(57)【要約】【課題】ＣＤ３１の生物学的機能をより良く理解することにより、Ｔ細胞活性化と関連する疾患の処置のためのより効率的な処置の提供を可能にすること。【解決手段】本発明は、血液白血球上に存在するＣＤ３１タンパク質の細胞外ドメインが分断され、かつ可溶性形態のＣＤ３１として循環中に放出されるという知見に起因する。本発明は、Ｔ細胞応答を阻害するＣＤ３１のフラグメントに対応するペプチド、ならびにアテローム性血栓症等の血栓障害、および自己免疫障害の治療におけるそれらの使用に関する。【選択図】図７
2011526485.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる、単離されたペプチド：
ａ）配列番号１のアミノ酸５７９〜６０１により規定される配列のうちの少なくとも６個のアミノ酸のフラグメント；
ｂ）非ヒト哺乳動物ＣＤ３１における（ａ）に対応する配列のうちの少なくとも６個のアミノ酸のフラグメント；あるいは
ｃ）（ａ）に少なくとも８０％同一の配列からなるフラグメントであって、該ペプチドが、インビトロにおけるＴ細胞増殖の用量依存性阻害を発揮し、かつ配列番号５または６のアミノ酸配列からなるものではない、フラグメント。
【請求項２】
前記ペプチドが以下からなる、請求項１に記載のペプチド：
ａ）配列番号１のアミノ酸５７９〜６０１により規定される配列のうちの６〜１５個のアミノ酸のフラグメント；
ｂ）非ヒト哺乳動物ＣＤ３１における（ａ）に対応する配列のうちの６〜１５個のアミノ酸のフラグメント；あるいは
ｃ）（ａ）に少なくとも８０％同一の配列からなるフラグメントであって、該ペプチドがインビトロにおけるＴ細胞増殖の用量依存性阻害を発揮する、フラグメント。
【請求項３】
前記フラグメントが膜近傍フラグメントである、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが配列番号２、３または４に少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが配列番号２、３または４のいずれか一つを含む、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドがその安定性および／またはその生物学的利用性を改善する少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項７に記載の核酸、および生理学的に許容され得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項９】
インビボにおけるＣＤ３１媒介シグナル伝達の活性化における使用のための、以下を含む、または以下からなる、ペプチド：
ａ）配列番号１のうちのアミノ酸５７９〜６０１；
ｂ）非ヒト哺乳動物ＣＤ３１における（ａ）に対応するアミノ酸；
ｃ）（ａ）のうちの少なくとも６個のアミノ酸のフラグメント；
ｄ）（ｂ）のうちの少なくとも６個のアミノ酸のフラグメント；あるいは
ｅ）（ａ）または（ｃ）に少なくとも８０％同一の配列であって、該ペプチドがインビトロにおけるＴ細胞増殖の用量依存性阻害を発揮する、配列。
【請求項１０】
血栓障害または自己免疫障害の処置における使用のための、以下を含む、または以下からなる、ペプチド：
ａ）配列番号１のうちのアミノ酸５７９〜６０１；
ｂ）非ヒト哺乳動物ＣＤ３１における（ａ）に対応するアミノ酸；
ｃ）（ａ）のうちの少なくとも６個のアミノ酸のフラグメント；
ｄ）（ｂ）のうちの少なくとも６個のアミノ酸のフラグメント；あるいは
ｅ）（ａ）または（ｃ）に少なくとも８０％同一の配列であって、該ペプチドがインビトロにおけるＴ細胞増殖の用量依存性阻害を発揮する、配列。
【請求項１１】
前記ペプチドが最大で３０個のアミノ酸の長さを有する、請求項９または１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
ＣＤ３１−Ｔリンパ球の表現型を有する個体の処置における使用のための、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドがその安定性および／またはその生物学的利用性を改善する少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが以下からなる、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のペプチド：
ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド；
ｂ）配列番号５または６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチド；あるいは
ｃ）配列番号５または６のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１５】
前記障害が、アテローム性血栓症、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、虚血性発作、末梢動脈疾患および腹部大動脈瘤からなる群より選ばれる血栓障害である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記障害が、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、グレーブス病および糖尿病からなる群より選ばれる自己免疫障害である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドのペプチド模倣物を同定するための方法であって、
該ペプチド模倣物が血栓障害または自己免疫障害の治療および／または予防のための候補化合物であり、
以下の工程：
ａ）ペプチド模倣物を提供すること；ならびに
ｂ）該ペプチド模倣物が、インビトロにおけるＴ細胞増殖、および／または混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の用量依存性阻害を発揮するかどうかを決定すること；
を含み、
該ペプチド模倣物が用量依存性阻害を発揮する場合に、該ペプチド模倣物が血栓障害または自己免疫障害の治療および／または予防のための候補化合物である、方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）は、該ペプチド模倣物が免疫抑制および／または抗血小板活性を発揮するかどうかを決定することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血液白血球上に存在するＣＤ３１タンパク質の細胞外ドメインが分断され、かつ可溶性形態のＣＤ３１として循環中に放出されるという知見に起因する。本発明は、Ｔ細胞応答を阻害するＣＤ３１のフラグメントに対応するペプチド、ならびに血栓障害および自己免疫障害の処置におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
血栓障害
健常なヒトでは、恒常的平衡が、前駆凝固因子（血餅化）力と抗凝血および線溶力との間に存在する。多くの遺伝的、後天的および環境的因子が、凝固によりこの平衡を傾けることができ、静脈中の血栓の病的形成（例、深部静脈血栓症）、動脈の病的形成（例、アテローム性血栓症、心筋梗塞、虚血性発作）、または心腔の病的形成に至る。血栓は、形成部位で血流を閉塞することができ、または剥離して、遠位血管を遮断するように塞栓を形成することができる（例、肺塞栓症、発作）。
【０００３】
蓄積している証拠は、世界における主要な生命を脅かす疾患であるアテローム性血栓症が血管壁内における血液白血球の病的活性化および破壊的な炎症応答を誘起する欠陥性の免疫調節に関連付けられることを示す。結果として、血管接触面での免疫調節の回復は、アテローム性血栓症に取り組むための革新的な処置上の選択肢を表す。
【０００４】
自己免疫障害
自己免疫障害では、免疫系は、内因性抗原に対する抗体を生成する。抗体でコーティングされた細胞は、任意の同様にコーティングされた外来粒子の様に、補体系を活性化し、組織傷害を生じる。自己免疫障害としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、グレーブス病および糖尿病が挙げられる。
【０００５】
幾つかの機構は、自身に対する身体の攻撃を説明し得る。自己抗原は、免疫原性になり得る。なぜならば、それらは、化学的、物理的または生物学的に変化するためである。所定の化学物質は、身体のタンパク質とカップリングして、それらを免疫原性にする（接触皮膚炎など）。薬物は、血清または組織タンパク質に共有結合することにより幾つかの自己免疫反応を生じることができる（下記を参照）。光過敏症としては、物理的に誘導される自己アレルギー（紫外線が皮膚タンパク質を変化させて、患者がアレルギーになる）が例示される。動物モデルでは、宿主組織と化合するＲＮＡウイルスとの持続的な感染が、生物学的に自己抗原を変化させ、ＳＬＥに類似する自己アレルギー障害を生じる。
【０００６】
殆どのヒト自己免疫疾患は、特定の抗原により誘起されるＴ細胞疾患である。特定の抗原性エピトープに応答するＴ細胞クローンは、これらの疾患の開始および／または伝播を担う。同様に、特定の抗原により誘起されるＴ細胞応答は、臓器の同種移植の拒絶および腫瘍に対する免疫応答を担う。活性化Ｔ細胞は、自己免疫疾患、臓器移植拒絶および腫瘍免疫に付随する慢性炎症についての「動力」を提供する。
【０００７】
ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）
免疫応答は、血管接触面の細胞に排他的かつ構成的に発現している阻害性免疫レセプター、なかでもＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）により制御され得る。
【０００８】
ＣＤ３１は、６個のＩｇ様細胞外ドメイン、短い膜貫通セグメントおよび２個の免疫チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩｍｍｕｎｏＴｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｍｏｔｉｆ：ＩＴＩＭ）を含有する細胞質テイルを含む単鎖分子からなる。ＣＤ３１の構造を、以下の表に示す。
【０００９】
【表１】
2011526485.tif 000003
【００１０】
ＣＤ３１の免疫調節特性は、ＣＤ３１シグナル伝達が血液白血球の相互反発を誘起し、かつ自然および獲得免疫細胞の双方の阻害性シグナルと刺激性シグナルとの間の平衡を調節するという事実により支持される。ＣＤ３１の遠位Ｉｇ様細胞外ドメインの機械的な係合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、そのＩＴＩＭのリン酸化により誘発される外側から内側への阻害性シグナル伝達、ならびにＳＨ２含有ホスファターゼの動員および活性化を誘導する。
【００１１】
Ｚｅｈｎｄｅｒら（非特許文献１）は、特異的かつ用量依存的な様式において混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を阻害するＣＤ３１抗体を同定した。彼らはさらに、この抗体のエピトープ（即ち、ＣＤ３１の２３個の膜近位アミノ酸）に対応するＣＤ３１ペプチドがＭＬＲを強力に阻害することを見出した。彼らは、ＣＤ３１の２３個の膜近位アミノ酸が機能的に重要な領域を構成しており、そしてＣＤ３１ペプチドが結合性エピトープについて競合することによりリンパ球活性化に干渉すると仮定した。しかしながら、Ｚｅｈｎｄｅｒらは、ＣＤ３１媒介シグナル伝達がＣＤ３１ペプチドにより活性化されるかまたは阻害されるかを教示し得なかった。
【００１２】
Ｃｈｅｎら（非特許文献２）は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のマウスモデルにおいて、このペプチドがこの疾患の発症を遅延させ、かつ長期生存を向上させることを示した。彼らは、ＣＤ３１ペプチドがＴ細胞活性化における通常の経路を阻害すると仮定した。また、Ｃｈｅｎらは、Ｔ細胞活性化においてＣＤ３１ペプチドにより果たされる役割を解明し得なかった。特に、これらの従来の研究は、ＣＤ３１シグナル伝達カスケードに対する、より正確には、ＣＤ３１  ＩＴＩＭのリン酸化状態に対するこのペプチドの推定効果を評価しなかった。
【００１３】
依然として未知の機構によって、ＣＤ３１は、所定の循環リンパ球上で「消失」している。その消失は、リンパ球の活性化の際に観察されており、そして、リンパ球のＣＤ３１シグナル伝達の非存在が、次いで、アテローム性血栓症の発症に関与する病的免疫応答を高めることが最近示されている。
【００１４】
膜貫通セグメントを欠損するバリアント転写物に起因する可溶性形態のＣＤ３１もまた、報告されており、したがって、循環ＣＤ３１の個々の量は、遺伝的に決定されると現在では考えられている。結果として、多数の従来の研究は、可溶性ＣＤ３１の血漿レベルとアテローム性血栓症または他の自己免疫疾患の危険性との間の相関性を見出すことを試みていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｚｅｈｎｄｅｒら，１９９５，Ｂｌｏｏｄ，８５（５）：１２８２−８
【非特許文献２】Ｃｈｅｎら，１９９７，Ｂｌｏｏｄ，８９（４）：１４５２−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、解析された特定の遺伝的多型とは無関係に、データは、広範な範囲の血漿ＣＤ３１値を示し、これらの異なる研究の結果は、相反していた。
【００１７】
したがって、ＣＤ３１の生物学的機能をより良く理解する必要性が存在する。これは、Ｔ細胞活性化と関連付けられる疾患の処置のためのより効率的な処置の提供を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の説明）
驚くべきことに、活性化／記憶Ｔリンパ球上のＣＤ３１の推測された消失が、実際には不完全であり、そして第５の細胞外Ｉｇ様ドメインと第６の細胞外Ｉｇ様ドメインとの間でのＣＤ３１の分断から生じることが見出された。次いで、ＣＤ３１の分断された細胞外ドメイン（「分断ＣＤ３１（ｓｈｅｄ  ＣＤ３１）」とさらに称する）は、循環中に放出され、そこで、それはＣＤ３１の可溶性スプライスバリアントと共に存在する。
【００１９】
また、アテローム性血栓症の高い危険性が、循環中における分断ＣＤ３１の増加およびスプライスバリアントＣＤ３１の減少と関連付けられること、ならびに循環ＣＤ３１の全体レベルと関連付けられないことが示された。
【００２０】
ＣＤ３１が血液リンパ球上で消失せずに切断されるのみであるという知見は、この分子の残留部分を標的とすることによりその生理学的免疫調節機能をレスキューする独特の機会を提供する。具体的には、本発明は、それらの循環Ｔリンパ球の表面からＣＤ３１が見かけ上消失した患者においてさえも、ＣＤ３１の生理学的免疫調節機能をレスキューできるＣＤ３１の外部ドメインの膜近傍（ｊｕｘｔａ−ｍｅｍｂｒａｎｅ）アミノ酸に対応するペプチドを提供する。
【００２１】
このようなペプチドは、アテローム性動脈硬化症についてのマウスモデルにおける疾患の進行および動脈瘤の形成を予防し得ることが実証されている。２３個のアミノ酸の既知のペプチドのうちの最後の１０個または６個のＣＯＯＨ末端アミノ酸に制限されるより短くかつより安定なペプチドは、既知のペプチドよりも、優れたインビトロ免疫抑制特性（より低いＥＤならびにアッセイ内およびアッセイ間のより低い変動性）を示す。これらのアミノ酸は、膜とＣＤ３１の第６のＩｇ様ドメインとの間に含まれる短い細胞外フラグメントに対応する。
【００２２】
したがって、本発明は、本明細書中にさらに記載されるように、細胞外ＣＤ３１の膜近傍−近位部分および第６のＩｇ様ドメインの部分を含むフラグメントからなるペプチド、ならびに血栓または自己免疫の処置におけるこのようなペプチドの使用を提供する。
【００２３】
このようなペプチドは、ＣＤ３１の全てまたは殆どのＩｇ様ドメインを含む可溶性形態のＣＤ３１に比較して、独特の特性を有する。実際、このようなペプチドは、高度に同種親和性（ｈｏｍｏｐｈｉｌｉｃ）である。なぜならば、それらは、ＢＩＡｃｏｒｅ解析により評価した場合、１０−７ＭのＫｄを有するためである。それ故、それらは、強力なホモオリゴマー化を介して、その切断後に発現したままである細胞外ＣＤ３１の膜近傍−近位部分を架橋することにより、ＣＤ３１シグナル伝達を係合（ｅｎｇａｇｅ）することができる。これとは対照的に、選択的にスプライシングされた可溶性ＣＤ３１は、初めの１０個の膜近傍−近位アミノ酸を欠損し、２３マーのペプチドと弱い同種親和性結合を示す（ＢＩＡｃｏｒｅ解析により評価した場合、１７μＭのｋｄ）。さらに、インビトロでは、本発明のペプチドのみが、ＣＤ３１の短縮型アイソフォームの下流にあるＩＴＩＭ経路を係合し得、したがって、ＣＤ３１が見かけ上消失したＴリンパ球におけるＣＤ３１シグナル伝達を回復し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１ａ】図１ａは、ヒト、マウス、ブタおよびウシのＣＤ３１の配列間のアライメントを示す。配列番号４のアミノ酸５７９〜６０１により規定される配列（ヒトＣＤ３１）、ならびにマウス、ブタおよびウシのＣＤ３１における対応する配列を、囲いにより強調する。
【図１ｂ】図１ｂは、ヒト、マウス、ブタおよびウシのＣＤ３１の配列間のアライメントを示す。
【図２】図２は、健常ドナーからのヒト末梢血細胞の１０色フローサイトメトリー解析の代表的な例を示す。抗体である抗ＣＤ３１  ｄｏｍ１および抗ＣＤ３１  ｄｏｍ６のアイソタイプコントロールを、挿入図中に示す。リンパ球、単球および顆粒球を、ＦＳＣ／ＳＳＣ散乱内でゲートした。Ｂ（ＣＤ２０  Ａ７００＋）およびＴ（ＣＤ３  ＰＥ−ＴＲ＋）リンパ球を同定し、「リンパ球」内にゲートし、ＣＤ８＋（ＰｅｒＣＰ）およびＣＤ４＋（ＡＰＣ）亜集団を、Ｔリンパ球内にゲートした。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ４５ＲＡの発現についてさらに解析し、それにより活性化（１）、記憶（２）およびナイーブ（３）細胞に細分割した。全ての白血球は、ＣＤ３１  ｄｏｍ６について陽性であった。ｄｏｍ１の欠損は、ナイーブ（３）から記憶（２）から活性化（１）Ｔ細胞へと増加した。
【図３ａ】図３ａは、リンパ球上のＣＤ３１の見かけ上の消失がその細胞外分断に起因することを示す。可溶化された細胞膜結合ＣＤ３１分子を、培養Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ４＋Ｔ細胞から抽出し、蛍光ビーズにカップリングした。ｄｏｍ１ビーズ結合分子の百分率は、休止状態では６％未満であり、ＴＣＲ係合５’後では９９％を超えている。
【図３ｂ】図３ｂは、リンパ球上のＣＤ３１の見かけ上の消失がその細胞外分断に起因することを示す。ＴＣＲ活性化Ｔ細胞の培養上清（白四角）中、およびヒト血漿（黒四角）中の殆どの可溶性ＣＤ３１は、ｄｏｍ１〜ｄｏｍ５を含み、かつｄｏｍ６を欠損する単一の短縮型フラグメントからなる。ｄｏｍ５およびｄｏｍ６の双方を欠損する、無視し得るレベルの短縮型ＣＤ３１が、血漿中でのみ検出できた。
【図４ａ】図４ａは、ＣＤ３１ｓｈｅｄＴ上の残留細胞外フラグメントの同型のペプチドがＣＤ３１−ＩＴＩＭリン酸化を誘導することを示す。漸増用量のＣＤ３１ペプチド５５１〜５７４の存在下におけるヒト末梢血単核細胞のＴＣＲ会合に対する増殖応答。＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  用量「０」。
【図４ｂ】図４ｂは、ＣＤ３１ｓｈｅｄＴ上の残留細胞外フラグメントの同型のペプチドがＣＤ３１−ＩＴＩＭリン酸化を誘導することを示す。培養Ｊｕｒｋａｔ  ＣＤ４＋Ｔ細胞からの可溶化された膜結合ＣＤ３１に対する６８６ＩＴＩＭリン酸化のフローサイトメトリー評価。可溶化されたタンパク質を、Ｅ９−ＰＥＣＡＭ−１．２（ｄｏｍ６）機能性ＣＢＡビーズにより補足し、検出を、抗ｐＹ６８６ウサギ血清、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８−抗ウサギ二次抗体により行った。柱状図は、２０００  Ｅ９−ＰＥＣＡＭ−１．２獲得ビーズに対するＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ｐＹ６８６）の中央蛍光強度（ＭＦＩ）±変動係数（ＣＶ％）の％を示す。Ｐｅｒｖａｎ＝陽性コントロール（ペルバナデート：ｐｅｒｖａｎａｄａｔｅ）；ＣＤ３／ＣＤ２８＝抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（各１μｇ／ｍｌ）；ペプチド＝ＣＤ３１ペプチド５５１〜５７４（１００μＭ）。
【図５ａ】図５ａは、ＣＤ３１同型ペプチド５５１〜５７４がＴ細胞応答を阻害することを示す。解析物の２倍段階希釈物（１２．５、２５、５０および１００μＭ）における、マウスＣＤ３１ペプチド５５１〜５７４同型結合のＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）解析。データを、コントロールチャネルに対してノーマライズし、ΔＲＵ（共鳴単位）として表した。
【図５ｂ】図５ｂは、ＣＤ３１同型ペプチド５５１〜５７４がＴ細胞応答を阻害することを示す。Ｆｌｕｏ−３ＡＭをロードした脾臓細胞におけるフローサイトメトリーにより決定されたＴＣＲ誘導性細胞内カルシウム流動。データを、ＭＦＩ（５３０／３０ｎｍ）として表す。灰色の矢印＝抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体および架橋剤の単独（黒四角＝コントロール）、あるいは１００μＭのペプチド５５１〜５５４（黒丸）または抗マウスＣＤ３１抗体（白丸）とのいずれかの添加。
【図５ｃ】図５ｃは、ＣＤ３１同型ペプチド５５１〜５７４がＴ細胞応答を阻害することを示す。ＣＤ３１＋／＋（黒柱）およびＣＤ３１−／−（白柱）脾臓細胞におけるＴＣＲ刺激に対する応答における増殖。用量依存性阻害が、ＣＤ３１＋／＋細胞において観察されたが、最高用量のペプチドのみがＣＤ３１−／−脾細胞の増殖に影響した。１００μＭ用量の混雑（ｓｃｒａｍｂｌｅ）ペプチドでは、ＣＤ３１＋／＋細胞に対して、如何なる効果も観察されなかった（十字形柱）。＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  以前のペプチド用量。
【図５ｄ】図５ｄは、ＣＤ３１同型ペプチド５５１〜５７４がＴ細胞応答を阻害することを示す。ＤＴＨモデルにおけるペプチドの免疫抑制効果。＊ｐ＜０．０１  ｖｓ  混雑（十字形柱）および１０μＭ用量のペプチド５５１〜５７４。データを、平均±ＳＥＭとして表す。
【図６ａ】図６ａは、ＣＤ３１ペプチド生物療法がアテローム性動脈硬化症の促進および動脈瘤の形成を予防することを示す。コントロール（黒四角）およびペプチド５５１〜５７４（白四角）処置マウスにおける最初の尖（ｆｉｒｓｔ  ｃｕｓｐ）の外観からの、２００、４００、６００、８００μｍでの大動脈起始部の連続断面における、アテローム性動脈硬化症の病変表面積の平均±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  コントロール（ＡＮＯＶＡ、繰返し測定）。
【図６ｂ】図６ｂは、ＣＤ３１ペプチド生物療法がアテローム性動脈硬化症の促進および動脈瘤の形成を予防することを示す。腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）の存在を、外膜組織を注意深く乖離した後に、Ａ．Ｇ．およびＡ．Ｎ．により、肉眼で盲目的に評価した。動脈瘤は、双方の実験において、１／８ペプチド処置マウスのみとは対照的に、８／１０（実験番号１）または６／８（実験番号２）コントロールマウスにおいて存在した（カイ２乗検定によるとｐ＜０．００１）。下の画像は、腹部大動脈の動脈瘤の非存在（ＡＡＡなし）と比較した、動脈瘤（ＡＡＡ：矢印）の例を示す。
【図６ｃ】図６ｃは、ＣＤ３１ペプチド生物療法がアテローム性動脈硬化症の促進および動脈瘤の形成を予防することを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するペプチド（５０μＭ）の効果（細胞溶解％）およびマクロファージ（ＭＭＰ−２／９活性）機能に対するペプチド（５０μＭ）の効果（ＭＭＰ−２／９活性）のフローサイトメトリー解析。データは、３〜４匹のマウス／群からの培養の平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  コントロール
【図７】図７は、ＥＡＥ活性の臨床スコア（麻痺レベル）を示す。「ｐｅｐＲＥＧ」とは、配列番号３のペプチドをいう。「ｐｅｐＳＣＲＡ」とは、配列番号１４のペプチドをいう。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
ＣＤ３１ペプチド
配列番号２の配列のうちの６個のアミノ酸長のＣＤ３１ペプチドおよび配列番号３の配列のうちの１０個のアミノ酸長のＣＤ３１ペプチドが、Ｔ細胞活性化を阻害し得ることが見出された。これらの２つのペプチドは、ＣＤ３１の第６の細胞外Ｉｇ様ドメインに隣接している、細胞外ＣＤ３１の膜近傍−近位部分を含むフラグメントに対応する。
【００２６】
したがって、本発明は、ＣＤ３１のフラグメントを含む、またはＣＤ３１のフラグメントからなる単離されたペプチドに関し、当該フラグメントは、以下からなる群より選ばれる：
ａ）配列番号１のアミノ酸５７９〜６０１により規定される配列のうちの少なくとも３個、６個または１０個のアミノ酸のフラグメント；
ｂ）非ヒト哺乳動物ＣＤ３１における（ａ）に対応する配列のうちの少なくとも３個、６個または１０個のアミノ酸のフラグメント；あるいは
ｃ）（ａ）に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列；
但し、（ｃ）の当該ペプチドは、配列番号５または６のアミノ酸配列からなるものではない。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、用語「ペプチド」は、当該分野において通常に与えられる意味を有する。より具体的には、タンパク質とペプチドとの間の境界線は、通常、およそ５０個のアミノ酸の長さに設定される。したがって、本発明のペプチドは、好ましくは、最大で５０個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１５個または１０個のアミノ酸の長さを有する。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、参照配列の用語「フラグメント」とは、参照配列よりも短い連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の鎖をいう。より具体的には、配列番号１のアミノ酸５７９〜６０１により規定される配列のフラグメントは、最大で２２個のアミノ酸の長さである。当該フラグメントは、例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個または２２個のアミノ酸の長さを有していてもよい。好ましくは、当該フラグメントは、３〜１８個、３〜１５個、３〜１０個、６〜１８個、６〜１５個または６〜１０個のアミノ酸の範囲内の長さを有する。
【００２９】
本発明の単離されたペプチドは、例えば、ＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸２〜２３）、ＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸３〜２３）、ＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸４〜２３）、ＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸５〜２３）、ＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸６〜２３）、ＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸７〜２３）、ＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸８〜２３）、ＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸９〜２３）、ＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸１０〜２３）、ＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸１１〜２３）、ＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸１２〜２３）、ＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸１３〜２３）、ＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸１４〜２３）、ＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸１５〜２３）、ＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸１６〜２３）、ＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸１７〜２３）、ＬＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸１８〜２３）、ＡＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸１９〜２３）、ＰＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸２０〜２３）、ＷＫＫ（配列番号５のアミノ酸２１〜２３）、ＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸２〜２３）、ＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸３〜２３）、ＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸４〜２３）、ＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸５〜２３）、ＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸６〜２３）、ＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸７〜２３）、ＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸８〜２３）、ＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸９〜２３）、ＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸１０〜２３）、ＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸１１〜２３）、ＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸１２〜２３）、ＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸１３〜２３）、ＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸１４〜２３）、ＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸１５〜２３）、ＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸１６〜２３）、ＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号６のアミノ酸１７〜２３）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫ（配列番号５のアミノ酸１〜２２）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷ（配列番号５のアミノ酸１〜２１）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰ（配列番号５のアミノ酸１〜２０）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡ（配列番号５のアミノ酸１〜１９）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬ（配列番号５のアミノ酸１〜１８）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦ（配列番号５のアミノ酸１〜１７）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶ（配列番号５のアミノ酸１〜１６）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲ（配列番号５のアミノ酸１〜１５）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶ（配列番号５のアミノ酸１〜１４）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡ（配列番号５のアミノ酸１〜１３）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬ（配列番号５のアミノ酸１〜１２）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴ（配列番号５のアミノ酸１〜１１）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳ（配列番号５のアミノ酸１〜１０）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳ（配列番号５のアミノ酸１〜９）、ＳＳＭＲＴＳＰＲ（配列番号５のアミノ酸１〜８）、ＳＳＭＲＴＳＰ（配列番号５のアミノ酸１〜７）、ＳＳＭＲＴＳ（配列番号５のアミノ酸１〜６）、ＳＳＭＲＴ（配列番号５のアミノ酸１〜５）、ＳＳＭＲ（配列番号５のアミノ酸１〜４）、ＳＳＭ（配列番号５のアミノ酸１〜３）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫ（配列番号６のアミノ酸１〜２２）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷ（配列番号６のアミノ酸１〜２１）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰ（配列番号６のアミノ酸１〜２０）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡ（配列番号６のアミノ酸１〜１９）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬ（配列番号６のアミノ酸１〜１８）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩ（配列番号６のアミノ酸１〜１７）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶ（配列番号６のアミノ酸１〜１６）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲ（配列番号６のアミノ酸１〜１５）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶ（配列番号６のアミノ酸１〜１４）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴ（配列番号６のアミノ酸１〜１３）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬ（配列番号６のアミノ酸１〜１２）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩ（配列番号６のアミノ酸１〜１１）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫ（配列番号６のアミノ酸１〜１０）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳ（配列番号６のアミノ酸１〜９）、ＮＨＡＳＳＶＰＲ（配列番号６のアミノ酸１〜８）、ＮＨＡＳＳＶＰ（配列番号６のアミノ酸１〜７）、ＮＨＡＳＳＶ（配列番号６のアミノ酸１〜６）、ＮＨＡＳＳ（配列番号６のアミノ酸１〜５）、ＮＨＡＳ（配列番号６のアミノ酸１〜４）、ＮＨＡ（配列番号６のアミノ酸１〜３）、ＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫ（配列番号５のアミノ酸２〜２２）、ＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷ（配列番号５のアミノ酸３〜２１）、ＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰ（配列番号５のアミノ酸４〜２０）、ＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡ（配列番号５のアミノ酸５〜１９）、ＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬ（配列番号５のアミノ酸６〜１８）、ＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦ（配列番号５のアミノ酸７〜１７）、ＲＳＳＴＬＡＶＲＶ（配列番号５のアミノ酸８〜１６）、ＳＳＴＬＡＶＲ（配列番号５のアミノ酸９〜１５）、ＳＴＬＡＶ（配列番号５のアミノ酸１０〜１４）、ＴＬＡ（配列番号５のアミノ酸１１〜１３）、ＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫ（配列番号６のアミノ酸２〜２２）、ＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷ（配列番号６のアミノ酸３〜２１）、ＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰ（配列番号６のアミノ酸４〜２０）、ＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡ（配列番号６のアミノ酸５〜１９）、ＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬ（配列番号６のアミノ酸６〜１８）、ＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩ（配列番号６のアミノ酸７〜１７）、ＲＳＫＩＬＴＶＲＶ（配列番号６のアミノ酸８〜１６）、ＳＫＩＬＴＶＲ（配列番号６のアミノ酸９〜１５）、ＫＩＬＴＶ（配列番号６のアミノ酸１０〜１４）およびＩＬＴ（配列番号６のアミノ酸１１〜１３）からなる群より選ばれる配列を有するフラグメントを含んでいてもよく、または当該フラグメントからなるものであってもよい。
【００３０】
好ましい実施形態では、当該フラグメントは、膜近傍フラグメント、即ち、ＣＤ３１の膜貫通ドメインに直接に隣接するフラグメントに対応する。換言すれば、当該フラグメントは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸５７９〜６０１からなる配列、または非ヒト哺乳動物ＣＤ３１における対応する配列のＣ末端先端を含むフラグメントに対応する。例えば、配列番号１のアミノ酸５７９〜６０１により規定される配列のうちの１５個のアミノ酸の膜近傍フラグメントからなるペプチドは、配列番号１のアミノ酸５８７〜６０１からなる。
【００３１】
特定の実施形態では、ＣＤ３１の膜貫通ドメインまたはその部分を含むペプチドは、本発明の範囲から除かれる。
【００３２】
本発明のＣＤ３１ペプチドの配列は、好ましくは、ヒトまたはマウスＣＤ３１の配列に由来する。しかしながら、ＣＤ３１の配列は、任意の非ヒト哺乳動物ＣＤ３１配列に由来していてもよい。図１は、ヒト、マウス、ウシおよびブタＣＤ３１配列の間のアライメントを示す。配列番号１のアミノ酸５７９〜６０１により規定される配列に対応する配列は、囲いにより強調されている。当業者は、図１に示される配列との配列アライメントを行うことにより、別の非ヒト哺乳動物ＣＤ３１タンパク質における対応する配列を容易に同定することができる。
【００３３】
ＣＤ３１フラグメントに加えて、ペプチドは、必要に応じて、ＣＤ３１に対して異種の配列を含んでいてもよい。これらの異種配列は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、サイログロブリン（ＴＨＹ）または多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）等のキャリア分子に対応していてもよい。
【００３４】
好ましい実施形態では、ペプチドは、以下からなる群より選ばれるペプチドを含むか、または当該ペプチドからなるものである：
−ヒトおよびマウスＣＤ３１配列の双方に存在する、配列番号２として示される６個のアミノ酸長のペプチド；
−配列番号３として示される１０個のアミノ酸長のペプチドであって、その配列がマウスＣＤ３１配列に由来するもの；ならびに
−配列番号４として示される１０個のアミノ酸長のペプチドであって、その配列がヒトＣＤ３１配列に由来するもの。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号２、３または４のいずれか一つに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％，９６％，９７％，９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含むか、または当該アミノ酸配列からなる。
【００３６】
本発明のＣＤ３１ペプチドは、インビトロにおけるＴ細胞増殖の用量依存性阻害を発揮する、および／または混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を阻害する生物学的活性を有する。それらの生物学的活性は、例えば、実施例３、実施例６またはＺｅｈｎｄｅｒら（１９９５，Ｂｌｏｏｄ．８５（５）：１２８２−８）に記載されるように測定されてもよい。
【００３７】
Ｔ細胞増殖アッセイは、試験されるべき化合物の存在下または非存在下のいずれかにおいて培養されたＴ細胞中に取り込まれた放射活性を比較することを含んでいてもよい。このアッセイは、例えば、以下のとおりに行われてもよい：
−抗ＣＤ３抗体を補充した完全培地を含むマルチウェルプレートを提供すること；
−漸増濃度の試験されるべき化合物をウェルに補充すること；
−末梢血単核細胞（例、脾臓細胞のもの）を蒔くこと；
−細胞を約７２時間培養すること；
−（３Ｈ）チミジンを添加し、かつ細胞を約１６時間培養すること；
−放射活性を測定すること；ならびに
−試験されるべき化合物の存在下において測定された放射活性を、当該化合物の非存在下において測定された放射活性と、ならびに／あるいは参照化合物の存在下において、および／またはネガティブコントロールの存在下において、比較すること。
【００３８】
あるいは、Ｔ細胞増殖アッセイは、試験されるべき化合物の存在下または非存在下のいずれかにおいて培養されたＴ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現レベルを比較することを含んでいてもよい。このアッセイは、例えば、以下のとおり行なわれてもよい：
−精製ＣＤ４＋細胞（例、Ｃ５７Ｂｌ６マウスから精製）を提供すること；
−抗ＣＤ３精製抗体および骨髄由来樹状細胞の添加により、当該ＣＤ４＋細胞を刺激すること；
−細胞を約１８時間培養すること；ならびに
−初期活性化マーカーＣＤ６９の発現について、例えば、フローサイトメトリーにより、当該細胞を解析すること；ならびに
−試験されるべき化合物の存在下においてＣＤ６９発現を比較すること。
【００３９】
本発明の問合せアミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、９５％「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、被験ポリペプチドのアミノ酸配列は、被験ポリペプチド配列が問合せアミノ酸配列の１００個のアミノ酸毎に５個のアミノ酸までの変更を含んでいてもよいことを除き、問合せ配列に同一であることが意図される。換言すれば、問合せアミノ酸配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、被験配列における５％（１００個のうちの５個）までのアミノ酸残基が、挿入されていてもよく、欠失されていてもよく、または別のアミノ酸で置換されていてもよい。
【００４０】
２以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法は、当該分野において周知である。したがって、例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ（バージョン９．１）で利用可能なプログラム（例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰ）が、２つのポリヌクレオチド間の％同一性ならびに２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定するために用いられてもよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの「局所相同性」アルゴリズムを用いており、２つの配列間の類似性の最良の単一領域を見出す。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた、当該分野で知られている〔例えば、ワールドワイドウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）におけるＮＣＢＩのホームページを通じてアクセス可能である、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、およびＦＡＳＴＡ〕。
【００４１】
参照配列に対して「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一」のアミノ酸配列からなるペプチドは、参照配列と比較して、欠失、挿入および／または置換等の変異を含んでいてもよい。置換の場合、置換は、好ましくは、以下の表に示されるような保存的置換に対応する。好ましい実施形態では、参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列からなるペプチドは、保存的置換によって参照配列と異なるのみである。別の好ましい実施形態では、参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列からなるペプチドは、参照配列の天然に生じるアレルバリアントに対応する。さらに別の好ましい実施形態では、参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列からなるペプチドは、参照配列とは別の非ヒト哺乳動物種に由来する相同配列に対応する。
【００４２】
【表２】
2011526485.tif 000004
【００４３】
好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、以下の表に示される配列のいずれか一つからなる。
【００４４】
【表３】
2011526485.tif 000005
【００４５】
本発明のＣＤ３１ペプチドは、固相合成、液相合成または遺伝子工学などの、当該分野における任意の周知の手法により調製してもよい。固相合成としては、例えば、合成されるべきペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を、有機溶媒中に不溶性である支持体に結合させ、そして、適切な保護基で保護されたそれらのアミノ基および側鎖の官能基を有するアミノ酸を、Ｃ末端からＮ末端の順番で一つずつ縮合する反応、および樹脂に結合したアミノ酸、またはペプチドのアミノ基の保護基を、放出する反応を、交互に繰り返すことによって、ペプチド鎖が、この様式においてこのように伸長される。所望のペプチドの合成後に、それは、脱保護反応に供され、固体支持体から切り出される。
【００４６】
本発明のＣＤ３１ペプチドは、必要に応じて、それらの安定性および／またはそれらの生物学的利用性（ｂｉｏｄｉｓｐｏｎｉｂｉｌｉｔｙ）を改善する化学修飾を含んでいてもよい。このような化学修飾は、インビボにおける酵素分解に対するペプチドの保護が向上した、および／または膜の障壁を横切る能力が向上したペプチドを得て、それにより、その半減期を向上させ、かつその生物学的活性を維持または改善することを目的とする。当該分野において知られている任意の化学修飾を、本発明にしたがって採用することができる。このような化学修飾は、以下を含むがこれらに限定されない：
−例えば、Ｎ末端アシル化（好ましくは、アセチル化）または脱アミノ化等の、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の終端に対する修飾、あるいはアミドまたはアルコール基へのＣ末端カルボキシル基の修飾；
−２つのアミノ酸間のアミド結合での修飾：２つのアミノ酸を連結するアミド結合の窒素原子またはα炭素でのアシル化（好ましくは、アセチル化）またはアルキル化（好ましくは、メチル化）；
−例えば、２つのアミノ酸を連結するアミド結合のα炭素でのアシル化（好ましくは、アセチル化）またはアルキル化（好ましくは、メチル化）等の、２つのアミノ酸を連結するアミド結合のα炭素での修飾；
−例えば、１つ以上の天然に生じるアミノ酸（Ｌエナンチオマー）の対応するＤ−エナンチオマーとの交換等の不斉性の変化；
−（Ｃ末端終端からＮ末端終端への）アミノ酸鎖の反転と共に、１つ以上の天然に生じるアミノ酸（Ｌ−エナンチオマー）を、対応するＤ−エナンチオマーと交換する、逆反転（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ）；
−１つ以上のα炭素を窒素原子と交換する、アザペプチド；ならびに／あるいは
−１つ以上のアミノ酸のアミノ基を、α炭素ではなくβ炭素に結合させる、βペプチド。
【００４７】
「単離されたペプチド」によって、生存している生物内（例、ヒトの身体内）にペプチドが存在しないことが意図される。しかしながら、単離されたペプチドは、組成物またはキットの一部であってもよい。単離されたペプチドは、好ましくは、精製される。
【００４８】
本発明の化合物は、化学合成技術および組換え技術を含む、当該分野における任意の周知の手法によって製造されてもよい。
【００４９】
化学合成技術の例は、固相合成および液相合成である。固相合成としては、例えば、合成されるべきペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を、有機溶媒中に不溶性である支持体に結合させ、そして、適切な保護基で保護されたそれらのアミノ基および側鎖の官能基を有するアミノ酸を、Ｃ末端からＮ末端の順番で一つずつ縮合する反応、および樹脂に結合したアミノ酸、またはペプチドのアミノ基の保護基を、放出する反応を、交互に繰り返すことによって、ペプチド鎖が、この様式においてこのように伸長される。固相合成法は、用いられる保護基の種類に依存して、ｔＢＯＣ法およびＦｍｏｃ法に大きく分類される。代表的に用いられる保護基としては、アミノ基について、ｔＢｏｅ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオイイ（ｏｙｙ）カルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｏｍｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）およびＣｌｚ−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）；グアニジノ基について、ＮＯ２（ニトロ）およびＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）；ならびにヒドロキシル基について、ｔＢｕ（ｔ−ブチル）が挙げられる）。所望のペプチドの合成後に、それを脱保護反応に供し、固体支持体から切り出す。このようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法については、フッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸を用いて、ならびにＦｍｏｃ法については、ＴＦＡを用いて行われてもよい。
【００５０】
あるいは、ペプチドは、組換え技術を用いて合成されてもよい。この場合には、本発明のペプチドをコードする核酸（「本発明の核酸」とさらに称する）が発現ベクター中にクローニングされる。本発明の核酸は、好ましくは、その発現を可能にする発現シグナル（例、プロモーター、ターミネーターおよび／またはエンハンサー）の制御下に配置される。次いで、発現ベクターは、宿主細胞（例、ヒト、ＣＨＯ、マウス、サル、真菌または細菌の宿主細胞）中にトランスフェクトされ、トランスフェクトされた宿主細胞は、ペプチドの発現に適切な条件下で培養される。
【００５１】
ペプチドを製造する方法は、必要に応じて、当該ペプチドを精製する工程、当該ペプチドを化学的に修飾する工程、および／または当該ペプチドを医薬組成物中に処方する工程を含んでいてもよい。
【００５２】
本発明はまた、本発明のペプチドのペプチド模倣物を同定するための方法を包含する。当該ペプチド模倣物は、血栓障害または自己免疫障害の治療および／または予防のための候補化合物である。本方法は、以下の工程を含む：
ａ）ペプチド模倣物を提供すること；ならびに
ｂ）当該ペプチド模倣物が、以下を発揮するかどうかを決定すること：
ｉ．インビトロにおけるＴ細胞増殖、および／または混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の用量依存性阻害；
ｉｉ．免疫抑制活性；ならびに／あるいは
ｉｉｉ．抗血小板活性。
ここで、当該ペプチド模倣物がインビトロにおけるＴ細胞増殖、および／または混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の用量依存性阻害、免疫抑制活性、ならびに／あるいは抗血小板活性を発揮する場合に、当該ペプチド模倣物は、血栓障害または自己免疫障害の治療および／または予防のための候補化合物である。
【００５３】
上記方法の工程（ａ）は、当該ペプチド模倣物を設計すること、および合成することを含んでいてもよい。
【００５４】
本発明のペプチドのペプチド模倣物を同定するための上記方法の工程（ｂ）は、（ｉ）；（ｉｉ）；（ｉｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉ）；（ｉ）および（ｉｉｉ）；（ｉｉ）および（ｉｉｉ）；あるいは（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含んでいてもよく、またはこれらからなるものであってもよい。
【００５５】
当該ペプチド模倣物がインビトロにおけるＴ細胞増殖、および／または混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の用量依存性阻害、免疫抑制活性、ならびに／あるいは抗血小板活性を発揮するかどうかを決定するための方法は、当業者に周知である。
【００５６】
当該ペプチド模倣物がインビトロにおけるＴ細胞増殖、および／または混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の用量依存性阻害を発揮するかどうかの決定は、例えば、実施例３に記載されるように行われてもよい。
【００５７】
免疫抑制および抗血小板活性は、例えば、活性化表面マーカー（例、血小板についてのＣＤ６２Ｐおよび／または白血球についてのＣＤ６９）または可溶性活性化マーカー（例、血小板についてのＴＸＡ２および／またはリンパ球についてのＩＬ−２）の発現を解析することにより評価することができる。
【００５８】
本明細書中で用いられる場合、用語＜＜ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）＞＞とは、本発明のＣＤ３１ペプチドの生物学的作用を模倣する非ペプチド構造要素を含有する化合物をいう。所与のペプチドのペプチド模倣物を設計および合成するための方法は、当該分野において周知であり、例えば、ＲｉｐｋａおよびＲｉｃｈ（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１９９８；２（４）：４４１−５２）およびＰａｔｃｈおよびＢａｒｒｏｎ（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００２；６（６）：８７２−７）に記載されるものが挙げられる。
【００５９】
血栓障害および自己免疫障害の処置のためのＣＤ３１ペプチドの使用
ＣＤ３１の第６の細胞外Ｉｇ様ドメインの一部を含むフラグメントに対応するＣＤ３１ペプチドが、ＣＤ３１−（即ち、ＣＤ３１ｓｈｅｄ）Ｔリンパ球においてでさえも、ＣＤ３１媒介シグナル伝達を活性化し得ることが見出されている。また、このようなペプチドは、アテローム性動脈硬化症についてのマウスモデルにおける疾患の進行および動脈瘤の形成を予防し得る。
【００６０】
したがって、本発明は、ＣＤ３１媒介シグナル伝達の活性化における使用のための、以下を含む、または以下からなる、単離されたペプチドに関する：
ａ）配列番号１のうちのアミノ酸５７９〜６０１；
ｂ）非ヒト哺乳動物ＣＤ３１における（ａ）に対応するアミノ酸；
ｃ）（ａ）のうちの少なくとも６個のアミノ酸のフラグメント；
ｄ）（ｂ）のうちの少なくとも６個のアミノ酸のフラグメント；あるいは
ｅ）（ａ）または（ｃ）に少なくとも８０％同一の配列。
これらのペプチドは、好ましくは、インビトロにおけるＴ細胞増殖の用量依存性阻害を発揮する。ＣＤ３１媒介シグナル伝達の活性化は、インビトロ活性化であってもよく、またはインビボ活性化であってもよい。
【００６１】
本明細書を通じて用いられる場合、用語「ＣＤ３１媒介シグナル伝達」とは、ＣＤ３１が関与するシグナル伝達経路をいう。このような経路は、当該分野において周知であり、例えば、ＮｅｗｍａｎおよびＮｅｗｍａｎ（２００３  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２３：９５３−９６４）およびＮｅｗｔｏｎ−ＮａｓｈおよびＮｅｗｍａｎ（１９９９．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：６８２−６８８）に記載されるものが挙げられる。
【００６２】
本発明はさらに、血栓障害または自己免疫障害の処置における使用のための、以下を含む、または以下からなる、単離されたペプチドに関する：
ａ）配列番号１のうちのアミノ酸５７９〜６０１；
ｂ）非ヒト哺乳動物ＣＤ３１における（ａ）に対応するアミノ酸；
ｃ）（ａ）のうちの少なくとも６個のアミノ酸のフラグメント；
ｄ）（ｂ）のうちの少なくとも６個のアミノ酸のフラグメント；あるいは
ｅ）（ａ）または（ｃ）に少なくとも８０％同一の配列。
これらのペプチドは、好ましくは、インビトロにおけるＴ細胞増殖の用量依存性阻害を発揮する。
【００６３】
本明細書を通じて用いられる場合、用語「血栓障害」としては、アテローム性血栓症、アテローム性動脈硬化症、急性冠状動脈症候群、虚血性発作、末梢動脈疾患および腹部大動脈瘤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書を通じて用いられる場合、用語「自己免疫障害」としては、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グレーブス病および糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態では、当該血栓障害または自己免疫障害は、ＣＤ３１＋Ｔリンパ球の表現型の消失と関連する。実際、驚くべきことに、ＣＤ３１ペプチドがＣＤ３１−Ｔリンパ球の表現型を伴う個体においてでさえもＣＤ３１シグナル伝達を回復することが見出された。したがって、本発明の状況では、ＣＤ３１ペプチドは、好ましくは、ＣＤ３１−Ｔリンパ球の表現型を有する個体および／または患者の亜群を処置するために用いられる。
【００６６】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＣＤ３１−Ｔリンパ球の表現型」は、用語「ＣＤ３１ｓｈｅｄＴリンパ球の表現型」と変更可能に用いられる。これらの用語は、例えば、Ｓｔｏｃｋｉｎｇｅｒら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２，７５（１）：５３−８）、Ｄｅｍｅｕｒｅら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９６，８８（１）：１１０−５）、Ｃａｌｉｇｉｕｒｉら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ，２００５，２５（８）：１６５９−６４）またはＣａｌｉｇｉｕｒｉら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ，２００６，２６（３）：６１８−２３）に記載されるものなどの、ＣＤ３１を検出するための従来の先行技術の方法が用いられる場合に、その循環Ｔ細胞上のＣＤ３１が見かけ上消失した個体の表現型をいう。このような方法では、ＣＤ３１を検出するために用いられる抗体は、第１〜第５の細胞外Ｉｇ様ドメインのいずれか一つに局在するエピトープに結合する。
【００６７】
好ましくは、ＣＤ３１−Ｔリンパ球の表現型を有する個体は、それらの循環ＣＤ４＋／ＣＤ３１＋Ｔリンパ球のうち、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％を消失している。換言すれば、それらの循環Ｔリンパ球のうち、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％が、ＣＤ３１ｓｈｅｄリンパ球である。ＣＤ３１＋Ｔリンパ球と比較した、ＣＤ３１−Ｔリンパ球の血漿的な割合または細胞的な割合のいずれかが、測定されてもよい。
【００６８】
ＣＤ３１媒介シグナル伝達を活性化するため、および／または血栓障害または自己免疫障害を処置するために用いられるＣＤ３１ペプチドは、「ＣＤ３１ペプチド」との表題が付された上記段落において記載されるペプチドのいずれか一つであってもよい。
【００６９】
あるいは、ＣＤ３１媒介シグナル伝達を活性化するため、および／または血栓障害または自己免疫障害を処置するために用いられるＣＤ３１ペプチドは、以下を含むか、または以下からなる：
ａ）配列番号１のうちのアミノ酸５７９〜６０１；
ｂ）非ヒト哺乳動物ＣＤ３１における（ａ）に対応するアミノ酸；
ｃ）（ａ）または（ｂ）に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列。
【００７０】
本明細書中で用いられるペプチドは、例えば、１０〜１００個、１５〜８０個、２０〜６０個、２５〜５０個および２０〜４０個のアミノ酸の間に含まれる長さを有していてもよい。これらのペプチドは、好ましくは、ＣＤ３１の膜貫通ドメインに直接に隣接するフラグメントを含むか、または当該フラグメントからなる。ペプチドは、例えば、配列番号５または６に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列からなるペプチドに対応していてもよい。ペプチドは、好ましくは、配列番号５または６からなる。これらのペプチドは、必要に応じて、それらの安定性および／またはそれらの生物学的利用性を改善する化学修飾を含んでいてもよい。
【００７１】
本発明はまた、本明細書中に記載されるようなペプチド、またはそれをコードする核酸の有効量を、それを必要とする個体に投与する工程を含む、血栓障害または自己免疫障害を治療または予防する方法に関する。それを必要とする当該個体は、好ましくは、血栓障害または自己免疫障害に罹患しているか、または罹患する危険性がある。最も好ましくは、当該個体は、ＣＤ３１−Ｔリンパ球の表現型を有する。
【００７２】
「有効量」は、処置されるべき疾患を予防、治療または低減（ｓｌｏｗ  ｄｏｗｎ）し得るペプチドの濃度を達成するのに十分な量を意味する。このような濃度は、当業者によって慣用的に決定することができる。実際に投与される化合物の量は、代表的には、処置されるべき状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、体重、および応答性、患者の症状の重篤度などを含む関連する状況を考慮して、医師によって決定される。また、投与されるペプチドの安定性に投薬量が依存していてもよいことが、当業者によって理解される。
【００７３】
本発明の枠組みにおいて処置される個体は、好ましくは、ヒトの個体である。しかしながら、他の哺乳動物を処置するためのＣＤ３１ペプチドの獣医学的な使用もまた、本発明によって意図される。
【００７４】
医薬組成物
本明細書中で記載されるＣＤ３１ペプチドは、医薬組成物中に処方される。したがって、本発明は、上記ＣＤ３１ペプチドのいずれか一つおよび生理学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を意図する。生理学的に許容され得る担体は、当業者に知られている任意の方法によって調製することができる。
【００７５】
本発明の少なくとも１つのペプチドを含む医薬組成物としては、意図される目的を達成するために有効な量においてペプチドが含有される全ての組成物が挙げられる。また、医薬組成物は、活性化合物の処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む医薬として許容され得る適切な担体を、医薬に使用することができる調製物中に含有していてもよい。医薬として許容され得る適切なビヒクルは、当該分野において周知であり、例えば、本分野における標準の参考教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＵＳＡ，１９８５）に記載されている。医薬として許容され得るビヒクルは、ペプチドの投与の様式、溶解性および安定性に応じて慣用的に選ぶことができる。例えば、静脈内投与のための処方物としては、滅菌水溶液が挙げられてもよいが、これはまた、緩衝液、希釈剤および他の適切な添加剤を含有していてもよい。薬物送達のための生体材料および他のポリマーの使用、ならびに投与の特定の様式を検証する異なる技術およびモデルが、刊行物中に開示されている。
【００７６】
本発明のペプチドは、意図される目的を達成する任意の手段によって投与されてもよい。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、脳内、髄腔内、鼻腔内、経口、直腸、経皮、口腔内、外用、局所、吸入または皮下の使用を含むがこれらに限定されない、多数の異なる経路によって達成されてもよい。
【００７７】
投与されるべき投薬量は、個体のニーズ、所望される効果および選択される投与経路に依存する。投与される投薬量は、受容者の年齢、性別、健康、および体重、併用している処置、もしあれば、処置の頻度、および所望される効果の性質に依存することが理解される。各処置に必要とされる総用量は、複数回の用量により、または単回用量において投与されてもよい。
【００７８】
意図される送達経路に依存して、化合物は、液体（例、溶液、懸濁液）、固体（例、丸剤、錠剤、坐剤）または半固体（例、クリーム、ゲル）の形態として処方されてもよい。
【００７９】
好ましい実施形態では、組成物は、正確な投薬を容易にするために単位投薬量の形態において提示される。用語「単位投薬量の形態」とは、ヒト被験体および他の哺乳動物に対する単一投薬量として適切な物理的に分離した単位であって、各単位が適切な医薬の賦形剤と共同して、所望の処置効果を生じるように計算された、予め決定された量の活性材料を含有するものをいう。代表的な単位投薬量の形態としては、液体組成物の予め充填され、予め測定されたアンプルまたはシリンジ、あるいは固体組成物の場合における丸剤、錠剤、カプセル剤などが挙げられる。このような組成物において、本発明の化合物は、通常、僅かな成分であり（約０．１〜約５０重量％、または好ましくは約１〜約４０重量％）、残りは、種々のビヒクルまたは担体および所望の投薬形態の形成に役立つ処理補助剤である。
【００８０】
本発明の化合物はまた、徐放性の形態において、または徐放性薬物送達系から投与することができる。
【００８１】
表現「生理学的に許容され得る」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、かつ投与される宿主に有毒でない任意の担体を包含することを意味する。例えば、非経口投与については、上記活性成分は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンゲル溶液等のビヒクル中で注射用単位投薬量の形態において処方されてもよい。
【００８２】
医薬として許容され得る担体に加えて、本発明の組成物はまた、安定化剤、賦形剤、緩衝剤および保存剤等の、微量の添加剤を含むことができる。
【００８３】
本発明はまた、例えば、遺伝子治療による処置の枠組みにおいて、本発明のペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物を意図する。この場合には、核酸は、好ましくは、ベクター上に提示され、ベクター上では、ペプチドをコードする配列が、その発現を可能にする発現シグナル（例、プロモーター、ターミネーターおよび／またはエンハンサー）の制御下に配置される。ベクターは、例えば、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクター等のウイルスベクターに対応していてもよい。
【００８４】
本発明はさらに、本発明のＣＤ３１ペプチドを含む医薬組成物、および投与の様式に関する使用説明書を含むキットを提供する。これらの使用説明書は、例えば、医学的適応、および／または投与経路、および／または投薬量、ならびに／あるいは処置されるべき患者の群を示していてもよい。
【００８５】
雑誌の記事または要約、公開または未公開の特許出願、発行された特許あるいは任意の他の参考文献を含む、本明細書中で引用される全ての参考文献は、参照により全体が本明細書中に援用され、参照としては、引用された参考文献中に提示されている全てのデータ、表、図および文章が挙げられる。
【００８６】
異なる意味を有するが、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、本明細書を通じて変更可能に使用されており、互いに交換されてもよい。
【００８７】
本発明はさらに、以下の実施例及び図を参照して評価される。
【実施例】
【００８８】
実施例１：材料および方法
ＣＤ３１＋およびＣＤ３１ｓｈｅｄ血液白血球の評価
１０色のフローサイトメトリーを、基礎条件における、または可溶性１μｇ/ｍｌの精製抗ＣＤ３抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）による一晩の刺激後のいずれかの５人の健常な個体からの末梢血白血球に対して行った。１０色のフローサイトメトリーを、処理前にＰＢＳ／ホルムアルデヒド  １％／ＦＣＳ  １％中で３７℃にて４分間固定された、５人の健常な個体からのヘパリン処理された末梢血白血球に対する赤血球の低張溶解（３７℃で１０分  Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ、ＮＨ４Ｃｌ  １５５ｍＭ、ＫＨＣＯ３  １０ｍＭ中で１：１０  ｖ：ｖ、ｐＨ７．４）後に行った。ヒト血液に対する全ての実験は、国際倫理委員会により承認された（ワールドワイドウェブページｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ；識別番号：ＮＣＴ００４３０８２０を参照）。ペレット細胞を、室温で３０分間インキュベートし、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＣＤ３（ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ＣＤ４（ＰＥ−Ｃｙ７）、ＣＤ８（ＰｅｒＣＰ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、ＣＤ４５ＲＡ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、および抗ＣＤ３１（ＷＭ５９、ＰＥ）、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの抗ＣＤ２０（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００）および抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ  １．２、ＦＩＴＣ）に対する蛍光モノクローナル抗体（各１μｌ）のカクテルにより光から保護した。３つのレーザー（４０５、４８８および６３３ｎｍ）が取り付けられたＢＤ  ＬＳＲＩＩ（登録商標）を用いて、少なくとも５０，０００の事象を、リンパ球ゲート中に確認し、ＢＤ  ＤＩＶＡ（登録商標）６．０ソフトウェアで解析した。
【００８９】
可溶性ＣＤ３１のサブトラクティブ測定
血漿および培養上清中のスプライスバリアントおよび短縮型ＣＤ３１を検出するため、サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ（登録商標）、ＢＤ）をカスタマイズした。３つの異なる機能性ＣＢＡビーズ（Ａ９、Ｄ５およびＥ９）を、以下の精製モノクローナル抗ＣＤ３１抗体ＪＣ７０Ａ（ドメイン１、ＤＡＫＯ）、ＭＥＭ−０５（ドメイン５、Ｚｙｍｅｄ）およびＰＥＣＡＭ  １．２（ドメイン６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれか一つとカップリングした。次いで、カップリングしたビーズを、同じ５人の健常コントロールの血漿（図２）または培養上清と共にインキュベートし、循環ＣＤ３１の陽性結合を、ＰＥ（ＢＤ）とカップリングした第４の抗ＣＤ３１モノクローナル抗体ＷＭ−５９（ドメイン１〜２）により検出した。ＣＤ３１のうち、少なくともドメイン１（ＪＣ７０Ａ）、またはドメイン１〜５（ＭＥＭ−０５）、あるいは全ての細胞外ドメイン１〜６（ＰＥＣＡＭ  １．２）を含む血漿ＣＤ３１の濃度を、サンプルおよび同じ標品（組換え、全長細胞外ＣＤ３１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の連続希釈物に関する１００以上のゲートビーズに対する検出抗体の中央蛍光強度を解析することにより決定した。多様な抗体の結合親和性における差異に起因する任意の偏りを克服するため、標準曲線を、同じ既知濃度の組換えＣＤ３１を用いて、ビーズの各々について得た。ＰＥＣＡＭ  １．２にカップリングしたビーズ（ｄｏｍ  １〜６）により決定されたＣＤ３１のｎｇ／ｍｌにおける濃度を、ＭＥＭ−０５にカップリングしたビーズを用いて得られたものから差し引いて、ｄｏｍ６を欠損する循環ＣＤ３１（ｄｏｍ１〜５）の量を得た。後者を、ＪＣ７０Ａにカップリングしたビーズを用いて得られたＣＤ３１の濃度から差し引いて、ｄｏｍ５および６の双方を欠損するが、少なくともドメイン１および２を含有する可溶性ＣＤ３１（ｄｏｍ１〜２）の値を算出した。
【００９０】
ＣＤ３１−ＩＴＩＭリン酸化の評価
Ｌｏｇ相のＪｕｒｋａｔ細胞（１０７細胞／条件）を、２０分の間、未刺激で放置するか（陰性コントロール）、またはペルバナデートと共にインキュベートするか（陽性コントロール）、あるいはペプチド５５１〜５７４（１００μＭ）の存在下または非存在下において、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、各１μｇ／ｍｌ）で刺激するか、あるいはペプチド単独と共にインキュベートした。次いで、細胞を、氷上で１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液により３０分間溶解し、超遠心分離し、１６μｌの上清を、ＰＥＣＡＭ  １．２でコーティングされた機能性Ｅ９  ＣＢＡ（登録商標）ビーズ（ＢＤ）と共に室温で２時間インキュベートした。引き続き、ビーズを、ＣＢＡ洗浄緩衝液で洗浄し、２μｌの未希釈のウサギ抗ＣＤ３１ホスホ−チロシン６８６（ｐＹ６８６）血清と共にインキュベートし、続いて２回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合（Ｆａｂ’）２フラグメント（ＣＢＡ洗浄緩衝液中で１：１００）と共にインキュベートした。最後に、ビーズ（２０００／条件）を、ＦＩＴＣチャネル（５３０／３０ｎｍ）においてフローサイトメトリーにより解析し、データを、ＤＩＶＡ  ６．０（登録商標）ソフトウェア（ＢＤ）で算出した中央蛍光強度（ＭＦＩ）±変動係数（ＣＶ％）の百分率として表した。二連の溶解物の分割物および組換えＣＤ３１の連続希釈物を、ＰＥＣＡＭ  １．２でコーティングしたビーズと共にインキュベートし、ｄｏｍ１＋細胞に結合したＣＤ３１の量を、抗ＣＤ３１  ＷＭ５９−Ｒ−ＰＥ（ｄｏｍ１）およびＰＥＣＡＭ  １．２−ＦＩＴＣ（ｄｏｍ６）抗体を用いて明らかにした（データを図３ａに示す）。
【００９１】
蛍光ペプチド結合
ＣＤ３１＋およびＣＤ３１ｓｈｅｄＣＤ４＋Ｔ細胞に対するペプチド結合の可視化のため、上記のように調製された、新たに精製した末梢血白血球を、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ペプチドのエンドサイトーシスを回避するため）を含有する緩衝化溶液で洗浄し、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングしたｉｂｉｄｉ（登録商標）  ８−ウェル培養庫（Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ）において、５０μＭ  ＦＩＴＣ標識ＣＤ３１ペプチド５５１〜５７４、および蛍光モノクローナル抗ＣＤ３１（ＰＥ）および抗ＣＤ４（ＡＰＣ）抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１：１０希釈物と共に、暗加湿器中で室温で一晩インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、ＤＡＰＩで核を対比染色し、０．３μｍ細胞内切片のデジタル画像を、ＡｐｏＴｏｍｅ（登録商標）および冷却した単色光デジタルカメラ（Ｚｅｉｓｓ）が取り付けられたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  Ｍ２００顕微鏡（×６３油浸用対物鏡）で得た。
【００９２】
カルシウム流動アッセイ
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの脾臓細胞を、Ｃａｌｉｇｉｕｒｉら（２００５  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２５：１６５９−１６６４）に記載されるように調製した。細胞を、製造業者の使用説明書に沿ってＦｌｕｏ−３ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号Ｆ１２４２）と共にインキュベートした。カルシウム結合トレーサーの蛍光を、ハムスター抗マウスＣＤ３／ＣＤ２８モノクローナル抗体（各４０μｇ／ｍｌ）およびラット／ハムスターｃｏｍｐＢｅａｄ（登録商標）（１：５０）を、単独で、あるいはラット抗マウスＣＤ３１抗体（クローン３９０、１０μｇ/ｍｌ）の存在下、またはＣＤ３１ペプチド５５１〜５７４（１００μＭ）の存在下のいずれかにおいて、添加する前、および添加後に６０秒間、ＬＳＲＩＩ（登録商標）サイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のＦＩＴＣチャネルにおいて測定した。陰性コントロールは、ラットＩｇＧアイソタイプコントロールおよび混雑（ｓｃｒａｍｂｌｅ）ペプチドを含んでいた。抗体およびｃｏｍｐＢｅａｄｓ（登録商標）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからであった。
【００９３】
プラズモン表面共鳴
同種親和性結合の会合および解離定数を、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＧＥ）により算出した。簡潔には、ペプチド５５１〜５７４を、製造業者の使用説明書にしたがって、ＣＭ５チップ上に３４００共鳴単位（ＲＵ）でコーティングした。可溶性ペプチド５５１〜５７４（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０の２００μｌ中において１２．５、２５、５０および１００μＭ）を、ペプチドでコーティングしたチャネル上に、およびコーティングしていないチャネル上に、２５℃にて２０μｌ／分で注入した。解離を、３００秒間モニターした。会合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）定数を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）３．０ソフトウェア（ＧＥ）を用いて算出した。混雑ペプチドでコーティングしたチャネル上へのペプチド５５１〜５７４の注入は、無視し得るシグナルを生じた。
【００９４】
インビトロ免疫調節の評価
同種異系マウス大動脈平滑筋細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞媒介細胞溶解活性、およびマクロファージゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２／９）活性の測定を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのキットおよび試薬を用いて、Ｃａｌｉｇｉｕｒｉら（２００６  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２６：６１８−６２３）においてヒト細胞について以前に記載されているように行った。簡潔には、ＦＶＢ／Ｎマウス大動脈平滑筋細胞の初代培養物を、脂溶性トレーサーＤＩＯ（緑）で標識し、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞強化脾臓細胞と共に３時間共培養した（混雑ペプチド  ｎ＝３、およびペプチド５５１〜５７４  ｎ＝３、５０μＭ）。細胞溶解を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の細胞内蓄積により評価した。細胞を、フローサイトメトリーにより解析し、細胞溶解の％を、標的（ＤＩＯ＋）細胞に占める死（ＰＩ＋）細胞の数を表すことにより算出した。細胞内ＭＭＰ−２／９（ゼラチナーゼ）活性を、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの７日齢の骨髄由来マクロファージにおいて、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ（登録商標）ゼラチン（ＭＦＩ）の取り込み３時間後に、フローサイトメトリーにより測定した（混雑ペプチド  ｎ＝３、およびペプチド５５１〜５７４  ｎ＝３、５０μＭ）。Ｔ細胞増殖を、以前に記載（Ｃａｌｉｇｉｕｒｉら  ２００５  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２５：１６５９−１６６４）されているように、Ｃ５７Ｂｌ／６（ＣＤ３１＋／＋）およびＣＤ３１−／−マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ）からの脾臓細胞のヒト末梢血単核細胞のいずれかを用いて行った。簡潔には、細胞を、１μｇ／ｍｌ抗マウスＣＤ３／ＣＤ２８または５μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＤ３抗体（ＢＤ）を適切に含有する完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１％ピルビン酸、１％グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン−ファンギゾン、１０％非働化仔ウシ血清、全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからである）において、Ｕ底９６ウェルプレート中に０．２×１０６細胞／ウェルにて３連で蒔いた。２５、５０および１００μＭの最終濃度のＣＤ３１（５５１〜５７４）および混雑ペプチドを、細胞を蒔く直前に、ウェル中に沈殿させた。蒔いた細胞を、５％ＣＯ２において３７℃で７２時間培養した。（３Ｈ）チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を、最後の１６時間添加し、増殖を、Ｔｏｍｔｅｃ回収器を用いて評価し、Ｗａｌｌａｃマイクロベータ計数器で解析した。データを、３連におけるｃｐｍの平均±ＳＥＭとして表す。
【００９５】
インビボ免疫調節の評価
遅延型過敏症（ＤＴＨ）の抑制を、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）４．０．１−４．０．２  Ｕｎｉｔ  ４．２」に記載されるように評価した。簡潔には、ＴＮＣＢ（２−クロロ−１，３，５−トリニトロベンゼン、Ｆｌｕｋａ  番号７９８７４）を、アセトン／オリーブ油（１：１  ｖ／ｖ）中に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ＢＡＬＢ/ｃマウス（ｎ＝６／群）を、腹部ａの剃毛領域に、合計０．２ｍｌの調製物を塗布することによって準備した（ｎ＝６／群）。実験は、ペプチド５５１〜５７４についての３つの群（１０、５０、１００μＭ）および１００μＭの混雑ペプチドで処置した１つの群を含んでいた）。準備の５日後に、１０μｌのＴＮＣＢ溶媒混合物を、ペプチド５５１〜５７４または混雑ペプチドの皮下（肩甲骨間）投与の３０分後に、右耳介上に塗布した。耳の厚さの増大を、各マウスの右および左の耳介の厚みを差し引くことにより算出し（右−左／左×１００）、ダイアル皮脂厚計（「Ｐｏｃｏｔｅｓｔ」、Ｋｒｏｅｐｌｉｎ  Ｌａｎｇｅｎｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｃｋ）で２４時間目に測定した。測定を、各耳に対して５回行い、さらなる解析のために平均した。ペプチドの免疫抑制効果を、抑制％＝（１−ΔＴＥ／ΔＴＳ）×１００〔式中、ΔＴ＝（誘発２４時間後の耳の厚み）−（ベースラインの耳の厚み）、Ｅ＝感作動物、Ｓ＝処置動物〕として算出した。データを、平均±ＳＥＭとして表す。
【００９６】
アテローム性動脈硬化症の病変サイズおよび大動脈瘤の形成の検出
本発明者らの飼育施設からの２８週齢アポリポタンパク質Ｅ−／−の雄マウス（ｎ＝８〜１０マウス／群）を、通常の固形食餌で維持し、標準的な条件下で保った。アテローム性動脈硬化症の促進および大動脈瘤の形成を、以前に記載（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０５：１６０５−１６１２）されるように、浸透ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ、番号２００４）を用いて、２８日間の皮下アンジオテンシンＩＩ（Ｓｉｇｍａ、番号Ａ９５２５）注入（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）により誘導した。全ての実験は、本発明者らの機関の倫理委員会により承認された。アテローム性動脈硬化症の病変サイズを、以前に記載（Ｃａｌｉｇｉｕｒｉら  ２００５  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｂａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２５：１６５９−１６６４）されるように、測定した。これらの実験を２回繰り返したところ、同様の結果であった。
【００９７】
ペプチド
ヒト材料に対する全ての実験を、ヒトペプチド配列を用いて行い、一方で、マウス等価物を、全てのマウス実験において用いた。ペプチドの配列を、以下の表に示す。
【００９８】
【表４】
2011526485.tif 000006
【００９９】
実施例２：血液リンパ球の表面でのＣＤ３１の見かけ上の消失は、第５の細胞外Ｉｇ様ドメインと第６の細胞外Ｉｇ様ドメインとの間のその分断に起因する。
消失したＣＤ３１がその６つの細胞外Ｉｇ様ドメインの一部に制限されるか、または全体に拡張されるかを確立するために、この分子の膜遠位および膜近位Ｉｇ様ドメインを特異的に認識する２つの異なる抗体を用いて、５人の健常ドナーからの全血白血球の多色フローサイトメトリー解析を行った。異なる白血球集団間を識別し、かつ成熟および活性のそれらの状態を評価できるようにするため、一団の系譜マーカーならびにＣＤ４５ＲＡおよびＨＬＡ−ＤＲの発現を、同時に用いた。ＣＤ３１の第１ドメインに特異的なモノクローナル抗体（クローンＷＭ−５９、ｄｏｍ１〜２）により検出されるような、ＣＤ３１の発現を、ナイーブ血液Ｔ細胞で認識したが、活性化／記憶血液Ｔ細胞では認識しなかった。全ての細胞は、成熟／活性化のそれらの状態にかかわらず、ＣＤ３１の第６のＩｇ様ドメインに特異的な別のモノクローナル抗体（クローンＰＥＣＡＭ  １．２、ｄｏｍ６）により検出される分子の膜近位細胞外フラグメントを発現していた（図２）。
【０１００】
フロー細胞サイトメトリーは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）係合が、８０％を超える血液休止Ｔ細胞について、ＣＤ３１  ｄｏｍ１＋／ｄｏｍ６＋からｄｏｍ１−／ｄｏｍ６＋（ＣＤ３１ｓｈｅｄ）表現型への転換を誘導することを示した。培養Ｔ細胞溶解物からの膜タンパク質の分子解析は、９９％を超えるＴ細胞結合ＣＤ３１分子が、インビトロにおいてＴＣＲ刺激の５’分後に既に、ｄｏｍ１を含有する遠位部分を脱離させることを実証した（図３ａ）。上清の解析は、同時に、ＣＤ３１の初めの５つのＩｇ様ドメインに限定される単一の短縮型可溶性タンパク質が培養上清中に蓄積することを示した（図３ｂ）。さらに、同じ健常ドナーの血漿の解析は、血漿中の大部分の可溶性ＣＤ３１が、Ｉｇ様ドメイン１〜５を含み、かつインビトロおよびインビボの双方で見かけ上ＣＤ３１陰性（ＣＤ３１  ｄｏｍ１−）であるリンパ球に常に係留したままである膜近位の第６ドメインを特異的に欠損する短縮型分子から構成されていることを示した（図３ｂ）。最小量の可溶性ＣＤ３１のみが、培養上清中および血漿中の双方において、以前に報告（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒら  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１７１８３−１７１９１）されていたバリアントスプライシング形態で、予測されていた全ての６つの細胞外ドメインを含有していた（図３ｂ）。この分子の有意な他の切断は、第５ドメインの上流で、何ら生じなかった。なぜならば、後者は、実質的に、短縮型可溶性ＣＤ３１タンパク質における第１ドメインに付随して、常に存在していたからである（図３ｂ）。
【０１０１】
実施例３：ＣＤ３１ｓｈｅｄＴ細胞上の残留細胞外ＣＤ３１フラグメント中に含有されるペプチドは、ＣＤ３１−ＩＴＩＭのリン酸化を増進する
このヒト分子の外部ドメインの膜近傍の２３個のアミノ酸（５５１〜５７４）に対応するＣＤ３１  ｄｏｍ６由来合成ペプチドは、ＣＤ３１  ｄｏｍ１＋およびＣＤ３１  ｄｏｍ１−（ＣＤ３１ｓｈｅｄ）ＣＤ４＋Ｔリンパ球の双方にエキソビボで結合する。重要なことに、Ｔ細胞に対するこのペプチドの結合は、免疫細胞の制御に対して機能的な結果をもたらす。なぜならば、それは、インビトロでヒト末梢血Ｔ細胞増殖の用量依存性阻害を発揮するからである（図４ａ）。このペプチドの阻害効果が同種親和性結合およびＣＤ３１シグナル伝達の係合によって媒介され得るかどうかを評価するため、培養Ｔ細胞におけるＣＤ３１  ＩＴＩＭチロシンの６８６位のリン酸化のレベル（６８６ＩＴＩＭ）を評価した。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体単独によるＴＣＲの刺激、またはこのペプチドの存在のみは、ＣＤ３１  ｐＹ６８６の僅かな増加を誘導した（図４ｂ）が、このペプチドの存在下における付随するＴＣＲ刺激は、ＣＤ３１６８６ＩＴＩＭのリン酸化を、２３倍を超えてブーストした（図４ｂ）。
【０１０２】
実施例４：ＣＤ３１同型ペプチド５５１〜５７４は、インビトロおよびインビボにおける数々の細胞媒介免疫応答を阻害する
本発明者らの仮説をさらに試験するため、インビボ実験を行い、したがって、ＣＤ３１（５５１〜５７４）ペプチドのマウス等価物を合成した。その特性を、インビトロおよびインビボで評価した。先ず、表面プラズモン共鳴解析によるその同種親和性相互作用を確立した（図５ａ）。会合および解離定数は、それぞれ、１３４±１２０  Ｍ−１Ｓ−１および１．５８Ｅ−０３±１．０７Ｅ−０３  Ｓ−１であり、平衡での親和性は、１７．８±９．７μＭであり、他の系を用いて組換えヒトＣＤ３１ホモ二量体化に対してなされた以前の測定と一致した。次に、マウスＣＤ３１（５５１〜５７４）ペプチドが、脾臓リンパ球においてＣＤ３および共刺激分子ＣＤ２８の共会合に応答してカルシウム流動を阻害できるかどうかを評価した。データは、この小さなペプチドによるＣＤ３１の膜近傍部分の同種親和性標的化が、特異的なモノクローナル抗体を用いてこの分子を架橋することによる、ＣＤ３およびＣＤ２８のＣＤ３１の遠位部分との連結と、同程度の効率的な免疫調節戦略であることを示す（図５ｂ）。このペプチドによるＣＤ３１分子経路の係合は、インビトロおよびインビボにおいて、抗原誘起リンパ球応答の効果的な抑制を実現することができた。ペプチド５５１〜５７４は、インビトロにおいて、Ｔ細胞レセプターの刺激に応答する脾臓細胞の増殖を、用量依存的な様式で阻害することが見出された（図５ｃ）。低い用量では、このペプチドの効果は、ＣＤ３１分子とのその同種親和性結合に専ら起因していた。なぜならば、ＣＤ３１−／−マウスからの脾臓細胞に対して、如何なる効果も観察されなかったからである（図３ｃ）。しかしながら、高濃度では、このペプチドはまた、ＣＤ３１を欠損する細胞でもまた１００μＭ用量におけるその効果により示唆されているように、他の（低親和性）異種親和性リガンドに結合することができる（図５ｃ）。最高用量で使用された混雑ペプチドは、効果的ではなかった（図５ｃ）。最後に、一致した組織適合性抗原により誘起される免疫応答の状況において、インビボにおけるこのペプチドの治療上の免疫抑制の可能性を、遅延型過敏症のモデルを用いて評価した。ハプテン誘発特異的免疫応答の遠位復活（ｄｉｓｔａｌ  ｒｅｃａｌｌ）は、このモデルでは、ペプチド５５１〜５７４により用量依存的な様式で抑制された（図５ｄ）。効果的な免疫抑制が、５０μＭのペプチド５５１〜５７４の単回皮下投与により達成された一方で、混雑ペプチドは効果的ではなかった（図５ｄ）。
【０１０３】
実施例５：ＣＤ３１ｓｈｅｄ細胞標的化ペプチド生物療法は、アテローム性動脈硬化症マウスにおける疾患の進行および大動脈瘤の形成を予防する
老齢アポリポタンパク質Ｅ−／−マウスへのアンジオテンシンＩＩ注入のモデル（２５）を用いた。このモデルは、ヒトにおけるアテローム性血栓症を厳密に模倣している。５０μＭのペプチドの毎日の皮下投与は、このモデルにおいて、大動脈起始部における粥腫（ｐｌａｑｕｅ）成長の促進（図６ａ）およびアテローム性血栓症の腹部大動脈の動脈瘤（ＡＡＡ）の形成（図６ｂ）の双方を予防した。インビトロでは、ＣＤ３１由来ペプチド５５１〜５７４は、骨髄由来マクロファージにおける基質分解酵素の活性およびマウス大動脈平滑筋細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞依存性細胞溶解の双方を阻害した（図６ｃ）。
【０１０４】
実施例６：１０個のアミノ酸長のペプチド候補であるペプチド「ＰｅｐＲｅｇ」のインシリコおよびインビトロ検証
１０個のＣＯＯＨ末端アミノ酸に対応するより短いネスト型（ｎｅｓｔｅｄ）ペプチドを試験した。このペプチドを配列番号３として示し、「ＰｅｐＲｅｇ」と称する。以下の表に示されるように、このペプチドは、２３個のアミノ酸のＣＤ３１  ５５１〜５７４ペプチドよりも安定であると予期された。
【０１０５】
【表５】
2011526485.tif 000007
【０１０６】
ＰｅｐＲｅｇ（１０ａａ）  ｖｓ  ２３ａａ親ペプチドの免疫抑制特性を、インビトロで評価した。Ｃ５７Ｂｌ６マウスからネガティブに精製されたＣＤ４＋細胞を、可溶性抗ＣＤ３精製抗体および骨髄由来樹状細胞により刺激した。３連のウェルからの細胞を、１０％仔ウシ血清を補充した完全ＲＰＭＩ培地中で１８時間培養した後に、初期活性化マーカーＣＤ６９の発現について解析した。フローサイトメトリーは、ＰｅｐＲｅｇが、ＣＤ６９を発現するＣＤ４細胞の百分率により決定した場合、Ｔ細胞活性化の抑制において２３ａａペプチドと少なくとも同程度に効率的であったことを示した。興味深いことに、この効果は、より再現性があり（より小さな標準偏差）、親（２３ａａ）ペプチドと比較した場合に、より低い用量（５０μｇ／ｍｌ  ｖｓ  １００μｇ／ｍｌ）のＰｅｐＲｅｇ（１０ａａ）で観察された。ＰｅｐＲｅｇによるＴ細胞増殖の抑制を、［Ｈ３］チミジン取り込みにより解析し、１０％血清中における３７℃での７日目の培養まで持続させたところ、インシリコで得られたペプチドの安定性に関するデータが、インビトロで検証されたことが実証された。
【０１０７】
実施例７：ＥＡＥモデルにおける１０個のアミノ酸長のペプチド候補であるペプチド「ＰｅｐＲｅｇ」のインビボ検証
実験的アレルギー性脳脊髄炎とも呼ばれる実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症の動物モデルである。
【０１０８】
１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、８００μｇの失活乾燥結核菌Ｈ３７ＲＡを含有する完全フロイントアジュバント中に１：１の容量で乳化された３００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチドで免疫した。最終容量２００μｌのこの乳剤を、側腹部に対して４箇所（５０μｌ／部位）に皮下注射した。また、３００ｎｇの百日咳毒素を、同日および２日後に静脈内（眼窩後叢）注射した。ＥＡＥの臨床徴候を、以下の採点システムにより毎日評価した：０、徴候なし；１、後肢の脱力；２、後肢の脱力および尾部の麻痺；３、後肢および尾部の麻痺；４、後肢および尾部の麻痺、ならびに前肢の脱力；５、瀕死状態；ならびに６、死亡。ピーク（漸増相）は、およそ２１日目に生じた。このＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスモデルでは、本発明者らの研究室において４１日目まで評価したところ、如何なる警告相も存在しなかった。
【０１０９】
この実験は、一群当たり１０匹のマウスで行った。各群のマウスを、以下のいずれかで処置した：
−ＰＢＳ；
−ＰｅｐＲｅｇ（配列番号３）；または
−ＰｅｐＳｃｒａ（配列番号１４）。
【０１１０】
投薬は、一匹のマウス当たりおよび一日当たり５０μｇのペプチドであった（即ち、一日当たり約２ｍｇ／Ｋｇ）。このペプチドを、皮下注射により投与した。
【０１１１】
疾患の保護は、マウスの中枢神経系におけるＩＬ１７＋およびＩＦＮｇ＋ＴヘルパーＣＤ４＋細胞の湿潤の減少および調節性ＣＤ２５＋／ｆｏｘＰ３  ＣＤ４＋細胞の割合の増加と関連する。
【０１１２】
図７に示されるように、ＰｅｐＲｅｇは、漸増相（１５日目）において疾患の発症を停止し得、かつプラトー相（２１日目から３５日目まで）における疾患の伸展を低減し得る。
【０１１３】
混雑ペプチドもまた、ＰｅｐＲｅｇほどではないが、有益であった。この結果は、配列自体ではなくアミノ酸組成物が有益な効果のために重要であることを示唆する。この結果は、ペプチド模倣物の開発のための重要な意義を有する。
【０１１４】
実施例８：アテローム性血栓症に罹患している患者からの血漿における、および罹患していない個体における分断ＣＤ３１の検出
ＣＤ３１の総量、分断ＣＤ３１の量およびスプライスされたＣＤ３１の量を、アテローム性血栓症に罹患している１１人の個体、および２３人の罹患していない個体の双方において測定した。
【０１１５】
群「アテローム性血栓症」は、安静時でさえも胸痛に苦しみ、かつ異常な冠状動脈造影を呈する１１人の個体を含んでいた。
【０１１６】
群「アテローム性血栓症なし」は、２３人の個体を含んでいた。補足解析を、群「アテローム性血栓症なし」に対して行った。この群は、以下を含むことが判明した。
−胸痛にかかわらず、正常な冠状動脈造影および正常な頸動脈エコードップラー（ｃａｒｏｔｉｄ  ｅｃｈｏｄｏｐｐｌｅｒ）を呈する８人の個体；
−胸痛にかかわらず、正常な冠状動脈造影を呈するが、アテローム性動脈硬化症が頸動脈エコードップラーにより検出された４人の個体；ならびに
−労作時のみ胸痛に苦しみ、かつ異常な冠状動脈造影を呈する（即ち、血栓症を伴わない、冠状動脈のアテローム性動脈硬化症に罹患している）１１人の個体。
【０１１７】
ＣＤ３１の総量、分断ＣＤ３１の量およびスプライスされたＣＤ３１の量を、以下のとおりに決定した。
１．総量（１μｌ／試験）のビーズ（Ｅ９、クローンＪＣ７０Ａとカップリング、ＤＡＫＯ）を、円錐チューブに移し、２００ｇで５分間遠心分離した。上清を注意深く廃棄し、同量の血清強化緩衝液（ＢＤ  番号５１−９００２１５０）に交換し、室温で１５分間インキュベートした。
２．蛍光標識抗体の抗体混合物（ＰＥ−ＷＭ５９；ＦＩＴＣ−ＨＣ１／６；ＰＢ−ＰＥＣＡＭ１．２）を調製した（各々１μｇ／ｍｌ、各１μｌ／条件）。
３．３μｌの標品希釈物または血漿サンプルを各々含有する１個のチューブの前準備物（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を調製した。再構成したビーズを、２００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、血清強化緩衝液を、蛍光標識抗体の混合物に交換した。３μｌのこの溶液を、標品希釈物およびサンプルを含有するチューブの各々に分配し、溶液を、暗中で４℃にて１時間インキュベートした。
４．１５０μｌの洗浄緩衝液（ＢＤ  番号５１−９００３７９７）を、各チューブに添加し、シグナルを得た。
【０１１８】
以下の表に示されるように、分断ＣＤ３１の百分率は、全ての個体が胸痛に罹患しているという事実にもかかわらず、罹患していない個体よりも、アテローム性動脈硬化症に罹患している個体において、より高かった。
【０１１９】
【表６】
2011526485.tif 000008
【０１２０】
全体のＣＤ３１量は、４つの群において同様であったが、分断ＣＤ３１の量およびスプライスされたＣＤ３１の量は、各々の対をなす群の比較において有意に異なっていた。分断ＣＤ３１は、異常な冠状動脈造影を伴う個体において増加しており、アテローム性動脈硬化症に罹患している個体が最も高い値を有していた。スプライスＣＤ３１は、アテローム性血栓症を伴わないアテローム性動脈硬化症に罹患している患者に依然として存在していたが、それは、アテローム性血栓症に罹患している患者では殆ど検出不能であった。
【０１２１】
これらの結果は、患者が頸動脈粥腫に最終的に付随する非特異的な胸痛に罹患していることを、低レベルの分断ＣＤ３１に付随する高レベルのＣＤ３１可溶性スプライスバリアントが示すことを実証する。正常レベルまたは減少レベルのＣＤ３１可溶性スプライスバリアントに付随する分断ＣＤ３１レベルの僅かな増加は、患者がアテローム性動脈硬化症に罹患していることを示す。検出不能な量のＣＤ３１可溶性スプライスバリアントに付随する分断ＣＤ３１レベルの顕著な増加は、患者がアテローム性血栓症に罹患していることを示す。
【０１２２】
実施例９：結果の考察
異常免疫疾患は、免疫応答の適切な制御の欠損に関連付けられる。アテローム性動脈硬化症およびその合併症は、代謝の障害に起因しているのみではなく、異常免疫疾患として次第に認識されており、重要な現在の問題は、免疫調節を回復できる介入的ツールの同定である。粥腫破裂および血栓症（Ｃａｌｉｇｉｕｈら  ２００５  Ａｒｔｅｈｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  ２５：１６５９−１６６４）または動脈瘤合併症（Ｃａｌｉｇｉｕｒｉら  ２００６  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  ２６：６１８−６２３）等のアテローム性血栓症の徴候が、末梢血中のＣＤ３１＋Ｔリンパ球の有意な減少に付随することが以前に示されている。これらの従来の研究では、本発明者らは、リンパ球に対するＣＤ３１シグナル伝達の欠損がアテローム性血栓症前の免疫応答を誘発する一方で、Ｔ細胞上のＣＤ３１の存在がそれらを阻害できることを立証した。
【０１２３】
ここで、活性化／記憶Ｔリンパ球上でのこの分子の推定される消失は、実際には不完全であり、第５の細胞外Ｉｇ様ドメインと第５の細胞外Ｉｇ様ドメインとの間でのＣＤ３１の分断から生じることが実証される。ＣＤ３１分断は、Ｔリンパ球に対する細胞活性化の直後に生じ、上清中の短縮型分子の蓄積を、この細胞により生成される僅かなレベルのスプライスバリアントと共に伴う。この知見は疑う余地がない。なぜならば、血漿ＣＤ３１を検出する全ての市販の試験は、ＣＤ３１ドメイン１〜５に対する抗体を用いるものであり、したがって、スプライスバリアント（６個の細胞外ドメインの全てを含有する）形態のＣＤ３１と短縮型（ドメイン１〜５）形態のＣＤ３１との間を識別できないためである。本明細書中に記載されるサブトラクティブ免疫吸着アッセイは、可溶性ＣＤ３１の２つの形態間を識別することができ、血漿中のそれらの各々の割合を正確に定量する。このアッセイは、大部分の血漿ＣＤ３１がドメイン１〜５を含むが、血液ＣＤ３１  ｄｏｍ１−リンパ球に係留したままである膜近位の第６ドメインを欠損することを示した。したがって、これらのリンパ球を、ＣＤ３１「陰性」細胞ではなく、ＣＤ３１ｓｈｅｄ細胞と称することを提案する。インビトロにおける以前の研究は、この分子の膜貫通セグメントからＮ末端にある未同定の位置におけるＣＤ３１の分断が、アポトーシスを起こした内皮細胞で生じ得ることを示した（Ｉｌａｎら．２００１．Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １５：３６２−３７２）。初めて、分断が血液リンパ球上のＣＤ３１（不完全）消失を担うこと、および循環ＣＤ３１が、分泌されたスプライスバリアント形態からではなく、Ｉｇ様ドメイン５とＩｇ様ドメイン６との間でのその切断に由来する短縮形態から主になることが本明細書中で示された。ＣＤ３１についての遺伝的多型が記載されているが、可溶性ＣＤ３１レベルの予測値は、アテローム性血栓症または他の異常免疫疾患のいずれかにおいて矛盾していた。実際、スプライスされた形態の量は、異なる遺伝的バリアントにより予測することができ、タンパク質の分断から生じる形態の割合は、ＣＤ３１遺伝子多型により決定されない。異なる研究間の不同性は、循環ＣＤ３１が遺伝的バリアントおよび短縮型形態の混合物であり、ＣＤ３１の２つの形態間の識別が可能ではなかったという事実に起因していたと考えられる。本明細書中に記載されるサブトラクティブ方法は、ＣＤ３１の分断に関連付けられるものとは無関係に、ＣＤ３１の遺伝的バリアントにより決定される予後値の鑑別を可能にする。
【０１２４】
ＣＤ３１が血液リンパ球で完全には消失しないという事実は、この分子の残留細胞外部分を標的化することにより、その生理学的免疫調節機能をレスキューする独特の機会を提供する。実際、このことが、インビトロおよびインビボの双方において、同型ペプチドに基づく療法により達成することができることが、本明細書中で立証された。このペプチドの同種親和性結合は、ＣＤ３１  ６８６ＩＴＩＭのリン酸化を劇的に強化し、それらのＴＣＲ誘導性増殖を阻害した。ＣＤ３１およびＣＤ３表面分子の抗体媒介架橋によるＣＤ３１  ＩＴＩＭリン酸化の誘導は、ヒトＴ細胞株における抗ＣＤ３抗体により誘導されるカルシウム流動を阻害することが以前に知られていた。顕著なことに、小さな同型ペプチドによるＣＤ３１の膜近傍部分の同種親和性標的化は、抗体でこの分子を架橋することによる、ＣＤ３およびＣＤ２８のＣＤ３１の遠位部分との連結と、同程度の効率的な免疫調節戦略であることが見出された。選択的な小さな合成ペプチド戦略は、明らかにより単純であり、また、免疫学的障害の生物療法について、モノクローナル抗体および架橋剤等の大きなタンパク質を用いるものよりも、より安全であるかもしれない（Ｉｓａａｃｓ  ２００７．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７：４１８−４２５）。
【０１２５】
この着想を心に留めつつ、このペプチドによるＣＤ３１分子経路の係合が、一致した組織適合性抗原により誘起される免疫応答の状況において、インビトロおよびインビボでの抗原誘起リンパ球応答の効果的な抑制を実現できるかどうかを評価した。ハプテンにより誘発される特異的な免疫応答の遠位回復は、このペプチドの単回皮下投与により、用量依存的な様式において抑制された。単回ペプチド注射の同様の保護効果もまた、実験的自己免疫脳脊髄炎（多発性硬化症のマウスモデル）において観察され、５日目まで持続した。
【０１２６】
結果として、合成ペプチド５５１〜５７４によるＣＤ３１媒介免疫調節のレスキューが、アテローム性血栓症に取り組む生物療法において採用されることができるかどうかを評価した。なぜならば、ＣＤ３１媒介免疫調節は、この疾患では典型的に消失するからである。それは、アテローム性血栓症のアンジオテンシン誘導モデルを用いるために選択された。なぜならば、このモデルにおける血栓により併発する、アテローム性動脈硬化症の粥腫成長の急速な促進および腹部大動脈の動脈瘤の発達は、生理学的なペプチド（アンジオテンシンＩＩ）の過剰な生物学的利用性により単に生じるものであり、手術、遺伝子移入または高脂肪食の使用（各々がこの結果の解釈にかなりの偏りを生じさせ得る）を必要としないからである。ＣＤ３１ペプチドは、このモデルにおいて、大動脈起始部における粥腫成長の促進、およびアテローム性血栓症の腹部大動脈の動脈瘤の形成の双方を予防した。このような劇的な保護効果は、これまでに試験した如何なる治療用分子よりも優れており、遺伝的操作により達成されたものと同等である。
【０１２７】
マクロファージおよびリンパ球は、アテローム性血栓症の発達に関与する殆どの重要な免疫細胞を演じる。これらの細胞の局所機能は、動脈層の細胞および細胞外成分を傷害し、アテローム性動脈硬化症の粥腫の被膜に生じる場合には、粥腫の破裂および管腔血栓症のいずれかを生じ、あるいは動脈の外層で起こった場合には、動脈瘤の形成および最終的には破裂を生じる。細胞外基質の分解は、本質的には、マクロファージ由来基質メタロプロテアーゼの活性に起因する一方で、動脈平滑筋細胞の死は、おそらく、Ｔ細胞媒介細胞溶解により引き起こされる。顕著なことには、ＣＤ３１＋Ｔリンパ球は、ＣＤ３１ｓｈｅｄＴ細胞により逆に悪化するこれらの現象に対する重要な免疫抑制機能を発揮する。アテローム性血栓症を患う患者におけるＣＤ３１＋細胞の異常な減少は、この疾患で観察される欠陥的な免疫調節に潜在する。ここで、ＣＤ３１由来ペプチド５５１〜５７４は、基質分解酵素の活性および動脈壁細胞のＴ細胞依存性細胞溶解の双方を阻害することが示されている。このペプチドにより伝達される免疫調節は、免疫調節性ＣＤ３１＋Ｔ細胞により発揮されるものと同程度に効率的であり、それ故、ヒトのアテローム性血栓症における生理学的なＣＤ３１依存性免疫調節の消失に拮抗し得る。
【０１２８】
ペプチドに基づく生物療法がアテローム性血栓症の欠陥的な免疫調節の特徴を修正し、かつ患者におけるこの疾患の発症を予防することを想起したのは、これが初めてである。また、このような生物療法は、他の衰弱した異常免疫疾患に対して拡張し得る。特に、実験的な研究は、ＣＤ３１シグナル伝達が関節リウマチ（Ｗｏｎｇら．２００５．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５：１９−２８）、多発性硬化症（Ｇｒａｅｓｓｅｒら．２００２．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０９：３８３−３９２）および非アルコール性脂肪肝疾患（Ｇｏｅｌら．２００７．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９３：Ｇ１２０５−１２１４）における保護的な役割を果たし得ることを示唆した。
【０１２９】
実施例１０：本発明の９６個のペプチドの評価
以下からなる群より選ばれる配列を有するフラグメントからなる９６個のペプチドを、これらのペプチドがＣＤ３１−ＩＴＩＭリン酸化を誘導することを確認するために試験する：
−配列番号５のうちのアミノ酸２〜２３、３〜２３、４〜２３、５〜２３、６〜２３、７〜２３、８〜２３、９〜２３、１０〜２３、１１〜２３、１２〜２３、１３〜２３、１４〜２３、１５〜２３、１６〜２３、１７〜２３、１８〜２３、１９〜２３、２０〜２３および２１〜２３；ならびに
−配列番号６のうちのアミノ酸２〜２３、３〜２３、４〜２３、５〜２３、６〜２３、７〜２３、８〜２３、９〜２３、１０〜２３、１１〜２３、１２〜２３、１３〜２３、１４〜２３、１５〜２３、１６〜２３および１７〜２３；ならびに
−配列番号５のうちのアミノ酸１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４および１〜３；ならびに
−配列番号６のうちのアミノ酸１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４および１〜３；ならびに
−配列番号５のうちのアミノ酸２〜２２、３〜２１、４〜２０、５〜１９、６〜１８、７〜１７、８〜１６、９〜１５、１０〜１４および１１〜１３；ならびに
−配列番号６のうちのアミノ酸２〜２２、３〜２１、４〜２０、５〜１９、６〜１８、７〜１７、８〜１６、９〜１５、１０〜１４および１１〜１３。
ＣＤ３１−ＩＴＩＭリン酸化は、実施例３に記載されるように、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体で刺激した培養Ｊｕｒｋａｔ細胞のＣＤ３１−ＩＴＩＭリン酸化に対する、本発明のペプチドの漸増用量の効果を研究することにより、評価する。
【０１３０】
上記ペプチドが、Ｃａｌｉｇｉｕｈら（２００５  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  ２５：１６５９−１６６４）により記載されるプロトコルを用いてＴ細胞増殖を阻害することが確認される。
【０１３１】
これらのペプチドが、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１，４．０．１−４．０．２  Ｕｎｉｔ  ４．２）に記載されるプロトコルを用いて効果的な免疫抑制を達成できることが確認される。
【０１３２】
血栓障害を治療するためのこれらのペプチドの効力は、ヒトにおけるアテローム性血栓症を厳密に模倣する、老齢アポリポタンパク質Ｅ−／−マウスに対するアンジオテンシンＩＩ注入のモデルにおいて確認される。
【０１３３】
自己免疫障害を治療するためのこれらのペプチドの効力は、多発性硬化症の動物モデルである、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいて、および関節リウマチについてのモデルにおいて、確認される。
【０１３４】
実施例１１：関節リウマチ（ＲＡ）の動物モデルにおける本発明のペプチドの評価
本発明のペプチド（例、ＰｅｐＲｅｇおよび／または実施例１０に記載されるペプチド）は、関節リウマチ（ＲＡ）の動物モデルにおいて、疾患の発症を停止し得ること、および／または疾患の伸展を低減し得ることが確認される。
【０１３５】
関節リウマチ（ＲＡ）は、免疫系による関節の攻撃を引き起こす、慢性的かつ全身性の炎症性自己免疫障害である。この疾患は、未処置のままである場合には、関節の軟骨および骨の進行性の破壊につながる、攻撃的な滑膜の過形成（パンヌス形成）および炎症（滑膜炎）により特徴付けられる。破壊的な病変は、免疫応答および非抗原特異的な生来の炎症プロセスの双方から生じる。幾つかの研究は、ＣＤ３１がこの疾患において重要な役割を果たすことを示した。なぜならば、この疾患の発病および進行は、その非存在において促進されるからである。
【０１３６】
ＤＢＡ／１マウスを、この実験に使用する。ＲＡの誘導を、１２週齢のマウスで開始する。０日目に、マウスを、尾の基部にて、２００μｇのＨ３７ＲＡ結核菌を含有する等容量のフロイント完全アジュバントで乳化した１５０μｇのウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）で皮内免疫する。２１日目に、マウスに、ブースター（フロイント不完全アジュバント中の１５０μｇのウシＣＩＩの皮内注射）を施す。同時に、マウスは、５０μｇのＬＰＳの静脈内注射を受ける。マウスを、２ヶ月間、継続管理する。免疫後に、動物は、重篤な軟骨および骨の侵食により特徴付けられる自己免疫性多発性関節炎を発症する。マウスコラーゲン誘導性ＲＡは、幾つかの臨床的、組織病理学的および免疫学的特質を、ヒトＲＡと共有する。
【０１３７】
本発明のペプチドを、以下の処置計画のうちのいずれか一つの後に投与する。
−計画１：予防投与。２つの用量（５０および１００ｍｇ／ｋｇ）のペプチドを、ＣＩＩ免疫の１日前に、次いで、研究期間の間（２ヶ月）に、毎日、あるいは週に２回、または毎週のいずれかで、マウスに投与する。混雑配列を有するペプチド（即ち、本発明のペプチドと同じアミノ酸を含むが、同じ配列ではないペプチド）を、コントロール群のマウスに投与する。処置を１ヶ月間続ける。
−計画２：治癒投与。ペプチド（５０および１００ｍｇ／ｋｇ）ならびに混雑ペプチドを、症状が出始めたマウスに、研究の終了まで、毎日、あるいは週に２回または毎週のいずれかで投与する。同等の群のマウスを、従来の収容施設中で維持し、尾静脈から毎週採血して、出血時間および血清中の特異的な病原性抗体の上昇をモニターする（ＣＤＴＡ、Ｏｒｌｅａｎｓ）。
【０１３８】
関節炎の発症を、週に３回の身体検査によりモニターする。４本の手足の各々における炎症を、０〜３の度合いで格付けし、４本の手足に対するスコアを加算する（一匹のマウス当たり１２の最大スコアを生じる）。関節炎指標を、関節炎マウスの数で実験マウスの総スコアを除算することにより算出する。
【０１３９】
関節における病変もまた、追跡する。マウスの足首の関節を、免疫６週後に切開し、１０％緩衝ホルマリン中で固定し、１０％  ＥＤＴＡ中で脱灰し、パラフィンに包埋し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。滑膜の過形成、細胞性炎症、およびパンヌス形成の強度を評価し、関節炎を、盲検様式において０〜４の度合いで格付けする。
【０１４０】
免疫組織化学をさらに用いて、関節に浸潤した炎症細胞を追跡し、かつその表現型を調べる。
【０１４１】
免疫調節状態を、ＣＩＩに対する血清ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのレベルを測定することにより評価する。この測定を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により行う。排液リンパ節および脾臓から単離されたＴ細胞の増殖を、ＣＩＩをロードした樹状細胞に応答する３Ｈチミジンの取り込みにより試験する。
【０１４２】
リンパ器官および滑液中の細胞集団を、フローサイトメトリーにより解析する。
【０１４３】
この実験は、本発明のペプチドの連続投与がＲＡの発病を予防することを確認することを可能にする。治癒の局面は、現在の生物製剤に応答しない患者（すなわち、４０％の患者）におけるＲＡを治療するためのペプチドの治療可能性を評価することを可能にする。関節中の炎症細胞の退行、および臨床スコアの退行を誘起できる投与の用量および頻度もまた、決定する。
【配列表フリーテキスト】
【０１４４】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、ヒトＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号２、３、４、１０、１１および１２は、本発明のＣＤ３１ペプチドに対応する。
配列番号５および６は、本発明の方法における使用のためのＣＤ３１ペプチドに対する。
配列番号７は、マウスＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号８は、ウシＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号９は、ブタＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号１３および１４は、コントロールとして用いられる混雑ペプチドに対応する。
【図１ａ】
2011526485.tif 000009
【図１ｂ】
2011526485.tif 000010
【図３ａ】
2011526485.tif 000011
【図３ｂ】
2011526485.tif 000012
【図４ａ】
2011526485.tif 000013
【図４ｂ】
2011526485.tif 000014
【図５ａ】
2011526485.tif 000015
【図５ｂ】
2011526485.tif 000016
【図５ｃ】
2011526485.tif 000017
【図５ｄ】
2011526485.tif 000018
【図６ａ】
2011526485.tif 000019
【図６ｂ】
2011526485.tif 000020
【図６ｃ】
2011526485.tif 000021
【図７】
2011526485.tif 000022
【図２】
2011526485.tif 000023
【配列表】
2011526485000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月4日(2011.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011526485000001.app
【国際調査報告】
2011526485.tif 000024
2011526485.tif 000025
2011526485.tif 000026
2011526485.tif 000027