(57)【要約】  体液からの、特に歯肉溝滲出液または涙液からの物質、特にタンパク質、例えば酵素を吸収するための平面状装置であって、受容要素（１０）、支持要素（２０）を含み、・受容要素（１０）が親水性であり、０．２２μｍ〜５μｍ、特に０．５μｍ〜３μｍの細孔径を有し、プラスチック材またはプラスチック材の混合物よりなり、特に、不活性プラスチック材または不活性プラスチック材の混合物よりなり、・支持要素（２０）が疎水性であり、受容要素（１０）の表面の１つを少なくとも部分的に覆い、・該装置が更に、受容要素（１０）の対表面に位置する識別要素（４０）を含むことを特徴とする、平面状装置。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液からの、特に歯肉溝滲出液または涙液からの物質、特にタンパク質、例えば酵素を吸収するための平面状装置であって、受容要素（１０）、支持要素（２０）を含み、
・受容要素（１０）が親水性であり、０．２２μｍ〜５μｍ、特に０．５μｍ〜３μｍの細孔径を有し、プラスチック材またはプラスチック材の混合物よりなり、特に、不活性プラスチック材または不活性プラスチック材の混合物よりなり、
・支持要素（２０）が疎水性であり、受容要素（１０）の表面の１つを少なくとも部分的に覆い、
該装置が更に、受容要素（１０）の対表面に位置する識別要素（４０）を含むことを特徴とする、平面状装置。
【請求項２】
受容要素（１０）が、０．６μｍ〜２．５μｍ、特に０．７５μｍ〜１．７５μｍの細孔径を有する、請求項１記載の装置。
【請求項３】
受容要素（１０）が膜である、請求項１および／または２記載の装置。
【請求項４】
該材がフルオロ炭化水素重合体、特にポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）である、請求項１〜３のいずれか１項記載の装置。
【請求項５】
識別要素（４０）が該装置の円形化末端（３０）の反対側に位置する、請求項１〜４のいずれか１項記載の装置。
【請求項６】
該プラスチック材またはプラスチック材の混合物が１〜６ＧＰａ、特に２〜５、または１〜４ＧＰａの弾性率（ヤング率）を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の装置。
【請求項７】
支持要素（２０）も、１〜４ＧＰａ、特に２〜３、または１〜２ＧＰａの弾性率（ヤング率）を有するプラスチック材またはプラスチック材の混合物を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の装置。
【請求項８】
該装置が、受容要素（１０）において、そして好ましくは支持要素（２０）においても、円形化末端（３０）を有する、請求項１〜７のいずれか１項記載の装置。
【請求項９】
該装置が、体液内の該装置の所望の浸漬深さを示す目印要素（６０）を有する、請求項１〜８のいずれか１項記載の装置。
【請求項１０】
体液からの、特に歯肉溝滲出液または涙液からの溶出後の物質、特にタンパク質、例えば酵素、特にコラゲナーゼ、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ−８（ＭＭＰ−８）、ＭＭＰ−１３、ＴＮＦα、インターロイキン１β（ＩＬ−１Ｂ）、オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）の吸収および／または貯蔵のための、請求項１〜９のいずれか１項記載の装置の使用であって、貯蔵期間が１〜３１日間、特に７〜３１日間または７〜２１日間である、使用。
【請求項１１】
該酵素が１〜３１日間、特に７〜３１日間または７〜２１日間の貯蔵期間にわたり、４℃〜４２℃、特に４℃〜３７℃または８℃〜２０℃の温度で安定である、請求項１０記載の装置の使用。
【請求項１２】
酵素の活性が貯蔵後にほぼ維持される、タンパク質、特に酵素の貯蔵のための、請求項１０または１１記載の装置の使用。
【請求項１３】
酵素、特に酵素のエピトープの免疫反応が貯蔵後にほぼ維持される、タンパク質、特に酵素を安定化させるための、請求項１０または１１記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液からのタンパク質を吸収するための装置、およびその装置の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）、唾液、涙液または創傷の滲出物は、歯科医院において又はベッドの傍で又は警察による取り締まり中に、非侵襲的に、したがって外科的介入を伴わずに回収されうる媒体である。診断において、それらは重要な役割を果たしうる。なぜなら、それらは、とりわけ、ヒトタンパク質、および微生物由来のタンパク質、医薬およびそれらの代謝産物、中毒性物質（違法薬物）およびそれらの代謝産物、またはフリーラジカルを含有しうるからである。
【０００３】
一般に、非侵襲的に得られた流体中の物質の濃度は、哺乳動物の血清中に存在するそのような物質のレベルの類似像となりうる。さらに、局所的に存在する物質、例えば炎症マーカーは、サンプル採取部位における局所的病理学的変化、例えば歯周組織の炎症を示しうる。しかし、これらは、より低い濃度、部分的には実質的に、より低い濃度で存在することが公知であり（Ｕｉｔｔｏ，Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ  ２０００，Ｖｏｌ．３１，２００３）、したがって、分析のためには高感度法が必要とされている（例えばイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ法）。
【０００４】
例えば、診断用または分析用測定（アッセイ）においては、そのような物質の濃度は、以下のものに関して結論づけることを可能にする：
・歯周組織（例えば、歯周炎、インプラント周囲炎、歯根う蝕）の現在および将来の疾患；
・現在および将来の全身疾患（例えば、ウイルス性疾患）；
・現在の及び予想される全身疾患（例えば、糖尿病、アレルギー）；
・現在の急性疾患（感染）；
・免疫状態（ワクチン接種）；
・将来の疾患のリスク（フリーラジカル、免疫状態）。
【０００５】
したがって、例えば、歯肉溝滲出液は、歯科分析法、特に、歯肉炎および歯周炎疾患のモニターにより検査される。歯肉炎および歯周炎は歯バイオフィルムからの持続的な攻撃により引き起こされる。しかし、歯周炎が実際に生じるかどうかは宿主生物の防御反応により決定される。宿主内因性コラゲナーゼは歯周炎および歯槽骨破壊の開始および進行をもたらす。
【０００６】
歯周病原性破壊過程のための最も重要なコラゲナーゼはマトリックスメタロプロテイナーゼ−８（ＭＭＰ−８）またはコラゲナーゼ２である。
【０００７】
マトリックスメタロプロテイナーゼは以下の３つの異なる形態で存在する：
１．不活性前駆体またはプロ形態（多形核顆粒球における貯蔵形態）、
２．活性化または活性形態、
３．抑制形態または複合形態。
【０００８】
組織内で遊離した活性形態（ａＭＭＰ−８）は最終的に組織破壊をもたらす。高いａＭＭＰ−８レベルは活性炎症を示し、したがって、治療を要する急性状態を示す。
【０００９】
ａＭＭＰ−８は、歯周組織がいつ破壊されたのかを認識するための客観的診断マーカーである。
【００１０】
先行技術においては、タンパク質は受容要素としての単純な水吸収膜により体液から集められる。一般に、吸取紙片（吸取紙ストリップ）が使用される。吸取紙片によりサンプルを採取する場合には、多数の問題が生じうる。
【００１１】
例えば、ＧＣＦを採集する場合には、該サンプルは唾液または周皮との接触により汚染または希釈されうる。さらに、望ましくない成分、例えば上皮細胞、粘膜細胞、細菌、ＰＭＮ細胞（多形核好中球）、細胞成分または固体が採取され又は付着し、後の分析測定を妨げうる。
【００１２】
膜の形状およびサイズは、しばしば、標準化されたものではなく、したがって、サンプル採取の量における変動を招きうる。適用中に、取り扱い上の問題（例えば、液体中への深すぎる浸漬、不十分および不完全な充填、適用位置の誤り）は適用誤差を招きうる。さらに、含有されるサンプルおよび目的アナライトの溶出は、しばしば、不完全であり、長時間を要し、標準化不可能である。
【００１３】
ＵＳ  ２００４／０５７８７６は、好ましくは唾液を吸収する装置を開示しているが、不純物を伴わないＧＣＦは吸収され得ない。さらに、この装置は平面状ではなく、識別要素を含まない。
【００１４】
ＥＰ−Ａ−０  ４２０  ０２１は、歯ポケットには適用できず従ってＧＣＦを吸収しない親水性積層多孔性膜を開示している。これらの膜は識別要素を含まないため、使用の方向が定められない。また、該膜は、円形化（角を取って丸くされた）末端を含んでおらず、このため、歯ポケット内に損傷が生じうる。
【００１５】
ＷＯ  ９３／０４１９３は親水性ＰＶＤＦ膜およびプラスチック支持体を開示しているが、不純物を伴わずにＧＣＦを吸収しうる、少なくとも識別要素または円形化末端を含む装置は開示していない。
【００１６】
ＵＳ−Ａ−５  ６５６  ４４８は、膜およびプラスチックシートを含むイムノアッセイ浸漬棒を開示しており、ここで、該棒は、円形化末端も識別要素も含まない。さらに、この浸漬棒は、不純物を伴わないＧＣＦを吸収することができない。
【００１７】
先行技術の吸取紙片の膜におけるサンプルの輸送は、限られた度合で可能であるに過ぎず、サンプルは、例えば、ＧＣＦを検査するための世界的な研究においては、サンプル採取場所で更に加工され凍結される必要がある（Ｕｉｔｔｏ，Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ  ２０００，Ｖｏｌ．３１，２００３）。
【００１８】
また、この結果として、そのようなサンプルの分析は数個の大学に限定され、例えば診断媒体としてのＧＣＦの遍在的利用は行われていないか、または可能となっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０５７８７６号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０  ４２０  ０２１号明細書
【特許文献３】国際公開第９３／０４１９３号
【特許文献４】米国特許第５  ６５６  ４４８号明細書
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｕｉｔｔｏ，Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ  ２０００，Ｖｏｌ．３１，２００３
【発明の概要】
【００２１】
したがって、本発明の目的は、物質、特にタンパク質の貯蔵を可能にし更には先行技術の受容要素の前記欠点を克服する、物質、特にタンパク質の改善された吸収のための装置を提供することである。
【００２２】
本明細書中で用いる「吸収」は、受容要素による物質の取り込みを意味する。これは、受容要素の表面における析出（吸着）ではなく、受容要素の体積内への取り込みである。
【００２３】
さらに、「弾性率」（ヤング率）は、材料の剛性を示す材料特性である。弾性率のＳＩ単位はパスカル（Ｎ／ｍ２）である。後記に示す弾性率値は室温（２０℃）のものである。
【００２４】
本明細書中で用いる「識別要素」なる語は、該装置の導入または使用の方向を定めると意図される要素を特徴づけるものである。さらに、本発明の装置は、特に、例えば図１および２の装置のように、それが２つの主要対抗表面を含む及び／又はそれが二次元特性を有する場合、平面状である。
【００２５】
さらに、「親水性」は、材料が水または水溶液を取り込む（吸収する）能力を意味する。「疎水性」はその反意語であり、可能な場合には、水または水溶液を吸収しない、材料の傾向を示す。
【００２６】
さらに、化学的に「不活性」は、他の材料との化学反応を受けない又は実質的に受けない物質に関するものである。
【００２７】
「プラスチック材」は、合成的に製造された有機重合体よりなる材料を意味する。「プラスチック材の混合物」は少なくとも２つのプラスチック材よりなる。
【００２８】
「貯蔵」は、酵素、特にａＭＭＰ−８が、３ヶ月以上または少なくとも１日以上、特に１〜３１日間貯蔵されることを意味する。該貯蔵期間中、該酵素は「安定」である。このことは、該酵素の活性が貯蔵期間にわたって有意に減少しないことを意味する。
【００２９】
本発明は、例えば、体液からの、特に歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）または涙液からの物質、特にタンパク質、例えば酵素を吸収するための平面状装置５であって、受容要素１０および支持要素２０を含み、
・受容要素１０が親水性であり、０．２２μｍ〜５μｍ、特に０．５μｍ〜３μｍの細孔径を有し、プラスチック材またはプラスチック材の混合物よりなり、特に、不活性プラスチック材または不活性プラスチック材の混合物よりなり、
・支持要素２０が疎水性であり、受容要素１０の表面の１つを少なくとも部分的または完全に覆い、
・該装置が更に、受容要素１０の対表面に位置する識別要素４０を含む、平面状装置５に関する。
【００３０】
識別要素４０は該装置の使用の方向を示すと意図される。なぜなら、それが、例えば歯ポケット内に鉗子で配置されうることは該装置の利点の１つだからである。該装置は、誤った適用が回避されうるよう識別要素４０が前面を向くように、該ポケット内に配置されるべきである。したがって、ＧＣＦが吸収された場合、唾液または周皮との接触によるサンプルの汚染が回避される。
【００３１】
さらに、該細孔径は全細胞および大きな細胞成分ならびに微生物の吸収を妨げる。
【００３２】
本発明の装置５の１つの実施形態においては、受容要素１０は、０．６μｍ〜２．５μｍ、特に０．７５μｍ〜１．７５μｍ、または０．９μｍ〜１．３５μｍの細孔径を有する。
【００３３】
装置５のもう１つの実施形態においては、識別要素４０は該装置の円形化末端３０の反対側に位置する。したがって、該装置を歯ポケット内に配置した後、該識別要素は明らかに視認可能である。使用の方向を示すために、該識別要素は、特異的な色、蛍光または標識表面などにより特徴づけられうる。しかし、毒性もしくは有害物質または他の種類の不純物を生成しないあらゆる可能な表示方法が識別要素として用いられうる。
【００３４】
もう１つの実施形態においては、受容要素１０は膜である。もう１つの実施形態においては、そのような膜１０はプラスチック材またはプラスチック材の混合物、特に、不活性プラスチック材または不活性プラスチック材の混合物よりなる。
【００３５】
本発明の装置５の更にもう１つの実施形態においては、プラスチック材はフルオロ炭化水素重合体、特にポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）である。
【００３６】
もう１つの実施形態においては、受容要素１０と支持要素２０とを含む装置５は従って、好ましくは１〜６ＧＰａ、特に２〜５、１〜４、１〜２、１〜３、または２〜３ＧＰａの弾性率（ヤング率）を有するプラスチック材またはプラスチック材の混合物を含む。
【００３７】
本発明のもう１つの実施形態においては、支持要素２０はまた、１〜４ＧＰａ、特に２〜３、１〜２、または１〜３ＧＰａの弾性率（ヤング率）を有するプラスチック材またはプラスチック材の混合物を含む。これは、装置５が、体液を取り込んだ際に変形せず従って例えば患者の歯肉溝または眼において困難を伴うことなく体液から取り去られうるという利点を有する。また、これは、歯肉溝からの体液のみが取り込まれ、口腔の他の流体、例えば唾液または周皮が吸収されないという利点を有する。
【００３８】
図５に示すもう１つの実施形態においては、本発明の装置は、受容要素１０において、そして好ましくは支持要素２０においても、円形化末端３０を有する。この円形化は、装置５により患者が傷つけられるのを防ぐ。
【００３９】
本発明の装置５の１つの実施形態においては、受容要素１０は１．２μｍの細孔径を有する。それは、１３５℃／３０８２ｈＰａまでで４５分間にわたり高圧滅菌することにより滅菌されうる。
【００４０】
装置５のもう１つの実施形態においては、それは、体液内の該装置の所望の浸漬深さを示す目印要素６０を有する。これは装置５の取り扱いを簡単にする。
【００４１】
本発明の装置のもう１つの実施形態においては、支持要素２０の反対側に面する受容要素１０の表面を示す着色要素４０が円形化末端３０の反対側に設けられている。これは装置５の正しい取り扱いを助ける。なぜなら、このようにして該装置の受容側ならびに前面および背面の両方が決定されるからである（図１〜５を参照されたい）。
【００４２】
本発明のもう１つの態様は、体液からの、特に歯肉溝滲出液または涙液からの物質、特にタンパク質、例えば酵素、特にコラゲナーゼ、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ−８（ＭＭＰ−８）、ＭＭＰ−１３、ＴＮＦα、インターロイキン１β（ＩＬ−１Ｂ）、オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）の吸収および／または貯蔵のための、装置５の使用である。マトリックスメタロプロテイナーゼのような酵素はそれらの不活性前駆体形態（チモーゲンなど）、活性化形態または抑制形態として吸収される。さらに、抗体、細菌タンパク質またはフリーラジカルも吸収される。これらの吸収物質は分析的にアッセイされ、あるいは科学的または技術的に別の方法で、場合によっては貯蔵後に使用されうる。また、分析は装置５の上または中で直接的に行われうる。
【００４３】
装置５のそのような使用の１つの実施形態においては、該酵素は１〜３１日間、特に７〜３１日間、または７〜２１日間の貯蔵期間にわたり、４℃〜４２℃、特に４℃〜３７℃、または８℃〜２０℃の温度で安定である。これは、吸収物質を含む本発明の装置の、室温でさえも簡便な貯蔵、そして更には簡便な出荷を可能にする。
【００４４】
そのような貯蔵の後、該酵素の活性はほとんどそのまま又は実際に維持される。これは、該酵素の活性が貯蔵中に減少せず、装置５により維持されることを証明している。
【００４５】
本発明のもう１つの実施形態は、タンパク質、特に酵素を安定化させるための、装置５の使用であって、該酵素、特に該酵素のエピトープの免疫反応が該貯蔵後にほぼ維持されることを特徴とする使用である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は本発明の装置５の一例の断面図を示す。受容要素１０は支持要素２０に結合している。一方の末端において、装置５は、体液を取り込む円形化末端３０を有する。反対の末端においては、支持要素２０の反対側の受容要素１０の表面を示す識別要素４０が設けられている。さらに、受容要素１０の十分な充填を示す指標要素５０が示されている。目印要素６０は体液中の装置５の所望の浸漬深さを示す。また、装置５は結合材８０を介して基部要素７０に結合している。
【図２】図２は本発明の装置５の一例の平面図を示す。本発明の受容要素１０は円形化末端３０および識別要素４０を含む。さらに、目印要素６０が示されている。
【図３】図３は、幾つかの装置５がどのようにして基部要素７０上に配置されるかを示す平面図である。
【図４】図４は、結合材８０を介して基部要素７０に結合している本発明の装置５の１つの実施形態の寸法を伴うもう１つの断面図である。
【図５】図５は、受容要素１０、円形化末端３０および着色要素４０を有する本発明の装置５の設計の平面図を開示する。
【図６ａ】図６ａは、室温（ＲＴ）および３７℃でインキュベートされた該吸収装置、ならびに室温（ＲＴ−Ｋ）および３７℃（３７℃−Ｋ）でインキュベートされた陽性対照におけるａＭＭＰ−８の濃度を開示する。
【図６ｂ】図６ｂは、室温（ＲＴ）および３７℃でインキュベートされた該吸収装置、ならびに室温（ＲＴ−Ｋ）および３７℃（３７℃−Ｋ）でインキュベートされた陽性対照におけるａＭＭＰ−８の濃度を開示する。
【図７】図７は、４℃〜４２℃の温度変動を伴う５日間にわたる該吸収片における一定量のａＭＭＰ−８を示す。
【図８ａ】図８ａ：ＲＴおよび４℃でインキュベートされた、第０日および第１４日に該吸収片から回収されたａＭＭＰ−８の濃度を示す。
【図８ｂ】図８ｂ：ＲＴおよび４℃でインキュベートされた、第０日および第１４日に該吸収片から回収されたａＭＭＰ−８の濃度を示す。
【図９ａ】図９ａ：ＲＴおよび４℃でインキュベートされた、第０日および第１４日に該吸収片においてデンシトメトリーを用いて定量されたａＭＭＰ−８の濃度を示す。
【図９ｂ】図９ｂ：ＲＴおよび４℃でインキュベートされた、第０日および第１４日に該吸収片においてデンシトメトリーを用いて定量されたａＭＭＰ−８の濃度を示す。
【図１０ａ】図１０ａ：ＲＴおよび４℃でインキュベートされた、第０日および第１４日に該吸収片においてデンシトメトリーを用いて定量されたＭＭＰ−９の活性化形態の濃度を開示する。
【図１０ｂ】図１０ｂ：ＲＴおよび４℃でインキュベートされた、第０日および第１４日に該吸収片においてデンシトメトリーを用いて定量されたＭＭＰ−９の活性化形態の濃度を開示する。
【図１１ａ】図１１ａ：ＲＴおよび４℃でインキュベートされた、第０日および第１４日に該吸収片においてＥＬＩＳＡを用いて定量されたミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の活性化形態の濃度を開示する。
【図１１ｂ】図１１ｂ：ＲＴおよび４℃でインキュベートされた、第０日および第１４日に該吸収片においてＥＬＩＳＡを用いて定量されたミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の活性化形態の濃度を開示する。
【００４７】
実施例
【実施例１】
【００４８】
親水性受容要素の仕様
該膜は一体型均質フィルムとして注型されている。該膜は、１３５℃、３０ｐｓｉｇまでで４５分間高圧滅菌することにより滅菌されうる。該膜の完全性はバブルポイント試験により測定されうる。
【００４９】
【表１】
2011517488.tif 000003
【実施例２】
【００５０】
装置の仕様
基部要素７０：ＩＣＩにより製造されたメリネックス（Ｍｅｌｉｎｅｘ）５３９ポリエステルフィルム（１７５μｍ）。
結合材８０：医学等級接着剤。
支持要素２０：
製造番号：            ＡＲＣＡＲＥ７８１５
接着剤：              ＡＳ１１０、アクリル医学等級接着剤
基体：                ５１μｍポリエチレンフィルム（ＰＥＴ）
コーティング：        シリコンＰＥＴコーティング
識別要素４０：        着色フィルム。
【実施例３】
【００５１】
サンプル収集および溶出の方法
鉗子でＧＣＦ収集ストリップを歯ポケット内に３０秒間配置することによる標準的な方法に従い、ＧＣＦサンプルを集めた。識別要素４０が前面を向き、該ストリップの２〜３ｍｍのみが該ポケット内に留まるように、該ＧＣＦストリップは該ポケット内に配置されるべきである。３０秒後、ＧＣＦを含有するストリップを１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内に配置する。
【００５２】
溶出：溶出バッファー（１５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４＊１２  Ｈ２Ｏ，７ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ，５５０ｎＭ  ＮａＣｌ，０，０５％  ５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン（ＢＮＤ），０，２％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０，３％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ  ２０）またはＴｅｔｒｏｎｉｃ  １３０７（ＢＡＳＦ  ＳＥ，エチレンオキシド／プロピレンオキシドのブロック共重合体）を含有する）を、該ストリップを含有するエッペンドルフチューブ内に、ピペットを使用して注ぎ、室温で５分間インキュベートした。該チューブを手動で少なくとも５回反転させた後、該ストリップを鉗子でゆっくりと取り出した。該サンプル（溶出後）は直ちに分析されるか、または−２０℃で貯蔵されるべきである。
【００５３】
該サンプルをＭＭＰ−８感受性ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）において定量的に分析した。溶出液をＰｒｅｓｃｈｅｒら及びＭｕｎｊａｌら（Ｐｒｅｓｃｈｅｒら，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，２００７，１０９８，４９３−９５；Ｍｕｎｊａｌら，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，２００７，１０９８，４９０−９２）の方法に従い更に分析した。
【実施例４】
【００５４】
ａＭＭＰ−８の定量的検出のためのＥＬＩＳＡ
方法：ＥＬＩＳＡを製造業者の指示（ｄｅｎｔｏＥＬＩＳＡ，ｄｅｎｔｏｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い行った。該ＥＬＩＳＡは、ａＭＭＰ−８に対する２つの特異的モノクローナル（ｍａｂ）抗体（Ｋ８７０８およびＫ８７０６）（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，Ｆｉｎｌａｎｄ）（Ｈａｎｅｍａａｉｊｅｒら  １９９７）を使用するサンドイッチイムノアッセイ系に基づくものであった。簡潔に説明すると、自動ＥＬＩＳＡコーティングプラットフォーム（Ｓｅｒａｍｕｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、９６ウェル平底プレート（Ｎｕｎｃ）を１μｇ／ｍｌの濃度のｍａｂ  Ｋ８７０８でコートした。希釈バッファー中で１：５０で希釈することにより、臨床サンプルを調製した。全ての標準物および対照は、該ＥＬＩＳＡの説明マニュアルに従い調製した。１００μｌの標準物、対照および希釈臨床サンプルを２通りの適当なウェル内に分注した。該プレートをフォイルで覆い、３７℃で１時間インキュベートした。自動洗浄器を使用して、該プレートを洗浄バッファーで５回洗浄した。ポリ−ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した検出抗体（Ｋ８７０６）を０．２５μｇ／ｍｌの濃度で全ウェルに加えた。該プレートをフォイルで覆い、３７℃で１時間インキュベートした。自動洗浄器を使用して、該プレートを洗浄バッファーで５回洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｓｅｒａｍｕｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を全ウェルに加え、該プレートを室温で１５分間インキュベートした。反応を４％  Ｈ２ＳＯ４により停止させ、吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｅｃａｎ）において４５０／６２０ｎｍで読み取った。各プレートにおいて、ａＭＭＰ−８抗原（Ｉｎｖｅｎｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での検量線を常に含めた。
【００５５】
結果（各サンプルのａＭＭＰ−８値）を以下のとおりに算出した。
【００５６】
１．各標準対照および試験臨床サンプルの平均吸光度を算出した。
【００５７】
２．標準物の平均吸光度をＹ軸として、その対応対数濃度（Ｘ軸）に対して、回帰曲線をプロットした。
【００５８】
３．この標準曲線からの単純な内挿および希釈度（１：５０）の掛け算により、対応するａＭＭＰ−８濃度を決定するために、各臨床サンプルの平均吸光度を用いた。
【００５９】
４．最高の標準物より大きな平均吸光度を有するサンプルを、より高い希釈度で再び試験した。
【実施例５】
【００６０】
ＧＣＦストリップにおけるａＭＭＰ−８抗原のストレスインキュベーション安定性
方法：ａＭＭＰ−８抗原を陰性臨床サンプル中で希釈することにより、２つの「スパイク（ｓｐｉｋｅ）サンプル」を調製した。該スパイク化サンプルを高濃度（４０μｇ／ｍｌ）および中濃度（１０μｇ／ｍｌ）として分類した。１μｌの各スパイク化サンプルをストリップ（ｎ＝３６）上でピペッティングし、該ストリップを１．５ｍｌ  エッペンドルフチューブ内に配置した。該エッペンドルフチューブを３７℃（ｎ＝１８）およびＲＴ（ｎ＝１８）でインキュベートした。ａＭＭＰ−１８抗原を吸収した後のストリップは吸収ストリップとして知られる。また、溶出パッファー（ｐｕｆｆｅｒ）を含有するエッペンドルフチューブ内で１μｌの各スパイク化サンプルを直接的にピペッティングし、それらを陽性対照として３７℃（ｎ＝１８）およびＲＴ（ｎ＝１８）でインキュベートした。溶出パッファー（ｐｕｆｆｅｒ）を含有するエッペンドルフチューブ内で１μｌの陰性臨床サンプル（スパイク化無し）を直接的にピペッティングし、それらを陰性対照として３７℃（ｎ＝１８）およびＲＴ（ｎ＝１８）でインキュベートした。
【００６１】
溶出時間：
それぞれの２つのストリップに関して、第０、１、４、７、１５、２１および３１日に、溶出を行った。対照チューブも同様にして分離した。溶出サンプルおよび対照チューブを−２０℃で貯蔵し、後の時点で一緒に試験した。溶出サンプルは、前記のとおりのＥＬＩＳＡにおいて試験した。
【００６２】
結果：該吸収ストリップにおけるａＭＭＰ−８濃度（高濃度または中濃度）は３７℃で３１日間のインキュベーションの後でさえも安定であった（図６ａおよび６ｂ）。図６ａおよび６ｂは、室温（ＲＴ）および３７℃でインキュベートされた吸収ストリップならびに室温（ＲＴ−Ｋ）および３７℃（３７℃−Ｋ）でインキュベートされた陽性対照におけるａＭＭＰ−８の濃度を示す。該陽性対照サンプルにおける濃度の若干の減少が認められたが、該吸収ストリップにおける濃度は安定なままであった。陰性対照サンプルにおいてはａＭＭＰ−８は検出されなかった。これは、ａＭＭＰ−８が該吸収ストリップにおいて高度に安定であり、保存または貯蔵または輸送のための媒体として使用されうることを示している。
【実施例６】
【００６３】
ＧＣＦストリップにおけるａＭＭＰ−８抗原の輸送安定性
方法：ａＭＭＰ−８抗原を陰性臨床サンプル中で希釈することにより、１つの「スパイクサンプル」を調製した。該スパイク化サンプルを中濃度（１０μｇ／ｍｌ）として分類した。ａＭＭＰ−８抗原をストリップに吸収させるための２つの方法を用いた。
【００６４】
吸収方法Ｉ：１μｌのスパイク化サンプルをストリップ（ｎ＝１８）上でピペッティングし、ついで１．５ｍｌ  エッペンドルフチューブ内に配置した。
【００６５】
吸収方法ＩＩ：「歯ポケットモデル」と称される、歯ポケットと同様の人工モデルを作製した。１μｌのスパイク化サンプルを「歯ポケットモデル」のポケット内でピペッティングし、実際の状態で用いられるのと同様にして個々のストリップを「歯ポケットモデル」のポケット内に配置した。該ストリップ（ｎ＝１８）に該スパイク化サンプルを３０秒間吸収させ、ついで該ストリップを１．５ｍｌ  エッペンドルフチューブ内に配置した。
【００６６】
また、１μｌのスパイク化サンプルを、陽性対照としての溶出パッファー（ｐｕｆｆｅｒ）を含有するエッペンドルフチューブ（ｎ＝１８）内で直接的にピペッティングした。１μｌの陰性臨床サンプル（スパイク化無し）を、陰性対照としての溶出パッファーを含有するエッペンドルフチューブ（ｎ＝１８）内で直接的にピペッティングした。
【００６７】
該吸収ストリップおよび対照の全てを、輸送中に生じると予想される温度変動にふさわしい以下の条件に付した。
【００６８】
・両方の方法の２つのストリップを参照体として直ちに溶出した（第０日）。２つの対照も第０日参照体として分離した。
【００６９】
・残りの全てのチューブおよび対照を室温（ＲＴ）で１時間、４℃で４時間、４２℃で１６時間インキュベートした。
【００７０】
・８つのストリップからの溶出を中間参照体（第１日）として行った。８つの対照チューブも第１日参照体として分離した。
【００７１】
・残りの全てのチューブおよび対照をＲＴで２時間、４℃で２日間およびＲＴで２時間インキュベートした。
【００７２】
・残りの全てのストリップに関して、溶出を行った。これは輸送終了の最終参照体（第５日）とみなされた。残りの全ての対照チューブも分離した。
【００７３】
該溶出サンプルおよび対照チューブを−２０℃で貯蔵し、一緒に試験した。該溶出サンプルを、前記のとおりのＥＬＩＳＡにおいて試験した。
【００７４】
結果：該サンプルの輸送中に生じうる温度変動において、該吸収ストリップにおけるａＭＭＰ−８の濃度は安定なままであった（図７）。図７は、４℃から４２℃までの温度変動を伴う５日間にわたる該吸収ストリップにおける一定量のａＭＭＰ−８を示している。それらの２つの吸収方法における相違は観察されなかった。陽性対照（ＰＫ）において、同じ期間において同様の結果が見出されたが、本発明者らは、これまでの実験から、室温および３７℃で３１日間維持された陽性対照においてａＭＭＰ−８の濃度の若干の減少が見られたことを観察している。該陰性対照サンプルにおいてはａＭＭＰ−８は検出されなかった。
【実施例７】
【００７５】
患者から採集された吸収ＧＣＦストリップ（臨床サンプル）におけるａＭＭＰ−８の安定性
方法：
１．ＧＣＦ採集：健常、歯肉炎および歯周炎罹患歯から標準的な方法（採集ストリップ）（Ｍｕｎｊａｌら，２００７；Ｍａｎｔｙｌａら，２００３）でＧＣＦを集めた。各歯（同一部位）から、それぞれ３０分間隔で４回、４つのサンプルを集めた。被験者は、サンプル採取前の１時間およびサンプル採集中は飲食しないよう通知された。
【００７６】
２．溶出：該ストリップを直ちに溶出するか、あるいはエッペンドルフチューブ内に４℃または室温（ＲＴ）で維持し、第０、４、７および１４日に溶出した。ある後の時点で溶出した各ストリップは第０日における参照体（即時溶出）を有していた。該サンプル（溶出後）を異なるアリコートに分け、−２０℃で貯蔵した。
【００７７】
３．ａＭＭＰ−８回収アッセイ：ＧＣＦサンプルにおけるａＭＭＰ−８の濃度を、前記のとおりのＥＬＩＳＡで決定した。
【００７８】
４．アイソフォームプロファイルおよびコラゲナーゼ活性：ＭＭＰ−８および−１３の分子量形態を、修飾ＥＣＬウエスタンブロッティングキットにより、その製造業者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）により推奨されているプロトコールに従い検出した。簡潔に説明すると、１４μｌのＧＣＦサンプルを、いずれの還元試薬をも含有しない５μｌの修飾Ｌａｅｍｍｉサンプルバッファーと混合し、５分間加熱し、ついで１１％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルでのタンパク質分離を行った。電気泳動後、該タンパク質をニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔｒａｎ，Ｗｈａｔｍａｎ  ＧｍｂＨ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上にエレクトロトランスファーした。非特異的結合をＴＢＳＴバッファー（２２ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）中の５％  乳粉末（Ｖａｌｉｏ  Ｌｔｄ．，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で１時間ブロッキングした。ついで該膜を、ＴＢＳＴ中で３回、１５分間洗浄し、それをＴＢＳＴ中で一晩放置し、ついで翌朝、膜を一次ポリクローナル抗ＭＭＰ−８（１：５００）（Ｈａｎｅｍａａｉｊｅｒら  １９９７，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：３１５０４−９；Ｓｏｒｓａら  １９９４，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７３２：１１２−３１）およびモノクローナル抗ＭＭＰ−１３（［１μｌ／ｍｌ］，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ａ  Ｂｒａｎｄ  ｏｆ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｌａ  ＪｏＩＩａ，ＣＡ，Ａｎ  Ａｆｆｉｌｉａｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａｔ  ＃ＩＭ４４Ｌ）と共に５時間インキュベートした。二次抗体として、ＭＭＰ−８に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧおよびＭＭＰ−１３に対する抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１時間使用した。該二次抗体の前および後に、膜をＴＢＳＴ中で４回、１５分間洗浄した。増強化学発光（ＥＣＬ）系（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、該タンパク質を可視化した。ＭＭＰ−８および−１３の種々の分子量形態の強度を、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ，Ｂａｓｉｃ−ｐｒｏｇｒａｍを使用するＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｄｅｌ  ＧＳ−７００イメージングデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して走査し分析した。結果を光学濃度／ｍｍ２（ＯＤｕ）として表した。
【００７９】
５．アイソフォームプロファイルおよびゼラチナーゼ活性：エンザイモグラフィー（ｅｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）［２−メトキシ−２，４−ジフェニル−３−（２Ｈ）フラノン（ＭＤＰＦ，Ｆｌｕｋａ，Ｂｕｃｈｓ  ＳＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）標識ゼラチンを基質として使用し、１ｍｇ／ｍｌ  蛍光色素を含浸させた１１％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルを使用するもの］によりゼラチン溶解活性をアッセイした。電気泳動前に、該ＧＣＦサンプル（１４μｌ）を、いずれの還元試薬をも含有しない５μｌの修飾Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーと共に２時間インキュベートした。予め染色された低分子量範囲のＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準物（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を分子量マーカーとして使用した。電気泳動後、該ゲルを、２．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．０２％  ＮａＮ３を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で３０分間洗浄し、ついで、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１μＭ  ＺｎＣｌ２で補足された同じバファーで３０分間洗浄した。最後に、該ゲルを、０．０２％  ＮａＮ３、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１μＭ  ＺｎＣｌ２を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）中、３７℃で一晩インキュベートした。ゼラチンの分解をＵＶ光下で可視化し、ついで１％  クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。ゼラチン溶解活性は染色ゲル上の青色の背景に対して透明なバンドとして可視化された。ゼラチン溶解活性の強度を、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ，Ｂａｓｉｃ−ｐｒｏｇｒａｍを使用するＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｄｅｌ  ＧＳ−７００イメージングデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で評価した。結果を光学濃度／ｍｍ２（ＯＤｕ）として表した。
【００８０】
６．他の酵素の回収：商業的に入手可能な酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを該製造業者のプロトコール（ＰＭＮ  ｅｌａｓｔａｓｅ；Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ，Ｃａｍｐｕｓ  Ｖｉｅｎｎａ  Ｂｉｏｃｅｎｔｅｒ  ２，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ  ａｎｄ  ＭＰＯ；Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ＡＧ，Ｓｔｕｂｅｎｗａｌｄ−Ａｌｌｅｅ  ８ａ，Ｂｅｎｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い使用して、ＰＭＮエラスターゼおよびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の濃度を決定した。いわゆる二次抗体をＰＭＮエラスターゼに関してはホースラディッシュペルオキシダーゼに、そしてＭＰＯに関してはウサギ抗ＭＰＯペルオキシダーゼ標識抗体に結合させた。全てのキットにおける基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用した。Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＲＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｔａ  ＦＥ，ＵＳＡ）を使用して、吸光度を４５０ｎｍにおいて測定した。ＰＭＮエラスターゼおよびＭＰＯのレベルをｎｇ／ｍｌとして表した。
【００８１】
結果：
ａＭＭＰ−８回収アッセイ：ＲＴおよび４℃でインキュベートされた第０日および第１４日における吸収ストリップから回収されたａＭＭＰ−８の濃度をそれぞれ図８ａおよび８ｂに示す。４℃およびＲＴでインキュベートされ第０、４、７および１４日に溶出された吸収ストリップから回収されたａＭＭＰ−８の濃度は同じ範囲内であったが、これは、実際の状態における少なくとも１４日間にわたる該装置における該酵素の安定性を示している。
【００８２】
コラゲナーゼのアイソフォームプロファイルおよびそれらのデンシトメトリー定量：ＰＭＮ型プロ形態、繊維芽細胞型プロ形態、複合形態およびＰＭＮ型活性化形態（断片化を伴わないもの）のような種々の分子量形態のＭＭＰ−８をウエスタンブロット分析において発現させた。ＲＴおよび４℃でインキュベートされた第０日および第１４日における吸収ストリップにおける、光学濃度／ｍｍ２として表された、デンシトメトリーを用いて定量されたａＭＭＰ−８の濃度を、それぞれ図９ａおよび９ｂに示す。同様に、複合およびプロＭＭＰ形態のような種々の重量形態のＭＭＰ−１３を断片化を伴わずに発現させた。該プロ活性形態は活性化されず、該アイソフォームはいずれも、該吸収ストリップにおいてインキュベーション期間中にそれ以上は断片化されなかった。このことは、該ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−１３が１４日間にわたりＲＴおよび４℃で該吸収ストリップにおいて安定であり無傷であることを示した。
【００８３】
ゼラチナーゼ活性およびそのデンシトメトリー定量：プロ形態、複合形態および活性化形態（断片化を伴わないもの）のような種々の分子量形態のＭＭＰ−９および２をウエスタンブロット分析において発現させた。ＲＴおよび４℃でインキュベートされた第０日および第１４日における吸収ストリップにおける、光学濃度／ｍｍ２として表された、デンシトメトリーを用いて定量された活性化形態のＭＭＰ−９の濃度を、それぞれ図１０ａおよび１０ｂに示す。このことは、コラゲナーゼだけでなくゼラチナーゼ活性およびそれらの濃度も、１４日間にわたりＲＴおよび４℃でインキュベートされた吸収ストリップにおいて安定なままであることを示した。
【００８４】
他の酵素の回収：ＲＴおよび４℃でインキュベートされた第０日および第１４日における吸収ストリップにおいて定量されたミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の濃度をそれぞれ図１１ａおよび１１ｂに示す。４℃およびＲＴでインキュベートされ第０、４、７および１４日に溶出された吸収ストリップから回収されたＭＰＯの濃度は同じ範囲内であったが、これは、実際の状態における少なくとも１４日間にわたる該ストリップにおける該酵素の安定性を示している。同様の結果がエラスターゼの濃度で観察された。このことは、幾つかの他の酵素またはタンパク質も該吸収ストリップにおいて安定なままであることを明らかに示した。
【００８５】
ａＭＭＰ−８、エラスターゼおよびＭＰＯと並んで、歯科疾患に関する幾つかの他の関連因子がＧＣＦに存在することが公知である。これらのうちの幾つかを、１２名の被験者での実験的歯肉炎（ＥＧ）研究計画［第０日に歯清掃を行い、その後の１４日間は機械的歯清掃（すなわち、歯ブラッシング）を行わない］におけるサンプル採取系で定量した。該ストリップでＧＣＦを集めることにより、生物マーカーの評価を行った。サンプルを直ちに溶出し、４８時間後、溶出液を−２０℃で凍結させ、ついで最新の研究方法で定性化した。評価したタンパク質はＭＭＰ−１３、ＴＮＦａ、インターロイキン１β、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）であった。予想どおり、これらのパラメーターはＥＧ条件においては有意量では存在せず、さらに時には、それらは対応ＥＬＩＳＡ検出試験の検出限界未満であった。したがって、使用した個々の試験キットから得た校正体で再評価を行った。そのようなものとして、校正体（１μｌ）をタンパク質ごとにストリップ（ｎ＝４）に吸収させた。該ストリップの２つを吸収直後に溶出し、２つを４℃で４８時間貯蔵し、その後溶出した。全ての溶出は同じ方法で行った。すなわち、ストリップを３００〜６００μｌの溶出バッファー中に５分間にわたり、この時間内の５×５の振とうサイクルで導入した。５分後、該ストリップを該バッファーから取り出し、ついで直ちに溶出液を−２０℃で凍結させた。直ちに溶出したストリップおよび４℃で４８時間貯蔵したストリップのそのような比較は評価可能であった。結果は、観察された全てのタンパク質に関して一貫して満足しうるものであった。濃度の減少率は０．３〜１０．９％の範囲であり、用いた分析方法の相関係数の範囲内であった。少数の実験のため、評価したタンパク質の全てに関する該ストリップの保存能力の主張は、ａＭＭＰ−８に関して見出されたデータに類似したものであるという傾向予想が得られうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【国際調査報告】
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