(57)【要約】本出願は、変異体異種リボ核タンパク質G（HnRNPG）のエピトープに対する癌特異的抗体の重鎖および軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列および核酸配列を提供する。加えて、本出願は、癌特異的抗体および毒素または標識に付着した癌特異的抗体を含む免疫複合体、ならびにその使用法を提供する。本出願は、本明細書において開示する癌特異的抗体を用いる診断法およびキットにも関する。さらに、本出願は、変異体HnRNPGの新規癌関連エピトープおよび抗原、ならびにその使用を提供する。2011501946.tif 000043
2011501946.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される、単離された相補性決定領域（CDR）：
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列またはその変異体を含む単離された軽鎖CDR1；
アミノ酸配列SEQ ID NO:8またはその変異体を含む単離された軽鎖CDR2；
アミノ酸配列SEQ ID NO:9またはその変異体を含む単離された軽鎖CDR3；
アミノ酸配列SEQ ID NO:10またはその変異体を含む単離された重鎖CDR1；
アミノ酸配列SEQ ID NO:11またはその変異体を含む単離された重鎖CDR2；
アミノ酸配列SEQ ID NO:12またはその変異体を含む単離された重鎖CDR3。
【請求項２】
請求項1記載の相補性決定領域をコードする、単離された核酸配列。
【請求項３】
以下からなる群より選択される、単離された可変領域：
SEQ ID NO:7、8および/もしくは9の軽鎖相補性決定領域またはその変異体を含む単離された軽鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO:10、11および/もしくは12の重鎖相補性決定領域またはその変異体を含む単離された重鎖可変領域。
【請求項４】
単離された軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項3記載の可変領域。
【請求項５】
単離された重鎖可変領域が、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列またはその変異体を含む、請求項3記載の可変領域。
【請求項６】
請求項3記載の可変領域をコードする、単離された核酸配列。
【請求項７】
SEQ ID NO:15の軽鎖可変領域またはその変異体を含む、請求項6記載の核酸配列。
【請求項８】
SEQ ID NO:13の重鎖可変領域またはその変異体を含む、請求項6記載の核酸配列。
【請求項９】
請求項3から5記載の可変領域の1つまたは複数を含む、結合タンパク質。
【請求項１０】
SEQ ID NO:7、8および/もしくは9で規定されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域、ならびにSEQ ID NO:10、11および/もしくは12で規定されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域またはその変異体を含む、請求項9記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
SEQ ID NO:16の軽鎖可変領域またはその変異体を含む、請求項9記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
SEQ ID NO:14の重鎖可変領域またはその変異体を含む、請求項9記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
SEQ ID NO:16の軽鎖可変領域およびSEQ ID NO:14の重鎖可変領域、またはその変異体を含む、請求項9記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
前立腺幹細胞抗原（SEQ ID NO:17）、変異体HnRNPG、SEQ ID NO:71のアミノ酸配列を有する変異体HnRNPG、216位、218位、219位および/もしくは222位に1つもしくは複数のアミノ酸置換を伴うSEQ ID NO:113のアミノ酸配列を有する変異体HnRNPG、またはSEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、もしくはSEQ ID NO:112のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項9から13のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111またはSEQ ID NO:112のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的である、請求項14記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
癌細胞上または癌細胞内の抗原に結合することができる結合タンパク質であって、
1つまたは複数の濃度の試験結合タンパク質が、抗原またはエピトープへの結合に関してAb1と競合するその能力について試験される、
（1）請求項9から15のいずれか一項記載の結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体断片（Ab1）；および
（2）SEQ ID NO: 17、71、23、41、111もしくは112のアミノ酸配列を含む抗原またはエピトープ
を含む競合結合アッセイ法
によって、同定することができる結合タンパク質。
【請求項１７】
抗体である、請求項9から16のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
前記抗体が抗体断片である、請求項17記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
前記抗体断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二量体、ミニボディ、二重特異性抗体、もしくはその多量体、または二重特異性抗体断片である、請求項18記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
請求項9から19のいずれか一項記載の結合タンパク質をコードする、単離された核酸配列。
【請求項２１】
請求項9から19のいずれか一項記載の結合タンパク質、ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤
を含む、組成物。
【請求項２２】
（2）癌治療薬
に付着した、
（1）癌細胞上の抗原に結合する請求項9から19のいずれか一項記載の結合タンパク質
を含む、免疫複合体。
【請求項２３】
前記癌治療薬が細胞毒素である、請求項22記載の免疫複合体。
【請求項２４】
前記細胞毒素がリボソーム不活化ポリペプチドである、請求項23記載の免疫複合体。
【請求項２５】
前記細胞毒素が、ゲロニン、ボウガニン（bouganin）、サポリン、リシン、リシンA鎖、ブリオジン（bryodin）、ジフテリア、レストリクトシン（restrictocin）およびシュードモナス（Pseudomonas）外毒素Aまたはその変異体からなる群より選択される、請求項23記載の免疫複合体。
【請求項２６】
前記細胞毒素が改変ボウガニンまたはその変異体である、請求項23記載の免疫複合体。
【請求項２７】
前記細胞毒素が、アミノ酸252〜608からなる切断型のシュードモナス外毒素Aまたはその変異体である、請求項23記載の免疫複合体。
【請求項２８】
免疫毒素が癌細胞によって内部に取り込まれる、請求項22から27のいずれか一項記載の免疫複合体。
【請求項２９】
SEQ ID NO:49のアミノ酸配列を含む、請求項22記載の免疫複合体。
【請求項３０】
SEQ ID NO:51のアミノ酸配列を含む、請求項21記載の免疫複合体。
【請求項３１】
請求項22から30のいずれか一項記載の免疫複合体をコードする、単離された核酸配列。
【請求項３２】
SEQ ID NO:48の核酸配列を含む、請求項31記載の単離された核酸配列。
【請求項３３】
SEQ ID NO:50の核酸配列を含む、請求項31記載の単離された核酸配列。
【請求項３４】
請求項22から30のいずれか一項記載の免疫複合体を薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤と共に含む、組成物。
【請求項３５】
癌を治療または予防するための、請求項22から30のいずれか一項記載の免疫複合体の有効量の使用。
【請求項３６】
同時、別々または連続的に癌を治療または予防するための医薬の製造のための1つまたは複数のさらなる癌治療薬の使用をさらに含む、請求項35記載の使用。
【請求項３７】
癌を治療または予防するためのキットであって、
請求項22から30のいずれか一項記載の免疫複合体の有効量、および癌を治療または予防するためのその使用に関する説明書を含む、キット。
【請求項３８】
被験者の癌を検出またはモニターする方法であって、
以下の段階を含む方法：
（1）該被験者から採取した試験試料を、癌細胞上または癌細胞内の抗原に特異的に結合する請求項9から19のいずれか一項記載の結合タンパク質と接触させて、結合タンパク質-抗原複合体を生成する段階；
（2）該試験試料中の結合タンパク質-抗原複合体の量を測定する段階；および
（3）該試験試料中の結合タンパク質-抗原複合体の量を対照と比較する段階。
【請求項３９】
癌を診断するためのキットであって、
癌細胞上または癌細胞内の抗原に結合する請求項9から19のいずれか一項記載の結合タンパク質、およびその使用に関する説明書を含む、キット。
【請求項４０】
（2）直接的もしくは間接的に検出可能なシグナルを生じる標識
に付着した、
（1）癌細胞上または癌細胞内の抗原に結合する請求項9から19のいずれか一項記載の結合タンパク質
を含む、診断薬。
【請求項４１】
標識が、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、造影剤または金属イオンである、請求項60記載の診断薬。
【請求項４２】
請求項40または41の診断薬およびその使用に関する説明書を含む、キット。
【請求項４３】
請求項2、6、7、8、20、31、32または33のいずれか一項記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項４４】
請求項43記載の組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４５】
SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、216位、218位、219位および/もしくは222位に1つもしくは複数のアミノ酸置換を伴うSEQ ID NO:113、またはSEQ ID NO:71のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、あるいはその変異体。
【請求項４６】
SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、216位、218位、219位および/もしくは222位に1つもしくは複数のアミノ酸置換を伴うSEQ ID NO:113、またはSEQ ID NO:71のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド、あるいはその変異体。
【請求項４７】
請求項45または46記載の単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸配列。
【請求項４８】
請求項47記載の核酸配列を含む、組換え発現ベクター。
【請求項４９】
癌を有するまたは癌を有することが疑われる被験者において癌を検出またはモニターする方法であって、
単離されたポリペプチドが細胞上または細胞内で検出される場合には癌を示す、試料中の細胞上または細胞内の請求項45または46記載の単離されたポリペプチドを検出する段階
を含む方法。
【請求項５０】
適した希釈剤または担体との混合物中の、請求項45もしくは46記載の単離されたポリペプチドまたはその断片、請求項47記載の単離された核酸配列、あるいは請求項48記載の組換え発現ベクターの有効量を含む、薬学的組成物。
【請求項５１】
アジュバントをさらに含む、請求項50記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
被験者において癌を治療もしくは予防するためのまたは免疫応答を誘発するための、請求項50または51記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、新規の抗体および抗原、ならびに癌を治療および検出するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
2000年に、世界中で推定2,200万人が癌に罹患しており、620万例の死亡がこのクラスの疾患に起因していた。毎年、1,000万を超える新しい症例があり、この推定値は次の15年で50％増加すると予想される（WHO、世界がん報告（World Cancer Report）、Bernard W. Stewart and Paul Kleihues, eds. IARC Press, Lyon, 2003）。現行の癌治療は侵襲性の手術、放射線療法および化学療法アプローチが優位を占め、これらはしばしば効果がなく、潜在的に重度の副作用、非特異的毒性を有し、かつ/または身体像および/もしくは生活の質を傷つける変化を引き起こすことがある。現行の癌治療が不適切である一因は、患部組織および細胞に対する選択性がないことである。癌細胞に対してより高い選択性を持つ治療であれば、正常な細胞に害を与えず、したがって転帰、副作用の特性および生活の質を改善すると考えられる。
【０００３】
癌治療の選択性は、癌細胞に特異的で、正常細胞には見いだされない標的指向分子によって改善することができる。次いで、これらの分子は、抗体に基づく診断もしくは治療法の標的として、またはそれらの機能を変更することができる薬物に用いることができる。
【０００４】
HnRNPGすなわち異種リボ核タンパク質GはRBMXとしても公知である。これは主に核に局在し、そこでいくつかのタンパク質と複合体を形成して、いくつかの遺伝子のスプライシングを調節し、p53のDNA修復機能に影響をおよぼすことが明らかにされている（Li et al 2003, Venables et al 2000; Najib et al 2005）。これらのメカニズムの多くは腫瘍形成に結びつけられている（米国特許第6,627,405 B1号; Nandabalan et al 2003）。最近、Shin et al 2006および2007は、正常なHnRNPGが腫瘍抑制因子機能を有し、発現は腫瘍細胞においては減少することが判明したと報告し、p53調節DNA修復機能と正常なHnRNPG発現との間の関連を確立した。Shin et al 2006は、RNA結合ドメインの残基22で1つのアミノ酸が変化しているHnRNPGの腫瘍関連型を記載し、HnRNPGの膜関連発現の免疫組織化学による検出を報告している。
【０００５】
PSCAは、細胞表面上に見いだされる123アミノ酸のグリコシル-ホスファチジル-イノシトール（GPI）連結糖タンパク質である。そのmRNAは、正常な組織で発現されるが、腫瘍性組織で上方制御される（Gu et al., Cancer Res., 2005, 65:9495）。その過剰発現は、前立腺癌（Zhigang and Wenlv, World J. Surg. Oncol., 2004a, 2:13, Zhigang and Wenlv, Jpn. J. Clin. Oncol., 2004b, 34:414）、膵臓癌（Wente et al., Pancreas, 2005, 31:119）および膀胱癌（Amara et al., Cancer Res., 2001, 61:4660）に関連づけられている。ヒト化された、またはトランスジェニックマウス（Xenomouse）から得た、抗PSCAモノクローナル抗体が開発され（米国特許第6,825,226号、米国特許第2006/0269557号、国際公開公報第2005/118864号）、いくつかは癌の治療用に評価がなされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、新規の抗体および抗原を同定した。具体的には、本発明者らは新規の癌特異的ヒト抗体を同定し、これは肺癌、肝臓癌、前立腺癌、皮膚癌（黒色腫を含む）、膵臓癌、頭頸部癌および乳癌を含むいくつかの型の癌細胞に結合する。重要なことに、この抗体は、正常組織に有意には結合せず、それによって癌療法および診断に適した候補となる。本発明者らは、新規の抗体が特異的に結合する抗原およびエピトープも同定した。
【０００７】
本発明者らは、抗体をクローニングおよび配列決定し、抗体の軽鎖および重鎖可変領域ならびに相補性決定領域1、2および3の配列を決定した。
【０００８】
したがって、本出願は、アミノ酸配列SGNKLGDKYAC (SEQ ID NO:7)を含む単離された軽鎖相補性決定領域1（CDR1）；アミノ酸配列QDSKRPS (SEQ ID NO:8)を含む単離された軽鎖相補性決定領域2（CDR2）；およびアミノ酸配列QAWDNSTAV (SEQ ID NO:9)を含む単離された軽鎖相補性決定領域3（CDR3）；ならびにアミノ酸配列SYAMS (SEQ ID NO:10)を含む単離された重鎖CDR1；アミノ酸配列
2011501946.tif 000003
を含む単離された重鎖CDR2；およびアミノ酸配列DRTRYYGMDV (SEQ ID NO:12)を含む単離された重鎖CDR3を開示する。
【０００９】
本出願は、アミノ酸配列SGNKLGDKYAC (SEQ ID NO:7)を含む軽鎖CDR1；アミノ酸配列QDSKRPS (SEQ ID NO:8)を含む軽鎖CDR2；アミノ酸配列QAWDNSTAV (SEQ ID NO:9)を含む軽鎖CDR3；アミノ酸配列SYAMS (SEQ ID NO:10)を含む重鎖CDR1；アミノ酸配列
2011501946.tif 000004
を含む重鎖CDR2；およびアミノ酸配列DRTRYYGMDV (SEQ ID NO:12)を含む重鎖CDR3をコードする単離された核酸配列も開示する。
【００１０】
本出願において開示するさらなる局面は、本明細書において開示する軽鎖CDR1、CDR2および/またはCDR3(SEQ ID NO:7-9)を含む単離された軽鎖可変領域、ならびに本明細書において開示する重鎖CDR1、CDR2および/またはCDR3(SEQ ID NO:10-12)を含む単離された重鎖可変領域である。一つの態様において、軽鎖可変領域は図2に示すアミノ酸配列(SEQ ID NO:16)を含む。別の態様において、重鎖可変領域は図1に示すアミノ酸配列(SEQ ID NO:14)を含む。
【００１１】
本出願は、本明細書において開示する軽鎖可変領域をコードする単離された核酸配列、および本明細書において開示する重鎖可変領域をコードする単離された核酸配列も開示する。一つの態様において、軽鎖可変領域をコードする核酸配列は図2に示す核酸配列(SEQ ID NO:15)を含む。別の態様において、重鎖可変領域をコードする核酸配列は図1に示す核酸配列(SEQ ID NO:13)を含む。
【００１２】
本出願の別の局面は、結合タンパク質、好ましくは本明細書において開示する少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域（すなわち、SEQ ID NO:7-9の1つまたは複数）および/または本明細書において開示する少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（すなわち、SEQ ID NO:10-12の1つまたは複数）を含む、抗体または抗体断片である。本出願は、結合タンパク質、好ましくは本明細書において開示する軽鎖可変領域および/または本明細書において開示する重鎖可変領域を含む、抗体または抗体断片も開示する。
【００１３】
前述のとおり、本発明者らは本明細書において開示する結合タンパク質が結合する抗原も同定した。したがって、本出願は、前立腺幹細胞抗原(SEQ ID NO:17)および変異体HnRNPGに結合する結合タンパク質を開示する。本発明者らは本明細書において開示する結合タンパク質が結合する抗原上のエピトープも同定した。
したがって、本出願は、アミノ酸
2011501946.tif 000005
を含むポリペプチドに結合する結合タンパク質を開示する。
【００１４】
加えて、本出願は、抗体および抗体断片などの本明細書において開示する結合タンパク質、ならびに薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤を含む組成物を開示する。
【００１５】
さらに、本出願は、本明細書において開示する結合タンパク質をコードする単離された核酸配列を開示する。
【００１６】
本出願の別の局面は、
（2）エフェクター分子
に付着した、
（1）本明細書において開示する結合タンパク質、好ましくは癌細胞上または癌細胞内の抗原または分子に結合する抗体または抗体断片
を含む、免疫複合体である。本出願のさらなる局面は、
（2）エフェクター分子
に付着した、
（1）本明細書において開示する結合タンパク質、好ましくは癌細胞によって内部に取り込まれた抗原または分子に結合する抗体または抗体断片
を含む、免疫複合体である。好ましい態様において、エフェクター分子は、
（i）直接的もしくは間接的に検出可能なシグナルを生じうる標識、あるいは
（ii）細胞毒性、細胞分裂抑制性、またはそうではなく癌細胞の分裂および/もしくは転移する能力を防止もしくは低減する癌治療薬
である。好ましくは、癌治療薬は毒素または細胞毒素である。一つの態様において、免疫複合体は、SEQ ID NO:49によって規定されるアミノ酸配列を含む。別の態様において、免疫複合体はSEQ ID NO:51によって規定されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本出願は、本明細書において開示する免疫複合体をコードする単離された核酸配列も提供する。一つの態様において、単離された核酸配列はSEQ ID NO:49のアミノ酸配列を含む免疫複合体をコードする。別の態様において、単離された核酸配列はSEQ ID NO:48を含む。さらなる態様において、単離された核酸配列はSEQ ID NO:51のアミノ酸配列を含む免疫複合体をコードする。別の態様において、単離された核酸配列はSEQ ID NO:50を含む。
【００１８】
本出願は、癌を治療または予防するための医薬の製造のための、および診断目的のための、本明細書において開示する免疫複合体を含む組成物および免疫複合体の使用も提供する。加えて、本出願は、本明細書において開示する免疫複合体を用いた癌の治療または予防法、ならびに関係するキットを提供する。
【００１９】
本出願のさらなる局面は、被験者の癌を検出またはモニターする方法であって、以下の段階を含む方法である：
（1）該被験者から採取した試験試料を、本明細書において開示し、かつ癌細胞上または癌細胞内の抗原に特異的に結合する、結合タンパク質または免疫複合体と接触させて、結合タンパク質-抗原複合体を生成する段階；
（2）該試験試料中の結合タンパク質-抗原複合体の量を測定する段階；および
（3）該試験試料中の結合タンパク質-抗原複合体の量を対照と比較する段階。
【００２０】
本出願の別の局面は、エフェクター分子が直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じうる標識である、本明細書において開示する免疫複合体を含む診断薬である。
【００２１】
本出願は、本明細書において開示する結合タンパク質の1つと特異的に結合しうる単離されたタンパク質、その核酸配列および使用も含む。
【００２２】
本発明者らは、本明細書において開示する結合タンパク質が結合する抗原（すなわち、前立腺幹細胞抗原および変異体HnRNPG）を同定し、本発明者らは本明細書において開示する結合タンパク質が結合するエピトープ（すなわち、SEQ ID NO: 23、41、111および112）を同定した。したがって、本出願は、SEQ ID NO: 17、71、23、41、111もしくは112のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはその変異体を提供する。さらに、本出願は、SEQ ID NO: 17、71、23、41、111もしくは112のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド、またはその変異体を提供する。本出願は、これらのポリペプチドをコードする単離された核酸配列も提供する。
【００２３】
本出願は、癌の治療および診断における、本明細書において開示する抗原またはエピトープの使用を開示する。したがって、本出願は、癌を有する、または癌を有することが疑われる被験者の癌を検出またはモニターする方法であって、細胞上または細胞内で抗原またはエピトープが検出または過剰発現される場合には癌を示す、試料中の細胞上または細胞内の本明細書において開示する抗原またはエピトープを検出する段階を含む方法を開示する。
【００２４】
本出願の別の局面は、変異体HnRNPGの存在または発現をスクリーニングすることによって、癌を検出またはモニターする方法である。一つの態様において、方法は、以下の段階を含み、対照と試験試料との間の変異体HnRNPGの発現の差が癌を示す：
（a）被験者からの該試験試料中の変異体HnRNPGの発現を判定する段階；および
（b）変異体HnRNPGの発現を対照と共に含む段階。
【００２５】
本出願は、本明細書において開示する抗原もしくはエピトープ、本明細書において開示する抗原もしくはエピトープをコードする単離された核酸配列、または本明細書において開示する抗原もしくはエピトープをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターの有効量を、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤と共に含む薬学的組成物も開示する。
【００２６】
本出願のさらなる局面は、被験者の免疫応答を誘発するための、本明細書において開示する抗原もしくはエピトープ、本明細書において開示する抗原もしくはエピトープをコードする単離された核酸配列、または本明細書において開示する抗原もしくはエピトープをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターの使用である。
【００２７】
本出願のさらなる局面は、癌を治療または予防するための、本明細書において開示する抗原もしくはエピトープ、本明細書において開示する抗原もしくはエピトープをコードする単離された核酸配列、または本明細書において開示する抗原もしくはエピトープをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターの使用である。
【００２８】
加えて、本出願は、被験者の癌の治療または予防法であって、被験者または被験者からの細胞に、本明細書において開示する抗原もしくはエピトープ、本明細書において開示する抗原もしくはエピトープをコードする単離された核酸配列、または本明細書において開示する抗原もしくはエピトープをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターの有効量を投与する段階を含む方法を含む。
【００２９】
本出願は、本明細書において開示する抗原またはエピトープに対する被験者の免疫応答を誘導する方法であって、被験者または被験者からの細胞に、本明細書において開示する抗原もしくはエピトープ、本明細書において開示する抗原もしくはエピトープをコードする単離された核酸配列、または本明細書において開示する抗原もしくはエピトープをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターの有効量を投与する段階を含む方法も含む。
【００３０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかであると考えられる。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変更および改変は、当業者であればこの詳細な説明から明らかであると考えられるため、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示している一方で、例示のために示すにすぎないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本発明をここで図面に関連して説明する。
（図１）VB1-213のγ、VH3鎖のヌクレオチド(SEQ ID NO:13)およびアミノ酸(SEQ ID NO: 14)配列を示す。
（図２）VB1-213のλ、VL3鎖のヌクレオチド(SEQ ID NO:15)およびアミノ酸(SEQ ID NO: 16)配列を示す。
（図３）VB1-213で染色したSK-OV-3固定細胞ペレットを示す。200X；膜、細胞質および核染色が観察される。
（図４）（A）VB1-213で染色した肺癌組織を示す。400X；膜染色（等級2+）が、いくらかの細胞質染色と共に観察される（白矢印）。（B）VB1-213で染色した前立腺癌組織；400X；膜染色を白矢印で示す。同様に、核（黒矢印）および糸状細胞質染色も観察される。
（図５）共焦点顕微鏡による、VB1-213の内部取り込みの評価を示す。A-375細胞をVB1-213と共に4℃でインキュベートし、洗浄し、37℃で60分間加温した。細胞を固定し、透過化処理し、蛍光標識した二次抗体で標識した。A）VB1-213の4℃で60分間のインキュベーション後のA-375細胞の蛍光標識、標識の断続的な表面分布を黒矢印で示す、倍率（60X×3）。B）抗体結合細胞の37℃で60分間のインキュベーション後、細胞は内部に取り込まれた抗体による細胞内染色を示す、倍率（60X×3）。
（図６）VB1-213の結合親和性を示す。A）VB1-213の飽和曲線を、漸増濃度のVB1-213のA-375癌細胞への反応性をフローサイトメトリーで測定することによりもとめた。B：ラインウィーバー-バーク法、結合定数をラインウィーバー-バーク法によりもとめた。
（図７）VB1-213を用いた免疫沈降後の、VB1-213反応性タンパク質のウェスタンブロット分析である。5つの陽性細胞株、すなわち、DU-145、PC-3、A549、Panc-1、およびSKBR-3、ならびに1つの陰性細胞株、すなわち、CF-Pac-1の細胞パネルを用いた。
（図８）VB1-213をプローブに用いて得た2D-PAGEのウェスタンブロット特性である。ゲルからの対応するスポット（囲み）を同定のために用いた。
（図９）DU-145から抽出したペプチドイオンの質量分析である。図9Aはすべて多重荷電ペプチドイオンによるTOFMSスキャンであり、図9Bは質量再構築後の単一荷電ペプチドイオンによる脱重畳積分スペクトルである。
（図１０）2D-PAGEゲルからのVB1-213反応性タンパク質スポットから回収したペプチドのペプチド質量フィンガープリント法の結果である。64よりも大きいタンパク質スコアを有意と考えた。
（図１１）二重荷電分子（742.00000、2+）として現れている、分子量1481.9584の中性ペプチドのMS/MSイオン断片化を示す。
（図１２）図12Aは、得られたペプチドの完全マッピングおよび変異体HnRNPG (SEQ ID NO:71)の配列包括度を示す。太字のアミノ酸はMS分析から同定されたアミノ酸配列を表す。下線付き部分は、216位、218位、219位および222位のアミノ酸変化を示す新たに配列決定されたペプチド(SEQ ID NO:70)を表し、かつ図12Bは、正常ヒトHnRNPGのアミノ酸配列を示す。変異体に対応する領域に下線を付け、置換されたアミノ酸を太字で示す。
（図１３）試料中のすべてのペプチドイオンの存在を検出するために、DU-145細胞株からのVB1-213による1Dゲル免疫沈降およびウェスタンブロットから得たペプチドのTOFMSスキャンを示す。図13Aは、すべて多重荷電ペプチドイオンによるTOF_MSスキャンを表し、図13Bは、単一荷電ペプチドイオンによる脱重畳積分スペクトルを表す。
（図１４）試料中のすべてのペプチドイオンの存在を検出するために、SKBR-3細胞株からのVB1-213による1Dゲル免疫沈降およびウェスタンブロットから得たペプチドのTOFMSスキャンを示す。図14Aは、すべて多重荷電ペプチドイオンによるTOF_MSスキャンを表し、図14Bは、単一荷電ペプチドイオンによる脱重畳積分スペクトルを表す。
（図１５）試料中のすべてのペプチドイオンの存在を検出するために、Panc-1からのVB1-213による1Dゲル免疫沈降およびウェスタンブロットから得たペプチドのTOFMSスキャンを示す。図15Aは、すべて多重荷電ペプチドイオンによるTOF_MSスキャンを表し、図15Bは、単一荷電ペプチドイオンによる脱重畳積分スペクトルを表す。
（図１６）VB1-213免疫沈降物のゲル中消化物から回収したペプチドのペプチド質量フィンガープリント法の結果を示す。64よりも大きいタンパク質スコアを有意と考えた。
（図１７）VB1-213免疫沈降物の溶液中消化物から回収したペプチドのペプチド質量フィンガープリント法の結果を示す。64よりも大きいタンパク質スコアを有意と考えた。
（図１８）得られたペプチドの完全マッピングおよび前立腺幹細胞抗原、NCBIアクセッション番号GI|9367212の配列包括度を示す。太字で下線付きのアミノ酸はMS分析から同定されたアミノ酸配列を表す。
（図１９）三重荷電分子（623.00000、3+）として現れている、分子量1866.00の中性ペプチドMS/MSイオン断片化を示す。ペプチド配列は前立腺幹細胞抗原からのペプチドに正確に一致していた。
（図２０）抗PSCAで免疫沈降させ、抗PSCAおよびVB1-213をプローブに用いて得た、Panc-1およびDaudi膜調製物のウェスタンブロットを示す。
（図２１）PSCA配列から誘導した合成ペプチドへのVB1-213の結合を、ELISAおよび競合アッセイ法により、無関係の抗体（抗EGFR）およびPSCAに対する市販の抗体と比較して示す。10mM濃度の適切なペプチドを96穴プレートの各ウェルにコーティングした。各実験のペプチド濃度を、アッセイ前にビオチンレベルを測定することにより確認した。VB1-213はHP-1に非常に強力に結合したが、他の3つの抗体、すなわち、4B5-IgG（アイソタイプが一致した対照）、抗EGFR（無関係の抗体）および市販の抗PSCAはペプチドHP1への結合を示さなかった（A）。図21Bは、VB1-213のDU-145への結合を競合阻害するHP1の能力を、4B5-IgG、抗EGFRおよび抗PSCAと比べて示す。10Xから100Xの範囲のペプチド濃度を抗体と混合し、DU-145への結合の置き換えをフロー分析によりモニターした。C、DおよびEは、異なる抗体のペプチドPSPep1、PSPep2およびPSPep3（陰性）への結合特性を表し、F、GおよびHは、漸増濃度の様々なペプチド存在下での、VB1-213のDU-145への結合を示す。
（図２２）PCR反応によって作成した断片を確認するため、およびVB1-213に基づく免疫毒素の操作のために用いたアガロースゲルならびに大腸菌（E-coli）による集合した免疫毒素の産生を確認するために用いたウェスタンブロットを示す。DNAを、臭化エチジウムを用い、UVランプ下で検出した。AおよびB）SOE-PCR VB6-213-Fab-PE。A）EcoRI-PelB-VH213、VH213-ApaI、SfiI-6xHis-VL213およびCL-XhoI断片の最初のPCR反応物をそれぞれレーン1、2、4および5にロードした。1Kbラダーをレーン3および6にロードした。星印は予想されたサイズのPCR生成物を示す。B）最初のPCR反応の断片を用いて、断片EcoRI-PelB-VH213-ApaI（図22B、レーン1および2）および
2011501946.tif 000006
（レーン3および4）を#記号で示す予測サイズで生成した。C）SOE-PCR VB6-213-CL-de-ボウガニン（bouganin）。EcoRI-PelB-6xHis-VH213、VH213-ApaI、ApaI-CH-PelB-SfiIおよびSfiI-VL213-CL-XhoI断片の最初のPCR反応物、それぞれレーン1、2、3および4をアガロースゲル上で分析した。レーン5は1kBラダーである。EcoRI-PelB-6xHis-VH213-ApaI断片を最初のPCR反応から生成した（図22C、レーン6）。D）VB6-213-CL-de-ボウガニンのウェスタンブロット。VB6-213-CL-de-ボウガニン（レーン2）およびVB6-170クローン（レーン1）の上清を、SDS-PAGEゲルに非還元条件下でロードし、ウサギ抗ボウガニン抗体と、続いてヤギ抗ウサギHRPで免疫ブロットした。矢印はおよそ65kDaに移動した全長タンパク質を示す。Lはラダーである。E）VB6-213-Fab-PEのウェスタンブロット。レーン1はVB6-011-Fab-PE上清に対応し、レーン2はVB6-213-Fab-PEに、およびレーン3はVB6-213-Fab-PEに対応する。矢印はおよそ75kDaに移動した全長タンパク質を示す。
（図２３）VB6-213-CL-de-ボウガニンヌクレオチド配列(SEQ ID NO:42)を示す。
（図２４）VB6-213-Fab-PEヌクレオチド配列(SEQ ID NO:43)を示す。
（図２５）VH213-CHのアミノ酸配列（SEQ ID NO:44)を示す。
（図２６）VL213-CL-de-ボウガニンのアミノ酸配列(SEQ ID NO:45)を示す。
（図２７）VH213-CH-PEのアミノ酸配列(SEQ ID NO:46)を示す。
（図２８）VL213-CLのアミノ酸配列(SEQ ID NO:47)を示す。
（図２９）VB6-213-CL-de-ボウガニン構築物を示す。ヌクレオチド配列を示し(SEQ ID NO:48)、アミノ酸配列を示す(SEQ ID NO:49)。
（図３０）VB6-213-Fab-PE構築物を示す。ヌクレオチド配列を示し(SEQ ID NO:50)、アミノ酸配列を示す(SEQ ID NO:51)。
（図３１）VB6-213-CL-de-ボウガニンのγカセットを示す。
（図３２）VB6-213-Fab-PEのγカセットを示す。
（図３３）VB1-213または対照抗体VB1-4B5と組み合わせてのC33-A細胞上のaldefluorへの結合を示す、フローサイトメトリーの結果である。
（図３４）VB1-213または対照抗体VB1-4B5と組み合わせてのDU-145細胞上のaldefluorへの結合を示す、フローサイトメトリーの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
（A）定義
「細胞」なる用語は、1つの細胞ならびに複数の細胞または細胞集団を含む。物質を細胞に投与するとは、インビトロおよびインビボ投与の両方を含む。
【００３３】
本明細書において用いられる「全身投与」なる用語は、免疫複合体および/または他の癌治療薬を、注射（皮下、静脈内、筋肉内など）、経口投与、吸入、経皮投与もしくは局所適用（局所クリームまたは軟膏など）、坐剤適用、または植込み物の手段などの、好都合な様式で全身投与してもよいことを意味する。植込み物は、シアラスティック（sialastic）膜などの膜、または線維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料のものでありうる。坐剤は一般に、0.5重量％から10重量％の範囲の活性成分を含む。
【００３４】
「アミノ酸」なる用語は、天然アミノ酸ならびに改変アミノ酸のすべてを含む。
【００３５】
本明細書において用いられる「抗体」なる用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびキメラ抗体を含むことが意図される。抗体は、組換え供給源由来でもよく、および/またはトランスジェニック動物中で産生してもよい。本明細書において用いられる「抗体断片」なる用語は、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二量体、ミニボディ、二重特異性抗体、およびその多量体、多重特異性抗体断片ならびにドメイン抗体を含むことが意図されるが、それらに限定されるわけではない。抗体は、通常の技術を用いて断片化することもできる。例えば、F(ab')2断片は、抗体をペプシンで処理することによって生成することができる。得られたF(ab')2断片を、ジスルフィド架橋を還元するよう処理して、Fab'断片を生成することができる。パパイン消化はFab断片を生成することができる。Fab、Fab'およびF(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二量体、ミニボディ、二重特異性抗体、二重特異性抗体断片および他の断片も組換え技術によって合成することができる。
【００３６】
「本明細書において開示する抗体または抗体断片」なる用語は、本明細書において開示する少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域（すなわち、SEQ ID NO:7-9の1つまたは複数）および/または少なくとも1つの本明細書において開示する重鎖相補性決定領域（すなわち、SEQ ID NO:10-12の1つまたは複数）を含む。一つの態様において、抗体または抗体断片は、軽鎖CDR配列(SEQ ID NO:7-9)および/または重鎖CDR配列(SEQ ID NO:10-12)を含む。別の態様において、抗体または抗体断片は、SEQ ID NO:16のアミノ酸（軽鎖可変領域）および/またはSEQ ID NO:14のアミノ酸（重鎖可変領域）を含む。この用語は、本明細書において開示する抗原もしくはエピトープに結合する抗体または抗体断片も含む。抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片が正常細胞には実質的に結合することなく癌細胞に結合しうるような配列の機能的変異体も含む。
【００３７】
「本明細書において開示する抗原」または「本明細書において開示する癌関連抗原」なる用語は、前立腺幹細胞抗原(SEQ ID NO:17)およびHnRNPGの癌関連変異体、ならびにその断片を意味する。この用語は、本明細書において開示するエピトープを含むポリペプチドを含む。
【００３８】
本明細書において用いられる「HnRNPGの癌関連変異体」または「変異体HnRNPG」なる用語は、HnRNPGの新規変異体を意味する。一つの態様において、変異体HnRNPGは癌細胞において優先的に発現される。別の態様において、変異体HnRNPGは細胞膜に関連する。さらなる態様において、変異体HnRNPGは前立腺幹細胞抗原（PSCA）と同時発現される。別の態様において、変異体HnRNPGは、216位、218位、219位および/または222位に1つまたは複数のアミノ酸置換を伴うHnRNPGのアミノ酸配列(SEQ ID NO:113)を有する。一つの態様において、変異体HnRNPGはSEQ ID NO:71のアミノ酸配列を含む。別の態様において、変異体HnRNPGはSEQ ID NO:71のアミノ酸配列からなる。別の態様において、変異体HnRNPGは、214から224位にSEQ ID NO:111または112のアミノ酸配列による置換を伴うHnRNPGのアミノ酸配列(SEQ ID NO:113)を有する。
【００３９】
「少なくとも中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、溶液中の2つの相補的核酸分子の間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは核酸配列分子のすべてまたは一部に起こりうる。ハイブリダイズする部分は、典型的には長さが少なくとも15（例えば、20、25、30、40または50）ヌクレオチドである。当業者であれば、核酸二重鎖、またはハイブリッドの安定性はTmによって規定され、このTmはナトリウム含有緩衝液中でのナトリウムイオン濃度および温度の関数である（Tm = 81.5℃ - 16.6 (Log10 [Na+]) + 0.41(％(G+C) - 600/l)、または類似の式）であることを理解すると考えられる。したがって、ハイブリッドの安定性を規定する洗浄条件のパラメーターは、ナトリウムイオン濃度および/または温度である。公知の核酸分子に類似であるが、同一ではない分子を同定するために、1％のミスマッチはTmの約1℃の低下を引き起こすと想定され、例えば、＞95％の同一性を有する核酸分子を探す場合、最終洗浄温度を約5℃低下させる。これらの考察に基づき、当業者であれば、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することができると考えられる。好ましい態様において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するために以下の条件を用いてもよい：前述の式に基づくTm - 5℃で5×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）/5×デンハート液/1.0％SDSでのハイブリダイゼーション、およびその後の60℃で0.2×SSC/0.1％SDSの洗浄。中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、42℃での3×SSC中の洗浄段階を含む。しかし、代替の緩衝液、塩および温度を用いて同等のストリンジェンシーを達成しうることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる指標は下記に見いだされる：Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 2002、およびSambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001。
【００４０】
本明細書において用いられる「結合タンパク質」なる用語は、本明細書において開示する癌関連抗原またはエピトープなどの別の物質に特異的に結合するタンパク質を意味する。一つの態様において、結合タンパク質は、抗体または抗体断片である。
【００４１】
「インビボでの投与に適した生物学的適合型」とは、任意の毒性効果よりも治療効果がまさっている、投与する物質の型を意味する。
【００４２】
本明細書において用いられる「癌」なる用語は、本明細書において開示する結合タンパク質、好ましくは本明細書において開示する抗体または抗体断片によって結合されうる任意の癌を含む。
【００４３】
「癌細胞」なる用語は、癌もしくは腫瘍形成細胞、形質転換細胞、または癌もしくは腫瘍形成細胞になると疑われる細胞を含む。
【００４４】
「相補的」なる用語は、標準のワトソン-クリック相補性規則に従って塩基対形成することができるか、またはストリンジェントな条件下で特定の核酸セグメントにハイブリダイズすることができる核酸配列を意味する。
【００４５】
本明細書において用いられる「保存的アミノ酸置換」とは、タンパク質の所望の性質を破壊することなく別のアミノ酸残基で1つのアミノ酸残基を置き換える置換である。
【００４６】
本明細書において用いられる「対照」なる用語は、癌を有しているもしくは有していないことが公知であるか、または特定の悪性度もしくは重症度の癌を有していることが公知である被験者または被験者群からの試料を意味する。
【００４７】
本明細書において用いられる「制御放出系」なる用語は、制御された様式で投与することができる、本明細書において開示する免疫複合体および/または他の癌治療薬を意味する。例えば、マイクロポンプは腫瘍の領域に制御された用量を直接送達し、それにより薬学的組成物のタイミングおよび濃度を細かく調節しうる（例えば、Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138参照）。
【００４８】
「ペプチドの誘導体」なる用語は、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された1つまたは複数の残基を有するペプチドを意味する。そのような誘導体化分子には、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子が含まれる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて塩、メチルおよびエチルエステルもしくは他の型のエステルまたはヒドラジドを形成しうる。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されてO-アシルまたはO-アルキル誘導体を形成しうる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化されてN-im-ベンジルヒスチジンを形成しうる。誘導体として同様に含まれるのは、20の標準アミノ酸の1つまたは複数の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドである。例えば：プロリンを4-ヒドロキシプロリンで置換してもよく；リジンを5-ヒドロキシリジンで置換してもよく；ヒスチジンを3-メチルヒスチジンで置換してもよく；セリンをホモセリンで置換してもよく；かつリジンをオルニチンで置換してもよい。
【００４９】
「癌を検出またはモニターすること」なる語句は、被験者が癌を有しているかどうか、癌の範囲、癌の重症度および/または癌の悪性度を判定する方法またはプロセスを意味する。
【００５０】
本明細書において用いられる「直接投与」なる用語は、癌治療薬を、腫瘍内、血管内、および腫瘍周囲に投与しうることを意味するが、それらに限定されるわけではない。例えば、癌治療薬は、腫瘍内への1回または複数回の直接注入により、腫瘍内への持続または非持続灌流により、癌治療薬のレザバーの導入により、腫瘍内への徐放装置の導入により、腫瘍内への徐放製剤の導入により、および/または腫瘍への直接適用により投与してもよい。「腫瘍内への」投与の様式とは、癌治療薬の腫瘍の領域への、または実質的に腫瘍の領域内に直接流入する血管もしくはリンパ管内への導入が含まれる。
【００５１】
本明細書において用いられる「有効量」なる語句は、所望の結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を意味する。治療薬の有効量は、動物の疾患状態、年齢、性別、体重などの因子に応じて変動しうる。投与法は、最適な治療反応を提供するために調節しうる。例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与してもよく、または治療状況の緊急性によって指示されるとおり、用量を比例的に低減してもよい。
【００５２】
本明細書において用いられる「免疫応答を誘発すること」または「免疫応答を誘導すること」なる用語は、例えば、液性または細胞仲介性のいずれかの免疫系の任意の応答を開始する、誘発する、引き起こす、増強する、改善する、または増大させることを意味する。免疫応答の開始または増強は、抗体アッセイ法（例えば、ELISA法）、抗原特異的細胞毒性アッセイ法およびサイトカインの産生（例えば、ELISPOTアッセイ法）を含むが、それらに限定されるわけではない、当業者には公知のアッセイ法を用いて評価することができる。好ましくは、本明細書において開示する単離されたタンパク質、核酸配列または組換え発現ベクター、および本明細書において開示する方法は、細胞性免疫応答、より好ましくはT細胞応答を誘発または増強する。
【００５３】
「本明細書において開示するエピトープ」または「本明細書において開示する癌関連エピトープ」なる用語は、本明細書において開示する抗体によって認識される、本明細書において開示する抗原上の部位を意味する。一つの態様において、エピトープはSEQ ID NO:23、41、111または112のアミノ酸配列を含む。別の態様において、エピトープはSEQ ID NO:23、41、111または112のアミノ酸配列からなる。
【００５４】
本明細書において用いられる「重鎖相補性決定領域」なる用語は、抗体分子の重鎖可変領域内の高頻度可変性の領域を意味する。重鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、重鎖相補性決定領域1、重鎖相補性決定領域2および重鎖相補性決定領域3と呼ばれる3つの相補性決定領域を有する。
【００５５】
本明細書において用いられる「重鎖可変領域」なる用語は、重鎖の可変領域を意味する。
【００５６】
「本明細書において開示する免疫複合体」なる用語は、
（2）エフェクター分子
に付着した、
（1）本明細書において開示する結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体断片
を含む。エフェクター分子は、
（i）直接的もしくは間接的に検出可能なシグナルを生じうる標識、あるいは
（ii）細胞毒性、細胞分裂抑制性、またはそうではなく癌細胞の分裂および/もしくは転移する能力を防止もしくは低減する癌治療薬
を含むが、それらに限定されるわけではない、癌細胞に送達することを望まれる任意の分子でありうる。「本明細書において開示する免疫毒素」なる用語は、エフェクター分子が細胞毒性、細胞分裂抑制性、またはそうではなく癌細胞の分裂および/または転移する能力を防止または低減する毒素などの癌治療薬である、免疫複合体を意味する。
【００５７】
本明細書において用いられる「単離された核酸配列」なる用語は、組換えDNA技術によって生成した場合は、細胞材料もしくは培地、または化学的に合成した場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を意味する。単離された核酸は、核酸の由来元である、核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の5'および3'末端に位置する配列）も実質的に含まない。「核酸」なる用語は、DNAおよびRNAを含むことが意図され、二本鎖または一本鎖のいずれであってもよく、かつセンスまたはアンチセンス鎖を表す。さらに、「核酸」なる用語は、相補的核酸配列を含む。
【００５８】
「単離されたポリペプチド」なる用語は、組換えDNA技術によって生成した場合は、細胞材料もしくは培地、または化学的に合成した場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないポリペプチドを意味する。
【００５９】
本明細書において用いられる「軽鎖相補性決定領域」なる用語は、抗体分子の軽鎖可変領域内の高頻度可変性の領域を意味する。軽鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、軽鎖相補性決定領域1、軽鎖相補性決定領域2および軽鎖相補性決定領域3と呼ばれる3つの相補性決定領域を有する。
【００６０】
本明細書において用いられる「軽鎖可変領域」なる用語は、軽鎖の可変領域を意味する。
【００６１】
本明細書において用いられる「改変ボウガニン」なる用語は、PCT/CA2005/000410および米国特許第2005-0238642 A1号として公開された米国特許出願第11/084,080号に記載の、免疫応答を活性化する性向が低い改変ボウガニンを意味する。一例において、改変ボウガニンはアミノ酸配列
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を有する。
【００６２】
本明細書において用いられる「核酸配列」なる用語は、天然の塩基、糖および糖間（骨格）連結からなるヌクレオシドまたはヌクレオチド単量体の配列を意味する。この用語は、非天然単量体またはその一部を含む改変または置換配列も含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（DNA）またはリボ核酸配列（RNA）であることができ、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む天然塩基を含みうる。配列は改変塩基も含みうる。そのような改変塩基の例には、アザおよびデアザアデニン、アザおよびデアザグアニン、アザおよびデアザシトシン、アザおよびデアザチミジンならびにアザおよびデアザウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンを含みうる。
【００６３】
本明細書において用いられる「試料」なる用語は、癌についてアッセイしうる、被験者からの任意の体液、細胞または組織試料を意味する。
【００６４】
本明細書において用いられる「配列同一性」なる用語は、2つのポリペプチド配列または2つの核酸配列の間の配列同一性のパーセンテージを意味する。2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性パーセントをもとめるために、配列を最適な比較のために整列化させる（例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために、第一のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列におけるある位置が第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されている場合、それらの分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の重なる位置の数/位置の総数×100％）。一つの態様において、2つの配列は同じ長さである。2つの配列間の同一性パーセントは、数学的アルゴリズムを用いてもとめることもできる。2つの配列の比較に用いる数学的アルゴリズムの好ましい非限定例は、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268のアルゴリズムを、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877のとおりに改変したものである。そのようなアルゴリズムをAltschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込む。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTヌクレオチドプログラムパラメーターを、例えば、スコア=100、語長=12に設定して行い、本出願の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラムパラメーターを、例えば、スコア-50、語長=3に設定して行い、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップありアライメントを得るために、ギャップありBLAST（Gapped BLAST）をAltschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のとおりに用いることができる。または、PSI-BLASTを用いて、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うこともできる（Id.）。BLAST、ギャップありBLAST、およびPSI-Blastプログラムを用いる場合、それぞれのプログラムの（例えば、XBLASTおよびNBLASTの）デフォルトパラメーターを用いることができる（例えば、NCBIウェブサイト参照）。配列の比較に用いる数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを用いる場合、PAM120重量残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を用いることができる。2つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを与えてまたは与えずに前述のものと同様の技術を用いてもとめることもできる。同一性パーセントを算出する際に、典型的には厳密な一致だけを数える。
【００６５】
本明細書において用いられる「被験者」なる用語は、動物界の任意のメンバー、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。好ましい態様において、被験者は、癌を有すると疑われるかまたは癌を有している。
【００６６】
本明細書において用いられる「癌を治療または予防すること」なる語句は、癌細胞複製を阻害すること、細胞の癌形成細胞への形質転換を防止すること、癌の伝播（転移）を阻害すること、腫瘍成長を阻害すること、癌細胞数もしくは腫瘍成長を低減すること、癌の悪性度（例えば、分化の増大）を低下させること、または癌関連症状を改善することを意味する。
【００６７】
本明細書において用いられる「変異体」なる用語は、本明細書において開示するポリペプチドまたは核酸分子と実質的に同じ機能を実質的に同じ様式で行う、本明細書において開示するアミノ酸配列および核酸配列の改変物または化学的等価物を含む。例えば、本明細書において開示するポリペプチドの変異体は、保存的アミノ酸置換を含むが、それらに限定されるわけではない。ポリペプチドの変異体は、本明細書において開示するポリペプチド配列への付加および欠失も含む。加えて、変異体のみ（des）および変異体ヌクレオチド配列が、その類縁体および誘導体を含む。癌関連抗原の変異体とは、癌細胞上もしくは癌細胞内で発現されるが、正常細胞上もしくは正常細胞内では発現されない、または正常細胞に比べて癌細胞上もしくは癌細胞内で過剰発現される、タンパク質配列を意味する。
【００６８】
（B）相補性決定領域および結合タンパク質
（i）軽鎖および重鎖相補性決定領域ならびに軽鎖および重鎖可変領域
本出願は、アミノ酸配列SGNKLGDKYAC (SEQ ID NO:7)を含む単離された軽鎖相補性決定領域1（CDR1）；アミノ酸配列QDSKRPS (SEQ ID NO:8)を含む単離された軽鎖相補性決定領域2（CDR2）；およびアミノ酸配列QAWDNSTAV (SEQ ID NO:9)を含む単離された軽鎖相補性決定領域3（CDR3）を開示する。加えて、本出願は、アミノ酸配列SYAMS (SEQ ID NO:10)を含む単離された重鎖CDR1；アミノ酸配列
2011501946.tif 000008
を含む単離された重鎖CDR2；およびアミノ酸配列DRTRYYGMDV (SEQ ID NO:12)を含む単離された重鎖CDR3を開示、提供する。
【００６９】
本出願は、上で開示したCDR配列によって認識される同じエピトープまたは抗原に結合しうる、CDR配列の変異体も開示する。
【００７０】
本出願のさらなる局面は、本明細書において開示する軽鎖CDR1、CDR2および/またはCDR3(SEQ ID NO:7-9)を含む単離された軽鎖可変領域、ならびに本明細書において開示する重鎖CDR1、CDR2および/またはCDR3(SEQ ID NO:10-12)を含む単離された重鎖可変領域である。一つの態様において、軽鎖可変領域は図2に示すアミノ酸配列(SEQ ID NO:16)を含む。別の態様において、重鎖可変領域は図1に示すアミノ酸配列(SEQ ID NO:14)を含む。
【００７１】
本出願は、上で開示した単離された軽鎖可変領域および単離された重鎖可変領域によって認識される同じエピトープまたは抗原に結合しうる、単離された軽鎖可変領域および重鎖可変領域の変異体も開示する。
【００７２】
当業者であれば、本出願は、化学的等価物を含む、SEQ ID NO:7-12、14および16のアミノ酸配列の変異体を含むことを理解すると考えられる。そのような等価物には、本明細書において開示する特定のタンパク質と実質的に同じ機能を実質的に同じ様式で行うタンパク質が含まれる。例えば、CDR配列の機能的変異体は、本来のCDR配列によって認識される抗原またはエピトープに結合することができると考えられる。例えば、等価物には、保存的アミノ酸置換体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００７３】
一つの態様において、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3、ならびに重鎖CDR1、CDR2およびCDR3の変異体アミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:7-12に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、最も好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらに最も好ましくは95％の配列同一性を有する。
【００７４】
別の態様において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の変異体アミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:16および14に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、最も好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらに最も好ましくは95％の配列同一性を有する。
【００７５】
本出願は、本明細書において開示する軽鎖可変領域をコードする単離された核酸配列、および本明細書において開示する重鎖可変領域をコードする単離された核酸配列も開示する。一つの態様において、単離された核酸配列は、図2に示すアミノ酸配列(SEQ ID NO:16)を含む軽鎖可変領域をコードする。別の態様において、単離された核酸配列は、図1に示すアミノ酸配列(SEQ ID NO:14)を含む重鎖可変領域をコードする。さらなる態様において、軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、図2に示す核酸配列(SEQ ID NO:15)を含む。さらなる態様において、重鎖可変領域をコードする核酸配列は、図1に示す核酸配列(SEQ ID NO:13)を含む。
【００７６】
本出願は、本明細書において開示する軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする核酸配列の変異体も開示する。例えば、変異体には、少なくとも中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書において開示する軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列が含まれる。別の態様において、変異体核酸配列は、SEQ ID NO:13または15に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、最も好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらに最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。
【００７７】
本出願は、アミノ酸配列SGNKLGDKYAC (SEQ ID NO:7)を含む軽鎖CDR1；アミノ酸配列QDSKRPS (SEQ ID NO:8)を含む軽鎖CDR2；アミノ酸配列QAWDNSTAV (SEQ ID NO:9)を含む軽鎖CDR3；アミノ酸配列SYAMS (SEQ ID NO:10)を含む重鎖CDR1；アミノ酸配列
2011501946.tif 000009
を含む重鎖CDR2；およびアミノ酸配列DRTRYYGMDV (SEQ ID NO:12)を含む重鎖CDR3をコードする単離された核酸配列も開示する。
【００７８】
本出願は、前述のCDR配列および可変領域配列の変異体をコードする単離された核酸配列も提供する。
【００７９】
変異体核酸配列には、少なくとも中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、SEQ ID NO: 7-12、14および16に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列ならびにその変異体にハイブリダイズするか、またはSEQ ID NO: 7-12、14および16に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して少なくとも50％、60％、70％、80％もしくは90％の配列同一性を有する核酸配列が含まれる。
【００８０】
（ii）結合タンパク質
本出願の別の局面は、結合タンパク質、好ましくは本明細書において開示する少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域（すなわち、SEQ ID NO:7-9の1つまたは複数）および/または本明細書において開示する少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（すなわち、SEQ ID NO:10-12の1つまたは複数）を含む、抗体または抗体断片である。
【００８１】
一つの態様において、結合タンパク質は、アミノ酸配列SGNKLGDKYAC (SEQ ID NO:7)；QDSKRPS (SEQ ID NO:8)；およびQAWDNSTAV (SEQ ID NO:9)をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域1、2および3；ならびにアミノ酸配列SYAMS (SEQ ID NO:10)；
2011501946.tif 000010
；およびDRTRYYGMDV (SEQ ID NO:12)をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域1、2および3を含む。本出願は、結合タンパク質、好ましくは図2に示す軽鎖可変領域(SEQ ID NO:16)および/または図1に示す重鎖可変領域(SEQ ID NO:14)を含む、抗体または抗体断片も開示する。
【００８２】
当業者であれば、本出願は、上で開示した結合タンパク質と実質的に同じ機能を実質的に同じ様式で行う、上で開示した配列に対する化学的等価物を含む、上で開示した特定の結合タンパク質の変異体を含むことを理解すると考えられる。結合タンパク質の機能的変異体は、上で開示した結合タンパク質と同じ抗原またはエピトープに結合することができると考えられる。一つの態様において、変異体結合タンパク質は前立腺幹細胞抗原(SEQ ID NO:17)に結合する。別の態様において、変異体結合タンパク質は変異体HnRNPGに結合する。別の態様において、変異体結合タンパク質はSEQ ID NO:71のアミノ酸配列を有する変異体HnRNPGに結合する。別の態様において、変異体結合タンパク質は、216位、218位、219位および/または222位に1つまたは複数のアミノ酸置換を伴うHnRNPGのアミノ酸配列(SEQ ID NO:113)を有する変異体HnRNPGに結合する。さらなる態様において、変異体結合タンパク質は、214位から224位にSEQ ID NO:111または112のアミノ酸配列による置換を伴うHnRNPGのアミノ酸配列(SEQ ID NO:113)を有する変異体HnRNPGに結合する。別の態様において、変異体結合タンパク質は、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO: 111またはSEQ ID NO: 112のアミノ酸配列を有するエピトープに結合する。
【００８３】
本発明者らは、本明細書において開示する結合タンパク質が結合する抗原を同定した。したがって、本出願は、前立腺幹細胞抗原(SEQ ID NO:17)、または変異体HnRNPGに結合するタンパク質を開示する。一つの態様において、変異体HnRNPGはSEQ ID NO:71のアミノ酸配列を有する。本発明者らは、本明細書において開示する結合タンパク質が結合する抗原上のエピトープも同定した。したがって、本出願は、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO: 111またはSEQ ID NO: 112のアミノ酸配列を有するエピトープに結合する結合タンパク質を提供する。
【００８４】
特定の態様において、抗体または抗体断片は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、IgMまたはIgD定常領域などの重鎖定常領域のすべてまたは一部を含む。好ましくは、重鎖定常領域はIgG1重鎖定常領域である。さらに、抗体または抗体断片は、カッパ軽鎖定常領域またはλ軽鎖定常領域のすべてまたは一部を含みうる。好ましくは、軽鎖定常領域はλ軽鎖定常領域である。
【００８５】
ヒトモノクローナル抗体を生成するために、癌を有するヒトから抗体生成細胞（リンパ球）を採取し、標準の体細胞融合法により骨髄腫細胞と融合させ、したがってこれらの細胞を不死化して、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような技術は、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunol. Today 4:72 (1983)）、ヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBV-ハイブリドーマ技術（Roder et al., Methods Enzymol, 121:140-67 (1986)）、およびコンビナトリアル抗体ライブラリのスクリーニング（Huse et al., Science 246:1275 (1989)）などの他の技術と同様に、当技術分野において周知である（例えば、Kohler and Milstein (Nature 256:495-497 (1975))によって最初に開発されたハイブリドーマ技術）。ハイブリドーマ細胞を、癌細胞と特異的に反応性の抗体の産生についてスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
【００８６】
癌細胞上または癌細胞内の抗原または分子などの、特定の抗原または分子に対して反応性の特異的抗体または抗体断片を、細胞表面成分を有する細菌中で発現させた免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリをスクリーニングすることにより生成してもよい。例えば、完全Fab断片、VH領域およびFV領域を、ファージ発現ライブラリを用いて細菌中で発現させることができる（例えば、Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); およびMcCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)参照）。
【００８７】
本出願は、本明細書において開示する抗体または抗体断片と同じ抗原またはエピトープに結合するすべての抗体および抗体断片を含む。当業者であれば、結合アッセイ法を用いて、本明細書において開示する抗体および抗体断片と同じ結合特異性を有する他の抗体および抗体断片を見いだしうることを理解すると考えられる。以下に例示するとおり、競合結合アッセイ法を用いてそのような他の抗体を見いだすことができる。
【００８８】
競合アッセイ法をフローサイトメトリーを用いて実施する前に、固定の数の癌細胞に対して最大の結合を示す、本明細書において開示する抗体（Ab1）の最小濃度をもとめる。合計106の細胞を指数関数的に成長している培養物から回収し、様々な抗体濃度と共に4℃で1時間インキュベートする。細胞を洗浄し、適した検出抗体と共に4℃でさらに1時間インキュベートする。洗浄後、細胞をフローサイトメトリーで分析する。各試験抗体について、抗体濃度に対して蛍光中央値をプロットすることによるデータから飽和曲線を生成した。
【００８９】
競合アッセイ法のために、癌細胞を前述のとおりに調製し、固定濃度の抗体（Ab1）で二通り処理する。固定濃度は、上でもとめた固定の数の癌細胞に対して最大の結合を示す抗体の最小濃度である。Ab1の添加直後に、様々な濃度の可能な阻害抗体（Ab2）を各チューブに加え、混合物を4℃で1時間インキュベートする。阻害パーセントおよび蛍光の最大中央値の変化の両方を、各試験試料の蛍光読み取りの中央値（Ab1＋Ab2）からバックグラウンド蛍光（PBS-5％FCS）を差し引くことにより計算する。次いで、結果をAb1だけの蛍光中央値（最大結合）-バックグラウンド（下記参照）で割る。100をかけて阻害結果のパーセントを得る。反復測定の平均およびそれぞれの標準誤差を抗体濃度に対してプロットする。以下の式を用いて阻害パーセントを算出する。
PI = [(MF(Ab1+Ab2) - MFBgd)/(MFAb1 - MFBgd)] x 100
式中、PI = 阻害パーセント；MF(Ab1+Ab2) = Ab1＋Ab2混合物について測定した蛍光中央値；およびMFBgd = PBS-5％FCSによるバックグラウンド蛍光中央値。
【００９０】
したがって、本出願は、癌細胞上の抗原に結合することができる結合タンパク質であって、対照PIから統計学的に有意な差を有するPIが、試験結合タンパク質が癌細胞上の抗原またはエピトープに結合可能であることを示す、以下の段階を含む方法によって、同定することができる該結合タンパク質を提供する：
（1）固定の数の癌細胞を、固定の数の癌細胞に対して最大の結合を生じる、最小濃度の本明細書において開示する結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体断片（Ab1）と共にインキュベートし、Ab1の蛍光中央値（MFAb1）を測定する段階；
（2）試験結合タンパク質（Ab2）をAb1および癌細胞に加えることにより複数の濃度のAb2を試験し、蛍光中央値（MF(Ab1+Ab2)）を測定する段階；
（3）バックグラウンド蛍光中央値（MFbgd）を測定する段階；
（4）PI = [(MF(Ab1+Ab2) - MFBgd)/(MFAb1 - MFBgd)] x 100である、PIを計算する段階；および
（5）PIを対照PI値と比較する段階。
【００９１】
当業者であれば、本明細書において開示する抗原またはエピトープを用いる競合アッセイ法を含む、他の競合アッセイ法を用いうることを理解すると考えられる。例えば、抗原またはエピトープを基質上に固定することができ、次いで試験結合タンパク質を固定化抗原またはエピトープに結合させることができる。次いで、本明細書において開示する結合タンパク質の固定化抗原またはエピトープへの結合を測定して、試験結合タンパク質が抗原またはエピトープへの結合タンパク質の結合に対して競合するかまたは該結合を阻止することができるかどうかを判定することができる。本出願の実施例9は、競合アッセイ法の別の例である。
【００９２】
一つの態様は、癌細胞上または癌細胞内の抗原に結合することができる結合タンパク質であって、1つまたは複数の濃度の試験結合タンパク質が、抗原またはエピトープへの結合に関してAb1と競合するその能力について試験される、
（1）本明細書において開示する結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体断片（Ab1）；および
（2）本明細書において開示する抗原またはエピトープ、好ましくはSEQ ID NO: 17、71、23、41、111または112のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を含む競合結合アッセイ法
によって、同定することができる結合タンパク質である。
【００９３】
当業者であれば、親和性成熟技術を用いて、本明細書において開示する結合タンパク質または免疫複合体を、その抗原またはエピトープに対する親和性を高めることにより改変しうることを理解すると考えられる。
【００９４】
抗体の結合親和性を増強するために、2つの戦略が日常的に用いられる。1つのアプローチは、抗原結合に関与する鍵となる残基を同定するために、Ab-Ag複合体の結晶構造の分析を用いる（Davies D.R., Cohen G.H. 1996. Interactions of protein antigens with antibodies. Proc Natl. Acad. Sci. U.S A. 93, 7-12）。続いて、それらの残基を突然変異させて相互作用を増強することができる。他方のアプローチは、B細胞によって産生される免疫グロブリンの親和性成熟を駆動するインビボでの抗原刺激を模倣する。免疫応答の成熟中、免疫グロブリンの可変領域は体細胞突然変異を受ける（Mc Heyzer-Williams M. 2003. B-cell signaling mechanism and activation. Fundamental Immunology, Fifth edition, 195-225）。このプロセスは、免疫系に高度に特異的で、非常に高率での点突然変異の導入によって特徴付けられる。これは可変領域をコードするDNA断片内でのみ起こり、保存ドメインは除外する。次いで、体細胞突然変異した変異抗体を発現するB細胞を抗原仲介性選択に供し、その結果、より高い親和性の免疫グロブリンが選択される。この現象をインビトロで再現するために、無作為または標的指向プロセスのいずれかによる突然変異を導入するためのいくつかのアプローチが用いられている。無作為突然変異は、エラープローンPCR、鎖シャッフリングまたはミューテーター大腸菌株を用いて導入することができる（Clackson T. Hoogenboom N.R., Griffiths A.D. and Winter G. 1991 Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 352, 624-628, Hawkins R.E., Russell S.J. and Winter G. 1992. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation. J. Mol. Biol. 226, 889-896, Low N., Holliger P. and Winter G. 1996. Mimicking somatic hypermutation: affinity maturation of antibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutator strain. J Mol. Biol. 260, 359-368）。この戦略は、反応性クローンが、リボソーム、ファージまたは酵母などのディスプレイ技術によって選択される大きいライブラリの作成につながる（Min L. (2000). Applications of display technology in protein analysis. Nat. Biotechnol. 18, 1251-1256）。
【００９５】
CDR、特に軽鎖および重鎖のCDR3の標的指向突然変異は、抗体親和性を高めるのに有効な技術であることが明らかにされている。CDR3の3から4アミノ酸のブロックまたは「ホットスポット」と呼ばれる特定の領域が突然変異誘発の標的とされる。Yangらは、4つのCDR残基を突然変異させることにより、抗HIV gp120 Fab断片の420倍の増大を報告した（Yang W.P., Green K., Pinz-Sweeney S., Briones A.T., Burton D.R. and Barbas C.F. III. 1995. CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of a potent human anti-HIV-1 antibody into picomolar range. J.Mol.Biol., 254, 392-403）。VL CDR3における1つの突然変異は、C6.5 scFvのVH CDR3における3つの突然変異との組み合わせで、親和性が1230倍高まった（Schier R., McCall A., Adams G.P., Marshall K.W., Merrit H., Yin M., Crawford R.S. Weiner L.M., Marks C. and Marks J.D. 1996. Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2 single-chain Fv by molecular evolution of the complementary determining regions in the center of the antibody binding site. J. Mol. Biol., 263, 551-567）。
【００９６】
「ホットスポット」は、インビボで体細胞超変異が起こる配列である（Neuberger M.S and Milstein C. 1995. Somatic hypermutation. Curr. Opin. Immunol. 7, 248-254）。ホットスポット配列は、特定のコドンにおけるコンセンサスヌクレオチド配列と定義することができる。コンセンサス配列はテトラヌクレオチド、RGYWであり、ここでRはAまたはGのいずれかでありえ、YはCまたはTでありえ、かつWはAまたはTのいずれかでありうる（Neuberger M.S and Milstein C. 1995. Somatic hypermutation. Curr. Opin. Immunol. 7, 248-254）。加えて、ヌクレオチドAGYによってコードされるセリン残基は、可能なホットスポット配列に対応するTCNによってコードされるものよりも、可変ドメインのCDR領域において優勢に存在する（Wagner S.D., Milstein C. and Neuberger M.S. 1995. Codon bias targets mutation. Nature, 376, 732）。構造分析により、CDRループ、特にCDR3ループは、抗原結合に最も貢献していることが明らかにされている（Giudicelli V., Chaume D. and Lefranc M.P. 2004. IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res. 32, 435-440）。したがって、各抗体の重鎖および軽鎖のCDRのヌクレオチド配列を、ホットスポット配列およびAGYコドンの存在について走査する。同定した軽鎖および重鎖のCDR領域のホットスポットを、生殖細胞の重鎖および軽鎖の配列と、International ImMunoGen Ticsデータベース（IMGT, http://imgt.cines.fr/textes/vquest/）を用いて比較する（Davies D.R., Padlan E.A. and Sheriff S. 1990. Antibody-antigen complexes. Annu. Rev. Biochem. 59, 439-473）。生殖系列と同一の配列は、体細胞突然変異が起こっていないことを示唆し；したがって、無作為突然変異を導入して、インビボで起こる体細胞事象を模倣する。これに対して、異なる配列は、いくらかの体細胞突然変異がすでに起こっていることを示す。インビボでの体細胞突然変異が最適であったかどうかをいまだに調べられていない。CDR内の埋没または保存アミノ酸をコードするホットスポットは突然変異誘発されない。これらの残基は通常、全体の構造にとって重要であり、埋没しているため、抗原と相互作用することはありそうにない。加えて、配列を、体細胞突然変異が優勢に起こる生殖系列の配列において予測される位置と比較することができる（Tomlinson I.M., Cox J.P.L., Gherardi E., Lesk A.M. and Chotia C. 1995. The structural repertoire of the human Vldomain. EMBO J. 14, 4628-4638, Tomlinson I.M., Walter G., Jones P.T., Dear P.H., Sonnhammer E.L.L. and Winter G. 1996. The imprint of somatic hypermutation on the repertoire of human germline V genes. J.Mol.Biol. 256, 813-817）。同様の戦略がBL22 scFvの親和性成熟に適用された。重鎖のCDR3に導入された点突然変異は、様々なCD22陽性細胞株における結合活性の5から10倍の増大をもたらした（Salvatore G., Beers R., Margulies I., Kreitman R.J. and Pastan I. 2002. Improved cytotoxic activity toward cell lines and fresh leukemia cells of a mutant anti-CD22 immunotoxin obtained by antibody phage display. Clinical Cancer research, 8, 995-1002）。同様に、CDR1およびCDR2ループにおける様々なアミノ酸の突然変異も、3倍から7倍の範囲の高い親和性を有する突然変異体を生じた（Ho M., Kreitman J., Onda M. and Pastan I. 2005. In vitro antibody evolution targeting germline hot spots to increase activity of an anti-CD22 immunotoxin. J.Biol. Chem., 280, 607-617）。
【００９７】
突然変異を、無作為または標的指向プロセスのいずれかにより導入した後、抗体を発現させ、機能について評価する。例えば、機能スクリーニングを結合に基づいて行うことができる。いったん機能を評価すると、選択した抗体のDNA配列決定を公知の方法を用いて実施することができる。
【００９８】
別の態様において、本明細書において開示する結合タンパク質または免疫複合体の親和性成熟のために、Harvey, Bらによって記載された固定化ペリプラズム発現（APEx）法（PNAS 2004 June 22; 101(25): 9193-8）を用いる。
【００９９】
したがって、本出願は、前立腺幹細胞抗原(SEQ ID NO:17)、変異体HnRNPGもしくはSEQ ID NO:71のアミノ酸配列を有する変異体HnRNPG、またはSEQ ID NO:23、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111もしくはSEQ ID NO:112のアミノ酸配列を有するエピトープに対する結合タンパク質の親和性を増大させるために親和性成熟させた、本明細書において開示する結合タンパク質を含む。
【０１００】
本出願はまた、開示する結合タンパク質、好ましくは抗体および抗体断片を薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤と共に含む、組成物も提供する。
【０１０１】
さらに、本出願は、本明細書において開示する結合タンパク質をコードする単離された核酸配列を提供する。本出願は、これらの核酸配列に対する変異体も含む。例えば、変異体には、少なくとも中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書において開示する結合タンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズするか、または本明細書において開示する結合タンパク質をコードする核酸配列に対して少なくとも50％、60％、70％、80％、90％もしくは95％の配列同一性を有する核酸配列が含まれる。
【０１０２】
（C）癌関連抗原
本発明者らは、本明細書において開示する結合タンパク質が結合する抗原（すなわち、前立腺幹細胞抗原(SEQ ID NO:17)および変異体HnRNPG）を同定した。前立腺幹細胞抗原は、癌細胞の表面上に発現され、かつ正常細胞の表面上には有意に発現されない。変異体HnRNPGは癌細胞において発現される細胞内タンパク質である。したがって、本出願は、本明細書において開示する結合タンパク質の1つと特異的に結合することができる単離されたポリペプチド、ならびにその核酸配列および使用を含む。
【０１０３】
本出願は、新規癌関連抗原、すなわち、HnRNPGの癌関連変異体を含む。
【０１０４】
加えて、本発明者らは、本明細書において開示する結合タンパク質が結合するエピトープ（すなわち、SEQ ID NO: 23、41、111および112）を同定した。したがって、本出願は、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、SEQ ID NO:111のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、およびSEQ ID NO:112のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。別の態様は、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド、SEQ ID NO:111のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド、およびSEQ ID NO:112のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドを含む。
【０１０５】
当業者であれば、本出願が、化学的等価物を含むSEQ ID NO:23、41、111および112のアミノ酸配列に対する変異体を含むことを、理解すると考えられる。そのような等価物には、本明細書において開示する特定のタンパク質と実質的に同じ機能を実質的に同じ様式で行うタンパク質が含まれる。例えば、等価物には、保存的アミノ酸置換体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０６】
一つの態様において、本明細書において開示する単離されたポリペプチドの変異体アミノ酸配列は、SEQ ID NO:23、41、111または112に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、最も好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらに最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。
【０１０７】
本出願は、これらの単離されたポリペプチドの使用を含む。例えば、癌を治療もしくは予防するために用いることができるか、または被験者の癌を検出もしくはモニターするために用いることができる、結合タンパク質および免疫複合体を生成するため、および癌を治療または抑制するための医薬の製造における、ポリペプチドの使用。
【０１０８】
さらに、本出願は、本明細書において開示するポリペプチドをコードする単離された核酸配列を提供する。本出願は、これらの核酸配列に対する変異体も含む。例えば、変異体には、少なくとも中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書において開示するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸配列、または本明細書において開示するポリペプチドをコードする核酸配列に対して少なくとも50％、60％、70％、80％、90％もしくは95％の配列同一性を有する核酸配列が含まれる。
【０１０９】
（D）免疫複合体
本出願はまた、
（2）エフェクター分子
に付着した、
（1）本明細書において開示する結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体断片
を含む、免疫複合体を含む。一つの態様において、結合タンパク質は癌細胞上または癌細胞内の抗原または分子に結合する。一つの態様において、抗原または分子は前立腺幹細胞抗原または変異体HnRNPGを含む。別の態様において、抗原または分子はSEQ ID NO:23、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 111またはSEQ ID NO: 112のアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
好ましい態様において、エフェクター分子は、
（i）直接的もしくは間接的に検出可能なシグナルを生じうる標識、あるいは
（ii）細胞毒性、細胞分裂抑制性、またはそうではなく癌細胞の分裂および/もしくは転移する能力を防止もしくは低減する癌治療薬
である。
【０１１１】
一つの態様において、エフェクター分子は癌治療薬である。癌治療薬は、好ましくは、細胞毒性、細胞分裂抑制性、またはそうではなく癌細胞の分裂および/もしくは転移する能力を防止もしくは低減する毒素である。したがって、本出願の一つの局面は、
（2）細胞毒素などの癌治療薬
に付着した、
（1）本明細書において開示する結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体断片
を含む、免疫複合体である。
【０１１２】
別の態様において、免疫複合体は内部に取り込まれ、癌治療薬は細胞のタンパク質合成を阻止し、そこで細胞死を引き起こす細胞毒素である。重要なことに、ほとんどの正常細胞は癌細胞上に存在する抗原を広範囲には発現しないため、それらは免疫複合体に結合して、内部に取り込むことはできず、毒素または他の癌治療薬の殺傷効果から保護される。
【０１１３】
様々なエフェクター分子を用いてもよく、いくつかのそのようなエフェクター分子は細胞内で活性のある分子である。したがって、一つの態様において、免疫複合体は癌細胞によって内部に取り込まれる。
【０１１４】
好ましい態様において、エフェクター分子は、癌治療薬、より好ましくはゲロニン、ボウガニン、サポリン、リシン、リシンA鎖、ブリオジン（bryodin）、ジフテリア毒素、レストリクトシン（restrictocin）、シュードモナス（Pseudomonas）外毒素Aおよびその変異体を含むが、それらに限定されるわけではない、リボソーム不活化活性を有するポリペプチドを含む細胞毒素である。タンパク質がリボソーム不活化タンパク質である場合、免疫複合体は、タンパク質が細胞に対して細胞毒性であるために、癌細胞への結合後に内部に取り込まれなければならない。したがって、一つの態様において、エフェクター分子は細胞毒素であり、免疫複合体は癌細胞によって内部に取り込まれる。
【０１１５】
一つの態様において、毒素は、ボウガニンまたはシュードモナス外毒素A、およびその変異体である。別の態様において、毒素は、細胞結合ドメインを欠く改変ボウガニンまたは切断型のシュードモナス外毒素Aである。さらなる態様において、毒素は、T細胞エピトープを実質的に欠くボウガニンまたはアミノ酸252〜608からなる切断型のシュードモナス外毒素Aである。
【０１１６】
他の非限定的な態様において、癌治療薬は、DNAを破壊するように作用する薬剤を含む。したがって、癌治療薬は、エンジイン（例えば、カリケアミシンおよびエスペラミシン）および非エンジイン低分子薬剤（例えば、ブレオマイシン、メチジウムプロピル-EDTA-Fe(II)）から選択されてもよいが、それらに限定されるわけではない。他の癌治療薬には、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ジスタマイシンA、シスプラチン、マイトマイシンC、エクチナサイジン、デュオカルマイシン/CC-1065、およびブレオマイシン/ペプレオマイシンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１７】
他の非限定的な態様において、癌治療薬は、チューブリンを破壊するように作用する薬剤を含む。そのような薬剤には、リゾキシン/マイタンシン、パクリタキセル、ビンクリスチンおよびビンブラスチン、コルヒチン、オーリスタチンドラスタチン10MMAE、ならびにペロルシドAが含まれうるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１８】
他の非限定的な態様において、免疫複合体の癌治療薬部分には、アサレーNSC 167780、AZQ NSC 182986、BCNU NSC 409962、ブスルファンNSC 750、カルボキシフタラトプラチナムNSC 271674、CBDCA NSC 241240、CCNU NSC 79037、CHIP NSC 256927、クロラムブシルNSC 3088、クロロゾトシンNSC 178248、シス-プラチンNSC 119875、クロメゾンNSC 338947、シアノモルホリノドキソルビシンNSC 357704、シクロジソンNSC 348948、ジアンヒドロガラクチトールNSC 132313、フルオロドパンNSC 73754、ヘプスルファムNSC 329680、ヒカントンNSC 142982、メルファランNSC 8806、メチルCCNU NSC 95441、マイトマイシンC NSC 26980、マイトゾラミドNSC 353451、ナイトロジェンマスタードNSC 762、PCNU NSC 95466、ピペラジンNSC 344007、ピペラジンジオンNSC 135758、ピポブロマンNSC 25154、ポルフィロマイシンNSC 56410、スピロヒダントインマスタードNSC 172112、テロキシロンNSC 296934、テトラプラチンNSC 363812、チオテパNSC 6396、トリエチレンメラミンNSC 9706、ウラシルナイトロジェンマスタードNSC 34462、およびヨシ-864 NSC 102627を含むが、それらに限定されるわけではない、アルキル化剤が含まれうる。
【０１１９】
他の非限定的な態様において、免疫複合体の癌治療薬部分には、アロコルヒチンNSC 406042、ハリコンドリンB NSC 609395、コルヒチンNSC 757、コルヒチン誘導体NSC 33410、ドラスタチン10 NSC 376128（NG-オーリスタチン由来）、マイタンシンNSC 153858、リゾキシンNSC 332598、タキソールNSC 125973、タキソール誘導体NSC 608832、チオコルヒチンNSC 361792、トリチルシステインNSC 83265、硫酸ビンブラスチンNSC 49842、および硫酸ビンクリスチンNSC 67574を含むが、それらに限定されるわけではない、抗有糸分裂剤が含まれうる。
【０１２０】
他の非限定的な態様において、免疫複合体の癌治療薬部分には、カンプトテシンNSC 94600、カンプトテシン、ナトリウム塩NSC 100880、アミノカンプトテシンNSC 603071、カンプトテシン誘導体NSC 95382、カンプトテシン誘導体NSC 107124、カンプトテシン誘導体NSC 643833、カンプトテシン誘導体NSC 629971、カンプトテシン誘導体NSC 295500、カンプトテシン誘導体NSC 249910、カンプトテシン誘導体NSC 606985、カンプトテシン誘導体NSC 374028、カンプトテシン誘導体NSC 176323、カンプトテシン誘導体NSC 295501、カンプトテシン誘導体NSC 606172、カンプトテシン誘導体NSC 606173、カンプトテシン誘導体NSC 610458、カンプトテシン誘導体NSC 618939、カンプトテシン誘導体NSC 610457、カンプトテシン誘導体NSC 610459、カンプトテシン誘導体NSC 606499、カンプトテシン誘導体NSC 610456、カンプトテシン誘導体NSC 364830、カンプトテシン誘導体NSC 606497、およびモルホリノドキソルビシンNSC 354646を含むが、それらに限定されるわけではない、トポイソメラーゼI阻害剤が含まれうる。
【０１２１】
他の非限定的な態様において、免疫複合体の癌治療薬部分には、ドキソルビシンNSC 123127、アモナフィドNSC 308847、m-AMSA NSC 249992、アントラピラゾール誘導体NSC 355644、ピラゾロアクリジンNSC 366140、ビサントレンHCL NSC 337766、ダウノルビシンNSC 82151、デオキシドキソルビシンNSC 267469、ミトキサントロンNSC 301739、メノガリルNSC 269148、N,N-ジベンジルダウノマイシンNSC 268242、オキサントラゾールNSC 349174、ルビダゾンNSC 164011、VM-26 NSC 122819、およびVP-16 NSC 141540を含むが、それらに限定されるわけではない、トポイソメラーゼII阻害剤が含まれうる。
【０１２２】
他の非限定的な態様において、免疫複合体の癌治療薬部分には、L-アラノシンNSC 153353、5-アザシチジンNSC 102816、5-フルオロウラシルNSC 19893、アシビシンNSC 163501、アミノプテリン誘導体NSC 132483、アミノプテリン誘導体NSC 184692、アミノプテリン誘導体NSC 134033、アンチフォルNSC 633713、アンチフォルNSC 623017、ベーカーの可溶性アンチフォルNSC 139105、ジクロロアリルローソンNSC 126771、ブレキナールNSC 368390、フトラフール（プロドラッグ）NSC 148958、5,6-ジヒドロ-5-アザシチジンNSC 264880、メトトレキセートNSC 740、メトトレキセート誘導体NSC 174121、N-(ホスホノアセチル)-L-アスパルテート（PALA）NSC 224131、ピラゾフリンNSC 143095、トリメトレキセートNSC 352122、3-HP NSC 95678、2'-デオキシ-5-フルオロウリジンNSC 27640、5-HP NSC 107392、αTGDR NSC 71851、アフィディコリングリシネートNSC 303812、アラ-C NSC 63878、5-アザ-2'-デオキシシチジンNSC 127716、β-TGDR NSC 71261、シクロシチジンNSC 145668、グアナゾールNSC 1895、ヒドロキシ尿素NSC 32065、イノシングリコジアルデヒドNSC 118994、マクベシンII NSC 330500、ピラゾロイミダゾールNSC 51143、チオグアニンNSC 752、およびチオプリン NSC755を含むが、それらに限定されるわけではない、RNAまたはDNA代謝拮抗剤が含まれうる。
【０１２３】
別の非限定的な態様において、免疫複合体の治療薬部分は核酸であってもよい。使用されうる核酸には、アンチセンスRNA、遺伝子、または他のポリヌクレオチド、チオグアニンおよびチオプリンなどの核酸類縁体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１２４】
本出願はさらに、
（2）間接的または直接的に検出可能なシグナルを生じうる標識である、エフェクター分子
に付着した、
（i）本明細書において開示する結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体断片
を含む、免疫複合体を提供する。これらの免疫複合体は、癌のインビボ検出を含む、研究または診断適用のために使用することができる。標識は、好ましくは、直接的または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを生じることができる。例えば、標識は、3H、14C、32P、35S、123I、125I、131Iなどの、放射線不透過物もしくは放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリンなどの、蛍光化合物（蛍光体）もしくは化学発光化合物（発色団）；アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼもしくはセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素；造影剤；または金属イオンであってもよい。
【０１２５】
別の態様において、免疫複合体は間接的に検出可能である。例えば、免疫複合体を検出するために、免疫複合体に特異的で、かつ検出可能な標識を含む二次抗体を使用することができる。
【０１２６】
本明細書において開示する結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体断片は、結合タンパク質がエフェクター分子と会合するかまたはエフェクター分子に連結することができる任意の手段によって、エフェクター分子に「付着させて」もよい。例えば、結合タンパク質は、化学的手段または組換え手段によって、エフェクター分子に付着させてもよい。融合体または複合体を調製するための化学的手段は当技術分野において公知であり、かつ免疫複合体を調製するために用いることができる。結合タンパク質およびエフェクター分子を複合するために用いる方法は、結合タンパク質が癌細胞上または癌細胞内の抗原に結合する能力を妨げることなく、結合タンパク質をエフェクター分子に連結できなければならない。
【０１２７】
結合タンパク質をエフェクター分子に間接的に連結してもよい。例えば、結合タンパク質を、いくつかのタイプの1つのエフェクター分子を含むリポソームに直接的に連結してもよい。エフェクター分子および/または結合タンパク質を固体表面に結合してもよい。
【０１２８】
一つの態様において、結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体断片、およびエフェクター分子は両方ともタンパク質で、かつ当技術分野において周知の技術を用いて複合することができる。2つのタンパク質を複合することができる利用可能な数百の架橋剤がある。（例えば、「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」. 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor参照）。架橋剤は一般に、結合タンパク質、好ましくは抗体もしくは抗体断片、および/またはエフェクター分子上で利用可能な、またはその上に挿入された反応性官能基に基づいて選ばれる。加えて、反応基がない場合には、光活性化可能な架橋剤を使用することができる。特定の例において、結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体断片と、エフェクター分子との間にスペーサーを含むことが望ましいこともある。当技術分野において公知の架橋剤には、ホモ2官能性物質：グルタルアルデヒド、ジメチルアジピミデートおよびビス（ジアゾベンジジン）、ならびにヘテロ2官能性物質：m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ-m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドが含まれる。
【０１２９】
特定の場合において、結合タンパク質を、エフェクター分子の化学的付着のための特定の残基で操作してもよい。当技術分野において公知の分子の化学的付着のために用いる特定の残基には、リジンおよびシステインが含まれる。架橋剤は、結合タンパク質上に挿入され、エフェクター分子上で利用可能な反応性官能基に基づいて選ばれる。
【０１３０】
組換えDNA技術を用いて、結合タンパク質-エフェクター分子タンパク質融合体を調製してもよい。そのような場合、結合タンパク質をコードするDNA配列を、エフェクター分子をコードするDNA配列に融合し、結果としてキメラDNA分子を生じる。融合タンパク質を発現する宿主細胞内に、キメラDNA配列を形質移入する。当技術分野において公知の技術を用いて、融合タンパク質を細胞培養から回収し、精製することができる。
【０１３１】
標識であるエフェクター分子を結合タンパク質に付着させる例には、Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982); Wensel and Meares, Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983); およびColcher et al., 「Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice」, Meth. Enzymol., 121:802-16 (1986) に記載された方法が含まれる。
【０１３２】
一つの態様において、免疫複合体はSEQ ID NO:49によって規定されるアミノ酸配列を含む。別の態様において、免疫複合体はSEQ ID NO:51によって規定されるアミノ酸配列を含む。本出願は、これらの配列に対する変異体も含む。
【０１３３】
本出願は、本明細書において開示する免疫複合体をコードする単離された核酸配列も提供する。一つの態様において、単離された核酸配列はSEQ ID NO: 49のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。別の態様において、単離された核酸配列はSEQ ID NO:48を含む。さらなる態様において、単離された核酸配列はSEQ ID NO:51のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。別の態様において、単離された核酸配列はSEQ ID NO:50を含む。
【０１３４】
本出願は、これらの核酸配列に対する変異体も含む。例えば、変異体には、少なくとも中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書において開示する免疫複合体をコードする核酸配列にハイブリダイズするか、または本明細書において開示する免疫複合体をコードする核酸配列に対して少なくとも50％、60％、70％、80％、90％もしくは95％の配列同一性を有する核酸配列が含まれる。
【０１３５】
（E）タンパク質の調製
当業者であれば、軽鎖および重鎖相補性決定領域、軽鎖および重鎖可変領域、抗体および抗体断片、本明細書において開示する免疫複合体、癌関連抗原およびエピトープなどの、本明細書において開示するポリペプチドを、いくつかの方法のうちの任意の方法で調製してもよいが、組換え法を用いて調製することが最も好ましいと理解すると考えられる。
【０１３６】
したがって、本明細書において開示する核酸分子を、ポリペプチドの良好な発現を保証する適切な発現ベクターに公知の方法で組み入れてもよい。可能な発現ベクターには、ベクターが用いる宿主細胞と適合性であるかぎり、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。発現ベクターは「宿主細胞の形質転換に適切」であり、これは発現ベクターが、核酸分子と、核酸分子に機能的に連結される、発現用に使用される宿主細胞に基づいて選択された調節配列とを含むことを意味する。機能的に連結されるとは、核酸の発現を可能にする様式で、核酸を調節配列に連結することを意味するよう意図される。
【０１３７】
したがって、本出願は、本明細書において開示する核酸分子、またはその断片、ならびに挿入されたタンパク質配列の転写および翻訳のために必要な調節配列を含む、組換え発現ベクターを含む。
【０１３８】
適した調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫遺伝子を含む、様々な供給源に由来してもよい（例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) に記載された調節配列を参照されたい）。適切な調節配列の選択は、以下に議論するとおりに選ばれる宿主細胞に依存し、当業者であれば容易に達成しうる。そのような調節配列の例には：転写プロモーターおよびエンハンサーまたはRNAポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が含まれる。加えて、選ばれる宿主細胞および用いられるベクターに応じて、複製開始点、さらなるDNA制限部位、エンハンサー、および転写の誘導能を付与する配列などの、他の配列を発現ベクターに組み入れてもよい。
【０１３９】
組換え発現ベクターは、本明細書において開示する組換え分子で形質転換または形質移入された宿主細胞の選択を容易にする選択可能なマーカー遺伝子を含んでいてもよい。選択可能なマーカー遺伝子の例は、特定の薬物に対する耐性を与えるG418およびハイグロマイシンなどのタンパク質、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、または免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン、好ましくはIgGのFc部分などの、その部分をコードする遺伝子である。選択可能なマーカー遺伝子の転写を、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼなどの選択可能なマーカータンパク質の濃度の変化によってモニターする。選択可能なマーカー遺伝子がネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合、形質転換細胞をG418で選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生き残るが、他の細胞は死滅することになる。これによって、本明細書において開示する組換え発現ベクターの発現を可視化およびアッセイすること、特に発現および表現型に対する突然変異の効果を判定することが可能となる。選択可能なマーカーを関心対象の核酸とは別のベクター上に導入しうることが理解されると考えられる。
【０１４０】
組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現の増大；組換えタンパク質の溶解性の増大；および親和性精製でリガンドとして作用することによる標的組換えタンパク質の精製の補助を提供する融合部分をコードする遺伝子を含んでいてもよい。例えば、融合タンパク質の精製後に、組換えタンパク質の融合部分からの分離を可能にするために、タンパク質分解による切断部位を標的組換えタンパク質に付加してもよい。典型的な融合発現ベクターには、組換えタンパク質にグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAをそれぞれ融合するpGEX（Amrad Corp., Melbourne, Australia）、pMal（New England Biolabs, Beverly, MA）、およびpRIT5（Pharmacia, Piscataway, NJ）が含まれる。
【０１４１】
組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換された宿主細胞を生成することができる。「形質転換された」、「形質移入された」、「形質転換」、および「トランスフェクション」なる用語は、当技術分野において公知の多くの可能な技術の1つによる細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を含むことが意図される。本明細書において用いられる「形質転換された宿主細胞」なる用語は、本明細書において開示する組換え発現ベクターで形質転換された、糖鎖修飾が可能な細胞も含むことが意図される。原核細胞を、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウムを介した形質転換により、核酸で形質転換することができる。例えば、核酸を哺乳動物細胞に、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、DEAE-デキストランを介したトランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションなどの従来の技術を通じて導入することができる。宿主細胞を形質転換および形質移入するための適した方法は、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）、および他の実験用教科書において見いだすことができる。
【０１４２】
適した宿主細胞には、多様な真核宿主細胞および原核細胞が含まれる。例えば、本明細書において開示するポリペプチドを酵母細胞または哺乳動物細胞で発現させてもよい。他の適した宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)において見いだすことができる。加えて、本明細書において開示するポリペプチドを、大腸菌などの原核細胞で発現させてもよい（Zhang et al., Science 303(5656): 371-3 (2004)）。加えて、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）などのシュードモナスに基づく発現系を用いることができる（米国特許出願公開番号US2005/0186666、Schneider, Jane C et al.）。
【０１４３】
本明細書において開示する方法を実行するために適した酵母および真菌宿主細胞には、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア（Pichia）属またはクルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、および様々な種のコウジカビ（Aspergillus）属が含まれるが、それらに限定されるわけではない。出芽酵母における発現用ベクターの例には、pYepSec1（Baldari. et al., Embo J. 6:229-234 (1987)）、pMFa（Kurjan and Herskowitz, Cell 30:933-943 (1982)）、pJRY88（Schultz et al., Gene 54:113-123 (1987)）、およびpYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）が含まれる。酵母および真菌の形質転換のためのプロトコールは、当業者には周知である（Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929 (1978); Ito et al., J. Bacteriology 153:163 (1983)、およびCullen et al.(Nat BiolTech 5:369 (1987) 参照）。
【０１４４】
適した哺乳動物細胞には、とりわけ：COS（例えば、ATCC番号CRL 1650または1651）、BHK（例えば、ATCC番号CRL 6281）、CHO（ATCC番号CCL 61）、HeLa（例えば、ATCC番号CCL 2）、293（ATCC番号1573）およびNS-1細胞が含まれる。哺乳動物細胞での発現を導くために適した発現ベクターには一般に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス2型、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40などのウイルス材料由来）、ならびに他の転写および翻訳制御配列が含まれる。哺乳動物発現ベクターの例には、pCDM8（Seed, B., Nature 329:840 (1987)）およびpMT2PC（Kaufman et al., EMBO J. 6:187-195 (1987)）が含まれる。
【０１４５】
本明細書において提供される教示を考慮すれば、適切な型の発現ベクターを植物、鳥類、および昆虫細胞に導入するためのプロモーター、ターミネーター、および方法も容易に達成しうる。例えば、一つの態様の範囲内において、本明細書において開示するポリペプチドを植物細胞から発現させうる（アグロバクテリウム-リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）ベクターの使用を概説している、Sinkar et al., J. Biosci (Bangalore) 11:47-58 (1987) を参照されたい；とりわけ、PAPS2022、PAPS2023、およびPAPS2034を含む、植物細胞用の発現ベクターの使用を記載している、Zambryski et al., Genetic Engineering, Principles and Methods, Hollaender and Setlow (eds.), Vol. VI, pp. 253-278, Plenum Press, New York (1984) も参照されたい）。
【０１４６】
適した昆虫細胞には、ボンビックス（Bombyx）種、トリコプルシア（Trichoplusia）種またはスポドテラ（Spodotera）種由来の細胞および細胞株が含まれる。培養昆虫細胞（SF 9細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、pAcシリーズ（Smith et al., Mol. Cell Biol. 3:2156-2165 (1983)）およびpVLシリーズ（Lucklow, V.A., and Summers, M.D., Virology 170:31-39 (1989)）が含まれる。
【０１４７】
または、本明細書において開示するポリペプチドを、ラット、ウサギ、ヒツジおよびブタなどの非ヒトトランスジェニック動物で発現させてもよい（Hammer et al. Nature 315:680-683 (1985); Palmiter et al. Science 222:809-814 (1983); Brinster et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 (1985); Palmiter and Brinster Cell 41:343-345 (1985) および米国特許第4,736,866号）。
【０１４８】
本明細書において開示するポリペプチドを、固相合成（Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154 (1964); Frische et al., J. Pept. Sci. 2(4): 212-22 (1996)）または均一溶液中での合成（Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 I and II, Thieme, Stuttgart (1987)）などのタンパク質の化学において周知の技術を用いた化学合成によって調製してもよい。
【０１４９】
タンパク質などの他の分子と複合した本明細書において開示するポリペプチドを含むN末端またはC末端融合タンパク質を、組換え技術を通じて融合することにより調製してもよい。結果として生じる融合タンパク質は、本明細書に記載の選択されたタンパク質またはマーカータンパク質に融合した本明細書において開示するポリペプチドを含む。本明細書において開示する組換えポリペプチドを、公知の技術によって他のタンパク質と複合してもよい。例えば、国際公開公報第90/10457号に記載のヘテロ2官能性チオール含有リンカーである、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ-プロプリオネート)またはN-スクシンイミジル-5チオアセテートを用いて、タンパク質をカップリングさせてもよい。融合タンパク質または複合体を調製するために使用しうるタンパク質の例には、免疫グロブリン、ホルモン、成長因子、レクチン、インスリン、低密度リポタンパク質、グルカゴン、エンドルフィン、トランスフェリン、ボンベシン、アシアロ糖タンパク質 グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ヘマグルチニン（HA）、および切断されたmycなどの細胞結合タンパク質が含まれる。
【０１５０】
したがって、本出願は、軽鎖および重鎖相補性決定領域、軽鎖および重鎖可変領域、抗体および抗体断片などの結合タンパク質、本明細書において開示する免疫複合体、抗原およびエピトープなどの、本明細書において開示するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを提供する。さらに、本出願は、本明細書において開示する核酸配列または組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１５１】
（F）結合タンパク質および免疫毒素の治療法および薬学的組成物
本発明者らは、本明細書において開示する結合タンパク質が癌細胞に対して特異性を示すことを明らかにした。加えて、本発明者らは、本明細書において開示する結合タンパク質が癌細胞によって内部に取り込まれることを明らかにした。したがって、本明細書において開示する結合タンパク質を、造影剤、放射性薬剤または細胞毒性薬剤などの、生物活性のあるまたは医学的に関連する薬剤の標的指向送達のために用いることができる。
【０１５２】
一つの態様は、癌を治療または予防する方法であって、癌を有するまたは癌を有することが疑われる被験者に本明細書において開示する免疫複合体の有効量を投与する段階を含む方法である。別の態様は、癌を治療または予防するための医薬の製造のための、本明細書において開示する免疫複合体の有効量の使用である。さらに、本出願は、本明細書において開示する免疫複合体の有効量の使用であって、同時、別々または連続的に癌を治療または予防するための医薬の製造のための追加の癌治療薬の使用をさらに含む使用を提供する。本出願は、癌を治療または予防するための、本明細書において開示する免疫複合体の有効量の使用も提供する。さらに、本出願は、本明細書において開示する免疫複合体の有効量の使用であって、同時、別々または連続的に癌を治療または予防するための追加の癌治療薬の使用をさらに含む使用を提供する。
【０１５３】
一つの態様において、癌には、胃癌、大腸癌、前立腺癌ならびに子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、消化器癌、乳癌（癌腫、腺管癌、小葉癌、および乳頭癌など）、肺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、および慢性骨髄性白血病など）、脳癌、神経芽細胞腫、肉腫、直腸癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮内膜癌、形質細胞腫、リンパ腫、および黒色腫が含まれるが、それらに限定されるわけではない。別の態様において、癌は上皮癌である。さらなる態様において、癌は、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、皮膚癌（黒色腫を含む）、卵巣癌、膵臓癌、および頭頸部癌または乳癌である。さらなる態様において、癌は肺癌、肝臓癌、皮膚癌（黒色腫を含む）または前立腺癌である。
【０１５４】
本明細書において開示する免疫複合体が癌を有する細胞を選択的に阻害または破壊する能力を、癌細胞株を用いてインビトロで容易に試験してもよい。本明細書において開示する免疫複合体の選択的阻害効果を、例えば、癌細胞の細胞増殖の選択的阻害を示すことによって判定してもよい。
【０１５５】
細胞の生存度に基づいて毒性を測定してもよく、例えば、免疫複合体に曝露した癌および正常細胞培養物の生存度を比較してもよい。細胞の生存度を、トリパンブルー排除アッセイ法などの公知の技術によって評価してもよい。
【０１５６】
別の例において、本明細書において開示する免疫複合体の有効性を試験するために、いくつかのモデルを使用してもよい。Thompson, E. Wら（Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370 (1994)）は、腫瘍細胞を介する細胞外マトリックスのタンパク質分解および再構成基底膜（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルまたはゼラチン）の腫瘍細胞侵襲を測定することによる、インビトロでのヒト乳癌細胞の侵襲性を判定するためのモデルを記載している。他の適用可能な癌細胞モデルには、培養卵巣腺癌細胞（Young, T.N. et al. Gynecol. Oncol. 62:89-99 (1996); Moore, D.H. et al. Gynecol. Oncol. 65:78-82 (1997)）、ヒト濾胞性甲状腺癌細胞（Demeure, M.J. et al., World J. Surg. 16:770-776 (1992)）、ヒト黒色腫（A-2058）およびヒト線維肉腫（HT-1080）細胞株（Mackay, A.R. et al. Lab. Invest. 70:781 783 (1994)）、ならびに肺扁平上皮（HS-24）細胞株および腺癌（SB-3）細胞株（Spiess, E. et al. J. Histochem. Cytochem. 42:917-929 (1994)）が含まれる。無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍の移植ならびに腫瘍成長および転移の測定を含むインビボ試験系も記載されている（Thompson, E.W. et al., Breast Cancer Res. Treatment 31:357-370 (1994); Shi, Y.E. et al., Cancer Res. 53:1409-1415 (1993)）。
【０１５７】
免疫複合体を、インビボでの投与に適した生物学的に適合性の形態で、被験者への投与用の薬学的組成物に製剤してもよい。物質を、ヒト、および動物を含む生物に投与してもよい。薬学的組成物の治療的活性量の投与は、所望の結果を達成するのに必要な用量および期間で有効な量と定義される。例えば、物質の治療的活性量は、個人の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに組換えタンパク質が個人において所望の反応を引き出す能力などの因子に応じて変動してもよい。最適な治療反応を提供するために、投薬法を調節してもよい。例えば、数回に分けた用量を毎日投与してもよく、または治療状況の緊急性が示すとおりに、用量を比例的に減少させてもよい。
【０１５８】
したがって、本出願は、癌を治療または予防するための薬学的組成物であって、本明細書において開示する免疫複合体、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物を提供する。好ましい態様において、薬学的組成物中の免疫複合体のエフェクター分子は、癌治療薬、より好ましくは毒素である。
【０１５９】
免疫複合体を含む薬学的調製物を全身投与してもよい。薬学的調製物を癌部位に直接投与してもよい。投与経路に応じて、免疫複合体を、化合物を不活化しうる酵素、酸および他の自然条件の作用から化合物を保護するための材料でコーティングしてもよい。
【０１６０】
本出願の一つの局面に従って、免疫複合体を直接投与により患者に送達する。本出願は、薬学的組成物が少なくとも終点に達するのに十分な量で投与されることを企図し、必要に応じて、薬学的に許容される担体を含む。
【０１６１】
本出願は、手術後の合併症のリスクを低下させる方法であって、癌を治療するための手術前、手術中、または手術後に、免疫複合体の有効量を投与する段階を含む方法も提供する。
【０１６２】
本明細書に記載の組成物を、活性物質の有効量が薬学的に許容される媒体と混合物中で組み合わされるように、被験者に投与しうる薬学的に許容される組成物を調製するためのそれ自体公知の方法によって調製することができる。適した媒体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 2000）に記載されている。これに基づいて、組成物には、1つまたは複数の薬学的に許容される媒体または希釈剤と共に、適したpHおよび生理液と等浸透圧の緩衝溶液に含まれる、物質の溶液が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６３】
薬学的組成物には、凍結乾燥粉末、または水性もしくは非水性の滅菌注射溶液もしくは懸濁液が含まれるが、それらに限定されるわけではなく、これらは組成物を意図する受容者の組織または血液と実質的に適合性にする、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および溶質をさらに含んでいてもよい。そのような組成物中に存在しうる他の成分には、例えば、水、界面活性剤（トゥイーンなど）、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が含まれる。即時調合用の注射溶液および懸濁液を、滅菌粉末、顆粒、錠剤、または濃縮溶液もしくは懸濁液から調製してもよい。例えば、免疫複合体を患者への投与の前に滅菌水または食塩水で再構成する凍結乾燥粉末として供給してもよいが、それらに限定されるわけではない。
【０１６４】
薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。適した薬学的に許容される担体には、薬学的組成物の生物学的活性の有効性を妨げない、基本的に化学的不活性かつ非毒性の組成物が含まれる。適した薬学的担体の例には、水、食塩水、グリセロール溶液、エタノール、塩化N-(1(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)N,N,N-トリメチルアンモニウム（DOTMA）、ジオレシルホスファチジル-エタノールアミン（DOPE）、およびリポソームが含まれるが、それらに限定されるわけではない。そのような組成物は、患者への直接投与のための形態を提供するための適した量の担体と共に、治療的有効量の化合物を含むべきである。
【０１６５】
前記組成物は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの遊離アミノ基と形成される塩、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものなどの遊離カルボキシル基と形成される塩を含むが、それらに限定されるわけではない、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。
【０１６６】
様々な態様において、薬学的組成物を全身に直接投与するか、または腫瘍の領域に直接投与する。
【０１６７】
薬学的組成物を、癌を有する、哺乳動物、好ましくはヒトを含む動物を治療するための方法において用いてもよい。投与する免疫複合体の用量および型は、ヒト被験者で容易にモニターしうる様々な因子に依存すると考えられる。そのような因子には、癌の病因および重症度（悪性度および病期）が含まれる。
【０１６８】
本明細書において開示する免疫複合体を用いた癌治療の臨床結果は、医師などの、関連技術分野の当業者によって容易に認識される。例えば、癌の臨床マーカーを測定するための標準的な医学的検査は、治療の有効性の強力な指標でありうる。そのような検査には、身体検査、性能尺度、疾患マーカー、12誘導ECG、腫瘍測定、組織生検、細胞検査、細胞学、腫瘍計算の最長直径、放射線撮影法、腫瘍のデジタル画像、生命徴候、体重、有害事象の記録、感染エピソードの評価、併用薬の評価、痛みの評価、血液または血清化学、尿検査、CTスキャン、および薬物動態解析が含まれるが、それらに限定されるわけではない。さらに、免疫複合体および別の癌治療薬剤を含む併用療法の相乗効果を、単独療法を受けている患者との比較試験によって、判定してもよい。
【０１６９】
大多数の承認された癌療法において、癌療法は他の癌療法と組み合わせて用いられる。したがって、本出願は、本明細書において開示する免疫複合体を、少なくとも1つの追加の癌療法と組み合わせて用いる、癌を予防または治療する方法を提供する。他の癌療法は、免疫複合体の投与の前、重複して、同時に、および/または後に施してもよい。同時に投与する場合、免疫複合体および他の癌治療薬を、単一製剤で投与してもよく、または別々の製剤で投与してもよく、別々の場合には、任意に異なる投与様式で投与してもよい。1つまたは複数の免疫複合体および1つまたは複数の他の癌療法の組み合わせは、腫瘍または癌と闘うのに相乗的に作用する可能性がある。他の癌療法には、以下を含むがそれらに限定されるわけではない他の癌治療薬が含まれるが、それらに限定されるわけではない：2,2,2トリクロロトリエチルアミン、3-HP、5,6-ジヒドロ-5-5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-アザシチジン、5-フルオロウラシル、5-HP、5-プロパゲルマニウム、6-アザウリジン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、アブリン、アセグラロン、アシビシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アクチノマイシンD、アルデスロイキン、アロコルヒチン、アルタミン、αフェトプロテイン、αTGDR、アルトレタミン、アミノカンプトテシン、アミノグルテチミド、アミノプテリン誘導体、アモナフィド、アムサクリン、アンアンチフォル、アナストロゾール、アンシタビン、アンジオジェニンアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンジオスタチン、アントラマイシン、アントラピラゾール誘導体、抗トロンビン、アフィディコリングリシネート、ara-C、アスパラギナーゼ、アウリスタチン、自己細胞もしくは組織、アバスチン、アザシチジン、アザセリン、アジリジン、AZQ、バチルス、ベーカーの可溶性アンチフォル、バチマスタット、BCG生ワクチン、bcl-2 アンチセンスオリゴヌクレオチド、BCNU、ベンゾデパ、ベタメタゾン、β-TGDR、ビアオマイシン、ビカルタミド、ビサントレン、ブレオマイシン、ブレキナール、ブセレリン、ブスルファン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルステロン、カンパス-1、カンプトテシン、カンプトテシンNa塩、カペシタビン、カルボプライン、カルボプラチン、カルボコン、カルボキシフタラトプラチナム、癌胎児抗原、カルモフール、カルムスチン、カンプトテシン誘導体、カルビシン、カルジノフィリン、CBDCA、CCNU、CHIP、クロラブシン、クロラムブシル、酢酸クロルマジノン、クロルナファジン、クロロゾトシン、クロモマイイシン、シスプラチン、シスプラチナム、クラドリビン、クロメゾン、コルヒチン、コルヒチン誘導体、コラーゲン14-アミノ酸ペプチド、コルチゾル、コルチゾン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクララビン、シクロシチジン、シクロジソン、シクロホスファミド、シクロトスファミド、シタラビン、サイトカラシンB、シトシンアラビノシド、ダカルバジン、ダクリノマイシン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デホスファミド、デヒドロテストステロン、デメコルシン、デノプテリン、デオキシドキソルビシン、デキサメタゾン、ジアンヒドロガラクチトール、ジアジクオン、デトルビシン、ジアジ���ン、ジクロルアリルローソン、ジフテリア毒素、ジスタマイシンA、ドセタキセル、ドラスタチン10、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロモスタノロン、デュオカルミシン/CC-1065、エクチナサイジン、エダトレキセート、エフロミシン、酢酸エリプチニウム、エメチン、エミテフール、エンドスタチン、エノシタブン、エピポドフィロトキシン、エピルビシン、エピチオスタノール、エルビタックス、エリオチニブ、エスペラミシン、エストラムスチン、エストロゲン、臭化エチジウム、エトグルシド、エトポシド、ファドロゾール、フェンレチニド、フィブロネクチン29kDa N末端タンパク質分解性断片、フィブロネクチン40kDa C末端N末端タンパク質分解性断片、フロラフブル（florafbr）（プロドラッグ）、フロキシウリドヘ（floxuridhe）、フロキシウリジン、フルダラビン、フルオロドパン、フルタミド、フォリン酸、フォルメスタン、ホスフェストール、フォテムスチン、硝酸ガリウム、ゲフィチニム、ゲムシタビン、ゲムシチビン、ゲムツズマブ、グルココルチコイド、ゴセレリン、グラミシジンD、顆粒球単球コロニー刺激因子、グアナゾールNCS 1895、グエリン、ハリコンドリンB、ヘプスルファム、ヘキサメチルメラミン、ヘキセストロール、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、ヒカントン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インプロスルファン、イノシングリコジアルデヒド、インターフェロン、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、インターロイキン-12、インターロイキン-15、インターロイキン-18、インターロイキン-1、インターロイキン-2、インターロイキン-2、インターロイキン-6、インターロイキン、イリノテカン、イウビダゾン（iubidazone）、クリングル5、L-アラノシン、ラパチニブ、L-アスパラギナーゼ、酢酸ラウプロリド、レンチナン、レトロゾール、ロイプロリド、酢酸ロイプロリド（ルプロン）、レバミゾール、リドカイン、リポソームジヒドロキシアントラシンジオン、ロムスリン、ロムスチン、ロニダミン、リンフォカイン、リンフォトキシン、リソドレン、マクベシン、マクロファージ炎症性タンパク質、m-AMSA、マンノムスチン、マイタンシン、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストール、メラニン細胞系統タンパク質、メレンゲストール、メルファラン、メノガリル、メピチオスタン、メルカプトプリン、メスナ、メチジウムプロピル-EDTA-Fe(I1))、メトトレキセート、メトトレキセート誘導体、メツレデパ、ミボプラチン、ミルテフォシン、鉱質コルチコイド、ミトラマイシン、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシンC、ミトタン、ミトキサントロン、ミトゾラミド、モピダモール、モルホリノドキソルビシン、突然変異腫瘍特異抗原、ミコフェノール酸、N-(ホスホノアセチル)-L-アスパルテート（PALA）、N,N-ジベンジルダウノマイシン、神経成長因子、ニロチニブ、ニルタミド、ニムスチン、ニトラシン、ナイトロジェンマスタード、ノガラマイシン、非自己細胞もしくは組織、ノブエンビキン、オリボマイシン、オンタク、オニキス-015、オキサリプラチン、オキサントラゾール、パクリタキセル、PCNU、ペガスペルガーゼ、ペロムシドA、ペントスラチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、フェナメット、フェネステリン、ピカマイシン、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ピポスルファン、ピラルビシン、ピリトレキシム、血小板由来成長因子、血小板因子-4 7.8kDaタンパク質分解性断片、血小板因子-4 13アミノ酸ペプチド、プリカマイシン、ポドフィリン酸2-エチル-ヒドラジド、ポドフィロトキシン、リン酸ポリエストラジオール、ポルフィマー、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プレドニゾン、プロカバジン、プロカイン、プロゲスチン、プロラクチン16kDaタンパク質分解性断片、プロプラノロール、シュードモナス外毒素、PSK、プテロプテリン、ピューロマイシン、ピラゾフリン、ピラゾロアクリジン、ピラゾロイミダゾール、ラニムスチン、ラゾキサン、レチノイド、リゾキシン、リゾキシンマイタンシン（rhizoxinlmaytansine）、リシンA、リツキサン、リツキシマブ、リウキシルマブ（riuxlmab）、ロキニメクス、セルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）、シゾフィカン、ソブゾキサン、ソラフェニブ、SPARC、20-アミノ酸ペプチド、スピロゲルマニウム、スピロヒダントインマスタード、ストラプロゾシン（straplozocin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スニチニブ、タモキシフェン、タキソール、タキソール誘導体、テガフール、テモゾアミド（temozoamide）、テニポシド、テヌアゾン酸、テロキシロン、テストラクトン、テトラカイン、テトラプラチン、サリドマイド、チアミプリン、チオコルヒチン、チオエパ（thioepa）、チオプリン、チオテパ、トロンボスポンジンI 19アミノ酸ペプチド、組織プラスミノゲン活性化因子、トムデックス、トポテカン、トレミフェン、トラスツズツマバン（trastuzutmaban）、トレチノイン、トリアジクオン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、トリロスタン、トリメトレキセート、トリプトレリン、トリチルシステイン、トロホスファミド、トロンテカン（trontecan）、ツベルシジン、腫瘍壊死因子様サイトカイン、腫瘍壊死因子、ウベニメクス、ウラシルマスタード、ウラシルナイトロジェンマスタード、ウレデパ、ウレタン、バンデタニブ（ZD6474）、VEGFアンチセンスオリゴヌクレオチド、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、VM-26、VP-16、yoshi-864、ジノスタチンおよび/またはゾルビシン。
【０１７０】
別の態様において、本明細書において開示する1つまたは複数の免疫複合体は、放射線照射、手術、遺伝子療法、副作用を制御するための薬剤（例えば、抗ヒスタミン剤、制吐剤）、癌ワクチン、血管形成の阻害剤、免疫調節物質、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗原の発現を増大させる薬剤、癌療法に関連する他の薬剤、化学療法剤、免疫療法剤、光増感剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、代謝拮抗剤、DNAを破壊するよう作用する薬剤、チューブリンを破壊するよう作用する薬剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼI阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、サイトカイン、成長因子、ホルモン療法、ビンカアルカロイド、植物アルカロイド、および/または有糸分裂阻害剤を含むが、それらに限定されるわけではない、癌療法または治療薬の範疇の1つまたは複数と組み合わせて投与することができる。
【０１７１】
事実、そのような治療を必要とする患者への免疫複合体の有効量の投与により、臨床的に顕著な効果を有する別の癌治療薬の用量の減量につながることもある。減量した用量の他の癌治療薬のそのような有効性は、免疫複合体の投与がない場合には観察されない可能性がある。したがって、本出願は、腫瘍または癌を治療するための方法であって、減量した用量の1つまたは複数の他の癌治療薬を投与する段階を含む方法を提供する。
【０１７２】
さらに、そのような治療を必要とする患者に対する免疫複合体を含む併用療法は、標準的治療法のサイクルの継続時間または回数と比べて、相対的に短い治療時間を可能にする場合がある。したがって、本出願は、腫瘍または癌を治療するための方法であって、相対的に短い継続時間および/またはより少ない治療サイクルで、1つまたは複数の他の癌治療薬を投与する段階を含む方法を提供する。
【０１７３】
したがって、本出願に従い、免疫複合体および別の癌治療薬を含む併用療法は、全般的な癌治療の毒性（すなわち、副作用）を低下させうる。例えば、単独療法または別の併用療法と比較した場合、減量した用量の免疫複合体および/もしくは他の癌治療薬を送達する時、ならびに/またはサイクルの継続時間（すなわち、単回投与の期間または一連のそのような投与の期間）を短縮する時、ならびに/またはサイクルの回数を減少させる時に、毒性の低下が観察されうる。
【０１７４】
したがって、本出願は、任意に薬学的に許容される担体中の、免疫複合体および1つまたは複数の追加の抗癌治療薬を含む薬学的組成物を提供する。
【０１７５】
本出願は、任意に1つまたは複数の他の癌治療薬と組み合わせた、免疫複合体の有効量を、癌を治療するためのその使用に関する説明書と共に含むキットも提供する。キットは補助的物質を含むこともできる。例えば、キットは、シリンジなどの免疫複合体を被験者に注入するための器具；免疫複合体を保存もしくは輸送するための容器；および/または薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤もしくは安定剤を含むことができる。
【０１７６】
前述のとおり、免疫複合体との併用療法は、追加の癌治療薬の投与に対して癌または腫瘍を敏感しうる。したがって、本出願は、癌を予防、治療、および/または癌の再発を予防するための併用療法であって、減量した用量の癌治療薬の前、後、または同時に、免疫複合体の有効量を投与する段階を含む療法を企図している。例えば、免疫複合体による初回治療は、1用量の癌治療薬によるその後の攻撃に対して癌または腫瘍の感受性を増大させうる。この用量は、癌治療薬を単独で、もしくは免疫複合体なしで投与する場合の標準的用量の下限に近いか、またはそれよりも少ない。同時に投与する場合、免疫複合体を癌治療薬と別々に投与してもよく、任意に異なる投与様式によって投与してもよい。
【０１７７】
代わりの態様において、追加の癌治療薬の投与は、免疫複合体または結合タンパク質に対して癌または腫瘍を敏感しうる。そのような態様において、追加の癌治療薬を、免疫複合体または結合タンパク質の投与の前に与えてもよい。
【０１７８】
したがって、併用療法は、投与された免疫複合体および/または追加の癌治療薬に対する癌または腫瘍の感受性を高めうる。この様式で、より短い治療サイクルが可能となり、それによって毒性事象が軽減されうる。サイクルの継続時間は、使用中の特定の癌治療薬に応じて変動しうる。本出願は、持続的もしくは非持続的な投与、または数回の部分投与に分けた毎日の用量を企図している。特定の癌治療薬のための適切なサイクル継続時間は、当業者であれば理解されると考えられ、本出願は、各々の癌治療薬のための最適な治療スケジュールの継続評価を企図している。当業者のための具体的な指針は当技術分野において公知である。例えば、Therasse et al., 2000, 「New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada」, J Natl Cancer Inst. Feb 2;92(3):205-16を参照されたい。
【０１７９】
免疫複合体は、注射、経口投与、吸入、経皮または腫瘍内などの任意の適した方法によって投与してもよく、その一方、任意の他の癌治療薬は、同じまたは別の投与様式で患者に送達してもよいことが企図される。加えて、複数の癌治療薬を患者に送達することが意図される場合、免疫複合体および1つまたは複数の他の癌治療薬を1つの方法で送達してもよく、その一方、他の癌治療薬を別の投与様式で送達してもよい。
【０１８０】
（G）結合タンパク質および免疫毒素を用いた診断法および薬剤
開示する結合タンパク質は、癌細胞上もしくは癌細胞内または癌細胞によって内部に取り込まれた分子に選択的に結合し、正常細胞には有意に結合しない。したがって、結合タンパク質を癌の診断において使用することができる。前述のとおり、本発明者らは、本発明の結合タンパク質が癌細胞に結合することを示した。
【０１８１】
したがって、本出願は、癌細胞が存在するか否かを判定するために、それら自体で、または治療法の前、間、もしくは後に使用することができる診断法、診断薬、および診断キットを含む。
【０１８２】
一つの態様において、本出願は、被験者において癌を検出またはモニターする方法であって、以下の段階を含む方法を提供する。
（1）該被験者からの試験試料を、本明細書において開示し、癌細胞上または癌細胞内の抗原に特異的に結合する、結合タンパク質または免疫複合体と接触させて、結合タンパク質-抗原複合体を生成する段階；
（2）該試験試料中の結合タンパク質-抗原複合体の量を測定する段階；および
（3）該試験試料中の結合タンパク質-抗原複合体の量を対照と比較する段階。
【０１８３】
一つの態様において、抗原は前立腺幹細胞抗原である。別の態様において、前立腺幹細胞抗原は細胞表面上に局在する。別の態様において、抗原は変異体HnRNPGである。さらなる態様において、変異体HnRNPGは細胞内の細胞膜に局在する。別の態様において、細胞は前立腺幹細胞抗原および変異体HnRNPGの療法を発現する。別の態様において、抗原はエピトープSEQ ID NO: 23、41、111または112を含む。
【０１８４】
本出願はさらに、本明細書において開示する結合タンパク質または免疫複合体の任意の1つ、および癌を診断するためのその使用に関する説明書を含む、癌を診断するためのキットを含む。キットは補助的物質を含むこともできる。例えば、キットは、本明細書において開示する結合タンパク質もしくは免疫複合体を直接的もしくは間接的に検出するための物質などの追加の試薬；結合タンパク質もしくは免疫複合体を保存もしくは輸送するための容器；陽性および/もしくは陰性対照または参照標準；ならびに/あるいは他の緩衝剤もしくは安定剤を含むことができる。
【０１８５】
診断適用における使用のために、結合タンパク質、好ましくは抗体または抗体断片を、3H、14C、32P、35S、123I、125I、131Iなどの放射線不透過物もしくは放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリンなどの、蛍光化合物（蛍光体）もしくは化学発光化合物（発色団）；アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼもしくはセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素；造影剤；または金属イオンなどの検出可能なマーカーで標識してもよい。前述のとおり、抗体または抗体断片などの結合タンパク質に標識を付着させる方法は、当技術分野において公知である。
【０１８６】
本出願の別の局面は、被験者において癌を検出またはモニターする方法であって、以下の段階を含む方法である。
（1）該被験者から採取した試験試料中の本明細書において開示する抗体の量を測定する段階；および
（2）該試験試料中の本明細書において開示する抗体の量を対照と比較する段階。
【０１８７】
一つの態様において、試験試料中の抗体の量を、例えばELISAで測定することによって、抗体の量を測定する。別の態様において、試験試料中の本明細書において開示する抗体をコードする核酸の発現レベルを、例えばRT-PCRで測定することによって、抗体の量を測定する。
【０１８８】
（H）新規癌関連エピトープの薬学的組成物、方法、および使用
本出願は、癌細胞上または癌細胞内で発現し、かつ正常細胞上または正常細胞内では有意に発現しない、新規癌関連エピトープまたは抗原を提供する。したがって、インビボでの免疫応答を誘発するためのエピトープまたは抗原の使用を含む、癌を治療または予防するための療法において、エピトープまたは抗原を使用することができる。加えて、本出願は、癌を検出またはモニターするため抗原またはエピトープの使用を含む。
【０１８９】
（i）薬学的組成物
一つの態様は、適した希釈剤または担体との混合物中の本明細書において開示するエピトープまたは抗原の有効量を含む薬学的組成物である。別の態様は、適した希釈剤または担体との混合物中の本明細書において開示するエピトープまたは抗原をコードする単離された核酸の有効量を含む薬学的組成物である。本出願のさらなる局面は、適した希釈剤または担体との混合物中の本明細書において開示するエピトープまたは抗原をコードする核酸配列を含む組換え発現の有効量を含む薬学的組成物である。
【０１９０】
例えば、薬学的組成物を、癌を治療または予防するために用いることができる。加えて、薬学的組成物を、本明細書において開示するエピトープまたは抗原を発現する癌細胞に対する被験者の免疫応答を誘発するために用いることができる。
【０１９１】
上で議論したとおり、薬学的組成物を調製し、投与することができる。上で議論したとおり、薬学的組成物を他の抗癌治療薬と組み合わせて用いることができる。
【０１９２】
免疫剤（すなわち、本明細書において開示するエピトープもしくは抗原またはその変異体、および/あるいはそれをコードする核酸配列、および/あるいは組換え発現ベクター）および/または組成物を、投与の形式を問わず、アジュバントと共免疫する場合、免疫原性を顕著に改善することができる。一般に、アジュバントは、リン酸緩衝化食塩水中の0.05から1.0パーセント溶液として使用される。アジュバントは、免疫原の免疫原性を高めるが、必ずしもそれ自体で免疫原性があるわけではない。アジュバントは、投与部位の近くに局所的に免疫原を保持し、免疫系の細胞への緩徐で持続的な免疫原の放出を容易にするデポー効果を生じることによって作用しうる。アジュバントは、免疫系の細胞を免疫原デポーに引き付け、免疫応答を誘発するようにそのような細胞を刺激することができる。したがって、態様はアジュバントをさらに含む薬学的組成物を包含する。
【０１９３】
アジュバントは、例えば、ワクチンに対する宿主の免疫応答を改善するために、長年にわたって使用されてきた。内因性アジュバント（リポ多糖など）は通常、ワクチンとして使用される死滅または弱毒化細菌の成分である。外因性アジュバントは、典型的には非共有結合によって抗原に連結され、宿主の免疫応答を増強するために製剤された免疫調節物質である。したがって、非経口で送達される抗原に対する免疫応答を増強するアジュバントが同定されている。しかし、これらのアジュバントのいくつかは毒性で、望ましくない副作用を引き起こす可能性があり、それらをヒトおよび多くの動物での使用に不適当にしている。事実、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（一般にミョウバンと総称される）のみが、ヒトおよび獣医学的ワクチンにおけるアジュバントとして日常的に使用されている。ジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答を増大させる際のミョウバンの効果は、十分に確立されている。それにもかかわらず、それは限界を有する。例えば、ミョウバンは、インフルエンザのワクチン接種には効果がなく、他の免疫原による細胞性免疫応答を誘発するが、一貫性がない。ミョウバンをアジュバントにした抗原によって誘発される抗体は、マウスでは主にIgG1アイソタイプであり、これはいくつかのワクチン剤による保護に最適でない可能性がある。
【０１９４】
多様な外因性アジュバントが、免疫原に対する強力な免疫応答を惹起することができる。これらには、膜タンパク質抗原に対して複合体を形成したサポニン（免疫刺激複合体）、鉱油とのプルロニックポリマー、死滅マイコバクテリアおよび鉱油、フロイントの完全アジュバント、ムラミルジペプチド（MDP）およびリポ多糖（LPS）、ならびにリピドAなどの細菌産物、およびリポソームが含まれる。
【０１９５】
本出願の一つの局面において、本明細書に記載の本発明の態様のいずれかにおいて有用なアジュバントは、以下の通りである。非経口免疫化用のアジュバントには、アルミニウム化合物（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびヒドロキシリン酸アルミニウムなど）が含まれる。標準的なプロトコールに従って、抗原をアルミニウム化合物と共に沈殿させるか、またはアルミニウム化合物の上に吸着させることができる。RIBI（ImmunoChem, Hamilton, MT）などの他のアジュバントも、非経口投与で使用することができる。
【０１９６】
粘膜免疫化用のアジュバントには、細菌毒素（例えば、コレラ毒素（CT）、大腸菌易熱性毒素（LT）、クロストリジウム-ディフィシレ（Clostridium difficile）毒素Aおよび百日咳毒素（PT）、またはその組み合わせ、サブユニット、トキソイド、もしくは突然変異体）が含まれる。例えば、本来のコレラ毒素サブユニットB（CTB）の精製調製物が有用でありうる。それらがアジュバント活性を保持するならば、任意のこれらの毒素に対する断片、ホモログ、誘導体、および融合体も適当である。好ましくは、毒性が減少した突然変異体を使用する。適した突然変異体が記載されている（例えば、国際公開公報第95/17211号（Arg-7-Lys CT突然変異体）、国際公開公報第9606627号（Arg-192-Gly LT突然変異体）、および国際公開公報第95/34323号（Arg-9-LysおよびGlu-129-Gly PT突然変異体））。本明細書において開示する方法および組成物において用いることができるさらなるLT突然変異体には、例えば、Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-Asp、およびGlu-112-Asp突然変異体が含まれる。他のアジュバント（様々な供給源（例えば、大腸菌、サルモネラ-ミネソタ（Salmonella minnesota）、サルモネラ-チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、またはシゲラ-フレックスネリ（Shigella flexneri）の細菌モノホスホリルリピドA（MPLA）、サポニン、またはポリ乳酸グリコリド（PLGA）ミクロスフェアなど）も粘膜投与で使用することができる。
【０１９７】
粘膜および非経口免疫化の両方に有用なアジュバントには、ポリホスファゼン（例えば、国際公開公報第9502415号）、DC-chol（3 b-(N-(N',N'-ジメチルアミノメタン)-カルバモイル)コレステロール（例えば、米国特許第5,283,185号および国際公開公報第96/14831号）およびQS-21（例えば、国際公開公報第8809336号）が含まれる。
【０１９８】
当業者には公知の任意の通常の経路によって、本明細書において開示する1つまたはいくつかのエピトープまたは抗原、それをコードする単離された核酸配列、および/または組換え発現ベクターを含む薬学的組成物で、被験者を免疫してもよい。これには、例えば、粘膜（例えば、眼球、鼻腔内、口腔、胃、肺、腸、直腸、膣、または尿道）表面から、非経口（例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または腹腔内）経路から、または結節内の免疫化が含まれうる。当業者には明白であるように、好ましい経路は免疫原の選択に依存する。投与は、単一用量または間隔を置いた反復用量で達成することができる。適切な用量は、免疫原自体（すなわち、ペプチド対核酸（より具体的にはその型））、投与経路およびワクチン接種する動物の状態（体重、年齢など）などの、当業者には理解される様々なパラメーターに依存する。
【０１９９】
本出願は、任意に1つまたは複数の他の癌治療薬と組み合わせた、本明細書において開示するエピトープまたは抗原の有効量を、その使用に関する説明書と共に含むキットも提供する。キットは補助的物質を含むこともできる。例えば、キットは、シリンジなどの本明細書において開示するエピトープもしくは抗原を被験者に注入するための器具；本明細書において開示するエピトープもしくは抗原を保存もしくは輸送するための容器；アジュバント；および/または薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤もしくは安定剤を含むことができる。
【０２００】
（ii）治療法
前述のとおり、本明細書において開示するエピトープまたは抗原は、癌細胞上または癌細胞内には存在するが、正常細胞上または正常細胞内には有意に存在しない。したがって、本明細書において開示するエピトープまたは抗原を、癌を予防または治療するための治療法において用いることができる。加えて、本明細書において開示するエピトープまたは抗原を、被験者において免疫応答を誘発するために、例えばワクチンにおいて用いることができる。
【０２０１】
一つの態様は、癌を治療または予防するための医薬の製造における、本明細書において開示するエピトープまたは抗原の使用である。別の態様は、被験者において免疫応答を誘発するための医薬の製造における、エピトープまたは抗原の使用である。
【０２０２】
本出願は、癌を治療または予防するための医薬の製造における、本明細書において開示するエピトープまたは抗原をコードする単離された核酸配列の使用を含む。加えて、本出願は、被験者において免疫応答を誘発するための医薬の製造における、エピトープまたは抗原をコードする単離された核酸配列の使用を含む。
【０２０３】
さらなる態様は、癌を治療または予防するための医薬の製造における、本明細書において開示するエピトープまたは抗原をコードする単離された核酸配列を含む組換え発現ベクターの使用である。また、本出願は、被験者において免疫応答を誘発するための医薬の製造における、本明細書において開示するエピトープまたは抗原をコードする単離された核酸配列を含む組換え発現ベクターの使用を含む。
【０２０４】
さらなる態様は、癌を有するまたは癌を有することが疑われる被験者において癌を治療または予防する方法であって、該被験者に本明細書において開示するエピトープまたは抗原の有効量を投与する段階を含む方法である。加えて、本出願は、癌を有するまたは癌を有することが疑われる被験者において癌を治療または予防する方法であって、該被験者に本明細書において開示するエピトープまたは抗原をコードする単離された核酸配列の有効量を投与する段階を含む方法を含む。さらに、本出願は、癌を有するまたは癌を有することが疑われる被験者において癌を治療または予防する方法であって、該被験者に本明細書において開示するエピトープまたは抗原をコードする単離された核酸配列を含む組換え発現ベクターの有効量を投与する段階を含む方法を含む。
【０２０５】
別の態様は、被験者において癌に対する免疫応答を誘導する方法であって、該被験者に本明細書において開示するエピトープまたは抗原の有効量を投与する段階を含む方法である。加えて、本出願は、被験者において癌に対する免疫応答を誘導する方法であって、該被験者に本明細書において開示するエピトープまたは抗原をコードする単離された核酸配列の有効量を投与する段階を含む方法を含む。さらに、本出願は、被験者において癌に対する免疫応答を誘導する方法であって、該被験者に本明細書において開示するエピトープまたは抗原をコードする単離された核酸配列を含む組換え発現ベクターの有効量を投与する段階を含む方法を含む。
【０２０６】
（iii）診断法
本明細書において開示するエピトープまたは抗原は、癌細胞上または癌細胞内で発現し、かつ正常細胞上または正常細胞内では有意に発現せず、したがって本明細書において開示する抗原またはエピトープの検出を癌の診断法として用いることができる。
【０２０７】
一つの態様は、癌を有するまたは癌を有することが疑われる被験者において癌を検出またはモニターする方法であって、本明細書において開示する1つまたは複数の抗原またはエピトープが細胞上または細胞内で検出され場合には癌を示す、試料中の細胞上または細胞内の本明細書において開示する抗原またはエピトープを検出する段階を含む方法である。
【０２０８】
細胞上または細胞内の本明細書において開示する抗原またはエピトープを検出するために、いくつかの技術を使用することができる。例えば、本明細書において開示する結合タンパク質を、本明細書において開示する抗原またはエピトープの細胞表面発現を検出するための免疫アッセイ法において用いることができる。当業者であれば、エピトープまたは抗原の細胞表面発現を検出および/または定量するために、ウェスタンブロット、免疫沈降と続くSDS-PAGE、免疫細胞化学、FACS、タンパク質アレイなどを含む、いくつかの技術を使用しうることを理解すると考えられる。
【０２０９】
本出願の別の局面は、癌を有するまたは癌を有することが疑われる被験者において癌を検出またはモニターする方法であって、本明細書において開示する抗原またはエピトープの発現が細胞内で検出される場合には癌を示す、試料中の細胞内の本明細書において開示する抗原またはエピトープの発現を検出する段階を含む方法である。一つの態様において、細胞内の本明細書において開示する抗原またはエピトープの発現を検出するために、本明細書において開示する抗原またはエピトープをコードするRNA発現産物を使用する。当業者であれば、本明細書において開示する抗原またはエピトープをコードするmRNA、あるいは本明細書において開示する抗原またはエピトープをコードするmRNAに特異的および/または選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、cDNA、DNA、RNA、PCR産物、合成DNA、合成RNA、または他の天然もしくは改変ヌクレオチドの組み合わせを検出することによって、RNA発現産物を検出または定量しうることを理解すると考えられる。
【０２１０】
細胞内の本明細書において開示する抗原またはエピトープのRNA発現を検出および/または定量するために、RT-PCR、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法およびS1ヌクレアーゼアッセイ法などのヌクレアーゼ保護アッセイ法、ならびにノーザンブロットなどを含む、いくつかの方法を使用することができる。
【０２１１】
一つの態様は、変異体HnRNPGの存在または発現をスクリーニングすることによって、癌を検出またはモニターする方法である。一つの態様において、方法は、以下の段階を含み、対照と試験試料との間の変異体HnRNPGの発現の差が癌を示す：
（a）被験者からの該試験試料中の変異体HnRNPGの発現を判定する段階；および
（b）変異体HnRNPGの発現を対照と共に含む段階。
【０２１２】
前述の開示は、本発明を概説するものである。以下の具体的実施例を参照することによってより完全な理解を得ることができる。これらの実施例は例示のために記載するにすぎず、本発明の範囲を限定する意図はない。状況が示唆するか、または好都合にすると思われる場合、形態の変化および等価物の置換が企図される。本明細書において特定の用語が用いられているが、そのような用語は説明の意味で意図され、限定のためではない。
【０２１３】
以下の非限定的な実施例は、本発明を例示するものである。
【０２１４】
実施例
実施例1：VB1-213モノクローナル抗体の生成
卵巣癌患者のリンパ節からVB1-213モノクローナル抗体を生成した。モノクローナル抗体を生成するための融合相手としてMFP-2を使用した（米国特許第7,220,559号；米国特許第6,197,582号）。VB1-213はIgG1、λモノクローナル抗体である。
【０２１５】
ハイブリドーマ細胞からメッセンジャーRNA（mRNA）を単離し、第1鎖相補DNA（cDNA）を、逆転写酵素を用いて合成した。次いで、cDNAを用い、PCRによって抗体HおよびL鎖遺伝子を単離した。H（γ）およびL（λ）鎖アイソタイプのコンセンサスフレームワーク領域に従って、PCRプライマーを設計した（注を参照）。PCR産物は、個々にTOPO-pCR 2.1ベクターにクローニングし、大腸菌細胞内に形質転換した。TOPO-pCR 2.1中にインサートを含む個々のクローンを単離し、増殖させた。プラスミドDNAを精製し、配列決定した。
【０２１６】
γプライマー：
2011501946.tif 000011
λプライマー：
2011501946.tif 000012
注：λ鎖を単離するために、特定のコンセンサス配列のための混合塩基を含む5'プライマーの混合物を使用した：R＝A＋G、S＝C＋G、W＝A＋T、Y＝C＋T。
【０２１７】
PCR反応は、以下の成分を含む50μLの反応量を含んだ。
10×PCR緩衝剤  5μL
2mM dNTPs  5μL
5'プライマー  20pmol
3'プライマー  20pmol
Taq DNAポリメラーゼ  2.5U
DNA鋳型  50ng
【０２１８】
PCRサイクルの条件は：94℃で1分間、62℃で1分間、72℃で1分間を30サイクル、および72℃で10分間の最終伸長であった。増幅したPCR産物を、1％アガロースゲル上で電気泳動的に分離し、切り出し、Qiaquickゲル抽出キットを用いて精製し、TOPO pCR 2.1クローニングベクターにクローニングし、次いで373 DNAシーケンサー配列を用いてDNA配列決定した（Griffin G. H. and Griffin M.A.: PCR technology, Current innovations. CRC Press, Boca. Raton. Florida3431.USA; （クローニングベクター pCR2.1, カタログ番号205184. Invitrogen, Carlsbad, CA; Qiagen, Qiaquickゲル抽出キット, カタログ番号28706. Qiagen Inc., Mississauga, ONおよび373 DNA Stretch. PE Applied Biosystems, Mississauga ON.）。
【０２１９】
VB1-213についてのCDR配列(SEQ ID NO: 7-12)を表1に示す。重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれ図1および2に示す(SEQ ID NO: 13-16)。
【０２２０】
実施例2：腫瘍細胞反応性を測定することによる抗体プロファイリング
実施例4に示す腫瘍マイクロアレイの結果に基づいて選択した4つの異なる型の上皮癌に対する腫瘍細胞反応性について、VB1-213をフローサイトメトリーで試験した。VB1-213の結果を表2にまとめる。MF値は、各々の適応症における全ての細胞株からの対照抗体に対する蛍光中央値の平均増加倍数の合計から計算した平均を示す。最も強い結合は肺（A-549、NCI-H460）に対してであり、続いて前立腺（DU-145、PC-3、LNCaP）、黒色腫（A-375、SK-MEL-28）および乳房（MDA-MB-231、MDA-MB-435S、SK-BR3）であった。
【０２２１】
実施例3：正常
SK-OV-3腫瘍細胞株に対するVB1-213結合を試験することにより、染色のために最適な条件を規定した。SK-OV-3は卵巣腫瘍細胞株で、染色最適化は抗体の由来元である腫瘍の型を代表する細胞株（この場合は、卵巣癌患者のリンパ節）を用いて日常的に実施される。VB1-213染色をこれらの細胞の膜、細胞質および核で検出した。ホルマリン固定した細胞ペレット中心の細胞膜染色の代表的な写真を図3に示す。
【０２２２】
いったん最適な染色条件を同定すると、正常組織反応性について、正常な決定組織の低密度（LD）アレイでアイソタイプ対照（IgG骨髄腫）と比較して、抗体を試験した。VB1-213についての組織マイクロアレイの結果を表3にまとめる。肺以外に、任意の正常な決定組織の顕著な膜染色は観察されなかった。膜染色の最大スコアは陽性細胞の20％以下であった。
【０２２３】
実施例4：腫瘍
腫瘍組織反応性について、HDホルマリン固定した腫瘍組織マイクロアレイにおいてVB1-213を試験した（表4）。最も高いVB1-213反応性が肺、肝臓、前立腺および皮膚癌組織に対して検出された。中等度から低い結合が、乳房、膵臓および頭頸部癌に対して観察された。
【０２２４】
VB1-213のいくつかの癌への結合を例示する代表的写真を図4AおよびBに示す。皮膚腫瘍組織で観察された膜染色は、対照アイソタイプ抗体でも検出されたため、非特異的結合と考えた。
【０２２５】
実施例5：フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡法によるVB1-213結合および内部取り込みの評価
VB1-213および腫瘍細胞株A-375に対する強い反応性を示す対照抗体5E9を用いて、VB1-213の内部取り込みを、レーザー走査共焦点顕微鏡法を用いた蛍光分布および細胞内染色の直接可視化により評価した。A-375細胞をVB1-213（100mg/mL）と共に4℃でインキュベートした。細胞を洗浄した後、試料の半分を37℃で1時間加温し、残りの半分を4℃で維持した。細胞は固定せず、または固定し（ホルムアルデヒド溶液で）、フルオレセイン標識した二次抗体で標識した。5E9と同様に、A-375のVB1-213との4℃で60分間のインキュベーションは、蛍光標識の断続的表面分布を示した（図5A）。VB1-213抗体が結合した細胞を37℃まで温めることにより、図5Bに示すとおり、60分以内に内部取り込みされた抗体による細胞内染色の断続的パターンが示された。
【０２２６】
実施例6：結合親和性
フローサイトメトリーを用いて結合親和性を評価した（C. A. Benedict, A. J. MacKrell, W. F. Anderson, J. Immunol. Methods 201, 223 (1997)）。一連の抗体濃度を固定の数の腫瘍細胞（A-375）に対して2時間試験し、飽和曲線を得た。値およびグラフによる解析をSigma Plot（Jandel Scientific, San Rafael, CA）を用いて生成した。もとめた蛍光中央値の逆数を抗体濃度の逆数の関数としてプロットし、ラインウィーバー-バーク法によってKDをもとめた。直線を生成し、KDを曲線の傾斜から算出した（図6Aおよび6B）。解離定数であるKD値を以下の式によりもとめた：1/F = 1/Fmax + (KD /Fmax)(1/IgG)、ここでF = バックグラウンドを差し引いた蛍光中央値であり、Fmaxはプロットから算出した。VB1-213の解離定数が6.27×10-7Mであることが示された。
【０２２７】
実施例7：VB1-213抗原同定
この方法についてのより詳細な情報は、国際公開公報第2006/105653号において見いだすことができる。
【０２２８】
細胞
前立腺腫瘍細胞株、DU-145、乳癌細胞株、MDA-MB 435SおよびSKBR-3；膵臓細胞株、PANC-1およびCFPac-1；およびＴ細胞株、Daudiを試験に用いた（表5）。これらの細胞株は、フローサイトメトリーによる腫瘍細胞株プロファイリングの結果に基づいて選択した。
【０２２９】
腫瘍細胞株の増殖および維持
試験における細胞株をATCCから購入し、ATCCの指針および推奨に従って培養した。細胞を生存度＞90％の90％集密で回収した。
【０２３０】
VB1-213への抗原結合の予備的特徴付け
予備的特徴づけデータを、ドットプロットアッセイ法によるゲルに基づくアプローチの実行可能性を評価するよう設計された実験から、および抗原に関連するエピトープの性質を判定するために実施した実験から得た。
【０２３１】
これらの実験からのデータは、VB1-213抗原を、ペプチドエピトープを有する「ブロット可能」な抗原と分類した。抗原は結合部位以外の部位でも糖鎖修飾されうることに留意すべきである。
【０２３２】
免疫沈降
免疫親和性沈降のために、最低500μgの膜タンパク質を用いた。プロテインGセファロースのみ用いた予備的透明化段階が、抗体添加前の抗原の精製における第一段階であった。特定の場合には、アッセイ法により高いストリンジェンシーを加えるために、予備的透明化を2回行った。合計50μgの抗体を混合物中の沈降剤として用いた。抗原-抗体混合物を、生理的条件を模倣する緩衝液条件を用い、4℃で終夜回転させた。抗原単離工程のすべての段階で、プロテアーゼ阻害剤を確実に用いるよう注意した。
【０２３３】
免疫複合体を遠心分離し、RIP-A溶解緩衝液で洗浄し、0.2Mグリシン、pH2.5で溶出した。親和性精製によって単離されなかったタンパク質を試験するために、未結合画分の上清を保存した。免疫沈降を、1つの強陽性細胞株（DU-145）、2つの中等度陽性細胞株（MDA-MB-435SおよびPanc-1）、1つの弱陽性細胞株（SKBR-3）および2つの陰性細胞株（CFPAC-1およびDaudi）において、すべての時点で並行に処理したVB1-213および等量の4B5（アイソタイプが一致した対照）を用いて実施した。
【０２３４】
ゲルに基づく解析およびウェスタンブロッティング：
免疫沈降したタンパク質を、試料調製の還元条件に供し、続いてSDS-PAGE/ウェスタンブロッティングによって解析した。免疫沈降したタンパク質を、1％β-メルカプトエタノールを含む試料緩衝液により65℃で15分間処理した。得られたブロットを、関連する抗体およびHRPに複合した対応する2次抗体をプローブに用いて調べ、化学発光によって免疫沈降したタンパク質を可視化した。DU-145、PC-3、A549、SKBR-3およびPanc-1で1つの特定のバンドが約56kDaに検出された（図7）。VB1-213非反応性細胞株であるCFPAC-1では、同じバンドは発現が少なかった。どの細胞株も4B5では陽性の免疫沈降を示さなかった。
【０２３５】
1D-PAGE解析で等電点（pI）をもとめ、タンパク質スタッキングの可能性を評価するために、VB1-213に対して免疫沈降したタンパク質を二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2D-PAGE）で分離し、PVDF膜に転写し、VB1-213をプローブに用いて調べ、ECL（化学発光）によって検出した。図8に、1つのスポットが約42kDa/pI = 10.02に検出されたことを示す。1Dおよび2D両方のクーマシー染色ゲルから対応するタンパク質バンドまたはスポットを切り出し、ペプチド抽出のために処理した。
【０２３６】
ペプチド抽出および抗原ID：
1D-ゲルバンドおよび2D-ゲルスポットからのタンパク質をトリプシンで消化してゲルからそれらを放出し、逆相LC-MS/MSシステムでおよびより良い被覆のための静的ナノスプレーで解析した。タンパク質の同一性を、標準の生物情報学ツールを用いたデータベース解析により明らかにした。生データは、TOF MSスペクトル、MS/MS断片化データ、および単離されたタンパク質のpIまたは分子量に一致しない混入物を含む示唆されたタンパク質のリストに挙げた、得られたペプチドを含んでいた。完全分析を得るために、MS/MSスペクトルをwww.Matrixscience.com.からアクセス可能なMascot検索エンジンに直接かけた。トリプシン消化を、配列決定等級のトリプシンにより20時間のペプチド抽出処理で行い、最終的に得られたペプチドの抽出物を、静的ナノスプレーを用いた作業流速20〜50nL/分のナノソース（nanosource）が装備されたQSTAR Pulsar-I（ESI-qTOF-MS/MS）で、LCモードで解析した。イオン化したペプチドを二重、三重または四重に荷電した分子として検出し、次いでこれらをそれぞれの質量にまで精製した。同定したタンパク質の新規配列決定も、可能な場合はいつでも行った。正しい抗原の同定であると確かめるために、陽性および陰性細胞株の両方からペプチドを抽出した。質量スペクトルから抽出したペプチド質量を用いて、MASCOT、SEQUEST、およびProspectorなどの検索エンジンを通じてアクセス可能であるタンパク質データベース上で得られたMOWSEスコアにより、抗原を直接同定した。
【０２３７】
DU-145膜画分の2D-ゲルから切り出したタンパク質スポットをHnRNPGと同定した（図9および10）。pIおよび分子量は、HnRNPGのものと明確に一致していた。18の一致しているペプチドによる合計38％の配列包括度が得られ（表6）（SEQ ID NO 53-70）、そのうちの17は元のタンパク質と100％の相同性を示した。ペプチド1481.9584（SEQ ID NO: 70）のMS/MS断片化のために、ナノソース上に取り付けられた別個のナノスプレーヘッドを用いた。衝突エネルギーは48Vで、カーテンガスおよびCADガスをそれぞれ25および6で維持し、安定な質量イオン断片化を得るために、試料を1.667分間（100サイクル）循環させた。ペプチド（1481.9584、742.000000、2+）（SEQ ID NO: 70）のMS/MS断片化によって、図11に示す断片イオンが生じた。ペプチド、
2011501946.tif 000013
は、隣接配列におけるHnRNPGと100％の相同性を示したが、中央部の配列では示さず、新規配列の同定を示すものであった。回収したペプチドのリストおよびHnRNPGからの配列に対してマッピングしたそれらの位置は、図12および表6に示すとおりである。示したすべてのペプチドは新たな配列決定によって得た。
【０２３８】
1D-ゲルから精製した56±2kDaのバンドの解析：
3つの細胞株、DU-145、SKBR-3およびPanc-1すべての質量スペクトルから得たデータは、VB1-213に結合する抗原としてHnRNPGを示している（図13、14、15、および16）。スクリーニングしたすべての細胞株のうち、前立腺細胞株、DU-145は最も高い得点同一性を示した。乳癌細胞株のSKBR-3および膵臓細胞株のPanc-1は、抗原の過剰発現も示した。これらの細胞株それぞれからの膜調製物を用いて、VB1-213抗原を親和性精製した。TOF-MSスキャンを得た。VB1-213抗体で得た免疫沈降物中のHnRNPGの存在がデータによって支持されている。しかし、HnRNPGの予想分子量（42kDa）および1Dゲル上で観察されたバンドの分子量（56kDa）には差がある。溶液中の液相分析を実施して、この明らかな矛盾を明白にした。
【０２３９】
溶液中消化物から抽出したペプチドの解析
3つの陽性細胞株、DU-145、SKBR-3およびPanc-1からの免疫沈降物を、溶液中ペプチド抽出に直接供した。抽出したペプチドを濃縮し、μ-C18カラムを用いて脱塩し、MS分析のために用いた。3つの細胞株すべてにおいて、2つの異なるタンパク質を、HnRNPG＋前立腺幹細胞抗原（PSCA）からなる「混合物1」として同定した。同定したタンパク質実体およびそのそれぞれのスコアも図17に示す。HnRNPGおよびPSCAを、それぞれ76％および95％の配列包括度ならびに非常に顕著な413という組み合わせスコアを有する「混合物1」として同定した。PSCAに対応する配列包括度およびペプチドを図18および19ならびに表7に示す（SEQ ID NO: 18から22）。この方法によって単離されたペプチドは表8に示すとおりHnRNPGに対応している（SEQ ID NO: 72から110）。MS/MS断片化およびペプチドの同一性より、HnRNPGおよびPSCAがVB1-213で得られた免疫沈降物中に存在することが確認される。
【０２４０】
大量のペプチドのMS/MS断片化：
ペプチドのうちの4つ（1866.000、(623.000.000000、3+) (SEQ ID NO: 21)；1481.985448、(742.000000、2+) (SEQ ID NO 70)；2089.96、(698.000000、3+) (SEQ ID NO 84)；1486.6418、(744.600000、2+) (SEQ ID NO 75)のMS/MS断片化によって、それぞれPSCAおよびHnRNPGからのペプチドにマッピングされた断片イオンが生じた。これら4つのペプチドはTOF-MSで十分に検出されたため、質量フィンガープリンティング由来のペプチドの他に、これらのペプチドをMS/MSイオン断片化に使用した。本目的のために、ナノソース上に取り付けられた別個のナノスプレーヘッドを用いた。衝突エネルギーは48Vであり、カーテンガスおよびCADガスをそれぞれ25および6で維持し、安定な質量イオン断片化を得るために、試料を1.667分間（100サイクル）循環させた。スペクトルから得られたペプチドは、ペプチド、1481.95、742.00000、2+ (SEQ ID NO 70)以外は、HnRNPGおよびPSCA上の配列と明確に一致した。回収したペプチドの隣接領域はHnRNPGと正確に一致した。しかし、配列の残りは配列情報において69.6％の相同性しか示さなかった。これは、HnRNPGの216位、218位、219位および222位に4つのアミノ酸置換を有する新規配列であることを明らかにした。これらの4つの変化はまた、PSCAのペプチドと81％相同であるHnRNPGのペプチド配列YSCKAQYSNRD (SEQ ID NO:111)ももたらす。イオン断片化データによって、VB1-213の同種抗原としての変異体HnRNPGおよびPSCAの同一性がさらに確認されている。
【０２４１】
細胞表面抗原としてのPSCAおよび細胞内タンパク質としてのHnRNPG：
上記データは、PSCAがVB1-213によって認識される抗原であることを示している。ゲルに基づく精製には限界があるため、PSCAは液相抽出以外の調製物のいずれにおいても同定されなかった。したがって、PSCAがVB1-213抗原であることをさらに確かめるために、抗PSCA（PSCAに対する市販の抗体）を確認実験用に購入した。2つの細胞株Daudi（T細胞株）およびPanc-1（VB1-213 +ve）を抗PSCAで免疫沈降し、溶出物をSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングで分離した。ブロットを抗PSCAおよびVB1-213の両方をプローブに用いて調べた。図20に見られるとおり、同じ位置（56kDa）に両方の抗体に反応する陽性バンドが見られた。VB1-213または抗PSCAをプローブに用いた場合、約13kDaまたは約42kDaの2つのバンドとは異なり、56kDaに1つのバンドが検出され、HnRNPGおよびPSCAは互いに独立にVB1-213に結合する代わりに、一緒に複合体を形成することが示唆された。Daudi（以前は213について陰性）は、両方の抗体により約56kDaに反応性バンドを示した。Daudiからのタンパク質バンドのMS分析からは、利用可能な結果は得られず、抗体の残存物が同定されただけであった。
【０２４２】
細胞表面上のHnRNPGの存在を試験するための実験を設計した。DU-145細胞をトリプシンで30分間処理し、細胞表面から遊離したタンパク質を含む上清を濃縮し、MS分析に用いた。PSCA、ならびに他の細胞外マトリックスタンパク質および血清タンパク質だけが検出された。上清中にHnRNPGに属するペプチドは存在しなかった。したがって、突然変異体HnRNPGは、細胞膜調製物中に見られるが、細胞質側に局在する。データより、HnRNPGおよびPSCAは腫瘍中で同時発現され、これらは細胞膜レベルで関連し、かつ/または免疫沈降後にゲル中で共に移動する可能性が示唆される。
【０２４３】
実施例8：エピトープマッピング-結合実験
方法および試薬
ペプチド：
合成ペプチドは、Global Peptides LLC（Fort Collins, Colorado USA）がカスタム合成した。
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のアミノ酸配列はPSCA由来で、このペプチドは、VB1-213に同様に結合する抗原である変異体HnRNPG上のペプチド（SEQ ID NO 111）に81％相同（2つのアミノ酸が異なるだけ）であったため、PSCA上のVB1-213が結合するペプチドであるとの仮説が立てられた。別のペプチド、
2011501946.tif 000015
はPSCA由来であり；市販の抗PSCA抗体の免疫原の一部である2つの他のペプチド、すなわち
2011501946.tif 000016
も合成し、エピトープ試験で用いた。（表9）
【０２４４】
ペプチドの可溶化：
すべてのペプチドをPBSに可溶化した。溶解性に任意の困難が見られた場合、溶液のpHを0.01N HClまたは0.01N NaOHで調節した。ペプチドを保存溶液（1000nM）中、-20℃で保存した。
【０２４５】
ELISAプレートへのペプチドのコーティング：
ペプチド溶液を、0.5％ホルムアルデヒドを含むハンクス液（HBSS）で1/100に希釈した。希釈ペプチド溶液100μLを96穴プレートの各ウェルに分配した。プレートを室温で1時間インキュベートした。上清を除去し、プレートを37℃のインキュベーター内に覆いをせずに16〜18時間放置した。ペプチドコーティングされたプレートをポリ袋に入れ、必要となるまで2〜8℃で保存した。
【０２４６】
または、ペプチドを炭酸/炭酸水素塩緩衝液、pH9.6中で希釈し、プレートにコーティングした。コーティング緩衝液の変更を除く他の段階は、すべて同じであった。
【０２４７】
ペプチドコーティングしたプレートを終夜インキュベートした後、300μLの洗浄緩衝液（0.5％トゥイーン20を含むPBS）を各プレートに、8チャンネルアダプターを備えた連続分注用ピペットを用いて手動で加えた。プレートの内容物を廃棄し；プレートを逆さにし、8〜10cm（3〜4インチ）のペーパータオル上で軽く叩いて、過剰の液体を除去した。前述の段階をさらに2回繰り返した。
【０２４８】
ブロッキング：
ペプチドコーティングしたプレートを300μL/ウェルのブロッキング緩衝液（1％BSAを含むPBS）でブロックした。プレートを室温で30〜60分間インキュベートした。ブロッキング緩衝液をインキュベートした後に廃棄した。
【０２４９】
ペプチドコーティングしたELISAプレートへのVB1-213の結合：
75μg/mLのVB1-213に等価の一定量を各ウェルに加え、37℃で2時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（0.5％トゥイーン20を含むPBS）で前述のとおりに洗浄した。プレートを抗ヒトIgG-HRPの1：6000希釈液と共に室温で1時間インキュベートした。プレートを前述のとおりに洗浄した。100μLのTMB基質（TMBペルオキシダーゼ基質KPLカタログ番号50-76-00）を各ウェルに加え、暗所で5〜10分間インキュベートした。100μLの1Mリン酸を各ウェルに加えることにより、反応を停止した。光学密度を、ELISAプレート読み取り器を用いて450nmで測定した。
【０２５０】
結果
OD＝1.8でHP1（10μg/mLで）に非常に強く結合したVB1-213を除き、他の抗体は、HP1に対していかなる結合もまったく示さなかった（図21A）。さらに、VB1-213は、PSPep1、PSPep2またはPSPep3への有意な結合を示さなかった（図21C、DおよびE）。結果を表9にまとめている。アイソタイプが一致した対照、4B5-IgGおよび無関係の抗体、抗EGFRはいずれも、非常に高いレベルのバックグラウンド結合を示した。4B5-IgGは、HP1以外のすべてのペプチドに対して優先的結合を示した。
【０２５１】
実施例9：エピトープマッピング競合実験
方法および試薬
腫瘍細胞株の増殖および維持：
VB1-213陽性の細胞株、すなわち、DU-145を、ATCCの指針に従って培養および維持した。
【０２５２】
合成ペプチド：
すべてのペプチドをPBSに可溶化し、1.428mM（2mg/mL）および100μM溶液として-20℃で保存した。
【０２５３】
競合アッセイ法：
VB1-213（75mg/mL）-0.5μM濃度を非競合対照として用いた。モル過剰、すなわち20×、40×、100×および200×のペプチドを用いてVB1-213と競合させた。ペプチド/VB1-213混合物を氷上で10分間インキュベートした後、フローによって結合させた。抗PSCAを抗原一致対照として用い、4B5-IgGをアイソタイプ一致対照として用い、抗EGFRを無関係の抗体として用いた。これら3つの抗体をVB1-213と厳密に同じ処理をした。
【０２５４】
VB1-213の結合：
VB1-213、ならびに抗PSCA、抗EGFRおよび4B5-IgG抗体のDU-145細胞への結合をフローサイトメトリーにより評価し；実施例5に記載した最適化プロトコールに従って実施した。ペプチドで処理した細胞および未処理のものを同様に処理した。
【０２５５】
結果
図21Bに示すとおり、HP1はVB1-213結合の92％に競合した。陰性ペプチド、PSPep3による結合の有意な置換は観察されなかった。HP1は、抗EGFR、4B5-IgGまたは抗PSCAの結合を阻害することはできなかった。図21F、21Gおよび21Hは、PSPep1、PSPep2およびPSpep3が試験においてスクリーニングした抗体すべての結合を阻害しなかったことを示す。
【０２５６】
VB1-213、抗EGFR（無関係の抗体）、4B5-IgG（アイソタイプ一致対照）および抗PSCA（市販の抗体）に対する合成ペプチド試験からの結果を表10にまとめている。結果は、PSCAが細胞表面抗原であり、HP1（YSCKAQVSNED）がVB1-213に対するエピトープであることを明確に示している。PSPep1、PSPep2およびPSPep3の結合および競合特性は、非特異的相互作用の特徴を示している。
【０２５７】
実施例10：VB6-213免疫毒素の細胞毒性
VB6-213-Fab-PE操作の分子操作
VB6-213-Fab-PE構築物を、EcoRI-ApaI-CH-PE-PelB-SfiI-XhoI/pING3302プラスミドに挿入されたEcoRI-PelB-VH213-ApaIおよびSfiI-6xHis-VL213-CL-XhoI断片を作成することによって操作した。操作した断片を、アラビノース誘導性araBADプロモーターの制御下で、pING3302 Xomaベクターに直接クローニングした。L-(+)アラビノースによる誘導後、関心対象の遺伝子に隣接するPelBリーダー配列の存在は、培養上清へのタンパク質の分泌を引き起こした。VL-CLドメインのN末端に置いたヒスチジン親和性タグにより、Ni2+キレート化捕捉法を用いた精製が可能となった。
【０２５８】
EcoRI-PelB-VH213-ApaI断片は、鋳型としてのPelBおよびVB1-213-VH DNAプラスミドと以下のプライマーとを用いたスプライス重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（Splice Overlapping Extension Polymerase Chain Reaction）法により組み立てられた。
2011501946.tif 000017
【０２５９】
二段階スプライス重複伸長PCRアプローチを、上に挙げた4つのプライマーすべてを用いて行い、EcoRI-PelB-VH213-ApaIを作成および増幅した。PelB-VH213のEcoRI-ApaI-CH-PE-PelB-SfiI-XhoI/3302ベクターへのクローニングを容易にするために、EcoRIおよびApaI制限部位（太字）を加えた。PCR反応は、以下の成分を含む50μLの反応量を含んだ。
10×PCR緩衝液  5μL
2mM dNTPs  5μL
50mM MgCl2  2μL
プライマー5'  20pmol
プライマー3'  20pmol
Taq DNAポリメラーゼ  2.5U
DNA鋳型  50ng
【０２６０】
PCRサイクルの条件は以下のとおりであった：94℃で1分間、62℃で1分間、および72℃で1.5分間の合計20サイクルと、その後の最終伸長を72℃で10分間。
【０２６１】
段階1
最初のPCR反応は、プライマー1および2ならびにPelB鋳型を含んだ。これにより、5'末端にEcoRI制限部位を有するPelB領域と、3'末端にPelBリーダーシグナルを含む断片を得た。
【０２６２】
別のPCR反応において、プライマー3および4を213 VH鋳型と共に用いて、5'末端にPelBリーダーシグナルおよびVHドメインの開始部が隣接し、3'末端にApaI部位を有するCHドメインの21ヌクレオチドを有するVH213を増幅した。（図22A）
【０２６３】
段階2
次のPCR反応において、プライマー1および4を各PCR産物からの1μLと共に用いて、EcoRI-PelB-VH213-ApaIを生成した。（図22B）
【０２６４】
SfiI-6xHis-VL213-CL断片は、鋳型としてのVB6-213およびVB1-213軽鎖DNAプラスミドと以下のプライマーとを用いたスプライス重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応法により組み立てられた。
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【０２６５】
二段階スプライス重複伸長PCRアプローチを、上に挙げた4つのプライマーすべてを用いて行い、
2011501946.tif 000019
を作成および増幅した。SfiI-6xHis-VL213-CL-XhoIのEcoRI-ApaI-CH-PE-PelB-SfiI-XhoI/3302ベクターへのクローニングを容易にするために、SfiIおよびXhoI制限部位（太字）を加えた。
【０２６６】
段階1
最初のPCR反応において、プライマー1および2をVB1-213軽鎖鋳型と共に用いて、5'末端にSfiI制限部位および6xHisが隣接し、3'末端にCLドメインの最初の21ヌクレオチドを含む、SfiI-6xHis-VL213を増幅した。（図22A）
【０２６７】
第二のPCR反応をプライマー3および4をCL鋳型と共に用いて行い、3'末端にXhoI制限部位を含むλ定常軽鎖を得た。
【０２６８】
段階2
次のPCR反応において、プライマー1および4を各PCR産物からの1μLと共に用いて、
2011501946.tif 000020
断片を生成した。（図22B）
【０２６９】
いったん配列が確認されると、PelB-VH213断片をEcoRIおよびApaI制限酵素で消化し、同じ酵素であらかじめ消化したEcoRI-ApaI-CH-PE-PelB-SfiI-XhoI/3302ベクターに連結した。10Fコンピテント細胞に連結反応物を形質転換し、テトラサイクリンを追加したLB-寒天プレート上に播種した。プラスミドPelB-VH213-CH-PE-PelB-SfiI-XhoI/3302の制限マッピングにより、インサートの存在を確認した。次いで、
2011501946.tif 000021
断片を、SfiIおよびXhoI制限酵素で消化し、同じ酵素であらかじめ消化したPelB-VH213-CH-PE-PelB-SfiI-XhoI/3302ベクターに連結して、VB6-213-Fab-PEを操作した（図24、SEQ ID NO: 43ならびに図30、SEQ ID NO 50および51）。いったん正しいインサートの存在が制限マッピングにより確認されると、小規模発現試験のために、構築物を大腸菌E104細胞に形質転換した。
【０２７０】
VB6-213-CL-de-ボウガニンの分子操作
VB6-213-CL-de-ボウガニン構築物を、VB6-213-CL-de-ボウガニン/pING3302プラスミドに挿入された3つの断片、EcoRI-PelB-6xHis-VH213-ApaI、ApaI-CH-PelB-SfiIおよびSfiI-VL213-CL-XhoI断片を作成することによって操作した。VB6-213-CL-de-ボウガニンの定常軽鎖における保存SmaI制限部位をサブクローニングのために用いた。
【０２７１】
EcoRI-PelB-6xHis-VH213-ApaIは、前述のとおりSOE-PCRにより組み立てられたが、例外として6xHisタグを導入するためにプライマー2および3を置き換えた。
2011501946.tif 000022
ApaI-CH-PelB-SfiIを、以下のプライマーを用いて一段階PCRによって作成した。
2011501946.tif 000023
SfiI-VL213-CL-XhoI断片も、以下のプライマーを用いて一段階PCRによって作成した。
2011501946.tif 000024
【０２７２】
いったん配列が確認されると（図22C）、SfiI-VL213-CL-XhoI断片を、EcoRI（pcR2.1ベクターから）およびSmaI制限酵素で消化し、同じ酵素であらかじめ消化したVB6-213-CL-de-ボウガニン/3302ベクターに連結した。10Fコンピテント細胞に連結反応物を形質転換し、テトラサイクリンを追加したLB-寒天プレート上に播種した。この段階により、3302ベクター中の以下のインサートEcoRI-SfiI-VL213-CL-de-ボウガニンが作成された。次いで、3302ベクターをEcoRIおよびSfiI制限酵素で消化し、EcoRI/ApaIおよびApaI/SfiIでそれぞれ消化したEcoRI-PelB-6xHis-VH213-ApaI、およびApaI-CH-PelB-SfiIインサートと同時に連結して、VB6-213-CL-de-ボウガニンを作成した。（図23、SEQ ID NO: 42ならびに図29、SEQ ID NO: 48および49）
【０２７３】
VB6-213-Fab-PEおよびVB6-213-CL-de-ボウガニンの小規模発現
VB6-213-Fab-PE/E104およびVB6-213-CL-de-ボウガニン/E104細胞の終夜培養物（OD600＝3の1％接種物）を用いて、250mL振盪フラスコ中の30mLのTB培地に接種した。培養物を37℃でインキュベートし、225rpmで光学密度（OD600）＝2に達するまで振盪した。次いで、発現を0.1％L-(+)アラビノースで誘導し、培養物を25℃でさらにインキュベートした。誘導後16時間で、培養上清およびペレットを14,000rpmで5分間の遠心沈降により分離した。VB6-213-Fab-PEおよびVB6-213-CL-de-ボウガニン上清の一定量、16mLを、非還元条件下でSDS-PAGEアクリルアミドゲルにロードし、それぞれウサギ抗PE抗体およびウサギ抗ボウガニンを用いたウェスタンブロットにより分析した後、HRPに結合したヤギ抗ウサギ抗体で組換えタンパク質の同一性およびサイズを確認した。VB6-213-Fab-PE/3302プラスミドまたはVB6-011-Fab-PEもしくはVB6-170-CL-de-ボウガニンを有するE104細胞も同じ条件を用いて誘導し、可溶性タンパク質を含む上清をウェスタンブロットにおける陽性対照として用いた。図22DおよびE参照。
【０２７４】
VB6-213-CL-de-ボウガニンの精製
マスター細胞バンクから1つのバイアルを解凍し、2.0L三角フラスコ中の25mg/Lのテトラサイクリンを追加した2xYT培地250mLに接種するために用いる。この培養物を37.0℃でインキュベートし、225rpmでOD600＝2.0±0.5となるまで6〜7時間振盪する。続いて、13LのTB培地を含む15L発酵槽に種の1％接種物を接種する。培養物を25℃で増殖させ、OD600＝20が達成されると、発現をL-(+)アラビノースの連続パルスで誘導する。誘導後30時間で、細菌培養物を遠心沈降し、上清を回収し、30kDa mwco膜を用いて20から30回濃縮する。VB6-213を含む濃縮上清を、20mM NaPO4 pH6.9の溶液に対して透析濾過（diafilter）する。次いで、試料を20mM NaPO4 pH6.9で平衡化したCM-セファロースカラムにロードする。カラムを20mM NaPO4、25mM NaCl pH6.9で洗浄し、結合したタンパク質を20mM NaPO4、150mM NaCl pH7.5で溶出する。次いで、CM-セファロースカラムの溶出物を、0.1M NiCl2水溶液を前もって充填したニッケルキレート化親和性カラムに吸着させる。次いで、カラムを20mM NaPO4、150mM NaCl、0.25％トリトン-X100 pH7.5で開始し、続いて20mM NaPO4、150mM NaCl pH 7.5と、最後に20mM NaPO4、150mM NaCl、10mMイミダゾールpH7.5の3種類の緩衝液で逐次洗浄する。結合した材料をカラムから、20mM NaPO4、250mMイミダゾール、pH7.2を用いて溶出する。溶出物を20mM NaPO4、150mM NaCl pH7.5で平衡化したSECカラムに吸着させ、10mL分画を集める。すべての分画をSDS-PAGEゲルで分析し、クーマシーブルーで染色する。無傷の生成物を含む分画を集め、セントリプラス濃縮器を用いて濃縮し、滅菌ろ過し、分注し、-20℃で保存する。
【０２７５】
VB6-213-CL-de-ボウガニン結合のフローサイトメトリーによる検出
ヒト前立腺DU-145およびヒトT細胞Daudi細胞株を、ATCCプロトコールに従いそれぞれの培地中で増殖させる。30から40％集密度および90％よりも高い生存度で細胞を回収する。DU-145およびDaudiをそれぞれ陽性および陰性細胞株として用いる。
【０２７６】
VB6-213の生物学的活性をフローサイトメトリーで判定し、VB1-213を陽性対照として用いる。簡単に言うと、VB6-213およびVB1-213を0.45×106腫瘍細胞と共に氷上で1.5時間インキュベートする。洗浄後、細胞表面に結合したVB6-213およびVB1-213を、それぞれウサギ抗ボウガニンおよびビオチン化ヤギ抗ヒトHおよびL鎖により、氷上で1時間検出する。細胞を、洗浄し、FITC結合抗ウサギIgGまたはストレプトアビジン-FITCと共に氷上で30分間インキュベートする。続いて、細胞を、洗浄し、フローサイトメトリーによるFab結合の評価のために、ヨウ化プロピジウムを含むPBS 5％FCS中に再懸濁する。
【０２７７】
VB6-213-CL-de-ボウガニンの細胞毒性
VB6-213の細胞毒性をMTSアッセイ法により測定する。簡単に言うと、DU-145およびDaudi細胞を、1000細胞/ウェルで播種し、37℃で3時間インキュベートする。続いて、等モル濃度のVB6-213およびボウガニンをこれらの細胞に加え、5日後、細胞生存度を判定する。
【０２７８】
実施例11：血清中の抗エピトープ-ペプチド抗体の測定
本明細書において開示する抗原に対する抗体が被験者の血清/血漿中に存在して、本発明の1つまたは複数の抗原の発現または過剰発現の可能性、したがって癌細胞の存在が示されることがある。一つの例において、被験者からの血清/血漿試料を、以下に記載し、以前の記載（M. Tanaka et al., Oncol Rep 18, 161 (2007)から改変されたELISA技術により試験して、被験者の血清中の抗ペプチド-エピトープ抗体の存在および抗体価をもとめる。別の例において、血清試料を、例えば、ペプチド担持ビーズを用いたフローサイトメトリーにより試験してもよい。ペプチド担持カルボキシレートビーズは以下のとおりに調製することができる。
【０２７９】
本明細書において開示するエピトープ、YSCKAQVSN (SEQ ID NO: 41)、YSCKAQYSNRD (SEQ ID NO: 111)およびYSCKAQVSNED (SEQ ID NO:23)を含みうる、関心対象のペプチドを、公知の方法を用いて合成する。ペプチドをジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、-80℃で保存し、使用直前に食塩水で希釈する。ペプチドをカルボキシレートビーズ（xMAP；Luminex Corporation, Austin, TX, USA）に製造者の説明を改変したものに従って結合する。100mlのxMAPビーズを0.1M MES緩衝液、pH7.0で洗浄し、続いて100μlのペプチド（0.1M MES緩衝液、pH7.0中1mg/ml）と混合する。次いで、ペプチド担持ビーズをEDC（1mg/ml）と共に、暗所、室温で30分間インキュベートし、次いで同じ条件下でさらに2回インキュベートし、ビーズを0.05％トゥイーン-20 PBS（PBST）で洗浄する。最後に、ビーズを2-アミノエタノールにより暗所、室温で15分間処理し、次いでBlock Ace中の0.05％NaN3 1mlで2回洗浄し、再懸濁する。ビーズは、1つの型（配列）のペプチドだけまたは複数の型のペプチドを提示するように、調製することができる。例えば、1バッチのビーズを本発明の1つのペプチドエピトープだけ、または本発明の複数のペプチドエピトープを用いて、調製することができる。同様に、非結合ペプチドについても、そのようなペプチド配列1つだけまたはいくつかの異なる非結合配列を用いて、ビーズを調製することができる。
【０２８０】
次いで、試料中のペプチド特異的免疫グロブリンレベルの存在をフローサイトメトリーによって測定することができる。プレート振盪機上の96穴フィルタープレート内で、被験者の試料の一定量を170μlのペプチドコーティングしたビーズと共に室温で2時間インキュベートする。インキュベートした後、プレートを真空マニフォールド装置を用いて洗浄し、100μlのビオチン化ヤギ抗ヒトIgG（γ鎖特異的）と共にプレート振盪機上、室温で1時間インキュベートする。次いで、プレートを洗浄し、100μlのストレプトアビジン-PEをウェルに加え、プレートをプレート振盪機上、室温で40分間インキュベートする。結合したビーズを3回洗浄し、続いて100μlのPBSTを各ウェルに加え、次いでプレートをプレート振盪機上に3分間置く。PE蛍光を、励起波長488nmおよび発光波長575nmでELISAプレート読み取り器を用いて測定する。
【０２８１】
または、被験者の血漿または血清試料を、ペプチドが固定されているELISAプレートを用いて試験することができる。抗体吸着試験用のペプチド固定ELISAプレートの調製のために、ペプチド（SEQ ID NO: 23、41および111）を、化学的架橋剤、スベリン酸ジスクシンイミジル（Pierce）を含む0.1M炭酸塩緩衝液中で希釈する。ELISAプレートを標的ペプチド（20μg/ウェル）により4℃で終夜コーティングする。ウェルを0.05％PESTで3回洗浄する。プレートをBlock Aceにより4℃で終夜ブロックする。抗ペプチドIgGの特異性を試験するために、100μl/ウェルの血漿試料（0.05％PBSTで1：1000希釈）を、ウェル中の固定ペプチド（20μg/ウェル）に吸着させ、室温で2時間維持する。吸着を3回繰り返し、次いで得られた上清中のペプチド特異的免疫グロブリンのレベルを測定する。
【０２８２】
実施例12：エピトープを有するペプチドの細胞毒性Tリンパ球を誘導する能力
異なるエピトープを有するPSCA由来のペプチドは、免疫原性であり、末梢血単核細胞（PBMC）から細胞毒性Tリンパ球を誘導することが以前に明らかにされている（米国特許第2002000498075号）。野生型HnRNPGからの異なる免疫原性ペプチドに対応する抗体が、全身性紅斑性狼蒼のイヌから単離された（Soulard et al, 2002）。
【０２８３】
エピトープを有するペプチド（SEQ ID NO: 23、41、および111）を、健常供与者からのPBMC（末梢血単核細胞）によるT細胞増殖アッセイ法において用いる。MHCクラスIIアロタイプの十分な適用範囲を得るために、約20名の供与者からのPBMC試料を用いた。
【０２８４】
保存期間が12時間未満のヒト血液からの軟膜を、英国立血液センター（National Blood Service）（Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK）から入手する。フィコール-パック（Ficoll-paque）はAmersham Pharmacia Biotech（Amersham, UK）から入手する。一次ヒトリンパ球の培養用で、L-グルタミン、50ug/mlストレプトマイシン、10ug/mlゲントマイシンおよび0.1％ヒト血清アルブミンを含む無血清AIM V培地は、Gibco-BRL（Paisley, UK）から入手する。
【０２８５】
軟膜の緩和な遠心沈降により、血漿および血小板から赤血球および白血球を分離する。上層（血漿および血小板を含む）を除去して廃棄する。赤血球および白血球をリン酸緩衝化食塩水（PBS）中で1：1に希釈した後、15mlのフィコールパック（Amersham Pharmacia, Amersham UK）上に層化する。製造者の推奨条件に従って遠心沈降を行い、PBMCを血清+PBS/フィコールパック界面から回収する。PBMCをPBSと混合（1：1）し、遠心沈降により回収する。上清を除去して廃棄し、PBMCペレットを50mlのPBSに再懸濁する。細胞を遠心沈降により再度ペレットとし、PBS上清を廃棄する。細胞を50mlのAIM V培地を用いて再懸濁し、この時点で計数し、生存度をトリパンブルー色素排除法を用いて評価する。細胞を遠心沈降により再度回収し、上清を廃棄する。細胞を低温保存のために3×107/mlの密度で再懸濁する。保存培地は、90％（v/v）熱不活化ABヒト血清（Sigma, Poole, UK）および10％（v/v）DMSO（Sigma, Poole, UK）である。細胞を調節された凍結容器（Sigma）に移し、-70℃で終夜放置する。使用が必要になれば、細胞を37℃の水浴中で急速に解凍した後、10mlのあらかじめ加温したAIM V培地に移す。
【０２８６】
エピトープYSCKAQVSN (SEQ ID NO: 41)、YSCKAQYSNRD (SEQ ID NO: 111)およびYSCKAQVSNED (SEQ ID NO:23)に対するものなどの合成ペプチドを調製する。ペプチドをDMSO中で最終濃度10mMまで溶解し、次いでこれらの保存溶液をAIM V培地中で1/500に希釈する（最終濃度20uM）。ペプチドを平底96穴プレートに加えて、100μl中1および5uMの最終濃度とする。
【０２８７】
解凍したPBMCの生存度を、トリパンブルー色素排除法を用いて評価し、次いで細胞を2×106細胞/mlの密度で再懸濁し、100μl（2×105 PBMC/ウェル）を、ペプチドを含む各ウェルに移す。三通りのウェル培養物を各ペプチド濃度でアッセイする。プレートを37℃、5％CO2の加湿雰囲気下で7日間インキュベートする。増殖を、3H-チミジン（3H-Thy；Amersham-Pharmacia, Amersham, UK）取り込みによって評価する。細胞に1uCi 3H-Thy/ウェルを18〜21時間適用した後、フィルターマット上に回収する。CPM値を、Wallacマイクロプレートベータトッププレート計数器（Perkin Elmer）を用いてもとめる。刺激指数（S.I.）を、取り込まれた3Hの量を模擬刺激対照細胞において取り込まれた3Hの量で割った値として、算出する。
【０２８８】
実施例13：VB1-213の抗体依存性細胞性細胞障害（ADCC）を誘導する能力
PBMCをフィコールハイパック（Ficoll-hypaque）勾配遠心沈降により濃縮し、1×PBS中で洗浄し、計数する。2つのアプローチを用いて細胞毒性を評価することができる：フローサイトメトリーおよびELISA法。簡単に言うと、フローサイトメトリーアプローチにより、標的細胞、DU-145を0.2μMのカルセインと共に37℃で25分間インキュベートする。1回洗浄した後、10から100μg/mLの範囲の様々な濃度の抗体存在下、DU-145細胞をPMBCと1：20の比で37℃で3.5時間混合する。最終濃度1μg/mlのヨウ化プロピジウムの溶液を加え、FACSCaliburを用いて分析する。DU-145細胞を0.1％トリトンX-100で処理し、この処理の結果放出されたカルセインの量を溶解の最大％と考える。細胞毒性のパーセンテージを、カルセインを含まず（緑色を呈していない）、PI染色された標的腫瘍細胞を最大溶解（トリトンX処理）で割った比によりもとめる。ELISA法のために、標的腫瘍細胞を96穴プレート上に、前に記載したものと同じ比のPBMCおよび抗体存在下で播種する。例えば、損傷細胞から上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をELISAにより測定して、抗体の細胞毒性活性を定量する。DU-145に結合しないIgG 4B5を陰性対照として用いる。
【０２８９】
実施例14：腫瘍診断としてのHnRNPGの腫瘍関連発現および位置決定
野生型HnRNPGは細胞核において発現される。しかし、実施例1に記載したとおり、本発明者らはこのタンパク質の変異体を腫瘍細胞の膜画分から単離し、これは膜の細胞内側に結合していると位置決定した。したがって、変異体のこの異常な細胞上の局在を癌の診断法として用いることができる。ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、またはフローサイトメトリーを含む、HnRNPGまたは変異体HnRNPGの細胞上の局在を検出するために使用しうる、当技術分野において公知のいくつかの方法がある。
【０２９０】
実施例15：癌の指標としてのゲノムDNA配列の検出
ヒト哺乳動物HnRNPGタンパク質をコードする遺伝子は、染色体X q26.3に位置づけられている。癌関連変異体の遺伝子配列は、エキソン特異的PCR増幅または公知の配列へのプライマーから開始する直接DNA配列決定などの、当技術分野において公知の遺伝子配列決定技術を用いて、決定することができる。
【０２９１】
突然変異した遺伝子の配列がいったん同定されると、その検出に基づく診断試験を用いて、患者を評価することができる。例えば、野生型および突然変異両方の遺伝子のセンスおよびアンチセンス配列に対応するオリゴヌクレオチドを付着させることにより、DNAチップアレイを作成することができる。ゲノムDNAは、末梢全血からまたは腫瘍組織から単離することができる。次いで、野生型配列および予想される突然変異の両方に対応し、適切なプローブ（通常は蛍光）で標識したプライマーによるPCRを用いて、関心対象の遺伝子を増幅する。次いで、DNAをチップ上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、蛍光パターンを蛍光読み取り器で決定する。蛍光パターンをオリゴヌクレオチド配列の公知の位置のマップと比較することにより、患者の遺伝子の配列を野生型または変異体のいずれかと確定することができる。（Cooper et al 2004）特に、p53遺伝子における一般的な突然変異のアレイ（Affymetrix）はすでに市販されており、カスタムアレイサービスも利用可能である。
【０２９２】
実施例16
VB1-213の結合をaldefluor（ALDH1）染色と共に用いて、癌幹細胞反応性を評価した。一般に、高いALDH染色を示す腫瘍細胞は、自己再生可能であり、かつ異種移植片において腫瘍生成可能な癌幹細胞画分である。高いALDH1活性は、特定の化学療法剤に対する耐性を付与し、患者における新しい腫瘍の生成およびその後の再発につながると考えられる（120、121）。2色フローサイトメトリーを用いて、卵巣細胞株C-33-Aおよび前立腺腫瘍細胞株DU-145のALDH1+細胞へのVB1-213結合を測定した。ALDH1+ C-33-AおよびDU-145亜集団へのVB1-213結合は、それが癌幹細胞に対して有用である可能性を強調するものである。
【０２９３】
実験設計：
簡単に言うと、2×105細胞をaldefluor試薬と共に37℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、25μg/mLのVB1-213存在下、4℃で2時間インキュベートした。細胞に結合したVB1-213を、ビオチン化ヤギ抗ヒトHおよびLと、続いてストレプトアビジンCy5とを用いて検出した。ヒトIgG抗IdであるVB1-4B5を陰性対照として用いた。同様に、aldefluor染色の特異性を反応の阻害剤であるDEAB存在下で示した。
【０２９４】
結果：
データの分析により、C-33-A（図33）およびDU-145（図33）でそれぞれ癌幹細胞の2.8および3.1％が検出された（右下、図33Bおよび34B）。同様に、VB1-213はC-33-AおよびDU-145細胞にそれぞれ細胞の90および75％で結合し、左上四半分にシフトした（図33Cおよび34C）。図33Dおよび34DはC33-A（2.1％）およびDU-145（1.6％）のALDH1+癌幹細胞がVB1-213存在下で右上四半分にシフトしたことを示す。このデータは、VB1-213が癌幹細胞画分に結合することを示唆している。
【０２９５】
本発明を、好ましい実施例であると現在考えられていることに関して記載してきたが、本発明は、開示した実施例に限定されないことが理解されるべきである。反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる様々な改変および等価の脚色を対象とすることが意図されている。
【０２９６】
全ての出版物、特許および特許出願は、それぞれ個々の出版物、特許または特許出願がその全体が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２９７】
（表１）CDR配列
2011501946.tif 000025
【０２９８】
（表２）異なる臨床適応における腫瘍細胞表面結合の比較
2011501946.tif 000026
MFは2つの無関係の実験からの対照抗体に対する蛍光中央値の平均増加倍数を示す。2MF：値は、各々の適応における全ての細胞株からの対照抗体に対する蛍光中央値の平均増加倍数の合計から計算した平均を示す。ゼロ値は、対照抗体と比べて計測可能な反応性がないことを示す。aは、AntiCancer Inc.から提供された同所性モデルを示す。bは、GFP（緑色蛍光タンパク質）-トランスフェクタントとして入手可能な細胞株を示す。cアンドロゲン反応性。dアンドロゲン非反応性。
【０２９９】
（表３）VB1-213についての正常な決定組織のLDアレイ
2011501946.tif 000027
*0〜3+の規模でスコアを評価し、0＝染色なし、および1+未満だが、0よりも大きいものを微量とした。1+から3+の等級は染色の強度増大を表し、強い濃褐色の染色を3+とした。一般に、5名の異なる患者の1つの標本をスクリーニングした。スクリーニングした患者が5名に満たない場合は、中心が欠けていたか、または染色されるべき組織の代表でなかったかのいずれかを示す。「染色された組織のパーセンテ−ジ」は、採点範囲で染色された細胞の最も高いパーセンテ−ジを示す。
【０３００】
（表４）VB1-213についてのHD腫瘍TMA
2011501946.tif 000028
0〜3+の規模でスコアを評価し、0＝染色なし、および1+未満だが、0よりも大きいものを微量とした。1+から3+の等級は染色の強度増大を表し、強い濃褐色の染色を3+とした。一般に、8名の異なる患者の2つの標本をスクリーニングした。スクリーニングした試料が9つに満たない場合（各試料は異なる患者から）は、中心が欠けていたか、または染色されるべき組織の代表でなかったかのいずれかを示す。頭頸部癌は、気管、喉頭、扁桃、咽頭、軟口蓋、舌、口および口唇の癌を含んだ。「染色された腫瘍のパーセンテ−ジ」は採点範囲で染色された細胞の最も高いパーセンテ−ジを示す。
【０３０１】
（表５）試験に用いた各細胞株のアイソタイプ一致対照に対するVB1-213についての蛍光中央値の増加
2011501946.tif 000029
【０３０２】
（表６）HnRNPGに対応する2Dゲルのバンド分析から回収したペプチド
2011501946.tif 000030
【０３０３】
（表７）PSCAに対応する溶液中消化物から回収したペプチド
2011501946.tif 000031
【０３０４】
（表８）HnRNPGに対応する溶液中消化物から回収したペプチド
2011501946.tif 000032
【０３０５】
（表９）VB1-213エピトープマッピング試験のために合成したペプチドの概要
2011501946.tif 000033
【０３０６】
（表１０）PSCAペプチドに対する異なる抗体の結合親和性の比較プロファイリング
2011501946.tif 000034
強調した部分は実験における結合および競合特異性を示す。
【０３０７】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３０−４】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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