(57)【要約】  本発明は、分泌型熱ショックタンパク（ｈｓｐ）ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞を提供する。本発明は、分泌型ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞を投与することによって腫瘍に対する免疫反応を促進する方法をも提供する。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌型ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞発現ベクターがトランスフェクトされた腫瘍細胞を具えることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記分泌型ｇｐ９６ポリペプチドが、ｇｐ９６ポリペプチドと免疫グロブリンシグナルペプチド（ＩｇＳＰ）とを含む融合タンパクであることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物において、前記免疫グロブリンシグナルペプチドが、マウス免疫グロブリンシグナルペプチド、ラット免疫グロブリンシグナルペプチド、ブタ免疫グロブリンシグナルペプチド、サル免疫グロブリンシグナルペプチド、及び、ヒト免疫グロブリンシグナルペプチドからなる群より選択されることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物において、前記免疫グロブリンシグナルペプチドがマウス免疫グロブリンシグナルペプチドであることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項２に記載の組成物において、前記免疫グロブリンシグナルペプチドがヒト免疫グロブリンシグナルペプチドであることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物が、さらに、Ｂ細胞抗原に対する抗体を少なくとも１つ具えることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物において、前記抗体が、類人霊長類抗体、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群より選択されることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の組成物において、前記抗体が、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項６に記載の組成物において、前記Ｂ細胞抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ７４からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
ヒト対象において防御免疫反応を生じさせる方法において、分泌型ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞発現ベクターがトランスフェクトされた有効量の腫瘍細胞を前記対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記分泌型ｇｐ９６ポリペプチドが、ｇｐ９６ポリペプチドと免疫グロブリンシグナルペプチドとを含む融合タンパクであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記免疫グロブリンシグナルペプチドが、マウス免疫グロブリンシグナルペプチド、ラット免疫グロブリンシグナルペプチド、ブタ免疫グロブリンシグナルペプチド、サル免疫グロブリンシグナルペプチド、及び、ヒト免疫グロブリンシグナルペプチドからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記免疫グロブリンシグナルペプチドがマウス免疫グロブリンシグナルペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法において、前記免疫グロブリンシグナルペプチドがヒト免疫グロブリンシグナルペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法において、前記ｇｐ９６免疫化を約１週間から約６週間の期間にわたって１日２回行うことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法が、前記ｇｐ９６免疫化を約１週間から約６週間の期間にわたって１日１回行うことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法において、薬学的に許容可能な担体とＢ細胞抗原に対する少なくとも１つの抗体とを含む治療組成物を前記対象に投与するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記治療組成物を、単位用量当たり２０ｍｇ〜２０００ｍｇの用量で非経口的に投与することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法において、前記対象に反復的非経口投与によって前記抗体を接種することを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法において、前記抗体が、類人霊長類抗体、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法において、前記抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、又は、ヒト化抗体であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１７に記載の方法において、前記Ｂ細胞抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ７４からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
ヒト対象において防御免疫反応を生じさせる方法において、分泌型熱ショックタンパク（ｈｓｐ）ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞発現ベクターがトランスフェクトされた有効量の腫瘍細胞を前記対象に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
癌に対するワクチンを製造する方法において、分泌型熱ショックタンパク（ｈｓｐ）ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を含む真核生物の発現ベクターがトランスフェクトされた腫瘍細胞をコードする核酸を発現するように癌細胞集団を遺伝子操作するステップを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２００８年３月２０日に提出した米国仮特許出願第６１／０３８，３１３号の優先権の利益を主張する。これらの全内容はここで言及することによって組み込まれている。
［政府支援］
本発明は、国立衛生研究所によってＡＣＧＴから与えられた許可番号ＣＡ１０９０９４、ＣＡ０３９２０１の下の米国政府支援によってなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有することがある。
［技術分野］
本発明は、医学、免疫学及び腫瘍学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、動物対象の腫瘍に対する免疫反応を誘導する方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗腫瘍ワクチン接種は、非常に有効であり、腫瘍を有しない未治療マウスに投与すればその後の投与時に腫瘍増殖を防ぐ。予防が持続性で腫瘍特異的であることは、一般に、適応的免疫反応の関与を示唆している。既に定着した腫瘍の治療的処置にワクチンを用いるときには、この様相が根本的に変わる。防御免疫を有効に確立することができるワクチンの同じ用量は、通常、治療的利益を与えることができない。治療ワクチン接種が有効でない理由は、腫瘍によって誘導される抑制細胞の誘導、制御性細胞の発生、Ｔ細胞アネルギー又は耐性の誘導、又は、これらの機構の組合せに起因すると考えられる。腫瘍によって誘導される免疫抑制の正確な機構がどのようなものであったとしても、癌治療のためのワクチン接種療法の成功は、これらの腫瘍によって誘導される抑制作用を克服又は制圧することに依存するであろう。
【０００３】
小胞体（ＥＲ）に局在する熱ショックタンパク（ｈｓｐ）ｇｐ９６は、ペプチドがＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子になる過程においてシャペロンとして機能すると考えられている。Ｇｐ９６をシャペロンとして折りたたまれるペプチドは、ペプチドの全薬効領域及び細胞内で生成された大きなタンパク断片を含んでおり、小胞体中に移される。腫瘍細胞から得られてワクチンとして用いられるＧｐ９６は、おそらくは、腫瘍特異的ペプチドのＡＰＣへの輸送を介して、特異的腫瘍免疫性を誘導する。Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｎｏｖ  １５；１６３（１０）：５１７８−８２を参照されたい。
【０００４】
本出願に記載されている発明は、抗腫瘍組成物を提供する。熱ショックタンパク糖タンパク（ｇｐ）９６関連ペプチドは、樹状細胞によってＣＤ８細胞に交差提示される。ワクチン接種系は、抗腫瘍療法に適するように開発された。Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８  Ｍａｙ；３１（４）：３９４−４０１及びそこで引用されている文献を参照されたい。ｇｐ９６−免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ１−Ｆｃ融合タンパクを腫瘍細胞内にトランスフェクトすることによって、シャペロンで折りたたまれた腫瘍ペプチドと複合したｇｐ９６−Ｉｇが分泌される。ｇｐ９６−Ｉｇを分泌する腫瘍の非経口投与は、先天性免疫系の活性化と結びついて、強い抗原特異的ＣＤ８細胞毒性Ｔリンパ球増殖を生じさせる。腫瘍によって分泌されるｇｐ９６は、ｇｐ９６分泌部位に樹状細胞（ＤＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の動員を生じさせ、ＣＤ９１及びトール様受容体−２及びトール様受容体−４に結合することによって樹状細胞活性化を媒介する。ｇｐ９６のエンドサイトーシス的取り込み、及び、そのシャペロンによって折りたたまれたペプチドは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩと、ＣＤ４細胞から独立した同族ＣＤ８の強い活性化とによって、ペプチド交差提示を誘導する。このモデル系において、適合移植された、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニック緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）で標識されたＣＤ８Ｔ細胞を用いることによって、ワクチン接種から４日〜５日以内にＣＤ８ＣＴＬ増殖を正確に定量することができる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、分泌型熱ショックタンパク（ｈｓｐ）ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞を提供する。また、本発明は、分泌型ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞を投与することによって、癌腫瘍を含む腫瘍に免疫反応を促進する方法を提供する。好ましくは、免疫反応は防御免疫反応である。好ましくは、腫瘍細胞は同種異系腫瘍細胞である。本発明は、分泌型ｇｐ９６ポリペプチドを発現するように遺伝操作された腫瘍細胞、例えば癌腫瘍細胞を投与することによって、癌を含む腫瘍を抑制する方法をさらに提供する。好ましくは、腫瘍細胞は同種異系腫瘍細胞である。本発明は、癌に対するワクチンを製造する方法であって、分泌型熱ショックタンパク（ｈｓｐ）ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞発現ベクターを用いてトランスフェクトされた腫瘍細胞をコードする核酸を発現するように癌細胞群を遺伝子操作するステップを含む方法をさらに提供する。本発明は、ヒト対象において防御免疫反応を生じさせる方法であって、分泌型熱ショックタンパク（ｈｓｐ）ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞発現ベクターを用いてトランスフェクトした有効量の腫瘍細胞を前記対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
【０００６】
ある好ましい実施形態によれば、ｇｐ９６ポリペプチドは、ｇｐ９６ポリペプチドと免疫グロブリンシグナルペプチド（ＩｇＳＰ）とを含む融合タンパクである。選択的に、前記ＩｇＳＰは、マウスＩｇＳＰ、ラットＩｇＳＰ、ブタＩｇＳＰ、サルＩｇＳＰ、ヒトＩｇＳＰからなる群より選択される。
【０００７】
好ましい実施形態によれば、約１日から約６か月の期間中にｇｐ９６免疫化をたびたび（例えば、１日１回又は１日２回）実行する。その他の好ましい実施形態によれば、治療用組成物を単位用量当たり２０ｍｇ〜２０００ｍｇの投薬量で非経口的に投与する。
【０００８】
好ましい実施形態によれば、ｇｐ９６免疫化を、正常なＢリンパ球及び／又は悪性のＢリンパ球を破壊する化合物、又は、多すぎるＢ細胞、過活性Ｂ細胞又は機能障害Ｂ細胞を有することを特徴とする疾病を治療するために用いられる化合物と組み合わせて投与する。そのような疾病には、白血病又はリンパ腫などの腫瘍疾患が含まれる。好ましくは、Ｂ細胞破壊する化合物が抗体である。いくつかの実施形態においては、抗体が、類人霊長類の抗体、ネズミのモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選択される。他の実施形態においては、抗体が結合するＢ細胞抗原が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ７４から選択される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ−Ｆ  ｇｐ９６−ＩｇをトランスフェクトしたＥ．Ｇ７（Ａ）及びＬＬＣ（Ｂ）の低下した腫瘍形成性。■、Ｇｐ９６−Ｉｇをトランスフェクトしたもの；○、疑似トランスフェクトしたもの；及び、□、トランスフェクトしていない細胞。ワクチン接種を行った細胞の用量当たりに６つのマウスの群を用いた。Ｃ−Ｆ、分泌ｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種は、腫瘍特異的メモリーを生じさせる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０６個のｇｐ９６−ＩｇがトランスフェクトされたＥ．Ｇ７（すべてのパネルにおいて■）によって、１０６個の放射線照射されたＥ．Ｇ７（□）によって隔週の間隔で２回免疫化を行い、又は、免疫化を行わなかった（・）。２週間後に、パネルに示した数の腫瘍細胞をマウス（１群当たり６頭のマウス）に投与した。腫瘍を増殖させていないマウスを３か月間観察して腫瘍がないと判断した。
【図２】図２Ａ−Ｃ  Ａ、初期段階中の１０６個のＥ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇの拒絶反応に対する免疫適格細胞の枯渇の効果；コントロールにＰＢＳを投与した。個々のマウスの腫瘍増殖曲線を示す。概略的に枯渇スケジュールを頂部に示す。１０６個のＥ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇの接種の２日前に、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４又はカラギーナンを用いて免疫適格細胞の枯渇を実行した。Ｂ、ＣＤ４欠損マウスは、Ｅ．Ｇ７−ｇｐ−Ｉｇを拒絶することができる。５頭のＣＤ４欠損マウスに未照射の１０６個のＥ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇを皮下注射で投与した。腫瘍成長を記録して平均腫瘍直径として公表する。Ｃ、Ｅ．Ｇ７拒絶反応のエフェクター段階に対する免疫適格細胞の枯渇の効果。免疫化及び免疫によるタンパク除去の時間的推移を頂部に概略的に示す。免疫化のために、６頭のマウスの群に１０６個の未照射のＥ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇを皮下注射で２回接種させた。１０６個のＥ．Ｇ７を投与する３日前に、上記のように免疫細胞が枯渇した；コントロールにＰＢＳを接種した。腫瘍増殖を記録して平均腫瘍直径として公表した。
【図３】図３Ａ−Ｂ  ＣＤ８Ｔ細胞のＧｐ９６媒介性クロスプライミングは、ＣＤ４細胞の非存在下で強まるが、ＣＤ４０Ｌの不存在によって影響されない。マウスの静脈内に１００万個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉを接種し、２日後に４００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇを腹腔内に接種して免疫化させた。さらに５日後に腹膜腔（ＰＣ）から細胞を採取し、ＦＡＣＳによってＣＤ８ゲートにおけるＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ頻度について分析した。値は、腹膜中のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉの絶対数として表されている。Ａ、ＷＴマウスと比較したＣＤ４欠損マウス。Ｂ、ＣＤ４０Ｌ欠損マウス。
【図４】図４Ａ−Ｃ  ＣＤ８Ｔ細胞のＧｐ９６媒介性クロスプライミングは、ＣＤ８０及びＣＤ８６を必要とし、ＮＫＴ細胞に依存しない。マウスに１００万個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉを静脈内に接種し、２日後に腹腔内に４００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ（Ａ及びＣ）あるいは、２００万個の３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇ（Ｂ）を接種して免疫化させた。さらに５日後に脾臓（ＳＰ）又はその腹膜から細胞を採取し、ＦＡＣＳによってＣＤ８ゲートにおけるＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ頻度について分析した。Ａ、ＣＤ８０又はＣＤ８６の単欠損；Ｂ、ＣＤ８０／ＣＤ８６の二重欠損；及び、Ｃ、ＮＫＴ欠損（Ｊα１８ｋｏ）。
【図５Ａ】図５Ａ  リンパ腺の非存在下におけるｇｐ９６による効率的なクロスプライミング。ＬＴａ欠損、代表的なＦＡＣＳデータ。マウスの静脈内に１００万個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉを接種し、２日後に２００万個の３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇを腹腔内に接種して免疫化させた。さらに５日後に示されている部位から細胞を採取し、ＦＡＣＳによってＣＤ８ゲートにおけるＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ頻度について分析した。
【図５Ｂ】図５Ｂ  リンパ腺の非存在下におけるｇｐ９６による効率的なクロスプライミング。ヒストグラムで表示した同じデータ。データは、２つの独立した試験の代表値であり、各バーは、２つのマウスの平均±標準誤差を表す。
【図５Ｃ】図５Ｃ  リンパ腺の非存在下におけるｇｐ９６による効率的なクロスプライミング。エクスビボにおける３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−ＩｇによるＯＴ−Ｉのクロスプライミング。３日前に３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇ、３Ｔ３−ｇｐ９６−Ｉｇ又は３Ｔ３を腹腔内に注入したマウスから採取したＰＥＣを、１：１０、１：１００及び１：１０００のＯＴ−Ｉ：ＰＥＣの比率でＣＦＳＥラベルされたＯＴ−Ｉと共に７２時間培養した（ａ〜ｆ）。さらなるコントロールとして、３Ｔ３トランスフェクタントをそのままＯＴ−Ｉと共にインビトロで培養した。細胞を抗ＣＤ８−ＰＥによって染色し、ＣＦＳＥ希釈について分析した。これらをｂ〜ｈに示す。
【図６】図６Ａ−Ｂ  ｇｐ９６−ＯＶＡによるＣＤ８Ｔ細胞のクロスプライミングは、ＥＧ７−Ｋｂ−ＯＶＡを介した抗原提示による直接プライミングよりも効率的である。マウスの静脈内に１００万個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ接種し、２日後に２００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ又はＥＧ７を腹腔内に接種して免疫化させた。Ａ、免疫化前（免疫前）及び免疫化の５日後に腹膜から細胞を採取し、ＦＡＣＳによってＣＤ８ゲートにおけるＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ頻度について分析した。Ｂ、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ及びＥＧ７免疫化の後の腹膜及び脾臓におけるＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ増殖の動態；規定の部位におけるＧＦＰ−ＯＴ−Ｉの総数がプロットされている。
【図７】図７Ａ−Ｂ  ｇｐ９６による先天性免疫細胞の腹膜への動員の増加。第２日に１００万個のＯＴ−１を静脈内に移し、２日後に４００万個のＥＧ７又はＥＧ７ｇｐ９６−Ｉｇ細胞を腹腔内に注入した。示されている日に腹膜から細胞を採取し、フローサイトメトリによって表現型を決定した。Ａ、ＣＤ１１ｃ＋の動員、ＮＫ１．１＋、及び、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇの注入によるＦ４／８０ｄｉｍ細胞。Ｆ４／８０ｂｒｉｇｈｔ細胞は免疫化前に腹膜内存在しており、免疫化後に数が変わらない。Ｂ、ＥＧ７及びＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによる腹膜への細胞動員の比較。
【図８】図８Ａ−Ｃ  Ｇｐ９６分泌は、樹状細胞及びＣＤ８細胞の増殖を媒介し、腹腔においてナチュラルキラー細胞を活性化する。マウスの静脈内に１００万個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉを接種し、２日後に４００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ又はＥＧ７を腹腔内に接種して免疫化させた。Ａ、４×１０６個のＥＧ７又はＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによる免疫化の２日後及び４日後にＢｒｄＵ染色によって測定した腹膜、腸間膜、大動脈周囲リンパ節（ｄＬ）及び脾臓（ＳＰ）のＣＤ１１ｃ＋細胞の増殖。ＣＤ１１ｃ＋細胞を閉じ込めて、細胞内染色によるＢｒｄＵについて分析した。第２日の腹膜においてＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ投与後のみのＣＤ１１ｃ＋増殖（赤い線）に留意されたい。免疫化を行った日からマウスに飲用水中からＢｒｄＵを摂取させた。Ｂ、ＢｒｄＵ取り込みによって測定されたＣＤ８増殖は、第２日の腹膜において（赤い線）ｇｐ９６プライミング後のみに検出可能である。第４日の腹膜においてＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ免疫化後の大幅なＣＤ８の増殖；ｄＬＮ、流入リンパ節（傍大動脈、腸間膜）；ｎｄＬＮ、非流入リンパ節（鼠蹊）。Ｃ、ＣＤ６９アップレギュレーションで測定したＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ免疫化による腹膜中のＮＫ１．１細胞の活性化。Ａ−Ｃ、３つの独立試験の代表である。
【図９】図９Ａ−Ｂ  遊離ＯＶＡタンパクと比較した、ｇｐ９６よって折りたたまれたＯＶＡによって強められたＣＤ８Ｔ細胞クロスプライミング。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの静脈内に１００万個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉを接種し；２日後に、異なる数の同系ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ若しくは同種異系３Ｔ３−ＯＶＡ若しくは３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇによって、又は、ＰＢＳ中のＯＶＡタンパクによって腹腔で免疫化させた。腹腔内注入用の細胞数を、Ｘ軸上に示されているように２４時間内に分泌されるｇｐ９６−Ｉｇ又はＯＶＡの量を生成するように調節した。ＯＶＡ及びｇｐ９６−Ｉｇ分泌を、それぞれ、ＥＬＩＳＡによってインビトロにおいて測定した。免疫化の５日後に、フローサイトメトリによって腹膜内でＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ増殖を測定した。Ａ、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ及びＯＶＡタンパクに対するＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ増殖。Ｂ、３Ｔ３−ＯＶＡ、３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇ及びＯＶＡタンパクに対するＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ増殖。
【図１０】図１０Ａ−Ｂ  Ｇｐ９６は、タンパククロスプライミングのためのアジュバントであり、連続的に放出されたときに最も効率的に作用する。Ａ、マウスの静脈内に１００万個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉを接種し、２日後に示されているように腹腔内で免疫化を行った。インビボにおけるＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ増殖を免疫化の４日後にＦＡＣＳによって測定した。注入した細胞から分泌された生成物をインビトロにおいてＥＬＩＳＡで定量した。示されている生成物の分泌量は、注入された細胞数によって２４時間以内の培養で分泌された量を表す。３Ｔ３−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞から分泌された２００ｎｇのｇｐ９６を加えた５０μｇのＯＶＡが、〜０．１％のｇｐ９６−ＯＶＡを含む３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇから分泌された２００ｎｇのｇｐ９６−Ｉｇよりも少ないＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ増殖を引き起こすことに留意されたい。Ｂ、マウスの静脈内に１００万個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉを接種し、２日後に腹腔内で上澄み３Ｔ３−ＯＶＡ  ｇｐ９６−Ｉｇ培養から採取した２００ｎｇの可溶性ｇｐ９６−Ｉｇを用いて、又は、続く２４時間以内に２００ｎｇのｇｐ９６−Ｉｇを分泌する３Ｔ３−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞数を用いて免疫化を行った。免疫化の４日後に腹膜におけるＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ増殖をフローサイトメトリによって測定した。
【図１１】図１１Ａ−Ｄ  離れた定着腫瘍によるＯＴ−Ｉ  ＣＴＬ増殖の抗原非特異的抑制。Ａ、免疫化していないマウス；腫瘍がない免疫化マウス；及び、ＥＧ７癌を有する免疫化マウスの腹膜におけるＯＴ−Ｉ  ＣＤ８  ＣＴＬ頻度の比較。１００万個のＥＧ７腫瘍細胞をわき腹の皮下に移植し、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによる免疫化の５日前に定着させた。免疫化の２日前に１００万個のＯＴ−Ｉ  ＣＤ８  Ｔ細胞を静脈内に適合移植した。２００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇを用いて腹腔内でマウスを免疫化させた。５日後にフローサイトメトリによって腹膜細胞を分析した。Ｂ、定着腫瘍によるＯＴ−Ｉ増殖の抑制は抗原非特異的である。ＥＧ７に代えて、オバルブミンを発現しないＥＬ４及びＬＬＣを５日間定着させた。ＯＴ−Ｉ適合移植及びワクチン接種をＡと同様に行った。Ｃ、定着腫瘍の不存在下又は存在下においてワクチン接種部位である腹膜腔に蓄積するＯＴ−Ｉの絶対数（Ｂと同じ試験）。Ｄ、腹膜腔に入れた総細胞数は、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ免疫化によって定着腫瘍の存在下で増加する。３つ以上の個々の試験の代表的試験を示す。Ｎ＝各グループに３〜５頭のマウス。図に示した有意値は、ｔ試験によって計算した。ネガティブコントロールは免疫化されていない（免疫前）マウスであり、ポジティブコントロールはわき腹に末梢腫瘍がないマウスである。ＣＴＬは細胞毒性Ｔリンパ球；ｇｐは糖タンパク；Ｉｇは免疫グロブリン；ＬＬＣはルイス肺癌を表す。
【図１２】図１２Ａ−Ｄ  頻繁なｇｐ９６免疫化は腫瘍によって誘導される免疫抑制を克服することができる。Ａ、１００万個のＥＧ７腫瘍細胞をわき腹の皮下に移植した。腫瘍移植と同日又は２日後若しくは４日後に、１００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ又は被照射ＥＧ７の腹腔内投与による免疫化を開始した。ネガティブコントロール−非治療、ｎ＝１７；被照射ＥＧ７免疫化、ｎ＝１５。異なるスケジュールでのＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによる免疫化、ｎ＝１５。Ｂ、腹腔内免疫化を第３日に開始して第１４日（黒矢印）まで毎日繰り返した以外は、Ａと同様に行った。１００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ（ｎ＝１７）又は１００万個のＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇ（ｎ＝５）又は被照射ＥＧ７（ネガティブコントロール、ｎ＝５）又は、非療法（ネガティブコントロール、ｎ＝１９）。Ｃ、腫瘍を５日間定着させ、次いで、１００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇを用いて第５日〜第１６日まで１日１回（黒矢印）若しくは１日２回（赤矢印）腹腔内において免疫化させた。各群につきｎ＝５であった。Ｄ、腫瘍を７日間定着させ、次いで、１００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇを用いて１日１回（黒矢印）若しくは１日２回（赤矢印）、又は、第７日〜第１８日まで１日１回若しくは２回腹腔内において免疫化させた。各群につきｎ＝５であった。腫瘍増殖における差の有意値を各グラフに示す。ｇｐは糖タンパク；Ｉｇは免疫グロブリン；ＬＬＣはルイス肺癌；ｎｓは有意でないこと（ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）を意味する。
【図１３】図１３  頻繁な免疫化は、定着したＬＬＣの腫瘍増殖遅延を生じさせる。ＬＬＣ（１０５個）をわき腹の皮下に移植し、３日間定着させた。１００万個のＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇ（ｎ＝１５）、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ（ｎ＝５）、若しくは、被照射ＬＬＣ（ｎ＝５）による免疫化、又は、非療法（ｎ＝１９）を、第３日に開始し、第７日、第１０日、及び、第１４日に繰り返した。１９頭の非治療マウスと、１５頭の治療された癌があるマウスとの間に有意差が示された（Ｐ＝０．０２３４）。ｇｐは糖タンパク；Ｉｇは免疫グロブリン；ＬＬＣはルイス肺癌を意味する。
【図１４Ａ】図１４Ａ  Ｂ細胞は、ｇｐ９６によって媒介されるナチュラルキラー細胞の腹膜腔への動員、及び、腹膜腔内の樹状細胞の保持を抑制する。ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ免疫化による腹膜腔内へのＢ細胞の動員、わずかのみのＣＤ５＋Ｂ細胞の動員。腫瘍がないマウスに１００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇを接種した。その後にフローサイトメトリによってＣＤ５＋細胞及びＣＤ５＿Ｂ細胞の蓄積を毎日測定した。３つより多い試験の代表。
【図１４Ｂ】図１４Ｂ  Ｂ細胞は、ｇｐ９６によって媒介されるナチュラルキラー細胞の腹膜腔への動員、及び、腹膜腔内の樹状細胞の保持を抑制する。Ｂ細胞欠損マウス（ＢＣＤＭ）におけるナチュラルキラー細胞の動員増加並びにナチュラルキラー細胞及び樹状細胞の保持と、Ｂ細胞の適合移植によるその逆転。ＷＴ及びＢＣＤＭを２００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇを用いて腹腔内で免疫化させ、細胞を２日後及び４日後に腹膜腔から採取し、フローサイトメトリによって分析した。ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇを用いた免疫化の２日前に、１０７個の野生型Ｂ細胞の静脈内適合移植によってＢ細胞再構成を行った。３回の試験の代表。ＢＣＤＭはＢ細胞欠損マウス、ＤＣは樹状細胞；ｇｐは糖タンパク質；Ｉｇは免疫グロブリン；ＮＫはナチュラルキラー；ＷＴは野生型を示す。
【図１５】図１５Ａ−Ｂ  Ｇｐ９６によって媒介されるＯＴ−Ｉ  ＣＤ８  ＣＴＬ増殖は、Ｂ細胞の非存在下において増加して持続する。野生型マウス及びＢ細胞欠損マウスに１００万個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉを接種し、さらに、Ｂ細胞が再構成されたマウスに１０００万個の野生型Ｂ細胞を静脈内に適合移植した。２日後に４００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇでマウスを免疫化し、示されている日に腹膜腔（Ａ）と腸間膜と大動脈周囲リンパ節（ｄＬＮ）（Ｂ）とから細胞を採取することによって分析した。＊Ｐ＝反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって０．０４。各グループに４頭のマウス、３回の試験の代表。ＡＮＯＶＡは分散の分析；ＣＴＬは細胞毒性Ｔリンパ球；ｄＬＮは流入リンパ節；ＧＦＰは緑色蛍光タンパク；ｇｐは糖タンパク；Ｉｇは免疫グロブリン；ＷＴは野生型を意味する。
【図１６】図１６Ａ−Ｂ  Ｇｐ９６によって媒介される腫瘍拒絶反応は、ＢＣＤＭにおいて強まり、Ｂ細胞再構成によって停止する。Ａ、野生型マウス。Ｂ、ＢＣＤＭ。１００万個のＬＬＣ−ｏｖａ細胞を含む０．２ｍＬ  ＰＢＳをわき腹に移植した。５日後に１００万個のＯＴ−Ｉを静脈内に接種した。腫瘍移植の７日後にマウスの静脈内に１００万個のＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇを接種して免疫化させた。腫瘍サイズをキャリパを用いて二次元で測定した。各グループにおいてＮ＝５、３回の試験の代表。ＢＣＤＭはＢ細胞欠損マウス；ｇｐは糖タンパク質；Ｉｇは免疫グロブリン；ＬＬＣはルイス肺癌；ＰＢＳはリン酸塩緩衝食塩水を意味する。
【図１７】図１７Ａ−Ｃ  高いＣＴＬ前駆物質頻度及び免疫化は、ＢＣＤＭにおいてｇｐ９６ワクチンによる腫瘍拒絶反応を強める。Ａ、ＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇによるワクチン接種を省略した以外は、図６のようにＢＣＤＭを処理した。Ｂ、ＯＴ−Ｉ移植を省略した以外は図６のように行った。Ｃ、腫瘍（ＬＬＣ−ｏｖａ）移植前に１０００万個のＢ細胞を用いてＢＣＤＭマウスを再構成した以外は、図１６に示されているように行った。各グループにおいてｎ＝５〜６であり、２つの試験の代表である。ＢＣＤＭはＢ細胞欠損マウス；ＣＴＬは細胞毒性Ｔリンパ球；ｇｐは糖タンパク；Ｉｇは免疫グロブリン；ＬＬＣはルイス肺癌を意味する。
【図１８】図１８  小型Ｂ細胞群は、ＬＬＣ−ｏｖａ腫瘍抗原投与に対する免疫反応を抑制する可能性がある。ＬＬＣ−ｏｖａ移植の４日後（ＯＴ−Ｉ注入の１日前）に、ヒトＣＤ２０トランスジェニックマウスのそれぞれに１ｍｇのリツキシマブ（登録商標）又はＰＢＳを接種した。この処理の７日後に、フローサイトメトリによってＰＢＬ中のＣＤ１９＋細胞の頻度を調べた。リツキシマブ（登録商標）を注入した後にＰＢＬ中に残されたＣＤ１９＋細胞群は、約３％であった。各バーのデータは、３頭のマウスの平均値±標準誤差である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
いくつかの好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒト対象の防御免疫反応を生じさせる方法であって、形態分泌の熱ショックタンパク（ｈｓｐ）ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞発現ベクターをトランスフェクトした有効量の腫瘍細胞を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１１】
いくつかの好ましい実施形態によれば、癌に対するワクチンを製造する方法であって、分泌型熱ショックタンパク（ｈｓｐ）ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞発現ベクターがトランスフェクトされた腫瘍細胞を形成する核酸を発現するように癌細胞群を遺伝子操作するステップを含む方法を提供する。
【００１２】
いくつかの好ましい実施形態によれば、本発明は、腫瘍に対する免疫反応を促進する方法であって、対象に分泌型熱ショックタンパク（ｈｓｐ）ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞発現ベクターをトランスフェクトした有効量の腫瘍細胞を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
いくつかの好ましい実施形態によれば、本発明は、腫瘍増殖を阻害する方法であって、分泌型熱ショックタンパク（ｈｓｐ）ｇｐ９６ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞発現ベクターをトランスフェクトした有効量の腫瘍細胞を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
ｇｐ９６ポリペプチド
好ましくは、ｇｐ９６ポリペプチドは、野生型タンパクの１つであり、より好ましくは野生型ヒトｇｐ９６ポリペプチドである。本発明に有用なｇｐ９６ポリペプチドには、上記ｇｐ９６ポリペプチドに対する実質的な相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を有するｇｐ９６ポリペプチドが含まれる。好ましくは、用いるｇｐ９６ポリペプチドは、ここに記載されている又は当業界で知られているｇｐ９６ポリペプチドと少なくとも７０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、又は、さらにより好ましくは９５％以上の同一性又は相同性を有する。最も好ましくは、用いるｇｐ９６ポリペプチドは、野生型ヒトｇｐ９６ポリペプチドに対して少なくとも９９％以上の相同性又は同一性を有する。
【００１５】
候補ポリペプチドが本発明のｇｐ９６ポリペプチドとの相同性を共有する程度は、２つのアミノ酸配列間の相同性又は同一性の程度として決定される。
【００１６】
高いレベルの配列同一性は、第１の配列が第２の配列に由来している可能性を示す。アミノ酸配列同一性は、２つの整列した配列間における同一のアミノ酸配列を必要とする。従って、参照配列と７０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、位置合わせ後に、候補配列のアミノ酸の７０％が参照配列の対応アミノ酸と同一であることを必要とする。同一性は、以下に限定されないが、例えば、クラスタルＸコンピュータ配列プログラム(Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ  Ｄ，Ｇｉｂｓｏｎ  Ｔ  Ｊ，Ｐｌｅｗｎｉａｋ  Ｆ，Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ  Ｆ，＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ  Ｇ：“Ｔｈｅ  ＣｌｕｓｔａＩＸ  ｗｉｎｄｏｗｓ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｉｄｅｄ  ｂｙ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ”；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５（２４）：４８７６−８２）及びこれに示されているデフォルトパラメータなどのコンピューター分析によって決定される。このプログラムを用いて、本発明の類似ＤＮＡ塩基配列によってコードされたポリペプチドの成熟部分は、ｇｐ９６ポリペプチド配列のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは少なくとも９９％以上のの程度の同一性を示す。
【００１７】
本発明のｇｐ９６ポリペプチドは、様々なポリペプチドを含む。本発明の文脈において、「様々なポリペプチド」という用語は、１つ以上のアミノ酸位置において野生型ｇｐ９６ポリペプチドと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド（又はタンパク）を含む。そのような様々なポリペプチドには、上述した組み換えポリペプチド、保存的置換体、スプライス変異体、アイソフォーム、他種に由来する同族体及び多様型も含まれる。
【００１８】
ここに定義するように、上記の「保存的置換」という用語は、生物学的に類似した他の残基によるアミノ酸残基の置換を表す。通常は、生物学的相同性は、上で言及したように、保存されたアミノ酸による野生型配列の置換を反映する。
【００１９】
例えば、特にポリペプチド又はタンパクにおける残基の総数の１０％未満に相当すれば、保存アミノ酸置換が生物活性に対してほとんど影響を与えないか又は全く影響しないことが予想される。好ましくは、保存アミノ酸置換は、ポリペプチド又はタンパクの５％未満において変化し、最も好ましくはポリペプチド又はタンパクの２％未満で変化する。
【００２０】
一実施形態において、ｇｐ９６ポリペプチドが最大１５個のアミノ酸置換を含む。別の一実施形態においては、ｇｐ９６ポリペプチドが最大１２個のアミノ酸置換を含む。別の一実施形態においては、ｇｐ９６ポリペプチドが最大１０個のアミノ酸置換を含む。別の一実施形態においては、ｇｐ９６ポリペプチドが最大８個のアミノ酸置換を含む。別の一実施形態においては、ｇｐ９６ポリペプチドが最大５個のアミノ酸置換を含む。特に好ましい実施形態においては、成熟配列に１個のアミノ酸置換を有し、置換されたアミノ酸及び置換するアミノ酸のいずれもが非環式である。特に保存的置換の他の例には、疎水性残基による、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどのその他の残基の置換、又は、アルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、若しくは、グルタミンによるアスパラギンの置換などの極性残基による他の残基の置換が含まれる。
【００２１】
この保存的置換という用語は、置換されたポリペプチドに対して上昇した抗体が置換されていないポリペプチドと免疫反応するのであれば、置換されていない親アミノ酸残基に代えて置換されたアミノ酸残基を使用することを含む。
【００２２】
この一次アミノ酸配列の変更は、変更されていない対応ポリペプチドと比べて実質的に同等な活性を有するタンパクを生じさせ、従って、親タンパクの機能的な類似化合物と考えることができる。そのような変更は、例えば、部位特異的変異誘発による意図的なものであってもよいし、又は、自然発生的なものであってもよく、スプライス変異体、アイソフォーム、他の種に由来する同族体及び多様型が含まれる。そのような機能的類似化合物も本発明によって意図されている。
【００２３】
シグナルペプチド
シグナルペプチドは、染色体ＤＮＡのコーディング部位に囲まれており、リボソーム器官によってタンパクの一部として合成される。シグナルペプチドは、通常Ｎ末端を構成し、新たに合成されたそのポリペプチドを粗面小胞体に誘導する。ここで、シグナルペプチドはポリペプチドから切断され、成熟したタンパクが周囲に分泌される。従って、シグナルペプチドは細胞内に残る。
【００２４】
シグナルペプチド−真核生物のシグナルペプチド。真核生物のシグナルペプチドは、分泌されるか又は膜成分となるように予定されたタンパクに存在するペプチドである。それは通常タンパクに対してＮ末端である。本文脈においては、ＳｉｇｎａｌＰ（バージョン２．０又は好ましくはバージョン３．０）によって確認されるすべてのシグナルペプチドがシグナルペプチドと考えられる。
【００２５】
哺乳類のシグナルペプチドは、小胞体から分泌される哺乳類のタンパクに由来するシグナルペプチドである。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態によれば、ｇｐ９６分子をシグナルペプチド（ＳＰ）に結合させてｇｐ９６−ＳＰ融合タンパクを生成する。本発明による発現ベクターは、ｇｐ９６ポリペプチドに作用可能な状態で連結されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を導くことができるプロモーター配列を含む核酸を含む。
【００２７】
シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドなどの異種シグナルペプチドなどのいかなる機能性シグナルペプチドであってもよい。このシグナルペプチドは、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタなどのあらゆる適切な種に由来していてもよい。
【００２８】
ある実施形態においては、免疫グロブリンシグナルペプチド（ＩｇＳＰ）は、哺乳動物のほとんどのグループで知られている１９個の小さなアミノ酸ペプチドである。マウスＩｇＳＰが、マウス、ラット及びヒトにおいて機能性であることが知られているので、ＩｇＳＰはマウス又はヒト起源であることが好ましい。ヒトに使用する場合は、あらゆる異種間副作用のリスクを低減するために、ＩｇＳＰがヒト起源であることが好ましい。
【００２９】
好ましくは、ＩｇＳｐは：ヒトＩｇＳＰ（Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ａｌａ）；アカゲザル（サル）ＩｇＳＰ；（Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ）；マーモセット（サル）ＩｇＳＰ（Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  ＧＩｙ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ）；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）ＩｇＳＰ（Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ）；Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ（ブタ）ＩｇＳＰ（Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ）；及び、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）ＩｇＳＰ（Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ）の１つ以上である。
【００３０】
シグナルペプチドの切断：発現構築物に組み込むための特異的ｇｐ９６形態を決定する前に、ＩｇＳＰなどのシグナルペプチドの切断の可能性を最先端の予測ツールを用いてチェックすることができる。そのような好ましい予測ツールの１つは、ＳｉｇｎａｌＰソフトウェア（ＳｉｇｎａｌＰ  ＷＷＷサーバから入手可能）又は同じサーバーから入手可能なより新しいバージョン３．０が好ましい。さらに、シグナルペプチドを選択するためのツール及び技術を記載するいくつかの参考文献が存在する。これらの参考文献には：Ｈｅｎｒｉｋ  Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊａｃｏｂ  Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｓｒｅｎ  Ｂｒｕｎａｋ  ａｎｄ  Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０，１−６（１９９７）．Ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＳｉｇｎａｌＰ−ＨＭＭ  ｏｕｔｐｕｔ  ｍｏｄｅｌ：Ｈｅｎｒｉｋ  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓ  Ｋｒｏｇｈ：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ａｎｃｈｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ．Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＭＢ  ６），ＡＡＡＩ  Ｐｒｅｓｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，ｐｐ．１２２−１３０（１９９８）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ−ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０．Ｊａｎｎｉｃｋ  Ｄｙｒｌｖ  Ｂｅｎｄｔｓｅｎ，Ｈｅｎｒｉｋ  Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  ａｎｄ  Ｓｒｅｎ  Ｂｒｕｎａｋ．Ｊ  Ｍ  Ｂ（２００４）．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ａｎｃｈｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ．Ｈｅｎｒｉｋ  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓ  Ｋｒｏｇｈ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＭＢ  ６），ＡＡＡＩ  Ｐｒｅｓｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，ｐｐ．１２２−１３０，１９９８．が含まれる。上記各参考文献は、ここで言及することによって全体が本明細書に組み込まれている。
【００３１】
投与
いくつかの好ましい実施形態によれば、約１日から約６か月の期間で頻繁に（例えば１日１回、１日２回、１日３回など）ｇｐ９６免疫化を行う。ある実施形態によれば、投与期間は、約１日から９０日；約１日から６０日；約１日から３０日；約１日から２０日；約１日から１０日；約１日から７日である。いくつかの実施形態によれば、投与の期間が約１週から５０週；約１週間から５０週間；約１週間から４０週間；約１週間から３０週間；約１週間から２４週間；約１週間から２０週間；約１週間から１６週間；約１週間から１２週間；約１週間から８週間；約１週間から４週間；約１週間から３週間；約１週間から２週間；約２週間から３週間；約２週間から４週間；約２週間から６週間；約２週間から８週間；約３週間から８週間；約３週間から１２週間；又は、約４週間から２０週間である。
【００３２】
併用療法
いくつかの好ましい実施形態によれば、ｇｐ９６免疫は、正常Ｂリンパ球及び／又は悪性Ｂリンパ球を破壊する化合物、又は、多すぎるＢ細胞、過活性Ｂ細胞又は機能不全Ｂ細胞を特徴とする疾病の治療に用いられる化合物（例えばリツキシマブ（登録商標））と組み合わせて投与される。そのような疾病には、白血病又はリンパ腫などの腫瘍疾患が含まれる。
【００３３】
前記多すぎるＢ細胞、過活性Ｂ細胞又は機能不全Ｂ細胞を特徴とする疾病の治療に用いられる化合物は、Ｂ細胞をターゲットにする抗体であることが好ましい。例えば、米国特許公開公報第２００３／０１３３９３０号を参照されたい。この文献は、ここで言及することによって全体が組み込まれている。Ｂ細胞をターゲットにする抗体は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ７４などのＢ細胞抗原に対する抗体であることが好ましい。好ましくは、治療組成物は、単位用量につき２０ｍｇ〜２０００ｍｇの用量で非経口的に投与される。いくつかの実施形態によれば、非経口投与で抗体を対象に接種する。いくつかの実施形態によれば、対象に、反復的に非経口投与で抗体を接種する。いくつかの実施形態によれば、その抗体は、類人霊長類の抗体、マウスのモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の１つである。いくつかの実施形態によれば、その抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化された抗体の１つである。
【００３４】
いくつかの好ましい実施形態によれば、ｇｐ９６免疫は、１つ以上の抗癌剤と組み合わせて投与される。多くのタイプの抗癌剤は、本発明の方法の用途を有するものの例である。そのようなクラスの抗癌剤及びそれらの好ましい作用機構を以下に述べる。
１．アルキル化剤：ヌクレオチドにアルキル基を提供する化合物。アルキル化されたＤＮＡ自体は複製不能であり、細胞増殖が停止する。そのような化合物の例は、限定されないが、ブスルファン、配位金属複合物（例えばカルボプラチン、オキサリプラチン及びシスプラチンなどの白金配位化合物）、シクロホスファミド（シトキサン）、ダカルバジン、イホスファミド、メクロレタミン（マスタージェン）、及びメルファランを含む。
２．二機能性アルキル化剤：４炭素アルキル鎖の反対端部に結合した２つの不安定なメタンスルフォナート基を有する化合物。メタンスルフォナート基は、癌細胞中のＤＮＡと相互作用し、癌細胞のＤＮＡにダメージを与え、その複製を阻害する。そのような化合物の例は、限定されないが、クロラムブチル及びメルファランを含む。
３．非ステロイド性アロマターゼ阻害剤：エストロジェン生産に関与する酵素アロマターゼを抑制する化合物。従って、アロマターゼをブロックすると、エストロジェンの生産を阻害することになる。そのような化合物の例には、アナストロゾール及びエキセメスタンが含まれる。
４．免疫療法剤：悪性に伴うタンパクを作り出す癌細胞をターゲットにする抗体又は抗体断片。例示的免疫療法剤は、乳癌の約２５％から３０％で高頻度に生じるＨＥＲ２又はＨＥＲ２／ｎｅｕをターゲットにするハーセプチン；結腸癌の上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）をターゲットにするアービタックス；結腸癌によって発現される血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）をターゲットにするアバスチン；及び、Ｂ細胞リンパ腫においてアポトーシスを生じさせるリツキサン、抗ＣＤ２０抗体を含む。さらなる免疫療法剤は、免疫毒素を含み、リシン、ジフテリア毒素及びシュードモナス毒素などの毒素分子は、腫瘍特異抗原を認識する抗体に結合する。結合は、生化学的に又は組換ＤＮＡ方法によって達成することができる。
５．ニトロソ尿素化合物：ＤＮＡ修復に必要とされる酵素を抑制する。これらの薬剤は、脳腫瘍、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫及び悪性黒色腫の治療に用いられるように、脳に移行することができる。ニトロソ尿素の例には、カルマスティン及びロムスチンが含まれる。
６．代謝拮抗物質：ＤＮＡ及びリボ核酸（ＲＮＡ）の合成を阻害する薬剤クラス。これらの薬剤は、位相特異的（Ｓ位相）であり、慢性白血病、並びに、乳房、子房、及び胃腸管の腫瘍の治療に用いられる。代謝拮抗物質の例には、５−フルオロウラシル、メトトレザト、ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、シタラビン（アラ−Ｃ）、及び、フルダラビンが含まれる。
７．抗腫瘍性抗生物質：抗菌活性及び細胞毒性活性を有する化合物。そのような化合物は、酵素及び有糸分裂を化学的に阻害するか又は細胞膜を変化させることによってＤＮＡに干渉してもよい。具体例は、必ずしも限定されるものではないが、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、及び、マニュマイシン（例えば、マニュマイシンＡ、マニュマイシンＣ、マニュマイシンＤ、マニュマイシンＥ、及び、マニュマイシンＧ、並びに、これらの誘導体；例えば米国特許第５，４４４，０８７号を参照されたい）含む。
８．有糸分裂阻害剤：有糸分裂を阻害することができる化合物（例えば、チューブリン結合化合物）、又は、細胞増殖に必要とされるタンパク合成を阻害する酵素を阻害することができる化合物。有糸分裂阻害剤の例には、パクリタキセル及びドセタセルなどのタキサン、エポチロン、エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、並びに、ビノレルビンが含まれる。
９．放射線治療：限定されるものではないが、ビームなどの外部供給源に由来するか又は小さな放射性源の移植によるＸ線又はγ線が含まれる。
１０．トポイソメラーゼＩ阻害剤：トポイソメラーゼ活性を妨げることによってＤＮＡ複製を阻害する薬剤。限定されるものではないが、そのような薬剤には、ＣＰＴ−１１及びトポテカンが含まれる。
１１．ホルモン療法：限定されるものではないが、タモキシフェンなどの抗エストロゲン、リュープロンなどのＧＮＲＨアゴニスト、及び、メゲースなどのプロゲスチン薬剤が含まれる。
【００３５】
当然、広範な様々な機構によって機能する他のタイプの抗癌剤は、ｇｐ９６免疫化及び本発明の方法における用途を有している。そのような薬剤さらなるものには、例えば、ロイコボリン、イレッサ及びフラボピリドールなどのキナーゼ阻害剤、タキサン類似化合物及びエポチロン類似化合物などの従来の化学療法剤の類似化合物、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤などの血管新生阻害剤、及び、ＺＤ６４７４及びＳＵ６６６８などのその他のＶＥＧＦ阻害剤が含まれる。ターグレチンなどのレチノイドをｇｐ９６免疫化及び本発明の方法において使用することもできる。ファメシルトランスフェラーゼ活性を妨げるシグナル変換阻害剤、及び、例えば、バルスポダルといった化学療法抵抗性モジュレーターを使用することもできる。Ｃ２２５及び抗ＶＥＧＦｒ抗体などのモノクローナル抗体を使用することもできる。
【００３６】
癌のタイプ
この「腫瘍」という用語は、良性の腫瘍性成長（例えば、転移をせず、隣接した正常組織を破壊しない腫瘍）、又は、悪性／癌（例えば、周辺組織に侵入し、一般に転移することができ、切除しても後にも再発することがあり、十分に治療しなければ宿主が死亡する）を意味するように用いられる（Ｓｔｅａｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，２６ｔｈ  Ｅｄ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９５）を参照されたい)。ここで用いているように、「腫瘍」、「腫瘍増殖」又は「腫瘍組織」という用語は、互いに交換して用いることができ、制御されていない進行性の細胞増殖の結果から生じ、生理的機能を発揮しない組織の増殖異常を表す。
【００３７】
固形腫瘍は、悪性（例えば、転移する傾向があり、生命を脅かす）又は良性であり得る。本発明の方法によって治療又は予防することができる固形腫瘍の例は、限定されるものではないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、卵管癌、腹膜の原発性癌腫、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭の腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝癌、肝転移、胆管がん、絨毛癌、セミノーマ、精上皮腫、組織非形成性甲状腺癌などの甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚部癌、精巣腫瘍、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌などの肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、並びに、網膜芽腫などの肉腫及び癌を含む。
【００３８】
さらに、頚部、食道及び肺の組織などの上皮組織において、悪性増殖的変化（メタプラシア及びディスプレシアなど）を含む腫瘍は、ｇｐ９６免疫化又は本発明の方法によって治療又は予防することができる。従って、本発明は、知られた又は新生組織形成又は癌に進行することが疑われる病状、特に、異常増殖、メタプラシアからなる非腫瘍性細胞増殖、又は、最も特に、ディスプレシアが発生した場合の治療を提供する（そのような増殖異常症状の検討にＲｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ，１９７６，Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８  ｔｏ  ７９を参照されたい）。異常増殖は、構造又は機能の顕著な変化を伴わない、組織又は器官内の細胞数の増加を含むコントロールされた細胞増殖の形態である。例えば、子宮内膜増殖症は、多くの場合、子宮内膜癌の前に発症する。メタプラシアは、コントロールされた細胞増殖の一形態であり、ある種の成熟細胞又は完全に分化した細胞がその他の種の成熟細胞を置換する。メタプラシアは、上皮組織細胞又は結合組織細胞で生じ得る。特殊なメタプラシアは、やや無秩序な化生上皮を含む。ディスプレシアは、多く場合において癌の前兆であり、主として上皮でみられる。それは、非腫瘍性細胞増殖の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性及び細胞の構造的配向性の損失を含む。形成異常細胞は、多くの場合、異常に大きく、濃染核を有しており、多態性を示す。ディスプレシアは、慢性の刺激又は炎症が存在するところで特徴的に生じ、多くの場合、頚部、気道、口腔及び胆嚢の中で発見される。そのような疾患の検討については、Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい。
【００３９】
良性であり、本発明の方法に従って治療又は予防することができる腫瘍のその他の例は、特に頭蓋内部位の動静脈（ＡＶ）形態異常、及び、骨髄腫を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、固形腫瘍増殖（例えば乳房、前立腺、黒色腫、腎、結腸、頚部腫瘍増殖）及び／又は転移をコントロールする方法であって、必要性のある対象に有効量の本発明の化合物を投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態においては、その対象が哺乳動物である。いくつかの実施形態においては、その哺乳動物がヒトである。
【００４１】
ここで用いているように、「有効量」という用語は、癌に罹患した動物（好ましくはヒト）において望ましい抗癌効果又は抗腫瘍効果を提供するのに充分な量を意味する。前記望ましい抗腫瘍効果は、限定されるものではないが、腫瘍増殖の変化（例えば、腫瘍増殖遅延）、腫瘍サイズ、又は、転移、特定の抗ガン剤に伴う毒性及び副作用の低減、癌の臨床的機能障害又は症状の改善又は最小化、そのような治療の非存在下で期待される期間を超えて対象の生存期間の伸ばすこと、及び、投与前に腫瘍形成がない動物における腫瘍増殖の予防、すなわち、予防的投与を含む。
【００４２】
ここで用いられているように、「調整する」、「調整している」又は「調整」という用語は、特定のプロセスが生じる速度を変化させること、特定のプロセスを阻害すること、特定のプロセスを逆行させること、及び／又は、特定のプロセスの開始を防ぐことを意味する。従って、特定のプロセスが腫瘍増殖又は転移であれば、「調整」という用語は、限定されるものではないが、腫瘍増殖及び／又は転移が生じる速度を低下させること；腫瘍増殖及び／又は転移を阻害すること；腫瘍増殖及び／又は転移を逆行させること（腫瘍収縮及び／又は根絶を含む）、及び／又は、腫瘍増殖及び／又は転移を防ぐことを含む。
【００４３】
ここで用いられているように、「相乗効果」は、２つの薬剤の組合せによって生じる相加よりも強い癌抗効果であって、各薬剤のみの投与によって生じるものを超える効果を意味する。２つの薬剤間の相乗作用の１つの基準は、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙ（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：２４３４−２４３９，（１９８５）を参照されたい)のコンビネーションインデックス（ＣＩ）法であり、この方法は、半有効原理に基づいている。この方法は、様々なレベルの細胞毒性において２つの薬剤間の相乗作用、相加性又は拮抗作用の程度を算出する。ＣＩ値が１未満であれば、２つの薬剤間に相乗作用がある。ＣＩ値が１であれば、相加効果があり、相乗効果はない。１を超えるＣＩ値は、拮抗作用を示す。ＣＩ値が小さいほど、相乗効果が強い。相乗作用のその他の測定値は、部分阻害濃度（ＦＩＣ）である。この部分的な値は、組み合わせで作用する薬剤のＩＣ５０を、単独で作用する薬剤のＩＣ５０の機能として表すことによって決定される。相互作用する２つの薬剤について、各薬剤のについてのＦＩＣ値の合計は、相乗的作用の尺度を表す。ＦＩＣが１未満である場合、２つの薬剤間に相乗作用がある。ＦＩＣ値が１であれば、相加効果を示す。ＦＩＣ値が小さいほど、相乗作用が強い。
【００４４】
ここで用いられている「抗癌剤」という用語は、腫瘍増殖又は転移を調整することができる化合物又は電磁放射線（特にＸ線）を意味する。形態分泌のｇｐ９６ポリペプチドと共にそのような薬剤を使用することを言及する場合は、この用語は、分泌型ｇｐ９６ポリペプチド以外の薬剤を表す。別段の定めがない限り、この用語は、そのような薬剤の１つ（又はそれ以上）を含んでいてもよい。１つよりも多い抗癌剤を用いるのであれば、分泌型ｇｐ９６ポリペプチドの投与の相対的時間は、要求されるように、１つ又はそれ以上の抗癌剤の時間依存的な有効腫瘍濃度を与えるように選択することができる。
【００４５】
この明細書において用いられているように、単数形「ａ」、「ａｎ」「ｔｈｅ」は、別段の定めがない限り、その用語が表す複数形を明確に包含する。ここで用いられているように、別段の定めがない限り、「又は」という用語は、「及び／又は」という「包括的な」意味で用いられ、「いずれかの」という「排他的な」意味で用いられていない。明細書及び添付の特許請求の範囲においては、別段の定めがない限り、単数形は、複数の対象を含む。
【００４６】
ここで用いられている「約」という用語は、およそ、その領域において、おおざっぱに、前後を意味する。「約」という用語が数値域と共に用いられていれば、この用語は、記載されている数値の上及び下の境界を拡張することによってその範囲を修飾する。通常、「約」という用語は、本明細書においては、記載されている値を上下に２０％修飾するように用いられる。この明細書において用いられているように、移行句又は請求項の本体のいずれであっても、「含む(ｃｏｍｐｒｉｓｅ)」及び「含んでいる(ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ)」という用語は、オープンエンドな意味に解釈されるように意図されている。すなわち、この用語は、「少なくとも有する」又は「少なくとも含む」というフレーズと同じ意味に解釈されるように意図されている。この「含んでいる」という用語は、プロセスの文脈において用いられたとき、そのプロセスが列挙されたステップを少なくとも含んでいることを意味するが、さらなるステップを含んでいてもよい。この「含んでいる」という用語は、化合物又は組成物の文脈において用いられたとき、その化合物又は組成物が列挙された特徴又は成分を少なくとも含んでいることを意味するが、さらなる特徴又は成分を含んでもよい。
【００４７】
その他の定義
本発明の組成物及び方法は、腫瘍に対する免疫反応を促進するのに有用である。そのような免疫反応は、腫瘍に関連した兆候又は症状を治療又は緩和するのに有用である。そのような免疫反応は、肺癌に関連した兆候又は症状を改善することができる。ここで用いられているように、「治療すること」は、本発明によって治療されていない患者の症状と比較して、本発明の化合物が投与された患者の症状を軽減、予防、及び／又は、逆行させることを意味する。施術者は、ここに記載されている組成物及び方法が、後の治療方法を決定するために、熟練した施術者（医師又は獣医）による連続的な臨床評価を伴って用いられるように意図されていることを理解するであろう。従って、治療後に、施術者は、標準的方法による肺の炎症の治療におけるあらゆる改善を評価するであろう。そのような評価は、特定の治療用量、投与様式などを増やすか、減らすか、又は、継続するべきであるかを評価することを助け、情報を与えるであろう。
【００４８】
従って、本発明の方法を用いて、例えば、癌を含む腫瘍を治療することができる。本発明の方法を用いて、例えば、さらなる腫瘍増殖を防ぐことによって、腫瘍増殖を遅延させることによって、又は、腫瘍退縮を生じさせることによって、腫瘍増殖を阻止することができる。従って、本発明の方法を用いて、例えば、肺癌などの癌を治療することができる。本発明の化合物を投与する対象が特定の外傷的状態に悩まされる必要がないことは理解されるであろう。実際に、本発明の化合物をあらゆる症状（例えば癌が寛解している患者）の発現前に予防的に投与してもよい。「治療的」、「治療的な」という用語、及び、これらの用語の入れ替えは、治療的、緩和的及び予防的な使用を含むように用いられる。従って、ここで用いられているように、「症状を治療又は緩和する」ことは、そのような投与を受けない患者の症状と比較して、本発明の組成物の治療的有効量を投与する患者の症状を低減、予防及び／又は逆行させることを意味する。
【００４９】
この「治療的有効量」という用語は、求められる治療結果を達成するのに有効な投薬用量での治療を表すのに用いられる。更に、当業者は、本発明の組成物の治療的有効量を、治療効果（例えば相乗的に）を強めるために、微調整によって及び／又は一以上の本発明の組成物を投与することによって（例えば、遺伝子操作された２つの異なる腫瘍細胞の同時投与によって）若しくは本発明の組成物を他の化合物と共に投与することによって、減らすか又は増やしてもよいことを理解するであろう。従って、本発明は、投与／治療を、ある哺乳動物に固有な特別な必要性に適合させる方法を提供する。以下の実施例で説明するように、この治療的有効量を、例えば、比較的低い用量からスタートすることによって、及び、有益な効果の同時並行的評価による段階的増加によって、経験的に容易に決定することができる。従って、単独で又は他の周知の腫瘍治療と組み合わせて本発明の方法を用いて、腫瘍を有する患者を治療するできる。当業者は、例えば、肺癌患者の期待寿命を延ばすこと及び／又は肺癌患者の生活の質を改善することにおける本発明の有利な使用を容易に理解するであろう。
【００５０】
ここに開示されているようなワクチン接種アプローチは、非免疫原性腫瘍を有する患者において免疫反応を誘導する有効な手段になりえる。
【００５１】
ここで用いられる技術的用語及び科学用語は、別段の定めがない限り、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。
【００５２】
本発明の方法は、本発明の方法の利益を受け得るあらゆる対象に使用されることを意図されている。従って、本発明によれば、「対象」、「患者」及び「患者」（区別なく用いられる）には、ヒト及びヒト以外の対象、特に家畜が含まれる。
【００５３】
ここで用いられているように、「同種異系細胞」は、その細胞が投与される患者に由来しない細胞、すなわち、その患者とは異なる遺伝子構成を有する細胞を意味する。同種異系細胞は、通常、その細胞が投与される患者と同じ種から得られる。例えば、この同種異系細胞は、ここで開示されているように、癌患者などのヒト患者に投与するためのヒト細胞であってもよい。ここで用いられているように、「同種異系腫瘍細胞」は、その同種異系細胞が投与される患者に由来しない腫瘍細胞を意味する。
【００５４】
通常、同種異系腫瘍細胞は、その細胞が投与される患者において腫瘍に対する免疫反応を促進することができる１つ以上の腫瘍抗原を発現する。ここで用いられているように、「同種異系癌細胞」、例えば肺癌細胞は、その同種異系細胞が投与される患者に由来しない癌細胞を意味する。通常、この同種異系癌細胞は、その細胞が投与される患者の、例えば肺癌といった癌に対する免疫反応を促進することができる１つ以上の腫瘍抗原を発現する。
【００５５】
ここで用いられているように、「遺伝子操作された細胞」は、例えばトランスフェクション又はトランスダクションによって外因性核酸を発現するように遺伝子操作された細胞を意味する。
【００５６】
ここで開示されているように、これまでは全細胞ワクチンが優れた臨床的結果を与えているので、同種異系全細胞ワクチンを選択してもよい。同種異系細胞をベースとするワクチンは、腫瘍抗原が異なる患者の腫瘍において共有されており、その抗原が患者の抗原提示細胞によって交差提示され得るという仮定の下で、自己由来のワクチンに代わるものを提示する。例えば、Ｆｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２４５−２７３（２０００）；Ｂｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：３３７−３６５（１９９４）を参照されたい。
【００５７】
分泌型ｇｐ９６ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞を含む本発明の組成物を、免疫化に有用なあらゆる公知成分を含むことによって、ワクチンに有用な生理学的に許容可能な担体と組み合わせることができる。その生理学的担体の成分は、ワクチン中に投与される抗原に対する免疫反応を容易にするか又は強めるように意図されている。この製剤は、抗原に対する免疫反応を促進する組成物中に、好ましいｐＨ領域を維持するための緩衝剤、患者に抗原を提示する塩又はその他の成分を含んでいてもよい。生理学的に許容可能な担体は、抗原に対する免疫反応を強める１つ以上の添加物を含んでいてもよい。製剤を、皮下、筋肉内、皮内又は免疫化に許容可能なあらゆる方法で投与することができる。
【００５８】
アジュバントは、分泌型ｇｐ９６ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞などの本発明の免疫原性薬剤に加えたときに、その混合物に晒されたレシピエントストにおいてその薬剤に対する免疫反応を非特異的に高めるか又は強化する物質を意味する。アジュバントは、例えば、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、ミョウバン（アルミニウム塩）、ポリスチレン、デンプン、ポリホスファゼン及びポリラクチド／ポリグリコシドなどのリポソーム及び微粒子を含んでいてもよい。
【００５９】
アジュバントには、例えば、スクワレン混合物（ＳＡＦ−Ｉ）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調合物、モノホスホリルリピドＡ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロック共重合体界面活性剤、Ｑｕｉｌ  Ａ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファゼン及び誘導体、及び、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：８７３−８７５（１９９０）記載されているものなどの免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）も含まれ得る。獣医学的使用及び動物の抗体の生産のために、フロイントのアジュバント（完全及び不完全）の細胞分裂促進成分を用いることができる。ヒトにおいては、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が有用なアジュバントの１つである。様々な適切なアジュバントが当業界において知られている（例えば、Ｗａｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｄｉｄ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８：８３（１９８８）；Ａｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｙａｒｓ，ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９２）を参照されたい）。さらなるアジュバントには、例えば、バチルカルメットゲラン（ＢＣＧ）、ＤＥＴＯＸ(マイコバクテリウムフレイの細胞壁骨格含有（ＣＷＳ）、及び、サルモネラミネソタに由来するモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）等が含まれる(例えば、Ｈｏｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，５．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１１：３９０（１９９３）；Ｗｏｏｄｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２２：２５１−２５９（１９９９）を参照されたい)。
【００６０】
ここに開示されている本発明の組成物及び方法は、腫瘍を有する患者を治療するのに有用である。特定の実施形態を肺癌によって例示するが、適切な同種異系細胞を使用し、同様のアプローチを用いて癌を含む他の種の腫瘍を治療できることは理解されであろう。
【００６１】
本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響しない変形をここで提供されている本発明の定義内で提供することは理解される。従って、以下の実施例は本発明を限定しないように意図されている。特許請求の範囲に記載した発明が特定の実施形態を参照しながら詳細に記載されているので、その精神及び範囲から逸脱せずに特許請求の範囲に記載した発明に様々な変更及び修飾を行うことができることは当業者に明らかであろう。従って、例えば、当業者は、ルーティーン試験以上の試験を行うことなく、ここに記載されている特定の物質及び手順の数多くの均等物を認識又は確認することができるだろう。そのような均等物は、本発明の範囲内であると考えられ、特許請求の範囲に包含されている。
【００６２】
実施例１：腫瘍分泌された熱ショック融合タンパクは、ＣＤ８細胞を拒絶反応に誘導する
腫瘍抗原に由来するものを含む小胞体内在性熱ショックタンパクｇｐ９６は、ＭＨＣクラスＩによる提示の過程で、シャペロンとしてペプチドを折りたたむ。マウスＩｇＧ１のＦｃ部分によるｇｐ９６の小胞体保留シグナルの置換は、ｇｐ９６、ｇｐ９６−Ｉｇの分泌形態を生成した。ｇｐ９６−Ｉｇを分泌する腫瘍細胞は、インビボにおいて低下した腫瘍形成性及び増加した免疫原性を示し、初期増殖後に拒絶された。拒絶は、プライミング及びエフェクター期中にＣＤ８Ｔ細胞を必要とした。ＣＤ４Ｔ細胞は、いずれの期においても拒絶に必要ではなかった。カラギーナン（インビボでマクロファージを不活性化することが知られている化合物）は、ＣＤ８によって媒介される腫瘍拒絶を低下させなかった。従って、ｇｐ９６−Ｉｇを分泌する腫瘍による免疫化は、ＣＤ４又はマクロファージ支援を必要とすることなく、効率的に腫瘍を拒絶するＣＤ８ＣＴＬ生成する。対照的に、精製された腫瘍由来ｇｐ９６による免疫化又は被照射腫瘍細胞による免疫化は、両方を必要とする。
【００６３】
分泌型ｇｐ９６、ｇｐ９６−Ｉｇを開発し、腫瘍モデルにおいて試験した。ｇｐ９６−Ｉｇに対するｃＤＮＡを用いた腫瘍細胞のトランスフェクションは、結果的にｇｐ９６−Ｉｇを分泌させた。この公報に示されているように、ｇｐ９６−Ｉｇ分泌腫瘍細胞は、インビボにおいてＣＤ８細胞のみに依存して強力な免疫化及び腫瘍拒絶を引き起こした。
【００６４】
細胞系：すべての細胞系を米国培養菌保存施設（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、１０％ＦＣを含む媒体中で培養した。ヒト小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞系（ＳＣＬＣ−２及びＳＣＬＣ−７）をＳａｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０：３９８．に記載されているように定着させた。発現ベクターａｐｃ−ＮＥＯ−ＯＶＡ中にクローンされたニワトリＯＶＡは、Ｍ．Ｂｅｖａｎ博士（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から提供され、ルイス肺癌（ＬＬＣ）をトランスフェクトするために用いられた。
【００６５】
ｇｐ９６−Ｉｇの構築：ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパクを生成するために、ＫＤＥＬ配列を除去し、ヒンジ、マウスのＣＨ２及びＣＨ３ドメインで置換した；二本鎖ｃＤＮＡをＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いてＪｕｒｋａｔ  ＤＮＡから調製し、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲプライマーは、５’−ＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＣＡＴＧＡＧＧＧ−３’及び５’−ＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴＴＴＧＣ−３’であった。ＰＣＲプライマーは、ＸｈｏＩ部位（順方向プライマー）及びＢａｍＨＩ部位（逆方向プライマー）を含んでいた。マウスＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドメインであるそのヒンジを、テンプレートとしてマウスＩｇＧ１ｃＤＮＡを用いることによって増幅し、ヒンジ部分の３個のシステインをセリンに変異させた。ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＡＡＧ−３’及び５’−ＣＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧ−３’であった。ＰＣＲプライマーは、ＢａｍＨＩ部位（順方向プライマー）及びＮｏｔＩ部位（逆方向プライマー）を含んでいた。Ｇｐ９６を真核細胞発現ベクターであるｐＢＣＭＧＳＮｅｏ及びｐＢＣＭＧＨｉｓのＸｈｏＩ及びＢａｍＨｌ部位に挿入し、ＳＣＬＣ−２、ＳＣＬＣ−７、Ｂ１６Ｆ１０、ＭＣ５７、ＬＬＣ  ＮＩＨ３Ｔ３、ＥＬ４、Ｅ．Ｇ７及びＰ８１５にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８又は２．５ｍＭ〜１０ｍＭのＬ−ヒスチジノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて選択した。Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９（Ｎｏｖ１５）；１６３（１０）：５１７８−８２及びそこに引用されている引用文献を参照されたい。
【００６６】
ＥＬＩＳＡ：Ｉｇタグに対する抗体を用いて行った。Ｇｐ９６−Ｉｇを生産する細胞を、１０％ＦＣを含むＡＩＭＶ又はＩＭＤＭ中において１０６／ｍｌで平板培養し、様々な時点で培養液上清を採取した。ｇｐ９６−Ｉｇの細胞内発現の分析のために、細胞を、３回の凍結融解サイクルによって溶解させ、１３，０００×ｇで６０分間遠心分離した。
【００６７】
ｇｐ９６−Ｉｇ融合タンパクの精製：標準的手順（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、プロテインＡカラムによる親和性クロマトグラフィーによってＧｐ９６−Ｉｇを精製した。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパクアッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によってｇｐ９６−Ｉｇの濃度を測定した。標準的手順でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロットを行った。
【００６８】
ＦＡＣＳ分析：ｇｐ９６−ＩｇがトランスフェクトされたＳＣＬＣの細胞膜染色のために、細胞を、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ又はコントロールとしてヤギ抗ウサギＩｇＧＦＩＴＣを用いて４℃で１５分間染色し、ベクトンディッキンソンＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータ（サンディエゴ、カリフォルニア）によって分析した。細胞内染色のために、細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％サポニンで透過性にし、次いで、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥ、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ、又は、ヤギ抗シリアンハムスターＩｇＧ−ＦＩＴＣによって４℃で１５分間染色し、フローサイトメータによって分析した。
【００６９】
腫瘍接種及びワクチン接種：マウスのわき腹に生きた腫瘍細胞を含む２００μｌのＰＢＳを皮下注射することによってインビボにおける腫瘍原性を決定した。腫瘍の二次元サイズを週２回少なくとも２か月間測定した。平均腫瘍増殖が直径１０ｍｍを超えたときにマウスを屠殺した。
【００７０】
マウスの右脇腹への（２００μｌのＰＢＳに含まれる）１０６個の生きたＥ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇ又はコントロールとして被照射Ｅ．Ｇ７の皮下注射注入によって免疫化を行った。２週間の時間間隔で２回免疫化を行った。２週間後に、マウスの左脇腹に、示されている数の生きた腫瘍細胞（ＥＬ４、Ｅ．Ｇ７、ＬＬＣ又はＬＬＣ−ＯＶＡを含む２００μｌのＰＢＳ）を皮下注射することによって投与した。
【００７１】
インビボにおけるＴ細胞又はマクロファージの消耗：合計１００μｇのＧＫ１．５（抗ＣＤ４）又は２．４３（抗ＣＤ８）を含む２００μｌのＰＢＳを腹腔内注射によって投与した。ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞の枯渇をＦＡＣＳ分析によって確認した。ＣＤ４又はＣＤ８のレベルは、Ａｂ注入（データは示されていない）の２週間後にも低いままであった（＞９５％の消耗）。マクロファージの機能的阻害のために、１ｍｇのカラギーナン（タイプＩＩ；Ｓｉｇｍａ）を含む２００μｌのＰＢＳを腹腔内注入によって投与した。
【００７２】
結果：腫瘍細胞から精製された小胞体内在性ｈｓｐ  ｇｐ９６は、腫瘍特異的免疫を提供できる。ｇｐ９６のＣ末端配列ＫＤＥＬは、小胞体保留シグナルとして機能する。この配列の欠失は、結合ペプチドと共にトランスフェクトされた腫瘍細胞からのｇｐ９６の分泌を生じさせ、腫瘍を免疫原性にして免疫系による腫瘍拒絶を可能にする。
【００７３】
ｇｐ９６のＫＤＥＬ配列をヒンジ（マウスＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃ受容体結合の効率が悪いＩｇアイソタイプ）で置換すること、及び、ｃＤＮＡの腫瘍細胞中へのトランスフェクションによって、培養液上清中へのｇｐ９６−Ｉｇの分泌が生じた。それをＥＬＩＳＡによって定量した。プロテインＡ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製されたｇｐ９６−Ｉｇは、融合タンパクについて予想された１２０ｋＤａの分子量の主要バンドと、非修飾ｇｐ９６について以前に報告されていた小さい分子量及び大きい分子量の２つのバンドと共に泳動した。ｇｐ９６に対して特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いたウェスタンブロッティングによって融合タンパクの同一性を確認した。主要バンドだけが染色されたことは、Ａｂによって認識されない小さなバンドがｇｐ９６のグリコシル化変異体であることを示している。
【００７４】
ｇｐ９６−Ｉｇの分泌は、上澄み中に時間依存的な直線的蓄積をもたらした。細胞内ｇｐ９６−Ｉｇがトランスフェクトされた細胞の溶解産物中に低く一定の定常レベルで検出されたことは、ｇｐ９６−Ｉｇが細胞中に蓄積しないことを示している。細胞膜が損傷されていないトランスフェクトされた腫瘍細胞のＦＡＣＳ分析によって、抗マウスＩｇＧによるバックグラウンドを超えた染色が検出されなかったことは、融合タンパクのＩｇ部位が原形質膜の外葉上に提示されないことを示している。対照的に、膜の透過性により、ｇｐ９６−Ｉｇは、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｂによって細胞内で検出されるが、コントロールのヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ａｂによっては検出されない。ｇｐ９６の膜貫通領域は、ｇｐ９６−Ｉｇの分泌を妨げず、細胞内蓄積に至らない。これらのデータは、膜貫通領域が膜においてｇｐ９６の固定に用いられておらず、ｇｐ９６が必須の膜タンパクではないことを示唆する以前の報告に一致している（Ａｌｔｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６９：３４０）。
【００７５】
ｇｐ９６−Ｉｇがトランスフェクトされたすべてのマウス及びヒト細胞株は、融合タンパクを分泌した。模擬トランスフェクトされた細胞は、ｇｐ９６−Ｉｇを分泌しなかった。Ｅ．Ｇ７は、同系のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて致死腫瘍を形成するＥＬ４リンパ腫のＯＶＡトランスフェクタントである。Ｅ．Ｇ７のＧｐ９６−Ｉｇトランスフェクションは、Ｅ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇが、Ｅ．Ｇ７、ＯＶＡ代用薬抗原トランスフェクト腫瘍に加えて、ＥＬ４親腫瘍に対しても免疫化させるか否かを決定することができる。第２の腫瘍としてｇｐ９６−Ｉｇ又はＯＶＡをトランスフェクトしたＬＬＣを用いた。ＬＬＣは、Ｅ．Ｇ７と対比して非造血性であり、低免疫原性の腫瘍だからである。両方の細胞株が同程度の量のｇｐ９６−Ｉｇを分泌する。
【００７６】
分泌されたｇｐ９６−Ｉｇは、低下した腫瘍原性の原因である：ｇｐ９６−Ｉｇの分泌は、模擬トランスフェクト又はトランスフェクトしていないＥ．Ｇ７と比較して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥ．Ｇ７の腫瘍形成性を１／１００よりも小さくする。１０００万個のｈｓｐ分泌腫瘍細胞を皮下接種させると、接種したマウスの１０％のみにおいて腫瘍が発生した（図１Ａ）。ｇｐ９６−Ｉｇ分泌による腫瘍形成性の同様の低下は、トランスフェクトしたＥＬ４で観察された（データは示されていない）。ＬＬＣによるＧｐ９６−Ｉｇ分泌は、より穏やかな、〜５倍の腫瘍形成性の低下をもたらした（図１Ｂ）。
【００７７】
免疫原性及び免疫記憶反応を決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、拒絶された未照射Ｅ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇ（１０６個）の１用量で２週間の時間間隔で２回免疫化させた。続いて、それらに、トランスフェクトしていない又は模擬トランスフェクトしたＥ．Ｇ７、親ＥＬ４、トランスフェクトされていないＬＬＣ、及び、ＯＶＡトランスフェクトされたＬＬＣを投与した（図１Ｃ〜Ｆ）。被照射Ｅ．Ｇ７を用いて免疫化したマウス又はワクチン接種をしていないマウスをコントロールとして用いた。Ｅ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇ−免疫化マウスは、被照射細胞を接種したマウス又は非免疫化マウスと比較して、Ｅ．Ｇ７による１０倍高い腫瘍を拒絶した（図１Ｃ）。ワクチンを接種したマウスにおける腫瘍増殖は、高頻度で遅延した。この免疫化の効果は、ＥＬ４を投与したときにより明らかであり、コントロール（図１Ｄ）と比較して５０倍に増加したＥＬ４投与用量を許容する。予想通りに、Ｅ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇ免疫化は、トランスフェクトされていない又はベクタートランスフェクトされたＬＬＣによる投与に対して防御を与えなかったが（図１Ｅ）、ＯＶＡトランスフェクトＬＬＣを抗原投与として用いたときには、防御における中程度の、〜３倍の増加がみられた（図１Ｆ）。Ｅ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇを用いてＥＬ４抗原投与に対して免疫化させたマウスの強い防御は、Ｅ．Ｇ７とＥＬ４とによって共有される外発性腫瘍抗原によるものであるかもしれない。ＬＬＣ−ＯＶＡによる抗原投与に対する弱い防御は、Ｔ細胞認識のためのＯＶＡ代用薬抗原に由来するエピトープの単一又は限定された数を認識するＴ細胞に依存する。
【００７８】
ＣＤ８細胞は、プライミング及びエフェクター期に必要である：Ｅ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇの拒絶における免疫機構の関与を、インビボにおける免疫適格細胞の枯渇／不活性化によってさらに検査した。メタＡ腫瘍由来ｇｐ９６が有効な免疫化のためにＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞及びマクロファージを必要とする一方で、被照射メタＡ腫瘍細胞による免疫化は、ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞を必要とするが、マクロファージを必要としないことが報告されている。
【００７９】
プライミングのために、ｇｐ９６−Ｉｇを分泌する１００万個の未照射生存Ｅ．Ｇ７を皮下注射で接種した。この用量は、約８ｍｍの平均径に成長し、次いで、縮み、拒絶される腫瘍を確立するのに充分である。腫瘍拒絶は、腫瘍接種の２日前（図２Ａ）又は３日後まで（図示せず）に抗ＣＤ８Ａｂ２．４３で処理したマウスにおいて阻害された。抗ＣＤ４ＡｂＧＫ１．５は、注入の時点にかかわらず、腫瘍拒絶に対して何の効果もなかった（図２Ａ）。一方で、＞１４日の間にＣＤ４細胞を完全に枯渇させた（データ示さず）。ＣＤ４欠損マウスがＥ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇを拒絶することができたこと（図２Ｂ）は、ＣＤ８細胞の重要性を支持している。ｇｐ９６−Ｉｇを分泌しないＥ．Ｇ７は、処理していない免疫枯渇マウスにおいて腫瘍を形成する。インビボにおいてマクロファージを不活性化すると知られているカラギーナンは、腫瘍拒絶に対して効果がなかった。
【００８０】
腫瘍拒絶のエフェクター期を研究するために、マウスを、生存Ｅ．Ｇ７−ｇｐ９６−Ｉｇを用いて１４日間の時間間隔で２回免疫化させた。１１日後（第２５日）に免疫細胞が枯渇し、３日後にトランスフェクトされていないＥ．Ｇ７をマウスに接種した。ＣＤ８細胞だけがエフェクター期に必要である。ＣＤ４細胞の枯渇又はマクロファージのカラギーナン不活性化は、エフェクター期におけるＥ．Ｇ７拒絶に影響しなかった（図２Ｃ）。
【００８１】
ｇｐ９６の小胞体残留シグナルの欠失及びＦｃ部分による置換は、ＩｇＧ１が容易にｇｐ９６−Ｉｇの分泌をもたらせば、それはＩｇＧ１時間鎖によって二量化されると考えられる。Ｅ．Ｇ７から分泌されたｇｐ９６が永続的な特異的免疫を提供することができることは、ｇｐ９６がシャペロンとして腫瘍ペプチドを折りたたむことを示唆している。対照的に、被照射又は模擬トランスフェクトされたＥ．Ｇ７は、防御免疫を提供することができない。コリネバクテリウムパルブムもＥ．Ｇ７免疫化のためのアジュバントとしては機能しなかった。分泌されたｇｐ９６−Ｉｇは、代用薬抗原ＯＶＡ及びその他のＥＬ４抗原の両方に対して免疫特異性を提供するが、ＬＬＣ由来腫瘍抗原に対して交差免疫化しない。
【００８２】
このデータは、分泌されたｇｐ９６−Ｉｇに関連したペプチドがクラスＩ  ＭＨＣに運ばれてクラスＩ  ＭＨＣによって提示され、腫瘍特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ反応を促進して腫瘍拒絶を生じさせるという説明に一致している。ＣＤ８反応は、ＣＤ４支援に依存せず、マクロファージを必要としないようである。細胞内必要条件がｇｐ９６−Ｉｇ二量体化によるものであるかどうかはわかっていない。
【００８３】
精製された腫瘍由来ｇｐ９６と腫瘍から分泌されたｇｐ９６−Ｉｇとで免疫化の機構を比較することは有益である。メタＡ腫瘍細胞から精製されたｇρ９６を免疫化に用いたＵｄｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国  ９１：３０７７、１９９４年）は、プライミング期におけるＣＤ８細胞及びマクロファージの必要性、及び、メタＡ腫瘍の腫瘍拒絶のエフェクター相におけるＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞並びにマクロファージの必要性を報告した。被照射メタＡ腫瘍による免疫化は、プライミング期にＣＤ４細胞を必要とし、エフェクター相にＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞のいずれをも必要とした。被照射ＥＧ７は、その後の投与に対して免疫を生産しない。腫瘍から分泌されるｇｐ９６−Ｉｇの劇的効果は、ＣＤ４支援のないＣＤ８細胞に完全に依存する。ＣＤ８細胞は、腫瘍に対するＣＴＬ反応のプライミング期及びエフェクター期に必要である。マクロファージは、必要ではないようである。ｇｐ９６をシャペロンとして折りたたまれるペプチドのＣＤ８細胞への提示における樹状細胞又はその他のＡＰＣの役割はわかっていないが、可能性が残されている。ｇｐ９６−Ｉｇを分泌するＥＧ７がＣＤ８細胞を直接的に促進することもありえる。
【００８４】
実施例２：ＣＤ８細胞毒性Ｔリンパ球への強化された抗原交差提示の分子的及び細胞的必要性
この実施例は、腫瘍から分泌される熱ショックタンパクであるｇｐ９６をシャペロンとして折りたたまれるペプチドがＣＤ８ＣＴＬの抗原クロスプライミングの効率をシャペロンによって折りたたまれていないタンパクのみのクロスプライミングの活性と比較して数百万倍も高めることを実証する。Ｇｐ９６は、シャペロンによって折りたたまれていないタンパクによるクロスプライミングのためのアジュバントとしても機能するが、この活性において、Ｇｐ９６は、ペプチドシャペロンとしてよりも活性が１０００倍小さい。機械論的に、トランスフェクトされた腫瘍細胞によるｇｐ９６−Ｉｇのｉｎ  ｓｉｔｕ分泌は、ｇｐ９６放出部位への樹状細胞及びナチュラルキラー細胞を動員し活性化し、ＣＤ８ＣＴＬ増殖を局所的に促進する。Ｇｐ９６によって媒介されるＣＤ８Ｔ細胞のクロスプライミングは、Ｂ７．１／２共刺激を必要とするが、リンパ節欠損マウスにおいて、ＮＫＴ及びＣＤ４の細胞の非存在下でＣＤ４０Ｌなしで妨げられずに進行する。リンパ節の非存在下でＧｐ９６によって促進されるＣＤ８ＣＴＬのＭＨＣＩクロスプライミングは、ｇｐ９６放出部位における局所的な組織ベースＣＴＬ生成の新規なメカニズムを提供する。この経路は、決定的に重要な、抗原性薬剤を傷つける組織に対する有効な防御のための実質組織において有用な早期発見及び迅速な反応機構を構成し得る。
【００８５】
熱ショックタンパクは、ＡＰＣに取り込まれてＣＤ８細胞に交差提示され得るシャペロンペプチドである。外因性熱ショックタンパク（ＨＳＰ）は、ＣＤ９１及びＬＯＸ−Ｉによって樹状細胞（ＤＣ）上に能動的に捕捉され、シャペロンによって折りたたまれたペプチドをＭＨＣクラスＩ経路に届けることによってＣＤ８＋ＣＴＬに交差提示されてペプチド特異的な免疫反応を誘発する。ＨＳＰ−ｇｐ９６によるクロスプライミングは、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４刺激並びにＣＤ８ＣＴＬに偏った反応を生じさせる樹状細胞成熟に関連する。
【００８６】
ｇｐ９６を分泌する腫瘍細胞による免疫化は、腫瘍特異的でＣＤ４細胞に依存しない代用抗原特異的免疫を生成した（Ｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ａｕｇ  １５；１７９（４）：２３１０−７）。この実施例は、ＣＤ８反応を定量化するためにこの免疫化方法を用いて、ｇｐ９６をシャペロンとして折りたたまれた極めて小さいフェムトモル量の抗原がリンパ節及びＣＤ４細胞と無関係にｇｐ９６放出部位における局所的な同族ＣＤ８クロスプライミングに十分であることを示す。
【００８７】
マウス：野生型（ｗｔ）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７．１／２、ＣＤ４０Ｌ、リンフォトキシンα（ＬＴα）及びＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）バックグラウンドのＣＤ４欠損マウスをジャクソン研究所から入手した。Ｂ６．Ｊα２８１−／−マウス（ＮＫＴ欠損、Ｊαｌ８ノックアウト（ｋｏ）と名前を変更された）は、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ博士（千葉大学、千葉、日本）による許可と共にＭ．Ｌｏｔｚｅ博士（ピッツバーグ医療センター大学、ピッツバーグ、ＰＡ）から提供された。
【００８８】
生産者の許可を得てＧＦＰトランスジェニックマウスを入手した。Ｃ５７ＢＬ／６  ＯＴ−Ｉマウスを、Ｍ．Ｂｅｖａｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、シアトル、ワシントン）から入手した。すべてのマウスをアンチジーンの６週〜１２週に用いた。
【００８９】
細胞株：ＥＧ７、Ｍ．Ｂｅｖａｎ博士によって寛大に提供されたＯＶＡトランスフェクトＥＬ４リンパ腫系統に、前述のｇｐ９６−Ｉｇを含むベクターｐＣＭＧ−Ｈｉｓをさらにトランスフェクトした。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＯＶＡが含まれるｐＡＣ−Ｎｅｏ−ＯＶＡ（Ｍ．Ｂｅｖａｎ博士によって寛大に提供された）をトランスフェクトし、また、ｇｐ９６−Ｉｇが含まれるｐＣＭＧ−Ｈｉｓをトランスフェクトした。
【００９０】
抗体：蛍光抗体をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社及びｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。
【００９１】
ＯＴ−Ｉ細胞の精製及び適合移植：ＧＦＰで標識されたＯＴ−Ｉ細胞を、磁気分離を用いた抗ＣＤ８によるポジティブ選択によって精製した（９５％超の純度；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）。１００万個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ細胞が含まれる０．３ｍｌ体積のＰＢＳをＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈から適合移植した。
【００９２】
免疫化：ＧＦＰ−ＯＴ−Ｉの適合移植の２日後に、０．５ｍｌの体積のＰＢＳ中の２〜４×１０６個の未照射ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞又はコントロールＥＧ７細胞を腹腔に注入した。いくつかの試験のために、ＰＢＳ中に溶解した３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇ、３Ｔ３−ＯＶＡ、又は、完全なＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をマウスの腹腔内に投与して免疫化させた。
【００９３】
ＯＴ−ＩのエクスビボにおけるＡｇ交差提示及びクロスプライミング：２×１０６個の３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇ又は３Ｔ３−ｇｐ９６−Ｉｇを腹腔内投与してＢ６野生型マウスのグループを免疫化させた。３日後に腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を回収し、１０５個のＰＥＣを、円形底部の９６−ウェルのマイクロタイタープレートにおいて、ＣＦＳＥ標識された精製された未処理のＯＴ−Ｉと共に様々な比率（５：１、１０：１、１００：１及び１０００：１）で、２００μｌの組織培養液中で４８時間及び７２時間共培養した。ＣＦＳＥ標識されたＯＴ−Ｉを、３Ｔ３、３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇ及び３Ｔ３−ｇｐ９６−Ｉｇと共にそのまま共培養した。示されている時間の後に、その細胞を回収して抗ＣＤ８−ＰＥを用いて染色した。ＯＴ−Ｉ増殖を、ＬＳＲＩＩフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって分析されるＣＦＳＥ希釈によって測定した。細胞分裂は、閉じ込められたリンパ球又は全ＣＦＳＥ＋細胞におけるＣＦＳＥ希釈によって分析し、ＣＦＳＥ＋細胞の全パーセンテージとして表す。
【００９４】
ＢｒｄＵラベル及び分析：免疫化時にマウスをＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む飲料水（０．８ｍｇ／ｍｌ）で処理した。固定及び透過化の後にＢｒｄＵ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に対して染色することによって細胞サンプルを分析した。
【００９５】
ＣＤ４細胞は、ＨＳＰｇｐ９６−ペプチドによるＣＤ８ＣＴＬへのＡｇ交差提示を阻害する：分泌可能形態のｇｐ９６、ｇｐ９６−Ｉｇをトランスフェクトした腫瘍細胞は、マウスにおいて免疫原性になり、腫瘍特異的免疫を誘導するＹａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５１７８−５１８２（１９９９）。腫瘍免疫性はＣＤ８細胞を必要としたが、免疫反応の求心性部分又は遠心性部分のいずれにおいてもＣＤ４細胞に依存していなかった。
【００９６】
ＣＤ４細胞がヘルパー細胞活性及び制御性細胞活性の両方を発現するので、これらの逆の機能のいずれがｇｐ９６によるＣＤ８細胞のクロスプライミングを制御したかについて関心が寄せられる。適合移植されたＫｂ−ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８細胞、ＯＴ−Ｉを用いて、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ又はＥＧ７腹腔内免疫化に対するＣＴＬ増殖を定量した。ＥＧ７は、ＯＶＡをトランスフェクトしたＥＬ４リンパ腫である。この系におけるＯＴ−Ｉ増殖は、ｇｐ９６−ｍｙｃが等しく活性であるので、ｇｐ９６をシャペロンとして折りたたまれるＯＶＡペプチドに依存し、Ｉｇ−Ｆｃタグによって影響されないことが以前に示されている。腫瘍から分泌されるｇｐ９６−Ｉｇ免疫化系は、本物の腫瘍抗原に対する免疫を生成する。しかしながら、ＯＴ−Ｉ増殖を測定することは、腫瘍拒絶を測定するよりも正確で迅速な読み出しを提供する。
【００９７】
ＣＤ４ノックアウトにおいて、ＣＤ４機能（ヘルパー及び制御）はすべて削除されているが、ＣＤ４０Ｌノックアウトにおいては、初めからＣＤ４細胞のヘルパー細胞機能が欠損している。従って、ＣＤ４ノックアウト及びＣＤ４０ＬノックアウトにおいてＥＧ７−ｇｐ９６によって分泌されるｇｐ９６−ＯＶＡに対するＯＴ−Ｉ増殖を野生型マウスと比較した（図３）。分析を容易にするために、ＧＦＰトランスジェニックマウスと共にＯＴ−Ｉマウスを育成することによって、ＯＴ−Ｉ  ＴＣＲトランスジェニック細胞をＧＦＰ標識した（ＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ）。野生型マウスと比較すると、ＣＤ４ノックアウトマウスにおけるＯＴ−Ｉ増殖は、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇに対して１００％増加しており、ＣＤ４細胞の存在がＣＤ８クローン性増殖を妨げることが示唆された（図３Ａ）。対照的に、ＣＤ４０Ｌノックアウトマウスにおいては、ＯＴ−Ｉ増殖が野生型マウスの増殖と同程度であった（図３Ｂ）。このデータは、ＣＤ４０Ｌによって媒介されるＣＤ４ヘルパー機能がＣＤ８ＣＴＬへのｇｐ９６によって媒介される抗原交差提示に必要でないことを示す。ＣＤ４ノックアウトに存在しないＣＤ４＋Ｔ制御性細胞は、対照的に、通常はｇｐ９６−ＯＶＡによるＯＴ−Ｉクロスプライミングをダウンレギュレートする。
【００９８】
ｇｐ９６によるＣＤ８クロスプライミングは、Ｂ７．１及びＢ７．２に依存し、ＮＫＴ細胞に依存しない：効率的なＴ細胞プライミングは、樹状細胞成熟、並びに、ＭＨＣ及びしばしばＣＤ４０シグナルを介して媒介される共刺激分子のアップレギュレーションを必要とする。しかしながら、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０軸を介したＣＤ４支援は、ｇｐ９６によって媒介されるＯＴ−Ｉプライミングには明らかに必要ではない（図３）。Ｇｐ９６は、ＣＤ９１並びにＴＬＲ２及びＴＬＲ４に結合し、それによってＣＤ４０に依存しない樹状細胞を活性化することができる。インビボにおけるＣＤ８細胞のクロスプライミングのこのメカニズムがＢ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）共促進に依存するかどうか判断した。Ｂ７．１又はＢ７．２のいずれかのみが欠損したマウスは、野生型マウスの５０％以下の効率でＯＴ−Ｉのｇｐ９６媒介性クロスプライミングを共促進することができた（図４Ａ）。しかしながら、Ｂ７．１及びＢ７．２のいずれもが完全に欠損した二重欠損マウス（図４Ｂ）においては、ＯＴ−Ｉのｇｐ９６媒介性クロスプライミングが完全に消失した。
【００９９】
ＮＫＴ細胞は高頻度で抗腫瘍免疫に関与する。Ｊα１８ノックアウトマウスは、ＣＤ１ｄ限定不変異体ＮＫＴ細胞に特徴的なＴＣＲｖα１４鎖を生成することができないせいで、ＮＫＴ細胞を欠損している。Ｊα１８ノックアウトマウスが、低下しないＯＴ−Ｉ増殖をサポートする能力（図４Ｃ）は、ＮＫＴ細胞がｇｐ９６媒介性ＯＴ−Ｉクロスプライミングに必須ではないことを示している。
【０１００】
ｇｐ９６によるＡｇ交差提示は、リンパ節を必要としない：流入リンパ節はＡＰＣ、ＣＤ４ヘルパー細胞、ＣＤ８ＣＴＬ前駆物質及びナチュラルキラー細胞を集めて、細胞間相互作用を促進し、ＣＴＬプライミング及び増殖を強める。ｇｐ９６によって媒介される抗原クロスプライミングは、ＣＤ４支援に依存していないので、ＯＴ−Ｉ増殖に対する流入リンパ節の必要性の問題が提起された。ＬＴα欠損マウスは、パイエル集腺を含む末梢及び腸間膜リンパ節を欠損しており、抗ウイルス性反応が損なわれている。しかしながら、ｇｐ９６−ＯＶＡ媒介性ＯＴ−Ｉ増殖を分析するとき、ＬＴα欠損マウスは、腹膜腔（ＰＣ）において野生型マウスと比べてほとんど正常なＯＴ−Ｉ増殖を示した（図５Ａ及び図５Ｂ）。脾臓においてＧＦＰ  ＯＴ−Ｉの蓄積が５０％減少したことは、リンパ節をベースとするＯＴ−Ｉクローン性増殖がないことを反映している。この調査結果は、リンパ節がｇｐ９６媒介性ペプチドクロスプライミングに必須ではなく、局所的クロスプライミングがｇｐ９６放出部位で生じることを示している。
【０１０１】
リンパ節に依存しないＯＴ−Ｉのクロスプライミングを直接的に試験するために、同種異系３Ｔ３細胞、３Ｔ３−ＯＶＡ細胞又は３ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞を用いて腹腔内で免疫化させた後の第３日にＢ６マウスからＰＥＣを分離した。ＰＥＣを様々な比率でＣＦＳＥラベルされたＯＴ−Ｉと混合し、４８時間後及び７２時間後にＣＦＳＥ希釈で測定した。３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇを注入されたマウスから分離したＰＥＣは、ＣＦＳＥ希釈によって示されるように、インビトロにおいてＯＴ−Ｉをクロスプライミングすることができた（図５Ｃ、ａ〜ｄ）。対照的に、３Ｔ３−ｇｐ９６を注入されたマウスから単離されたＰＥＣ又はトランスフェクトされていない３Ｔ３は、ＯＴ−Ｉ増殖を促進することができなかった（図５ｃ、ｅ、ｆ）。同様に、３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇ又は３Ｔ３−ｇｐ９６−ＩｇとのＣＳＦＥラベルされたＯＴ−Ｉのインビトロにおける直接的なインキューベーションは、ＣＳＦＥ希釈を生じさせることができなかった。このデータは、腹膜腔においてリンパ節の非存在下で同族のＣＤ８細胞へのｇｐ９６−ＯＶＡによって誘導される抗原交差提示のモデルをサポートする。
【０１０２】
Ｇｐ９６は、その放出部位に樹状細胞及びナチュラルキラー細胞を動員し、それらの活性化を生じさせる：ＣＤ４細胞がこのモデル系に必須ではないが、最低限のクロスプライミングは、ＡＰＣ及びＣＤ８細胞を集めることを必要とする。腹膜腔におけるｇｐ９６の局所的放出がＡＰＣ及びＯＴ−Ｉの局所的動員及び活性化を生じさせ、それによってリンパ節の必要性がなくなるかどうか判断した。
【０１０３】
ｇｐ９６−Ｉｇ免疫化によるＯＴ−Ｉ増殖は、第４日及び第５日までに最大であり、腹膜腔において最も顕著である。実質的に０から５０万個のＯＴ−Ｉが腹膜腔において第４日及び第５日に蓄積し、動員されたＣＤ８細胞の最大６０％に相当する。他者によっても観察されているように、強いＯＴ−Ｉ増殖はｇｐ９６−Ｉｇ分泌に大きく依存し（図６）、ＥＧ７に対して最小である。野生型マウスにおいて４日以内にＣＤ８細胞をクロスプライミングするｇｐ９６の能力は、ＡＰＣ及びその他の先天性細胞の早期活性化を示唆する。インビトロにおいてｇｐ９６が樹状細胞を活性化及び成熟させることができること、並びに、インビトロ及びインビボにおいてｇｐ９６をシャペロンとして折りたたまれるペプチドがＭＨＣ  Ｉによって樹状細胞及びマクロファージ上に交差提示されることが知られている（Ｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ａｕｇ  １５；１７９（４）：２３１０−７）。ｇｐ９６がナチュラルキラー細胞を活性化することができることも報告されている（Ｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ａｕｇ  １５；１７９（４）：２３１０−７）。損なわれていないＯＴ−Ｉ活性化がＬＴαノックアウトマウスにおいて生じるという事実は、細胞動員及び活性化がｇｐ９６放出部位で局所的に生じているに違いないことを示している。
【０１０４】
ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ又はコントロールとしてのＥＧ７の腹腔内注入後に、ＰＥＣを第１日〜第４日に採取し、表現型及びＢｒｄＵの取り込みによって活性化について分析した。ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによって動員された細胞の最大比率、８０％〜９０％は、Ｆ４／８０ｄｉｍ単球／マクロファージであった。免疫化前に内在する腹膜マクロファージは、Ｆ４／８０ｂｒｉｇｈｔであり、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ注入後に数が変わらなかった。ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞及びＮＫ１．１＋ナチュラルキラー細胞は、それぞれ、腹膜腔内に最初の２日間で動員された細胞の５％〜１０％を構成する。Ｂ細胞及びＣＤ４Ｔ細胞は、腹膜腔において第３日の初めに数の増加がみられ、第４日及び第５日にさらに増加した（データ示さず）。ＥＧ７に比べると、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇの腹腔内注入は、腹膜腔内に動員された全細胞数を最初の２日間に２倍にした（図７Ａ）。ＥＬＩＳＡによって測定されるように、この効果は、２４時間以内に注入された細胞による少なくとも６０ｎｇのｇｐ９６−Ｉｇの分泌を必要とした（Ｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ａｕｇ  １５；１７９（４）：２３１０−７）。注入された細胞数によるｇｐ９６−Ｉｇの分泌がより少ない量であれば、細胞動員及びＣＤ８クロスプライミングに対する効果が徐々に減少することは、クロスプライミングの刺激に対する感受性の閾値があることを示唆している（データは示されていない）。ＥＧ７によるＧｐ９６分泌は、動員されたＦ４／８０ｄｉｍ細胞の総数を２倍にし、ｇｐ９６−Ｉｇを分泌しないＥＧ７に対して樹状細胞及びナチュラルキラー細胞の数を３倍にした（図７Ｂ）。最初の２日間にｇｐ９６によって腹膜腔内に動員された樹状細胞がかなりの量のＢｒｄＵを取り込んだことは、それらの活性化を示している。流入大動脈周囲リンパ節から分離された樹状細胞、腸間膜リンパ節及びひ臓は、対照的にＢｒｄＵ陰性であった（図８Ａ）。この発見は、樹状細胞が活性化されてｇｐ９６分泌部位において局所的に増殖することを強く示唆している。ＢｒｄＵ陽性の樹状細胞がリンパ節及び脾臓にもみられるのは後だけである。ＥＧ７は、ｇｐ９６を分泌しておらず、最初の２日間に腹膜腔内において樹状細胞によるＢｒｄＵ取り込みを生じさせなかった。興味深いことに、しかしながら、ＥＧ７によって動員された樹状細胞が第４日に弱くＢｒｄＵ陽性であったこと（図８Ａ）は、ＥＧ７−ｇｐ９６による初期の強い活性化とは対照的に、ＥＧ７による遅延した弱い活性化を示す。ｗｔ腫瘍ＥＧ７によるこの遅延した樹状細胞活性化は、最小限のＣＤ８増殖を伴う。
【０１０５】
ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇグループにおいて第２日までに腹膜腔内に存在するＣＤ８細胞が有意なＢｒｄＵ取り込みを示し、一方で、同時に流入リンパ節及びひ臓中のＣＤ８細胞はＢｒｄＵ陰性のままであった（図８Ｂ）。この発見は、リンパ節ではなく、ＣＤ８増殖の局所的な腹膜の開始と一致している。第４日までに、腹膜腔におけるＣＤ８細胞によるｇｐ９６依存的ＢｒｄＵ取り込みは、非常に顕著であり、リンパ節又は脾臓よりもさらに有意に高かった（図８Ｂ）。
【０１０６】
ｇｐ９６グループのナチュラルキラー細胞がＣＤ６９（図８Ｃ）及び２Ｂ４（データは示されていない）アップレギュレーションによって示されるように第４日までに活性化されたが、ＥＧ７グループは活性化されなかった。ＣＤ６９アップレギュレーションによって測定されるようなＮＫ活性化が、ＰＥＣのみにおいて生じ（図８Ｃ）、リンパ節又は脾臓において生じなかった（データは示されていない）ことは、局所的活性化を示唆する。
【０１０７】
これらのデータは、腹膜腔における局所的ｇｐ９６放出が、先天性免疫細胞及び適応性免疫細胞の局所的動員及び活性化を生じさせるシグナルを送信できることを実証しており、リンパ節及びＣＤ４細胞に依存しないＣＤ８クロスプライミングに対する細胞内メカニズムを提供する。ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ又は３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇの皮下注射投与が、ＯＴ−Ｉクロスプライミングに等しく有効であるので（データは示されていない）、このクロスプライミングメカニズムは、腹膜腔の特別な組織に依存しない。
【０１０８】
ｇｐ９６をシャペロンとして折りたたまれるペプチドによる非常に効率的なＣＤ８ＣＴＬクロスプライミング：両方の細胞株が同程度の量のＯＶＡを分泌するが（〜８０ｎｇ／２４時間×１０６個の細胞）（図６）、ＥＧ７と比較すると、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによるｇｐ９６−Ｉｇの分泌は、ＯＴ−Ｉ増殖を劇的に増加させる。同種異系の３Ｔ３−ＯＶＡと３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−ＩｇとでＯＴ−Ｉ増殖を比較すると、ＯＴ−Ｉ増殖に同様の差がみられる（Ｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ａｕｇ  １５；１７９（４）：２３１０−７）。ＯＶＡをトランスフェクトした細胞から分泌されるＧｐ９６−Ｉｇは、ＯＶＡペプチド（ｇｐ９６−ＯＶＡ）を折りたたむｇｐ９６分子を少ない割合（０．１％以下）で含んでおり、これらがＯＴ−Ｉクロスプライミングに関与していると考えられる。しかしながら、分泌されたｇｐ９６は、樹状細胞の動員及び活性化のための非特異的アジュバントとしても機能し、それによって、ＯＶＡタンパクの取り込み及びクロスプライミングを強めているかもしれない。最後に、ｇｐ９６−Ｉｇ及びＯＶＡタンパクが独立した分子として分泌され、細胞外でｇｐ９６−Ｉｇ−ＯＶＡ複合体を形成していることもあり得る。これらの可能性を区別するためにいくつかの試験を行った。
【０１０９】
まず、３Ｔ３−ＯＶＡ、３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇ、又は、ＥＧ７、ＥＧ７ｇｐ９６−Ｉｇ及び純粋なＯＶＡタンパクの腹腔内注入後に腹膜腔及びひ臓におけるＯＴ−Ｉ増殖の効率の用量作用プロファイルを比較した（図９）。ＯＶＡ及びｇｐ９６−Ｉｇの分泌速度を、それぞれ、２４時間当たりに分泌されたナノグラムとしてインビトロにおいてＥＬＩＳＡによって測定した。図９に示すように、異なる細胞数の注入によって分泌ＯＶＡ及びｇｐ９６−Ｉｇの用量範囲を実現した。ＯＴ−Ｉ増殖を刺激の４日後に測定した。２４時間当たり８０ｎｇ〜８００ｎｇの速度でＯＶＡのみを分泌する３Ｔ３−ＯＶＡ細胞は、ＯＴ−Ｉを増殖させることができなかった。明らかに、このＯＶＡ量は、免疫系の同種異系活性化の存在下でさえもＯＴ−Ｉをクロスプライミングすることができない。同様に、ＯＶＡだけを分泌する同系ＥＧ７細胞は、ＥＧ７細胞がＫｂ−ＯＶＡを発現しても、ＯＴ−Ｉを最小限度に増殖させる（図６）。このことは、ＯＴ−Ｉの直接的プライミングが非常に非能率的であることを示している。対照的に、ｇｐ９６がＯＶＡ含有腫瘍細胞から分泌されるときに、２４時間当たり８０ｎｇ〜８００ｎｇのｇｐ９６は、効率的にＯＴ−Ｉをクロスプライミングし、それらの脾臓における局所的増殖を生じさせる。対照的に、ＯＶＡタンパクによる効率的ＯＴ−Ｉクロスプライミングは、３ｍｇ〜１０ｍｇのタンパクを必要とする。ＯＴ−Ｉ増殖の感受性における差は、ＯＶＡタンパク対ＯＶＡ含有細胞から分泌されたｇｐ９６において重量換算で〜１０，０００倍である（図９）。分子量、及び、分泌されるｇｐ９６分子の最大０．１％がＯＶＡペプチドに結合しているという事実を考慮に入れると、ＯＴ−Ｉクロスプライミング活性の差は、ｇｐ９６−ＯＶＡ対ＯＶＡタンパクにおいてモル換算で約２０００万倍である。
【０１１０】
シャペロンによって折りたたまれていないタンパクによるＣＤ８−ＣＴＬクロスプライミングに対するｇｐ９６のアジュバントの活性：図９に示すデータは、ｇｐ９６−ＯＶＡ複合体としてではなく、独立した分子として分泌されるｇｐ９６−Ｉｇ及びＯＶＡが、ＯＴ−Ｉの効率的なクロスプライミングに関与しているという可能性を留保する。この可能性を検討するために、ｇｐ９６及びＯＶＡを意図的に独立した分子として投与する条件下においてＯＴ−Ｉ増殖を研究した。ＯＶＡではないｇｐ９６のみを分泌する３Ｔ３−ｇｐ９６細胞を腹腔内に単独で注入するか又はＯＶＡタンパクと共に同時注入し、ＯＴ−Ｉ増殖を従来通り定量した。図１０Ａに示すように、２４時間当たり２００ｎｇのｇｐ９６−Ｉｇを分泌する同種異系３Ｔ３−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞は、非特異的ＯＴ−Ｉ増殖を生じさせなかった。同様に、単独で注入された２００ｎｇ及び５０μｇのＯＶＡは、ＯＴ−Ｉ増殖を媒介することができなかった。対照的に、５０μｇのＯＶＡを、２４時間当たり２００ｎｇのｇｐ９６−Ｉｇを分泌する３Ｔ３−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞と共に同時注入したときに、おおよそ最適なＯＴ−Ｉ増殖がみられた。このことは、ｇｐ９６がＯＴ−ＩのＯＶＡクロスプライミングのためのアジュバントとして機能することを示している。ＯＶＡと共にトランスで作用するｇｐ９６の作用がＯＴ−ＩクロスプライミングをＯＶＡのみよりも１００倍〜１０００倍増加させる一方で、（シスで）ＯＶＡを折りたたむｇｐ９６はクロスプライミングを（ＯＶＡのみと比較して）１００万倍超に増加させる。ネガティブコントロールとして、ＯＶＡの非存在下の３Ｔ３−ｇｐ９６−Ｉｇは、同種抗原性にもかかわらずＯＴ−Ｉ増殖に対して効果がなかった。さらに、２００ｎｇのｇｐ９６−Ｉｇを分泌する３Ｔ３−ｇｐ９６−Ｉｇは、同時注入された２００ｎｇのＯＶＡタンパクと組み合わされてもＯＴ−Ｉをクロスプライミングすることができなかった。これによって、ｇｐ９６−ＩｇとＯＶＡとが細胞外で複合体の形成するという可能性が除外された。
【０１１１】
このデータは、ｇｐ９６のアジュバント効果が樹状細胞の活性化及びピノサイトーシスの刺激によって媒介され、ＯＶＡタンパクの取り込み増加及びＭＨＣ  ＩによるＯＴ−Ｉに対する交差提示をもたらすことを示している。ｇｐ９６は、シャペロンによって折りたたまれていないＯＶＡのクロスプライミングに対してかなりのアジュバント活性を示すが、ＣＤ９１レセプタを介したｇｐ９６−ＯＶＡ複合体の内在化は、ｇｐ９６をシャペロンとして折りたたまれた、クラスＩ  ＭＨＣ提示のためのペプチドを得ることにおいてさらに効率的であり、それによってクロスプライミング効率をさらに高める。
【０１１２】
ｇｐ９６−Ｉｇの連続的分泌は、適合移植されたＣＤ８細胞に対して及び内因性ＣＤ８細胞に対して最大のＣＤ８クロスプライミング活性を与える：腫瘍細胞からのｇｐ９６の分泌のモデル系は、ＯＴ−Ｉクロスプライミングに対する効果において、どのようにしてｇｐ９６の連続的分泌がｇｐ９６の急速注入に匹敵するのかという疑問を提起する。ＯＶＡ及びＯＴ−Ｉが人工試験系であるので、ＯＴ−Ｉを用いて得たデータが内因性の非トランスジェニックＣＤ８細胞に適用可能であることを確認することも重要であった。重要なことに、Ｂ６マウスのＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ免疫化が、その後の親ＥＬ４細胞による抗原投与に対するＣＤ８依存的防御を、免疫化前のマウスと比較して５０倍〜１００倍に増加させるが、ルイス肺癌に対しては増加させないということは、内因性腫瘍抗原に対するｇｐ９６依存的クロスプライミングを示唆している（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５１７８−５１８２）。２０，０００個に１個の低頻度（０．００５％）で生じる、内因性の、非トランスジェニックＯＶＡ特異的ＣＤ８細胞は、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ免疫化まで、ＣＤ８ゲートにおいて１％〜３％の頻度に上昇し、より低い頻度から始まる（データは示されていない）ＯＴ−Ｉと同様の増殖を示している。同時に、これらのデータは、ｇｐ９６によって媒介されるクロスプライミングが、ＴＣＲトランスジェニックＯＴ−Ｉ細胞に限定されていないことのみならず、内因性腫瘍特異的ＣＤ８細胞及びＯＶＡ特異的ＣＤ８細胞によっても機能することを示している。
【０１１３】
３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇ培地から採取した２００ｎｇの血清を含まないｇｐ９６−Ｉｇ−ＯＶＡの腹腔内注入の効果と、インビボにおいて２４時間に２００ｎｇを分泌する３Ｔ３−ＯＶＡ−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞を注入する効果とを比較すると、ｇｐ９６―ＯＶＡが連続的に分泌されるときに、急速なｇｐ９６−ＯＶＡに比べてＯＴ−Ｉ増殖の劇的な増加がみられた（図１０Ｂ）。この観察は、例えば感染による進行中の細胞死の結果として生じ得るｇｐ９６の連続的な放出が、ＣＤ４支援なしの、リンパ節を必要としない同族ＣＤ８クロスプライミングのための最適な刺激であることを示す。
【０１１４】
驚くべきことに、この研究は、ｇｐ９６をシャペロンとして折りたたまれるペプチドによるクロスプライミングの活性が純粋なタンパクのみと比較して１００万倍超に強化されることを明らかにしている。この発見は、瀕死細胞によって放出される抗原ペプチドに対するＣＤ８ＣＴＬの生成のための非常に感度がよいメカニズムを提供するので、有意義である。
【０１１５】
抗原交差提示の効率のこの分析において、ＯＴ−Ｉ増殖は、ｇｐ９６−ＯＶＡ、ｇｐ９６を加えたＯＶＡ、又は、ＯＶＡのみによる抗原交差提示のための感度がよい量的読み出し情報として機能した。ＯＴ−Ｉ増殖において観察された差は、異なる形態のＯＶＡの交差提示の活性の効率によってのみ説明することができる。Ｇｐ９６をシャペロンとして折りたたまれたＯＶＡは、明らかに、交差提示において最も活性であり、次いで、アジュバントｇｐ９６を加えたＯＶＡ、及び、ＯＶＡのみは、シャペロンで折りたたまれたＯＶＡよりもクロスプライミングにおいて１００万倍も活性が小さかった。
【０１１６】
細胞が、感染又はネクローシス、細胞死を生じさせる感染因子に由来するｇｐ９６によって折りたたまれる抗原ペプチドの放出が伴い得るプロセスによって死ぬときに、ｇｐ９６媒介性クロスプライミングのこのメカニズムが生理学的に重要である。感染、細胞死及びｇｐ９６放出の部位への樹状細胞及びナチュラルキラー細胞の誘引及び活性化は、ｇｐ９６によって折りたたまれる抗原性ペプチドのＣＤ８細胞への交差提示、及び、リンパ節に依存せずに原位置でのＣＴＬの生成のための効率的な経路を提供する。次いで、これらのＣＴＬは、周囲の感染細胞を除去するように機能し、それによって感染因子の拡大を限定する。
【０１１７】
熱ショックタンパクによる先天性免疫系の促進に基づいた防衛体制は、明らかに両生動物の初期脊椎動物系統に既に存在していた。適応免疫の進化と共に、ｇｐ９６の役割は、そのアジュバント機能から、ＣＤ８ＣＴＬの効率的なＭＨＣ  Ｉクラス交差提示及びクロスプライミングのための特異性抗原の担体の役割まで拡張したと考えられる。
【０１１８】
このモデル及び仮説の裏付けとして、原位置でのｇｐ９６分泌が、同族のＣＤ８細胞を局所的に活性化することができる多数の樹状細胞及びナチュラルキラー細胞の局所的動員及び活性化につながるという証拠を提供する。樹状細胞は、ｇｐ９６に呼応して腹膜腔内で増殖するが、その他の部位では増殖しない。同様に、ナチュラルキラー細胞は、腹膜腔内のみにおいて活性化されるようになる。同族のＣＤ８細胞は、腹膜腔において最も早く最大の活性増殖を示す。しかし、その後に、ＣＤ８増殖が脾臓を含むその他の部位にも広がる。ｇｐ９６によるＣＤ８細胞の局所的クロスプライミングの解釈から、腹膜腔におけるモデルにおいて示唆されているように、クロスプライミングプロセスがリンパ節の非存在下において機能できるに違いないことが予測及び要求される。これはＬＴαノックアウトマウスにおいて確認された。ｇｐ９６−Ｉｇによる効率的なＣＤ８クロスプライミングが腹膜腔に限定されないことは重要である。同じように効率的なＣＤ８クロスプライミング及び全身性免疫の生成は、ｇｐ９６−Ｉｇを分泌する腫瘍を用いた皮下注射免疫処置によっても観察された。アクセスが容易であり、その他の部位にみられる交絡細胞群が存在しないことから、分析のために腹膜部位を選択した。
【０１１９】
ｇｐ９６によって折りたたまれたペプチドによるＣＤ８細胞のリンパ節非依存的クロスプライミングは、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４支援の独立と一致する。むしろ、樹状細胞活性化は、他者によって以前に示されていように、ＣＤ９１及びＴＬＲ２／４へのｇｐ９６結合によって媒介されるようである。予備実験において、抗ＣＤ９１抗体がｇｐ９６媒介性ＣＤ８クロスプライミングを完全にブロックすることを実証することができた。しかしながら、ＣＤ８０とＣＤ８６とによるＣＤ８細胞の同時刺激は、ｇｐ９６によるＣＤ８クロスプライミングに絶対に必要である。
【０１２０】
これらの研究は、ｇｐ９６が、細胞外環境に存在する抗原タンパクのクロスプライミングを強めることによって、ＣＴＬ生成のアジュバントとして機能し得ることも示す。瀕死細胞からの熱ショックタンパク質の放出は、樹状細胞を活性化すること、樹状細胞による細胞外タンパクの飲作用の促進、及び、それらのＭＨＣ  Ｉ交差提示によって先天性免疫反応を活性化する「危険信号」として作用し得る。ｇｐ９６のアジュバント活性がナチュラルキラー細胞を活性化し、それによってＴｈ１反応を生じさせ、細胞外の感染因子の除去を強める。
【０１２１】
ｇｐ９６の異常なクロスプライミング活性の重要な要因は、分泌によるその連続的な持続的放出である。そのモデル系において、同種異系細胞又は同系腫瘍細胞がｇｐ９６を分泌し、インビボ系において、単一変数、ｇｐ９６分泌対非分泌の分析を可能にする。この方法は、細胞分画法及び抗原又はｇｐ９６の精製を必要とせず、それによって、生化学的な精製手順に伴う潜在的問題を回避する。データは、小量のペプチド複合体（〜２００ｎｇ／２４時間）の持続的（２４時間）放出（分泌）が、急速に注入された同じ量のｇｐ９６ペプチド複合体よりも、ＣＤ８クロスプライミングにおいてはるかに効率的であることを示している。一見したところ、進行中の感染においてみられるものに似ている、ある程度の時間にわたる連続的な免疫系の刺激は、急速に希釈された又は食細胞によって取り込まれる急速投与よりも、はるかに強い免疫刺激である。予備データは、腹腔内に注入されたｇｐ９６を分泌する生存同種異系３Ｔ３繊維芽細胞が除去される前に５日〜７日残存することを示す。ｇｐ９６を分泌する腫瘍細胞の照射又はマイトマイシンＣによる治療が、それらのｇｐ９６分泌及びインビボにおけるクロスプライミング活性のいずれをも低下させない（データは示されていない）ことは、細胞複製が強化されたＣＤ８クロスプライミングに必要でないことを示している。
【０１２２】
潜在的に重要なリンパ節及びＣＤ４非依存的免疫防御メカニズムを明らかにすることに加えて、これらの研究は、効率的な細胞ワクチン戦略の設計のための基礎を提供する。
【０１２３】
実施例３：腫瘍によって誘導される免疫抑制をＢ細胞の非存在下において高頻度のワクチン接種又は免疫化によって克服する
この実施例は、腫瘍によって誘導される免疫抑制が、抗原非特異的であり、高頻度の免疫化又はＢ細胞の不存在によって克服され得ることを実証する。定着腫瘍は、ＣＤ８Ｔ細胞クローン性増殖をインビボにおいて抑制する。それは、通常は腫瘍を有しないマウスにおいて抗原特異的糖タンパク（ｇｐ）９６シャペロンワクチン接種によってみられる。定着腫瘍によるＣＤ８Ｔ細胞増殖の抑制は、ＣＤ８Ｔ細胞受容体によって認識される抗原の腫瘍関連発現に依存しない。腫瘍を有しないマウスと比較すると、腫瘍を有するマウスのワクチン接種は、ワクチン部位への増加した細胞動員を伴う。しかしながら、定着した抑制性を有する腫瘍の拒絶は、高頻度（毎日）のｇｐ９６ワクチン接種を必要とした。Ｂ細胞は、ヘルパーＴ細胞１反応を減少させることがわかっている。Ｂ細胞欠損マウスにおいて、単独ワクチン接種によって定着腫瘍の腫瘍拒絶を達成することができることがわかった。従って、腫瘍を有しないＢ細胞欠損マウスにおいて、同族ＣＤ８細胞毒性Ｔリンパ球クローン性増殖が、ｇｐ９６シャペロンワクチン接種に呼応して強められる。細胞ワクチンによる高頻度ワクチン接種及びそれと同時に起こるＢ細胞枯渇は、患者において抗癌性ワクチン療法の活性を非常に強める。
【０１２４】
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、メイン）又はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、メリーランド）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド［Ｂ細胞欠損マウス（ＢＣＤＭ）］を有するＩｇ−ｍ鎖欠損マウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。
【０１２５】
ＧＦＰマウスを親切な許可によって生産者から入手した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊオキシトシン−１（ＯＴ−１）マウス（Ｍ．Ｂｅｖａｎ博士、ワシントン大学、シアトル、ワシントンから入手した）は、Ｈ−２Ｋｂ−限定ニワトリオバルブミン由来ペプチド２５７〜２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に対して特異的なトランスジェニックＴＣＲ（Ｖａ２Ｖｂ５．１．２）を発現する。マイアミ大学の動物施設において施設内ガイドラインに従って、ＧＦＰマウスをＯＴ−Ｉマウスと交雑させてＧＦＰ−ＯＴ−Ｉマウスを作成した。その後代マウスを、ｏｖａ−ＴＣＲ遺伝子の発現に対するポリメラーゼチェーン反応及びＧＦＰに対する螢光によって選別した。すべてマウスをアンチジーンから６週間〜１２週間で用いた。
【０１２６】
細胞株：ＥＧ７細胞株（Ｍ．Ｂｅｖａｎから入手した）にｇｐ９６−Ｉｇを含むベクターｐＣＭＧ−Ｈｉｓを記載されているようにトランスフェクトした。コントロール細胞にはベクターのみをトランスフェクトした。ルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。その細胞にｐＡＣ−ｎｅｏ−ｏｖａを含むオバルブミン、又は、そのオバルブミンベクターとｐＣＭＧ−Ｈｉｓを含むｇｐ９６−Ｉｇとの両方をトランスフェクトした。１０％ウシ胎仔血清及びゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含むイスコーブ修飾されたダルベッコ媒体（ＧＩＢＣＯ、カールズバッド、カリフォルニア）においてすべて細胞を培養した。トランスフェクトされた細胞を維持するために、選択用抗生物質（Ｇ４１８又はＬ−ヒスチジノール、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ）を培地に加えた。
【０１２７】
抗体：抗ＣＤ１６／３２（２．４Ｇ２）、ＣｙＣｈｒｏｍｅ抗ＣＤ３ｅ（１４５−２Ｃ１１）、ＣｙＣｈｒｏｍｅ抗ＣＤ５（ＵＣＨＴ２）、ＣｙＣｈｒｏｍｅ抗ＣＤ８ａ（５３−６．７）、ＰＥ−ＣＤ１９（４Ｇ７）、ＰＥ又はＦＩＴＣ抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、及び、ＰＥ又はＦＩＴＣ抗ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）をＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（サンディエゴ、カリフォルニア）から購入した抗体を染色に用いた。
【０１２８】
ＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ細胞及びＣＤ１９＋Ｂ細胞の精製及び適合移植：脾細胞及びリンパ節細胞の貯蔵された単個細胞浮遊液は、ＧＦＰ−ＯＴ−Ｉマウスから得られ、塩化アンモニウム溶解によって赤血球を除去した。製造社の説明書に従って、抗ＣＤ８ａ磁気マイクロビーズ及びＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、オーバーン、カリフォルニア）を用いて、ポジティブカラム選択によってＧＦＰ−ＯＴ−Ｉ細胞を分類した。フローサイトメトリ分析によって測定すると、分離されたＯＴ−Ｉ細胞の純度は９５％以上であった。精製された細胞におけるＶａ２及びＶｂ５．１．２の発現量をフローサイトメトリによって定量した。Ｂ細胞の精製のために、抗ＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、オーバーン、カリフォルニア）を用いてＣＤ１９＋細胞を精製した。腫瘍細胞の移植の２日前に尾静脈から１０７個の精製された細胞を適合移植して、ＢＣＤＭマウス中のＢ細胞を再構成した。
【０１２９】
インビボにおけるＣＤ８ＣＴＬ増殖の分析：ＣＤ８＋ＣＴＬ増殖を測定するために、マウスは、１０６個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉを適合移植され、２日後に１×１０６個から４×１０６個の未照射ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞の腹腔内注入によって免疫化させた。免疫化後の定めた時間間隔の後に、腹膜腔、腸間膜、大動脈周囲リンパ節［流入リンパ節］（ｄＬＮ）及び示されている時点における末梢血から細胞を採取した。塩化アンモニウム溶解によってサンプルから赤血球を除去した。０．５％ウシ血清アルブミン（フェニルホウ酸）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中において、抗ＣＤ１６／３２モノクローナル抗体と共に１００万個の細胞を４℃で１０分間インキュベートして、ＦｃＲ結合を阻害した。その後、示されている抗体と共に細胞を３０分間インキュベートした。ＣＥＬＬ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によってサンプルを分析した。示されている組織当たりの免疫細胞の総数は、ターゲット細胞のパーセンテージ及び各組織中の細胞総数から算出した。
【０１３０】
腫瘍接種及び処理プロトコル：未照射ＥＧ７、ＬＬＣ又はＬＬＣ−ｏｖａ細胞を含む２００ｍＬのＰＢＳをマウスのわき腹に皮下注入した。ＬＬＣ−ｏｖａ細胞の接種（第５日）の５日後に、精製された１０６個のＧＦＰ−ＯＴ−Ｉを含む０．３ｍＬ体積のＰＢＳを尾静脈から注入した。２日後に、グラフに示されているスケジュールに従って、１０６個の未照射ＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞又はＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞を含む０．５ｍＬ体積のＰＢＳを腹腔内に注入してマウスを免疫化させた。コントロールマウスをＰＢＳ、ＥＧ７又はＬＬＣ−ｏｖａによって処理した。わき腹の腫瘍の二次元サイズを週２回少なくとも２０日間にわたって測定した。
【０１３１】
統計分析：反復測定分散分析及びウィルコクソン符号順位検定によって有意性を評価した。Ｐ＜０．０５の値が統計的有意差を示しているとみなした。
【０１３２】
定着腫瘍は、ＴＣＲ特異性に依存せずにＧｐ９６媒介性Ｄ８ＣＴＬ増殖を抑制する：腫瘍細胞中への熱ショック融合タンパクｇｐ９６−Ｉｇのトランスフェクションは、ｇｐ９６をシャペロンとして折りたたまれたペプチドに加えてｇｐ９６−Ｉｇの分泌につながる。Ｇｐ９６−Ｉｇは、ＩｇＧ１のＦｃ部分によるｇｐ９６の小胞体保留シグナル（ＫＤＥＬ）の置換によって生成される融合タンパクである。ｇｐ９６−Ｉｇを分泌する腫瘍細胞をマウスに注入すると、腫瘍特異的免疫及び免疫記憶の誘導並びにその後の同じものの投与に対する防御が生じるが、トランスフェクトされていない腫瘍では生じない。分泌されたｇｐ９６−Ｉｇによって生じる腫瘍免疫性は、ＥＬ４特異的抗原などの腫瘍内因性抗原に由来するペプチドを含むｇｐ９６によって折りたたまれたペプチドに対して、及び、ＥＬ４（ＥＧ７）又はＬＬＣ（ＬＬＣ−ｏｖａ）にトランスフェクトされたオバルブミンなどの代用抗原に対して特定的である。このオバルブミン代用抗原は、オバルブミンに特異的な、ＯＴ−Ｉ  ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８細胞の適合移植によってインビボにおけるＣＤ８ＣＴＬ増殖を正確に測定する方法を提供する。
【０１３３】
定着腫瘍は、ＣＴＬ増殖に対して抑制性であることがわかっている。ＴＣＲトランスジェニックＯＴ−１系を用いて、定着腫瘍の存在下又は不存在下におけるＣＴＬ反応を測定した。この系においては、トランスジェニックＣＤ８ＣＴＬが、オバルブミンがトランスフェクトされた同系又は同種異系腫瘍であって、ｇｐ９６−Ｉｇ−ｏｖａを分泌する腫瘍に対して応答する。移植可能腫瘍モデルとして、オバルブミントランスフェクションによるＥＬ４に由来するＥＧ７を用いた。これは、免疫原性であり、かつ、腫瘍形成性が高いものとして分類される。免疫原性がより低く、かつ、腫瘍形成性が高いと考えられるＬＬＣ及びＬＬＣ−ｏｖａをさらに用いた。両方の細胞株の分裂速度は、培養における倍増時間が８時間〜１２時間と非常に急速である。
【０１３４】
１０６個の細胞当たり２４時間に６０ｎｇ〜８０ｎｇのｇｐ９６−Ｉｇを分泌する１００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞による単独の腹腔内免疫化の後に、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８Ｔ細胞は、ＣＤ８ゲートにおいては低くから免疫前レベル（Ｂ０．２％）まで、腫瘍を有しないマウスにおいては高頻度（１５％〜４０％）まで増殖する（図１１Ａ）。ｇｐ９６−Ｉｇを分泌しない被照射ＥＧ７の投与は、有意なＯＴ−Ｉ増殖を生じさせることができない。しかしながら、わき腹の離れた部位の皮下に定着したＥＧ７腫瘍の存在は、ｇｐ９６ワクチンによって誘導されるＯＴ−Ｉの増殖を、腹膜腔（図１１Ａ−Ｃ）並びに脾臓及びリンパ節（図示せず）において全身的に有意に阻害する。ＥＧ７腫瘍は、オバルブミンを分泌し、Ｋｂ−ｏｖａを発現する。従って、その適合移植されたＯＴ−Ｉは、腫瘍床又は腫瘍ｄＬＮを経由した再循環によって、共刺激シグナルを受けない一方でそれらのＫｂ−ｏｖａ特異的ＴＣＲを経由したシグナルを受けることによって、アネルギーになり得る。この仮説を試験するために、どちらもオバルブミンを発現しない同系腫瘍のＥＬ４及びＬＬＣを離れた部位において皮下に定着させた。次いで、ＯＴ−Ｉを静脈から適合移植し、マウスを前述のようにＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによって腹腔内において免疫化させた。定着したＥＬ４及びＬＬＣは、分泌されたｇｐ９６−ｏｖａによってＯＴ−Ｉ増殖を抑制することにおいて定着したＥＧ７と同じくらい効果がある。このことは、この抑制が腫瘍中の適切なＴＣＲ抗原、Ｋｂ−ｏｖａに依存しないことを示している（図１１Ｂ、Ｃ）。腹膜腔内における及び全身的なＯＴ−Ｉ増殖は、離れた部位のＬＬＣ及びＥＬ４の存在によって抑制されたが、驚くべきことに、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによって腹膜腔内に免疫化を行った後の全細胞動員は、腫瘍を有しないマウスと比較すると、実際に増加した（図１１Ｄ）。
【０１３５】
このデータは、定着腫瘍がＣＴＬ増殖の抗原非特異的抑制を誘導し得ることを示す。この抑制の誘導は、腹膜腔内のワクチン部位への細胞動員の増加に関連している。この増加した細胞動員がＣＤ８Ｔ細胞の抑制の原因であるかどうかについては調査中である。
【０１３６】
抗原非特異的免疫抑制を克服するために、これらの試験は、ワクチン接種によるＣＤ８ＣＴＬの頻繁に繰り返される抗原特異的刺激が、腫瘍を有するマウスにみられる抑制活性を打ち消すことができるかどうかをテストする。
【０１３７】
定着腫瘍の拒絶は、頻繁なＧｐ９６−Ｉｇ免疫化を必要とする。分泌ｇｐ９６−Ｉｇを含む多くのワクチン接種戦略によって腫瘍及び腫瘍抗原に対するマウスにおける防御免疫を確立することは可能であるが、治療ワクチン接種によって既に定着した腫瘍を拒絶することはさらに難しい。ＣＤ８増殖の抗原非特異的抑制の観察を考慮して、様々なワクチン接種スケジュールがどのように腫瘍拒絶及び／又は腫瘍増殖に影響するかを分析した。
【０１３８】
まず、腫瘍移植と同じ日にワクチン接種を始めることによって治療ワクチン接種の効果を分析した。１００万個のＥＧ７腫瘍細胞を同系マウスのわき腹の皮下に移植した。同じ日（第０日）に、１０６個の細胞当たり２４時間に６０ｎｇ〜８０ｎｇの速度でｇｐ９６−Ｉｇを分泌する、１００万個のｇｐ９６―Ｉｇ分泌ＥＧ７ワクチン細胞（ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ）をワクチンとして腹腔内投与し、ワクチン接種を第３日、第７日、第１０日及び第１４日に繰り返した。治療を受けていないマウスと比較して、腫瘍増殖は、腫瘍移植と同じ日に開始した４回のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種によって有意に（Ｐ＝０．００７８）減少した（図１２Ａ）。この治療効果はｇｐ９６及び抗原依存的である。ｇｐ９６−Ｉｇを分泌しない被照射ＥＧ７（図１２Ａ）、又は、ＥＧ７抗原を発現しないがＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇと同じ速度でｇｐ９６−Ｉｇを分泌するＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇ（図１２Ｂ）は、ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇと同じ量及びスケジュールでワクチンとして腹腔内投与されたときに、腫瘍増殖を遅延させることができない。ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによるワクチン接種を２日後又はＥＧ７接種後に開始すると、同じワクチン接種スケジュールを用いても治療効果が実質的に低下した（図１２Ａ）。これらのデータは、２日後でさえも、定着腫瘍は、新たに移植する腫瘍よりも、ワクチン接種によって抑制するのが困難であることを実証する。
【０１３９】
より高頻度のワクチン接種スケジュールによって３日間以上の定着した腫瘍を抑制することができるかどうかについても試験を行った。１００万個のＥＧ７腫瘍細胞をわき腹の皮下に移植し、３日〜７日間定着させて、少なくとも７回以上腫瘍細胞を倍増させた。この期間に腫瘍小結節の血管新生が発生する。これは視覚的にみつけることができる。次いで、マウスは、１００万個のＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞による腹腔内ワクチン接種が毎日行われるか、又は、同じスケジュール及び用量のＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞若しくは特異性コントロールとして被照射ＥＧ７細胞を接種されるか、又は、ワクチン接種をせずに放置された。ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによる毎日のワクチン接種は、３日間定着したＥＧ７の増殖を有意に（Ｐ＝０．００７８）かつ効果的に抑制した（図１２Ｂ）。一方で、被照射ＥＧ７又はＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇによる毎日のワクチン接種は、定着したＥＧ７の増殖に対して効果がなかった（図１２Ｂ）。さらなる研究において、移植したＥＧ７腫瘍をＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによるワクチン接種を始める前に５日間及び７日間定着させた。図１２Ｃ及び図１２Ｄに示すように、腫瘍定着のこの後期段階においては、腫瘍増殖を遅延させるために１日２回のワクチン接種が必要であった。このデータは、マウスにおいて頻繁な免疫化が２４日間の腫瘍増殖を抑制することができることを示す。継続的な長期ワクチン接種スケジュールによって、腫瘍を完全に根絶することができるかどうか判断するためにはさらなる研究が必要であろう。
【０１４０】
免疫原性がより低い定着したＬＬＣを用いた試験を繰り返して、免疫原性ＥＧ７リンパ腫を用いて得たデータを検証した（図１３）。腫瘍移植から３日後に始めるＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇを用いた反復腹腔内免疫化（第３日、第７日、第１０日及び第１４日）は、ＬＬＣの腫瘍増殖を有意に（Ｐ＝０．０２３４）遅延させた。ＬＬＣに対する毎日の免疫化は、腫瘍遅延にあまり効果がなかった。ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種がＬＬＣ腫瘍増殖を抑制することができなかったので、免疫化の効果は腫瘍特異的であった。腫瘍増殖抑制は、被照射ＬＬＣによっても達成されたが、ｇｐ９６−Ｉｇ分泌に依存していた。
【０１４１】
これらのデータは、分泌されたｇｐ９６−Ｉｇ及びそれによって折りたたまれたペプチドによる抗原交差提示と組み合わされた高頻度の樹状細胞及びナチュラルキラー細胞活性化が、定着腫瘍によって誘導される抗原非特異的免疫抑制を克服することができることを示している。
【０１４２】
Ｇｐ９６によって媒介される樹状細胞及びナチュラルキラー細胞の動員及びＣＤ８ＣＴＬ増殖は、ＢＣＤＭにおいて強められる：野生型（ＷＴ）マウスと比較すると、ＢＣＤＭにおいてヘルパーＴ細胞１非腫瘍性反応が強められることは、いくつかのグループによって報告されている。従って、ｇｐ９６によって媒介されるＣＴＬ増殖及び抗腫瘍免疫におけるＢ細胞の役割を研究した。腹膜腔は、ＣＤ５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ５＋ＣＤ１９＋Ｂ１−Ｂ細胞によって占められ、後者は、ＩｇＭ抗体を作り、活性化によるアイソタイプスイッチが生じない（図１４Ａ）。ＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇによる腹腔内免疫化によって、ＣＤ５＋ＣＤ１９＋群は、免疫化から４日後までに約５倍になるが、ＣＤ５＋Ｂ１−Ｂ細胞は穏やかに増加する（図１４Ａ）。Ｇｐ９６によって媒介されるＯＴ−Ｉ増殖は、免疫化から４日後及び５日後に最大である。それに先行して、ワクチン接種の部位である腹膜腔における樹状細胞及びナチュラルキラー細胞の動員及び活性化が生じる。ナチュラルキラー細胞は、前に示されているように、ｇｐ９６−Ｉｇによって媒介されるＣＤ８ＣＴＬ増殖の重要な促進因子である。ＢＣＤＭにおいて、腹膜腔（ワクチン部位）への樹状細胞の動員は、野生型マウスにおけるワクチン接種から２日後の動員と同様であった。しかしながら、野生型マウスにおいては樹状細胞数がワクチン接種から４日後までに５０％減少したが、Ｂ細胞欠損マウスにおいては樹状細胞数が同じ高頻度のままであった（図１４Ｂ）。ＢＣＤＭにおいてはナチュラルキラー細胞動員が第２日及び第４日に増加した（図１４Ｂ）。差が有意ではなかったが、３つの独立試験において再現可能であった。ＢＣＤＭへの野生型Ｂ細胞の適合移植は、樹状細胞の増加した保持及びナチュラルキラー細胞の動員を消失させた。この発見は、Ｂ細胞がｇｐ９６によって誘導される先天性免疫細胞の動員に作用することを示唆しており、また、Ｂ細胞もＣＤ８ＣＴＬ増殖の調節又は抑制に関与していることを示唆している。
【０１４３】
従って、ＧＦＰ標識したＯＴ−Ｉ  ＣＤ８  ＣＴＬの増殖がｇｐ９６免疫化に応じてＢＣＤＭにおいて増加するかどうかについても試験を行った。図１５に示すように、野生型マウスと比較して、ｇｐ９６免疫化後のＯＴ−Ｉ増殖は、ＢＣＤＭにおいて第５日に有意に高まった。重要なことに、ＯＴ−Ｉは、免疫化から７日後及び１２日後に腹膜腔において有意に高い（Ｐ＝０．０４）頻度で残存していた（図１５Ａ）。ｄＬＮ（図１５Ｂ）においても、ＯＴ−Ｉ増殖及び保持が増加したが、有意ではなかった。免疫化前におけるＢＣＤＭへの野生型Ｂ細胞の適合移植は、ＯＴ−Ｉ増殖を、野生型マウスにおいてみられるレベル又はそれより低いレベルにした（図１５Ａ、図１５Ｂ）。ＩＬ−１０欠損マウスがＢＣＤＭにおいてみられるような高められた増殖ではなく野生型マウスと同様のＯＴ−Ｉ増殖を示すので、Ｂ細胞の存在によるＯＴ−Ｉ増殖の抑制は、インターロイキン（ＩＬ）−１０生産によって媒介されていない。
【０１４４】
Ｇｐ９６によって媒介される定着非免疫原性腫瘍の拒絶は、Ｂ細胞の非存在下で強められる：上に示されているように、野生型マウスに定着しているＥＧ７腫瘍の増殖抑制は、最低でもｇｐ９６免疫化を毎日行うことを必要とする。同様に、頻繁な免疫によってＬＬＣ進行を遅延させることができる。ＥＧ７及びＥＬ４細胞は、ＢＣＤＭにおいて拒絶され、腫瘍を定着させない。しかしながら、ＬＬＣ及びＬＬＣ−ｏｖａは、野生型マウスにおけるよりも遅い速度で増殖するが、ＢＣＤＭにおいて定着することができる。ＢＣＤＭマウス及びＷＴマウスにおいてＬＬＣ−ｏｖａをわき腹皮下に５日間定着させた。ＯＴ−Ｉを静脈から適合移植し、２日後に、１００万個のＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇを単一用量として腹腔内投与し、わき腹における腫瘍増殖をモニターした。野生型マウスにおいて、ＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇによる単独免疫化は、わき腹において腫瘍増殖の有意な遅延を生じさせたが、腫瘍を拒絶することができなかった（図１６Ａ）。対照的に、ＢＣＤＭにおいて、単独免疫化は、７日間定着したＬＬＣ−ｏｖａ腫瘍を、３頭のマウスにおいては完全に拒絶し、２頭においては有意に減少させた（図１６Ｂ）。治療の非存在下において、ＬＬＣ−ｏｖａは、野生型マウスにおける速度（図１６Ａ）よりも遅いとはいえ、ＢＣＤＭにおいて徐々に増殖する（図１６Ｂ）。ＢＣＤＭのＢ細胞再構成（図１７Ｃ）は、ワクチン接種の効果を、野生型マウスにおいてみられるもの（図１６Ａ）、すなわち進行の遅延、に類似させるようにした。抗体による完全な又は部分的なＢ細胞枯渇がＢ細胞欠損と同じ効果を有するかどうかについて測定することは興味深い。継続中の予備研究は、このアプローチをサポートしているように考えられる。
【０１４５】
単独免疫化によるＢＣＤＭに定着しているＬＬＣの最適な腫瘍抑制は、十分に多い数の腫瘍特異的ＣＴＬ前駆物質（ＯＴ−Ｉ）及び抗原特定的免疫化（ＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ）に応じて変わる。ＢＣＤＭにおいて、ｇｐ９６免疫化を伴わない１００万個の適合移植されたＯＴ−Ｉの存在は、ほとんどのマウスにおいて腫瘍拒絶を生じさせない（図１７Ａ）。同様に、ＯＴ−Ｉ移植を伴わない単独のｇｐ９６免疫化は、組合せほどで有効ではない（図１７Ｂ）。
【０１４６】
定着腫瘍が抗腫瘍免疫を抑制することは広く理解されている。腫瘍特異的Ｔ細胞は定着腫瘍の存在下でアネルギーになる。その研究において用いられたＢ細胞リンパ腫に対するアネルギーは、抗原特異的で、ＭＨＣ限定であり、ＭＨＣが一致した骨髄由来抗原提示細胞の存在に依存する。その他の研究において、抗原非特異的骨髄性抑制細胞及びＴ制御性細胞が抗腫瘍免疫の抑制に関与していた。本研究は、インビボにおけるＣＴＬ反応の抑制は、抗原に依存しない経路を介して、定着腫瘍によってもたらされ得ることを示す。ｇｐ９６−ｏｖａワクチン接種に呼応したＯＴ−Ｉ  ＣＤ８  ＣＴＬ増殖は、腫瘍によるオバルブミンの発現に依存しない定着腫瘍によって阻害される。このタイプの抑制は、Ｔ制御性細胞によって、又は、骨髄抑制細胞又はＭ２マクロファージなどのその他の抑制細胞によってもたらされ得る。この仮説と一致して、この抑制活性は、予備実験において、腫瘍を有するマウスにおいてｇｐ９６ワクチン接種によって誘導された腹膜細胞の移植によって、腫瘍がないマウスに移すことができる。
【０１４７】
ｇｐ９６−ｏｖａ免疫化に対するＯＴ−Ｉ反応が定着腫瘍の存在下において強く阻害されるが、完全にブロックされないということは、定着腫瘍による免疫抑制と、分泌されたｇｐ９６−ｏｖａによって促進された活性化樹状細胞による抗原交差提示を介したワクチン誘導ＣＤ８ＣＴＬ活性化との間にバランスがあることを示している。我々は以前に、未処置マウスのｇｐ９６−ｏｖａが、腫瘍においてナチュラルキラー細胞及び樹状細胞の動員及び活性化を生じさせ、その後にＯＴ−Ｉ増殖を伴うことを示した。定着腫瘍が、ＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇワクチン接種によって腹膜腔内への細胞の動員を実際に強めるが、ＯＴ−Ｉ増殖を抑制することは、定着腫瘍の存在下においては、多くの動員された細胞が抑制細胞であることを示している。この仮説によって、ｇｐ９６−ｏｖａによる頻繁な免疫化が、反復的なｇｐ９６媒介性樹状細胞及びナチュラルキラー細胞刺激、抗原交差提示の増加及びＣＴＬプライミングを介して、そのバランスを抑制から増大した免疫活性化に移すことによって、抑制活性を克服することが予測される。確かに、頻繁な免疫化は腫瘍発達の遅延に対して著しい効果がある。定着ＥＧ７の場合、１日１回又は２回のワクチン接種は、腫瘍増殖を阻止することにおいて、２日に１回又は３日に１回のワクチン接種よりもはるかに有効であった。ＬＬＣに対しては、１日おきに又は３日おきの免疫化が充分であり、毎日の免疫化はあまり効果的ではなかった。これらの腫瘍に特異的な相違は、抑制細胞が末梢腫瘍の存在によって形成される速度に関している可能性がある。あるいは、それは、腫瘍が抑制細胞の誘導を媒介するメカニズム又はその誘導された抑制細胞の特性に依存しているのかもしれない。
【０１４８】
腫瘍から分泌されるｇｐ９６−ｏｖａを用いた腹腔内免疫化に対するＯＴ−Ｉ反応の研究によって、ワクチン部位である腹膜腔内に多数のＢ細胞が動員されることがわかった。Ｂ細胞が抗腫瘍免疫に対して抑制性であることが報告されていることは、ｇｐ９６媒介性ＯＴ−Ｉ増殖におけるその役割に関する疑問を生じさせる。ＢＣＤＭを用いて、腹膜腔におけるナチュラルキラー細胞及び樹状細胞の動員及び保持が増加し、ＯＴ−Ｉ増殖がｇｐ９６−ｏｖａ免疫化後に増加したことが直ちに明らかになった。Ｂ細胞を再構成されたＢＣＤＭがｇｐ９６−ｏｖａによって媒介されるＯＴ−Ｉ増殖に対して野生型マウスのように応答したということは、Ｂ細胞欠損がｇｐ９６−ｏｖａ免疫化に対するＢＣＤＭの反応性をＢ細胞の不存在に無関係な態様で変化させた可能性を除外する。Ｂ細胞欠損は、ＯＴ−Ｉ増殖を増加させるだけでなく、ｇｐ９６−Ｉｇによる単独の免疫化の後に７日間定着したＬＬＣ−ｏｖａ腫瘍の腫瘍拒絶を非常に高めた。このデータは、腫瘍によって媒介される抑制細胞の誘導がＢ細胞の非存在下において大幅に減少すること、又は、それらのＢ細胞が「抑制細胞」として機能していることを示している。Ｂ細胞が抑制細胞の誘導に関与しているかどうか、又は、Ｂ細胞自体がＣＴＬ反応対して免疫抑制性であるかどうかについては、さらなる研究が必要とされる。しかしながら、ＩＬ−１０は、Ｂ細胞によって媒介される腫瘍免疫性の抑制に関与しているとは考えられない。継続中の研究において、ＯＸ４０−Ｌ−欠損Ｂ細胞は、抗腫瘍免疫反応を抑制する能力が低いことがわかった。
【０１４９】
これらの研究は、抗原に依存しない免疫抑制を研究してさらに定義することができるモデルを提供する。Ｂ細胞の役割は、このプロセスにおいて特に興味深い。さらに、これらの研究は、抗腫瘍ワクチン剤がより効果的になり得る方法を提示する。抗体とＢ細胞の枯渇、及び、例えば腫瘍から分泌されたｇｐ９６ワクチンによるその後の頻繁なワクチン接種は、従来のワクチン接種方法によってみられたよりも、さらに効率的な腫瘍増殖の抑制をもたらすかもしれない。
【０１５０】
実施例４：熱ショックタンパクｇｐ９６ワクチン接種による抗腫瘍作用は、Ｂ細胞の非存在下において強まる
Ｂ細胞の非存在下において増大したｇｐ９６の抗腫瘍活性：免疫学的腫瘍拒絶は、通常、Ｔｈ１に偏った抗腫瘍免疫反応中の細胞毒性ＣＤ８細胞の生成に依存する。腫瘍回避戦略は、しばしば、Ｔｈ２サイトカインの生産を含むＴｈ２に偏った体液性応答への免疫偏向を含む。Ｔｈ２反応がＢ細胞活性化及びＴＨ１偏向のフィードバック阻害に関連しているので、ｇｐ９６に対する抗腫瘍免疫反応がＢ細胞の不存在によって影響されるかどうかについて試験を行った。腫瘍系としてＬＬＣ−ｏｖａを用い、代用抗原としてオバルブミンをトランスフェクトした移植可能な自然発生肺腫瘍を用いた。ＬＬＣ−ｏｖａは、非免疫原性であり、増殖が速く（１６時間の分裂期間）、約４週以内に死に至る。ＬＬＣ−ｏｖａにｇｐ９６−Ｉｇをさらにトランスフェクトして、２４時間に１００万個の細胞によって８０ｎｇの速度でｇｐ９６−Ｉｇを分泌する腫瘍であるＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇを作成した。ＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇは、強い同族ＣＤ８−ＣＴＬ活性化を媒介し、抗腫瘍免疫性を生じさせる。この免疫化モデルは、非腫瘍性反応に対するＢ細胞の不存在の効果を評価するために用いられた。野生型マウス及びＢ細胞欠損（ｐＭＴ）マウスのわき腹の皮下にＬＬＣ−ｏｖａを移植し、１００万個の生きたＬＬＣ―ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞を腹腔内に注入したとき（第０日）から７日間定着させた。ＩＣｂによって提示されるオバルブミン由来ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬを検出するＴＣＲトランスジェニックＯＴ−Ｉ細胞（１０６個の細胞）をＬＬＣ−ｇｐ９６−Ｉｇによる免疫化の２日前に静脈内から与えた。野生型マウス中のＬＬＣ−ｏｖａは、免疫化の非存在下においてＯＴ−Ｉが存在するときでさえも徐々に増殖する（図１６）。１００万個のＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞の腹腔内投与は、腫瘍増殖を遅らせるが、完全な腫瘍拒絶を媒介することができない。Ｂ細胞欠損マウスにおいて、ＬＬＣ−ｏｖａは、すべてのマウスにおいて進行性の腫瘍を形成するが、野生型マウスよりも腫瘍増殖が遅い。ｇｐ９６を分泌するＬＬＣ−ｏｖａを用いた７日間の定着した腫瘍を有するＢ細胞欠損マウスの免疫化は、完全な腫瘍拒絶を生じさせた。腫瘍は追跡期間である６週間にわたって再発しなかった。
【０１５１】
明らかに、このモデル腫瘍系におけるＢ欠損マウスは、高頻度の腫瘍特異的前駆物質ＣＴＬ（ＯＴ−Ｉ）の存在下において、ｇｐ９６−免疫化による腫瘍拒絶反応を増やすことができる。適合移植したＯＴ−Ｉの非存在下においてＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇに対する抗腫瘍反応が有意に低下したので、腫瘍拒絶は両方の成分に依存していた（図１７Ｂ）。同様に、ＯＴ−Ｉのみは、免疫化なしではＬＬＣ−ｏｖａを拒絶することができなかった（図１７Ａ）。野生型Ｂ細胞の移植によるＢ細胞欠損マウスにおけるＢ細胞の再構成は、定着腫瘍を拒絶するｇｐ９６の能力を消失させた（図１７Ｃ）。明らかに、正常なＢ細胞の不存在は、Ｂ欠損マウスにおける増大した腫瘍拒絶反応の原因である。
【０１５２】
Ｂ細胞欠損マウスにおける増大したＣＤ８ＣＴＬクローン性増殖：Ｂ欠損マウスにおける定着したＬＬＣ−ｏｖａ腫瘍を拒絶するｇｐ９６に基づいた免疫化の能力向上は、ＣＤ８ＣＴＬ活性化が増加したことを示している。ｇｆｐ標識したＯＴ−Ｉ細胞を用いて、Ｂ細胞欠損マウス及び野生型マウスの免疫化後にＯＴ−Ｉ細胞のクローン性増殖を比較した。ＯＴ−Ｉ細胞を静脈内に適合移植し、２日間の平衡期間の後にＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇをマウスに注入した。免疫化の５日後、７日後及び１２日後に腹膜腔、腸間膜排水及び傍大動脈のリンパ節においてｇｆｐ−ＯＴ−Ｉの頻度を測定した。免疫化前に腹膜腔にはＯＴ−Ｉが実質的に存在せず、流入リンパ節における頻度はＣＤ８ゲートにおいて０．５％である。以前に報告されているように、腫瘍から分泌されたｇｐ９６は、野生型マウスにおいて強いＣＤ８ＣＴＬ増殖を媒介しており、第５日に最大となる。ｇｐ９６−Ｉｇを分泌しないＬＬＣ−ｏｖａは、ＯＴ−Ｉを増殖させない。増殖後の次週に減少が伴う（図１５）。Ｂ細胞欠損マウスにおいては、ＣＤ８ＣＴＬ増殖が、一貫して野生型マウスにおいてみられた数のおよそ２倍に増加する。
【０１５３】
野生型Ｂ細胞によるＢ欠損マウスの再構成は、野生型マウスと表現型を区別することができないＣＤ８反応を生じさせる。ｇｐ９６を分泌する腫瘍細胞による腹腔内免疫化は、Ｂ細胞、樹状細胞及びナチュラルキラー細胞を含む多数の免疫細胞の動員をもたらす。野生型マウスにおいて、Ｂ細胞蓄積は、ＣＤ８ＣＴＬ増殖と動力学的に同時に生じ、いずれもが第３日〜第５日の間に最大となる。樹状細胞及びナチュラルキラー細胞は、ｇｐ９６−Ｉｇ免疫化後の最初の４８時間に腹膜腔内に動員される。Ｂ細胞の非存在下において、樹状細胞及びナチュラルキラー細胞の動員は増加した。一方で、野生型Ｂ細胞によるＢ細胞欠損マウスの再構成は、樹状細胞及びナチュラルキラー細胞の動員を野生型レベルまで回復させた。
【０１５４】
ＯＴ−Ｉ細胞及びＣＤ１９＋Ｂ細胞の精製及び適合移植：脾細胞及びリンパ節細胞の貯蔵された単個細胞浮遊液は、ｇｆｐ−ＯＴ−Ｉマウスから得られ、塩化アンモニウム溶解によって赤血球が除去された。製造社の説明書に従って、抗ＣＤ８ａ磁気マイクロビーズ及びＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、オーバーン、カリフォルニア）を用いて、ポジティブカラム選択によってＧｆｐ−ＯＴ−Ｉ細胞を分類した。フローサイトメトリ分析によって決定すると、分離されたＯＴ−Ｉ細胞の純度はＣＤ８陽性の９５％超であった。注入前に、精製された細胞におけるＶａ２及びＶＰ５．１．２発現量をフローサイトメトリによって定量した。Ｂ細胞の精製のために、抗ＣＤ１９マイクロビーズによる同じ手順でＣＤ１９＋細胞を精製した。ｐＭＴマウスにおいてＢ細胞を再構成するために、１０’精製された細胞を、ＬＬＣ−ｏｖａ細胞接種の２日前に尾静脈から適合移植した。
【０１５５】
腫瘍接種及び治療プロトコル：未照射のＬＬＣ又はＬＬＣ−ｏｖａ細胞が含まれる２００ｍｌＰＢＳをマウスのわき腹に皮下注入した。ＬＬＣ−ｏｖａ細胞の接種（第５日）から５日後に、１０６個の精製されたＯＴ−Ｉを含む０．３ｍｌ体積のＰＢＳを尾静脈から注入した。第７日に、照射されていない１０６個のＬＬＣ−ｏｖａ−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞を含む０．５ｍｌ体積のＰＢＳを腹腔内に注入することによってマウスを免疫化させた。非処理コントロールとして、第５日及び第７日にマウスをＰＢＳで処理した。少なくとも２０日間にわたって週２回腫瘍の二次元サイズを測定した。ＯＴ−Ｉ増殖に対処するために、１０６個のｇｆｐ−ＯＴ−Ｉの適合移植後に、４×１０〜個の照射されていないＥＧ７−ｇｐ９６−Ｉｇ細胞を腹腔内に注入することによってマウスを免疫化させた。リツキシマブ（登録商標）処理したヒトＣＤ２０トランスジェニックマウスにおける腫瘍増殖を評価するために、第４日に１ｍｇのリツキシマブ（登録商標）を含む０．５ｍｌのＰＢＳ又はＰＢＳのみを腹腔内注入することよってマウスを処理した。実験の詳細は、リツキシマブ処理を除いて上述したプロトコルと同様であった。
【０１５６】
フローサイトメトリ分析：設定した時間間隔の後に、示されている回数にわたって腸間膜及び傍大動脈リンパ節（ｄＬＮ）、並びに、腹膜腔から細胞を採取した。リツキシマブ（登録商標）処理の後にヒトＣＤ２０を発現するＢ細胞の枯渇を調べるために、注入の１週間後に末梢血赤血球を得た。塩化アンモニウム溶解によってサンプルから赤血球を除去した。最初に、１００万個の細胞が、ＦｃＲ結合を妨害するために０．５％のＢＳＡ（ＰＢＡ）を含むＰＢＳにおいて抗ＣＤ１６１３２モノクローナル抗体と共に４℃において１０分で培養された。その後、示されている抗体中で細胞を３０分間インキュベートした。ＣＥＬＬ  Ｑｕｅｓｔ  ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）と共にＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてサンプルを分析した。示されている免疫細胞の各組織当たりの総数を、ターゲット細胞パーセンテージと各組織における全細胞数から算出した。腫瘍増殖における有意差を反復分散分析によって評価した。ｐ＜０．０５の試験値を統計的有意差を示す値とみなした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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