(57)【要約】本発明は、特に感染, 炎症, 腫瘍, 疼痛, 創傷および／または傷の治療および／または予防のためヒトラクトフェリンの配列に基づいて設計された新規アルギニン置換ペプチド及びその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)で表されるペプチドであって、
R1-Phe-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Lys-Val-Arg-X8-R2 
| α
R3           式(I)
式中のアミノ酸X1はGln またはAlaであり, アミノ酸X2 はTrp またはLeuであり, アミノ酸X3 はGln, Ala, Orn, Nle またはLysであり, アミノ酸X4 はArg, Ala またはLysであり, アミノ酸X5 はAsn, Ala, Orn またはNleであり, アミノ酸X6 はMet, Ala またはLeuであり, アミノ酸X7 はArg, Ala またはLysであり, アミノ酸X8 はGly, Lys, Glu またはAspであり;
X8 がGlyである場合、R3はSer-(Arg)n-X9であり、結合αはGlyのカルボキシル基およびSerのアミノ基の間のペプチド結合であり;
X8 がLysである場合、R3はX9-(Arg)n-Serであり、結合αはLysのε-アミノ基およびSerのカルボキシル基の間のアミド結合であり;
X8 がGlu またはAspである場合、R3はSer-(Arg)n-X9であり、結合αはGluのγ-カルボキシル基またはAspのβ-カルボキシル基およびSerのアミノ基の間のアミド結合であり;
アミノ酸 X9は、アミノ酸がないか又はGlyのいずれかであり;
n は、1〜10の整数, 好ましくは 2〜6の整数, 好ましくは 4〜6の整数, なおより好ましくは 3〜4の整数であり;
R1 は、アミノ酸がない, Cys または以下を含む配列番号 3 及びそのＮ末端で切断された断片から選択されるペプチド配列のいずれかであり、
Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys,
Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Arg-Arg-Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Arg-Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Ala-Thr-Lys-Cys, 
Thr-Lys-Cys, 
および
Lys-Cys, 
R2 は、アミノ酸がない, Pro または以下を含む配列番号 4 又はそのＣ末端で切断された断片から選択されるペプチド配列のいずれかである、
Pro-Pro-Val-Ser-Cys-Ile-Lys-Arg, 
Pro-Pro-Val-Ser-Cys-Ile-Lys, 
Pro-Pro-Val-Ser-Cys-Ile,
Pro-Pro-Val-Ser-Cys,
Pro-Pro-Val-Ser,
Pro-Pro-Val, および
Pro-Pro。
【請求項２】
請求項1に記載のペプチドであって、式中のアミノ酸X8はGlyであり、R3はSer-(Arg)n-X9であり、結合αはGlyのカルボキシル基およびSerのアミノ基の間のペプチド結合であるペプチド。
【請求項３】
請求項1に記載のペプチドであって、式中のアミノ酸X8はLysであり、R3はX9-(Arg)n-Serであり、結合αはLysのεアミノ基およびSerのカルボキシル基の間のアミド結合であるペプチド。
【請求項４】
請求項1に記載のペプチドであって、式中のアミノ酸X8はGluであり、R3はSer-(Arg)n-X9であり、結合αはGluのγ-カルボキシル基およびSerのアミノ基の間のアミド結合であるペプチド。
【請求項５】
請求項 1〜4の何れか一項に記載のペプチドであって、式中のアミノ酸X1はGln, アミノ酸X2はTrp, アミノ酸X3はGlnまたはLys, アミノ酸X4はArg, アミノ酸X5はAsnまたはAla, アミノ酸X6はMet, アミノ酸X7はArgであるペプチド。
【請求項６】
請求項1〜5の何れか一項に記載のペプチドであって、式中のアミノ酸X9はGlyであるペプチド。
【請求項７】
請求項1〜6の何れか一項に記載のペプチドであって、式中のR1はアミノ酸がないか又はペプチド配列 Ala-Thr-Lys-Cysのいずれかであるペプチド。
【請求項８】
請求項1〜7の何れか一項に記載のペプチドであって、式中のR2はアミノ酸がないか又はペプチド配列 Pro-Pro-Val-Ser-Cys-Ile-Lys-Argのいずれかであるペプチド。
【請求項９】
請求項1〜8の何れか一項に記載のペプチドであって、カルボキシル末端でのフリーのCOOHがCONH2に転換されたペプチド。
【請求項１０】
請求項1〜8の何れか一項に記載のペプチドであって、アミノ末端でのフリーのNH2基がアミドCH3CONHに転換されたペプチド。
【請求項１１】
請求項1〜8の何れか一項に記載のペプチドであって、アミノ酸 Cysが存在する場合にアセトアミドメチル-システインで置換されるペプチド。
【請求項１２】
以下から選択されるペプチド：
【化ｅ】
2011503137.tif 000011
。
【請求項１３】
以下から選択されるペプチド：
【化ｃ】
2011503137.tif 000012
。
【請求項１４】
以下から選択されるペプチド：
【化ｂ】
2011503137.tif 000013
。
【請求項１５】
請求項1〜14の何れか一項に記載のペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項１６】
感染, 炎症, 腫瘍, 疼痛, 創傷および 傷の治療および／または予防のための請求項15に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項15〜16の何れか一項に記載の薬学的組成物であって、経口投与, 全身投与, 非経口投与, 局所投与または局部投与（topical administration）に処方された薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項1〜14の何れか一項に記載のペプチドを含む食料品。
【請求項１９】
感染, 炎症, 腫瘍, 疼痛, 創傷および傷の治療および／または予防のための医薬品の製造における請求項1〜14の何れか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項２０】
請求項19に記載の使用であって、前記医薬品は経口投与, 全身投与, 非経口投与, 局所投与または局部投与に処方された使用。
【請求項２１】
感染, 炎症, 腫瘍, 疼痛, 創傷および傷を治療または予防する方法であって、効果的な量の請求項 1〜14の何れか一項に記載のペプチド, その断片, および機能上均等なホモログおよびアナログが患者に投与される方法。
【請求項２２】
請求項21に記載の方法であって、前記物質が経口的に, 全身性に, 非経口的に, 局所的に、又は局部的に投与される方法。
【請求項２３】
請求項22に記載の方法であって、前記物質が食料品に含まれる方法。
【請求項２４】
請求項23に記載の方法であって、前記物質が乳児食に含まれる方法。
【請求項２５】
医薬（medicament）として使用するための請求項1〜14の何れか一項に記載のペプチド。
【請求項２６】
感染, 炎症, 腫瘍, 疼痛, 創傷および傷の治療および／または予防のための請求項1〜14の何れか一項に記載のペプチド。
【請求項２７】
請求項26に記載のペプチドであって、経口投与, 全身投与, 非経口投与, 局所投与または局部投与に処方されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、特に感染, 炎症および／または腫瘍の治療および／または予防のための新規のペプチド及びその使用に関する。
【０００２】
［背景技術］
ラクトフェリンは、77 kdの分子量を有する単鎖の金属結合性の糖タンパク質である。殺菌特性を担うラクトフェリンの構造ドメインがラクトフェリシンと称されるペプシン切断断片であることが認められた〔例えば、Bellamy W., et al., Identification of the bactericidal domain of lactoferrin, Biochim. Biophys. Acta 1121: 130-136, 1992, および Bellamy W., et al., Antibacterial spectrum of lactoferricin  B, a potent bactericidal peptide derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin, J. Appl. Bact. 73: 472-479, 1992を参照されたい〕。
【０００３】
ラクトフェリンレセプターは、単球およびマクロファージ, レクチン刺激ヒト末梢血リンパ球（lectin-stimulated human peripheral blood lymphocytes）, 刷子縁細胞（brushborder cells）, および腫瘍細胞株を含む多くのタイプの細胞に見出される。
【０００４】
幾つかの特許公開公報は、感染または炎症の治療のためのラクトフェリンの使用を記載している。WO 98/06425において、ラクトフェリンおよびラクトフェリシンを感染, 炎症 および 腫瘍の治療および予防に使用できることなどが開示されている。
【０００５】
EP 629 347は、(A) ラクトフェリン加水分解物および／またはラクトフェリンに由来する一または二以上の抗菌ペプチド, および(B) 金属キレートタンパク質（metal-chelating protein）, トコフェロール, シクロデキストリン, グリセリン-脂肪酸エステル, アルコール, EDTA又はその塩, アスコルビン酸又はその塩, クエン酸又はその塩, ポリリン酸又はその塩, キトサン, システイン, および胆汁酸からなる群から選択される一または二以上の化合物を有効な成分として含んでいる抗微生物剤（antimicrobial agent）を記載する。この抗微生物剤は、生産物の処理, および特に食物および薬などの安全な処理を意図している。この文献の剤は、新しい保存剤である。文献において、幾つかのペプチド配列が提供され、これらの幾つかは本発明のペプチドに似ているが、さらに以下に記載される幾つかの重要な差が存在する。
【０００６】
US 5,304,633は、ヒトおよびウシのラクトフェリンの加水分解物から単離された抗微生物ペプチドを開示する。ヒトラクトフェリンのアミノ酸 12〜47, および 17〜41に対応するペプチドの単離が特に開示される。
【０００７】
JP 7145196は、ラクトフェリンの加水分解による抗生物質ペプチドの調製を記載する。ヒトのラクトフェリンのアミノ酸 17〜41に対応するペプチドの調製が特に記載される。
【０００８】
JP 8040925は、ラクトフェリン由来ペプチドを含んでいる薬学的組成物および角膜傷害（特に、角膜炎）の治療における使用を開示する。ヒトラクトフェリンのアミノ酸17〜41, 12〜58, および 19〜38に対応するペプチドが特に開示される。
【０００９】
JP 7274970は、抗菌性のラクトフェリシン由来ペプチドの組換え型の産生を記載し、特にヒトラクトフェリンのアミノ酸18〜42に対応するペプチドが開示される。
【００１０】
JP 8143468は、ラクトフェリン由来ペプチド及びその抗潰瘍薬としての使用を記載し、特にヒトラクトフェリンのアミノ酸 19〜33 に対応するペプチドが開示される。
【００１１】
WO 00/01730は、ヒトラクトフェリンから由来するペプチド及びその感染および炎症の治療のための使用を記載する。
【００１２】
EP 1228097は、ヒトラクトフェリンのすぐＮ末端から由来するペプチド及びその微生物剤（microbial agents）としての使用を記載する。
【００１３】
EP 1151009は、抗微生物および／またはエンドトキシン中和活性を有しているヒトラクトフェリンのアミノ酸 35〜50 に対応する配列を含んでいるペプチドを記載する。
【００１４】
WO 2006/047744は、少なくとも 33 アミノ酸を含んでおり、N-およびC-末端の両方が四つの陽性に荷電したアミノ酸で置換されたヒトラクトフェリンのＮ末端部分から由来する免疫調節性のペプチドを記載する。
【００１５】
［発明の概要］
本発明の課題は、ラクトフェリン, ラクトフェリシン または他のラクトフェリン由来ペプチドと同じ目的のために使用でき、同じ（またはより良い）効果を有し、生産的, 技術的および／または生化学的な利点を有している新規の合成ペプチドを提供することである。
【００１６】
本発明を導いた研究の目的は、感染, 炎症, 腫瘍, 創傷（wounds）, および傷（scar）の治療および予防において、ヒト ラクトフェリン, ヒト ラクトフェリシン および他のラクトフェリン由来ペプチドと本質的に同等に効率的（または、好ましくはより効率的）である新規のペプチドを設計することであった。
【００１７】
Ｎ末端から数えてヒトラクトフェリンのアミノ酸 21-31の全て又は幾つかで構成される配列で形成され、さらにアルギニン含有ペプチドで置換されたペプチドが所望の特性を有することが見出された。
【００１８】
本発明によると、ヒトラクトフェリンのＮ末端からのアミノ酸 21-31で構成される配列に基づいて設計され、アルギニン含有ペプチドで置換されたペプチドが、所望の特性を有することが見出された。
【００１９】
ヒトが刷子縁膜にヒトラクトフェリンに結合できるレセプターを有することが見出された〔例えば、Lonnerdal B., Lactoferrin receptors in intestinal brush border membranes, Adv. Exp. Med. Biol. 1994, 357: 171-175を参照されたい〕。ウシのラクトフェリンがこれらのレセプターに結合しないことも見出された。ヒトの身体におけるこれらの新規のペプチドの取り込みのための妥当（plausible）な機構は、ペプチドが細胞のレセプターへの結合を介して摂取されることである。しかしながら、本発明は、この機構に限定されない。
【００２０】
このように、本発明は、新しい合成ペプチド及びその機能上の均等なホモログ（homologues）またはアナログ（analogues）に関する。
【００２１】
さらにまた、本発明は、前記ペプチドを含んでいる医薬品（medicinal products）および食料品（特に、乳児食）に関する。
【００２２】
また、本発明は、感染, 炎症および腫瘍の治療および予防のための医薬品の製造のための前記ペプチドの使用に関する。
【００２３】
本発明のペプチドは殺真菌性で殺菌性であり、それゆえ係る特性を有する物質が所望される場合に他の適用に使用できる。それらを、例えば、保存剤として使用しえる。
【００２４】
本発明の特徴的な特性は、以下の記載および添付される特許請求の範囲における請求項などから明らかである。
【００２５】
[発明の詳細な記載]
従って、本発明は、タンパク質ヒトラクトフェリン(hLF)の断片のアミノ酸配列に基づいて設計されるペプチドに関する。本発明の基礎として使用されるhLFの断片は、hLFのポジション 21-31 におけるアミノ酸で構成され、その配列は次のものである：
Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg (配列番号1)。
【００２６】
記載中、一文字または三文字のシンボルがアミノ酸を意味するため使用される。これらのシンボル（当業者に周知である）は、次の意味を有する:  A = Ala = アラニン, C = Cys = システイン, D = Asp = アスパラギン酸, E = Glu = グルタミン酸, F = Phe = フェニルアラニン, G= Gly = グリシン, I- Ile = イソロイシン, K = Lys = リジン, M= Met = メチオニン, N = Asn = アスパラギン, P = Pro = プロリン, Q = Gln = グルタミン, R = Arg = アルギニン, S = Ser = セリン, T = Thr = スレオニン, V = Val = バリン, W = Trp = トリプトファン, Orn = オルニチン, Nle = ノルロイシン および X = Xaa = 可変性のアミノ酸（a variable amino acid）。幾つかの配列におけるAcおよびNH2は、それぞれアセチル (CH3CO-)基およびアミノ基を意味し、ペプチドのアミノおよびカルボキシル末端を修飾するため使用されている。
【００２７】
ヒトラクトフェリンのＮ末端部分は、ヒトラクトフェリンのアミノ酸 1-31の配列に関して以下に示されるようなアルギニンリッチ配列を含有する：
Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys--Phe-Gln-Trp-Gln-Arg-Asn-Met-Arg-Lys-Val-Arg (配列番号2)
配列 Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Serは、重要な配列モチーフと同定され、本発明のペプチドの設計に使用された。
【００２８】
本発明は、以下の式Iで表されるペプチドに関する、
R1-Phe-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Lys-Val-Arg-X8-R2 
| α
R3           式(I)
式中のアミノ酸X1はGln またはAlaであり, アミノ酸X2 はTrp またはLeuであり, アミノ酸X3 はGln, Ala, Orn, Nle またはLysであり, アミノ酸X4 はArg, Ala またはLysであり, アミノ酸X5 はAsn, Ala, Orn またはNleであり, アミノ酸X6 はMet, Ala またはLeuであり, アミノ酸X7 はArg, Ala またはLysであり, アミノ酸X8 はGly, Lys, Glu またはAspであり;
X8 がGlyである場合、R3はSer-(Arg)n-X9であり、結合αはGlyのカルボキシル基およびSerのアミノ基の間のペプチド結合であり;
X8 がLysである場合、R3はX9-(Arg)n-Serであり、結合αはLysのε-アミノ基およびSerのカルボキシル基の間のアミド結合であり;
X8 がGlu またはAspである場合、R3はSer-(Arg)n-X9であり、結合αはGluのγ-カルボキシル基またはAspのβ-カルボキシル基およびSerのアミノ基の間のアミド結合であり;
アミノ酸 X9は、アミノ酸がないか又はGlyのいずれかであり;
n は、1〜10の整数, 好ましくは 2〜6の整数, 好ましくは 4〜6の整数, なおより好ましくは 3〜4の整数であり;
R1 は、アミノ酸がない, Cys または以下を含む配列番号 3 及びそのＮ末端で切断された断片から選択されるペプチド配列のいずれかであり、
Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys,
Arg-Arg-Arg-Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys,
Arg-Arg-Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Arg-Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Arg-Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Ala-Thr-Lys-Cys, 
Thr-Lys-Cys, 
および
Lys-Cys, 
好ましくは、R1 は、アミノ酸がない, Cys または以下を含む配列番号 11 及びそのＮ末端で切断された断片から選択されるペプチド配列のいずれかであり、
Ser-Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Val-Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Gln-Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Trp-Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Cys-Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Ala-Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Val-Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Ser-Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Gln-Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Pro-Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Glu-Ala-Thr-Lys-Cys, 
Ala-Thr-Lys-Cys, 
Thr-Lys-Cys, 
および
Lys-Cys, 
R2 は、アミノ酸がない, Pro または以下を含む配列番号 4 及びそのＣ末端で切断された断片から選択されるペプチド配列のいずれかであり、
Pro-Pro-Val-Ser-Cys-Ile-Lys-Arg, 
Pro-Pro-Val-Ser-Cys-Ile-Lys, 
Pro-Pro-Val-Ser-Cys-Ile,
Pro-Pro-Val-Ser-Cys,
Pro-Pro-Val-Ser,
Pro-Pro-Val, および
Pro-Pro;
R2を規定している上記のペプチド配列は配列番号 4 又はそのC-末端で切断された断片により表される。
【００２９】
好適な態様において、X8はGlyであり、R3はSer-(Arg)n-X9であり、結合αはGlyのカルボキシル基およびSerのアミノ基の間のペプチド結合である。
【００３０】
好適な態様において、X8はLysであり、R3はX9-(Arg)n-Serであり、結合αはLysのε-アミノ基およびSerのカルボキシル基の間のアミド結合である。
【００３１】
別の好適な態様において、X8はGluであり、R3はSer-(Arg)n-X9であり、結合αはGluのγ-カルボキシル基およびSerのアミノ基の間のアミド結合である。
【００３２】
他の好適な態様において、アミノ酸 X1はGln, X2はTrp, X3はGln またはLys, X4はArg, X5はAsn またはAla, X6はMet, および／または X7はArgである。
【００３３】
別の好適な態様において、R1は、アミノ酸がないか又はペプチド配列 Ala-Thr-Lys-Cysのいずれかである。
【００３４】
なお別の好適な態様において、R2は、アミノ酸がないか又はペプチド配列 Pro-Pro-Val-Ser-Cys-Ile-Lys-Argのいずれかである。
【００３５】
好適な態様において、本発明は、配列番号 12 (Phe-Gln-Trp-X3-Arg-X5-Met-Arg-Lys-Val-Arg-Gly-Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly)を含んでいる精製ペプチドを提供し、式中のX3はGln またはLysであり、X5はAsn またはAlaであり、前記ペプチドは配列番号 5, 6, 7, 8, 9, または10である。
【００３６】
存在する場合、アミノ酸 Cysをアセトアミドメチル-システインで置換することは有利である可能性があり、これにより前記ペプチドが、ジスルフィドブリッジをシステインを含んでいる別のペプチドと形成すること, および／または分子間（intermolecular）のジスルフィドブリッジが形成されること(前記ペプチドが二つのCys 残基を含むとき)が回避される。
【００３７】
本発明の好適な側面によると、前記ペプチドのカルボキシル末端は、キャップされる〔つまり、カルボキシル 末端でのフリーのCOOHがCONH2に転換（transformed）される〕。
【００３８】
本発明の別の好適な側面によると、前記ペプチドのアミノ末端は、キャップされる（つまり、アミノ 末端でのフリーのNH2基がアミド CH3CONH- (AcNH-)に転換される）。
【００３９】
前記ペプチドが分枝状である場合、前記ペプチドのアミノ末端の一方または両方をキャップできる。前記ペプチドが分枝状である場合、前記ペプチドのカルボキシル末端の一方または両方をキャップできる。
【００４０】
本発明の別の好適な側面によると、前記ペプチドのカルボキシル末端 および アミノ-末端の両方がキャップされる。
【００４１】
キャップされたバージョンの利点は、これらのペプチドのN- およびC- 末端のアミノ酸が中性で無荷電（uncharged）であり、静電気的な特性が変化していることである。レセプターがヒト ラクトフェリンの対応する配列（N- および C 末端の荷電は存在しない）と結合すると仮定すると、キャップされたペプチドはより良好に結合するはずである。というのも、それらペプチドは未キャップのペプチド（uncapped peptides）よりも本来（native）のタンパク質にこの点で似ているからである。
【００４２】
本発明の好適なペプチドは以下のものである:
【００４３】
【化Ａ】
2011503137.tif 000002
【化Ｂ】
2011503137.tif 000003
【化Ｃ】
2011503137.tif 000004
【化Ｄ】
2011503137.tif 000005
【化Ｅ】
2011503137.tif 000006
【００４４】
CysMは、アセトアミドメチル-システインである。
【００４５】
ペプチドのN-末端および／または C-末端のキャップされた形態が提供される場合、本発明による未キャップの形態も使用することが可能である。
【００４６】
ペプチドのN-末端および／または C-末端の未キャップの形態が提供される場合、本発明によるキャップされた形態も使用することが可能である。
【００４７】
配列 Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser, Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser, Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Ser, Gly-Arg-Arg-Arg-Ser, Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly, Ser-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly およびSer-Arg-Arg-Arg-Arg-Glyは、生理的な条件下で陽性に荷電し、レセプターと強く特異的に相互作用する能力がある。従って、それらは本発明によるペプチドの重要な部分である。
【００４８】
本発明によるペプチドの利点は、それらがヒト ラクトフェリン タンパク質のラクトフェリシン 断片の一部、または発明者が本発明に関連して活性であることを認めた修飾バージョンを含むことである。
【００４９】
幾つかのケースにおいて、配列のキャップされた形態のみが、添付される配列表に提供される。しかしながら、本発明による非キャップ（non-capped）の形態も使用できる。
【００５０】
さらに本発明のペプチドを生じるhLFの活性フラグメントのArg含有ペプチドでの置換によって、hLFから由来する他の既知のペプチドと比較して改善された特性を有するペプチドが提供されることが見出された。
【００５１】
本発明によるペプチドは、感染, 炎症, 腫瘍, 疼痛, 創傷および 傷の治療および／または予防に適切である。本願の明細書等に使用される「治療（treatment）」の用語は、疾患の状態（disease state）, 疾患の進行（disease progression）または他の異常なコンディションの有害な影響を治癒させること（curing）, 好転させること（reversing）, 減弱させること（attenuating）, 緩和すること（alleviating）, 最小化させること（minimising）, 抑制すること（suppressing）または停止すること（halting）を意味する。また、本願の明細書等に使用される「予防（prevention）」の用語は、疾患の状態または進行または他の異常または有害なコンディションが発生するリスクを最小化させること, 減少させること又は抑制することを意味する。
【００５２】
本発明によるペプチドまたは医薬品で治療可能な感染には、全ての種類の病原体（例えば、細菌, ウイルス, 真菌, など）により生じる感染が含まれる。
【００５３】
異なるタイプの炎症を処置することも可能である。炎症は、異常な組織および器官の「発赤（redness）」および腫脹, 影響された領域における疼痛および熱（heat）, 毛細管の拡張（capillary dilation）, 白血球浸潤, などにより特徴付けられる複雑な現象である。炎症は、主に細菌および他の有害な因子（noxious agents）への曝露および物理的な傷害により生じる。炎症には、多くの形態が存在し、種々の異なるサイトカインおよび他の化学的なシグナルにより媒介される。これらの炎症のメディエータには、腫瘍壊死因子-α(TNF-α), インターロイキン-1 (IL-1), インターロイキン-6 (IL-6), インターロイキン-8 (IL-8), および様々なコロニー刺激因子(CSFs)が含まれる。
【００５４】
上述したとおり、本発明によるペプチドは、腫瘍の治療にも適切である。
【００５５】
本発明によるペプチドは、そのままで又は医薬品または薬学的製剤に含ませて使用しえる。また、本発明による医薬品または薬学的製剤は、薬学的製剤の製造または製剤の投与を促進するため使用される物質を含んでもよい。係る物質は、当業者に周知であり、例えば、薬学的に許容されるアジュバント, 担体 および 保存剤であってもよい。
【００５６】
本発明によるペプチドは、経口投与, 全身投与, 非経口投与, 局所投与または局部投与（topical administration）のいずれに処方されてもよい。
【００５７】
本発明によるペプチドまたは医薬品は、経口的に, 全身性に, 非経口的に, 局所的に、又は局部的に患者に投与することができる。本願の明細書等に使用される「患者（patient）」の用語は、疾患の状態, 疾患の進行または他の異常または有害なコンディションを被るリスクがある任意の者（person）に関する。
【００５８】
全身投与は、例えば、尿路感染症, 大腸炎 および 腫瘍の治療に適切である。全身投与は、経口, 経鼻, 静脈内, 動脈内, 腔内, 筋肉内, 皮下, 経皮, 坐剤(直腸内を含む)または当業者に知られている他の経路により行うことができる。経口投与が好適である。
【００５９】
局所投与は、例えば、皮膚感染, 粘膜におけるすべての感染および炎症などの治療に適切である。局所投与は、局所, 経口, 経鼻, 経膣または口咽頭（oropharyngeal）の経路により行うことができる。皮膚または粘膜における局所性の感染または炎症の治療のための、本発明によるペプチドまたは医薬品は、例えば、ゲル, クリーム, 軟膏, またはペーストに含まれてもよい。
【００６０】
本発明による方法において、効果的な量の本発明によるペプチドが、患者に投与される。本願の明細書等に使用される「効果的な量（effective amount）」の用語は、疾患の状態, 疾患の進行または他の異常または有害なコンディションを治療する又は予防するため十分（sufficient）な量に関する。
【００６１】
本発明によるペプチドまたは医薬品および方法は、特に尿路感染症および大腸炎の治療および／または予防に良く適合する。しかし、幾つかの他の炎症性および感染性の疾患も本発明により治療可能であり、例えば、炎症性の腸疾患, 関節リウマチ, ウイルス HIV-1により生じるコンディション, ウイルス CMVにより生じるコンディション, および真菌（例えば、Candidaの種、例えば、Candida albicansおよびCandida krusei, AspergillusおよびCryptococcus neoformans）により生じるコンディションである。このリストは、本発明の範囲を限定しない。
【００６２】
本発明によるペプチドまたは医薬品および方法は、尿路感染症または他の炎症性または感染性の疾患をこのような合併症を誘導するリスクの増加をともなう患者において発生するリスクを減少させることによる予防医学的なケアに良く適合する。
【００６３】
本発明のペプチドは、抗炎症性の及び免疫調節性の療法に適しており、限定されない例示は以下のものである：
1)  一般  , 炎症および／または炎症から生じる医学的なコンディションの治療, 具体的には,
2a)  腸    ; クローン病（Morbus Crohn）, 大腸炎, 潰瘍性大腸炎,
2b)  関節  ; 関節リウマチ, 関節炎, 関節症（Arthrosis）, 筋肉の痙攣, 筋肉の断裂（muscle tear）, 筋肉の傷害, 肉離れ（muscle strain）, 筋肉の捻挫（muscle sprain）を含む筋肉の局在性の障害,
2c)  皮膚  ; 乾癬, 湿疹〔エクセマ(excema)〕, 皮膚炎, ざ瘡,
2d)  心臓  ; 心外膜炎, 心内膜炎 心不全,
2e)  疼痛  ; (さらに以下2fで特定される)。
【００６４】
2f)  神経系; アルツハイマー, 多発性硬化症, 手根管症候群, ディスクヘルニア形成（Disc herniation）, 頚部リゾパシー（Cervical rhizopathy）, ベル麻痺（Bells palsy）, 急性の脊椎損傷（Acute spinal cord injury）, 脊髄圧迫, 脊髄の狭窄, 帯状疱疹後神経痛（Postherpetic neuralgia）, ウイルス脳炎, ウイルス性髄膜炎, メニエール病, ポリオおよびポリオ後合併症（Polio and postpolio complications）, 慢性炎症性の脱髄性多発性ニューロパチー（Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy）, ポリニューロパチー, 三叉神経痛, 慢性のてんかん性障害,
2g)  感覚器官; 緑内障
2h)  粘膜の表面(化学/放射線療法の結果としての炎症),
2i)  アレルギー,
2j)  自己免疫疾患
本発明のペプチドは、さらにコンディションおよび処置に関連する創傷および傷の予防および治療に適しており、限定されない例示は以下のものである：
3a)  様々な組織、例えば、皮膚, 筋肉, 腱, 神経組織, 血管, および身体の異なる部位、例えば、目, 耳, 声帯, 手, 脊髄, 腹内腔（intra-abdominal cavity）, 胸内腔（intra-thoracic cavity）, 頭蓋内腔（intra-cranial cavity）, 口腔, 婦人科学的な処置, 子宮内膜（endometrios）, 包茎における外科的な処置,
3b)  ざ瘡
3c)  肥厚性瘢痕（hypertrophic scars） ＆ ケロイド,
3d)  胸膜炎,
3e)  腹膜透析,
本発明のペプチドは、さらに抗血管形成誘導効果（anti-angiogenetic effects）を有すると信じられており、以下の病気の治療に適している：
4a)  癌
4b)  関節リウマチ
本発明のペプチドは、抗感染効果（anti-infectious effects）を有し、以下のものの予防および治療に適している：
5a)  抗細菌効果:
上および下気道(扁桃炎, 副鼻腔炎など)
眼の感染(例えば、結膜炎)
尿路感染
性的に伝播される疾患(コンドームの抗微生物コーティングを含む)
生殖管（膣疾患, 膣炎, 子宮頚炎, 子宮内膜炎, PIDを含む）
胃腸管の感染〔GIで開始される全身性の感染〕
中枢神経系の感染
皮膚〔ブドウ球菌, 一例を挙げると MRSA, 院内（nosocomial）, 創傷, 熱傷〕, 筋肉, 関節(例えば、敗血症性関節炎), 骨および造血系の感染
歯周炎（parodontitis）, 歯肉炎を含む口に関連する感染
5b)  抗ウイルス効果:
上および下気道
性的に伝播される疾患
胃腸管の感染(GIで開始される全身性の感染)
中枢神経系の感染
5c)  抗真菌効果:
上および下気道(例えば、アフタ, 皮膚粘膜カンジダ症)
尿生殖路, 例えば、陰門膣のカンジダ症, 亀頭炎,
胃腸管の感染(GIで開始される全身性の感染)
中枢神経系の感染
皮膚の感染（例えば、皮膚粘膜カンジダ症）
本発明によるペプチド、医薬品および方法は、単独で、互いを組み合わせて、または従来の治療と組み合わせて使用しえる。
【００６５】
本発明によると、ペプチドを効果的な量で、基礎疾患（underlying disease）, 低出生時体重（low birth weight）または薬物療法（medical treatment）によるコンディションのリスクが増加している患者における感染および／または炎症を減少させることを意図する任意の種類の食物または飲料中に含ませることも可能である。例えば、ペプチドを効果的な量で、乳児において細菌, ウイルスまたは真菌により生じる重量減少などの細菌の有害な影響を阻害することを意図する乳児食に含ませることも可能である。本発明によるペプチドが食料品（例えば、栄養目的のため）に使用される場合、天然起源（natural origin）のペプチドを使用することが特に好適である。
【００６６】
本発明によるペプチドは抗微生物効果を有するので、異なる食料品（food stuffs）および医薬品（例えば、 ゲル, クリーム, 軟膏, ペースト剤, 溶液剤, エマルジョン剤など）の保存剤として使用してもよい。
【００６７】
本発明は、以下の例でさらに説明される。これらの例は、本発明を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】HLBDarg1および 23-a.a.長のペプチド (hLFのアミノ酸 18〜40）の存在下のE.coliの成長阻害。ペプトン 培地(1%)を用いて、ミクロプレートを一晩インキュベーションし、650 nmで分光光度的に読んだ。認められるように、12.5 μg/mlの濃度は、成長を完全（totally）に低下させた。
【図２】A)  ペプチド-処理 および ビヒクル処理した動物の関節に局在するS.aureusの数。B)  3またはそれ以上〔最も重篤な関節組織の炎症 および／または 侵食（erosion）を5と評価し、組織学的な変化がないものを0と評価した)のスコアの動物の分布。2x104のS.aureus および 100 μg のペプチド (HLBDarg1)の用量を注射した。
【図３】カンジダ皮膚感染 におけるペプチド処理の効果〔各ペプチドに対して四重のスポット（quadruple spots）〕。処理の用量は、400 μg ／感染領域であった。アルギニン含有ペプチドは、LF (ペプチド 25 a.a. = hLFのアミノ酸 16-40に対応するペプチド)における抗菌領域に基づいた長いペプチド配列よりも高い程度で C.albicansを減少させた。
【図４】MeT-5A 細胞におけるIL-1-誘導性のIL-6 (A) またはPAI-1 (B)の産生におけるラクトフェリン-由来(HLBD1 Arg rak) ペプチドの阻害活性。指摘の濃度のペプチドをIL-1の付加後すぐにトリプリケート(n=3)で添加し、細胞上清をインキュベーションの3 時間 (A) または6 時間 (B)後に採取し、定量的な ELISAでIL-6 (A) またはPAI-1 (B)に関して分析した。結果を、それぞれ、ペプチドなしで得られたIL-6 レベル (288 pg/ml) またはPAI-1 レベル (18.3 ng/ml)と関連させて表した。統計学的な差を、両側スチューデントのt-検定で決定した(* p < 0.05; ** p < 0.01; ***  <p0.005; ****  <p0.001)。
【図５】ヒト 単球 由来マクロファージ 細胞株 THP-1 細胞におけるLPS-誘導性のTNF-α分泌におけるラクトフェリン由来ペプチド (HLBD1 Arg rak) の用量  ―  阻害活性。示したペプチド濃度を、LPS (0.1 ng/ml)の添加後30 minトリプリケート(n=3)で細胞に添加した。刺激の6 h 後のTNF-αレベルを、ELISAで測定した(R&D Systems, Minneapolis, MN)。結果を、ペプチドなしで得られたTNF-α レベル (288 pg/ml)と関連させて表す。ゲノタイプの間の統計学的な差を、両側スチューデントのt-検定で決定した(* p < 0.05)。
【図６】MeT-5A 細胞におけるIL-1β誘導性のIL-6 (A) またはPAI-1 (B)の産生におけるラクトフェリン由来ペプチドの用量  ―  阻害活性。指摘の濃度のペプチドをIL-1βの付加後すぐにトリプリケート(n=3)で添加し、細胞上清をインキュベーションの3 時間 (A) または6 時間 (B)後に採取し、定量的な ELISAでIL-6 (A) またはPAI-1 (B)に関して分析した。結果を、ペプチドなしで得られたIL-6 レベル (1770 pg/ml) またはPAI-1 レベル (63.0 ng/ml)と関連させて表した。統計学的な差を、両側スチューデントのt-検定で決定した(* p < 0.05;)。◆ = HLBDarg1rak, ▲= PXL11, × = PXL12, ■ = PXL13, ● = PXL14。
【図７】ヒト 単球 由来マクロファージ 細胞株 THP-1 細胞におけるLPS-誘導性のTNF-α分泌におけるラクトフェリン由来ペプチドの用量  ―  阻害活性。示したペプチド濃度を、LPS (0.1 ng/ml)の添加後30 minトリプリケート(n=3)で細胞に添加した。刺激の6 h 後のTNF-αレベルを、ELISAで測定した(R&D Systems)。結果を、ペプチドを10 μg/mlで添加して得られたTNF-α レベル (273-775 pg/ml) と関連させて表す。統計学的な差を、両側スチューデントのt-検定で決定した(* p < 0.05;)。◆ = HLBDarg1rak, ▲= PXL11, × = PXL12, ■ = PXL13, ● = PXL14。
【００６９】
［例］
例 1:  抗微生物アッセイ
Arg-Arg-Arg-Arg- またはArg-Arg-Arg- 含有ペプチド(表 1)を、E.coli, S.aureus および C.albicansを検査微生物として用いる抗菌アッセイで分析した。
【００７０】
洗浄した細胞を、1% Bactopeptone (BP)(Difco, USA)に懸濁した。細菌または真菌の細胞の濃度を、分光学的に調整した。BPで二倍に段階的に希釈したペプチドを、マイクロタイタープレートのウェルにデュプリケート（duplicate）またはトリプリケート（triplicate）で添加した(200 μl ／ウェル)。細菌または酵母の細胞の溶液を、10 μlの容量に添加して、終濃度の約 2 x 105 細胞／mlをえた。ストック溶液の濃度を、常に生存数の計数（viable counts）でチェックした。ミクロプレートを、他に記載しないかぎり、37゜Cで湿潤チャンバーで2 hインキュベーションした。五 μlを、各ウェルからとり、血液寒天プレートに滴下し、一晩37゜Cでインキュベーションした。
【００７１】
種菌の99% 減少を生じているラクトフェリンまたはペプチドの濃度を、MMC99と規定した。
【００７２】
ペプチドの殺菌活性によって、HLBDarg2 を除く全てのペプチドが天然の配列 アミノ酸 1-31 (HLBD31)よりも良好であったことが示された(表 2)。このペプチドにおいて、Arg-Arg-Arg-Arg-Arg 配列が、アミノ-末端側からスペーサー (三つのグリシン残基)を介してフェニルアラニンに連結された。
【００７３】
図 1において、HLBDarg1の成長阻害を、アミノ酸 18〜40からなる本来（native）のラクトフェリン由来ペプチド HLBD2と比較した。非常に強い抗微生物活性が、HLBDarg1に関してこの培地で記録された（この培地は多くの他の LF 由来ペプチドの抗菌活性が低下させる）。
【００７４】
【表１】
2011503137.tif 000007
【００７５】
【表２】
2011503137.tif 000008
【００７６】
例 2:  黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の関節の感染。
【００７７】
マウス。5〜8-週齡のマウスを、B&K (Sollentuna, Sweden)から取得し、イェーテボリ大学のリウマチ部門の動物施設で維持した。彼等を、標準的な条件の温度で光をあて、標準の固形飼料および水を自由に摂食させて10 ／ケージで飼育した。
【００７８】
細菌株および感染。S.aureus株AB-1を、使用した。細菌を、後肢の両方の膝関節 (滑膜間隙)に注射した。注射直前に、細菌およびペプチドまたはビヒクルのみを混合した。2x104のS.aureus および 100 μg のペプチド (HLBDarg1)の用量を注射した。右後肢の膝を、陽性の対照として使用した。また、幾つかの動物は、ペプチド溶液のみを注射された。動物を、感染後の第3日に屠殺し、膝関節をホルマリン中で固定し、組織学的な評価のために脱灰させた。左の関節に存在する細菌の数を、培養すること（皮膚の除去後の関節液の綿スワブ）で分析した。
【００７９】
関節中のS. aureusの数はビヒクル処置群で高かったが、統計学的な有意性は認められなかった（図 2）。関節の盲検試験での評価によって、ペプチド処理およびビヒクル処理の動物の間の有意差が明らかとなった。従って、ペプチドは、ブドウ球菌誘発性関節炎の重症度を低下させることが認められた。
【００８０】
例 3:  Candida albicans皮膚感染
Candida albicans。酵母細胞 (ATCC64549)を、一晩Sabourad ブロス中で23゜Cでインキュベーションした。細胞を、リン酸緩衝液(10 mM, pH 7.4)で洗浄し、2x1010/mlの濃度に調整した。
【００８１】
皮膚感染およびペプチド治療。マウスを、麻酔し、C. albicans(2x108 酵母細胞／スポット)を剃毛した領域にとがっていないプラスチック棒で10 μlの容量を穏やかに摩擦（rubbing）して処理した。次の日、麻酔下のマウスを、10 または 20 μl のペプチド溶液またはビヒクル (リン酸緩衝剤)で、感染スポットに適用して処理することで処理した。溶液を、乾燥させた。４ｈ後、処理を繰り返した。次の日、動物を屠殺した。生存数の計数を、前記スポットに対して配置された金属環を用い、Triton-x 100 (0.01%)を含んでいる100 μlのリン酸緩衝剤の存在下で穏やかに摩擦することで処理領域から得られた洗浄物で行なった。400, 100, および 25 μg ／スポットから開始される最大三つの異なる濃度のペプチドを使用した。可変性が高かったにもかかわらず（各濃度に関して四倍スポット）、コロニー形成単位(CFU)の明らかな減少が三つのペプチドで得られた (表 3)。400 μgで得られた結果を、図 3に示す。
【００８２】
【表３】
2011503137.tif 000009
【００８３】
例 4:  インビトロでの抗炎症性および線維素溶解性効果
正常なヒト中皮細胞に対応するMeT-5A 細胞株を、10% ウシ胎児血清 (FBS; PAA Laboratories GmbH), 3.3 nM 上皮細胞成長因子 (EGF; AMS Biotechnology Ltd), 400 nM ヒドロコルチゾン (MP Biomedicals), 20 mM Hepes (PAA Laboratories GmbH) および 870 nM ヒト組換え型インシュリン (Sigma)を添加したM199 培地(GIBCO)中で維持した。それぞれ、IL-6 またはPAI-1 アッセイの場合において組換え型 IL-1 (R&D Systems), 0.1 または0.5 ng/mlを5%の熱不活化（heat inactivated）されたFBSを含んでいる以外は上記で特定された培地に添加して細胞を誘導した。所与の濃度のペプチド HLBD1 Arg rakを、IL-1での刺激後すぐに添加した。
【００８４】
IL-6 産生を、誘導後3 時間でヒトモノクローナル 抗-IL-6 抗体 (R&D Systems)を用いた定量的なイムノアッセイ ELISAで測定した。
【００８５】
PAI-1レベルを、誘導後6 時間で市販の ELISA キット (Tint-Eliza PAI-1, Trinity Biotech)で測定した。
【００８６】
結果を、ペプチドを添加せずに得られたIL-6 (288 pg/ml) またはPAI-1 レベル(18.3 ng/ml)と関連させて表す。
【００８７】
結果(図 4)は、中皮細胞におけるIL-6 および PAI-1産生が前記ペプチドで有意にダウンレギュレーションしたことを示している。
【００８８】
例 5:  インビトロでの抗炎症効果
ヒト単球に対応するTHP-1 細胞株 (ATCC #TIB-202)を、10% ウシ胎児血清 (FBS; PAA), 1 mM ピルビン酸ナトリウム (Sigma), および 20 mM HEPES (PAA)を添加したRPMI 1640 (PAA Laboratories GmbH)で維持した。細胞密度を、1x106 細胞/mlに調整し、500 μl の細胞懸濁液を24-ウェルの細胞培養プレート (Sarstedt)に添加した。細胞を、10 ng/ml PMA (ホルボール 12-ミリスチン酸エステル 13-アセテート; Sigma) で48 時間処理して単球をマクロファージ様細胞に分化させた。48 時間後、0.1 ng/ml LPS (E. coli 血清型 O55:B5; Sigma)を上記で特定した培地（但し、5% 熱不活化したFBSを含有）を添加して細胞を刺激した。所与の濃度のペプチド HLBD1 Arg rakを、LPSの添加30 分間後に添加した。細胞上清を、6 時間のインキュベーション後に採取し、遠心分離し、ELISAでTNF-α産生に関して分析した(R&D Systems)。
【００８９】
実験の結果(図 5)によって、ヒト単球由来のマクロファージにおけるTNF-α産生が前記ペプチドで有意にダウンレギュレーションされたことが実証された。
【００９０】
例 6:  インビトロでの抗炎症性および線維素溶解性効果
正常なヒト中皮細胞に対応するMeT-5A 細胞株を、10% ウシ胎児血清 (FBS; PAA Laboratories GmbH), 3.3 nM 上皮細胞成長因子 (EGF; AMS Biotechnology Ltd), 400 nM ヒドロコルチゾン (MP Biomedicals), 20 mM Hepes (PAA Laboratories GmbH) および 870 nM ヒト組換え型インシュリン (Sigma)を添加したM199 培地(GIBCO)中で維持した。細胞密度を1.6x105 細胞/mlに調整し、100 μl の細胞懸濁液をウェルごとに96-ウェルの細胞培養プレート (Sarstedt)に添加した。細胞を48 時間インキュベーションし、細胞を付着させ、コンフルエンス（confluence）まで成長させた。48 時間後、それぞれIL-6 またはPAI-1 アッセイの場合において組換え型 IL-1β(R&D Systems), 0.1 または0.5 ng/mlを5%の熱不活化（heat inactivated）されたFBSを含んでいる以外は上記で特定された培地に添加して細胞を誘導した。所与の濃度の異なるペプチドを、IL-1βで刺激後すぐに添加した。
【００９１】
細胞上清を、インキュベーションの3 または6 時間後に採取し、それぞれIL-6 (R&D Systems) または PAI-1 (Tint-Eliza PAI-1, Trinity Biotech)に特異的なELISAsでIL-6 またはPAI-1に関して分析した。
【００９２】
結果(図 6)は、中皮細胞におけるIL-6 および PAI-1産生が前記ペプチドで有意にダウンレギュレーションしたことを示している。
【００９３】
例 7:  インビトロでの抗炎症効果
ヒト単球に対応するTHP-1 細胞株 (ATCC #TIB-202)を、10% ウシ胎児血清 (FBS; PAA), 1 mM ピルビン酸ナトリウム (Sigma), および 20 mM HEPES (PAA)を添加したRPMI 1640 (PAA Laboratories GmbH)で維持した。細胞密度を、1x106 細胞/mlに調整し、100 μl の細胞懸濁液をウェルごとに96-ウェルの細胞培養プレート (Sarstedt)に添加した。細胞を、10 ng/ml PMA (ホルボール 12-ミリスチン酸エステル 13-アセテート; Sigma) で48 時間処理して単球をマクロファージ様細胞に分化させた。48 時間後、細胞を、 0.1 ng/ml LPS (E. coli 血清型 O55:B5; Sigma)を上記で特定した培地（但し、5% 熱不活化したFBSを含有）を添加して刺激した。示した濃度の異なるペプチドを、LPSの添加後30 minに添加した。細胞上清を、6 時間のインキュベーション後に採取し、遠心分離し、ELISAでTNF-α産生に関して分析した(R&D Systems)。
【００９４】
実験の結果(図 7)によって、ヒト単球由来のマクロファージにおけるTNF-α産生が前記ペプチドで有意にダウンレギュレーションされたことが実証された。
【００９５】
例 8:  抗微生物アッセイ
Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg- またはArg-Arg-Arg Arg-Arg- 含有ペプチド(表 4)を、E.coli, S.aureus およびP. aeruginosaを検査微生物として用いる抗菌アッセイで分析した。
【００９６】
洗浄した細胞を、1% 脳  ―  心臓輸液媒体 (BHI；Brain-heart infusion medium)(Difco, USA)に懸濁した。細菌細胞の濃度を、分光学的に調整した。1% BHIで二倍に段階的に希釈したペプチドを、マイクロタイタープレートのウェルにデュプリケートで添加した(100 μl ／ウェル)。細菌の溶液を、5 μlの容量に添加して、終濃度の約 5 x 105 細胞／mlをえた。ストック溶液の濃度を、常に生存数の計数でチェックした。マイクロタイタープレートを、37゜C で二 時間インキュベーションした。５ μlを、各ウェルからとり、血液寒天プレートに滴下し、一晩37゜Cでインキュベーションした。
【００９７】
種菌の99% 減少を生じているペプチドの濃度を、MMC99と規定した。
【００９８】
【表４】
2011503137.tif 000010
【００９９】
【図１】
2011503137.tif 000014
【図２】
2011503137.tif 000015
【図３】
2011503137.tif 000016
【図４】
2011503137.tif 000017
【図５】
2011503137.tif 000018
【図６】
2011503137.tif 000019
【図７】
2011503137.tif 000020
【配列表】
2011503137000001.app
【国際調査報告】
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