(57)【要約】  本発明は、5'-リン酸モノエステル末端を含むオリゴヌクレオチドの製造に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特に：
- 超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン (DMP)、並びに
- スワーン試薬
から選択される少なくとも１つの酸化剤の、5'-リン酸モノエステル又は5'-チオリン酸モノエステル末端を含む修飾又は非修飾のオリゴヌクレオチド、特にオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成のための使用。
【請求項２】
- 5'-OH末端を含み、
- (ｎ＋１)個のヌクレオチドを有する
修飾又は非修飾のオリゴヌクレオチドの：
- 5'-リン酸モノエステル又は5'-チオリン酸モノエステル末端を含み、
- ｎ個のヌクレオチドを有する、
それぞれ修飾又は非修飾のオリゴヌクレオチドを得るための請求項１に記載の使用。
【請求項３】
合成が、固相合成である請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
以下の式(I)：
【化１】
2011517695.tif 000055
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、8-ヒドロキシ-アデニン、8-アミノ-グアニン、8-メトキシ-グアニン、8-ブロモ-グアニン、8-ブロモ-アデニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは：
-  水素、又は
- ヒドロキシル基、又は
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- -O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成し、
* R''及びRi''は独立して、ヒドロキシル(OH)又はメルカプト(SH)基を表す)
の化合物の合成のための請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
以下の式(II)：
【化２】
2011517695.tif 000056
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルを表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)
の化合物の合成のための請求項４に記載の使用。
【請求項６】
以下の式(III)：
【化３】
2011517695.tif 000057
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン又はシトシンを表す)
の化合物の合成のための請求項４又は５に記載の使用。
【請求項７】
以下の式(IV)：
【化４】
2011517695.tif 000058
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルを表す)
の化合物の合成のための請求項４又は５に記載の使用。
【請求項８】
以下の式(V')：
【化５】
2011517695.tif 000059
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルを表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)
の化合物の合成のための請求項４に記載の使用。
【請求項９】
以下の式(V)：
【化６】
2011517695.tif 000060
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)
の化合物の合成のための請求項４に記載の使用。
【請求項１０】
以下の式(VI)：
【化７】
2011517695.tif 000061
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは：
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- -O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成する)
の化合物の合成のための請求項４に記載の使用。
【請求項１１】
酸化剤がIBXである請求項１〜10のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
以下の式(I)：
【化８】
2011517695.tif 000062
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは：
- 水素、又は
- ヒドロキシル基、又は
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- -O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成し、
* R''及びRi''は独立して、ヒドロキシル又はチオール基を表す)
の化合物の製造方法であって：
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XI)：
【化９】
2011517695.tif 000063
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
* Rは：
- 水素、又は
- 特にアセチル(Ac)、tertブチルジメチルシリル(TBDMS)、トリイソプロピルシリルオキシメチル(TOM)基のようなシリルから選択される保護基で保護されたヒドロキシル基、
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- -O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)であって、アミン官能基が、特にフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基のようなカルバメート、トリフルオロアセトアミド(CO-CF3)及びフタルイミドのようなアミドから選択される保護基で保護されている基、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
(但し、R'が水素である最後の塩基の場合を除く)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成し、
* Ri''は独立して、酸素又は硫黄原子を表し、
【化１０】
2011517695.tif 000064
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化１１】
2011517695.tif 000065
から選択されるリンカーを表し、
【化１２】
2011517695.tif 000066
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(I)の化合物を得る
ステップを含む方法。
【請求項１３】
以下の式(II)：
【化１３】
2011517695.tif 000067
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルを表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)
の化合物の請求項12に記載の製造方法であって、
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XII)：
【化１４】
2011517695.tif 000068
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシルから選択される窒素含有塩基を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表し、
* R'は水素を表し、
【化１５】
2011517695.tif 000069
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化１６】
2011517695.tif 000070
から選択されるリンカーを表し、
【化１７】
2011517695.tif 000071
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(II)の化合物を得る
ステップを含む方法。
【請求項１４】
以下の式(III)：
【化１８】
2011517695.tif 000072
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン又はシトシンを表す)
の化合物を製造するための請求項12又は13に記載の方法であって、
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XIII)：
【化１９】
2011517695.tif 000073
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンから選択される窒素含有塩基を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
【化２０】
2011517695.tif 000074
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化２１】
2011517695.tif 000075
から選択されるリンカーを表し、
【化２２】
2011517695.tif 000076
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(III)の化合物を得る
ステップを含む方法。
【請求項１５】
以下の式(IV)：
【化２３】
2011517695.tif 000077
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルを表す)
の化合物を製造するための請求項12又は13に記載の方法であって、
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XIV)：
【化２４】
2011517695.tif 000078
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルから選択される窒素含有塩基を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
【化２５】
2011517695.tif 000079
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化２６】
2011517695.tif 000080
から選択されるリンカーを表し、
【化２７】
2011517695.tif 000081
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(IV)の化合物を得る
ステップを含む方法。
【請求項１６】
以下の式(V')：
【化２８】
2011517695.tif 000082
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルを表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)
の化合物を製造するための請求項12に記載の方法であって、
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XXI)：
【化２９】
2011517695.tif 000083
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0、B'i及びB'i+1は互いに独立して、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルから選択される窒素含有塩基を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
* Rは、特にアセチル(Ac)、tertブチルジメチルシリル(TBDMS)及びトリイソプロピルシリルオキシメチル(TOM)基のようなシリルから選択される保護基で保護されたヒドロキシル基を表し、
【化３０】
2011517695.tif 000084
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化３１】
2011517695.tif 000085
から選択されるリンカーを表し、
【化３２】
2011517695.tif 000086
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(V')の化合物を得る
ステップを含む方法。
【請求項１７】
以下の式(V)：
【化３３】
2011517695.tif 000087
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)
の化合物を製造するための請求項12に記載の方法であって、
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XV)：
【化３４】
2011517695.tif 000088
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表し、
【化３５】
2011517695.tif 000089
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化３６】
2011517695.tif 000090
から選択され、
【化３７】
2011517695.tif 000091
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(V)の化合物を得る
ステップを含む方法。
【請求項１８】
以下の式(VI)：
【化３８】
2011517695.tif 000092
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは：
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- -O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成する)
の化合物を製造するための請求項12に記載の方法であって、
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XVI)：
【化３９】
2011517695.tif 000093
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
* Rは：
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- -O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成するが、但し、R'が水素を表す最後の塩基の場合を除く、
* Ri''は独立して、ヒドロキシル又はチオール基を表し、
【化４０】
2011517695.tif 000094
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化４１】
2011517695.tif 000095
から選択され、
【化４２】
2011517695.tif 000096
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(VI)の化合物を得る
ステップを含む方法。
【請求項１９】
以下の式(XX)：
【化４３】
2011517695.tif 000097
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは：
- 水素、又は
- ヒドロキシル基、又は
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成し、
* Ri''は独立してヒドロキシル又はチオール基を表し、
* Raは、硫黄又は酸素原子を表し、
* Mは、蛍光プローブ、ペプチド、オリゴヌクレオチド又はインターカレート試薬を表す)
の化合物の製造方法であって、
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XI)：
【化４４】
2011517695.tif 000098
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
* Rは：
- 水素、又は
- ヒドロキシル基、又は
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- 酸素原子
を表し、
* R' は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成するが、但し、R'が水素を表す最後の塩基の場合を除く、
* Ri''は独立して、ヒドロキシル又はチオール基を表し、
【化４５】
2011517695.tif 000099
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化４６】
2011517695.tif 000100
から選択されるリンカーを表し、
【化４７】
2011517695.tif 000101
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、Raが硫黄原子である場合はM-GPの分子(Mは蛍光プローブ、ペプチド、オリゴヌクレオチド又はインターカレート試薬を表し、GPは、特に塩素、臭素、ヨウ素、トシレート、メシレート基から選択される脱離基を表す)と、又は
Raが酸素原子である場合は5'-ホスフェートの活性化の後にM-OH若しくはM-NH2の分子と反応させ、
塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(XX)の化合物を得る
ステップを含み、
M-GP、M-OH又はM-NH2の分子との反応、及び塩基性媒体中での反応は、連続的に、又は単独「ワンポット」ステップで行うことができる
方法。
【請求項２０】
酸化剤がIBXである請求項12〜19のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、5'-リン酸モノエステル又は5'-チオリン酸モノエステル末端を含むオリゴヌクレオチドの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
5'-リン酸末端を含むオリゴヌクレオチドは、とりわけ、酵素的連結又は核酸損傷修復機構の研究の関係における分子生物学において、及びCpGオリゴヌクレオチドを用いるワクチン調製若しくはsiRNAによる遺伝子発現の阻害のためのアジュバントとして治療において用いられる化合物である。
【０００３】
5'-リン酸オリゴヌクレオチドは、一般的に、以下の参考文献に記載されるホスホラミダイトのファミリーに属するリン酸化試薬により5'位にリン酸基を導入することによる化学合成により得られる(Solid phase 5'-phosphorylation of oligonucleotides, Connolly B.A., Tetrahedron Lett., 1987, 28, 463〜466; Chemical 5'-phosphorylation of oligonucleotides valuable in automated DNA synthesis, Uhlmann E., Engel J., Tetrahedron Lett., 1986, 27, 1023〜1026; A chemical 5'-phosphorylation of oligonucleotides that can be monitored by trityl cation release, Horn T., Urdea M.S., Tetrahedron Lett., 1986, 27, 4705〜4708; Synthesis and utility of a DNA phosphorylating agent based on 2-(triphenylsilyl)ethanol, Celebuski J. E., Chan C., J. Org. Chem., 1992, 57, 5535〜5538; A new approach for chemical phosphorylation of oligonucleotides at the 5'-terminus, Guzaev A., Salo H., Azhayev A, Lonnberg H., Tetrahedron, 1995, 51, 9375〜9384; A novel reagent for the chemical phosphorylation of oligonucleotides, Leuck M., Vagle K. E., Roach J. S., Wolter A., Tetrahedron Lett., 2004, 45, 321〜324; New reagent for the preparation of oligonucleotides involving a 5'-thiophosphate or a 5' phosphate group, Lartia R., Asseline U., Tetrahedron Lett., 2004, 45, 5949〜5952; An efficient reagent for the phosphorylation of deoxyribonucleotides, DNA oligonucleotides, and their thermolytic analogues, Ausin C., Grajkowski A., Cieslak J., Beaucage S. L., Org Lett., 2005, 7, 4201〜4204; A versatile reagent for the synthesis of 5'-phosphorylated, 5'-thiophosphorylated or 5'-phosphoramidate conjugated oligonucleotides, Meyer A., Bouillon C., Vidal S., Vasseur J.-J., Morvan F., Tetrahedron Lett., 2006, 47, 8867〜8871; Solid-phase synthesis of terminal oligonucleotide-phosphoramidate conjugates; Cooke L. A., Frauendorf C., Gilea M. A., Holmes S. C., Vyl J. S., Tetrahedron Lett., 2006, 47, 719〜722)。
【０００４】
しかし、これらの全ての異なるホスホラミダイト型の試薬は、この薬品のファミリーに固有の問題点、すなわち以下の問題点を有する：
・    時間がかかり冗長な製造プロセス、
・    試薬が市販されている場合に高価、
・    試薬を不活性雰囲気下で取り扱う必要性を生じる、水及び大気中の酸素のような酸化剤に対する高い感受性、
・    包装が開封されると特にそうである、試薬の短い貯蔵寿命、
・    特に少量を秤量する場合に取り扱いを困難にする、油の形態での存在。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明のある態様は、5'-リン酸モノエステル又は5'-チオリン酸モノエステル末端を含むオリゴヌクレオチドを、関連する問題点を有するホスホラミダイト型の試薬を用いることなく得ることを可能にする方法に関する。
本発明の別の態様は、5'-リン酸モノエステル又は5'-チオリン酸モノエステル末端を含むオリゴヌクレオチドの合成の単純な方法を提供する。
本発明のさらに別の態様は、5'位に蛍光プローブ、ペプチド、糖類、インターカレート試薬のような興味対象分子を含むオリゴヌクレオチドの合成の方法を提供することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、特に：
- 超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン (DMP)、並びに
- スワーン(Swern's)試薬
から選択される少なくとも１つの酸化剤の、5'-リン酸モノエステル又は5'-チオリン酸モノエステル末端を含む修飾又は非修飾のオリゴヌクレオチド、特にオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成のための使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
「超原子価ヨウ素誘導体」の表現により、８重項の規則により要求される原子価の殻において８個を超える電子をヨウ素原子が有するヨウ素化合物を意味する。超原子価ヨウ素誘導体は、ヨーダン(iodanes)とよばれる超原子価ヨウ素(III)誘導体、又はペルヨージナンとよばれる超原子価ヨウ素(V)誘導体であり得、第１級アルコールのアルデヒドへの酸化及び第２級アルコールのケトンへの酸化を可能にする。
【０００８】
多数の超原子価ヨウ素(III)誘導体が存在し、これらに限定されないが、例えば以下のようなものが存在する：PIFA (ビス(トリフルオロアセトキシ)ヨードベンゼン)、PIDA (ジアセトキシ)ヨードベンゼン)、Koser試薬：
【化１】
2011517695.tif 000002
IBA (ヨードシル安息香酸)誘導体：
【化２】
2011517695.tif 000003
(R= p-Ts又はMs)。
【０００９】
好ましい超原子価ヨウ素(V)誘導体の化合物は、これらに限定されないが、IBX：
【化３】
2011517695.tif 000004
及び
デス-マーチン(DMP)試薬：
【化４】
2011517695.tif 000005
である。
【００１０】
第１級アルコールをアルデヒドに酸化することを可能にするその他の酸化剤は、これに限定されないが、特に、スワーン試薬を用いることができる(Mancuso, A. J.; Huang, S. L.; Swern, D. J. Org. Chem., 1978, 43, 2480)。
【００１１】
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの短い配列(数十塩基)であり、これは、DNA (オリゴデオキシリボヌクレオチド)又はRNA (オリゴリボヌクレオチド)であり得る。
ヌクレオチドは、Ｎグリコシド結合により糖残基(DNAの場合に2-デオキシリボース、RNAの場合にリボース)に結合したプリン塩基又はピリミジン塩基の１つで形成される。
ヌクレオシドは、１つの単糖単位のC5炭素原子を、次のもののC3炭素原子に結合させるホスホジエステル結合により確実に鎖が形成される。
【００１２】
「修飾オリゴヌクレオチド」の表現により、ホスフェート基、塩基及び/又は糖が修飾された、すなわち、それらが天然の起源のものである場合と同じ構造を有さない、例えばβ-アノマー形の代わりにα-アノマー形の糖、又は化学置換が行われた塩基若しくは糖を有するオリゴヌクレオチドを意味するが、これらの例に限定されない。
【００１３】
好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される酸化剤と：
- 5'-OH末端を含み、
- (ｎ＋１)個のヌクレオチドを有する
修飾又は非修飾のオリゴヌクレオチドとの：
- 5'-リン酸モノエステル又は5'-チオリン酸モノエステル末端を含み、
- ｎ個のヌクレオチドを有する、
それぞれ修飾又は非修飾のオリゴヌクレオチドを得るための使用に関する。
【００１４】
反応は、模式的に以下のように表される：
【化５】
2011517695.tif 000006
GP1は、ホスフェートの保護基を表し、GP2は、アルコール官能基の保護基を表す。
【００１５】
よって、反応は、ヌクレオチドｎ＋１の5'アルコールをアルデヒドに酸化し、これが次いでβ脱離を受け、これが核酸塩基ｎ＋１の脱離を導いて、ｎ個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを得ることからなる。
【００１６】
別の実施形態によると、上記で規定される酸化剤と、5'-OH末端を含む修飾又は非修飾のオリゴヌクレオチドとの使用は、固相合成の関係において行われる。
「固相合成」との表現は、合成ポリマー、特に、しかしそれに限定されないが、「制御多孔性ガラス(controlled pore glass；CPG)」、すなわち制御されたサイズの孔を有するガラスマトリクス、又はポリスチレンビーズで構成される支持体上の固相で合成が行われることを意味する。
支持体は、ヌクレオチド１の3'位のアルコールに存在する(上記のGP2)。
【００１７】
酸化は、保護オリゴヌクレオチド(ODN)の固相合成の完了の際に起こる。得られるODNを、例えば、しかしそれに限定されないが、炭酸カリウム、又はメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン及び第３級アミンのような塩基を通常は用いる最初の穏やかな塩基処理に供してβ脱離を促進し、その後、濃縮水酸化アンモニウムで処理する。
【００１８】
好ましい実施形態によると、本発明は、上記で規定される酸化剤と、5'-OH末端を含む修飾又は非修飾オリゴヌクレオチドとの、以下の式(I)の化合物の合成を行うための使用を含む：
【化６】
2011517695.tif 000007
【００１９】
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、これらに限定されないが、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、8-ヒドロキシ-アデニン、8-アミノ-グアニン、8-メトキシ-グアニン、8-ブロモ-グアニン、8-ブロモ-アデニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは：
-  水素、又は
- ヒドロキシル基、又は
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- -O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成し、
* R''及びRi''は独立して、ヒドロキシル(OH)又はメルカプト(SH)基を表す)。
【００２０】
このように合成されるオリゴヌクレオチドは、5'-リン酸モノエステル又は5'-チオリン酸モノエステル末端を含む、DNA又はRNAの修飾若しくは非修飾オリゴヌクレオチドである。
【００２１】
さらにより好ましい実施形態によると、本発明は、上記で規定される酸化剤と、5'-OH末端を含む修飾又は非修飾オリゴヌクレオチドとの、以下の式(II)の化合物の合成を行うための使用を含む：
【化７】
2011517695.tif 000008
【００２２】
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルを表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)。
このように合成されるオリゴヌクレオチドは、5'-リン酸モノエステル末端を含むDNA又はRNAの非修飾オリゴヌクレオチドである。
【００２３】
さらにより好ましい実施形態によると、本発明は、上記で規定される酸化剤と、5'-OH末端を含む修飾又は非修飾オリゴヌクレオチドとの、以下の式(III)の化合物の合成を行うための使用を含む：
【化８】
2011517695.tif 000009
【００２４】
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン又はシトシンを表す)。
このように合成されるオリゴヌクレオチドは、5'-リン酸モノエステル末端を含むDNAの非修飾オリゴヌクレオチドである。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される酸化剤と、5'-OH末端を含む修飾又は非修飾オリゴヌクレオチドとの、以下の式(IV)の化合物の合成を行うための使用を含む：
【化９】
2011517695.tif 000010
【００２６】
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルを表す)。
このように合成されるオリゴヌクレオチドは、5'-リン酸モノエステル末端を含むRNAの非修飾オリゴヌクレオチドである。
【００２７】
さらにより好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される酸化剤と、5'-SH末端を含む非修飾オリゴヌクレオチドとの、以下の式(V')の化合物の合成を行うための使用を含む：
【化１０】
2011517695.tif 000011
【００２８】
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルを表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)。
このように合成されるオリゴヌクレオチドは、5'-チオリン酸モノエステル末端を含むDNA又はRNAの非修飾オリゴヌクレオチドである。
【００２９】
さらにより好ましい実施形態において、本発明は、上記で規定される酸化剤と、5'-OH末端を含む修飾又は非修飾オリゴヌクレオチドとの、以下の式(V)の化合物の合成を行うための使用を含む：
【化１１】
2011517695.tif 000012
【００３０】
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)。
このように合成されるオリゴヌクレオチドは、5'-チオリン酸モノエステル末端を含むDNA又はRNAの修飾オリゴヌクレオチド(ホスホロチオエート型)である。
【００３１】
別の実施形態によると、本発明は、上記で規定される酸化剤と、5'-OH末端を含む修飾又は非修飾オリゴヌクレオチドとの、以下の式(VI)の化合物の合成を行うための使用を含む：
【化１２】
2011517695.tif 000013
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは：
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- -O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成する)。
【００３２】
このように合成されるオリゴヌクレオチドは、5'-リン酸モノエステル末端を含む、RNAの修飾オリゴヌクレオチドである。
【００３３】
さらにより好ましい実施形態によると、上記で規定される5'-OH末端を含む修飾又は非修飾オリゴヌクレオチドの酸化のために用いられる酸化剤は、IBXである。
IBXは調製できるが、40% IBXと安息香酸とを含有する市販の安定化混合物を用いることもできる。
【００３４】
別の態様において、本発明は、以下の式(I)：
【化１３】
2011517695.tif 000014
【００３５】
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは：
- 水素、又は
- ヒドロキシル基、又は
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- -O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成し、
* R''及びRi''は独立して、ヒドロキシル又はチオール基を表す)
の化合物の製造方法であって：
【００３６】
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XI)：
【化１４】
2011517695.tif 000015
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
* Rは：
- 水素、又は
- 特にアセチル(Ac)、tertブチルジメチルシリル (TBDMS)、トリイソプロピルシリルオキシメチル(TOM)基のようなシリルから選択される保護基で保護されたヒドロキシル基、
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- -O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)であって、アミン官能基が、特にフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基のようなカルバメート、トリフルオロアセトアミド(CO-CF3)及びフタルイミドのようなアミドから選択される保護基で保護されている基、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
(但し、R' = Hのみであるβ脱離を受ける最後の塩基の場合を除く)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成し、
* Ri''は独立して、酸素又は硫黄原子を表し、
【００３７】
【化１５】
2011517695.tif 000016
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化１６】
2011517695.tif 000017
から選択されるリンカーを表し、
【化１７】
2011517695.tif 000018
は、特にCPG (異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有する制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(I)の化合物を得る
ステップを含む方法に関する。
【００３８】
プリン又はピリミジン塩基の保護基は当業者に公知であり、上記の基は、限定しない例として示される。
本明細書に示されるホスホジエステル結合の保護基(シアノ-エチル)は、例としてのみ示される。当業者に公知のこの結合のその他の保護基も用いることができる。
【００３９】
用語「リンカー」は、オリゴヌクレオチドが固体支持体に直接結合していないが、上記で規定されるようなスペーサーアームにより固体支持体から分けられていることを意味する。
リンカーは、一方でそのNH部分により支持体と結合し、他方でヌクレオチドの糖と結合する。
【００４０】
CPGは、均質なサイズの多数の孔を有するガラスマトリクスである。
「異なる多孔度の」との表現は、CPGガラスマトリクスが異なる孔サイズと、その結果として異なる多孔度とを有して得ることができることを意味する。孔のサイズは、合成できるオリゴヌクレオチドのサイズを決定する。
【００４１】
酸化反応は、DMSOのような溶媒中で、20℃〜60℃、好ましくは40℃の温度にて、15分〜４時間、好ましくは15分〜２時間、特に30分間の期間行われる。
【００４２】
塩基性媒体中での処理により、オリゴヌクレオチドをその支持体から脱保護し、まだ存在している保護基を切断することが可能になる。
これは、28%水酸化アンモニウム溶液中で、40℃〜60℃、好ましくは55℃の温度にて、14時間〜20時間、特に16時間の期間行われるのが好ましい。
【００４３】
好ましい実施形態において、上記で規定される製造方法は、以下の式(II)：
【化１８】
2011517695.tif 000019
【００４４】
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルを表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)
の化合物の製造を可能にし：
【００４５】
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XII)：
【化１９】
2011517695.tif 000020
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシルから選択される窒素含有塩基を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
* Rは、水素、又は特にアセチル(Ac)、tertブチルジメチルシリル(TBDMS)及びトリイソプロピルシリルオキシメチル(TOM)基のようなシリルから選択される保護基で保護されたヒドロキシル基を表し、
* R'は水素を表し、
【００４６】
【化２０】
2011517695.tif 000021
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化２１】
2011517695.tif 000022
から選択されるリンカーを表し、
【化２２】
2011517695.tif 000023
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(II)の化合物を得る
ステップを含む。
【００４７】
この実施形態において、5'-リン酸モノエステル末端を含む、DNA又はRNAの非修飾オリゴヌクレオチドが得られる。
リンカーは、一方でそのNH部分により支持体と結合し、他方でヌクレオチドの糖と結合する。
【００４８】
さらにより好ましい実施形態において、上記で規定される製造方法は、以下の式(III)：
【化２３】
2011517695.tif 000024
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン又はシトシンを表す)
の化合物の製造を可能にし：
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XIII)：
【化２４】
2011517695.tif 000025
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンから選択される窒素含有塩基を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
【００４９】
【化２５】
2011517695.tif 000026
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化２６】
2011517695.tif 000027
から選択されるリンカーを表し、
【化２７】
2011517695.tif 000028
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(III)の化合物を得る
ステップを含む。
【００５０】
この実施形態において、5'-リン酸モノエステル末端を含む、DNAの非修飾オリゴヌクレオチドが得られる。
【００５１】
別の実施形態によると、上記で規定される製造方法は、以下の式(IV)：
【化２８】
2011517695.tif 000029
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルを表す)
の化合物の製造を可能にし：
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XIV)：
【化２９】
2011517695.tif 000030
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルから選択される窒素含有塩基を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
【００５２】
【化３０】
2011517695.tif 000031
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化３１】
2011517695.tif 000032
から選択されるリンカーを表し、
【化３２】
2011517695.tif 000033
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(IV)の化合物を得る
ステップを含む。
この実施形態において、5'-リン酸モノエステル末端を含む、RNAの非修飾オリゴヌクレオチドが得られる。
【００５３】
別の実施形態によると、上記で規定される製造方法は、以下の式(V')：
【化３３】
2011517695.tif 000034
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルを表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)
の化合物の製造を可能にし：
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XXI)：
【化３４】
2011517695.tif 000035
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0、B'i及びB'i+1は互いに独立して、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルから選択される窒素含有塩基を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
【００５４】
* Rは、特にアセチル(Ac)、tertブチルジメチルシリル(TBDMS)及びトリイソプロピルシリルオキシメチル(TOM)基のようなシリルから選択される保護基で保護されたヒドロキシル基を表し、
【化３５】
2011517695.tif 000036
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化３６】
2011517695.tif 000037
から選択されるリンカーを表し、
【化３７】
2011517695.tif 000038
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(V')の化合物を得る
ステップを含む。
このように合成されるオリゴヌクレオチドは、5'-チオリン酸モノエステル末端を含む、DNA又はRNAの非修飾オリゴヌクレオチドである。
【００５５】
別のさらにより好ましい実施形態によると、上記で規定される製造方法は、以下の式(V)：
【化３８】
2011517695.tif 000039
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは、水素又はヒドロキシル基を表す)
の化合物の製造を可能にし：
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XV)：
【化３９】
2011517695.tif 000040
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
* Rは、水素、又は特にアセチル(Ac)、tertブチルジメチルシリル(TBDMS)及びトリイソプロピルシリルオキシメチル(TOM)基のようなシリルから選択される保護基で保護されたヒドロキシル基を表し、
【００５６】
【化４０】
2011517695.tif 000041
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化４１】
2011517695.tif 000042
から選択され、
【化４２】
2011517695.tif 000043
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(V)の化合物を得る
ステップを含む。
この実施形態において、5'-チオリン酸モノエステル末端を含む、DNA及びRNA (ホスホロチオエート型)の修飾オリゴヌクレオチドが得られる。
【００５７】
さらにより好ましい実施形態によると、上記で規定される製造方法は、以下の式(VI)：
【化４３】
2011517695.tif 000044
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは：
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- -O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成する)
の化合物の製造を可能にし：
【００５８】
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XVI)：
【化４４】
2011517695.tif 000045
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
【００５９】
* Rは：
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- アミン官能基が、特にフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基のようなカルバメート、トリフルオロアセトアミド(CO-CF3)及びフタルイミドのようなアミドから選択される保護基で保護されている-O-(CH2)m-NH2基(mは２〜10の整数を表す)、又は
- 酸素原子
を表し、
* R'は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成するが、但し、R'が水素のみを表すβ脱離を受ける最後の塩基の場合を除く、
* Ri''は独立して、ヒドロキシル又はチオール基を表し、
【化４５】
2011517695.tif 000046
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化４６】
2011517695.tif 000047
から選択され、
【００６０】
【化４７】
2011517695.tif 000048
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(VI)の化合物を得る
ステップを含む。
この実施形態において、5'-リン酸モノエステル末端を含む、RNAの修飾オリゴヌクレオチドが得られる。
【００６１】
別の態様によると、本発明は、以下の式(XX)：
【化４８】
2011517695.tif 000049
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎの整数であり、
* B0及びBiは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
* Rは：
- 水素、又は
- ヒドロキシル基、又は
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- 酸素原子
を表し、
* Ri''は独立してヒドロキシル又はチオール基を表し、
* Raは、硫黄又は酸素原子を表し、
* Mは、蛍光プローブ、ペプチド、オリゴヌクレオチド又はインターカレート試薬を表す)
の化合物の製造方法であって、
【００６２】
超原子価ヨウ素誘導体、特に2-ヨードキシ安息香酸(IBX)及びデス-マーチンペルヨージナン(DMP)、並びにスワーン試薬から選択される酸化剤を、以下の式(XI)：
【化４９】
2011517695.tif 000050
(式中：
* nは、１〜100、特に１〜50、特に５〜40の整数であり、
* iは、１〜ｎ＋１の整数であり、
* B'0及びB'iは互いに独立して、窒素含有塩基、特に：
- プリン誘導体、特にアデニン、グアニン、8-ヒドロキシグアニン、イノシン、又は
- ピリミジン誘導体、特にチミン、シトシン、ウラシル若しくは5-メチルシトシン、5-プロピニル-ウラシル、シュードウラシル、4-チオ-チミン、2-チオ-チミン、4-チオ-ウラシル、5-ハロゲノ-ウラシル、5-ハロゲノ-シトシン、5,6-ジヒドロ-チミン、5-ヒドロキシ-ウラシル、5-ヒドロキシ-シトシン、5,6-ジヒドロ-ウラシル、5-ヒドロキシメチル-ウラシル、5,6-ジヒドロキシ-チミン
を表し、
前記窒素含有塩基は、特にベンゾイル(Bz)、アセチル(Ac)、イソブチリル(iBu)、ジメチルホルムアミジン(dmf)、フェノキシアセチル(Pac)、4-イソプロピル-フェノキシアセチル(iPr-Pac)基から選択される少なくとも１つの保護基で保護され、
【００６３】
* Rは：
- 水素、又は
- アセチル(Ac)、tertブチルジメチルシリル(TBDMS)及びトリイソプロピルシリルオキシメチル(TOM)基のようなシリルから選択される保護基で保護されたヒドロキシル基、又は
- 直鎖状若しくは分岐鎖状で１〜４個の炭素原子を含む-O-アルキル基、又は
- 酸素原子
を表し、
* R' は：
- 水素、又は
- -(CH2)p-基(pは１〜４で変動する)
を表し、
Rが酸素原子を表す場合、R'は-(CH2)p-基を表し、R'が-(CH2)p-基を表す場合、Rは酸素原子を表し、R及びR'基は、橋かけされてエーテル環を形成するが、但し、R'が水素のみを表すβ脱離を受ける最後の塩基の場合を除く、
* Ri''は独立して、酸素又は硫黄原子を表し、
【化５０】
2011517695.tif 000051
は、特に：
- -CO-Z-CO-基(Zは、１〜２炭素原子を有するアルキル基を表す)、若しくは-CH2-O-Ph-O-CH2-基、
- -CO-CO-基、
- 以下の式(A)若しくは(B)の基：
【化５１】
2011517695.tif 000052
から選択されるリンカーを表し、
【００６４】
【化５２】
2011517695.tif 000053
は、特に、異なる多孔度の長鎖アミノアルキル(lcaa)を有するCPG (制御多孔性ガラス)、及びポリスチレンに由来する樹脂から選択される固体支持体を表す)
の化合物に対して反応させ、
その後、Raが硫黄原子である場合はM-GPの分子(Mは蛍光プローブ、ペプチド、オリゴヌクレオチド又はインターカレート試薬を表し、GPは、特に塩素、臭素、ヨウ素、トシレート、メシレート基から選択される脱離基を表す)と、又は
Raが酸素原子である場合は5'-ホスフェートの活性化の後にM-OH若しくはM-NH2の分子と反応させ、
塩基性媒体、特に水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、メチルアミン、炭酸カリウム又はこれらの塩基の混合物中で反応させて、式(XX)の化合物を得る
ステップを含み、
M-GP、M-OH又はM-NH2の分子との反応、及び塩基性媒体中での反応は、連続的に、又は単独「ワンポット」ステップで行うことができる
方法に関する。
【００６５】
「蛍光プローブ」により、これらに限定されないが、シアニン、フルオレセイン、テキサスレッドのような発光特性を有する分子を意味する。
「オリゴヌクレオチド」により、上記の方法又は当業者に公知でより長いオリゴヌクレオチドの合成を可能にする方法、特にフラグメントによる合流型(convergent)合成により合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。
「インターカレート試薬」により、これらに限定されないが、アクリジン、キナクリジンのようなDNAへの介在特性を有する多環芳香族型の分子を意味する。
【００６６】
上記のような塩基性媒体中での処理により、オリゴヌクレオチドをその支持体から脱保護し、まだ存在している保護基を切断することが可能になる。
好ましい実施形態によると、上記の方法で用いられる酸化剤は、IBXである。
【実施例】
【００６７】
実験部
1) 5'-リン酸又は5'-チオリン酸モノエステル結合を含むオリゴヌクレオチドの合成の全般的なダイアグラム
【化５３】
2011517695.tif 000054
【００６８】
ステップ１は、ホスホラミダイト経路によるオリゴヌクレオチド合成の完全なサイクルに相当し、トリクロロ酢酸又はジクロロ酢酸を用いる脱保護(脱トリチル化)と、その後の、ホスホラミダイトの形の次の塩基(n+1)とのカップリング、ヨウ素の水溶液によるリンIIIからリン(V)への酸化、アセチル化による「キャッピング」(反応させていない5'位のアルコールの保護)とからなる。
ステップ２は、超原子価ヨウ素誘導体を用いる酸化のステップに相当する。
ステップ３は、水酸化アンモニウムを用いる脱保護に相当する。
【００６９】
このダイアグラムは、R' = Hである分子を示す。
同じダイアグラムが、最後の塩基がR' = Hであることを条件として、R' = -(CH2)p-基(pは、１〜４で変動する)の場合にも有効である。
5'-ホスフェートの形成は、おそらく、IBX酸化により生じるアルデヒドからのα位の酸性プロトンの除去によるβ脱離機構による。
脱離が一旦行われると、分子M-PGを、単離されていない中間体に対して反応させて上記で規定される化合物を得ることが可能である。
【００７０】
2) 通常のオリゴヌクレオチド(DNA又はRNAのシリーズ)についてのプロトコル：
オリゴヌクレオチドは、標準的な固相合成経路(ホスホラミダイト経路)により調製する。合成が完了したら、オリゴヌクレオチドの3'末端を、完全に保護された形の固相支持体に結合させる。つまり、核酸塩基の環外のアミン基が、ベンゾイル(dA及びdCについて)又はイソブチリル(dGについて)又はその他の商業的な保護基の形で保護され、ヌクレオシド間ホスホジエステルがシアノエチルの形で、3'位のアルコールが支持体とのエステルの形で保護される。
RNAのシリーズにおいて、2'位のアルコール官能基は、TBDMS又はアセチル又はこの保護について記載されるその他の保護基の形で保護される。この支持体を、次いで、DMSO中のIBXの溶液(商業的な100 mM溶液)中に入れ、60℃にて16時間加熱する。このステップの目的は、5'位の第１級アルコール官能基をアルデヒドに酸化することである。
次いで、固体支持体を回収し、28%水酸化アンモニウム溶液中に入れ、55℃にて16時間加熱する。この処理は、オリゴヌクレオチドの通常の合成において一般的に行われ、オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、核酸塩基のアミン及びホスホジエステル結合を脱保護するステップに相当する。次いで、オリゴヌクレオチドを標準的な方法(高性能液体クロマトグラフィー又はゲル電気泳動)により精製する。
【００７１】
3) 修飾オリゴヌクレオチドについてのプロトコル：
合成プロトコルは、天然オリゴヌクレオチドについて以前に記載されたものと同じである。修飾は、構築者(constructeur)により記載されるプロトコルに従って組み込まれる。
例えば、ホスホロチオエート結合は、酸化ステップ中にBeaucage試薬を用いてホスホジエステル結合を置き換えることができ、2'位のOH官能基は、アルコキシの形であり得るか、又は4'位のメチレンを介して結合できる(LNA)。
【国際調査報告】
2011517695.tif 000102
2011517695.tif 000103