(57)【要約】本発明は、乳酸で５．３〜６．７のｐＨ値に酸性を帯びさせた好適な発酵培地中で細胞を生育する、細胞における巨大ミトコンドリアの形成のためのin vitro方法に関する。本発明はさらに、巨大ミトコンドリアの形成の阻害または低減が有益な効果を有する疾患の予防または処置のための、Ｈ＋イオノフォア、Ｋ＋のＨ＋への電気的に中性な交換を触媒するイオノフォアおよびアクチン重合阻害物質に関する。
2011527186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸で５．３〜６．７のｐＨ値に酸性化した好適な発酵培地中で細胞を生育する、細胞における巨大ミトコンドリアの形成のためのin vitro方法。
【請求項２】
ｐＨ値が５．７〜６．３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発酵培地が、イスコブ培地、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ダルベッコ改変イーグル培地または最小必須培地イーグルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
培地に含まれる乳酸の濃度が３〜３００ｍＭである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
巨大ミトコンドリアが、乳酸で酸性化された発酵培地を、７．０を超えるｐＨを有する一般的な発酵培地に交換することにより可逆的である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
巨大ミトコンドリアの形成の阻害または低減が有益な効果を有する疾患の予防または処置のための、Ｈ＋イオノフォアおよび／またはＫ＋のＨ＋への電気的に中性な交換を触媒するイオノフォア。
【請求項７】
巨大ミトコンドリアの形成の阻害または低減が有益な効果を有する疾患の予防または処置のための、アクチン重合阻害物質。
【請求項８】
ＣＣＣＰまたはナイジェリシンである、請求項６に記載のイオノフォア。
【請求項９】
サイトカラシンＢである、請求項７に記載の阻害物質。
【請求項１０】
ミトコンドリアミオパチー、乳酸アシドーシスまたはＭＥＬＡＳの予防または処置のための、請求項６〜９のいずれか一項に記載のイオノフォアまたは阻害物質。
【請求項１１】
Ｈ＋イオノフォアおよび／またはＫ＋のＨ＋への電気的に中性な交換を触媒するイオノフォアの、巨大ミトコンドリアの形成の阻害または低減が有益な効果を有する疾患の予防または処置のための医薬組成物の製造のための使用。
【請求項１２】
アクチン重合阻害物質の、巨大ミトコンドリアの形成の阻害または低減が有益な効果を有する疾患の予防または処置のための医薬組成物の製造のための使用。
【請求項１３】
イオノフォアが、ＣＣＣＰまたはナイジェリシンである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
阻害物質が、サイトカラシンＢである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
疾患が、ミトコンドリアミオパチー、乳酸アシドーシスまたはＭＥＬＡＳである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸で５．３〜６．７のｐＨ値に酸性化した好適な発酵培地中で細胞を生育する、細胞における巨大ミトコンドリアの形成のためのin vitro方法に関する。本発明はさらに、巨大ミトコンドリアの形成の阻害または低減が有益な効果を有する疾患の予防または処置のための、Ｈ＋イオノフォア、Ｋ＋のＨ＋への電気的に中性な交換を触媒するイオノフォア、およびアクチン重合阻害物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
文献において、並み外れた直径を有するミトコンドリアは、巨大ミトコンドリアとして知られている。生理的な巨大ミトコンドリアは多くの精子細胞（Hales and Fuller, 1997）、冬眠中の変温動物（Grodums, 1977）、および多くの哺乳動物の網膜（Samorajski et al., 1966、Kuhne, 1983、Lluch et al., 2003）に存在する。さらに、これらはヒドラジンまたはＨ２Ｏ２などの化学物質によって誘導することができ（Karbowski et al., 1997、Karbowski et al., 1999）、また、これらはアルコール肝などのヒトの多くの病的障害の副次的特性であり（Rubin und Lieber, 1968、Iseri und Gottlieb, 1971、Yokoo et al., 1978、Chedid et al., 1980）、ＭＥＬＡＳなどのミトコンドリアＤＮＡの変異に起因する障害にも存在する（Pavlakis et al., 1984）。この変異は、ミトコンドリアｔＲＮＡＬｅｕ（ＵＵＲ）遺伝子内の３２４３位におけるＡ→Ｇ塩基対置換と関係しており、ｔＲＮＡＬｅｕ（ＵＵＲ）の構造を変えるだけでなく、ｒＲＮＡ遺伝子の転写終止に関与するセグメント中に位置してもいる。低身長、発作、痴呆、聴力障害および卒中に類する神経学的症状などの異常のほか、細胞レベルでは、巨大ミトコンドリアの形成には、特に運動後の乳酸アシドーシス、ねじれたクリステ構造、および呼吸鎖の機能障害が伴う（Hirano et al., 1994、Goto et al., 1992、Ciafaloni et al., 1992）。
【０００３】
これら後者の細胞レベルの病的特性は、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させた培養細胞の特別な特徴である。これらのいわゆるρ０細胞は、呼吸鎖複合体を構成するサブユニットのうちの１３個が存在せず、インタクトな酸化的リン酸化なしで増殖する。ρ０細胞内でのエネルギー産生は、嫌気的解糖経路に専ら依存している。さらに、この細胞はピルビン酸塩（King and Attardi, 1989）およびウリジン（Gregoire et al., 1984、Morais et al., 1980）の追加補給に依存性であり、過度の乳酸発酵による培地の急速な酸性化を示す（Jakobs et al., 1994）。哺乳動物ρ０細胞の構造的な調査により、小さな個々のミトコンドリアユニットが細胞質に分布する、乱れたネットワーク構造が示された。基質は電子が空のようであり、大部分のクリステは、２枚の膜からなる同心円状のリングが緊密に接しているため、基質中に横たわる湾曲した外観を示していた（Gilkerson et al., 2000）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、本発明の根底にある技術的課題は、巨大ミトコンドリアの形成のための方法を提供することである。これらの巨大ミトコンドリアは、ミトコンドリア疾患（例えばＭＥＬＡＳまたはミトコンドリアミオパチーなど）を調査するための、また、巨大ミトコンドリアの形成と関連するか、もしくは、巨大ミトコンドリアの存在を特徴とする疾患の処置のための化合物を特定するためのツールとして使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記技術的問題の解決は、特許請求の範囲で特徴づけられる態様を提供することにより達成される。
【０００６】
本発明をもたらした研究において、ミトコンドリアＤＮＡを欠損させた（ρ０）骨肉腫細胞系における巨大ミトコンドリアの形成を検討した。巨大ミトコンドリアの発生が乳酸発酵で産生される乳酸塩とプロトンの両方に依存しており、クリステ構造の大幅な変化を伴うことが判明した。しかしながら、酸性の培養培地を交換すると巨大ミトコンドリアのネットワーク状構造への急速な逆形成（back-formation）が起こるため、これはアポトーシス過程によるものではない。さらにまた、乳酸による野生型骨肉腫およびＨｅＬａ細胞の処理は、依然としてｍｔＤＮＡを保有している細胞において、巨大ミトコンドリアを誘導する。これらの結果は、乳酸誘導性の融合（＝形成）および分裂（＝逆形成）のアンバランスを示唆しており、また、ＭＥＬＡＳ患者の筋生検で見出される巨大ミトコンドリアをもたらすメカニズムを示している。さらにまた、細胞骨格成分の影響の調査は、哺乳動物細胞におけるミトコンドリアの融合および分裂過程に対するアクチン細胞骨格の強い影響を初めて明らかにする。これらの結果はまた、高い乳酸濃度の所見と、ＭＥＬＡＳ患者の筋線維の超微細構造研究で観察することができる、病的な巨大ミトコンドリアの発生との関係を示している。
【０００７】
最後に、薬剤ＣＣＣＰ、ナイジェリシンおよびバリノマイシンにより、巨大ミトコンドリアの形成および逆形成に対するミトコンドリアの電気化学的膜電位の種々の構成要素の影響を検討した。これらのイオノフォア（Ｈ＋イオノフォア、およびＫ＋のＨ＋への電気的に中性な交換を触媒するイオノフォア）の一部が巨大ミトコンドリアの形成を阻害できることが判明した。
【０００８】
したがって、本発明は、乳酸で５．３〜６．７のｐＨ値に酸性化された好適な発酵培地中で細胞を生育する、細胞における巨大ミトコンドリアの形成のためのin vitro方法に関する。
【０００９】
好適な発酵培地は当業者に知られており、生育する細胞に依存する。例は、イスコブ培地、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ダルベッコ改変イーグル培地または最小必須培地イーグルである。これらの培地には、一般的な添加物、例えば、ウシ胎仔血清、ブロモデオキシウリジン、ピルビン酸塩、ウリジン、アール塩、Ｌ−グルタミン、重炭酸ナトリウムまたは可欠アミノ酸などを添加してもよい。
【００１０】
５．３〜６．７、好ましくは５．７〜６．３のｐＨに達するまで、乳酸を発酵培地に加える。培地中の乳酸（すなわち乳酸塩）の濃度は、好ましくは５〜３００ｍＭ、より好ましくは４０〜７０ｍＭである。
本発明の方法の特徴の１つは、形成された巨大ミトコンドリアが、乳酸で酸性化した発酵培地を、ｐＨ７．０を超える、好ましくはｐＨ７．４と等しいか、これを超えるｐＨを有する一般的な発酵培地に交換することによって、可逆的であることである。
【００１１】
したがって、本発明はさらに、巨大ミトコンドリアの形成の阻害または低減が有益な効果を有する疾患の予防または処置のための、Ｈ＋イオノフォアおよび／またはＫ＋のＨ＋への電気的に中性な交換を触媒するイオノフォアに関する。
本発明はまた、巨大ミトコンドリアの形成の阻害または低減が有益な効果を有する疾患の予防または処置のための、アクチン重合阻害物質に関する。
【００１２】
本明細書で用いる用語「巨大ミトコンドリア」は、簡易な光学顕微鏡法で見えるようになるサイズ、すなわち直径約＞２μｍのミトコンドリアを意味する。巨大ミトコンドリアは、種々の形態および形状のもの（球状〜針状）を観察することができる。
【００１３】
本発明において有用なイオノフォアは、当業者に知られている。好適なＨ＋イオノフォアの例は、ＣＣＣＰ、ＦＣＣＰまたはジニトロフェノールを含む。Ｋ＋のＨ＋への電気的に中性な交換を触媒する好適なイオノフォアの例は、ナイジェリシンである。
本発明において有用なアクチン重合阻害物質も当業者に知られている。好適な阻害物質の例は、サイトカラシンＢである。
【００１４】
上記の化合物は、巨大ミトコンドリアの存在または形成を特徴とする任意の疾患、または、巨大ミトコンドリアの形成の阻害または巨大ミトコンドリアの逆形成の促進が有益な効果を有する任意の疾患の予防または処置に有用である。かかる疾患の例は、ミトコンドリアミオパチー、乳酸アシドーシスまたはＭＥＬＡＳである。
【００１５】
投与のために、上述のイオノフォアまたは阻害物質は、好適な医薬キャリヤーと好ましくは組合わされる。好適な医薬キャリヤーの例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン、例えば油/水エマルジョンなど、種々のタイプの湿潤剤、無菌液等を含む。かかるキャリヤーは従来の手法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。上述のイオノフォアまたは阻害物質、好ましくは薬学的に許容し得るキャリヤーと組み合わせたものの投与は、様々な手法で、例えば経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、または皮内投与によって行うことができる。投与経路は、当然ながら、処置する疾患の性質に依存する。投与計画は、主治医および他の臨床的要因により決定される。医学分野で周知のとおり、任意の１人の患者のための投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与の時間および経路、疾患の種類、一般健康状態、および併用する他の薬剤を含む多くの要因に依存する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１の（Ａ）は、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞におけるＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏの蛍光の発現による、位相差での球状凝集体のミトコンドリアとの共局在分析を示した写真図である。キャリブレーションマークは５０μｍに相当する。図１の（Ｂ）は、２４時間（Ａ１）、４０時間（Ａ２）、４８時間（Ａ３）および６２時間（Ａ４）の培養中の１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞における巨大ミトコンドリア形成のin vivoでの共焦点顕微鏡記録である。ミトコンドリアの染色は、ＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏの安定発現によって行った。キャリブレーションマークは１０μｍに相当する。図１の（Ｃ）は、４０時間、４８時間および６２時間の培養時間中の巨大ミトコンドリアの直径の増大のグラフ記録である。異なる細胞からの１００個のミトコンドリアの直径を、倒立型共焦点顕微鏡法（inverse confocal microscopy）によって検討し、統計学的に分析した。エラーバーが表示されている。図１の（Ｄ）は、播種の２４時間後（Ａ１〜Ａ２）、４８時間後（Ｂ１〜Ｂ２）および６２時間後（Ｃ１〜Ｃ３）の１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞における巨大ミトコンドリア形成の電子顕微鏡法による分析を示した写真図である。画像Ａ１、Ｂ１およびＣ１は概観像を示す。単一の巨大ミトコンドリアの詳細または内部構造は、Ａ２、Ｂ２、Ｃ２およびＣ３にそれぞれ示す。キャリブレーションマークは１μｍに相当する。
【００１７】
【図２】図２は、使用済の酸性培地を新鮮な培地に交換した後の１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞における巨大ミトコンドリア逆形成のin vivo共焦点顕微鏡所見を示した写真図である。ＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ染色された細胞の記録は１４０分間行った。キャリブレーションマークは１０μｍに相当する。
【００１８】
【図３】図３は、（Ａ）１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞により６８時間の培養の後に生成された酸性培養培地中のインキュベーションによるか、または、（Ｂ）乳酸、ｐＨ６．０〜６．３で酸性を帯びさせた培地による、細胞系１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７（Ａ１〜Ａ３）、１４３Ｂ．ＴＫ−ｇｍ（Ｂ１〜Ｂ３）およびＨｅＬａ（Ｃ１〜Ｃ３）における巨大ミトコンドリアの誘導を示した写真図である。ミトコンドリアの染色は示したとおりに行った。巨大ミトコンドリアの逆形成を示すため、巨大ミトコンドリアの誘導の１時間後に、培地を新鮮な培地に交換した（Ａ２、Ｂ２、Ｃ２）。画像Ａ３、Ｂ３およびＣ３は、未処理対照を示す。
【００１９】
【図４】図４は、巨大ミトコンドリアの形成（Ａ、Ｂ）および逆形成（Ｃ）に対するミトコンドリア膜電位の影響を示した写真図である。（Ａ）播種の２４時間後に、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞を、１０μＭのＣＣＣＰ（Ａ  Ａ１）、１０μＭのバリノマイシン（Ａ  Ａ２、Ｂ）または１μＭのナイジェリシン（Ａ  Ａ３）とともに１８時間インキュベートした。（Ｂ）バリノマイシンによって誘導された構造を、ＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ（４Ｂ  Ａ１）と、ミトコンドリア内膜を特異的に染める（データは示さない）ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ（４Ｂ  Ａ２）との共染色により詳細に分析した（Ａ３）。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓで染色されるか、または位相差で見える、隔壁をなす（septating）内膜を、白矢頭で示す。（Ｃ）巨大ミトコンドリアを有する１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞を、１０μＭのＣＣＣＰ（Ｃ  Ａ１、Ｂ１）、１０μＭのバリノマイシン（Ｃ  Ａ２、Ｂ２）または１μＭのナイジェリシン（Ｃ  Ａ３、Ｂ３）とともに３０分間インキュベートした。培地交換（ＭＥ）の６０分後、ミトコンドリアの形態を分析した。未処理対照を、Ａ  Ａ４およびＣ  Ａ４、Ｂ４に示す。キャリブレーションマークは１０μｍに相当する。
【００２０】
【図５】図５は、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞における巨大ミトコンドリアの発生および逆形成の最中のＤｒｐ１の内在性局在の共焦点顕微鏡記録を示した写真図である。巨大ミトコンドリア形成の最中のＤｒｐ１の分布についての免疫局在研究は、２４時間（Ａ１〜Ａ４）および６２時間（Ｂ１〜Ｂ４）の培養時間で行い、逆形成については、酸性培地交換の３０分後（Ｃ１〜Ｃ４）および６０分後（Ｄ１〜Ｄ４）に行った。ミトコンドリアは、ミトコンドリア外膜マーカータンパク質ＰＡＧＦＰ−ＯＭＰ２５−Ｆｒ．の発現により染色した（Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２）。Ｄｒｐ１検出の二次抗体は、Ｃｙ３と結合していた（Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、Ｄ３）。画像Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１は概観を示し、詳細なオーバレイはＡ４、Ｂ４、Ｃ４、Ｄ４に示す。キャリブレーションバーは５μｍに相当する。
【００２１】
【図６】図６は、巨大ミトコンドリアの発生および逆形成に対する細胞骨格成分の影響を示した写真図である。（Ａ）〜（Ｃ）は、巨大ミトコンドリアの形成（Ａ）および逆形成（Ｂ、Ｃ）に対するアクチン細胞骨格の影響を示す。（Ａ）ＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏで染色した１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞を、種々の培養時間にて、４μＭのサイトカラシンＢ（Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２）または対照として等量の溶媒（Ａ３、Ａ４、Ｂ３、Ｂ４）で９〜１５時間処理した。アクチン細胞骨格の染色は、固定した細胞において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４６５ファロイジンにより行った（Ａ２、Ｂ２、Ａ４、Ｂ４）。矢頭は、６２時間の培養時間後のアクチン染色によって観察可能な細胞質における円形の領域を示す。（Ｂ）１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞における巨大ミトコンドリアの逆形成に対するアクチン細胞骨格の影響は、２．４μＭのサイトカラシンＢ（Ａ１、Ａ２、Ｃ１、Ｄ１）または対照として等量の溶媒（Ｂ１、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２）での３時間の処理により試験した。ミトコンドリアの形態は、培地交換の１時間後（Ｃ１、Ｃ２）または３時間後（Ｄ１、Ｄ２）に分析した。アクチン細胞骨格の染色は、固定した細胞において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４６５ファロイジンにより行った（Ａ２、Ｂ２）。（Ｃ）リング状（ring shaped）アクチン構造と１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞の巨大ミトコンドリアとの共局在は、ｐＥＧＦＰ−ＯＭＰ２５−Ｆｒ．のトランスフェクション（Ａ１）、および固定した細胞におけるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４６５ファロイジンでのアクチン細胞骨格の染色（Ａ２）により行った。キャリブレーションマークは、１０μｍに相当する。（Ｄ）巨大ミトコンドリアの逆形成に対するチューブリン細胞骨格の影響。巨大ミトコンドリアを有する１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞を６μＭのノコダゾール（Ａ１、Ａ２、Ｃ１、Ｄ１）または対照として等量の溶媒（Ｂ１、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２）とともに３時間インキュベートした。ミトコンドリアの構造の変化の分析は、酸性培地交換の１時間後（Ｃ１、Ｃ２）または３時間後（Ｄ１、Ｄ２）に行った。矢頭は、少なくとも３時間持続している異常なリング状ミトコンドリア構造を示す。キャリブレーションバーは、１０μｍに相当する。（Ｅ）リング状ミトコンドリア構造の共焦点顕微鏡分析は、（Ｄ）に記載したノコダゾールとのインキュベーションの後、巨大ミトコンドリアをＥＧＦＰ−ＯＭＰ２５−Ｆｒ．により染色して行った。（Ａ１）にｘｙ断面を、ならびに同一の細部のｘｚ断面（Ａ２）を示す。キャリブレーションマークは、５μｍに相当する。
【００２２】
【図７】図７は、生きている１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７におけるミトコンドリア膜電位の記録を示した写真図である。２４時間（Ａ１〜Ａ３、Ｂ１〜Ｂ３）および６２時間（Ｃ１〜Ｃ３、Ｄ１〜Ｄ３）の培養時間におけるＪＣ−１染色による記録。Ｊ凝集体（J-aggregate）の赤色蛍光（Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１）ならびに緑色のモノマー形態（Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２）を、４８８ｎｍの励起波長により同時に分析した。画像Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、Ｄ３はオーバーレイを示す。キャリブレーションバーは、１０μｍに相当する。
【００２３】
【図８】図８は、巨大ミトコンドリアの誘導を示した写真図である。巨大ミトコンドリアの誘導は、酸性化した培地（ＨＣｌ）中、または３０〜１８０ｍＭの乳酸ナトリウムで富化したｐＨ調整していない培地（ｐＨ７．４を維持）中での１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞のインキュベーションによっては可能ではなかった（Ａ１、Ａ２）。未処理対照をＡ３に示す。キャリブレーションマークは、１０μｍに相当する。
【００２４】
【図９】図９は、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞における巨大ミトコンドリアの逆形成に対するＮａＯＨ（Ａ）、乳酸（Ｂ）、ＨＣｌ（Ｃ）および乳酸ナトリウム（Ｄ）の影響を示した写真図である。Ａ）酸性培地への１．３ｍＭのＮａＯＨの添加（Ａ１）は、巨大ミトコンドリアの逆形成をもたらさなかった。しかしながら、２．０ｍＭのＮａＯＨの添加は、巨大ミトコンドリアの逆形成を誘導するのに十分であった（Ａ２）。Ｂ）巨大ミトコンドリアを有する１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞の、乳酸でｐＨ６．８（Ｂ、Ａ１）およびｐＨ７．０（Ｂ、Ａ２）に、およびＣ）ＨＣｌでｐＨ６．０（Ｃ、Ａ１）およびｐＨ７．０（Ｃ、Ａ２）に酸性を帯びさせた新鮮な培地による処理は、巨大ミトコンドリア逆形成の閾値がプロトン濃度に依存することを示した。Ｄ）３０ｍＭ（Ａ１）または１８０ｍＭの乳酸ナトリウム（Ａ２）を補充した培地で処理した、巨大ミトコンドリアを有する１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞が示すとおり、巨大ミトコンドリアの持続は乳酸塩イオンに依存していない。キャリブレーションマークは、１０μｍに相当する。
【００２５】
【図１０】図１０は、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞における巨大ミトコンドリアの発生および逆形成の最中のＭＦＮ２の内在性局在の共焦点顕微鏡記録を示した写真図である。巨大ミトコンドリアの形成の最中のＭＦＮ２の分布のための免疫局在性研究は、２４時間（Ａ１〜Ａ４）および６２時間（Ｂ１〜Ｂ４）の培養時間後に行い、逆形成については酸性培地の交換の３０分後（Ｃ１〜Ｃ４）および６０分後（Ｄ１〜Ｄ４）に行った。ミトコンドリアは、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓで染色した（Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２）。ＭＦＮ２検出の二次抗体は、ＦＩＴＣに結合していた（Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、Ｄ３）。画像Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１は概観を示し、詳細なオーバレイはＡ４、Ｂ４、Ｃ４、Ｄ４に示す。キャリブレーションバーは、５μｍに相当する。
【００２６】
【図１１】図１１は、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞における巨大ミトコンドリアの形成に対するチューブリン細胞骨格の影響を示した写真図である。１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞を、１０μＭのノコダゾール（Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２）または対照として等量の溶媒（Ａ３、Ａ４、Ｂ３、Ｂ４）で、種々の培養時間にて、９〜１５時間処理した。ミトコンドリアの形態を、in vivoのＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ染色により、画像Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ａ３、Ｂ３、Ｃ３に示す。チューブリン細胞骨格の染色は、固定した細胞において、アルファチューブリンに対する抗体およびＣｙ３結合二次抗体により行った（Ａ２、Ｂ２、Ａ４、Ｂ４）。キャリブレーションバーは、１０μｍに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下の例は、本発明を例示する。
例１
材料と方法
（Ａ）哺乳動物発現プラスミドの構築
ミトコンドリア外膜用のマーカータンパク質を生成するため、ミトコンドリア外膜へのインポートおよびターゲティングシグナルをコードする（Nemoto and De Camilli, 1999）ＯＭＰ２５（アクセッション番号NM_018373.1）のＣ末端膜貫通領域を、１４３Ｂ．ＴＫ−ゲノムＤＮＡから、以下のプライマーによるＰＣＲで増幅した：ｈＯＭＰ２５−３０３−ＦＯＲ  ５’−ｇｇｔｇｃａｇａａｔｇｇａｃｃｔａｔａｇｇａｃａｔｃｇ−３’およびｈＯＭＰ−４３８−ＲＥＶ  ５’−ｔｃａａａｇｔｔｇｔｔｇｃｃｇｇｔａｔｃｔｃａｔ−３’。増幅物をプライマーｈＯＭＰ２５−３２５−ＦＯＲ  ５’−ａｇａｔｃｔｃａｔｃｇａｇｇｔｇａａｇｇｇｇａｃｃｃ−３’およびｈＯＭＰ−４３８−ＲＥＶ（２）  ５’−ｇａａｔｔｃｔｃａａａｇｔｔｇｔｔｇｃｃｇｇｔａｔｃｔｃａｔ−３’によるＰＣＲにおけるテンプレートとして用い（ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位に下線を付す）、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩでｐＰＡＧＦＰ−Ｃ１およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１にサブクローニングした。
【００２８】
（Ｂ）試薬および抗体
サイトカラシンＢおよびナイジェリシンはSigma-Aldrich（Taufkirchen, Germany）から得、ノコダゾール、ジェネティシン、ＣＣＣＰ、バリノマイシン、ＨＣｌおよび乳酸はAppliChem（Darmstadt, Germany）からのものであり、ＭＯＷＩＯＬはCalbiochem（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）からのものであった。
エタノール中（１ｍｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ、１ｍＭのナイジェリシン）またはＤＭＳＯ中（１０ｍＭのノコダゾール、１０ｍＭのＣＣＣＰ、１０ｍＭのバリノマイシン）の原液は、−２０℃で保存した。
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓ、ＪＣ−１、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ｃｙ３二次抗体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＦＩＴＣ二次抗体およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６ファロイジンはInvitrogen（Karlsruhe, Germany）から得た。チューブリン（Ｋ−アルファ−１（Ａ０２））に対するポリクローナル一次抗体およびＤｒｐ１に対するモノクローナル一次抗体はAbnova Corporation（Taipei City, Taiwan）からのものであり、ＭＦＮ２に対するポリクローナル一次抗体はManuel Rojo, INSERM, U.582, University Pierre et Marie Curie, Paris, Franceからの寄贈であった。
【００２９】
（Ｃ）細胞培養
ヒト骨肉腫細胞１４３Ｂ．ＴＫ−野生型（ATCC c/o LGC Standards, Wesel, Germany）および１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０は、５％のウシ胎仔血清、１％のブロモデオキシウリジン、１００μｇ／ｍｌのピルビン酸塩および５０μｇ／ｍｌのウリジンを添加した、グルタマックス（Invitrogen）を含むダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）中、標準的な条件で培養した。ＨｅＬａ細胞は、５％のウシ胎仔血清および１００ｍＭの可欠アミノ酸を添加した、アール塩、Ｌ−グルタミンおよび重炭酸ナトリウムを含む最小必須培地イーグル（Sigma-Aldrich）中で培養した。
ｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ（Clontech, Palo Alto, USA）、ｐＰＡＧＦＰ−ＯＭＰ２５−Ｆｒ．およびｐＥＧＦＰ−ＯＭＰ２５−Ｆｒ．による１４３Ｂ．ＴＫ−および１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞のトランスフェクションは、メタフェクテン（Biontex, Martinsried, Germany）を用いて行った。ジェネティシン（Ｇ４１８）（７００μｇ／ｍｌ）による選択は、安定したクローンの単離まで行った。
巨大ミトコンドリア形成の誘導は、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ρ０細胞からの酸性培地の移入、および乳酸、ｐＨ６．０〜６．３による新鮮な培地の人為的な酸性化によって行った。培養培地のさらなる変化は、ＨＣｌによる培地の酸性化、３０〜１８０ｍＭの乳酸ナトリウムおよび１．３〜２．０ｍＭのＮａＯＨの添加により行った。
【００３０】
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭおよびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓは、製造者のプロトコルに従って４００ｎＭの濃度でミトコンドリアを標識するのに用いた。
薬剤（終濃度６〜１０μＭのノコダゾール、２．４〜４μＭのサイトカラシンＢ、１０μＭのＣＣＣＰ、１０μＭのバリノマイシンおよび１μＭのナイジェリシン）は、標準培養培地に、巨大ミトコンドリア発生の種々の段階で添加した。
【００３１】
（Ｄ）ミトコンドリア膜電位の測定
巨大ミトコンドリア形成の様々な段階と対照細胞とのミトコンドリア膜電位の違いを測定するために、電位差測定色素（potentiometric dye）ＪＣ−１の二重発光を観察した。細胞は、標準的な培養培地中に希釈し０．２μｍのシリンジフィルターで１回濾過した３μＭのＪＣ−１と直接、３７℃で３０分間インキュベートするか、膜電位のない細胞の比較のため、最初にＣＣＣＰ（終濃度１０μＭ）で３０分間処理した。ミトコンドリア膜電位の局所的な違いを観察するために、細胞を、倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡によりin vivoで観察した（４８８ｎｍの波長による赤色および緑色蛍光の同時励起）。
【００３２】
（Ｅ）免疫細胞化学
カバースリップ上で生育させた細胞を示したとおりに処理し、メタノール（−２０℃）で５分間固定し、ＰＢＳ中の０．２％のトリトンＸ−１００により室温で５分間透過処理した。ＰＢＳ（５分）で３回洗浄後、ブロッキング反応を、室温で３０分間のＰＢＳ中の３％のウシ血清アルブミンに続き、ＰＢＳ中の１００ｍＭのグリシンで１０分間行った。
【００３３】
次いで、カバースリップをＰＢＳ中の１％のＢＳＡで１：５０に希釈したマウス抗アルファチューブリンポリクローナル一次抗体とともに、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ（５分）で３回細胞を洗浄した後、カバースリップを、ＰＢＳ中の１０％のヤギ血清中のＣｙ３結合ヤギ二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ（７分）で３回洗浄後、Ｍｏｗｉｏｌでマウントし、蛍光顕微鏡法で分析した。Ｄｒｐ１抗体とミトコンドリアとの共局在のために、ｐＯＭＰ２５−ｆｒａｇｍｅｎｔ−ＥＧＦＰのトランスフェクションの１〜２日後、カバースリップ上で生育した細胞を室温のメタノール／アセトン（５０％）で２分間固定し、透過処理工程なしで、上述のとおり処理した。内因性ＭＦＮ２の検出は、５分間のメタノール固定（−２０℃）の後、１０％のＦＣＳ中に希釈したＭＦＮ２−ＮＧに対する一次抗体を３０分間、引続くＰＢＳ中での洗浄工程、およびＰＢＳ中の１０％のヤギ血清中のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ｃｙ３二次抗体を室温で１時間により行った。
【００３４】
アクチン細胞骨格の検出のために、カバースリップ上の示したとおりに処理した細胞をＰＢＳ中の３．７％のホルムアルデヒドで室温にて１０分間固定し、ＰＢＳ中で５分間３回洗浄した後、ＰＢＳ中の０．１％のトリトンＸ−１００で５分間透過処理した。ＰＢＳ（５分）によるさらなる洗浄工程の後、細胞をＰＢＳ中の１％のＢＳＡで室温にて３０分間ブロッキングし、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ中の１単位（５μｌ）のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６ファロイジンとともに室温で２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで７分間３回洗浄した後に、カバースリップをＭｏｗｉｏｌでマウントし、共焦点顕微鏡で分析した。
【００３５】
（Ｆ）蛍光顕微鏡法および共焦点顕微鏡法
生細胞は、倒立型蛍光顕微鏡ＤＭＩ  ６０００  Ｂ（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）で観察し、ガラスボトムディッシュ（MatTek Corporation, Ashland, USA）上で培養し、倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡ＴＣＳ  ＳＰ５（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）で観察した。多重染色化合物の励起におけるクロストークを避けるために、共焦点顕微鏡法においては常に順次走査モードを用いた。
画像は電荷結合素子カメラまたは光電子増倍管でそれぞれ取得し、顕微鏡写真はLeica Application Suite Advanced Fluorescence 1.5.1およびAdobe Photoshop CS（Version 8.0.1)ソフトウェアで処理および分析した。
【００３６】
（Ｇ）電子顕微鏡法
カバースリップ上で生育させた細胞を、１００ｍＭのカコジレートバッファーｐＨ７．４中の２．５％のグルタールアルデヒド、２％のホルムアルデヒド（パラホルムアルデヒドから作製）の溶液で４℃にて１．５時間固定し、カコジレートバッファーで２回洗浄し、エタノール、次いでプロピレンオキシドで脱水し、プロピレンオキサイドとエポンとの１：１の混合物中に１〜２時間浸漬した。最後に、細胞をエポン中に６０℃での２日間の重合により封埋した。超薄切片は、Ｚｅｉｓｓ  ＥＭ１０（Zeiss/Oberkochen, Germany）で分析した。
【００３７】
例２
骨肉腫ρ０細胞系における巨大ミトコンドリアの形成
最初のρ０培養細胞の開発（Desjardins et al., 1985、Desjardins et al., 1986、King and Attardi, 1988、Morais et al., 1988）以来、多くの調査がこのモデル系を用いてミトコンドリア−核相互作用に対する知見を得るために行われた。本研究は、ミトコンドリアＤＮＡ変異に関連する障害において観察され得る病理学的特徴に類似するこれらの細胞の特性に焦点を当てている。
本研究に用いたρ０細胞は、骨肉腫細胞系１４３Ｂ．ＴＫ−から、低用量のエチジウムブロマイドとのインキュベーションにより（１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０）（King and Attardi, 1988）、またはミトコンドリアを標的とする制限エンドヌクレアーゼの一過性発現により（１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７）派生したものである。同一の実験を、親細胞系（１４３Ｂ．ＴＫ−、野生型、ミトコンドリアＤＮＡを含んでいる細胞）について行った。ｒｈｏ０細胞系について記述した巨大ミトコンドリアの形成は、親細胞系において同じであることが認められた。
【００３８】
これらのρ０細胞の培養中、持続的に増加する球状の低コントラストの凝集体が細胞質内に現れた。ＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏの一過性発現により、球状凝集体とＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏ染色との共局在が明らかになったが、これは、ミトコンドリアのネットワーク構造が巨大ミトコンドリアを示す形態に変化したことを示している（図１Ａ）。異なる方法論的アプローチによって開発した１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０および１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７の両ρ０細胞系における巨大ミトコンドリアの形成は、これがρ０状態にある１４３Ｂ．ＴＫ−細胞の基本的な特質であることを示すものである。この形成を記録するために、細胞系１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７をｐＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏで安定的にトランスフェクトし、細胞系１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍを得た。ミトコンドリアのネットワークの分析は、２４、４０、４８および６２時間の培養時間に共焦点顕微鏡法により行った（図１Ｂ）。さらに、培養中の巨大ミトコンドリアのこの増加を、異なる細胞からの１００個のミトコンドリアの直径を決定することにより、統計学的に評価した（図１Ｃ）。ρ０細胞特有の複数の単一ミトコンドリアユニット（これは、２４時間以降に膨大しているようであった（図１Ｂ  Ａ１））を有するネットワークから、培養時間が進むに連れ、複数の単一ユニットとして存続する、顕著に大きな直径を有する当初は小球状のミトコンドリアが出現した（図１Ｂ  Ａ２、Ａ３、Ａ４）。これに付随して、ミトコンドリアの全体数は、播種の６２時間後に細胞１個あたり最多でミトコンドリア１０〜２０個に減少した（図１Ｂ  Ａ４）。これは、ミトコンドリアの極度の膨大だけでなく、多数の融合イベントにもよるものである。ミトコンドリアの直径の平均は、培養時間を継続するに連れ、４０時間の１．０８±０．２４μｍから４８時間後の１．５８±０．２９μｍへ、そして培養時間６２時間には２．１７±０．５９μｍまで増大した（図１Ｃ）。播種細胞数の培地体積に対する最適な比率、および最適な培養時間により、７μｍまでの直径を有する巨大ミトコンドリアを得ることが可能であった。
【００３９】
巨大ミトコンドリアの形成にもかかわらず、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞は継続的に増殖し、細胞の円形化、核の変形または「アポトーシス小体」の生成などの特徴的なアポトーシス示標は観察できなかった。しかしながら、培養培地の強度の酸性化は細胞の円形化を引き起こし、これらは結合した大きな細胞構造で培養皿の底からはがれ、細胞死をもたらした。ミトコンドリアのクリステ構造の変化を記録するために、巨大ミトコンドリア形成の透過型電子顕微鏡による検討を、２４、４８および６２時間の培養時間に行った（図１Ｄ）。巨大ミトコンドリア生成の初期において、しばしば膨大した外観および電子が空の基質を伴う単一ミトコンドリアユニットを有する「ファジーオニオン（fuzzy onion）」と呼ばれるミトコンドリアの外観（図１Ｄ  Ａ１、Ａ２）が見られた。ミトコンドリア直径の増大により、識別できる内膜構造は少なく、電子密度はさらに低下した。いくらかの環状の二重膜部分（図１Ｄ  Ｂ２、Ｃ２、Ｃ３黒矢頭）、ならびに、ミトコンドリア内部境界膜と依然つながりを有する半環状のコンパートメント（図１Ｄ  Ｂ２、Ｃ３白矢頭）が観察できた。極度の形態学的変化にもかかわらず、ミトコンドリアは依然二重膜の外被を確保していた。さらに、基質内に、１枚の膜からなる多数の反転体（inversion）および封入体（inclusion）が確認できた（図１Ｄ  Ｂ２、Ｃ２白矢印）。全体として、これらの変化は、巨大ミトコンドリアの形成に伴うミトコンドリアのクリステ構造の大幅な変化を示す。
【００４０】
例３
酸性培養培地交換後の巨大ミトコンドリアの逆形成
酸性培養培地を新鮮な培地と交換すると、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞の巨大ミトコンドリアは、ρ０細胞に典型的なミトコンドリアネットワークへの急速な逆形成を示した。これは、共焦点顕微鏡法によって記録した（図２）。新鮮な培地を加えた１０分後に、大部分のミトコンドリアは、若干の変形を伴う変化した形態を示した。その後の進行の中で、巨大ミトコンドリアは細長い楕円形を呈し、さらなる細管化（tubulation）が生じた。さらに分枝ミトコンドリアが出現し、単一点状のミトコンドリア（single punctiform mitochondria）が発散した（emanated）。
したがって、巨大ミトコンドリアの逆形成は、酸性培養培地の交換によって誘導される急速な過程であり、ミトコンドリアの分裂イベントを伴う。
【００４１】
例４
巨大ミトコンドリア形成中のミトコンドリアの膜電位の色素ＪＣ−１による検討
巨大ミトコンドリア形成中のミトコンドリア膜電位を決定するために、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞をＪＣ−１（３μｇ／ｍｌ）で直接染色するか、またはその前に１０ｍＭのＣＣＣＰとともに３０分間インキュベートした。これは、膜電位を保有しないミトコンドリアに関する比較として行った。巨大ミトコンドリア膜電位の局所的差異の分析は、２４時間の培養時間の後、６２時間の培養時間まで、ＪＣ−１との３０分のインキュベーションの後、共焦点顕微鏡法により行った（図７）。１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞のミトコンドリアは、２４時間（図７  Ａ１〜Ａ３）ならびに６２時間（図７  Ｃ１〜Ｃ３）の培養時間の後に膜電位を示した。これは、ＣＣＣＰ処理細胞での染色と比較することにより明らかであった（図７  Ｂ１〜Ｂ３、Ｄ１−Ｄ３）。ここで、赤色蛍光は明らかに不明瞭であり、緑色モノマー蛍光は細胞内での拡散した分布を示した。さらに、画像はＪＣ−１色素がミトコンドリアを囲むミトコンドリア膜を染色することを示す。
【００４２】
例５
培地の変更による巨大ミトコンドリア形成の誘導および分析
いずれの因子が巨大ミトコンドリアの形成に関与するかについての知見を得るために、外因性に巨大ミトコンドリアを誘導することができるかを検討した。最初に、巨大ミトコンドリア形成がこれらの細胞の飢餓過程によるという可能性は、酸性培地に４．５ｇ／ｌのグルコースを加えることによって除外された。しかしながら、この栄養分の回復は、巨大ミトコンドリアの構造の少しの変化ももたらさなかった（データは示さない）。したがって、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７、１４３Ｂ．ＴＫ−ｇｍおよびＨｅＬａ細胞を、巨大ミトコンドリアを有する１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞の使用済の酸性培養培地で培養し、この培地が巨大ミトコンドリアの誘導をもたらす物質を含むかどうか試験した（図３Ａ）。１時間のインキュベーションの後、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７およびＨｅＬａ細胞をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭで染色した後で、ミトコンドリアの形態をin vivoで分析した。
使用した全ての細胞系において、ミトコンドリアのネットワークは、拡大したロッド状および細管状の（tubule）形状から、様々な直径の多数の球状ミトコンドリアに変化した（図３Ｂおよび図３Ｂ  Ａ１、Ｂ１、Ｃ１白矢頭）。しかしながら、これらの巨大ミトコンドリアの直径は、ρ０細胞の内因性の巨大ミトコンドリアのサイズに達しなかった。
【００４３】
巨大ミトコンドリアを、培養培地中のｐＨ値または乳酸濃度の外因性の変化によって誘導できるかを試験するために、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ、１４３Ｂ．ＴＫ−ｇｍおよびＨｅＬａを、ＨＣｌおよび乳酸をそれぞれ補充した培地（ｐＨ６．７〜５．３）でインキュベートした。さらに、巨大ミトコンドリア形成に対する高濃度の乳酸ナトリウム（３０〜１８０ｍＭ）の影響を、ｐＨを変えずに決定した。６．７〜６．８のｐＨ値および３０ｍＭの乳酸塩濃度が、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞の分析した培養培地での測定値に一致する。細胞のインキュベーションは１時間行い、次いで、in vivoでのミトコンドリア形態の分析を行った。試験した全ての細胞系において、巨大ミトコンドリアの誘導は、ＨＣｌで酸性化した培養培地、またはｐＨ調整を行わない（ｐＨ７．４を維持）のない高濃度の乳酸ナトリウムとのインキュベーションの後では可能でなかった（図８）。
ｃｃｃ  しかしながら、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ、１４３Ｂ．ＴＫ−ｇｍおよびＨｅＬａ細胞の、乳酸で人為的にｐＨ値５．３〜６．７に酸性化した培地でのインキュベーションは、これらの細胞系において巨大ミトコンドリアの形成をもたらしたが（図３Ｂ  Ａ１、Ｂ１、Ｃ１白矢頭）、これらは内因性のものの寸法に達しなかった。
これらの観察されたミトコンドリアの変化が可逆的であり、アポトーシスの徴候ではないことを確認するために、酸性培地を再度変更し、新鮮な培地と交換した。インキュベーションの１時間後に、ミトコンドリアをin vivoで観察した。処理した全ての細胞系において、特徴的なミトコンドリアのネットワークが逆形成された（図３Ａ  Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、３Ｂ  Ａ２、Ｂ２、Ｃ２）。
【００４４】
したがって、巨大ミトコンドリアは、巨大ミトコンドリアを有する１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７細胞の使用済の培地に含有される物質によって誘導することができる。巨大ミトコンドリアの形成を誘導するには、プロトンのみまたは乳酸塩のみを培地に加えることでは十分でないが、むしろ、十分量のプロトンと乳酸塩アニオンとが必須である。さらにまた、ｍｔＤＮＡを依然含んでいる細胞もまた、これらの条件で巨大ミトコンドリアを生じることを証明することができた。しかしながら、それらの巨大ミトコンドリアは、ρ０細胞における内因性のものとは対照的に、減少した直径を示す。したがって、細胞のρ０状態による、過剰量の乳酸塩およびプロトンを生成する代謝の変化が、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７および１４３Ｂ．ＴＫ−ρ０細胞における巨大ミトコンドリアの形成に関与している。
【００４５】
巨大ミトコンドリアの逆形成を調査するために同様の実験を行った（図９）。このために、巨大ミトコンドリアを有する１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞を、種々の添加物で補充した培地中でインキュベートした。ｐＨ値の変更は、使用済の培養培地への０．０４〜０．２ｍＭのＮａＯＨの添加により、また、新鮮な培養培地へのｐＨ値７．０〜５．６のＨＣｌおよび乳酸のそれぞれの添加により達成した。さらに、巨大ミトコンドリアの逆形成に対する高濃度の乳酸ナトリウムの影響を、２０〜２１０ｍＭの乳酸ナトリウム、ｐＨ７．４を新鮮な培地へ、ｐＨ値を変えずに添加することにより分析した。種々の培地による細胞の処理は１時間行い、その後、ミトコンドリアの形態を蛍光顕微鏡法によって分析した。巨大ミトコンドリアを有する１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞の酸性培地へのＮａＯＨの添加は、培地のｐＨ値をアルカリ性に転じさせた。１．３ｍＭのＮａＯＨの添加は、巨大ミトコンドリアの逆形成をもたらさなかった。
【００４６】
しかしながら、培地への２．０ｍＭのＮａＯＨの添加は、ミトコンドリアの形態の、球形から細管およびネットワーク様構造への変化をもたらした（図９Ａ）。ＨＣｌで人為的に酸性化した新鮮な培地は低いｐＨ値を示すが、、高い乳酸塩濃度を示さない。ｐＨ６．０では巨大ミトコンドリアはその形態を変えなかったが、ｐＨ７．０では巨大ミトコンドリアが管状のネットワークに逆形成された（図９Ｃ）。球形から管状構造への変化が起こるｐＨの閾値は明瞭に決定されなかったが、連続的に現れ、漸次的な形態学的変化を伴った。乳酸ナトリウムの新鮮な培地への添加は、使用した全ての濃度で巨大ミトコンドリアの逆形成をもたらした（図９Ｄ）。これは、高濃度の乳酸塩の存在が巨大ミトコンドリアの逆形成を回避させないことを証明するものである。さらにまた、乳酸で７．０のｐＨ値に酸性を帯びさせた培地は、ｐＨ６．８の培地とは対照的に、巨大ミトコンドリアの逆形成をもたらし、そこでは球状のミトコンドリアが管状ネットワークに変化した（図９Ｂ）。
【００４７】
全体として、この結果は、ミトコンドリアの逆形成のために、閾値レベルの十分に低いプロトン濃度を培地中にもたらさなければならないことを示している。培養培地中の乳酸塩アニオンの存在は、巨大ミトコンドリアの存続にとって必須ではない。
【００４８】
例６
巨大ミトコンドリアの形成および逆形成に対するミトコンドリア膜電位の影響
巨大ミトコンドリアの形成および逆形成に対するミトコンドリア膜電位の影響を調査するために、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞を１０μＭのＣＣＣＰ（Ｈ＋イオノフォア）、１０μＭのバリノマイシン（Ｋ＋選択的イオノフォア）、１μＭのナイジェリシン（選択的な電子的に中性なＫ＋／Ｈ＋交換）とインキュベートした（図４）。
ＣＣＣＰおよびナイジェリシン処理細胞における巨大ミトコンドリアの形成は阻害された。ネットワーク構造は、むしろ大いに断片化し、核の周囲に凝集した（図４Ａ  Ａ１、Ａ３）。対照的に、バリノマイシンとのインキュベーションは、対照細胞を上回る直径を有する巨大ミトコンドリアの形成をもたらした（図４Ａ  Ａ２）。さらにまた、他のグループ（Malka et al., 2005）の実験に記載されているとおり、ミトコンドリアは非融合内膜による隔壁を有している（septated）ようだった。これらの構造は、ＥＧＦＰ−Ｍｉｔｏと、ミトコンドリア内膜を特異的に染色する（データは示さない）ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＸＲｏｓとの共染色によって詳細に確認した（図４Ｂ）。
【００４９】
巨大ミトコンドリアの逆形成に対する種々の化学物質の影響を調査するために、細胞を、示した濃度のＣＣＣＰ、バリノマイシン、ナイジェリシンと３０分間インキュベートした（図４Ｃ）。同様に種々の薬剤を補充した新鮮な培地による酸性培地の交換の後、ＣＣＣＰおよびナイジェリシン処理細胞のミトコンドリアの形態は、対照細胞と同様であった（図４Ｃ  Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４）。しかしながら、バリノマイシンは、巨大ミトコンドリアのミトコンドリアネットワークへの逆形成を阻害したが、非融合ミトコンドリア内膜の隔壁を有するより一層大きな巨大ミトコンドリアをもたらした（図４Ｃ  Ｂ２）。
要約すると、この実験は、巨大ミトコンドリアの逆形成ではなく巨大ミトコンドリアの形成に対するＣＣＣＰおよびナイジェリシンの重大な影響を示している。逆の影響を、巨大ミトコンドリアの形成をもたらす条件だけでなく、巨大ミトコンドリアの逆形成をもたらす条件においても、より一層大きな巨大ミトコンドリアをもたらす、バリノマイシンとのインキュベーションによって観察することができた。
【００５０】
例７
巨大ミトコンドリアの形成および逆形成の最中の融合および分裂タンパク質の局在
培地の酸性化による巨大ミトコンドリアの形成は、ミトコンドリアの直径の増大および細胞あたりのミトコンドリアの総数の減少を伴う。したがって、融合と分裂の動的なバランスは、融合の方へ強くシフトしている。逆に、新鮮な培地による使用済の酸性培養培地の交換によって分裂イベントが誘導される。それゆえ、巨大ミトコンドリアの形成および逆形成過程におけるミトコンドリアの融合タンパク質ＭＦＮ２および分裂タンパク質Ｄｒｐ１の関与についての知見を得るために、これらのタンパク質のネイティブな（native）局在および分布を免疫細胞化学によって検討した。
【００５１】
ＭＦＮ２の分析により、巨大ミトコンドリアの形成ならびに逆形成の最中におけるミトコンドリアへの局在が判明した。そこでは、ＭＦＮ２はミトコンドリア外膜の別々の点状領域に位置していた。さらに、ミトコンドリアにおけるＭＦＮ２の量的な変化は観察できなかった（図１０）。
巨大ミトコンドリアの形成および逆形成の最中における内因性のＤｒｐ１の局在も調査した（図５）。巨大ミトコンドリアの形成の間中、Ｄｒｐ１の分布は、細胞質内の巣（foci）に加え、ミトコンドリア外膜の断続的な構造に不規則に位置していた（図５  Ａ１〜Ａ４、Ｂ１〜Ｂ４）。逆形成の間、大多数の点状Ｄｒｐ１領域は、細胞質からミトコンドリア上の推定分裂部位に移動する（図５  Ｃ１〜Ｃ４、Ｄ１〜Ｄ４）。
これらの結果は、ＭＦＮ２およびＤｒｐ１の両方が、融合イベントならびに分裂イベントを支援する条件でミトコンドリアに局在していることを示す。これは、巨大ミトコンドリア形成中に分裂過程の達成が恐らく阻害されていることを示す。
【００５２】
例８
巨大ミトコンドリアの形成および逆形成に対する細胞骨格成分の影響
生細胞内のミトコンドリアの形状は、複数の単一ミトコンドリアユニットから広範囲にわたるネットワークまで大きく変動する。さらに、１つの細胞内のミトコンドリアの分布はしばしば不均一であり、エネルギー消費の高い領域に集積している。それゆえ、ミトコンドリアはある種の移動性を示し、輸送機構は細胞骨格タンパク質成分と関係している。
巨大ミトコンドリアの形成に対するチューブリンまたはアクチン細胞骨格の影響をそれぞれ観察するために、１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞を１０μＭのノコダゾールまたは４ｍＭのサイトカラシンＢと９〜１５時間インキュベートした。蛍光顕微鏡法によるin vivoでの薬剤処理細胞と対照との比較は、巨大ミトコンドリアの形成に対するチューブリン細胞骨格の影響を示さなかった（図１１）。チューブリン重合の完全な抑制は、アルファチューブリンに対する抗体による免疫細胞化学染色によって証明された。薬剤処理の有効性をファロイジン染色で確認したところ、アクチン重合の阻害物質であるサイトカラシンＢとの細胞のインキュベーションは、巨大ミトコンドリアの形成を防止した（図６Ａ）。
【００５３】
巨大ミトコンドリアの逆形成に対するチューブリンおよびアクチン細胞骨格阻害の影響は、巨大ミトコンドリアを有する１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７ｇｍ細胞で、細胞を６μＭのノコダゾールまたは２．４ｍＭのサイトカラシンＢとインキュベートした３時間後に行った。使用済の酸性培地を換え、これを同様に薬剤を補充した新鮮な培地と交換した後、１時間および３時間後にミトコンドリアの構造変化を観察した。
チューブリン細胞骨格の阻害は、巨大ミトコンドリアの逆形成に、わずかな影響しか及ぼさなかった（図６Ｄ）。ノコダゾール処理細胞は、対照と類似したネットワーク様のミトコンドリア構造を示した。しかしながら、多数の単一ミトコンドリアの他に、リング状のミトコンドリア構造が、共焦点顕微鏡法で観察できた（図６Ｄ、白矢頭）。これらの構造は、ミトコンドリア外膜を染色するｐＥＧＦＰ−ＯＭＰ２５−Ｆｒによる１４３Ｂ．ＴＫ−Ｋ７の一過性トランスフェクションによってさらに調査した。示した白線に沿ったｘｚ断面の比較は、一方向に湾曲したカップ様のミトコンドリアを示した（図６Ｅ白矢頭）。焦点の位置によっては、このミトコンドリアのカップは、共焦点顕微鏡法の切片においてリングとして現れた。
【００５４】
アクチン重合阻害物質であるサイトカラシンＢは、巨大ミトコンドリア逆形成に重大な影響を及ぼした。実際、巨大ミトコンドリアの変形が起こったが、細管化の進行およびミトコンドリアネットワークの再構成は観察できなかった（図６Ｂ）。さらに、提示した画像は、巨大ミトコンドリアがアクチンのリングに組込まれていることを示しており（図６Ｂ  Ｂ２、白矢印）、これはファロイジンによるアクチンと、一過性トランスフェクション後のＥＧＦＰ−ＯＭＰ２５−Ｆｒによる巨大ミトコンドリアとの共染色によって確認された（図６Ｃ）。
要約すると、これらの結果は、巨大ミトコンドリアの形成に対するチューブリン細胞骨格の影響を証明しないが、逆形成の間の細管化における関与を証明している。サイトカラシンＢ処理の間、拡大したミトコンドリアは生じず、また、使用済培地の交換後、ミトコンドリアネットワークの再構築が妨げられた。
【００５５】
【表１】
2011527186.tif 000003
【００５６】
【表２】
2011527186.tif 000004
【００５７】
【表３】
2011527186.tif 000005
【００５８】
【表４】
2011527186.tif 000006
【００５９】
【表５】
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【図１】
2011527186.tif 000008
【図２】
2011527186.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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