(57)【要約】  本発明は、親和性タグ標識された巨大分子複合体（例えば、リボソーム）の製造及び精製方法に関する。さらに詳しくは、本方法は親和性タグ及び選択マーカーに対して特異的なヌクレオチド配列のフレーム内融合を含んでなり、該融合はマルチコピータンパク質をエンコードする遺伝子の染色体部位にあり、巨大分子複合体は前記親和性タグの多重コピーを含んで発現される。本発明はまた、親和性タグ標識リボソーム、かかる親和性タグ標識リボソームを含む細胞、及びそれの様々な使用にも関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親和性タグ標識された巨大分子複合体の製造方法であって、親和性タグ及び選択マーカーを含むヌクレオチド配列のフレーム内融合を含んでなり、該融合がマルチコピータンパク質をエンコードする遺伝子の染色体部位にある、方法。
【請求項２】
マルチコピータンパク質が巨大分子複合体の表面に露出している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
巨大分子複合体が、複製複合体、転写複合体、翻訳複合体、リボソーム、及び多量体機能分子を含む任意の複合体から選択される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
巨大分子複合体がリボソームであり、マルチコピータンパク質が原核Ｌ１２又はその相同体である、請求項１、請求項２又は請求項３記載の方法。
【請求項５】
フレーム内融合が遺伝子の染色体部位の３’末端にあり、組換えによる線状配列のフレーム内融合によって達成される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
選択マーカー遺伝子が耐薬剤性遺伝子である、上記請求項の１以上に記載の方法。
【請求項７】
親和性タグがマルチコピータンパク質をエンコードする遺伝子中の停止コドンの直前又は近傍に挿入され、該遺伝子はその機能を保持する、上記請求項の１以上に記載の方法。
【請求項８】
親和性タグが、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ａｒｇタグ、Ｔ７タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ、アプタマータグ及びこれらのタグの任意の組合せから選択される、上記請求項の１以上に記載の方法。
【請求項９】
親和性タグがＨｉｓ6タグである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記親和性タグを用いてリボソームのような巨大分子複合体の親和性精製を行うことを含む、上記請求項の１以上に記載の方法。
【請求項１１】
リボソームがＨｉｓタグで標識され、親和性精製方法がアフィニティークロマトグラフィーである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
アフィニティークロマトグラフィーが固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
インタクトな活性７０Ｓリボソームが精製される、上記請求項の１以上に記載の方法。
【請求項１４】
インタクトなリボソームサブユニットが精製される、請求項１乃至請求項１２の１以上に記載の方法。
【請求項１５】
いずれもが親和性タグ標識された原核Ｌ１２タンパク質又はその相同体の多重コピーを含んでなる、親和性タグ標識リボソーム。
【請求項１６】
２以上のＨｉｓ残基で親和性タグ標識された、請求項１５記載の親和性タグ標識リボソーム。
【請求項１７】
請求項１５又は請求項１６記載の親和性タグ標識リボソームを含んでなる細胞。
【請求項１８】
細胞がそのリボソーム遺伝子中に１以上の突然変異を有する、請求項１７記載の細胞。
【請求項１９】
請求項１５又は請求項１６記載の親和性タグ標識リボソームのインビトロでの使用。
【請求項２０】
タンパク質のインビトロ合成のための、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
翻訳複合体及び／又はこれらに結合された成分の単離のための、請求項１９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親和性タグ標識された巨大分子複合体（例えば、リボソーム）の製造及び精製方法に関する。好ましい実施形態では、本発明は、染色体レベルでタグを挿入することで親和性タグ標識リボソームを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常７０Ｓリボソームといわれる細菌リボソームは、５０Ｓといわれる大サブユニット及び３０Ｓといわれる小サブユニットからなっている。ここで、Ｓは沈降速度の尺度であるスベドベリ（Ｓｖｅｄｂｅｒｇ）を表す。リボソームは５０種以上のタンパク質及び３種のＲＮＡ（５Ｓ、１６Ｓ及び２３Ｓ）を含み、細菌細胞の最大の巨大分子アセンブリである。リボソームを主成分とする、カスタムタンパク質及びペプチドのインビトロ合成のための最適化系に対する関心が高まりつつある。これらの方法の大部分は、細菌タンパク質合成に関する基礎研究のために広く使用されている細菌細胞（さらに具体的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））からの活性リボソーム及びリボソームサブユニットの精製に依存している。大腸菌リボソームの通常の精製方法は、特殊な機器構成を必要とすると共に、複数の超遠心分離及び／又はカラムクロマトグラフィー段階を含み、したがって時間、労力、設備及び試薬の点から見てかなり高価である。様々なグループにより、活性リボソームの精製のための一層簡単なプロトコルを開発する試みがいくつか行われたが、大きな成功は収めなかった。
【０００３】
親和性タグに基づく精製方法が、タンパク質精製分野に革命を起こした。最近、親和性タグを用いて細菌、植物及び酵母のリボソームを精製する試みが発表された（Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｉｎａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｌｅｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｙｏｕｎｇｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，２００５；Ｚａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。これらの方法の２つでは、プラスミド上のｒＲＮＡオペロンと融合したストレプトアビジン結合アプタマータグ（Ｌｅｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）及びＭＳ２コートタンパク質結合タグ（Ｙｏｕｎｇｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，２００５）がそれぞれ使用された。これら２つの方法は、主としてｒＲＮＡ中に突然変異を有する大腸菌リボソームの精製を目指していた。他の方法は、プラスミドから過剰発現された、それぞれ出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのある種のリボソームタンパク質に対するＦｌａｇ−Ｈｉｓ6タグ（Ｉｎａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｚａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）又はＳ−ペプチドタグ（Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）の融合を含んでいた。
【０００４】
特開２００５−２６１３１３号には、大腸菌で過剰発現されるプラスミド上の小サブユニットタンパク質（Ｓ１６、Ｓ１０、Ｓ９、Ｓ８又はＳ６）の配列にＨｉｓタグを付加することによって得られる親和性タグ標識リボソームが記載されている。
【０００５】
これらの従来方法のすべては親和性タグと融合したリボソーム成分のプラスミドに基づく過剰発現を使用しているので、これらの方法の成否は過剰発現レベルに依存すると共に、リボソーム上への過剰発現された標識成分の優先的組込みにも依存する。もう１つの避けがたい結果はリボソームによる標識成分の汚染であり、したがってさらなる精製段階が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
国際公開第２００６／０８５９５４号パンフレット
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、細胞中に存在する任意の巨大分子複合体を親和性タグに基づいて精製するための一般的方法を提供することで従来方法の欠点を解決する。原則として、親和性タグをエンコードする任意のヌクレオチド配列を遺伝子の染色体部位とフレーム内で融合することができる。遺伝子は、複合体中に多重コピーとして存在し、好ましくは十分に露出した末端を有する巨大分子複合体の正規成分をエンコードすべきである。このような遺伝子操作の結果として、巨大分子複合体はその表面上に親和性タグを担持しており、これをそれの精製のために使用できる。
【０００８】
かくして第１の態様では、本発明は、親和性タグ標識された巨大分子複合体を製造するための組換え方法であって、親和性タグ及び選択マーカーに対して特異的なヌクレオチド配列のフレーム内融合を含んでなり、該融合がマルチコピータンパク質（即ち、巨大分子複合体中に多重コピーとして存在するタンパク質）をエンコードする遺伝子の染色体部位にある方法に関する。したがって、巨大分子複合体は前記親和性タグの多重コピーを含んで発現される。好ましくは、マルチコピータンパク質は巨大分子複合体の表面に露出している。これは、親和性タグが単離／精製目的のため容易にアクセス可能であることを意味する。
【０００９】
巨大分子複合体は、好ましくは複製複合体、転写複合体、翻訳複合体、リボソーム、及び多量体機能分子を含む任意の複合体から選択される。
【００１０】
好ましくは、巨大分子複合体はリボソームであり、遺伝子は配列番号１に開示されたヌクレオチド配列を含むｒｐｌＬ又は遺伝暗号の縮重性のためにｒｐｌＬをエンコードするその他任意の配列である。
【００１１】
この配列は、原核マルチコピータンパク質Ｌ１２（大腸菌ではＬ７／Ｌ１２（Ｌ７はＬ１２タンパク質のＮ末端アセチル化形態である）とも呼ばれる）をエンコードする。本発明はまた、細菌におけるその相同体、或いは真核生物におけるその機能的又は組成的類似体（例えば、Ｐ１／Ｐ２タンパク質）にも関する。Ｌ１２タンパク質の詳細な説明は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０Ａ７Ｋ４に見出すことができる。
【００１２】
好ましい実施形態では、フレーム内融合は遺伝子の染色体部位の３’末端にあり、組換えによる線状配列のフレーム内融合によって達成される。
【００１３】
選択目的のためには、好ましくは線状配列はマーカー遺伝子をも含む。マーカー遺伝子は、例えば、ｋａｎ耐性又はａｍｐ耐性又はｔｅｔ耐性又はｃａｍ耐性カセットのような耐薬剤性遺伝子、或いはｌａｃＺ、或いは細菌系及び真核生物系に適した他の常用マーカーであり得る。
【００１４】
親和性タグは、好ましくはリボソームタンパク質に関する遺伝子中の停止コドンの直前挿入されるが、巨大分子複合体上におけるマルチコピータンパク質の構造及び位置に応じて他の位置を有していてもよい。
【００１５】
本発明に従えば、それが十分に小さくて巨大分子複合体の全体的な構造及び機能を妨害しない限り、任意の親和性タグが使用できる。親和性タグの例は、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｒｇタグ、Ｔ７タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ、アプタマータグ及びこれらのタグの任意の組合せである。好ましくは、親和性タグはＨｉｓ6タグである。
【００１６】
親和性タグは、リボソームのような巨大分子複合体の親和性精製のために使用される。好ましくは、巨大分子複合体はＨｉｓタグ標識リボソームであり、親和性精製方法はアフィニティークロマトグラフィーを使用する。Ｈｉｓタグ複合体を得るためには、アフィニティークロマトグラフィーは好ましくは固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）である。
【００１７】
本発明の方法は、インタクトな活性７０Ｓリボソームの精製ばかりでなく、インタクトなリボソームサブユニットの精製を可能にする。本方法は、野生型株及び突然変異株からのリボソームを精製するために使用できる。
【００１８】
好ましい実施形態では、本発明は、親和性タグ標識リボソーム（好ましくは、大腸菌からのテトラ−（Ｈｉｓ）6タグ標識リボソーム）の高スループット一段階親和性精製方法に関する。本発明の方法は、非常に高い収率のインタクトな活性７０Ｓリボソームを与える迅速で簡単な精製方法である。
【００１９】
第２の態様では、本発明は、いずれもが親和性タグ標識されたＬ１２タンパク質又はその相同体の４コピーを含んでなる親和性タグ標識リボソームに関する。好ましくは、タグ標識リボソームは２以上のＨｉｓ残基で親和性標識されている。
【００２０】
第３の態様では、本発明は上述した親和性タグ標識リボソームを含んでなる株又は細胞系に関する。株又は細胞系は、細菌、酵母又は植物由来のものであり得る。
【００２１】
第４の態様では、本発明は上述した親和性タグ標識リボソームのインビトロでの使用に関する。好ましい使用はタンパク質のインビトロ合成である。別の使用は、翻訳複合体の単離／精製のための使用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Ａ）線状ＤＮＡカセットを設計するための戦略、Ｂ）染色体部位への線状カセットの挿入、及びＣ）電気泳動による線状カセット挿入の検証を表している。
【図２】図２は、ＬＢ、３７℃中におけるＭＧ１６５５株とＪＥ２８株との間の増殖速度の比較を表している。
【図３】図３は、Ａ260によってモニターしたＨｉｓトラップカラム上でのＨｉｓ6タグ標識リボソームの精製を表している。
【図４】図４は、下記のＡ）〜Ｃ）によるＨｉｓ6タグ標識リボソームの特性決定を表している。Ａ）ショ糖勾配分析であって、灰色の線は本発明を表し、黒色の線は先行技術を表している。Ｂ）２Ｄゲル分析であって、Ｌ７／Ｌ１２タンパク質は白色の矢印でマークされている。参照タンパク質Ｌ１０は灰色でマークされていて、ゲル上でのＬ１２の位置の変化を示している。Ｃ）ジペプチド形成におけるリボソーム活性アッセイである。
【図５】図５は、Ａ）Ｈｉｓトラップカラム上でのサブユニット分離を示すイミダゾール溶出プロファイル、及びＢ）上図で得られたピークのショ糖勾配分析を表している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、若干の非限定的な実施例に関連して本発明を説明しよう。
【実施例１】
【００２４】
実施例１：λレッドリコンビニアリングのための線状ＤＮＡカセットの調製
標準的なＰＣＲ条件の使用により、テンプレートとしてのｐＥＴ２４ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）及び２種の特別に設計されたプライマーを用いてカナマイシン耐性カセット（ｋａｎ）を増幅した（図１Ａ）。順方向プライマーは、停止コドンを除く大腸菌のｒｐｌＬ遺伝子の３’末端と相同の４３のヌクレオチドを含み、次いで６個のヒスチジンをコードする６つのＣＡＣの反復を含み、次いで停止コドンＴＡＡ及びＮｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴ２４ｂプラスミド上のｋａｎカセットの始まりと相同の２５のヌクレオチドを含む配列（５´−ＧＡＡＡＡＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＡＡＡＡＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＡＧＧＧＧＴＧＴＴＡＴＧ−３´）（配列番号２）を有していた。逆方向プライマー（５´−ＡＴＣＡＧＣＣＴＧＡＴＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＧＧＴＴＧＧＣＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＡＡ−３´）（配列番号３）は、ｒｐｌＬ遺伝子の直後に位置する３９のヌクレオチドに対して逆相補性の配列を含み、次いでｐＥＴ２４ｂのｋａｎカセットの最後の３０のヌクレオチドに対する逆相補性配列を含んでいた。プライマー中、大腸菌のｒｐｌＬ遺伝子の３’末端と相同の配列及びｒｐｌＬ遺伝子の下流領域に対して逆相補性の配列の長さは３０〜５５の範囲内で変化し得るが、最適長さは約４０ヌクレオチドであることに注意すべきである。これら２つの配列は、ＤＮＡ組換え部位（又はさらに厳密にはλレッドリコンビニアリング部位）を構成する。同様に、薬剤カセット（ｋａｎカセット）に関するアニーリングのためプライマー中に使用される配列の長さは１０以上であり得るが、プライマーの全長に応じて広域側に変化し得る。両プライマーは、カスタム合成されかつＰＡＧＥ精製された状態でＮｏｖａｇｅｎ社から購入した。市販キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＰＣＲ生成物をアガロースゲルから精製し、λレッドリコンビニアリング用の線状ＤＮＡカセットとして使用した。
【実施例２】
【００２５】
実施例２：大腸菌株の構築
大腸菌ＨＭＥ６株からＪＥ５株を構築した（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ  ａｎｄ  Ｃｏｕｒｔ，２００３；Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。この場合、λレッドリコンビニアリング系（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）を用いて、（リボソームタンパク質Ｌ１２をコードする）ｒｐｌＬ遺伝子の停止コドンを、６個のヒスチジン、ＴＡＡ停止コドン、次いでカナマイシン耐性カセットをエンコードする線状ＰＣＲ生成物で置換した（図１Ｂ）。ＨＭＥ６細胞を電気穿孔適格性にし、１００μｌの電気穿孔適格性ＨＭＥ６細胞に１〜２μｌの高品質ＰＣＲ生成物（２００〜４００μｇ／μｌ）を添加し、１．２ｋＶ、２５μＦ及び２００Ωで電気穿孔にかけた。電気穿孔細胞を通気しながら１ｍｌのＬＢ中において３０℃で一晩インキュベートした。成功した染色体組換えコロニーをカナマイシンプレート上で選択し、標的部位のフランキング領域と相同のプライマーを用いたＰＣＲによって確認した（図１Ｃ）。さらに、若干の組換えコロニーからのｒｐｌＬ遺伝子のＣ末端を配列決定することで、Ｌ１２のＣ末端におけるｈｉｓ6タグの正しい挿入を撹拌した。所望の挿入を有するものをＪＥ５と名付けた。さらに、標準プロトコルを用いて、バクテリオファージＰ１での普遍形質導入によってｈｉｓタグ標識ｒｐｌＬ遺伝子をＪＥ５から野生型ｌａｂ株ＭＧ１６５５に移入し、新しい安定な大腸菌ＪＥ２８株を生み出した。ＪＥ２８株はカナマイシン耐性を有しており、それからのｒｐｌＬ遺伝子のＣ末端の配列決定により、Ｌ１２のＣ末端におけるｈｉｓタグの内因性挿入を確認した。本発明で使用した株の遺伝子型を下記表１に示す。
【００２６】
【表１】
2011503176.tif 000003
ＪＥ２８の増殖速度を親株ＭＧ１６５５と比較するため、両株を３７℃のＬＢ中で増殖させ、６００ｎｍでの吸光度をモニターした（図２）。ＪＥ２８に関しては、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）の存在下でアッセイを繰り返したが、これはその増殖速度にほとんど影響を及ぼさなかった。
【実施例３】
【００２７】
実施例３：ｈｉｓタグ標識リボソームの精製
テトラ−Ｈｉｓ6タグ標識リボソームを精製するため、ＪＥ２８を３７℃のＬＢ中で約１．０のＡ600まで増殖させ、４℃に徐冷してランオフリボソームを得、ペレット化した。細胞をリゾチーム（０．５ｍｇ／ｍｌ）及びＤＮアーゼＩ（１０μｇ／ｍｌ）と共に細胞溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ及び２００μｌ／ｌ  ＰＭＳＦプロテアーゼインヒビター）中に再懸濁し、フレンチプレス又は（＜２〜３ｇの小さい細胞ペレットに関しては）超音波処理器を用いて溶解した。溶解物を４℃で１８０００ｒｐｍで２０分間遠心することによって２回清澄化した。
【００２８】
溶解物を二等分し、一方の半分から通常の方法（Ａ、下記）で７０Ｓリボソームを精製すると共に、他方の半分については親和性精製方法（Ｂ、下記）を使用した。並行して、比較のために親株ＭＧ１６５５からのリボソームも通常の方法で精製した。
【００２９】
Ａ：通常の方法
ＪＥ２８リボソームを通常の方法で精製するためには、清澄な溶解物を緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、５００ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ、１０．５ｍＭ酢酸Ｍｇ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び７ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）中に作製された等容の３０％ｗ／ｖショ糖クッション上に積層し、４℃で１０００００ｇで１６時間遠心した。この段階を２回繰り返し、その間にペレットを同じ緩衝液で穏やかに洗浄した。貯蔵又はショ糖勾配分析のためには、最終リボソームペレットを親和性精製リボソームと同様に処理した。並行して、ＭＧ１６５５の７０Ｓリボソームも通常の方法で調製した。
【００３０】
Ｂ：本発明に係る親和性精製
親和性精製のためには、ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラム（Ｎｉ2+セファロース予備充填、５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）をＡＫＴＡプライムクロマトグラフィーシステムに連結し、細胞溶解緩衝液で平衡させた。溶解物（２ｍｌ／分）をロードした後、カラムをカラム体積の数倍にわたって細胞溶解緩衝液中５ｍＭイミダゾールで洗浄し、Ａ260が基線に達するまで続けた。次いで、Ｈｉｓタグ標識リボソームを１５０ｍＭイミダゾール含有細胞溶解緩衝液で溶出させ、直ちにプールし、２５０ｍｌの細胞溶解緩衝液中で４×１０分間透析した。透析後、４℃で１５００００ｇで２時間遠心することでリボソームを濃縮し、５ｍＭ塩化アンモニウム、９５ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム、８ｍＭプトレッシン、１ｍＭスペルミジン、５ｍＭリン酸カリウム及び１ｍＭジチオエリトリトールを含む１×ポリミックス緩衝液中に再懸濁し、貯蔵のため液体窒素中でショック凍結するか、或いはショ糖勾配分析のためオーバーレイ緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、６０ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ、５．２５ｍＭ酢酸Ｍｇ、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び３ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）中に溶解した。対照系として、野生型大腸菌ＭＧ１６５５株からの溶解物を同じカラムに適用し、上記に準じて処理したが、溶出液中にリボソームは全く見られなかった。
【実施例４】
【００３１】
実施例４：リボソームのショ糖勾配分析
親和性方法で精製したＪＥ２８からのｈｉｓタグ標識リボソームのサブユニット組成をショ糖勾配分析によって評価した。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、３００ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ、５ｍＭ酢酸Ｍｇ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び７ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含む緩衝液中に調製した２０〜５０％ショ糖密度勾配（１８ｍｌ）上に３０００ｐｍｏｌのリボソームを配置し、４℃で１０００００ｇで１６時間遠心した。比較のため、通常の方法で調製したＪＥ２８リボソームも並行して分析した。通常の方法で調製した大腸菌ＭＧ１６５５のリボソーム及びサブユニットを標準として使用した。精製リボソームの二次元ゲル分析を、本発明に従って調製したリボソーム及び通常の方法で調製したリボソームに関して実施した。
【実施例５】
【００３２】
実施例５：ジペプチド形成アッセイにおける精製リボソームの活性
ジペプチドｆＭｅｔ−Ｐｈｅに関してＡｎｔｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．により記載されたプロトコル（Ａｎｔｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，００６）に従いながら、ジペプチドｆＭｅｔ−Ｌｅｕの形成のために必要な修正を施すことでジペプチドアッセイを設計した。このアッセイの修正のために特に必要な成分としては、Ａｎｔｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．が使用したｆＭｅｔ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−ｓｔｏｐ  ｍＲＮＡ、ＰｈｅＲＳ、ｔＲＮＡPhe及びアミノ酸Ｐｈｅの代わりに、ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−ＳｔｏｐをコードするｍＲＮＡ、ｔＲＮＡアミノアシルシンテターゼＬｅｕＲＳ、ｔＲＮＡLeu及びアミノ酸Ｌｅｕをそれぞれ使用した。Ａｎｔｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．が使用したＬＳ緩衝液の代わりに、本アッセイは上述した１×ポリミックス緩衝液中で実施した。
【実施例６】
【００３３】
実施例６：ＪＥ２８リボソームからのリボソームサブユニットの精製
親和性方法を用いてリボソームサブユニットを精製するためには、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭ  ＫＣｌ及び３０ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌを含む低Ｍｇ緩衝液中でｈｉｓ6タグ標識リボソームを透析又は希釈し、同じ緩衝液で平衡させたＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラム上にロードした。ｈｉｓ6タグは５０Ｓサブユニット上にあるので、３０Ｓサブユニットはカラム上に保持されず、フロースルー画分中に集められた。ｈｉｓ6タグ標識５０Ｓサブユニットをカラムから溶出させ、ｈｉｓ6タグ標識７０Ｓリボソームに関して上述したものと同じ手順に従ってサブユニットを濃縮した。
【００３４】
通常の方法でリボソームサブユニットを分離するためには、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６、３００ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ、３ｍＭ酢酸Ｍｇ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び７ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含む低Ｍｇ緩衝液中で７０Ｓリボソームを透析し、同じ緩衝液中に調製した２０〜５０％ショ糖密度勾配（１８ｍｌ）上での超遠心（４℃で８５０００ｇで１６時間）によって分離した。２６０ｎｍでの吸光度をモニターしながら、勾配を分画した。５０Ｓ及び３０Ｓに関するそれぞれのピーク画分をプールし、４℃で１５００００ｇで２時間の遠心によって濃縮し、１×ポリミックス緩衝液中に再懸濁し、７０Ｓリボソームに関して上述したようにして貯蔵した。
【００３５】
結果
大腸菌ＪＥ２８株では、（リボソームタンパク質Ｌ１２をコードする）単一コピーｒｐｌＬ遺伝子の染色体部位においてその３’末端にヘキサ−ヒスチジン親和性タグをエンコードするヌクレオチド配列がフレーム内融合されており、次いでｋａｎカセット（約８００ヌクレオチド）が選択マーカーとして挿入されている。挿入配列の全長は約８５０ヌクレオチドであった。挿入配列の安定性をそのカナマイシン耐性によって確認すると共に、ｒｐｌＬ遺伝子のフランキングプライマーを用いたＰＣＲによってチェックした場合（図１Ｃｌ）、ＪＥ２８はｋａｎ−ＬＢプレート上での数世代にわたる増殖に成功した。ＭＧ１６５５と比較した場合、それはカナマイシンの存在にもかかわらず液体培地（ＬＢ）中で本質的に同じ増殖速度を示した（図２）（データは示さず）。このような結果によって以下のことが確認される。第一に、染色体部位における標的化挿入は安定であり、同じオペロン上においてさらに下流に位置する遺伝子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードするｒｐｏＢ）の発現に影響を及ぼさなかった（図１Ｂ）。第二に、リボソームの５０Ｓサブユニット上においてＬ１２タンパク質のＣ末端に挿入されたｈｉｓ6タグはインビボでのリボソーム機能を妨害せず、さらに詳しくはリボソーム「ｓｔａｌｋ」タンパク質Ｌ１２の機能を妨害しなかった。これはさらにインビトロで試験された。
【００３６】
大腸菌ＪＥ２８のリボソームの大サブユニット上においてＬ１２タンパク質のＣ末端に挿入されたｈｉｓ6タグを利用する、大腸菌リボソームを精製するための新規な親和性タグに基づく方法が開発された。図３は、２６０ｎｍでの吸光度の関数としてモニターしたＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）からの溶出プロファイルを示している。１５０ｍＭイミダゾールで溶出させたピーク画分は１．９のＡ260／Ａ280比を示したが、これはリボソームに関する典型的な値であった。これらの画分をプールし、濃縮し、ショ糖密度勾配遠心、２Ｄゲル、及びジペプチド結合形成における活性アッセイによる追加の分析に供した。ＭＧ１６５５からの溶解物に関する対照実験では、ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラムから大きなピークは溶出せず、プールしたピーク画分は核酸に特異的な２６０ｎｍでの吸光度を示さなかった（データは示さず）。
【００３７】
親和性方法及び通常の方法で精製したＪＥ２８リボソームをショ糖密度勾配遠心分析に供した。上述した緩衝液条件下では、親和性精製リボソームは７０Ｓリボソームのみを含んでいたのに対し、通常の方法で精製したリボソームは７０Ｓと共に５０Ｓ及び３０Ｓサブユニットを含んでいた（図４Ａ）。親和性精製リボソームにおける純粋な７０Ｓリボソームの収率は、通常の精製方法に比べてずっと高かった。これは、親和性精製方法では一段階のＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラム溶出から純粋な７０Ｓリボソームが直接に得られたのに対し、通常の方法では７０Ｓリボソームの精製のために追加のショ糖密度勾配超遠心が必要とされたことに原因している。
【００３８】
ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラム上で精製したｈｉｓ6タグ標識ＪＥ２８  ７０Ｓリボソームを２Ｄゲル上で特性決定した（図４Ｂ）。並行して、比較のためにＭＧ１６５５からの７０Ｓリボソームも２Ｄゲルに供した（図４Ｂ、挿入図）。両試料において、５２のリボソームタンパク質のすべてがゲル上の同一位置で同定された。例外は（図４Ｂ中に白色の矢印で示される）Ｌ１２（Ｌ７／Ｌ１２）タンパク質であって、これらはｈｉｓ6タグの挿入のために元の位置から移動した。このことは、その位置を（図４Ｂ中に灰色の矢印で示される）別のリボソームタンパク質Ｌ１０と比較した場合にはっきりと認められる。Ｌ１２は高酸性のタンパク質（ｐＩ４．６）であり、Ｌ７はＬ１２のＮ末端アセチル化形態である。Ｌ１２への６個の塩基性ヒスチジン残基の付加は、該タンパク質のｐＩの変化（５．２）をもたらし、２Ｄゲル上での位置の変化を引き起こした。
【００３９】
ペプチド結合形成は、リボソーム機能の中心である。大腸菌からの精製成分からなる無細胞翻訳系では、親和性方法で精製したテトラ−（ｈｉｓ）6タグ標識ＪＥ２８リボソーム（図４Ｃ中のＪＥ２８カラム）は、通常の方法で精製したＪＥ２８リボソーム及びＭＧ１６５５リボソーム（図４Ｃ中にそれぞれＪＥ２８超遠心及びＭＧ１６５５として示す）に比べて速いジペプチド（ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ）形成速度を示した。このような結果により、Ｌ１２タンパク質のＣ末端へのテトラ−（ｈｉｓ）6タグの染色体挿入は翻訳因子に関連するペプチド結合形成におけるリボソームの機能に悪影響を及ぼさないことが確認された。ジペプチド形成における高い活性は、親和性方法で精製された７０Ｓリボソームの高い均質性に原因する可能性があった。超遠心による通常の方法で精製されたリボソームは、ショ糖勾配分析（図４Ａ）で証明された通り、７０Ｓと共に若干の遊離５０Ｓ及び３０Ｓサブユニットを含んでいた。
【００４０】
テトラ−（ｈｉｓ）6タグが５０Ｓサブユニット上のみに存在し、３０Ｓサブユニット上には存在しないことは、低Ｍｇ+2緩衝液中でＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＨＰカラムを用いてリボソームサブユニットを精製する方法の開発を可能にした。図５Ａは、２つの相異なるピークを有するカラムの溶出プロファイルを表している。第１のピーク（フロースルー画分）をプールしてショ糖勾配分析で分析したところ、これは３０Ｓサブユニットのみを示し、１５０ｍＭイミダゾールで溶出させた第２のピークは５０Ｓサブユニットとして同定された（図５Ｂ）。
【００４１】
本発明に係るタグ標識リボソームの用途
テトラ−ｈｉｓ6タグ標識リボソームは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、翻訳因子、新生タンパク質鎖及び／又はリボソーム関連タンパク質（例えば、チャペロン）と結合した機能性翻訳複合体を単離することができる。細菌リボソームの構造及び機能は分子的な細部まで知られているので、様々な機能段階で捕捉されるリボソーム複合体の低温ＥＭ又はＸ線結晶学による構造研究に対する要求が高まっている。リボソーム上の親和性タグ及び適当な生理的緩衝液条件を使用すれば、リボソーム上に付着した因子と共に機能性複合体を直接に単離することができる。
【００４２】
リボソームＲＮＡ又はタンパク質遺伝子中の突然変異を有する大腸菌株は、しばしば細胞中に少量のリボソームを含み、したがって通常の方法によって良好な収率で精製するのが困難である。これらの突然変異株からリボソームを精製するためには、バクテリオファージＰ１を用いた普遍形質導入によって親和性タグを薬剤マーカーと共にＪＥ２８からそれぞれの突然変異株に移動させ、次いでＪＥ２８リボソームの親和性精製方法に従えばよい。
【００４３】
親和性精製されたリボソームを「細胞溶解物」に基づくインビトロタンパク質合成系に添加することで、これらの系からのタンパク質生産効率を高めることができる。
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【００４４】
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【図１】
2011503176.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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