(57)【要約】  本出願は、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターを提供する方法、およびその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターであって、前記ナノクラスターはリンペプチドまたはリンタンパク質を含み、前記リンペプチドまたはリンタンパク質は、
ａ）組換えによって発現されたリンペプチドまたはリンタンパク質であって、
ｉ）リン酸塩中心であって、リン酸化残基および酸性残基のうちの少なくとも１つ、またはこれらの残基の組み合わせが、前記リン酸塩中心内で増加され、それにより前記リン酸塩中心が増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有するように修飾されたリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉ）修飾されて、それにより前記修飾された組換えによって発現されたリンペプチドが、前記組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態と比較して、増加した数の別個のリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉｉ）好ましくは、アミノ酸残基の数および／または種類および／またはリン酸化、またはリン酸塩中心内の特定のアミノ酸残基の間隔の変更によって、あるいは非晶質リン酸カルシウムがより結晶性の高い相、例えばアパタイトに変換するのを促進するアミノ酸配列を除去することによって修飾されて、それにより前記修飾された組換えリンペプチドが、前記組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態よりも増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有する、
組換えによって発現されたリンペプチド、あるいは
ｂ）カルシウム結合リンタンパク質／リンペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片（このとき前記リンペプチドまたはリンタンパク質は、単一のカゼイン、またはカゼインの混合物、または単一のカゼインもしくはカゼインの混合物の酵素消化物を含まない）、あるいは
ｃ）ａ）とｂ）との組み合わせ、
から選択される、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項２】
前記リンペプチドまたはリンタンパク質が、フェチュインＡ（配列番号１０）、プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（配列番号１１）、マトリックスＧｌａタンパク質（配列番号１２）、分泌型リンタンパク質２４（配列番号１３）、リボフラビン結合タンパク質（配列番号１４）、オステオポンチン（配列番号１５）、インテグリン結合シアロリンタンパク質（配列番号１６）、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（配列番号１７）、象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（配列番号１８）、またはそれらの変異体もしくは断片からなる群から選択される少なくとも１つの要素であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項３】
前記リンペプチドまたはリンタンパク質が、オステオポンチン、インテグリン結合シアロリンタンパク質、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質、象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１、またはそれらの変異体もしくは断片からなる群から選択される少なくとも１つの要素であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項４】
少なくとも１個のリンペプチドまたはリンタンパク質が、ＯＰＮ１−１４９（配列番号１）、ＯＰＮ１−１４７、およびＯＰＮ１−１５０、またはＯＰＮ１−１４９の断片のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項５】
少なくとも１個のリンペプチドまたはリンタンパク質が、ＯＰＮ１−１４９（配列番号１）、ＯＰＮ１−１４７、およびＯＰＮ１−１５０、またはＯＰＮ１−１４９の断片のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列から構成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項６】
少なくとも１個のリンペプチドまたはリンタンパク質が、フェチュインＡ（配列番号１０）、またはフェチュインＡの断片のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項７】
少なくとも１個のリンペプチドまたはリンタンパク質が、単一のカゼイン、カゼインの混合物、またはそれらの断片であり、前記カゼインのリン酸塩中心において、グルタミン酸残基がアスパラギン酸残基で置換されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項８】
前記カゼインのリン酸塩中心における少なくとも３個のグルタミン酸残基が、アスパラギン酸残基で置換されている、請求項７に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項９】
前記リンペプチドまたはリンタンパク質のリン酸塩中心が、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＳＤＤＤＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号２）、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号３）、または
ＭＲＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫＩＥＤＰＮＳＳＳＶＤＫＬＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号４）
のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項１０】
３ｎｍ以上のコア半径を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項１１】
前記ナノクラスターにおけるリン酸塩中心１個当たりのコア表面積が０．６ｎｍ２未満である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項１２】
熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターを提供する方法であって、
ナノクラスター形成溶液を製造するステップであって、カルシウムイオンと、リン酸イオンと、リンペプチドまたはリンタンパク質とを混合することによって、前記ナノクラスター形成溶液を製造するステップを含み、
このとき前記リンペプチドまたはリンタンパク質は、
ａ）組換えによって発現されたリンペプチドであって、
ｉ）リン酸塩中心であって、リン酸化残基および酸性残基のうちの少なくとも１つ、またはこれらの残基の組み合わせが、前記リン酸塩中心内で増加され、それにより前記リン酸塩中心が増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有するように修飾されたリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉ）修飾されて、それにより前記修飾された組換えによって発現されたリンペプチドが、前記組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態と比較して、増加した数の別個のリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉｉ）好ましくは、アミノ酸残基の数および／または種類および／またはリン酸化、またはリン酸塩中心内の特定のアミノ酸残基の間隔の変更によって、あるいは非晶質リン酸カルシウムがより結晶性の高い相、例えばアパタイトに変換するのを促進するアミノ酸配列を除去することによって修飾されて、それにより前記修飾された組換えリンペプチドが、前記組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態よりも増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有する、
組換えによって発現されたリンペプチド、あるいは
ｂ）カルシウム結合リンタンパク質／リンペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片（このとき前記リンペプチドまたはリンタンパク質は、単一のカゼイン、またはカゼインの混合物、または単一のカゼインもしくはカゼインの混合物の酵素消化物を含まない）、あるいは
ｃ）ａ）とｂ）との組み合わせ、
のうちの少なくとも１つを含む、方法。
【請求項１３】
前記リンペプチドまたはリンタンパク質が、フェチュインＡ（配列番号１０）、プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（配列番号１１）、マトリックスＧｌａタンパク質（配列番号１２）、分泌型リンタンパク質２４（配列番号１３）、リボフラビン結合タンパク質（配列番号１４）、オステオポンチン（配列番号１５）、インテグリン結合シアロリンタンパク質（配列番号１６）、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（配列番号１７）、象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（配列番号１８）、またはそれらの変異体もしくは断片からなる群から選択される少なくとも１つの要素であるアミノ酸配列を含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記リンペプチドが、オステオポンチン、インテグリン結合シアロリンタンパク質、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質、象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１、またはそれらの変異体もしくは断片からなる群から選択される少なくとも１つの要素であるアミノ酸配列を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１個のリンペプチドまたはリンタンパク質が、ＯＰＮ１−１４９（配列番号１）、ＯＰＮ１−１４７、およびＯＰＮ１−１５０、またはＯＰＮ１−１４９の断片のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１個のリンペプチドまたはリンタンパク質が、ＯＰＮ１−１４９（配列番号１）、ＯＰＮ１−１４７、およびＯＰＮ１−１５０、またはＯＰＮ１−１４９の断片のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列から構成される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１個のリンペプチドまたはリンタンパク質が、フェチュインＡ（配列番号１０）、またはフェチュインＡの断片のアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１個のリンペプチドが、単一のカゼイン、カゼインの混合物、それらの全カゼインまたは断片であり、前記カゼインのリン酸塩中心において、グルタミン酸残基がアスパラギン酸残基で置換されている、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
カゼインの前記リン酸塩中心における少なくとも３個のグルタミン酸残基が、アスパラギン酸残基で置換されている、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記リンペプチドまたはリンタンパク質のリン酸塩中心が、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＳＤＤＤＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号２）、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号３）、または
ＭＲＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫＩＥＤＰＮＳＳＳＶＤＫＬＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号４）
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ナノクラスター形成溶液を製造するステップにおいて、前記溶液中の尿素のウレアーゼによる触媒加水分解によって、前記溶液中にアンモニアを均一に生成させ、それにより穏やかにｐＨを上昇させることによって、前記ナノクラスター形成溶液のｐＨを上昇させて、前記リン酸カルシウムナノクラスターを形成する、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ナノクラスター形成溶液を製造するステップにおいて、強塩基と、カルシウム、リン酸塩、およびリンペプチドの酸性溶液との単純混合によって、前記ナノクラスター形成溶液のｐＨを上昇させて、前記リン酸カルシウムナノクラスターを形成する、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１２〜２２に記載のいずれか１項に記載の方法を用いて得ることができる、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項２４】
前記ナノクラスターが３ｎｍ以上のコア半径を有する、請求項１２〜２２に記載のいずれか１項に記載の方法を用いて得ることができる、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項２５】
前記ナノクラスターにおけるリン酸塩中心１個当たりのコア表面積が０．６ｎｍ２未満である、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の方法を用いて得ることができる、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項２６】
３ｎｍ以上のコア半径を有する、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項２７】
前記ナノクラスターにおけるリン酸塩中心１個当たりのコア表面積が、０．６ｎｍ２未満である、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項２８】
請求項１２〜２７のうちのいずれか１項に記載の方法において使用するためのリンペプチドまたはリンタンパク質であって、前記リンペプチドが、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）がより結晶性の高い相、例えばそのアパタイトに変換するのを促進する残基を含まない、分泌型カルシウム結合リンペプチドまたはリンタンパク質、あるいはそれらの変異体もしくは断片を含み、あらゆる単一のカゼインまたはカゼインの混合物、あるいはあらゆる単一のカゼインまたはカゼインの混合物の酵素消化物を除外した、リンペプチドまたはリンタンパク質。
【請求項２９】
請求項１２〜２７に記載の方法において使用するためのリンペプチドまたはリンタンパク質であって、前記リンペプチドが、組換えリンペプチドまたはリンタンパク質、あるいはそれらの組み合わせを含み、前記組換えリンペプチドまたはリンタンパク質が、
ｉ）リン酸塩中心であって、前記リン酸塩中心内に増加した数のリン酸化残基をもたらし、それにより前記リン酸塩中心が増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有するように修飾されたリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉ）修飾されて、それにより修飾されてない組換えによって発現されたリンペプチドよりも、増加された数の別個のリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉｉ）増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖を可能にする修飾を含む、
リンペプチドまたはリンタンパク質。
【請求項３０】
前記リンペプチドまたはリンタンパク質が、フェチュインＡ（配列番号１０）、プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（配列番号１１）、マトリックスＧｌａタンパク質（配列番号１２）、分泌型リンタンパク質２４（配列番号１３）、オステオポンチン（配列番号１５）、インテグリン結合シアロリンタンパク質（配列番号１６）、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（配列番号１７）、象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（配列番号１８）、またはそれらの変異体もしくは断片からなる群から選択される少なくとも１つの要素であるアミノ酸配列を含む、請求項２８または請求項２９に記載のリンペプチドまたはリンタンパク質。
【請求項３１】
ＯＰＮ１−１４９（配列番号１）、ＯＰＮ１−１４７、およびＯＰＮ１−１５０、またはＯＰＮ１−１４９の断片のアミノ酸配列を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のリンペプチドまたはリンタンパク質。
【請求項３２】
前記リンペプチドまたはリンタンパク質がウシカゼインであり、前記カゼインのリン酸塩中心において、グルタミン酸残基がアスパラギン酸残基に置換されている、請求項２９に記載のリンペプチドまたはリンタンパク質。
【請求項３３】
前記リンペプチドが、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＳＤＤＤＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号２）、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号３）、および
ＭＲＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫＩＥＤＰＮＳＳＳＶＤＫＬＡＡＡ  ＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号４）
のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のリンペプチド。
【請求項３４】
請求項１〜１１または２１〜２５のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターを含む、医薬組成物。
【請求項３５】
請求項１〜１１または２１〜２５のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターを含む、アジュバント。
【請求項３６】
カルシウムと、請求項１〜１１または２１〜２５のいずれか１項に記載のリン酸カルシウムナノクラスターと、リンペプチドまたはリンタンパク質とを含む配合物であって、全カルシウムの一部がリン酸カルシウムナノクラスターの形態で存在し、リンペプチドまたはリンタンパク質が過剰に含まれる配合物。
【請求項３７】
前記ナノクラスターが、ＯＰＮ１−１４９（配列番号１）、ＯＰＮ１−１４７、およびＯＰＮ１−１５０、またはＯＰＮ１−１４９の断片を含む、請求項３４、３５、または３６のいずれか１項に記載の医薬組成物、アジュバント、または配合物。
【請求項３８】
請求項１〜１１または２３〜２７のいずれか１項に記載のナノクラスターを含む、血液、血漿、細胞外液およびリンパ液、滑液、脳脊髄液、尿、および唾液の代用物のうちの少なくとも１つとして使用するための、人工生体液。
【請求項３９】
薬剤における、請求項１〜１１または２３〜２７のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターの使用。
【請求項４０】
鉱化組織の脱ミネラル化の抑制または予防のための、請求項１〜１１または２３〜２７のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターの使用。
【請求項４１】
病的石灰化の処置または予防のための、請求項１〜１１または２３〜２７のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターの使用。
【請求項４２】
食品または飲料における、請求項１〜１１または２３〜２７のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターの使用。
【請求項４３】
液体の安定性および過飽和度を維持するための、天然液または合成液における、請求項１〜１１または２３〜２７のいずれか１項に記載のナノクラスターの使用。
【請求項４４】
人工生体液における、請求項１〜１１または２３〜２７のいずれか１項に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターを提供する方法に関し、具体的には、強化されたリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有する熱力学的に安定なナノクラスターと、それに使用するためのリンペプチドと、前記ナノクラスターの使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
基本的な物理化学的課題の一つは、いかにして鉱化組織周辺の過飽和の状態を維持しながら、軟部組織および循環液における鉱化を抑制または予防するかということである。カゼインは、牛乳において、αｓ１−カゼイン、αｓ２−カゼイン、およびβ−カゼインの配列中のリン酸化残基のクラスターにより、リン酸カルシウムを金属イオン封鎖する機能を有するものと理解されている。カゼインミセル構造の現在のモデルによると、カゼインは、最頻半径が約１００ｎｍのほぼ球形の粒子の分布として存在する。このミセルのタンパク質マトリックス中に埋め込まれているのは、さらに多くの電子密度の高いリン酸カルシウム粒子であり、これらは半径が数ｎｍであり、リン酸化カゼイン残基を介してタンパク質マトリックスと結合している。一部のカゼインホスホペプチドは、非晶質リン酸カルシウムの沈殿物を金属イオン封鎖して、リン酸カルシウムナノクラスター（ＣＰＮ）として知られる熱力学的に安定なナノ粒子を形成することが示されている。
【０００３】
具体的には、２５残基のＮ−末端β−カゼイントリプシンリンペプチド（β−カゼイン１−２５）は、１．６ｎｍ厚のリンペプチド５０個のシェルに囲まれた、半径２．４ｎｍを有する非晶質で酸性の水和したリン酸カルシウムのコアを含む、リン酸カルシウムナノクラスターを形成することが確認されている。その他の分泌型リンタンパク質の作用、およびリン酸カルシウムの化学的性質については多大な研究がなされているが、本発明者らは、非カゼイン分泌型リンタンパク質によって形成される平衡ナノクラスターについて公開されている他のいかなる報告も認識していない。タンパク質ＤＭＰ１（象牙質マトリックスリンタンパク質１）との鉱物複合体が、Ｈｅ等により混同してナノクラスターと称されているが、これらは非平衡粒子である（Ｈｅ，Ｇ．，Ｇａｊｊｅｒａｍａｎ，Ｓ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｄ．，Ｃｏｏｋｓｏｎ，Ｄ．，Ｑｉｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｂｕｔｌｅｒ，Ｗ．Ｔ．，Ｈａｏ，Ｊ．Ｊ．＆  Ｇｅｏｒｇｅ，Ａ．（２００５）．Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｄｅｎｔｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎｕｃｌｅｉ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４，１６１４０−１６１４８）。米国特許第５，２２７，１５４号は、歯石を制御するためのカゼインホスホペプチドの使用を示しているが、この中で、この特定のカゼインホスホペプチドは、５〜４０個のアミノ酸を含有し、これはカゼイン消化物から抽出することができる。米国特許第５，０１５，６２８号は、虫歯および歯肉炎に関するリンペプチドの使用を示しているが、このリンペプチドは、配列Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、独立して、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ホスホヒスチジン、グルタミン酸塩、およびアスパラギン酸塩である）を含む、５〜３０個のアミノ酸を有する。また費用面を考慮して、カゼインからリンペプチドを抽出したほうがより経済的であることが示されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、ナノクラスターを形成することができるリンタンパク質またはリンペプチドの特徴を決定し、該ナノクラスターは、従来既知のナノクラスターのものに対して変更されたコア−シェル構造を有するナノクラスターの設計を可能にする。具体的には、本発明者らは、金属イオン封鎖リンペプチドの性質によって、リン酸カルシウムナノクラスターのコアのサイズを変更できることを確認した。有利には、これによってコアサイズを大きくしたナノクラスターの製造が可能になるが、これはより大量の非晶質リン酸カルシウムを金属イオン封鎖することができる。
【０００５】
本発明の第１の態様によると、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターを提供する方法が提供され、この方法は、
ナノクラスター形成溶液を製造するステップであって、ナノクラスター形成溶液をカルシウムイオンと、リン酸イオンと、リンペプチドまたはリンタンパク質とを混合することによって製造するステップを含み、
このとき前記リンペプチドまたはリンタンパク質は、
ａ）組換えによって発現されたリンペプチドであって、
ｉ）リン酸塩中心であって、リン酸化残基および酸性残基のうちの少なくとも１つ、またはこれらの残基の組み合わせがリン酸塩中心内で増加され、それによりリン酸塩中心が増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有するように修飾されたリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉ）修飾されて、それにより修飾された組換えによって発現されたリンペプチドが、組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態と比較して、増加した数の別個のリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉｉ）修飾されて、それにより修飾された組換えリンペプチドが、組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態よりも増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有する、
組換えによって発現されたリンペプチド、あるいは
ｂ）カルシウム結合リンタンパク質／リンペプチド、またはその変異体もしくは断片（このときリンペプチドまたはリンタンパク質は、単一の全カゼイン、またはカゼインの混合物、または単一のカゼインもしくはカゼインの混合物の酵素消化物を含まない）、あるいは
ｃ）ａ）とｂ）との組み合わせ、
のうちの少なくとも１つを含む。
【０００６】
実施形態において、ペプチドの金属イオン封鎖能に、例えばリン酸塩中心内のアミノ酸の修飾による、残基の数および／または種類、および／またはリン酸塩中心内の残基の間隔および／またはリン酸化によって影響を与えることができる（組換えカゼインホスホペプチドに関して、後述の結果を参照。その中で、組換えＣＫ２−ＳおよびＣＫ２−ＳＳペプチドのリン酸塩中心において、多数のＡｓｐ残基をより少ない数のＧｌｕ残基の代わりに含めることは、これらのペプチドを用いて製造されたナノクラスターのサイズを、それ以外は非常に類似しているβ−カゼイン１−２５リンペプチドから形成されたナノクラスターと比較して大きくする原因となる可能性が高いと考えられている）。実施形態において、リン酸塩中心周辺に与えられるフランキング配列は、シェル中のペプチドまたはタンパク質の充填密度を制限することによって、リン酸塩中心の占有面積に影響を与えうる。これに関連して、球状タンパク質は、小さい占有面積を達成しうる短ペプチドまたは折り畳まれていないタンパク質と比較して、不利な立場にあることが予測できる。それにもかかわらず、球状ドメインは、延長された柔軟なリンカー配列を有して、リン酸塩中心と連結している場合には、天然の折り畳まれていないタンパク質または短ペプチドとちょうど同程度に有効であることを予想することができる。
【０００７】
全カゼイン、β−およびκ−カゼインの混合物、β−カゼイン５Ｐ、カゼインであるαｓ１−カゼイン２Ｐ（ｆ４６−５１）、αｓ１−カゼイン４Ｐ（ｆ６１−７０）、β−カゼイン４Ｐ（ｆ１１−２１）、αｓ２−カゼイン３Ｐ（ｆ５−１２）、αｓ２−カゼイン４Ｐ（ｆ４９−６１）、およびαｓ２−カゼイン２Ｐ（ｆ１２６−１３３）、β−カゼインホスホペプチド、４Ｐ（ｆ１−２５）または４Ｐ（ｆ２−２５）または５Ｐ（ｆ１−４２）、臭化シアン切断断片であるαｓ１−カゼイン２Ｐ（ｆ１−５４）またはαｓ１−カゼイン６Ｐ（ｆ６１−１２３）、トリプシンリンペプチドであるαｓ１−カゼイン１Ｐ（ｆ１０４−１１９）またはαｓ１−カゼイン２Ｐ（ｆ４３−５８）またはαｓ１−カゼイン５Ｐ（ｆ５９−７９）またはαｓ１−カゼイン７Ｐ（ｆ４３−７９）を含有する、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のプロテアーゼＸＩＶおよびパパインＩＶ型による全カゼインの消化物を含む、カゼインまたはカゼインホスホペプチドから形成されるナノクラスターまたはナノクラスターを含有する構造体が作製できることはすでに立証されている。これらのナノクラスターを形成するのに使用されるのと同じ技法を、代替のリンタンパク質もしくはリンペプチド分子を用いる本発明において利用することができる。ナノクラスター形成溶液をもたらし、かつリン酸カルシウムナノクラスターの形成に適当なｐＨを有するカルシウムイオン、リン酸イオン、およびリンタンパク質もしくはリンペプチド分子の適当な濃度の例は、本明細書および米国特許第７０６０４７２号、Ｈｏｌｔ  Ｃ，Ｗａｈｌｇｒｅｎ  ＮＭ，  ＆  Ｄｒａｋｅｎｂｅｒｇ  Ｔ．（１９９６）  Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｂｅｔａ−ｃａｓｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｏ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｄｉｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３１４，１０３５−１０３９；Ｈｏｌｔ  Ｃ，Ｔｉｍｍｉｎｓ  ＰＡ，Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｎ，＆  Ｌｅａｖｅｒ  Ｊ．（１９９８）Ａ  ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ｂｅｔａ−ｃａｓｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ−ａｎｇｌｅ  Ｘ−ｒａｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｎ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２５２，７３−７８；Ｈｏｌｔ  Ｃ，Ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｓａｌｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃａｓｅｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄａｉｒｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ  ３：Ｌａｃｔｏｓｅ，Ｗａｔｅｒ，Ｓａｌｔｓ  ａｎｄ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ（Ｐ．Ｆ．Ｆｏｘ，Ｅｄ．）Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ  ｐｐ  ２３３−２５４（１９９７）．Ｌｉｔｔｌｅ，Ｅ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｌｔ，Ｃ．（２００４）Ａｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎ��ｍｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｙ  ｃａｓｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３３，４３５−４４７，Ｈｏｌｔ，Ｃ．（２００４）Ａｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｙ  ｃａｓｅｉｎ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｌｔｓ  ｉｎ  ｍｉｌｋ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３３，４２１−４３４に記載されている。
【０００８】
いくつかの実施形態において、リン酸カルシウムナノクラスターは、複合塩混合物、例えば、３７ｍＭのＣａ（ＮＯ３）、６ｍＭのＭｇ（ＮＯ３）２、３６ｍＭのＫＮＯ３、２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２６ｍＭのＫＮＯ３、１．５ｍＭのＮａＮ３（防腐剤として）または３０ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２、４ｍＭのＭｇ（ＮＯ３）２、１０ｍＭのクエン酸三カリウム、２０ｍＭのＫＨＰＯ４、２６ｍＭのＫＮＯ３、１．５ｍＭのＮａＮ３（防腐剤として）から作製されており、これはリンペプチドも含む。典型的には、この溶液は、初期にはｐＨ５．５であり、このｐＨを上昇させてリン酸カルシウムナノクラスターを形成する。適切には、本明細書に記載するように、２つの方法を用いることができる。これらは、ｉ）ウレアーゼによる溶液中の尿素の触媒加水分解によって、アンモニアを溶液中に均一に生成させてｐＨを穏やかに上昇させる方法、またはｉｉ）強塩基および／または塩基性リン酸塩と、カルシウム、リン酸塩、およびリンペプチドの酸性溶液との単純混合による方法である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ナノクラスター形成溶液は、３．１以下の［Ｃａｔ］／［ＰＰ］を有し；［Ｐｉ，ｔ］＝（０．８７５±０．１２５），［ＰＰ］−１．６７±０．２５であり、このとき［ＰＰ］は、リンペプチドの濃度（グラム／リットル）であり、［Ｐｉ，ｔ］は、無機リン酸塩の合計ミリモル濃度であり、［Ｃａｔ］は、カルシウムの合計ミリモル濃度である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ナノクラスターは、［Ｃａ（ＨＰＯ４２−）０．４−１．０（ＰＯ４３−）（Ｈ２Ｏｘ）］５．１５・［Ｃａ２−５−ＳｅｒＰｙ−ペプチド］の範囲の実験式を有し、式中、ｙは３以上であり、両大括弧内のイオンの電荷の和はおよそゼロであり、Ｃａ２−５ＳｅｒＰｙ−ペプチドは、リン酸化リンペプチド分子のカルシウム塩である。
【００１１】
実施形態において、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターは、リン酸カルシウムナノクラスター形成溶液から形成することができる。このときリン酸カルシウムナノクラスター形成溶液は、濃度比［Ｃａ］／［Ｐｏ］≦３．１（式中、Ｃａはカルシウムであり、Ｐｏは有機リンである）で、カルシウムイオンと、リン酸イオンと、リンペプチドもしくはリンタンパク質分子とを単純混合することによって製造する。このときリン酸カルシウムナノクラスター形成溶液のｐＨを、リン酸カルシウムナノクラスター形成溶液の成分の単純混合によって初期ｐＨから最終ｐＨに調整し、このとき前記成分の単純混合は、リン酸カルシウムナノクラスター形成溶液中にウレアーゼが含まれることを必要としない。
【００１２】
変異体カルシウム結合リンタンパク質という用語は、カルシウム結合リンタンパク質またはリンペプチド、例えば分泌／分泌型カルシウム結合リンタンパク質／リンペプチド、または分泌／分泌型カルシウム結合リンタンパク質のパラロガス群の要素との７０％を上回る、８０％を上回る、９０％を上回る、９５％を上回る、または９９％を上回る配列相同性を有するカルシウム結合リンペプチドを意味する。
【００１３】
下記に挙げるリンペプチド１〜５は、本発明の修飾された組換えリンペプチドとはみなされない。
１）．Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｓｅ−Ｉｌｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｓｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（配列番号５）、
２）．Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｓｅ−Ｌｅｕ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（配列番号６）、
３）．Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｓｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（配列番号７）、
４）．Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｓｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号８）、および
５）．Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｓｅ−Ｐｔｈ−Ｐｓｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（配列番号９）、
（Ｐｓｅはホスホセリンであり、Ｓｅｒはセリンであり、Ｐｔｈはホスホスレオニンであり、Ｔｈｒはトレオニンであり、Ｇｌｕはグルタミン酸塩であり、Ａｓｐはアスパラギン酸塩であり、Ａｌａはアラニンであり、Ａｓｎはアスパラギンであり、Ｇｌｎはグルタミンであり、Ｇｌｙはグリシンであり、Ａｒｇはアルギニンであり、Ｈｉｓはヒスチジンであり、Ｉｌｅはイソロイシンであり、Ｌｅｕはロイシンであり、Ｌｙｓはリジンであり、Ｍｅｔはメチオニンであり、Ｐｒｏはプロリンであり、Ｔｙｒはチロシンであり、Ｖａｌはバリンである）。
【００１４】
好ましくは、ナノクラスター形成溶液は、リンタンパク質またはリンペプチドではない他のカルシウムキレート剤を著しい量（０．１ｍＭを上回る）で含有しない。好ましくは、クエン酸塩などのカルシウムキレート剤が含まれる場合、ナノクラスター形成溶液中に増量したカルシウムを見込んでおかなければならない。
【００１５】
小角Ｘ線もしくは中性子散乱によって測定されるナノクラスターのサイズは、水和した非晶質リン酸カルシウムコアの半径、ペプチドシェルの厚さおよび構造、ならびにコアとシェルとの相対散乱長密度によって異なる。所定のペプチドでは、コアのサイズは、ペプチドの金属イオン封鎖能によって異なる。熱力学的には、平衡サイズは、ペプチドによる金属イオン封鎖の負の自由エネルギーの、リン酸カルシウムコアの形成の正の自由エネルギーに対するバランスによってもたらされる。前者はコア表面積に比例し、一方後者はコア体積に伴って増加する。
【００１６】
実施形態において、本発明のナノクラスターは、コア半径が、３ｎｍ以上、４ｎｍ以上、５ｎｍ以上、８ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、１５ｎｍ以上、または２０ｎｍ以上であってよい。
【００１７】
実施形態において、本発明のナノクラスターは、ナノクラスター中のリン酸塩中心１個当たりのコア表面積が、０．２５ｎｍ２未満、０．３ｎｍ２未満、０．４ｎｍ２未満、０．５ｎｍ２未満、０．６ｎｍ２未満、または１ｎｍ２未満であってよい。
【００１８】
有利には、本発明の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターは、ｉ）生体材料の正常な非毒性成分から作成されているため、生体適合性であってもよく、および／またはｉｉ）例えば血液内または動物の体内、例えばヒトの循環において通常存在するペプチドを使用することによって、免疫学的にサイレントであってよい。
【００１９】
本発明の第２の態様によると、本発明の第１の態様の方法において使用するリンペプチドでが提供されるが、このリンペプチドは、
−カルシウム結合リンペプチドもしくはリンタンパク質、またはそれらの変異体もしくは断片を含み、このときリンペプチドもしくはリンタンパク質は、いかなるカゼイン、またはいかなるカゼインの酵素消化物も含まない。
【００２０】
本発明の第３の態様によると、組換えによって発現されたリンペプチドが提供され、このとき前記組換えリンペプチドは、
ｉ）リン酸塩中心であって、リン酸化残基および酸性残基のうちの少なくとも１つ、またはこれらの残基の組み合わせがリン酸塩中心内で増加され、それによりリン酸塩中心が増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有するように修飾されたリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉ）修飾されていない組換えによって発現されたリンペプチドよりも、増加した数の別個のリン酸塩中心を含むように修飾されているか、または
ｉｉｉ）修飾された組換えリンペプチドが、組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態よりも、増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有するように修飾されており、これは好ましくは、アミノ酸残基の数および／または種類および／またはリン酸化、またはリン酸塩中心内の特定のアミノ酸残基の間隔の変更によって、あるいは非晶質リン酸カルシウムがより結晶性の高い相、例えばアパタイトに変換するのを促進するアミノ酸配列を除去することによって行なわれる。
【００２１】
定義された本発明のリンペプチドを用いてナノクラスターを形成することによって、新規の改善されたナノ構造体の設計の機会がもたらされる。
【００２２】
リンペプチド分泌／分泌型カルシウム結合リンタンパク質
ナノクラスターを形成するために使用するリンペプチド／リンタンパク質は、ナノクラスターの用途によって選択することができる。リンペプチドまたはリンタンパク質は、リン酸化の中心を含んでもよく、また典型的には、疎水性部分をほとんどあるいは全く含まなくてもよい。当業者には当然のことながら、ナノクラスターは、複数の異なる種類のリンペプチドまたはリンタンパク質、あるいはこれら両者の組み合わせから形成してもよい。一部の生物医学的応用例では、カゼインの免疫原性により、非カゼインのリンペプチドまたはリンタンパク質を使用することが好ましいであろう。一般に、短いリンペプチド／リンタンパク質が好適であるが、これはリンペプチドの所定のモル濃度をもたらすために、より少ない質量のリンペプチドを必要とするためである。
【００２３】
実施形態において、リンペプチドは、ナノクラスターの外側シェルを架橋するのに適した長さを有するリンカーペプチドと連結したリン酸塩中心を含んでもよい。例えば、ｎｐペプチドから形成されたコア半径ｒｃおよびシェル厚ｌのナノクラスターについて考えてみると、一端がリン酸塩中心に結合し、他端が半径ｒｇの球状タンパク質に結合しているｎｒｅｓ残基の単一のリンカーペプチドは、このリンカーペプチドがシェルにわたる場合、ナノクラスターに組み込むことができる。したがって、リンカーペプチドは、シェルを形成するペプチド中の最も長いフランキング配列と少なくとも同等の長さである必要がある。複数のリンカーペプチドがそれぞれのナノクラスターに組み込まれている場合、球状タンパク質結合の立体障害を考慮する必要がある。ｎｐ全てのシェル分子が球状タンパク質と結合する限りにおいて、シェルの最小厚は、ｎｐ全ての球状タンパク質を組み込むことができるナノクラスターの表面積によって特定される。
2011527898.tif 000002
【００２４】
ｌにおけるこの二次方程式の正根は、
2011527898.tif 000003
によって示される最小シェル厚ｌｍｉｎである。したがって、リンカーペプチド中の残基の最少数は、ｌｍｉｎを完全に伸長したコンフォメーションのペプチド結合の長さで除することによって得られる。
【００２５】
ナノクラスター表面に結合させる有用な球状タンパク質には、ワクチン中に使用するための抗原タンパク質、および標的細胞への薬物送達のための受容体リガンドが含まれるが、より短い機能配列が含まれてもよく、これには線状エピトープ、負荷電分子、例えばｓｉＲＮＡの結合のためのオリゴ−Ａｒｇもしくはオリゴ−Ｌｙｓ配列、および正荷電分子または表面、例えばシュウ酸カルシウムとの結合のためのオリゴ−Ｇｌｕもしくはオリゴ−Ａｓｐ配列がある。
【００２６】
実施形態において、カルシウム結合リンペプチドは、分泌または分泌型カルシウム結合リンタンパク質／リンペプチド、例えば分泌カルシウム結合リンタンパク質のパラロガス群の要素、またはそのようなタンパク質／ペプチドの変異体または断片であってよい。一般論として、パラロガス群の要素を作成する遺伝子重複は、機能の相違を可能にする。さらに、新規の機能に向かう適応的突然変異は、本来の機能と競争し、それにより後者が失われる。これを考慮すると、カルシウム感受性カゼインが平衡ナノクラスターを形成しうるというこれまでの研究結果を踏まえて、分泌カルシウム結合リンタンパク質の群の別の要素が、リン酸カルシウムを金属イオン封鎖する能力を共有し、平衡錯体を形成しうるということは、当業者には決して明らかではなかった。
【００２７】
本発明の実施形態において、本発明のリンペプチドは、
−フェチュインＡ（ＦＥＴＵＡ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７６５）（配列番号１０）、
−プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（ＰＲＢ４）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０１６３）（配列番号１１）、
−マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０８４９３）（配列番号１２）、
−分泌型リンタンパク質２４（ＳＰＰ−２４）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３１０３）（配列番号１３）、
−リボフラビン結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７５２）（配列番号１４）、
−オステオポンチン（ＯＰＮ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０４５１）（配列番号１５）、
−インテグリン結合シアロリンタンパク質ＩＩ（ＩＢＳＰ−ＩＩ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ２１８１５）（配列番号１６）、
−マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（ＭＥＰＥ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＱ７６）（配列番号１７）、
−象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（ＤＭＰ１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３３１６）（配列番号１８）、
からなる群から選択される要素、あるいはこれらの変異体または断片であってよく、またこれらの配列に与えられた慣用名が用語上異なるものも考慮に入れる。
【００２８】
適切には、リンペプチドの実施形態において、リン酸塩中心における全てのリン酸塩部位はリン酸化されていてもよく、またペプチド中の他のどのリン酸塩部位もリン酸化されていないため、金属イオン封鎖は非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）の熟成よりも好ましい。実施形態において、本発明のリンペプチドは、少なくとも３つのリン酸化残基を含む少なくとも１つのリン酸塩中心を有する、象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（ＤＭＰ１）、フェチュインＡ（ＦＥＴＵＡ）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、分泌型リンタンパク質２４（ＳＰＰ−２４）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、またはインテグリン結合シアロリンタンパク質（ＩＢＳＰＩＩ）のアイソフォームを含んでもよい。ＤＭＰ１、フェチュインＡ、ＭＧＰ、ＳＰＰ−２４、ＯＰＮ、およびＩＢＳＰＩＩの完全なタンパク質のアミノ酸配列は、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）のより結晶性の高い相、例えばアパタイトへの変換を促進する可能性が高いと考えられるため、このようなリンペプチドの好適な実施形態においては、ＤＭＰ１、フェチュインＡ、ＭＧＰ、ＳＳＰ−２４、ＯＰＮ、およびＩＢＳＰＩＩのリンペプチド配列は、フェチュインＡおよびＳＰＰ−２４に見られるようなシスタチンドメインＤ１、ＭＧＰに見られるような４個以上のＧｌａ残基のクラスター、ＩＢＳＰＩＩに見られるような５個または典型的には８個以上の連続するＧｌｕ残基のオリゴＧｌｕ配列、あるいはＤＭＰ−１のＣ−末端側半分（ラットにおけるＳ−１８０以降）、またはＯＰＮのＣ−末端部分（雌ウシにおける残基Ｋ−１４９以降）に見られるような１０個以上のリン酸化の部位を含有する長いリン酸化配列を含有しない。好適なリンペプチド配列は、当該技術分野で周知の方法を用いた、親タンパク質の選択的なタンパク質分解切断によって形成することができる。例えば、プラスミンによる、雌ウシ由来のＯＰＮの１４９−Ｋ−Ｋ−１５０における切断、Ａｓｐ−特異的プロテアーゼによる、ラット由来のＤＭＰ１の１８０−Ｓ−Ｄ−１８１における切断は、Ｃ−末端配列のＡＣＰのＨＡ転換傾向を有さない、リン酸塩中心を含有する機能性Ｎ−末端ペプチドをもたらす。あるいは、分泌型カルシウム結合リンタンパク質／リンペプチドの部分配列は、例えば組換え法によって作製することができる。実施形態において、リンペプチドは、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）のより結晶性の高い相、例えばアパタイトへの変換を促進する可能性が高い配列を含まないように修飾された、オステオポンチン、あるいはその変異体または断片であってもよい。好ましくは、オステオポンチンのアミノ酸配列、あるいはその変異体または断片は、リン酸塩中心内に実質的に全てのリン酸化の部位を有する。実施形態において、本発明のオステオポンチン断片は、配列番号１（オステオポンチン（ＯＰＮ）１−１４９）を含んでもよい。本明細書において使用する用語ＯＰＮ１−１４９は、プラスミン触媒加水分解によって生成されるＮ−末端リンペプチド群を表現するために使用される。これらには、配列ＯＰＮ１−１４７、１−１４９、および１−１５０が含まれる。実施形態において、本発明のオステオポンチン断片は、配列番号１（ＯＰＮ１−１４９）からなってもよい。適切には、本発明の第１の態様において使用するリンペプチドは、ＯＰＮ１−１４９（配列番号１）であってよい。
【００２９】
本発明者らは、分泌型リンタンパク質、または分泌型リンタンパク質に由来するペプチドによるリン酸カルシウムナノクラスターの形成は、体内で、乳汁および血液、およびその他の何らかの生体液の安定性、ならびに軟部組織中の細胞外液の安定性を維持するのに、ある程度有効であろうと考えている。同様に、このナノクラスターは、鉱化性組織の細胞外マトリックスにおけるリン酸カルシウムの相分離の準安定度および速度を制御すること、または軟部組織における異所性鉱化を逆転させることに関与している可能性がある。生きた真核細胞または組織から、規定のリン酸化状態で内因性細胞内タンパク質を抽出するには、キナーゼ活性およびホスファターゼ活性を厳しく抑制する必要がある。これは困難で、かつ時間がかかるであろう。代替の手法は、組換え法を用いて、規定のリン酸化状態のタンパク質基質またはポリペプチド基質を発現するものである。これは、リンペプチドの修飾またはｄｅ  ｎｏｖｏ合成も可能にする。
【００３０】
リンペプチド−組換えリンペプチド
改善されたリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有するナノクラスターは、組換えリンペプチドを含んでもよく、このとき前記組換えリンペプチドは、リン酸塩中心内の増加した数のリン酸化残基、リン酸カルシウム金属イオン封鎖能が増大したリン酸塩中心、または増加した数の別個のリン酸塩中心のうちの少なくとも１つを提供するように修飾されている。組換えリンペプチドは、要望により、リン酸塩中心とは異なる配列でさらに修飾して、例えばリンペプチドの長さを減少させてもよい。組換えリン酸塩中心を含むリンペプチドは、化学的にｄｅ  ｎｏｖｏ合成しても、あるいは既知のリンペプチド、例えば分泌型カルシウム結合リンタンパク質／リンペプチドまたはカゼインペプチドに基づき、その中に突然変異を導入してもよい。このような突然変異は、既知のリン酸塩中心におけるリン酸化残基の数を増加させることができ、および／またはリン酸塩中心の数を増加させる、および／またはリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を増大させることができる。実施形態において、組換えリンペプチドは、ウシβカゼインに基づいていてもよい。実施形態において、組換えリンペプチドは、酵素消化部位、例えばトリプシン切断部位を含んでもよい。本発明の実施形態において、リンペプチドは、非カゼイン分泌型リンタンパク質である、組換え分泌カルシウム結合リンタンパク質であってもよい。実施形態において、カゼインのリン酸塩中心においてグルタミン酸残基がアスパラギン酸残基で置換された、組換えカゼインホスホペプチドが提供される。このような実施形態において、好ましくは、カゼインのリン酸塩中心は、Ｇｌｕ残基に優先してＡｓｐ残基を導入するように突然変異されていてもよく、このとき３個のＧｌｕ残基の代わりに少なくとも３個のＡｓｐ残基が提供され、より好ましくは４個のＧｌｕ残基の代わりに少なくとも４個のＡｓｐ残基が提供される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、組換えリンペプチドは、ＣＫ２−ＳＳおよびＣＫ２−ＳおよびＣＫ２−Ｓ−６Ｈ（下記を参照）のうちの少なくとも１つを含んでもよい。ＣＫ２ＳＳコンストラクトは、トリプシン切断部位によって分離されたＣＫ２−Ｓ配列のタンデムリピートを含有する。
2011527898.tif 000004
【００３２】
ポリペプチド基質の選択的かつ排他的なリン酸化は、リンペプチドを提供する目的で、単一の組換えキナーゼと組換えポリペプチド基質とを共発現させることによって達成することができる。例えば、組換えコンストラクトにおけるリン酸塩中心のそれぞれは、組換えペプチドとタンパク質キナーゼ−カゼインキナーゼ２の触媒サブユニット（ＣＫ２α）との共発現によってリン酸化することができる。組換えリンペプチドＣＫ２−ＳＳ、ＣＫ２−Ｓ、およびＣＫ２−Ｓ−６Ｈに関連して、これにより一連のリン形態を生じるが、それらのうちのほとんどは、そのリン酸塩中心に３個以上のリン酸化残基を含有する。これは、複数の部位における平均リン酸化度、例えば約６１〜８３％を含む、組換えによって発現されたリンペプチドを生成する方法の本発明のさらなる態様を提供する。この方法は、例えば大腸菌宿主中に２つの適合する共生プラスミドを提供するステップを含み、このプラスミドは高コピー数および低コピー数を有し、タンパク質キナーゼと、より多量なポリペプチド基質をそれぞれ発現する。大腸菌は宿主細胞としての使用に有利であるが、これは大腸菌が熟知されており、使用が容易であり、適応性を有するためである。さらに、大腸菌は、内因性タンパク質キナーゼによる、組換えによって発現されたポリペプチドのバックグラウンドリン酸化を生じない。いくつかの実施形態において、大腸菌の宿主株は、ＢＬ２１  ｓｔａｒ［リン酸化候補タンパク質／ポリペプチドをコードするｐＥＴプラスミドとｐＡＣＹＣ  Ｄｕｅｔ−１−ｈＣＫ２αとで二重形質転換したＤＥ３］であってよい。
【００３３】
当然のことながら、いかなるタンパク質またはペプチドも、適切なリン酸塩中心配列を含有するように操作することができ、またいかなる球状タンパク質も、ナノクラスターのコア表面に結合する能力がある、リン酸塩中心を含有する柔軟なリンカー配列によって、そのＣ−末端またはＮ−末端のいずれかにおいて延長することができる。必要であれば、変性剤、ジスルフィド結合還元、およびｐＨ調整のうちの少なくとも１つを用いて、組換えペプチド／タンパク質をアンフォールドしてもよい。慎重に、この修飾された配列を他の既知のリンペプチドから形成された一連の熱力学的に安定なナノ粒子に組み込んでも、または新規のリンペプチドを作成するために使用してもよい。いくつかの実施形態において、本方法で用いるリンペプチドは、片側またはそれぞれの側が柔軟なアミノ酸配列に隣接した、少なくとも１つのリン酸塩中心を含む。実施形態において、リン酸塩中心がＮ−末端またはＣ−末端付近に位置するとき、そのリン酸塩中心は、片側が予測される柔軟な配列に隣接していてもよい。柔軟な配列は、適切なコンピュータプログラム、例えばＰＯＮＤＲ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｏｎｄｒ．ｃｏｍ）を用いて決定することができる。非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）のより結晶性の高い相、例えばアパタイトへの変換を促進する可能性が高いアミノ酸配列を含有するリンペプチドは、リン酸カルシウムの金属イオン封鎖による平衡ナノクラスターの形成を妨げうる。このことを考慮すると、好適な実施形態において、リンペプチドは、非晶質リン酸カルシウムのより結晶性が高い相、例えばヒドロキシアパタイトへの熟成を促進するサブ配列を含有すべきではない。特定の実施形態において、リンペプチドは、疎水性部分をほとんどまたは全く含有しない。
【００３４】
理論に拘束されることを望むものではないが、組換えペプチド（ＣＫ２−ＳＳ、ＣＫ２−Ｓ、およびＣＫ２−Ｓ−６Ｈ）を用いた研究であって、ＯＰＮおよび全カゼインから調製されたトリプシンリンペプチドに関して本発明者らが実施した研究に基づくと、リン酸塩中心を含むペプチドまたはタンパク質の長さが、考慮すべき重要事項ではないことは明らかである。さらに、例として挙げた組換えペプチドは、ウシβ−カゼインとの類似性を有するが、オステオポンチンプラスミン（ＯＰＮ）ペプチドは、リン酸塩中心以外のいかなるカゼイン配列とも著しい配列類似性を有さない。本研究を踏まえ、ＯＰＮに基づく適切な組換えリンタンパク質／リンペプチドが提供できるであろうことが予想される。
【００３５】
リン酸塩中心
リンペプチドは、リン酸化の中心を含む。これは、例えばおよそ５〜９残基の長さ、より好ましくはおよそ７残基の長さの短い配列中に、３個以上のリン酸化残基を含有するペプチドまたはタンパク質の領域であってよい。実施形態において、リン酸化の中心は、少なくとも３個のリン酸化残基、好ましくは多重リン酸化ペプチド中で互いに近接した少なくとも３個のリン酸化残基、例えば、リンペプチド分子またはリンタンパク質分子の一次構造における一連の６個の連続する残基中の３個のリン酸化残基を有してもよい。本発明者らは、有能なリン酸塩中心（ＰＣ）は、カゼインに見られるよりも、例えばｐＳ［Ｉ，Ｌ］ｐＳｐＳｐＳＥＥ（配列番号２２３）よりもずっと広い範囲の一次構造をリン酸化または部分リン酸化することによって形成することができると判断した（本明細書における第３〜５表は、カゼインのリン酸塩中心の例を示している）。いくつかの実施形態において、本発明者らは、リン酸塩中心は３個以上のリン酸化の潜在部位を含有し、典型的なリン酸塩中心は、４個または５個の実際のリン酸化残基を含有すると判断した。実施形態において、各リン酸塩中心は、リンタンパク質の一次構造に、少なくとも３個のリン酸化残基を含む短い酸性配列を含んでもよい。リン酸塩中心は、連続するリン酸化部位のブロックと、それに続くキナーゼ一次認識部位の［Ｓ，Ｔ］ＥＥ、［Ｓ，Ｔ］ＥＤ、［Ｓ，Ｔ］ＤＥ、または［Ｓ，Ｔ］ＤＤ（大括弧内の残基は選択肢である）を含有してもよい（［Ｓ，Ｔ］ＤＤは、カゼイン中には認められないことに留意）。あるいは、リン酸塩中心は、一次キナーゼ認識３塩基［Ｓ，Ｔ］ＸＥ（マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ））または［Ｓ，Ｔ］ＤＥ（オステオポンチン（ＯＰＮ））の３回以上の反復を含む小パターンを含んでもよい。
【００３６】
ＰＯＮＤＲ（登録商標）の予測によると、同定された分泌型リンタンパク質のサブセット中の特定のリン酸塩中心配列の位置は、常に、分泌型カルシウム結合リンタンパク質中の予測される柔軟な配列内にある。これらのリンタンパク質は、低複雑度の２つのフランキング配列を有してもよく、あるいはリン酸塩中心がリンペプチドのＮ−末端またはＣ−末端の付近に位置する場合、１つのそのようなフランキング配列を有してもよい。
【００３７】
有能なリン酸塩中心におけるリン酸化の部位の最大数は、ラットαｓ１−カゼインにおいて９個であり、これらのリン酸化部位のうち８個は連続していて、２つのαｓ２−カゼイン配列中にある。このことから、また本明細書において検討するパターン認識方法を踏まえて、リン酸塩中心配列は、好ましくは、３〜９個のリン酸化の部位を有してもよく、そのうちの少なくとも３個は実際にリン酸化された残基である。分泌型リンタンパク質のリン酸化に関与するキナーゼは、とりわけ、ゴルジ体キナーゼ、ならびにカゼインキナーゼ２型特異性を有する、核内および細胞外キナーゼを含む。キナーゼ認識配列は厳格に規定されていないが、ゴルジ体キナーゼおよびカゼインキナーゼ２の部位は、モチーフ［Ｓ，Ｔ］Ｘ（ｍ，ｎ）［Ｅ，Ｄ，ｐＳ，ｐＴ］（Ｘは、任意の残基であり、Ｘ（ｍ，ｎ）は、ｍからｎまでの長さの可変配列を示す）に適合する。典型的には、ゴルジ体キナーゼの場合にはｍ＝ｎ＝１であり、カゼインキナーゼ２の場合にはｍ＝ｎ＝２である。特定の実施形態において、このようなモチーフがリン酸塩中心をもたらしてもよい。リン酸化の部位のクラスター化およびリン酸化度の可変性は、分泌型リンタンパク質では一般的であり、これは生理学的に重要となりうる。
【００３８】
同定されたリン酸塩中心の多くは、少なくとも２つの連続するリン酸化の部位を含有する。例には、以下のものがある。
ｉ）真獣類β−カゼインにおけるリン酸塩中心モチーフであり、これはウマ配列を例外として、ｐＳ［Ｌ，Ｖ］ｐＳ（２，３）ＥＥである（配列番号２１３および２１４）。
ｉｉ）真獣類αｓ１−カゼインのＰＣ−３は、ｐＳ［Ｉ，Ｇ，−］ｐＳ（３，７）ＥＥである（配列番号２１５）。
ｉｉｉ）αｓ２−カゼインのＰＣ−２は、ラクダ配列、ウサギＢ配列、およびマウスＢ配列を例外として、ｐＳ（３，５）ＥＥｐＳ（０，２）である（配列番号２１６）。
ｉｖ）ＯＰＮのＰＣ−１は、ラット配列を例外として、ｐＳ（１，２）［Ｇ，Ａ］ｐＳｐＳＥＥである（配列番号２１７）。
ｖ）ＯＰＮのＰＣ−２は、ウサギ配列およびマウス配列を例外として、ｐＳｐＳＥＥｐＴＤＤである（配列番号２１８）。
ｖｉ）ＩＢＳＰ−ＩＩの保存されたリン酸塩中心モチーフの一部は、ニワトリ配列を例外として、ｐＳｐＳＥ（３，８）である。
ｖｉｉ）マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（ＭＥＰＥ）のリン酸塩中心は、ｐＳｐＳＥｐＳｐＳ［Ｄ，ｐＳ］ｐＳＧｐＳｐＳｐＳＥｐＳ（１，２）である（配列番号２１９）。
【００３９】
全ての既知のＳＰＰ−２４リン酸塩中心は、最小モチーフｐＳｐＳＥＥ（配列番号２２０）を含む。唯一の既知のプロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（ＰＲＢ４）配列は、ｐＳｐＳｐＳＥＤ（配列番号２２１）を有するが、ニワトリリボフラビン結合タンパク質（ＲＢＰ）のリン酸塩中心は、保存されていない。
【００４０】
また、ゴルジ体キナーゼ認識配列［Ｓ，Ｔ］Ｘ［Ｅ，Ｄ，ｐＳ，ｐＴ］のタンデムリピートによって、連続するリン酸化の部位を有さないリン酸塩中心を形成することもできる。この例は、オステオポンチンのリン酸塩中心３（ＯＰＮのＰＣ−３）、フェチュインＡ、およびマトリックスＧｌａタンパク質に見られる。この種のリン酸塩中心のコンセンサスモチーフは、（ｐＳＸＥ）３（配列番号２２２）である。タンパク質が１つ以上のよく保存されたリン酸塩中心を含む場合、その他のリン酸塩中心は、より可変性を示すと考えられるか、あるいは全く存在しない可能性もある。例には、αｓ１−カゼインにおけるＰＣ−１およびより程度は低いがＰＣ−２、αｓ２−カゼインにおけるＰＣ−３、ならびにＤＭＰにおけるＰＣ−１以外の全てのＰＣがある。典型的には、ナノクラスター形成リンタンパク質は、１つ以上のリン酸塩中心と、それらのリン酸塩中心の間に位置する実質的に柔軟なリンカー部とを含む。実施形態において、リン酸カルシウム金属イオン封鎖ペプチドのリン酸塩中心のフランキング配列は、残基多様性が低く、疎水性残基をほとんど有さず、システイン残基を有さない。実施形態において、溶液中の実質的に柔軟なリンカーは、リンタンパク質をアンフォールドすることによってもたらすことができる。アンフォールドは当業者に既知の手段で行なうことができ、これには変性剤の使用、ジスルフィド結合還元、またはｐＨ調整が含まれる。等電点ｐＨから、例えば、典型的には極めて酸性またはアルカリ性のｐＨへのｐＨの調整は、しばしば球状タンパク質を完全に変性させ、ジスルフィド架橋の還元またはアルキル化と組み合わせると、ほとんどの場合、タンパク質を完全にアンフォールドするのに十分である。同様に、ジスルフィド結合の還元またはアルキル化と組み合わせた、６−Ｍ尿素またはグアニジニウム塩酸塩の添加は、タンパク質の大部分をアンフォールドするのに十分であろう。グアニジニウム塩酸塩の使用は尿素よりも好適であるが、これは前者の変性剤の存在下では、尿素／ウレアーゼ反応によるｐＨの微調整が依然として可能であるためである。アンフォールドした後、タンパク質のコンフォメーションは大幅に柔軟になる。
【００４１】
本発明の第４の態様によると、本発明の第２または第３の態様のリンペプチドを含む、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターが提供される。
【００４２】
本発明のさらなる態様によると、リンタンパク質またはリンペプチドを含む熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターが提供されるが、このリンタンパク質またはリンペプチドは、
ａ）組換えによって発現されたリンペプチドであって、
ｉ）リン酸塩中心であって、リン酸化残基および酸性残基のうちの少なくとも１つ、またはこれらの残基の組み合わせが、リン酸塩中心内で増加され、それによりリン酸塩中心が増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有するように修飾されたリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉ）修飾されて、それにより修飾された組換えによって発現されたリンペプチドが、組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態と比較して、増加した数の別個のリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉｉ）修飾されて、それにより修飾された組換えリンペプチドが、組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態よりも増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有する、
組換えによって発現されたリンペプチド、あるいは
ｂ）カルシウム結合リンタンパク質／リンペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片（このときリンペプチドまたはリンタンパク質は、単一のカゼイン、またはカゼインの混合物、または単一のカゼインもしくはカゼインの混合物の酵素消化物を含まない）、あるいは
ｃ）ａ）とｂ）との組み合わせ、
のうちの少なくとも１つを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、修飾された組換えリンペプチドは、アミノ酸残基の数および／または種類および／またはリン酸化、またはリン酸塩中心内の特定のアミノ酸残基の間隔の変更によって、リン酸塩中心に隣接するアミノ酸残基またはそのアミノ酸残基の数を変更することによって、あるいは非晶質リン酸カルシウムがより結晶性の高い相、例えばアパタイトに変換するのを促進するアミノ酸配列を除去することによって、組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態よりも増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有してもよい。
【００４４】
実施形態において、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターは、本発明の第１の態様の方法によって提供することができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ナノクラスターは、配列番号１（ＯＰＮ１−１４９）を含むリンペプチドを含んでもよい。理論に拘束されることを望むものではないが、ＯＰＮ含有ナノクラスターの構造のモデリングに基づいて、本発明者らは、ナノクラスター上のＯＰＮ１−１４９ペプチド鎖の数が、２５００〜２７００の範囲であり、具体的には約２６１８本のペプチド鎖であると考えている。
【００４６】
上記に記載したように、ナノクラスターは、常に過剰な非晶質リン酸カルシウムを生成しない条件下で製造することができる。これは、過剰な非晶質リン酸カルシウムが、金属イオン封鎖されてナノクラスター溶液を形成することができる前に、熟成してより結晶性が高い相を形成しうるためである。熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターを形成する方法は、当該技術分野で既知である。これは例えば、米国特許第７，０６０，４７２号を参照されたい。ナノクラスターは、尿素／ウレアーゼ法によって、または単純混合によって製造することができ、１〜２日間の熟成後、保管時に変化しない平衡サイズを得ることができる。尿素／ウレアーゼ法は、混合時に局所的な過剰濃度を生じないため、また酵素濃度によって反応速度を容易に制御できるため好適である。このことにもかかわらず、単純混合法を用いて、１リットル規模で、過剰量の３００ｍＭのＣａを含有するカゼインホスホペプチドナノクラスター溶液の生成に成功している。ｍＭ未満のペプチド濃度では、ナノクラスターの検出および特徴付けが困難である。
【００４７】
適切には、特定の実施形態において、ナノクラスターは別の成分を含んで、ナノクラスターをある細胞型に誘導する、または免疫応答を引き出すなど、付加機能を有するナノクラスターを提供してもよい。例えば、ＯＰＮナノクラスターは、インテグリン受容体に結合したＲＧＤ配列を含有する。インテグリン結合は、ＳＣＰＰの下位群の特徴である。特定の実施形態において、ＯＰＮ１−１４９ナノクラスターをアジュバントの一部として提供することができる。そのようなアジュバントは、抗原を含有していてもよく、また免疫賦活成分または細胞誘導成分を含んでいてもよい。ＯＰＮ１−１４９またはフェチュインＡの使用は、カゼインナノクラスターの使用よりも有利であるが、これはカゼインとは対照的に、ＯＰＮまたはフェチュインＡが免疫学的にサイレントなナノクラスターをもたらすためである。本発明のリン酸カルシウムナノクラスターおよびリンペプチドには、多様な鉱質代謝障害の予防、診断、および処置における用途、およびプロテーゼ、移植器官、および腎臓透析膜の鉱化の防止における用途がある。さらに、これらを用いて、生体液および／または生体液代用物を安定化させることができる。
【００４８】
したがって、本発明の第５の態様は、鉱質代謝障害の予防、診断、および処置における、本発明によるリン酸カルシウムナノクラスターの使用を提供する。特定の実施形態において、障害には、骨粗しょう症、くる病、骨疾患、乳腺の石灰化、病的石灰化、鉱化組織、例えば歯の脱ミネラル化、および歯垢の石灰化も含みうる。異所性石灰化は、心臓弁の置換の際によく見られる合併症であり、その置換の主要原因でもある。これは脈管構造においても発生し、虚血、脳卒中、および心筋梗塞などの急性疾患のリスクを高める。軟部組織における腫瘍の異所性石灰化は、化学療法によるその処置を困難にし、薬物の有効性を低下させる。腎不全、メタボリックシンドローム、または糖尿病などによるミネラルの不均衡の結果、肺、心臓、大動脈、腎臓、および胃を含む内臓の石灰化が頻繁に生じる。
【００４９】
適切には、本発明のナノクラスターは、例えば血液透析においてなど、沈殿の危険性を伴わずに過飽和を維持する必要がある場合に、生体液、または人工液、例えば合成血清の安定性を制御するために使用することができる。したがって、本発明のさらなる態様は、天然液または合成液の安定性と過飽和度とを維持するための、ナノクラスター含有溶液の使用を提供する。好ましくは、この液体は、生体液、例えば血液、血漿、細胞外液およびリンパ液、滑液、脳脊髄液、および唾液であってよい。この生体液は、リン酸カルシウムと接触し、かつリン酸カルシウムに対して過飽和であってよく、また組織、例えば骨、歯、および類骨の鉱化状態を維持することが要求されうる。好ましくは、液体中の全てのカルシウムおよびリン酸塩のうちの著しい割合をナノクラスターの形態で提供して、イオン濃度およびｐＨの調節を助けてもよい。好ましくは、液体は、血清の生理的値前後、具体的には約１．２５ｍＭの遊離カルシウム濃度、および２８０〜３１０ｍＭの等張容量オスモル濃度を有してもよい。適切には、ナノクラスターは、通常血漿中に含まれるリンタンパク質またはリンペプチド、例えばＯＰＮ、フェチュインＡ、ＳＰＰ−２４、またはマトリックスＧｌａタンパク質を含んでもよく、それによりナノクラスターは低い免疫原性を有する。特定の実施形態において、リンペプチドは、ＯＰＮ１−１４９またはその変異体であってよい。
【００５０】
本発明のさらなる態様によると、全カルシウムの一部がリン酸カルシウムナノクラスターの形態で存在し、過剰の金属イオン封鎖リンペプチドが存在する配合物が提供される。本発明のナノクラスターを含有する人工生体液が、生理的濃度のカルシウムおよびリン酸塩を含有することができ、かつ依然として、リン酸カルシウムの沈殿物を生成することなく、最終的に加熱滅菌できることは、この技術のとりわけ有利な点である。実施形態において、本発明のナノクラスターを含む配合物は、最適な量のリン酸塩と、少なくとも１個のリン酸塩中心を含有するリンペプチドまたはリンタンパク質を含んでもよく、例えば、この溶液は、ｐＨ７．３〜７．５、容量オスモル濃度２８０〜３１０、および膠質浸透圧２０〜３０ｍｍＨｇを有してもよい。容量オスモル濃度は、第一に電解質によって、さらに膠質浸透圧剤、リンペプチド、および場合によってはブドウ糖（好ましくは０〜１２５ｍＭ）によって決定される。デキストラン（０〜１００ｇｍ／ｌ）およびポリエチレングリコール（０〜２５ｇｍ／ｌ）などの物質を添加して、要求される膠質浸透圧を得ることができる。場合によっては、抗酸化剤またはフリーラジカル捕捉剤、例えばマンニトール（０〜２０ｇｍ／ｌ）、グルタチオン（０〜４ｇｍ／ｌ）、アスコルビン酸（０〜０．３ｇｍ／ｌ）、およびビタミンＥ（０〜１００ＩＵ／ｌ）を添加してもよい。実施形態において、リンペプチドは、０．５〜２．０ｍＭの範囲で含まれていてよく、合計Ｃａ＋＋は約０．５〜４．０ｍＭの範囲の量、合計Ｃｌ−は７０〜１６０ｍＭの範囲の量、合計Ｍｇ＋＋は０〜１０ｍＭの範囲の量、合計Ｋ＋は０〜５ｍＭの範囲の量、合計リン酸塩は５〜１５ｍＭの範囲の量で含まれていてもよく、場合によってはヘキソース単糖２〜５０ｍＭが含まれていてもよい。この溶液は、最終的に加熱滅菌することができる。ＮａＨＣＯ３を市販されている滅菌１Ｍ溶液として、使用直前に、滅菌した配合物に添加してもよい。一般に、１リットル当たり５ｍｌの１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加することができるが、それ以上添加してもよい。
【００５１】
この溶液は、血漿中のカルシウムイオン、ナトリウムイオン、およびマグネシウムイオンの正常な生理的濃度の範囲内の濃度の前記イオンを含んでもよい。一般的に、これらのイオンの所望の濃度は、同様に溶液の状態の溶解されたナトリウムの塩化物およびリン酸塩から得ることができる。実施形態において、ナトリウムイオン濃度は、好ましくは、７０ｍＭ〜約１６０ｍＭの範囲、好ましくは約１３０〜１５０ｍＭの範囲である。総カルシウム濃度は、約０．５ｍＭ〜４．０ｍＭの範囲、好ましくは約２．０ｍＭ〜２．５ｍＭの範囲であってよい。総マグネシウム濃度は、０〜１０ｍＭの範囲、好ましくは約０．３ｍＭ〜０．４５ｍＭの範囲であってよい。遊離カルシウムイオン濃度は、０．５〜２ｍＭの範囲、好ましくは１．２５ｍＭであり、これは正常血漿中の正常濃度である。遊離マグネシウムイオン濃度は、０．２〜１．０ｍＭの範囲、好ましくは０．６ｍＭであり、これは正常血漿中の正常濃度である。塩化物イオン濃度は、７０ｍＭ〜１６０ｍＭの範囲、好ましくは１１０〜１２５ｍＭのＣｌ−である。また、溶液は、ある量のヘキソース単糖、例えばブドウ糖、フルクトース、およびガラクトースも含んでいてよく、このうちブドウ糖が好適である。本発明の好適な実施形態において、ヘキソース栄養糖を使用してもよく、また糖類の混合物を使用してもよい。一般的に、糖濃度は、２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲であってよく、５ｍＭのブドウ糖濃度が好適である。場合によっては、ヘキソース糖の濃度を上昇させて、対象の組織における液体貯留を減少させることは望ましいであろう。したがって、必要であれば、ヘキソース糖の範囲を最大約５０ｍＭまで引き上げて、処置中の対象における浮腫を予防または制限してもよい。膠質浸透圧剤は、分子であって、毛細血管床の開窓を横断して体組織の間質空間内へと移動することによる、循環からのその損失を防ぐのに十分なサイズの分子から構成されていてもよい。集合的に、膠質浸透圧剤は、血漿増量剤に例示される。ヒト血清アルブミンは、血漿体積を増すために使用される血漿タンパク質である。また、血漿増量剤として使用される、一般にグルカン高分子として特徴付けられる多糖類も知られている。一般的に、この多糖は非抗原性であることが好ましい。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明のナノクラスターを使用して、プロテーゼ、移植器官、および腎臓透析膜の鉱化を予防することができる。
【００５３】
本発明のさらなる態様によると、本発明によるリンペプチドおよび／またはナノクラスター（１つ以上）の使用であって、
ｉ）触媒のための高表面積の支持体として、
ｉｉ）受容体または受容体リガンドの担体として、
ｉｉｉ）ワクチンアジュバントとして、
ｉｖ）薬物または栄養分の標的化送達を可能にするため、
ｖ）抗原に対する強化され、かつ選択的な免疫応答を引き出すため、
ｖｉ）カルシウム含有食品または飲料を提供するため、
の使用が提供される。
【００５４】
正常な血液タンパク質、例えばＯＰＮ、フェチュインＡ、ＳＰＰ−２４、またはマトリックスＧｌａタンパク質に由来する免疫学的にサイレントな有能なリンペプチド、例えばＯＰＮ１−１４９から形成された本発明のナノクラスターは、カゼインナノクラスターよりも有利であるが、これはカゼインが正常血液タンパク質ではなく、したがってアジュバントとして使用した場合に免疫応答を引き出しうるためである。免疫系に非自己として認識されず、そのため免疫応答を誘発しない免疫学的にサイレントなナノクラスターは、とりわけ、薬物送達において、ワクチンアジュバントとしての特定の用途、および骨セメント用途を有する。
【００５５】
さらに、例えば本発明の方法を用いて、本発明のナノクラスターを形成する際に、本発明のリンペプチドを用途に合わせて調整することにより、ナノクラスターの特性をナノクラスターの特定の最終用途に適合させることができる。例えば、ナノクラスターのｐＨ／解離特性を変更することができ、および／またはリンペプチド／ナノクラスターに部分を添加して、標的分子、薬物、例えば細胞障害性薬物、免疫賦活分子などとナノクラスターの外側との化学的カップリングを可能にすることができる。
【００５６】
本発明の態様において、本発明のリンペプチドおよび／またはナノクラスターは、体に供給するための組成物中に提供することができる。例えば、リンペプチドは、口内洗浄剤、歯磨剤、練り歯磨き、ガム、ゲル、または歯垢の石灰化を抑制するために歯に適用するのに適した別の固相の成分として提供することができる。さらに、そのような組成物は、当該技術分野で既知であろうような研削剤、研磨材料、および／または抗菌剤を含んでもよい。ナノクラスターを機能性食品、栄養製品、および薬理製剤中に提供して、多量ミネラルおよび微量ミネラル、ならびにその他の栄養補助食品の送達を行なうことができる。あるいは、本発明のリンペプチドおよび／またはナノクラスターは、カテーテルおよび心臓弁を含むがこれらに限定されない医療用プロテーゼのためのコーティング剤の製造に適した材料中に提供することもできる。本発明の方法またはリンペプチドを用いて製造したリン酸カルシウムナノクラスターは、分散剤および／または防腐剤、例えば非イオン性界面活性剤のｎ−オクチルグルコシドまたはカチオン性界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウム、あるいは静菌性添加剤、例えばアジ化ナトリウムまたはチメロサールをさらに含む組成物中に提供してもよい。追加的に、または代替的に、得られたナノクラスターまたはナノクラスター組成物を低温殺菌または滅菌および／または凍結乾燥してもよい。凍結乾燥されたＯＰＮ１−１４９から製造したナノクラスター粉末は、その元の体積の水に事実上即座に溶解して澄明溶液を形成し、ナノクラスターのサイズは変わらないことが認められた。単純混合によって製造したナノクラスター溶液の熟成は、熱力学的により安定なナノクラスターの形成により、非晶質リン酸カルシウムの初期沈殿物の逆転に関与した。また、本発明のナノクラスターは、細胞内薬物送達、または核酸、例えばＲＮＡｉの送達媒体に使用することができる。
【００５７】
定義
本明細書において別段に定めがない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同様の意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施において使用することができるが、好適な方法および材料を本明細書に記載する。したがって、下記に定義する用語は、明細書を全体として参照することによって、より完全に説明される。
【００５８】
断片という用語は、ナノクラスターを形成するために適切に使用することができる、本明細書において具体的に言及されているリンペプチドまたはリンタンパク質の部分、例えば適切なリン酸塩中心を保有する断片を意味する。好ましくは、このような断片は、非晶質リン酸カルシウムからのヒドロキシアパタイトの形成を促進するアミノ酸サブ配列を含まない。断片は、当業者に周知の任意の適切な方法によって生成することができる。断片を生成する適切な方法には、コードしているＤＮＡからの断片の組換え発現、化学合成によるもの、または同族タンパク質の化学的もしくは酵素的断片化が含まれるが、これらに限定されない。断片は、コードしているＤＮＡを取得し、発現させる部分のいずれかの側に適切な制限酵素認識部位を同定し、その部分をＤＮＡから切り取ることによって生成することができる。次に、標準的な市販の発現系における好適なプロモーターに、この部分を操作可能に結合させることができる。別の組換え手法は、適切なＰＣＲプライマーを用いて、ＤＮＡの関連部分を増幅するものである。
【００５９】
本明細書において「組換え体」という用語は、組換え発現ベクターによるペプチドの発現を含むがこれらに限定されない分子生物学的操作を用いて作成されたペプチドを指す。
【００６０】
本明細書において「タンパク質」は、アミノ酸から構成され、当業者によりタンパク質として認識されるあらゆる組成物を指す。「タンパク質」、「ペプチド」、およびポリペプチドという用語は、本明細書において、互いに置き換えて使用することができ、このときペプチドはタンパク質の一部であり、当業者は文脈で用語の用途を理解する。同様に、「リンタンパク質」、「リンペプチド」、および「ホスホポリペプチド」という用語は、本明細書において、互いに置き換えて使用することができ、このときリンペプチドまたはホスホポリペプチドは、リンタンパク質の一部であり、当業者は文脈において用語の用途を理解する。
【００６１】
本発明のリンペプチドの変異体は、「関連タンパク質」とみなされる、機能的に類似するタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、これらの関連タンパク質は、生物の綱の違いを含む、異なる属および／または種に由来する（例えば、細菌タンパク質と真菌タンパク質）。さらなる実施形態において、関連タンパク質は、同一種からもたらされる。また、変異体という用語は、本明細書において具体的に言及されている特定のペプチドを含み、これは例えば、Ｃ−末端部およびＮ−末端部のうちのいずれか一方あるいは両方に１つ以上のアミノ酸を付加するか、アミノ酸配列の１つ以上の異なる部位において、１つ以上のアミノ酸を置換するか、および／またはタンパク質の一端または両端において、またはアミノ酸配列の１つ以上の部位において、１つ以上のアミノ酸を欠失させるか、および／またはアミノ酸配列の１つ以上の部位において、１つ以上のアミノ酸を挿入するように修飾されているが、ナノクラスターを形成することができるリンタンパク質としての機能は保持している、配列番号１〜４および１０〜１８のうちの１つである。そのような変異体の製造は、好ましくは、本明細書において具体的に言及されているように、リンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を修飾し、そのＤＮＡ配列を適切な宿主に形質転換し、修飾されたＤＮＡ配列を発現させて変異体を形成することによって達成される。当然のことながら、変異体リンタンパク質／リンペプチドは、親リンタンパク質／リンペプチド（例えば、本明細書において具体的に言及されているペプチド）と、また互いに、少数のアミノ酸残基が異なっていてもよい。異なるアミノ酸残基の数は、１つ以上、好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、またはそれ以上のアミノ酸残基であってよい。好適な一実施形態において、変異体間の異なるアミノ酸の数は、１〜１０個である。特に好適な実施形態において、関連タンパク質およびとりわけ変異体タンパク質は、本明細書において具体的に言及されているペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を含む。さらに、本明細書において、関連タンパク質または変異体タンパク質は、フェチュインＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７６５）、プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０１６３）、マトリックスＧｌａタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０８４９３）、分泌型リンタンパク質２４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３１０３）、リボフラビン結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７５２）、オステオポンチン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０４５１）、インテグリン結合シアロリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ２１８１５）、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＱ７６）、または象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３３１６）からなる群から選択される要素と、複数の領域、例えばリン酸塩中心が異なるタンパク質を指す。例えば、いくつかの実施形態において、変異体タンパク質は、フェチュインＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７６５）、プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０１６３）、マトリックスＧｌａタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０８４９３）、分泌型リンタンパク質２４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３１０３）、リボフラビン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７５２）、オステオポンチン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０４５１）、インテグリン結合シアロリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ２１８１５）、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＱ７６）、または象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３３１６）からなる群から選択される要素と異なる、１個、２個、３個、４個、５個、または１０個の相当する領域を有する。適切には、これらの領域がリン酸塩中心を含む場合、このリン酸塩中心は、リン酸化される能力を保持している。変異体タンパク質を形成するための置換、挿入、欠失が考えられる残基には、保存残基、または保存されていないその他の残基を含みうる。保存されていない残基の場合、１つ以上のアミノ酸の置き換えは、自然界に見られる配列（天然配列）と一致しないアミノ酸配列を有する変異体を生成する置換に限定することができる。保存残基の場合、このような置き換えは天然配列をもたらさないはずである。当然ながら、変異体がリン酸塩中心におけるアミノ酸配列の修飾を含む場合、このリン酸塩中心は、そのリン酸化される能力を保持するべきであり、増加したリン酸化を有してもよい。いくつかの実施形態において、変異体という用語は、フェチュインＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７６５）、プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０１６３）、マトリックスＧｌａタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０８４９３）、分泌型リンタンパク質２４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３１０３）、リボフラビン結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７５２）、オステオポンチン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０４５１）、インテグリン結合シアロリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ２１８１５）、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＱ７６）、または象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３３１６）からなる群から選択される要素と類似する機能、三次構造、および／または保存残基を備えるタンパク質／ペプチドを指してもよい。特定の実施形態において、変異体は、フェチュインＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７６５）、プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０１６３）、マトリックスＧｌａタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０８４９３）、分泌型リンタンパク質２４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３１０３）、リボフラビン結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７５２）、オステオポンチン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０４５１）、インテグリン結合シアロリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ２１８１５）、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＱ７６）、または象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３３１６）からなる群から選択される要素と類似する機能、三次構造を備えるタンパク質／ペプチド、これらと実質的に同一のタンパク質／ペプチド、および／またはこれらの同族体のタンパク質／ペプチドを指す。特定の実施形態において、変異体は、フェチュインＡ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７６５）、プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０１６３）、マトリックスＧｌａタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０８４９３）、分泌型リンタンパク質２４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３１０３）、リボフラビン結合タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２７５２）、オステオポンチン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１０４５１）、インテグリン結合シアロリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ２１８１５）、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ９ＮＱ７６）、または象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ１３３１６）からなる群から選択される要素の同族体であってよい。同族体は、異なってはいるが通常は近縁の種からのタンパク質／ペプチドであってよく、これは種分化によって別れたタンパク質（すなわち、新種の発生）（例えば、オルソロガス遺伝子）、さらに遺伝子重複によって別れた遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）に相当し、これらを包含する。本明細書において「オルソロガス」および「オルソロガス遺伝子」という用語は、共通の先祖遺伝子（すなわち相同遺伝子）から、種分化によって進化した異なる種の遺伝子を指す。典型的には、オルソログは、進化の過程において同じ機能を保持する。オルソログの同定は、新しく配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼できる予測に使用されている。本明細書において「パラログ」および「パラロガス遺伝子」は、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子を指す。オルソログが進化の過程を通して同じ機能を保持する一方、パラログは、いくつかの機能はしばしば元の機能と関連してはいるが、新しい機能を進化させる。特定の実施形態において、同族体はオルソログである。２つのタンパク質が実質的に同一であることを示す１つの指標は、第１のタンパク質が第２のタンパク質と免疫学的に交差反応性を示すことである。典型的には、保存的アミノ酸置換によって異なるタンパク質は、免疫学的に交差反応性を有する。したがって、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、あるタンパク質が第２のタンパク質と実質的に同一であるとみなすことができる。
【００６２】
配列間の相同性の程度は、当該技術分野で既知の任意の適切な方法（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，４８：４４３［１９７０］；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、米国ウィスコンシン州マディソン）；およびＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５［１９８４］を参照）、またはＡｌｔｓｃｈｕｌ等によって記載されたＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，［１９９０］）を用いて決定することができる。本明細書において「パーセント（％）核酸配列同一性」は、その配列のヌクレオチド残基と同一である、候補配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージと定義される。リンペプチドをコードする２つの核酸配列が実質的に同一であることを示す別の指標は、これら２つの分子がストリンジェントな条件下（例えば、中〜高ストリンジェンシーの範囲内）で互いにハイブリダイズすることである。
【００６３】
本明細書において「ハイブリダイゼーション」という用語は、当該技術分野で既知のように、塩基対合によって、リンペプチドをコードする核酸鎖と相補鎖とを結合する方法を指す。「ハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション反応を実施するときの条件を指し、これらの条件は、典型的には、ハイブリダイゼーションを測定するときの条件の「ストリンジェンシー」の程度によって分類される。ストリンジェンシーの程度は、例えば、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいてよい。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い温度）で生じ、「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約５〜１０℃低い温度で生じ、「中間ストリンジェンシー」は、プローブのＴｍより約１０〜２０℃低い温度で生じ、「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍより約２０〜２５℃低い温度で生じる。代替的に、あるいは追加的に、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの塩またはイオン強度条件、および／または１回以上のストリンジェンシー洗浄に基づいてもよい。例えば、６×ＳＳＣ＝極めて低ストリンジェンシー；３×ＳＳＣ＝低〜中ストリンジェンシー；１×ＳＳＣ＝中ストリンジェンシー；０．５×ＳＳＣ＝高ストリンジェンシーである。機能的には、最大ストリンジェンシー条件を用いて、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する核酸配列を同定することができるが、高ストリンジェンシー条件は、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列を同定するために使用される。高い選択性が要求される用途では、典型的には比較的ストリンジェントな条件を採用して、ハイブリッドを形成することが望まれるであろう（例えば、比較的低塩および／または高温度条件が用いられる）。
【００６４】
少なくとも２つの核酸またはポリペプチドに関連して、実質的に類似する、および「実質的に同一の」とは、典型的には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、基準（例えばオステオポンチンＯＰＮ）ペプチド配列と比較して、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、いっそう好ましくは９５％、最も好ましくは９７％、場合によっては９８％および９９％もの配列同一性を有する配列を含むことを意味する。
【００６５】
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、あるいはその変化形、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」または「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、明記した整数または整数の群を含むことを示唆するが、任意の他の整数または整数の群を含まないことを示唆するものではないことは理解されるであろう。本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないと示されない限り、複数の意味を包含する。
【００６６】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本発明の各態様の好適な特徴および実施形態は、必要な変更を加えて、他のそれぞれの態様のものと同様である。
【００６７】
以下の実施例を参照しながら、本発明の実施形態を説明するが、これらの実施例は、説明の目的で示され、本発明を制限するものと解釈されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】（ａ）は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５を用いた１０ｍｇのＯＰＮ試料（ＯＰＮｍｉｘ）のクロマトグラフィー分離を図示しているが、ここでは２つの小さいピークＦ１およびＦ２が主ピークの前縁に検出されている。（ｂ）クロマトグラフィー分離から収集した個々の管のＳＤＳ  ＭＯＰＳゲル電気泳動を図１ｂに示している。ピークＦ１のどの材料もゲルに浸透せず、それに続く画分は、タンパク質またはペプチドの含有量が徐々に少なくなっている。これらの管を採取して画分Ｆ２、Ｆ３ａ、およびＦ３ｂを作成した。このときＦ２画分は、見かけの分子量が５０〜５５，０００Ｄａの単一バンドを示し、またＦ３試料は、２つの主要なバンド群を示したので、これらをＦ３ａとＦ３ｂとに分けた。回収した質量中のＦ２、Ｆ３ａ、およびＦ３ｂは、それぞれ１０．２質量％、５６．７質量％、３３．１質量％であった。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定および計算結果は、Ｆ２が全長型（ＯＰＮ１−２６２）であり、Ｆ３ａ画分が、おそらく主要な牛乳のプロテイナーゼであるプラスミンの作用によって形成されたＮ−末端断片ＯＰＮ１−１４９であることを示した。全長天然ＯＰＮは、実験的に決定された分子量３３．９ｋＤａを有し、このうち１．７ｋＤａはリン酸基に起因し、およそ２．９ｋＤａはＯ−結合グリカンに起因した。Ｆ３ａにおけるＮ−末端断片に関しては、対応する数字は１９．８ｋＤａであり、これはリン酸基からの０．９ｋＤａとグリカンからの２．９ｋＤａを含んだ。したがって、全タンパク質中の２８個の潜在的リン酸化部位の平均リン酸化度は７９％であった。Ｎ−末端断片の分析は、Ｎ−末端プラスミンペプチド中の１６部位の平均約６０〜６５％のリン酸化に一致した。全てのグリカン（３〜４部位）は、両者に含まれていた。
【図２】β−カゼイン１−２５の等温線を当てはめることによって得られた、３つのＣａイオン会合定数が、３０００、４００、および３０Ｍ−１であったことを示している。単離したＰｓｅ残基は、有効ｐＫ６．０を有し、３個のＰｓｅ残基のクラスターは、ｐＫ７．２でイオン化されていた。ＯＰＮ１−１４９の等温線を２つＣａイオン会合定数３０００（二価アニオン性リン酸塩）および３０Ｍ−１、ならびにｐＫ６．４および５．０によって当てはめた。
【図３】ＯＰＮｍｉｘナノクラスター溶液の限外濾過液におけるイオン平衡を示す。（ａ）は、方程式（９）において、ｙ＝０〜１に対して算出されたイオン活量積である。（ｂ）は、ｙに対するイオン活量積の勾配である。
【図４】ＯＰＮｍｉｘナノクラスター溶液の算出された特性を示している。（ａ）は、Ｐｉ、Ｃａ、および遊離Ｃａ２＋の算出された限外濾過液濃度であり、実験値は記号として示す。（ｂ）は、算出された反応したＰＣの割合である。
【図５】２０ｍＭのＰｉ緩衝液（ｐＨ７．０、イオン強度８０ｍＭ）中のＯＰＮ、およびナノクラスター実験で使用したリン酸カルシウム希釈緩衝液中で測定したＯＰＮ１−１４９のＳＡＸＳのＫｒａｔｋｙプロットを示している。当てはめた曲線は、みみず鎖モデルからのものである。（ａ）は、ＯＰＮ（５、１０、および１５ｍｇ  ｍｌ−１）、およびＯＰＮ１−１４９（１０ｍｇ  ｍｌ−１）のｑ２で重み付けした正規化ＳＡＸＳに対する、濃度の影響である。（ｂ）は、１０ｍｇ  ｍｌ−１のＯＰＮおよびＯＰＮ１−１４９の、ｑ２で重み付けしたＳＡＸＳであり、各軸は、当てはめ法によって決定した二乗平均回転半径によって定める。
【図６】ウレアーゼ法によってＯＰＮ１−１４９を用いて作成したナノクラスターの熟成の、ＳＡＸＳによる試験の結果を示している。（ａ）は、Ｇｕｉｎｉｅｒ法によって決定した回転半径に対する時間の影響である。（ｂ）は、所定の時間後、５ｍｇ  ｍｌ−１まで希釈したナノクラスターの正規化したｑ２重み付けＳＡＸＳである。（ｃ）は、ガウスコポリマーミセル様ナノクラスターと遊離ペプチドとからの散乱が混合したものとしての、熟成されたナノクラスター溶液の散乱のモデルである。ナノクラスターの散乱は、全体の散乱から遊離ペプチドの散乱を減じることによって得た。モデル計算は、パラメータｂ＝０．０７ｎｍ、Ａｃｏｒｅ＝０．２５ｎｍ２、ｒｏ＝１２．５ｎｍ、β＝０．３５を用いた。
【図７】ｐＨ（時間）のβ−カゼイン１−２５ナノクラスターの流体力学半径に対する影響（●）、およびＣＰＰナノクラスターの１日後の平衡サイズ（■）を図示している。
【図８】ｐＨ７．０でのＯＰＮ１−１４９の正規化されたＤＳＣサーモグラムを図示している。
【図９】既知のまたは潜在的リン酸塩中心配列を有する分泌型リンタンパク質における不規則の予測を図示している。既知のまたは予測されるリン酸塩の位置は、太線で示す。（ａ）はＳＣＰＰであり、（ｂ）は非ＳＣＰＰである。
【図１０】組換えリンペプチドＣＫ２−Ｓ−６ＨおよびＣＫ２−Ｓのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー図を示している。２つの代表的吸光度プロファイル（２２０ｎｍ）を、ＣＫ２−Ｓを実線で、ＣＫ２−Ｓ−６Ｈを破線で示し、本方法の第２段階の一部において算出された線形リン酸塩濃度勾配に重ねる。
【図１１】ＣＫ２−Ｓ−６Ｈのそのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィープロファイルにわたる異なるリン形態の分布を示している。ＣＫ２−Ｓ−６Ｈのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる分離時に画分（３００ｓ）を回収し（図１０のクロマトグラムの破線を参照）、各画分にタンデムナノ−ＬＣ／ＭＳ分析を行なって、存在する異なるリン酸化度（３〜６ｍｏｌ  Ｐ／ｍｏｌ（ペプチド））を定量化した。グレースケールの棒グラフは、特に主ピークおよび前縁の小ピークに存在する４Ｐリン形態を含む画分の、平均吸光度を乗じたモル分率を示している。
【図１２】リンペプチドＣＫ２−ＳおよびＣＫ２−ＳＳを用いて製造したナノクラスターの回転半径（Ｒｇ）に対する、熟成時間の影響を示している。黒丸は、ＣＫ２−Ｓの４つの異なる調製物のものであり、白丸は、ＣＫ２−ＳＳの単一バッチからの試料のものであり、測定は２回の別々の機会に行なった。繰り返しの反復測定は、３回のビームタイム配分期間に及んだ。方程式Ｒｇ，ｔ＝Ｒｇ，∞／（１＋ｔ１／２／ｔ）［式中、ｔ１／２は、熟成時間の半分であり、Ｒｇ，ｔは、時間ｔにおける回転半径であり、Ｒｇ，∞は、その完全に熟成した値である］の重み付けしていない非線形最小二乗回帰によって、観察結果と適合する単線を算出した。
【図１３】リンペプチドＣＫ２−Ｓ−６Ｈを用いて製造したナノクラスターの回転半径（Ｒｇ）に対する、熟成時間の影響を示している。測定は単一バッチの組換えリンペプチドに対して実施し、繰り返しの反復測定は、３回のビームタイム配分に及んだ。図１２の場合と同様に、観察結果と適合する単線を算出した。
【図１４】ヒドロキシアパタイトに対して（Ａ）高親和性および（Ｂ）低親和性を有する、ＣＫ２−Ｓ−６Ｈの４Ｐリン形態の存在のための仮説を図示している。四角形として示されるリン酸化の潜在部位を有する、ＣＫ２−Ｓ−６Ｈの一次構造の図表示を提示する。６個の部位のうち、４個は集まってクラスター化してリン酸塩中心配列を形成し、残りの２部位は、第２の小さいクラスターをＣ−末端付近に形成している。四角形の中の黒丸は、リン酸化された残基に相当し、空白の四角形は、リン酸化されていない残基に相当する。４Ｐリン形態のこれら１５個の位置異性体のうち、９個はリン酸塩中心に３または４個のリン酸化残基を有し、小クラスターに０または１個のリン酸化残基を有した。これらの異性体は、リン酸塩中心にわずか２個、小クラスターに２個のリン酸化残基を有する他の異性体よりも、ヒドロキシアパタイトに対して、より高い結合親和性を有すると仮定された。
【図１５】オステオポンチンリン酸塩中心１〜３のアラインメントを示す、第６表である。
【図１６】保存切断部位Ｄ−２０２のＮ−末端側にあるＤＭＰ１における６つの潜在リン酸塩中心型配列を示す、第７表である。
【図１７】天然ウシβ−カゼインＡ２と比較した、組換え多重リン酸化タンパク質の配列を示す、第１４表である。
【図１８ａ】フェチュインＡの比率の増加に伴う、カゼインホスホペプチド混合物から形成されたナノクラスターの強度重み付け流体力学的サイズ分布を示している。各分布曲線に対するフェチュインＡの濃度をｍｇ  ｍｌ−１で示し、明確にするために分布曲線を垂直方向にずらした。
【図１８ｂ】フェチュインＡ濃度に対する、ナノクラスターピークの流体力学半径の最頻値を示している。
【図１８ｃ】無限大のフェチュインＡ濃度へのナノクラスター流体力学半径の最頻値の外挿を示している。ｙ軸の切片は、純粋なフェチュインＡナノクラスターのサイズを示す。
【図１９】安定な人工尿による動的光散乱を示している。（ａ）は、ｐＨに対する全散乱強度である。（ｂ）は、およそのｐＨ領域５〜８における、典型的な強度重み付けサイズ分布である。明確にするために、個々の分布曲線を垂直方向にずらした。
【００６９】
方法
リン酸カルシウム金属イオン封鎖の熱力学モデル
電気的中性のリン酸カルシウムナノクラスターの化学式は、単一のリン酸塩中心（ＰＣ）を含有するその実験式の倍数として記述することができる。
2011527898.tif 000005
【００７０】
水、カルシウム、および無機リン（Ｐｉ）のリン酸塩中心に対する平均モル比は、それぞれＲｗ、ＲＣａ、およびＲｐであり、
2011527898.tif 000006
は、ナノクラスター中のリン酸塩中心の平均数であり、Ｐｅｐは、ペプチドをそれが含有するリン酸塩中心の数で除した化学式である。このモノマーの式は、非晶質水和リン酸カルシウムと、カルシウムリンペプチドの金属イオン封鎖リガンドとに分割することができる。電気的中性のリン酸カルシウムの不変実験化学式は、
2011527898.tif 000007
［式中、３ｙ／（２＋ｙ）は、ジアニオン型におけるＰｉのモル分率である］である。次に、平均複合体の実験化学式は、次のように記述することができる。
2011527898.tif 000008
2011527898.tif 000009
リン酸塩中心１個当たりのペプチドの正味荷電がＺである場合、
2011527898.tif 000010
である。
【００７１】
最も特徴付けられたＣａＰナノクラスターは、ウシβ−カゼイン１−２５によって形成されたものであり、これは沈降平衡法によって測定した質量が１９７ｋＤａであり、ＲＣａ＝１３．２、Ｒｐ＝６．５、およびｙ＝０．４である。これによりモノマー質量４２４６Ｄａ、およびモノマー平均数４６．３が求められる。コアの半径は、ＳＡＮＳにより、シェル中のタンパク質のコントラスト一致点において、２．３９ｎｍであることが認められた。これによりＰＣ（Ａｃｏｒｅ）１モル当たりのコア表面積９．２２．１０９ｃｍ２ｍｏｌ−１が求められる。ナノクラスター中のリン酸カルシウム分子の平均数
2011527898.tif 000011
が、
2011527898.tif 000012
［式中、
2011527898.tif 000013
であり、ＮＡは、アボガドロ定数であり、Ｖｃｏｒｅは、リン酸カルシウムの実験式のモル体積である］で表わされることは、簡単な幾何学により容易に示すことができる。方程式（６）、
2011527898.tif 000014
、およびＶｃｏｒｅ＝８９．６ｃｍ３ｍｏｌ−１から、ＳＡＮＳによって定義されたコア体積は、おそらくリン酸ペプチド部分と結合カルシウムを含むが、この体積は、モノマー１個当たり約１０個の水分子も含有するのに十分な大きさである（すなわち、方程式（３）におけるｘは約１．３である）。既に、コア材料が、非晶質であり水和したコアの最も近い結晶性類似体であるＤＣＰＤのモル体積である、
2011527898.tif 000015
を有すると仮定して、
2011527898.tif 000016
の値３５０が算出されている。この結晶構造は、ＣａのＫ−吸収端においてＸ線吸収微細構造分光法によって測定した、ミセルリン酸カルシウム中の非晶質リン酸カルシウムの短範囲構造をモデル化するために使用されている。
【００７２】
リン酸カルシウムナノクラスター形成の自由エネルギー
ナノクラスター形成のＧｉｂｂｓ自由エネルギー（ΔＧＣＰＮ）は、コア−シェル構造を形成するための、ＣａＰのコア形成の自由エネルギー（ΔＧｃｏｒｅ）と、リンタンパク質による表面におけるＣａＰの金属イオン封鎖の自由エネルギー（ΔＧｓｈｅｌｌ）とに分割することができる。
2011527898.tif 000017
【００７３】
コアにおけるＣａＰの自由エネルギーは、バルク相
2011527898.tif 000018
と比較して、ケルビン方程式に関して、
2011527898.tif 000019
［式中、γｃｏｒｅおよびｒｃｏｒｅは、コアの界面張力および半径であり、ａｓは、バルク相の飽和溶液中のモノマー活量である］として記述することができる。明らかに、コア半径が定数である場合、コア形成の自由エネルギーも一定である。次に、リン酸カルシウムの実験化学式を用いて、イオン活量に関して、溶解性定数Ｋｓを定義することができる。水の活量が事実上１である希釈溶液において、
2011527898.tif 000020
である。
【００７４】
純粋なバルク相の溶解度積と同様に、形成定数をナノクラスターの形成の程度を算出するために使用することができる。それにもかかわらず、所定の金属イオン封鎖ペプチドに対するＫｓの実効値は一定ではあるが、方程式の形式およびその数値は、金属イオン封鎖自由エネルギーによって異なる。
【００７５】
ナノクラスターを形成すると予測されるリンペプチドの決定
Ｎ−末端ペプチドＯＰＮ１−１４９（全タンパク質ではない）が、リン酸カルシウムと平衡ナノメートルサイズ複合体を形成することができるという判断に基づき、本発明者らは、一般的リン酸塩中心配列モチーフ、およびナノクラスター形成に要求される条件を決定した。リン酸カルシウム鉱化プロセスに関与していると本発明者らが認識している分泌型リンタンパク質について、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのＥｘＰＡＳｙサーバ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｏｍ）上のＵｎｉＰｒｏｔ（＝Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ＋ＴｒＥＭＢＬ）データベースを検索して、可能性のあるナノクラスター形成リンペプチドを同定した。オルソロガスな配列のアラインメントを行ない、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅサーバ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）上で、ＣｌｕｓｔａｌＷ２法およびパターン検索ルーチンＰＲＡＴＴをそれぞれ用いて、一般的モチーフを生成した。顕著な配列可変性および高スコアの残基の希少性を踏まえ、カゼインに適用した標準的なスコアリングマトリックスは、補助的な制約を用いずには十分に機能しないことが既に認められている（Ｈｏｌｔ，Ｃ．  ＆  Ｓａｗｙｅｒ，Ｌ．（１９９３）．Ｃａｓｅｉｎｓ  ａｓ  Ｒｈｅｏｍｏｒｐｈｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｐｈａ−Ｓ１−Ｃａｓｅｉｎｓ，Ｂｅｔａ−Ｃａｓｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｐｐａ−Ｃａｓｅｉｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ−Ｆａｒａｄａｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ８９，２６８３−２６９２）。また、これは他の分泌カルシウム結合リンタンパク質、およびリン酸塩中心の周囲の全ての他の分泌型リンタンパク質配列にも当てはまることが認められている。これを踏まえ、スプライスジャンクションの保存傾向を用いて、個々のエキソンまたは隣接するエキソンによってコードされる配列から、アラインメントを作成した。また、リン酸化の既知の部位および予想される部位をＣｙｓ残基になるように修正することで、ＳｅｒまたはＴｈｒよりも高いアラインメントスコアを与えた。リン酸化の予想される部位を、ゴルジ体およびカゼインキナーゼ２のキナーゼによって、コンセンサス基準に従って同定した。リン酸カルシウム鉱化に関与していることが知られる、真核生物タンパク質のオルソログのアラインメントから、潜在的リン酸塩中心配列を手作業で選択した。比較の目的で、配列基準を満たすが、現在のところ鉱化に関与していることが認められていない、ニワトリリボフラビン結合タンパク質を用いて例外を作成した。同定された、証明済みまたは候補のリン酸塩中心を含有するリンタンパク質（主にヒト配列）を第１表に示す。一連のリンペプチドにおいて決定されたリン酸塩中心を示す別の表も、例示の目的で提示する。当然ながら、他の種において存在する、第１表に示したようなリンタンパク質は、そのような配列が上記に記載したパラメータに一致する場合、使用することができる。
2011527898.tif 000021
【００７６】
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録は、ほぼ全てヒト配列であり、考慮すべきいくつかのアイソフォームがある場合には、アイソフォーム１を選択した。２ＳＣＣＰは、分泌カルシウム結合リンタンパク質の略称である。３ヒトＣＳＮ１Ｓ２は、偽遺伝子であり、ウシオルソログが付与される。４ニワトリＲＢＰは、リン酸塩中心配列を含有させる唯一のＲＢＰである。
【００７７】
リン酸塩中心配列の例は、第２表に示す。
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追加の第６表および第７表は、図面において提示する。
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【００７８】
柔軟な配列の予測
予測されたリン酸塩中心が、同定されたリンペプチドの柔軟な配列部分に与えられるかどうかを決定するために、ＰＯＮＤＲ（登録商標）のＶＬ−ＸＴプレディクター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｏｎｄｒ．ｃｏｍ／；これは３層のフィードフォワードニューラルネットワーク：ＶＬ１プレディクター、Ｎ−末端プレディクター（ＸＮ）、およびＣ−末端プレディクター（ＸＣ）を統合する）を用いて予測を行なった。ＶＬ−ＸＴの出力は、１〜０の実数であり、このとき１は不規則性の理想的予測であり、０は規則性の理想的予測である。ＶＬ−ＸＴの出力は、典型的には厳密でなく、０．５以上の値に割り当てられる不規則性によって閾値を適用する。４０以上の残基を有する長い柔軟な領域の予測は、短い領域よりもより信頼性が高いと考えられる。
【００７９】
ナノクラスターのサイズ分布
ｉｍａｘは正の実数でなければならないことから、可能性のある溶液が２つ存在する。古典的核生成理論において、表面エネルギーは正であり、バルク自由エネルギー項は負である。沈殿は、ａ１＞ａｓである過飽和溶液から生じる。ナノクラスターの形成において、有効表面エネルギーは負であり、したがって溶液は、バルク相に対して不飽和である（ａ１＜ａｓ）。これに関連して、バルク相は非晶質リン酸カルシウムであることに留意されたい。その配列中にｆ有能なリン酸塩中心をモル濃度［ＰＰ］で有するリンペプチドまたはリンタンパク質を含有する液体体積Ｖリットルについて考えた場合、ｐモルのリン酸カルシウム（ＣａＰ）が、平衡からの局所的なゆらぎの状態の溶液から沈殿した場合、溶液の全体積における熱力学的安定性は、
2011527898.tif 000034
［式中、αは、反応したリン酸塩中心の割合であり、Ｖは、液体の総体積である］である。明らかに、溶液が安定である（α＜１）ためには、過剰のリン酸塩中心が存在しなければならない。熱力学的安定性は、ナノクラスターの形成によって、ヒドロキシアパタイトに対する過飽和の状態を維持しながら達成することができる。方程式（１８）は、生体液中のＣａおよびＰｉの濃度の上限を設定していないが、これは総Ｃａ濃度１００ｍＭを上回るいくつかの乳汁の形成において用いられている。それにもかかわらず、遊離Ｃａイオン濃度およびヒドロキシアパタイトに対する過飽和は、依然として血液中のものに相当する。
【００８０】
非晶質リン酸カルシウムと、十分に高い濃度の有能な金属イオン封鎖ペプチドの溶液との二相系において、非晶質リン酸カルシウムを利用して、ナノクラスターが自発的に形成するであろうと考えられている。本発明者らは、新たに形成された軟部組織における異所性沈着物の除去に、または非晶質リン酸カルシウム核が生体液においてコロイドまたは巨視的結晶粒子に成長するのを防止するために利用できると考えている。あるいは、ヒドロキシアパタイトとナノクラスター溶液との二相系においてと同様に、ヒドロキシアパタイトがナノクラスターを利用して成長する傾向がある場合、ナノクラスター溶液は、硬組織の成長または脱ミネラル化のためのＣａおよびＰｉの貯蔵庫として機能することも可能である。本発明者らは、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）への熟成を促進するアミノ酸配列を含有するタンパク質またはペプチドを添加することが、溶液を不安定化するとは考えていない。これは、ヒドロキシアパタイト形成の唯一の経路は、非晶質リン酸カルシウムの形成を介するものであるからである。
【００８１】
実施例１−ゲル濾過クロマトグラフィーによるＯＰＮｍｉｘ試料の分画および組成
Ｓｏｒｅｎｓｅｎ等（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｅ．Ｓ．，Ｈｏｊｒｕｐ，Ｐ．＆  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｅ．（１９９５）．Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ−Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２８  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ３  Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４，２０４０−２０４９、およびＳｏｒｅｎｓｅｎ，Ｅ．Ｓ．，＆  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｅ．（１９９３）  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｓｅ  ｐｅｐｔｏｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｍｉｌｋ．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ  ６０：１８９−１９７）の方法によって、オステオポンチン画分（ＯＰＮｍｉｘ）をウシ乳汁から単離した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５ゲルクロマトグラフィーに続いてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換クロマトグラフィーを尿素の存在下で実施することによって、ウシ乳汁のプロテオースペプトン画分から、３つの主要画分を単離した。グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるそれらの移動度から、これらのタンパク質は、見かけの分子量１７ｋＤａ、２８ｋＤａ、および６０ｋＤａを有することが認められた。６０ｋＤａのタンパク質を収集して、凍結乾燥した。これは９５％を上回るのオステオポンチンまたはオステオポンチンペプチドを含み、全ての部位においてある程度リン酸化されていた。これを床長６４ｃｍのＰｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ  １６カラムを用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲル濾過クロマトグラフィー（流速０．３ｍｌ  ｍｉｎ−１）によってさらに分画した。１０ｍｇの試料を１ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．０）に溶解し、１２０ｍｌの溶出緩衝液に対して一晩透析し、その後カラムに装填した。１ｍｌの画分を収集し、ＳＤＳ−ＭＯＰＳゲル電気泳動によって分析した（Ｑｉ，Ｘ．Ｌ．，Ｈｏｌｔ，Ｃ，ＭｃＮｕｌｔｙ，Ｄ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｄ．Ｔ．，Ｂｒｏｗｎｌｏｗ，Ｓ．＆  Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．Ｒ．（１９９７）．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｔ  ｐＨ  ６．７，ａｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ＣＤ  ａｎｄ  ＩＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ａ  ｔｅｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｌｔｅｎ  ｇｌｏｂｕｌｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３２４，３４１−３４６  ａｎｄ  ＭｃＣｌｅｎａｇｈａｎ，Ｍ．，Ｈｉｔｃｈｉｎ，Ｅ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｃｌａｒｋ，Ａ．Ｊ．，Ｈｏｌｔ，Ｃ．＆  Ｌｅａｖｅｒ，Ｊ．（１９９９）．Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｖｉｎｅ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２，２５９−２６４）。次にこ��らを４つの画分（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３ａ、およびＦ３ｂ）に分け、脱イオン水に対して徹底的に透析し、その後凍結乾燥し、回収した質量を記録した。この手順を必要に応じて繰り返し、物理化学的研究に十分なそれぞれの画分を収集した。
【００８２】
図１ａに示されているように、ゲル濾過クロマトグラムは、明らかな部分構造を有する主ピーク（Ｆ３）と、前縁の２つのそれよりずっと小さいピーク（Ｆ１およびＦ２とする）を示している。１．０ｍｌの画分を回収し、ＳＤＳゲル電気泳動によって分析した（図１ｂに図示する）。いずれのＦ１試料もゲルに浸透せず、Ｍ＞２００，０００Ｄａのボイド容量の物質であることが示された。Ｆ２画分は、見かけの分子量が５０〜５５，０００Ｄａの単一バンドであり、またＦ３試料は、２つの主要なバンド群を含有しており、これらをＦ３ａおよびＦ３ｂとして採取した。回収した質量中のＦ２、Ｆ３ａ、およびＦ３ｂは、それぞれ１０．２質量％、５６．７質量％、３３．１質量％であった。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定値および計算結果は、Ｆ２は全長型（ＯＰＮ１−２６２）であり、Ｆ３ａ画分は、おそらく主要な牛乳のプロテイナーゼであるプラスミンの作用によって形成された、Ｎ−末端断片ＯＰＮ１−１４９であることを示した。全長天然ＯＰＮは、実験的に決定された分子量３３．９ｋＤａを有し、このうち１．７ｋＤａはリン酸基に起因し、およそ２．９ｋＤａはＯ−結合グリカンに起因した。Ｆ３ａにおけるＮ−末端断片に関しては、対応する数字は１９．８ｋＤａであり、これはリン酸基からの０．９ｋＤａとグリカンからの２．９ｋＤａを含んだ。したがって、全タンパク質中の２８個の潜在的リン酸化部位の平均リン酸化度は、７９％であった。Ｎ−末端断片の分析は、Ｎ−末端プラスミンペプチド中の１６部位の平均約６０〜６５％のリン酸化に一致した。全てのグリカン（３〜４部位）は、両者に含まれていた。
【００８３】
実施例２−リン酸カルシウムナノクラスターの製造
尿素／ウレアーゼ法
上記に記載のように、また当該技術分野で既知のように（Ｈｏｌｔ，Ｃ，Ｗａｈｌｇｒｅｎ，Ｎ．Ｍ．＆  Ｄｒａｋｅｎｂｅｒｇ，Ｔ．（１９９６）．Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｂｅｔａ−ｃａｓｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｏ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  ｄｉｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３１４，１０３５−１０３９）、尿素／ウレアーゼ法によってナノクラスターを製造した。ただしこのとき、リンペプチドは、上記に記載したＯＰＮｍｉｘか、またはゲル濾過分離による画分のいずれかを用いた。典型的には、ＯＰＮｍｉｘ試料（２５ｍｇ）を１ｍｌの水に溶解し、５００ｍｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡに対して一晩透析し、その後脱イオン水に対して徹底的に透析して、Ｃａイオンを除去した。Ｃａを含まないペプチドを凍結乾燥させることによって回収した。
【００８４】
２２ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２、２０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、３６ｍＭのＫＮＯ３、および１．５ｍＭのＮａＮ３の組成のｐＨ５の塩の初期不飽和溶液（Ｍｇを含まない緩衝液Ａ）を用いて、ペプチドを溶解した。２００ｍＭの原溶液から十分な尿素（０〜３０ｍＭ）を添加して、２単位のタチナタマメ由来のウレアーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、製品番号６６６１３３）による加水分解後、所望の最終ｐＨを得た。これらの条件は、数分以内にｐＨを目標値の０．００４単位以内に上昇させた。ＯＰＮｍｉｘおよびＦ３ａの標準濃度は、２５ｍｇ  ｍｌ−１または３０ｍｇ  ｍｌ−１のいずれかであった。ＳＡＸＳ測定、電気泳動光散乱測定、および示差走査熱量測定のために、ＯＰＮ１−１４９ナノクラスターを、それらの完全性を維持する緩衝液で５〜１０ｍｇ  ｍｌ−１の適切な濃度に希釈した。希釈緩衝液は、ナノクラスター溶液から調製した限外濾過液と同じ塩組成およびｐＨを有したが、ただし防腐剤としてのアジ化ナトリウム（１．５ｍＭ）と、保管時に緩衝液におけるリン酸カルシウムの沈殿を抑制するための０．０１％の全カゼイントリプシンリンペプチド混合物を添加した。
【００８５】
単純混合法
最終濃度３０ｍｇ  ｍｌ−１のＯＰＮｍｉｘ試料を用いて、実験を行なった。この濃度では、Ｐｉ原料の単回添加によっても（ただしこれはよく攪拌しながらゆっくりと添加した）、初期沈殿はなかった。初期の濁りは、約１週間かけてゆっくりと消滅し、尿素／ウレアーゼ法によって製造したナノクラスターのものと同等のわずかに乳白色の溶液が得られた。ペプチド濃度を１０ｍｇ  ｍｌ−１まで低下させた場合、初期コロイド状沈殿物が発生し、これは静置時に完全には再分散しなかった。しかしながら、初期濁りの発生直後に、さらなるＯＰＮｍｉｘを最終濃度３０ｍｇ  ｍｌ−１まで添加した場合、溶液は約１週間かけて完全に澄明化した。ただし、リンペプチドの添加が遅れた場合、あるいは初期ペプチド濃度が５ｍｇ  ｍｌ−１未満であった場合、完全な再分散は４ヶ月後でも達成されなかった。
【００８６】
混合法によって製造された非晶質リン酸カルシウムの自発的な再分散、および尿素／ウレアーゼ法によるナノクラスターの簡便な製造は、このナノクラスターが、過飽和溶液からの正反応によっても、非晶質リン酸カルシウムの予備形成した沈殿物を用いた逆反応によっても形成することができることを示している。ただし、非晶質リン酸カルシウムの熟成を許した場合、たとえそれがわずか数分であっても、オステオポンチンペプチドによってそれを分散することができなかった。尿素／ウレアーゼ法によって平衡リン酸カルシウムナノクラスターを形成するための標準化された条件により、数年間にわたって安定な溶液が得られた。したがって、ＯＰＮ１−１４９ナノクラスター溶液は、特に過剰の遊離ペプチドが存在する場合に、非晶質リン酸カルシウムの相分離に関して、熱力学的に安定であるとみなすことができる。
【００８７】
実施例３−限外濾過による塩の分離
尿素／ウレアーゼ法によって、ｐＨ５．０〜７．５を有する、Ｍｇを含まない緩衝液Ａ中のＣａを含まないＯＰＮｍｉｘのナノクラスター溶液を製造した。これらを平衡化させてから、求心力場５０００ｘｇを用いて、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ０．５ｍｌ濃縮装置（分画分子量１０，０００Ｄａの製品ＶＳ０１０１、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ、ドイツ）によって１５分間限外濾過した。限外濾過液および出発溶液におけるＣａ、遊離Ｃａ２＋、およびＰｉの濃度を測定した（Ｌｉｔｔｌｅ，Ｅ．Ｍ．＆  Ｈｏｌｔ，Ｃ．（２００４）．Ａｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｙ  ｃａｓｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３，４３５−４４７）。半透膜を横切る各拡散性イオン種のＤｏｎｎａｎ平衡に達した後、複合したＰｉとＣａ、［Ｐｉ］ｃと［Ｃａ］ｃのそれぞれの濃度を、総濃度と限外濾過液濃度との差から算出した（Ｈｏｌｔ，Ｃ．（１９９７）．Ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｓａｌｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｓｅｉｎ．Ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄａｉｒｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔ．（Ｆｏｘ，Ｐ．Ｆ．，ｅｄ．），Ｖｏｌ．３，ｐｐ．２３３−２５６．Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ）。次に、このペプチドを含まない限外濾過液組成物を用いて、イオン平衡（Ｈｏｌｔ，Ｃ，Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ，Ｄ．Ｇ．＆  Ｊｅｎｎｅｓｓ，Ｒ．（１９８１）．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｍｉｌｋ．２．Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｏｎ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ  ｉｎ  Ｍｉｌｋ  Ｄｉｆｆｕｓａｔｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３，１５４−１６３）、およびＣａＰのイオン活量積（方程式（９）によって、０（トリ−リン酸カルシウム）〜１（ジ−リン酸カルシウム）の範囲のｙについて）を算出した。限外濾過液におけるイオン活量積を、各ｐＨにおいて一連のｙ値について算出し、それによりｐＨとは無関係の値を求めた。図３ａにおいて、ｙの各値の平均で除し、異なる曲線を分離するために定数を加えた後の結果を示す。各曲線の勾配を直線回帰によって求め、ゼロ勾配に相当する不変イオン活量積（図３ｂ）をトリ−リン酸カルシウムの化学量論量（ｙ＝０、Ｋｓ＝７．６．１０−１０Ｍ１．６６’）に対して求めた。これは、ｙ＝０．４を有するカゼインナノクラスターに認められるものよりも塩基性が高いＡＣＰである。
【００８８】
実施例４−カルシウムイオンのＯＰＮ１−１４９との結合
ＯＰＮ１−１４９ナノクラスター溶液における化学種のモデル化には、５．０〜８．０の範囲の任意のｐＨにおける、Ｃａイオンの遊離ペプチドとの結合を算出する必要がある。半経験的モデルを用いて、このｐＨ領域においてβ−カゼイン１−２５リンペプチドについて予め得た結合等温線を示し、同じモデルをｐＨ７．０で測定したＯＰＮ１−１４９の結合等温線に当てはまるように適合させた。次にこの再設計したモデルを用いて、他の任意のｐＨ値における結合を予測した。Ｃａイオンのβ−カゼイン１−２５ペプチドとの結合は、大部分は４個のリン酸化残基とのものであり、より少ない程度で７個のＧｌｕ残基およびＣ末端とのものである。
【００８９】
実験的等温線を
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［式中、加算は、Ｃａイオン会合定数Ｋａ，ｉを有する全ての結合部位である］の形の方程式に当てはめた。関数Ｎｉ（ｐＨ）は、ｐＨとの関数としてのｉ型の部位の数を示し、φｉはリン酸化度である。リン酸化された全ての部位は、平均リン酸化度
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を有すると仮定した。所定のｐＨでの二価アニオン性ホスホセリル部位の数は、
2011527898.tif 000037
で表わされる。
【００９０】
−ｓＰＸｓＰｓＰｓＰＥＥ−型のリン酸塩中心におけるカゼインリン酸基の滴定挙動は、３つの部位の連続クラスター（ｐＫ＝６．７）に関連する２つの有効ｐＫを示したが、残りの部位（ｐＫ＝５．９５）は、独立した残基により典型的である。これらの部位は独立していないため、有効ｐＫは、Ｃａイオンの結合によって影響されるであろう。
【００９１】
β−カゼインの結合挙動は、１個のＣａイオンが残りのものよりもずっと強力に結合していることを示していたため、リン酸二価アニオン性基との結合のためのモデルに、２つのｐＫおよび２つのＣａイオン会合定数を認めた。リン酸化された部位は、プロトン化したときにＣａイオンとの親和性が低下するので、これらはカルボキシル基と同様の低親和性を有するものとして扱った。リン酸基の最初のイオン化のｐＫは、対象ｐＨ領域における結合に影響しないため、モデルから除外した。ＯＰＮペプチドは、１６個のリン酸化部位（そのうち６０％は実際にリン酸化されていた）、およびＣ−末端を含む３７個のカルボキシル基を有する。しかしながら、この配列は、β−カゼインリン酸塩中心の３個の連続するリン酸化残基を含有しない。部位の型の数を２つ、すなわちｐＫ６．４で滴定する高親和性の二価アニオン性ホスホセリル部位と、カルボキシル基およびプロトン化ホスホセリル残基を含む低親和性部位とに減らすことが可能であることが証明された。
【００９２】
２０ｍＭのＰｉおよび５０ｍＭのＫＮＯ３でｐＨ７．０に緩衝化した、２５ｍｇ  ｍｌ−１のＦ３ａを含有する溶液に、１００ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２の原溶液を連続して少量ずつ添加した後、Ｃａイオン選択的電極を用いて遊離Ｃａイオンの濃度を測定することによって、画分Ｆ３ａから回収したペプチドのＣａ２＋結合等温線を決定した。総Ｃａ濃度の範囲は０〜１９．３ｍＭであり、相当するイオン強度は８０〜９３ｍＭであった。β−カゼイン１−２５ペプチドの実験的等温線への同時当てはめにおいて、３つのｐＫおよびＣａイオン会合定数を変化させた。得られた当てはめ曲線を図２に示す。３つの部位の連続クラスターにおけるリン酸塩部分のイオン化によって、１つの高親和性部位が生成され、同時により低い親和性の２つの部位と、第３の低親和性部位とが、独立したホスホセリル残基のイオン化によってもたらされた。部位の最低親和性は、カルボキシル残基とプロトン化ホスホセリル残基との組み合わせによってもたらされた。２つのｐＫおよび会合定数を有するモデルを使用するが、可能な限り多くのカゼインモデルからの定数を維持する単独等温線を別個に当てはめることによって、計算ＯＰＮ１−１４９等温線を得た。
【００９３】
実施例５−ナノクラスター溶液における化学種の算出
反応したリン酸塩中心所定の割合において、非拡散性（複合した）ＣａおよびＰｉの濃度は、
2011527898.tif 000038
［式中、［ＰＰ］は、リンペプチド濃度である］で表わされる。これらの値から拡散可能な濃度を算出し、それにより膜を横切る仮定Ｄｏｎｎａｎ平衡から、限外濾過液の組成を得た。ｐＨ５．９７未満では、イオン活量積がＫｓ未満であるため、ナノクラスターを形成することができなかった。平衡状態には、小さいイオン、イオン錯体、およびペプチドに結合したイオンのみが含まれた。ｐＨ５．９７を上回ると、カゼインホスホペプチドナノクラスターの場合に認められるものと同じＲＣａおよびＲｐの値を仮定して、ナノクラスター溶液中のイオン活量積をＫｓと同等にするリン酸塩中心の反応の程度が求められた。
【００９４】
ＯＰＮ１−１４９ペプチドの質量比は全体の６０％未満であるが、全てのペプチドがＯＰＮ１−１４９と同じ特性を有するかのようにペプチド結合をモデル化した。次に、イオン平衡の完全モデルを用いて、実験的限外濾過液の組成と比較できるように、平衡拡散物質の組成を算出した（図４ａ）。図４ｂは、算出したＰＣの反応の程度が、ｐＨに伴ってどのように変化したかを示している。算出された遊離Ｃａイオン濃度は低ｐＨ値で体系的に実験を下回ったが、モデルの実験との全般的一致は十分である。所定の反応の程度において、遊離ペプチドの割合は、３個のリン酸塩中心が、リン酸カルシウムを金属イオン封鎖する際に、独立して反応するか、一緒に反応するかによって異なる。これらが独立していない場合、遊離ペプチドの割合は（１−α）であるが、これらが完全に独立して反応する場合、反応したＰＣを含まないペプチド鎖の割合は（１−α）３である。ＯＰＮｍｉｘ試料を用いた研究に加え、純粋なＯＰＮ１−１４９ペプチドから製造したｐＨ７．０のナノクラスター溶液における塩の分離から、１つの測定を実施した。実験の、およびモデル（括弧内）のＰｉ、Ｃａ、およびＣａ２＋の限外濾過液濃度は、それぞれ１２．１（１１．１）ｍＭ、１．４（０．９２）ｍＭ、および１．１（０．５２）ｍＭであった。これらは、ＯＰＮｍｉｘを用いて得られた値と極めて近似した。
【００９５】
実施例６−構造モデル
ＳＡＸＳ実験では、ＣＣＬＲＣ  Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいてステーション２．１で測定を実施し、正規化された散乱強度ｌ（ｑ）を測定した。等方性単分散粒子の分散について、
2011527898.tif 000039
［式中、Ｎは、溶媒全体の平均過剰散乱長密度
2011527898.tif 000040
を有する粒子の数、体積はＶｐ、および質量はＭである］によって、ｌ（ｑ）を粒子間構造因子Ｓ（ｑ）および粒子散乱因子Ｐ（ｑ）と関連付けた。散乱波ベクターは、ｑ＝４π  ｓｉｎθ／λ０［式中、θは散乱角の半分であり、λ０は、Ｘ線の波長である］である。Ｓ（ｑ）＝１であり、かつペプチド鎖の割合α’がナノクラスターの多分散分布を形成している希釈溶液において、方程式（２２）は、
2011527898.tif 000041
［式中、Ｎはペプチド鎖の数である］となる。
【００９６】
散乱長密度
リン酸化されていない残基のモル体積をＪａｃｒｏｔおよびＺａｃｃａｉ（Ｊａｃｒｏｔ，Ｂ．＆  Ｚａｃｃａｉ，Ｇ．（１９８１）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ  ｂｙ  Ｎｅｕｔｒｏｎ−Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２０，２４１３−２４２６）から引き出した。Ｓｕｎｄａｒａｌｉｎｇａｍ（Ｓｕｎｄａｒａｌｉｎｇａｍ，Ｍ．＆  Ｐｕｔｋｅｙ，Ｅ．Ｆ．（１９７０）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＩＩ．Ａ  ｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｌ−Ｏ−  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ．Ａ  ｖｅｒｙ  ｓｈｏｒｔ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｂ２６，７９０−８００）によって決定されるように、アミノ酸の単位格子体積から、オルト−Ｌ−ホスホセリンのモル体積を算出し、１１Å３を減じて残基体積１６８．７Å３を得た。次にセリンとホスホセリンとの残基体積の差を用いて、ホスホスレオニンの残基体積１９１．７Å３を算出した。原子散乱因子を用いて、元素組成から残基のＸ線前方散乱振幅を算出した。ＯＰＮ１６Ｐ  １−１４９およびＯＰＮ２８Ｐ  １−２６２については、１０−１０ｃｍ−２の単位における散乱長密度をそれぞれ１２．５６および１２．４８であると算出した。ＯＰＮ１６Ｐ  １−１４９を用いて製造したナノクラスターについては、３個のＰＣ中に認められた１０個のリン酸化残基のリン酸塩部分がコアに割り当てられていると仮定し、ｐｓｈｅｌｌ＝１２．４０×１０１０ｃｍ−２を得た。コアについては、方程式（２）で表わされる組成を有する水和したＣａＰから、ｐｃｏｒｅ＝１９．１×１０１０ｃｍ−２を得た。全タンパク質およびＮ−末端ポリペプチドの回転半径は、５〜１５ｍｇ  ｍｌ−１の範囲において、濃度とは無関係であった。ＯＰＮについては、Ｇｕｉｎｉｅｒ法による３回の測定の平均は５．５０±０．１７ｎｍであり、ＯＰＮ１−１４９の対応する値は２．１７±０．２４ｎｍであった。２６２残基を有するＯＰＮについて、方程式（２８）は回転半径５．３８ｎｍを予測し、１４９残基を有するＮ−末端プラスミンペプチドについては、この予測値は３．８４ｎｍであった。
【００９７】
より高いｑ値では、ＯＰＮのＳＡＸＳに与える濃度の影響は著しく（図５ａ）、これは溶媒中での自己会合によって負の第二ビリアル係数を生じたことによるものと考えられた。しかし試験した全ての濃度において、ＯＰＮ１−１４９のＳＡＸＳは同じであり、実験誤差範囲内であった。みみず鎖のＫｒａｔｋｙプロットは、そのみみず鎖が十分に長く、一次構造の離れたセグメントのガウス鎖統計値を示すのであれば、
2011527898.tif 000042
でプラトーを示すであろう。ＯＰＮもＯＰＮ１−１４９もそのようなプラトー領域を示さなかった。両ペプチドは、ｌ（ｑ）がｑ−１に伴って変化する領域を示したが（図５ｂ）、これは短い棒状のセグメントを有するみみず鎖に特徴的である。しかしながら、ポリマー鎖の統計的性質は、局所的な骨格コンフォメーションは、経時的に持続する必要がないことを意味している。これは特に、ポリ−Ｌ−プロリン−ＩＩ（ＰＰ−ＩＩ）コンフォメーションが、いかなる直接残基間Ｈ結合によっても安定化されていないためである。方程式（２４）は、ＯＰＮについてｂ＝１．９ｎｍを導き、これはみみず鎖モデルからここで算出したＫｕｈｎ長１．７４±０．１４ｎｍと一致する。この長さは、例えば、ＰＰ−ＩＩの局所的らせんに一時的に配置された平均５〜６残基に相当しうる。ＯＰＮ１−１４９については、方程式（２４）は、実験的回転半径と一致しない。ＯＰＮ１−１４９の鎖の低い剛性は、それぞれがシス立体配置における鎖の方向の急激な変更を生じるＰｒｏ残基の配列のこの部分における割合（合計１３個のうちの１０個）、および短い側鎖により、他の残基よりも著しく高い骨格鎖柔軟性を可能にするＧｌｙ残基の割合（合計４個のうちの４個）が高いことによると考えられる。Ａｓｐを除いて、残りの残基は、二等分したＯＰＮ中に同様の割合で含まれる。したがって、ＯＰＮおよびＯＰＮ１−１４９の両者が、同様のサイズの局所ＰＰ−ＩＩ構造の連続を含有することは可能であるが、ＯＰＮ１−１４９において、より高い骨格柔軟性を可能にするヒンジ残基の出現頻度がより高い。
【００９８】
実施例７−みみず鎖モデル
完全に天然の折り畳まれていないタンパク質および化学的に変性された球状タンパク質は、主にＰＰ−ＩＩ型の短距離構造の証拠を示すが、ジスルフィド架橋または二次修飾を含まない完全に変性されたタンパク質の二乗平均回転半径
2011527898.tif 000043
は、与えられる残基の数Ｎｒｅｓへの依存を示す（Ｋｏｈｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｉｌｌｅｔｔ，Ｉ．Ｓ．，Ｊａｃｏｂ，Ｊ．，Ｚａｇｒｏｖｉｃ，Ｂ．，Ｄｉｌｌｏｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｃｉｎｇｅｌ，Ｎ．，Ｄｏｔｈａｇｅｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｓ．，Ｔｈｉｙａｇａｒａｊａｎ，Ｐ．，Ｓｏｓｎｉｃｋ，Ｔ．Ｒ．，Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｚ．，Ｐａｎｄｅ，Ｖ．Ｓ．，Ｒｕｃｚｉｎｓｋｉ，Ｉ．，Ｄｏｎｉａｃｈ，Ｓ．＆  Ｐｌａｘｃｏ，Ｋ．Ｗ．（２００４）．  Ｒａｎｄｏｍ−ｃｏｉｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０１，１２４９１−１２４９６）。
【００９９】
2011527898.tif 000044
ベキ指数は、排除体積がある良溶媒中のホモポリマーに予想される３／５の値に近似しているが、前因子は、ペプチド結合長よりも小さい。
【０１００】
ガウス鎖については、
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（Ｌは、輪郭長であり、ｂは、同じ二乗平均末端間距離を有する同等の自由連結鎖のＫｕｈｎセグメント長である）である。
【０１０１】
ＢｅｎｏｉｔおよびＤｏｔｙ（Ｂｅｎｏｉｔ，  Ｈ．  ＆  Ｄｏｔｙ，  Ｐ．  （１９５４）．  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎ−Ｇａｕｓｓｉａｎ  Ｃｈａｉｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５７，  ９５８−９６３）によると、みみず鎖の相当する関係は、
2011527898.tif 000046
である。
【０１０２】
輪郭長の計算において、平面全トランスコンフォメーションに相当する、ペプチド結合長０．３８ｎｍを仮定したが、これはシス立体配置にねじれを導入しうるＰｒｏペプチド結合の影響を無視している。原則的に、短距離構造の証拠は、ランダムコイルのガウス統計からのずれが明らかになる、より高値のｑにおけるＳＡＸＳ測定値またはＳＡＮＳ測定値から得ることができる。
【０１０３】
Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ（Ｋｈｏｌｏｄｅｎｋｏ，Ａ．Ｌ．（１９９３）．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｏｆ  Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄｉｒａｃ  Ｐｒｏｐａｇａｔｏｒ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６，４１７９−４１８３）によって導かれ、Ｐｏｔｓｃｈｋｅ等のＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏシミュレーション（Ｐｏｔｓｃｈｋｅ，Ｄ．，Ｈｉｃｋｌ，Ｐ．，Ｂａｌｌａｕｆｆ，Ｍ．，Ａｓｔｒａｎｄ，Ｐ．Ｏ．＆  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｓ．（２０００）．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｏｒｍ−ｌｉｋｅ  ｃｈａｉｎｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ−ａｎｇｌｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：Ｍｏｎｔｅ−  Ｃａｒｌｏ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｔｈｅｏｒｙ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ９，３４５−３５３）によって検証された、ＫｒａｔｋｙおよびＰｏｒｏｄのみみず鎖の粒子散乱因子は、ＳＡＸＳデータをモデル化するために使用されている。ＯＰＮおよびＯＰＮ１−１４９に対する実験的ＳＡＸＳ測定値を、５〜１５ｍｇ  ｍｌ−１の範囲のペプチド濃度の関数として得た。ｑ＝０での回転半径および切片をＧｕｉｎｉｅｒプロット（ｌｎ（ｌ）ｖｓ．ｑ２）によって決定した。散乱曲線をＧｕｉｎｉｅｒの切片で除することによって正規化し、ｑ２によって重み付けして、低強度特性を強調した（Ｋｒａｔｋｙプロット）。次に、各濃度における正規化された散乱を、鎖の断面積を考慮して構造因子に当てはめた。
【０１０４】
実施例８−ナノクラスターモデル
ＯＰＮ１−１４９ナノクラスターについて、コア−シェルモデルによって得られるものよりもより明確な、コア周囲のペプチドセグメント分布の記述を検討した。一端が均一球状コアに結合したガウス鎖によってコロナが形成された、最も単純なブロックコポリマーミセルモデルを用いた。ナノクラスターをＳＡＸＳステーション上で製造して即座に測定するか、あるいはナノクラスターを２日前に製造して系を平衡化させた。次に試料を室温で保管し、その後のビームタイム配分時の５ヶ月後に再測定した。ＯＰＮｍｉｘ試料を用いて製造したナノクラスターによる予備実験は、ペプチド濃度７ｍｇ  ｍｌ−１では、散乱が濃度と無関係であることを立証した。したがって、全ての測定は、希釈緩衝液で５ｍｇ  ｍｌ−１まで希釈した後に実施し、このとき事実上Ｓ（ｑ）＝１とした。方程式（２３）を対数正規分布または理想溶液近似における方程式（１５）のうちのいずれかともに用いて、熟成した平衡ナノクラスターに対する実験的ＳＡＸＳの結果を多分散コポリマーミセルモデル（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｓ．＆  Ｇｅｒｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｃ．（１９９６）．Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｏｒｍ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２９，１３６３−１３６５）に当てはめた。さらに、動的光散乱によって粒子の特徴付けを行なった。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ計器を用いて、強度平均拡散係数
2011527898.tif 000047
を決定した。
【０１０５】
標準物質として、狭いサイズ分布、および平均流体力学的直径２０ｎｍを有するポリスチレンラテックス標準物質を使用した。計器のソフトウェアにおけるＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｎａｒｒｏｗ  Ｍｏｄｅｓアルゴリズムを用いた強度自己相関関数の反転によって、強度で重み付けしたサイズ分布を得た。これを用いて、多分散度およびずっと大きい粒子の存在をテストした。大粒子が認められた場合、０．２μｍの多孔性膜を通してナノクラスター溶液を濾過することによって、それらを除去した。Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程式：
2011527898.tif 000048
［式中、ηは、水性媒体の粘度である］を用いて、拡散係数から平均流体力学半径
2011527898.tif 000049
を算出した。
【０１０６】
計器とともに供給される使い捨て単回使用セルにおいて、相分析法によって、電気泳動移動度を測定した。Ｈｅｎｒｙ方程式：
2011527898.tif 000050
［式中、εは、誘電率であり、ｋは、Ｄｅｂｙｅ−Ｈｕｃｋｅｌ長の逆数である］を用いて、単位電界における電気泳動移動度（Ｕｅ）からゼータ電位（ζ）を算出した。方程式（２７）における関数
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は、小さいｋｒｈにおけるＨｕｃｋｅｌ限界１／６と、大きい
2011527898.tif 000052
におけるＳｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ限界１／４との間で異なり、中間サイズでは、Ｈｅｎｒｙによって与えられる級数展開により近似する。例えば、イオン強度８０ｍＭおよび流体力学半径２２ｎｍでは、ｆ（ｋｒｈ）＝１／４．９である。ナノクラスターの低移動度および溶液の比較的高いイオン強度に関して、二重層緩和のためのさらなる補正は必要であるとみなさなかった。
【０１０７】
ウレアーゼの添加後に時間の関数として測定されるナノクラスター副試料に対するＳＡＸＳ測定の結果は、図６ａおよび６ｂにまとめる。最初の２つの副試料は、１７分後のｐＨ６．８２のとき、および５０分後のｐＨ６．８７のときに採取したが、３番目の試料までにはｐＨは本質的に一定となり、これは７．０に近かった。回転半径のＧｕｉｎｉｅｒ推定値（図６ａ）および完全なＳＡＸＳ（図６ｂ）は、統計ポリマーの散乱が優位である初期状態から、強散乱性の球状粒子の出現を示しているが、約２日後には、散乱プロファイルはほぼ一定となった。組換えリンペプチドＣＫ２−Ｓ、ＣＫ２−ＳＳ、およびＣＫ２−Ｓ−６Ｈを用いた試験も、同様に、それらのナノクラスターが平衡サイズに達するのに１〜２日かかることを示した（図１２および１３）。リン酸塩中心の算出された反応度、および動的光散乱試験によって得られた相関関数の分析によると、平衡状態が著しい過剰量の遊離ペプチドを有し、そこからの散乱は、低いｑ値では無視できるものの、高いｑ値でＳＡＸＳをモデル化する際には考慮しなければならない。
【０１０８】
したがって、方程式（２３）を用いて、このナノクラスター粒子の散乱を回復した。遊離ペプチドのみみず鎖モデルを、同ペプチド上のリン酸塩中心が全て一緒に反応して、完全に結合したペプチド、または完全に遊離したペプチドのいずれかを生じる、したがってα＝α’であるという仮定で使用した。リン酸塩中心が遊離して独立しているという反対仮説は、ずっと小さい割合の完全に遊離したペプチドを予測し、これは動的光散乱結果の相関関数解析に矛盾する（下記を参照）。重み付け減算により、統計散乱要素のコロナを有する、球状であるが多分散の粒子を特徴とする散乱曲線が得られた。ＰｅｄｅｒｓｅｎおよびＧｅｒｓｔｅｎｂｅｒｇのガウスコポリマーミセルモデルは、対数正規分布関数とともに、遊離溶液中のＯＰＮペプチド鎖はガウス鎖ではないものの、ナノクラスターの散乱の合理的に近似するモデルをもたらした。
【０１０９】
実施例９−ナノクラスターによる電気泳動光散乱
ナノクラスターのサイズは、ウレアーゼの作用によってｐＨが上昇した後数時間は増加したが、その後一定を保った（図７）。β−カゼイン１−２５ナノクラスターの平衡流体力学半径は５．０５ｎｍであり、これはコントラスト変調ＳＡＮＳから導かれたコア−シェルモデルの外側シェル半径よりも約１ｎｍ大きかった。カゼインホスホペプチド混合物を用いて、混合法によりナノクラスターを製造し、室温で２週間保管したとき、溶液の吸光度
2011527898.tif 000053
は、最初の５日間で０．０１７から０．００３に減少し、その後一定を保った。流体力学半径は、非常に低い比率の平均半径約１５０ｎｍを有する粒子の影響を受けた。大粒子は相関関数においても、強度重み付けサイズ分布においても明白であった。０．２μｍフィルタを通して濾過することによってこれらを除去した後、強度平均流体力学半径は６．０５ｎｍであり、尿素／ウレアーゼ法によって得られた（濾過していない）結果の６．７５ｎｍと十分に一致していた。ＯＰＮ１−１４９ナノクラスターは、２日間の平衡化後に流体力学半径２１．９ｎｍを有したが、これはＳＡＸＳによって決定された回転半径に匹敵する。濾過していないナノクラスターの強度重み付けサイズ分布において、ずっと大きい粒子の極めて小さいピークが存在し、主要ナノクラスターピークの低い側には、遊離ペプチドによる全散乱強度の８．５％を占める別の小さいピークが存在した。可視光での遊離ペプチドによる散乱はナノクラスターと比較して低いため、ペプチドピークの検出は、実質的な割合のペプチドが反応してナノクラスターを形成していないことを示す指標である。このため、理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、３個全てのリン酸塩中心が一緒に反応して、粒子を形成するものと考えている。したがって、遊離ペプチドの割合は、化学分析によってｐＨ７．０において約６２％であると算出される、反応していないリン酸塩中心の割合と同じであると推測される。この技法による強度平均流体力学半径と、ＳＡＸＳまたはＳＡＮＳによって得られるいわゆるＺ−平均半径とのあらゆる正確な比較は、これら２つの方法から得られるさまざまな種類の平均、光周波数およびＸ線周波数における不均一粒子に与えられるさまざまな重み付け、およびせん断面の位置に影響する外側シェルを介した溶媒の排出を考慮に入れなければならない。
【０１１０】
流体力学的測定は、ＳＡＸＳによるものに匹敵するナノクラスターサイズの推定値を導いた。ＯＰＮ１−１４９およびＣＰＰリンペプチドナノクラスターの電気泳動移動度は、１．４および１．０μｍ  ｓ−１Ｖ−１ｃｍであった。方程式（２７）を用い、流体力学半径とイオン強度との差を考慮すると、これらの移動度は、ζ−電位のそれぞれ−１５．４ｍＶおよび−９．２ｍＶに相当する。カゼインナノクラスターのせん断面は、Ｄｅｂｙｅ−Ｈｕｃｋｅｌ長に匹敵する距離である、ナノクラスターの外面から約１ｎｍに位置することから、表面電荷密度は、ナノクラスターを囲む二重層によって事実上遮蔽されている。それにもかかわらず、これらの値は、カゼイントリプシンリンペプチドと比較して、ＯＰＮ１−１４９ペプチドが有するより大きい正味の負電荷を反映している。
【０１１１】
実施例１０−微小熱量測定
図８に示すサーモグラムは、安定なコンフォメーションをとらないポリペプチドに予想されるような、温度に伴う比熱のほぼ完全に滑らかな増加を示している。比熱容量の変化は、安定な折り畳み状態からの変性によってもたらされる骨格または側鎖の水和のいかなる変化よりも、むしろ温度の上昇に伴って励起された振動状態および回転状態の集団の増加を反映している。この結果は、ＯＰＮの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける低い化学シフト分散とも一致する。
【０１１２】
実施例１１−天然および修飾ウシβ−カゼインのコード配列のクローニング
大腸菌培地１リットル当たり１０〜１００ｍｇの収率で、完全に（またはほぼ完全に）リン酸化された組換えタンパク質またはペプチドがルーチン的に得られる方法であって、タンパク質ホスホキナーゼと同族タンパク質（またはペプチド）基質との共発現を伴う方法を用いた。ホスホトランスフェラーゼのカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）を用いて、そのうちのいくつかは一緒にクラスター化してリン酸塩中心を形成する複数の部位で、β−カゼインまたはオステオポンチンをリン酸化した。組換えリン酸化は、選定されたキナーゼによる、同じ（リン酸化されていない）基質の最適化されたｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化からによってもたらされたリン酸化度を正確に再現した。泌乳牛の乳腺組織から単離したポリ−Ａ付加ＲＮＡから、全長ＯＲＦをコードするβ−カゼイン（Ｎ−末端シグナル配列を含む）を、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。続いて、部位特異的突然変異誘発によって、塩基配列の微調節を行ない、二本鎖配列決定によって検証して、推定翻訳産物がＡ２変異体であることを確認した。適切なプライマーを用いたＰＣＲ−突然変異誘発によって、ｃＤＮＡの５’末端において、Ｎｄｅｌ部位に関連して、シグナル配列が除去され、翻訳開始コドンに置き換えられるようにさらなる配列修飾を行ない、６３３ｂｐのＯＲＦを得た。推定翻訳産物において、このメチオニンは、天然の成熟分泌型β−カゼインのＮ−末端アミノ酸配列（ＲＥＬＥＥ−第１４表（配列番号２０９））の直前に位置した。ｃＤＮＡの３’末端には、２つの配列変異体が構築された。一方では、Ｃ−末端配列−ＰＩＩＶ−の翻訳を終結させる野生型塩基配列の終止コドンの後、すぐにＢａｍＨＩ部位が続いて、アンピシリン耐性発現ベクターｐＥＴ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へのライゲーションを含む、さらなるサブクローニング操作を容易にした。他方では、終止コドンが除去されて、ＢａｍＨＩ部位に置き換えられ、そのリーディングフレームは、ＢａｍＨＩがＮｄｅｌとともにβ−カゼインｃＤＮＡのｐＥＴ２１ｂへの方向性クローニングに使用されているときに、６−Ｈｉｓ−タグの読み過ごしを許した。したがって、このコンストラクトにおいて、Ｃ−末端配列が延長され、ＰＩＩＶＰＲＤＰＮＳＳＳＶＤＫＬＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１９）となった。全てのＰＣＲ反応は、高忠実度ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）によって触媒され、ＰＣＲアンプリコンは、最初に平滑末端クローニング増殖ベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングした。ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔにおけるインサートの配列忠実度、方向性、およびリーディングフレームは、二本鎖配列決定によって検証した。全てのオリゴヌクレオチドプライマーおよびカスタムＤＮＡ配列決定は、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社による。
【０１１３】
ＣＫ２の作用によるリン酸塩中心の生成は、天然配列におけるＧ−ＣＫ認識配列へのある程度の適合が必要とされる。乳腺Ｇ−ＣＫの標準的一次認識配列は、［Ｓ＊，Ｔ＊］Ｘ［Ｅ，Ｄ］（配列番号２１０）であり、このとき大括弧内の残基は選択肢であり、Ｘは任意の残基であるが、より嵩高くない側鎖が好ましい。ほとんどの部位は、Ｔに優先してＳを有し、Ｄに優先してＥを有する。２つの一次Ｇ−ＣＫ認識部位を含有する配列［Ｓ＊，Ｔ＊］［Ｓ＊，Ｔ＊］［Ｅ，Ｄ］［Ｅ，Ｄ］（配列番号２１１）は、それにより２つの近接残基をリン酸化させ、二次認識配列の［Ｓ＊，Ｔ＊］Ｘ［ｐＳ，ｐＴ］は、隣接する部位のより長い配列からリン酸塩中心を形成させる。ＣＫ２の標準的一次認識配列は、類似する［Ｓ＊，Ｔ＊］ＸＸ［Ｅ，Ｄ］であるが、ＤがＥよりも良いとみなされる。したがって、隣接リン酸化残基の３塩基は、［Ｓ＊，Ｔ＊］［Ｓ＊，Ｔ＊］［Ｓ＊，Ｔ＊］［Ｅ，Ｄ］［Ｅ，Ｄ］［Ｅ，Ｄ］（配列番号２１２）によって形成することができ、連続するリン酸化残基のより長い配列は、標準的二次認識部位の［Ｓ＊，Ｔ＊］ＸＸ［ｐＳ，ｐＴ］を利用して形成することができる。β−カゼインのリン酸塩中心内のセリンおよび近接する残基の部位特異的突然変異誘発（ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−またはＣＫ２−ｓｍａｒｔｅｒ−配列を得るため；第１６表を参照）は、テンプレートとして野生型β−カゼイン配列を用い、これらの残基のコドンのすぐ５’側のユニークＳｅｘＡＩ制限部位を利用して、ＰＣＲによって実施した。変異フォワードプライマーは全て、その５’末端に向かってこの部位を組み込み、リバースプライマーは、β−カゼインｃＤＮＡのユニークＳｔｕｌ部位下流にわたり、その５’側に翻訳的にサイレントな特徴的なＮｓｐｌ部位を組み込んだ。増幅した配列をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔに平滑末端クローニングし、非メチル化宿主ＳＣＳ１１０中で増殖し、初期に予想サイズのＳｅｘＡＩ−Ｓｔｕｌインサートであることを究明した。適格な候補に、二本鎖配列決定を行なった。正確な突然変異配列を有するプラスミドクローンをドナーとして用いて、ＳｅｘＡＩ−Ｓｔｕｌ配列をｐＥＴ２１−野生型６−Ｈｉｓ−タグ化β−カゼインプラスミド（上記を参照）から切り取ったときに得られた線状化プラスミドに、ＳｅｘＡＩ−Ｓｔｕｌ  ５４１ｂｐカセットを転移した。ライゲーション後、形質転換体（非メチル化宿主株ＳＣＳ１１０中の）を、ＳｅｘＡＩ−Ｓｔｕｌ間およびＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩ間の予想したサイズのインサートの存在、および余分な特徴的なＮｓｐｌ部位（この制限エンドヌクレアーゼによる５−断片消化もたらす）の存在について確認した。これらの操作により、２つの関連するｐＥＴ２１由来発現プラスミドを生成した。このうち一方は、ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−β−カゼイン−６−Ｈｉｓをコードし、他方はＣＫ２−ｓｍａｒｔｅｒ−β−カゼイン−６−Ｈｉｓをコードする。
【０１１４】
リン酸塩中心配列の比率を増加させた組換えコンストラクト
ＭＷ約２６７００Ｄａの組換え修飾されたβ−カゼインの各分子から、ＭＷおよそ３３００Ｄａの容易に単離された２８−ｍｅｒトリプシンペプチド（第１４表を参照）の一部として、単一のリン酸塩中心生じる可能性を有する、ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−およびＣＫ２−ｓｍａｒｔｅｒ−β−カゼインコンストラクトを生成した。したがって、１００ｍｇの組換えリンタンパク質を１リットルの培養物から生成した細菌バイオマスからルーチン的に回収した。精製されたＣＫ２−ＳまたはＣＫ２−ＳＳの最終収率は、理論上は約１２ｍｇを超えず、実際は典型的には３ｍｇ前後であった。培養物１リットル当たりのリン酸塩中心ペプチドの最終収率を上昇させるために、成功したＣＫ２−ｓｍａｒｔ設計に基づき、２つのさらなるコード配列を構築した。これらのコンストラクトでは、ＣＫ２−ｓｍａｒｔクラスター化セリンモチーフが、一次組換え翻訳産物の完全な配列のずっと大きい比率として存在した。これらのうちの１つ目（ＣＫ２−Ｓ−６Ｈ）は、第１４表に示す推定配列を有し、短い全ポリペプチド配列内に単一のリン酸塩中心を有するリンペプチドを直接発現する試みを示して、トリプシンによる消化の要件を事実上回避し、発現されたタンパク質の単位質量当たりのリン酸塩中心ペプチドの一次収率をおよそ４．５倍に増加させた。このコンストラクトは、はじめにＣＫ２−ｓｍａｒｔ−β−カゼインのｃＤＮＡの最初の９６塩基をＰＣＲによって増幅することによって作成した。ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−β−カゼインのｃＤＮＡは、テンプレートととして機能した。フォワードプライマーの設計は、開始ＡＴＧをＮｄｅｌ部位に関連して配置し、リバースプライマーの設計は、ＧＡＧコドン（塩基９３〜９６）と重複するＢａｍＨＩ部位を配置し、それにより発現ベクターｐＥＴ２１の６−Ｈｉｓ−タグコード領域のインフレーム翻訳を可能にした。このアンプリコンをＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＥＴ２１ｂにクローニングしたとき、得られたＯＲＦは、第１４表に示す配列を有する、５３残基のポリペプチド（ＭＷ５９４５）をコードしていた。第２のｄｅ  ｎｏｖｏコンストラクト（ＣＫ２−ｓｍａｒｔ反復；第１４表）は、代替の戦略に従って設計し、これはトリプシン切断部位によって分離されたＣＫ２−Ｓ配列の反復を複数含む。このポリペプチドのコード配列を構築するために、ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−β−カゼインのｃＤＮＡの塩基４〜９６（すなわち、開始ＡＴＧコドンを省く）を、高忠実度ＰＣＲによって増幅した。上記のように、このためのテンプレートは、ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−β−カゼインのｃＤＮＡである。フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーに平滑末端切断制限エンドヌクレアーゼ部位を与え、これらの制限酵素による切断後、それらのプライマーが組み込まれることになるアンプリコン分子のセルフライゲーションを可能にした。Ｓｒｆｌ部位であるＧＣＣＣ／ＧＧＧＣ（平滑末端切断部位を斜線で示す）をフォワードプライマーの第１コドン（ＡＧＡ）のすぐ上流に配置した。リバースオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、「センス」方向に読んだときに、塩基ＧＧＡＧＧ／ＣＣＴが、ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−β−カゼイン２−３２の最後のアミノ酸（Ｇｌ��）をコードする３塩基ＧＡＧに続くようにした。Ｓｔｕｌ部位はこれら８塩基内に生じるが、その平滑末端切断の位置は斜線で示した。次にＰＣＲ増幅によって得られたアンプリコン分子の集団を、リガーゼ緩衝液中の触媒活性を維持することができる２つの平滑末端切断制限酵素であるＳｒｆｌおよびＳｔｕｌの存在下で、ＤＮＡリガーゼとともにインキュベートした。これらの制限酵素の存在は、（ＳｒｆｌおよびＳｔｕｌによる制限後に生成された１０２ｂｐアンプリコンの）あらゆるｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄまたはｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌライゲーションが再切断され、それにより制限後に残ったいずれのライゲーションされた分子もｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌライゲーションであることを確実にした。このライゲーション／制限インキュベーションによって得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によってサイズ分別し、表面上は５００〜１０００ｂｐの分子を切り取って、精製し、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔに平滑末端ライゲーションした。各候補組換えプラスミドにおけるあらゆるこのサイズのインサートをＮｏｔｌ／Ｐｓｔｌによる消化によってスクリーニングし、その配列を決定した。生成された組換えＤＮＡ分子の集団が、異なる回数の反復を有する個々の分子含み、また多くの分子は１回のみの反復を有したことは、ここで用いるこれらのライゲーション／制限／ＰＣＲ／クローニング法に固有である。実際には、時間の制約により、１回を上回る反復を有する最初の適格な候補形質転換体をさらに成長させることになり、結局はこれが３回の反復を有することが証明された。これをＢａｍＨＩおよびＮｏｔｌによってｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔから切り離し、これと同じ組み合わせの制限酵素による消化によって線状化したｐＥＴ２９ｃにライゲーションした。このプラスミドに関連して、遺伝子操作コンストラクトは、推定配列（ＭＷ１４９８４）が第１４表に示されるタンパク質ＣＫ２−ｓｍａｒｔ反復の発現を導くことができた。ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−β−カゼインと比較して、このタンパク質が、所定の質量の発現されたタンパク質からのリン酸塩中心の収率をおよそ５．３倍増加させることができることは明らかである。原則的には、より多くの反復を有するコンストラクトから、またはＮ−末端配列の切断によって、より大きい収率の優位性が得られる。これらの「リン酸塩中心高密度」コンストラクトのそれぞれは、容易に可溶性の形態で、そのコードするポリペプチドの大量発現を促進した。ＣＫ２αとの共発現は、それらのリン酸塩中心の多重リン酸化をもたらした。
【０１１５】
ＣＫ２−ｓｍａｒｔリン酸塩中心のＧＳＴキメラへのクローニング
ＧＳＴのコード配列のＮ−末端の３’側に多重クローニング部位を含み、介在終止コドンを含まず、またタグ配列に隣接する、発現プラスミドｐＥＴ−４２（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を構築した。ＰＣＲを用いて、ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−β−カゼインのリン酸塩中心配列にわたるアンプリコン群を調製し、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔにクローニングした。これらの配列のうちの１つは、Ｐｓｔｌ＋ＳａｃｌによってｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔから切り離し、ｐＥＴ４２ａを同じ組み合わせの制限酵素による消化によって線状化した後、このプラスミドにライゲーションすることができるようなものとした。得られたコンストラクトからの推定翻訳産物は、３６５アミノ酸キメラ（ＭＷ４１２１５）であり、その中でＣＫ２−Ｓリン酸塩中心ペプチド配列は、ＧＳＴのＮ−末端側の、オリゴ−Ｈｉｓタグ、およびｐＥＴ４２に固有のその他の発現特性に隣接する融合配列内に位置していた。この推定配列（ＧＳＴｅｔｃ＋ＣＫ２−Ｓキメラ）は、第１６表に示す。有用な制御融合タンパク質（ＭＷ３５４４８）は、非修飾プラスミドｐＥＴ４２ｂから発現することができた。そのコード配列のオープンリーディングフレームは、Ｐｓｔｌ部位とＳａｃｌ部位との間の塩基（ｐＥＴ４２ｂにおいて、これらは４個のアミノ酸をコードし、一方リン酸塩中心キメラにおいては、この挿入配列は５３アミノ酸長であった）以外は、ＧＳＴｅｔｃ＋ＣＫ−２などのものと同じであった。
【０１１６】
ヒトオステオポンチンＡ（ｈＯＰＮ−Ａ）のコード配列のクローニング
ヒトオステオポンチン４種のスプライス変異体が存在すると知られているが、これらはタンパク質のＮ−末端にあるシグナル配列近くの翻訳エキソンのサイズが異なる（Ｓａｉｔｏｈ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１０４５１）。ＯＰＮ−Ａ、ＯＰＮ−Ｂ、およびＯＰＮ−Ｃ、ならびにＯＰＮ−Ｄの一次翻訳産物は、それぞれ３１４、３００、２８７、および２９２アミノ酸長であり、変異体Ａは、最大密度の予測ＣＫ２リン酸化部位を有する。そのコード配列を、テンプレートとしてＩＭＡＧＥクローン３８２８８８５（ＭＲＣ  Ｇｅｎｅｓｅｒｖｉｃｅ：ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ）を用いてＰＣＲにより増幅し、これを増殖ベクターｐＤＮＲ−ＬＩＢに付与した。フォワードプライマーは、シグナルペプチドを除外し、増幅産物内に、Ｎｃｏｌ部位に関連して、新しい開始Ｍｅｔコドンを導入するように設計された。これは、シグナル配列のすぐＣ−末端側のアミノ酸を（ひいては、成熟タンパク質の正常Ｎ−末端を）Ｉｌｅ〜Ｖａｌに変化させる作用を有した。リバースプライマーは、翻訳終結コドンを欠失させ、発現ベクターｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の６−Ｈｉｓ−タグまでの翻訳のための正しいリーディングフレームにＢａｍＨＩ部位を付加した。得られたアンプリコンを増殖ベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔに平滑末端クローニングし、そのプラスミドにおいて配列検証を行ない、その後Ｎｃｏｌ＋ＢａｍＨＩによって切断し、８９７ｂｐのインサートとして、ｐＥＴ２１ｄに方向性クローニングした。このｐＥＴ２１ｄに基づくコンストラクトにおいてコードされた発現産物は、第１４表に示す推定配列（ＭＷ３６２２８）を有する、３２１アミノ酸残基のＣ−末端６−Ｈｉｓ−タグ化タンパク質である。
【０１１７】
ヒトＣＫ２αのコード配列のクローニング
ｌｓｓｉｎｇｅｒ教授の研究室からの寛大な贈与品であるプラスミドｈＣＫ２α−ｐＴ７−７（Ｇｒａｎｋｏｗｓｋｉ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）は、ヒトＣＫ２αの全長コード配列を含有する。このプラスミドを大腸菌宿主株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ内で増殖させ、精製したプラスミドＤＮＡから、ＣＫ２αコード配列をＮｄｅｌ−Ｆｓｐｌ断片として切断した。次にこれをＮｄｅｌ−ＥｃｏＲＶで線状化した発現プラスミドｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＭＣＳ  ２にライゲーションした。この戦略により、Ｎｄｅｌ部位と、平滑末端化されたＥｃｏＲＶおよびＦｓｐｌ末端との間の方向性クローニングが可能となった。このクローニング戦略は、融合タグを連結せずに、プラスミドｐＡＣＹＣ  Ｄｕｅｔ−１からのキナーゼ触媒サブユニットの誘導発現をもたらした。このプラスミドは、ｐＥＴファミリーのプラスミド（コピー数約４０）と比較して、比較的低いコピー数（大腸菌のＢＬ２１株において約１１）で発現し、２つの多重クローニング部位を有したが、このうち１つを本申請において使用している。これはクロラムフェニコール耐性遺伝子を有する。リン酸塩中心コンストラクトをコードするｐＥＴベクターに基づくプラスミドと、プラスミドｐＡＣＹＣ  Ｄｕｅｔ−１−ｈＣＫ２αとを、増殖の目的で、適当な選択的抗生物質の存在下、大腸菌のＸＬ１−Ｂｌｕｅ株内に保持した。
【０１１８】
多重リン酸化候補とＣＫ２αとの共発現
非分泌性発現宿主株大腸菌であるＢＬ２１  ｓｔａｒ［ＤＥ３］を、Ｈｉｓ−タグ化または非タグ化リン酸化候補ポリペプチドをコードするｐＥＴプラスミド、およびｐＡＣＹＣ  Ｄｕｅｔ−１−ｈＣＫ２αによって二重形質転換した。適当な選択的抗生物質により、形質転換された宿主のその後の処理を通じて、プラスミドを保持することができた。ｌａｃ  ｚ遺伝子によって、ｐＥＴおよびｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１ベクターの両者からの誘導タンパク質発現が促進される。実際には、候補リンタンパク質の最も高い発現量は、自己誘導培地Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）における３７℃での一晩培養物から得られることが認められた。細菌細胞ペレットを回収し、遠心分離により洗浄して、液体窒素中で瞬間凍結後−２０℃で保管するか、あるいは細胞内組換えタンパク質の精製に即座に使用した。
【０１１９】
Ｈｉｓ−タグ化タンパク質としての組換え（リン）タンパク質および（リン）ペプチドの精製
直径６ｍｍのプローブを装着した最大出力１５０ワットの超音波発生装置で５×３０秒間の超音波処理することにより、細菌細胞ペレットを５倍量の緩衝液（８Ｍの尿素、０．１Ｍのリン酸Ｎａ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ８．０；プロテアーゼ阻害剤のカクテルであるＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を含有）に溶解した。本研究において記載する２つを除く全ての組換え６−Ｈｉｓ−タグ化リンタンパク質／リンペプチドが、顆粒状封入体として、部分的に不溶性あるいは完全に不溶性のいずれかの形態で発現された。この溶解緩衝液に尿素を追加し、それがその後の精製の段階を通して存在することで（下記を参照）、これらを可溶性にし、また可溶性を維持することができた。可溶性の形態で発現された組換えＨｉｓ−タグ化リンペプチド（ＣＫ２−Ｓ−６ＨおよびＧＳＴｅｔｃ＋ＣＫ２−キメラ；第１４表を参照）では、精製中に尿素は存在しなかった。５００００ｘｇでの６０分間の遠心分離後、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ社）を充填したカラム（直径１６ｍｍ×１００ｍｍ）を用いた金属キレート親和性（ＭＣＡ）クロマトグラフィーによって、清澄な上澄みから、６−Ｈｉｓ−タグ化タンパク質を精製した。洗浄緩衝液に１０ｍＭのイミダゾールを加えることによる弱く結合したタンパク質の脱離後、製造会社の推奨に従って、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液に対象タンパク質を溶出した。９倍量の氷冷アセトンの添加により、この溶出緩衝液からタンパク質が沈殿し、氷冷アセトン：水（９：１）で洗浄することにより、この沈殿物から残留緩衝塩および尿素の大部分を除去し、真空中で乾燥させた。最終精製は実験規模の逆相（ＲＰ−）ＨＰＬＣによって行い、このときポリマービーズマトリックス（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ；ＰＬＲＰ−Ｓ；ビーズ直径１０μｍ；孔径３００Å）を充填したカラム（直径２５ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を用い、平衡化し、水／０．１％ギ酸におけるアセトニトリル／０．１％ギ酸のグラジエントで実行（１０ｍｌ／分）した。溶解性を促進する必要に応じてギ酸を含有する水に、ＲＰ−ＨＰＬＣ用の試料タンパク質を溶解した。溶出液の２２０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度をモニターし、１０ｍｌ画分で収集した。対象タンパク質を含有するこれらの画分を混ぜ合わせ、凍結乾燥した。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって示された６−Ｈｉｓ−タグ化ＣＫ２−ｓｍａｒｔｅｒ−β−カゼインの最終純度（９８％）は、本研究の全ての組換えタンパク質に典型的であった。
【０１２０】
非タグ化タンパク質
尿素の不在下で上記のように調製した細菌超音波溶解物の遠心分離の上澄みから、ｐＨ４．５における等電沈殿により、ＣＫ２−ｓｍａｒｔ反復タンパク質を濃縮した。沈殿したタンパク質を希ギ酸に再溶解させた後、上記のように、分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製を実施した。非タグ化組換えウシβ−カゼイン（野生型、ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−変異体、およびＣＫ２−ｓｍａｒｔｅｒ変異体）の精製には、同様の戦略を用いたが、ただしこの例では細菌の溶解、遠心分離、および等電沈殿のプロセスを通して、尿素が存在した。
【０１２１】
Ｂａ２＋沈殿によるリンペプチド濃縮
バリウム塩による、複数のホスホセリン残基を含有するペプチドの選択的沈殿のための方法は、既に公開されている方法に基づいた（Ｗ．Ｍａｎｓｏｎ，Ｗ．Ｄ．Ａｎｎａｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  β−Ｃａｓｅｉｎ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  １４５（１９７１）１６−２６  Ｅ．Ｃ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｐ．Ｆ．Ｒｉｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．Ａｄａｍｓｏｎ，Ａ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｙｌ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１７（１９９４）２７７−２８４）。トリプシン消化によって、ウシβ−カゼインの周囲に構築した我々の組換えタンパク質から、またＣＫ２−ｓｍａｒｔ反復タンパク質およびＧＳＴｅｔｃ＋ＣＫ２−Ｓキメラから、このような沈殿を起こしやすい、１つ以上の同一または近似する推定リン酸塩中心含有リンペプチドが放出されることが予測された。これらのタンパク質の溶液（およそ１０ｍｇ／ｍｌ；必要な場合には、最初は尿素の存在下で）を５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して徹底的に透析した後、ＴＬＣＫ処理したトリプシンを最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌまで添加し、３７℃で１８時間、オービタルシェイカーでインキュベーションした。トリプシンの２回目の添加を行ない、濃度を０．４ｍｇ／ｍｌにし、インキュベーションをさらに２時間継続した。
【０１２２】
これらのトリプシン消化物から、以下の方法によって、リンペプチドを濃縮した。この方法は、容易に可溶性のタグ化ペプチドＣＫ２−Ｓ−６Ｈを、上述のように細菌溶解物からＭＣＡクロマトグラフィーによって初期単離した後、濃縮およびさらに精製するためにも有用であった。まず、手順全体を通して０〜４℃に維持された試料のｐＨをＨＣｌの慎重な添加により４．５に調整し、３０分間の静置後に不溶性となったあらゆる材料を、遠心分離によって除去した。この清澄なｐＨ４．５の上澄みに、ＢａＣｌ２の溶液（１０％（ｗ／ｖ））を最終ＢａＣｌ２濃度０．２５％（ｗ／ｖ）まで添加した。次に絶えず攪拌しながらエタノールを添加して、濃度を５０％（ｖ／ｖ）にした。沈殿したリンペプチドを遠心分離によって回収し、ペレット化した材料を空気中で乾燥させた。上記に記載した条件を用いて、得られた材料に、最終精製ステップである分取ＲＰ−ＨＰＬＣを行なった。
【０１２３】
リン酸カルシウムナノクラスターの製造
３種の組換えリンペプチド（ＣＫ２−Ｓ、ＣＫ２−ＳＳ、およびＣＫ２−Ｓ−６Ｈ）の、ナノクラスターの形態でリン酸カルシウムを金属イオン封鎖するそれらの能力について検討した。それらのアラインメントされた配列を、これらの新規の変異体をリン酸塩中心配列中に生成するためのテンプレートとして使用したＮ−末端β−カゼインホスホペプチド［β−カゼイン４Ｐ（ｆ１−２５）］とともに、第１４表に示す。
【０１２４】
ほとんどの実験において、β−カゼイン様前駆体のトリプシン分解、およびバリウム沈殿およびＲＰ−クロマトグラフィーによる単離によって得られたＣＫ２−Ｓ配列を使用した。バリウムリンペプチドの最終的な実験規模のＲＰ−ＨＰＬＣ精製における主要ピークの前縁、中間、および後縁から、ＣＫ２−Ｓの３つの画分を単離した。ＣＫ２−ＳおよびＣＫ２−Ｓ−６Ｈのいわゆる高親和性画分を、ぞれぞれのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー分画における主ピークから回収した。リン酸カルシウムナノクラスターは、リン酸カルシウム複合体または沈殿物の形成を防止するのに十分に低いｐＨで、ペプチドおよび必要な塩を溶解することによって調製する。ナノクラスターの形成は、ｐＨを最終値の７．０まで上昇させることによって誘導され、これを達成するための最も簡潔な方法は、上記に記載したような尿素／ウレアーゼ法を用いる。全体を通して使用する塩濃度は、Ｍｇを含まない緩衝液Ａのものであり、ＣＫ２−ＳペプチドおよびＣＫ２−ＳＳペプチドにはペプチド濃度５ｍｇ・ｍｌ−１を使用した。これらの条件は、天然カゼインペプチドのβ−カゼイン４Ｐ（ｆ１−２５）およびαｓ１−カゼイン４Ｐ  ５９−７９を用いた前の研究において使用したものと極めて類似するペプチドおよび塩のモル濃度をもたらす。類似するペプチドのモル濃度をもたらすために、ペプチド濃度１０ｍｇ  ｍｌ−１を用いてＣＫ２−Ｓ−６Ｈナノクラスターを製造し、既に記載したような希釈緩衝液を用いて、ＳＡＸＳ測定の直前に５ｍｇ  ｍｌ−１まで希釈した。新たなナノクラスター試料は、配分されたビームタイムの数日前に、あるいはＳＡＸＳステーションで調製した。また、残りの材料が十分にある場合には、周囲温度で保管して、最長１６ヶ月後にもう一度再測定した。測定の間隔は、次のビームタイムの配分のタイミング、およびシンクロトロン放射源およびステーションの順調な機能に依存した。
【０１２５】
組換えβ−カゼインおよび誘導体の配列：ＣＫ２によるリン酸化
ウシＡ２β−カゼイン（６Ｈｉｓ−タグ化または非タグ化にかかわらず）の成熟配列をＣＫ２αと共発現させ、その後記載したように精製したとき、得られたタンパクは、乳腺で発現されたタンパク質の完全にリン酸化された状態の５Ｐと比較して、化学量論量未満の約０．２ｍｏｌ  Ｐ／ｍｏｌ（カゼイン）までしかリン酸化されていなかった。
【０１２６】
この結果は、ＣＫ２によるウシβ−カゼイン中のリン酸塩中心セリンの認識が弱いまたは欠如しているという予測と一致する（Ｍｅｇｇｉｏ，Ｆ．，Ｍａｒｉｎ，Ｏ．ａｎｄ  Ｐｉｎｎａ，Ｌ．Ａ．（１９９４）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＣＫ２．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．４０，４０１−４０９）。対照的に、ＣＫ２による、ヒトβ−カゼインのリン酸塩中心の組換えリン酸化（データは示さず）は、乳腺ゴルジ体キナーゼによってリン酸化が行なわれるｉｎ  ｖｉｖｏで認められるその不均一なリン酸化状態をよく再現する形で達成された。この観察結果は、本明細書に記載するツイン−プラスミド共発現系とともに、ＣＫ２ホロ酵素を含むα−サブユニットおよびβ−サブユニットの両者をコードするポリシストロニックな発現コンストラクトを含む組換え技術を用いた、Ｔｈｕｒｍｏｎｄ等（Ｔｈｕｒｍｏｎｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｈａｒｄｓ，Ｒ．Ｇ．，Ｓｅｉｐｅｌｔ，Ｃ．Ｔ．，Ｌｅｏｎａｒｄ，Ａ．Ｅ．，Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｏｍｑｖｉｓｔ，Ｍ．，Ｂｙｓｔｒｏｍ，Ｍ．，Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｋ．，Ｘｕ，Ｂ．Ｃ．，Ｋｏｐｃｈｉｃｋ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｕｋｅｒｊｉ，Ｐ．（１９９７）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１０，２０２−２０８）により以前に報告された結果を裏付けた。ヒトβ−カゼインの生理的リン酸化パターンは、タンパク質がＣＫ２と共発現されたときに忠実に模倣されるという、本研究とＴｈｕｒｍｏｎｄ等とが使用した異なる技術がもたらした共通の結果は、異なるタンパク質における他の点では類似するリン酸塩中心間の詳細な一次配列の違い、およびおそらくは三次元構造の違いは、タンパク質キナーゼによるリン酸化のためのアクセプター基質としてのそれらの能力に強く影響しうる、という結論を強化した。ＣＫ２はウシβ−カゼインの生理的リン酸化を再現できなかったため、後者のリン酸塩中心の基質適合性を、その配列の部位特異的修飾によって、「ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−」として第１４表に示す配列にすることによって強化した。このＣＫ２−ｓｍａｒｔ配列のセリンは、強く予測されたＣＫ２のリン酸化標的であり、２−プラスミド系を用いて、ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−β−カゼインがＣＫ２αと共発現されたとき、高レベルの生合成リン酸化が達成され（下記を参照）、限界化学量論量４ｍｏｌ  Ｐ／ｍｏｌ（タンパク質）の部分的な達成を示唆した。ＣＫ２−ｓｍａｒｔ配列のさらなる部位特異的変異原性修飾を行なって、第１４表に示すような、「ＣＫ２−ＳＳ」と称される、ＣＫ２−ｓｍａｒｔｅｒである可能性のあるトリプシンペプチドを得た。大腸菌内でＣＫ２−ｓｍａｒｔｅｒ−β−カゼインをＣＫ２αと共発現させたとき、その結果の生合成リン酸化（下記を参照）の分析は、分子のうちの少なくともいくつかにおいて、遺伝子操作されたリン酸塩中心における４個全てのセリンを占めることを示した。試験した全ての例において、これらの生合成リン酸化レベルは、これらのタンパク質の組換えによって生成されたリン酸化されていない形態（すなわち、ＣＫ２α発現プラスミドは含まない宿主から発現された）を、ホスホキナーゼ活性のための最適条件下、ＣＫ２αとともにｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートしたときに得られたものと類似していた（データは示さず）。
【０１２７】
リンペプチドのトリプシン放出
生合成的にリン酸化されたＣＫ２−ｓｍａｒｔ−およびＣＫ２−ｓｍａｒｔｅｒ−β−カゼインのトリプシン消化は、よく特徴付けられた天然β−カゼイン５Ｐの消化との類推によって、多重リン酸化ペプチド（第１４表において特定されるトリプシン切断ペプチドを参照）を放出すると予測された。この予測を、上記に記載したような、リンペプチドの選択的沈殿ためのＢａ２＋およびエタノールを用いた、トリプシン消化物の分画によって試験した。得られた沈殿物の主ペプチド成分を精製し、その後、標準物質および陽性対照としてリンペプチドβ−カゼイン４Ｐ  １−２５を用い、分析ＲＰ−ＨＰＬＣおよび強アニオン交換ＨＰＬＣによって特徴付けた。ＣＫ２−ｓｍａｒｔ−およびＣＫ２−ｓｍａｒｔｅｒ−β−カゼイからの推定リンペプチドのクロマトグラフィー特性は、標準の陽性対照リンペプチドのものと類似していた。
【０１２８】
天然β−カゼイン４Ｐ（ｆ１−２５）
このペプチドを用いて、この純粋なよく特徴付けられた材料における、４つの既知の独特な完全にリン酸化された部位が、イオントラップ法単独で位置特定できるかどうかを確認した。ＭＳ１モードにおいて、極めて多数の別の断片とともに、２＋および３＋のイオン化状態に相当する２つのピークが、ｍ／ｚ約１５６２および１０４２に認められた。１５６２ピークのＭＳ２スペクトルにおいて、１５６２における４Ｐ親２＋イオンからのＰ損失に由来する４つの顕著なピークが、ｍ／ｚ約１５１３、１４６４、１４１４、および１３６５に存在した。さらなる顕著なピークが、最大３個の水分子のさらなる損失により形成された。これは、５個のセリン残基のうちの４個のみがリン酸化されていることを裏付けるが、どの残基かは確認されない。１３６５ピークは、４個全てのリン酸化残基がデヒドロアラニンの形態に変換されていたことから、さらなるＭＳ３分析に選択された。ＭＳ３スペクトルにおいて、ｍ／ｚ値１６０８、１６７７、１７９０、１８５９、１９２７、および１９９７におけるピークは、それぞれｂ１４、ｂ１５、ｂ１６、ｂ１７、ｂ１８、およびｂ１９イオンに相当する。イオンｂ１５、ｂ１７、ｂ１８、およびｂ１９の出現およびｍ／ｚは、リン酸基の位置をＳ−１５、Ｓ−１６、Ｓ−１７、およびＳ−１９に限定し、Ｓ−２２がリン酸化されていないことを裏付ける。
【０１２９】
ＣＫ２−Ｓ
それ以外は非常に複雑な直接注入ＭＳ１スペクトルの主な特徴は、３３３６Ｄａの親ペプチドを予測する、ｍ／ｚ約１６６８（２＋）および１１１２（３＋）におけるピークであった。組換えタンパク質配列に由来する潜在的トリプシンペプチドの中に、３Ｐ形態で、計算質量３３３３Ｄａを有する、ＣＫ２−ｓｍａｒｔ  β−カゼイン（第１６表）の残基３〜３０を含む、２つの誤トリプシン切断部位を有するペプチドがあった。そこには４つの潜在リン酸化部位があり、４つの潜在的位置異性体が考えられる。１６６８ピークのＭＳ２分析を実施し、１、２、および３個のリン酸塩のニュートラルロスに相当する顕著なピークがあり、それぞれにおいて親イオンから最大２個のさらなる水分子の損失があることが容易に確認された。この候補配列の予測を用いて、ｂ−イオンおよびｙ−イオン、ならびにリン酸塩および水分子のニュートラルロスによるそれらの誘導体を検索した。最も顕著な４０ピークの中に、ｂ７、ｂ１４、ｂ１６、ｂ１７、ｂ１８、およびｂ１９、ならびにｙ１３、ｙ１５、ｙ１７、およびｙ１８に相当する、さらなる誘導体または元の断片イオンがあった。１１１２ピークのＭＳ２スペクトルにおいて、残基１２までの配列に予測された全てのｂイオンを同定することが可能であった。したがって、候補配列が確認された。さらに、予測されたｂ１６およびｂ１８の両イオンからの３個のリン酸塩分子の損失に相当する顕著なピークが存在し、少なくともこの主要なリン異性体が、残基１３、１４、および１５でリン酸化されていることを確認した。また、１１１２ピークのＭＳ２分析は、ｙ２−２２からの最大３個のリン酸塩部分のニュートラルロスを明らかにした。この系列のうち完全に脱リン酸化された要素をさらにＭＳ３により分析し、その配列を十分に同定して、Ｓ−１３、Ｓ−１４、およびＳ−１５におけるリン酸化を確認したが、Ｓ−１９におけるリン酸化は確認しなかった。それにもかかわらず、ＭＳ１スペクトルにおける別の２＋ピークのＭＳ２分析により、存在する全ての種が三重にリン酸化されているとは限らないことのある程度の証拠が認められた。上記のように、ｍ／ｚ約９９８におけるピークは、２個のみのリン酸塩部分の喪失を示したが、ｍ／ｚ約１０４３におけるピークは、最大４個のリン酸塩のニュートラルロスを示した。ポリマー逆相ＰＬＲＰ−Ｓカラムを用いた、タンデムＬＣ−ＭＳによる同じトリプシンペプチドの分析は、１つのみの著しいペプチド（ＵＶ吸光度）ピークを示したが、このピークの通過中に記録したＭＳ１およびＭＳ２スペクトルは、そこに著しい不均一性が存在し、主画分が完全にリン酸化された４Ｐペプチドを含むことを示した。ピークの前縁において、Ｓ−１３またはＳ−１９のいずれかでリン酸化されていない３Ｐペプチドの２つの異性体から小さいシグナルが生じ、誤トリプシン切断によりＣ−末端に付加配列−ＩＥＫ−を有する、４Ｐ形態に相当するさらなるペプチドが検出された。この分析から、異なるペプチドおよびリン形態の相対比率を定量的に決定することはできなかった。
【０１３０】
ＣＫ２−ＳＳ
このリンペプチドは、リンペプチドＣＫ２−Ｓに関して上記に記載したものと質的に類似する、複雑な直接注入ＭＳスペクトルを生じ、主要ピークは、ｍ／ｚ１６６８（２＋）および１１１２（３＋）に存在した。１６６８ピークのＭＳ２分析は、３個のリン酸化されたセリン残基について、一連のリン酸塩のニュートラルロス、および付随する水の損失を明らかにした。このペプチドは、ＣＫ２−Ｓの異性体であり、それらの推定配列は、アスパラギン残基とセリン残基との単一の置き換えのみにおいて異なる。質量およびリン酸化密度に関するそれらの同等性が立証され、このペプチドが、ＣＫ２−ＳよりもＣＫ２αによって、リン酸化基質としてより認識されることはないことが示唆されたので、ＣＫ２−ＳＳ変異体にさらなるＭＳまたはＬＣ−ＭＳ分析は行なわなかった。
【０１３１】
ＣＫ２  ｓｍａｒｔ反復
このタンパク質の質量スペクトルのデコンボリューションは、一連のリン酸化状態（０〜１１ｍｏｌ  Ｐ／ｍｏｌ（タンパク質））に予想される値と正確に一致する、予測分子量の群を生じた。０Ｐ〜６Ｐのリン形態は、低い（合計の１０％未満）、ほぼ同等な相対量で存在した。９Ｐリン形態が最も多く、続く８Ｐおよび１０Ｐリン形態はそれに近似し、それらのおよそ半分の濃度で７Ｐおよび１１Ｐリン形態が続いた。
【０１３２】
ＣＫ２−Ｓ−６Ｈ
このリンペプチドをタンデムＬＣ−ＭＳによってある程度詳細に分析した。ＭＳスキャンデータを記録して、全ての吸光度ピークを包含する、１〜６の連番を付けたサンプリング位置で分析試料を回収した。サンプリング位置１〜６の全てのスキャンデータは、５＋、６＋、７＋、および８＋のイオン化状態に相当する、顕著な質量シグナルを示した。さらに、サンプリング位置１および２において、９＋状態に相当する認識可能なシグナルが示され、サンプリング位置３〜６において、４＋状態に相当するシグナルが示された。これらのＭＳスキャンデータからの生物量計算により、５９４８．０Ｄａ、６０３０．１Ｄａ、６１０７．３Ｄａ、６１８７．７Ｄａ、６２６７．７Ｄａ、および６３４８．１Ｄａの質量が求められ、１〜６位置でサンプリングした分析物が、それぞれＣＫ２−Ｓ−６Ｈ配列（第１４表に示す）の０Ｐ、１Ｐ、２Ｐ、３Ｐ、４Ｐ、および４Ｐと５Ｐとのおよそ同量の混合物のリン形態を含むという結論をもたらした。全体に占める割合として表わされる、サンプリング位置１〜６にその極大を有する吸光度ピーク下の積分面積は、２％、２％、１０％、２６％、５４％、および６％であり、ペプチドの大部分が４Ｐ形態であることが示された。画分６において、４Ｐリン形態と５Ｐリン形態との同量混合物を仮定すると、質量平均リン酸化度は３．４３である。ＣＫ２−Ｓ−６Ｈペプチドのトリプシン消化物をエレクトロスプレーイオン化装置に直接注入することにより、ＭＳ１スペクトルにおける複数のリンペプチドの同定が可能となった。最も顕著なピークは、２、３、または４個のリン酸化残基を有する、リン酸塩中心配列−ＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤ−（配列番号２０）を含有するトリプシンペプチドに相当した。別の顕著なピークは、非リン酸化ペプチドＫＩＥＤＰＮＳＳＳＶＤＫ（配列番号２１）およびＩＥＤＰＮＳＳＤＫ（配列番号２２）に起因すると特定された。総合すると、これらの結果は、この主要なリン酸塩中心が、このペプチドとの組換え共発現時に、キナーゼのためのアクセプター部位の主な位置を提供することを裏付けた。それにもかかわらず、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによってこのペプチドをさらに分画し、個々の画分を回収し、タンデムＨＰＬＣ−ＭＳによって分析したとき、ペプチドの小部分が６Ｐ形態であったが、これはこのリン酸化の部位の小クラスターが、その３個のセリンのうち最大２個をリン酸化されうる場合にのみ可能である。
【０１３３】
ＧＳＴｅｔｃ＋ＣＫ２−Ｓキメラ
このタンパク質について、極めて限定されたＭＳデータのみを取得し、そのトリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ分析（従来のＣ１８  ＰｅｐＭａｐナノカラムを用いた）から、その推定配列の７０％を確認した。この分析は、挿入したＣＫ２−ｓｍａｒｔ配列を含み、それとＧＳＴ融合パートナー分子との間で重複する、最大３個のリン酸化を含むトリプシンペプチドの存在を裏付けた。
【０１３４】
ｈＯＰＮ−Ａ
このタンパク質は、複雑なＭＳ特性を有し、それは（それぞれＣ−末端およびＮ−末端からのものと推定される）ヒスチジンまたはメチオニンの損失（後者はヒスチジンの酸化を伴う）に関してのみ、推定配列と照合することができると判明した。これらの修飾体は、質量分析計内でのタンパク質のエレクトロスプレーイオン化時に生じた可能性が最も高い。それにもかかわらず、これらの質量欠損親イオンから、少なくとも４個のリン酸塩の一連のリン酸塩ニュートラルロスがいくつか生じていることが明らかに認められた。このタンパク質は、ＣＫ２の６つの標的配列を含有する。第１４表において、β−カゼイン、ならびにそのＣＫ２−ｓｍａｒｔ−およびＣＫ２−ｓｍａｒｔｅｒ−誘導体のＮ−末端領域のみの部分配列を示す。それ以外のポリペプチドの配列は全体を示し、最初の５配列は、それぞれのリン酸塩中心と隣接する残基に対してアラインメントされている。ゴルジ体キナーゼによる実際のリン酸化部位、またはＣＫ２の強く予測されるリン酸化部位、および天然β−カゼインから維持された配列は太字で示す。それぞれのβ−カゼイン−関連タンパク質からのリン酸塩中心配列を含有する主要トリプシンペプチドには下線を引き、ＧＳＴｅｔｃ＋ＣＫ２−Ｓキメラにおけるその類似リン酸塩中心ペプチドには、二重下線を引いた。
【０１３５】
生体液代用物の配合を改善するための、リン酸カルシウム金属イオン封鎖の使用の実施例
ＯＰＮ１−１４９ペプチドの使用は、最終的な蒸気滅菌、低免疫原性、および既に開示されている代用生体液配合物よりも高い金属イオン封鎖能という点で、改善された性能を提供する。そのような溶液中に存在する過剰リンペプチドは、これらが、（ｉ）血漿代用液の滅菌時および保管時のリン酸カルシウム沈殿を抑制し、（ｉｉ）使用時の異所性石灰化を抑制するように作用するため有利である。熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターの溶液の形態でのカルシウムの提供は、アシドーシスが発生する状況、または正常な生理学的機序がカルシウムおよびリン酸イオンの除去をもたらす状況で、カルシウムおよびリン酸塩の遊離イオン濃度、ならびにｐＨを調節するように設計されている。特定の実施形態において、通常血漿中に存在するリンタンパク質またはリンペプチド、例えばＯＰＮ、具体的にはＯＰＮ１−１４９、またはその適切な断片、フェチュインＡ、ＳＰＰ−２４、またはマトリックスＧｌａタンパク質を用いて、低免疫原性を有するようなナノクラスターで、代用生体液配合物中のナノクラスターを形成することができる。
【０１３６】
一実施例において、血漿代用液配合物は、最適量のリン酸塩、および少なくとも１個のリン酸塩中心を含有するリンペプチドまたはリンタンパク質を含む。この溶液は、ｐＨ７．３〜７．５、重量オスモル濃度２８０〜３１０ｍＭ、および膠質浸透圧２０〜３０ｍｍＨｇを有してよい。重量オスモル濃度は、第一に電解質によって、さらに膠質浸透圧剤、リンペプチド、および任意の原料のブドウ糖（好ましくは０〜１２５ｍＭ）によって決定される。デキストラン（０〜１００ｇｍ／ｌ）およびポリエチレングリコール（０〜２５ｇｍ／ｌ）などの物質を添加して、要求される膠質浸透圧を得ることができる。場合によっては、抗酸化剤またはフリーラジカル捕捉剤、例えばマンニトール（０〜２０ｇｍ／ｌ）、グルタチオン（０〜４ｇｍ／ｌ）、アスコルビン酸（０〜０．３ｇｍ／ｌ）、およびビタミンＥ（０〜１００ＩＵ／ｌ）を添加してもよい。リンペプチドは、０．５〜２．０ｍＭの範囲で含まれていてよく、合計Ｃａ＋＋は約０．５〜４．０ｍＭの範囲の量、合計Ｃｌ−は７０〜１６０ｍＭの範囲の量、合計Ｍｇ＋＋は０〜１０ｍＭの範囲の量、合計Ｋ＋は、０〜５ｍＭの範囲の量、合計リン酸塩は５〜１５ｍＭの範囲の量で含まれていてもよく、場合によってはヘキソース単糖２〜５０ｍＭが含まれていてもよく、この溶液は、最終的に加熱滅菌することができる。ＮａＨＣＯ３を市販されている滅菌１Ｍ溶液として、使用直前に、滅菌した溶液に添加してもよい。一般に、１リットル当たり５ｍｌの１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を添加するが、それ以上添加してもよい。
【０１３７】
この溶液を製造する方法は、カゼインナノクラスターの製造に関して既に開示されている方法、すなわち上記に記載したような、また当技術分野において理解されるであろうような、単純混合法または尿素／ウレアーゼ法に厳密に従うことになる。溶液を製造するために、リン酸塩を除く全ての原料を、最終体積の９０％以下を占める体積の水に溶解してもよい。次に、モノ−、ジ−、もしくはトリ−リン酸ナトリウムまたはＮａＯＨのうちの２つ以上の原溶液を一定分量添加することによって、溶液のｐＨをｐＨ７．３〜７．５まで上昇させる。この添加は、高速混合条件下でゆっくりと行ない、リン酸カルシウムの不可逆的沈殿を生じうる局所的な過剰濃度を回避する。最終ｐＨに達し、全てのリン酸塩の添加が終わると、この溶液を規定の体積にし、１２０℃で１５分間オートクレーブすることによって加熱滅菌した。
【０１３８】
代替の方法において、全ての原料を最終体積の９０％の水に添加してｐＨ５．０にし、２〜２０単位のウレアーゼを用いてｐＨを７．３〜７．５に上昇させるのに十分な尿素を添加する。ウレアーゼは１ｍｌの水に溶解し、血漿代用溶液に進入するのを防止するために透析袋に入れてもよい。２４時間穏やかに攪拌しながらｐＨをモニターし、必要に応じて追加の尿素を添加して最終ｐＨにし、その後透析袋を除去して、溶液を滅菌する。
【０１３９】
尿素／ウレアーゼ法による安定なヒト血漿代用液の配合実施例
リンペプチドとして４０ｍｇのＯＰＮｍｉｘを使用し、以下の原溶液：２７０μｌのＣａＣｌ２（１００ｍＭ）、１００μｌのＭｇＣｌ２（１００ｍＭ）、１３８０μｌのＮａＣｌ（１−Ｍ）、２５０μｌのＫＣｌ（１００ｍＭ）、１００μｌのＮａＮ３（１５０ｍＭ）、２００μｌのＮａＨ２ＰＯ４（１００ｍＭ）、５７２μｌのＮａＨＣＯ３（１００ｍＭ）、５０００μｌのブドウ糖（１００ｍＭ）、および３０μｌの尿素（１−Ｍ）を添加して、尿素／ウレアーゼ法によって、ナノクラスターを含む１０ｍｌの人工血漿を調製した。ｐＨは６．６４２と記録され、これを６０μｌのＨＣｌ（１−Ｍ）の添加により５．２６７まで低下させ、２０３８μｌのＨ２Ｏを添加して、最終体積１０ｍｌにした。ｐＨ５．２６７において、この溶液は、ＡＣＰおよびＤＣＰＤに対して不飽和であると算出された。濃度１０ｍｇ  ｍｌ−１のウレアーゼ（タチナタマメ由来のＳｉｇｍａ  Ｔｙｐｅ  Ｃ−３）の原溶液を作成し、４０μｌをＶｉｓｋｉｎｇ透析チューブに入れ、これを密封して人工血漿溶液中に入れた。９２分後、ｐＨが６．９６０に上昇し、その後３時間かけて１回の尿素原溶液１μｌで３回の添加を行なって、ｐＨを最終安定値７．３６７にし、その時点で透析袋を除去し、澄明溶液を周囲温度で保管した。
【０１４０】
単純混合法による安定なヒト血漿代用液の配合実施例
リンペプチドとして２０ｍｇのＯＰＮｍｉｘを使用し、以下の量の原溶液：２７０μｌのＣａＣｌ２（１００ｍＭ）、１００μｌのＭｇＣｌ２（１００ｍＭ）、１３８０μｌのＮａＣｌ（１−Ｍ）、２５０μｌのＫＣｌ（１００ｍＭ）、２００μｌのＮａ２ＨＰＯ４（１００ｍＭ）、４００μｌのＯＰＮｍｉｘ（５０ｍｇ  ｍｌ−１）、５０００μｌのブドウ糖（１００ｍＭ）、５７２μｌのＮａＨＣＯ３（１００ｍＭ）を用いて、単純混合法によって、ナノクラスターを含む１０ｍｌの人工血漿を調製した。混合後、ｐＨは６．７６０であり、このｐＨを１１０μｌの１−Ｍ  ＮａＯＨを用いて、攪拌しながらゆっくりと７．４８まで上昇させ、Ｈ２Ｏで体積を１０ｍｌにした。この溶液の組成および算出された特性を第１５表に示す。この溶液は、光学的に澄明であり、１２６℃および１．５ｂａｒでの２０分間の蒸気滅菌後もその状態を維持した。次に、一定分量の滅菌した人工血漿を凍結乾燥し、元の体積の蒸留水中で再構成した。凍結乾燥粉末が溶解するときに少量のゼラチン状沈殿物が出現したが、これは数分以内に消失し、ｐＨ８．０４５の澄明溶液を生じた。１−ＭのＨＣｌを添加してこのｐＨを７．１３９まで低下させ、４５分後、この光学的に澄明な溶液のｐＨは、７．１９０で安定していた。貯蔵寿命を測定するために、滅菌していない試料および再構成試料に、ＮａＮ３を最終濃度１．５ｍＭまで添加した。混合法で調製した３試料を周囲温度で３週間保管して、動的光散乱法によって試験した。動的光散乱測定には、Ｄｙｎａｐｒｏ  ８０１  ＴＣ計器（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．）を用いた。測定に先立って、試料を孔径０．２μｍのＷｈａｔｍａｎ  Ａｎｏｔｏｐ  １０フィルタを通して濾過した。測定は２５℃で実施し、Ｓｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程式を用いて、強度平均拡散係数から流体力学半径を算出した。Ａｌａｎｇｏ  ＬｔｄのＤｙｎａＬＳプログラムに実装されるラプラス変換の特異値分解法を用いて、相関関数を逆にして流体力学半径の強度重み付け分布を求めた。滅菌していない試料も、再構成試料も粒径の安定した測定値を得るのに十分な光を散乱しなかった。しかしながら、滅菌試料は、分析に十分な散乱を示し、強度平均流体力学的サイズ４．５３ｎｍが示された。正規化された強度分布は、遊離ペプチドに予想される大きさの強いピークと、最頻半径３６．２ｎｍのナノ粒子のより小さいピークを示した。このリンペプチド混合物によって形成されたナノ粒子のサイズは、ＯＰＮ１−１４９とＭｇを含まずかつ炭酸塩を含まない緩衝液Ａとによって形成されたナノクラスターのほぼ２倍の大きさである。これにもかかわらず、この人工血漿は、ナノ粒子がリン酸カルシウムナノクラスターでもある場合に予想されるように、最終的加熱滅菌に耐え、かつ凍結乾燥状態から容易に再構成された。
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【０１４１】
ナノクラスターの形成におけるフェチュインＡの使用実施例
Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から、製品番号Ｆ３００４としてフェチュインＡを購入した。このＳｉｇｍａ社のフェチュインＡの純度は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる判定によると約８０〜９０％であり、高分子量および低分子量の著しい不純物を含むことが認められた。この材料で、Ｍｇを含まない緩衝液Ａおよび尿素／ウレアーゼ法を用いて、タンパク質濃度６６．４ｍｇ  ｍｌ−１（分子量３６，３５３Ｄａと仮定して１．６ｍＭ）でナノクラスターを作成しようと試みたが、生成物の一部が沈殿して、フェチュインＡナノクラスターのサイズを測定することが不可能になった。本発明者らは、より低いフェチュインＡ濃度では、沈殿の問題はずっと軽減されると判断し、カゼインホスホペプチドと可変濃度のフェチュインＡとを用いて混合ナノクラスターを調製し、より低い濃度から、外挿法によって、フェチュインナノクラスターのサイズを得る手法を採用した。カゼインホスホペプチド混合物は、Ａｒｌａ  Ｌｔｄ（デンマーク）から製品Ｌａｃｐｒｏｄａｎ  ２０９０（Ｎａ塩）として供給された。このカゼインホスホペプチド混合物を用いて調製したナノクラスターについては、以前に記載されている（Ｈｏｌｔ  Ｃ，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＥＳ  ＆  Ｃｌｅｇｇ  ＲＡ（２００９）Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７６，２３０８−２３２３，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１７４２−４６５８．２００９．０６９５８．ｘ  ａｎｄ  Ｌｉｔｔｌｅ  ＥＭ  ＆  Ｈｏｌｔ  Ｃ（２００４）Ａｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｙ  ｃａｓｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３，４３５−４４７，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２４９−００３−０３７６−ｘ）。
【０１４２】
それぞれ０、１、２、４、８、または１６ｍｇ  ｍｌ−１のフェチュインＡとともに、ｐＨ５のＭｇを含まない緩衝液Ａ中に固定濃度１０ｍｇ  ｍｌ−１で溶解したＬａｃｐｒｏｄａｎ  ２０９０を用いて、試料を調製した。３０ｍＭの尿素と１ｍｌ当たり１０単位のウレアーゼとを用いてｐＨを上昇させ、１日以内に最終ｐＨ７．６５±０．１５を得た。しかしながら、０および１ｍｇ  ｍｌ−１のフェチュインＡを含む試料は、それよりも高いｐＨに達したので、これを少量の一定分量の１−ＭのＨＣｌを添加して低下させて、他の試料のｐＨと一致させ、平衡化にさらに１日を設けてから、流体力学的サイズを測定した。６試料の相関関数のラプラス変換によって算出した強度重み付け正規化分布曲線を明確にするために垂直方向にずらしたもの（図１８ａ）は、約６ｎｍのナノクラスターピークを示し、前の研究と一致したが、フェチュインＡ濃度が増加するに伴い、第２のピークがより大きいサイズで次第に重要になった。それにもかかわらず、これらのより低いフェチュイン濃度では、凝集した材料は、ナノクラスターピークの最頻値の測定を妨げなかった。正確な推定は困難ではあったが、均一な球状粒子による散乱に基づいて、これらの実験における凝集材料の重量分率は、全ての例において１％未満であると算出された。フェチュイン濃度の増加の作用は、一般に、流体力学的サイズを減少させることであったが（図１８ｂ）、初期作用は小さい増加を生じるものであった。フェチュインＡナノクラスターの流体力学的サイズを算出するために、無限大の濃度への外挿を行なって、流体力学半径をフェチュインＡ濃度の逆数に対してプロットし（図１８ｃ）、そこからフェチュインＡナノクラスターが流体力学半径５．８ｎｍを有することが判明した。
【０１４３】
ナノクラスターにフェチュインＡを加えることは、流体力学半径を増加させるであろうと予想されていた。フェチュインＡは、配列のＮ−末端側半分に２つの球状シスタチンドメインを有し、単一のリン酸塩中心を含有する折り畳まれていないＣ−末端側半分を有すると考えられている。フェチュインＡをナノクラスターに組み込むことは、最も低いフェチュインＡ濃度で実際に認められたように、シェル厚を増加させると予想できる。しかしながら、コア半径は、全体としてのシェルの金属イオン封鎖自由エネルギーにも依存しており、フェチュインＡの結合がこれをより負でなくするならば、コア半径は減少するであろう。フェチュインの組み込みによって生じる流体力学半径のあまり大きくない減少は、両作用がほぼ相殺しているであろうことを示唆している。
【０１４４】
フェチュインナノクラスターは、分泌型リンタンパク質によるナノクラスターの形成の別の実施例を提示し、さらに非ＳＣＰＰによるナノクラスター形成の第１の実施例、非カゼイン全タンパク質によって形成されるナノクラスターの第１の実施例、および金属イオン封鎖リンタンパク質の一部が安定な球状コンフォメーションを有すると予測されるナノクラスターの最初の実施例を提示する。フェチュインＡは血漿の正常な成分であるため、フェチュインＡ、またはこの配列に由来するリンペプチドを用いて製造したナノクラスターは、低い免疫原性を有すると予想され、これは薬物送達、ワクチンアジュバント、および人工生体液などの生物医学的用途に特に有用である。
【０１４５】
シュウ酸カルシウムの沈殿に対する尿様溶液の安定化
先進国の人口のおよそ５％が尿石症に罹患していることから、尿中の結晶成長を予防または抑制することは望ましい。本発明者らは、ある種のリンペプチド、例えばＯＰＮ１−１４９またはＯＰＮｍｉｘを用いたナノクラスター形成は、この症状の処置に有用であろうと考えている。別の安定化タンパク質およびペプチドを使用してもよく、これらは当業者には明らかであろう。尿は、典型的には、ｐＨがおよそ６であり、均一溶液を含み、場合によっては種々の塩の結晶、最も一般的にはシュウ酸カルシウム、尿酸および尿酸塩、およびリン酸カルシウム、および高ｐＨにおけるリン酸アンモニウムマグネシウムを有する。過去の研究は、健常対象およびさまざまな種類の結石対象からのヒト尿における総塩濃度を示している（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｗ，Ｐｅａｃｏｃｋ  Ｍ  ＆  Ｎｏｒｄｉｎ  ＢＥＣ（１９６８）  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｓｔｏｎｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｓｔｏｎｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｒｉｎｅ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４，５７９−５９４）。析出相は、尿分析の通常の方法によっては小さすぎて検出できない粒子を形成すると仮定されている。
【０１４６】
尿のイオン平衡に対する巨大分子の影響は、周知の結晶成長速度の低下による以外には、これまで測定されていない。尿中のＯＰＮペプチドの量、特にモル濃度の定量測定は、複数の系統誤差および不確定要素を生じやすく（Ｋｏｎ  Ｓ，Ｍａｅｄａ  Ｍ，Ｓｅｇａｗａ  Ｔ，Ｈａｇｉｗａｒａ  Ｙ，Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ  Ｙ，Ｃｈｉｋｕｍａ  Ｓ，Ｔａｎａｋａ  Ｋ，Ｒａｓｈｉｄ  ＭＭ，Ｉｎｏｂｅ  Ｍ，Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＡＦ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ｒｅｖｅａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７７，４８７−４９８、およびＴｈｕｒｇｏｏｄ  ＬＡ，Ｇｒｏｖｅｒ  ＰＫ  ＆  Ｒｙａｌｌ  ＲＬ（２００６）  Ａ  ｐｒｏｂｌｅｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ．Ｉｎ（Ｅｖａｎ  ＡＰ，  Ｌｉｎｇｅｍａｎ  ＪＥ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＣ，ｅｄｓ），ｐｐ．１９６−１９９，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、大きく異なる結果が報告されている。
【０１４７】
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等の研究における健常男性被験者６０例の対照群からの、尿の平均塩組成に極めて近似する人工尿例を使用した。これは、以下の原溶液：ＣａＣｌ２（１００ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１００ｍＭ）、ＮａＣｌ（１−Ｍ）、ＫＣｌ（１−Ｍ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１００ｍＭ）、ＮａＨ２ＰＯ４（１０００ｍＭ）、Ｈ３−クエン酸塩（１００ｍＭ）、Ｈ２−シュウ酸塩（２０ｍＭ）、ＯＰＮｍｉｘ（５０ｍｇ  ｍｌ−１）、Ｎａ２−尿酸塩（４ｍＭ）、およびＨＣｌ（１−Ｍ）から、単純混合法によって調製した。第１６表に示す順序で混合を行ない、ｐＨは、ＨＣｌの添加前には５．３であり、ＨＣｌの添加後には５．０であった。溶液の組成および算出された特性を第１６表に示す。尿酸をｐＨ８まで滴定して、尿酸ナトリウム原料を調製した。オステオポンチンの不在下で尿酸の沈殿物が形成し、これは溶液の加温時に再溶解することができた。尿酸塩濃度を０．５ｍＭ以下に下げた場合、人工尿はｐＨ５で室温において安定であった。尿酸塩濃度１．５ｍＭでは、オステオポンチン原溶液の添加によって、沈殿を防止することができた。１．０または０．１ｍｇ  ｍｌ−１のＯＰＮｍｉｘを含む別の２つの配合物では、尿酸の沈殿は認められなかった。
【０１４８】
一定分量のこの標準人工尿のｐＨを、１−ＭのＮａＯＨをよく攪拌しながら添加することによって調整して、およそのｐＨ領域５〜８の試料を作成し、１２６℃および１．５ｂａｒで２０分間蒸気滅菌した。沈殿は発生せず、試料のｐＨは、５．０４８、５．３８７、５．９９５、６．３８５、７．３８０、７．８７０、８．０００、および８．２３７であった。溶液は、室温での１ヶ月間の保管時にも安定を保ち、その後動的光散乱法によって試験した。
2011527898.tif 000055
【０１４９】
コア−シェル構造の考察
本発明者らの測定から、コア表面上のＯＰＮペプチドの回転半径は、遊離溶液中でのその値の約３分の１であった。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、このペプチドが、３個のリン酸塩中心など、いくつかの地点でこの表面に結合していると考えている。この仮定は、遊離ペプチドのモル分率、ナノクラスターの組成、および反応したリン酸塩中心の算出されたモル分率とも矛盾しない。以前のカゼインナノクラスターと比較して、ＯＰＮナノクラスターのコアリン酸カルシウムはより塩基性であるが（トリ−リン酸カルシウムの実験化学式に相当する）、ＣａまたはＰｉのＰＣに対するモル比は、同じであると算出された。ＳＡＸＳ分析によると、ＯＰＮ１−１４９ナノクラスターのコアは、以前のカゼインホスホペプチドを用いて製造したものの約４倍近い大きさであり、組換えＣＫ２−Ｓ、ＣＫ２−ＳＳ、およびＣＫ２−Ｓ−６Ｈペプチドを用いて製造したもののおよそ２倍の大きさであった。本発明者らの試験結果に基づき、リン酸塩中心の金属イオン封鎖能などの要素を調節し、リン酸塩中心１個当たりのコア表面積、ならびにリン酸カルシウムにおける水和および長距離規則度を変更することによって、ナノクラスターのサイズを増加させる手段が提供される。ＯＰＮ１−１４９ナノクラスターにおけるリン酸塩中心１個当たりのコア表面積は０．２５ｎｍ２であることがわかり、これはβ−カゼイン１−２５で作成したナノクラスターについて算出された表面積の約４分の１であるため、このことのみがＯＰＮナノクラスターの従来既知のカゼインナノクラスターとのサイズの違いを説明しうる。
【０１５０】
本明細書に記載される本発明には、本発明の適用範囲から逸脱することなく、種々の変更を行なうことができる。
【図１】
2011527898.tif 000056
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年6月28日(2011.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターであって、前記ナノクラスターはリンペプチドまたはリンタンパク質を含み、前記リンペプチドまたはリンタンパク質は、    ａ）組換えによって発現されたリンペプチドまたはリンタンパク質であって、
ｉ）リン酸塩中心であって、リン酸化残基および酸性残基のうちの少なくとも１つ、またはこれらの残基の組み合わせが、前記リン酸塩中心内で増加され、それにより前記リン酸塩中心が増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有するように修飾されたリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉ）修飾されて、それにより前記修飾された組換えによって発現されたリンペプチドが、前記組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態と比較して、増加した数の別個のリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉｉ）好ましくは、アミノ酸残基の数および／または種類および／またはリン酸化、またはリン酸塩中心内の特定のアミノ酸残基の間隔の変更によって、あるいは非晶質リン酸カルシウムがより結晶性の高い相、例えばアパタイトに変換するのを促進するアミノ酸配列を除去することによって修飾されて、それにより前記修飾された組換えリンペプチドが、前記組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態よりも増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有する、
組換えによって発現されたリンペプチド、あるいは
ｂ）カルシウム結合リンタンパク質／リンペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片（少なくとも１個のリンペプチドまたはリンタンパク質が選択的に、カゼインの混合物、またはそれらの断片であり、前記カゼインのリン酸塩中心におけるグルタミン酸残基がアスパラギン酸残基で置換される場合に、前記リンペプチドまたはリンタンパク質は、単一のカゼイン、またはカゼインの混合物、または単一のカゼインもしくはカゼインの混合物の酵素消化物を含まない）、あるいは
ｃ）ａ）とｂ）との組み合わせ、
から選択される、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項２】
前記リンペプチドまたはリンタンパク質が、フェチュインＡ（配列番号１０）、プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（配列番号１１）、マトリックスＧｌａタンパク質（配列番号１２）、分泌型リンタンパク質２４（配列番号１３）、オステオポンチン（配列番号１５）、インテグリン結合シアロリンタンパク質（配列番号１６）、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（配列番号１７）、象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（配列番号１８）、またはそれらの変異体もしくは断片からなる群から選択される少なくとも１つの要素であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項３】
前記リンペプチドまたはリンタンパク質のリン酸塩中心が、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＳＤＤＤＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号２）、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号３）、または
ＭＲＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫＩＥＤＰＮＳＳＳＶＤＫＬＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号４）
のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項４】
３ｎｍ以上のコア半径を有し、および／または、前記ナノクラスターにおけるリン酸塩中心１個当たりのコア表面積が０．６ｎｍ２未満である、請求項１に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項５】
熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターを提供する方法であって、
ナノクラスター形成溶液を製造するステップであって、カルシウムイオンと、リン酸イオンと、リンペプチドまたはリンタンパク質とを混合することによって、前記ナノクラスター形成溶液を製造するステップを含み、
このとき前記リンペプチドまたはリンタンパク質は、
ａ）組換えによって発現されたリンペプチドであって、
ｉ）リン酸塩中心であって、リン酸化残基および酸性残基のうちの少なくとも１つ、またはこれらの残基の組み合わせが、前記リン酸塩中心内で増加され、それにより前記リン酸塩中心が増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有するように修飾されたリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉ）修飾されて、それにより前記修飾された組換えによって発現されたリンペプチドが、前記組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態と比較して、増加した数の別個のリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉｉ）好ましくは、アミノ酸残基の数および／または種類および／またはリン酸化、またはリン酸塩中心内の特定のアミノ酸残基の間隔の変更によって、あるいは非晶質リン酸カルシウムがより結晶性の高い相、例えばアパタイトに変換するのを促進するアミノ酸配列を除去することによって修飾されて、それにより前記修飾された組換えリンペプチドが、前記組換えによって発現されたリンペプチドの修飾されていない形態よりも増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有する、
組換えによって発現されたリンペプチド、あるいは
ｂ）カルシウム結合リンタンパク質／リンペプチド、またはそれらの変異体もしくは断片（このとき前記リンペプチドまたはリンタンパク質は、単一のカゼイン、またはカゼインの混合物、または単一のカゼインもしくはカゼインの混合物の酵素消化物を含まない）、あるいは
ｃ）ａ）とｂ）との組み合わせ、
のうちの少なくとも１つを含む、方法。
【請求項６】
前記リンペプチドまたはリンタンパク質が、フェチュインＡ（配列番号１０）、プロリンリッチ塩基性リンタンパク質４（配列番号１１）、マトリックスＧｌａタンパク質（配列番号１２）、分泌型リンタンパク質２４（配列番号１３）、オステオポンチン（配列番号１５）、インテグリン結合シアロリンタンパク質（配列番号１６）、マトリックス細胞外骨リン糖タンパク質（配列番号１７）、象牙質マトリックス酸性リンタンパク質１（配列番号１８）、またはそれらの変異体もしくは断片からなる群から選択される少なくとも１つの要素であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記リンペプチドまたはリンタンパク質のリン酸塩中心が、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＳＤＤＤＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号２）、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号３）、または
ＭＲＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫＩＥＤＰＮＳＳＳＶＤＫＬＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号４）
のうちの少なくとも１つを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ナノクラスター形成溶液を製造するステップにおいて、前記溶液中の尿素のウレアーゼによる触媒加水分解によって、前記溶液中にアンモニアを均一に生成させ、それにより穏やかにｐＨを上昇させることによって、前記ナノクラスター形成溶液のｐＨを上昇させて、前記リン酸カルシウムナノクラスターを形成する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
請求項５に記載の方法を用いて得ることができる、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項１０】
前記ナノクラスターが３ｎｍ以上のコア半径を有する、および／または、前記ナノクラスターにおけるリン酸塩中心１個当たりのコア表面積が０．６ｎｍ２未満である、請求項５に記載の方法を用いて得ることができる、熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスター。
【請求項１１】
請求項５に記載の方法において使用するためのリンペプチドまたはリンタンパク質であって、
ａ）前記リンペプチドが、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）がより結晶性の高い相、例えばそのアパタイトに変換するのを促進する残基を含まない、分泌型カルシウム結合リンペプチドまたはリンタンパク質、あるいはそれらの変異体もしくは断片を含み、あらゆる単一のカゼインまたはカゼインの混合物、あるいはあらゆる単一のカゼインまたはカゼインの混合物の酵素消化物を除外し、
ｂ）前記リンペプチドが、組換えリンペプチドまたはリンタンパク質、あるいはそれらの組み合わせを含み、前記組換えリンペプチドまたはリンタンパク質が、
ｉ）リン酸塩中心であって、前記リン酸塩中心内に増加した数のリン酸化残基をもたらし、それにより前記リン酸塩中心が増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖能を有するように修飾されたリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉ）修飾されて、それにより修飾されてない組換えによって発現されたリンペプチドよりも、増加された数の別個のリン酸塩中心を含むか、または
ｉｉｉ）増大したリン酸カルシウム金属イオン封鎖を可能にする修飾を含む、
リンペプチドまたはリンタンパク質。
【請求項１２】
前記リンペプチドが、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＳＤＤＤＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号２）、
ＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫ（配列番号３）、および
ＭＲＥＬＥＥＬＮＶＰＧＡＤＤＳＳＳＤＤＤＳＤＤＤＤＲＩＮＫＫＩＥＤＰＮＳＳＳＶＤＫＬＡＡＡ  ＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号４）
のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のリンペプチド。
【請求項１３】
請求項１に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターを含む：配合物；医薬組成物；アジュバント；血液、血漿、細胞外液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、尿、および唾液の代用物のうちの少なくとも１つとして使用するための人工生体液。
【請求項１４】
薬剤における、鉱化組織の脱ミネラル化の抑制または予防のための、病的石灰化の処置または予防のための、食品または飲料における、液体の安定性および過飽和度を維持するための、天然液または合成液における、人工生体液における、請求項１に記載の熱力学的に安定なリン酸カルシウムナノクラスターの使用。
【国際調査報告】
2011527898.tif 000155
2011527898.tif 000156
2011527898.tif 000157