(57)【要約】セルロース材料を含めた複雑な植物性多糖を燃料および他の化学物質に変換するための方法が開示される。好適な実施形態では、この方法は、２種以上の微生物による植物性多糖の連続加水分解を含む。さらなる好適な実施形態では、この方法は、１つの生物によって、植物性多糖をより短い鎖の多糖または他の化合物に変換することを含み、次いでこれは、別の生物によって基質として使用されて所望の化合物を生成する。他の好適な実施形態では、この方法は、セルロース分解性好気性微生物による植物性多糖の連続加水分解、および嫌気性微生物による加水分解産物の発酵を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノールおよび他の化学物質を作製するためのプロセスであって、
植物性多糖を含む、前処理されたバイオマス由来材料を提供する工程と、
酸素の存在下で、該前処理されたバイオマス由来材料に、セルロース分解性好気性微生物を含む第１の培養物を接種して、好気性ブロスを生成する工程であって、該好気性微生物は、該植物性多糖を少なくとも部分的に加水分解できる工程と、
該セルロース分解性好気性微生物が、該酸素の少なくとも一部を消費し、そして該植物性多糖の少なくとも一部を加水分解するまで、該好気性ブロスをインキュベートし、それによって該好気性ブロスを、発酵性糖を含む加水分解産物を含む嫌気性ブロスに変換する工程と、
該嫌気性ブロスに、発酵性糖をエタノールおよび他の化学物質に変換できる嫌気性微生物を含む第２の培養物を接種する工程と、
該発酵性糖の少なくとも一部がエタノールおよび他の化学物質に変換されるまで、該接種された嫌気性ブロスを発酵させる工程と
を含むプロセス。
【請求項２】
前記エタノールの少なくとも一部が、前記発酵した嫌気性ブロスから回収される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
残存する発酵性糖および細胞内容物を含む溶解産物を生成するために、前記発酵した嫌気性ブロス中の前記好気性および嫌気性微生物を溶解させる工程をさらに含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記溶解産物を追加の物理的および／または化学的処理に供する工程をさらに含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記溶解産物に、前記残存する発酵性糖のエタノールおよび他の化学物質への変換を加速させることができる別の微生物および／または酵素カクテルを接種する工程をさらに含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項６】
燃料として適している材料を作製するためのプロセスであって、
多糖を含む植物由来材料を提供する工程と、
該植物由来材料に、セルロース分解性好気性微生物を含む第１の培養物を接種して、ブロスを生成する工程であって、該好気性微生物は、該多糖を少なくとも部分的に加水分解できる工程と、
該多糖の少なくとも一部が１つまたは複数の糖種に加水分解されるように、酸素の存在下で該ブロスをインキュベートする工程と、
該ブロスを嫌気性ブロスに変換するように該酸素の濃度を低減する条件下で該ブロスをインキュベートする工程と、
該嫌気性ブロスに、該１つまたは複数の糖種を、燃料として適した材料に変換できる嫌気性微生物を含む第２の培養物を接種する工程と、
該接種された嫌気性ブロスを発酵させて、燃料として適した材料を生成する工程と
を含むプロセス。
【請求項７】
燃料として適した前記材料の少なくとも一部を、前記発酵した嫌気性ブロスから回収する、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記発酵した嫌気性ブロス中の前記好気性および嫌気性微生物を溶解させて、細胞内の糖および細胞内容物を含む溶解産物を生成する工程をさらに含む、請求項６または７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記溶解産物を追加の物理的および／または化学的処理に供する工程をさらに含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記溶解産物に別の微生物を接種する工程をさらに含む、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
セルロース分解性好気性微生物を接種する前に、前記植物由来材料が前処理される、請求項６に記載のプロセス。
【請求項１２】
燃料として適した前記材料がエタノールを含む、請求項６に記載のプロセス。
【請求項１３】
エタノールおよび他の化学物質を作製するためのプロセスであって、
植物性多糖を含むバイオマス由来材料を提供する工程と、
該植物性多糖の少なくとも一部を加水分解するために、嫌気性条件下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの細胞を含む第１の培養物を用いて該バイオマス由来材料をインキュベートする工程であって、該培養物の該細胞が、加水分解した植物性多糖の少なくとも一部を細胞内化合物として取り込む工程と、
溶解したブロスを生成するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの該細胞を溶解させる工程と、
発酵性糖をエタノールおよび／または他の化学物質に変換できる嫌気性微生物を含む第２の培養物を、該溶解したブロスに接種する工程と、
該発酵性糖の少なくとも一部が、エタノールおよび／または他の化学物質に変換されるまで、該接種された嫌気性ブロスを発酵させる工程と
を含むプロセス。
【請求項１４】
生物燃料を製造する方法であって、
閉じた容器内で、嫌気性条件下でバイオマス材料を提供する工程であって、該バイオマスは、外部から供給される化学物質または酵素で処理されていない工程と、
遺伝的に改変されていない嫌気性菌の第１の培養物を用いて該バイオマスを処理する工程であって、該遺伝的に改変されていない嫌気性菌は、該バイオマスの少なくとも一部を単糖および二糖に変換する工程と、
偏性好気性菌ではない微生物の第２の培養物を用いて該バイオマスを処理する工程であって、該単糖および二糖が生物燃料に変換される工程と
を含む方法。
【請求項１５】
遺伝的に改変されていない細菌の前記第１の培養物がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
微生物の前記第２の培養物が、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚ．  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃ．  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
残存する発酵性糖および細胞内容物を含む溶解産物を生成するために、前記発酵した嫌気性ブロス中の前記好気性微生物を溶解させる工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶解産物を追加の物理的および／または化学的処理に供する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記残留バイオマスおよび培養物から前記変換された生物燃料を分離し、回収する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記バイオマスが、セルロースおよびヘミセルロースを含有する材料を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオマスがリグニンを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記リグニン含有バイオマスの少なくとも一部を加水分解するのに十分な濃度でアルカリ水溶液と前記バイオマスを接触させる工程と、前記処理されたバイオマスをｐＨ７〜８に中和する工程とをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２３】
生物燃料を製造する方法であって、セルロースならびにヘミセルロースを含有する植物材料を含むバイオマスを、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓならびに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓからなる群から選択される第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種の共培養物の存在下で、中温性条件下で発酵に供する工程を含み、該培養物の比が、セルロース：エタノールおよびヘミセルロース：エタノールの変換比が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたは該第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種を単独で使用して得られる比より大きい量である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／０３２，０４８号の利益を主張し、この米国仮特許出願は本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
再生可能で持続可能なバイオマス資源から使用可能なエネルギーを製造する方法を開発することにおいて関心がもたれている。炭水化物の形態でのエネルギーは、廃棄バイオマス、および穀物（例えば、トウモロコシもしくはコムギ）、または草（例えば、スイッチグラス）などの専用のエネルギー作物において見出すことができる。セルロース材料およびリグノセルロース材料は、いくつかの用途において大量に生成、加工、および使用される。
【０００３】
現在の課題は、炭水化物を使用可能なエネルギー形態に変換するための実行可能で経済的なストラテジーを開発することである。炭水化物から有用なエネルギーを得るためのストラテジーには、エタノール（「セルロースエタノール」）および他のアルコール（例えば、ブタノール）の生成、炭水化物の水素への変換、ならびに燃料電池による炭水化物の電気的エネルギーへの直接変換が含まれる。例えば、バイオマスエタノールストラテジーは、ＤｉＰａｒｄｏ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｕｔｌｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｎｄ  （ＥＴＡ  Ｆｏｒｅｃａｓｔｓ）、２００２年；非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；およびＬｙｎｄら、「Ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ：  Ａｎ  Ｕｐｄａｔｅ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻：５７７〜５８３頁、２００５年によって記載されている。
【０００４】
穀物および糖からエタノールを製造することは周知であるが、そのような方法は、有益な食物作物をエネルギー生成に転用することを伴う。したがって、リグノセルロース材料などの安価でより豊富な植物材料をエタノールにすることが望ましい。残念ながら、リグノセルロース材料（セルロース、ヘミセルロース、およびリグニン）を含む植物由来ポリマーを、燃料および／または化学物質に効率的かつ完全に生物変換することは、非常に望ましい一方で挑戦的であり、その理由は、リグノセルロース材料のセルロースおよびヘミセルロース成分のみを、エタノールなどの燃料に現在公知の生体触媒によって変換できるためである。さらに、材料の緻密な／高密度な構造は、リグノセルロース材料のリグニン成分の消化の困難さと相まって、リグノセルロース材料中のセルロースおよびヘミセルロースの相当な部分のバイオアベイラビリティーを制限する。すべての生物がこれらの複合化合物および構造を利用できるわけではない。しばしば、燃料または他の機能的な化合物として利用できる化合物を含めた、望ましい最終生成物を産生できる生物は、単糖または他の特定の炭素基質を好む。
【０００５】
リグノセルロース材料を燃料および／または化学物質に生物変換するための現在の方法は、機械的、熱化学的、および生化学的プロセスによる材料の広範で高価な前処理を含む場合がある。一般に、そのような前処理プロセスの目的には、（１）セルロースポリマーおよびヘミセルロースポリマーを、微生物にとってよりアクセス可能にすること、ならびに（２）複雑なセルロース多糖およびヘミセルロース多糖を、微生物によって燃料および他の化学物質により容易に変換される、より単純な発酵性糖または他の単純な化合物に変換することが含まれる。リグノセルロース材料の前処理において頻繁に使用される、機械的、熱化学的、および生化学的プロセスは、主要なコストを構成し、完全に有効ではない。さらに、リグノセルロース材料から燃料および他の化学物質を生成するために現在使用される微生物は、複雑な植物性多糖を糖に分解し（糖化）、次いで様々な得られた糖を、効率的に燃料および他の化学生成物に変換することの両方について必要な細胞機構を欠いている。したがって、複雑な多糖を糖化し、より広い範囲の発酵性糖を燃料および他の化学物質により効率的に変換するための、より万能な微生物および／または微生物の組合せを活用する生物変換プロセスについての相当な未だ対処されていない必要性が残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈｅｅｈａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、１５巻：８１７９頁、１９９９年
【非特許文献２】Ｍａｒｔｉｎ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１巻：２７４頁、２００２年
【非特許文献３】Ｇｒｅｅｒ、ＢｉｏＣｙｃｌｅ、６１〜６５頁、２００５年４月；Ｌｙｎｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、６６巻：３号、５０６〜５７７頁、２００２年
【非特許文献４】Ｌｙｎｄら、「Ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ：  Ａｎ  Ｕｐｄａｔｅ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻：５７７〜５８３頁、２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、セルロース材料を含めた複雑な植物性多糖を、燃料および他の化学物質に変換するための方法を提供する。好適な実施形態では、この方法は、１つの生物によって、植物性多糖をより短い鎖の多糖または他の化合物に変換することを含み、次いでこれは、別の生物によって基質として使用されて所望の化合物を生成する。他の好適な実施形態では、この方法は、セルロース分解性好気性微生物による植物性多糖の連続加水分解、および嫌気性微生物による加水分解産物の発酵を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、エタノールなどの生物燃料および他の化学物質を製造するためのプロセスが開示される。このプロセスは、（１）嫌気性条件下でバイオマス材料を提供する工程であって、バイオマスは、外部から供給される化学物質または酵素で処理されていない工程と、（２）遺伝的に改変されていない嫌気性菌の第１の培養物を用いてバイオマスを処理する工程であって、この遺伝的に改変されていない嫌気性菌は、バイオマスの少なくとも一部を単糖および二糖に変換する工程と、（３）偏性好気性菌ではない微生物の第２の培養物を用いてバイオマスを処理する工程であって、単糖および二糖が生物燃料に変換される工程とを含む。いくつかの実施形態では、このプロセスは閉じた容器内で行う。遺伝的に改変されていない嫌気性菌の第１の培養物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓであり得る。
【０００９】
第２の態様では、エタノールおよび他の化学物質を作製するための、本発明の好ましい実施形態によるプロセスが開示される。この方法は、（１）植物性多糖を含む、前処理されたバイオマス由来材料を提供する工程と、（２）酸素の存在下でセルロース分解性好気性微生物を含む第１の培養物を、前処理されたバイオマス由来材料に接種して、好気性ブロス（ａｅｒｏｂｉｃ  ｂｒｏｔｈ）を生成する工程であって、好気性微生物は、植物性多糖を少なくとも部分的に加水分解できる工程と、（３）セルロース分解性好気性微生物が、酸素の少なくとも一部を消費し、植物性多糖の少なくとも一部を加水分解するまで好気性ブロスをインキュベートし、それによって好気性ブロスを、発酵性糖を含む加水分解産物を含む嫌気性ブロス（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｂｒｏｔｈ）に変換する工程と、（４）発酵性糖をエタノールに変換できる嫌気性微生物を含む第２の培養物を嫌気性ブロスに接種する工程と、（５）発酵性糖の一部がエタノールに変換されるまで、接種された嫌気性ブロスを発酵させる工程とを含む。
【００１０】
第３の態様では、エタノールなどの精製された生物燃料および他の化学物質を製造するための３段階法が開示される。この方法は、（１）バイオマス材料が、遺伝的に改変されていない嫌気性菌の第１の培養物で、嫌気性条件下で処理され、この遺伝的に改変されていない嫌気性菌は、外部から供給される化学物質または酵素なしでバイオマスを単糖および二糖に実質的に変換する第１段階と、（２）この単糖および二糖が第２の微生物の培養物で処理され、単糖および二糖が生物燃料に変換される第２段階と、（３）得られた生物燃料を、残留バイオマスおよび培養物から分離し、回収する第３段階とを含む。いくつかの実施形態では、この方法は閉じた容器内で行う。遺伝的に改変されていない嫌気性菌の第１の培養物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓであり得る。
【００１１】
上述した方法のいくつかの実施形態では、エタノールの少なくとも一部は、発酵した嫌気性ブロスから回収される。
【００１２】
他の実施形態では、この方法は、残存する発酵性糖および細胞内容物を含む溶解産物を生成するために、発酵した嫌気性ブロス中の好気性および嫌気性微生物を溶解させる工程をさらに含む。一変形では、溶解産物は追加の物理的および／または化学的処理に供することができる。別の変形では、溶解産物に、残存する発酵性糖のエタノールおよび他の化学物質への変換を加速できる別の嫌気性微生物を接種できる。
【００１３】
別の態様では、エタノールおよび他の化学物質を作製するための、本発明の好ましい実施形態による方法が開示される。この方法は、（１）植物性多糖を含むバイオマス由来材料を提供する工程と、（２）植物性多糖の少なくとも一部を加水分解するために、嫌気性条件下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの細胞を含む第１の培養物をバイオマス由来材料に接種する工程であって、培養物の細胞が、加水分解した植物性多糖の少なくとも一部を細胞内化合物として取り込む工程と、（３）溶解したブロスを生成するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの細胞を溶解させる工程と、（４）発酵性糖をエタノールおよび他の化学物質に変換できる嫌気性微生物を含む第２の培養物を、溶解したブロスに接種する工程と、（５）発酵性糖の少なくとも一部がエタノールおよび／または他の化学物質に変換されるまで、接種された嫌気性ブロスを発酵させる工程とを含む。
【００１４】
別の態様では、エタノールなどの生物燃料および他の化学物質を製造するための方法が開示される。この方法は、セルロースならびにヘミセルロースを含有する植物材料を含むバイオマスを、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓならびに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓからなる群から選択される第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種の共培養物の存在下で、中温性条件下で発酵に付す工程であって、培養物の比が、セルロース：エタノールおよびヘミセルロース：エタノールの変換比が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたは第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種を単独で使用して得られる比より大きい量である工程を含む。
【００１５】
別の態様では、エタノールなどの生物燃料、および他の化学物質を製造するための方法が開示される。この方法は、セルロースおよびヘミセルロースを含有する植物材料を含むバイオマスを、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓおよびＺｙｍｏｎｏｍａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓの共培養物の存在下で、中温性条件下で発酵に付す工程であって、培養物の比が、セルロース：エタノールおよびヘミセルロース：エタノールの変換比が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたはＺｙｍｏｎｏｍａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓを単独で使用して得られる比より大きい量である工程を含む。
【００１６】
別の態様では、バイオマス由来のセルロース固体を同時に糖化かつ発酵させて、エタノールなどの生物燃料、または他の化学物質にするための方法が開示される。この方法は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌がバイオマスを単糖および二糖に実質的に変換するのに十分な糖分解酵素を産生する条件下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌を用いて、閉じた容器内でバイオマスを処理する工程と、第２の微生物の培養物を導入する工程であって、第２の生物は、単糖および二糖を生物燃料に実質的に変換できる工程とを含む。
【００１７】
別の態様では、リグニン含有バイオマスから生物燃料を製造するための方法が開示される。この方法は、（１）リグニン含有バイオマスの少なくとも一部を加水分解するのに十分な濃度でアルカリ水溶液とリグニン含有バイオマスを接触させる工程と、（２）処理されたバイオマスをｐＨ７〜８に中和する工程と、（３）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌が、処理されたバイオマスを単糖および二糖に実質的に変換するのに十分な糖分解酵素を産生する条件下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌を用いて、閉じた容器内でバイオマスを処理する工程と、（４）第２の微生物の培養物を導入する工程であって、この第２の生物は、単糖および二糖を生物燃料に実質的に変換できる工程とを含む。
【００１８】
別の態様では、バイオマスから生物燃料および栄養分を含む発酵残留物を製造するための方法が開示される。この方法は、（１）発酵反応において、アルコール、ならびにアミノ酸、補助因子、ホルモン、タンパク質、ビタミン、および脂質からなる群から選択される栄養分を含む発酵残留物を産生するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓを含む培養物を用いてバイオマスを処理する工程と、（２）生物燃料を生成するのに適した条件下、および栄養分を生成するのに適した条件下で培養物を発酵させる工程と、（３）培養物から生物燃料を分離する工程と、（３）栄養分を含む発酵残留物を回収する工程とを含む。
【００１９】
別の態様では、セルロース基質からエタノールを製造するための方法が開示される。この方法は、（１）嫌気性にしたセルロース基質、糖分解酵素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌、および場合によりＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ菌を含むスラリーの形態で反応混合物を反応器内に提供する工程と、（２）第１の選択された時間間隔の間、反応混合物を撹拌する工程であって、発酵反応を開始および維持するのに十分な条件下で反応混合物が反応する工程と、（３）第２の選択された時間間隔の間に、反応混合物の不溶性基質を沈殿させるために、十分な時間反応混合物の撹拌を中止し、それによって懸濁した固体を実質的に含まないエタノール含有流出物層および残留固体層を形成する工程と、（４）第２の選択された時間間隔を満了し、かついずれのさらなる撹拌をする前に、エタノール含有流出物を反応器から取り出す工程と、（５）残留固体を含有する反応器に、工程（１）の反応混合物の成分を含む第２の反応混合物を添加する工程と、（６）連続的な発酵反応を維持するために工程（２）〜（５）を繰り返す工程とを含む。
【００２０】
別の態様では、本発明は、外部から供給される酵素、空気、および添加される栄養分の実質的な非存在下で、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓの第１の培養物、ならびにＺｙｍｏｍｏｎａｓの増殖および発酵を阻害しない量でのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの第２の培養物を含有する発酵バイオマスを含む組成物を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、エタノールを製造するためのクローズドシステム法を提供する。このシステムは、（１）バイオマスから糖を産生できるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌の存在下、かつ好気的および嫌気的の両方で糖を発酵させることができる通性嫌気性菌の存在下で、少なくとも約３５℃の温度で、発酵容器内でバイオマスのエタノール産生嫌気性発酵を実施し、嫌気性発酵でエタノールを製造する工程と、（２）嫌気性発酵から発酵培地の一部を連続的に引き出す工程と、（３）引き出された発酵培地から細菌を分離し、分離された細菌を嫌気性発酵に再利用する工程と、（４）発酵培地の引き出された部分からエタノールを取り出す工程とを含む。
【００２２】
参照による組込み
本明細書に述べられるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれるように具体的にかつ個々に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【００２３】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲において特定性を伴って示される。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照して得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態の方法を概略的に示すブロック図を表す。
【図２】図２は、Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのストックの増殖を示す（０．３％のＣＢ．ＭＢ）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
別段の定義のない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
【００２６】
「生物燃料」、「燃料およびまたは他の化学物質」ならびに「他の生成物」は互換的に使用され、液体燃料、ガス燃料、試薬、化学供給原料、化学添加物、加工助剤、食品添加物、ならびに化学物質を入れることができる他の用途として適当な化合物を含むように本明細書で使用され、それだけに限らないが、炭化水素、水素、メタン、ヒドロキシ化合物、例えば、アルコール（例えば、エタノール、ブタノール、プロパノール、メタノールなど）など、カルボニル化合物、例えば、アルデヒドおよびケトン（例えば、アセトン、ホルムアルデヒド、１−プロパナールなど）、有機酸、有機酸の誘導体、例えば、エステル（例えば、ワックスエステル、グリセリドなど）、ならびにそれだけに限らないが、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、乳酸、ギ酸、酢酸、コハク酸、ピルビン酸を含めた他の官能基を含む化合物、酵素、例えば、セルラーゼ、ポリサッカレーゼ（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒａｓｅ）、リパーゼ、プロテアーゼ、リグニナーゼ、およびヘミセルラーゼなどを含み、純粋な化合物、混合物、または純粋でないもしくは希釈された形態として存在できる。
【００２７】
「生体触媒」は、溶液、懸濁液、および酵素と微生物の混合物を含めて、酵素および微生物を含むように本明細書で使用される。一部の脈絡では、この単語は、特定の機能を果たすための酵素または微生物の可能な用途を指し、他の脈絡では、この単語は、２つの併用を指し、他の脈絡では、この単語は、２つのうちの１つのみを指す。この語句の脈絡は、当業者に対して意図された意味を示す。
【００２８】
「植物性多糖」は、植物物質に存在する糖および糖誘導体のポリマー、ならびに糖ポリマーの誘導体を指すのに本明細書で使用される。例示的な植物性多糖には、リグニン、セルロース、デンプン、およびヘミセルロースが含まれる。一般に、多糖は、この２つ以上の糖単位または糖単位の誘導体を有できる。糖単位および／または糖単位の誘導体は、規則的なパターン、または他の方法で繰り返すことができる。糖単位はヘキソース単位もしくはペントース単位、またはこれらの組合せであり得る。糖単位の誘導体は、糖アルコール、糖酸、アミノ糖などであり得る。
【００２９】
「バイオマス」は、生物燃料、化学物質または他の生成物に変換できる生体物質を含むように本明細書で使用される。バイオマスの１つの例示的な供給源は植物物質である。植物物質は、例えば、木本物質、非木本物質、セルロース材料、リグノセルロース材料、ヘミセルロース材料、炭水化物、ペクチン、デンプン、イヌリン、フルクタン、グルカン、トウモロコシ、サトウキビ、草、スイッチグラス、竹、およびこれらに由来する材料であり得る。植物物質は、存在する化学種、例えば、タンパク質、多糖、および油などを参照することによりさらに記述できる。多糖には、グルコース、フルクトース、ラクトース、ガラクツロン酸、ラムノースなどを含めた、様々な単糖および単糖の誘導体のポリマーが含まれる。植物物質には、農業廃棄副生成物またはサイドストリーム、例えば、搾りかす、トウモロコシ浸出液、トウモロコシ浸出固体（ｓｔｅｅｐ  ｓｏｌｉｄ）、ジスチラーズグレイン、皮、種、発酵廃棄物、わら、木材、汚水、生ごみ、および食物の食べ残しも含まれる。これらの材料は、飼育場、森林、工業原料、家庭などに由来し得る。バイオマスの別の非限定例は、動物物質であり、例えば、乳、肉、脂肪、動物加工廃棄物、および動物廃棄物が含まれる。「供給原料」は、本明細書に記載されるものなどの方法に使用されているバイオマスを指すのに頻繁に使用される。
【００３０】
「発酵性糖」は、微生物によって炭素源として利用できる糖および／または糖誘導体を指すのに本明細書で使用され、２つ以上のこれらの化合物を含めた、これらの化合物のモノマー、二量体、およびポリマーを含む。場合によっては、生物は、分解された材料を取り込む前に、加水分解などによってこれらのポリマーを分解できる。例示的な発酵性糖には、それだけに限らないが、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、セロビオース、ラクトース、スクロース、マルトース、およびフルクトースが含まれる。
【００３１】
「ブロス」は、接種直後、および任意またはすべての細胞活性が止まった後の期間を含めた、増殖の任意の段階での接種された培地を指すのに本明細書で使用され、発酵処理後の材料を含むことができる。これには、適切な場合、可溶性および不溶性物質、懸濁した物質、細胞、ならびに培地の組合せの内容物全体が含まれる。
【００３２】
「糖化」は、植物性多糖を手近な生物によって利用できる低分子量種に変換することを指すのに本明細書で使用される。一部の生物については、これは、単糖、二糖、三糖、および最大約７モノマー単位までのオリゴ糖、ならびに同様のサイズの鎖の糖誘導体、および糖と糖誘導体の組合せへの変換を含む。一部の生物については、許容できる鎖連結はより長い場合があり、一部の生物については、許容できる鎖連結はより短い場合がある。
【００３３】
「前処理」または「前処理された」は、植物バイオマス中のセルロースおよびヘミセルロースポリマーを、セルロース分解性酵素および／または微生物にとってより利用可能にするように、リグニンの除去または破壊を実現する、機械的、化学的、熱的、生化学的プロセス、または組み合わせた工程であっても、順次実施されるのであっても、これらのプロセスの組合せを指すのに本明細書で使用される。いくつかの実施形態では、前処理は、植物バイオマス中のセルロースおよびヘミセルロースポリマーを、セルロース分解性酵素および／または微生物にとってより利用可能にするように、リグニンを除去または破壊することを含むことができる。いくつかの実施形態では、前処理は、植物性多糖を、別の種類の微生物にとってよりアクセス可能にするように、１つの種類の微生物を使用することを含むことができる。いくつかの実施形態では、前処理は、セルロースおよび／またはヘミセルロース材料の破壊または膨張も含むことができる。蒸気爆砕、およびアンモニア繊維膨張（または爆砕）は、周知の熱的／化学的技法である。酸および／または酵素を利用する方法を含めた加水分解を使用できる。他の熱的、化学的、生化学的、酵素的技法も使用できる。
【００３４】
説明
以下の説明および実施例では、本発明の好適な実施形態を詳細に例示する。当業者は、本発明の範囲によって包含される多数の変形および改変が存在することを認識するであろう。したがって、好適な実施形態の説明は、本発明の範囲を限定すると見なされるべきではない。
【００３５】
本発明の様々な実施形態は、１）ポリマーをよりアクセス可能にする、ポリマーを加水分解する、誘導体化する、または１つの初期の前処理工程の有効性に頼るのではなく、プロセス全体にわたって漸進的な様式で、ポリマーが手近の生物によって利用されることを可能にするこれらもしくは他の方法で、ポリマーに作用することのいずれによってでも、リグノセルロース材料中のセルロースおよびヘミセルロースポリマーを、生物が利用可能にすること、２）植物ポリマーをより完全に糖化すること、植物由来の糖を燃料および／または化学物質をより完全に変換すること、植物由来の糖を燃料および／または化学物質により迅速に変換することを実現するために複数の生体触媒を利用すること、３）プロセスから酵素を除去して、嫌気性微生物を引き続いて使用することを可能にするために、好気性微生物を利用すること、または嫌気性もしくは好気性微生物を引き続いて使用する前に嫌気性微生物を利用すること、４）培地のコストを最小限にするためにプロセス内で栄養分を再利用すること、ならびに５）プロセスにおいて２種以上の生成物を同時に作製する方法を提供することに関係する利点を提供する。本発明のいくつかの実施形態は、これらの利点のすべてを示すことができる一方で、他の実施形態は、より少ない利点を示すが、依然として本開示の範囲内に残ることができる。
【００３６】
好適な一実施形態では、セルロース、ヘミセルロース、および／またはリグノセルロースを含有する供給原料、例えば、農作物、作物残渣、樹木、木くず、おがくず、紙、ボール紙、および他の材料など（一括して「供給原料」）は、前処理されているか、または処理されておらず、供給原料中の植物性多糖の１つまたは複数を、燃料および／または他の化学物質の製造において第２の微生物によって炭素源として利用できる低分子量種（複数も）に変換できる嫌気性生物と接触している。これらの低分子量種は、細胞外化合物として残存することができ、細胞内化合物として吸収されることができ、または細胞内および細胞外化合物の両方として存在できる。生物はまた、少なくとも部分的に重合し、または何か他の方法で混合したこれらの化合物。
【００３７】
そのような一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓが使用される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓには、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ７００３９４Ｔが含まれ、これはいくつかの実施形態では、培養された菌株、ＩＳＤｇＴの表現型および遺伝子型の特徴に基づいて定義できる（Ｗａｒｎｉｃｋら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５２巻：１１５５〜６０頁、２００２年）。本発明の態様は一般に、エタノールなどの燃料、および／または他の有用な有機生成物などを製造するためのシステム、方法、および組成物を含み、例えば、菌株ＩＳＤｇＴおよび／または菌株ＩＳＤｇＴから得ることができ、もしくは別々に単離できるものを含めた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ種の任意の他の菌株を伴う。いくつかの例示的な種は、標準的な分類学的考察を使用して定義することができ（ＳｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔおよびＧｏｅｂｅｌ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、４４巻：８４６〜９頁、１９９４年）、基準株（ＩＳＤｇＴ）と比較した場合、９７％以上の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列相同性値を有する菌株、および少なくとも約７０％のＤＮＡ再会合値を有する菌株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓと見なすことができる。７０％以上のＤＮＡ再会合値を有する多くの微生物は、少なくとも９６％のＤＮＡ配列同一性も有し、種を定義する表現型の特徴を共有することを示すかなりの証拠が存在する。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌株ＩＳＤｇＴのゲノム配列の分析は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ種のすべてまたはほとんどすべての菌株において見出すことができる、この微生物の普通でない発酵特性を生じている、植物性多糖発酵のための機構および経路に関与している可能性がある多数の遺伝子および遺伝学的な座位の存在を示す。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌株は、天然の分離株であっても、遺伝的に改変された菌株であってもよい。
【００３８】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓは、バイオマスをエタノールおよび他の生成物に変換するための有利な利点をもたらす。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの１つの利点は、多糖および高級糖類を、低分子量の糖類、オリゴ糖、二糖、および単糖に加水分解できる酵素を産生するその能力である。いくつかの実施形態では、生物は、エタノール、水素、または他の化学物質、例えば、ギ酸、酢酸、および乳酸を含めた有機酸などを製造するための発酵の準備などにおいて、バイオマス中に存在する様々な高級糖類を低級糖類に加水分解するのに使用できる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの別の利点は、ヘキソース糖単位を含有する、ペントース糖単位を含有する、および両方を含有する多糖および高級糖類を、低級糖類、および場合によっては、単糖に加水分解するその能力である。これらの酵素および／または加水分解産物は、燃料、他の化学物質を含めた様々な生成物を製造するための発酵において使用できる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの別の利点は、単糖などの低級糖から、エタノール、水素、ならびに他の燃料または化合物、例えば、酢酸、ギ酸、および乳酸を含めた有機酸などを産生するその能力である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの別の利点は、糖および／または高級糖類または多糖を含有する高分子量バイオマスを、低級糖に加水分解する工程と、これらの低級糖を、エタノール、水素、ならびに他の化合物、例えば、ギ酸、酢酸、および乳酸を含めた有機酸などを含めた望ましい生成物に発酵させる工程との合わせた工程を実施するその能力である。
【００３９】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの別の利点は、上昇したエタノール濃度、高糖濃度、低糖濃度を含む条件下で成長し、不溶性炭素源を利用し、かつ／または嫌気性条件下で機能するその能力である。これらの特徴は、様々な組合せで、長い発酵サイクルを用いた操作を実現するために使用することができ、バッチ発酵、給餌バッチ（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ）発酵、自然播種／部分集菌（ｐａｒｔｉａｌ  ｈａｒｖｅｓｔ）発酵、および最終発酵からの細胞の接種材料としての再利用と組み合わせて使用できる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓは、セルロース、ヘミセルロースおよび／またはリグノセルロース材料を含有する、前処理された、または前処理されていない供給原料と接触させられる。窒素含有化合物、例えば、アミノ酸、タンパク質、加水分解されたタンパク質、アンモニア、尿素、ニトレート、ニトリト、ダイズ、ダイズ誘導体、カゼイン、カゼイン誘導体、粉乳、乳誘導体、乳清、酵母エキス、加水分解酵母、自己消化酵母、トウモロコシ浸出液、トウモロコシ浸出固体、グルタミン酸一ナトリウム、および／または他の発酵窒素源など、ビタミン、および／またはミネラルサプリメントなどを含めた追加の栄養分が存在してもよい。いくつかの実施形態では、グルコース、スクロース、マルトース、コーンシロップ、乳酸などの１つまたは複数の追加の低分子量炭素源を添加することができ、またはこれが存在してもよい。そのような低分子量炭素源は、発酵期間の開始時に初期炭素源を提供すること、細胞数を増やすのを助長すること、炭素／窒素比を制御すること、過剰窒素を取り除くこと、またはいくつかの他の機能を含めて複数の機能を果たすことができる。
【００４１】
Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓと接触させることは一般に、生物にセルロース分解性酵素を増加および／もしくは産生させ、かつ／または細胞内に糖／多糖／オリゴ糖材料を貯蔵させ、かつ／または燃料および／もしくは他の化学物質を産生させるために、十分に低い溶解酸素とともに少なくともある時間を含む。適切には、低溶解酸素条件は、培地を加熱すること、低酸素ガスを用いて培地、ブロス、または発酵槽をパージすること、嫌気性生物を添加すること、培地を調製する間に空気を排除することなどを含めた任意の適当な方法によって実現できる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ細胞は嫌気性環境下で培養され、この環境は、培地の表面より下に沈められたガス出口を含むバブラーによって、実質的に酸素のないガスをバブリングすることによって実現かつ／または維持できる。培地中の反応からの過剰のガスおよび流出物はヘッドスペースを満たし、容器の壁に形成されたガス出口開口部から最終的に逃される。嫌気性条件を維持するのに使用できるガスには、Ｎ２、Ｎ２／ＣＯ２（８０：２０）、Ｎ２／ＣＯ２／Ｈ２（８３：１０：７）、および希（Ｎｏｂｅｌ）ガス、例えば、ヘリウムおよびアルゴンが含まれる。嫌気性条件を実現するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓという表題の、２００７年１月２６日に出願された米国出願第１１／６９８，７２２号に記載されている。
【００４３】
ある特定の実施形態では、Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓは、供給原料中の１つまたは複数の多糖の分子量を低減し、低分子量化合物の少なくとも一部を細胞内に取り込むことができる。これらの化合物を取り込んだ後、細胞を溶解し、別の生物と接触させて、燃料および／または他の化学物質を生成する。溶解は、第２の生物を接種する前、間、または接種した後に行うことができる。溶解と第２の接種の相対的なタイミングは、使用される溶解方法、第２の生物の頑強さ、およびＣ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの頑強さなどの事情に依存し得る。いくつかの状況下では、Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓを接種すると同時に、または接種する前に第２の生物をブロスに接種できる。第２の生物として使用するのに適した生物には、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、水素、メタン、乳酸、酢酸、コハク酸、ピルビン酸、ホルムアルデヒド、アセトン、または燃料となる他の化合物、および／または他の化学物質を産生できるものが含まれる。好適な生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母、Ｃ．  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、およびＣ．  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓなどのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ種、ならびにＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓなどのエタノールを産生する細菌が含まれる。
【００４４】
適当な溶解方法には、単独または組合せで、酵素、例えば、リゾチーム、プロテアーゼ、リパーゼ、ポリサッカレーゼなどの添加、キレート化剤、例えば、リン酸塩、ＥＤＴＡ、炭酸塩、イオン交換樹脂などの添加、高剪断混合、超音波処理、圧力−降下均質化、酸もしくは塩基の添加、酸化剤もしくは還元剤の添加、または他の適当な手段が含まれる。
【００４５】
生成される燃料および／または他の化合物は、生成される特定の物質、および所望の純度のレベルに応じて、適当な処理方法によって回収できる。例えば、エタノールを生成するとき、反応の内容物全体を蒸留ユニットに移すことができ、９６パーセントのエタノール／４パーセントの水（体積で）を蒸留および収集できる。燃料グレードのエタノール（９９〜１００パーセントのエタノール）は、９６パーセントのエタノールを共沸蒸留することによって、例えば、ベンゼンを添加し、次いで混合物を再蒸留することによって、または９６パーセントのエタノールを分子篩に通過させて水を除去することによって得ることができる。
【００４６】
一態様では、本発明は、セルロース／リグノセルロース材料を燃料および化学物質に生物変換するために、連続した好気性または嫌気性の繰り返しを使用する。
【００４７】
いくつかの実施形態は、セルロース／リグノセルロース材料を燃料および化学物質に生物変換するために好気性／嫌気性の繰り返しを使用する。いくつかの実施形態では、嫌気性微生物は、前処理を必要とすることなく、バイオマスを直接発酵させることができる。ある特定の実施形態では、供給原料は、植物由来のポリマー材料を、低分子量生成物に分解できる生体触媒と接触させられ、この低分子量生成物は、引き続いて生体触媒によって燃料および／または他の望ましい化学物質に変換され得る。
【００４８】
一実施形態によるプロセス工程は、１）供給原料を好気性セルロース分解性微生物と接触させる工程と、２）得られた処理された供給原料を、糖を燃料および／または化学物質に発酵させることもできる嫌気性セルロース分解性微生物と接触させる工程と、３）液体部分（燃料および／または他の化学物質の少なくとも一部を含む）から固体部分（微生物細胞、残留供給原料、および部分的に代謝された供給原料の少なくとも一部を含む）を分離する工程と、４）残留供給原料材料中の植物ポリマーの少なくとも部分的な分解を実現するため、かつ有効炭水化物（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、糖アルコール、および糖の他の誘導体）、および事前のプロセス工程から得られる、微生物の細胞に付随する他の栄養分を作るために、機械的、熱的、および／または化学的技法によって固体を処理する工程と、５）炭水化物の少なくとも一部を燃料および／または他の化学物質に変換できる微生物と、処理された個体を接触させる工程とを含むことができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、供給原料は、熱的、機械的、および／または化学的手段などによって前処理できる。そのような前処理は、存在する炭水化物もしくはタンパク質を少なくとも部分的に加水分解し、細胞構造を破壊し、表面積を増加させ、または炭水化物を微生物もしくは酵素にとってよりアクセス可能にできる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、プロセス工程は、１）前処理したバイオマス材料を、好気性条件下で、好気性細菌の第１の培養物と接触させる工程であって、好気性細菌は、前処理したバイオマスを少なくとも部分的に加水分解できる工程と、３）セルロース分解性好気性微生物が、酸素の少なくとも一部を消費し、バイオマスの少なくとも一部を加水分解するまで、好気性ブロスをインキュベートし、それによって好気性ブロスを、発酵性糖を含む加水分解産物を含む嫌気性ブロスに変換する工程と、２）発酵性糖を生物燃料に変換できる嫌気性微生物を含む微生物の第２の培養物で処理する工程とを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態は、セルロース／リグノセルロース材料を燃料および化学物質に生物変換するために、嫌気性／好気性の繰り返しを使用する。他の実施形態は、セルロース／リグノセルロース材料を燃料および化学物質に生物変換するために、嫌気性／嫌気性の繰り返しを使用する。いくつかの実施形態では、嫌気性微生物は、前処理を必要とすることなくバイオマスを直接発酵させることができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、プロセス工程は、１）バイオマス材料を、嫌気性条件下で、遺伝的に改変されていない嫌気性菌の第１の培養物と接触させる工程であって、バイオマスは、外部から供給される化学物質または酵素で処理されておらず、遺伝的に改変されていない嫌気性菌は、バイオマスの少なくとも一部を単糖および二糖に変換する工程と、２）偏性好気性菌ではない微生物の第２の培養物でバイオマスを処理する工程であって、単糖および二糖が生物燃料に変換される工程とを含む。このプロセスは、閉じた容器内で行うことができる。いくつかの実施形態では、嫌気性菌はＣ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓである。いくつかの実施形態では、第２の培養物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ種、例えば、Ｃ．  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、およびＣ．  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓなど、またはＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓである。いくつかの実施形態では、このプロセス工程は、３）得られた生物燃料、残留バイオマス、および培養物を分離および回収する工程も含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明は、生物燃料を製造するための方法であって、セルロースおよびヘミセルロースを含有する植物材料を含むバイオマスを、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓおよびＺｙｍｏｎｏｍａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓの共培養物の存在下で、中温性条件下で発酵に付す工程であって、培養物の比が、セルロース：エタノールおよびヘミセルロース：エタノールの変換比が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたはＺｙｍｏｎｏｍａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓを単独で使用して得られる比より大きい量である工程を含む方法を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓおよびＺｙｍｏｎｏｍａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓの共培養物を用いて得られる変換比は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたはＺｙｍｏｎｏｍａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ単独で使用して得られる比より、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％大きい。中温性条件は、好ましくは、約２８°〜約３５°に維持される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明は、生物燃料を製造するための方法であって、セルロースならびにヘミセルロースを含有する植物材料を含むバイオマスを、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓならびに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓからなる群から選択される第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種の共培養物の存在下で、中温性条件下で発酵に付す工程であって、培養物の比が、セルロース：エタノールおよびヘミセルロース：エタノールの変換比が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたは第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種を単独で使用して得られる比より大きい量である工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓおよび第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種の共培養物を用いて得られる変換比は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたは第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種を単独で使用して得られる比より、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％大きい。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明は、バイオマス由来のセルロース固体を同時に糖化および発酵させて生物燃料にするための方法を提供する。この方法は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌がバイオマスを単糖および二糖に実質的に変換するのに十分な糖分解酵素を産生する条件下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌を用いて、閉じた容器内でバイオマスを処理する工程を含んでいた。次いでこの培養物は、第２の微生物と接触させられ、この第２の生物は、単糖および二糖を生物燃料に実質的に変換できる。第２の培養物の例には、それだけに限らないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ種、例えば、Ｃ．  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、およびＣ．  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓなど、ならびにＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓが含まれる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明は、リグニン含有バイオマスから生物燃料を製造するための方法を提供する。この方法は、１）リグニン含有バイオマスの少なくとも一部を加水分解するのに十分な濃度でアルカリ水溶液とリグニン含有バイオマスを接触させる工程と、２）処理されたバイオマスをｐＨ７〜８に中和する工程と、３）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌が、処理されたバイオマスを単糖および二糖に実質的に変換するのに十分な糖分解酵素を産生する条件下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌を用いて閉じた容器内でバイオマスを処理する工程と、４）第２の微生物の培養物を導入する工程であって、この第２の生物は、単糖および二糖を生物燃料に実質的に変換できる工程とを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明は、バイオマスから生物燃料および栄養分を含む発酵残留物を製造するための方法を提供する。この方法は、１）発酵反応において、アルコール、ならびにアミノ酸、補助因子、ホルモン、タンパク質、ビタミン、および脂質からなる群から選択される栄養分を含む発酵残留物を産生するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓを含む培養物を用いてバイオマスを処理する工程と、２）生物燃料を生成するのに適した条件下、および栄養分を生成するのに適した条件下で培養物を発酵させる工程と、３）培養物から生物燃料を分離する工程と、４）栄養分を含む発酵残留物を回収する工程とを含む。
【００５８】
本発明の一実施形態を概略的に図１に示す。処理された、または未処理の供給原料１１が好気性バイオリアクター１に供給され、そこでこの原料は、１つまたは複数の好気性微生物によって作用される。工程１は、随意の好気性の前処理工程である。次いで、好気的に培養された供給原料１２が嫌気性バイオリアクター２に供給され、そこでこの原料は、１つまたは複数の嫌気性微生物によって作用されることによって、燃料または他の目的として有用な１つまたは複数の化合物が生成され、場合により存在する糖類が脱重合される。別の実施形態では、好気性培養１および嫌気性培養２は、同じ容器内で実施できる。嫌気的に処理された材料１３が分離器３に供給され、そこで実質的に液体の部分１５が、固体に富む嫌気的に処理された残留部分１４から分離される。工程３は随意の分離工程である。ここで、「実質的に液体の部分」は、懸濁した固体がより少ない、分離から得られる画分を意味する。この部分は一般に流動性であり、いくつかの実施形態では、他の画分より高い光透過率を有する。実質的に液体の部分１５は、燃料または所望の化学物質を単離するなどのために、必要である場合、さらに処理される。分離器３は、密度分離ユニット、例えば、沈殿槽、浄化器、遠心分離機、ハイドロサイクロンなどとすることができ、あるいはこれは、膜デバイス、例えば、逆浸透ユニット、クロスフローマイクロ濾過、限外濾過、ナノ濾過などとすることができ、あるいはこれは、濾過ユニット、もしくはスクリーニングユニット、もしくは浮上ユニット、またはこれらの型のデバイスの組合せであり得る。嫌気的に処理された残留部分１４は、処分し、再利用し、さらに処理し、または、これらの方法の組合せを用いて取り扱うことができる。
【００５９】
嫌気的に処理された残留部分１４のさらなる処理として、機械的、化学的、熱処理工程を挙げることができる。別の実施形態では、残留部分１４は、発酵によって処理される。別の実施形態では、残留部分１４は、少なくとも１つの処理工程と発酵の組合せを用いて処理される。処理された残留部分１４は、その中に存在する１つまたは複数の生成物を販売するために処理することもできる。
【００６０】
図１において、嫌気的に処理された残留部分１４は、処理工程４を用いて処理されることによって、処理された残留物１６が生成され、次いでこれは、発酵工程５においてさらに処理されることによって、発酵した残留物１７が生成される。次いで発酵した残留物１７は、分離工程６において処理されることによって、燃料または化学物質などの有用な生成物が部分的または完全に単離される。一実施形態では、分離工程６は、固体に富む相１８から実質的に液体の相１９を分離する。実質的に液体の相１９は、さらに処理することによって、燃料または化学物質として有用な材料を単離および／または精製できる。実質的に液体の相１９の少なくとも一部を、プロセス内で再利用することもできる。固体に富む相１８は、処分し、再利用し、埋め立てごみ処理し、堆肥にし、作物を肥やすのに使用し、またはその組成物に関係する他の目的にあてがうことができる。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、エタノールを製造するためのクローズドシステム法であって、１）バイオマスから糖を産生できるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌の存在下、かつ好気的および嫌気的の両方で糖を発酵させることができる通性嫌気性菌の存在下で、少なくとも約３５℃の温度で、発酵容器内でバイオマスのエタノール産生嫌気性発酵を実施し、嫌気性発酵でエタノールを製造する工程と、２）嫌気性発酵から発酵培地の一部を連続的に引き出す工程と、３）引き出された発酵培地から細菌を分離し、分離された細菌を嫌気性発酵に再利用する工程と、３）発酵培地の引き出された部分からエタノールを取り出す工程とを含む方法を提供する。一実施形態では、通性嫌気性菌はＥ．  Ｃｏｌｉである。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、セルロース基質からエタノールを製造するための方法であって、１）嫌気性にしたセルロース基質、糖分解酵素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌、および場合によりＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ菌を含むスラリーの形態で反応混合物を反応器内に提供する工程と、２）第１の選択された時間間隔の間、反応混合物を撹拌する工程であって、発酵反応を開始および維持するのに十分な条件下で反応混合物が反応する工程と、３）第２の選択された時間間隔の間に、反応混合物の不溶性基質を沈殿させるために、十分な時間反応混合物の撹拌を中止し、それによって懸濁した固体を実質的に含まないエタノール含有流出物層および残留固体層を形成する工程と、４）第２の選択された時間間隔を満了し、かついずれのさらなる撹拌をする前に、エタノール含有流出物を反応器から取り出す工程と、５）残留固体を含有する反応器に、工程１）の反応混合物の成分を含む第２の反応混合物を添加する工程と、６）連続的な発酵反応を維持するために工程（２）〜（５）を繰り返す工程とを含む方法を提供する。
【００６３】
本発明は組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、外部から供給される酵素、空気、および添加される栄養分の実質的な非存在下で、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓの第１の培養物、ならびにＺｙｍｏｍｏｎａｓの増殖および発酵を阻害しない量でのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの第２の培養物を含有する発酵バイオマスを含む組成物を提供する。
供給原料−セルロース、ヘミセルロース、およびリグノセルロース材料源
セルロース、ヘミセルロース、および／またはリグノセルロース材料を含有できる供給原料は、農作物、作物残渣、樹木、木くず、おがくず、紙、ボール紙、草、および他の供給源から得ることができる。
【００６４】
セルロースは、グルコースユニットがβ（ｌ→４）連結を介して結合している、グルコースの線状ポリマーである。ヘミセルロースは、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、およびアラビノースを含むいくつかの糖モノマーの分岐ポリマーであり、同様に存在するマンヌロン酸およびガラクツロン酸などの糖酸を有することもできる。リグニンは、大部分はｐ−クマリルアルコール、コンフェリル（ｃｏｎｆｅｒｙｌ）アルコール、およびシナピルアルコールの架橋されたラセミ巨大分子である。これらの３つのポリマーは、植物バイオマス中のリグノセルロース（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｓｉｃ）材料中に一緒に存在する。３つのポリマーの異なる特徴は、組合せの加水分解を困難にし得るが、これは、各ポリマーは、酵素の攻撃から他のポリマーを遮蔽する傾向があるためである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、供給原料材料は、燃料および化学物質を製造するためのバイオプロセスにおいて使用される前に、随意の機械的、熱化学的、および／または生化学的前処理に付すことができるが、未処理のリグノセルロース材料も同様にこのプロセスで使用できる。機械的プロセスは、リグノセルロース材料の粒径を低減することができ、その結果これは、より好都合なことには、バイオプロセスにおいて取り扱うことができ、化学物質／生化学物質／生体触媒との接触を促進するために、供給原料の表面積を増加させることができる。リグノセルロース材料は、植物ポリマーをよりアクセス可能にするために、熱的および／または化学的前処理に付すこともできるが、様々な実施形態は、リグノセルロース処理の複数の工程を組み込むことができるので、より穏やかで安価な熱化学的前処理条件を使用することが可能になり得る。植物ポリマーを分解する（糖化）酵素の添加を、従来のリグノセルロース生物変換プロセスの構成要素として利用できるが、これらの酵素はかなりのコストを構成する場合がある。
【００６６】
機械的プロセスには、洗浄、浸漬、粉砕、サイズ低減、スクリーニング、剪断、およびサイズ分類プロセスが含まれ、これらに限らない。化学的プロセスには、それだけに限らないが、漂白、酸化、還元、酸処理、塩基処理、亜硫酸塩処理、酸亜硫酸塩処理、塩基性亜硫酸塩処理、および加水分解が含まれる。熱的なプロセスには、それだけに限らないが、滅菌、蒸気爆砕、水の存在または非存在下での高温での保持、および凍結が含まれる。生化学的プロセスには、それだけに限らないが、酵素を用いた処理、および微生物を用いた処理が含まれる。利用できる様々な酵素としてセルラーゼ、アミラーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、グルコナーゼ、および他のポリサッカレーゼ；リゾチーム；ラッカーゼ、および他のリグニン修飾酵素；リポキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、および他の酸化的酵素；プロテアーゼ；ならびにリパーゼが挙げられる。機械的、化学的、熱的、および生化学的プロセスのうちの１つまたは複数を組み合わせ、または別々に使用できる。そのような組み合わせたプロセスは、紙、セルロース製品、微結晶性セルロース、およびセルロースの製造において使用されるものも含むことができ、パルプ化、クラフトパルプ化、酸性亜硫酸塩処理を含むことができる。供給原料は、セルロース、ヘミセルロース、またはリグノセルロース材料に対してこれらのプロセスの１つまたは複数を利用する施設、例えば、紙プラント、セルロースプラント、綿処理プラント、または微結晶性セルロースプラントからのサイドストリームまたは廃棄物の流れであってもよい。供給原料は、セルロース含有材料またはセルロース含有廃棄物材料も含むことができる。
【００６７】
供給原料に嫌気性生物を接種するための準備において、追加の栄養分、例えば、窒素源、塩、ビタミン、および微量元素などをブロスに添加できる。接種の前、接種と同時、または接種後に、ブロスの酸素レベルは、使用される特定の生物に適したレベルまで低減される。１つの好適な生物はＣ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓである。酸素レベルを低減するのに様々な手段を使用できる。例えば、ブロスもしくは発酵槽に窒素もしくは酸素を含有しないガス流を流すことができ、培地は、酸素を除外して作ることができ、培地は加熱することができ、または好気性生物を添加できる。一実施形態では、やはり所望の燃料および／または他の化学物質を作ることができる好気性生物または通性嫌気性生物が利用される。次いで第１の生物から第２の生物への移行は、通気パターンを変更し、第１の生物を選択的に溶解することによって実現できる。
【００６８】
嫌気性バイオリアクター
本発明にとって特に興味深いのは、セルロースおよびヘミセルロースを分解し、リグノセルロース材料の糖化から得られるヘキソースおよびペントース糖の両方を代謝する能力を有する嫌気性セルロース分解性微生物である（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）。糖を燃料および／または化学物質に変換することもできる嫌気性セルロース分解性（ｃｅｌｌｙｌｏｌｙｔｉｃ）生体触媒を促進するために、栄養分を添加することによって、迅速な増殖および生化学的活性を促進することが必要であるが、プロセスにおいて使用するために選択される微生物培養物は、これが必要とする栄養分の単純性および低コストに少なくとも部分的に基づいて選択できる。嫌気性微生物は、同時にリグノセルロース材料を糖化し、植物ポリマーから生じるすべてのヘキソースおよびペントース糖を燃料および／または化学物質に変換できる一方で、それぞれの型のヘキソースまたはペントース糖が燃料および／または化学物質に変換される速度は変化する。したがって、一部の糖は他の糖より急速に、嫌気性生体触媒によって燃料および／または化学物質に変換される。したがって、本発明の一実施形態は、実質的に完全な糖化であるが、糖の、燃料および／または生成物への部分的な変換のみを実現するために、リグノセルロース材料と嫌気性セルロース分解性発酵生体触媒の間の十分な接触時間を可能にする。
【００６９】
一実施形態では、セルロース、ヘミセルロース、またはリグノセルロース材料を加水分解し、所望の燃料および／または他の化学物質を産生できる少なくとも１種の嫌気性菌を含む嫌気性培養物が、供給原料の一部、例えば、供給原料１２に添加される。別の実施形態では、セルロース、ヘミセルロース、またはリグノセルロース材料を加水分解し、加水分解された材料を細胞内に貯蔵できる少なくとも１種の嫌気性菌を含む嫌気性培養物が、供給原料の一部に添加される。いくつかの実施形態では、供給原料に添加される嫌気性菌は、加水分解された材料を細胞内に貯蔵し、所望の燃料および／または他の化学物質を産生することの両方を行うことができる。好適な実施形態では、嫌気性菌はＣ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓである。
【００７０】
Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓを含む嫌気性培養物は、好ましくは、約３０°で約１２０時間維持される。しかし、様々な生物および様々な培地組成物は、より高いまたはより低い温度、およびより長いまたはより短い発酵時間を必要とする場合がある。この時間の間に、嫌気性菌は、ブロス中に存在する炭水化物を代謝することによって所望の燃料および／または他の化学物質を産生し、別の微生物による後続の発酵のために、残留バイオマスをより生物が利用可能にできる。他の実施形態では、嫌気性菌は、ブロス中に存在する炭水化物を加水分解し、加水分解された材料を細胞内に貯蔵する。他の実施形態では、嫌気性菌は、炭水化物を加水分解し、加水分解された材料の一部を細胞内に貯蔵することと、加水分解された材料および／または貯蔵された材料の一部から燃料および／または他の化学物質を産生することの両方を行う。不完全に加水分解された供給原料が存在する場合などのいくつかの実施形態では、嫌気性菌は、残存する供給原料の少なくとも一部をさらに加水分解できる。産生される燃料および／または他の化学物質は、一般に細胞外の培地中に集まるが、場合によっては、燃料および／または他の化学物質は別の位置に集まる。例えば、水素を含めたガス状生成物は、バイオリアクターのヘッドスペース内に蓄積する場合があり、そこからこれを逃す、捕獲するなどができる。他の燃料および／または他の化学化合物は、細胞内に集めることができる。
【００７１】
嫌気的に処理された供給原料の随意の分離
供給原料が枯渇した場合、植物性多糖の加水分解が遅くなった場合、生物による炭素の貯蔵が遅くなった場合に、またはスムーズな発酵プラント操作を維持するためなどのいくつかの他の理由のために、嫌気性発酵工程を停止できる。生物の活性をモニターし、嫌気性発酵を停止する時点を特定するために、それだけに限らないが、オフガス率および／または組成物、ブロスのｐＨ、および培地組成のモニタリングを含めた様々な方法を使用できる。場合によっては、生産速度が減少したときに停止された発酵において、ＣＯ２生成の割合および／または水素生成の割合をモニターできる。次いで、遠心分離、沈殿、濾過、膜を用いた処理、ハイドロサイクロンなどによって、ブロスを固体に富む部分および主に液体の部分に分画できる。例えば、図１では、次いでブロスを固体に富む部分１４、および主に液体の部分１５に分画できる。
【００７２】
様々な実施形態では、主に液体の部分（例えば、液体部分１５）は、さらに精製するか、直接使用できる、１つまたは複数の望ましい燃料および／または他の化学物質を含有できる。生成物の例には、アルコール、酵素、有機酸、および有機酸エステルが含まれる。使用される精製方法として、蒸発、限外濾過などの濃度法、結晶化、塩を用いて、または非溶媒の添加などの析出、液液分離、蒸留、クロマトグラフィー、イオン交換、吸着、透析、および乾燥を挙げることができる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の生成物は、固体に富む部分中に含まれ、１つの生成物は固体に富む部分中にある場合があり、同じもしくは異なる生成物は主に液体の部分中にある場合がある。生成物が固体に富む部分中に含まれる場合、固体に富む部分は、生成物自体として処理することができ、またはこの部分は、所望の純度および生成物の特徴を実現するために、乾燥、洗浄、溶解、抽出、誘導体化および／または他の技法によってさらに処理できる。
【００７４】
あるいは、嫌気的に処理された供給原料は、生成物材料および残留部分に直接分離できる。この手法の例は、スティルボトム（ｓｔｉｌｌ  ｂｏｔｔｏｍ）が残留物部分（例えば、残留部分１４）である、嫌気的に処理された供給原料からのエタノールの蒸留であろう。
【００７５】
この手法に対する変形は、発酵過程の間の１つまたは複数のガス状生成物、例えば水素またはメタンなどの回収であろう。図１に示された実施形態では、分離３は、発酵を停止した後ではなく、発酵容器内で発酵の間に行うことができ、発酵ブロス１４からのガス状生成物流１５の分離を伴う。
【００７６】
液体画分
主に液体の部分（例えば、液体部分１５）は、嫌気性発酵の間に生成された燃料および／または化学物質をしばしば含有する。所望の燃料および／または他の化学物質の回収は、微生物によって産生される特定の化合物に依存する。例えば、アルコール、例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノールなどの場合では、液体部分を蒸留することによって高濃度のアルコールを生成することができ、次いでこれは、分子篩、浸透気化法、共沸混合物を分解し、もしくはさもなければ分離を促進するための作用剤を用いたものを含めた追加の蒸留工程、または分離を実施するための他の技法などを用いて、さらに脱水できる。所望の燃料および／または他の化学物質は、精製することによって他の微量成分を除去することもでき、またはこれはそのまま使用できる。
随意の分離工程が利用されない場合の、嫌気的に処理された残留部分および嫌気的に  処理されたブロスの処理
嫌気的に処理された残渣（例えば、嫌気的に処理された残渣１４）、または嫌気的に処理されたブロス（例えば、嫌気的に処理されたブロス１３）は、随意の分離工程（例えば、分離工程３）が利用されない場合、機械的、熱化学的、および／または生化学的な処理（例えば、生化学的処理４）を付されることによって、不応性の植物ポリマーがさらに放出され、植物ポリマーが糖化され、かつ／または未代謝の糖もしくは貯蔵された糖／糖ポリマー、および微生物細胞の細胞内内容物に由来する可溶性栄養分が放出される。そのように処理された材料は、随意の分離工程（例えば、分離工程３）が、処理において使用されても、使用されなくても、「処理された残留物」と呼ばれる。処理固体または嫌気的に処理されたブロスのさらなる処理から生じる、処理された残留物（例えば処理された残留物１６）は、動物の餌のために使用し、燃料として燃やし、またはプロセス内での追加の処理もしくは再利用などによって他に利用できる。
【００７７】
使用される処理技法として、超音波処理、高剪断混合、蒸気爆砕、酵素を用いた処理、化学物質を用いた処理、浸透圧ショック、または他の適切な技法などによる細胞溶解を挙げることができる。他の処理技法として、酵素、酸、温度を用いた処理などによるタンパク質および／もしくは多糖の加水分解、または他の適切な技法を挙げることができる。
【００７８】
細胞外酵素および／または分泌酵素などの他の生成物も、適切な技法によって回収できる。そのような技法の例として、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透、濾過、遠心分離、重力沈降、浮遊、乾燥、透析、塩析出、非溶媒の添加による析出、等電点または等電点付近での析出、ならびにこれらの方法および他の方法の組合せによるものを挙げることができる。
【００７９】
利用できる酵素には、単独または組合せでの、リゾチーム、プロテアーゼ、ポリサッカレーゼ、リパーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、２種以上のプロテアーゼが使用される場合など、これらの分類のうちの１つの中で１種を超える酵素を使用できる。これらは、精製された、もしくは部分的に精製された形態で個々の酵素を添加することによって、または複数の酵素、および複数の型の酵素が存在した酵素カクテルを添加することによって利用できる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、化学的、熱的、または機械的処理を、酵素添加とともに利用できる。そのような追加の処理は、酵素を添加する前、間、および／または後に行うことができる。そのような処理として、加熱、冷却、浸透圧の変更、キレート化剤の添加、高剪断混合、均質化、超音波処理、酸化剤の添加、還元剤の添加、およびこれらの組合せ、ならびに他の適切な技法を挙げることができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、溶解工程によって曝される細胞内物質は、糖含有化合物を含むことができる。多糖を含めたこれらの糖含有化合物の加水分解により、単糖、二糖、三糖、またはより高級の糖類を放出できる。一般に、そのような加水分解の目的は、微生物を用いて引き続いて培養するために、これらの糖のバイオアベイラビリティーを増大させることである。この培養は、再利用工程の一部としてであっても、後続の下流の発酵工程のためであってもよい。
【００８２】
処理された残留物の発酵
処理された残留物（例えば、残留物１６）は、１つまたは複数の追加の生物、例えば、嫌気性微生物を用いて発酵させることによって、発酵した残留物（例えば、発酵した残留物１７）を生成することができ、この発酵した残留物は燃料または化学物質として有用な１つまたは複数の化合物を含む。例示的な追加の微生物には、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚ．  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃ．  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、ｃ．  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓ、ならびにアルコール、有機酸、有機酸誘導体、アルデヒド、ケトン、水素、またはメタンを産生し、または産生するように操作された他の生物が含まれる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、追加の生物は、嫌気性培養工程において使用される微生物によって徐々にのみ利用される糖を選択的に利用するものであり得る。例えば、Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓについては、徐々に利用される糖には、ラクトース、アラビノース、およびキシロースが含まれ、一方より急速に利用される糖には、グルコース、セロビオース、およびガラクトースが含まれる。Ｚ．  ｍｏｂｉｌｉｓでは、より急速に利用される糖には、グルコース、フルクトース、およびスクロースが含まれる。この工程で生成される生成物は、嫌気性の発酵工程において産生される生成物と同じであっても、異なっていてもよい。処理された残留物についての発酵条件は、使用される特定の生物、および所望の最終の生成物によって変化する。Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓについては、約２８〜約３８℃、または好ましくは約３３〜３６℃もしくは約３５℃の温度が、酸素を除外する条件下、および約８．５未満のｐＨで使用される。他の培養条件は、２００７年８月２日に出願されたＳｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓという表題の米国特許出願第１１／６９８，７２７号、およびＴｈｏｍａｓ  Ａ．  Ｗａｒｎｉｃｋら、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ｓｐ．  ｎｏｖ．，  Ａ  Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  Ｍｅｓｏｐｈｉｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｓｏｉｌ、５２  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１５５巻（２００２年）に見出すことができ、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００８４】
発酵した残留物の分離
発酵した残留物（例えば、発酵した残留物１７）は、遠心分離、沈殿、濾過、膜を用いた処理、ハイドロサイクロンなどによって、固体に富む部分（例えば、固体に富む部分１８）、および主に液体の部分（例えば、液体部分１９）に分離できる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、発酵した残留物は、生成物材料、および固体に富む材料に直接分離できる。この手法の例は、スティルボトムが固体に富む材料（例えば、固体に富む材料１８）である、嫌気的に処理された供給原料からのエタノールの蒸留であろう。生成物が水素またはメタンなどのガスである場合などの他の実施形態では、発酵した残留物（例えば、発酵した残留物１７）からの生成物の分離は、発酵槽から気相を除去することによって、発酵槽内で行うことができる。生成物がブロスから直接分離される場合、およびガス状生成物が発酵槽から収集される場合の両方の場合で、追加の精製工程または処理工程を、生成物の流れ上で実施できる。
【００８６】
固体に富む材料
固体に富む部分（例えば、固体に富む部分１８）は一般に、リグノセルロース材料および微生物細胞を含有する。いくつかの実施形態では、この画分は、処分し、動物の餌として使用し、肥料として使用し、または埋め立てごみ処理できる。他の実施形態では、この固体は、機械的、化学的、熱的方法、またはこれらの組合せを用いて処理できる。処理された固体は、追加の生成物を回収させることができ、またはこれらは、プロセス内の上流点に再利用することができ、またはこれらは、例えば、追加の発酵工程において処理できる。いくつかの実施形態では、固体に富む材料は、糖および／または栄養分を含有する主に液体の部分を単離するために処理できる。この主に液体の部分は、材料の残りと同じ様式、または異なる様式で利用できる。
【００８７】
処理固体（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｏｌｉｄ）の後続の発酵
様々な実施形態では、分離された固体に富む画分は、より早い培養工程に再利用されることによって、再利用しない場合に可能であるより完全な、植物ポリマーの糖および有用な生成物への変換を可能にする。いくつかの実施形態では、「ワンススルー」プロセスと比較した場合、より穏やかな処理および／または安価な処理工程が可能となり得るが、これは、リグノセルロース材料が、供給原料への微生物の作用の結果として著しく軟化するためである。さらに、プロセスの培養された段階において増殖した細胞から遊離される細胞材料の再利用は、コスト低減をもたらし得る段階のための栄養分として機能を果たすことができる。
【００８８】
他の実施形態では、処理された処理固体は、追加の生物を用いて培養されることによって、燃料および／または他の化学物質が生成される。好適な生物には、嫌気性培養工程において使用される微生物によって徐々にのみ利用される糖を急速に利用するものが含まれる。この工程で生成される生成物は、嫌気性発酵工程において産生される生成物と同じであっても、異なっていてもよい。
【００８９】
随意の好気性バイオリアクター前処理
いくつかの実施形態では、前処理された、またはされていないリグノセルロース材料を、同時にかつ／または順次、糖化を促進し、酸素を消費する、生きた好気性セルロース分解性微生物（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）と場合により接触させることができる。糖化酵素のインサイツ生成は、プロセスコストを低減することができ、酸素の除去は、嫌気性セルロース分解性微生物の増殖に適した環境を作り出す。
【００９０】
一実施形態では、少なくとも１つの好気性セルロース分解性微生物を含有する培養物が供給原料に添加される。追加の栄養分、例えば、窒素源、ビタミン、ミネラル、および微量元素などを、微生物が必要とする場合添加できる。妥当な時間内に良好な増殖をもたらすために、十分な接種材料が添加される。ｐＨは、微生物にとって適当な範囲に制御または緩衝できる。生物が必要とする場合、通気することができ、温度は適当な範囲内で操作できる。
【００９１】
別の実施形態では、上記のような、少なくとも１つの好気性セルロース分解性微生物を含有する培養物が、好気性細胞が増殖するのに十分な供給原料および栄養分を含有するスラリーに添加される。この培養物は、生物の増殖を支持するのに十分な通気を伴って、生物にとって適切な温度およびｐＨで維持される。さらに、所望の細胞活性または溶解酸素レベルを実現するために、空気の流れの代わりに、またはこれと組み合わせて、酸素を富化したガスの流れを使用できる。
【００９２】
好気性発酵の最後に、リグノセルロース基質の加水分解の割合をモニターするか、または他の適切な技法によって決定される場合、通気が低減されることによって、嫌気性培養物の増殖に備えて、生物に残りの酸素を消費させる。酸素レベルを低減するのに様々な手段を使用できる。例えば、バッチ培養では、入口の空気を単純にとめることができ、または空気を窒素の流れもしくは酸素が枯渇した流れで置換できる。あるいは、培養物を別の容器に移動させることができ（例えばパイプを介して）、移動の間に、培養物は酸素供給から遮断される。連続的な培養では、ブロスを酸素が加えられていないゾーンに通すことができる。そのようなゾーンは、バイオリアクターの一範囲、パイプ、別の容器であってもよい。
【実施例】
【００９３】
（実施例１）
ＭＢ１培地の調製
ＭＢ１培地は、ビーカー内で：
ａ．再蒸留Ｈ２Ｏ（Ｈ２０）７５０ｍＬ
ｂ．Ｋ２ＨＰＯ４  ８ｇ
ｃ．ＫＨ２ＰＯ４  ４ｇ
ｄ．（ＮＨ４）２ＳＯ４  １ｇ
ｅ．システイン６ｇ
ｆ．Ａｍｂｅｒｅｘ６９５ＡＧ  ６ｇ  ６ｇ（安価な酵母エキス：Ｂａｃｔｏを使用してもよい）
ｇ．基質  −  例えば、セロビオース、グルコース、セルロース、ならびに本明細書に記載される他の基質
を混合することによって調製できる。
【００９４】
基質が不溶性である場合（例えば、トウモロコシ茎葉、製紙スラッジ）、培地のｐＨは、基質を含まないｐＨを用いないで調整する。培地を別々の容器中に分配し、基質を各容器に別々に添加する。接種材料増殖のための標準物質は０．３％のセロビオースである。ＮａＯＨまたはＫＯＨを用いてｐＨを７．５０に調整する。ｄｄＨ２Ｏを添加して体積を１Ｌにする。培地を容器中に分配し、密閉し、嫌気性にする。
【００９５】
培地を１２１℃での液体設定で最低２０分間オートクレーブする。オートクレーブ内の全体積が３Ｌを超えるか、容器が５００ｍＬを超えて保持する場合、時間を増やす。他の時間および温度を使用できるが、加熱が多すぎるか、または長すぎると糖基質を破壊し得るという制限がある。Ａｍｂｅｒｅｘ  ６９５ＡＧは、Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  Ｆｌａｖｏｒｓ  Ｃｏ．、３３０  Ｓ．  Ｍｉｌｌ  Ｓｔｒｅｅｔ，  Ｊｕｎｅａｕ  ＷＩ  ５３０３９（９２０−３８６−４５２７）から得ることができる。
【００９６】
基質は、オートクレーブする前に添加できる。レサズリンを使用する必要はない。容器が嫌気性であることを保証するために、場合によりレサズリンを添加できる。成分をすべてビーカー中に入れる。水を添加し、ｐＨを、必要であれば、６ＮのＫＯＨを用いてｐＨ７．５０に調整する。この混合物をマイクロ波でちょうど沸騰するまで加熱する。迅速に取り出した後、Ｈｕｎｇａｔｅ方法を使用して嫌気性にするか、または真空マニホールドを使用することによって、窒素ガスを用いて試験管またはフラスコを嫌気性にする。
【００９７】
真空マニホールドを使用する場合、培地は、ゴムセプタムを収容できる試験管またはフラスコ／瓶内に置くべきである。フランジ付試験管は一般に、ゴムセプタム（カタログ番号２０４８−１１８００  Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ  Ｉｎｃ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ  ＮＪなど）で密閉し、またはより大きな培養体積については、スクリューキャップを用いて適切な位置に保持された適切なサイズのゴムセプタムを備えたスクリューキャップ瓶／フラスコを使用する。試験管およびフラスコのゴムセプタムに、引き続いて滅菌した針で穴をあけることによって、接種材料もしくは基質を添加し、または分析のために試料を取り出すことができる。
【００９８】
（実施例２）
ＧＳ−２培地の調製
ＧＳ−２培地は、ビーカー内で：
ａ．再蒸留Ｈ２Ｏ  ７５０ｍＬ
ｂ．Ｋ２ＨＰＯ４  ２．９０ｇ
ｃ．ＫＨ２ＰＯ４  １．５０ｇ
ｄ．尿素２．１０ｇ
ｅ．システインＨＣｌ  ２．００ｇ
ｆ．ＭＯＰＳ  １０．００ｇ
ｇ．クエン酸ナトリウム三塩基＊２Ｈ２Ｏ  ３．００ｇ
ｈ．Ｂａｃｔｏ酵母エキス（カタログ番号２１２７５０  Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．）６．００ｇ
ｉ．０．１％のレサズリン  １．００ｍＬ
ｊ．基質  −  例えば、セロビオース、グルコース、セルロース、ならびに本明細書に記載される他の基質
を混合することによって調製できる。
ｄｄＨ２Ｏを添加することによって９００ｍＬにする。基質が不溶性である場合（トウモロコシ茎葉、製紙スラッジ）、基質を用いないでｐＨを調整する。次いで培地を別々の容器中に分配し、基質を各容器に別々に添加する。接種材料増殖のための標準物質は０．３％のセロビオースである。ＮａＯＨまたはＫＯＨを用いてｐＨを７．５０に調整する。
【００９９】
培地を丸底フラスコに移し、培地を吹きこぼすことなく、マイクロ波で沸騰するまで加熱する。フラスコをＨｕｎｇａｔｅ装置付近の加熱した撹拌プレート上に置き、培地が「桃色を失う（ｄｅｐｉｎｋ）」まで、Ｎ２ガスを流しながら沸騰直前まで加熱し続ける。
【０１００】
一定のＮ２雰囲気下で、管あたり８．７ｍｌを分配し、レサズリンが無色になるまでＮ２を流す。培地を室温に冷却し、次いで氷浴中で１０分間冷却する。
【０１０１】
管をオートクレーブプレス（ｐｒｅｓｓ）内に置き、トッププレートおよびパッドをストッパーの頂部にしっかりとねじでとめる。（管が割れるのを防止するため、底部にゴムパッドを有する試験管ラックを使用する）
培地を１２１℃での液体設定で最低２０分間オートクレーブする。オートクレーブ内の全体積が３Ｌを超えるか、容器が５００ｍＬを超えて保持する場合、時間を増やす。他の時間および温度を使用できるが、加熱が多すぎるか、または長すぎると糖基質を破壊し得るという制限がある。オートクレーブした後、管を室温にさせ、オートクレーブプレスから取り出す。
【０１０２】
Ｈｕｎｇａｔｅ装置およびＮ２ガスの一定の流れを使用して、滅菌したＧＳ−２塩１．０ｍｌを添加する。オートクレーブした後、１０％のｖ／ＶのＧＳ−２塩を添加する。ＧＳ−２塩についてのレシピを以下に述べる：
ＧＳ−２塩
ａ．  ｄｄＨ２Ｏ                １００ｍＬ
ｂ．  ＭｇＣｌ２＊６Ｈ２０            １．０ｇ
ｃ．  ＣａＣｌ２＊２Ｈ２０            ０．１５ｇ
ｄ．  ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２０          ０．００１２５ｇ。
【０１０３】
培地は嫌気性にすることができ、または好気的に使用できる。好気性である場合、培地は、添加されるときわずかに桃色になり、これは、培地中のシステインのためにまもなく桃色を失うはずである。培地（上記）と同様にオートクレーブする。
【０１０４】
両方が冷却された後、かつ接種する前に、１０％のｖ／Ｖ塩の培地に添加する：培地の管の場合、１０ｍＬの最終体積について、ＧＳ−２培地９ｍＬ、およびＧＳ−２塩１ｍＬ。
【０１０５】
（実施例３）
培地のオートクレーブ手順
オートクレーブ
温度を１２１℃に設定し、これは１５ｐｓｉの圧力に匹敵する。
【０１０６】
液体サイクル：オートクレーブ内の全体積の培地が３リットル未満または３リットルに等しい場合、２０分間実施し、オートクレーブ内の全体積の培地が３Ｌを超えるか、または個々の容器が５００ｍＬ以上を保持する場合、オートクレーブ時間を増やす。
【０１０７】
オートクレーブサイクルの時間および温度についての最大の制限要因は、培地中の可溶性糖が「カラメルになる」（これは暗褐色になり、テクスチャーが変化する）危険があることである。これは、糖の特性を変化させるので回避されるべきである。
【０１０８】
容器
【０１０９】
【表１】
2011514806.tif 000002
【０１１０】
【表２】
2011514806.tif 000003
（実施例４）
培地から酸素を除去するための手順
嫌気性の指標：レサズリン  −  桃色＝好気性
無色＝嫌気性
レサズリンは、培地がオートクレーブ中に入る時間までに無色であるべきである。これが桃色である場合、容器内に酸素が存在する。
【０１１１】
しかし、システインは遅い還元剤であり、１００ｍＬの瓶について、ガス処理（ｇａｓ）した後に桃色を失うのに１０分かかることは珍しいことではない。
【０１１２】
培地が、オートクレーブから出るとき依然として桃色である場合、またはオートクレーブから取り出したばかりの容器を振盪した後桃色になる場合、酸素が存在する。
【０１１３】
ＭＢ１をガス処理するとき、培地が暗すぎてレサズリンの色を確実に見ることができない場合は、分配された培地の容器の体積に等しい嫌気性指示液を用いて容器を準備する。嫌気性指示液についてのレシピを以下に述べる。
嫌気性指示液１００ｍＬ
ａ．ｄｄＨ２Ｏ  １００ｍＬ
ｂ．システイン０．０６ｇ
ｃ．１％のレサズリン溶液０．０１ｍＬ
容器を培地と同時に嫌気性指示液でガス処理し、明らかに目に見えるレサズリン反応を使用することによって培地の好気性条件を判断する。
【０１１４】
真空マニホールド手順
これは、クリンプトップ管およびフラスコ内での嫌気性環境の準備、ＨＰＬＣ緩衝液の濾過、残留基質の濾過、ならびに真空乾燥において使用するために設計された多目的デバイスである。
【０１１５】
窒素タンクを開けること
ａ．窒素タンクがレギュレータに適切に接続されているかを確認する。
【０１１６】
ｉ．閉じている場合：レギュレータの前部の黄銅Ｔ−バルブを緩めることによってダイヤフラム上の圧力を解放し、次いで窒素タンクの頂部のバルブを開く
ｉｉ．大きい黒色ダイヤルを用いてレギュレータの圧力を３または４ｐｓｉに調整する
ｉｉｉ．レギュレータの側部の小さい黄銅ダイヤルをオンにして、Ｎ２／真空選択バルブに窒素を流すことを可能にする
冷トラップおよび真空ポンプの作動
ｉｖ．浸漬冷却機プローブとともに冷トラップの頂部を、トラップバケット（ｔｒａｐ  ｂｕｃｋｅｔ）中に移動させ、冷却機をオンにする。
【０１１７】
ｖ．プローブがトラップを冷却するのに１０分待つと、下側のコイルにしっかりついた不凍液に気づくであろう。
【０１１８】
ｖｉ．冷却機の傍らの電源コードのスイッチを押すことによって真空ポンプをオンにする。
【０１１９】
ｂ．管およびフラスコの脱ガス
ｉ．真空マニホールド上の５つのポートのそれぞれに２２ゲージ針を施す。針は再利用できる。
【０１２０】
ｉｉ．主マニホールド上の５つの黒色プラスチックバルブをすべて閉じる。オーバー圧力解放バルブに取り付けられた６番目の黒色プラスチックバルブを調整してはならない。
【０１２１】
ｉｉｉ．使用者の管またはフラスコのセプタムに穴をあける
ｉｖ．ガラス二重斜位バルブ（ｄｏｕｂｌｅ  ｏｂｌｉｑｕｅ  ｖａｌｖｅ）を使用して真空機能を選択する
ｖ．５つの黒色プラスチックマニホールドバルブを開け、各ポートに真空を施す。
【０１２２】
ｖｉ．管を２分間、５００ｍＬ未満のフラスコを２分間、５００ｍＬ以上のフラスコを５分間、３００ｍＢａｒｓ以下で吸引する
ｖｉｉ．ガラス選択バルブを窒素に回し、オーバー圧力緩和バルブの底部の白色テフロン（登録商標）ボールが鳴るまで管に流す（約２０秒）
ｖｉｉｉ．液体の表面が波打つのが止まるのを確認する（さらに約５秒）
ｉｘ．ガラス二重斜位バルブを回して、真空サイクルを繰り返す
ｘ．窒素で３回流した後、セプタムから針を除き、５つのポートすべてを閉じ、二重斜位セレクターを真空に回し、５つの新しい管またはフラスコに切り換える。
【０１２３】
ｃ．ＨＰＬＣ緩衝液の濾過
ｉ．主マニホールド上の５つの黒色プラスチックバルブをすべて閉じる。オーバー圧力解放バルブに取り付けられた６番目の黒色プラスチックバルブを調整してはならない。
【０１２４】
ｉｉ．サイドアームエルレンマイヤー濾過フラスコを、１穴ストッパーを介して大きい金属マニホールドに取り付ける。＃８ストッパーを用いて残りのポートを密閉する。
【０１２５】
ｉｉｉ．フィルターホルダー中に０．４５μｍフィルターを置き、クランプで留め、エルレンマイヤーフラスコ内に置く
ｉｖ．ガラスバルブを使用して、真空ラインをマニホールドに向けて開ける。
【０１２６】
ｖ．フィルター漏斗中に緩衝液を注ぎ、溶液が濾過されるまで繰り返す
ｖｉ．ガラスバルブを閉じて真空ラインを真空ポンプに回す
ｖｉｉ．黒色ダイヤルを用いてマニホールドポートを開いて大気圧に回復させる
ｖｉｉｉ．濾過された緩衝液を取り出す。
【０１２７】
ｄ．残留基質の濾過
ｉ．主マニホールド上の５つの黒色プラスチックバルブをすべて閉じる。オーバー圧力解放バルブに取り付けられた６番目の黒色プラスチックバルブを調整してはならない。
【０１２８】
ｉｉ．マニホールド上の６つのポートのそれぞれにガラス濾過漏斗を置く。
【０１２９】
ｉｉｉ．予め秤量した０．４５μｍのフィルターを各漏斗に置く
ｉｖ．濾過マニホールドのための液体トラップが空であることを確認する。
【０１３０】
ｖ．フィルター漏斗中に上澄みを注ぐ
ｖｉ．ガラスバルブを回してマニホールドに真空ラインを適用する。
【０１３１】
ｖｉｉ．濾過が完了したとき、ガラスバルブを閉じて真空の流れを止める。黒色プラスチックバルブを開けることによって大気圧に回復させる
ｖｉｉｉ．濾紙および残留固体を取り出す
ｅ．真空乾燥器の作動
ｉ．主マニホールド上の５つの黒色プラスチックバルブをすべて閉じる。オーバー圧力解放バルブに取り付けられた６番目の黒色プラスチックバルブを調整してはならない。
【０１３２】
ｉｉ．乾燥器の真空ラインを１穴ストッパーを介してマニホールドに取り付ける。＃８ストッパーを用いて残りのポートを密閉する。
【０１３３】
ｉｉｉ．ガラスバルブを回して真空ラインを乾燥器に適用する。
【０１３４】
ｉｖ．乾燥器の頂部のダイヤルを使用して圧力を調節する。所望の圧力に到達したとき、バルブを閉める。
【０１３５】
ｖ．完了したとき、ガラスバルブを閉じて真空の流れを止める
運転停止
ｆ．ガラスバルブを閉じてマニホールドを通る真空の流れを止める。
【０１３６】
ｇ．真空ポンプを停止する。
【０１３７】
ｈ．冷却機を停止する。
【０１３８】
ｉ．レギュレータの側部の小さい黄銅ダイヤルによって窒素流を停止する。タンクは開いたままでもよい。
【０１３９】
ｊ．マニホールド前部の黒色プラスチックバルブを開くことによって、マニホールドを大気圧に回復させる
Ｈｕｎｇａｔｅ手順
Ｈｕｎｇａｔｅをオンにするために、
ａ．銅のすべてが加熱ユニット内部にあるようにガラス管をスライドさせる。
【０１４０】
ｂ．スイッチを下に押し下げることによって可変抵抗器をオンにして１２０ボルトにする：頂部のダイヤルは熱を調節し、一度調整したら動かさない！
ｃ．Ｎ２を出すこと
ｉ．ディスプレイに垂直な大きいノブは緩いべきである
ｉｉ．タンク上の主バルブを開く
ｉｉｉ．左側のダイヤル中の針が動くまで、大きいノブを締める。針は大きく動く必要はない。このノブは、流れを調節するダイヤフラム上のばねを調節する。これらは圧力の突然の変化によって損傷する場合があり、これが、タンクを開くときに大きいノブが緩いべきである理由である。
【０１４１】
ｉｖ．レギュレータ上の小さいサイドノブを使用することによって（ディスプレイと一致して）流れを調整する。培地をガス処理する状態になるまで１つのポートだけを通じて小さく流れるようにし、これにより雰囲気に対してＮ２の正の流れが保証される。
【０１４２】
ｄ．４０分間空気流を用いて銅を加熱させた後、Ｈｕｎｇａｔｅを使用する。
培地をガス処理するためのＨｕｎｇａｔｅの使用
ａ．培地をフラスコに移し、電子レンジ内またはホットプレート上で沸騰するまで加熱するが、吹きこぼしてはならない。
【０１４３】
ｂ．Ｈｕｎｇａｔｅ装置付近の加熱された撹拌プレート上にフラスコを置く。培地が「桃色を失う」まで、沸騰直前まで加熱し続け、ＨｕｎｇａｔｅからＮ２を流す。分配しながら流し続け、かつ加熱し続ける。
【０１４４】
ｃ．それぞれＮ２を流しながら培地を容器に分配する。フラッシングカニューレ上にストッパーを軽く置く。
＊培地は、分配の間わずかに桃色になる；室温よりわずかに低くなるまで氷浴中で冷却しながら、培地が桃色を失うまで流す。＊
ｄ．大気による汚染を最小限にするために、ストッパーを押し下げながらカニューレを取り出す。
【０１４５】
ｅ．管ラックプレス内に管ラックを置く。他の容器についてはストッパーを固定する。容器および全体積にとって適切な場合（上述した）、オートクレーブする。
【０１４６】
Ｈｕｎｇａｔｅを停止するために、
ａ．１つを除いてすべてのポートを、非常に少量の流れがその１つのポートを通る状態で閉じるべきである。
【０１４７】
ｂ．可変抵抗器をオフにする：スイッチは中央の位置にあるべきである（上＝１４０ｖ）。
【０１４８】
ｃ．銅のすべてが加熱素子から出るようにガラス管をスライドさせる。
【０１４９】
ｄ．銅を１５〜２０分（銅が素手で触るのに快適になるまで）冷却させた後、Ｎ２を停止する。
【０１５０】
ｅ．Ｎ２を停止する    ｉ．主タンクバルブを閉じる。
【０１５１】
ｉｉ．両方のダイヤルの針がゼロで静止するのを待つ
ｉｉｉ．両方のダイヤルがゼロを指したら、大きいノブ（ｋｎｏｗ）を緩くなるまで反時計回りに回すことによってダイヤフラムレギュレータを解放する
（実施例５）
発酵条件−Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ
温度：３５℃または３０℃
ａ．３５°は増殖を促進し、可溶性の基質とともに使用される
ｂ．３０°は不溶性の基質のために使用される
撹拌：試験管培養物は、撹拌をすることなく定常に成長する
フラスコ中の培養物は、静的に、または様々な撹拌速度で成長できる。撹拌は、基質が不溶性であり（すなわち、Ａｖｉｃｅｌ）、アクセス可能な基質の表面積が制限要因となり得る場合有用である。撹拌速度は、懸濁液中に基質を維持するように調整され、これは、基質の種類および基質濃度に応じて変化する。
【０１５２】
ｐＨ：７．５０（培地ＳＯＰを参照）
Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓはｐＨ６．５〜８．５で増殖することができ、範囲の中央より高い側が最良である
基質：０．３％のセロビオース  −  接種材料維持のための標準物質
２．５％より高いと阻害を生じる場合がある
グルコース上の増殖は、セルロース酵素の産生を阻害するといういくつかの証拠  −  この阻害は、セルロースに移行する前に、セロビオースへの中間の移行を伴った可逆性となり得る。
移行条件
一般に、Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの通常在庫は、０．３％のセロビオースを含有するＧＳ−２またはＭＢ１培地中で、活発に増殖する栄養培養物として維持される。試験管中での増殖について２％の接種材料体積を使用して、培養物を増殖の中期対数期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）において移す（以下を参照）。バイオリアクターは一般に、１０％の接種材料体積を使用して接種する。接種材料の体積は、実験の要求を支持するのに必要な時間で、増殖の中期対数期を実現するように調整できる。Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの増殖は、６６０ｎｍの波長でＯＤを測定することによって判定できる（図２）。中期対数のＯＤは基質に依存する：
ａ．０．３％の基質：ＯＤ６６０ｎｍの０．５００〜０．７００の吸光度単位で移行し、基質が制限的であり、培養物は、０．７００の吸光度単位の後まもなく静止期に入る
ｂ．１％以上の基質：ＯＤ０．５００〜０．７００吸光度単位で移行する
（実施例６）
Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの凍結在庫の調製
Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの凍結在庫を調製するために、中期対数期の培養物を調製し、等体積の滅菌したグリセロール（３０％の原液）を添加し、−８０℃のフリーザー内に置く。これらの凍結在庫は無期限に貯蔵できる。凍結在庫を復活させるために、一般に試験管内で、原料を氷上で解凍し、培養物を適切な寒天プレート上にストリークし、または２％の接種材料を液体培地中に使用する。培養物を寒天上にストリークする場合、良好な増殖を得るために、３０℃で嫌気的に３〜５日インキュベートさせる。滅菌した接種ループを使用することによって、１つのコロニーをマイクロチューブ中の滅菌した培地（ＧＳ−２またはＭＢ１）１ｍｌに移し、撹拌して細菌性細胞の懸濁液を生成する。滅菌したシリンジを使用することによって、細菌懸濁液を吸い上げ、密閉した嫌気性の試験管中にそれを接種する。解凍した培養物を試験管に直接添加する場合、滅菌したシリンジを使用することによって、適切な体積（２％の接種材料の体積が一般的である）の微生物細胞懸濁液を吸い上げ、ＧＳ−２またはＭＢ−１培地を含有する、密閉した嫌気性試験管のセプタムを通じてこれを注射する。すべてのこれらの操作を、嫌気性グローブボックス内で実施する。凍結した培養物を復活させた後、少なくとも２回の継代培養イベントをさせてから、栄養通常在庫として使用する。これにより凍結在庫を液体培養での増殖に順応させることが可能になり、信頼できる増殖動態が生じる。
【０１５３】
（実施例７）
糖およびエタノール分析
生成物形成および残存する基質の濃度についてのデータは、ＨＰＬＣ分析に由来する。
１）培養物を嫌気的に試料採取する：２２ゲージ針がストッパーを通じた嫌気性サンプルリングにとって好適である。以下の工程が続く。
【０１５４】
ａ．嫌気性ガスをシリンジ中に引き入れ、少なくとも２回それを排出する
ｂ．試料体積に等しい量の嫌気性ガスを引き上げてシリンジ中に入れる
ｃ．容器中に嫌気性ガスを注射する
ｄ．試料を採取する（一般に１〜１．５ｍｌ）
２）試料をマイクロチューブ内に入れ、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
３）上澄を０．４５ミクロンのシリンジフィルターを用いて、ＨＰＬＣサンプリングバイアル中に濾過する（インサートを使用してもよい）。
４）０．００５ｍＭのＨ２ＳＯ４移動相を用いて５５℃で作動させるＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラムを使用して、高圧液体クロマトグラフィーを使用して試料を分析する。セロビオースの濃度も、同じカラム上で、または水移動相を用いて８０℃でＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラムを使用して定量化できる。
【０１５５】
（実施例８）
汚染物質についての培養物の評価
汚染物質は、様々な方法で検出できる。例えば：
ａ．顕微鏡下で試料を見ることによって。Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ以外の他のものが見られる場合、試料は汚染されている。
【０１５６】
ｂ．培養物のｐＨをモニターすることによって、ｐＨが６．８未満である場合、汚染が疑われる。
【０１５７】
ｃ．ＨＰＬＣデータは、より一般的な混入物のうちの１つを時に示すことができる；非常に大量の乳酸が検出される場合、培養物は汚染されている。
【０１５８】
ｄ．培養物の試料は、寒天プレート上にストリークできる（Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの選択的な寒天または他の寒天についてのレシピを得るために、寒天培地についてのＳＯＰを参照）。形態学的に異なるコロニーが、ストリーク経路内に成長する場合、培養物は汚染されている。
【０１５９】
本明細書に記載される実施例において使用できる試薬の例、および発注の詳細を以下の表に記載する。
【０１６０】
発注の詳細
【０１６１】
【表３】
2011514806.tif 000004
【０１６２】
【表４】
2011514806.tif 000005
本発明の好適な実施形態を、本明細書に示し、説明してきたが、そのような実施形態は、例としてのみ提供されていることが当業者に明白となるであろう。多数の変形、変更、および置換は、本発明から逸脱することなく、今では当業者が考えつくであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替を、本発明を実行するのに使用できることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにその均等物は、特許請求の範囲によって網羅されることが意図されている。
【図１】
2011514806.tif 000006
【図２】
2011514806.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月9日(2010.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
第１の態様では、エタノールなどの生物燃料および他の化学物質を製造するための方法が開示される。この方法は、（１）嫌気性条件下でバイオマス材料を提供する工程であって、バイオマスは、外部から供給される化学物質または酵素で処理されていない工程と、（２）遺伝的に改変されていない嫌気性菌の第１の培養物を用いてバイオマスを処理する工程であって、この遺伝的に改変されていない嫌気性菌は、バイオマスの少なくとも一部を単糖および二糖に変換する工程と、（３）偏性好気性菌ではない微生物の第２の培養物を用いてバイオマスを処理する工程であって、単糖および二糖が生物燃料に変換される工程とを含む。いくつかの実施形態では、この方法は閉じた容器内で行う。遺伝的に改変されていない嫌気性菌の第１の培養物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓであり得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
エタノールおよび他の化学物質を作製するためのプロセスであって、
植物性多糖を含む、前処理されたバイオマス由来材料を提供する工程と、
酸素の存在下で、該前処理されたバイオマス由来材料に、セルロース分解性好気性微生物を含む第１の培養物を接種して、好気性ブロスを生成する工程であって、該好気性微生物は、該植物性多糖を少なくとも部分的に加水分解できる工程と、
該セルロース分解性好気性微生物が、該酸素の少なくとも一部を消費し、そして該植物性多糖の少なくとも一部を加水分解するまで、該好気性ブロスをインキュベートし、それによって該好気性ブロスを、発酵性糖を含む加水分解産物を含む嫌気性ブロスに変換する工程と、
該嫌気性ブロスに、発酵性糖をエタノールおよび他の化学物質に変換できる嫌気性微生物を含む第２の培養物を接種する工程と、
該発酵性糖の少なくとも一部がエタノールおよび他の化学物質に変換されるまで、該接種された嫌気性ブロスを発酵させる工程と
を含むプロセス。
（項目２）
前記エタノールの少なくとも一部が、前記発酵した嫌気性ブロスから回収される、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
残存する発酵性糖および細胞内容物を含む溶解産物を生成するために、前記発酵した嫌気性ブロス中の前記好気性および嫌気性微生物を溶解させる工程をさらに含む、項目１または２に記載のプロセス。
（項目４）
前記溶解産物を追加の物理的および／または化学的処理に供する工程をさらに含む、項目３に記載のプロセス。
（項目５）
前記溶解産物に、前記残存する発酵性糖のエタノールおよび他の化学物質への変換を加速させることができる別の微生物および／または酵素カクテルを接種する工程をさらに含む、項目３に記載のプロセス。
（項目６）
燃料として適している材料を作製するためのプロセスであって、
多糖を含む植物由来材料を提供する工程と、
該植物由来材料に、セルロース分解性好気性微生物を含む第１の培養物を接種して、ブロスを生成する工程であって、該好気性微生物は、該多糖を少なくとも部分的に加水分解できる工程と、
該多糖の少なくとも一部が１つまたは複数の糖種に加水分解されるように、酸素の存在下で該ブロスをインキュベートする工程と、
該ブロスを嫌気性ブロスに変換するように該酸素の濃度を低減する条件下で該ブロスをインキュベートする工程と、
該嫌気性ブロスに、該１つまたは複数の糖種を、燃料として適した材料に変換できる嫌気性微生物を含む第２の培養物を接種する工程と、
該接種された嫌気性ブロスを発酵させて、燃料として適した材料を生成する工程と
を含むプロセス。
（項目７）
燃料として適した前記材料の少なくとも一部を、前記発酵した嫌気性ブロスから回収する、項目６に記載のプロセス。
（項目８）
前記発酵した嫌気性ブロス中の前記好気性および嫌気性微生物を溶解させて、細胞内の糖および細胞内容物を含む溶解産物を生成する工程をさらに含む、項目６または７に記載のプロセス。
（項目９）
前記溶解産物を追加の物理的および／または化学的処理に供する工程をさらに含む、項目８に記載のプロセス。
（項目１０）
前記溶解産物に別の微生物を接種する工程をさらに含む、項目９に記載のプロセス。
（項目１１）
セルロース分解性好気性微生物を接種する前に、前記植物由来材料が前処理される、項目６に記載のプロセス。
（項目１２）
燃料として適した前記材料がエタノールを含む、項目６に記載のプロセス。
（項目１３）
エタノールおよび他の化学物質を作製するためのプロセスであって、
植物性多糖を含むバイオマス由来材料を提供する工程と、
該植物性多糖の少なくとも一部を加水分解するために、嫌気性条件下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの細胞を含む第１の培養物を用いて該バイオマス由来材料をインキュベートする工程であって、該培養物の該細胞が、加水分解した植物性多糖の少なくとも一部を細胞内化合物として取り込む工程と、
溶解したブロスを生成するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの該細胞を溶解させる工程と、
発酵性糖をエタノールおよび／または他の化学物質に変換できる嫌気性微生物を含む第２の培養物を、該溶解したブロスに接種する工程と、
該発酵性糖の少なくとも一部が、エタノールおよび／または他の化学物質に変換されるまで、該接種された嫌気性ブロスを発酵させる工程と
を含むプロセス。
（項目１４）
生物燃料を製造する方法であって、
閉じた容器内で、嫌気性条件下でバイオマス材料を提供する工程であって、該バイオマスは、外部から供給される化学物質または酵素で処理されていない工程と、
遺伝的に改変されていない嫌気性菌の第１の培養物を用いて該バイオマスを処理する工程であって、該遺伝的に改変されていない嫌気性菌は、該バイオマスの少なくとも一部を単糖および二糖に変換する工程と、
偏性好気性菌ではない微生物の第２の培養物を用いて該バイオマスを処理する工程であって、該単糖および二糖が生物燃料に変換される工程と
を含む方法。
（項目１５）
遺伝的に改変されていない細菌の前記第１の培養物がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
微生物の前記第２の培養物が、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚ．  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃ．  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
残存する発酵性糖および細胞内容物を含む溶解産物を生成するために、前記発酵した嫌気性ブロス中の前記好気性微生物を溶解させる工程をさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記溶解産物を追加の物理的および／または化学的処理に供する工程をさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記残留バイオマスおよび培養物から前記変換された生物燃料を分離し、回収する工程をさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記バイオマスが、セルロースおよびヘミセルロースを含有する材料を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
前記バイオマスがリグニンを含む、項目１４に記載の方法。
（項目２２）
前記リグニン含有バイオマスの少なくとも一部を加水分解するのに十分な濃度でアルカリ水溶液と前記バイオマスを接触させる工程と、前記処理されたバイオマスをｐＨ７〜８に中和する工程とをさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目２３）
生物燃料を製造する方法であって、セルロースならびにヘミセルロースを含有する植物材料を含むバイオマスを、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓならびに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓからなる群から選択される第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種の共培養物の存在下で、中温性条件下で発酵に供する工程を含み、該培養物の比が、セルロース：エタノールおよびヘミセルロース：エタノールの変換比が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓまたは該第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種を単独で使用して得られる比より大きい量である、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵最終生成物を製造するプロセスであって：
（ａ）閉じた容器内で、嫌気性条件下で前処理されたバイオマス材料を提供する工程；
（ｂ）嫌気性微生物の第１の培養物を用いて、該バイオマスを処理する工程であって、該嫌気性微生物は、該バイオマスの少なくとも一部を単糖および二糖に変換する工程；ならびに
（ｃ）偏性好気性菌ではない微生物の第２の培養物を用いて該バイオマスを処理する工程であって、該単糖および二糖が発酵最終生成物に変換される工程
を含む、プロセス。
【請求項２】
発酵最終生成物を製造するプロセスであって：
（ａ）バイオマス由来材料を提供する工程；
（ｂ）該バイオマス由来材料の少なくとも一部を加水分解するために、嫌気性条件下で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの細胞を含む第１の培養物を用いて、該バイオマス由来材料をブロス中で処理する工程；
（ｃ）該バイオマス由来材料を、発酵性糖を発酵最終生成物に変換する微生物の第２の培養物を用いて、ブロス中で処理する工程であって、微生物の該第２の培養物は嫌気性微生物である、工程；ならびに
（ｄ）該発酵性糖の少なくとも一部が発酵最終生成物に変換されるまで、接種された嫌気性ブロスを発酵させる工程
を含む、プロセス。
【請求項３】
微生物の前記第１の培養物が、  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
微生物の前記第２の培養物  が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓ．からなる群から選択される、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項５】
前記変換された発酵最終生成物を、残留バイオマスおよび培養物から分離および回収する工程をさらに含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項６】
前記バイオマスは、セルロースおよびヘミセルロースを含むバイオマス材料を含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項７】
前記バイオマスが、搾りかす、トウモロコシ浸出液、トウモロコシ浸出固体、トウモロコシ茎葉、ジスチラーズグレイン、皮、種、発酵廃棄物、農作物、わら、木材、汚水、生ごみ、および食物の食べ残しまたは動物性物質、ならびに他の供給源を含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項８】
前記嫌気性条件が、セルロースおよび／またはヘミセルロースを含む外因性酵素を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記バイオマスは、前記第１の培養物および第２の培養物と同時に処理される、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記バイオマスは、前記第１の培養物または第２の培養物を用いる処理の前に、前処理される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項１１】
発酵最終生成物を製造する方法であって、セルロースおよびヘミセルロースを含むバイオマスを、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ならびに酵母、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓからなる群から選択される第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種の共培養物の存在下で中温性条件下で発酵に供する工程を含み、該培養物の比が、セルロース：エタノールおよびヘミセルロース：エタノールの変換比が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、該酵母または該第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種のいずれかを単独で使用して得られる比より大きい量である、方法。
【請求項１２】
以下の工程を含むプロセスにより調製される発酵最終生成物：
（ａ）閉じた容器内で、嫌気性条件下で前処理されたバイオマス材料を提供する工程；
（ｂ）嫌気性微生物の第１の培養物を用いて、該バイオマスを処理する工程であって、該嫌気性微生物は、該バイオマスの少なくとも一部を単糖および二糖に変換する工程；ならびに  
（ｃ）偏性好気性菌ではない微生物の第２の培養物を用いて該バイオマスを処理する工程であって、該単糖および二糖が該生成物に変換され、該生成物が、エタノール、生物燃料、または他の化学物質である、工程。
【請求項１３】
発酵最終生成物を製造する方法により調製される発酵最終生成物であって、セルロースおよびヘミセルロースを含むバイオマスを、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓならびに酵母、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｏｖｏｒａｎｓからなる群から選択される第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種の共培養物の存在下で中温性条件下で発酵に供する工程を含み、該培養物の比が、セルロース：エタノールおよびヘミセルロース：エタノールの変換比が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、該酵母または該第２のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種のいずれかを単独で使用して得られる比より大きい量である、発酵最終生成物。
【請求項１４】
前記生成物が燃料である、請求項１２または１３に記載の生成物。
【請求項１５】
前記生成物がアルコールである、請求項１２または１３に記載の生成物。
【請求項１６】
前記生成物がエタノールまたは他の化学物質である、請求項１２または１３に記載の生成物。
【国際調査報告】
2011514806.tif 000008
2011514806.tif 000009
2011514806.tif 000010
2011514806.tif 000011