(57)【要約】本発明は、細胞中のｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡを標的とし、ｍｔＧＰＡＴ１の発現低下をもたらすオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。ｍｔＧＰＡＴ１発現の低下は、過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症（ｈｅｐａｔｏｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）などの、ある種の医学的障害の治療に有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡを発現している細胞中のｍｔＧＰＡＴ１遺伝子またはｍＲＮＡの発現を阻害する、長さが１０〜３０のヌクレオチドの一本鎖オリゴマーであって、前記オリゴマーは、合計１０〜３０のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号２６３またはその天然の変異体などの哺乳動物ｍｔＧＰＡＴ１遺伝子またはｍＲＮＡの逆相補配列に対応する領域と少なくとも８０％相同であるオリゴマー。
【請求項２】
連続ヌクレオチド配列は、配列番号２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、および２９０のいずれかに対応する領域と少なくとも８０％相同である、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
連続ヌクレオチド配列は、配列番号２６３の対応する領域の逆相補配列に対してミスマッチを含まないまたは１つまたは２つ以下のミスマッチを含む、請求項１または２に記載のオリゴマー。
【請求項４】
オリゴマーのヌクレオチド配列は、前記連続ヌクレオチド配列から成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項５】
連続ヌクレオチド配列は、長さが１０〜１８のヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項６】
連続ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド類似体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項７】
連続ヌクレオチドは、配列番号１〜２６２のいずれか１つを含むまたはそれから成る、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項８】
ヌクレオチド類似体は、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位から成る群から選択される糖修飾ヌクレオチドなどの糖修飾ヌクレオチドである、請求項６または７に記載のオリゴマー。
【請求項９】
ヌクレオチド類似体は、ＬＮＡである、請求項６または７に記載のオリゴマー。
【請求項１０】
ギャップマーである、請求項６〜９のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項１１】
オリゴマーは、配列番号２、３３、１２５、１４２、１４７、１６９、１７６、１８２、２１４、２４９、２５０、および２５４のいずれか１つである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴマーおよび前記オリゴマーに共有結合された少なくとも１つの非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項１３に記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容できる希釈剤、担体、塩、またはアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項１４】
過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療のためなど、医薬として使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を治療するための医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項１３に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１６】
過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を治療するための方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項１２に記載のコンジュゲートまたは請求項１３に記載の医薬組成物を、過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に罹患している、またはそれに罹患する可能性がある患者に投与するステップを含む方法。
【請求項１７】
ｍｔＧＰＡＴ１を発現している細胞中のｍｔＧＰＡＴ１を阻害するための方法であって、前記細胞中のｍｔＧＰＡＴ１を阻害するために、前記細胞に、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項１２に記載のコンジュゲートを投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞中のｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡを標的とし、ｍｔＧＰＡＴ１の発現低下をもたらすオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。ｍｔＧＰＡＴ１発現の低下は、過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症（ｈｅｐａｔｏｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）などの一連の医学的障害に有益である。
【背景技術】
【０００２】
背景
ミトコンドリアグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ１（ＥＣ  ２．３．１．１５。ＧＰＡＴ１、ｍｔＧＰＡＴ１、ＧＰＡＭ、ｍｔＧＰＡＭとしても知られている）は、肝性トリグリセリド形成において主な役割を果たし、高レベルのｍｔＧＰＡＴ１活性は、脂肪肝（肝臓脂肪症）をもたらすのに対して、ｍｔＧＰＡＴ１の不在は、低レベルの肝臓トリグリセリドおよび刺激された脂肪酸酸化をもたらす。
【０００３】
グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）は、トリグリセリド合成における律速工程を触媒する酵素のファミリーである。これらの酵素は、グリセロール−３−リン酸と活性脂肪酸（アシルコエンザイムＡ、アシルＣｏＡ）の間のエステル結合の形成を触媒する。複数の酵素が細胞中のＧＰＡＴ酵素活性を担い、小胞体およびミトコンドリアの両方の外膜中に酵素活性が存在し、一部分の酵素は、ＮＥＭによる不活性化に非感受性であるものもあれば、感受性であるものもあることが早期に認識された［Coleman et al. (2000) Annu. Rev. Nutr. 20, 77-103-3；Coleman et al. (2004) Prog. Lipid Res. 43, 134-176；Coleman (2007) Cell Metab 5, 87-89］。
【０００４】
ｍｔＧＰＡＴ１は、ＮＥＭによる不活性化に非感受性であり、ミトコンドリア中にのみ存在するＧＰＡＴ酵素として同定された。ｍｔＧＰＡＴ１の活性は、肝外組織中で低く、それは、全ＧＰＡＴ活性の１０％を担うのに対して、活性は肝臓中で高く、ｍｔＧＰＡＴ１は全ＧＰＡＴ活性の５０％までを占める［Coleman et al. (2000) Annu. Rev. Nutr. 20, 77-103-3；Coleman et al. (2004) Prog. Lipid Res. 43, 134-176；Coleman (2007) Cell Metab 5, 87-89］。すべてのＧＰＡＴ活性の産物であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、トリグリセリドおよびリン脂質の両方の合成に向かって進行し得る。トリグリセリド合成に関与するほとんどの酵素は、小胞体中に存在し、そのため、ｍｔＧＰＡＴ１は主にリン脂質前駆物質合成に関与すると、より早期に考えられていた。しかしながら、ｍｔＧＰＡＴ１活性のホルモンおよび栄養の調節は、肝性トリグリセリド合成における決定的な役割を示す［Coleman et al. (2000) Annu. Rev. Nutr. 20, 77-103-3；Coleman et al. (2004) Prog. Lipid Res. 43, 134-176；Coleman (2007) Cell Metab 5, 87-89］。ｍｔＧＰＡＴ１活性は、摂食に応じて肥満マウス中で劇的にアップレギュレートされる（Xu et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 349, 439-448）。
【０００５】
ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞中のｍｔＧＰＡＴ１の過剰発現は、細胞内トリグリセリドのレベルの確実な増加をもたらす［Igal et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 42205-42212］。肝細胞中のｍｔＧＰＡＴ１の過剰発現は、細胞の燃料用の脂肪酸の利用（β−酸化）の減少と同時に、さらに高いレベルの細胞内脂質蓄積をもたらし［Lewin et al. (2005) Am. J. Physiol Endocrinol. Metab 288, E835-E844］、高レベルのｍｔＧＰＡＴ１活性が、増加した肝脂肪酸取り込みおよびトリグリセリド合成（脂質生成による同化）ならびに減少した脂肪酸酸化（脂質異化）をもたらすかのように見える。これは、マロニルＣｏＡコントロール「代謝スイッチ」についての見解と一致しており、細胞のエネルギー必要量（マロニルＣｏＡ濃度のコントロールを通して）が、脂質生成／貯蔵（ｍｔＧＰＡＴ１活性）に向かって活性脂肪酸を導くまたはミトコンドリアの中への移動を導き、その後に、脂肪酸酸化が続く（律速酵素としてカルニチン（ｃａｒｎｉｔｉｎ）パルミトイルトランスフェラーゼ−１、ＣＰＴ−１を用いて）。高レベルのｍｔＧＰＡＴ１を発現するすべての細胞中で、トリグリセリド合成は、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｉｌｉｐｉｄ）またはコレステロールエステルへの活性脂肪酸の挿入に対して有利であった。
【０００６】
ｍｔＧＰＡＴ１の一過性の肝性アデノウイルス誘発性過剰発現は、肝臓トリアシルグリセロールの大量の増加、つまり肝臓脂肪症［Linden et al. (2006) FASEB J. 20, 434-443］およびインスリン抵抗性［Nagle et al. (2007) J. Biol. Chem. 282, 14807-14815］をもたらす。ｍｔＧＰＡＴ１ノックアウトマウスが、生成された。標準固形飼料で飼育された場合、動物は、より低い体重および生殖腺脂肪パッド重量、より低い肝臓トリグリセリドレベル、より低い血漿トリグリセリド、ならびにより低いＶＬＤＬ分泌を有する［Hammond et al. (2002) Mol. Cell Biol. 22, 8204-8214；Yazdi et al. (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 369, 1065-1070］。ｍｔＧＰＡＴ１ノックアウト動物はまた、インスリン抵抗性から保護されるようにも見える［Neschen et al. (2005) Cell Metab 2, 55-65］。４カ月の間、高脂肪高スクロース食餌で飼育されたマウスでは、ｍｔＧＰＡＴ１の不在は、血漿β−ヒドロキシ酪酸の増加したレベルなどの刺激された脂肪酸酸化の表れと共に、肝性トリグリセリド含有量の６０％の減少をもたらした［Hammond et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 25629-25636］。高齢のｍｔＧＰＡＴ１ノックアウトマウスは、長鎖脂肪酸−ＣｏＡの増加した肝蓄積を有し、酵素活性の釣り合いのとれたダウンレギュレーションは、タンパク質の完全な不在と比較して好ましいことを示唆する［Hammond et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 25629-25636］。しかしながら、ｍｔＧＰＡＴ１の不在は、肝臓サイズ、肝細胞数、またはミトコンドリアの形態のあらゆる全体の変化をもたらすようには見えない［Hammond et al. (2007) Exp. Mol. Pathol. 82, 210-219］。全体的な結論は、高ｍｔＧＰＡＴ１活性が、肥満症、インスリン抵抗性、および肝脂質蓄積に相関するということである。
【０００７】
ｍｔＧＰＡＴ１活性の阻害は、これまで、酵素の活性部位に向けられる小分子に限られてきた。しかしながら、ＧＰＡＴファミリーの異なるメンバーの活性部位に対してタンパク質配列の大きな相同性があり［Gonzalez-Baro et al. (2007) Am. J. Physiol Gastrointest. Liver Physiol 292, G1195-G1199］、タンパク質ファミリーの１つの個別のメンバーに特異的な小分子阻害剤の設計を難題にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、ｍｔＧＰＡＴ１特異的阻害剤などのサブタイプ特異的ＧＰＡＴ阻害剤が必要とされている。本発明のＬＮＡ含有ＲＮＡアンタゴニストは、ｍｔＧＰＡＴ１発現の調整を含む、治療、診断および研究用途に対する満たされていない必要性を満たすｍｔＧＰＡＴ１特異的阻害剤である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、合計１０〜３０ヌクレオチドの連続(contiguous)ヌクレオチド配列を含む、長さが１０〜３０ヌクレオチドのオリゴマーであって、前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号２６３またはその自然発生の変異体などの哺乳動物ｍｔＧＰＡＴ１遺伝子またはｍＲＮＡの逆相補配列(reverse complement)に対応する領域と少なくとも８０％（たとえば８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）相同であるオリゴマーを提供する。したがって、たとえば、オリゴマーは、配列番号２６３の一部の配列を有する一本鎖核酸分子とハイブリダイズする。
【００１０】
本発明は、本発明によるオリゴマーおよび前記オリゴマーに共有結合された少なくとも１つの非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲートを提供する。
【００１１】
本発明は、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートおよび薬学的に許容できる希釈剤、担体、塩、またはアジュバントを含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療のためなど、医薬として使用するための、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートを提供する。
【００１３】
本発明は、過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を治療するための医薬の製造のための、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートの使用を提供する。
【００１４】
本発明は、過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を治療するための方法であって、過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に罹患している、またはそれに罹患する可能性がある患者に、本発明によるオリゴマー、コンジュゲート、または医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
本発明は、ｍｔＧＰＡＴ１を発現している細胞中のｍｔＧＰＡＴ１を阻害するための方法であって、前記細胞中のｍｔＧＰＡＴ１の阻害を達成するために、前記細胞に、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートを投与するステップを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ｍｔＧＰＡＴ１に対する一連のＬＮＡ含有一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で同じナノモルの範囲で強力であることを示す。Ａ）ｍｔＧＰＡＴ１に対する一連のＬＮＡ含有アンチセンス分子を用いる脂質支援トランスフェクションの後のＬＴＫ−Ｄ２細胞中の相対的なｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡ発現。データは、偽トランスフェクト細胞中の対応するｍＲＮＡの比率のうちのパーセントとして表現される、ｍｔＧＰＡＴ１／ＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡ発現についての平均値±ＳＤを表す。Ｂ）ｍｔＧＰＡＴ１に対する一連のＬＮＡ含有アンチセンス分子を用いる脂質支援トランスフェクションの後のＨｕＨ７細胞中の相対的なｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡ発現。データは、偽トランスフェクト細胞中の対応するｍＲＮＡの比率のうちのパーセントとして表現される、ｍｔＧＰＡＴ１／ＧＡＤＰＨ  ｍＲＮＡ発現についての平均値±ＳＤを表す。
【図２】図２は、メスＣ５７ＢＬ／６マウス中での肝臓ｍｔＧＰＡＴ  ｍＲＮＡ発現のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ダウンレギュレーションを示す。肝臓ｍｔＧＰＡＴ  ｍＲＮＡ発現に対する５つの異なるｍｔＧＰＡＴアンチセンスオリゴマー、配列番号３３、１２５、１４７、１７６、および２４９の効果が試験された。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
配列番号の簡単な説明
１〜２６２は、表１中に示される。
【００１８】
２６３は、実施例の部の後の配列表中に示される。
【００１９】
２６４〜２９０は、表２中に示される。
【００２０】
表１のアンチセンス配列から選択される、特に好ましいアンチセンス配列のリストは、表３中に示される。
【００２１】
発明の詳細な説明
オリゴマー
本発明は、配列番号２６３に示されるｍｔＧＰＡＴ１核酸および哺乳動物ｍｔＧＰＡＴ１をコードするそのような核酸分子の天然の変異体などの、哺乳動物ｍｔＧＰＡＴ１をコードする核酸分子の機能を調整するのに使用するためのオリゴマー化合物（オリゴマーとして本明細書で言及される）を利用する。本発明と関連した用語「オリゴマー」は、２つ以上のヌクレオチドの共有結合によって形成された分子（つまりオリゴヌクレオチド）を指す。オリゴマーは、長さが１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列から成るまたはそれを含む。
【００２２】
様々な実施形態では、本発明の化合物は、ＲＮＡ（単位）を含まない。本発明による化合物は、線状分子であるか、または線状分子として合成されることが好ましい。オリゴマーは、一本鎖分子であり、好ましくは、たとえば、同じオリゴマー内の等価な領域に相補的である、少なくとも３、４、または５の連続ヌクレオチドの短い領域（つまり二重鎖）を含まず、この点について、オリゴマーは、（本質的に）二本鎖ではない。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、ｓｉＲＮＡではないように、本質的に二本鎖ではない。様々な実施形態では、本発明のオリゴマーは、もっぱら、連続ヌクレオチド領域から成っていてもよい。したがって、オリゴマーは、実質的に、自己相補的ではない。
【００２３】
標的
好適には、本発明のオリゴマーは、ｍｔＧＰＡＴ１遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる。この点について、本発明のオリゴマーは、典型的に、ヒト細胞などの哺乳動物で、ｍｔＧＰＡＴ１の阻害を達成することができる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、標的核酸に結合し、通常の発現レベルと比較して少なくとも１０％または２０％の発現の阻害、より好ましくは、通常の発現レベルと比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の阻害を達成する。いくつかの実施形態では、そのような調整は、本発明の化合物を０．０４〜２５ｎＭ、たとえば、０．８〜２０ｎＭの濃度で使用する場合に見られる。同じまたは異なる実施形態では、発現の阻害は、１００％未満、たとえば、９８％未満の阻害、９５％未満の阻害、９０％未満の阻害、８０％未満の阻害、たとえば、７０％未満の阻害である。発現レベルの調整は、タンパク質レベルを測定することによって、たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後に続く、標的タンパク質に対して産生される、適した抗体を使用するウエスタンブロッティングなどの方法によって決定されてもよい。その代わりに、発現レベルの調整は、ｍＲＮＡのレベルを測定することによって、たとえば、ノーザンブロッティングまたは定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定することができる。ｍＲＮＡレベルを介して測定する場合、適切な投薬量、たとえば０．０４〜２５ｎＭ、たとえば０．８〜２０ｎＭの濃度を使用する場合のダウンレギュレーションのレベルは、いくつかの実施形態では、典型的に、本発明の化合物の非存在下での通常のレベルの１０〜２０％のレベルまでである。
【００２４】
そのため、本発明は、ｍｔＧＰＡＴ１タンパク質および／またはｍＲＮＡを発現している細胞中のｍｔＧＰＡＴ１タンパク質および／またはｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートまたは阻害するための方法であって、前記細胞中のｍｔＧＰＡＴ１タンパク質および／またはｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートまたは阻害するために前記細胞に本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートを投与するステップを含む方法を提供する。好適には、細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。投与は、いくつかの実施形態では、インビトロで行われてもよい。投与は、いくつかの実施形態では、インビボで行われてもよい。
【００２５】
本明細書で使用される用語「標的核酸」は、配列番号２６３などの、ヒトｍｔＧＰＡＴ１などの哺乳動物ｍｔＧＰＡＴ１ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、ｍｔＧＰＡＴ１コード核酸またはその天然の変異体、およびそれに由来するＲＮＡ核酸、好ましくは成熟ｍＲＮＡであるが、好ましくはプレｍＲＮＡなどのｍＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、たとえば、研究または診断で使用される場合、「標的核酸」は、ｃＤＮＡまたは上記のＤＮＡに由来する合成オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ核酸標的であってもよい。本発明によるオリゴマーは、好ましくは、標的核酸とハイブリダイズすることができる。配列番号２６３は、ｃＤＮＡ配列であり、そのため、ウラシルがｃＤＮＡ配列中ではチミジンと交換されるが、成熟ｍＲＮＡ標的配列に対応することが認識されるであろう。
【００２６】
用語「その天然の変異体」は、マウス、サル、好ましくはヒトなどの、哺乳動物などの規定される分類群内に自然に存在する、核酸配列のｍｔＧＰＡＴ１ポリペプチドの変異体を指す。典型的に、ポリヌクレオチドの「天然の変異体」を指す場合、用語はまた、染色体転座または重複によって染色体１０；位置：１０ｑ２５．２Ｍｂに認められる、ｍｔＧＰＡＴ１コードゲノムＤＮＡの任意の対立遺伝子変異体およびそれに由来するｍＲＮＡなどのＲＮＡを包含してもよい。「天然の変異体」はまた、ｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡの選択的スプライシングに由来する変異体を含んでいてもよい。特定のポリペプチド配列が参照される場合、たとえば、用語はまた、そのため、たとえば、シグナルペプチド切断、タンパク分解性の切断、グリコシル化などの同時翻訳修飾または翻訳後修飾によって処理されてもよい、タンパク質の天然の形態を含む。
【００２７】
配列
オリゴマーは、配列番号２６３中に存在するヌクレオチド配列の逆相補配列に対応する連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれから成る。したがって、オリゴマーは、配列番号１〜２６２から成る群から選択される配列を含みまたはそれから成ることができ、前記オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、所望により、前記選択される配列に対して１、２、または３つのミスマッチを有していてもよい。
【００２８】
表１：本発明のオリゴマー配列の表
別記されるように、この表中のオリゴマー配列は、オリゴヌクレオチドのＴｍを増加させるヌクレオチド類似体を含むことによって、本発明に従って設計されてもよい。さらに、ホスホロチオエート結合が、ヌクレオチド間結合として存在してもよい。
【００２９】
「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を表し、太字は、ＬＮＡ分子を表す。
【００３０】
【表１−１】
2011526482.tif 000002
【表１−２】
2011526482.tif 000003
【表１−３】
2011526482.tif 000004
【表１−４】
2011526482.tif 000005
【表１−５】
2011526482.tif 000006
【表１−６】
2011526482.tif 000007
【表１−７】
2011526482.tif 000008
【００３１】
オリゴヌクレオチドの好ましい設計は、３−１０−３、３−９−３、３−８−３、２−８−３、３−８−２、２−８−２のＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡタイプのギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）である。
【００３２】
表２：特に好ましいアンチセンス配列モチーフの選択
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、列挙されるモチーフのいずれか１つの配列の一部を含むかまたはそれから成るであろう。
【００３３】
【表２−１】
2011526482.tif 000009
【表２−２】
2011526482.tif 000010
【００３４】
表３：表１の番号と同一の配列番号を有する、特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択
さらに、この表で、オリゴヌクレオチドの好ましい設計は、３−１０−３、３−９−３、３−８−３、２−８−３、３−８−２、２−８−２のＬＮＡ−ＤＮＡ−ＬＮＡタイプのギャップマーである。
【００３５】
【表３−１】
2011526482.tif 000011
【表３−２】
2011526482.tif 000012
【００３６】
オリゴマーは、哺乳動物ｍｔＧＰＡＴ１をコードする核酸（たとえば配列番号２６３）の等価な領域に完全に相補的な（十分に相補的な）連続ヌクレオチド配列を含んでいてもよく、またはそれから成ってもよい。したがって、オリゴマーは、アンチセンスヌクレオチド配列を含むかまたはそれから成ることができる。
【００３７】
しかしながら、いくつかの実施形態では、オリゴマーは、標的配列とハイブリダイズし、なお標的に十分に結合して、所望の効果、つまり標的のダウンレギュレーションを示す場合、１、２、３、もしくは４つの（またはそれ以上の）ミスマッチを許容してもよい。ミスマッチは、たとえば、ヌクレオチド配列内に存在する、オリゴマーヌクレオチド配列の増加した長さおよび／またはＬＮＡなどのヌクレオチド類似体の増加した数によって補われてもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、哺乳動物ｍｔＧＰＡＴ１をコードする核酸の対応する領域になどの標的配列とハイブリダイズする場合、３つ以下、たとえば２つ以下のミスマッチを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、哺乳動物ｍｔＧＰＡＴ１をコードする核酸の対応する領域などの標的配列とハイブリダイズする場合、単一のミスマッチしか含まない。
【００４０】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号１〜２６２から成る群から選択される対応する配列と少なくとも８０％相同、たとえば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％相同、たとえば１００％相同（同一）（homologous(identical)）である。
【００４１】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号２６３中に存在する対応する配列の逆相補配列と少なくとも８０％相同、たとえば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％相同、たとえば１００％相同（同一）である。
【００４２】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号２６３中に存在するサブ配列と少なくとも８０％相補的、たとえば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％相補的、たとえば１００％相補的（完全に相補的）である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２から成る群またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチドのサブ配列から選択されるか、またはそれから選択される配列の１つを含み、前記オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、所望により、配列と比較した場合、１、２、または３つのミスマッチを含んでいてもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、サブ配列は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９の連続ヌクレオチド、１２〜２２、たとえば１２〜１８のヌクレオチドから成ってもよい。好適には、いくつかの実施形態では、サブ配列は、本発明のオリゴマーの連続ヌクレオチド配列と同じ長さである。
【００４５】
しかしながら、いくつかの実施形態では、オリゴマーのヌクレオチド配列は、標的配列に非相補的である、さらなる５’または３’ヌクレオチド、たとえば、独立して、５’および／または３’に１、２、３、４または５つのさらなるヌクレオチドを含んでいてもよいことが認識される。この点で、本発明のオリゴマーは、いくつかの実施形態では、さらなるヌクレオチドが５’および／または３’に隣接する連続ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態で、さらなる５’または３’ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、さらなる５’または３’ヌクレオチドは、本明細書で、ギャップマーオリゴマーとの関連で言及される領域Ｄを表してもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２６４によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２６５によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２６６によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２６７によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２６８によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２６９によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２７０によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２７１によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２７２によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２７３によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２７４によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２７５によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２７６によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２７７によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２７８によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２７９によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２８０によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２８１によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２８２によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２８３によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２８４によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２８５によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２８６によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２８７によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２８８によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２８９によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、配列番号２９０によるヌクレオチド配列またはそのサブ配列から成るかまたはそれを含む。
【００７３】
好ましい一実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号２、３３、１２５、１４２、１４７、１６９、１７６、１８２、２１４、２４９、２５０、および２５４のいずれか１つである。
【００７４】
本発明のオリゴマー（または連続ヌクレオチド配列）および本明細書で開示されるものなどの、哺乳動物ｍｔＧＰＡＴ１をコードする核酸またはその逆相補配列の間の「相同性」を決定する場合、相同性の決定は、本発明の化合物の対応するヌクレオチド配列および哺乳動物ｍｔＧＰＡＴ１をコードする核酸の対応する領域（もしくは標的核酸）またはその逆相補配列を用いる単純なアライメントによってなされてもよく、相同性は、アライメントされる塩基の数を数え、本発明の化合物中の連続ヌクレオチドの総数によって割り、１００をかけることによって決定される。そのような比較で、ギャップが存在する場合、そのようなギャップは、ギャップ内のヌクレオチドの数が本発明のヌクレオチド配列および標的核酸の間で異なるエリアではなく、単にミスマッチであることが好ましい。
【００７５】
用語「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ）」および「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ）」は、オリゴマーのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列（第１の配列）と、ｉ）配列番号２６３などの、ｍｔＧＰＡＴ１タンパク質をコードするｍＲＮＡなどの、核酸標的の逆相補配列のサブ配列、ならびに／またはｉｉ）配列番号２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、および２９０から成る群などの、本明細書で提供されるヌクレオチドの配列のいずれかから選択されるさらなる配列の相当する連続ヌクレオチド配列との比較を指す。ヌクレオチド類似体は、その相当または対応するヌクレオチドと直接比較される。ｉ）またはｉｉ）のさらなる配列に対応する第１の配列は、典型的に、第１の配列（連続ヌクレオチド配列など）の全長にわたってその配列と同一であるか、または本明細書に記載の通りであり、いくつかの実施形態では、対応する配列と少なくとも８０％相同、たとえば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％相同、たとえば１００％相同（同一）である。
【００７６】
用語「対応するヌクレオチド類似体」および「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体中のヌクレオチドおよび天然のヌクレオチドが同一であることを示すことを意図する。たとえば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位がアデニンに連結される場合、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに連結されたペントース単位（２−デオキシリボースと異なる）を含有する。
【００７７】
長さ
オリゴマーは、長さが、連続する合計１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれから成る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、長さが、連続する合計１０〜２２、たとえば１２〜１８、たとえば、１３〜１７または１２〜１６、たとえば１３、１４、１５、１６ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれから成る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、長さが合計１０、１１、１２、１３、または１４の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれから成る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、２２以下のヌクレオチド、たとえば２０以下のヌクレオチド、たとえば１８以下のヌクレオチド、たとえば１５、１６、または１７のヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、２０未満のヌクレオチドを含む。
【００８１】
ヌクレオチド類似体
本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分、およびリン酸またはホスホロチオエートヌクレオチド間連結基などの共有結合基を含む配糖体を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然のヌクレオチドならびに本明細書で「ヌクレオチド類似体」とも言及される、修飾された糖および／または塩基部分を含む非天然のヌクレオチドの両方を包含する。本明細書で、単一のヌクレオチド（単位）はまた、単量体または核酸単位として言及されてもよい。
【００８２】
生化学の分野では、用語「ヌクレオシド」は、糖部分および塩基部分を含む配糖体を指すために一般に使用され、そのため、オリゴマーのヌクレオチドの間のヌクレオチド間連結によって共有結合されるヌクレオチド単位を指す場合、使用されてもよい。
【００８３】
当業者が認識するように、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドは、５’末端基を含んでいても含んでいなくてもよいが、５’ヌクレオチド間連結基を含まない。
【００８４】
非天然のヌクレオチドは、二環式ヌクレオチドまたは２’置換ヌクレオチドなどの２’修飾ヌクレオチドなどの修飾された糖部分を有するヌクレオチドを含む。
【００８５】
「ヌクレオチド類似体」は、糖および／または塩基部分中の修飾によって、ＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチドなどの天然のヌクレオチドの変異体となる。類似体は、基本的に、オリゴヌクレオチドとの関連で天然のヌクレオチドに対して単に「無変化」または「等価」とすることができ、つまり、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害するように作用する方法に対する機能効果を有していない。しかしながら、そのような「等価な」類似体は、たとえば、それらが、製造するのにより容易である、もしくはより安価である、または貯蔵もしくは製造条件に対して、より安定している、またはタグもしくは標識を表す場合、有用であり得る。しかしながら、好ましくは、類似体は、たとえば、標的に対する増加した結合親和性および／または細胞内ヌクレアーゼに対する増加した抵抗性および／または細胞の中への輸送の増加した容易性をもたらすことによって、オリゴマーが発現を阻害するように作用する方法に対する機能効果を有するであろう。ヌクレオシド類似体の特定の例は、たとえばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213ならびにスキーム１中に記載されている。
【００８６】
【化１】
2011526482.tif 000013
【００８７】
スキーム１
オリゴマーは、したがって、天然ヌクレオチド、好ましくは２’−デオキシヌクレオチド（本明細書において一般に「ＤＮＡ」として言及される）、さらにおそらくリボヌクレオチド（本明細書において一般に「ＲＮＡ」として言及される）の単純な配列またはそのような天然のヌクレオチドおよび１つもしくは複数の非天然のヌクレオチド、つまりヌクレオチド類似体の組み合わせを含んでいてもよく、またはそれから成ってもよい。そのようなヌクレオチド類似体は、好適には、標的配列に対するオリゴマーの親和性を増強してもよい。
【００８８】
適した好ましいヌクレオチド類似体の例は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２によって提供され、またはそこで参照される。
【００８９】
ＬＮＡまたは２’−置換糖などの、オリゴマー中の親和性増強ヌクレオチド類似体の組み込みは、特異的に結合するオリゴマーのサイズを低下させることを可能にすることができ、また、非特異的または異常な結合が起こる前に、オリゴマーのサイズに対する上限を低下させ得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも２つのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、３〜８つのヌクレオチド類似体、たとえば６または７つのヌクレオチド類似体を含む。さらに最も好ましい実施形態では、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも１つは、ロックド核酸（ＬＮＡ）である、たとえば、少なくとも３または少なくとも４または少なくとも５または少なくとも６または少なくとも７または８つのヌクレオチド類似体は、ＬＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体はすべて、ＬＮＡであってもよい。
【００９１】
ヌクレオチドのみから成る、好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列を指す場合、その配列によって規定される本発明のオリゴマーは、前記配列中に存在する１つまたは複数のヌクレオチドの代わりに、オリゴマー／標的二重鎖の二重鎖安定性／Ｔｍを上昇させるＬＮＡ単位または他のヌクレオチド類似体（つまり親和性増強ヌクレオチド類似体）などの、対応するヌクレオチド類似体を含んでいてもよいことが認識されるであろう。
【００９２】
いくつかの実施形態では、オリゴマーのヌクレオチド配列および標的配列の間のあらゆるミスマッチは、好ましくは、本明細書で言及される領域Ｂおよび／もしくは本明細書で言及される領域Ｄなどの、親和性増強ヌクレオチド類似体の外側の領域中にならびに／またはオリゴヌクレオチド中のＤＮＡヌクレオチドなどの非修飾の部位にならびに／または連続ヌクレオチド配列の５’または３’側にある領域中に存在している。
【００９３】
ヌクレオチドのそのような修飾の例は、２’置換基を提供するためのおよび結合親和性を増強する架橋（ロックド核酸）構造を生産するための糖部分の修飾を含み、また、増加したヌクレアーゼ抵抗性を提供してもよい。
【００９４】
好ましいヌクレオチド類似体は、オキシ−ＬＮＡ（たとえば、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）および／またはアミノ−ＬＮＡ（たとえば、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ）および／またはチオ−ＬＮＡ（たとえば、ベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−チオ−ＬＮＡ）および／またはＥＮＡ（たとえば、ベータ−Ｄ−ＥＮＡおよびアルファ−Ｌ−ＥＮＡ）などのＬＮＡである。ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡが最も好ましい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、たとえば、本発明のオリゴマー内（たとえば、本明細書で言及される領域ＡおよびＣ中）に存在するヌクレオチド類似体は、独立して、たとえば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２’−フルオロ−ＡＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ（挿入核酸−Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925、参照によってこれによって組み込まれる）単位、および２’ＭＯＥ単位から選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列中に存在する上記のタイプのたった１つのヌクレオチド類似体がある。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体は、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、またはＬＮＡヌクレオチド類似体であり、そのため、本発明のオリゴヌクレオチドは、これらの３つのタイプの類似体から独立して選択されるヌクレオチド類似体を含んでいてもよく、または３つのタイプから選択されるたった１つのタイプの類似体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも１つは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の２’−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオチド単位などの、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも１つは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の２’−フルオロ−ＤＮＡヌクレオチド単位などの、２’−フルオロ−ＤＮＡである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）単位、たとえば、１、２、３、４、５、６、７もしくは８個のＬＮＡ単位、たとえば３〜７もしくは４〜８個のＬＮＡ単位、または３、４、５、６もしくは７個のＬＮＡ単位を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体はすべて、ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡと、以下のＬＮＡ単位：ベータ−Ｄもしくはアルファ−Ｌ立体配置のいずれかのチオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、および／もしくはＥＮＡまたはその組み合わせのうちの１つまたは複数とを両方含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＡシトシン単位はすべて、５’メチル−シトシンである。本発明のいくつかの実施形態では、オリゴマーは、ＬＮＡ単位およびＤＮＡ単位の両方を含んでいてもよい。好ましくは、ＬＮＡ単位およびＤＮＡ単位を組み合わせた合計は、１０〜２５個、好ましくは１０〜２０個、さらに好ましくは１２〜１６個である。本発明のいくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列などのオリゴマーのヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＬＮＡから成り、残りのヌクレオチド単位は、ＤＮＡ単位である。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、所望によりホスホロチオエートなどの修飾ヌクレオチド間連結と共に、ＬＮＡヌクレオチド類似体および天然のヌクレオチド（たとえばＲＮＡまたはＤＮＡ、最も好ましくはＤＮＡヌクレオチド）のみを含む。
【００９８】
用語「核酸塩基」は、ヌクレオチドの塩基部分を指し、天然および非天然の変異体の両方を包含する。したがって、「核酸塩基」は、知られているプリンおよびピリミジンヘテロ環だけでなく、そのヘテロ環式類似体および互変異性体（tautomeres）をも包含する。
【００９９】
核酸塩基の例は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、イソシトシン、偽イソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンを含むが、これらに限定されない。
【０１００】
いくつかの実施形態では、オリゴマー中に存在する核酸塩基の少なくとも１つは、５−メチルシトシン、イソシトシン、偽イソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンから成る群から選択される修飾核酸塩基である。
【０１０１】
ＬＮＡ
用語「ＬＮＡ」は、「ロックド核酸」として知られている二環式ヌクレオチド類似体を指す。それは、ＬＮＡモノマーを指してもよいまたは「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」との関連で使用される場合、ＬＮＡは、１つまたは複数の、そのような二環式ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを指す。ＬＮＡヌクレオチドは、たとえば、下記に記載されるように、ビラジカルＲ４＊−Ｒ２＊として示されるように、リボース糖環のＣ２’およびＣ４’の間のビラジカル「架橋」の存在によって特徴づけられる。
【０１０２】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物中で使用されるＬＮＡは、好ましくは、一般式Ｉの構造を有する。
【０１０３】
【化２】
2011526482.tif 000014
すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよく；
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＲＮ＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−から選択され、たとえば、いくつかの実施形態では−Ｏ−であり；
Ｂは、水素、所望により置換されるＣ１〜４−アルコキシ、所望により置換されるＣ１〜４−アルキル、所望により置換されるＣ１〜４−アシルオキシ、天然および核酸塩基類似体を含む核酸塩基、ＤＮＡ干渉物質、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、リポーター基、およびリガンドから選択され；
Ｐは、隣接するモノマーに対するヌクレオチド間連結または５’末端基を示し、そのようなヌクレオチド間連結または５’末端基は、置換基Ｒ５または等しく適用可能な置換基Ｒ５＊を所望により含み；
Ｐ＊は、隣接するモノマーに対するヌクレオチド間連結または３’末端基を示し；
Ｒ４＊およびＲ２＊は、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、および＞Ｃ＝Ｚから選択される１〜４つの基／原子から成るビラジカルをともに示し、
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、および−Ｎ（Ｒａ）−から選択され、ＲａおよびＲｂは、それぞれ、水素、所望により置換されるＣ１〜１２−アルキル、所望により置換されるＣ２〜１２−アルケニル、所望により置換されるＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、所望により置換されるＣ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシアルキル、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ２〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ、およびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルホノ（ｓｕｌｐｈｏｎｏ）、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡ干渉物質、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、リポーター基、ならびにリガンドから独立して選択され、アリールおよびヘテロアリールは、所望により、置換されてもよく、２つのジェミナルな置換基ＲａおよびＲｂは、ともに、所望により置換されるメチレン（＝ＣＨ２）を示してもよく、すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよく；
存在する、それぞれの置換基Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６、およびＲ６＊は、水素、所望により置換されるＣ１〜１２−アルキル、所望により置換されるＣ２〜１２−アルケニル、所望により置換されるＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシアルキル、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡ干渉物質、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、リポーター基、ならびにリガンドから独立して選択され、アリールおよびヘテロアリールは、所望により、置換されてもよく、２つのジェミナルな置換基は、ともに、オキソ、チオキソ、イミノ、または所望により置換されるメチレンを示してもよく；ＲＮは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択され、２つの隣接する（非ジェミナルな）置換基は、二重結合をもたらす、さらなる結合を示してもよく；
ＲＮ＊は、存在し、ビラジカルに関与しない場合、水素およびＣ１〜４−アルキル；ならびにその塩基性塩および酸付加塩から選択される。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよい。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ともに、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲａＲｂ）−、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−、Ｃ（ＲａＲｂ）−ＮＲａ−、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｓ−、およびＣ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−から成る群から選択される群から成るビラジカルを示し、ＲａおよびＲｂはそれぞれ、所望により、独立して選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ＲａおよびＲｂは、水素およびＣ１〜６−アルキルから成る群から所望により独立して選択されていてもよく、たとえばメチル、たとえば水素である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換Ｃ１〜６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換Ｃ１〜６アミノアルキルから成る群から独立して選択される。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換Ｃ１〜６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換Ｃ１〜６アミノアルキルから成る群から独立して選択される。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよい。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、水素である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、Ｒ５およびＲ５＊は、それぞれ、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ２から成る群から独立して選択される。好適には、いくつかの実施形態では、Ｒ５またはＲ５＊は、水素であり、他方の基（それぞれＲ５またはＲ５＊）は、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、置換Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルキニル、または置換アシル（−Ｃ（＝Ｏ）−）から成る群から選択され；置換基は、それぞれ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、置換Ｃ２〜６アルキニル、ＯＪ１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、ＣＮ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ，Ｊ２、またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｘ）Ｎ（Ｈ）Ｊ２から独立して選択される置換基の群とモノまたはポリ置換され、Ｘは、ＯまたはＳであり；Ｊ１およびＪ２は、それぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、置換Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アミノアルキル、置換Ｃ１〜６アミノアルキル、または保護基である。いくつかの実施形態では、Ｒ５またはＲ５＊は、置換Ｃ１〜６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５またはＲ５＊は、置換メチレンであり、好ましい置換基の群は、Ｆ、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、ＯＪ１、ＳＪ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ，Ｊ２、またはＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｊ２から独立して選択される、１つまたは複数の群を含む。いくつかの実施形態では、Ｊ１およびＪ２は、それぞれ、独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５またはＲ５＊は、メチル、エチル、またはメトキシメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５またはＲ５＊は、メチルである。さらなる実施形態では、Ｒ５またはＲ５＊は、エチレニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５またはＲ５＊は、置換アシルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５またはＲ５＊は、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２である。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよい。そのような５’修飾二環式ヌクレオチドは、ＷＯ２００７／１３４１８１で開示され、これは、その全体が参照によってこれによって組み込まれる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、Ｂは、アデニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシルから成る群から選択される核酸塩基ならびに／または５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２’チオ−チミン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、および２，６−ジアミノプリンなどの修飾もしくは置換核酸塩基などの、核酸塩基類似体を含む核酸塩基ならびにプリンもしくはピリミジンなどの天然の核酸塩基または本明細書で言及される核酸塩基などの置換プリンもしくは置換ピリミジンである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ともに、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｎ（Ｒｅ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−、および−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｓ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｓ−から選択されるビラジカルを示し、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、およびＲｆは、それぞれ、水素、所望により置換されるＣ１〜１２−アルキル、所望により置換されるＣ２〜１２−アルケニル、所望により置換されるＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシアルキル、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡ干渉物質、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、リポーター基、ならびにリガンドから独立して選択され、アリールおよびヘテロアリールは、所望により、置換されてもよく、２つのジェミナルな置換基ＲａおよびＲｂは、ともに、所望により置換されるメチレン（＝ＣＨ２）を示してもよい。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよい。
【０１１２】
さらなる実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ともに、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−、および−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−Ｏ−、ならびに／または−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ＝ＣＨ−から選択されるビラジカル（二価の基）を示す。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよい。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ともに、ビラジカルＣ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−を示し、ＲａおよびＲｂは、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換Ｃ１〜６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換Ｃ１〜６アミノアルキルから成る群から独立して選択され、たとえば水素であり、Ｒｃは、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換Ｃ１〜６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換Ｃ１〜６アミノアルキルから成る群から選択され、たとえば水素である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ともに、ビラジカルＣ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−を示し、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、およびＲｄは、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換Ｃ１〜６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換Ｃ１〜６アミノアルキルから成る群から独立して選択され、たとえば水素である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ビラジカル−ＣＨ（Ｚ）−Ｏ−を形成し、Ｚは、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、置換Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール、または置換チオから成る群から選択され；それぞれの置換基は、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、およびＣＮから独立して選択される保護置換基の群で所望によりモノまたはポリ置換され、Ｊ１、Ｊ２、およびＪ３は、それぞれ、独立して、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＪ１である。いくつかの実施形態では、Ｚは、Ｃ１〜６アルキルまたは置換Ｃ１〜６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｚは、メチルである。いくつかの実施形態では、Ｚは、置換Ｃ１〜６アルキルである。いくつかの実施形態では、前記置換基の群は、Ｃ１〜６アルコキシである。いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ３ＯＣＨ２−である。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよい。そのような二環式ヌクレオチドは、米国特許第７，３９９，８４５号に開示されており、これは、その全体が参照によってこれによって組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３＊は、水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊の一方または両方は、上記にまたはＷＯ２００７／１３４１８１で言及されるように、水素以外のものであってもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ともに、ビラジカル−ＣＨ２Ｎ（Ｒｃ）−から成るまたはそれを含むなど、架橋中に置換アミノ基を含むビラジカルを示し、Ｒｃは、Ｃ１〜１２アルキルオキシである。いくつかの実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ともに、ビラジカル−Ｃｑ３ｑ４−ＮＯＲ−を示し、ｑ３およびｑ４は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換Ｃ１〜６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換Ｃ１〜６アミノアルキルから成る群から独立して選択され；置換基は、それぞれ、独立して、ハロゲン、ＯＪ１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＣＯＯＪ１、ＣＮ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ１Ｊ２、またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｘ＝Ｎ（Ｈ）Ｊ２から独立して選択される置換基の群とモノまたはポリ置換され、Ｘは、ＯまたはＳであり；Ｊ１およびＪ２は、それぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アミノアルキル、または保護基である。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよい。そのような二環式ヌクレオチドは、ＷＯ２００８／１５０７２９に開示されており、これは、その全体（entirity）が参照によってこれによって組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換Ｃ１〜６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換Ｃ１〜６アミノアルキルから成る群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊の一方または両方は、上記にまたはＷＯ２００７／１３４１８１で言及されるように、水素以外のものであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ともに、ビラジカル（二価の基）Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−を示し、ＲａおよびＲｂは、それぞれ、独立して、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、ＯＪ１、ＳＪ１、ＳＯＪ１、ＳＯ２Ｊ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、もしくはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２であり；またはＲａおよびＲｂは、ともに、＝Ｃ（ｑ３）（ｑ４）であり；ｑ３およびｑ４は、それぞれ、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、または置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキルであり；置換基は、それぞれ、独立して、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６���ルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ＯＪ１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２から独立して選択される置換基の群とモノまたはポリ置換され、Ｊ１およびＪ２は、それぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、または保護基である。そのような化合物は、参照によってその全体がこれによって組み込まれるＷＯ２００９００６４７８Ａに開示されている。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ビラジカル−Ｑ−を形成し、Ｑは、Ｃ（ｑ１）（ｑ２）Ｃ（ｑ３）（ｑ４）、Ｃ（ｑ１）＝Ｃ（ｑ３）、Ｃ［＝Ｃ（ｑ１）（ｑ２）］−Ｃ（ｑ３）（ｑ４）、またはＣ（ｑ１）（ｑ２）−Ｃ［＝Ｃ（ｑ３）（ｑ４）］であり；ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４は、それぞれ、独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜１２アルキル、置換Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ２〜１２アルケニル、置換Ｃ１〜１２アルコキシ、ＯＪ１、ＳＪ１、ＳＯＪ１、ＳＯ２Ｊ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２であり；Ｊ１およびＪ２は、それぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アミノアルキル、または保護基であり；所望により、ＱがＣ（ｑ１）（ｑ２）（ｑ３）（ｑ４）であり、ｑ３またはｑ４の一方がＣＨ３である場合、ｑ３もしくはｑ４の他方またはｑ１およびｑ２の一方の少なくとも１つは、Ｈ以外のものである。いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよい。そのような二環式ヌクレオチドは、ＷＯ２００８／１５４４０１に開示されており、これは、その全体が参照によってこれによって組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換Ｃ１〜６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１〜６アミノアルキル、または置換Ｃ１〜６アミノアルキルから成る群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊の一方または両方は、上記にまたはＷＯ２００７／１３４１８１もしくはＷＯ２００９／０６７６４７で言及されるように、水素以外のものであってもよい（アルファＬ−二環式核酸アナログ）。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド化合物中で使用されるＬＮＡは、好ましくは、一般式ＩＩの構造を有する。
【０１１９】
【化３】
2011526482.tif 000015
Ｙは、−Ｏ−、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、Ｎ（Ｒｅ）、および／または−ＣＨ２−から成る群から選択され；ＺおよびＺ＊は、ヌクレオチド間連結、ＲＨ、末端基、または保護基の中で独立して選択され；Ｂは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）を構成し、ＲＨは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択され；Ｒａ、Ｒｂ  Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、所望により、水素、所望により置換されるＣ１〜１２−アルキル、所望により置換されるＣ２〜１２−アルケニル、所望により置換されるＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシアルキル、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡ干渉物質、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、リポーター基、ならびにリガンドから成る群から独立して選択され、アリールおよびヘテロアリールは、所望により、置換されてもよく、２つのジェミナルな置換基ＲａおよびＲｂは、ともに、所望により置換されるメチレン（＝ＣＨ２）を示してもよく；ＲＨは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒａ、Ｒｂ  Ｒｃ、Ｒｄ、およびＲｅは、所望により、水素およびＣ１〜６アルキルから成る群から独立して選択され、たとえばメチルである。すべてのキラル中心について、非対称性の基は、Ｒ配向またはＳ配向で存在していてもよく、たとえば、２つの例示的な立体化学異性体は、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌアイソフォームを含み、これらは、以下のように示されてもよい。
【０１２０】
【化４】
2011526482.tif 000016
【０１２１】
特定の例示的なＬＮＡ単位は、下記に示される。
【０１２２】
【化５−１】
2011526482.tif 000017
【化５−２】
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【０１２３】
用語「チオ−ＬＮＡ」は、上記の一般式中のＹがＳまたは−ＣＨ２−Ｓ−から選択されるロックドヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−立体配置の両方の立体配置をとることができる。
【０１２４】
用語「アミノ−ＬＮＡ」は、上記の一般式中のＹが−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、および−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−から選択されるロックドヌクレオチドを含み、Ｒは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される。アミノ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−立体配置の両方の立体配置をとることができる。
【０１２５】
用語「オキシ−ＬＮＡ」は、上記の一般式中のＹが−Ｏ−を表すロックドヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−立体配置の両方の立体配置をとることができる。
【０１２６】
用語「ＥＮＡ」は、上記の一般式中のＹが−ＣＨ２−Ｏ−であるロックドヌクレオチドを含む（−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子が塩基Ｂに関して２’位に結合される）。Ｒｅは、水素またはメチルである。
【０１２７】
いくつかの例示的な実施形態では、ＬＮＡは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、およびベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、特にベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡから選択される。
【０１２８】
ＲＮアーゼ動員
オリゴマー化合物は、翻訳の立体障害または他の方法によってなど、標的ｍＲＮＡの非ＲＮアーゼ媒介性の分解を介して機能してもよいことが認識されるが、本発明の好ましいオリゴマーは、ＲＮアーゼＨなどのエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）を動員することができる。
【０１２９】
オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列は、連続する７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６ヌクレオチドを含む、連続する少なくとも６、たとえば少なくとも７ヌクレオチド単位、たとえば連続する少なくとも８または少なくとも９ヌクレオチド単位（残基）の領域を含み、これは、相補的な標的ＲＮＡと共に二重鎖を形成した場合、ＲＮアーゼを動員することができることが好ましい。ＲＮアーゼを動員することができる連続配列は、本明細書で記載されるギャップマーと関連して言及される領域Ｂであってもよい。いくつかの実施形態では、領域Ｂなどの、ＲＮアーゼを動員することができる連続配列のサイズは、より大きくてもよく、たとえば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド単位である。
【０１３０】
ＥＰ１２２２３０９は、ＲＮアーゼＨを動員するための能力を決定するために使用されてもよい、ＲＮアーゼＨ活性を決定するためのインビトロ方法を提供する。オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的と共に提供された場合に、それが、ＥＰ１２２２３０９の実施例９１〜９５によって提供される方法論を使用して、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合基を有する等価なＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドの少なくとも１％、たとえば少なくとも５％、たとえば少なくとも１０％または２０％未満のｐｍｏｌ／ｌ／分で測定される初速度を有する場合、ＲＮアーゼＨを動員することができると見なされる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的およびＲＮアーゼＨと共に提供された場合に、ＥＰ１２２２３０９の実施例９１〜９５によって提供される方法論を使用してｐｍｏｌ／ｌ／分で測定されるＲＮアーゼＨ初速度が、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合基を有する等価なＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを使用して決定される初速度の１％未満、たとえば５％未満、たとえば１０％未満または２０％未満である場合、ＲＮアーゼＨを本質的に動員することができないと見なされる。
【０１３２】
他の実施形態では、オリゴマーは、相補的ＲＮＡ標的およびＲＮアーゼＨと共に提供された場合に、ＥＰ１２２２３０９の実施例９１〜９５によって提供される方法論を使用してｐｍｏｌ／ｌ／分で測定されるＲＮアーゼＨ初速度が、２’置換を有さず、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合基を有する等価なＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを使用して決定される初速度の少なくとも２０％、たとえば少なくとも４０％、たとえば少なくとも６０％、たとえば少なくとも８０％である場合、ＲＮアーゼＨを本質的に動員することができると見なされる。
【０１３３】
典型的に、相補的な標的ＲＮＡと共に二重鎖を形成した場合、ＲＮアーゼを動員することができる、連続したヌクレオチド単位を形成するオリゴマーの領域は、ＲＮＡ標的とＤＮＡ／ＲＮＡ様の二重鎖を形成するヌクレオチド単位から成り、ＤＮＡ単位およびアルファ−Ｌ立体配置をとり、アルファ−Ｌ−オキシＬＮＡであることが特に好ましいＬＮＡ単位の両方を含む。
【０１３４】
本発明のオリゴマーは、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含んでいてもよく、ギャップマー、ヘッドマー（ｈｅａｄｍｅｒ）、またはミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）の形態をしていてもよい。
【０１３５】
ヘッドマーは、５’末端の非ＲＮアーゼ動員ヌクレオチド類似体の連続ストレッチ、３’末端に向かってＲＮアーゼによって認識可能で、切断可能である、その後に続くＤＮＡの連続ストレッチまたは修飾ヌクレオチド単位（たとえば、そのような少なくとも７ヌクレオチド）によって規定され、テイルマー（ｔａｉｌｍｅｒ）は、５’末端の、ＲＮアーゼによって認識可能で、切断可能である、ＤＮＡの連続ストレッチまたは修飾ヌクレオチド（たとえば、そのような少なくとも７ヌクレオチド）、その後に続く、３’末端に向かう、非ＲＮアーゼ動員ヌクレオチド類似体の連続ストレッチによって規定される。ミックスマーとして言及される本発明による他のキメラは、ＲＮアーゼによって認識可能で、切断可能である、ＤＮＡまたは修飾ヌクレオチドの代替の組成物および非ＲＮアーゼ動員ヌクレオチド類似体から成る。いくつかのヌクレオチド類似体はまた、ＲＮアーゼＨ結合および切断を媒介することができてもよい。α−Ｌ−ＬＮＡは、ある程度までＲＮアーゼＨ活性を動員するので、ギャップマーコンストラクトのための、ＲＮアーゼＨによって認識可能で、切断可能であるＤＮＡまたは修飾ヌクレオチドのより小さなギャップが、必要とされてもよく、ミックスマーコンストラクションに、より多くの柔軟性が導入されてもよい。
【０１３６】
ギャップマー設計
好ましくは、本発明のオリゴマーは、ギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、本明細書で領域Ｂとして言及される、少なくとも６または７つのＤＮＡヌクレオチドの領域などの、ＲＮアーゼＨなどのＲＮアーゼを動員することができるヌクレオチドの連続ストレッチを含むオリゴマーであり、領域Ｂは、ＲＮアーゼ−を動員することができるヌクレオチドの連続ストレッチの５’および３’側に、１〜６つのヌクレオチド類似体などの親和性増強ヌクレオチド類似体の領域（これらの領域は、それぞれ領域ＡおよびＣとして言及される）が５’および３’の両方に隣接する。
【０１３７】
好ましくは、ギャップマーは、式（５’〜３’）、Ａ−Ｂ−Ｃまたは所望により、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤもしくはＤ−Ａ−Ｂ−Ｃの（ポリ）ヌクレオチド配列を含み、領域Ａ（５’領域）は、ＬＮＡ単位などの、１〜６つのヌクレオチド類似体などの、少なくとも１つのＬＮＡ単位などの、少なくとも１つのヌクレオチド類似体から成るまたはそれを含み；領域Ｂは、ＤＮＡヌクレオチドなどの、ＲＮアーゼを動員することができる（ｍＲＮＡ標的などの相補的ＲＮＡ分子と共に二重鎖を形成した場合）、少なくとも５つの連続したヌクレオチドから成るまたはそれを含み；領域Ｃ（３’領域）は、ＬＮＡ単位などの、１〜６つのヌクレオチド類似体などの、少なくとも１つのＬＮＡ単位などの、少なくとも１つのヌクレオチド類似体から成るまたはそれを含み；領域Ｄは、存在する場合、ＤＮＡヌクレオチドなどの１、２または３つのヌクレオチド単位から成るまたはそれを含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、領域Ａは、３もしくは４つのＬＮＡ単位などの、３もしくは４つのヌクレオチド類似体などの、２〜５つのＬＮＡ単位などの、２〜５つのヌクレオチド類似体などの、ＬＮＡ単位などの、１、２、３、４、５、もしくは６つのヌクレオチド類似体から成り；および／または領域Ｃは、３もしくは４つのＬＮＡ単位などの、３もしくは４つのヌクレオチド類似体などの、２〜５つのＬＮＡ単位などの、２〜５つのヌクレオチド類似体などの、ＬＮＡ単位などの、１、２、３、４、５、もしくは６つのヌクレオチド類似体から成る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、Ｂは、ＲＮアーゼを動員することができる、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２個の連続したヌクレオチドまたは８つなどの６〜１０個のもしくは７〜９つの、ＲＮアーゼを動員することができる連続したヌクレオチドから成るまたはそれを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｂは、１〜１２個のＤＮＡ単位、好ましくは４〜１２個のＤＮＡ単位、７〜１０個のＤＮＡ単位などの、より好ましくは６〜１０個のＤＮＡ単位、最も好ましくは８、９、または１０個のＤＮＡ単位など、少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチド単位から成るまたはそれを含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、領域Ａは、ＬＮＡなどの、３または４つのヌクレオチド類似体から成り、領域Ｂは、７、８、９、または１０個のＤＮＡ単位から成り、領域Ｃは、ＬＮＡなどの、３または４つのヌクレオチド類似体から成る。そのような設計は、（Ａ−Ｂ−Ｃ）３−１０−３、３−１０−４、４−１０−３、３−９−３、３−９−４、４−９−３、３−８−３、３−８−４、４−８−３、３−７−３、３−７−４、４−７−３を含み、ＤＮＡ単位などの、１または２ヌクレオチド単位を有していてもよい領域Ｄをさらに含んでいてもよい。
【０１４１】
さらなるギャップマー設計は、ＷＯ２００４／０４６１６０に開示されており、参照によってこれによって組み込まれる。
【０１４２】
参照によってこれによって組み込まれる米国仮特許出願第６０／９７７４０９号は、「ショートマー（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）」ギャップマーオリゴマーに言及し、これは、いくつかの実施形態では、本発明によるギャップマーオリゴマーであってもよい。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、合計１０、１１、１２、１３、または１４ヌクレオチド単位の連続ヌクレオチド配列から成り、連続ヌクレオチド配列は、式（５’〜３’）、Ａ−Ｂ−Ｃまたは所望により、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤもしくはＤ−Ａ−Ｂ−Ｃであり、Ａは、ＬＮＡ単位などの、１、２、または３つのヌクレオチド類似体単位から成り；Ｂは、相補的ＲＮＡ分子（ｍＲＮＡの標的など）と共に二重鎖を形成した場合、ＲＮアーゼを動員することができる、７、８、または９つの連続ヌクレオチド単位から成り；Ｃは、ＬＮＡ単位などの、１、２、または３つのヌクレオチド類似体単位から成る。存在する場合、Ｄは、単一のＤＮＡ単位から成る。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、Ａは、１つのＬＮＡ単位から成る。いくつかの実施形態では、Ａは、２つのＬＮＡ単位から成る。いくつかの実施形態では、Ａは、３つのＬＮＡ単位から成る。いくつかの実施形態では、Ｃは、１つのＬＮＡ単位から成る。いくつかの実施形態では、Ｃは、２つのＬＮＡ単位から成る。いくつかの実施形態では、Ｃは、３つのＬＮＡ単位から成る。いくつかの実施形態では、Ｂは、７つのヌクレオチド単位から成る。いくつかの実施形態では、Ｂは、８つのヌクレオチド単位から成る。いくつかの実施形態では、Ｂは、９つのヌクレオチド単位から成る。いくつかの実施形態では、Ｂは、２、３、４、５、６、７、または８つのＤＮＡ単位などの、１〜９つのＤＮＡ単位を含む。いくつかの実施形態では、Ｂは、ＤＮＡ単位から成る。いくつかの実施形態では、Ｂは、アルファ−Ｌ−立体配置の２、３、４、５、６、７、８、または９つのＬＮＡ単位などの、アルファ−Ｌ立体配置をとっている、少なくとも１つのＬＮＡ単位を含む。いくつかの実施形態では、Ｂは、少なくとも１つのアルファ−Ｌ−オキシＬＮＡ単位を含み、アルファ−Ｌ−立体配置のＬＮＡ単位はすべて、アルファ−Ｌ−オキシＬＮＡ単位である。いくつかの実施形態では、Ａ−Ｂ−Ｃで存在するヌクレオチドの数は、（ヌクレオチド類似体単位−領域Ｂ−ヌクレオチド類似体単位）：１−８−１、１−８−２、２−８−１、２−８−２、３−８−３、２−８−３、３−８−２、４−８−１、４−８−２、１−８−４、２−８−４または；１−９−１、１−９−２、２−９−１、２−９−２、２−９−３、３−９−２、１−９−３、３−９−１、４−９−１、１−９−４または；１−１０−１、１−１０−２、２−１０−１、２−１０−２、１−１０−３、３−１０−１から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、Ａ−Ｂ−Ｃのヌクレオチドの数は、２−７−１、１−７−２、２−７−２、３−７−３、２−７−３、３−７−２、３−７−４、および４−７−３から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、ＡおよびＣの両方は、それぞれ、２つのＬＮＡ単位から成り、Ｂは、８つまたは９つのヌクレオチド単位、好ましくはＤＮＡ単位から成る。
【０１４５】
ヌクレオチド間連結
用語「連結基」または「ヌクレオチド間連結」は、２つのヌクレオチド、２つのヌクレオチド類似体、ならびに１つのヌクレオチドおよび１つのヌクレオチド類似体などをともに共有結合することができる基を意味するように意図される。特定の好ましい例は、リン酸基およびホスホロチオエート基を含む。
【０１４６】
本発明のオリゴマーのヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、連結基を介してともに連結される。好適には、それぞれのヌクレオチドは、連結基を介して３’の隣接するヌクレオチドに連結される。
【０１４７】
適したヌクレオチド間連結は、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２内に列挙されるもの、たとえば、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２（参照によって本明細書に組み込まれる）の３４ページの第１節に列挙されるヌクレオチド間連結を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、その通常のホスホジエステルから、ホスホロチオエートまたはボラノリン酸−これらの２つはＲＮアーゼＨによって切断可能であるなど、ヌクレアーゼ攻撃に対してより抵抗性であるものにヌクレオチド間連結を修飾すること、標的遺伝子の発現を低下させる際、アンチセンス阻害のその経路を可能にすることもまた好ましい。
【０１４９】
本明細書で提供される、適した硫黄（Ｓ）含有ヌクレオチド間連結が好ましくてもよい。ホスホロチオエートヌクレオチド間連結はまた、特に、ギャップマーのギャップ領域（Ｂ）についても好ましい。ホスホロチオエート結合はまた、フランキング領域に使用されてもよい（ＡおよびＣならびにＡまたはＣをＤに連結するためにならびに領域Ｄ内で、適切なように）。
【０１５０】
しかしながら、領域Ａ、Ｂ、およびＣは、特に、たとえば、領域ＡおよびＣがＬＮＡヌクレオチドを含む場合など、ヌクレオチド類似体の使用により、エンドヌクレアーゼ分解から領域ＡおよびＣ内のヌクレオチド間連結を保護する場合、ホスホジエステル連結などの、ホスホロチオエート以外のヌクレオチド間連結を含んでいてもよい。
【０１５１】
オリゴマー中のヌクレオチド間連結は、標的ＲＮＡのＲＮアーゼＨ切断を可能にするように、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはボラノリン酸であってもよい。ホスホロチオエートは、改善されたヌクレアーゼ抵抗性および製造の容易性などの他の理由で好ましい。
【０１５２】
本発明のオリゴマーの一態様では、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート基の手段によって互いに連結される。
【０１５３】
１または２つの連結などのホスホジエステル連結の、特に、ヌクレオチド類似体単位の間のまたはそれに隣接する、他の場合にはホスホロチオエートオリゴマーへの包含（典型的に領域ＡまたはＣ中）は、オリゴマーの生物学的利用率および／または体内分布を修飾することができることが認識される。参照によってこれによって組み込まれるＷＯ２００８／０５３３１４を参照されたい。
【０１５４】
上記に言及される実施形態などのいくつかの実施形態では、適しており、特に示されない場合、残りの連結基はすべて、ホスホジエステルもしくはホスホロチオエートまたはその混合物のいずれかである。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間連結基はすべて、ホスホロチオエートである。
【０１５６】
本明細書で提供されるものなどの、特異的なギャップマーオリゴヌクレオチド配列に対して言及する場合、様々な実施形態では、連結が、ホスホロチオエート結合である場合、本明細書で開示されるものなどの代替の連結が、使用されてもよい、たとえば、リン酸（ホスホジエステル）連結が、特に、ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の間の連結について使用されてもよいことが理解されるであろう。同様に、本明細書で提供されるものなどの、特異的なギャップマーオリゴヌクレオチド配列に対して言及する場合、Ｃ残基が、様々な実施形態で、５’メチル修飾シトシンとして注釈をつけられる場合、オリゴマー中に存在する、１つまたは複数のＣは、いくつかの実施形態では、非修飾Ｃ残基であってもよい。
【０１５７】
オリゴマー化合物
本発明のオリゴマーの配列は、たとえば、配列番号１〜２６２および２６４〜２９０から成る群から選択されてもよい。
【０１５８】
コンジュゲート
文脈中で、用語「コンジュゲート」は、本明細書で記載されるオリゴマーの、１つまたは複数の非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分への共有結合（「コンジュゲーション」）によって形成される異種分子を示すように意図される。非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分の例は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはその組み合わせなどの高分子作用物質を含む。典型的に、タンパク質は、標的タンパク質に対する抗体であってもよい。典型的なポリマーは、ポリエチレングリコールであってもよい。
【０１５９】
そのため、様々な実施形態では、本発明のオリゴマーは、典型的にヌクレオチドの連続配列から成るポリヌクレオチド領域およびさらなる非ヌクレオチド領域の両方を含んでいてもよい。連続ヌクレオチド配列から成る本発明のオリゴマーに対して言及する場合、化合物は、コンジュゲート成分などの非ヌクレオチド成分を含んでいてもよい。
【０１６０】
本発明の様々な実施形態では、オリゴマー化合物は、リガンド／コンジュゲートに連結され、これらは、たとえば、オリゴマー化合物の細胞の取り込みを増加させるために使用されてもよい。ＷＯ２００７／０３１０９１は、適したリガンドおよびコンジュゲートを提供し、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
本発明はまた、本明細書で記載される、本発明による化合物を含むコンジュゲートおよび前記化合物に共有結合された少なくとも１つの非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分をも提供する。そのため、本発明の化合物が本明細書で開示される、明示される核酸またはヌクレオチド配列から成る様々な実施形態では、化合物はまた、前記化合物に共有結合される、少なくとも１つの非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分を含んでいてもよい（たとえば、１つまたは複数のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まない）。
【０１６２】
コンジュゲーション（Conjugation）（コンジュゲート部分との）は、本発明のオリゴマーの活性、細胞の分布、または細胞の取り込みを増強してもよい。そのような部分は、抗体、ポリペプチド、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、たとえばヘキシル−ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪鎖、たとえばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、たとえばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ｈ−ホスホン酸、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むが、これらに限定されない。
【０１６３】
本発明のオリゴマーはまた、活性薬物質、たとえばアスピリン、イブプロフェン、サルファ薬、抗糖尿病薬、抗菌薬、または抗生物質にコンジュゲートされてもよい。
【０１６４】
ある実施形態では、コンジュゲート部分は、コレステロールなどのステロールである。
【０１６５】
様々な実施形態では、コンジュゲート部分は、たとえば、長さが３〜１０個などの、２〜２０個などの１〜５０個のアミノ酸残基の正電荷ペプチドなどの正電荷ポリマーおよび／またはポリエチレングリコール（polyethylglycol）（ＰＥＧ）もしくはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドを含むまたはそれから成る。参照によってこれによって組み込まれるＷＯ２００８／０３４１２３を参照されたい。好適には、ポリアルキレンオキシドなどの正電荷ポリマーは、ＷＯ２００８／０３４１２３に記載される遊離可能なリンカー（inker）などのリンカーを介して本発明のオリゴマーに結合されてもよい。
【０１６６】
例として、以下のコンジュゲート部分は、本発明のコンジュゲート中に使用されてもよい。
【０１６７】
【化６】
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【０１６８】
活性化オリゴマー
本明細書で使用される用語「活性化オリゴマー」は、１つまたは複数のコンジュゲート部分、つまりそれら自体、核酸またはモノマーでない部分へのオリゴマーの共有結合を可能にし、本明細書で記載されるコンジュゲートを形成する、少なくとも１つの機能部分に共有結合される（つまり機能性の）本発明のオリゴマーを指す。典型的に、機能部分は、たとえば３’−ヒドロキシル基またはアデニン塩基の環外のＮＨ２基を介してオリゴマーに共有結合することができる化学基、好ましくは親水性であるスペーサー、およびコンジュゲート部分に結合することができる末端基（たとえばアミノ基、スルフヒドリル基、またはヒドロキシル基）を含むであろう。いくつかの実施形態では、この末端基は、保護されない、たとえばＮＨ２基である。他の実施形態では、末端基は、たとえば、"Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載されるものなどの任意の適した保護基によって保護される。適したヒドロキシル保護基の例は、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチルなどのアラルキル基、およびテトラヒドロピラニルを含む。適したアミノ保護基の例は、ベンジル、アルファ−メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、第三級ブトキシカルボニル、およびトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルなどのアシル基を含む。いくつかの実施形態では、機能部分は、自己切断性である。他の実施形態では、機能部分は、生分解性である。たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８７，２２９号を参照されたい。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、オリゴマーの５’末端とのコンジュゲート部分の共有結合を可能にするために５’末端で機能性である。他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、３’末端で機能性となることができる。他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、バックボーンに沿ってまたはヘテロ環式塩基部分上で機能性となることができる。他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、５’末端、３’末端、バックボーン、および塩基から独立して選択される、１つを超える位置で機能性となることができる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本発明の活性化オリゴマーは、機能部分に共有結合される、１つまたは複数のモノマーを合成の間に組み込むことによって合成される。他の実施形態では、本発明の活性化オリゴマーは、機能性でなかったモノマーと共に合成され、オリゴマーは、合成の完成に際して機能性となる。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、アミノアルキルリンカーを含有するヒンダード(hindered)エステルと共に機能性となり、アルキル部分は、式（ＣＨ２）ｗを有し、ｗは、１〜１０の範囲の整数、好ましくは約６であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖または分枝鎖とすることができ、官能基は、エステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＮＨ）を介してオリゴマーに結合される。
【０１７１】
他の実施形態では、オリゴマーは、（ＣＨ２）ｗ−スルフヒドリル（ＳＨ）リンカーを含有するヒンダードエステルと共に機能性となり、ｗは、１〜１０の範囲の整数、好ましくは約６であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖または分枝鎖とすることができ、官能基は、エステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＳＨ）を介してオリゴマーに結合される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドは、ポリエチレングリコールまたはペプチドなどのポリマー部分とコンジュゲートされる（ジスルフィド結合の形成を介して）。
【０１７３】
上記に記載されるヒンダードエステルを含有する活性化オリゴマーは、当技術分野で知られている任意の方法、特に、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２００８／０３４１２２に開示される方法およびその中の実施例によって合成することができる。
【０１７４】
他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、実質的に米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に記載される機能試薬、つまり、保護または非保護スルフヒドリル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含む反対の末端に親水性スペーサー鎖を通して連結される、一方の末端にホスホラミダイトを有する実質的に線状の試薬の手段によって、オリゴマーの中へスルフヒドリル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を導入することによって機能性となる。そのような試薬は、主として、オリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの実施形態では、そのような活性化オリゴマーは、オリゴマーの５’−ヒドロキシル基に結合される機能試薬を有する。他の実施形態では、活性化オリゴマーは、３’−ヒドロキシル基に結合される機能試薬を有する。他の実施形態では、本発明の活性化オリゴマーは、オリゴマーのバックボーン上のヒドロキシル基に結合される機能試薬を有する。さらなる実施形態では、本発明のオリゴマーは、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に記載される、１つを超える機能試薬と共に機能性となる。そのような機能試薬を合成し、モノマーまたはオリゴマーの中へそれらを組み込むための方法は、米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に開示される。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、固相結合オリゴマーの５’末端は、ジエニルホスホラミダイト誘導体と共に機能性となり、脱保護オリゴマーと、ディールス−アルダー環化付加反応を介した、たとえばアミノ酸またはペプチドとのコンジュゲートが後に続く。
【０１７６】
様々な実施形態では、オリゴマーの中への、２’−カルバメート置換糖または２’−（Ｏ−ペンチル−Ｎ−フタルイミド）−デオキシリボース糖などの２’糖修飾を含有するモノマーの組み込みは、オリゴマーの糖とコンジュゲート部分の共有結合を促進する。他の実施形態では、１つまたは複数のモノマーの２’位にアミノ含有リンカーを有するオリゴマーは、たとえば５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（ｅ−フタルイミジルアミノペンチル）−２’−デオキシアデノシン−３’−−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエトキシホスホラミダイトなどの試薬を使用して調製される。たとえばManoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171を参照されたい。
【０１７７】
さらなる実施形態では、本発明のオリゴマーは、Ｎ６プリンアミノ基上、グアニンの環外Ｎ２上、またはシトシンのＮ４もしくは５位上を含む核酸塩基上にアミン含有機能部分を有していてもよい。様々な実施形態では、そのような機能化は、オリゴマー合成で既に機能性の市販の試薬を使用することによって達成されてもよい。
【０１７８】
いくつかの機能部分は、市販で入手可能であり、たとえば、ヘテロ二機能性およびホモ二機能性の連結部分は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．）から入手可能である。他の市販の連結基は、５’−アミノ−修飾因子Ｃ６および３’−アミノ−修飾因子試薬であり、共に、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖａ．）から入手可能である。アミノ連結−２および３’−アミノ−修飾因子はまた、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）からも入手可能であるように、５’−アミノ−修飾因子Ｃ６はまた、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）からも入手可能である。
【０１７９】
組成物
本発明のオリゴマーは、医薬製剤および医薬組成物で使用されてもよい。好適には、そのような組成物は、薬学的に許容できる希釈剤、担体、塩、またはアジュバントを含む。ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２は、適した、好ましい薬学的に許容できる希釈剤、担体、およびアジュバントを提供し、これらは、参照によってこれによって組み込まれる。適した投薬量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた、参照によってこれによって組み込まれるＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２で提供される。
【０１８０】
適用
本発明のオリゴマーは、たとえば診断薬、治療薬、および予防法のための研究試薬として利用されてもよい。
【０１８１】
研究では、そのようなオリゴマーは、細胞および実験動物中でのｍｔＧＰＡＴ１タンパク質の合成を特異的に阻害するために使用されてもよく（典型的に、ｍＲＮＡを分解しまたは阻害し、それによってタンパク質形成を予防することによって）、それによって、標的の機能分析または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を促進する。
【０１８２】
診断薬では、オリゴマーは、ノーザンブロッティング、インサイツハイブリダイゼーション、または類似した技術によって、細胞および組織中のｍｔＧＰＡＴ１発現を検出し、定量するために使用されてもよい。
【０１８３】
治療薬について、ｍｔＧＰＡＴ１の発現を調整することによって治療することができる疾患または障害を有する疑いがある動物またはヒトは、本発明に従ってオリゴマー化合物を投与することによって治療される。さらに、本発明のオリゴマーまたは組成物の１つまたは複数の治療有効量または予防有効量を投与することによって、ｍｔＧＰＡＴ１の発現と関連する疾患または状態を有する疑いがある、またはその傾向があるヒトを治療するなど、哺乳動物を治療するための方法が提供される。
【０１８４】
本発明はまた、本明細書で言及される障害を治療するための医薬の製造のためのまたは本明細書で言及される障害の治療の方法のための、記載される、本発明の化合物またはコンジュゲートの使用を提供する。
【０１８５】
本発明はまた、本明細書で言及される障害を治療するための方法であって、その必要性のある患者に、本明細書で記載される本発明による化合物および／または本発明によるコンジュゲートおよび／または本発明による医薬組成物を投与するステップを含む方法もまた提供する。
【０１８６】
医療適用
本発明によるオリゴマーおよび他の組成物は、ｍｔＧＰＡＴ１の突然変異バージョンの過剰発現または発現と関連する状態の治療に使用することができる。
【０１８７】
本発明は、本明細書で言及される疾患、障害、または状態を治療するための医薬の製造における本発明の化合物の使用をさらに提供する。
【０１８８】
概説するならば、本発明の一態様は、異常レベルのｍｔＧＰＡＴ１と関連する状態に罹患している、またはそれにかかりやすい哺乳動物を治療するための方法であって、１つまたは複数のＬＮＡ単位を含む、ｍｔＧＰＡＴ１を標的とするオリゴマーの治療有効量を哺乳動物に投与するステップを含む方法に関する。
【０１８９】
本明細書で言及される疾患または障害は、いくつかの実施形態では、ｍｔＧＰＡＴ１遺伝子またはそのタンパク質産物がｍｔＧＰＡＴ１と関連もしくは相互作用する遺伝子中の突然変異と関連していてもよい。そのため、いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡは、ｍｔＧＰＡＴ１配列の突然変異形態である。
【０１９０】
本発明の興味ある態様は、本明細書で言及される疾患、障害、または状態を治療するための医薬の調製のための、本明細書に記載のオリゴマー（化合物）および本明細書に記載のコンジュゲートの使用に関する。
【０１９１】
本発明の方法は、好ましくは、異常レベルのｍｔＧＰＡＴ１によって引き起こされる疾患に対する治療または予防法のために利用される。
【０１９２】
その代わりとして述べると、いくつかの実施形態では、本発明は、異常レベルのｍｔＧＰＡＴ１を治療するための方法であって、その必要性のある患者に、本発明のオリゴマーまたは本発明のコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物を投与するステップを含む方法にさらに関する。
【０１９３】
本発明はまた、医薬として使用するための、本明細書に記載のオリゴマー、組成物、またはコンジュゲートにも関する。
【０１９４】
本発明は、異常レベルのｍｔＧＰＡＴ１またはｍｔＧＰＡＴ１の突然変異体形態（本明細書で言及される疾患の１つと関連するものなどの対立遺伝子変異体などの）の発現を治療するための医薬の製造のための、本明細書に記載の化合物、組成物、またはコンジュゲートの使用にさらに関する。
【０１９５】
さらに、本発明は、本明細書で言及されるものなどの疾患または状態に罹患している対象を治療するための方法に関する。
【０１９６】
治療を必要としている患者は、疾患または障害に罹患している、またはそれに罹患する可能性がある患者である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される用語「治療」は、既存の疾患（たとえば本明細書で言及される疾患もしくは障害）の治療または疾患の予防、つまり予防法の両方を指す。そのため、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であってもよいことが認識されるであろう。
【０１９８】
実施形態
本発明の以下の実施形態は、本明細書で記載される他の実施形態と組み合わせて使用されてもよい。
１．合計１０〜３０のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、長さが１０〜３０のヌクレオチドのオリゴマーであって、前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号２６３またはその天然の変異体などの哺乳動物ｍｔＧＰＡＴ１遺伝子またはｍＲＮＡの逆相補配列に対応する領域と少なくとも８０％相同であるオリゴマー。
２．連続ヌクレオチド配列は、配列番号２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、および２９０のいずれかに対応する領域と少なくとも８０％相同である、実施形態１に記載のオリゴマー。
３．連続ヌクレオチド配列は、配列番号２６３の対応する領域の逆相補配列とミスマッチを含まないまたは１つまたは２つ以下のミスマッチを含む、実施形態１または２に記載のオリゴマー。
４．オリゴマーのヌクレオチド配列は、連続ヌクレオチド配列から成る、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のオリゴマー。
５．連続ヌクレオチド配列は、長さが１０〜１８個のヌクレオチドである、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のオリゴマー。
６．連続ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド類似体を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のオリゴマー。
７．連続ヌクレオチドは、配列番号１〜２６２のいずれか１つを含むかまたはそれから成る、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のオリゴマー。
８．ヌクレオチド類似体は、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位から成る群から選択される糖修飾ヌクレオチドなどの糖修飾ヌクレオチドである、実施形態６または７に記載のオリゴマー。
９．ヌクレオチド類似体は、ＬＮＡである、実施形態６または７に記載のオリゴマー。
１０．ギャップマーである、実施形態６〜９のいずれか１つに記載のオリゴマー。
１１．オリゴマーは、配列番号２、３３、１２５、１４２、１４７、１６９、１７６、１８２、２１４、２４９、２５０、および２５４のいずれか１つである、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のオリゴマー。
１２．ｍｔＧＰＡＴ１遺伝子またはｍＲＮＡを発現している細胞中のｍｔＧＰＡＴ１遺伝子またはｍＲＮＡの発現を阻害する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のオリゴマー。
１３．実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のオリゴマーおよび前記オリゴマーに共有結合された少なくとも１つの非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲート。
１４．実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のオリゴマーまたは実施形態１３に記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容できる希釈剤、担体、塩、またはアジュバントを含む医薬組成物。
１５．過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を治療するためなど、医薬として使用するための、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のオリゴマーまたは実施形態１３に記載のコンジュゲート。
１６．過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を治療するための医薬の製造のための、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のオリゴマーまたは実施形態１３に記載のコンジュゲートの使用。
１７．過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を治療するための方法であって、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のオリゴマーまたは実施形態１３に記載のコンジュゲートまたは請求項１４に記載の医薬組成物を、過体重、肥満症、脂肪肝、肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に罹患している、またはそれに罹患する可能性がある患者に投与するステップを含む方法。
１８．ｍｔＧＰＡＴ１を発現している細胞中のｍｔＧＰＡＴ１を阻害するための方法であって、前記細胞中のｍｔＧＰＡＴ１を阻害するために、前記細胞に、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のオリゴマーまたは実施形態１３に記載のコンジュゲートを投与するステップを含む方法。
【実施例】
【０１９９】
ＬＮＡモノマーおよびオリゴヌクレオチドの合成は、ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０７０３の実施例１および２で言及される方法論を使用して実行した。
【０２００】
ヒトまたはラットの血漿中のＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性は、ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０７０３の実施例４で言及される方法論を使用して実行する。
【０２０１】
インビトロモデル；ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成は、ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０７０３の実施例７で言及される方法論を使用して実行する。
【０２０２】
ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０７０３の上記に言及される実施例は、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。
【０２０３】
［実施例１］
インビトロモデル：細胞培養
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、様々な細胞型のいずれかで試験することができ、ただし、標的核酸が測定可能なレベルで存在する。標的は、内因的にまたは前記核酸をコードする核酸の一過性のもしくは安定したトランスフェクションによって発現することができる。
【０２０４】
標的核酸の発現レベルは、常法に従って、たとえばノーザンブロット分析、定量ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を使用して決定することができる。以下の細胞型は、例示的な目的のために提供されるが、他の細胞型を常法に従って使用することができ、ただし、標的が選ばれた細胞型中で発現される。
【０２０５】
細胞は、下記に記載される適切な培地中で培養し、９５〜９８％の湿度および５％のＣＯ２で３７℃で維持した。細胞は、毎週２〜３回、常法に従って継代培養した。
【０２０６】
ＬＴＫ−Ｄ２：マウス線維芽細胞細胞株ＬＴＫ−Ｄ２は、ＡＴＣＣから購入し、１０％ＦＢＳ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ＋非必須アミノ酸＋ゲンタミシンを有するＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。
【０２０７】
ＨｕＨ７：ヒト肝細胞株ＨｕＨ７は、ＡＴＣＣから購入し、１０％ＦＢＳ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ＋非必須アミノ酸＋ゲンタミシンを有するイーグルＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で培養した。
【０２０８】
［実施例２］
インビトロモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる処理
細胞培養およびトランスフェクション：ＨｕＨ７またはＬＴＫ−Ｄ２の２．５×１０５または４×１０５細胞をそれぞれ、１０％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ、およびゲンタミシンを補足した増殖培地中で、３７℃（５％ＣＯ２）で、６ウェルプレートのそれぞれのウェル中に接種した。細胞が６０〜７０％のコンフルエントとなったら、それらは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（５μｇ／ｍｌ）を使用し、異なる濃度のオリゴヌクレオチド（０．０４〜２５ｎＭ）を用いて、二通りでトランスフェクトした。トランスフェクションは、本質的にDean et al.（1994, JBC 269:16416-16424）に記載されるように実行した。手短に言えば、細胞は、ＯｐｔｉＭＥＭ中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅと共に１０分間インキュベートし、その後、ウェル当たり０．５ｍｌトランスフェクションミックスの総容量までオリゴヌクレオチドを追加した。４時間後に、トランスフェクションミックスは除去し、細胞は、洗浄し、約２０時間、３７℃で成長させた（適切な増殖培地中でのｍＲＮＡ分析およびタンパク質分析）。次いで、細胞は、タンパク質分析およびＲＮＡ分析のために採取した。
【０２０９】
［実施例３］
インビトロおよびインビボモデル：リアルタイムＰＣＲによるｍｔＧＰＡＴ１発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
ｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ分析
治療サンプルおよび未治療サンプル中の相対的なマウスｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡレベルを決定するために、生成したｃＤＮＡを、７５００Ｆａｓｔ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する定量ＰＣＲ分析で使用した。
【０２１０】
ｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡの定量は、市販で入手可能なＴａｑＭａｎアッセイおよび試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実行した。手短に述べると、４μｌの第１のｃＤＮＡ鎖（ヌクレアーゼなしの水中で１５回希釈した）を、０．５μｌ  ２０×プライマープローブミックス（ｍｔＧＰＡＴ１またはＧＡＰＤＨ）を補足した６μｌ  Ｔａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックス（２×）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に追加した。
【０２１１】
偽トランスフェクト細胞ｃＤＮＡ反応の２倍ｃＤＮＡ希釈シリーズは（サンプル中よりも２．５倍多い全ＲＮＡを使用）、増幅の線形範囲（Ｃｔ対相対的なコピー数）を確認するために標準として用いた。それぞれのサンプルは、ＰＣＲプログラムを使用して二通りで分析した：９５℃、２０秒間、その後に続く４０サイクルの９５℃、３秒間、６０℃、３０秒間。
【０２１２】
相対的な量のｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、計算した閾値サイクルから決定した。
【０２１３】
分析の結果を図１に示す。データは、偽トランスフェクト細胞に対するダウンレギュレーションパーセンテージとして示す。転写定常状態は、リアルタイムＰＣＲによってモニターし、ＧＡＰＤＨ転写定常状態に標準化した。
【０２１４】
［実施例４］
インビボモデル；ｍｔＧＰＡＴ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる治療の後の実験動物での肝臓脂質含有量の分析
１つまたはいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子をインビボ実験での評価のために選択することとする。選択プロセスは、それぞれの分子の１用量の後の、ｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡのダウンレギュレーションの点からのオリゴヌクレオチド分子についての選択の効率の初期のスクリーニング（スクリーニングの間の典型的なオリゴヌクレオチド濃度は５〜２５ｍｇ／ｋｇとする）を含むが、これに限定されず、その後に、１つまたはいくつかの選択したオリゴヌクレオチド分子に関する用量応答研究が続き、用量／週の濃度および数は、ｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡの効率的で安定したダウンレギュレーションおよびそれに関連する生物学的効果に対して可能性のある、用量の最も低い濃度および数を決定するために最適化される（以下を参照されたい）。
【０２１５】
動物実験は、これらに限定されないが、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ、ＮＭＲＩ、または他の脂質感受性のマウスなどの異なるマウス系統でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの血管内注射または皮下注射で実行することとする。動物は、研究の期間、標準固形飼料もしくは高脂肪食で飼育することとする、または治療を始める前に高脂肪食で、次いで治療の期間の間、標準固形飼料で飼育することとする。動物のある群は、参照／対照として使用する食塩水を用いて治療することとする。
【０２１６】
実験の終了の後に、肝臓などの標的器官は、解剖し、液体窒素中で急速冷凍することとする。それぞれの組織の部分標本は、ｍｔＧＰＡＴ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現についてならびに他の関係のあるタンパク質の発現について分析することとする。脂質蓄積は、組織の脂質抽出物のＨＰＴＬＣ（高性能薄層クロマトグラフィー）分析によって評価することとする。脂質抽出物は、十分に確立された標準プロトコール（Ｂｌｉｇｈｔ  Ｄｙｅｒ脂質抽出）を使用して、実行することとする。脂質蓄積は、組織質量または組織タンパク質含有量に対して標準化した脂質含有量と共に、組織脂質抽出物中の中性脂質（トリアシルグリセロール、コレステロールエステル、および遊離コレステロール）の定量によって評価することとする。対照を上回るレベルの中性脂質の肝臓蓄積は、脂肪肝／肝臓脂肪症と考えられるであろう。肝臓脂質蓄積はまた、組織脂質含有量の評価のための十分に確立された技術である、組織切片のオイルレッドＯ染色によって確証することとする。
【０２１７】
［実施例５］
インビボモデル；ｍｔＧＰＡＴ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる治療の後の実験動物での血漿脂質、リポタンパク質、および炎症マーカーの含有量の分析
これらの分析は、実施例４に概説されるものと同じ実験動物から収集するサンプル中で実行することとする。
【０２１８】
治療の間または実験の終了の後に、実験動物からの血漿または血清は、収集し、直接分析しまたはプロテアーゼ阻害剤のカクテルと混合し、分析まで−８０℃で保存することとする。部分標本は、メーカーの指示に従って標準プロトコールを使用する比色酵素ベースの分析を使用して、総コレステロールおよび総トリグリセリド含有量について分析することとする（ＡＢＸ  Ｐｅｎｔｒａ、Ｈｏｒｉｂａ、Ｆｒａｎｃｅ）。サンプルはまた、なおまたメーカーの指示に従って標準プロトコールを使用して、リポタンパク質脂質分布について分析することとする（Ｓｅｂｉａ、Ｆｒａｎｃｅ）。
【０２１９】
組織中の脂質蓄積は、脂肪毒性の一部として言及されることが多いプロセスである炎症反応を始める可能性がある。血清／血漿への炎症誘発サイトカインの分泌の定量は、組織炎症のモニタリングの手段として使用することができる。実験動物からの血清または血漿中の炎症促進性サイトカインおよび抗炎症サイトカインのレベルは、メーカーの指示に従って標準プロトコールを使用するＥＬＩＳＡまたはＬｕｍｉｎｉｘ（Ｌｕｍｉｎｉｘ）法によって分析することとする。サイトカイン分析は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＳＡＡの血漿または血清レベルの定量を含むこととする。
【０２２０】
［実施例６］
メスＣ５７ＢＬ／６マウス中の肝臓ｍｔＧＰＡＴ  ｍＲＮＡ発現のインビボダウンレギュレーション
肝臓ｍｔＧＰＡＴ  ｍＲＮＡ発現に対する５つの異なるｍｔＧＰＡＴアンチセンスオリゴマー、配列番号３３、１２５、１４７、１７６、および２４９の効果を試験した。メスＣ５７ＢＬ／６マウスに、９日目の実験の終了の前に１５ｍｇ／ｋｇでそれぞれの化合物を３回（０、３、および７日目）注射し、最後の注射の４８時間後に注射した。肝臓ｍＲＮＡは、単離し、ｍｔＧＰＡＴ１およびＧＡＰＤＨについてのＲＴ−ＰＣＲは、ｃＤＮＡ合成の後に実行した。図２中に示すデータは、食塩水を注射した対照動物中のｍｔＧＰＡＴ１／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの濃度のパーセントとして、ｍｔＧＰＡＴ１／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの濃度として表現する。
【図１−Ａ】
2011526482.tif 000020
【図１−Ｂ】
2011526482.tif 000021
【図２】
2011526482.tif 000022
【配列表】
2011526482000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月2日(2011.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011526482000001.app
【国際調査報告】
2011526482.tif 000029