(57)【要約】  化学プロセスおよび化学プロセスと無関係の観察プロセスの組み合わせを伴う核酸の自動化ハイ・スループット塩基配列決定のための拡張性の高い反応および検出システムが提供される。個別機能ユニットは、システムにおいて光学画像収集および／または解析のための個別装置コンポーネントと併せて異なる塩基配列決定反応コンポーネントを入れ換えて利用できるような構成にされうる。
2011501965.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイ・スループット核酸塩基配列決定のためのシステムであって、
反応ユニット内の核酸試料に対し生化学的塩基配列決定反応を実行するための反応サブシステムと、
前記塩基配列決定反応の光学画像を取得し、前記塩基配列決定反応と無関係に前記光学画像の解析に使用する、個別検出サブシステムと、
反応プラットフォームと前記検出システムとの間に前記核酸試料を移動し、それにより前記プラットフォームおよび前記検出システムが可逆的に統合されたシステム内で物理的疎結合される、結合サブシステムとを備えるシステム。
【請求項２】
前記反応サブシステムは、
複数の個別反応プラットフォームを入れ換えて利用可能であるように構成された少なくとも１つの個別反応プラットフォームを備える請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記反応プラットフォームは、
複数の反応ユニットを備え、それぞれの反応ユニットは前記反応プラットフォームから取り外し可能である少なくとも１つの個別フロー・セルを収納する請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記結合サブシステムは、
他の個別反応プラットフォームと関係なく前記少なくとも１つの個別反応プラットフォームのうちの選択された１つの反応プラットフォームから前記反応ユニットを選択し、前記反応ユニットを前記検出サブシステムに移動するように動作可能な把持メカニズムを有する搬送デバイスを備える請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記把持メカニズムは、反応プラットフォームの作業場に対して垂直な軸を中心として回転可能な移動可能アームを備える請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
検出および処理試薬を保管し、前記検出および処理試薬を前記フロー・セルに移動するための流体工学サブシステムをさらに備える請求項４に記載のシステム。
【請求項７】
複数の前記反応プラットフォームは、前記検出サブシステムに関して互いに隣接するように並べて配設されている請求項４に記載のシステム。
【請求項８】
複数の前記反応プラットフォームは、前記検出サブシステムに関して互いに隣接するように前後に並べて配設されている請求項４に記載のシステム。
【請求項９】
前記少なくとも１つの反応プラットフォームは、光学観察のための蛍光塩基配列決定反応産物として核酸試料を調製するように動作可能であり、
前記検出サブシステムは、コンピュータ援用識別のため前記複数の蛍光反応産物のカラー画像を取り込むように動作可能である請求項４に記載のシステム。
【請求項１０】
核酸上の自動化塩基配列決定反応を処理し検出するための方法であって、
複数のフロー・セルを反応プラットフォーム上に留置し、それぞれのフロー・セルは複数の識別可能な反応部位および前記複数の反応部位に付着された複数の核酸試料を備えることと、
処理試薬を前記フロー・セル内に注入することと、
一定の処理期間の間、前記処理試薬を前記核酸試料と反応させて、蛍光塩基配列決定産物を生成する塩基配列決定反応を引き起こすことと、この後、
前記フロー・セルを前記反応プラットフォームから検出サブシステムに、前記検出サブシステムに物理的に疎結合されている自動化結合サブシステムを使用して移動することと、
前記検出サブシステムにおいて前記フロー・セルを照射することで、前記蛍光塩基配列決定産物に、前記識別可能な反応部位において識別可能なスペクトルで蛍光発光させることと、
前記フロー・セル内の前記識別可能な反応部位から蛍光のカラー画像を取り込み、核酸塩基配列を識別するために使用することとを含み、前記取り込み段階の持続時間は前記反応段階の時間よりも実質的に短い方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
<<関連出願の相互引用>>
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２００７年１０月３０日に出願された「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」という表題の米国仮出願第６０／９８３，８８６号の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）項に従って主張するものである。
【０００２】
<<連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する記載>>
・・・  該当なし。
<<コンパクト・ディスクで提出された「シーケンス・リスティング」、表、またはコンピュータ・プログラム・リスティング付録への参照>>
・・・  該当なし。
【０００３】
技術分野
本発明は、一般的に、核酸の自動化された光学的検出の分野に関する。本発明は、一般的に、核酸の自動化されたハイスループット塩基配列決定のための拡張性の高い反応および検出システムを対象とする。
【背景技術】
【０００４】
ヒト・ゲノム計画の誕生で、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）などの核酸の塩基配列決定のための改善された方法を開発することが必要になった。ヒト・ゲノムの３，０００，０００，０００個の全塩基配列の決定は、数多くの疾病の遺伝的な根拠を明らかにするための基礎をもたらした。しかし、それぞれの疾病に関連する遺伝的変異を明らかにするという多大な作業がやり残されており、またそれぞれの個人に対する６，０００，０００，０００個の塩基の配列決定を行う現時点でのコスト（二倍体ヒト・ゲノムのサイズ）は、いぜんとして、ことのほか難題であるだけでなく、法外なコストでもある。
【０００５】
これまで多くの企業が、ＤＮＡ塩基配列決定システムの開発によってハイスループットＤＮＡ塩基配列決定の難題にアプローチしてきた。そのようなシステムは、コストを低減し、ＤＮＡ塩基配列決定の効率を高めたが、これらのシステムは、一般的に、複数の相互依存するコンポーネントを有する自給自足型ユニットである。このような単一ユニット塩基配列決定システムには、拡張性、革新技術を特定のコンポーネントに導入するまでのタイム・ラグ、およびシステムのそれぞれのコンポーネントに対するシステム全体の機能の直接的依存性を含む、多くの制限がある。
【０００６】
塩基配列決定反応および分析のためのフロー・セルが知られている。このようなフロー・セルの例としては、本明細書でさらに詳しく説明されているもの、ならびに米国特許第５，９５８，７６０号、米国特許第６，４０３，３７６号、米国特許第６，９６０，４３７号、米国特許第７，０２５，９３５号、米国特許第７，１１８，９１０号、米国特許第７，２２０，５４９号、米国特許第７，２４４，５５９号、米国特許第７，２６４，９２９号、国際公開ＷＯ０１／３５０８８、および米国特許出願公開第２００７／０１２８６１０号において説明されているものなどの塩基配列決定反応の実行に使用される基材を備えるものが挙げられる。
【０００７】
本発明では、知られている従来技術の制限を取りあげて説明する。
【０００８】
定義
現在の技術に関する十分な背景知識を前提とするうえで、以下の技術用語を理解しておくことが役立つ。
【０００９】
「単位複製配列」は、ポリヌクレオチド増幅反応の産物、つまり、１つまたは複数の開始塩基配列から複製されるポリヌクレオチドの集団を意味する。単位複製配列は、限定はしないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、直線ポリメラーゼ反応、核酸塩基配列ベース増幅、ローリング・サークル増幅、およびこれらと同様の反応を含む、さまざまな増幅反応によって生成されうる（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，９６５，１８８号、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第４，８００１５９号、米国特許第５，２１０，０１５号、米国特許第６，１７４，６７０号、米国特許第５，３９９，４９１号、米国特許第６，２８７，８２４号、および米国特許第５，８５４，０３３号、ならびに米国公開第２００６／００２４７１１号を参照）。
【００１０】
「アレイ」または「マイクロアレイ」は、核酸を含む部位の集合体を、その集合体に含まれるそれぞれの部位が空間的に画定され、アレイの他の部位と重なり合わないように、つまり、それらの部位が空間的に離散するように担持する、表面、ただし、好ましくは、排他的でなく、平面的または実質的に平面的な表面を有する固相担体を指す。アレイまたはマイクロアレイは、ビーズまたはウェルなどの表面を持つ非平面的なインタロゲート可能な構造も備えることができる。アレイのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、固相担体に共有結合されうるか、または非共有結合されうる。従来のマイクロアレイ技術は、例えば、Ｓｃｈｅｎａ、Ｅｄ．（２０００）、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）において検討されている。本明細書で使用されているような、「ランダム・アレイ」または「ランダム・マイクロアレイ」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの同一性が、少なくとも当初は、その配置から識別可能でないが、アレイに対する特定の生化学検出技術によって決定されうるマイクロアレイを指す。例えば、米国特許第６，３９６，９９５号、米国特許第第６，５４４，７３２号、米国特許第６，４０１，２６７号、米国特許第第７，０７０，９２７号、国際公開ＷＯ２００６／０７３５０４、国際公開ＷＯ２００５／０８２０９８、米国公開第２００７／０２０７４８２号、および米国公開第２００７／００８７３６２号を参照のこと。
【００１１】
「ハイブリダイゼーション」は、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合して安定した二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指す。「ハイブリダイゼーション」という用語は、三本鎖ハイブリダイゼーションを指す場合もある。その結果得られた（通常の）二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「二本鎖」である。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、塩濃度が１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満、および約２００ｍＭ未満という条件を含む。「ハイブリダイゼーション緩衝液」は、５×ＳＳＰＥ、または同様のものなどの緩衝塩溶液である。ハイブリダイゼーション温度は、５℃程度と低くてもよいが、典型的には、２２℃より高い、より典型的には３０℃より高い、好ましくは約３７℃を超える。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件の下で実行される、つまり、プローブがその標的部分塩基配列にハイブリダイズする条件の下で実行される。ストリンジェントな条件は、塩基配列依存であり、環境が異なれば異なる。フラグメントは長いほど、特異的ハイブリダイゼーションに対して高いハイブリダイゼーション温度を必要とする場合がある。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、塩基ミスマッチの程度を含む、他の要因もハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼしうるので、パラメータの組み合わせは、どれか１つのパラメータ単独の絶対尺度よりも重要である。一般に、ストリンジェントな条件は、画定されたイオン強度およびｐＨにおいて特定塩基配列に対しＴmより約５℃低い温度となるように選択される。ストリンジェントな条件の例としては、７．０から８．３までの範囲のｐＨ、少なくとも２５℃の温度で、少なくとも０．０１Ｍから１Ｍ以下までのＮａイオン濃度（または他の塩）である塩濃度が挙げられる。例えば、５×ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ  ７５０ｍＭ、ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ５ｍＭ、ｐＨ  ７．４）および２５℃〜３０℃の温度という条件は、対立遺伝子特異的プローブ・ハイブリダイゼーションに適している。ストリンジェントな条件については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈｅ、およびＭａｎｉａｔｉｓ著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」２nd  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＡｎｄｅｒｓｏｎ著「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１st  Ｅｄ．、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９９）を参照のこと。
【００１２】
「〜に特異的にハイブリダイズする」または同様の表現は、１つの分子をストリンジェントな条件の下で特定の１つまたは複数のヌクレオチド塩基配列に実質的に、または特定の１つまたは複数のヌクレオチド塩基配列にのみ、その塩基配列が複合混合物（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ内に存在しているときに、結合すること、二本鎖化すること、またはハイブリダイズすることを指す。
【００１３】
「ライゲーション」は、テンプレート駆動反応において、２つまたはそれ以上の核酸、例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの末端間に共有結合または連結を形成することを意味する。結合または連結の性質は、広範に異なることがあり、ライゲーションは、酵素的に、または化学的に実行されうる。本明細書で使用されているように、ライゲーションは、通常、１つのオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの５’炭素と他のオリゴヌクレオチドの３’炭素との間のホスホジエステル結合を形成するために酵素的に実行される。さまざまなテンプレート駆動ライゲーション反応が、以下の参考文献、Ｗｈｉｔｅｌｙらの米国特許第４，８８３，７５０号、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒらの米国特許第５，４７６，９３０号、Ｆｕｎｇらの米国特許第５，５９３，８２６号、Ｋｏｏｌの米国特許第５，４２６，１８０号、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎらの米国特許第５，８７１，９２１号、ＸｕおよびＫｏｏｌのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７：８７５−８８１（１９９９）、ＨｉｇｇｉｎｓらのＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８：５０−７１（１９７９）、ＥｎｇｌｅｒらのＴｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、１５：３−２９（１９８２）、およびＮａｍｓａｒａｅｖの米国特許公開第２００４／０１１０２１３号において説明されている。酵素ライゲーションは、通常、リガーゼ緩衝液中で生じ、このリガーゼ緩衝液は、使用される特定のリガーゼに対し、必要な二価陽イオン、補因子、および同様のものを含む緩衝塩溶液である。
【００１４】
「ミスマッチ」は、ワトソン−クリック塩基対Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔ以外の塩基Ａ、Ｔ（またはＲＮＡの場合にはＵ）、Ｇ、およびＣのうちのどれか２つの塩基がなす塩基対を意味する。８つの可能なミスマッチは、Ａ−Ａ、Ｔ−Ｔ、Ｇ−Ｇ、Ｃ−Ｃ、Ｔ−Ｇ、Ｃ−Ａ、Ｔ−Ｃ、およびＡ−Ｇである。
【００１５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特異的ＤＮＡ塩基配列のインビトロ増幅に対する反応を意味する。言い換えると、ＰＣＲは、プライマー結合部位により両脇を固められる標的核酸の複数のコピーまたは複製を作製するための反応であり、このような反応は、（ｉ）標的核酸を変性させ、（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位にアニールし、および（ｉｉｉ）ヌクレオシド・トリホスフェートの存在下で核酸ポリメラーゼによってプライマーを伸長するプロセスの１つまたは複数の繰り返しを含む。通常、反応は、熱サイクル機器内のそれぞれの反応条件について最適化された異なる温度で循環される。反応と反応との間の特定の温度、持続時間、および変化速度は、当業者によく知られている多くの要因に依存し、これらは、例えば参考文献、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、編者、ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ＡｐｐｒｏａｃｈおよびＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（それぞれ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１年および１９９５年）で例示されている。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＰＣＲでは、二本鎖標的核酸は、９０℃より高い温度で変性され、プライマーは５０〜７５℃の範囲の温度でアニールされ、プライマーは７２〜７８℃の範囲の温度で伸長されうる。上述のように、「ＰＣＲ」という用語は、限定はしないが、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、入れ子型ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重化ＰＣＲ、および同様のものを含む、反応の派生形態を包含する。反応体積は、数百ナノリットル、例えば、２００ｎＬから、数百μＬ、例えば、２００μＬまでの範囲である。
【００１６】
「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書では、ヌクレオチドモノマーのポリマーを意味するために使用される。本明細書で使用されているように、これらの用語は、二本鎖形態も指しうる。核酸およびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、ワトソン−クリック型の塩基対合、塩基の積み重ね、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型塩基対合、または同様のものなどの規則正しいパターンのモノマー間相互作用によって天然ポリヌクレオチドに特異的に結合し、二本鎖または三本鎖形態を形成することができる。このようなモノマーおよびそのインターヌクレオシド結合は、天然のものであるか、またはその類似体、例えば、天然もしくは非天然類似体とすることができる。非天然類似体としては、ペプチド核酸、ロックト核酸、ホスホロチオエート・インターヌクレオシド結合、蛍光体などの標識の付着を可能にする連結基を含む塩基、またはハプテン、および同様のものなどが挙げられる。オリゴヌクレオチドまたは核酸の使用が、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーション、または同様の反応などの酵素処理を必要とするときには、当業者は、これらの事例におけるオリゴヌクレオチドまたは核酸が、インターヌクレオシド結合のいくつかの類似体、糖部分、または任意の位置もしくはいくつかの位置における塩基を、そのような類似体が酵素反応と親和性を有しないときに含まないことを理解するであろう。核酸は、典型的には、通常「オリゴヌクレオチド」と称される場合の数モノマー単位、例えば、５〜４０から、数１０万以上のモノマー単位までの範囲のサイズを有する。核酸またはオリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列（大文字または小文字）によって表される場合、別段の指示のない限り、または文脈から明らかでない限り、ヌクレオチドは左から右へ５’→３’の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はチミジンを表し、「Ｉ」はデオキシイノシンを表し、「Ｕ」はウリジンを表すものと理解されるであろう。別に指摘されていない限り、用語および原子番号の振り方は、ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）に開示されている内容に従う。通常、核酸は、ホスホジエステル結合によって結合された天然ヌクレオシド（例えば、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、ＤＮＡの場合にはデオキシチミジンまたはＲＮＡの場合にはその対応するリボース）を含むが、これらは、非天然ヌクレオチド類似体、例えば、修飾塩基、糖、またはインターヌクレオシド結合も含みうる。当業者にとっては、酵素が活性に対する特異的オリゴヌクレオチドまたは核酸基質要件、例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖、または同様の条件を有する場合、オリゴヌクレオチドまたは核酸基質に対する適切な組成の選択は、特にＳａｍｂｒｏｏｋら著Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）および同���の参考文献などの専門書の手引きがあれば、当業者の知識で十分に対応できる。
【００１７】
「プライマー」は、ポリヌクレオチド・テンプレートで二本鎖を形成した後に、核酸合成の開始点として働くことができ、また伸長された二本鎖が形成されるようにテンプレートにそってその３’末端から伸長できる、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。伸長プロセスの際に加えられるヌクレオチドの塩基配列は、テンプレート・ポリヌクレオチドの塩基配列によって決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、通常、ヌクレオチド９個から４０個までの範囲の長さを有するか、またはいくつかの場合には、ヌクレオチド１４個から３６個までの範囲の長さを有する。
【００１８】
本明細書で使用されているような「プローブ」は、未知の塩基配列の核酸の中の相補配列をインタロゲートするために使用される、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを指す。標的ポリヌクレオチドに対する特異的プローブのハイブリダイゼーションは、標的ポリヌクレオチド塩基配列内のプローブに相補的な特異的塩基配列を示す。
【００１９】
「読み出し」は、測定および／または検出され、数、値、または評価のための他の印として表現されうる１つまたは複数のパラメータを意味する。いくつかの文脈において、読み出しは、そのような収集または記録されたデータの実際の数値表現を指すものとしてよい。例えば、マイクロアレイからの蛍光強度シグナルの読み出しは、マイクロアレイのそれぞれのハイブリダイゼーション部位で生成されるシグナルの位置および蛍光強度であり、そのため、そのような読み出しは、さまざまな方法で、例えば、マイクロアレイの画像として、数の表として、または同様の形式で登録または格納されうる。
【００２０】
「固相担体」および「担体」は、入れ換えて使用可能であり、１つまたは複数の剛体または半剛体表面を有する材料または材料の群を指す。マイクロアレイは、通常、顕微鏡用スライド・ガラスなどの少なくとも１つの平面的な固相担体を備える。
【００２１】
本明細書で使用されているように、「Ｔm」という用語は、「融解温度」を指すために使用される。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる温度である。核酸のＴmを計算するいくつかの数式が、当技術分野でよく知られている。標準文献に示されているように、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液中にある場合Ｔm値の単純な推定値は、式Ｔm＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）で算出されうる（ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照）。他の文献（例えば、Ａｌｌａｗｉ、Ｈ．Ｔ．＆  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ、Ｊ．、Ｊｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６、１０５８１−９４（１９９７））には、Ｔmの算出のために構造および環境に関する、さらには塩基配列に関する特性を考慮する代替計算方法が示されている。
【００２２】
説明のため、断りのない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が関係している技術分野の当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する。
【００２３】
値の範囲が与えられた場合、その範囲およびその規定されている範囲内の他の規定されている、または間に入る値の上限と下限との間の、文脈上明確に別の値が指示されていない限り下限の１／１０までの、それぞれの間に入る値は、本発明に包含されることは理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限がより小さな範囲に独立に含まれうるということも、規定されている範囲内の特に除外されている限界を条件として、本発明に包含される。規定されている範囲が、これらの限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００２４】
以下の説明では、本発明をより完全に理解できるように、多数の具体的詳細が述べられている。ただし、当業者にとって、本発明がこれらの具体的詳細がなくても実施されうることは明らかであろう。他の場合には、当業者によく知られている特徴および手順は、本発明をわかりにくくしないために説明されていない。
【００２５】
一般的に、指示されている場合を除き、本発明に関して参照されている分子生物学および塩基配列解析法は、その基本的態様において、関連分野で使用されているものの技術の範囲内の従来の方法である。そのような技術は、文献において完全に説明されており、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８２）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、ＲｕｓｓｅｌｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２００１）を参照されたい。本明細書で使用されている核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、当該分野の標準専門書および教科書の用語および記号に従っており、例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７５）、ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、編者、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）、Ｇａｉｔ、編者、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４）、および同様の書籍を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】米国特許第５，９５８，７６０号
【特許文献２】米国特許第６，４０３，３７６号
【特許文献３】米国特許第６，９６０，４３７号
【特許文献４】米国特許第７，０２５，９３５号
【特許文献５】米国特許第７，１１８，９１０号
【特許文献６】米国特許第７，２２０，５４９号
【特許文献７】米国特許第７，２４４，５５９号
【特許文献８】米国特許第７，２６４，９２９号
【特許文献９】国際公開ＷＯ０１／３５０８８
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００７／０１２８６１０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明によれば、ゲノム解析のために核酸塩基配列決定法を実行するためのシステムは、光学画像の収集および／または解析のための個別装置コンポーネントとともに異なる塩基配列決定反応コンポーネントを取り替え可能な形で利用できるように構成されうる、例えば、試料調製および観察のための個別機能単位を備え、これにより異なる速度で動作する試料調製およびデータ抽出におけるボトルネックを最小にする。
【００２８】
本発明は、未知の塩基配列を持つ核酸の塩基配列決定を行うためのハイスループット・システムを実現する。本発明によるシステムは、そのようなシステム内に物理的に疎結合され、塩基配列のインタロゲートおよび解析を行うために可逆的に統合されている多目的個別コンポーネントを備える。システムの疎結合および可逆的統合性により、さまざまなシステム・コンポーネントを使用する際の効率および多目的性が向上し、したがって、時間要件およびそれぞれのコンポーネントの能力に基づいてシステムを最適化することができる。このため、拡張性が高まり、システムに改善機能を追加しやすくなり、当技術分野において現在利用可能な完全統合システムと比べてユーザーの自由度が高められた複数のシステム構成を構築することができる。
【００２９】
システム要素が疎結合され、可逆的に統合されることで、多数の利点が得られ、例えば、システム全体における他のコンポーネントを中断することなくシステムの単一コンポーネント内で行われる必要のある修理が容易になる。それに加えて、個別システム・コンポーネントの連結戦略をとることで、単一コンポーネントに改善を導入しやすくなり、したがって、革新技術の使用が促進され、最新の革新技術がシステム全体に適用される。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明の特定のいくつかの実施形態では、核酸塩基配列決定法に必要な各活動の実行に複数のコンポーネントを使用することによって、より高いスループットを達成できる。例えば、複数の光学的検出機器および／または複数の塩基配列決定反応コンポーネントを使用することで、決定される塩基配列の数を大幅に増大し、そうするために必要な時間を短縮することができる。
【００３１】
これらの実施形態のうちの１つの実施形態において、塩基配列決定のための単一反応装置ならびに単一光学的検出および解析機器が製作され、その際に、反応装置は光学機器と物理的に疎結合され、可逆的に統合される。
【００３２】
他の実施形態では、異なる塩基配列決定反応コンポーネント、例えば、合成による塩基配列決定を目的とするコンポーネントおよびプローブ・ライゲーションによる塩基配列決定を目的とするコンポーネントとともに使用するための、複数の生化学コンポーネントおよび単一光学的検出機器が製作される。そのようなシステムの塩基配列決定反応コンポーネントは、個別ユニットに保持され、それぞれのユニットは光学的撮像システムに物理的に可逆的相互接続されうる。このため、単一システムにおいて異なる塩基配列決定技術を使用することができ、単一デバイス構成の複数の異なる塩基配列決定法の強みを活かすことができる。光学機器を、解析コンポーネントを有する単一システム内に配設することができるか、またはそれらを、システム全体の２つの別々のコンポーネントとして配備することができる。
【００３３】
特定の一実施形態では、システムは、３つのコンパートメント化されたコンポーネントを備えることができ、これらのコンポーネントは、（ｉ）検出および処理試薬、例えば、プローブ、洗浄液、および同様の物質を保管し、移動するための流体システム、（ｉｉ）一連の反応チャンバー、または（複数の）フロー・セルで生化学的塩基配列決定反応を実行するための反応プラットフォーム、および（ｉｉｉ）塩基配列決定反応の光学画像の取り込み、そのような画像を解析するための個別照明および検出システムである。
【００３４】
生化学的塩基配列決定反応のための反応プラットフォームは、好ましくは、個別フロー・セルを備える複数の反応ユニットおよび生化学的塩基配列決定反応が完了した後に反応装置から照明および検出システムにそれぞれのフロー・セルを移動するためのメカニズムを有する。
【００３５】
複数の実施形態の好ましい一態様では、フロー・セルは、固体表面、例えば、ガラスまたはフィルムもしくは膜などの可撓性材料に付着させた未知の塩基配列を持つ核酸のアレイを備える。他の実施形態では、それぞれのフロー・セルは、固体または半固体表面に適宜付着させたビーズに付着する未知の塩基配列を持つ核酸のアレイを備える。
【００３６】
本発明の実施形態の特定の一態様において、システムの塩基配列決定反応コンポーネントは、試料を処理するのに使用するための複数のフロー・セルを備える。好ましい一態様では、それぞれのフロー・セルは、塩基配列決定反応で使用される流体の導入および除去をそれぞれ行うための流体入口と流体出口とを持つ実質的に封止されたチャンバーを備える。
【００３７】
特定の一実施形態では、２つまたはそれ以上の塩基配列決定反応プラットフォームは、それぞれの反応ユニットから送られてくる別々の塩基配列決定情報を記録し、解析することができる、単一の光学的撮像システムに相互接続されうる。特定の一態様において、複数の反応プラットフォーム上の反応ユニットおよびフロー・セルのそれぞれは、複数のフロー・セル上で同じハイ・スループット核酸塩基配列決定生化学を実施するように設計されている。他の態様では、異なる反応プラットフォームおよびフロー・セルは、それぞれの反応プラットフォームが特定のフロー・セル塩基配列決定反応を実行するように最適化された、ハイ・スループット核酸塩基配列決定に対する異なる生化学的アプローチをとるように設計されている。それぞれが塩基配列決定法の特定の生化学に対応できるように設計され、単一の照明および解析システムと可逆的に相互接続された、最適化された反応プラットフォームおよびフロー・セル生化学的反応ユニットを備えることができるため、空間と実行時間を最適な形で利用することができ、また潜在的な生化学的塩基配列決定用途毎に別のシステム一式を備える場合に比べて費用効果も高い。
【００３８】
いくつかの実施形態の特定の一態様において、それぞれのフロー・セルの内面の一部は、担体の試料担持面によって画定され、その配列構成は、フロー・セル・アセンブリに関わるコンポーネントの数を最小限度に抑えられるという利点を有する。
【００３９】
特定の一実施形態において、特定の塩基配列決定反応ユニットのフロー・セルは、それぞれ、２つの固体平面状表面の間にガラスとガスケットをサンドイッチ状に挟むことによって未知の塩基配列を持つ標的核酸のアレイを備える。一方の平面は、撮像を行える十分なサイズの開口部、およびカバー・スリップ用の指標付けポケットを有する。他方の平面は、ガスケット用の指標付けポケット、流体口、およびオプションの温度制御システムを有する。
【００４０】
本発明の特定の一態様において、塩基配列決定反応ユニットとの特定の使用に合わせて設計されたフロー・セルは、厚さ１７０マイクロメートル、広さ１”平方のカバー・スリップを備える。好ましい一実施形態では、このフロー・セルは、ハイ・スループット、ゲノム・スケールの塩基配列決定法のため未知の塩基配列を持つ巨大分子生物学的構造を結合するように誘導体化された１つの表面を有する。
【００４１】
本発明のいくつかの特定の態様において、フロー・セルは、フロー・セルとの間で流体の出入りを行わせることができるデバイス（例えば、注射器ポンプ）に接続されている流体口を備えることができる。
【００４２】
本発明の他の特定の態様において、フロー・セルは、液体レベル・センサーを適宜備える、混合チャンバーに接続された口を備える。塩基配列決定反応に必要な溶液が、このチャンバー内に分注され、必要に応じて混合され、次いでフロー・セル内に引き込まれる。好ましい一態様では、チャンバーは、事実上円錐形状であり、漏斗として機能する。本発明のいくつかの実施形態のいくつかの態様において、それぞれのフロー・セルは、温度を約５〜９５℃までの範囲内に、より精密には１０〜８５℃の範囲内に維持することができる、温度制御サブシステムを備え、毎秒約０．５〜２℃の速度で温度を変化させることができる。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態の他の一態様において、システムは、担体上に担持されている、試料、特に生体試料を処理するための自動化装置をさらに備え、この装置は、その担体またはそれぞれの担体上の試料が各実質的に封止されたチャンバー内に存在する、１つまたは複数の担体を保持するための担体保持手段と、処理流体をそのチャンバーまたはそれぞれのチャンバーに送出するための流体送出手段と、流体をそのチャンバーまたはそれぞれのチャンバーから取り出すための廃液収集手段と、塩基配列決定反応を監視するためのコンピュータ制御手段とを備える。好ましくは、この装置は、上で画定されたフロー・セルのうちの１つまたは複数と併せて使用される。
【００４４】
本発明は、当業者であれば、以下でさらに詳しく説明されているような方法の詳細を読んだ後さらによく理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の塩基配列決定反応プラットフォームの基本形態を示す図である。
【００４６】
【図２】塩基配列決定反応プラットフォームと光学的撮像デバイスとを備えるシステムの第１の実施形態を示す図である。
【００４７】
【図３】塩基配列決定反応プラットフォームと光学的撮像デバイスとを備えるシステムの第２の実施形態を示す図である。
【００４８】
【図４】伸縮アームを備える塩基配列決定反応プラットフォームと光学的撮像デバイスとを備えるシステムの第３の実施形態を示す図である。
【００４９】
【図５】塩基配列決定反応プラットフォームの並列構成を備えるシステムを示す図である。
【００５０】
【図６】本発明によるシステムの詳細を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
図１は、反応作業空間を持ち、長さ寸法Ｘ、幅寸法Ｙ、および高さ寸法Ｚを有する、例示的な塩基配列決定反応プラットフォームの側面略図を示している。
【００５２】
図２は、本発明の塩基配列決定システム実施形態の好ましい一態様の第１の塩基配列決定反応プラットフォームの上面略図を示している。このような性質のプラットフォームは、米国特許第７，２６４，４３２号でも開示されている。この反応プラットフォーム３は、個別固相担体２’上に配置され、長さ寸法Ｘおよび幅寸法Ｙを有する少なくとも１つの本質的に水平方向のテーブル４上に位置決めされたフロー・セル２を備える。このプラットフォーム３は、Ｘ方向に平行に延在する少なくとも１つのレール５、および搬送デバイス９を有する少なくとも１つの変位ユニット６を備え、このデバイスはＸ方向に物体を運ぶために、レール５にそってこの変位ユニットと一緒に移動可能である。搬送デバイス９は、変位ユニット６と一緒にレール５にそって移動可能である、搬送プレート１１、およびそれぞれの個別担体２を把持し、結合された光学的キャラクタライゼーション・ツール７に向けて移動するための電動式把持メカニズム８としてここでは実装されている。把持メカニズム８を使用することで、担体２’およびフロー・セル２は、搬送プレート１１上に引っ張られ、搬送デバイス９を利用してＸ方向に、観察ツール７、つまり、撮像デバイスに向けて移動される。
【００５３】
フロー・セル２とともに収容される個別担体２’は、搬送プレート１１のＸ位置に応じて作業領域４上のその元の位置に割り当て可能である。搬送プレート１１のＸ位置および物体を把持するための把持メカニズム８の移動経路（物体の元のＹ位置）をこのように検出することは、関連技術の当業者に知られているように、直線的な移動を検出するための好適なセンサー（図示されていない）を介して実行される。これらのセンサーからの情報の処理、Ｘ方向に搬送デバイス１１を移動しＹ方向に把持メカニズム８を移動するための駆動装置の制御、および物体の元のＸ／Ｙ位置へのこの情報の割り当ての処理は、好ましくは、これもまたシステムの結合された一部である、デジタル・コンピュータ（図示されていない）内に実装された適宜プログラムされるコントローラを使用して実行される。
【００５４】
未知の核酸の塩基配列決定において、フロー・セル内に収納されたすべての試料は、ある程度可変となるため、プラットフォーム３全体のすべてのフロー・セル担体２の識別が望ましく、また有益である。ソフトウェア・アプリケーションを介して一連のフロー・セルの個別配列を追跡することが重要である場合もある。反応プラットフォーム上のフロー・セルの画定された位置および配向により、塩基配列決定試料のそれぞれの集合を識別することができ、したがって、後からの照合およびアセンブリを目的として試料を追跡することができる。
【００５５】
これらの実施形態の特定の態様において、フロー・セル２および担体２’は、単一の統合された構造物として形成される。図３に示されている特定の一実施形態では、システム３は、バーコード・リーダーなどのキャラクタライゼーション・ツール１２をさらに備える。このキャラクタライゼーション・ツールは、担体２’の１つまたは複数の識別要素を読み取って、対応するフロー・セル内の試料の同一性を判定することができる。この識別は、好ましくは、担体２’が搬送デバイス９の搬送プレート１１上に引っ張られている間に実行される。
【００５６】
図４は、反応プラットフォーム３のものと異なる平面内で撮像システムへＺ方向に移動されるときのフロー・セル２を備える担体２’を示す。一方の位置で把持メカニズム要素８、他方の位置で把持メカニズム要素８’を備える把持メカニズムは、ここでは、伸縮アームとして実装されるが、これの代わりに、多関節アームとしても実装されうる。搬送デバイス９は、ある角度で回転可能であり、この角度は、好ましくは、水平作業場４に垂直なＺ軸に関して＋１８０°および／または−１８０°である。把持メカニズム（図示されていない）の他の代替実施形態は、例えば、キャリアを把持し、および／または配置するために昇降させることができる、無限軌道を有するＹ方向に走るレールを備える。搬送デバイス９を使用することで、フロー・セル２を備える担体２’をＸ方向に移動し、次いで、把持メカニズム８を使用して、有意には観察前に化学作用が実行される領域である、作業領域４上の物体の元の位置と異なる、観察ツール７の表示領域内の位置に配置することができる。それと同時に、把持メカニズム８が出されるときに、試料および／または物体の同一性が、好ましくは、もう一度検出され、フロー・セル２および担体２’の新しいＸ／Ｙ位置が、システムの結合されているコンピュータ・コンポーネント内に格納される。
【００５７】
前の説明から、担体２’は、把持され、平面内で移動されるだけでなく、把持メカニズム８’を使用して再び配置されうること、担体２’は、一方の平面からＺ方向においてその上または下に位置する平面へ移動されてそこに留められ、本発明のシステムの照明、検出、および解析コンポーネントを使用してさらに解析も行えることがわかる。これらの移動作業が実行されるときに、絶対に必要というわけではないが、キャラクタライゼーション・ツール１２（図３）を使用して物体のそれぞれを識別するか、または他の何らかの形で特徴付けると有益である。
【００５８】
図５に示されているように、２つより多い作業プラットフォームを組み合わせて高次システムを形成できる。作業場４、４’は、順次端と端を接して、または重ねて互いに平行になるように位置決めされ、水平面（図示されていない）内で任意の角度で回転されうる。
【００５９】
本発明の一態様は、反応コンポーネントの自動化塩基配列決定をタイミングよく、また効率的に行う支援機能である。このプロセスは、未知の塩基配列を持つ核酸の生化学的インタロゲーションを行えるように最適化された複数の塩基配列決定反応システム・コンポーネントを伴いうる。本発明のシステムとともに、限定はしないが、米国特許第６，８６４，０５２号、米国特許第６，３０９，８２４号、米国特許第６，４０１，２６７号、および米国特許公開第２００５／０１９１６５６号で開示されているようなハイブリダイゼーション・ベースの方法、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，８２８，１００号、米国特許第６，８３３，２４６号、米国特許第６，９１１，３４５号、論文Ｒｏｎａｇｈｉら（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１：３６３−３６５、およびＬｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１００：４１４−４１９（２００３）で開示されているような合成法による塩基配列決定法、ならびに例えば、国際特許出願ＷＯ１９９９０１９３４１、国際特許出願ＷＯ２００５０８２０９８、国際特許出願ＷＯ２００６０７３５０４、および論文Ｓｈｅｎｄｕｒｅら（２００５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９：１７２８−１７３９で開示されているようなライゲーション・ベースの方法を含む、さまざまな生化学的塩基配列決定反応が使用されうる。
【００６０】
特定の実施形態では、システムの塩基配列決定反応コンポーネントは、実際の生化学的塩基配列決定反応が行われる１つまたは複数のフロー・セル２（つまり、反応チャンバー）（図６）を備える。本発明の好ましい実施形態では、システムの塩基配列決定反応コンポーネントのフロー・セル２は、例えば、それぞれ入口３０、出口３２、および入口３０を通して液体輸送で注入されたときに核酸を領域に付着できるように製造されているか、または他の方法で処理されている例示的な領域３４、３６を有する表面を持つ、フロー・セル・チャンバー２内へのスペーサー２３、２４、２６、２８によって相隔てられた光学顕微鏡スライド２０、２２で構成された担体構造２’内にチャンバーを備える。フロー・セルは、適宜、それぞれの核酸の同一性が反応プロセス全体を通して監視されうるようにランダム・アレイとして、または微小部位の所定のアレイでフロー・セルの表面領域３４、３６に付着された核酸またはプライマーを含む。核酸またはプライマーは、担体構造２’の壁を通して見たときに核酸またはプライマーの少なくとも一部が個別に光学的分解可能であるように表面に付着できる。
【００６１】
好ましい一実施形態では、フロー・セル２は、未知の塩基配列を持つ核酸が固定化される固相担体または少なくとも１つのバッキングを有する実質的に封止されたチャンバーを備える。フロー・セル２は、好ましくは、システムの塩基配列決定反応コンポーネント内に固相担体またはバッキングを留置するための担体保持部材（テーブルまたはカセット）を伴う。フロー・セル２は、例えば、塩基配列決定反応システム・コンポーネント上で隣り合わせで、または一方の後ろに他方が来るように配置されうる。固相担体２’が、顕微鏡スライド２２を備える場合、担体保持部材は、典型的には、従来サイズのスライドとともに使用されうるような寸法である（つまり、典型的には、約２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍの大きさのスライド）。担体が、膜である場合、保持部材の寸法は、同様に、膜はスライドと比べてむしろサイズが可変であるけれども、従来サイズの膜とともに使用されうるような寸法である（つまり、典型的には、８０ｍｍ×１２０ｍｍの大きさ）。
【００６２】
フロー・セルの構造的態様は、典型的には、接着剤（スペーサー要素２３、２４、２６、２８に付随する）または締め付け手段４０、４２によって固定される。本発明の実施形態のいくつかの態様では、締め付け手段４０、４２は、複数のフロー・セルの部分を一緒に締め付けることができる。典型的には、１つから約１２または１６個までのフロー・セルを単一の締め付け手段によって同時に締め付けることができる。フロー・セルは、実質的に水平になるように、または実質的に垂直になるように締め付け手段内に配置されうるが、それら２つの位置の間の任意の中間位置をとることも可能である。
【００６３】
締め付ける代わりに、または締め付けることに加えて、フロー・セルに、フロー・セルのコンポーネント同士を連結するバイアス構造を備えることができる。バイアス構造は、１つまたは複数のバネ式バイアス部材４６、４８、５０、５２を備えることができる。特定の実施形態において、担体はバネ仕掛けの取り付けピンによってクランプに取り付けられ、これにより、フロー・セルの形成がバネ仕掛けの取り付けピンのバネに圧縮力を加え、したがって、このバネは、フロー・セルのコンポーネントを接続する。
【００６４】
本発明の実施形態の他の特定の態様では、締め付け手段および／またはバイアス手段によってフロー・セル構造に印加される力は、担体と担体保持部材との間の流体密封シールを確実なものにするのに役立つ。
【００６５】
いくつかの態様において、フロー・セルは、実質的に封止されたチャンバーの形成を助ける封止手段をさらに備えることが一般的に好ましい。封止手段は、担体保持部材の一体部分であるか、またはフロー・セルのセパレート・コンポーネントとして形成されうる。封止手段は、典型的には、シリコン・ゴムまたは他の好適な材料で形成されうるガスケットを備える。一実施形態では、封止手段は、Ｏリング・ガスケットを備え、その形状は、一般的に、担体保持部材の一方の部分の中の溝に据え付けられたフレーム状の囲いの形状である。代替実施形態では、封止手段は、平たいフレーム状の囲いのガスケット（厚さ約１００から１５０μｍ）を備える。他の特定の態様では、ガスケットまたは他のスペーサー材料を接着剤で取り付けることができる。
【００６６】
いずれのタイプのガスケットも、１回使用した後に（例えば、放射能プローブで汚染された場合に）廃棄されるか、または望ましい場合には再利用されうる。平たいガスケット実施形態は、１回使用した後に廃棄される、使い捨て型ガスケットとして特に適している。ガスケットの厚さ（ガスケットを交換することによって容易に変更されうる）は、一部は、実質的に封止されているチャンバーの容積を決定することができることは明らかである。
【００６７】
塩基配列決定反応で小さな体積を使用する本発明の他の態様では、フロー・セル・コンポーネントは、接着剤を使用して直接接続される。接着剤は、好ましくは、さまざまなフロー・セル・コンポーネント、例えば、アレイとカバースリップを含むスライドの間の接着が最適なものとなる表面に導入される。
【００６８】
流体入口３０を使用して、担体上の試料を処理するのに必要な流体を実質的に封止されているチャンバー内に導入することができる。典型的には、このような流体は、緩衝液、溶媒（例えば、エタノール／メタノール、キシレン）、試薬（例えば、プライマーもしくはプローブ含有溶液）、および同様の液体である。流体出口では、処理流体を試料から除去することができる（例えば、洗浄のため、またはさらなる試薬を加えられるようにするため）。好ましくは、担体が処理されているときに、その配向は、流体入口が実質的に封止されているチャンバーの底部にあり、また流体出口が実質的に封止されているチャンバーの上部にあるような配向である。
【００６９】
典型的には、核酸試料がスライド２２上に担持されている場合、実質的に封止されているチャンバーは、５０μｌから３００μｌまで、好ましくは１００〜１５０μｌの範囲の容積を有する。このような小さな容積であるため、試薬を経済的に使用することができ、また（温度調節が必要である場合）熱応答時間も短い。試料が膜上に担持される場合、チャンバーは、一般的に、大きいものとなる（最大２〜３ｍｌまで）。
【００７０】
特定の態様において、フロー・セル２は、担体に付着された試料に対し増幅（例えば、ローリング・サークル増幅またはポリメラーゼ連鎖反応増幅）を実行する際に使用するのに適するように適合される。そのような一実施形態では、フロー・セルは、さらなる試薬を加えられるように開口部を有していなければならない。この開口部は、一時的であって、フロー・セルから漏れが生じないように、また新しい試薬を加えた後にフロー・セルが汚染しないように新しい液体の流れが厳重に制御されるように設計されなければならない。
【００７１】
いくつかの実施形態の特定の態様において、例えば、ＰＣＲまたは厳重に制御される温度調節が必要とされる他の反応とともに使用することについて考えられるものでは、フロー・セルは、試料およびＰＣＲ混合の高速な加熱および冷却（つまり、温度サイクリング）を行えるようにする温度制御手段を備える。典型的には、フロー・セルは、電気発熱体またはペルチェ素子を備える。また、フロー・セルは、改善された空冷を行えるように（例えば、冷却手段を備えることで）適合されうる。ほとんどの用途では、３℃〜１０５℃の範囲の温度制御で十分である。
【００７２】
適切な流体送出手段に対する多数の配列構成が考えられうる。好ましい一実施形態では、処理流体（例えば、緩衝液、染色液など）の多数の貯蔵槽が備えられ、それぞれの貯蔵槽はポンプ・メカニズムに取り付けられている。好ましいポンプ・メカニズムとしては、限定はしないが、Ｈｏｏｋ  ａｎｄ  Ｔｕｃｋｅｒ社（英国サリー州クロイドン所在）によって製造されるものなどの注射器ポンプ６０、または１から１０ｍｌまでの範囲の行程容積を有するＫｌｏｅｎが挙げられる。１つのこのようなポンプ６０を処理流体貯蔵槽毎に備えるか、または単一ポンプを備え、マルチポート・バルブ構成を使って複数の貯蔵槽のそれぞれから流体をポンプで入口３０と位置合わせ可能な複数の注射器針６２、６４、６６、６８に送るようにできる。
【００７３】
次いで、それぞれの注射器ポンプ６０をユニバーサル・コネクタなどを使用して、中央のマニホールド７０（ユニバーサル・コネクタなど）に取り付けることができる。好ましくは、中央のマニホールド７０は、必要ならば、複数の試料が同時に処理されている場合に、それぞれの試料が異なる処理流体または処理流体の組み合わせで処理されうるように、選択的マルチアウトレット・バルブ７２内に注ぎ込む形をとる。好適な選択的マルチアウトレット・バルブは、Ｏｍｎｉｆｉｔ社（英国ケンブリッジ所在）によって供給されている１０アウトレット回転バルブなどの回転バルブである。したがって、マルチアウトレット・バルブ７２からのそれぞれの出口は、別々のフロー・セルに接続されうる。必要ならば、１つまたは複数のフィルタを組み込むことができる。典型的には、フィルタは、それぞれの貯蔵槽とその付随する注射器ポンプとの間に位置する。
【００７４】
それぞれの注射器ポンプ６０が、コンピュータ制御手段によって個別に作動されうるか、または２つまたはそれ以上のポンプが、２つまたはそれ以上の処理流体の混合物を供給するように同時に作動されうる。したがって、それぞれのポンプ６０の動作速度を制御することで、結果として得られる処理流体の混合物の組成が制御される。
【００７５】
代替実施形態では、流体送出手段は、２つまたはそれ以上のピストン／ＨＰＬＣ型ポンプを備え、それぞれのポンプはマルチインレット・バルブを介して複数の処理流体貯蔵槽から供給を受ける。好適なポンプは、例えば、Ａｎａｃｈｅｍ社（英国ベッドフォードシャー州ルートン所在）から入手可能である。マルチインレット・バルブは、回転バルブである。それぞれのポンプは、当業者によく知られているタイプの回転式混合器内に注ぎ込み、それにより、必要ならば、処理流体の可変組成の混合物を生成することができる。
【００７６】
次いで、いくつかの態様では、処理流体または処理流体の混合物が、インライン・フィルタに通され、次いで、選択的マルチアウトレット・バルブ（回転バルブなど）を通り、その後、フロー・セル内に注ぎ込まれる。
【００７７】
上で画定された処理流体の一般的に「並列の」供給の代わりに、処理流体を「直列に」供給し、例えば、流体が一方の実質的に封止されているチャンバーから他方のチャンバーに送られるようにできる。この実施形態は、必要な試薬の量を最小限度に抑えられるという利点を有する。
【００７８】
１つまたは複数のバルブを備える本発明の態様において、バルブは、典型的には、２つの入口と実質的に封止されたフロー・セルに至る１つの出口を備える三方弁である。バルブの入口の１つは、処理流体の貯蔵槽による間接的供給を受ける。第２の入口は、典型的には、注射器、ピペット、またはマイクロピペット（一般的に１００〜５０００μｌの容積）である局所貯蔵槽による供給を受ける。この局所貯蔵槽は、コンピュータ制御手段によって制御されるか、または手動で制御されうる。局所貯蔵層は、典型的には、試薬が希少であるか、または高価である場合に使用される。このような局所貯蔵層を備えることで、必要な試薬の量が最小限度に抑えられ、洗浄が簡素化され、それぞれのフロー・セルが必要ならば個別に処理されうる柔軟性を有する。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態の特定の一態様では、フロー・セル反応で使用する「流れ」は、重力によって、例えば、フロー・セルをある角度で配置することによって、またはフロー・セルの出口３２に施されている吸収材を使用することによって得られる。これらの実施形態の他の態様では、機械的または電気的手段を使用して、例えば、フロー・セルの出口縁に真空装置を導入することで、流れを発生する。このような実施形態におけるフロー・セルは、実質的に封止されうるか、またはフロー・セルを通る流体の移動に利用可能な入口と出口の両方を有することができる。
【００８０】
本発明の実施形態の他の特定の態様では、流体は、底部のところでフロー・セルに入り、上方に移動し、上部のところにある流体出口を通ってフロー・セルから出る。しかし、好ましい一態様では、流体は上部からフロー・セルに入り、重力によって反応に通され、底部のところの流体出口を通ってフロー・セルを出る。流体出口は、共通収集ダクトに注ぎ込み、そのダクトは収集容器内に排出する。この容器は、望ましくは、定期的に空にし、および／または洗浄できるように装置から取り外し可能である。
【００８１】
本発明によれば、処理される材料のさまざまな不適合反応速度および体積に対応できるようにするため、塩基配列決定反応コンポーネントは、多数のフロー・セルおよび／または担持試料が処理を必要とする場合に、追加の要素を既存の機器に容易に追加できるように実質的にモジュール式である。そのような一実施形態では、システムの観察コンポーネントとともに塩基配列決定反応コンポーネントは、好ましくは、試料がスライドまたは膜上に担持されるかどうかに関係なく、フロー・セルのモジュール型アレイを受け入れることができる。
【００８２】
塩基配列決定反応コンポーネントをシステムに可逆的に統合することは、システムの機能要素の異なる活動を調整することができる、コンピュータ制御手段への接続を含むことができる。コンピュータ制御手段は、適宜、作動させる１つまたは複数のポンプの選択、（複数の）作動ポンプを通る処理流体の絶対体積および流量、処理流体を供給するフロー・セルの選択、装置内の担持試料の温度、システムの塩基配列決定反応装置から撮像コンポーネントへのフロー・セルの移動、およびさまざまな事象のタイミングのうちの２つまたはそれ以上のパラメータを制御することができる。
【００８３】
本発明は、担体上の試料を処理する際の本発明のフロー・セルおよび／または装置の製造および使用にさらに関係し、そこで本発明は、上で画定されたフロー・セルおよび／または自動化塩基配列決定反応装置を使用して担体上の試料を処理する方法、フロー・セルを製作する方法、本発明による塩基配列決定反応コンポーネントを備える疎結合の可逆的統合システムを製作する方法を提供する。
【００８４】
本発明は、本発明のシステムの塩基配列決定反応コンポーネントの結果を識別するための検出コンポーネントを実現する。シグナルに対する検出システムは、使用される標識部分に依存する可能性があり、これは、利用可能な化学作用によって画定されうる。採用されている標識の種類に適した検出方法が使用され、また本発明のシステムの検出コンポーネント内で使用されうる。したがって、例示的な検出方法は、放射能検出、光吸収検出、例えば、ＵＶ−可視光吸収検出、光学発光検出、例えば、蛍光もしくは化学発光を含む。光学的装置は、近視野走査顕微鏡法、遠視野共焦点顕微鏡法、広視野落射照明、光散乱、暗視野顕微鏡法、光変換、単一光子および／または多光子励起、スペクトル波長識別、蛍光体識別、エバネセント波照射、および全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法を含む。
【００８５】
標識された核酸分子は、使用される走査方法に応じて、同時に、または逐次的に、それぞれの基材の全部または一部を走査することによって基材上で検出されうる。蛍光標識法では、基材上の選択された領域は、Ｆｏｄｏｒ（米国特許第５，４４５，９３４号）およびＭａｔｈｉｅｓら（米国特許第５，０９１，６５２号）で説明されているような、蛍光顕微鏡装置を使用して１つずつ、または１行ずつ逐次的に走査されうる。表面上のナノスケール構造を解析し、検出するためにそのような技術を使用することに関する文献に手引きが載っており、Ｒｅｉｍｅｒら、編者、Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｍａｇｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ、２nd  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９８）、Ｎｉｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７８：１５２８−１５３４（２００６）、Ｈｅｃｈｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、１１２：７７６１−７７７４（２０００）、Ｚｈｕら、編者、Ｎｅａｒ−Ｆｉｅｌｄ  Ｏｐｔｉｃｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ、１９９９）、Ｄｒｍａｎａｃの国際特許公開ＷＯ  ２００４／０７６６８３、Ｌｅｈｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７５：２４１４−２４２０（２００３）、Ｎｅｕｓｃｈａｆｅｒら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、１８：４８９−４９７（２００３）、Ｎｅｕｓｃｈａｆｅｒらの米国特許第６，２８９，１４４号、および同様の文献に明らかにされている。
【００８６】
本発明で使用するための１つの特定の撮像技術は、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法であり、これは、単一の蛍光体（Ｃｙ−３またはＣｙ−５標識ｄＮＴＰ）を視覚化するために使用できる。ＴＩＲＦ顕微鏡法では、全内部反射励起光を使用し、また検出は、一般的に、エバネセント波照射およびＴＩＲＦ顕微鏡法を使用して実行される。エバネセント光照射野は、表面に設定され、例えば、蛍光標識された核酸分子を撮像することができる。レーザー光線が、液体と固体基材（例えば、ガラス）との間の界面で全反射する場合、励起光線は液体中に短い距離だけ貫通する。言い換えると、光照射野は、反射界面でいきなり終わることはなく、その強度は、距離とともに指数関数的に減少する。「エバネセント波」と称される、この表面電磁界は、界面近くの液体中の蛍光分子を選択的に励起することができる。界面における薄いエバネセント光照射野は、低い背景雑音をもたらし、可視波長において高い信号対雑音比を持つ単一分子の検出を容易にする。この技術の例は、Ｎｅｕｓｃｈａｆｅｒらの米国特許第６，２８９，１４４号、Ｌｅｈｒら（上記参照）、およびＤｒｍａｎａｃの国際特許公開ＷＯ２００４／０７６６８３で開示されている。
【００８７】
蛍光落射照明も、本発明の検出コンポーネント内に使用されうる。蛍光落射照明顕微鏡法は、蛍光標識された相補的ＤＮＡ塩基配列のハイブリダイゼーションの際に取り込まれる蛍光色素と称される特別な種類の組織染色による染色を伴う技術である。
【００８８】
ＴＩＲＦおよび落射照明の両方において、ほとんどのどのような光源でも使用できる。光源は、コヒーレント、非コヒーレントのラスター化された拡散ビームであり、単一スペクトルもしくは多スペクトル光源から発するものとすることができる。これらの実施形態の１つの特定の態様において、撮像は、ＴＩＲＦまたは落射照明およびＺｅｉｓｓ  ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００上の１．３メガピクセルのＨａｍａｍａｔｓｕ  ｏｒｃａ−ｅｒ−ａｇ、または同様のシステム・コンポーネントを使用して１００×の対物レンズにより行うことができる。
【００８９】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）も、一検出方式として使用可能である。塩基配列決定の文脈におけるＦＲＥＴは、一般的に、参照により本明細書に組み込まれている、ＢｒａｓｌａｖａｓｋｙらのＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１００：３９６０−３９６４（２００３）で説明されている。本質的に、一実施形態では、供与体蛍光体は、プライマー、ポリメラーゼ、またはテンプレートに付着される。プライマーに組み込むために加えられたヌクレオチドは、２つが接近したときに供与体によって活性化される受容体蛍光体を含む。
【００９０】
蛍光ベースの信号に好適な照明および検出システムは、ＴＩＲＦスライダーが８０ミリワット５３２ｎｍの固体レーザーに結合されているＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００である。スライダーは、正しいＴＩＲＦ照射角度で対物レンズを通して基材を照射する。また、ＴＩＲＦは、基材に光学的に結合されているプリズムを通して基材を照射することによって対物レンズを使用せずに実行されうる。平面波導波路も、ＴＩＲＦを基材上に実装するために使用されうる。
【００９１】
撮像システムの一実施形態は、視野１．２５ｍｍの２０×レンズを備え、検出は１０メガピクセル・カメラを使用して実行される。このようなシステムで、１ミクロン・ピッチでパターン形成アレイに付着されている約１５０万個の核酸分子を撮像する。この構成の下では、核酸分子１個当たりピクセル数は約６．４個である。核酸分子１個当たりのピクセル数は、対物レンズの視野を増減することによって調節されうる。例えば、１ｍｍの視野では、核酸分子１個当たり１０個のピクセルの値が得られ、２ｍｍの視野では、核酸分子１個当たり２．５個のピクセルの値が得られる。視野は、対物レンズの倍率およびＮＡに関して調節され、これにより、光学系、および画像解析ソフトウェアによってそのまま分解できる最低ピクセル数の核酸分子が得られる。撮像速度は、対物レンズの倍率を下げ、グリッド・パターン形成アレイを使用し、それぞれの画像で収集されたデータのピクセルの数を増やすことによって改善されうる。
【００９２】
光信号について、光ファイバーまたは電荷結合素子（ＣＣＤ）の組み合わせを、塩基配列決定反応の検出で使用可能である。したがって、特定の実施形態において、塩基配列決定反応から形成されるアレイのハイブリダイゼーション・パターンは、ＣＣＤカメラ（例えば、Ｍｏｄｅｌ  ＴＥ／ＣＣＤ５１２ＳＦ、ニュージャージ州トレントン所在のＰｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）をＹｅｒｓｈｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．９３：４９１３（１９９６）で説明されているような適当な光学系（Ｐｌｏｅｍ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍａｓｏｎ、Ｔ．Ｇ．Ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌａｎｄｏｎ、ｐｐ．１−１１（１９９３））とともに使用して走査され、これにより、非常に多数の標識された標的核酸の同時走査を行うことができる。
【００９３】
特定の実施形態において、塩基配列決定システムの効率は、マルチイメージング・システム・コンポーネントを使用して高められうる。例えば、システムの撮像コンポーネント内で、好ましくは、１０〜１６メガピクセル範囲の最大４台またはそれ以上のカメラを使用することができる。複数のバンドパス・フィルタおよび２色性ミラーも、最大４つまたはそれ以上の発光スペクトルにわたってピクセル・データを収集するために使用されうる。倍率の低い対物レンズの低い集光度を補うために、励起光源の出力を高めるとよい。スループットを高めるには、それぞれのカメラとともに１つまたは複数のフロー・セルを使用し、それにより、試料のハイブリダイズ／反応が行われている間に撮像システムがアイドル状態にならないようにする。アレイのプローブ動作は、非逐次的である場合があるため、複数の撮像システムを使用して、アレイ群からデータを収集し、アッセイ時間をさらに短縮することができる。
【００９４】
１つの照射方式は、撮像装置の間で共通の単色照明光源（６〜８色に対して約４つのレーザー）を共有することである。それぞれの撮像装置は、所定の時刻に異なる１つの波長でデータを収集し、光源は、光スイッチング・システムを介して撮像装置に切り替えられる。このような一実施形態では、照明光源は、好ましくは、少なくとも６つ、ただし、より好ましくは８つの異なる波長を発生する。そのような光源として、ガス・レーザー、ファイバー・カプラを通じて結合された複数のダイオード励起固体レーザー、フィルタに通されたキセノン・アーク・ランプ、チューナブル・レーザー、またはより新規性のある、まもなくＴｉｄａｌ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社によって供給されることになっている、Ｓｐｅｃｔｒａｌｕｍ  Ｌｉｇｈｔ  Ｅｎｇｉｎｅが挙げられる。Ｓｐｅｃｔｒａｌｕｍ  Ｌｉｇｈｔ  Ｅｎｇｉｎｅは、プリズムを使用して、光をスペクトル成分に分離する。スペクトルは、ファイバーまたは光コネクタ内にスペクトルの一部を選択的に反射することができるＴｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＤｉｇｉｔａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ上に投射される。このシステムは、個別の波長にわたって出力を監視し、較正して、波長を一定に保ち、電球の経年変化に関する、または電球を交換した場合の強度の差異を自動的に補正することができる。
【００９５】
撮像プロセスでは、基材は、焦点が合っていなければならない。焦点を保つ際のいくつかの重要なファクタとして、基材の平坦さ、焦面に対する基材の直交性、および変形させる可能性のある基材に加えられる機械力が挙げられる。１／４波長よりもよい平坦さを有するガラス板は容易に得られるので、基材の平坦さは適切に制御されうる。基材に加えられる不均一な機械力は、ハイブリダイゼーション・チャンバーを適切に設計することで最小限に抑えられる。焦面に対する直交性は、きちんと調節された高精度のステージによって達成されうる。それぞれの画像が撮られた後、高速アルゴリズムを使用してこの画像を解析し、その画像の焦点が合っているかどうかを判定する。画像がピンぼけである場合、オート・フォーカス・システムが、次の撮像サイクルにおいてそのアレイのセクションを再撮像できるようにピンぼけ画像の位置情報を格納する。基材のさまざまな配置の位置をマッピングすることによって、基材画像取得に必要な時間が短縮されうる。
【００９６】
測定されたシグナルを、手動で、または好ましくは、コンピュータを使用する適切な方法で解析し、結果を表形式にすることができる。基材および反応条件は、ハイブリダイゼーションおよび伸長条件の完全性を検証し、必要ならば、定量化の標準曲線を与えるための適切な対照を備えることができる。例えば、対照核酸を試料に加えることができる。
【００９７】
大規模な塩基配列決定操作において、それぞれの撮像装置は、好ましくは、１６メガピクセルのＣＣＤに対する３００ミリ秒の暴露時間に基づき、毎日〜２００，０００個の画像を撮る。したがって、本発明のシステムの照明および検出コンポーネントに対する機器設計は、それぞれフロー・セル４個一組を４セット（合計１６個のフロー・セル）備える４つの撮像装置モジュールを備えることができる。それぞれの撮像装置は、１０００万ピクセルを使用するＣＣＤ検出器を備え、おおよそ３００ミリ秒の暴露時間で使用されうる。他の蛍光体が撮像されている間の光源による意図しない光漂白は、照明出力を低く、暴露時間を最短に維持することによって低減されうる。
【００９８】
強化されたＣＣＤ（ＩＣＣＤ）を使用することによって、おおよそ同じ品質のデータが、標準ＣＣＤより数桁低い照明強度および暴露時間で収集される。ＩＣＣＤは、一般的に、１〜１．４メガピクセル範囲内で利用可能である。これらが要する暴露時間はかなり短くて済むので、１メガピクセルのＩＣＣＤは、標準ＣＣＤが単一の画像を取得する時間内に１０またはそれ以上の画像を取得できる。高速フィルタ・ホイール、および高速フロー・セル・ステージと併せて使用される、１メガピクセルＩＣＣＤは、１０メガピクセル標準ＣＣＤと同じ量のデータを収集することができる。
【００９９】
特定の一実施形態では、電子増倍ＣＣＤ（ＥＭＣＣＤ）が、核酸の撮像に使用される。ＥＭＣＣＤは、センサー内に組み込まれた独自の電子増倍構造を使って達成可能な、高い量子効率を維持しつつ単一光子事象を検出することができる定量デジタル・カメラ技術である。従来のＣＣＤとは異なり、ＥＭＣＣＤは、高い読み出し速度で動作していても、出力増幅器の読み出し雑音によって制限されない。これは、固体電子増倍（ＥＭ）レジスタを通常のシリアル・レジスタの終わりに追加することによって達成され、このレジスタを使用することにより、出力増幅器によって読み出し雑音が加えられる前に、弱いシグナルを増倍することができ、したがって、読み出し雑音が無視できるくらい小さくなる。ＥＭレジスタは、通常のクロック電圧より高い電圧を使用する数百個のステージを有する。電荷がそれぞれのステージを通って移動されるときに、衝撃イオン化の現象を利用して、二次電子を発生し、したがってＥＭ利得を生じる。これが、数百のステージにわたって実行される場合、その結果得られる利得は、１から数百さらには数千回も（ソフトウェア）制御されうる。
【０１００】
ＥＭＣＣＤシステムは、Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ（ＡＯＴＦ）変調とマルチライン・レーザー・システム、好ましくは、固体レーザー・ソリューションとを統合することで、複数の蛍光体標識を撮像するためにＴＩＦＲＭ技術と併せて使用されうる。この技術は、ＦＲＥＴ解析に、好ましくは発光側の好適なビーム・スプリット・デバイスの統合によって容易に適合されうる。
【０１０１】
塩基配列決定化学に関連して高分解能および高速撮像ならびに読み出しにおいて考慮されるべきファクタは、移動する部分によって引き起こされる間接振動であり、振動は、もし制御または分離されなければ、画像取り込みを失敗させ、その結果、低品質の画像分解能になる可能性がある。移動する部分からの振動の影響を最小にするために、特に、電動式把持メカニズム８、８’を備える搬送ツール９、光学コンポーネントを備えるキャラクタライゼーション・ツール７、および反応プラットフォーム３は、特に物理的に疎結合される。特に、これらは、並べて動作する場合でも、衝撃絶縁装置または同様の装置によって互いから物理的に絶縁される。これは、搬送ツール９の一部として制御および感知メカニズムがあること、さらにはキャラクタライゼーション・ツール７の一部として位置合わせメカニズムがあることを必要とする。そのようなさまざまなメカニズムは、関連する技術の教示の範囲内にある。例えば、電子の眼、感知されうる線列マーク、および同様のものが移動を確実にするために使用されるロボット工学装置は、連続的またはほぼ連続的な動作を可能にするためにキャラクタライゼーション・ツールの敏感な視野内に過度の振動を引き起こすことなく正確である。目標は、効率的な連続動作解析法にこれまで組み込まれていなかった、機械、電子、光学、および生化学の側面を持つバッチ様プロセスを伴う、２つまたはそれ以上の技術とインターフェースしながら、大量のデータを正確に、また効率よく収集して処理することである。
【０１０２】
本発明は、本発明の好ましい実施形態に関連して詳しく説明されているように、多くの異なる形態の実施形態により達成されるが、本開示は本発明の原理の例であるとみなされ、本発明を本明細書で例示され説明されている特定の実施形態に制限することを意図されていないことは理解される。当業者であれば、本発明の精神から逸脱することなく、多くの変更を加えることができる。本発明の範囲は、対応するユーティリティ出願およびその等価物の請求項によってのみ画定される。要約書および表題は、本発明の範囲を制限するものと解釈されないものとし、その目的は、当局が、さらには一般大衆が、本発明の一般的特質を素早く判別することができるようにすることである。対応するユーティリティ出願の請求項において、「手段」という用語が使用されていない限り、そこに記載されている特徴または要素はどれも、米国特許法第１１２条第６項に従う手段＋機能(means-plus-function) 限定として解釈されるべきではない。
【符号の説明】
【０１０３】
２  フロー・セル；  ２’  担体；  ３  反応プラットフォーム；  
４  作業領域（テーブル）；  ５  レール；  ６  変位ユニット；  
７  観察ツール７；  ８、８’  把持メカニズム；  ９  搬送デバイス。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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