(57)【要約】  本発明は、リノール酸［「ＬＡ」；１８：２  ω−６］をγ−リノレン酸［「ＧＬＡ」；１８：３  ω−６］におよび／またはα−リノレン酸［「ＡＬＡ」；１８：３  ω−３］をステアリドン酸［「ＳＴＡ」；１８：４  ω−３］に転換する能力を有するΔ６デサチュラーゼに関する。Δ６デサチュラーゼをコードする断片を含んでなる単離された核酸断片および組み換え構築物、ならびにこれらのΔ６デサチュラーゼを油性酵母中で使用して長鎖多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］を生成する方法が開示される。
2011529689.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子；
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子；または
（ａ）または（ｂ）と完全に相補的な単離された核酸分子
からなる群から選択される、Δ６デサチュラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２】
少なくとも２２７個のコドンがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のためにコドン最適化された、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号１および配列番号４６からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
ＢＬＡＳＴＰアラインメント法に基づいて配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも４７１個のアミノ酸のΔ６デサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列；または
前記第１のヌクレオチド配列の相補配列を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号２に記載のΔ６デサチュラーゼ酵素をコードするポリペプチド。
【請求項６】
少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、請求項１または４のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項７】
請求項１または請求項４に記載の単離された核酸配列を含んでなる微生物宿主細胞。
【請求項８】
微生物宿主細胞が、酵母、藻類、細菌、ユーグレナ属、ストラメノパイル、卵菌綱、および真菌からなる群から選択される、請求項７に記載の微生物宿主細胞。
【請求項９】
細胞が、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）からなる群から選択される属のメンバーである、請求項８に記載の微生物宿主細胞。
【請求項１０】
細胞が油性酵母である、請求項８に記載の微生物宿主細胞。
【請求項１１】
油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のメンバーである、請求項１０に記載の微生物宿主細胞。
【請求項１２】
ａ）請求項１または請求項４に記載の核酸配列を発現する微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）γ−リノレン酸が生成する条件下においてリノール酸源存在下で（ａ）の宿主細胞を増殖させるステップと
を含んでなる、γ−リノレン酸を生成する方法。
【請求項１３】
ａ）請求項１または請求項４のいずれかに記載の核酸配列発現する微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）ステアリドン酸が生成する条件下において、α−リノレン酸源存在下で（ａ）の宿主細胞を増殖させるステップと
を含んでなる、ステアリドン酸を生成する方法。
【請求項１４】
ａ）単離された核酸分子が前記配列番号１および配列番号４６からなる群から選択される核酸配列を有し、
ｂ）宿主細胞がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、
請求項１２または１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する２００８年８月１日に出願された米国仮特許出願第６１／０８５，４８２号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は生物工学の分野にある。より具体的には本発明は、Δ６脂肪酸デサチュラーゼをコードするポリヌクレオチド配列の同定、および長鎖多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］生成におけるこれらのデサチュラーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］の商業的な生産手段として、植物、藻類、真菌、ストラメノパイル、および酵母をはじめとする多様な異なる宿主が調査されている。遺伝子操作は、いくつかの宿主の自然の能力を実質的に改変して（天然ではリノール酸［ＬＡ；１８：２  ω−６］およびα−リノレン酸［ＡＬＡ；１８：３  ω−３］脂肪酸産生に限定されるものでさえ）、様々な長鎖ω−３／ω−６ＰＵＦＡの高レベル産生をもたらし得ることを実証している。これが自然の能力または組み換え技術の結果であるのかどうかに関わらず、アラキドン酸［ＡＲＡ；２０：４  ω−６］、エイコサペンタエン酸［ＥＰＡ；２０：５  ω−３］、およびドコサヘキサエン酸［ＤＨＡ；２２：６  ω−３］の産生は、全てΔ６デサチュラーゼの発現を要するかもしれない。
【０００４】
これまでに同定されたほとんどのΔ６デサチュラーゼ酵素は、ＬＡをγ−リノレン酸［ＧＬＡ；１８：３  ω−６］に転換する主要能力を有し、ＡＬＡをステアリドン酸［ＳＴＡ；１８：４  ω−３］に転換する二次的活性がある。例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡの合成においてΔ６デサチュラーゼ酵素が果たすかもしれない役割に基づいて、様々な原料からこれらの酵素を同定し特性解析するかなりの努力がなされている。このようであるので、公の文献（例えばＧｅｎＢａｎｋ）および特許文献（例えば米国特許第５，９６８，８０９号明細書、米国特許第７，０６７，２８５号明細書、および米国特許第７，３３５，４７６号明細書、および米国特許出願公開第２００６−０１１７４１４号明細書）の双方で多数のΔ６デサチュラーゼが開示されている。Δ５、Δ８、およびΔ４デサチュラーゼと並んで、Δ６デサチュラーゼは長鎖ＰＵＦＡ「フロントエンド」デサチュラーゼ（メチル依存性不飽和化とは対照的に既存の二重結合と脂肪酸のアシル基のカルボキシル末端との間で不飽和化が起きる）として知られている。これらのデサチュラーゼは、３個のヒスチジンボックス［Ｈ（Ｘ）3-4Ｈ（配列番号３および４）、Ｈ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号５および６）、およびＨ／Ｑ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号７および８）］によって特徴付けられ、電子供与体として機能するそれらのＮ末端に融合チトクロームｂ5ドメインを保有することから、チトクロームｂ5融合スーパーファミリーのメンバーである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Δ６デサチュラーゼをコードする遺伝子は知られているが、ω−３／ω−６脂肪酸の生成において使用するための多様な宿主生物中での異種性発現に適した様々な酵素的特性があるこれらの酵素の追加的種類に対する必要性がある。出願人らは、紅藻ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）からΔ６デサチュラーゼをコードする遺伝子を単離することで、既述の必要性に対処した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Δ６デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする新しい遺伝子構築物、およびＰＵＦＡを生成するための藻類、細菌、酵母、ユーグレナ属、卵菌綱、ストラメノパイル、および真菌中でのそれらの使用に関する。
【０００７】
したがって本明細書では、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子；
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子；または
（ａ）または（ｂ）と完全に相補的な単離された核酸分子
からなる群から選択される、Δ６デサチュラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子が提供される。
【０００８】
第２の実施態様では、本発明は、
ＢＬＡＳＴＰアラインメント法に基づいて配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較すると、少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも４７１個のアミノ酸のΔ６デサチュラーゼ酵素をコードす相補物を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【０００９】
第３の実施態様では、本発明は、本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチド、および同核酸配列を含んでなる微生物宿主細胞を提供する。
【００１０】
第４の実施態様では、本発明は、
ａ）請求項１または請求項４の核酸配列を発現する微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）γ−リノレン酸が生成される条件下においてリノール酸源存在下で（ａ）の宿主細胞を増殖させるステップと
を含んでなる、γ−リノレン酸を生成する方法を提供する。
【００１１】
第５の実施態様では、本発明は、
ａ）請求項１または請求項４のどちらかの核酸配列を発現する微生物宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）ステアリドン酸が生成する条件下において、α−リノレン酸源存在下で（ａ）の宿主細胞を増殖させるステップと
を含んでなるステアリドン酸を生成する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ω−３およびω−６脂肪酸生合成経路を示し、下記のこの経路の説明を検討する際に図１Ｂと合わせ見るべきである。
【図１Ｂ】ω−３およびω−６脂肪酸生合成経路を示し、下記のこの経路の説明を検討する際に図１Ａと合わせ見るべきである。
【図２】ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎTMｖ６．１プログラムを使用した、フェオダクチラム・トリコルナタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）（配列番号３７）、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（配列番号３８）、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（配列番号３９）、およびモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（配列番号４０）からのΔ６デサチュラーゼ；およびミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ８デサチュラーゼ（配列番号４１）中の２つの保存領域のアラインメントである。３つの枠内領域の保存アミノ酸は、７つの縮重プライマーに対応する。
【図３】ｐＹ１０９  ＃１のプラスミドマップである。
【００１３】
本発明は、本明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明からより完全に理解できる。
【００１４】
次の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）、およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００１５】
配列一覧
配列番号１〜５０は、表１で同定されるような遺伝子、タンパク質（またはその一部）、プライマーまたはプラスミドをコードするＯＲＦである。
【００１６】
表１
核酸およびタンパク質配列番号の要約
【表１】
2011529689.tif 000003
2011529689.tif 000004
2011529689.tif 000005
【発明を実施するための形態】
【００１７】
健康に良いＰＵＦＡの生成のため生化学的経路を操作するために使用されてもよい、新しいポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）Δ６デサチュラーゼ酵素、および同酵素をコードする遺伝子が本明細書で開示される。
【００１８】
ＰＵＦＡまたはその誘導体は、食餌代用物または栄養補給剤として、特に乳児用調製粉乳中で、静脈内栄養補給される患者のために、または栄養失調を予防しまたは治療するために使用される。代案としては、通常の使用において受容者が所望量の食事補給を受け入れるように調合された、料理用油、脂肪またはマーガリン中に、精製されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）を組み込んでもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤またはその他の食品に組み込まれてもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としても用途があるかもしれない。組成物はヒト用または獣医学用どちらかの医薬用途のために使用されていてもよい。
【００１９】
本明細書で言及する全ての特許および非特許文献は、参照によって本明細書に援用する。
【００２０】
本開示では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
「オープンリーディングフレーム（読み取り枠）」はＯＲＦと略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
「アメリカンタイプカルチャーコレクション（米国微生物系統保存機関）」はＡＴＣＣと略記される。
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記される。
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略記される。
「総脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略記される。
【００２１】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書での用法では本発明の特定の一実施態様への限定は意図されず、一般に特許請求の範囲および明細書に記載されるあらゆる全ての本発明の実施態様に適用される。
【００２２】
「脂肪酸」という用語は、約Ｃ12〜Ｃ22の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指すが、より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られている。優勢な鎖長はＣ16〜Ｃ22の間である。脂肪酸の構造は簡易表記体系「Ｘ：Ｙ」によって表され、式中Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、および「ω６脂肪酸」［「ω−６」または「ｎ−６」］対ω３脂肪酸［「ω−３」または「ｎ−３」］の間の区別に関する追加的詳細は、参照によって本明細書に援用する米国特許第７，２３８，４８２号明細書中に提供される。
【００２３】
本明細書においてＰＵＦＡを既述するのに使用される命名法を下の表２に示す。「略記法」と題された欄では、オメガ−参照システムが使用されて炭素数、二重結合数、およびオメガ炭素（この目的では番号１）から数えて、オメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示唆する。表の残りの部分は、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆物質の一般名、明細書の残りの部分全体を通じて使用される略語、および各化合物の化学名を要約する。
【００２４】
表２
多価不飽和脂肪酸および前駆物質の命名法
【表２】
2011529689.tif 000006
【００２５】
表３に列挙するω−３／ω−６ＰＵＦＡは、本明細書に記載される方法を使用して油性酵母の油画分中に蓄積する可能性が最も高いものであるが、この一覧は限定的または完全なものとみなすべきではない。
【００２６】
「油」という用語は、２５℃で液体であり、通常は多価不飽和である脂質物質を指す。油性の生物中では、油が総脂質の大部分を構成する。「油」は主にトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］からなるが、その他の中性脂質、リン脂質、および遊離脂肪酸もまた含有してよい。油中の脂肪酸組成と総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似している。したがって総脂質中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少は、油中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少に対応し、逆もまた然りである。
【００２７】
「中性脂質」とは貯蔵脂肪としての脂肪体の細胞中に一般に見られる脂質を指し、細胞のｐＨにおいて、脂質が荷電基を有さないことからこのように称される。一般にそれらは完全に非極性で、水に対する親和性がない。中性脂質とは、一般に脂肪酸によるグリセロールのモノ−、ジ−、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはトリアシルグリセロールとも称され、または集合的にアシルグリセロールと称される。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出する為には、加水分解反応が起きなくてはならない。
【００２８】
「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］という用語は、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびにより短鎖の飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。
【００２９】
「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］という用語は、本明細書では、例えば生物由来資源または油であってもよい特定サンプル中で、（当該技術分野で知られているような）塩基エステル交換法によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化し得る細胞性脂肪酸の総和を指す。したがって総脂肪酸は、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびＴＡＧをはじめとする）からの脂肪酸、および極性脂質画分（ＰＣおよびＰＥ画分をはじめとする）からの脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸は含まない。
【００３０】
細胞の「総脂質含量」という用語は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の％としてのＴＦＡ測定値であるが、総脂質含量は、ＤＣＷの％としてのＦＡＭＥ測定値［「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」］として近似し得る。したがって総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷあたりの総脂肪酸のミリグラムに相当する。
【００３１】
総脂質中の脂肪酸濃度は、本明細書では、例えば１００ミリグラムのＴＦＡあたりの特定の脂肪酸のミリグラムのように、ＴＦＡの質量％［「％ＴＦＡ」］として表される。特に断りのない限り本開示では、総脂質を基準とする特定の脂肪酸の％への言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に相当する（例えば総脂質の％ＥＰＡはＥＰＡ％ＴＦＡに相当する）。
【００３２】
「脂質プロファイル」および「脂質組成物」と言う用語は置き替え可能であり、総脂質または油などの特定の脂質画分中に含有される個々の脂肪酸量を指し、量はＴＦＡの質量％として表される。混合物中に存在する個々の各脂肪酸の和は、１００になるべきである。
【００３３】
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸に；およびＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸に転換する代謝過程を指す。この過程については文献で十分に記載されている（例えば米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書を参照されたい）。簡単に述べるとこの過程は、小胞体膜内に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特有な延長酵素および不飽和化酵素による、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合の付加を通じた分子の不飽和化を伴う。より具体的には「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」とは、ＰＵＦＡの生合成と関連付けられている以下の酵素のいずれか（および上記酵素をコードする遺伝子）を指す。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼおよび／またはＣ20/22エロンガーゼ。
【００３４】
「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」という用語は、最低限少なくとも１つのΔ６デサチュラーゼおよび少なくとも１つのＣ18/20エロンガーゼ（同義的にΔ６エロンガーゼとも称される）を含むＰＵＦＡ生合成経路を指し、それによってＧＬＡおよび／またはＳＴＡを中間体脂肪酸として、それぞれＬＡおよびＡＬＡからＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡが生合成できるようになる。その他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼの発現により、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡもまた合成されてもよい。
【００３５】
「デサチュラーゼ」と言う用語は、不飽和化できる、すなわち１個もしくはそれ以上の脂肪酸に二重結合を導入して、対象とする脂肪酸または前駆物質を生じさせるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸を指すために、本明細書全体を通じてω参照システムを使用するが、デルタ系を使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。本明細書で特に興味深いのは、分子のカルボキシル末端から数えて６番目と７番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化するΔ６デサチュラーゼであり、それは例えばＬＡからＧＬＡへおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの転換を触媒し得る。その他の脂肪酸デサチュラーゼとしては、例えばΔ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、およびΔ９デサチュラーゼが挙げられる。当該技術分野では、Δ１５およびΔ１７デサチュラーゼはまた、時としてω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に転換する能力に基づいて、「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」と称される（例えばそれぞれＬＡからＡＬＡ、およびＡＲＡからＥＰＡへの変換）。脂肪酸デサチュラーゼのための遺伝子によって適切な宿主を形質転換し、宿主の脂肪酸プロファイルに対するその影響を判定することで、特定の脂肪酸デサチュラーゼの特異性を経験的に判定することが望ましいであろう。
【００３６】
本明細書の目的では、「ＰｃＤ６」という用語は、本明細書の配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる、紅藻ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）から単離されたΔ６デサチュラーゼ酵素（配列番号２）を指す。同様に「ＰｃＤ６Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化されたＰ．クルエンタム（Ｐ．ｃｒｕｅｎｔｕｍ）に由来する合成Δ６デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号４６および４７）。
【００３７】
「変換効率」および「％基質変換」という用語は、それによって特定酵素（例えばデサチュラーゼ）が基質を生成物に変換できる効率を指す。変換効率は、次の式に従って測定される。（［生成物］／［基質＋生成物］）*１００。式中、「生成物」は即時の生成物およびそれに由来する経路中の全ての生成物を含む。
【００３８】
「エロンガーゼ」という用語は、脂肪酸炭素鎖を延長して、エロンガーゼが作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分長い酸を生成し得るポリペプチドを指す。この延長過程は、米国特許出願公開第２００５／０１３２４４２号明細書に記載されるように、脂肪酸シンターゼと共同して多段階機序で起きる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、ＬＡからＥＤＡ、ＡＲＡからＥＴｒＡ、ＡＲＡからＤＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。
【００３９】
一般にエロンガーゼの基質選択性はいくぶん広いが、鎖長と不飽和度の双方によって差別される。例えばＣ14/16エロンガーゼはＣ14基質（例えばミリスチン酸）を利用し、Ｃ16/18エロンガーゼはＣ16基質（例えばパルミチン酸）を利用し、Ｃ18/20エロンガーゼはＣ18基質（例えばＬＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ）を利用し、Ｃ20/22エロンガーゼはＣ20基質（例えばＡＬＡ、ＥＰＡ）を利用する。本明細書の目的では、２つの異なるタイプのＣ18/20エロンガーゼを定義し得る。Δ６エロンガーゼはそれぞれＧＬＡおよびＳＴＡからＤＧＬＡおよびＥＴＡへの転換を触媒する一方、Δ９エロンガーゼはそれぞれＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの転換を触媒し得る。
【００４０】
いくつかのエロンガーゼは広い特異性を有し、したがって単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できてもよいことに留意することが重要である（例えばそれによってＣ16/18エロンガーゼおよびＣ18/20エロンガーゼの双方として機能する）。適切な宿主を脂肪酸エロンガーゼ遺伝子で形質転換して、宿主の脂肪酸プロファイルに対するその効果を判定することにより、脂肪酸エロンガーゼの特異性を経験的に判断することが望ましいかもしれない。
【００４１】
「油性の」という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０年）。一般に油性微生物の細胞油分はＳ字形曲線に従い、脂質濃度は対数後期または定常期初期で最大に達するまで増大し、次に定常期後期および死滅期において徐々に減少する（ＹｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉおよびＷａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９〜２５（１９９１年））。油性微生物がそれらの乾燥細胞重量の約２５％以上を油として蓄積することは珍しくない。
【００４２】
「油性酵母」という用語は、油を産生し得る酵母に分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿った特定位置で保存される一組のアミノ酸を意味する。その他の位置のアミノ酸は相同タンパク質の間で変化し得るのに対し、特定位置の高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性において必須のアミノ酸を示す。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列中のそれらの高度な保存によって同定されるので、それらは新しく判定された配列があるタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定する識別子または「シグネチャー」として使用し得る。Δ６デサチュラーゼ酵素中に普遍的に見られるモチーフ（すなわち動物、植物、および真菌）としては、３つのヒスチジンボックス（すなわちＨ（Ｘ）3-4Ｈ（配列番号３および４）、Ｈ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号５および６）、およびＨ／Ｑ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号７および８））が挙げられる。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「単離された核酸断片」という用語は、本明細書で同義的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基が含有されていてもよい、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチド（通常それらの５’一リン酸の形態で見られる）は、次のような一文字名によって言及される。「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、および「Ｎ」はあらゆるヌクレオチドである。
【００４５】
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸断片の一本鎖形態がその他の核酸断片とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は良く知られており、参照によって本明細書に援用するＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）の特に第１１章および表１１．１で例示される。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェントな条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似の断片をスクリーニングするため、そして（近縁の生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの）高度に類似した断片をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件のセットは、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェントな条件のセットはより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件のセットは、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。さらに別のストリンジェントな条件のセットは、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションを含む。
【００４６】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とする。核酸がハイブリダイゼーションする適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で良く知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。より高いＴｍに対応する、核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性は次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さがヌクレオチド１００個を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出９．５０〜９．５１参照）。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最小の長さは少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、プローブの長さなどの要因次第で、温度および洗浄液の塩濃度を必要に応じて調節してもよいことを認識する。
【００４７】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化アラインメントおよび同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。一般に推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定、および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本明細書の開示は、特定の真菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書で報告される配列の便益を有する当業者は、当業者に知られている目的のために、今や開示される配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって添付の配列一覧に報告される完全な配列、ならびに上で定義される配列のかなりの部分は本開示に包含される。
【００４８】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって添付の配列一覧に報告される完全な配列に相補的な単離された核酸断片、ならびに実質的に同様の核酸配列は本開示に包含される。
【００４９】
「相同性」および「相同的な」という用語は、同義的に使用される。それらは１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が、核酸断片が遺伝子発現を仲介する能力、または特定のフェノタイプを生じる能力に影響しない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の無修飾断片と比較して得られる核酸断片の機能特性を実質的に改変しない、１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの核酸断片の修飾も指す。
【００５０】
さらに当業者は、相同的な核酸配列がまた、例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃の中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に例証される配列と、または本明細書で開示されるヌクレオチド配列と機能的に同等のそのあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によって定義されることも認識する。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物からの相同的な配列などの中程度に類似した断片、および近縁関係にある生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの類似性の高い断片をスクリーニングするために調節し得る。
【００５１】
「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における、非標的核酸配列へのそのハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度により高い程度の（例えばバックグラウンドの少なくとも２倍）核酸配列の特定の核酸標的配列へのハイブリダイゼーションへの、および非標的核酸の実質的排除への言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的に互いに少なくとも約８０％の配列同一性、または９０％の配列同一性、１００％以下の配列同一性（すなわち完全に相補的）を有する。
【００５２】
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、その下でプローブがその標的配列と選択的にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況において異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを調節することで、プローブと１００％相補的な標的配列を同定し得る（相同プロービング）。代案としては、より低い程度の類似性が検出されるようにストリンジェンシー条件を調節して、配列中のいくらかのミスマッチを許容し得る（非相同プロービング）。一般にプローブは長さが約１０００未満のヌクレオチドであり、長さが５００未満のヌクレオチドとされていてもよい。
【００５３】
典型的にストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．５ＭのＮａイオン未満、典型的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン（またはその他の塩）濃度であり、短いプローブ（例えば１０〜５０個のヌクレオチド）では温度が少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０個のヌクレオチドを超える）では少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成できる。低ストリンジェンシー条件の具体例としては、３７℃で３０〜３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いたハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が挙げられる。中程度のストリンジェンシー条件の具体例としては、３７℃で４０〜４５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の具体例としては、３７℃で５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃で０．１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。追加的なストリンジェントな条件の組としては、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００５４】
特異性は典型的にハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な要因は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７〜２８４頁（１９８４年）の式、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから近似でき、式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびトシシンヌクレオチドの百分率であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは相補的標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨ下における）温度である。Ｔｍは１％のミスマッチあたり約１℃低下するので、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を調節して、所望の同一性がある配列にハイブリダイズさせることができる。例えば≧９０％同一の配列を求める場合、Ｔｍを１０℃低下できる。一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列およびその相補物の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。しかし厳しいストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも１、２、３または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき、中程度にストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも６、７、８、９または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき、低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍよりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。数式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションが、固有に述べられることを理解するであろう。所望のミスマッチ程度が、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合、より高い温度を使用できるようにＳＳＣ濃度を増大させることが好ましい。核酸ハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，第１部，第２章，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３年）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２章，Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５年）にある。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１２０または２４０分間適用できる。
【００５５】
「％同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係を指す。「％同一性」は、場合によっては、比較される配列間の整合百分率によって判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「％同一性」および「％類似性」は、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８年）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３年）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４年）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７年）；および５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１年）に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算できる。
【００５６】
％同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。％同一性および％類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎTMプログラムを使用して実施してもよい。配列の多重アラインメントは、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」および「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」をはじめとするアルゴリズムのいくつかの変種を包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９〜１９１（１９９２年）により記載され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎTM（バージョン８．０．２）プログラムにある）。どちらかのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、プログラムの「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることが可能である。
【００５７】
アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用した多重アラインメントでは、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用したタンパク質配列のペアワイズ配列比較および％同一性計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸ではこれらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を使用した多重アラインメントのデフォルトパラメーターは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢに相当する。
【００５８】
「配列比較のＢＬＡＳＴＮ法」が、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較する、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するアルゴリズムであるのに対し、「ＢＬＡＳＴＰアラインメント法」は、デフォルトパラメーターを使用してタンパク質配列を比較する、ＮＣＢＩによって提供されるアルゴリズムである。
【００５９】
その他の種から同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者はよく理解している。適切な核酸断片、すなわち本明細書の開示に従った単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で報告されるアミノ酸配列と少なくとも約７０〜８５％同一のポリペプチドをコードする一方、より好ましい核酸断片は少なくとも約８５〜９５％同一のアミノ酸配列をコードする。好ましい範囲は上述のようであるが、％同一性の有用な例としては、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％のあらゆる整数百分率が挙げられる。またこの単離されたヌクレオチド断片のあらゆる全長または部分的相補物も興味深い。
【００６０】
適切な核酸断片は上述の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、なおもより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００６１】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする遺伝子コードの性質を指す。したがって本明細書は、実質的に配列番号２に記載の藻類ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全てまたはかなりの部分をコードするあらゆる核酸断片について記載する。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００６２】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位からアセンブルできる。これらのオリゴヌクレオチド構成単位はアニールされ、次にライゲートされて遺伝子セグメントを形成し、それは次に酵素的にアセンブリーされて遺伝子全体が構築される。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために個別に調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の可能性を理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用頻度プロファイルは、米国特許第７，１２５，６７２号明細書に提供される。
【００６３】
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源由来の制御配列およびコード配列、あるいは同一起源由来であるが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物ゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。
【００６４】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が挙げられる。
【００６５】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、その全体を天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、または発達の異なる段階で、または異なる環境または生理学的条件に応えて、遺伝子発現を誘導してもよいことは当業者によって理解される。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に定義されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一プロモーター活性を有するかもしれないことがさらに認識されている。
【００６６】
「３’非コード配列」および「転写ターミネーター」という用語は、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これとしては、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、通常ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。３’領域は、随伴コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響できる。
【００６７】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列の転写に起因する生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであれば、それは一次転写物と称される。ＲＮＡ転写物は、それが一次転写物の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列であれば、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とは、イントロンがなく、細胞がタンパク質に翻訳できるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡテンプレートに対して相補的で、酵素逆転写酵素を使用してそれから合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であることができ、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を使用して二本鎖形態に変換できる。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含んで、細胞中または生体外でタンパク質に翻訳できるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的で標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。
【００６８】
「作動的に連結する」という用語は、一方の機能がもう一方によって影響されるような、単一核酸断片上の核酸配列の協合を指す。例えばプロモーターがそのコード配列の発現に影響できる、すなわちコード配列がプロモーターの転写制御下にある場合、それはコード配列と作動的に連結する。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列と作動的に連結できる。
【００６９】
「組み換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、２つのさもなければ別々の配列セグメントの人為的組み合わせを指す。
【００７０】
「発現」という用語は、本明細書での用法では、センス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。したがって「発現」という用語は、本明細書での用法ではまた、機能性最終産物（例えば［前駆または成熟いずれかの］ｍＲＮＡまたはタンパク質）の産生も指す。
【００７１】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物中への核酸分子の転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「組換え生物」または「リコンビナント」または「形質転換」または「形質転換体」生物と称される。
【００７２】
「プラスミド」および「ベクター」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの直線または環状、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が結合または組み換えされて、細胞に発現カセットを導入できるユニークな構造になる。
【００７３】
「発現カセット」という用語は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、異種宿主中での遺伝子の増強された発現ができるようにする要素を有するＤＮＡ断片を指す。  一般に発現カセットは、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現に必要である、コード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列とを含んでなる。したがって発現カセットは、典型的に１）プロモーター配列、２）コード配列［「ＯＲＦ」］、および３）真核生物では通常はポリアデニル化部位を含有する３’非翻訳領域（すなわちターミネーター）から構成される。発現カセットは通常はベクターに含まれて、クローニングおよび形質転換を容易にする。各宿主に対して妥当な制御配列を使用しさえすれば、異なる発現カセットを細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞をはじめとする異なる生物に形質転換できる。
【００７４】
「組み換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組み換えＤＮＡ構築物」という用語は、本明細書で同義的に使用される。組み換え構築物は、例えば自然界に一緒には見られない、制御配列およびコード配列などの核酸断片の人為的組み合わせを含んでなる。例えば組み換えＤＮＡ構築物は、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列、または同一起源に由来する制御配列およびコード配列を含んでなってもよいが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される。このような構築物はそれ自体を使用してもよく、またはベクターと併せて使用してもよい。ベクターを使用する場合、当業者によく知られているように、ベクターの選択は宿主細胞を形質変換するのに使用される方法に左右される。例えばプラスミドベクターが使用できる。当業者は、本明細書に記載の単離された核酸断片のいずれかを含んでなる宿主細胞を成功裏に形質変換し、選択し、増殖するためにベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素について十分承知している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１〜２４１８頁（１９８５年）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８〜８６頁（１９８９年））、したがって所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るために多数の事象をスクリーンしなくてはならないことを認識する。このようなスクリーニングは特に、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタン分析または表現型分析によって達成されてもよい。
【００７５】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年））、および３．）ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本説明中で分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合はいつでも、特に断りのない限り、分析結果は言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づく。本明細書での用法では「デフォルト値」とは、ソフトウェアを最初に初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメーターのあらゆる組を意味する。
【００７６】
ここで使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術については当該技術分野で良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）による出版（１９８７年）でさらに詳しく述べられている。
【００７７】
一般に油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地中に存在する総合的な炭素と窒素との比率に応えて始動する。油性微生物中における遊離パルミチン酸（１６：０）の新規合成をもたらすこの過程は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書で詳細に記載される。パルミチン酸は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて形成される長鎖飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆物質である（図１）。
【００７８】
ＴＡＧ（脂肪酸の主要な貯蔵単位）は、以下が関与する一連の反応によって形成される。１）アシル基転移酵素による１分子のアシル−ＣｏＡのグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化がリゾホスファチジン酸を生じ、２）アシル基転移酵素による第２のアシル−ＣｏＡ分子のエステル化が１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じ、３）ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去が１，２−ジアシルグリセロール［「ＤＡＧ」］を生じ、４）アシル基転移酵素の作用による第３の脂肪酸の付加がＴＡＧを形成する。飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする、幅広い脂肪酸をＴＡＧに組み込むことができる。
【００７９】
概要：ω脂肪酸およびトリアシルグリセロールの生合成
オレイン酸がω−３／ω−６脂肪酸に変換される代謝過程は、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合の付加を通じた分子の不飽和化を伴う。これには、小胞体膜中に存在する一連の特殊不飽和化およびエロンガーゼが必要である。しかし図１に示されて後述されるように、特定のω−３／ω−６脂肪酸生成のために存在する複数の代案経路があることが多い。
【００８０】
具体的には図１は下述の経路を描写する。全ての経路は、オレイン酸がΔ１２デサチュラーによって、第１のω−６脂肪酸であるリノール酸［「ＬＡ」］に最初に変換されることを要する。次に「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」および基質としてＬＡを使用して、長鎖ω−６脂肪酸が次のように形成される。１）ＬＡがΔ６デサチュラーゼによってγ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］に変換され、２）ＧＬＡがＣ18/20エロンガーゼによってジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に変換され、３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に変換され、４）ＡＲＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に変換され、５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に変換される。代案としては、「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ」は基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］を使用し、次のように長鎖ω−３脂肪酸を生成できる。１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって第１のω−３脂肪酸ＡＬＡに変換され、２）ＡＬＡがΔ６デサチュラーゼによってステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に変換され、３）ＳＴＡがＣ18/20エロンガーゼによってエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に変換され、４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に変換され、５）ＥＰＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に変換され、６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に変換される。場合によりω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に変換されてもよく、例えばＥＴＡおよびＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性によってそれぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。
【００８１】
ω−３／ω−６脂肪酸の生合成のための別の経路は、Δ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼ（すなわち「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」）を利用する。より具体的にはΔ９エロンガーゼによって、ＬＡおよびＡＬＡがそれぞれエイコサジエン酸［「ＥＤＡ」］およびエイコサトリエン酸［「ＥＴｒＡ」］に変換されてもよい。次にΔ８デサチュラーゼは、ＥＤＡをＤＧＬＡにおよび／またはＥＴｒＡをＥＴＡに変換する。下流ＰＵＦＡが、上述のように引き続いて形成される。
【００８２】
ω−３／ω−６脂肪酸を生成するために特定の宿主生物中に導入される必要がある特定の機能性は、宿主細胞（およびその天然ＰＵＦＡプロファイルおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロファイル）、基質可用性、および所望の最終産物に左右されることが考察される。Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路を通じて生じるＰＵＦＡはＧＬＡおよび／またはＳＴＡを欠いていないので、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現に対立するものとして、例えばΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の発現は、いくつかの実施態様では好ましいかもしれない。
【００８３】
当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成のために所望される各酵素をコードする、様々な候補遺伝子を同定できるであろう。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列はあらゆる供給源に由来してもよく、例えば天然供給源（細菌、藻類、真菌、植物、動物など）から単離され、半合成経路によって生成され、または新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成される。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のための考慮事項としては以下が挙げられる。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のための配慮としては以下が挙げられる。１）ポリペプチドの基質特異性、２）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡ合成に必須であるかどうか、４）ポリペプチドが必要とする補助因子および／または５）その導入後にポリペプチドが（例えばキナーゼまたはプレニルトランスフェラーゼによって）修飾されるかどうか。発現されるポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適合するパラメーターを有する（追加的詳細については米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい）。
【００８４】
追加的実施態様では、特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を考慮することもまた有用であろう。より具体的には、各酵素が基質を生成物に変換するのに１００％の効率で機能することは稀なので、宿主細胞中に生成される未精製油の最終脂質プロファイルは、典型的に所望のω−３／ω−６脂肪酸、ならびに様々な上流中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物である。したがって所望の脂肪酸生合成を最適化する場合、各酵素の転換効率もまた考慮すべき変数である。
【００８５】
上述のそれぞれの考慮を念頭に、公的に入手可能な文献（例えばＧｅｎＢａｎｋ）、特許文献、およびＰＵＦＡ生成能力を有する生物の実験的分析に従って、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、およびＣ20/22エロンガーゼ）を有する候補遺伝子を同定できる。これらの遺伝子は、特定宿主生物に導入して、生物のＰＵＦＡ合成を可能にしまたは増強するのに適する。
【００８６】
本開示は、ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）から単離され、下の表３に要約されるΔ６デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列に関する。
【００８７】
表３
ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）Δ６デサチュラーゼの要約
【表３】
2011529689.tif 000007
*注記：配列番号４７は配列番号２の配列と同一である。
【００８８】
したがって本明細書に記載されるのは、ＢＬＡＳＴＰアラインメント法に基づいて、配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドとの比較で少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも４７１個のアミノ酸のΔ６デサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列；または第１のヌクレオチドの相補配列を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離されたポリヌクレオチドである。
【００８９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用したＰ．クルエンタム（Ｐ．ｃｒｕｅｎｔｕｍ）Δ６デサチュラーゼヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と、公共データベースとの比較（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７年）およびＦＥＢＳ  Ｊ．，２７２：５１０１〜５１０９（２００５年）；国立バイオテクノロジー情報センター［「ＮＣＢＩ」］によって提供される）からは、最も類似した既知の配列が、４７１個のアミノ酸長にわたり本Δ６デサチュラーゼのアミノ酸配列と約４０％同一であることが明らかにされる。
【００９０】
より好ましいアミノ酸断片は、本明細書の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、少なくとも８０％〜９０％同一の配列が特に適切であり、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列が最も好ましい。同様に当該ＯＲＦに対応する好ましいΔ６デサチュラーゼをコードする核酸配列は活性タンパク質をコードするものであり、本明細書で報告されるΔ６デサチュラーゼをコードする核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％と同一であり、少なくとも約８０％〜９０％同一の配列が特に適切であり、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列が最も好ましい。
【００９１】
別の実施態様では、当該ＰｃＤ６配列は特定宿主生物中での発現のためにコドン最適化し得る。当該技術分野でよく知られているように、ポリペプチドをコードする外来遺伝子の発現を実質的に増強できるので、コドン最適化は、別の宿主中で酵素発現をさらに最適化する有用な手段であることができる。一般に宿主が好むコドンは、好ましくは最大量で発現するタンパク質中でのコドン使用を調べ、いずれのコドンが最高頻度で使用されるかを判定することで、関心のある特定の宿主種内で判定し得る。次に宿主種中で好まれるコドンを使用して、例えばデサチュラーゼ活性を有する関心のあるポリペプチドのコード配列を全部または部分的に合成できる。ＤＮＡの全部（または部分）はまた、転写ｍＲＮＡ中に存在するあらゆる不安定化配列または二次構造領域を除去するように合成できる。ＤＮＡの全部（または部分）はまた、塩基組成を所望の宿主細胞中でより好まれるものに改変するように合成できる。
【００９２】
したがってＰｃＤ６（配列番号１）はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された。これは以前のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）コドン使用頻度プロファイル判定、好ましいコドンの同定、および「ＡＴＧ」開始コドン周辺の共通配列の判定に基づいて可能であった（米国特許７，２３８，４８２号明細書および米国特許第７，１２５，６７２号明細書を参照されたい）。得られた合成遺伝子はＰｃＤ６Ｓ（配列番号４６）と称される。コドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子（すなわち配列番号４７）によってコードされるタンパク質配列は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号２）と同一である。
【００９３】
当業者はここでの教示を使用して、野生型ＰｃＤ６配列に記載のその変異型に基づいて、別の宿主（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）以外）中での最適発現に適した、その他のコドン最適化された様々なΔ６デサチュラーゼタンパク質を作り出すことができるであろう。したがって本開示は、野生型配列ＰｃＤ６（すなわち配列番号２によってコードされる）に由来するあらゆるコドン最適化されたΔ６デサチュラーゼタンパク質に関する。これとしては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ６デサチュラーゼタンパク質をコードする配列番号４６に記載のヌクレオチド配列（すなわちＰｃＤ６Ｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。別の実施態様では、ＰｃＤ６をコードするコドンの一部を修飾して、植物または植物部位、藻類、細菌、代案の酵母、ユーグレナ属、卵菌綱、ストラメノパイルまたは真菌をはじめとするが、これに限定されるものではない、宿主生物中での遺伝子の発現を増強することが望ましいかもしれない。
【００９４】
当該デサチュラーゼ配列（すなわちＰｃＤ６またはＰｃＤ６Ｓ）のいずれかまたはそのあらゆる一部を使用して、配列分析ソフトウェアを使用し、同一または別の細菌、藻類、真菌、卵菌類、酵母、ストラメノパイル、ユーグレナ属または植物種中でΔ６デサチュラーゼ相同体を検索してもよい。一般にこのようなコンピュータソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の修飾に相同性の程度を割り当てることで、類似した配列をマッチさせる。
【００９５】
低複雑性フィルターと、次のパラメーター：期待値＝１０、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ  ６２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７年））でのＢＬＡＳＴＰアラインメント法などのソフトウェアアルゴリズムの使用は、あらゆるΔ６デサチュラーゼタンパク質を核またはタンパク質配列のデータベースと比較し、それによって好ましい宿主生物中の類似した既知の配列を同定するために良く知られている。
【００９６】
既知の配列のデータベースを綿密にチェックするためのソフトウェアアルゴリズムの使用は、特に配列番号２で記載されるものなどの公的に入手可能なΔ６デサチュラーゼ配列と比較的低い％同一性を有する相同体の単離に適する。公的に入手可能なデサチュラーゼ配列と少なくとも約７０％〜８５％同一性のΔ６デサチュラーゼ相同体について、単離が比較的容易であろうことは予測可能である。さらに少なくとも約８５％〜９０％同一の配列は特に単離に適し、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列は最も容易に単離されるであろう。
【００９７】
デサチュラーゼ相同体はまた、デサチュラーゼ酵素にユニークなモチーフの使用によって同定し得る。これらのモチーフはおそらくタンパク質の構造、安定性または活性に必須であるデサチュラーゼタンパク質の領域を表し、これらのモチーフは新しいデサチュラーゼ遺伝子を迅速に同定するための診断用ツールとして有用である。Δ６デサチュラーゼ酵素（すなわち動物、植物、および真菌）中に普遍的に見られるモチーフとしては、３個のヒスチジンボックス（すなわちＨ（Ｘ）3-4Ｈ（配列番号３および４）、Ｈ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号５および６）、およびＨ／Ｑ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号７および８））が挙げられる。これらの３つのモチーフは全てＰｃＤ６（配列番号２）中に存在し、ＰｃＤ６がΔ６デサチュラーゼ活性を有することが予測されるさらなる証拠を提供する。
【００９８】
代案としては、Δ６デサチュラーゼ相同体同定のためのハイブリダイゼーション試薬として、当該デサチュラーゼ配列のいずれかまたはその一部を用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。適切なプローブは典型的に、検出される核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は５個の塩基から数万個の塩基の間で変動し得るが、典型的に約１５個の塩基〜約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出する核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列との相補性は完璧でなくてもよい。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域内の特定の塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【００９９】
ハイブリダイゼーション法については、良く定義されている。典型的にはプローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触させなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムなどのカオトロピック剤が添加されていてもよい。所望するならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）［「容積基準」］添加できる。
【０１００】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。それらは典型的に約２０〜６０容積％、好ましくは３０容積％の極性有機溶剤からなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウムと、（例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの）約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液と、（例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの）約０．０５〜０．２％の洗剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００ｋＤ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋＤ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識担体核酸、（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母菌ＲＮＡなどの）核酸ＤＮＡ断片が含まれ、約０．５〜２％重量／容積［「容積基準」］のグリシンが含まれていてもよい。様々な（例えばポリエチレングリコールなどの）極性水溶性または水性膨張剤、（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどの）陰イオンポリマー、硫酸デキストランなどの陰イオン糖類ポリマーをはじめとする容積排除剤などのその他の添加剤が含まれてもよい。
【０１０１】
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ形式に適合できる。最も適切なものの１つは、サンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチタイプのアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部と相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着し、またはそれと共有結合する。
【０１０２】
Δ６デサチュラーゼ核酸断片または同定されたそのあらゆる相同体のいずれかを使用して、同一または別の細菌、藻類、真菌、卵菌類、酵母、ストラメノパイル、ユーグレナ属または植物種から、相同的なタンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同的遺伝子の単離は、技術分野で周知である。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１）核酸ハイブリダイゼーション法、２）ポリメラーゼ連鎖反応［「ＰＣＲ」］（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）；リガーゼ連鎖反応［「ＬＣＲ」］（Ｔａｂｏｒ、Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：１０７４（１９８５年））；または鎖置換増幅［「ＳＤＡ」］（Ｗａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２年））などの核酸増幅技術の様々な使用で例証されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法、および３）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
【０１０３】
例えば本明細書に記載されるΔ６デサチュラーゼに類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者によく知られている方法を使用して、核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、あらゆる所望の酵母菌または真菌からライブラリーをスクリーニングして直接単離できる（ＧＬＡおよび／またはＳＴＡを産生する生物が好ましい）。核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、技術分野で既知の方法によってデザインおよび合成できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）。さらに例えばランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳または末端標識技術などの当業者に既知の方法によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成でき、または利用できる生体外転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成できる。さらに特異的プライマーをデザインして使用し、本配列の一部または全長を増幅できる。得られた増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下でプローブとして使用し、完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
【０１０４】
典型的には、ＰＣＲ−タイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は技術分野で一般的であり、よく知られている。（ＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ，「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」，ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ  Ｅｄ．，（１９８６年）ｐｐ３３〜５０，ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；およびＲｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．Ｅｄ．，（１９９３年）Ｖｏｌ．１５，ｐｐ３１〜３９，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））。
【０１０５】
一般にΔ６デサチュラーゼ配列の２本の短い断片をＰＣＲプロトコルで使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。ＰＣＲはまたクローンされた核酸断片ライブラリーに対して実施してもよく、１つのプライマーの配列は開示される核酸断片に由来する。別のプライマーの配列は、真核生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。
【０１０６】
代案としては第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいてもよい。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：８９９８（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向を向いたプライマーは、開示される配列からデザインできる。市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（例えばＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（Ｏｈａｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：５６７３（１９８９年）；Ｌｏｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：２１７（１９８９年））。
【０１０７】
代案としては、本明細書に記載されるΔ６デサチュラーゼ核酸断片のいずれか（または同定されるそのあらゆる相同体）を使用して、新しいおよび／または改善された脂肪酸デサチュラーゼを作り出してもよい。当該技術分野で良く知られているように、生体外変異誘発および選択、化学的変異誘発、「遺伝子シャフリング」法またはその他の手段を用いて、天然デサチュラーゼ遺伝子の突然変異が得られる（このような突然変異としては、欠失、挿入、および点突然変異、またはそれらの組み合わせが挙げられる）。これは生体内で、それぞれ所望のＰＵＦＡのより長い半減期またはより高い生成速度など、宿主細胞中で機能するためのより望ましい物理的および動力学的パラメーターがある、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドの生成を可能にする。または必要に応じて、通例の変異誘発、得られた変異ポリペプチドの発現、およびそれらの活性の判定を通じて、対象のポリペプチド（すなわちΔ６デサチュラーゼ）の酵素活性に重要な領域を判定できる。これらの技術の概要は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載される。ＰｃＤ６に由来するこのような全ての突然変異タンパク質およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、本開示の範囲内である。
【０１０８】
改善された脂肪酸はまたドメイン交換によって合成されてもよく、本明細書に記載されるΔ６デサチュラーゼ核酸断片のいずれかからの機能ドメインが、別のデサチュラーゼ遺伝子中の機能ドメインと交換されて、それによって新しいタンパク質がもたらされる。本明細書での用法では、「ドメイン」または「機能ドメイン」とは微生物中で生物学的応答を引き起こせる核酸配列を指す。
【０１０９】
生化学的経路を操作する有用な方法は、当業者に良く知られている。適切なプロモーター制御下における、本明細書に記載されるΔ６デサチュラーゼ（すなわちＰｃＤ６、ＰｃＤ６Ｓまたはその他の変異酵素、コドン最適化酵素またはその相同体）をコードするキメラ遺伝子の導入は、形質転換宿主生物中でそれぞれＧＬＡおよび／またはＳＴＡの産生増大をもたらすことが予測される。したがって本明細書では、脂肪酸基質（すなわちＬＡおよび／またはＡＬＡ）が所望の脂肪酸生成物（すなわちそれぞれＧＬＡおよび／またはＳＴＡ）に変換されるように、基質を本明細書に記載されるデサチュラーゼ酵素（例えばＰｃＤ６またはＰｃＤ６Ｓ）に暴露するステップを含んでなる、ＰＵＦＡを直接生産する方法が開示される。
【０１１０】
より具体的には本明細書では微生物宿主細胞（例えば酵母、藻類、細菌、ユーグレナ属、卵菌綱、ストラメノパイル、および真菌）中でＧＬＡを生成する方法が提供され；微生物宿主細胞は、
ａ）ＢＬＡＳＴＰアラインメント法に基づいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとの比較で少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するΔ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
ｂ）ＬＡ源
を含んでなり；Δ６デサチュラーゼをコードする核酸断片が発現してＬＡがＧＬＡに変換される条件下で微生物宿主細胞を増殖させ、ＧＬＡは回収されていてもよい。
【０１１１】
別の実施態様では、Δ６デサチュラーゼを使用してＡＬＡをＳＴＡに転換してもよい。したがって本明細書ではＳＴＡを生成する方法が提供され；微生物宿主細胞は、
ａ）ＢＬＡＳＴＰアラインメント法に基づいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとの比較で少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するΔ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えヌクレオチド分子、および
ｂ）ＡＬＡ源
を含んでなり；Δ６デサチュラーゼをコードする核酸断片が発現してＡＬＡがＳＴＡに変換される条件下で微生物宿主細胞を増殖させ、ＳＴＡは回収されていてもよい。
【０１１２】
代案としては、様々なω−６およびω−３ＰＵＦＡを生成するために、本明細書に記載される各Δ６デサチュラーゼ遺伝子およびその対応する酵素生成物を間接的に使用し得る（図１および米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい）。ω−３／ω−６ＰＵＦＡの間接的生成は、脂肪酸基質が、中間体ステップまたは経路中間体の手段を通じて、所望の脂肪酸生成物に間接的に変換されて起きる。したがって本明細書に記載されるΔ６デサチュラーゼ（すなわちＰｃＤ６、ＰｃＤ６Ｓまたはその他の変異酵素、コドン最適化酵素またはその相同体）をＰＵＦＡ生合成経路の酵素（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ20/22エロンガーゼ）をコードする追加的遺伝子と併せて発現させ、例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡなどのより鎖長の長いω−３／ω−６脂肪酸のより高レベルの生成をもたらしてもよいことが考察される。
【０１１３】
好ましい実施態様では、開示されるΔ６デサチュラーゼは最低限Ｃ18/20エロンガーゼと併せて発現される。しかし特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡプロファイルおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロファイル）、基質の利用可能性、および所望の最終産物に左右される。
【０１１４】
代案としては、本明細書に記載される完全な配列、それらの完全な配列の相補物、それらの配列のかなりの部分、それらから誘導されるコドン最適化されたデサチュラーゼ、およびそれらに実質的に相同的な配列に基づいて、宿主生物体の天然Δ１５デサチュラーゼを中断することが有用かもしれない。
【０１１５】
Δ６デサチュラーゼをコードする読み取り枠を含んでなる組み換え構築物（すなわちＰｃＤ６、ＰｃＤ６Ｓまたはその他の変異酵素、コドン最適化酵素またはその相同体）を作り出して、適切な宿主細胞に導入する必要がある。当業者は、１）ＤＮＡ分子、プラスミドなどの巨大分子の構築、操作、および単離のための特定の条件および手順；２）組み換えＤＮＡ断片および組み換え発現構築物の作成；および３）クローンのスクリーニングおよび単離について記載する標準的資料を知っている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ｂｙ  Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪによる出版（１９８７年）を参照されたい。
【０１１６】
一般に構築物に含まれる配列の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、および形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する提案される手段に左右される。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換させ、選択し、増殖させるために、プラスミドベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素を知っている。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択性標識、および自律性複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域、すなわちプロモーター、遺伝子コード配列および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域、すなわちターミネーターを含んでなる。双方の制御領域は必ずしも生産宿主に天然の遺伝子に由来しなくてもよいが、それらが形質転換宿主細胞からの遺伝子に由来することが最も好ましい。
【０１１７】
所望の微生物宿主細胞中で本Δ６デサチュラーゼＯＲＦの発現を促進するのに有用な転写開始制御領域（また開始制御領域またはプロモーターも）は良く知られている。これらの制御領域は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲ領域、およびタンパク質および／またはＲＮＡ安定化要素を含んでもよい。このような要素はそれらの強度および特異性が異なっていてもよい。宿主種からの転写および翻訳領域が特に有用であるが、実質的に、選択された宿主細胞中でこれらの遺伝子の発現を指示できるあらゆるプロモーター、すなわち天然、合成、またはキメラが適切である。宿主細胞中の発現は、誘導的または構成的様式で達成できる。誘導的発現が関心のある遺伝子と作動的に連結する調節可能なプロモーターの活性を誘導することで起きるのに対し、構成的発現は構成的プロモーターの使用によって起きる。
【０１１８】
宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域は、特に宿主種から提供される（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で使用するための好ましい転写開始調節領域については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに対応する、米国特許出願公開第２００６−００１１５８８１−Ａ１号明細書を参照されたい）。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、対象とするＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの調節配列のいずれか１つを使用できる。
【０１１９】
翻訳開始コドン「ＡＴＧ」周囲のヌクレオチド配列は、酵母細胞中での発現に影響することが分かっている。所望のポリペプチドが酵母中で不十分に発現される場合、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を修正して効率的な酵母翻訳開始配列を含め、最適の遺伝子発現を得ることができる。酵母中での発現のためには、これは、内在性酵母遺伝子、好ましくは高度に発現される遺伝子に、非効率的に発現される遺伝子をインフレームで融合させることで、それを部位特異的変異誘発させて実行できる。代案としては、宿主中のコンセンサス翻訳開始配列を判定して、対象の宿主中における異種遺伝子の最適発現のために、この配列を異種遺伝子中に遺伝子操作できる。
【０１２０】
転写終結領域をコードする３’非コード配列が組み換え構築物中で提供されてもよく、それから開始領域が得られた遺伝子の３’領域からのもの、または異なる遺伝子からのものであってもよい。多数の終結領域が知られており、それらが由来するのと同じおよび異なる属と種のどちらで利用する場合も多様な宿主中で満足に機能する。終結領域は通常、特定の特質のためでなく、むしろ便宜上から選択される。終結領域はまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。終結領域は、通常、特定の特質のためというよりむしろ便宜的に選択される。当業者は利用できる情報を使用して、転写ターミネーターとして機能する３’領域配列をデザインおよび合成し得るので、別の実施態様では３’領域はまた合成し得る。終結領域は不必要かもしれないが、高度に好ましい。
【０１２１】
遺伝子をクローニングベクターに単に挿入することは、所望の速度、濃度、量、その他でのその発現を保証しない。高発現率に対する必要に応えて、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性および位置、酸素制限、および微生物宿主細胞からの分泌を制御する、いくつかの異なる遺伝的要素を操作することにより、多数の特殊発現ベクターが作り出されている。操作される特徴のいくつかとしては、次が挙げられる。関連する転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質；クローン遺伝子コピー数（単一発現構築物中で追加的コピーをクローンしてもよく、および／またはプラスミドコピー数を増大させることで、またはゲノム中へのクローン遺伝子の複数の組み込みにより、追加的コピーを宿主細胞中に導入してもよい）；遺伝子がプラスミド由来であるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか；合成外来性タンパク質の最終的細胞内所在；宿主生物中のタンパク質翻訳および正しい折りたたみの効率；宿主細胞中のクローン遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有の安定性；およびその使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようなクローン遺伝子中のコドン使用頻度。これらのそれぞれを本明細書に記載される方法および宿主細胞中で使用して、Δ６デサチュラーゼの発現をさらに最適化してもよい。
【０１２２】
例えばΔ６デサチュラーゼの発現は、ｍＲＮＡまたはコードされたタンパク質のどちらかから不安定配列を除去／消去して、またはｍＲＮＡに安定化配列を付加して（米国特許第４，９１０，１４１号明細書）、より強力なプロモーター（調節または構成のどちらか）の使用を通じて発現増大を引き起こし、転写レベルで増大できる。代案としては、単一発現構築物中で追加的コピーをクローニングすることによって；またはプラスミドコピー数を増大させることにより、またはゲノム中へのクローン遺伝子の複数の組み込みにより追加的コピーを宿主細胞中に導入することによって、Δ６デサチュラーゼ遺伝子の追加的コピーを組み換え宿主細胞中に導入し、それによってＰＵＦＡ産生と蓄積を増大させてもよい。
【０１２３】
プロモーター、Δ６デサチュラーゼ読み取り枠［「ＯＲＦ」］、およびターミネーターを含んでなる、少なくとも１つのキメラ遺伝子を含んでなる組み換え構築物を作り出した後、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、または宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは宿主ゲノム内で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座内の遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有する構築物の使用を通じて標的を定めることができる。構築物が内在性遺伝子座を標的とする場合、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域が、内在性遺伝子座によって提供できる。
【０１２４】
２つ以上の遺伝子が別個の複製ベクターから発現される場合、各ベクターが異なる選択手段を有し、その他の構築物との相同性を欠いて、安定した発現を保ち、構築物間の要素の再集合を妨げる。全ての導入された遺伝子が、所望の生成物の合成を提供するのに必要なレベルで発現されるように、調節領域の賢明な選択、導入された構築物の選択手段および増殖法は、実験的に判定できる。
【０１２５】
対象の遺伝子を含んでなる構築物は、あらゆる標準技術によって微生物宿主細胞に導入されてもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６〜１８７頁（１９９１年）））、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、真空濾過または宿主細胞中に関心のある遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。
【０１２６】
便宜上、例えば発現カセット中にＤＮＡ配列を取り込むようにあらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「形質転換体」または「組み換え」と本明細書で称する。形質転換された宿主は発現構築物の少なくとも１つのコピーを有して、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数コピーを有する染色体外要素上に存在するかどうか次第で、２つ以上を有するかもしれない。
【０１２７】
形質転換された宿主細胞は、導入された構築物上に含有されるマーカーの選択によって同定できる。代案としては、多くの形質転換技術が多くのＤＮＡ分子を宿主細胞中に導入する場合、所望の構築物と共に別個のマーカー構築物を同時形質転換してもよい。
【０１２８】
典型的には、形質転換された宿主は、選択的培地上で増殖するそれらの能力について選択され、選択培地には抗生物質が組み込まれていてもよく、または栄養素または成長因子などの非形質転換宿主の増殖に必要な要素が欠如していてもよい。導入されたマーカー遺伝子は、形質転換された宿主中で発現すると抗生物質抵抗性を与え、または必須成長因子または酵素をコードしてもよく、それによって選択培地上での増殖を可能にしてもよい。発現したマーカータンパク質を直接または間接に検出し得る場合にもまた、形質転換された宿主を選択し得る。追加的選択技術は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書、米国特許第７，２５９，２５５号明細書、および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載される。
【０１２９】
形質転換に続いて、本Δ６デサチュラーゼ（場合により宿主細胞内で同時発現されるその他のＰＵＦＡ酵素）に適した基質が、宿主によって天然にまたは遺伝子導入的に生成されてもよく、またはそれらは外来的に提供されてもよい。
【０１３０】
選択される宿主または発現構築物が何であれ、複数の形質転換体をスクリーンして所望の発現レベル、制御、およびパターンを示す株を得なくてはならない。例えばＪｕｒｅｔｚｅｋら（Ｙｅａｓｔ，１８：９７〜１１３（２００１年））は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の組み込まれたＤＮＡ断片の安定性が、使用される個々の形質転換体、受容者株、および標的プラットフォームに左右されると述べた。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３年））、タンパク質発現のウェスタン分析、ＰＵＦＡ生成物の表現型分析またはＧＣ分析によって達成されてもよい。
【０１３１】
細菌、酵母、藻類、ストラメノパイル、卵菌類、ユーグレナ属および／または真菌をはじめとする多様な真核生物が、それによって本明細書に記載されるΔ６デサチュラーゼを含んでなる形質転換体を生じる宿主として適切である。これは転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置が高度に保存されていることから考察される。したがって適切な宿主は、広い温度およびｐＨ値範囲にわたり、単純または複合糖質、脂肪酸、有機酸、油、グリセロール、およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で増殖するものを含んでもよい。
【０１３２】
好ましい微生物宿主は、油性生物である。これらの油性生物は自然に油を合成および蓄積でき、総油分は乾燥細胞重量の約２５％を超え、より好ましくは乾燥細胞重量の約３０％を超え、最も好ましくは乾燥細胞重量の約４０％を超え得る。様々な細菌、藻類、ユーグレナ属、コケ、真菌、酵母、およびストラメノパイルが自然に油性に分類される。別の実施態様では、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母非油性生物を遺伝子改変して、油性にし得る。
【０１３３】
より好ましい実施態様では、微生物宿主細胞は油性酵母である。油性酵母として典型的に同定される属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には例証的な油合成酵母としては、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に分類された）が挙げられる。最も好ましいのは油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施態様で最も好ましいのはＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．、およびＡｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９頁（２００２年））。
【０１３４】
油性酵母（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の形質転換に応用できる特定の教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２〜２３５（１９９７年））が挙げられる。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡ産生を導くのに応用できる特定の教示は、それぞれ米国特許出願第１１／１９８９７５号明細書（国際公開第２００６／０３３７２３号パンフレット）、米国特許出願第１１／２６４７８４号明細書（国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット）、米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）、および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書（国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット）に提供される。
【０１３５】
この酵母中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主ゲノム中への線状ＤＮＡ組み込みによるものであり；遺伝子の高レベル発現が所望される場合、ゲノム中の複数位置への組み込みが特に有用であり得る［例えばＵｒａ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子遺伝子座（Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３２４４；またはＡｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子遺伝子座（米国特許第７，２１４，４９１号明細書）、Ｌｉｐ１遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）、Ｌｉｐ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）、ＳＣＰ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４３１３６２）、Ｐｅｘ３遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８５６５）、Ｐｅｘ１６遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９６２２）および／またはＰｅｘ１０遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６）］。
【０１３６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンが欠如している培地上で増殖する能力である。別の実施態様では、酵母Ｕｒａ-突然変異体を選択するために５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物；「５−ＦＯＡ」）が使用され（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書）、または形質転換体を選択するためにスルホニル尿素除草剤抵抗性を与える天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（またはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）が利用される（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）。部位特異的リコンビナーゼシステムの使用によって、複数逐次形質転換で使用するために好ましい選択マーカーのペアを「再利用する」ユニークな方法もまた、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書で教示される。
【０１３７】
上記に基づいて、本明細書では、
（ａ）
（ｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結した、Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする第１の組み換えヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）ＬＡおよび／またはＡＬＡからそれぞれ構成されるデサチュラーゼ基質源
を含んでなる油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））を提供するステップと；
（ｂ）適切な発酵性炭素源の存在下でステップ（ａ）の酵母を増殖させて、Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が発現し、それぞれＬＡがＧＬＡに変換されおよび／またはＡＬＡがＳＴＡに変換されるステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）のＧＬＡおよび／またはＳＴＡがそれぞれ回収されていてもよいステップ
を含んでなる、ＧＬＡまたはＳＴＡのどちらかをそれぞれ生成する方法が開示される。
【０１３８】
基質供給が必要とされるかもしれない。好ましい実施態様では、Δ６デサチュラーゼポリペプチドは配列番号２で記載されてもよい。したがって例えばΔ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号４６（配列番号１と比較して少なくとも２２７個のコドンがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中での発現のために最適化される）で記載されてもよい。
【０１３９】
天然では油性酵母中で生成されるＰＵＦＡは、１８：２脂肪酸（すなわちＬＡ）と、一般的ではないが１８：３脂肪酸（すなわちＡＬＡ）に限定されるので、油性酵母を遺伝子改変し、本明細書に記載されるΔ６デサチュラーゼに加えて長鎖ＰＵＦＡ生合成に必要な複数酵素を発現させて（それによって例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡを生成できるようにして）もよい。
【０１４０】
具体的には本明細書では、
（ａ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結した、Δ６デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる第１の組み換えＤＮＡ構築物；および
（ｂ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結した、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、およびＣ20/22エロンガーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる少なくとも１つの追加的組み換えＤＮＡ構築物
を含んでなる油性酵母が考察される。
【０１４１】
その他の好適な微生物宿主としては、油性細菌、藻類、鞭毛生物、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、卵菌綱（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、およびその他の真菌が挙げられ、この広範な微生物宿主群の中で特に興味深いのは、ω−３／ω−６脂肪酸を合成する微生物（またはこの目的のために遺伝子改変できるもの［例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのその他の酵母］）である。したがって例えば（ＡＲＡ生産のために商業利用される）モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）を誘導性プロモーターまたは調節プロモーター制御下にある本Δ６デサチュラーゼ遺伝子のいずれかによって形質転換し、ＧＬＡ合成量が増大した形質転換体生物を生じることができ、ＧＬＡはＣ18/20エロンガーゼおよびΔ５デサチュラーゼの同時発現によってＡＲＡにさらに変換できる。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の形質転換法は、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６：４６５５（２０００年））に記載される。同様にヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物（例えばスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））の形質転換法は、米国特許第７，００１，７７２号明細書で開示される。
【０１４２】
本明細書に記載されるΔ６デサチュラーゼ発現のために選択される宿主に関わりなく、所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得るために複数形質転換体をスクリーニングしなくてはならない。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３年））、タンパク質発現のウェスタンおよび／またはＥｌｉｓａ分析、ＰＵＦＡ生成物の表現型分析またはＧＣ分析によって達成されてもよい。
【０１４３】
本Δ６デサチュラーゼの配列知識は、様々な宿主細胞中でω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を操作する上で有用であろう。生化学的経路を操作する方法は当業者によく知られており、油性酵母中、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中において、ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を最大化するために、多数の操作が可能であることが予期される。この操作は、ＰＵＦＡ生合成経路中の代謝エンジニアリング、または炭素からＰＵＦＡへの生合成経路に寄与する経路の追加的操作を必要とするかもしれない。望ましい生化学的経路のアップレギュレート、および望ましくない生化学的経路のダウンレギュレートに有用な方法は、当業者に良く知られている。
【０１４４】
例えばエネルギーまたは炭素についてω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終産物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子破壊によって排除し、またはその他の手段により（例えばアンチセンスｍＲＮＡ）ダウンレギュレートしてもよい。
【０１４５】
ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡを増大させる手段としてのＰＵＦＡ生合成経路中の操作（およびその関連技術）の詳細な考察は、それぞれ国際公開第２００６／０３３７２３号パンフレット、国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書］、国際公開第号パンフレット２００６／０５２８７０［米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書］、および国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書］にあり、ＴＡＧ生合成経路およびＴＡＧ分解経路（およびその関連技術）において望ましい操作についても同様である。
【０１４６】
上述の戦略いずれか１つによって、脂肪酸生合成経路の発現を調節することが有用かもしれない。例えば本明細書ではω−３および／またはω−６脂肪酸を生成するために、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ生合成経路中の鍵酵素をコードする遺伝子を油性酵母中に導入する方法が提供される。本Δ６デサチュラーゼ遺伝子をω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路を天然に有さない油性酵母中で発現して、これらの遺伝子の発現を連係させることは、宿主生物の代謝工学のための様々な手段を使用して、好ましいＰＵＦＡ生成物の生成最大化するために特に有用である。
【０１４７】
形質転換された微生物宿主細胞は、キメラ遺伝子の発現（例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ）を最適化する条件下で増殖させて、最大かつ最も経済的な所望のＰＵＦＡ収率を生じさせる。一般に最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、異なる無機イオン量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間および方法が挙げられる。油性酵母（例えばヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））などの関心のある微生物は、一般に複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））で、または増殖に必要な構成要素が欠如することで所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地（例えばＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）からの酵母菌窒素ベース）上で増殖させる。
【０１４８】
本発明中の発酵培地は、適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源については米国特許第７，２３８，４８２号明細書で教示される。本明細書の方法で利用される炭素源は、多種多様な炭素含有源を包含してもよいことが考察されるが、好ましい炭素源は、糖（例えば、グルコース）、グリセロール、および／または脂肪酸である。
【０１４９】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ4）2ＳＯ4）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸）原料から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、油性宿主の増殖と、ＰＵＦＡ産生に必須の酵素的経路の促進とに適することが当業者に知られている、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、およびその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＦｅ+2、Ｃｕ+2、Ｍｎ+2、Ｃｏ+2、Ｚｎ+2、Ｍｇ+2）が注目されている（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ，Ｄ．Ｊ．ＫｙｌｅおよびＲ．Ｃｏｌｉｎ，ｅｄｓ．ｐｐ６１〜９７（１９９２年））。
【０１５０】
好ましい増殖培地は、一般的な酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの商業的調製培地である。その他の合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）または合成（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）増殖培地もまた使用してもよく、形質転換宿主細胞の増殖に適した培地は、微生物学または発酵化学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、初期増殖条件のための範囲としてｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で実施してもよく、微好気条件が好ましい。
【０１５１】
代謝状態は増殖と脂肪の合成／保存との間で「平衡状態」でなくてはならないので、典型的に油性酵母細胞中のＰＵＦＡの高レベルの蓄積は、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中でのＰＵＦＡ生成のために二段階発酵過程が必要である。このアプローチは米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載され、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、流加、および連続）および増殖中の配慮についても同様である。
【０１５２】
ＰＵＦＡは、宿主微生物中に遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質または糖脂質などのエステル化形態として存在してもよく、当該技術分野で良く知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母脂質の抽出技術、品質分析、および合格基準の１つの総説は、Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２（５／６）：４６３〜４９１頁（１９９２年））によるものであるＡ．ＳｉｎｇｈおよびＯ．Ｗａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４５：２７１〜３１２頁（１９９７年））による後処理プロセスに関する簡潔な概要もまた入手できる。
【０１５３】
一般にＰＵＦＡ精製のための手段としては、有機溶剤による抽出（例えば米国特許第６，７９７，３０３号明細書、および米国特許第５，６４８，５６４号明細書）、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば二酸化炭素を使用する）、鹸化、および圧搾などの物理的手段、またはそれらの組み合わせが挙げられる。追加的詳細については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書の教示を参照されたい。
【０１５４】
ω−３および／またはω−６脂肪酸、特に例えばＡＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡが組み込まれた多数の食品および飼料製品がある。
【０１５５】
長鎖ＰＵＦＡを含んでなる微生物バイオマス、ＰＵＦＡを含んでなる部分的に精製された微生物バイオマス、ＰＵＦＡおよび／または精製ＰＵＦＡを含んでなる精製微生物油は、食品および飼料製品中で機能して、現行の調合物に健康上の利点を与えることが考察される。より具体的にはω−３および／またはω−６脂肪酸を含有する油は、類似食品、肉製品、穀物製品、ベークド食品、スナック食品、および乳製品をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な食品および飼料製品中での使用に適する（より詳しくは米国特許出願公開第２００６−００９４０９２号明細書を参照されたい）。
【０１５６】
さらに調合物中で本組成物を使用して、医療栄養物、健康補助食品、乳児用調製粉乳ならびに医薬品をはじめとするメディカルフードに健康上の利点を与えてもよい。食品加工および食品調合の当業者は、本油の一定量および組成物をどのように食品または飼料製品に添加してもよいかを理解するであろう。このような量は本明細書で「有効」量と称され、食品または飼料製品、栄養補給することが意図される食餌、またはメディカルフードまたは医療栄養物が矯正しまたは治療することが意図される疾患によって決まる。
【実施例】
【０１５７】
本発明が具体的に完成することを例証するがその可能なバリエーションの全てを完全に定義するものではない、以下の実施例において本発明についてさらに詳述する。
【０１５８】
一般方法
実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、１．）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２．）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；および３．）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）による出版（１９８７年）で述べられる。
【０１５９】
微生物培養の維持および増殖に適した材料および方法は、当該技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術については、次で述べられている。Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ、およびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年）、またはＴｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）。微生物細胞の増殖および維持のために使用される全ての試薬制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−２細胞（カタログ番号２００１５０）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入され；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は典型的にルリア・ベルターニ（ＬＢ）プレート上で３７℃で増殖させた。
【０１６０】
一般分子クローニングは、標準法に従って実施された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。オリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｓｐｒｉｎｇ，ＴＸ）によって合成された。ＤＮＡ配列は、ベクターおよび挿入断片特異的プライマーの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動配列決定装置上で作り出された。配列編集はシーケンチャー（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）内で実施された。全ての配列は、双方向に少なくとも２回のカバレッジに相当する。遺伝子配列の比較は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して達成された。
【０１６１】
略語の意味は次のとおり。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリトルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」マイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロ塩基を意味する。
【０１６２】
発現カセット命名法
発現カセットの構造は簡易表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」で表され、Ｘはプロモーター断片を表し、Ｙは遺伝子断片を表し、Ｚはターミネーター断片を表し、それらは全て互いに作動的に連結している。
【０１６３】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養：
ＡＴＣＣ登録番号＃２０３６２、＃７６９８２、および＃９０８１２のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入された。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、典型的に下に示すレシピに従ったいくつかの培地中で２８〜３０℃で増殖させた。寒天プレートは必要に応じて、標準法に従って各液体培地に２０ｇ／Ｌの寒天を添加して調製した。
【０１６４】
ＹＰＤ寒天培地（１Ｌあたり）：１０ｇの酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］；２０ｇのＢａｃｔｏペプトン［Ｄｉｆｃｏ］；および２０ｇのグルコース。
【０１６５】
基本最少培地（ＭＭ）（１Ｌあたり）：２０ｇグルコース；１．７ｇアミノ酸非含有酵母窒素ベース；１．０ｇプロリン；およびｐＨ６．１（調節なし）。
【０１６６】
最少培地＋タージトール（ＭＭＴ）（１Ｌあたり）：ＭＭ培地を上記のように調製して０．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）タージトールを添加する。
【０１６７】
最少培地＋５−フルオロオロト酸（ＭＭ＋５−ＦＯＡ）（１Ｌあたり）：２０ｇグルコース；６．７ｇ酵母窒素ベース；７５ｍｇウラシル；７５ｍｇウリジンおよび１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの様々な濃度範囲に対するＦＯＡ活性試験に基づく適量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）（供給元から受領された各バッチには変動があるため）。
【０１６８】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載されるように実施した。
【０１６９】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析：
脂肪酸分析のために、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．およびＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３７：９１１〜９１７頁（１９５９年））で述べられているように、遠心分離によって細胞を収集して脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル交換によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥＳ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．、およびＮｉｓｈｉｄａ，Ｉ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２７６（１）：３８〜４６頁（１９９０年））、引き続いて３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は、３．５℃／分で１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
【０１７０】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞（０．５ｍＬ培養物）を収集して蒸留水で１回洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ内で５〜１０分間真空乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μｌの１％）および既知量のＣ１５：０トリアシルグリセロール（Ｃ１５：０ＴＡＧ；カタログ番号Ｔ−１４５、Ｎｕ−ＣｈｅｃｋＰｒｅｐ，Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）をサンプルに添加し、次にサンプルをボルテックスして５０℃で３０分間振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠沈した。上層を除去して、ＧＣによって分析した。
【０１７１】
ＧＣ分析を通じて記録されたＦＡＭＥピークは、既知の脂肪酸との比較でそれらの滞留時間によって同定され、ＦＡＭＥピーク面積を既知量の内部基準（Ｃ１５：０ＴＡＧ）と比較することで定量化された。したがってあらゆる脂肪酸ＦＡＭＥ［「μｇ  ＦＡＭＥ」］の近似量（μｇ）は、式、（特定の脂肪酸のＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピークの面積）*（標準Ｃ１５：０  ＴＡＧのμｇ）に従って計算され、１μｇのＣ１５：０  ＴＡＧは０．９５０３μｇの脂肪酸に等しいので、あらゆる脂肪酸の量（μｇ）［「μｇＦＡ」］は、式、（特定の脂肪酸のＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０  ＴＡＧのμｇ）＊０．９５０３に従って計算される。換算係数０．９５０３はほとんどの脂肪酸について測定された値の近似であり、それは０．９５〜０．９６の範囲にわたることに留意されたい。
【０１７２】
ＴＦＡの重量％として個々の各脂肪酸量を要約する脂質プロファイルは、個々のＦＡＭＥピーク面積を全てのＦＡＭＥピーク面積の和で除して１００を乗じて判定される。
【０１７３】
実施例１
ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）ｃＤＮＡライブラリーの構築
本実施例は、全ＲＮＡの調製およびポリ（Ａ）＋ＲＮＡの単離に続く、ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＣｒｅａｔｏｒTMＳｍａｒｔTMｃＤＮＡライブラリーキット（カタログ番号Ｋ１０５３−１、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用した、ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）のｃＤＮＡライブラリーの構築について記載する。
【０１７４】
具体的にはＰ．クルエンタム（Ｐ．ｃｒｕｅｎｔｕｍ）ＣＣＭＰ  １３２８株の培養物をＴｈｅ  Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ（Ｂｏｏｔｈｂａｙ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入した。細胞をＢｅｃｋｍａｎ  ＧＨ３．８ローター内で３７５０ｒｐｍで１０分間遠心分離してペレット化した、２×０．６ｍＬのＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁した。再懸濁された細胞をそれぞれ０．６ｍＬの０．５ｍｍガラスビーズを含有する２本の２ｍＬスクリューキャップ管に移した。Ｂｉｏｓｐｅｃミニビーズビーター（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）の均質化設定で、細胞を２分間均質化した。管を短時間遠心分離してビーズを沈降させた。液体を２本の新しい１．５ｍＬ微量遠心管に移し、各管に０．２ｍＬクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を添加した。管を１分間手で振って３分間静置した。次に管を４℃および１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上層を２本の新しい管に移した。イソプロピルアルコール（０．５ｍＬ）を各管に添加した。管を室温で１５分間インキュベートし、１４，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間の遠心分離がそれに続いた。ペレットを各１ｍＬの（ＲＮａｓｅ非含有水で作った）７５％エタノールで洗浄して風乾した。次に全ＲＮＡサンプルを５００μｌのＲＮａｓｅ非含有水に再溶解した。
【０１７５】
Ｑｉａｇｅｎ  ｏｌｉｇｏＴｅｘ  ｍＲＮＡミニキット（カタログ番号７００２２；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って全ＲＮＡサンプルからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡサンプルを５００μｌの緩衝液ＯＢＢおよび５５μｌのｏｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液と混合した。混合物を７０℃で３分間インキュベートし、室温で１０分間放冷した。次にそれをエッペンドルフ微量遠心管内で１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を廃棄した。ペレットを４００μｌ緩衝液ＯＷ２に再懸濁して、キットで提供されるスピンカラムにロードした。カラムを１．５ｍＬ微量遠心管に入れ、エッペンドルフ微量遠心管内で１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを新しい１．５ｍＬ微量遠心管内に移して、４００μＬの緩衝液ＯＷ２をカラムに入れた。再度１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、カラムを新しいＲＮａｓｅフリー１．５ｍＬ微量遠心管に移した。７０℃に予熱した２０μｌ緩衝液ＯＥＢを添加してポリ（Ａ）＋ＲＮＡをカラムから溶出させ、１４，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離がそれに続いた。溶出ステップを１回繰り返し２つの溶出サンプルを合わせた。
【０１７６】
ＢＤ−ＣｌｏｎｔｅｃｈＣｒｅａｔｏｒTMＳｍａｒｔTMｃＤＮＡライブラリーキット（以前のカタログ番号Ｋ１０５３−１；カタログ番号６３４９０３とも示される）中のＬＤ−ＰＣＲ法、および０．１μｇのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡサンプルを使用してｃＤＮＡを作り出した。具体的には第一鎖ｃＤＮＡ合成のために、２本の１．５ｍＬ微量遠心管中で、１μｌのポリ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルと、１μｌのＳＭＡＲＴ  ＩＶオリゴヌクレオチド（配列番号９）および１μｌのＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０）とを混合した。混合物を７２℃で２分間加熱して、氷上で２分間冷却した。各管に以下を添加した。２μｌの第一鎖緩衝液、１μｌの２０ｍＭ  ＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、および１μｌのＰｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素。混合物を４２℃で１時間インキュベートして、氷上で冷却した。
【０１７７】
第一鎖ｃＤＮＡ合成混合物をＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。具体的には反応混合物は以下を含有した。２μｌの第一鎖ｃＤＮＡ混合物、２μｌの５’−ＰＣＲプライマー（配列番号１１）、２μｌのＣＤＳＩＩＩ／３’−ＰＣＲプライマー（配列番号１０）、８０μｌの水、１０μｌの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ＰＣＲ緩衝液、２μｌの５０×ｄＮＴＰミックス、および２μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ポリメラーゼミックス。２つの反応混合物を調製した。サーモサイクラー条件をＧｅｎＡｍｐ  ９６００装置上で９５℃で２０秒間、続いて１５サイクルの９５℃で５秒間および６８℃で６分間に設定した。アガロースゲル電気泳動法および臭化エチジウム染色によってＰＣＲ産物を定量した。
【０１７８】
Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットでＰＣＲ産物を精製した。各反応混合物で、ＰＣＲ産物と５００μｌの緩衝液ＰＢとを混合した。混合物をスピンカラムにロードして、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを０．７５ｍＬの緩衝液ＰＥで洗浄し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。次にカラムをもう一度１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムに５０μｌの水を添加してｃＤＮＡサンプルを溶出し、カラムを室温で１分間静置して、カラムを１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。２つのサンプルを合わせた。
【０１７９】
引き続いて精製されたｃＤＮＡをＳｆｉＩで消化した（７９μｌのｃＤＮＡを１０μｌの１０×ＳｆｉＩ緩衝液、１０μｌのＳｆｉｌ酵素、および１μＩの１００×ＢＳＡと混合し、混合物を５０℃で２時間インキュベートした）。キシレンシアノール染料（２μｌの１％）を添加した。次に製造業者の手順に正確に従って、ＣｒｅａｔｏｒTMＳｍａｒｔTMｃＤＮＡライブラリーキットで提供されるＣｈｒｏｍａ  Ｓｐｉｎ−４００カラム上で混合物を分画した。カラムから収集された画分をアガロースゲル電気泳動法によって分析した。ｃＤＮＡを含有する最初の３つの画分をプールして、ｃＤＮＡをエタノールで沈殿させた。沈殿したｃＤＮＡを７μｌの水に再溶解し、ＣｒｅａｔｏｒTMＳｍａｒｔTMｃＤＮＡライブラリーキットで提供されるｐＤＮＲ−ＬＩＢにライゲートした。
【０１８０】
実施例２
ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）Δ６デサチュラーゼのクローニング
紅藻、ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）の脂肪酸プロファイルは、ＥＤＡおよびＧＬＡの双方の存在を示し（Ｓｉｒａｎ，Ｄ．ら，Ｌｉｐｉｄｓ，３１（１２）：１２７７（１９９６年））、この藻類中のＥＰＡの生合成が、Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路および／またはΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路のどちらか、または双方を利用するかもしれないことを示唆する。本生物からΔ８デサチュラーゼをクローンする目的で、縮重プライマーを使用してデサチュラーゼ様タンパク質の内部部分を単離した。
【０１８１】
ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）デサチュラーゼ様タンパク質の内部部分をコードするＰＣＲ産物のクローニングおよび配列決定
既知のΔ６およびΔ８デサチュラーゼ中の高度に保存されたアミノ酸領域に対して作成された縮重ＰＣＲプライマーを使用して、デサチュラーゼの内部断片をクローンした。このためにＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎTMｖ６．１プログラムを使用して、フェオダクチラム・トリコルナタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＬ９２５６３［ｇｉ＿１９８７９６８９］；配列番号３７）、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ１１０３３［ｇｉ＿３７９０２０９］；配列番号３８）、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＴ８５６６１［ｇｉ＿５０８８２４９１］；配列番号３９）、およびモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＬ７３９４７［ｇｉ＿１８４８３１７５］；配列番号４０）からのΔ６デサチュラーゼ、およびミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＤ４５８７７［ｇｉ＿５６３９７２４］；配列番号４１）からのΔ８デサチュラーゼを配列比較した。このアラインメントの比較の一部を図２に示し；縮重プライマーは、図２に示す保存アミノ酸配列の枠線内領域とアニールするようにデザインされた。具体的には上流縮重プライマー５２３（配列番号１２）、５２４（配列番号１３）、および５２５（配列番号１４）が、保存アミノ酸配列ＷＱＱＭＧＷＬ（Ｓ／Ａ）ＨＤ（配列番号１５）に対して作成された。下流縮重プライマー５２６（配列番号１６）および５２７（配列番号１７）が保存アミノ酸配列ＨＨＬ（Ｗ／Ｆ）Ｐ（Ｔ／Ｓ）（Ｍ／Ｌ）ＰＲＨＮ（配列番号１８）に対して作成されたのに対し、下流縮重プライマー５２８（配列番号１９）および５２９（配列番号２０）は保存アミノ酸配列ＧＧＬ（Ｎ／Ｈ）ＹＱＩＥＨＨ（配列番号２１）に対して作成された。
【０１８２】
ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）ｃＤＮＡライブラリー（実施例１）をテンプレートとして、表４に記載される上流および下流縮重プライマーの様々な組み合わせを使用して、４つの個々のＰＣＲ反応を実施した。
【０１８３】
表４
推定上のデサチュラーゼを単離するために実施される縮重ＰＣＲ反応
【表４】
2011529689.tif 000008
【０１８４】
ＬＡ  ＴａｑTMＤＮＡポリメラーゼ（〒５２０−２１９３滋賀県大津市タカラバイオ株式会社；カタログ番号ＴＡＫ＿ＲＲ００２Ｍ）を使用して、製造業者の使用説明書のとおりにＰＣＲを実施した。サーモサイクラー条件は、９５℃で１分間、続いて３０サイクルの９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間、続いて７２℃で１０分間の最終延長であった。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離し、全反応で観察された予測される約７００ｂｐのＰＣＲ断片を切り出して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎキット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ番号１００１−６００）を使用して精製し、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ番号Ｋ４５３０−２０）で提供されるｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローンした。ライゲーションを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−２細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。
【０１８５】
Ｔ３（配列番号２２）およびＴ７（配列番号２３）プライマーを使用して、６つの形質転換体からのプラスミドＤＮＡ中のクローンされたＰＣＲ産物を配列決定した。６つの全ての内部配列、すなわち縮重上流および下流プライマー領域を含まない配列は互いに類似していた。より具体的には６つの全ての内部配列の比較からは、それらが合計１７の異なる残基で異なることが明らかにされた（その内サイレント突然変異は５つのみ）。いずれの２つのクローンも同一の変異残基を有さず、変異型の多くがおそらくＰＣＲの誤りに起因することが示唆された。ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）クローンの１つの６９３ｂｐの配列は、配列番号５１で示される。
【０１８６】
翻訳配列を使用してＢＬＡＳＴ「ｎｒ」タンパク質データベース中に含有される配列との類似性を検索する、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ［「ＮＣＢＩ」］ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．１８（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍａｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９〜３４０２（１９９７年）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７２：５１０１〜５１０９（２００５年））を実施することで、配列番号５１のアイデンティティを判定した。「ｎｒ」データベース中に含有される全ての公的に入手可能なタンパク質配列との類似性について、配列を分析した。クローンされたＰ．クルエンタム（Ｐ．ｃｒｕｅｎｔｕｍ）配列との（相同性に基づく）最良のヒットは、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＦ０８６８５．１；配列番号２４）であった。
【０１８７】
推定上のデサチュラーゼの３’末端のクローニング
推定上のデサチュラーゼの３’末端をクローンするために、上でクローンされたＰＣＲ産物の内部配列を使用して、３’入れ子ＰＣＲのためにＰＣＲプライマー（すなわちプライマー５３５［配列番号２５］およびプライマー５３６［配列番号２６］）に特異的な順方向遺伝子をデザインした。
【０１８８】
このようにして、実施例１からのポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、遺伝子特異的プライマー５３５（配列番号２５）およびＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０；配列５’−ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ−ｄ（Ｔ）30（Ａ／Ｇ／Ｃ）Ｎ−３’を有するＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマーはＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＣｒｅａｔｏｒTMＳｍａｒｔTMｃＤＮＡライブラリーキット（カタログ番号Ｋ１０５３−１；Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）中で提供される）を含んでなるプライマーペアを使用して、ＰＣＲを上述のように実施した。次に遺伝子特異的プライマー５３６（配列番号２６）およびＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０）を含んでなるプライマーペアを使用して、ＰＣＲ反応生成物に第２のネステッドＰＣＲ反応を施した。ＰＣＲ反応は１％アガロースゲル上で実施した。
【０１８９】
予測されたサイズ（およそ５００ｂｐ）のＰＣＲ産物を切り出してＧｅｎｅＣｌｅａｎキット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を使用して精製し、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で提供されるｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにライゲートした。ライゲートしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−２細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。６つの個々の形質転換体のプラスミドＤＮＡから、クローンされたＰＣＲ産物を配列決定した。１つのクローンからの４１０ｂｐ配列を配列番号５２として示す。
【０１９０】
全ての配列のアラインメントからは、おそらくはＰＣＲの誤りに起因する５位の変異型ヌクレオチド残基が明らかにされた。
【０１９１】
推定上のデサチュラーゼの５’末端のクローニング
５’ＲＡＣＥキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ番号１８３７４−０５８）を使用して、製造業者の使用説明書のとおりに推定上のデサチュラーゼｃＤＮＡ５’末端をクローンした。このために上でクローンされたＰＣＲ産物の内部配列を使用して、逆方向遺伝子特異的ＰＣＲプライマー（すなわちプライマー５３３［配列番号２７］、プライマー５３４［配列番号２８］、およびプライマー５３７［配列番号２９］）をデザインした。後者は５’ＲＡＣＥキット中のＡＵＡＰプライマー（配列番号３０）と共に機能するようにデザインされた。
【０１９２】
遺伝子特異的プライマー５３３（配列番号２７）およびポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）全ＲＮＡ（実施例１）をテンプレートとして使用し、キットを使用して第一鎖ｃＤＮＡを合成した。製造業者の使用説明書のとおりに、第一鎖ｃＤＮＡをＲＮａｓｅで処理してＳ．Ｎ．Ａ．Ｐ．カラムによって精製し、ＴｄＴでｔａｉｌを付加した。
【０１９３】
キットで提供される順方向ＡＡＰプライマー（配列番号３１、配列５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧ−３’を有する、式中Ｉ＝デオキシイノシン）および逆方向遺伝子特異的プライマー５３４（配列番号２８）を使用して、ｔａｉｌを付加したｃＤＮＡをテンプレートとして使用してｃＤＮＡの５’末端を増幅した。ＰＣＲ反応は１％アガロースゲル上で実施した。
【０１９４】
予測されるサイズ（約８００ｂｐ）に対応する薄いバンドが観察された。キットの説明書のとおりに、５００〜１０００ｂｐの全ての断片を切り出してＧｅｎｅＣｌｅａｎキット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を使用して精製し、順方向ＡＵＡＰプライマー（配列番号３０）および逆方向遺伝子特異的プライマー５３７（配列番号２９）を使用した、第２の入れ子５’ＲＡＣＥのためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応は１％アガロースゲル上で実施した。
【０１９５】
全てのＰＣＲ産物を切り出してＧｅｎｅＣｌｅａｎキット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を使用して精製し、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で提供されるｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにライゲートした。ライゲートを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−２細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。５つの個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡから、クローンＰＣＲ産物を配列決定した。配列のアラインメントから５つの配列の内４つが同一であることが明らかにされた。この８２２ｂｐの配列を配列番号５３として示す。
【０１９６】
第５の配列は、配列番号５３との比較で３個のミスマッチ（すなわちＡ４４１Ｇ、Ｃ６５３Ｔ、およびＧ７２２Ａ；Ｈ１２５ＧおよびＬ１９６Ｆ突然変異をもたらす）を有した；しかし配列中のこの矛盾もまたおそらくＰＣＲの誤りに起因することが推測された。
【０１９７】
推定上のデサチュラーゼの５’末端（配列番号５３）、内部（配列番号５１）、および３’末端（配列番号５２）配列を電子的にアセンブルして、完全長ＤＮＡ配列（配列番号１）を作り出した。
【０１９８】
全長デサチュラーゼｃＤＮＡのクローニング
推定上のデサチュラーゼの５’末端、内部、および３’末端は、誤り耐性でないＬＡ  ＴａｑＴTMＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を使用して得られたので、全長デサチュラーゼは、誤り耐性ＰｆｕＵｌｔｒａTMＨｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；カタログ番号６００３８０）を使用してＰＣＲによってクローンした。このためには、製造業者の使用説明書のとおりに、上述の推定上のデサチュラーゼクローンの５’および３’末端配列に基づいてデザインされた上流プライマー５３９（配列番号３２）および下流プライマー５４０（配列番号３３）を使用して、テンプレートとしての実施例１からのポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）ｃＤＮＡライブラリー上でＰＣＲを実施した。予測されるサイズ（約１４７０ｂｐ）のＰＣＲ産物を切り出して、ＧｅｎｅＣｌｅａｎキット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を使用して精製した。
【０１９９】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）発現プラスミドｐＹ９１は、ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ消化によるキメラゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）Δ６デサチュラーゼ［「ＤｒＤ６」］遺伝子の切除に続いて、プラスミドｐＹ９１Ｍ（配列番号３４；米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書に記載される）から誘導される。次にクローンされたＯＲＦが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーター（米国特許公開第７，２０２，３５６号明細書）およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｅｘ２０遺伝子のＰｅｘ２０ターミネーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）と作動的に連結するように、ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニングによって、推定上の全長ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）デサチュラーゼを含んでなる１４７０ｂｐのＰＣＲ産物をｐＹ９１のＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位の間にライゲートする（Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎTMＰＣＲクローニングキット、カタログ番号６３１７７４；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。
【０２００】
ライゲートしたＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−２細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。プラスミドＤＮＡの制限分析からは、７つの形質転換体の内６つが予測されたＳａｌ１／ＢｇｌＩＩ断片を有することが明らかにされた。これらのプラスミドの内３つ（すなわちミニプレップ＃１、＃２、および＃４）の中のクローンされたｃＤＮＡ  ＯＲＦ挿入断片を集合的にｐＹ１０９と命名した。上流および下流配列決定プライマー３７３（配列番号３５）および５０７（配列番号３６）をそれぞれ使用して、ＯＲＦを配列決定した。
【０２０１】
３つのｃＤＮＡ配列のアラインメントからは、ｐＹ１０９  ＃１とｐＹ１０９  ＃４が同一である一方、ｐＹ１０９  ＃２が６ヌクレオチド残基の違いを有し、その内５個はアミノ酸置換をもたらすことが明らかにされた。変異残基Ａ５９１Ｔがサイレント突然変異であったのに対し、変異残基Ｃ４９４Ｔ、Ｔ７８５Ｃ、Ｔ９８０Ｃ、Ｃ１０５２Ｔ、およびＡ１１１８Ｇは、Ｓ１６５Ｌ、Ｌ２６２Ｓ、Ｉ３２７Ｔ、Ａ３５１Ｖ、およびＨ３７３Ｒアミノ酸変異型をもたらした。（列挙される各置換［例えばＡ５９１Ｔ］では、第１の文字はｐＹ１０９  ＃１中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基に相当する一方、第２の文字はｐＹ１０９  ＃２中の同一位置に見られるヌクレオチドまたはアミノ酸残基に相当し、すなわちＡ５９１Ｔが５９１位におけるｐＹ１０９  ＃１中のアデニンからｐＹ１０９  ＃２中のチミンへの変化を示す一方で、Ｓ１６５Ｌは１６５位におけるｐＹ１０９  ＃１中のセリンからのｐＹ１０９  ＃２中のロイシンへの変化を示す）。Ｈ３７３Ｒ変異は高度に保存された残基である。
【０２０２】
プラスミドｐＹ１０９  ＃１中のポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）Δ６デサチュラーゼＯＲＦ（「ＰｃＤ６」と称する）の１４１６個のヌクレオチド配列を配列番号１に示す一方、配列番号１に対応する４７１個の推定アミノ酸配列は配列番号２として示す。キメラＦＢＡＩＮ：：ＰｃＤ６：：Ｐｅｘ２０遺伝子、ならびにＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での選択のためのアンピシリン−抵抗性遺伝子（ＡｍｐR）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｆ１複製起点、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律複製配列（ＡＲＳ１８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ１７６０８）、およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｕｒａ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）を含んでなるプラスミドｐＹ１０９  ＃１（配列番号４４）を図３に示す。
【０２０３】
プラスミドｐＹ１０９  ＃２中のポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）Δ６デサチュラーゼＯＲＦ（「ＰｃＤ６＊」と称する）中の１４１６個のヌクレオチド配列を配列番号４２に示す一方、配列番号４２に相当する推定４７１個のアミノ酸配列は配列番号４３として示す。ｐＹ１０９  ＃２のヌクレオチド配列は、配列番号４５として提供される。
【０２０４】
デフォルトパラメーター（ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１０；ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝３；ｓｃｏｒｉｎｇ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１；ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１）を使用して、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」タンパク質配列データベース中に含有される配列との類似性に対するＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰ  ２．２．１８検索（全ての非重複性ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ翻訳、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの三次元構造から誘導される配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベースの最新の主要公開に含まれる配列、ＷＧＳプロジェクトからの環境サンプルを除いたＰＩＲおよびＰＲＦを含んでなる）によって、ＰｃＤ６（配列番号２）のアミノ酸配列を評価した。それに対して配列番号２が最大の類似性を有する配列を要約するＢＬＡＳＴＰ比較の結果を％同一性、％類似性、および期待値に準じて報告する。「％同一性」は、２つのタンパク質間で同一であるアミノ酸の百分率と定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質間で同一であるまたは保存されているアミノ酸の百分率と定義される。「期待値」は、完全に偶発的にこの大きさのデータベース検索において期待される特定スコアを有するマッチ数を規定して、マッチの統計学的有意さを推定する。
【０２０５】
したがってクエリー配列としてＰｃＤ６（すなわち配列番号２）の全長アミノ酸配列を使用したＢＬＡＳＴＰ検索の結果は、それがモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）Δ６脂肪酸デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ０８６８５．１）と期待値５ｅ−９１で４０％の同一性および５７％の類似性を共有することを示した。さらにＰｃＤ６は、モルティエラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）のΔ６デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＬ７３９４８．１）と３９％の同一性および５７％の類似性を共有する。
【０２０６】
Δ６デサチュラーゼ酵素に普遍的に見られる３個のヒスチジンボックス（すなわちＨ（Ｘ）3-4Ｈ（配列番号３および４）、Ｈ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号５および６）、およびＨ／Ｑ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号７および８））は、配列番号２中に存在することが確認された。具体的には配列番号２のアミノ酸残基１９８〜２０２はＨｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ［またはＨＤＦＬＨ；配列番号４８］であり；アミノ酸残基２３５〜２３９はＨｉｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ［またはＨＮＨＨＨ；配列番号４９］であり；アミノ酸残基４１６〜４２０はＧｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ［またはＱＩＥＨＨ；配列番号５０］である。
【０２０７】
実施例３
推定上のポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）Δ６デサチュラーゼＯＲＦの特性解析
それぞれキメラＦＢＡＩＮ：：ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）Δ６デサチュラーゼ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミドｐＹ１０９  ＃１（配列番号４４）およびｐＹ１０９  ＃２（配列番号４５）を様々なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株に形質転換した。ＧＣ分析は、ｐＹ１０９  ＃１中のＰｃＤ６（配列番号１および２）が発現時にＬＡをＧＬＡに能動的に不飽和化できることを実証した。
【０２０８】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株およびＬ１０３株の単離
米国特許出願公開第２００７−０２９２９２４−Ａ１号明細書の実施例１３に記載されるようにして、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自律突然変異からのＦＯＡ抵抗性突然変異体）を単離した。
【０２０９】
米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書の実施例１８に記載されるようにして、総脂肪酸［「ＴＦＡ」］の百分率として４７％のＡＬＡを産生するＬ１０３株を作り出した。この株遺伝子型は、野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２との比較で次のとおりであった。Ｕｒａ３−、３コピーのキメラＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１５：Ｌｉｐ２遺伝子（ＦｍＤ１５はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ遺伝子である；米国特許出願公開第２００５−０１３２４４２−Ａ１号明細書もまた参照されたい）、２コピーのキメラＧＰＤ：：ＦｍＤ１５：ＸＰＲ遺伝子および１コピーのキメラＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２：：Ｌｉｐ２遺伝子（ＦｍＤ１２はＦ．モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子である；米国特許第７，５０４，２５９号明細書もまた参照されたい）。
【０２１０】
形質転換および増殖
標準酢酸リチウム法によって、プラスミドｐＹ１０９  ＃１およびｐＹ１０９  ＃２（実施例２から、それぞれＰｃＤ６およびＰｃＤ６＊を含んでなる）をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌ１０３株に形質転換する。
【０２１１】
ＭＭプレート上で３日間増殖させることで、ＵＲＡ原栄養株を選択した。各株の４つの個々の形質転換体を新鮮なＭＭプレート上に画線塗抹して３０℃で一晩インキュベートし、３ｍＬＭＭに接種するのに使用した。Ｙ２２２４およびＬ１０３対照株の四連の培養物を同様に調製した。３０℃の振盪機内で一晩の増殖後、細胞を収集し、各０．５ｍＭの最終脂肪酸濃度でＥＤＡとＥＴｒＡとの混合物を含有するＭＭＴ（ＭＭ＋タージトール）に再懸濁した。増殖を２４時間継続させた。細胞を収集してＮＰ−４０（カタログ番号１２７０８７−８７−０；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および蒸留水で洗浄した。総脂質を抽出してエステル交換した。ＦＡＭＥを一般方法に記載されるようにＧＣによって分析した。
【０２１２】
各株の４つの形質転換体の脂肪酸組成、ならびに平均脂肪酸組成を下の表に示す。脂肪酸は１６：０、１８：０、１８：１（ω−９）、１８：２（ω−６）、ＧＬＡ（１８：３  ω−６）、ＡＬＡ（１８：３  ω−３）、ＳＴＡ（１８：４  ω−３）、ＥＤＡ（２０：２  ω−６）、ＤＧＬＡ（２０：３  ω−６）、ＡＲＡ（２０：４  ω−６）、ＥＴｒＡ（２０：３  ω−３）、ＥＴＡ（２０：４  ω−３）、およびＥＰＡ（２０：５  ω−３）と同定された。転換効率（「ＣＥ」と略記する）は（［生成物］／［基盤＋生成物］）＊１００と計算される。したがって「Δ６ＣＥ」はＧＬＡ／（ＬＡ＋ＧＬＡ）＊１００］と計算され、対照的に「Δ８ＣＥ」は、ＤＧＬＡ／（ＥＤＡ＋ＤＧＬＡ）＊１００と計算される。
【０２１３】
表５
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換体中の脂肪酸組成（％総脂肪酸）
【表５】
2011529689.tif 000009
【０２１４】
比較のために、さらにＹＰＤ中で１日間、それに続きＭＭＴ中で１日間増殖させた野性型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株の脂肪酸組成（ＴＦＡの％として）は、７．９％の１６：０、１４．２％の１６：１（ｎ−１１）、１．２％の１８：０、５０．０％の１８：１（ｎ−９）、および２５．１％の１８：２（ｎ−６）である。ＧＬＡは野性型ＡＴＣＣ＃２０３６２中で不在である。
【０２１５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株のｐＹ１０９  ＃１形質転換体中のＧＬＡの存在は、Ｙ１０９  ＃１中のＰｃＤ６  ＯＲＦ（配列番号１）によってコードされるΔ６デサチュラーゼ活性の徴候である。より具体的にはｐＹ１０９  ＃１（配列番号４４）形質転換体は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株中で発現すると２５％のΔ６デサチュラーゼ転換効率を有する。この転換効率は、コドン最適化および導入遺伝子の染色体組み込みによって改善することが予測される。
【０２１６】
対照的に、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌ１０３株（Ｙ２２２４株の誘導体）のｐＹ１０９  ＃２形質転換体中のＧＬＡの不在は、Ｙ１０９  ＃２（配列番号４５）中のＰｃＤ６＊ＯＲＦ（配列番号４２）によってコードされるΔ６デサチュラーゼ活性の欠如の徴候である。これはｐＹ１０９  ＃１中で発現されるＰｃＤ６配列と比較した、ＰｃＤ６＊中の５個のアミノ酸残基の違いに起因する見込みが高い。
【０２１７】
ｐＹ１０９  ＃１およびｐＹ１０９  ＃２形質転換体双方の中の痕跡量のＤＧＬＡの存在は、双方が痕跡量のΔ８デサチュラーゼ活性を有することを示唆する。しかし外来性脂肪酸混合物中の痕跡量のＤＧＬＡ汚染のために、それが本物なのか、またはバックグラウンドレベルのＤＧＬＡに起因する人工産物であるのかは明白でない。
【０２１８】
要約すれば、この実験データは、ルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）Δ６デサチュラーゼ（すなわちＰｃＤ６、配列番号１および２に記載される）が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で発現すると、ＬＡをＧＬＡに能動的に不飽和化することを実証する。
【０２１９】
実施例４
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためにコドン最適化されたΔ６デサチュラーゼ遺伝子（ＰｃＤ６Ｓ）の合成
国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットおよび米国特許第７，１２５，６７２号明細書に記載されるのと同様の方法で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために、ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）のΔ６デサチュラーゼ遺伝子［「ＰｃＤ６」］のコドン使用頻度を最適化する。具体的にはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（米国特許第７，１２５，６７２号明細書）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周辺の共通配列、およびＲＮＡ安定性原則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｇ．およびＪ．Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇｅｎｅ，２６５（１〜２）：１１〜２３（２００１年））に従って、コドン最適化Δ６デサチュラーゼ遺伝子（「ＰｃＤ６Ｓ」と称される）がＰｃＤ６（配列番号１）のコード配列に基づいてデザインされる。翻訳開始部位の修飾に加えて、１４１６ｂｐのコード領域の２４８ｂｐ（１７．５％）が修飾され２２７コドン（４８．１％）が最適化される。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位は、翻訳開始コドン周囲、およびＰｃＤ６Ｓ（配列番号４６）停止コドンの後ろにそれぞれ組み込まれるであろう。コドン最適化遺伝子によってコードされるタンパク質配列は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号２）と同一であろう。デザインされたＰｃＤ６Ｓ遺伝子はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローンされてｐＰｃＤ６Ｓが作り出される。
【０２２０】
当業者はｐＰｃＤ６Ｓ中に含有されるＰｃＤ６Ｓ遺伝子（配列番号４６）を取り出して、それを適切な制御配列（例えばｐＹ９１、配列番号３４に記載）を含んでなる適切な発現ベクターにライゲートし、ＰｃＤ６Ｓを適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中で発現できるであろう。ＰｃＤ６ＳのΔ６デサチュラーゼ転換効率はＰｃＤ６（配列番号１および２）と比較でき、またはそれを超えることが予測される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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