(57)【要約】２又はそれ以上の疎水性の尾部を有し、その少なくとも１つがステロールであるステロール修飾親水性脂質化合物が開示される。また、これらの化合物を合成する方法、それらの化合物を含有する組成物、及びそれらの化合物の対象とする試薬、例えば治療薬、画像化剤、超音波適用のための造影剤、ワクチン、滋養補助食品、及びスキンケア製品ｎのデリバリーにおける使用も開示される。
2011503188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性の頭部と、２又はそれ以上の疎水性の尾部を有するステロール修飾親水性脂質（ＳＭＬ）を含み、前記疎水性の尾部の少なくとも1つがステロールを含有する化合物。
【請求項２】
前記頭部がリン酸塩を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記親水性の頭部が、リン酸塩、ホスホコリン、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホイノシトール、及びエチルホスホリルコリンからなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ホスホエタノールアミン頭部が、ホスホエタノールアミン−Ｎ−［モノメトキシポリエチレングリコール］２０００、及びホスホエタノールアミン−Ｎ−スクシニル−Ｎ−トリニトリル酢酸からなる群から選択される、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
ステロールが、動物ステロール及び植物ステロールからなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
ステロールが、コレステロール、ステロイドホルモン、カンペステロール(campesterol)、サイトステロール(sitesterol)、エルゴステロール、及びスチグマステロールからなる群から選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
疎水性の尾部の少なくとも１つが非ステロールを含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項８】
非ステロール疎水性部が、飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐状の、置換又は非置換の脂肪族炭化水素を含む、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
ＳＭＬが、モノステロール修飾親水性脂質、及びジステロール修飾親水性脂質からなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項１０】
ＳＭＬが、ステロール修飾グリセロリン脂質、ステロール修飾スフィンゴリン脂質、ステロール修飾カルニチン脂質、及びステロール修飾アミノ酸脂質からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
親水性の頭部が、アミノ酸、活性化された官能基、メラミン、グルコサミン、ポリアミン、カルボキシレート（ＣＯＯ−）、サルフェート（ＳＯ４−）、スルホネート（ＳＯ３−）、分岐ポリエチレングリコール、ポリグリセロール、トリニトリル酢酸、及び炭水化物からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
疎水性尾部の１つがプロドラッグである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
ＳＭＬ１ａ、ＳＭＬ１ｂ，ＳＭＬ１ｃ，ＳＭＬ２ａ，ＳＭＬ２ｂ，ＳＭＬ２ｃ，ＳＭＬ２ｄ，ＳＭＬ３ａ，ＳＭＬ３ｂ，ＳＭＬ３ｃ，ＳＭＬ３ｄ，ＳＭＬ４ａ，ＳＭＬ４ｂ，ＳＭＬ４ｃ，ＳＭＬ４ｄ，ＳＭＬ５ａ，ＳＭＬ５ｂ，ＳＭＬ５ｃ，ＳＭＬ５ｄ，ＳＭＬ６ａ，ＳＭＬ６ｂ，ＳＭＬ６ｃ，ＳＭＬ６ｄ，ＳＭＬ７ａ，ＳＭＬ７ｂ，ＳＭＬ８ａ，ＳＭＬ８ｂ，ＳＭＬ８ｃ，ＳＭＬ８ｄ，ＳＭＬ８ｅ，ＳＭＬ８ｆ，ＳＭＬ９ａ，ＳＭＬ９ｂ，ＳＭＬ９ｃ，ＳＭＬ１０ａ，ＳＭＬ１０ｂ，ＳＭＬ１０ｃ，ＳＭＬ１０ｄ，ＳＭＬ１０ｅ，ＳＭＬ１０ｆ，ＳＭＬ１１ａ，ＳＭＬ１１ｂ，ＳＭＬ１１ｃ，ＳＭＬ１１ｄ，ＳＭＬ１１ｅ，ＳＭＬ１１ｆ，ＳＭＬ１２ａ，ＳＭＬ１２ｂ，ＳＭＬ１２ｃ，ＳＭＬ１２ｄ，ＳＭＬ１２ｅ，ＳＭＬ１２ｆ，ＳＭＬ１３ａ，ＳＭＬ１３ｂ，ＳＭＬ１３ｃ，ＳＭＬ１３ｄ，ＳＭＬ１３ｅ，ＳＭＬ１３ｆ，ＳＭＬ１３ｇ，ＳＭＬ１３ｈ，ＳＭＬ１３ｉ，ＳＭＬ１３ｊ，ＳＭＬ１３ｋ，ＳＭＬ１４ａ，ＳＭＬ１４ｂ，ＳＭＬ１４ｃ，ＳＭＬ１４ｄ，ＳＭＬ１４ｅ，ＳＭＬ１４ｆ，ＳＭＬ１５ａ，ＳＭＬ１５ｂ，ＳＭＬ１５ｃ，ＳＭＬ１５ｄ，ＳＭＬ１５ｅ，ＳＭＬ１５ｆ，ＳＭＬ１５ｇ，ＳＭＬ１５ｈ，ＳＭＬ１５ｉ，ＳＭＬ１５ｊ，ＳＭＬ１５ｋ，ＳＭＬ１６ａ，ＳＭＬ１６ｂ，ＳＭＬ１６ｃ，ＳＭＬ１６ｄ，ＳＭＬ１６ｅ，ＳＭＬ１６ｆ，ＳＭＬ１６ｇ，ＳＭＬ１６ｈ，ＳＭＬ１６ｉ，ＳＭＬ１６ｊ，ＳＭＬ１６ｋ，ＳＭＬ１６ｌ，及びＳＭＬ１６ｍ，及びこれらの誘導体からなる群から選択される、ステロール修飾親水性脂質。
【請求項１４】
請求項１に記載のステロール修飾親水性脂質（ＳＭＬ）を含む組成物。
【請求項１５】
ＳＭＬがステロール修飾両親媒性リン脂質（ＳＰＬ）である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が治療薬、化粧成分、及び検出可能標識の少なくとも１つを更に含有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、非ステロール両親媒性脂質を更に含有し、当該非ステロール両親媒性脂質が飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐状の、置換又は非置換の脂肪族炭化水素を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＳＰＬ及び非ステロール両親媒性脂質が、ほぼ同じ長さの疎水性尾部を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ＳＰＬがモノステロール修飾両親媒性リン脂質であり、非ステロール両親媒性脂質がジアシルリン脂質であり、各々が約６−２４炭素の鎖長の非ステロール疎水性尾部を有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ステロール修飾両親媒性脂質を合成する方法であって、当該方法が：
少なくとも１つのステロール尾部を分岐コアを介して親水性頭部に結合させ、それにより２又はそれ以上の疎水性尾に結合した親水性頭部を有するステロール修飾両親媒性脂質を生成させることを含み、疎水性尾部の少なくとも１つがステロール尾部を含む方法。
【請求項２１】
ステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物の製造方法であって、当該方法が：
ステロール修飾両親媒性脂質を、非ステロール両親媒性脂質、治療薬、化粧成分、検出可能標識、バッファー、溶媒、及び賦形剤の少なくとも１つと混合することを含む方法。
【請求項２２】
ステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物を動物又は細胞に投与する方法であって、当該方法が：
動物又は細胞を請求項１４に記載の組成物に接触させることを含む方法。
【請求項２３】
流体中の被分析物の存在又は不存在を検出する方法であって、当該方法が：
前記流体を請求項１４に記載の組成物に接触させ、そして
脂質組成物又は流体の検出可能な特性の少なくとも１つの変化を検出することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体として本明細書に組み込まれている、２００７年１１月１４日に出願した米国仮出願第６０／９８８，０３８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
政府の権利
本発明は、ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された連邦助成金Ｒ０１−ＧＭ０６１８５１号の下で政府支援により行われた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、両親媒性脂質化合物、並びに組成物及び使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
真核細胞膜は、二重層構造を有し、主としてリン脂質、スフィンゴ脂質及びコレステロールから構成されている。これらの成分のうち、コレステロール又はコレステロール様ステロールは、真核細胞膜における最も豊富な単一化学種である。したがって、生体膜におけるコレステロールの特性及び機能並びに特定の疾患におけるコレステロールの役割の理解にかなりの関心が払われている。
【０００５】
人工小胞は、リン脂質、スフィンゴ脂質及び他の両親媒性合成脂質から調製することができる。リポソームとして知られている、これらの人工小胞は、二重層膜のモデル及び薬物送達媒体などの多くの適用分野で用いられてきた。
【０００６】
遊離コレステロールは、リポソーム組成物における成分として広く用いられてきた。遊離コレステロールは、脂質混合物中に約３０モルパーセント超存在する場合、リポソーム二重層の安定化を促進する。そのような遊離コレステロール含有リポソームは、薬物送達適用分野で、造影剤用に、また生物物理学的研究に用いられる。遊離コレステロールと合成リン脂質の混合物の特性は、十分に特性が評価されている。遊離コレステロールとリン脂質を含む２成分混合物については、コレステロールのモルパーセントとリン脂質のモルパーセントを加えると１００モルパーセントに等しくなる。そのような脂質混合物に含めることができるコレステロールの最大モルパーセントは、約５０モルパーセントであることがわかっている。合成リン脂質を含む組成物に高モルパーセントの遊離コレステロール（３０モル％を超える）を含めることにより、ジアシルリン脂質の検出可能な転移熱がなくなり、合成リン脂質から形成されたリポソームに認められる検出可能な相転移がなくなる。高モルパーセントの遊離コレステロールを含むリポソームは、遊離コレステロールを含まないものより一般的に安定で、漏れやすくなく、化学療法薬の製剤に広く用いられている。
【０００７】
しかし、遊離コレステロール及びリン脂質からなるリポソームを他の生体脂質及び血清を含む生体液に入れた場合、遊離コレステロールは、リポソームから生体脂質中に速やかに移動する。リポソームからの遊離コレステロールのこの損失は、通常、脂質二重層の安定性の低下とその後のリポソームからの封入内容物の損失をもたらす。リポソームからの遊離コレステロールの過剰な非コレステロール含有脂質への移動の半減期は、約２時間である。さらに、血清の存在は、血清リポタンパク質により遊離コレステロールが吸収されるため、リポソームからタンパク質への遊離コレステロールの移動に起因するリポソームの漏れを著しく増加させるものとなる。リポソームからの遊離コレステロールの生体膜への速やかな移動に関連するこの漏れの問題は、遊離コレステロールが他の両親媒性脂質成分と物理的に混合している従来のリポソーム製剤により満足に解決することはできなかった。
【０００８】
したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで安定なリポソームを形成するのに用いることができる脂質を開発することが望ましいと思われる。望ましい分子は、安定化効果をもたらすのに十分な量のステロイドを製剤に組み込むことができるだけでなく、生体液に曝露したとき製剤中のステロイドを保持することもできるものであるべきである。
【０００９】
水溶性ステロール誘導体の使用が記載されている。ステロール−ヘミコハク酸、ステロール−ホスホコリン、ステロール−ポリエチレングリコール及びステロール−硫酸などの水溶性ステロール誘導体を調製するために、様々な親水性基がステロールに付加された。これらの分子は、疎水性部分としての唯一のステロール及び比較的大きい親水性頭部を有するので、それ自体でミセルを形成し、リポソーム二重層から生体液に速やかに移動する傾向がある。したがって、そのような水溶性ステロールは、安定なリポソーム製剤の適切な成分ではない。
【００１０】
疎水性ステロールは、脂肪酸エステル又はアルキルエステルがステロールに付加したステロール誘導体の他の既知のカテゴリーである。これらの分子は脂肪族分子鎖によりリポソーム二重層にステロールを保持する助けとなるが、低いモルパーセント（１５％未満）を製剤に組み込むことができるにすぎない。遊離コレステロールエステルのパーセントが約１５モルパーセントを超えた場合、コレステロールエステル相は、二重層に組み込まれない独立した相に分離する。したがって、そのような疎水性ステロールは、相転移をなくし、リポソーム二重層を安定化するのに十分なステロールのモルパーセントで脂質組成物に導入することはできない。
【００１１】
本発明は、これらの問題を解決することができる化合物を提供し、望ましい物理的特性を有するリポソームを提供する。
【００１２】
文献
ステロイド、脂質及び一般的な送達製剤は、Ｆａｈｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）、第４６巻、８３９〜８６１頁；Ｆｅｌｇｎｅｒ、１９９０、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第５巻、１６２〜１８７頁；及びＦｅｌｇｎｅｒ、１９９３、Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．、第３巻、３〜１６巻でレビューされている。
【００１３】
コレステロールを含む脂質化合物及び組成物は、例えば、次の文献に開示されている：Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｆｆら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９８２、第６９１巻、２２７〜２３２頁；Ｄｅｍｅｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９８４、第７７１巻、１４２〜１５０頁；Ｐａｔｅｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９８４、第７９７巻、２０〜２６頁；Ｌａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８５、第２４巻、１６４６〜１６５３頁；Ｅｐａｎｄら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ、１９９０、第５５巻、４９〜５３頁；Ｇｏｔｏｈら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓ．、２００６、第３巻、１９８〜２０９頁；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  Ｖ．Ｐ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．、２００５、第４巻、１４５〜６０頁；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９８７、第９０６巻、２２３〜７６頁；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ．Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．、２００３、第１４巻、２６３〜２７１頁；Ｋａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９２、第３１巻、１８６６〜７４頁；Ｕｒａｔａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．、２００１、第１０３巻、２９〜３９頁；Ｓａｌｕｎｋｅら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００６、第１３巻、８１３〜４７頁；Ｇｕｏら、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、２００３、第３６巻、３３５〜３４１頁；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００５、第９巻、６４７〜５５巻；及びＨｕａｎｇら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第３版、Ｅ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ．編、Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００７、第１巻、１６５〜１９６頁。例えば、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００５、第９巻、６４７〜５５巻）は、脂質の設計並びに様々な生化学的、物理的及び化学的適用分野におけるそれらの利用をレビューしている。
【００１４】
核酸の送達用の脂質化合物及び組成物は、例えば、次の特許に開示されている：米国特許第４，４９３，８３２号；米国特許第４，８９７，３５５号；米国特許第５，６５１，９８１号；米国特許第５，６６１，０１８号；米国特許第５，６８８，６２０号；米国特許第５，６８８，９５８号；米国特許第５，７８０，０５３号；米国特許第５，８５５，９１０号；米国特許第５，８９１，７１４号；米国特許第６，６２７，２１８号；Ｌｅｗｉｓら、米国特許出願公開第２００３０１２５２８１号；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００３／０７７８２９；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／０５／００７１９６；Ｖａｒｇｅｅｓｅら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０００５００７８５４；ＭｃＳｗｉｇｇｅｎら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５／０１９４５３、ＷＯ０３／７０９１８、ＷＯ０３／７４６５４並びに米国特許出願公開第２００５００２０５２５号及び第２００５００３２７３３号；Ｃｈｅｎら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００７／０８６８８３。例えば、Ｃｈｅｎら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００７／０８６８８３）は、単鎖干渉性核酸（ｓｉＮＡ）をトランスフェクト又は送達する陽イオン性脂質、ミクロ粒子、ナノ粒子及びトランスフェクション剤を開示している。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、一般的に、ステロール修飾両親媒性脂質化合物に関する。これらの化合物の合成方法、そのような化合物を含む組成物、問題とする物質、例えば、治療薬、ワクチン、造影剤、超音波適用分野用造影剤、バイオセンサー、栄養補助食品、スキンケア製品及び化粧品の送達におけるそのような化合物の使用も提供する。
【００１６】
本発明のステロール修飾両親媒性脂質化合物は、親水性頭部及び２つ以上の疎水性尾部を含み、疎水性尾部の少なくとも１つはステロールを含む。
【００１７】
本発明の化合物及び組成物は、様々な製薬、化粧及び医療適用分野、並びに脂質系が用途を見いだす一連の工業及び商業適用分野に適応することができる。例えば、本開示の化合物は、例えば、二重層、単層、立方相、六方相、油及び水乳剤（水中油型又は油中水型乳剤）、ゲル剤、泡剤、ローション剤並びにクリーム剤を安定化するのに用いることができる。
【００１８】
したがって、１つの態様において、本開示は、親水性頭部及び２つ以上の疎水性尾部を有する、ステロール修飾両親媒性脂質を含む化合物であって疎水性尾部の少なくとも１つがステロールを含む化合物を提供する。１つの実施形態において、ステロールは、動物ステロール及び植物ステロールからなる群から選択される。関連実施形態において、ステロールは、コレステロール、ステロイドホルモン、カンペステロール、シトステロール、エルゴステロール及びスチグマステロールからなる群から選択される。
【００１９】
さらなる実施形態において、親水性頭部は、荷電頭部、極性頭部並びに荷電及び極性頭部の組合せからなる群から選択される。関連実施形態において、親水性頭部は、ホスフェート、ホスホコリン、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホイノシトール、エチルホスホスホリルコリン、ポリエチレングリコール、ポリグリセロール、メラミン、グルコサミン、トリメチルアミン、ポリアミン、ヒドロキシル（ＯＨ）、カルボキシレート（ＣＯＯ−）、硫酸（ＳＯ４−）、スルホネート（ＳＯ３−）及び糖からなる群から選択される。
【００２０】
さらなる実施形態において、疎水性尾部の少なくとも１つは、非ステロールを含む。関連実施形態において、非ステロールは、飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換である脂肪族炭化水素である。さらなる関連実施形態において、非ステロール構成成分は、アルキル基で飽和された鎖などの飽和脂肪族炭化水素鎖に基づく置換脂肪族炭化水素である。さらなる関連実施形態において、アルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上の個数の炭素原子（一般的に約１０個を超えない炭素原子）は、酸素、ケイ素、硫黄若しくは窒素原子から選択されるヘテロ原子で置換されており、かつ／又はアルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上の個数の水素原子（一般的に水素原子の総数を超えない）は、フッ素で置換されている。
【００２１】
さらなる実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質は、モノステロール修飾両親媒性脂質及びジステロール修飾両親媒性脂質からなる群から選択される。関連実施形態において、ジステロール修飾両親媒性脂質は、同じである（複数の）ステロール疎水性尾部を含む。さらなる実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質は、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、カルニチン脂質及びアミノ酸脂質からなる群から選択される。
【００２２】
さらなる実施形態において、親水性頭部及び疎水性尾部は、１，２−ジヒドロキシ，３−アミノプロパンを介して結合している。
【００２３】
１つの実施形態において、疎水性尾部の１つは、レチノイン酸などのプロドラッグである。
【００２４】
さらなる態様において、本開示は、親水性頭部及び２つ以上の疎水性尾部を有するステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物であって、疎水性尾部の少なくとも１つがステロールを含む組成物を提供する。関連実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質は、モノステロール修飾両親媒性脂質及びジステロール修飾両親媒性脂質からなる群から選択される。さらなる実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質は、コレステロール、ステロイドホルモン、カンペステロール、シトステロール、エルゴステロール及びスチグマステロールからなる群から選択される。
【００２５】
関連実施形態において、組成物は、乳剤である。さらなる実施形態において、組成物は、ペイロードを場合によって含む、リポソームである。リポソームがペイロードを含む実施形態において、ペイロードは、治療薬、化粧品及び検出可能な標識の少なくとも１つを含む。さらなる実施形態において、リポソームは、非ステロール両親媒性脂質を含む。関連実施形態において、リポソームは、１つ又は複数の賦形剤を含み、医薬製剤又は化粧用製剤として提供することができる。
【００２６】
さらなる実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質は治療薬を含み、ステロール修飾両親媒性脂質は、リポソーム中に提供することができる。
【００２７】
さらなる実施形態において、非ステロール両親媒性脂質は、飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換である脂肪族炭化水素からなる群から選択される。さらなる実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質及び非ステロール両親媒性脂質は、ほぼ同じ長さである疎水性尾部を含む。いくつかの実施形態において、組成物のステロール修飾両親媒性脂質は、モノステロール修飾両親媒性脂質である。
【００２８】
他の態様において、本開示は、ステロール修飾両親媒性脂質の合成の方法であって、２つ以上の疎水性尾部に結合した親水性頭部を有するステロール修飾両親媒性脂質を生成するように、少なくとも１つのステロール尾部を分枝コアを介して親水性頭部にカップリングさせることを含み、疎水性尾部の少なくとも１つがステロール尾部を含む方法を提供する。
【００２９】
さらなる態様において、本開示は、ステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物の製造の方法であって、ステロール修飾両親媒性脂質を、非ステロール両親媒性脂質、治療薬、化粧品、検出可能な標識、緩衝剤、溶媒及び賦形剤の少なくとも１つと混合することを含む方法を提供する。関連実施形態において、該方法は、組成物を精製することをさらに含む。
【００３０】
さらなる態様において、本開示は、ステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物を動物に投与する方法であって、動物を本開示のステロール修飾脂質組成物と接触させることを含む方法を提供する。
【００３１】
さらなる態様において、本開示は、ステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物を細胞に投与する方法であって、細胞を本開示のステロール修飾脂質組成物を含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。
【００３２】
他の態様において、本開示は、液中の分析対象物の存在又は非存在を検出する方法であって、液を本開示のステロール修飾脂質組成物を含む組成物と接触させること、及び脂質組成物又は液の検出可能な特性の少なくとも１つの変化を検出することを含む方法を提供する。関連実施形態において、液は生体液である。さらなる関連実施形態において、検出は、脂質組成物の特性の評価によるものである。
【００３３】
本発明の他の態様及び実施形態は、本開示を読むことにより容易に明らかになるであろう。
【００３４】
本発明は、添付図面と共に読むとき、以下の詳細な説明から最も十分に理解することができる。以下の図を図面に含める。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＳＣｈｃＰＣ及びＤＳＰＣの混合物の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムである。
【図２】種々のパーセントのコレステロールを含むステロール修飾両親媒性脂質（「ＳＭＬ」）／ジアシル脂質混合物の転移温度及びエンタルピーを示すグラフである。図２に示す結果において、ＳＭＬは同じ鎖長のジアシル脂質と混合されている。
【図３】浸透応力誘発性漏れの分析の結果を示すグラフである。リポソームからのカルセインの放出を種々の浸透圧のもとで測定した。リポソームに留まっていたカルセインの割合を計算し、浸透圧勾配に対してプロットした。データの誤差は、０．５％以内である。
【図４】リン酸緩衝生理食塩水中３０容積％ウシ胎児血清中のリポソーム組成物の漏れの分析の結果を示すグラフである。種々のインキュベーション時間における開始時蛍光強度からの蛍光強度の変化を測定することにより、３７℃での３０容積％ウシ胎児血清中のリポソームからのカルセインの放出をモニターした。リポソーム中に留まっていたカルセインの割合を計算し、インキュベーションの時間に対してプロットした。対照製剤（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ及びＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ）中に４０％のコレステロールが存在していた。
【図５】３７℃でのコレステロール交換の相対速度の解析の結果を示すグラフである。
【図６】Ｃ２６大腸癌細胞に対する選択したステロール修飾両親媒性脂質の細胞毒性を示すグラフである。
【図７】ホスホリパーゼＡ２によるステロール修飾両親媒性脂質からの全トランスレチノイン酸の加水分解を示すグラフである。
【図８】ドキソルビシン封入ＳＰＬリポソームの各種製剤１５ｍｇ／ｋｇｉ．ｖ．で処置したｓ．ｃ．Ｃ−２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。Ｆ１はＳｅＣｈｃＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／α−トコフェロール、９４．８／５．０／０．２であり、Ｆ２はＳｅＣｈｃＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００／α−トコフェロール、９４．８／５．０／０．２であり、Ｆ３はＤＣｈｃＰＣ／ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／α−トコフェロール、１０．６／８４．２／５．０／０．２であり、Ｆ４はＰＣｈｃＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／α−トコフェロール、９４．８／５．０／０．２であり、Ｆ５はＤＣＨＥＭＳＰＣ／ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／α−トコフェロール、３３／６１．８／５．０／０．２であり、Ｆ６はＤＣＨＥＭＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／α−トコフェロール、９４．８／５．０／０．２である。
【図９】キソルビシン封入ＳＰＬリポソームの各種製剤１５ｍｇ／ｋｇｉ．ｖ．で処置したｓ．ｃ．Ｃ−２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの生存曲線を示すグラフである。Ｆ１はＳｅＣｈｃＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／α−トコフェロール、９４．８／５．０／０．２であり、Ｆ２はＳｅＣｈｃＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００／α−トコフェロール、９４．８／５．０／０．２であり、Ｆ３はＤＣｈｃＰＣ／ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／α−トコフェロール、１０．６／８４．２／５．０／０．２であり、Ｆ４はＰＣｈｃＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／α−トコフェロール、９４．８／５．０／０．２であり、Ｆ５はＤＣＨＥＭＳＰＣ／ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／α−トコフェロール、３３／６１．８／５．０／０．２であり、Ｆ６はＤＣＨＥＭＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／α−トコフェロール、９４．８／５．０／０．２である。
【図１０】ＤＣｈｃＰＣ／ＤＰＰＣ混合物の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムである。
【図１１】還元感受性ＳＭＬ脂質を用いるナノリポ粒子の連続集合を示す概略図である。最初に、透析法によりＤＮＡをナノサイズの陽イオン性リポソーム中に封入する。次に、還元剤ＨＳＲ'を用いてジスルフィド交換により粒子表面を修飾する。最後に、ミセル移動法又はジスルフィド交換により、標的リガンドを粒子の表面上に組み込む。ＳＭＬ−ＳＳＲ：頭部（Ｒ）にジスルフィド結合（ＳＳ）を有する陽イオン性ステロール修飾脂質；ＳＭＬ−ＳＳＲ'：頭部交換ステロール修飾両親媒性脂質。
【図１２】ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中３０容積％ウシ胎児血清中のリポソーム組成物の漏れの解析の結果を示すグラフである。種々のインキュベーション時間における開始時蛍光強度からの蛍光強度の変化を測定することにより、３７℃での３０容積％ウシ胎児血清中のリポソームからの５−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の放出をモニターした。２８日目におけるリポソームから放出されたＣＦの割合を計算し、リポソーム製剤のアルキル鎖長に対してプロットした。
【図１３】３７℃でのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中３０容積％ウシ胎児血清中のジアシル／ＳＭＬ６ｂを含むリポソームからのＣＦの放出のプロファイルを示すグラフである。ラベルは、リポソームに用いたジアシル脂質の鎖長を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の具体例としての実施形態を述べる前に、本発明は、述べる特定の実施形態に限定されず、したがって、もちろん変化し得ることを理解すべきである。本発明の範囲は添付する特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で用いる用語は、個々の実施形態のみを記述する目的のためのものであって、限定されるものでないことも理解すべきである。
【００３７】
値の範囲が示されている場合、文脈上別の方法で明確に示されない限り、当該範囲の上限と下限の間の下限の単位の十分の一までのそれぞれの介在値も具体的に開示されていると理解される。記述した値の間のより小さい範囲又は記述した範囲における介在値及び当該記述範囲における他の記述若しくは介在値は、本発明の範囲内に含まれる。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立に範囲に含まれるか、又は除外されてよく、記述範囲における特に除外される限界次第で、より小さい範囲にどちらの限界が含まれるか、どちらの限界も含まれないか、又は両方の限界が含まれる各範囲も本発明の範囲内に含まれる。記述範囲が限界の１つ又は両方を含む場合、含まれる限界のいずれか又は両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【００３８】
特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の技術者により一般的に理解されているのと同じ意味を持つ。本明細書で述べたものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、いくつかの可能な及び具体例としての方法及び材料を記述することができる。本明細書で言及するありとあらゆる刊行物は、引用する刊行物に関連する方法及び／又は材料を開示し、記述するために参照により本明細書に組み込まれている。本開示は、組み込まれている刊行物のあらゆる開示に、不両立が存在する程度まで、取って代わることが理解される。
【００３９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いているように、単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、文脈上別の方法で明確に示されない限り、複数の指示対象を含むことを注意しなければならない。したがって、例えば、「ステロール修飾両親媒性脂質」への言及は、複数のそのようなステロール修飾両親媒性脂質を含み、「リポソーム」への言及は、１つ又は複数のリポソームへの言及を含む等である。
【００４０】
特許請求の範囲は任意選択であってよいあらゆる要素を除外するように起草されることがあることがさらに指摘される。したがって、この陳述は、特許請求の範囲の要素の詳述に関連して「ただ単に」、「のみ」などのような排他的用語の使用、又は「消極的」限定の使用の前提となることを意図する。
【００４１】
本明細書で述べる刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示のためにのみ記載する。本明細書における何ものも、本発明が先行発明によるそのような刊行物に先行する権利を与えられないという容認として解釈すべきでない。さらに、記載した公開日付は、独立に確認する必要がある可能性がある実際の公開日と異なっていることがある。
【００４２】
定義
「両親媒性脂質」は、構造が主として脂質様（疎水性）であるが、１つの末端が極性、荷電又は極性と荷電の組合せ（親水性）である領域を有する分子を意味する。親水性領域は、頭部と呼ばれ、脂質部分は、（１つ又は複数の）尾部と呼ばれる。両親媒性脂質の例としては、リン脂質、グリコ脂質及びスフィンゴ脂質などがある。
【００４３】
「分析対象物」は、滴定、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、分光光度法、サーモグラフィーなどの分析又は定量的検出法で測定される物質又は化学成分を意味する。分析対象物自体は測定することはできないが、分析対象物の測定可能な特性は測定することができる。例えば、測定又は検出される一般的特性は、濃度、吸光度、分子量、融解温度、結合特性、生物学的活性などである。
【００４４】
「遊離ステロール」は、他の化合物に共有結合していないステロールを意味する。したがって、「遊離コレステロール」は、他の化合物に共有結合していないコレステロールを意味する。例えば、脂質への遊離コレステロールの付加は、リポソームの安定性の向上をもたらすための通常の技術として用いられている。したがって、「遊離コレステロール」は、ステロール修飾両親媒性脂質化合物の構成要素として共有結合していないコレステロールを特に意味する。
【００４５】
「医薬品」は、機能性食品を含む医薬として試験、開発又は適用における用途を見いだす物質を意味する。
【００４６】
「多胞性リポソーム」（ＭＶＬ）は、各リポソーム粒子内に複数の非同心チャンバーを含み、「泡様」マトリックスに類似したリポソームを意味する。
【００４７】
「多重層リポソーム」（多重層小胞又は「ＭＬＶ」としても知られている）は、各リポソーム粒子内に二重層からなる複数の同心チャンバーを含み、「タマネギの層」に類似したリポソームを意味する。
【００４８】
「モノステロール修飾両親媒性脂質」又は「ｍ−ＳＭＬ」は、構造に唯一のステロールを有するＳＭＬを意味する。
【００４９】
「ジステロール修飾両親媒性脂質」又は「ｄｉ−ＳＭＬ」は、構造に２つのステロールを有するＳＭＬを意味する。
【００５０】
「トリステロール修飾両親媒性脂質」又は「ｔｒｉ−ＳＭＬ」は、構造に３つのステロールを有するＳＭＬを意味する。
【００５１】
「テトラステロール修飾両親媒性脂質」又は「ｔｅｔｒａ−ＳＭＬ」は、構造に４つのステロールを有するＳＭＬを意味する。
【００５２】
「ステロール」又はステロイドアルコールは、コレステロール及びそれらの誘導体並びに植物ステロール及びそれらの誘導体並びに真菌ステロール及びそれらの誘導体に例示され、含まれるような遊離ヒドロキシルを有するステロイド又はその誘導体のサブグループを意味する。ステロールは、天然又は合成であってよい。
【００５３】
「ステロール修飾両親媒性脂質」は、本明細書で用いているように、親水性頭部、及び少なくとも１つがステロールである２つ以上の疎水性尾部を有する両親媒性脂質化合物を一般的に意味する。「ステロール修飾両親媒性リン脂質」又は「ＳＰＬ」は、ホスホコリン又はホスホグリセロールなどのリン酸含有部分を含むステロール修飾両親媒性脂質を意味する。
【００５４】
「治療薬」は、医薬品を含む治療薬として試験、開発又は適用における用途を見いだす物質を意味する。
【００５５】
「造影剤」は、光学剤、超音波造影剤、高質量Ｘ線造影剤、放射性造影剤又は核磁気造影剤を含む、動物における脂質粒子の位置の探知に用途を見いだす物質を意味する。
【００５６】
「化粧剤」は、化粧品として試験、開発又は適用における用途を見いだす物質を意味する。
【００５７】
「治療上許容できる」、「製薬上許容できる」及び「美容上許容できる」という用語は、生物学的にも、或いは他の面でも望ましくないことはない物質を意味する。すなわち、物質は、許容できる品質のものであり、望ましくない生物学的影響をもたらことなく、或いはそれが含まれる組成物の他の成分のいずれかと有害な様態で相互作用することなく、選択される有効成分とともに個体に投与することができる組成物である。
【００５８】
「乳剤」という用語は、２つの不混和性（非混合性）物質の混合物を意味する。
【００５９】
「二重層」という用語は、内側に疎水性尾部及び外側表面に極性頭部を有する２分子層として配列している両親媒性脂質分子（しばしばリン脂質）からなる「サンドイッチ様」構造を意味する。
【００６０】
「単層」という用語は、一方の側に濃縮され、実質的に整列している頭部及び反対側に濃縮され、実質的に整列している疎水性基を有する両親媒性分子の分子層によって定義される構造を意味する。
【００６１】
「賦形剤」という用語は、本明細書で用いているように、被検体への問題とする（１つ又は複数の）化合物の適用又は投与のような所定の最終用途における許容できる媒体となる任意の適切な物質を意味する。賦形剤の例としては、希釈剤、添加剤、佐剤及び担体と呼ばれている物質などである。例えば、「製薬上許容できる賦形剤」、「製薬上許容できる希釈剤」、「製薬上許容できる担体」及び「製薬上許容できる佐剤」は、一般的に安全で、非毒性であり、生物学的にも、或いは他の面でも望ましくないことはない医薬組成物を調製するのに有用である賦形剤、希釈剤、担体及び佐剤を含み、家畜への使用並びにヒト用の製薬上の使用に許容できる賦形剤、希釈剤、担体及び佐剤を含み、１つ及び複数のそのような賦形剤、希釈剤、担体及び佐剤を含んでいてよい。
【００６２】
「生理的条件」という用語は、生存細胞と適合性のある条件、例えば、生存細胞と適合性のある温度、ｐＨ、塩分などの主として水性条件を含むことを意味する。
【００６３】
「治療用組成物」、「医薬組成物」、「化粧用組成物」「治療用製剤」、「医薬製剤」又は「化粧用製剤」という用語は、哺乳動物、特にヒトなどの被検体への適用又は投与に適する組成物を含むことを意味する。一般的に、そのような組成物は、安全で、通常無菌性であり、好ましくは、被検体の望ましくない反応を誘発することができる汚染物質を含まない（例えば、組成物中の（１つ又は複数の）化合物は、所定の最終用途用の許容できる等級のものである）。組成物は、局所、経口、口腔内、直腸、非経口、皮下、静脈内、腹腔内、皮内、気管内、髄腔内、肺などを含む多くの各種投与経路によるそれを必要とする被検体又は患者への適用又は投与用に設計することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、経皮経路による適用又は投与に適している。他の実施形態において、組成物は、経皮投与以外の経路による適用又は投与に適している。
【００６４】
本発明の化合物の「誘導体」という用語は、その塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、ヒドラゾン、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物又はプロドラッグを含む。そのような誘導体は、当業者がそのような誘導体化についての既知の方法を用いて容易に調製することができる。
【００６５】
化合物の「その塩」という用語は、親化合物の所望の活性を有する塩を意味する。そのような塩は、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸などの無機酸により形成される、又は酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、１，２，３，４ブタンテトラカルボン酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、ショウノウスルホン酸、グルコヘプタン酸、４，４'−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三級ブチル酢酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸などの有機酸により形成される、酸付加塩、或いは（２）親化合物に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン若しくはアルミニウムイオンにより置換されるとき、又はエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミン、トリエチルアミンなどの有機塩基と配位結合するときに形成される塩を含む。
【００６６】
本発明の化合物の「溶媒和物又は水和物」という用語は、親化合物の所望の薬理活性を有する溶媒和物又は水和物複合体を意味し、本発明の化合物と１つ若しくは複数の溶媒又は水分子、或いは１〜約１００個、或いは１〜約１０個、或いは１〜約２、３又は４個の溶媒又は水分子との複合体を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
「保護基」という用語は、官能基をその通常の化学反応性から保護又は遮蔽するために、官能基の化学修飾により分子に導入された化学基を意味する。保護基、それらの付加及び除去は、よく知られている（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００５）。保護基の除去により、「非保護基」と呼ばれることがある元の官能基が得られる。
【００６８】
「プロドラッグ」という用語は、そのようなプロドラッグを哺乳動物被検体に投与するときにｉｎ  ｖｉｖｏで活性親薬物を放出する任意の化合物を意味する。プロドラッグは、修飾体がｉｎ  ｖｉｖｏで開裂して親化合物を放出するように化合物に存在する官能基を修飾することにより調製される。プロドラッグは、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル又はスルフヒドリル基が、ｉｎ  ｖｉｖｏで開裂してそれぞれ遊離のヒドロキシル、アミノ、カルボキシル又はスルフヒドリル基を生ずることができる任意の基に結合している、化合物を含む。プロドラッグの例は、エステル、カルバメート、ヒドラゾン、ジスルフィドなどを含むが、これらに限定されない。
【００６９】
「被検体」、「宿主」、「患者」及び「個体」という用語は、診断又は治療が望まれる任意の哺乳動物被検体、特にヒトを指すために本明細書では同義で用いる。他の被検体は、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、魚などを含んでいてよい。非ヒト動物モデル、特に、哺乳動物、例えば、霊長類、マウス、ウサギ目の動物などは、実験的研究に用いることができる。
【００７０】
本明細書で用いているように、「測定すること（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、「測定すること（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」及び「評価すること」及び「アッセイすること」という用語は、同義で用い、定量的及び定性的測定を含む。
【００７１】
本開示を通して、両親媒性脂質化合物を記述するために用いる命名法は次の通りである。第一に、化合物のステロールに、コレステロール、スチグマステロール及びシトステロールなどの従来の名称を用いる。記述の都合上、主鎖としてグリセロールを有するステロール修飾両親媒性脂質は、グリセロリン脂質の一般名についての同様な規則に従って略記する。例えば、１−コレステリルカルボニル−２−パルミチル−グリセロ−３−ホスファチジルコリンは、ＣｈｃＰｅＰＣと略記され、ここで、１）ｓｎ−１／ｓｎ−２位の基は、それらの置換位置の配列における大文字略語（例えば、コレステロールについては「Ｃｈ」、コレステリルヘミスクシニルについては「ＣＨＥＭＳ」、パルミトイルについては「Ｐ」）により表し、２）慣例に従ってカルボネートについては「ｃ」、エーテルについては「ｅ」、カルバメートについては「ａ」、エステルについては空白（又は小文字又は下付き文字なし）などの下付き文字又は小文字を用いて結合の種類を示し、３）頭部は、ホスホコリンについては「ＰＣ」及びホスホグリセロールについては「ＰＧ」のように慣例に従って命名する。
【００７２】
緒言
本開示は、少なくとも１つがステロールである、２つ以上の疎水性尾部を有する両親媒性脂質化合物（本明細書では「ステロール修飾両親媒性脂質」と呼び、「ＳＭＬ」と略記する）を提供する。本開示はまた、そのようなＳＭＬ化合物及びそれらを含む組成物を製造する方法を提供する。本開示はまた、ＳＭＬを使用する方法並びに１つ又は複数のＳＭＬ化合物及び／又は組成物を含むキットを提供する。
【００７３】
本発明の化合物及び組成物は、治療薬、化粧品、検出可能な標識及び問題とする他の物質の送達を促進するための、分析対象物、バイオセンサーなどの存在又は非存在を検出するための、例えば、それら自体治療薬、化粧品及び画像剤としての両親媒性脂質の使用を見いだす、又はそれにより利益を得る様々な適用分野に適応させることができる。ＳＭＬは、化粧品又は栄養食品用の油中水型又は水中油型乳剤を安定化するように設計することができる。ＳＭＬはまた、下でより詳細に述べるように、薬物又はプロドラッグとして作用するように設計することができる。
【００７４】
両親媒性である本開示の化合物は、溶液中、乳剤中で、又は乾燥粉末として、単独若しくは他の成分とともに様々な構造を形成し、したがって、多くの用途に利用することができる。ＳＭＬ化合物は、例えば、凝集体、層、粒子、乳濁液、構造化相（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｐｈａｓｅｓ）などを形成し得るものであり、そのような目的のために微調整することがきる。したがって、化合物は、１つ又は複数のそのような構造を含む組成物として、例えば、乳剤又はリポソーム組成物として、並びに特に、治療用組成物、医薬組成物、化粧用組成物及び検出用組成物として調製することができる。
【００７５】
ＳＭＬ化合物及び組成物は、特有な特性を有する。そのような１つの特性は、安定剤としてなにも用いない、又は遊離ステロールを用いるものと比較して様々な脂質系の安定性を改善するＳＭＬの能力である。例えば、ＳＭＬは、脂質系並びに対応する遊離ステロールを安定化することができるが、ＳＭＬは、脂質系からはるかに遅く移動し、ひいてはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで脂質系の安定性を改善する（例えば、一般的に標準的な脂質系の使用を制限する様々な生理的及び他の条件下での解離、分解又は漏れに対する抵抗性の増加）。したがって、１つ又は複数のＳＭＬ化合物を含む脂質系は、安定剤を用いない、又は遊離ステロール（例えば、遊離コレステロール）を安定剤として用いる従来の脂質系より有効な適用を可能にする。ＳＭＬは、本明細書でさらに述べるように他の有利な特性を有する。
【００７６】
１つの利点は、ＳＭＬ化合物は、問題とする薬剤として単独で、又は問題とする薬剤の送達におけるように他の成分と組み合せて用いることができる。例えば、ＳＭＬそれ自体は、治療薬、化粧品又は検出可能な物質を含んでいてよい。治療用又は化粧用ＳＭＬとして、ＳＭＬの親水性頭部、及び／又は１つ若しくは複数の親水性尾部は、ステロイドホルモン若しくはその誘導体を含むステロールを含む尾部、及び／又はカルニチンなどの親水性物質を含む頭部などの治療薬又は化粧品を含んでいてよい。検出可能なＳＭＬとして、化合物は、検出可能な標識で標識することができ、或いはＳＭＬそれ自体がコントラスト画像法適用分野に適する微小泡を形成する場合に造影剤として利用することができる。
【００７７】
他の利点は、標準的脂質系と比較して、安定化脂質系を用いることによって利益を得ることができる広範囲な適用分野があることである。例えば、問題とする薬物の送達のために他の成分と組み合せて用いる場合、ＳＭＬは、安定化乳剤又はリポソーム製剤などの安定化脂質製剤として提供することができる。
【００７８】
特に重要な脂質系の適用の例としては、非経口薬物投与のためのドキソルビシン、エピルビシン、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、５−フルオロウラシル、シタラビン、シスプラチン、タモキシフェン、イマチニブ、イリノテカンなどの毒性薬物の安定な薬物担体としてのＳＭＬ及び組成物の使用が挙げられる。他の例としては、同じ担体における２つ以上の薬物の安定な薬物担体としてのＳＭＬ及び組成物の使用が挙げられる。他の例としては、吸入による肺内送達のためのトブラマイシンなどの抗菌化合物の安定な薬物担体としての、アンホテリシンＢ又はレチノイン酸のような水に対する不十分な溶解度を有する薬物の薬物送達システムとしてのＳＭＬの使用が挙げられる。さらなる例としては、佐剤及び／又はワクチン担体としての安定な小胞としてのＳＭＬの使用が挙げられる。さらなる例としては、磁気共鳴造影剤又は放射性造影剤などの造影剤の安定な担体としてのＳＭＬの使用が挙げられる。さらなる例としては、酵素感受性薬物の送達のためのリポソームプロドラッグとしてのＳＭＬ、還元感受性薬物の送達のための脂質組成物、脂質ラフトのモデリング及び膜タンパク質の送達のためのスフィンゴシンを有するＳＭＬ、スキンケア製品用のレチノイン酸を有するＳＭＬ乳剤の使用、及び超音波診断における微小泡用のＳＭＬの使用が挙げられる。他の例としては、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾核酸などの生体巨大分子の送達のためのナノ粒子としてのＳＭＬ及び組成物の使用、又はタンパク質の安定化のためのナノ粒子としての使用、高コレステロール血症の治療のための栄養製品におけるシトステロール若しくはスチグマステロールを含むＳＭＬの使用、及びバイオセンサーとしてのＳＭＬ及び組成物の使用が挙げられる。
【００７９】
ステロール修飾両親媒性脂質
本開示の化合物は、少なくとも１つがステロールである２つ以上の疎水性尾部を有する両親媒性脂質化合物である。親水性頭部は、一般的に２つ又は３つの疎水性尾部に結合しているが、４つの疎水性尾部を有するジホスファチジルグリセロール頭構造（カルジオジピンの場合のように）に基づくステロール修飾両親媒性脂質のように、それ以上のものを含んでいてよい。
【００８０】
化合物は、１）ステロールを親水性頭部に共有結合させる、及び２）化合物は２つ以上の疎水性尾部を有する両親媒性分子であるという少なくとも２つの一般的な原則に基づいて設計される。したがって、ＳＭＬ化合物は、設計上の著しい柔軟性、並びに１）２つの尾部の全体的疎水性と頭部の親水性とのバランス、及び２）特定のステロール修飾両親媒性脂質の所望の機能（例えば、送達を促進するための乳剤又はリポソームとしての使用、対プロドラッグ又は薬物自体としての機能など）などの所定の最終用途における特性の微調整を可能にする。
【００８１】
対象化合物は、脂質系に十分なステロールを組み込んで、ステロール修飾両親媒性脂質が存在する系を安定化することを促進するだけでなく、ステロールは共有結合して系と強く会合するので、構造からのステロールの移動も抑制する可能性がある。例えば、リポソーム中のステロール修飾両親媒性脂質は、リポソームを安定化し、生理的条件（生体液の存在下、例えば、血清の存在下３７℃）下でのリポソーム内容物の漏れに対する抵抗性の増大をもたらすことができる。
【００８２】
ＳＭＬ化合物のステロール成分に関しては、ステロール基は、一般的に、ＳＭＬの親水性頭部に対する共有結合に使用される官能基を有する（又は修飾されて有する）ステロール化合物に基づく又は由来する天然又は合成構造である。例えば、生物源からのステロールは、遊離ステロールアルコール、アシル化（ステロールエステル）、アルキル化（ステリルアルキルエーテル）、硫酸化（硫酸コレステロール）又はそれ自体アシル化（アシル化ステロールブリコシド）されていることがあり得るグリコシド部分に結合した（ステリルグリコシド）状態として通常見いだされる（例えば、参照がその全体として組み込まれている、例えば、Ｆａｈｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）、第４６巻、８３９〜８６１頁を参照）。例としては、（１）動物ステロール、コレステロール及び特定のステロイドホルモンなどの、本明細書で「動物ステロール」と呼ぶ動物源から得られるステロール、並びに（２）カンペステロール、シトステロール、スチグマステロール及びエルゴステロール植物ステロールなどの、本明細書で「ステロール」と呼ぶ植物、菌類及び海洋源から得られるステロールが挙げられる。これらのステロールは、一般的に、通常環Ａの３位、他の位置又はその組合せの位置に少なくとも１つの遊離ヒドロキシル基を有するか、或いは必要に応じて適切なヒドロキシル又は他の官能基を組み込むように修飾することができる。したがって、ＳＭＬの構造、組成及び／又は所定の最終用途によって、ステロール成分は、ステロール構造の様々な位置でＳＭＬ化合物に結合させることができる。
【００８３】
特に重要なステロールは、ＳＭＬの頭部への結合のための特有な官能基を有する単純ステロールである。特に重要なものとして挙げられるものは、特有な官能基がヒドロキシルである単純ステロール、及び特に、環Ａの３位に位置するヒドロキシル基を有する単純ステロールアルコールである（例えば、コレステロール、β−シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール及びブラシカステロール、エルゴステロールなど、並びにその誘導体）。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ＳＭＬは、少なくとも１つの単純ステロールを含む。他の実施形態において、ＳＭＬは、ステロールの環Ａの３位でＳＭＬ頭部に結合した少なくとも１つの単純ステロールを含む。特定の実施形態において、ＳＭＬは、ステロールの環Ａの３位でＳＭＬ頭部に結合した少なくとも１つの単純ステロールを含み、チオコレステロールなどのステロールが、環Ａの３位に位置する１つのヒドロキシル基を有する単純ステロールに基づく又は由来するものである（例えば、コレステロール、β−シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール及びブラシカステロール、エルゴステロールなど、並びにその誘導体）。
【００８５】
特定の実施形態において、ＳＭＬのステロール成分は、胆汁酸又は胆汁酸塩以外である。他の実施形態において、ＳＭＬのステロール成分は、ステロイド以外である。いくつかの実施形態において、ＳＭＬのステロール成分は、ステロイド抱合体以外である。特定の実施形態において、ＳＭＬのステロール成分は、セコステロイド以外である。
【００８６】
他の実施形態において、ＳＭＬ化合物は、胆汁酸成分を含んでいてよい。例えば、特に重要な胆汁酸成分を含むＳＭＬ化合物の１つのクラスは、胆汁酸のカルボキシル基が、疎水性鎖を変化させることができる次の分子：Ｄ−エリスロスフィンゴシン、スフィンゴシン−１−リン酸、スフィンゴシンホスホリルコリン（リソスフィンゴミエリン）、グリコシル化スフィンゴシン、スフィンガニン、スフィンガニン−１−リン酸、スフィンガニンホスホリルコリンなどのアミンに結合している化学種である。問題とする胆汁酸成分を含むＳＭＬ化合物の第２のクラスは、胆汁酸が、グリセロールホスホコリンの１つ又は２つのヒドロキシル基に結合しているものである。
【００８７】
他の実施形態において、ＳＭＬ化合物は、適切な結合基を介して疎水性鎖を変化させることができる次の分子：Ｄ−エリスロスフィンゴシン、スフィンゴシン−１−リン酸、スフィンゴシンホスホリルコリン（リソスフィンゴミエリン）、グリコシル化スフィンゴシン、スフィンガニン、スフィンガニン−１−リン酸、スフィンガニンホスホリルコリンなどに、或いは他の実施形態において、他のリン脂質基に結合しているステロイド成分、ステロイド抱合体成分及び／又はセコステロイド成分を含んでいてよい。
【００８８】
特定の重要な具体例としてのＳＭＬは、次の通りである：置換又は非置換コレステロールを含むＳＭＬ、置換又は非置換β−シトステロールを含むＳＭＬ、置換又は非置換スチグマステロールを含むＳＭＬ、置換又は非置換カンペステロールを含むＳＭＬ、置換又は非置換ブラジカステロールを含むＳＭＬ、及び置換又は非置換エルゴステロールを含むＳＭＬ。
【００８９】
コレステロールが特に重要である。問題とするコレステロールクラス（置換のコレステロールを含む）の代表的なステロールは、例えば、次のもの（表１を参照）を含む：（１）コレステロール（羊毛）、コレステロール（植物由来）、デスモステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、チオコレステロール、アクリル酸３−コレステリルなどの天然及び合成ステロール、（２）コレスタノール及びコレステノンなどのＡ環置換オキシステロール、（３）７−ケトコレステロール、５α，６α−エポキシコレスタノール、５β，６β−エポキシコレスタノール及び７−デヒドロコレステロールなどのＢ環置換オキシステロール、（４）１５−ケトコレステン及び１５−ケトコレスタンなどのＤ環置換オキシステロール、（５）２５−ヒドロキシコレステロール、２７−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｒ／Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、２４（Ｒ／Ｓ），２５−エポキシコレステロール及び２４（Ｓ），２５−エポキシコレステロールなどの側鎖置換オキシステロール、（６）２４−ジヒドロラノステロール及びラノステロールなどのラノステロール、（７）Ｆ７−コレステロール、Ｆ７−５α，６α−エポキシコレスタノール、Ｆ７−５β，６β−エポキシコレスタノール及びＦ７−７−ケトコレステロールなどのフッ素化ステロール、（８）２５−ＮＢＤコレステロール、デヒドロエルゴステロール及びコレステロールトリエンなどの蛍光コレステロール。これらの化合物は、重水素化及び非重水素化形を含んでいてもよく、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．などから市販されている。
【００９０】
【表１】
2011503188.tif 000003
【表２】
2011503188.tif 000004
【表３】
2011503188.tif 000005
【表４】
2011503188.tif 000006
【００９１】
ＳＭＬ化合物は、ラセミ又は立体的に純粋な化合物として提供することができる。いくつかの実施形態において、ＳＭＬ化合物は、立体化学的に純粋である。他の実施形態において、ラセミＳＭＬを提供する。例えば、リソスフィンゴミエリン及びリソＰＣを含むＳＭＬは１つの異性体を得るために合成することができる（結合しているものがラセミでない場合）が、他の経路ではラセミ化合物が得られる。頭部の一部としてアミノ酸分枝コアを有するＳＭＬの場合、これらは、Ｄ若しくはＬ形として、又はラセミ化合物として存在し得る。したがって、ＳＭＬは、Ｄ若しくはＬ異性体として、又はラセミ化合物として（合成に用いる形によって）提供することができる。分枝コアとして特に有用であるアミノ酸は、リシン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ジアミノ酢酸、アミノエチルグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、チロシン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、ヒドロキシルプロリン、δ'，δ'−ビスアミノプロピルオルニチン、プロパギルグリシン及び３，５−アミノ安息香酸などである。
【００９２】
少なくとも１つの非ステロール疎水性尾部を含むＳＭＬ化合物については、（１つ又は複数の）非ステロール疎水性尾部は、飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換脂肪族鎖を含む。特に重要なものとして挙げられるものは、約２〜約４０個の炭素原子長を含む非ステロール疎水性尾部であり、飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換であってよい。例えば、この場合のＳＭＬの非ステロール部分は、２〜４０個の炭素原子、通常４〜３０個の炭素原子、通常４〜２５個の炭素原子、より通常６〜２４個の炭素原子、より通常１０〜２０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換炭化水素鎖である。
【００９３】
非ステロール部分が、アルキル基で飽和された鎖などの飽和脂肪族炭化水素鎖に基づく置換脂肪族炭化水素鎖である場合、アルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上の個数の炭素原子（一般的に約１０個以下の炭素原子）は、酸素、ケイ素、硫黄又は窒素原子から選択されるヘテロ原子により置換することができ、アルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上の個数の水素原子（一般的に水素原子の総数以下である）は、フッ素で置換することができる。
【００９４】
特に重要な非ステロール鎖の例は、Ｆａｈｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）、第４６巻、８３９〜８６１頁に記載されている脂質に由来するもののような、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、プレノール脂質及び糖脂質のような様々な脂質に基づく、又は由来するものである。
【００９５】
ＳＭＬ化合物の疎水性尾部の炭化水素鎖における炭素の数は分子の望ましい親油性に従って選択することができることを注意すべきである。分子の親油性は、選択される鎖長と直接相関する。ステロール修飾両親媒性脂質をリポソームに用いなければならない場合、分子に安定な小胞を形成するのに適する疎水性を与える１０〜２０個の炭素原子を有する分子が特に重要である。酸素などのヘテロ原子による炭化水素鎖のアルキレン基の（１つ又は複数の）炭素原子の置換は、分子の親油性に対する望ましい効果をもたらし得る。同じ原理がフッ素化炭化水素鎖に当てはまる。したがって、１つ又は複数の疎水性尾部の望ましい炭化水素鎖長は、ヘテロ原子置換の程度によって異なる可能性がある。置換脂肪族炭化水素鎖は、芳香族（例えば、フェニル若しくは置換フェニル）又はヘテロ芳香族（例えば、ピリジン若しくは置換ピリジン）などの１つ又は複数のアリール又はヘテロアリール基で置換されたものを含んでいてよいことも指摘される。
【００９６】
ＳＭＬ化合物は、疎水性尾部を開裂（酵素的又は化学的開裂）により親化合物から放出させることができるものも含む。例えば、ＳＭＬにおける１つ又は複数の共有結合は、エステラーゼ又はアルカリｐＨ条件に曝露したエステル結合のように、あらかじめ選択した条件下で開裂することができる。他の例において、還元条件下で開裂させることができる、ジスルフィド結合がＳＭＬに存在する。特に重要なものとして挙げられるものは、疎水性尾部の少なくとも１つが開裂性結合によりＳＭＬに結合している疎水性物質又は薬物を含むＳＭＬである。
【００９７】
特定の実施形態において、ＳＭＬの１つ又は複数の疎水性尾部は、１０，１２−トリコサジイン酸などの重合性脂肪酸である。他の実施形態において、ＳＭＬは、（ｉ）６〜３０個の炭素原子を有する短いポリプロピレングリコール鎖、（ｉｉ）３〜３０個のケイ素原子を有するケイ素含有直又は分枝鎖、及び／又は（ｉｉｉ）５〜４０個の炭素原子を有するプレノール脂質を含む１つ又は複数の疎水性尾部を含む。
【００９８】
親水性頭部に関して、ＳＭＬ化合物のこの成分は、荷電基、極性基、又は荷電基と極性基の組合せを含む。荷電基は、陰イオン性及び陽イオン性部分を含む。この状況においてＲにより表される疎水性尾部及び分子の分枝コア部分を有する、陰イオン性基の例は、両親媒性脂質の頭部の共通の荷電官能性を示すホウ酸（ＲＢＯ２Ｈ２）、カルボン酸（ＲＣＯ２−）、硫酸（ＲＳＯ４−）、スルホン酸（ＲＳＯ３−）及びリン酸（ＲＰＯ４Ｈ−）、ホスホン酸（ＲＰＯ３Ｈ−）を含むが、これらに限定されない。陽イオン性基の例は、アミン（ＲＮＨ３＋）、メチル化アミン、スペルミンなどのポリアミンなど、並びに、両親媒性脂質の頭基の荷電機能性も示す、特定のｐＨで両性イオン又は陽イオンとして存在する酸性及び塩基性基の両方を含む（またしたがって両性である）両性電解質（例えば、ヒスチジン）を含むが、これらに限定されない。極性非電荷基は、グリセロールのようなアルコール（−ＯＨ）、糖、極性アミノ酸（両性イオンアミノ酸）及びオリゴエチレングリコールにより例示される。特定の実施形態において、親水性頭部は、コリン、エタノールアミン、グリセロール、核酸、糖、イノシトール、アジド、プロパルギル及びセリンなどの両親媒性脂質糖基の他の付加的な要素を含む。
【００９９】
親水性頭部は、頭部全体が親水性であるならば、アミノ酸若しくは誘導体、ペプチド、金属キレーター、アリール若しくはヘテロアリール誘導体、又は尾部に結合し、荷電若しくは極性特性を有するのに適する構造などの天然又は合成の頭部であってよい。親水性頭部は、ＳＭＬの疎水性尾部への共有結合に用いられる１つ又は複数の官能基を有する（又は有するように修飾された）両親媒性脂質に基づく又は由来する構造であってもよい。例えば、親水性頭部は、Ｆａｈｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）、第４６巻、８３９〜８６１頁に記載されている脂質由来のものなどのグリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質及び糖脂質などの両親媒性脂質の生物源に基づく又は由来のものであってよい。
【０１００】
問題とする親水性頭部の特定の例は、コリン、エタノールアミン、グリセロール、核酸、糖、イノシトール及びセリンから選択される第２の分子の残基と場合によって結合している、ホウ酸（ＲＢＯ２Ｈ２）、カルボン酸（ＲＣＯ２−）、硫酸（ＲＳＯ４−）、スルホン酸（ＲＳＯ３−）及びリン酸（ＲＰＯ４Ｈ−）、ホスホン酸（ＲＰＯ３Ｈ−）、アミン（ＲＮＨ３＋）、グリセロール、乳糖など若しくはヒアルロン酸由来の糖、極性アミノ酸、モノメトキシポリエチレングリコール、分枝ポリエチレングリコール及びオリゴエチレングリコールなどのポリエチレンオキシド（ポリエチレングリコールとしても知られている）から選択される第１の分子を含む頭部を含むが、これらに限定されない。ここで再び、頭部は、他の様々な修飾を含んでいてよく、例えば、オリゴエチレングリコール及びポリエチレンオキシド（ＰＥＧ）頭部の場合、そのようなＰＥＧ鎖は、メチル基で終わっていてよく、或いはさらなる修飾のための末端官能基を有していてよい。
【０１０１】
特に重要な親水性頭部の例は、リン酸、ホスホコリン、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホイノシトール、エチルホスホスホリルコリン、ポリエチレングリコール、ポリグリセロール、トリニトリロ三酢酸、メラミン、グルコサミン、トリメチルアミン、スペルミン、スペルミジン、並びに複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）カルボン酸、硫酸塩、ホウ酸、スルホン酸、硫酸及び糖を含むが、これらに限定されない。再び、頭部は、アジド、マレイミド、ブロモアセチル、２−ピリジルジチオール、アルケン又はプロパルギルのような活性化官能基により末端官能基化されたポリエチレングリコール頭部のような、様々な修飾を含んでいてよい。親水性頭部は、第２の分子の残基を含み、かつ／又はそれと結合していてもよく、ホスホエタノールアミン−Ｎ−［モノメトキシポリエチレングリコール］２０００及びホスホエタノールアミン−Ｎ−スクシニル−Ｎ−トリニトリロ酢酸は特に重要な一部の例である。
【０１０２】
したがって、特定の実施形態において、ＳＭＬは、頭部及び／又は天然アミノ酸を含む分枝コアを含む。他の実施形態において、ＳＭＬは、頭部及び／又は合成アミノ酸を含む分枝コアを含む。「天然アミノ酸」とは、遺伝的にエンコードされるアミノ酸及び天然に存在する他のリボソームにより導入される他のアミノ酸のような生物源から得られるアミノ酸を意味する。「合成アミノ酸」とは、生物源から分離できるもの以外のアミノ酸を意味する。上述のように、そのような天然及び合成アミノ酸の例は、リシン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸、ジアミノ酢酸、アミノエチルグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、チロシン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、ヒドロキシルプロリン、δ'，δ'−ビスアミノプロピルオルニチン、プロパギルグリシン及び３，５−アミノ安息香酸などであり、Ｄ若しくはＬ異性体として、又はラセミ化合物として（合成に用いられる形によって）ＳＭＬに存在し得る。
【０１０３】
さらなる実施形態において、ＳＭＬは、標的リガンドのようなリガンド結合部分を有する親水性頭部を含む。標的リガンドに適合させたＳＭＬは、特定のエピトープに選択的に結合する抗体又はそのフラグメントなどの標的分子との高親和性結合対を選択的に形成することができる。１つの実施形態において、標的リガンドは、金属キレーターである。金属キレーターの例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）及びその誘導体を含むが、これらに限定されない。例えば、トリニトリロ三酢酸（ｔｒｉ−ＮＴＡ）及びその様々な誘導体は、Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．、２００６、第１７巻、１５９２〜１６００頁に記載されている。特色とするＳＭＬは、トリニトリロ三酢酸、及びホスホエタノールアミン−Ｎ−スクシニル−Ｎ−トリニトリロ酢酸などのその誘導体を含む頭部を含み、それらのＳＭＬは、ヒスチジン標識分子を高い親和性で結合させるのに特に有用である。
【０１０４】
特に重要なものとして挙げられるのは、以下の式
（Ｒ１）（Ｒ２）Ｇ−Ｘ                        式Ｉ
を含むＳＭＬであり、
Ｒ１及びＲ２は、疎水性尾部であり、Ｇは、分枝コアであり、Ｘは、親水性頭部であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つはステロールである。
【０１０５】
化合物が少なくとも１つの頭部及び少なくとも１つがステロールである少なくとも２つの疎水性尾部（例えば、式ＩＩＩを参照）を含んでいるとするならば、式ＩのＸ、Ｇ、Ｒ１及びＲ２基は、式Ｉの化合物の１又は複数の他の特徴に個別に寄与し得る。再び、化合物が少なくとも１つの頭部及び少なくとも１つがステロールである少なくとも２つの疎水性尾部を含んでいるとするならば、式Ｉの化合物は、１つ若しくは複数の追加の分枝点、１つ若しくは複数の追加の部、及び／又は１つ若しくは複数の頭部を有する化合物をさらに含んでいてよい。例は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が存在する、カルジオジリピン頭／分枝コア構造に基づくＳＭＬの場合のような、式（Ｒ１）（Ｒ２）Ｇ−Ｘ−Ｇ（Ｒ３）（Ｒ４）のＳＭＬ化合物などであり、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ個別に存在又は非存在である。特に重要なものとして挙げられるのは、単一頭／分枝コア基に結合している２つの疎水性尾部を有する式Ｉのモノステロール及びジステロール両親媒性脂質により例示されるＳＭＬである。
【０１０６】
１つの実施形態において、式Ｉの化合物が１つのステロール部分のみを含む（すなわち、ステロールはＲ１又はＲ２に位置する）場合、非ステロール部分は、約２個〜約４０個の炭素原子長の脂肪族鎖を含み、飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換であってよい。例えば、非ステロール部分（対応するＲ１又はＲ２における）は、２個〜４０個の炭素原子、通常４個〜３０個の炭素原子、通常４個〜２５個の炭素原子、より通常６個〜２４個の炭素原子、より通常１０個〜２０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換炭化水素鎖であり、Ｒ１又はＲ２のアルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上の炭素原子（通常約１０個以下の炭素原子）は、酸素、ケイ素、硫黄又は窒素原子から選択されるヘテロ原子により置換することができ、Ｒ１又はＲ２のアルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上の水素原子（一般に水素原子の総数以下である）は、フッ素で置換することができる。ここで再び、ＳＭＬ化合物の非ステロール疎水性尾部の炭素の数並びに置換の種類及び量は、分子の所望の特性に従って選択することができる。
【０１０７】
１つの実施形態において、モノステロール両親媒性脂質は、式Ｉのものであり、Ｒ１又はＲ２の１つは、動物ステロール又は植物ステロール（例えば、コレステロール、ステロイドホルモン、カンペステロール、シトステロール、エルゴステロール及びスチグマステロールンなど）を含むステロールであり、Ｒ１及びＲ２の１つは、２個〜３０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換炭化水素鎖を含む非ステロール部分であり、Ｇは、親水性頭部ＸにＲ１及びＲ２を結合させる分枝コアである。
【０１０８】
他の実施形態において、式ＩのＲ１又はＲ２の１つは、２個〜４０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換炭化水素鎖である。特定の実施形態において、式ＩのＲ１又はＲ２の１つは、４個〜２４個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換炭化水素鎖である。他の実施形態において、式ＩのＲ１又はＲ２の１つは、６個〜２４個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換炭化水素鎖である。さらなる実施形態において、式ＩのＲ１又はＲ２の１つは、１０個〜２０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換炭化水素鎖である。
【０１０９】
一般的に、式ＩのＲ１又はＲ２の１つが１つ又は複数のアルキレン基を有する不飽和置換脂肪族炭化水素鎖である場合、さらなるＲ１又はＲ２基は、アルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上であるが、一般的に約１０個以下の炭素原子を酸素、ケイ素、硫黄又は窒素原子から選択されるヘテロ原子により置換することができるものを含む。さらに、不飽和Ｒ１又はＲ２脂肪族炭化水素鎖のアルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上の水素原子（一般的に水素原子の総数以下である）は、フッ素で置換することができる。
【０１１０】
特に重要な非ステロール鎖の例は、Ｆａｈｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）、第４６巻、８３９〜８６１頁に記載されている脂質に由来するもののような、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、プレノール脂質及び糖脂質のような様々な脂質に基づく、又は由来するものである。
【０１１１】
他の実施形態において、式Ｉの上の化合物のＲ１又はＲ２は、酵素開裂により親化合物から放出させることができる疎水性薬物である。他の実施形態において、式Ｉの上の化合物によれば、Ｒ１、Ｒ２及びＸは、還元条件に曝露したジスルフィド結合又はアルカリ条件に曝露したエステルのような、あらかじめ選択した条件下で少なくとも１つを開裂することができる共有結合によりＧに結合している。他の実施形態において、式Ｉの上の化合物のＲ１又はＲ２は、１０，１２−トリコサジイン酸などの重合性脂肪酸である。他の実施形態において、式Ｉの上の化合物のＲ１又はＲ２は、６個〜３０個の炭素原子を有する短いポリプロピレングリコール鎖である。他の実施形態において、式Ｉの上の化合物のＲ１又はＲ２は、３個〜３０個のケイ素原子を有するケイ素含有線状又は分枝鎖である。他の実施形態において、式Ｉの上の化合物のＲ１又はＲ２は、５個〜４０個の炭素原子を有するプレノール脂質である。
【０１１２】
１つの実施形態において、式Ｉの上の化合物のＧは、少なくとも３つの結合点を有する分枝コアであり、１つの結合点は、親水性頭部Ｘに結合しており、２つの結合点は、それぞれ別々に親水性尾部Ｒ１及びＲ２に結合している。したがって、特定の実施形態において、Ｇは、以下の構造：
【化１】
2011503188.tif 000007
から選択される化合物のような、Ｒ１、Ｒ２及びＸの結合のための少なくとも３つの官能基を有する化合物に由来する分枝コアであって、ｎは、０、１、２又は３であってよい。この実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、任意の位置にあってよく、残りの位置は、Ｘにより占有されている。したがって、親水性頭部Ｘは、１つの官能基（例えば、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、アミン（−ＮＨ２）又はアルコール（−ＯＨ））に結合しており、親水性尾部Ｒ１及びＲ２は、残りの官能基（例えば、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、アミン（−ＮＨ２）又はアルコール（−ＯＨ））に結合している。
【０１１３】
式ＩにおけるＸは、親水性基、通常は親水性頭部である。特定の実施形態において、親水性基は、荷電基、極性基又は荷電及び極性基の組合せを含む。したがって、ＳＭＬの頭部の全体が親水性であるならば、親水性基Ｘ（又はＧ−Ｘ）は、アミノ酸若しくは誘導体、アリール若しくはヘテロアリール誘導体、又は尾部に結合し、荷電若しくは極性特性を有するあらゆる適切な構造などの合成基であってよい。特に重要なアリール若しくはヘテロアリール誘導体親水性基Ｘの例は、クロモリン及びグリコール酸クロモリン（Ｇ−Ｘ）である。親水性基Ｘ（又はＧ−Ｘ）は、ＳＭＬの疎水性尾部への共有結合に用いられる１つ又は複数の官能基を有する（又は有するように修飾された）両親媒性脂質に基づく又は由来する構造であってもよい。例えば、親水性頭部Ｘ（又はＧ−Ｘ）は、Ｆａｈｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）、第４６巻、８３９〜８６１頁に記載されている脂質由来のものなどのグリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質及び糖脂質などの両親媒性脂質の生物源に基づく又は由来のものであってよい。Ｘ及びＧ−Ｘの具体例としての基は、リン酸、ホスホコリン、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホイノシトール、エチルホスホスホリルコリン、ポリエチレングリコール、ポリグリセロール、メラミン、グルコサミン、ヒアルロン酸及びトリメチルアミンを含むが、これらに必ずしも限定されない。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、Ｇ−Ｘは、問題とする部分により供給される。例えば、下でより詳細に述べるように、Ｇ−Ｘは、式Ｉに従って次にＲ１又はＲ２に結合する、カルニチンにより供給することができる。
【０１１５】
他の実施形態において、Ｇ−Ｘは、式Ｉに従って次にＲ１又はＲ２基（少なくとも２つで、４つまで）に結合する、ジホスファチジルグリセロール（例えば、カルジオリピンの場合と同様に）により供給される。
【０１１６】
特に重要な具体例としての化合物は、Ｇがグリセロールであり、Ｘがホスホコリンである、一般式Ｉの化合物である。
【０１１７】
他の実施形態において、式Ｉの上の化合物のＲ１−Ｇは、スフィンゴシン及びスフィンゴニンから選択される。他の実施形態において、式Ｉの上の化合物のＧ−Ｘは、カルニチンである。
【０１１８】
特に重要なものとして挙げられるのは、脂肪酸尾部の代わりに置換された少なくとも１つのステロールを有するグリセロールコアを有する脂質を意味する、ステロールグリセロリン脂質である。ステロールグリセロリン脂質の例は、グリセロール部分に結合した少なくとも１つのステロール残基、及び例えば、含窒素塩基、グリセロール又はイノシトール単位からなる極性頭部を含むｓｎ−グリセロ−３リン酸の任意の誘導体などである。モノステロールグリセロリン脂質については、ステロールがグリセロール部分の１つの残基に結合しており、グリセロール部分の他の残基は、例えば、Ｏ−アシル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルカ−１'−エニル又はＯ−カルバメートである。それらは、ステロール及び脂肪酸の同じ又は異なるサブユニットであってよい。
【０１１９】
ステロールグリセロリン脂質の特定の具体例としての実施形態において、化合物は、Ｇがグリセロールであり、Ｘがホスホコリンである、式Ｉの化合物である。特に重要な化合物は、以下の一般式ＩＩ：
【化２】
2011503188.tif 000008
を有するもの又はその製薬上許容できる塩として記述され、式中Ｒ１及びＲ２は独立に疎水性部分であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つはステロールであり、Ｒ１又はＲ２の１つのみがステロールである場合、非ステロール部分は、２個〜４０個の炭素原子、通常４個〜２５個の炭素原子、より通常６個〜２４個の炭素原子、より通常１０個〜２０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換炭化水素鎖であり、Ｒ１（又はＲ２）のアルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上の個数の炭素原子は、酸素、硫黄又は窒素原子から選択されるヘテロ原子により置換することができ、Ｒ１（又はＲ２）のアルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上の個数の水素原子は、フッ素で置換することができる。Ｒ１（又はＲ２）の非ステロール部分は、上述のいずれかの非ステロール部分であってよい。
【０１２０】
特定の実施形態において、式ＩＩの化合物は、下の表２に示す通りである。
【表５】
2011503188.tif 000009
ａ一般構造については式ＩＩ参照；ｂ，ｃ，ｅｎ＝１８，１６，１４；ｄ，ｆｎ＝１７，１５，１３。ｇCHEMS＝コレステリルヘミコハク酸；ｈStigHS＝スチグマステリルヘミコハク酸；ｉSitoHS＝サイトステリルヘミコハク酸。
【０１２１】
さらなる特定の実施形態において、Ｒ１、Ｇ及びＸがスフィンゴシンホスホリルコリン（リソスフィンゴミエリン）に含まれ、Ｒ２がステロールである、以下の式ＩＩＩ：
【化３】
2011503188.tif 000010
の化合物、又はその製薬上許容できる塩である。
【０１２２】
特に重要な式ＩＩＩの化合物の例は、Ｒ２がヘミコハク酸コレステロール又は他のステロール誘導体であるものである。
【０１２３】
上の式Ｉに反映されているように、本開示は、Ｒ１又はＲ２の１つがステロールである化合物、並びにＲ１及びＲ２がステロールである化合物を予期する。そのような実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、それらが同じ又は異なるステロールであり得るように独立に選択される。特に有用なステロイドの組合せの例は、コレステロールとエルゴステロール、コレステロールとシトステロール、コレステロールとスチグマステロール、及びスチグマステロールとシトステロールである。
【０１２４】
特に重要な具体例としてのＳＭＬは、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、カルニチン脂質及びアミノ酸脂質から選択される両親媒性脂質に基づく又は由来するものなどである。例えば、アミノ酸脂質は、リン酸修飾アミノ酸親水性頭部に結合している脂質である。
【０１２５】
例は、以下を含むが、それらに限定されない：
【０１２６】
（１）ＳＭＬ１ａ、ＳＭＬ１ｂ、ＳＭＬ１ｃ、ＳＭＬ２ａ、ＳＭＬ２ｂ、ＳＭＬ２ｃ、ＳＭＬ２ｄ、ＳＭＬ３ａ、ＳＭＬ３ｂ、ＳＭＬ３ｃ、ＳＭＬ３ｄ、ＳＭＬ４ａ、ＳＭＬ４ｂ、ＳＭＬ４ｃ、ＳＭＬ４ｄ、ＳＭＬ５ａ、ＳＭＬ５ｂ、ＳＭＬ５ｃ、ＳＭＬ５ｄ、ＳＭＬ６ａ、ＳＭＬ６ｂ、ＳＭＬ６ｃ、ＳＭＬ６ｄ、ＳＭＬ７ａ、ＳＭＬ７ｂ、ＳＭＬ９ａ、ＳＭＬ９ｂ、ＳＭＬ９ｃ、ＳＭＬ１０ａ、ＳＭＬ１０ｂ、ＳＭＬ１０ｃ、ＳＭＬ１０ｄ、ＳＭＬ１０ｅ、ＳＭＬ１０ｆ、ＳＭＬ１３ａ、ＳＭＬ１３ｂ、ＳＭＬ１３ｃ、ＳＭＬ１３ｄ、ＳＭＬ１３ｅ、ＳＭＬ１３ｆ、ＳＭＬ１３ｇ、ＳＭＬ１３ｈ、ＳＭＬ１５ａ、ＳＭＬ１５ｂ、ＳＭＬ１５ｃ、ＳＭＬ１５ｄ、ＳＭＬ１５ｅ、ＳＭＬ１５ｆ、ＳＭＬ１５ｇ、ＳＭＬ１５ｈ、ＳＭＬ１５ｉ、ＳＭＬ１５ｊ、ＳＭＬ１５ｋ、ＳＭＬ１６ａ、ＳＭＬ１６ｂ、ＳＭＬ１６ｃ、ＳＭＬ１６ｄ、ＳＭＬ１６ｅ、ＳＭＬ１６ｆ、ＳＭＬ１６ｇ、ＳＭＬ１６ｈ、ＳＭＬ１６ｉ、ＳＭＬ１６ｊ、ＳＭＬ１６ｋ、ＳＭＬ１６ｌ及びＳＭＬ１６ｍ並びにその誘導体から選択される化合物などの式ＩＩによるステロール修飾グリセロリン脂質；
【０１２７】
（２）ＳＭＬ８ａ、ＳＭＬ８ｂ、ＳＭＬ８ｃ、ＳＭＬ８ｄ、ＳＭＬ８ｅ及びＳＭＬ８ｆ並びにその誘導体から選択される化合物などの式ＩＩＩによるステロール修飾スフィンゴリン脂質；
【０１２８】
（３）ＳＭＬ１１ａ、ＳＭＬ１１ｂ、ＳＭＬ１１ｃ、ＳＭＬ１１ｄ、ＳＭＬ１１ｅ及びＳＭＬ１１ｆ並びにその誘導体から選択される化合物などの式Ｉによるステロール修飾カルニチン脂質；
【０１２９】
（４）ＳＭＬ１２ａ、ＳＭＬ１２ｂ、ＳＭＬ１２ｃ、ＳＭＬ１２ｄ、ＳＭＬ１２ｅ、ＳＭＬ１２ｆ、ＳＭＬ１３ｉ、ＳＭＬ１３ｊ及びＳＭＬ１３ｋ並びにその誘導体から選択される化合物などの、特に親水性頭部がアミノ酸を含む式Ｉによるステロール修飾アミノ酸脂質；並びに
【０１３０】
（５）ＳＭＬ１４ａ、ＳＭＬ１４ｂ、ＳＭＬ１４ｃ、ＳＭＬ１４ｄ、ＳＭＬ１４ｅ及びＳＭＬ１４ｆ並びにその誘導体から選択される化合物などの、アジド、マレイミド、ブロモアセチル、２−ピリジルジチオール、アルケン及びプロパルギルなどの活性化部分により末端官能基化されている活性化親水性頭部を有する式Ｉによるステロール修飾両親媒性脂質。
【０１３１】
したがって、特色とする実施形態は、ＳＭＬ１ａ、ＳＭＬ１ｂ、ＳＭＬ１ｃ、ＳＭＬ２ａ、ＳＭＬ２ｂ、ＳＭＬ２ｃ、ＳＭＬ２ｄ、ＳＭＬ３ａ、ＳＭＬ３ｂ、ＳＭＬ３ｃ、ＳＭＬ３ｄ、ＳＭＬ４ａ、ＳＭＬ４ｂ、ＳＭＬ４ｃ、ＳＭＬ４ｄ、ＳＭＬ５ａ、ＳＭＬ５ｂ、ＳＭＬ５ｃ、ＳＭＬ５ｄ、ＳＭＬ６ａ、ＳＭＬ６ｂ、ＳＭＬ６ｃ、ＳＭＬ６ｄ、ＳＭＬ７ａ、ＳＭＬ７ｂ、ＳＭＬ８ａ、ＳＭＬ８ｂ、ＳＭＬ８ｃ、ＳＭＬ８ｄ、ＳＭＬ８ｅ、ＳＭＬ８ｆ、ＳＭＬ９ａ、ＳＭＬ９ｂ、ＳＭＬ９ｃ、ＳＭＬ１０ａ、ＳＭＬ１０ｂ、ＳＭＬ１０ｃ、ＳＭＬ１０ｄ、ＳＭＬ１０ｅ、ＳＭＬ１０ｆ、ＳＭＬ１１ａ、ＳＭＬ１１ｂ、ＳＭＬ１１ｃ、ＳＭＬ１１ｄ、ＳＭＬ１１ｅ、ＳＭＬ１１ｆ、ＳＭＬ１２ａ、ＳＭＬ１２ｂ、ＳＭＬ１２ｃ、ＳＭＬ１２ｄ、ＳＭＬ１２ｅ、ＳＭＬ１２ｆ、ＳＭＬ１３ａ、ＳＭＬ１３ｂ、ＳＭＬ１３ｃ、ＳＭＬ１３ｄ、ＳＭＬ１３ｅ、ＳＭＬ１３ｆ、ＳＭＬ１３ｇ、ＳＭＬ１３ｈ、ＳＭＬ１３ｉ、ＳＭＬ１３ｊ、ＳＭＬ１３ｋ、ＳＭＬ１４ａ、ＳＭＬ１４ｂ、ＳＭＬ１４ｃ、ＳＭＬ１４ｄ、ＳＭＬ１４ｅ、ＳＭＬ１４ｆ、ＳＭＬ１５ａ、ＳＭＬ１５ｂ、ＳＭＬ１５ｃ、ＳＭＬ１５ｄ、ＳＭＬ１５ｅ、ＳＭＬ１５ｆ、ＳＭＬ１５ｇ、ＳＭＬ１５ｈ、ＳＭＬ１５ｉ、ＳＭＬ１５ｊ、ＳＭＬ１５ｋ、ＳＭＬ１６ａ、ＳＭＬ１６ｂ、ＳＭＬ１６ｃ、ＳＭＬ１６ｄ、ＳＭＬ１６ｅ、ＳＭＬ１６ｆ、ＳＭＬ１６ｇ、ＳＭＬ１６ｈ、ＳＭＬ１６ｉ、ＳＭＬ１６ｊ、ＳＭＬ１６ｋ、ＳＭＬ１６ｌ及びＳＭＬ１６ｍ（これらの化合物は表３に示す）並びにその誘導体から選択されるＳＭＬ化合物を含む。
【０１３２】
【表６】
2011503188.tif 000011
【０１３３】
【表７】
2011503188.tif 000012
【０１３４】
【表８】
2011503188.tif 000013
【０１３５】
【表９】
2011503188.tif 000014
【０１３６】
【表１０】
2011503188.tif 000015
【０１３７】
ステロール修飾両親媒性脂質の特性
本開示のステロール修飾両親媒性脂質は、リポソームにおけるような二重層で存在するとき、様々な物理的特性を示すように設計することができる。そのような物理的特性の例は、相転移挙動、エンタルピー及びリポソーム内容物の漏れに対する抵抗性である。例えば、本開示のＳＭＬを含むリポソームの安定性は、１つ又は複数の内容物漏れアッセイ、すなわち、生理的条件下（例えば、血清の存在下３７℃）又は浸透応力に曝露したときの漏れにより評価することができる。合成ジアシルリン脂質の転移温度及びエンタルピーに対するＳＭＬの影響もそれらを特徴づけるのに用いることができる。
【０１３８】
１つの実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質は、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％未満から検出できないリポソーム内容物の漏れが約７日間の期間にわたり検出されるような、生理的ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下（又はそのようなｉｎ  ｖｉｖｏ生理的条件を模擬するｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下）で漏れに抵抗性のある安定化リポソームを提供する。さらなる実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質は、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満又は５％未満又は１％未満から検出できないリポソーム内容物の漏れが約１４日間の期間にわたり検出されるような、生理的条件下で漏れに抵抗性のあるリポソームを提供することができる。さらに、ステロール修飾両親媒性脂質は、約８０％、９０％若しくはそれ以上のリポソーム内容物が生理的条件下で約７日間維持され、約６０％、７０％、８０％、９０％若しくはそれ以上のリポソーム内容物が生理的条件下で約１４日間維持され、約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくはそれ以上のリポソーム内容物が生理的条件下で約２１日間維持され、かつ／又は約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくはそれ以上のリポソーム内容物が生理的条件下で約２８日間維持されるような、漏れに抵抗性のあるリポソームを提供することができる。
【０１３９】
特定の実施形態において、安定化リポソーム組成物は、通常少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％であり、１５％〜９０％、１５％〜３５％、３０％〜７０％、３５％〜８０％、３５％〜６５％又は４０％〜７０％であってよく、より高い量、例えば、リポソームの総脂質モル含量の９０％〜９５％又はそれ以上として存在していてよい、モル含量のステロール修飾両親媒性脂質を含む。特定の実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質のステロール（例えば、コレステロール）は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％又はそれ以上のステロールのモル含量を有するようにリポソーム組成物中に存在する。特定の実施形態において、リポソーム組成物は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも７０％、少なくとも８５％又はそれ以上のモル含量のモノステロール修飾両親媒性脂質を含む。他の特定の実施形態において、リポソーム組成物は、約１５％〜３５％であり、少なくとも３０％又はそれ以上、少なくとも４０％、少なくとも４５％又はそれ以上であってよい、モル含量のジステロール修飾両親媒性脂質を含む。
【０１４０】
プロドラッグ、薬物としてのステロール修飾両親媒性脂質及び望ましい特性
本開示のステロール修飾両親媒性脂質は、望ましい物理的特性（例えば、親油性）及び／又は機能活性（例えば、薬物又はプロドラッグとしての活性）などの望ましい特性を有するように設計することができる。
【０１４１】
例えば、本開示のステロール修飾両親媒性脂質は、プロドラッグ、すなわち、より低い活性形からより高い活性形に変換することができる（通常、化合物が投与される被検体の体内で）化合物として作用するように設計することができる。したがって、１つの実施形態において、一般式Ｉの上の化合物のＲ１又はＲ２は、酵素開裂により親化合物から放出させることができる疎水性薬物である。したがって、例えば、一般式Ｉは、Ｒ１が問題とする薬物であり、Ｒ２がステロールである化合物を予期するものである。安定なリポソームは、ステロール修飾両親媒性脂質プロドラッグ単独又は最小限の相補的成分により達成することができ、それによりプロドラッグ製剤設計を単純化することができるため、単一のステロール修飾両親媒性脂質へのステロール及び薬物の組み込みは、従来のリポソームプロドラッグと比べて有利であり得る。さらに、共有結合したステロールは生体液中のリポソームプロドラッグの安定化を促進することができ、そのため、リポソームは、標的治療部位、例えば、プロドラッグの開裂が体内の他の部位と比較して促進される部位（例えば、高い酵素活性、又は７．４より低い若しくは高いｐＨの部位など）に徐々に蓄積し得る。
【０１４２】
一般式Ｉによる化合物がプロドラッグである場合、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは、ステロールであり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも１つは、疎水性薬物である。具体例としての疎水性薬物は、ステロール（ステロイドなど）、カロテノイド、ビタミン、脂肪酸、小分子疎水性薬物、分化因子及び麻酔薬などである。疎水性薬物の例は、レチノイン酸（例えば、全トランスレチノイン酸；１３−シスレチノイン酸）、ステロイド及び誘導体（例えば、Ｃ１８ステロイド（エストロゲン及び誘導体；Ｃ１９ステロイド（アンドロゲン、テストステロン及びアンドロステロンなど）及び誘導体；Ｃ２１ステロイド（グルコ／鉱質コルチコイド、プロゲステロン並びにグルココルチコイド及び鉱質コルチコイド、並びに誘導体）、並びにセコステロイド及び誘導体（コア構造の開Ｂ環を特徴とし、したがって「セコ」接頭辞がある、例えば、ビタミンＤ２及び誘導体；ビタミンＤ３及び誘導体）を含むが、これらに必ずしも限定されない。特に重要なものとして挙げられるのは、Ｒ１が単純ステロールであり、Ｒ２が疎水性薬物である、式Ｉのプロドラッグ化合物である。１つの実施形態において、Ｒ１はステロールであり、Ｒ２はレチノイン酸である。Ｇ−Ｘがホスホコリンである場合、ｓｎ−２位におけるエステル結合は、ホスホリパーゼＡ２により開裂され、レチノイン酸の放出がもたらされる可能性がある。当業者は、所望の薬物のＳＭＬリポソームプロドラッグの調製において多くの変形及び修飾を行うことができることを認識するであろう。
【０１４３】
ステロール修飾両親媒性脂質をプロドラッグとして提供することが望ましい場合、Ｒ１、Ｒ２及びＸは、少なくとも１つが所望の条件下で開裂を受けやすいような共有結合により式ＩのＧに結合させる。例えば、ステロール修飾両親媒性脂質は、酵素開裂可能、還元条件下で開裂可能、又は低ｐＨ下で開裂可能であり得る。例えば、Ｒ１、Ｒ２及びＸは、少なくとも１つが還元条件下で開裂可能である共有結合により式ＩのＧに結合させることができる。例えば、開裂が還元環境により誘発されるように、ジスルフィド結合をＲ２とＸの間に導入することができる。本発明の化合物は、細胞内環境、例えば、サイトゾル中、細胞内小胞（例えば、エンドソーム、食作用小胞）内などに見いだされるような還元環境を特徴とする特定の部位における薬物の誘発性放出に有用である。
【０１４４】
ステロール修飾両親媒性脂質は、非共有電荷−電荷相互作用により負に荷電した治療用構成成分の送達を促進するように、陽イオン性頭部を有するように設計することもできる。例えば、式ＩのＧ−Ｘは、身体の代謝過程における必須分子であるカルニチンであってよい。本発明の化合物は、培養細胞内及びｉｎ  ｖｉｖｏ細胞内へのＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡなどの核酸の送達に有用なツールを提供し得る。例えば、負に荷電した核酸は、この目的のため設計されたＳＭＬの陽イオン性頭部により複合体を形成させ、標的部位に送達することができる。
【０１４５】
ステロール修飾両親媒性脂質は、Ｒ１及び／又はＲ２基がリポソームにおけるような化合物の構築に影響を及ぼし得るように設計することもできる。例えば、１つの実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質は、重合性鎖を含み得る。例えば、式Ｉの上の化合物のＲ１又はＲ２は、１０，１２−トリコサジイン酸などの重合性脂肪酸を含む。ステロール修飾両親媒性脂質の少なくとも１つの鎖の重合は、基礎的な生物医学研究、センサー適用分野又は製薬適用分野に有用である可能性がある相挙動（ｐｈａｓｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）のような特性を分子に与え得る。
【０１４６】
Ｒ１又はＲ２もステロール修飾両親媒性脂質に所望の親油性を与えるように選択することができる。例えば、式Ｉの上の化合物のＲ１又はＲ２は、短いアルキレングリコール鎖、例えば、６個〜３０個の炭素原子を有するポリプロピレングリコール鎖であってよい。ステロール修飾両親媒性脂質における短いポリプロピレングリコール鎖の導入は、分子の疎水性に影響を及ぼし、ステロール修飾両親媒性脂質の構築に影響を及ぼす可能性がある。コレステリック脂質結晶相は、ステロール修飾両親媒性脂質の構造を微調整する場合に達成することができる。
【０１４７】
ステロール修飾両親媒性脂質は、「脂質ラフト」として機能するように設計することもできる。例えば、Ｒ２がステロール（例えば、コレステロール）であってよく、式ＩのＲ１−Ｇをスフィンゴシン及びスフィンゴニンから選択することができる。そのような化合物は、例えば、スフィンゴシンとコレステロールとの相互作用により人工脂質ラフトを形成することができる。人工脂質ラフトは、膜タンパク質シグナリング及び病原体侵入に重要な役割を果たすと考えられる、タンパク質−脂質ラフト相互作用の研究のツールとして利用することができる。これらのステロール修飾両親媒性脂質は、タンパク質の送達又は病原体の侵入を防止するための細胞膜ドメインの調節にも用いることができる。
【０１４８】
ステロール修飾両親媒性脂質の生成の方法
他の態様において、本発明は、本発明による化合物の合成の様々な方法を提供する。一般的に、方法は、分枝コアを介して２つ以上の疎水性尾部に結合した親水性頭部を有し、疎水性尾部の少なくとも１つがステロール尾部を含む、ステロール修飾両親媒性脂質を生成するように、少なくとも１つのステロール尾部を分枝コアを介して親水性頭部にカップリングさせるステップを含む。
【０１４９】
特定の実施形態において、上記方法は、（ｉ）分枝コアが少なくとも１つのステロール尾部を含む場合に、分枝コアを親水性頭部にカップリングさせるステップ、及び（ｉｉ）分枝コアを介して２つ以上の疎水性尾部に結合した親水性頭部を有し、疎水性尾部の少なくとも１つがステロール尾部を含む、ステロール修飾両親媒性脂質を生成させるステップを含む。
【０１５０】
他の特定の実施形態において、方法は、（ｉ）分枝コアが親水性頭部に結合している場合に、少なくとも１つのステロール尾部を分枝コアにカップリングさせるステップ、及び（ｉｉ）分枝コアを介して２つ以上の疎水性尾部に結合した親水性頭部を有し、疎水性尾部の少なくとも１つがステロール尾部を含む、ステロール修飾両親媒性脂質を生成させるステップを含む。
【０１５１】
上の方法において、ステロール修飾両親媒性脂質が少なくとも１つの非ステロール尾部を含む場合、非ステロール尾部は、ステロール尾部を結合させる前、それと同時、又はその後に、分枝コアに結合させることができる。
【０１５２】
したがって、上記方法は、所望の最終生成物への複数の異なる経路を提供する種々の合成戦略を含む。例えば、式Ｉの化合物は、（ｉ）成分（ａ）が分枝コアＧであり、成分（ｂ）がＲ１及びＲ２を含む疎水性尾部であり、成分（ｃ）が親水性頭部Ｘである成分（ａ）〜（ｃ）を、独立したあらかじめ生成させたカップリング用の成分として供給し、次いで、（ｉｉ）式Ｉの分子を生成するように成分（ａ）〜（ｃ）をカップリングさせることにより、一般的に生成させることができる。或いは、式Ｉの化合物は、（ｉ）成分（ｄ）が、疎水性尾部成分Ｒ１及びＲ２の一部を含むか、又は結合している分枝コアＧ（すなわち、（Ｒ１）（Ｒ２）−Ｇ'）であり、成分（ｅ）が親水性頭部Ｘである、カップリング用の中間成分（ｄ）及び（ｅ）を供給し、次いで、（ｉｉ）式Ｉの分子を生成するように成分（ｄ）及び（ｅ）をカップリングさせることにより、一般的に生成させることができる。化学選択的（ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）カップリング戦略、直交保護基及び除去の使用などの、標準的な有機合成法をそのような目的のために用いることができる。
【０１５３】
一般的に、個別の合成経路の長さは、個別の標的分子の複雑さ及び出発物質の利用可能性に依存する。例えば、ジステロールホスホコリンは、グリセロホスホコリンを出発物質として用いる１ステップ反応で合成することができる。しかし、エーテル結合を含む脂質の合成は、より多くのステップを必要とする。
【０１５４】
特に、グリセロホスホコリンは、一般式ＩＩのステロール修飾両親媒性脂質の調製のための有用な出発物質であるが、ほとんどの反応溶媒における不十分な溶解度を有する。したがって、本発明は、塩素の対イオンとして、また特に、一般的にホスホコリン含有両親媒性脂質の効率がよく、高収率の合成のための相関移動触媒として、テトラフェニルホウ酸を用いることにより有機溶媒中のグリセロホスホコリンを可溶化する効率のよい方法を提供する。
【０１５５】
特定の実施形態として、ホスホコリン含有両親媒性脂質の合成の方法であって、（ｉ）少なくとも１つの官能基を有するホスホコリン化合物を有機溶媒中でテトラフェニルホウ酸との複合体を形成させるステップ、及び（ｉｉ）１つ又は複数の脂質をホスホコリン化合物の官能基とカップリングさせるステップを含み、脂質がホスホコリン化合物の官能基と反応し、カップリングすることができる少なくとも１つの官能基を含む、方法を提供する。本発明のこの態様において、有機溶媒、官能基化ホスホコリン化合物及び（１つ又は複数の）官能基化脂質は、反応との適合性を得るために選択する。カップリングのための溶媒及び他の試薬は、標準的なものである（例えば、メタノール、ピリジン、４，４−ジメチルアミノピリジンなど）。官能基は、脂質のクロロギ酸エステル及びホスホコリン化合物の官能基のヒドロキシルなどの反応において化学選択的であるあらゆるものであってよい。官能基化ホスホコリン化合物の例は、グリセロホスホコリン、アミノ酸官能基化ホスホコリンなどを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、様々な保護基戦略を単一脂質結合スキーム並びに各種脂質の直交結合に利用することができる。上記方法は、（ｉｉｉ）ホスホコリン含有両親媒性脂質を精製するステップをさらに含んでいてよい。
【０１５６】
本発明はまた、ステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物の製造の方法を提供する。この方法は、ステロール修飾両親媒性脂質を、非ステロール両親媒性脂質、治療薬、化粧品、検出可能な標識、緩衝剤、溶媒及び賦形剤の少なくとも１つと混合するステップを含む。この方法は、組成物を精製するステップをさらに含んでいてよい。一般的に、脂質含有組成物を製造する方法は、よく知られており、したがって、本発明のＳＭＬ組成物の製造に利用することができる。この方法は、リポソーム及び乳剤の製造に特に有用である。
【０１５７】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、本発明のステロール修飾両親媒性脂質化合物を含むリポソームを形成する方法を提供する。一般的に、方法は、ステロール修飾両親媒性脂質をリポソーム形成条件下におき、それによりリポソームを形成させるステップを含む。リポソーム形成条件は、一般的にリポソーム技術分野でよく知られている標準的条件である。上記方法は、ステロール修飾両親媒性脂質を１つ若しくは複数の他の両親媒性脂質、薬物、緩衝剤、溶媒及び／又は賦形剤と混合するステップ、並びに混合物をリポソーム形成条件下におくステップを場合によって含んでいてよい。上記方法はまた、クロマトグラフィー、相分離、溶媒抽出、凍結乾燥、再水和によるなどの様々なよく知られている方法によりリポソームをさらに精製するステップをさらに含んでいてよい。
【０１５８】
特定の実施形態において、本発明のリポソームのステロール修飾両親媒性脂質含量は、少なくとも１％から１００％までの範囲にあり、これは、具体的には０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％及び５％の増分などの部分増分内、例えば、ステロール修飾両親媒性脂質含量が５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び１００％から選択される５％の増分内にあるその間の範囲を含む。
【０１５９】
特定の実施形態において、リポソームを製造する方法は、リポソーム形成条件下で（ｉ）１つ又は複数の両親媒性脂質を（ｉｉ）１つ又は複数のステロール修飾両親媒性脂質と混合することによりリポソームを形成させることを含み、ステロール修飾両親媒性脂質は分枝コアを介して２つ以上の疎水性尾部に結合した頭部を含み、疎水性尾部の少なくとも１つはステロールを含む。
【０１６０】
特定の実施形態において、少なくとも１％であるステロール修飾両親媒性脂質のモルパーセントを有するリポソーム組成物を提供するためのモル比で、両親媒性脂質とステロール修飾両親媒性脂質とを混合する。したがって、特定の実施形態において、具体的には０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％及び５％の増分などの部分増分内、例えば、ステロール修飾両親媒性脂質含量が５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％から選択される５％の増分内にあるその間の範囲を含む、少なくとも１％から１００％までの範囲にあるステロール修飾両親媒性脂質のモル含量を有するリポソーム組成物を提供するためのモル比で、両親媒性脂質とステロール修飾両親媒性脂質とを混合する。
【０１６１】
本発明の特色とする態様は、リポソームの総脂質モル含量の通常、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％であり、１５％〜９０％、１５％〜３５％、３０％〜７０％、３５％〜８０％、３５％〜６５％又は４０％〜７０％であってよく、より高い量で、例えば、９０％〜９５％又はそれ以上として存在してよい、ステロール修飾両親媒性脂質のモル含量を有するリポソーム組成物である。特定の実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質のステロール（例えば、コレステロール）は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％又はそれ以上のステロールのモル含量を与えるようにリポソーム組成物中に存在する。特定の実施形態において、リポソーム組成物は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも７０％、少なくとも８５％又はそれ以上であるモル含量のモノステロール修飾両親媒性脂質を含む。他の特定の実施形態において、リポソーム組成物は、約１５％〜３５％であり、少なくとも３０％若しくはそれ以上、少なくとも４０％、少なくとも４５％又はそれ以上であってよいモル含量のジステロール修飾両親媒性脂質を含む。
【０１６２】
他の実施形態において、本発明は、本発明のステロール修飾両親媒性脂質化合物を含む乳剤を形成させる方法を提供する。一般的に、上記方法は、ステロール修飾両親媒性脂質を乳剤形成条件下におき、それにより、乳剤を形成させることを含む。上記方法は、水中油型ＳＭＬ乳剤、油中水型ＳＭＬ乳剤などを製造するのに用いることができる。例えば、上記方法は、ＳＭＬミセル（例えば、水中油系）並びに逆性又は反転ＳＭＬミセル（例えば、油中水系）の構築に利用することができる。
【０１６３】
乳剤形成条件は、一般的に乳剤技術分野でよく知られている標準的条件である。例えば、乳剤形成条件は、ＳＭＬを水性連続相中に分散させることを含み、それにより、ＳＭＬの油中水型乳剤を製造する。或いは、乳剤形成条件は、ＳＭＬの連続相中に水相を分散させることを含み、それにより、ＳＭＬの水中油型乳剤を製造する。
【０１６４】
乳剤形成方法は、ステロール修飾両親媒性脂質を１つ又は複数の他の両親媒性脂質、薬物、緩衝剤、溶媒及び／又は賦形剤と混合し、混合物を乳剤形成条件下におくステップを場合によって含んでよい。上記方法はまた、種々のよく知られている方法により乳剤を精製するステップをさらに含んでいてよい。
【０１６５】
乳剤を形成させるために必要に応じて、振とう、撹拌、均質化又は噴霧法により、乳化を促進することができる。ＳＭＬは、例えば、貯蔵用の乳剤を安定化するために、また特に治療薬、化粧品及び医薬を含む乳剤（例えば、製剤、クリーム剤及びローション剤）の調製に用いるために、界面活性剤として、又は他の乳剤における乳化剤として用いることができる。
【０１６６】
乳剤が油中水型乳剤になるか、又は水中油型乳剤になるかは、両相の容積分率及び乳化剤の種類に一部依存する。一般的に、バンクロフトの法則（Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ｒｕｌｅ）が当てはまり、乳化剤及び乳化粒子は、それらがさほどよく溶解しない相の分散を促進する傾向がある。
【０１６７】
特定の実施形態において、分散相中の粒子のサイズが１０００ナノメートル未満である、ナノエマルションを提供する。
【０１６８】
ステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物
本開示は、本開示のステロール修飾両親媒性脂質を含む様々な組成物を予期する。そのような組成物は、ステロール修飾両親媒性脂質化合物に関して均一であってよく、或いは本明細書で開示する異なるステロール修飾両親媒性脂質化合物のうちの１つ又は複数を含んでいてよい。異なるステロール修飾両親媒性脂質、例えば、異なるステロール修飾両親媒性リン脂質の混合物を有する組成物は、特に組成物がリポソームである場合に、組成物の物理的特性の微調整を可能にし得る。
【０１６９】
例えば、両親媒性脂質及びステロール修飾両親媒性脂質（例えば、モノステロール修飾両親媒性脂質（又は「ｍ−ＳＭＬ」）、ジステロール修飾両親媒性脂質（又は「ｄ−ＳＭＬ」）又は両方の組合せ）の相対量は、例えば、相転移温度、生理的条件下での漏れに対するリポソームの抵抗性、所望の期間（例えば、少なくとも１週間、少なくとも１ヵ月、少なくとも１年など）にわたる貯蔵安定性（例えば、約４℃で）などの所望の物理的特性を与えるために変化させることができる。一般的に、「安定な製剤」は、規定された期間にわたり封入内容物の約９０％を保持するものである。
【０１７０】
したがって、特定の実施形態において、脂質含有組成物（例えば、リポソーム又は乳剤）のステロール修飾両親媒性脂質含量は、具体的には０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％及び５％の増分などの部分増分内、例えば、ステロール修飾両親媒性脂質含量が５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び１００％から選択される５％の増分内にあるその間の範囲を含む、少なくとも１％から１００％までの範囲にあってよい。具体例としての実施形態において、脂質含有組成物は、リポソームの総脂質モル含量の通常、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％であり、１５％〜９０％、１５％〜３５％、３０％〜７０％、３５％〜８０％、３５％〜６５％又は４０％〜７０％であってよく、より高い量で、例えば、９０％〜９５％又はそれ以上として存在してよい、モル含量のステロール修飾両親媒性脂質を含む。特定の実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質のステロール（例えば、コレステロール）は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％又はそれ以上のステロールのモル含量を与えるようにリポソーム組成物中に存在する。特定の実施形態において、リポソーム組成物は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも７０％、少なくとも８５％又はそれ以上であるモル含量のモノステロール修飾両親媒性脂質を含む。他の特定の実施形態において、リポソーム組成物は、約１５％〜３５％であり、少なくとも３０％若しくはそれ以上、少なくとも４０％、少なくとも４５％又はそれ以上であってよいモル含量のジステロール修飾両親媒性脂質を含む。
【０１７１】
予期される脂質含有組成物は、少なくとも１％であるステロール修飾両親媒性脂質含量を有する脂質含有組成物を提供するためのモル比の非ステロール修飾修飾両親媒性脂質及びステロール修飾両親媒性脂質を有するものも含む。したがって、特定の実施形態において、例えば、リポソーム、非ステロール修飾両親媒性脂質及びステロール修飾両親媒性脂質は、具体的には０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％及び５％の増分などの部分増分内、例えば、ステロール修飾両親媒性脂質含量が５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％から選択される５％の増分内にあるその間の範囲を含む、少なくとも１％から１００％までの範囲にある、ステロール修飾両親媒性脂質含量を有するリポソーム組成物を提供するためのモル比で混合された脂質含有組成物中に存在する。
【０１７２】
ＳＭＬ含有組成物における非ステロール両親媒性脂質は、飽和又は不飽和、線状又は分枝かつ／又は置換又は非置換である脂肪族炭化水素鎖を有する非ステロール修飾両親媒性脂質などのあらゆる適切な両親媒性脂質（市販の脂質を含む、様々な従来の脂質のいずれかを含む）であってよい。ＳＭＬがモノステロール修飾修飾両親媒性脂質である場合、非ステロール両親媒性脂質及びｍ−ＳＭＬの疎水性尾部の特性が同様である、例えば、非ステロール両親媒性脂質及びｍ−ＳＭＬの疎水性尾部がほぼ同じ長さであり、同様に置換されているなどであるように、組成物におけるｍ−ＳＭＬ及び非ステロール両親媒性脂質を選択することが望ましいと思われる。
【０１７３】
非ステロール両親媒性脂質の脂肪族炭化水素鎖は、いかなる種々の鎖長、例えば、２個〜約４０個の炭素原子長のものであってよく、飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換であってよい。例えば、この例における非ステロール部分は、２〜４０個の炭素原子、通常４〜３０個の炭素原子、通常４〜２５個の炭素原子、より通常６〜２４個の炭素原子、より通常１０〜２０個の炭素原子を有する飽和又は不飽和、線状又は分枝、置換又は非置換炭化水素鎖である。非ステロール部分が、アルキル基で飽和された鎖などの飽和脂肪族炭化水素鎖に基づく置換脂肪族炭化水素鎖である場合、アルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上の個数の炭素原子（一般的に約１０個以下の炭素原子）は、酸素、硫黄又は窒素原子から選択されるヘテロ原子により置換することができ、アルキレン基の１個、２個、３個、４個又はそれ以上の個数の水素原子（一般的に水素原子の総数以下である）は、フッ素で置換することができる。
【０１７４】
組成物を被検体に投与する場合、組成物は無菌であり、無菌容器（例えば、無菌バイアル）に保存できることが一般的に望ましい。組成物は、非経口、腸、鼻及び肺投与を含む種々の投与経路用に製剤化することができ、１つ又は複数の賦形剤を含んでいてよい。具体例としての製剤は、局所、注射、エアゾール及び経口製剤などであり、医薬製剤、薬用化粧用製剤、機能性食品製剤などとして製剤化することができる。ステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物は、凍結乾燥し、乾燥粉末として貯蔵することができ、或いは溶液で保存することができる。
【０１７５】
ステロール修飾両親媒性脂質を含む脂質粒子
本開示のＳＭＬ含有組成物は、本明細書で一般的に脂質粒子と呼ぶ種々の形で提供することができる。本明細書で用いる「脂質粒子」は、定義された又は定義されていない構造のＳＭＬ含有粒子を含むことを意味する。両親媒性分子は親水性及び疎水性セグメントからなっているので、水性環境においては、ＳＭＬ頭部は水に対面するが、それらの疎水性尾部は互いに相互作用して、脂質組成及び条件によって、ラメラ二重層を、また、より低い程度に他の凝集構造を形成する。したがって、ＳＭＬ化合物は、脂質及び水含量、並びに温度によって球（小胞）、ロッド（管）及び薄層（板）などの種々の形状を形成し得る。これらの形状は、相互作用して、ラメラ相（例えば、二重層板、閉じた球）、六方相（例えば、ロッド）又は立方相（例えば、球、ロッド又は溶媒チャンネルによって連結された薄層）として分類される二又は三次元格子マトリックス構造を形成する基本単位である。
【０１７６】
分子を溶媒に分散させる場合にセグメントを構成する最も有利な方法は、疎水性及び親水性部が異なるドメインに分離されている構造を形成することである。これらのドメイン及び構成されたドメインから生ずる構造は、溶媒誘導液晶相（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｐｈａｓｅｓ）と呼ばれる。そのような相の例は、ミセル、ラメラ、六方、立方及びスポンジ相である。相は、正常及び逆であってよい。前者の場合、界面は油のほうに曲げられ、逆の場合、界面は水のほうに曲げられる。相の種類は、混合物の水と油との比などの包括的なパラメーター及び両親媒性分子のより特異的な特性の両方に依存する。六方相において、両親媒性分子は、無限長の円筒構造に凝集し、これらの円筒凝集体は、六方格子上に配置して、相に長距離配向秩序を与える。２相連続立方相も存在し得る。薬物送達のためのより重要な相は、ミセル、立方及びラメラである。本明細書で述べる両親媒性分子は、これらの相の１つ又は複数の一部であること、又はこれらの相の１つ又は複数のものを形成するのに適している。
【０１７７】
具体例としての脂質粒子は、リポソーム（例えば、多小胞、多重層リポソーム、パウシラメラリポソーム、一枚膜リポソームなど）、乳剤（油及び水乳剤、例えば、水中油型乳剤、油中水型乳剤など、油は、例えば、トリグリセリドであってよい）、固体コア乳剤、脂質凝集体（例えば、六方、立方相）、脂質単層（例えば、表面上に存在する可能性がある）、脂質発泡体などである。
【０１７８】
問題とする薬剤をペイロードとしてさらに場合によって含んでいてよい、ステロール修飾両親媒性脂質含有リポソーム及び乳剤は、特に重要である。「リポソーム」という用語は、脂質二重層系により囲まれたコンパートメントを含む。脂質小胞と呼ぶこともできる「リポソーム」は、多重層リポソーム（一般的に０．５〜１０マイクロメートルの範囲の平均直径を有し、水性相の層と交互の２から数百のうちのいずれかの数の同心脂質二重層からなる）、一枚膜小胞（一般的に単一脂質層からなり、一般的に約２０〜約４００ナノメートル（ｎｍ）、約５０〜約３００ｎｍ、約３００〜約４００ｎｍ、約１００〜約２００ｎｍの範囲の平均直径を有する）及びパウシラメラ小胞又は多小胞リポソームなどの他の小胞形などの様々な形のリポソームを含むことを意味する。
【０１７９】
ステロール修飾両親媒性脂質を有する組成物を調製する方法
本開示はまた、ステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物を製造する方法を提供する。一般的に、そのような方法は、ステロール修飾両親媒性脂質を少なくとも１つの非ステロール両親媒性脂質と混合し、例えば、治療薬（例えば、医薬品、機能性食品）、化粧品、検出可能な物質（例えば、造影剤）であってよいペイロードを組成物に場合によって負荷することを含む。組成物は、緩衝剤、溶媒及び賦形剤の１つ又は複数の存在下で混合することができる。上記方法はまた、リポソームにペイロードを負荷する前又は後に実施することができる、リポソームを分粒（ｓｉｚｉｎｇ）するステップをさらに含んでよい。場合によって、方法は、クロマトグラフィー、相分離、溶媒抽出、凍結乾燥、再水和などによるなどの様々なよく知られている方法によりリポソームを精製するステップを含んでいてよい。これらの方法により調製された組成物は、不純物を少なくとも６０％含まない、通常少なくとも７５％含まない、最も通常少なくとも９０％含まないように、精製することができる。
【０１８０】
これらの方法は、上述の組成物のステロール修飾両親媒性脂質含量を有する脂質含有組成物を提供するための両親媒性脂質とステロール修飾両親媒性脂質とのモル比を有する脂質含有組成物の製造を含む。
【０１８１】
１つ又は複数のステロール修飾両親媒性脂質粒子を含む組成物は、利用可能な技術により容易に生成させることができる。例えば、そのような組成物は、ステロール修飾両親媒性脂質を含む脂質を水溶液に入れ、溶液を数秒から数時間の期間撹拌することにより、容易に生成させることができる。単純な方法により、約１〜１０マイクロメートルの範囲の直径を有する大きい多重層リポソーム又は小胞が生成する。これらのリポソームは、脂質が中に存在した水相の層と交互になっていてよい２つから数百の同心脂質二重層からなっている。リポソームを調製するさらなる具体例としての方法を下に示す。
【０１８２】
封入ペイロード（例えば、封入薬、治療薬、造影剤又は同様のもの）を有するリポソームを含む組成物を提供することが望まれる場合、そのような物質は、封入量の１つ又は複数のステロール修飾両親媒性脂質、例えば、１つ又は複数のステロール修飾両親媒性リン脂質を用いて水相内に含めることができる。或いは、問題とする物質が疎水性であり、したがって、水に溶けにくい場合、そのような物質は、脂質二重層内に含めることができる。「封入量」という用語は、問題とする物質を封入し、所望のサイズのリポソームを形成するのに必要な脂質の量を意味する。一般的に、平均リポソームサイズは、直径が１００００ｎｍ未満、より通常５０００ｎｍ未満、より通常約２０〜６００ｎｍである。封入量は、特定の化合物及び選択した操作条件に依存するが、一般的に約２：１〜１：１００化合物：脂質であり、通常約１：１〜約１：２０である。或いは、遠隔制御負荷法を用いて、ペイロードをリポソーム中に導入することができる。上述の負荷方法と異なり、遠隔負荷法は、最初にリポソームを形成させ、次にイオン勾配によりペイロードをリポソーム中に導入することを伴う。
【０１８３】
ペイロードの組み込み
ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物は、脂質粒子による（例えば、リポソームによる）輸送のためのペイロードを含んでいてよい。「ペイロード」は、ＳＭＬ含有組成物により輸送され、送達されるステロール修飾両親媒性脂質含有組成物の成分を意味する。代表的なペイロードは、脂質粒子の構造内（例えば、リポソーム内）に含まれ、ＳＭＬ脂質自体の一部（ＳＭＬプロドラッグ）として脂質粒子の二重層又は単層に存在し、又は脂質粒子の表面に付着させた（例えば、共有又は非共有結合により）成分などである。したがって、「ペイロード」は、脂質粒子により封入される成分（例えば、医薬品、機能性食品、化粧品、造影剤（例えば、空気を含むガス、放射性医薬品、核磁気共鳴造影剤など））などであり得る。特定の実施形態において、封入ペイロードは、結晶として、粉末として、又はその組合せとして溶液中に一般的に存在する。いくつかの実施形態において、ペイロードは、化合物に存在する開裂性結合の開裂により放出させることができるステロール修飾両親媒性脂質の成分である（例えば、ステロール修飾両親媒性脂質がプロドラッグとして働く場合）。いくつかの実施形態において、ペイロードは、ウイルス（例えば、不活性化又は弱毒化ウイルス）又は細菌（例えば、不活性化又は弱毒化細菌）又は核酸であってよい。
【０１８４】
薬物含有リポソーム懸濁液を調製する方法は、一般的に従来のリポソーム調製方法に準拠する。１つの具体例としての方法において、ステロール修飾両親媒性脂質を適切な有機溶媒又は溶媒系に溶解し、真空中又は不活性ガス中で乾燥して脂質薄膜とする。問題とする親油性物質を薄膜を形成する脂質に含めることができる。脂質粒子中及び／又は脂質粒子二重層内に封入すべきペイロードは、最大捕捉を促進するように脂質溶液で提供することができる（例えば、リポソームにおける物質の最終的な最大所望濃度を超えるモルで）。或いは、問題とする物質が水溶性（例えば、より親水性）である場合、物質は、脂質を水和するのに用いる水性媒体に含めることができる。或いは、脂質粒子（例えば、リポソーム）を最初に生成させ、次に遠隔負荷法、例えば、問題とする物質のリポソーム内への移動を促進するイオン勾配（例えば、硫酸アンモニウム勾配）を与えることによってペイロードを粒子内に導入する。
【０１８５】
脂質粒子の表面へのペイロードの付着は、例えば、脂質粒子のステロール修飾両親媒性脂質の末端官能基への共有結合により達成することができる（実施例１４）。ペイロードの使用に適する、又はペイロードの付着のための使用に適用することができる様々な方法は、例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００３、Ｖ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ及びＶ．Ｗｅｉｓｓｉｇ編に記載されている。
【０１８６】
分粒
リポソーム懸濁液は、約１ミクロン未満、通常約０．０５〜０．５ミクロン、最も通常約０．０５〜０．２ミクロンの粒径範囲の小胞の所望の粒度分布を達成するために分粒することができる。分粒は、より大きいリポソームを除去し、最適の薬物動態特性を有する規定の粒径範囲を得るのに役立つ。
【０１８７】
リポソームの粒径及び粒径の不均一性を減少させるためのいくつかの技術が利用可能である。浴又はプローブ超音波処理法によりリポソーム懸濁液を超音波処理することにより、粒径が約０．０５ミクロン未満の小一枚膜小胞（ＳＵＶｓ）までの漸進的な粒径の減少がもたらされる。均質化は、大きいリポソームをより小さいものに細分化するためにせん断エネルギーに依拠する他の方法である。一般的な均質化法において、一般的に約０．１〜０．５ミクロンの選択されるリポソーム粒径が認められるまで、ＭＬＶを標準乳剤ホモジナーザーを通して再循環させる。二重非対称遠心分離機に入れたバイアル中で硬質球状ビーズの存在下で脂質分散体を処理することにより、リポソーム粒径を０．０４〜０．３ミクロンに減少させることができる。これらの３つの方法において、粒径分布は、従来のレーザービーム粒径識別によりモニターすることができる。
【０１８８】
小孔ポリカーボネート膜を通しての押出しは、平均値が膜の孔径によって約０．０５〜８ミクロンの範囲内にある比較的よく定義された粒径分布までリポソーム粒径を減少させる有効な方法である。一般的に、所望のリポソーム粒径分布が達成されるまで、懸濁液を膜を通して数回循環させる。リポソーム粒径の徐々の減少を達成するために、リポソームをより小さい孔径の膜を通して連続的に押し出すことができる。
【０１８９】
遠心分離及び分子ふるいクロマトグラフィーは、１ミクロン未満の選択される閾値を下回る粒径を有するリポソーム懸濁液の製造に利用可能な他の方法である。これらの２つの方法は、大きい粒子の小さい粒子への変換でなく、より大きいリポソームの除去を必要とする。リポソームの収率は、それに対応して低い。
【０１９０】
遊離ペイロード物質の除去
組み込まれていないペイロード、すなわち、「遊離」ペイロードは、例えば、組成物中に存在するリポソームと捕捉されたペイロードとの比を増加させるために除去することができる。除去は、遊離物質の最終濃度を組成物中に存在する全ペイロード（例えば、全薬物）の約２０％未満、通常約１０％未満に減少させるように計画することができる。
【０１９１】
リポソーム懸濁液から遊離ペイロードを除去するためにいくつかの方法が利用可能である。分粒済みのリポソーム懸濁液は、高速遠心分離によりペレット化し、遊離ペイロード及び非常に小さいリポソームを上清中に残すことができる。他の方法は、限外ろ過により懸濁液を濃縮し、次いで、濃縮リポソームを物質を含まない置換媒体に再懸濁させることを必要とする。或いは、ゲルろ過を用いて、より大きい粒子を溶質分子から分離することができる。
【０１９２】
遊離ペイロードを除去する１つの具体例としての方法は、遊離であるが、リポソームに結合した形でない物質を結合することができるイオン交換樹脂を利用するものである。陽イオン交換又は陰イオン交換樹脂の選択は、例えば、中性ｐＨの遊離物質の電荷に基づいて行うことができる。
【０１９３】
ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物のペイロード
ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物は、組成物に結合したペイロードの送達を促進するように利用することができる。上記のように、「ペイロード」は、ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物とともに輸送されるステロール修飾両親媒性脂質含有組成物の成分を意味し、したがって、例えば、脂質粒子の構造内（例えば、リポソーム内）に含まれ、脂質粒子の二重層中に存在し、又は脂質粒子の表面に付着させた（例えば、共有結合又は非共有結合により）成分を含み得る。
【０１９４】
したがって、ペイロードは、医薬、機能性食品、化粧品及び診断適用分野を含むが、これらに限定されない種々の用途に適応することができる種々の物質のいずれかであってよい。具体例としての物質は、ビスホスホネート、カルボプラチン、シスプラチン、オキサロプラチン、カルムスチン、カンプトテシン、シプロフロキサシン、クロロメタン、シクロホスファミド、シクロパミン、シトシンアラビノシド、デカルバジン、レチノイン酸、ドキシフルリジン、フルオロオルチン酸、ゲルダナマイシン、ゲムシタビン、ゴシポール、イフォスファミド、ヒドロキシタモキシフェン、インリノテカン、フィチン酸、プロテインキナーゼ阻害剤、パクリタキセル、レスベラトロール、タキサン、メチルセラノシステイン、メトトレキサート、６−チオグアニン、チルホスチン、ウォゴニン、エトポシド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、化学修飾ＲＮＡ、クエン酸塩、１，２，３，４ブタンテトラカルボン酸、オクタ硫酸スクロース、ポリリン酸、シプロフロキサシン、モルヒネ、オキシモルホン、ブプレノルフィン及びメタドンを含むが、これらに限定されない。そのような物質は、単独で、又は相乗効果を得るために他の物質（例えば、１つ又は複数の物質、２つ以上の物質）とともに同じリポソームに封入することができる。
【０１９５】
特に重要なペイロードは、抗癌化学療法薬（例えば、ドキソルビシン、ダノルビシン、カンプトテシン、シスプラチンなど）、抗生物質（例えば、抗菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、駆虫薬など）、鎮痛薬、麻酔薬、抗にきび薬、生体分子（例えば、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、ポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド及びペプチドを含む、天然又は化学修飾ポリペプチド及びペプチド（例えば、ＰＥＧ化ポリペプチド）を含む、ペプチド）、抗体など）、抗原性物質（例えば、ワクチンの成分であってよい）、抗血液凝固薬、神経変性疾患を治療するための化合物、ベンゾカイン、クロロプロカイン、コカイン、プロカイン、テトラカイン、ブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、フェンタニル及びトリメカインなどの麻酔薬、ジクロフェナクなどの鎮痛薬並びに硫酸アンモニウム、硫酸トリエチルアミン、オクタ硫酸スクロースのトリエチルアミン塩、ポリリン酸トリエチルアミン、フィチン酸のアンモニウム塩、酢酸のナトリウム、トリエチルアミン又はアンモニウム塩、シュウ酸のナトリウム、トリエチルアミン又はアンモニウム塩、プロパン酸のナトリウム、トリエチルアミン又はアンモニウム塩、コハク酸のナトリウム、トリエチルアミン又はアンモニウム塩、１，２，３，４ブタンテトラカルボン酸のナトリウム、トリエチルアミン又はアンモニウム塩、ピリジン−２，３，５，６テトラカルボン酸のナトリウム、トリエチルアミン又はアンモニウム塩、１，２，４，５−ベンゼンテトラカルボン酸のナトリウム、トリエチルアミン又はアンモニウム塩、１，２，４，５−シクロヘキサンテトラカルボン酸のナトリウム、トリエチルアミン又はアンモニウム塩、１，３，５−ベンゼントリカルボン酸のナトリウム、トリエチルアミン又はアンモニウム塩、スペルミン、スペルミジン、トリスアミノエチルアミンなどのポリアミンンの酢酸塩などのリポソーム内へのイオン勾配充填を可能にする分子を含むが、これらに限定されない。
【０１９６】
機能性食品（例えば、フラボノイド、ガンマ−リノレン酸などの抗酸化剤、ベータ−カロテン、アントシアニン、ベータ−シトステロール）及び栄養補助食品（例えば、ビタミン）も本開示の脂質組成物におけるペイロードとして用いることができる。
【０１９７】
本開示の組成物のペイロードとして機能し得る具体例としての化粧用物質は、水和剤、タンパク質（例えば、コラーゲン）、ビタミン、植物から誘導された化学薬品、酵素、抗酸化剤、精油、ＵＶ防護剤（例えば、オキシベンゾン）、洗顔剤、色素、芳香剤など（例えば、化粧品、洗面用品、芳香剤、香料、スキンケア製品及び美容補助剤に使用できるような）を含み得る。レチノイン酸、特にスキンケア製品用のレチノイン酸を有するステロール修飾両親媒性脂質の乳剤が特に重要である。
【０１９８】
診断用薬は、放射性標識、発蛍光団、発光団、ガドリウムなどの核磁気共鳴造影剤、陽電子放射断層撮影標識などであってよい、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態において、リポソーム自体は、例えば、超音波診断において微小泡として用いられているような診断用薬として機能し得る。
【０１９９】
特に重要なものとして挙げられるものは、毒性薬物（種々の癌化学療法薬、ドキソルビシン、ダノルビシン、カンプトテシンなどのような）及び／又は不十分な水溶解度を有する薬物（例えば、アンホテリシンＢ、レチノイン酸など）用の薬物担体として機能するステロール修飾両親媒性脂質含有組成物である。また特に重要なものは、特に貯蔵安定性を示す（例えば、環境温度及び／又は４℃で）ワクチン担体として機能するステロール修飾両親媒性脂質含有組成物である。
【０２００】
活性薬又はプロドラッグとしてのステロール修飾両親媒性脂質
いくつかの実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質又は化合物の成分は、ペイロードとして機能する。例えば、ステロール修飾両親媒性脂質は、それ自体薬物又はプロドラッグであり得る。例えば、ステロール修飾両親媒性脂質のステロールは、ステロール修飾両親媒性脂質中に存在するとき、かつ／又は開裂性リンカーの開裂後にステロール修飾両親媒性脂質から放出されるときに、有用な効果をもたらす薬物であり得る。１つの具体例としての実施形態において、ステロール修飾両親媒性脂質のステロールは、高コレステロール血症療法に用いることができる、β−シトステロールである。或いは、又はさらに、ステロール修飾両親媒性脂質の非ステロール疎水性尾部は、ステロール修飾両親媒性脂質中に存在するとき、かつ／又は開裂性リンカーの開裂後に当化合物から放出されるときに、有用な効果をもたらす薬物であり得る。例えば、ステロール修飾両親媒性脂質の非ステロール疎水性尾部は、レチノイン酸であってよい。
【０２０１】
他の成分
ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物は、ペイロードに加えて他の活性又は不活性物質を含み得る。例えば、リポソーム組成物は、組成物を用いて送達される薬物の毒性の低下及び／又はリポソームの成分の毒性の低下をもたらし得る薬物保護化合物を含み得る。例えば、そのような追加の物質は、α−トコフェロール又はコハク酸α−トコフェロールなどのその製薬上許容できる類似体若しくはエステルなどの親油性フリーラジカル捕捉剤などであってよい。他の適切なフリーラジカル失活剤としては、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、没食子酸プロピル（Ａｕｇｕｓｔｉｎ）及びそれらの製薬上許容できる塩などが挙げられる。ヒトにおける投与に許容できるさらなる親油性フリーラジカル失活剤も用いることができる。そのような追加の物質は、例えば、封入又は膜結合により問題とする薬物とともに共捕捉することができる。ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物は、薬物負荷リポソームの体内動態をｉｎ  ｖｉｖｏで確認し、かつ／又は追跡することができるように１つ又は複数の造影剤を含めることもできる。
【０２０２】
本開示のリポソームの水性懸濁液は、リポソーム脂質の酸化的分解の減少に対する抵抗性を向上させるための物質を有利には含んでいてよい。デスフェラル（フェリオキサミン）などの水溶性鉄特異的キレート化剤がそのような物質の具体例である。
【０２０３】
製剤
組成物は、非経口、腸、鼻及び肺投与などの種々の投与経路用に製剤化することができ、１つ又は複数の賦形剤を含んでいてよい。具体例としての製剤としては、局所、経皮、注射（例えば、静脈内、筋肉内、皮下）、エアゾール及び経口製剤などが挙げられ、医薬製剤、薬用化粧用製剤、機能性食品製剤などとして製剤化することができる。ステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物は、凍結乾燥することができ、或いは溶液で保存することができる。
【０２０４】
したがって、ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物は、ステロール修飾両親媒性脂質及び許容できる担体又は媒体を含む製剤を含む。製剤の許容できる剤形は、水溶液、懸濁剤、分散体、皮膚軟化剤、ローション剤、クリーム剤、ロウ膏（ｓａｌｖｅｓ）、香膏及び軟膏剤を含むが、これらに限定されない。ステロール修飾両親媒性脂質組成物は、例えば、消化管で溶解する錠剤又はカプセル剤並びに坐剤として固体剤形で投与することもできる。組成物は、パッチ、包帯などのような用具で提供することもできる。
【０２０５】
局所製剤は、ステロール修飾両親媒性脂質、及び所望の場合、ペイロード物質に加えて、動物の皮膚又は粘膜への適用に適する製薬上許容できる局所担体を含んでいてよい。局所製剤は、ローション剤、ゲル剤、ロウ膏、クリーム剤、香膏、軟膏剤などを含むが、これらに必ずしも限定されない種々の適切な剤形で提供することができる。これらの組成物は、水溶液の形、又は乳剤、例えば、油及び水乳剤（水中油型又は油中水型乳剤）の形であってよい。所望の場合、局所製剤は、皮膚を介しての送達を促進するための浸透促進剤又は他の物質を含んでいてよい。
【０２０６】
本明細書で予期する剤形は、生理的に許容できる担体、賦形剤、安定化剤などを用いて一般的に調合することができ、徐放性又は時限放出製剤として提供することができる。治療用の許容できる担体、賦形剤及び希釈剤は、製薬分野でよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、１９８５）に記載されている。そのような物質は、用いる用量及び濃度で受容体に対して無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩及び他の有機酸塩などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、ポリアルギニンなどの低分子量（約１０残基未満）ペプチド、血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリ（ビニルピロリドン）などの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸及びアルギニンなどのアミノ酸、単糖、二糖、並びにセルロース及びその誘導体、グルコース、マンノース及びデキストリンなどの他の糖、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、マンニトール及びソルビトールなどの糖アルコール、並びに局所製剤におけるＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ及びＰＥＧなどの従来の陽イオン性及び非イオン性界面活性剤などである。
【０２０７】
治療適用のために用いる投与製剤は、無菌性でなければならない。無菌性は、無菌膜を通してのろ過、或いは照射又はガス、熱若しくは高圧力による処理などの他の従来の方法により容易に達成される。本発明の投与製剤のｐＨは、一般的に３〜１１、より好ましくは５〜９であろう。本発明の投与製剤を用いる治療を必要とする被検体（一般的に哺乳類）は、最適の効力をもたらす用量で投与することができる。用量及び投与方法は、被検体ごとに異なり、治療する宿主の種類のような因子、並びに動物の場合、その性、体重、食餌、併用薬、全般的な臨床状態、用いる個々の疎水性化合物、これらの化合物が用いられる特定の用途、及び当業者が認識する他の因子に依存するであろう。有効な用量レベル、すなわち、所望の結果を達成するのに必要な用量レベルの決定は、当業者の活動領域内にある。
【０２０８】
製剤は、ペイロードの活性の保存並びにステロール修飾両親媒性脂質及び存在する可能性がある他の脂質の完全性の維持に適する条件下での貯蔵用に調製することができる。実施例で説明するように、ステロール修飾両親媒性脂質を含むリポソームは、４℃で１年又はそれ以上の期間安定であり、したがって、４℃での貯蔵は、本明細書で述べるステロール修飾両親媒性脂質組成物の長期維持に適している。
【０２０９】
ステロール修飾両親媒性脂質の使用方法
ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物は、種々の医薬、薬用化粧品、診断及び生物医学適用分野で用いることができる。具体例としての使用は、下で述べる。
【０２１０】
例えば、医薬、機能性食品及び薬用化粧品適用は、一般的にステロール修飾両親媒性脂質を含む組成物を動物被検体に投与することを含む。投与は、動物を組成物と接触させることによって一般的に達成され、任意の適切な経路（例えば、非経口、腸、鼻、肺など）によるものであってよい。これらの適用の状況において、被検体は治療を必要とするか、又はそのような治療から利益を得る可能性があるので、当動物は、治療を必要とするか、又は治療が望まれる被検体である。本明細書で用いる「動物被検体」は、治療方法に関連して、治療を必要とする被検体、及び／又は、診断方法に関連して、診断方法により検出することができる状態を有すると推定される被検体を一般的に意味する。被検体は、ヒト、家畜、家畜ペットなどの哺乳動物を含む動物などである。
【０２１１】
「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、本明細書では所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを一般的に指すために用いる。効果は、疾患若しくはその症状を完全若しくは部分的に予防するという点で予防的であってよく、かつ／又は、疾患及び／又は疾患に起因する有害効果の部分的若しくは完全な安定化若しくは治癒の点で治療的であってよい。本明細書で用いる「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を含み、（ａ）疾患又は症状にかかりやすいが、それを有するとまだ診断されなかった被検体において疾患又は症状が発生することを予防すること、（ｂ）疾患症状を抑制すること、すなわち、その発生を阻止すること、或いは（ｃ）疾患症状を軽減すること、すなわち、疾患又は症状の退行をもたらすことを含む。
【０２１２】
ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物及びそのペイロードは、被検体及び治療する状態並びに投与から得ようとする恩恵に応じて選択される。
【０２１３】
ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物は、診断法にも用いることができる。そのような方法は、動物被検体からの生物学的試料中に存在する分析対象物の検出による状態の診断を含む。
【０２１４】
本明細書で用いる「診断」は、一般的に疾患又は障害に対する被検体の感受性の判定、被検体が疾患又は障害に現在かかっているかどうか、疾患又は障害に罹患した被検体の予後についての判定、及び治療計量（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）の使用（例えば、治療の効果又は効力に関する情報を提供するために被検体の状態をモニタリングすること）を含む。「生物学的試料」という用語は、生物から得られる種々の試料型を含み、診断又はモニタリングアッセイに用いることができる。当用語は、血液及び生物学的起源の他の液体試料、生検検体又は組織培養若しくはそれから得られた細胞及びその継代などの固形組織試料を含む。当用語は、試薬による処理、可溶化、又は特定の成分の濃縮によるなどの、それらの獲得後に何らかの方法で処理された試料を含む。当用語は、臨床試料を含み、細胞培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液及び組織試料も含む。
【０２１５】
一般的に、ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物を用いる診断方法は、液中の分析対象物の存否を検出するステップを含むものであり、液をステロール修飾両親媒性脂質含有組成物と接触させ、脂質組成物の変化を検出するステップを含み、脂質組成物の変化が分析対象物の存否を示す。脂質組成物の変化は、例えば、ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物に存在する重合性ステロール修飾両親媒性脂質の重合の増加又は減少に起因する色の変化（例えば、封入発蛍光団の放射波長の変化に起因する）、ステロール修飾両親媒性脂質含有リポソームのサイズ又は完全性の変化などであり得る。したがって脂質組成物の変化は、光学的特性（例えば、反射率）、相転移などの脂質組成物の特性を評価することによって検出することができる。
【０２１６】
他の用途
ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物は、治療や診断と直接関連しない適用分野においても様々な用途がある。例えば、ステロール修飾両親媒性脂質含有組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞へのペイロード（例えば、核酸、ポリペプチド）の輸送を促進するために用いることができる。この方法において、培養動物細胞（例えば、ヒト細胞などの培養哺乳類細胞）を問題とするペイロードを含むステロール修飾両親媒性脂質組成物と接触させて、細胞へのペイロードの送達を促進する。そのような方法は、核酸、ポリペプチド又は動物細胞膜を容易に越えることがない他の化合物の導入を達成するために用いることができる。
【０２１７】
他の例において、スフィンゴシンを有するステロール修飾両親媒性脂質は、脂質ラフトのモデリング並びに膜タンパク質の送達に用いることができる。
【０２１８】
ステロール修飾両親媒性脂質は、人工二重層としても用いることもでき、したがって、バイオセンサーなどの場において用いることができる。人工二重層の使用を必要とするバイオセンサーは、当技術分野でよく知られている。それらは、脂質表面が血液、血漿、血清又は細胞、タンパク質又は脂質を含む他の体液と直接接触させる場合に特に適している。
【０２１９】
キット及びシステム
本明細書で開示する組成物の製造及び／又は使用を促進することができるキット及びシステムを提供する。本明細書で予期するキットは、別個の容器で、又はより通常、滅菌済み容器に入れた単一組成物で提供することができる、１つ又は複数のステロール修飾両親媒性脂質、送達するための問題とする薬物を含み得る。
【０２２０】
さらに、キットは、キットの成分、特にキットに含まれる本発明の組成物を使用することに関する指示書を含み得る。
【実施例】
【０２２１】
以下の実施例は、本発明をどのように行い、使用するかについての完全な開示及び記述を当業者に提供するために示すものであって、発明者らがそれらの発明とみなすものの範囲を限定するものでなく、また下記の実験が実施されたすべて又は唯一の実験であることを示すものでもない。用いた数値（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証する努力は払ったが、ある程度の実験誤差及び偏りは考慮すべきである。特に示さない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧又は大気圧に近い。
【０２２２】
方法及び材料
以下は、下の実施例で用いた一般的な材料及びプロトコールである。
【０２２３】
試薬：グリセロホスホコリンは、ＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）から入手した。リソ−リン脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から購入した。他の試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から入手した。溶媒は、標準プロトコールに従って、直接使用したか、又は使用前に精製し、乾燥した。
【０２２４】
手法：ＴＬＣ分析は、次の各種展開システムを用いて０．２５ｍｍシリカゲルＦ２５４プレート上で実施した：（Ａ）ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ（６２／２５／４）、（Ｂ）ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ（６５／３５／５）、（Ｃ）ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（６２／２５／４）、（Ｄ）へキサン／ＥｔＯＡｃ（２／１）、（Ｅ）へキサン／ＥｔＯＡｃ（１０／１）、（Ｆ）へキサン／ＥｔＯＡｃ（５／１）、（Ｇ）トルエン／エーテル（９／１）、（Ｈ）トルエン／エーテル（１／１）。高性能フラッシュクロマトグラフィー（ＨＰＦＣ）は、プレパックシリカゲルカラム（６０Å、４０〜６３μｍ）付きのＢｉｏｔａｇｅ（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）ＨＰＦＣ（商標）システム上で実施した。特に示さない限り、溶媒混合物の組成を記述する比率は相対的容積を示す。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ４００ＭＨｚ機器又はＢｒｕｋｅｒ３００ＭＨｚ機器で得た。化学シフトは、テトラメチルシランを内部標準として用いてｐｐｍ（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）として表した。Ｊ値は、ヘルツ単位である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）の質量分析施設（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）において得た。
【０２２５】
合成方法：合成に用いた一般的手順を下で述べる。
【０２２６】
１−置換グリセロールの３−ヒドロキシ基の保護：無水ピリジン中１置換グリセロールと塩化トリフェニル（１．５当量）の混合物を無水条件下で５０℃で１８時間撹拌した。室温（ｒ．ｔ．、約２３℃）に冷却した後、混合物を氷冷水中に注加し、３部のヘキサンで抽出した。不溶のトリフェニルメタノールをろ過により除去した。ろ液を水で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発し、残留物を最小限の量のヘキサンに溶解した。４℃で一夜放置することにより、さらなるトリフェニルメタノールを溶液から析出させた。固体をろ別し、ろ液を蒸発乾固した。残留物を高真空で乾燥し、次のステップの反応に直接用いた。反応をＴＬＣによりモニターしたところ、収率は一般的に８０〜９０％であった。
【０２２７】
１，２−置換−３−トリチルグリセロールからのトリチル基の除去：クロロホルム中１，２−置換−３−トリチルグリセロールを三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（４当量）で０℃で３時間処理した。溶液を水／クロロホルム／メタノール（２：２：１）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発した。残留物を乾燥し、次のステップの反応に直接用いた。反応をＴＬＣによりモニターしたところ、収率は９０％を上回っていた。
【０２２８】
１，２−置換グリセロールのリン酸化：無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中１，２−置換グリセロール及び無水ピリジン（２当量）の溶液をＴＨＦ中新たに蒸留したリンオキシクロリド（１．１当量）に０℃で撹拌しながら１滴ずつ加えた。撹拌を０℃で２〜３時間続けた。次いで、１０％重炭酸ナトリウム（約５当量）を加え、混合物を０℃で１５分間撹拌した。次いで、溶液を氷水上に注ぎ、ＨＣｌ（ｐＨ約２）で酸性化し、ジエチルエーテルで抽出した。アセトンを水中に加えることにより、水層中の生成物を析出させた。析出物をエーテル抽出物からの生成物と合わせ、トルエンを用いて共沸乾燥し、次のステップの反応に直接用いた。収率は一般的に９０％を上回っていた。
【０２２９】
１，２−置換−グリセロ−ホスホコリン：１，２−置換−グリセロリン酸、コリンテトラフェニルホウ酸（２当量）及び塩化２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル（ＴＰＳ）（２．５当量）を短時間加温しながら無水ピリジンに溶解し、次いで、７０℃で１時間、室温で３時間撹拌した。水を加えた後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去した。残留物をジエチルエーテルで２回抽出した。抽出物を合わせ、蒸発した。粗生成物をＨＰＦＣにより精製した。このステップの収率は、一般的に８０〜９０％である。
【０２３０】
実施例１：脂質ＳＭＬ１Ａ、ＳＭＬ１Ｂ及びＳＭＬ１Ｃの調製
本明細書でＳＭＬ１ａ、ＳＭＬ１ｂ及びＳＭＬ１ｃと呼ぶ脂質（総称してＳＭＬ１ａ〜ＳＭＬ１ｃと呼ぶ）の合成のための合成スキームをスキーム１に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ１ａ〜ｃの合成の詳細な記述により下に例示する。
【０２３１】
スキーム１．ＳＭＬ１a-cの合成ａ
【化４】
2011503188.tif 000016
【０２３２】
ａ試薬及び条件。（Ａ）塩化トリチル（１．０３当量）、ＺｎＣｌ２（０．０５当量）、ＤＭＦ、４℃、１０時間；（Ｂ）イソシアン酸アルキル（１．０当量）、ＤＭＳＯ、１００℃、２４時間；（Ｃ）ＣＨＣｌ３中ＴＦＡ（１６．７％）、ｒ．ｔ．、４時間；（Ｄ）クロロギ酸コレステリル（５当量）、ＤＩＰＥＡ（５．２当量）、ＣＨＣｌ３、ｒ．ｔ．、１６時間。「Ｔｒ」は、トリチル基を表す。「Ｃｈｏｌ−ＯＨ」＝コレステロール。
【０２３３】
１−Ｏ−トリチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（６）：塩化亜鉛粉末（無水、２５ｇ、１７５ｍモル）を無水ＤＭＦ（５００ｍＬ）中グリセロホスホコリン（５０ｇ、１８５ｍモル）の懸濁液に加えた。混合物をｒ．ｔ．で３０分間撹拌し、塩化トリチル（５３ｇ、１９０ｍモル）を４℃で加えた。反応物を４℃に１０時間保持した。次いで、１Ｌのジエチルエーテルを加えることにより、粗生成物を析出させた。油性生成物を１Ｌのクロロホルム／イソブタノール（２：１）に溶解し、３００ｍｌの４％水性アンモニアで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。揮発性物質の蒸発後、粗生成物をトルエンを用いて共沸乾燥した。残留物をアセトニトリルを用いてｒ．ｔ．で５時間摩砕した。次いで、白色析出物を収集し、高真空で乾燥した。収量：４５．２ｇ（４９重量％グリセロホスホコリン）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０８（溶出液Ａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４），δ３．１２（ｍ，２Ｈ）；３．１５（ｓ，９Ｈ）；３．５６（ｍ，２Ｈ）；３．９０（ｍ，２Ｈ）；４．０１（ｍ，ＩＨ）；４．２０（ｍ，２Ｈ）；７．２７（ｍ，９Ｈ）；７．４２（ｍ，６Ｈ）。MALDI-MS ：Ｃ２７Ｈ３５ＮＯ６Ｐ＋［Ｍ  ＋  Ｈ］＋  計算値５００．２２、実測値５００．３１。
【０２３４】
１−Ｏ−トリチル−２−ステアリルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（７ａ）：ジメチルスルホキシド（無水、１０ｍＬ）中６（１ｇ、２ｍモル）の溶液に、オクタデシルイソシアナート（０．６ｇ、２ｍモル）を加えた。反応混合物をＮ２下１００℃で２４時間撹拌した。溶媒の蒸発後、残留物をメタノールで抽出した。白色固体をろ別し、ろ液を蒸発乾固した。粗生成物をＨＰＦＣ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、３５／１３／２）により精製した。収量：４５０ｍｇ（２８．３重量％６）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２５（溶出液Ａ）。1H NMR(CDCl3), δ0.89 (t, J = 6.4, 3H); 1.25-1.31 (m, 30H); 1.47 (m, 2H); 3.01 (m, 2H); 3.20 (s, 9H);3.27 (m, 2H); 3.72 (m, 2H); 4.03-4.12 (m, 3H); 4.24 (m, 2H); 5.07 (br, IH); 7.20 (m, 9H); 7.41 (m, 6H)。MALDI-MS ：C46H72N2O7P+ [M + H]+ 計算値795.51、実測値795.52。
【０２３５】
１−Ｏ−トリチル−２−パルミチルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（７ｂ）：この化合物は、７ａの同じ手順に従って合成し、次のステップの反応に直接用いた。
【０２３６】
１−Ｏ−トリチル−２−ミリスチルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（７ｃ）：この化合物は、７ａの同じ手順に従って合成し、次のステップの反応に直接用いた。
【０２３７】
１−ヒドロキシ−２−ステアリルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（８ａ）：化合物７ａ（４２０ｍｇ、０．５２ｍモル）をクロロホルム（５ｍＬ）中トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１ｍＬ）によりｒ．ｔ．で４時間処理した。揮発性物質を蒸発させ、残留物をＨＰＦＣ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、１０／５／１）により精製した。収量：３２０ｍｇ（９９重量％７ａ）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（溶出液Ｂ）。1H NMR(CDCl3), δ0.88 (t, y = 6.4, 3H); 1.21-1.31 (br, 30H); 1.47 (m, 2H); 3.03 (m, IH); 3.1 1 (m, IH);3.29 (s, 9H); 3.66 (m, 2H); 3.76 (m, 2H); 3.99 (m, 2H); 4.30 (m, 2H); 4.78 (m, IH); 6.51 (br,IH)。MALDI-MS ：C27H58N2O7P+ [M + H]+ 計算値553.40、実測値553.38。
【０２３８】
１−ヒドロキシ−２−パルミチルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（８ｂ）：この化合物は、８ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（溶出液Ｂ）。1HNMR (CDCl3), δ0.89 (t, J = 6.4, 3H); 1.21-1.31 (br, 26H); 1.48 (m, 2H); 3.03 (m, IH); 3.11 (m,IH); 3.30 (s, 9H); 3.66-3.76 (m, 4H); 4.0 (m, 2H); 4.30 (m, 2H); 4.79 (m, IH); 6.52 (br, IH).MALDI-MS：C25H54N2O7P+ [M + H]+ 計算値525.37、実測値525.28。
【０２３９】
１−ヒドロキシ−２−ミリスチルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（８ｃ）：この化合物は、８ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（溶出液Ｂ）。1HNMR (CDCl3), δ0.89 (t, J = 6.4, 3H); 1.21-1.31 (m, 22H); 1.47 (m, 2H); 3.03 (m, IH); 3.11 (m,IH); 3.29 (s, 9H); 3.66-3.76 (m, 4H); 3.99 (m, 2H); 4.30 (m, 2H); 4.78 (m, IH); 6.52 (br, IH)。MALDI-MS ：C23H50N2O7P+ [M + H]+ 計算値497.34、実測値497.36。
【０２４０】
１−コレステリルカルボノイル−２−ステアリルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１ａ、ＣＨｃＳａＰＣ）：乾燥エタノール不含有クロロホルム（１０ｍＬ）中８ａ（０．３ｇ、０．５４ｍモル）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、０．５ｍＬ、２．８ｍモル）の溶液に、エタノール不含有クロロホルム（５ｍＬ）中クロロギ酸コレステリル（１．２１ｇ、２．７ｍモル）の溶液をｒ．ｔ．で１滴ずつ加えた。ｒ．ｔ．で１６時間の反応後に、揮発性物質を蒸発させ、残留物をＨＰＦＣ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、４０／１８／３）により精製した。収量：４３８ｍｇ（８４重量％８ａ）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２８（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 68H); 1.78-2.01 (m, 5H); 2.38 (m, 2H); 3.03 (m, IH); 3.17 (m, IH); 3.38 (s, 9H); 3.88 (m, 2H); 4.0 (m, 2H); 4.25 (m, IH); 4.36 (m, 4H); 5.08 (m, IH); 5.39 (IH, d, J = 4.4); 6.02 (br, IH)。MALDI-MS ：C55H102N2O9P+ [M + H]+ 計算値965.73、実測値965.68。
【０２４１】
１−コレステリルカルボノイル−２−パルミチルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１ｂ、ＣＨｃＰａＰＣ）：この化合物は、ＳＭＬ１ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２３（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 64H); 1.78- 2.01 (m, 5H); 2.37 (m, 2H); 3.0 (m, IH); 3.16 (m, IH); 3.37 (s, 9H); 3.88 (m, 2H); 3.98 (m, 2H);4.24 (m, IH); 4.36 (m, 4H); 5.07 (m, IH); 5.39 (IH, d, J = 4.4); 6.17 (br, IH)。MALDI-MS ：C53H98N2O9P+ [M + H]+ 計算値937.70、実測値937.69。
【０２４２】
１−コレステリルカルボノイル−２−ミリスチルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１ｃ、ＣＨｃＭａＰＣ）：この化合物は、ＳＭＬ１ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２５（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 60H); 1.78- 2.06 (m, 5H); 2.38 (m, 2H); 3.03 (m, IH); 3.17 (m, IH); 3.38 (s, 9H); 3.88 (m, 2H); 4.0 (m, 2H);4.25 (m, IH); 4.36 (m, 4H); 5.08 (m, IH); 5.40 (IH, d, J = 4.4); 6.02 (br, IH)。MALDI-MS ：C5IH94N2O9P+ [M + H]+ 計算値909.67、実測値909.70。
【０２４３】
実施例２：脂質ＳＭＬ２Ａ、ＳＭＬ２Ｂ、ＳＭＬ２Ｃ及びＳＭＬ２Ｄの調製
脂質ＳＭＬ２ａ、ＳＭＬ２ｂ、ＳＭＬ２ｃ及びＳＭＬ２ｄ（総称してＳＭＬ２ａ〜ＳＭＬ２ｄと呼ぶ）の合成のための合成スキームをスキーム２に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ２ａ〜ｄの合成の詳細な記述により下に例示する。
【０２４４】
スキーム２．ＳＭＬ２a、ＳＭＬ２b、ＳＭＬ２c及びＳＭＬ２dの合成ａ
【化５】
2011503188.tif 000017
【０２４５】
ａ試薬及び条件。（Ａ）１）ＮａＨ（１．２当量）、トルエン、ｒ．ｔ．、３０分；２）ヨードアルカン（１．２５当量）、還流、一夜；（Ｂ）ＭｅＯＨ中ＨＣｌ（濃）（１０％）、還流、５時間；（Ｃ）クロロギ酸コレステリル（１．０５当量）、ＤＩＰＥＡ（１．４当量）、ＤＭＡＰ（０．５当量）、ＣＨＣｌ３、０℃、０．５時間次いでｒ．ｔ．、一夜；（Ｄ）ＰＯＣｌ３（１．１当量）、ピリジン（２当量）、ＴＨＦ、０℃、２〜３時間；（Ｅ）コリンテトラフェニルホウ酸（２当量）、ＴＰＳ（２．５当量）、ピリジン、７０℃、１時間次いでｒ．ｔ．、３時間。「Ｃｈｏｌ−ＯＨ」＝コレステロール
【０２４６】
１，３−ベンジリデン−２−ステアリル−グリセロール（９ａ）：トルエン（１００ｍＬ）中１，３−ベンジリデングリセロール（７．２ｇ、４０ｍモル）の溶液をトルエン（３０ｍＬ）中ＮａＨ（鉱油中６０％、１．９２ｇ、４８ｍモル、ヘキサンで洗浄）懸濁液に撹拌しながらｒ．ｔ．で加えた。次いで、トルエン（４０ｍＬ）中１−ヨード−オクタデカン（２０ｇ、５０ｍモル）を反応混合物中に１滴ずつ加えた。添加後、混合物を窒素中で一夜還流し、ｒ．ｔ．に冷却した。水を混合物中に注意深く加えることにより、過剰なＮａＨを破壊した。次いで、反応混合物を水（１００ｍＬ×２）で洗浄した。有機層を収集し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発し、残留物を次のステップの反応に直接用いた。
【０２４７】
１，３−ベンジリデン−２−パルミチル−グリセロール（９ｂ）：この化合物は、９ａの同じ手順に従って合成した。
【０２４８】
１，３−ベンジリデン−２−ミリスチル−グリセロール（９ｃ）：この化合物は、９ａの同じ手順に従って合成した。
【０２４９】
１，３−ベンジリデン−２−オレイル−グリセロール（９ｄ）：この化合物は、９ａの同じ手順に従って合成した。
【０２５０】
２−ステアリル−グリセロール（１０ａ）：９ａの粗生成物を、ＨＣｌ（濃、３０ｍＬ）とメタノール（２７０ｍＬ）の混合溶液中で５時間還流することにより加水分解した。反応混合物をｒ．ｔ．に冷却し、減圧下で蒸発した。残留物をジエチルエーテル（３００ｍＬ）に溶解し、水酸化ナトリウム溶液（０．５Ｍ、１００ｍＬ）及び水（１５０ｍＬ×２）で連続的に洗浄した。次いで、エーテル層を乾燥し、蒸発した。粗生成物をＨＰＦＣ（ヘキサン中３０〜８０％酢酸エチル）により精製した。収量：１１．３ｇ（８２重量％、１，３−ベンジリデングリセロール）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１７（溶出液Ｄ）。1H NfMR (CDCl3), δ0.86 (t, J = 6.4, 3H); 1.29 (br, 30H); 1.58 (m, 2H); 3.44-3.78 (m, 7H)。MALDI-MS ：C21H45O3+ [M + H]+ 計算値345.34、実測値345.33。
【０２５１】
２−パルミチル−グリセロール（１０ｂ）：この化合物は、１０ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１６（溶出液Ｄ）。1H NMR (CDCl3), δ0.86 (t, J = 6.4, 3H); 1.29 (br, 26H); 1.57 (m, 2H); 3.44-3.78 (m, 7H)。MALDI-MS ：Ci9H41O3+ [M + H]+ 計算値317.31、実測値317.28。
【０２５２】
２−ミリスチル−グリセロール（１０ｃ）：この化合物は、１０ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１８（溶出液Ｄ）。1H NMR (CDCl3), δ0.87 (t, J = 6.4, 3H); 1.29 (br, 22H); 1.58 (m, 2H); 3.44-3.78 (m, 7H)。MALDI-MS ：CnH37O3+ [M + H]+ 計算値289.28、実測値289.26。
【０２５３】
２−オレイル−グリセロール（１０ｄ）：この化合物は、１０ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１７（溶出液Ｄ）。1H NMR (CDCl3), δ0.87 (t, J = 6.4, 3H); 1.29 (br, 22H); 1.58 (m, 2H); 2.0 (m, 4H); 3.44-3.78 (m, 7H); 5.34 (m, 2H)。MALDI-MS ：C21H43O3+ [M + H]+. 計算値343.32、実測値343.32。
【０２５４】
１−コレステリルカルボノイル−２−ステアリル−グリセロール（１１ａ）：乾燥エタノール不含有クロロホルム（１０ｍＬ）中１０ａ（０．７ｇ、２ｍモル）、ＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ、２．８ｍモル）及びＤＭＡＰ（０．１２ｇ、１ｍモル）の溶液に、クロロギ酸コレステリル（０．９４ｇ、２．１ｍモル）クロロホルム溶液（１０ｍＬ）を０℃で１滴ずつ加えた。反応混合物を０℃で５時間、次いで、ｒ．ｔ．で一夜撹拌した。揮発性物質を蒸発させ、粗生成物をＨＰＦＣ（ヘキサン中５〜１５％酢酸エチル）により精製した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４１（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 68H); 1.78- 2.01 (m, 5H); 2.40 (m, 2H); 3.52 (m, 2H); 3.60 (m, 2H); 3.68 (m, IH); 4.22 (m, 2H); 4.43 (m, IH); 5.40 (IH, d, J = 4.4)。MALDI-MS ：C49H89O5+ [M + H]+ 計算値757.67、実測値757.68。
【０２５５】
１−コレステリルカルボノイル−２−パルミチル−グリセロール（１１ｂ）：この化合物は、１１ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３９（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 64H); 1.79-2.01 (m, 5H); 2.39 (m, 2H); 2.80 (m, IH);3.51 (m, 2H); 3.61 (m, 2H); 3.72 (m, IH); 4.21 (m, 2H); 5.39 (IH, d, J = 4.4)；MALDI-MS ：C47H85O5+ [M + H]+ 計算値729.64、実測値729.61。
【０２５６】
１−コレステリルカルボノイル−２−ミリスチル−グリセロール（１１ｃ）：この化合物は、１１ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４０（溶出液Ｅ）。1H NMR(CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 60H); 1.78-2.02 (m, 5H); 2.38 (m, 2H); 2.82 (m, IH);3.51 (m, 2H); 3.60 (m, 2H); 3.72 (m, IH); 4.22 (m, 2H); 5.41 (IH, d, J = 4.4)；MALDI-MS ：C45H8IO5+ [M + H]+ 計算値711.69、実測値711.68。
【０２５７】
１−コレステリルカルボノイル−２−オレイル−グリセロール（１１ｄ）：この化合物は、１１ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４０（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s,3H); 0.85-1.65 (m, 60H); 1.78-2.01 (m, 9H); 2.38 (m, 2H); 3.51 (m, 2H); 3.60 (m, 2H); 3.71 (m,IH); 4.22 (m, 2H); 4.46 (m, IH); 5.35 (m, 2H); 5.40 (d, J = 4.4, IH)；MALDI-MS ：C49H87O5+ [M + H]+ 計算値755.66、実測値755.62。
【０２５８】
１−コレステリルカルボノイル−２−ステアリル−ｒａｃ−グリセロ−３−リン酸（１２ａ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（溶出液Ａ）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、Ｃ４９Ｈ８９ＮａＯ８Ｐ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算８５９．６２、観測８５９．６０
【０２５９】
１−コレステリルカルボノイル−２−パルミチル−ｒａｃ−グリセロ−３−リン酸（１２ｂ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（溶出液Ａ）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、Ｃ４７Ｈ８５ＮａＯ８Ｐ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算８３１．５９、観測８３１．６１
【０２６０】
１−コレステリルカルボノイル−２−ミリスチル−ｒａｃ−グリセロ−３−リン酸（１２ｃ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（溶出液Ａ）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、Ｃ４５Ｈ８１ＮａＯ８Ｐ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算８０３．５６、観測８０３．５５
【０２６１】
１−コレステリルカルボノイル−２−オレイル−ｒａｃ−グリセロ−３−リン酸（１２ｄ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（溶出液Ａ）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、Ｃ４９Ｈ８７ＮａＯ８Ｐ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋について計算８５７．６０、観測８５７．６２
【０２６２】
１−コレステリルカルボノイル−２−ステアリル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ２ａ、ＣｈｃＳｅＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３（溶出液Ａ）。δ 0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 68H); 1.78-2.04 (m, 5H); 2.38 (m, 2H); 3.41 (s, 9H); 3.52 (m, 2H); 3.68 (m, IH); 3.88 (m, 4H); 4.19 (m, IH); 4.35 (m, 4H); 5.39 (IH, d, J = 4.4)；MALDI-MS ：C54H1OiNO8P+ [M + H]+ 計算値922.73、実測値922.74。
【０２６３】
１−コレステリルカルボノイル−２−パルミチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ２ｂ、ＣｈｃＳｅＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３（溶出液Ａ）。δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 64H); 1.78- 2.04 (m, 5H); 2.38 (m, 2H); 3.41 (s, 9H); 3.52 (m, 2H); 3.68 (m, IH); 3.88 (m, 4H); 4.19 (m, IH); 4.35 (m, 4H); 5.39 (IH, d, J = 4.4)；MALDI-MS ：C52H97NO8P+ [M + H]+ 計算値894.69、実測値894.70。
【０２６４】
１−コレステリルカルボノイル−２−ミリスチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ２ｃ、ＣｈｃＳｅＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３（溶出液Ａ）。δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 60H); 1.78- 2.04 (m, 5H); 2.38 (m, 2H); 3.41 (s, 9H); 3.52 (m, 2H); 3.68 (m, IH); 3.88 (m, 4H); 4.19 (m, IH); 4.35 (m, 4H); 5.39 (IH, d, J = 4.4)；MALDI-MS ：C52H97NO8P+ [M + H]+ 計算値866.66、実測値866.67。
【０２６５】
１−コレステリルカルボノイル−２−オレイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ２ｄ、ＣｈｃＳｅＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３（溶出液Ａ）。δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 60H); 1.78- 2.04 (m, 9H); 2.39 (m, 2H); 3.40 (s, 9H); 3.54 (m, 2H); 3.70 (m, IH); 3.84-3.97 (m, 4H); 4.20 (m, IH); 4.35-4.44 (m, 4H); 5.35 (m, 2H); 5.39 (IH, d, J = 4.4)；MALDI-MS ：C54H99NO8P+ [M + H]+ 計算値920.71、実測値920.73。
【０２６６】
実施例３：脂質ＳＭＬ３Ａ、ＳＭＬ３Ｂ、ＳＭＬ３Ｃ及びＳＭＬ３Ｄの調製
脂質ＳＭＬ３ａ、ＳＭＬ３ｂ、ＳＭＬ３ｃ及びＳＭＬ３ｄ（総称してＳＭＬ３ａ〜ＳＭＬ３ｄと呼ぶ）の合成のための合成スキームをスキーム３に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ３ａ〜ｄの合成の詳細な記述により下に例示する。
【０２６７】
スキーム３．ＳＭＬ３a-dの合成ａ
【化６】
2011503188.tif 000018
【０２６８】
ａ試薬及び条件。（Ａ）コレステリルトシラート、トルエン、９０℃、４時間；（Ｂ）ＴＦＡ−ＨＣｌ（濃）２：１、ＴＨＦ、ｒ．ｔ．、４時間；（Ｃ）塩化トリチル（１．５当量）、ピリジン、５０℃、１８時間；（Ｄ）脂肪酸（１．０５当量）、ＤＣＣ（１．０５当量）、ＤＭＡＰ（０．３当量）、ＣＨＣｌ３、ｒ．ｔ．、一夜；（Ｅ）ＢＦ３．Ｅｔ２Ｏ（４当量）、ＣＨＣｌ３、０℃、３時間；（Ｆ）ＰＯＣｌ３（１．１当量）、ピリジン（２当量）、ＴＨＦ、０℃、２〜３時間；（Ｇ）コリンテトラフェニルホウ酸（２当量）、ＴＰＳ（２．５当量）、ピリジン、７０℃、１時間、次いで、ｒ．ｔ．、３時間。「Ｔｒ」はトリチル基を意味する。「Ｃｈｏｌ−ＯＨ」＝コレステロール。
【０２６９】
３−（２，３−イソプロピリデン−１−グリセリル）コレステロール（１３）：トルエン（５０ｍＬ）中コレステリルトシラート（５０ｇ、９０ｍモル）及びソルケタール（２５０ｍＬ、２モル）の混合物を窒素中で８０〜９０℃で４時間撹拌した。ｒ．ｔ．に冷却した後、トルエン（３００ｍＬ）を混合物に加えた。混合物を食塩水（３００ｍＬ）で洗浄した。分離後、追加の２００ｍＬのトルエンを有機層に加えた。次いで、有機層を食塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、蒸発乾固した。粗生成物を次のステップの反応に直接用いた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５５（溶出液Ｇ）。
【０２７０】
１−グリセリルコレステロール（１４）：１３の粗生成物をＴＨＦ（１３０ｍＬ）−ＴＦＡ（４０ｍＬ）−ＨＣｌ（濃、２０ｍＬ）の混合溶媒に溶解した。混合物をｒ．ｔ．に４時間保持した。揮発性物質を減圧下で蒸発させた。残留物をＣＨＣＬ３／ＭｅＯＨ（４００ｍＬ／１００ｍＬ）に溶解し、水（１００ｍＬ）で洗浄した。次いで、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、蒸発した。粗生成物を−２０℃のエタノールからの再結晶化により精製した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１２（溶出液Ｈ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 33H); 1.78-2.31 (m, 7H); 3.10 (m, IH); 3.45-3.70 (m, 4H); 3.79 (m, IH); 5.34 (IH, d, J = 4.4)；MALDI-MS ：C30H53O3+ [M + H]+ 計算値461.40、実測値461.44。
【０２７１】
１−コレステリル−３−トリチルグリセロール（１５）：トリチル基による１４の３−ヒドロキシ基の保護を一般的手順に従って行った。生成物をＨＰＦＣ（ヘキサン中９％〜２５％酢酸エチル）により精製した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３８（溶出液Ｆ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 33H); 1.86 (m, 3H); 2.0 (m, 2H); 2.18 (m, IH); 2.32 (m, IH); 2.42 (br, IH); 3.1 1- 3.22 (m, 3H); 3.57 (m, 2H); 3.93 (m, IH); 5.35 (IH, d, J = 4.4); 7.28 (m, 9H); 7.43 (m, 6H)。MALDI-MS ：C49H67O3+ [M + H]+ 計算値703.51、実測値703.53。
【０２７２】
１−コレステリル−２−ステアロイル−３−トリチルグリセロール（１６ａ）：乾燥エタノール不含有クロロホルム（２０ｍＬ）中１５（２．１１ｇ、３ｍモル）、ステアリン酸（０．９４ｇ、３．１５ｍモル）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．１３ｇ）の溶液に、ＤＣＣ（０．６５ｇ、３．１５ｍモル）を０℃で加えた。反応混合物を０℃で３０分間、次いで、ｒ．ｔ．で一夜撹拌した。白色沈殿をろ別し、ろ液を蒸発乾固した。粗生成物をＨＰＦＣ（ヘキサン中１％〜１０％酢酸エチル）により精製した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 66H); 1.81 (m, 3H); 2.0 (m, 2H); 2.19 (m, IH); 2.26 (m, IH); 2.35 (t, J = 7.2, 2H); 3.12 (m, IH);3.25 (m, 2H); 3.67 (m, 2H); 5.17 (m, IH); 5.32 (d, J = 4.4, IH); 7.27 (m, 9H); 7.44 (m, 6H)。MALDI-MS ：C67H1OiO4+ [M + H]+ 計算値969.77、実測値969.73。
【０２７３】
１−コレステリル−２−パルミトイル−３−トリチルグリセロール（１６ｂ）：この化合物は、１６ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 62H); 1.80 (m, 3H); 1.99 (m, 2H); 2.10 (m, IH); 2.27 (m, IH); 2.35 (t, J = 7.2, 2H); 3.12 (m, IH); 3.25 (m, 2H); 3.66 (m, 2H); 5.16 (m, IH); 5.32 (d, / = 4.4, IH);7.26 (m, 9H); 7.42 (m, 6H)。MALDI-MS ：C65H97O4+ [M + H]+ 計算値941.74、実測値941.72。
【０２７４】
１−コレステリル−２−ミリストイル−３−トリチルグリセロール（１６ｃ）：この化合物は、１６ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 58H); 1.81 (m, 3H); 2.0 (m, 2H); 2.19 (m, IH); 2.26 (m, IH); 2.35 (t, J = 7.2, 2H); 3.12 (m, IH); 3.25 (m, 2H); 3.66 (m, 2H); 5.17 (m, IH); 5.32 (d, J = 4.4, IH); 7.27 (m, 9H); 7.44 (m, 6H)。MALDI-MS ：C63H93O4+ [M + H]+ 計算値913.71、実測値913.71。
【０２７５】
１−コレステリル−２−オレオイル−３−トリチルグリセロール（１６ｄ）：この化合物は、１６ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 58H); 1.81 (m, 3H); 2.01 (m, 6H); 2.11 (m, IH); 2.27 (m, IH); 2.37 (t, J = 7.2, 2H); 3.13 (m, IH); 3.24 (m, 2H); 3.66 (m, 2H); 5.17 (m, IH); 5.35 (m, 3H); 7.28 (m, 9H);7.45 (m,' 6H)。MALDI-MS ：C67H99O4+ [M + H]+ 計算値967.75、実測値967.74。
【０２７６】
１−コレステリル−２−ステアロイルグリセロール（１７ａ）：トリチル基の除去を一般的手順に従って行った。粗生成物を次のステップの反応に直接用いた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０８（溶出液Ｅ）。
【０２７７】
１−コレステリル−２−パルミトイルグリセロール（１７ｂ）：トリチル基の除去を一般的手順に従って行った。粗生成物を次のステップの反応に直接用いた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０８（溶出液Ｅ）。
【０２７８】
１−コレステリル−２−ミリストイルグリセロール（１７ｃ）：トリチル基の除去を一般的手順に従って行った。粗生成物を次のステップの反応に直接用いた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（１０／１）で０．０８。
【０２７９】
１−コレステリル−２−オレオイルグリセロール（１７ｄ）：トリチル基の除去を一般的手順に従って行った。粗生成物を次のステップの反応に直接用いた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０８（溶出液Ｅ）。
【０２８０】
１−コレステリル−２−ステアロイル−ｒａｃ−グリセロ−３−リン酸（１８ａ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（溶出液Ａ）。
【０２８１】
１−コレステリル−２−パルミトイル−ｒａｃ−グリセロ−３−リン酸（１８ｂ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（溶出液Ａ）。
【０２８２】
１−コレステリル−２−ミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−リン酸（１８ｃ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（溶出液Ａ）。
【０２８３】
１−コレステリル−２−オレオイル−ｒａｃ−グリセロ−３−リン酸（１８ｄ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．０５（溶出液Ａ）。
【０２８４】
１−コレステリル−２−ステアロイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ３ａ、ＣｈｅＳＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３１（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 66H); 1.84 (m, 3H);2.0 (m, 2H); 2.12 (m, IH); 2.30 (m, 3H); 3.15 (m, IH); 3.39 (s, 9H); 3.63 (m, 2H); 3.81 (m, 2H);4.25-4.45 (m, 5H); 5.33 (d, J = 4.4, IH)。MALDI-MS ：C53H99NO7P+ [M + H]+ 計算値892.72、実測値892.73。
【０２８５】
１−コレステリル−２−パルミトイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ３ｂ、ＣｈｅＰＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３１（溶出液Ａ）。 1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 62H); 1.83 (m, 3H); 1.99 (m, 2H); 2.11 (m, IH); 2.29 (m, 3H); 3.14 (m, IH); 3.38 (s, 9H); 3.64 (m, 2H); 3.82 (m,2H); 4.24-4.44 (m, 5H); 5.32 (d, J = 4.4, IH)。MALDI-MS ：C51H9sNO7P+ [M + H]+  計算値864.68、実測値864.70。
【０２８６】
１−コレステリル−２−ミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ３ｃ、ＣｈｅＭＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３１（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 58H); 1.83 (m, 3H);1.99 (m, 2H); 2.12 (m, IH); 2.30 (m, 3H); 3.14 (m, IH); 3.39 (s, 9H); 3.62 (m, 2H); 3.83 (m,2H); 4.22-4.42 (m, 5H); 5.33 (d, J = 4.4, IH)。MALDI-MS ：C49H91NO7P+ [M + H]+  計算値836.65、実測値836.65。
【０２８７】
１−コレステリル−２−オレオイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ３ｄ、ＣｈｅＯＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３０（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 58H); 1.83 (m, 3H);2.0 (m, 6H); 2.12 (m, IH); 2.29 (m, 3H); 3.13 (m, IH); 3.36 (s, 9H); 3.60 (m, 2H); 3.82 (m, 2H);4.25-4.45 (m, 5H); 5.32 (m, 3H)。MALDI-MS ：C53H97NO7P+ [M + H]+ 計算値890.70、実測値890.67。
【０２８８】
実施例４：脂質ＳＭＬ４Ａ〜４Ｄの調製
脂質ＳＭＬ４ａ、ＳＭＬ４ｂ、ＳＭＬ４ｃ及びＳＭＬ４ｄ（総称してＳＭＬ４ａ〜ｄと呼ぶ）の合成のための合成スキームをスキーム４に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ４ａ〜ｄの合成の詳細な記述により下に例示する。
【０２８９】
スキーム４．ＳＭＬ４a-dの合成ａ
【化７】
2011503188.tif 000019
【０２９０】
ａ試薬及び条件。（Ａ）ＮａＨ（１．７当量）、ブロモアルカン（０．９当量）、トルエン、１２０℃、一夜；（Ｂ）ＭｅＯＨ中ＨＣｌ（２Ｍ）、還流、１．５時間；（Ｃ）塩化トリチル（１．５当量）、ピリジン、５０℃、１８時間；（Ｄ）クロロギ酸コレステリル（１．２当量）、ＤＭＡＰ（１．２当量）、ＣＨＣｌ３、ｒ．ｔ．、一夜；（Ｅ）ＢＦ３．Ｅｔ２Ｏ（４当量）、ＣＨＣｌ３、０℃、３時間；（Ｆ）ＰＯＣｌ３（１．１当量）、ピリジン（２当量）、ＴＨＦ、０℃、２〜３時間；（Ｇ）コリンテトラフェニルホウ酸（２当量）、ＴＰＳ（２．５当量）、ピリジン、７０℃、１時間、次いで、ｒ．ｔ．、３時間。「Ｃｈｏｌ−ＯＨ」＝コレステロール。
【０２９１】
１−パルミチル−２，３−イソプロピリデングリセロール（１９ｂ）：５０ｍＬ無水トルエン中ＮａＨ（９ｇ、０．２２５モル）の懸濁液に、ソルケタール（１９．８ｇ、０．１５モル）を１滴ずつ加えた。添加後、反応混合物を１２０℃で１５分間撹拌した。次いで、１−ブロモテトラデカン（４０ｍＬ、０．１３４モル）を混合物に加え、反応物を１２０℃に一夜保持した。反応混合物をｒ．ｔ．に冷却した後、水（４００ｍＬ）を注意深く加えて過剰なＮａＨを破壊し、続いてヘキサン（４００ｍＬ）を加えた。次いで、有機層を水（２００ｍＬ×２）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、蒸発した。残留物を次のステップの反応に直接用いた。
【０２９２】
１−ミリスチル−２，３−イソプロピリデングリセロール（１９ｃ）：この化合物は、１９ｂの同じ手順に従って合成した。
【０２９３】
１−オレイル−２，３−イソプロピリデングリセロール（１９ｄ）：この化合物は、１９ｂの同じ手順に従って合成した。
【０２９４】
１−パルミチルグリセロール（２０ｂ）：粗生成物１９ｂを２００ｍＬのメタノール及び４０ｍＬの濃ＨＣｌに溶解し、１．５時間還流した。次いで、混合物をｒ．ｔ．に冷却し、４℃で一夜放置した。結晶を収集し、メタノールから再結晶化した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（溶出液Ｄ）。1H NMR (CDCl3), δ0.87 (t, J = 7.2, 3H); 1.27 (br, 26H); 1.53 (m, 2H); 2.52 (br, 2H); 3.30-3.90 (m, 7H)。MALDI-MS ：C19H41O3+ [M + H]+ 計算値317.31、実測値317.30。
【０２９５】
１−ミリスチルグリセロール（２０ｃ）：この化合物は、２０ｂの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（溶出液Ｄ）。1H NMR (CDCl3), δ0.87 (t, / = 7.2, 3H); 1.27 (br, 22H); 1.52 (m, 2H); 2.50 (br, 2H); 3.31-3.90 (m, 7H)。MALDI-MS ：CnH37O3+ [M + H]+ 計算値289.28、実測値289.25。
【０２９６】
１−オレイルグリセロール（２０ｄ）：この化合物は、２０ｂの同じ手順に従って合成したが、ＨＰＦＣ（ヘキサン中３０〜７０％酢酸エチル）により精製した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（溶出液Ｄ）。1H NMR (CDCl3), δ0.87 (t, J = 7.2, 3H); 1.27 (br, 22H); 1.57 (m, 2H); 2.0 (m, 4H); 2.62 (br, 2H); 3.36-3.54 (m, 4H); 3.68 (m, 2H); 3.85 (m, IH); 5.34 (m, 2H)。MALDI-MS ：C2IH43O3+ [M + H]+ 計算値343.32、実測値343.36。
【０２９７】
１−ステアリル−３−トリチルグリセロール（２１ａ）：３−トリチル基を一般的手順に従って導入した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１１（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.87 (t, J = 7.2, 3H); 1.27 (br, 30H); 1.55 (m, 2H); 2.40 (br, IH); 3.18 (m, 2H); 3.32-3.53 (m, 4H). 3.94 (m, IH); 7.23 (m, 9H); 7.43 (m, 6H)。MALDI-MS ：C40H59O3+ [M + H]+ 計算値587.45、実測値587.44。
【０２９８】
１−パルミチル−３−トリチルグリセロール（２１ｂ）：３−トリチル基を一般的手順に従って導入した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１１（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.87 (t, J = 7.2, 3H); 1.27 (br, 26H); 1.55 (m, 2H); 2.42 (br, IH); 3.18 (m, 2H); 3.32-3.53 (m, 4H). 3.94 (m, IH); 7.22 (m, 9H); 7.42 (m, 6H)。MALDI-MS ：C38H55O3+ [M + H]+ 計算値559.42、実測値559.40。
【０２９９】
１−ミリスチル−３−トリチルグリセロール（２１ｃ）：３−トリチル基を一般的手順に従って導入した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１１（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.87 (t, J = 7.2, 3H); 1.27 (br, 22H); 1.55 (m, 2H); 2.41 (br, IH); 3.14 (m, 2H); 3.34-3.53 (m, 4H). 3.94 (m, IH); 7.27 (m, 9H); 7.44 (m, 6H)。MALDI-MS ：C36H51O3+ [M + H]+ 計算値531.39、実測値531.38。
【０３００】
１−オレイル−３−トリチルグリセロール（２１ｄ）：３−トリチル基を一般的手順に従って導入した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１１（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.88 (t, J = 7.2, 3H); 1.28 (br, 22H); 1.56 (m, 2H); 2.0 (m, 4H); 2.42 (br, IH); 3.20 (m, 2H); 3.36-3.54 (m, 4H); 3.96 (m, IH); 5.35 (m, 2H); 7.25 (m, 9H); 7.45 (m, 6H)。MALDI-MS ：C40H57O3+ [M + H]+ 計算値585.43、実測値585.44。
【０３０１】
１−ステアリル−２−コレステリルカルボノイル−３−トリチルグリセロール（２２ａ）：乾燥エタノール不含有クロロホルム（１０ｍＬ）中２１ａ（２．４ｇ、４ｍモル）及びＤＭＡＰ（０．６ｇ）の溶液に、クロロホルム（５ｍＬ）中クロロギ酸コレステリル（２．２ｇ、４．８ｍモル）の溶液をｒ．ｔ．で１滴ずつ加えた。反応混合物をｒ．ｔ．で一夜撹拌した。次いで、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（４０ｍＬ／２０ｍＬ／３０ｍＬ）の混合溶媒を反応混合物に加えた。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、蒸発した。粗生成物をＨＰＦＣ（ヘキサン中０〜１０％酢酸エチル）により精製した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４３（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 68H); 1.79- 2.02 (m, 5H); 2.42 (m, 2H); 3.25 (m, 2H); 3.38 (m, 2H); 3.60 (m, 2H); 4.48 (m, IH); 5.04 (m, IH); 5.39 (d, J = 4.4, IH); 7.27 (m, 9H); 7.43 (m, 6H)。MALDI-MS ：C68H103O5+ [M + H]+ 計算値999.78, 実測値999.75。
【０３０２】
１−パルミチル−２−コレステリルカルボノイル−３−トリチルグリセロール（２２ｂ）：この化合物は、２２ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４３（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 64H); 1.79-2.02 (m, 5H); 2.42 (m, 2H); 3.24 (m, 2H); 3.37 (m, 2H); 3.61 (m, 2H); 4.48 (m, IH); 5.04 (m, IH); 5.39 (d, J = 4.4, IH); 7.27 (m, 9H); 7.43 (m, 6H). MALDI-MS：C66H99O5+ [M + H]+ 計算値971.75、実測値971.78。
【０３０３】
１−ミリスチル−２−コレステリルカルボノイル−３−トリチルグリセロール（２２ｃ）：この化合物は、２２ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４３（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 60H); 1.79-2.02 (m, 5H); 2.42 (m, 2H); 3.23 (m, 2H); 3.37 (m, 2H); 3.61 (m, 2H); 4.48 (m, IH); 5.04 (m, IH); 5.39 (d, J = 4.4, IH); 7.27 (m, 9H); 7.43 (m, 6H). MALDI-MS：C64H95O5+ [M + H]+ 計算値943.72、実測値943.71。
【０３０４】
１−オレイル−２−コレステリルカルボノイル−３−トリチルグリセロール（２２ｄ）：この化合物は、２２ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４３（溶出液Ｅ）。1H NMR (CDCl3), J0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 60H); 1.79-2.02 (m, 9H); 2.40 (m, 2H); 3.23 (m, 2H); 3.37 (m, 2H); 3.61 (m, 2H); 4.48 (m, IH); 5.04 (m, IH); 5.33-5.39 (m, 3H); 7.27 (m, 9H); 7.44. (m, 6H)。MALDI-MS：C68HiOiO5+ [M + H]+ 計算値997.77、実測値997.74。
【０３０５】
１−ステアリル−２−コレステリルカルボノイルグリセロール（２３ａ）：この化合物は、トリチル基の除去の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６３（溶出液Ｄ）。
【０３０６】
１−パルミチル−２−コレステリルカルボノイルグリセロール（２３ｂ）：この化合物は、トリチル基の除去の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６３（溶出液Ｄ）。
【０３０７】
１−ミリスチル−２−コレステリルカルボノイルグリセロール（２３ｃ）：この化合物は、トリチル基の除去の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６３（溶出液Ｄ）。
【０３０８】
１−オレイル−２−コレステリルカルボノイルグリセロール（２３ｄ）：この化合物は、トリチル基の除去の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６３（溶出液Ｄ）。
【０３０９】
１−ステアリル−２−コレステリルカルボノイル−ｒａｃ−グリセロ−３−リン酸（２４ａ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５７（溶出液Ｃ）。
【０３１０】
１−パルミチル−２−コレステリルカルボノイル−ｒａｃ−グリセロ−３−リン酸（２４ｂ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５７（溶出液Ｃ）。
【０３１１】
１−ミリスチル−２−コレステリルカルボノイル−ｒａｃ−グリセロ−３−リン酸（２４ｃ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５７（溶出液Ｃ）。
【０３１２】
１−オレイル−２−コレステリルカルボノイル−ｒａｃ−３−グリセロ−リン酸（２４ｄ）：この化合物は、リン酸化の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５７（溶出液Ｃ）。
【０３１３】
１−ステアリル−２−コレステリルカルボノイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ４ａ、ＳｅＣＨｃＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５３（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 3H); 0.85- 1.65 (m, 66H); 1.84-2.05 (m, 5H); 2.36 (m, 2H); 3.39 (s, 9H); 3.44 (m, 2H); 3.61 (m, 2H); 3.83 (m, 2H); 4.01 (m, 2H); 4.35 (m, 2H); 4.44 (m, IH); 4.98 (m, IH); 5.39 (d, J = 4.4, IH)。MALDI- MS：C54H1OiNO8P+ [M + H]+ 計算値922.73、実測値922.73。
【０３１４】
１−パルミチル−２−コレステリルカルボノイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ４ｂ、ＰｅＣＨｃＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５３（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 3H); 0.85- 1.65 (m, 62H); 1.84-2.05 (m, 5H); 2.36 (m, 2H); 3.38 (s, 9H); 3.45 (m, 2H); 3.61 (m, 2H); 3.82 (m, 2H); 4.02 (m, 2H); 4.35 (m, 2H); 4.44 (m, IH); 4.98 (m, IH); 5.39 (d, J = 4.4, IH)。MALDI- MS：C52H97NO8P+ [M + H]+ 計算値894.69、実測値894.68。
【０３１５】
１−ミリスチル−２−コレステリルカルボノイル−ｒａｃ−３−グリセロ−ホスホコリン（ＳＭＬ４ｃ、ＭｅＣＨｃＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５３（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 3H); 0.85- 1.65 (m, 58H); 1.84-2.05 (m, 5H); 2.37 (m, 2H); 3.39 (s, 9H); 3.44 (m, 2H); 3.61 (m, 2H); 3.83 (m, 2H); 4.02 (m, 2H); 4.35 (m, 2H); 4.44 (m, IH); 4.98 (m, IH); 5.39 (d, J = 4.4, IH)。MALDI- MS：C50H93NO8P+ [M + H]+ 計算値866.66、実測値866.64。
【０３１６】
１−オレイル−２−コレステリルカルボノイル−ｒａｃ−３−グリセロ−ホスホコリン（ＳＭＬ４ｄ、ＯｅＣＨｃＰＣ）：この化合物は、ホスホコリン合成の一般的手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５３（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.69 (s, 3H); 0.85- 1.65 (m, 58H); 1.84-2.05 (m, 9H); 2.37 (m, 2H); 3.38 (s, 9H); 3.45 (m, 2H); 3.62 (m, 2H); 3.84 (m, 2H); 4.02 (m, 2H); 4.35 (m, 2H); 4.45 (m, IH); 4.98 (m, IH); 5.35-5.39 (m, 3H)。MALDI-MS：C54H99NO8P+ [M + H]+ 計算値920.71、実測値920.71。
【０３１７】
実施例５：脂質ＳＭＬ５Ａ〜５Ｄの調製
脂質ＳＭＬ５ａ、ＳＭＬ５ｂ、ＳＭＬ５ｃ及びＳＭＬ５ｄ（総称してＳＭＬ５ａ〜ｄと呼ぶ）の合成のための合成スキームをスキーム５に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ５ａ〜ｄの合成の詳細な記述により下に例示する。
【０３１８】
スキーム５．ＳＭＬ５a-dの合成ａ
【化８】
2011503188.tif 000020
【０３１９】
ａ試薬及び条件。（Ａ）クロロギ酸コレステリル（２．３当量）、ＤＭＡＰ（４当量）、ＣＨＣｌ３、ｒ．ｔ．、「Ｃｈｏｌ−ＯＨ」＝コレステロール。
【０３２０】
１−ステアロイル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ５ａ、ＳＣｈｃＰＣ）：エタノール不含有乾燥クロロホルム（５０ｍＬ）中１−ステアリル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロホスホコリン（１ｇ、１．９１ｍモル）及びＤＭＡＰ（１ｇ）の溶液に、クロロギ酸コレステリル（２ｇ、４．４５ｍモル）のクロロホルム溶液（１０ｍＬ）をｒ．ｔ．で１滴ずつ加えた。ｒ．ｔ．で１６時間の反応後、溶媒を蒸発させ、残留物をＨＰＦＣ（ＣＨＣｌ３〜ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（６５／２５／４））により精製した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５４（溶出液Ｃ）。1H NMR (CDCl3/Me0H-d4/pyridine-d5, 10:2:1), δ0.68 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 66H); 1.84-2.05 (m, 5H); 2.33 (t, J = 7.6 Hz, 2H); 2.39 (m, 2H); 3.28 (s, 9H); 3.67 (m, 2H); 4.10 (m, 2H); 4.24 (m, IH); 4.32 (m, 2H); 4.47 (m, 2H); 5.11 (m, IH); 5.41 (d, 7 = 4.4, IH)。MALDI-MS：C54H99NO9P+ [M + H]+ 計算値937.61、実測値937.67。
【０３２１】
１−パルミトイル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ５ｂ、ＰＣｈｃＰＣ）：この化合物は、５ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５４（溶出液Ｃ）。 1H NMR (CDCls/MeOH-d4/pyridine-d5, 10:2: 1), δ0.68 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 62H); 1.84-2.05 (m, 5H); 2.31 (t, J = 7.6, 2H); 2.36 (m, 2H); 3.27 (s, 9H); 3.66 (m, 2H); 4.08 (m, 2H); 4.23 (m, IH); 4.30 (m, 2H); 4.44 (m, 2H); 5.08 (m, IH); 5.40 (d, J = 4.4, IH)。MALDI-MS：C52H95NO9P+ [M + H]+ 計算値908.67、実測値908.67。
【０３２２】
１−ミリストイル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ５ｃ、ＭＣｈｃＰＣ）：この化合物は、５ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５４（溶出液Ｃ）。1H NMR (CDCl3/MeOH-d4/pyridine-d5, 10:2: 1), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 58H); 1.84-2.05 (m, 5H); 2.33 (t, J = 7.6, 2H); 2.39 (m, 2H); 3.27 (s, 9H); 3.67 (m, 2H); 4.09 (m, 2H); 4.24 (m, IH); 4.31 (m, 2H); 4.45 (m, 2H); 5.09 (m, IH); 5.40 (d, J = 4.4, IH)。MALDI-MS：C52H95NO9P+ [M + H]+ 計算値908.67、実測値908.67。
【０３２３】
１−オレオイル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ５ｄ、ＯＣｈｃＰＣ）：この化合物は、５ａの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５４（溶出液Ｃ）。1H NMR (CDCls/MeOH-d4/pyridine-d5, 10:2: 1), δ0.69 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 58H); 1.84-2.06 (m, 9H); 2.33 (t, J = 7.6, 2H); 2.39 (m, 2H); 3.28 (s, 9H); 3.68 (m, 2H); 4.10 (m, 2H); 4.24 (m, IH); 4.32 (m, 2H); 4.47 (m, 2H); 5.10 (m, IH); 5.36 (m, 2H); 5.40 (d, J = 4.4, IH)。MALDI-MS：C54H97NO9P+ [M + H]+ 計算値934.69、実測値934.68。
【０３２４】
実施例６：ＳＭＬ６Ａ〜Ｄの調製
脂質ＳＭＬ６ａ、ＳＭＬ６ｂ、ＳＭＬ６ｃ及びＳＭＬ６ｄ（総称してＳＭＬ６ａ〜ｄと呼ぶ）の合成のための特定の合成スキームをスキーム６に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ６ａ〜ｄの合成の詳細な記述により下に例示する。
【０３２５】
ＳＭＬ６a-dの合成
【化９】
2011503188.tif 000021
【０３２６】
１，２−ジコレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ６ａ、ＤＣｈｃＰＣ）：グリセロホスホコリン（０．５１４ｇ、２ｍモル）及びテトラフェニルホウ酸ナトリウム（０．７１９ｇ、１．０５当量）を１５ｍＬのメタノールに溶解した。溶媒を蒸発させ、残留物をトルエンを用いて共沸乾燥した。次いで、乾燥固体を無水ピリジン（６０ｍＬ）に溶解し、続いて、４，４−ジメチルアミノピリジン（０．７３２ｇ、６ｍモル）を加えた。クロロギ酸コレステリル（２．７０、６ｍモル）を反応混合物にｒ．ｔ．で激しく撹拌しながら少しずつ加えた。次いで、反応フラスコを窒素でパージし、暗所に３日間保持した。揮発性物質をロータリーエバポレーターで蒸発させた。粗生成物をクロロホルム−メタノール（２：１、１５０ｍＬ）に溶解し、５０ｍＬの蒸留水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、蒸発した。残留物をさらなる精製のためにＨＰＦＣにかけた（ＣＨＣｌ３〜ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（６５／２５／４））。収量０．３８ｇ（１７．７％）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 6H); 0.85-1.65 (m, 66H); 1.81-2.06 (m, 10H); 2.37 (m, 4H); 3.42 (s, 9H); 3.89 (m, 2H); 4.06 (m, 2H), 4.26 (m, 2H); 4.36 (m, 2H); 4.44 (m, 2H); 5.04 (m, IH); 5.38 (d, J = 4.4, 2H)。MALDI-MS：C64HiO9NOi0P+ [M + H]+ 計算値1082.79、実測値1082.73。
【０３２７】
１，２−ジコレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ６ｂ、ＤＣＨＥＭＳＰＣ）：グリセロホスホコリン（１．０３ｇ、４ｍモル）及びテトラフェニルホウ酸ナトリウム（１．３３ｇ、１当量）を３０ｍＬのメタノールに溶解した。溶媒を蒸発させ、残留物をトルエンを用いて共沸乾燥した。次いで、乾燥固体を無水ピリジン（１２０ｍＬ）に溶解し、続いて、４，４−ジメチルアミノピリジン（０．９ｇ）及びヘミコハク酸コレステリル（４．８６ｇ、１０ｍモル）を加えた。混合物を加温して固体を完全に溶解した。反応混合物を室温に冷却した後にジシクロヘキシルカルボジイミド（２．３２ｇ、１１ｍモル）を反応混合物に加えた。混合物を窒素中で室温で３日間撹拌した。揮発性物質をロータリーエバポレーターで蒸発させ、残留物をクロロホルム−メタノール（２：１、３０００ｍＬ）に溶解し、８０ｍＬの蒸留水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、蒸発し、さらなる精製のためにＨＰＦＣにかけた（ＣＨＣｌ３〜ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（６５／２５／４））。収量２．３ｇ（４８％）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４２（溶出液Ａ）。1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 6H); 0.85-1.65 (m, 66H); 1.81-2.06 (m, 10H); 2.30 (m, 4H); 2.60 (m, 8H); 3.39 (s, 9H); 3.85 (m, 2H); 3.99 (m, 2H), 4.23 (m, 2H); 4.35 (m, 2H); 4.58 (m, 2H); 5.22 (m, IH); 5.37 (d, J = 4.4, 2H)。MALDI-MS：C70HH6NOI2P+ [M + H]+ 計算値1194.84、実測値1194.79。
【０３２８】
１，２−ジスチグマステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ６ｃ、ＤＳｔｉｇＨＳＰＣ）：この化合物は、ＳＭＬ６ｂの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３６（溶出液Ａ）。構造は、ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳにより確認された。
【０３２９】
１，２−ジシトステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ６ｄ、ＤＳｉｔｏＨＳＰＣ）：この化合物は、ＳＭＬ６ｂの同じ手順に従って合成した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４０（溶出液Ａ）。構造は、ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳにより確認した。
【０３３０】
実施例７：プロドラッグ脂質ＳＭＬ７Ａ〜Ｂの調製
レチノイン酸プロドラッグＳＭＬ７ａ及びＳＭＬ７ｂ（ＳＭＬ７ａ〜ｂと総称する）は、実施例３で示したのと同様の合成経路により合成した。ＳＭＬ７ａ〜ｂの合成のための簡単な合成経路をスキーム７に略述した。このスキームは、脂質ＳＭＬ７ａ〜ｂの合成の記述により下に例示する。
スキーム７：ＳＭＬ７a-bの合成
【化１０】
2011503188.tif 000022
【０３３１】
選択的に保護されたコレステリルグリセロール中間体は、上の実施例３で示した同じ手順に従って合成した。次いで、レチノイン酸をエステル結合を介してｓｎ−２ヒドロキシル基にカップリングさせた後、３−ヒドロキシル基からトリチル基（Ｔｒ）を除去した。次いで、実施例の一般的プロトコールに記述されている標準的手順に従って、中間体を直ちに対応するホスホコリンに変換した。最終生成物をＨＰＦＣにより精製し、構造をＴＬＣ、ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳにより確認した。
【０３３２】
実施例８：脂質ＳＭＬ８Ａ〜Ｆの調製
脂質ＳＭＬ８ａ、ＳＭＬ８ｂ、ＳＭＬ８ｃ、ＳＭＬ８ｄ、ＳＭＬ８ｅ及びＳＭＬ８ｆ（ＳＭＬ８ａ〜ｆと総称する）の合成のための合成スキームをスキーム８に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ８ａ〜ｆの合成の詳細な記述により下に例示する。
スキーム８．ＳＭＬ８a-fの合成
【化１１】
2011503188.tif 000023
【０３３３】
ステロール−リソスフィンゴミエリン複合体（ＳＭＬ８ａ〜ｃ）は、スキーム８に示す合成経路に従って合成した。最初にステロールのヘミコハク酸エステルをＤＣＣによりＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化した。ステロールの活性化エステルをリソ−スフィンゴミエリンのアミノ基とカップリングさせた。最終生成物をＨＰＦＣによりさらに精製した。
【０３３４】
ＳＭＬ８ｄ〜ｆは、それぞれリソ−スフィンゴミエリンとクロロギ酸コレステリル、トシル酸コレステリル及びアクリル酸コレステリルとの反応により合成した。
【０３３５】
コレステリルオキシ−４−オキソブタンアミド−３−ヒドロキシオクタデク−４−エニル２−（トリメチルアンモニオ）エチルリン酸（ＳＭＬ８ａ）：室温のエタノール不含有乾燥クロロホルム（６ｍＬ）中リソスフィンゴミエリン（２５ｍｇ、５３μモル）の溶液に、コハク酸スクシンイミジルコレステリル（６２ｍｇ、１０６μモル）及びＤＭＡＰ（１０ｍｇ）を加えた。反応混合物ｒ．ｔ．で２４時間撹拌した。溶媒を蒸発させた。残留物を精製のためにＨＰＦＣにかけた（ＣＨＣｌ３〜ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ６５／２５／４）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３３（溶出液Ｃ）。1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 3H); 0.85-0.92 (m, 14H); 1.00-1.15 (m, 10H); 1.25 (br, 28H); 1.42- 1.62 (m, 6H); 1.84-2.05 (m, 7H); 2.29 (m, 2H); 2.51 (m, 4H); 2.68 (br, IH); 3.28 (s, 9H); 3.72(m, IH); 4.01 (m, 4H); 4.28 (m, 2H); 4.58 (m, 2H); 5.34 (m, IH); 5.44 (d, J = 4.2, IH); 5.68 (m, IH); 7.51 (br, IH)。MALDI- MS：C54H98N2O8P+ [M + H]+ 計算値933.72、実測値933.68。
【０３３６】
２−コレステリルオキシカルボニルアミノ−３−ヒドロキシオクタデク−４−エニル２−（トリメチルアンモニオ）エチルリン酸（ＳＭＬ８ｄ）：室温のエタノール不含有乾燥クロロホルム（４ｍＬ）中リソ−スフィンゴミエリン（２５ｍｇ、５３μモル）及びＤＭＡＰ（２０ｍｇ）の溶液に、２ｍＬ乾燥エタノール不含クロロホルム中クロロギ酸コレステリル（４８ｍｇ、１０６μモル）を加えた。ｒ．ｔ．で２４時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。残留物を精製のためにＨＰＦＣにかけた（ＣＨＣｌ３〜ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ６５／２５／４）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４１（溶出液Ｃ）。1H NMR (CDCl3), δ0.68 (s, 3H); 0.85-0.92 (m, 14H); 1.00-1.15 (m, 10H); 1.25 (br, 28H);1.47-1.528 (m, 6H); 1.84-2.05 (m, 7H); 2.29 (m, 2H); 2.65 (br, IH); 3.3 (s, 9H); 3.61(m, IH); 3.89 (m, 4H); 4.28 (m, 4H); 5.34 (m, IH); 5.48 (d, J = 4.4, IH); 5.73 (m, IH); 6.16 (br, IH)。MALDI-MS：C5iH94N2O7P+ [M + H]+ 計算値877.69、実測値877.76。
【０３３７】
実施例９：脂質ＳＭＬ９Ａ〜Ｃの調製
脂質ＳＭＬ９ａ〜ｃの合成のための特定の合成スキームをスキーム９に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ９ａ〜ｃの合成の詳細な記述により下に例示する。
スキーム９．ＳＭＬ９a-cの合成
【化１２】
2011503188.tif 000024
【０３３８】
重合性ＳＭＬ脂質（ＳＭＬ９ａ〜ｃ）は、スキーム９に示す合成経路に従って合成することができる。最初にステロールのヘミコハク酸エステルをグリセロホスホコリンのｓｎ−１位に選択的にカップリングさせることができる。次いで、１０，１２−トリコソジイン酸をｓｎ−２位に結合させて最終生成物を得ることができる。粗生成物をＨＰＦＣにより精製することができる。
【０３３９】
実施例１０：分枝脂質ＳＭＬ１０Ａ〜Ｆの調製
脂質ＳＭＬ１０ａ〜ｆの合成のための特定の合成スキームをスキーム１０に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ１０ａ〜ｆの合成の詳細な記述により下に例示する。
スキーム１０．ＳＭＬ１０a-fの合成
【化１３】
2011503188.tif 000025
実施例６で述べたＳＭＬ６ｂの同様な合成方法を用いたが、出発物質の異なるモル比を用いて、分枝イソステアリン酸をグリセロホスホコリンのｓｎ−１位に結合させた。次いでモノ−イソ−ステアロイルホスホコリンをＨＰＦＣにより分離し、ジシクロヘキシルカルボジイミドによりステロールのヘミコハク酸エステルに結合させた。最終生成物をＨＰＦＣにより精製した。
【０３４０】
実施例１１：分枝脂質ＳＭＬ１１Ａ〜Ｆの調製
脂質ＳＭＬ１１ａ〜ｆの合成のための特定の合成スキームをスキーム１１に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ１１ａ〜ｆの合成の詳細な記述により下に例示する。
スキーム１１．ＳＭＬ１１a-fの合成
【化１４】
2011503188.tif 000026
【０３４１】
標的ＳＭＬ脂質ＳＭＬ１１ａ〜ｆは、カルニチンを出発物質として用いて２ステップで合成することができる。最初に、活性化脂肪酸をエステル結合によりヒドロキシル基に結合させる。次いで、ステロールをエステル結合によりカルボキシル基に結合させる。最終生成物は、ＨＰＦＣにより精製することができる。
【０３４２】
実施例１２：チロシンＳＭＬ１２Ａ〜Ｆを有するＳＭＬの調製
脂質ＳＭＬ１２ａ〜ｆの合成のための特定の合成スキームをスキーム１２に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ１２ａ〜ｆの合成の詳細な記述により下に例示する。
スキーム１２．ＳＭＬ１２a-fの合成
【化１５】
2011503188.tif 000027
【０３４３】
ステロール修飾両親媒性脂質ＳＭＬ１２ａ〜ｆは、スキーム１２に示した経路に従って合成することができる。最初に、脂肪族アルコールを選択的に保護したチロシンのカルボキシル基に結合させた後、ピペリジンによりＦｍｏｃ基を除去する。次いで、ステロールヘミスクシネートをアミノ基にカップリングさせる。ｔｅｒｔ−ブチル基の除去の後、フェノール基を硫酸化する。フェノール基は、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ホウ酸エステル又はヒドラゾンにも変換することができる。この経路は、適切に保護されたアミノ酸を分枝コアとして用いる場合、他のアミノ酸ベースのステロール修飾脂質への合成経路となる。
【０３４４】
実施例１３：還元感受性ＳＭＬ１３Ａ〜Ｈの調製
還元感受性ＳＭＬ脂質は、細胞サイトゾル中に認められるような還元性生物学的環境下で選択的に開裂させることができる分子中の還元可能結合を有するように設計されている。これは、脂質粒子を不安定にし、薬物の放出を選択的に促進する。ジスルフィド結合は、側鎖（ＳＭＬ１３ａ〜ｈ）又は頭部（ＳＭＬ１３ｉ〜ｋ）などの分子の各種部分に配置させることができる。脂質ＳＭＬ１３ａ〜ｋの合成は、スキーム１３．１、スキーム１３．２及びスキーム１３．３に略述する。スキームは、脂質ＳＭＬ１３ａ〜ｋの合成の詳細な記述により下に例示する。
スキーム１３．１  ＳＭＬ１３a-dの合成
【化１６】
2011503188.tif 000028
スキーム１３．２  ＳＭＬ１３e-hの合成
【化１７】
2011503188.tif 000029
スキーム１３．３  ＳＭＬ１３i-kの合成
【化１８】
2011503188.tif 000030
【０３４５】
ＳＭＬ１３ａ〜ｄは、上の実施例４で述べたＳＭＬ４ａ〜ｄの同様な方法により合成することができる。クロロギ酸コレステリルの代わりに、２−コレステリルジスルファニル酢酸をｓｎ−２ヒドロキシル基に結合させる。ＳＭＬ１３ｅ〜ｈは、クロロギ酸コレステリルの代わりに２−コレステリルジスルファニル酢酸を用いることにより、ＳＭＬ５ａ〜ｄの同じ方法により合成することができる。ＳＭＬ１３ｉ〜ｋの合成において、２−チオピリジン活性化ジスルフィド部分をアミノ基に最初に結合させる。次いで、ステロールを第一級アルコールに結合させた後、脂肪酸を第二級アルコールに結合させる。最後に、ジスルフィド交換反応により陽イオン性頭部を導入する。ＳＭＬ１３ｉ〜ｋは、還元感受性陽イオン性ＳＭＬ化合物である。それらは、遺伝子及びｓｉＲＮＡの送達に非常に有用である可能性がある。
【０３４６】
実施例１４：頭部の末端にアジドを有するＳＭＬ  ＳＭＬ１４Ａ〜Ｆの調製
標的リポソームの設計は、大部分の場合に官能基化脂質アンカーを有するあらかじめ形成した小胞の表面にリガンドを結合させることを含む、よく制御された生体抱合反応の開発に主として依存する。利用可能な多くの抱合法のうち、最も一般的なものは、「クリック化学」によりチオエーテル若しくはジスルフィド結合、又はアジド、アルケンによる環化を発生させる、チオール含有リガンドとマレイミド、ブロモアセチル、又は２−ピリジルジチオ結合などのチオール反応性官能性を有するアンカーとの反応を含む。末端官能基化ＳＭＬを用いることは、従来の脂質より二重層からの相分離や分配を起こす可能性が低いので、標的リガンド又は表面標識の固定法として有利であり得る。ＳＭＬ化合物ＳＭＬ１４ａ〜ｆは、「クリック化学」によりリガンド又はバイオマーカーを結合させるのに用いることができる頭部の末端にアジド基を有する一部のモデル化合物である。プロパルギル基などの他の官能基を同様な方法で導入することができる。脂質ＳＭＬ１４ａ〜ｆの合成のための特定の合成スキームをスキーム１４に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ１４ａ〜ｆの合成の詳細な記述により下に例示する。
スキーム１４．ＳＭＬ１４a-fの合成
【化１９】
2011503188.tif 000031
【０３４７】
ＳＭＬ１４ａ〜ｆの合成は、簡単である。最初に、アジド官能基化ポリエチレンオキシドをより反応性の高いアミンに結合させる。次いで、ステロールヘミスクシネートを第一級アルコールに結合させる。最後のステップにおいて、脂肪酸を最も反応性の低い第二級アルコールに結合させる。官能基の反応性に差があるため、保護基は必要でない。
【０３４８】
実施例１５：選択されるＳＭＬの示差走査熱量測定
ＳＭＬ化合物の特性を検討するために、特定のＳＭＬをモデル化合物として用いた。相挙動は、脂質二重層の最も重要な特性の１つであり、細胞膜の種々の生物学的機能に関連する。リン脂質二重層に遊離コレステロールを加えると、遊離コレステロールとグリセロ脂質及びスフィンゴ脂質との混合並びに遊離コレステローのイソプレノール尾部が二重層におけるアシル鎖の充填に対して及ぼす影響により二重層の相挙動が変化する。示差走査熱量測定を用いることにより、ＳＭＬが、合成脂質からなる二重層におけるアシル鎖の充填に対して遊離コレステロールと同様な影響を及ぼすことが示された。したがって、種々の結合を有するＣ−１６鎖を含むＳＭＬ（ＳＭＬ１ｂ〜５ｂ）及び異なる鎖を有する１群のＳＭＬ（ＳＭＬ５ａ〜５ｄ）をＤＳＣ試験に選択した。
【０３４９】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）試験は、３つの再使用可能Ｈａｓｔｅｌｌｏｙ試料アンプル及び参照アンプルを用いて改良型高温ＭＣ−ＤＳＣ４１００熱量計（Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｌｉｎｄｏｎ、ＵＴ）で行った。データは、一般的にＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水を対照標準として用いて０．５℃／分で５〜８５℃の範囲にわたって収集した。ＣＳＣ製のＣｐＣａｌｃ２．１ソフトウエアパッケージを用いて生データをモル熱容量（ＭＨＣ）に変換した。次にデータをさらなる処理及び計算のためにＯｒｉｇｉｎ６０（Ｍｉｃｒｏｃａｌ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）にエクスポートした。ＤＳＣ測定に用いたリポソームは、脂質薄膜（１０μモル）をアルゴン中でＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水（２００μＬ）で６０℃で間欠的にボルテックス混合しながら１５分間水和することにより準備した。次いで試料を室温に冷却し、脱気し、気密Ｈａｍｉｌｔｏｎ（登録商標）注射器を用いて試料アンプル中に充填した（試料当たり１００μＬ）。試料を加熱−冷却−加熱サイクルにより走査し、第２の加熱走査データを解析に用いた。
【０３５０】
遊離コレステロール及びジアシルリン脂質の通常の脂質混合物において、総脂質中のコレステロール（Ｃｈｏｌ）のモルパーセントは、以下の式により計算される。
Ｃｈｏｌ％＝ｎｃｈｏｌ／（ｎｃｈｏｌ＋ｎｄｉａｃｙｌ）×１００
ここで、
ｎｃｈｏｌは、コレステロールのモルを意味し、
ｎｄｉａｃｙｌは、ジアシル脂質のモルを意味する。
【０３５１】
ｍ−ＳＭＬ（モノステロールＳＭＬ）をジアシルリン脂質と混合する場合、ジアシル脂質の総モルの計算において占めるｍ−ＳＭＬにおける追加のアシル鎖が存在する。ｍ−ＳＭＬとジアシル脂質の混合物中の等価ステロールモルパーセントは、以下の式による通常の脂質混合物の方法に従って計算する。
ステロール％＝ｎｍ−ＳＭＬ／（１．５×ｎｍ−ＳＭＬ＋ｎｄｉａｃｙｌ）×１００
ｎｍ−ＳＭＬは、ｍ−ＳＭＬのモルを意味し、
ｎｄｉａｃｙｌは、ジアシル脂質のモルを意味する。
【０３５２】
例えば、純ｍ−ＳＭＬは１つのステロール及び１つのアシル鎖を有し、したがって、等価遊離ステロールパーセントは、１／１．５×１００＝６７である。ｍ−ＳＭＬとジアシル脂質の１：１モル混合物では、等価遊離ステロールパーセントは、１／（１．５＋１）×１００＝４０である。同じ計算方法を他のすべてのｍ−ＳＭＬ製剤に適用した。ＤＳＣ結果を図１及び図２に示す。
【０３５３】
図１において、等価コレステロール（Ｃｈｏｌ）のパーセント値は、モルパーセントを意味する。ＤＳＰＣは、ジステアロイルホスファチジルコリンを意味し、ＳＣｈｃＰＣは、単一ステロールを有するＳＭＬ、特に１−ステアロイル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ５ａ）を意味する。
【０３５４】
図２に、種々のモルパーセントの遊離コレステロールを含むＳＭＬ／ジアシル脂質混合物の転移温度及びエンタルピーを示す。ＳＭＬを同じ鎖長のジアシル脂質と混合した。図２における試験したＳＭＬは、以下の通りであった。
・１−コレステリルカルボノイル−２−パルミチルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１ｂ、ＣＨｃＰａＰＣ）
・１−コレステリルカルボノイル−２−パルミチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ２ｂ、ＣｈｃＳｅＰＣ）
・１−コレステリル−２−パルミトイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ３ｂ、ＣｈｅＰＰＣ）
・１−パルミチル−２−コレステリルカルボノイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ４ｂ、ＰｅＣＨｃＰＣ）
・１−ステアリル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ５ａ、ＳＣｈｃＰＣ）
・１−パルミトイル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ５ｂ、ＰＣｈｃＰＣ）
・１−ミリストイル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ５ｃ、ＭＣｈｃＰＣ）
・１−オレオイル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ５ｄ、ＯＣｈｃＰＣ）
【０３５５】
ＳＣｈｃＰＣ及びそのＤＳＰＣとの混合物のＤＳＣサーモグラム（図１）は、試験したほとんどのＳＭＬの典型的な結果であった。主転移温度（Ｔｍ）及びエンタルピー（ΔＨ）を脂質混合物中のコレステロールのパーセントに対してプロットした（図２）。ＳＭＬの化学構造に関係なく供試ＳＭＬのすべてについて１０〜８０℃の温度範囲に検出可能な相転移はなかった。したがって、コレステロールと脂肪族鎖が互いに緊密に保持されている場合、高コレステロール濃度（約６７％）の均一な液体秩序二重層が達成可能である。生細胞において、膜タンパク質が脂質鎖及びコレステロールの両方に対して強い親和性を有する場合、形質膜上に同様なドメインが形成される可能性がある。
【０３５６】
遊離コレステロールを添加した場合と同様に、対応するジアシル脂質にＳＭＬを添加することにより、転移ピークが広くなり、転移温度及びエンタルピーが低下した。この効果は、濃度依存的であり、コレステロールが特定の濃度に達したときに、結局、相転移の消失につながった。
【０３５７】
異なる結合のＳＭＬの凝縮作用（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ）は同様であるが、特に異性体であるＣｈｃＳｅＰＣとＰｅＣＨｃＰＣとの間にＴｍ及びΔＨの顕著な差がある。ＣｈｃＳｅＰＣは、Ｔｍ及びΔＨを急速に低下させ、３０％等価コレステロールで相転移を完全に消失させることができたが、同じ鎖長を有する他のＳＭＬは、少なくとも３５％の等価コレステロールを必要とした。ＣｈｃＳｅＰＣの２−エーテル結合がＣｈｃＳｅＰＣとＣｈｃＳａＰＣ及びＰｅＣＨｃＰＣとの比較による差の原因であると思われる。ＤＳＰＣにＯＣｈｃＰＣを添加することにより、コレステロールが２０％以下であったとき、転移ピークが非常に広くなったことも認められる。これは、ＤＳＰＣに対するＳＣｈｃＰＣの影響（図１）と著しく異なっており、不飽和オレオイル鎖と飽和ステアロイル鎖との鎖不適合の結果である可能性がある。
【０３５８】
実施例１６：リポソームにおけるカルセインペイロードの封入
蛍光色素カルセイン（２．４９ｇ、４ｍモル）をトリス−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５、６ｍＬ）に５０％水酸化ナトリウム（６９５μＬ、１３．２ｍモル）の添加後に溶解した。次いで、この保存溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（２．５ｃｍ×４０ｃｍ）に加え、トリス−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）により溶出した。カルセインのプールした画分の濃度を、ｐＨ９の希釈した試料の吸光度（４９４ｎｍ）を測定することによって求めた。次いで、漏れアッセイのために精製カルセインをリポソーム内に封入した。一般的に、所定の製剤の乾燥脂質薄膜（１０μモル）をアルゴン中で１ｍＬのカルセイン含有緩衝液で６０℃で間欠的にボルテックス混合しながら１５分間水和した。次いで、試料をポリカーボネート膜を通して６０℃で１１回押し出した後、対応する等張溶出液を用いてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムに通した。次いで、プールしたリポソーム画分を分析してカルセイン濃度を求め、下記の漏れ試験に備えて線形蛍光範囲まで希釈した。
【０３５９】
実施例１７：浸透ストレス(osmotic stress)誘発性の漏洩
ＳＭＬ含有リポソームの１つの有利な特性は、リポソームからのリポソーム内容物（例えば、薬物）の漏れに対する抵抗である。脂質二重層にＳＭＬを含めることにより、一般的にリポソームがｉｎ  ｖｉｔｒｏでより漏れにくくなる。浸透圧下でのリポソームの漏れの試験は、脂質膜の弾性変形及び臨界破壊（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ）を評価する有効な方法であることが証明された。リポソームを高い浸透圧のもとにおいたとき、膜は、膨張し、臨界点で破裂して、内容物を急速に放出する。十分な内容物が排出されたならば、小胞は再び密閉して機械的に安定な構造になる。したがって、浸透圧による漏れプロファイルは、人工的浸透圧勾配下での急速な平衡に基づいている。
【０３６０】
本試験に用いた高濃度内容物（５６ｍＭカルセイン、１０ｍＭトリス、７１１ｍＭ  ＮａＣｌ）を有するリポソームを上記の方法（実施例１１）により調製し、１００ｎｍ膜を通して押し出し、等張性緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、７７５ｍＭ  ＮａＣｌ）で溶出した。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）単独及びＤＭＰＣとコレステロール（１：１モル比）のリポソームをＳＭＬ化合物ＣＨｃＭａＰＣ（１−コレステリルカルボノイル−２−ミリスチルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＳＭＬ１ｃ）リポソームの漏れ試験における陽性対照として用いた。カルセイン不含有等張性緩衝液（１６００ｍＯｓｍ）と５０ｍＯｓｍ希釈緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）とを混合することにより、種々の浸透圧濃度の溶液を調製した。次いで、１０μＬのリポソームを９９０μＬの試験緩衝液と３７℃で混合することにより、リポソームを種々の浸透圧濃度の溶液に曝露した。Ｑｕａｎｔｅｃｈ（商標）分光蛍光光度計（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ、Ｄｕｂｕｑｕｅ、ＩＡ）を用いて５分間の平衡の後に５１７ｎｍ（励起：４９４ｎｍ）での蛍光シグナルを読み取った。次いで、１００μＬの１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えることによってリポソームを溶解して、カルセインを完全に放出させた。総カルセインの蛍光を測定し、１００％シグナル（Ｆ１００％）として用いた。溶解の前にリポソーム中に残存していたカルセインの割合を１−（Ｆｓｉｇｎａｌ−Ｆｂｌａｎｋ）／（Ｆ１００％−Ｆｂｌａｎｋ）と定義した。ここで、Ｆｓｉｇｎａｌは試料の蛍光強度であり、Ｆｂｌａｎｋは等張性緩衝液中の蛍光強度である。結果を図３に示す。
【０３６１】
浸透圧の勾配のもとでのＣＨｃＭａＰＣ及びＤＭＰＣ／コレステロール（１：１）の漏れを３７℃でモニターした（図３）。両リポソームは、同様な浸透圧漏れプロファイルを示し、ＤＭＰＣリポソームと比較して良好な安定性を示した。他のＳＭＬは、ＣＨｃＭａＰＣと同様な浸透圧漏れプロファイルを示した。したがって、ＳＭＬリポソームは、試験した浸透圧勾配のもとで少なくともそれらの内容物並びに対応するコレステロール／ジアシル脂質混合物を維持した。
【０３６２】
実施例１８：３０％ウシ胎児血清中の漏れに対するＳＭＬ含有リポソームの評価
生理的環境は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリポソーム薬物送達に関する他の課題、すなわち、遊離のコレステロールをリポソーム二重層から抽出し漏れをもたらすという、血清タンパク質及び生体膜の傾向を提示する。この相互作用は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）によりリポソーム表面を保護することによって著しく減少させることができる。ＳＭＬリポソームの安定性及び抵抗を試験した。
【０３６３】
カルセインを上述の方法によりリポソーム内に封入した。リポソームを２００ｎｍ膜を通して押し出し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を等張性溶出液として用いてリポソームをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムに通すことにより、遊離のカルセインを除去した。４０％のコレステロールを含む従来のリポソーム製剤を長期漏れアッセイにおける対照として用いた。リポソーム試料の一部（２０〜５０μＬ）を３０％ウシ胎児血清により２ｍＬの総容積まで希釈した。次いで、試料をガラス管に封入し、３７℃でインキュベートした。試料の蛍光強度を種々の時点にモニターし、リポソーム中に残存したカルセインの割合を浸透ストレス誘発性漏れと同様の方法により求めた。供試ＳＭＬは以下の通りであった。
・１−コレステリルカルボノイル−２−ミリスチルカルバモイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１ｃ、ＣＨｃＭａＰＣ）
・１−ステアロイル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ５ａ、ＳＣｈｃＰＣ）
・１−コレステリル−２−ミリストイル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ３ｃ、ＣｈｅＭＰＣ）
・１−ミリストイル−２−コレステリルカルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ５ｃ、ＭＣｈｃＰＣ）
遊離コレステロールを含むＤＳＰＣ（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ）及び遊離コレステロールを含むＤＭＰＣ（ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ）のリポソームを対照とした。
【０３６４】
図４に示す結果で示されているように、ＣｈｃＭａＰＣリポソームは完全なままであったが、ＤＳＰＣ／コレステロールリポソームの内容物は次の４週間にわたって徐々に放出された。２：１のモル比のＣｈｃＭａＰＣ及びコレステロールからなっていたリポソームは、ＣｈｃＭａＰＣと同様の漏れプロファイルを示した。ＣｈｃＭａＰＣ／コレステロール（２：１）及びＤＳＰＣ／コレステロール（１：１）のリポソームは同じ比率のコレステロール（５０％）及び鎖長（Ｃ−１８）を有するので、それらの漏れプロファイルの差は、二重層へのコレステロールの組み込まれ方に主として起因する可能性がある。
【０３６５】
顕著な所見は、ＣｈｃＭａＰＣリポソームは完全なままであったが、ＤＳＰＣ／コレステロールリポソームの内容物は試験した４週間にわたって徐々に放出されたことである。２：１のモル比のＣｈｃＭａＰＣ及びコレステロールからなっていたリポソームは、ＣｈｃＭａＰＣと同様の漏れプロファイルを示した。ＣｈｅｃＭａＰＣ／コレステロール（２：１）及びＤＳＰＣ／コレステロール（１：１）のリポソームは同じ比率のコレステロール（５０％）及び鎖長（Ｃ−１８）を有するので、それらの漏れプロファイルの差は、二重層へのコレステロールの組み込まれ方に主として起因する可能性がある。ＳＭＬにおける共有結合は、血清タンパク質によるいかなる形の非共有結合性親和力による二重層からのコレステロールの抽出も防ぐのに十分に強い。
【０３６６】
これらの結果から、一般式Ｉの本明細書で開示した化合物は、従来のリポソームと比較してより安定なリポソームを形成することがわかる。
【０３６７】
実施例１９：コレステロール交換の分析
一枚膜リポソームを押出し法により調製した。ドナーリポソームは、４０％のコレステロール（又はＳＭＬからのモル当量）、１０％の負に荷電した１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）及び５０％の１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）（又はＳＭＬからのモル当量）からなっていた。具体的には、３つのドナーリポソームを次のモル比で調合した：１）ＰＣｈｃＰＣ／ＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ（５０／４０／１０）、２）ＤＣｈｃＰＣ／ＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ（２５／６５／１０）、３）Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ（４０／５０／１０）。中性１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）リポソームをアクセプターとして用いた。押出し後、ドナーリポソームの直径は約１００ｎｍであり、アクセプターリポソームの直径は１４０ｎｍであった。
【０３６８】
交換実験のために、１ｍＬのドナーリポソーム（１０ｍＭ）及び１ｍＬのアクセプターリポソーム（１００ｍＭ、１０倍）を最初に３７℃に加温し、次いで、混合し、３７℃でインキュベートした。混合物の一部（２５０μＬ）を所定の時点に試料として採取し、小型（長さ約１ｃｍ）陰イオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ）に加えた。カラムは、中性リポソームの非特異的結合を減少させるために、交換試料を加える前に０．１ｍＬの１０ｍＭ  ＰＯＰＣで前処理した。カラムを１ｍＬの１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４緩衝液で溶出した。溶出液を凍結乾燥し、コレステロールアッセイにより分析して、交換されたコレステロールの量を定量した。
【０３６９】
図５に示すように、ＤＣｈｃＰＣ又はＰＣｈｃＰＣを含むリポソームは、特にＣｈｏｌ／ＤＰＰＣ／ＤＰＰＧの対照リポソームと比較してコレステロールの検出可能な交換を非常にわずかに可能にしたか、又は全く可能にしなかった。これらのデータは、ＳＭＬ化合物における共有結合したコレステロールは二重層から有意な量で移動しないが、従来のリポソームにおける遊離コレステロールはコレステロール交換について約２時間の半減期を有することを示している。
【０３７０】
したがって、コレステロール交換実験の結果から、一般式Ｉの化合物における共有結合したコレステロールは二重層から有意又は検出可能なレベルで移動しないが、従来のリポソームにおける遊離コレステロールはコレステロール交換について約２時間の半減期を有することがさらに確認される。
【０３７１】
実施例２０：細胞毒性の評価
ＳＭＬ脂質の細胞毒性を標準ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイ法により評価した。簡潔に述べると、Ｃ２６細胞を種々の濃度の脂質とともに３７℃で一定の時間インキュベートした。次いで、培地をＭＴＴ作業試薬と交換し、細胞をさらに２時間インキュベートした。次いで、試薬を注意深く除去した。変換色素を酸性イソプロパノールで可溶化した。色素の吸光度を５７０ｎｍで測定し、６５０ｎｍでのバックグラウンドを差し引いた。処置細胞と無処置細胞との結果を比較することにより、細胞生存率データを得た。選択したＳＭＬ脂質の結果を図６に要約した。ほとんどのＳＭＬは、１ｍＭと高い濃度で明らかな細胞毒性を示さなかった。ＣｈｃＰａＰＣ及びＣｈｃＳａＰＣなどのカルバメート結合を含む一部のＳＭＬは、ある程度の細胞毒性を示した。したがって、一般式Ｉの化合物のＲ１、Ｒ２及び結合型の組合せを変化させることによりＳＭＬの毒性を調整することが可能である。
【０３７２】
実施例２１：ホスホリパーゼＡ２による薬物の放出
レチノイン酸を酵素誘発性薬物放出の検討のためのモデル薬物として用いた。ＳＭＬ７ａ（１−コレステリル−２−全トランス−レチノイル−ｓｎ−グリセロホスホコリン）からの全トランスレチノイン酸の放出を、ウシ、ムフェジコブラ（ｎａｊａ  ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ）及びストレプトミセス・ビアラセオルバー（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉａｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）などの各種の源からのホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を用いて評価した。すべてのＰＬＡ２をＡｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａから入手した。５０ｍＬ丸底フラスコに入れたＳＭＬ７ａ（５０μモル）のクロロホルム溶液をロータリーエバポレーターにより蒸発した。フラスコを一夜高真空のもとにおいた。脂質薄膜を２０ｍＭ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び５０ｍＭ  ＫＣｌを含む１０ｍＬのｐＨ８．８緩衝液で水和した。室温で１０分間間欠的にボルテックス混合した後に透明な溶液が得られた。溶液の一部（２５０μＬ）を３７℃で１０分間プレインキュベートし、次いで、ＰＬＡ２アッセイに用いた。ＰＬＡ２溶液の分割量（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び５０ｍＭ  ＫＣｌの２５０μＬｐＨ８．８緩衝液の２５単位）を３７℃で１０分間プレインキュベートし、ＳＭＬ７ａのあらかじめ加温した溶液の分割量と混合した。種々の時点に、加水分解試料をＴＬＣにより分析し、濃度計により定量した。結果を図７に示す。３つのＰＬＡ２酵素のすべてがＳＭＬ７ａから全トランスレチノイン酸を完全に放出させることができたが、ムフェジコブラのＰＬＡ２は最高活性を示した。
【０３７３】
実施例２２：Ｃ２６大腸癌により腫瘍を発生させたＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける種々の組成のリポソームに封入したドキソルビシンの腫瘍の進行及び動物の生存に対する効果の比較
ＳＭＬ含有リポソームの薬物担体としての一般的適用可能性を実証するために、抗癌薬を種々のステロイルリン脂質を含む多数のリポソーム組成物に封入した。腫瘍の進行及び動物の生存に対するこれらの製剤の効果を、Ｃ２６大腸癌により腫瘍発生させたＢａｌｂ／Ｃマウスにおける非封入ドキソルビシン又は食品医薬品局により承認されているドキソルビシンの市販のリポソーム製剤であるＤｏｘｉｌ（商標）の効果と比較した（図８及び９、表３）。
【０３７４】
このモデルにおいて、薬物不含有媒体ＰＢＳで処置した動物は、２２日の生存時間中央値を有し、どの動物も６０日まで生存しなかった（表３）。最大耐量の非封入ドキソルビシン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）で処置した動物は、２６日の生存時間中央値を有し、どの動物も６０日まで生存しなかった。１５ｍｇ／ｋｇのＤｏｘｉｌ（商標）で処置した動物は、６０日を超える生存時間中央値を有し、５匹の動物のうちの４匹が６０日目まで生存した。１５ｍｇ／ｋｇのジステロール含有製剤ＤＣＨＥＭＳＰＣ−ＤＳＰＣ−ＰＥＧＤＳＰＥ２０００−αＴ（３３：６１．８：５．０：０．２）中ドキソルビシンを投与した動物は、６０日を超える生存時間中央値を有し、５匹の動物のうちの５匹が６０日目まで生存した（表３）。種々のステロイル脂質含有製剤に封入したドキソルビシンは、ステロイル脂質を含まない現在承認されている脂質製剤と同様に良好又はより良好な、Ｃ２６大腸癌モデルにおけるすぐれた治療効果をもたらした（表３、図８及び９）。
【０３７５】
すべての合成リン脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から購入した。ＳＭＬリン脂質は、上述のように合成した。コレステロール（Ｃｈｏｌ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ４樹脂は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から購入した。ドキソルビシン（ＤＯＸ）は、Ｂｅｄｆｏｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＯＨ）から購入した。培地（イーグルのＢＳＳ（ＥＢＳＳ）を含むイーグルのＭＥＭ）は、ＵＣＳＦ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した。他のすべての試薬は、分析用グレードであった。溶液は、０．２ミクロン無菌膜を通してろ過し滅菌済み容器中に入れた。すべての容器は、無菌性であり、発熱物質を含んでいなかった。
【０３７６】
所定サイズの薬物負荷リポソームは、当技術分野でよく知られており、例えば、（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００３、Ｖ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ及びＶ．Ｗｅｉｓｓｉｇ編）に記載されている方法により調整した。脂質薄膜は、クロロホルムに溶解した１０μモルの脂質混合物を室温でロータリーエバポレーターを用いてガラス管中で減圧下で乾燥させた後、高真空に一夜曝露して調製した。リポソームは、ネジ蓋付きガラス管中で滅菌済み２５０ｍＭ硫酸アンモニウム溶液で脂質の転移温度以上の温度で薄い脂質膜を再水和した後、浴型超音波処理装置で６０℃で１０分間超音波処理して調製した。次いで、リポソーム製剤を０．１ミクロンポリカーボネート膜を通して押し出した。非封入硫酸アンモニウムは、２４時間に１回交換した４℃の１００倍量の５％グルコースに対して透析することにより除去した。５％グルコースに溶解したドキソルビシンの溶液をリポソームを含む硫酸アンモニウムとともに６０℃で２時間インキュベートすることにより、ドキソルビシンを封入した。非封入ドキソルビシンは、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ４を含むカラムに製剤を通すことによりリポソームから除去した。封入効率は、通常７０％を超えており、薬物：リン脂質比は約１００μｇ／μモル総脂質である。平均小胞直径は、短分散粒径分布を有する８５〜１４０ｎｍの範囲の多モードプログラム（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用いて動的光散乱法により測定した。リポソーム封入ドキソルビシン製剤を滅菌済み０．２ミクロン膜を通してろ過し滅菌済み１５ｍＬコニカル遠心管中に入れ、動物に注射するまで４℃で保存した。
【０３７７】
すべての動物実験は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により承認されたプロトコールに従って動物研究に関するＮＩＨガイドラインに準拠して実施した。すべての化学療法実験について、０日目にＢａｌｂ／ｃマウスの右側腹部にＣ２６腫瘍細胞（マウス当たり４×１０５細胞）を皮下注射し、１群当たり５匹のマウスとして無作為化し、番号付けを行った。実験期間中毎日マウスの体重を測定し、腫瘍サイズをモニターした。腫瘍容積は、測径器を用いて３つの直交径（ａ、ｂ及びｃ）を測定することにより推定した。容積は、（ａ×ｂ×ｃ）×０．５ｃｍ３として計算した。触知できた腫瘍は、１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍと定義した。各実験において、マウスを接種後６０日まで、又は次の安楽死の条件のうちの１つが満たされるまでモニターした：１）マウスの体重がそれらの初期の質量の１５％以下に低下した；２）それらの腫瘍のいずれかの直径が２．０ｃｍより大きかった；３）それらが嗜眠状態又は罹患状態になり、給餌することができなくなった；或いは４）それらが死亡したことが認められた。６０日目に、すべての生存マウスを安楽死させた。しかし、生存マウスのいずれかが６０日目に触知可能な腫瘍を有していた場合、実験に留まっていたすべてのマウスのモニタリングを９０日目まで続け、その時点にマウスを安楽死させた。６０日間生存したすべての動物は、同じく９０日目まで生存した。
【表１１】
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製剤成分のモル比は、以下の各製剤成分について示している。
DCHEMSPC=SML6b；DSPC=ジステアロイルホスファチジルコリン；PEGDSPE=１,２-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノール-アミン-N-[ポリ-(エチレングリコール)-2000]；αT=α-トコフェロール；SeCHcPC=1 -ステアリル-２-コレステリルカルボノイル-rac-グリセロ-S-ホスホコリン。
【０３７８】
実施例２３：アンホテリシンＢ封入リポソーム
選択したＳＭＬをアンホテリシンＢの封入について評価した。ＳＭＬは、種々の比でアンホテリシンＢを封入するために対応するジアシルＰＣ（同じ鎖長）を用いて製剤化した。最初に、所定の比のＳＭＬ／ジアシルＰＣ脂質混合物のクロロホルム溶液を蒸発し、脂質薄膜を高真空のもとに一夜おいた。次いで、所定の量のアンホテリシンＢのＤＭＳＯ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を脂質薄膜に加えた後、ｐＨ７．４ＰＢＳを加えた。混合物をアルゴン中で６０℃で１時間超音波処理した。次いで、混合物をｐＨ７．４ＰＢＳに対して透析した。得られた黄色溶液を２２０ｎｍ膜を通してろ過することにより滅菌した。生成物を将来の試験に備えて４℃で保存した。アンホテリシンＢをＳＭＬを用いて適切に製剤化した場合（例えば、ＳＭＬ：ＰＣ：ＡｍＢ＝２：２：１（モル））、ＰｅＣｈｃＰＣ、ＭｅＣｈｃＰＣ、ＳＣｈｃＰＣ及びＰＣｈｃＰＣを含む製剤などの製剤の大部分は、１年間以上４℃で安定であった。これらの結果は、アンホテリシンＢの封入のための最適化製剤はＳＭＬを用いて達成することができることを示した。
【０３７９】
実施例２４：タンパク質送達用リポソーム
特定の治療用タンパク質は、リポソーム表面に結合することができる。これは、リポソームタンパク質複合体を動物に注射する場合、タンパク質の安定化及びより長い循環時間につながり得る。例えば、組換えＦＶＩＩは、非共有結合によるが、高い親和力でリポソーム外側表面に結合する。第ＶＩＩＩ因子は、５０ｍＭクエン酸緩衝液（９％（重量／容積）溶液）に懸濁した９７：３モル比の９０％（重量／重量）パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン−Ｎ−［ポリ−（エチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）からなる合成ＰＥＧ化リポソームで再構成したとき、第ＶＩＩＩ因子の循環時間を延長させ、前臨床モデル及びヒトにおける出血を減少させるために用いられた。この製剤は、コレステロールが存在しない場合循環から非常に速やかに除去されるため最適でない。
【０３８０】
タンパク質の送達を示す安定化ＳＭＬリポソーム製剤は、次の通りである。それぞれ９７：３モル比の実施例３で述べたように合成するＳＭＬ３ｄ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）からなるＳＭＬリポソーム製剤は、１００μモルの脂質混合物を５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．０に再懸濁することを除いて、ドキソルビシン実施例で述べたように調製する。１ｍＬの一枚膜ＳＭＬ３ｄ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソームを１００ＩＵ単位の組換え第ＶＩＩＩ因子、ＫｏｇｅｎａｔｅＦＳ（Ｂａｙｅｒ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）と混合する。ＳＭＬ３ｄ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソーム製剤は、９７：３モル比のパルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン−Ｎ−［ポリ−（エチレン）−グリコール２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）などのコレステロールを欠く製剤より、第ＶＩＩＩ因子を製剤化するための安定なリポソームを提供する。ＳＭＬ３ｄ−ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソームは、第ＶＩＩＩ因子のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を改善するために用いることができる。
【０３８１】
タンパク質は、活性を失わずにＳＭＬリポソームと安定な粒子を形成する可能性がある。ポリヒスチジンタグを有するタンパク質は、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２００６、１７巻、１５９２〜１６００頁に記載されているＤＯＤ−トリ−ＮＴＡのような脂質−トリ−ニトリロトリ酢酸を介してＳＭＬリポソーム上に固定される。一般的な製剤は、５％ＤＯＤ−トリ−ＮＴＡ、５０％ジアシルホスホコリン及び４５％ｍ−ＳＭＬを含む。タンパク質は、ＮＴＡ−Ｎｉ−ヒスチジン相互作用によりリポソーム上に組み込まれている。タンパク質負荷リポソームをサイズ排除カラムに通して精製する。次いで、製剤の安定性及びタンパク質活性を適切な方法を用いて評価する。
【０３８２】
実施例２５：高コレステロール血症のためのＳＭＬの使用
β−シトステロール及びβ−スチグマステロールなどの植物ステロールは、コレステロールの吸収を抑制し、ヒトにおける血漿コレステロールレベルを低下させることが知られている。ＳＭＬ含有β−シトステロールは、高コレステロール血症の治療に有用である。
【０３８３】
ＳＭＬ含有β−シトステロールは、血中コレステロールレベルを低下させる助けとなる食品添加物又は注射剤として製剤化される。例えば、ＳＭＬジステロール脂質ＳＭＬ６ｄを３０ｍｇ／ｍＬの濃度でｔｅｒｔ−ブタノールに溶解し、次いで、０．１ミクロンガラスフィルターを通してろ過することにより滅菌する。滅菌済み脂質溶液を−７０℃で凍結し、次いで、凍結乾燥装置で完全な乾燥まで２４時間凍結乾燥させる。乾燥脂質粉末（１５０ｍｇ）を３０ｍｇのペクチン、４２ｍｇのカルシウム（リン酸二カルシウムとして）、２６ｍｇのリン（リン酸二カルシウムとして）及び結晶セルロースと混合する。乾燥粉末をゼラチンカプセル中に充填して、１５０ｍｇの用量のジシトステロールホスファチジルコリンを提供する。食事の直前に経口摂取するとき、このシトステロール誘導体は、コレステロールの吸収を抑制するのに用いることができる。
【０３８４】
実施例２６：ＳＭＬを用いる微小泡の調製
微小泡は、脂質の単層により安定化されているガス充填泡である。過去には、微小泡は、コレステロールを欠く合成リン脂質混合物を用いて調製された。これは、微小泡が生体膜及びリポタンパク質と接触するとき、コレステロールが単層を速やかに離れるためであり、これが微小泡の不安定化をもたらす。
【０３８５】
ＳＭＬは、微小泡の形成に用いることができる。ＳＭＬから調製したリポソームは、血清の存在下での内容物の保持の増加を示す（実施例１８）。微小泡は、デカフルオロブタンガスから調製し、９０：１０のモル比のＳＭＬ４ａ（実施例４）及びＰＥＧ−ＤＳＰＥ−２０００（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）の混合物からなる単層により安定化する。クロロホルム中適切な量のＳＭＬ４ａ、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ−２０００（モル比９０：１０）をガラス試験管に入れる。クロロホルムをＮ２中で除去した後、真空中で少なくとも２時間蒸発させる。１００ｍＭトリス（ｐＨ７．４）：グリセロール：プロピレングリコール（８０：１０：１０、容積比）からなる緩衝希釈剤を乾燥脂質に加えて、１ｍＭの脂質濃度（１ｍｇ／ｍＬ）を得る。脂質懸濁液を脂質の相転移温度（６０℃）以上で十分に混合して、多重層小胞の乳状溶液を形成させる。浴型超音波処理装置を用いて透明になるまで懸濁液を超音波処理する（２０ｋＨｚ、１００Ｗ、１０分）。１ｍｇ／ｍＬの最終濃度のリポソーム溶液を１ｍＬロットに小分けして２ｍＬバイアルに入れる。次いで、１０ｃｍ３のデカフルオロブタンガス（Ｆｌｕｒａ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、ＴＮ、ＵＳＡ）をゴムキャップを通してバイアルに徐々に注入し、針（２０Ｇ１、ｓｈｏｒｔ  Ｂｅｖｅｌ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通気孔として用いて空気を交換する。ゴムキャップにアルミニウムシールを用いてバイアルに直ちに蓋をする。デカフルオロブタンヘッドスペースを有するリポソーム溶液を含む密閉バイアルは、使用するまで４℃で保存することができる。微小泡は、Ｂｉｏｂｅｄ振とう機を用いてリポソーム溶液のバイアルの機械的撹拌により形成される。バイアルを４５秒間振とうすると、溶液は乳状になり、３ｍＬ注射器に吸引し、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて３ｍＬの最終容積に希釈することができる。リポソーム（微小泡中に組み込まれていない）及びサブミクロンサイズの泡は、３００×ｇで３分間の浮選により溶液から除去することができる。
【０３８６】
化合物ＳＭＬ４ａを含む組成物から形成された微小泡は、動物の定められた部位における超音波破壊を用いた撮像のため又は分子の送達のために注射することができる。一定の範囲の物理的化学的特性を有するＳＭＬの入手可能性が精密に調節された特性を有する微小泡の形成を可能にする。
【０３８７】
実施例２７：化合物部ＳＭＬ９Ａから調製したポリジアセチレン小胞又は単層を用いた診断アッセイプラットフォーム
ポリジアセチレンが二重層小胞の形で形成されているリポソームを用いた比色アッセイは、重合小胞の表面に組み込んだ受容体への分析対象物の結合時にポリジアセチレン材料の吸収スペクトルが大きくシフトするので、使用場所での診断アッセイに提案された。このアッセイの感度は、ポリジアセチレンポリマーの長さ及びその配向に依存する。この適用分野に通常用いられる組成物は、１０，１２トリコサジイン酸（ＴＲＣＤＡ）と混合されたジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）などの合成リン脂質からなっている。ＴＲＣＤＡ及びＤＭＰＣの保存液は、塩化メチレン溶液中に６／４モル比で調製する。この組成物から調製したリポソームをその後、２５４ｎｍの手持ち形ＵＶランプ下で重合させる。生体液からのリポソームタンパク質が表面と相互作用し、非特異的な変色をもたらすので、これらの組成物は、多くの生体液における使用に適さない。タンパク質の吸収を減少させるためにこれらの混合物に遊離コレステロールを含める試みは十分でなかった。その理由は、ＴＲＣＤＡの重合時にコレステロール相が分離し、リポソームが分析対象物に反応する能力が損なわれるためである。より安定なＴＲＣＤＡを提供するために、上の組成物中のＤＭＰＣの代わりにＳＭＬ２ｃを用いることができる。
【０３８８】
他のアプローチは、安定性を増大させるために実施例９で述べたＳＭＬ化合物ＳＭＬ９ａを用いることである。ＳＭＬ９ａは、コレステロール含有ホスファチジルコリン頭部に結合した重合性トリコサジイン酸を含む。リポソーム二重層において、ＴＲＣＤＡは、隣接するコレステロールにより有利な配向をなして容易な重合を受ける。重合するとき、コレステロールは、リン脂質に結合しているため相分離することがでない。ＳＭＬ９ａ脂質を、９７／３モル比のクロロホルム溶液からのガングリオシドＧＭ１などの脂質結合受容体とともにガラス管の側面上で乾燥し、溶媒を蒸発する。リン酸緩衝生理食塩水を乾燥脂質混合物に加え（最終濃度、１ｍＭ総脂質）、浴超音波処理を行う。脂質が主相転移温度を上回ることを保証するために、超音波処理中に試料を４５℃に加熱する。ＳＭＬ中に共有結合したコレステロールが存在するため、リポソームの製造をより低い温度で行うことができる。これは、アッセイに含められる多くの生物学的標的（例えば、受容体）の安定性のために重要である。
【０３８９】
ＳＭＬリポソーム製剤を０．８μＭポリカーボネート膜を通して加温してろ過し、４℃で一夜保存する。試料を室温とし、２５４ｎｍ光手持ち形ＵＶランプを用いて重合させて、重合小胞の暗青色／灰色溶液を得る。この重合モノステロールＳＭＬリポソーム組成物は、腸毒素がＧＭ１に結合するので生体液中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）腸毒素の存在を検出するのに用いることができる。ＳＭＬ中の共有結合したコレステロール部分は、バイオフェーズ（ｂｉｏｐｈａｓｅ）に認められるタンパク質の挿入から、重合リポソームを安定化し、遊離コレステロールがするであろうように、バイオフェーズ中の生体膜にリポソームから移動しない。したがって、ＳＭＬは、より感度が高く、より安定な使用場所診断システムを推進するものである。
【０３９０】
実施例２８：若返りヘアコンディショナー用のモノステロールＳＭＬの使用
リン脂質及びコレステロールは、人体の必須の成分であり、皮膚及び毛に養分を与え、湿らせ、浄化し、状態を整えるパーソナルケア製品の一般的成分である。モノ及びジステロールＳＭＬグリセロ脂質並びにＳＭＬスフィンゴ脂質は、単一分子におけるこれらの２つの重要な成分を合わせもっている。それらはまた、生分解性又は生体安定性の形でそれらに備わっている。
【０３９１】
この実施例では、ヘアコンディショニング組成物を、すべてを重量パーセントで加える次の成分から調製する：水８６．６％、ヒドロキシエチルセルロース０．７％、ジステアリン酸コレステロール０．７％、セチルアルコール２．０％、ＳＭＬ成分ＳＭＬ４ｄ（実施例４）１０％。この混合物を調製するために、ヒドロキシエチルセルロースを高速一定撹拌条件下で水に加え、６０℃に加熱する。残りの成分を撹拌を継続しながら加え、温度を７０℃に上昇させる。着色剤、芳香剤及び抗菌剤をこの時点で加えることができる。成分が気持ちのよい堅さを持つ滑らかな流体を形成するまで、混合物を撹拌する。成分を室温に冷却する。このヘアコンディショニングを毛に適用すると毛に健康で、快い外観を与える。この適用で用いるエーテル結合モノステロールＳＭＬは、製剤中の種々の成分に長い貯蔵寿命及びすぐれた混合をもたらす。
【０３９２】
実施例２９：モノステロール及びジステロールＳＭＬを用いて形成されるナノエマルション
ナノエマルション又はサブミクロン乳剤は、５０〜１０００ｎｍの平均液滴直径を有する水中油型乳剤である。通常、平均液滴径は１００〜５００ｎｍである。通常、ナノエマルションは、０．５〜２％の卵又は大豆レシチンで安定化された１０〜２０％の油を含む。この実施例で述べるＳＭＬは、ステロール成分が、遊離コレステロールがし得るように両親媒性頭部から相分離することを可能にしない理想的な乳剤である。
【０３９３】
この実施例におけるＳＭＬナノエマルションの調製には、高圧均質化及びＳＭＬ成分ＳＭＬ５ｄを用いる。形成される粒子は、リン脂質の単分子層により周囲の水層から分離された液体親油性コアを示す。そのようなレシチン安定化油滴の構造は、キロミクロンと比較することができる。したがって、ナノエマルションは、リン脂質二重層が水性コアを親水性外部相から分離している、リポソームと異なっている。或いは、過剰なリン脂質を用いて調製されたナノエマルションは、同時にリポソームを形成する可能性がある。
【０３９４】
スキンケアの目的のためのナノエマルションは、生分解性ＳＭＬを用いて形成させることができる。例えば、ＳＭＬ５ｄは、ＳＭＬは時間の経過とともに加水分解されるので、コレステロール及びオレイン酸を発生し、したがって、スキンケア製品として用いることができる。下の表４にＳＭＬナノエマルションスキンケア組成物を示す。
【表５】
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【０３９５】
上のスキンケア製剤の変形形態は、上の製剤（表４）中の１重量％のＳＭＬ５ｄ脂質（実施例５）の代わりに１％のＳＭＬ７ａ（実施例７）を用いるものである。ＳＭＬ７ａ脂質は、トランス−レチノイン酸の徐放性剤形を有するスキンケア組成物を提供する。この後者のスキンケア製剤は、皮膚を若返えらせ、しわを除去するために用いることができる。
【０３９６】
実施例３０：複数の薬物の封入及び同じリポソームからの送達
薬物の組合せの使用は、臨床癌療法における広く適用されている戦略である。種々の薬物の比率における薬物相互作用はｉｎ  ｖｉｔｒｏで系統的に研究することができるが、各種薬物の薬物動態特性は異なるため、これらの比率はｉｎ  ｖｉｖｏで容易に適用することはできない。薬物を内部に安定に封じ込めることができる場合、リポソーム内への２つの薬物の共封入により、薬物の分布に「同時性をもたせる」ことができる。これは、理論的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果のｉｎ  ｖｉｖｏへのより直接的な適用を可能にする。しかし、標準的なリポソームの材料の安定性が不十分で、漏れがあるため、封入された薬物は異なる速度で放出される可能性があり、有効な遊離薬物濃度を予測することが困難になる。
【０３９７】
この実施例においては、安定化ＳＭＬリポソームを種々の薬物の組合せの制御された同時放出のために利用する。上で示したように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下ではＤＭＰＣ／遊離コレステロール組成物とＳＭＬベースのリン脂質ＳＭＬ１ｃ（ＣｈｃＭａＰＣ）から調製したリポソームとの間にモデル化合物の浸透圧誘発性放出の差はない。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件を模擬する条件下では、ＤＭＰＣ／遊離コレステロール組成物からの３０％ウシ胎児血清の存在下でのカルセインの放出について、ＳＭＬベースのＳＭＬ１ｃリポソームからの２８日で１％未満の漏れと比較して、７日までに８０％の漏れと実質的な差がある（図４）。したがって、ＳＭＬにより構成されたリポソームに２つの薬物を共封入することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータからｉｎ  ｖｉｖｏ放出がよりよく予測されることなど、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出とｉｎ  ｖｉｖｏ放出との差が著しく減少する可能性がある。
【０３９８】
次の２つの薬物の組合せの安定な共封入により、ＳＭＬから調製したリポソームからのｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの送達が同時に起る。イリノテカン／フルオクスリジン、ダウノルビシン／シタラビン、シスプラチン／ダウノルビシン、シスプラチン／ドキソルビシン、ビノレルビン／シスプラチン、プロテインキナーゼ阻害薬／ドキソルビシン、ミトラマイシン／ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル／トポテカン、７−ヒドロキシスタウロスポリン／カンプトテシン、ロイコボリン／５−フルオロウラシル、ロイコボリン／フルオロオロチン酸、メルカプトプリン／シトシンアラビノシド、ビノレルビン／パクリタキセル、ビノレルビン／ドキソルビシン、シトシンアラビノシド／シスプラチン、レベルサトロール／シトシンアラビノシド、カルボプラチン／ゲムシトビン、トポテカン／シスプラチン、又は薬物とｓｉＲＮＡ若しくは他のオリゴヌクレオチドとの組合せ。薬物は、それらのｉｎ  ｖｉｖｏでの既知の有効量、並びにサイズ排除カラム上で封入薬物を放出薬物から分離することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定したそれらの放出プロファイルに従って共封入する。
【０３９９】
実施例３１：肺薬物送達用のＳＭＬにより構成されたリポソーム
肺薬物送達システムは、喘息、気腫、グラム陰性細菌感染及び真菌感染などの呼吸障害の治療用の薬物を送達するために何十年間にもわたって用いられている。嚢胞性線維症に罹患している患者へのトブラマイシンなどのアミノグリコシドの送達は、ＣＦ患者における抗菌療法の中心になった。進歩しつつある技術は、食作用、粒径の最適化及び分解などの課題を克服しつつあり、薬物を血流中に送達するために肺の莫大な表面積を利用することを可能にしつつある。肺は、胃腸管をバイパスすることが必要であるインスリンのようなタンパク質のような薬物に対する最善の選択肢であると考えられる。
【０４００】
このような高い必要性にもかかわらず、肺内への送達用の承認されたリポソーム封入薬物は存在しない。肺薬物送達のためにリポソームを使用することがない理由は、現在用いられている合成脂質から調製されるリポソームを破壊することがあり得る界面活性物質で肺が満たされていることである。遊離コレステロールはリポソームから肺界面活性物質に速やかに移るため、遊離コレステロールを現在のリポソームを安定化するために用いることはできない。
【０４０１】
ここで述べるＳＭＬ化合物は、リポソームから肺内への薬物の制御された放出も促進すると同時に、肺界面活性物質によるリポソームの破壊の問題を回避する。
【０４０２】
この実験において、アンホテリシンＢを含むＳＭＬリポソームは、実施例２３で述べたＳＭＬ及びジアシルリン脂質の混合物から、当技術分野でよく知られており、例えば、（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００３、Ｖ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ及びＶ．Ｗｅｉｓｓｉｇ編）に記載されている方法により調製する。アンホテリシンＢ負荷ＳＭＬリポソームを、アスペルギルス症などの真菌感染の療法として試験動物又は患者の肺内にエーロゾルにして送入する。他の実施例において、実施例２３で述べた処方に従って調製したアンホテリシンＢ負荷ＳＭＬリポソームを凍結乾燥し、乾燥粉末として肺内に送達する。これは、患者にとってより都合がよく、より安定な剤形であるので、特に有利である。
【０４０３】
他の実施例において、実施例６で述べたジステロールＳＭＬ脂質を用いて、肺界面活性物質の存在下で安定である抗生物質負荷リポソームを調製する。トブラマイシン又はシプロフロキサシンなどの抗生物質をこの目的のために用いることができる。リポソームは、純ＳＭＬ６ｂから、或いはＳＭＬ６ｂとジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ−２０００）などの種々の合成ジアシルリン脂質の組合せから調製する。定義されたサイズのリポソームを当技術分野でよく知られており、例えば、（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００３、Ｖ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ及びＶ．Ｗｅｉｓｓｉｇ編）に記載されている方法により調製する。脂質薄膜は、クロロホルムに溶解した１００μモルの脂質混合物を室温でロータリーエバポレーターを用いてガラス管中で減圧下で乾燥させた後、高真空に一夜曝露して調製する。特定の組成物は、９５μモルＳＭＬ６ｂ及び５μモルＤＳＰＥ−ＰＥＧ又は４０μモルＳＭＬ６ｂ、５５μモルＤＳＰＣ及び５μモルＰＥＧ−ＤＳＰＥ−２０００又はＳＭＬ２ａ及び５μモルＰＥＧ−ＤＳＰＥ−２０００である。リポソームは、ネジ蓋付きガラス管中でトブラマイシンの滅菌済み２００ｍｇ／ｍＬ溶液で脂質の転移温度以上の温度で薄い脂質膜を再水和した後、浴型超音波処理装置で６０℃で１０分間超音波処理して調製する。次いで、リポソーム製剤を０．１ミクロンのポリカーボネート膜を通して押し出す。非封入トブラマイシンは、２４時間に１回交換した４℃の１００倍量の５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４に対する透析により除去する。封入効率は通常１０％を超え、薬物：リン脂質比は約２００μｇ／μモル総脂質である。動的光散乱法により測定される平均小胞直径は、どの製剤を選択するかに応じて１００ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲であろう（Ｍａｌｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）。リポソーム封入トブラマイシン製剤を滅菌済み０．２ミクロン膜を通してろ過し滅菌済み１５ｍＬコニカル遠心管中に入れ、エーロゾルにして試験動物に送入するまで４℃で保存する。この組成物の製薬上許容できる製剤は、エーロゾルにして患者に送入することができる。
【０４０４】
他の実施例において、カルニチンベースのＳＭＬ化合物から調製した陽イオン性脂質製剤（実施例１１）を用いて、ｓｉＲＮＡなどの陰イオン性オリゴヌクレオチド又はＤＮＡなどのポリヌクレオチドとの複合体を生成させる。脂質薄膜は、クロロホルムに溶解した１００μモルの脂質混合物を室温でロータリーエバポレーターを用いてガラス管中で減圧下で乾燥させた後、高真空に一夜曝露して調製する。特定の組成物は、３０μモルＳＭＬ６ａ及び７０μモル１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）である。リポソームは、ネジ蓋付きガラス管中で滅菌済み１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．０で脂質の転移温度以上の温度で薄い脂質膜を再水和した後、浴型超音波処理装置で２５℃で１０分間超音波処理して調製する。次いで、リポソーム製剤を０．１ミクロンのポリカーボネート膜を通して押し出す。送達する核酸をリポソーム製剤とトリエチルアンモニウム基対核酸リン酸基の３／１モル比で混合する。これらの条件下では、すべての核酸が脂質粒子と結合している。動的光散乱法により測定される平均粒子径は、どの製剤を選択するかに応じて１００ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であろう（Ｍａｌｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）。核酸を結合したリポソーム製剤を滅菌済み０．４ミクロン膜を通してろ過し滅菌済み１５ｍＬコニカル遠心管中に入れ、エーロゾルにして動物に送入するまで４℃で保存する。この製剤又はその製薬上許容できる製剤は、試験動物又は患者の肺内にポリヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを輸送するのに適している。
【０４０５】
実施例３２：ワクチンの誘導のための抗原送達のためのＳＭＬ並びに及びＳＭＬ及び非ＳＭＬ脂質の混合物により構成されたリポソーム及び脂質粒子
ＳＭＬ化合物は、高度の流動性を維持すると同時に生体液中で例外的安定性を有する。これらの特性があるため、それらは抗原を送達するためのよい候補物である。
【０４０６】
１つの実施例において、ワクチン適用のためのＳＭＬベースの製剤を１／１のモル比で混合したＳＭＬ８ａ（実施例８）と１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）から調製する。他の実施例において、ＤＯＴＡＰの代わりにカルニチンに基づく陽イオン性ＳＭＬ（ＳＭＬ１１ａ）を用いる。脂質薄膜は、クロロホルムに溶解した１００μモルの脂質混合物を室温でロータリーエバポレーターを用いてガラス管中で減圧下で乾燥させた後、高真空に一夜曝露して調製する。リポソームは、ネジ蓋付きガラス管中で滅菌済み１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．０で脂質の転移温度以上の温度で薄い脂質膜を再水和した後、浴型超音波処理装置で２５℃で１０分間超音波処理して調製する。次いで、リポソーム製剤を０．１ミクロンのポリカーボネート膜を通して押し出す。抗原として知られているタンパク質又はペプチドエピトープをリポソーム製剤と３０／１脂質／抗原〜１／１脂質対抗原の種々の重量比で混合する。抗原が正味の負の電荷を有する場合（抗原の等電点に依存する）、抗原は、陽イオン性ＳＭＬ製剤を含む脂質粒子と結合する。動的光散乱法により測定される平均粒子直径は、どの製剤を選択するかに応じて１００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲であろう（Ｍａｌｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）。抗原製剤と結合したＳＭＬリポソームを滅菌済み０．４ミクロン膜を通してろ過し滅菌済み１５ｍＬコニカル遠心管中に入れ、試験動物に投与するまで４℃で保存する。製剤は、投与経路及び動物種に適する用量で皮内、筋肉内、皮下、鼻内、経口、肺又は非経口経路により投与する。この組成物の製薬上許容できる製剤を患者に投与することができる。
【０４０７】
他の実施例において、陰イオン性ＳＭＬリポソーム製剤を９対１のモル比でジステアロイルホスファチジルグリセロールと混合したＳＭＬ化合物ＳＭＬ８ａを用いて、調製する。さらに、２５μｇ対１ｍｇ脂質の比率のモノホスホリル脂質Ａ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を上述のように調製する。この陰イオン性ＳＭＬリポソーム製剤による免疫応答を増大させるために、ペプチド又はタンパク質抗原をリポソーム二重層に１ｍｇの脂質当たり２５〜１００μｇ抗原の比率で結合させる。結合は、共有結合によるものか、或いは電荷相互作用による、又はリポソーム表面上のキレート化金属と抗原上のヒスチジンタグ（「Ｈｉｓ−Ｔａｇ」）との間の金属キレート化相互作用を用いるなどの非共有結合的手段によるものであってよい。製剤は、投与経路及び動物種に適する用量で皮内、筋肉内、皮下、鼻内、経口、肺又は非経口経路により動物に投与する。この組成物の製薬上許容できる製剤を患者に投与することができる。
【０４０８】
さらなる実施例において、固形コアＳＭＬベースの脂質乳剤を抗原送達用に調製する。固形コアＳＭＬ粒子は、ステアロイル又はパルミトイル鎖を含むトリグリセリドから２５℃で調製する。適切なＳＭＬに基づくワクチン製剤は、上述のように１／１のモル比で混合したＳＭＬ８ａ（実施例８）及び１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）から調製する。
【０４０９】
実施例３３：核酸の送達用のＳＭＬを含むリポプレックス
陽イオン性脂質系は、培養細胞及び動物又は患者の細胞内へのＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ又は他のオリゴ及びポリヌクレオリドなどの核酸の送達に用いることができる。文献に記載された非常に多数の陽イオン性脂質及び陽イオン性脂質を含む系が存在する。粒子はｉｎ  ｖｉｖｏで安定でないため、これらのすべてがｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸輸送効率の点が限られたものであった。例えば、安定性の欠如は、コレステロールが欠けている陽イオン性系は動物又は患者に注射した場合にタンパク質によって速やかに覆われた状態になるという事実に起因する可能性がある。脂質系を安定化するための遊離コレステロールを含むものは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与したとき、遊離コレステロールを細胞膜内に失う。ＳＭＬ化合物を含むリポプレックス組成物は、この問題を回避する。
【０４１０】
上述のように調製した陽イオン性ＳＭＬベースのリポソーム又は陽イオン性ＳＭＬベースのミセルを陰イオン性核酸と混合して、核酸上の負電荷と陽イオン性ＳＭＬベースの脂質粒子上の正電荷との間の電荷相互作用による複合体を形成させる。これらの複合体は、リポプレックス又はＳＭＬリポプレックスとして知られている。ＤＮＡが陽イオン性ＳＭＬベースのリポソーム又は陽イオン性ＳＭＬベースのミセルと複合体を形成したポリヌクレオチドである場合、ＳＭＬ製剤は、ＤＮＡを送達するために用いることができる（例えば、「遺伝子導入」のため）。ｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドが陽イオン性ＳＭＬベースのリポソーム又は陽イオン性ＳＭＬベースのミセルと複合体を形成する場合、ＳＭＬ製剤は、ｓｉＲＮＡ又は修飾ｓｉＲＮＡを送達するために用いることができる（例えば、「遺伝子サイレンシング」のため）。
【０４１１】
１つの実施例において、化合物ＳＭＬ６ａなどのジステロールＳＭＬからなる脂質混合物を１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）とクロロホルム溶液中で１／４：ＳＭＬ／ＤＯＴＡＰのモル比で混合する。脂質薄膜は、クロロホルムに溶解した１００μモルの脂質混合物を室温でロータリーエバポレーターを用いてガラス管中で減圧下で乾燥させた後、高真空に一夜曝露して調製する。リポソームは、ネジ蓋付きガラス管中で滅菌済み１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．０で脂質の転移温度以上の温度で薄い脂質膜を再水和した後、浴型超音波処理装置で２５℃で１０分間超音波処理して調製する。次いで、リポソーム製剤を０．２ミクロンのポリカーボネート膜を通して押し出す。次いで、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解した核酸を、陽イオン性脂質の正電荷と核酸の負電荷とが３対１となるように陽イオン性ＳＭＬリポソームに加える。これをＳＭＬリポプレックスと呼ぶ。次いで、ＳＭＬリポプレックスを培養細胞に加えるか、又は注射によるなどの種々の経路により試験動物に投与する。この組成物の製薬上許容できる製剤を患者に投与することができる。
【０４１２】
脂質ＳＭＬ６ａは、水相を経て生体膜内に容易に移行しない形でコレステロールをリポプレックスに与える。そのためリポプレックスは、遊離コレステロールを用いて形成させたものよりバイオフェーズにおいてはるかに安定である。さらに、脂質ＳＭＬ６ａは、コレステロールと脂質との比が約３０モル％コレステロール以上に増加するときに、新たな相の形成を含み得る。これは、図１０のＤＳＣトレースにおいて明らかであり、等価遊離コレステロールモル％が３０モル％である場合に新たな転移が約２０℃に認められる。この脂質混合物から調製したリポプレックスは、良好なポリヌクレオチド導入試薬である。この実施例における陽イオン性脂質はＤＯＴＡＰであるが、モノカチオン性又はマルチカチオン性のあらゆる陽イオン性脂質をＤＯＴＡＰの代わりに用いることができる。
【０４１３】
他の実施例において、カルニチンベースのＳＭＬ化合物（実施例１１）を陽イオン性ＳＭＬ粒子を形成し、ｓｉＲＮＡなどの核酸と相互作用する単一種として用いる。そのような陽イオン性ＳＭＬ粒子の特性は、ステロール部分及び脂肪族部分の結合の位置並びに脂肪族鎖長、脂肪族鎖の不飽和又は分枝の程度に基づいて調節する。陽イオン性ＳＭＬベースのリポソームと核酸との複合体は、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中核酸を１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．０中あらかじめ形成させた陽イオン性粒子に３／１の正電荷対負電荷比で加えることにより形成させる。そのように形成させたＳＭＬリポプレックスは、細胞培養及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効な核酸送達媒体である。単一ＳＭＬ化合物と核酸から形成させたＳＭＬベースのリポプレックスの付加的な利点は、それらが容易に凍結乾燥することができ、核酸導入活性リポプレックスに速やかに再水和することができることである。
【０４１４】
したがって、この実施例で示したように、種々の一価及び多価ＳＭＬ化合物を核酸送達媒体として用いるためのリポプレックス組成物として容易に形成させることができる。
【０４１５】
実施例３４：核酸薬物送達用の還元可能ＳＭＬを含むナノリポ粒子組成物
核酸をｉｎ  ｖｉｖｏで定められた標的に送達することができる長期循環ナノ粒子を得るためには、ナノ粒子上の陽イオン電荷を除去又は効果的に保護することが必要である。これは、過去にｐＨ７．４でプロトン化しない滴定可能な陽イオン性基を用いることにより、ナノ粒子を形成させた後にそれを反応させて陰イオン性若しくは中性種を形成させることにより、又は陽イオン性基をジスルフィド交換反応で陰イオン性若しくは中性種と交換することにより陽イオン性基を除去することにより試みられた。他のアプローチは、陽イオン性種の使用を避け、静電相互作用の代わりにｐＨ７．４で陽イオン性でない水素結合種を用いることである。これらの努力にもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性の欠如により、並びに特に、血液及び他の体液中に認められる血漿タンパク質及びリポタンパク質との破壊的な相互作用により、ナノ脂質粒子の安定性は損なわれる。本明細書で述べるＳＭＬ化合物は、非交換性ステロールを提供することによりナノリポ粒子の安定性を増大させ、またナノ粒子上の陽イオン電荷を除去又は効果的に保護するために用いることができる。
【０４１６】
１つの実施例において、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物応答性ポリヌクレオチドの送達のための開裂性結合としてジスルフィド結合を利用するＳＭＬナノ粒子を調製する。この結合のｉｎ  ｖｉｖｏでの開裂は、酸化性細胞外空隙と還元性細胞内環境との間の高い酸化還元電位差に依拠している。例えば、ジスルフィド結合性陽イオン性官能基化脂質を含む陽イオン性ＳＭＬナノ粒子は、細胞外マトリックスにおいては安定であるが、細胞質内の還元性環境では脂質アンカーから開裂する。脂質から陽イオン性部分が開裂することにより、ナノ粒子から電荷濃縮ＤＮＡが放出され、その結果、ＤＮＡが核内に移動する。この実施例において、陽イオン性ジスルフィド含有ＳＭＬ化合物ＳＭＬ１３ｉ（実施例１３）を用いる透析法を用いて、プラスミドＤＮＡをＰＥＧ保護ナノ脂質粒子内に封入する（図１１）。次いで、それぞれシステイン（Ｃｙｓ）及びグルタチオン（ＧＳＨ）とのジスルフィド交換反応により、正の表面電荷を中性又は負電荷に変換する。したがって、この方法は、中性、両性イオン又は非イオン性表面を有する粒子を作るのに用いることができる。さらに、今や非陽イオン性ＳＭＬナノ粒子は、ＳＭＬにより安定化されている。非陽イオン性ナノ脂質粒子は、ナノ粒子を細胞表面に結合させるための細胞表面分子に対して反応性の抗体などの標的リガンドを組み込むことによってさらに修飾することができる。
【０４１７】
特定の実施例において、プラスミドＤＮＡを２８ｍＭオクチルグルコシド中１／５／５のモル比のＰＥＧ−脂質／ＳＭＬ−５ｄ／陽イオン性ジスルフィドＳＭＬ１３ｉの脂質混合物中に加え、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳｐＨ８．５に対して透析することによりオクチルグルコシドを除去する。総乾燥脂質２．５μモル（ＰＥＧ−脂質／ＳＭＬ−５ｄ／ＳＭＬ１３ｉのモル比は１／５／５）を１．４７ｍＬの５ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）緩衝液（ｐＨ８．５）中２８ｍＭｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）で０．５時間水和する。同容積の界面活性剤緩衝液中ＤＮＡプラスミド（１３７．３μｇ）を脂質溶液中に穏やかにボルテックス混合しながら３０秒間にわたり加える。次いで、溶液をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセット（ＭＷＣＯ  １０Ｋ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に移し、１リットルの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して４℃で２日間にわたり透析緩衝液を４回交換して透析する。
【０４１８】
粒子の表面電荷を修正するために、粒子の形成に用いたＳＭＬ１３ｉの量より１０倍大きいモル比で、ＧＳＨ又はＣｙｓをＳＭＬナノ脂質粒子溶液中に加え、その溶液を５分間インキュベートし、透析カセットに入れ、直ちに１リットルの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して４℃で透析して還元剤を除去する。
【０４１９】
得られるＳＭＬナノ脂質粒子の粒子径は、同じ電荷比のリポプレックス製剤（１７０〜３６０ｎｍ）と比較して実質的に小さい（直径約１００ｎｍ）。ＳＭＬナノ脂質粒子をそれぞれ過剰の還元剤：ＧＳＨ及びＣｙｓと短期間混合することにより、粒子表面をさらに修飾することができる。未反応の還元試薬を透析によりＳＭＬナノ脂質混合物から除去する。得られるＳＭＬナノ脂質粒子の粒子径は、通常約４０ｎｍ増加する。陽イオン性リポプレックス中の８６％封入値と比較して、封入されたＤＮＡプラスミドの約５０％が表面修飾後に粒子内に残存する。ＧＳＨ又はＣｙｓで処理した陽イオン性ＳＭＬナノ脂質粒子の表面電荷は、それぞれ陰イオン性又は中性電荷に変換される。表面電荷のこの変化は、負に荷電したＧＳＨ又は両性イオン性Ｃｙｓによる陽イオン性頭部の交換に起因する。これらのＳＭＬナノ脂質粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのポリヌクレオチド又はｓｉＤＮＡの送達にも適しており、標的ＳＭＬナノ脂質粒子を調製するのに用いる脂質混合物中に脂質結合標的リガンドを混入することによってさらに修飾することができる。
【０４２０】
実施例３５：脂質ＳＭＬ１５Ａ〜Ｊの調製
脂質ＳＭＬ１５ａ、ＳＭＬ１５ｂ、ＳＭＬ１５ｃ、ＳＭＬ１５ｄ、ＳＭＬ１５ｅ、ＳＭＬ１５ｆ、ＳＭＬ１５ｇ、ＳＭＬ１５ｈ、ＳＭＬ１５ｉ及びＳＭＬ１５ｊ（総称してＳＭＬ１５ａ〜ｊと呼ぶ）の合成のための特定の合成スキームをスキーム１５に略述する。このスキームは、脂質ＳＭＬ１５ｆの合成の詳細な記述により下に例示する。
スキーム１５．ＳＭＬ１５a-jの合成
【化２０】
2011503188.tif 000034
【０４２１】
１−パルミトイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１５ｆ、ＰＣｈｅｍｓＰＣ）：室温のエタノール不含有乾燥クロロホルム（５０ｍＬ）中１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０．９５ｇ、１．９１ｍモル）及びヘミコハク酸コレステリル（１．８５ｇ、３．８２ｍモル）の溶液に、ＤＭＡＰ（０．２４ｇ、１．９１ｍモル）及びＤＣＣ（０．７９ｇ、３．８２ｍモル）を加えた。反応混合物をｒ．ｔ．で２４時間撹拌した。混合物をろ過し、ろ液をロータリーエバポレーターにより濃縮した。残留物を精製のためにＨＰＦＣ（ＣＨＣｌ３〜ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ  ６５／２５／４）にかけた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５４（溶出液Ｃ）。
【０４２２】
実施例３６：脂質ＳＭＬ１６Ａ〜Ｍの調製
ＳＭＬ１６の合成をスキーム１６に示す。代表的な手順を下で述べる。
スキーム１６．ＳＭＬ１６a-mの合成
【化２１】
2011503188.tif 000035
【０４２３】
１−コレステリルヘミスクシノイル−２−ヒドロキシル−３−グリセロ−ホスホコリンは、ＳＭＬ６Ｂ（実施例６参照）の合成における副生成物であり、ＳＭＬ１６ａ〜ｍの合成における出発物質として用いた。
【０４２４】
１−コレステリルヘミスクシノイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１６ｆ、ＣｈｅｍｓＰＰＣ）：室温のエタノール不含有乾燥クロロホルム（６ｍＬ）中１−コレステリルヘミスクシノイル−２−ヒドロキシル−３−グリセロ−ホスホコリン（２０６ｍｇ、０．２８ｍモル）及びパルミチン酸（８７．３ｍｇ、０．３４ｍモル）の溶液に、ＤＭＡＰ（３５ｍｇ、０．２８ｍモル）及びＤＣＣ（７０．２ｍｇ、０．３４ｍモル）を加えた。反応混合物を室温（ｒ．ｔ．）で４８時間撹拌した。混合物をろ過し、ろ液をロータリーエバポレーターにより濃縮した。残留物を精製のためにＨＰＦＣ（ＣＨＣｌ３〜ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ  ６５／２５／４）にかけた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３４（溶出液Ｃ）。1H NMR (CDCl3), δ0.61 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 62H); 1.84-2.05 (m, 5H); 2.20 (t, 7 = 9, 4H); 2.50 (m, 4H); 3.31 (s, 9H); 3.78 (m, 2H); 3.88 (m, 2H); 4.09 (m, IH); 4.28 (m, 3H); 4.50 (m, IH); 5.10 (m, IH); 5.27 (d, J = 4.2, IH)。MALDI-MS：C55H99NOi0P+ [M + H]+ 計算値964.71、実測値964.73。
【０４２５】
１−コレステリルヘミスクシノイル−２−（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３−オクタオキサヘキサコサン−２６−オイル）ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１６ｍ、ＣｈｅｍｓＰＥＯ８ＰＣ）：室温のエタノール不含有乾燥クロロホルム（６ｍＬ）中１−コレステリルヘミスクシノイル−２−ヒドロキシル−３−グリセロホスホコリン（１４０ｍｇ、０．１９３ｍモル）及び２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３−オクタオキサヘキサコサン−２６−酸（１００ｍｇ、０．２４２ｍモル）の溶液に、ＤＭＡＰ（２０ｍｇ）及びＤＣＣ（６０ｍｇ、０．２９ｍモル）を加えた。反応混合物を室温（ｒ．ｔ．）で４８時間撹拌した。混合物をろ過し、ろ液をロータリーエバポレーターにより濃縮した。残留物を精製のためにＨＰＦＣ（ＣＨＣｌ３〜ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ  ６５／２５／４）にかけた。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４７（溶出液Ｃ）。 1H NMR (CDCl3), δ0.67 (s, 3H); 0.85-1.65 (m, 33H); 1.84-2.05 (m, 5H); 2.29-2.31 (m, 2H); 2.55-2.62 (m, 6H); 3.31 (s, 9H); 3.37 (s, 3H); 3.54-3.69 (m, 30H); 3.81 (m, 2H); 3.98 (m, 2H); 4.16 (m, IH); 4.35 (m, 3H); 4.58 (m, IH); 5.21 (m, IH); 5.35 (d, J = 4.4, IH)。MALDI-MS：C57Hi03NOi8P+ [M + H]+ 計算値1120.70、実測値1120.64。
【０４２６】
実施例３７：ＳＭＬ１６Ｍの適用
ＳＭＬ１６ｍは、疎水性脂質鎖を両親媒性ポリ（エチレングリコール）鎖で置換することによって従来のリン脂質より大きい表面積を有するように設計された。ＳＭＬ１６ｍは水に容易に溶解する。１０ｍＭの濃度で、ＳＭＬ１６ｍは、検出可能な粒子を水中に形成しない。従来の両親媒性分子と異なり、ＳＭＬ１６ｍは、撹拌したとき発泡しないが、溶液の表面の上のガラス壁に沿って薄膜を形成する。ＳＭＬ１６ｍは、１：１又はそれより高いモル比でアンホテリシンＢを効果的に可溶化して、５ｍｇ／ｍＬの濃度を得ることができる。ＳＭＬ１６ｍはまた、他の脂質とともに製剤化して小リポソームを得ることができる。例えば、ＤＰＰＣの多重層小胞の粒径は、２０モル％のＳＭＬ１６ｍを加えたとき、有意に減少した。
【０４２７】
実施例３８：３０％ウシ胎児血清中のＳＭＬ含有リポソームからの５−カルボキシフルオレセインの放出制御
リポソームからの薬物の放出速度は、脂質二重層の硬さ及び透過性により制御される。アルキル鎖長及び不飽和の程度は、リポソーム製剤において重要な役割を果たす。３０％ウシ胎児血清を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）（ＨＢＳ）中で、ＳＭＬリポソームからの５−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の放出を評価した。
【０４２８】
ＣＦを実施例１６で述べたのと同様の方法によりリポソームに封入した。リポソームを２００ｎｍポリカーボネート膜を通して押し出し、ＨＢＳを等張性溶出液として用いてＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上に加えたリポソームを溶出することにより、遊離ＣＦを除去した。リポソーム試料の一部（１０μＬ）を９６ウエルプレートでＨＢＳ又はＦＢＳにより０．０２％アジ化ナトリウムを含む２００μＬの総容積まで希釈した。次いで、プレートを透明プラスチックフィルムで密封し、３７℃でインキュベートした。試料の蛍光強度を種々の時点にモニターし、リポソームから放出されたＣＦのパーセントを次の式により求めた。
ＣＦ％＝（Ｆｔ−Ｆ０）／（Ｆａ−Ｆ０）＊１００％
式中、
Ｆ０＝バックグラウンド蛍光シグナル
Ｆａ＝総蛍光シグナル
Ｆｔ＝測定時の蛍光シグナル
【０４２９】
供試ＳＭＬは次の通りであった。
・１−ヘキサノイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１５ａ）
・１−デカノイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１５ｃ）
・１−ドデカノイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１５ｄ）
・１−テトラデカノイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１５ｅ）
・１−ヘキサデカノイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１５ｆ）
・１−オクタデカノイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１５ｇ）
・１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１５ｈ）
・１−イコサノイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１５ｉ）
・１−ドコサノイル２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ１５ｊ）
・１，２−ジコレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＭＬ６ｂ）
【０４３０】
以下の４種類のリポソーム製剤をＣＦ放出試験に用いた。
（１）４５モル％等価コレステロールを含むＳＭＬ６ｂ及びジアシルリン脂質のリポソーム、図１２でＦ１と表す；
（２）同じ鎖長の１−アシル２−ｃｈｅｍｓ−ホスホコリン及びジアシルリン脂質のリポソーム、図１２でＦ２と表す；
（３）４５モル％コレステロールを含むコレステロール及びジアシルリン脂質のリポソーム、図１２でＦ３と表す；
（４）純１−アシル２−ｃｈｅｍｓ−ホスホコリン（ＳＭＬ１５系列）のリポソーム、図１２でＦ４と表す。
【０４３１】
図１２に示す結果に示すように、長鎖脂質を含むすべての製剤が良好な安定性及び漏れに対する抵抗を示した。純１−アシル−２−ｃｈｅｍ−ＰＣのリポソームは、Ｃ１０と低い鎖長から始まる広範囲の鎖長で安定性を示し、ＣＦの放出は３０％未満であった。しかし、ジアシル脂質と混合することにより、曲線はより長いアルキル鎖の方向に劇的に移動した。ジアシル／ＳＭＬ６ｂリポソームは、ＣＦの放出を減少させるために従来のジアシル／コレステロールリポソームよりわずかに長いアルキル鎖を必要とする。ジアシル鎖長が１２未満である場合、ジアシル／コレステロール混合物から安定なリポソームを調製することは可能でなかった。これは、ＳＭＬ製剤Ｆ４のさらなる利点である。ジアシル／ＳＭＬ６ｂの完全な放出プロファイルを図１３に示す。全体として、３つのＳＭＬ製剤は、所望の速度での薬物の放出の制御の広い範囲の選択を可能にする。
【図１】
2011503188.tif 000036
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011503188.tif 000042
【図８】
2011503188.tif 000043
【図９】
2011503188.tif 000044
【図１０】
2011503188.tif 000045
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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