(57)【要約】【課題】複雑な装置を必要とせずに、混合物から所望のフラクションを簡便に分離可能な分離法を提供する。【解決手段】本発明の分離法は、直列に接続された少なくとも２個のクロマトグラフィーカラムを備える装置を用意する工程と、装置の単一のポイントから、分離対象混合物を断続的に注入する工程と、装置の単一のポイントから、目的物質が濃縮されたフラクションを断続的に分取する工程と、異なる溶出力を有する溶離剤を各カラムに注入する工程と、溶離剤を注入するポイントを移動させる工程とを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離対象混合物から目的物質が濃縮されたフラクションを分離する方法であって、
直列に接続された少なくとも２個のクロマトグラフィーカラムを備える装置を用意する工程と、
前記装置における単一のポイントから、分離対象混合物を断続的に注入する工程と、
前記装置における単一のポイントから、フラクションを断続的に分取する工程と、
異なる溶出力を有する溶離剤を各カラムに注入する工程と、
溶離剤を注入するポイントを移動させる工程と、
を含む分離法。
【請求項２】
請求項１において、分離対象混合物を注入する工程を、サイクル単位で実行する分離法。
【請求項３】
請求項１または２において、濃縮されたフラクションを分取する工程を、サイクル単位で実行する分離法。
【請求項４】
請求項３において、溶離剤の注入ポイントを移動させる工程を、ピリオド単位で実行する分離法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項において、溶離剤を連続的または断続的に注入する分離法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項において、少なくとも１種の溶離剤を断続的に注入する分離法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項において、各溶離剤の組成が一定である分離法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項において、少なくとも１種の溶離剤の組成が、他の溶離剤とは独立して可変である分離法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項において、少なくとも１種の溶離剤を非同期的に移動させる分離法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項において、少なくとも２個のカラムが、移動相の流れ方向に沿って、処理対象のフィードを注入するポイントと目的物質を分取するポイントとの間に存在する分離法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項において、系の全てのカラムが、移動相の流れ方向に沿って、処理対象のフィードを注入するポイントと目的物質を分取するポイントとの間に存在する分離法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項において、分離対象混合物が、注入ループ、注入ポンプおよび加圧容器で構成された群から選択される注入手段によって注入される分離法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項において、分離対象混合物が、増設カラムに通されてから、前記装置に注入される分離法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項において、増設カラムが、混合物の注入手段と混合物が装置に注入される単一のポイントとの間に存在するか、または前記装置における２個のカラム間に存在する分離法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の分離法の、合成分子、天然抽出物、発酵由来のタンパク質、合成もしくは半合成によるタンパク質、免疫グロブリン、モノクローナル抗体、発酵由来のペプチド、または合成もしくは半合成によるペプチドを分離するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィーで混合物からフラクション（画分）を分離する、グラジエント溶出マルチカラム分離法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーは、混合物に含まれる化合物を、移動相と固定相（吸着相と呼ばれる場合もある）とにおける分配の差に基づき分離する方法である。例えば、液体、ガス、超臨界溶媒などを、吸着相が充填されたデバイス（カラム）に通すことにより、混合物に含まれる化合物を分離することができる。この方法は、混合物中の化合物を同定及び定量するための分析法として広く利用されている。また、精製法に利用されることもある。
【０００３】
必要に応じて、様々なクロマトグラフィー法を分子の精製に利用することができる。これらのクロマトグラフィー法は、幾つかの基準にしたがって分類される。例えば：非連続式または連続式の方法であるか否か；単一のカラムかまたは複数のカラムを使用するのか否か；溶離剤の組成がアイソクラティック（一定）であるのか、それともグラジエント（経時的に変化する）であるのか；などといった基準が挙げられる。
【０００４】
溶出タイプのクロマトグラフィーまたはバッチ式のクロマトグラフィーが普及している。バッチ式のクロマトグラフィーは、適当な固定相で充填されたカラムに対して精製対象混合物を断続的に注入し、溶離剤をカラムに通すことで、カラム内で物質を確実に移動及び分離させる方法である。分離した物質はカラムの出口から分取される。注入工程は、所定のピリオド（期間）を挟みながら繰り返し行ってもよい。一連の注入の間、分離状態は十分に持続される。
【０００５】
いわゆるバッチ式のクロマトグラフィー（バッチ式クロマトグラフィー）は、特に小〜中スケールで適用する方法であり、広く利用されている。この方法は簡単に利用可能であり（シングルカラム方式）、総じて有効であるが、生産性に劣る。具体的には、精製対象物質が溶離溶媒中で低濃度に希釈されているため、生産性が低い。
【０００６】
溶出相と吸着相とを向流させるという着想に研究を重ねた結果、「移動床」というコンセプトが生まれた。さらに、１９６１年に、カラム間を巧みに連結することで固定相の移動を模擬的に実現させた、「擬似移動床」（ＳＭＢ）という方法が登場した。この方法の特徴は、フィード（仕込液）を導入するポイントと溶離剤を導入するポイントとを主流の流れ方向に一定期間で前進させると共に、ラフィネート（回収液）を分取するポイント及びエクストラクト（抽出液）を分取するポイントも同じ前進量で移動させるという点である。
【０００７】
特許文献１には、周期的圧力勾配（driving-force gradient）を擬似移動床（ＳＭＢ）法と組み合わせた方法が記載されている。当該文献には、幾つかの化合物を含む混合物の連続式または準連続式の精製法が開示されている。ＳＭＢ法と同じく、幾つかのゾーンが設けられる。この精製は、溶媒及び混合物を導入する少なくとも２個のクロマトグラフィーカラム、好ましくは３個のクロマトグラフィーカラムを用いて行われる。混合物は、上記幾つかの化合物として、低重量の不純物、中重量の精製対象物質および高重量の不純物を少なくとも含む。カラムは、バッチ式モードにおいて少なくとも１つの工程または位置で使用される。このとき、１個のカラムのカラム出口が、中重量の精製対象物質を分取するのに利用される。さらに、カラムは、連続式モードもしくは準連続式モードにおいて少なくとも１つの工程または位置で使用される。このとき、少なくとも１個のカラムのカラム出口が、少なくとも１個の別のカラムの入口に流体連通状態で連結される。バッチ式モードと連続式または準連続式モードとは、同時にまたは段階的に実行される。カラムは、カラム切換え時又は切換え後に、溶媒の実質的な流れ方向と正反対の方向に移動される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１７１６９００号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の方法の短所は、複雑な装置を要する点と、当該方法を把握するためのシミュレーションツールを要する点である。
【００１０】
本発明の目的は、簡便に実行可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的のため、分離対象混合物から目的物質が濃縮されたフラクションを分離する方法であって、
−直列に接続された少なくとも２個のクロマトグラフィーカラムを備える装置を用意する工程と、
−前記装置における単一のポイントから、分離対象混合物を断続的に注入する工程と、
−前記装置における単一のポイントから、フラクションを断続的に分取する工程と、
−異なる溶出力を有する溶離剤を各カラムに注入する工程と、
−溶離剤を注入するポイントを移動させる工程とを含む分離法を提案する。
【００１２】
他の実施形態において、分離対象混合物からフラクションを分離する方法であって、
−直列に接続された３個のクロマトグラフィーカラムを備える装置を用意する工程と、
−前記装置における単一のポイントから、分離対象混合物を断続的に注入する工程と、
−前記装置における単一のポイントから、目的物質が濃縮されたフラクションを断続的に分取する工程と、
−異なる溶出力を有する溶離剤を各カラムに注入する工程と、
−溶離剤を注入するポイントを移動させる工程とを含む分離法を提案する。
【００１３】
他の実施形態において、分離対象混合物を注入する工程はサイクル単位で実行される。
【００１４】
他の実施形態において、濃縮されたフラクションを分取する工程はサイクル単位で実行される。
【００１５】
他の実施形態において、溶離剤の注入ポイントを移動させる工程はピリオド単位で実行される。
【００１６】
他の実施形態において、溶離剤は連続的または断続的に注入される。
【００１７】
他の実施形態において、少なくとも１種の溶離剤が断続的に注入される。
【００１８】
他の実施形態において、各溶離剤の組成は一定である。
【００１９】
他の実施形態において、少なくとも１種の溶離剤の組成は他の溶離剤とは独立して可変である。
【００２０】
他の実施形態において、少なくとも１種の溶離剤が非同期的に移動される。
【００２１】
他の実施形態において、少なくとも２個のカラムが、移動相の流れ方向に沿って、処理対象のフィードを注入するポイントと目的物質を分取するポイントとの間に存在する。
【００２２】
他の実施形態において、系の全てのカラムが、移動相の流れ方向に沿って、処理対象のフィードを注入するポイントと目的物質を分取するポイントとの間に存在する。
【００２３】
他の実施形態において、分離対象混合物は、注入ループ、注入ポンプおよび加圧容器で構成された群から選択される注入手段によって注入される。
【００２４】
他の実施形態において、分離対象混合物は、増設されたクロマトグラフィーカラム（増設カラム）に通されてから、前記装置に注入される。
【００２５】
他の実施形態において、増設カラムが、混合物の注入手段と混合物が装置に注入される単一のポイントとの間に存在するか、または前記装置における２個のカラム間に存在する。
【００２６】
他の実施形態において、目的物質が濃縮されたフラクションの分取量は可変である。
【００２７】
他の実施形態において、分離対象混合物は、注入ループおよび注入ポンプで構成された群から選択される注入手段によって注入される。
【００２８】
他の実施形態において、分離対象混合物は、増設カラムに通されてから、前記装置に注入される。
【００２９】
他の実施形態において、増設カラムが、混合物の注入手段と混合物が装置に注入される単一のポイントとの間に存在するか、または前記装置における２個のカラム間に存在する。
【００３０】
他の実施形態において、各溶離剤の組成は、他の溶離剤とは独立して一定であるか、または可変である。
【００３１】
他の実施形態において、溶離剤は連続的または断続的に注入される。
【００３２】
他の実施形態において、溶離剤は他の溶離剤とは独立して移動される。
【００３３】
他の実施形態において、本発明にかかる方法はサイクル単位で動作する。
【００３４】
他の実施形態において、前記装置には、少なくとも１つの入口（上流口）と少なくとも１つの出口（下流口）とが常に存在する。
【００３５】
他の実施形態において、目的物質の分取は、フィードが導入（注入）されるカラムの前に存在するカラムのカラム出口において実行される。
【００３６】
他の実施形態において、目的物質の含有率が低いフラクションが、前記装置に再注入される。
【００３７】
さらに、前述の分離法の使用であって、合成分子、天然抽出物、発酵由来のタンパク質、合成もしくは半合成によるタンパク質、免疫グロブリン、モノクローナル抗体、発酵由来のペプチド、または合成もしくは半合成によるペプチドを分離するための使用を提案する。
【００３８】
本発明の他の特徴および利点は、図面を参照して行う本発明の実施形態についての以下の詳細な説明から明らかになる。なお、以下の実施形態は単なる例示に過ぎない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明にかかる分離法の一例の動作を示す図である。
【図２】本発明にかかる分離法の一例の動作を示す図である。
【図３】混合物の注入装置の一例を示す図である。
【図４】混合物の注入装置の一例を示す図である。
【図５】実施例における化合物の溶出グラフである。
【図６】実施例における化合物の溶出グラフである。
【図７】実施例における化合物の溶出グラフである。
【図８】実施例における化合物の溶出グラフである。
【図９】実施例における化合物の溶出グラフである。
【図１０】実施例における化合物の溶出グラフである。
【図１１】実施例における化合物の溶出グラフである。
【図１２】分離法の一例の動作を示す概略図である。
【図１３】分離法の一例の動作を示す概略図である。
【図１４】分離法の一例の動作を示す概略図である。
【図１５】分離法の一例の動作を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
分離対象混合物からフラクション（画分）を分離する方法を提案する。この方法は、直列に接続された少なくとも２個のクロマトグラフィーカラムを備える装置で利用される。この方法は、前記装置における単一のポイントから、分離対象混合物を断続的に注入する工程と、前記装置における単一のポイントから、目的物質が濃縮されたフラクションを断続的に分取する工程と、各カラムに溶離剤を注入する工程と、溶離剤を注入するポイントを移動させる工程とを含む。各溶離剤は、異なる溶出力を有する。この方法により、分離を簡便かつ効率良く行うことができる。
【００４１】
この方法は、勾配を利用したマルチカラム分離法である。この方法はバッチ法ではない。この方法は、特に、少なくとも２種類の化合物を含む混合物の分離に利用される。この方法は、クロマトグラフィー時に溶出力をグラジエント変化（勾配的に変化）させることで分離を行う。
【００４２】
精製される分子としては、例えば：合成分子、天然抽出物、発酵由来のタンパク質、合成もしくは半合成によるタンパク質、免疫グロブリン、モノクローナル抗体、発酵由来のペプチド、合成もしくは半合成によるペプチドなどが挙げられる。
【００４３】
使用可能な固定相として、例えば：多孔質の固相担体（例えば、シリカなど（順相固相と称される場合もある））、グラフト重合された多孔質の固相担体（例えば、逆相固相と称される場合もある）、イオン交換樹脂、グラフト重合（例えば、タンパク質と）された樹脂などが挙げられる。広くいえば、移動相の組成をグラジエント変化させることのできる固定相であれば、どの種類の固定相を使用してもよい。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（分子ふるいクロマトグラフィー）の場合、界面活性剤をグラジエントで添加する（勾配的に添加する）。
【００４４】
移動相の組成のグラジエント変化は、様々な方法で実行することができる。例えば、別の組成に直接切り換える方法（「ステップ」グラジエントと称される）や、組成を徐々に変化させる方法（「リニア」グラジエントと称される）が挙げられる。
【００４５】
使用可能な移動相として、以下の流体、例えば、
−液体、例えば、水および／または有機溶媒（塩または緩衝液を任意で混合してもよい）
−超臨界ガスおよび／または超臨界流体（有機溶媒を任意で混合してもよい）
などが挙げられる。
【００４６】
印加する圧力の範囲は、固定相の粒子径、溶媒の粘度、カラム内での移動相の速度に応じて様々であり、一般的に、０．１〜３００バール（ｂａｒ）である。例えば：
−粒子径が５０μｍから４００μｍの場合には０．１〜１０バール（ｂａｒ）、
−粒子径が５μｍから９０μｍの場合には３〜５０バール（ｂａｒ）、
−液相に溶解したＣＯ２、液体状態のＣＯ２または超臨界状態のＣＯ２を含む溶離剤の場合には４０〜３００バール（ｂａｒ）、
が印加される。
【００４７】
図１に、本発明にかかる分離法の動作を示す。この分離法は、複数のクロマトグラフィーカラムを備える装置で利用される。この方法により、分離対象混合物（フィード）からフラクション（画分）を分離することができる。この混合物は、二成分系（２種類の化合物を含む混合物）や、三成分系（３種類の化合物を含む混合物）であってもよい。三成分系の混合物（３種類の化合物を含む混合物）の場合、目的物質は、コアフラクション（コア画分）に存在する（すなわち、目的物質は、その保持時間よりも短い保持時間または長い保持時間を有する不純物に囲まれている）。しかしながら、この混合物は、４種類以上の化合物を含むものであってもよい。図１において、上記装置は、直列に接続され得る３個のカラム１，２，３を備えている。つまり、カラム１のカラム出口１２は、カラム２のカラム入口２１につながれており；カラム１のカラム出口１２は、カラム１，２間で流体が往来可能なようにカラム２のカラム入口２１と接続されてもよい。さらに、カラム２のカラム出口２２は、カラム３のカラム入口３１につながれている。以下の説明において、カラム間で流体が往来可能なようにカラムのカラム出口と次のカラムのカラム入口とが接続された複数のカラムのことを、直列カラムと称する。
【００４８】
上記方法は、開管型（open loop）で動作する。つまり、どの瞬間においても、上記装置には、少なくとも１つの入口（上流口）と少なくとも１つの出口（下流口）が存在する。
【００４９】
異なる溶出力を有する溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃが、それぞれ、部位１１においてポイント４１からカラム１に、部位２１においてポイント４２からカラム２に、部位３１においてポイント４３からカラム４に注入される。そして、出口（下流口）４はカラム３のカラム出口３２と接続されている。あるピリオド（期間）Ｔ１の後、溶離剤Ａの注入ポイント４１、溶離剤Ｂの注入ポイント４２、溶離剤Ｃの注入ポイント４３が移動される。ピリオドとは、同じ溶離剤が、あるカラムから別のカラムへ移動されるまでの期間を指す。図１では、注入ポイント４１，４２，４３が、それぞれ、部位２１，３１，１１に移動され、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃが、それぞれ、カラム２，３，１に注入される。カラム３のカラム出口３２に位置した出口４も同じく移動され、カラム１のカラム出口１２に接続される。さらなるピリオドＴ２の後、注入ポイント４１，４２，４３が、それぞれ、部位３１，１１，２１に移動され、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃが、それぞれ、カラム３，１，２に注入され、かつ、出口４がカラム２のカラム出口２２に接続される。
【００５０】
なお、ピリオドＴ３の終了における移動により、装置は最初の状態（すなわち、ピリオドＴ１の状態）に戻る。つまり、本明細書で説明する分離法は、サイクル単位で動作するものであり、各サイクルが終了すると、装置が最初の形態に戻る。
【００５１】
注入ポイント４１，４２，４３の上記移動により、所定のピリオドＴが経つと、カラム１，２，３内で移動相の組成がグラジエントに変化する。事実、ピリオドＴ１（すなわち、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃが、それぞれ、カラム１，２，３に注入される期間）では、溶離剤Ａが単独でカラム１を通過し、溶離剤ＡおよびＢの混合物がカラム２を通過し、溶離剤Ａ、ＢおよびＣの混合物がカラム３を通過する。ピリオドＴ１の終了からピリオドＴ２の開始までの間に、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃが移動され（溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃそれぞれの注入ポイントが移動され）、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃが、それぞれ、カラム２，３，１に注入される。この注入により、溶離剤Ａ、ＢおよびＣの混合物がカラム１を通過し、溶離剤Ａが単独でカラム２を通過し、溶離剤ＡおよびＢの混合物がカラム３を通過する。同じように、ピリオドＴ２の終了からピリオドＴ３の開始までの間に、溶離剤の注入ポイントが移動されることにより、溶離剤ＡおよびＢの混合物がカラム１を通過し、溶離剤Ａ、ＢおよびＣの混合物がカラム２を通過し、溶離剤Ａが単独でカラム３を通過する。ピリオドＴ３が終了すると、溶離剤の注入ポイントが移動される。図１に当てはめると、溶離剤の注入ポイントはピリオドＴ１での位置に戻ることになる。
【００５２】
このようにして、１つのカラム内の移動相の組成は、１回のサイクルの間（すなわち、溶離剤の注入ポイントが最初の位置に戻るまでの間）に変化する。例えば、１回のサイクルの間、カラム３には、溶離剤Ａ、ＢおよびＣの混合物、次いで溶離剤ＡおよびＢの混合物、最後に溶離剤Ａ単独が通過する。同様の現象が、各カラムにおいて、それぞれに対応する順番で生じる。このように、溶離剤を移動させる（溶離剤の注入ポイントを移動させる）だけで、各カラム内の移動相の組成をグラジエントに変化させることができる。この構成は、生産性の観点（短いサイクルで実行できる）や、分離性の観点（異なる物質間の良好な分離能および室間再現精度）からみて有利である。
【００５３】
また、図１に示す出口４からの流れの一部または全体を、溶離剤の注入ポイント４１、４２および４３のうちの１つに再注入するようにしてもよい。
【００５４】
一例として、図１では、各溶離剤（各溶離剤の注入ポイント）の移動は同時に実行される。この場合、ピリオドの数はカラムの数だけ存在する。しかし、別の例として、各溶離剤を、他の溶離剤とは独立して移動させる（非同期的に移動させる）ようにしてもよいし、または他の溶離剤とは独立してその位置で維持してもよい（同位置に維持する）。その場合、このような、他の溶離剤とは独立して行なわれる非同期的な移動は、ピリオド単位で行われる。
【００５５】
また、各溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃの組成を、１つ以上のピリオドの間もしくは１つのサイクルの間、同一（一定）としてもよいし、または他の溶離剤とは独立した様々な組成としてもよい。この構成は、所望の分離（分離比、目的物質の純度など）および目的物質の特性（移動相の組成の変化に対する目的物質の保持時間の応答）に応じて溶離剤の組成を調節できるので有利である。サイクル中に、１つのカラムに対し、そのカラム入口で特定の組成が得られるように、異なる組成を有する２種類の溶離剤を同時に注入するようにしてもよい。この構成は、僅かな種類の組成（固定された組成を含むリザーバ（溶離剤槽））を用いて、カラム入口において様々な種類の組成を得ることができるので有利である。
【００５６】
また、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃは、連続的または断続的に注入するようにしてもよい。すなわち、溶離剤の注入を、途中で中断することなく実行してもよいし、途中で中断してもよい。断続的な注入は、溶離剤を所望の期間だけ適用でき、優れた柔軟性を有する点で有利である。溶離剤を断続的に注入する場合、その注入を中断するのは、注入ポイントの移動時に行うようにしてもよい。連続的に注入するのは、適用が単純である点で有利である。
【００５７】
分離対象混合物は、装置の単一ポイントから注入される。図１において、分離対象混合物は、混合物の注入ポイント６１からカラム１のカラム入口１１に注入される。この注入ポイント６１は唯一存在する定位置に維持されている。この定位置構成は、複雑な装置に限らず、あらゆる一般的な注入装置が使用可能になるので極めて有利である。また、この定位置構成により、カラム毎に注入装置を設ける必要がなくなる。よって、この装置は、必要となる導管（配管）およびバルブの数が少ないので、洗浄を容易に行うことができる。また、この装置は、分離対象混合物を注入するポイントを複数備えた装置よりも、制御が容易である。
【００５８】
事実、あらゆる一般的な注入手段を利用することができる。例えば、注入ループが使用可能である。この注入手段により、所定量の分離対象混合物を流れ中に注入することができる。また、注入ポンプも使用可能である。この注入手段では、フィードを、直接処理対象の混合物として注入することもできるし、既存の流れへ追加して注入することもできる。
【００５９】
分離対象混合物は、断続的（非連続的）に注入される。すなわち、混合物の注入は途中で中断される。このような注入は、柔軟に対応できるとともに、容易に適用可能であるため有利である。
【００６０】
分離対象混合物の注入は、サイクル単位で、複数あるピリオドのうちの１つの間に、または２つのピリオド間に実行される。図１の例では、混合物の注入はピリオドＴ３の間に実行される。この場合、ピリオドＴ３は、分離対象混合物を注入するシーケンスＳ１を含む。混合物の注入がピリオドＴ３の期間よりも短い期間で実行される場合、シーケンスＳ１の期間はピリオドＴ３の期間よりも短い。混合物が注入される時間および混合物が注入されるカラムは可変である。また、場合に応じて、注入シーケンスは、サイクル中の複数のピリオドのうちの１つの間に実行されてもよいし、あるピリオドで開始して次のピリオドで終了するようにされてもよい。
【００６１】
目的物質が濃縮されたフラクション（画分）は、装置における単一のポイントから分取される。図１において、分取は、カラム３のカラム出口３２において実行される。この構成の利点は、カラム毎に分取装置を必要とせず、装置全体に対して単一の分取装置を設けるだけでよい点である。よって、この装置では、必要となる導管（配管）およびバルブの数が少ないので、洗浄を簡単に行うことができる。さらに、この装置は、簡単に制御できる。
【００６２】
目的物質が濃縮されたフラクション（画分）の分取は、断続的に実行される。すなわち、分取は途中で中断される。この分取構成の利点は、分取量の調節が柔軟にできることである。この構成により、系の物理的限度（移動相に対する可溶度、固定相の飽和度など）内で、フラクション（画分）の濃度を調節することができる。分取量が少ないほど、濃度を高くできる。また、このような断続的な分取は、連続的な分取よりも容易に実施することができる。
【００６３】
目的物質が濃縮されたフラクションの分取は、サイクル単位で実行される。この分取は、複数あるピリオドのうちの１つの間において実行されてもよいし、あるピリオドで開始して次のピリオドで終了するようにしてもよい。フラクションの一部（あるカラムから次のカラムへの流れの一部）または全体を分取してもよい。図１の例では、目的物質が濃縮されたフラクションの分取は、ピリオドＴ３の間に分取ポイント６２において実行される。この場合、ピリオドＴ３は、目的物質が濃縮されたフラクションを分取するシーケンスＳ１を含む。目的物質が濃縮されたフラクションの分取がピリオドＴ３の期間よりも短い期間で実行される場合、シーケンスＳ１の期間はピリオドＴ３の期間よりも短い。図１に示すように、一例として、分取ポイント６２における分取と注入ポイント６１における混合物の注入が同一のシーケンスＳ１に含まれていてもよい。しかしながら、注入と分取は、異なるシーケンスで実行されてもよい。また、図１の例に示すように、目的物質が濃縮されたフラクションの分取を、シーケンスＳ１を超えて、混合物の注入が実行されないシーケンスＳ２まで引き続き行ってもよい。図１の例では、ピリオドＴ３は、シーケンスＳ１およびシーケンスＳ２よりも長い。この場合、ピリオドＴ３は、目的物質が濃縮されたフラクションの分取および混合物の注入のいずれも実行されないシーケンスＳ３を含む。
【００６４】
好ましくは、分離対象混合物の注入を最初のカラム（最も上流のカラム）のカラム入口において実行する場合、目的物質の分取は最後のカラム（最も下流のカラム）のカラム出口において実行される。この構成は、目的物質を系の全てのカラムに通した後に分取できるので極めて有利である。
【００６５】
図１に示すように、分離対象混合物の注入と目的物質の分取を同時に実行してもよい。特に、図１の場合、目的物質の分取は、サイクル中において、分離対象混合物の新たな注入と同時に開始される。しかし、この構成は本発明を限定するものでない。
【００６６】
処理対象のフィードを注入する工程の間、少なくとも１種の溶離剤の注入を中断するようにしてもよい。また、目的物質を分取する間、少なくとも１種の溶離剤の注入を中断するようにしてもよい。注入が実行される期間の長さと、目的物質の分取が実行される期間の長さを、互いに異ならせてもよい。
【００６７】
図２に、２個のカラムを使用した分離法の動作の一例を示す。この方法は、２個の直列カラムを備えた装置で利用される。図２では、サイクル中の第１のピリオドＴ１において、異なる溶出力を有する２種類の溶離剤が、それぞれ、カラム１，２に注入される。
【００６８】
ピリオドＴ１は、２つのシーケンスに分割してもよい。第１のシーケンスＳ１には、２種類の溶離剤Ａ，Ｂを、それぞれ、注入ポイント４１からカラム１に、注入ポイント４２からカラム２に注入する工程が含まれる。第２のシーケンスＳ２には、２種類の溶離剤Ａ，Ｃを、それぞれ、注入ポイント４１からカラム１に、注入ポイント４３からカラム２に注入する工程が含まれる。
【００６９】
この方法では、ピリオドＴ１の後にピリオドＴ２が続く。ピリオドＴ２にもシーケンスＳ１，Ｓ２が含まれる。溶離剤を注入するポイントが移動され、シーケンスＳ１では、溶離剤Ａ，Ｂが、それぞれ、（注入ポイント４１から）カラム２に，（注入ポイント４２から）カラム１に注入され、シーケンスＳ２では、溶離剤Ａ，Ｃが、それぞれ、（注入ポイント４１から）カラム２に，（注入ポイント４３から）カラム１に注入される。
【００７０】
第２のピリオドＴ２では、カラム２のカラム出口がカラム１のカラム入口に接続される。この方法のサイクルは、２つのピリオドで構成される。分離対象混合物を注入するシーケンス（図示せず）および目的物質を分取するシーケンス（図示せず）は、それぞれ、サイクルにおいて１回だけ実行される。例えば、混合物を、ピリオドＴ２のシーケンスＳ１で、カラム２のカラム入口において注入するようにし、かつ、目的物質を、ピリオドＴ２のシーケンスＳ１およびＳ２で、カラム１のカラム出口において分取するようにしてもよい。上記の例は、本発明におけるピリオドのシーケンスの内容および数を限定するものではない。
【００７１】
図３および図４に、混合物の注入装置を示す。いずれの図の装置も、注入手段としてのポンプ（注入ポンプ）１３，１４、および増設カラム５を備える。増設カラム５は、プレカラムとも称される。混合物は、装置に注入される前に増設カラム５に通される。増設カラム５は、分離対象混合物中の不純物、特に、カラムに極めて強く保持される不純物を除去する役割を果たす。この構成により、一部の不純物による装置の汚染を抑制することができるので、洗浄が容易になる。
【００７２】
図３に、混合物の注入装置であって、直列に接続された第１のカラムのカラム出口と第２のカラムのカラム入口との間に増設カラム５を設けた注入装置を示す。例えば、図１にこの注入装置を応用した場合、増設カラム５は、カラム３のカラム出口３２とカラム１のカラム入口１１との間に設けられてもよい。増設カラム５のカラム入口に三方向切り換えバルブ（三方弁）６、そのカラム出口に三方向切り換えバルブ（三方弁）７がそれぞれ配設され、直列カラムと増設カラム５とを接続している。カラム入口におけるバルブ６は、分離対象混合物８の注入、または増設カラム５を洗浄するための再生用の溶媒９の注入を可能にする。カラム出口におけるバルブ７は、増設カラム５のカラム出口をその次のカラムのカラム入口から切り離し、ライン１０を介して再生用の溶媒９および排出対象の不純物を排出することを可能にする。この構成は、装置全体を再生する必要がなく、増設カラム５のみを再生すればよいという優れた利点を有する。さらに、この構成は、装置を汚染することなく、増設カラムを洗浄することができるという他の利点も有する。洗浄および再生シーケンスを、サイクル中に実行するようにしてもよい。
【００７３】
図４に、混合物の注入装置であって、増設カラム（プレカラム）５が、一群の導管（配管）および三方向切り換えバルブ（三方弁）１７，１８，１９，２０により、直列に接続された第１のカラムのカラム出口と第２のカラムのカラム入口との間に間接的に接続された注入装置を示す。これら一群の導管および三方向切り換えバルブ（三方弁）１７，１８，１９，２０は、様々な組合せ（流路）を可能にする：例えば、分離対象混合物８を注入ポイントからカラムのカラム入口に直接注入できるようにバルブを切り換えることもできるし、また、分離対象混合物８を増設カラム５に通してから、カラムのカラム入口に注入するようにバルブを切り換えることも可能である。この構成の場合、本発明にかかる分離法では、増設カラム５の再生工程を実行するに際し、装置の分離動作を中断することなく、増設カラム５をカラムのカラム入口から切り離すことができ、装置を汚染することなく増設カラム５の再生工程を実行できる。例えば、図１にこの注入装置を応用した場合、増設カラム５は、カラム３のカラム出口３２にバルブ１９（図４）を介して接続され、かつ、カラム１のカラム入口１１にバルブ２０（図４）を介して接続されてもよい。また、バルブ１９とバルブ２０を直接連通させた場合、増設カラム５への通過を省略することもできる。
【００７４】
なお、図３の注入装置よび図４の注入装置は、フィードの注入を実行する上での、増設カラム５の使用方法の例示に過ぎない。図示のバルブとは異なる個数の、複数方向の切換えが可能なバルブ（多方弁）を、ポンプや溶媒に接続して用いた装置も考えられる。また、増設カラムにおける流体の流れ方向を、図３および図４における方向と反対の方向に設定することも考えられる。
【００７５】
処理対象のフィードは、注入ポンプに代えて、加圧容器によって系に注入されてもよい。
【００７６】
処理対象のフィードに含まれる不純物以外のフラクションは、ピリオド単位で移動する分取ラインによって分取されるか、または系における単一のポイントで分取される。任意で、フラクションの分取は、流れの一部または全体を分取することで実行してもよい。
【００７７】
系のカラムを再生するための再生シーケンスを、ピリオド単位で設けてもよい。
【００７８】
また、本発明にかかる方法は、国際公報第２００８／０２５８８７号パンフレットに記載されているような、ＣＯ２を含有する流体（例えば、超臨界流体または亜臨界流体）などの非液体の溶離剤を使用することも可能である。なお、溶離剤に共溶媒を添加してもよい。
【００７９】
本発明の他の実施形態において、カラムの容積は互いに同一であってもよいし、互いに異なるものであってもよい。
【００８０】
本発明の他の実施形態において、ピリオドの長さは互いに同一であってもよいし、互いに異なるものであってもよい。
【００８１】
本発明の他の実施形態において、洗浄シーケンス、強く保持された物質を脱離するための脱離シーケンス、カラムを再生するための再生シーケンス、カラムを平衡化するための平衡化シーケンスなどが設けられてもよく、また、それらのシーケンスの長さは、ピリオドに応じて互いに同一であってもよいし、互いに異なるものであってもよい。他の実施形態において、これらの工程は、溶離剤の流れ方向を反対方向にすることで実行されてもよい。
【００８２】
本発明の他の実施形態において、目的でない物質を分取する１つ以上のシーケンスを、系において時々実行するようにしてもよい。この分取構成により、所望の物質と保持時間が近接する不純物について、その濃度が過度に高くなるのを防ぐことができる。
【００８３】
以下の実施例は本発明の例示であって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８４】
［実施例１］
本実施例は、本発明にかかる方法とバッチ法を、シミュレーションによって比較したものである。本実施例におけるシミュレーションは、当該実施例で説明するシーケンスを複数のサイクルにわたって繰り返した場合を正確に再現している。
【００８５】
使用するモデルは、内部流動に伴って抵抗が生じる軸方向拡散（管型反応器）モデルをＬＤＦ（線形推進力近似）法で記述したものである。パラメータは、平衡式のパラメータを求める際の濃度と同じモディファイア（modifier）の濃度における、ファンディームター（Van Deemter）式の係数から抽出した。吸着平衡式および処理対象のフィードの組成については、Strohlein et al. (J. Chrom. A 1126 (1-2), 338-346, 2006)に掲載されたモデルを利用した：このモデルでは、モディファイアの量を１８０ｇ／Ｌとし、溶離剤の流れ速度を１．６ｍＬ／分とした際に、直径１ｃｍおよび長さ３０ｃｍのカラムにおいて、処理対象のフィードに含まれる３種類の化合物の保持時間が、それぞれ、１２７分、１６８分、２０８．５分となり、モディファイアの量を２００ｇ／Ｌとした際の保持時間が、それぞれ、３８．５分、４９．５分、６０．５分となる。
【００８６】
本実施例は、図１の方法を用いる。
【００８７】
カラムの長さは１０ｃｍとし、カラムの直径は１ｃｍとする。
【００８８】
異なる溶出力を有する溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃを、それぞれ、部位１１においてポイント４１からカラム１に、部位２１においてポイント４２からカラム２に、部位３１においてポイント４３からカラム３に注入する。出口４はカラム３のカラム出口３２に接続される。
【００８９】
ピリオドＴ１の後、溶離剤Ａの注入ポイント４１、溶離剤Ｂの注入ポイント４２、溶離剤Ｃの注入ポイント４３が移動され、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃが、それぞれ、部位２１においてカラム２に、部位３１においてカラム３に、部位１１においてカラム１に注入される。出口４はカラム１のカラム出口１２に接続される。
【００９０】
ピリオドＴ２の後、注入ポイント４１，４２，４３が移動され、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃが、それぞれ、部位３１においてカラム３に、部位１１においてカラム１に、部位２１においてカラム２にカラム３，１，２に注入される。出口４はカラム２のカラム出口２２に接続される。
【００９１】
ピリオドＴ１，Ｔ２，Ｔ３の長さ（分）は、それぞれ、１２．５分である。合計３７．５分のサイクルは、時間ｔ＝０（分）で始まる。ピリオドＴ１はｔ＝０からｔ＝１２．５まで続く。ピリオドＴ２はｔ＝１２．５からｔ＝２５まで続く。ピリオドＴ３はｔ＝２５からｔ＝３７．５まで続く。
【００９２】
図１のように、ピリオドＴ３を３つのシーケンスに分割してもよい。第１のシーケンスＳ１はｔ＝２５からｔ＝２６．５まで続く。このシーケンスにおいて、分離対象混合物３．４５ｍＬがカラム１のカラム入口１１に注入される。分取はカラム３のカラム出口３２において実行される。
【００９３】
第２のシーケンスＳ２はｔ＝２６．５からｔ＝２７．１まで続く。このシーケンスでは、分離対象混合物の注入は終了している。ただし、分取はカラム３のカラム出口３２において引き続き行われる。
【００９４】
第３のシーケンスＳ３はｔ＝２７．１からｔ＝３７．５まで続く。このシーケンスでは、分離対象混合物の注入、分取のいずれも実行されていない。
【００９５】
上記の場合、注入および分取がｔ＝２５で同時に開始され、注入は分取よりも先に終了する（ｔ＝２６．５）。ただし、本発明はこの構成に限定されない。
【００９６】
本実施例では、溶離剤Ａのモディファイアの組成は、ピリオドの開始から終了までに、２０５〜２１５ｇ／Ｌと線形的に変化し、溶離剤Ａの溶出力を変化させる。一方、溶離剤Ｂのモディファイアの量および溶離剤Ｃのモディファイアの量は、それぞれ、１８０．７ｇ／Ｌ、１７２．８ｇ／Ｌと一定である。溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃの流れ速度は、それぞれ、１．６ｍＬ／分、０．８ｍＬ／分、１．４ｍＬ／分である。
【００９７】
図５に、カラム３のカラム出口において得られるクロマトグラムを示す。図５では、化合物ＩＩが目的とする精製対象の化合物である。図中の曲線５１は、時間あたりの化合物Ｉの濃度の変化を示したものである。曲線５２は、時間あたりの化合物ＩＩの濃度の変化を示したものである。曲線５３は、時間あたりの化合物ＩＩＩの濃度の変化を示したものである。曲線５４は、時間あたりのモディファイアの濃度の変化を示したものである。図中に２本の一点鎖線で示した時間間隔５５は、分取が実行される期間の長さを表している。純度は９６％で、収率は８９％である。図６に、化合物Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの混合物（濃度は、それぞれ、０．１５ｇ／Ｌ、０．５５ｇ／Ｌ、０．２５ｇ／Ｌ）を、注入量３．４５ｍＬで、バッチ法によりグラジエント溶出（流れ速度Ｑ＝１．６ｍＬ／分；モディファイア濃度Ｃｍｏｄ＝１８０〜２１５ｇ／Ｌで変化させる）する際のクロマトグラムを示す。カラムの長さは３０ｃｍであり、カラムの直径は１ｃｍである。化合物ＩＩが目的とする精製対象の化合物である。図中の曲線５１は、時間あたりの化合物Ｉの濃度の変化を示したものである。曲線５２は、時間あたりの化合物ＩＩの濃度の変化を示したものである。曲線５３は、時間あたりの化合物ＩＩＩの濃度の変化を示したものである。曲線５４は、時間あたりのモディファイアの濃度の変化を示したものである。図中に２本の一点鎖線で示した時間間隔５５における分取フラクションは、純度が９４％で、収率が２０％である。つまり、サイクル毎に（サイクル単位で）処理されるフィードの量および使用される固定相の量が同一であっても、本発明にかかる方法は、純度および収率の両方において優れている。
【００９８】
［実施例２］
本実施例は、図２の２個のカラムについて、実施例１の条件を繰り返し適用するものである。カラムの長さは１０ｃｍであり、カラムの直径は１ｃｍである。
【００９９】
第１のピリオドでは、カラム１のカラム出口がカラム２のカラム入口に接続されている。第１のピリオドの第１のシーケンスＳ１において、溶離剤Ａ，Ｂが、それぞれ、カラム１、カラム２に注入される。第１のピリオドの第２のシーケンスＳ２において、溶離剤Ａ，Ｃが、それぞれ、カラム１、カラム２に注入される。
【０１００】
第２のピリオドでは、カラム２のカラム出口がカラム１のカラム入口に接続されている。第２のピリオドの第１のシーケンスＳ１において、溶離剤Ａ，Ｂが、それぞれ、カラム２、カラム１に注入される。第２のピリオドの第２のシーケンスにおいて、溶離剤Ａ，Ｃが、それぞれ、カラム２、カラム１に注入される。
【０１０１】
シーケンスＳ１は７．５分間続き、シーケンスＳ２は１７分間続く。１つのピリオドの長さは合計２４．５分間であり、サイクル全体の長さは４９分である。
【０１０２】
ピリオド中において、溶離剤Ａのモディファイアの量はｔ＝０からｔ＝７．５のあいだ１９０ｇ／Ｌと一定であり、そこからピリオドの終了における２００ｇ／Ｌに達するまで線形的に変化する。
【０１０３】
溶離剤Ｂ，Ｃの組成は、それぞれ、２１５ｇ／Ｌ、１２７ｇ／Ｌと一定である。
【０１０４】
溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃの流れ速度は、それぞれ、２ｍＬ／分、１．３３ｍＬ／分、０．２５ｍＬ／分である。
【０１０５】
分離対象混合物の注入は、ｔ＝３８．５〜ｔ＝３９．５のあいだ、カラム１において、流れ速度２ｍＬ／分で実行される。
【０１０６】
目的物質の回収は、ｔ＝３８．５〜ｔ＝４０．５のあいだ、カラム２のカラム出口において実行される。得られる目的物質の純度は９３％であり、収率は７６％である。
【０１０７】
［実施例３］
本実施例は、本発明にかかる方法を、Ｆｍｏｃ法（９−フルオレニルメトキシカルボニル法）による固相上でのペプチド合成で得られたロイシン−エンケファリンを含む、２種類の錯体混合物Ｍ１，Ｍ２に対して適用したものである。これらの各フィードについて、以下に記載される方法に従って、類似の方法を適用した。
【０１０８】
モデルを構築するには、ピークの保持時間およびピークの分散（分離）を算出する必要がある。
【０１０９】
ピークの保持時間は、吸着平衡式から再現可能である。この吸着平衡式には、前述した実施例と同じ式を利用する。平衡式のパラメータは、実験データから算出した。図７、図８および図９は、混合物Ｍ１を溶離するための緩衝液として異なる組成の水／エタノールを適用することで得られた、混合物Ｍ１のクロマトグラム（ＵＶ  λ＝２２０ｎｍ）であり、それぞれ、水／エタノールの組成を７５／２５、７０／３０、６５／３５と変化させている。ここでは、長さ１５ｃｍおよび直径０．４６ｃｍ（固定相としてＫｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ１８の５μｍを使用）のカラムを用いており、溶離剤の流れ速度は０．５ｍＬ／分である。得られたロイシン−エンケファリンの保持時間は、それぞれのクロマトグラムにおいて、２３．０分、１２．４分、７．８分である。これらの保持時間から、平衡式のパラメータを推測できる。
【０１１０】
ピークの分散を算出するためのパラメータは、図１０のクロマトグラム（カラム粒子径５μｍ）および図１１のクロマトグラム（カラム粒子径２５μｍ）上のピークの分散を測定し、これらを用いて推測した。分散式には、簡略化したファンディームター（Van Deemter）式を使用する：
ＨＥＴＰ＝Ａ×ｄｐ＋Ｂｕ                              
［式中、ＨＥＴＰは理論段相当高さ（ｃｍ）を示し、ｕは流体の線速度（ｃｍ／秒）を示し、ｄｐは粒子径（ｃｍ）を示し、ＡおよびＢは係数である。（ｄｐ＝２０μｍとした際に、Ａ＝７．８、Ｂ＝０．５８８（秒）となる。Ｂは粒子径の二乗に依存する。）］
【０１１１】
混合物Ｍ１，Ｍ２中のロイシン−エンケファリンの含有率は、それぞれ、５１％、９２％である（クロマトグラム上の面積  ＵＶ  λ＝２２０ｎｍ）。このモデルにより、ロイシン−エンケファリンのピークの挙動およびこれに近接する不純物の挙動を、実際の場合に近い形で再現することができた。図１０および図１１の両方に、実験で得られたクロマトグラム（実線）、およびこのモデルによって得られるクロマトグラム（点線）を示す。同図から分かるように、このモデルから、実際の場合に近いデータを算出することができる。
【０１１２】
図１３に示す方法を混合物Ｍ１に対して適用する際の条件を以下に説明する。
【０１１３】
１回のサイクル（９．１５分）は、３つのピリオドＴ１，Ｔ２，Ｔ３で構成される。かつ、１つのピリオドは、２つのシーケンスＳ１，Ｓ２（それぞれの長さは、０．７７５分、２．２７５分）で構成される。図１２に、第１のピリオドＴ１における入口ライン（配管）および出口ライン（配管）の組合せを概略的に示す。ピリオドＴ１，Ｔ２，Ｔ３の長さは、いずれも３．０５分である。第１のピリオドＴ１から、カラムの入口ラインおよび出口ラインの位置を切り換えることにより、ピリオドＴ２の状態（入口ラインおよび出口ラインをカラム１個分切り換えた場合）やピリオドＴ３の状態（入口ラインおよび出口ラインをカラム２個分切り換えた場合）に達することができる（図１３を参照）。
【０１１４】
ピリオドＴ１は２つのシーケンスＳ１，Ｓ２を有する。第１のシーケンスＳ１では、３種類の溶離剤Ａ，Ｂ，Ｄを、それぞれ、部位１１においてポイント４１からカラム１に、部位２１においてポイント４２からカラム２に、部位３１においてポイント４３からカラム３に注入する。出口５１，５２は、それぞれ、カラム２のカラム出口２２に、カラム３のカラム出口３２に接続される。第２のシーケンスＳ２では、３種類の溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃを、それぞれ、部位１１においてポイント４１からカラム１に、部位２１においてポイント４２からカラム２に、部位３１においてポイント４３からカラム３に注入する。出口５２はカラム３のカラム出口３２に接続される。この第２のシーケンスにおいて、カラム２のカラム出口がカラム３のカラム入口に接続される。
【０１１５】
ピリオドＴ１の後、溶離剤の注入ポイント４１，４２，４３が移動される。そして分離方法はピリオドＴ２へと進む。ピリオドＴ１と同じく、ピリオドＴ２も２つのシーケンスＳ１，Ｓ２を有する。第１のシーケンスＳ１において、溶離剤を注入するポイントが移動され、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｄが、それぞれ、（注入ポイント４１から）カラム２に、（注入ポイント４２から）カラム３に、（注入ポイント４３から）カラム１に注入され、出口５１，５２が、それぞれ、カラム３のカラム出口３２、カラム１のカラム出口１２に接続される。第２のシーケンスＳ２において、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃが、それぞれ、（注入ポイント４１から）カラム２に、（注入ポイント４２から）カラム３に、（注入ポイント４３から）カラム１に注入され、出口５２がカラム１のカラム出口１２に接続される。この第２のシーケンスＳ２において、カラム３のカラム出口がカラム１のカラム入口に接続される。
【０１１６】
ピリオドＴ２の終了において、溶離剤の注入ポイント４１，４２，４３が移動される。続いて、方法はピリオドＴ３に進む。ピリオドＴ１，Ｔ２と同じく、ピリオドＴ３も２つのシーケンスＳ１，Ｓ２を有する。第１のシーケンスＳ１において、溶離剤を注入するポイントが移動され、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｄが、それぞれ、（注入ポイント４１から）カラム３に、（注入ポイント４２から）カラム１に、（注入ポイント４３から）カラム２に注入され、出口５１，５２が、それぞれ、カラム１のカラム出口１２、カラム２のカラム出口２２に接続される。第２のシーケンスＳ２において、溶離剤Ａ，Ｂ，Ｃが、それぞれ、（注入ポイント４１から）カラム３に、（注入ポイント４２から）カラム１に、（注入ポイント４３から）カラム２に注入され、出口５２がカラム２のカラム出口に接続される。この第２のシーケンスＳ２において、カラム１のカラム出口がカラム２のカラム入口に接続される。
【０１１７】
溶離剤のラインＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、以下の組成および流れ速度を特徴とする：
・  ラインＡ：シーケンスＳ１において３３〜３３．５体積％エタノールを５ｍＬ／分の速度で供給し、シーケンスＳ２において３３．５〜３５体積％エタノールを５ｍＬ／分の速度で供給する。
・  ラインＢ：２０体積％エタノールを０．５ｍＬ／分の速度で供給する。
・  ラインＣ：２０体積％エタノールを０．５ｍＬ／分の速度で供給する。
・  ラインＤ：５０体積％エタノールを６ｍＬ／分の速度で供給する。
【０１１８】
分離対象混合物を注入し、かつ、目的物質を分取するシーケンスＳ０（図１４）はサイクル毎に（サイクル単位で）１回実行され、詳細には、ピリオドＴ３の開始において実行される。
【０１１９】
第３のピリオドＴ３の開始（ｔ＝６．１０）において、目的物質の回収および処理対象混合物の注入が、同時に０．５分間実行される。収集は、カラム３のカラム出口３２において出口５３を介して実行され、注入は、カラム１のカラム入口１１において注入ポイント４２から実行される。得られる純度および収率は９９％を超える。
【０１２０】
図１３に示す方法を混合物Ｍ２に対して適用する際の条件を以下に説明する。
【０１２１】
１つのピリオドは、２つのシーケンスＳ１，Ｓ２（それぞれの長さは、０．７２分、３．５分）で構成される（図１２および図１３を参照）。ピリオドの長さは４．２２分である。
【０１２２】
溶離剤のラインＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄは、以下の組成および流れ速度を特徴とする：
・  ラインＡ：シーケンスＳ１において３３．１〜３３．６体積％エタノールを３．５ｍＬ／分の速度で供給し、シーケンスＳ２において３３．６〜３５体積％エタノールを３．５ｍＬ／分の速度で供給する。
・  ラインＢ：２０体積％エタノールを０．２８ｍＬ／分の速度で供給する。
・  ラインＣ：２０体積％エタノールを０．３ｍＬ／分の速度で供給する。
・  ラインＤ：５０体積％エタノールを５ｍＬ／分の速度で供給する。
【０１２３】
分離対象混合物を注入し、かつ、目的物質を分取するシーケンスＳ０（図１５）はサイクル毎に（サイクル単位で）１回実行され、詳細には、ピリオドＴ２の開始において実行される。
【０１２４】
第２のピリオドＴ２において（詳細には、ｔ＝７．６〜ｔ＝８．１の間）、目的物質の回収および処理対象混合物の注入が、同時に０．５分間実行される。収集は、カラム３のカラム出口３２において出口５１を介して実行され、注入は、カラム１のカラム入口１１において注入ポイント４３から実行される。この場合、得られる純度および収率は９９％を超える。
【０１２５】
上記の実施例から、本発明にかかる方法が、精製対象となる原料フィードのプロファイルが異なっていても、それぞれに対応できることは明らかである。混合物Ｍ２の場合の条件が混合物Ｍ１の場合の条件と少し異なる理由は、混合物Ｍ２の不純物のプロファイルが目的物質に近いプロファイルを有しているためである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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