(57)【要約】本開示は、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化のインヒビターでの処置に感受性のがん組織を同定するための方法を提供する。上記方法は、がん組織に由来するサンプル中のＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを決定する工程を包含し、ここで上記サンプル中のＨｅｙＬ遺伝子発現のみの上昇したレベルは、上記がん組織がＮｏｔｃｈ受容体活性化のインヒビターでの処置に感受性であることを示す。Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する薬剤での処置に対して感受性であるがん組織としては、乳房腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、および膵臓腫瘍のような固形腫瘍が挙げられる。Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する薬剤での処置に対して感受性のがん組織としてはまた、体液（例えば、血液および骨髄）が挙げられ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する薬剤での処置に感受性のヒトもしくはマウスのがん組織を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）該がん組織に由来するサンプル中のＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを測定する工程；および
（ｂ）該ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを、標準値に対して比較し、それによって、ＨｅｙＬ遺伝子発現のみに基づいて、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する薬剤での処置に対して感受性のがん組織を同定する工程であって、ここで該サンプル中のＨｅｙＬ遺伝子発現の上昇したレベルは、該がん組織が該薬剤での処置に感受性であることを示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記がん組織が、固形腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍が、乳房腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、および膵臓腫瘍からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記がん組織が、血液および骨髄からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨｅｙＬ遺伝子発現の上昇したレベルが、適切なコントロールサンプル中のＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルと比較して、少なくとも２倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルが、ｍＲＮＡを検出することによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍＲＮＡ検出が、マイクロアレイによるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍＲＮＡ検出が、定量的ＰＣＲによるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルが、ＨｅｙＬポリペプチド検出によって測定される、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、  ２００８年７月１１日に出願された米国仮特許出願番号第６１／０８０，１２２号および２００９年１月２７日に出願された米国出願番号第１２／３６０，７９０号への優先権およびその利益を主張し、各々の全容は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、分子生物学および腫瘍学である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
大部分のがん薬物は、ある患者には有効であるが、他の患者には有効ではない。このことは、腫瘍間の遺伝的バリエーションから生じ、同じ患者内の腫瘍間ですら観察され得る。変動し得る患者応答は、標的化治療に関して特に顕著である。従って、標的化治療の完全な可能性は、どの患者がどの薬物から利益を受けるかを決定するための適切な生体マーカーなしでは現実化できない。国立衛生研究所（ＮＩＨ）は、生体マーカーを以下のように定義する：
インジケーター、または通常の生物学的もしくは病原性プロセス、または治療的介入への薬理学的応答として客観的に測定かつ評価される形質。
【０００４】
生体マーカーの発見に基づく改善された診断の開発は、予め、所定の薬物に対し最も臨床的応答を示すであろう患者を同定することによって、新薬開発を促進する可能性を有する。このことは、臨床試験の規模、期間および費用を顕著に低下させる。ゲノミクス、プロテオミクスおよび分子画像化のような技術は、現在、特定の遺伝子変異、特定の遺伝子の発現レベル、および他の分子的生体マーカーの迅速、高感度かつ信頼性ある検出を可能にしている。腫瘍の分子的特徴付けのための種々の技術の利用可能性にも拘わらず、がん生体マーカーの臨床的利用は、十分には利用されていないままである。なぜなら、がん生体マーカーがほとんど発見されていないからである。例えば、近年の総説記事は、以下のように述べている：
がんの診断および処置を改善するために、生体マーカーおよびその使用の迅速な開発が、非常に必要とされている（非特許文献１）。
【０００５】
がん生体マーカーに対する別の近年の総説記事は、以下の見解を含む：
難題は、がん生体マーカーを発見することである。分子標的化薬剤を使用して、いくつかの腫瘍タイプ（例えば、慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、肺がんおよび多形性神経膠芽腫）の分子的に定義されたサブセットを標的化することにおいて臨床的に成功してきたが、このような成功をより広い状況において適用する能力は、患者において標的化薬剤を評価するために効率的なストラテジーがないことによって、厳しく制限されている。問題は、主に、これら刺激的な新薬を評価する臨床試験のために、分子的に定義されたがんを有する患者を選択することができないことにある。その解決法は、特定の薬剤から利益を受ける可能性が最も高い患者を確実に同定する生体マーカーを必要とする（非特許文献２）。
このような見解は、臨床的に有用な生体マーカーおよびそのような生体マーカーに基づく診断法の発見の必要性の認識を示す。
【０００６】
脊椎動物（哺乳動物を含む）は、４つの異なるＮｏｔｃｈタンパク質（Ｎｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ１〜Ｎｏｔｃｈ４）としても公知）を有する。全４つのＮｏｔｃｈ受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む１型膜貫通タンパク質である。
【０００７】
上記Ｎｏｔｃｈ経路は、細胞間シグナル伝達について高度に保存されたシステムである。これは、全ての後生動物に存在し、通常の成長および発生において複数の役割を果たす。上記Ｎｏｔｃｈ経路に関する総説については、例えば、非特許文献３を参照のこと。Ｎｏｔｃｈ機能は複雑であり、細胞の状況（一時的な状況、および解剖学的状況）に非常に依存する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、多くのがんにおいて調節不全（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅ）となっている。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は広い範囲の細胞タイプおよびプロセスに影響を及ぼしているだけでなく、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、異なる細胞状況において活性化される場合には、反対の効果も生じる。例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖を刺激し、アポトーシスを阻害すると同時に、細胞周期を停止させ、Ｂ細胞におけるアポトーシスを誘導する。Ｎｏｔｃｈは、ある細胞状況においては腫瘍遺伝子として機能する一方で、他の細胞状況においては、腫瘍リプレッサーとして機能する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ，２００７，６：２５
【非特許文献２】Ｓａｗｙｅｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５２：５４８〜５５２，５４８にて
【非特許文献３】Ｉｌａｇａｎら，Ｃｅｌｌ，２００７，１２８：１２４５〜１２４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｎｏｔｃｈは、特定のがんの処置における潜在的な治療標的である。しかし、Ｎｏｔｃｈ生物学の複雑性は、任意の所定の腫瘍におけるＮｏｔｃｈ経路阻害の効果を推測不能にする。このことは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のインヒビターでの処置に応答する腫瘍を同定するための診断法の発見が必要であることを強調する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、特定の哺乳動物のがんに由来する組織サンプル中のＨｅｙＬ遺伝子発現の上昇したレベルがＮｏｔｃｈ受容体活性化のインヒビターでの処置に対する感受性を示すという発見に一部基づく。
【００１１】
よって、本発明は、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する薬剤での処置に感受性のがん組織を同定するための方法を提供する。上記方法は、（ａ）上記がん組織に由来するサンプル中のＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを決定する工程；および（ｂ）ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを、標準値に対して比較し、それによって、ＨｅｙＬ遺伝子発現のみに基づいて、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する薬剤での処置に感受性のがん組織を同定する工程を包含する。上記サンプル中のＨｅｙＬ遺伝子発現の上昇は、上記薬剤での処置に対する上記がん組織の感受性を示す。特定の環境下では、工程（ｂ）における同定する工程は、ＨｅｙＬ以外のいかなる遺伝子の発現レベルにも基づかない。本発明のいくつかの実施形態において、ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルの上昇は、適切なコントロールサンプル中のＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルと比較して、少なくとも２倍（例えば、２倍〜４倍、または４倍〜３０倍）である。本発明のいくつかの実施形態において、上記ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルは、ｍＲＮＡ検出によって決定される。本発明のいくつかの実施形態において、上記ｍＲＮＡ検出は、マイクロアレイによるものである。本発明のいくつかの実施形態において、上記ｍＲＮＡ検出は、定量的ＰＣＲによるものである。本発明のいくつかの実施形態において、上記ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルは、ＨｅｙＬポリペプチドアッセイによって決定される。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する薬剤での処置に感受性のがん組織を同定するための方法を提供する。ここで上記方法は、（ａ）がん組織からサンプルを得る工程；（ｂ）上記サンプル中のＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを決定する工程；および（ｃ）上記ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを、標準値に対して比較し、それによって、ＨｅｙＬ遺伝子発現のみに基づいて、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する薬剤での処置に対して感受性のがん組織を同定する工程を包含する。本明細書に記載される場合、上記サンプル中のＨｅｙＬ遺伝子発現の上昇は、上記がん組織が上記薬剤での処置に対して感受性であることを示す。
【００１３】
Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する薬剤での処置に対して感受性であるがん組織としては、乳房腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、および膵臓腫瘍のような固形腫瘍が挙げられる。Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する薬剤での処置に対して感受性のがん組織としてはまた、体液（例えば、血液および骨髄）が挙げられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、線形回帰トレンド線を示す散布図である。線形回帰分析は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される場合のＨｅｙＬ  ｍＲＮＡ発現と、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対するヒト結腸がん細胞株の応答との間の高度の相関を示す。試験した７種のヒト結腸がん細胞株の中で、Ｒ２値は、０．８６９９（ｐ＝０．００２２）であった。これは、参照に対するＨｅｙＬ発現のレベル（比率）が大きくなるほど、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対する上記細胞株の感受性が大きくなることを示す。実線は、線形回帰を示す；破線は、９５％信頼区間を示す。参照は、市販のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７４００００）である。
【図２】図２は、線形回帰トレンド線を示す散布図である。線形回帰分析は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される場合のＨｅｙＬ  ｍＲＮＡ発現と、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対するヒト膵臓がん細胞株の応答との間の高度の相関を示す。試験した７種のヒト結腸がん細胞株の中で、Ｒ２値は、０．６１２３（ｐ＝０．００２６）であった。これは、ＨｅｙＬ発現のレベルが高くなるほど、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対する上記細胞株の感受性が大きくなることを示す。実線は、線形回帰を示す；破線は、９５％信頼区間を示す。参照は、市販のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７４００００）である。
【図３】図３は、マイクロアレイ発現プロフィールである。Ｎｏｔｃｈ１が近位Ｍｏ−ＭｕＬＶ組み込みによって活性化されかつＮｏｔｃｈ受容体活性化に依存するマウス腫瘍におけるＨｅｙＬ発現のマイクロアレイ分析は、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化に直接影響を与えずかつＮｏｔｃｈ受容体活性化に依存しない遺伝子を活性化するＭｏ−ＭｕＬＶ組み込みによって駆動されるマウス腫瘍と比較される。これらのような結果は、Ｎｏｔｃｈ依存性腫瘍が、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化に依存しない腫瘍より有意に高いレベルのＨｅｙＬを発現することを示す（ｐ＝８．５×１０−７）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
（生体マーカー）
がん生体マーカーには３種の異なるタイプがある：（１）予後生体マーカー、（２）推定生体マーカー、および（３）薬力学的（ＰＤ）生体マーカー。予後生体マーカーは、がん（例えば、固形腫瘍）を、攻撃性（すなわち、増殖および／もしくは転移の速度）、および処置への治療抵抗性（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）に従って分類するために使用される。これは、ときおり、「良好な結果」の腫瘍の、「悪い結果」の腫瘍からの区別といわれる。推定生体マーカーは、特定の患者が特定の薬物での処置から利益を得る可能性を評価するために使用される。例えば、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２もしくはＮＥＵ）遺伝子が増幅される乳がんを有する患者は、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））での処置から利益を受ける可能性があるのに対して、ＥＲＢＢ２遺伝子増幅がない患者は、トラスツズマブでの処置から利益を受ける見込みはない。ＰＤ生体マーカーは、患者が薬物を摂取している間の、上記患者に対する上記薬物の効果の指標である。よって、ＰＤ生体マーカーは、しばしば、新薬の臨床開発の初期段階の間に、投与レベルおよび投与頻度をガイドするために使用される。がん生体マーカーの考察については、例えば、Ｓａｗｙｅｒｓ，２００８，Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：５４８−５５２を参照のこと。
【００１６】
本明細書で記載される研究は、ＨｅｙＬが推定生体マーカーでありかつＨｅｙＬ遺伝子発現の上昇したレベルが、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のインヒビターでの処置に対する腫瘍の感受性を示すことを実証する。上記ＨｅｙＬ遺伝子発現の（適切な標準に対する）レベルは、他の遺伝子発現データの非存在下で、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のインヒビターでの処置に対して応答する可能性に従って腫瘍を分類するための生体マーカーとして使用され得る。腫瘍のこのような分類は、臨床状況においてヒト患者を処置するために有用である。このような分類はまた、実験動物（例えば、遺伝的に操作されたマウスがんモデル）を伴う実験研究のために有用である。
【００１７】
（定義）
本明細書で使用される場合、ＨｅｙＬ遺伝子発現の「上昇したレベル」とは、適切な比較の標準（すなわち、ベースライン値）より有意に高い、ＲＮＡレベルもしくはタンパク質レベルで測定されるＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを意味する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「ＨｅｙＬ遺伝子」とは、（ａ）配列番号１からなるポリペプチドをコードするヒト遺伝子（アクセッション番号ＮＰ＿０５５３８６）；（ｂ）（ａ）の対立遺伝子改変体；および（ｃ）（ａ）の哺乳動物オルソログを意味する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「Ｎｏｔｃｈリガンド」とは、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、もしくはＤＮＥＲを意味する。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「Ｎｏｔｃｈ受容体」とは、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３もしくはＮｏｔｃｈ４を意味する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「Ｎｏｔｃｈ受容体活性化」とは、核へのトランスロケーションのためにＮｏｔｃｈ細胞質ドメインを放出するＮｏｔｃｈ受容体の調節された部位特異的タンパク質分解切断を意味する。Ｎｏｔｃｈタンパク質分解切断を調節するタンパク質の例としては、Ｎｏｔｃｈリガンド（ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、およびＤＮＥＲ）、Ａｄａｍ１０、Ａｄａｍ１７、プレセニリン、ニカストリン（ｎｉｃａｓｔｒｉｎ（ＮＣＴ））、ＰＥＮ２、ＡＰＨ１およびＣｒｕｍｂｓが挙げられる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「標準値」とは、適切な比較の標準、すなわち、ＨｅｙＬ遺伝子発現の測定されたレベルが比較されて、ＨｅｙＬ遺伝子発現の上記測定されたレベルが上昇したレベルであるか否かが決定されるベースライン値を意味する。
【００２３】
（ＨｅｙＬおよびＮｏｔｃｈ）
ＨｅｙＬ（ＹＲＰＷモチーフ様関連へアリー／スプリットのエンハンサー（ｈａｉｒｙ／ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｏｆ−ｓｐｌｉｔ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＹＲＰＷ  ｍｏｔｉｆ−ｌｉｋｅ））として公知のヒト遺伝子は、３２８アミノ酸のポリペプチドをコードし、ベーシックヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）タイプ転写因子のＨＥＳＲ（へアリーおよびスプリットのエンハンサー関連（ｈａｉｒｙ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｓｐｌｉｔ−ｒｅｌａｔｅｄ））ファミリーに属する。Ｈｅｙ１およびＨｅｙ２とともに、ＨｅｙＬは、上記ＨＥＳＲファミリー内のＨＥＲＰ（ＨＥＳ関連リプレッサータンパク質（ＨＥＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ））サブファミリーに属する。Ｈｅｙ１およびＨｅｙ２と共通して、上記ＨｅｙＬタンパク質は、保存されたｂＨＬＨドメインおよびＯｒａｎｇｅドメインを含む。ＨｅｙＬは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の下流エフェクターであり、乳がんにおいて頻繁に過剰発現されるといわれている。ＨｅｙＬは、細胞周期インヒビターｐ１５を（転写的に）標的化して、ｐ１５の影響を低下させ、細胞周期を細胞が進む速度を増大させると言われている。例えば、ＷＯ  ２００７／１３６８５６を参照のこと。上記ＨＥＲＰファミリーおよびＨＥＳファミリーは、密接に、構造的におよび機能的に関連しているが、ＨｅｙＬのみが（他のＨＥＳファミリー遺伝子、またはＨｅｙ１もしくはＨｅｙ２のいずれでもなく）、示されたがんにおけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害に対する感受性の生体マーカーとして働く。
【００２４】
多くの研究から、がん処置における上記Ｎｏｔｃｈ経路の標的化が示唆された。例えば、Ｍｉｅｌｅら，２００６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ６：３１３−３２３を参照のこと。これら研究の大部分において、上記Ｎｏｔｃｈ経路の種々の下流転写標的（Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５、Ｈｅｙ１、Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、Ｄｅｌｔｅｘ、ＮｒａｒｐおよびＮＦｋＢを含む）の状態が、目的の細胞におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達のレベルの代理マーカーとして使用されてきた。このような下流標的の上昇した発現は、活性なＮｏｔｃｈ経路（増大したＮｏｔｃｈシグナル伝達）を示すと解釈され、およびこのような標的の低下した発現は、低下したＮｏｔｃｈシグナル伝達を示すと解釈された。上記種々の下流標的は、本質的に、所定の組織もしくは細胞株におけるＮｏｔｃｈ活性（シグナル伝達）のレベルを示すという点で等価である。このことは、刊行物（例えば、Ｉｓｏら，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：６５９８−６６０７；Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒら，２００６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２６：２０９−２２０；Ｆｉｓｃｈｅｒら，２００７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：４５８３−４５９６；およびＬｅｏｎｇら，２００７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：２９３５−２９４８）によって示されている。
【００２５】
一般に、上記Ｎｏｔｃｈ経路が活性である任意の細胞株において、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害は、下流の標的遺伝子の発現の低下をもたらす。しかし、重要なことには、本発明者らは、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害が、上記経路が活性である全ての細胞株の増殖を阻害しない（もしくは生存率を低下させない）ことを見いだした。例えば、γ−セクレターゼインヒビターによるＮｏｔｃｈ活性化の阻害は、ＨＴ−２９結腸がん細胞株およびＬＳ−１０３４結腸がん細胞株の両方においてＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現を低下させる。しかし、ＬＳ−１０３４細胞は、Ｎｏｔｃｈ活性化に非常に依存的である一方で、ＨＴ−２９細胞は、Ｎｏｔｃｈ活性化の阻害に対して比較的非感受性である。このことは、Ｎｏｔｃｈ経路標的遺伝子のパネルの上昇した発現への信頼は、Ｎｏｔｃｈ依存性細胞株を同定するために効果的ではないことを示す。特定の生体マーカー（その発現は、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化インヒビターに応じた細胞の増殖の低下および／もしくは生存率の低下と相関する）を同定することが必要である。
【００２６】
ＨｅｙＬ遺伝子発現は、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対する細胞の感受性（Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に対する依存性）と（正に）相関するのに対して、他の個々のＮｏｔｃｈ標的遺伝子の発現レベルも、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の組み合わせも、このような感受性と相関しない。代わりに、それらは、上記Ｎｏｔｃｈ経路が活性であることを示すに過ぎない。このことは、細胞もしくは組織におけるＮｏｔｃｈ経路活性もしくはＮｏｔｃｈシグナル伝達の証明が、その細胞もしくは組織がＮｏｔｃｈ受容体活性化のインヒビターでの処置に感受性であることを推定するには不十分であることを意味する。ＨｅｙＬは、他のＮｏｔｃｈ標的遺伝子とは異なる。なぜなら、上記ＨｅｙＬは、Ｎｏｔｃｈ経路活性（もしくはその欠如）を示すのみならず、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化のインヒビターに対する感受性（もしくはその欠如）をも示すからである。
【００２７】
ヒト原発性腫瘍からの発現プロフィールデータの分析から、種々のがんタイプの中でのＨｅｙＬ遺伝子発現レベルにおけるバリエーションが明らかにされている。さらに、これらデータは、ＨｅｙＬ遺伝子発現の上昇は、Ｎｏｔｃｈ経路シグナル伝達に増殖が依存する（および低分子であろうが生物製剤であろうが、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する薬剤によって増殖が阻害される）ヒトがんに印をつけることを示す。ＨｅｙＬ遺伝子発現レベルにおける有意なバリエーションを有するヒトがんとしては、膵臓がん、乳がん（特に、基底様乳がん（ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ））および結腸がんおよび小細胞肺がんが挙げられる。Ｎｏｔｃｈ１変異体Ｔ−ＡＬＬはまた、高いＨｅｙＬ発現を示す。これらがんは、ＨｅｙＬ遺伝子発現が、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対する感受性を推定する生体マーカーである状況を示す可能性が高い。神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞株のような他の状況では、ＨｅｙＬは、有意なレベルでは発現されず、ＧＢＭ細胞株の中で、ＨｅｙＬ遺伝子発現レベルにおける有意なバリエーションは存在しない。さらに、Ｎｏｔｃｈアンタゴニスト（例えば、Ｊａｇ１−Ｆｃ）でのＧＢＭ細胞株の処置は、Ｎｏｔｃｈ依存性ヒトＧＢＭ細胞株を同定するが、ＨｅｙＬ発現は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害に対するＧＢＭ細胞株感受性と相関がないことを示す。従って、ＨｅｙＬは、上記Ｎｏｔｃｈ経路の阻害に対する感受性の生体マーカーとして具体的に定義された腫瘍において使用され得る。
【００２８】
本発明の前に、Ｎｏｔｃｈの任意の１つの特定の下流標的の発現レベルが、Ｎｏｔｃｈ経路インヒビターに対する特定のがん（例えば、特定の腫瘍）の感受性を推定することを示さなかった。本発明者らは、驚くべきことに、特定のがんにおいて、（ａ）ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルが、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化のインヒビターでの処置に対する感受性についての推定生体マーカーであること、および（ｂ）Ｎｏｔｃｈの他の下流標的（例えば、Ｈｅｙ１およびＨｅｙ２）が、個々でも、グループとしても、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化のインヒビターでの処置に対する感受性についての推定生体マーカーでないことを発見した。
【００２９】
（Ｎｏｔｃｈ受容体活性化のインヒビター）
Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する種々の薬剤は、公知である。例えば、ＴＮＦα変換酵素の低分子インヒビター（ＴＡＣＥインヒビター）（ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７が挙げられる）（Ｍｏｓｓら，２００８，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：２−８）、およびγ−セクレターゼインヒビター（ＤｅＳｔｒｏｏｐｅｒら，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：５１８−５２２）は、上記Ｎｏｔｃｈ受容体のタンパク質分解切断を阻害することによって、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害する。Ｎｏｔｃｈリガンドを隔離する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）可溶性受容体のおとり（ｄｅｃｏｙ）は、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害するために使用され得る（Ｆｕｎａｈａｓｈｉら，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：４７２７−４７３５）。また、Ｎｏｔｃｈ受容体へのリガンド結合を阻害する可溶性リガンド（Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅら，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：１０３２−１０３７）が使用され得る。Ｎｏｔｃｈリガンドに結合する抗体（Ｒｉｄｇｗａｙら，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：１０８３−１０８７；Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅら，前出）もしくはＮｏｔｃｈ受容体に結合する抗体（Ｌｉら，２００８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ＩＥＰ  Ｊａｎｕａｒｙ  ８，２００８）は、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化を阻害するために使用され得る。さらに、上記γ−セクレターゼ複合体の成分（例えば、ニカストリン）に結合する抗体が使用され得る。
【００３０】
（組織サンプルの提供）
本発明の方法は、哺乳動物（例えば、実験マウスもしくはヒト患者）における癌性組織からサンプルを提供し、その結果、ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルが、上記サンプル中で決定され得ることを包含する。上記サンプルの形態および上記サンプルを得るための方法は、関与する癌性組織のタイプに依存する。
【００３１】
例えば、上記癌性組織が血液である場合、急性リンパ芽球性白血病と同様に、上記サンプルは、骨髄サンプルであり得、上記骨髄サンプルは、従来の骨髄生検機器および手順を使用して得られ得る。あるいは、上記サンプルは、血液自体のサンプルであり得、上記血液は、従来の瀉血機器および手順を使用して得られ得る。必要に応じて、全血球、もしくは特定のタイプの血球（例えば、白血球）は、ＨｅｙＬ遺伝子発現の決定のために単離され得る。
【００３２】
上記癌性組織が固形腫瘍（例えば、癌腫、肉腫、神経膠腫もしくはリンパ腫）である場合、上記サンプルは、腫瘍サンプルであり、上記腫瘍サンプルは、従来の腫瘍生検機器および手順を使用することによって得られ得る。内視鏡生検、切除生検、切開生検、細針生検、パンチ生検、薄片生検および皮膚生検は、本発明の方法を実施することにおいて使用するための腫瘍サンプルを得るために、当業者によって使用され得る認められた医療手順の例である。
【００３３】
（ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルの決定）
本発明を実施するにあたって、上記ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルの決定は、任意の適切な方法（例えば、ｍＲＮＡベースの方法もしくはタンパク質ベースの方法）によって行われ得る。目的の遺伝子の発現レベルを決定するための種々の方法は、当該分野で公知である。このような方法は、一般に、上記ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを決定することにおいて適用され得る。本発明の目的のために、ＨｅｙＬ遺伝子発現は、ｍＲＮＡレベルにおいて、もしくはポリペプチドレベルにおいて決定され得る。
【００３４】
上記ＨｅｙＬ遺伝子発現の相対レベルを評価するために、がん組織サンプル中の上記ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルは、種々の比較のうちの１つ以上に供され得る。一般に、（ａ）がんが発生した器官に由来する正常組織中のＨｅｙＬ遺伝子発現レベル；（ｂ）同種のがん組織サンプルの収集物におけるＨｅｙＬ遺伝子発現レベル；（ｃ）正常組織サンプルの収集物におけるＨｅｙＬ遺伝子発現；または（ｄ）任意の標準中のＨｅｙＬ遺伝子発現レベルと比較され得る。
【００３５】
例えば、自発性マウス乳房腫瘍におけるＨｅｙＬ遺伝子発現の上昇したレベルは、自発性マウス乳房腫瘍の参照収集物におけるＨｅｙＬ遺伝子発現の平均レベルより有意に高いレベルであり得る。ここでＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを、同じ方法（例えば、定量的ＰＣＲ）によって測定した。第２の例において、ヒト基底様乳がん組織サンプル中のＨｅｙＬ発現の上昇したレベルは、ヒト基底様乳がん組織サンプルの参照収集物中のＨｅｙＬ遺伝子発現の平均レベルより有意に高いレベルであり得る。ここでＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを、同じ方法（例えば、免疫組織化学）によって測定した。
【００３６】
上記比較は、間接比較および直接比較であり得る。よって、組織サンプル中の上記ＨｅｙＬ発現のレベルは、同じタイプの組織サンプルが比較される代わりに、任意の標準（例えば、特定の培養細胞株における上記ＨｅｙＬ発現のレベル）と比較して表され得る。本発明のいくつかの実施形態において、ＨｅｙＬ遺伝子発現の上昇したレベルは、任意の標準（例えば、１０個のヒトがん細胞株から全ＲＮＡのプール）中のＨｅｙＬ遺伝子発現レベルより少なくとも２倍高い。上記標準は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７４００００）として市販されている。
【００３７】
（ＨｅｙＬ  ｍＲＮＡ測定）
ｍＲＮＡレベルとしてＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを決定するための方法の例としては、従来のマイクロアレイ分析および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）が挙げられる。ＲＮＡは、標準的プロトコルを使用して、目的の細胞、腫瘍もしくは組織から抽出され得る。
【００３８】
（マイクロアレイ）
複数遺伝子についてのｍＲＮＡのレベルは、従来のマイクロアレイ発現プロフィール分析を使用して決定され得る。機器、マイクロアレイチップ、試薬およびプロトコルは、当該分野で公知であり、商業的供給源から入手可能である。目的のサンプルから単離されるＲＮＡは、製造業者のプロトコル（例えば、ＡｇｉｌｅｎｔもしくはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して単離され得、任意の特定のマイクロアレイプラットフォームに必要な標識物質に変換され得る。マイクロアレイハイブリダイゼーションは、上記マイクロアレイ上のプローブによって表される、全ての遺伝子の発現の相対的なレベルを決定するために定量化され得る。比較は、単一のサンプル内の異なる遺伝子間で、または複数サンプル（コントロールサンプルを含む）の間での同じ遺伝子間で、行われ得る。
【００３９】
（定量的ＰＣＲ）
特定の遺伝子（ＨｅｙＬを含む）についてのｍＲＮＡのレベルは、従来の定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術を使用して測定され得る。定量的ＰＣＲのための組織サンプルの処理に関するガイダンスは、種々の情報源から入手可能である。例えば、ｗｗｗ．Ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ；またはｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍを参照のこと。定量的ＰＣＲが本発明を実施するにあたって使用される場合、目的の遺伝子（例えば、ヒトＨｅｙＬ）に対して特異的なプライマーは、上記遺伝子のｃＤＮＡ配列に基づく。商業的技術（例えば、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎもしくはＴａｑＭａｎＴＭ）は、業者の説明書に従って使用され得る。メッセンジャーＲＮＡレベルは、ハウスキーピング遺伝子（例えば、Ｂ−アクチンもしくはＧＡＰＤＨ）のレベルを比較することによって、サンプル間でのローディングの差異について正規化され得る。上記ｍＲＮＡ発現のレベルは、任意の単一のコントロールサンプル（例えば、正常もしくは非腫瘍の組織もしくは細胞に由来するｍＲＮＡ）と比較して、表わされ得る。あるいは、上記ｍＲＮＡ発現のレベルは、腫瘍サンプルもしくは腫瘍細胞株のプールに由来するか、またはコントロールｍＲＮＡの市販のセット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから市販される参照ＲＮＡ）に由来するｍＲＮＡと比較して、表わされ得る。
【００４０】
適切なＰＣＲプライマーの設計および使用は、当該分野で公知である。増幅（ＰＣＲ）プライマーとしての使用については、約１７〜２５ヌクレオチド長が好ましい。プライマーは、融解温度（Ｔｍ）予測のための従来のアルゴリズムを使用して、特定のＴｍを有するように設計され得る。プライマー設計およびＴｍ予測のためのソフトウェアは、商業的にもしくはインターネット上で入手可能である（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＰｒｉｍｅｒ３（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））。
【００４１】
（ＨｅｙＬタンパク質測定）
タンパク質レベルにおいてＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルを決定するための方法の例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）が挙げられる。
【００４２】
（ＥＬＩＳＡ）
ＨｅｙＬ  ＥＬＩＳＡを行うには、少なくとも１種の抗ＨｅｙＬ抗体（すなわち、検出抗体）が必要である。分析されるべきサンプルからのＨｅｙＬタンパク質は、ポリスチレンマイクロタイタープレートのような固体支持体上に固定される。この固定は、上記ＨｅｙＬの非特異的結合によって、すなわち、表面への吸着を介して、であり得る。あるいは、固定化は、特異的結合によって（すなわち、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗体（検出抗体とは異なる抗ＨｅｙＬ抗体）によって上記サンプルからのＨｅｙＬタンパク質の結合を介して）、であり得る。上記ＨｅｙＬが固定化された後に、上記検出抗体が添加され、上記検出抗体は、結合したＨｅｙＬと複合体を形成する。上記検出抗体は、直接的もしくは間接的のいずれかで、例えば、上記検出抗体を特異的に認識する２次抗体を介して酵素に連結される。代表的には、各工程の間に、結合したＨｅｙＬを有する上記プレートは、マイルドな界面活性剤溶液で洗浄される。代表的なＥＬＩＳＡプロトコルはまた、１回以上のブロッキング工程を包含し、上記工程は、上記プレートへのタンパク質試薬の所望されない非特異的結合をブロックするために、非特異的結合タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）の使用を伴う。最終洗浄工程の後に、上記プレートは、適切な酵素基質の添加によって発色（ｄｅｖｅｌｏｐ）させられ、目に見えるシグナルを生じ、上記シグナルは、上記サンプル中のＨｅｙＬの量を示す。上記基質は、例えば、色素生成基質もしくは蛍光生成基質であり得る。ＥＬＩＳＡ法、試薬および装置は、当該分野で周知であり、市販されている。
【００４３】
（免疫組織化学（ＩＨＣ））
ＩＨＣによるＨｅｙＬのアッセイは、少なくとも１種の抗ＨｅｙＬ抗体を必要とする。標準的なアプローチを使用して、上記抗ＨｅｙＬ抗体は、腫瘍から得られた切片（パラフィン包埋切片および凍結腫瘍切片を含む）においてＨｅｙＬタンパク質の存在を検出するために使用され得る。代表的には、上記腫瘍切片は、上記腫瘍物質を収集かつ保護する最初のプロセスにおいて固定された、タンパク質の抗原性構造を回復させるような方法で最初に処理される。次いで、スライドはブロッキングされて、上記抗ＨｅｙＬ検出抗体による非特異的結合が妨げられる。次いで、ＨｅｙＬタンパク質の存在は、上記ＨｅｙＬタンパク質への上記抗ＨｅｙＬ抗体の結合によって検出される。上記検出抗体は、直接的もしくは間接的のいずれかで、例えば、上記検出抗体を特異的に認識する２次抗体を介して、酵素に連結される。代表的には、上記腫瘍切片は、各工程の間に洗浄され、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）でブロッキングされる。上記スライドは、適切な酵素基質を使用して発色させられて、目に見えるシグナルが生じ、次いで、上記サンプルは、ヘマトキシリンで対比染色される。
【００４４】
（信頼度）
上昇したＨｅｙＬ発現は、Ｎｏｔｃｈアンタゴニストに対する感受性の定性的な生体マーカーであるだけではない。本発明はまた、定量的生体マーカーとしてのＨｅｙＬ発現レベルの使用を提供する。ＨｅｙＬ遺伝子発現のレベルが高くなるほど：（ａ）感受性を推定し得る信頼性が高くなり、かつ（ｂ）Ｎｏｔｃｈアンタゴニストに対する感受性の程度が高くなる。
【００４５】
ＨｅｙＬ発現レベルがＮｏｔｃｈ経路インヒビターに対する感受性を推定するために使用され得ることの信頼性の程度は、多くのアプローチを使用して決定され得る。一例において、ＨｅｙＬ発現レベルと、Ｎｏｔｃｈアンタゴニストに対するヒトがん細胞の感受性との間の相関の程度は、２変数を比較するために、線形回帰分析を使用して決定され得る。例えば、ヒト結腸がん細胞株において、ＨｅｙＬ発現レベルと、Ｎｏｔｃｈアンタゴニストに対する感受性との間には、非常に強い相関が認められる（Ｒ２＝０．８７、ｐ＝０．００２２）。同様に、ヒト膵臓がん細胞株において、ＨｅｙＬ発現レベルと、Ｎｏｔｃｈアンタゴニストに対する感受性との間には、非常に強い相関計が認められる（Ｒ２＝０．６１、ｐ＝０．００２６）。これらデータは、ＨｅｙＬが発現されるレベルが高くなるほど、Ｎｏｔｃｈアンタゴニストに対する感受性が高くなることを示す。第２の例において、サンプルは、３群に分類され得る−ＨｅｙＬの高発現（参照を少なくとも２倍上回る）、中レベルのＨｅｙＬ発現（参照の２倍未満であるが、参照の０．５倍より高い）もしくは低ＨｅｙＬ発現（参照の０．５倍未満）。この場合、ＨｅｙＬ発現のレベルとＮｏｔｃｈアンタゴニストに対する感受性の程度との間の相関は、評価者内一致（ｉｎｔｅｒ−ｒａｔｅｒ  ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）の統計的尺度であるＣｏｈｅｎ’ｓ  ｋａｐｐａを使用して計算され得る。２３個のヒト膵臓がん細胞株、結腸がん細胞株、乳房がん細胞株、ＳＣＬＣがん細胞株およびＴ−ＡＬＬがん細胞株の、高レベル、中レベルおよび低レベルのＨｅｙＬ発現への分類は、非常に高い信頼性（Ｃｏｈｅｎ’ｓ  ｋａｐｐａ＝０．８７７）で、それぞれ、高程度、中程度および低い程度のＮｏｔｃｈアンタゴニストに対する感受性を示す細胞株を推定する。
【実施例】
【００４６】
（実施例）
本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。実施例は、例示目的でのみ提供されるのであって、本発明の範囲もしくは趣旨を限定するとは少しも解釈されない。
【００４７】
（実施例１：Ｊａｇ１−Ｆｃインヒビター）
可溶性形態のＮｏｔｃｈリガンド細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、Ｎｏｔｃｈ受容体への通常のＮｏｔｃｈリガンドの結合を妨害し、それによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のアンタゴニストとして作用することが、以前に示された。従って、上記ＮｏｔｃｈリガンドＪａｇ１の可溶性形態を、以下に記載される実験における使用のために構築した。これを、ＰＣＲを使用して、ヒトＪａｇｇｅｄ１の細胞外ドメインを増幅し、これをヒトＩｇＧ１に由来するＦｃドメインに結合することによって行った。上記構築物を、ｐＥＥ１４．４ベクター（Ｌｏｎｚａ）へとクローニングし、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞へとトランスフェクトし、安定な発現クローンを作製するために選択した。Ｊａｇ１−Ｆｃタンパク質を、上記細胞上清から精製し、定量し、使用時まで−８０℃で凍結した。
【００４８】
（実施例２：可溶性Ｊａｇ１−Ｆｃインヒビターを用いた増殖アッセイ）
可溶性Ｊａｇ１−Ｆｃインヒビターを用いた増殖アッセイを、以下の細胞株について行った：ＨＰＡＣ、Ｐａｎｃ１０．０５、ＰＬ４５、ＰＡＮＣ−１、ＣＡＰＡＮ−１、ＣＡＰＡＮ−２、ＡｓＰＣ−１、ＨＰＡＦ  ＩＩ、ＳＷ１９９０、ＢｘＰＣ−３、ＭｉａＰａＣａ−２、Ｈｓ７６６Ｔ（膵臓がん細胞株）；ＨＣＴ−１１６、ＬＳ−１０３４、ＳＷ−４８０、ＤＬＤ１、ＨＣＴ−１５、ＨＴ−２９、ＣＯＬＯ−２０５（結腸がん細胞株）；ＤＵ４４７５、ＭＣＦ１２Ａ（乳がん細胞株）；Ｋａｒｐａｓ４５（Ｔ−ＡＬＬ細胞株）；およびＮＣＩ−Ｈ１８７（肺がん細胞株）。
【００４９】
以下のプロトコルを、全ての細胞株に対して使用した。Ｎｏｔｃｈ依存性ヒトがん細胞株を同定するために、本発明者らは、上記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に融合した上記ＪＡＧ１の可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を使用した。ヒトがん細胞株の増殖および生存性を、Ｊａｇ１−Ｆｃの非存在下および存在下で試験して、ヒトがん細胞株の増殖および生存率に対するＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害の影響を決定した。
【００５０】
増殖アッセイのために、全てのヒトがん細胞株を、最終濃度２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を有する適切な培地中で培養した。各細胞株についての最適な播種密度を、上記アッセイが終わる前に細胞密集度が７０〜８０％より大きくならないように決定した。細胞を、三連において、適切な細胞密度で９６ウェルプレートに蒔き、その後、Ｊａｇ１−Ｆｃ（無血清培地中で希釈）を添加して、最終濃度１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、もしくは２５μｇ／ｍＬの上記可溶性リガンドを与えた。精製ＧＰ１２０抗体、マウスＩｇＧおよび無血清培地を、ネガティブコントロールとして使用した。細胞を４８時間にわたって増殖させ、次いで、ＭＴＴ（チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド）アッセイもしくはＢｒｄＵアッセイ（Ｒｏｃｈｅ）によってアッセイした。
【００５１】
ＭＴＴアッセイのために、ＭＴＴを、ＰＢＳ中に（５ｍｇ／ｍｌにおいて）再懸濁し、０．２μｍフィルタを通して濾過した。４８時間の処理後に１０μｌのＭＴＴを細胞（最終容積１００μｌにおいて可溶性リガンドもしくはコントロールで処理した）に添加し、４時間インキュベートし、次いで、９０μｌの０．０１Ｎ  ＨＣｌ／１０％  ＳＤＳの添加によって停止させた。ＭＴＴをまた、播種の際に少数のウェルに添加して、出発細胞数を決定した。３７℃において一晩インキュベーションした後、プレートを、［Ａ５７０〜Ａ６９０］にて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ−Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ  ｍ２で読み取った。ＢｒｄＵアッセイのために、細胞を、４８時間にわたって増殖させ、次いで、細胞を固定して製造業者のプロトコルに従って処理する前に、５時間もしくは２４時間のいずれかにわたってＢｒｄＵで標識した。Ｊａｇ１−ＦｃによるＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害に対する各細胞株の％応答を、上記アッセイ（ＭＴＴアッセイ）の開始時に播種した細胞数に対して比較するか、またはバックグラウンドシグナル（ＢｒＤＵアッセイ）に対して比較することによって、定量した。
【００５２】
並行して、同じセットの細胞株を、上記Ｎｏｔｃｈ経路の任意のインヒビターを存在させないで標準的な培養条件下で増殖させながら、ＲＮＡを上記細胞株から収集した。がん細胞株を、１０％  ＦＢＳ＋１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充した適切な培養培地中で培養し、約７０％の密集度になったら、トリプシン処理によって採取した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することによって得、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いる使用のために、１０ｎｇ／μｌへと希釈した。他のヒトがん細胞株に対して発現レベルを比較するために、１０ｎｇ／μｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をまた、各標的遺伝子に対するプライマーを使用して増幅させた。β−アクチン遺伝子の増幅も行って、細胞株にわたって発現の正規化を可能にした。以下のＮｏｔｃｈ経路遺伝子のヒトがん細胞株間の発現の相対的レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した：Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｊａｇ１、Ｊａｇ２、ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５、Ｈｅｓ６、Ｈｅｓ７、Ｈｅｙ１、Ｈｅｙ２、ＨｅｙＬ、およびＨｅｌｔ。
【００５３】
Ｎｏｔｃｈ経路遺伝子発現と、上記ヒトがん細胞株の増殖に対するＪａｇ１−Ｆｃの影響との比較は、ＨｅｙＬの発現と、Ｊａｇ１−Ｆｃ阻害に対する感受性との間に、高い程度の相関があったことを示した。Ｃｏｈｅｎ’ｓ  ｋａｐｐａ値０．８７７を、この相関について計算した。このことは、ＨｅｙＬレベルが、Ｊａｇ１−Ｆｃに対する応答と相関しているということの非常に高い程度の信頼性を示している。さらに、線形回帰分析は、ヒト結腸がん細胞株（Ｒ２＝０．８７、ｐ＝０．００２２）（図１）および膵臓がん細胞株（Ｒ２＝０．６１、ｐ＝０．００２６）（図２）について、ＨｅｙＬ発現と、Ｎｏｔｃｈ経路の阻害に対する感受性との間の高い程度の相関があることを示す。
【００５４】
他の試験した遺伝子のいずれについても、発現レベルと、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害に対する応答との間に、相関を観察しなかった。このことは、上昇したＨｅｙＬ遺伝子発現が、Ｎｏｔｃｈ経路シグナル伝達の阻害に対する感受性の特異的生体マーカーであることを示した。
【００５５】
上昇したＨｅｙＬ遺伝子発現と、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対する感受性との相関を、結腸がん細胞および膵臓がん細胞に加えて、他の細胞株に関しても観察した。例えば、上昇したＨｅｙＬ遺伝子発現と、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対する感受性との間の有意な正の相関を、ヒト乳がん細胞において観察した。ＤＵ４４７５細胞は、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対して非常に感受性であり、５１個の試験したヒト乳がん細胞株の中で最高レベルのＨｅｙＬを発現する。対照的に、ＭＣＦ１２Ａ細胞は、Ｎｏｔｃｈに依存性でなく、同じセットの試験した５１個のヒト乳がん細胞株の中で最低レベルのＨｅｙＬを発現する。ヒトＴ−ＡＬＬ細胞（Ｋａｒｐａｓ  ４５）および肺がん細胞（ＮＣＩ−Ｈ１８７）は、上昇したレベルのＨｅｙＬ遺伝子発現を示し、また、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対して感受性であった。
【００５６】
９個の神経膠芽腫細胞株の中で、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対する感受性と、ＨｅｙＬ発現との間に、相関を観察しなかった。このことは、ＨｅｙＬ発現レベルがこの特定の腫瘍タイプにおいてＮｏｔｃｈ受容体活性化の阻害に対する感受性の生体マーカーではないことを示唆する。
【００５７】
（実施例３：γ−セクレターゼインヒビターでの細胞の処理）
細胞を、２ｍＬの培地中で、６ウェルプレートに播種した。細胞の複製ウェルを、播種の直後に、１μＭ、３μＭ、および６μＭのγセクレターゼインヒビター（ＧＳＩ；Ｓｉｇｍａ  Ｌ−６８５，４５８）、もしくはＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ２６５０）（ビヒクルコントロール）で処理した。細胞を、処理後、３７℃、５％  ＣＯ２において２０時間にわたってインキュベートし、次いで、収集し、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １４０４０−１３３）ですすぎ、細胞ペレットを、ドライアイスで凍結させ、−８０℃において貯蔵した。その後、ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙＴＭ  ｍｉｎｉｐｒｅｐカラム（Ｑｉａｇｅｎ  ＧＲ８ＲＮＡ）を使用して手動で調製し、ｑＲＴ−ＰＣＲを、標準的プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ  ２０４２４５）に従って、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子発現を分析するために行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで行った。結果を、比較Ｃｔ法を使用して分析した。βアクチンを、ハウスキーピング遺伝子として使用し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７４００００）を、外部参照サンプルとして使用して、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５、Ｈｅｓ６、Ｈｅｓ７、Ｈｅｙ１、Ｈｅｙ２、ＨｅｙＬ、およびＨｅｌｔの発現のレベルを決定した。
【００５８】
細胞増殖および生存率を測定するために、ＨＴ２９細胞およびＬＳ１０３４細胞を０．２５％  トリプシン（ＧＩＢＣＯ  Ｃａｔ．Ｎｏ．２５２００）で採取し、１０％  ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１０４３８）および１％  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１１８７５）中に再懸濁し、次いで、数を数えた。細胞を遠心分離し、無血清ＲＰＭＩで洗浄し、次いで、４％  ＦＢＳおよび１％  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ培地中で１．２×１０５細胞／ｍＬに再懸濁した。ＨＴ２９細胞およびＬＳ１０３４細胞の両方を、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３５９５）において、６Ｋ／ウェル（５０μＬ／細胞懸濁物のウェル）で最終的に播種した。ビヒクルコントロールもしくはＮｏｔｃｈ受容体活性化のインヒビターいずれか５０μｌを、三連で上記細胞に添加し、その結果、各ウェル中のＦＢＳの最終濃度は、２％であった。これら実験において、Ｊａｇ１−Ｆｃもしくはγ−セクレターゼインヒビター（ＧＳＩ；Ｓｉｇｍａ  Ｌ−６８５，４５８）を、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化のインヒビターとして使用した。
【００５９】
ＤＭＳＯ（ＧＳＩのビヒクルコントロール）を、以下のように調製した：１．０％、０．５％、０．２５％および０．１％のＤＭＳＯを、無血清ＲＰＭＩ中の２×溶液として調製した。無処理細胞に、無血清ＲＰＭＩを与えた。ＧＳＩ希釈物を、ＤＭＳＯ中の１ｍＭストックから、以下のように調製した：１．０μＭ、２．５μＭ、５μＭ、および１０μＭ  ＧＳＩ希釈物を、無血清ＲＰＭＩ中の２×溶液として調製した。ＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）を、上記９６ウェルプレート上のウェルの列外（ｏｕｔｓｉｄｅ  ｒｏｗ）に添加して、試験ウェルの蒸発を妨いだ。Ｊａｇ１−Ｆｃでの処理および細胞増殖を測定するための全てのＭＴＴアッセイを、上記のように行った。
【００６０】
これら分析は、上記Ｎｏｔｃｈ経路の阻害が、ＬＳ−１０３４細胞の完全な増殖阻害および細胞死を生じさせた（＞１００％増殖阻害）が、ＨＴ−２９細胞の増殖に対しては中程度の効果のみを有した（＜１７％増殖阻害）ことを示した。
【００６１】
さらにＮｏｔｃｈ依存性であるヒトがん細胞株を、免疫無防備状態のマウスにおいて異種移植片としてインビボで増殖させた場合に、ＨｅｙＬの上昇したレベルが示されることを実証した。例えば、Ｔ−ＡＬＬ細胞株であるＫａｒｐａｓ４５（これは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害に対して非常に感受性であり、培養物において上昇したレベルのＨｅｙＬを発現する）はまた、インビボで正常組織と比較して、腫瘍において上昇したレベルのＨｅｙＬを発現することを（Ｋａｒｐａｓ４５異種移植片腫瘍の切片の免疫組織化学染色によって）示した。
【００６２】
目的の腫瘍を、１０％緩衝化ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。４μＭ厚切片を、ミクロトームを使用してスライスした。２×５分間インキュベーションを使用して、キシレン中で脱パラフィン（ｄｅ−ｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅ）する前に、スライドを、５５℃において１０分間加温した。漸減エタノール濃度（１００％、９５％、７０％）中で切片を水和し、工程ごとに、２×２分間で洗浄した。内因性ペルオキシダーゼを、３０分間にわたって０．３％  Ｈ２Ｏ２中でインキュベートすることによって抑制（ｑｕｅｎｃｈ）した。スライドを、マイクロ波オーブン（中出力レベル）において、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で３×５分間で加熱し、次いで、２０分間にわたって１０％ヤギ血清中でブロックした。免疫染色のために、一次抗体およびアイソタイプコントロール抗体（ウサギＩｇＧ、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ）を、１％  ＦＢＳ中４μｇ／ｍＬで作製し、３０〜４５分間にわたってインキュベートした。２次抗体（ヤギα−ウサギビオチン化，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を１％  ＦＢＳ中で、１：２００で希釈し、３０〜４５分間にわたってインキュベートした。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を、製造業者の説明書に従って使用した。スライドを、ＤＡＢ酵素基質とともに５分間にわたってインキュベートし（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）、ＤＡＢ増強溶液とともに２分間にわたってインキュベートした（Ｚｙｍｅｄ）。サンプルを、Ｍａｙｅｒｓヘマトキシリンで１分間対比染色し、次いで、濃度漸増のエタノール（７０％、９５％、１００％）中での２×２分間のインキュベーション、およびその後の、キシレンでの２×５分間のインキュベーションで脱水し、その後、カバースリップで密封した。
【００６３】
抗ヒトマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ６１２７７）を使用する場合に、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍ．Ｏ．Ｍ．（マウス−オン−マウス（ｍｏｕｓｅ−ｏｎ−ｍｏｕｓｅ））キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用して、マウス異種移植片モデルとして増殖させた腫瘍について宿主組織の非特異的染色を低下／排除した。腫瘍を切片化し、上記のように脱パラフィンし、次いで、Ｍ．Ｏ．ＭマウスＩｇＧブロッキング試薬とともに６０分間にわたってインキュベートした。免疫染色については、一次抗体およびアイソタイプコントロール（マウスＩｇＧ，Ｓｉｇｍａ）を、Ｍ．Ｏ．Ｍ．希釈物中、１０μｇ／ｍＬで作製し、３０分間にわたってインキュベートした。２次抗体（抗マウスビオチン化，Ｍ．Ｏ．Ｍ．キット，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を、Ｍ．Ｏ．Ｍ．希釈物中で作製し、３０分間にわたってインキュベートした。検出、対比染色、および脱水を、上記のように行った。
【００６４】
ＨｅｙＬ遺伝子発現が、Ｎｏｔｃｈ１遺伝子座近くへのＭｏ−ＭｕＬＶの染色体組み込みによって引き起こされるＮｏｔｃｈ１の増強された発現に応じて自発的に発生するマウス腫瘍において上昇することを見出した。このような腫瘍の増殖は、ＧＳＩ（γセクレターゼインヒビター（Ｓｉｇｍａ  Ｌ−６８５，４５８））による阻害に対する感受性によって示されるように、Ｎｏｔｃｈ依存性であった。上昇したＮｏｔｃｈ１発現を示さず、ＧＳＩに対して感受性ではなかったマウス腫瘍は、有意に低いレベルのＨｅｙＬ遺伝子発現を示した。一般に、Ｎｏｔｃｈ受容体をコードする遺伝子付近へのＭｏ−ＭｕＬＶ組み込みを示し、上記Ｎｏｔｃｈ受容体の上昇した発現がｑＲＴ−ＰＣＲもしくはマイクロアレイ発現分析によって確認された腫瘍はまた、（１）Ｎｏｔｃｈ受容体発現のレトロウイルス誘導性アップレギュレーションが存在しない、Ｎｏｔｃｈ遺伝子座とは異なる部位におけるＭｏ−ＭｕＬＶ組み込みから生じる腫瘍；および（２）ＭＭＴＶプロモーターによって駆動される外因性Ｈｅｒ２腫瘍遺伝子を過剰発現するＩｎｋ４ａヌルマウスにおける自発的乳房腫瘍、に対する比較において、上昇したＨｅｙＬ遺伝子発現を示した。両側スチューデントＴ検定は、Ｎｏｔｃｈ経路活性化によって駆動されない腫瘍に対する比較によって、Ｎｏｔｃｈ依存性腫瘍におけるＨｅｙＬ遺伝子発現の非常に有意な上昇を示した（ｐ＜１×１０−６）。Ｎｏｔｃｈ受容体発現のレトロウイルスアップレギュレーションに起因するＮｏｔｃｈ依存性と、上昇したレベルのＨｅｙＬとの間のこの相関は、Ｎｏｔｃｈ経路依存の生体マーカーとしてのＨｅｙＬ遺伝子発現の役割をさらに実証した。
【００６５】
上記レトロウイルス誘導性腫瘍における分析を行うために、腫瘍保有動物を安楽死させ、腫瘍を収集し、ＲＰＭＩ培地中の４ｍｇ／ｍｌ  コラゲナーゼを使用して、３７℃で２時間にわたって０．２ｇの小片を脱凝集させた。細胞を、１８Ｇニードルに５〜１０回通すことによってさらに脱凝集させた。懸濁物中の単一細胞を、さらなる分析のために上清中に吸引した。
【００６６】
細胞生存率アッセイのために、単一細胞を、１０％  ＦＢＳ、１％  ＰｅｎＳｔｒｅｐ、および０．０１μＭ  β−エストラジオールを補充したＲＰＭＩ培地中、１２ウェルプレートにおいて１００，０００細胞／ウェルで再度播種した。次いで、細胞を、１μＭ、３μＭもしくは１０μＭのＧＳＩ（Ｓｉｇｍａ  Ｌ−６８５，４５８）またはビヒクルコントロールで４８時間にわたって処理した。細胞生存率およびアポトーシスを、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ−９６  Ｖｉａｃｏｕｎｔ  Ｆｌｅｘ試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．４７００−００６０）を使用してアッセイし、製造業者のプロトコルに従って、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ−９６機器を使用して測定した。ｍＲＮＡ発現レベルを測定するために、新鮮な腫瘍サンプルを収集し、ＲＮＡを、標準的なプロトコルを用いて調製し、マイクロアレイ遺伝子発現プロフィール分析を、製造業者の推奨プロトコルに従って、Ａｇｉｌｅｎｔ  ｃＤＮＡマイクロアレイチップを使用して行った。ＨｅｙＬおよび他の遺伝子の相対的発現を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのユニバーサルマウス参照ＲＮＡサンプル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０１００）に対する比較によって計算した。腫瘍を、ＨｅｙＬ発現の相対的レベルに従ってランク付けし、スチューデントＴ検定を使用して、上記Ｎｏｔｃｈ経路のレトロウイルス活性化を欠いている腫瘍に対して比較することによって、Ｎｏｔｃｈ受容体をコードする遺伝子付近にＭｏ−ＭｕＬＶ組み込みを示し、かつ上記Ｎｏｔｃｈ受容体の上昇した発現がｑＲＴ−ＰＣＲもしくはマイクロアレイ発現分析によって確認される腫瘍における、ＨｅｙＬ発現の差異の有意性を決定した。
【００６７】
（参照による援用）
本明細書で言及される特許文書および科学論文の各々の開示全体は、全ての目的で、参照によって援用される。
【００６８】
（等価物）
本発明は、その趣旨もしくはその本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。従って、前述の実施形態は、全ての観点において、本明細書に記載される発明に対する限定ではなく、例示として解釈されるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の説明によるのではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と等価の意味および範囲内にある全ての変更は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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