(57)【要約】  全身および／または細胞代理マーカーを用いた、特異的薬理シャペロンによるポンペ病の治療を監視する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性α−グルコシダーゼの特異的薬理シャペロンを有効量投与した後ポンペ病患者の治療的応答を監視するための方法であって、ポンペ病と関連する代理マーカーにおける改善が存在するか否かを判定するステップを含む方法。
【請求項２】
酸性α−グルコシダーゼの特異的薬理シャペロンを投与した後ポンペ病患者の治療を監視するための方法であって、ポンペ病と関連する代理マーカーにおける改善が存在するか否かを判定するステップを含み、改善が、その患者が応答者であることを標示する方法。
【請求項３】
代理マーカーが全身代理マーカーである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
マーカーが、リソソーム酸性α−グルコシダーゼ活性の減少；脂質を持ったマクロファージ（「ポンペマクロファージ」）の存在；カテプシンＢレベルの増加、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）レベルの増加、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）レベルの増加、インタロイキン−６（ＩＬ−６）レベルの増加、インタロイキン−８（ＩＬ−８）レベルの増加、インタロイキン−１７（ＩＬ−１７）レベルの増加、コラーゲンＩＶレベルの増加、カテプシンＤレベルの減少、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）レベルの減少、血小板由来成長因子ＡＡ／ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＢＢ）レベルの減少、インタロイキン−７（ＩＬ−７）レベルの減少、およびインタロイキン−１２ｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ｐ４０）レベルの減少からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
代理マーカーが亜細胞代理マーカーである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
亜細胞代理マーカーが、ポンペ患者由来の細胞内のα−グルコシダーゼのＥＲからリソソームまでの異常輸送；エンドソーム経路を通した細胞脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾル内の増加した量の誤った折り畳み構造のα−グルコシダーゼの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定される通りの）α−グルコシダーゼの毒性蓄積の結果としてもたらされるＥＲおよび／またはストレスの存在；異常なエンドソームｐＨレベル；単球上のＭＨＣＩＩおよび／またはＣＤ１ｄの原形質膜発現増加の存在；異常な細胞形態；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
特異的薬理シャペロンが酸性α−グルコシダーゼの阻害物質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
阻害物質が可逆的競合的阻害物質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
阻害物質が１−デオキシノジリマイシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
酸性α−グルコシダーゼに結合する有効量の特異的薬理シャペロンを患者に投与した後ポンペ病患者の治療を監視するための方法であって、患者由来の細胞の細胞質染色に対する効果を判定するステップを含み、健常な個体由来の細胞内の染色パターンに類似する細胞内の染色パターンの検出が、ポンペ病を患う個体が応答者であることを標示する、方法。
【請求項１１】
細胞質染色がリソソーム染色である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リソソーム染色がα−グルコシダーゼの存在の検出である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リソソーム染色がＬＡＭＰ−１発現の検出である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
細胞質染色がポリユビキチン化タンパク質の検出である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
特異的薬理シャペロンがα−グルコシダーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
阻害物質が可逆的競合的阻害物質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
阻害物質が１−デオキシノジリマイシンである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、内容が参照により本明細書に援用されている２００８年３月１２日出願のU.S. Provisional Application No. 61/035,869に対する優先権を請求するものである。
【０００２】
本発明は、α−グルコシダーゼ、カテプシン、成長因子およびサイトカインなどの特異的代理マーカーの存在およびレベルを判定することにより、ポンペ病を患う個体の特異的薬理シャペロンを用いた治療を監視するための方法を提供する。本発明は同様に、細胞レベルで治療の効果を評価することにより、ポンペ病を患う個体の特異的薬理シャペロンを用いた治療を監視する方法をも提供する。
【０００３】
ポンペ病は、およそ４０種あるリソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）の１つである遺伝性代謝性疾患である。ＬＳＤは、欠陥加水分解酵素に起因する細胞スフィンゴ糖脂質、グリコーゲンまたはムコ多糖体の蓄積によって引き起こされる一群の常染色体劣性疾患である。リソソーム障害の例としては、ゴーシェ病（非特許文献１）、ＧＭ１−ガングリオシドーシス（非特許文献２）、フコシドーシス（非特許文献３）、ムコ多糖症（非特許文献４）、ポンペ病（非特許文献５）、ハーラー・シャイエ病（非特許文献６）、ニーマン・ピック病Ａ型およびＢ型（非特許文献７）、およびファブリー病（非特許文献８）がある。
【０００４】
全体が参照により本明細書に援用されているＦａｎらに対する特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５にあるように、リソソーム貯蔵障害に関与する数多くの酵素について、特異的薬理シャペロン（「ＳＰＣ」）戦略が実証されてきた。例えば変異ファブリー酵素α−ガラクトシダーゼＡ（α−Ｇａｌ  Ａ；ＧＬＡ）の効能ある競合的阻害物質であるガラクトースの小分子誘導体１−デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）が、試験管内にて中性ｐＨでヒト変性α−Ｇａｌ  Ａ（Ｒ３０１Ｑ）の安定性を効果的に増大させ、それはＲ３０１ＱまたはＱ２７９Ｅの変異を有するファブリー患者から確立されたリンパ芽球内の変異酵素活性を増強させた。その上、変異（Ｒ３０１Ｑ）α−Ｇａｌ  Ａを過剰発現する遺伝子導入マウスに対してＤＧＪを経口投与すると、主要な臓器内で酵素活性が実質的に上昇した（非特許文献９）。特許文献５に記述されている別のイミノ糖、イソファゴミン（ＩＦＧ）およびその誘導体を用い、かつグルコセレブロシダーゼに特異的なその他の化合物（共に２００４年１１月１２日出願の係属中の特許文献６および特許文献７の中で記述されている）を用いて、ゴーシェ患者細胞由来のグルコセレブロシダーゼ（酸性β−グルコシダーゼ、ＧＢＡ）の類似のレスキューが記述されてきた。前述の特許文献２は、変異ＧＡＡを安定化しポンペ病の治療用の酵素の細胞レベルを増大させることが予想される、１−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、α−ホモノジリマイシンおよびカスタノスペルミンを含めた複数の小分子化合物を開示している。
【０００５】
しかしながら、前述の通り、ＳＰＣ療法の成功が期待される候補は、安定化されＥＲから外への輸送を可能にする立体配座へと折り畳まれる潜在性を有する酵素を産出する結果となる変異を有していなければならない。ナンセンス変異などの酵素を激しく切断する変異、またはシャペロンの結合を妨げる触媒ドメイン内の変異は、ＳＰＣ療法を用いて「レスキュー可能」または「増強可能」となる確率が低い。しかしながら、触媒部位の外にあったとしても特異的変異の応答性を予測することは困難であることが多く、実証的実験を必要とする。その上ＷＢＣは培養中（生体外）で短時間しか生存できないことから、ＧＡＡのＳＰＣ増強についてのスクリーニングは困難である。
【０００６】
表現型の不一致にもかかわらず、ポンペ患者は、治療に対する臨床的応答を評価するために用いられる、この疾病の一貫性あるいくつかの代理マーカーを示す。本発明は、ポンペ病の少なくとも１つ、好ましくは複数の代理マーカーの変化を評価することにより、特異的薬理シャペロンを用いた治療後にポンペ患者の治療を監視する方法に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ポンペ病に関連する代理マーカーの存在および／またはレベルの変化を評価することにより、α−グルコシダーゼ（Ｇａａ）向けの特異的薬理シャペロンを用いたポンペ病患者の治療を監視するための方法において、改善が、その個体がシャペロン療法に応答していることを標示する、方法を提供する。
【０００８】
一実施形態において、代理マーカーは全身代理マーカーである。
【０００９】
全身代理マーカーは、以下のものを少なくとも１つ含む：細胞および尿中のリソソームＧａａ活性の減少；脂質を持ったマクロファージ（「ポンペマクロファージ」）の存在；カテプシンＢレベルの増加、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）レベルの増加、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）レベルの増加、インタロイキン−６（ＩＬ−６）レベルの増加、インタロイキン−８（ＩＬ−８）レベルの増加、インタロイキン−１７（ＩＬ−１７）レベルの増加、コラーゲンＩＶレベルの増加、カテプシンＤレベルの減少、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）レベルの減少、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）レベルの減少、血小板由来成長因子ＡＡ／ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＢＢ）レベルの減少、インタロイキン−７（ＩＬ−７）レベルの減少、およびインタロイキン−１２ｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ｐ４０）レベルの減少。
【００１０】
付加的な代理マーカーには、さまざまな体内組織、特に心臓、骨格筋、肝臓および神経系に影響を及ぼす全身的な進行性筋ミオパシー；重症の筋無緊張；衰弱；肥大肝および拡張型心筋症；心筋ミオパシー；嚥下困難；舌突出および／または拡大；呼吸器ミオパシー；横隔膜筋、体幹筋肉および／または下肢筋肉の衰弱が含まれる。
【００１１】
具体的な一実施形態において、薬理シャペロンを用いたポンペ病の治療後に予想されるマーカーの組合わせは、以下のとおりである：白血球、皮膚および尿中のα−グルコシダーゼ（Ｇａａ）レベルの増加；白血球、血漿、血清、尿および皮膚内のスフィンゴ糖脂質、グリコーゲン、および／またはムコ多糖体レベルの減少；血漿中のカテプシンＢレベルの減少、血漿中のマクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）レベルの減少、血漿中の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）レベルの減少、血漿中のインタロイキン−６（ＩＬ−６）レベルの減少、血漿中のインタロイキン−８（ＩＬ−８）レベルの減少、血漿中のインタロイキン−１７（ＩＬ−１７）レベルの減少、血漿中のコラーゲンＩＶレベルの減少、血漿中のカテプシンＤレベルの増加、血漿中の肝細胞成長因子（ＨＧＦ）レベルの増加、血漿中の血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）レベルの増加、血漿中の血小板由来成長因子ＡＡ／ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＢＢ）レベルの増加、血漿中のインタロイキン−７（ＩＬ−７）レベルの増加、および血漿中のインタロイキン−１２ｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ｐ４０）レベルの増加。
【００１２】
別の実施形態において、代理マーカーは亜細胞代理マーカーである。
【００１３】
亜細胞代理マーカーには、以下のもののうちの少なくとも１つが含まれる：ポンペ患者由来の細胞内でのＧａａのＥＲからリソソームに向かう異常輸送；エンドソーム経路を通した細胞脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾル内での増大した量の誤った折り畳み構造のＧａａの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定される通りの）Ｇａａの毒性蓄積の結果としてもたらされるＥＲおよび／またはストレスの存在；異常なエンドソームｐＨレベル；単球上のＭＨＣＩＩおよび／またはＣＤ１ｄの原形質膜発現増加の存在；異常な細胞形態；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加。
【００１４】
さらなる実施形態において、療法中で使用される特異的薬理シャペロンは、可逆的競合的阻害物質などのＧａａの阻害物質である。
【００１５】
具体的実施形態において、阻害物質は１−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）である。
【００１６】
本発明は同様に、Ｇａａに結合する有効量の特異的化学シャペロンでポンペ病を治療し、細胞の細胞質染色に対するその効果を監視する方法において、異常な染色パターンの回復が、ポンペ病を患う個体がシャペロン治療に応答していることを標示する方法をも提供している。一実施形態において、細胞質染色は、特にリソソーム内でのＧａａまたはＬＡＭＰ−１の発現を検出するためのリソソーム染色である。
【００１７】
別の実施形態において、細胞質染色はポリユビキチン化タンパク質の検出である。
【００１８】
詳細な実施形態において、特異的薬理シャペロンは、可逆的競合的阻害物質などの、Ｇａａの阻害物質である。
【００１９】
具体的実施形態において、阻害物質はＤＮＪである。
【００２０】
本特許出願は、カラーで作成した少なくとも１枚の図面を含む。１枚または複数のカラー図面を伴う本特許または特許出願公報のコピーは、要請すれば所要手数料を支払いの上特許庁より入手可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ポンペ病細胞系ＰＭ−１１内の酸性α−グルコシダーゼの活性に対する１−ＤＮＪ、ＮＢ−ＤＮＪおよびＮ−（シクロプロピル）メチルＤＮＪイミノ糖誘導体の効果を示す。
【図２Ａ】２週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの脳内におけるＧａａの増強を示す。
【図２Ｂ】２週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの肝臓内におけるＧａａの増強を示す。
【図２Ｃ】２週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの腓腹筋内におけるＧａａの増強を示す。
【図２Ｄ】２週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの舌内におけるＧａａの増強を示す。
【図３Ａ】２週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの腎臓内におけるＧａａの増強を示す。
【図３Ｂ】２週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの横隔膜内におけるＧａａの増強を示す。
【図３Ｃ】２週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの心臓内におけるＧａａの増強を示す。
【図３Ｄ】２週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスのヒラメ筋内におけるＧａａの増強を示す。
【図４Ａ】４週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの脳内におけるＧａａの増強を示す。
【図４Ｂ】４週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの肝臓内におけるＧａａの増強を示す。
【図４Ｃ】４週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの腓腹筋内におけるＧａａの増強を示す。
【図４Ｄ】４週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの舌内におけるＧａａの増強を示す。
【図５Ａ】４週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの腎臓内におけるＧａａの増強を示す。
【図５Ｂ】４週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの横隔膜内におけるＧａａの増強を示す。
【図５Ｃ】４週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスの心臓内におけるＧａａの増強を示す。
【図５Ｄ】４週間さまざまな濃度のＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪで処置された正常なＣ５７ＢＬ６マウスのヒラメ筋内におけるＧａａの増強を示す。
【図６Ａ】ポンペ病ＰＭ８線維芽細胞におけるＧａａ免疫染色を示す。
【図６Ｂ】ポンペ病ＰＭ８線維芽細胞におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についてのリソソーム染色を示す。
【図６Ｃ】野生型線維芽細胞におけるＧａａ免疫染色を示す。
【図６Ｄ】野生型線維芽細胞におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についてのリソソーム染色を示す。
【図６Ｅ】ポンペＰＭ８線維芽細胞におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ−１についてのリソソーム染色を示す。
【図６Ｆ】ポンペＰＭ８線維芽細胞におけるＧａａ免疫染色を示す。
【図６Ｇ】ＰＭ８線維芽細胞についてのＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイを同様に示す。
【図６Ｈ】野生型線維芽細胞についてのＧａａおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイを同様に示す。
【図７Ａ】ＧａａおよびＬＡＭＰ−１のオーバーレイを示す。
【図７Ｂ】ＰＭ９ポンペ線維芽細胞におけるＧａａについての免疫蛍光染色を示す。
【図７Ｃ】ＧａａおよびＬＡＭＰ−１のオーバーレイを示す。
【図７Ｄ】ＰＭ９ポンペ線維芽細胞におけるＧａａについての免疫蛍光染色を示す。
【図７Ｅ】ＰＭ９ポンペ線維芽細胞におけるＬＭＰ−１についての免疫蛍光染色を示す。
【図７Ｆ】ＧａａとＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイを示す。
【図８】ＤＮＪまたはＮＢ−ＤＮＪで処置されたＰＭ１１ポンペ細胞系におけるＧａａ、ＬＡＭＰ−１およびＧａａ／ＬＡＭＰ−１二重染色を示す。
【図９】対照由来の血漿と比較した、ポンペ患者からの血漿中のカテプシンＢ、カテプシンＢ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＢＢ、ＭＩＰ−１α、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１７およびコラーゲンＩＶの濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、治療後のポンペ病の特異的代理マーカーの評価により明らかとなるような、ポンペ病モデルにおけるＳＰＣでの治療に対する応答を実証する。したがって本発明は、特異的代理マーカーにおける変化すなわち改善について患者を評価することによりポンペ患者におけるＳＰＣ治療に対する応答を評価するための治療標準を提供する。
【００２３】
定義
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明の文脈内において、かつ各用語が使用される特定の文脈内で、当該技術分野におけるその通常の意味を有する。一部の用語については、本発明の組成物および方法そしてそれらの使用方法を記述する上で医師に付加的な指針を提供するために、以下で、または本明細書の他の場所で論述される。
【００２４】
酸性マルターゼ欠損症、グリコーゲン貯蔵症ＩＩ型（ＧＳＤＩＩ）および２型糖原病とも呼ばれる「ポンペ病」という用語は、グリコーゲンを代謝するＧａａ遺伝子内の変異を特徴とする遺伝性リソソーム貯蔵障害である。本明細書で使用される場合、この用語には、この疾患の小児型、若年性および成人発症型が含まれる。
【００２５】
「患者」とは、特定の疾病の診断を受けた対象を意味する。患者はヒトまたは動物であってよい。「ポンペ病患者」とは、ポンペ病の診断を受け、そして以下でさらに定義する通り変異を受けたＧａａを有する個体を意味する。
【００２６】
本明細書で使用される「変異α−グルコシダーゼ」または「変異Ｇａａ」は、改変されたα−グルコシダーゼアミノ酸配列を結果としてもたらす遺伝的変異を含む遺伝子から翻訳されたα−グルコシダーゼポリペプチドを意味する。一実施形態においては、野生型α−グルコシダーゼと比べた場合、ＥＲ内に通常存在する条件の下で天然の立体配座を達成しないか、または野生型α−グルコシダーゼと比べて減少した安定性または活性を示すα−グルコシダーゼタンパク質が変異の結果もたらされる。このタイプの変異は本明細書において「立体配座変異」と呼ばれ、かかる変異を担持するタンパク質は「立体配座変異体」と呼ばれる。この立体配座を達成できない場合、結果としてα−グルコシダーゼタンパク質は、タンパク質輸送系内の正常な経路を通して細胞内のその天然の位置までまたは細胞外環境内に輸送されるのではなく、むしろ分解されるか凝集されることになる。一部の実施形態においては、タンパク質の発現効率が低くなるという結果をもたらす変異、例えば転写効率、スプライシング効率、ｍＲＮＡ安定性などに影響を及ぼす変異が、α−グルコシダーゼをコードする遺伝子の非コーティング部分の中で発生するかもしれない。α−グルコシダーゼ薬理シャペロンの投与は、α−グルコシダーゼの野生型ならびに立体配座変異多様体の発現レベルを増強することにより、このような効率の悪いタンパク質発現によってもたらされた欠損を改善することができる。或いは、ＥＲ内に蓄積するかもしれないスプライシング変異体またはナンセンス変異については、リソソーム加水分解酵素活性を回復させることなく、変異体に結合し、変異体がＥＲを退出するのを補助するシャペロンの能力が、ポンペ患者における一部の細胞病理を改善し、かくして症候を改善するのに充分であるかもしれない。
【００２７】
Ｇａａの例示的立体配座変異としては、以下のものが含まれる：Ｄ６４５Ｅ (Lin et al., Zhonghua Min Guo Xiao Er Ke Yi Xue Hui Za Zhi. 1996;37(2):115-21)；Ｄ６４５Ｈ (Lin et al., Biochem Biophys Res Commun. 1995 17;208(2):886-93)；Ｒ２２４Ｗ、Ｓ６１９ＲおよびＲ６６０Ｈ (New et al. Pediatr Neurol. 2003;29(4):284-7)；Ｔ１０６４ＣおよびＣ２１０４Ｔ (Montalvo et al., Mol Genet Metab. 2004;81(3):203-8)；Ｄ６４５ＮおよびＬ９０１Ｑ (Kroos et al., Neuromuscul Disord. 2004;14(6):371-4)；Ｇ２１９Ｒ、Ｅ２６２Ｋ、Ｍ４０８Ｖ (Fernandez-Hojas et al., Neuromuscul Disord. 2002;12(2):159-66)；Ｇ３０９Ｒ(Kroos et al., Clin Genet. 1998;53(5):379-82)；Ｄ６４５Ｎ、Ｇ４４８Ｓ、Ｒ６７２ＷおよびＲ６７２Ｑ (Huie et al., Biochem Biophys Res Commun. 1998; 27;244(3):921-7)；Ｐ５４５Ｌ(Hermans et al., Hum Mol Genet. 1994;3(12):2213-8)；Ｃ６４７Ｗ (Huie et al., Huie et al., Hum Mol Genet. 1994;3(7):1081-7)；Ｇ６４３Ｒ (Hermans et al., Hum Mutat. 1993;2(4):268-73)；Ｍ３１８Ｔ (Zhong et al., Am J Hum Genet. 1991;49(3):635-45)；Ｅ５２１Ｋ (Hermans et al., Biochem Biophys Res Commun. 1991;179(2):919-26)；Ｗ４８１Ｒ (Raben et al., Hum Mutat. 1999;13(1):83-4)；およびＬ５５２ＰおよびＧ５４９Ｒ（未公開データ）。
【００２８】
スプライシング変異体には、ＩＶＳ１ＡＳ、Ｔ＞Ｇ、−１３およびＩＶＳ８＋１Ｇ＞Ａ）が含まれる。
【００２９】
付加的なＧａａ変異体が同定され、当該技術分野において公知である。立体配座変異体は、当業者であれば容易に同定可能である。
【００３０】
Ｇａａの折り畳みひいては輸送を損なう変異は、タンパク質がゴルジ体に入るか否かを判定するためのグリコシダーゼ処置または細胞内部のＧａａ局在化についての蛍光免疫染色を伴うおよび伴わないパルスチェイス代謝標識などの当該技術分野において周知の日常的検定によって判定することができる。野生型Ｇａａは、１１０ｋＤの前駆体として分泌され、これは次に９５ｋＤの中間体を介して７６ｋＤの成熟Ｇａａに変換される。
【００３１】
このような機能性は、このようなタンパク質の機能性を確立するものとして知られるあらゆる手段によって試験することができる。例えば、Ｇａａ活性を判定するために、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドなどの蛍光基質を用いた検定を使用することができる。このような検定は、当該技術分野において周知である。（例えば前出のＨｅｒｍａｎｓらを参照のこと）。
【００３２】
本明細書で使用される「特異的薬理シャペロン」（「ＳＰＣ」）という用語は、１つのタンパク質に対して特異的に結合し、（ｉ）そのタンパク質の安定した分子立体構造の形成を増強させる；（ｉｉ）ＥＲから別の細胞位置、好ましくは未変性細胞位置までのタンパク質の輸送を誘発する、すなわちタンパク質のＥＲ関連分解を防止する；（ｉｉｉ）誤った折畳み構造のタンパク質の凝集を防止する；および／または（ｉｖ）タンパク質に対し少なくとも部分的な野生型機能および／または活性を回復させるまたは増強させる、という効果のうちの１つ以上を有する、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、カルボン酸塩などを含めたあらゆる分子を意味する。例えばＧａａに対し特異的に結合する化合物というのは、その化合物が関係するまたは無関係の酵素の属性群ではなくＧａａに対して結合しそれに対してシャペロン効果を及ぼすことを意味する。以下に記すのは、本発明により企図されている一部の（ＳＰＣ）特異的薬理シャペロンについての記述である。
【００３３】
１−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）は、以下の構造を有する化合物を意味する。
【化１】
2011512876.tif 000002
【００３４】
この用語は、遊離塩基および任意の塩形態の両方を含む。
【００３５】
Ｇａａのためのさらにその他のＳＰＣは、共にその全体が参照により本明細書に援用されているＦａｎらに対するU.S. Patent 6,599,919およびＭｕｇｒａｇｅらに対するU.S. Patent Application Publication US 20060264467の中に記述されており、これにはＮ−メチル−ＤＮＪ、Ｎ−エチル−ＤＮＪ、Ｎ−プロピル−ＤＮＪ、Ｎ−ブチル−ＤＮＪ、Ｎ−ペンチル−ＤＮＪ、Ｎ−ヘキシル−ＤＮＪ、Ｎ−ヘプチル−ＤＮＪ、Ｎ−オクチル−ＤＮＪ、Ｎ−ノニル−ＤＮＪ、Ｎ−メチルシクロプロピル−ＤＮＪ、Ｎ−メチルシクロペンチル−ＤＮＪ、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ＤＮＪおよび５−Ｎ−カルボキシペンチル−ＤＮＪが含まれる。
【００３６】
ポンペ病の「代理マーカー」または「代理臨床マーカー」とは、ポンペ病に付随し、単独でまたはポンペ病のその他の異常なマーカーまたは症候と組合わせた形でポンペ病の信頼できる指標である（ただし健常な個体には付随しない）バイオマーカーの異常な存在、レベルの増加、異常な欠如、またはレベルの減少を意味する。
【００３７】
非限定的な例として、ポンペ病の代理マーカーには、リソソームＧａａ活性の減少；脂質を持ったマクロファージ（「ポンペマクロファージ」）の存在；カテプシンＢレベルの増加、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）レベルの増加、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）レベルの増加、インタロイキン−６（ＩＬ−６）レベルの増加、インタロイキン−８（ＩＬ−８）レベルの増加、インタロイキン−１７（ＩＬ−１７）レベルの増加、コラーゲンＩＶレベルの増加、カテプシンＤレベルの減少、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）レベルの減少、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）レベルの減少、血小板由来成長因子ＡＡ／ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＢＢ）レベルの減少、インタロイキン−７（ＩＬ−７）レベルの減少、およびインタロイキン−１２ｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ｐ４０）レベルの減少が含まれる。
【００３８】
付加的な代理マーカーには、さまざまな体内組織、特に心臓、骨格筋、肝臓および神経系に影響を及ぼす全身的な進行性筋ミオパシー；重症の筋無緊張；衰弱；肥大肝および拡張型心筋症；心筋ミオパシー；嚥下困難；舌突出および／または拡大；呼吸器ミオパシー；横隔膜筋、体幹筋肉および／または下肢筋肉の衰弱が含まれる。
【００３９】
その他の代理マーカーは、亜細胞レベルで存在し（亜細胞代理マーカー）、これには以下のものが含まれる：ポンペ患者由来の細胞内でのＧａａのＥＲからリソソームに向かう異常輸送；エンドソーム経路を通した細胞脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾル内での増大した量の誤った折り畳み構造のＧａａの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定される通りの）Ｇａａの毒性蓄積の結果としてもたらされるＥＲおよび／またはストレスの存在；異常なエンドソームｐＨレベル；単球上のＭＨＣＩＩおよび／またはＣＤ１ｄの原形質膜発現増加の存在；異常な細胞形態；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加。
【００４０】
「代理マーカーにおける改善」とは、ポンペ病を患っておらず、かつその代理マーカーの異常な存在、不在または改変されたレベルを説明するその他の疾病を患っていない健常な個体と比べて、ポンペ病において異常に存在するかまたは異常に高くなった１つ以上の臨床代理マーカーのＳＰＣでの治療後の改善または減少、あるいはポンペ病において異常に減少するかまたは欠如した１つ以上の臨床代理マーカーのＳＰＣでの治療後の存在または増加といった効果を意味する。
【００４１】
「応答者」とは、ポンペ病などのＧａａタンパク質の誤った折り畳みをひき起こすＧａａ変異に関連する疾病の診断を受け、ここで請求されている方法にしたがって治療され、１つ以上の臨床症候の改善、その改良または予防、あるいは上述の１つ以上の代理マーカーにおける改善を示す個体である。
【００４２】
さらに、一個体が応答者であるか否かの判定は、ＳＰＣでの治療に応答しての変異体Ｇａａタンパク質の細胞内輸送などの亜細胞代理マーカーにおける改善を評価することにより、亜細胞レベルで行なうことができる。ＥＲからの輸送の回復は、応答を標示するものである。一個体が応答者であるか否かを判定するために査定できるその他の亜細胞評価には、上述の亜細胞代理マーカーにおける改善が含まれる。
【００４３】
「治療上有効な用量」という用語は、治療的応答を結果としてもたらすのに充分な特異的薬理シャペロンの量を意味する。治療的応答というのは、上述の症候および代理臨床マーカーにおける改善を含めた、療法に対する有効な応答としてユーザー（例えば医師）が認識するあらゆる応答であってよい。かくして、治療的応答は一般に、上述のもののような疾病または障害の１つ以上の症候の改良である。
【００４４】
「薬学的に許容できる」という語句は、生理学的に許容可能であり、ヒトに投与された場合に典型的には、望ましくない反応を生成しない分子的実体および組成物を意味する。好ましくは、本明細書で使用されている薬学的に許容できるという用語は、連邦または州政府の規制機関により承認されていることまたは、動物、より詳細にはヒトにおける使用のために米国薬局方またはその他の一般的に認知された薬局方の中に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、化合物を投与する場合に用いられる希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。かかる薬学的担体は、水および油などの無菌の液体であり得る。特に注射用溶液用の担体として、好ましくは、水または水溶液食塩溶液およびデキストロースおよびグリセロール水溶液が利用される。適切な薬学的担体は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin, 18th Editionの中に記載されている。
【００４５】
「約」および「およそ」という用語は、一般に、測定の性質または精度から許容可能な程度の測定数量についての誤差を意味する。典型的には、例示的な誤差の程度は所与の値または値範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、そしてより好ましくは５％以内である。或いは、特に生体系において、「約」および「およそ」という用語は、所与の値の好ましくは１０倍または５倍そしてより好ましくは２倍という範囲内にある平均値であり得る。本明細書中で示されている数値的数量は、特に明記しないかぎり近似であり、これは、明示的に記載されていない場合に「約」または「およそ」という用語が暗示され得る、ということを意味している。
【００４６】
調合、投薬量および投与
ＤＮＪおよび誘導体は、例えば錠剤、カプセルまたは液体の形での経口投与または注射用無菌水溶液中での投与を含め、あらゆる投与経路に適した形で投与可能である。１つの具体的実施形態においては、ＤＮＪ（例えばＤＮＪ塩酸塩）は、粉末充てんカプセルとして投与される。化合物が経口投与向けに調合される場合、錠剤またはカプセルを、薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充てん剤（例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）と共に従来の手段により調製することができる。当該技術において周知の方法により、錠剤をコーティングしてもよい。
【００４７】
経口投与のための液体調製物は例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形をとってよく、あるいは、使用前に水または別の適切なビヒクルで再構成するための乾燥製品としての体裁をとっていてもよい。このような液体調製物は、薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁剤（例えば水、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂）；乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および防腐剤（例えばメチルまたはプロピル−Ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）と共に従来の手段により調製されてよい。調製物は同様に、適宜緩衝塩、着香剤、着色剤および甘味剤を含んでいてもよい。経口投与向けの調製物は、セラミド特異的グルコシルトランスフェラーゼ阻害物質の制御放出または持続放出を提供するように適切に調合されてよい。
【００４８】
非経口／注射用途に適したＤＮＪまたは誘導体の医薬調合物は一般に、無菌注射用溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末および無菌水溶液または分散液を含む。全ての場合において形態は無菌でなくてはならず、かつ、容易に注入できる程度の流動性を有していなければならない。またはこの形態は、製造条件および保管条件の下で安定していなくてはならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保存されていなくてはならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリコール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒質であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合の所要粒子サイズの維持および界面活性剤の使用により維持可能である。微生物の作用は、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、ソルビン酸などによって予防することが可能である。多くの場合において、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含み入れることが合理的である。例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物中で使用することにより注射用組成物を長期にわたり吸収させることができる。
【００４９】
無菌注射用溶液は、必要であれば以上で列挙したその他の成分のうちのさまざまなものを伴う適切な溶媒中に所要量のＤＮＪまたは誘導体を取込み、その後ろ過または最終減菌することにより調製される。一般に、分散液は、以上で列挙されたもののうちの塩基性分散媒質とその他の所要成分を含む無菌ビヒクル中に、さまざまな減菌済み活性成分を取込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それによって予め減菌ろ過された溶液から活性成分とあらゆる付加的な所望の成分の粉末が生成される。
【００５０】
上述の調合物は、１つまたは複数の賦形剤を含むことができる。調合物中に含み入れてより薬学的に許容される賦形剤は、緩衝剤例えばクエン酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤および、重炭酸塩緩衝剤、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質例えば血清アルブミン、コラーゲンおよびゼラチン；塩例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡおよび塩化ナトリウム；リポソーム；ポリビニルピロリドン；糖例えばデキストラン、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロール；プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００）；グリセロール、グリシンまたはその他アミノ酸および脂質である。調合物で使用するための緩衝剤系としては、クエン酸塩、酢酸塩、重炭酸塩およびリン酸塩緩衝剤が含まれる。リン酸塩緩衝剤が、好適な実施形態である。
【００５１】
調合物は同様に、非イオン洗浄剤をも含むことができる。好ましい非イオン洗浄剤としては、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｏｃｔｙｌ  α−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｏｃｔｙｌ  β−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｂｒｉｊ  ３５、ＰｌｕｒｏｎｉｃおよびＴｗｅｅｎ  ２０が含まれる。
【００５２】
投与
ＤＮＪまたは誘導体の投与経路は、経口経路（好適）または静脈内、皮下、動脈内、腹腔内、眼内、筋内、口腔、直腸、膣内、眼窩内、脳内、皮内、頭蓋内、髄腔内、心室内、くも膜下内、嚢内、関節包内、肺内、鼻腔内、経粘膜、経皮または吸入を含む非経口経路であってよい。
【００５３】
ＤＮＪまたは誘導体の上述の非経口調合物の投与は、調製物のボーラスの定期的注入によるものであってよく、または、外部貯蔵器（例えば点滴用袋）または内部貯蔵器（例えば生分解性インプラント）からの静脈内または腹腔内投与によるものであってもよい。例えば、各々参照により本明細書に援用されているU.S. Patent No. 4,407,957、およびU.S. Patent No. 5,798,113を参照のこと。肺内送出方法および装置は、例えば、各々参照により本明細書に援用されているU.S. Patent No. 5,654,007、U.S. Patent No. 5,780,014およびU.S. Patent No. 5,814,607内に記述されている。その他の有用な非経口送出系としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植輸液系、ポンプ送出、カプセル化細胞送出、リポソーム送出、針送出型注入、無針注入、ネブライザ、エアロゾル化装置、電気穿孔、および経皮パッチが含まれる。無針注入装置は、その明細書が参照により本明細書に援用されているU.S. Patent No. 5,879,327；U.S. Patent No. 5,520,639；U.S. Patent No. 5,846,233およびU.S. Patent No. 5,704,911中に記載されている。上述の調合物のいずれも、これらの方法を用いて投与可能である。
【００５４】
さらに詰替え可能な注入ペンおよび無針注入装置などの患者の便宜のために設計されたさまざまな装置を、本明細書中で論述する通りに本発明の調合物に使用してよい。
【００５５】
投薬量
当業者であれば、本発明の方法において使用されるＤＮＪまたは誘導体の有効量が日常的な実験により決定可能であることを理解するものである。非限定的例としては、大部分の「レスキュー可能な」個体においてＧａａを増大させるのに充分であると予想される用量および計画は、その全体が参照により本明細書に援用されている２００８年２月１２日付けのU.S. Provisional Application 61/028,105中で記載されている通りである。
【００５６】
代理マーカーを用いたポンペ病治療監視
本発明は特異的薬理シャペロンを用いてポンペ患者の治療を監視するための方法を提供する。具体的には、疾病の進行およびＤＮＪでの治療に対するその応答を評価するために、さまざまな検定が用いられる。詳細には、さまざまな全身および亜細胞マーカーを検定することができる。本発明の監視態様には、さまざまな細胞物質の観血的および非観血的測定の両方が包含される。
【００５７】
スフィンゴ糖脂質、グリコーゲンおよびムコ多糖体。スフィンゴ糖脂質、グリコーゲンおよびムコ多糖体は、ポンペ患者において、病的に蓄積する化合物である。レベルは、許容可能なさまざまな方法を用いて尿中および血漿および組織内で測定可能である。さらに、１つの一般的なポンペ代理マーカーは、「ポンペマクロファージ」の存在である。ポンペマクロファージは、活性化されたマクロファージを標示する全く異なる形態を有する脂質を持った拡大マクロファージである。
【００５８】
酸性α−グルコシダーゼ活性。Ｇａａの減少が、ポンペ病に付随する。上述の通り、Ｇａａ活性の非観血的査定を、ポンペ患者に由来する末梢的に得られたリンパ芽球、白血球および多核白血球（ＰＭＮ）について評価することができる。皮膚生検由来の培養線維芽細胞も同様に使用できる。このような検定には典型的に、患者からの血液白血球の抽出、細胞の溶解および４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（４ＭＵ−αＧｌｃ）などの基質を添加した時点での活性の判定が関与する（例えばHermans et al. Human Mutation 2004; 23: 47-56を参照のこと）。
【００５９】
患者の細胞内のＧａａ活性を評価するために、フローサイトメトリを使用することもできる（Lorincz et al., Blood. 1997; 189: 3412-20;およびChan et al., Anal Biochem. 2004;334(2):227-33）。この方法は、飲作用により細胞内に取込まれ得る蛍光性Ｇａａ基質を利用する。細胞はこのとき、従来のフルオレセイン発光光学を用いて評価される。蛍光レベルは、Ｇａａ活性の量と相関性を有する。
【００６０】
細胞形態。血液白血球およびＰＭＮに関する超微細構造的解析がこれまでに記述されている（Laslo et al., Acta Paediatr. Hung. 1987; 28: 163-73）。簡単に言うと、ポンペ病患者における空胞形成の病理を電子顕微鏡によって明らかにすることができる。この方法は同様にポンペマクロファージの存在を判定するためにも使用可能である。
【００６１】
血液学的徴候。ポンペ病の血液学的徴候には、カテプシンＢの血漿レベルの増加、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）レベルの増加、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）レベルの増加、インタロイキン−６（ＩＬ−６）レベルの増加、インタロイキン−８（ＩＬ−８）レベルの増加、インタロイキン−１７（ＩＬ−１７）レベルの増加、コラーゲンＩＶレベルの増加、カテプシンＤレベルの減少、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）レベルの減少、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）レベルの減少、血小板由来成長因子ＡＡ／ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＢＢ）レベルの減少、インタロイキン−７（ＩＬ−７）レベルの減少、およびインタロイキン−１２ｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ｐ４０）レベルの減少が含まれる。
【００６２】
ミオパシーバイオマーカー。付加的な代理マーカーには、さまざまな体内組織、特に心臓、骨格筋、肝臓および神経系に影響を及ぼす全身的な進行性筋ミオパシー；重症の筋無緊張；衰弱；肥大肝および拡張型心筋症；心筋ミオパシー；嚥下困難；舌突出および／または拡大；呼吸器ミオパシー；横隔膜筋、体幹筋肉および／または下肢筋肉の衰弱が含まれ、これらの全てがポンペ病の徴候を標示できるバイオマーカーである。
【００６３】
臓器肥大症。ポンペ病に罹患しているかまたはその疑いのある患者の理学的検査から、通常、心臓および／または肝臓の正常な個体に比べた肥大が明らかになる。腹部の超音波検査またはＭＲ画像法は、ポンペ患者における臓器肥大症の程度を判定することができる。
【００６４】
これらのマーカーは、治療前に異常であると識別された場合にのみ、治療監視目的で使用できるものと理解すべきである。さらに、マーカーの異常な上昇または減少が、疾病の存在と相関関係を有し、肝疾患、虚血壊死、肺または心臓血管疾患などのその他の原因または合併症のせいではないことが好ましい。
【００６５】
亜細胞マーカーを検出するための分子生物学監視検定
特異的薬理シャペロンを用いたポンペ病の治療の監視は、上述の全身性または巨視的レベルに加えて、亜細胞レベルで行なうことができる。例えば、ゴルジ複合体への脂質のエンドソーム−リソソーム膜輸送の妨害が、リソソーム蓄積症の特徴である（Sillence et al., J Lipid Res. 2002;43(11):1837-45）。したがって、ポンペの治療を監視する一つの方法は、患者由来の細胞を、標識脂質（ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒ）、または標識グリコーゲンと接触させ、エンドソーム構造内でのその輸送を監視することにあると思われる。例えばエンドソーム構造内の病的蓄積は、患者が治療に対し充分応答していないことの標示であると考えられる。
【００６６】
一例として、細胞によるエンドサイトーシスを受けたｐＨ感応性蛍光プローブをリポソームおよびエンドソーム内のｐＨ範囲を測定するために使用することができる（すなわち、フルオレセインはｐＨ５で赤、５．５から６．５で青から緑色である）。リソソームの形態およびｐＨが、野生型およびシャペロン処置されたおよび未処置の患者細胞内で比較される。この検定は、ｐＨ感受性を判定するために平板読取り装置検定と並行して実施することができる。例えば、ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒは、正常な細胞ではゴルジ体まで輸送されるが、脂質蓄積障害を有する場合は細胞のリソソーム内に蓄積する。ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒは、膜内の濃度に応じて緑色または赤色の蛍光を発するため、濃度変化を測定する目的でリソソーム内の緑色／赤色比を使用することができる。
【００６７】
生きた健常細胞および化合物で処置されたおよび未処置の患者の細胞を、ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒと共にインキュベートし、ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡を用いて赤色／緑色比を測定でき、共焦点顕微鏡を用いて染色パターン（リソソーム対ゴルジ体）を判定することが可能である。
【００６８】
輸送は、ｐＨ勾配（すなわちＥＲではｐＨ約７、ゴルジ体ではｐＨ約６．２〜７．０、トランスゴルジ体ネットワークではｐＨ約６．０、初期および後期エンドソームではｐＨ約６．５、リソソームではｐＨ約４．５）に沿って細胞内で起こり、内腔およびエンドソームｐＨは、ポンペ細胞などの輸送欠陥を伴う細胞内で中断される。したがって、野生型、ＳＰＣ−処置済みおよび未処置の患者細胞内のｐＨ感受性を判定するための検定を、輸送に対するｐＨのプラス効果と相関させた場合、これを用いてポンペ患者における輸送の回復を監視することができる。患者の細胞がｐＨの変化に対してより高い感受性を有する場合には、細胞のｐＨ感受性を低減させるか、リソソームの形態または機能を回復させるか、またはより一般的に正常な輸送を回復させるＳＰＣについてのスクリーニング検定を作り上げることが可能であると思われる。
【００６９】
さらに、Ｌｙｓｏ−Ｔｒａｃｈｅｒ(登録商標)といったようなリソソームマーカーとの欠損酵素（Ｇａａ）の共局在化を判定することにより、分子レベルで輸送欠陥の軽減を査定することが可能である。リソソーム内のＧａａの局在化は、特異的薬理シャペロンでの処置によってＥＲからリソソームへの輸送が回復することの証拠である。簡単に言うと、ＳＰＣによる処置を受けたおよび未処置の患者の細胞および正常な細胞を固定し、酵素およびエンドソーム／リソソームマーカー（例えばＲａｂ７、Ｒａｂ９、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ジストロフィン関連タンパク質ＰＡＤ）に対する一次抗体および蛍光タグ付けされた二次抗体で染色する。ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡を用いて、酵素およびその他のエンドサイトーシス経路マーカーの濃縮に起因する蛍光量を定量化し、共焦点顕微鏡を用いて染色パターンの変化を判定することができる。
【００７０】
さらに、エンドグリコシダーゼＨ処置と組合わせたパルス−チェイス代謝標識などの伝統的生化学方法。Ｅｎｄｏ  Ｈは、ＥＲグリコシル化を獲得した（高マンノースＮ結合型）タンパク質、すなわち局在化するＥＲであるタンパク質のみを分割し、ＥＲから出てゴルジ体まで送られゴルジ体内で追加のグリコシル化を獲得したタンパク質を分割しない。したがって、Ｅｎｄｏ  Ｈ感受性Ｇａａのレベルが高くなればなるほど、ＥＲ内のタンパク質の蓄積は多くなる。Ｇａａがゴルジ体内に入った場合、タンパク質がゴルジ体を退出したか否かを確認するためには、グリコシダーゼＰＮＧａｓｅＦが全てのＮ結合型糖を分割することから、これを使用することができる。
【００７１】
ＥＲストレス。例えばポンペ患者における誤って折畳まれたＧａａなどの細胞のＥＲ内の誤って折畳まれたタンパク質の毒性蓄積は、多くの場合ＥＲストレスを結果としてもたらす。これは、細胞恒常性の破壊を解消しようとする細胞ストレス応答の誘発を導く。したがって、特異的薬理シャペロンでの治療の後の患者におけるＥＲストレスマーカーを測定することで、治療の効果を監視するための別の方法が提供される。このようなマーカーとしては、ＢｉＰ、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ／ＡＴＦ４、ＡＴＦ６、ＸＢＰ１（Ｘ−ｂｏｘ結合因子１）およびＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ）を含む、折り畳まれていないタンパク質の応答に付随する遺伝子およびタンパク質が含まれる。ＥＲストレスを査定する１つの方法は、野生型とポンペ患者細胞の間と同様にＳＰＣ処置済み細胞と未処置細胞の間の発現レベルも比較することにある。対照として、ＥＲストレス誘発物質（例えばＥＲ内の折り畳まれていないタンパク質のＮ−グリコシル化および蓄積の阻害のためのツニカマイシン、ラクタシスチンまたはＨ２Ｏ２）およびストレス緩和剤（例えばタンパク質合成を阻害するためのシクロヘキサミド）を使用することができる。
【００７２】
ＥＲストレス応答を監視するために企図された別の方法は、遺伝子チップ解析を介したものである。例えば、ＥＲストレス応答（早期、後期、アポトーシスなど）の発現レベルおよびタイプを測定するために、さまざまなストレス遺伝子を伴う遺伝子チップを使用することができる。一例として、ＨＧ−Ｕ９５Ａアレイを使用することができる（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．）。
【００７３】
最後に、長期にわたるＥＲストレスは、ＥＲ内の折り畳まれていないタンパク質のレベルおよび結果としてのストレスレベルに応じてアポトーシスおよび細胞死を結果としてもたらす可能性があることから、細胞は、ツニカマイシンまたはプロテアゾーム阻害剤などのＥＲストレス誘発物質に対し多少の差こそあれ感受性を有する。細胞のストレス誘発物質に対する感受性が高ければ高いほど、観察されるアポトーシスまた死枯細胞数は多くなる。アポトーシスは、カスパーゼ３（アポトーシスの早期指標）のための蛍光性基質類似体を用いて測定可能である。アポトーシスまたは細胞死について陽性である細胞の百分率を判定するため（ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡法）にＦＡＣＳ、共焦点顕微鏡法および／または蛍光平板読取り装置（ハイスループット検定用の９６ウェル構成）が使用され、あるいは、蛍光平板読取り装置を伴う９６ウェル構成においてタンパク質濃度との比較において蛍光強度を測定することができる。
【００７４】
ＥＲ内の毒性タンパク質蓄積の結果としてのＥＲストレスに対する別の応答は、ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制である。これにより、エンドサイトーシス経路の全体的破壊が導かれる（Rocca et al., Molecular Biology of the Cell. 2001; 12: 1293-1301）。誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積は、時としてポリユビキチン量の増加と相関される（Lowe et al., Neuropathol Appl Neurobiol. 1990; 16: 281-91）。
【００７５】
プロテアソーム機能およびユビキチン化は、日常的検定を用いて査定可能である。例えば生きた動物における２６Ｓプロテアソーム機能の画像形成による評価は、生体発光画像形成のためのユビキチン−ルシフェラーゼレポーターを用いて達成されている（Luker et al., Nature Medicine. 2003. 9, 969 - 973）。プロテアソーム単離用キットが、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から市販されている（カタログ番号５３９１７６）。ユビキチン化は、免疫組織化学または免疫蛍光を用いて形態学的研究によって検査可能である。例えば、健常細胞およびＳＰＣで処置されたおよび未処置の患者細胞を固定し、ユビキチン化されたタンパク質に対する一次抗体で染色することができ、ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡法による二次抗体の蛍光検出を用いて、ユビキチン化されたタンパク質レベルの変化が判定される。
【００７６】
ユビキチン化されたタンパク質を検出するための別の検定は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）である。このモデルでは、ビオチン−ユビキチン（ｂｉｏ−Ｕｂ）を用いて、ＧＳＴ−ＵｂｃＨ５ａ融合タンパク質のＧＳＴ部分がユビキチン化される。ＡＴＰの存在下でＥ１によりユビキチンを活性化させた後、ｂｉｏ−ＵｂはＵｂｃＨ５ａに移される。この反応において、ＵｂｃＨ５ａは、そのタグ付けされたＧＳＴ部分にｂｉｏ−Ｕｂを移すための担体として作用する。ビオチニル化されユビキチン化された状態になるタンパク質は、このとき抗ＧＳＴアクセプタおよびストレプトアビジンにより捕捉される。ドナーは、数珠つなぎになり、結果としてシグナルが生成される。ユビキチン化が不在である場合、いかなるシグナルも生成されない。
【００７７】
最後に、ユビキチン化された変異Ｇａａを捕捉するためにＥＬＩＳＡサンドイッチ検定を使用することができる。Ｇａａに対する一次抗体（例えばウサギ）は、表面に吸収され、酵素は細胞溶解物または血清とのインキュベーション中に捕捉され、次に、二次酵素結合型検出と共にユビキチン化タンパク質に対する抗体（例えばマウスまたはラット）が、ユビキチン化酵素を検出しその量を定量化するために使用されると考えられる。あるいは、検定を用いて、細胞抽出物または血清中の多量ユビキチン化タンパク質の合計量を定量化することができると考えられる。
【００７８】
組合わせ療法
本発明の治療監視は同様に、ＤＮＪおよび誘導体そしてＥＲＴまたは遺伝子療法の組合わせを用いた患者の治療後にも適用可能である。このような組合わせ療法は、本発明の特許権者が所有する、U.S. patent application publication number 2004/0180419 (serial number 10/771,236)およびU.S. patent publication 2004/0219132 (serial number 10/781,356)の中で記述されている。両方の出願共に、その全体が参照により本明細書に援用されている。
【実施例】
【００７９】
本発明は、以下で提示される実施例を用いてさらに記述される。このような実施例の使用は単に例示を目的としているにすぎず、本発明およびいずれかの例示された用語の範囲および意味をいかなる形であれ限定するものではない。同様にして、本発明は、本明細書中に記載された任意の特定の好ましい実施形態に限定されない。実際、本発明の多くの修正および変形形態が、本明細書の読了時点で当業者に明らかとなる。したがって、本発明は、クレームが資格を有する等価物の全範囲と合わせて、添付クレームの文言によってのみ限定されるべきものである。
【００８０】
実施例１
ＤＮＪおよびＤＮＪ誘導体によるＧａａの増強。以下で記述する実験は、糖脂質合成を担当する酵素の公知の阻害物質であるＤＮＪおよびＤＮＪ誘導体Ｎ−ブチル−ＤＮＪも、糖脂質合成を阻害することなく変異Ｇａａに結合しその活性を増強することができるということを示している。
【００８１】
方法
細胞の培養および播種。ＰＭ１１（Ｐ５４５Ｌ）、ＰＭ８およびＰＭ１２（両方共スライシングの欠陥）、線維芽細胞系を、増強実験のために使用した。これらの細胞はポンペ患者から単離した線維芽細胞である。細胞を、無菌黒色透明底９６ウェルのＣｏｓｔａｒ平板内の１８０μＬの培地中に１ウェルあたり約５０００細胞の割合で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で約３〜６時間インキュベートした。培地は、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを伴うＤＭＥＭで構成されていた。
【００８２】
薬剤処置。全ての被験化合物を１：１のＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ中で、１００ｍＭの原液濃度まで溶解させる。別の無菌黒色透明底Ｃｏｓｔａｒ平板を用いた細胞の階段希釈を以下のように実施する。
１．  １：１のＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏを２０μＬと培地１８０μＬを、培地中でＤＭＳＯが５％、Ｈ２Ｏが５％という濃度となるように行３−１１、および行１、列Ｅ−Ｈに加えた。
２．  １００ｍＭのＤＮＪの２０μＬおよび培地１８０μＬを、ＤＮＪの濃度が１０ｍＭとなるように行１、列Ａ−Ｄに添加した。
３．  それぞれ１００ｍＭの被験原液３０μＬを、１０ｍＭの濃度となるように２７０μＬの培地と共に行２内の適切なウェルに加えた。
４．  マルチチャンネルピペットを用いて行１を３回上下に混合した。
５．  行２を上述の通りに混合し、行２から行３に１００μＬを移した。行３を上述の通りに混合し、１００μＬを行４〜１１の各々に対し逐次移し（行１２はブランクのまま放置）、３倍階段希釈物を生成した。
４．  ２０μＬを表１にしたがって階段希釈物平板から移した。
５．  平板を６日間（一日目を投薬日として）３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【００８３】
酵素活性検定。細胞を２００μＬのｄＰＢＳで２回洗浄し、その後クエン酸塩−リン酸塩緩衝剤（３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、４０ｍＭの第２リン酸ナトリウム、ｐＨ４．０）中の基質（２．１１ｍＭ３ｍＭの４−ＭＵ−α−Ｄ−ｇｌｕ）７０μＬおよび２．５％のＤＭＳＯを行１〜１２に添加した。５％ＣＯ２と共に３７℃で約３時間インキュベートした後、７０μＬの停止緩衝剤（０．４Ｍのグリシン、ｐＨ１０．８）を行１〜１２に添加した。Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルカウンターＷａｌｌａｃ蛍光平板読取り装置内で平板を読取り、３５５ｎｍの励起および４６０ｎｍの発光で１ウェルあたり１秒の読取り時間を用いてＦ４６０ｎｍでの蛍光をｂとして判定した。発出された蛍光量から上清中のタンパク質１μｇあたりの酵素活性を計算したが、これは、加水分解された基質の量ひいては溶解物中のＧａａ活性の量に正比例している。増強比は、ＤＮＪ誘導体の存在下でのＧａａ活性を化合物無しのＧａａ活性で除したものである。
【００８４】
結果
ＤＮＪ、ＮＢ−ＤＮＪおよびＮ−（シクロプロピル）メチルＤＮＪ。図１に示す通り、ＤＮＪ（１）、Ｎ−ブチル−ＤＮＪ、（５）およびＮ−（シクロプロピル）メチルＤＮＪ（１１）で処置された細胞は、ＰＭ１１細胞系内の未処置の対照細胞に比べてＧａａ活性の用量依存性の増加を示した。１ｍＭというＤＮＪの最高濃度は、未処置の細胞におけるＧａａ活性（データ示さず）と比べてＧａａ活性を約７．８倍増大させる。
【００８５】
ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪも同様に、５０μＭという濃度でＰＭ１２細胞系内でＧａａ活性を著しく（２倍超）増加させた。ＤＮＪによるＰＭ８細胞系内のＧａａ活性の増大は同じく一切観察されなかった（データ示さず）。ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪによるＧａａの増強は、用量依存性であり、増強の増加は、水平域に先立つ３．０〜１．００μＭの範囲内で実証された（データ示さず）。
【００８６】
その他のＤＮＪ誘導体。下表１および２で報告されている通り、ＤＮＪ誘導体Ｎ−メチル−ＤＮＪ、Ｎ−（２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド）エチルオキシ−ＤＮＪ（１５）、Ｎ−４−ｔ−ブチルオキシカルボニル−ピペリジニルメチル−ＤＮＪ（１６）、Ｎ−２−Ｒ−テトラヒドロフラニルメチル−ＤＮＪ（１７）、Ｎ−２−Ｒ−テトラヒドロフラニルメチル−ＤＮＪ（１８）、Ｎ−（２−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）エチル−ＤＮＪ（１９）、Ｎ−２−メトキシエチル−ＤＮＪ（２０）、Ｎ−２−エトキシエチル−ＤＮＪ（２１）、Ｎ−４−トリフルオロメチルベンジル−ＤＮＪ（２３）、Ｎ−α−シアノ−４−トリフルオロメチルベンジル−ＤＮＪ（２４）、Ｎ−４−トリフルオロメトキシベンジル−ＤＮＪ（２５）、Ｎ−４−ｎ−ペントキシベンジル−ＤＮＪ（２６）およびＮ−４−ｎ−ブトキシベンジル−ＤＮＪ（２７）も同様に、ＰＭ−１１内のＧａａ活性を著しく増加させた。Ｎ−メチルＤＮＪおよびＮ−カルボキシペンチルＤＮＪを用いたＧａａ活性の増加は、約３〜１００μＭで用量依存性であった（データ示さず）。
【００８７】
％Ｅｍａｘとは、１ｍＭのＤＮＪの存在下で観察された増強との比較における実験化合物の最大増強百分率を意味する。それは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン３．０２を用いて解析された理論上の非線形回帰曲線の頂部として計算される。増強は、１ｍＭのＤＮＪの存在下での平均最大計数および化合物の不在下での最小平均計数に正規化された多数の蛍光計数の平均として定義される。蛍光計数はバックグラウンド除去された。バックグラウンドは、細胞の存在から不在を減じた平均計数により定義される。ＥＣ５０（μＭ）は、Ｅｍａｘの５０％を達成する化合物の濃度を意味する。
【００８８】
特定の機序に限定されることなく、ＤＮＪおよびＤＮＪ誘導体は、ＥＲ内の変異Ｇａａに結合し、変異を受けたタンパク質の適正な折り畳みを誘発し、酵素がＥＲを退出し、それが酵素活性を若干示し得るリソソームまで輸送されることを可能にする。
【００８９】
【表１】
2011512876.tif 000003
【００９０】
【表２】
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【００９１】
【表３】
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【００９２】
【表４】
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【００９３】
【表５】
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【００９４】
実施例２：ＤＮＪおよびＤＮＪ誘導体を用いた処置時点での生体内Ｇａａ活性
薬剤投与。この実施例は、マウスに対するＤＮＪ誘導体の効果についての情報を提供する。ＤＮＪ誘導体被験化合物を０．１ｍｇ／ｋｇ／日；１０ｍｇ／ｋｇ／日；および１００ｍｇ／ｋｇ／日の割合でマウスに投与し、臓器および血漿を、研究の開始から２週間および４週間後に収集した。１グループあたり２０匹の雄のＣ５７ＢＬ６（２５ｇ）マウスを使用した。薬剤を飲料水に入れて与え、こうして毎日水の消費を監視した。
【００９５】
対照グループ（０ｍｇ／ｋｇ／日）では、マウスに毎日飲料水（薬剤無し）を投与し、２つのグループに分けた。２週間の処置の後１０匹の動物を安楽死させ、下行大動脈または大静脈から血液を収集し、組織を収穫し、その後剖検した。４週間の処置の後、残りの１０匹の動物を安楽死させ、同じ評価に付した。
【００９６】
第１の被験グループにおいては、２０匹のマウスに、１ｍｇ／ｋｇ−日という投与目標で飲料水中に入れて毎日投薬した（体重２５ｇのマウスが、一日５ｍＬの飲水速度を有すると仮定すると、飲料水は０．０２５ｍｇ／５ｍｌまたは５マイクログラム／ｍｌの濃度を有するべきである）。対照と同様に、１０匹のマウスを２週間の処置後に安楽死させ、評価した。４週間の治療後、残りの１０匹の動物を安楽死させ、評価した。
【００９７】
１０ｍｇ／ｋｇ−日を目標とする被験化合物については、飲料水中に入れて毎日２０匹のマウスに投薬し（５０マイクログラム／ｍｌの化合物濃度を推定）、以上のグループについて記述した通り試験のため２つのグループに分けた。
【００９８】
１００ｍｇ／ｋｇ−日を目標とする被験化合物については、飲料水中に入れて毎日２０匹のマウスに投薬し、（５００マイクログラム／ｍｌの化合物濃度を推定）、以上のグループについて記述した通り２つのグループに分けて試験した。
【００９９】
血液標本をリチウムヘパリン中に引き込み、血漿のために転回させた。血を抜いた後、心臓、肝臓、腓腹筋、ヒラメ筋、舌、腎臓および脳を取り出し、バイアル中に置いた。このバイアルを急速凍結のためドライアイス内に入れた。その後、Ｇａａおよびグリコーゲンの組織レベルについて組織および血漿を分析した。
【０１００】
組織調製。ごく一部の組織を取り出し、５００μｌの溶解緩衝剤（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むｐＨ４．０の２０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび４０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム）に添加した。その後、短時間マイクロホモジナイザーを用いて組織を均質化し、その後４℃で１０分間、１０，０００ｒｐｔで遠心分離した。新しい管に上清を移し、酵素検定に使用した。
【０１０１】
組織酵素検定。２．５μｌの上清（９６ウェル平板中）に対して、１７．５μｌの反応緩衝剤（リン酸クエン酸塩緩衝剤、Ｔｒｉｔｏｎ無し）および５０μｌの４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）標識基質、α−グルコピラノシドまたは標識された負の対照、β−グルコピラノシドおよびα−ガラクトピラノシドを添加した。１時間３７℃で平板をインキュベートし、その後７０μｌの停止緩衝剤（０．４Ｍのグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ１０．６）を添加した。１ウェルあたり１秒の読取り時間（Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルカウンターＷａｌｌａｃ）を用いて３５５ｎｍで励起することで４６０ｎｍでの吸収度を測定することにより、Ｇａａの活性を判定した。酵素活性を、添加された溶解物のμｌ単位量に正規化し、溶解物１μｌあたりの酵素活性を推定した。増強比は、化合物無しの活性に対する化合物有りの活性に等しい。
【０１０２】
結果
図２Ａ−Ｄおよび図３Ａ−Ｄにより実証されている通り、Ｇａａレベルは、脳、肝臓、腓腹筋、舌（図２Ａ−Ｄ）においてと同様、腎臓、横隔膜、心臓およびヒラメ筋（図Ａ−Ｄ）内においてもＤＮＪおよびＮ−ブチル−ＤＮＪでの２週間の処置の後に増加した。結果は、線形トレンドについて有意であった。ＤＮＪについては、増加は、脳、腓腹筋、舌、腎臓、横隔膜、心臓およびヒラメ筋において用量依存性であった（線形トレンドについて有意）。Ｎ−ブチル−ＤＮＪについては、増加は、脳、肝臓、腓腹筋、舌および腎臓において用量依存性であった。
【０１０３】
４週間の処置の後、Ｇａａ活性の増加が、脳、肝臓、腓腹筋および舌（図４Ａ−Ｄ）と同様、腎臓、横隔膜、心臓およびヒラメ筋（図５Ａ−Ｄ）においても、ＤＮＪでの処置後に観察された。Ｎ−ブチルＤＮＪについての結果は、増加が見られなかった横隔膜、心臓およびヒラメ筋を除いて、類似していた。増加は、脳、腓腹筋、舌、腎臓（ＤＮＪのみ）、横隔膜（ＤＮＪのみ）、心臓（ＤＮＪのみ）およびヒラメ筋（ＤＮＪのみ）において用量依存性であるように思われた。
【０１０４】
これらの結果は、特異的薬理シャペロンが非変異Ｇａａの活性を生体内で増加させることができる、ということを確認している。
【０１０５】
実施例３：ＤＮＪ誘導体に対する曝露を伴うおよび伴わないＧａａの蓄積および局在化
この実験においては、残留Ｇａａ活性をほとんど乃至全く示さなかったポンペ患者に由来する４つの細胞系を、Ｇａａの蓄積および局在化について野生型線維芽細胞と比較した。
【０１０６】
方法
細胞系。ＰＭ８、ＰＭ９、ＰＭ１１およびＰＭ１２細胞系を評価した。ＰＭ８は、一部の残留Ｇａａ活性を結果としてもたらすスプライシング欠陥を有しており（ＩＶＳ１ＡＳ、Ｔ＞Ｇ、−１３）；ＰＭ９は、１つの対立遺伝子（Ｒ８５４Ｘ）上にナンセンス変異を、そしてもう一方の対立遺伝子（Ｄ６４５Ｅ、Ｖ８１６ＩおよびＴ９２７Ｉ）上に３つのミスセンス変異を有し、本質的に残留Ｇａａ活性を全く有しておらず（＜１％）；ＰＭ１１は、ミスセンス変異（Ｐ５４５Ｌ）を含み、幾分かの残留Ｇａａ活性を有する。ＰＭ１２は同様にスプライシング欠陥（ＩＶＳ８＋Ｇ＞Ａ／Ｍ５１９Ｖ）も有している。
【０１０７】
免疫蛍光および顕微鏡法。を伴ってまたは伴わずに５日間培養した細胞を、ＮＢ−ＤＮＪを伴うガラス製カバースリップ上で、５日間成長させた。細胞を３．７％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定し、５分間０．５％のサポニンで透過化し、その後ウサギ抗ヒトＧａａ（Ｂａｒｒｙ  Ｂｙｒｎｅ氏から寄贈）および／またはマウスモノクローナル抗−ＬＡＭＰ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５７９８）の１：３００希釈物で一時間室温で標識した。二次抗体すなわちＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８と複合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５９４と複合させたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を次に１：５００希釈度で添加し、室温で１時間インキュベートした。１０μｌのＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄを伴うスライド上にカバースリップを置き、速乾性マニュキュア液で密閉し、９０ｉ  Ｎｉｋｏｎ  Ｃ１共焦点顕微鏡で検分した。
【０１０８】
結果
ＰＭ８。残留Ｇａａ活性をほとんど有していないにも関わらず、ＰＭ８細胞は、野生型線維芽細胞と比べてＬＡＭＰ−１およびＧａａ細胞質ゾル染色の増加を示し、異なる染色パターンを有していた。図６に示されている通り、ＮＢ−ＤＮＪで処置された野生型線維芽細胞は、ＬＡＭＰ−１およびＧａａの両方について断続染色パターンを示し（図６Ｃ−Ｄ）、これはリソソーム内で共局在化するように思われた。これとは対照的に、ＰＭ８線維芽細胞内では、染色は、ＬＡＭＰ−１およびＧａａの両方について細胞質内で拡散的であった（図６Ａ−Ｂおよび６Ｅ−Ｆ）。集密的な野生型線維芽細胞内のＬＡＭＰ−１およびＧａａの両方のオーバーレイは、リソソームに対する共局在化を裏付けており（図６Ｈ）、一方集密的ＰＭ８線維芽細胞内のオーバーレイは、ＬＡＭＰ−１およびＧａａの細胞質ゾル余剰を裏付けている（図６Ｇ）。上述の結果は、リソソーム形成における欠陥の可能性または異常に形成されたエンドソーム／リソソーム構造の大きな凝集体（アグレソーム）の存在を示唆している。
【０１０９】
ＰＭ９。ＰＭ９線維芽細胞も同様に、細胞質ゾル（図７Ｂ）中のＧａａ（図７Ｂおよび７Ｄ）およびＬＡＭＰ−１（図７Ｅ）染色の余剰を示した。オーバーレイは、アグレソームに似たＧａａ凝集体の形成を示す（図７Ａ、７Ｃおよび７Ｆ、矢印およびインレイはアグレソームを示す）。ＤＮＪ誘導体での処置がリソソームに対するＧａａの局在化を回復させ、アグレソーム形成を削減するものと予想される。ＤＮＪ誘導体での処置が、リソソームに対するＧａａの適正な局在化を回復させ、細胞質ゾルアグレソームの存在を削減するものと予想される。
【０１１０】
ＰＭ１１。ＰＭ１１線維芽細胞は、Ｇａａ活性の低下を示す。ＮＢ−ＤＮＪ（５０μＭ）およびＤＮＪ（１００μＭ）で処置された時点で、ＰＭ１１細胞は、リソソームマーカーＬＡＭＰ−１での共標識化により査定される通り、リソソーム内のＧａａの標識化についての強度の増加を示し、輸送の回復を標示する（図８）。未処置のＰＭ１１線維芽細胞は幾分かのＧａａ染色を示し、そのほとんどがＬＡＭＰ−１と共局在化しない。
【０１１１】
さらに、ＰＭ１１細胞内の欠陥がリソソームへのリソソーム酵素（Ｇａａ）の輸送であることを確認するために、野生型線維芽細胞およびＰＭ１１細胞を、それぞれ早期および後期エンドソームマーカーＥＥＡ１およびＭ６ＰＲについて染色した。野生型線維芽細胞とポンペＰＭ１１線維芽細胞の間には、早期および後期エンドソームについての局在化パターンの差は一切存在しなかった（データ示さず）。
【０１１２】
ＰＭ１２。ＮＢ−ＤＮＪで処置されたＰＭ１２線維芽細胞内には、Ｇａａ染色強度の有意な増加も同様に観察された（データ示さず）。
【０１１３】
論述
この実施例は、本発明の薬理シャペロンが、Ｇａａを不安定化し、合成中にＥＲから退出できないようにする変異以外の（およびそれに加えた）Ｇａａ内の変異を包含する細胞の表現型を回復できる、ということを実証している。このことは、筋肉などの組織内のポンペ病の一部の病原性効果を改善するためには、たとえリソソーム内のＧａａ加水分解酵素活性の回復が無くてもＥＲからリソソームへの変異Ｇａａの輸送を改善するだけで充分であるかもしれないという仮定を裏付けるものである。グリコーゲン代謝回転が、ポンペ病における患者の表現型を改善するのに充分でないことは明白である。したがって、輸送における改善がポンペ病変をどうして改善し得るかについての１つの仮説は、Ｇａａ活性の欠如が細胞内のグルコース欠損を引き起こし、それが（グルコースの急速放出のために細胞質グリコーゲンを使用するための）自食性応答の引き金となるかそれを永続化させるかもしれないというものである。この自食性応答は、エンドソーム輸送経路を通した輸送を損ない、結果として膜安定化タンパク質の誤った輸送をもたらし、最終的には、筋肉繊維を破壊する。
【０１１４】
シャペロン療法は、Ｇａａ活性をレスキューし、グルコース欠損およびそれによって誘発される自食性応答を軽減させ、最終的に膜安定化タンパク質の輸送を回復させて、さらなる筋肉の損傷を妨げるかもしれない。
【０１１５】
実施例４：腸内Ｇａａに対するＤＮＪ誘導体の効果：カウンタースクリーニング
理想的な特異的薬理シャペロンは阻害濃度未満の濃度で腸内Ｇａａを阻害することなくリソソームＧａａを増強させる。したがって、腸内Ｇａａ活性を、７．０というｐＨでマウスの腸由来の粗製抽出物中で評価した。さらに、ＤＮＪおよびＮＢ−ＤＮＪなどの化合物が腸内Ｇａａに対し阻害的効果を及ぼしたか否かを判定するために、腸内Ｇａａ酵素阻害検定が確立された。
【０１１６】
方法
組織調製。上述の通りに、Ｃ５７ＢＫ６マウス由来のマウスの腸から、粗製抽出物を調製した。上清を新しい管に移し、酵素検定のためにこれを使用した。
【０１１７】
結果
ＤＮＪは、１μＭのＩＣ５０値をもつ腸内Ｇａａのより強力な阻害物質であり、一方ＮＢ−ＤＮＪは、２１μＭというＩＣ５０阻害値を有していた（データ示さず）。
【０１１８】
実施例５：ＤＮＪ誘導体でのポンペ患者の治療
以上の結果を考慮すると、本発明のＤＮＪおよびＤＮＪ誘導体でのポンペ患者の治療は、筋組織内のグリコーゲンの病的蓄積を削減して疾病の状態を改良する。現在承認されている唯一のポンペ病治療ＥＲＴは、組換え型酵素が筋肉組織に侵入できないことから、骨格筋内のグリコーゲン蓄積を削減する上で有効ではないという事実を考慮すると、この方法は当該技術分野における永年にわたる切実なニーズを解決するものである。
【０１１９】
方法
患者集団。乳幼児、若年および／または成人発症型のポンペ病を患う患者が募集され、経口投与されたＤＮＪ誘導体の無作為、２重盲検、複数回用量、非盲検試験において評価される。患者が治療適格であるためには、少なくとも以下のもののうちの１つを有していなくてはならない：ａ）断面心エコー検査法により判定される左心室重量指数（ＬＶＭＩ）として定義される心筋ミオパシー；ｂ）観血的または非観血的換気補助の必要性（ここで非観血的換気というのは、気管内チューブを使用することなく適用されるあらゆる形態の換気補助として定義される）；またはｃ）デンバー式発達スクリーニング検査（ＤＤＳＴ−２； Hallioglo et al., Pediatr Int. 2001; 43(4):400-4）で通常の年齢対等者の９０％が達成できる粗大運動技術の遂行不能として定義される重度の運動遅滞。
【０１２０】
薬剤投与。１０名の対照からなる２つのグループに、２４週間にわたり１日２回５０ｍｇまたは１００ｍｇのＤＮＪまたはＤＮＪ誘導体のいずれかを与える。これはゴーシェ病において基質のスフィンゴ糖脂質喪失のために示される量よりも低いものである。
【０１２１】
評価項目。臨床的効能は、例えばデンバー式発達スクリーニング検査およびアルバータ乳幼児運動発達評価法（Piper et al., Motor Assessment of the Developing Infant. Philadelphia, PA, W.B. Saunders Co., 1994）、ベイレー乳幼児スケールＩＩ（BSIDII; Bayley et al., Bayley Scores of Infant Development. 2nd Ed., San Antonio, TX: Harcourt Brace & Co. 1993）、ならびに筋生検の組織学的および生化学的分析すなわち、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）陽性染色および酵素活性検定を用いた治療済み患者対未治療患者におけるグリコーゲンレベルの判定、そして患者から得た線維芽細胞内のＧａａ活性の測定を用いて測定される、人口呼吸器無しでの生存率、左心室重量指数、運動発達および骨格筋機能によって評価される。臨床的測定は、４週、１２週および２４週目に査定される筋生検を除いて、２週間に一度査定される。
【０１２２】
結果
ＤＮＪ誘導体での治療は、症候の一部を改良し、筋組織のグリコーゲンレベルを低下させることから、ポンペ病の治療にとって有効である。例えば、１２週間以内に、筋肉内のＧａａ活性の増加が見られ、筋肉中のグリコーゲンの蓄積が低下すると予想される。さらにＬＶＭＩは削減され、呼吸器症状は改善すると予想される。最後に特に若年患者における運動発達および筋緊張の向上が予想される。
【０１２３】
実施例６：ヒトポンペ患者およびヒト対照における代理マーカーの分析
この研究には、異なる遺伝子型のポンペ患者が含まれていた。酵素補充療法を受けていた任意の患者から、酵素輸注の直前に血液を採取した。ポンペ患者由来の血漿を、炎症（サイトカイン）、筋肉再生、膜無欠性（コラーゲンＩＶ）および自食作用（カテプシンＢ）についてスクリーニングした（図９）。リソソームマーカーカテプシンＤおよび成長因子ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＢＢそしてＨＧＦの血漿レベルは、ＧＳＤ−ＩＩ患者では対照に比べて著しく（Ｐ＜０．０５、対応のないＴ検定）低く、一方カテプシンＢおよびサイトカインＭＩＰ−１αおよびＶＥＧＦは、ＧＳＤ−ＩＩ患者では対照に比べて著しく（Ｐ＜０．０５、対応のないＴ検定）高いものであった。対照の個体と比較した場合、ポンペ患者において、インタロイキン６（ＩＬ−６）レベルの増加、インタロイキン８（ＩＬ−８）レベルの増加、インタロイキン１７（ＩＬ−１７）レベルの増加、コラーゲンＩＶレベルの増加、インタロイキン７（ＩＬ−７）レベルの減少、およびインタロイキン１２ｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２ｐ４０）レベルの減少も検出された。サイトカインレベルについて血漿標本をスクリーニングするためにＭｉｌｌｉｐｏｒｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｌｉｎｃｏｐｌｅｘパネルを使用した。その他全てのマーカーは、市販のＥＬＩＳＡを用いて測定した。グラフ上の線は、ポンペおよび対照グループについての中央値を表わしている。
【０１２４】
本発明は、本明細書中に記載された具体的実施形態によってその範囲が限定されるものではない。実際、以上の記述および添付図面から当業者には、本明細書に記載されているものに加えて本発明のさまざまな修正が明らかになる。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に包含されるものである。
【０１２５】
さらに、全ての値は概数で説明を目的として提供されたものであることを理解すべきである。
【０１２６】
本出願全体を通して、特許、特許出願、刊行物、製品説明およびプロトコルが引用されているが、それらの開示は全ての目的のためその全体が参照により本明細書に援用されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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