(57)【要約】  本発明は、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼに、βインテグリンサブユニットの結合ドメイン、またはその結合ドメインの変異形態もしくは改変形態を提供するポリペプチドを提示するデンドリマー薬剤、および癌細胞の成長を阻害するためのこのデンドリマーの使用に関する。このペプチドは、１種または複数種のポリペプチドを８単位より多く提示しており、そのポリペプチドの例としてペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）が挙げられる。
2011512364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼに、βインテグリンサブユニットの細胞質結合を提供する少なくとも１種のポリペプチド、または前記ＭＡＰキナーゼが結合するその変異形態もしくは改変形態を８単位より多く提示するデンドリマー。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、前記βインテグリンサブユニットの結合ドメインを含む、または前記βインテグリンサブユニットの結合ドメインから成る、請求項１に記載のデンドリマー。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、前記結合ドメインの変異形態または改変形態を含む、請求項１に記載のデンドリマー。
【請求項４】
前記βインテグリンサブユニットの前記結合ドメインは、前記ＭＡＰキナーゼに結合する両末端領域を有し、前記両末端領域は、前記ＭＡＰキナーゼとの結合に必須ではない介在アミノ酸リンカー配列によって互いに連結されている、請求項３に記載のデンドリマー。
【請求項５】
前記βインテグリンサブユニットの前記結合ドメインと比較して、前記介在アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸が前記ポリペプチドにおいて欠失している、請求項４に記載のデンドリマー。
【請求項６】
前記結合ドメインと比較して、前記介在アミノ酸配列中のアミノ酸の全てが前記ポリペプチドにおいて欠失している、請求項５に記載のデンドリマー。
【請求項７】
前記結合ドメインの前記両末端領域が、前記ポリペプチドにおいて変化せずに残っている、請求項３〜６のいずれか１項に記載のデンドリマー。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、Ｒ／ＫｘＲ／Ｋ＊Ｒ／Ｋ−ｘｘ＊ｘ＊ＮＰＬＹ／ＦＲ／Ｋによって表されるアミノ酸配列を含み、またはＲ／ＫｘＲ／Ｋ＊Ｒ／Ｋ−ｘｘ＊ｘ＊ＮＰＬＹ／ＦＲ／Ｋによって表されるアミノ酸配列からなり、ここで、各Ｒ／Ｋは、独立して、アルギニンまたはリジンのいずれかであり、Ｙ／Ｆは、チロシンまたはフェニルアラニンのいずれかであり、ｘは任意のアミノ酸であり、＊は疎水性アミノ酸であり、−はアミノ酸であり、配列−ｘｘ＊ｘ＊の１つ以上のアミノ酸が必要に応じて欠失している、請求項３に記載のデンドリマー。
【請求項９】
−により規定される前記アミノ酸がセリンである、請求項８に記載のデンドリマー。
【請求項１０】
−により規定される前記アミノ酸が欠失している、またはスレオニン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸である、請求項８に記載のデンドリマー。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、Ｒ／ＫｘＲ／Ｋ＊Ｒ／ＫＮＰＬＹ／ＦＲ／Ｋによって規定されるアミノ酸配列を有する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のデンドリマー。
【請求項１２】
前記βインテグリンサブユニットの前記結合ドメインの前記変異形態または改変形態が、少なくとも２つの正に荷電したアミノ酸残基を含む、請求項３または４に記載のデンドリマー。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、ＲＳＫＡＫＷＱＴＧＴＮＰＬＹＲ（配列番号２）、ＲＡＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫ（配列番号３）、ＲＳＲＡＲＹＥＭＡＳＮＰＬＹＲ（配列番号４）、ＫＥＫＬＫＳＱＷＮＮＤＮＰＬＦＫ（配列番号５）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）、ＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）、ＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）、およびＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ（配列番号９）から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、またはその群より選択されるアミノ酸配列から成る、請求項３または４に記載のデンドリマー。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、１０アミノ酸長以上である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のデンドリマー。
【請求項１５】
前記デンドリマーが、前記ポリペプチドを１０単位提示する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のデンドリマー。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、１つ以上のＤ−アミノ酸を含み、かつ／またはタンパク質分解からＮ末端もしくはＣ末端が保護されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のデンドリマー。
【請求項１７】
前記βインテグリンサブユニットが、β２、β３、β５、およびβ６から成る群より選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のデンドリマー。
【請求項１８】
前記ＭＡＰキナーゼがＥＲＫ２である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のデンドリマー。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のデンドリマーを、薬学的に許容可能なキャリアと一緒に含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のデンドリマーの有効量で癌細胞を処置する工程を包含する、癌細胞の成長を阻害するための方法。
【請求項２１】
哺乳動物における癌の予防または処置のための方法であり、前記デンドリマーを前記哺乳動物に投与する工程を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記βインテグリンサブユニットが前記癌の癌細胞によって発現される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、乳癌、結腸癌、胃癌および前立腺癌から選択される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞の成長および／または増殖の阻害、ならびにそのためのデンドリマー薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞の転移には、細胞外マトリックス足場を通る腫瘍細胞移動、基底膜の浸潤、循環腫瘍細胞の捕捉、腫瘍細胞の管外遊出、および転移部位における腫瘍細胞の増殖が関与する。一次腫瘍塊からの細胞の解離および細胞周囲環境の改変が、血管およびリンパ管中への腫瘍細胞の進入を助ける。大多数の悪性疾患を患う患者の運命を最終的に決定するのは、腫瘍細胞の潜在的な浸潤能力および転移能力である。したがって、腫瘍形成は、癌細胞が増殖し、周囲のマトリックスバリアを消化する能力を反映する、組織リモデリング過程と見なされ得る。これらの事象は、少なくともある程度、細胞接着分子およびマトリックス分解酵素によって調整されると考えられている。
【０００３】
癌細胞表面の細胞接着レセプタは、細胞増殖、移動、浸潤および転移を調整し得る複雑な細胞シグナル伝達に関与し、これらの事象に寄与するいくつかの接着分子のファミリー（インテグリン、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリー、ヒアルロン酸レセプタ、およびムチンを含む）が、これまでに同定されている。一般的に、これらの細胞表面分子が、細胞−細胞結合および細胞−マトリックス結合の両方を仲介し、後者は、腫瘍細胞の細胞外足場分子（例えば、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニン）への付着を含む。
【０００４】
細胞接着分子の全てのファミリーのうち、最も良く特徴付けられているのは、インテグリンとして知られるファミリーである。インテグリンは、いくつもの基本的な過程（白血球動員、免疫活性化、血栓形成、創傷治癒、胚形成、ウイルス内在化および腫瘍形成を含む）に関与する。インテグリンは、細胞外マトリックス分子と細胞骨格成分の間で構造上および機能上の橋渡しを細胞に提供する、密接に関連するアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖から成る膜貫通糖タンパク質である。インテグリンファミリーは、１７種の異なるαサブユニットおよび８種のβサブユニットを包含し、そのαβの組み合わせは、３つのサブファミリーに組み込まれる。
【０００５】
β２の呼称で呼ばれる白血球インテグリンサブファミリーを除き、残りのインテグリンは、共通の鎖を共有することに基づいてβ１およびαｖと呼ばれる２つの主要なサブグループに分類される。
【０００６】
β１サブファミリーにおいて、β１鎖は、９つのα鎖メンバー（α１〜９）のうちのいずれか１つと組み、β１と会合するα鎖が、そのレセプタのマトリックス結合特異性を決定する。例えば、α２β１はコラーゲンおよびラミニンと結合し、α３β１はコラーゲン、ラミニンおよびフェブロネクチンと結合し、α５β１はフィブロネクチンと結合する。αｖレセプタサブファミリーにおいて、豊富な混交のαｖ鎖は、５つのβ鎖のうちのいずれか１つと組む。αｖインテグリンを特色付ける特徴は、それらが全て、それらが接着するマトリックス分子中に存在するアルギニン−グリシン−アスパルタート（ＲＧＤ）（配列番号１）配列を識別し、高親和性で結合することである。
【０００７】
インテグリンについての現在知られている像は、αおよびβサブユニットのＮ末端ドメインが一緒になって１つのリガンド結合頭部（ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｅａｄ）を形成するというものである。陽イオン結合ドメインを含むこの頭部は、両サブユニットに対応する２つの柄（ｓｔａｌｋ）によって、膜貫通部分に、したがって、２つの細胞質ドメインに連結される。βサブユニットは全て、アミノ酸レベルでかなりの類似性を示す。２１０ｋＤａであるより大きなβ４を例外として、全て、９０と１１０ｋＤａの間の分子量を有する。同様に、４８個を有するβ４を例外として、これらは全て、５６個の保存されたシステイン残基を含む。これらのシステインは、ジスルフィド結合によって内部連結されていると考えられている４つの反復パターン中に配される。αサブユニットは、１５０〜２００ｋＤａの範囲にわたる分子量を有する。これらはβ鎖よりも低い程度の類似性を示すが、全て、非反復ドメインを間に置いた７つの反復アミノ酸配列を含む。
【０００８】
βサブユニット細胞質ドメインは、インテグリンを細胞骨格と連結させるために必要とされる。多くの場合、この連結はフォーカルコンタクトへの局在化に反映され、α−アクチニン、テーリンおよびフォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）を含むシグナル伝達複合体の構築を引き起こすと考えられている。β１インテグリンのフォーカルコンタクト局在化に必要とされる少なくとも３つの異なる領域が、詳細に説明された（Ｒｅｓｚｋａ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。これらの領域は、β２、β３、β５、β６およびβ７インテグリンサブユニットの細胞質ドメインにおいても見出される保存配列を含んでいる。これら細胞質ドメイン間のシグナル伝達能に関する機能上の差異は、未だ確立されていない。
【０００９】
インテグリンβ６サブユニットは、αｖβ６ヘテロダイマーの一部として培養上皮細胞中に初めて同定され、αｖβ６複合体は、ヒト膵臓癌腫細胞においてアルギニン−グリシン−アスパルタート（ＲＧＤ）依存様式でフィブロネクチンと結合することが証明された（Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）。β６サブユニットは７８８個のアミノ酸から成り、他のインテグリンサブユニットβ１〜β５と３４〜５１％の配列相同性を共有する。β６サブユニットはまた、細胞外ドメインに９つの潜在的グリコシル化部位を含む（Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）。これらの細胞質ドメインは、インテグリンサブユニット間で高度に保存されている４１アミノ酸の領域および特有の１１アミノ酸のカルボキシ末端伸長領域から成るという点で、他のサブユニットと異なる。この１１アミノ酸の伸長領域は、フォーカルコンタクトへのβ６の局在化に必要でないことが示された。それどころか、その領域の除去はレセプタ局在化を強めるようである。しかしながら、フォーカルコンタクトへのβ１インテグリンの局在化に重要であると確認された３つの保存領域（Ｒｅｓｚｋａ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）のいずれの除去も、フォーカルコンタクトへのβ６の動員を無くすことが示された（Ｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）。
【００１０】
インテグリンαｖβ６は、インビトロおよびインビボで結腸癌細胞の成長を増強することが以前に示されており、この成長増強効果は、少なくともある程度、αｖβ６により媒介されるゼラチナーゼＢ分泌に起因する（Ａｇｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。この上皮に限定されたインテグリンを癌においてとりわけ興味深くしてきたのは、それが正常上皮細胞では発現されないか非常に低いレベルで発現されるが、創傷治癒および腫瘍形成の間には特に腫瘍細胞島の浸潤縁で高度に発現される（Ｂｒｅｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９５；Ａｇｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）ことである。
【００１１】
インテグリンは、細胞膜を貫いてどちらの方向にもシグナルを伝達し得る。インテグリンの細胞外結合活性は、例えばインテグリン細胞質ドメインのリン酸化により細胞内部から調整され得るが（インサイドアウトシグナル伝達）、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の結合は、細胞内に伝達されるシグナルを誘発する（アウトサイドインシグナル伝達）。アウトサイドインシグナル伝達は、２つの記述上のカテゴリーに大きく分けられ得る。１つ目は、インテグリンの連結およびクラスター化が唯一の細胞外刺激である「直接的シグナル伝達」である。要するに、ＥＣＭタンパク質の接着が、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、フォーカルアドヒージョンキナーゼＦＡＫ）およびセリン／スレオニンキナーゼ（例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードにおけるセリン／スレオニンキナーゼ）を活性化し、脂質代謝（例えば、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（Ｐ１Ｐ２）の合成）を刺激し得る。インテグリンシグナル伝達の２つ目のカテゴリーは、インテグリン媒介性の細胞接着が、他種のレセプタ（特にポリペプチド増殖因子により活性化される受容体型チロシンキナーゼ）により開始されるシグナル伝達事象を調節する「協同的シグナル伝達（ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）」である。しかしながら、全ての場合において、インテグリン媒介性の接着が、細胞質ゾルまたは核への能率的なシグナルの伝達に必要とされるようである。
【００１２】
ＭＡＰキナーゼは、原形質膜における種々のレセプタ開始シグナル伝達事象の収束点として機能する。ＭＡＰキナーゼ経路の核となる構成単位は、ＭＡＰキナーゼがＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）によりリン酸化され、同様に、ＭＡＰキナーゼキナーゼがＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（例えば、Ｒａｆ−１）によりリン酸化される、３メンバープロテインキナーゼカスケードである。ＭＡＰキナーゼファミリーの１２メンバータンパク質には、チロシンおよびスレオニン残基のリン酸化により活性化される細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）があり（Ｂｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１）、これは、既知の全てのＭＡＰキナーゼアイソフォームに共通する活性化の種類である。ＥＲＫ１／２（それぞれ４４ｋＤおよび４２ｋＤのＭＡＰキナーゼ）は、９０％のアミノ酸同一性を共有し、シグナル伝達経路の遍在する構成要素である（Ｂｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１）。これらセリン／スレオニンキナーゼは、調整機能を有する多くのタンパク質（他のプロテインキナーゼ（例えば、ｐ９０ｒｓｋ）、細胞骨格タンパク質（例えば、微小管関連ホスホリパーゼＡ２）、上流調節因子（例えば、上皮成長因子レセプタおよびＲａｓ交換因子）および転写因子（例えば、ｃ−ｍｙｃおよびＥｌｋ−１）を含む）をリン酸化し、機能調節する。ＥＲＫは、成長促進事象において、特に細胞が利用し得る成長因子の濃度が限られている場合、主要な役割を果たす（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９９）。
【００１３】
最近になって、ＭＡＰキナーゼがインテグリンの細胞質ドメインと直接関連することが見出され、ＥＲＫ２に対するβ３、β５およびβ６の結合ドメインが特徴付けられた（国際特許出願ＷＯ２００１／０００６７７号パンフレットおよび国際特許出願ＷＯ２００２／０５１９９３号パンフレット参照）。これらの特許出願はまた、癌細胞の成長が各結合ドメインを含むペプチドによって阻害され得ることを明らかにした。β２に対する結合ドメインも、国際特許出願ＷＯ２００５／０３７３０８号パンフレットに報告されている。
【００１４】
当該技術分野において、様々な組織内のβ６インテグリンサブユニットの分布がインサイチューハイブリダイザーションおよび免疫染色の両方により評価され、報告されてきた。例えば、成体霊長類組織においてβ６ｍＲＮＡは上皮細胞中のみに検出され、大多数の正常組織において非常に低いレベルかまたは検出不可能なレベルであった（Ｂｒｅｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９３）。β６の高レベルの発現が分泌子宮内膜腺中に観察された一方で、低レベルの発現が唾液腺、乳腺および精巣上体の腺管上皮中、胆嚢および膀胱中、ならびに消化管中に検出された。
【００１５】
免疫染色データはまた、β６発現が上皮に制限され、形態形成事象、腫瘍形成および上皮修復と並行してアップレギュレートされることを明らかにした（Ｂｒｅｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９３；１９９５）。腎臓、肺および皮膚の発達の間β６は特定の種類の上皮細胞によって発現されるが、正常成体の腎臓、肺および皮膚においてはほとんどの場合検出不可能である。対照的に、β６の高レベルの発現が数種の癌腫において観察された。例えば、β６は、口腔粘膜由来の扁平上皮癌においてはほぼ必ずネオマイシン耐性遺伝子が発現され（ｎｅｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）、多くの場合、腫瘍細胞島の浸潤縁において局所的に局在する（Ｂｒｅｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）。さらに、β６サブユニットの発現は、腎細胞癌腫細胞株および精巣腫瘍細胞株において観察され（Ｔａｋｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）、肺癌の５０％がこのサブユニットを発現することが明らかにされた（Ｓｍｙｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）。
【００１６】
最近の研究はまた、αｖβ６が結腸直腸癌における主要なフィブロネクチン結合レセプタであることを明らかにした（Ａｇｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。また、癌患者からの正常結腸上皮は、免疫染色試験においてαｖβ６を発現せず、口腔粘膜由来の扁平上皮癌について（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）と同様に、結腸癌における最大のβ６発現が腫瘍細胞島の浸潤縁において観察された（Ａｇｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。
【００１７】
実際に、β６サブユニットは様々に由来の異なる癌において広範に観察される（Ｂｒｅｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）。例えば、β６は腸癌腫瘍の少なくとも５０％において検出される。他には、口腔咽頭癌におけるその存在が報告されており、腸癌において一般的に見出されるように、口腔咽頭癌においても癌細胞島の浸潤縁に存在し、強く発現される。口腔咽頭粘膜においては、β６は口の正常管壁細胞に全く観察されないが、口腔咽頭粘膜由来の原発性腫瘍および転移性腫瘍に観察される。分化の程度と関連しないβ６の強い発現が見られ、特に、上皮細胞の基底層に制限される。
【００１８】
β６の発現は、実験的上皮創傷治癒の間に創縁にて遊走ケラチノサイトにおいてもアップレギュレートされる。αｖβ６は正常上皮においては発現されない（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。しかしながら、実験的創傷後、αｖは、再上皮形成の間にヘテロ二量体の会合をβ５からβ６サブユニットに変えるようである。創傷から３日後にβ６は存在しないが、次いで、遊走表皮の基底細胞の周囲に現れる。
【００１９】
ヒト粘膜創傷においては、β６の最大発現が観察されたのは比較的遅く、上皮層（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｈｅｅｔ）が融合され、肉芽組織が存在するときであった（Ｈａａｐａｓａｌｍｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。さらに、この研究者らは、αｖβ６発現とともに、テネイシンの最大発現を観察した。興味深いことに、新たに単離されたケラチノサイトはβ６を発現しないが、継代培養後にこの発現を開始することが見出された。結腸癌細胞において観察された持続的なαｖβ６の発現とは対照的に、遊走ケラチノサイトにおけるαｖβ６の新たな発現は、いったん再上皮形成が終わると、検出不可能なレベルまでダウンレギュレートされる。さらに、正常な無傷の皮膚においては、他の正常上皮と同様に、αｖβ６発現は本質的に存在しない。
【００２０】
これまでに、様々な方法が、投与された治療用ペプチドの半減期を拡張するため、またはそのようなペプチドの標的細胞への進入を促進するために用いられてきた。そうした方法は、標的細胞への進入を促進するために、細胞透過性部分にペプチドを連結することを包含した。そのような細胞透過性部分は、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、シグナルペプチドおよびそのフラグメント、ＴＡＴ由来ペプチド、デンドリマーなどを包含した。デンドリマーは、比較的大きな枝分れ骨格を含み、ペプチドまたはその他の因子の多数の複製を連結させる足場を提供する。デンドリマーは、このペプチドによって規定されるエピトープに対する抗体をその後のその抗体の標的を癌細胞に定めるためにインビボで生じさせる、または免疫応答を生じさせて個体の免疫をもたらすために用いられてきた。
【００２１】
通常、癌の処置のための新規治療の開発に対する焦点は、特に、治療用分子が外細胞膜の通過により細胞の細胞質に侵入してその効果を発揮する必要がある場合、低分子の提供に置かれる。また典型的に、特に、長期にわたり繰り返されるその分子での処置を必要とし得る癌の処置においては、この分子に対する抗体の生成を回避することが望ましい。特にこれは、活性なより長いペプチドよりはむしろ活性なより短いペプチドの同定を重要視するペプチド治療に当てはまる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼに対するβインテグリンサブユニットの結合ドメインに基づく抗癌ポリペプチドを提示するデンドリマーの投与が、癌細胞へのこのポリペプチドの侵入を促進するための少なくともいくらかの低分子部分に連結される場合のこのポリペプチドと比較して、癌細胞成長の向上した阻害を提供し得るという所見に由来する。驚くべきことに、このポリペプチドを８単位提示するデンドリマーは、癌細胞中の基礎の刺激されていないＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ活性を増大し得る（癌の処置において好ましくない）が、１つ以上の実施形態においてこれは回避され得、実際、このデンドリマーが同じポリペプチドを８単位より多く提示するように改変される場合、それらの細胞において同じデンドリマー濃度でＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ活性が阻害され得ることも見出した。ポリペプチドを８単位提示するデンドリマーはＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ活性を活性化し得るが、デンドリマーによってポリペプチドが８単位より多く提示される場合にＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ活性が阻害される理由は知られていない。それにもかかわらず、これらの驚くべき発見は、癌の処置における著しい進歩を提供する。
【００２３】
本発明の一局面において、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼにβインテグリンサブユニットの細胞質結合を提供する少なくとも１種のポリペプチド、または上記ＭＡＰキナーゼが結合するその変異形態もしくは改変形態を８単位より多く提示するデンドリマーが提供される。
【００２４】
別の局面において、本発明により具現化されるデンドリマーを薬学的に許容可能なキャリアと一緒に含む薬学的組成物が提供される。
【００２５】
別の局面において、癌細胞の成長を阻害するための方法であって、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼにβインテグリンサブユニットの細胞質結合を提供する少なくとも１種のポリペプチド、または上記ＭＡＰキナーゼが結合するその変異形態もしくは改変形態を８単位より多く提示するデンドリマーの有効量で上記細胞を処置する工程を包含する方法が提供される。このデンドリマーでの癌細胞の処置は、インビトロであってもインビボであってもよい。
【００２６】
したがって、本発明の別の局面において、哺乳動物における癌の予防または処置のための方法であって、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼにβインテグリンサブユニットの細胞質結合を提供する少なくとも１種のポリペプチド、または上記ＭＡＰキナーゼが結合するその変異形態もしくは改変形態を８単位より多く提示するデンドリマーの有効量を哺乳動物に投与する工程を包含する方法が提供される。
【００２７】
本発明の別の局面において、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼにβインテグリンサブユニットの細胞質結合を提供する少なくとも１種のポリペプチド、または上記ＭＡＰキナーゼが結合するその変異形態もしくは改変形態を８単位より多く提示するデンドリマーの、哺乳動物における癌の予防または処置のための使用が提供される。
【００２８】
本発明の別の局面において、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼにβインテグリンサブユニットの細胞質結合を提供する少なくとも１種のポリペプチド、または上記ＭＡＰキナーゼが結合するその変異形態を８単位より多く提示するデンドリマーの、哺乳動物における癌の予防または処置のための医薬の製造における使用が提供される。
【００２９】
少なくとも一部の形態において、βインテグリンサブユニットの結合ドメインは、その結合ドメインの両末端領域を互いに連結する、上記ＭＡＰキナーゼの結合に必須ではないアミノ酸リンカー配列を組み入れている。βインテグリンサブユニットの結合ドメインと比較して、介在アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸が上記ポリペプチドにおいて欠失しているかまたは異なり得る。
【００３０】
典型的に、上記結合ドメインと比較して、介在アミノ酸配列中の全てのアミノ酸が上記ポリペプチドにおいて欠失している。
【００３１】
典型的に、上記結合ドメインの両末端領域はそれぞれのアミノ酸配列によって規定され、両末端領域のアミノ酸配列同一性は、上記ポリペプチドにおいて変化せずに残っている。
【００３２】
また典型的に、βインテグリンサブユニットは、癌の癌細胞によって発現される。他の形態において、癌細胞は、本質的に、βインテグリンサブユニットを発現しない。
【００３３】
少なくとも一部の実施形態において、ポリペプチドは、ＲＳＫＡＫＷＱＴＧＴＮＰＬＹＲ（配列番号２）、ＲＡＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫ（配列番号３）、ＲＳＲＡＲＹＥＭＡＳＮＰＬＹＲ（配列番号４）、ＫＥＫＬＫＳＱＷＮＮＤＮＰＬＦＫ（配列番号５）、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）、ＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）、ＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）、およびＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ（配列番号９）から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、またはその群より選択されるアミノ酸配列から成る。
【００３４】
βインテグリンサブユニットの結合ドメイン（またはその結合ドメインの変異形態もしくは改変形態）は融合タンパク質に組み込まれ得、本発明は、本明細書に記載されるようなデンドリマーにおけるそのような融合タンパク質の使用にまで、明白に拡張される。
【００３５】
βインテグリンサブユニットは、通常、β２、β３、β５およびβ６からなる群より選択される。最も一般的には、βインテグリンサブユニットはβ６である。
【００３６】
一般的に、ＭＡＰキナーゼは、ＥＲＫ１またはＥＲＫ２であり、最も一般的にはＥＲＫ２である。
【００３７】
デンドリマーは、本発明により具現化される方法における使用に適すると考えられる任意のデンドリマーであり得る。デンドリマーは、例えば、結合ドメイン（またはその改変形態もしくは変異形態）が連結された枝分かれ有機骨格（例えば、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、トリス（エチレンアミン）アンモニアまたはポリ（プロピレンイミン）（Ａｓｔｒａｍｏｌ（商標））により構成される骨格）を有し得る。他の形態において、デンドリマーは、ペプチドが連結された枝分かれ単位を構成するポリアミノ酸を組み入れた骨格を有し得る。少なくとも一部の実施形態において、デンドリマーは、ポリアミノ酸により構成される枝分かれ単位の骨格を有する。
【００３８】
典型的に、デンドリマーは、ペプチドが連結されたポリアミノ酸枝分かれ単位の複数の層／世代を有する。ポリアミノ酸枝分かれ単位は、通常、リジン残基により構成される。デンドリマーによって提示されるペプチドのそれぞれの単位は、ＥＲＫにβインテグリンサブユニットの同じかまたは異なる結合ドメイン（またはその変異形態）を提供し得る。典型的に、デンドリマーは、ペプチドのモノマーを提示する。デンドリマーはまた、デンドリマーの枝分かれ骨格を伸長させた開始核を有し得る。
【００３９】
癌は、上皮細胞癌、肉腫、リンパ腫および血球癌（白血病（例えば、骨髄性白血病、好酸球性白血病および顆粒球性白血病）を含む）から成る群より選択され得るが、これらに限定されない。白血球癌（例えば、白血病）の予防または処置については、インテグリンのβサブユニットは、発現が白血球に限定されるβ２であり得る（Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。
【００４０】
哺乳動物は、本発明の方法で処置し得る任意の哺乳動物であり得る。例えば、哺乳動物は、ウシ、ブタ、ヒツジもしくはウマ科のメンバー、実験用試験動物（例えば、マウス、ウサギ、モルモット）、ネコもしくはイヌ、または霊長類もしくはヒトであり得る。典型的に、哺乳動物はヒトである。
【００４１】
抗癌ポリペプチドの有効性の著しい向上が、本発明の１つ以上の実施形態において得られ得る。ポリペプチドの有効性の向上は、投与されるポリペプチドの投与量を同様に減少させ得、それによりその処置と関連付けられる副作用が生じる可能性を最小限に抑え得る、かつ／または改善した処置結果を提供し得るという実質的な利点を提供する。
【００４２】
本明細書全体にわたり、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその変形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、明示された構成要素、整数もしくは工程、または構成要素、整数もしくは工程の群を包含するが、あらゆる他の構成要素、整数もしくは工程、または構成要素、整数もしくは工程の群を排除しないことを示唆すると理解される。
【００４３】
本明細書において言及される全ての文献が、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載された文献、行為、材料、装置、物品などについての考察は、いずれも単に本発明の文脈を提供することを目的とする。これらの事項のいずれかもしくは全てが先行技術の基礎の一部を構成するということ、または本出願の優先日より前にオーストラリアもしくはその他の地域に存在したがゆえに本発明に関連する分野における技術常識であったということを認めるものとして見なされるべきではない。
【００４４】
本発明の特徴および利点は、以下の非限定的な実施形態の詳細な説明からさらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ペプチドデンドリマーの概略図である。
【図２】図２（ａ）は、８個のペプチドモノマーを組み入れた多抗原ペプチドデンドリマー（ＭＡＰ）の概略図を示している。（ｂ）は、Ｌｙｓ枝分かれ単位の数の増加が、表面アミノ基の数を増加させることを示している。
【図３】図３は、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０ペプチドモノマー提示するペプチドデンドリマー（本明細書においてデンドリマーＩＫ２４８ＢまたはＤｅｎｄ１０  １０（４）と呼ばれる）の概略図である。
【図４】図４は、ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を８モノマー単位提示するペプチドデンドリマーＩＫ２４８（本明細書においてＤｅｎｄ８またはＤｅｎｄ８  １０（４）とも呼ばれる）（５μＭ、１時間）に暴露されたＨＴ２９結腸癌細胞における活性ホスホ−ＥＲＫの阻害を示すグラフである。
【図５】図５は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）により細胞を刺激した場合および刺激しなかった場合の１時間のインキュベーション後に２０μＭのＩＫ２４８デンドリマーで処理されたＨＴ２９結腸癌細胞におけるホスホ−ＥＲＫレベルを示すグラフである。
【図６】図６は、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０モノマー単位提示するデンドリマーＩＫ２４８Ｂによる、ＨＴ２９結腸癌細胞の増殖の阻害を示すグラフである。
【図７】図７は、４８時間にわたって培養されたＨＴ２９ヒト結腸癌細胞の増殖に対する、デンドリマーＤｅｎｄ９  １０（４）およびＤｅｎｄ１２  １０（４）（それぞれ、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を９および１２モノマー提示する）の効果を示すグラフである。
【図８】図８は、シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）および５−フルオロウラシル（５ＦＵ）と比較される、ＨＴ２９結腸癌細胞の増殖の阻害におけるデンドリマーＩＫ２４８Ｂ（ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）がビペグ化され（ｂｉｐｅｇｙｌａｔｅｄ）、完全にＤ−アミノ酸から成る）の有効性を示すグラフである。
【図９】図９は、ペプチドＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）を８モノマー単位提示するペプチドデンドリマー（Ｄｅｎｄ８  β３）（中実の三角形）またはペプチドＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）を８モノマー提示するペプチドデンドリマー（Ｄｅｎｄ８  β５）（中実の正方形）を用いたＨＴ２９結腸癌細胞の処置を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ビヒクルのみのコントロール（中実の菱形）と比較される、デンドリマーＩＫ２４８Ｂ（中実の正方形）によるＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおけるＨＴ２９結腸癌腫瘍成長の阻害を示すグラフである。
【図１１】図１１は、マウス血清をマウスへのペプチドの静脈内注射に続く５分、１０分、３０分および６０分の時点で抽出し、次いでその血清をインビトロでのＨＴ２９結腸癌細胞の成長を阻害する能力について試験した、腫瘍を有さないマウスモデルにおけるＩＫ２４８Ｂデンドリマー（ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）がビペグ化され、完全にＤ−アミノ酸から成る）のインビボ安定性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本明細書に記載されるデンドリマーによって提示されるポリペプチドは、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼにβインテグリンサブユニットの結合ドメインを提供し得るか、または上記結合ドメインと１つ以上のアミノ酸が異なり得る。ポリペプチドは、さらに、または代替的に、上記結合ドメインに隣接するβインテグリンサブユニットの片方または両方の領域と１つ以上のアミノ酸が異なり得る。
【００４７】
用語「結合ドメイン」とは、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼとの結合の最適レベルを実質的に妥協しない、上記ＭＡＰキナーゼの結合に必要とされるβインテグリンサブユニットの連続したアミノ酸配列の最小長さを意味する。さらに、用語「結合ドメイン」は、自然に起こる変異体および多型対立遺伝子によってコードされる結合ドメインを包含する。
【００４８】
ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼに対するβインテグリンサブユニットの結合ドメインの「変異形態」という用語は、上記ＭＡＰキナーゼによる結合に本質的に悪影響を及ぼさない１つ以上のアミノ酸が上記結合ドメインと異なるアミノ酸配列を意味している。
【００４９】
用語「改変形態」とは、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼに対するβインテグリンサブユニットの結合ドメインが、上記ＭＡＰキナーゼによる結合に本質的に悪影響を及ぼさない１つ以上のアミノ酸変化により改変された、アミノ酸配列を意味する。
【００５０】
上記結合ドメインの変異形態および改変形態は、上記結合ドメインの誘導体およびペプチド擬態物を包含する。上記結合ドメインの変異形態または改変形態は、概して、２個以上の正に荷電したアミノ酸残基（各々独立して正または負に荷電している）を含み、典型的には、最低３個の正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓおよび／またはＡｒｇ）を含む。
【００５１】
典型的に、上記結合ドメインは、ＭＡＰキナーゼのβインテグリンサブユニットへの結合に必須ではない欠失させ得るいくつかの介在アミノ酸（すなわち、アミノ酸リンカー配列）によって互いに連結される両末端領域を有する。
【００５２】
本明細書に記載されるデンドリマーにおいて有用なポリペプチド（例えば、その結合ドメインを組み入れているβインテグリンサブユニットの結合ドメインの改変形態）の提供は、上記結合ドメインの１つ以上のアミノ酸の付加、欠失および／または別の１つもしくは複数のアミノ酸での置換により達成され得る。
【００５３】
アミノ酸の逆位およびアミノ酸配列の変更をもたらすあらゆるその他の変異変化もまた包含される。例えば、上記結合ドメインの非必須介在アミノ酸リンカー配列の１つ以上のアミノ酸を欠失させるか、別の１つもしくは複数のアミノ酸に置換（例えば、保存的アミノ酸置換）させ得る。そのような改変ポリペプチドは、変異を起こさせた核酸配列の発現により所望のアミノ酸変化が達成されるようにヌクレオチド変化を核酸配列に導入することによって、または、例えば、所望のアミノ酸変化を組み入れたアミノ酸配列を合成することによって調整され得る。その実現可能性は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００５４】
さらに、本明細書に記載される改変結合ドメインまたはポリペプチドは、遺伝暗号によってコードされない１つもしくは複数のアミノ酸、またはアミノ酸アナログを組み入れ得る。例えば、Ｌ−アミノ酸ではなくＤ−アミノ酸が利用され得る。実際、本発明の実施形態において有用なペプチドは、部分的または完全にＤ−アミノ酸から成り得る。Ｄ−ペプチドは、当該技術分野において周知の技術を用いた化学合成により生成され得る。したがって、一部の実施形態において、ペプチドが、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはＬ−およびＤ−アミノ酸の混合物を含み得る。Ｄ−アミノ酸を含むペプチドの合成は、当該技術分野において知られるように、ペプチダーゼ活性（例えばエンドペプチダーゼ）を阻害し得、それにより、対応するＬ−ペプチドと比較して、ペプチドのインビボでの安定性を向上させ、半減期を増大させ得る。
【００５５】
同様に、ポリペプチド／ペプチドのＮ末端またはＣ末端は、インビボでの分解（例えば、エンドペプチダーゼによる）から保護する、またはインビボでの分解を阻害するために改変され得る。例えば、ポリペプチドのＣ末端は、エンドペプチダーゼによる分解から保護するためにアミド化され得る。あるいは、本明細書に記載されるポリペプチドのＮ末端またはＣ末端はまた、インビボでのプロテアーゼによる分解に対する抵抗性をより低くする、または腎臓を介した循環からのそれらのクリアランスを阻害するためにペグ化され得る。ポリペプチド／ペプチドのペグ化の方法は当該技術分野において周知であり、そのような方法の全てが明示的に包含される。典型的に、本発明により具現化される方法において用いられるペグ化ポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の２個以上のモノマー単位、一般的には、ＰＥＧの約２個〜約１１個のモノマー（すなわち、（ＰＥＧ）ｎであり、ｎは２〜１１に相当する）に連結される。最も一般的には、ｎは２である。
【００５６】
アミノ酸の置換は、保存的または非保存的なアミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基を、類似の立体化学特性（例えば、構造、荷電、酸性または塩基性特性）を有し、結合ドメインの結合活性に実質的に悪影響を及ぼさない別のアミノ酸と置き換えることを意味する。例えば、極性アミノ酸は別の極性アミノ酸と置換され得、保存的アミノ酸変化は当業者に周知である。
【００５７】
本明細書に記載されるアミノ酸配列間の配列同一性は、それらの配列が比較のために最適にアラインメントされた時の、配列中の各位置におけるアミノ酸を比較することによって決定され得る。これらの配列は、ある位置のアミノ酸が同じアミノ酸残基であれば、その位置において同じであると見なされる。配列のアラインメントは、任意の適切なプログラムまたはアルゴリズムを用いて（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）による）実施され得る。コンピュータ援用の配列アラインメントは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）の一部であるＧＡＰなどの標準的なソフトウェアプログラムを用い、ギャップ作製ペナルティを５０、ギャップ伸長ペナルティを３とするデフォルトスコアリングマトリックスを用いて好都合に実施され得る。
【００５８】
典型的に、本明細書に記載されるデンドリマーにおいて有用なポリペプチドは、βインテグリンサブユニットと、少なくとも約４０％、より一般的には少なくとも約５０％、６０％または７０％以上、最も好ましくは少なくとも約８０％、９０％または９５％配列同一性以上の全アミノ酸配列同一性を有する。βインテグリンサブユニットの結合ドメインとの配列同一性は、これら２つの配列間の全アミノ酸配列同一性より大きくなり得、一般的には約６０％、７０％または８０％より大きく、より一般的には約９０％または９５％以上である。しかしながら、ポリペプチドの全配列同一性または上記結合ドメインとのポリペプチドの配列同一性は、上記で具体的に述べた個々の値内の任意の特定の値または範囲であり得る。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列同一性は、少なくとも６６％または７５％以上であり得、そうした配列同一性および範囲の全てが、本発明に明示的に包含される。
【００５９】
本発明により具現化される方法において有用なポリペプチドの誘導体は、親分子の開裂環化によって、および／または溶解性、親油性特性を改善して細胞による取込み、安定性もしくは生物学的半減期、細胞毒性の低下をいっそう良くするような、または、例えばその後の検出などのためのラベルとして機能する、１つ以上の更なる部分との連結によって提供され得る。誘導体はまた、翻訳後または合成後改変（例えば、炭水化物部分の連結）または構造改変をもたらすような化学反応（例えば、アミノ酸残基のアルキル化もしくはアセチル化、または化学結合の形成を伴う他の変化）の結果としても得られ得る。
【００６０】
用語「ポリペプチド」は、本明細書においてペプチドと相互交換可能に使用される。例えば、ペプチド因子（例えば、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）およびＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ（配列番号９））は、用語ポリペプチドの範囲内に入ると理解される。
【００６１】
ペプチドデンドリマーは、本発明の方法における使用に特に適している。本発明の少なくとも一部の実施形態におけるペプチドデンドリマーは、ポリアミノ酸の枝分かれした骨格（典型的にはリジン枝分かれ単位）に連結させたポリペプチドインヒビターを複数単位提示する。デンドリマーは、典型的に、アミノ酸枝分かれ単位を少なくとも３層／世代有しており、ポリペプチドインヒビターの単位はアミノ酸枝分かれ単位の最外層／世代に連結されるため、デンドリマーはポリペプチドを８単位より多く提示する。モノマー単位のポリペプチドが好ましいが、他の実施形態においては、デンドリマーのポリアミノ酸枝分かれ単位に連結させた多単位のポリペプチド（マルチマー）（例えば、（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ）ｎであり、ｎは、このポリペプチドの反復回数（典型的に１〜３）である）を組み入れたデンドリマーが利用され得る。したがって、デンドリマーにより提示されるポリペプチドの単位は、ポリペプチドのモノマー単位、マルチマー単位、ならびに／またはモノマーおよびマルチマー単位の混合物であり得る。
【００６２】
抗癌ポリペプチドは、デンドリマーの骨格を構成するポリアミノ酸枝分かれ単位の最外層／世代に結合されるか、またはデンドリマーのポリアミノ酸枝分かれ単位上に合成により構築され得る。より具体的には、本発明により具現化される１つ以上の方法において有用なデンドリマーの合成は、分岐合成法または収束合成法により達成され得る。
【００６３】
分岐法は、固相合成により固体支持体上に連続操作で逐次的にデンドリマーが構築される直接的なアプローチである。逐次的合成は、デンドリマーの枝分かれ開始核の合成、それに続くポリペプチドインヒビターの合成を連続的に含む。分岐法は、三官能性酸（例えば、ポリアミノ酸）の骨格を有するデンドリマーの合成に特に適している。そのような固相合成法は、２箇所が保護されたリジンを用いて多レベルのリジンの枝分かれ骨格を生成する場合のリジン枝分かれ単位の合成に最も好まれる方法である。リジンのジアミノの性質が、各レベルのリジンの追加毎にポリペプチドインヒビターを直接合成させ得る部位の数を効果的に倍加させる。
【００６４】
収束法は、ポリペプチドおよび枝分かれ開始核単位が別個に調製され、次いで互いに連結される、間接的なモジュール的アプローチである。デンドリマーの収束合成において用いられる枝分かれ骨格を有する開始核単位は市販されており、典型的に、有機アミノ化合物（例えば、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、トリス（エチレンアミン）アンモニアまたはポリ（プロピレンイミン）（Ａｓｔｒａｍｏｌ（商標）））から構成され、通常それに、別個に調製されたインヒビターを共有結合させる。
【００６５】
本明細書に記載されるインヒビターが連結され得る適切なペプチドデンドリマー骨格、およびペプチドデンドリマーを提供するための方法は、例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，２００５；Ｓａｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔａｍ，２００２；およびＣｌｏｎｉｎｇｅｒ，２００２に記載されており、それらの全内容が、参照により完全に本明細書に援用される。本発明の実施形態における使用に適した種類のペプチドデンドリマーの例が、図１および図２（Ｓａｄｌｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，２００２）および図３に概略的に図示される。
【００６６】
本発明により具現化される方法において用いられるデンドリマーは、ポリペプチドを８単位より多く（例えば、９、１０または１２単位）提示する。デンドリマーにより提示されるポリペプチドは、通常全て同じであるが、本明細書に記載されるポリペプチドの混合物もまた用いられ得る。例えば、デンドリマーによって提示されるポリペプチドの単位の半分は、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼにβ６インテグリンサブユニットの結合ドメインを提供し得るが、ポリペプチドの残りの単位は、β５インテグリンサブユニットの結合ドメイン（またはこれらの結合ドメインの変異形態もしくは改変形態）を提示する。
【００６７】
しかしながら、異なる抗癌ポリペプチド因子の比率もまた、デンドリマーにおいて異なり得ることが理解される。本発明により具現化される方法において用いられるデンドリマーによって提示されるペプチドはまた、典型的に、タンパク質分解からＮ−末端またはＣ−末端が保護されている（例えば、アミド生成、ペグ化（すなわち、ＰＥＧ単位の付加）などによる）。ポリペプチドのペグ化などの方法は当業者の能力の範囲内であり、そのような方法の全てが明示的に包含される。
【００６８】
典型的に、本発明の実施形態に従うデンドリマーにおいて提示されるポリペプチドは、約６０アミノ酸以下の長さを有する。一般的に、ポリペプチドは５より大きなアミノ酸長を有し、通常、最大約５０までのアミノ酸長、４０、３５、３０、２５、２０または１５アミノ酸長である。少なくとも一部の実施形態において、このポリペプチドは、６、７、８、９または１０アミノ酸から約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２５アミノ酸までの範囲の長さを有し得る。しかしながら、本明細書に記載されるデンドリマーにおける使用に適する上記で特定された特定の長さおよび長さ範囲の範囲内の全ての特定の長さおよび長さ範囲のポリペプチドが明示的に包含されることが理解される（例えば、１３もしくは１４アミノ酸、または１０〜２２アミノ酸など）。
【００６９】
ＭＡＰキナーゼＥＲＫ２に対するβインテグリンサブユニットβ２、β３、β５およびβ６の結合ドメインは、国際特許出願ＷＯ２００１／０００６７７号パンフレットおよび国際特許出願ＷＯ２００２／０５１９９３号パンフレットに記載されている。ＥＲＫ２に対するβ２インテグリンサブユニットの結合ドメインは、国際特許出願ＷＯ２００５／０３７３０８号パンフレットに記載されている。これらの国際特許出願の全ての開示が、参照により完全に、本明細書に明示的に援用される。特に、βインテグリンサブユニットのＭＡＰキナーゼへの結合を阻害するための更なるポリペプチド因子であって、本明細書に記載されるデンドリマーへの組み入れに適したポリペプチド因子もまた、結合ドメインの位置決定および特徴付けの方法に加え、これらの出願に記載されている。
【００７０】
より具体的には、結合ドメインは、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼに対するβインテグリンサブユニットの細胞質結合ドメインのそれぞれの重複するペプチドフラグメントの能力を評価することにより位置特定され得る。次いで、結合ドメインを構成する特定のアミノ酸配列が、漸次小さくしていくペプチドフラグメントを利用して決定され得る。この目的のために、試験ペプチドが、より大きなペプチドフラグメントのＮ末端およびＣ末端の片方または両方からの１つもしくは複数のアミノ酸の欠失を伴って所望の長さに容易に合成され、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼと結合するそれらの能力について試験される。このプロセスは、実測された最適結合レベルを実質的に妥協しない、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼと結合し得る最短のペプチドが同定されるまで繰り返される。
【００７１】
ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ−βインテグリン相互作用において本質的な役割を果たすアミノ酸の同定は、上記配列の１つ以上のアミノ酸を欠失させたかまたは１つもしくは複数の異なるアミノ酸と置換させたさらに合成された試験ペプチドを用いて、ペプチドの結合能力に対する効果を決定することにより達成され得る。典型的に、置換変異誘発は、アミノ酸配列の選択されたアミノ酸とアラニンまたは他の中性荷電アミノ酸との置換を含む。
【００７２】
β６インテグリンサブユニットについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列データは、例えば、Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９０に見出される。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２は、高い全アミノ酸配列同一性を有しており、ＥＲＫ１は、β６に対する結合部位を提供するＥＲＫ２の２６マーアミノ酸配列と約９６％の配列同一性を有する（国際特許出願ＷＯ２００２／０５１９９３号パンフレット参照）。ＥＲＫ２についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、Ｂｏｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１に見出される。そうした公開データの参照は、本明細書に記載されるデンドリマーにおいて有用なポリペプチドの容易な設計、およびそのポリペプチドをコードする対応する核酸配列の提供を可能にする。
【００７３】
ポリペプチドまたは他の因子を結合に必要とされる三次元構造に拘束するために、ポリペプチドまたは他の因子は、側鎖構造を用いるか、またはジスルフィド架橋を形成するシステイン残基を組み入れることにより合成され得る。また、ポリペプチドまたは他の因子は、環化されると剛性が増し、それによりインビボでの安定性を提供し得る。種々のそのような方法が、当該技術分野において知られている。
【００７４】
上記のように、本発明により具現化されるデンドリマーにおいて有用なポリペプチドは、βインテグリンサブユニットの結合ドメイン、または結合ドメインの介在アミノ酸配列のＭＡＰキナーゼの結合に必須ではない１つ以上のアミノ酸を欠失させたその変異形態もしくは改変形態を含み得る、あるいはβインテグリンサブユニットの結合ドメイン、または結合ドメインの介在アミノ酸配列のＭＡＰキナーゼの結合に必須ではない１つ以上のアミノ酸を欠失させたその変異形態もしくは改変形態から成り得る。１例として、β６の結合ドメインは、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＷＱＴＧＴＮＰＬＹＲ（配列番号２）を含む。しかしながら、介在アミノ酸配列ＷＱＴＧＴ（配列番号１０）はＭＡＰキナーゼＥＲＫ２の結合に必須ではない。すなわち、配列ＷＱＴＧＴ（配列番号１０）を欠失させたとしても、アミノ酸配列ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を有するペプチドは、依然としてＥＲＫ２により結合される。同様に、ＥＲＫ２に対するβ２、β３およびβ５の結合ドメインは、それぞれＫＥＫＬＫＳＱＷＮＮＤＮＰＬＦＫ（配列番号５）、ＲＡＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫ（配列番号３）およびＲＳＲＡＲＹＥＭＡＳＮＰＬＹＲ（配列番号４）により与えられる。これらの配列からの介在配列ＳＱＷＮＮＤ（配列番号１１）、ＷＤＴＡＮ（配列番号１２）およびＹＥＭＡＳ（配列番号１３）の欠失は、１０マーペプチドＫＥＫＬＫＮＰＬＦＫ（配列番号９）、ＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）およびＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）を生じ、これらは全て、依然としてＥＲＫ２に結合する。理解されるように、ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）はペプチドＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）と８０％の配列同一性を有しており、逆の場合もまた同じである。
【００７５】
β２、β３およびβ５ならびにβ６の結合ドメインのアラインメントの結果として、コンセンサス配列（ｃｏｎｃｅｎｓｕｓ  ｓｃｈｅｍｅ）Ｒ／ＫｘＲ／ＫｘＲ／Ｋ−ｘｘｘｘｘＮＰＬＹ／ＦＲ／Ｋ（ここで、Ｒ／Ｋはアルギニンまたはリジンのいずれかであり、Ｙ／Ｆはチロシンまたはフェニルアラニンのいずれかであり、ｘは任意のアミノ酸であり得、「−」（すなわちダッシュ）は必須ではない欠失され得るアミノ酸である）が得られ、本明細書に記載されるデンドリマーに利用されるポリペプチドは、このコンセンサス配列により表され得るか、このコンセンサス配列を含み得る。「−」により示されるアミノ酸は、セリン残基であり得るが、別のアミノ酸（例えば、スレオニン、チロシン、アスパラギンまたはグルタミン）であってもよい。典型的に、ポリペプチドは、Ｒ／ＫｘＲ／Ｋ＊Ｒ／Ｋ−ｘｘ＊ｘ＊ＮＰＬＹ／ＦＲ／Ｋ（ここで、各＊は、独立して、疎水性アミノ酸、またはセリン、チロシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸である）により表されるアミノ酸配列を有する。疎水性アミノ酸は非極性アミノ酸であり、例として、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンが挙げられる。したがって、−ｘｘｘｘｘにより示される介在アミノ酸配列全体（またはその配列のアミノ酸のうちの１つ以上）もまた、ポリペプチドが配列Ｒ／ＫｘＲ／ＫｘＲ／ＫＮＰＬＹ／ＦＲ／Ｋを含むか、または配列Ｒ／ＫｘＲ／ＫｘＲ／ＫＮＰＬＹ／ＦＲ／Ｋからなるように欠失させ得る。
【００７６】
ＭＰＡキナーゼにβインテグリンサブユニットの結合ドメインを提供するポリペプチドを組み入れた融合タンパク質の使用は、明示的に本発明に包含される。ポリペプチドおよび融合タンパク質などは、従来の組み換え技術を用いて合成または生成され得る。融合タンパク質をコードする核酸は、例えば、所望のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする別個のＤＮＡフラグメントを、平滑末端およびオリゴヌクレオチドリンカー、適宜付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）を与えるような消化、付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄ）の連結を採用することによって繋ぐことにより提供され得る。代替的に、ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅が、後に互いに連結され得る相補的な末端を有するアンプリコンを生じさせるプライマーを用いて利用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１  ａｎｄ  ２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。また、被験体への投与のためにポリペプチドおよび融合タンパク質をインビトロで発現させ、細胞培養物から精製してもよいし、ポリペプチドまたは融合タンパク質のインビトロまたはインビボ発現のためにそのポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸を細胞にトランスフェクトしてもよい。核酸は、典型的に、最初はクローニングベクターに導入され、宿主細胞において増幅され、その後、核酸が摘出され、細胞のトランスフェクションに適した発現ベクター内に組み込まれる。本発明のデンドリマーにおいて有用なポリペプチドのクローニング、発現および精製の方法もまた、当業者の能力の範囲内である。
【００７７】
リポソーム、ゴースト細菌細胞、合成ポリマー因子、超遠心機で分離したナノ粒子および他の無核ナノ粒子（例えば、正常な細菌細胞分裂を制御する遺伝子を不活性化させた結果として生成される（Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  Ｐ．Ａ．，１９８９））に、本明細書に記載されるデンドリマーまたはペプチドを加え、癌細胞へのデンドリマーの標的化送達（例えば、ナノ粒子上に担持／塗布された二双特異性抗体による）に用いられ得る。そのようなナノ粒子は、注射用、またはデンドリマーを胃の酸性環境を通過させて小腸を介して放出させ、吸収させるための経口摂取用に処方され得る。
【００７８】
本明細書に記載されるデンドリマーの毒性プロファイルは、細胞形態の評価、トリパンブルー排除、アポトーシスの評価および細胞増殖試験（例えば、細胞計数、３Ｈ−チミジン摂取およびＭＴＴアッセイ）によって、正常細胞および異常細胞（例えば、癌細胞）に対して試験され得る。
【００７９】
本発明の方法により処置される癌は、例えば、白血病、骨髄性白血病、好酸球性白血病、顆粒球性白血病、ならびに肝臓、舌、唾液腺、歯肉、口底、口の他の部分、口腔咽頭、鼻咽頭、下咽頭、他の口腔、食道、消化管、胃、小腸、十二指腸、結腸、直腸、胆嚢、膵臓、喉頭、気管、気管支、肺、乳房、子宮、頸部、卵巣、腟、外陰部、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、甲状腺および皮膚の癌から成る群より選択され得る。癌は、典型的には上皮癌であり、最も一般的には非皮膚癌である。
【００８０】
意図された被験体への投与のために、デンドリマーが、典型的に、薬学的に許容可能なキャリアおよび／または賦形剤を含む薬学的組成物に処方される。デンドリマー、またはデンドリマーを含む薬学的組成物は、限定されるわけではないが、経口的に、静脈内に、非経口的に、直腸内に、皮下に、注入により、局所的に（例えば、皮膚癌の処置において）、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内に、および適切と考えられる任意の他の経路により投与され得る。薬学的組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、クリーム剤、摂取可能な錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、散剤、トローチ剤、エリキシル剤の形態、または選択された投与経路に適した他の形態にあり得る。
【００８１】
特に、本発明により具現化される薬学的組成物は、水剤を包含する。注射可能な組成物は、注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する範囲の流動性を有し、典型的に、製造後の保管に与えられた所定の期間の間、常態では安定している。さらに、薬学的に許容可能なキャリアとしては、任意の適切な従来知られている溶媒、分散媒、生理食塩剤または液、等張剤または液、および界面活性剤が挙げられる。適切な分散媒は、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングルコールなど）、植物油およびそれらの混合物のうちの１種以上を含有し得る。
【００８２】
経口投与用には、任意の経口的に許容可能なキャリアが用いられ得る。特に、デンドリマーは、不活性な賦形剤、同化可能な食用キャリアと一緒に処方されてもよいし、硬殻または軟殻ゼラチンカプセル中に封入されてもよい。
【００８３】
内用または外用のクリーム剤、ローション剤または軟膏剤を形成するために、従来用いられている局所的に許容可能なキャリアが用いられ得る。そのような組成物は、処置されることになる部位に直接適用されてもよいし、その組成物を滲み込ませた包帯剤を介して適用されてもよい。
【００８４】
本明細書に記載される薬学的組成物はまた、インビボおよび／または局所投与に適した１種以上の保存剤（例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサールも含み得る。また、組成物の長時間にわたる吸収が、吸収を遅延させるための薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の、組成物における使用によりもたらされ得る。デンドリマーを含有する錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下のうちの１つ以上を含有し得る：結合剤（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチン）；崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、バレイショデンプンまたはアルギン酸）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；甘味剤（例えば、ショ糖、乳糖またはサッカリン）；および着香料。
【００８５】
薬学的組成物における上記のような成分および媒質の使用は周知である。デンドリマーと不適合である範囲のあらゆる従来の媒質または成分を除き、本明細書に記載される治療および予防用の組成物における従来の媒質または成分の使用が包含される。
【００８６】
投与を容易にし、投与量を均一にするための単位剤形に非経口用組成物を処方することが、特に好ましい。本明細書で用いられる単位剤形は、処置されようとする被験体に対するまとまった投薬量として適する物理的に別個の単位であって、各単位が、所望の治療または予防効果を生ずるように計算された所定量の活性薬剤を、用いられる適切なキャリアと一緒に含むものを意味すると見なされるべきである。単位剤形が、例えば、カプセル剤、錠剤または丸剤である場合、投薬単位の物理的形状を違った風に改変するため、または個体への投与を容易にするために、種々の成分がコーティングとして用いられ得る（例えば、シェラック、糖または両方）。
【００８７】
薬学的組成物は、概して少なくとも約１重量％のデンドリマーを含有する。当然この割合は変更され得、好都合に組成物または製剤の約５％〜約８０％（ｗ／ｗ）の間であり得る。理解されるように、組成物中のデンドリマーの量は、企図される投与経路を考慮し、適切な有効投薬量が被験体に送達されるというようなものである。本発明により具現化される好ましい経口用組成物は、約０．１μｇと１５ｇの間のデンドリマーを含有する。
【００８８】
デンドリマーの投薬量は数多くの要素によって決まり、その要素として、デンドリマーが予防用途のために投与されることになるのか、それとも治療用途のために投与されることになるのか、デンドリマーの投与が意図される状態、状態の重症度、被験体の年齢、および関連する要素（個体の体重および認められた法則に従って医師または看護人（ａｔｔｅｎｄａｎｔ）により判断され得るような総合的な健康状態を含む）が挙げられる。例えば、低投薬量が初期に投与され、その後、個体の応答の評価に従い各投与において増加され得る。同じく、投与頻度も同様に、すなわち各投薬間の個体の応答を継続的にモニタリングすること、また、必要に応じ、投与頻度を増加する、あるいは投与頻度を減少することによって決定され得る。
【００８９】
典型的に、デンドリマーは、本発明の方法に従って、個体の体重１ｋｇ当たり最大約５０ｍｇまで、好ましくは体重１ｋｇ当たり約２０ｍｇ〜４０ｍｇの範囲内の投薬量のポリペプチドインヒビターを提供するように投与される。少なくとも一部の実施形態において、デンドリマーは、体重１ｋｇ当たり約５〜２５ｍｇの範囲、一般的には約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲、より一般的には１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲内の投薬量のポリペプチドを提供するように投与される。経口的に投与される場合、最大約２０ｇまでのデンドリマーが１日に投与され得る（例えば、各々５ｇのデンドリマーを含む４経口用量）。
【００９０】
静脈内経路に関し、特に好適な経路は、注射により血管内に入れ、処置されることになる腫瘍または特定の器官に供給する経路である。薬剤はまた、腔（例えば、胸膜腔または腹膜腔）内に送達されてもよいし、腫瘍組織内に直接注射されてもよい。本発明の組成物において有用な、好適な薬学的に許容可能なキャリアおよび処方物は、例えば、当業者に周知のハンドブックおよびテキスト（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９５）」）に見出され得、その内容は、参照により完全に本明細書に援用される。
【実施例】
【００９１】
以下に、いくつかの非限定的な実施例を参照して、本発明が記載される。
【００９２】
実施例１：材料および方法
１．１  細胞株および培養
ＨＴ２９細胞（結腸直腸腺癌）、ＤＵ１４５細胞（前立腺癌腫）、ＭＣＦ-７細胞（乳腺癌）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）から入手した。ＭＫＮ４５（胃癌腫）を、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手した。全ての細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）濾過ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ｖｉｃ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓａｔｅｓ）中に維持した。細胞株を、３７℃にて、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中に維持した。細胞を、０．０５％トリプシンおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む溶液を用い、コンフルエントになる前の密度で継代培養した。
【００９３】
１．２  細胞増殖（ＭＴＴ）アッセイ
トリプシン処理した生細胞の単細胞懸濁液を、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む１００μＬの容量の適切な培地中（例えば、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｈｅｐｅｓおよび抗生物質を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））、１ウェル当たり２×１０３細胞の密度で９６ウェル組織培養プレートに播種した。試験することになるペプチドデンドリマーの各濃度に対し、３つで１組のウェルを調製した。非処理細胞または培地のみを含む追加のサンプルウェルを各処理プレートに設け、参照コントロールとして並行して処理した。処理していない細胞および培地のみのウェルのゼロ時のプレートを同時に調製し、処理プレートへの試験ペプチドデンドリマーの添加の際に、このプレートに対してＭＴＴアッセイを実施した。試験デンドリマーの添加前に、全てのプレートを２４時間にわたり培養した。ＭＴＴ溶液を調製するために、１００ｍｇのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（Ｃａｔ＃．Ｍ−１２８，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ．）を、ｐＨ７．４の２０ｍＬのＰＢＳと混合する。結果として生じる溶液を濾過滅菌（０．２μＭ  シリンジフィルター）し、光から保護された状態で、使用するまで４℃にて保管する。ＭＴＴ基質が増殖細胞中で開裂し、水に不溶性の塩を生じる。塩結晶の可溶化後、着色生成物が生成され、これを測定することにより培養細胞の増殖活性を定量し得る。
【００９４】
適切な濃度の試験デンドリマーを、新たに調製した１ｍＭ  滅菌倍液の細胞培養培地中への希釈により、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを含む最終ウェル容量が２００μＬとなるように調製した。その際に、ＭＴＴの添加によりゼロ−プレートを処理した。細胞培養をさらに２４〜４８時間にわたり継続した後、２０μＬのＰＢＳ中ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ、０．２μｍ  フィルター滅菌）を添加した。ＭＴＴ細胞増殖アッセイは細胞増殖速度を測定し、また、細胞生存率が妥協される場合には、このアッセイは細胞生存率の相対的な減少を示す。ＭＴＴの存在下での３時間のインキュベーション（空気中５％ＣＯ２、３７℃）後、プレートを４５０ｇで５分間遠心分離機にかけ、上清を静かに吸引して除去し、沈殿させたテトラゾリウム塩を、１５０μＬ  ＤＭＳＯ：グリシン（０．１Ｍ  グリシン、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ１０．５）（６：１（ｖ／ｖ））溶液中に再懸濁させた。プレートを静かにボルテックスして結晶質の可溶化を完了させ、吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて５４０〜５５０ｎｍで読み取った。試料データを処理して、非処理コントロールと比較した処理試料の相対的な増殖を決定した。
【００９５】
１．３  ホスホ−ＥＲＫおよび全−ＥＲＫ  ＥＬＩＳＡの決定
ＨＴ２９細胞を、０．５％トリプシンＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて採取し、５０００細胞を２００μＬ中に再懸濁させ、きれいなＮＵＮＣ組織培養処理済み９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）の各ウェルに加えた。細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２％１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に播種した。次いで、細胞を一晩中３７℃にてインキュベートした。翌日、この増殖培地を１％Ｌ−グルタミンおよび２％１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を補充した１００μＬの血清非含有のＤＭＥＭと交換し、さらに２４時間にわたり３７℃にてインキュベートした。デンドリマーの最終濃度が０．１〜２０μＬＡの範囲となるように、デンドリマーを試験ウェルの血清非含有培地中に加えた。各ウェルの総容量は２００μＬであり、細胞を５分〜４時間の範囲の時間にわたり３７℃にてインキュベートした。細胞を血清による刺激に供した試験において、２２μＬ  ＦＣＳ（１０％（ｖ／ｖ）最終濃度）を３７℃での培養期間の最後の１０分間、ウェルに加えた。血清非含有培地（ＳＦＭ）のみ（２２μＬ）を、血清により刺激されていない細胞に加えた。
【００９６】
ホスホ−ＥＲＫレベルを、製造業者の指示に従いＦＡＣＥ  ＥＲＫ１／２  ＥＬＩＳＡキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、キットはＡｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，ＷＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手）を用いて決定した。簡潔に述べると、培地を交換し、細胞をＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで固定し、抗体ブロッキング緩衝剤（供給される）を加えてから１時間後、第一ホスホ−ＥＲＫ抗体または全−ＥＲＫ抗体を加え、一晩中４℃にてインキュベートした。抗体希釈緩衝剤のみを、第一抗体を含まないコントロール試験ウェルに加えた。翌日、ＨＲＰ結合第二抗体を１時間加えた後、プレートを展開し、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸマイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００９７】
１．４  ペプチドデンドリマー
βインテグリンサブユニットβ３、β５またはβ６へのＥＲＫ２の結合のいずれかに対するポリペプチドインヒビターのモノマー単位に連結されたリジン枝分かれ単位を含む図３に図示されている種類のペプチドデンドリマーを、以下の実施例において用いた。
【００９８】
実施例２：ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を４または８モノマー単位含むペプチドデンドリマーによるＨＴ２９結腸癌細胞の増殖の阻害
ポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を４（Ｄｅｎｄ４）または８（本明細書においてデンドリマーＩＫ２４８、Ｄｅｎｄ８またはＤｅｎｄ８  １０（４）と呼ばれる）モノマー単位含むペプチドデンドリマーが、実施例１．２に記載されたＭＴＴアッセイによって評価される場合に、ＨＴ２９結腸癌細胞の増殖を阻害することが見出された。特に、ＩＫ２４８は、上記ポリペプチドを４モノマー含むペプチドデンドリマーと比べて、細胞成長／増殖を阻害するのに実質的により効果的であることが見出された（２４時間のインキュベーション期間）。
【００９９】
別の試験において、ＩＫ２４８デンドリマーはまた、ＭＫＮ４５胃癌腫細胞、ＭＣＦ−７乳癌細胞およびＤＵ１４５前立腺癌細胞の成長／増殖も阻害した。この試験においては、デンドリマーの存在下で、これらの細胞を４８時間にわたってインキュベートした。
【０１００】
実施例３：種々の薬剤で処理されたＨＴ２９ヒト結腸癌細胞におけるホスホ−ＥＲＫレベル
ＨＴ２９癌細胞の細胞質ゾル中への血漿細胞膜を超えてのポリペプチドの進入を促進するための異なるペプチド促進因子部分と連結させたポリペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を含む種々の薬剤と比較される、実施例２に記載されたペプチドデンドリマーＩＫ２４８の、ＨＴ２９癌細胞中のＥＲＫの成長因子媒介性（すなわち、ＦＣＳにより刺激された）活性化の阻害における有効性を評価した。５μＭ  ＩＫ２４８（Ｄｅｎｄ８）またはポリペプチド−促進因子部分薬剤での１時間にわたる処理（いずれも、５μＭ、同じ継続時間）後の細胞におけるホスホ−ＥＲＫレベルを、基本的に実施例１．３に記載されるとおりに測定した。利用した促進因子部分は、シグナルペプチドフラグメントＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡ（配列番号１４）、ＴＡＴ−ＧペプチドＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧ（配列番号１５）、改変貫通配列Ｔｒ−Ｐｅｎ  ＲＲＱＫＷＫＫＧ（配列番号１６）、および貫通ペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＣＳ−ＳＣ（配列番号１７）（ここで、Ｓ−Ｓは、隣接するシステイン残基間のジスルフィド架橋を示している）であった。
【０１０１】
１時間の時点での、ＨＴ２９細胞におけるＩＫ２４８およびポリペプチド−促進因子部分による活性ホスホ−ＥＲＫのパーセント阻害を図４に示す。図から分かるように、ＩＫ２４８は、最も近いレベルの阻害を発揮した試験薬剤（すなわち、ＴＡＴ−Ｇ  ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）ポリペプチド）よりも少なくとも３０％大きな阻害を示した。４時間で、５μＭ  ＩＫ２４８は、ポリペプチド−促進因子部分による相対的に低いレベルの阻害（データは示されていない）と比べ、活性ホスホ−ＥＲＫの約９５％阻害を示した。
【０１０２】
実施例４：ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を提示するペプチドデンドリマーで処理したＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞におけるホスホ−ＥＲＫレベル
４．１  細胞培養および処理条件
ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）、すなわちペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を８（ＩＫ２４８）または１０（ＩＫ２４８Ｂ）モノマー単位提示するリジン枝分かれ単位を含む図３に図示されている種類のペプチドデンドリマーを本試験で利用した。ホスホ−ＥＲＫレベルを、実施例１．３に記載されるとおりＡｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  ＦＡＣＥ  ＥＲＫ１／２  ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，ＷＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を利用して、ＥＬＩＳＡにより評価した。
【０１０３】
４．２  結果
４．２．１  成長因子の不在下におけるホスホ−ＥＲＫレベル（ＨＴ２９細胞をＨＩ  ＦＣＳで刺激せず）
用量応答試験において、より低い濃度のＩＫ２４８デンドリマーで処理（１μＭ〜１０μＭ、４時間のインキュベーション）したＨＴ２９細胞におけるホスホ−ＥＲＫのレベルはコントロール細胞と比較して増大することが見出され、それによりデンドリマーによる基礎の刺激されていないＥＲＫの活性化が示された。さらに、５μＭ  ＩＫ２４８デンドリマーと共にインキュベートしたＨＴ２９細胞は、評価された全ての時点（５分、１０分、３０分および１時間）でコントロール細胞と比較してホスホ−ＥＲＫレベルの著しい上昇を示した。
【０１０４】
対照的に、デンドリマーＩＫ２４８Ｂ（ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０モノマー単位提示する）はＨＴ２９細胞における基礎のホスホ−ＥＲＫレベルを刺激せず、試験されたデンドリマーの全ての用量（０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭおよび５μＭの用量応答、４時間のインキュベーション）について、ＨＴ２９細胞におけるホスホ−ＥＲＫのレベルはコントロール細胞におけるより低いままであった。
【０１０５】
４．２．２  成長因子の存在下におけるホスホ−ＥＲＫレベル（ＨＴ２９細胞をＨＩ  ＦＣＳで刺激）
ＨＩ  ＦＣＳでの刺激に続き、ＨＴ２９コントロール細胞におけるホスホ−ＥＲＫレベルは約３倍上昇すると認められた。２０μＭ  ＩＫ２４８で処理（１時間のインキュベーション）した細胞において、ホスホ−ＥＲＫレベルは、このデンドリマーで処理したＦＣＳ非刺激細胞におけるよりも低かったが、デンドリマーでの処理もＦＣＳでの刺激も行わなかったコントロール細胞におけるホスホ−ＥＲＫ基礎レベルよりも高いままであった（図５参照）。全ＥＲＫレベルは、ＩＫ２４８デンドリマーで処理したＨＴ２９細胞において本質的に影響されないままであった。
【０１０６】
デンドリマーＩＫ２４８Ｂで処理したＨＴ２９細胞において、ホスホ−ＥＲＫレベルは、ＫＩ２４８Ｂデンドリマーの投薬量が漸次増加するに従いコントロール細胞と比較して低下し、５μＭの用量でほぼ完全に無効にされた。ＥＲＫ活性（ホスホ−ＥＲＫレベルにより示されるとおり）は、ＨＴ２９細胞において１０μＭの濃度のＩＫ２４８Ｂにより完全に阻害された（データは示されていない）。
【０１０７】
さらに、ＩＫ２４８Ｂデンドリマーで処理したＨＴ２９細胞におけるホスホ−ＥＲＫレベルは、正常皮膚線維芽細胞と比較してかなり低減され、正常細胞と比較した癌細胞に対するデンドリマーの実質的な選択性が示された（データは示されていない）。更なる試験において、同じ種類ではあるが、ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）ペプチドのスクランブルさせた形態を１０モノマー単位提示すデンドリマーは、スクランブルさせていないＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）ペプチドを提示するＩＫ２４８Ｂデンドリマーと比べ、ＦＣＳで刺激したＨＴ２９結腸癌細胞のＥＲＫ活性化の阻害に比較的効果がなかった。
【０１０８】
実施例５：ＨＴ２９ヒト腺癌細胞における増殖阻害
ＨＴ２９細胞を、選択されたデンドリマーの存在下で４８時間にわたって培養し、細胞の増殖を、基本的に実施例１．２に記載されるとおりにＭＴＴアッセイにより評価した。結果を、コントロール細胞（デンドリマーで処理されない）に対するパーセント増殖として計算した。
【０１０９】
５．１  デンドリマーＩＫ２４８Ｂによる増殖阻害
ＨＴ２９細胞をペプチドデンドリマーＩＫ２４８Ｂで処理した。その結果を図４に示す。図から分かるように、デンドリマーにより細胞の増殖が阻害された。
【０１１０】
５．２  デンドリマーのサイズ
ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を９（Ｄｅｎｄ９（１０）４）または１２（Ｄｅｎｄ１２  １０（４））モノマー単位提示する上記スキーム３に記載される種類のデンドリマーを、ＨＴ２９細胞の増殖を阻害する能力について評価した。図５に示されるように、Ｄｅｎｄ１２は、細胞増殖の阻害においてＤｅｎｄ９より効果的であった。デンドリマーＩＫ２４８Ｂ（ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０モノマー単位提示する）と比較される場合、Ｄｅｎｄ１２  １０（４）は、ＩＣ５０値に僅かな改善（１．８μＭに対し１μＭ）を示したが、全滅に必要とされるデンドリマー濃度（すなわち、Ｄｅｎｄ１２（１０）４およびＩＫ２４８Ｂの両方について１０μＭ）の増加は全く得られなかった。デンドリマーＩＫ２４８Ｂは、同様に、デンドリマーＩＫ２４８（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲペプチド（配列番号６）を８モノマー単位提示する）よりも効果的であった（それぞれ、１．８μＭおよび５μＭのＩＣ５０）。
【０１１１】
５．３  Ｄ−アミノ酸から成るペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）の使用
ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲペプチド（配列番号６）のモノマー単位が完全にＤ−アミノ酸から成り、それらのカルボキシ末端にて２つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位でペグ化されたペプチドデンドリマーＩＫ２４８Ｂ（改変（Ｍｏｄ．）ＩＫ２４８ＢまたはＰｅｇ２  Ｄｅｎｄ１０  Ｄ−１０（４）と同定される）の、ヒトＨＴ２９細胞の増殖の阻害における有効性を、シスプラチン、イリノネクチン（ｉｒｉｎｏｎｅｃｔｉｎ）（ＣＰＴ−１１）および５−フルオロウラシル（５ＦＵ）と比較した。細胞の増殖をＭＴＴアッセイにより評価した。その結果を図６に示す。図から分かるように、改変ＩＫ２４８Ｂデンドリマーは、シスプラチン、ＣＰＴ−１１および５ＦＵのみと比べてかなり大きな細胞増殖阻害をもたらした。
【０１１２】
実施例６：ＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７）またはＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）を提示するペプチドデンドリマーでのＨＴ２９結腸癌細胞の処理
ＨＴ２９結腸癌細胞を、β３ベースの１０マーペプチド（ＲＡＲＡＫＮＰＬＹＫ（配列番号７））（Ｄｅｎｄ８  β３）またはβ５ベースのペプチド（ＲＳＲＡＲＮＰＬＹＲ（配列番号８）（Ｄｅｎｄ８  β５と同定される）を８モノマー単位提示する図３に図示されている種類のペプチドデンドリマーで処理した。試験細胞を、４８時間にわたってデンドリマーに暴露し、細胞の増殖を、基本的に上記実施例１．２に記載されるとおりにＭＴＴアッセイを用いて評価した。吸光度を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて５５０ｎｍで読み取り、試験細胞の増殖のパーセント阻害を、非処理コントロール細胞と比較して計算した。結果を図７に示す。図から分かるように、デンドリマーＤｅｎｄ８  β３およびＤｅｎｄ８  β５の両方が、ＨＴ２９癌細胞の増殖を阻害したが、Ｄｅｎｄ８  β５はより効果的であった。
【０１１３】
実施例７：マウスモデルにおける腫瘍成長の阻害
７．１  材料
ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌細胞の培養のための試薬を以下の供給業者から入手した：ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地、ＦＢＳおよびＨＢＳＳをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ（Ｍｔ  Ｗａｖｅｒｌｅｙ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手；ペニシリン−ストレプトマイシン、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）およびトリパンブルーをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手。
【０１１４】
７．２  腫瘍細胞生成
ＨＴ２９ヒト結腸直腸腺癌細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび５０ＩＵ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地で培養した。細胞をトリプシン処理により採取し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、計数した。次いで、最終濃度が２×１０７細胞／ｍＬとなるように細胞をＨＢＳＳに再懸濁した。
【０１１５】
７．３  試験系
種：マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）
株：ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ
供給者：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｄｅｌａｉｄｅ（Ｗａｉｔｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｕｒｒｂｒａｅ，ＳＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）
試験における動物の総数：雌２０匹
試験群数：２群（１試験群、１コントロール群）
１群当たりのマウス数：１０匹
体重範囲：処置開始時２０．６１〜２５．２７ｇ（平均２２．２７ｇ）
週齢範囲：処置開始時１０〜１２週
【０１１６】
７．４  腫瘍接種
接種前に、注射部位（背右脇）の皮膚にアルコールを塗った。動物の右肩直下の皮下空間に皮膚を通して針を挿入し、１００μＬの細胞（２×１０６細胞）を吐出させた。マウスの処置は、ＨＴ２９細胞接種の９日後に開始し、平均腫瘍体積は６８ｍｍ３（平均変動性６．１％）であった。
【０１１７】
７．５  体重および腫瘍測定
体重および腫瘍寸法（長さおよび直径）を、全ての動物について処置の初日（０日目）に測定し、次いで週に３回（試験の終了日（２４日目）を含む）測定した。
【０１１８】
７．６  投与
試験の０日目に、マウスを体重に基づき無作為抽出し、２つの１０匹のマウスから成る群に分けた。ペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）を１０モノマー単位提示するペプチドデンドリマーＩＫ２４８Ｂ（実施例８参照）を、本試験に用いた。ビヒクルコントロール（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））およびＩＫ２４８Ｂデンドリマー（２０ｍｇ／ｋｇ）の各々を、０日目に開始し、１日１回、５日間連続して腫瘍内注射により投与した。
【０１１９】
ビヒクルコントロールおよびＩＫ２４８Ｂデンドリマーを、２１ｇのマウスに基づき４．７６２ｍＬ／ｋｇ（１００μＬ）の投与容量で投与した。投薬の直前に各動物の体重を測定した。各マウスに投与される投与溶液の容量を個々の体重に基づいて計算し、調節した。
【０１２０】
７．７  試料回収および計算
死後に全てのマウスから腫瘍を摘出し、計量した。腫瘍体積を以下の方程式を用いて計算した。
Ｖ（ｍｍ３）＝長さ×直径２×ｐ／６
腫瘍の変動性を以下の方程式を用いて計算した。
変動性（％）＝（標準誤差腫瘍体積／腫瘍体積平均）×１００
ΔＴ／ΔＣ（％）を以下の方程式を用いて計算した。
ΔＴ／ΔＣ％＝（Δ体積処置／Δ体積コントロール）×１００
式中、Δ＝０日目から最終測定日または対象の指定日までの体積変化
【０１２１】
７．８  統計的計算
全ての統計的計算を、ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ３．０（ＳＰＳＳ  Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ，Ｎｏｒｔｈ  Ｓｙｄｎｅｙ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて実施した。二標本ｔ検定を用いて、０日目と４日目の間および０日目と試験終了日の間の処置群内の体重変化の有意性を決定した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、本試験の最後に全てのマウスにおいて測定された腫瘍体積に対して実施した。データに有意差が見出された場合は、全対多重比較法（ホルム−サイダック（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ）法）を実施した。二標本ｔ検定を用いて、ビヒクルコントロールおよびＤｅｎｄ１０  １０（４）処置群についての腫瘍重量データ間の有意差を証明した。０．０５未満のｐ値は有意と見なされた。
【０１２２】
７．９  結果
【表１】
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【０１２３】
図８でより明確に示されるように、腫瘍成長は、ビヒクルのみのコントロール（中実の菱形）と比較して、デンドリマーＩＫ２４８Ｂ（Ｄｅｎｄ１０  １０（４））（中実の正方形）によって著しく阻害された。特に、５日目〜１５日目の間に、コントロール群に比べ、処置群において腫瘍の成長が顕著に遅くなった。本試験の終了時のコントロール群における平均腫瘍重量は、ＩＫ２４８Ｂ処置群についての０．４３７ｇ±０．０７２（標準誤差）と比較して０．９６２ｇ±０．１２４（標準誤差）であり、高度に有意な結果であった（Ｐ≦０．００３）。
【０１２４】
実施例８：インビボでのデンドリマーの安定性
８．１  材料
９６ウェル細胞培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｏｒｔｈ  Ｒｙｄｅ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（商標））細胞生死判別アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）。ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地、ＦＢＳおよびＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ｍｔ  Ｗａｖｅｒｌｅｙ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。ペニシリン−ストレプトマイシンおよびトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。生理的食塩水（Ｂａｘｔｅｒ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳ蛍光測定器（Ａｄｅｌａｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｄｅｌａｉｄｅ，ＳＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。マウス血清（ＭＳ）については、眼窩採血を行い、続いて遠心分離機にかけることにより、ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した。
【０１２５】
８．２  動物モデル
種：マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）
株：ＢＡＬＢ／ｃ
供給者：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｄｅｌａｉｄｅ（Ｗａｉｔｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｕｒｒｂｒａｅ，ＳＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）
試験における動物の総数：９（インビボ試験用）
体重範囲：処置開始時１７．８〜２０．７ｇ（平均１９．１２ｇ）
開始時の週齢範囲：処置開始時８〜１０週
【０１２６】
全ての動物は、詳細な身体的検査（体重測定を含む）を受けた。これらの動物は、十分に健康であると認められ、単一のマイクロアイソレーターケージに収容された。このケージには、試験番号、性別、および処方された投与濃度および投与容量を表示したケージカードで明確に分類した。各動物を、バーコードリーダー（ＤａｔａＭａｒｓ  ＬａｂＭａｘ  Ｉ）で走査され得るトランスポンダー（Ｂａｒ  Ｃｏｄｅ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｔａｎｙ  Ｂａｙ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって識別した。トランスポンダーは、マウスがイソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で誘発した知覚麻痺下にある間に肩甲骨間に、皮下注射により挿入された。
【０１２７】
動物を、制御された環境（対象範囲：温度２１±３℃、湿度３０〜７０％、１時間に１０〜１５回の換気）において、各１２時間の明／暗サイクルを用い、バリア（検疫）条件下に飼育した。温度および相対湿度を継続的にモニタリングした。全ての動物を同じ環境条件に供した。標的範囲からのどのような逸脱も動物の健康に影響を及ぼさなかったと評価された。標準的な公認の市販の齧歯動物用食餌（Ｒａｔ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｕｂｅｓ，Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｆｅｅｄｓ，Ｇｌｅｎ  Ｆｏｒｒｅｓｔ，ＷＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）および水道水を、動物に自由に飲食させた。食餌供給はオートクレーブで処理することにより殺菌して行い、水供給は塩酸で酸性化（ｐＨ２．４〜２．７）することにより殺菌して行った。試験開始前の２４時間の間、動物を実験室の環境に慣れさせた。
【０１２８】
８．３  細胞培養
ヒト結腸直腸腺癌細胞株ＨＴ−２９を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から調達した。ＨＴ−２９細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび５０ＩＵ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地で培養した。全ての細胞を、９５％空気／５％ＣＯ２が供給される加湿細胞培養インキュベータで３７℃にて増殖させた。本試験で用いられた細胞は、２継代後に用いられた。
【０１２９】
細胞をトリプシン処理により採取し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、計数した。次いで、１×１０４細胞／ｍＬの濃度となるように、細胞を適切な培養培地に再懸濁させた。５０μＬのこの希釈物（４，０００細胞を含む）を、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。
【０１３０】
８．４  デンドリマーＰｅｇ２  Ｄｅｎｄ１０  Ｄ−１０（４）
様態：白色粉末
分子量：１４，８４３ダルトン
ロットＮｏ．：Ｔ４０８００
使用期限：該当なし
保存条件：４℃
取扱い上の注意事項：標準的な実験注意事項
【０１３１】
Ｐｅｇ２  Ｄｅｎｄ１０  Ｄ−１０（４）デンドリマーを、０．７２ｍｇの純粋なペプチドを含む１ｍｇバイアルで供給した。投与の日に、４つのバイアルを２２６μＬの滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて再構成させた。これら４つのバイアルの中身を投与前に一緒にまとめておいた。インビトロ試験用には、このＰｅｇ２  Ｄｅｎｄ１０  Ｄ−１０（４）の倍液を陽性コントロールとして用い、最終濃度が０．５μＬおよび１．０μＭとなるように、細胞培養培地で希釈した。陽性コントロールに用いられるマウス血清を、非処置マウス（群１）から調製した。
【０１３２】
単一の１５ｍｇ／ｋｇ用量のＰｅｇ２  Ｄｅｎｄ１０  Ｄ−１０（４）デンドリマーを、４．７ｍＬ／ｋｇの投与容量で尾の静脈から静脈内投与した。各動物の体重を、投与直前に測定した。各マウスに投与される投与溶液の容量を個体の体重に基づいて計算し、調節した。
【０１３３】
８．５  試料回収および終了
本試験において用いられる９匹のマウスを、３つの３匹から成る群に割り振った。群１のマウスを処置せずに放置し、採血を行った。群２のマウスの採血をＰｅｇ２  Ｄｅｎｄ１０  Ｄ−１０（４）処置の５分後および３０分後に行い、群３の動物の採血をＰｅｇ２  Ｄｅｎｄ１０  Ｄ−１０（４）処置の１５分後および６０分後に行った。全ての場合において、眼窩採血により採血を行った。全血液試料を、ヘパリン処理したキャピラリ−チューブ中に収集し、新しいチューブに移して氷上に置いた。試料を、２分〜３分にわたり４℃にて遠心分離機（１０００×ｇ）にかけた。血漿成分を新しいチューブに回収し、４℃にてインビトロ試験に移した。全てのマウスを、イソフルオランで誘発した知覚麻痺下において、心穿刺による致命的な出血により安楽死させた。
【０１３４】
８．６  細胞増殖アッセイ
ＨＴ−２９細胞を２×９６ウェルプレートに入れ、播種の２４時間後、一方のプレートを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を用いてアッセイした（６ウェル）。他方のプレートについては、２０％マウス血清中のＰｅｇ２  Ｄｅｎｄ１０  Ｄ−１０（４）デンドリマーの存在下でさらに７２時間にわたってインキュベートし、次いで、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイに供した。２４時間の増殖後に得られた平均値を、９６時間のインキュベーション（デンドリマーの存在下では７２時間）の間に得られた値から引いた。パーセント阻害を、以下の式を用いて計算した。
阻害（％）＝［１−（所与の用量における蛍光／非処置細胞の蛍光）］×１００
【０１３５】
８．７  Ｃｅｌｌｔｉｔｒｅ−ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイ
細胞のインキュベーション後、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）を各ウェルに加え、細胞培養インキュベータにおいて３７℃にてインキュベートした。蛍光を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳ蛍光測定器を用いて測定した。
【０１３６】
８．８  結果
結果を図９に示す。インビトロ試験において、ＨＴ２９癌細胞増殖の４０％より大きな阻害が０．５μＭの濃度のデンドリマーについて観察され、約５８％阻害が１μＭのデンドリマーの濃度で観察された。
【０１３７】
薬物動態試験を、腫瘍を有さないＢａｌｂ／ｃマウスにおいて行った。マウスからの血清を、デンドリマーの静脈内投与後の様々な時間間隔で得た。インビトロでＨＴ２９細胞の増殖を阻害する２０％マウス血清の能力を評価することにより、マウス血清中の活性なペプチド（ＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ、配列番号６）の存在をエクスビボで決定した。
【０１３８】
５分、１５分および３０分の時点について、血清中ＨＴ２９細胞の７０％を超えるインビトロ増殖阻害が観察された。６０分での阻害はほぼゼロであった。６０分時点はデンドリマーを注射した３匹の動物間で高い変動性を示したが、それは一匹のマウスが非常に高い測定値を示し、ほぼ間違いなくアウトライアーであったためである。その動物についての結果を無視すると、６０分時点の阻害は約６７％となる。
【０１３９】
注射時のマウスの末梢血中のペプチドＲＳＫＡＫＮＰＬＹＲ（配列番号６）の濃度は約１０．６μＭ（マウスの全血液２ｍＬ中０．３１５ｍｇ）であった。これらの結果は、静脈内投与の５分後、１５分後および３０分後の末梢血中Ｐｅｇ２  Ｄｅｎｄ１０  Ｄ−１０（４）デンドリマー濃度が少なくとも１μＭより高いことを示唆している。
【０１４０】
これらのデータは、Ｐｅｇ２  Ｄｅｎｄ１０  Ｄ−１０（４）デンドリマーが静脈内投与後に少なくとも３０分間はマウスの末梢血中に存在することを明確に示している。
【０１４１】
多数の好ましい実施形態が記載されたが、広く記載される本発明の精神または範囲から逸脱することなく数多くの変更および／または改変がなされ得ることが当業者により理解される。したがって、本実施形態は、あらゆる点で、説明のためのものと見なされるべきであり、限定するものと見なされるべきではない。
【０１４２】
参照文献
１．Ａｇｒｅｚ，  Ｍ．Ｖ．，  Ｂａｔｅｓ  Ｒ．Ｃ．，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｄ．，  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｎ．，  Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，  Ｎ．，  Ａｎｓｅｌｉｎｅ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ．  Ｄ．，  Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  aｖ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７３，  ８８７−８９２  （１９９６）．
２．Ａｇｒｅｚ，  Ｍ．Ｖ．，  Ｇｕ，  Ｘ．，  Ｔｕｒｔｏｎ，  Ｊ．，  Ｍｅｌｄｒｕｍ，  Ｃ．，  Ｎｉｕ，  Ｊ．，  Ａｎｔａｌｉｓ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ，  Ｅ．Ｗ．，  Ｔｈｅ  αｖβ６  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ  Ｂ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８１，  ９０−９７  （１９９９）．
３．Ｂｏｕｌｔｏｎ，  Ｔ．Ｇ．，  Ｎｙｅ，  Ｓ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｄ．  Ｊ．，  ＥＲＫｓ：  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  ＮＧＦ．  Ｃｅｌｌ  ６５，  ６６３−６７５  （１９９１）．
４．Ｂｒｅｕｓｓ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｇａｌｌｏ，  Ｊ．，  Ｄｅ  Ｌｉｓｓｅｒ，  Ｈ．Ｍ．，  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ，  Ｉ．Ｖ．，  Ｆｏｌｋｅｓｓｏｎ，  Ｈ．Ｇ．，  Ｐｉｔｔｅｔ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｓ．Ｌ．，  Ａｌｄａｐｅ，  Ｋ．，  Ｌａｎｄｅｒｓ，  Ｄ．Ｖ．，  Ｃａｒｒｅｎｔｅｒ，  Ｗ．，  Ｇｉｌｌｅｔ，  Ｎ．，  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｄ．，  Ｍａｔｈａｙ，  Ｍ．，  Ａｌｂｅｄａ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｋｒａｍｅｒ，  Ｒ．Ｈ．，  ａｎｄ  Ｐｙｔｅｌａ，  Ｒ．，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  β６  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １０８，  ２２４１−２２５１  （１９９５）．
５．Ｂｒｅｕｓｓ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｇｉｌｌｅｔ，  Ｎ．，  Ｌｕ，  Ｌ．，  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｐｙｔｅｌａ，  Ｒ．，  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ  ６  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ４１，  １５２１−１５２７  （１９９３）．
６．Ｃｌｏｎｉｎｇｅｒ，  Ｍ．Ｊ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ６，  ７４２−７４８  （２００２）．
７．Ｃｏｎｅ，  Ｒ．Ｉ．，  Ｗｅｉｎａｃｋｅｒ，  Ａ．，  Ｃｈｅｎ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｄ．，  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ  ｖ  ｂｅｔａ  ６  ｔｏ  ｆｏｃａｌ  ｃｏｎｔａｃｔｓ．  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２，  １０１−１１３  （１９９４）．
８．Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ＰＡ，  Ｃｒｏｓｓｌｅｙ，  ＲＥ，  ａｎｄ  Ｒｏｔｈｆｉｅｌｄ，  ＬＩ．  Ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ    ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｄｅｄ  ｆｏｒ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｉｉｃｅｌｌ  ｌｏｃｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｐｒｏｐｅｒ  ｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｓｅｐｔｕｍ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ．  Ｃｅｌｌ，  ５６；６４１−６４９，  １９８９．
９．Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ，  Ｆ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．，  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，  １０２８−１０３２  （１９９９）．
１０．Ｈａａｐａｓａｌｍｉ，  Ｋ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｋ．，  Ｔｏｎｎｅｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｏｌｅｒｕｄ，  Ｊ．，  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｄ．，  Ｓａｌｏ，  Ｔ．，  Ｋｒａｍｅｒ，  Ｒ．，  Ｃｌａｒｋ，  Ｒ．Ａ．Ｆ．，  Ｕｉｔｌｏ，  Ｖ−Ｊ．  ａｎｄ  Ｌａｒｊａｖａ，  Ｈ．，  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｗｏｕｎｄｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｖｂ６  ｉｎｔｅｇｒｉｎ．  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １０６，  ４２−４８  （１９９６）．
１１．Ｈｏｗｅ，  Ａ．，  Ａｐｌｉｎ，  Ａ．Ｅ．，  Ａｌａｈａｒｉ，  Ｓ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｊｕｌｉａｎｏ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０，  ２２０−２３１  （１９９８）．
１２．Ｈｙｎｅｓ，  Ｒ．  Ｏ．，  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ，  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  ６９，  １１−２５  （１９９２）．
１３．Ｊｏｎｅｓ，  Ｊ．，  Ｗａｔｔ，  Ｆ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｐｅｉｇｈｔ，  Ｐ．Ｍ．，  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ｖ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．  Ｊ．  Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈ．  ＆  Ｍｅｄ．  ２６，  ６３−６８  （１９９７）．
１４．Ｌｅｅ，  Ｃ．Ｃ．，  ＭａｃＫａｙ，  Ｊ．Ａ．，  Ｆｒｅｃｈｅｔ，  Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｚｏｋａ，  Ｆ．Ｃ．  Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３，  １５１７−１５２６  （２００５）．
１５．Ｎｅｅｄｌｅｍｅｎ，  Ｓ．Ｂ．，  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｃ．Ｃ．  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８（３），  ４４３−５３，  １９７０．
１６．Ｒｅｓｚｋａ，  Ａ．Ａ．，  Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，  Ａ．Ｆ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ  １  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１７，  １３２１−１３３０  （１９９２）．
１７．Ｓａｄｌｅｒ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｔａｍ，  Ｊ．Ｐ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ９０，  １９５−２２９，  （２００２）．
１８．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｄ．，  Ｒｏｚｚｏ，  Ｃ．，  Ｓｔａｒｒ，  Ｌ．，  Ｑｕａｒａｎｔａ，  Ｖ．，  Ｅｒｌｅ，  Ｄ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｐｙｔｅｌａ，  Ｒ．，  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  β  ｓｕｂｕｎｉｔ  （β６）  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  １１５０２−１１５０７  （１９９０）．
１９．Ｓｍｙｔｈｅ，  Ｗ．Ｒ．，  Ｌｅｂｅｌ，  Ｅ．，  Ｂａｖａｒｉａ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｋａｉｓｅｒ，  Ｌ．Ｒ．  ａｎｄ  Ａｌｂｅｌｄａ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ  ＆  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １４，  ２２９−２３９  （１９９５）．
２０．Ｔａｋｉｕｃｈｉ，  Ｈ．，  Ｋａｎｏｋｏｇｉ，  Ｍ．，  Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，  Ｎ．，  Ｈａｎａｆｕｓａ，  Ｔ．，  Ｋｙｏ，  Ｍ．，  Ｉｃｈｉｋａｗａ，  Ｙ．，  Ｎａｇａｎｏ，  Ｓ．，  Ｆｕｋｕｎｉｓｈｉ，  Ｔ．，  Ｙａｂｕｍｏｔｏ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｉｈａｒａ，  Ｈ．，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ．  Ｊａｐ．  Ｊ．  Ｕｒｏｌｏｇｙ  ８５，  ５８４−５８８  （１９９４）．
１．Ｔｈｏｍａｓ，  Ｇ．Ｊ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｐｅｉｇｈｔ，  Ｐ．Ｍ．，  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３３，  ３８１−３８８  （１９９７）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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