(57)【要約】検査装置は、１つ以上の試料ウェルと、該試料ウェルに配置されたバイオセンサーを有する。バイオセンサーは、沈着した物質、例えば表面化学物質が、試料ウェル内の指定された所定の領域内にとどまるように閉じ込めることを促進する構造的特徴を有する。バイオセンサーは、異なる共鳴値（ピーク波長値またはＰＷＶ）を示す２つ以上の異なる空間的領域を用いて構成される。１つの異なる空間的領域は、上記の物質が沈着する指定された所定の領域内を取り囲み、ＰＷＶ１で共鳴する。該指定された所定の領域内を取り囲む別の空間的領域はＰＷＶ２で共鳴する。上記の２つの領域の間に緩衝領域を設けることもできる。該検査装置は、低濃度の分析物の検出を可能とし、かつバイオセンサーに対するウェル内自己参照能を向上させる。
2011527571.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の試料ウェルを有し、各試料ウェルが底部を有するマルチウェル検査器具と、各試料ウェルの底部に配置されたフォトニック結晶型バイオセンサーとを備えた検査装置であって、
各試料ウェルにおいては、試料ウェルの第１の空間的領域内に配置されて共鳴状態で第１のピーク波長値を示すように設計された第１の周期的格子構造体と、試料ウェルの第２の空間的領域内に配置されて共鳴状態で第２のピーク波長値を示すように設計された第２の周期的格子構造体とによってフォトニック結晶型バイオセンサーが構成され、
第１および第２の空間的領域が、試料ウェルの異なる空間的領域を含む、該検査装置。
【請求項２】
第１および第２の空間的領域が、緩衝領域により互いに分離される請求項１記載の検査装置。
【請求項３】
第１の空間的領域内に沈着した液相物質が第２の空間的領域内へ移動するのを抑制するように、周期的表面格子を用いて緩衝領域が構成されている請求項２記載の検査装置。
【請求項４】
第１の空間的領域が外形形状を有し、緩衝領域の周期的表面格子が、第１の空間的領域の外形形状と並列した状態にある格子によって構成される請求項２記載の検査装置。
【請求項５】
第１の空間的領域が円形の外形形状を有し、緩衝領域が該円形の外形形状を囲む環状領域を有し、該環状領域の格子が同心円として配置される請求項４記載の検査装置。
【請求項６】
第１の空間的領域が四つの側面を有する矩形の外形形状を有し、緩衝領域の格子が、該矩形の外形形状の四つの側面と並列した状態に配置される請求項４記載の検査装置。
【請求項７】
上記フォトニックバイオセンサーが、少なくとも３つの空間的に分離された領域を用いて構成され、各領域が、それぞれ異なるピーク波長値を示すように構成される請求項１記載の検査装置。
【請求項８】
検査装置に接続され、少なくとも３つの空間的に分離された領域を同時にすべて読み取る読取装置を用いて各ピーク波長値が検出できるように、各ピーク波長値が分光学的に分離される請求項７記載の検査装置。
【請求項９】
分光学的な分離が５〜１５ｎｍである請求項８記載の検査装置。
【請求項１０】
第１および第２の空間的領域が、チェッカー盤状に配置される請求項１記載の検査装置。
【請求項１１】
空間的に分離された各領域が行列状に配置され、空間的に分離された各領域が別の空間的に分離された領域と境界を共有する請求項７記載の検査装置。
【請求項１２】
空間的に分離された領域はクラスターに群化され、該クラスターが緩衝領域により分離される請求項１１記載の検査装置。
【請求項１３】
ウェル当たり２つ以上のクラスターが存在する請求項１１記載の検査装置。
【請求項１４】
緩衝領域が、第１および第２のピーク波長値とは異なる第３のピーク波長値を示す領域を含む請求項２記載の検査装置。
【請求項１５】
試料ウェルを形成する構造体と、該試料ウェルの中に配置されたバイオセンサーとを備えた検査装置であって、
該バイオセンサーが２つの特徴、すなわち、
１）ウェル内に沈着した物質がバイオセンサー表面の指定された所定の領域内にとどまるように閉じ込めることを促進する構造的特徴、および
２）該バイオセンサーが２つ以上の異なる空間的領域によって構成され、該空間的領域が、バイオセンサーへの光の照射に応答して、十分に分光学的に分離された異なる共鳴値を示すことにより該分光学的な分離が、該検査器具を読み取る検出装置により分析されるという特徴を有し、
異なる空間的領域の１つの領域が、指定された所定の領域を含み、異なる空間的領域の別の領域が、該所定の領域を囲む領域を含む、該検査装置。
【請求項１６】
バイオセンサーが、フォトニック結晶型バイオセンサーを含み、
第１の空間的領域が試料ウェルの中心部を占有する領域を含み、
第２の空間的領域が第１の空間的領域の周囲の領域を占有する領域を含む請求項１５記載の検査装置
【請求項１７】
上記の、ウェル内に沈着した物質がバイオセンサー表面の指定された所定の領域内にとどまるように閉じ込めることを促進する構造的特徴が、上記の所定の領域の境界と並列した状態に配置された周期的格子を有する請求項１５記載の検査装置。
【請求項１８】
ウェル内に沈着した物質がバイオセンサー表面の指定された所定の領域内にとどまるように閉じ込めることを促進する構造的特徴が、バイオセンサーの表面の隆起した領域を含む請求項１５記載の検査装置。
【請求項１９】
異なる共鳴値を示す２つ以上の異なる空間的領域が、チェッカー盤状に配置された２つの空間的領域を含む請求項１５記載の検査装置。
【請求項２０】
異なる共鳴値を示す２つ以上の異なる空間的領域が、緩衝領域により囲まれた異なる空間的領域の１つ以上のクラスターを含む請求項１５記載の検査装置。
【請求項２１】
各クラスターが、それぞれ異なる共鳴値を示す少なくとも３つの異なる空間的領域を含む請求項２０記載の検査装置。
【請求項２２】
各クラスターが、３つ〜９つの空間的領域を含む請求項２１記載の検査装置。
【請求項２３】
試料ウェルが、検査化合物を含有する貯蔵ウェルと検査ウェルとを含み、該貯蔵ウェルがマイクロ流路により該検査ウェルに接続される請求項１記載の検査装置。
【請求項２４】
底部を備えた複数の試料ウェルを有するマルチウェル検査器具であって、該複数の試料ウェルが検査ウェルと少なくとも１つの貯蔵ウェルとを有する該マルチウェル検査器具と、
各検査ウェルの底部に配置されたフォトニック結晶型バイオセンサーと、
少なくとも１つの貯蔵ウェルと検査ウェルとを接続する流路または流路群を備えた検査装置であって、
各検査ウェルにおいては、フォトニック結晶型バイオセンサーは、区分されたバイオセンサーを含み、該区分されたバイオセンサーは、試料ウェルの第１の空間的領域内に配置されて共鳴状態で第１のピーク波長値を示すように設計された第１の周期的格子構造体と、試料ウェルの第２の空間的領域内に配置されて共鳴状態で第２のピーク波長値を示すように設計された第２の周期的格子構造体とによって構成され、
第１および第２の空間的領域が、試料ウェルの異なる空間的領域を含む、該検査装置。
【請求項２５】
第１および第２の空間的領域が、検査ウェルを貯蔵ウェルに接続すると共に検査化合物を検査ウェルに導く流路の方向に対して直交するように配置される請求項２４記載の検査装置。
【請求項２６】
マルチウェルプレートを含む請求項２４記載の検査装置。
【請求項２７】
検査器具が、同数の検査ウェルと貯蔵ウェルを含む請求項２４記載の検査装置。
【請求項２８】
（ａ）（１）区分されたバイオセンサーを含む複数の検査ウェルおよび（２）該検査ウェルと流体を介して連通する１つ以上の貯蔵ウェルを有する検査装置を用意する工程と、
（ｂ）該検査ウェルに細胞試料を添加する工程と、
（ｃ）検査化合物を１つ以上の貯蔵ウェルに添加し、該検査化合物を１つ以上の該貯蔵ウェルから該検査ウェルに移動させる工程と、および
（ｄ）区分されたバイオセンサーからのピーク波長値を測定する工程を含む、高処理性の細胞試料アッセイ方法。
【請求項２９】
区分されたバイオセンサーが、複数のＰＷＶ領域を含み、
細胞試料の移動が、細胞試料と検査化合物との間の相互作用に応答して検査ウェル内で発生したかどうかを決定すると共に、該細胞試料の移動の方向が、より高濃度の検査化合物を含む検査ウェルの領域への方向かあるいは該領域から離れる方向であるのかを決定するために、工程（ｄ）で実施される測定を用いることができるような状態に該複数のＰＷＶ領域が配置される請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
検査ウェルが、少なくとも２種類の細胞を含む請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
上記検査装置が、複数の貯蔵ウェルを有し、該複数の貯蔵ウェルが異なる検査化合物を含む請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１つの検査ウェル内に、複数種の細胞を存在させる請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
区分されたバイオセンサーが、ストライプ群として配置されたセンサー表面を有するフォトニック結晶型バイオセンサーを含み、各ストライプが異なる公称共鳴ピーク波長値を有する請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
ストライプ群が、隣接する矩形群として配置される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ストライプ群が、隣接する同心状の曲線群として配置される請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、バイオセンサー装置であって、該装置の表面または内部への生物学的分析物または化学的分析物、例えば、ＤＮＡ、タンパク質、ウィルス、細胞および薬品等の吸着を光学的に検出するために設計された該バイオセンサーに関する。
【０００２】
本明細書では、「分析物」という用語は、溶液中に存在する物質であって、バイオセンサーの表面に固定された標的種に結合する物質を指すために使用される。反応性被膜形成作用（本明細書では「表面化学作用」（surface chemistry）という。）を示す物質、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、バイオセンサーの一部の領域に沈着すると、標的種をバイオセンサーに対して比較的高濃度で結合させる。続いて、バイオセンサーは標的種に対する分析物の結合を検出する。バイオセンサーによる、分析物−標的種結合の変換には、アッセイ信号が含まれる。標識不使用のフォトニック結晶型バイオセンサーにおいて、バイオセンサーが共鳴状態にある時のバイオセンサー表面からの反射光のピーク波長値のシフトによってこのアッセイ信号が決定され、該シフトの大きさは分析物−標的種結合の量に関連づけられる。
【背景技術】
【０００３】
格子型バイオセンサーは、光学装置の新たな部類を示すものであって、該光学装置は近年の半導体製造ツールの進歩により可能となったものであり、該ツールによれば、物質の堆積とエッチングを１００ｎｍ未満の精度で行うことができる。
【０００４】
フォトニック結晶は、その複数の特性により、格子型光学バイオセンサーとしての応用の理想的な候補となっている。第１に、フォトニック結晶の反射特性および透過特性は、タンパク質、ＤＮＡ、細胞、ウィルス粒子およびバクテリア等の生物学的物質の該結晶上への吸着によって容易に調整することができる。これらの種類の物質について、それらの有限誘電率（finite dielectric permittivity）により、それら自身を通過する光の光路長を変化させることができることが示されている。第２に、フォトニック結晶の反射／透過スペクトルは非常に狭くできるので、簡単な照明装置と検出装置を用いるだけで、生化学的結合に伴う光学的特性のシフトを高分解能で決定することができる。第３に、フォトニック結晶構造は、電磁場の伝搬を高度に局在化させるように設計できるので、一つのフォトニック結晶の表面を用いることにより、複数の生化学的結合現象を、３〜５ミクロン未満の範囲内において、隣接領域間で光学的干渉を起こすことなく、同時に測定することができる。最後に、高い表面／体積比率と、生化学的検査試料と接触する領域に電磁場強度を集中させる機能とを備えた実用的なフォトニック結晶装置を組み立てるために、広範囲の材料と作製方法を用いることができる。材料と作製方法は、プラスチック系材料を用いる大量生産または半導体材料を用いる高感度性能を最適化するように選択することができる。
【０００５】
格子型バイオセンサーの代表的な例が、
Ｂ．Ｔ．カニングハム、Ｐ．リ、Ｂ，リン及びＪ．ペパー、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ  Ｂ、第８１巻（２００２年）、第３１６頁〜第３２８頁（「直接的な生化学的アッセイ法としての熱量測定による共鳴反射」）、
Ｂ．Ｔ．カニングハム、Ｊ．キュウ、Ｐ．リ、Ｊ．ペパー及びＢ．フー、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ  Ｂ、第８５巻（２００２年）、第２１９頁〜第２２６頁（「標識の介在しない生化学的相互作用の多重同時検出のための熱量測定によるプラスチック製共鳴光学的バイオセンサー」）、及び
Ａ．Ｊ．ヘス及びＲ．Ｐ．Ｖ．ドゥイン、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー、第１２４巻（２００２年）、第１０５９６頁〜第１０６０４頁（「ナノスケールの光学的バイオセンサー：三角形状の銀ナノ粒子の局存化表面プラスモン共鳴スペクトロスコピーに基づくアプローチの感度と選択度」）、に開示されている。
【０００６】
フォトニック結晶型バイオセンサーと組み合わせることによる利益を、他の標識不使用のバイオセンサー技術が超えることはないであろう。高感度で、小型で、低コストで、高度に並列的であるバイオセンサーと、簡単で、小型で、耐久性のある読取り装置の開発により、従来経済的観点から使用できなかった用途において、医薬の開発、診断試験、環境関連試験および食品安全等の分野におけるバイオセンサーの応用が可能となるであろう。
【０００７】
バイオセンサーとして機能するようにフォトニックバンドギャップ装置を適合させるためには、該装置構造のいくつかの部分は検査試料に接触している必要がある。生体分子、細胞、タンパク質、または他の物質が、フォトニック結晶の一部に導入され、共鳴時において局所的に閉じ込められた電磁場強度が最大となる場所に吸着される。その結果、結晶への光の共鳴結合が変更され、反射または透過の出力（すなわち、ピーク波長値または本明細書のＰＷＶ）が調整される（すなわち、シフトする）。反射による出力のシフト量は、センサー上に存在する物質の量に関係している。センサーは、センサーの中に光を導入して反射光または透過光を捕捉する照明−検出装置と共に用いられる。反射光または透過光は、ピーク波長のシフトを測定する分光器へ送られる。
【０００８】
共鳴光結合（resonant light coupling）の高い品質係数（Ｑ）、高い電磁エネルギー密度、および漏れのない光学的閉じ込めを提供するフォトニック結晶の機能を利用して、高感度の生化学的センサーを製造することができる。ここで、Ｑは、共鳴周波数におけるピーク波長の鋭さを示す尺度である。フォトニック結晶型バイオセンサーは、検査試料が周期格子に浸透し、生体分子または細胞の付着による該結晶の表面誘電率の変化によって共鳴性の光学的結合条件に同調するように設計される。共鳴による高いＱ値および結合電磁場と表面結合物質との強い相互作用に起因して、報告されている最高感度を有するいくつかのバイオセンサー装置がフォトニック結晶から得られている（カニンガムらによる前記の論文参照）。この種の装置が、２００ダルトン（Ｄａ）未満の分子量を有する分子を高い信号対雑音の許容範囲で検出する機能及び個々の細胞を検出する機能を有していることは証明されている。フォトニック結晶内において共鳴的に結合した光は空間的に効果的に閉じ込めることができるので、フォトニック結晶表面は、アレイ形式による複数の同時におこなわれる生化学的アッセイを可能にする。この場合、互いに約１０μｍ未満の範囲内にある隣接領域は独立して測定することができる。この点に関しては次の文献を参照されたい：Ｐ．リ、Ｂ．リン、Ｊ．ゲルステンマイヤー及びＢ．Ｔ．カニンガム、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ  Ｂ、２００３年（「生体分子の相互作用の標識を介在させないイメージングに関する新規な方法」）。
【０００９】
フォトニック結晶構造に基づく標識不使用バイオセンサーには多くの実用的な利点がある。蛍光物質、放射性リガンド又は二次的レポーターを使用しない生化学的な細胞性結合の直接的検出法は、実験上の不正確さ、即ち、分子のコンフォメーションに対する標識の効果、活性な結合性エピトープの遮断、立体障害、標識サイトへの不到達性、又は実験における全ての分子に対して同等に機能する適当な標識を見出すことができないことによってもたられる不正確さの問題を除去する。標識を使用しない検出法は、アッセイ法の開発に要する時間と労力を著しく単純化すると共に、失活、貯蔵寿命及びバックグラウンド蛍光のための必要な実験的道具を必要としない。標識を使用しないその他の光学的バイオセンサーに比べて、フォトニック結晶の機能は、広帯域の光源（例えば、白熱電球又はＬＥＤ）から垂直の入射角で光を照射し、反射される色彩のシフトを測定することによって容易に調べることができる。簡単な励起／読取りスキームの利用により、実験室用器具に使用するのに適した安価で小型の強靱なシステム、及びケア医療用診断法や環境の監視に使用される手持ちの携帯システムを得ることが可能となる。フォトニック結晶自体は電力を消費しないので、この種の装置は、種々の液体状又は気体状のサンプリングシステム内へ容易に埋設することができる。あるいは、この種の装置は、単一の照明／検出基地によって建物内の何千ものセンサーの状態が追跡される光学的ネットワーク中に配置させることができる。フォトニック結晶型バイオセンサーは広範囲の材料と方法によって製造することができるが、連続的なフィルム状シートを用いておこなうプラスチックに基づく製法によれば、高感度の構造体が得られることが判明している。従来はその他のバイオセンサーに対しては経済的に不適当とされていたプラスチックに基づく設計と製法によれば、低コスト／アッセイが要求される用途において使用されるべきフォトニック結晶型バイオセンサーが得られる。
【００１０】
本発明の譲受人の一人は、フォトニック結晶型バイオセンサー及び標識不使用下での結合の検出のためのこれに関連する検出装置を開発した。このセンサーと検出装置は次の特許文献に記載されている：米国特許出願公開公報２００３／００２７３２７号、同２００２／０１２７５６５号、同２００３／００５９８５５号および同２００３／００３２０３９号。共鳴ピーク波長のシフトの検出法は、米国特許出願公開公報２００３／００７７６６０号に教示されている。これらの特許文献に記載されているバイオセンサーは、プラスチック製のフィルム又は基体の連続的シート上へ適用された一次元的又は二次元的な周期的構造化表面を含む。この結晶の共鳴波長は、垂直入射におけるピーク反射率を、０．５ピコメーターの波長分解能が得られる分光計を用いて測定することによって決定される。三次元的なヒドロゲル表面の化学的性質を利用しないで得られた質量検出感度（１ｐｇ／ｍｍ２よりも小さな値）は、その他の市販のバイオセンサーによっては証明されていない。
【００１１】
前記の特許出願の明細書に記載されているバイオセンサー装置の基本的な利点は、プラスチック材料を用いる連続的な工程（１〜２フィート／分）によって大量生産できることである。このようなセンサーを大量生産する方法は、米国特許出願公開公報２００３／００１７５８１号に記載されている。読取り用フォトニック結晶型バイオセンサー用の読取り装置に関する詳細は、公開された米国特許出願公開公報２００３／００５９８５５号に記載されている。センサー自体を製造した後、底なしマイクロウェルプレートまたは同様の試験体の底にバイオセンサーを取り付けて、使用可能な検査器具を作製する。それらの構造は、前記の特許文献に記載されている。
【００１２】
関連する他の特許文献としては、米国特許公報第７２６４９７３号、米国特許公報第７３０９６１４号および米国特許出願公開公報２００６／０１４１５２７号がある。
【００１３】
一般に、分析物が低濃度であっても強い信号を有することが望ましい。バイオセンサーの中で標的に占有される領域の大きさに比例して、分析物の低濃度検出限界（ＬＤＬ）が決められる。バイオセンサーの表面上の標的スポットの大きさを小さくすると、所定のバイオセンサー信号を発生するのに必要なウェル中の分析物の量をより少なくすることができる。バイオセンサーの表面構造および／またはバイオセンサーの表面エネルギーに影響を与える要素が、小さな表面物質スポットの沈着を困難にすることがある。例えば、一次元のバイオセンサー構造（格子）では、表面上に置かれた液体は格子線の方向へ流れる。物質は、ウェルの壁の方向に広がる。壁に接触すると、表面物質は壁を伝い、必要以上に大きな面積をコートする。
【００１４】
米国特許公報第７３０９６１４号は、バルクの屈折率変化により誘起されたバイオセンサーの信号を温度および組成に対して正規化するための、ウェル内参照（intra-well referencing）の概念を導入した。本明細書に記載された概念は、この技術の実施可能性と実用性を改良するものである。本発明は、出願人の譲受人の保有するＢＩＮＤスキャナー等の高分解のイメージャー（imager）に依存するのではなく、出願人の譲受人の保有する高スループットのＢＩＮＤプレートリーダーを備えたウェル間参照を特に実用可能にするものである。
【００１５】
前記の引用した文献は、すべて本明細書の一部となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００２７３２７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／０１２７５６５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／００５９８５５号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／００３２０３９号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／００７７６６０号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００３／００１７５８１号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００３／００５９８５５号明細書
【特許文献８】米国特許第７２６４９７３号明細書
【特許文献９】米国特許第７３０９６１４号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００６／０１４１５２７号明細書
【特許文献１１】米国特許第７３０９６１４号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｂ．Ｔ．カニングハム、Ｐ．リ、Ｂ，リン及びＪ．ペパー、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ  Ｂ、第８１巻（２００２年）、第３１６頁〜第３２８頁（「直接的な生化学的アッセイ法としての熱量測定による共鳴反射」）
【非特許文献２】Ｂ．Ｔ．カニングハム、Ｊ．キュウ、Ｐ．リ、Ｊ．ペパー及びＢ．フー、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ  Ｂ、第８５巻（２００２年）、第２１９頁〜第２２６頁（「標識の介在しない生化学的相互作用の多重同時検出のための熱量測定によるプラスチック製共鳴光学的バイオセンサー」）
【非特許文献３】Ａ．Ｊ．ヘス及びＲ．Ｐ．Ｖ．ドゥイン、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー、第１２４巻（２００２年）、第１０５９６頁〜第１０６０４頁（「ナノスケールの光学的バイオセンサー：三角形状の銀ナノ粒子の局存化表面プラスモン共鳴スペクトロスコピーに基づくアプローチの感度と選択度」）
【非特許文献４】Ｐ．リ、Ｂ．リン、Ｊ．ゲルステンマイヤー及びＢ．Ｔ．カニンガム、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ  Ｂ、２００３年（「生体分子の相互作用の標識を介在させないイメージングに関する新規な方法」）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本明細書は、いくつかの利点を有するフォトニック結晶型バイオセンサー等の新規なサブ波長（sub-wavelength）共鳴バイオセンサーについて記載している。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（１）微小な標的（タンパク質）スポットを試料ウェル内に沈着させることにより、低濃度でも分析物を検出することが可能となる。本明細書に記載されているバイオセンサー構造は、表面化学作用物質が指定された所定の領域内にとどまるように該物質の沈着を制限するのに寄与する。特に、バイオセンサーの活性領域の格子構造の特定のパターニングは、指定された標的領域の外側に表面化学作用物質が広がるのを防止するのに寄与する。
【００２０】
（２）ウェル内の自己参照機能を向上させる。これは、マイクロウェル等の検査器具の読み取りを行い、かつ本明細書に記載したようにバイオセンサーを組み込んだ、高処理性の読取装置にとって重要な特徴である。
【００２１】
本発明の一の態様として、試料ウェルを形成する構造体と、該試料ウェルの中に配置されたバイオセンサーとを備えた検査装置が開示される。試料ウェルを形成する該構造体は、試料ウェルに特徴を有するマルチウェルプレートの形状、または他の検査器具の形状をとることができる。本発明のバイオセンサーは２つの特徴を有している：すなわち、１）ウェル内に沈着した物質（例えば表面化学作用を示す物質）がバイオセンサー表面の指定された所定の領域内にとどまるように閉じ込めることを促進する構造的特徴；および２）バイオセンサーはさらに２つ以上の互いに異なる空間的領域を用いて構成され、該空間的領域は、バイオセンサーへの光の照射に応答して、十分に光学的分離がなされた異なる共鳴値（ＰＷＶ１、ＰＶＷ２、・・・）を示し、該光学的分離は検査装置を読み取る検出装置により分析できる。異なるＰＷＶ値についての必要な光学的分離の値は、検出装置の感度、異なる領域の数および他の要素によって変わるが、５〜１５ｎｍの光学的分離が特に規定される。
【００２２】
互いに異なる空間的領域の一の領域は、物質が沈着する指定された所定の領域を含み、該空間的領域の別の領域は、前記の指定された所定の領域を囲む領域を含む。以下に詳細に説明するように、この２つの互いに異なる空間的領域の特徴は、自己参照機能を促進するものである。基本的に、閉じ込めおよび異なる空間的領域を、異なる共鳴値と組み合わせることは、分析物の下限検出限界値を低くくし、かつ所定の分析物濃度におけるＳＮ比を増大させるのに寄与する。小さな標的スポットは、所定の信号レベルを確保するのに必要な、結合した分析物の絶対量を減らす。ウェル内参照機能を用いれば、バイオセンサーのノイズは減少する。
【００２３】
一の特定の態様において、バイオセンサーは、フォトニック結晶型バイオセンサーの形態をとる。しかしながら、本発明の特徴は格子型バイオセンサー、例えば標識された分析物を検出するいわゆるエバネッセント共鳴（ＥＲ）バイオセンサーとともに用いることができる。
【００２４】
第１および第２の空間的領域のための種々の空間的配置が開示されている。一例として、第１の空間的領域はウェルの中心部を占有する領域であり、第２の空間的領域はウェルの中心部の周辺領域を占有する領域である。チェッカー盤状の複数のタイプも開示されている。さらに、空間的領域を、緩衝領域により分離されたクラスター群として配置することもできる。いくつかの態様では、各クラスターは少なくとも３個の異なる空間的領域を有しており、それぞれが異なる共鳴値を示す。９個の異なる空間的領域を有し、それぞれが異なるＰＷＶを有する態様が記載されている。
【００２５】
指定された所定の領域内にとどまるようにウェル内に沈着した物質の閉じ込めを促進する、バイオセンサーの表面上の構造的特徴としては、複数の形態が可能である。一の形態として、該構造的特徴は、該所定の領域の境界と並列した状態に配置された周期的格子の形態をとることができ、その格子の配置が、沈着した物質が指定された所定の領域を越えて毛管現象等により移動することを抑制する。例えば、前記の所定の領域はウェルの中心部に配置された円形領域の形態をとることができ、構造的領域は環状の緩衝領域の形態をとることができ、該緩衝領域は中央の円形領域を囲む同心円状に配置された格子を有している。別の態様として、沈着した物質の閉じ込めを促進する構造的特徴は、バイオセンサーの表面の隆起した領域の形態をとることができる。
【００２６】
別の態様として、複数の試料ウェルを有し、各ウェルが底部を有するマルチウェルの検査器具と、各ウェルの底部に配置されたフォトニック結晶型バイオセンサーとを備えた検査装置が開示されている。各ウェルでは、フォトニック結晶型バイオセンサーは、共鳴状態で第１のピーク波長値（ＰＷＶ１）を示すように設計され、ウェルの第１の空間的領域内に配置された第１の周期的格子構造体と、共鳴状態で第２のピーク波長値（ＰＷＶ２）を示すように設計され、ウェルの第２の空間的領域内に配置された第２の周期的格子構造体とを用いて構成されている。第１および第２の空間的領域は、ウェルの異なる空間的領域を有している。
【００２７】
いくつかの態様では、第１および第２の空間的領域は、緩衝領域を介して相互に分離されている。別の態様では、空間的領域は相互に接触しており（他の領域と少なくとも１つの境界を有している）、さらにクラスター群として配置されている。クラスターは緩衝領域により相互に分離されている。ウェル当たりに２つまたはそれ以上のクラスターがあってもよい。
【００２８】
第１領域内に沈着した液相物質が第２の空間的領域内に移動するのを抑制するように、周期的表面格子を用いて緩衝領域は構成されている。例えば、緩衝領域の該周期的表面格子は、第１の空間的領域の外形形状と並列した状態にある格子を用いて構成されている。例えば、ＰＷＶ１を発生させる第１の空間的領域は、円形の外形形状を有し、緩衝領域はその円形の外形形状を囲む環状領域であり、該環状領域の格子は同心円として配置されている。別の例では、第１の空間的領域は四つの側面を有する矩形の外形形状を有し、緩衝領域の格子は、該矩形の外形形状の四つの側面と並列した状態に配置されている。さらに、緩衝領域は、ＰＷＶ１およびＰＷＶ２を発生させる空間的領域のピーク波長値とは異なるピーク波長値を示す領域を含んでもよい。
【００２９】
本明細書のバイオセンサーは、高処理性の細胞アッセイを含む種々の検査アッセイ（testing assays）に用いることができる。一の態様として、高処理性の細胞試料アッセイ方法が開示され、該方法は、
（ａ）区分されたバイオセンサーと貯蔵ウェルとを備え、該貯蔵ウェルが検査ウェルと液体を介して連絡している検査装置を用意し、
（ｂ）該検査ウェルに細胞試料を添加し、
（ｃ）該貯蔵ウェルに検査化合物を添加し、ここで該検査化合物は該貯蔵ウェルから該検査ウェルへ移動し、および
（ｄ）区分されたバイオセンサーからのピーク波長値を測定する、ことからなる。
好ましくは、区分されたバイオセンサーは、検査ウェル内に配置された複数のＰＷＶ領域で構成される形態をとることができ、該形態は、工程（ｄ）で行われる測定を、細胞試料と検査化合物との間の相互作用に応答して検査ウェル内で細胞試料の移動が起きているかどうか、およびその移動の方向が、高濃度の検査化合物を含む検査ウェル内の領域へ近づく方向かまたは該領域から離れる方向であるかどうか、を決定するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
典型的な実施形態が図面中の参照図に記載されている。本明細書に開示された実施形態および図は、例示であって、限定的に解釈されるべきではない。
【図１】図１は、複数の試料ウェルを有するマルチウェル器具の一部を示す斜視図である。格子型バイオセンサーは、試料ウェルの底部に配置されている。
【図２】図２は、図１の切断線２−２における、図１の器具の断面図である。
【図３】図３は、図１の一つのウェルの平面図であり、ウェルの底部におけるバイオセンサーの配置およびウェル内に置かれた表面化学作用を示す物質を示している。バイオセンサーは、中心部の空間的領域を占有する一つの第１の検出領域を有し、該第１の検出領域は一つの波長（ＰＷＶ１）で共鳴するように設計された格子構造体で構成されている。バイオセンサーは、第１の検出領域を囲む別の空間的領域を占有する第２の周辺領域を有し、該第２の周辺領域は、第２の波長（ＰＷＶ２）で共鳴するように設計された格子構造体で構成されている。これらの２つの空間的領域は環状の緩衝領域で分離されている。緩衝領域は、沈着した表面化学溶液が中央領域から周辺領域へと移動するのを抑制する特徴を有しており、例えば、該特徴は、同心円として配置された格子、または中央領域の格子の高さより高い隆起部を有する格子である。
【図４】図４は、図３のバイオセンサー配置の別の実施形態を示す平面図であり、各ウェルは、一つの波長で共鳴するように設計された格子構造体で構成された１個の第１の検出領域と、第１の検出領域を囲む４個の第２の領域であって、それぞれが第２の波長で共鳴するように設計された格子構造体で構成された第２の領域とを有している。第１の検出領域と４個の第２の領域は緩衝領域によって分離されている。
【図５】図５は、バイオセンサーに占有された複数のウェルを有するマイクロウェル検査装置の平面図であり、各ウェルのバイオセンサーは９個の空間的領域からなるクラスターとして構成され、各空間的領域は、クラスターが９個の異なる共鳴波長を持つように、異なる周期的表面格子構造体で構成されている。
【図６】図６は、図５のマイクロウェル検査器具の模式図であり、連続する場所を示しており、該場所において、マイクロウェル検査器具の読取装置がＰＷＶ測定値を取得する。装置は、各場所で９個のバイオセンサーからのピーク波長値の測定値を集める。９個の領域のそれぞれにおいて、各ＰＷＶ測定値に十分なスペクトル分離が存在していれば（好ましくは少なくとも５ｎｍ）、装置は１個またはそれ以上のクラスターから同時に９個の異なるＰＷＶ測定値を取得することができる。
【図７】図７は、共鳴波長と、一次元周期的表面格子のフォトニック結晶周期との関係を示すプロットであり、入射光はＴＭモード、格子深さは２７５ｎｍで、格子上には厚さが８５ｎｍのＴｉＯ２の高屈折率被膜を有する。
【図８】図８は、格子型バイオセンサーの一部を示す詳細図であり、周期的表面格子構造体の一部およびバイオセンサーを読み取るための読取装置の要素を示している。円はバイオセンサーの表面に塗布された標的種を表し、「＋」記号は標的種に結合する分析物を表す。いくつかの実施形態では、標的種は格子構造体の表面に結合している。一の可能な実施形態では、標的種は細胞に結合せず、分析物は細胞中に重要な動きを発生させる検査化合物である。
【図９】図９は、マイクロウェル検査器具を読み取り、検査器具中のバイオセンサーからＰＷＶ測定値を取得する、プレート読取装置および接続されたコンピュータワークステーションを示している。
【図１０】図１０は、マルチウェル検査器具用のバイオセンサーの別のもう一つの配置を示している。バイオセンサーは、同心円領域および中心領域からなる。各領域は異なる格子構造体を有し、各該領域は異なるＰＷＶ共鳴波長を有する。細胞は、単位セルの概中央にあるバイオセンサーの上に播種されている。単位セルの周囲の領域は、細胞に引き寄せられる（または反発する）検査化合物でコーティングされている。各領域のＰＷＶ測定のシフトを長時間測定することにより、細胞が検査被膜へ近づくのかまたは試験被膜から離れるのかを測定するために装置を用いることができる。
【図１１】図１１は、ウェル対を有する検査器具の一部を示しており、該ウェル対の一方のウェルが検査ウェルであって区分けされたＰＷＶセンサーを含み、他方のウェルは貯蔵部として使用され、化学的誘引物質または反発試薬（repulsion agent）等の検査化合物を含んでいる。図１１の検査器具は、走化性（chemo-taxis）研究の新規な方法を代表する細胞移動アッセイに用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
図１は、複数の試料ウェル１２を形成する構造体を有するマルチウェルの検査器具の一部を示す斜視図である。バイオセンサー１４は試料ウェルの底部に配置されている。図示された実施形態において、バイオセンサーはフォトニック結晶型バイオセンサーである。しかしながら、他の格子型光学バイオセンサーもバイオセンサー１４として用いることが可能である。図２は、図１の切断線２−２における、図１の検査器具の断面図である。図８は、より詳細な断面図である。検査器具１０は、底のないマルチウェルマイクロプレートの形状を有している。バイオセンサー１４は、格子層１０２から成り、該格子層はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）シート等の透明基板材料１００の上に形成されている。高屈折率物質１０４（図８）の層を格子層１０２の表面上に沈着させている。層１００，１０２および１０４から成る層構造を検査器具の底部に結合することにより、バイオセンサー１４がウェル１４の底面を形成する。デュアルファイバー束１１２のファイバーから器具に対して光による応答指令信号が送られ、特定波長の光を器具に照射することによりバイオセンサーに共鳴を生じさせる。反射光は束１１２の別のファイバーにより捕獲され、分光器に送られる。バイオセンサー１４の表面に分析物が結合すると、反射光のピーク波長値のシフトが発生し、このシフトは分光器により検出される。
【００３２】
図３は、図１および２のウェル１２の一つの平面図であり、ウェルの底部におけるバイオセンサー１４の配置およびウェル内に置かれた表面化学作用を示す沈着物２２を示している。図３では、表面化学作用を示す沈着物２２は黒のハッチングで表されている。バイオセンサーはウェル１２の中心に位置する一つ第１の検出領域２０を有し、該検出領域は一つの波長（ＰＷＶ１）で共鳴するように設計された格子構造体で構成されている。バイオセンサーは、第１の検出領域を囲む第２の周辺領域１６を有しており、該周辺領域は第２の波長（ＰＷＶ２）で共鳴するように設計された格子構造体で構成されている。２つの領域は、環状緩衝領域１８を介して互いに空間的に分離されている。緩衝領域１８は、沈着した表面化学作用を示す溶液２２が中央領域２０から周辺領域１６へと移動するのを抑制する特徴を有しており、例えば、該特徴は、中央領域２０の表面外形を同心とする同心円として配置された表面格子構造体である。あるいは、緩衝領域１８の格子が、中央領域２０の格子の高さより高い隆起部を有する。
【００３３】
検査器具１０を読み取るための機器として用いるプレートリーダー（plate reader）は、光を照射し、リーダーの光路の中の開口の直径で規定される、マイクロプレートウェル１２のいずれかの領域からのバイオセンサーの共鳴位置を測定する。この「読取領域」は、図２および３の３０において破線で示される円形領域であり、典型的には１から３ｍｍの直径を有する。本明細書では、開口の大きさ３０が、ウェル内の表面化学−標的スポット２２よりも大きな面積範囲を有する読取領域となるような特別かつ典型的なケースを考えている。よって、測定される光は、生物学的に活性なスポット２０と、該スポットの外側にあるかなり活性の低いセンサー領域の両方、すなわち、緩衝領域と領域「ＰＷＶ２」とから来る。そのような条件で、２つの異なる波長を有する共鳴測定値が得られる。詳しくは、ＰＷＶ１（ピーク波長値１）は領域２０、すなわち、標的スポットおよび表面化学作用を示す被膜がバイオセンサーを覆っているバイオセンサーの領域から来る。ＰＷＶ２は、領域２０と空間的に分離されかつ領域２０の外側にある領域１６、すなわち、表面化学作用を示す標的被膜がないバイオセンサーの領域から来る。ＰＷＶ１はＰＷＶ２よりも大きい。領域２０および１６の両方を同時にサンプリングする読取装置は、ＰＷＶ１−ＰＷＶ２が共鳴幅（半値幅、ＦＷＨＭ）を越える場合には、２つの、分光学的な共鳴特徴を分離する。しかし、２つの領域間のＰＷＶの差が小さければ（標的量が少ない）、２つの重なり合った共鳴は一つの広い共鳴として現れる。
【００３４】
図３の構造は上記の２つの領域間のスペクトルの違いを際立たせるものであり、同時参照点としてのＰＷＶ２（領域１６からの測定値）の使用を促進するものである。本明細書では、表面被膜効果のみによってではなく、構造によりＰＷＶ１とＰＷＶ２との分離を行う。特に、値ＰＷＶ２（領域１６）の信号を発生させるバイオセンサー領域用の格子構造体は、２つの分光学的共鳴特徴であるＰＷＶ２およびＰＷＶ１を検出機器により決定できるように、ＰＷＶ２が信号ＰＷＶ１（領域２０から発生）から十分に分離されるように設計されている。典型的な実施形態では、ＰＷＶ２とＰＷＶ１は少なくとも５ｎｍで隔てられ、典型的にはこの差は５〜１５ｎｍ、あるいはそれ以上であるが、異なるＰＷＶを有する異なる領域が、所定の読取領域３０内のバイオセンサー上にどの程度の数存在しているのかによる。
【００３５】
２つの特徴の組み合わせ、すなわち、１）表面化学作用を示す沈着物２２からなる沈着物を閉じ込め、指定された所定領域内（２０に加えて、緩衝領域１８の一部またはすべて）に留めること、および２）十分にスペクトルが分離した２つの異なる共鳴値（ＰＷＶ１およびＰＷＶ２）を持つ異なる空間的領域（２０と１６）を有するバイオセンサー格子構造体を用意することは、分析物の検出下限値を下げ、かつ所定の分析物濃度におけるＳ／Ｎ比を大きくする。小さな標的スポットは、所定の信号レベルを確保するに必要な結合する分析物の絶対量を減少させる。ウェル内参照機能を用いれば、バイオセンサーのノイズは減少する。
【００３６】
別の態様として、本発明は、バイオセンサーにより占有された表面領域をパターン化する方法を記載しており、該方法は、すべてのウェルを一度にサンプリングする、低分解能で高処理の読取機器により、微小標的領域の作製と測定を促進する。一つの可能な実施形態として、読取機器により１回の読み取りでサンプリングされた領域３０は、ウェル１２のすべての空間範囲と同一の広がりを有する。
【００３７】
例えば、図３を再度参照すると、この実施形態では、ウェル領域１２には異なる機能性バイオセンサー領域のパターンが付与されており、該バイオセンサー領域は意図的に異なる共鳴波長を生じさせるとともに、バイオセンサーの表面上に沈着した機能性化合物を含有し易くするように配列された格子特徴を有する。一例では、バイオセンサー１４がマイクロプレートウェル１２の底部に置かれている。バイオセンサーは、同心領域として配置された３つの領域を有している。最も内側の領域２０は概ね円形の形状を有し、ゾーン１と呼ばれ、波長ＰＷＶ１の信号を発生させる。表面化学作用を示す物質および標的物質（図３にまとめて２２として示す）を、バイオセンサーを使用している間にゾーン１に沈着させる。中間の環状形状の緩衝領域１８はゾーン１（２２）に外接している。外側の領域１６（ゾーン２）は中間の緩衝領域１８を囲み、円形ウェル用に環状形状を有している。ゾーン２（１６）は波長ＰＷＶ２の信号を発生させる。一例では、ゾーン２（１６）はウェルの残りの部分を覆う。ゾーン１（２０）とゾーン２（１６）のバイオセンサーの表面に形成されたサブ波長格子構造体の周期は十分に異なっており、各共鳴のＦＷＨＭを越える値でＰＷＶ１とＰＷＶ２とを分離でき、それにより、確実に、全てのウェルで測定されるスペクトルから常に２つの分離可能なＰＷＶを得ることができる。
【００３８】
緩衝領域１８は、２つの実際的な目的のために役立つ。第１に、ゾーン２（１６）の参照機能を低下させることなく、表面化学標的物質２２の配置と広がりに自由度を与える。第２に、緩衝領域１８は、表面化学標的物質２２が広がるのを物理的に制限する役割も有する。これは、緩衝領域にあるバイオセンサーの表面に形成された格子構造体を配向および／または作製することにより達成され、該格子構造体は、ゾーン１に沈着した物質２２の、例えば毛管作用による外向きの流れを防止または抑制する方向に向けてまたは配向を有するように形成されている。例えば、図３の実施形態では、緩衝領域１８は、同心の環状格子構造体から成るものでもよい。表面化学標的物質をさらに閉じ込めるために、ゾーン１の隣接した格子構造体よりも高さの高い格子構造体を緩衝領域の中に設けることもできる。パターン用マスター製造に関する問題等の製造上の観点からは、緩衝領域の格子構造体が、ゾーン１のバイオセンサー領域の活性なサブ波長格子と同じ高さを有していれば、１回のエッチング工程でマスターを製造することが可能となる、ことを指摘できる。物質を保持するという特徴を確保すること、例えば高さを高くすること、は２回目のエッチング工程を必要とする。
【００３９】
別の実施形態では、緩衝領域１８は、例えば、ＰＷＶ１（ゾーン１の）またはＰＷＶ２（ゾーン２の）のいずれとも異なるＰＷＶ緩衝を発生させるサブ波長格子構造体から成るものでもよい。
【００４０】
図３の説明を続けると、読取装置の測定領域３０は、ウェル１２の大部分を覆う。そのため、１個のウェルにより生じるスペクトルは、ＰＷＶ１、ＰＷＶ２および恐らくＰＷＶ緩衝に対応する２個または３個の共鳴を含む。
【００４１】
ゾーン１および２のサブ波長格子構造体は、直線状でもよく、同じ配置または異なる配置を持ってもよい。それらは穴または柱のアレイ等の２次元構造体であってもよい。それらは、同心の環状構造体から構成されてもよい。
【００４２】
ＰＷＶ２を有するゾーン２（１６）の存在は２つの利点を提供する。第１に、記載したように、標的で覆われていない離れたセンサー領域から作用する光の影響を受けることなく、ゾーン１（２０）からの共鳴（ＰＷＶ１）を標的領域（２２）上での結合に対して明確に応答させることができる。第２に、ゾーン２からの共鳴は、いわゆる「バルク」効果および／または「非特異的」な結合に対して応答し、観測されたＰＷＶ１シフトのための参照測定または補正係数を提供するものである。バルクシフトは、バイオセンサー１４の上の液体の屈折率が変化した時に生じるものであり、分析物と標的との結合を検出するのに必要な信号とは関係のないバイオセンサー信号を発生させる。これは、例えば、温度または緩衝液の変化に応じて発生する。非特異的結合は、標的以外の物質への分析物の結合を検出することをいう。両現象は、特定の分析物−標的結合の測定に対し誤差を与える。
【００４３】
図３のバイオセンサー配置用の読取機器の最適化には、全ウェル領域、すなわちすべての領域からできる限り光を集めることができるように、照射用機器および検出用光学系を設計することが含まれる。ウェルの境界を越えても、通常は問題とはならない。その理由は、接着剤（センサー１４をマイクロウェルプレート１０のフレームに結合するために用いられる）で覆われたバイオセンサーの共鳴は、センサーの実用範囲の長波長側で発生するからである。同様のピーク強度を維持するために、必要な積算時間（信号収集時間）は増加する。何故なら、各共鳴を発生させる領域が減少するからである。
【００４４】
図４は、３個の異なる共鳴波長を発生させる３個の異なる格子ピッチを有する区分けされたバイオセンサー１４のパターンを示している。破線１２が境界を示す領域は、３８４ウェルのマイクロウェルプレートの中の矩形ウェルの領域を示しているが、ウェルの外形は重要ではなく、円形でもよい。領域３０は、検出機器によりサンプリングされる領域を示している。ウェルの中心の領域５０にある周期的表面格子は、第１の波長における共鳴を発生させる。領域５０は、緩衝領域５２に囲まれ、該緩衝領域は、図示するように、領域５０の矩形領域の外形と配列した状態で配置されている。緩衝領域５２は、第２の波長で共鳴を発生させる。５０で示す格子は、３８４ウェルのアッセイにおける最初の検出のために使用される。バイオセンサーは、ウェル当たり、周囲を囲む４個の四角（square）５４も含み、各四角５４は隣接する緩衝領域５２により囲まれている。ウェル当たり４個の四角５４があり、３８４ウェルプレートではそのような四角が１５３６個ある。図４に示すこのパターンを、標準的な３８４ウェルおよび１５３６ウェルのマイクロプレート型式の両方で使用できるように、四角５４は離間配置されている。四角５４は第３の波長で共鳴を発生させる。標的物質は、四角５０および／または５４の中心に置かれ、緩衝領域５２は、外側の参照領域、領域６０上への流出を防止する。全緩衝領域の周囲の外側領域６０により取得された共鳴信号は、ウェルの中心の四角５０から得られる最初の共鳴信号のための参照信号となる。
【００４５】
異なるＰＷＶを有する複数の領域の概念を拡げることにより、他の利点が得られる。例えば、バイオセンサーをチェッカー盤パターンを用いて設計することができ、該チェッカー盤パターンは、各四角の間が十分に分光学的に分離された、異なるサブ波長格子構造体周期（よって異なる共鳴波長）を各四角の中に有している。検出機器がチェッカー盤のセンサーパターンの上をスキャンすると、読取機器の各位置で複数の四角が撮像される。そのようなセンサーは、読取装置の大きなサンプリング領域を用いながら、低分解能の空間映像効果を生じさせることができる。スペクトルの各共鳴ピークは、ウェルマップ上の既知の領域に対応する。このようにして、細胞がウェルを横切る時の運動性を異なるＰＷＶを用いてモニターすることができる。
【００４６】
別のさらに微細なチェッカー盤パターンは、ＰＷＶ１で「黒」の四角が共鳴し、ＰＷＶ２で「赤」の四角が共鳴するもので、両方の波長を同時に分解できるので、映像機器の分解能を効果的に２倍にすることができる。撮像された画素当たり４個の共鳴領域は、分解能を４倍に増加させる。光源および分光器のスペクトルの幅が、システムが分解できる異なるＰＷＶの数を制限している。
【００４７】
空間的位置とＰＷＶとを相関させることは、所定の空間的分解能を確保するために読取装置が読取ヘッドの位置を正確にモニターする必要がない場所への、スキャニング型読取装置の接近も促進する。例えば、図３に示す区分されたセンサーを用いると、該センサーは、ゾーン１ではＰＷＶ１で共鳴し、ゾーン２ではＰＷＶ２で共鳴し、読取装置はＰＷＶ１がウェルの中心に対応することを「知る」。読取ヘッドは、ウェルのそばをスキャンし、正確な位置で停止することなくＰＷＶ１の値を記録する。
【００４８】
例えば、複数のＰＷＶ色の区分を有するチェッカー盤のようなパターンを形成するＰＷＶｎの複数領域の実施形態について詳しく説明すると、非画素化（non-pixilated）の読取型機器は低分解能のスキャナーになる。読取装置の開口部は、ｎ個の四角を有する領域に光を照射し、各四角は、単一のＰＷＶを示し、および機器内で信号が分解できるように、各四角のスペクトルは十分に分離されている。実際には、センサーのチェッカー盤パターンにより画素化が行われている。読取装置が、センサー領域の上でその開口部をスキャンすると、四角パターンは空間的頻度で繰り返し、ＰＷＶｎを有する１個の四角のみに対して一度に照射を行うことを可能とする。次いで、読取装置のソフトウェアは、開口部の既知の位置に基づいてＰＷＶｎのシフトの対応付け(map)を行い、分解能が「開口部の大きさ／ｎ」である非標識のシフト画像を作製する。
【００４９】
さらに、読取装置（光源および分光器）の使用可能なスペクトル幅が、開口部の中に存在できる領域の数を規定している。現在のセンサーおよび検査の実務に従えば、ＰＷＶｎとＰＷＶｎ＋１は、１０ｎｍ以下の範囲で分離している必要がある。そのため、使用可能なスペクトル幅が１００ｎｍである読取装置は、１０個以下の異なるＰＷＶ領域を多重送信することができる。センサー製造においては、この方法は９個の領域に制限される可能性がある。
【００５０】
本発明の別の態様は、細胞運動性検査の必要性に応えるＰＷＶ領域を備えたウェルの底をパターン化することを含む。簡単な例として、ＰＷＶ１を有するセンサー領域上のウェルの中に細胞を置くことができる。ＰＷＶ１のシフトがセンサー表面へのこれらの細胞の付着を記録する。次いで細胞は検査化合物に曝され、該検査化合物により細胞に重要な運動が発生する。ＰＷＶ２を有する隣接する領域は、細胞がＰＷＶ１とＰＷＶ２との間の空間部分を横切る時に、ピーク波長のプラスの波長シフトを記録するが、ＰＷＶ１は、細胞がこの領域を通過すると低下する。この考え方をさらに拡張すると、ウェルの底は、ウェルを横切る細胞の移動を監視する、ｎ個のストライプ状または環状の領域を備えることもできる。最初の細胞播種領域から離れた領域が、細胞を誘引する検査化合物皮膜を備えることもできる。細胞がこれらの検査皮膜に接近する時または遠ざかる時に、ＰＷＶｎ領域におけるシフトが細胞の動きを記録する。以下に、図１０を用いて実施例について説明する。
【００５１】
図５は、１２で示される複数のウェルを備えたマイクロウェル検査器具の平面図であり、図５に示されていない検査器具の構造は、図示のために削除されている。各ウェルのバイオセンサーは、行列状に配列された９個の領域６２からなる１個のクラスターとして構成され、各領域は、該クラスターが９個の異なる共鳴波長を示すように、異なる周期的表面格子構造体で形成されている。本実施例では、９個の領域は互いに分離されておらず、別の領域と少なくとも一つの共通の境界を共有している。バイオセンサークラスター６０は、９個の領域とは異なるＰＷＶを有する緩衝領域６４を介して互いに分離され、開口部のサンプリングの固有性を確保するとともに、前述の自己参照機能を提供している。
【００５２】
図６は、図５のマイクロウェル検査器具の模式図であり、連続する場所群、７０Ａ、７０Ｂ７、７０Ｃ、７０Ｄ、７０Ｅを示しており、該場所群においてマイクロウェル検査器具の読取装置がＰＷＶ測定値を取得する。計器が、７０Ａ、７０Ｂ等の各場所においてバイオセンサーの９個の領域のピーク波長の測定値を収集する。例えば、７０Ａの場所では、右側のクラスターのＰＷＶ１からＰＷＶ６の示す値と、左側のクラスターのＰＷＶ７、ＰＷＶ８およびＰＷＶ９の示す値を収集する。９個の領域のそれぞれについて、各ＰＷＶ測定値のスペクトルが十分に分離されていれば（好ましくは少なくとも５ｎｍ）、計器は、９個の異なるＰＷＶ測定値を同時に取得することができる。公知の開口部位置と公知のＰＷＶｎ領域地図を組み合わせることにより、空間的に分解されたＰＷＶの画像を得ることができ、それによって連続掃引により得られるＰＷＶ値を比較することにより、結合活性を表す画像を得ることができる。
【００５３】
図７は、一次元周期の表面格子に対してＴＭモードの入射光を用いた場合の、フォトニック結晶周期と共鳴波長との関係を示すプロット８０であり、該表面格子は格子深さが２７５ｎｍで、格子上には８５ｎｍのＴｉＯ２の高屈折率被膜を有している。このプロットは、格子周期が約５４０ｎｍから５８０ｎｍの範囲では、波長周期１ｎｍの増加に対し１．４４ｎｍの傾きで共鳴波長が増加することを示している。図７は、図５および図６に示す９個のＰＷＶ領域に、９個のフォトニック結晶周期、すなわち、約５４０ｎｍ、５４５ｎｍ、５５０ｎｍ、５６０ｎｍ、５６５ｎｍ、５７０ｎｍ、５７５ｎｍおよび５８０ｎｍを設けることにより、約７ｎｍの間隔で分光学的に分離された９個の共鳴波長が得られることを示している。
【００５４】
図８は、格子型バイオセンサー１４の一部の詳細図であり、周期性表面格子構造体の一部およびバイオセンサーを読み取るための読取装置の構成部品の一部を示している。層１００は、基材であり、ガラス、透明プラスチックまたは他の材料を用いることができる。格子構造体は層１０２であり、紫外線硬化性材料の形をとってもよい。高屈折率材料層１０４（例えばＴｉＯ２）を、格子層の上に堆積させている。円の印２００は、バイオセンサーの表面に沈着または塗布された標的種および／または表面化学作用を示す物質を示し、”＋”の印２０２は、標的種に結合する分析物を示す。いくつかの態様では、標的種２００は格子構造体の表面に結合する。一の可能な態様として、標的種２００が結合していない細胞であり、分析物２０２が細胞に大きな動きを発生させる検査化合物である。標的および／または分析物をバイオセンサーの表面に空間的に分布させてもよい。図８は、検出装置の主たる部品、すなわち、光源１１０および光ファイバー束１１２も示しており、該光ファイバー束１１２は光源に結合され、１１４で示すようにバイオセンサーの表面に光を向ける一方、１１６で示すように反射光を取り込む。取り込まれた光は分光器１１８に向けられる。検出装置はＸＹステージ（図示せず）を備えていてもよく、該ＸＹステージは、検出装置の光学系に対して検査器具を、例えば矢印１５０で示すように相対移動させる。
【００５５】
図９は、プレート読取装置３００を示す図であり、該プレート読取装置は、光源１１０、光ファイバー束１１２、図８の分光器１１８、およびプレート読取装置の中の分光器１１８からのデータを取り込む付属のコンピュータワークステーション３０２を備えている。プレート読取装置３００は、マイクロウェル検査器具１０を読み取り、検査器具１０の中のバイオセンサーからのＰＷＶ測定値を取り込むように設計されている。ワークステーションは、中央演算ユニット３０６、キーボード３０８およびマウス３１０を備えている。オペレータは、ワークステーションを用いて、分光器から得られたデータ、例えば図９に示すＰＷＶ信号のプロットをディスプレイ上で見ることができる。プレート読取装置は、ＢＩＮＤプレート読取装置の形をとることができ、該ＢＩＮＤプレート読取装置は、出願人の譲受人から購入することができ、前述の参考特許文献に記載されている。
【００５６】
図１０は、マルチウェル検査器具用バイオセンサーの別の代替配置を示す図である。バイオセンサー１４は、同心円状領域６２と中心領域ＰＷＶ８とのクラスターまたはユニットとして構成されている。各領域は異なる格子構造体を有しており、例えば各領域は、ＰＷＶ１、ＰＷＶ２、・・・・、ＰＷＶ８で示される異なるＰＷＶ共鳴波長を示す。各クラスターは、マルチウェル検査器具１０の中では、ウェルと実質的に同一の広がりを有している。沈着した細胞２２は、バイオセンサー上の概ねクラスターの中央に播種されている。クラスターの周囲の領域は、細胞に引きつけられるあるいは反発する検査化合物で被覆されている（ＰＷＶ１およびＰＷＶ２の領域の影の部分）。検出装置の光学系は、全ウェル１２から一度にデータを取り込めるように設計されている。各領域においてＰＷＶ測定値のシフトを長時間測定することによって、該装置を、検査被膜に接近または遠ざかる細胞の遊走を測定することに用いることができる。
【００５７】
読取装置の構造が、図４，５，６または１０に示す器具またはそれらの変形例の器具で同時に取得することのできるＰＷＶ測定値の数ｎを制限する。おそらく、１台で同時に１０をはるかに越える領域を読み取ることができるだろう。用途に応じて、領域間の間隔または領域の大きさを小さくすることができ、それにより、各読取領域にさらに多くの領域を設けることができる。ｎの値としては１００が可能と思われる。
【００５８】
細胞遊走検査
図１１は、サンプル用検査器具１０の一部を示し、該検査器具は、高処理性の細胞遊走検査に適した一対のウェル１２Ａおよび１２Ｂを有している。好ましい態様として、検査器具１０は、ウェル１２Ａおよび１２Ｂの対が何百も配列されたマルチウェルプレートであり、図１１はその一対のみを示している。図１１の器具の使用は、化学遊走の研究に対する新規なアプローチである。その検査は、検査ウェル１２Ａの底に形成されたフォトニック結晶センサー１４の表面に置かれた細胞の母集団を、貯蔵ウェルまたは付随ウェル（companion well）１２Ｂに最初に添加された検査化合物の濃度勾配に曝すものである。２つのウェル１２Ａと１２Ｂは、互いに液体連絡可能であり、例えば、マイクロ流体流路４００により互いに連結され、それにより検査化合物が貯蔵ウェル１２Ｂから検査ウェル１２Ａへと移動することができる。もし、検査化合物に引き寄せられると、細胞はフォトニック結晶センサーの表面を横切って左から右へと矢印４１０の方向に沿って検査化合物の濃度が高い方向へ移動し、もし検査化合物により反発されれば、矢印４１２の方向に沿って右から左へと移動して、ウェル１２Ａのマイクロウェル流路の中に移動する。この例は、複数の共鳴領域（共鳴領域ＰＷＶ１  ４０２、ＰＷＶ２  ４０４、ＰＷＶ３  ４０６、およびＰＷＶ４  ４０８）でパターン化されたバイオセンサーが、検査用マルチウェルプレートおよび高処理性読取装置を用いる自動化された高処理性の化学遊走検査を可能とする方法を示すものである。
【００５９】
この検査を実施するために、マイクロプレートウェル１２Ａ（例えば、３８４個のウェルを有するプレートの中にウェルとして形成されたもの）には、区分されたフォトニック結晶センサー１４が組み込まれており、該フォトニック結晶センサーは、複数のストライプ状領域（４０２、４０４、４０６および４０８）を有する上記のサブ波長格子構造体を有し、該ストライプ状領域は、液体流路４００と貯蔵ウェル１２Ｂの方向とに垂直に配置され、それにより、予想される実際の細胞の運動（左から右および右から左）に対して垂直になる。領域またはストライプ４０２、４０４、４０６および４０８は、液体流路４００が検査ウェル１２Ａに入る場所を中心とする同心状の曲線の形をとることもできる。各領域は、隣接する領域と、例えば５ｎｍで分光学的に分離された異なる共鳴値またはＰＷＶ値を有している。読取装置により記録されるウェル領域１６は、すべての領域の全ウェルに及ぶ。この検査ウェル１２Ａは、検査中の細胞を含んでいる。自動化されたディスペンサー装置が、細胞試料を各ウェル１２Ａの中に供給し、そこで、センサー１４に塗布された細胞外マトリックス物質の被膜にそれら細胞試料が付着する。
【００６０】
隣接するウェル１２Ｂ（四角形、円形または他の形状であってもよい）は、検査化合物を含み、該検査化合物は、検査ウェル１２Ａの中のセンサー１４に細胞が付着した後でウェル１２Ｂの中に供給されたものである。マイクロ流路４００は、検査化合物の貯蔵ウェル１２Ｂを検査ウェル１２Ａに接続する。拡散または他の能動制御によって、検査化合物の流動が促され、流路４００を通って、貯蔵ウェル１２Ｂから、細胞を含む検査ウェル１２Ａへ流動する。流路４００から検査ウェル１２Ａへの検査化合物の緩やかな移動は、矢印４１０で示される濃度勾配を生成させる。貯蔵ウェル１２Ｂを検査ウェル１２Ａに接続する別の流路４００を設けることにより、該濃度勾配をより制御することが可能となる。マイクロ流路は、プレート１０のフレームの中あるいはバイオセンサー１４の基材層の中に形成することができる。
【００６１】
検査器具は、読取装置（図９の３００）の中に置かれる。読取装置は、そのウェルを含むプレート全領域を速やかにスキャンし、各領域を同定する共鳴のスペクトル位置に対する変化を監視する。時間ゼロでは、読取装置のデータが、中間の空間分布を有する細胞が付着したすべての検査ウェル１２Ａ中のすべての領域に対する基準共鳴値を決定する。隣接する貯蔵ウェル１２Ｂに検査化合物を添加すると、マイクロ流路４００を介して検査ウェル１２Ａ中に勾配が発生する。細胞がマイクロ流路の開口の方向（検査ウェル１２Ａの右側）へ移動すると、誘因物質の場合と同様に、流路４００から離れた領域（すなわち、領域４０２と４０４）は、該領域を去る細胞の数に比例して減少する共鳴波長を記録する。流路の開口に近い領域（領域４０６と４０８）は、該領域に細胞が到着すると実質的にプラスの共鳴シフトを示す。ウェル１２Ａの中のすべての領域（４０２，４０４，４０６，４０８）の実質的なＰＷＶ応答を評価することにより、ウェル内において、検査化合物に曝した時の、細胞母集団の移動方向および移動距離を簡単に決定することができる。周期的に、領域の再読み取りを行うと、細胞の移動速度の情報が得られる。細胞を添加する前に基準値を測定することにより、細胞母集団の密度に比例する領域の信号を得ることができるので、母集団百分率で細胞運動信号を表現することができる。
【００６２】
図１１の態様では、検査器具１０は、３８４ウェルのマイクロプレートであり、該マイクロプレートは、例えば、１９２個の検査ウェル１２Ａと１９２個の隣接する化合物用貯蔵ウェル１２Ｂを有している。３８４個のすべてのウェルは、ウェル１２Ａについて示される領域パターンを有するバイオセンサー１４を含んでもよく、それにより検査配置に自由度が得られる。最新式の読取装置は、１９２個のウェルを１０秒以内で読み取ることができるので、細胞移動の監視のための適切な時間分解法を提供する。
【００６３】
化合物用貯蔵ウェル１２Ｂは、読み取りを行わないでおくこともでき、あるいはさらに有用な結合情報を提供することもできる。例えば、検査化合物用貯蔵ウェル１２Ｂは、固定された結合ターゲットを含むことができ、それにより、濃度勾配の発生に伴う検査化合物の結合情報を提供することができる。
【００６４】
このように、本態様では、高処理性の細胞試料検査方法が企図され、該方法は、（ａ）区分されたバイオセンサー１４および貯蔵ウェル１２Ｂを有する検査ウェル１２Ａを備え、該貯蔵ウェル１２Ｂが該検査ウェルと流体を介して連通する（例えば流路４００を介して）、検査装置（１０）を用意する工程と、（ｂ）該検査ウェル１２Ａに細胞試料を添加する工程と、（ｃ）検査化合物を貯蔵ウェル１２Ｂに添加し、該検査化合物を該貯蔵ウェルから該検査ウェルに移動させる工程と、および（ｄ）区分されたバイオセンサー１４からのピーク波長値を測定する工程を有する。好ましくは、区分されたバイオセンサーが、複数のＰＷＶ領域の形態をとり、該複数のＰＷＶ領域は、検査ウェルの中に図１１に示すような状態で配置され、該状態では、細胞試料の移動が、細胞試料と検査化合物との間の相互作用に対応して検査ウェル内で発生したかどうかを決定するために、およびその移動の方向が、高濃度の検査化合物を含む検査ウェルの領域の方向かあるいは該領域から離れる方向であるのかを決定するために、工程（ｄ）で実施される測定を用いることができる。
【００６５】
図１１は、検査ウェル１２Ａ当たり１個の貯蔵ウェル１２Ｂを示し、多くの検査化合物を検討対象とするよりは、細胞母集団の置換(permutation)を検討対象としているが、貯蔵ウェルが、例えば適切な流路ネットワークにより、結合した検査ウェルと流体を介して連通すれば、１個の貯蔵ウェル１２Ｂを多くの検査ウェル１２Ａのための貯蔵ウェルとして機能させることができる。例えば、マルチウェル検査器具は、貯蔵ウェルよりも多くの検査ウェルをマルチウェル検査器具の中に持つことができ、おそらく１個の貯蔵ウェル当たりに９６個あるいは可能性として何百もの検査ウェルを持つことができる。検査ウェルは、ウェル内部に異なる多くの領域を持つこともできる。
【００６６】
さらに、細胞遊走検査の別の変形例も可能である。種類の異なる細胞を種々の異なる検査ウェルに配置することができる。種類の異なる細胞を同じ検査ウェルの中に配置することができる。一つの可能な変形例では、検査器具の各検査ウェルが種類の異なる細胞を含んでいる。検査は、所定の検査化合物に対するウェル間の異なる応答を期待する。また、各検査ウェルが同じ種類の細胞を含み、各貯蔵ウェルが異なる検査化合物を含む。
【００６７】
上記の説明においては、多くの例示的な観点と実施形態について議論したが、当業者であれば、これらに関連する特定の修正、変更、追加及び下位概念的組合せが上記の開示内容に包含されることを認識できる。したがって、添付の特許請求の範囲および今後提示される特許請求の範囲は、それらすべての修正、変更、追加及び下位概念的組合せが特許請求の範囲によって規定される技術的思想と技術的範囲に包含されるものと理解されるべきである。
【符号の説明】
【００６８】
１０  マルチウェル検査器具、１２，１２Ａ，１２Ｂ  試料ウェル、１４  バイオセンサー、１６  周辺領域、１８  緩衝領域、２０  中心領域、２２  表面化学沈着物、３０  読み取り領域、５０  領域、５２  緩衝領域、５４  矩形領域、６０  外部領域、６２  クラスター、６４  緩衝領域、７０Ａ，７０Ｂ，７０Ｃ，７０Ｄ，７０Ｅ  位置、
１００  透明基材、１０２  格子層、１０４  屈折材料層、１１０  光源、１１２  光ファイバー束、１１８  分光器、２０２  分析物、３００  プレートリーダー、３０２  ワークステーション、３０４  ディスプレイ、３０６  ＣＰＵ、３０８  キーボード、３１０  マウス、４００  流路、４０２，４０４，４０６，４０８  ストライプ領域。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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