(57)【要約】デフィブロチドの効果を模倣する、種々の規定されたサイズのホスホジエステルオリゴヌクレオチドの組成物が作られた。該組成物は、４０ｍｅｒ〜６５ｍｅｒのＮｍｅｒを含む合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの混合物から本質的になる。該ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは好ましくは、それぞれの位置でＡ、Ｇ、Ｃ及びＴのいずれかから構成されるヘテロポリマーであるが、ホモポリマー、すなわち該オリゴヌクレオチドのそれぞれの位置で同じ塩基が存在しうる、であってもよい。これらの混合物は、ガン及び他の疾患の処置において有効である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
約４０塩基〜約６５塩基の長さを有する合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの混合物。
【請求項２】
該オリゴヌクレオチドが約４０塩基〜約６０塩基の長さを有する、請求項１の混合物。
【請求項３】
該オリゴヌクレオチドが約４５塩基〜約６０塩基の長さを有する、請求項１の混合物。
【請求項４】
該オリゴヌクレオチドが約４５塩基〜約５５塩基の長さを有する、請求項１の混合物。
【請求項５】
該オリゴヌクレオチドが約５０塩基〜約５５塩基の長さを有する、請求項１の混合物。
【請求項６】
該オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項１の混合物。
【請求項７】
該オリゴヌクレオチドの配列がＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列である、請求項１の混合物。
【請求項８】
該オリゴヌクレオチドの配列がランダム配列である、請求項１の混合物。
【請求項９】
該オリゴヌクレオチドのプリン塩基が、グアニン、アデニン、キサンチン及びヒポキサンチンから選ばれ、及びピリミジン塩基がシトシン、チミン、メチルシトシン及びウラシルから選ばれる、請求項１の混合物。
【請求項１０】
該オリゴヌクレオチドの糖がリボース及びデオキシリボースから選ばれる、請求項１の混合物。
【請求項１１】
医薬としての使用の為の、請求項１〜１０のいずれか１項の混合物。
【請求項１２】
静脈閉塞疾患の処置及び／又は予防における使用の為の、請求項１〜１０のいずれか１項の混合物。
【請求項１３】
血栓性血小板減少性紫斑病の処置及び／又は予防における使用の為の、請求項１〜１０のいずれか１項の混合物。
【請求項１４】
腫瘍の処置における使用の為の、請求項１〜１０のいずれか１項の混合物。
【請求項１５】
血管新生依存性腫瘍の処置における使用の為の、請求項１〜１０のいずれか１項の混合物。
【請求項１６】
造血性前駆細胞を動員する能力を有する少なくとも１つの造血性因子と一緒に又は時間的近傍で投与されたときに、哺乳類の末梢血中の幹細胞及び前駆細胞の量を増加することにおける使用の為の、請求項１〜１０のいずれか１項の混合物。
【請求項１７】
血液抗凝固剤としての使用の為の、請求項１〜１０のいずれか１項の混合物。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか１項の混合物を含む医薬組成物。
【請求項１９】
水性溶液であることを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
静脈内に投与されることを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
哺乳類に投与されることを特徴とする、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
該哺乳類がヒトであることを特徴とする、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
５〜６０マイクロモル／リットルのオリゴヌクレオチド濃度を有することにより特徴付けられる、請求項１９に記載の水性溶液。
【請求項２４】
１０〜５０マイクロモル／リットルのオリゴヌクレオチド濃度を有することにより特徴付けられる、請求項２３に記載の水性溶液。
【請求項２５】
約４０塩基〜約６５塩基の長さを有する合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの混合物を投与することを含む、疾患又は状態を処置する方法。
【請求項２６】
該オリゴヌクレオチドが約４０塩基〜約６０塩基の長さを有する、請求項２５の方法。
【請求項２７】
該オリゴヌクレオチドが約４５塩基〜約６０塩基の長さを有する、請求項２５の方法。
【請求項２８】
該オリゴヌクレオチドが約４５塩基〜約５５塩基の長さを有する、請求項２５の方法。
【請求項２９】
該オリゴヌクレオチドが約５０塩基〜約５５塩基の長さを有する、請求項２５の方法。
【請求項３０】
該オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項２５の方法。
【請求項３１】
該オリゴヌクレオチドの配列がＤＮＡ配列及び／又はＲＮＡ配列である、請求項２５の方法。
【請求項３２】
該オリゴヌクレオチドの配列がランダム配列である、請求項２５の方法。
【請求項３３】
該オリゴヌクレオチドのプリン塩基が、グアニン、アデニン、キサンチン及びヒポキサンチンから選ばれ、及びピリミジン塩基がシトシン、チミン、メチルシトシン及びウラシルから選ばれる、請求項２５の方法。
【請求項３４】
該オリゴヌクレオチドの糖がリボース及びデオキシリボースから選ばれる、請求項２５の方法。
【請求項３５】
該疾患又は状態が静脈閉塞疾患である、請求項２５の方法。
【請求項３６】
該疾患又は状態が血栓性血小板減少性紫斑病である、請求項２５の方法。
【請求項３７】
該疾患又は状態が腫瘍である、請求項２５の方法。
【請求項３８】
該疾患又は状態が血管新生依存性腫瘍である、請求項２５の方法。
【請求項３９】
該疾患又は状態が血液抗凝固剤の使用から利益を得るものである、請求項２５の方法。
【請求項４０】
哺乳類の末梢血中の幹細胞及び前駆細胞の量を増加する為の方法であって、造血性前駆細胞を動員する能力を有する少なくとも１つの造血性因子と一緒に又は時間的近傍で、約４０塩基〜約６５塩基の長さを有する合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの混合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４１】
該オリゴヌクレオチドが約４０塩基〜約６５塩基の長さを有する、請求項４０の方法。
【請求項４２】
該オリゴヌクレオチドが約４５塩基〜約６０塩基の長さを有する、請求項４０の方法。
【請求項４３】
該オリゴヌクレオチドが約４５塩基〜約５５塩基の長さを有する、請求項４０の方法。
【請求項４４】
該オリゴヌクレオチドが約５０塩基〜約５５塩基の長さを有する、請求項４０の方法。
【請求項４５】
該オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項４０の方法。
【請求項４６】
該オリゴヌクレオチドの配列がＤＮＡ配列及び／又はＲＮＡ配列である、請求項４０の方法。
【請求項４７】
該オリゴヌクレオチドの配列がランダム配列である、請求項４０の方法。
【請求項４８】
該オリゴヌクレオチドのプリン塩基が、グアニン、アデニン、キサンチン及びヒポキサンチンから選ばれ、及びピリミジン塩基がシトシン、チミン、メチルシトシン及びウラシルから選ばれる、請求項４０の方法。
【請求項４９】
該オリゴヌクレオチドの糖がリボース及びデオキシリボースから選ばれる、請求項４０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、４０塩基長〜６５塩基長の、Ｎ塩基長（Nmers）と呼ばれる合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの混合物に関し、特には、ガンを含む疾患を処置する為にこれらのオリゴヌクレオチドを使用することに関する。該ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは好ましくはそれぞれの位置でＡ、Ｇ、Ｃ及びＴのいずれかから構成されたヘテロポリマーであるが、ホモポリマー、すなわち同じ塩基が該オリゴヌクレオチドのそれぞれの位置で存在しうる、でもありうる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
語「デフィブロチド」は、動物の及び／又は植物の組織からの及び特にはブタ又はウシの腸からの抽出により得られた一本鎖オリゴヌクレオチド（１５〜８０ｍｅｒ、平均４５ｍｅｒ）の複合混合物をいう（米国特許第３，７７０，７２０号明細書及び米国特許第３，８９９，４８１号明細書）。デフィブロチド、これは１６．５±２．５ｋＤａの平均分子量を有する、は通常は、アルカリ金属、一般的にはナトリウムの塩の形で用いられる。それは主に、その抗血栓活性について用いられるが（米国特許第３，８２９，５６７号明細書）、それは種々の用途、例えば急性腎不全の処置（米国特許第４，６９４，１３４号明細書）及び急性心筋虚血の処置（米国特許第４，６９３，９９５号明細書）など、において用いられうる。デフィブロチドについての追加の文献が以下に引用される。
【０００３】
米国特許第５，８０１，１０９号明細書は、進行期（ＩＩＩ及びＩＶ期）の末梢動脈疾患を処置する為のデフィブロチドの使用を開示する。
【０００４】
米国特許第５，１１６，６１７号明細書は、デフィブロチド含有組成物を局所的に施与することを含む、ヒトにおける毛細血管を強化する方法を開示する。
【０００５】
米国特許第５，９７７，０８３号明細書は、正常マーカー、疾患マーカー及びリペアマーカーにおける観察された変動（例えば、増加、減少、出現、消失）に応答してデフィブロチドの用量を修正することにより、種々の疾患状態が処置されうることを開示する。
【０００６】
米国特許第６，０４６，１７２号明細書は、４０００〜１００００ダルトンの分子量を有する、動物由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドを開示し、これはポリデオキシリボヌクレオチドの分画により又は高分子量のデオキシリボ核酸の化学的又は酵素的脱重合により得られうる。
【０００７】
米国特許第６，６９９，９８５号明細書及び米国特許第５，６２４，９１２号明細書は、ＨＩＶ感染を含む種々の疾患状態を処置する為にデフィブロチドを使用する方法を開示する。
【０００８】
米国特許第７，３３８，７７７号明細書は、デフィブロチドの生物学的活性を決定する方法を開示する。
【０００９】
欧州特許出願公開第１２７６４９７号明細書は、造血性前駆細胞を結集する能力を有する少なくとも一つの造血性因子（例えばＧ−ＣＳＦなど）と一緒に又は時間的近傍にデフィブロチドを投与することにより、哺乳類の末梢血中の幹細胞及び前駆細胞の量を増加する方法を開示する。
【００１０】
国際公開第２００５／０２３２７３号パンフレットは、デフィブロチドの抗腫瘍作用を開示する。
【００１１】
国際公開第２００６／０９４９１６号パンフレットは、血管新生依存腫瘍を処置する為にデフィブロチドを使用する方法を記載する。
【００１２】
加えて、Ｋｏｒｎｂｌｕｍらによる総説「Ｄｅｆｉｂｒｏｔｉｄｅ，a  Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｆｅｓａｖｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｖｅｎｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ，」（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６：１０５−１１４（２００６））は、デフィブロチド及び、静脈閉塞疾患（ＶＯＤ）の処置におけるその使用を議論する。
【００１３】
１９９８年に、ボストン、マサチューセッツのＤａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰａｕｌ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ博士が、骨髄移植後の重度の肝臓ＶＯＤのための処置としてデフィブロチドの使用を開始した。該薬剤は、ほとんど毒性を伴わず、静脈内に投与され、そしてこれまでは症例の９５％において致死であった疾患において、患者の約４５％〜５０％を治した。続く、米国及び欧州における複数施設試験は、その作用機構は未知であるが、デフィブロチドの有効性を確認した。
【００１４】
米国特許第４，９８５，５５２号明細書及び米国特許第５，２２３，６０９号明細書は、デフィブロチドの製造方法を記載し、これは、一定の且つ明確な物理化学的特徴を有し且つ望ましくない副作用のいずれもが無い製品を得られることを可能にする。
【００１５】
欧州特許出願公開第１３２５１６２号明細書は、デフィブロチドの生物学的活性を決定する為の方法を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
数十年間、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化の故に薬剤として用いられ得ないという定説があったが、この考え方は、それらの低い毒性の故にそれらが患者に投与されうる大きな量を無視している。デフィブロチドによる臨床的経験は明らかに、これらの種類の分子が、治療的有効性とともに与えられうることを示す。しかしながら、デフィブロチドが、それが天然産物であるので、同じく再生産されうるかどうかについていくつか疑問がある。それ故に、デフィブロチドと同じ効果を有するが、同一に再生産されることができるであろう組成物を開発することの当技術分野におけるニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、約４０塩基〜約６５塩基、好ましくは約４０塩基〜約６０塩基、さらにより好ましくは約４５塩基〜約６０塩基、約４５塩基〜約５５塩基又は約５０塩基〜約５５塩基の長さを有する合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの混合物を投与することを含む、疾患又は状態を処置する方法に向けられる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、上記で説明されたとおりの平均の長さを有する合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと医薬的キャリア（と任意的に医薬的に許容できる賦形剤及び／又はアジュバント）とから本質的になり、且つ、該合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの活性に実質的に影響する他の成分を含まない医薬組成物も包含する。
【００１９】
本発明の方法において、該オリゴヌクレオチドは、一本鎖でありうる；該オリゴヌクレオチドの配列はＤＮＡ配列及び／又はＲＮＡ配列でありうる；該オリゴヌクレオチドの配列はランダム配列でもありうる。
【００２０】
本発明の方法において、該オリゴヌクレオチドのプリン塩基はグアニン、アデニン、キサンチン及びヒポキサンチンから選ばれてよく、及び、ピリミジン塩基は、シトシン、チミン、メチルシトシン及びウラシル選ばれてよい；該オリゴヌクレオチドの糖はリボース及びデオキシリボースから選ばれうる。
【００２１】
本発明の方法において、該疾患及び状態は、静脈閉塞性疾患、血栓性血小板減少性紫斑病、腫瘍、血管新生依存性腫瘍、又は、血液抗凝固剤の使用から利益を享受する疾患又は状態でありうる；該ホスホジエステルオリゴヌクレオチドが造血前駆細胞を結集する能力を有する少なくとも一つの造血性因子と一緒に又は時間的近傍に投与されるときに、該方法は哺乳類の末梢血中において幹細胞及び前駆細胞の量を増加する為にも用いられうる。
【００２２】
本発明のこれらの局面及び他の局面は、以下の詳細な説明及び添付された図面を参照して明らかになるであろう。本明細書内の上記又は下記において引用された全ての刊行物、特許、特許出願は、それら全体を引用することにより、本明細書内に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】Ｃ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８のｂＦＧＦへの結合についての、デフィブロチド及びデフィブロチド分子量画分による競合を示すバンド強度を示す図である。
【図１Ｂ】標準化されたバンド強度対、デフィブロチド又はデフィブロチド分子量画分濃度のｌｏｇのプロットを示す図である。
【図２】ｂＦＧＦへ結合するＣ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８のデフィブロチド及びデフィブロチド分子量画分およびＮｍｅｒ競合物についてのＫｃ値の比較を示すチャート及び表である。
【図３】[図３Ａ]は、オリゴデオキシヌクレオチド、Ｃ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８、をアルキル化することによるＰＤＧＦ  ＢＢの修飾を示すバンド強度を示す図である。[図３Ｂ]は、相対的バンド強度対反応性オリゴデオキシヌクレオチド濃度のプロットを示す図である。[図３Ｃ]は、図３Ｂにおけるデータの二重逆数プロットを示す図である。
【図４】ｂＦＧＦへ結合するＣ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８のデフィブロチド、デフィブロチド分子量画分およびＮｍｅｒ競合物についてのＫｃ値の比較を示すチャート及び表である。
【図５】ＶＥＧＦへ結合するＣ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８のＮｍｅｒ競合物及びＴｍｅｒ競合物についてのＫｃ値の比較を示すチャート及び表である。
【図６】ラミニンへ結合するＣ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８のＮｍｅｒ競合物及びＴｍｅｒ競合物についてのＫｃ値の比較を示すチャート及び表である。
【図７】ラミニンへ結合するＣ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８のＮｍｅｒ競合物及びＴｍｅｒ競合物のＫｃ値の比較を示すチャート及び表である。
【図８Ａ】ｂＦＧＦにより媒介されたＨＭＥＣ−１増殖のデフィブロチドによる抑制のチャートである。
【図８Ｂ】ｂＦＧＦの不在下における細胞増殖に対するデフィブロチドの抑制効果のチャートである。
【図９】[図９Ａ]はｂＦＧＦにより媒介されたＨＭＥＣ−１増殖のＮｍｅｒによる抑制のチャートである。[図９Ｂ]は、ｂＦＧＦの不在下における細胞増殖に対するＮｍｅｒの抑制効果のチャートである。
【図１０】部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）に対するデフィブロチド及びＮｍｅｒの効果を示すチャートである。
【図１１】[図１１Ａ]は、ＨＭＥＣ−１細胞の増加する濃度のデフィブロチドへの24時間の曝露による、馴化培地へのＴＦＰＩの用量依存的放出を示すチャートである。[図１１Ｂ]は、５μＭデフィブロチドにより誘発された、馴化培地へのＴＦＰＩ放出の時間経過を示すチャートである。[図１１Ｃ]は、ＨＭＥＣ−１細胞の増加する濃度のデフィブロチドへの３０分間の曝露による、馴化培地へのＴＦＰＩの用量依存的放出を示すチャートである。
【図１２】[図１２Ａ]は、ＨＭＥＣ−１細胞の増加する濃度のデフィブロチド分子量画分への曝露による、馴化培地へのＴＦＰＩの用量依存的放出を示すチャートである。[図１２Ｂ]は、５μＭデフィブロチドにより誘発された馴化培地へのＴＦＰＩ放出の時間経過を示すチャートである。
【図１３】ＦＧＦＲ２をトランスフェクトされたＣ１１細胞の、ｂＦＧＦ＋ヘパリンにより刺激された増殖における、ヘパリンの代わりをするデフィブロチド及びＮｍｅｒの能力を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
以下の定義が、本発明のより良い理解の為に与えられる。
【００２５】
ヌクレオチドは、３つの部分からなる化学的化合物である：複素環塩基、糖、及び1又は複数のホスフェート基。最も一般的なヌクレオチドにおいて、該塩基はプリン又はピリミジンの誘導体であり、そして、該糖はペントース（五炭糖）デオキシリボース又はリボースである。ヌクレオチドは、核酸のモノマー、例えばＤＮＡ又はＲＮＡなどである。
【００２６】
オリゴヌクレオチドはヌクレオチドの短い配列であり、典型的には２０又はそれより少ない塩基を有する。自動化された合成装置が、最大で１６０〜２００塩基のオリゴヌクレオチドの合成を許す。合成された塩基の長さは通常は、「ｍｅｒ」（ギリシャ語ｍｅｒｏｓ（部分）から）により表示される。例えば、２５塩基のフラグメントは、２５ｍｅｒと呼ばれるであろう。
【００２７】
ホスホジエステル結合は、ホスフェート基中のリン原子と２つのエステル結合上の２つの他の分子との間の一群の強力な共有結合である。ホスホジエステル結合は、ＤＮＡ及びＲＮＡの鎖の骨格を構成する。
【００２８】
ＤＮＡ及びＲＮＡは、ホスホジエステル結合により連結された糖とホスフェート基とからなる骨格を有する、ヌクレオチドと呼ばれる単純な単位の長いポリマーである。塩基と呼ばれる分子の4種類の一つが、それぞれの糖に付けられている。ＤＮＡ及びＲＮＡにおいて、該ホスホジエステル結合は、リボース糖の３’炭素原子と５’炭素の間の連結である。
【００２９】
ＤＮＡはしばしば二本鎖であり、そして、通常は、2種類のプリン塩基、グアニン及びアデニン、並びに2種類のピリミジン塩基、シトシン及びチアミン、を含む。或る場合に、プリン及びピリミジン塩基は、それらの変異した形によりそれぞれ置き換えられうる：グアニン及びアデニンは、キサンチン及びヒポキサンチンにより置き換えられうる一方で、シトシンはメチルシトシンにより置き換えられうる。ＲＮＡは、ＤＮＡに非常に類似しているが、少しの重要な構造的詳細において異なる：ＲＮＡは典型的には一本鎖であり、一方でＤＮＡは典型的には二本鎖である。また、ＲＮＡヌクレオチドはリボース糖を含む一方で、ＤＮＡはデオキシリボースを含む；さらに、ＲＮＡはＤＮＡ中に存在するチアミンの代わりにウラシルを含む。
【００３０】
ランダムヌクレオチド配列は、２つの異なるプリン塩基及び２つの異なるピリミジン塩基の等しい混合物を本質的に含むヌクレオチド配列であり、ここで該配列のそれぞれの位置で、それぞれのプリン又はピリミジン塩基は、２５％±５の存在確率、好ましくは２５％±２の存在確率、より好ましくは２５％±１の存在確率を有する。
【００３１】
本明細書において用いられるときに、語「単離された」は、言及されている物質が、それが天然に見つけられる環境から取り除かれ、及びそれが特定の試料中に存在することを確立するのに十分な程度に特徴付けられていることを意味する。そのような特徴付けは、任意の標準的技術、例えばシークエンシング、ハイブリダイゼーション、イムノアッセイ、機能的アッセイ、発現、サイズ決定又は同様のものにより達成されうる。すなわち、生物学的物質は、もしそれが細胞成分、すなわち、該物質が天然に見つけられ又は生成される細胞の成分を含まないならば、「単離された」となりうる。
【００３２】
単離されたオルガネラ、細胞、又は組織は、原料生物中に見られる解剖学的部位（細胞、組織又は生物）から取り除かれたものである。単離された物質は、精製されていてもよく又は精製されていなくてもよい。語「精製された」は、本明細書において用いられるときに、他の混入物質の存在を検出可能な程度に減少し又は排除する条件下で単離された物質（例えば、核酸分子又はタンパク質）をいう。混入物質は、該精製された物質が得られた天然物質を含んでもよく又は含まなくてもよい。精製された物質は好ましくは、約９０重量％より少ない、約７５重量％より少ない、約５０重量％より少ない、約２５重量％より少ない、約１０重量％より少ない、約５重量％より少ない、又は約２重量％より少ない、それが当初に伴った他の成分を含む。
【００３３】
特に反対に示されない限り、本発明の実施は、当技術分野の技術範囲内の分子生物学、細胞生物学およびタンパク質化学の慣用の方法を採用するであろう。この多くが、説明の為に以下に記載される。そのような技術は、該文献中に十分に説明される。例えば、Sambrook,  et  al.,  “Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual” (2nd  Edition,  1989); “DNA  Cloning:  A  Practical  Approach,  vol.  I  &  II”;(D.  Glover,  ed.); “Oligonucleotide  Synthesis”(N.  Gait,  ed.,  1984);  “Nucleic  Acid  Hybridization”(B.  Hames  &  S.  Higgins,  eds.,  1985); Perbal, “A  Practical  Guide  to  Molecular  Cloning” (1984);  Ausubel  et  al.,  “Current  protocols  in  Molecular  Biology”(New  York,  John  Wiley  and  Sons,  1987); 及び Bonifacino  et  al.,  “Current  Protocols  in  Cell  Biology” (New  York,  John  Wiley  &  Sons,  1999)を参照されたい。
【００３４】
語「約」は、当技術分野の当業者により決定されたときに、特定の値についての許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、該値がどのように測定され又は決定されるかに、すなわち測定システムの限界に、部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、当技術分野における実施につき、許容可能な標準偏差内を意味しうる。あるいは、「約」は、或る値の最大で±２０％、好ましくは最大で±１０％、より好ましくは最大で±５％、そしてより好ましくはなお最大で±１％の範囲を意味しうる。あるいは、特には生物学的システム又はプロセスに関して、該語は、値の桁の範囲内、好ましくは値の２倍の範囲内（within  2-fold）を意味しうる。特定の値が本願および請求項内において記載されるところで、他に言及されない限り、語「約」が、暗に示されており、そして、本文脈において、該特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味する。
【００３５】
本発明の文脈において、本明細書内において述べられる疾病状態のいずれかに関する限り、語「処置する」、「処置」及び同様のものは、そのような状態に付随する少なくとも１つの症状を防ぎ又は軽減し又は緩和することを意味し、又はそのような状態の進行を遅らせ又は逆戻りさせることを意味する。例えば、本発明の意味内において、語「処置する」は、発病（onset）を止め、遅らせる（すなわち、疾患の臨床的顕在化の前の期間）こと及び／又は疾患が発達し又は悪化するリスクを減ずることも意味する。語「守る」は、本明細書内において、対象における疾患の発達又は継続又は悪化を、必要に応じて、防ぎ、遅らせ若しくは処置し又は全てをすることを意味する。
【００３６】
句「医薬的に許容できる」は、本発明の組成物との関係で用いられるときに、哺乳類（例えばヒト）などの動物に投与されたときに、生理学的に許容でき且つ典型的には有害な反応を生成しないような組成物の分子実体及び他の成分をいう。好ましくは、本明細書において用いられるときに、語「医薬的に許容できる」は、連邦政府又は州政府の監督官庁により承認されていること、又は米国薬局方において又は哺乳類及びより特にはヒトにおける使用についての他の一般的に認められた薬局方において掲げられていることを意味する。
【００３７】
本明細書において用いられるときに、表現「合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの混合物」は、同じ及び／又は異なる配列を有しうる合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの混合物を意味する。第一の実施態様に従い、該混合物は、同じ配列を有するオリゴヌクレオチドと異なる配列を有するオリゴヌクレオチドとの両方を含んでよく、それらの場合について、異なる配列を有するそのようなオリゴヌクレオチドは同じ又は異なる長さを有しうる。第二の実施態様に従い、該混合物は、異なる配列を有するが同じ長さを有するオリゴヌクレオチドから構成されうる。
【００３８】
語「投与すること」又は「投与」は、化合物をそれが意図された作用部位に直接的に及び間接的に届けることについての全ての手段を包含することが意図される。
【００３９】
語「動物」は、哺乳類を含む任意の動物を意味し、そして特にはヒトを意味する。
【００４０】
添付された図面は、いかなる様式であっても本発明を限定することなく、本発明の好ましい実施態様をもっぱら説明する為に含まれている。
【００４１】
発明の詳細な説明
【００４２】
オリゴヌクレオチド、例えばデフィブロチドなど、はヘパリンに結合するタンパク質に結合することができる。本明細書内において用いられるときに、語「ヘパリン」は、低親和性ヘパリンを意味する。天然の産物と同等の活性又は天然の産物よりも高い活性を有する合成デフィブロチドアナログが作成されることができ、そしてこれらのアナログは、ヘパリン結合性成長因子に結合するそれらの能力の故に、抗ガン活性を有する。ガン細胞に対する大きな重要性を有する３つのヘパリン結合性タンパク質は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びラミニンを含む；本発明の組成物は、これらのタンパク質に、ナノモルの親和性で結合することができ、しかしこの結合は配列特異的でない。
【００４３】
本組成物は、約４０ｍｅｒから約６５ｍｅｒの長さを有する合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの混合物が、デフィブロチドの特性を再現し（recapitulate）、そして、すなわち、そのような活性成分の合成代替物として用いられうるとの驚くべき発見に基づく。本発明の該オリゴヌクレオチドは好ましくは、約４０〜６０ｍｅｒ、好ましくは約４５〜６０ｍｅｒの長さを有しうる；本発明のより良い実施態様に従い、それらは約４５〜５５ｍｅｒの長さ、好ましくは約５０〜５５ｍｅｒの長さを有しうる。
【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドのプリン塩基は好ましくは、グアニン、アデニン、キサンチン及びヒポキサンチンから選ばれ、そして、ピリミジン塩基は、シトシン、チミン、メチルシトシン及びウラシルから選ばれる。１つの実施態様に従い、配列は、該オリゴヌクレオチド中のそれぞれの位置でそれぞれの遺伝的塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴ）の混合物から構成されるだろう；好ましくは、それらはランダム配列だろう。他の実施態様に従い、配列は、該オリゴヌクレオチドのそれぞれの位置で同じ塩基（例えばチミジン、すなわちＴｘ）からなるだろう。さらなる実施態様に従い、本オリゴヌクレオチドの糖はリボース及びデオキシリボースから選ばれる。
【００４５】
他の実施態様に従い、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ配列及び／又はＲＮＡ配列から構成される。
【００４６】
好ましい実施態様に従い、本発明のオリゴヌクレオチドは一本鎖である。
【００４７】
実験の部から明らかになるであろうとおり、本発明者らは驚くべきことに、低分子量を有するデフィブロチドの画分及び、特には、４０ｋＤａより低い分子量を有するそれらが、ヘパリン結合性成長因子に結合するより低い能力を有するものであることを発見した。そのような発見はすなわち、容易に且つ同等に再現されることができ且つデフィブロチドの効果を模倣することができるオリゴヌクレオチドのはっきり定義された（well-defined）混合物の選択を許した。
【００４８】
本発明の混合物はすなわち、デフィブロチドを投与することにより処置されるだろう疾患、例えばＶＯＤ、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、腫瘍、血管新生依存性腫瘍（例えば多発性骨髄腫又は乳ガンなど）など、に苦しむ哺乳類の患者、好ましくはヒト、を処置する為に用いられうる；それらの混合物は、造血前駆細胞を動員する能力を有する少なくとも１つの造血因子と一緒に又は時間的近傍で投与されたときに、血液抗凝固剤として又は哺乳類の末梢血中の幹細胞及び前駆細胞の量を増加する為にも用いられうる。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドの混合物は、デフィブロチドと同じように投与されうる；好ましくはそれらは、水性溶液によって、注射により、好ましくは静脈注射により、投与されるだろう。そのような水性溶液は、５〜６０マイクロモル／リットル、好ましくは１０〜５０マイクロモル／リットルのオリゴヌクレオチド濃度を有しうる。
【実施例１】
【００５０】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、より良く理解されるであろう。
【００５１】
材料及び方法
【００５２】
合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの生成
Ｎｍｅｒのシリーズを作る為に、ＤＮＡシークエンシングマシーン（例えばＡＢＩ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅにより市場で一般に入手可能）が用いられた。それぞれの塩基（アデニン、シトシン、グアニン及びチミン）の等しい量（モル濃度により測定されたとき）が、該シークエンシング反応において用いられた。該マシーンは、２５塩基〜２００塩基のサイズの、ランダムな長さの一本鎖ＤＮＡを作ることがプログラムされ、そしてそれぞれの塩基は４つの遺伝的塩基からランダムに選ばれた。
【００５３】
細胞培養
ＳＶ４０により形質転換されたＨＭＥＣ−１細胞が、ジョージア州アトランタのＣＤＣから得られた。それらは、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧナトリウム及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンサルフェートを補われたＭＣＤＢ１３１培地中で増殖された。マイコプラズマフリーのヒトメラノーマ細胞株５１８Ａ２が、オーストリアのウィーン大学のＶｏｌｋｅｒ  Ｗａｃｈｅｃｋ博士から得られた。細胞は、１０％の熱不活化ＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧナトリウム及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンサルフェートを補われたＤＭＥＭ中で増殖させられた。ＬＸ２ヒト肝星細胞株がＳＶ４０Ｔ抗原自然発生的不死化により低い血清条件下で作られ、そしてニューヨークのｔｈｅ  Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＳｃｏｔｔ  Ｌ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ博士により提供された。ＬＸ２細胞は、１％の熱不活化ＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧナトリウム及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンサルフェートを補われたＤＭＥＭ中で増殖させられた。ストックカルチャーは、加湿された５％ＣＯ２インキュベータ中で３７℃で維持された。
【００５４】
デフィブロチド、デフィブロチド分子量画分、及び合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの生成
デフィブロチド、一本鎖ホスホジエステルポリデオキシリボヌクレオチド（分子量は１６．５±２．２５ｋＤａ）から構成された非常に複雑な多分散系物質、がブタの腸組織から抽出されたＤＮＡの、制御された脱重合により調製され、そしてＧｅｎｔｉｕｍ（Ｃｏｍｏ、イタリア）により用意された。デフィブロチド分子量画分、これはブタ腸組織から単離されそして次に分画されたデフィブロチドである（分子量９，３５３；１２，２５８；１６，７６１；２１，８４０；及び２６，１９０ダルトンをそれぞれ有するＡ２、Ｅ２、Ｇ２、Ｉ２、Ｌ２）、もまたＧｅｎｔｉｕｍにより供給された。Ｎｍｅｒ（種々の明確な長さの、一連の合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチド）及びＴｍｅｒ（明確な長さの、チミジンの一連のホスホジエステルホモポリマー）が合成され、上記で詳述された手順により精製され、そして、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（サンディエゴ、カリフォルニア州）により供給された。
【００５５】
組換えタンパク質及び細胞培養物質
組換えヒトｂFGF及びVEGF１６５、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ  ＢＢ）及びヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入された。ラミニンが、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から入手された。ＤＭＥＭ、ＭＣＤＢ  １３１、Ｍ１９９培地、及びＦＢＳが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、カリフォルニア州）から入手された。フィブロネクチンにより覆われたプレート及びＭａｔｒｉｇｅｌが、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ベッドフォード、ＭＡ）から購入された。ＩＭＵＢＩＮＤ  Ｔｏｔａｌ  ＴＦＰＩ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（スタンフォード、コネティカット州）から入手された。
【００５６】
アルキル化（alkylating）オリゴデオキシヌクレオチドプローブＣ１ＲＮＨ３２ｐ−ＯｄＴ１８の合成
１０ＯＤ  ＵのＯｄＴ１８が、５’−ポリヌクレオチドキナーゼとの反応によって、［３２Ｐ］ホスフェートにより５’標識された。過剰のＡＴＰが、該反応産物から、０．１Ｍリチウムパークロレート中で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５クロマトグラフィーにより分離された。次に、該オリゴヌクレオチドが、２％  ＬｉＣｌＯ４／アセトンの添加により沈殿させられ、そして、２００ＯＤ  Ｕ／μｌの濃度で水中に溶解された。次に、該オリゴヌクレオチドは、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液の８％水性溶液の添加により沈殿させられ、そして乾燥された。次に、２０μｌのジメチルホルムアミド中の６．５ｍｇのｐ−（ベンジルアミノ）−Ｎ−クロロエチル−Ｎ−メチルアミン（ＣｌＲＮＨ２）、続いて８ｍｇのジピリジルジスルフィド及び９．５ｍｇのトリフェニルホスフィンが、該乾燥したオリゴヌクレオチドに添加された。2時間後、該オリゴヌクレオチドが、２％のＬｉＣｌＯ４／アセトンの添加により沈殿され、１ＭのＮａＣｌの２５μｌ中に溶解させられ、エタノールにより沈殿させられ、そして乾燥させられた。最終産物は、水中に再度溶解され、そして−８０℃で保蔵された。
【００５７】
Ｃ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８によるヘパリン結合性タンパク質の修飾
Ｃ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８によるヘパリン結合性タンパク質の修飾が、Yakubov  et  al.  (Oligonucleotides  interact  with  recombinant  CD4  at  multiple  sites.  J.  Biol.  Chem.  1993  268:19918-18823)の方法により達成された。最初に、ｂＦＧＦ（５０ｎＭ濃度）、ＰＤＧＦ  ＢＢ（５００ｎＭ）、ＶＥＧＦ（１５０ｎＭ）、ラミニン（５０ｎＭ）又はＨＢ−ＥＧＦ（４００ｎＭ）が、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０〜２０μＭのＣ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８を有する、の中でインキュベートされた。デフィブロチド、デフィブロチド分子量画分、Ｔｍｅｒ又はＮｍｅｒが、増加する濃度で、該プローブホスホジエステルオリゴヌクレオチドの該タンパク質への結合の競合物として用いられた。３７℃での1時間後、１０％のグリセロール、４％の２−メルカプトエタノール、４％のＳＤＳ及び０．２％のブロモフェノールブルーを有する1体積のバッファーが添加され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥが実施された。ゲルが乾燥され、そして、バンドが可視化されるまでＫｏｄａｋ  Ｘ線フィルムに曝露された。該フィルムが現像され、そしてバンド密度がレーザー密度測定により定量された。
【００５８】
増殖アッセイ
コンフルエントなＨＭＥＣ−１細胞が、それらの場所で、24時間、２．５％ＦＢＳを有するＭ１９９培地中で処理され、そして次にフィブロネクチンにより覆われた９６ウェルプレート中に（２．５％ＦＢＳを補われたＭ１９９培地中に）まかれた。続いて、該培地は次に、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ単独、ｂＦＧＦと一緒の又はｂＦＧＦを伴わないデフィブロチド又はＮｍｅｒのいずれかを有する新鮮培地により置き換えられた。３７℃での3日の処理後、細胞増殖がスルホローダミンＢ染色により評価された。全ての実験は4重に実施された。
【００５９】
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）放出の測定
ＨＭＥＣ−１細胞が、２４ウェルプレート中に、２．５％ＦＢＳを有するＭ１９９培地中に１０×１０４細胞／ウェルの密度でまかれた。該細胞は、デフィブロチド又はデフィブロチド分子量画分、又はＮｍｅｒにより、種々の時間間隔の間処理された。次に、該馴化細胞培地が集められ、１０，０００ｇで１０分間遠心されて、細胞デブリを除去し、そして該培地中の組織因子経路インヒビター（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＦＰＩ））の濃度が、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、製造者により記載されたとおりに、測定された。
【００６０】
結果
【００６１】
デフィブロチド分子量画分及びＮｍｅｒはヘパリン結合性タンパク質と同様に相互作用する
デフィブロチド、デフィブロチド分子量画分及びＮｍｅｒは、腫瘍増殖、生存能力、血管新生、及び遊走において重要であるヘパリン結合性タンパク質と相互作用する。ヘパリン結合性タンパク質へ結合する為の、デフィブロチド、デフィブロチド分子量画分及びＮｍｅｒの能力の評価が、競合アッセイを介して実行された。最初のステップにおいて、チミジンのアルキル化３２Ｐ標識されたホスホジエステル１８ｍｅｒホモポリマー（Ｃ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８）が合成された。この分子が、１０〜２０μＭの標識されたプローブを有する０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、中でインキュベートされたｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ  ＢＢ、ＢＢ、ＶＥＧＦ、ラミニン又はＨＢ−ＥＧＦと混合され、及び、増加する濃度のデフィブロチド、デフィブロチド分子量画分又はＮｍｅｒと混合された。該混合物が次に、ゲル電気泳動により分離されそしてオートラジオグラフされた。デフィブロチド、デフィブロチド分子量画分及びＮｍｅｒは、Ｃ１ＲＮＨ３２ｐ−ＯｄＴ１８の結合の競合物であり及びすなわち放射性活性的に標識されたオリゴオリゴヌクレオチドによるタンパク質のアルキル化（alkylation）の競合物であった。これらのタンパク質のそれぞれについてのＣ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８についてのＫｄの値はあらかじめ決定された：ｂＦＧＦについての平均Ｋｄは０．５μＭであり（Guvakova,  et  al.,  "Phosphorothioate  oligodeoxynucleotides  bind  to  basic  fibroblast  growth  factor,  inhibit  its  binding  to  cell  surface  receptors,  and  remove  it  from  low  affinity  binding  sites  on  extracellular  matrix",  J.  Biol.  Chem.,  1995,  (270)  2620-2627）、そして、ラミニンについての平均Ｋｄは１４μＭである（Khaled,  et  al.  Multiple  mechanisms  may  contribute  to  the  cellular  antiadhesive  effects  of  phosphorothioate  oligodeoxynucleotides",  Nucl.  Acids  Res.,  1996,  (24)  737-745）。ＶＥＧＦ１６５についてのＫｄを決定する為に、Ｃ１ＲＮＨ３２Ｐ−ＯｄＴ１８によるＶＥＧＦの修飾濃度依存性が試験された（図３Ａ）。これらの結果は図３Ｂに示されており、オリゴデオキシヌクレオチドを修飾する濃度が、ゲルバンド強度の関数としてプロットされる。ＶＥＧＦの該修飾するオリゴデオキシヌクレオチドとの結合は、おおよそ飽和結合を示し、そして、ミカエリス−メンテンタイプのシングル部位の結合の等式（single-site  binding  equation）により記載されうる。図３Ｃは、図３Ｂにおけるデータの二重逆数再プロットを示す。これらのデータは線形であり（Ｒ２＝０．９８）、そして該線は、３３．９μＭの見かけＫｄ値に対応する横座標を交差する。同様の実験が、ＰＤＧＦ  ＢＢ及びＨＢ−ＥＧＦについて実施された。Ｋｄはそれぞれ、４．５及び８．７μＭである。
【００６２】
Ｋｃは、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆにより記載されたとおりの等式Ｉ
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から計算された。
図１Ａにおいて、ｂＦＧＦへの結合についての競合が示される。等式１のとおり、ゲルバンドの標準化された強度対競合物濃度のプロットは線形であった（図１Ｂ）。ＩＣ５０が調査により決定された。種々の競合物の関心のある全てのタンパク質への結合についての同様の競合も決定された。同一の様式で決定されたＫｃの値が、図２、４、５、６及び７の表中にまとめられている。
【００６３】
Ｎｍｅｒ、長さ依存性様式にある、及びデフィブロチドはヘパリン結合性成長因子の能力を阻害して、組織培養においてＳＶ４０形質転換されたＨＭＥＣ−１細胞の増殖を最大に刺激する
サイトカインにより刺激された細胞増殖が、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）を用いることにより決定された。これらの実験は、増殖がｂＦＧＦにより刺激された、ＳＶ４０形質転換されたＨＭＥＣ−１細胞において実施された。該細胞は、ｂＦＧＦ細胞表面受容体を上方制御する為に２．５％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地中でｂＦＧＦにより処理される前に24時間０％血清中にあり、そして次に、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有する培地中で、増加する濃度のデフィブロチド又はＮｍｅｒと一緒に又は無しで、3日間インキュベートされた。図８及び９に示されるとおり、Ｎｍｅｒ、長さ依存性様式（約４５ヌクレオチドの長さ及びそれより長いものが効果を有する）で、及びデフィブロチドの両方が、最大のｂＦＧＦ誘発された細胞増殖における小さな（及びＮｍｅｒの場合、長さ依存的）減少を引き起こす。ＨＭＥＣ−１細胞の増殖速度は、刺激されていない集団と比較して、ｂＦＧＦ対照と比較して、ｂＦＧＦ処置後に６０〜７０％だけ増加した。ｂＦＧＦの1時間前に添加されたときに、デフィブロチドの抑制効果は、同時に添加されたときに観察されたものと有意に異ならなかった（データは示されていない）。
【００６４】
デフィブロチド及びＮｍｅｒの毒性の評価
デフィブロチド及びＮｍｅｒの主な毒性、凝血障害及び出血、が、凝固カスケードのヘパリン結合性メンバーへの該オリゴヌクレオチドの結合及びそれらの機能の抑制からもたらされる。この抗凝固効果は、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）により評価された。健康なボランティアからの血漿が、種々の濃度のデフィブロチド又はＮｍｅｒと混合され、そして標準的ＰＴＴアッセイが実施された。図１０において示されるとおり、デフィブロチド及びＮｍｅｒはＰＴＴの有意な上昇を引き起こさない。高濃度のデフィブロチドでだけ、Ｎ５０又はＮ６０（〜１００μＭ）、観察されたＰＴＴの（対照と比較して１．５〜１．７倍）延長があった（図１０）。より長いＮｍｅｒ、Ｎ８０、について、この効果は、２５μＭ濃度でさえ見られた。
【００６５】
デフィブロチド、デフィブロチド分子量画分及びＮｍｅｒは、ＨＭＥＣ−１細胞からの組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の合成及び放出を増加する
ＨＭＥＣ−１細胞からのＴＦＰＩ（これは凝血障害を減少するタンパク質である）の急な及び長期間の放出にデフィブロチドがどれだけ影響するかを調べる為に、濃度及び時間経過の両方の研究が実施された。ＨＭＥＣ−１細胞からの馴化培地が、選択された時間間隔で集められ、そしてＴＦＰＩレベルが、製造者により記載されたとおりのＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定された。図１１Ａにおいて示されるとおり、１２．５μＭのデフィブロチドが、２０〜３０分後に放出された相当な量で、該培地へのＴＦＰＩの時間依存性増加を引き起こした（対照細胞と比較して５〜６倍の増加）。急性期（３０分）の間、増加する濃度のデフィブロチドによるＨＭＥＣ−１の刺激は、ＴＦＰＩ放出の濃度依存的増加を引き起こし、これは１２．５μＭのデフィブロチド濃度でプラトーに達した（図１１Ｃ）。該細胞と１２．５μＭデフィブロチド分子量画分又はＮｍｅｒとの２４時間インキュベーションは、刺激されていない細胞と比較して、該培地中におけるＴＦＰＩにおける７〜８倍の増加を引き起こした。
【００６６】
Ｃ１１細胞における分裂促進の決定
Ｃ１１クローンは、線維芽細胞成長因子受容体１（ＦＧＦＲ−１、これにｂＦＧＦが高い（ｐＭ）親和性で結合する）を過剰発現する為に操作されたＢＡＦ３マウスリンパ系細胞である。これらの細胞が、Ｄ．Ｏｒｎｉｔｚ（ワシントン大学、セントルイス）から得られた。これらの細胞は、増殖の為に、ｂＦＧＦについての絶対的な要件を有する；さらに、ヘパリンはｂＦＧＦの活性のためにも要求されると長く知られている。ＤＦ及びＮｍｅｒが、ｂＦＧＦを細胞外マトリックス上のその低親和性（ｎＭ）結合性部位から除去できることが以前に実証された（Guvakova,  et  al.,  "Phosphorothioate  oligodeoxynucleotides  bind  to  basic  fibroblast  growth  factor,  inhibit  its  binding  to  cell  surface  receptors,  and  remove  it  from  low  affinity  binding  sites  on  extracellular  matrix",  J.  Biol.  Chem.,  1995,  (270)  2620-2627）。本発明者らは今、ＤＦ及びＮｍｅｒが、ｂＦＧＦのその高親和性結合性部位への結合を干渉することができるかどうかを決定したかった。従って、Ｃ１１細胞がＩＬ−３を欠くＲＰＭＩ培地により２回洗浄された。２．２×１０４細胞が、４８ウェルプレート中に、ウェル毎にプレートされた。ｂＦＧＦ（最終濃度１ｎＭ）及びＤＦ又はＮｍｅｒ（最終濃度１０μＭ）又はヘパリン（１μｇ／ｍＬ）が、合計体積２００μＬで添加された。該細胞（それぞれの実験についてｎ＝３）が次に、２〜３日間インキュベートされ、そしてスルホローダミンブルー（ＳＲＢ）により染色された。細胞数は、対照（ｂＦＧＦ、ヘパリン又はオリゴヌクレオチドのいずれか不在下における増殖）に対して標準化された。図１３において見られるとおり、ｂＦＧＦ又はヘパリンそれら自体は、３日後の細胞増殖に対して影響を有さず又はほとんど有さなかった。ｂＦＧＦの活性は、ヘパリン及びＤＦの両方により高められ、これはＤＦがヘパリンの代わりをすることができることを実証する。しかしながら、ＤＦは、ｂＦＧＦのその高親和性結合部位への結合に影響しない。長さ依存性様式にあるＮｍｅｒもまた、ＤＦ又はヘパリンの代わりをすることができるが、それらの活性は、約８０ｍｅｒの長さに至るまでは、ＤＦと同じほど大きくない。
【００６７】
結論
【００６８】
本発明の合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチド（Ｎｍｅｒ）はデフィブロチドの特性を実質上再現する（recapitulate）ことができる。
【００６９】
Ｎｍｅｒ及びデフィブロチドが、ヘパリン結合性タンパク質（ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ  ＢＢ、ＶＥＧＦ１６５、ラミニン、及びＨＢ−ＥＧＦを含む）へ結合する能力、及びＨＭＥＣ−１細胞からのＴＦＰＩ放出を引き起こすそれらの能力に関して評価されそして比較された。Ｎｍｅｒは、静脈内点滴を介して、標準的生理食塩水中において又は水中の５％デキストロースにおいて、ガン又はＶＯＤ（又はデフィブロチドを投与することにより処置されるだろう他の疾患）を患う患者へと、一日当たり体重の１０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇの用量で、単回投与又は分割投与で、約１４日間投与されうる。該用量は、特定の治療経過への個々の患者の応答に依存して調節されうる。
【００７０】
ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦ並びに種々の長さのＮｍｅｒについてのＫｃの値（図２、４、５、６、７）は、少なくとも約４０ｍｅｒのＮｍｅｒ長が、最大のＮｍｅｒ活性にとって十分であることを実証する。そのようなＫｃ値はまた、より長いＮｍｅｒが、全体のヘパリン結合性タンパク質親和性にほとんど追加しないことも実証する；結果として、それらのより高い体重／用量比及びそれらを合成することの困難性の両方に基づき、約６５ｍｅｒ超の長さを有するＮｍｅｒが、デフィブロチドの代わりとして有用でないとみえる。
【００７１】
すなわち、約４０ｍｅｒ〜約６５ｍｅｒの長さを有する合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、デフィブロチドの代替物として用いられることができそして特に、それらは「発明の背景」と表題を付けられた章において上記で記載された治療的用途の全て（これは引用することにより全てそっくりそのまま本明細書内に組み込まれる）において用いられることができる。
【００７２】
本発明の利点の一つは、関連する医薬組成物の投与量は、生物学的活性の関係におけるよりもむしろ、合成ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの濃度の関係で決定されうる。なぜなら、それは現在のところ抽出起源のオリゴヌクレオチド混合物について偶然に生じるからである。
【００７３】
さらなる利点は、本発明が、活性配列だけの投与を提供するという事実により表される；すなわち、もしたとえば抽出起源のオリゴヌクレオチド混合物と比較したならば、有効性、安全性及び副作用の点における明白な利点とともに、投与量当たりのより少ないオリゴヌクレオチドの投与を提供する。
【００７４】
本発明を説明してきたが、今、多くの変更及び修正が、本発明の精神及び範囲から離れることなく、上記記載された実施態様になされうることが明らかであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ）】
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【図８Ｂ）】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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