造のものであり、ｃ）周知の三次元分子構成を有し、ｄ）サイズが小さく、かつ／またはｅ）その安定性を変化させることなく、欠失および／または挿入によって改変可能な領域を含んでなるタンパク質から選択されることを特徴とする、抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
【０１０２】
好ましい実施態様によれば、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、そのペプチドスキャフォールドが、ｉ）フィブロネクチン、好ましくは３型フィブロネクチンの１０番目のドメイン、リポカリン、アンチカリン、黄色ブドウ球菌のＡタンパク質のＢドメインに由来するＺタンパク質、チオレドキシンＡに由来するスキャフォールド、ｉｉ）「アンキリンリピート」、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」または「テトラトリコペプチドリピート」型の反復モチーフを有するタンパク質、およびまた、ｉｉｉ）ニューロンＮＯシンターゼ（ＰＩＮ）のタンパク質阻害剤から選択されることを特徴とする。
【０１０３】
本発明の別の態様によれば、以上に記載される抗体の機能的フラグメントも同様である。
【０１０４】
より詳しくは、本発明は、抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを対象とし、該機能的フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントおよびダイアボディー、ならびにペグ化フラグメントなどの半減期が延長されている任意のフラグメントから選択されることを特徴とする。
【０１０５】
本発明による抗体のこのような機能的フラグメントは、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは単鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’もしくはｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントまたはダイアボディー、または例えばポリ（エチレン）グリコール（「ペグ化」）（ＰＥＧ化フラグメントはＦｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）（ポリ（エチレン）グリコールという表記から「ＰＥＧ」）などのポリ（アルキレン）グリコールの付加などの化学的修飾によるか、またはリポソーム、ミクロスフェアもしくはＰＬＧＡへの組み込みにより、半減期が延長されている任意のフラグメントからなり、該フラグメントは本発明による特徴的なＣＤＲの少なくとも１つを有し、特に、一般に、それが由来する抗体の活性を、部分的であっても示し得る。
【０１０６】
好ましくは、該機能的フラグメントは、それらが由来する抗体の可変の重鎖または軽鎖の部分的配列からなるか、またはそれらを含んでなり、該部分的配列はそれが由来する抗体と同じ結合特異性および十分な親和性、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましくは少なくとも１／１０に相当する親和性を保持するのに十分なものである。
【０１０７】
このような機能的フラグメントは、それが由来する抗体の配列からの、少なくとも５つの連続するアミノ酸、好ましくは１０、１５、２５、５０または１００個の連続するアミノ酸を含んでなる。
【０１０８】
好ましくは、これらの機能的フラグメントは、一般にはそれらが得られた抗体と同じ結合特異性を有するＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ型のフラグメント、またはダイアボディーである。本発明によれば、本発明の抗体のフラグメントは、以上に記載されているような抗体から出発し、ペプシンもしくはパパインなどの酵素を用いた消化、および／または化学的還元の手段によるジスルフィド橋の切断などの方法によって得ることができる。本発明に含まれる抗体フラグメントはまた、当業者に同様に周知である遺伝子組換え技術によるか、または例えば、Applied Biosystems社などにより提供されているものなどの自動ペプチド合成装置の手段によるペプチド合成によって得ることもできる。
【０１０９】
別の特定の態様によれば、本発明は、本発明によるキメラ抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関し、該抗体はまた、マウスとは異種の、特にヒト由来の抗体に由来する定常軽鎖および重鎖領域を含んでなる。
【０１１０】
本発明のさらに別の態様によれば、ヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントは、ヒト抗体に由来する定常軽鎖および重鎖領域がそれぞれλまたはκ領域およびγ−１、γ−２またはγ−４領域であることを特徴とする。
【０１１１】
別の態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌し得る第一のネズミハイブリドーマ、特に、２００８年２月２２日に番号Ｉ−３９２０としてthe Centre National de Cultures de Microorganismes (CNCM)（パスツール研究所、パリ、フランス）に寄託されたネズミ起源のハイブリドーマに関する。該ハイブリドーマは、免疫Ｂａｌｂ／ｃマウス脾細胞とＳｐ  ２Ｏ  Ａｇ  １４骨髄腫細胞系統の融合により得られたものである。２００８年２月２２日に番号Ｉ−３９２０としてＣＮＣＭに寄託されたこのハイブリドーマは、本明細書において２０３Ｂ６と呼ばれるモノクローナル抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを分泌する。
【０１１２】
別の態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌し得る第二のネズミハイブリドーマ、特に、２００８年２月２２日に番号Ｉ−３９２１としてthe Centre National de Cultures de Microorganismes (CNCM)（パスツール研究所、パリ、フランス）に寄託されたネズミ起源のハイブリドーマに関する。該ハイブリドーマは、免疫Ｂａｌｂ／ｃマウス脾細胞とＳｐ  ２Ｏ  Ａｇ  １４骨髄腫細胞系統の融合により得られたものである。２００８年２月２２日に番号Ｉ−３９２１としてＣＮＣＭに寄託されたこのハイブリドーマは、本明細書において２０５Ｈ８と呼ばれるモノクローナル抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを分泌する。
【０１１３】
別の態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌し得る第三のネズミハイブリドーマ、特に、２００８年２月２１日に番号Ｉ−３９１８としてthe Centre National de Cultures de Microorganismes (CNCM)（パスツール研究所、パリ、フランス）に寄託されたネズミ起源のハイブリドーマに関する。該ハイブリドーマは、免疫Ｂａｌｂ／ｃマウス脾細胞とＳｐ  ２Ｏ  Ａｇ  １４骨髄腫細胞系統との融合により得られたものである。２００８年２月２１日に番号Ｉ−３９１８としてＣＮＣＭに寄託されたこのハイブリドーマは、本明細書において２１１Ｆ３と呼ばれるモノクローナル抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを分泌する。
【０１１４】
最後に、別の態様によれば、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を分泌し得る第四のネズミハイブリドーマ、特に、２００８年２月２１日に番号Ｉ−３９１９としてthe Centre National de Cultures de Microorganismes (CNCM)（パスツール研究所、パリ、フランス）に寄託されたネズミ起源のハイブリドーマに関する。該ハイブリドーマは、免疫Ｂａｌｂ／ｃマウス脾細胞とＳｐ  ２Ｏ  Ａｇ  １４骨髄腫細胞系統の融合により得られたものである。２００８年２月２１日に番号Ｉ−３９１９としてＣＮＣＭに寄託されたこのハイブリドーマは、本明細書において２１４Ｂ２と呼ばれるモノクローナル抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを分泌する。
【０１１５】
より明解には、本明細書の下記の表２に、本発明の種々の抗体に対応する種々のアミノ酸配列をまとめる。なお、太字のＣＤＲ配列はＩＭＧＴに従って定義され、斜体のものはＫａｂａｔに従って定義されている。
【０１１６】
【表２】
2011517565.tif 000003
【０１１７】
本発明による抗体はまた、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む。
【０１１８】
キメラ抗体は、ある種の抗体に由来する天然可変（軽鎖および重鎖）領域をその種とは異なる種の抗体の定常軽鎖および重鎖領域とともに含む抗体を表すものと理解される。
【０１１９】
本発明によるキメラ型の抗体、またはそれらのフラグメントは、遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明による非ヒト、特にネズミモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体の定常領域をコードする配列とを含んでなる組換えＤＮＡをクローニングすることによって作製することができる。このような組換え遺伝子によりコードされている本発明のキメラ抗体は、例えばマウス−ヒトキメラであり、その抗体の特異性はネズミＤＮＡに由来する可変領域により決定され、そのイソ型はヒトＤＮＡに由来する定常領域により決定される。キメラ抗体の製造方法に関しては、例えばVerhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988)の文献を参照することができる。
【０１２０】
ヒト化抗体は、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、その抗体分子の他の部分は１つ（または複数の）ヒト抗体または生殖細胞系に由来している抗体を表すものと理解される。さらに、その骨格（ＦＲと呼ばれる）の残りのセグメントのいくつかは、結合親和性を保存するために改変することができる(Jones et al, Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988)。
【０１２１】
本発明によるヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に既知の技術（例えば、Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992;またはBebbington et al, Bio/Technology, 10:169-175, 1992の文献に記載されているものなど）によって作製することができる。このような本発明によるヒト化抗体は、in vitro診断法またはin vivo予防的および／または治療的処置におけるそれらの使用に好ましい。また、例えば、特許ＥＰ０４５１２６１、ＥＰ０６８２０４０、ＥＰ０９３９１２７、ＥＰ０５６６６４７あるいはまた米国特許第５，５３０，１０１号、同第６，１８０，３７０号、同第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号の主題である、ＰＤＬにより記載されている「ＣＤＲグラフティング」の技術など、他のヒト技術も当業者に知られている。また、米国特許第５，６３９，６４１号、あるいはまた米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号が挙げられる。
【０１２２】
さらに、本発明はまた、以上に記載されているネズミおよびキメラ抗体に由来するヒト化抗体も対象とする。
【０１２３】
好ましくは、ヒト抗体に由来する定常軽鎖および重鎖領域は、それぞれλまたはκ領域およびγ−１、γ−２またはγ−４領域である。
【０１２４】
ＩｇＧ１イソ型に相当する実施態様では、抗体のさらなる特徴は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）および／またはＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）などのエフェクター機能を有するということである。
【０１２５】
さらに、本明細書の下記の実施例から明らかなように、本発明が関する抗体は、腫瘍細胞の増殖を阻害し得るという点でこれまでに知られている抗体と異なる。
【０１２６】
以上に述べたように、ＣＤ１５１タンパク質はテトラスパニンファミリーに属し、そのために細胞外ループとも呼ばれる２つの細胞外ドメインＥＣ１（アミノ酸１８個、配列［４０〜５７］）およびＥＣ２（アミノ酸１０９個、配列［１１３〜２２１］）を含む。
【０１２７】
本発明によれば、使用される抗体はその細胞外ドメインに存在する少なくとも１つのエピトープと結合し得る。好ましくは、該抗体はそれ自体、ループＥＣ１および／またはＥＣ２と結合する。
【０１２８】
より詳しくは、本発明の好ましい実施態様によれば、少なくとも１つの抗ＣＤ１５１抗体、またはＣＤ１５１タンパク質のそれぞれアミノ酸４０〜５７および１１３−２２１に相当する細胞外ループ１（ＥＣ１）および／または２（ＥＣ２）、好ましくはＥＣ２に含まれるエピトープと結合し得るその機能的フラグメントの使用が記載される。
【０１２９】
ＥＣ１ループ［４０〜５７］は１８個のアミノ酸を含み、理論分子量は２００２．２Ｄａである。
【０１３０】
ＥＣ２ループ［１１３〜２２１］はＮ−グリコシル化部位（残基Ａｓｎ１５９）と６個のシステイン残基を含み、３つのジスルフィド橋を形成している。テトラスパニン、特にＣＤ１５１のＥＣ２ループの構造モデルは、テトラスパニンＣＤ８１のＥＣ２ループの三次元構造に基づいて提案されている(Seigneuret et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 40055-40064)。このモデルによれば、テトラスパニンは、３つのαヘリックスと特異的可変ドメインからなる共通の、比較的保存されたスキャフォールドを有する。ＣＤ１５１については、このスキャフォールドは領域［１１３〜１５７］および［２０９〜２２１］からなると思われ、可変ドメインは領域［１５８〜２０８］からなると思われる。
【０１３１】
ＥＣ２ループの可変ドメインは、より詳しくは、ＣＤ１５１とインテグリンファミリーのタンパク質との特異的相互作用に関与するものと思われる。指定突然変異誘発実験は、ＣＤ１５１とインテグリンα３β１またはα６β４などのある種のラミニン受容体インテグリンの組合せにおいて、特に、領域［１９３〜２０８］、より正確にはトリペプチドＱＲＤ［１９４〜１９６］と１９２番のシステイン残基の重要性を示している(Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309)。
【０１３２】
いっそうより好ましくは、本発明は、ＥＣ２領域のエピトープと結合し得る少なくとも１つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的フラグメントの使用を対象とする。
【０１３３】
新たな態様において、本発明は、
以下の核酸：
ａ）以上に定義される抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ核酸；
ｂ）ａ）として以上に定義される核酸と相補的な核酸；
ｃ）高ストリンジェンシー条件下で、配列番号９〜１６、２５〜３２、３８〜４２、５１〜５８、６４〜６８、７４〜７８、８２〜８４、９０〜９４、９８〜１００または１０４〜１０６の核酸配列の少なくとも１つ、または最適なアライメントの後にこれらの配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を有する配列とハイブリダイズし得る少なくとも１８個のヌクレオチドの核酸
から選択されることを特徴とする、単離された核酸に関する。
【０１３４】
下表３に、本発明による抗体に関する種々のヌクレオチド配列をまとめる。太字のＣＤＲ配列はＩＭＧＴに従って定義され、斜体のものはＫａｂａｔに従って定義されている。
【０１３５】
【表３】
2011517565.tif 000004
【０１３６】
核酸、核配列または核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列は本明細書において互換的に用いられ、修飾されている、または修飾されていないヌクレオチドの正確な連なりを表し、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび該ＤＮＡの転写産物に等しく相当し得る核酸のフラグメントまたは領域（非天然ヌクレオチドを含む、または含まない）を定義することができるものと理解される。
【０１３７】
また、本明細書においては、本発明はそれらの天然の染色体環境にある、すなわち、天然の状態のヌクレオチド配列に関するのではないと理解すべきである。それらは単離され、かつ／または精製された配列であり、すなわち、それらは、少なくとも部分的に改変されたそれらの環境を例えばコピーすることにより直接または間接的に抽出されたものである。それらはまた、本明細書においては、例えば宿主細胞を用いた遺伝子組換えにより得られたか、または化学合成によって得られた単離された核酸を表すものと理解される。
【０１３８】
最適なアライメントの後に好ましい配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性パーセンテージを有する核酸配列は、参照核酸配列に対して、特に欠失、末端切断、延長、キメラ融合および／または置換、特に点置換などのある種の改変を有する核酸配列を表すものと理解される。それらは好ましくは、その配列が参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列（これは遺伝コードの縮重による）、または特に以下に記載されるように、好ましくは高ストリンジェンシー条件下で参照配列と特異的にハイブリダイズし得る相補的配列である。
【０１３９】
高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度に関する条件が、２つの相補的ＤＮＡフラグメント間でハイブリダイゼーションの維持を可能とするように選択されることを意味する。例を挙げれば、以上に記載されているポリヌクレオチドフラグメントを定義するためのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェンシー条件は有利には次の通りである。
【０１４０】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムの溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート液、５％デキストラン硫酸および１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブの大きさに応じた温度（すなわち、プローブの大きさ＞１００ヌクレオチドでは４２℃）で適切には２０時間のハイブリダイゼーションの後、２０℃、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、２０分の洗浄２回、２０℃、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、２０分の洗浄１回。最後の洗浄は、プローブの大きさ＞１００ヌクレオチドでは、６０℃、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で３０分間行う。大きさが定義されたポリヌクレオチドに関して以上に記載した高ストリンジェンシー条件は、当業者ならば、Sambrook et al, (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)の教示に従い、それより大きい、または小さいオリゴヌクレオチドに対して適合可能である。
【０１４１】
本発明はまた、本発明による核酸を含んでなるベクターに関する。
【０１４２】
本発明は、特に、本発明によるヌクレオチド配列を含むクローニングベクターおよび／または発現ベクターを対象とする。
【０１４３】
本発明によるベクターは、好ましくは特定の宿主細胞においてそのヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とするエレメントを含んでなる。従って、このベクターは、プロモーター、翻訳開始および終結シグナルおよび適当な転写調節領域を含んでならなければならない。それは宿主細胞で安定に維持可能でなければならず、所望により翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特定のシグナルを有してもよい。これらの種々のエレメントは、用いる細胞宿主に関して当業者により選択および最適化される。これを達成するため、本発明によるヌクレオチド配列は、選択された宿主内で自己複製するベクターに挿入することもできるし、あるいは選択された宿主の組み込みベクターとすることもできる。
【０１４４】
このようなベクターは当業者により慣例的に用いられる方法によって作製され、得られたクローンをリポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショックまたは化学的方法などの標準的な方法により好適な宿主に導入することができる。
【０１４５】
本発明によるベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらは本発明によるヌクレオチド配列をクローニングする、または発現させるために宿主細胞を形質転換する際に有用である。
【０１４６】
本発明はまた、本発明によるベクターにより形質転換された、または本発明によるベクターを含む宿主細胞も含む。
【０１４７】
細胞宿主は、原核生物系または真核生物系から選択することができ、例えば細菌細胞などであるが、酵母細胞または動物細胞、特に哺乳類細胞であってもよい。昆虫細胞または植物細胞も使用可能である。
【０１４８】
本発明はまた、本発明による形質転換細胞を含んでなる、ヒトを除く動物に関する。
【０１４９】
別の態様によれば、本発明は、以下の工程：
ａ）本発明による宿主細胞を、好適な培養培地中、好適な培養条件下で培養する工程；および
ｂ）それにより産生された前記抗体またはその機能的フラグメントを、培養培地から、または前記培養細胞から回収する工程
を含んでなる、本発明による抗体またはその機能的フラグメントの製造方法に関する。
【０１５０】
本発明による形質転換細胞は本発明による組換えポリペプチドの製造方法に使用可能である。本発明によるベクターおよび／またはベクターにより形質転換された細胞を用いることを特徴とする本発明によるポリペプチドの組換え型での製造方法は、それら自体、本発明に含まれる。好ましくは、本発明によるベクターにより形質転換された細胞を前記ポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養し、該組換えペプチドを回収する。
【０１５１】
上述のように、細胞宿主は原核生物系または真核生物系から選択される。特に、このような原核生物系または真核生物系において分泌を助ける本発明によるヌクレオチド配列を同定することが可能である。従って、このような配列を運ぶ本発明によるベクターは分泌を意図する組換えタンパク質の生産において有利に使用することができる。実際、着目するこれらの組換えタンパク質の精製は、宿主細胞の内部ではなく細胞培養の上清に存在するということにより容易になる。
【０１５２】
また、化学合成により本発明によるポリペプチドを作製することもできる。このような製造方法もまた、本発明の主題に含まれる。当業者ならば、例えば、固相を用いる技術（特に、Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd Ed., (1984)参照）、または部分的固相を用いる、もしくはフラグメントの縮合の手段による、もしくは従来の液相合成による技術などの化学合成法を知っている。対応する非天然アミノ酸を含み得る化学合成により得られるポリペプチドもまた本発明に含まれる。
【０１５３】
本発明による方法により得ることができる抗体、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントもまた、本発明に含まれる。
【０１５４】
さらに別の態様によれば、本発明は、さらに二重特異性である、すなわち、ＣＤ１５１以外のヒトタンパク質またはヒト受容体と特異的に結合し得ることを特徴とする、以上に記載の抗体に関する。
【０１５５】
二重特異性または二機能性の抗体は、２つの異なる領域が同じ分子内に組み合わされている第二世代のモノクローナル抗体を構成する(Hollinger and Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18:411-419)。それらの有用性は、新たなエフェクター機能を動員する、または腫瘍細胞の表面上の複数の分子を標的とするそれらの能力により、診断分野と治療分野の双方で実証されている。これらの抗体は、化学法(Glennie MJ et al. 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al. 1995 J. Hemat. 377-382)または体細胞法(Staerz U.D. and Bevan M.J. 1986 PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et al. 1986 Method Enzymol. 121: 210-228)により得ることができるが、好ましくは、ヘテロ二量体形成を余儀なくし、それにより求める抗体を精製する方法を助けることができる遺伝子工学技術による(Merchand et al. 1998 Nature Biotech. 16: 677-681)。
【０１５６】
これらの二重特異性抗体は、ＩｇＧ全体として、二重特異性Ｆａｂ’２として、Ｆａｂ’ＰＥＧとして、またはダイアボディーとして、または二重特異性ｓｃＦｖとして、あるいはまた標的とされる核抗原に２つの結合部位が存在する四価二重特異性抗体(Park et al. 2000 Mol. Immunol. 37(18): 1123-30)として、または以上に記載のそのフラグメントとして構築することができる。
【０１５７】
このような二重特異性抗体の使用は、二重特異性抗体の作製および投与が２つの特異的抗体の作製よりも煩雑でないという事実による経済的利点の他、処置の毒性を軽減するという利点を有する。二重特異性抗体の使用は、実際に、循環している抗体の総量を引き下げ、結果として、毒性の可能性を軽減することを可能とする。
【０１５８】
本発明の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は二価または四価の抗体である。
【０１５９】
最後に、本発明は、薬剤としての、以上に記載の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントを対象とする。
【０１６０】
本発明はまた、有効成分として、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントからなる化合物を含んでなる医薬組成物に関する。好ましくは、該抗体に賦形剤および／または薬学上許容される担体が添加される。
【０１６１】
さらに別の実施態様によれば、本発明はまた、同時使用、個別使用または時間差使用のための組合せ製品として、少なくとも１つの他の抗体、細胞傷害性／細胞増殖抑制剤、細胞毒または放射性元素をさらに含んでなる、以上に記載されている医薬組成物に関する。
【０１６２】
「同時使用」とは、１つの同じ剤形に含まれた本発明による組成物の２つの化合物の投与として理解される。
【０１６３】
「個別使用」とは、それぞれ別々の剤形に含まれる、本発明による組成物の２つの化合物の同時投与として理解される。
【０１６４】
「時間差使用」とは、それぞれ別々の剤形に含まれる、本発明による組成物の２つの化合物の連続的投与として理解される。
【０１６５】
通常、本発明による組成物は癌治療の有効性を著しく高める。言い換えれば、本発明による抗体の治療効果は、細胞傷害剤の投与によって予期しないほど増強される。本発明による組成物によって生じる、次に大きな利点は、より少ない有効量の有効成分を用いることが可能となることに関するものであり、このことによって、特に細胞傷害剤の影響が現れる副作用のリスクを回避または軽減することが可能となる。さらに、本発明によるこの組成物によって、より早く期待される治療効果に達することが可能となる。
【０１６６】
「抗癌治療剤」または「細胞傷害剤」とは、患者に投与された際に、患者における癌の発達を治療または予防する物質として理解すべきである。このような薬剤の非限定的な例としては、「アルキル化」剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗脈管形成剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲンまたは免疫調節剤が挙げられる。
【０１６７】
このような薬剤は、例えば、ＶＩＤＡＬにおいて、「細胞傷害剤」の欄で癌腫学および血液学に関するページに記載されており、この文献に参照として記載されている細胞傷害化合物は、本発明において好ましい細胞傷害剤として挙げられる。
【０１６８】
「アルキル化剤」とは、細胞内の任意の分子、好ましくは核酸（例えば、ＤＮＡ）と共有結合するか、または該分子をアルキル化することができる任意の物質を意味する。このようなアルキル化剤の例としては、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、塩酸塩、ピポブロマン、プレドニムスチン、リン酸ナトリウムもしくはエストラムスチンなどのナイトロジェンマスタード；シクロホスファミド、アルトレタミン、トロホスファミド、スルホホスファミドもしくはイホスファミドなどのオキサザホスホリン；チオテパ、トリエチレンアミンもしくはアルテトラミンなどのアジリジンもしくはエチレンイミン；カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチンもしくはロムスチンなどのニトロソウレア；ブスルファン、トレオスルファンもしくはインプロスルファンなどのスルホン酸アルキル；ダカルバジンなどのトリアゼン；またはさらに、シスプラチン、オキサリプラチンもしくはカルボプラチンなどのプラチン複合体が挙げられる。
【０１６９】
「代謝拮抗剤」とは、ある種の活性、一般にはＤＮＡ合成に干渉することにより、細胞増殖および／または細胞代謝を遮断する物質を意味する。代謝拮抗剤の例としては、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシンおよびペントスタチンが挙げられる。
【０１７０】
「抗腫瘍抗生物質」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の合成を回避または阻害し得る化合物を意味する。このような抗腫瘍抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、ミトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびプロカルバジンが挙げられる。
【０１７１】
「分裂阻害剤」は、細胞周期および有糸分裂の通常の進行を妨げるものである。通常、微小管阻害剤またはパクリタキセルおよびドセタキセルなどの「タキソイド」は有糸分裂を阻害することができる。また、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンなどのビンカアルカロイドも、有糸分裂を阻害することができる。
【０１７２】
「クロマチン機能阻害剤」または「トポイソメラーゼ阻害剤」とは、トポ−イソメラーゼＩおよびＩＩなどのクロマチンモデリングタンパク質の正常な機能を阻害する物質を意味する。このような阻害剤の例としては、トポイソメラーゼＩでは、カンプトテシン、およびイリノテカンまたはトポテカンなどのその誘導体が、トポイソメラーゼＩＩでは、エトポシド、リン酸エトポシドおよびテニポシドが挙げられる。
【０１７３】
「抗脈管形成剤」とは、血管の成長を阻害する任意の薬物、化合物、物質または薬剤を意味する。抗脈管形成剤の例としては、限定されるものではないが、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフジノン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、ＣＤＣ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチンおよびビタキシンが挙げられる。
【０１７４】
「抗エストロゲン」または「抗エストロゲン剤」とは、エストロゲンの作用を低下させるか、拮抗作用を及ぼすか、または阻害する任意の物質を意味する。このような薬剤の例は、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾールおよびエキセメスタンである。
【０１７５】
「抗アンドロゲン」または「抗アンドロゲン剤」とは、アンドロゲンの作用を低下させるか、拮抗作用を及ぼすか、または阻害する任意の物質を意味する。抗アンドロゲンの例は、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スピロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリドおよびシメチジンである。
【０１７６】
免疫調節剤は免疫系を刺激する物質である。このような免疫調節剤の例としては、インターフェロン、インターロイキン（アルデスロイキン、ＯＣＴ−４３、デニロイキンジフチトクスもしくはインターロイキン−２など）、腫瘍壊死因子（タソネルミンなど）、またはレンチナン、シゾフィラン、ロキニメクス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン、ポリＩ：Ｃ、もしくはレバミソールと組み合わせた５−フルオロウラシルなどのその他のタイプの免疫調節剤が挙げられる。
【０１７７】
より詳細については、当業者は、"Traite de chimie therapeutique, Vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, ed. TEC & DOC, 2003"と題された、French Association of Teachers of Therapeutic Chemistryによって刊行されているマニュアルを参照することができる。
【０１７８】
特に好ましい実施態様において、本発明による組合せ製品の形態の前記組成物は、該細胞傷害剤が同時使用のために該抗体に化学的に結合されることを特徴とする。
【０１７９】
特に好ましい実施態様において、本発明による前記組成物は、前記細胞傷害／細胞増殖抑制剤が、紡錘体阻害剤または安定剤、好ましくはビノレルビンおよび／またはビンフルニンおよび／またはビンクリスチンから選択されることを特徴とする。
【０１８０】
前記細胞傷害剤と本発明による前記抗体の結合を促進するために、特に、結合させる２つの化合物の間に、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリ（アルキレン）グリコールまたはアミノ酸のようなスペーサー分子を導入することができるか、または別の実施態様では、本発明による前記抗体と反応し得る機能が導入されている前記細胞傷害剤の活性誘導体を用いることができる。これらの結合技術は当業者によく知られており、本明細書では詳述しない。
【０１８１】
別の態様によれば、本発明は、少なくとも前記抗体の１つ、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントが細胞毒および／または放射性元素とコンジュゲートされていることを特徴とする組成物に関する。
【０１８２】
好ましくは、前記毒素または前記放射性元素は腫瘍細胞の成長または増殖を妨げることができ、特に、前記腫瘍細胞を完全に不活性化することができる。
【０１８３】
また、好ましくは、前記毒素は腸内細菌毒素、特に、シュードモナス外毒素Ａである。
【０１８４】
治療に用いられる、抗体と好適にコンジュゲートされる放射性元素（または放射性同位元素）は、ガンマ線を放射する放射性同位元素であり、好ましくは、ヨウ素１３１、イットリウム９０、金１９９、パラジウム１００、銅６７、ビスマス２１７およびアンチモン２１１である。β線およびα線を放射する放射性同位元素も治療に用いることができる。
【０１８５】
本発明による少なくとも１つの抗体またはその機能的フラグメントとコンジュゲートされる毒素または放射性元素とは、前記毒素または前記放射性元素を少なくとも１つの前記抗体に結合させることを可能にする任意の手段、特に、結合分子の導入を伴ってまたは伴わずに２つの化合物間の共有結合による手段を意味する。
【０１８６】
全部または一部のコンジュゲートの元素の化学的（共有）結合、静電結合または非共有結合を可能とする薬剤としては、特に、ベンゾキノン、カルボジイミド、より詳しくは、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミド塩酸塩）、ジマレイミド、ジチオビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、１以上のフェニルアジド基とともに、紫外線（ＵＶ）と反応する１以上の基を有する「架橋」剤と呼ばれる薬剤、極めて好ましくは、Ｎ−［４−（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）および６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）が挙げられる。
【０１８７】
別の結合形態、特に放射性元素についての結合形態は、二官能性イオンキレート剤の使用からなり得る。
【０１８８】
これらのキレート剤としては、金属、特に放射性金属と免疫グロブリンを結合させるために開発されたＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）から誘導されるキレート剤が挙げられる。従って、ＤＴＰＡおよびその誘導体を炭素鎖上において様々な基で置換して、配位子−金属複合体の安定性と剛性を高めることができる(Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991);米国特許第４，８３１，１７５号)。
【０１８９】
例えば、医学および生物学で長年、幅広く、遊離形態また金属イオンとの複合体の形態で用いられているＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）およびその誘導体は、金属イオンと安定したキレートを形成し、癌治療における放射性免疫複合体の開発のための抗体のような、治療上または診断上着目されるタンパク質と結合されるという、注目すべき特徴を有している(Meases et al, (1984); Gansow et al. (1990))。
【０１９０】
また好ましくは、本発明による前記コンジュゲートを形成する少なくとも１つの前記抗体は、その機能的フラグメント、特に、ｓｃＦｖフラグメントなどのＦｃ成分を欠いたフラグメントから選択される。
【０１９１】
本発明はさらに、癌の予防または治療を意図した薬剤の製造における本発明による組成物の使用を含んでなる。
【０１９２】
本発明はまた、腫瘍細胞の増殖の阻害を意図した薬剤の製造における本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント、好ましくは、ヒト化されたもの、および／または組成物の使用に関する。一般に、本発明は、癌の予防または治療を意図した薬剤の製造における本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメント、好ましくは、ヒト化されたもの、および／または組成物の使用に関する。
【０１９３】
予防および／または治療され得る癌としては、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌、多発性骨髄腫もしくは卵巣癌、膵臓癌または他のいずれかの癌が好ましい。
【０１９４】
好ましくは、前記癌は前立腺癌、肺癌、結腸癌、乳癌および／または膵臓癌から選択される癌である。
【０１９５】
さらに別の態様によれば、本発明は、ＣＤ１５１の発現レベルに関連する疾患に関する診断法（好ましくは、in vitro）における本発明による抗体の使用に関する。より詳しくは、本発明は、ＣＤ１５１タンパク質の異常な存在が疑われる生体サンプルから出発して、ＣＤ１５１タンパク質の過剰発現または過少発現を有する疾患に関するin vitro診断法を対象とし、該方法は前記生体サンプルを本発明による抗体と接触させることからなり、適当であれば、該抗体は標識されていてもよい。
【０１９６】
好ましくは、前記診断法におけるＣＤ１５１タンパク質に関連する疾患は癌である。
【０１９７】
前記の抗体またはその機能的フラグメントは、検出可能かつ／または定量可能なシグナルを得るために、免疫複合体または標識抗体の形態であってもよい。
【０１９８】
本発明による標識抗体またはそれらの機能的フラグメントには、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼもしくはグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素と、またはビオチン、ジゴキシゲニンもしくは５−ブロモ−デオキシウリジンなどの分子とコンジュゲートさせることができる、免疫複合体と呼ばれる抗体が含まれる。また、蛍光標識も本発明による抗体、またはそれらの機能的フラグメントとコンジュゲートさせることができ、特に、フルオレセインおよびその誘導体、フルオロクロム、ローダミンおよびその誘導体、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ダンシル、ウンベリフェロンなどを含む。このようなコンジュゲートでは、本発明の抗体またはそれらの機能的フラグメントは、当業者に公知の方法により作製することができる。それらは、直接、またはポリアルデヒド、例えば、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）もしくはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）などのスペーサー基または架橋基を介して、または治療用コンジュゲートに関して以上に述べられたものなどの結合剤の存在下で、酵素または蛍光標識と結合させることができる。フルオレセイン型の標識を含んでなるコンジュゲートは、イソチオシアネートと反応させることにより製造することができる。
【０１９９】
他のコンジュゲートとしては、ルミノールおよびジオキセタンなどの化学発光標識、ルシフェラーゼおよびルシフェリン、などの生物発光標識、あるいはまたヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３３、臭素７７、テクネチウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、フッ素１８、イットリウム１９９、ヨウ素１３１などの放射性標識を含み得る。放射性同位元素を抗体に直接または以上に記載のＥＤＴＡまたはＤＴＰＡなどのキレート剤を介して結合させるために存在する当業者に公知の方法は、診断において放射性元素として使用可能である。従ってまた、クロラミンＴ技術[Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495]による［Ｉ１２５］Ｎａでの、あるいはまたCrockford et al. （米国特許第４，４２４，２００号）の技術によるテクネチウム９９ｍでの標識が挙げられ、あるいはHnatowich（米国特許第４，４７９，９３０号）により記載されているようにＤＴＰＡを介して結合してもよい。
【０２００】
本発明はまた、ＣＤ１５１タンパク質を発現または過剰発現する細胞に生物学的に活性な化合物を特異的にターゲティングすることを意図した薬剤の製造における本発明による抗体の使用に関する。
【０２０１】
生物学的に活性な化合物は、本明細書では、細胞の活性、特にそれらの成長、それらの増殖または遺伝子の転写もしくは翻訳を改変し得る、特に阻害し得る任意の化合物を表すものと理解される。
【０２０２】
本発明はまた、本発明による抗体またはその機能的フラグメント、好ましくは標識されたもの、特に放射性標識されたものを含んでなるin vivo診断試薬、および医療画像法、特に、細胞によるＣＤ１５１タンパク質の発現または過剰発現に関連する癌の検出におけるその使用に関する。
【０２０３】
本発明はまた、薬剤としての、本発明による、組合せ製品の形態の組成物または抗ＣＤ１５１／毒素もしくは放射性元素コンジュゲートに関する。
【０２０４】
好ましくは、組合せ製品の形態の該組成物または本発明によるコンジュゲートには、賦形剤および／または薬学上許容される担体が添加される。
【０２０５】
本明細書において、薬学上許容される担体は、医薬組成物に含まれる、二次反応を生じず、例えば、有効化合物の投与を助けること、身体におけるその寿命もしくは有効性を高めること、溶液中のその溶解度を高めること、またはその貯蔵性を向上させることを可能にする化合物または化合物の組合せを表すものと理解される。このような薬学上許容される担体は周知のものであり、当業者により、選択される有効化合物の性質および投与様式に関して適合される。
【０２０６】
好ましくは、これらの化合物は全身経路、特に静脈内経路によるか、筋肉内、皮内、腹腔内もしくは皮下経路によるか、または経口経路により投与される。より好ましくは、本発明による抗体を含んでなる組成物は、時間差をおいた複数回で投与される。
【０２０７】
それらの最適な投与様式、投与計画および生薬形態は、例えば患者の年齢もしくは体重、患者の健康状態の重篤度、治療の耐用性および確定されている副作用など、患者にとって好適な治療を確立する上で一般に考慮される基準に従って決定することができる。
【０２０８】
従って、本発明は、ＣＤ１５１を発現または過剰発現する細胞に生物学的に活性な化合物を特異的にターゲティングすることを意図した薬剤の製造における抗体、またはその機能的フラグメントの使用に関する。
【０２０９】
本発明の他の特徴および利点は、実施例および図面（凡例を下記に示す）を含む本明細書の残りの部分で明らかになる。
【実施例】
【０２１０】
実施例１：ＣＤ１５１分子の発現の研究
前立腺癌または肺癌に罹患している患者から得たヒト組織のサンプルにおいて、ＣＤ１５１タンパク質の発現を免疫組織化学（ＩＨＣ）によって研究した。これらの患者については、腫瘍に隣接する正常組織のスライドも利用可能であることから、腫瘍組織対正常組織の発現レベルを較正するためにこれらのスライドも含めた。
【０２１１】
これらの実験では、市販の「組織アレイ」型のスライドを用いる。脱蝋後、ペプシンを含有する酵素溶液（Labvision、品番ＡＰ−９００７−００５）を用いて抗原のアンマスキングを３０℃で行う。この段階の後、水中０．３％の過酸化水素(Sigma)の溶液中で切片をインキュベートすることにより内在するペルオキシダーゼを除去する工程を行う。次に、Ｕｌｔｒａ−Ｖ−Ｂｌｏｃｋ（Labvision、品番ＴＡ−１２５−ＵＢ）の溶液を用いて非特異的部位の飽和を行い、市販のネズミ抗ＣＤ１５１抗体（Serotech、品番ＭＣＡ１８５６）を終濃度５μｇ／ｍｌで用いて標識を行う。ネズミＩｇＧ１イソ型対照抗体（DakoCytomation、品番Ｘ０９３１）を陰性実験対照として用いる。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｄｕａｌ  Ｌｉｎｋ可視化システム（DakoCytomation、品番Ｋ４０６１）を用いて標識の可視化を行い、ペルオキシダーゼ基質であるＤＡＢの参照は、DakoCytomationのＳ３３０９である。
【０２１２】
図７に示した結果は、前立腺腫瘍を発症している何人かの患者がＣＤ１５１分子の過剰発現を示すことを示している。この過剰発現は試験した患者の２０％（患者ＡおよびＣ）で極めて著しいか、または軽度である（患者ＡおよびＤ）と言える。内皮細胞レベルを除き、対応する正常な前立腺組織はＣＤ１５１を発現しないかまたはほとんど発現せず、発現した場合にも、腺様構造に限定されているようであるということは注目すべきことである。患者ＥはＣＤ１５１を発現しない腫瘍の例を示す。
【０２１３】
肺癌の場合（図８）、軽度の発現（患者Ａ）から強い発現（患者Ｂ）が正常な肺組織のいくつかの細胞で観察された。しかし、腫瘍組織は強く標識された細胞の非常に高い密度を示している（患者ＡおよびＢ）。患者ＣはＣＤ１５１を発現しない腫瘍の例である。
【０２１４】
実施例２：抗体の作製および選択
それらの表面でヒトＣＤ１５１を発現する２０×１０６のＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（これらの細胞はＣＤ１５１遺伝子でトランスフェクトすることにより作製された）を用い、ＢＡＬＢ／ｃマウスを皮下経路により免疫した。最初の免疫はフロイントの完全アジュバントの存在下で行い、次の２回はフロイントの不完全アジュバントの存在下で行った。融合３日前に、１０×１０６  ＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１細胞の最後の追加免疫注射を腹腔内経路により行った。その後、Kohler and Milsteinにより記載されている慣例の技術を用い、マウス脾細胞をＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と１／１の比率で融合させた。
【０２１５】
次に、この融合から得られたハイブリドーマからの上清中へ分泌された抗体を、ＥＬＩＳＡにより、ＣＤ１５１の組換え細胞外ループＥＣ２を認識するそれらの能力に関して、また、フローサイトメトリーにより、ヒトＰＣ３前立腺癌腫瘍系統の表面に発現されたＣＤ１５１に関してスクリーニングした。
【０２１６】
ＥＬＩＳＡでは、９６ウェルプレートにＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの組換え細胞外ループＥＣ２を＋４℃にて一晩感作させる。ＰＢＳで洗浄した後、ウェルを３７℃にて１時間、ＰＢＳ中０．５％のゼラチン溶液で飽和し、その後、ＰＢＳで再び洗浄する。ハイブリドーマ培養上清を、希釈を行わずに評価する（３７℃で１時間インキュベーション）。固定化されたＥＣ２ループに結合した抗体を、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Jackson/USA、１／５０００希釈、３７℃で１時間）、次いで、ペルオキシダーゼ基質（TMB、Interchim/France、周囲温度で１０分）で順次インキュベーションすることにより検出する。１Ｍ硫酸を添加することにより反応を停止させ、光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定する。
【０２１７】
フローサイトメトリー分析も９６ウェルプレートで行う。無希釈のハイブリドーマ上清を、予めウェルに入れた１０００００  ＰＣ３細胞に加える。＋４℃で２０分インキュベートした後に洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Molecular Probes、１／５００希釈）を加える。＋４℃でさらに２０分インキュベートした後、細胞蛍光計により蛍光強度（ＭＦＩ）を測定する。
【０２１８】
このスクリーニングの終了時に次の４つのハイブリドーマが選択された（選択基準：ＥＬＩＳＡに関してはＯＤ＞０．５およびフローサイトメトリーに関してはＭＦＩ＞５０）：  ２０３Ｂ６、２０５Ｈ８、２１１Ｆ３および２１４Ｂ２。これら４つのハイブリドーマに関して得られた結果を下表４に示す。
【０２１９】
【表４】
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【０２２０】
クローニングの後、選択された各ハイブリドーマのクローンを増幅した。生産された抗体のイソ型を、ネズミ抗体アイソタイピングキット（ＳＢＡクロノタイピングシステム、Southern Biotech）を用いて各培養上清について調べた後、最終的な同定を、これまでに記載した条件下で、ネズミ系統ＮＩＨ  ３Ｔ３および安定な形質転換体ＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１に対して、次いで、肺癌Ａ５４９、前立腺癌ＤＵ１４５および膵臓癌ＢｘＰＣ３のヒト腫瘍系統に対して、ＥＬＩＳＡ（細胞外ループＥＣ２）およびフローサイトメトリーによって行った。上清の抗体濃度はＥＬＩＳＡでは５μｇ／ｍｌに、フローサイトメトリー分析では１０μｇ／ｍｌに調整した。得られた結果を下表５に示す。
【０２２１】
【表５】
2011517565.tif 000006
【０２２２】
図９、１０、１１および１２は、抗体２０３Ｂ６、２０５Ｈ８、２１１Ｆ３および２１４Ｂ２に関して得られた、フローサイトメトリーによる、ＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１、ＰＣ３およびＡ５４９細胞に対する認識特性を示す。これらの特性は抗ＣＤ１５１抗体５０−６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６９６）で得られたものに匹敵し、ＣＤ１５１に対するこれらの抗体の特異性を実証する。
【０２２３】
その後、これらのハイブリドーマをＣＮＣＭ、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15に寄託した。
【０２２４】
実施例３：抗体の特異性
２０３Ｂ６、２０５Ｈ８、２１１Ｆ３および２１４Ｂ２抗体の特異性をウエスタンブロットにより評価した。
【０２２５】
ＣＤ１５１のＥＣ２ループを、大腸菌(Escherichia coli)の周辺質で可溶型として発現させるためのベクターｐＥＴ２２ｂにクローニングした。生産されるタンパク質は、ヒトＣＤ１５１ペプチド配列のアミノ酸１３０〜２２１に、精製を容易にするためにＣ末端位においてポリ−Ｈｉｓテールが付加されているものを含む。組換えＥＣ２タンパク質を、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ支持体(GE Healthcare)での固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。
【０２２６】
漸増量の組換えＣＤ１５１  ＥＣ２タンパク質（１、２、４および８μｇ）およびＨＴ−２９細胞溶解液（総タンパク質１０、２０および５０μｇ）を４〜１２％アクリルアミドゲル(BioRad)上に置いた。電気泳動（非還元的条件）後、これらのタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。次に、この転写膜を精製した２０３Ｂ６、２０５Ｈ８、２１１Ｆ３および２１４Ｂ２抗体（０．５μｇ／ｍｌ）とともに、次いで、ペルオキシダーゼと結合したウサギ抗マウスＩｇポリクローナル抗体(GE Healthcare)とともにインキュベートした後、化学発光により可視化した。
【０２２７】
２０３Ｂ６、２０５Ｈ８、２１１Ｆ３および２１４Ｂ２抗体は、ウエスタンブロットにより完全なＣＤ１５１タンパク質および組換えＥＣ２ループを認識する（図１３）。抗体２０５Ｈ８は、これらの分析条件下では完全なＣＤ１５１タンパク質に対して反応性が低い。抗体２０３Ｂ６、２１１Ｆ３および２１４Ｂ２に関して得られるシグナルに比べ、抗体２０５Ｈ８に対して得られるシグナルは弱いことが分かる。この違いは組換えＥＣ２タンパク質の認識に関しては見られない。
【０２２８】
実施例４：ＰＣ３異種移植モデルにおける抗ＣＤ１５１抗体の抗腫瘍活性
材料および方法
ヒト組織アレイシリーズに対する免疫組織化学により前立腺癌の腫瘍組織におけるＣＤ１５１の過剰発現が見られたので、ＰＣ３前立腺癌細胞異種移植片での抗ＣＤ１５１抗体の評価を計画した。ＰＣ３系統は、ＡＴＣＣから入手し、Ｆ１２Ｋ培地(Invitrogen Corporation, Scotland, United Kingdom)、１０％ＦＣＳ(Invitrogen Corporation)で培養したアンドロゲン非依存性前立腺系統である。細胞が対数増殖期となるよう、移植２日前に分割した。５００万のＰＣ３細胞を６週齢の雄スイスヌードマウスに皮下移植する。移植５日後に、腫瘍体積を測定し、これらのマウスを、統計学的に異ならない群となるように無作為化し、マウス当たり初回免疫量２ｍｇの抗体の腹腔内注射により処置を始める。その後、マウス当たり１ｍｇ用量の抗体で１週間に２回処置し、腫瘍を１週間に２回測定する。対照群の動物にはＰＢＳ注射を施す。腫瘍体積は、式π／６×長さ×幅×高さに従って算出する。統計分析は、マン−ホイットニー検定を用い、測定ごとに行う。
【０２２９】
結果
図１４に示した結果は、抗体２０３Ｂ６、２１４Ｂ２および２１１Ｆ３がＰＣ３細胞のin vivo腫瘍成長の有意な阻害を示すことを示す。抗体２０５Ｈ８は、阻害剤ではあるが、このモデルにおいて軽度の抗腫瘍活性を示す。
【０２３０】
実施例５：抗ＣＤ１５１抗体とＰＣ３細胞の結合の研究
抗ＣＤ１５１抗体２０３Ｂ６および２１４Ｂ２をまず、クロラミンを用いた方法により、ヨウ素１２５で標識した。標識後、遊離のヨウ素１２５を除去するためにＰＤ−１０カラム(GE Healthcare)での分子ふるいクロマトグラフィーにより抗体を精製した。精製後、シリカ薄層クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム(GE Healthcare)での分析的分子ふるいクロマトグラフィー、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動後のオートラジオグラフィーにより放射化学的に純粋な放射性標識抗体を決定した。図１５は、この２つの抗体の重鎖（〜５０ｋＤａ）および軽鎖（〜２５ｋＤａ）が同じ方法で標識されることを示し（１５Ａ）、精製後に遊離のヨウ素１２５が存在しないことが確認される（１５Ｂ）。放射性標識抗体の特異的放射能はγカウンターを用いて測定した(Wallace Wizard 1480, Perkin Elmer)。
【０２３１】
ヨウ素１２５で放射性標識された２０３Ｂ６および２１４Ｂ２抗体、すなわち、［１２５Ｉ］−２０３Ｂ６および［１２５Ｉ］−２１４Ｂ２の物理化学的特徴を下表６にまとまる。
【０２３２】
【表６】
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【０２３３】
次に、細胞表面上のそれらのＣＤ１５１標的に対する２つの放射性標識抗体の親和性をＰＣ３前立腺癌細胞について測定した、これらの抗体の解離定数ＫＤをスキャッチャードの方法により求めた。ＰＣ３細胞（１×１０６細胞／０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳバッファー５０μｌ）を６ｎｇ／ｍｌ〜２７μｇ／ｍｌ（含む）の間の漸増濃度の放射性標識抗体の存在下、４℃で１時間インキュベートした（最終量１５０μｌ）。インキュベーション後、細胞と会合した総放射能（結合している標識抗体）を、γカウンターを用いて測定した。過剰量の非放射性標識抗体（×１００）の存在下で、各試験濃度に関して非特異的結合を測定した。特異的結合は、総放射能から非特異的放射能を差し引くことによって算出する。図１６Ａおよび１７Ａに、それぞれ抗体［１２５Ｉ］−２０３Ｂ６および［１２５Ｉ］−２１４Ｂ２に関する飽和曲線を示す。Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてデータ処理を行った後に得られたスキャッチャード曲線（図１６Ｂおよび１７Ｂ）により、２つの抗体の解離定数ＫＤ（傾き＝−１／ＫＤ）を求めることができる：
２０３Ｂ６  ＫＤ＝１２．８５±０．９９ｎＭ
２１４Ｂ２  ＫＤ＝６．３８±０．４５ｎＭ
【０２３４】
実施例６：血小板機能に対する抗ＣＤ１５１抗体の効果
凝集は、例えば血管の傷害に応答した、血液凝固プロセスにおける血小板の基本的機能である。この現象は一般に血小板の活性化で始まり、それはそれらの表面でのある種のタンパク質の曝露およびそれらの貯蔵顆粒（α顆粒および濃染顆粒）の内容物の分泌を含む。ＣＤ１５１が血小板上で発現する(Goschnick and Jackson, 2007, Mini-Rev.- Med. Chem. 7: 1236-1247)という事実から、血小板機能に対する抗ＣＤ１５１抗体の効果を、血小板凝集および活性化試験を用いてin vitroで評価した。
【０２３５】
この試験のために、抗凝固剤としてクエン酸三ナトリウムを用い、絶食ドナーから血液サンプルを採取した。２０℃にて１００ｇで１０分間遠心分離すると小板豊富な血漿（ＰＲＰ）を得ることができ、２０℃にて１５００ｇで１０分間遠心分離すると血小板が少ない血漿（ＰＰＰ）が得られる。血小板凝集は、３０００００血小板／ｍｍ３に調整した後、Ｂｏｒｎの原理（光透過の改変）に従い、３７℃にて５００ｒｐｍで攪拌しながら、１０人のドナーのＰＲＰで測定した。測定時間は、トロンビンおよびＡＤＰ（陽性対照）では５分、供試抗体では１５分であった。血小板の活性化は。蛍光測定検出によるＨＰＬＣを用い、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミンまたは５−ＨＴ）の分泌を測定することにより、１０人のドナーのＰＰＰで測定した。血小板機能に対するこれらの抗体の効果を、１０μｇ／ｍｌの濃度に関して測定した。数種の対照抗体を用いた：陽性対照抗体としてＰＭ６／２４８（抗ＣＤ４１、インテグリンα１１ｂ）および１４Ａ２．Ｈ１（抗ＣＤ１５１）、イソ型対照（ＩｇＧ１）として９Ｇ４。
【０２３６】
種々の供試化合物により生じた血小板凝集を、トロンビンにより生じた凝集（参照とする（１００％））のパーセンテージとして各ドナーに関して評価する。図１８Ａは、各供試化合物に関して得られた平均凝集値を示す。原因となる作用を有するが、トロンビンよりも効力の低い薬剤であるＡＤＰおよび抗体ＰＭ６／２４８は、それぞれ１０．５％および４７．６±１２．７％と、匹敵する凝集をもたらす。通常、止血作用において、得られた値の変動が見られ、個体間変動によるものである。予期されたように、９Ｇ４抗体は血小板凝集を生じず、この抗体のより検出閾値（５ｎＭ）を定義することができる。抗ＣＤ１５１抗体２０３Ｂ６および２１４Ｂ２により生じる凝集はそれぞれ７．３±３．２％および４．９±１．６％と比較的低く、検出閾値に近い。これらの２つの抗体により生じる凝集は対照抗体１４Ａ２．Ｈ１よりも小さい。
【０２３７】
図１８Ｂは、種々の供試化合物の存在下で血小板（ｎＭ）により放出されたセロトニンの平均値を示す。この血小板活性化試験で得られた結果は、上記のものに匹敵する。９Ｇ４抗体は血小板の活性化を生じないが、トロンビンは極めて顕著なセロトニン放出をもたらす（〜４３０ｎＭ）。セロトニンの放出量は、ＡＤＰ、ＰＭ６／２４８および１４Ａ２．Ｈ（平均値はそれぞれ７２．６ｎＭ、３４．６ｎＭおよび２１．６ｎＭ）の存在下では低いが、これらの化合物は血小板アクチベーターとして分類することができる。抗ＣＤ１５１抗体２０３Ｂ６および２１４Ｂ２により生じるセロトニン放出は極めて低く、事実、これら２つの抗体で測定された平均値は、対照抗ＣＤ１５１抗体１４Ａ２．Ｈ１の平均値よりもそれぞれ２．４倍および３．６倍低い。
【０２３８】
結論として、これら２つの試験により、抗インテグリンα１１ｂ対照抗体ＰＭ６／２４８および抗ＣＤ１５１対照抗体１４Ａ２．Ｈ１はin vitroで血小板凝集をもたらすことができ、血小板の活性化を生じることができる(Roberts et al., 1995, Br. J. Haematol. 89: 853-860; Hornby et al, 1991, Br. J. Haematol. 79: 277-285)。これに対して、１４Ａ２．Ｈ１抗体、抗ＣＤ１５１抗体２０３Ｂ６および２１４Ｂ２が生じる血小板凝集および活性化のレベルは極めて低く、ヒト臨床という点で有意ではない。
【０２３９】
実施例７：in vivoにおけるＮＣＩ−Ｈ４４１腫瘍の成長に対する抗ＣＤ１５１抗体の活性に関する研究
ＡＴＣＣから入手したＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、１０％ＦＣＳおよび１％Ｌ−グルタミンを加えたＲＰＭＩ  １６４０培地で培養する。移植日に対数増殖期の細胞が得られるように、移植２日前に細胞を分割する。１０００万個のＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を無胸腺ヌードマウスに皮下移植する。移植５日後、腫瘍が測定可能となり、匹敵する大きさの腫瘍を担持する動物を６群に分ける。これらのマウスを、マウス当たり初回免疫抗体量２ｍｇ、その後、マウス当たり１ｍｇの抗体で１週間に２回、腹腔内経路により処置する。腫瘍体積は１週間に２回評価し、式π／６×長さ×幅×高さを用いて算出する。データの詳細分析は、マン−ホイットニー検定を用い、測定ごとに行う。
【０２４０】
図１９に示されている結果は、抗体２０３Ｂ６および２１４Ｂ２がin vivoにおいてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞の成長を有意に（ｐ＜０．０５）阻害し得ることを示している。
【０２４１】
実施例８：マクロファージ機能に対する２つの抗ＣＤ１５１抗体の活性の評価
血液細胞上でのＣＤ１５１発現の評価は、この分子がリンパ球および単球上で有意に発現することを示す。潜在毒性の問題を排除するため、２１４Ｂ２および２０３Ｂ６抗体をマクロファージの活性化に対する有効効果に関して試験した。ＴＮＦαの分泌がマクロファージの活性化のマーカーであるという事実から、試験下の抗体の存在下または不在下で培養したＴＨＰ−１細胞の培養物からの上清のＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡにより評価した。ＴＨＰ−１細胞系統は、ＰＭＡまたはＤ３型１α，２５−ジヒドロキシビタミンの薬剤の存在下でマクロファージ系統に分化することができる。この活性化プロセスにはＴＮＦαの極めて著しい分泌が伴う。これらの抗体を評価するため、ＴＨＰ−１細胞を、ＰＭＡ（２５０ｎＭ）の存在下または不在下で７２時間、６ウェルプレートに播種する。このインキュベーション期間の後、ＰＭＡの存在下での分化を顕微鏡観察またはＣＤ１４／ＣＤ１１ｂマーカーのＦＡＣＳ分析により確認するため、細胞の一部を採取する。試験下の抗体（２４１Ｂ２および２０３Ｂ６）を他のウェルにさらに２４時間加える。イソ型対照として９Ｇ４抗体を同じ条件下で用いる。陽性実験対照としてＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を用いる。次に、培養上清を抜き取り、遠心分離し、ＥＬＩＳＡ試験によりそれらのＴＮＦα含量をアッセイするまで−８０℃で保存する。
【０２４２】
図２０Ａに示された結果は、ＰＭＡの不在下では、ＴＨＰ１細胞は非接着性で、屈折力を有し、球形である。ＰＭＡの存在下では、これらの細胞は接着性となり、これが単球からマクロファージへの分化の明らかな指標となる。ＦＡＣＳ分析（図２０Ｂ）は、ＰＭＡの不在下では、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１４を発現するのはＴＨＰ−１細胞の２０％未満である。予期された通り、ＰＭＡにより引き起こされる細胞分化は、ＣＤ１１ｂを発現する細胞の有意な増加（９％から６５％に変化）と関連している。ＣＤ１４の発現も実質的に増加し、陽性細胞の数は２０％から３７％に変化する。用いた評価モデルの有効性がこのデータにより実証されたので、この試験で抗ＣＤ１５１抗体の評価を行った。図２０Ｃは、ＴＨＰ−１細胞を分化インデューサーの不在下で培養した場合、ＴＮＦαの産生は見られないことを示す。これに対し、極めて有意なＴＮＦα産生（１００〜２００ｐｇ／ｍｌ）が見られる。予期されたように、陽性実験対照として導入されたＬＰＳも高レベルのサイトカイン分泌をもたらし、分化インデューサーの存在下でも不在下でもそうである。
【０２４３】
評価した抗ＣＤ１５１抗体はいずれも、細胞分化の状況に拘わらず、ＴＮＦαの分泌を生じさせなかった。
【０２４４】
実施例９：抗原提示機能に関する２つの抗ＣＤ１５１抗体の評価
ＣＤ１５１分子が抗原提示細胞で広く発現するという事実から、ＣＤ１５１に向けられた療法の、抗原提示機能に対する潜在的影響を確認するために試験を行った。行った試験は、破傷風毒素タンパク質をＰＢＭＣｓに導入した際のＴＴ抗原の特異的なリンパ球増殖をモニタリングすることからなる。この構成では、このタンパク質は抗原提示細胞によって処理され、ＭＨＣ分子と会合した同じ細胞により提示されなければならない。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋リンパ球に対するこの抗原提示は抗原特異的クローンの増殖を誘発する。従って、抗原提示に対する影響はそれ自体、リンパ球増殖の調節に現れる。この実験のため、ＰＢＭＣはフィコール勾配で全血を遠心分離することにより単離する。ＰＢＳで２回洗浄した細胞を計数し、１０％ＦＣＳおよび１％グルタミンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中に０．２５×１０細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させる。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに、抗原および試験下の抗体の存在下に播種する。２１４Ｂ２および２０３Ｂ６抗体は終濃度１０μｇ／ｍｌで評価する。９Ｇ４抗体も実験のイソ型対照として同じ終濃度で導入する。リンパ球増殖のポリクローナルアクチベーターであるＰＨＡ（ウェル中２．５μｇ／ｍｌ）を陽性増殖対照として用いる。破傷風毒素（ＴＴ）を試験抗原として選択し、終濃度１００μｇ／ｍｌで用いる。このプレートを３７℃で９６時間インキュベートし、終了時に、各ウェルに０．２５μＣｉの３Ｈ−チミジンをさらに２４時間加える。インキュベーション後、細胞をフィルター上に回収し、放射能を評価する。
【０２４５】
図２１Ａに示されている結果は、予期されたように、陽性対照として用いたＰＨＡが極めて著しいリンパ球増殖をもたらすことを示す。シグナル強度は細胞増殖のポリクローナル活性化とよく一致している。イソ型対照として実験に含まれた９Ｇ４は、ＰＨＡの存在下でも不在下でも細胞増殖に影響を持たない。同様に、２つの供試抗ＣＤ１５１抗体も、いずれ場合にも増殖を変化させない。ＴＴ抗原は、このリンパ球集団の一部の有意な増殖を誘発する（図２１Ｂ）。９Ｇ４または２つの供試抗ＣＤ１５１抗体の存在下ではこの増殖に影響はなく、この実験条件下では、抗原提示は供試化合物により影響を受けないことが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１】ＣＤ１５１タンパク質のヌクレオチド配列およびタンパク質配列を示す。なお、配列上にＥＣ１ループとＥＣ２ループを示す。
【図２】ＣＤ１５１タンパク質、および極めて詳しくは２つの細胞外ループＥＣ１およびＥＣ２が属すテトラスパニンの構造を示す図である。
【図３】本発明による抗体２０３Ｂ６の個々の重鎖および軽鎖配列を示す。ＩＭＧＴシステムに従って定義されたＣＤＲを下線と斜体で示し、Ｋａｂａｔに従って定義されたＣＤＲを四角で示す。
【図４】本発明による抗体２０５Ｈ８の個々の重鎖および軽鎖配列を示す。ＩＭＧＴシステムに従って定義されたＣＤＲを下線と斜体で示し、Ｋａｂａｔに従って定義されたＣＤＲを四角で示す。
【図５】本発明による抗体２１１Ｆ３の個々の重鎖および軽鎖配列を示す。ＩＭＧＴシステムに従って定義されたＣＤＲを下線と斜体で示し、Ｋａｂａｔに従って定義されたＣＤＲを四角で示す。
【図６】本発明による抗体２１４Ｂ２の個々の重鎖および軽鎖配列を示す。ＩＭＧＴシステムに従って定義されたＣＤＲを下線と斜体で示し、Ｋａｂａｔに従って定義されたＣＤＲを四角で示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｅは、前立腺癌に罹患している患者におけるＣＤ１５１分子の発現を示す。各文字は１人の患者の調査に相当し、各患者について、上のパネルは腫瘍に隣接する正常組織に相当し、下のパネルは主要組織に相当する。
【図８】肺癌に罹患している患者におけるＣＤ１５１分子の発現を示す。各文字は１人の患者の調査に相当し、各患者について、上のパネルは腫瘍に隣接する正常組織に相当し、下のパネルは主要組織に相当する。
【図９】ＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１、ＰＣ３およびＡ５４９細胞の表面におけるネズミ抗体２０３Ｂ６によるＣＤ１５１の認識の、フローサイトメトリーによる分析を示す。
【図１０】ＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１、ＰＣ３およびＡ５４９細胞の表面におけるネズミ抗体２０５Ｈ８によるＣＤ１５１の認識の、フローサイトメトリーによる分析を示す。
【図１１】ＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１、ＰＣ３およびＡ５４９細胞の表面におけるネズミ抗体２１１Ｆ３によるＣＤ１５１の認識の、フローサイトメトリーによる分析を示す。
【図１２】ＮＩＨ  ３Ｔ３−ＣＤ１５１、ＰＣ３およびＡ５４９細胞の表面におけるネズミ抗体２１４Ｂ２によるＣＤ１５１の認識の、フローサイトメトリーによる分析を示す。
【図１３】ウエスタンブロットによる、抗体２０３Ｂ６、２０５Ｈ８、２１１Ｆ３および２１４Ｂ２の特異性の評価結果を示す。
【図１４】ＰＣ３前立腺腫瘍異種移植モデルにおける抗ＣＤ１５１モノクローナル抗体の抗腫瘍活性を示す。ＰＣ３細胞はスイスヌードマウス（ｎ＝６）に皮下経路によってグラフトされた。細胞をグラフトしてから５日後に、マウスに刺激用量２ｍｇ／マウスの供試抗体を腹腔内経路により投与し、その後、用量１ｍｇ／マウスのその抗体を１週間に２回投与した。腫瘍体積は、式π／６×長さ×幅×厚さにより求められる。
【図１５】ヨウ素１２５で放射性標識した抗体２０３Ｂ６および２１４Ｂ２の、（Ａ）還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動後のオートラジオグラフィーによる分析、および（Ｂ）分子ふるいクロマトグラフィーによる分析。
【図１６】放射性標識２０３Ｂ６抗体とＰＣ３細胞の結合の研究を示す：（Ａ）飽和曲線および（Ｂ）スキャッチャードプロットによる、平衡時の親和定数の決定。
【図１７】放射性標識２１４Ｂ２抗体とＰＣ３細胞の結合の研究を示す：（Ａ）飽和曲線および（Ｂ）スキャッチャードプロットによる、平衡時の親和定数の決定。
【図１８】（Ａ）血小板凝集および（Ｂ）血小板活性化（セロトニンの放出）を用いた、血小板機能に対する抗ＣＤ１５１抗体の効果を示す。
【図１９】ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞のin vivo腫瘍成長に対する抗ＣＤ１５１抗体の効果を示す。
【図２０】ＰＭＡの不在下または存在下で培養したＴＨＰ−１細胞の表現型Ａ）および分化マーカーＢ）を示す。Ｃ）ＰＭＡの不在下または存在下で培養したＴＨＰ−１細胞によるＴＮＦの分泌に対する抗ＣＤ１５１抗体（２１４Ｂ２および２０３Ｂ６）の効果。イソ型対照として抗体９Ｇ４を用い、陽性活性化対照としてＬＰＳを用いる。
【図２１】抗原提示に対する抗体２４１Ｂ２および２０３Ｂ６の効果を示す。Ａ）ポリクローナル増殖対照、Ｂ）抗原特異的増殖。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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