(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．確立された細胞株由来の細胞を再標的化エンドペプチダーゼを含む試料を用いて処理すること、ここで該確立された細胞株由来の細胞は、再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である；
ｂ．前記処理した細胞から、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５開裂産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を単離すること；
ｃ．前記ＳＮＡＰ−２５成分を、固相担体に結合させたα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させること、ここで前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５開裂産物由来のＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を含むエピトープに結合する、
前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、もしくは配列番号：８１の核酸配列、または配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、もしくは配列番号：８１と少なくとも９０％同一の核酸配列にコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する、
前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：８９、もしくは配列番号：９１の核酸配列、または配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：８９、もしくは配列番号：９１と少なくとも９０％同一の核酸配列にコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、および
前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、および配列番号：８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９０、および配列番号：９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する；
ｄ．前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体および前記ＳＮＡＰ−２５開裂産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出すること、ここで該抗体−抗原複合体による検出が、再標的化エンドペプチダーゼの活性を示す、
を含む、再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する方法。
【請求項２】
前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：８４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：８８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：７８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：９０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体が、配列番号：８０または配列番号：８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：９２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＳＮＡＰ−２５開裂産物がＳＮＡＰ−２５１９７である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記抗体−抗原複合体の存在がサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＳＮＡＰ−２５開裂産物由来のＢｏＮＴ／Ａ切断部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を含むエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体、ここで、
前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、もしくは配列番号：８１の核酸配列、または配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、もしくは配列番号：８１と少なくとも９０％同一の核酸配列にコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する、
前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：８９、もしくは配列番号：９１の核酸配列、または配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：８９、もしくは配列番号：９１と少なくとも９０％同一の核酸配列にコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、および
前記α−ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、および配列番号：８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９０、および配列番号：９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。
【請求項９】
配列番号：７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：８４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号：７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：８８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号：７８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：９０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号：８０または配列番号：８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号：９２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１３】
前記ＳＮＡＰ−２５開裂産物がＳＮＡＰ−２５１９７である、請求項８〜１２のいずれかに記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年３月１３日に提出され、米国特許法第第１１９（ｅ）項によって、米国特許仮出願第６１／１６０，２１７号に対する優先権を主張し、全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に開示されている配列は本明細書に添付された配列リストに含まれ、全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
神経伝達を阻害するボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴｓ）、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇ、ならびに破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）などのクロストリジウム毒素の能力は、幅広い様々な治療と美容の用途に活用されている。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．  Ｌｉｐｈａｍ、Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  （Ｓｌａｃｋ，  Ｉｎｃ．，  ２００４）を参照のこと。医薬組成物として市販されているクロストリジウム毒素は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｒｖｉｎｅ，  ＣＡ）、ＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）／ＲＥＬＯＸＩＮ（登録商標）  （Ｉｐｓｅｎ  Ｌｔｄ．，  Ｓｌｏｕｇｈ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）、ＰＵＲＴＯＸ（登録商標）  （Ｍｅｎｔｏｒ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，  ＣＡ）、ＸＥＯＭＩＮ（登録商標）  （Ｍｅｒｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  ＧｍｂＨ．，  Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＮＥＵＲＯＮＯＸ（登録商標）  （Ｍｅｄｙ−Ｔｏｘ，  Ｉｎｃ．，  Ｏｃｈａｎｇ−ｍｙｅｏｎ，  Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）、ＢＴＸ−Ａ  （Ｂｉｏｇｅｎ−ｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｙａｎｔａｉ，  Ｓｈａｎｄｏｎｇ，  Ｃｈｉｎａ）などのＢｏＮＴ／Ａ調製物およびＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標）／ＮＥＵＲＯＢＬＯＣ（登録商標）  （Ｓｏｌｓｔｉｃｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）などのＢｏＮＴ／Ｂ調製物を含む。一例として、ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、現在、１つ以上の国において、以下の適応症：アカラシア、成人痙縮、肛門裂傷、背部痛、眼瞼痙攣、歯ぎしり、痙性斜頸、本態性振戦、眉間の表情皺または運動過多性顔面線、頭痛、片側顔面けいれん、膀胱の亢進、多汗症、若年性脳性麻痺、多発性硬化症、ミオクローヌス疾患、鼻唇褶の皺、痙攣性発声障害、斜視およびＶＩＩ脳神経障害などにおいて承認されている。
【０００４】
クロストリジウム毒素処理は、シナプス間隙に神経伝達物質およびニューロペプチドを分泌するのに使うエキソサイトーシスプロセスを破壊して神経伝達物質およびニューロペプチドの放出を阻害する。クロストリジウム毒素治療を種々の慢性疼痛、神経性の炎症、および尿路性器系疾患などの感覚神経の疾患、さらには膵炎などの他の疾患を治療している筋弛緩薬での現在の適用を超えて拡張したいという強い要望が製薬業界にある。クロストリジウム毒素の治療を拡張するのに用いる１つのアプローチは、修飾された毒素が目的の神経細胞または非神経細胞について変化した細胞ターゲティング能力を有するようにするクロストリジウム毒素の修飾である。再標的化エンドペプチダーゼまたは標的化血管エキソサイトーシスモジュレーター蛋白質（ＴＶＥＭＰｓ）と呼ばれ、この分子は目的の神経または非神経標的細胞にある標的受容体を用いてエキソサイトーシス阻害作用を達成する。この再標的化能力は、目的の神経または非神経標的細胞にある非クロストリジウム毒素受容体について選択的結合活性を示す標的ドメインでクロストリジウム毒素の天然の結合ドメインを置換して達成する。このような修飾の結合ドメインは、標的細胞にある非クロストリジウム毒素受容体に選択的に結合できる分子をもたらす。再標的化エンドペプチダーゼは標的受容体と結合し、細胞質に転位し、かつ、目的の神経または非神経標的細胞のＳＮＡＲＥ複合体に対する蛋白質分解作用を発揮することができる。
【０００５】
再標的化エンドペプチダーゼの１つの群は、オピオイド標的ドメインを有する分子を含む。このオピオイド再標的化エンドペプチダーゼはオピオイド標的ドメイン、クロストリジウム毒素転座ドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含む。オピオイド再標的化エンドペプチターゼまたはオピオイド−ＴＶＥＭＰの非限定的な例は、Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｍｏｄｉｆｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ａｆｆｅｒｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ（米国特許第５，９８９，５４５号）；  Ｊ．  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ（米国特許第７，１３２，２５９号）；  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ（米国特許第７，２４４，４３７号）；  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ（米国特許第７，４１３，７４２号）；  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ（米国特許第７，４１５，３３８号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ（米国特許第７，５１４，０８８号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ、Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（米国特許出願公開第２００８／００６４０９２号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ、Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（米国特許出願公開第２００９／００３５８２２号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ（米国特許出願公開第２００９／００４８４３１号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ、Ｎｏｎ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（米国特許出願公開第２００９／０１６２３４１号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００５／０２３３０９号）；およびＬａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ（国際公開第２００８／００８８０５号）に記載されている。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
再標的化エンドペプチダーゼとクロストリジウム毒素との間の全般的な違いの１つは、再標的化エンドペプチダーゼが運動ニューロンを典型的には標的にせず、哺乳動物に再標的化エンドペプチダーゼの過剰投与に関連する致死性は完全に避けられていないが、大幅に小さいことである。例えば、オピオイド再標的化エンドペプチダーゼは致死性の証拠が認められる前に治療有効用量の１０，０００倍で投与することができ、かつ、この致死性は分子受動拡散によるものであり中毒プロセス経由によるものではない。従って実際には再標的化エンドペプチダーゼは非致死の分子である。この非致死の特性は治療的利益はあるが、クロストリジウム毒素に基づく生物製剤の製薬に使う標準的活性アッセイが致死性テストのマウスＬＤ５０バイオアッセイなので製造上の問題がある。例えば、Ｓ．  Ｓ．  Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＪＡＭＡ  ２８５：  １０５９−１０７０  （２００１）を参照のこと。現在、マウスＬＤ５０バイオアッセイはクロストリジウム毒素製剤の力価を表すために全ての製薬会社で使用されている。実際、クロストリジウム毒素の活性単位はマウスＬＤ５０単位である。しかしながら、再標的化エンドペプチダーゼが本質的に非致死なのでマウスＬＤ５０バイオアッセイはこれらの分子の力価の評価に使用できない。従って再標的化エンドペプチダーゼに必要な全ての工程の完全性を評価できる簡単で、信頼性があり、実証され、かつ、政府が許容するアッセイは有意に価値がある。
【発明の効果】
【０００７】
本明細書は、例えば、製薬および食品産業などの多様な産業に有用な再標的化エンドペプチダーゼ活性の新規の組成物、細胞およびアッセイ方法を提示し、かつ、関連する利点も合わせて提供する。そのような組成物、細胞および方法は生きた動物または生きた動物の細胞を使用しないで再標的化エンドペプチダーゼの作用に必要な全ての工程を評価できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は中枢と末梢神経における神経伝達物質放出およびクロストリジウム毒素の中毒における現在のパラダイムの概略図を示す。図１Ａは中枢と末梢神経の神経伝達物質放出の放出機構の概略図を示す。放出プロセスは以下の２つの工程を含むものとして説明することができる。１）伝達物質分子を含む小胞の小胞結合ＳＮＡＲＥ蛋白質が、原形質膜に位置する膜結合ＳＮＡＲＥ蛋白質に関連する小胞ドッキング、および２）原形質膜と融合する小胞および神経伝達物質分子がエキソサイトーシスされた神経伝達物質放出。図１Ｂは中枢と末梢神経における破傷風菌とボツリヌス毒素活性における中毒機構の概略図を示す。この中毒プロセスは４つの工程を含むものとして説明することができる。１）クロストリジウム毒素がクロストリジウム受容体複合体と結合し、中毒プロセスを開始する受容体結合工程、２）毒素結合後に毒素／受容体システム複合体を含む小胞が細胞内にエンドサイトーシスした複合体の内在化工程、３）小胞の内部ｐＨの変化、クロストリジウム毒素重鎖のＨＮドメインを含むチャンネル孔の形成、重鎖からのクロストリジウム毒素軽鎖の分離、軽鎖の放出等を含んだ多重事象が起こると考えられている軽鎖の転座工程および４）クロストリジウム毒素の軽鎖がＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ、またはシンタキシンなどの標的ＳＮＡＲＥ基質の蛋白質分解を起こし、これにより小胞ドッキングおよび神経伝達物質放出を防止する酵素標的の改変工程。
【図２】図２はＯＲＬ−１を過剰発現するＯＲＬ−１クローン＃６のクローン細胞株での再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａに対する標準用量応答を示す。Ｎｏｃ／Ａの特異的取り込みはＯＲＬ−１を過剰発現するＯＲＬ−１クローン＃６のクローン細胞株で認めることができる。切断されたＳＮＡＰ−２５１９７のＥＣＬ  ＥＬＩＳＡでのＯＲＬ−１安定細胞株クローン＃６に対しておこなわれたＮｏｃ／Ａ（ＬＨＮ／Ａに結合リガンドノシセプチン変異体を加えた）およびＬＨＮ／Ａ（結合ドメインを有さないＬＣ／ＡおよびＨＮ）の処理は、Ｎｏｃ／Ａの取り込みがこのクローン細胞株で特異的であることを示した。また、クローン細胞株は１．２ｎＭのＥＣ５０でＮｏｃ／Ａの高感度を示す。
【図３】図３はＳＫ−Ｎ−ＤＺ単一細胞由来のクローン＃３および＃２２におけるＮｏｃ／Ａに対する標準用量応答を示す。ＬＨＮ／Ａ（ｎ＝４独立試験運転）と比べたＳＫ−Ｎ−ＤＺ単一細胞由来のクローン＃３および＃２２におけるＮｏｃ／Ａの特異的取り込み。細胞はＲＰＭＩ  ＳＦＭ  ＋Ｎ２＋Ｂ２７＋ＮＧＦ中のポリ−Ｄ−リシン９６ウェルプレート上にプレーティングした。化合物の処理は２２時間である。切断されたＳＮＡＰ−２５１９７のＥＣＬ  ＥＬＩＳＡはＮｏｃ／Ａの取り込みがこのクローン細胞株において特異であることを示した。さらにクローン細胞株はクローン＃３が０．３ｎＭのＥＣ５０で、クローン＃２２が０．９ｎＭのＥＣ５０でＮｏｃ／Ａについて高感度を示す。
【図４】図４は再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａで処理されたＯＲＬ１  ＮＤ７クローン１Ｃ１１、４Ｂ７および４Ｃ９からのＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。親ＮＤ７およびＯＲＬ１  ＮＤ７クローンはＮｏｃ／Ａで２４時間処理し、その後２日間インキュベーションした。これが約５０％のＳＮＡＰ−２５１９７切断に達するだけなのでクローンＮＤ７  ＥＣ５０は計算できない。クローン４Ｂ７および１Ｃ１１は約８０％を超えるＳＮＡＰ−２５１９７切断に達する。ＥＣ５０値は、それぞれ５．７±０．５、６．７±１および８．６±２ｎＭと計算される。
【図５】図５は抗ノシセプチンポリクローナル抗体がＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン＃３、クローン＃２２およびＡＧＮ  Ｐ３３  ＯＲＬ−１クローン＃６細胞株における再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａ取込をブロックできることを示す。細胞をＲＰＭＩ  ＳＦＭ  ＋Ｎ２＋Ｂ２７＋ＮＧＦ中のポリ−Ｄ−リシン９６ウェルプレート上にプレーティングし、１ｎＭのＮｏｃ／Ａ中で異なる希釈率（０〜３μｇ／ｍＬ）で抗ノシセプチンポリクローナル抗体を含む無血清培地中で２２時間処理した。
【図６】図６はＳｉＭａクローンＡＦ４由来の細胞を示し、かつ、ウエスタンプロット像に示されるように０．０１７ｎＭ〜１μＭの濃度で樹立された細胞株ＰＣ−１２が再標的化エンドペプチダーゼＤｙｎ／Ａで処理された。投与量依存的な取り込みが両細胞株について認められた。
【図７】図７は抗体２Ｅ２Ａ６、１Ｄ３Ｂ８、３Ｃ１Ａ５および２Ｃ９Ｂ１０並びに市販のＭＣ−６０５０およびＭＣ−６０５３の７．８ｎＭでの正規化ＢＩＡｃｏｒｅＳＰＲ曲線を示す。図７Aは各抗体のオン・レートについて正規化データを示す。図７Ｂは、各抗体のオフ・レートについて正規化データを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書は試料中の活性再標的化エンドペプチダーゼの有無を測定および標的エンドペプチダーゼの活性／力価を測定する新規のアッセイを提示する。本明細書における新規の細胞ベースのアッセイは、アッセイが試料中のナノモル量の再標的化エンドペプチダーゼを検出することを可能にする細胞、試薬および検出法に依存している。本明細書に開示された細胞ベースのアッセイは再標的化エンドペプチダーゼの複数の機能、例えば、細胞表面の受容体に対する再標的化エンドペプチダーゼ結合、エンドペプチダーゼ受容体複合体の内在化、細胞質内への酵素ドメインの転座、基質の酵素ドメイン切断等を解析するのに役立つ。以下に説明するように、新規の方法および組成物は粗および塊サンプルならびに高度に精製された２本鎖再標的化エンドペプチダーゼおよび処方再標的化エンドペプチダーゼ製品の解析に使用でき、また、自動高速スループットアッセイ形式に適している。
【００１０】
従って、本明細書の１つの態様は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むエピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する免疫反応誘導組成物を提示する。免疫反応誘導組成物はＳＮＡＰ−２５抗原とキャリアとの間に柔軟性リンカーが介在し、アジュバンドおよびＳＮＡＰ−２５抗原に結合しているキャリアまたはＳＮＡＰ−２５抗原に結合している柔軟性スペーサと結合しているキャリアのＳＮＡＰ−２５抗原を含む組成物を誘導する免疫反応を含むことができる。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する免疫反応を誘発する全てのＳＮＡＰ−２５抗原は、ＳＮＡＰ−２５抗原として有用であり得るように構成されたものであり、限定するものではなく、天然のＳＮＡＰ−２５由来のＳＮＡＰ−２５抗原、天然では存在しないＳＮＡＰ−２５由来のＳＮＡＰ−２５およびＳＮＡＰ−２５の免疫反応性断片を含むＳＮＡＰ−２５抗原、天然のＳＮＡＰ−２５または天然には存在しないＳＮＡＰ−２５由来のＳＮＡＰ−２５を含む。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体の産生に有用なＳＮＡＰ−２５抗原は、限定するものではなく、配列番号３８を包含するキャリアペプチドに結合したカルボキシル化Ｃ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５エピトープを含むＳＮＡＰ−２５抗原を含む。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を構成するのに有用な他の免疫反応誘導組成物は、ＳＮＡＰ−２５抗原とキャリアとの間に柔軟性リンカーが介在し、限定するものではなく、ＳＮＡＰ−２５抗原に（カルボキシル化Ｃ末端グルタミンの）結合した柔軟性リンカーに結合したキャリアを含む免疫反応誘導組成物を含む。全てのアジュバンドは、限定するものではなく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、完全なアジュバントおよび不完全なアジュバントを含んだ免疫反応誘導組成物において有用であり得るように構成されたものである。
【００１１】
本明細書に開示された別の態様はＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むエピトープに選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する方法を提示する。この方法の態様は、（ａ）本明細書に記載したＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物を動物に投与する工程、（ｂ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体産生細胞を含む試料を動物から回収する工程、および（ｃ）試料からα−ＳＮＡＰ−２５抗体を単離する工程、を含む。本明細書に開示する方法は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むエピトープに選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体またはＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むエピトープに選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体のいずれかを産生する有用な方法である。
【００１２】
本明細書に開示されたさらに別の態様は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５を含むエピトープに選択的に結合したα−ＳＮＡＰ−２５抗体を提示する。そのようなα−ＳＮＡＰ−２５抗体は天然および天然では存在しない抗体に加え、さらにはモノクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体またはポリクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体も含む。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体として有用なモノクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、限定するものではなく、ハイブリドーマ細胞株１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５および３Ｃ３Ｅ２から産生したモノクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含む。
【００１３】
本明細書に開示された更に別の態様は、再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する免疫を利用した方法を提示する。この方法の態様は、（ａ）樹立した細胞株由来の細胞を再標的化エンドペプチダーゼを含む試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である、（ｂ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、（ｃ）ＳＮＡＰ−２５成分を本明細書に開示したα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程および（ｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ここで該抗体−抗原複合体による検出が再標的化エンドペプチダーゼ活性を示す、を含む。工程（ｃ）のα−ＳＮＡＰ−２５抗体は任意で固相支持体に結合されてもよい。
【００１４】
本明細書に開示された更に別の態様はオピオイド−ＴＶＥＭＰ活性を検出する免疫を利用した方法を提示する。この方法の態様は、（ａ）再標的化エンドペプチダーゼを取り込むことができる樹立した細胞株由来の細胞であり、樹立した細胞株由来の細胞を再標的化エンドペプチダーゼを含む試料で処理する工程、（ｂ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５を含むＳＮＡＰ−２５成分から処理した細胞を単離する工程、（ｃ）ＳＮＡＰ−２５成分を本明細書に開示したα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、および（ｄ）抗体−抗原複合体による検出が再標的化エンドペプチダーゼ活性を示し、α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、を含む。工程（ｃ）のα−ＳＮＡＰ−２５抗体は任意で固相支持体に結合してもよい。
【００１５】
本明細書に開示の別の態様は哺乳動物の再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗を測定する方法を提示する。この方法の態様は、（ａ）抗体を中和するα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の有無を試験する哺乳動物から得た再標的化エンドペプチダーゼを試験試料に添加する工程、（ｂ）再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞であり、樹立した細胞株由来の細胞を試験試料で処理する工程、（ｃ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、（ｄ）ＳＮＡＰ−２５成分を本明細書に開示したα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、（ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、（ｆ）試験試料ではなく陰性対照試料を用いて工程ａ−ｅ工程を繰り返す工程および（ｇ）工程（ｆ）で検出の抗体−抗原複合体の量と比べた工程（ｅ）で検出の抗体−抗原複合体の少量の検出は、α−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の存在を示唆し、工程（ｆ）で検出の抗体−抗原複合体の量を工程（ｅ）で検出の抗体−抗原複合体の量と比較する工程、を含む。工程（ｄ）のα−ＳＮＡＰ−２５抗体は任意で固相支持体に結合してもよい。さらに工程（ｆ）の標準試料は、陰性対照試料に加えて陽性対照試料を含むことができる。
【００１６】
ボツリヌス菌、破傷風菌、クロストリジウム・バラティおよび酪酸菌が産生するクロストリジウム毒素は、ヒトおよび他の哺乳類への治療と美容治療に幅広く使われている。ボツリヌス菌株はヒト（ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／ＥおよびＢｏＮＴ／Ｆ）、動物（ＢｏＮＴ／Ｃ１およびＢｏＮＴ／Ｄ）においてまたは土壌から単離（ＢｏＮＴ／Ｇ）されたボツリヌス症の発生を調べて同定されるボツリヌス毒素（ＢｏＮＴｓ）の抗原的に異なる７つの血清型を産生する。７つのボツリヌス毒素の血清型の全ては類似する構造と生物特性を有する一方で、例えば、薬理学的性質などの異種的な特性も示す。対照的に、破傷風毒素（ＴｅＮＴ）は、破傷風菌の統一した群により産生される。さらにクロストリジウムの他の２つの種であるクロストリジウム・バラティおよび酪酸菌はＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｅに類似する毒素をそれぞれ産生する。
【００１７】
それぞれのクロストリジウム毒素は、内因性クロストリジウム属の毒素プロテアーゼなどの天然のプロテアーゼまたは環境中で産生される天然のプロテアーゼなどが原因で、後にジスルフィドループ内でタンパク質分解切断によって開裂する約１５０ｋＤａの単一鎖ポリペプチドとして翻訳される。この翻訳後プロセスは、単一ジスルフィド結合および非共有結合的相互作用によりまとめられている約５０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）と約１００ｋＤａの重鎖（ＨＣ）を含む２本鎖分子を生じる。それぞれの成熟した２本鎖分子は機能的に異なる３つのドメインを含む。１）神経伝達物質放出装置のコアとなる成分を特異的に標的とする亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を包含するメタロプロテアーゼ領域を含むＬＣに位置する酵素ドメイン、２）細胞内小胞から標的細胞の細胞質内へのＬＣの放出を促進するＨＣ（ＨＮ）のアミノ末端半分以内に含有される転座ドメインおよび３）標的細胞の表面に位置する受容体複合体に対する毒素の結合活性および結合特異性を決定するＨＣ（ＨＣ）のカルボキシ末端半分以内に認められる結合ドメイン。
【００１８】
これら３つの機能的ドメインの結合、転座および酵素活性は毒性に必要なものである。このプロセスに関する詳細はまだ正確には明らかになっていないが、クロストリジウム毒素がニューロンに入り神経伝達物質放出を阻害するという総合的な細胞中毒機構は血清型またはサブタイプに係らずに類似している。出願者は以下の記載により限定されることを望まないが、中毒機構は少なくとも４つの工程を含むものとして説明することができる。１）受容体結合、２）複合体の内在化、３）軽鎖の転座および４）酵素標的の改変（図１）。クロストリジウム毒素のＨｃ結合ドメインが標的細胞の原形質膜表面に位置する毒素特異的な受容体システムに結合する場合にプロセスが開始される。受容体複合体の結合特異性はガングリオシドおよび個々のクロストリジウム毒素受容体複合体を明確に含むと考えられる蛋白質受容体の特定の組み合わせにより一部は達成されると考えられる。結合後、毒素／受容体複合体はエンドサイトーシスにより取り込まれ、かつ、取り込まれた小胞は特定の細胞内経路へ区分けされる。転座工程は小胞コンポーネントの酸性化により起こされると考えられる。このプロセスは疎水性を増大させ、小孔形成を促進させ、毒素の重鎖と軽鎖の分離を促進させる重要なｐＨ依存性の構造再構成を開始すると思われる。分離後は細胞内小胞から神経伝達物質放出装置のコアとなる成分を特異的に標的とすると考えられるサイトゾルに毒素の軽鎖エンドペプチダーゼが放出される。このコアとなる蛋白質、小胞結合膜蛋白質（ＶＡＭＰ）／シナプトブレビン、２５ｋＤａシナプトソーム結合蛋白質（ＳＮＡＰ-２５）およびシンタキシンは、神経終末でのシナプス小胞ドッキングおよび融合に必要であり、かつ、可溶性Ｎエチルマレイミド感受性因子接着蛋白質受容体（ＳＮＡＲＥ）ファミリーのメンバーを構成する。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅはカルボキシル末端領域におけるＳＮＡＰ−２５を切断し、９または２６のアミノ酸断片をそれぞれ放出し、さらにＢｏＮＴ／Ｃ１はカルボキシル末端の近傍のＳＮＡＰ−２５を切断して８つのアミノ酸断片を放出する。ボツリヌス血清型ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＦおよびＢｏＮＴ／Ｇ、ならびに破傷風毒素はＶＡＭＰの保存されている中央部分に働き、かつ、ＶＡＭＰのアミノ酸末端部分をサイトゾルに放出する。ＢｏＮＴ／Ｃ１はサイトゾルの膜表面の近傍の単一の部位でシンタキシンを切断する。シナプスＳＮＡＲＥの選択的な蛋白質分解は、インビボでクロストリジウム毒素により起こる神経伝達物質放出のブロックに関係がある。クロストリジウム毒素のＳＮＡＲＥ蛋白質標的は、さまざまな非神経細型におけるエキソサイトーシスに共通であり、神経細胞と同様にこのような細胞において、軽鎖ペプチダーゼ活性はエキソサイトーシスを阻害する。例えば、Ｙａｎｎ  Ｈｕｍｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｏｗ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  Ｂｌｏｃｋ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ、８２（５）  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．  ４２７−４４６  （２０００）；  Ｋａｔｈｒｙｎ  Ｔｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ��  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｔｉｌｉｔｙ、２７（１１）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ５５２−５５８．  （２００２）；  Ｇｉｏｖａｎｎａ  ＬａＩＩｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎｅｙ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ、１１（９）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３１−４３７、（２００３）を参照のこと。
【００１９】
一般的に再標的化エンドペプチダーゼは外因性プロテアーゼ切断サイトで天然の２本鎖ループプロテアーゼ切断サイトを置換する。例えば、Ｄｏｌｌｙ，  Ｊ．  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ（米国特許第７，４１９，６７６号）を参照のこと。この特許文献を本明細書中に参考として援用する。標的部分のサイズのために再標的化エンドペプチダーゼはその全般的な分子量が異なるが、活性化プロセスおよび２本鎖分子を産生する外因性切断サイトでの切断への依存性はクロストリジウム毒素の場合と本質的に同じである。例えば、Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ（米国特許出願公開第２００９／０００５３１３号）；  Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第１１／７７６，０７５号）；  Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第２００８／０２４１８８１号）を参照のこと。これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
本開示の態様は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する免疫反応誘導組成物を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「免疫反応誘導組成物」は動物に投与された場合、ＳＮＡＰ−２５抗原に対する免疫反応を刺激するＳＮＡＰ−２５抗原を含む組成物を言い、それによりＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する。用語「免疫反応」は免疫反応誘導組成物に対する動物の免疫システムの反応を言う。例示的な免疫反応は、ＣＤ８＋ＣＴＬｓの抗原−特異的な誘導を包含するＣＴＬ反応、Ｔ細胞増殖反応およびサイトカインの放出を包含するヘルパーＴ細胞、抗体産生反応などを包含するＢ細胞反応などの細胞、局所および全身での体液性免疫が挙げられるが、これらに限定されない。用語「免疫反応を誘導する」は免疫反応が影響を受け、つまり、刺激され、開始され、誘導された場合に免疫反応誘導組成物または免疫反応誘導組成物をコード化するポリヌクレオチドの投与を言う。
【００２１】
ＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物は、ＳＮＡＰ−２５抗原を含む。本明細書で使用されるとき、用語「抗原」は免疫反応を誘発する分子を言い、限定するものではなく、ペプチド、多糖、リポ蛋白質および糖脂質などの脂質の共役体を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＳＮＡＰ−２５抗原」は免疫反応を誘発するＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有する抗原を言う。免疫反応誘導組成物に用いる「ＳＮＡＰ−２５抗原」は実質的に固有な配列でありえるほどに大きくなければならなく、従ってＳＮＡＰ−２５よりも抗原に対し交差反応性である抗体を産生する可能性は減少する。更に免疫反応誘導組成物に用いるＳＮＡＰ−２５抗原は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に対して免疫反応を実質的に誘発するのみで十分に小さくなければならず、従ってＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５をＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有しないＳＮＡＰ−２５から区別できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する可能性は増加する。また、再現性に優れた選択的で高収率な単一のアミノ酸配列であり、かつ、高感度のアッセイのデザインを可能にする許容される結合活性で結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を生成することが大いに望まれる。
【００２２】
ＳＮＡＰ−２５に存在するＢｏＮＴ／Ａ切断サイトの周囲の配列はＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’として表示され、ここでＰ１−Ｐ１’は切断性部位を表す。再標的化エンドペプチダーゼにより切断され、得られた切断製品はＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１配列を含む断片およびＰ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’を含む断片を含む。従って本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５」は自身のカルボキシ末端アミノ酸としてＰ１残基を有するＳＮＡＰ−２５を言う。例えば、ヒトＳＮＡＰ−２５（配列番号５）のＱ１９７−Ｒ１９８はＢｏＮＴ／Ａ切断サイトのＰ１−Ｐ１’切断性部位を表す。従ってＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のカルボキシ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５」とは、グルタミンが切断性部位のＱ１９７を表し、自身のカルボキシ末端アミノ酸にグルタミンを有するＳＮＡＰ−２５切断製品になる。別の例では、トルペド・マルモラタＳＮＡＰ−２５（配列番号１６）のＫ２０４−Ｈ２０５は、ＢｏＮＴ／Ａ切断サイトのＰ１−Ｐ１’切断性部位を表す。従って「ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のカルボキシ末端リシンを有するＳＮＡＰ−２５」とは、リシンが切断性部位のＫ２０４を表し、自身のカルボキシ末端アミノ酸にリシンを有するＳＮＡＰ−２５切断製品である。
【００２３】
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は、修飾が無い場合には免疫原性、非免疫原性または低免疫原性であるＳＮＡＰ−２５抗原、ハプテンまたはその他の抗原性化合物の免疫原性を高めるように修飾することができる。本実施形態の一態様では、ＳＮＡＰ−２５抗原の切断性部位はカルボキシ末端Ｐ１残基はカルボキシル化することができる。カルボキシル化はＳＮＡＰ−２５抗原の所望の免疫原性の特性を２点において高める。第１に、電荷を帯びたアミノ酸は免疫原性を高めるので、ＣＯＯ−基のカルボキシ末端残基への添加はＳＮＡＰ−２５抗原の全般的な免疫原性を高める。第２に、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基は切断により電荷状態にあるので、ＣＯＯ−基のカルボキシ末端残基への添加は本明細書に開示したα−ＳＮＡＰ−２５抗体を選択的に結合するようにデザインする実際の抗原を優れて模倣する。
【００２４】
本実施形態の一態様では、ＳＮＡＰ−２５抗原からのアミノ−末端残基はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、チログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、大豆トリプシン阻害因子（ＳＴＩ）または多重結合ペプチド（ＭＡＰ）などのキャリア蛋白質にＳＮＡＰ−２５抗原を取付けるように備えられたアミノ酸の添加で修飾することができる。例えば、キャリア蛋白質KLHに結合するため、システイン残基はアミノ末端に設置することができる。
【００２５】
従って、一実施形態ではＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は、例えば、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０のアミノ酸の長さである可能性がある。別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は、例えば、最大で５、最大で６、最大で７、最大で８、最大で９、最大で１０、最大で１１、最大で１２、最大で１３、最大で１４、最大で１５、最大で１６、最大で１７、最大で１８、最大で１９、最大で２０、最大で２５または最大で３０のアミノ酸の長さである可能性がある。更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は７〜１２アミノ酸、１０〜１５アミノ酸または１３〜１８アミノ酸である可能性がある。
【００２６】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号３３を含む。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９を含む。また別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号４０を含む。
【００２７】
更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号４１を含む。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６を含む。また別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号４７を含む。
【００２８】
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する免疫反応を誘発する全てのＳＮＡＰ−２５抗原は、ＳＮＡＰ−２５抗原として有用であり得るように構成されたものである。従って配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、列番号４１、列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６を含むアミノ酸配列変異体は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する免疫反応を誘発するのにＳＮＡＰ−２５抗原として有用であり得る。従って、一実施形態では、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、列番号４１、列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６を含むＳＮＡＰ−２５抗原に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５つのアミノ酸を置換、欠失または付加でＳＮＡＰ−２５抗原は置換えることができる。更に別の実施形態では、ＳＮＡＰ−２５抗原は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、列番号４１、列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６を含むＳＮＡＰ−２５抗原と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有することができる。
【００２９】
１つ以上のキャリアは、キャリアに関連していない場合には免疫原性、非免疫原性または低免疫原性であるＳＮＡＰ−２５抗原の免疫原性を高めるためにＳＮＡＰ−２５抗原に結合し得ると考えられる。非限定的な例として、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、チログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、大豆トリプシン阻害因子（ＳＴＩ）または多重結合ペプチド（ＭＡＰ）が挙げられる。当該技術分野において公知であるように、非抗原性または低抗原性である抗原をキャリアにカップリングさせて抗原性にすることができる。抗原をキャリアにカップリングさせる種々のその他のキャリアと方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ、１９９８ａ；  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ、１９９８ｂ；  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．  Ｗａｇｇｏｎｅｒ、Ｊｒ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ（米国特許出願公開第２００４００５７９５８号）（Ｍａｒ．  ２５，  ２００４）を参照のこと。さらに融合蛋白質としてエピトープを発現することでエピトープは生成できる。ポリペプチド融合を発現させる方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９）に記載されているように当業者には周知である。ＳＮＡＰ−２５抗原のカルボキシ末端はＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でなければならないので、キャリアはＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ末端に結合していなければならない。
【００３０】
１つ以上の屈曲性スペーサは屈曲性リンカーに関連していない場合には免疫原性、非免疫原性または低免疫原性であるＳＮＡＰ−２５抗原の免疫原性を高めるためにＳＮＡＰ−２５抗原に結合するように構成されたものである。屈曲性スペーサはＳＮＡＰ−２５抗原の全般的なペプチド長を伸ばして柔軟性を増し、それにより免疫細胞に対するＳＮＡＰ−２５抗原の適切な提示が促進される。非限定的な例として、ＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物は免疫細胞に対してＳＮＡＰ−２５抗原をより良く提示するために１つ以上のタンデムの屈曲性スペーサに結合したＳＮＡＰ−２５抗原を含むことができ、それにより免疫反応が促進される。
【００３１】
ペプチドを含む屈曲性スペーサは少なくとも１つのアミノ酸の長さであり、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはセリンなどの小さな側鎖Ｒ基を有する電荷を帯びていないアミノ酸を含む。従って一実施形態では、屈曲性スペーサは、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のアミノ酸の長さである可能性がある。別の実施形態では、屈曲性スペーサは、例えば、最大で１、最大で２、最大で３、最大で４、最大で５、最大で６、最大で７、最大で８、または最大で９、最大で１０のアミノ酸の長さであってもよい。更に別の実施形態では、屈曲性スペーサは、例えば、１〜３アミノ酸、２〜４アミノ酸、３〜５アミノ酸、４〜６アミノ酸または５〜７アミノ酸であってもよい。屈曲性スペーサの非限定的な例は、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号５７）およびＧＧＧＧＳ（配列番号５８）などのＧ−スペーサ、またはＡＡＡ、ＡＡＡＡ（配列番号５９）およびＡＡＡＡＶ（配列番号６０）などのＡ−スペーサを含む。屈曲性スペーサは融合蛋白質としてＳＮＡＰ−２５抗原にフレーム単位で連結する。
【００３２】
上述のように、屈曲性スペーサはＳＮＡＰ−２５抗原のペプチドの全長を伸ばすように一部使用されている。例えば、５−１０アミノ酸ＳＮＡＰ−２５抗原は３−５アミノ酸屈曲性スペーサをＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ末端に結合して伸ばした全長を有することができる。別の例として、５−１０アミノ酸ＳＮＡＰ−２５抗原は４〜６アミノ酸屈曲性スペーサをＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ末端に結合して伸ばした全長を有することができる。別の例として５−１０アミノ酸ＳＮＡＰ−２５抗原は７〜１０アミノ酸屈曲性スペーサをＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ末端に結合して伸ばした全長を有することができる。別の例として７−１２アミノ酸ＳＮＡＰ−２５抗原は１〜３アミノ酸屈曲性スペーサをＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ末端に結合して伸ばした全長を有することができる。別の例として７−１２アミノ酸ＳＮＡＰ−２５抗原は４〜６アミノ酸屈曲性スペーサをＳＮＡＰ−２５抗原のアミノ末端に結合して伸ばした全長を有することができる。屈曲性スペーサによって伸ばした長さで小さなサイズのＳＮＡＰ−２５抗原を選択することができ、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に対して実質的にＳＮＡＰ−２５抗原が免疫反応を誘発する可能性が高まり、従ってＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５を、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有しないＳＮＡＰ−２５と区別できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する可能性が増加する。
【００３３】
本明細書に開示したＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物は、任意で本明細書に開示したＳＮＡＰ−２５抗原および１つ以上のアジュバントを含んでもよいように構成されたものである。本明細書で使用されるときに、ＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物に関して使用されている場合には、用語「アジュバント」は、ＳＮＡＰ−２５抗原に対する免疫反応を高めるかまたは多様化させる物質または物質の混合物を言う。例えば、免疫反応を誘導するアジュバントは、免疫の数または防御免疫に必要な抗原の量を減らすのに役立つ。免疫反応誘導組成物内の免疫反応を誘導するアジュバントの使用は周知である。このアジュバントの主要な目的は免疫反応を高めることである。非限定的なアジュバンドとしては、例えば、リポソーム、油相、限定するものではなく、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）などのアジュバントのフロイントタイプ、フロイント不完全アジュバント、サポニンなどのサポゲニングリコシド、カーボポール、Ｎ‐アセチルムラミル‐Ｌ‐アラニル‐Ｄ‐イソグルタミン（一般的にはムラミルジペプチドまたは「ＭＤＰ」と知られている）およびリポ多糖（ＬＰＳ）などのを含む。一般的にはそのようなアジュバントは水相を有するエマルジョンの形態で使用されているか、より一般的には水に不溶の無機塩を含んでよい。例えば、この無機塩は水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、コロイド状水酸化鉄、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムを含んでもよい。水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）は一般に使用されるアジュバントである。現在、唯一のＦＤＡ承認アジュバントは抗原の沈殿により「デポー」抗原に使用されるアルミニウム塩（Ａｌｕｍ）である。上述したアジュバントは例示する目的のみである。事実、免疫反応を誘導する必須の特性を満足させるアジュバントである限り、免疫反応を誘導するアジュバントは本明細書に開示した免疫反応誘導組成物中で使用されてもよい。
【００３４】
さらに本明細書で開示したキャリアはアジュバントとして作用することができる。特定のアジュバントの作製および使用方法はＧｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １１  ：  ９９３−３０６，  １９９３；  Ａｒｎｏｎ，  Ｒ．  （Ｅｄ．）  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １  ：８３−９２，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＩａ．，  １９８７；  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．  Ｗａｇｇｏｎｅｒ，  Ｊｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ−Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ（米国特許出願公開第２００４００５７９５８号）（Ｍａｒ．  ２５，  ２００４）に記載されている。追加のアジュバントはＣｈａｐｔｅｒ  ７  （ｐｐ  １４１−２２７）  ｏｆ  “Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”  （ｅｄｓ．  Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｍ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，  Ｍ．  Ｊ．）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ６，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている化合物を含む。この概要の例はムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびモンタニド７２０を含む。ポリイノシン、シトシン（Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）またはＣｐＧモチーフを含むプラスミドＤＮＡなどの分子は、さらに微粒子中に封入した抗原との組み合わせでアジュバントとして投与することができる。別の例では、アジュバントは、リステリオリシン、ストレプトリシンまたはこれらの組み合せなどの細胞の細胞質内へ抗原性化合物のエントリーを促進する薬剤である。
【００３５】
従って、一実施形態では、ＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物はキャリアペプチドに結合したカルボキシル化カルボキシ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５抗原を含む。本実施形態の態様では、カルボキシル化カルボキシ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５抗原は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９を含む。本実施形態の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号４０を含む。本実施形態の態様では、キャリアペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、チログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、大豆トリプシン阻害因子（ＳＴＩ）または多重結合ペプチド（ＭＡＰ）である。
【００３６】
別の実施形態では、ＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物はキャリアペプチドに結合したカルボキシル化カルボキシ末端リシンを有するＳＮＡＰ−２５抗原を含む。本実施形態の態様では、カルボキシル化カルボキシ末端リシンを有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６を含む。本実施形態の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号４７を含む。本実施形態の態様では、キャリアペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、チログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、大豆トリプシン阻害因子（ＳＴＩ）または多重結合ペプチド（ＭＡＰ）である。
【００３７】
更に別の実施形態では、ＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物はＳＮＡＰ−２５抗原とキャリアペプチドとの間に屈曲性リンカーが介在し、１つ以上の屈曲性リンカーに結合したカルボキシル化Ｃ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５抗原およびキャリアペプチドを含む。本実施形態の態様では、カルボキシル化カルボキシ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９を含む。別の実施形態では、ＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号４６を含む。本実施形態の態様では、キャリアペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、チログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、大豆トリプシン阻害因子（ＳＴＩ）または多重結合ペプチド（ＭＡＰ）である。本実施形態の態様では、屈曲性リンカーはＧ−スペーサまたはＡ−スペーサである。
【００３８】
更に別の実施形態では、ＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物はＳＮＡＰ−２５抗原とキャリアペプチドとの間に屈曲性リンカーが介在し、屈曲性リンカーおよびキャリアペプチドに結合したカルボキシル化カルボキシ末端リシンを有するＳＮＡＰ−２５抗原を含む。本実施形態の態様では、カルボキシル化カルボキシ末端リシンを有するＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５または配列番号４６を含む。本実施形態の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５抗原は配列番号４７を含む。本実施形態の態様では、キャリアペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、チログロブリン（ＴＨＹ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、大豆トリプシン阻害因子（ＳＴＩ）または多重結合ペプチド（ＭＡＰ）である。本実施形態の態様では、屈曲性リンカーはＧ−スペーサまたはＡ−スペーサである。
【００３９】
本開示の態様は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する方法を一部含む。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は当該技術分野において周知である多種多様な方法で産生することができる。抗体の製造、使用、検出の特定的プロトコール、さらに抗体結合特異性、結合親和性および結合活性の測定は当該技術分野において周知である。例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  （Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、ｅｄｓ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ  ｅｄ．  １９９８ａ）；  ａｎｄ  ＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ：  ＰＯＲＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬ  ＮＯ．  Ｉ  （Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８ｂ）；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２００１；  ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００４；  Ｄａｖｉｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｓａｍｅ、ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ（米国特許第７，０３４，１３２号）（Ａｐｒ．  ２５，  ２００５）；およびＢｅａｔｒｉｚ  Ｍ．  Ｃａｒｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  ＣＴＬＡ４（米国特許第７，０３４，１２１号）（Ａｐｒ．  ２５，  ２００６）を参照のこと。
【００４０】
非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物などに本明細書に開示した免疫反応誘導組成物の１回以上の注入をすることで産生できる。別の非限定的例として、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体は、例えば、鶏卵などの卵に本明細書に開示した免疫反応誘導組成物の１回以上の注入により産生することができる。免疫化した動物の抗体価を固定された抗原または細胞をベースとした活性アッセイを用いた酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な技法で経時的に監視することができる。所望により、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体におけるモノクローナル抗体は哺乳動物（例えば、血液）から単離でき、ＩｇＧ画分を得るのにプロテインＡアフィニティクロマトグラフィまたは抗体の生成に使用するペプチドに対するアフィニティ精製などの周知の技術でさらに精製できる。
【００４１】
別の非限定的な例は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体はハイブリドーマ法を用いて産生することができる。例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ６  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｐｐ．  １９６−２４４、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ、１９９８ａ；  ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ７  Ｇｒｏｗｉｎｇ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、ｐｐ．  ２４５−２８２、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ、１９９８ａ；  ａｎｄ  Ｇｏｄｉｎｇ、ｐｐ．  ５９−１０３、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）を参照のこと。この方法においては、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物などの宿主動物は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に特異的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘発させるために典型的には本明細書に開示したＳＮＡＰ−２５抗原を１回以上、注入投与される。免疫化した動物の抗体価を、固定された抗原または細胞をベースとした活性アッセイを用いた酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な技法で経時的に監視することができる。または、リンパ球は、好適な培養細胞系を用いてインビトロで免疫化することができる。免疫後の適切な時点で、例えば、抗体価が最高値の時に抗体産生細胞を動物から単離する。一般的には、何れの末梢血リンパ球も、ヒト起源の細胞が所望される場合に使用され、また、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞がヒト以外の哺乳動物である供給源が所望される場合に使用される。単離された抗体産生細胞は、その後、例えば、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、具体的には齧歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。典型的には、マウスの骨髄腫細胞株はハイブリドーマを産生するために適切に免疫化したマウスから採取した脾細胞と細胞融合を行う。好ましい不死化細胞株はヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含む培地に感受性のあるマウス骨髄腫細胞株である。多くの骨髄腫細胞株はＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞株などの標準的技術に従い融合パートナーとして使用することができる。次に、融合の結果によるハイブリドーマ細胞は非融合および非生産的融合骨髄腫細胞（形質転換されないので非融合脾細胞は数日後に培養液中で死亡する）を殺すＨＡＴ培地を用いて選択される。次に、ハイブリドーマ細胞が成長する培地はＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。例えば、免役沈降法、放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）あるいは酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイまたは細胞をベースと���た活性アッセイ等においてα−ＳＮＡＰ−２５陽性培地を用いてハイブリドーマ上清をスクリーニングすることができる。このような技術およびアッセイは当該分野公知である。例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  １１  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ、ｐｐ．  ４２１−４７０、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ、１９９８ａ；  Ｃｈａｐｔｅｒ  １２  Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ、ｐｐ．  ４７１−５１０、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ、１９９８ａ；  Ｃｈａｐｔｅｒ  １４  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、ｐｐ．  ５５３−６１２、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ、１９９８ａを参照のこと。また抗体がＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有しないＳＮＡＰ−２５に対して無反応性であるかどうかを測定するさらなる研究が可能である。加えて、α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合親和性、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析で測定することができる。例えば、Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．  Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｒｏｄｂａｒｄ、Ｌｉｇａｎｄ：  Ａ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｆｏｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１０７（１  ）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２０−２３９  （１９８０）を参照のこと。所望のハイブリドーマ細胞が同定された後は、所望のモノクロール抗体を発現するクローン細胞株を得るまで１個の細胞から起因するクローンを単離するのに限界稀釈手順を使用する。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５について十分に選択的で、かつ、十分に高い結合活性で結合する抗体を、さらなる特徴付けおよび試験に基づいて選択する。
【００４２】
ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を調製する別の代替法は、例えば、ＳＮＡＰ−２５ペプチドを用いて抗体ファージディスプレイライブラリーなどの組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングして、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５を結合する免疫グロブリンライブリーメンバーを単離する。ファージディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングのためのキットは、例えば、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）およびＳｕｒｆＺＡＰ（商標）  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  ＪｏＩＩａ，  ＣＡ）から市販されている。さらに抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングの使用に有用な方法および試薬の例は、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，２２３，４０９号）；  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，７１２，０８９号）；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（（米国特許第５，８８５，７９３号）；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，９６２，２５５号）；  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，９６９，１０８号）；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，０１０，８８４号）；  Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，０１７，７３２号）；  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，０２７，９３０号）；  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，１４０，４７１号）；  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（（米国特許第６，１７２，１９７号）に見出すことができる。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
本開示の態様は、α−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体産生細胞を含む試料の回収を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「α−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体産生細胞を含む試料」は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合する少なくとも１つのα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含有しているまたは含有している可能性がある生体物質を言う。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含むことができる全ての試料をこの方法で使用することができ、試料には血液、血漿、血清およびリンパ液が含まれるが、これらには限定されないように構成されたものである。さらにＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生することができる細胞をこの方法で使用することができ、細胞はＣＤ8細胞、ＣＴＬ細胞、ヘルパーＴ−細胞およびＢ−細胞が含まれるが、これらには限定されないように構成されたものである。種々の周知の方法がα−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体産生細胞を含有している個々の試料から回収するために使用することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ、１９９８ａ；  ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ、１９９８ｂを参照のこと。同様にＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を単離するために試料の処理に種々の周知の方法を使用することができる。試料を回収する手順は単離する抗体のタイプに基づいて選択することができる。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を単離する場合、適切な試料はα−ＳＮＡＰ抗体を含んだ血液試料であってもよく、一方、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を単離するとき、適切な試料は脾臓細胞またはハイブリドーマなどのα−ＳＮＡＰ-25抗体産生細胞であってもよい。
【００４４】
本開示の態様は、試料からＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を単離することを一部含む。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体またはＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体などのα−ＳＮＡＰ−２５抗体を単離する方法は当業者に周知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  ｓｕｐｒａ，  １９９８ａ；  ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、ｓｕｐｒａ、１９９８ｂを参照のこと。例えば、そのようなα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体は主として免疫血清のＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティクロマトグラフィなどの周知の技術により試料から単離することができる。続いてまたは別法として、特定のＳＮＡＰ−２５抗原はカラムまたは磁気ビーズに固定化し、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を免疫アフィニティクロマトグラフィで精製することができる。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体はプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィなどの従来の免疫グロブリン精製手順で培養培地あるいは腹水から単離することができる。
【００４５】
従って、一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する方法は（ａ）キャリアペプチドに結合したカルボキシル化Ｃ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５抗原を含むＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物を動物に投与する工程、（ｂ）動物からα−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体産生細胞を含む試料を回収する工程、および（ｃ）試料からα−ＳＮＡＰ−２５抗体成分を単離する工程、を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体はポリクローナル抗体である。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体はモノクローナル抗体である。本実施形態の更に態様では、産生されたＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体はＩｇＧサブタイプである。本実施形態の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）またはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などのアジュバントをさらに含む。
【００４６】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体を産生する方法は（ａ）ＳＮＡＰ−２５ペプチドとキャリアペプチドとの間に屈曲性リンカーが介在し、屈曲性リンカーおよびキャリアペプチドに結合したカルボキシル化Ｃ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５ペプチドを含むＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物を動物に投与する工程、（ｂ）動物からα−ＳＮＡＰ−２５抗体またはα−ＳＮＡＰ−２５抗体産生細胞を含む試料を回収する工程、および（ｃ）試料からα−ＳＮＡＰ−２５抗体成分を単離する、工程を含む。本実施形態の一態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体はポリクローナル抗体である。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５抗体はモノクローナル抗体である。本実施形態の更に態様では、産生されたＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合できるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体はＩｇＧサブタイプである。本実施形態の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５免疫反応誘導組成物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）またはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などのアジュバントをさらに含む。
【００４７】
本開示の態様は試料からＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合する単離されたα−ＳＮＡＰ−２５抗体を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は抗原に特異的に結合した特定の抗原に反応することで作り出された免疫システムにより生成される分子を言い、かつ、天然の抗体と天然には存在しない抗体の両方を含む。本明細書で使用されるとき、用語「単離された」はヒトの介入により自然の環境から分子を分離することを言う。例えば、断片が所望の生物活性およびその単一鎖誘導体を示す限り、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二量体、多量体、多特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２機能性抗体、Ｉｇ受容体などの細胞関連抗体、線形抗体、二重特異性抗体またはミニボディ等であることができる。抗体はＶＨおよびＶＬドメイン、さらに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片などの完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片を含む完全長免疫グロブリン分子であることができる。抗体は脊椎動物（ヒト、ヤギ、ウマ、ロバ、マウス、ラット、ウサギまたはニワトリ）から誘導することができ、かつ、いかなるタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧＩ、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ＩｇＡ1およびｌｇＡ２）であってもよい。天然の抗体、天然には存在しない抗体およびそれらの原性化合物結合断片の構造に関する一般的な開示については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．  １１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．  ２６９−３１５  （１９９４）；  Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２ｄ  ｅｄ．  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照のこと。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
通常、天然の抗体は２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖にリンクされ、一方ジスルフィドリンケージの数は異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖の間で変動する。さらにそれぞれの重鎖および軽鎖は一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有している。個々の重鎖は一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）、これに続いて多数の定常ドメインを有している。個々の軽鎖は一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を、その他方の末端に定常ドメインを有している。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１定常ドメインと整列しており、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの接触面を形成していると考えられている。
【００４９】
完全な抗原−認識および抗原−結合部位はＦｖ断片である抗体の可変ドメイン内に含まれる。この断片は１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが硬く非共有的に会合している二量体を含む。各ドメインはβ−シート構造に結合するループを形成し、ある場合には構造の部分を形成する三つの超可変領域によって結合された、主としてβ−シート立体配置を採用する四つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。各超可変領域は相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応するアミノ酸配列を含む。総称して、これは抗原結合特異性を付与するＶＨ−ＶＬ二重体の表面上の抗原−結合部位を定義する６つのＣＤＲ領域の三次元立体配置である。例えば、Ｃｙｒｕｓ  Ｃｈｏｔｈｉａ、ｅｔ  ａｌ．、Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２（６２５２）：  ８７７−８８３  （１９８９）；  Ｅｌｖｉｎ  Ａ．  Ｋａｂａｔ、ｅｔ  ａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．  （１９９１  ）を参照のこと。上記のそれぞれは全内容が参照により本明細書に組み込まれる。抗体の定常領域は抗体の抗原への結合には直接関与しないが種々のエフェクター機能、例えば、抗体の抗体依存性細胞傷害作用への関与を示す。
【００５０】
標的抗原は一般的には、ＣＤＲ形成抗原−結合部位によって認識される多数の結合部位（エピトープとも呼ばれる）を有する。本明細書で使用されるとき、「エピトープ」は「抗原性決定基」と同意語とみなし、かつ、免疫グロブリンまたはＴ−細胞受容体に特異結合することまたはさもなくば分子と相互作用することが可能なペプチド、多糖または脂質含有分子などの標的抗原上の部位を言う。異なるエピトープに特異的に結合するそれぞれの抗体は異なる構造を有する。従って１つの抗原は１つ以上の対応する抗体を有してもよい。
【００５１】
ポリクローナル抗体は、特定の抗原に結合が可能な少なくとも２種の抗体を含む抗体分子の不均一集団を言う。定義に従い、ポリクローナル抗体は少なくとも２つの異なるエピトープに結合する２つの異なる抗体を含む。本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体（単数）」または「モノクローナル抗体」は、微量に存在する自然に生じる突然変異を除いて集団を含む個々の抗体が同一であり、特定の抗原を結合できる１種類の抗体のみを含む抗体分子の実質的に均一な集団を言う。定義に従い、モノクローナル抗体は単一のエピトープに結合する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、１つの抗原性部位に対して指向される。さらにポリクローナル抗体と対照的に各モノクローナル抗体は抗原上にある１つの決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体はそれらに他の抗体が混入しておらず、合成されてもよい点で有利である。修飾語「モノクローナル」は実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生が必要であるとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成することができ、また、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第５，８０７，７１５号を参照）によって作成することもできる。さらにモノクローナル抗体は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９９１  ）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：６２４−６２８；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９１）  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１−５９７に記載されている技術を用いたファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００５２】
従って、一実施形態では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。本実施形態の一態様では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８２または配列番号１３３である。本実施形態の別の態様では、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０または配列番号９２である。
【００５３】
別の実施形態では、核酸配列はＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むα−ＳＮＡＰ−２５抗体をコードする。本実施形態の一態様では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は核酸配列（配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１または配列番号１３２）によりコードされる。本実施形態の別の態様では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１または配列番号１３２と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。本実施形態の更に他の態様では、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１によりコードされる。本実施形態の更に別の態様では、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号８９または配列番号９１と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である核酸配列によりコードされる。
【００５４】
別の実施形態では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、ＣＤＲ３領域またはこれらの組み合せを含む。本実施形態の一態様では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲ１領域は配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号１１８、配列番号１１９または配列番号１２０である。本実施形態の別の態様では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲ２領域は配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１２１、配列番号１２２または配列番号１２３である。本実施形態の更に別の態様では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲ３領域は配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１２４、配列番号１３４または配列番号１３５である。
【００５５】
別の実施形態では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合する重鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、ＣＤＲ３領域またはこれらの組み合せを含む。本実施形態の一態様では、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ１領域は配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８または配列番号１２9である。本実施形態の別の態様では、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ２領域は配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１または配列番号１１２である。本実施形態の更に他の態様では、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ３領域は配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６または配列番号１１７である。
【００５６】
更に別の実施形態では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５を含むエピトープに特異的に結合する。本実施形態の一態様では、エピトープは配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号３７を含む。本実施形態の一態様では、エピトープは配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４４を含む。
【００５７】
上述のように、ＳＮＡＰ−２５に存在するＢｏＮＴ／Ａ切断サイトの周囲の配列はＰ５５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’として表示され、ここでＰ１−Ｐ１’は切断性部位を表す。ＢｏＮＴ／Ａにより切断され、得られた切断製品はＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１配列を含む断片およびＰ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’を含む断片を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体」は、Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１配列を含むＳＮＡＰ−２５切断製品断片に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を言うが、しかし、Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’配列を含むＳＮＡＰ−２５切断製品断片またはＢｏＮＴ／Ａ切断部位の未改変Ｐ１−Ｐ１’切断可能結合を有するＳＮＡＰ−２５を言わない。本明細書で使用されるとき、用語「α−ＳＮＡＰ−２５１９７抗体」は配列番号５のグルタミン１９７に対応するＰ１残基でカルボキシ末端Ｐ１残基を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合する抗体を言う。本明細書で使用されるとき、用語「α−ＳＮＡＰ−２５２０４抗体」は配列番号１６のリシン２０４に対応するＰ１残基でカルボキシ末端Ｐ１残基を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合する抗体を言う。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、用語「選択的に」は特異な効果あるいは影響が有るまたは唯一の方法あるいは唯一の物で反応を示すことを言う。本明細書で使用されるとき、用語「選択的に結合」または「選択的結合」が抗体を参照している場合には抗体が実質的に非標的エピトープと交差反応しないように抗体と所定の標的エピトープとの特殊な結合を言う。本明細書で使用されるとき、ペプチドエピトープの最小サイズは約５アミノ酸であり、典型的にはペプチドエピトープは少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０アミノ酸を含む。ペプチドエピトープは非連続性であってもよい、つまりペプチドの一次構造において隣接していないアミノ酸残基を含むが、しかしペプチドの二次、三次または四次構造でエピトープに一緒にまとめられている。さらに注目すべきはエピトープは糖残基、リポ蛋白質または糖脂質などの脂質部分またはリン酸化されたアミノ酸などの化学修飾されたアミノ酸部分などであるアミノ酸配列以外の分子の一部を含んでもよいことである。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０のアミノ酸を含むＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープを選択的に結合する。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は最大で５、最大で６、最大で７、最大で８、最大で９、最大で１０、最大で１５、または最大で２０のアミノ酸を含むＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープを選択的に結合することができる。
【００５９】
選択的結合は結合親和性、結合特異性および結合活性などの結合特性を含む。例えば、Ｄａｖｉｄ  Ｊ．  Ｋｉｎｇ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｐｐ．  ２４０  （１９９８）を参照のこと。結合親和性は抗体がそのエピトープ結合部位に存在する時間の長さを言い、抗体がそのエピトープを結合する力であるとみなされる。結合親和性は平衡でＫｄ／Ｋａ比と定義する非平衡解離定数（ＫＤ）と記載される。ここで、Ｋａは抗体の会合速度定数であり、Ｋｄは抗体の解離速度定数である。結合親和性は会合と解離の両方で決定するのであり、決して高い会合あるいは低い解離だけで高い親和性を確定するものではない。会合速度定数（Ｋａ）、あるいは正方向の速度定数（Ｋｏｎ）は単位ごとの結合事象の数または抗体−抗原複合体へ可逆的に会合しようとする抗体および抗原の性向を計測する。会合速度定数はＭ−１ｓ−１の単位で、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］ｘＫｏｎと表される。会合速度定数が大きければ大きいほど抗体はその抗原により早く結合しまたは抗体と抗原の親和性がより高くなる。解離速度定数（Ｋｄ）または逆方向の速度定数（Ｋｏｆｆ）は単位ごとの解離事象の数または成分分子、つまり抗体と抗原へ可逆的に分離（解離）しようとする抗体−抗原複合体の性向を計測する。解離速度定数はｓ−１の単位で、［Ａｂ＋Ａｇ］ｘＫｏｆｆと表される。解離速度定数が小さければ小さいほど抗体はその抗原に対してより強く結合しまたは抗体と抗原の親和性がより高くなる。平衡解離定数（ＫＤ）は形成された新規の抗体−抗原複合体での速度が平衡で抗体−抗原複合体が解離する速度と等しい速度を計測する。平衡解離定数はＭの単位で、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ＝［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ＋Ａｇ］と表される。ここで、［Ａｂ］は抗体のモル濃度、［Ａｇ］は抗原のモル濃度および［Ａｂ  ＋  Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、すべての濃度は系が平衡状態である時の成分である。平衡解離定数が小さければ小さいほど抗体はその抗原に対してより強く結合しまたは抗体と抗原の親和性がより高くなる。
【００６０】
従って、一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合親和性は、例えば、１ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１未満、１ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１未満、１ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１未満または１ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１未満の会合速度定数であることができる。別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、１ｘ１０５Ｍ−１−ｓ−１超、１ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１超、１ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１超または１ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１以上の会合速度定数であることができる。別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、１ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１〜１ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、１ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１〜１ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、１ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１〜１ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１または１ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１１ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数であることができる。
【００６１】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合親和性は、１ｘ１０−３ｓ−１未満、１ｘ１０−４ｓ−１または１ｘ１０−５ｓ−１未満の解離速度定数であることができる。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、１．０ｘ１０−４ｓ−１未満、２．０ｘ１０−４ｓ−１未満、３．０ｘ１０−４ｓ−１未満、４．０ｘ１０−４ｓ−１未満、５．０ｘ１０−４ｓ−１未満、６．０ｘ１０−４ｓ−１未満、７．０ｘ１０−４ｓ−１未満、８．０ｘ１０−４ｓ−１または９．０ｘ１０−４ｓ−１未満の解離速度定数であることができる。別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、１ｘ１０−３ｓ−１超、１ｘ１０−４−１超または１ｘ１０−５ｓ−１超の解離速度定数であることができる。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、１．０ｘ１０−４ｓ超、２．０ｘ１０−４ｓ−１超、３．０ｘ１０−４ｓ−１超、４．０ｘ１０−４ｓ−１超、５．０ｘ１０−４ｓ−１超、６．０ｘ１０−４−１ｓ超、７．０ｘ１０−４ｓ−１超、８．０ｘ１０−４−ｓ−１超または９．０ｘ１０−４ｓ−１超の解離速度定数であることができる。
【００６２】
別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、０．５００ｎＭ未満の平衡解離定数であることができる。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は０．５００ｎＭ未満、０．４５０ｎＭ未満、０．４００ｎＭ未満、０．３５０ｎＭ未満、０．３００ｎＭ未満、０．２５０ｎＭ未満、０．２００ｎＭ、０．１５０ｎＭ未満、０．１００ｎＭ未満または０．０５０ｎＭ未満の平衡解離定数であることができる。別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、０．５００ｎＭ超の平衡解離定数であることができる。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、０．５００ｎＭ超、０．４５０ｎＭ超、０．４００ｎＭ超、０．３５０ｎＭ超、０．３００ｎＭ超、０．２５０ｎＭ超、０．２００ｎＭ超、０．１５０ｎＭ超、０．１００ｎＭ超または０．０５０ｎＭ超の平衡解離定数であることができる。
【００６３】
更に別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合親和性は、未改変ＳＮＡＰ−２５について１ｘ１００Ｍ−１ｓ−１未満、１ｘ１０１Ｍ−１ｓ−１未満、１ｘ１０２  Ｍ−１ｓ−１未満以下、１ｘ１０３Ｍ−１ｓ−１未満、または１ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１未満の会合速度定数であることができる。別の実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合親和性は、未改変ＳＮＡＰ−２５について最大で１ｘ１００Ｍ−１ｓ−１、最大で１ｘ１０１Ｍ−１ｓ−１、最大で１ｘ１０２Ｍ−１ｓ−１、最大で１ｘ１０３Ｍ−１ｓ−１または最大で１ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数であることができる。
【００６４】
結合特異性はエピトープを含む分子とエピトープを含有しない分子を識別する抗体の能力である。結合特異性を測る１つの方法はエピトープを含有しない分子における抗体のＫｏｎ会合速度とエピトープを含む分子における抗体のＫｏｎ会合速度との比較である。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有しないＳＮＡＰ−２５エピトープまたはＢｏＮＴ／Ａ切断部位の未改変Ｐ１−Ｐ１’切断可能結合を有するＳＮＡＰ−２５エピトープなどのエピトープを含有しないＳＮＡＰ−２５に比べて、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープにおけるα−ＳＮＡＰ−２５抗体の会合速度定数（Ｋａ）を比較する。本実施形態の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は１ｘ１００Ｍ−１ｓ−１未満、１ｘ１０１Ｍ−１ｓ−１未満、１ｘ１０２Ｍ−１ｓ−１未満、１ｘ１０３Ｍ−１ｓ−１未満または１ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１未満のエピトープを含有しないＳＮＡＰ−２５の会合速度定数（Ｋａ）を有する。本実施形態の別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は最大で１ｘ１００Ｍ−１ｓ−１、最大で１ｘ１０１Ｍ−１ｓ−１、最大で１ｘ１０２Ｍ−１ｓ−１、最大で１ｘ１０３Ｍ−１ｓ−１または最大で１ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１のエピトープを含まないＳＮＡＰ−２５の会合速度定数（Ｋａ）を有する。
【００６５】
本実施形態のさらに態様では、エピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に比べて、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、少なくとも２倍超、少なくとも３倍超、少なくとも４倍超、少なくとも５倍超、少なくとも６倍超、少なくとも７倍超、少なくとも８倍超、または少なくとも９倍超のエピトープの会合速度定数（Ｋａ）を有する。本実施形態の更に態様では、エピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に比べてＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、少なくとも１０倍超、少なくとも１００倍超、少なくとも１，０００倍超、または少なくとも１０，０００倍超のエピトープの会合速度定数（Ｋａ）を有する。本実施形態の更に別の態様では、エピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に比べてＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、最大で１倍超、最大で２倍超、最大で３倍超、最大で４倍超、最大で５倍超、最大で６倍超、最大で７倍超、最大で８倍超または最大で９倍超のエピトープの会合速度定数（Ｋａ）を有する。本実施形態の更に別の態様では、エピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に比べたＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、最大で１０倍超、最大で１００倍超、最大で１，０００倍超または最大で１０，０００倍超のエピトープの会合速度定数（Ｋａ）を有する。
【００６６】
また、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体の結合特異性は、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有しないＳＮＡＰ−２５エピトープまたはＢｏＮＴ／Ａ切断部位の未改変Ｐ１−Ｐ１’切断可能結合を有するＳＮＡＰ−２５エピトープなどのエピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に比べてＳＮＡＰ−２５エピトープを識別できるようなα−ＳＮＡＰ−２５抗体の比率であることにその特徴がある。本実施形態の態様では、エピトープを含まないＳＮＡＰ−２５に比べてＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６4：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１または少なくとも４０：１であるＳＮＡＰ−２５エピトープの結合特異性比率を有する。本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有しないＳＮＡＰ−２５と比べてＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合すα−ＳＮＡＰ−２５抗体は少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１または少なくとも４０：１であるＳＮＡＰ−２５エピトープの結合特異性比率を有する。本実施形態の更に別の態様では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の未改変Ｐ１−Ｐ１’切断可能結合を有するＳＮＡＰ−２５と比べてＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合すα−ＳＮＡＰ−２５抗体は少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６4：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１または少なくとも４０：１であるＳＮＡＰ−２５エピトープの結合特異性比率を有する。
【００６７】
機能性アフィニティとしても知られている結合活性は多価抗体およびその抗原の間の機能性結合力の合計を言う。抗体分子は１つ以上の結合部位（例えば、ＩｇＧでは２、ＩｇＭでは１０）を有することができ、かつ、多くの抗原は１つ以上の抗原性部位を含む。抗体の結合活性は個々の抗体結合部位の結合親和性に依存する一方で、抗体が完全に解離するには抗体−抗原相互作用のすべてが崩壊しなければならないので結合活性は結合親和性よも大きい。ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、抗体のすべてのエピトープに選択的に結合するこができるように構成されたものである。
【００６８】
従って、一実施形態では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体である。本実施形態の態様では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体はカルボキシ末端グルタミンを有するＳＮＡＰ−２５と選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体またはカルボキシ末端アミノ酸にリシンを有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体である。本実施形態の別の態様では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号５のグルタミン１９７に対応するＰ１残基でカルボキシ末端Ｐ１残基を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体または配列番号１６のリシン２０４に対応するＰ１残基でカルボキシ末端Ｐ１残基を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体である。本実施形態の更に別の態様では、α−ＳＮＡＰ−２５抗体は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６のカルボキシ末端アミノ酸配列を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体である。
【００６９】
本開示の態様は再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する免疫を利用した方法を一部含む。本明細書に開示した免疫を利用した方法を精密度、精度、検出限界（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、範囲、特異性、選択性、直線性、耐久性およびシステム適合性を含めた数種類のパラメータで評価することができる。方法の精密度は分析法の厳密さの測定または測定値と取り決めによる真の値あるいは認定基準値として受け入れられる値との間の一致の近似性である。方法の精度は手順を均一の試料から多数回採取に反復適用した場合の、個々の試験結果の間の一致の程度である。従って、精度は、１）アッセイ内変動、２）日内変動（併行精度）および３）日間変動（室内再現精度）および４）室間再現精度（再現性）を評価する。変動係数（ＣＶ％）は観測または理論的な平均値に対して表した精度の量的測定である。
【００７０】
本明細書に開示した免疫を利用した方法はバックグラウンドを超えてＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５を含むα−ＳＮＡＰ−２５抗体−抗原複合体の存在を検出できなければならない。方法における検出限界（ＬＯＤ）とは陰性対照またはブランクからは有意に違いがあるシグナルを出す分析対象物の濃度を言い、かつ、バックグラウンドから識別することができる分析対象物の最低濃度を表す。
【００７１】
従って、一実施形態では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は陰性対照またはブランクからは有意に違いがある量で再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを検出できる。本実施形態の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は１０ｎｇ以下、９ｎｇ以下、８ｎｇ以下、７ｎｇ以下、６ｎｇ以下、５ｎｇ以下、４ｎｇ以下、３ｎｇ以下、２ｎｇ以下、１ｎｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを有する。本実施形態の更に別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は９００ｐｇ以下、８００ｐｇ以下、７００ｐｇ以下、６００ｐｇ以下、５００ｐｇ以下、４００ｐｇ以下、３００ｐｇ以下、２００ｐｇ以下、１００ｐｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを有する。本実施形態の更に態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は、９０ｐｇ以下、８０ｐｇ以下、７０ｐｇ以下、６０ｐｇ以下、５０ｐｇ以下、４０ｐｇ以下、３０ｐｇ以下、２０ｐｇ以下、１０ｐｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを有する。本実施形態の別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は、９ｐｇ以下、８ｐｇ以下、７ｐｇ以下、６ｐｇ以下、５ｐｇ以下、４ｐｇ以下、３ｐｇ以下、２ｐｇ以下、１ｐｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを有する。本実施形態の更に別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は、０．９ｐｇ以下、０．８ｐｇ以下、０．７ｐｇ以下、０．６ｐｇ以下、０．５ｐｇ以下、０．４ｐｇ以下、０．３ｐｇ以下、０．２ｐｇ以下、０．１ｐｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを有する。
【００７２】
本実施形態の別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを有する。本実施形態の別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は、９００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下または１００ｐＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを有する。本実施形態の別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は１００ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、８０ｐＭ以下、７０ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下または１０ｐＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを有する。本実施形態の更に別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は１０ｐＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼ、９ｐＭ以下、８ｐＭ以下、７ｐＭ以下、６ｐＭ以下、５ｐＭ以下、４ｐＭ以下、３ｐＭ以下、２ｐＭ以下または１ｐＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを有する。
【００７３】
定量限界（ＬＯＱ）とは許容可能な精密度および精度で測定することができる試料および標本中の分析対象物の最低濃度と最高濃度である。定量の下限とは検出法がバックグラウンドから一貫して計測できる最小限の用量を言う。定量の上限とはシグナル飽和が起こる前に検出法が一貫して計測できる最大限の用量である。この方法の線形範囲とは定量の下限と上限の間の面積である。線形範囲は定量の上限から定量の下限を差し引いて計算できる。本明細書で使用されるとき、用語「下漸近線におけるシグナル対ノイズ比」とは検出の下限をバックグラウンドシグナルで分割する方法で検出されたシグナルを言う。本明細書で使用されるとき、用語「上漸近線におけるシグナル対ノイズ比」とは検出の上限をバックグラウンドシグナルで分割する方法で検出されたシグナルを言う。
【００７４】
従って、一実施形態では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は陰性対照またはブランクからは有意に違いがある量で再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを検出できる。本実施形態の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は、１０ｎｇ以下、９ｎｇ以下、８ｎｇ以下、７ｎｇ以下、６ｎｇ以下、５ｎｇ以下、４ｎｇ以下、３ｎｇ以下、２ｎｇ以下、１ｎｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを有する。本実施形態の更に別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は９００ｐｇ以下、８００ｐｇ以下、７００ｐｇ以下、６００ｐｇ以下、５００ｐｇ以下、４００ｐｇ以下、３００ｐｇ以下、２００ｐｇ以下、１００ｐｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを有する。本実施形態の更に態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は９０ｐｇ以下、８０ｐｇ以下、７０ｐｇ以下、６０ｐｇ以下、５０ｐｇ以下、４０ｐｇ以下、３０ｐｇ以下、２０ｐｇ以下、１０ｐｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを有する。本実施形態の別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は、９ｐｇ以下、８ｐｇ以下、７ｐｇ以下、６ｐｇ以下、５ｐｇ以下、４ｐｇ以下、３ｐｇ以下、２ｐｇ以下、１ｐｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを有する。本実施形態の更に別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は０．９ｐｇ以下、０．８ｐｇ以下、０．７ｐｇ以下、０．６ｐｇ以下、０．５ｐｇ以下、０．４ｐｇ以下、０．３ｐｇ以下、０．２ｐｇ、０．１ｐｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを有する。
【００７５】
本実施形態の別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを有する。本実施形態の別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は９００ｐＭ以下、８００ｐＭ以下、７００ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下または１００ｐＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを有する。本実施形態の別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は、１００ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、８０ｐＭ以下、７０ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下または１０ｐＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを有する。本実施形態の更に別の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は、１０ｐＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼ、９ｐＭ以下、８ｐＭ以下、７ｐＭ以下、６ｐＭ以下、５ｐＭ以下、４ｐＭ以下、３ｐＭ以下、２ｐＭ以下または１ｐＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを有する。
【００７６】
開示した方法の実践面に有効な免疫を利用した方法は５０％以下の精度を有しなければならない。本実施形態の態様では、免疫を利用した方法は、５０％以下、４０％以下、３０％以下または２０％以下の精度を有する。本実施形態の別の態様では、免疫を利用した方法は、１５％以下、１０％以下、５％以下の精度を有する。本実施形態の別の態様では、免疫を利用した方法は、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下の精度を有する。
【００７７】
開示した方法の実践面に有効な免疫を利用した方法は、少なくとも５０％未満の精密度を有しなければならない。本実施形態の態様では、免疫を利用した方法は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％の精密度を有する。本実施形態の別の態様では、免疫を利用した方法は、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の精密度を有する。本実施形態の別の態様では、免疫を利用した方法は少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の精密度を有する。
【００７８】
本明細書に開示した免疫を利用した方法は統計的に有意な下漸近線におけるシグナル対ノイズ比および統計的に有意な上漸近線におけるシグナル対ノイズ比を有しなければならない。本実施形態の態様では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１または少なくとも２０：１の下漸近線におけるシグナル対ノイズ比を有する。本実施形態の別の態様では、免疫を利用した方法は少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、少なくとも４０：１、少なくとも４５：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも３００：１、少なくとも３５０：１、少なくとも４００：１、少なくとも４５０：１、少なくとも５００：１、少なくとも５５０：１または少なくとも６００：１の上漸近線におけるシグナル対ノイズ比を有する。
【００７９】
方法の特異性とは、部分的に活性または不活性分析対象物などの関連のあるその他の成分を排除して目的の分析対象物を計測する方法の能力である。方法の選択性は、試料中の種々の物質を区別する分析的方法の能力を表す記載。方法の直線性は試料中の分析対象物の濃度に比例して直接的または良好に規定された数学的な変換によって結果を引き出す能力である。従って一実施形態では、本明細書に開示した免疫を利用した方法は完全に活性な再標的化エンドペプチダーゼの７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下または１０％以下の活性を有する部分的に活性な再標的化エンドペプチダーゼから完全に活性な再標的化エンドペプチダーゼを識別できる。
【００８０】
方法の耐久性は通常の（しかし可変的）試験状態下で同一の試料について得た試験結果の再現性である。方法の頑健性とは分析法の条件を小さい範囲で故意に変動させたときに測定値が影響を受けにくい能力のことであり、通常の作業状態における分析法の信頼性の指標となる。従って耐久性は避けえない変化を評価するが頑健性は意図的な変化を評価する。耐久性と頑健性で評価する典型的なパラメータは凍結／融解、インキュベーション時間、インキュベーション温度、試薬の寿命、試料調製物、試料保管、細胞継代数、再標的化エンドペプチダーゼのロット、精製の間の差およびニッキング反応間の差を含む。細胞ベースのアッセイの頑健性パラメータは細胞バンク（凍結の開始、中間および終了）、細胞継代レベル、細胞播種濃度、細胞株濃度（培養中の日数）、フラスコ内の細胞年齢（播種までの待ち時間）、インキュベーション時間、異なるプレイト、過量の血清および試薬源を含む。方法のシステム適合性は経時的に標準物質または標準分子での分析による試薬および装置の性能を含ま含んだアッセイ性能の決定である。ＦＤＡのガイドラインは装置、エレクトロニクス、アッセイ性能および分析する試料が集積システムを構成するという事実に言及してシステム適合性を強調している。システム適合性はログ投与量に対する反応をプロットすることで平行度テストにより評価することができ、標準の連続希釈および試料の連続希釈が平衡曲線を生じさせる。
【００８１】
本開示の態様は樹立した細胞株由来の細胞を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「細胞」は、再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である任意の真核細胞または再標的化エンドペプチダーゼを取り込みできる任意の真核細胞を言う。細胞という用語はさまざまな生物由来、例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類、ヒトの細胞などの細胞を含む。それらはさまざまな細胞型、例えば、神経細型および非神経細型由来で、異種細胞集団、組織または臓器からまたはその一部から分離できるものである。本明細書で使用されるとき、用語「樹立された細胞株」は、「死化細胞株」または「形質転換細胞株」と同意語とみなし、かつ、組織、細胞または臓器由来の細胞集団からの不明確な増殖における選択された細胞の細胞培養を言う。定義に従い、樹立された細胞株は一次細胞の細胞培養を除く。本明細書で使用されるとき、用語「一次細胞」は、新鮮組織または臓器から直接収集した細胞であり不確定に増殖する可能性を持たない。樹立された細胞株は細胞の異種集団または細胞の均一集団を含むことができる。単細胞由来の樹立された細胞株はクローン細胞株と言う。樹立された細胞株は、再標的化エンドペプチダーゼがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし再標的化エンドペプチダーゼのその受容体への結合、エンドペプチダーゼ／受容体複合体のエンドペプチダーゼ、細胞内小胞から細胞質内へ再標的化エンドペプチダーゼ軽鎖の転座ならびにＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解的切断を含む全般的な細胞機構を行う細胞に必要な全ての成分を内因的に発現する細胞であってもよい。あるいは、樹立された細胞株は再標的化エンドペプチダーゼがＳＮＡＰ−２５基質およびエキソサイトーシスの蛋白質分解を起こし再標的化エンドペプチダーゼのその受容体への結合、エンドペプチダーゼ／受容体複合体の内在化、細胞内小胞から細胞質内へ軽鎖の転座ならびにＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解的切断を含む全般的な細胞機構を行う細胞に必要な少なくとも１つの成分の外因性源から導入された細胞であってもよい。また、遺伝子改変細胞株においてそのような樹立された細胞株由来の細胞は、例えば、外因性ＯＲＬ１、外因性ＤＯＲ、外因性ＫＯＲ、外因性ＭＯＲ、外因性ガラニン受容体１、外因性ガラニン受容体２、外因性ガラニン受容体３またはこれらの組み合せを発現してもよい。
【００８２】
本開示の態様は、再標的化エンドペプチダーゼに感受性である樹立した細胞株由来の細胞を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「再標的化エンドペプチダーゼに感受性である細胞」、「再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である細胞」または「再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞」は、再標的化エンドペプチダーゼがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし全般的な細胞機構を行うことができる細胞を言い、それによりエキソサイトーシスを阻害し再標的化エンドペプチダーゼのその受容体への結合、エンドペプチダーゼ／受容体複合体のエンドペプチダーゼ、細胞内小胞から細胞質内へ再標的化エンドペプチダーゼ軽鎖の転座ならびにＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解的切断を含む。定義に従い、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である細胞は少なくとも１つの再標的化エンドペプチダーゼ受容体および少なくとも１つのＳＮＡＰ−２５基質を発現するか発現するように改変されなければならない。本明細書で使用されるとき、用語「再標的化エンドペプチダーゼを取り込む細胞」または「再標的化エンドペプチダーゼを取り込むことができる樹立した細胞株を含む細胞」は、再標的化エンドペプチダーゼがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし全般的な細胞機構を行うことができる細胞を言い、それによりエキソサイトーシスを阻害し再標的化エンドペプチダーゼのその受容体への結合、エンドペプチダーゼ／受容体複合体のエンドペプチダーゼ、細胞内小胞から細胞質内へ再標的化エンドペプチダーゼ軽鎖の転座ならびにＳＮＡＰ−２５のタンパク質分解的切断を含む。定義に従い、再標的化エンドペプチダーゼを取り込むことができる細胞は少なくとも１つの再標的化エンドペプチダーゼ受容体および少なくとも１つのＳＮＡＰ−２５基質を発現するか発現するように改変されなければならない。
【００８３】
従って、一実施形態では、樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である。本実施形態の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は、約１００ｎＭ以下、約９０ｎＭ以下、約８０ｎＭ以下、約７０ｎＭ以下、約６０ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である。別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は約９ｎＭ以下、約８ｎＭ以下、約７ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、約１ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である。さらに別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は約０．９ｎＭ以下、約０．８ｎＭ以下、約０．７ｎＭ以下、約０．６ｎＭ以下、約０．５ｎＭ以下、約０．４ｎＭ以下、約０．３ｎＭ以下、約０．２ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である。本明細書で使用されるとき、用語「約」は、記載された事項、数、パーセンテージまたは用語の値が特定された場合には記載された事項、数、パーセンテージまたは用語の値のプラスまたはマイナス１０パーセントの範囲を言う。
【００８４】
別の実施形態では、樹立したクローン細胞株を含む細胞は再標的化エンドペプチダーゼを取込みできる。本実施形態の態様では、樹立したクローン細胞株を含む細胞は約１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、約８０ｎＭ以下、約７０ｎＭ以下、約６０ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭまたは以下の再標的化エンドペプチダーゼを取込みできる。別の態様では、樹立したクローン細胞株を含む細胞は約９ｎＭ以下、約８ｎＭ以下、約７ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、約１ｎＭまたは以下の再標的化エンドペプチダーゼを取り込む能力を有する。さらに別の態様では、樹立したクローン細胞株を含む細胞は約０．９ｎＭ以下、約０．８ｎＭ以下、約０．７ｎＭ以下、約０．６ｎＭ以下、約０．５ｎＭ以下、約０．４ｎＭ以下、約０．３ｎＭ以下、約０．２ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼを取り込む能力を有する。
【００８５】
本開示の態様は本明細書で開示した再標的化エンドペプチダーゼについて選択的結合を示す樹立した細胞株由来の細胞を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「選択的に結合」または「選択的結合」が再標的化エンドペプチダーゼを参照している場合には再標的化エンドペプチダーゼが実質的に非標的エピトープと交差反応しないような、再標的化エンドペプチダーゼと所定の標的エピトープとの特殊な結合を言う。再標的化エンドペプチダーゼについて樹立した細胞株由来の細胞が選択的に結合する程度は、これらの細胞が再標的化エンドペプチダーゼの標的ドメインを有しない分子について非選択的な取込を示す範囲から測定することができる。再標的化エンドペプチダーゼの標的ドメインを有しない分子について非選択的な取込を評価する１つの方法はＬＨＮ断片の非選択的な取込を計測する方法である。ＬＨＮ断片はクロストリジウム毒素転座ドメインおよびクロストリジウム毒素酵素ドメインを含むが標的ドメインを有しない。ＬＨＮ断片の非限定的例はＬＨＮ／Ａ断片、ＬＨＮ／Ｂ断片、ＬＨＮ／Ｃ断片、ＬＨＮ／Ｄ断片、ＬＨＮ／Ｅ断片、ＬＨＮ／Ｆ断片およびＬＨＮ／Ｇ断片を含む。ＬＨＮ／Ａ断片の例はポリヌクレオチド分子配列番号１４７によりコードされる配列番号１４６である。
【００８６】
従って、一実施形態では、樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼについて選択的結合を示す。本実施形態の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は少なくとも７５％のアッセイをした総合活性、少なくとも８０％のアッセイをした総合活性、少なくとも８５％のアッセイをした総合活性、少なくとも９０％のアッセイをした総合活性または少なくとも９５％のアッセイをした総合活性を表す再標的化エンドペプチダーゼについて選択的結合を示す。本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は約７５％から１００％のアッセイをした総合活性、約８０％から約１００％のアッセイをした総合活性、約８５％から約１００％をした総合活性、約９０％から約１００％をした総合活性を表す再標的化エンドペプチダーゼについて選択的結合を示す。
【００８７】
別の実施形態では、樹立した細胞株由来の細胞は最小ＬＨＮ断片の非選択的な取込を示す。本実施形態の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は最大で２５％の計測された総合取込、最大で２０％の計測された総合取込、最大で１５％の計測された総合取込、最大で１０％の計測された総合取込または最大で５％の計測された総合取込であるＬＨＮ断片の非選択的な取込を示す。本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は約０％から約２５％の計測された総合取込、約０％から約２０％の計測された総合取込、約０％から約１５％の計測された総合取込、約０％から約１０％の計測された総合取込または約０％から約５％の計測された総合取込であるＬＨＮ断片の非選択的な取込を示す。
【００８８】
更に別の実施形態では、樹立した細胞株由来の細胞は最小ＬＨＮ／Ａ断片の非選択的な取込を示す。本実施形態の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は最大で２５％の計測された総合取込、最大で２０％の計測された総合取込、最大で１５％の計測された総合取込、最大で１０％の計測された総合取込または最大で５％の計測された総合取込であるＬＨＮ／Ａ断片の非選択的な取込を示す。本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は約０％〜約２５％の計測された総合取込、約０％〜約２０％の計測された総合取込、約０％〜約１５％の計測された総合取込、約０％〜約１０％の計測された総合取込または約０％から約５％の計測された総合取込であるＬＨＮ／Ａ断片の非選択的な取込を示す。
【００８９】
本開示の態様は感度がよく、かつ、選択的な結合を付与する原形質膜上の十分な数の受容体結合部位を示す樹立した細胞株由来の細胞を一部含む。平衡飽和結合アッセイは種々の濃度でのリガンドの総および非特異的結合を測定する。リガンドの平衡解離定数（Ｋｄ）および最大数の受容体結合部位Ｂｍａｘは非線形回帰分析を用いて特異的結合から計算できる。特異的結合はリガンドの非特異的結合を観測された総結合から差し引いて計算できる。Ｋｄは最大半量結合に到達するのに必要とされるリガンドの濃度であり、かつ、モル濃度で計測される。Ｂｍａｘは原形質膜上の結合部位の最大数であり、ｐｍｏｌ／ｍｇ、ｐｍｏｌ／ｃｅｌｌ、ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、あるはｓｉｔｅｓ／ｃｅｌｌの単位で計測される。
【００９０】
従って、一実施形態では、樹立した細胞株由来の細胞は感度の良く、かつ、選択的な結合を付与する原形質膜上の十分な数の受容体結合部位を示す。本実施形態の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼの標的リガンドについて少なくとも０．１ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも０．２ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも０．３ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも０．４ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも０．５ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも０．６ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも０．７ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも０．８ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも０．９ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌまたは少なくとも１．０ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌのＢｍａｘ値を示す。本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼの標的リガンドについて少なくとも１ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも２ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも３ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも４ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも５ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも６ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも７ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも８ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌ、少なくとも９ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌまたは少なくとも１０ｆｍｏｌ／ｃｅｌｌのＢｍａｘ値を示す。
【００９１】
本開示の態様は、クローン細胞株を得た親細胞株由来の細胞よりもより安定している再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立したクローン細胞株由来の細胞を一部含む。ここで、用語「安定している」は、同じアッセイ条件および同じ再標的化エンドペプチダーゼが両方のアッセイで使用される場合、同一または類似の継代数のクローン細胞株を得た親細胞株由来の細胞により示される相対的なＥＣ５０、感度、有効性、明確に定義された上漸近線および／または明確に定義された用量応答曲線の値と類似する再標的化エンドペプチダーゼ活性のＥＣ５０、感度、有効性、明確に定義された上漸近線および／または明確に定義された用量応答曲線を示す特定の継代数における樹立したクローン細胞株由来の細胞を言う。
【００９２】
従って、一実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞はクローン細胞株が由来した親細胞株と比較してより安定している。本実施形態の一態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は親ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株と比べてより安定している。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は親ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１４９と比べてより安定している。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞はクローン細胞株が由来した親細胞株と比較して例えば、少なくとも５超の継体、少なくとも１０超の継体、少なくとも１５超の継体、少なくとも２０超の継体、少なくとも２５超の継体、または少なくとも３０超の継体についてより安定している。本実施形態の更に別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞はクローン細胞株が由来した親細胞株と比較して例えば、少なくとも５超の継体、少なくとも１０超の継体、少なくとも１５超の継体、少なくとも２０超の継体、少なくとも２５超の継体、または少なくとも３０超の継体についてより安定している。
【００９３】
本開示の態様は複数の細胞継代で安定している再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立したクローン細胞株由来の細胞を一部含む。ここで、用語「安定している」とは同じアッセイ条件および同じ再標的化エンドペプチダーゼが両方のアッセイで使用される場合、同じ樹立したクローン細胞株の先行する継代数の細胞に由来する細胞により示される相対的なＥＣ５０、感度、有効性、明確に定義された上漸近線および／または明確に定義された用量応答曲線の値と類似する再標的化エンドペプチダーゼ活性のＥＣ５０、感度、有効性、明確に定義された上漸近線および／または明確に定義された用量応答曲線を示す特定の継代数における樹立したクローン細胞株由来の細胞を言う。
【００９４】
本明細書に開示した樹立した細胞株由来の細胞は複数の細胞継体での再標的化エンドペプチダーゼ活性における一貫した感度を示すことができる。本明細書で使用されるとき、用語「再標的化エンドペプチダーゼ活性に対する感度」は、無投与対照またはバックグランドシグナルにより検出されるシグナルを超えたアッセイが測定できる最低投与量を言う。
【００９５】
従って、一実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞はどのような継体であれ標的エンドペプチダーゼの１００ｎＭ以下、約８０ｎＭ以下、約７０ｎＭ以下、約６０ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約０．９ｎＭ以下、約０．８ｎＭ以下、約０．７ｎＭ以下、約０．６ｎＭ以下、約０．５ｎＭ以下、約０．４ｎＭ以下、約０．３ｎＭ以下、約０．２ｎＭ以下または約０．１ｎＭ以下での再標的化エンドペプチダーゼ活性における感度を示す。本実施形態の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞はどのような継体であれ再標的化エンドペプチダーゼの約０．０１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約０．０１ｎＭ〜約７５ｎＭ、約０．０１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約０．０１ｎＭ〜約２５ｎＭ、約０．０１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約０．０１ｎＭ〜約１５ｎＭ、約０．０１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約０．０１ｎＭ〜約５ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約７５ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約２５ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約１５ｎＭ、約０．００１ｎＭ〜約１０ｎＭ、または約０．００１ｎＭ〜約５ｎＭの再標的化エンドペプチダーゼ活性における感度を示す。
【００９６】
別の実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、５以上の細胞継体、１０以上の細胞継体、１５以上の細胞継体、２０以上の細胞継体、２５以上の細胞継体、３０以上の細胞継体、３５以上の細胞継体、４０以上の細胞継体、４５以上の細胞継体または５０以上の細胞継体について約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下または約１ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼ活性における感度を示す。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、約１５〜約６０の継体、約２0〜約６０の継体、約２５〜約６０の継体、約３０〜約６０の継体、約３５〜約６０の継体、約４０〜約６０の継体、約４５〜約６０の継体、約５０〜約６０の継体、約１５〜約５０の継体、約２０〜約５０の継体、約２５〜約５０の継体、約３０〜約５０の継体、約３５〜約５０の継体、約４０〜約５０の継体、約１５〜約４０の継体、約２０〜約４０の継体、約２５〜約４０の継体または約３０〜約４０の継体について約１００ｎＭ以下、約７５ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下または約１ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼ活性における感度を示す。
【００９７】
本明細書に開示した樹立した細胞株由来の細胞は、複数の細胞継体での再標的化エンドペプチダーゼ活性における一貫性がある相対的な有効性を示すことができる。本明細書で使用されるとき、用語「相対的な有効性」は、どの程度現在のアッセイ試験において検出された再標的化エンドペプチダーゼ活性について上漸近線がそのアッセイで使用されている標準物質、標準分子または標準継体数において検出された再標的化エンドペプチダーゼ活性における上漸近線と比較できるのかを言う。本明細書で使用されるとき、用語「上漸近線におけるシグナル対ノイズ比」とは無治療対照またはバックグラウンドシグナルで検出できるシグナルで分割した検出の最大値でアッセイで検出されたシグナルを言う。検出の最大値はシグナルの飽和が起こる前における信号のアッセイが一貫して測定ができる最高用量である。
【００９８】
従って、一実施形態では、本明細書において開示した樹立したクローン細胞株由来の細胞は複数の細胞継体で明確に定義された上漸近線を示ことができ、かつ、アッセイにとって一貫して十分なシグナル対ノイズ比を維持することができる。本実施形態の態様では、本明細書において開示した樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、少なくとも４０：１、少なくとも４５：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも３００：１、少なくとも３５０：１、少なくとも４００：１、少なくとも４５０：１、少なくとも５００：１、少なくとも５５０：１、または少なくとも６００：１以上の、例えば、５以上の細胞継体、１０以上の細胞継体、１５以上の細胞継体、２０以上の細胞継体、２５以上の細胞継体、３０以上の細胞継体、３５以上の細胞継体、４０以上の細胞継体、４５以上の細胞継体、または５０以上の細胞継体で再標的化エンドペプチダーゼ活性に関する上漸近線についてシグナル対ノイズ比を有しなければならない。本実施形態の別の態様では、本明細書において開示した樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも３５：１、少なくとも４０：１、少なくとも４５：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも３００：１、少なくとも３５０：１、少なくとも４００：１、少なくとも４５０：１、少なくとも５００：１、少なくとも５５０：１、または少なくとも６００：１以上の、例えば、約１５〜約６０の継体、約２０〜約６０の継体、約２５〜約６０の継体、約３０〜約６０の継体、約３５〜約６０の継体、約４０〜約６０の継体、約４５〜約６０の継体、約５０〜約６０の継体、約１５〜約５０の継体、約２０〜約５０の継体、約２５〜約５０の継体、約３０〜約５０の継体、約３５〜約５０の継体、約４０〜約５０の継体、約１５〜約４０の継体、約２０〜約４０の継体、約２５〜約４０の継体、または約３０〜約４０の継体で再標的化エンドペプチダーゼ活性に関する上漸近線について明確に定義されたシグナル対ノイズ比を有しなければならない。
【００９９】
本明細書において開示した樹立したクローン細胞株由来の細胞は、複数の細胞継体で再標的化エンドペプチダーゼ活性について明確に定義された用量応答曲線を示すことできる。本明細書で使用されるとき、用語「用量応答曲線」は、どの程度生データがかかるアッセイにおける選択の統計モデルに適合するかを言う。非限定的な例として４−パラメータロジスティック適合表示のＳ字状曲線は効力アッセイなどの酵素活性アッセイにおける用量応答曲線である。他の非限定的な例として単一部位飽和適合があるリガンド結合はリガンド／抗体結合アッセイにおける用量応答曲線である。
【０１００】
従って、一実施形態では、本明細書において開示した樹立したクローン細胞株由来の細胞は複数の細胞継体で再標的化エンドペプチダーゼ活性について明確に定義された用量応答曲線を示す。本実施形態の態様では、本明細書において開示した樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、５以上の細胞継体、１０以上の細胞継体、１５以上の細胞継体、２０以上の細胞継体、２５以上の細胞継体、３０以上の細胞継体、３５以上の細胞継体、４０以上の細胞継体、４５以上の細胞継体、または５０以上の細胞継体で再標的化エンドペプチダーゼ活性について明確に定義された用量応答曲線を示す。本実施形態の別の態様では、本明細書において開示した樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、約１５〜約６０の継体、約２０〜約６０の継体、約２５〜約６０の継体、約３０〜約６０の継体、約３５〜約６０の継体、約４０〜約６０の継体、約４５〜約６０の継体、約５０〜約６０の継体、約１５〜約５０の継体、約２０〜約５０の継体、約２５〜約５０の継体、約３０〜約５０の継体、約３５〜約５０の継体、約４０〜約５０の継体、約１５〜約４０の継体、約２０〜約４０の継体、約２５〜約４０の継体、または約３０〜約４０の継体で再標的化エンドペプチダーゼ活性について明確に定義された用量応答曲線を示す。
【０１０１】
本明細書において開示する樹立したクローン細胞株由来の細胞は複数の細胞継体で再標的化エンドペプチダーゼ活性について一貫性がある相対的なＥＣ５０値を示すことができる。本明細書で使用されるとき、用語「相対的なＥＣ５０」または「相対的なＥＣ５０値」はそのアッセイで使用されている標準物質、標準分子または標準継体数について計算したＥＣ５０に対して正規化した再標的化エンドペプチダーゼ活性のＥＣ５０値を言う。
【０１０２】
従って、一実施形態では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は複数の細胞継体で再標的化エンドペプチダーゼ活性について一貫性がある相対的なＥＣ５０値を示す。本実施形態の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、約±１０％、約±２０％、約±３０％、約±４０％、約±５０％、約６０％、約７０％または約±７５％、再標的化エンドペプチダーゼ活性について相対的なＥＣ５０値、例えば、５以上の細胞継体、１０以上の細胞継体、１５以上の細胞継体、２０以上の細胞継体、２５以上の細胞継体、３０以上の細胞継体、３５以上の細胞継体、４０以上の細胞継体、４５以上の細胞継体、または５０以上の細胞継体で再標的化エンドペプチダーゼ活性について一貫性がある相対的なＥＣ５０値を示す。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は、例えば、約±１０％〜約７５％、約±１０％〜約７０％、約±１０％〜約６０％、約±１０％〜約５０％、約±１０％〜約４０％、約±１０％〜約３０％または約±１０％〜約２０％、再標的化エンドペプチダーゼ活性について相対的なＥＣ５０値、例えば、５以上の細胞継体、１０以上の細胞継体、１５以上の細胞継体、２０以上の細胞継体、２５以上の細胞継体、３０以上の細胞継体、３５以上の細胞継体、４０以上の細胞継体、４５以上の細胞継体、または５０以上の細胞継体で再標的化エンドペプチダーゼ活性について一貫性がある相対的なＥＣ５０値を示す。
【０１０３】
本開示の態様は再標的化エンドペプチダーゼを一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「再標的化エンドペプチダーゼ」は「標的化血管エキソサイトーシスモジュレーター蛋白質」または「ＴＶＥＭＰ」と同意語とみなす。再標的化エンドペプチダーゼの非限定的な例はＫｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｍｏｄｉｆｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ａｆｆｅｒｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ（米国特許第５，９８９，５４５号）；  Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｃ．  Ｓｈｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（米国特許第６，４６１，６１７号）；  Ｃｏｎｒａｄ  Ｐ．  Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｃｕｓ  Ｈｙｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ（米国特許第６，６３２，４４０号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ（米国特許第６，８４３，９９８号）；  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ（米国特許出願公開第２００２／００３７８３３号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎ−ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第２００３／０１８０２８９号）；  Ｊ．  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ（国際公開第２００１／０１４５７０号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００５／０２３３０９号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ（米国特許出願公開第１１／３７６，６９６号）；  Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第１１／７７６，０７５号）；  Ｄｏｌｌｙ、Ｊ．  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ（米国特許出願公開第１１／８２９，４７５号）；  Ｆｏｓｔｅｒ、Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（国際公開第２００６／０５９０９３号）；  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ、Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｏｎ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００６／０５９１０５号）に開示されている。上記のそれぞれは、全内容が参照により本明細書に組み込ま��る。再標的化エンドペプチダーゼの非限定的な例配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１３０および配列番号１３１を含む。
【０１０４】
従って、一実施形態では、検出される再標的化エンドペプチダーゼは再標的化エンドペプチダーゼからである。本実施形態の態様では、検出される再標的化エンドペプチダーゼはＫｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｍｏｄｉｆｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ａｆｆｅｒｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ（米国特許第５，９８９，５４５号）；  Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｃ．  Ｓｈｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（米国特許第６，４６１，６１７号）；  Ｃｏｎｒａｄ  Ｐ．  Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｃｕｓ  Ｈｙｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ（米国特許第６，６３２，４４０号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ（米国特許第６，８４３，９９８号）；  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ（米国特許出願公開第２００２／００３７８３３号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎ−ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第２００３／０１８０２８９号）；  Ｊ．  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ（国際公開第２００１／０１４５７０号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００５／０２３３０９号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ（米国特許出願公開第１１／３７６，６９６号）；  Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第１１／７７６，０７５号）；  Ｄｏｌｌｙ、Ｊ．  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ，（米国特許出願公開第１１／８２９，４７５号）；  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（国際公開第２００６／０５９０９３号）；およびＦｏｓｔｅｒ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｎ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００６／０５９１０５号）に開示した再標的化エンドペプチダーゼからである。上記のそれぞれは全内容が参照により本明細書に組み込まれる。本実施形態の態様では、再標的化エンドペプチダーゼは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１３０または配列番号１３１である。
【０１０５】
別の実施形態では、検出される再標的化エンドペプチダーゼはＫｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｍｏｄｉｆｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ａｆｆｅｒｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ（米国特許第５，９８９，５４５号）；  Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｃ．  Ｓｈｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（米国特許第６，４６１，６１７号）；  Ｃｏｎｒａｄ  Ｐ．  Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｃｕｓ  Ｈｙｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ（米国特許第６，６３２，４４０号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ（米国特許第６，８４３，９９８号）；  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ（米国特許出願公開第２００２／００３７８３３号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎ−ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第２００３／０１８０２８９号）；  Ｊ．  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ（国際公開第２００１／０１４５７０号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００５／０２３３０９号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ（米国特許出願公開第１１／３７６，６９６号）；  Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第１１／７７６，０７５号）；  Ｄｏｌｌｙ、Ｊ．  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ（米国特許出願公開第１１／８２９，４７５号）；  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（国際公開第２００６／０５９０９３号）；およびＦｏｓｔｅｒ、Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｏｎ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００６／０５９１０５号）に開示されている再標的化エンドペプチダーゼを少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する再標的化エンドペプチダーゼからである。上記のそれぞれは全内容が参照により本明細書に組み込��れる。別の実施形態では、検出される再標的化エンドペプチダーゼは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１３０または配列番号１３１の再標的化エンドペプチダーゼと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する再標的化エンドペプチダーゼからである。
【０１０６】
本実施形態の別の態様では、検出される再標的化エンドペプチダーゼはＫｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｍｏｄｉｆｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ａｆｆｅｒｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ（米国特許第５，９８９，５４５号）；  Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｃ．  Ｓｈｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（米国特許第６，４６１，６１７号）；  Ｃｏｎｒａｄ  Ｐ．  Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｃｕｓ  Ｈｙｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ（米国特許第６，６３２，４４０号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ（米国特許第６，８４３，９９８号）；  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ（米国特許出願公開第２００２／００３７８３３号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎ−ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第２００３／０１８０２８９号）；  Ｊ．  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ（国際公開第２００１／０１４５７０号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００５／０２３３０９号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ（米国特許出願公開第１１／３７６，６９６号）；  Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第１１／７７６，０７５号）；  Ｄｏｌｌｙ、Ｊ．  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ（米国特許出願公開第１１／８２９，４７５）；  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（国際公開第２００６／０５９０９３号）；およびＦｏｓｔｅｒ、Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｏｎ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００６／０５９１０５号）に開示した再標的化エンドペプチダーゼと比べて１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の非連続アミノ酸が置換、欠失または付加された再標的化エンドペプチダーゼからであ���。上記のそれぞれは全内容が参照により本明細書に組み込まれる。本実施形態の別の態様では、検出される再標的化エンドペプチダーゼは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１３０または配列番号１３１の再標的化エンドペプチダーゼと比べて１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の非連続アミノ酸が置換、欠失または付加された再標的化エンドペプチダーゼからである。
【０１０７】
本実施施形態の更に別の態様では、検出される再標的化エンドペプチダーゼはＫｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｍｏｄｉｆｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ａｆｆｅｒｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ（米国特許第５，９８９，５４５号）；  Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｃ．  Ｓｈｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（米国特許第６，４６１，６１７号）；  Ｃｏｎｒａｄ  Ｐ．  Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｃｕｓ  Ｈｙｐｅｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎ（米国特許第６，６３２，４４０号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ（米国特許第６，８４３，９９８号）；  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ（米国特許出願公開第２００２／００３７８３３号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎ−ｎｅｕｒａｌ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第２００３／０１８０２８９号）；  Ｊ．  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ（国際公開第２００１／０１４５７０号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００５／０２３３０９号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ（米国特許出願公開第１１／３７６，６９６号）；  Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第１１／７７６，０７５号）；  Ｄｏｌｌｙ、Ｊ．  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ（米国特許出願公開第１１／８２９，４７５号）；  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（国際公開第２００６／０５９０９３号）；およびＦｏｓｔｅｒ、Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｏｎ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００６／０５９１０５号）に開示した再標的化エンドペプチダーゼと比べて例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ変異体からである。上記のそれぞれは全内容が参照により本明細書に組み込まれる。本実施形態の更に別の態様では、検出される再標的化エンドペプチダーゼは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１３０または配列番号１３１の再標的化エンドペプチダーゼと比べて１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼからである。
【０１０８】
更に別の実施形態では、検出される再標的化エンドペプチダーゼ活性はオピオイド再標的化エンドペプチダーゼからである。オピオイド再標的化エンドペプチダーゼまたはオピオイド−ＴＶＥＭＰの非限定的な例はＫｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｍｏｄｉｆｙ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ａｆｆｅｒｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ（米国特許第５，９８９，５４５号）；  Ｊ．  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｄｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ（米国特許第７，１３２，２５９号）；  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ（米国特許第７，２４４，４３７号）；  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ（米国特許第７，４１３，７４２号）；  Ｓｔｅｐｈａｎ  Ｄｏｎｏｖａｎ，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｉｎ（米国特許第７，４１５，３３８号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ（米国特許第７，５１４，０８８号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（米国特許出願公開第２００８／００６４０９２号；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（米国特許出願公開第２００９／００３５８２２号）；  Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ（米国特許出願公開第２００９／００４８４３１号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｎｏｎ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（米国特許出願公開第２００９／０１６２３４１号）；  Ｋｅｉｔｈ  Ａ．  Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（国際公開第２００５／０２３３０９号）；およびＬａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ（国際公開第２００８／００８８０５号）に開示した。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
更に別の実施形態では、検出される再標的化エンドペプチダーゼ活性は、ガラニン再標的化エンドペプチダーゼからである。ガラニン再標的化エンドペプチダーゼまたはガラニン−ＴＶＥＭＰの非限定的な例はＳｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（米国特許出願公開第１１／７７６，０４３号）（Ｊｕｌ．  １１，  ２００７）；  Ｓｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第１１／７７６，０５２号）（Ｊｕｌ．  １１，  ２００７）；およびＳｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許出願公開第１１／７７６，０７５号）（Ｊｕｌ．  １１，  ２００７）に開示した。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
本開示の態様はＳＮＡＰ−２５を一部を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＳＮＡＰ−２５」は、天然のＳＮＡＰ−２５または再標的化エンドペプチダーゼにより優先的に切断されている天然には存在しないＳＮＡＰ−２５を言う。本明細書で使用されるとき、用語「優先的に切断されている」は再標的化エンドペプチダーゼによる他の基質と比べて少なくとも１桁より高い再標的化エンドペプチダーゼによるＳＮＡＰ−２５の開裂速度を言う。本実施形態の態様では、再標的化エンドペプチダーゼによるＳＮＡＰ−２５の開裂速度は再標的化エンドペプチダーゼによる他の基質の開裂速度と比べて少なくとも２桁より高い、少なくとも３桁より高い、少なくとも４桁より高い、または少なくとも５桁より高い。
【０１１１】
本明細書で使用されるとき、用語「天然のＳＮＡＰ−２５」は、天然のプロセス、限定するものではなく、翻訳後修飾から産生されたＳＮＡＰ−２５アイソフォーム、異なるスプライシングにより生成した転写物または自発突然変異およびＳＮＡＰ−２５サブタイプにより産生されたＳＮＡＰ−２５を言う。天然のＳＮＡＰ−２５は、限定するものではなく、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４または配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４からの１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。
【０１１２】
本明細書で使用されるとき、用語「天然には存在しないＳＮＡＰ−２５」は、限定するものではなく、ランダム突然変異誘導または合理的な設計を用いて遺伝子操作により産生されたＳＮＡＰ−２５およびインビトロでの化学合成により産生されたＳＮＡＰ−２５を含むヒトの操作の支援で修飾された構造のＳＮＡＰ−２５を言う。天然には存在しないＳＮＡＰ−２５の非限定的例はＳｔｅｗａｒｄ，  Ｌ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＲＥＴ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  ７，３３２，５６７；  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｐｏｈｉｌｉｃ  Ｄｙｅ−ｂａｓｅｄ  ＦＲＥＴ  Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（米国特許出願公開第２００８／０１６０５６１号）に開示した。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。天然には存在しないＳＮＡＰ−２５は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４からの１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上のアミノ酸を置換、欠失または付加してもよい。
【０１１３】
従って、一実施形態では、ＳＮＡＰ−２５は天然のＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の態様では、ＳＮＡＰ−２５はＳＮＡＰ−２５アイソフォームまたはＳＮＡＰ−２５サブタイプである。本実施形態の態様では、天然のＳＮＡＰ−２５は少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４の天然のＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４との少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然のＳＮＡＰ−２５である。
【０１１４】
別の実施形態では、ＳＮＡＰ−２５は天然には存在しないＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然には存在しないＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の別の態様では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４と比べて１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の非連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＳＮＡＰ−２５である。本実施形態のさらに別の態様では、ＳＮＡＰ−２５は配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４と比べて例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＳＮＡＰ−２５である。
【０１１５】
ＳＮＡＰ−２５は内因性ＳＮＡＰ−２５または外因性ＳＮＡＰ−２５であってもよい。本明細書で使用されるとき、用語「内因性ＳＮＡＰ−２５」は、ＳＮＡＰ−２５の外部物質源またはＳＮＡＰ−２５をコード化する遺伝物質の外部物質源を必要とすることなく細胞がＳＮＡＰ−２５を固有に発現するように細胞のゲノム中に天然にコードされている細胞に天然に存在するＳＮＡＰ−２５を言う。内因性ＳＮＡＰ−２５の発現は細胞分化などの環境刺激を加えてもまた加えなくてもよい。定義に従い、内因性ＳＮＡＰ−２５は天然のＳＮＡＰ−２５またはその変異体だけである。例えば、以下の樹立された細胞株はＢＥ（２）−Ｍ１７、Ｋｅｌｌｙ、ＬＡ１−５５ｎ、Ｎ１Ｅ−１１５、Ｎ４ＴＧ３、Ｎ１８、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＮＧ１０８−１５、ＰＣ１２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳｉＭａ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺおよびＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）−Ｃなどの内因性ＳＮＡＰ−２５を発現する。
【０１１６】
本明細書で使用されるとき、用語「外因性ＳＮＡＰ−２５」は、ＳＮＡＰ−２５の外部物質源またはヒトの操作によりＳＮＡＰ−２５をコード化する遺伝物質の外部物質源を導入することで細胞内に発現するＳＮＡＰ−２５を言う。外因性ＳＮＡＰ−２５の発現は細胞分化などの環境刺激を加えてもまた加えなくてもよい。非限定的な例として、樹立した細胞株由来の細胞はＳＮＡＰ−２５の一時的または安定したトランスフェクションにより外因性ＳＮＡＰ−２５を発現できる。他の非限定的な例として、樹立した細胞株由来の細胞はＳＮＡＰ−２５の蛋白質移入により外因性ＳＮＡＰ−２５を発現できる。外因性ＳＮＡＰ−２５は天然のＳＮＡＰ−２５またはその変異体でありまたは天然には存在しないＳＮＡＰ−２５またはその変異体である。
【０１１７】
従って、一実施形態では、樹立した細胞株は内因性ＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の態様では、樹立した細胞株により発現する内因性ＳＮＡＰ−２５は天然のＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞により発現した内因性ＳＮＡＰ−２５は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４である。本実施形態のさらなる態様では、樹立した細胞株由来の細胞により発現した内因性ＳＮＡＰ−２５はＳＮＡＰ−２５アイソフォームまたはＳＮＡＰ−２５サブタイプなどの天然のＳＮＡＰ−２５である。本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞により発現した内因性ＳＮＡＰ−２５は少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４との少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然のＳＮＡＰ−２５である。
【０１１８】
別の実施形態では、樹立した細胞株由来の細胞は、一過性にまたは安定的に操作され、内因性ＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の一態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、天然のＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４の天然のＳＮＡＰ−２５を発現する。さらに別の実施形態では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、ＳＮＡＰ−２５アイソフォームまたはＳＮＡＰ−２５サブタイプなどの天然のＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の更に別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は、一過性にまたは安定的に操作され、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４との少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然のＳＮＡＰ−２５を発現する。
【０１１９】
本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は、一過性にまたは安定的に操作され、天然では存在しないＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然では存在しないＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態の別の態様では、樹立したクローン細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４と比べて例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の非連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＳＮＡＰ−２５を発現する。本実施形態のさらに別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４と比べて例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しないＳＮＡＰ−２５を発現する。
【０１２０】
再標的化エンドペプチダーゼ曝露後のＳＮＡＰ−２５の切断を検出するアッセイは、細胞が内因性または外因性ＳＮＡＰ−２５を発現するかを評価するに用いることができる。このアッセイにおいてはＳＮＡＰ−２５切断産物の生成は再標的化エンドペプチダーゼ曝露後にＳＮＡＰ−２５を発現する細胞で検出される。ウェスタンブロット法ならびに十分に特性が明らかな試薬、条件およびプロトコールの非限定的な例は、限定するものではなく、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ；  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ；  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ；  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ、ａｎｄ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ  ＪｏＩＩａ、ＣＡなどの業者から容易に利用可能である。ＳＮＡＰ−２５切断におけるこれらおよび類似のアッセイは内因性または外因性ＳＮＡＰ−２５を発現する細胞を同定するのに有用となる可能性があることが理解される。
【０１２１】
非限定的な例として、ＳＮＡＰ−２５−切断産物またはＳＮＡＰ−２５の切断型と非切断型の両方を認識する抗体を用いたウェスタンブロット法は、再標的化エンドペプチダーゼ取込のアッセイに使用してもよい。このアッセイに有用なα−ＳＮＡＰ−２５抗体の例は、限定するものではなく、α−ＳＮＡＰ−２５  マウスモノクローナル抗体  ＳＭＩ−８１  （Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、ｍｏｕｓｅ  α−ＳＮＡＰ−２５  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｌ  ７１．１  （Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、α−ＳＮＡＰ−２５  マウスモノクローナル抗体  Ｃｌ  ７１．２  （Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、α−ＳＮＡＰ−２５  マウスモノクローナル抗体  ＳＰ１２  （Ａｂｅａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、α−ＳＮＡＰ−２５  ウサギポリクローナル抗血清  （Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、α−ＳＮＡＰ−２５  ウサギポリクローナル抗血清  （Ａｂｅａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびα−ＳＮＡＰ−２５  ウサギポリクローナル抗血清  Ｓ９６８４  （Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む。
【０１２２】
開示の態様は再標的化エンドペプチダーゼ受容体を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「再標的化エンドペプチダーゼ受容体」は、再標的化エンドペプチダーゼ反応を誘発するように再標的化エンドペプチダーゼと優先的に相互作用する天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体または天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体を言う。本明細書で使用されるとき、用語「優先的に相互作用する」は、再標的化エンドペプチダーゼ受容体における再標的化エンドペプチダーゼの平衡解離定数（ＫＤ）が他の受容体における再標的化エンドペプチダーゼの場合よりも少なくとも１桁低いことを言う。平衡解離定数は再標的化エンドペプチダーゼおよび再標的化エンドペプチダーゼ受容体複合体などの構成要素分子へ可逆的に分離（解離）を行う再標的化エンドペプチダーゼ−再標的化エンドペプチダーゼ容体複合体を性質を測定する特定のタイプの平衡定数である。平衡ではＫＤ＝Ｋａ／Ｋｄと定義する。会合定数（Ｋａ）はＫａ＝［Ｃ］／［Ｌ］［Ｒ］と定義し、解離定数（Ｋｄ）はＫｄ＝［Ｌ］［Ｒ］／［Ｃ］と定義する。ここで、［Ｌ］は再標的化エンドペプチダーゼのモル濃度、［Ｒ］は再標的化エンドペプチダーゼ受容体のモル濃度および［Ｃ］はエンドペプチダーゼ―受容体複合体のモル濃度であり、さらにすべての濃度は系が平衡である場合の成分である。解離定数が小さくなるほど、再標的化エンドペプチダーゼがその受容体により強く結合し、または再標的化エンドペプチダーゼと再標的化エンドペプチダーゼ受容体間の結合親和性が高くなる。本実施形態の態様では、再標的化エンドペプチダーゼのその受容体における解離定数は他の受容体における再標的化エンドペプチダーゼと比べて少なくとも２桁低い、少なくとも３桁低い、少なくとも４桁低いまたは少なくとも５桁低い。本実施形態の別の態様では、受容体と優先的に相互作用する再標的化エンドペプチダーゼの結合親和性は、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下または１００ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）を有することができる。本実施形態の別の態様では、受容体と優先的に相互作用する再標的化エンドペプチダーゼの結合親和性は９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下または１０ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）を有することができる。本明細書で使用されるとき、用語「再標的化エンドペプチダーゼ反応を誘発する」は、再標的化エンドペプチダーゼと相互作用してエンドペプチダーゼ／受容体複合体を形成し、かつ、その後、複合体を細胞質への内在化する再標的化エンドペプチダーゼ受容体の能力を言う。
【０１２３】
本明細書で使用されるとき、用語「天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体」は天然のプロセス、限定するものではなく、翻訳後修飾から産生された再標的化エンドペプチダーゼ受容体アイソフォーム、異なるスプライシングにより生成した転写物または自発突然変異および再標的化エンドペプチダーゼ受容体サブタイプで産生された再標的化エンドペプチダーゼ受容体を言う。天然の再標的化エンドペプチダーゼは、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｉｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅｓ，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  ６，２６５，５６３；  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｏｐｉｏｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（米国特許第６，４３２，６５２号）；  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｉｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ（米国特許第７，２８２，５６３号）；およびＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｌｔａ  Ｏｐｉｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（米国特許出願公開第２００８／０２１９９２５号）に記載されている、限定するものではなく、アヘン剤様受容体１（ＯＲＬ１）、δ−オピオイド受容体（ＤＯＲ）、κ−オピオイド受容体（ＫＯＲ）およびμ−オピオイド受容体（ＭＯＲ）などの天然のオピオイド受容体を含む。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。天然の再標的化エンドペプチダーゼの他の例は、限定するものではなく、ガラニン受容体１、ガラニン受容体２およびガラニン受容体３を含む。霊長類、ウシ、イヌ、マウス、ニワトリおよび魚などの他の脊椎動物天然のオピオイド受容体は当該分野で周知であり本明細書の態様において使用することができる。
【０１２４】
天然のＯＲＬ１は、限定するものではなく、配列番号２５および配列番号２６または配列番号２５あるいは配列番号２６から１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。天然のＤＯＲは、限定するものではなく、配列番号２７および配列番号２８または配列番号２７あるいは配列番号２８から１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。天然のＫＯＲは、限定するものではなく、配列番号２９および配列番号３０または配列番号２９あるいは配列番号３０から１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。天然のＭＯＲは、限定するものではなく、配列番号３１または配列番号３１から１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。
【０１２５】
天然のガラニン受容体１は、限定するものではなく、配列番号１３６、配列番号１３７および配列番号１３８または配列番号１３６、配列番号１３７あるいは配列番号１３８から１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。天然のガラニン受容体２は、限定するものではなく、配列番号１３９または配列番号１３９から１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。天然のガラニン受容体３は、限定するものではなく、配列番号１４０または配列番号１４０から１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含む。
【０１２６】
本明細書で使用されるとき、用語「天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体変異体」は、限定するものではなく、ランダム突然変異誘導または合理的な設計を用いて遺伝子操作により産生された再標的化エンドペプチダーゼ受容体、および、化学合成により産生された再標的化エンドペプチダーゼ受容体を含むヒトの操作または設計の支援で産生した再標的化エンドペプチダーゼ受容体を言う。天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体変異型の非限定的な例は保存的な再標的化エンドペプチダーゼ受容体変異体、非保存的な再標的化エンドペプチダーゼ受容体変異体再標的化エンドペプチダーゼ受容体キメラ変異体および活性再標的化エンドペプチダーゼ受容体断片などを含む。
【０１２７】
本明細書で使用されるとき、用語「天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体」は、限定するものではなく、ランダム突然変異誘導または合理的な設計を用いて遺伝子操作により産生された再標的化エンドペプチダーゼ受容体およびインビトロでの化学合成により産生された再標的化エンドペプチダーゼ受容体を含むヒトの操作の支援で修飾された構造の再標的化エンドペプチダーゼ受容体を言う。天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９または配列番号１４０からの１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上のアミノ酸を置換、欠失または付加したものを含んでもよい。
【０１２８】
従って、一実施形態では、再標的化エンドペプチダーゼはＯＲＬ１、ＤＯＲ、ＫＯＲまたはＭＯＲなどの天然の再標的化エンドペプチダーゼである。本実施形態の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は再標的化エンドペプチダーゼ受容体アイソフォームまたは再標的化エンドペプチダーゼ受容体サブタイプである。本実施形態の態様では、天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１の天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１の少なくとも７０%、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。
【０１２９】
別の実施形態では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は遺伝子改変ＯＲＬ１、遺伝子改変ＤＯＲ、遺伝子改変ＫＯＲまたは遺伝子改変ＭＯＲなどの天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼである。本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１の少なくとも７０%、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１と比べて例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の非連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。本実施形態のさらに別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１と比べて例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。
【０１３０】
別の実施形態では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体はガラニン受容体１、ガラニン受容体２またはガラニン受容体３などの天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。本実施形態の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は再標的化エンドペプチダーゼ受容体アイソフォームまたは再標的化エンドペプチダーゼ受容体サブタイプである。本実施形態の態様では、天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、または配列番号１４０の天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、または配列番号１４０の少なくとも７０%、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。
【０１３１】
別の実施形態では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は遺伝子改変ガラニン受容体１、遺伝子改変ガラニン受容体２または遺伝子改変ガラニン受容体３などの天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、または配列番号１４０の少なくとも７０%、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９または配列番号１４０と比べて例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の非連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。本実施形態の更に別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９または配列番号１４０と比べて例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。
【０１３２】
再標的化エンドペプチダーゼ受容体は内因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体または外因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体であってもよい。本明細書で使用されるとき、用語「内因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体」は細胞内に天然に存在する再標的化エンドペプチダーゼ受容体を言う。これは細胞のゲノム中に天然にコードされており、再標的化エンドペプチダーゼ受容体の外部原因または再標的化エンドペプチダーゼ受容体をコード化する遺伝物質の外部原因を必要とすることなく細胞が再標的化エンドペプチダーゼ受容体を固有に発現するからである。内因性標的エンドペプチダーゼ受容体の発現は細胞分化またはプロモータ活性化などの環境刺激を加えてもまた加えなくてもよい。例えば、次の樹立した細胞株は少なくとも１つの内因性標的エンドペプチダーゼ受容体を発現する。それらはＡＧＮ  Ｐ３３、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＳｉＭａおよびＳＫ−Ｎ−ＤＺである。内因性標的エンドペプチダーゼ受容体は天然の標的エンドペプチダーゼ受容体またはそれらの天然の異性体だけである。
【０１３３】
本明細書で使用されるとき、用語「外因性標的エンドペプチダーゼ受容体」は標的エンドペプチダーゼ受容体の外部の原因またはヒトの操作により標的エンドペプチダーゼ受容体をコード化する遺伝物質の外部原因を導入することで細胞内に発現する標的エンドペプチダーゼ受容体を言う。外因性標的エンドペプチダーゼ受容体の発現は細胞分化またはプロモータ活性化などの環境刺激を加えてもまた加えなくてもよい。非限定的な例として、樹立した細胞株由来の細胞はＯＲＬ１、ＤＯＲ、ＫＯＲ、ＭＯＲ、ガラニン受容体１、ガラニン受容体２またはガラニン受容体３などの標的エンドペプチダーゼ受容体をコード化するポリヌクレオチド分子の一時的または安定したトランスフェクションによる１つ以上の外因性標的エンドペプチダーゼ受容体を発現できる。別の非限定的な例として、樹立した細胞株由来の細胞はＯＲＬ１、ＤＯＲ、ＫＯＲ、ＭＯＲ、ガラニン受容体１、ガラニン受容体２またはガラニン受容体３などの標的エンドペプチダーゼ受容体の蛋白質トランスフェクションによる１つ以上の外因性標的エンドペプチダーゼ受容体を発現できる。外因性標的エンドペプチダーゼ受容体は、天然の標的エンドペプチダーゼ受容体あるいはそれらの天然の異性体または天然には存在しない標的エンドペプチダーゼ受容体あるいはそれらの天然には存在しない異性体であることができる。
【０１３４】
従って、一実施形態では、樹立した細胞株由来の細胞は内因性標的エンドペプチダーゼ受容体を発現する。本実施形態の態様では、樹立した細胞株由来の細胞により発現した外因性標的エンドペプチダーゼ受容体は天然の標的エンドペプチダーゼ受容体である。本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞により発現した内因性標的エンドペプチダーゼ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９または配列番号１４０である。本実施形態のさらに態様では、樹立した細胞株由来の細胞により発現した内因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体は再標的化エンドペプチダーゼ受容体アイソフォームまたは再標的化エンドペプチダーゼ受容体サブタイプなどの天然の再標的化エンドペプチダーゼである。本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞により発現した内因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体は配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９または配列番号１４０の少なくとも７０%、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体である。
【０１３５】
別の実施形態では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、内因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する。本実施形態の一態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する。本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９または配列番号１４０の天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する。本実施形態のさらに別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、再標的化エンドペプチダーゼ受容体アイソフォームまたは再標的化エンドペプチダーゼ受容体サブタイプなどの天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する。本実施形態の更に別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９または配列番号１４０の少なくとも７０%、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然の再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する。
【０１３６】
本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する。本実施形態の別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９または配列番号１４０の少なくとも７０%、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する。本実施形態の更に別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号１３６、配列番号１３７、、配列番号１３８、配列番号１３９または配列番号１４０と比べて例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の非連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する。本実施形態のさらに別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１配列番号１３６、配列番号１３７、、配列番号１３８、配列番号１３９または配列番号１４０と比べて例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上または１００以上の連続アミノ酸が置換、欠失または付加された天然には存在しない再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する。
【０１３７】
別の実施形態では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、外因性ＯＲＬ１、外因性ＤＯＲ、外因性ＫＯＲ、外因性ＭＯＲまたはそれらの任意の組み合せを発現する。本実施形態の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、天然のＯＲＬ１，天然のＤＯＲ，天然のＫＯＲ，天然のＭＯＲまたはそれらの任意の組み合せを発現する。本実施形態のさらに別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、天然には存在しないＯＲＬ１、天然には存在しないＤＯＲ、天然には存在しないＫＯＲ、天然には存在しないＭＯＲまたはそれらの任意の組み合せを発現する。本実施形態の更に別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、天然のＯＲＬ１または天然には存在しないＯＲＬ１のいずれか、天然のＤＯＲまたは天然には存在しないＤＯＲのいずれか、天然のＫＯＲまたは天然には存在しないＫＯＲのずれか、天然のＭＯＲまたは天然には存在しないＭＯＲのいずれかまたはこれらの任意の組み合せを発現する。
【０１３８】
更に別の実施形態では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、外因性ガラニン受容体１、外因性ガラニン受容体２、外因性ガラニン受容体３またはそれらの任意の組み合せを発現する。本実施形態の態様において、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、天然のガラニン受容体１、天然のガラニン受容体２、天然のガラニン受容体３またはそれらの任意の組み合せを発現する。本実施形態のさらに別の態様では、樹立した胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、天然には存在しないガラニン受容体１、天然には存在しないガラニン受容体２、天然には存在しないガラニン受容体３またはそれらの任意の組み合せを発現する。本実施形態の更に別の態様では、樹立した細胞株由来の細胞は一過性にまたは安定的に操作され、天然のガラニン受容体１または天然には存在しないガラニン受容体１のいずれか、天然のガラニン受容体２または天然には存在しないガラニン受容体２のいずれか、天然のガラニン受容体３または天然には存在しないガラニン受容体３のずれかまたはこれらの組み合せを発現する。
【０１３９】
１つ以上の内因性または外因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する細胞は再標的化エンドペプチダーゼ取込の直接および間接アッセイを含む定められた方法により同定することができる。再標的化エンドペプチダーゼ結合または取込特性を測定するアッセイは細胞が再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現するかを評価するのに使用することができる。そのようなアッセイは、限定するものではなく、［１２５ｌ〕  ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ｓｅｅ，  ｅ．ｇ．、Ｎｏｒｉｋｏ  Ｙｏｋｏｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｙｐｅ  Ｃ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，  ５７（１）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２７２−２７７  （１９８９）；  Ｎｏｒｉｋｏ  Ｙｏｋｏｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｙｐｅ  Ｃｌ，  Ｄ  ａｎｄ  Ｅ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅｓ，  ２９（２）  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ２６１−２６４（１９９１）；  ａｎｄ  Ｔｅｉ−ｉｃｈｉ  Ｎｉｓｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｙｐｅ  Ｂ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅｓ、２６９（１４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １０４９８−１０５０３  （１９９４）などの標識再標的化エンドペプチダーゼを用いた架橋アッセイを含む。他の非限定的なアッセイは標識または非標識抗体を用いて再標的化エンドペプチダーゼ結合を検出する免疫細胞化学的アッセイを含み例えば、Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｙｐｅ  Ｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｔｏｘｉｎ  ｉｎｔｏ  ＨＴ−２９  ｃｅｌｌｓ、３１９（２）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３２７−３３３  （２００４）を参照し、さらには標識または非標識抗体を用いて結合再標的化エンドペプチダーゼを検出する免疫沈降アッセイを含み例えば、Ｙｕｋａｋｏ  Ｆｕｊｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｔｙｐｅ  Ｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｔｏｘｉｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ、１５０（Ｐｔ  ５）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２９−１５３８（２００４）を参照する。これらのアッセイに有用な抗体は、限定するものではなく、再標的化エンドペプチダーゼに対して選択された抗体および／または、例えば、ＯＲＬ１、ＤＯＲ、ＫＯＲ、ＭＯＲ、ガラニン受容体１、ガラニン受容体２またはガラニン受容体３などの再標的化エンドペプチダーゼ受容体に対して選択された抗体を含む。抗体が標識されている場合、分子の結合は当業者に周知の技術を用いてウェスタンブロット法、抗体の細胞内の位置を直接に顕微鏡下での観察、洗浄工程の後の細胞または基質結合抗体の測定、フローサイトメトリー、キャピラリー電気泳動などを含めた種々の方法で検出が可能である。抗体が非標識の場合、結合分子の間接的検出に標識二次抗体を用いてもよく、検出は標識抗体と同じように処理できる。再標的化エンドペプチダーゼ取込特性または特徴を測定するこれらと類似のアッセイは内因性または外因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体発現する細胞を同定するのに有用である可能性があることが理解される。
【０１４０】
さらに再標的化エンドペプチダーゼ処理後の分子の放出をモニターするアッセイは、細胞が１つ以上の内因性または外因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現するかを評価するのに用いることができる。これらのアッセイでは分子放出の阻害が再標的化エンドペプチダーゼ処理後に再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する細胞に起こる。周知のアッセイは［３Ｈ］ノルアドレナリンまたは、例えば、［３Ｈ］ドーパミン分泌などの神経細胞からの放射能標識化カテコールアミン放出の阻害を測定する方法を含む。例えば、Ａ  Ｆａｓｓｉｏ  ｅｔ  ａｌ．破傷風毒素およびボツリヌス毒素ｔｙｐｅ  Ｆに非感受性なカルシウム依存性小胞伝達物質放出の証拠９０（３）  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８９３−９０２（１９９９）およびＳａｒａ  Ｓｔｉｇｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．ボツリヌス毒素のＣ１及びＥに対するカテコールアミン遊離の感受性は容易に遊離可能なプール内への小胞セットの選択的標的化を示唆する８５（２）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ４０９−４２１（２００３）または蛍光法を用いてカテコールアミン放出を測定する。参照文献の例、Ａｎｔｏｎ  ｄｅ  Ｐａｉｖａ  ｅｔ  ａｌ．エクトアクセプタに結合し細胞内への伝達物質遊離を阻害する毒素誘導体により明らかにされるボツリヌス神経毒Ａの内在化における鎖間ジスルフィドまたはその関与するチオールの役割２６８（２８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０８３８−２０８４４（１９９３）、Ｇａｒｙ  Ｗ．  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．無処理および透過性クロム親和性細胞のボツリヌス毒素ＡまたはＢによる２５ｋＤａシナプトソーム会合蛋白質（ＳＮＡＰ‐２５）あるいはシナプトブレビン切断後の異なったエキソサイトーシス応答２３６（３）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ８７７−８８６  （１９９６）およびＰａｔｒｉｃｋ  Ｆｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．ボツリヌス神経毒Ｃ１は無傷ならびに透過性処理クロム親和性細胞においてシンタキシンとＳＮＡＰ‐２５を分解する、そのカテコールアミン放出妨害との関連３５（８）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６３０−２６３６（１９９６）。他の非限定的な例は垂体前葉細胞または卵巣細胞などの内分泌細胞からのホルモン放出の阻害を計測するアッセイを含む。分子の放出のこれらと類似のアッセイは内因性、外因性あるいは再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する細胞を同定するのに有用である可能性があることが理解される。
【０１４１】
さらに再標的化エンドペプチダーゼ曝露後のＳＮＡＰ−２５基質の切断を検出するアッセイは細胞が１つ以上の内因性または外因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現するかを評価するのに用いることができる。このアッセイにおいてはＳＮＡＰ−２５基質切断産物の生成または無処理ＳＮＡＰ−２５の消失は再標的化エンドペプチダーゼ処理後の再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する細胞内で検出できる。ウェスタンブロット法ならびに十分に特性が明らかな試薬、条件およびプロトコールの非限定的な例は、限定するものではなく、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ；  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ；  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ；  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ、ａｎｄ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ  ＪｏＩＩａ、ＣＡなどの業者から容易に利用可能である。ＳＮＡＰ−２５基質切断におけるこれらおよび類似のアッセイは内因性または外因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する細胞を同定するのに有用となる可能性があることが理解される。
【０１４２】
非限定的な例としてＳＮＡＰ−２５−切断産物またはＳＮＡＰ−２５の切断型と非切断型の両方を認識する抗体を用いたウェスタンブロット法は再標的化エンドペプチダーゼ取込のアッセイに使用できる可能性がある。これらのアッセイに有用なα−ＳＮＡＰ−２５抗体の例は、限定するものではなく、ＳＭＩ−８１  α−ＳＮＡＰ−２５  マウスモノクローナル抗体  （Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、Ｃｌ  ７１．１  ｍｏｕｓｅ  α−ＳＮＡＰ−２５  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｃｌ  ７１．２  α−ＳＮＡＰ−２５  マウスモノクローナル抗体  （Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＳＰ１２  α−ＳＮＡＰ−２５  マウスモノクローナル抗体  （Ａｂｅａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、α−ＳＮＡＰ−２５  ウサギポリクローナル抗血清  （Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、α−ＳＮＡＰ−２５  ウサギポリクローナル抗血清  Ｓ９６８４  （Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびα−ＳＮＡＰ−２５  ウサギポリクローナル抗血清  （Ａｂｅａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を含む。
【０１４３】
開示の態様は外因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つ以上の外因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する遺伝子操作または組換え技術により作製される細胞を提示する。遺伝子操作または組換え技術により作製される外因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つ以上の外因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体の発現に有用な細胞は外因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つ以上の外因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する場合も、発現しない場合もある神経細胞および非神経細胞を含む。そのような遺伝子操作と組換えられた細胞は構成的、組織特異的、細胞特異的、誘導プロモータエレメント、エンハンサーエレメントまたは両方の制御下で外因性ＳＮＡＰ−２５および１つ以上の外因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現するかもしれないとがさらに理解される。外因性ＳＮＡＰ−２５および／または１つ以上の外因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現するよう細胞が遺伝子操作され、かつ、組換えられ再標的化エンドペプチダーゼ活性となりえる可能性がある限り細胞は有用であることが理解される。
【０１４４】
再標的化エンドペプチダーゼが、例えば、ＳＮＡＰ−２５、ＯＲＬ１、ＤＯＲ、ＫＯＲまたはＭＯＲなどのＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし、全体的細胞性機構を行う細胞に必要な成分をコード化する外因性ポリヌクレオチド分子を細胞に導入するのに有用な方法は、限定するものではなく、リン酸カルシウム媒介、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）‐デキストラン媒介、脂質媒介、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）‐媒介、ポリリジン媒介およびポリブレン媒介などの化学物質媒介送達法、さらにバイオリスティック粒子送達法、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポレーションなどの物理的媒介送達法およびレトロウイルス媒介トランスフェクションなどのウイルス媒介送達法を含む。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、ｐｐ．  １６．１−１６．６２  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、ｅｄｓ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｏｌ．  ３、３ｒｄ  ｅｄ．  ２００１  ）；  Ａｌｅｓｓｉａ  Ｃｏｌｏｓｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、２９（２）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１４−３１８、３２０−３２２、３２４  （２０００）；  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｗａｓｈｂｏｕｒｎｅ  ＆  Ａ．  Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ  ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｎｅｕｒｏｎｓ、１２（５）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ５６６−５７３  （２００２）；  ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ｐｐ  ９．１６．４−９．１６．１１  （２０００）を参照のこと。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。ポリヌクレオチド分子を細胞に導入する特定の方法の選択は再標的化エンドペプチダーゼがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし、全般的な細胞機構を行う細胞に必要な少なくとも１つの成分を一過性にまたは安定的に含む細胞かどうかに一部依存することは当業者は理解できる。再標的化エンドペプチダーゼがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし全体的細胞性機構を行う細胞に必要な成分をコード化するポリヌクレオチド分子の非限定的な例は、配列番号６１または配列番号６２のＯＲＬ１ポリヌクレオチド分子、配列番号６３または配列番号６４のＤＯＲポリヌクレオチド分子、配列番号６５または配列番号６６のＫＯＲポリヌクレオチド分子、配列番号６７のＭＯＲポリヌクレオチド分子、配列番号１４１、配列番号１４２または配列番号１４３のガラニン受容体１ポリヌクレオチド分子、配列番号１４４のガラニン受容体２ポリヌクレオチド分子、配列番号１４５のガラニン受容体３ポリヌクレオチド分子および配列番号６８または配列番号６９のＳＮＡＰ−２５ポリヌクレオチド分子である。
【０１４５】
化学物質媒介送達法は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊｏｒｄａｎ  ＆  Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｗｏｒｍ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｈｅｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３６−１４３  （２００４）；  Ｃｈｕｎ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  Ｂｒａｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ、３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４４−１５０  （２００４）に記載されており、当業者に周知である。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。そのような化学物質媒介送達法は標準的な手順で調製することができ、かつ、市販されている。例えば、ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）；  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  ＤＥＡＥ  Ｄｅｘｔｒａｎ、（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ  ＪｏＩＩａ、ＣＡ）；  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；  ＥｘＧｅｎ  ５００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｉｎｃ．、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＭＤ）およびＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を参照のこと。
【０１４６】
物理的媒介送達法は、例えば、Ｊｅｉｋｅ  Ｅ．  Ｂｉｅｗｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｓｍｉｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、７１  （１）  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ６７−７５（１９９７）；  Ｊｏｈｎ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＆  Ｓａｒａｈ  Ｃ．  Ｒ．  Ｌｕｍｍｉｓ、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｄｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ：  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ  ｔｏ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  Ｄｙｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２１−１２５  （２００４）；  Ｍ．  Ｇｏｌｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｉｅｌｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２６−１３５  （２００４）；およびＯｌｉｖｅｒ  Ｇｒｅｓｃｈｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｗ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ、３３（２）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５１−１６３  （２００４）に記載されており、当業者に周知である。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４７】
ウイルス媒介送達法は、例えば、Ｃｈｏｏｉ  Ｍ．  Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ａｄｅ  ｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、２１（１２）  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ８９５−９１３  （２００２）；  ｌｌｙａ  Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、９３（２１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  １１３７１−１１３７７  （１９９６）；  Ｒｏｌａｎｄ  Ｗｏｌｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、２４６  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ３９１−４１１  （２００４）；  Ａ．  Ｈｕｓｅｒ  ＆  Ｃ．  Ｈｏｆｍａｎｎ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ｎｏｖｅｌ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅ−Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、３（１  ）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５３−６３  （２００３）；  Ｔｉｚｉａｎａ  Ｔｏｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−  ａｎｄ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、２８５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  １４１−１４８  （２００４）；  Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｇｏｓｓｅｎ  ＆  Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｂｕｊａｒｄ、Ｔｉｇｈｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ（米国特許第５，４６４，７５８号）；  Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｂｕｊａｒｄ  ＆  Ｍａｎｆｒｅｄ  Ｇｏｓｓｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（米国特許第５，８１４，６１８号）；  Ｄａｖｉｄ  Ｓ．  Ｈｏｇｎｅｓｓ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｓａｍｅ（米国特許第５，５１４，５７８号）；  Ｄａｖｉｄ  Ｓ．  Ｈｏｇｎｅｓｓ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｅｃｄｙｓｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（米国特許第６，２４５，５３１号）；  Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ  Ｖｅｇｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｃ．  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ（米国特許第５，３６４，７９１号）；  Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ  Ｖｅｇｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｕｔａｔｅｄ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（米国特許第５，８７４，５３４号）に記載され��おり、当業者に周知である。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。そのようなウイルス媒介送達法は標準的な手順で調製することができ市販されている。例えば、ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（登録商標）  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）  ａｎｄ  ＶＩＲＡＰＯＷＥＲＴＭ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ２５−０５４３  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、（Ｊｕｌ．  １５、２００２）；およびＡＤＥＡＳＹ（登録商標）  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．、Ｌａ  ＪｏＩＩａ、ＣＡ）  ａｎｄ  ＡＤＥＡＳＹＴＭ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ０６４００４ｆ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．を参照のこと。さらにそのようなウイルス送達システムは標準的な手順で調製することができ、かつ、市販されている。例えば、ＢＤ（商標）  Ｔｅｔ−Ｏｆｆ  ａｎｄ  Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）  ａｎｄ  ＢＤ（商標）  Ｔｅｔ−Ｏｆｆ  ａｎｄ  Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ、ＰＴ３００１−１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、（Ｍａｒ．  １４、２００３）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（商標）  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）  ａｎｄ  ＧＥＮＥＳＷＩＴＣＨ（商標）  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａ  Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｄ、２５−０３１３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、（Ｎｏｖ．  ４、２００２）；  ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）  ａｎｄ  ＶＩＲＡＰＯＷＥＲ（商標）  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ２５−０５０１  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、（Ｄｅｃ．  ８、２００３）；およびＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  ＪｏＩＩａ、ＣＡ）およびＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ（登録商標）  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ、０６４００５ｅである。
【０１４８】
従って、一実施形態では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし全体的細胞性機構を行う細胞に必要な成分をコード化するポリヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞は、再標的化エンドペプチダーゼがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし全体的細胞性機構を行う細胞に必要な複数の成分をコード化するポリヌクレオチド分子を含む。本実施形態の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＯＲＬ１、ＤＯＲ、ＫＯＲ、ＭＯＲまたはＳＮＡＰ−２５をコード化するポリヌクレオチド分子を含む。本実施形態の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＯＲＬ１をコード化する配列番号６１または配列番号６２のポリヌクレオチド分子を含む。本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＤＯＲをコード化する配列番号６３または配列番号６４のポリヌクレオチド分子を含む。本実施形態のさらに別の態様では、標的エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＫＯＲをコード化する配列番号６５または配列番号６６のポリヌクレオチド分子を含む。本実施形態の更に別の態様では、標的エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＭＯＲをコード化する配列番号６７のポリヌクレオチド分子を含む。
【０１４９】
本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はガラニン受容体１をコード化する配列番号１４１、配列番号１４２または配列番号１４３のポリヌクレオチド分子を含む。本実施形態のさらに別の態様では、標的エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はガラニン受容体２をコード化する配列番号１４４のポリヌクレオチド分子を含む。本実施形態の更に別の態様では、標的エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞は、ガラニン受容体３をコード化する配列番号１４５のポリヌクレオチド分子を含む。本実施形態の更に態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＳＮＡＰ−２５をコード化する配列番号６８または配列番号６９のポリヌクレオチド分子を含む。
【０１５０】
別の実施形態では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞は、再標的化エンドペプチダーゼがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし全体的細胞性機構を行う細胞に必要な成分をコード化するポリヌクレオチド分子を安定的に含む。別の実施形態では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞は、再標的化エンドペプチダーゼがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし全体的細胞性機構を行う細胞に必要な複数の成分をコード化するポリヌクレオチド分子を安定的に含む。本実施形態の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＯＲＬ１、ＤＯＲ、ＫＯＲ、ＭＯＲまたはＳＮＡＰ−２５をコード化するポリヌクレオチド分子を安定的に含む。本実施形態の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＯＲＬ１をコード化する配列番号６１または配列番号６２のポリヌクレオチド分子を安定的に含む。本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＤＯＲをコード化する配列番号６３または配列番号６４のポリヌクレオチド分子を安定的に含む。本実施形態のさらに別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＫＯＲをコード化する配列番号６５または配列番号６６のポリヌクレオチド分子を安定的に含む。本実施形態のさらに別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＭＯＲをコード化する配列番号６７のポリヌクレオチド分子を安定的に含む。
【０１５１】
本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はガラニン受容体１をコード化する配列番号１４１、配列番号１４２または配列番号１４３のポリヌクレオチド分子を安定的に含む。本実施形態のさらに別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はガラニン受容体２をコード化する配列番号１４４のポリヌクレオチド分子を安定的に含む。本実施形態のさらに別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はガラニン受容体３をコード化する配列番号１４５のポリヌクレオチド分子を安定的に含む。本実施形態の更に別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である樹立した細胞株由来の細胞はＳＮＡＰ−２５をコード化する配列番号６８または配列番号６９のポリヌクレオチド分子を安定的に含む。
【０１５２】
上記のように、本明細書に記載されているＳＮＡＰ−２５、ＯＲＬ１、ＤＯＲ、ＫＯＲ、ＭＯＲ、ガラニン受容体１、ガラニン受容体２またはガラニン受容体３などの再標的化エンドペプチダーゼがＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし全般的な細胞機構を行う細胞に必要な外因性成分を細胞に導入することができる。細胞集団へ送達させる送達剤を有している全てのそのような外因性成分の導入に有用な方法は、方法が所与の細胞集団内の少なくとも５０％の細胞に本明細書に記載した外因性成分を一過性に導入する条件下では有用であることができる。従って本実施形態の態様は、再標的化エンドペプチダーゼが本明細書に記載されているＳＮＡＰ−２５、ＯＲｌ１、ＤＯＲ、ＫＯＲ、ＭＯＲ、ガラニン受容体１、ガラニン受容体２またはガラニン受容体３などのＳＮＡＰ−２５基質の蛋白質分解を起こし、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の所与の細胞集団は全般的な細胞機構を行う細胞に必要な外因性成分を含む細胞集団を含むことができる。本明細書で使用されるとき、用語「送達剤」は共有結合、非共有結合する剤または他の方法においてポリペプチドの細胞への導入に関連する剤の内在化を可能にして高める分子を言う。従って用語「送達剤」は、限定するものではなく、蛋白質、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、ポリヌクレオチド分子、リポソーム、脂質、ウイルス、レトロウイルスであり、かつ、限定するものではないが、細胞膜、細胞質または核に共有結合または非共有結合した分子を輸送する細胞を含む。用語「送達剤」は、その機能が受容体媒介エンドサイトーシスを介し、かつ、受容体媒介エンドサイトーシスとは独立している送達剤を含む機構により取り込まれる分子を含むことがさらに理解される。
【０１５３】
さらに送達剤は、例えば、化学結合または一般的に産生された融合蛋白質を用いてＳＮＡＰ−２５、ＯＲＬ１、ＤＯＲ、ＫＯＲ、ＭＯＲ、ガラニン受容体１、ガラニン受容体２またはガラニン受容体３などの共有結合成分の細胞組込みを可能にし、高める薬剤であってもよい。送達剤と共有結合させる方法およびそのような薬剤を用いる方法は、例えば、Ｓｔｅｖｅｎ  Ｆ．  Ｄｏｗｄｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ  ＷＯ  ００／３４３０８；  Ｇｅｒａｒｄ  Ｃｈａｓｓａｉｎｇ  ＆  Ａｌａｉｎ  Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ｃａｎ  ｂｅ  Ｕｓｅｄ  ａｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（米国特許第６，０８０，７２４号）；  Ａｌａｎ  Ｆｒａｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ＴＡＴ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｍｏｉｅｒｔ（米国特許第５，６７４，９８０号）；  Ａｌａｎ  Ｆｒａｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ＴＡＴ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（米国特許第５，７４７，６４１号）；  Ａｌａｎ  Ｆｒａｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ＴＡＴ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（米国特許第５，８０４，６０４号）；  Ｐｅｔｅｒ  Ｆ．  Ｊ．  Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（米国特許第６，７３４，１６７号）；  Ｙａｏ−Ｚｈｏｎｇ  Ｌｉｎ  ＆  Ｊａｃｋ  Ｊ．  Ｈａｗｉｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｏｒｔｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許第５，８０７，７４６号）；  Ｙａｏ−Ｚｈｏｎｇ  Ｌｉｎ  ＆  Ｊａｃｋ  Ｊ．  Ｈａｗｉｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｏｒｔｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許第６，０４３，３３９号）；  Ｙａｏ−Ｚｈｏｎｇ  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（米国特許第６，２４８，５５８号）；  Ｙａｏ−Ｚｈｏｎｇ  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（米国特許第６，４３２，６８０号）；  Ｊａｃｋ  Ｊ．  Ｈａｗｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｏｒｔｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｃｅｌｌｓ（米国特許第６，４９５，５１８号）；  Ｙａｏ−Ｚｈｏｎｇ  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（米国特許第６，７８０，８４３号）；  Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｂ．  Ｒｏｔｈｂａｒｄ  ＆  Ｐａｕｌ  Ａ  Ｗｅｎｄｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ａｃｒｏｓｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（米国特許第６，３０６，９９３号）；  Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｂ．  Ｒｏｔｈｂａｒｄ  ＆  Ｐａｕｌ  Ａ  Ｗｅｎｄｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ａｃｒｏｓｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（米国特許第６，４９５，６６３号）；およびＰａｍｅｌａ  Ｂ．  Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（米国特許第６，２８７，８１７号）に記載されている。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
さらに送達剤はＳＮＡＰ−２５、ＯＲＬ１、ＤＯＲ、ＫＯＲ、ＭＯＲ、ガラニン受容体１、ガラニン受容体２またはガラニン受容体３などの非共有結合と関連する成分の細胞取込を可能にして高める薬剤でありることができる。共有結合の不存在下において機能する方法およびそのような薬剤を使用する方法は、例えば、Ｇｉｌｌｅｓ  Ｄｉｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ（米国特許第６，８４１  ，５３５号）；  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｌ  Ｆｅｉｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｉｅｒ  Ｚｅｌｐｈａｔｉ、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ（米国特許出願公開第２００３／０００８８１３号）；およびＭｉｃｈａｅｌ  Ｋａｒａｓ、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（米国特許出願公開第２００４／０２０９７９７号）に記載されている。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。そのようなペプチド送達剤は標準的な手順で調製することができ、かつ、市販されている。例えば、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；  ＢＩＯ−ＰＯＲＴＥＲ（登録商標）  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＢＩＯ  ＴＲＥＫ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  ＪｏＩＩａ、ＣＡ）およびＰＲＯ−ＪＥＣＴ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）である。
【０１５５】
開示の態様は再標的化エンドペプチダーゼ受容体含む試料を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「再標的化エンドペプチダーゼ受容体含む試料」は活性再標的化エンドペプチダーゼを含むかまたは潜在的に含む生体物質を言う。本明細書に開示した方法に従い、限定するものではなく、精製された、部分精製されたまたは未精製の再標的化エンドペプチダーゼ、天然のまたは天然には存在しない配列を有する組み換え１本または２本鎖再標的化エンドペプチダーゼ、修飾プロテアーゼ特異性を有する組み換え再標的化エンドペプチダーゼ、変化した細胞特異性を有する組み換え再標的化エンドペプチダーゼ、バルク再標的化エンドペプチダーゼ、製剤再標的化エンドペプチダーゼ製品、供給源がバクテリア、酵母菌、昆虫または哺乳動物からである細胞または粗製、分画した、あるいは部分精製した細胞溶解物、血液、血漿または血清、生の部分的に調理した、調理したまたは加工食品、飲料、動物のエサ、土壌試料、水試料、池の堆積物、ローション、化粧品および臨床製剤を含ま含んだ様々な試料をアッセイすることができる。試料という用語は組織試料、限定するものではなく、哺乳動物の組織試料、ヒツジ、ウシ、ブタの組織細胞を含む家畜組織試料およびヒト組織試料を含むことが理解される。そのような試料は、限定するものではなく、幼児腸内試料などの腸内試料および創傷の細胞試料を含む。非限定的な例として再標的化エンドペプチダーゼを投与されたかまたはボツリヌス中毒の１つ以上の症状を有するヒトまたは動物由来の試料のアッセイをする、バルク再標的化エンドペプチダーゼの産生および精製中の活性に従う、医薬または化粧品の用途での製剤再標的化エンドペプチダーゼ製品をアッセイする、α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体の中和の存在または非存在について被験体の血清のアッセイをするなど、再標的化エンドペプチダーゼ活性のピコモル量を検出する方法は再標的化エンドペプチダーゼの存在または活性を測定するのに有用であることができる。
【０１５６】
従って、一実施形態では、再標的化エンドペプチダーゼを含む試料はいずれかの大きさの再標的化エンドペプチダーゼを含む試料である。本実施形態の態様では、再標的化エンドペプチダーゼを含む試料は約１００ｎｇ以下、約１０ｎｇ以下、約１ｎｇ以下、約１００ｐｇ以下、約１０ｐｇ以下または約１ｐｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼを含む。本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼを含む試料は約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼを含む。
【０１５７】
開示の態様はＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５を含むＳＮＡＰ−２５成分から処理した細胞を単離する、を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５を含むＳＮＡＰ−２５成分」はＳＮＡＰ−２５切断産物を含む細胞成分を言う。ＳＮＡＰ−２５成分を富化するまたは単離するのに好適な方法は、限定するものではなく、細胞溶解プロトコール、スピンカラム精製プロトコール、免疫沈降、アフィニティ精製および蛋白質クロマトグラフィを含め有用であることができるように構成されたものである。
【０１５８】
開示の態様は固相支持体に結合したα−ＳＮＡＰ−２５抗体を一部含む。本明細書で使用されるとき、用語「固相支持体」は、「固相」と同意語とみなし本明細書に開示したα−ＳＮＡＰ−２５抗体を固定化するのに使用することができるマトリックスを言う。固相支持体の非限定的な例は試験管内、プレート、カラム、ピン、「試験紙」、アガロース、セファロース、シリカおよびプラスチックなどの磁性粒子、ビーズまたは他の球体あるいは繊維性クロマトグラフィ充填剤、ならびにニトロセルロースおよびポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）などのシートまたは膜を含む。固相支持体はガラス、カーボン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、ジアゾセルロースまたはでんぷんなどの多種多様の材料を用いて構築することができる。選択された固相支持体は溶解性または非結合材料から容易に分離することができ、かつ、一般的に過剰の試薬、反応副産物または溶媒などの非結合材料を固相支持体―結合アッセイ成分から（洗浄、濾過、遠心分離などにより）分離させるかまたは除去させることができる物性を持つことができる。固相支持体の生成および使用方法の非限定的な例はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｓｕｐｒａ，  （２００１  ）；および  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｓｕｐｒａ，  （２００４）に記載されている。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
開示の態様はＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出することを一部含む。シグナル対ノイズ比が抗体−抗原複合体のシグナルをバックグランドシグナルから統計学的に有意な程度で識別できる条件下で、検出システムは本開示免疫を利用した方法を実施に使用するように構成されたものである。開示免疫を利用した方法の非限定的な例はウェスタンブロット法およびドットブロッティング法、免疫沈降分析、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびサンドイッチＥＬＩＳＡなどのイムノブロット分析を含む。シグナルの検出は画像およびりん画像診断を用いたオートラジオグラフィー（ＡＵ）、化学ルミネセンス（ＣＬ）、電気化学ルミネセンス（ＥＣＬ）、バイオルミネセンス（ＢＬ）、を蛍光、共鳴エネルギー移動、面内偏光、比色またはフローサイトメトリー（ＦＣ）を用いて達成することができる。免疫を利用した検出システムの記載はＭｉｃｈａｅｌ  Ｍ．Ｒａｕｈｕｔ，  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，  Ｉｎ  Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｅｄ．  Ｇｒａｙｓｏｎ，  ３ｒｄ  ｅｄ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９８５）；  Ａ．  Ｗ．  Ｋｎｉｇｈｔ，  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  １８（１  ）：  ４７−６２  （１９９９）；  Ｋ．  Ａ．  Ｆａｈｎｒｉｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｔａｌａｎｔａ  ５４（４）：  ５３１−５５９  （２００１  ）；  Ｃｏｍｍｏｎｌｙ  Ｕｓｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｐｐ．  Ａ８．１−Ａ８−５５  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｖｏｌ．  ３，  ３ｒｄ  ｅｄ．  ２００１  ）；  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ｐｐ．  Ａ９．１−Ａ９−４９  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｖｏｌ．  ３，  ３ｒｄ  ｅｄ．  ２００１  ）；  Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，  （Ｅｄ．  Ａｌｌｅｎ  Ｊ．  Ｂａｒｄ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  ２００４）に開示されている。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
サンドイッチＥＬＩＳＡ（またはサンドイッチイムノアッセイ）は、抗原の異なるエピトープに結合した２つの抗体に基づく方法である。目的の抗原の高い特異性を有する捕捉抗体は固体表面に結合している。次に抗原を添加し、検出抗体で参照した第二の抗体を添加する。検出抗体は抗原を捕捉抗体と異なるエピトープに結合する。従って抗原は２つの抗体の間に「サンドイッチされた」状態になる。通常は、抗原に対する抗体結合親和性はイムノアッセイ感度の決定要因である。抗原の濃度が上昇するに従い、検出抗体の量が上昇して測定した応答がより大きくなる。第二の抗体に結合した酵素および酵素反応が検出シグナルとして読み取りを形成するリポーター基質などの異なるレポーターシステムの結合程度の定量化を使用することができる。発信するシグナルは試料中に存在する標的抗原の量に比例する。結合事象を測定するリポーター基質が検出モードを決定する。分光光度計プレート読み出し器は比色検出に使用される。シグナルをより増幅させ、かつ、蛍光読み出し器で読める化学ルミネセンスおよび電気化学ルミネセンスが作成されてきた。さらにリポーターはアッセイの酵素工程がフルオロフォアで代替されている読み出しであってもよく、さらに読み出しは蛍光読み出し器を用いて計測される。ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを実施するのに必要な試薬およびプロトコールは、限定するものではなく、ＭＳＤ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ−ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  （Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）から市販されている。
【０１６１】
従って、一実施形態では、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出することは、イムノブロット分析、免疫沈降分析、ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて実施することができる。本実施形態の態様では、検出はＡＵ、ＣＬ、ＥＣＬあるいはＢＬイムノブロット分析、、ＡＵ、ＣＬ、ＥＣＬ、ＢＬあるいはＦＣ  免疫沈降分析、ＡＵ、ＣＬ、ＥＣＬ、ＢＬあるいはＦＣ  ＥＬＩＳＡまたはＡＵ、ＣＬ、ＥＣＬ、ＢＬあるいはＦＣサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて実施する。
【０１６２】
本開示の態様は一重（singleplex）または多重(multiplex)の方法で実施することができる。一重の方法で実施する再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する免疫を利用した方法はα−ＳＮＡＰ−２５およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するα−ＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出するのみの方法である。多重の方法で実施する再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する免疫を利用した方法は２以上の抗体−抗原複合体の存在を同時に検出する方法であり、その１つはα−ＳＮＡＰ−２５およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するα−ＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体であり、他は第２、第３、第４などの異なる蛋白質に結合する抗体−抗原複合体である。例えば、検出したα−ＳＮＡＰ−２５／ＳＮＡＰ−２５抗体−抗原複合体の量を第二の蛋白質用に検出した抗体−抗原複合体の量に正規化することで第二の蛋白質を試料間のバラツキを最小にする内部標準となどに使用することができる。そのために通常、第二の蛋白質はハウスキーピング蛋白質などの細胞により一貫して発現される蛋白質である。有用な第二の蛋白質の非限定的な例は、例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、シンタキシン、サイトカインを含む。多重の方法で免疫を利用したアッセイを実施する方法はＵ．  Ｂ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｈ．  Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ，  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ａｓｓａｙｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆｏｒｍａｔ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２９０（１−２）：  １０７−１２０  ２００４）；  Ｒ．  Ｂａｒｒｙ  ａｎｄ  Ｍ，  Ｓｏｌｏｖｉｅｖ，  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙｓ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ４（１２）：  ３７１７−３７２６  （２００４）；  Ｍ．  Ｍ．  Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  ＭｏＩ  Ｄｉａｇｎ．  ７（１  ）：  ８７−９８  （２００７）；  Ｓ．  Ｘ．  Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｊ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ  Ａ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．  ６３（８）：  ８７９−８８４  （２００８）に記載されている。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
従って、一実施形態では、α−ＳＮＡＰ２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出することだけで、一重の方法で実施する再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する免疫を利用した方法である。別の実施形態では、α−ＳＮＡＰ２５抗体およびＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物、ならびに例えば、ＧＡＰＤＨあるいはシンタキシンなどのＳＮＡＰ−２５以外の蛋白質に結合する少なくとも１つの他の抗体−抗原複合体を含む抗体−抗原複合体の存在を同時に検出することで、多重の方法で実施する再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する免疫を利用した方法である。
【０１６４】
開示の態様は再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗性を測定する方法を一部で提示する。本明細書で使用されるとき、用語「再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗性」は哺乳動物の免疫反応が治療の有効性を直接的または間接的に低減させることにより再標的化エンドペプチダーゼ治療に完全に反応しないかまたは、再標的化エンドペプチダーゼ治療の有効性が低減した哺乳動物を意味する。有効性を低減させる非限定的な例は、再標的化エンドペプチダーゼの特異性または活性を低減または妨げるように再標的化エンドペプチダーゼに結合する哺乳動物における少なくとも１つの中和α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体の存在である。本明細書で使用されるとき、用語「再標的化エンドペプチダーゼ治療」は哺乳動物に再標的化エンドペプチダーゼを用いて、あるいは医薬、臨床、治癒、美容、治療、その他の有効作用がある再標的化エンドペプチダーゼの薬、製剤または混合物の統制した服用量を複数投与することで処置、治療、施療、ヒーリング、リハビリテーションまたは神経調節を必要とする哺乳動物において好ましくないものを打ち消すなどの他の手段を意味する。再標的化エンドペプチダーゼ治療は、限定するものではなく、いかなる製剤であれキャリアまたは有効成分と混合し、かつ、任意の経路により投与された天然のまたはそれらの修飾断片の使用を含む。
【０１６５】
開示の態様は再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の有無につて試験をした哺乳動物から取得した試験試料を一部提示する。本明細書で使用されるとき、用語「試験試料」は少なくとも１つのα−再標的化エンドペプチダーゼを含むかまたは潜在的に含む生体物質を言う。α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体は中和α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体または非中和α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体であることができる。本明細書で使用されるとき、用語「中和α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体」は生理学的条件下で、再標的化エンドペプチダーゼ治療において再標的化エンドペプチダーゼの効果の発揮を低減または防止しするように再標的化エンドペプチダーゼの領域に結合する任意の中和α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体を意味する。本明細書で使用されるとき、用語「非中和α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体」は生理学的条件下で、再標的化エンドペプチダーゼ治療において再標的化エンドペプチダーゼの効果の発揮を防止しないように再標的化エンドペプチダーゼの領域に結合する任意の中和α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体を意味する。α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体を含んでもよいすべての試料は、限定するものではなく、血液、血漿、血清およびリンパ液を含めた方法で使用することができるように構成されたものである。加えて、再標的化エンドペプチダーゼに対してα−再標的化エンドペプチダーゼ抗体を作ることができるすべての生物は、限定するものではなく、トリ、さらにはマウス、ヒツジ、ロバ、ウシ、霊長類およびヒトを含めた哺乳動物を含んだ試料の源となることができる。血液回収および血清調製物の特異的プロトコールの非限定的な例はＭａｒｊｏｒｉｅ  Ｓｃｈａｕｂ  Ｄｉ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  ＆  Ｓｕｓａｎ  Ｋｉｎｇ  Ｓｔｒａｓｉｎｇｅｒ，  ＢＬＯＯＤ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＩＮ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ  （Ｆ．Ａ．  Ｄａｖｉｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ２００１）；  ａｎｄ  Ｄｉａｎａ  Ｇａｒｚａ  ＆  Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ｂｅｃａｎ−ＭｃＢｒｉｄｅ，  ＰＨＬＥＢＯＴＯＭＹ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ：  ＢＬＯＯＤ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬＳ  （Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，  ６ｔｈ  ｅｄ．，  ２００２）に記載されている。これらのプロトコールは当業者と本明細書中の教示の範囲内である慣用の手順である。試験試料は再標的化エンドペプチダーゼを投与する前、再標的化エンドペプチダーゼを単回投与後、再標的化エンドペプチダーゼを複数回投与後、再標的化エンドペプチダーゼ治療に対して耐性が出る前または再標的化エンドペプチダーゼ治療に対して耐性が出た後に生物から得ることができる。
【０１６６】
開示の態様は標準試料を一部提示する。本明細書で使用されるとき、用語「標準試料」は試験試料の有無が周知であり陰性対照試料と陽性対照試料の両方を含む任意の試料を意味する。中和α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体に関して、陰性対照試料は再標的化エンドペプチダーを一度も投与されたことがない個体から取得することができ、かつ、限定するものではなく、再標的化エンドペプチダーゼ療法能の実施前であれば試験試料を提供している同一の個体からの試料、再標的化エンドペプチダーを一度も投与されたことがない異なる個体からの試料、ＢｏＮＴ／Ａを一度も投与されたことがない複数の異なる個体からのプール試料を含んでもよい。中和α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体に関して、陽性対照試料は再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗性を呈する個体から取得することができ、かつ、限定するものではなく、患者に基づく試験アッセイで陽性であった個体、インビボバイオアッセイで陽性であった個体、ならびに再標的化エンドペプチダーゼをワクチン接種された個体などの過剰免疫を呈する個体を含める。
【０１６７】
さらにα−再標的化エンドペプチダーゼ抗体は試料から精製が可能であることが見通されます。限定するものではなく、蛋白質Ａ／Ｇクロマトグラフィおよびアフィニティクロマトグラフィを含む種々の手順を用いてα−再標的化エンドペプチダーゼ抗体は試料から精製するこができる。試料から抗体を精製する特異なプロトコールの非限定的な例はＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  （Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  １９９８）；  ＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ：  ＰＯＲＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＯＣＯＬ  ＮＯ．  Ｉ  （Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９８）；  ａｎｄ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ｓｕｐｒａ，  （２００１）に記載されている。全内容が参照により本明細書に組み込まれる。加えて、抗体精製方法ならびに十分に特性が明らかな試薬、条件、プロトコールの非限定的な例は、限定するものではなく、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ；  ａｎｄ  Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡを含んだ販売業者から入手できる。これらのプロトコールは当業者が理解できる範囲内の慣用の手順である。
【０１６８】
従って、一実施形態では、試料は血液を含む。本実施形態の態様では、試料はマウスの血液、ラットの血液、ヤギの血液、ヒツジの血液、ウマの血液、ロバの血液、霊長類の血液またはヒトの血液を含む。別の実施形態では、試料は血漿を含む。本実施形態の一態様では、試験試料はマウスの血漿、ラットの血漿、ヤギの血漿、ヒツジの血漿、ウマの血漿、ロバの血漿、ウシの血漿、霊長類の血漿またはヒトの血漿を含む。別の実施形態では、試料は血清を含む。本実施形態の一態様では、試験試料はマウスの血清、ラットの血清、ヤギの血清、ヒツジの血清、ウマの血清、ロバの血清、ウシの血清、霊長類の血清またはヒトの血清を含む。別の実施形態では、試料はリンパ液を含む。本実施形態の一態様では、試験試料はマウスのリンパ液、ラットのリンパ液、ヤギのリンパ液、ヒツジのリンパ液、ウマの血清、ロバのリンパ液、ウシのリンパ液、霊長類のリンパ液またはヒトのリンパ液を含む。更に別の実施形態では、試料は試験試料である。更に別の実施形態では、試料は標準試料である。本実施形態の態様では、標準試料は陰性対照試料または陽性対照試料である。
【０１６９】
開示の態様は工程（ｄ）で検出したＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５の量と工程（ｅ）で検出したＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５の量を比較することを一部提示する。一実施形態では、試験試料中のＳＮＡＰ−２５切断産物の量は標準試料中のＳＮＡＰ−２５切断産物の量と比べて大きい。本実施形態の態様では、陽性対照試料とくらべて多量の標準試料中のＳＮＡＰ−２５切断産物は哺乳動物における再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗性の低減または欠如を示す。本実施形態の別の態様では、陰性対照試料と比べて試験試料中の等量のＳＮＡＰ−２５切断産物は哺乳動物における再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗性の低減または欠如を示す。別の実施形態では、試験試料中のＳＮＡＰ−２５切断産物の量は標準試料中のＳＮＡＰ−２５切断産物の量と比べて少量である。本実施形態の態様では、陽性対照試料と比べて試験試料中の少量または等量のＳＮＡＰ−２５切断産物は哺乳動物における再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗性の増大または存在を示す。本実施形態の別の態様では、陰性対照試料と比べた試験試料中の少量のＳＮＡＰ−２５切断産物は哺乳動物における再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗性の増大または存在を示す。
【０１７０】
直線的および非直線的アッセイ条件などの試料中の中和α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体の存在を検出するのに好適な全てのアッセイ条件は、本明細書に開示した方法において有用であるように構成されたものである。一実施形態では、アッセイ条件は直線的である。本実施形態の態様では、再標的化エンドペプチダーゼのアッセイ量は超過である。本実施形態の別の態様では、再標的化エンドペプチダーゼのアッセイ量は律速である。本実施形態の別の態様では、試験試料のアッセイ量は律速である。
【０１７１】
本開示の態様は以下のように記載することができる。
１．以下を含む、再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する方法：ａ）樹立した細胞株由来の細胞を再標的化エンドペプチダーゼを含む試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である、ｂ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、ｃ）ＳＮＡＰ−２５成分をα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体はＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、ｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ここで該抗体−抗原複合体による検出は再標的化エンドペプチダーゼ活性を示す。
２．以下を含む、再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する方法：ａ）樹立した細胞株由来の細胞を再標的化エンドペプチダーゼを含む試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞は該再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である、ｂ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を、処理した細胞から単離する工程、ｃ）ＳＮＡＰ−２５成分を固相支持体に結合したα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、ｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ここで該抗体−抗原複合体による検出が再標的化エンドペプチダーゼ活性を示す。
３．以下を含む、再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する方法：ａ）樹立した細胞株由来の細胞を再標的化エンドペプチダーゼを含む試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である、ｂ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、ｃ）ＳＮＡＰ−２５成分を固相支持体に固定化する工程、ｄ）ＳＮＡＰ−２５成分をα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、およびｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ここで該抗体−抗原複合体による検出が再標的化エンドペプチダーゼ活性を示す。
４．以下を含む、再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する方法：ａ）樹立した細胞株由来の細胞を再標的化エンドペプチダーゼを含む試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼを取り込むことができる、ｂ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、ｃ）ＳＮＡＰ−２５成分をα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、およびｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ここで該抗体−抗原複合体による検出が再標的化エンドペプチダーゼ活性を示す。
５．以下を含む、再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する方法：ａ）樹立した細胞株由来の細胞を再標的化エンドペプチダーゼを含む試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼを取り込むことができる、ｂ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理した細胞から単離する工程、ｃ）ＳＮＡＰ−２５成分を固相支持体に結合したα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、およびｄ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ここで該抗体−抗原複合体による検出が再標的化エンドペプチダーゼ活性を示す。
６．以下を含む、再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する方法：ａ）樹立した細胞株由来の細胞を再標的化エンドペプチダーゼを含む試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼを取り込むことができる、ｂ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、ｃ）ＳＮＡＰ−２５成分を固相支持体に固定化する工程、ｄ）ＳＮＡＰ−２５成分をα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、およびｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ここで該抗体−抗原複合体による検出が再標的化エンドペプチダーゼ活性を示す、を含む。
７．以下を含む、哺乳動物の再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗を測定する方法：ａ）α−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の有無について試験をした哺乳動物から取得した試験試料に再標的化エンドペプチダーゼを添加する工程、ｂ）樹立した細胞株由来の細胞を試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である、ｃ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、ｄ）ＳＮＡＰ−２５成分をα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ｆ）試験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｅを繰り返す工程、該陰性対照試料は再標的化エンドペプチダーゼおよびα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体を包含しないことが公知である血清を含む、およびｇ）工程ｆで検出した抗体−抗原複合体の量を工程ｅで検出した抗体−抗原複合体の量と比較する工程、ここで該工程ｆにおいて検出した抗体−抗原複合体の量と比べて工程ｅで検出した少量の抗体−抗原複合体の検出はα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の存在を示す。
８．以下を含む、哺乳動物の再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗を測定する方法：ａ）α−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の有無について試験をした哺乳動物から取得した試験試料に再標的化エンドペプチダーゼを添加する工程、ｂ）樹立した細胞株由来の細胞を試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である、ｃ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、ｄ）ＳＮＡＰ−２５成分を固相支持体に結合したα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、ｅ）α−再標的化エンドペプチダーゼ抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ｆ）試験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｅを繰り返す工程、該陰性対照試料は再標的化エンドペプチダーゼおよびα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体を包含しないことが公知である血清を含む、およびｇ）工程ｆで検出した抗体−抗原複合体の量を工程ｅで検出した抗体−抗原複合体の量と比較する工程、ここで該工程ｆで検出した抗体−抗原複合体の量と比べて工程ｅで検出した少量の抗体−抗原複合体はα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の存在を示す。
９．以下を含む、哺乳動物の再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗を測定する方法：ａ）α−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の有無につて試験をした哺乳動物から取得した試験試料に再標的化エンドペプチダーゼを添加する工程、ｂ）樹立した細胞株由来の細胞を試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞は再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である、ｃ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、ｄ）ＮＡＰ−２５成分を固相支持体に固定化する工程、ｅ）ＳＮＡＰ−２５成分をα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、ｆ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ｇ）試験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｆを繰り返す工程、該陰性対照試料は、再標的化エンドペプチダーゼおよびα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体を包含しないことが公知である血清を含む、およびｈ）工程ｇで検出した抗体−抗原複合体の量を工程ｆで検出した抗体−抗原複合体の量と比較する工程、ここで該工程ｇで検出した抗体−抗原複合体の量と比べて工程ｆで検出した少量の抗体−抗原複合体の検出はα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の存在を示す。
１０．以下を含む、哺乳動物の再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗を測定する方法：ａ）α−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の有無について試験をした哺乳動物から取得した試験試料に再標的化エンドペプチダーゼを添加する工程、ｂ）樹立した細胞株由来の細胞を試験試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞が再標的化エンドペプチダーゼを取り込むことができる、ｃ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、ｄ）ＳＮＡＰ−２５成分をα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ｆ）試験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｅを繰り返す工程、該陰性対照試料は再標的化エンドペプチダーゼおよびα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体を包含しないことが公知である血清を含む、およびｇ）工程ｆで検出した抗体−抗原複合体の量を工程ｅで検出した抗体−抗原複合体の量と比較する工程、ここで該工程ｆで検出した抗体−抗原複合体の量と比べて工程ｅで検出した少量の抗体−抗原複合体の検出はα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の存在を示す。
１１．以下を含む、哺乳動物の再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗を測定する方法：ａ）抗体を中和するα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の有無を試験する哺乳動物から得た再標的化エンドペプチダーゼを試験試料に添加する工程、ｂ）樹立した細胞株由来の細胞を試験試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞が再標的化エンドペプチダーゼを取り込むことができる、ｃ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、ｄ）ＳＮＡＰ−２５成分を固相支持体に結合したα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、ｅ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ｆ）試験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｅを繰り返す工程、ここで該陰性対照試料は再標的化エンドペプチダーゼおよびα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体を包含しないことが公知である血清を含む、およびｇ）工程ｆで検出した抗体−抗原複合体の量を工程ｅで検出した抗体−抗原複合体の量と比較する工程、ここで該工程ｆで検出した抗体−抗原複合体の量と比べて工程ｅで検出した少量の抗体−抗原複合体の検出はα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の存在を示す。
１２．以下を含む、哺乳動物の再標的化エンドペプチダーゼ免疫抵抗を測定する方法：ａ）α−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の有無について試験をした哺乳動物から取得した試験試料に再標的化エンドペプチダーゼを添加する工程、ｂ）樹立した細胞株由来の細胞を試験試料で処理する工程、ここで該樹立した細胞株由来の細胞が再標的化エンドペプチダーゼを取り込むことができる、ｃ）ＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を有するＳＮＡＰ−２５切断産物を含むＳＮＡＰ−２５成分を処理された細胞から単離する工程、ｄ）ＳＮＡＰ−２５成分を固相支持体に固定化する工程、ｅ）ＳＮＡＰ−２５成分をα−ＳＮＡＰ−２５抗体に接触させる工程、ここで該α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、ｆ）α−ＳＮＡＰ−２５抗体およびＳＮＡＰ−２５切断産物を含む抗体−抗原複合体の存在を検出する工程、ｇ）試験試料の代わりに陰性対照試料で工程ｂ−ｆを繰り返す工程、ここで該陰性対照試料は再標的化エンドペプチダーゼおよびα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体を包含しないことが公知である血清を含む、およびｈ）工程ｇで検出した抗体−抗原複合体の量を工程ｆで検出した抗体−抗原複合体の量と比較する工程、ここで該工程ｇで検出した抗体−抗原複合体の量と比べて工程ｆで検出した少量の抗体−抗原複合体の検出はα−再標的化エンドペプチダーゼ中和抗体の存在を示す。
１３．細胞が約５００ｎＭ以下、約４００ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼによる再標的化エンドペプチダーゼ活性に感受性である、１〜３および７〜９の方法。
１４．細胞が約５００ｎＭ以下、約４００ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼを取り込むことができる、４〜６および１０〜１２の方法。
１５．試料が約１００ｎｇ以下、約１０ｎｇ以下、約１ｎｇ以下、１００ｆｇ以下、１０ｆｇ以下、または１ｆｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼを含む、１−６の方法。
１６．試料が約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約０．５ｎＭ以下、または約０．１ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼを含む、１〜６の方法。
１７．抗体−抗原複合体の存在がイムノブロット分析、免疫沈降分析、ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出される、１−１２の方法。
１８．本方法の下漸近線におけるシグナル対ノイズ比が少なくとも３：１、少なくとも５：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも５０：１または少なくとも１００：１である、１〜１２の方法。
１９．本方法の上漸近線におけるシグナル対ノイズ比が少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３００：１、少なくとも４００：１、少なくとも５００：１、または少なくとも６００：１である、１〜１２の方法。
２０．本方法が少なくとも１００ｎｇ、少なくとも５０ｎｇ、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも５ｎｇ、少なくとも１００ｐｇ、少なくとも５０ｐｇ、少なくとも１０ｐｇ、少なくとも５ｐｇ、少なくとも１００ｆｇ、少なくとも５０ｆｇ、少なくとも１０ｆｇ、または少なくとも５ｆｇの再標的化エンドペプチダーゼのＥＣ５０活性を検出できる、１〜１２の方法。
２１．本方法は少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ，少なくとも５ｎＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも０．５ｎＭまたは少なくとも０．１ｎＭの再標的化エンドペプチダーゼのＥＣ５０活性を検出できる方法であり、１〜１２の方法。
２２．本方法は１０ｐｇ以下、９ｐｇ以下、８ｐｇ以下、７ｐｇ以下、６ｐｇ以下、５ｐｇ以下、４ｐｇ以下、３ｐｇ以下、２ｐｇ以下、１ｐｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを有する、１〜１２の方法。
２３．本方法は１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下または１０ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＤを有する、１〜１２の方法。
２４．本方法は１０ｐｇ以下、９ｐｇ以下、８ｐｇ以下、７ｐｇ以下、６ｐｇ以下、５ｐｇ以下、４ｐｇ以下、３ｐｇ以下、２ｐｇ以下、１ｐｇ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを有する、１〜１２の方法。
２５．本方法は１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下の再標的化エンドペプチダーゼのＬＯＱを有する、１〜１２の方法。
２６．本方法は完全に活性な再標的化エンドペプチダーゼＡの７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下または１０％以下の活性を有する部分的に活性な再標的化エンドペプチダーゼから完全に活性な再標的化エンドペプチダーゼを識別できる、１〜１２の方法。
２７．α−ＳＮＡＰ−２５抗体がＳＮＡＰ−２５切断産物からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のＰ１残基でカルボキシ末端を含むエピトープを結合する、１〜１２の方法。
２８．α−ＳＮＡＰ−２５抗体が１  ｘ  １０-１  Ｍ−１ｓ−１以下であるＳＮＡＰ−２５切断製品からのＢｏＮＴ／Ａ切断部位の切断可能結合のカルボキシ末端グルタミンを含まないエピトープの会合速度定数を有し、かつ、α−ＳＮＡＰ−２５抗体が０．４５０ｎＭ以下であるエピトープの平衡解離定数を有する、２７の方法。
２９．単離したα−ＳＮＡＰ−２５抗体が配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号８０、および配列番号８２を包含する基から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、さらには配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０および配列番号９２包含する基から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、２７の方法。
３０．単離したα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号９３のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９４のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９５のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１８のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１９のＶＨ  ＣＤＲ１または配列番号１２０のＶＨ  ＣＤＲ１を含む、２７の方法。
３２．単離したα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号９６のＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号９７のＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号９８のＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号９９のＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号１２１のＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号１２２のＶＨ  ＣＤＲ２または配列番号１２３のＶＨ  ＣＤＲ２を含む、２７の方法。
３３．単離したα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号１００のＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号１０１のＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号１０２のＶＨ  ＣＤＲ３または配列番号１２４のＶＨ  ＣＤＲ３を含む、２７の方法。
３４．単離したα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号１０３のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１０４のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１０５のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１０６のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１０７のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１２５のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１２６のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１２７のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１２８のＶＬ  ＣＤＲ１または配列番号１２９のＶＬ  ＣＤＲ１を含む、２７の方法。
３５．単離したα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号１０８のＶＬ  ＣＤＲ２、配列番号１０９のＶＬ  ＣＤＲ２、配列番号１１０のＶＬ  ＣＤＲ２、配列番号１１１のＶＬ  ＣＤＲ２または配列番号１１２のＶＬ  ＣＤＲ２を含む、２７の方法。
３６．単離したα−ＳＮＡＰ−２５抗体が少なくとも配列番号１１３のＶＬ  ＣＤＲ３、配列番号１１４のＶＬ  ＣＤＲ３、配列番号１１５のＶＬ  ＣＤＲ３、配列番号１１６のＶＬ  ＣＤＲ３または配列番号１１７のＶＬ  ＣＤＲ３を含む、２７の方法。
３７．単離したα−ＳＮＡＰ−２５抗体が配列番号９３、配列番号１２１および配列番号１００を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１０５、配列番号１１０および配列番号１１５を含む軽鎖可変領域を含む、２７の方法。
３８．単離したα−ＳＮＡＰ−２５抗体が配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号１４７または配列番号１４８のＳＮＡＰ−２５エピトープを選択的に結合する、２７の方法。
３９．単離したα−ＳＮＡＰ−２５抗体が配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３または配列番号４４のＳＮＡＰ−２５エピトープを選択的に結合する、２７の方法。
【実施例】
【０１７２】
実施例Ｉ  内因性再標的化再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する候補細胞株のスクリーニング
以下の実施例は、細胞を用いた効力アッセイの作成に必要とされる、再標的化エンドペプチダーゼの取り込み能力を有する確立された細胞株をどのように同定したかを説明する。
【０１７３】
１．候補細胞株のストック培養の成長。
細胞株を生育させるために、試験する細胞株由来の好適な密度の細胞を３０ｍＬの好適な成長培地（表１を参照）を入れた１６２ｃｍ２の組織培養フラスコにプレーティングし、３７℃のインキュベーター中、５％又は１０％二酸化炭素存在下で細胞が所望の密度に達するまで生育させた。
【表１】
0005826635.tif 000002
【０１７４】
２．細胞表面に標的受容体を発現する細胞のスクリーニング。
フローサイトメトリー及び／又はリガンド結合アッセイを用い、所望の標的受容体の存在について細胞株をスクリーニングした。下記の実施例においては原形質膜におけるオピオイド又はオピオイド様受容体を同定するための試薬を用いたが、開示した方法は、いずれの再標的化エンドペプチダーゼに対する関連する受容体を同定するために用いることができる。
【０１７５】
ａ．フローサイトメトリーを用いた細胞株の同定。
細胞表面において再標的化エンドペプチダーゼに対する標的受容体を発現する確立された細胞株を構成する細胞を同定するために、フローサイトメトリー解析を行った。それぞれの候補細胞株の細胞をセクション１に記載した通りに生育させ、トリプシンで処理し、１ｘＰＢＳ、０．５％  ＢＳＡを含む染色バッファー中で洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。沈殿した細胞を染色バッファー中に再懸濁し、約２．０ｘ１０６個の細胞を、試験するそれぞれの受容体用の２本の新しいチューブに移した。オピオイド又はオピオイド様受容体の存在をスクリーニングするために、約２．０〜５．０μＬのα−ＯＲＬ−１  ＲＡ１４１３３（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、Ｅｄｉｎａ、ＭＮ）、α−ＤＯＲウサギポリクローナル抗体ＲＡ１０１０１（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、Ｅｄｉｎａ、ＭＮ）、α−ＫＯＲウサギポリクローナル抗体ＲＡ１０１０３（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、Ｅｄｉｎａ、ＭＮ）、又はα−ＭＯＲウサギポリクローナル抗体ＲＡ１０１０４（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、Ｅｄｉｎａ、ＭＮ）を１本のチューブに加え、その混合液を４℃で１時間インキュベートした。２本目のチューブにはいずれの抗体も加えずに４℃で１時間インキュベートし、陰性対照とした。抗体をインキュベートした後、１．０ｍＬの染色バッファーをそれぞれのチューブに加え、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞沈殿物を１．０ｍＬの染色バッファーでもう一度洗浄した。細胞沈殿物を２００μＬの染色バッファーに再懸濁し、２．０μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣ抗体をそれぞれのチューブに加え、４℃で１時間、暗所にてインキュベートした。二次抗体とインキュベートした後、１．０ｍＬの染色バッファーをそれぞれのチューブに加え、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞沈殿物を１．０ｍＬの染色バッファーでもう一度洗浄し、沈殿物を５００μＬの染色バッファー中に再懸濁した。フローサイトメーターを用いて試料を解析し、ウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣ染色の上に抗受容体抗体染色を重ねたものをデータとして表示させた。
【０１７６】
結果は、試験した細胞株のうち、ＳｉＭａ、ＳｉＭａ  Ｐ＞３３、クローン  Ｈ１０、ＮＤ７、及びＳＫ−Ｎ−ＤＺ確立された細胞株を構成する細胞の約５０％の細胞表面でＯＲＬ−１が発現し；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＮＤ１５確立された細胞株を構成する細胞の約２５％〜約５０％の細胞表面でＯＲＬ−１が発現し；及びＮＤ３、ＮＤ８、Ｎ１８、及びＮｅｕｒｏ−２ａ確立された細胞株を構成する細胞の約２５％未満の細胞表面でＯＲＬ−１が発現したことを示す（表２）。結果は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＮＤ７確立された細胞株を構成する細胞の約５０％の細胞表面でＫＯＲが発現し；ＳｉＭａ  クローン  Ｈ１０、ＳｉＭａＰ＞３３、ＮＤ１５、及びＮｅｕｒｏ−２ａ確立された細胞株を構成する細胞の約２５％〜約５０％の細胞表面でＫＯＲが発現し；及びＮＤ３、ＮＤ８、及びＮ１８確立された細胞株を構成する細胞の約２５％未満の細胞表面で発現したことをもまた示す（表２）。結果は、ＮＤ７、ＮＤ１５、及びＳｉＭａ  Ｐ＞３３確立された細胞株を構成する細胞の約５０％の細胞表面でＭＯＲが発現し；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＳｉＭａ  クローン  Ｈ１０、ＮＤ８、及びＮｅｕｒｏ−２ａ確立された細胞株を構成する細胞の約２５％〜約５０％の細胞表面で発現し；並びにＮＤ３及びＮ１８確立された細胞株を構成する細胞の約２５％未満の細胞表面でＭＯＲが発現したことをもまた明らかにした（表２）。α−ＤＯＲウサギポリクローナル抗体ＲＡ１０１０１は正確に機能しなかったため、使用可能なデータが生成されなかった。
【０１７７】
ｂ．リガンド結合を用いた細胞株の同定。
細胞表面に再標的化エンドペプチダーゼに対する標的受容体を発現する確立された細胞株を構成する細胞を同定するために、リガンド結合解析を行った。結合を促進するために、試験する候補細胞株由来の細胞を黒色−透明底型９６ウェルプレート上に約４時間播種した。オピオイド又はオピオイド様受容体の存在をスクリーニングするために、その後それぞれのウェルから培地を吸引し、０（未処理対照）、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、又は１ｎＭいずれかのＦＡＭ−ノシセプチン（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）；又は０（未処理対照）、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、又は１ｎＭいずれかのＦＡＭ−ダイノルフィンＡ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を含む５０μＬのリガンド溶液で置換した。細胞をリガンド溶液と共に、３７℃インキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で１時間インキュベートした。結合しなかったリガンドを除去するために、１００μＬの１ｘＰＢＳを用いて細胞を３回洗うことによって細胞を洗浄した。プレートをＴｙｐｈｏｏｎ（Ｅｘ４８８及びＥｍ５２０ｎｍ）でスキャンし、その後ＲＦＵシグナルをＭ５プレートリーダー（Ｅｘ４９５及びＥｍ５２０ｎｍ）で測定した。結果は、ＳｉＭａ  クローン  Ｈ１０、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、及びＳＫ−Ｎ−ＤＺ確立された細胞株を構成する細胞はノシセプチンと結合し、ＳｉＭａ  クローン  Ｈ１０を構成する細胞はダイノルフィンともまた結合することを示す（表２）。
【表２】
0005826635.tif 000003
【０１７８】
同様の方法を用い、その他の再標的化エンドペプチダーゼに対する関連する受容体を有する細胞を含む細胞株を、これらエンドペプチダーゼへの標的ドメインのＦＡＭ標識及び上述したような細胞株のスクリーニングによって同定することができる。
【０１７９】
３．再標的化エンドペプチダーゼ分子を用いた候補細胞株の単回投与スクリーニング。
細胞株が適切な再標的化エンドペプチダーゼ分子を取り込むことができるかどうかを決定するために、試験する細胞株のストック培養由来の好適な密度の細胞を１ｍＬの適切な血清成長培地（表１）を入れた２４ウェル組織培養プレートのウェルにプレーティングした。３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で細胞が所望の密度に達するまで細胞を生育させた（およそ１８〜２４時間）。オピオイド再標的化エンドペプチダーゼの取り込みを評価するために、成長培地をそれぞれのウェルから吸引し、１）オピオイド再標的化エンドペプチダーゼを含まない新しい成長培地（未処理細胞株）又は２）３０ｎＭのノシセプチン再標的化エンドペプチダーゼ（Ｎｏｃ／Ａ）又は１００ｎＭのダイノルフィン再標的化エンドペプチダーゼ（Ｄｙｎ／Ａ）（処理細胞株）を含む新しい成長培地のいずれかで置換した。一晩インキュベートした後、成長培地を吸引し、２００μＬの１ｘＰＢＳでそれぞれのウェルをリンスすることによって細胞を洗浄した。細胞を回収するために、１ｘＰＢＳを吸引し、５０μＬの２ｘＳＤＳローディングバッファーを加えることによって細胞を溶解し、溶解物を清潔なテストチューブに移し、試料を９５℃まで５分間加熱した。
【０１８０】
開裂していないＳＮＡＰ−２５基質及び開裂したＳＮＡＰ−２５産物両方の存在を検出するために、それぞれの回収した試料の一部をウエスタンブロットによって解析した。この解析においては、１２μＬの回収した試料を変性、還元条件下で、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  １２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  プレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、ＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。分離したタンパク質を、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ（登録商標）ＳＤセミドライ電気泳動トランスファーセル装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いたウエスタンブロットにより、ゲルからポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上に移した。トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）（２５ｍＭ  ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭ  塩化ナトリウム、２．７ｍＭ  塩化カリウム）、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）、２％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５％  脱脂粉乳を含む溶液中、室温で２時間インキュベートすることによりＰＶＤＦ膜をブロッキングした。ブロッキングした膜を、１）１：５，０００希釈したα−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体（ＳＭＩ−８１；Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；又は２）１：５，０００希釈したＳ９６８４ α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗血清（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のいずれかを一次抗体として含む、ＴＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）、２％  ＢＳＡ、及び５％  脱脂粉乳中、４℃で一晩インキュベートした。それぞれの細胞株における全ＳＮＡＰ−２５発現と、再標的化エンドペプチダーゼの取り込み量を評価するための指標として再標的化エンドペプチダーゼ処理後のＳＮＡＰ−２５開裂のパーセンテージを評価することを可能にすることにより、ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル及びウサギポリクローナル抗体の両方は、開裂していないＳＮＡＰ−２５基質及びＳＮＡＰ−２５開裂産物の両方を検出することができる。一次抗体でプロービングしたブロットをＴＢＳ、ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で３回、それぞれの回につき１５分間洗浄した。洗浄した膜を、１）１：１０，０００希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｚｙｍｅｄ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）に結合したヤギポリクローナル抗マウス免疫グロブリンＧ、重鎖及び軽鎖（ＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ）抗体；又は２）１：１０，０００希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｚｙｍｅｄ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）に結合したヤギポリクローナル抗ウサギ免疫グロブリンＧ、重鎖及び軽鎖（ＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ）抗体のいずれかを二次抗体として含むＴＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−��０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）、２％  ＢＳＡ、及び５％  脱脂粉乳中、室温で２時間インキュベートした。二次抗体でプロービングしたブロットをＴＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で３回、それぞれの回につき１５分間洗浄した。ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（商標）ウエスタンブロット検出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて標識したＳＮＡＰ−２５産物のシグナル検出を可視化し、膜を画像化して開裂したＳＮＡＰ−２５産物のパーセンテージをＴｙｐｈｏｏｎ  ９４１０  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ及びＩｍａｇｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて定量した。ピクセルサイズの選択（１００〜２００ピクセル）及びＰＭＴ電圧設定（３５０〜６００、通常は４００）は、それぞれのブロットに依存する。
【０１８１】
ＳＮＡＰ−２５開裂産物の検出に基づき、ＢＥ（２）−Ｃ、Ｎ１８ＴＧ２、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＳｉＭａ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）−Ｃ、及びＳＫ−Ｎ−ＤＺの細胞株が３０ｎＭ  Ｎｏｃ／Ａの取り込みを示し（表３）；一方、Ｎ１８ＴＧ２、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＰＣ１２、及びＳｉＭａ細胞株が１００ｎＭ  Ｄｙｎ／Ａの取り込みを示した。これらのうちいくつかの感受性細胞株をより低容量の化合物及び／又は完全用量反応を用いて試験した。
【表３】
0005826635.tif 000004
【０１８２】
同様の方法を用い、その他の再標的化エンドペプチダーゼに対する関連する受容体を有する細胞を含む細胞株の、再標的化エンドペプチダーゼの取り込みを評価することができる。
【０１８３】
実施例ＩＩ  内因性再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する候補クローン細胞株のスクリーニング
１．親ＳｉＭａ細胞株からの、候補クローン細胞株の単回投与再標的化エンドペプチダーゼスクリーニング。
関連特許出願であるＺｈｕ  Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂａｓｅｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ａ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙｓ（米国特許出願第６１／１６０，１９９号）は、Ｅｓｔｅｒ  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂａｓｅｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ａ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙｓ（米国特許出願第１２／４０３，５３１号）に記載されたようなＢｏＮＴ／Ａ効力アッセイにおいて有用な、親ＳｉＭａ細胞株由来のクローン細胞株を開示し、それぞれの特許は引用することによりその全文が本明細書に組み入れられる。これらクローン細胞株が適切な再標的化エンドペプチダーゼを取り込むことができるかどうかを決定するために、ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いてそれぞれをスクリーニングした。
【０１８４】
再標的化エンドペプチダーゼで処理した溶解物を調製するために、試験する細胞株のストック培養由来の好適な密度の細胞を１００μＬの適切な血清成長培地（表１）を入れた９６ウェル組織培養プレートのウェルに一晩プレーティングした。播種した細胞からの培地をそれぞれのウェルから吸引し、３０ｎＭのＮｏｃ／Ａ再標的化エンドペプチダーゼ又は８０ｎＭのＤｙｎ／Ａ再標的化エンドペプチダーゼのいずれかを含む新しい培地で置換した。２４時間インキュベートした後、成長培地を吸引し、２００μＬの１ｘＰＢＳでそれぞれのウェルをリンスすることによって細胞を洗浄した。細胞を回収するために、１ｘＰＢＳを吸引し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む３０μＬのリシスバッファーをそれぞれのウェルに加えることによって細胞を溶解し、プレートを、５００ｒｐｍで回転している振とう機上、４℃で３０分間インキュベートした。細胞残渣を沈殿させるためにプレートを４０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心分離し、検出工程を行うために上清を補足抗体をコーティングした９６ウェルプレートに移した。
【０１８５】
α−ＳＮＡＰ−２５１９７補足抗体溶液を調製するために、ハイブリドーマ細胞株２Ｅ２Ａ６由来の腹水に含まれるα−ＳＮＡＰ−２５１９７マウスモノクローナル抗体（実施例ＸＩ）を、標準的なプロテインＡ精製プロトコールを用いて精製した。
【０１８６】
α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を調製するために、α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体Ｓ９６８４（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を製造業者による説明書に従って（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、ルテニウム（ｌｌ）−トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホン酸）ＮＨＳエステル標識試薬（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に結合させた。ＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）ストック溶液を再構成した蒸留水３０μＬを２００μＬの２ｍｇ／ｍＬ  α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体に加え、反応液を室温で２時間、暗所にてインキュベートすることにより、結合反応を行った。標識した抗体を標準的なスピンカラムプロトコールを用いて精製し、標準的な比色タンパク質アッセイを用いてタンパク質の濃度を決定した。１リットル当たりのモル濃度を決定するために、α−ＳＮＡＰ−２５抗体／ＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）結合体の吸光度を、分光光度計を用いて４５５ｎｍで測定した。検出抗体溶液を使用まで４℃で保存した。使用しない一部を―２０℃で長期間保存した。
【０１８７】
α−ＳＮＡＰ−２５１９７補足抗体を含むα−ＳＮＡＰ−２５固相担体を調製するために、およそ５μＬの適切なα−ＳＮＡＰ−２５１９７モノクローナル抗体溶液（１ｘＰＢＳ中に２０μｇ／ｍＬ）を、９６ウェルＭＳＤ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  プレートのそれぞれのウェルに添加し、溶液中の液体を蒸発させるために、生物学的に安全なキャビネット中で２〜３時間風乾させた。ブロッキングしたプレートを密閉し、使用まで４℃で保存した。
【０１８８】
開裂したＳＮＡＰ−２５産物の存在をＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出するために、次に、２％  Ａｍｅｒｓｈａｍブロッキング試薬（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）及び１０％  ヤギ血清（ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を含む１５０μＬのブロッキングバッファーを室温で２時間添加することにより、補足抗体が結合したウェルをブロッキングした。ブロッキングバッファーを吸引し、再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞由来の溶解物２５μＬをそれぞれのウェルに加え、プレートを４℃で一晩インキュベートした。細胞溶解物を吸引し、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でそれぞれのウェルを３回リンスすることにより、プレートウェルを洗浄した。洗浄した後、１ｘＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）に溶解した２％  Ａｍｅｒｓｈａｍブロッキング試薬を含む２５μＬの５μｇ／ｍＬ  α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液をそれぞれのウェルに加え、密閉し、振とうさせながら、室温で１時間インキュベートした。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体をインキュベートした後、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でウェルを３回洗浄した。洗浄した後、１５０μＬの１ｘリードバッファー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をそれぞれのウェルに加え、ＳＥＣＴＯＲ（商標）Ｉｍａｇｅｒ  ６０００  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてプレートを測定した。生データをＥＣＬ  ｉｍａｇｅｒを用いて回収した。
【０１８９】
結果は、親ＳｉＭａ細胞株並びにクローン細胞株Ｈ１０が、Ｎｏｃ／Ａ再標的化エンドペプチダーゼの良い取り込みを示す（表４）。加えて、これらの結果は、多くの細胞株がＤｙｎ／Ａ再標的化エンドペプチダーゼの取り込みを示したことを明らかにする（表４）。３つのクローン細胞株（１Ｅ１１、ＡＦ４、及びＤＣ４）はＤｙｎ／Ａ再標的化エンドペプチダーゼのよい取り込みを示し；１１のクローン細胞株（１Ｅ３、２Ｄ２、２Ｄ６、３Ｄ８、５Ｃ１０、５Ｆ３、ＢＢ１０、ＢＦ８、ＣＧ８、ＣＧ１０、及びＤＥ７）は中程度のＤｙｎ／Ａ再標的化エンドペプチダーゼの取り込みを示し；並びに（３Ｂ８、２Ｂ９、ＣＥ６、ＹＢ８、４Ｃ８、２Ｆ５、ＡＣ９、ＣＤ６、ＤＤ１０、ＹＦ５）は、最小のＤｙｎ／Ａ再標的化エンドペプチダーゼの取り込みを示した。これらのうちいくつかの候補細胞株を、対応する再標的化エンドペプチダーゼを用いた完全用量反応において試験した。
【表４−１】
0005826635.tif 000005
【表４−２】
0005826635.tif 000006
【表４−３】
0005826635.tif 000007
【０１９０】
２．候補細胞株の完全用量反応スクリーニング。
上記で同定した確立された細胞株を続いて、適切な再標的化エンドペプチダーゼの完全用量反応を用いて評価した。異なる細胞株由来の細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、様々な濃度のＮｏｃ／Ａ（０、０．１４ｎＭ、０．４ｎＭ、１．２３ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、及び１００ｎＭ）又はＤｙｎ／Ａ（０．０１７ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１５ｎＭ、０．４５ｎＭ、１．４ｎＭ、４．１ｎＭ、１２ｎＭ、３７ｎＭ、１１１ｎＭ、３３３ｎＭ、及び１０００ｎＭ）に２４時間曝露した。再標的化エンドペプチダーゼを含む培地をその後除去し、新しい完全培地で置換した。ＳＮＡＰ−２５を開裂させるために、プレートをさらに２４時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下でインキュベートした。細胞をリシスバッファー中で溶解し（表５）、残渣を除去するためにプレートを遠心分離した。溶解物をウエスタンブロットアッセイ又はサンドイッチＥＬＩＳＡのいずれかに用いた。
【０１９１】
ウエスタンブロット解析では、完全なＳＮＡＰ−２５及びＳＮＡＰ−２５開裂産物の両方の存在について、実施例Ｉに記載したように試料を解析した。
【０１９２】
サンドイッチＥＬＩＳＡ用には、２Ｅ２Ａ６モノクローナル抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、１５０μＬのブロッキングバッファー中、室温で２時間、ブロッキングした。ブロッキングバッファーを除去した後、２５μＬの細胞溶解物をそれぞれのウェルに加え、プレートを４℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでプレートを３回洗浄し、ウェルの底部の隅に、ＰＢＳ−Ｔ中の２％  ブロッキング試薬に５μｇ／ｍＬの濃度で溶解したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ  ＮＨＳ−エステル標識検出抗ＳＮＡＰ２５  ｐＡｂ抗体２５μＬを加えた。プレートを密閉し、室温で１時間振とうさせ、その後ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄した。洗浄が完了した後、１つのウェル当たり１５０μＬの１ｘリードバッファーを加え、試験した細胞株それぞれの感受性を決定するためにＳＩ６０００  Ｉｍａｇｅ  ｒｅａｄｅｒを用いてプレートを測定し、それぞれの細胞株のＥＣ５０値を算出した。Ｎｏｃ／Ａ再標的化エンドペプチダーゼにおける値を表５にまとめた。再標的化エンドペプチダーゼＤｙｎ／Ａの完全用量反応は、ＰＣ１２及びクローンＡＦ４についてのみ行った。どちらの例におけるアッセイも上側の漸近線に達しなかったため、ＥＣ５０は算出できなかった。ＡＦ４クローンにおけるシグナルが生成したより低い用量は、両方の細胞株において１２ｎＭであった。
【表５】
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【０１９３】
同様の方法を用い、その他の再標的化エンドペプチダーゼに対する関連する受容体を有する細胞を含むクローン細胞株をスクリーニングし、再標的化エンドペプチダーゼの取り込みを評価することができる。
【０１９４】
実施例ＩＩＩ  候補細胞株の再標的化エンドペプチダーゼの取り込みにおける生育条件の評価
以下の実施例は、確立された細胞株における再標的化エンドペプチダーゼの取り込みを最大にする培養条件、成長及び分化をどのように決定したかを説明する。
【０１９５】
１．候補細胞株の再標的化エンドペプチダーゼの取り込みにおける細胞分化及び栄養素の効果。
細胞分化又は成長培地中の栄養素の存在が再標的化エンドペプチダーゼの取り込みを改善するがどうかを決定するために、Ｎｏｃ／Ａの良好な取り込みを示した細胞株を、異なる培地組成物を用いて試験した。試験するＳｉＭａ  Ｐ＞３０細胞株のストック培養由来の好適な密度の細胞を、ＲＰＭ１１６４０、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミン、サプリメントＢ２７、及びＮ２を含む１００μＬの無血清培地、又はＲＰＭＩ１６４０、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、サプリメントＢ２７、Ｎ２、及びＮＧＦ（神経成長因子、１００ｎｇ／ｍＬ）を含む１００μＬの無血清培地を入れた９６ウェル組織培養プレートのウェル中にプレーティングした。これらの細胞を、成長停止及び神経突起伸展などの標準的及び慣習的な形態学的な基準によって評価されるように細胞が分化するまで、３７℃のインキュベーター中、５％  二酸化炭素存在下でインキュベートした（およそ１〜２日間）。対照として、試験する細胞株のストック培養由来の好適な密度の細胞を、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を加えた又は加えない１００μＬの適切な成長培地（表１）を入れた９６ウェル組織培養プレートのウェル中にプレーティングした。これら未分化対照細胞を、細胞が所望の密度に達するまで、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で生育させた（およそ１８〜２４時間）。分化した及び未分化対照培養両方由来の培地をそれぞれのウェルから吸引し、０（未処理試料）又は様々な濃度いずれかのＮｏｃ／Ａ（０．１４、０．４、１．２３、３．７、１１．１、３３．３、及び１００ｎＭ）を含む新しい培地で置換した。２４時間処理後、細胞を洗浄し、生産されるＳＮＡＰ２５１９７の量を増加させるために、再標的化エンドペプチダーゼを含まない培地中で２４時間インキュベートした。その後細胞を洗浄し、実施例ＩＩに記載したようなＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ用に回収した。
【０１９６】
ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株においては、栄養素の効果もまた試験した。ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞を、１つのウェル当たり２５，０００細胞になるように、８つの異なるＳＭ培地（表６）を用いて、７２時間、ポリ−Ｄ−リジンコーティング９６ウェルプレートにプレーティングした。０、０．３ｎＭ、３ｎＭ、及び３０ｎＭ用量のＮｏｃ／Ａを加えた同じ８つの培地中で細胞を処理した。２４時間処理後、細胞を洗浄し、生産されるＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物の量を増加させるために、再標的化エンドペプチダーゼを含まない培地中で２４時間インキュベートした。その後細胞を洗浄し、実施例Ｉに記載したようなウエスタンブロットアッセイように回収した。
【０１９７】
分化は、ＳｉＭａ  ＞Ｐ３０細胞株のＮｏｃ／Ａ取り込みにおいては効果がなかったが、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株における取り込みを改善したようだった。基本培地はＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株におけるＮｏｃ／Ａの取り込みに有意な効果を示し、栄養素Ｎ２及びＢ２７を含むＲＰＭＩ１６４０が最も良い組み合わせであった。ＮＧＦの存在は、試験した２つの細胞株における取り込みを改善しないようだった。
【表６】
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【０１９８】
同様の方法を用い、その他の再標的化エンドペプチダーゼに対する関連する受容体を有する細胞を含むクローン細胞株の成長及び分化条件を評価することができる。
【０１９９】
実施例ＩＶ  外生の再標的化エンドペプチダーゼ受容体を発現する確立された細胞株の作成
以下の実施例は、再標的化エンドペプチダーゼに対する外生の受容体を発現する確立された細胞株をどのように作出したかを説明する。
【０２００】
１．候補細胞株を構成する細胞への標的受容体のトランスフェクション。
再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａは、オピオイド受容体様−１（ＯＲＬ−１）の天然のリガンドであるノシセプチン標的ドメインを含む。ＯＲＬ−１のオープンリーディングフレームを含む発現コンストラクトを得るために、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｐｏｅｉａ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｐｏｅｉａ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）から、発現コンストラクトであるｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ０２／ＯＲＬ−１を得た。
【０２０１】
一方、標準的な方法（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）を用いて、ＯＲＬ−１アミノ酸配列（例えば、配列番号２５又は配列番号２６のアミノ酸配列）に基づくポリヌクレオチド分子を合成することができる。２０〜５０塩基の長さのオリゴヌクレオチドは、標準的なホスホラミダイト合成によって合成される。これらのオリゴヌクレオチドは、完全長ポリヌクレオチド分子を構成するために、共にライゲーションされる二本鎖デュプレックス中にハイブリダイゼーションされる。このポリヌクレオチド分子は、ｐＵＣＢＨＢ1／ＯＲＬ−１を作出するために、標準的な分子生物学的手法を用いてｐＵＣＢＨＢ1ベクターのＳｍａＩ部位にクローニングされる。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）及びＡＢＩ  ３１００シークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を用いたシークエンシングにより、合成したポリヌクレオチド分子を確認する。必要に応じて、大腸菌株における発現を改善するために、ＯＲＬ−１アミノ酸配列（例えば、配列番号２５又は配列番号２６のアミノ酸配列）に基づいて、発現を最適化したポリヌクレオチド分子を合成することができる。ＯＲＬ−１をコードしているポリヌクレオチド分子を、１）大腸菌株の天然型ポリヌクレオチド分子に典型的に存在する同義語コドンを含むように；２）大腸菌株で見られる天然型ポリヌクレオチド分子の平均Ｇ＋Ｃ含量と、より密接に一致するＧ＋Ｃ含量を含むように；３）ポリヌクレオチド分子に見られるポリモノヌクレオチド領域が減少するように；及び／又は４）ポリヌクレオチド分子中に見られる内部の制御部位又は構成部位を除去するように、改変することができる。例えば、Ｌａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ（米国特許出願公開第２００８／００５７５７５号）（２００８年３月６日）；及びＬａｎｃｅ  Ｅ．  Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ｅ、（米国特許出願公開第２００８／０１３８８９３号）（２００８年６月１２日）を参照のこと。配列の最適化が完了すると、２０〜５０塩基の長さのオリゴヌクレオチドは標準的なホスホラミダイト合成によって合成される。これらのオリゴヌクレオチドは、完全長ポリヌクレオチド分子を構成させるために、共にライゲーションされる二本鎖デュプレックス中にハイブリダイゼーションされる。ｐＵＣＢＨＢ１／ＯＲＬ−１を作出するため、標準的な分子生物学的手法を用いてこのポリヌクレオチド分子をｐＵＣＢＨＢ1ベクターのＳｍａｌ部位にクローニングする。ＤＮＡシークエンシングにより、合成したポリヌクレオチド分子を確認する。必要に応じて、例えば、酵母株、昆虫細胞株又は哺乳動物の細胞株などの異なる生物における発現の最適化を行うことができる。例えば、Ｓｔｅｗａｒｄ（米国特許出願公開第２００８／００５７５７５号）、上記、（２００８）；及びＳｔｅｗａｒｄ（米国特許出願公開第２００８／０１３８８９３号）、上記、（２００８）を参照のこと。ＯＲＬ−１をコードしているポリヌクレオチド分子の例としては、配列番号６１及び配列番号６２が挙げられる。
【０２０２】
ＯＲＬ−１をコードしている発現コンストラクトを構築するため、ｐＵＣＢＨＢ１／ＯＲＬ−１コンストラクトを、１）ＯＲＬ−１のオープンリーディングフレームをコードしているポリヌクレオチド分子を切断し；および２）このポリヌクレオチド分子をｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に操作可能に連結することを可能にする、制限エンドヌクレアーゼを用いて消化する。この挿入断片をＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ技術を用いてｐｃＤＮＡ３ベクターにサブクローニングし、さらにｐｃＤＮＡ３／ＯＲＬ−１を得るために適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化する。エレクトロポレーション法により、ライゲーション混合液をエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）に形質転換し、細胞を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１．５％  Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレート（ｐＨ７．０）上にプレーティングし、３７℃インキュベーター中に静置して一晩生育させる。発現コンストラクトを含むバクテリアは、アンピシリン抵抗性のコロニーとして同定される。候補コンストラクトは、アルカリ溶菌プラスミドミニプレパレーション法によって単離され、挿入断片の存在及び方向を決定するために制限エンドヌクレアーゼ消化マッピングによって解析される。このクローニング方法により、ＯＲＬ−１をコードしているポリヌクレオチド分子を含むｐｃＤＮＡ３発現コンストラクトが得られる。
【０２０３】
再標的化エンドペプチダーゼＤｙｎ／Ａは、κ−オピオイド受容体（ＫＯＲ）の天然のリガンドであるダイノルフィン標的ドメインを含む。ＯＲＬ−１のオープンリーディングフレームを含む発現コンストラクトを得るために、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｐｏｅｉａ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｐｏｅｉａ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて発現コンストラクトであるｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ０２／ＫＯＲ−１を得た。一方、ＫＯＲをコードしている発現コンストラクトを合成し、ｐｃＤＮＡ３．１／ＫＯＲ発現コンストラクトを作出するために用いた、上述した方法と類似の方法を用いてサブクローニングすることができる。ＫＯＲアミノ酸配列の例としては配列番号２９及び配列番号３０が；ＫＯＲをコードしているポリヌクレオチド分子の例としては配列番号６５及び配列番号６６が挙げられる。
【０２０４】
例えば、ｐｃＤＮＡ３．１／ＤＯＲ又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭＯＲ、ｐｃＤＮＡ３．１／ガラニン受容体１、ｐｃＤＮＡ３．１／ガラニン受容体２、又はｐｃＤＮＡ３．１／ガラニン受容体３などの、その他の再標的化エンドペプチダーゼ受容体をコードしている発現コンストラクトを作出するために類似のクローニング方法を用いることができる。ＤＯＲアミノ酸配列の例としては配列番号２７及び配列番号２８が；ＭＯＲアミノ酸配列の例としては配列番号３１が、ガラニン受容体１アミノ酸配列の例としては配列番号１３６、配列番号１３７、及び配列番号１３８が；ガラニン受容体２アミノ酸配列の例としては配列番号１３９が；並びにガラニン受容体３アミノ酸配列の例としては配列番号１４０が挙げられる。ＤＯＲをコードしているポリヌクレオチド分子の例としては配列番号６３及び配列番号６４が；ＭＯＲをコードしているポリヌクレオチド分子の例としては配列番号６７が；ガラニン受容体１をコードしているポリヌクレオチド分子の例としては配列番号１４１、配列番号１４２、及び配列番号１４３が；ガラニン受容体２をコードしているポリヌクレオチド分子の例としては配列番号１４４が；並びにガラニン受容体３をコードしているポリヌクレオチド分子の例としては配列番号１４５が挙げられる。
【０２０５】
再標的化エンドペプチダーゼ受容体をコードしている発現コンストラクトを導入するために、再標的化エンドペプチダーゼ受容体をコードしている発現コンストラクトを用いて細胞株をトランスフェクションした。オピオイド又はオピオイド様受容体を用いて細胞株をトランスフェクションするためには、候補細胞株由来の細胞をＴ１７５コラーゲンＩＶコーティングフラスコ中に１ｘ１０７個の細胞密度で播種し、細胞が所望の密度に達するまで、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で生育させた。室温で５分間インキュベートした２００μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む４ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清使用量低減培地を２０μｇのｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ０２／ＯＲＬ−１又は２０μｇのｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｍ０２／ＫＯＲ−１を含む４ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清使用量低減培地に加えることにより４．２ｍＬのトランスフェクション溶液を調製した。このトランスフェクション溶液を室温でおよそ２０分間インキュベートした。培地を８ｍＬの新しい無血清、抗生物質を含まない培地で置換し、トランスフェクション溶液を細胞に加えた。その後細胞を３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下でおよそ１６〜１８時間インキュベートした。トランスフェクション培地を新しい成長培地で置換し、細胞を３７℃インキュベーター中、５％二酸化炭素存在下でインキュベートした。２４時間後、成長培地を培養培地中に１ｍｇ／ｍＬ濃度の抗生物質Ｇ４１８を含む新しい成長培地（選択培地）で置換し、細胞を７日間インキュベートした。全４週間にわたり、選択培地を毎週交換した（約９０％細胞が死に、毎週の培地交換の際に除去した）。
【０２０６】
ＯＲＬ−１受容体を用いてトランスフェクションした候補細胞株は、ＳｉＭａ  ＞Ｐ３０、ＮＤ１５、ＮＤ７、ＮＧ１０８−Ｔ１５及びＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株である。ＫＯＲ−１受容体を用いてトランスフェクションした候補細胞株は、ＳｉＭａ、ＳｉＭａ  ＞Ｐ３０、ＮＤ１５、ＮＤ７、ＮＧ１０８−Ｔ１５及びＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株である。トランスフェクションしたＮＧ１０８−Ｔ１５細胞は、Ｇ４１８による選別において生き残らなかった。
２．安定にトランスフェクションした細胞株の、再標的化エンドペプチダーゼ分子を用いた単回投与及び用量反応スクリーニング。
【０２０７】
前セクションにおいてトランスフェクションし、選別した候補細胞株由来の細胞を、化合物を処理する前にＮ２及びＢ２７サプリメント、並びにＮＧＦ（５０〜１００ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、１ウェル当たり１ｘ１０５細胞になるように９６ウェルポリ−Ｄ−リジン又はコラーゲンＩＶコーティングプレートに、２０±４時間プレーティングした。その後同じ培地中で、ＯＲＬ−１受容体を安定してトランスフェクションされた細胞を３０ｎＭの再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａで２４±２時間処理した。ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株は１０ｎＭの再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａで処理した。１２０μＬのリシスバッファー中で細胞を溶解し、実施例Ｉに詳述したように行うウエスタンブロットアッセイ用に、２０μＬの溶解物を２ｘＳＤＳバッファーと混合した。ＯＲＬ−１受容体を用いてトランスフェクションした場合、全ての細胞株における再標的化されたＮｏｃ／Ａ化合物の取り込みが増加することが示された（表７）。
【表７】
0005826635.tif 000010
【０２０８】
前セクションにおいてトランスフェクションし、選別した候補細胞株由来の細胞を、化合物を処理する前に１０％  ＦＢＳ及びＮ２及びＢ２７サプリメントを含むＲＰＭ１１６４０培地中で、１ウェル当たり１ｘ１０５細胞になるように９６ウェルポリ−Ｄ−リジン又はコラーゲンＩＶコーティングプレートに、２０±４時間プレーティングした。ＫＯＲ−１受容体を安定してトランスフェクションされた細胞を、同じ培地中で２４±２時間、１００ｎＭの再標的化エンドペプチダーゼＤｙｎ／Ａで処理した。１２０μＬのリシスバッファー中で細胞を溶解し、実施例Ｉに詳述したように行うウエスタンブロットアッセイ用に、２０μＬの溶解物を２ｘＳＤＳバッファーと混合した。ヒトＫＯＲ−１受容体を用いてトランスフェクションした場合、全ての細胞株における再標的化されたＤｙｎ／Ａ化合物の取り込みが増加することが示された。
【０２０９】
３．連続希釈による、高い感受性を示す安定してトランスフェクションされたクローン細胞株の選抜
以下の実施例は、再標的化エンドペプチダーゼの作用を受けやすい又は再標的化エンドペプチダーゼの取り込み能力を有する、安定してトランスフェクションされ、確立された細胞株由来のクローン細胞をどのように同定したかを説明する。
【０２１０】
上記に記載した、選択した細胞由来の単一の細胞をクローニングするために、限界希釈細胞株クローニング方法を用いた。細胞をトリプシン処理し、数を計測し、１００μＬ当たり０．５〜１細胞になるように希釈し、１つのウェル当たり１００μＬを、５つのポリ−Ｄ−リジンコーティング９６ウェルプレートに入れた選択培地上にプレーティングした。ウェルの底部にコロニーが形成されるまで、２週間以上細胞をインキュベートした。単一細胞由来の陽性のコロニーに印を付けた。顕微鏡カメラを用いてクローン由来の単一細胞の写真を撮影した。単一クローンを入れたウェルからの細胞をさらに１週間生育させ、クローニング開始から約４週間後に２４ウェルプレートに移した。
【０２１１】
クローンの選抜のための陽性クローンをスクリーニングするために用いた指標は、完全な及び開裂したＳＮＡＰ−２５の両方を認識する抗体を用いたウエスタンブロット解析によって測定した、Ｎｏｃ／Ａ又はＤｙｎ／Ａ処理後の最も多いＳＮＡＰ−２５開裂の量であった。試験に十分な細胞が得られた後、できる限りすぐに、ＯＲＬ−１を過剰発現しているクローンを1０ｎＭ及び３０ｎＭの再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａで一晩試験した（表８）。ＫＯＲ−１を過剰発現しているクローンをは１００ｎＭの再標的化エンドペプチダーゼＤｙｎ／Ａで一晩試験した（表９）。加えて、ＫＯＲ−１を過剰発現しているクローンは、実施例Ｉに記載したようなダイノルフィン結合アッセイにおいて試験した。
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【０２１２】
４．再標的化エンドペプチダーゼを用いた、安定してトランスフェクションされたクローン細胞株の用量反応スクリーニング。
セクション３において再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａの良好な取り込みを示した、安定してトランスフェクションされた候補クローン細胞株を、再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａに対する感受性及び効果を決定するために完全用量反応実験において試験した。化合物を処理する前に、Ｎ２及びＢ２７サプリメント、並びにＮＧＦ（５０〜１００ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、１ウェル当たり１ｘ１０５細胞になるように９６ウェルポリ−Ｄ−リジン又はコラーゲンＩＶコーティングプレートに２０±４時間プレーティングした。親ＡＧＮ  Ｐ３３細胞株及びＮＤ７クローン細胞株由来の細胞を、同じ培地中で２４時間、０、０．１４ｎＭ、０．４ｎＭ、１．２３ｎＭ、３．７ｎＭ、１１．１ｎＭ、３３．３ｎＭ、及び１００ｎＭのＮｏｃ／Ａで試験し、ＳＮＡＰ−２５を開裂させるために、再標的化エンドペプチダーゼを含まない培地中でさらに２４時間インキュベートした。親ＡＧＮ  Ｐ３３細胞株由来の細胞はまた、同じ培地中で２４時間、０、０．０３ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．２４ｎＭ、０．７４ｎＭ、２．２２ｎＭ、６．６７ｎＭ、及び２０ｎＭのＮｏｃ／Ａを用いて試験し、ＳＮＡＰ−２５を開裂させるために再標的化エンドペプチダーゼを含まない培地中でさらに２４時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を洗浄し、実施例ＩＩに記載したように、ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ用に細胞を溶解した。ＯＲＬ−１受容体を用いて試験したＡＧＮ  Ｐ３３親細胞株及び安定してトランスフェクションされたクローン細胞株のデータを表１０にまとめた。クローン＃２及び＃６は、親細胞株よりも再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａに対するより高い感受性及び効果を示した。さらに、新規のクローン細胞株の増加した感受性は、新規のクローン細胞株の感受性がより高いことを確認する用量反応において、より低い濃度の使用を可能にした。
【表１０】
0005826635.tif 000018
【０２１３】
ＯＲＬ−１受容体を用いて試験したＮＤ７親細胞株及び安定してトランスフェクションされたクローン細胞株からのデータを表１１にまとめた。試験した全てのクローンが、親細胞株ＮＤ７よりも再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａに対する改善した感受性及び効果を示した。クローン４Ｂ７、１Ｅ６、及び１Ｃ１１の感受性が最も高く、ＥＣ５０値は１０ｐＭ未満であった。
【表１１】
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【０２１４】
異なる細胞バックグラウンドにおける、ＯＲＬ−１受容体を過剰発現しているクローン細胞株の作出及び試験から得られた結果を表１２にまとめた。
【表１２】
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【０２１５】
実施例Ｖ  親ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株由来のクローン細胞株の作成。
以下の実施例は、再標的化エンドペプチダーゼのエキソサイトーシスの阻害に感受性である、又は再標的化エンドペプチダーゼの取り込み能力を有するクローン細胞をどのように確立された親細胞株から同定したかを説明する。
【０２１６】
１．クローン細胞株の単離。
ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株の解析を行っている間に、この確立された細胞株を構成する細胞には少なくとも５つの異なる細胞表現型が含まれることが明らかになった。これら表現型の異なる細胞型のうちのいずれか１つが、この細胞株の再標的化エンドペプチダーゼのエキソサイトーシスの阻害を受けやすい原因かどうかを決定するため、それぞれ表現型の異なる細胞型を単離する単一のコロニー得るための２種類の異なる限界希釈スクリーニングを行った。
【０２１７】
ＳＫ−Ｎ−ＤＺストック由来の好適な密度の細胞を、Ｔ１７５コラーゲンＩＶコーティングフラスコに入れたＤＭＥＭ、１０％  ウシ胎仔血清（熱不活性化）、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン中で生育させた。二回目の継代の後、細胞懸濁液を用意するために細胞をトリプシン処理した、細胞濃度を決定した。この細胞懸濁液から約４．０ｘ１０６個の細胞を５０ｍＬのチューブに移し、１０ｍＬシリンジを用い、１８．５ゲージの針を通して強制的に排出することを繰り返すことにより、細胞を単一の細胞になるまで分離した。次に、この分離単一細胞懸濁液からの細胞を１５ｍＬの新しい成長培地を添加することによって０．２ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度まで希釈し、１０細胞／ｍＬの濃度になるように、この希釈液２．５μＬを５０ｍＬの新しい成長培地に添加した。９６ウェルコラーゲンＩＶコーティングプレートのそれぞれのウェルにこの最終希釈ストックから１００μＬの成長培地を添加し、この細胞を一定に保たれた３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で４週間生育させた。４個の９６ウェルプレートを解析のために用意した。コロニーの成長を評価するために、定期的にプレートを顕微鏡的に解析した。４週間後、成育中の単一のコロニーを同定するためにそれぞれのウェルを顕微鏡的に解析し、同定されたそれぞれの成長中のコロニーについて、１００μＬの新しい成長培地をそれぞれのウェルに添加し、細胞を一定に保たれた３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で２週間生育させた。さらに２週間生育させた後、成長中の単一のコロニーをトリプシンで処理し、さらに培養を続けるために新しい９６ウェルプレートに移した。目視検査によってコロニーが約１，０００細胞まで生育したと判断した時点で細胞をトリプシンで処理し、それぞれの細胞懸濁液を２４ウェルコラーゲンＩＶコーティングプレートの新しいウェル中に移した。細胞を、必要に応じて２〜３日ごとに新しい成長培地で満たしながら、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で生育させた。培養が約６０％以上のコンフルエンスに達するまで細胞を生育させ、その時点で細胞をトリプシンで処理し、２４ウェルプレート中の細胞のコンフルエンスに基づき、それぞれの細胞懸濁液を２５ｃｍ２のコラーゲンＩＶコーティングフラスコ中に移した。細胞を、必要に応じて２〜３日ごとに新しい成長培地で満たしながら、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で生育させた。フラスコ中の細胞が７０〜８０％コンフルエンスに達した時点でそれらを凍結させ、Ｎｏｃ／Ａのエキソサイトーシスの阻害の受けやすさを決定するためにクローン細胞株を試験するまで、液体窒素中で保存した。両方のスクリーニングにおいて当初単離された３８４コロニーのうち、２４のクローン細胞株を生存能力及び成長の特徴に基づいて選択し、続くスクリーニング過程のために拡大した。これらのうち、早く成長する１２のを細胞株を同定した。
【０２１８】
２．再標的化エンドペプチダーゼを用いた、クローン細胞株由来細胞の再標的化エンドペプチダーゼ活性の受けやすさの一次スクリーニング。
クローン細胞株由来の細胞が再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａ活性に感受性であるかどうかを決定するために、エンドペプチダーゼ活性を決定する免疫を用いた一次スクリーニングを行った。
【０２１９】
１３のＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン（＃３、＃４、＃５、＃８、＃９、＃１０、＃１３、＃１５、＃１６、＃１７、＃１８、＃２２、及び＃２３）並びにＳＫ−Ｎ−ＤＺ親細胞をＥＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ、１ｘＢ２７、及び１ｘＮ２を入れた９６ウェルプレートにプレーティングし（１ウェル当たりの細胞数は不明）、一晩インキュベートした。細胞を１ｎＭのＮｏｃ／Ａで２４時間試験した。細胞を１００μＬのリシスバッファー中で２０分間溶解させ、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。１５μＬの２ｘＳＤＳ試料バッファーを５０μＬの細胞溶解物に加え、９５℃で５分間加熱した。１レーン当たり１０μＬのタンパク質試料を１２％  ＮｕＰａｇｅゲルにローディングし、実施例Ｉに記載した通りにウエスタンブロットアッセイを行った。全ＳＮＡＰ−２５及び開裂したＳＮＡＰ−２５の評価は、クローン＃３、＃８、＃１５、及び＃２２は親細胞と少なくとも同程度のＮｏｃ／Ａを取り込むことを示した。細胞を増やした後に完全用量反応処理及びＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いた解析を行った。
【０２２０】
３．再標的化エンドペプチダーゼ分子を用いたクローン細胞株の二次反応スクリーニング。
クローン細胞株由来の細胞が再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａ活性に感受性であるかどうかを決定するために、エンドペプチダーゼ活性を決定する免疫を用いた方法による二次スクリーニングを行った。
【０２２１】
クローニングしたこれらＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株をさらに比較するために、ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを行った。５つのクローン（＃３、＃９、＃１５、＃１６、＃２２）及びＳＫ−Ｎ−ＤＺ親細胞を、ＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＢＳ、１ｘＢ２７、及び１ｘＮ２培地（ＮＧＦを含まない）を入れた９６ウェルポリ−Ｄ−リジンコーティングプレートに、１細胞株につき、１ウェル当たり２５，０００細胞を週末にかけてプレーティングした。細胞を０〜２０ｎＭ（０、０．０３、０．０８、０．２４、０．７４、２．２２、６．６７、２０ｎＭ）の用量のＮｏｃ／Ａで２４時間処理した。実施例Ｉに記載したように、開裂したＳＮＡＰ−２５１９７をＥＣＬ  ＥＬＩＳＡアッセイを用いて定量した。
【０２２２】
表１３は、５つのクローン細胞株及び親細胞株のＥＣ５０値及びシグナル対ノイズを示す。＃３、＃９、及び＃１５とした３つのクローンはより低いＥＣ５０値（＜１ｎＭ）を表し、クローン＃１６及び＃２２は親細胞株（〜２ｎＭ）と比較して同程度のＥＣ５０値を表した。しかしながら、開裂したＳＮＡＰ２５からのシグナル総量はクローン＃３、＃２２、及び親細胞においてより高かった。残りの細胞株と比較して、クローン＃９、＃１６、及び＃１５はより低いシグナル総量を示した。
【表１３】
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【０２２３】
ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローンへのＮｏｃ／Ａ処理の条件を最適化し、クローン＃３、＃１５、及び＃２２、及び親異種ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株を比較するアッセイを行った。表１４は比較試験の結果を示し、アッセイの最適化がこのアッセイにおけるシグナル対ノイズを大きく改善したことを示した。クローン＃３及び＃２２が非常に良い感受性及び効果を有したため、これらをさらなるアッセイの作成のために選択した。
【表１４】
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【０２２４】
実施例Ｖ  再標的化エンドペプチダーゼの取り込みに関する、クローン細胞株の解析及び比較
以下の実施例は、異種の細胞集団を含む確立された細胞株から、又は標的受容体のトランスフェクションと続く細胞株のクローニングから得られたクローン細胞株をどのように解析及び比較したかを説明する。
【０２２５】
再標的化エンドペプチダーゼの取り込みにおける特異性又は選択性を評価するために、標的ドメインを欠損した再標的化エンドペプチダーゼを用いた非特異的取り込みアッセイを行った。オピオイド再標的化エンドペプチダーゼについては、ＡＧＮ  Ｐ３３クローン＃６細胞株（ＯＲＬ−１受容体をコードしている発現コンストラクトで安定して形質転換された細胞を含む）及びＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃３及び＃２２（内因性ＯＲＬ−１受容体を発現する細胞を含む）由来の細胞を、Ｎ２及びＢ２７サプリメント、及びＮＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０無血清培地を入れた９６ウェルポリ−Ｄ−リジンコーティングプレートに１ウェル当たり１５０，０００細胞個になるように播種し、化合物で処理する前に３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター中で２０±４時間インキュベートした。細胞を、同じ培地中で０〜２０ｎＭ又は０〜４０ｎＭまでの範囲の８種類の用量のＮｏｃ／Ａ、０〜４００ｎＭ又は０〜４０ｎＭまでの範囲の８種類の用量のＬＨＮ／Ａで２２時間処理した。サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ用に培地を除去し、細胞を洗浄し、溶解し、残渣を除去するために遠心分離した。２Ｅ２Ａ６モノクローナル抗体を用いてコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、１５０μＬブロッキングバッファー中、室温で１時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを除去した後、３０μＬの細胞溶解物をそれぞれのウェルに加え、プレートを４℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いてプレートを３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中の２％  ブロッキング試薬に溶解した５μｇ／ｍＬ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ  ＮＨＳ−エステル標識検出α−ＳＮＡＰ２５ポリクローナル抗体３０μＬをウェルの底部の隅に加えた。プレートを密閉し、室温で１時間振とうし、その後ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。洗浄が完了した後、１ウェル当たり１５０μＬの１ｘリードバッファーを加え、ＳＩ６０００  Ｉｍａｇｅ  ｒｅａｄｅｒを用いてプレートを測定した。陰性対照であるＬＨＮ／Ａに対するＮｏｃ／Ａの取り込みを比較した結果を表１５及び表１６に示した。Ｎｏｃ／Ａの特異的な取り込みを示していることにより、これらの結果は、両方の細胞株においてＮｏｃ／Ａ及びＬＨＮ／Ａの取り込みがよく分離したことを示す。
【表１５】
0005826635.tif 000023
【表１６−１】
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【０２２６】
３つの細胞株の解析及び比較における結果を表１７にまとめた。ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃３及び＃２２は、再標的化エンドペプチダーゼＮｏｃ／Ａにおけるロバストアッセイを作成するための初期ｅＤＲＧと同等の感受性、及び非常に良いシグナル対ノイズを有する。ＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６もまた、低い非特異的取り込み及び十分な感受性を有することから、非常に良い候補である。
【表１７】
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【０２２７】
再標的化エンドペプチダーゼ取り込みの感受性を評価するために、リガンド飽和結合アッセイを行った。大部分のリガンドの相互作用を、それらの結合部位を用いて結合親和性の観点から解析することができる（ＮＩＨアッセイの手引き）。通常、親和性の高い結合は親和性の低い結合よりも、リガンドのその受容体結合部位への長い滞留時間を含む。リガンド（Ｌ）（薬剤など）とタンパク質（Ｐ）との間の親和性、すなわち、リガンドがどの程度特定のタンパク質に強く結合するか、を記載するためには、解離定数が一般的に用いられる。平衡飽和結合実験は、様々な放射性リガンド濃度での、全及び非特異的結合（ＮＳＢ）を測定する。平衡解離定数又は放射性リガンドへの親和性であるＫｄ、及び受容体結合部位の最大数であるＢｍａｘは、非線形回帰解析を用いた特異的結合（全−ＮＳＢ）から算出することができる。特異的結合のＫｄは、下記の式で示した、一部位結合双曲線非線形回帰解析（すなわちＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を用いて算出することができる。式中、Ｂｍａｘは結合部位の最大数（ｐｍｏｌ／ｍｇ、又はｐｍｏｌ／細胞、又は部位／細胞）、及びＫｄ（ｎＭ、ｐＭ、など）は最大半量結合に達するために必要な放射性リガンドの濃度である。
【数１】
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【０２２８】
オピオイド再標的化エンドペプチダーゼについては、ＡＧＮ  Ｐ３３クローン＃６細胞株（ＯＲＬ−１受容体をコードしている発現コンストラクトで安定して形質転換された細胞を含む）、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ親細胞株、及びＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃３、＃１５、及び＃２２（内因性ＯＲＬ−１受容体を発現する細胞を含む）由来の細胞を、１ｘＮ２及び１ｘＢ２７サプリメントを含むＲＰＭＩ１６４０無血清培地を入れた４８ウェルポリ−Ｄ−リジンコーティングプレートに１ウェル当たり２００，０００細胞になるように播種し、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター中で一晩インキュベートした。培地を除去し、全結合を評価するために使用するウェルには細胞と１５０μＬのトリス結合バッファーを加え、非特異的結合を評価するために使用するウェルには１００μＬのトリス結合バッファーを加えた。約５０μＬの４ｘ最終濃度の放射性標識していないノシセプチン（ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株には２．５μＭ、及びＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６には１μＭ）を非特異的結合ウェルに加え、及び５０μＬの４ｘ最終濃度の３Ｈ−ノシセプチン（ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株には０ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．８ｎＭ、１．６ｎＭ、３．１ｎＭ、６．３ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、及び５０ｎＭ、及びＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６には０、０．０１ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０３９ｎＭ、０．０７８ｎＭ、０．１５６ｎＭ、０．３１３ｎＭ、０．６２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５．０ｎＭ、及び１０ｎＭ）を全結合ウェル及び非特異的結合ウェルの両方に、最終容量が２００μＬになるように加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、０．５ｍＬの放射性標識していない洗浄バッファーでウェルを２回洗浄した。その後細胞を２００μＬの２Ｎ  ＮａＯＨ中で変性し、５ｍＬのシンチレーション溶液を入れた２０ｍＬのシンチレーションバイアルに移した。生データを用いて用量反応グラフをプロッティングし、それぞれの試料のＫｄを算出した。得られた生データをＳｉｇｍａＰｌｏｔ  ｖ１０．０に移し、リガンド結合の数式カテゴリ以下の用量反応曲線を定義するために一部位飽和フィットを用いた。Ｒ２（相関係数）、Ｂｍａｘ、及びＫｄ±ＳＥ（係数±標準誤差）の指標を含む画像レポートを生成した。ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃３、＃１５、及び＃２２、並びにＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６細胞について行ったアッセイから、全結合、特異的結合、及び非特異的結合の画像を得た。ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃３及び＃２２は、濃度依存的、及び飽和可能な３Ｈ−ノシセプチンの結合を表した。同じ実験条件下において、ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃１５は３Ｈ−ノシセプチンの用量依存的な反応を表したが、最も高い５０ｎＭにおいても飽和しなかった。内因性ＯＲＬ−１を発現しているＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株と比較して、ＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６由来の細胞は、低い非特異性的結合を伴う、３Ｈ−ノシセプチンへの有意に高い親和性結合を示した（最大用量は１０ｎＭ対ＳＫ−Ｎ−ＤＺにおける５０ｎＭ）。
【０２２９】
異なる３日間に、１細胞株当たりに３回独立して行った結合実験のＫｄ及びＢｍａｘ値を予測するために、ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃３、＃２２、＃１５及びＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６の飽和結合曲線を用いた。これら４つの細胞株の順位は：ＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６（Ｋｄ＝１．８６ｎＭ及びＢｍａｘ＝２．９ｆｍｏｌ／細胞）＞ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃３（Ｋｄ＝１４ｎＭ及びＢｍａｘ＝０．６ｆｍｏｌ／細胞）＞ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃２２（Ｋｄ＝１７ｎＭ及びＢｍａｘ＝０．６ｆｍｏｌ／細胞）≫ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃１５（Ｋｄ＞５０ｎＭ）である。ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃１５の飽和用量反応を得るためには、必要とされるより高い用量範囲の３Ｈ−ノシセプチンを用いた。安定な細胞株である３つのＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株、＃３、＃１５、及び＃２２、並びにＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６における特異的な原形質膜ノシセプチン−結合部位の解析におけるデータを表１６にまとめる。データは以下のことを示した：１）ＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６における、非常に低い非特異的結合を伴う高い親和性部位（Ｋｄ、１．８ｎＭ、及びＢｍａｘ、２．９ｆｍｏｌ／細胞）；２）内因性受容体を発現しているＳＫ−Ｎ−ＤＺ天然細胞においてノシセプチン−結合が生じる可能性がある；３）ＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６はＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株よりも約１０倍高いノシセプチンへの親和性を有した；４）細胞を用いた効力アッセイにおいて見られるように、ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃３及び＃２２（Ｋｄ、１４〜１７ｎＭ、Ｂｍａｘ、０．６ｆｍｏｌ／細胞）は１細胞当たりにＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃１５よりも数多くの受容体部位を有した（同じ用量範囲では飽和しない）。
【表１８】
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【０２３０】
再標的化エンドペプチダーゼの取り込みの感受性を評価するために、発現した再標的化エンドペプチダーゼ受容体の量を、ＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルで評価した。細胞において発現した受容体の量は試験に用いる細胞株の解析において重要な観点であり、再標的化エンドペプチダーゼの感受性に関係する。発現した再標的化エンドペプチダーゼ受容体の量は、その他の可能性のある細胞株のスクリーニングにおける、及び標的受容体を発現しない細胞株を除去するための道具にもまたなる。受容体発現を測定する１つの方法は、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて再標的化エンドペプチダーゼ受容体ｍＲＮＡの量を定量することである。
【０２３１】
オピオイド再標的化エンドペプチダーゼについては、無血清培地又は血清を含む培地のいずれかで生育させたトランスフェクションしていない親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞、ＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６由来の細胞、親ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株由来の細胞、及びＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃３及び＃２２由来の細胞からＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ＯＲＬ−１を増幅させ、下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、それぞれの細胞株中に存在する相対量を決定するためにリアルタイムを測定した。ＯＲＬ−１用プライマー：フォワード５’−ＣＡＣＴＣＧＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１４８）及びリバース５’−ＡＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＡＧＴＣＴＣＧＣ−３’（配列番号１４９）。ＤＮＡを、反応液中に存在する二本鎖ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）の量に比例して蛍光を発する、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｒｅｅｎを用いて定量する。蛍光量対サイクル数をプロッティングすることにより、それぞれの反応のロジスティック曲線が得られる。曲線の直線位相により早く達する反応中には、より多くのＯＲＬ−１受容体ｃＤＮＡが存在する。異物の混入がないかどうかを決定するために、酵素を加えていない対照ＲＴ反応を用いる。この反応中にはＲＴ酵素が含まれないため、ｃＤＮＡは生産されない。ＲＮＡ鋳型を用いてもＰＣＲ産物が生産されないが、−ＲＴ反応においてＰＣＲ曲線が見られる場合、唯一の可能性はゲノムＤＮＡの混入である。−ＲＴ反応において、ＰＣＲプロットが見られない場合、最小限のゲノムＤＮＡの混入しかないことが確認できる（データは示さない）。表１８に細胞株とそのＣＴ値を示す。ＣＴはＰＣＲのサイクル数であり、設定した閾値以上のシグナルを生じるＰＣＲ反応と対応する。対応するＣＴ値を見ることにより、細胞株中のＯＲＬ−１受容体ｍＲＮＡの量を別のものと比較することができる。ＣＴ値によると、無血清培地（平均ＣＴ：２８．６対１７．３）及び血清を含む培地（平均ＣＴ：２６．１対１６．５）において、ＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６由来の細胞は親ＳｉＭａ細胞株由来の細胞よりも非常に多いＯＲＬ−１  ｍＲＮＡを含んだ。また、ＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６の６回目の継代対１６回目の継代由来の細胞から得られたｍＲＮＡにおいては最小限の差がみられるようだった。また、親ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株対クローン細胞株＃３及び＃２２のＣＴ値及びプロットにおいても最小限の差が見られた。この結果は血清を含む培地及び無血清培地中で生育させた細胞において真実であり、及びＮｏｃ／Ａにおける細胞を用いた効力アッセイで見られたこれら細胞株の類似性を反映している。
【表１９】
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【０２３２】
実施例ＶＩＩ  ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基に自由なカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の作成
以下の実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体をどのように作成したかを説明する。
【０２３３】
１．α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の生成。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合することができるモノクローナルα−ＳＮＡＰ−２５抗体を作成するために、ＳＮＡＰ−２５開裂産物抗原として１３−残基のペプチドＣＤＳＮＫＴＲＩＤＥＡＮＱｃｏｏＨ（配列番号３８）を設計した。このペプチドは、柔軟なリンカー領域、並びにＫＬＨ及びカルボキシル化Ｃ末端グルタミン（配列番号３８）を有するヒトＳＮＡＰ−２５（配列番号５）の及びアミノ酸１８６〜１９７と結合するためのＮ末端システイン残基を含む。適切に選択した、エピトープ特異性の制御を提供する独特なペプチド配列に対するモノクローナル抗体の生成は、近縁のアイソフォームのプール間のタンパク質の同定の亜集団の特定を可能にする。Ｂｌａｓｔ検索により、このペプチドがＳＮＡＰ−２５のみに対して高い相同性を有し、かつ、神経細胞におけるその他のいずれのタンパク質ともほとんど交差反応しないことが明らかになった。疎水性親水性指標、タンパク質表面確率、可撓性のある領域、及び好ましい二次構造、並びに続く特定の配向及び選択したペプチド配列の表出を決定するためのコンピューターアルゴリズムを用いて、配列をまた、注意深く精査した。ペプチドを合成し、免疫原性を高めるために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた。６匹のＢａｌｂ／ｃマウスをこのペプチドを用いて免疫し、約８週間における３回の免疫化の後、試験のためにマウスから採血した。血液を４℃で６０分間インキュベートすることによって凝固させた。細胞残渣を沈殿させるために、凝血塊を１０，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した。得られた血清試料を５０μＬずつに分け、使用まで−２０℃で保存した。
【０２３４】
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を作成するために、その他のＳＮＡＰ−２５抗原をもとに、本明細書において開示したものと類似の方法を用いることができる。例えば、、配列番号４５のＳＮＡＰ−２５抗原を配列番号３８のＳＮＡＰ−２５抗原の代わりにＫＬＨに結合させることができる。別の例としては、配列番号３８のＳＮＡＰ−２５抗原由来のヒトＳＮＡＰ−２５の１８６〜１９７番目のアミノ酸を配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４で置換することができる。
【０２３５】
２．α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の存在のスクリーニング。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の存在を決定するために、抽出したマウス血清を用いて、比較ＥＬＩＳＡ及び細胞を用いた開裂アッセイを行った。比較ＥＬＩＳＡ用に、配列番号４８のＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７、及び配列番号４９のＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６の、２つの融合タンパク質を構築した。ＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７は、配列番号５の１３４〜１９７番目のアミノ酸を含むＳＮＡＰ−２５ペプチドにアミノ末端によって結合する、配列番号５０の天然にビオチン化した１６アミノ酸のＢｉｒＡペプチドを含む。ＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６は、配列番号５の１３４〜２０６番目のアミノ酸を含むＳＮＡＰ−２５ペプチドにアミノ末端によって結合する、配列番号５０の天然にビオチン化した１６アミノ酸のＢｉｒＡペプチドを含む。１０μｇ／ｍＬ濃度のＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７及びＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６のこれら２つの基質を１ｘＰＢＳ中に懸濁した。およそ１００μＬの適した基質溶液を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートすることにより、ＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７及びＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６を個別のプレート上にコーティングした。洗浄したプレートを、１：１０〜１：１００に希釈した免疫した６匹のマウス（マウス１、マウス２、マウス３、マウス４、マウス５、及びマウス６）のうちの１匹由来の抗体を含む血清を含む１ｘＴＢＳに含まれる０．５％  ＢＳＡ中で３７℃で１時間インキュベートした。一次抗体でプロービングしたプレートを、２００μＬ  ＴＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で４回、それぞれの回につき５分間洗浄した。洗浄したプレートを、１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を二次抗体として含む１ｘＴＢＳ中、３７℃で１時間インキュベートした。二次抗体をプロービングしたプレートを、２００μＬ  ＴＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で４回洗浄した。標識したＳＮＡＰ−２５産物の発色の検出をＩｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ  ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いた発色の検出によって可視化した。ＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７でコーティングしたプレートでは黄色の発色が見られ、ＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６をコーティングしたプレートでは見られなかったことは、α−ＳＮＡＰ−２５抗体が主にＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物を認識することを意味した。結果は、免疫化に用いられた６匹のマウスのうち、３匹のマウス（マウス２、マウス３、及びマウス４）がより高い力価を有し、かつ、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に対してより特異性が高いことを示した。
【０２３６】
これらの結果をＥＬＩＳＡ軽鎖活性アッセイを用いて確認した。およそ１００μＬの以下の基質溶液を添加することにより、９６ウェルＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄストレプトアビジンコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を調製した。A〜C列を１２種類の異なる濃度のＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７、１００μＬでコーティングした；Ｄ〜Ｈ列を、１０μｇ／ｍＬのＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６、１００μＬでコーティングした。基質溶液を吸引し、２００μＬ  ＴＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でそれぞれのウェルを３回リンスすることにより、プレートを洗浄した。ＢｏＮＴ／Ａインキュベーションバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１％  ウシ胎仔血清、１０μＭ  ＺｎＣｌ２、１０ｍＭ  ジチオトレイトール）中、３７℃で２０分間、ＢｏＮＴ／Ａ希釈液を先に還元し、１００μＬの先に還元したＢｏＮＴ／Ａを基質コーティングプレート上に添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。ＢｏＮＴ／Ａインキュベーションバッファーを吸引し、２００μＬ  ＴＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でそれぞれのプレートを３回リンスすることにより、ＢｏＮＴ／Ａで処理したプレートを洗浄した。洗浄したプレートを、１：１０〜１：１００に希釈した試験する抗体を含む血清を含む１ｘＴＢＳに溶解した０．５％  ＢＳＡ中、３７℃で１時間インキュベートした。一次抗体でプロービングしたプレートを２００μＬ  ＴＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で４回、それぞれの回につき５分間洗浄した。洗浄したプレートを、１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を二次抗体として含む１ｘＴＢＳ中、３７℃で１時間インキュベートした。二次抗体でプロービングしたプレートを、２００μＬ  ＴＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）中で４回洗浄した。標識したＳＮＡＰ−２５産物の発色の検出は、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ  ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いた発色の検出の可視化によって行った。免疫化した全てのマウス（マウス１、マウス２、マウス３、マウス４、マウス５、及びマウス６）由来の抗体を含む血清を用いることにより、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物の存在に対応する黄色の発色がＢｏＮＴ／Ａで処理した試料においては見られたが、未処理の対照においては見られなかった。従って、比較ＥＬＩＳＡ解析は免疫化に用いたマウスのうち、３匹のマウス（マウス２、マウス３、及びマウス４）がより高い力価を有し、かつ、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に対してより高い特異性を有することを示した。
【０２３７】
細胞を用いた開裂アッセイ用に、好適な密度のＰＣ１２細胞を、３ｍＬの適した血清培地（表１）を入れた６０ｍｍ２の組織培養プレート中にプレーティングした。細胞を、細胞が適当な密度に達するまで、３７℃のインキュベーター中、５％  二酸化炭素存在下で生育させた。室温で５分間インキュベートした１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清使用量低減培地を、１０μｇのｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクト（配列番号５１）を含む２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清使用量低減培地に添加することにより、５００μＬのトランスフェクション溶液を調製した。ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクトは、そのプロモーターエレメントが、配列番号５２のＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖をコードしているポリヌクレオチドに機能的に連結しているｐＱＢＩ−２５発現ベクター（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む。このトランスフェクション混合液を室温でおよそ２０分間インキュベートした。培地を新しい添加していない培地で置換し、５００μＬのトランスフェクション溶液を細胞に添加した。細胞をその後、３７℃のインキュベーター中、５％  二酸化炭素存在下でおよそ６〜１８時間インキュベートした。実施例ＩＩに記載したように、細胞を洗浄し、回収した。開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物の存在を検出するために、それぞれの回収した試料の一部を、１：１，０００に希釈した抗体を含む血清を一次抗体として、及び１：２０，０００に希釈したマウスα−ＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を二次抗体として使用した以外は実施例ＩＩに記載したようにウエスタンブロットによって解析した。３匹のマウス（マウス２、マウス３、及びマウス４）由来の抗体を含む血清を用いた場合、ＢｏＮＴ／Ａで処理した試料においては、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物に対応する単一のバンドが検出されたが、未処理の対照においては検出されなかった。従って、細胞を用いた開裂アッセイは、免疫化に用いたマウスのうち、３匹のマウス（マウス２、マウス３、及びマウス４）がより高い力価を有し、かつ、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に対してより高い特性性を有することを示した。
【０２３８】
３．ハイブリドーマの作出。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作出するために、最終的な「追加」免疫化の３日間後に、マウス２から脾臓を摘出し、標準的なハイブリドーマプロトコールを用いて、脾臓細胞を骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３  Ａｇ８．６５３と融合させた。これらの細胞を５つの９６ウェルプレートにプレーティングし、ＨＡＴ培地を用いて雑種を選別した。融合後８〜１４日間以内に、ＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７及びＢｉｒＡ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（登録商標）−ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６ペプチドでコーティングした２枚の個別のプレートを用いた比較ＥＬＩＳＡにより、およそ４８０の親クローンの一次スクリーニングを行った。比較ＥＬＩＳＡは、開裂したＳＮＡＰ−２５１９７に特異的な抗体を生産するハイブリドーマを同定するための迅速なスクリーニングを提供した。上から１８のクローンを、上述した細胞を用いた開裂アッセイ及びＬＣ／Ａをトランスフェクションした細胞の免疫染色を用いたさらなるスクリーニングに用いた（表２０）。
【表２０】
0005826635.tif 000029
【０２３９】
クローン１Ｄ３、１Ｇ１０、２Ｅ２、３Ｃ１、３Ｃ３、及び３Ｅ８によって生産された馴化培地がＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物とＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質との比１９７／２０６が少なくとも４：１である、好ましい結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含んだことから、クローン１Ｄ３、１Ｇ１０、２Ｅ２、３Ｃ１、３Ｃ３、及び３Ｅ８を限界希釈法によってさらにクローニングし、細胞を用いた開裂アッセイ及びＧＦＰ−ＬＣ／Ａを用いてトランスフェクションしたＰＣ１２細胞の免疫染色によってＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物を検出した。同様に、クローン２Ｃ９、２Ｆ１１、３Ｇ２、４Ｄ１及び４Ｇ６よって生産される馴化培地がＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質とＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物との比１９７／２０６が少なくとも１．５：１の好ましい結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含んだことから、クローン２Ｃ９、２Ｆ１１、３Ｇ２、４Ｄ１及び４Ｇ６を限界希釈法によってさらにクローニングし、細胞を用いた開裂アッセイを用いてＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質を検出した。比較ＥＬＩＳＡ、細胞を用いた開裂、及び、それらの親和性及び特異性を確認するための免疫染色を用いてこれら単一細胞由来のクローンを再度スクリーニングし、標準的な方法を用いて抗体のアイソタイプを分類した。クローン１Ｄ３Ｂ８（ＩｇＭ．ｋ）、１Ｇ１０Ａ１２（ｌｇＧ３．ｋ）、２Ｃ９Ｂ１０（ｌｇＧ３．ｋ）、２Ｅ２Ａ６（ｌｇＧ３．ｋ）、２Ｆ１１Ｂ６（ＩｇＭ．ｋ）、３Ｃ１Ａ５（ｌｇＧ２ａ．ｋ）、及び３Ｃ３Ｅ２（ｌｇＧ２ａ．ｋ）から腹水を生産した。クローン３Ｅ８はクローニングの過程の最中に抗体生産を停止したため、それ以上評価することができなかった。
【０２４０】
４．α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合特異性の評価。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合特異性を評価するために、細胞を用いた活性アッセイ、免疫細胞化学及び免疫沈降によるＳＮＡＰ−２５開裂産物の検出において、クローン１Ｄ３Ｂ８、１Ｇ１０Ａ１２、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、２Ｆ１１Ｂ６、３Ｃ１Ａ５、及び３Ｃ３Ｅ２由来の腹水を用いた。
【０２４１】
細胞を用いた活性アッセイについては、ウエスタンブロット解析により、α−ＳＮＡＰ−２５抗体を含む腹水の、開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質及び開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物を検出する能力を解析することによって結合特異性を決定した。好適な密度のＰＣ１２細胞を、３ｍＬの適した血清 培地を入れた６０ｍｍ２組織培養プレート中にプレーティングし、細胞が適当な密度に達するまで３７℃のインキュベーター中、５％  二酸化炭素存在下で生育させ、ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクト（トランスフェクションしていない細胞）を含まないトランスフェクション溶液又はｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクト（トランスフェクションした細胞）を含むトランスフェクション溶液のいずれかを用いて上述した通りにトランスフェクションした。実施例Ｉに記載したように細胞を洗浄し、回収した。開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質及び開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物両方の存在を検出するために、それぞれの回収した試料の一部を、１：１００に希釈したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を含む腹水を一次抗体として、及び１：２０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したα−マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を二次抗体として使用した以外は実施例Ｉに記載したようにウエスタンブロットによって解析した。加えて、３種類の市販されているマウスα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を試験した。製造業者によると開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質及び開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物の両方を検出する、α−ＳＮＡＰ−２５抗体であるＳＭＩ−８１（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｌｕｔｈｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、製造業者の推奨に従って１５，０００倍希釈で使用した。製造業者によると開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質及び開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物の両方を検出するα−ＳＮＡＰ−２５抗体であるＭＣ−６０５０（Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｌａｓ  Ｖｅｇａｓ、ＮＶ）を、製造業者の推奨に従って１：１００希釈で使用した。製造業者によると開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物のみを検出するα−ＳＮＡＰ−２５抗体であるＭＣ−６０５３（Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｌａｓ  Ｖｅｇａｓ、ＮＶ）を、製造業者の推奨に従って１：１００希釈で使用した。
【０２４２】
表２１は、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物のみを検出したα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含む腹水を示す。細胞を用いた開裂アッセイは、クローン１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５、及び３Ｃ３Ｅ２から生産された腹水がＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質と比較した場合に、この開裂産物を選択的に認識することを可能にする、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物への高い結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を合成することを示した。市販の抗体であるＳＭＩ−８１はＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質を検出したが、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物をわずかにしか認識しなかった（表２１）。驚くことに、市販の抗体であるＭＣ−６０５０はＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質のみしか検出せず、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物を認識しなかった（表２１）。さらに驚くことに、市販の抗体であるＭＣ−６０５０はＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質のみしか認識せず、この抗体がＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物を選択的に検出するという製造業者による広告にも関わらず、ＳＮＡＰ−２５−Ｉ９７開裂産物を認識しなかった（表２１）。従って、この解析は、１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５、及び３Ｃ３Ｅ２はＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物への好適な選択性を示すが、１Ｇ１０Ａ１２及び２Ｆ１１Ｂ６はそうではないことを示す。加えて、市販の抗体であるＳＭＩ−８１、ＭＣ−６０５０及びＭＣ−６０５３の全てがＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物の選択的な検出に失敗したことから、本明細書で開示した免疫を用いた方法には適さない。
【０２４３】
免疫細胞化学解析については、α−ＳＮＡＰ−２５抗体を含む腹水の、開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質及び開裂したＳＮＡＰ−２５−Ｉ９７産物を検出する能力を免疫染色によって解析することにより、結合特異性を決定した。例えば、Ｅｓｔｅｒ  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ、Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（９）：３２０８−３２１３（２００４）を参照のこと。好適な密度のＰＣ１２細胞をプレーティングし、生育させ、ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクトを含まないトランスフェクション溶液（トランスフェクションしていない細胞）又はｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクトを含むトランスフェクション溶液（トランスフェクションした細胞）のいずれかを用いて、上述したようにトランスフェクションした。１ｘＰＢＳ中で細胞を洗浄し、５ｍＬのＰＡＦ中、室温で３０分間固定した。固定した細胞をリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、５ｍＬの１ｘＰＢＳに溶解した０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル）中でインキュベートし、１ｘＰＢＳで洗浄し、５ｍＬのメタノール中、−２０℃で６分間透過処理を行った。透過処理を行った細胞を５ｍＬの１００ｍＭ  グリシン中、室温で３０分間ブロッキングし、１ｘＰＢＳ中で洗浄し、１ｘＰＢＳに溶解した５ｍＬの０．５％  ＢＳＡ中、室温で３０分間ブロッキングした。ブロッキングした細胞を１ｘＰＢＳ中で洗浄し、１：１０に希釈した試験するクローンハイブリドーマ細胞株由来の腹水を含む１ｘＰＢＳに溶解した０．５％  ＢＳＡ中、室温で２時間インキュベートした。一次抗体でプロービングした細胞を１ｘＰＢＳ中で３回、それぞれの回につき５分間洗浄した。洗浄した細胞を１：２００希釈したＡＬＥＸＡ（登録商標）ＦＬＵＯＲ  ５６８に結合したヤギポリクローナル抗マウス免疫グロブリンＧ、重鎖及び軽鎖（ＩｇＧ、Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を二次抗体として含む１ｘＰＢＳ中、室温で２時間インキュベートした。二次抗体でプロービングした細胞を１ｘＰＢＳ中で３回、それぞれの回につき５分間洗浄した。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）封入培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）にマウントし、カバーグラスを乗せることにより、顕微鏡実験用に洗浄した細胞を調製した。適したレーザーの設定を用いたＬｅｉｃａ共焦点顕微鏡により、シグナル検出画像を得た。表２１は、ＳＮＡＰ−２５１９７−開裂産物を特異的に検出したα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含む腹水を示す。免疫細胞化学解析は、クローン１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５、及び３Ｃ３Ｅ２由来の腹水は、ＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質と比較した場合に、この開裂産物を主に認識することを可能にする、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物に対して高い結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５モ��クローナル抗体を合成することを示した。
【０２４４】
免疫沈降解析については、精製されたα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体であるプロテインＡ（ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＡ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の、開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質及び開裂したＳＮＡＰ−２５−Ｉ９７産物を沈殿させる能力を解析することにより、結合特異性を決定した。例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ８  Ｓｔｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｐｐ．３０９−３１１、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、前記、１９９８ａを参照のこと。好適な密度のＰＣ１２細胞をプレーティングし、生育させ、ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ発現コンストラクトを含むトランスフェクション溶液（対照細胞；配列番号５３）又はｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ−ＢｏＮＴ／Ａ−ＬＣ発現コンストラクトを含むトランスフェクション溶液（実験細胞）のいずれかを用いて、上述したようにトランスフェクションした。ｐＱＢＩ−２５／ＧＦＰ発現コンストラクトは、そのプロモーターエレメントが配列番号５４のＧＦＰをコードしているポリヌクレオチドに機能的に連結している発現ベクターを含む。一晩インキュベートした後、成長培地を吸引し、２００μＬの１ｘＰＢＳを用いてそれぞれのウェルをリンスすることによって細胞を洗浄した。細胞を回収するために、ＰＢＳを吸引し、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＤＴ、１０％  グリセロール、１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル）及び１ｘＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む免疫沈降リシスバッファーを添加し、４℃で一時間インキュベートすることによって細胞を溶解した。細胞残渣を除去するために、溶解した細胞を３，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を清潔なチューブに移し、タンパク質濃度がおよそ１ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。およそ５μｇの精製したモノクローナル抗体を０．５ｍＬの希釈した上清に添加し、４℃で２時間インキュベートした。一次抗体をインキュベートした後、およそ５０μＬの固定化プロテインＧ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を希釈した上清に添加し、４℃で１時間インキュベートした。０．５ｍＬの免疫沈降リシスバッファーを添加し、タンパク質Ｇを沈殿させるために３００ｘｇ、４℃で１分間遠心分離し、上清を移すことにより、インキュベートした上清を３回、それぞれの回につき３０分間洗浄した。洗浄した後、沈殿物を３０μＬの１ｘＳＤＳローディングバッファー中に再懸濁し、試料を９５℃まで５分間加熱した。開裂していないＳＮＡＰ−２５２０６基質及び開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物の両方の存在を検出するために、それぞれの回収した試料の一部を、１：１，０００に希釈したα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体血清（実施例Ｖを参照）を一次抗体として用い、１：２０，０００に希釈したウサギα−ＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒ���ｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を二次抗体として用いた以外は実施例Ｉに記載したように、ウエスタンブロットによって解析した。表２１は免疫沈降解析によってＳＮＡＰ−２５１９７−開裂産物を特異的に沈降させたα−ＳＮＡＰ−２５抗体を含む腹水を示す。免疫沈降解析は、クローン２Ｅ２Ａ６及び３Ｃ１Ａ５由来の腹水が、ＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質と比較した場合にこの開裂産物を主に認識することを可能にする、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物への高い結合特異性を有するα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を合成することを示した。
【表２１】
0005826635.tif 000030
【０２４５】
５．α−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合親和性の評価。
ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物又はＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質のいずれかに対して高い結合特異性を示すα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の結合親和性を決定するために、結合親和性アッセイを、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭ５）センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いたＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００装置上で行った。解析は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０を含むＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用い、２５℃、流速１０μＬ／分で行った。標準的なアミンカップリングを用い、ＣＭ５センサーチップの表面に配列番号５のアミノ酸１３４〜１９７（ＳＮＡＰ−２５１３４−１９７）又は配列番号５のアミノ酸１３４〜２０６（ＳＮＡＰ−２５１３４−２０６）を含むＳＮＡＰ−２５ペプチドを共有結合させた。簡潔に説明すると、０．２Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及び０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドの混合液を７分間注入することによってＣＭ５チップを活性化し；その後ＳＮＡＰ−２５ペプチドを、２０分かけて流速１０μＬ／分で１０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中に注入し；そして１Ｍ  エタノールアミン塩酸塩、ｐＨ８．５を７分間注入することにより反応していないコハク酸イミドエステルをブロッキングした。チップ上の固定化量のＳＮＡＰ−２５１３４−１９７又はＳＮＡＰ−２５１３４−２０６は、反応単位で１００〜１５０の上昇（約０．１０〜０．１５ｎｇ／ｍｍ２）を反映した。結合時間を１０分、解離時間を２０分として、クローン１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５、及び３Ｃ３Ｅ２から生産した腹水又は精製したモノクローナル抗体を含む抗体試料、並びに市販されているα−ＳＮＡＰ−２５抗体のいずれかをＣＭ５チップの表面に流した。１０ｍＭ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を流速１５μＬ／分で１分間注入することにより、解析間で表面を再生した。センサーグラム曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを用いて１：１の動的結合モデルにフィッティングさせた。
【０２４６】
結果は、２Ｅ２Ａ６及び３Ｃ１Ａ５の両方が、ＳＮＡＰ−２５開裂していない基質よりも開裂したＳＮＡＰ−２５１９７産物に高い特異性を有することを示す（表２２）。ＭＣ−６０５０及びＭＣ−６０５３の結合親和性と比較した場合、これら市販の抗体と比べ、１Ｄ３Ｂ６はおよそ１０倍高いＳＮＡＰ−２５開裂産物に対する平衡解離定数を有した（表２２）。興味深いことに、これら市販の抗体と比べて、２Ｅ２Ａ６はわずかに低いＳＮＡＰ−２５開裂産物対する平衡解離定数のみを有した（０．４０５ｎＭ対０．４９７及び０．５０８）（表２２）。これら市販のα−ＳＮＡＰ−２５抗体はいずれもＳＮＡＰ−２５開裂産物を選択的に認識せず（表２１）、それら選択性の達成に部分的には問題のある、０．５ｎＭよりも低い平衡解離定数を示した。同様に、ＭＣ−６０５０及びＭＣ−６０５３の結合親和性と比較した場合、２Ｅ２Ａ６は少なくとも約１倍遅いオフレート／解離定数（６．７４ｘ１０−５対８．８２ｘ１０−４ｓ−１及び１．１８ｘ１０−３ｓ−１）（表２２）を有した。このことはさらに、ＳＮＡＰ−２５開裂産物に対する選択的な結合を達成するには部分的に問題のある、約８．８２ｘ１０−４よりも低いオフレート／解離定数を示すことを示唆する。この結果は、５．７８ｘ１０−５ｓ−１のオフレート／解離定数を有した１Ｄ３Ｂ８の結果と一致する（表２２）。
【表２２】
0005826635.tif 000031
【０２４７】
６つの異なる抗体を比較するために、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェアからのプログラムを用いて、それぞれのオンレート（ｋａ）及びオフレート（ｋｄ）を標準化した。オンレートの比較用に、まず最初に再生部分及び注入によるスパイク状のノイズを除去することによってデータを個々にトリミングし、その後０〜１００スケールに標準化した。オフレートの比較については、注入のストップ／トップポイントまでデータを標準化した。この解析は、２Ｃ９Ｂ１０がその他の抗体よりもかなり遅いオンレートを有し（図７Ａ）、ＭＣ−６０５３がその他の抗体よりかなり早いオフレート（解離）を有したことを示した（図７Ｂ）。ＭＣ−６０５３の早いオフレートは、洗浄しの工程においてこの抗体が基質抗原への結合を維持することが難しいため、この抗体が本明細書において開示した方法においてはうまく機能しないことを示す。
【０２４８】
６．単離したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のエピトープのシークエンシング。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−
２５抗原に選択的に結合することができる単離したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のエピトープを決定するために、ハイブリドーマ１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５及び３Ｃ３Ｅ２由来のα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体の可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）鎖をコードしているポリヌクレオチド分子のシークエンシングを行った。標準的なプロトコールを用いてそれぞれのハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出、精製し、オリゴｄＴ抗センスプライマー又は遺伝子特異的（マウスＩｇＧ１  ＣＨ及びカッパＣＬ）抗センスプライマーのいずれかを用いてｃＤＮＡへと逆転写した。抗体のアイソタイプを決定するために、ｃＤＮＡ生産後、マウス及びヒト定常ドメイン特異的プライマーを用いてＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅した。ｃＤＮＡからの可変ドメインを増幅するために、ＶＨ及びＶＬ縮重プライマーを用いた。５’ＲＡＣＥ用に、ホモポリマーｄＣＴＰテイルをｃＤＮＡの３’末端に付加した。その後、オリゴｄＧセンスプライマー及び遺伝子特異的（ＣＨ／ＫＣ）抗センスプライマーを用いて重鎖及び軽鎖を増幅した。シグナルペプチド、可変ドメイン及び定常ドメインの配列に含まれるＰＣＲ産物は抗センスプライマー次第であった。小断片を除去するためにＰＣＲ産物をゲルを用いて精製しそしてシークエンシング用に平滑又はＴＡベクターにクローニングした。それぞれの鎖につき、５つの個別のクローンをシークエンシンし、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖及びコンセンサス配列のアライメントを作成した。ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を決定する方法は、引用することによりそのそれぞれの全文が本明細書に組み入れられる、例えば、Ｒｏｇｅｒ  Ａ．  Ｓａｂｂａｄｉｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓａｍｅ，米国特許第２００７／０２８１３２０号；及びＰｅｔｅｒ  Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  ａｓ  Ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，  ６５（９）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ３７４３−３７５２，に記載される。加えて、抗体の可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖をシークエンシング、及びＣＤＲ領域を同定する、市販のサービスもまた使用できる。例えば、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｉｒｅｌａｎｄを参照のこと。一例として、３Ｃ１Ａ５  ＶＬ領域を、アフィニティ精製した抗体を高分解能２ＤＥ電気泳動により分離し、その後タンパク質をタンパク消化した後に高分解能ｎａｎｏＬＣ−ＭＳＭＳを用いたペプチド断片化フィンガープリント解析にかけることによってアミノ酸配列を決定した。
【０２４９】
本明細書において開示したハイブリドーマから生産したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含むポリヌクレオチド配列は以下の通りである：１Ｄ３Ｂ８  ＶＨ（配列番号７１）、２Ｃ９Ｂ１０  ＶＨ（配列番号７３）、２Ｅ２Ａ６  ＶＨ（配列番号７５）、３Ｃ１Ａ５  ＶＨ（配列番号７７）、３Ｃ３Ｅ２  ＶＨ変異体１（配列番号７９）、３Ｃ３Ｅ２  ＶＨ変異体２（配列番号８１）、３Ｃ３Ｅ２  ＶＨ変異体３（配列番号１３２）、１Ｄ３Ｂ８  ＶＬ（配列番号８３）、２Ｃ９Ｂ１０  ＶＬ（配列番号８５）、２Ｅ２Ａ６  ＶＬ（配列番号８７）、３Ｃ１Ａ５  ＶＬ（配列番号８９）、及び３Ｃ３Ｅ２  ＶＬ（配列番号９１）。本明細書において開示したハイブリドーマから生産したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含むアミノ酸配列は以下の通りである：１Ｄ３Ｂ８  ＶＨ（配列番号７２）、２Ｃ９Ｂ１０  ＶＨ（配列番号７４）、２Ｅ２Ａ６  ＶＨ（配列番号７６）、３Ｃ１Ａ５  ＶＨ（配列番号７８）、３Ｃ３Ｅ２  ＶＨ変異体１（配列番号８０）、３Ｃ３Ｅ２  ＶＨ変異体２（配列番号８２）；３Ｃ３Ｅ２  ＶＨ変異体２（配列番号１３３）、１Ｄ３Ｂ８  ＶＬ（配列番号８４）、２Ｃ９Ｂ１０  ＶＬ（配列番号８６）、２Ｅ２Ａ６  ＶＬ（配列番号８８）、３Ｃ１Ａ５  ＶＬ（配列番号９０）、及び３Ｃ３Ｅ２  ＶＬ（配列番号９２）。ハイブリドーマ１Ｄ３Ｂ８、２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６、３Ｃ１Ａ５、及び３Ｃ３Ｅ２から生産したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲドメインを含むアミノ酸配列を表２３に示す。
【表２３】
0005826635.tif 000032
【０２５０】
本明細書において開示したハイブリドーマから生産したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＨ  ＣＤＲドメイン変異体を含むアミノ酸配列の非限定的な例としては、１Ｄ３Ｂ８のＶＨ  ＣＤＲ１変異体、配列番号１１８；２Ｃ９Ｂ１０、２Ｅ２Ａ６及び３Ｃ１Ａ５  ＶＨのＶＨ  ＣＤＲ１変異体、配列番号１１９；３Ｃ１Ａ５  ＶＨ及び３Ｃ３Ｅ２変異体３のＶＨ  ＣＤＲ１変異体、配列番号１２０；１Ｄ３Ｂ８及び２Ｅ２Ａ６のＶＨ  ＣＤＲ２変異体、配列番号１２１；２Ｃ９Ｂ１０及び３Ｃ１Ａ５  ＶＨのＶＨ  ＣＤＲ２変異体、配列番号１２２；３Ｃ１Ａ５  ＶＨ及び３Ｃ３Ｅ２変異体３のＶＨ  ＣＤＲ２変異体、配列番号１２３；１Ｄ３Ｂ８及び２Ｃ９Ｂ１０のＶＨ  ＣＤＲ３変異体ＭＤＹ；２Ｅ２Ａ６及び３Ｃ１Ａ５  ＶＨのＶＨ  ＣＤＲ３変異体ＭＧＹ；及び３Ｃ１Ａ５  ＶＨ及び３Ｃ３Ｅ２変異体３のＶＨ  ＣＤＲ３変異体、配列番号１２４が挙げられる。本明細書において開示したハイブリドーマから生産したα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体のＶＬ  ＣＤＲドメイン変異体を含むアミノ酸配列の非限定的な例としては、１Ｄ３Ｂ８のＶＬ  ＣＤＲ１変異体、配列番号１２５；２Ｃ９Ｂ１０のＶＬ  ＣＤＲ１変異体、配列番号１２６；２Ｅ２Ａ６のＶＬ  ＣＤＲ１変異体、配列番号１２７；３Ｃ１Ａ５のＶＬ  ＣＤＲ１変異体、配列番号１２８；３Ｃ３Ｅ２のＶＬ  ＣＤＲ１変異体、配列番号１２９；１Ｄ３Ｂ８のＶＬ  ＣＤＲ２変異体ＫＶＳ；２Ｃ９Ｂ１０のＶＬ  ＣＤＲ２変異体ＮＡＫ；２Ｅ２Ａ６のＶＬ  ＣＤＲ２変異体ＬＶＳ；３Ｃ１Ａ５のＶＬ  ＣＤＲ２変異体ＹＡＴ；及び３Ｃ３Ｅ２のＶＬ  ＣＤＲ２変異体ＹＡＳが挙げられる。
【０２５１】
実施例ＶＩＩＩ
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基に自由なカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の作成。
以下の実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５エピトープに選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体をどのように作成したかを説明する。
【０２５２】
ＳＮＡＰ−２５開裂産物のＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を含むエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を作成するために、ＳＮＡＰ−２５開裂産物抗原として１０残基のペプチドＣＧＧＧＲＩＤＥＡＮＱ（配列番号４６）を設計した。このペプチドは、ＫＬＨに結合するＮ末端システイン残基、ヒトＳＮＡＰ−２５の１９１〜１９７番目のアミノ酸（配列番号５）に連結したＧ−ｓｐａｃｅｒ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｐａｃｅｒ（ＧＧＧ）及びカルボキシル化Ｃ末端グルタミンを含む。Ｂｌａｓｔ検索により、このペプチドがＳＮＡＰ−２５のみに対して高い相同性を有し、神経細胞におけるその他のタンパク質とはほぼ交差反応しないことが明らかになった。疎水性親水性指標、タンパク質表面確率、可撓性のある領域、及び好ましい二次構造、それに続く特定の配向、並びに選択したペプチド配列の表出を決定するために、コンピューターアルゴリズムを用いて、配列を注意深く精査した。免疫原性を高めるために、ペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた。動物を免疫する前に、細胞溶解物中に存在するタンパク質に対する免疫活性を有さない動物を同定するため、ウエスタンブロットにおいて候補細胞株由来の細胞溶解物に対してナイーブなウサギを最初にスクリーニングした。このペプチドを用いて、最初にスクリーニングを行った２匹のウサギを免疫し、約８週間中３回の免疫化の後に、試験のためにウサギから採血した。血液を凝固させるために、４℃で６０分間インキュベートした。細胞残渣を沈殿させるために、凝血塊を１０，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した。得られた血清試料を５０μＬずつにわけ、使用まで−２０℃で保存した。
【０２５３】
ＳＮＡＰ−２５開裂産物のＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を含むエピトープに結合するα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を作成するために、本明細書において開示したその他のＳＮＡＰ−２５抗原に基づく同様の方法を用いる。例えば、、配列番号４７のＳＮＡＰ−２５抗原を、配列番号４６のＳＮＡＰ−２５抗原の代わりにＫＬＨに結合させることができる。別の例として、配列番号３８のＳＮＡＰ−２５抗原由来のヒトＳＮＡＰ−２５の１９１〜１９７番目のアミノ酸を、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、又は配列番号４４で置換することができる。
【０２５４】
２．α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の存在のスクリーニング。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の存在を決定するために、実施例ＩＩＩに記載したように、抽出したウサギ血清を用いた比較ＥＬＩＳＡ及び細胞を用いた開裂アッセイを行った。両方のウサギから得られた血清は、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を含んだ。α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体をＮＴＰ２２及びＮＴＰ２３と表した。
【０２５５】
３．α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の精製。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を精製するために、ウサギ血清から得られたＮＴＰ２２及びＮＴＰ２３抗体を配列番号４６のＳＮＡＰ−２５抗原を含むアフィニティ精製した。
【０２５６】
４．α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の結合特異性の評価。
ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５抗原に選択的に結合することができるα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体の結合特異性を評価するために、精製したＮＴＰ２２及びＮＴＰ２３α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を、実施例ＩＩＩに記載したような開裂産物を検出するための細胞を用いた活性アッセイ、免疫細胞化学及び免疫沈降に用いた。細胞を用いた開裂アッセイ、免疫細胞化学解析及び免疫沈降解析の全ては、ＮＴＰ２２及びＮＴＰ２３α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体は開裂していないＳＮＡＰ−２５と交差反応しないことを示した。従って、ＮＴＰ２２及びＮＴＰ２３両方は、ＳＮＡＰ−２５２０６開裂していない基質と比較してこの開裂産物を主に認識することを可能にする、ＳＮＡＰ−２５１９７開裂産物への高い結合特異性を有する。抗原に対する親和性は、実施例ＩＩＩに記載したように、ＳＰＲを用いてＢｉＡｃｏｒｅで決定することもできる。
【０２５７】
実施例ＩＸ  サンドイッチＥＬＩＳＡのための要素及び条件の調整
以下の実施例は、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を用いたＳＮＡＰ−２５開裂産物の検出による、再標的化エンドペプチダーゼ活性の免疫を用いた検出法に有用なサンドイッチＥＬＩＳＡの実施に必要な要素及び条件をどのように同定し、調製したかを説明する。
【０２５８】
１．再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞からの細胞溶解物の調製
解析のための再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞溶解物を得るために、Ｎｅｕｒｏ−２ａのストック培養由来の好適な密度の細胞を最小必須培地、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｉ  ｗｉｔｈ  Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｓａｌｔｓ、１ｘＢ２７サプリメント、１ｘＮ２サプリメント、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む５０ｍＬの無血清培地を入れたＴ１７５フラスコに播種した。これらの細胞を、成長停止及び神経突起伸展などの標準的及び慣習的な形態学的な基準によって評価されるように細胞が分化するまで、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下でインキュベートした（およそ２〜３日間）。対照として、Ｎｅｕｒｏ−２ａのストック培養由来の好適な密度の細胞を、５０ｍＬの適切な成長培地（表１）を入れたＴ１７５フラスコに播種した。これら未分化対照細胞を、５０％コンフルエンスに達するまで、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で生育させた（およそ１８時間）。分化した及び未分化対照培養両方からの培地をそれぞれのウェルから吸引し、０（未処理試料）又は１０ｎＭいずれかの再標的化エンドペプチダーゼを含む新しい培地で置換した。一晩インキュベートした後、細胞を洗浄し、新たに調製したＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００リシスバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中、４℃で３０分間一定に振とうさせて溶解することにより、細胞を回収した。残渣を除去するために、卓上遠心分離機をもちいて溶解した細胞を４０００ｒｐｍで、４℃で２０分間遠心分離した。細胞溶解物のタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイによって測定した。
【０２５９】
２．サンドイッチＥＬＩＳＡのための要素の調製及び同定。
適切な補足抗体−検出抗体対を同定するために、１１の異なるα−ＳＮＡＰ−２５補足抗体及び７の異なるα−ＳＮＡＰ−２５検出抗体を含む（表１２）、２６種類の異なる補足及び検出抗体対の組み合わせについて、ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ解析を行った。使用したα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、本明細書において開示した２Ｅ２Ａ６及び３Ｃ１Ａ５  α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体、本明細書において開示したＳＭＩ−８１、ＭＣ−６０５０、及びＭＣ−６０５３  α−ＳＮＡＰ−２５マウスモノクローナル抗体、本明細書において開示したＮＴＰ２３  α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体、Ｓ９６８４  α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｈ−５０  α−ＳＮＡＰ−２５  ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｃ−１８  α−ＳＮＡＰ−２５  ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ｎ−１９  α−ＳＮＡＰ−２５  ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、並びにＳＰ１２  α−ＳＮＡＰ−２５  マウスポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）である。
【０２６０】
補足抗体溶液を調製するために、標準的なプロテインＡ精製プロトコールを用いて、ハイブリドーマ細胞株２Ｅ２Ａ６及び３Ｃ１Ａ５由来の腹水に含まれるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体、並びにα−ＳＮＡＰ−２５  ＭＣ−６０５０及びＭＣ−６０５３モノクローナル抗体を精製した。その他の全てのα−ＳＮＡＰ−２５抗体は、精製された抗体を購入した。
【０２６１】
検出抗体溶液を調製するために、製造業者による説明書に従って（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、適切なα−ＳＮＡＰ−２５抗体をルテニウム（ｌｌ）−トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホン酸）ＮＨＳエステル標識試薬（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に結合させた。ＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）ストック溶液を再構成した３０μＬの蒸留水を２００μＬの２ｍｇ／ｍＬのα−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体に加え、反応液を室温で２時間、暗所にてインキュベートすることにより、結合反応を行った。標識した抗体を標準的なスピンカラムプロトコールを用いて精製し、タンパク質濃度を標準的な比色タンパク質アッセイによって決定した。１リットル当たりのモル濃度を決定するために、α−ＳＮＡＰ−２５抗体／ＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）結合体の吸光度を、分光光度計を用いて４５５ｎｍで測定した。検出抗体溶液を使用まで４℃で保存した。
【０２６２】
ＳＮＡＰ−２５開裂産物に特異的な補足抗体を含む固相担体を調製するために、およそ５μＬの適切なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体溶液（１ｘＰＢＳ中に２０μｇ／ｍＬ）を、９６ウェルＭＳＤ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  プレートのそれぞれのウェルに添加し、溶液中の液体を蒸発させるために、生物学的に安全なキャビネット中で２〜３時間風乾させた。次に補足抗体が結合したウェルを、２％  Ａｍｅｒｓｈａｍ  ブロッキング試薬（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）及び１０％  ヤギ血清（ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を含む１５０μＬのブロッキングバッファーを加え、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキングしたプレートを密閉し、使用まで４℃で保存した。
【０２６３】
開裂したＳＮＡＰ−２５産物の存在をＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出するために、保存したプレートのウェルからブロッキングバッファーを吸引し、上述したように再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞由来の溶解物２５μＬをそれぞれのウェルに加え、プレートを４℃で一晩インキュベートした。細胞溶解物を吸引し、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でそれぞれのウェルを３回リンスすることにより、プレートのウェルを洗浄した。洗浄した後、１ｘＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）に溶解した２％  Ａｍｅｒｓｈａｍブロッキング試薬を含む２５μＬの５μｇ／ｍＬの検出抗体溶液をそれぞれのウェルに加え、プレートを密閉し、振とうさせながら、室温で１時間インキュベートした。検出抗体をインキュベートした後、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でウェルを３回洗浄した。洗浄した後、１５０μＬの１ｘリードバッファー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をそれぞれのウェルに加え、ＳＥＣＴＯＲ（商標）Ｉｍａｇｅｒ  ６０００  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてプレートを測定した。それぞれの抗体対について１０ｎＭ用量から得られたシグナルを、それぞれの抗体対の０ｎＭ用量から得られたシグナルで割ることにより、比を算出した（表２４）。これらの結果は、試験した異なる２６種類の抗体対の組み合わせのうち、対１（２Ｅ２Ａ６マウスｍＡｂ及びＳ９６８４ウサギｐＡｂ）、対４（３Ｃ１Ａ５マウスｍＡｂ及びＳ９６８４ウサギｐＡｂ）、及び対１８（Ｓ９６８４ウサギｐＡｂ及び２Ｅ２Ａ６マウスｍＡｂ）の３つの抗体対のみが、試験したより高い用量に対して１０：１を超えるシグナル対ノイズ比を有したことを示した。さらなるアッセイの作成のために、抗体対１を選択した。
【表２４−１】
0005826635.tif 000033
【表２４−２】
0005826635.tif 000034
【０２６４】
実施例Ｘ  ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖酵素活性を有する再標的化エンドペプチダーゼの免疫を用いた検出方法
以下の実施例は、ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡによって、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５開裂産物に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を利用したＳＮＡＰ−２５開裂産物の検出による、免疫を用いた再標的化エンドペプチダーゼ活性の検出方法を説明する。
【０２６５】
ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖酵素活性を有する再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞からの溶解物を調製するために、確立された細胞株由来の好適な密度の細胞を、１００μＬの適切な培地を入れた９６ウェル組織培養プレートのウェル中にプレーティングした。これらの細胞を、３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で約２４時間インキュベートした。細胞の培地をそれぞれのウェルから吸引し、０（未処理試料）又は、その再標的化エンドペプチダーゼに対する用量反応実験から決定した用量のうちの１つのいずれかを含む新しい培地で置換した。２４時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、回収した。
【０２６６】
α−ＳＮＡＰ−２５補足抗体溶液を調製するために、標準的なプロテインＡ精製プロトコールを用いてハイブリドーマ細胞株２Ｅ２Ａ６由来の腹水に含まれるα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を精製した。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を調製するために、製造業者による説明書に従って（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、α−ＳＮＡＰ−２５ウサギポリクローナル抗体Ｓ９６８４（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をルテニウム（ｌｌ）−トリス−ビピリジン−（４−メチルスルホン酸）ＮＨＳエステル標識試薬（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に結合させた。結合反応、標識したα−ＳＮＡＰ−２５抗体の精製、濃度の決定及び保存は、実施例ＶＩに記載したように行った。
【０２６７】
ＳＮＡＰ−２５開裂産物に特異的な補足抗体を含む固相担体を調製するために、およそ５μＬの適切なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体２Ｅ２Ａ６溶液（１ｘＰＢＳ中に２０μｇ／ｍＬ）を、９６ウェルＭＳＤ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  プレートのそれぞれのウェルに添加し、溶液中の液体を蒸発させるために、生物学的に安全なキャビネット中で２〜３時間風乾させた。次に補足抗体が結合したウェルをブロッキングし、再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出するために、直接使用した。
【０２６８】
開裂したＳＮＡＰ−２５産物の存在をＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出するために、保存したプレートのウェルからブロッキングバッファーを吸引し、再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞由来の溶解物２５μＬをそれぞれのウェルに加え、プレートを４℃で一晩インキュベートした。細胞溶解物を吸引し、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でそれぞれのウェルを３回リンスすることにより、プレートウェルを洗浄した。洗浄した後、１ｘＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）に溶解した２％  Ａｍｅｒｓｈａｍブロッキング試薬を含む２５μＬの５μｇ／ｍＬの検出抗体溶液をそれぞれのウェルに加え、プレートを密閉し、密閉したプレートを振とうさせながら、室温で１時間インキュベートした。検出抗体をインキュベートした後、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でウェルを３回洗浄した。洗浄した後、１５０μＬの１ｘリードバッファー（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をそれぞれのウェルに加え、ＳＥＣＴＯＲ（商標）Ｉｍａｇｅｒ  ６０００  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてプレートを測定した。回収したデータを解析し、実施例ＶＩに記載したようにＥＣ５０を算出した。オピオイド再標的化エンドペプチダーゼについて、これらの結果は、下側の漸近線へのシグナル対ノイズ比が約１５：１〜約２０：１であり、かつ、上側の漸近線へのシグナル対ノイズ比が約１８０：１〜約３００：１である、平均して１．０ｎＭのＮｏｃ／Ａ（約０．３ｎＭ〜約２．０ｎＭの範囲）のＥＣ５０が検出されたことを示した。
【０２６９】
実施例ＸＩ  ＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた、免疫を用いた再標的化エンドペプチダーゼ活性の検出方法
以下の実施例は、ＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡより、ＢｏＮＴ／Ａ開裂部位切断可能結合のＰ１残基にカルボキシル末端を有するＳＮＡＰ−２５に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体を用いてＳＮＡＰ−２５開裂産物の検出することによる、免疫を用いた再標的化エンドペプチダーゼ活性の検出方法を説明する。
【０２７０】
再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞からの溶解物及びα−ＳＮＡＰ−２５補足抗体溶液は、実施例ＶＩＩに記載したように調製される。
【０２７１】
α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を調製するために、製造業者による説明書に従って（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体Ｓ９６８４（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させる。５００μＬの１ｍｇ／ｍＬ  α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体を、凍結乾燥して活性化させたペルオキシダーゼ入れたバイアルに加え、成分を混合し、その後１０μＬのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えることによって結合反応を行う。この反応混合液をドラフト内、室温で１時間、インキュベートする。反応をクエンチした後、標準的なスピンカラムプロトコールを用いて標識した抗体を精製し、標準的な比色タンパク質アッセイによってタンパク質濃度を決定する。１リットル当たりのモル濃度を決定するために、α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体／ＨＲＰ結合体の吸光度を、分光光度計を用いて４５５ｎｍで測定する。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液を使用まで４℃で保存する。
【０２７２】
ＳＮＡＰ−２５開裂産物に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５補足抗体を含む固相担体を調製するために、およそ１００μＬのα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体２Ｅ２Ａ６溶液（１ｘＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍＬ）を、９６ウェル  Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｗｈｉｔｅ  プレートのそれぞれのウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートし、その後いくらかでも過剰な抗体溶液を捨てる。次に補足抗体が結合したウェルを、２％  Ａｍｅｒｓｈａｍ  ブロッキング試薬（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）及び１０％  ヤギ血清（ＶＷＲ、ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を含む１５０μＬのブロッキングバッファーを加え、室温で１時間ブロッキングする。ブロッキングバッファーを捨て、ペーパータオル上で、反転させ、余分な液体をはじいて除去することでプレートを拭いて乾燥させる。補足抗体が結合したウェルをその後ブロッキングし、直接再標的化エンドペプチダーゼ活性の検出に用いる。
【０２７３】
開裂したＳＮＡＰ−２５産物の存在をＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出するために、再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞由来の溶解物５０μＬをそれぞれのウェルに加え、プレートを密閉し、密閉したプレートを５００ｒｐｍで回転させながら、４℃で２〜４時間から一晩インキュベートする。細胞溶解物を吸引し、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．０５％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でそれぞれのウェルを３回リンスすることにより、プレートウェルを洗う。洗浄した後、１ｘＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）に溶解した２％  Ａｍｅｒｓｈａｍ  ブロッキング試薬を含む１００μＬの１ｍｇ／ｍＬ  α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体／ＨＲＰ検出抗体溶液をそれぞれのウェルに加え、プレートを密閉し、密閉したプレートを６５０ｒｐｍで回転させながら、室温で１時間インキュベートする。検出抗体をインキュベートした後、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．０５％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でウェルを３回洗う。洗浄した後、１００μＬのＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  １：１  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）をそれぞれのウェルに加え、照度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて３９５ｎｍで、プレートを測定する。回収したデータを、実施例ＶＩに記載したように解析し、ＥＣ５０を算出する。
【０２７４】
実施例ＸＩＩ  複合体ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた、免疫を用いた再標的化エンドペプチダーゼ活性の検出方法
以下の実施例は、ＳＮＡＰ−２５開裂産物に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体及び異なるタンパク質に対する二次抗体対を用いてＳＮＡＰ−２５開裂産物を検出することによる、免疫を用いた再標的化エンドペプチダーゼ活性の検出方法を説明する。
【０２７５】
再標的化エンドペプチダーゼ効力アッセイは、多重ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて行うことができる。それらのアッセイは、関連特許出願であり、引用することによりその全文が本明細書に組み入れられる、Ｅｓｔｅｒ  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂａｓｅｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ａ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙｓ、米国特許出願第１２／４０３，５３１号に記載され、、本明細書において開示した細胞株及び再標的化エンドペプチダーゼ並びに対応する細胞株を使用して、この方法を用いることができる。
【０２７６】
実施例ＸＩＩＩ  多重ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた、免疫を用いた再標的化エンドペプチダーゼ活性の検出方法
以下の実施例は、ＳＮＡＰ−２５開裂産物に特異的なα−ＳＮＡＰ−２５モノクローナル抗体及び異なるタンパク質に対する二次抗体対を用いてＳＮＡＰ−２５開裂産物を検出することによる、複合体免疫を用いた再標的化エンドペプチダーゼ活性の検出方法を説明する。
【０２７７】
再標的化エンドペプチダーゼ効力アッセイは、多重ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて行うことができる。それらのアッセイは、関連特許出願であり、引用することによりその全文が本明細書に組み入れられる、Ｅｓｔｅｒ  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂａｓｅｄ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ａ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙｓ、米国特許出願第１２／４０３，５３１号に記載され、、本明細書において開示した細胞株及び再標的化エンドペプチダーゼ並びに対応する細胞株を使用して、この方法を用いることができる。
【０２７８】
実施例ＸＩＶ  ナノモル量の再標的化エンドペプチダーゼを検出するための、免疫を用いた方法
以下の実施例は、ナノモル量の再標的化エンドペプチダーゼ活性の免疫を用いた検出方法をどのように行ったかを説明する。
【０２７９】
１．ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡによる、免疫を用いた再標的化エンドペプチダーゼの検出方法。
再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞由来の溶解物を調製するために、アッセイにおいて安定な、確立された細胞株由来のおよそ５０，０００〜１５０，０００の細胞を、１００μＬの適切な培地（実施例Ｉ及びＩＩ参照）を入れた９６ウェル組織培養ポリ−Ｄ−リジンプレートのウェル中にプレーティングした。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中、５％二酸化炭素存在下で２４時間インキュベートした。細胞由来の培地をそれぞれのウェルから吸引し、０（未処理試料）及び、この方法におけるそれぞれの再標的化エンドペプチダーゼにおいて記載された適切な用量反応のいずれかの再標的化エンドペプチダーゼを含む新しい培地で置換した。２４時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、回収し、又は回収の前に再標的化エンドペプチダーゼを加えずにさらに２日間インキュベートした。細胞を回収するために、培地を吸引し、１ｘＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む３０μＬのリシスバッファーをそれぞれのウェルに加えることで細胞を溶解し、プレートを５００ｒｐｍで回転している振とう機上、４℃で３０分間インキュベートした。細胞残渣を沈殿させるためにプレートを４０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離し、検出工程を行うために、上清を補足抗体をコーティングした９６ウェルプレートに移した。
【０２８０】
α−ＳＮＡＰ−２５補足抗体溶液、α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液、及びＳＮＡＰ−２５開裂産物に特異的な補足抗体を含む固相担体を実施例ＶＩＩに記載したように調製した。
【０２８１】
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ解析によって開裂したＳＮＡＰ−２５産物の存在を検出するために、保存していたプレートからブロッキングバッファーを吸引し、再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞由来の溶解物２５−３０μＬをそれぞれのウェルに加え、プレートを４℃で２時間、又は２４時間インキュベートした。細胞溶解物を吸引し、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でそれぞれのウェルを３回リンスすることにより、プレートウェルを洗浄した。洗浄した後、１ｘＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）に溶解した２％  Ａｍｅｒｓｈａｍブロッキング試薬を含む２５μＬの５μｇ／ｍＬ  α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液をそれぞれのウェルに加え、プレートを密閉しそして密閉したプレートを振とうさせながら、室温で１時間インキュベートした。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体をインキュベートした後、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でウェルを３回洗浄した。洗浄した後、プレートを処理し、回収したデータを、実施例ＶＩに記載したように解析し、ＥＣ５０を算出した。これらの結果は、ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃３細胞を用いた場合には、上側の漸近線へのシグナル対ノイズ比が約２０：１〜約３００：１である、平均して１．０ｎＭ（約０．３ｎＭ〜約２．０ｎＭの範囲）のＮｏｃ／ＡのＥＣ５０が検出されたことを示した。さらに、ＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６細胞を用いた場合には、上側の漸近線へのシグナル対ノイズ比が約２０：１〜約５００：１である、平均して３．７ｎＭ（約２．０ｎＭ〜約５．５ｎＭの範囲）のＮｏｃ／ＡのＥＣ５０が検出された。ダイノルフィンＡリガンドを含む再標的化エンドペプチダーゼに特異的なＳＫ１２細胞については、ＳＫ１２細胞を用いて、上側の漸近線へのシグナル対ノイズ比が約１０：１〜約２０：１である、平均８．４ｎＭ（約４．５ｎＭ〜約１０．０ｎＭの範囲）のＤｙｎ／ＡのＥＣ５０が検出された。加えて、Ｎｅｕｒｏ−２ａクローン細胞株＃７細胞を用いた場合には、上側の漸近線へのシグナル対ノイズ比が約２０：１〜約２００：１である、平均８．８ｎＭ（約５．０ｎＭ〜約１５．５ｎＭの範囲）のＴＶＥＭＰ−ガラニンのＥＣ５０が検出された。この方法は、実施例ＩＸに記載したような複合体を用いる方法においてもまた行うことができる。
【０２８２】
２．ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた、免疫を用いた再標的化エンドペプチダーゼの検出方法
再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞からの溶解物及びα−ＳＮＡＰ−２５補足抗体溶液は、実施例ＶＩＩに記載したように調製される。α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液及びＳＮＡＰ−２５開裂産物に特異的な補足抗体を含む固相担体は、実施例ＶＩＩＩに記載したように調製される。
【０２８３】
ＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ解析を用いて開裂したＳＮＡＰ−２５産物の存在を検出するために、再標的化エンドペプチダーゼで処理した細胞由来の溶解物１００μＬをそれぞれのウェルに加え、プレートを密閉し、密閉したプレートを５００ｒｐｍで回転している振とう機上、４℃で２時間、又は２４時間インキュベートする。細胞溶解物を吸引し、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．０５％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でそれぞれのウェルを３回リンスすることにより、プレートウェルを洗う。洗浄した後、１ｘＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）に溶解した２％  Ａｍｅｒｓｈａｍ  ブロッキング試薬を含む１００μＬの１ｍｇ／ｍＬ  α−ＳＮＡＰ−２５ポリクローナル抗体／ＨＲＰ検出抗体溶液をそれぞれのウェルに加え、プレートを密閉し、密閉したプレートを６５０ｒｐｍで回転している振とう機上、室温で１時間インキュベートする。検出抗体をインキュベートした後、２００μＬ  １ｘＰＢＳ、０．０５％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウリン酸モノエステル）でウェルを３回洗う。洗浄した後、１００μＬのＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  １：１  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）をそれぞれのウェルに加え、照度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて３９５ｎｍで、プレートを測定する。回収したデータを、実施例ＶＩに記載したように解析し、ＥＣ５０を算出する。この方法は、実施例  ＩＸ  に記載したような複合体を用いる方法においてもまた行うことができる。
【０２８４】
実施例ＸＶ  中和α再標的化エンドペプチダーゼ抗体を検出するための、免疫を用いた方法
以下の実施例は、中和α−Ｎｏｃ／Ａ抗体の存在を検出することができる免疫を用いた方法を、どのように実施したかを説明する。
【０２８５】
Ｎｏｃ／Ａをここまで、しばしば慢性である、疼痛状態の治療のために評価してきた。Ｎｏｃ／Ａをによる治療を繰り返して長期間行うことにより患者においては、免疫抵抗を引き起こす、再標的化エンドペプチダーゼへの中和α−Ｎｏｃ／Ａ抗体が発現する可能性がある。中和α−Ｎｏｃ／Ａ抗体は、標的リガンド及び／又は再標的化エンドペプチダーゼの転位ドメイン（ＨＮ）に結合することにより、神経細胞及びその他の標的細胞への再標的化エンドペプチダーゼの取り込みを停止することによって再標的化エンドペプチダーゼ活性を阻害する。患者の血液中における中和α−Ｎｏｃ／Ａ抗体の存在を決定する確立されたアッセイはない。再標的化エンドペプチダーゼで治療した患者における中和抗体を検出するための細胞を用いたアッセイが作成されたとしても、それはより高価で時間のかかるものとなるだろう。
【０２８６】
中和α−Ｎｏｃ／Ａ抗体の存在又は欠如を検出するためには、本明細書において開示した、再標的化エンドペプチダーゼ活性を検出する免疫を用いた方法を用いることができる。様々な濃度のＮｏｃ／Ａで処理した後のＳＮＡＰ−２５開裂産物の存在量を決定するための一つの方法はウエスタンブロット検出法の使用であり、その他の方法はＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡ検出法を用いることである。
【０２８７】
中和α−Ｎｏｃ／Ａ抗体を含む試料を調製するために、Ｎｏｃ／Ａを用いて免疫したサルの血液から血清を単離し、抗体をアフィニティ精製した。Ｎｏｃ／Ａ分子に存在する標的リガンドであるノシセプチン変異体ペプチドを用いてウサギをまた免役し、その血清を回収し、抗体をアフィニティ精製した（抗ノシセプチンポリクローナル抗体）。
【０２８８】
Ｎｏｃ／Ａを含む試料で処理した細胞由来の溶解物を調製するために、ＳＫ−Ｎ−ＤＺクローン細胞株＃３細胞及びＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６細胞をポリ−Ｄ−リジン９６ウェルプレートに１６〜１８時間播種した。１ｎＭのＮｏｃ／Ａを含むＲＰＭＩ  ＳＦＭ（Ｎ２、Ｂ２７、及びＮＧＦサプリメントを含む）で抗ノシセプチンｐＡｂを０〜３μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、混合液を室温で１時間、プレインキュベートした。その後溶液を細胞に加え、ＥＣＬ  ＥＬＩＳＡアッセイを行う前に２４時間インキュベートした。両方の細胞株において、１μｇ／ｍＬのこの抗ノシセプチン変異体抗体は、１ｎＭのＮｏｃ／Ａ取り込みを完全に遮断した（＞９０％阻害）。これら細胞株について、抗Ｎｏｃ／Ａサルポリクローナル抗体もまたアッセイした。細胞をＮ２、Ｂ２７、及びＮＧＦを含むＲＰＭＩ成長培地を入れた９６ウェル  ポリ−Ｄ−リジンプレート中、１ウェル当たり１００，０００個の細胞を２４時間プレーティングした。１ｎＭ  Ｎｏｃ／Ａを含む培地中に、抗Ｎｏｃ／Ａポリクローナル抗体を０〜２０μｇ／ｍＬの濃度で希釈し、混合液を室温で１時間プレインキュベートした。その後混合液を細胞に加え、ＥＣＬ  ＥＬＩＳＡアッセイを行う前に２４時間インキュベートした。より高濃度、６〜２０μｇ／ｍＬの抗Ｎｏｃ／ＡｐＡｂにおいて、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ細胞株では最大で６０％の阻害が見られ、ＡＧＮ  Ｐ３３クローン細胞株＃６細胞株では約３０％阻害が見られた。このことは、抗Ｎｏｃ／Ａポリクローナル抗体が結合部位に特異的でないこと、及び、試験した濃度においては部分的な遮断のみを生じる、分子のその他の部分に結合するその他の抗体を含むことによると考えられる。完全な遮断を達成するためには、より高い濃度が必要である可能性がある。
【０２８９】
開裂したＳＮＡＰ−２５産物の存在をウエスタンブロット解析によって検出するためには、培地をそれぞれのウェルから吸引し、５０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーに細胞を懸濁し、９５℃まで５分間加熱する。それぞれの回収した試料の一部分を、回収した試料を１２％  ２６ウェルＣｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離すること及びウサギポリクローナルα−ＳＮＡＰ−２５１９７抗体血清を一次抗体として使用すること（実施例Ｖ参照）以外は実施例Ｉに記載したようにウエスタンブロットで解析する。結果は、ウエスタンブロットにおいてＳＮＡＰ−２５開裂産物を検出可能なバンドを生じる、再標的化エンドペプチダーゼの最低濃度を明らかにする。
【０２９０】
開裂したＳＮＡＰ−２５産物をＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡによって検出するために、培地をそれぞれのウェルから除去し、実施例ＶＩに記載したように細胞を溶解した。実施例ＶＩＩＩに記載したようにα−ＳＮＡＰ−２５補足抗体溶液、α−ＳＮＡＰ−２５検出抗体溶液、及びα−ＳＮＡＰ−２５固相担体を調製した。上清をα−ＳＮＡＰ−２５固相担体に移し、実施例ＶＩに記載したようにＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＥＣ５０はその最大である１／２に対する再標的化エンドペプチダーゼ活性を阻害するために必要な血清の希釈であり、及び最大シグナル（シグナル最大）に対する最小シグナル（シグナル最小）の比は抗体の最高希釈を用いて得られたＳＮＡＰ−２５開裂産物シグナルを抗体の最小希釈を用いて得られたシグナルで割ることによって得られること以外は実施例ＶＩに記載したように、回収したデータを解析し、ＥＣ５０を算出した。
【０２９１】
結果は、サル血清における中和α−Ｎｏｃ／Ａ抗体の存在及びウサギ由来のα−ノシセプチン変異体抗体の存在が検出できたことを示す。免疫した動物由来のアフィニティ精製した抗体中でインキュベートしたＮｏｃ／Ａ分子の活性は、抗体希釈が減少につれて低下した。Ｄｙｎ／Ａ及びＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物について、試験するそれぞれの化合物に特異的な細胞株を用いて同じアッセイを行う。
【０２９２】
実施例ＸＶ  ガラニン再標的化エンドペプチダーゼへの細胞を用いたアッセイの作成
以下の実施例は、細胞を用いた効力アッセイの作成に必要とされる、再標的化エンドペプチダーゼの取り込み能力を有する確立された細胞株をどのように同定したかを説明する。
【０２９３】
１．候補細胞株のストック培養の成長。
細胞株を生育させるために、試験する細胞株由来の好適な密度の細胞を、３０ｍＬの好適な成長培地（表２５参照）を入れた１６２ｃｍ２組織培養フラスコ中にプレーティングし、細胞が所望の密度に達するまで、３７℃インキュベーター中、５％又は１０％二酸化炭素存在下で生育させた。
【表２５】
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【０２９４】
２．ガラニンＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物感受性における市販の細胞株のスクリーニング
対応する化合物で処理した後のＳＮＡＰ２５の開裂を測定することにより、ＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物に対するそれらの感受性について、市販の細胞株をスクリーニングした。様々なＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物をスクリーニング及び試験に用いた。ＰＣ−１２、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＳｉＭａ、及びＰ１９細胞を無血清培地中に３日間、又はＣＭ中に１日プレーティングした。これらの分化した及びナイーブ細胞を、０及び７５ｎＭ濃度のＴＶＥＭＰ−ガラニン  バッチＡで１８時間処理した。ＴＶＥＭＰ−ガラニン  バッチＡは、開裂したＳＮＡＰ２５の存在が上昇したことによって見られるように、ＰＣ−１２及びＮｅｕｒｏ−２ａ細胞の両方において活性を示し、及び分化した条件におけるＮｅｕｒｏ−２ａ細胞がナイーブ細胞よりもガラニンリガンドを有するＴＶＥＭＰ化合物に対してより感受性であることを示した。細胞活性の順位は、ＰＣ−１２が最も高い活性を有し、続いてＮｅｕｒｏ−２ａ、最後がＳｉＭａ細胞であることを示す。取り込みがこれらガラニン再標的化化合物に特異的かどうかを決定することが必要であり、さらに細胞をガラニンリガンドを含まない化合物を用いて試験することが重要であった。Ｎｏｃ／Ａはノシセプチン変異体リガンドを含む再標的化化合物であり、及びＬＨＮ／Ａ（陰性対照）は結合ドメインを欠損した化合物である。ＬＨＮ／Ａの取り込みは非特異的であり、及び細胞株が再標的化化合物の取り込みに対して特異性を有する場合、ＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物よりも有意に低い活性を有するはずである。既に、Ｎｏｃ／ＡがＳｉＭａ細胞において特異的な取り込みを有することが示されていたため、試験細胞株に対する基線として用いた。適した細胞株はＬＨＮ／Ａ及びＮｏｃ／Ａ化合物の低い取り込みを示し、かつ、ＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物の高い取り込みを示すものである。この実験から得られた結果を表２６に示す。
【表２６】
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【０２９５】
結果は、ＴＶＥＭＰ−ガラニン  バッチＡ及びＴＶＥＭＰ−ガラニン  バッチＢは試験した細胞株における陰性対照と同等の、又は１〜２倍のみ高い活性のプロット、並びにＥＣ５０値を有したことを示す。このデータは、ナイーブ細胞が十分に感受性ではないこと、及びこれらの細胞をガラニン受容体タンパク質ＧａｌＲ１又はＧａｌＲ２受容体をコードしているプラスミドでトランスフェクションする必要があることを意味する。
【０２９６】
３．ＧａｌＲを用いたＰＣ−１２、Ｎｅｕｒｏ−２ａ、及びＳｉＭａ細胞の安定なトランスフェクション。
トランスフェクションの１日前、６ウェル  コラーゲンＩＶ  コーティングプレート（カタログ番号５４５５４：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ＳｉＭａ、ＰＣ−１２）又は６ウェル  コスタープレート（カタログ番号３５１６：Ｃｏｒｎｉｎｇ）（Ｎｅｕｒｏ−２ａ）のいずれかに、０．５ｘ１０６細胞／ウェルの密度で細胞を播種した。トランスフェクションは、１２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（カタログ番号５２７５８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５０μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ血清使用量低減培地（カタログ番号３１９５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈し、その後室温で５分インキュベートすることにより行った。４μｇのＧａＩＲプラスミドＤＮＡを２５０μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ血清使用量低減培地中の０．４μｇ  ｐＡｄ  Ｖａｎｔａｇｅ（商標）ベクター（１ｍｇ／ｍＬ、カタログ番号Ｅ１７１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）と５分間混合した。５分間インキュベートした後、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００と希釈したプラスミドＤＮＡを混合し、複合体を形成させるためにさらに２０分間室温でインキュベートした。その間に、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）で細胞を洗浄し、０．５ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）をそれぞれのウェルに加えた。２０分間インキュベートした後、複合体を含む０．５ｍＬの希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００と希釈したプラスミドＤＮＡを、０．５ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）を入れたウェルに注意深く加えた。プレートを３７℃で５時間インキュベートし、その後、１ｍＬの完全培地を加えた。翌日、培地を成長培地で４８時間置換した。４日目、細胞をトランスフェクションから回収した後、成長培地を０．５ｍｇ／ｍＬ（１：１００希釈）のジェネティシン（登録商標）（カタログ番号１０１３１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む新しい成長培地で置換し、さらに３日間インキュベートした。トランスフェクションの７日後、細胞を成長培地及びジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍＬ、１：１００希釈）を入れた７５ｃｍコラーゲンＩＶフラスコ（カタログ番号３５４２３：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。この形質転換においては、およそ９０％の細胞が死に、培地交換に際して除去された。２１日目まで、２日おきにジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍＬ、１：１００希釈）を含む成長培地を交換した。
【０２９７】
ガラニンＴＶＥＭＰ化合物を取り込むことができる安定な細胞の選別のための指標は、モノクローナル２Ｅ２Ａ６コーティングプレートを補足用に及びポリクローナルＳＮＡＰ２５（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ９６８４）スルホタグ（ｓｕｌｆｏｔａｇｇｅｄ）抗体を検出用に用いたＥＣＬサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、ＴＶＥＭＰ−ガラニンで処理した場合に最高のパーセンテージのＳＮＡＰ２５開裂を生じるクローンをスクリーニングすることである。表２７中のＥＣ５０値は、ＴＶＥＭＰ−ガラニン  バッチＤは、Ｇａｌ  Ｒ１及びＧａｌ  Ｒ２でトランスフェクションしたＳｉＭａ及びＮｅｕｒｏ−２ａ細胞においては陰性対照と比較して少なくとも１０倍高い取り込みを、トランスフェクションしたＰＣ−１２細胞においては２〜４倍のみ高い取り込みを示すことを表す。トランスフェクションしたＰＣ−１２細胞がＳｉＭａ及びＮｅｕｒｏ−２ａ細胞よりも低い感受性及び特異性を有するようだったため、それらをクローニングしないだろう。また、ＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物中のガラニン１〜１６ｍｅｒのリガンドがＧＡＬ  Ｒ２よりも高い親和性でＧＡＬ  Ｒ１受容体に結合するため、ＧＡＬ  Ｒ１でトランスフェクションした細胞のみがクローニングされる。図は、ＴＶＥＭＰ−ガラニンバッチＣ及びＤがＮｅｕｒｏ−２ａ  Ｇａｌ  Ｒｌにおいて、ＬＨＮ／Ａ及び再標的化されたノシセプチン化合物ＴＶＥＭＰ−ノシセプチンの両方よりも９〜１０倍高い取り込みを表すことをもまた示す。
【表２７】
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【０２９８】
選別された非クローン集団は、それらが異なるレベルの受容体を発現している細胞の混合物を含み、かつ、これらの集団が経時的に変化する可能性があるために習慣的に用いるには適さない細胞集団である。単一の細胞由来の安定な細胞株を得るために、希釈性クローニング方法を開始した。２１日目に、トランスフェクションした細胞おトリプシン処理し、ニードルを用いて分離し、計測した。残りのトランスフェクションした細胞株は今後の使用のために凍結した。ジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍＬ、１：１００希釈）を含む成長培地中に１０細胞／ｍＬになるまで細胞を連続して希釈した。１細胞／ウェルの密度になるように、１００μＬ／ウェルで、２ｘ９６ウェルコラーゲンＩＶコーティングプレート（ＳｉＭａ、ＰＣ−１２）又は２ｘ９６ウェルコスタ−プレート（Ｎｅｕｒｏ−２ａ）のいずれかをプレーティングした。プレートをインキュベーター中に戻し、コロニーを形成させるために２週間放置した。２週間後（３５日目）、ウェルの底部に形成された単一のコロニーの存在について、ウェルを注意深く確認した（複数のコロニーについてウェル全体を注意深く確認した）。ウェルに単一の細胞集団があると同定した場合には、唯一の細胞集団が存在していることを確認するためにそのウェル全体を注意深く精査した。その単一集団の写真を撮影した。複数の集団があるという疑問がある場合には、そのウェルを選択しなかった。３６日目に、選択したクローンをＴｒｙｐＬＥを用いて分離し、トリプシン反応を停止させるためにジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍＬ、１：１００希釈）を含む０．５ｍＬの完全培地を加えた。この全量を６ウェルプレートに移し、ジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍＬ、１：１００希釈）を含む３．０ｍＬの追加の完全培地を用いてさらに希釈した。クローンを９０％コンフルエンスまで生育させ、その後再度トリプシン処理し、ジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍＬ、１：１００希釈）を含む１０．０ｍＬの完全培地を入れた７５ｃｍコラーゲンＩＶ又はコスターフラスコに移した。細胞が再度９０％コンフルエンスに達した時点で、細胞を保存のために３本のクライオバイアルに充填するため、又はガラニン再標的化化合物におけるＥＬＩＳＡアッセイにおけるスクリーニングのためのいずれかに用いた。
【０２９９】
独立した試験を行う２つのオペレーターを用いてこれらクローンを試験するためには、参照化合物であるＴＶＥＭＰ−ガラニン  バッチＣを用いた。ＳｉＭａ  Ｇａｌ  Ｒ１クローンはゆっくりと成長したため、この時点では試験に用いることができなかった。幸運にも、Ｎｅｕｒｏ−２ａクローンはより早く成長し、すぐに十分な量に達した１２クローンのうちの８つを試験に用いることができた。これらＮｅｕｒｏ−２ａ  Ｇａｌ  Ｒ１クローン細胞を完全用量範囲のＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物（０〜３００ｎＭ）を用いて試験し、これらクローンのうちの９つにおける結果を以下に示した。残りの４クローンは非常にゆっくりと成長したため、試験しなかった。評価基準として用いるために、選択した非クローン親細胞をクローンと共にプレーティングした。ＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物を用いて試験した場合の、それぞれの８クローンの活性並びに選択したがクローニングしなかったＮｅｕｒｏ−２ａ  ＧａｌＲ１細胞の活性を表２８に示す。試験した８つのクローンのうち、クローン＃４、７及び１２のみが満足できるＥＣ５０値を有するＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物の良い取り込みを示した。Ｎｅｕｒｏ−２ａ  Ｇａｌ  Ｒ１クローン＃１、３及び１０はＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物を取り込まず、クローン＃５、１１及び１３並びに非クローン集団は非常に高いＥＣ５０値を生じたため、これら細胞を用いたさらなる試験は行わなかった。
【表２８】
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【０３００】
４．クローン細胞株におけるＧａｌＲ１発現の解析
クローンのスクリーニングは、クローン＃４、７、及び１２のみが非クローン細胞よりも感受性であることを示した。実施例Ｖに記載したＲＴ−ＰＣＲ条件及び表２９に記載したプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによる解析のために、これら３クローン、並びにトランスフェクションしていない親及び安定してトランスフェクションした非クローンＮｅｕｒｏ−２ａ細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出した。
【表２９】
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【０３０１】
表３０の結果は、トランスフェクションした非クローン細胞及びクローンは親細胞よりも非常に多い量のＧＡＬＲ１  ｍＲＮＡを有することを示す。ＴＶＥＭＰ−ガラニン細胞スクリーニングにおいては、クローン＃７がＴＶＥＭＰ−ガラニンに対して最も感受性であることが示された。表３０によると、クローン＃７はまた最も多量のＧＡＬＲ１  ｍＲＮＡを有することが示される。Ｎｅｕｒｏ−２ａ  ＧａｌＲ１  クローン７（Ｎｅｕｒｏ−２ａ＃７）のＣＴ値は最低であり、続いてクローン４、次がクローン１２であった。試験した非クローンはこの時点ではクローン１２に近似したＣＴを提供したが、しかしながら、これらの細胞は多様な濃度のＧａｌ  Ｒ１受容体を含む絶えず変化している細胞集団を含むため、今後の研究のための良い集団とは考えられなかった。低いＥＣ５０値を有する３つのクローンのうち、Ｎｅｕｒｏ−２ａクローン  ＧａｌＲ１クローン＃１２（Ｎｅｕｒｏ−２ａ＃１２）が最も早く成長し、続いてＮｅｕｒｏ−２ａクローン＃７、最後がＮｅｕｒｏ−２ａクローン＃４であった。その遅い成長速度に加え、Ｎｅｕｒｏ−２ａクローン＃７の感受性がクローン＃４よりもかなり高かったため、その後はＮｅｕｒｏ−２ａクローン＃４を試験しなかった。
【表３０】
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【０３０２】
５．Ｎｅｕｒｏ−２ａクローン＃７及び＃１２のＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物への感受性及び特異性の比較
２つのクローンうちの最も感受性及び特異性の高いものを同定し、最も優れたクローンからデータを確信をもって収集する目的で、２つのクローンの比較試験を行った。表３１は、ＴＶＥＭＰ−ガラニンバッチＣ及びＬＨＮ／Ａで処理した場合のこれら２つのクローン感受性及び選択性の結果をそれぞれ示す。両方のクローンが高いシグナル対ノイズ比を示す。Ｎｅｕｒｏ−２ａクローン＃７は５．５ｎＭのＥＣ５０を有し、一方でＮｅｕｒｏ−２ａクローン＃１２のＥＣ５０は６８．４ｎＭである。Ｎｅｕｒｏ−２ａクローン＃１２は０〜３００ｎＭの用量範囲で試験する必要があり、Ｎｅｕｒｏ−２ａクローン＃７は用いた最高濃度でのプラトーを誘導するために０〜３０ｎＭの用量範囲で試験することができる。両方のクローンがＬＨＮ／ＡとＴＶＥＭＰ−ガラニンバッチＣとの間の良好な分離を示し、Ｎｅｕｒｏ−２ａクローン＃１２は高濃度ではいくらかの非特異的取り込み示したが、Ｎｅｕｒｏ−２ａクローン＃７は示さなかった。表にした結果に見られるように、Ｎｅｕｒｏ−２ａ＃７細胞を用いた試験における範囲はＮｅｕｒｏ−２ａ＃１２細胞についてもより１０倍低く、Ｎｅｕｒｏ−２ａ＃７においては用いる化合物がＮｅｕｒｏ−２ａ＃１２の１０分の１未満となる。比較としてＬＨＮ／Ａを用いた場合には、Ｎｅｕｒｏ−２ａ＃７はＮｅｕｒｏ−２ａクローン＃１２よりも８倍を超えて選択的である。シグナル対ノイズ比は両方のクローンにおいて１００を超え、しかしながら、細胞を用いた効力アッセイの作成には比が１０であれば十分であった。Ｎｅｕｒｏ−２ａ＃７クローンのＥＣ５０は５．５ｎＭであり、ＥＣ５０が６８．４ｎＭであるＮｅｕｒｏ−２ａ＃１２よりも約１２倍低い。試験を行うためのより低い用量範囲、ＬＨＮ／Ａへの２４倍の選択性、高いシグナル対ノイズ比、低いＥＣ５０を生じる優れた感受性、及びそれぞれの試験において必要とされるタンパク質量が少ないこと全てが、Ｎｅｕｒｏ−２ａクローン＃７がＴＶＥＭＰ−ガラニン化合物に対する効力比の決定において用いられる、細胞を用いた効力アッセイを進めるためのクローンであることを意味する。
【表３１】
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【０３０３】
実施例ＸＶＩ  ダイノルフィンＡ再標的化エンドペプチダーゼの取り込みのためのＫＯＲ−１受容体を過剰発現しているクローン細胞株の作出
以下の実施例は、標的受容体を用いたトランスフェクション及び続く細胞株のクローニングから得られた確立された細胞株由来の複数クローン細胞株をどのように解析及び比較したかを説明する。この特定の実施例は、実施例ＩＩＩ、表９において最初に記載されたｈＫＯＲ−１を用いてトランスフェクションしたクローン細胞株の同定及び解析について言及する。
【０３０４】
４つのＡＧＮ  Ｐ３３−ＫＯＲクローン（クローン番号８、９、１０、及び１２、実施例ＩＩＩの表９）を選択し、完全用量反応が０〜１５０ｎＭのＤｙｎ／Ａを用いて試験した。同時に、２つのＳｉＭａ−ＫＯＲクローン（クローン番号１２、及び１６、実施例ＩＩＩの表９）を選択し、完全用量反応が０〜１５０ｎＭのＤｙｎ／Ａで試験した。この実験においては、ＡＧＮ  Ｐ３３−ＫＯＲクローン８、９、及び１２は非常に低い取り込みを生じたためにこれを捨て；ＡＧＮ  Ｐ３３−ＫＯＲクローン１０は良い取り込みを示し、３０．３ｎＭのＥＣ５０が得られた。試験した２つのＳｉＭａ−ＫＯＲクローンは良い取り込みを示し、及びクローン１６については２６．６ｎＭのＥＣ５０が得られ、クローン１２については１１．８ｎＭのＥＣ５０が得られた。これら３つのクローンを次に、標的リガンドを欠損した陰性対照であるＬＨＮ／Ａ及びＮｏｃ／Ａ対照に対する標的Ｄｙｎ／Ａ化合物の取り込みを比較することにより、感受性及び選択性について試験した。０〜１５０ｎＭの完全用量反応を用いた３つのクローン及び親ＳｉＭａ細胞の比較を表３２にまとめた。
【表３２】
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【０３０５】
ＫＯＲ−１を用いてトランスフェクションし、Ｄｙｎ／Ａで処理したクローンにおいては、Ｄｙｎ／Ａ取り込みが顕著に上昇したが、親ＳｉＭａ細胞は化合物の最小の取り込みを示した（陰性対照ＬＨＮ／Ａと同等の取り込み）。親ＳｉＭａ細胞を含む全ての細胞株中にいくらかのＮｏｃ／Ａが存在した。この再標的化化合物に対するアッセイの作成に際して、Ｎｏｃ／Ａの取り込みがＳｉＭａ細胞において観察されたことから、これは当然のことである。さらに、Ｎｏｃ／Ａ取り込みは、この再標的化エンドペプチダーゼに対して特異的に生成したＡＧＮＰ３３細胞株において最も良かった。Ｎｏｃ／Ａ取り込みとＤｙｎ／Ａ化合物取り込みとの間の差はクローンＳｉＭａ−ＫＯＲクローン１２（ＳＫ１２）細胞においてより大きかった。全てのグラフにおいて、結合ドメインが欠損すると、これら細胞株における特異的な取り込みが失われるをことを示す陰性対照、ＬＨＮ／Ａ、の活性が最小であり、Ｄｙｎ／Ａ化合物の取り込みが高度に特異的であることを示すＳＫ１２細胞において最低であった。これらの結果から、さらなる最適化及び解析のためにＳＫ１２クローンを選択した。
【０３０６】
ロバストで特異的、かつ、感受性のアッセイを作成するために、ＳＫ１２細胞を用いて最適化研究を行った。プレーティング培地及びプレーティング密度、処理培地、及び処理時間を含む複数の指標についてアッセイした。最適化に際して得られたデータの要約を表３３に示した。
【表３３】
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【０３０７】
表Ｂは、１ウェル当たり１００，０００細胞をＣＭ中にプレーティングし、ＣＭ中において化合物で処理した細胞は、１つの実験から次の実験にかけて、ＥＣ５０値においてより大きい変動を示したが（４．６；１．２及び１３．７２ｎＭ）、１ウェル当たり１００，０００細胞をＳＦＭ中にプレーティングし、ＳＦＭ中で希釈した化合物で処理した細胞は最も良い曲線と一致するＥＣ５０値（９．０及び８．４ｎＭ）を示した。今後細胞は、１ウェル当たり１００，０００細胞でＳＦＭ中にプレーティングされ、またＳＦＭ中で化合物を用いて処理されるだろう。
【０３０８】
１ウェル当たり１００，０００細胞のＳＦＭ中のＳＫ１２を入れたＰＤＬプレートに２４時間プレーティングし、その後ＳＦＭ中で１６時間処理することにより、８．４＋／−１．１ｎＭの最低のＥＣ５０値及び１２のシグナル対ノイズ比を得た。これら両方の値は、ＣＢＰＡにおけるこの細胞の今後の使用について満足のいくものであった。
【０３０９】
飽和結合アッセイを用いたＳＫ１２細胞の解析
本明細書で用いた飽和結合アッセイについては実施例Ｖで詳細に記載した。結合を評価するために、ＫＯＲ−１アンタゴニスト３Ｈ−ジプレノルフィンを用いて飽和結合研究を行った。全、特異的、及び非特異的結合を複数の実験で測定した。受容体と３Ｈ−ジプレノルフィンの飽和結合曲線を２つの独立した実験化から生成した。分子の受容体に対する結合の約２５％の結合が非特異的、及び７５％が特異的のようである。分子の受容体に対する親和性は６．５ｎＭで十分である。Ｂｍａｘは、ＳＫ１２細胞においては、１細胞当たり２３ｆｍｏｌのＫＯＲ−１受容体があることを示す。
【０３１０】
別段の指定のない限り、明細書及び請求項で用いられた構成要素の量、分子量、反応条件などの特性などを表す全ての数は、「約」という用語により、全ての例において調節されることを理解されたい。従って、反対に指定のない限り、明細書及び添付の請求項において示した数値パラメータは、本発明によって得ることが目的とされる所望の性質に依存して多様になり得る近似値である。少なくとも、請求項の範囲の等価物の原則の適用を限定する意図でなく、それぞれの数値パラメータは、少なくとも報告された有効数字の数を考慮して、かつ、一般的な丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広い範囲において示している数値の範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において示した数値は、できるだけ正確に報告した。しかしながら、いずれの数値も、それぞれの試験した測定においてみられる標準誤差からどうしても生じる、特定の誤差を本質的に含む。
【０３１１】
別段の指定のない限り、本明細書においては、本発明を説明する文脈で（特に以下の請求項における文脈で）用いられる「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語及び類似の指示対象は単数及び複数の両方を含むように解釈され、又は文脈からそうでないことが明白である。本明細書における値の範囲の詳細は単に、その範囲内にあるそれぞれ別個の値を個別に言及する、簡潔な方法を提供する目的のためである。本明細書において別段の指定のない限り、それぞれの個別の値は、本明細書において個別に記載された通りに本明細書に組み込まれる。本明細書において別段の指定のない限り、本明細書において記載した全ての方法は任意の好適な方法によって実施することができ、又はそうでないことが文脈から明白である。本明細書において提供した、いずれの及び全ての実施例、又は例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は単に、本発明をより明確にする目的のためだけのものであり、請求項に記載しない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の実施において必須の、請求項に記載していないいずれの要素を示す言葉は、本明細書においては記載されていないと解釈されたい。
【０３１２】
本明細書で開示した発明の別の要素、又は実施形態の分類は、限定としては解釈されない。それぞれの群のメンバーは個別に、又はその群のその他のメンバー若しくは本明細書に見られるその他の要素との任意の組み合わせにおいて記載され、及び請求され得る。便宜上及び／又は特許権の理由から、ある群の１つ以上のメンバーが、群に含まれる又は群から除かれてもよい。そのような任意の包含又は除去が生じた場合には、本明細書はその群を変更した群に含まれると見なし、そのため、添付の請求項において用いた全てのマーカッシュ群について記載した詳細を満たす。
【０３１３】
発明者らに既知の本発明の実施における最適な方法を含む、本発明の特定の実施形態を本明細書において記載した。当然のことながら、前述の明細書を読むことにより、これら記載した実施形態の変異型が当業者には明らかになるだろう。熟練した技術者は、それら変異型を適した形態として用いることを発明者らは予期し、、本明細書に記載した方法以外の方法で本発明が実施されることを発明者らは意図する。従って、本発明は、適用法によって許可される通り、添付の請求項に記載した対象物の全ての変更及び等価物を含む。さらに、本明細書において別段の指定のない限り又は文脈からそうでないことが明らかでない限り、全ての可能な変異型における上述した要素のいずれの組み合わせもまた、本発明に包含される。
【０３１４】
本明細書において開示した特定の実施形態は、「からなる」又は「本質的にからなる」という言葉を使用する請求項においてはさらに限定され得る。請求項において用いられた場合、分野として又は補正に加えられたとしても、「からなる」という移行句は、その請求項において指定されていないいずれの要素、工程、又は成分を除外する。「本質的にからなる」という移行句は、指定した材料又は工程、並びに基本的な及び新規の特徴に物質的に影響を及ぼさない材料又は工程に、発明の範囲をに制限する。請求項に記載された本発明の実施形態は、本質的に又は明確に記載され、本明細書において使用可能である。
【０３１５】
さらに、本明細書を通じて、参考文献として数多くの特許及び発行された印刷物を引用した。上記で引用したそれぞれの参考文献及び発行された印刷物は、個別のその全文が引用することにより本明細書に組み入れられる。
【０３１６】
終わりに、本明細書で開示した本発明の実施形態は、本発明の原理を説明するものであることを理解されたい。用いられる可能性のあるその他の変更もまた、本発明の範囲に含まれる。従って、非限定的な一例として、本発明の別の形態が、本明細書の教えに従って用いられる可能性がある。従って、本発明は、示し及び記載したように正確には限定されない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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