(57)【要約】  本発明は呼吸器疾患を処置、予防または改善するための新規治療剤の開発のためのＴｒｋＢ抗体を記載している。本発明は、また、該状態を処置、予防または改善する方法およびそのための医薬組成物、ならびに呼吸器疾患と関連する状態を処置するための治療的有用性を有する化合物を同定する方法に関する。
2011501760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器疾患と関連する状態を処置、診断、予防または改善する方法であって、それを必要とする対象に有効量のＴｒｋＢ結合分子を投与することを含む方法。
【請求項２】
該ＴｒｋＢ結合分子がＴｒｋＢ作動性(agonizing)抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該抗体がヒト化抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該抗体がチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該抗体がＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合しない、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該抗体がＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合しない、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
抗体がＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：１を含む重鎖可変領域および配列番号：２を含む軽鎖可変領域を含む競合抗体と競合する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
抗体が配列番号：１を含む重鎖可変領域および配列番号：２を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
抗体が１つ以上の配列番号：５、配列番号：９および配列番号：１３を含む重鎖可変領域ならびに１つ以上の配列番号：６、配列番号：１０および配列番号：１４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
該抗体がＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）へ結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
該抗体がＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
抗体がＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：３を含む重鎖可変領域および配列番号：４を含む軽鎖可変領域を含む競合抗体と競合する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が配列番号：３を含む重鎖可変領域および配列番号：４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
抗体が１つ以上の配列番号：７、配列番号：１１および配列番号：１５を含む重鎖可変領域、ならびに１つ以上の配列番号：８、配列番号：１２および配列番号：１４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
呼吸困難の症状を処置、診断、予防または改善する方法であって、それを必要とする対象に有効量のＴｒｋＢ結合分子を投与することを含む方法。
【請求項１６】
該ＴｒｋＢ結合分子がＴｒｋＢ作動性抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該抗体がヒト化抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該抗体がチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
該抗体がＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合しない、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
該抗体がＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合しない、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
抗体がＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：１を含む重鎖可変領域および配列番号：２を含む軽鎖可変領域を含む競合抗体と競合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
抗体が配列番号：１を含む重鎖可変領域および配列番号：２を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
抗体が１つ以上の配列番号：５、配列番号：９および配列番号：１３を含む重鎖可変領域ならびに１つ以上の配列番号：６、配列番号：１０および配列番号：１４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
該抗体がＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
該抗体がＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
抗体がＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：３を含む重鎖可変領域および配列番号：４を含む軽鎖可変領域を含む競合抗体と競合する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
抗体が配列番号：３を含む重鎖可変領域および配列番号：４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体が１つ以上の配列番号：７、配列番号：１１および配列番号：１５を含む重鎖可変領域ならびに１つ以上の配列番号：８、配列番号：１２および配列番号：１４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
レット症候群（ＲＴＴ）と関連する状態を処置、診断、予防または改善する方法であって、それを必要とする対象に有効量のＴｒｋＢ結合分子を投与することを含む方法。
【請求項３０】
該ＴｒｋＢ結合分子がＴｒｋＢ作動性抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該抗体がヒト化抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該抗体がチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
該抗体がＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合しない、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
該抗体がＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合しない、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
抗体がＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：１を含む重鎖可変領域および配列番号：２を含む軽鎖可変領域を含む競合抗体と競合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
抗体が配列番号：１を含む重鎖可変領域および配列番号：２を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
抗体が１つ以上の配列番号：５、配列番号：９および配列番号：１３を含む重鎖可変領域ならびに１つ以上の配列番号：６、配列番号：１０および配列番号：１４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
該抗体がＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
該抗体がＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
抗体がＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：３を含む重鎖可変領域および配列番号：４を含む軽鎖可変領域を含む競合抗体と競合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
抗体が配列番号：３を含む重鎖可変領域および配列番号：４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
抗体が１つ以上の配列番号：７、配列番号：１１および配列番号：１５を含む重鎖可変領域ならびに１つ以上の配列番号：８、配列番号：１２および配列番号：１４を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
呼吸器疾患と関連する状態を処置、診断、予防または改善する方法であって、それを必要とする対象に治療または予防有効量のＴｒｋＢ作動性抗体を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項４４】
呼吸困難の症状を処置、診断、予防または改善する方法であって、それを必要とする対象に治療または予防有効量のＴｒｋＢ作動性抗体を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項４５】
レット症候群（ＲＴＴ）と関連する状態を処置、診断、予防または改善する方法であって、それを必要とする対象に治療または予防有効量のＴｒｋＢ作動性抗体を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
チロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）はＴｒｋＡおよびＴｒｋＣを含む１回膜貫通受容体チロシンキナーゼのファミリーに属する。これらのチロシンキナーゼ受容体（ｔｒｋ）はニューロトロフィンの活性を介在する。ニューロトロフィンはニューロンの生存および発達のために必要であり、ニューロン構造およびシナプス可塑性の調節を介してシナプス伝達を調節する。ニューロトロフィンは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）を含むが、これらに限定されない（Lo, KY et al., (2005) J. Biol. Chem., 280:41744-52）。
【背景技術】
【０００２】
ＴｒｋＢはＢＤＮＦの高親和性受容体であり（Minichiello, et al., Neuron 21:335-45 (1998)）、脳、特に新皮質、海馬、線条体および脳幹において高度に発現され；アイソタイプは、また、骨格筋において見出すことができる。ｔｒｋへのニューロトロフィン結合は受容体を活性化し、二量体化し、受容体の細胞内ドメインの特定のチロシン残基を自己リン酸化する（Jing, et al., (1992) Neuron 9:1067-1079; Barbacid, (1994) J. Neurobiol. 25:1386-1403; Bothwell, (1995) Ann. Rev. Neurosci. 18:223-253; Segal and Greenberg, (1996) Ann. Rev. Neurosci. 19:463-489; Kaplan and Miller, (2000) Curr. Opinion Neurobiol. 10:381-391）。これらのホスホチロシン残基は神経細胞死の抑制、神経突起伸長の促進およびニューロトロフィンの他の効果を引き起こす細胞シグナル伝達カスケードの成分に対するドッキング部位として働く。例えば、Ｓｈｃ、ＦＲＳ−２、ＳＨ２Ｂ、ｒＡＰＳおよびＰＬＣγはリン酸化チロシン残基を介してＴｒｋＢと相互作用する。これらのアダプター分子と活性化ＴｒｋＢの結合によって、マイトージェン活性タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよびＰＬＣγ経路を含むシグナル伝達経路が開始され、それによりニューロトロフィンの作用を介在する（Lo, KY et al., (2005) J. Biol. Chem., 280:41744-52）。
【０００３】
１９６６年にＤｒ．Ａｎｄｒｅａｓ  Ｒｅｔｔにより最初に確認されたレット症候群（ＲＴＴ）は、遅発神経発達障害から生じる深刻なＣＮＳ障害である。それは、もっぱら、１／１０，０００−１５，０００の生児出生の割合ですべての民族の女児を冒す。ＲＴＴを有するいくつかの個体は若年で死亡する；しかしながら、多数は成人になることができ、深刻な障害を受ける。患者の２５％までが心／呼吸不全で死亡する。今までのところ該疾患に対する有効な処置はない。
【０００４】
明白な正常発達期間後、罹患している女児は６−１８月齢にてＲＴＴ症状を発症し、今後数年にわたって進行的に悪化する。症状は、出生時は正常の頭囲、次に頭部成長の減速；後天的言語障害、コミュニケーション機能障害、認識機能障害；意図的な手の動きから型通りの手の動き（曲がりくねった手のもみ合わせ、手を洗う、拍手、軽くたたくなど）への変化；運動障害または悪化（歩行失調、硬直など）；起きている間の呼吸困難；早期乳児期からの睡眠パターン障害；筋肉疲労および筋失調症を伴う異常筋緊張；末梢血管運動神経障害；進行性側弯症または後弯症；および成長遅延を含む。
【０００５】
該障害は、また、中枢自律神経機能障害により特徴付けられ、Ｒｅｔｔ患者は以下の症状のいくつか、またはすべてを示す：呼吸停止、浅呼吸、過呼吸、遷延性無呼吸期間からなる多発性呼吸律動不整；ベースラインの心臓の迷走神経緊張の減少による心不整脈；および圧反射心臓感受性。これらの症状は致命的であり、Ｒｅｔｔ患者に突然死の危険性を与える。それらの患者は、脳幹未成熟ならびに心肺ネットワーク内の、および起きている間の視床下部または辺縁皮質からの統合的阻害の欠如を示す。さらに、脳幹ニューロトロフィンシグナル伝達（ＮＧＦおよびＢＤＮＦ）の変化がＲｅｔｔ患者において報告され、モノアミン（セロトニン、ノルエピネフリン）および神経ペプチド（サブスタンスＰ）レベルが減少する。
【０００６】
ＲＴＴは大半の場合に転写リプレッサーＭｅＣＰ２（メチル−ＣｐＧシトシン結合タンパク質２）をコードするＸ染色体関連遺伝子ｍｅｃｐ２における変異により引き起こされる単一遺伝子疾患である。ＭｅＣＰ２は優先的にメチル化ＤＮＡに結合する。
【０００７】
ニューロトロフィン因子ＢＤＮＦはＭｅＣＰ２の既知の直接標的であり、そしてノルエピネフリンおよびセロトニン神経に対する重要な栄養因子である。驚くべきことに、Ｍｅｃｐ２−ＫＯマウスは脳ＢＤＮＦが不足しており、脳ＢＤＮＦの遺伝子過剰発現が寿命を延長させ、いくつかの運動障害から救うことができる。現在、レット症候群および他の呼吸器疾患のような状態のためのＢＤＮＦ治療戦略を探し出す必要性が存在する；このような戦略ではチロシンキナーゼ受容体ＴｒｋＢのようなこのようなＢＤＮＦの結合パートナーを標的としている。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明は呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））を処置、診断、予防および／または改善する方法であって、チロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）の単離された抗体アゴニスト（本明細書において“ＴｒｋＢ作動性(agonizing)抗体”、“ＴｒｋＢ結合分子”などとも称する）を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。他の態様において、抗体は一本鎖抗体である。いくつかの態様において、抗体はチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない。いくつかの態様において、抗体はヒトバージョンのＴｒｋＢに結合することができ、他の種のＴｒｋＢに結合することができない。いくつかの態様において、抗体はヒトバージョンのＴｒｋＢに結合することができ、他の種のＴｒｋＢに同様に結合することができる（すなわち、交差反応することができる）（例えば、マウス、ラットおよび／または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）を含む）。
【０００９】
いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合する。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合する。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：３を含む重鎖可変領域および配列番号：４を含む軽鎖可変領域を含む競合抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体は配列番号：７を含む重鎖可変領域および配列番号：８を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：１１を含む重鎖可変領域および配列番号：１２を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：１５を含む重鎖可変領域および配列番号：１６を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：７、配列番号：１１および／または配列番号：１５を含む重鎖可変領域ならびに配列番号：８、配列番号：１２および／または配列番号：１６を含む軽鎖可変領域の組合せを含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：３を含む重鎖可変領域および配列番号：４を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１０】
いくつかの態様において、本方法の抗体はＢＤＮＦ模倣物として作用し、例えば、該リガンドの栄養活性を反復することができる（したがって、神経保護および神経栄養効果を持続することができる）。
【００１１】
いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合しない。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合しない。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：１を含む重鎖可変領域および配列番号：２を含む軽鎖可変領域を含む競合抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体は配列番号：５を含む重鎖可変領域および配列番号：６を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：９を含む重鎖可変領域および配列番号：１０を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：１３を含む重鎖可変領域および配列番号：１４を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：５、配列番号：９および／または配列番号：１３を含む重鎖可変領域ならびに配列番号：６、配列番号：１０および／または配列番号：１４を含む軽鎖可変領域の組合せを含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：１を含む重鎖可変領域および配列番号：２を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１２】
ＴｒｋＢ作動性抗体はＴｒｋＢと相互作用し、それによりＴｒｋＢ機能を調節することができる。ＴｒｋＢ作動性結合分子はＴｒｋＢ経路シグナル伝達を促進するために使用することができ；したがって、ＴｒｋＢ作動性結合分子は（例えば、罹患している対象におけるＴｒｋＢの変異バージョンまたはそのタンパク質インタラクターの１つによる）、例えば、異常に低いレベルのＴｒｋＢ経路シグナル伝達と関連する呼吸器疾患の症状を診断、改善、その疾患から保護、およびその疾患を処置するために使用することができる。例えば、ＴｒｋＢの変異バージョンまたはそのタンパク質インタラクターの１つによる、ＴｒｋＢシグナル伝達の異常下方調節と関連する障害の非限定的な例は、（ｉ）ＭｅＣＰ２（これはＢＤＮＦに直接結合する）をコードする遺伝子における変異により特徴づけられるレット症候群（ＲＴＴ）；および（ｉｉ）ＴｒｋＢ機能欠失変異による深刻な肥満および発育遅延である（Giles, S., et al. (2004) Nature Neuroscience 7:1187-9）。
【００１３】
本発明は、また、治療または予防有効量のＴｒｋＢ作動性抗体；および医薬担体を含む医薬組成物を投与することを含む、呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。いくつかの態様において、医薬組成物はさらに呼吸窮迫の症状（例えば、呼吸困難）を処置、診断、予防および／または改善することができる別の独立した薬物、例えば、ノルエピネフリンおよび／またはセロトニン経路の小分子活性化因子（例は三環式抗鬱剤デシプラミン（ＤＭＩ）、セロトニン１Ａ受容体部分的アゴニスト、ブスピロンおよび潜在的により選択的な抗鬱剤フルオキセチンおよびレボキセチンである）、グルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の活性化因子：アンパカインＣＸ５４６、プロスタグランジン、プロゲステロンまたはＴｒｋＢ活性の増強剤（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤）を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））または呼吸困難の症状の処置、診断、予防および／または改善に有効な治療および／または予防有効量の第２の薬物をＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）と共に個体に投与する。いくつかの態様において、第２の薬物およびＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）を混合物として投与する。いくつかの態様において、第２の薬物はノルエピネフリンおよび／またはセロトニン経路の小分子活性化因子（例は三環式抗鬱剤デシプラミン（ＤＭＩ）、セロトニン１Ａ受容体部分的アゴニスト、ブスピロンならびに潜在的により選択的な抗鬱剤フルオキセチンおよびレボキセチンである）、グルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の活性化因子：アンパカイン、ＣＸ５４６、プロスタグランジン、プロゲステロンまたはＴｒｋＢ活性の増強剤（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤）からなる群から選択される。
【００１５】
本発明は、また、ＴｒｋＢ作動性抗体（または同じものを含む医薬組成物）を投与することを含む、呼吸困難の症状、例えば、呼吸器疾患にて一般的に見られるものを処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。該症状は呼吸困難（例えば、喘鳴またはゼイゼイ音、呼吸停止、浅呼吸、過呼吸、遷延性無呼吸）、血液の酸素化の低下または減少（例えば、チアノーゼ）（例えば、酸素の吸収障害、血液における肺の不十分な潅流などによる）、ノルエピネフリン（ＮＥ）含有量の減少、骨髄におけるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現ニューロンの減少および胸痛を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、該方法は治療または予防有効量のチロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）の抗体アゴニストを個体に投与することを含む。いくつかの態様において、該方法は治療または予防有効量のＴｒｋＢ作動性抗体および医薬担体を含む医薬組成物を個体に投与することを含む。いくつかの態様において、個体は１つ以上の呼吸器疾患を有し、そして／または１つ以上の呼吸困難の症状を経験している。いくつかの態様において、個体は呼吸困難の症状に感染しやすい。いくつかの態様において、個体はレット症候群を有する。
【００１６】
本発明は、神経細胞死を抑制する方法であって、ＴｒｋＢ作動性抗体（または同じものを含む医薬組成物）を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。他の態様において、抗体は一本鎖抗体である。いくつかの態様において、抗体はチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない。いくつかの態様において、抗体はニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＲに結合しない。いくつかの態様において、抗体はヒトバージョンのＴｒｋＢに結合することができ、他の種のＴｒｋＢに結合することができない。いくつかの態様において、抗体はヒトバージョンのＴｒｋＢに結合することができ、他の種のＴｒｋＢに同様に結合することができる（すなわち、交差反応することができる）（例えば、マウス、ラットおよび／または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）を含む）。
【００１７】
いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。
【００１８】
種々の態様において、本発明は、ＴｒｋＢの１つ以上の生物学的機能を調節する（例えば、促進する）ＴｒｋＢ作動性抗体にて、呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））または呼吸困難の症状を処置、診断、予防および／または改善する方法、または神経細胞死を抑制する方法を提供する。例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢの二量体化、次にＴｒｋＢ細胞内ドメインにおいて特定のチロシン残基の自己リン酸化を調節することができる。さらなる例として、ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢ関連細胞内シグナル伝達カスケード（例えば、マイトージェン活性タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよびＰＬＣγ経路）を開始させ、神経細胞死の抑制、神経突起伸長の促進およびニューロトロフィンの他の効果を引き起こすことができる。
【００１９】
ＴｒｋＢ作動性抗体は、例えば、ＴｒｋＢ（例えば、ＴｒｋＢの特定のドメインまたはエピトープ内、ＴｒｋＢのリガンド結合ドメインまたはリガンド結合ドメインの外側）に結合する抗体およびこのような抗体の抗原結合部分を含むポリペプチドを含む。ＴｒｋＢ作動性抗体は、また、結合部分が抗体由来ではなく、例えば、免疫グロブリン様フォールドを有するポリペプチド由来ＴｒｋＢ作動性抗体であり、抗原結合部分がランダム化、選択および親和性成熟を介してＴｒｋＢに結合するように加工された分子を含む。
【００２０】
種々の態様において、本発明は、ヒトＴｒｋＢ内のエピトープに結合し、かつ非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）のＴｒｋＢタンパク質（またはそれらの部分）と交差反応するＴｒｋＢアゴニスト抗体にて、呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））または呼吸困難の症状を処置、診断、予防および／または改善する方法、または神経細胞死を抑制する方法を提供する。種々の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体は齧歯動物種のＴｒｋＢ（例えば、マウスＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢ）と交差反応する。種々の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体はヒトＴｒｋＡまたはＴｒｋＣと交差反応する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、ヒトＴｒｋＢ内のエピトープに結合するが、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）のＴｒｋＢタンパク質（またはそれらの部分）と交差反応しないＴｒｋＢ抗体にて、呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））または呼吸困難の症状を処置、診断、予防および／または改善する方法、または神経細胞死を抑制する方法を提供する。種々の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体は齧歯動物種のＴｒｋＢ（例えば、マウスＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢ）と交差反応しない。種々の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体はヒトＴｒｋＡまたはＴｒｋＣ、またはニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＲと交差反応しない。
【００２２】
種々の態様において、本方法のＴｒｋＢ作動性抗体の抗原結合部分は直鎖エピトープに結合する。種々の態様において、該抗原結合部分は非直鎖エピトープに結合する。
【００２３】
種々の態様において、本方法のＴｒｋＢ作動性抗体の抗原結合部分は解離定数（ＫＤ）１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５ｎＭまたは０．１ｎＭ以下にてＴｒｋＢに結合する。
【００２４】
いくつかの態様において、抗体はヒトバージョンのＴｒｋＢに結合することができ、他の種のＴｒｋＢに結合することができない。いくつかの態様において、抗体はヒトバージョンのＴｒｋＢに結合することができ、他の種のＴｒｋＢに同様に結合することができる（すなわち、交差反応することができる）（例えば、マウス、ラットおよび／または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）を含む）。
【００２５】
種々の態様において、本方法のＴｒｋＢ作動性抗体の抗原結合部分はＫＤ０．３ｎＭ以下にて非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはチンパンジー）のＴｒｋＢに結合する。
【００２６】
種々の態様において、該抗原結合部分はＫＤ０．５ｎＭ以下にてマウスＴｒｋＢに結合する。
【００２７】
１つの態様において、本方法のＴｒｋＢ作動性抗体はヒト抗体である。他の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体は非ヒト抗体である。他の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体はキメラ（例えば、ヒト化、ヒューマニアード(humaneered)）抗体である。
【００２８】
１つの態様において、本方法のＴｒｋＢ作動性抗体の抗原結合部分はヒト抗体の抗原結合部分である。該抗原結合部分はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の抗原結合部分であり得る。
【００２９】
本方法のＴｒｋＢ作動性抗体は、例えば、抗体のＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメントを含む。
【００３０】
いくつかの態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体をペグ化する。いくつかの態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体はペグ化Ｆａｂフラグメントである。
【００３１】
１つの態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体は一本鎖Ｆｖを含む。
【００３２】
１つの態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体はダイアボディ（例えば、一本鎖ダイアボディまたは２つのポリペプチド鎖を有するダイアボディ）を含む。
【００３３】
いくつかの態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体の抗原結合部分は下記のいずれかのアイソタイプの抗体由来である：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４。いくつかの態様において、該抗体の抗原結合部分はＩｇＡまたはＩｇＥアイソタイプの抗体由来である。
【００３４】
本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体は１つ以上の多くの生物学的活性を示すことができる。種々の態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＢＤＮＦ、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）および／またはニューロトロフィン５（ＮＴ−５）へのＴｒｋＢ結合を阻害する。例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＢＤＮＦ、ＮＴ−４および／またはＮＴ−５へのＴｒｋＢ結合を対照と比較して（例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体の非存在下での結合と比較して）少なくとも５％、１０％、１５％、２５％または５０％阻害する。他の態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＢＤＮＦ、ＮＴ−４および／またはＮＴ−５へのＴｒｋＢ結合を阻害せず、全く競合しない。
【００３５】
１つの態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合し、それによってＴｒｋＢ経路シグナル伝達の生物学的活性および結果を調節する。非限定的な例として、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体は（例えば、ＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合することにより）ＴｒｋＢ経路活性化およびシグナル伝達を活性化、強化または永続化することができる。いくつかの態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢリガンド結合ドメインに結合し、それによってＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合する。
【００３６】
いくつかの態様において、本方法の抗体はＢＤＮＦ模倣物として作用し、例えば、該リガンドの栄養活性を反復することができる（したがって、神経保護および神経栄養効果を持続することができる）。
【００３７】
他の態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢリガンド結合ドメインに結合せず、ＴｒｋＢとの結合に対してＢＤＮＦと競合しないが、それにもかかわらずＴｒｋＢシグナル伝達経路を調節することができる（例えば、ＴｒｋＢ経路活性化およびシグナル伝達を活性化、強化または永続化する）。
【００３８】
種々の態様において、本発明は、ＴｒｋＢにより直接または間接様式において通常、調節される下流生物学的活性を調節するＴｒｋＢ作動性抗体にて、呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））または呼吸困難の症状を処置、診断、予防および／または改善する方法、または神経細胞死を抑制する方法を提供する。該活性の非限定的な例はＴｒｋＢの二量体化、次にＴｒｋＢ細胞内ドメインにおいてチロシン残基の自己リン酸化；ＴｒｋＢ関連細胞内シグナル伝達カスケード、例えば、マイトージェン活性タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよびＰＬＣγ経路の開始；ならびに神経細胞死の抑制、神経突起伸長の促進およびニューロトロフィンの他の効果を含む。例えば、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体は神経細胞死を対照と比較して（例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体の非存在下での活性と比較して）少なくとも５％、１０％、１５％、２５％または５０％以上抑制する。さらなる例として、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢタンパク質レベルを対照と比較して（例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体の非存在下での活性と比較して）少なくとも５％、１０％、１５％、２５％または５０％以上安定化する。
【００３９】
種々の態様において、本発明は非抗体ＴｒｋＢ作動性分子にて呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））または呼吸困難の症状を処置、診断、予防および／または改善する方法、または神経細胞死を抑制する方法を提供する。非抗体ＴｒｋＢアゴニスト分子は非抗体ポリペプチド、例えば、以下のいずれかのものなどの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）フォールド由来アミノ酸配列を有するＴｒｋＢ結合ドメインを含む：テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ−受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質、色素タンパク質、ミエリン膜接着分子、Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ−細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２およびＶＣＡＭ−１のＩ−ｓｅｔドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ−細胞抗原受容体、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬまたはソーマチン。一般的に、ＴｒｋＢ結合ドメインのアミノ酸配列は、免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列と比較して、ＴｒｋＢ結合ドメインが特異的にＴｒｋＢに結合するように改変される（すなわち、ここで、免疫グロブリン様フォールドは特異的にＴｒｋＢに結合しない）。
【００４０】
種々の態様において、ＴｒｋＢ結合ドメインのアミノ酸配列はフィブロネクチン、サイトカイン受容体またはカドヘリンの免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも６５％、７５％、８０％、８５％または９０％同一）である。
【００４１】
種々の態様において、ＴｒｋＢ結合ドメインのアミノ酸配列は以下のいずれかの免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８０％、８５％または９０％同一である：テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ−受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質、色素タンパク質、ミエリン膜接着分子、Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ−細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２およびＶＣＡＭ−１のＩ−ｓｅｔドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ−細胞抗原受容体、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬまたはソーマチン。
【００４２】
種々の態様において、ＴｒｋＢ結合ドメインはＫＤ１ｎＭ以下（例えば、０．５ｎＭ、０１ｎＭ）にてＴｒｋＢに結合する。
【００４３】
いくつかの態様において、Ｉｇ様フォールドはフィブロネクチンのＩｇ様フォールド、例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンのＩｇ様フォールド（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンのモジュール１０のＩｇ様フォールド）である。
【００４４】
本発明は、また、本明細書に記載されているＴｒｋＢアゴニスト抗体を含む医薬組成物を使用する方法を特徴とする。該組成物は、例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体および薬学的に許容される担体を含む。
【００４５】
１つの局面において、本発明は、治療および／または予防有効量のＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）を投与することにより、神経細胞死を抑制するか、または神経突起伸長を促進する方法を特徴とする。これらの方法は組織または生物学的サンプル（例えば、ＴｒｋＢ発現神経細胞）を治療および／または予防有効量のＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）と接触させ、それによりＴｒｋＢシグナル伝達経路を活性化および／または安定化し、ニューロトロフィン、例えば、ＢＤＮＦの効果から保護することを含む。ＴｒｋＢアゴニスト抗体（または同じものを含む医薬組成物）は神経細胞死を抑制するか、または神経突起伸長を促進する有効量にて投与することができる。
【００４６】
いくつかの態様において、該方法はＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）の腹膜内注射投与を特徴とする。
【００４７】
本発明の１つ以上の態様の詳細は添付の図面および以下に記載されている。本発明の他の特徴、対象および利点は本記載および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１はＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したＭｅｃｐ２ノックアウトマウスにおいて見られる体重および食糧摂取の低下の図である。図１Ａにおいて、上から１段目（データの点として白色四角記号）は塩水を投与したＭｅｃｐ２野生型マウスを表す。上から２段目（データの点として黒色四角記号）はＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したＭｅｃｐ２野生型マウスを表す。下から２段目（データの点として白色丸記号）は塩水を投与したＭｅｃｐ２ノックアウトマウスを表す。下から１段目（データの点として黒色丸記号）はＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したＭｅｃｐ２ノックアウトマウスを表す。図１Ｂにおいて、白色の棒は塩水を投与したＭｅｃｐ２野生型マウスを表す。黒色の棒はＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したＭｅｃｐ２野生型マウスを表す。薄灰色の棒は塩水を投与したＭｅｃｐ２ノックアウトマウスを表す。濃灰色の棒はＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したＭｅｃｐ２ノックアウトマウスを表す。図１Ｂの左は６週齢での測定、右は８週齢での測定を表す。
【００４９】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したＭｅｃｐ２ノックアウトマウスにおける握力および体脂肪組成物の改善の図である。図２において、データの点として四角記号は塩水（ＳＡＬ）またはＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｃ２０で処置された野生型（ＷＴ）マウスを表し；データの点として丸記号は塩水（ＳＡＬ）またはＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｃ２０で処置されたノックアウト（ＫＯ）マウスを表す。左の図２Ａは後肢での測定、そして右の図２Ａは前肢での測定を表す。左の図２Ｂは体脂肪量、そして右の図２Ｂは除脂肪量を表す。
【００５０】
【図３】図３はＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したＭｅｃｐ２ノックアウトマウスにおいて見られる寿命の延長の図である。図３Ａにおいて、ノックアウトマウスはＫＯとして、野生型はＷＴとして表す。ＳＡＬは塩水を投与したことを意味し、そしてＣ２０はＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したことを意味する。図３Ｂにおいて、ノックアウトマウスはＫＯとして表し、ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＣ２０として表す。図３に示されるとおり、ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂ−処理ノックアウトマウス（ＫＯ−Ｃ２０）は塩水処理ＫＯマウスの少なくとも２倍の年齢まで生存することができる。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明は、チロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）の単離された抗体アゴニスト（また、“ＴｒｋＢ作動性抗体”などと称される）にて呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。
【００５２】
該方法はいずれかのＴｒｋＢアゴニスト抗体を使用することができ、具体的に挙げられているものは非限定的な態様と考慮する。
【００５３】
本発明は、ＴｒｋＢに結合する分子（“ＴｒｋＢ作動性抗体”）、特にヒトＴｒｋＢに結合し、その機能を調節するヒト抗体およびそれらの部分を提供する。ＴｒｋＢのエピトープおよびこれらのエピトープに結合する薬物は、また、本出願に提供される。
【００５４】
ヒトＴｒｋＢの全長配列はＧｅｎｂａｎｋ（登録商標）受入番号ＡＡＢ３３１０９（ＧＩ：９１３７１８）の下に見られ、８２２残基を有する。それはＧｅｎｂａｎｋ（登録商標）受入番号Ｓ７６４７３（ＧＩ：９１３７１７）を有するｍＲＮＡ配列によってコードされる。ＴｒｋＢは脳において広範に分布するニューロトロフィン受容体である。それは細胞外リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、膜貫通領域および細胞内チロシンキナーゼドメインからなるマルチドメイン膜貫通タンパク質である。ＴｒｋＢはＢＤＮＦの高親和性受容体であり、同様にニューロトロフィン４（ＮＴ−４）に結合することができる。
【００５５】
いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。他の態様において、抗体は一本鎖抗体である。いくつかの態様において、抗体はチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない。いくつかの態様において、抗体はヒトバージョンのＴｒｋＢに結合することができ、他の種のＴｒｋＢに結合することができない。いくつかの態様において、抗体はヒトバージョンのＴｒｋＢに結合することができ、他の種のＴｒｋＢに同様に結合することができる（すなわち、交差反応することができる）（例えば、マウス、ラットおよび／または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）を含む）。
【００５６】
いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合する。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合する。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：３を含む重鎖可変領域および配列番号：４を含む軽鎖可変領域を含む競合抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体は配列番号：７を含む重鎖可変領域および配列番号：８を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：１１を含む重鎖可変領域および配列番号：１２を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：１５を含む重鎖可変領域および配列番号：１６を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：７、配列番号：１１および／または配列番号：１５を含む重鎖可変領域ならびに配列番号：８、配列番号：１２および／または配列番号：１６を含む軽鎖可変領域の組合せを含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：３を含む重鎖可変領域および配列番号：４を含む軽鎖可変領域を含む。
【００５７】
いくつかの態様において、本方法の抗体はＢＤＮＦ模倣物として作用し、例えば、該リガンドの栄養活性を反復することができる（したがって、神経保護および神経栄養効果を持続することができる）。
【００５８】
いくつかの態様において、本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢリガンド結合部位に結合し、そして／またはＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合する。ＴｒｋＢのリガンド結合部位に結合する典型的な抗体は抗体Ａ１０Ｆ１８．２（本明細書において“Ａ１０Ｆ１８”または“Ａ１０”とも称される）である。抗体Ａ１０の重鎖可変領域は配列番号：３に示し、そして抗体Ａ１０の軽鎖可変領域は配列番号：４に示す。
【００５９】
したがって、本発明はＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：３を含む重鎖可変領域および配列番号：４を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合するアゴニスト抗体を提供する。いくつかの態様において、本発明の抗体は配列番号：３および／または４の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つを含む。本発明の範囲を限定する意図はないが、ＣＤＲ３が抗体Ａ１０の結合において重要な役割を果たすことが信じられている。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗体は配列番号：７および／または８を含む。しかしながら、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２は、結合においても役割を果たす。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗体は配列番号：１１および／または１２または１５および／または１６を含む。
【００６０】
いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合しない。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合しない。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：１を含む重鎖可変領域および配列番号：２を含む軽鎖可変領域を含む競合抗体と競合する。いくつかの態様において、抗体は配列番号：５を含む重鎖可変領域および配列番号：６を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：９を含む重鎖可変領域および配列番号：１０を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：１３を含む重鎖可変領域および配列番号：１４を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：５、配列番号：９および／または配列番号：１３を含む重鎖可変領域；および配列番号：６、配列番号：１０および／または配列番号：１４を含む軽鎖可変領域の組合せを含む。いくつかの態様において、抗体は配列番号：１を含む重鎖可変領域および配列番号：２を含む軽鎖可変領域を含む。
【００６１】
いくつかの態様において、本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢリガンド結合部位に結合せず、そして／またはＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合しない。ＴｒｋＢのリガンド結合部位に結合しない典型的な抗体は抗体Ｃ２０．ｉ．１．１（本明細書において“Ｃ２０．ｉ１”、“Ｃ２０．Ｉ１”および“Ｃ２０”とも称される）である。抗体Ｃ２０の重鎖可変領域は配列番号：１に示す。したがって、本発明はＴｒｋＢへの結合に対して配列番号：１を含む重鎖可変領域および配列番号：２を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合するアゴニスト抗体を提供する。いくつかの態様において、本発明の抗体は配列番号：１および／または２の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つを含む。本発明の範囲を限定する意図はないが、ＣＤＲ３が抗体Ｃ２０の結合において重要な役割を果たすことが信じられている。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗体は配列番号：５および／または６を含む。しかしながら、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２は、また、結合において役割を果たす。したがって、いくつかの態様において、本発明の抗体は配列番号：９および／または１０または１３および／または１４を含む。
【００６２】
ＴｒｋＢ作動性抗体はＴｒｋＢと相互作用し、それによりＴｒｋＢ機能を調節することができる。ＴｒｋＢ作動性結合分子はＴｒｋＢ経路シグナル伝達を促進するために使用することができ；したがって、ＴｒｋＢ作動性結合分子は（例えば、罹患している対象におけるＴｒｋＢの変異バージョンまたはそのタンパク質インタラクターの１つによる）、例えば、異常に低いレベルのＴｒｋＢ経路シグナル伝達と関連する呼吸器疾患の症状を診断、改善、その疾患から保護、およびその疾患を処置するために使用することができる。例えば、ＴｒｋＢの変異バージョンまたはそのタンパク質インタラクターの１つによる、ＴｒｋＢシグナル伝達の異常下方調節と関連する障害の非限定的な例は、ＭｅＣＰ２（これはＢＤＮＦに直接結合する）をコードする遺伝子における変異により特徴づけられるレット症候群（ＲＴＴ）である。
【００６３】
本発明は、また、治療または予防有効量のＴｒｋＢ作動性抗体；および医薬担体を含む医薬組成物にて呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。いくつかの態様において、医薬組成物はさらに呼吸窮迫の症状（例えば、呼吸困難）を処置、診断、予防および／または改善することができる別の独立した薬物、例えば、ノルエピネフリンおよび／またはセロトニン経路の小分子活性化因子（例は三環式抗鬱剤デシプラミン（ＤＭＩ）、セロトニン１Ａ受容体部分的アゴニスト、ブスピロンならびに潜在的により選択的な抗鬱剤フルオキセチンおよびレボキセチンである）、グルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の活性化因子：アンパカイン、ＣＸ５４６、プロスタグランジン、プロゲステロンまたはＴｒｋＢ活性の増強剤（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤）を含む。
【００６４】
該方法は治療または予防有効量のいずれかのＴｒｋＢアゴニスト抗体を含む医薬組成物を使用することができ、具体的に挙げられている抗体は非限定的な態様と考慮する。
【００６５】
本発明は、また、呼吸困難の症状、例えば、呼吸器疾患にて一般的に見られるものを処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。該症状は呼吸困難（例えば、喘鳴またはゼイゼイ音、呼吸停止、浅呼吸、過呼吸、遷延性無呼吸）、血液の酸素化の低下または減少（例えば、チアノーゼ）（例えば、酸素の吸収障害、血液における肺の不十分な潅流などによる）および胸痛を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、該方法は治療または予防有効量のチロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）の抗体アゴニストを個体に投与することを含む。いくつかの態様において、該方法は治療または予防有効量のＴｒｋＢ作動性抗体および医薬担体を含む医薬組成物を個体に投与することを含む。いくつかの態様において、個体は１つ以上の呼吸器疾患を有し、そして／または１つ以上の呼吸困難の症状を経験している。いくつかの態様において、個体は呼吸困難の症状に感染しやすい。いくつかの態様において、個体はレット症候群を有する。
【００６６】
該方法はいずれかのＴｒｋＢアゴニスト抗体（またはいずれかのＴｒｋＢアゴニスト抗体を含む医薬組成物）を使用することができ、具体的に挙げられている抗体は非限定的な態様と考慮する。
【００６７】
いくつかの態様において、呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））の処置、診断、予防および／または改善に有効な治療および／または予防有効量の第２の薬物をＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）と組み合わせて個体に投与する。いくつかの態様において、第２の薬物およびＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）を混合物として投与する。いくつかの態様において、第２の薬物がノルエピネフリンおよび／またはセロトニン経路の小分子活性化因子（例は三環式抗鬱剤デシプラミン（ＤＭＩ）、セロトニン１Ａ受容体部分的アゴニスト、ブスピロンならびに潜在的により選択的な抗鬱剤フルオキセチンおよびレボキセチンである）、グルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の活性化因子：アンパカイン、ＣＸ５４６、プロスタグランジン、プロゲステロンまたはＴｒｋＢ活性の増強剤（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤）からなる群から選択される。
【００６８】
いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。
【００６９】
種々の態様において、本発明はＴｒｋＢの１つ以上の生物学的機能を調節する（例えば、促進する）ＴｒｋＢ作動性抗体にて呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））または呼吸困難の症状を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢの二量体化、次にＴｒｋＢ細胞内ドメインにおいて特定のチロシン残基の自己リン酸化を調節することができる。さらなる例として、ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢ関連細胞内シグナル伝達カスケード（例えば、マイトージェン活性タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよびＰＬＣγ経路）を開始させ、神経細胞死の抑制、神経突起伸長の促進およびニューロトロフィンの他の効果を引き起こすことができる。
【００７０】
ＴｒｋＢ作動性抗体は、例えば、ＴｒｋＢ（例えば、ＴｒｋＢの特定のドメインまたはエピトープ内、ＴｒｋＢのリガンド結合ドメインまたはリガンド結合ドメインの外側）に結合する抗体およびこのような抗体の抗原結合部分を含むポリペプチドを含む。ＴｒｋＢ作動性抗体は、また、結合部分が抗体由来ではなく、例えば、免疫グロブリン様フォールドを有するポリペプチド由来ＴｒｋＢ作動性抗体であり、抗原結合部分がランダム化、選択および親和性成熟を介してＴｒｋＢに結合するように加工された分子を含む。
【００７１】
種々の態様において、本発明はヒトＴｒｋＢ内のエピトープに結合し、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）のＴｒｋＢタンパク質（またはそれらの部分）と交差反応するＴｒｋＢアゴニスト抗体にて呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））または呼吸困難の症状を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。種々の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体は齧歯動物種のＴｒｋＢ（例えば、マウスＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢ）と交差反応する。種々の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体はヒトＴｒｋＡまたはＴｒｋＣと交差反応する。
【００７２】
他の態様において、本発明はヒトＴｒｋＢ内のエピトープに結合するが、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）のＴｒｋＢタンパク質（またはそれらの部分）と交差反応しないＴｒｋＢ抗体にて呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））または呼吸困難の症状を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。種々の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体は齧歯動物種のＴｒｋＢ（例えば、マウスＴｒｋＢ、ラットＴｒｋＢ）と交差反応しない。種々の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体はヒトＴｒｋＡもしくはＴｒｋＣまたはニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＲと交差反応しない。
【００７３】
種々の態様において、本方法のＴｒｋＢ作動性抗体の抗原結合部分は直鎖エピトープに結合する。種々の態様において、該抗原結合部分は非直鎖エピトープに結合する。
【００７４】
種々の態様において、本方法のＴｒｋＢ作動性抗体の抗原結合部分は解離定数（ＫＤ）１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５ｎＭまたは０．１ｎＭ以下にてＴｒｋＢに結合する。
【００７５】
いくつかの態様において、抗体はヒトバージョンのＴｒｋＢに結合することができ、他の種のＴｒｋＢに結合することができない。いくつかの態様において、抗体はヒトバージョンのＴｒｋＢに結合することができ、他の種のＴｒｋＢに同様に結合することができる（すなわち、交差反応することができる）（例えば、マウス、ラットおよび／または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）を含む）。
【００７６】
種々の態様において、本方法のＴｒｋＢ作動性抗体の抗原結合部分はＫＤ０．３ｎＭ以下にて非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはチンパンジー）のＴｒｋＢに結合する。
【００７７】
種々の態様において、該抗原結合部分はＫＤ０．５ｎＭ以下にてマウスＴｒｋＢに結合する。
【００７８】
１つの態様において、本方法のＴｒｋＢ作動性抗体はヒト抗体である。他の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体は非ヒト抗体である。他の態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体はキメラ（例えば、ヒト化、ヒューマニアード）抗体である。
【００７９】
１つの態様において、本方法のＴｒｋＢ作動性抗体の抗原結合部分はヒト抗体の抗原結合部分である。該抗原結合部分はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の抗原結合部分であり得る。
【００８０】
本方法のＴｒｋＢ作動性抗体は、例えば、抗体のＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメントを含む。
【００８１】
いくつかの態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体をペグ化する。いくつかの態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体はペグ化Ｆａｂフラグメントである。
【００８２】
１つの態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体は一本鎖Ｆｖを含む。
【００８３】
１つの態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体はダイアボディ（例えば、一本鎖ダイアボディまたは２つのポリペプチド鎖を有するダイアボディ）を含む。
【００８４】
いくつかの態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体の抗原結合部分は下記のいずれかのアイソタイプの抗体由来である：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４。いくつかの態様において、該抗体の抗原結合部分はＩｇＡまたはＩｇＥアイソタイプの抗体由来である。
【００８５】
１つの態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合し、それによりＴｒｋＢ経路シグナル伝達の生物学的活性および結果を調節する。非限定的な例として、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体は（例えば、ＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合することにより）ＴｒｋＢ経路活性化およびシグナル伝達を活性化、強化または永続化することができる。いくつかの態様において、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢリガンド結合ドメインに結合し、それによりＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合する。
【００８６】
いくつかの態様において、本方法の抗体はＢＤＮＦ模倣物として作用し、例えば、該リガンドの栄養活性を反復することができる（したがって、神経保護および神経栄養効果を持続することができる）。
【００８７】
他の態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢリガンド結合ドメインに結合せず、ＴｒｋＢとの結合に対してＢＤＮＦと競合しないが、それにもかかわらずＴｒｋＢシグナル伝達経路を調節すること（例えば、ＴｒｋＢ経路活性化およびシグナル伝達を活性化、強化または永続化すること）ができる。
【００８８】
種々の態様において、本発明はＴｒｋＢにより直接または間接様式において通常、調節される下流生物学的活性を調節するＴｒｋＢ作動性抗体にて呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））または呼吸困難の症状を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。該活性の非限定的な例は、ＴｒｋＢの二量体化の調節、次にＴｒｋＢ細胞内ドメインにおいてチロシン残基の自己リン酸化；ＴｒｋＢ関連細胞内シグナル伝達カスケード、例えば、マイトージェン活性タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよびＰＬＣγ経路の開始；ならびに神経細胞死の抑制、神経突起伸長の促進およびニューロトロフィンの他の効果を含む。例えば、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体は対照と比較して（例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体の非存在下での活性と比較して）少なくとも５％、１０％、１５％、２５％または５０％以上神経細胞死を抑制する。さらなる例として、該ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＴｒｋＢタンパク質レベルを対照と比較して（例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体の非存在下での活性と比較して）少なくとも５％、１０％、１５％、２５％または５０％以上安定化する。
【００８９】
種々の態様において、本発明は、非抗体ＴｒｋＢ作動性分子にて、呼吸器疾患（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））または呼吸困難の症状を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。非抗体ＴｒｋＢアゴニスト分子は非抗体ポリペプチド、例えば、以下のいずれかのものなどの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）フォールド由来アミノ酸配列を有するＴｒｋＢ結合ドメインを含む：テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ−受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質、色素タンパク質、ミエリン膜接着分子、Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ−細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２およびＶＣＡＭ−１のＩ−ｓｅｔドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ−細胞抗原受容体、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬまたはソーマチン。一般的に、ＴｒｋＢ結合ドメインのアミノ酸配列は、免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列と比較して、ＴｒｋＢ結合ドメインが特異的にＴｒｋＢに結合するように改変される（すなわち、ここで、免疫グロブリン様フォールドは特異的にＴｒｋＢに結合しない）。
【００９０】
種々の態様において、ＴｒｋＢ結合ドメインのアミノ酸配列はフィブロネクチン、サイトカイン受容体またはカドヘリンの免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも６５％、７５％、８０％、８５％または９０％同一）である。
【００９１】
種々の態様において、ＴｒｋＢ結合ドメインのアミノ酸配列は以下のいずれかの免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８０％、８５％または９０％同一である：テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ−受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質、色素タンパク質、ミエリン膜接着分子、Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ−細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２およびＶＣＡＭ−１のＩ−ｓｅｔドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ−細胞抗原受容体、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬまたはソーマチン。
【００９２】
種々の態様において、ＬＲＰ６結合ドメインはＫＤ１ｎＭ以下（例えば、０．５ｎＭ、０１ｎＭ）にてＴｒｋＢに結合する。
【００９３】
いくつかの態様において、Ｉｇ様フォールドはフィブロネクチンのＩｇ様フォールド、例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンのＩｇ様フォールド（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンのモジュール１０のＩｇ様フォールド）である。
【００９４】
本発明は、また、本明細書に記載されているＴｒｋＢアゴニスト抗体を含む医薬組成物を使用する方法を特徴とする。組成物は、例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体および薬学的に許容される担体を含む。
【００９５】
１つの局面において、本発明は治療および／または予防有効量のＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）を投与することにより、神経細胞死を抑制するか、または神経突起伸長を促進する方法を特徴とする。これらの方法は組織または生物学的サンプルを治療および／または予防有効量のＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）と接触させ、それによりＴｒｋＢシグナル伝達経路を活性化および／または安定化させることを含む。ＴｒｋＢアゴニスト抗体（または同じものを含む医薬組成物）は神経細胞死を抑制または神経突起伸長を促進するための有効量にて投与することができる。
【００９６】
いくつかの態様において、該方法はＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）の腹腔内投与を特徴とする。
【００９７】
すべての型のＴｒｋＢアゴニスト抗体を本発明の方法に使用することができる。一般的に、使用される抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は当分野で既知のすべての方法（例えば、ハイブリドーマ、組換え発現および／またはファージディスプレイを使用して）により製造することができる。限定はしないが、以下の特許および非特許文献のすべてのＴｒｋＢアゴニスト抗体を本方法において使用することができる：Qian, M., et al. (2006) Journal of Neurosci. 26(37); 9394-9403；米国特許番号５，９１０，５７４（および関連ファミリーメンバー）；ＰＣＴ特許公報番号ＷＯ０６／１３３１６４（および関連ファミリーメンバー）。
【００９８】
定義
本明細書において使用される“呼吸器疾患”なる用語は、無気肺、嚢胞性線維症、レット症候群（ＲＴＴ）、喘息、無呼吸（例えば、睡眠時無呼吸）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、急性呼吸困難、多呼吸、起座呼吸、リウマチ性肺疾患、肺鬱血または浮腫、慢性閉塞性気道疾患（例えば、気腫、慢性気管支炎、気管支喘息および気管支拡張症）、低換気、ピックウィック症候群、肥満−低換気症候群、乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ）および高炭酸を含むが、これらに限定されない。
【００９９】
さらに“呼吸器疾患”は、また、遺伝子異常に関連する既知のヒトの状態、例えば、シャルコー・マリー・ツース病、チェーン・ストークス呼吸障害、プラダーウィリ症候群、乳幼児突然死症候群、先天性中枢性低換気、びまん性間質性疾患（例えば、サルコイドーシス、塵肺症、過敏性肺炎、細気管支炎、グッドパスチャー症候群、特発性肺線維症、特発性肺ヘモジデリン沈着症、肺胞タンパク症、剥離性間質性肺炎、慢性間質性肺炎、線維化性肺胞炎、ハンマン・リッチ症候群、肺好酸球増多症、びまん性間質性線維症、ウェゲナー肉芽腫、リンパ腫様肉芽腫および脂質性肺炎）または腫瘍（例えば、気管支癌腫、細気管支肺胞癌腫、気管支カルチノイド、過誤腫および間葉性腫瘍）を含む。
【０１００】
本明細書において使用される“調節する”は直接的または間接的にコントロールまたは影響する能力を示し、あるいは、非限定的な例として、阻害または刺激する、作動性であるまたはアンタゴナイズする、妨害または促進する、および強めるまたは弱めることを意味することができる。
【０１０１】
本発明のＴｒｋＢ作動性抗体の“予防有効量”および“治療有効量”は疾患症状（例えば、異常に低いレベルのＴｒｋＢまたはＴｒｋＢの変異体コピーと関連する障害の症状）それぞれの発症を予防するか、または疾患症状の重症度を低下させることができる。該用語は、また、疾患無症状期間の頻度および期間をそれぞれ増加または延長することができる。“予防有効量”および“治療有効量”は、また、ＴｒｋＢ関連または呼吸器疾患の罹患による欠陥または障害を予防または改善することができる。
【０１０２】
“対象”なる用語は異常ＴｒｋＢシグナル伝達経路と関連する疾患、障害または状態に罹患しているか、または患っている生物、例えば、真核生物を含むことを意図する。対象の例は哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットおよび遺伝子導入非ヒト動物を含む。特定の態様において、対象はヒト、例えば、本明細書に記載されている呼吸器疾患または状態（例えば、レット症候群（ＲＴＴ））に罹患している、罹患している危険性がある、または罹患する可能性があるヒトである。
【０１０３】
本明細書において使用される“抗体”なる用語はインタクトな抗体または抗原結合フラグメント（すなわち、“抗原−結合部分”）またはそれらの一本鎖（すなわち、軽鎖または重鎖）に関する。インタクトな抗体はジスルフィドにより相互結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと省略する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域により分断されている相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分類できる。それぞれのＶＨおよびＶＬはアミノ−末端からカルボキシ−末端へ次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４にて配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への結合を介し得る。
【０１０４】
本明細書において使用される抗体の“抗原結合部分”なる用語は、特異的に任意の抗原（例えば、ＴｒｋＢ）に結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つ以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能はインタクトな抗体のフラグメントにより実施できる。抗体の“抗原結合部分”なる用語内に包含される結合フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメント（一般的に重鎖および軽鎖から１つ）を含む二価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１０５】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する一本のタンパク質鎖として作製可能とする人工ペプチドリンカーにより連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても既知；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426;およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883、参照）。このような一本鎖抗体は抗体の１つ以上の“抗原結合部分”を含む。これらの抗体フラグメントは当業者に既知の慣用の技術を使用して得られ、これらのフラグメントはインタクトな抗体と同様に有用性に関してスクリーニングされる。
【０１０６】
抗原結合部分は、また、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに組み込まれていてもよい（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136、参照）。抗体の抗原結合部分はポリペプチドに基づく骨組、例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）にグラフトすることができる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載している米国特許第６，７０３，１９９号、参照）。
【０１０７】
抗原結合部分は相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に１対の抗原結合領域を形成する、１対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込まれていてもよい（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062;および米国特許第５，６４１，８７０号）。
【０１０８】
本明細書において使用される“ラクダ抗体”なる用語は、ラマ種（Lama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna）を含むラクダおよびヒトコブラクダ（Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius）科のメンバーから得られる１つ以上のフラグメントのインタクトな抗体タンパク質を意味する。ＶＨＨとして同定された小さい１本の可変ドメインであるラクダ抗体の領域は、標的に対して高い親和性を有する小タンパク質を得るための遺伝子工学により得ることができ、“ラクダナノボディ”として既知の低分子量抗体由来タンパク質が得られる。米国特許第５，７５９，８０８、参照；Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62;およびLauwereys. et al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520も参照。
【０１０９】
本明細書において使用される“単離されたＴｒｋＢアゴニスト抗体”は、ＴｒｋＢ以外の抗原に対する抗原特異性を有する分子を実質的に含まない結合分子を意味する（例えば、特異的にＴｒｋＢに結合する単離された抗体は特異的にＴｒｋＢ以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、特異的にＴｒｋＢに結合する単離された結合分子は他の種の他の抗原、例えば、ＴｒｋＢ分子に対して交差反応性を有し得る。細胞材料を実質的に含まないとき、結合分子は“精製”されている。
【０１１０】
本明細書において使用される“ヒューマニアード抗体”なる用語は同じエピトープに結合するが、配列が異なっている抗体を意味する。例として、技術はＫａｌｏｂｉｏｓのヒューマニアード技術により製造されるヒューマニアード抗体であって、ここで、抗原結合領域の配列は保存的アミノ酸置換によるよりむしろ、例えば、変異により誘導される抗体を含む。
【０１１１】
本明細書において使用される“特異的にＴｒｋＢに結合する”ＴｒｋＢアゴニスト抗体（例えば、抗体またはその抗原結合部分）はＴｒｋＢにＫＤ１×１０−７Ｍ以下にて結合するＴｒｋＢアゴニスト抗体を意味することを意図する。“抗原と交差反応する”ＴｒｋＢアゴニスト抗体（例えば、抗体またはその抗原結合部分）は抗原にＫＤ１×１０−６Ｍ以下にて結合するＴｒｋＢアゴニスト抗体を意味することを意図する。特定の抗原と“交差反応しない”ＴｒｋＢアゴニスト抗体（例えば、抗体またはその抗原結合部分）は検出可能にその抗原に結合しないか、またはＫＤ１×１０−５Ｍ以上にて結合する、ＴｒｋＢアゴニスト抗体を意味することを意図する。特定の態様において、抗原と交差反応しないこのような結合分子は標準結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して本質的に検出できない結合を示す。
【０１１２】
本明細書において使用される“モノクローナル抗体組成物”なる用語は単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。
【０１１３】
本明細書において使用される“ヒト抗体”なる用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来している可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含むとき、定常領域は、また、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列または突然変異型のヒト生殖細胞系列配列に由来する。本発明のヒト抗体はヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムまたは部位特異的突然変異またはインビボで体細胞変異により導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される“ヒト抗体”なる用語は、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことを意図しない。
【０１１４】
“ヒトモノクローナル抗体”なる用語はフレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト配列に由来している可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を意味する。１つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は不死化細胞に融合させた遺伝子導入非ヒト動物（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入マウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより製造される。
【０１１５】
本明細書において使用される“組換えヒト抗体”なる用語は、組換え手段により製造、発現、作製または単離されたすべてのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入または染色体導入された動物（例えば、マウス）またはそれから製造されたハイブリドーマから単離された抗体；ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体；組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体；およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他の手段により製造、発現、作製または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体はフレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。しかしながら、特定の態様において、このような組換えヒト抗体をインビトロ突然変異（または、ヒトＩｇ配列に対して動物遺伝子導入が使用されるとき、インビボ体細胞突然変異）に付すことができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連するが、自然にヒトにおいてヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に存在しない配列である。
【０１１６】
本明細書において使用される“アイソタイプ”は重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）を意味する。
【０１１７】
“抗原を認識する抗体”および“抗原に対して特異的な抗体”なる用語は“抗原に特異的に結合する抗体”なる用語と互換的に使用される。
【０１１８】
“特異的に（または選択的に）（抗体に）結合する”または“特異的に（または選択的に）（抗体と）免疫反応性”なるフレーズは、タンパク質またはペプチドについて言及するとき、タンパク質または他の生物学的物質の異成分からなる集団におけるタンパク質の存在の決定要因となる結合反応を意味する。したがって、設計された免疫測定条件下で、特定の抗体はバックグラウンドの少なくとも２倍特定のタンパク質に結合し、有意な量でサンプル中に存在する他のタンパク質に実質的に結合しない。このような条件下での抗体への特定の結合は特定のタンパク質に対するその特異性によって選択される抗体を必要とし得る。この選択は、例えば、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＣまたはニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＲと交差反応する抗体を取り除くことにより達成され得る。種々の免疫測定フォーマットは特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫測定がタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために一般的に使用される（特定の免疫活性を決定するために使用することができる免疫測定フォーマットおよび条件の記載に関して、例えば、Harlow & Lane, Antibody, A Laboratory Manual (1998)、参照）。一般的に、特異的または選択的反応はバックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍、より一般的にバックグラウンドの１０から１００倍以上である。
【０１１９】
“抗体アゴニスト”なる用語は完全な、または部分的な受容体介在応答を誘導するように受容体を活性化することができる抗体を意味する。例えば、ＴｒｋＢのアゴニストはＴｒｋＢに結合し、ＴｒｋＢ介在シグナル伝達を誘導する。いくつかの態様において、アゴニストに対するＴｒｋＢ抗体は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と接触させたとき、または本明細書に記載がない限り、ＴｒｋＢに結合し、神経突起伸長を誘導する能力により同定され得る。
【０１２０】
本発明のポリペプチドの“活性”は天然細胞または組織におけるポリペプチドの構造、調節または生化学機能を意味する。ポリペプチドの活性の例は直接的な活性および間接的な活性の両方を含む。典型的な直接的な活性はリガンド結合を含むポリペプチドとの直接的相互作用、例えば、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）へのＢＤＮＦの結合の結果である。
【０１２１】
本明細書において使用される、“高い親和性”なる用語は、ＩｇＧ抗体に対する言及のとき、抗体が標的抗原に対してＫＤ１０−９Ｍ以下を有することを意味する。
【０１２２】
核酸配列は、産生細胞または生物、一般的に真核細胞、例えば、酵母菌、例えば、ピキア(Pichia)の細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように改変されているとき、“最適化”されていると呼ぶ。最適化された核酸配列は“親”配列としても既知である、元の出発核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と同一またはほぼ同一のアミノ酸配列をコードするように加工される。
【０１２３】
本発明の種々の局面は以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載されている。
【０１２４】
種々の種のＴｒｋＢおよび特定のＴｒｋＢのエピトープに結合する分子の能力を評価するための標準アッセイは、当分野で既知であり、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを含む。ＴｒｋＢアゴニスト抗体がＴｒｋＢの特定のエピトープに結合するかどうかの同定にペプチドエピトープ競合アッセイを使用することができる。例えば、ＴｒｋＢアゴニスト抗体をペプチドの飽和濃度にて興味あるＴｒｋＢエピトープに対応するペプチドとインキュベートする。プレインキュベートしたＴｒｋＢアゴニスト抗体を、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析により、固定化ＴｒｋＢへの結合に対して試験する。ペプチドとのプレインキュベーションによるＴｒｋＢ結合の阻害は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体がペプチドエピトープに結合することを示す（例えば、米国特許出願第２００７００７２７９７号、参照）。結合動態は、また、当分野で既知の標準アッセイ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析またはＦＡＣＳ分析による明白な結合により評価することができる。ＴｒｋＢの機能特性に対するＴｒｋＢ作動性抗体の作用を評価するためのアッセイは以下にさらに詳細に記載されている。
【０１２５】
したがって、当分野において既知であり、本明細書に記載されている方法論にしたがって決定される１つ以上のこれらのＴｒｋＢ機能特性（例えば、生化学的、細胞的、生理学的または他の生物学的活性など）を“阻害する”ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、結合分子の非存在下（例えば、無関連の特異性の対照分子が存在するとき）と比較して特定の機能特性において統計学的に有意な低下を引き起こすと理解される。ＴｒｋＢ活性を阻害するＴｒｋＢアゴニスト抗体は測定パラメーターの少なくとも５％の統計学的に有意な低下を引き起こす。特定の態様において、アンタゴナイズ抗体または他のＴｒｋＢアゴニスト抗体は対照と比較して選択された機能特性において少なくとも１０％、２０％、３０％または５０％の減少を引き起こし得る。
【０１２６】
ＴｒｋＢ活性を作動性または促進するＴｒｋＢアゴニスト抗体は測定パラメーターの少なくとも５％の統計学的に有意な増加を引き起こす。特定の態様において、ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその部分は対照と比較して選択された機能特性において少なくとも１０％、２０％、３０％または５０％の増加を引き起こし得る。
【０１２７】
抗体
本明細書に記載されている抗ＴｒｋＢ抗体はヒトモノクローナル抗体を含む。いくつかの態様において、ＴｒｋＢに結合する抗体の抗原結合部分（例えば、ＶＨおよびＶＬ鎖）は他の抗ＴｒｋＢ作動性抗体を創造するように“混合および適合”される。このような“混合および適合”された抗体の結合は前記結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。特定のＶＬ配列と混合および適合するＶＨを選択するとき、一般的に１つはＶＬとの対において置き換えられるＶＨと構造的に類似しているＶＨを選択する。同様に特定の全長重鎖／全長軽鎖対の全長重鎖配列は一般的に構造的に類似している全長重鎖配列と置換すべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対のＶＬ配列は構造的に類似しているＶＬ配列と置換すべきである。同様に特定の全長重鎖／全長軽鎖対の全長軽鎖配列は構造的に類似している全長軽鎖配列と置換すべきである。この文脈における構造類似の同定は当分野においてよく知られている方法である。
【０１２８】
他の局面において、本発明は１つ以上のＴｒｋＢ結合抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を種々の組合せにおいて含む抗体を提供する。これらの抗体のそれぞれがＴｒｋＢに結合し、抗原−結合特異性が主としてＣＤＲ１、２および３領域により提供され得ることを考慮すると、ＶＨのＣＤＲ１、２および３配列とＶＬのＣＤＲ１、２および３配列は“混合および適合”され得る（すなわち、異なる抗体からのＣＤＲは混合および適合され得る）。このような“混合および適合”された抗体のＴｒｋＢ結合は本明細書に記載されている結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨのＣＤＲ配列が混合および適合されているとき、特定のＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３は構造的に類似しているＣＤＲ配列と置換すべきである。同様に、ＶＬのＣＤＲ配列が混合および適合されているとき、特定のＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は構造的に類似しているＣＤＲ配列と置換すべきである。この文脈における構造類似の同定は当分野でよく知られている方法である。
【０１２９】
本明細書において使用される、ヒト抗体は、抗体の可変領域または全長鎖が配列源としてヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られるとき、特定の生殖細胞系列配列の“生成物”である、またはそれに“由来”する重鎖または軽鎖可変領域または全長重鎖または軽鎖を含む。このような系の１つにおいて、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスにより製造される。遺伝子導入は興味ある抗原（例えば、ＴｒｋＢのエピトープ）により免疫化される。あるいは、ヒト抗体は、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを提供し、興味ある抗原（例えば、ＴｒｋＢのエピトープ）ライブラリーをスクリーニングすることにより同定される。
【０１３０】
ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の“生成物”である、またはそれに“由来”するヒト抗体はヒト抗体のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較して、ヒト抗体の配列と配列において非常に近い（すなわち、同一性％が非常に高い）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を選択することによりそれ自体同定することができる。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の“生成物”である、またはそれに“由来”するヒト抗体は生殖細胞系列にコードされた配列と比較して、例えば、自然に起こる体細胞変異または人工部位特異的変異によるアミノ酸の違いを含み得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は一般的にヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したとき、ヒト抗体をヒトとして同定するアミノ酸残基を含む。特定の場合において、ヒト抗体は生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
【０１３１】
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップ数および各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の＃／位置の全＃×１００）。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定はＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (1988 Comput. Appl. Biosci., 4:11-17)のアルゴリズムを使用して、PAM120 weight residue table、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用して決定される。
【０１３２】
一般的に、特定のヒト生殖細胞系列配列由来ヒト抗体のＶＨまたはＶＬはヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とわずか１０個のアミノ酸の違いを示す。特定の場合において、ヒト抗体のＶＨまたはＶＬは生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とわずか５つまたはわずか４、３、２または１つのアミノ酸の違いを示し得る。
【０１３３】
ラクダ抗体
新世界(New World)メンバー、例えば、ラマ種（Lama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna）を含むラクダおよびヒトコブラクダ（Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius）科のメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性およびヒト対象に対する抗原性に対して特徴付けられている。この科の哺乳動物において自然に見られる特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠き、したがって他の動物の抗体において典型的な２つの重鎖および２つの軽鎖を有する４鎖の四次構造とは構造的に異なる。ＷＯ９４／０４６７８、参照。
【０１３４】
ＶＨＨとして同定された小さい１本の可変ドメインであるラクダ抗体の領域は、標的に対して高い親和性を有する小タンパク質を得るための遺伝子工学により得ることができ、“ラクダナノボディ”として既知の低分子量抗体由来タンパク質が得られる。米国特許第５，７５９，８０８号、参照；Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62;およびLauwereys. et al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520も参照。ラクダ抗体および抗体フラグメントの加工されたライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト起源の他の抗体に関して、ラクダ抗体のアミノ酸配列はヒト配列をより密接に似ている配列を得るために組換え的に改変させることができる、すなわち、ナノボディはヒト化することができる。したがって、ヒトに対するラクダ抗体の本来の低い抗原性をさらに低減することができる。
【０１３５】
ラクダナノボディはヒトＩｇＧ分子の分子量の約１／１０を有し、該タンパク質はわずか数ナノメーターの物理的直径を有する。小さいサイズの１つの結果は、より大きい抗体タンパク質によっては機能的に見えない抗原部位に結合するラクダナノボディの能力であり、すなわち、ラクダナノボディは従来の免疫技術を使用して他の方法では隠れている抗原を検出する試薬、および可能性としては治療剤として有用である。したがって、小さいサイズのさらなる結果は、ラクダナノボディが標的タンパク質の溝または狭い割れ目の特定の部位に結合する結果として阻害することができ、したがって従来の抗体よりも従来の低分子量薬物の機能とより密接に似ている能力で働き得ることである。
【０１３６】
さらに、低分子量および緻密化サイズの結果、ラクダナノボディが極めて熱安定性であり、極端なｐＨおよびタンパク質分解消化に対して安定であり、抗原性が低い。さらなる結果は、ラクダナノボディが循環系から組織へ、血液脳関門を介する場合でも容易に移動し、神経組織に影響する障害を処置することができることである。さらにナノボディは血液脳関門を介する薬物輸送を促進することができる。２００４年８月１９日公開の米国特許出願第２００４０１６１７３８号、参照。これらの特徴は、ヒトにおける低い抗原性と結合して、大きな治療的可能性を示す。さらに、これらの分子は原核細胞、例えば、大腸菌において完全に発現することができる。
【０１３７】
したがって、本発明の特徴はＴｒｋＢに対して高い親和性を有するラクダ抗体またはラクダナノボディである。本明細書におけるある特定の態様において、ラクダ抗体またはナノボディはラクダ動物で自然に製造され、すなわち、ＴｒｋＢまたはそのペプチドフラグメントで免疫化した後、他の抗体に関して本明細書に記載されている技術を使用してラクダにより製造される。あるいは、抗ＴｒｋＢラクダナノボディは、すなわち、例えば、適当に突然変異させたラクダナノボディタンパク質を提示するファージのライブラリーから標的として本明細書に記載されているＴｒｋＢまたはＴｒｋＢエピトープを使用したパンニング法を使用して選択により加工、すなわち製造される。さらに、加工されたナノボディをレシピエント対象において４５分から２週間の半減期を有するように遺伝子工学によりカスタマイズすることができる。
【０１３８】
ダイアボディ
ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖で発現され、あまりに短すぎるため同じ鎖の２つのドメイン間で対になることができないリンカーにより結合している、二価、二重特異性分子である。ＶＨおよびＶＬドメインは別の鎖の相補的ドメインと対を作り、それによって２つの抗原結合部位を創造する（例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123、参照）。ダイアボディは同じ細胞内で構造ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ構成）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ構成）のいずれかを有する２つのポリペプチド鎖を発現させることにより製造することができる。それらのほとんどは細菌において可溶性形態で発現させることができる。
【０１３９】
一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を約１５アミノ酸残基のリンカーと結合させることにより、製造される（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36、参照）。ｓｃＤｂは細菌において可溶性かつ活性な単量体型で発現させることができる（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21、参照）。
【０１４０】
ダイアボディはＦｃと融合させ、“ジ−ダイアボディ”を製造することができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65、参照）。
【０１４１】
加工および修飾された抗体
本発明の抗体は、出発抗体から改変された特性を有し得る修飾された抗体を加工するように、出発物質として１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を使用して製造することができる。抗体を１つまたは両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域および／または１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することにより加工することができる。さらに、または、あるいは、抗体を、例えば、抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することにより加工することができる。
【０１４２】
実施することができる可変領域加工の１つはＣＤＲグラフト法である。抗体は、主として６つの重鎖および軽鎖ＣＤＲに存在するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列はＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間でより異なっている。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク配列にグラフトされた特定の天然抗体のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen et al., 1989 Proc. Natl. Acad。U.S.A. 86:10029-10033、参照;米国特許第5,225,539号および米国特許第5,530,101; 5,585,089; 5,693,762および6,180,370号、参照）。
【０１４３】
フレームワーク配列は生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは刊行されている参照文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖細胞系列配列データベース（インターネットwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用できる）、ならびにKabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992  J. Mol. Biol. 227:776-798;およびCox et al., 1994 Eur. J. Immunol. 24:827-836;（これらのそれぞれの内容を出典明示により本明細書に包含させる）において見出すことができる。
【０１４４】
ＶＨのＣＤＲ１、２および３の配列およびＶＬのＣＤＲ１、２および３の配列をフレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子において見出されたものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトすることができ、またはＣＤＲ配列を生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域にグラフトすることができる。例えば、ある場合において、抗体の抗原結合力を維持または強化するためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出されている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号、参照）。
【０１４５】
ＣＤＲは、また、免疫グロブリンドメイン以外のポリペプチドのフレームワーク領域にグラフトさせることができる。適当な骨組は、局在した表面を形成し、興味ある標的（例えば、ＴｒｋＢ）に結合するようにグラフトされた残基を示す、構造的に安定なフレームワークを形成する。例えば、ＣＤＲは、フレームワーク領域がフィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノスタチン、シトクロムｂ、ＣＰ１亜鉛フィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメインまたはテンドラミスト(tendramisat)に基づく骨組上にグラフトすることができる（例えば、Nygren and Uhlen, 1997 Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469、参照）。
【０１４６】
別種の可変領域修飾はＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域のアミノ酸残基の変異であり、それによって“親和性成熟”として既知の興味ある抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善する。部位特異的突然変異またはＰＣＲ介在突然変異を導入するために実施することができ、抗体結合の作用または興味ある他の機能特性を本明細書に記載されているインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価することができる。保存的修飾を導入することができる。変異はアミノ酸の置換、付加または欠失であり得る。さらに、一般的にＣＤＲ領域内のわずか１、２、３、４または５つの残基が改変される。
【０１４７】
加工された本発明の抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に行われたものを含む。一般的にこのようなフレームワーク修飾は抗体の免疫原性を軽減するために行われる。例えば、１つのアプローチは１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列へと“復帰変異(backmutate)”させることである。さらに特に、体細胞変異がおこった抗体は抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は抗体のフレームワーク配列と抗体が由来する生殖細胞系列配列を比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系列の構成へ戻すために、体細胞変異を、例えば、部位特異的突然変異またはＰＣＲ介在突然変異により生殖細胞系列配列へ“復帰変異”させることができる。このような“復帰変異”抗体は、また、本発明により包含されることを意図する。
【０１４８】
別種のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞−エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を減少するために、フレームワーク領域内の、さらには１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基の変異を含む。このアプローチは、また、“脱免疫化”として称され、Carr et alによる米国特許公報第２００３０１５３０４３号においてさらに詳細に記載されている。
【０１４９】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加え、またはあるいは、本発明の抗体は、一般的に１つ以上の抗体の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存細胞傷害性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように加工することができる。さらに、本発明の抗体は、再び１つ以上の抗体の機能特性を改変するために、化学的に修飾させるか（例えば、１つ以上の化学部分を抗体に結合させることができる）、またはそのグリコシル化を改変するために修飾させることができる。
【０１５０】
１つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基の数が改変、例えば、増加または減少されるように修飾される。このアプローチはBodmer et al.による米国特許第５，６７７，４２５号においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の組み立てを促進するか、または抗体の安定性を増強または低下させるために改変される。
【０１５１】
他の態様において、抗体のＦｃヒンジ領域を抗体の生体半減期を短縮するために変異させる。さらに特に、１つ以上のアミノ酸変異は、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して損なわれたブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に導入される。このアプローチはWard et al.による米国特許第６，１６５，７４５号においてさらに詳細に記載されている。
【０１５２】
他の態様において、抗体は生体半減期を延長するために修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号はインビボで半減期を延長するＩｇＧにおける下記変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆを記載している。あるいは、生体半減期を延長するため、抗体は、Presta et al.による米国特許第５，８６９，０４６および６，１２１，０２２号に記載されているとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で改変され得る。
【０１５３】
さらに他の態様において、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を改変するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることにより改変される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が改変されているエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは両方Winter et al. による米国特許第５，６２４，８２１および５，６４８，２６０号においてさらに詳細に記載されている。
【０１５４】
他の態様において、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基により置き換えて、抗体がＣ１ｑ結合を改変され、そして／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を減少または排除されるようにすることができる。このアプローチはIdusogie et al.による米国特許第６，１９４，５５１号においてさらに詳細に記載されている。
【０１５５】
他の態様において、１つ以上のアミノ酸残基を改変し、それによって抗体が補体を固定する能力を改変する。このアプローチはBodmer et al.によるＷＯ９４／２９３５１においてさらに詳細に記載されている。
【０１５６】
さらに他の態様において、Ｆｃ領域は、抗体が抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介在する能力を増強するため、および／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性を増強するために、１つ以上のアミノ酸を修飾することにより修飾される。このアプローチはPrestaによるＷＯ００／４２０７２においてさらに詳細に記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位はマッピングされており、改良された結合を有する変異体は記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604、参照）。
【０１５７】
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化は修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗体の抗原に対する親和性を増強するために改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内でグリコシル化の１つ以上の部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによってその部位のグリコシル化を排除することを行うことができる。このようなグリコシル化は抗体の抗原に対する親和性を増強し得る。このようなアプローチはCo et al.による米国特許第５，７１４，３５０および６，３５０，８６１号においてさらに詳細に記載されている。
【０１５８】
さらに、またはあるいは、抗体は改変された型のグリコシル化を有する抗体、例えば、少ない量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を製造することができる。このような改変されたグリコシル化パターンは抗体のＡＤＣＣ能力を増強することが証明されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現することにより達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は当分野で報告されており、本発明の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用し、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を製造することができる。例えば、Hang et al.によるＥＰ１，１７６，１９５は、発現された抗体が低フコシル化を示すような、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子機能的に破壊されている細胞系を記載している。PrestaによるＰＣＴ出願ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースがＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合する能力を減少させ、また、宿主細胞において発現された抗体の低フコシル化を引き起こす、変異ＣＨＯ細胞系であるＬｅｃｌ３細胞を記載している（Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。Umana et al.によるＷＯ９９／５４３４２は、加工された細胞系において発現された抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増強を引き起こすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように加工された細胞系を記載している（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照）。
【０１５９】
本発明により考慮される本明細書の抗体のさらなる修飾はペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生体（例えば、血清）半減期を延長するためにペグ化することができる。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントは、一般的にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と１つ以上のＰＥＧ部分が抗体または抗体フラグメントに結合するようになる条件下で反応させる。ペグ化は反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）でのアシル化反応またはアルキル化反応により実施することができる。本明細書において使用される“ポリエチレングリコール”なる用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの全ての形態を包含することを意図する。特定の態様において、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当分野で既知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Nishimura et al.によるＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.によるＥＰ０４０１３８４、参照。
【０１６０】
加えて、ペグ化は非天然アミノ酸の導入により本発明のＴｒｋＢ結合ポリペプチドの任意の部分で達成することができる。特定の非天然アミノ酸はDeiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004またはＵＳ特許第７，０８３，９７０号に記載されている技術により導入することができる。簡潔には、いくつかのこれらの発現系は部位特異的突然変異を含み、ナンセンスコドン、例えば、アンバーＴＡＧが本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに導入される。次にこのような発現ベクターを導入されたナンセンスコドンに対して特異的なｔＲＮＡを利用することができる宿主に導入し、一般的に好まれる非天然アミノ酸で満たす。部分が本発明のポリペプチドに結合するために有益である特定の非天然アミノ酸は、アセチレンおよびアジド側鎖を有するものを含む。次にこれらの新規アミノ酸を含むポリペプチドをタンパク質のこれらの選択された部位でペグ化することができる。
【０１６１】
抗体を加工する方法
上記のとおり、抗ＴｒｋＢ抗体は全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれに結合した定常領域を修飾することにより、新規抗Ｔｒｋ抗体を創造するために使用することができる。例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲ領域は、新規組換え加工された抗ＴｒｋＢ抗体を創造するために、既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲで組換えにより組み合わせることができる。他の型の修飾は前のセクションにおいて記載されているものを含む。加工する方法のための出発物質は１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域である。加工された抗体を創造するため、１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に作製（すなわち、タンパク質として発現）する必要はない。それどころか、配列に含まれる情報を元の配列に由来する“第二世代”配列を創造するため出発物質として使用し、次に“第二世代”配列をタンパク質として製造および発現させる。
【０１６２】
標準分子生物学技術は改変された抗体配列を製造および発現させるために使用することができる。改変された抗体配列によってコードされる抗体は、機能特性が、本明細書に記載されている特異的なＴｒｋＢへの結合、ニューロトロフィン（例えば、ＢＤＮＦ）に結合するＴｒｋＢの能力の妨害、および細胞内ドメインにてチロシン残基を二量体化および自己リン酸化するＴｒｋＢの能力の調節を含むが、これらに限定されない、抗ＴｒｋＢ抗体の機能特性の１つ、一部または全部を保持するものである。改変された抗体の機能特性は当分野で利用できる、および／または本明細書に記載されている標準アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して評価することができる。
【０１６３】
本発明の抗体を加工する方法の１つの態様において、変異は抗ＴｒｋＢ抗体コード配列の全体または一部にランダムまたは選択的に導入することができ、得られた修飾された抗ＴｒｋＢ抗体は結合活性および／または他の機能特性（例えば、本明細書に記載されている特異的なＴｒｋＢへの結合、ニューロトロフィン（例えば、ＢＤＮＦ）に結合するＴｒｋＢの能力の妨害、および細胞内ドメインにてチロシン残基を二量体化および自己リン酸化するＴｒｋＢの能力の調節）に関してスクリーニングすることができる。変異法は当分野で報告されている。例えば、ShortによるＰＣＴ出願ＷＯ０２／０９２７８０は飽和突然変異、合成連結アセンブリまたはその組合せを使用して抗体変異を創造およびスクリーニングする方法を記載している。あるいは、Lazar et al.によるＷＯ０３／０７４６７９は抗体の物理化学的特性を最適化するためにコンピューター利用スクリーニング方法を使用する方法を記載している。
【０１６４】
非抗体ＴｒｋＢ作動性抗体
さらに、本発明は抗体の機能特性を示すが、他のポリペプチド（例えば、抗体遺伝子によってコードされるか、またはインビボで抗体遺伝子の組換えにより製造されるもの以外のポリペプチド）からのこれらのフレームワークおよび抗原結合部分に由来するＴｒｋＢ作動性抗体を提供する。これらの結合分子の抗原結合ドメイン（例えば、ＴｒｋＢ結合ドメイン）は指向進化過程を介して製造される。米国特許第７，１１５，３９６号、参照。抗体の可変ドメインのフォールド（“免疫グロブリン様”フォールド）と類似している全フォールドを有する分子が適当な骨格タンパク質である。得られる抗原結合分子に適当な骨格タンパク質はフィブロネクチンまたはフィブロネクチンダイマー、テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ−受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質色素タンパク質、ミエリン膜接着分子、Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ−細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２およびＶＣＡＭ−１のＩ−ｓｅｔドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ−細胞抗原受容体、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬおよびソーマチンを含む。
【０１６５】
非抗体結合分子の抗原結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン様フォールド）は１０ｋＤより小さいまたは７．５ｋＤより大きい分子量（例えば、分子量７．５−１０ｋＤ）を有することができる。抗原結合ドメインを得るために使用されるタンパク質は天然哺乳動物タンパク質（例えば、ヒトタンパク質）を含み、抗原結合ドメインは得られるタンパク質の免疫グロブリン様フォールドと比較して５０％以下（例えば、３４％、２５％、２０％または１５％以下）の変異アミノ酸を含む。一般的に免疫グロブリン様フォールドを有するドメインは５０−１５０アミノ酸（例えば、４０−６０アミノ酸）からなる。
【０１６６】
非抗体結合分子を製造するため、抗原結合表面を形成する骨格タンパク質の領域（例えば、位置および構造において抗体可変ドメイン免疫グロブリンフォールドのＣＤＲに類似している領域）における配列がランダム化された、クローンのライブラリーを創造する。ライブラリークローンを興味ある抗原（例えば、ＴｒｋＢ）への特異的結合および他の機能（例えば、ＴｒｋＢの生物学的活性の阻害）に対して試験する。選択されたクローンをさらなるランダム化および選択に基づき、抗原に対して高い親和性の誘導体を製造するために使用することができる。選択プロトコールの１つの例は米国特許第６，２０７，４４６号に記載されている。
【０１６７】
高い親和性結合分子は、例えば、骨組としてフィブロネクチンＩＩＩの１０番目のモジュール（１０Ｆｎ３）を使用して製造される。ライブラリーを残基２３−２９、５２−５５および７８−８７で１０ＦＮ３の３つのＣＤＲ様ループのそれぞれに対して構築する。それぞれのライブラリーを構築するため、それぞれのＣＤＲ様領域と重複する配列をコードするＤＮＡセグメントをオリゴヌクレオチド合成によりランダム化する。選択可能な１０Ｆｎ３ライブラリーを製造するための技術は、米国特許第６，８１８，４１８および７，１１５，３９６号；Roberts and Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297；米国特許第６，２６１，８０４号；米国特許第６，２５８，５５８号；およびSzostak et al.ＷＯ９８／３１７００に記載されている。
【０１６８】
非抗体結合分子は標的抗原に対する親和性を増加するためにダイマーまたはマルチマーとして製造することができる。例えば、抗原結合ドメインをＦｃ−Ｆｃダイマーを形成する抗体の定常領域（Ｆｃ）を有する融合体として発現させる。例えば、米国特許第７，１１５，３９６号、参照。
【０１６９】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の他の局面は本発明のＴｒｋＢ作動性抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は細胞溶解物において細胞全体に存在してもよく、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ結合、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他当分野で既知の技術を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞性核酸またはタンパク質から精製されたとき、“単離された”または“実質的に純粋にされた”である。F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York、参照。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでいても含まなくてもよい。１つの態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。核酸はベクター、例えば、ファージディスプレイベクターまたは組換えプラスミドベクター中に存在していてもよい。
【０１７０】
本発明の核酸は標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載しているとおりのヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスから製造されたハイブリドーマ）により発現された抗体に関して、ハイブリドーマにより製造された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）得られた抗体に関して、抗体をコードする核酸はライブラリーのメンバーである種々のファージクローンから回収することができる。
【０１７１】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたとき、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメントはさらなるタンパク質、例えば、抗体定常領域もしくはフレキシブルリンカーをコードするさらなるＤＮＡ分子またはフラグメントに作動可能に連結されている。この文脈において使用されるとき“作動可能に連結された”なる用語は、２つのＤＮＡフラグメントが、例えば、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に残るように、またはタンパク質が所望のプロモーターのコントロール下で発現されるように機能する方法で連結されることを意味することを意図する。
【０１７２】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡはＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードするさらなるＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で既知であり（例えば、Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、参照）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子に関して、ＶＨをコードするＤＮＡは重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードするさらなるＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【０１７３】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡはＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードするさらなるＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で既知であり（例えば、Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、参照）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【０１７４】
ｓｃＦｖ遺伝子を創造するため、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、フレキシブルリンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有するＶＨおよびＶＬ配列が連続する一本鎖タンパク質として発現することができるように、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードするフレキシブルリンカーをコードするさらなるフラグメントに作動可能に連結される（例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554、参照）。
【０１７５】
モノクローナル抗体生成
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は慣用のモノクローナル抗体方法論を含む種々の技術、例えば、Kohler and Milstein (1975 Nature, 256:495)の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術により、またはライブラリーディスプレイ法、例えば、ファージディスプレイ法を使用して製造することができる。
【０１７６】
ハイブリドーマを製造するための動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ製造はよく確立された方法である。免疫化プロトコールおよび免役された融合用脾細胞の単離のための技術は当分野で既知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合方法は、また、既知である。
【０１７７】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は上記のように製造されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて製造することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、標準分子生物学技術を使用して、興味あるマウスハイブリドーマから得ることができ、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように加工することができる。例えば、キメラ抗体を創造するために、マウス可変領域は、当分野で既知の方法を使用して、ヒト定常領域に連結することができる（例えば、Cabilly et al.による米国特許第４，８１６，５６７号、参照）。ヒト化抗体を創造するために、マウスＣＤＲ領域は、当分野で既知の方法を使用して、ヒトフレームワークに挿入することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号および米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号、参照。
【０１７８】
特定の態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＴｒｋＢに対するこのようなヒトモノクローナル抗体はマウス系よりむしろヒト免疫系部分を有する遺伝子導入されたまたは染色体導入されたマウスを使用して製造することができる。これらの遺伝子導入されたまたは染色体導入されたマウスは各々ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称される、および本明細書において“ヒトＩｇマウス”と総称されるマウスを含む。
【０１７９】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Medarex, Inc.）は、内因性μおよびκ鎖座を不活性化する標的変異とともに、非再配置ヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を含む（例えば、Lonberg et al., 1994 Nature 368(6474): 856 859、参照）。したがって、マウスはマウスＩｇＭまたはκの発現低下を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラス切り換えと体細胞突然変異を受け、高い親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを製造する（Lonberg, N. et al., 1994 supra; reviewed in Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭＡｂマウスの製造およびその使用およびこのようなマウスが有するゲノム修飾は、さらにTaylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591;およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851に記載されている（これらの全ての内容を出典明示によりその全体を本明細書の一部とする）。さらに、米国特許第５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，７８９，６５０；５，８７７，３９７；５，６６１，０１６；５，８１４，３１８；５，８７４，２９９；および５，７７０，４２９号（全てLonberg and Kay）；Surani et al.による米国特許第５，５４５，８０７号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ９２１０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７１１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２（全てLonberg and Kay）；ならびにKorman et al.によるＰＣＴ出願番号ＷＯ０１／１４４２４、参照。
【０１８０】
他の態様において、本発明のヒト抗体は導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するマウスを使用して製造することができる。“ＫＭマウス”として本明細書で称されるこのようなマウスはＷＯ０２／４３４７８において詳細に記載されている。
【０１８１】
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の遺伝子導入動物系が当分野で利用可能であり、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体を製造するために使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏマウス（登録商標）（Abgenix, Inc.）と称される別の遺伝子導入系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.による米国特許第５，９３９，５９８；６，０７５，１８１；６，１１４，５９８；６、１５０，５８４および６，１６２，９６３号に記載されている。
【０１８２】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の染色体を導入した動物系が当分野で利用可能であり、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体を製造するために使用することができる。例えば、“ＴＣマウス”と称されるヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を含むマウスを使用することができる；このようなマウスはTomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を有するウシは当分野で報告されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体を製造するために使用することができる。
【０１８３】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、また、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用して製造することができる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ方法は当分野で設立されている。例えば：Ladner et al.による米国特許第５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；および５，５７１，６９８号；Dower et al.による米国特許第５，４２７，９０８および５，５８０，７１７号；McCafferty et al.による米国特許第５，９６９，１０８および６，１７２，１９７号；ならびにGriffiths et al.による米国特許第５，８８５，７９３；６，５２１，４０４；６，５４４，７３１；６，５５５，３１３；６，５８２，９１５および６，５９３，０８１号、参照。ライブラリーは全長ＴｒｋＢまたは特定のＴｒｋＢのエピトープへの結合についてスクリーニングされ得る。
【０１８４】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫で製造され得るようにヒト免疫細胞を再構成されたＳＣＩＤマウスを使用して製造することもできる。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.による米国特許第５，４７６，９９６および５，６９８，７６７号に記載されている。
【０１８５】
ヒトＩｇマウスにおけるヒトモノクローナル抗体の製造
原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞）において発現される精製された組換えヒトＴｒｋＢは抗原として使用することができる。該タンパク質は担体、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合され得る。
【０１８６】
ＴｒｋＢに対する完全なヒトモノクローナル抗体はＨｕＭａｂ遺伝子導入マウスのＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＨＣｏ１７系ならびに遺伝子導入染色体導入マウスのＫＭ系（これらはそれぞれヒト抗体遺伝子を発現する）を使用して製造される。これらのマウス系のそれぞれにおいて、内因性マウスカッパ軽鎖遺伝子はChen et al., 1993 EMBO J.12:811-820に記載されているとおりホモ接合的に分断することができ、内因性マウス重鎖遺伝子はＷＯ０１１０９１８７の実施例１に記載されているとおりホモ接合的に分断することができる。これらのマウス系のそれぞれは、Fishwild et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851に記載されているとおりヒトカッパ軽鎖導入遺伝子、ＫＣｏ５を有する。ＨＣｏ７系は米国特許第５，５４５，８０６；５，６２５，８２５；および５，５４５，８０７号に記載されているとおりＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＨＣｏ１２系はＷＯ０１／０９１８７の実施例２に記載されているとおりＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＨＣｏ１７系はＨＣｏ１７ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＫＮＭ系はＷＯ０２／４３４７８に記載されているとおりＳＣ２０導入染色体を含む。
【０１８７】
ＴｒｋＢに対する完全なヒトモノクローナル抗体を製造するために、ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスを、精製された組換えＴｒｋＢ、ＴｒｋＢフラグメントまたはそれらのコンジュゲート（例えば、ＴｒｋＢ−ＫＬＨ）を抗原として免疫化する。ＨｕＭａｂマウスの一般的な免疫スキームはLonberg, N. et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851およびWO 98/24884に記載されている。マウスは抗原の初回注入時に６−１６週齢である。抗原の精製された組換え製造物（５−５０μｇ）を腹腔内、皮下（Ｓｃ）または足蹠注射によりＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスを免疫化するために使用する。
【０１８８】
遺伝子導入マウスを完全フロイントアジュバントまたはＲｉｂｉアジュバント中の抗原を腹腔内（ＩＰ）、皮下（Ｓｃ）または足蹠（ＦＰ）のいずれかにより２回免疫化させ、３−２１日間後にフロイントの不完全またはＲｉｂｉアジュバント中の抗原をＩＰ、ＳｃまたはＦＰ免疫化させる（最大１１回の免疫化）。免疫応答を眼窩後方採血によりモニタリングする。血漿をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、十分な力価の抗ＴｒｋＢヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合のために使用する。マウスを屠殺する３日および２日前に抗原を静脈内に追加し、脾臓を取り出す。一般的に、それぞれの抗原に対して１０−３５回の融合を行う。数ダースのマウスをそれぞれの抗原に対して免疫化する。ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７およびＫＭマウス系の全８２匹のマウスをＴｒｋＢで免疫化する。
【０１８９】
ＴｒｋＢと結合した抗体を製造するＨｕＭａｂまたはＫＭマウスを選択するため、免疫マウスの血清をFishwild, D. et al., 1996に記載されているＥＬＩＳＡにより試験することができる。手短に言えば、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中１−２μｇ／ｍｌで精製された組換えＴｒｋＢでコーティングし、５０μｌ／ウェルを４℃で一晩インキュベートし、次にＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中の５％のニワトリ血清を２００μｌ／ウェルでブロッキングする。ＴｒｋＢ免疫マウスからの血漿の希釈物をそれぞれのウェルに加え、１−２時間周囲温度でインキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体と１時間室温でインキュベートする。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ、Ａ−１８８８、０．２２ｍｇ／ｍｌ）で現像し、分光光度計によりＯＤ  ４１５−４９５で分析する。抗ＴｒｋＢ抗体の最高力価を表した抗マウスの脾細胞を融合のために使用する。融合を行い、ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡにより抗ＴｒｋＢ活性に関して試験する。
【０１９０】
ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスから単離されたマウス脾細胞を標準プロトコールに基づいてＰＥＧでマウス骨髄腫細胞系に融合させる。次に得られたハイブリドーマを抗原−特異的抗体の生成に関してスクリーニングする。免疫マウスからの脾臓リンパ細胞の単細胞懸濁液を１／４の数のＳＰ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８１）に５０％のＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ）で融合させる。細胞を平底マイクロタイタープレート中で約１×１０５／ウェルで置き、次に約２週間、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ＣＲＬ  １００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含む）プラス５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、ＣＲＬ  Ｐ−７１８５）中で１０％のウシ胎児血清、１０％のＰ３８８Ｄ  １（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  ＴＩＢ−６３）馴化培地、３−５％のＯｒｉｇｅｎ（登録商標）（ＩＧＥＮ）を含む選択培地中でインキュベートする。１−２週間後、細胞をＨＡＴがＨＴと置き換えられている培地中で培養する。次に個々のウェルをヒト抗ＴｒｋＢモノクローナルＩｇＧ抗体に対してＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。広範なハイブリドーマ増殖が起こると、通常、培地を１０−１４日後にモニタリングする。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、まだヒトＩｇＧ陽性のとき、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体を制限希釈により少なくとも２回サブクローニングする。次に安定なサブクローンをインビトロで培養し、さらなる特徴付けのために組織培養培地中で少量の抗体を得る。
【０１９１】
ヒトモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマの製造
本発明のヒトモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマを製造するため、免疫マウスからの脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、適当な不死化細胞系、例えば、マウス骨髄腫細胞系に融合することができる。得られたハイブリドーマ抗原−特異的抗体の生成に関してスクリーニングすることができる。例えば、免疫マウスからの脾臓リンパ細胞の単細胞懸濁液を１／６の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８０）に５０％のＰＥＧで融合させることができる。細胞を平底マイクロタイタープレート中で約２×１４５で置き、次に２０％の胎児クローン血清、１８％の“６５３”馴化培地、５％のＯｒｉｇｅｎ（登録商標）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０：０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴを融合２４時間後に加える）を含む選択培地中で２週間インキュベートする。約２週後、細胞をＨＡＴがＨＴと置き換えられている培地中で培養する。次に個々のウェルをヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体に対してＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。広範なハイブリドーマ増殖が起こると、通常、培地を１０−１４日後に観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、まだヒトＩｇＧ陽性のとき、モノクローナル抗体を制限希釈により少なくとも２回サブクローニングすることができる。次に安定なサブクローンをインビトロで培養し、特性化のため組織培養培地中で少量の抗体を生成する。
【０１９２】
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過し、濃縮し、タンパク質Ａ−セファロース（Pharmacia, Piscataway, N.J.）でアフィニティクロマトグラフィーに付すことができる。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによりチェックし、純度を確認することができる。バッファー溶液をＰＢＳに交換し、濃度を吸光係数１．４３を使用してＯＤ２８０により測定することができる。モノクローナル抗体をアリコートし、−８０℃で保存することができる。
【０１９３】
モノクローナル抗体を製造するトランスフェクトーマの製造
本発明の抗体は、また、例えば、当分野で既知である組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマ中で製造することができる（例えば、Morrison, 1985 Science 229:1202）。
【０１９４】
例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるため、部分的または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または興味ある抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング）により得ることができ、ＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、発現ベクターに挿入することができる。これに関して、“作動可能に連結された”なる用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図された機能を果たすように、ベクターに連結されることを意味することを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入するか、または、さらに一般的に、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入することができる。抗体遺伝子は標準方法（例えば、抗体遺伝子フラグメント上の相補性制限部位およびベクターの連結または制限部位が存在しないとき、平滑末端連結）により発現ベクターに挿入される。本明細書に記載されている抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントと作動可能に連結され、そしてＶＬセグメントがベクター内のＣＨセグメントと作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクターに挿入することにより、いずれかの抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を製造するために使用することができる。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
【０１９５】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現をコントロールする調節配列を有する。“調節配列”なる用語は抗体鎖遺伝子の転写または翻訳をコントロールするプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Gene Expression Technology. 1990 Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA）に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターのデザインが形質転換された宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者に理解されよう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびパピローマに由来する、哺乳動物細胞における高レベルタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、例えば、ユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターのような非ウイルス調節配列を使用され得る。なおさらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒト１型Ｔ細胞白血病ウイルスの長い末端反復配列からの配列を含む、異なる源からの配列、例えば、ＳＲａプロモーター系を含む（Takebe et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。
【０１９６】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターはさらなる配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）および選択マーカー遺伝子を有し得る。選択マーカー遺伝子はベクターが挿入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、すべてAxel et al.による米国特許第４，３９９，２１６；４，６３４，６６５；および５，１７９，０１７号、参照）。例えば、一般的に、選択マーカー遺伝子はベクターが挿入されている宿主細胞上で薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８を選択するため）を含む。
【０１９７】
軽鎖および重鎖の発現のため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。“トランスフェクション”なる用語の種々の形態は、外来ＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞に導入するために一般的に使用されている広範な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを含むことを意図する。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれにおいても本発明の抗体を発現させることは理論上可能である。このような真核細胞、特に哺乳動物細胞が原核細胞よりも適当に折りたたまれた免疫学的に活性な抗体をアッセンブルおよび分泌しやすいため、真核細胞、特に哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が議論される。抗体遺伝子の原核生物発現は高収率の活性抗体の生成には無効であることが報告されている（Boss and Wood, 1985 Immunology Today 6:12-13）。
【０１９８】
本発明の組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（例えば、Kaufman and Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621に記載されているようなＤＨＦＲ選択可能マーカーと使用されるUrlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞の使用に関して、さらなる発現系はＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に示されているＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するとき、宿主細胞中で抗体の発現または宿主細胞を増殖させる培養培地中へ抗体の分泌を可能にする十分な時間、宿主細胞を培養することにより抗体を製造する。抗体は標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収することができる。
【０１９９】
二重特異性分子
他の局面において、本発明は本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体（例えば、抗ＴｒｋＢ抗体またはそのフラグメント）を含む二重特異性分子を特徴とする。本発明のＴｒｋＢ作動性抗体は誘導体化されるか、または他の機能分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド）と結合し、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を製造することができる。実際に、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体は誘導体化されるか、または１つ以上の他の機能分子と結合し、２つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を製造することができる；このような多重特異性分子は、また、本明細書において使用される“二重特異性分子”なる用語により包含されることを意図する。本発明の二重特異性分子を創造するため、本発明の抗体を（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合またはその他のものにより）二重特異性分子となるように１つ以上の他の結合分子、例えば、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物に機能的に結合することができる。
【０２００】
したがって、本発明はＴｒｋＢに対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。
【０２０１】
１つの態様において、本発明の二重特異性分子は結合特異性のために少なくとも１つの抗体またはその抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖを含む。抗体は、また、軽鎖または重鎖ダイマーまたはそれらのいずれかの最小フラグメント、例えば、ＦｖまたはLadner et al. 米国特許第４，９４６，７７８号（この内容を明白に出典明示により包含させる）に記載されている一本鎖構築物であり得る。
【０２０２】
本発明の二重特異性分子は当分野で既知の方法を使用して成分結合特異性を結合させることによって製造することができる。例えば、二重特異性分子のそれぞれの結合特異性は、別々に製造され、次に互いに結合させることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、種々のカップリング剤または架橋剤を共有結合複合体のために使用することができる。架橋剤の例はタンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシニミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648、参照）。他の方法はPaulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83, and Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375に記載されているものを含む。結合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両方ともPierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手できる。
【０２０３】
結合特異性が抗体であるとき、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合により結合させることができる。特定の態様において、ヒンジ領域は結合の前に奇数、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
【０２０４】
あるいは、両方の結合特異性は同じベクターにおいてコードされ、同じ宿主細胞において発現およびアセンブルされる。この方法は、特に、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき有用である。本発明の二重特異性分子は１つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を製造するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３；５，４５５，０３０；４，８８１，１７５；５，１３２，４０５；５，０９１，５１３；５，４７６，７８６；５，０１３，６５３；５，２５８，４９８；および５，４８２，８５８号に記載されている。
【０２０５】
二重特異性分子のこれらの特異性標的への結合は、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）またはウェスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは一般的に興味ある複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することにより特定の興味あるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０２０６】
医薬組成物
他の局面において、本発明は、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体（例えば、モノクローナル抗体またはその抗原−結合部分）の１つまたは組合せを含む、薬学的に許容される担体とともに製剤化された組成物、例えば、医薬組成物を提供する。このような組成物は（例えば、２種以上の異なる）結合分子の１つまたは組合せを含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する抗体または薬物の組合せを含むことができる。
【０２０７】
本発明の医薬組成物は、また、組合せ治療、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、呼吸器疾患の処置に関して、組合せ治療はＴｒｋＢアゴニスト抗体を少なくとも１つの他の薬物と共に含むことができる。組合せ治療において使用することができる治療剤の例は、ノルエピネフリンおよび／またはセロトニン経路の小分子活性化因子（例は三環式抗鬱剤デシプラミン（ＤＭＩ）、セロトニン１Ａ受容体部分的アゴニスト、ブスピロンならびに潜在的により選択的な抗鬱剤フルオキセチンおよびレボキセチンである）、プロスタグランジン、プロゲステロンまたはＴｒｋＢ活性の増強剤（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤）を含むが、これらに限定されない。
【０２０８】
本明細書において使用される“薬学的に許容される担体”は、生理学的に適合するあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。担体は（例えば、注射または注入による）経口、腹膜内、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与に適しているべきである。投与経路に依存して、活性化合物を、化合物を不活性にし得る酸および他の天然条件の作用から化合物を保護するために物質でコーティングし得る。
【０２０９】
本発明の医薬化合物は１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。“薬学的に許容される塩”は所望の親化合物の生物学的活性を保持するが、望ましくない毒性作用を付与しない塩を意味する（例えば、Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19、参照）。このような塩の例は酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は無毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸など、ならびに無毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などに由来するものを含む。塩基付加塩はアルカリ土金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに無毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものを含む。
【０２１０】
本発明の医薬組成物は、また、薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は：水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファ−トコフェロールなど；および金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などを含む。
【０２１１】
本発明の医薬組成物において使用され得る適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれの適当な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、および注入可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルを含む。適当な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０２１２】
これらの組成物は、また、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含み得る。微生物存在の防止は上記殺菌手順ならびに種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含により確保され得る。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物に包含させることが望ましいこともある。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の延長は吸収を遅らせる薬物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの包含により実現され得る。
【０２１３】
薬学的に許容される担体は無菌注射可能溶液または分散液の即時製造調製のための無菌水溶液または分散液および無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬物の使用は当分野で既知である。慣用の媒体または薬物が活性な化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助的な活性化合物も組成物に包含することができる。
【０２１４】
一般的に、治療組成物は製造および保存の条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、ミクロエマルション、リポソームまたはその他の高濃度の薬物に適した調整構造物として調剤することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）および適当なそれらの混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことができる。注射可能な組成物の吸収の延長は組成物中に吸収を遅らせる薬物、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことにより実現することができる。
【０２１５】
無菌注射可能溶液は適当な溶媒中で必要な量の活性な化合物を上記に挙げられた成分の１つまたは組合せと混合し、必要なとき、次に無菌的精密濾過をすることにより製造することができる。一般的に、分散液は基本的分散媒および上記に挙げられたものから必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に活性な化合物を配合することにより製造される。無菌注射可能溶液の製造のための無菌粉末の場合、製造方法は、事前に無菌濾過した溶液から活性成分プラス何らかのさらなる所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドドライ（凍結乾燥）である。
【０２１６】
単位投与形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は処置される対象および特定の投与経路に依存して変化する。単位投与形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は一般的に治療効果を引き起こす組成物の量である。一般的に、１００％のうち、この量は薬学的に許容される担体との組み合わせで活性成分が約０．０１％から約９９％、約０．１％から約７０％または約１％から約３０％の範囲である。
【０２１７】
投与レジメンは所望の最適応答（例えば、治療応答）を提供するために調節される。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、経時的に数回の分割投与で投与してもよく、または治療状況の緊急性により指示されるとき、比例的に用量を減少または増加してもよい。とりわけ、投与の容易性および投与量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で調剤することが有利である。本明細書において使用される投与単位形態は処置される対象に対する単位用量として適した物理的に分離した単位を意味し；それぞれの単位は必要な医薬担体と一緒に所望の治療効果を引き起こすように計算されたあらかじめ決められた量の活性な化合物を含む。本発明の投与単位形態の仕様は活性な化合物の独自の特徴と達成すべき特定の治療効果、および各個体における治療感受性に関して、このような有効化合物を調剤する技術に固有の限界により規定され、かつ直接的に依存する。
【０２１８】
典型的な処置レジメンは１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回または１月に１回の投与を必要とする。本発明のＴｒｋＢ作動性抗体のための投与レジメンは腹膜内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、抗体を下記投与スケジュール：例えば、１週間に１回１ｍｇ／ｋｇ体重を４週間、次に１週間に１回３ｍｇ／ｋｇ体重を処置の残りの期間の１つを使用して与える。
【０２１９】
いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する２つ以上の結合分子（例えば、モノクローナル抗体）を同時に投与され、この場合、投与されるそれぞれの抗体の用量は示される範囲内である。ＴｒｋＢアゴニスト抗体を通常、複数回投与する。各投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３月ごとまたは１年ごとであり得る。間隔は、また、患者のＴｒｋＢに対する結合分子の血中レベルを測定することにより示されるように不定期であり得る。いくつかの方法において、用量はＴｒｋＢアゴニスト抗体の適当な血漿濃度を達成するように調節される。
【０２２０】
あるいは、ＴｒｋＢアゴニスト抗体を持続放出製剤として投与することができ、この場合、投与頻度は少なくてよい。用量および頻度は患者におけるＴｒｋＢアゴニスト抗体の半減期に依存して変化する。一般的に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。用量および投与頻度は処置が予防的または治療的であるかどうかに依存して変化し得る。予防的適用において、比較的低用量を比較的低頻度で長期間投与する。ある患者は残りの生涯、処置を受け続ける。治療的適用において、ときどき、比較的高用量を比較的短間隔で、疾患の進行を遅らせるかもしくは停止させるまで、または患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで必要である。その後、患者は予防レジメンで投与され得る。
【０２２１】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物および投与経路に対して所望の治療応答を達成するために有効であり、患者に毒性がない、活性成分の量を得るために変化させることができる。選択された用量レベルは使用される本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排泄速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態および病歴ならびに医薬分野で既知の因子を含む種々の薬物動態因子に依存する。
【０２２２】
本発明の組成物は、１つ以上の当分野で既知の種々の方法を使用して、１つ以上の投与経路により投与することができる。投与様式および／または投与経路は所望の結果に依存して変化することが、当業者に理解される。本発明のＴｒｋＢ作動性抗体の投与形路は、例えば、注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口経路の投与を含む。本明細書において使用されるフレーズ“非経口投与”は通常、注入による経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管的、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２３】
あるいは、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体は、非経口経路、例えば、局所、上皮または粘膜経路の投与、例えば、鼻腔内、経口的、経膣的、経直腸的、舌下的または局所的により投与することができる。
【０２２４】
活性な化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のように、化合物を迅速な放出に対して保護する担体とともに製造することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤の製造のための多数の方法は特許されているか、または一般的に当業者に既知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978、参照。
【０２２５】
治療組成物は当分野で既知の医療デバイスで投与することができる。例えば、１つの態様において、本発明の治療組成物は無針皮下注射デバイス、例えば、米国特許第５，３９９，１６３；５，３８３，８５１；５，３１２，３３５；５，０６４，４１３；４，９４１，８８０；４，７９０，８２４または４，５９６，５５６号に示されているデバイスで投与することができる。本発明において有用な既知のインプラントおよびモジュールの例は：コントロールされた速度で薬物を分配するためのインプラント可能な微小注入ポンプを示す米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介する薬物を投与するための治療デバイスを示す米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを示す米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための流量可変のインプラント可能な注入装置を示す米国特許第４，４４７，２２４号；複数チャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４７５，１９６号を含む。これらの特許は出典明示により本明細書に包含される。他のこのような多数のインプラント、送達系およびモジュールは当業者に既知である。
【０２２６】
特定の態様において、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体をインビボで適切な分布を確実にするため製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多数の高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを（所望により）通過することを確実にするため、それらは、例えば、リポソーム中で製剤化することができる。リポソームを製造する方法に関して、例えば、米国特許第４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；および５，３９９，３３１号、参照。リポソームは特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１以上の部分を含み得、したがって標的薬物送達を強化する（例えば、V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685、参照）。典型的な標的とする部分は葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.による米国特許第５，４１６，０１６号、参照）；マンノシド（Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180）；界面活性剤タンパク質Ａ受容体（Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090）を含む；K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273も参照。
【０２２７】
マウスモデル
Ｍｅｃｐ２ＫＯ（Ｍｅｃｐ２−ノックアウト）オスおよびＭｅｃｐ２ＨＴ（ヘテロ接合体）メスは、レット症候群（ＲＴＴ）に罹患した女児と同様の症状を示すため、ＲＴＴを試験するために非常に有用なモデル系である。Ｍｅｃｐ２−ＫＯオスは４週齢で下記のいくつかの症状を示すようになる：成長の低下；脳成長およびニューロンサイズの低下；振戦；運動障害；自発運動の抑制（発作）；不規則な呼吸；不安の高まり；後弯症；型通りの前肢の運動；および後肢の折り畳み(clasping)。
【０２２８】
マウスにおけるＭｅｃｐ２欠乏は低い内因性レベルのＢＤＮＦと関連し、マウス呼吸系を混乱させることが知られており、特に延髄呼吸系の異常調節を引き起こすノルエピネフリンおよびセロトニン量の進行性欠乏症と関連している（Viemari et al., (2005) J Neuroscience; 25:11521）。該混乱および呼吸困難はＭｅｃｐ２−ＫＯマウスにおいてより大きい程度を示す。これらのマウスにおいて見られる中枢自律神経機能障害は、〜２月齢に致命的な呼吸停止を引き起こす進行的に悪化する呼吸障害（不規則な呼吸パターン、可変サイクルおよび頻繁な無呼吸）；心臓ＱＴ間隔延長；および延髄呼吸ネットワークを調節する阻害系において平衡異常を引き起こす脳幹骨髄におけるチロシンヒドロキシラーゼ、ノルエピネフリンおよびセロトニン量の劇的な減少を含む。
【０２２９】
Ｍｅｃｐ２ＨＴメスは同様であるが遅延された表現型（発症＝３月）を示し、迅速な悪化ではないが弱くなる。それらは９−１２月間、生存することができる。しかしながら、メスＭｅｃｐ２−ＨＴは、また、より大きな１回肺気量、呼吸鬱病、過呼吸後の遷延性無呼吸および低酸素症への大きな応答により特徴付けられる呼吸表現型が存在する（Bissonnette and Knopp, (2006) Pediatric Research; 59:513）。
【０２３０】
本発明は完全に記載されており、以下の実施例および特許請求の範囲によりさらに説明されるが、これらは説明のためであり、さらなる限定を意図しない。当業者は慣用の実験、本明細書に記載されている特定の手順に対する多くの等価なもののみを使用して確認するか、または確かめることができる。このような等価なものは本発明の範囲および特許請求の範囲内である。本出願に引用されている発行特許および公開特許出願を含む全ての刊行物の内容は出典明示により本明細書に包含される。
【実施例】
【０２３１】
実施例
実施例１：Ｍｅｃｐ２マウスへのＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｃ２０）の投与
ＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｃ２０）または塩水を３ｍｇ／ｋｇ体重の用量にて週に２回、４週齢（早い症状）から８週齢（遅い症状）のＭｅｃｐ２−ＫＯおよび野生型オスの腹膜内に投与し、該動物を６から８週間試験した。全４グループ（塩水を投与した野生型、ｍＡｂを投与した野生型、塩水を投与したノックアウトおよびｍＡｂを投与したノックアウト）にて１グループあたり９から１４匹のマウスであった。Ｍｅｃｐ２ノックアウトマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓから購入した（ｌｉｎｅ  Ｂ６．１２９Ｐ２  Ｃ  Ｍｅｃｐ２ｔｍ１．１Ｂｉｒｄ／Ｊ（＃００３８９０））。
【０２３２】
図１Ａにおいて見られるとおり、ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂを投与したとき、マウスは体重の低下を示した。上から１段目（データの点として白色四角記号）は塩水を投与したＭｅｃｐ２野生型マウスを表す。上から２段目（データの点として黒色四角記号）はＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したＭｅｃｐ２野生型マウスを表す。下から２段目（データの点として白色丸記号）は塩水を投与したＭｅｃｐ２ノックアウトマウスを表す。下から１段目（データの点として黒色丸記号）はＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したＭｅｃｐ２ノックアウトマウスを表す。図１Ａにおいて示されるとおり、ＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したとき、Ｍｅｃｐ２マウスは両方の場合において体重が低下した。
【０２３３】
６週齢（図１Ｂの左）および８週齢（図１Ｂの右）の両方の試験において、２４時間にわたって測定したとき、ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂを投与したマウスは、また、食糧および水分摂取の低下を示した。
【０２３４】
さらに、図１において見られるとおり、ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂを投与したとき、マウスは、また、体重の低下を示した。上から１段目（データの点として白色四角記号）は塩水を投与したＭｅｃｐ２野生型マウスを表す。上から２段目（データの点として黒色四角記号）はＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したＭｅｃｐ２野生型マウスを表す。下から２段目（データの点として白色丸記号）は塩水を投与したＭｅｃｐ２ノックアウトマウスを表す。下から１段目（データの点として黒色丸記号）はＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したＭｅｃｐ２ノックアウトマウスを表す。図１において示されるとおり、ＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したとき、Ｍｅｃｐ２マウスは両方の場合において体重が低下した。
【０２３５】
さらに、ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂの投与は処理−ＫＯマウスの前肢および後肢の握力を改善することができる。これは図２Ａにおいて証明され、ここで、データの点として四角記号は塩水（ＳＡＬ）またはＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｃ２０で処理した野生型（ＷＴ）マウスを表し；データの点として丸記号は塩水（ＳＡＬ）またはＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｃ２０で処理したノックアウト（ＫＯ）マウスを表す。加えて、ＴｒｋＢアゴニスト抗体を投与したマウスは体脂肪の減少および除脂肪量の増加を示した。これは図２Ｂにおいて証明され、ここで、データの点として四角記号は塩水（ＳＡＬ）またはＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｃ２０で処理した野生型（ＷＴ）マウスを表し；データの点として丸記号は塩水（ＳＡＬ）またはＴｒｋＢアゴニスト抗体Ｃ２０で処理したノックアウト（ＫＯ）マウスを表す。
【０２３６】
ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂの投与は、また、Ｍｅｃｐ２−ＫＯマウスの寿命を延長することができる。Ｍｅｃｐ２−ＫＯマウスは約８週齢から１０週齢で死ぬことが知られているが、ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂｓを投与したときより長く生存することができる。これは少なくとも、塩水を投与したＫＯマウス（ＫＯ／ＳＡＬ）は約８−１０週齢で死に、ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂを投与したＫＯマウス（ＫＯ／Ｃ２０）は２３週齢まで生存する図３Ａにおいて証明される；（図３において、野生型マウスはＷＴとして表し、そしてノックアウトマウスはＫＯとして表し、ＴｒｋＢアゴニスト抗体はＣ２０として表す）。図３において示されるとおり、ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂ−処理マウス（ＫＯ／ＭＡＢ）は塩水処理ＫＯマウスの少なくとも２倍の年齢まで生存することができる。Ｍｅｃｐ２−ＫＯマウスの致命的な呼吸障害は延髄呼吸ネットワーク系において発現されるＴｒｋＢのＴｒｋＢアゴニスト抗体による刺激により救うことができると考えられ；該系は、Ｍｅｃｐ２が欠如および／または変異しているとき、マウスおよびヒトにおいて負に影響を与える。
【０２３７】
さらに、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、延髄呼吸系のニューロンに接近し、それによりチロシンヒドロキシラーゼ（ノルエピネフリン合成に対する律速酵素）、ノルエピネフリンおよびセロトニンを正常レベルに回復させ、したがって、ＫＯマウスの呼吸障害を予防し、寿命を延長すると考えられる。これらの呼吸および関連障害は試験されており、延髄呼吸系のノルエピネフリンおよびセロトニン調節の進行性の欠乏症と関連する（Viemari et al., (2005) J Neuroscience; 25:11521）。ノルエピネフリン再摂取阻害剤であるデシプラミンでの慢性処置は、この表現型を救い、Ｍｅｃｐ２ＫＯマウスの寿命を有意に延長することができる（Roux et al. (2007) Eur. J. Neuroscience; 25:1915）。あるいは、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は頸動脈小体を構成するニューロンに位置するＴｒｋＢ受容体に結合し、そして呼吸パターンを調節する脳（すなわち、皮質または視床下部）における混乱した伝達をより高い機能に回復することが信じられている。最後に、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、節状頭部感覚神経節のＴｒｋＢ受容体に作用し、心肺ホメオスタシスに重要である構造として報告されているＢＤＮＦの減少を補うと考えられる（Ogier et al., (2007) J. Neuroscience; 27:10912）。
【０２３８】
本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体は、同じ、または同様のメカニズムを介して、同じ様式において作用することができる（例えば、脳幹骨髄におけるこれらの神経伝達物質の正常レベルおよびバランスへの回復に作用することができる）。［３Ｈ］−標識ＴｒｋＢアゴニスト抗体における放射性イメージングにて、これらの発見をさらに確認することができ、起こりうるメカニズムをさらに解明することができる。本明細書において他に記載のない限り、いくつかの態様において、本方法のＴｒｋＢアゴニスト抗体は相加的効果のためにデシプラミンと組み合わせることができる。
【０２３９】
実施例２：Ｍｅｃｐ２マウスへのＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｃ２０）の投与
無呼吸の試験のため、Ｂｕｘｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓにより設計された系を使用して、全身プレチスモグラフィーを使用することができる。意識のある自由なマウスをプレチスモグラフチャンバー（直立プレキシガラス円柱  直径４インチおよび高さ５インチ）に置く。チャンバーへの一定の新鮮な空気の交換を確保するため、空気流を維持し、食料、寝床および水を提供する。無呼吸の頻度を正確に評価するために、マウスをプレチスモグラフチャンバーに順応させることが必要である。それらが完全に順応したら、チャンバーから動物を取り出さずに気道応答記録を種々の間隔にて行う。順応期間および記録期間は２時間を越えるべきではなく；したがって、マウスを一度に２時間以上、チャンバー内に置かない。
【０２４０】
プレチスモグラフ記録を同じ動物において週にわずか２回行う。プレチスモグラフ記録が完了したら、マウスをホームケージに戻す。プレチスモグラフチャンバー中に、マウスが激しく不自然な呼吸または不安の明らかなサインを示すとき、それらをチャンバーから取り出し、ホームケージに戻してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月8日(2010.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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