(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中の複数の抗原特異的免疫グロブリンを定量する方法であって、
（i）既知の抗原反応度を持つ免疫グロブリンを含む一連の試料と、第一の固相担体上に固定された複数の抗原成分またはそのフラグメントとの結合を測定する工程、
（ii）工程（i）で測定した結合度と前記既知の抗原反応度とを比較し、前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれの用量反応曲線を作成する工程、
（iii）総免疫グロブリン量が既知の、工程（i）で使用された前記免疫グロブリンと同じサブタイプの標準免疫グロブリン試料の段階希釈液と、
前記第一の固相担体または第二の固相担体上に、段階希釈液を用いて、工程(i)で固定された成分とクロスコンタミネーションすることなく固定された複数の抗免疫グロブリン抗体、そのフラグメントまたはその誘導体との結合を測定する工程、
（iv）工程（iii）で測定した結合度と前記既知の総標準免疫グロブリン量とを比較し、前記抗免疫グロブリン抗体、そのフラグメントまたはその誘導体の段階希釈液それぞれの結合能曲線を作成する工程、
（v）工程（ii）で作成した前記用量反応曲線と工程（iv）で作成した前記結合能曲線とを対照し、前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれについて前記用量反応曲線と最も近似する結合能曲線を同定し、前記同定された結合能曲線を前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれに割り当てる工程、
（vi）前記試験試料中の前記抗原特異的免疫グロブリンと、
前記第一の固相担体、前記第二の固相担体または第三の固相担体上に、工程(i)及び工程(iii)で固相担体上に固定された成分とクロスコンタミネーションすることなく固定された前記抗原成分またはそのフラグメントとの結合を測定する工程、及び
（vii）前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれについて、工程（vi）で測定した結合度と工程（v）の前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれに割り当てられた前記結合能曲線とを比較し、前記試験試料中の前記抗原特異的免疫グロブリンを定量する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程（iv）で作成した複数の前記結合能曲線を、異なる結合能をそれぞれ示す典型的ないくつかの結合能曲線に集約し、工程（v）の前記対照を、工程（iv）で作成した前記結合能曲線に代えて該典型的な結合能曲線と、工程（ii）で作成した前記用量反応曲線との間で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数の抗原特異的免疫グロブリンと、固相担体上に固定された複数の抗原またはそのフラグメントとの結合を測定するのに適した装置を校正する方法であって、
（i）既知の抗原反応度を持つ免疫グロブリンを含む一連の試料と、第一の固相担体上に固定された抗原成分またはそのフラグメントとの結合を測定する工程、
（ii）工程（i）で測定した結合度と前記既知の反応度とを比較し、前記抗原成分またはそのフラグメントのそれぞれについて用量反応曲線を作成する工程、
（iii）総免疫グロブリン量が既知の、工程（i）で使用された前記免疫グロブリンと同じサブタイプの標準免疫グロブリン試料の段階希釈液と、
前記第一の固相担体または第二の固相担体上に、段階希釈液を用いて、工程(i)で固定された成分とクロスコンタミネーションすることなく固定された複数の抗免疫グロブリン抗体、そのフラグメントまたはその誘導体との結合を測定する工程、
（iv）工程（iii）で測定した結合度と前記既知の総標準免疫グロブリン量とを比較して、前記抗免疫グロブリン抗体、そのフラグメントまたはその誘導体の段階希釈液それぞれの結合能曲線を作成する工程、
（v）工程（ii）で作成した前記用量反応曲線と工程（iv）で作成した前記結合能曲線とを対照し、前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれについて前記用量反応曲線と最も近似する結合能曲線を同定し、前記同定された結合能曲線を前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれに割り当てる工程、及び
（vi）工程（v）で得た結合能曲線を前記装置に入力し、各抗原の結合能曲線に、該抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを未知量含む試料からのシグナルを内挿できるようにする工程
を含む方法。
【請求項４】
工程（iv）で作成した複数の前記結合能曲線を、異なる結合能をそれぞれ示す典型的ないくつかの結合能曲線に集約し、工程（v）の前記対照を、工程（iv）で作成した前記結合能曲線に代えて該典型的な結合能曲線と、工程（ii）で作成した前記用量反応曲線との間で行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原は、任意に精製された、組換え抗原、天然抽出物由来抗原、またはその組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原はアレルゲンであり、前記免疫グロブリンはＩｇＥであり、前記抗免疫グロブリン抗体は抗ＩｇＥ抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
キットであって、
ａ）第一の固相担体上に、段階希釈液を用いて固定された複数の抗ＩｇＥ抗体、そのフラグメントまたはその誘導体、
前記第一の固相担体または第二の固相担体上にクロスコンタミネーションすることなく固定された複数のアレルゲン成分またはそのフラグメント、及び
前記第一の固相担体、前記第二の固相担体、又は第三の固相担体上にクロスコンタミネーションすることなく固定されたポジティブコントロール又はネガティブコントロール
を含み、さらに
ｂ）下記の一以上
i）標準ＩｇＥ試料
ii）該ＩｇＥに結合する第一の抗体を含む第一の抗体調整物
iii）前記第一の抗体に特異的に結合する第二の抗体を含む、第二の抗体調製物
iv）前記第二の抗体に特異的に結合する第三の抗体を含む、第三の抗体調製物
を含む、キット。
【請求項８】
前記アレルゲン成分は、任意に精製された、組換え抗原、天然抽出物由来抗原、またはその組み合わせである、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記異なる結合能は、超高結合能、高結合能、中結合能、及び低結合能であることを特徴とする、請求項２又は４に記載に方法。
【請求項１０】
前記固相担体がマイクロアレイチップである、請求項１〜６、又は９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記固相担体がマイクロアレイチップである、請求項７又は８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のＩｇＥを定量する免疫測定法、当該定量の実施に適した装置の校正方法、及び当該定量を行うためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法は、抗体の結合能を利用した方法であり、ある特定の抗原特異的抗体の試料中の存在について測定するため、よく利用される。この測定は、特定の抗原を表面に固定した固相担体上に試料を注いで洗い、次いで結合した抗体を種々の技術を用いて可視化することによって行われる。
【０００３】
免疫測定法では通常、未知の試料についてその値や濃度を決定するための標準物質（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒｓ）の使用が必要である。旧来の免疫測定法では、１セットの標準物質を用い、シグナル対濃度の校正曲線（検量線、ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）を１つ作成し、未知の試料の濃度を当該校正曲線への内挿（ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ）によって決定する。
【０００４】
アレルギー状態は、無害な環境抗原に対する不適当で過剰な免疫応答であることを特徴とする。そのような抗原は、アレルゲンと総称される。アレルゲンへの免疫応答のうち感作相第１段階は、（i）抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）によるアレルゲンの処理、（ii）ＡＰＣｓによる、処理されたアレルゲンのナイーブヘルパーＴ細胞（ナイーブＴｈ０細胞）への提示、（iii）ナイーブＴｈ０細胞のＴｈ２細胞への分化、及び（iv）Ｔｈ２細胞によるＢ細胞の刺激とその刺激によるＢ細胞からのアレルゲン特異的ＩｇＥの産生と分泌、からなる。
【０００５】
アレルゲンは、自身に特異的なＩｇＥ産生を引き起こす刺激となる。ＩｇＥ抗体は、２種類の細胞、すなわち、ヒスタミンを内包する顆粒を含む、肥満細胞及び好塩基球と相互作用可能な分子である。
【０００６】
感作相を引き起こしたアレルゲンと同じアレルゲンが２度目に個体内に入り対応する肥満細胞及び好塩基球に認識されると、そのアレルゲンは、惹起相として知られるアレルギー機序の第二段階を引き起こす。そのアレルゲンは、肥満細胞及び好塩基球の表面上に存在する自身に特異的なＩｇＥに結合し、それら肥満細胞及び好塩基球の脱顆粒及びヒスタミンの分泌へとつながる機構の引き金となる。これは、典型的アレルギー反応である炎症反応の要因となる。それに続くアレルギー反応の重篤度は、当該個体の持つアレルゲン特異的ＩｇＥの量に応じたものとなる。従って、アレルギーを持つ（またはアトピーの）個体を特定しそのアレルギー特性を把握するために、ある特定のアレルゲンによって生じた個体内のＩｇＥ検出とその濃度定量は重要である。
【０００７】
アレルギー診断における定量的免疫測定法では通常、世界保健機構（ＷＨＯ）の国際標準品（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）７５／５０２を用いてまたは参照して、校正システムを構築する。この国際標準品は、ＩｇＥの反応度が所与のヒト血清フリーズドライ試料である（Ｋｏｎｔｉｓ  Ｋ.ら(２００６) Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｕｒｂｏ−ＭＰ  ＲＩＡ  ｗｉｔｈ  ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ  ＦＥＩＡ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ａｌｌｅｒｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−Ｅ．  Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ．  ３６(１)：７９−８７;  Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  Ｊ．ら(１９９０)Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＲＡＳＴ  ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＣＡＰ  ｓｙｓｔｅｍ：  Ａ  ｎｅｗ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＥ  ａｓｓａｙ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ８５(６)：１０３９−４３;  本標準品情報は以下参照:ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｎｉｂｓｃ．ａｃ．ｕｋ/ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ/ｉｆｕ/７５−５０２．ｐｄｆ）。
【０００８】
アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の反応測定値は、典型的には総ＩｇＥ（ｔｏｔａｌ  ＩｇＥ）校正曲線（ＷＨＯ国際標準品）に照らして求められ、リットルあたりのＡｌｌｅｒｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｕｎｉｔｓ（ｋＵＡ／ｌ）を単位とした濃度で表される。ＩｇＥ標準曲線（参照曲線、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｕｒｖｅ）は、試験に供される全てのアレルゲンの用量反応曲線を描くために用いられるが、この際、ＩｇＥとアレルゲンの用量反応曲線が同じ傾向を示すよう、免疫測定用固相担体上に固定するアレルゲン成分の濃度を最適化する必要がある。用量反応曲線の観点からのアレルゲン濃度最適化は、異なる濃度のアレルゲンを既知の反応度を持つ複数試料のパネルを用いて試験し、得られた用量反応曲線の形状と傾きが、総ＩｇＥ曲線（ＷＨＯ国際標準品）を用いて作成したものと類似するようなアレルゲン濃度を決定することで行われる。
【０００９】
アレルギー性疾患の診断に現下使用されている免疫測定法には、放射性アレルゲン吸着法（ＲＡＳＴ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、及びＩｍｍｕｎｏＣＡＰなどがある。
【００１０】
ＲＡＳＴでは、固相のペーパーディスクにアレルゲン（または他の抗原）を共有結合させ、次いでそのペーパーディスクを、アレルギー状態について試験する患者由来の血清とともにインキュベートする。上記共有結合したアレルゲンに対する抗体がその血清に含まれていれば、それら抗体はそのアレルゲンと反応し、その抗体結合は放射標識された抗ＩｇＥ抗体によって可視化される。ＲＡＳＴの原型では、試験結果は、異種抗シラカバ花粉ＩｇＥ標準曲線への内挿で求められ、クラスまたは任意の単位を用いて表される。標準曲線は、ペーパーディスクに結合したシラカバアレルゲンを、既知の反応度を有する血清試料とともにインキュベートし、既知のＩｇＥ濃度に対して得られたシグナルをプロットして得る。ＷＨＯ／ＮＩＢＳＣ（世界保健機構／英国立生物学的製剤研究所）国際標準品ＩｇＥは、上記のように、このシラカバアレルゲンを用いた標準系における校正によく使用される。
【００１１】
同様に、ＥＬＩＳＡではアレルゲン（または他の抗原）は固相（典型的にはプラスチックのマルチウェルプレート）に吸着され、試験対象の患者由来血清とともにインキュベートされる。血清試料に含まれるＩｇＥと上記吸着されたアレルゲンとの結合は、上記吸着されたアレルゲンに結合したＩｇＥと酵素結合抗ＩｇＥ抗体をともにインキュベートし、次いで当該酵素に適した基質を加えることで可視化される。その基質の触媒作用によってプレート上で色の変化が起きる。発色の強さを測定しそれを標準曲線に内挿することで、血清中のＩｇＥの定量が可能となる。標準曲線は、ＥＬＩＳＡ用ウェルを捕捉用抗ＩｇＥ抗体でコーティングし、当該抗体をまずＷＨＯ／ＮＩＢＳＣ国際標準品ＩｇＥスタンダード試料ともにインキュベートし、次いで酵素結合抗ＩｇＥ抗体及び適当な基質とともにインキュベートすることで得る。捕捉用抗ＩｇＥ抗体の濃度は標準用ウェル間で一定であり、標準品ＩｇＥ量を漸増して標準曲線を得る。
【００１２】
ＥＬＩＳＡの例として、９６ウェルのフラットプレートの底部に配置したペーパーディスクに吸着された単一濃度のアレルゲン、及び単一濃度の捕捉用抗ヒトＩｇＥでコーティングされたディスクからなる、ＡＬＬＥＲＧＯＰＨＡＲＭＡ社のＥＬＩＳＡ  ＲＶ−５キットがある。アレルゲンでコーティングされたディスクは患者の血清とインキュベートされ、一方で、捕捉用抗ＩｇＥ抗体でコーティングされたディスクはＷＨＯ／ＮＩＢＳＣ国際標準品由来のヒトＩｇＥとハイブリダイズされる。標準曲線は、捕捉用抗ＩｇＥでコーティングされたウェルから得られるシグナル強度を既知のＷＨＯ／ＮＩＢＳＣ  ＩｇＥ濃度に対してプロットすることで得る。ＨＹＣＯＲ社のアレルギー試験用全自動酵素免疫測定法（ＥＩＡ）も、同じ原理によるものである。
【００１３】
ＰＨＡＤＩＡ社によるＣＡＰ法（標準法（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ））、すなわちＩｍｍｕｎｏＣＡＰは、上記の方法と、固相の性質において本質的に異なる。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰでは、固相はＣＮＢｒ活性化セルロース誘導体であり、これは他の基質より高い結合能を持つ（Ｄａｖｉｄ  Ｗ．（２００６）、Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社出版）。対象となるアレルゲンは、カプセル内に収められた親水性担体ポリマーと共有結合される。この担体は、高いタンパク質結合能を持つセルロース誘導体からなる。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰは患者血清中の特定のＩｇＥと反応でき、未結合のＩｇＥを洗浄で除いた後、酵素標識抗ＩｇＥ抗体を添加すると複合体が形成される。その複合体が蛍光基質とともにインキュベートされる。ＥＬＩＳＡの場合と同様に、その発色強度を校正のための血清総異種ＩｇＥ用量反応曲線に内挿し、血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥの量的指標が得られる。この測定はＩｇＥのＷＨＯ標準品に照らして校正を行うもので、２セットの標準物質、すなわち０．３５〜１００ｋＵＡ／ｌ（特定のＩｇＥ抗体及び低濃度範囲の総ＩｇＥ用）及び２０００ｋＵＡ／ｌ（広範囲の総ＩｇＥ用）を含む。抗ＩｇＥは、用量反応曲線の初期傾斜を同じくしつつ広範囲の測定を可能にするように設計されている。全ての固相化アレルゲンは各々、その測定範囲に対して最大用量内、最大反応内、及び低バックグラウンドノイズとなるよう最適化される。
【００１４】
ＰＨＡＤＩＡ社製ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ  ＩＳＡＣキットは、マイクロアレイによるアレルギー診断試験である。これは昨今のバイオチップ技術に基づいている。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ  ＩＳＡＣは小型の免疫測定プラットフォームであり、多様なアレルゲン成分に対する特異的ＩｇＥ抗体を多重測定できる。精製された天然または組換えアレルゲン（４０の一般的なアレルゲンソース）成分は、固相担体（バイオチップ）上に固定される。この試験は２ステップアッセイである。まず、患者血清由来のＩｇＥ抗体が、固定されたアレルゲン成分に結合する。次に、短時間の洗浄を経て、アレルゲンに結合したＩｇＥ抗体が蛍光標識抗ＩｇＥ抗体によって検出される。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ  ＩＳＡＣは半定量分析であり、結果はＩＳＡＣ標準化単位（ＩＳＡＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｕｎｉｔｓ、ＩＳＵ）で表される。
【００１５】
Ｄｅｉｎｈｏｆｅｒら（２００４）  Ｍｅｔｈｏｄｓ：３２：２４９−２５４には、マイクロアレイ技術をマルチアレルゲン試験システムに適用することが記載されている。
【００１６】
ＥＰ  １  ３２２  ９６０  Ｂ１には、マイクロアレイを用いたアレルゲン試験システム記載されている。
【００１７】
本明細書に記載される先に発行された文献またはその議論は、必ずしもその文献が技術水準または技術常識であると認めるものではないと解釈されるべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は上記の免疫測定法における課題を解決しようとするものである。本発明は、試験試料中のＩｇＥの定量のためのより正確な免疫測定法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の第一の側面によると、試験試料中の複数の抗原特異的免疫グロブリンを定量する方法であって、
（i）既知の抗原反応度を持ち、前記試験試料中の免疫グロブリンと同じサブタイプである免疫グロブリンを含む一連の試料、例えば一連の血清試料と、第一の固相担体上に固定された複数の組換えもしくは精製抗原成分またはそのフラグメントとの結合を測定（ａｓｓａｙ）する工程、
（ii）工程（i）で測定した結合度（（量的）レベル、ｌｅｖｅｌ）と前記既知の抗原反応度とを比較し、前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれの用量反応曲線を作成する工程、
（iii）総免疫グロブリン量が既知の、工程（i）で使用された前記免疫グロブリンと同じサブタイプの標準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）免疫グロブリン試料の段階希釈液と、前記第一の固相担体または第二の固相担体上に固定された複数の抗免疫グロブリン抗体、そのフラグメントまたはその誘導体の段階希釈液との結合を測定する工程と、
（iv）工程（iii）で測定した結合度と、前記既知の総標準免疫グロブリン量とを比較し、前記抗免疫グロブリン抗体、そのフラグメントまたはその誘導体の段階希釈液それぞれの結合能曲線を作成する工程、
（v）工程（ii）で作成した前記用量反応曲線と工程（iv）で作成した前記結合能曲線とを対照し、前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれについて前記用量反応曲線と最も近似する結合能曲線を同定し、それに基づき結合能曲線を前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれに割り当てる工程、
（vi）前記試験試料中の前記抗原特異的免疫グロブリンと、前記第一の固相担体、前記第二の固相担体または第三の固相担体上に固定された前記組換えもしくは精製抗原成分またはそのフラグメントとの結合を測定する工程、及び
（vii）前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれについて、工程（vi）で測定した結合度と工程（v）の前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれに割り当てられた前記結合能曲線とを比較し、前記試験試料中の前記抗原特異的免疫グロブリンを定量する工程
を含む方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
既知の免疫グロブリン反応度を持つ試料は、特定の抗原に対する免疫グロブリンの反応度が既知である試料であれば任意である。好ましくは、試料は既知のＩｇＥ反応度を持つ。試料の反応度は、本発明の方法に当該試料を使用する前に適当な免疫測定法によって決定される。当業者にはその方法はよく知られるものである。適当な免疫測定法は、例えばＥＬＩＳＡ等の上述の方法が挙げられる。好ましくは、試料は血清試料、例えばヒト血清試料である。この反応度は、ミリリットル当たりの国際単位（ＩＵ／ｍｌ）で表されてよい。用量反応曲線は例えば、免疫測定で得られた蛍光色素分子のシグナル強度を、国際単位（ＩＵ／ｍｌ）で表されるＩｇＥ反応度に対しプロットして作成する。
【００２１】
工程（i）で使用される一連の試料は、複数試料のパネル（ａ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｓａｍｐｌｅｓ）を含む。各試料は、一以上の固定された抗原またはほかの抗原と反応できる。この工程は、異なる試料間の相異なる性質、つまり同じ抗原に対し相異なるレベルの反応度を持つことが出来る点を利用しており、各抗原への結合度の違いが広範囲に亘るようにしている。例えば、試料１は抗原Ａに対し反応度ｘを持ち、試料２は抗原Ａに対し反応度ｙを持ち、試料３は抗原Ａに対し反応度ｚを持ってよい。これら試料１〜３の抗原Ａに対する反応度をそれぞれ曲線にプロットすると、用量反応曲線が得られる。従って、同じ抗原及び異なる抗原に対し相異なる反応度を持つこれら複数の試料は、本発明の方法において工程（i）の後の工程で使用される固定された抗原それぞれの用量反応曲線を作成するのに使用される。
【００２２】
既知の反応度を持つ試料、及び／または試験試料は、罹患体（ｐａｔｉｅｎｔ）、例えばヒトから得ることを想定しており、血清試料、全血試料、血漿試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、骨髄試料、肺吸引試料、尿試料、糞便試料、唾液試料、痰試料、組織試料、または免疫グロブリンを含むと考えられるその他の任意の試料であってよく、好ましくは、既知のＩｇＥ反応度を持つ血清試料である。
【００２３】
上記標準免疫グロブリン試料は、試験試料から検出したい免疫グロブリンのクラスに応じた適切なクラスの免疫グロブリンを含む。例えば、免疫測定法によって試験試料中のＩｇＥを検出する場合、標準免疫グロブリン試料は既知総量のＩｇＥを含む（ｔｏｔａｌ  ＩｇＥが既知である）ことになる。標準免疫グロブリン試料は、免疫グロブリン総濃度が既知の免疫グロブリン試料であれば任意である。例えば免疫グロブリンがＩｇＥの場合、標準ＩｇＥ試料はＷＨＯ／ＮＩＢＳＣ国際標準品であってよい。総ＩｇＥ（ｔｏｔａｌ  ＩｇＥ）は、国際単位（ＩＵ）／ｍｌで表されてよい。
【００２４】
免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／またはＩｇＭ、または本発明の方法に使用可能なその他のサブクラスの免疫グロブリンであってもよい。適切な抗免疫グロブリン抗体を用いれば、上記異なるクラスの免疫グロブリンそれぞれについて、特定の抗原への結合能を示す結合能曲線が得られる。つまり、検出対象の免疫グロブリンのサブクラスがＩｇＡである場合、標準免疫グロブリン試料と既知の反応度を持つ免疫グロブリン試料は適切なＩｇＡを含み、抗免疫グロブリン抗体は抗ＩｇＡである。
【００２５】
前記第一の側面の工程（iii）で使用される、第一の固相担体または別の固相担体上に固定された抗免疫グロブリン抗体のクラスは、検出対象である試験試料中の抗体のクラスに対応している。例えば、試験試料中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体が検出対象である場合、血清試料は既知の反応度を有するＩｇＥを含み、標準試料は既知量の総ＩｇＥ（ｔｏｔａｌ  ＩｇＥ）を含むことになる。従って、抗免疫グロブリン抗体は抗ＩｇＥ抗体ということになる。抗免疫グロブリン抗体の抗体サブクラスは、通常ＩｇＧである。従って、抗免疫グロブリン抗体は抗ＩｇＥ、ＩｇＧ抗体であることが想定される。
【００２６】
本願において、用語「抗原」には、免疫グロブリンによって特異的に認識されるエピトープを含む任意の物質も含まれる。従って、抗原は天然抽出物由来であってよく、組換えタンパク質でも、天然抽出物またはその他の由来から精製されたタンパク質またはその他分子（例えば多糖類など）でもよい。抗原は、好ましくはアレルゲン、すなわち個体に接触した際その個体にアレルギー反応を起こし得ると認識されている抗原である。抗原は、特性の明らかにされたアレルゲンであっても、まだ特性の明らかにされていないアレルゲンであってもよい。また、抗原はＩｇＥ分子に特異的に認識される任意の化合物でよい。
【００２７】
前述の固相担体上に含まれてよいアレルゲン成分として、例えば、チリダニの１種であるコナヒョウダニの主要アレルゲン分子Ｄｅｒ  ｐ１及びＤｅｒ  ｐ２、シラカバ花粉の主要アレルゲン分子Ｂｅｔ  ｖ１及びＢｅｔ  ｖ２、並びにオオアワガエリ花粉の主要アレルゲン分子Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ５、Ｐｈｌ  ｐ２及びＰｈｌ  ｐ６等が挙げられる。
【００２８】
前記第一の側面の工程（ii）では、固相担体上に含まれる抗原それぞれについて用量反応曲線を作成する。固相担体上の抗原の濃度は、適切な反応が得られるように最適化されてよい。抗原（例えばアレルゲン）の最適化は、最適な緩衝液を用いたタンパク質濃度の最適化でよい。抗原濃度の最適化と最適な緩衝液の選択は、本発明の方法を実施する前に予め行われる。各抗原について最適タンパク質濃度と当該タンパク質を希釈する最適緩衝液とを決定して、その抗原に対する既知の反応度を持つ試料と比較したとき反応度について最も近似するように、抗原最適化が行われる。固相担体上に固定される抗原を溶解し抗原濃度を最適化するのに適した緩衝液の例として、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、０．１ｇ／ｌのＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、及び／または１０％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などが挙げられる。
【００２９】
前記第一の側面の工程（i）〜（iv）が終わると、当業者は、固定された抗原それぞれの用量反応曲線、及び第一のまたはその他の固相担体上に存在する抗免疫グロブリン抗体の各濃度における結合能曲線を得ていることになる。つまり、２つのグラフが作成されている。１つ目は、各抗原への結合度と試料中の抗原特異的免疫グロブリンの既知の反応度との関係を表すもの（図１のＩｇＥ含有試料の曲線例を参照）であり、二つ目は、抗免疫グロブリン抗体の希釈液それぞれへの結合度と標準試料中に存在する総免疫グロブリン濃度の増加との関係を表すもの（図２ＡのＩｇＥ含有試料の曲線例を参照）である。
【００３０】
前記第一の側面の工程（v）では、これら２種のグラフを対照し、各抗原の曲線に近似する各抗免疫グロブリン抗体濃度の曲線を決定する。この対照は目視で行ってもよいし、その他の手段、例えばコンピュータソフトウェアを使用して行ってもよい。
【００３１】
ある抗原試料がある抗免疫グロブリン抗体濃度と適合すれば、その免疫グロブリン濃度がその抗原に割り当てられ、のちに、その特定の抗原の結合能をより正確に示す、その抗原に係る標準曲線または校正曲線として使用される。従って、抗原に新たに割り当てられた結合能校正曲線を使用することで、その抗原に特異的な抗体の試験試料中の濃度がより正確に得られる。
【００３２】
本発明者らは、複数の抗原、特に複数のアレルゲンを免疫測定する際の校正にただ１つの標準曲線を使用するという当技術分野の標準的手法は、相異なる複数の抗原が示す相異なる結合能を描写するには適していないことを明らかにした。本発明者らは、既知のＩｇＥ反応度を持つ複数の血清試料の免疫測定を行う際、相異なる複数のアレルゲン抽出物とインキュベートして、各アレルゲンについて得られたデータから相異なる複数の用量反応曲線が得られることを発見した。これは、図１で例示するとおりである。例えばアレルゲン試験において、これまでのアレルゲン免疫測定法で使用されてきた校正システムは、複数のアレルゲンの多重測定において血清試料のＩｇＥ反応度に関する正確な定量的情報を得るには適していなかった。
【００３３】
本発明者らは、現行の免疫測定法の問題点に対処できる校正システムを提供し、より正確な定量的免疫測定法を提供することを目的とした。標準曲線を各抗原の結合能に基づいてそれぞれ各抗原に割り当てる本発明の工程は、試験試料中の特定の免疫グロブリンのより正確な定量を可能にする。アレルゲン試験等において、本発明は、これまでの方法に比べ用量反応の挙動をより正確に表すことが可能である。
【００３４】
上記結合能曲線を、免疫測定分析装置を制御するソフトウェアに今後のスタンダード（ｓｔａｎｄａｒｄ）として使用するためにロードしてよい。各定量に対する内部制御は、各定量におけるマイナーな環境由来変動を補うために使用できる。また一方で、新たな一群のアレルゲンを固相担体上に載置するための調製にあたって、本願で説明されるように、定量の正確性を確保するため結合能曲線を適切に調整、または新たな結合能曲線を作成してよい。このような精度調整作業は、当業者であればよく理解しているものである。
【００３５】
前記第一の側面の工程（vi）及び工程（vii）によって、その前の工程で作成された結合能曲線を利用して、試験試料中の抗原特異的免疫グロブリンを定量する。本発明の第一の側面において記載される固定された成分は全て、本発明の方法を実施するために使用される測定装置の要求に応じて、同じ固相担体上または異なる複数の固相担体上に固定されることが想定される。従って、抗原、捕捉用免疫グロブリン、ポジティブコントロール及びネガティブコントロール等の適切な固定された成分全てが、同じ固相担体、例えばチップ上に固定されてもよい。とはいうものの、クロスコンタミネーションを避けるために、各試料はそれぞれ異なる固相担体とともにインキュベートされることが想定される。従って、各測定（アッセイ）では複数の固相担体、例えばチップが使用されることになる。例えば、５０の血清試料を固相担体上でインキュベートする場合、固定された適切な抗体／免疫グロブリン／コントロールを含む５０個のそれぞれ独立した固相担体が使用されてよい。同様に、各標準試料も、クロスコンタミネーションを避けるためにそれぞれ異なる固相担体上でインキュベートされてよい。試料のインキュベーションの正確な手順は、当業者であれば理解するように、使用する測定装置に依存する。
【００３６】
好ましい態様では、標準免疫グロブリン試料（例えばＷＨＯ国際標準品ＩｇＥ）が、最終免疫グロブリン濃度範囲が０．１〜１００  ＩＵ／ｍｌとなるよう使用される。好ましくは、固相担体上に固定される抗免疫グロブリン抗体（例えば抗ＩｇＥ抗体）は３０〜０．１μｇ／ｍｌの濃度範囲で使用される。
【００３７】
本願において、「免疫グロブリン」なる用語は「抗体」と同じ意味で用いられる。
【００３８】
前記第一の側面は更に、工程（iv）で作成された複数の結合能曲線を、異なる結合能のレベル、例えば超高結合能、高結合能、中結合能及び低結合能を表す典型的な結合能曲線にグループ化して集約し、工程（v）の対照を、工程（iv）で作成された複数の結合能曲線に代えて工程（iv）で作成された前記典型的な結合能曲線と、工程（ii）で作成された複数の用量反応曲線との間で行う工程を含んでよい。
【００３９】
上記更なる工程で少数の集約結合能曲線を作成することで、データ管理の簡単化が可能となり、従って校正の簡単化が可能となる。図２Ｂで例示されるようなこれら結合能曲線は、将来の試料分析のために免疫測定装置のソフトウェアに記憶されてよい。
【００４０】
「抗免疫グロブリン抗体、そのフラグメントまたはその誘導体」との表現は、当該抗体には、抗体またはその抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ分子（Ｆａｂ−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、Ｆｖ分子（Ｆｖ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ＶHとＶLのパートナードメインとが屈曲性（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）オリゴペプチドを介してリンクしている一本鎖Ｆｖ分子（ＳｃＦｖ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、または単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）なども含まれるという意味で用いられる。加えて、上述したような選択的結合特性を有する任意のリガンドも含まれる。
【００４１】
本発明の第二の側面によると、本発明は、複数の抗原特異的免疫グロブリンと複数の抗原またはそのフラグメントとの結合を定量するのに適した装置の校正を行う方法であって、
（i）既知の抗原反応度を持つ免疫グロブリンを含む一連の試料、例えば一連の血清試料と、第一の固相担体上に固定された複数の組換えもしくは精製抗原成分またはそのフラグメントとの結合を測定する工程、
（ii）工程（i）で測定した結合度と前記既知の反応度とを比較し、前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれについて用量反応曲線を作成する工程、
（iii）総免疫グロブリン量が既知の、工程（i）で使用された前記免疫グロブリンと同じサブタイプの標準免疫グロブリン試料の段階希釈液と、前記第一の固相担体または第二の固相担体上に固定された複数の抗免疫グロブリン抗体、そのフラグメントまたはその誘導体の段階希釈液との結合を測定する工程、
（iv）工程（iii）で測定した結合度と前記既知の総標準免疫グロブリン量とを比較し、前記抗免疫グロブリン抗体、そのフラグメントまたはその誘導体の段階希釈液それぞれについて結合能曲線を作成する工程、
（v）工程（ii）で作成した前記用量反応曲線と、工程（iv）で作成した前記結合能曲線とを対照し、前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれについて前記用量反応曲線と最も近似する結合能曲線を同定し、それに基づき結合能曲線を前記抗原成分またはそのフラグメントそれぞれに割り当てる工程、及び
（vi）工程（v）で得た結合能曲線を前記装置に入力し、前記各抗原の結合能曲線に、前記抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを未知量含む試料から得られたシグナルを内挿できるようにする工程
を含む方法を提供する。
【００４２】
前記第二の側面は更に、工程（iv）で作成された結合能曲線を異なる結合能、例えば超高結合能、高結合能、中結合能、低結合能を示す典型的な結合能曲線に集団化して集約し、工程（v）の対照を、工程（iv）で作成された結合能曲線に代えて前記典型的な結合能曲線と、工程（ii）で作成された用量反応曲線との間で行う工程を含んでよい。
【００４３】
装置を前記第二の側面の方法で校正すれば、試験試料中の抗原特異的免疫グロブリンの測定（アッセイ）と定量に利用することが出来る。
【００４４】
例えば、抗体に結合した抗原の可視化のため適切に処理されたマイクロアレイスライド（固相担体）は、ＡＤＡＭ装置（Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  Ｌｔｄ．）を用いて読み取ることが出来る。未加工データが収集され、用量反応曲線の算出に使用される。この装置のアウトプットは、マイクロアレイの全てのドットを列挙したテキストファイルである。それらドットは、マイクロアレイ上の座標、及びマイクロアレイ上のドットから放出された光子数である数値を用いて表現されている。Ｍａｔｌａｂのような数値計算環境を用い、読み取り機から得られたデータ全てを計算し用量反応曲線を描くための要素一セットを作成する。ＡＤＡＭ装置はこれら要素を用いて、内部マスター校正曲線（ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｃｕｒｖｅ）を作成し、構成ファイルに内挿する。
【００４５】
前記第一及び第二の側面の好ましい実施形態では、抗原はアレルゲンであり、免疫グロブリンはＩｇＥであり、抗免疫グロブリン抗体は抗ＩｇＥ抗体である。従ってこのような実施形態においては、本発明の方法を、患者の持つある特定のアレルゲンに対するアレルギーを検出する際、固相担体上に固定されたアレルゲン成分またはそのフラグメントに対するＩｇＥ反応度について患者由来の試料を測定することで実施できる。このような情報は特定のアレルゲンに対するアレルギーの診断の助けになると考えられる。
【００４６】
固相担体上に固定されてよいアレルゲンは、例えば表１に挙げたアレルゲン等でよい。
【００４７】
表１：アレルゲンのリスト
【表１】
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【００４８】
第三の側面では、本発明は、固相担体上に固定された複数の抗ＩｇＥ抗体、そのフラグメント、またはその誘導体の段階希釈液を含むマルチアレルゲン試験システムを提供する。このようなマルチアレルゲン試験システムは、先に述べてきた本発明の側面における方法で使用することが出来る。
【００４９】
前記第三の側面の実施形態では、前記試験システムは更に、前記固相担体または第二の固相担体上に固定された複数の組換えもしくは精製アレルゲン成分またはそのフラグメントを含んでよい。
【００５０】
第四の側面では、本発明は、前記第三の側面によるマルチアレルゲン試験システム、及び
i）標準ＩｇＥ試料、
ii）当該ＩｇＥを結合する第一の抗体を含む第一の抗体調製物、
iii）前記第一の抗体を特異的に結合する第二の抗体を含む第二の抗体調製物、及び
iv）前記第二の抗体を特異的に結合する第三の抗体を含む第三の抗体調製物
の一以上を含むパーツのキットであって、前記第二の抗体または前記第三の抗体のどちらか一方は検出可能マーカーと結合している、キットを提供する。
【００５１】
前記第四の側面の実施形態では、前記検出可能マーカーは、当業者であれば分かるように、酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリ性フォスファターゼでよい。ＨＲＰの適切な基質は、発色性基質（例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３‘−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）及び２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ））、及び化学発光基質（例えばＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌａ及びＥＣＬ）などが挙げられる。特に好ましい基質は、Ａｌｅｘａ５５５フルオロフォア標識チラミドである。
【００５２】
前記第四の側面における他の実施形態では、前記検出可能マーカーは、化学発光部分（ｍｏｉｅｔｙ）（例えばアクリジニウムエステル化合物）、放射性部分（ｍｏｉｅｔｙ）（例えば32Ｐ）、または蛍光部分（ｍｏｉｅｔｙ）（例えばフルオロセイン（ＦＩＴＣ））であってよい。当業者には、そのほかの適切な検出可能標識、並びにそれらの検出方法及びそれらの抗体への結合方法も、よく知られている。
【００５３】
本発明のいずれの側面における実施形態でも、固相担体はマイクロアレイチップであってよい。適切なマイクロアレイチップは次のように構築されてよい。まず、タンパク質溶液（すなわち抗原）を、タンパク質保存液を最適な緩衝液（予め選択されている、先の記載参照）で最適な濃度まで希釈して調製する。当業者であれば理解するように、それぞれの抗原の最終濃度は互いに異なってよい。次いで、タンパク質溶液を３８４ウェルプレートに充填する。そしてこのプレート及び固相担体をプリンタ、例えば非接触ピエゾ式プリンタ内に設置する。このプリンタでウェルから上記溶液を吸い出すための複数のノズルを操作し、その後それらウェルからの溶液が液滴で上記固相基板（すなわちマイクロアレイ）に分注される。各溶液が分注された後は前記ノズルが洗浄され、次の溶液処理への準備を整える。このプリンタは、ストロボスコープと呼ばれるカメラを備えている。このカメラは、分注されている液滴の写真を撮ることで溶液が正確に分注されているかを監視するものである。もし溶液が正確に分注されていなければ、ストロボスコープはその旨を報知する。マイクロアレイの作製にあたっては、任意の適切な光学担体を使用してよい。一般的には、ガラス担体またはその類似物が適切である。そのような担体は、多くの種類が当業者に知られている。
【００５４】
本発明の実施形態を、以下の図を参照し例を挙げて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、アレルゲン用量反応曲線を複数図示したものである。
【図２Ａ】図２Ａは、結合能曲線を複数図示したものである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明に係る統合した結合能曲線を図示したものである。
【００５６】
例１：結合能校正システムを利用した免疫測定法
マイクロアレイをプラットフォームとして使用した免疫測定法を用いた、血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥの正確な定量に適した校正システムについて記載する。ここに記載する免疫測定法は、おおよそ１００種含むアレルギーパネルに対応するおおよそ１００種の相異なるアレルゲン性抽出物を含む。
【００５７】
ここに記載する校正システムは、１００種全てのアレルゲン性抽出物の用量反応の挙動を高い信頼度で表すことができる。各アレルゲン性抽出物は、互いに異なるＩｇＥ結合能を持つ、すなわち用量反応の傾きが異なる固有の化合物である。本発明の校正システムはこれら相異なる結合能を考慮に入れ、試料に含まれるアレルゲン特異的ＩｇＥ量を正確に定量するものである。
【００５８】
マイクロチップの例
ここに記載するシステムは、最大約１０３種のアレルゲンを測定するよう設計された小型化免疫測定法による、マイクロアレイを使用した試験である。これらアレルゲン性抽出物は化学的に活性化されたガラススライド上に固定され、複数のアレイが作成される。天然アレルゲン性抽出物はそれぞれ、最適な緩衝液（予め選ばれたもの）中に最適なタンパク質濃度で含まれ、マイクロアレイ上に配置される。加えて、このマイクロアレイは、ポジティブコントロール（例えばヤギ抗ネズミＩｇＧ）、ネガティブコントロール（例えばウシ血清アルブミンのような非特異的タンパク質）、及び捕捉用抗ヒトＩｇＥ（ヤギ抗ヒトポリクローナル抗体）の段階希釈液も複数含む。
【００５９】
抗原可視化プロトコルの例
以下は、血清試料または標準試料中のＩｇＥの結合を可視化するプロトコル（この測定は、起こりうる環境条件のばらつきを制御するよう同時に、また用いる試薬を適宜同じくして行われる）の例であり、ここに記載するマイクロアレイに使用されてよい。
【００６０】
個々のアレイはまずＩｇＥ試料（血清試料または標準試料）とともにインキュベートされ、次いで、ＩｇＥが血清試料または標準試料中に存在し且つスポット中のアレルゲンに結合した場合に当該ヒトＩｇＥに結合する、抗ヒト（または、測定試料に応じた他の適切な抗体）ＩｇＥモノクローナル抗体（例えばマウス抗ヒトＩｇＥ  ＩｇＧ）とともにインキュベートされる。そして、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体が上記アレイに加えられ、次にＡｌｅｘａ５５５フルオロフォア標識チラミドが加えられる。各抗体インキュベーション工程の間には、適切な洗浄が行われる。
【００６１】
ＨＲＰ酵素は、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）の存在下、チラミド−Ａｌｅｘａ５５５をＨＲＰ標的相互作用部位の周辺の求核残基と反応する高反応度で短寿命のチラミド−Ａｌｅｘａ５５５ラジカルに変換する。これにより、結合したＨＲＰ酵素量に比例した強度で、特定波長（５５５  ｎｍ）の蛍光が発せられる。
【００６２】
上述のポリクローナル抗体及びＨＲＰ−チラミド系（非線形シグナル増幅系）を使用することで、マイクロアレイ免疫測定試験の感度が著しく増加する。
【００６３】
上記プロトコルによって、各アレルゲンスポットの蛍光強度が血清試料の濃度とともにグラフ上にプロットされ、標準曲線へ内挿される曲線が得られ、ＩｇＥが定量される。
【００６４】
本発明の校正方法
ここに記載する校正方法について、本発明のマイクロアレイチップを使用する下記の工程による例を挙げる。
【００６５】
１．各アレルゲンの用量反応曲線を同定する。既知のＩｇＥ反応度を持つ複数の血清試料がマイクロアレイチップ上で試験に供される。アレルゲンから得られたシグナル強度が収集されアレルゲン用量反応曲線の作成に使用される。
【００６６】
２．一群の結合能曲線を作成する。複数のＷＨＯ／ＮＩＢＳＣ国際標準品ＩｇＥ（０．１〜１００国際単位／ｍｌ）段階希釈液がチップ上でインキュベートされる。ＩｇＥがスポットの捕捉用抗ヒトＩｇＥに結合され、生じたシグナルの強度が測定され一群の結合能曲線の作成に使用される。曲線はそれぞれ捕捉用抗ヒトＩｇＥの濃度の１つに対応しており、上記インキュベーションに使用されたＷＨＯ/ＮＩＢＳＣ  ＩｇＥ濃度を対応するシグナル強度に対してプロットしていくことで得られる。チップ上に存在する捕捉用抗ヒトＩｇＥのスポット数に応じた数の結合曲線が得られる（図２Ａ参照。図２Ａでは、各曲線はアレイ上のスポットの捕捉用抗ヒトＩｇＥの濃度の１つと対応しており、各曲線は、ＷＨＯ／ＮＩＢＳＣ  ＩｇＥの濃度を対応するシグナル強度に対してプロットしたものである）。
【００６７】
３．結合能曲線を集約する。結合能曲線を、異なる結合能（例えば、超高結合能、高結合能、中結合能及び低結合能など）を表すグループごとに分ける。そして回帰曲線を各グループについて作成し、測定装置のソフトウェアに保存する（図２Ｂ参照。図２Ｂには、各グループに集約された結合能曲線が示されている）。
【００６８】
４．アレルゲンに結合能曲線を割り当てる。上記１．に記載するアレルゲン用量反応曲線の傾きと形とに照らして、複数ある結合能曲線（マスターカーブ（合成曲線、Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｕｒｖｅｓ）から１つ決定され各アレルゲンに割り当てられる。
【００６９】
５．アレルゲン特異的ＩｇＥの定量。この校正方法を使用し、マイクロアレイチップ上のスポットの特定のアレルゲンからのシグナル強度を前記対応付けられた結合能曲線に内挿することで、未知の患者血清の抗原特異的ＩｇＥ濃度を定量する。アレルギー反応度は、国際単位／ｍｌ及び／またはクラス値（Ｃｌａｓｓ  Ｓｃｏｒｅ）で表される。
【００７０】
６．各チップの内部制御（アジャスター）を使用することで、本システムは、上記４．で記載されるように作成されたマスター曲線（合成曲線、Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｕｒｖｅｓ）を調整して、スライドの保存条件及び環境条件を考慮に入れた用量反応内部曲線を作成することができる。アジャスターのシグナルに基づいてマスター校正曲線（合成校正曲線、Ｍａｓｔｅｒ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｃｕｒｖｅ）を移動するアルゴリズムを実行することで内部校正を実行する。例えば、期待値が１０００ユニットのシグナルが９５０であった場合、アルゴリズムによってマスター校正曲線が５％移動される。
【００７１】
単一の校正曲線を使用する従来の典型的なアレルゲン免疫測定法と異なり、本発明の免疫測定システムは、各アレルゲンの結合能の違いを考慮に入れている。そのため、試料中のアレルゲン特異的ＩｇＥの定量のための測定の正確性が著しく向上する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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