(57)【要約】  ＴＬＲ７の発現を下方制御するための、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、組成物および方法が提供される。組成物は、ＴＬＲ７をコードする核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。組成物はまた、ＴＬＲ７をコードする核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、他の治療的および／または予防的化合物および／または組成物と組み合わせて含んでもよい。ＴＬＲ７の発現を下方制御するために、およびＴＬＲ７発現の調節が有用である疾患の予防または処置のために、これらの化合物および組成物を用いる方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０〜５０ヌクレオチド長の、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡ（配列番号：２５８）を標的とする合成アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：１８、３１、５８、１０７、１１７、１１８、１３１、１４１、１５６、１６３、１８４、１９９、２０５または２０７を含む配列を有し、かつ前記オリゴヌクレオチドは、ヒトＴＬＲ７に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
修飾オリゴヌクレオチドが、アルキルホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、およびメチルホスホナートからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド間結合を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ヌクレオチド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合である、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
修飾オリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの２’−Ｏ置換リボヌクレオチドを含む、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、ＴＬＲ７の発現を阻害する方法。
【請求項８】
請求項６に記載の組成物を投与することを含む、ＴＬＲ７の発現を阻害する方法。
【請求項９】
哺乳動物におけるＴＬＲ７の発現を阻害する方法であって、哺乳動物に対して、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
哺乳動物におけるＴＬＲ７の発現を阻害する方法であって、哺乳動物に対して、請求項６に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
哺乳動物におけるＴＬＲ７媒介性免疫応答を阻害する方法であって、哺乳動物に対して、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
哺乳動物におけるＴＬＲ７媒介性免疫応答を阻害する方法であって、哺乳動物に対して、請求項６に記載の組成物の薬学的有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
ＴＬＲ７により媒介される疾患を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、前記哺乳動物に対して、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
ＴＬＲ７により媒介される疾患を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、前記哺乳動物に対して、請求項６に記載の組成物の薬学的有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
ＴＬＲ７により媒介される疾患または障害を有する哺乳動物において、疾患または障害を予防する方法であって、前記哺乳動物に対して、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドの予防有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
ＴＬＲ７により媒介される疾患または障害を有する哺乳動物において、疾患または障害を予防する方法であって、前記哺乳動物に対して、請求項６に記載の組成物の予防有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
ＴＬＲ７の発現を下方制御することにより、ＴＬＲ７を活性化する化合物による望ましくないＴＬＲ７媒介性免疫刺激を防ぐ方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを、該アンチセンスオリゴヌクレオチドがなければＴＬＲ７媒介性免疫応答を活性化し得る免疫刺激モチーフを含む１または２以上の化合物と組み合わせて投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
ＴＬＲ７の発現を下方制御することにより、ＴＬＲ７を活性化する化合物による望ましくないＴＬＲ７媒介性免疫刺激を防ぐ方法であって、請求項６に記載の組成物を、該組成物がなければＴＬＲ７媒介性免疫応答を活性化し得る免疫刺激モチーフを含む１または２以上の化合物と組み合わせて投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
哺乳動物がヒトである、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
疾患が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性疾患、感染症、マラリア、ライム病、眼の感染症、結膜炎、皮膚障害、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、移植拒絶反応、アレルギー、喘息または病原菌による疾患から選択される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
自己免疫障害が、エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症ショック、全身性脱毛症、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
炎症性疾患が、気道炎症、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性乾癬、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性腸疾患、再かん流障害、関節リウマチ、移植拒絶反応、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、結膜炎および血管炎から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
化合物が１または２以上の非ＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、それらがなければＴＬＲ７媒介性免疫応答を活性化し得る免疫刺激性モチーフを含んでいる、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２４】
投与経路が、非経口、筋肉内、皮下、腹腔内、静脈内、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、または洗口から選択される、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
１種または２種以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子またはこれらの組み合わせをさらに投与することを含む、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物に対して、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＴＬＲ７タンパク質アンタゴニストを投与することを含む、哺乳動物におけるＴＬＲ７発現および活性を阻害する方法。
【請求項２７】
ＴＬＲ７アンタゴニストが、抗ＴＬＲ７抗体または結合断片もしくはそれらペプヂド模倣薬、ＲＮＡベース化合物、オリゴヌクレオチドベース化合物、およびまたはＴＬＲ７活性の小分子阻害剤からなる群から選択される、請求書項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（代理人整理番号：ＩＤＲ−０４９ＰＣ）
関連出願
本願は、２００８年８月４日に出願された米国特許仮出願第61/086,011号の利益を主張し、その全内容は、本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）に関する。特に、本発明は、ＴＬＲ７をコードする核酸に特異的にハイブリダイズして、ＴＬＲ７発現および活性を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドに、およびＴＬＲ７に関連する、またはＴＬＲ７発現の調節が有益である疾患の処置または予防における、それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の概要
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は多くの免疫系細胞上に存在し、自然免疫応答に関与することが示されている（Hornung, V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537）。ＴＬＲは、脊椎動物が外来性分子を認識しそれに対する免疫応答を開始するための鍵となる手段であり、自然免疫応答と適応免疫応答を結びつけるための手段を提供する（Akira, S. et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145）。哺乳動物において、このファミリーはＴＬＲ１からＴＬＲ１１と呼ばれる少なくとも１１種のタンパク質からなり、これらは、細菌、真菌、寄生虫およびウイルス由来の分子パターンに関連する病原体（ＰＡＭＰ）を認識し、多くの転写因子によって媒介される免疫応答を誘導することが知られている。
【０００４】
いくつかのＴＬＲは細胞表面に位置し、細胞外病原体を検出してそれに対する応答を開始し、別のＴＬＲは細胞内に位置し、細胞内病原体を検出してそれに対する応答を開始する。表１は、ＴＬＲの提示、それに対する既知のアゴニスト、およびそのＴＬＲを含むことが知られている細胞型を示す（Diebold, S.S. et al. (2004) Science 303:1529-1531；Liew, F. et al. (2005) Nature 5:446-458; Hemmi H et al. (2002) Nat Immunol 3:196-200；Jurk M et al., (2002) Nat Immunol 3:499；Lee J et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6646-6651： Alexopoulou, L. (2001) Nature 413:732-738）。
【表１】
2011529967.tif 000002
【０００５】
リガンドとＴＬＲの相互作用が媒介するシグナル伝達経路は、ＴＬＲファミリーのほとんどのメンバーに共通しており、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲドメイン）、骨髄分化マーカー８８（ＭｙＤ８８）、ＩＬ−１Ｒ関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）、ＴＮＦ−受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＴＧＦβ活性化キナーゼ１、ＩκＢキナーゼ、ＩκＢ、およびＮＦ−κＢが関与している（例えばAkira, S. (2003) J. Biol. Chem. 278:38105およびGeller at al. (2008) Curr. Drug Dev. Tech. 5:29-38を参照）。より具体的には、ＴＦＲ１、２、４、５、６、７、８、９および１１については、このシグナル伝達系は、ＰＡＭＰリガンドが、エンドソーム膜または細胞表面にホモダイマーとして存在する膜結合ＴＬＲと相互作用し、これを活性化することから開始される。活性化に続いて、受容体は構造変化してタンパク質ＭｙＤ８８を含有するＴＩＲドメインの補充を可能とし、このＭｙＤ８８は、ＴＬＲ３を除く全ＴＬＲシグナル伝達経路に共通するアダプタータンパク質である。ＭｙＤ８８はＩＲＡＫ４を補充し、これはＩＲＡＫ１をリン酸化および活性化する。活性化されたＩＲＡＫ１はＴＲＡＦ６に結合し、これはポリユビキチンのＴＲＡＦ６への付加を触媒する。ユビキチンの付加はＴＡＫ／ＴＡＢ複合体を活性化し、これは次にＩＲＦをリン酸化して、ＮＦ−κＢの放出および核への移送をもたらす。核内のＮＦ−κＢは炎症性遺伝子の発現を誘導する（例えばTrinchieri and Sher (2007) Nat. Rev. Immunol. 7:179-190を参照）。
【０００６】
ＴＬＲの選択的局在化およびそれから生成されるシグナルは、免疫応答におけるそれらの役割についてある洞察を提供する。免疫応答には、その応答に関与する細胞のサブセットに基づいて、自然応答および適応応答の両方が関与する。例えば、遅延型過敏症および細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化などの古典的な細胞媒介性の機能に関与するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞は、Ｔｈ１細胞である。この応答は、抗原（例えばウイルスル感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞）に対する身体の自然応答であり、ＩＦＮ−γの分泌および同時にＣＴＬの活性化をもたらす。
【０００７】
炎症反応の調節に関与する結果、ＴＬＲは、自己免疫、感染症および炎症を含む多くの疾患の病因に役割を果たすことが示されている（Papadimitraki et al. (2007) J. Autoimmun. 29: 310-318；Sun et al. (2007) Inflam. Allergy Drug Targets 6:223-235；Diebold (2008) Adv. Drug Deliv. Rev. 60:813-823；Cook, D.N. et al. (2004) Nature Immunol. 5:975-979；Tse and Horner (2008) Semin. Immunopathol. 30:53-62；Tobias & Curtiss (2008) Semin. Immunopathol. 30:23-27；Ropert et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:41-51；Lee et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:3-9；Gao et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:29-40；Vijay-Kumar et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:11-21）。ＴＬＲの活性化は免疫応答の開始に関与するが、ＴＬＲを介した免疫系の制御されない、または望ましくない刺激は、免疫力が低下した対象において一定の疾患を悪化させたり、望ましくない免疫刺激を引き起し得る。したがって、ＴＬＲ発現および／または活性の下方制御は、疾患介入への有用な手段を提供することができる。
【０００８】
今日まで、ＴＬＲ活性を阻害することを選択的に狙った研究戦略には、小分子（WO/2005/007672）、抗体（例えばDuffy, K. et al. (2007) Cell Immunol. 248:103-114を参照）、一定のアンチセンス分子（Caricilli et al. (2008) J. Endocrinology 199:399）、および修飾またはメチル化または修飾オリゴヌクレオチドの競合的阻害（例えばKandimalla et al. US2008/0089883；Barrat and Coffman (2008) Immunol. Rev. 223:271-283参照）が関連している。例えばクロロキンおよびヒドロキシルクロロキンは、エンドソームの成熟を下方制御することにより、エンドソームＴＬＲシグナル伝達をブロックすることが示されている（Krieg, A. M. (2002) Annu. Rev. Immunol. 20:709）。また、Huangらは、ＴＬＲ４ ｓｉＲＮＡの使用であって、Ｔ細胞増殖および天然キラー細胞活性の、腫瘍媒介性の阻害を逆転するための前記使用（Huang et al. (2005) Cancer Res. 65:5009-5014）、およびＴＬＲ７ ｓｉＲＮＡの使用であって、眼の細菌誘発性の炎症を予防するための前記使用を示した（Huang et al. (2005) Invest. Opthal. Vis. Sci. 46:4209-4216）。   
【０００９】
さらに、いくつかのグループが、２つのトリプレット配列、近位「ＣＣＴ」トリプレットおよび遠位「ＧＧＧ」トリプレット、ポリ「Ｇ」（例えば「ＧＧＧＧ」または「ＧＧＧ」）または「ＧＣ」配列であって、一定の細胞内タンパク質と相互反応するものを有する合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いて、ＴＬＲシグナル伝達および同時に炎症性サイトカインの産生および放出の阻害をもたらした（例えば、Lenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22(10):621-631；Patole, P. et al. (2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16:3273-3280； Gursel, I., et al. (J. Immunol., 171: 1393-1400 (2003)；Shirota, H., et al., J. Immunol., 173: 5002-5007 (2004)；Chen, Y., et al., Gene Ther. 8: 1024-1032 (2001)；Stunz, L.L., Eur. J. Immunol. (2000) 32: 1212-1222；Kandimalla et al. WO2007/7047を参照)。しかし、グアノシンストリング（guanosine strings）を含むオリゴヌクレオチドは、四重体構造を形成し、アプタマーとして作用し、トロンビン活性を阻害することが示されている（Bock LC et al., Nature, 355:564-6, 1992；Padmanabhan, K et al., J Biol Chem., 268(24):17651-4, 1993）。したがって、これらの阻害性オリゴデオキシヌクレオチド分子の効用は、患者においては実現できない。
【００１０】
受容体タンパク質と相互作用し、受容体活性化を直接阻害することの代替として、いくつかの研究によれば、「ノックダウン」またはサイレンシング技術の効用が示唆されており、例えば、受容体の活性を阻害するためのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｄＲＮＡおよびｅｉＲＮＡ技術である。これらの技術は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の投与または発現に依存している。しかし、ＲＮＡｉ分子は触媒過程を介して作用し、これらの分子は、ＲＮＡ分子を標的としてその翻訳を阻害する他の技術とは異なると認識されている（例えば、Opalinska and Gewirtz (2002) Nature Reviews 1:503-514を参照）。さらにｓｉＲＮＡ分子は、ＴＬＲとの相互作用を介して、非特異的免疫刺激を誘導することが認められている（Kleinman et al., (2008) Nature 452:591-597；De Veer et. al. (2005) Immun. Cell Bio. 83:224-228；Kariko et al. (2004) J. Immunol. 172:6545-6549）。
【００１１】
ＴＬＲ７の活性を抑制するための期待されるアプローチは、オリゴヌクレオチドベースのアンタゴニストの使用である（Kandimalla et al., WO2007/7047396参照）。
【００１２】
ＴＬＲの発現をノックダウンするさらに可能性のあるアプローチは、アンチセンス技術である。アンチセンス技術の歴史は、遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの発見は比較的容易であるが、臨床上の候補としての真の可能性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの最適化は容易ではないことを示している。したがって、ＴＬＲ７を下方制御するアンチセンスアプローチが成功するためには、この結果をもっとも効率的に実現する、最適化アンチセンスオリゴヌクレオチドが必要である。かかる最適化アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それのみで、またはKandimalla et al.のアンタゴニストもしくは他の治療的アプローチと組み合わせて、用いることができるであろう。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ＴＬＲ７をコードする核酸を標的とし、ｍＲＮＡ翻訳の阻害および／またはＲＮａｓｅＨ媒介性メカニズムを介して、ＴＬＲ７の発現を効率的に阻害する、最適化合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを目的とする。
【００１４】
第１の側面において、本発明は、配列番号：１８、３１、５８、１０７、１１７、１１８、１３１、１４１、１５６、１６３、１８４、１９９、２０５または２０７を有するものを含む、最適化アンチセンスを提供する。
【００１５】
第２の側面において、本発明は、少なくとも１つの本発明による最適化アンチセンスオリゴヌクレオチドと、生理学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤とを含む、組成物を提供する。
【００１６】
第３の側面において、本発明は、ＴＬＲ７の発現を阻害する方法を提供する。この方法において、本発明の１つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、in vitroまたは細胞内のどちらかで、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡと特異的に接触するかまたはこれにハイブリダイズされる。
【００１７】
第４の側面において、哺乳動物における、特にヒトにおける、ＴＬＲ７の発現を阻害する方法を提供し、かかる方法は、哺乳動物に対して、本発明の化合物または組成物を投与することを含む。
【００１８】
第５の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＴＬＲ７媒介性の免疫応答を阻害する方法を提供し、該方法は、哺乳動物に対して、本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的有効量を投与することを含む。
【００１９】
第６の側面において、本発明は、ＴＬＲ７が媒介する疾患を有する哺乳動物を治療的に処置する方法を提供し、該方法は、該哺乳動物に対して、特にヒトに対して、本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその組成物の、薬学的有効量を投与することを含む。
【００２０】
第７の側面において、本発明は、ＴＬＲ７が媒介する疾患または障害にかかるかまたは発症するリスクのある哺乳動物、特にヒトにおける、疾患または障害を予防する方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、前記哺乳動物に対して、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその組成物の、予防有効量を投与することを含む。
【００２１】
第８の側面において、本発明は、ＴＬＲ７発現を下方制御して、ＴＬＲ７を活性化する副作用を有する一定の他のＲＮＡベースの分子、または他の化合物または薬物の、「オフターゲット」活性を防ぐための方法を提供する。例えば、本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１または２以上のＲＮＡベースの分子であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ標的ではなく、かつ本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドが不在であればＴＬＲ７媒介性免疫応答を活性化する免疫刺激性モチーフを含むものと組み合わせて、投与することができる。
【００２２】
第９の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＴＬＲ７発現および活性を阻害する方法であって、哺乳動物に対して、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび、ＴＬＲ７タンパク質アンタゴニスト、キナーゼ阻害剤またはＳＴＡＴ（シグナル伝達および転写）タンパク質の阻害剤を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００２３】
本発明の対象のオリゴヌクレオチドおよび方法はまた、細胞、または対照哺乳動物、またはＴＬＲ７に関連するかもしくはＴＬＲ７を介した免疫刺激に関連する疾患にかかった哺乳動物における、ＴＬＲ７遺伝子の機能を試験するためも、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのリニア合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチル。
【００２５】
【図２】図２は、ヒトＴＬＲ７を発現するＨＥＫ２９３ＸＬ細胞における、本発明の例示のヒトＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を描写したものである。データは、本発明の例示のオリゴヌクレオチドの、例２に従って培養および処理されたＨＥＫ２９３細胞においてＴＬＲ７の発現および活性化を阻害する能力を実証する。
【００２６】
【図３】図３は、ヒトＴＬＲ７を発現するＨＥＫ２９３ＸＬ細胞における、本発明の例示のヒトＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を描写したものである。データは、本発明の例示のオリゴヌクレオチドの、例２に従って培養および処理されたＨＥＫ２９３細胞においてＴＬＲ７の発現および活性化を阻害する能力を実証する。
【００２７】
【図４】図４は、本発明の例示のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの、例３に従ってn vivo投与後のＴＬＲ７誘導性ＩＬ−１２を阻害する活性を描写したものである。データは、本発明の例示のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与が、in vivoでのＴＬＲ７発現の下方制御を引き起し、ＴＬＲ７アゴニストによるＩＬ−１２の誘導を防止できることを実証する。さらに一般的には、データは、本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ＴＬＲ７アゴニストによる炎症性サイトカインの誘導を阻害する能力を実証する。
【００２８】
【図５】図５は、ヒトＴＬＲ７ ｍＲＮＡ（配列番号：２５８）（GenBank Accession No. AF240467; NM016562）を示す。
【図５−２】図５−２は、図５の続きである。
【００２９】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、最適化ＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチド、かかるオリゴヌクレオチドを含む組成物、および、ＴＬＲ７媒介性応答を阻害または抑制するための、これらの使用法に関する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは安定かつ特異的で、自然免疫応答を活性化せず、これにより前に試みられたアプローチの一定の問題点を克服する。本発明の化合物を含む医薬および他の組成物も提供される。さらに、細胞または組織におけるＴＬＲ７の発現を下方制御する方法であって、かかる細胞または組織を、１または２以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物のみと、またはこれらを他の予防的もしくは治療的組成物と組み合わせて、接触させることを含む、前記方法も提供される。
【００３０】
具体的には、本発明は、ゲノム領域またはそれから転写されるＲＮＡ分子に相補的となるようデザインされた、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。これらのＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特異的かつ特に利用可能なｍＲＮＡ配列を標的とする、ユニークな配列を有し、そのために、内因性および／または外因性のＴＬＲ７リガンドまたはＴＬＲ７アゴニストに応答して、ＴＬＲ７媒介性のシグナル伝達の最大限効果的な阻害または抑制をもたらす。
【００３１】
本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、種々の細胞型における、ならびに種々のin vitroおよびin vivoの実験モデルにおける、天然または人工的なＴＬＲ７アゴニストにより誘導される免疫応答を阻害する。したがって、本発明のアンチセンス組成物は、免疫系を試験するため、またヒトやマウスなどの種々の動物種の免疫系を比較するための、有用なツールである。
【００３２】
さらに提供されるのは、ＴＬＲ７活性化に関連する疾患または病態を有するか、有することが疑われるか、またはこれを発症しやすい哺乳動物、特にヒトを、本発明の１または２以上のアンチセンス化合物または組成物の治療または予防有効量を投与することにより、処置するための方法である。これは免疫治療用途に用いることができ、例えば限定することなく、成人および小児のヒトおよび動物適用における、癌、自己免疫障害、喘息、呼吸アレルギー、食物アレルギー、皮膚アレルギー、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節炎、胸膜炎、慢性感染症、炎症性疾患、炎症性腸症候群、敗血症、マラリア、ならびに細菌、寄生虫およびウイルス感染の処置である。さらに、本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、種々の疾患の予防および／または処置において、それのみで、または他の薬物または予防的もしくは治療的組成物と組み合わせて、または同時投与しても有用であり、その例としては、ＤＮＡワクチン、抗原、抗体、およびアレルゲンであり；および疾患の予防および処置のための、化学治療剤（従来からの化学療法および現代の標的化療法のどちらも）および／またはＴＬＲ７アゴニストと組み合わせても有用である。本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましくないＴＬＲ７媒介性免疫刺激特性を有する化合物と組み合わせても有用である。
【００３３】
本明細書に引用された特許および出版物は、当分野の知識のレベルを反映し、これらはその全体が、ここに参照として組み込まれる。これらの特許および出版物と本明細書の教示の間におけるいかなる不一致も、後者を支持して解決されるべきである。
【００３４】
上述および本発明のその他の目的、その種々の特徴、および発明それ自体は、添付の図面と共に読む場合に、以下の説明からより完全に理解することができ、ここでは以下である：
【００３５】
用語「２’−Ｏ−置換」とは、一般的に、ペントース部分の２’位の、次のものよる置換を意味する：１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基（例えば、限定はしないが２’−Ｏ−メチル）による、または２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基による置換であって、ここで、かかるアルキル、アリールまたはアリル基は、非置換であるかまたは置換されていてもよく（例えば２’−Ｏ−エトキシ−メチル、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルバルコキシル（carbalkoxyl）、もしくはアミノ基により）；または、ヒドロキシ、アミノ、またはハロ基による置換、ただし２’−Ｈ基による置換ではない。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、その５’末端において２’−Ｏ−アルキル化された４または５個のリボヌクレオチド（すなわち、５’ ２−Ｏ−アルキル化リボクレオチド）、および／またはその３’末端において２’−Ｏ−アルキル化された４または５個のリボヌクレオチド（すなわち、３’ ２−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチド）を含む。例示の態様において、合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオアートヌクレオチド間結合により連結されている。ホスホロチオアート結合は、ＲｐおよびＳｐエナンチオマーが混合されたものであるか、またはこれは、ＲｐまたはＳｐ形態のどちらかにおいて立体規則的であるか、もしくは実質的に立体規則的であってよい（Iyer et al. (1995) Tetrahedron Asymmetry 6:1051-1054を参照）。
【００３６】
指向的に用いられる場合、「３’」という語は一般的に、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域または位置からの、（ヌクレオチドの３’末端に向かう）ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’の領域または位置をいう。
【００３７】
指向的に用いられる場合、「５’」という語は一般的に、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域または位置からの、（ヌクレオチドの５’末端に向かう）ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’の領域または位置をいう。
【００３８】
「約」という語は、一般的に、正確な数が重要でないことを意味する。したがって、１または２少ない数のヌクレオシド残基または１から数個の追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記のそれぞれの態様の等価物であると意図される。
【００３９】
「アゴニスト」の語は、一般に、細胞の受容体に結合して応答を引き起こす物質をいう。アゴニストはしばしば、リガンドなどの天然の物質の作用を模倣する。
【００４０】
「アンタゴニスト」の語は、一般に、アゴニストの効果を弱める物質をいう。
【００４１】
「キナーゼ阻害剤」の語は一般的に、細胞内のリン酸化依存性細胞シグナル伝達経路および／または増殖経路に拮抗するまたは阻害する分子をいう。キナーゼ阻害剤は、天然または合成であってよく、経口療法として投与することが可能な小分子を含む。キナーゼ阻害剤は、標的キナーゼ分子の活性化を迅速かつ特異的に阻害する能力を有する。タンパク質キナーゼは、一つには、これらが広範囲の様々なシグナル伝達経路および増殖経路を調節し、多くの異なるタンパク質を含むために、魅力的な薬剤標的である。そのため、これらはキナーゼシグナル伝達が関与する疾患の処置において多くの可能性を有し、かかる疾患としては、癌、心血管疾患、炎症性疾患、糖尿病、黄斑変性症、および神経疾患が含まれる。キナーゼ阻害剤の例としては、ソラフェニブ（ネキサバール（Nexavar）（登録商標））、ステント（Sutent）（登録商標）、ダサチニブ、ダサチニブ（Dasatinib）（商標）、ザクチマ（Zactima）（商標）、チケルブ（Tykerb）（商標）およびＳＴＩ５７１が挙げられる。
【００４２】
「気道炎症」という語は一般的に、限定することなく、アレルゲンに起因する気道の炎症を含み、これは喘息を含む。
【００４３】
「アレルゲン」という語は一般的に、対象への曝露によってアレルギー反応を引き起こすところの、抗原または通常はタンパク質である分子の抗原部分をいう。典型的には、対象は、例えば膨疹および発赤試験（wheal and flare test）または当該技術分野において知られたあらゆる方法によって示されるように、アレルゲンに対してアレルギー性である。分子は、たとえ対象の小さなサブセットのみが、該分子への曝露によってアレルギー性（例えばＩｇＥ）免疫応答を示した場合でも、アレルゲンという。
【００４４】
「アレルギー」という語は一般的に、限定することなく、食物アレルギー、呼吸器アレルギーおよび皮膚アレルギーを含む。
【００４５】
「抗原」という語は一般的に、抗体またはＴ細胞抗原受容体によって認識され、選択的に結合される物質のことをいう。抗原は、これに限定するものではないが、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの組み合わせを含んでよい。抗原は天然または合成であってよく、一般的にその抗原に特異的な免疫応答を誘導する。
【００４６】
「自己免疫障害」という語は一般的に、「自分」の抗原が免疫系の攻撃を被る障害をいう。かかる語は、限定することなく、エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血性ショック、全身性脱毛症、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性喘息（autoimmune asthma）、敗血性ショック、および乾癬を含む。
【００４７】
「癌」という語は一般的に、限定することなく、異常なまたは制御されていない細胞増殖および／または分裂に起因する、あらゆる悪性増殖または腫瘍をいう。癌はヒトおよび／または哺乳動物で起こり得、任意のおよび全ての組織において生じ得る。癌を有する患者の処置は、異常なまたは制御されていない細胞増殖および／もしくは分裂または転移が影響を受けるように、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを投与することを含んでよい。
【００４８】
「担体」という語は一般的に、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有ベシクル、マイクロスフェア、リポソーム被包、または医薬製剤に用いられることが当業者に周知の他の材料を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特性は、特定の用途についての投与経路に依存するであろうことが理解されるだろう。これらの材料を含有する薬学的に許容可能な製剤の調製は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990などに記載されている。
【００４９】
「共投与」または「共投与された」という語は一般的に、少なくとも２つの異なる物質を、免疫応答を調節するために、十分に近い時間で投与することをいう。共投与は、少なくとも２つの異なる物質の、任意の順序における単一用量または分離された用量での、同時投与および、数日までの時間的間隔が置かれた順序で投与することをいう。
【００５０】
「組み合わせて」という語は一般的に、患者の処置過程において、本発明の化合物ならびに、該化合物のＴＬＲ７アンチセンス活性を無効にしない、疾患および病態を処置するのに有用な別の剤を投与することを意味する。かかる投与は、同時投与、ならびに数秒から数日までの時間的間隔が置かれた順序を含む、あらゆる順序で行われてよい。かかる組合せ処置はまた、本発明の化合物および／または独立して他の剤の、単回より多くの投与を含んでよい。本発明の化合物および他の剤の投与は、同一または異なる経路によってよい。
【００５１】
「個体」または「対象」または「脊椎動物」の語は一般的に、ヒトなどの哺乳動物をいう。
【００５２】
「リニア合成」という語は一般的に、１つのオリゴヌクレオチドの１つの末端から開始して、他端まで線形的に進行する合成をいう。リニア合成は、同一または非同一（長さ、塩基組成、および／または組込まれた化学的修飾に関して）どちらかのモノマー単位をオリゴヌクレオチドに組込むことを可能にする。
【００５３】
「哺乳動物」という語は明示的に、温血脊椎動物を含むことを意図し、これには限定することなく、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、畜牛、ウシ、ブタ、ヒツジおよびウサギを含む。
【００５４】
「ヌクレオシド」という語は一般的に、糖、通常はリボースまたはデオキシリボースと、プリンまたはピリミジン塩基からなる化合物をいう。
【００５５】
「ヌクレオチド」という語は一般的に、糖に付着したリン含有基を含むヌクレオシドをいう。
【００５６】
「修飾ヌクレオシド」という語は一般的に、修飾複素環式塩基、修飾糖部分、またはそれらのあらゆる組み合わせを含むヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、本明細書に記載されたように、非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。本発明の目的のため、修飾ヌクレオシド、ピリミジンまたはプリンアナログあるいは非天然のピリミジンまたはプリンは互換的に用いることができ、非天然の塩基および／または非天然の糖部分を含むヌクレオシドをいう。本発明の目的のため、塩基は、それがグアニン、シトシン、アデニン、チミンまたはウラシルでない場合、非天然であると考えられ、糖は、それがβ−リボ−フラノシドまたは２’−デオキシリボ−フラノシドでない場合、非天然であると考えられる。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、「修飾オリゴヌクレオチド」という語は、そのヌクレオチドの少なくとも２つが合成結合を介して共有結合しているオリゴヌクレオチドをいい、該合成結合とはすなわち、１つのヌクレオチドの５’末端と、５’ヌクレオチドホスフェートが任意数の化学基により置き換えられている他のヌクレオチドの３’末端との間のホスホジエステル結合以外の結合である。用語「修飾オリゴヌクレオチド」はまた、修飾塩基および／または糖を有する少なくとも１つのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドも包含し、例えば２’−Ｏ−置換、５’−Ｏ−置換、および／または３’−Ｏ−置換リボヌクレオチドである。
【００５８】
用語「核酸」は、ゲノム領域またはそれから転写されるＲＮＡ分子を包含する。いくつかの態様において、核酸はｍＲＮＡである。
【００５９】
用語「ヌクレオチド結合」は一般に、２つのヌクレオシドを、それらの糖（例えば３’−３’、２’−３’、２’−５’、３’−５’）を介して連結する化学結合をいい、隣接するヌクレオシド間のリン原子および帯電した、または中性の基（例えばホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートまたはメチルホスホナート）からなる。
【００６０】
用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合されたヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドをいう。ヌクレオシド単位は、ウイルス、細菌、細胞残屑、またはオリゴヌクレオチドベースの組成物（例えばｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ）の一部であってよい。かかるオリゴヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源からも得ることができるが、好ましくは合成法により産生される。ある態様において、各ヌクレオシド単位は、複素環式塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたはヘキソース糖基を含む。ヌクレオシド残基は、多くの知られているヌクレオシド間結合の任意のものにより互いに結合することができる。かかるヌクレオシド間結合としては、限定することなく、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート、アルキルホスホナート、アルキルホスホノチオアート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボナート、カルボアルコキシ、アセトアミダート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホナート、架橋ホスホロチオアート、およびスルホンヌクレオシド間結合が挙げられる。「オリゴヌクレオチドベース化合物」という語もまた、１または２以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオアート、アルキルホスホナート、またはホスホトリエステル連結）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書で使用された場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は明示的に、結合がリン酸基を含もうと含まなかろうと、あらゆるかかるヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを意図する。ある例示の態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオアートまたはホスホロジチオアート結合、あるいはそれらの組み合わせである。
【００６１】
用語「ゲノム領域またはそれから転写されるＲＮＡ分子に相補的である」とは、生理学的条件下で、例えばワトソン−クリック塩基対合（オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸の間の相互作用）により、またはフーグステン塩基対合（オリゴヌクレオチドと二本鎖核酸の間の相互作用）により、または任意の他の手段により（これには、オリゴヌクレオチドの場合、ＲＮＡに結合し、擬結節形成を引き起こすことを含む）、核酸配列に結合するオリゴヌクレオチドを意味することを意図する。ワトソン−クリックまたはフーグステン塩基対合による、生理学的条件下での結合は、核酸配列の機能との干渉を観察することにより、実質上測定される。
【００６２】
用語「ペプチド」は、該ペプチドがハプテンであろうと無かろうと、例えば抗体産生またはサイトカイン活性など、生物学的応答に影響するのに十分な長さおよび組成を有するポリペプチドを一般的にいう。用語「ペプチド」は、修飾アミノ酸（天然または非天然であるかどうかにかかわらず）を含んでもよく、かかる修飾は、これに限定するものではないが、リン酸化、グリコシル化、ＰＥＧ化、脂質化（lipidization）およびメチル化を含む。
【００６３】
用語「薬学的に許容し得る」とは、本発明の化合物の有効性または本発明の化合物の生物学的活性に干渉しない、非毒性物質を意味する。
【００６４】
用語「生理学的に許容し得る」とは、細胞、細胞培養物、組織または有機体などの生体系に適合的な、非毒性物質をいう。好ましくは生体系は生物であり、例えば哺乳動物、特にヒトである。
【００６５】
用語「予防有効量」とは、一般に、望ましくない生物学的効果の発生を防止または減少させるのに十分な量をいう。
【００６６】
用語「治療有効量」または「薬学的有効量」とは、一般に、例えば限定することなく、疾患または障害の兆候または症状の予防、低減、改善または除去を含む有益な結果などの望ましい生物学的効果に対して、影響を及ぼすのに十分な量をいう。したがって、医薬組成物または方法の各活性成分の総量は、限定することなく、免疫刺激を特徴とする慢性の病態の回復などの、有意義な患者の利益を示すのに十分である。したがって、「薬学的有効量」は、それが投与される状況に依存するであろう。薬学的有効量は、１または２以上の予防的または治療的投与において投与してよい。それのみで投与される個別の活性成分に適用される場合、この用語は、その成分のみをさす。組み合わせに適用される場合は、この用語は、組み合わせ投与か、連続投与か、または同時投与であるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の組み合わせの量をさす。
【００６７】
「処置」という語は一般的に、症状の緩和、または疾病の進行を遅らせるかまたは改善することを含み得る、有益な、または所望の結果を得ることを意図したアプローチをいう。
【００６８】
第１の側面において、本発明は、ヒトＴＬＲ７（配列番号：２５８）に特異的な核酸に相補的な、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡコード配列の標的領域または５’非翻訳領域または３’非翻訳領域に関して、それらの化学的修飾において、および／または両方に関して、最適化されている。この側面のいくつかの態様において、化合物は、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡのコード領域の核酸塩基１４０〜３２８９内、または５’非翻訳領域の１〜１３９内、または３’非翻訳領域の３２９０〜４１９２内の領域に相補的である。（配列番号：２５８）
【００６９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７媒介性免疫応答の阻害が有益である疾患の処置および／または予防に、有用である。本発明の有用なＴＬＲ７標的化アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、限定することなく、天然のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、および／または主鎖修飾オリゴヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。しかしながら、ｍＲＮＡがコードするタンパク質の翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非所望の生物学的効果を生成することができ、これらには限定することなく以下が含まれる：不十分に活性なアンチセンスオリゴヌクレオチド、不適切な生物学的利用能、準最適薬学動態、または薬理学、および免疫刺激。したがって本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの最適なデザインには、相補配列の単純な設計を超えた多くの考慮が必要である。したがって、本発明のＴＬＲ７標的化アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス活性に対する二次構造干渉を制限するため、オリゴヌクレオチドの標的特異性を増強するため、結合因子または競合因子（例えばタンパク質）との相互反応を最小化するため、細胞取り込み、安定性、生物学的利用能、薬物動態および薬力薬理学を最適化するため、および／または免疫細胞活性化を阻害、防止または抑制するために、必要な改変を組み込むことが意図される。免疫細胞活性化のかかる阻害、防止または抑制は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ｍＲＮＡ内に含まれるＴＬＲ７のためのヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を損なうことなく、多くの方法で実現することができ、これには、限定することなく以下が含まれる：１または２以上の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド結合の組み込みであって、ここで、かかる修飾ヌクレオチドは、「ＣｐＧ」ジヌクレオチドの「Ｃ」上の２’−Ｏ−メチル、３’−Ｏ−メチル、５−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル−Ｃ、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチル−Ｃ、および／または２’−Ｏ−メチル−５−メチル−Ｃ、ＣｐＧの「Ｇ」上の２’−Ｏ−置換−Ｇ、２’−Ｏ−メチル−Ｇ、および／または２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｇであり、およびかかる修飾ヌクレオチド結合は、「ＣｐＧ」ジヌクレオチドのＣとＧの間の非ホスフェートもしくは非ホスホロチオアートヌクレオチド間結合、メチルホスホナート結合、および／または「ＣｐＧ」ジヌクレオチドのＣとＧの間の２’−５’ヌクレオチド間結合である。
【００７０】
ヒトＴＬＲ７ ｍＲＮＡコード領域は約３．１ｋＢで構成されていることが決定されており、１０４９番のアミノ酸タンパク質に対応する転写物も、ヒトにおいて同定されている（Chuang and Ulevitch, Eur. Cytokine Network (2000) 3:372-378）。ＴＬＲ７をコードする遺伝子の配列は、マウス（Hemmi et al., Nature (2000) 408:740-745）およびヒト（Chuang and Ulevitch, Eur. Cytokine Network (2000) 3:372-378）について報告されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７発現を阻害するための標的としてもっとも効果的に作用する、ＴＬＲ７核酸配列の最適に利用可能な部分に指向されている。これらのＴＬＲ７遺伝子の標的化領域は、既知のエクソンまたは５’非翻訳領域の部分を含む。さらに、イントロン−エクソン境界、３’非翻訳領域およびイントロンは、ＴＬＲ７発現のアンチセンス阻害についての、潜在的に有用な標的である。ヒトＴＬＲ７に特異的な、いくつかの代表的な非限定的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号：１〜２５７を有する。本発明の最適化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号：１８、３１、５８、１０７、１１７、１１８、１３１、１４１、１５６、１６３、１８４、１９９、２０５または２０７を有するものを含む。
【００７１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらの組み合わせから構成され、１つのヌクレオチドの５’末端と、他のヌクレオチドの３’（または限定的なケースにおいては２’）末端が共有結合で連結されている。本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１４ヌクレオチド長であるが、好ましくは１５〜６０ヌクレオチド長、好ましくは２０〜５０ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、これらのオリゴヌクレオチドは、約１４〜２８のヌクレオチド、または約１６〜２５のヌクレオチド、または約１８〜２２のヌクレオチド、または２０のヌクレオチドを含む。これらのオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミデートまたはＨ−ホスホナートケミストリなどの当分野で認識されている方法により調製可能であり、これらは、手動で、または自動化合成機により実施することができる。本発明の合成ＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡにハイブリダイズするそれらの能力を損なうことなく、多くの方法で修飾してよい。かかる修飾には、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間結合が、以下であるものを含む：アルキルホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート、ホスフェートエステル、アルキルホスホノチオアート、ホスホルアミデート、カルバメート、カルボナート、ホスフェートトリエステル、アセトアミダート、またはカルボキシメチルエステル、またはこれらの組み合わせおよび、１つのヌクレオチドの５’末端と、他のヌクレオチドの３’末端の間の別のヌクレオチド間結合であって、ここで５’ヌクレオチドホスホジエステル結合が、任意数の化学基により置き換えられているもの。
【００７２】
例えば、米国特許第5,149,797号には、メチルホスホナートまたはホスホルアミデート隣接領域の間に挿入されたホスホロチオアートコア領域を有する、伝統的なキメラオリゴヌクレオチドが記載されている。米国特許5,652,356号には、オリゴヌクレオチドホスホロチオアートの１または２以上の領域に隣接する、１または２以上の非イオン性オリゴヌクレオチド領域（例えばアルキルホスホナート、および／またはホスホルアミデートおよび／またはホスホトリエステルヌクレオシド間結合）を含む、「逆転」キメラオリゴヌクレオチドが開示されている。修飾ヌクレオチド間結合を有する種々のオリゴヌクレオチドが、標準法により調製可能であり、ホスホロチオアート結合は、混合されたＲｐおよびＳｐエナンチオマーであってよく、またはこれらは、標準の手順によりＲｐまたはＳｐ形態のどちらかの、立体規則的または実質的に立体規則的なものとして作られてもよい。
【００７３】
自己安定化オリゴヌクレオチドもまた、本発明の方法において有用な修飾オリゴヌクレオチドと考えられる（Tang et al. (1993) Nucleic Acids Res. 20:2729-2735）。これらのオリゴヌクレオチドは、２つの領域を含む：標的とハイブリダイズする領域；および、自己安定化オリゴヌクレオチド内にある核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する、自己相補的領域。
【００７４】
その他の修飾としては、オリゴヌクレオチド分子の内部または末端（１または２以上）におけるものであって、ヌクレオシド間ホスフェート結合への分子の付加物を含み、例えばコレステロール、コレステリルまたはアミノ基間に種々の数の炭素残基を有するジアミン化合物、および末端のリボース、デオキシリボースおよびホスフェート修飾物であって、切断するか、または反対側の鎖に、またはゲノムに結合する関連酵素もしくは他のタンパク質に架橋するものである。かかる修飾オリゴヌクレオチドの例としては、修飾塩基および／またはリボースの代わりにアラビノースなどの糖を有するオリゴヌクレオチド、または、その３’および５’位の両方においてヒドロキシル基（その３’位において）およびホスフェート基（その５’位において）以外の化学基に付着している糖を有する、３’，５’−置換オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００７５】
糖への修飾の他の例は、リボース部分の２’位への修飾を含み、これには限定することなく、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む−Ｏ−アルキル基により、または−Ｏ−アリールにより、または２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリル基により置換された２’−Ｏ−を含み、かかる−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリール、または−Ｏ−アリル基は非置換であるか、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチルシアノ、ニトロアシルアシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルバルコキシルまたはアミノ基により置換されていてもよい。これらの置換のいずれも、リボースの場合は天然の２’−ヒドロキシル基を、またはデオキシリボースの場合は２’１−Ｈを除外することを意図しない。
【００７６】
米国特許第5,652,355号には、ＤＮＡコア領域に隣接する２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドの領域を有する、伝統的なハイブリッドオリゴヌクレオチドが開示されている。米国特許第5,652,356号には、２つのオリゴデオキシリボヌクレオチド領域の間の２’−Ｏ−置換（または２’ＯＨ、非置換）ＲＮＡ領域を含むオリゴヌクレオチドを含む、「逆転」ハイブリッドオリゴヌクレオチドが開示され、これは、「伝統的な」ハイブリッドオリゴヌクレオチドに対して「逆転」した構造である。本発明の特に有用なオリゴヌクレオチドの非限定的例は、２’−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドをそれらの３’、５’、または３’および５’末端において有し、少なくとも４または５つの連続したヌクレオチドがこのように修飾されている。２’−Ｏ−アルキル化基の非限定的例としては、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−ブチルおよび２’−Ｏ−エトキシメチルを含む。
【００７７】
他の修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性付与バルク置換基でその３’および／または５’末端をキャップされているか、１つのヌクレオチドあたり１つの非架橋酸素において置換基を有する。かかる修飾は、ヌクレオシド間結合のいくつかにおいて、またはその全てにおいて、およびオリゴヌクレオチドの末端の片側または両側および／または分子の内部において、生じることができる。
【００７８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、１または２以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または他の核酸含有化合物であって、本発明のアンチセンス分子とは同一の標的ではないもの、および本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドがなければＴＬＲ７媒介性免疫応答を活性化させる免疫刺激モチーフを含むものと、組み合わせて投与することができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、１または２以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、キナーゼ阻害剤、もしくは共刺激分子またはこれらの組み合わせと組み合わせて投与することができる。
【００７９】
ＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの非限定的なリストを、配列番号：１〜配列番号：２５７および下の表２に示す。本発明の最適化アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：１８、３１、５８、１０７、１１７、１１８、１３１、１４１、１５６、１６３、１８４、１９９、２０５または２０７を有するものを含む。表２において、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ７アンチセンス化合物は全て、ホスホロチオアート（ＰＳ）結合を有する。当業者はしかし、ホスホジエステル（ＰＯ）結合、またはＰＳ結合とＰＯ結合の混合も用いることができることを認識するであろう。
【表２】
2011529967.tif 000003
2011529967.tif 000004
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【００８０】
下線のヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである；他の全ては２’−デオキシリボヌクレオチドである。全ての配列はホスホロチオアート主鎖が修飾されている。例示の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、「ＣＧ」ジヌクレオチドが配列に含まれている場合、かかるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの免疫刺激特性を除去または妨害するように修飾されている。
【００８１】
第２の側面において、本発明は、少なくとも１つの本発明の最適化アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物を提供する。担体の特性は、投与経路に依存する。かかる組成物は、合成オリゴヌクレオチドおよび担体に加えて、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当分野によく知られた他の材料を含んでよい。本発明の医薬組成物はまた、ＴＬＲ７発現の阻害を強化する他の活性因子および／または剤を含んでもよい。例えば、それぞれがＴＬＲ７ ｍＲＮＡの異なる領域に指向された合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを、本発明の医薬組成物に用いてよい。本発明の医薬組成物は、さらに、ヌクレオチド類似体、例えばアジドチミジン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシンなどを含んでよい。かかる付加因子および／または剤は、医薬組成物に含有されて、本発明の合成オリゴヌクレオチドとの相乗効果、付加効果または増強効果を生成し、または本発明の合成オリゴヌクレオチドに起因する副作用を最小化することができる。本発明の医薬組成物はリポソームの形態であってよく、ここでは本発明の合成オリゴヌクレオチドが、他の薬学的に許容し得る担体に加えて、脂質などの両親媒性剤であって、ミセル、不溶性単層、液晶、または水溶液中の層状の層として凝集形態で存在するものと組み合わせられている。リポソーム製剤用に好適な脂質としては、限定することなく、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、ホスホリピッド、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。特に有用な脂質担体は、リポフェクチンである。かかるリポソーム製剤の調製は、当業者のレベル内であり、例えば米国特許第4,235,871号；第4,501,728号; 第4,837,028号；および第4,737,323号に開示されている通りである。本発明の医薬組成物はさらに、オリゴヌクレオチドの、細胞または遅延放出ポリマーへの送達を強化する、シクロデキストリンなどの化合物を含んでもよい。
【００８２】
第３の側面において、本発明は、ＴＬＲ７発現を阻害する方法を提供する。この方法において、本発明の１つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、in vitroまたは細胞内のどちらかで、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡと特異的に接触またはハイブリダイズする。
【００８３】
第４の側面において、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおけるＴＬＲ７の発現を阻害するための方法を提供し、かかる方法は、該哺乳動物に対して、本発明の化合物または組成物を投与することを含む。
【００８４】
第５の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＴＬＲ７媒介性の免疫応答を阻害する方法を提供し、該方法は、該哺乳動物に対して、本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的有効量を投与することを含み、ここで投与経路としては、限定することなく、非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、または点眼剤または洗口剤の形態が挙げられる。
【００８５】
第６の側面において、本発明は、ＴＬＲ７により媒介される疾患を有する哺乳動物を治療的に処置する方法を提供し、かかる方法は、該哺乳動物、特にヒトに対して、本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的有効量を投与することを含む。
【００８６】
ある態様において、疾患は、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性疾患、感染症、マラリア、ライム病、眼の感染症、結膜炎、皮膚障害、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、移植拒絶反応、アレルギー、喘息または病原菌による疾患である。好ましい自己免疫障害は、限定することなく、エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症ショック、全身性脱毛症、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症を含む。ある態様において、炎症性疾患は、限定することなく、気道炎症、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性乾癬、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性腸疾患、再かん流障害、関節リウマチ、移植拒絶反応、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、結膜炎および血管炎を含む。
【００８７】
第７の側面において、本発明は、ＴＬＲ７により媒介される疾患または障害にかかるかまたは発症するリスクのある哺乳動物、特にヒトにおいて、疾患または障害を予防する方法を提供する。この側面による方法は、該哺乳動物に対して、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは組成物の予防有効量を投与することを含む。かかる疾患または障害としては、限定することなく、哺乳動物における癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性疾患、感染症、マラリア、ライム病、眼の感染症、結膜炎、皮膚障害、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、移植拒絶反応、アレルギー、喘息または病原菌による疾患を含む。自己免疫障害は、限定することなく、エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症ショック、全身性脱毛症、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症を含む。炎症性疾患は、限定することなく、気道炎症、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性乾癬、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性腸疾患、再かん流障害、関節リウマチ、移植拒絶反応、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、結膜炎および血管炎を含む。
【００８８】
第８の側面において、本発明は、ＴＬＲ７発現を下方制御して、ＴＬＲ７を活性化する副作用を有する一定の他のアンチセンス分子、または他の化合物または薬物の、「オフターゲット」活性を防ぐための方法を提供する。ＴＬＲ７以外の標的の発現を下方制御するよう設計された、一定のアンチセンスおよび他のＤＮＡおよび／またはＲＮＡベースの化合物も、ＴＬＲ７タンパク質により認識され、免疫応答を誘導する。この活性は、「オフターゲット」効果と呼ぶことができる。本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７発現を下方制御して、非ＴＬＲ７標的化アンチセンス分子のＴＬＲ７媒介性オフターゲット活性を妨害する能力を有する。例えば、本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１または２以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、本発明のアンチセンス分子と同じ標的ではないもの、および、本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドがなければＴＬＲ７媒介性免疫応答を活性化する免疫刺激性モチーフを含むものと組み合わせて、投与することができる。したがって、例えば、ＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１または２以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ分子（例えば：ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｄＲＮＡおよびｅｉＲＮＡ）であって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ分子を標的としないものと組み合わせて投与してよい。
【００８９】
第９の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＴＬＲ７発現および活性を阻害する方法であって、哺乳動物に対して、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＴＬＲ７タンパク質のアンタゴニスト、キナーゼ阻害剤またはＳＴＡＴ（シグナル伝達および転写）タンパク質の阻害剤を投与することを含む、前記方法を提供する。この側面によれば、ＴＬＲ７発現はアンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害され、一方残余的に発現される任意のＴＬＲ７タンパク質は、アンタゴニストにより阻害される。好ましいアンタゴニストとしては、抗ＴＬＲ７抗体またはその結合断片もしくはペプヂド模倣薬、ＲＮＡベース化合物、オリゴヌクレオチドベース化合物、および／またはＴＬＲ７活性もしくはシグナル伝達タンパク質活性の小分子阻害剤が挙げられる。
【００９０】
本発明の種々の方法において、ＴＬＲ７の発現の阻害に効果的である本発明の合成オリゴヌクレオチドの、治療または予防有効量を、細胞に投与する。この細胞は、細胞培養物、血管新生組織培養物の一部であってよく、またはヒトもしくは他の哺乳動物などの哺乳動物の一部もしくは全身であってよい。投与は任意の好適な経路によってよく、これには限定することなく、非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、または点眼剤または洗口剤の形態が含まれる。ＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療組成物の投与は、既知の手順を用いて、当業者により決定されるように病態および応答に依存して、疾患の症状または代理マーカーを低下させるのに効果的な用量と時間の間、行うことができる。本発明の１または２以上の治療的ＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療有効量を、個人に対して、単回の処置エピソードとして、同時にまたは連続して投与することが望ましい場合もある。上記本発明の方法のいくつかの例示の態様において、オリゴヌクレオチドは、局所的および／または全身的に投与される。用語「局所的に投与する」とは、身体の規定の場所または領域に送達することをいい、一方用語「全身投与」とは、生物全体への送達を包含することを意味する。
【００９１】
本発明の全ての方法において、１または２以上のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それ単独でか、またはＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの免疫調節効果を減じさせない、疾患または病態を処置するのに有用な任意の他の剤と組み合わせて、投与することができる。本発明の全ての方法において、疾患または病態を処置するのに有用な剤としては、限定することなく、１種または２種以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバントまたはキナーゼ阻害剤であって、免疫応答の特異性または程度を強化するもの、または共刺激分子、例えばサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチドおよび修飾アミノ酸を含むペプチドが挙げられる。例えば、自己免疫疾患の処置において、ＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１または２以上の標的化治療剤および／またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与できることが意図される。あるいは、剤としては、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、直接免疫調節または抑制効果を生成することができる。１または２以上の他の療法と組み合わせて投与される場合、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、他の療法（単数または複数）と同時に、または順番に投与してよい。
【００９２】
本発明の種々の方法において、投与経路は、限定することなく、非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、または点眼剤または洗口剤の形態であってよい。
【００９３】
本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療有効量を経口的に投与する場合、合成オリゴヌクレオチドは、錠剤、カプセル、散剤、溶液またはエリキシル剤の形態である。錠剤形態で投与する場合、本発明の医薬組成物はさらに、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含んでよい。錠剤、カプセル、および散剤は、約５〜９５％の合成オリゴヌクレオチドを、好ましくは約２５〜９０％の合成オリゴヌクレオチドを含む。液体形態で投与する場合、水、石油、動物または植物起源の油、例えばピーナッツ油、鉱油、大豆油、ゴマ油、または合成油などの液体担体を加えてもよい。医薬組成物の液体形態はさらに、生理食塩水、デキストロースまたは他のサッカライド溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールを含んでよい。液体形態で投与する場合、医薬組成物は、約０．５〜９０重量％の合成オリゴヌクレオチドを、または約１〜５０重量％の合成オリゴヌクレオチドを含む。
【００９４】
本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療有効量を、非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃により、皮膚パッチ、または点眼剤または洗口剤の形態により投与する場合、合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、発熱物質なしの、非経口的に許容し得る水溶液の形態である。かかる非経口的に許容し得る水溶液で、ｐＨ、等張性、安定性などを有するものは、当分野の範囲内である。非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、または点眼剤または洗口剤の形態のための医薬組成物は、合成オリゴヌクレオチドに加えて、等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー液、デキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム液、乳酸加リンガー液、または当分野で知られている他のビヒクルなどを含むべきである。本発明の医薬組成物はまた、安定剤、保存剤、緩衝液、抗酸化剤または当業者に知られている他の添加物も含んでよい。
【００９５】
非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃による、皮膚パッチ、または点眼剤または洗口剤の形態により投与する場合、０．０１％〜１０％（重量／容積）の用量を用いてよい。液体形態で投与する場合、水、石油、動物または植物起源の油、例えばピーナッツ油、鉱油、大豆油、ゴマ油、または合成油などの液体担体を加えてもよい。局所投与は、リポソームまたは経皮的時間放出パッチによることができる。
【００９６】
本発明の医薬組成物中の合成オリゴヌクレオチドの量は、処置される病態の特質および重篤度、および患者が受けた前の処置の特質に依存する。本発明の方法を実施するために用いる種々の医薬組成物は、１ｋｇの身体または器官の重量毎に約１０μｇ〜約２０ｍｇの合成オリゴヌクレオチドを含むべきであることが企図される。
【００９７】
本発明の医薬組成物を用いる経静脈療法の継続時間は、処置される疾患の重篤度および、各個々の患者の病態および潜在的特異的応答に依存して変化する。
【００９８】
いくつかの疾患には急性の処置が必要であり、一方他は、より長期間の治療が必要である。疾患における急性および長期の介入は、両者ともに大事なゴールである。ＴＬＲ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの注射は、急性の状況における一定の疾患を阻害する有効な手段となりえる。しかし、何週間、何ヶ月または何年間にもおよぶ長期の療法については、生理食塩水、遅延放出ポリマーまたはリポソームなどの担体を用いる全身的送達（腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内）も考えられる。
【００９９】
いくつかの慢性疾患において、オリゴヌクレオチドの全身投与が好ましい可能性がある。注射の頻度は、連続的注入から１ヶ月１回、１ヶ月に数回であり、またはそれ以下の頻度は、疾患のプロセスおよびオリゴヌクレオチドの生物学的半減期に基づき決定される。
【０１００】
本発明のオリゴヌクレオチドおよび方法はまた、細胞内、対照哺乳動物、またはＴＬＲ７もしくはＴＬＲ７を介した免疫刺激に関連する疾患に苦しむ哺乳動物における、ＴＬＲ７遺伝子の機能を試験するためにも有用である。かかる使用において、細胞または哺乳動物は、オリゴヌクレオチドを投与され、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が試験される。
【０１０１】
いかなる理論またはメカニズムにも限定されることなく、本発明のオリゴヌクレオチドの活性は、オリゴヌクレオチドの標的核酸（例えば、ゲノム領域、遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部）へのハイブリダイゼーションに依存し、こうして標的の機能を妨害すると一般に考えられている。生理学的条件下でのかかるハイブリダイゼーションは、核酸配列の機能への干渉を観察することにより、実際に測定される。したがって、本発明にしたがって用いられる例示のオリゴヌクレオチドは、標的核酸と安定な二本鎖（またはフーグスティーンもしくは他の水素結合対合機構においては三本鎖）を形成することができ；ＲＮａｓｅＨまたは他のin vivo酵素を活性化させ、これにより標的ＲＮＡ分子の有効な分解を引き起こし；in vivoで核酸分解に抵抗する能力を有する（例えばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性）。当分野で知られている、オリゴヌクレオチドに対する上述の多数の修飾等は、これらの例示の特徴の各々に特異的にかつ成功して関与している。
【０１０２】
本発明の種々の処置方法および使用において、本発明の１、２または３以上の合成オリゴヌクレオチドの治療または予防有効量を、疾患または障害に苦しむか、またはこれを発症するリスクにある対象に投与する。１または２以上の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の方法にしたがって、それのみで、または他の既知の療法と組み合わせて投与されてよく、これには限定することなく、１または２以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバントまたはキナーゼ阻害剤であって、免疫応答の特異性または程度を強化するもの、または共刺激分子、例えばサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチドおよび修飾アミノ酸を含むペプチドが含まれる。１または２以上の他の療法と共投与する場合、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、他の処置（単数または複数）と同時か、または順番に投与してよい。
【０１０３】
以下の例は、本発明を作製し、実施するための例示の様式を説明するが、代替法を用いて類似の結果を得ることができるため、これは本発明の範囲を限定することは意味しない。
【０１０４】
例１：
ＴＬＲ７特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製
本発明の化学的実体を、１μｍｏｌ〜０．１ｍＭスケールで、自動化ＤＮＡ合成機（OligoPilot II, AKTA (Amersham)および／またはExpedite 8909 (Applied Biosystem)）を用いて、図１に概説したリニア合成手順に従って合成した。
【０１０５】
５’−ＤＭＴｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびＴホスホルアミダイトは、Proligo（Boulder, CO）から購入した。５’−ＤＭＴ７−デアザ−ｄＧおよびａｒａＧホスホルアミダイトは、Chemgenes（Wilmington, MA）より入手した。ＤｉＤＭＴ−グリセロールリンカー固体支持体は、Chemgenesより入手した。１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンアミダイトは、Glen Research（Sterling, VA）より入手し、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドアミダイトは、Promega（Obispo, CA）より入手した。本発明の全ての化合物は、ホスホロチオアート主鎖修飾であった。
【０１０６】
全てのヌクレオシドホスホルアミダイトは、３１Ｐおよび１Ｈ ＨＭＲスペクトルにより特定した。修飾ヌクレオシドは、供給業者推奨の通常のカップリングサイクルを用いて、特定部位に組み込んだ。合成の後、化合物は濃縮水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、脱トリチル化し、続いて透析した。ナトリウム塩形態の精製化合物は、使用の前に凍結乾燥した。純度はＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより試験した。エンドトキシンレベルをＬＡＬ試験により決定し、これらは１．０ＥＵ／ｍｇ未満であった。
【０１０７】
例２：
細胞培養条件および試薬
ＴＬＲ７アンチセンス活性のためのＨＥＫ２９３細胞培養アッセイ
ヒトＴＬＲ７を安定に発現するＨＥＫ２９３ＸＬ細胞（Invivogen, San Diego, CA）を、４８ウェルプレート中の２５０μＬ／ウェルの１０％熱不活性化ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中で、５％のＣＯ２インキュベータ内にてプレートした。８０％のコンフルエンス時点で、培養物を、培養培地中４μＬ／ｍＬのリポフェクタミン（Invitrogen, Carlsbad, CA）の存在下で、分泌型ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータープラスミド（ｐＮｉｆｔｙ２−Ｓｅａｐ）（Invivogen）４００ｎｇ／ｍＬを用いて、一時的にトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンを、血清非含有培地中で別々に希釈し、室温で５分間インキュベートした。インキュベーションの後、希釈ＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物を室温でさらに２０分間インキュベートした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μＬのリポフェクタミンを含有するＤＮＡ／リポフェクタミン混合物２５μＬのアリコートを、細胞培養プレートの各ウェルに加え、細胞を６時間トランスフェクトした。トランスフェクションの後、培地を新鮮な培養培地（抗生物質なし）と取り替え、アンチセンス化合物をウェルに加え、インキュベーションを１８〜２０時間継続した。細胞を次に、ＴＬＲ７アゴニストで６時間刺激した。
【０１０８】
処理の終わりに、２０μＬの培養物上清を各ウェルからとり、ＳＥＡＰアッセイについて、製造業者のプロトコルに従い（Invivogen）Quanti Blue法によりアッセイした。データは図２に、ＰＢＳ対照に対するＮＦ−κＢ活性の増加倍数として示す。
【０１０９】
例３：
ＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivo活性
５〜６週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝３／群）に、本発明の例示のＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチド５ｍｇ／ｋｇ、またはＰＢＳを、皮下で１日１回、３日間注射した。ＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与に続き、マウスに０．２５ｍｇ／ｋｇのＴＬＲ７アゴニストを皮下注射した。ＴＬＲ７アゴニスト投与の２時間後、血液を収集し、ＩＬ−１２濃度を図３に示すようにＥＬＩＳＡにより決定した。
【０１１０】
等価物
当業者は、ルーチンの実験以上のものを用いることなく、本明細書に記載の特定の物質および手順の多数の等価物を認識し、または解明することができる。例えば、オリゴヌクレオチドとオーバーラップするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてもよい。かかる等価物は本発明の範囲内と考えられ、以下のクレームに包含される。
【図１】
2011529967.tif 000009
【図２】
2011529967.tif 000010
【図３】
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【図４】
2011529967.tif 000012
【図５】
2011529967.tif 000013
【図５−２】
2011529967.tif 000014
【配列表】
2011529967000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月6日(2011.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０〜５０ヌクレオチド長の、ＴＬＲ７ ｍＲＮＡ（配列番号：２５８）を標的とする合成アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：１８、３１、５８、１０７、１１７、１１８、１３１、１４１、１５６、１６３、１８４、１９９、２０５または２０７を含む配列を有し、かつ前記オリゴヌクレオチドは、ヒトＴＬＲ７に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
修飾オリゴヌクレオチドが、アルキルホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、およびメチルホスホナートからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド間結合を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ヌクレオチド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオチド間結合である、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
修飾オリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの２’−Ｏ置換リボヌクレオチドを含む、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび生理学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、ＴＬＲ７の発現を阻害するための医薬組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の医薬組成物を含む、ＴＬＲ７の発現を阻害するための医薬組成物。
【請求項９】
哺乳動物におけるＴＬＲ７の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１０】
哺乳動物におけるＴＬＲ７の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項６に記載の医薬組成物を薬学的有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１１】
哺乳動物におけるＴＬＲ７媒介性免疫応答を阻害するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１２】
哺乳動物におけるＴＬＲ７媒介性免疫応答を阻害するための医薬組成物であって、請求項６に記載の医薬組成物を薬学的有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１３】
ＴＬＲ７により媒介される疾患を有する哺乳動物を治療的に処置するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１４】
ＴＬＲ７により媒介される疾患を有する哺乳動物を治療的に処置するための医薬組成物であって、請求項６に記載の医薬組成物を薬学的有効量で投与することを含む、前記医薬組成物。
【請求項１５】
ＴＬＲ７により媒介される疾患または障害を有する哺乳動物において、疾患または障害を予防するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを予防有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１６】
ＴＬＲ７により媒介される疾患または障害を有する哺乳動物において、疾患または障害を予防するための医薬組成物であって、請求項６に記載の医薬組成物を予防有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１７】
ＴＬＲ７の発現を下方制御することにより、ＴＬＲ７を活性化する化合物による望ましくないＴＬＲ７媒介性免疫刺激を防ぐための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを、該アンチセンスオリゴヌクレオチドがなければＴＬＲ７媒介性免疫応答を活性化し得る免疫刺激モチーフを含む１または２以上の化合物と組み合わせて含む、前記医薬組成物。
【請求項１８】
ＴＬＲ７の発現を下方制御することにより、ＴＬＲ７を活性化する化合物による望ましくないＴＬＲ７媒介性免疫刺激を防ぐための医薬組成物であって、請求項６に記載の医薬組成物を、該組成物がなければＴＬＲ７媒介性免疫応答を活性化し得る免疫刺激モチーフを含む１または２以上の化合物と組み合わせて含む、前記医薬組成物。
【請求項１９】
哺乳動物がヒトである、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
疾患が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性疾患、感染症、マラリア、ライム病、眼の感染症、結膜炎、皮膚障害、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労症候群、サルコイドーシス、移植拒絶反応、アレルギー、喘息または病原菌による疾患から選択される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
自己免疫障害が、エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症ショック、全身性脱毛症、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、限局性強皮症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
炎症性疾患が、気道炎症、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性乾癬、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性腸疾患、再かん流障害、関節リウマチ、移植拒絶反応、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、結膜炎および血管炎から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
化合物が１または２以上の非ＴＬＲ７アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、それらがなければＴＬＲ７媒介性免疫応答を活性化し得る免疫刺激性モチーフを含んでいる、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
投与経路が、非経口、筋肉内、皮下、腹腔内、静脈内、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、皮膚パッチ、点眼、または洗口から選択される、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
１種または２種以上のワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ＴＬＲ７ ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＴＬＲ７タンパク質アンタゴニストを含む、哺乳動物におけるＴＬＲ７発現および活性を阻害する医薬組成物。
【請求項２７】
ＴＬＲ７アンタゴニストが、抗ＴＬＲ７抗体または結合断片もしくはそれらペプチド模倣薬、ＲＮＡベース化合物、オリゴヌクレオチドベース化合物、およびまたはＴＬＲ７活性の小分子阻害剤からなる群から選択される、請求書項２６に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2011529967.tif 000015
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