(57)【要約】  幹細胞潜在力を保持する分化したヒト細胞を培養するためのプロセスを提供する。該プロセスは、ゼラチン・マイクロキャリアおよび第四級アンモニウム誘導体化ポリスチレン・マイクロキャリアからなる群より選択されるマイクロキャリアに固定された、幹細胞潜在力を保持する分化したヒト細胞を培養する工程を含む。【選択図】図１
2011529701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞潜在力を保持する分化したヒト細胞を培養するためのプロセスであって、ゼラチン・マイクロキャリアおよび第四級アンモニウム誘導体化ポリスチレン・マイクロキャリアからなる群より選択されるマイクロキャリアに固定された、幹細胞潜在力を保持する分化したヒト細胞を培養する工程を含む、前記プロセス。
【請求項２】
細胞が成人細胞であり、そして好ましくは間葉系細胞である、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
細胞が皮膚細胞、好ましくは皮膚鞘細胞、皮膚線維芽細胞または皮膚乳頭細胞である、請求項２記載のプロセス。
【請求項４】
培養プロセスが、細胞を培養し、前記細胞を採取し、そしてさらなる培養のために、細胞をマイクロキャリアに再付着させる工程を含む、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項５】
培養プロセス全体で、ゼラチン・マイクロキャリアを使用する、請求項４記載のプロセス。
【請求項６】
第四級アンモニウム誘導体化ポリスチレン・マイクロキャリアを、最初のまたは最後のマイクロキャリアとして使用する、請求項４記載のプロセス。
【請求項７】
流加培養または連続細胞培養条件を用いて行う、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項８】
共通のシャフト周囲に取り付けられた２以上のインペラーで培養容器を攪拌し、少なくとも１つのインペラーは培養容器中の培地の下３分の１に位置し、そして少なくとも１つのインペラーは容器中の培地の中央の３分の１または容器中の培地の上３分の１に位置する、先行する請求項いずれか記載のプロセス。
【請求項９】
各インペラーが、インペラーシャフト（単数または複数）の軸に比較して、角度が付いた、２、３、または４のブレードを含む、請求項８記載のプロセス。
【請求項１０】
インペラーが、少なくとも０．２５：１、例えば０．３：１〜０．７：１の範囲の直径：容器直径比を有する、請求項８または９記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞潜在力を保持する分化したヒト細胞を培養するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞および幹細胞潜在力を有する細胞は、多くの療法分野でますます関心が持たれてきている。こうした細胞は、典型的には、固体支持体媒体に固定された細胞の培養によって産生される。マウス胚性幹細胞は、Ｓｉｇｍａ  ＳｏｌｏＨｉｌｌ（フィブロネクチンをコーティングしたポリスチレン）およびＣｙｔｏｄｅｘ  ３（コラーゲン）マイクロキャリア上の攪拌懸濁培養中で増殖することが示されてきている（Ｆｏｋ  ＥＹら，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５，  ２３（９）：１３３３−４２）。ブタ骨髄由来初代間葉系幹細胞は、Ｃｙｔｏｄｅｘ  １型、２型および３型（コラーゲン）マイクロキャリア上で増殖することが示されてきている（Ｆｒａｕｓｃｈｕｈ  Ｓら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  ２００７，  ２３（１）：１８７−１９３）。胚性ネコ肺線維芽細胞は、ウェーブおよび攪拌タンクバイオリアクター中、Ｃｙｔｏｄｅｘ  １上で増殖することが示されてきている（Ｈｕｎｄｔ  Ｂら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００７，  ２５（１０）：３９８７−９５）。マウス胚性幹細胞はまた、スピナーフラスコ中、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリア上で増殖することも示されてきている（Ａｂｒａｎｃｈｅｓ  Ｅら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００７，  ９６（６）：１２１１−２１）。本発明を生じる研究中に、こうしたマイクロキャリアにはいくつかの欠陥があり、このため、幹細胞潜在力を保持する分化したヒト細胞の、信頼性がありそして拡大可能な産生に不適切なものになっていることが発見された。
【０００３】
ＵＳ２００７／０２６４７１３は、多くの異なるマイクロキャリアを使用して、多くの異なるタイプの幹細胞を増殖させうることを開示する。ヒト胚性幹細胞の培養において、コラーゲン・マイクロキャリアとともに、ゼラチン・マイクロキャリアが例示される。結果によって、コラーゲン・マイクロキャリアは、ゼラチン・マイクロキャリアよりも3倍多い細胞増加を生じることが示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＵＳ２００７／０２６４７１３
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｏｋ  ＥＹら，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５，  ２３（９）：１３３３−４２
【非特許文献２】Ｆｒａｕｓｃｈｕｈ  Ｓら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  ２００７，  ２３（１）：１８７−１９３
【非特許文献３】Ｈｕｎｄｔ  Ｂら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００７，  ２５（１０）：３９８７−９５
【非特許文献４】Ａｂｒａｎｃｈｅｓ  Ｅら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００７，  ９６（６）：１２１１−２１
【発明の概要】
【０００６】
本発明の１つの側面にしたがって、幹細胞潜在力を保持する分化したヒト細胞を培養するためのプロセスであって、ゼラチン・マイクロキャリアおよび第四級アンモニウム誘導体化ポリスチレン・マイクロキャリアからなる群より選択されるマイクロキャリアに固定（anchored）された、幹細胞潜在力を保持する分化したヒト細胞を培養する工程を含む、前記プロセスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は２Ｌガラス細胞培養バイオリアクター中の細胞株ＡＶＤＰ１の増殖を示す図である。
【図２】図２は細胞培養バイオリアクター中の細胞株ＡＶＤＦ２の増殖を示す図である。
【図３】図３は細胞培養バイオリアクター中の細胞株ＡＶＤＳ６の増殖を示す図である。
【図４】図４は細胞培養バイオリアクター中の細胞株ＡＶＤＳ６の増殖を示す図である。
【図５】図５は細胞培養バイオリアクター中の細胞株ＡＶＤＳ６の増殖を示す図である。
【図６】図６は細胞培養バイオリアクター中の細胞株ＡＶＤＦ３の増殖を示す図である。
【図７】図７は細胞培養バイオリアクター中の細胞株ＡＶＤＳ２の増殖を示す図である。
【図８】図８はＩｎｔｅｇｒａ皮膚再生テンプレート上に植え付けた細胞のＣＬＳＭ分析を示す図である。
【図９】図９はＡＶＤＳ４バイオリアクター後および静的培養（対照）に関するアネキシンＶアッセイ結果のドットブロット提示を示す図である。
【図１０】図１０はバイオリアクター後および対照培養のＡＶＳＤ４細胞におけるＴＧＦ-β１産生を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
細胞は、当該技術分野に知られる方法によって、マイクロキャリアに固定され、これには例えば、マイクロキャリア表面への付着によるか、マクロ多孔性マイクロキャリアの内部構造への付着によるか、またはマクロ多孔性マイクロキャリアの内部構造内の物理的捕捉によるものが含まれる。
【０００９】
本発明の方法で使用可能なゼラチン・マイクロキャリアは、キャリア物質、例えばポリスチレンまたはガラス粒子上のコーティングとして用いられるゼラチン粒子、架橋ゼラチン粒子またはゼラチンで構成されてもよい。ゼラチンは、天然供給源のものであっても、あるいは組換え的または合成的に産生されてもよい。ゼラチンまたはコラーゲンは、リジンのアミン基を介して、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボキシル基を介して、あるいはその組み合わせで架橋されてもよい。ゼラチン・マイクロキャリアは、典型的にはほぼ球形であるが、他の形状を有してもよく、そして多孔性または固形のいずれであってもよい。多孔性および固形型のマイクロキャリアはどちらも、商業的に入手可能である。マイクロキャリアは、細胞の固定を容易にするくぼみを伴う密な表面を有してもよい。マクロ多孔性ゼラチン・マイクロキャリアは、例えば、Ｐｅｒｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ  ＡＢ、スウェーデンより、商標名Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ、特にＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ  ＧおよびＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ  Ｓのもとに、商業的に入手可能である。ゼラチン・マクロ多孔性マイクロキャリアは、典型的には、非常に架橋されたゼラチン・マトリックスに基づく粒子を含み、粒子サイズはしばしば、１０〜５００μｍであり、そして典型的には１〜５０μｍの直径を有する多数の空洞を封入するポリマー・マトリックスを形成する。マイクロキャリアの粒子サイズ範囲は、幹細胞の固定に対応するのに十分に大きい一方、懸濁物を形成するのに十分に小さく、振盪フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、ウェーブ・バイオリアクターおよび攪拌タンクバイオリアクター系などの細胞培養バイオリアクター中で使用するのに適切な特性を伴う。
【００１０】
本発明で使用可能な第四級アンモニウム誘導体化ポリスチレン・マイクロキャリアは、ポリスチレンに付着したアミノ基を含み、アミノ基は好ましくは３つのアルキル基、特に３つのＣ１−４アルキル基によって四級化されている。こうしたマイクロキャリアの例には、Ｈｙｃｌｏｎｅ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃより商業的に入手可能なＨｙＱＳｐｈｅｒｅＴＭ  ＨＬＸ１１−１７０が含まれる。
【００１１】
ゼラチン・マイクロキャリアは、細胞を異なるバッチのマイクロキャリア上で培養する適用に特に適しており、この場合、細胞は、第一のバッチのマイクロキャリア上で培養され、そして次いで、培養スケールを拡大するため、細胞を採取し、そして次いで、場合によってある期間、保存した後、例えば冷凍庫で保存した後、マイクロキャリアに、典型的にはより大きいバッチのマイクロキャリアに、または合わせるとより多量のマイクロキャリアとなる多数の培養装置に再付着させる。こうした培養−採取および再付着を必要に応じてしばしば反復して、所望の量の細胞を生じてもよい。ゼラチン・マイクロキャリアを、最初のマイクロキャリアとして、または続くマイクロキャリアとして使用してもよいし、あるいは別のマイクロキャリア、特に第四級アンモニウム誘導体化ポリスチレン・マイクロキャリアを、最初のマイクロキャリアとして使用して、採取後の続く再付着をゼラチン・マイクロキャリアに対して行ってもよい。
【００１２】
第四級アンモニウム誘導体化ポリスチレン・マイクロキャリアは、細胞をマイクロキャリア上に植え付け、そして脱離および再付着なしに採取までそのマイクロキャリア上で培養する適用に、または続く採取およびゼラチン・マイクロキャリアへの再付着を伴う最初のマイクロキャリアとして適している。さらに、第四級アンモニウム誘導体化ポリスチレン・マイクロキャリアを最後のマイクロキャリアとして使用して、他のマイクロキャリアをより早い培養工程に使用してもよい。
【００１３】
本発明の方法によって産生可能な、幹細胞潜在力を保持する分化したヒト細胞は当該技術分野に知られ、そして好ましくは成人細胞であり、特に間葉系細胞であり、そして最も好ましくは脂肪細胞（ａｄｉｐｏｓｙｔｅ）を含む皮膚細胞である。特に好ましい細胞には、皮膚鞘細胞、皮膚線維芽細胞および皮膚乳頭細胞、特にＥＰ−Ａ−０９８０２７０に記載されるような皮膚鞘細胞、ＵＳ５８５１８３１に記載されるような皮膚乳頭細胞、そしてとりわけ、同時係属英国特許出願第０９１３４６９．３号に記載されるような皮膚線維芽細胞が含まれる。
【００１４】
本発明記載のプロセスを、当該技術分野に知られる容器中で行ってもよく、こうした容器には、組織培養フラスコ、振盪フラスコ、スピナーフラスコ、攪拌タンクバイオリアクター、使い捨てバッグに基づくバイオリアクター系、例えばウェーブ細胞培養系および拡大ベッドバイオリアクター系が含まれる。大規模産生のためのオプションにはまた、ローラーボトル、中空繊維系、単一、多数プレートまたは積み重ねプレート培養系および細胞キューブも含まれる。
【００１５】
本発明のプロセスは、一般的に、攪拌タンク培養容器系において、細胞を培養することによって行われる。典型的には、細胞、マイクロキャリアおよび栄養培地を培養容器に供給し、そして細胞拡大を実行可能な条件下で保存する。望ましい場合、培養が最終的に終結し、そして細胞を採取するまで、さらなる培地を培養容器系に添加してもよい。細胞の増殖を実行可能である一方、細胞の幹細胞潜在力を保持する条件下で、細胞を培養することによって、本発明のプロセスを行う。温度、ｐＨ、溶解酸素（低酸素条件を含む）等の培養条件は、特定の細胞に関して最適であることが知られるものであり、そして当業者には明らかであろう（例えば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  第２版，  Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，  Ｄ．およびＨａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９９２）を参照されたい）。典型的には、細胞は、中性ｐＨ前後のｐＨ、通常、６．５〜７．５の範囲、および約３０〜３８℃の範囲の温度で培養される。
【００１６】
本発明の特定の側面において、細胞は、培養容器の異なる深さに位置する２以上のインペラー、通常は回転スターラーを含む攪拌装置で攪拌される容器中で培養される。好ましくは、インペラーは、共通のシャフト周囲に取り付けられる。２つのインペラーを使用する場合、１つのインペラーは、好ましくは、培養容器中の培地の底部に向かって、例えば容器の下３分の１に取り付けられ、第二のインペラーは、容器中の培地中央に向かって、例えば中央の３分の１に、または容器中の培地の上部に向かって、例えば上３分の１のいずれかに取り付けられる。多くの態様において、各インペラーは、インペラーシャフト（単数または複数）の軸に比較して、角度が付いた、２、３、または４のブレード、例えばプロペラ型ブレードを含む。好ましくは、回転スターラーをインペラーとして使用する場合、スターラーは、少なくとも０．２５：１、例えば０．３：１〜０．７：１の範囲のスターラー直径：容器直径比を有するように選択される。
【００１７】
本発明の他の側面において、少なくとも１つのらせんブレード、そして好ましくは国際特許出願ＷＯ００／６６２５８に記載されるような、らせんスターラーを含む攪拌装置で攪拌される容器中で、細胞を培養する。
【００１８】
本発明の１つの態様において、プロセスは、１つの培養容器中で行われ、細胞は、マイクロキャリアを含有する培養容器内に直接接種され、望ましい細胞密度に到達するまで、細胞を増殖させ、そして細胞を採取する。
【００１９】
本発明の別の態様において、プロセスは、少なくとも２つの別個の細胞培養容器中で行われる。１以上のシード拡大容器中で培養を行ってもよく、その後、細胞産生容器中で培養し、そしてそこから細胞産物を採取する。最終産生細胞培養容器の接種に十分な数の細胞が得られるまで、培養容器サイズを大きくしながら、多数のシード拡大プロセスを行ってもよい。シード拡大培養容器は、同じタイプのもの（例えば組織培養フラスコ、振盪フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、ウェーブ・バイオリアクター、攪拌タンクバイオリアクター）であってもよいが、シード拡大が進行するにつれてサイズを大きくしてもよいし、または産生バイオリアクターへの移動に備えて、シード培養が拡大するにつれてサイズが増加する培養系の混合であってもよい（例えば組織培養フラスコから振盪フラスコ、そこからスピナーフラスコ、そこから攪拌タンクバイオリアクター系など）。
【００２０】
本発明の好ましい側面にしたがって、流加培養または連続細胞培養条件を考案して、培養中の細胞の増殖を増進させる。温度、ｐＨ、溶解酸素（ｄＯ２）等の培養条件は、特定の細胞で用いられるものであり、そして当業者には明らかであろう。一般的に、ｐＨは、酸（例えばＣＯ２）または塩基（例えばＮａ２ＣＯ３またはＮａＯＨ）のいずれかを用いて、約６．５〜７．５の間のレベルに調整される。細胞を培養するのに適した温度範囲は、しばしば、約３０℃〜３８℃の間であり、そして適切なｄＯ２は、しばしば、空気飽和の５〜９０％の間である。
【００２１】
細胞回収プロセス中の細胞採取物に対する潜在的な損傷を制限する、当該技術分野に知られる方法を用いて、ゼラチン・マイクロキャリアから細胞を遊離させてもよい。細胞は、一般的に、タンパク質分解酵素、例えばコラゲナーゼの補助で、ゼラチン・マイクロキャリアから遊離される。細胞増殖の終結に続いて、望ましい場合、キャリアからこうしたタンパク質分解酵素を用いて細胞を遊離させる。
【００２２】
マイクロキャリアが細胞培養容器の底に定着するのを可能にすることによって培地交換を実行し、その後、細胞培養増殖培地体積の選択した割合を取り除き、そして対応する割合の新鮮な細胞培養増殖培地を細胞培養容器に添加する。次いで、マイクロキャリアを培地中で再懸濁し、そして典型的には、培地除去および置換のこのプロセスを反復する。
【００２３】
培養中の細胞を記載するのに、多様な用語を用いる。「細胞培養」は、一般的に、生物から採取され、そして制御された条件下で増殖した細胞を指す。初代細胞培養は、最初の継代培養前の、生物から直接採取された細胞、組織または臓器の培養である。細胞は、増殖および／または分裂を促進する条件下で培地中に置かれると、培養中で拡大し、より多い細胞集団を生じる。細胞株は、初代細胞培養の１以上の継代培養によって形成される細胞集団である。各継代培養周期は、継代と称される。当業者には、継代期間中に多くの集団倍加がありうることが理解されるであろう。
【００２４】
本発明のプロセスで使用するのに適した培地が当該技術分野に知られ、これには、血清を補充した基本培地、血清不含培地、タンパク質不含培地または化学的に定義される増殖培地が含まれる。「馴化」培地を用いてもよい。馴化培地は、特別な細胞または細胞集団を培養し、そして次いで除去したものである。これらの細胞は、培地中で培養される間、他の細胞に対する補助を提供しうる細胞性因子を分泌する。細胞性因子を含有する培地が、「馴化」培地である。培地を馴化するのに用いる細胞は、続いて培養されるものと同じタイプのものであってもよいし、異なる細胞タイプまたは両方の組み合わせであってもよい。
【００２５】
本発明は、以下の実施例によって、限定されることなく例示される。
【実施例】
【００２６】
細胞株の樹立
以下に記載する修飾を伴って、本質的にＥＰ９８０２７０に記載されるように、毛包間葉系細胞を単離した。１μｇ／ｍｌアンホテリシンおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）で、ヒト皮膚組織試料を３回洗浄した。解剖顕微鏡下で、微細な外科用はさみを用いて成長期「末端球（ｅｎｄ  ｂｕｌｂｓ）」を切除し、そして少量（典型的には１００〜２００μｌ）のＭＥＭ内に入れた。針を用いて末端球を反転させ、そして乳頭を切開し、そして鞘を摘出した。次いで、乳頭および鞘を、別個に、４ウェル細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ）に移した。２０％ウシ胎児血清、０．５μｇ／ｍｌアンホテリシンおよび５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充した１ｍｌのＭＥＭ中、ウェルあたり、１０の乳頭および１０の鞘を移した。４ウェル細胞培養プレートを無菌および標準条件（３７℃、５％二酸化炭素）下で培養した。１０日間の細胞増殖後、細胞を各ウェルから脱離させ（当該技術分野でよく確立された標準法を用いる）、そして別個に３５ｍｍ直径細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ）に移した。細胞増殖が集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になったら、皮膚鞘（本明細書において、以後「ＡＶＤＳ」と称する）および皮膚乳頭（本明細書において、以後、「ＡＶＤＰ」と称する）を先に示すとおりに脱離させ、そして上述の条件下でさらに拡大するため、Ｔ２５細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移す。
【００２７】
多くの異なるヒト組織試料から、ＡＶＤＳおよびＡＶＤＰ細胞株を樹立した。以下の実施例に記載するこれらの細胞の要約を、以下の表１に提供する。
【００２８】
皮膚線維芽細胞株の樹立
上述のヒト皮膚組織試料と同じ試料から、皮膚線維芽細胞（本明細書において、以後、「ＡＶＤＦ」と称する）細胞株を樹立した。真皮を脂肪層から分離し、そして次いで、顕微鏡下でおよそ２〜３ｍｍ２表面積の片に切り裂いた。切り裂いた組織を、皮膚鞘および皮膚乳頭細胞株に関して記載するように補充したＭＥＭを含有するＴ２５細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移した。皮膚線維芽細胞（ＡＶＤＦ）細胞株を含有するＴ２５細胞培養フラスコを、無菌および標準条件（先に記載するとおり）下でインキュベーションした。次いで、培養が集密に到達した際、同じ条件を用いて、皮膚線維芽細胞（ＡＶＤＦ）細胞株をさらに拡大した。
【００２９】
多くの異なるヒト組織試料から、ＡＶＤＦ細胞株を樹立した。以下の実施例に記載するこれらの細胞株の要約を、以下の表１に提供する。
【００３０】
表１：細胞株の要約
【００３１】
【表１】
2011529701.tif 000003
【００３２】
比較実施例１
製造者によって記載される標準的調製および滅菌条件を用いて、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ＩおよびＣｙｔｏｄｅｘ  ＩＩＩマイクロキャリア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を調製した。次いで、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ＩおよびＩＩＩマイクロキャリアを５ｃｍ２／ｍｌの濃度で用い、そして１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した総体積１５ｍｌのＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｍ４６５５）中、１２５ｍｌ細胞培養振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）あたり、２．２ｘ１０５細胞の細胞濃度で、ＡＶＤＳ２細胞株を植え付けた。細胞培養フラスコを軌道振盪装置に入れ（日＝「０」）、そして７０ｒｐｍの攪拌を伴って３７℃でインキュベーションした。１０％ＦＢＳを補充したＭＥＭ増殖培地を、第３日に各フラスコに入れ直した。当該技術分野でよく確立された標準的細胞脱離法を用いて、５日後に細胞を採取し、そして当該技術分野においてよく確立されているように、トリパンブルー染色および細胞計数を用いて、ＡＶＤＳ生存細胞数を決定した。驚くべきことに、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ＩまたはＣｙｔｏｄｅｘ  ＩＩＩマイクロキャリアのいずれでも、培養から生存ＡＶＤＳ細胞は回収されなかった。
【００３３】
Ｃｙｔｏｄｅｘ  ＩおよびＣｙｔｏｄｅｘ  ＩＩＩマイクロキャリアは、広範囲の哺乳動物細胞タイプの培養のため、産業界で広く用いられ、成功している。Ｃｙｔｏｄｅｘ  ＩおよびＣｙｔｏｄｅｘ  ＩＩＩはどちらも、デキストランで構成される。Ｃｙｔｏｄｅｘ  Ｉは、陽イオン性ＤＥＡＥ基を含むデキストラン・マトリックスで構成され、一方、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ＩＩＩは、変性ブタ・コラーゲンでコーティングしたデキストラン・マトリックスで構成される。Ｃｙｔｏｄｅｘ  ＩおよびＣｙｔｏｄｅｘ  ＩＩＩ間の表面化学が異なること、そしてこれらのマイクロキャリアが胚性幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞および肺線維芽細胞を増殖させるために使用されていることを含めて、これらが産業界において広く使用されていることを考慮して、当業者は、これらのマイクロキャリアがまた、皮膚鞘細胞（ＡＶＤＳ）の増殖も補助すると予期していたであろう。
【００３４】
比較実施例２
２Ｄ  ＭｉｃｒｏＨｅｘマイクロキャリア（Ｎｕｎｃ）を用いて、細胞株ＡＶＤＳ１、ＡＶＤＳ２およびＡＶＤＰ１を培養した。製造者に推奨される標準法を用いてマイクロキャリアを調製し、そして滅菌した。２Ｄ  ＭｉｃｒｏＨｅｘマイクロキャリア（Ｎｕｎｃ）は、静置細胞培養で用いたものと同じ材料／表面化学で構成される（実施例１および２）。１．０ｃｍ２／ｍｌ、２．０ｃｍ２／ｍｌおよび４．４ｃｍ２／ｍｌのマイクロキャリア濃度を用い、そして１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した総体積４０ｍｌのＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｍ４６５５）中、２５０ｍｌ細胞培養振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）あたり、４ｘ１０５のＡＶＤＳ１、ＡＶＤＳ２、ＡＶＤＳ３およびＡＶＤＰ１細胞を植え付けた。７０ｒｐｍの攪拌を伴う３７℃の軌道振盪装置中に細胞培養フラスコを入れた。３〜１０日後に細胞培養フラスコを採取し、そして当該技術分野でよく確立された方法を用いて、生存細胞濃度を決定した。得た結果を表２に提示する。
【００３５】
間葉系皮膚幹細胞株ＡＶＤＳ１、ＡＶＤＳ２およびＡＶＤＰ１によって達成される増殖が劣っていることは、予期されないものであり、そして静置培養においては、これらの細胞株がフラスコ表面に付着し、そして容易に増殖したことを考慮すると、まったく驚くべきものであった。２Ｄ  ＭｉｃｒｏＨｅｘマイクロキャリアは、静置細胞培養フラスコで用いたものと同じ材料／表面化学で構成される。
【００３６】
表２：  ＭｉｃｒｏＨｅｘマイクロキャリア上の細胞株ＡＶＤＳ１、ＡＶＤＳ２、ＡＶＤＳ３およびＡＶＤＰ１の増殖
【００３７】
【表２】
2011529701.tif 000004
【００３８】
実施例３
各製造者に推奨される標準法を用いて、以下のマイクロキャリアを調製し、そして滅菌した。調製したマイクロキャリアは：  ＦＡＣＴおよびプロネクチンＦ（Ｓｉｇｍａ、ＳｏｌｏＨｉｌｌ）ＣＧＥＮ  １０２−Ｌ、ＨＬＸ１１−１７０、Ｐｒｏ−Ｆ  １０２−Ｌ、ＦＡＣＴ  １０２−Ｌ、Ｐ１０２−ＬおよびＰプラス１０２−Ｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）であった。ＦＡＣＴおよびプロネクチンＦを、５ｇ／Ｌで用い、ＣＧＥＮ  １０２−Ｌ、ＨＬＸ１１−１７０、Ｐｒｏ−Ｆ  １０２−Ｌ、ＦＡＣＴ  １０２−Ｌ、Ｐ１０２−ＬおよびＰプラス１０２−Ｌを、２．５ｇ／Ｌで用いた。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した４０ｍｌ  ＭＥＭ細胞培養増殖培地ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｍ４６５５）中、２５０ｍｌフラスコあたり、４ｘ１０５  ＡＶＤＳ２細胞を用いて、振盪フラスコに植え付けた。３７℃および７０ｒｐｍで軌道振盪インキュベーターにフラスコを入れた。６〜７日後にフラスコを採取し、そして先に記載するように生存細胞濃度を決定した。結果を表３に示す。
【００３９】
表３：多様なマイクロキャリア上での細胞株ＡＶＤＳ１、ＡＶＤＳ２およびＡＶＤＳ３の増殖
【００４０】
【表３】
2011529701.tif 000005
【００４１】
ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリアのみが、ＡＶＤＳ２間葉系皮膚幹細胞の何らかの有意な成長および増殖（元来植え付けた細胞数（４ｘ１０５細胞）を上回る）を補助するという発見は驚くべきものであった。ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリアは、陽イオン性トリメチルアンモニウムがコーティングされたポリスチレンで構成される。驚くべきことに増殖を補助しなかった他のマイクロキャリアは、陽イオン電荷を伴うＩ型ブタ・コラーゲン、非コーティング・ポリスチレン・プラスチック、あるいは表面電荷を伴うか、または組換えフィブロネクチンもしくはフィブロネクチンでコーティングされたかいずれかのプラスチックで構成された。先行技術によって、胚性幹細胞株、骨髄由来間葉系幹細胞株および肺線維芽細胞株などの広い範囲の細胞が、コラーゲンで構成されるマイクロキャリア上で容易に増殖することが立証されているのを考慮すると、ＡＶＤＳ２細胞増殖が劣っているのは、特に驚くべきことであった。
【００４２】
実施例４
当該技術分野でよく記載される方法を用いて、静置培養条件で増殖中の皮膚鞘細胞ＡＶＤＳ４の８つの２２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）を脱離させ、そして計数した。２．３ｘ１０７  ＡＶＤＳ４細胞を用いて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（Ｓｉｇｍａ  Ｐ１３００）および５ｇ／Ｌ  ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリア（先に記載するように調製しそして滅菌したもの）を補充した総体積１．０ＬのＭＥＭ細胞培養増殖培地（Ｓｉｇｍａ  Ｍ４６５５）を含有するガラス細胞培養バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）に接種した。バイオリアクターを３６．５℃の温度、ｐＨ７．０（二酸化炭素ガス散布および／または水酸化ナトリウム添加によって手動で調節）、および８０ｒｐｍのインペラー速度で培養した。記載する条件下で２日間インキュベーションした後、１０％ＦＢＳおよび０．２％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を補充したさらに１．０ＬのＭＥＭ細胞培養増殖培地を、細胞培養バイオリアクターに無菌的に添加した。記載する条件下で、さらに５日間、インキュベーションを続けた。次いで、バイオリアクターを採取し、そして４．４ｘ１０８  ＡＶＤＳ４生存細胞をバイオリアクターから回収した。結果によって、ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリアを、緊密に制御されそして拡大可能な条件下で、よく定義された特性を持つ多数の幹細胞の再現可能な生成に使用可能であることが立証される。
【００４３】
実施例５
実施例４に記載するＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリア・バイオリアクター培養から回収したＡＶＤＳ４細胞を用い、当該技術分野でよく確立された方法を用いて、凍結細胞ストックを調製した。液体窒素中に４日間保存した後、２つのアンプルを融解し、そして１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した３０ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地（Ｓｉｇｍａ  Ｍ４６５５）中で希釈した。次いで、このＡＶＤＳ４細胞懸濁物を用いて、表４に示すように、６つの細胞培養フラスコに植え付けた。ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリアを含む振盪フラスコを、３７℃および７０ｒｐｍの軌道振盪インキュベーターに入れ、そして２２５ｃｍ２細胞培養フラスコを、マイクロキャリアを含まず、静置培養条件（３７℃、５％二酸化炭素）下で増殖させた。５〜６日後、フラスコを採取し、そして先に記載するように生存細胞濃度を決定した。
【００４４】
表４：  ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリアからの採取後の静置および振盪フラスコ培養におけるＡＶＤＳ４細胞の増殖
【００４５】
【表４】
2011529701.tif 000006
【００４６】
次いで、フラスコ２および３（表４）由来の２．８ｘ１０６  ＡＶＤＳ４細胞を用いて、１０％ＦＢＳと５ｇ／Ｌ  ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリアを補充した総体積１２５ｍｌのＭＥＭ細胞増殖培地中、１Ｌ振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に植え付けた。ヘッドスペースを空気ガス中の５％ＣＯ２で平衡化し、そしてフラスコを、３７℃、７０ｒｐｍの軌道振盪装置インキュベーターに移した。記載する条件下で２日間インキュベーションした後、１０％ＦＢＳを補充した１２５ｍＬのＭＥＭ細胞増殖培地をさらにフラスコに添加した。記載する条件下で、インキュベーションをさらに４日間続けた。フラスコを採取し、そして先に記載するように生存細胞濃度を決定した。生存細胞はまったく回収されなかった。
【００４７】
驚くべきことに、ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリア（フラスコ４、５および６）は、ＡＶＳＤ４細胞の増殖をまったく支持せず（該細胞は、先に、ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリア・バイオリアクター培養から採取されている−実施例５）、そして元来植え付けたよりも少ない数の細胞しかフラスコから回収されなかった。ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリア・バイオリアクター培養から採取されたＡＶＤＳ４細胞（実施例５）は、マイクロキャリアの非存在下、静置培養中で成長し、そして増殖した（フラスコ１、２、３）。
【００４８】
フラスコ２および３から採取したＡＶＤＳ４細胞は、ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリア上に付着せず、そして増殖しないという発見は、さらにより予期せぬものであった。
【００４９】
ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリアを用いて、細胞を拡大可能である（実施例５）が、ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリア培養から先に採取されている場合、ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリア上に付着せず、そして増殖しないことが、データによって示唆される。
【００５０】
実施例６
当該技術分野でよく確立された方法を用いて、静置培養で増殖させた皮膚鞘細胞ＡＶＤＳ５の１つの２２５ｃｍ２細胞フラスコ（Ｎｕｎｃ）および２つの７５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）を脱離させた。次いで、２．２ｘ１０６および１．１ｘ１０６  ＡＶＤＳ５細胞を用いて、それぞれ、１Ｌ細胞培養振盪フラスコ（Ｎｕｎｃ）および５００ｍｌ細胞培養振盪フラスコ（Ｎｕｎｃ）に植え付けた。細胞培養フラスコは、１Ｌおよび５００ｍｌ振盪フラスコ中、それぞれ、１０％ＦＢＳを補充した総体積２００ｍｌおよび１００ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地中に、１ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（上に記載するように調製）を含有した。ヘッドスペースを空気ガス中の５％ＣＯ２で平衡化し、そしてフラスコを、３７℃、４０ｒｐｍの軌道振盪装置インキュベーターに移した。記載する条件下で７日間インキュベーションした後、フラスコの内容物を採取し、そしてマイクロキャリアから細胞を脱離させた。９．１ｘ１０６  ＡＶＤＳ５細胞を用いて、１０％ＦＢＳ＋０．２％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８と２ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリアを補充した総体積５００ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地中、２Ｌのガラス細胞培養バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）に接種した。バイオリアクターを３６．５℃、ｐＨ７．０（実施例６に記載するように維持）、および５０ｒｐｍの攪拌装置速度で培養した。記載する条件下で３日間インキュベーションした後、上述のような細胞培養増殖培地５００ｍｌをバイオリアクターに添加し、そして攪拌装置速度を６０ｒｐｍに増加させた。全部で７日間インキュベーションした後、バイオリアクターからマイクロキャリアを取り除き、そして細胞をマイクロキャリアから脱離させた。生存度８３％で、１．３ｘ１０７細胞を採取した。
【００５１】
実施例７
静置培養中で増殖させた皮膚乳頭細胞ＡＶＤＰ１の３つの２２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）を脱離させた。２．０ｘ１０６  ＡＶＤＰ１細胞を用いて、１０％ＦＢＳを補充した総体積２５０ｍｌのＭＥＭ細胞増殖培地中、１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリアを含有する２つの１．５Ｌ細胞培養スピナーフラスコ各々に植え付けた。ヘッドスペースを空気ガス中の５％ＣＯ２で平衡化した。スピナーフラスコを細胞培養インキュベーター（３７℃）に移し、そして磁気スターラーベースを用いて３０ｒｐｍで攪拌した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、１２５ｍｌの消費された細胞培養増殖培地を各フラスコから取り除き、そして上述のように、新鮮な細胞培養増殖培地と交換した。記載する条件下で６日間インキュベーションした後、ＡＶＤＰ１細胞をマイクロキャリアから脱離させた。１．６ｘ１０７細胞を用いて、１０％ＦＢＳ、０．２％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８および１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓを補充した総体積２ＬのＭＥＭ細胞増殖培地中、２Ｌのガラス細胞培養バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）に接種した。バイオリアクターを３７℃、ｐＨ７．１０（実施例６に記載するように調節）、溶解酸素圧２０％（空気飽和）および攪拌装置速度５０ｒｐｍで培養した。ＣＯ２およびＮ２散布を用いて、溶解酸素レベルを維持した。記載する条件下で４日間および８日間インキュベーションした後、１Ｌの消費された培地をバイオリアクターから取り除き、そして１Ｌの新鮮な培地と交換した（上述のとおり）。４日間インキュベーションした後、攪拌装置速度を７０ｒｐｍに増加させ、そしてインキュベーション第１１日、攪拌装置速度を９０ｒｐｍに増加させた。バイオリアクターから試料を定期的に取り除き、そして細胞を脱離させ、そして先に記載するように生存細胞数を決定した。生存度および細胞数を図１に提示する。２．９ｘ１０９  ＡＶＤＰ１細胞の有意に高いピークの生存細胞密度が達成された。
【００５２】
実施例５、６および７の結果によって、ゼラチン・マイクロキャリアもまた、緊密に制御されそして拡大可能な条件下で、よく定義された特性を持つ、有意に多数の幹細胞の再現可能な生成に使用可能であることが立証される。
【００５３】
実施例８
先に記載するように、ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリアを調製した。次いで、マイクロキャリアを用いて、皮膚線維芽細胞株ＡＶＤＦ１を培養した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した２５ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地（Ｓｉｇｍａ  Ｍ４６５５）を含む２５０ｍｌの攪拌フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、５ｘ１０５  ＡＶＤＦ１細胞および１ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリアを植え付けた。フラスコを３７℃および７０ｒｐｍの軌道攪拌装置インキュベーターに入れた。記載する条件下で２４時間インキュベーションした後、さらに２５ｍｌの増殖培地（上述のとおり）をフラスコに添加し、そしてフラスコを攪拌装置インキュベーターに戻し、そして上記の条件下でインキュベーションを続けた。５日間インキュベーションした後、フラスコ内容物を採取し、そして生存細胞の総濃度を先に記載するように決定した。総数２．１ｘ１０６生存細胞を採取した。
【００５４】
実施例９
当該技術分野でよく記載される方法を用いて、静置培養中で増殖させた皮膚線維芽細胞ＡＶＤＦ２の２つの２２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）を脱離させ、そして計数した。２．０ｘ１０６  ＡＶＤＦ２細胞を用いて、２ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を含有し１０％ＦＢＳを補充した総体積９０ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地を含有する２つの１Ｌ細胞培養振盪フラスコ（Ｎｕｎｃ）の各々に植え付けた。細胞培養フラスコのヘッドスペースを空気ガス中の５％ＣＯ２で平衡化した。細胞培養フラスコを３７℃の温度および４０ｒｐｍの攪拌の軌道攪拌装置インキュベーターに移した。記載する条件下でフラスコを２４時間インキュベーションし、そして各フラスコにさらに９０ｍｌの細胞培養増殖培地（上述のとおり）を添加した。上記条件下の振盪装置インキュベーターにフラスコを戻し、そしてインキュベーションを７日間続けた。フラスコの内容物を採取し、そして細胞をマイクロキャリアから脱離させた（先に記載するとおり）。次いで、１．６５ｘ１０７  ＡＶＤＦ２細胞を用いて、２ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリアを含有し１０％ＦＢＳを補充した総体積７５０ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地中、３Ｌスピナー細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に接種した。ヘッドスペースを空気ガス中の５％ＣＯ２で平衡化した。スピナーフラスコを細胞培養インキュベーター（３７℃）に移し、そして磁気スターラーベースを用いて３０ｒｐｍで攪拌した。記載する条件下で２日間インキュベーションした後、上述の細胞培養増殖培地をさらに７５０ｍｌ、スピナーフラスコに添加した。上述の条件下でインキュベーションをさらに４日間続けた。細胞培養スピナーフラスコの内容物を採取し、そして細胞を回収した。生存度９１％で、４．０ｘ１０７  ＡＶＤＦ２細胞を回収した。
【００５５】
実施例１０
当該技術分野でよく記載される方法を用いて、静置培養で増殖させた皮膚線維芽細胞ＡＶＤＦ２の１つの７５ｃｍ２フラスコ（Ｎｕｎｃ）を脱離させ、そして計数した。２．２ｘ１０６  ＡＶＤＦ２細胞を用いて、１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を含有し１０％ＦＢＳを補充した総体積２４０ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地中、１Ｌスピナー細胞培養フラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）に植え付けた。フラスコのヘッドスペースを窒素ガス中の５％ＣＯ２および２％Ｏ２で平衡化した。スピナーフラスコを細胞培養インキュベーター（３７℃）に移し、そして磁気スターラーベースを用いて４０ｒｐｍで攪拌した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、１２０ｍｌの細胞培養上清をスピナーフラスコから取り除き、そして１２０ｍｌの新鮮な細胞培養増殖培地（上記）をスピナーフラスコに添加した。上記条件下でインキュベーションをさらに２４時間続けた。細胞培養スピナーフラスコからさらなる試料（９０ｍｌ）を採取し、そして細胞を回収した。生存度７６％で、５．７ｘ１０６  ＡＶＤＦ２細胞を回収した。次いで、回収した細胞（２．４ｘ１０６  ＡＶＤＦ２細胞）を用いて、１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を含有する、フラスコあたり総体積３００ｍｌの細胞培養増殖培地（上記）中、２つの１Ｌスピナー細胞培養フラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）の各々に植え付けた。フラスコのヘッドスペースを窒素ガス中の５％ＣＯ２および２％Ｏ２で平衡化した。スピナーフラスコを細胞培養インキュベーター（３７℃）に移し、そして磁気スターラーベースを用いて４０ｒｐｍで攪拌した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、そして７日目まで、そして７日目を含めて、毎日、体積３０ｍｌの細胞培養上清を各スピナーフラスコから取り除き、そして３０ｍｌの新鮮な細胞培養増殖培地（上記）と交換した。記載する条件下で全部で８日間インキュベーションした後、生存度８８％で、６．６ｘ１０７  ＡＶＤＦ２細胞を回収した。これらの細胞（１．６ｘ１０７  ＡＶＤＦ２細胞）を用いて、１０％ＦＢＳ、０．２％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８および１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を補充した総体積２ＬのＭＥＭ細胞培養増殖培地中、２Ｌのガラス細胞培養バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）に接種した。バイオリアクターを３７℃、ｐＨ７．０（実施例７に記載するように調整）、溶解酸素圧２．０％（空気飽和）および攪拌装置速度５０ｒｐｍで培養し、攪拌装置速度を培養経過中、９０ｒｐｍに次第に増加させた。ＣＯ２およびＮ２ガス散布を用いて、溶解酸素レベルを維持した。発泡している場合、エマルジョンＣ消泡剤（Ｓｉｇｍａ）をバイオリアクターに添加した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、バイオリアクター中の総培養体積の２０％を新鮮な細胞培養増殖培地と２４時間ごとに交換した。バイオリアクターから試料を定期的に取り除き、そして先に記載するように細胞を脱離させ、そして生存細胞数を決定した。生存度および細胞数を図２に提示する。培養中で１８日後、５．０ｘ１０８細胞の生存細胞数に到達した。
【００５６】
実施例１１
細胞株ＡＶＤＳ６のバイアルを融解し、そして１０％ＦＢＳを補充した５０ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地を添加した。生存度９０％で、４．２ｘ１０６細胞を回収した。２ｘ１０６  ＡＶＤＳ６細胞を用いて、総体積２５０ｍＬの増殖培地（上記）中、８．０ｘ１０３細胞／ｍＬおよび１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を含む２つのスピナー細胞培養フラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）の各々に植え付けた。実施例１０に記載するようにフラスコをインキュベーションした。記載する条件下で、４、５、６および７日間インキュベーションした後、体積３０ｍｌの細胞培養上清を各スピナーフラスコから取り除き、そして３０ｍｌの新鮮な細胞培養増殖培地（上記）と交換した。全部で８日間インキュベーションした後、フラスコの内容物を採取し、そして生存度８０％で、４．９ｘ１０７細胞を回収した。次いで、１．６ｘ１０７  ＡＶＤＳ６細胞を用いて、１０％ＦＢＳ、０．２％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８および１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を補充した総体積１．５ＬのＭＥＭ細胞増殖培地中、２Ｌのガラス細胞培養バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）に接種した。バイオリアクターを３７℃、ｐＨ７．０（実施例７に記載するように調整）、溶解酸素圧２．０％（空気飽和）および攪拌装置速度５０ｒｐｍで培養し、攪拌装置速度を培養経過中、９０ｒｐｍに次第に増加させた。実施例１０に記載するように溶解酸素レベルを維持した。発泡している場合、エマルジョンＣ消泡剤（Ｓｉｇｍａ）をバイオリアクターに添加した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、バイオリアクターにさらに５００ｍｌの増殖培地（上記）を添加した。培養５日目から、総培養体積の５％を２４時間ごとに交換した。バイオリアクターから試料を定期的に取り除き、そして細胞を脱離させ、そして生存細胞数を決定した（先に記載するとおり）。生存度および細胞数を図３に提示する。培養中で１７日後、２Ｌバイオリアクター中、９．０ｘ１０７細胞の生存細胞数が観察された。
【００５７】
実施例１２
当該技術分野でよく記載される方法を用いて、静置培養中で増殖させた細胞株ＡＶＤＳ６の５つの２２５ｃｍ２フラスコ（Ｎｕｎｃ）から細胞を脱離させ、そして計数した。２．０ｘ１０６  ＡＶＤＳ６細胞を用いて、１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を含有し１０％ＦＢＳを補充した総体積２００ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地中、２つの１Ｌスピナー細胞培養フラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）の各々に植え付けた。ヘッドスペースを窒素ガス中の５％ＣＯ２および２％Ｏ２で平衡化した。スピナーフラスコを細胞培養インキュベーター（３７℃）に移し、そして磁気スターラーベースを用いて４０ｒｐｍで攪拌した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、そして６日目まで、そして６日目を含めて、毎日、体積２０ｍｌの細胞培養上清を各スピナーフラスコから取り除き、そして２０ｍｌの新鮮な細胞培養増殖培地（上記）と交換した。記載する条件下で７日間インキュベーションした後、フラスコを採取し、そして生存度８７％で、３．６ｘ１０７細胞を回収した。次いで、２．８ｘ１０７  ＡＶＤＳ６細胞を用いて、１０％ＦＢＳ、０．２％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８および１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を補充した総体積３．５ＬのＭＥＭ細胞培養増殖培地中、５Ｌのガラス細胞培養バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）に接種した。バイオリアクターを３６．５℃、ｐＨ７．１（実施例７に記載するように調整）、溶解酸素圧５．０％（空気飽和）および攪拌装置速度７０ｒｐｍ（培養経過中、１１０ｒｐｍに次第に増加させた）で培養した。実施例１０に記載するように溶解酸素レベルを維持した。発泡している場合、エマルジョンＣ消泡剤（Ｓｉｇｍａ）をバイオリアクターに添加した。記載する条件下で４〜７日間インキュベーションした後、総培養体積の１０％を２４時間ごとに交換した。培養中で８〜１０日目、培地全体の１５％を、そして培養中で１１〜２２日目、総培養体積の２０％を２４時間ごとに交換した。バイオリアクターから試料を定期的に取り除き、そして細胞を脱離させ、そして生存細胞数を決定した（先に記載するとおり）。生存度および細胞数を図４に提示する。培養２３日後、５Ｌバイオリアクター中で４．１ｘ１０８細胞の最大生存細胞数が観察され、５Ｌバイオリアクタースケールへのプロセス拡大が成功したことが立証された。
【００５８】
実施例１３
当該技術分野でよく記載される方法を用いて、静置培養中で増殖させた細胞株ＡＶＤＳ６の３つの２２５ｃｍ２フラスコ（Ｎｕｎｃ）を脱離させ、そして計数した。生存度８４％で、４．３ｘ１０６細胞を回収した。次いで、３．０ｘ１０６  ＡＶＤＳ６細胞を用いて、１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を含有し４ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ）を補充した総体積３００ｍｌの低血清（２％）増殖培地中、１Ｌスピナー細胞培養フラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）に植え付けた。実施例１２に記載するように培養をインキュベーションした。記載する条件下で６日間インキュベーションした後、フラスコの内容物を採取し、そして生存度９３％で、総数３．８ｘ１０７細胞を回収した。２．０ｘ１０７  ＡＶＤＳ６細胞を用いて、４ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ）、０．２％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８および１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を補充した総体積２．０Ｌの血清不含増殖培地を用い、ガラス細胞培養バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）に接種した。バイオリアクターを３６．５℃、ｐＨ７．１（実施例７に記載するように調節）、溶解酸素圧５．０％（空気飽和）および攪拌装置速度７０ｒｐｍで培養し、攪拌装置速度を培養経過中、１３０ｒｐｍに次第に増加させた。実施例１０に記載するように溶解酸素レベルを維持した。発泡している場合、エマルジョンＣ消泡剤（Ｓｉｇｍａ）をバイオリアクターに添加した。記載する条件下で４〜７日間インキュベーションした後、総体積の１０％を新鮮な細胞培養増殖培地と２４時間ごとに交換した。培養中で８〜１０日目、総培養体積の１５％を、そして培養中で１１〜２０日目、総培養体積の２０％を新鮮な細胞培養増殖培地と２４時間ごとに交換した。バイオリアクターから試料を定期的に取り除き、そして先に記載するように細胞を脱離させ、そして生存細胞数を決定した。生存度および細胞数を図５に提示する。培養２０日後、１．２ｘ１０８細胞の最大生存細胞数が観察された。これは、本発明のプロセスの広い有用性を立証する。さらに、当該技術分野によく通じているものは、低血清培地を用いて細胞を増殖させる利点を認識するであろう。
【００５９】
実施例１４
細胞株ＡＶＤＦ３のバイアルを融解し、そして１０％ＦＢＳを補充した４５ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地を用いて再懸濁した。生存度９４％で、７．７ｘ１０６  ＡＶＤＦ３細胞を回収した。２．４ｘ１０６細胞を用いて、総体積３００ｍＬの増殖培地（上記）中、８．０ｘ１０３細胞／ｍＬおよび１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を含む２つの１Ｌスピナー細胞培養フラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）の各々に植え付けた。実施例１０に記載するようにフラスコをインキュベーションした。これらの条件下で８日間インキュベーションした後、フラスコを採取し、そして生存度９６％で、８．４ｘ１０７細胞を回収した。１．６ｘ１０７細胞を用いて、１０％ＦＢＳ、０．２％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８および１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を補充した総体積２ＬのＭＥＭ細胞培養増殖培地中、ガラス細胞培養バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）に接種した。バイオリアクターを３６．５℃、ｐＨ７．０（実施例７に記載するように調整）、溶解酸素圧５．０％（空気飽和）および攪拌装置速度７０ｒｐｍで培養し、攪拌装置速度を培養経過中、１２０ｒｐｍに次第に増加させた。実施例１０に記載するように溶解酸素レベルを維持した。発泡している場合、エマルジョンＣ消泡剤（Ｓｉｇｍａ）をバイオリアクターに添加した。記載する条件下で４〜７日間インキュベーションした後、総培養体積の１０％を新鮮な増殖培地と２４時間ごとに交換した。培養中で８〜１０日目、総培養体積の１５％を、そして培養中で１１〜２０日目、総培養体積の２０％を新鮮な増殖培地と２４時間ごとに交換した。バイオリアクターから試料を定期的に取り除き、そして先に記載するように細胞を脱離させ、そして生存細胞数を決定した。生存度および細胞数を図６に提示する。第１５日、３．３ｘ１０８細胞の最大生存細胞数が達成された。
【００６０】
実施例１５
当該技術分野でよく記載される方法を用いて、静置培養条件で増殖させた皮膚線維芽細胞ＡＶＤＦ３の１つの２２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）を脱離させ、そして計数した。２．３ｘ１０６細胞を用いて、２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ）を補充した総体積３３０ｍｌの血清不含増殖培地中、１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を含有する１．５Ｌ細胞培養スピナーフラスコに植え付けた。フラスコのヘッドスペースを５％ＣＯ２、２％Ｏ２ガスで平衡化した。スピナーフラスコを３７℃の細胞培養インキュベーターに移し、そして磁気スターラーベースを用いて３５ｒｐｍで攪拌した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、３５ｍｌの細胞培養上清をフラスコから取り除き、そして新鮮な血清不含増殖培地（上記のとおり）と交換した。第５日および第７日、５０ｍｌの培養上清を取り除き、そして上述のように新鮮な血清不含培地と交換した。第８日、８０ｍｌの培養上清を取り除き、そして新鮮な血清不含培地と交換した。１０日間培養した後、ＡＶＤＦ３細胞をマイクロキャリアから脱離させた。１．３５ｘ１０７細胞を用いて、２ｍＭグルタミン、０．２％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８および１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を補充した総体積２Ｌの血清不含増殖培地中、ガラス細胞培養バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）に接種した。バイオリアクターを３６．５℃、ｐＨ７．０（実施例７に記載するように調整）、溶解酸素圧５．０％（空気飽和）および攪拌装置速度４０ｒｐｍで培養し、攪拌装置速度を培養経過中、６０ｒｐｍに次第に増加させた。実施例１０に記載するように溶解酸素圧を維持した。発泡している場合、エマルジョンＣ消泡剤（Ｓｉｇｍａ）をバイオリアクターに添加した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、バイオリアクターから２００ｍｌの培養上清を取り除き、そして新鮮な血清不含増殖培地（上記のとおり）と交換した。第６日、第８日、第１０日、第１１日、第１３日、第１５日、第１７日および第２１日に、さらに２００ｍｌの培養上清を取り除き、そして新鮮な血清不含増殖培地（上記のとおり）と交換した。バイオリアクターから試料を定期的に取り除き、細胞をマイクロキャリアから脱離させ、そして先に記載するように生存細胞数を決定した。第１５日に、７．３ｘ１０７細胞のピーク細胞密度が達成された。これは、プロセスの有用性をさらに立証する。血清不含培地を用いる利点、特に産生の再現可能性、より一貫した成績、偶発的な剤での細胞の汚染の可能性の減少は、当業者には明らかであろう。血清不含培地は当該技術分野に知られ、そして商業的供給者から容易に入手可能である。
【００６１】
実施例１６
当該技術分野でよく記載される方法を用いて、静置培養条件で増殖させた細胞株ＡＶＤＳ２の２つの２２５ｃｍ２フラスコ（Ｎｕｎｃ）から細胞を脱離させ、そして計数した。生存度９０％で、３．１ｘ１０６細胞を回収した。２．９ｘ１０６  ＡＶＤＳ２細胞を用いて、１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を含有し１０％ＦＢＳを補充した総体積３００ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地中、２つの１Ｌスピナー細胞培養フラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）の各々に植え付けた。フラスコのヘッドスペースを窒素ガス中の５％ＣＯ２および２％Ｏ２で平衡化した。スピナーフラスコを細胞培養インキュベーター（３７℃）に移し、そして磁気スターラーベースを用いて４０ｒｐｍで攪拌した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、そして７日目まで、そして７日目を含めて、毎日、体積３０ｍｌの細胞培養上清を各スピナーフラスコから取り除き、そして３０ｍｌの新鮮な細胞培養増殖培地（上記）と交換した。記載する条件下で８日間インキュベーションした後、フラスコを採取し、そして生存度９６％で、４．７ｘ１０７細胞を回収した。２．０ｘ１０７  ＡＶＤＳ２細胞を用いて、１０％ＦＢＳ、０．２％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８および１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓ（先に記載するように調製）を補充した総体積２ＬのＭＥＭ細胞培養増殖培地中、ガラス細胞培養バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）に接種した。バイオリアクターを３６．５℃、ｐＨ７．１（実施例７に記載するように調整）、溶解酸素圧５．０％（空気飽和）および攪拌装置速度４０ｒｐｍで培養し、攪拌装置速度を培養経過中、７０ｒｐｍに次第に増加させた。実施例１０に記載するように溶解酸素レベルを維持した。発泡している場合、エマルジョンＣ消泡剤（Ｓｉｇｍａ）をバイオリアクターに添加した。記載する条件下で４〜７日間インキュベーションした後、総培養体積の１０％を２４時間ごとに交換し、そして培養中で８〜１０日目、培地全体の１５％を２４時間ごとに交換した。本実施例で用いるインペラー（攪拌）配置を、実施例７〜１５におけるものに改変した。本実施例で用いたインペラー配置は、０．４および０．３のインペラー直径対バイオリアクター直径の比を持つ２つのインペラーからなった。実施例７〜１５では、インペラーシャフト基部、すなわち細胞培養容器基部に位置するものに関して、０．３の比のインペラーを用いた。本実施例では、インペラーシャフト基部／細胞培養容器基部では、０．４の直径比を持つインペラーを用い、そして中央位置（シャフト基部のインペラーおよび最終細胞培養培地体積（採取時）に比較して）のインペラーシャフトには、０．３の直径比を持つインペラーが付着した。バイオリアクターから試料を定期的に取り除き、そして先に記載するように細胞を脱離させ、そして生存細胞数を決定した。生存度および細胞数を図７に提示する。培養中で１０日後、２．０ｘ１０８細胞の生存細胞数が観察された。
【００６２】
驚くべきことに、インペラー配置を改変すると、プロセスに有意な改善が導かれる。細胞培養中により低い回転速度を使用可能であり、これによって、優れた細胞増殖および生存度を維持するのに必要な最適な混合に影響を及ぼすことなく、細胞に対する剪断ストレスの潜在的に負の影響を減少させる。より驚くべきことに、高い生存細胞数に到達するのに掛かる細胞培養時間が有意に減少した。実施例１３では、ＤＳ細胞株のピーク細胞数には、第２３日に到達することがわかる。本実施例では、第１１日に類似のピーク細胞数に到達し、細胞培養時間が有意に減少した。当業者には、療法的適用のために、プロセスを拡大して細胞を商業的に製造する際に、細胞製造時間の減少がどのように製造時間およびコストを減少させるかが明らかであろう。
【００６３】
実施例１７
皮膚由来前駆体（ＳＫＰ）は、皮膚細胞から単離可能な自己再生多能性前駆体集団である。ＳＫＰ細胞は、胚性神経冠幹細胞に類似の遺伝子発現プロフィールを示すとして当該技術分野によく記載されてきており、そしてしたがって、これを用いてシュワン細胞および末梢神経系のニューロンを含む、神経冠派生物を生成することも可能である。増殖培地中、高濃度の線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）を用いて、皮膚細胞を培養することによって、ＳＫＰ細胞を単離してもよい。ＳＫＰは浮遊球体として増殖し、そしてしたがって、当該技術分野でよく確立された方法を用いて、容易に可視化され、そして定量化される。上記実施例で生成した細胞を、先の実施例に記載する条件下で増殖させた後、ＳＫＰ形成アッセイに用いた。バイオリアクター条件を用いた拡大／増殖後に細胞がＳＫＰを形成する能力を、多能性の１つの測定値として用い、そしてこうして、これらの細胞の療法的潜在力が、バイオリアクター拡大／細胞産物製造後に不都合に影響を受けていないことを確認する。
【００６４】
バイオリアクター培養から採取しておいた細胞（実施例６）由来の凍結保存した細胞株ＡＶＤＳ５のバイアルを融解し、そして１０％ＦＢＳを補充した４４ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地を添加した。細胞懸濁物を２２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移し、そして上記の静置培養条件下で６日間インキュベーションした。次いで、細胞を脱離させ、そして計数し、そして生存度８０％で、総数８．３ｘ１０５細胞を回収した。次いで、細胞を１８０ｘｇで５分間遠心分離し、そして７４％ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）、Ｇｌｕｔａｍａｘを含む２４％Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、４０ｎｇ／ｍＬヒトＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および２％Ｂ２７補充剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなるＳＫＰ増殖培地中に再懸濁した。次いで、２．５ｘ１０５細胞を２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移し、そして上記のようにインキュベーションした。３〜４日ごとに、１ｍｌの細胞不含上清をフラスコから取り除き、そして５倍高い濃度のＥＧＦ、ＦＧＦ−２およびＢ２７補充剤を含有する１ｍｌのＳＫＰ増殖培地と交換した。
【００６５】
２２日間インキュベーションした後、ＳＫＰはフラスコ中で可視であり、実施例６に記載するＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリアを用いたバイオリアクター拡大が、細胞がＳＫＰを形成する能力に不都合に影響を及ぼしていなかったことが示され、そしてその多能性幹細胞特性が確認された。当業者は、拡大に対する細胞特性の保持、特に、限定されるわけではないが幹細胞多能性の保持の重要性を認識するであろう。
【００６６】
バイオリアクター中で増殖していないストック細胞（細胞培養フラスコ中の静置培養のみを用いて継代されたもの）由来の凍結保存した細胞株ＡＶＤＳ４のバイアルを融解し、そして１０％ＦＢＳを補充した１５ｍｌ  ＭＥＭ細胞培養増殖培地を添加した。細胞懸濁物を２つの２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移し、そして上記の条件下で１日間インキュベーションした。次いで、細胞をフラスコから脱離させ、そしてこれを用いて、総体積４５ｍｌの細胞培養増殖培地中、２２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に植え付けた。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、細胞を脱離させ、そして生存度８８％で、１．３ｘ１０６細胞を回収した。次いで、細胞を１８０ｘｇで５分間遠心分離し、そして上記のようなＳＫＰ増殖培地中に再懸濁した。次いで、２．５ｘ１０５細胞を２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）に移し、そして上記のようにインキュベーションした。３〜４日ごとに、１ｍｌの細胞上清をフラスコから取り除き、そして５倍高い濃度のＥＧＦ、ＦＧＦ−２およびＢ２７補充剤を含有する１ｍｌのＳＫＰ増殖培地と交換した。
【００６７】
２２日間インキュベーションした後、ＳＫＰはフラスコ中で可視であった。
【００６８】
本実施例は、ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア上で増殖させた細胞は、ＳＫＰを形成する能力を保持することを立証し、細胞が多能性幹細胞特性に対する能力を保持したことが確認された。ＨＬＸ１１−１７０マイクロキャリア上で増殖させた細胞は、ＳＫＰを形成せず、そしてしたがって、この重要な多能性潜在力を失っているため、これは、特に驚くべきことであった。
【００６９】
実施例１８
細胞株ＡＶＤＳ４の２つの２２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）を採取し、そして９１％の生存度で、４．７ｘ１０６細胞を回収した。次いで、２ｘ１０６細胞を用いて、１．５ｇ／Ｌ  ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア（先に記載するように調製）を含有し１０％ＦＢＳを補充した総体積２５０ｍｌのＭＥＭ細胞培養増殖培地中、１Ｌスピナー細胞培養フラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）に植え付けた。フラスコのヘッドスペースを窒素ガス中の５％ＣＯ２および２％Ｏ２で平衡化した。スピナーフラスコを細胞培養インキュベーター（３７℃）に移し、そして磁気スターラーベースを用いて４０ｒｐｍで攪拌した。記載する条件下で４日間インキュベーションした後、そして６日目まで、そして６日目を含めて、毎日、体積２５ｍｌの細胞培養上清を各スピナーフラスコから取り除き、そして２５ｍｌの新鮮な細胞培養増殖培地（上記）と交換した。記載する条件下で７日間インキュベーションした後、生存度９５％で、２．１ｘ１０７細胞を回収した。次いで、１．３ｘ１０５細胞を、総体積１７ｍｌの細胞培養増殖培地（上記）中、１２．５ｃｍ２片の三次元生体適合性組織再生骨格（Ｉｎｔｅｇｒａ皮膚再生テンプレート（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））を含有する１２５ｍｌ細胞培養振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に植え付けた。シリコン層が細胞培養フラスコ基部に向き、そしてコラーゲン表面が上方に向き、そしてしたがって細胞懸濁／細胞増殖培地中に浸るように、Ｉｎｔｅｇｒａ皮膚再生テンプレートをフラスコ中に配置する。フラスコのヘッドスペースを窒素ガス中の５％ＣＯ２および２％Ｏ２で平衡化し、そして３７℃および６０ｒｐｍに設定した軌道振盪インキュベーターに移した。３〜４日ごとに、８ｍｌの細胞上清をフラスコから取り除き、そして８ｍｌの新鮮な細胞培養増殖培地と交換した。フラスコをこれらの条件下で１４日間インキュベーションし、そして次いで、細胞を植え付けたＩｎｔｅｇｒａ皮膚再生テンプレートをフラスコから取り除き、そして当該技術分野でよく記載される方法を用いて、メタノール／アセトン（Ｆｉｓｈｅｒ）の５０／５０混合物で固定した。次いで、当該技術分野で確立されているように、ヨウ化プロピジウム（１０μｇ／ｍｌ、５４３ｎｍで励起、６１０〜６４０ｎｍの範囲で発光を捕捉）での細胞核染色、二分および共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって、Ｉｎｔｅｇｒａ皮膚再生テンプレート内への細胞の浸潤および増殖を分析した。画像分析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ、ＮＩＨ）を用いて、捕捉されたＣＬＳＭ画像を分析した。Ｉｎｔｅｇｒａ皮膚再生テンプレートの横断面のＣＬＳＭスキャンを分析し、そして細胞数（表面から骨格内への空間分布）を図８に提示する。
【００７０】
データによって、Ｉｎｔｅｇｒａ皮膚再生テンプレートへの細胞の浸潤および増殖が示される。これらのデータはさらに、プロセスの有用性を例示し、ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア培養を用いて製造された細胞が、Ｉｎｔｅｇｒａ皮膚再生テンプレートなどの生体適合性三次元骨格内で浸潤しそして増殖する能力を保持することを立証する。皮膚再生の当業者には、細胞が骨格の外表面のみに存在するならば、限定されるわけではないが細胞外マトリックス産生および血管新生などの創傷治癒の重要な側面が限定され、そして組織再生成功の可能性は低い／劣っているであろうことが明らかであろう。
【００７１】
実施例１９
アポトーシスは、細胞成長および増殖の重要でそして能動的な制御経路であることが当該技術分野でよく確立されている。アポトーシスは、（限定されるわけではないが）増殖培地、ストレス条件または他のパラメーターによって達成されうる。細胞培養集団におけるアポトーシス細胞のレベルの決定を、プロセス条件、細胞拡大などの負の影響を監視し、そして評価するツールとして用いてもよい。アネキシンＶアッセイは、当該技術分野でよく確立されており、そしてこれを用いて、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ細胞培養増殖培地を含むバイオリアクター中でのＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア上で増殖させた細胞におけるアポトーシスを測定した。静置培養中で連続継代し、また、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で増殖させた細胞を、対照として用いて、バイオリアクター中、ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリアを用いて増殖させた細胞集団におけるアポトーシスのレベルと比較した。
【００７２】
バイオリアクターから採取しておいた細胞ストック（実施例１１）由来の凍結保存した細胞株ＡＶＤＳ４のバイアルを融解し、そしてＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、２２５ｃｍ２フラスコに植え付けた。ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、２２５ｃｍ２フラスコに、先に記載するフラスコと同じレベルで植え付けた細胞バンク由来のＡＶＤＳ４を拡大することによって、対照培養を産生した。この対照培養は、マイクロキャリアまたはバイオリアクター培養を用いてプロセシングされていなかった。どちらのフラスコも、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベーションし、そして次いで、以下のように、分析のため各細胞培養を調製した。細胞単層から増殖培地を分離した。細胞単層を洗浄し、そして次いで、当該技術分野でよく確立されているように、組織培養フラスコから脱離させた。次いで、増殖培地、洗浄および脱離単層を再度合わせた。細胞を、３００ｘｇで５分間、室温で遠心分離した。上清を吸引し、そして細胞ペレットを新鮮なＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、５ｘ１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌのこの細胞懸濁物を、１００μｌのＧｕａｖａネキシン試薬（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ、米国ヘイワード）を含有する微量遠心管に移した。混合した後、細胞／試薬を暗所中、室温で２０分間インキュベーションした。次いで、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ細胞計数装置を用いて試料を分析した（Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ製造者ガイドにしたがう）。どちらの培養も、５日間インキュベーションした後、類似の生存細胞数を達成した。アッセイ結果のドットプロット提示を図９に示し、そして各集団におけるアポトーシス細胞レベルを表５に示す。
【００７３】
表５  細胞株ＡＶＤＳ４バイオリアクター後および静置培養（対照）におけるアポトーシス測定値
【００７４】
【表５】
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【００７５】
驚くべきことに、ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒマイクロキャリアを用いてバイオリアクター中で培養され、そして対照細胞より有意に長期間、培養中にあった細胞が、匹敵し、そして許容されうる細胞生存度／アポトーシス細胞レベルを示している。
【００７６】
実施例２０
トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−β１）は、サイトカインのトランスフォーミング増殖因子ベータ・スーパーファミリーのポリペプチドメンバーである。該因子は、多くの細胞機能を実行し、そして創傷治癒において重要な役割を有すると同定されてきている分泌タンパク質である。ＴＧＦ−ベータ１デュオＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ細胞培養増殖培地を含むバイオリアクター中、ＣｕｌｔｉＳｐｈｅｒ  Ｓマイクロキャリア上で増殖させた細胞由来の培養上清中のタンパク質レベルを決定した。やはりＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で増殖させた、組織培養フラスコを用いた静置培養中の連続継代由来の細胞を対照として用いて、２つの細胞集団によって産生されるＴＧＦ−β１レベルを比較した。
【００７７】
バイオリアクターから採取しておいた細胞ストック（実施例１１）由来の凍結保存した細胞株ＡＶＤＳ４のバイアルを融解し、そしてＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、２２５ｃｍ２フラスコに植え付けた。ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、２２５ｃｍ２フラスコに、先に記載するフラスコと同じレベルで植え付けた細胞バンク由来のＡＶＤＳ４を拡大することによって、対照培養を産生した。この対照培養は、マイクロキャリアまたはバイオリアクター培養を用いてプロセシングされていなかった。どちらのフラスコも、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベーションし、そして次いで、残った細胞培地を採取し、そしてＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてアッセイして、ＴＧＦ−β１濃度を決定した。試料を二つ組で分析し、そして結果を図１０に示す。ＴＧＦ−β１レベルを細胞濃度対フラスコ表面積に対して標準化した。
【００７８】
結果は、バイオリアクター培養中、マイクロキャリアを用いて拡大させた細胞が、静置培養を用いて継代されている細胞と同等のレベルでＴＧＦ−β１を発現し続け、そしてしたがってこの重要な品質特性を維持してきていることを明らかに立証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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