(57)【要約】被験体において天然のＡｃｆＤタンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、天然のＡｃｆＤタンパク質と比較して高い溶解度を持つことが同定されている、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ「ＡｃｆＤ前駆体」の変異体。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：（ａ）配列番号３〜１６のいずれか１つに対して同一である；（ｂ）（ａ）と比較して１個〜１０個の１アミノ酸の変化を持つ；（ｃ）配列番号３〜１６のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を持つ；（ｄ）配列番号３〜１６のいずれかの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片である、など。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって：
（ａ）配列番号３〜１６のいずれか１つに対して同一である；
（ｂ）（ａ）と比較して１個〜１０個の１アミノ酸の変化を持つ；
（ｃ）配列番号３〜１６のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を持つ；
（ｄ）配列番号３〜１６のいずれかの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片である、および／または
（ｅ）配列番号３〜１６のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘが３０であり、ｙが０．７５である、
ただし、前記アミノ酸配列は配列番号２ではない、ポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号３〜１６のいずれかに対して少なくとも７５％の同一性を有しており；そして（ｂ）配列番号３〜１６のいずれかの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ただし、前記アミノ酸配列は配列番号２ではない、ポリペプチド。
【請求項３】
腸内Ｅ．ｃｏｌｉ感染または尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ感染に対して哺乳動物を防御するための免疫応答を惹起させるために使用される、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチド：
（ａ）配列番号３〜１６のいずれか１つに対して同一である；
（ｂ）（ａ）と比較して１個〜１０個の１アミノ酸の変化を持つ；
（ｃ）配列番号３〜１６のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を持つ；
（ｄ）配列番号３〜１６のいずれかの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片である、および／または
（ｅ）配列番号３〜１６のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘが３０であり、ｙが０．７５である、ポリペプチド。
【請求項４】
Ｚｎ２＋イオンを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１または請求項２に記載のポリペプチドをコードするプラスミドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質の断片を含む免疫原性ポリペプチドであって、ここでは、前記断片には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質に関して、全長のタンパク質と比較して前記断片の溶解度を増大させる欠失が含まれ、ここでは、前記断片は、被験体において、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、免疫原性ポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質が、配列番号２〜１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を持つ、請求項６に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項８】
前記欠失が、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまでのＮ末端アミノ酸の実質的に全ての除去、Ｎ末端プロリンリッチリピート全体もしくはその一部の除去、またはそれらの両方である、請求項６または請求項７に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項９】
前記免疫原性ポリペプチド断片に、以下を含むアミノ酸配列が含まれる、請求項６〜８のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド：
（ｆ）配列番号９９〜１２８からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号９９〜１２８と比較した、１個から１０個の１アミノ酸の変化；
（ｈ）配列番号９９〜１２８のいずれか１つに対する少なくとも８５％の配列同一性；
（ｉ）配列番号９９〜１２８のいずれかの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片；および／または
（ｊ）配列番号９９〜１２８のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘが３０であり、ｙが０．７５である、免疫原性ポリペプチド。
【請求項１０】
以下を含むアミノ酸配列を含む、免疫原性ポリペプチドであって：
（ａ）配列番号９９〜１２８からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号９９〜１２８と比較した、１個〜１０個の１アミノ酸の変化；
（ｃ）配列番号９９〜１２８のいずれか１つに対する少なくとも８５％の配列同一性；
（ｄ）配列番号９９〜１２８のいずれかの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片、および／または
（ｅ）配列番号９９〜１２８のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘが３０であり、ｙが０．７５である、
ここでは、前記断片は、全長のタンパク質と比較して高い溶解度を持ち、天然の全長のタンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、免疫原性ポリペプチド。
【請求項１１】
前記天然の全長のタンパク質が、配列番号２〜１６のアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項１０に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項１２】
前記免疫原性ポリペプチド断片が、単離されているか、精製されているか、または組み換え体である、請求項６〜１１のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項１３】
アジュバントをさらに含む、請求項６〜１２のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項６〜１１のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項６〜１１のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチドをコードするプラスミドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項１６】
前記欠失が、ｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端アミノ酸の実質的に全ての除去、Ｎ末端プロリンリッチリピート全体もしくはその一部の除去、またはそれらの両方である、請求項６または請求項７に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項１７】
前記免疫原性ポリペプチド断片に、以下を含むアミノ酸配列が含まれる、請求項１６に記載の免疫原性ポリペプチド：
（ｋ）配列番号９９〜１２８からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｌ）配列番号９９〜１２８と比較した、１個から１０個の１アミノ酸の変化；
（ｍ）配列番号９９〜１２８のいずれか１つに対する少なくとも８５％の配列同一性；
（ｎ）配列番号９９〜１２８のいずれかの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片；および／または
（ｏ）配列番号９９〜１２８のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘが３０であり、ｙが０．７５である、免疫原性ポリペプチド。
【請求項１８】
前記免疫原性ポリペプチド断片が、単離されているか、精製されているか、または組み換え体である、請求項１６または請求項１７に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含む、請求項１６〜１８のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１６または請求項１７に記載の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１６または請求項１７に記載の免疫原性ポリペプチドをコードするプラスミドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項２２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質の断片を含む免疫原性ポリペプチドであって、ここでは、前記断片には、配列番号１２９、１３３、および１３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を持つＥ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質に関して、全長のタンパク質と比較して前記断片の溶解度を増大させる欠失が含まれ、ここでは、前記断片は、被験体において、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、免疫原性ポリペプチド。
【請求項２３】
前記欠失が、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまでのＮ末端アミノ酸の実質的に全ての除去、Ｎ末端プロリンリッチリピート全体もしくはその一部の除去、またはそれらの両方である、請求項２２に記載の免疫原性ポリペプチド
【請求項２４】
前記欠失が、ｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端アミノ酸の実質的に全ての除去、Ｎ末端プロリンリッチリピート全体もしくはその一部の除去、またはそれらの両方である、請求項２２または請求項２３に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチドであって、ここでは、前記免疫原性ポリペプチド断片に、以下を含むアミノ酸配列が含まれる、免疫原性ポリペプチド：
（ｐ）配列番号１３０、１３１、１３４、１３５、１３８、および１３９からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号１３０、１３１、１３４、１３５、１３８、および１３９と比較した、１個から１０個の１アミノ酸の変化；
（ｒ）配列番号１３０、１３１、１３４、１３５、１３８、および１３９のいずれか１つに対する少なくとも８５％の配列同一性；
（ｓ）配列番号１３０、１３１、１３４、１３５、１３８、および１３９のいずれかの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片；および／または
（ｔ）配列番号１３０、１３１、１３４、１３５、１３８、および１３９のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘが３０であり、ｙが０．７５である、免疫原性ポリペプチド。
【請求項２６】
以下を含むアミノ酸配列を含む、免疫原性ポリペプチド：
（ｆ）配列番号１３０、１３１、１３４、１３５、１３８、および１３９からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号１３０、１３１、１３４、１３５、１３８、および１３９と比較した、１個から１０個の１アミノ酸の変化；
（ｈ）配列番号１３０、１３１、１３４、１３５、１３８、および１３９のいずれか１つに対する少なくとも８５％の配列同一性；
（ｉ）配列番号１３０、１３１、１３４、１３５、１３８、および１３９のいずれかの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片；および／または
（ｊ）配列番号１３０、１３１、１３４、１３５、１３８、および１３９のいずれかと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘが３０であり、ｙが０．７５であり、
ここでは、前記断片は、全長のタンパク質と比較して高い溶解度を持ち、天然の全長のタンパク質と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、免疫原性ポリペプチド。
【請求項２７】
前記天然の全長のタンパク質が、配列番号１２９、１３３、および１３７のアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項１９に記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項２８】
前記免疫原性ポリペプチド断片が、単離されているか、精製されているか、または組み換え体である、請求項１６〜２０のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項２９】
アジュバントをさらに含む、請求項１６〜２１のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１６〜２１のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項１６〜２１のいずれかに記載の免疫原性ポリペプチドをコードするプラスミドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、（ｉ）２００８年２月２２日に出願された米国仮出願第６１／０３０９０２号、および（ｉｉ）２００８年７月９日に出願された伊国特許出願第ＭＩ２００８Ａ００１２４９号（これらの両方の内容は、全体が参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株に対する免疫化に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｅ．ｃｏｌｉ株は、伝統的に、片利共生的または病原性のいずれかとして分類されており、そして病原性株は、その後、腸内株または腸外株として下位分類される。病原性Ｅ．ｃｏｌｉは、参考文献１（非特許文献１）の中でさらに詳細に議論されており、多数の様々な病原型（すなわち、共通する毒性因子のセットを使用して１つの共通する疾患を引き起こすＥ．ｃｏｌｉ株の１つのグループ）に該当する。株の系統を区別することは日常的に行われている技術であり、これは、遺伝子型によって行うことができ、また、表現型によって行うこともできる。１つの最近の遺伝子型に基づいて系統を区別する方法［２（非特許文献２）］では、ＤＮＡマイクロアレイが使用される。
【０００４】
腸内株の間では、少なくとも６種類の十分に記載されている病原型が公知である：腸病原性（ＥＰＥＣ）、腸出血性（ＥＨＥＣ）、腸管凝集性（ＥＡＥＣ）、腸侵入性（ＥＩＥＣ）、腸毒性（ＥＴＥＣ）、および分散接着性（ＤＡＥＣ）。
【０００５】
Ｅ．ｃｏｌｉの腸外病原性株（すなわち、「ＥｘＰＥＣ」株［３（非特許文献３）、４（非特許文献４）］）には、尿路病原性（ＵＰＥＣ）株、新生児髄膜炎（ＮＭＥＣ）株、および敗血症関連株（ＳＥＰＥＣ）が含まれる。ＥｘＰＥＣは、尿管感染の最も一般的な原因であり、重篤な合併症および死に至る可能性があるヒトの新生児髄膜炎および新生児敗血症の主原因の１つである。他のタイプの腸外感染としては、骨髄炎、肺、腹内、柔組織、および血管内装置が関係している感染が挙げられる。ヒト以外の別のＥｘＰＥＣ病原型は鳥病原性（ＡＰＥＣ）であり、これは、家禽において腸外感染を引き起こす。
【０００６】
ほとんどの以前からあるＥｘＰＥＣワクチンは、細胞溶解物または細胞構造をベースとするものである。ＳＯＬＣＯＵＲＯＶＡＣ（商標）には、６種類のＥｘＰＥＣ株を含む１０種類の熱によって死滅させられた細菌が含まれている。ＵＲＯ−ＶＡＸＯＭ（商標）は、１８種類の選択されたＥ．ｃｏｌｉ株の凍結乾燥させられた細菌溶解物を含む、経口用の錠剤型のワクチンである。Ｂａｘｔｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅによっては、６種類から１０種類の株に由来する繊毛をベースとするＵＴＩワクチンが開発された。ＭｅｄＩｍｍｕｎｅによっては、ＦｉｍＨ接着複合体をベースとする、ＭＥＤＩ５１６と呼ばれる製品が開発されている。対照的に、参考文献５および６（特許文献１および２）には、ＮＭＥＣ株およびＵＰＥＣ株の両方に対して、定義されているワクチンに基づいて使用することができる、ＥｘＰＥＣ株由来の特異的免疫原が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００６／０８９２６４号
【特許文献２】国際公開第２００６／０９１５１７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｐｅｒら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４）２（２）：１２３−４０
【非特許文献２】Ａｎｊｕｍら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００７）７３：５６９２−７
【非特許文献３】ＲｕｓｓｏおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２０００）１８１：１７５３−１７５４
【非特許文献４】Ｓｍｉｔｈら、Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  Ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２００７）４：１３４−６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株に対して、さらに具体的には、腸内病原型（例えば、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＰＥＣ、およびＥＴＥＣ株）ならびにＥｘＰＥＣ病原型に対する免疫化に使用されるさらなるより優れた抗原を提供することが、本発明の１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の開示
参考文献５に開示されている多くの抗原の１つは、アクセサリー定着因子Ｄ（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｄ）（ＡｃｆＤ）前駆体と注釈が付けられている（その中の配列番号７０５１および７０５２；本明細書中では配列番号１および２）。参考文献５には、ＮＭＥＣ株のＩＨＥ３０３４に由来する配列が開示されており、本発明は、ＥｘＰＥＣ「ＡｃｆＤ前駆体」の変異体（これは、ＡＰＥＣ、ＵＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＰＥＣ、およびＥＴＥＣ株を含むさらなる病原型においても同定されている）に基づく。参考文献５の開示とは異なり、これらの変異体は、腸内病原型の処置に特に有用であり得る。したがって、本発明により、そのような変異体が、Ｅ．ｃｏｌｉ感染に対して患者を免疫化することにおけるそれらの使用とともに提供される。加えて、本開示には、全てのＥ．ｃｏｌｉ病原型のＡｃｆＤタンパク質の断片が含まれる。ここでは、これらの断片は、全長と比較して高い溶解度を有しているが、被験体においては、全長のタンパク質によって惹起されるものと実質的に類似する免疫応答を惹起させる。
【００１１】
本発明とともに使用されるポリペプチド
本発明により、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される：
（ａ）配列番号３〜１６のいずれか１つに対して同一である（すなわち、１００％同一である）；
（ｂ）配列番号３〜１６の１つまたは複数に対して少なくともａ％の配列同一性を有している；
（ｃ）配列番号３〜１６の１つまたは複数の少なくともｂ個の連続するアミノ酸の断片である；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）の配列と比較して、別々の位置にある場合も、また連続している場合もある１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個（またはそれ以上）の１アミノ酸の変化（欠失、挿入、置換）を有している；および／あるいは
（ｅ）配列番号３〜１６のいずれか１つと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウ（その結果、ｐ個のアミノ酸までに延ばす（ここでは、ｐ＞ｘである）アラインメントについては、ｐ−ｘ＋１個のそのようなウィンドウが存在する）は、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され、ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され、そして、ｘ・ｙが整数でない場合は、これは最も近い整数になるように丸められる。好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［７］であり、デフォルトパラメーターが使用される（例えば、ギャップ解放ペナルティー＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティー＝０．５とともに、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスが使用される）。このアルゴリズムは、通常は、ＥＭＢＯＳＳパッケージの針道具（ｎｅｅｄｌｅ  ｔｏｏｌ）の中で実行される［８］。
【００１２】
これらのポリペプチドには、配列番号３〜１６の変異体が含まれる。これには、対立遺伝子変異体、多形形態、ホモログ、オルトログ、パラログ、突然変異体などが含まれる。
【００１３】
ａの値は、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上から選択され得る。
【００１４】
ｂの値は、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれ以上から選択され得る。好ましい断片には、配列番号３〜１６に由来するエピトープまたは免疫原性断片が含まれる。他の好ましい断片は、配列番号３〜１６のＣ末端からの１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個、またはそれ以上）、および／または配列番号３〜１６のＮ末端からの１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個、またはそれ以上）を欠いているが、配列番号３〜１６の少なくとも１つのエピトープまたは免疫原性断片が保持されていることが好ましい。他の断片では、１つまたは複数のタンパク質ドメインが抜け落ちている（例えば、シグナルペプチドの脱落、細胞質ドメインの脱落、膜貫通ドメインの脱落、細胞外ドメインの脱落など）。Ｎ末端での、ＧＧＧＳＧ配列までのこれを含む欠失（すなわち、配列番号３については、アミノ酸１〜３０のアミノ酸の欠失）により、有用な断片がもたらされる（例えば、配列番号９９〜１１３を参照のこと）。本明細書中で明らかにされるように、そのような欠失によって、ＡｃｆＤポリペプチドの溶解度は増大するが、その免疫原性は実質的に保持される。
【００１５】
本発明の別の有用な断片は、配列番号３〜１６の１つの、そのＡｒｇリッチ領域（例えば、配列番号３の残基７７０〜７７５）の近くでの切断によって形成される。例えば、１つのそのような断片は、そのＣ末端の２０個のアミノ酸に、もしくはその中に、配列番号３のアミノ酸７６０〜７６９に対して少なくともａ％の同一性を有している配列を持ち、別のそのような断片は、そのＮ末端の２０個のアミノ酸に、もしくはその中に、配列番号３のアミノ酸７７６〜７８５に対して少なくともａ％の同一性を有している配列を持つ。Ａｒｇリッチ領域の下流の断片が特に有用である。
【００１６】
本発明によってはまた、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される：
（ａ）配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８のいずれか１つに対して同一である（すなわち、１００％同一である）；
（ｂ）配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８の１つまたは複数に対して少なくともａ％の配列同一性を有している；
（ｃ）配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８の１つまたは複数の少なくともｂ個の連続するアミノ酸の断片である；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）の配列と比較して、別々の位置にある場合も、また連続している場合もある１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個（またはそれ以上）の１アミノ酸の変化（欠失、挿入、置換）を有している；および／あるいは
（ｅ）配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８のいずれか１つと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウ（その結果、ｐ個のアミノ酸までに延ばす（ここでは、ｐ＞ｘである）アラインメントについては、ｐ−ｘ＋１個のそのようなウィンドウが存在する）は、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され、ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され、そして、ｘ・ｙが整数でない場合は、これは最も近い整数になるように丸められる。好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム［９］であり、デフォルトパラメーターが使用される（例えば、ギャップ解放ペナルティー＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティー＝０．５とともに、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスが使用される）。このアルゴリズムは、通常は、ＥＭＢＯＳＳパッケージの針道具の中で実行される［１０］。
【００１７】
これらのポリペプチドには、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、および配列番号１１４〜１２８の変異体が含まれる。これには、対立遺伝子変異体、多形形態、ホモログ、オルトログ、パラログ、突然変異体などが含まれる。
【００１８】
ａの値は、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上から選択され得る。
【００１９】
ｂの値は、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれ以上から選択され得る。好ましい断片には、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、および配列番号１１４〜１２８に由来するエピトープまたは免疫原性断片が含まれる。他の好ましい断片は、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８のＣ末端からの１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個、またはそれ以上）、および／または配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８のＮ末端からの１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個、またはそれ以上）を欠いているが、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８の少なくとも１つのエピトープまたは免疫原性断片が保持されていることが好ましい。他の断片では、１つまたは複数のタンパク質ドメインが抜け落ちている（例えば、シグナルペプチドの脱落、細胞質ドメインの脱落、膜貫通ドメインの脱落、細胞外ドメインの脱落など）。Ｎ末端での、ＧＧＧＳＧ配列までのこれを含む欠失（すなわち、配列番号３については、アミノ酸１〜３０のアミノ酸の欠失）により、有用な断片がもたらされる（例えば、配列番号９９〜１１３を参照のこと）。プロリンリッチ領域を除去するためのＮ末端での約９０個のアミノ酸の欠失もまた有用である（例えば、配列番号１１４〜１２８を参照のこと）。本明細書中で明らかにされるように、そのような欠失によって、ＡｃｆＤポリペプチドの溶解度は増大するが、その免疫原性は実質的に保持される。
【００２０】
断片内にあるエピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであり得る。そのようなエピトープは経験から（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［１１、１２］または類似する方法を使用して）同定することができ、また、これらは、（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数［１３］、マトリックスに基づくアプローチ［１４］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［１５］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［１６、１７］、神経ネットワーク［１８］、ＯｐｔｉＭｅｒ  ＆  ＥｐｉＭｅｒ［１９、２０］、ＡＤＥＰＴ［２１］、Ｔｓｉｔｅｓ［２２］、親水性［２３］、抗原性指数［２４］、または参考文献２５〜２９に開示されている方法などを使用して）予測することもできる。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位によって認識されて、それに結合する抗体の一部分であり、そしてこれらは、「抗原性決定基」と呼ばれる場合もある。
【００２１】
上記で議論された配列番号３〜１６の免疫原性断片には、適切な組成物（これには、アジュバント（以下の「免疫原性組成物および医薬品」のセクションの中で列挙されるかまたは議論される任意のアジュバントが含まれるがこれに限定されない）、またはポリペプチドに結合させられた適切な担体を含めることができる）の中で被験体に投与されると、それぞれ、単離された全長のポリペプチドである配列番号３〜１６（それから免疫原性断片が導かれた）を認識する、抗体またはＴ細胞に媒介される免疫応答を誘導する免疫原性断片が含まれるが、これに限定されない。
【００２２】
特に有用な断片としては、配列番号１７〜９５が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
上記で議論された配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８の免疫原性断片には、適切な組成物（これには、アジュバント（以下の「免疫原性組成物および医薬品」のセクションの中で列挙されるかまたは議論される任意のアジュバントが含まれるがこれに限定されない）、またはポリペプチドに結合させられた適切な担体を含めることができる）の中で被験体に投与されると、それぞれ、単離された全長のポリペプチドである配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８（それから免疫原性断片が導かれた）を認識する、抗体またはＴ細胞に媒介される免疫応答を誘導する免疫原性断片が含まれるが、これに限定されない。
【００２４】
配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１３１、配列番号１３３〜１３５、または配列番号１３７〜１３９の免疫原性断片には、適切な組成物（これには、アジュバント（以下の「免疫原性組成物および医薬品」のセクションの中で列挙されるかまたは議論される任意のアジュバントが含まれるがこれに限定されない）、またはポリペプチドに結合させられた適切な担体を含めることができる）の中で被験体に投与されると、それぞれ、単離された全長のポリペプチドである配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１３１、配列番号１３３〜１３５、または配列番号１３７〜１３９（それから免疫原性断片が導かれた）を認識する、抗体またはＴ細胞に媒介される免疫応答を誘導する免疫原性断片が含まれるが、これに限定されない。
【００２５】
本発明のポリペプチドにはまた、配列番号３〜１６のいずれか１つと比較して、１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個など）のアミノ酸置換、例えば、保存的置換（すなわち、１つのアミノ酸の、関連する側鎖を持つ別のアミノ酸での置換）が含まれる場合がある。遺伝子によってコードされるアミノ酸は、一般的には、以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）電荷を持たない極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸としてまとめて分類されることがしばしばある。一般的には、これらのファミリーの中での１つのアミノ酸の置換によっては、生物学的活性に対して重要な影響はない。
【００２６】
本発明のポリペプチドにはまた、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８のいずれか１つと比較して、１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個など）のアミノ酸置換、例えば、保存的置換（すなわち、１つのアミノ酸の、関連する側鎖を持つ別のアミノ酸での置換）が含まれる場合がある。遺伝子によってコードされるアミノ酸は、一般的には、以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）電荷を持たない極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸としてまとめて分類されることがしばしばある。一般的には、これらのファミリーの中での１つのアミノ酸の置換によっては、生物学的活性に対して重要な影響はない。
【００２７】
本発明のポリペプチドにはさらに、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、配列番号１１４〜１２８、配列番号１２９〜１３１、配列番号１３３〜１３５、または配列番号１３７〜１３９のいずれか１つと比較して、１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個など）のアミノ酸置換、例えば、保存的置換（すなわち、１つのアミノ酸の、関連する側鎖を持つ別のアミノ酸での置換）が含まれる場合がある。遺伝子によってコードされるアミノ酸は、一般的には、以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）電荷を持たない極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸としてまとめて分類されることがしばしばある。一般的には、これらのファミリーの中での１つのアミノ酸の置換によっては、生物学的活性に対して重要な影響はない。
【００２８】
ポリペプチドには、配列番号３〜１６のいずれか１つと比較して、１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個など）の１アミノ酸の欠失が含まれる場合がある。同様に、ポリペプチドには、配列番号３〜１６のいずれか１つと比較して、１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個など）の挿入（例えば、それぞれ、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、または５アミノ酸）が含まれる場合がある。
【００２９】
ポリペプチドにはまた、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８のいずれか１つと比較して、１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個など）の１アミノ酸の欠失が含まれる場合がある。同様に、ポリペプチドには、配列番号３〜１６のいずれか１つと比較して、１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個など）の挿入（例えば、それぞれ、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、または５アミノ酸）が含まれる場合がある。
【００３０】
ポリペプチドにはさらに、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８、配列番号１２９〜１３１、配列番号１３３〜１３５、または配列番号１３７〜１３９のいずれか１つと比較して、１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個など）の１アミノ酸の欠失が含まれる場合がある。同様に、ポリペプチドには、配列番号３〜１６、１２９、１３３、または１３７のいずれか１つと比較して、１つまたは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個など）の挿入（例えば、それぞれ、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、または５アミノ酸）が含まれる場合がある。
【００３１】
上記のいずれかのグループ（ｃ）の中では、欠失または置換はＮ末端にある場合も、そして／またはＣ末端にある場合もあり、あるいは、両方の末端にある場合もある。したがって、短縮は欠失の一例である。短縮には、Ｎ末端および／またはＣ末端での４０個まで（またはそれ以上）のアミノ酸の欠失が含まれ得る。上記のように、例えば、ＧＧＧＳＧ配列までＮ末端を削るための短縮を使用することができる。
【００３２】
一般的には、本発明のポリペプチドに、配列番号３〜１６の完全な１つのものに対して同一ではない配列が含まれている場合（例えば、これに、それに対して＜１００％の配列同一性を有している配列が含まれている場合、またはこれに、その断片が含まれている場合）には、このポリペプチドが、完全な配列番号の配列からなるポリペプチドを認識する抗体（すなわち、上記配列番号３〜１６の１つまたは複数に結合する抗体）を誘発できることが好ましい。そのような抗体は、それぞれ、配列番号３〜１６に対して特異的に結合することができるが、非特異的結合の参考基準としてのヒト血清アルブミンに対する抗体の非特異的親和性よりも有意に高い親和性では非ＡｃｆＤタンパク質に結合することはない。
【００３３】
同様に、本発明のポリペプチドに、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８の完全な１つのものに対して同一ではない配列が含まれている場合（例えば、これに、それに対して＜１００％の配列同一性を有している配列が含まれている場合、またはこれに、その断片が含まれている場合）には、このポリペプチドが、完全な配列番号の配列からなるポリペプチドを認識する抗体（すなわち、上記配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８の１つまたは複数に結合する抗体）を誘発できることが好ましい。そのような抗体は、それぞれ、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８に対して特異的に結合することができるが、非特異的結合の参考基準としてのヒト血清アルブミンに対する抗体の非特異的親和性よりも有意に高い親和性では非ＡｃｆＤタンパク質に結合することはない。
【００３４】
さらに、本発明のポリペプチドに、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、配列番号１１４〜１２８、配列番号１２９〜１３１、配列番号１３３〜１３５、または配列番号１３７〜１３９の完全な１つのものに対して同一ではない配列が含まれている場合（例えば、これに、それに対して＜１００％の配列同一性を有している配列が含まれている場合、またはこれに、その断片が含まれている場合）には、このポリペプチドが、完全な配列番号の配列からなるポリペプチドを認識する抗体（すなわち、上記配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、配列番号１１４〜１２８、配列番号１２９〜１３１、配列番号１３３〜１３５、または配列番号１３７〜１３９の１つまたは複数に結合する抗体）を誘発できることが好ましい。そのような抗体は、それぞれ、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、配列番号１１４〜１２８、配列番号１２９〜１３１、配列番号１３３〜１３５、または配列番号１３７〜１３９に対して特異的に結合することができるが、非特異的結合の参考基準としてのヒト血清アルブミンに対する抗体の非特異的親和性よりも有意に高い親和性では非ＡｃｆＤタンパク質に結合することはない。
【００３５】
１つの実施形態では、本発明により、（ａ）配列番号３〜１６のいずれか１つに対して少なくともａ％の同一性を有しており；そして（ｂ）上記配列番号の少なくともｂ個の連続するアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される
別の実施形態では、本発明により、（ａ）配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、または配列番号１１４〜１２８のいずれか１つに対して少なくともａ％の同一性を有しており；そして（ｂ）上記配列番号の少なくともｂ個の連続するアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【００３６】
なお別の実施形態では、本発明により、（ａ）配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、配列番号１１４〜１２８、配列番号１２９〜１３１、配列番号１３３〜１３５、または配列番号１３７〜１３９のいずれか１つに対して少なくともａ％の同一性を有しており；そして（ｂ）上記配列番号の少なくともｂ個の連続するアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【００３７】
本発明のポリペプチドには、金属イオン（例えば、ポリペプチド鎖の中の１つまたは複数のアミノ酸によって配位される金属イオン）が含まれ得る。例えば、ポリペプチドには、１価、２価、または３価の金属陽イオンが含まれ得る。２価の陽イオンは、典型的には、例えば、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋などである。２価の陽イオンは、好ましくはＺｎ２＋である。イオンは、ＨＥＡＧＨアミノ酸配列またはＨＥＶＧＨアミノ酸配列によって配位され得る。
【００３８】
本発明とともに使用されるポリペプチドは、様々な形態をとり得る（例えば、天然の形態、融合形態、グリコシル化形態、非グリコシル化形態、脂質化形態、非脂質化形態、リン酸化形態、非リン酸化形態、ミリストイル化形態、非ミリストイル化形態、単量体、多量体、粒子形態、変性形態など）。例えば、本発明のポリペプチドは、脂質化されたＮ末端システイン（例えば、配列番号３〜１６のＣｙｓ−２４）を持つ場合がある。
【００３９】
本発明とともに使用されるポリペプチドは、様々な手段（例えば、組み換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）によって調製することができる。組み換えによって発現されるタンパク質が好ましい。
【００４０】
本発明とともに使用されるポリペプチドは、精製された形態または実質的に精製された形態、すなわち、他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば、自然界に存在しているポリペプチドを含まない）形態、特に、他のＥ．ｃｏｌｉもしくは宿主細胞のポリペプチドを含まない形態で提供されることが好ましい。本発明とともに使用されるポリペプチドには、一般的には、少なくとも約５０％の純度であり（重量で）、そして通常は、少なくとも約９０％の純度であり、すなわち、組成物の約５０％未満、より好ましくは約１０％未満（例えば、５％）が、他の発現されたポリペプチドに占められる。したがって、組成物中の抗原は、その分子を発現させるために用いられる生命体全体から分離される。
【００４１】
本発明とともに使用されるポリペプチドは、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉポリペプチドである。そのようなポリペプチドは、さらに、ＮＭＥＣ、ＡＰＥＣ、ＵＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＰＥＣ、およびＥＴＥＣ  Ｅ．ｃｏｌｉポリペプチドから選択され得る。
【００４２】
用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーをいう。ポリマーは、直鎖であっても、または分岐鎖であってもよく、これには、修飾されたアミノ酸が含まれる場合があり、そして、これには、非アミノ酸が間に挟まれる場合もある。この用語にはまた、自然に修飾されたか、または介入（例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾（例えば、標識成分との結合））によって修飾されたアミノ酸ポリマーも含まれる。例えば、１つまたは複数のアミノ酸のアナログ（例えば、天然にはないアミノ酸などを含む）、ならびに当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、単鎖として存在することができ、また、会合した鎖として存在することもできる。
【００４３】
本発明により、配列−Ｐ−Ｑ−または−Ｑ−Ｐ−を含むポリペプチドが提供される。ここでは、−Ｐ−は上記で定義されたアミノ酸配列であり、そして−Ｑ−は上記で定義された配列ではない。すなわち、本発明により、融合タンパク質が提供される。−Ｐ−のＮ末端コドンがＡＴＧではない場合には、このコドンはポリペプチドのＮ末端には存在しないが、これは、Ｍｅｔではなく、そのコドンの標準的なアミノ酸として翻訳されるであろう。しかし、このコドンがポリペプチドのＮ末端にある場合には、これはＭｅｔとして翻訳されるであろう。−Ｑ−部分の例としては、ヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ここでは、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である）、マルトース結合タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明によってはまた、本発明のポリペプチドを含むオリゴマータンパク質も提供される。このオリゴマーは、二量体、三量体、四量体などであり得る。オリゴマーはホモオリゴマーでも、またヘテロオリゴマーでもあり得る。オリゴマーの中のポリペプチドは、共有結合されている場合も、また、非共有的に結合されている場合もある。
【００４５】
本発明によってはまた、全長のタンパク質を上回る高い溶解度を持つが、被験体において全長のタンパク質によって惹起される免疫応答と実質的に類似する免疫応答を惹起させる、全長のＡｃｆＤの断片であるＥ．ｃｏｌｉポリペプチド（配列番号２〜１６がその代表例である）も提供される。そのような免疫原性ポリペプチド断片の例としては、配列番号９９〜１２８の任意のものが挙げられる。溶解度の増大は、当業者が利用できる任意の手段によって測定することができる。１つの簡単な方法には、細菌の中での断片の過剰発現と、遠心分離後の細菌溶解物の上清に対して全細菌溶解物の試料を比較すること、あるいは遠心分離後の細菌溶解物の上清の試料に対して遠心分離後の細菌溶解物のペレット試料を比較することが含まれる。当業者は、標準的な技術（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌を、それらの断片を発現するｐＥＴ２１発現ベクターで形質転換し、細菌をＬＢ中で０．６のＯＤ６００になるまで増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、そして誘導後３時間培養する）を使用して、そのような免疫原性ポリペプチド断片を増殖させ、発現させるであろう。そのような試料は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（例えば、４％〜１２％のＭＯＰＳ）上を泳動させられ、そして得られた染色されたゲルをスキャンし、そしてバンドの相対的な大きさを測定することによっておおまかに定量化することができる。溶解度の増大は、本明細書中で使用される場合は、２５℃で決定される。そのような溶解度の増大は、可溶性ポリペプチドの１０％の増加、可溶性ポリペプチドの２０％の増加、可溶性ポリペプチドの３０％の増加、可溶性ポリペプチドの５０％の増加、可溶性ポリペプチドの７５％の増加、可溶性ポリペプチドの１００％の増加（すなわち、２倍）、可溶性ポリペプチドの３倍の増加、可溶性ポリペプチドの４倍の増加、可溶性ポリペプチドの５倍の増加、可溶性ポリペプチドの７倍の増加、または可溶性ポリペプチドの１０倍の増加であり得る。
【００４６】
本発明によってはさらに、全長に満たない長さのＡｃｆＤの断片であるＥ．ｃｏｌｉポリペプチド（配列番号２〜１６がその代表例である）が提供される。これらの全長に満たない長さの断片は、全長のタンパク質と比較して高い溶解度を有しているが、被験体において全長のタンパク質によって惹起される免疫応答と比較して、実質的に類似する免疫応答を惹起させる。そのような免疫原性ポリペプチド断片の例としては、配列番号９９〜１２８の任意のものが挙げられる。溶解度の増大は、当業者が利用できる任意の手段によって測定することができる。１つの簡単な方法には、細菌の中での断片の過剰発現と、遠心分離後の細菌溶解物の上清に対して全細菌溶解物の試料を比較すること、あるいは遠心分離後の細菌溶解物の上清の試料に対して遠心分離後の細菌溶解物のペレット試料を比較することが含まれる。当業者は、標準的な技術（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌を、それらの断片を発現するｐＥＴ２１発現ベクターで形質転換し、細菌をＬＢ中で０．６のＯＤ６００になるまで増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、そして誘導後３時間培養する）を使用して、そのような免疫原性ポリペプチド断片を増殖させ、発現させるであろう。そのような試料は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（例えば、４％〜１２％のＭＯＰＳ）上を泳動させられ、そして得られた染色されたゲルをスキャンし、そしてバンドの相対的な大きさを測定することによっておおまかに定量化することができる。溶解度の増大は、本明細書中で使用される場合は、２５℃で決定される。そのような溶解度の増大は、同じ条件下で測定された対応する全長のタンパク質と比較された、全長に満たない長さのポリペプチドのそれぞれの場合における、可溶性ポリペプチドの１０％の増加、可溶性ポリペプチドの２０％の増加、可溶性ポリペプチドの３０％の増加、可溶性ポリペプチドの５０％の増加、可溶性ポリペプチドの７５％の増加、可溶性ポリペプチドの１００％の増加（すなわち、２倍）、可溶性ポリペプチドの３倍の増加、可溶性ポリペプチドの４倍の増加、可溶性ポリペプチドの５倍の増加、可溶性ポリペプチドの７倍の増加、または可溶性ポリペプチドの１０倍の増加であり得る。
【００４７】
本発明によってはさらに、全長に満たない長さのＡｃｆＤの断片であるＥ．ｃｏｌｉポリペプチド（配列番号２〜１６、１２９、１３３、および１３７がその代表例である）が提供される。これらの全長に満たない長さの断片は、全長のタンパク質と比較して高い溶解度を有しているが、被験体において全長のタンパク質によって惹起される免疫応答と比較して、実質的に類似する免疫応答を惹起させる。そのような免疫原性ポリペプチド断片の例としては、配列番号９９〜１２８、配列番号１３０〜１３１、配列番号１３４〜１３５、および配列番号１３８〜１３９の任意のものが挙げられる。溶解度の増大は、当業者が利用できる任意の手段によって測定することができる。１つの簡単な方法には、細菌の中での断片の過剰発現と、遠心分離後の細菌溶解物の上清に対して全細菌溶解物の試料を比較すること、あるいは遠心分離後の細菌溶解物の上清の試料に対して遠心分離後の細菌溶解物のペレット試料を比較することが含まれる。当業者は、標準的な技術（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌を、それらの断片を発現するｐＥＴ２１発現ベクターで形質転換し、細菌をＬＢ中で０．６のＯＤ６００になるまで増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、そして誘導後３時間培養する）を使用して、そのような免疫原性ポリペプチド断片を増殖させ、発現させるであろう。そのような試料は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（例えば、４％〜１２％のＭＯＰＳ）上を泳動させられ、そして得られた染色されたゲルをスキャンし、そしてバンドの相対的な大きさを測定することによっておおまかに定量化することができる。溶解度の増大は、本明細書中で使用される場合は、２５℃で決定される。そのような溶解度の増大は、同じ条件下で測定された対応する全長のタンパク質と比較された、全長に満たない長さのポリペプチドのそれぞれの場合における、可溶性ポリペプチドの１０％の増加、可溶性ポリペプチドの２０％の増加、可溶性ポリペプチドの３０％の増加、可溶性ポリペプチドの５０％の増加、可溶性ポリペプチドの７５％の増加、可溶性ポリペプチドの１００％の増加（すなわち、２倍）、可溶性ポリペプチドの３倍の増加、可溶性ポリペプチドの４倍の増加、可溶性ポリペプチドの５倍の増加、可溶性ポリペプチドの７倍の増加、または可溶性ポリペプチドの１０倍の増加であり得る。
【００４８】
全長のタンパク質によって惹起される免疫応答との、このポリペプチドによって被験体において惹起される免疫応答の比較は、当業者が利用できる任意の手段を使用して実施することができる。以下の実施例で使用される１つの簡単な方法には、マウスのようなモデル被験体の免疫化、その後の致死量のＥ．ｃｏｌｉでの抗原投与が含まれる。適切な比較のために、当業者は、当然、同じアジュバント（例えば、フロイトの完全なアジュバント）を選択するであろう。例えば、このポリペプチドによって、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも７０％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも８０％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも８５％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９０％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９５％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９７％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９８％、または全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９９％が提供される場合には、そのような試験では、本発明の免疫原性ポリペプチド断片は、被験体において実質的に類似する免疫応答を惹起させるであろう（すなわち、致死量の抗原投与に対して実質的に同じ防御を提供するであろう）。
【００４９】
さらに、全長に満たない長さのポリペプチドによって被験体において惹起される免疫応答と、対応する全長のタンパク質によって惹起される免疫応答との間での比較は、当業者が利用できる任意の手段を使用して行うことができる。以下の実施例で使用される１つの簡単な方法には、マウスのようなモデル被験体の免疫化、その後の致死量のＥ．ｃｏｌｉでの抗原投与が含まれる。適切な比較のために、当業者は、当然、同じアジュバント（例えば、フロイトの完全なアジュバント）を選択するであろう。例えば、このポリペプチドによって、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも７０％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも８０％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも８５％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９０％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９５％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９７％、全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９８％、または全長のタンパク質によって提供される防御の少なくとも９９％が提供される場合には、そのような試験では、本発明の免疫原性の全長に満たない長さのポリペプチド断片は、対応する全長のタンパク質によって惹起される免疫応答と比較して被験体において実質的に類似する免疫応答を惹起させるであろう（すなわち、致死量の抗原投与に対して実質的に同じ防御を提供するであろう）。
【００５０】
それに対して免疫原性ポリペプチド断片が（溶解度と惹起される免疫応答の両方について）比較されるであろう全長のＡｃｆＤタンパク質は、任意の代表的なＥ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質であり得、これには、配列番号２〜１６が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＡｃｆＤタンパク質は、免疫原性ポリペプチド断片がそれから得られる対応する全長のタンパク質であろう。
【００５１】
いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドには、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質に関して、高い溶解度を生じる欠失が含まれるであろう。この欠失には、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端アミノ酸の実質的に全ての除去、Ｎ末端のプロリンリッチリピートの全てもしくは一部の除去、またはそれらの両方が含まれ得る。当業者は、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端アミノ酸が、図１のアラインメントにおいて「Ｇ」で示される本明細書中で同定されたＥ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質の領域に対してアラインメントされる、そのタンパク質のその部分である目的のＥ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質の領域に相当することを理解するであろう。同様に、当業者は、Ｎ末端のプロリンリッチリピートが、図１のアラインメントにおいて「Ｐ」と示される本明細書中で同定されたＥ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質の領域に対してアラインメントされる、そのタンパク質のその部分である目的のＥ．ｃｏｌｉ  ＡｃｆＤタンパク質の領域に相当することを理解するであろう。
【００５２】
特定の態様では、免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号２のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号９９または配列番号１１４を含む断片であり得る（配列番号９９のＮ末端と配列番号１１４のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１１４を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号３のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１００または配列番号１１５を含む断片であり得る（配列番号１００のＮ末端と配列番号１１５のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１１５を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号４のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１０１または配列番号１１６を含む断片であり得る（配列番号１０１のＮ末端と配列番号１１６のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１１６を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号５のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１０２または配列番号１１７を含む断片であり得る（配列番号１０２のＮ末端と配列番号１１７のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１１７を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号６のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１０３または配列番号１１８を含む断片であり得る（配列番号１０３のＮ末端と配列番号１１８のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１１８を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号７のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１０４または配列番号１１９を含む断片であり得る（配列番号１０４のＮ末端と配列番号１１９のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１１９を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号８のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１０５または配列番号１２０を含む断片であり得る（配列番号１０５のＮ末端と配列番号１２０のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１２０を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号９のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１０６または配列番号１２１を含む断片であり得る（配列番号１０６のＮ末端と配列番号１２１のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１２１を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号１０のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１０７または配列番号１２２を含む断片であり得る（配列番号１０７のＮ末端と配列番号１２２のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１２２を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号１１のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１０８または配列番号１２３を含む断片であり得る（配列番号１０８のＮ末端と配列番号１２３のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１２３を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号１２のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１０９または配列番号１２４を含む断片であり得る（配列番号１０９のＮ末端と配列番号１２４のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１２４を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号１３のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１１０または配列番号１２５を含む断片であり得る（配列番号１１０のＮ末端と配列番号１２５のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１２５を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号１４のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１１１または配列番号１２６を含む断片であり得る（配列番号１１１のＮ末端と配列番号１２６のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１２６を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号１５のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１１２または配列番号１２７を含む断片であり得る（配列番号１１２のＮ末端と配列番号１２７のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１２７を含む任意の断片を含む）。免疫原性ポリペプチド断片は、その免疫原性ポリペプチド断片が配列番号１６のアミノ酸配列を持たないとの条件で、配列番号１１３または配列番号１２８を含む断片であり得る（配列番号１１３のＮ末端と配列番号１２８のＮ末端との間に、Ｎ末端を持つ配列番号１２８を含む任意の断片を含む）。上記免疫原性ポリペプチド断片の任意のものには、その変異体が、任意の全長のＡｃｆＤタンパク質の配列を持つ免疫原性ポリペプチドを生じない限りにおいて、変異体も含まれ得る。これには、この「本発明とともに使用されるポリペプチド」のセクションで列挙されるバリエーションの任意のものが含まれるが、これらに限定されない。例としては、以下が挙げられる：利用できる配列番号のものと比較して１個から１０個の１アミノ酸の変化；利用できる配列番号のものに対する少なくとも８５％の配列同一性；利用できる配列番号のものの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の断片；および、利用できる配列番号のものと、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用してアラインメントされた場合に、Ｎ末端からＣ末端に向かうｘ個のアミノ酸のそれぞれのムービングウィンドウが、少なくともｘ・ｙの同一であるアラインメントされたアミノ酸を有しており、ここでは、ｘは３０であり、そしてｙは０．７５である。
【００５３】
本発明によってはまた、本発明のポリペプチドを生産するためのプロセスも提供される。これには、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドの発現を誘導する条件下で培養する工程が含まれる。その後、ポリペプチドは、例えば、培養上清から精製され得る。
【００５４】
本発明により、本発明のポリペプチドをコードするプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞が提供される。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の染色体にはＡｃｆＤのホモログが含まれる場合があり、また、そのようなホモログが含まれない場合もある。しかし、いずれの場合にも、本発明のポリペプチドはプラスミドから発現させることができる。プラスミドには、マーカーをコードする遺伝子などが含まれ得る。これらおよび適切なプラスミドについての他の詳細は以下に提供される。
【００５５】
本発明のポリペプチドの発現はＥ．ｃｏｌｉ株の中で行わせることができるが、本発明では、通常は、発現のために異種宿主が使用されるであろう。異種宿主は原核生物（例えば、細菌）である場合も、また真核生物である場合もある。適している宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明により、本発明のポリペプチドを生産させるためのプロセスが提供される。これには、化学的手段によってポリペプチドの少なくとも一部を合成する工程が含まれる。
【００５７】
上記タンパク質、ポリペプチド、ハイブリッドポリペプチド、エピトープ、および免疫原性断片のいずれかおよび全ては、以下を含む多数の形態のいずれか１つであり得るが、これらに限定されない：組み換え体、（そのようなタンパク質、ポリペプチド、ハイブリッドポリペプチド、エピトープ、および免疫原性断片と、それらの自然な状態において一緒に存在している物質から）単離されたかまたは実質的に精製された形態。
【００５８】
核酸
本発明によってはまた、本発明のポリペプチドおよびハイブリッドポリペプチドをコードする核酸が提供される。本発明によってはまた、本発明の１つもしくは複数のポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。
【００５９】
本発明によってはまた、そのようなヌクレオチド配列に対して配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む核酸も提供される。配列間の同一性は、上記に記載されたようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定されることが好ましい。そのような核酸には、同じアミノ酸をコードするために別のコドンを使用する核酸が含まれる。
【００６０】
本発明によってはまた、これらの核酸にハイブリダイズすることができる核酸が提供される。ハイブリダイゼーション反応は、様々な「ストリンジェンシー」の条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は広く知られており、当該分野で公開されている（例えば、参考文献２２４の７．５２頁）。（ストリンジェンシーを高めるための）関連する条件の例としては、以下が挙げられる：２５℃、３７℃、５０℃、５５℃、および６８℃のインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度（ここでは、ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である）、および他の緩衝液系を使用するそれらの等価物；０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアミド濃度；５分〜２４時間のインキュベーション時間；１回、２回、またはそれ以上の洗浄工程；１分、２分、または１５分の洗浄インキュベーション時間；および、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水である洗浄溶液。ハイブリダイゼーション技術とそれらの最適化は当該分野で周知である（例えば、参考文献３０、３１、２２４、２２６などを参照のこと）。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸は、低いストリンジェンシーの条件下で標的にハイブリダイズする。他の実施形態では、本発明の核酸は、中程度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。好ましい実施形態では、本発明の核酸は、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件の例示的なセットは、５０℃と１０×ＳＳＣである。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、５５℃と１×ＳＳＣである。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、６８℃と０．１×ＳＳＣである。
【００６２】
本発明には、（例えば、アンチセンスまたはプロ−ビングのための、あるいは、プライマーとしての使用のための）これらの配列に対して相補的な配列を含む核酸が含まれる。
【００６３】
本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション反応において（例えば、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、または核酸マイクロアレイ、または「遺伝子チップ」）、そして増幅反応において（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなど）、ならびに他の核酸技術において使用することができる。
【００６４】
本発明の核酸は様々な形態をとることができる（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識された形態など）。本発明の核酸は、環状である場合も、または分岐鎖である場合もあるが、通常は直鎖であろう。特に明記されないか必要とされない場合は、核酸を利用する本発明の任意の実施形態では、二本鎖形態と、二本鎖形態を形成する２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれのいずれを利用することもできる。プライマーおよびプローブは、これらがアンチセンス核酸であるので、一般的には一本鎖である。
【００６５】
本発明の核酸は、精製された形態または実質的に精製された形態、すなわち、他の核酸を（特に、他のＥ．ｃｏｌｉまたは宿主細胞の核酸を）実質的に含まない形態（例えば、自然界に存在している核酸を実質的に含まない形態）で提供されることが好ましく、一般的には、少なくとも約５０％純粋（重量で）であり、通常は、少なくとも約９０％純粋である。本発明の核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉ核酸であることが好ましい。
【００６６】
本発明の核酸は、多くの方法で、例えば、全体または一部が化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホルアミダイト合成）によって、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用したより長い核酸の消化によって、より短い核酸もしくはヌクレオチドの（例えば、リガーゼもしくはポリメラーゼを使用する）連結によって、ゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーからなどで調製することができる。
【００６７】
本発明の核酸は、固体支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、薄膜、スライド、マイクロアレイ支持体、樹脂など）に付着させることができる。本発明の核酸は、例えば、放射性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識で標識することができる。これは、核酸が検出技術において使用される場合、例えば、核酸がプライマーであるかまたはプローブとして使用される場合に特に有用である。
【００６８】
用語「核酸」には、一般的な意味において、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態が含まれる。これには、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらのアナログが含まれる。これには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが含まれる。核酸にはまた、ＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログ、例えば、修飾された骨格（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＳ）もしくはホスホロチオエート）または修飾された塩基を含むものが含まれる。したがって、本発明には、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組み換え体である核酸、分岐鎖の核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマーなどが含まれる。本発明の核酸がＲＮＡの形態をとる場合には、これは５’キャップを持つ場合も、また５’キャップを持たない場合もある。
【００６９】
本発明の核酸は、ベクターの一部、すなわち、１つまたは複数の細胞のタイプの形質導入／トランスフェクションのために設計された核酸構築物の一部である場合もある。ベクターは、例えば、「クローニングベクター」（これは、挿入されたヌクレオチドの単離、増殖、および複製のために設計される）、「発現ベクター」（これは、宿主細胞の中でのヌクレオチド配列の発現のために設計される）、「ウイルスベクター」（これは、組み換え体ウイルスもしくはウイルス様粒子の生産を生じるように設計される）、あるいは「シャトルベクター」（これには、ベクターの２種類以上のタイプが含まれる）であり得る。好ましいベクターは上記のようなプラスミドである。「宿主細胞」には、個々の細胞または細胞培養物が含まれ、これらは、外因性核酸のレシピエントであり得るかまたは外因性核酸のレシピエントである。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、この子孫は、自然な、偶発的な、または意図的な突然変異および／または変化が原因で、最初の親細胞と（形態に関して、または全ＤＮＡ成分に関して）必ずしも完全に同じではない場合がある。宿主細胞には、本発明の核酸でインビボまたはインビトロでトランスフェクションされたか、あるいは感染させられた細胞が含まれる。
【００７０】
核酸がＤＮＡである場合は、ＲＮＡ配列中の「Ｕ」は、ＤＮＡにおいては「Ｔ」に置き換わるであろうことが理解されるであろう。同様に、核酸がＲＮＡである場合には、ＤＮＡ配列中の「Ｔ」が、ＲＮＡにおいては「Ｕ」に置き換わるであろうことが理解されるであろう。
【００７１】
用語「相補物」または「相補性」は、核酸に関して使用される場合は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合をいう。したがって、Ｃの相補物はＧであり、Ｇの相補物はＣであり、Ａの相補物はＴ（またはＵ）であり、そしてＴ（またはＵ）の相補物はＡである。例えば、ピリミジン（ＣまたはＴ）に相補的なＩ（プリンイノシン）のような塩基を使用することも可能である。
【００７２】
本発明の核酸は、例えば、ポリペプチドを生産するために；生物学的試料中の核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして、；核酸のさらなるコピーを生じさせるために；リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生じさせるために；一本鎖のＤＮＡプライマーまたはプローブとして；あるいは、三本鎖を形成するオリゴヌクレオチドとして使用することができる。
【００７３】
本発明により、本発明の核酸を生産するためのプロセスが提供される。ここでは、核酸は、一部が、または全体が、化学的手段を使用して合成される。
【００７４】
本発明により、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）、およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。
【００７５】
本発明による核酸の増幅は、定量的および／またはリアルタイムであり得る。
【００７６】
本発明の特定の実施形態については、核酸は、少なくとも７ヌクレオチドの長さ（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００ヌクレオチド、またはさらに長い）であることが好ましい。
【００７７】
本発明の特定の実施形態については、核酸は、最長５００ヌクレオチドの長さ（例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５ヌクレオチド、またはさらに短い）であることが好ましい。
【００７８】
本発明のプライマーおよびプローブ、ならびに、ハイブリダイゼーションに使用される他の核酸は、１０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さ（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）であることが好ましい。
【００７９】
免疫原性組成物および医薬品
本発明のポリペプチドは、免疫原性組成物において有効成分（免疫原）として有用であり、そのような組成物はワクチンとして有用であり得る。本発明のワクチンは、予防的（すなわち、感染を防ぐため）または治療的（すなわち、感染を処置するため）のいずれかであり得るが、通常は予防的であろう。
【００８０】
免疫原性組成物は薬学的に許容されるであろう。これらには、通常は、抗原に加えて複数の成分が含まれるであろう。例えば、これらには、典型的には、１つまたは複数の薬学的担体（単数または複数）、賦形剤（単数または複数）、および／またはアジュバント（単数または複数）が含まれる。担体と賦形剤についての十分な議論は、参考文献２２１の中のものを利用することができる。ワクチンアジュバントについての十分な議論は、参考文献３２および３３の中のものを利用することができる。
【００８１】
組成物は、一般的には、水性の形態で哺乳動物に投与されるであろう。しかし、投与前は、この組成物は、非水性の形態であり得る。例えば、いくつかのワクチンは、水性形態で製造されるが、その後、調合され、分配され、そしてこれもまた、水性の形態で投与される。他のワクチンは、製造の際に凍結乾燥させられ、使用時に水性の形態になるように再構成される。したがって、本発明の組成物は、乾燥させられた、例えば、凍結乾燥させられた処方物であり得る。
【００８２】
組成物には、保存剤（例えば、チメロサールまたは２−フェノキシエタノール）が含まれ得る。しかし、ワクチンには、水銀性物質は実質的には含まれない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）（例えば、チメロサールが含まれない）ことが好ましい。水銀を含まないワクチンがより好ましい。保存剤が含まれていないワクチンが特に好ましい。
【００８３】
熱安定性を改善するために、組成物に、温度保護剤（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）が含まれる場合がある。
【００８４】
張度を制御するためには、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）が含まれることが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの間（例えば、約１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ）で存在し得る。含めることができる他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、脱水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００８５】
組成物は、一般的には、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは、２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間のオスモル濃度を持つであろう。さらに好ましくは、２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲にあるであろう。
【００８６】
組成物には、１種類または複数の種類の緩衝液が含まれ得る。典型的な緩衝液としては、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを含むもの）、またはクエン酸塩緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には、５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
【００８７】
組成物のｐＨは、一般的には、５．０〜８．１の間、より典型的には、６．０〜８．０の間、例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間であろう。
【００８８】
組成物は、好ましくは、滅菌されている。組成物には発熱物質が含まれないことが好ましい。例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的な基準）が含まれ、好ましくは、１用量あたり＜０．１ＥＵが含まれる。組成物にはグルテンが含まれないことが好ましい。
【００８９】
組成物には、１回の予防接種のための材料が含まれる場合があり、また、複数回の予防接種のための材料が含まれる場合もある（すなわち、「複数回投与用の」キット）。複数回投与用の構成においては、保存剤が含められることが好ましい。複数回投与用の組成物に保存剤を含めることの代わりに（またはそれに加えて）、組成物は、物質を取り出すための無菌のアダプターを持つ容器の中に入れられる場合もある。
【００９０】
ヒト用のワクチンは、典型的には、約０．５ｍｌの投与量で投与されるが、その半分の用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が子供に投与される場合もある。
【００９１】
本発明の免疫原性組成物にはまた、１種類または複数の種類の免疫調節因子が含まれる場合もある。免疫調節因子の１つまたは複数に、１つまたは複数のアジュバントが含まれることが好ましい。アジュバントには、以下でさらに議論されるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントが含まれ得る。
【００９２】
本発明の組成物において使用することができるアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
Ａ．無機物を含む組成物
本発明においてアジュバントとしての使用に適している無機物を含む組成物としては、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩（またはそれらの混合物）が挙げられる。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献３４の中で開示されている「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、これらの塩は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、不定形など）をとる。これらの塩の吸着が好ましい。無機物を含む組成物はまた、金属塩の粒子として処方される場合がある［３５］。
【００９３】
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントが使用され得る。これらの名称は便宜上であるが、便宜のためだけに使用され、存在する実際の化合物の正確な記載でもない（例えば、参考文献３２の第９章を参照のこと）。本発明では、アジュバントとして一般的に使用されている、「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントの任意のものを使用することができる。「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは通常は、少なくとも一部が結晶である。「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合には、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）も含まれる。これらは沈殿によって得ることができ、沈殿の際の反応条件と濃度が、塩の中のヒドロキシルでのリン酸塩の置換の程度に影響を及ぼす。
【００９４】
繊維状の形態（例えば、透過型電子顕微鏡で見られるようなもの）が、水酸化アルミニウムアジュバントについての典型である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には、約１１であり、すなわち、アジュバント自体は、生理学的ｐＨで正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で、１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり１．８ｍｇ〜２．６ｍｇの間のタンパク質の吸着能力が報告されている。
【００９５】
リン酸アルミニウムアジュバントは、一般的には、０．３〜１．２の間、好ましくは、０．８〜１．２の間、さらに好ましくは、０．９５±０．１のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。リン酸アルミニウムは、特に、ヒドロキシリン酸塩については、一般的には不定形であろう。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌで含まれる不定形のヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、一般的には粒子状であろう（例えば、透過型電子顕微鏡において見られる平板様の形態）。いずれかの抗原吸着後の粒子についての典型的な直径は、０．５μｍ〜２０μｍの範囲（例えば、約５μｍ〜１０μｍ）である。リン酸アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で、１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり、０．７ｍｇ〜１．５ｍｇのタンパク質の吸着能力が報告されている。
【００９６】
リン酸アルミニウムの電荷ゼロ点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルでのリン酸塩の置換の程度と逆の関係にあり、この置換の程度は、沈殿による塩の調製に使用される反応条件と反応物の濃度に応じて変わり得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離のリン酸塩イオンの濃度を変えることによって（リン酸塩が多い＝より酸性のＰＺＣ）、または緩衝液（例えば、ヒスチジン緩衝液）を加えることによって（ＰＺＣをより塩基性にする）も変化させられる。本発明にしたがって使用されるリン酸アルミニウムは、一般的には、４．０〜７．０の間、より好ましくは、５．０〜６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有するであろう。
【００９７】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液には、緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝液、またはヒスチジン緩衝液、またはＴｒｉｓ緩衝液）が含まれ得るが、これは、必ずしもそうである必要はない。懸濁液は、滅菌されており、発熱物質が含まれないことが好ましい。懸濁液には、遊離の水性のリン酸塩イオンが含まれる場合があり、例えば、１．０ｍＭ〜２０ｍＭの間、好ましくは、５ｍＭ〜１５ｍＭの間、そしてより好ましくは、約１０ｍＭの濃度で存在する。懸濁液にはまた、塩化ナトリウムも含まれる場合がある。
【００９８】
本発明では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用することができる。この場合、リン酸アルミニウムは水酸化物よりも多く存在し得、例えば、少なくとも２：１の重量比、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などで存在し得る。
【００９９】
患者に投与される組成物中でのＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満であり、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間である。０．８５ｍｇ／用量の最大が好ましい。
【０１００】
Ｂ．油乳剤
本発明においてアジュバントとしての使用に適している油乳剤組成物としては、スクワレン−水エマルジョン、例えば、ＭＦ５９［参考文献３２の第１０章；参考文献３６もまた参照のこと］（マイクロフルイダイザーを使用して１ミクロン未満の粒子になるように処方された、５％のスクワレン、０．５％のＴｗｅｅｎ  ８０、および０．５％のＳｐａｎ  ８５）が挙げられる。完全なフロイトのアジュバント（ＣＦＡ）および不完全なフロイトのアジュバント（ＩＦＡ）もまた使用される場合がある。
【０１０１】
様々な水中油型エマルジョンアジュバントが公知であり、これらには、典型的には、少なくとも１種類の油、および少なくとも１種類の界面活性剤が、生体分解性（代謝可能）であり、そして生体適合性である油（単数または複数）および界面活性剤（単数または複数）とともに含まれる。エマルジョンの中の油滴は、一般的には、５μｍ未満の直径であり、理想的には１ミクロン未満の直径であり、これらの小さい大きさは、安定なエマルジョンを提供するためのマイクロフルイダイザーを用いて得ることができる。２２０ｎｍ未満の大きさの液滴が好ましい。なぜなら、これらは、濾過滅菌を行うことができるからである。
【０１０２】
エマルジョンには、油、例えば、動物（例えば、魚）を供給源とするものまたは野菜類を供給源とするものが含まれ得る。野菜類の油としては、木の実油、種子油、および穀物油が挙げられる。ピーナッツ油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油、最も一般的に利用されている例としては、ナッツ油が挙げられる。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油としては、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀物のグループにおいては、トウモロコシ油が最も一般的に利用されているが、他の穀類（例えば、小麦、オーツ麦、ライ麦、コメ、テフ、ライ小麦など）の油もまた使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６個〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油の中には自然界においては存在しないが、ナッツ油および種子油由来の適切な出発材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳汁由来の脂肪および油は代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。動物である供給源から純粋な油を得るために必要な、分離、精製、鹸化、および他の手段についての手順は当該分野で周知である。ほとんどの魚には、容易に回収することができる代謝可能な油が含まれている。例えば、タラの肝油、サメの肝油、およびクジラの油（例えば、鯨ろう）が、本明細書中で使用することができる魚の油のいくつかの例である。多数の分岐鎖の油が、５個の炭素のイソプレン単位で生化学的に合成され、これは、一般的には、テルペノイドと呼ばれる。サメの肝油には、スクワレンとして知られている、分岐鎖の不飽和テルペノイドである、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン（これは、本明細書中では特に好ましい）が含まれる。スクアラン（スクワレンの飽和アナログ）もまた好ましい油である。スクワレンとスクアランを含む魚の脂は、商業的な供給業者から容易に入手することができ、また、当該分野で公知の方法によって得ることもできる。他の好ましい油はトコフェロールである（下記を参照のこと）。油の混合物を使用することができる。
【０１０３】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは、少なくとも１５、そしてより好ましくは、少なくとも１６のＨＬＢを持つ。本発明は、以下を含むがこれらに限定されない界面活性剤とともに使用することができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（まとめてＴｗｅｅｎｓと呼ばれる）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名で販売されている、エチレンオキサイド（ＥＯ）、プロピレンオキサイド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキサイド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、直鎖のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール（これは、エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰り返し回数が様々であり得、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が具体的な目的である；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；ならびに、ソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般的に知られている）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレート。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョンを含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１０４】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０））とオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００））との組み合わせもまた適している。別の有用な組み合わせには、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステル、および／またはオクトキシノールが含まれる。
【０１０５】
界面活性剤（重量％）の好ましい量は以下である：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）０．０１％〜１％、特に、約０．１％；オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、もしくはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤）０．００１％〜０．１％、特に、０．００５％〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％〜２０％、好ましくは、０．１％〜１０％、および特に、０．１％〜１％、または約０．５％。
【０１０６】
好ましいエマルジョンアジュバントは、＜１μｍの平均の液滴の大きさを持ち、例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、またはそれ未満である。これらの液滴の大きさは、マイクロフルイダイゼーションのような技術によって簡単に得ることができる。
【０１０７】
本発明に有用な特異的な水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・スクワレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＳｐａｎ  ８５の１ミクロン未満のエマルジョン。このエマルジョンの組成は、容積で、約５％のスクワレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ  ８５であり得る。重量では、これらの割合は、４．３％のスクワレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ  ８５になる。このアジュバントは、参考文献４０の第１０章および参考文献４１の第１２章にさらに詳細に記載されているように、「ＭＦ５９」として知られている［３７〜３９］。ＭＦ５９エマルジョンには、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭのクエン酸塩緩衝液が含まれることが有利である。
【０１０８】
・スクワレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ  ８０のエマルジョン。エマルジョンには、リン酸緩衝化生理食塩水が含まれ得る。これにはまた、Ｓｐａｎ  ８５（例えば、１％）および／またはレシチンも含まれ得る。これらのエマルジョンは、２％〜１０％のスクワレン、２％〜１０％のトコフェロール、および０．３％〜３％のＴｗｅｅｎ  ８０が含まれ得、そしてスクワレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、≦１である。なぜなら、これによってより安定なエマルジョンが提供されるからである。スクワレンとＴｗｅｅｎ  ８０は、約５：２の容積比で存在し得る。１つのそのようなエマルジョンは、ＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ  ８０を溶解させて、２％の溶液とし、その後、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクワレン）の混合物と混合し、その後、この混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製することができる。得られるエマルジョンは、１ミクロン未満の油滴を有し得、例えば、１００ｎｍ〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有し得る。
【０１０９】
・スクワレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。このエマルジョンにはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）もまた含まれ得る。このエマルジョンには、リン酸塩緩衝液が含まれる場合がある。
【０１１０】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。エマルジョンには、これらの３種類の成分が、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのα−トコフェロールスクシネート）が含まれ得、そしてこれらの濃度には、抗原に由来するこれらの成分の任意の寄与が含まれるはずである。このエマルジョンにはまた、スクワレンも含まれる場合がある。このエマルジョンにはまた、３ｄ−ＭＰＬも含まれ得る（下記を参照のこと）。水相には、リン酸塩緩衝液が含まれ得る。
【０１１１】
・スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）の中に処方することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいてはスレオニル−ＭＤＰとともに使用されている［４２］（０．０５％〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。これはまた、「ＡＦ」アジュバントと同様に、Ｔｈｒ−ＭＤＰを伴わずに使用することもできる［４３］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【０１１２】
・スクワレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ  ８０」）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または、２００ｎｍ未満の大きさを持つ油滴を少なくとも９０％（容積で）含む［４４］。このエマルジョンにはまた、アルジトール；凍結防止剤（例えば、糖、例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロース）；および／またはアルキルポリグリコシドの１つまたは複数が含まれ得る。そのようなエマルジョンは凍結乾燥させられ得る。
【０１１３】
・スクワレン、ポロキサマー１０５、およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［４５］。アジュバントワクチン中でのこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％のスクワレン、４％のポロキサマー１０５（プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌ））、および２％のＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ  ８５（Ｂｉｓ−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６  ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【０１１４】
・０．５％〜５０％の油、０．１％〜１０％のリン脂質、および０．０５％〜５％の非イオン性界面活性剤を含むエマルジョン。参考文献４６に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。１ミクロン未満の液滴の大きさが有利である。
【０１１５】
・代謝不可能な油（例えば、軽油）および少なくとも１種類の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、またはＳｐａｎ  ８０）の１ミクロン未満の水中油型エマルジョン。添加物，例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−脂溶性結合体（例えば、参考文献４７に記載されている、グルクロン酸のカルボキシル基を介するデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの付加によって得られるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンが含まれ得る。
【０１１６】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えば、コレステロール）がへリックスミセルとして会合しているエマルジョン［４８］。
【０１１７】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［４９］。
【０１１８】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［４９］。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、エマルジョンは、送達時に、即座に抗原と混合することができ、したがって、アジュバントと抗原は、使用時の最終的な処方の準備として、パッケージされたワクチンまたは分配されたワクチンの中に別々に保たれ得る。他の実施形態では、エマルジョンは、製造の際に抗原と混合され、したがって、組成物は、液体のアジュバント化された形態でパッケージされる。抗原は、一般的には、ワクチンが２種類の液体を混合することによって最終的に調製されるように、水性の形態であろう。混合される２種類の液体の容積比は様々であり得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般的には、約１：１である。成分の濃度が特定のエマルジョンについての上記の記載の中にある場合には、これらの濃度は、典型的には、未希釈の組成物についての濃度であり、したがって、抗原溶液との混合後の濃度は下がるであろう。
【０１２０】
組成物にトコフェロールが含まれる場合は、α、β、γ、δ、ε、またはζのいずれのトコフェロールも使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、いくつかの形態（例えば、様々な塩および／または異性体）をとることができる。塩としては、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールのいずれを使用することもできる。トコフェロールは、高齢の患者（例えば、６０歳以上）に使用されるワクチンに含められることが有利である。なぜなら、ビタミンＥが、この患者のグループにおいて免疫応答に対してポジティブな影響を有することが報告されているからである［５０］。これらはまた、エマルジョンの安定化を助けることができる、抗酸化特性も持つ［５１］。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、そしてこのトコフェロールの好ましい塩はコハク酸塩である。コハク酸塩は、インビボでＴＮＦ関連リガンドと協働することが明らかにされている。
【０１２１】
Ｃ．サポニン処方物［参考文献３２の第２２章］
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。サポニンは、多種多様な植物種の樹皮、葉、茎、根、およびさらには花でも見られる、ステロールグリコシドとトリテルペノイドグリコシドの不均質なグループである。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサプリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルヴェール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））由来のサポニンはまた、商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント処方物には、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）、ならびに、脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が含まれる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として販売されている。
【０１２２】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃを含む、これらの技術を使用した特異的な精製された画分が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は、参考文献５２に開示されている。サポニン処方物にはまた、コレステロールのようなステロールも含まれ得る［５３］。
【０１２３】
サポニンとコレステロールの組み合わせを、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる特有の粒子を形成させるために使用することができる［参考文献３２の第２３章］。ＩＳＣＯＭにはまた、典型的には、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）も含まれる。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭの中で使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭには、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣの１つまたは複数が含まれる。ＩＳＣＯＭについては、参考文献５３〜５５の中でさらに記載されている。状況に応じて、ＩＳＣＯＭＳには、それ以上の界面活性剤は含まれない場合がある［５６］。
【０１２４】
サポニン系のアジュバントの開発についての概要は、参考文献５７および５８の中で見ることができる。
【０１２５】
Ｄ．ヴィロソームおよびウイルス様粒子
ヴィロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明においては、アジュバントとして使用することができる。これらの構造には、一般的には、状況に応じてリン脂質と混合されたか、またはリン脂質と一緒に処方された、ウイルスに由来する１種類または複数の種類のタンパク質が含まれる。これらは、一般的には、非病原性、非複製性であり、一般的には、天然のウイルスゲノムは全く含まれない。ウイルスタンパク質は、組み換えによって生産することができ、また、完全なウイルスから単離することもできる。ヴィロソームまたはＶＬＰにおける使用に適しているこれらのウイルスタンパク質としては、以下に由来するタンパク質が挙げられる：インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、外被タンパク質）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）。ＶＬＰは、参考文献５９〜６４の中でさらに議論されている。ヴィロソームは、例えば、参考文献６５の中でさらに議論されている。
【０１２６】
Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明での使用に適しているアジュバントとしては、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖体（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチド、およびＡＤＰ−リボシル化毒素、ならびにそれらの解毒された誘導体が挙げられる。
【０１２７】
ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３  ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）の、４、５、または６アシル化された鎖との混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小さい粒子」の形態は、参考文献６６に開示されている。そのような３ｄＭＰＬの「小さい粒子」は、０．２２μｍの膜を通して濾過滅菌するためには十分に小さい［６６］。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）が挙げられる［６７、６８］。
【０１２８】
リピドＡ誘導体には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体、例えば、ＯＭ−１７４が含まれる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献６９および７０に記載されている。
【０１２９】
本発明においてアジュバントとしての使用に適している免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（グアノシンに結合させられたリン酸によって連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）が挙げられる。二本鎖ＲＮＡ、およびパリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
【０１３０】
ＣｐＧ’には、ホスホロチオエート修飾のようなヌクレオチドの修飾／アナログが含まれ得、そしてこれは、二本鎖であってもまた一本鎖であってもよい。参考文献７１、７２、および７３には、可能なアナログでの置換、例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでの置換が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献７４〜７９の中でさらに議論されている。
【０１３１】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）に特異的であり得る［８０］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮのように、Ｔｈ１免疫応答を誘導することについて特異的である場合があり、また、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮのように、Ｂ細胞応答を誘導することについてより特異的である場合もある。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮとＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献８１〜８３で議論されている。ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮであることが好ましい。
【０１３２】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のために利用しやすいように構築される。状況に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、「イムノマー」を形成させるために、それらの３’末端に結合させることができる。例えば、参考文献８０、および８４〜８６を参照のこと。
【０１３３】
有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９であり、これは、ＰｒｏＭｕｎｅ（商標）（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知である。別のものはＣｐＧ１８２６である。ＣｐＧ配列を使用する代わりに、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列を使用することができ［８７］、そしてこれらのオリゴヌクレオチドには、メチル化されていないＣｐＧモチーフは含まれない場合がある。免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、ピリミジンが多く含まれる場合がある。例えば、これには、２つ以上の連続するチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献８７に開示されているように、ＴＴＴＴ）が含まれ得、そして／またはこれは、＞２５％のチミジン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を含むヌクレオチド組成を持ち得る。例えば、これには、２つ以上の連続するシトシンヌクレオチド（例えば、参考文献８７に開示されているように、ＣＣＣＣ）が含まれ得、そして／またはこれは、＞２５％のシトシン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を含むヌクレオチド組成を持ち得る。これらのオリゴヌクレオチドには、メチル化されていないＣｐＧモチーフは含まれない場合がある。免疫刺激オリゴヌクレオチドには、典型的には、少なくとも２０個のヌクレオチドが含まれるであろう。これらには、１００個未満のヌクレオチドが含まれ得る。
【０１３４】
免疫刺激オリゴヌクレオチドについての特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１（商標）として知られている［８８］。したがって、本発明とともに使用されるアジュバントには、以下の混合物が含まれ得る：（ｉ）少なくとも１つの（および好ましくは、複数の）ＣｐＩモチーフ（すなわち、ジヌクレオチドを形成させるためにイノシンに連結させられたシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの間）、ならびに、（ｉｉ）少なくとも１つの（および好ましくは、複数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列（単数または複数）を含むオリゴペプチド（例えば、５アミノ酸〜２０アミノ酸の間）のようなポリカチオン性ポリマー。オリゴヌクレオチドは、２６マーの配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号９６）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。ポリカチオン性ポリマーは、１１マーのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号９７）を含むペプチドであり得る。
【０１３５】
細菌のＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を、本発明においてアジュバントとして使用することができる。好ましくは、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性腸毒素「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。解毒されたＡＤＰ−リボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献８９に記載されており、そして非経口アジュバントとしての使用は参考文献９０に記載されている。毒素または類毒素は、好ましくは、ホロ毒素の形態であり、これには、ＡサブユニットとＢサブユニットの両方が含まれる。Ａサブユニットには、解毒化突然変異が含まれることが好ましい。Ｂサブユニットは突然変異していないことが好ましい。好ましくは、アジュバントは、解毒されたＬＴ突然変異体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２である。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）のアジュバントとしての使用は、参考文献９１〜９８の中で見ることができる。有用なＣＴ突然変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである［９９］。アミノ酸の置換についての数字での言及は、好ましくは、その中のアラインメントおよびアミノ酸番号の目的だけのためにその全体が引用により具体的に本明細書中に組み入れられる、参考文献１００に示されるＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０１３６】
Ｆ．ヒトの免疫調節因子
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているヒトの免疫調節因子としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１０１］など）［１０２］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。好ましい免疫調節因子はＩＬ−１２である。
【０１３７】
Ｇ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［１０３］、または粘膜接着剤（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカライド、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る［１０４］。
【０１３８】
Ｈ．マイクロ粒子
マイクロ粒子もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。生体分解性であり、かつ非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）とともに形成させられるマイクロ粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、および最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、状況に応じて、負に荷電した表面を持つように（例えば、ＳＤＳで）処理されるか、または正に荷電した表面を持つように（例えば、陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）で）処理される。
【０１３９】
Ｉ．リポソーム（参考文献３２の第１３章および第１４章）
アジュバントとしての使用に適しているリポソーム処方物の例は、参考文献１０５〜１０７に記載されている。
【０１４０】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルの処方物
本発明での使用に適しているアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［１０８］。そのような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組み合わせられたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１０９］、ならびに少なくとも一種のさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせられたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤［１１０］が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１４１】
Ｋ．ホスファゼン
例えば、参考文献１１１および１１２に記載されているホスファゼン｛例えば、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）｝を使用することができる。
【０１４２】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１４３】
Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８３７」）［１１３、１１４］、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）［１１５］、およびそれらのアナログ、ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）が挙げられる。免疫刺激性のイミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献１１６〜１２０の中で見ることができる。
【０１４４】
Ｎ．置換された尿素
アジュバントとして有用な置換された尿素としては、「ＥＲ  ８０３０５８」、「ＥＲ  ８０３７３２」、「ＥＲ  ８０４０５３」、「ＥＲ  ８０４０５８」、「ＥＲ  ８０４０５９」、「ＥＲ  ８０４４４２」、「ＥＲ  ８０４６８０」、「ＥＲ  ８０４７６４」、「ＥＲ  ８０３０２２」、または「ＥＲ  ８０４０５７」のような、参考文献１２１において定義されているような、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、あるいはそれらの塩が挙げられ：
【０１４５】
【化１】
2011512152.tif 000002
例えば、以下である：
【０１４６】
【化２】
2011512152.tif 000003
Ｏ．さらなるアジュバント
本発明とともに使用することができるさらなるアジュバントとしては、以下が挙げられる：
・アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えば、ＲＣ−５２９［１２２、１２３］。
【０１４７】
・参考文献１２４の中で開示されているもののような、チオセミカルバゾン化合物。活性化合物を処方する、製造する、およびスクリーニングする方法もまた、参考文献１２４の中で記載されている。チオセミカルバゾンは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【０１４８】
・参考文献１２５に開示されているもののような、トリプタントリン化合物。活性化合物を処方する、製造する、およびスクリーニングする方法もまた、参考文献１２５の中で記載されている。チオセミカルバゾンは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【０１４９】
・以下のようなヌクレオシドアナログ：（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１５０】
【化３】
2011512152.tif 000004
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１２６〜１２８に開示されている化合物ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１２９］。
【０１５１】
・以下を含む、参考文献１３０に開示されている化合物：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１３１、１３２］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１３３］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物およびベンザゾール化合物［１３４］。
【０１５２】
・リン酸塩を含む非環式骨格に対して連結させられた脂質を含む化合物（例えば、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４）［１３５、１３６］：
・ポリオキシドニウムポリマー［１３７、１３８］または他のＮ−酸化ポリエチレンピペラジン誘導体。
【０１５３】
・メチルイノシン５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」）［１３９］。
【０１５４】
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１４０］、例えば、以下の式を持つもの：
【０１５５】
【化４】
2011512152.tif 000005
式中、Ｒは、水素、直鎖または分枝鎖である、非置換または置換の、飽和したまたは不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基、あるいはその薬学的に許容される塩または誘導体を含む群より選択される。例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなど。
【０１５６】
・ＣＤ１ｄリガンド、例えば、α−グリコシルセラミド［１４１〜１４８］（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３”−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど。
【０１５７】
・γインスリン［１４９］またはその誘導体、例えば、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）。
【０１５８】
【化５】
2011512152.tif 000006
アジュバントの組み合わせ
本発明にはまた、上記で同定されたアジュバントの１つまたは複数の態様の組み合わせが含まれる場合もある。例えば、以下のアジュバント組成物を、本発明において使用することができる：（１）サポニンと水中油型エマルジョン［１５０］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１５１］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（状況に応じて＋ステロール）［１５２］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［１５３］；（６）１０％のスクアラン、０．４％のＴｗｅｅｎ  ８０（商標）、５％のプルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ（１ミクロン未満のエマルジョンになるようにマイクロフルイダイズされたか、またはボルテックスされたかのいずれかが行われて、より大きな粒子サイズのエマルジョンが生じさせられた）；（７）２％のスクワレン、０．２％のＴｗｅｅｎ  ８０、ならびにモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１種類または複数の種類の細菌細胞壁成分を含む、Ｒｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１種類または複数の種類の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＰＭＬ）。
【０１５９】
免疫刺激因子として作用する他の物質は、参考文献３２の第７章に開示されている。
【０１６０】
水酸化アルミニウムアジュバントおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が特に好ましく、抗原は、一般的には、これらの塩に吸着される。リン酸カルシウムが別の好ましいアジュバントである。他の好ましいアジュバントの組み合わせとしては、Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントとの組み合わせ、例えば、ＣｐＧとａｌｕｍ、またはレシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）とａｌｕｍの組み合わせが挙げられる。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬとの組み合わせを使用することができる。
【０１６１】
本発明の組成物は、細胞に媒介される免疫応答と、体液性の免疫応答の両方を誘発することができる。この免疫応答は、長期間持続する（例えば、中和）抗体、および肺炎球菌に曝されると直ちに反応することができる細胞に媒介される免疫を誘導するであろうことが好ましい。
【０１６２】
Ｔ細胞の２つのタイプ（ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞）は、一般的には、細胞媒介性の免疫と体液性免疫を開始および／または増大させるために必要であると考えられている。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現することができ、一般的には、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれている。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示される抗原を認識するか、またはそれと相互作用することができる。
【０１６３】
ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現することができ、一般的には、Ｔへルパー細胞と呼ばれている。ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原性ペプチドを認識することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用すると、ＣＤ４細胞は、サイトカインのような因子を分泌することができる。これらの分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫応答に関与している他の細胞を活性化させることができる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、さらに、それらのサイトカインおよびエフェクター機能が異なる、以下のような２種類の機能的に異なるサブセットに分類することができる：  ＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型。
【０１６４】
活性化されたＴＨ１細胞は、細胞性免疫（抗原特異的ＣＴＬの生産の増大を誘導する）を増強し、したがって、細胞内感染に対する反応において特に有用である。活性化されたＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−βの１つまたは複数を分泌することができる。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化させることによって、局所炎症反応を生じ得る。ＴＨ１免疫応答はまた、ＩＬ−１２でＢ細胞およびＴ細胞の増殖を刺激することによって、免疫応答を拡大させるようにも作用し得る。ＴＨ１によって刺激されたＢ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌し得る。
【０１６５】
活性化されたＴＨ２細胞は、抗体の生産を増強させ、したがって、細胞外感染に対する反応において有用である。活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の１つまたは複数を分泌し得る。ＴＨ２免疫応答によっては、さらなる防御のための、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびメモリーＢ細胞の生産が生じ得る。
【０１６６】
増強された免疫応答には、増強されたＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答の１つまたは複数が含まれ得る。
【０１６７】
ＴＨ１免疫応答には、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答と関係があるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−β）の１つまたは複数の増加、活性化されたマクロファージの増加、ＮＫ活性の増大、あるいはＩｇＧ２ａの生産の増大の１つまたは複数が含まれ得る。好ましくは、増強されたＴＨ１免疫応答には、ＩｇＧ２ａの生産の増大が含まれるであろう。
【０１６８】
ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ１アジュバントは、一般的には、アジュバントを用いない抗原の予防接種と比較して、ＩｇＧ２ａの生産レベルの増大を誘発するであろう。本発明での使用に適しているＴＨ１アジュバントとしては、例えば、サポニン処方物、ヴィロソーム、およびウイルス様粒子、腸内細菌のリポ多糖体（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられ得る。免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド）が、本発明での使用に好ましいＴＨ１アジュバントである。
【０１６９】
ＴＨ２免疫応答には、ＴＨ２免疫応答と関係があるサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０）の１つまたは複数の増加、あるいは、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびメモリーＢ細胞の生産の増大の１つまたは複数が含まれ得る。好ましくは、増強されたＴＨ２免疫応答には、ＩｇＧ１の生産の増大が含まれるであろう。
【０１７０】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ２アジュバントは、一般的には、アジュバントを用いない抗原の予防接種と比較して、ＩｇＧ１の生産レベルの増大を誘発するであろう。本発明での使用に適しているＴＨ２アジュバントとしては、例えば、無機物を含む組成物、オイルエマルジョン、ならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒化誘導体が挙げられ得る。無機物を含む組成物（例えば、アルミニウム塩）が、本発明での使用に好ましいＴＨ２アジュバントである。
【０１７１】
本発明に、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物が含まれることが好ましい。好ましくは、そのような組成物は、増強されたＴＨ１応答と増強されたＴＨ２応答を誘発する、すなわち、アジュバントを用いない予防接種と比較した、ＩｇＧ１の生産とＩｇＧ２ａの生産の両方の増大を誘発する。なおより好ましくは、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物は、単一のアジュバントでの予防接種と比較して（すなわち、ＴＨ１アジュバントだけでの予防接種、またはＴＨ２アジュバントだけでの予防接種と比較して）、ＴＨ１免疫応答の増大および／またはＴＨ２免疫応答の増大を誘発する。
【０１７２】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であり得る。好ましくは、免疫応答により、増強されたＴＨ１応答および増強されたＴＨ２応答の一方または両方が提供される。
【０１７３】
増強された免疫応答は、全身性免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であり得る。好ましくは、免疫応答により、増強された全身性免疫応答および増強された粘膜免疫応答の一方または両方が提供される。好ましくは、粘膜免疫応答はＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答には、ＩｇＡの生産の増大が含まれる。
【０１７４】
Ｅ．ｃｏｌｉは、多数の解剖学的部位で疾患を引き起こす可能性があり［４］、したがって、本発明の組成物は、様々な形態で調製され得る。例えば、組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができる。注射前の、液体媒体中の溶液または懸濁液に適している固体形態（例えば、凍結乾燥組成物または噴霧凍結乾燥組成物）もまた、調製することができる。組成物は、局所投与のために、例えば、軟膏、クリーム剤、または散剤として調製される場合もある。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤またはカプセル剤として、噴霧剤として、あるいはシロップ剤として（状況に応じて、香味づけされたもの）調製される場合もある。組成物は、肺投与のために、例えば、微粉末を使用する吸入剤または噴霧剤として、調製される場合もある。組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製される場合もある。組成物は、鼻腔内投与、耳投与、または眼投与のために、例えば、点滴剤として調製され得る。組成物は、組み合わせられた組成物が患者への投与の直前に再構成されるように設計された、キットの形態であり得る。そのようなキットには、液体形態の中にある１つまたは複数の抗原と、１つまたは複数の凍結乾燥させられた抗原とが含まれる場合がある。
【０１７５】
組成物が、使用前に即座に調製され（例えば、１種類の成分が凍結乾燥させられた形態で存在する場合）、そしてキットとして提示される場合には、このキットには２つのバイアルが含まれる場合があり、また、１つの容易に充填することができる注射器と１つのバイアルが、注射前にバイアルの内容物を再度活性化させるために使用される注射器の内容物とともに含まれる場合もある。
【０１７６】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物には、免疫学的有効量の抗原（単数または複数）、ならびに、任意の他の成分が必要に応じて含まれる。「免疫学的有効量」によっては、単回投与または一連の投与の一部としてのいずれかでの個体へのその量の投与が、処置または予防に有効であることが意味される。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医学的状況についての処置を行う医師による評価、および他の関連する要因に応じて様々である。この量は、日常的に行われている試験を通じて決定することができる比較的広い範囲に入るであろうと予想される。
【０１７７】
処置方法、およびワクチンの投与
本発明によってはまた、有効量の本発明の組成物を投与する工程を含む、哺乳動物において免疫応答を惹起させるための方法が提供される。免疫応答は、好ましくは防御的であり、抗体および／または細胞媒介性の免疫が含まれることが好ましい。この方法によっては、追加免疫応答が惹起され得る。
【０１７８】
本発明によってはまた、医薬品として使用される、例えば、哺乳動物において免疫応答を惹起させるために使用される、本発明のポリペプチドが提供される。
【０１７９】
本発明によってはまた、哺乳動物において免疫応答を惹起させるための医薬品の製造における本発明のポリペプチドの使用も提供される。
【０１８０】
本発明によってはまた、本発明の免疫原性組成物が予め充填されている送達デバイスも提供される。
【０１８１】
これらの使用および方法によって哺乳動物の中で免疫応答を惹起させることにより、哺乳動物を、ＥｘＰＥＣ株および非ＥｘＰＥＣ株を含むＥ．ｃｏｌｉ感染に対して防御することができる。本発明は、腸内病原型（例えば、ＥＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＴＥＣおよびＤＡＥＣ病原型）を含む病原性Ｅ．ｃｏｌｉに対する広範囲に及ぶ防御を提供するために特に有用である。したがって、哺乳動物は、以下を含むがこれらに限定されない疾患に対して防御され得る：腹膜炎、腎盂腎炎、膀胱炎、心内膜炎、前立腺炎、尿管感染（ＵＴＩ）、髄膜炎（特に、新生児髄膜炎）、敗血症（またはＳＩＲＳ）、脱水症、肺炎、下痢（小児性下痢、旅行者下痢、急性下痢、持続性下痢など）、細菌性赤痢、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、心膜炎、細菌尿症など。
【０１８２】
配列番号３および１２、ならびにそれらの変異体は、ＥＡＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、下痢（急性および慢性の両方）の予防に特に有用である。
【０１８３】
配列番号３、１２、１９９、１０９、１１５、および１２４、ならびにそれらの変異体は、ＥＡＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、下痢（急性および慢性の両方）の予防に特に有用である。
【０１８４】
配列番号３、１２、１９９、１０９、１１５、１２４、１２９、１３０、および１３１、ならびにそれらの変異体は、ＥＡＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、下痢（急性および慢性の両方）の予防に特に有用である。
【０１８５】
配列番号４および１０、ならびにそれらの変異体は、ＵＰＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、以下を含むが、これらに限定されないＵＴＩの予防に特に有用である：腎盂腎炎，膀胱炎（急性および再発の両方）、腹膜炎、カテーテルによるＵＴＩ、前立腺炎（ｐｒｏｓｔａｔｉｓｉｓ）、および細菌尿症（無症候性細菌尿症を含む）。
【０１８６】
配列番号４、１０、１０１、１０７、１１６、および１２６、ならびにそれらの変異体は、ＵＰＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、以下を含むが、これらに限定されないＵＴＩの予防に、特に有用である：腎盂腎炎、膀胱炎（急性および再発の両方）、腹膜炎、カテーテルによるＵＴＩ、前立腺炎、および細菌尿症（無症候性細菌尿症を含む）。
【０１８７】
配列番号４、１０、１０１、１０７、１１６、１２６、１３３、１３４、１３５、１３７、１３８、および１３９、ならびにそれらの変異体は、ＵＰＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、以下を含むが、これらに限定されないＵＴＩの予防に、特に有用である：腎盂腎炎、膀胱炎（急性および再発の両方）、腹膜炎、カテーテルによるＵＴＩ、前立腺炎、および細菌尿症（無症候性細菌尿症を含む）。
【０１８８】
配列番号５およびその変異体は、ＥＩＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、赤痢（特に、細菌性赤痢）およびＨＵＳ（例えば、小児において）の予防に、特に有用である。
【０１８９】
配列番号５、１０２、および１１７、ならびにそれらの変異体は、ＥＩＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、赤痢（特に、細菌性赤痢）およびＨＵＳ（例えば、小児において）の予防に、特に有用である。
【０１９０】
配列番号６、９、および１１、ならびにそれらの変異体は、ＥＴＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、下痢（旅行者下痢、および小児性下痢を含む）の予防に、特に有用である。
【０１９１】
配列番号６、９、１１、１０３、１０６、１０８、１１８、１２１、および１２３、ならびにそれらの変異体は、ＥＴＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、下痢（旅行者下痢および小児性下痢を含む）の予防に、特に有用である。
【０１９２】
配列番号７、８、および１６、ならびにそれらの変異体は、ＥＰＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、下痢（小児性下痢を含む）の予防に、特に有用である。
【０１９３】
配列番号７、８、１６、１０４、１０５、１１３、１１９、１２０、および１２８、ならびにそれらの変異体もまた、ＥＰＥＣ病原型に対する予防接種に、したがって、下痢（小児性下痢を含む）の予防に、特に有用である。
【０１９４】
哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ネコ、またはイヌでもあり得る。なぜなら、Ｅ．ｃｏｌｉ病はまた、これらの種においても問題であるからである。［４］。ワクチンが予防的用途のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、子供（例えば、幼児または乳児）であるか、あるいは十代の若者であり、ワクチンが治療的用途のためのものである場合には、ヒトは、好ましくは、十代の若者または成人である。子供用に意図されるワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人にも投与され得る。
【０１９５】
治療的処置の有効性をチェックする１つの方法には、本発明の組成物の投与後にＥ．ｃｏｌｉ感染をモニタリングすることが含まれる。予防的処置の有効性をチェックする１つの方法には、組成物の投与後に、本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答を、全身的に（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの生産レベルをモニタリングする）および／または粘膜的に（例えば、ＩｇＡの生産レベルをモニタリングする）モニタリングすることが含まれる。典型的には、抗原特異的血清抗体応答は、予防接種後、抗原投与前に決定されるが、抗原特異的粘膜抗体応答は、予防接種後、抗原投与後に決定される。
【０１９６】
本発明の組成物の免疫原性を評価する別の方法は、免疫ブロットおよび／またはマイクロアレイによって患者の血清または粘膜分泌物をスクリーニングするために、組み換えによってタンパク質を発現させることである。タンパク質と患者の試料との間でのポジティブな反応は、その患者が、問われているタンパク質に対する免疫応答を増大させたことを示す。この方法はまた、免疫優勢抗原および／または抗原内のエピトープを同定するために使用され得る。
【０１９７】
ワクチン組成物の有効性はまた、ワクチン組成物を用いてＥ．ｃｏｌｉ感染の動物モデル（例えば、モルモットまたはマウス）に抗原投与することによって、インビボで決定することもできる。ＥｘＰＥＣおよび致死性敗血症のマウスモデルが、参考文献１５４に記載されている。コットンラットモデルが、参考文献１５５に開示されている。
【０１９８】
本発明の組成物は、一般的には、患者に直接投与されるであろう。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間隙腔に対して）によって、または経直腸、経口（例えば、錠剤、噴霧剤）、経膣、局所、経皮、もしくは鼻腔内、眼、経耳、肺もしくは他の粘膜投与によって行われ得る。
【０１９９】
本発明は、全身性免疫および／または粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身性免疫および／または粘膜免疫を誘発するために使用され得る。
【０２００】
好ましくは、増強された全身性免疫および／または粘膜免疫は、増強されたＴＨ１免疫応答および／またはＴＨ２免疫応答において反映される。好ましくは、増強された免疫応答には、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの生産の増大が含まれる。
【０２０１】
投薬は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールによって行うことができる。複数回投与は、一次予防接種スケジュールにおいて、および／または追加予防接種スケジュールにおいて使用され得る。複数回投与スケジュールでは、様々な用量が、同じ経路または異なる経路（例えば、非経口での一次と粘膜からの追加、粘膜からの一次と非経口での追加など）によって投与され得る。複数回投与は、典型的には、少なくとも１週間の間隔をあけて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与されるであろう。
【０２０２】
本発明のワクチンは、子供および成人の両方を処置するために使用され得る。したがって、ヒト患者は、１歳未満、１歳〜５歳、５歳〜１５歳、１５歳〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。ワクチンが投与される好ましい患者は、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若い（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、兵役に従事している者および軍人、妊婦、慢性疾患患者、または免疫不全患者である。ワクチンは、これらのグループについては単独では適していないが、１つの集団においてはより一般的に使用され得る。
【０２０３】
本発明のワクチンは、外科手術が予想される患者、または他の入院患者に特に有用である。これらはまた、カテーテルが挿入されるであろう患者にも有用である。これらはまた、思春期女性（例えば、１１歳〜１８歳）および慢性尿管感染の患者においても有用である。
【０２０４】
本発明のワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、同じ医療的診察、または医療の専門家もしくは予防接種センターを訪れた際に）、例えば、麻疹ワクチン、おたふく風邪ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、結合型髄膜炎菌ワクチン（例えば、４価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、呼吸器合胞体ウイルスワクチンなどと実質的に同時に、患者に投与され得る。
【０２０５】
核酸での予防接種
上記に記載された免疫原性組成物には、ポリペプチド抗原が含まれる。しかし、全ての場合において、ポリペプチド抗原は、そのようなポリペプチドをコードする核酸（典型的には、ＤＮＡ）に置き換えることができ、核酸での予防接種に基づく組成物、方法、および使用が提供される。核酸での予防接種は、現在開発が行われている分野である（例えば、参考文献１５６〜１６３などを参照のこと）。
【０２０６】
免疫原をコードする核酸は、患者への送達後にインビボで発現され、その後、発現された免疫原は、免疫系を刺激する。活性成分は、典型的には、以下を含む核酸ベクターの形態をとるであろう：（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）プロモーターに作動可能であるように連結させられた免疫原をコードする配列；および状況に応じて、（ｉｉｉ）選択マーカー。好ましいベクターにはさらに以下が含まれ得る：（ｉｖ）複製起点；および（ｖ）（ｉｉ）に対して下流に、かつ作動可能であるように連結させられた転写終結点。一般的には、（ｉ）と（ｖ）は真核生物のものであろう。そして（ｉｉｉ）と（ｉｖ）は原核生物のものであろう。
【０２０７】
好ましいプロモーターは、ウイルスプロモータ（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するウイルスプロモータ）である。ベクターにはまた、プロモーターに加えて転写調節配列（例えば、エンハンサー）も含まれ得る。そしてこれは、プロモーターと機能的であるように相互作用する。好ましいベクターには、最初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターが含まれ、より好ましいベクターには、ＣＭＶイントロンＡも含まれる。プロモーターは、免疫原をコードする配列の下流に作動可能であるように連結される。その結果、免疫原をコードする配列の発現は、プロモーターの制御下になる。
【０２０８】
マーカーが使用される場合は、これは、好ましくは、微生物宿主の中（例えば、原核生物の中、細菌の中、酵母の中）で機能するものであることが好ましい。マーカーは、好ましくは、原核生物の選択マーカー（例えば、原核生物のプロモーターの制御下で転写されるもの）である。便宜上、典型的なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。
【０２０９】
本発明のベクターは、好ましくは、自立複製するエピソームまたは染色体外ベクター（例えば、プラスミド）である。
【０２１０】
本発明のベクターには、好ましくは、複製起点が含まれる。複製起点は、原核生物の中では活性であり、真核生物の中では活性ではないことが好ましい。
【０２１１】
したがって、好ましいベクターには、ベクターを選択するための原核生物のマーカー、原核生物の複製起点、しかし、免疫原をコードする配列の転写を駆動するための真核生物のプロモーターが含まれる。したがって、ベクターは、（ａ）原核生物宿主の中では、ポリペプチドを発現させることなく増幅され、そして選択されるであろうが、（ｂ）真核生物宿主の中では、増幅されることなく発現されるであろう。この配置は、核酸での予防接種ベクターについては理想的である。
【０２１２】
本発明のベクターには、コード配列の下流に、真核生物の転写終結配列が含まれ得る。これは、転写レベルを増強することができる。コード配列がそれ自体ポリアデニル化配列を持たない場合には、本発明のベクターには、好ましくは、ポリアデニル化配列が含まれる。好ましいポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化配列である。
【０２１３】
本発明のベクターには、マルチクローニング部位が含まれ得る。
【０２１４】
免疫原およびマーカーをコードする配列に加えて、ベクターには、第２の真核生物のコード配列が含まれ得る。ベクターにはまた、免疫原としてのその転写物からの第２の真核生物ポリペプチドの翻訳を可能にするために、上記第２の配列の上流にあるＩＲＥＳも含まれ得る。あるいは、免疫原をコードする配列は、ＩＲＥＳの下流にある場合もある。
【０２１５】
本発明のベクターには、メチル化されていないＣｐＧモチーフ（例えば、２つの５’プリンと２つの３’ピリミジンが隣接している、グアニンが先行するシトシンを共通して持つメチル化されていないＤＮＡ配列）が含まれ得る。それらのメチル化されていない形態の中では、これらのＤＮＡモチーフは、いくつかのタイプの免疫細胞の強力な刺激因子であることが明らかにされている。
【０２１６】
ベクターは、標的化された方法で送達され得る。受容体に媒介されるＤＮＡ送達技術は、例えば、参考文献１６４〜１６９に記載されている。核酸を含む治療用組成物は、遺伝子治療プロトコールにおいては、局所投与について約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、そして約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコールの際に使用することができる。最終的な効力のために必要な投与量に影響を及ぼすであろう、作用方法（例えば、コードされる遺伝子産物のレベルを増強するかまたは阻害するための）、ならびに形質転換および発現の効率のような要因が考慮される。より広い組織領域にわたるより高い発現が所望される場合には、ポジティブな治療結果が得られるように、より多量のベクターが、または同量が、異なる隣接組織部分または近い組織部分に対して、連続投与プロトコールにおいて、あるいは数回の投与において再投与される。全ての場合において、臨床試験において日常的に行われる実験によって、最適な治療結果のための特異的な範囲が決定されるであろう。
【０２１７】
ベクターは、遺伝子送達媒体を使用して送達することができる。遺伝子送達媒体は、ウイルス起源のものであっても、また、ウイルス以外の起源のものであってもよい（一般的には、参考文献１７０〜１７３を参照のこと）。
【０２１８】
所望される核酸の送達および所望される細胞の中での発現のためのウイルスをベースとするベクターは当該分野で周知である。例示的なウイルスをベースとする媒体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：組み換え体レトロウイルス（例えば、参考文献１７４〜１８４）、アルファウイルスをベースとするベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）；これらのウイルスのハイブリッドまたはキメラも使用され得る）、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニア、鶏痘、カナリア痘、天然痘など）、アデノウイルスベクター、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献１８５〜１９０を参照のこと）。死滅させられたアデノウイルスに連結させられたＤＮＡの投与［１９１］もまた使用することができる。
【０２１９】
以下を含むが、これらに限定されない、非ウイルス送達媒体および方法もまた使用することができる：死滅させられたアデノウイルスだけに連結させられたか連結させられていないポリカチオン性縮合ＤＮＡ［例えば、１９１］、リガンドに連結させられたＤＮＡ［１９２］、真核生物の細胞送達媒体細胞［例えば、参考文献１９３〜１９７］、および核の電荷の中和または細胞膜との融合。裸のＤＮＡもまた、使用することができる。例示的な裸のＤＮＡの導入方法は、参考文献１９８および１９９に記載されている。遺伝子送達媒体として作用し得るリポソーム（例えば、免疫リポソーム）は、参考文献２００〜２０４に記載されている。さらに別のアプローチは、参考文献２０５および２０６に記載されている。
【０２２０】
使用に適しているさらなる非ウイルス送達としては、参考文献２０６に記載されているアプローチのような、機械的送達システムが挙げられる。さらに、コード配列とそのような発現産物は、光重合させられたヒドロゲル材料の沈着、または電離放射線の使用によって送達することができる［例えば、参考文献２０７および２０８］。コード配列の送達に使用することができる他の従来の方法としては、例えば、コンパクトな遺伝子導入粒子銃（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｇｕｎ）の使用［２０９］または導入された遺伝子を活性化させるための電離放射線の使用［２０７および２０８］が挙げられる。
【０２２１】
ＰＬＧ｛ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）｝マイクロ粒子を使用するＤＮＡの送達が、特に好ましい方法であり、例えば、状況に応じて、負に帯電した表面を持つように処理された（例えば、ＳＤＳで処理される）または正に帯電した表面を持つように処理された（例えば、ＣＴＡＢのような陽イオン性界面活性剤で処理される）、マイクロ粒子への吸着によって行われる。
【０２２２】
参考文献５および放棄条項
いくつかの実施形態では、本発明には、配列番号１によってコードされるポリペプチドの使用は含まれない場合がある。例えば、これには、アミノ酸配列である配列番号２を含むポリペプチドの使用は含まれないか、または、Ｎ末端配列である配列番号９８を有しているポリペプチドの使用は含まれない。そのようなポリペプチドおよびそれらのコード配列は、ＮＭＥＣ感染に対する予防接種における使用について、参考文献５の中で開示されている。
【０２２３】
しかし、他の実施形態では、参考文献５のポリペプチドが、例えば、新規の医学的目的について含まれる。本明細書中で開示されるように、様々なＥ．ｃｏｌｉ病原型の間での近いホモログは、ＮＭＥＣに由来するポリペプチドに対する免疫応答により、非ＮＭＥＣ株に対する干渉効果が提供され得ることを意味する。したがって、本発明がＮＭＥＣ病原型ではないＥ．ｃｏｌｉによって引き起こされる疾患（例えば、ＥｘＰＥＣのＡＰＥＣ株、ＵＰＥＣ株、もしくはＳＥＰＥＣ株に対して；または、ＥＰＥＣ株、ＥＡＥＣ株、ＥＩＥＣ株、ＥＴＥＣ株、もしくはＤＡＥＣ株のような腸内Ｅ．ｃｏｌｉ病原型に対して）の処置あるいは予防に関する場合には、参考文献５のポリペプチドが含まれ得る。
【０２２４】
抗体
Ｅ．ｃｏｌｉ抗原に対する抗体を、受動免疫法に使用することができる［２１０］。したがって、本発明により、配列番号３〜１６のそれぞれからなる１３種類のタンパク質の少なくとも２種類に対して（例えば、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、または１３種類全てに対して）結合する抗体が提供される。したがって、本発明により、配列番号３〜１６、配列番号９９〜１１３、および配列番号１１４〜１２８のそれぞれからなる１３種類のタンパク質の少なくとも２種類に対して（例えば、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、または１３種類全てに対して）結合する抗体が提供される。上記グループの１３種類のタンパク質の１種類だけに結合する抗体は本発明には含まれない。したがって、本発明により、配列番号３〜１６、１２９、１３３、１３７、および１４１、配列番号９９〜１１３、１３０、１３４、１３８、および１４２、ならびに配列番号１１４〜１２８、１３１、１３５、１３９、および１４３のそれぞれからなる１７種類のタンパク質の少なくとも２種類に対して（例えば、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類、１６種類、または１７種類全てに対して）結合する抗体が提供される。特定の実施形態では、それに対して抗体が結合する少なくとも２種類またはそれ以上のタンパク質の少なくとも１種類が、配列番号１２９、１３３、１３７、および１４１、配列番号１３０、１３４、１３８、および１４２、ならびに配列番号１３１、１３５、１３９、および１４３のそれぞれからなる４種類のタンパク質の１種類から選択されなければならない。上記グループの１７種類のタンパク質の１種類だけに結合する抗体は、本発明には含まれない。
【０２２５】
本発明によってはまた、治療におけるそのような抗体の使用も提供される。本発明によってはまた、医薬品の製造におけるそのような抗体の使用が提供される。本発明によってはまた、有効量の本発明の抗体を投与する工程を含む、哺乳動物を処置するための方法が提供される。免疫原性組成物について上記で記載されたように、これらの方法および使用により、Ｅ．ｃｏｌｉ感染に対して哺乳動物を防御することができる。
【０２２６】
用語「抗体」には、完全な免疫グロブリン分子、ならびに、抗原に結合することができるそれらの断片が含まれる。これらには、ハイブリッド（キメラ）抗体分子［２１１、２１２］；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）断片およびＦｖ分子；非共有ヘテロ二量体［２１３、２１４］；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）［２１５］；二量体および三量体抗体断片構築物；ミニボディー［２１６、２１７］；ヒト化抗体分子［２１８〜２２０］；およびそのような分子から得られた任意の機能的断片、ならびに、ファージディスプレイのような従来のプロセスではないプロセスによって得られた抗体が含まれる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を得る方法は当該分野で周知である。ヒト化抗体または完全なヒト抗体が好ましい。
【０２２７】
一般論
本発明の実施では、他の場所に明記されない限りは、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の従来の方法が使用されるであろう。そのような技術は、文献の中で十分に説明されている。例えば、参考文献２２１〜２２８などを参照のこと。
【０２２８】
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」には、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」が含まれる。例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなる場合があり、また、付加的な他のものを含む場合もある（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０２２９】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２３０】
「ＧＩ」ナンバリングが本明細書中で使用される。ＧＩ番号、すなわち「ＧｅｎＩｎｆｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」は、配列がそのデータベースに加えられた時に、ＮＣＢＩによって処理されたそれぞれの配列の記録に対して連続して割り当てられる一連の数字である。ＧＩ番号には、その配列記録の登録番号との類似性はない。配列がアップデートされると（例えば、修正のために、またはさらなる注釈もしくは情報を加えるために）、これには新しいＧＩ番号が与えられる。したがって、与えられたＧＩ番号と組み合わせられた配列は変わることはない。
【０２３１】
２つのアミノ酸配列間での配列同一性の割合（％）の言及は、アラインメントされた場合に、２つの配列を比較して同じであるアミノ酸の割合（％）を意味する。このアラインメントと相同性または配列同一性の割合（％）は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献２２９のセクション７．７．１８の中で記載されているもの）を使用して決定することができる。好ましいアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって、１２のギャップ解放ペナルティー、および２のギャップ伸長ペナルティー、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを用いるアフィンギャップ検索を使用して決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献２３０に開示されている。
【０２３２】
当業者は、「単離された」が、その天然の状態から「人の手によって」変化させられたことを意味する。すなわち、それが自然界に存在している場合には、これは変化しているか、もしくはそのもともとの環境から取り出されているか、またはそれらの両方である。例えば、生存している生命体の中に自然界において存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、そのような生存している生命体の中にある場合には「単離され」ていないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その自然な状態において一緒に存在している物質から分離されている場合には、この用語が本開示において使用される限りは、「単離され」ている。さらに、形質転換、遺伝子操作によって、または任意の他の組み換え方法によって生命体に導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、そのような形質転換、遺伝子操作、または他の組み換え方法によって、自然界に存在している生命体と別の方法では区別することができない生命体を生じる場合を除いて、それがなおも上記生命体の中に存在する場合でも、「単離された」と理解される。この生命体は、生存している場合も、また生存していない場合もある。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１−１】図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。
【図１−２】図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。
【図１−３】図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。
【図１−４】図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。
【図１−５】図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。
【図１−６】図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。
【図１−７】図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。
【図１−８】図１は、配列番号２〜配列番号１６のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。同じ免疫原性を実質的に維持しつつ、溶解度を増大させるために除去され得るＮ末端領域が、アラインメントの下部に示される。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域までのＮ末端領域は「Ｇ」で示され、プロリンリッチ領域は「Ｐ」で示される。
【図２】図２は、配列の対の間でのアミノ酸同一性を示す。
【図３】図３は、ＤＴＴの非存在下で見ることができる高ＭＷのバンドを持つ、精製されたタンパク質のゲル分析を示す。
【図４】図４は、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株と非病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株の、抗ＡｃｆＤ血清を使用したウェスタンブロットを示す。パネル（Ａ）は、全細胞溶解物のウェスタンブロットである。パネル（Ｂ）は、培養物に由来する上清のウェスタンブロットである。パネル（Ａ）および（Ｂ）のそれぞれのレーンは、左から右に、以下のとおりである：レーンＭ−パネル（Ａ）の左側に示した個々のマーカータンパク質のｋＤａでの分子量とともに、マーカータンパク質；１−ＩＨＥ３０３４；２−ＣＦＴ０７３；３−５３６；４−ＢＬ２１；５−ＭＧ１６５５；６−Ｗ３１１０；７−ＮＩＳＳＬＥ１９１７；８−ＩＨＥ３０３４ΔＡｃｔＤ。分析から観察されるように、病原性株（ＩＨＥ３０３４、レーン１；５３６、レーン３）は、ＡｃｆＤを発現し、分泌するが、非病原性株（ＭＧ１６５５、レーン５；Ｗ３１１０、レーン６；Ｎｉｓｓｌｅ  １９１７、レーン７）は、タンパク質を発現するが、その分泌が欠失している。株ＣＦＴ０７３（レーン２）およびＩＨＥ３０３４ＤＡｃｆＤ（レーン８）は、ネガティブ対照として使用される。なぜなら、これらはａｃｆＤ遺伝子を持たないからである。ＢＬ２１株（レーン４）は、ポジティブ対照として使用される研究室株である。なぜなら、これは、ＡｃｆＤを発現し、分泌するからである。
【図５】図５は、ＡｃｆＤタンパク質とこのタンパク質の様々な断片の溶解度の比較を示す。パネル（Ａ）は、上清（それぞれのタンパク質または断片について右側のレーン）に対してペレット（それぞれのタンパク質または断片について左側のレーン）を比較する、３７℃での試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（４％〜１２％のＭＯＰＳ緩衝液）である。レーンは、左から右に、以下のとおりである：分子量マーカー（１９１ｋＤａ、９７ｋＤａ、および６４ｋＤａのバンドが示される）、挿入物を含まないｐＥＴ発現ベクターで形質転換された対照の細菌、３５２６（ヒスタグ＋リーダーペプチドが除去されている）の細菌での発現、Ｌ３５２６（ヒスタグ＋全長）の細菌での発現、Ｌ３５２６−２ｓｔｏｐ（全長）の細菌での発現、３５２６−ＤＧ（ヒスタグ＋苛堯性グリシン−セリンリンカーまでのＡｃｆＤのＮ末端の除去）の細菌での発現、および３５２６−ＤＰ（ヒスタグ＋プロリンリッチ領域全体のＡｃｆＤのＮ末端領域の除去）の細菌での発現。パネル（Ｂ）は、パネル（Ａ）のレーンと同じ順序のレーンの、２５℃での試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（４％〜１２％のＭＯＰＳ緩衝液）である。
【図６】図６は、ＡｃｆＤタンパク質およびこのタンパク質の様々な断片の発現と精製の比較を示す。パネル（Ａ）は、様々な精製段階に由来する画分（ｆａｃｔｉｏｎ）を比較している、２５℃で培養された３５２６（ヒスタグ＋リーダーペプチドが除去されている）を発現する細菌由来の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％のＭＯＰＳ緩衝液）である。レーンは、左から右に、以下の通りである：Ｍ：分子量マーカー（１９１ｋＤａ、９７ｋＤａ、および６４ｋＤａのバンドが示される）、ＴＯＴ：全細菌溶解物、ＩＮＳ：細菌溶解物の不溶性画分、ＳＭ：細菌溶解物の可溶性画分、ＦＴ：ニッケルカラムからの流出液；５００ｍＭのイミダゾール緩衝液を用いたＥ１、Ｅ２、およびＥ３の３種類の溶離液。パネル（Ｂ）は、様々な精製段階に由来する画分を比較している、２５℃で培養されたΔＧ３５２６（ヒスタグ＋苛堯性グリシン−セリンリンカーまでのＡｃｆＤのＮ末端の除去）を発現している細菌由来の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％のＭＯＰＳ緩衝液）である。レーンは、左から右に、以下の通りである：Ｍ：分子量マーカー（１９１ｋＤａ、９７ｋＤａ、および６４ｋＤａのバンドが示される）、ＴＯＴ：全細菌溶解物、ＩＮＳ：細菌溶解物の不溶性画分、ＳＭ：細菌溶解物の可溶性画分、ＦＴ：ニッケルカラムからの流出液；５００ｍＭのイミダゾール緩衝液を用いたＥ１、Ｅ２、およびＥ３の３種類の溶離液。パネル（Ｃ）は、様々な精製段階に由来する画分を比較している、２５℃で培養されたΔＰ３５２６（ヒスタグ＋プロリンリッチ領域全体のＡｃｆＤのＮ末端の除去）を発現している細菌由来の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％のＭＯＰＳ緩衝液）である。レーンは、左から右に、以下の通りである：Ｍ：分子量マーカー（１９１ｋＤａ、９７ｋＤａ、および６４ｋＤａのバンドが示される）、ＴＯＴ：全細菌溶解物、ＩＮＳ：細菌溶解物の不溶性画分、ＳＭ：細菌溶解物の可溶性画分、ＦＴ：ニッケルカラムからの流出液、５００ｍＭのイミダゾール緩衝液を用いた、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３の３種類の溶離液。
【図７】図７は、配列のさらに別の対の間でのアミノ酸同一性を示す。１６種類の腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）が、ＡｃｆＤ遺伝子を持つことは明らかにはならなかった（未公開）。（示される）配列は、左から右に、または上から下に、以下のとおりである：１０種類の非病原性株または片利共生的株（１：片利共生的Ｅ．ｃｏｌｉ株、２：ＤＨ１０Ｂ株、３：ＭＧ１６５５株、４：Ｗ３１１０株（配列番号１４）；５：ＨＳ株（配列番号１３）；９：別の片利共生的Ｅ．ｃｏｌｉ株；および１０：なお別の片利共生的Ｅ．ｃｏｌｉ株）；３種類のＮＭＥＣ株（１：ＮＭＥＣ株ＲＳ２１８；２：ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４（配列番号２）；および３：ＮＭＥＣ株Ｓ８８（配列番号１４１））；１種類のＡＰＥＣ株（１：ＡＰＥＣＯ１株）；６種類のＵＰＥＣ株（２：ＵＰＥＣ株５３６（配列番号４）；３：ＵＴＩ８９；４：ＵＰＥＣ株Ｆ１１（配列番号１０）；５：ＵＰＥＣ株ＩＡＩ３９（配列番号１３３）；および６：ＵＰＥＣ株ＵＭＮ０２６（配列番号１３７））；３種類のＥＡＥＣ株（１：ＥＡＥＣ株１０１−１（配列番号３）；２：ＥＡＥＣ株Ｏ４２（配列番号１２；および３：ＥＡＥＣ株５５９８９（配列番号１２９））；１種類のＥＩＥＣ株（１：ＥＩＥＣ株５３６３８（配列番号５））；４種類のＥＰＥＣ株（２：ＥＰＥＣ株Ｅ２２（配列番号８））；３：ＥＰＥＣ株Ｅ２３４８／６９（配列番号１６）；および４：ＥＰＥＣ株Ｅ１１００１９（配列番号７））；３種類のＥＴＥＣ株（１：ＥＴＥＣ株Ｂ７Ａ（配列番号６）；２：ＥＴＥＣ株Ｅ２４３７７Ａ（配列番号９）；および３：ＥＴＥＣ株Ｈ１０４０７（配列番号１１））；ならびに１種類の抗生物質耐性株（１：抗生物質耐性株ＳＥＣＥＣ（配列番号１５））。
【０２３４】
【表１】
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Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ５５９８９（下痢に関連する単離物、プラスミドなし−配列番号１２９、１３０（ΔＧ）、１３１（ΔＰ）、および１３２）：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ５５９８９は、臨床的な腸管凝集性単離物である。腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ株は粘膜細胞に付着し、胃腸炎の新たな原因である。
【０２３５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＡＩ３９（尿管感染単離物、プラスミドなし−配列番号１３３、１３４（ΔＧ）、１３５（ΔＰ）、および１３６）：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＡＩ３９は、尿管感染由来の血清型Ｏ７：Ｋ１株である。
【０２３６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＵＭＮ０２６（尿管感染単離物、１プラスミド−配列番号１３７、１３８（ΔＧ）、１３９（ΔＰ）、および１４０）：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＵＭＮ０２６は、血清型Ｏ７：Ｋ１臨床単離物である。この株は薬剤耐性である。
【０２３７】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓ８８（髄膜炎菌単離物、プラスミドなし−配列番号１４１、１４２（ΔＧ）、１４３（ΔＰ）、および１４４）：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓ８８は、新生児髄膜炎の症例から単離された血清型Ｏ４５：Ｋ１株である。
【発明を実施するための形態】
【０２３８】
本発明の実施のための態様
参考文献５に開示されている抗原の１つは、ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４由来のアクセサリー定着因子Ｄ（ＡｃｆＤ）前駆体（本明細書中ではアミノ酸配列番号２）と注釈が付けられている。このタンパク質は、発現させられ、精製されており、これは、敗血症の動物モデルにおいてＥｘＰＥＣ株に対する防御を付与する。
【０２３９】
様々な他のＥ．ｃｏｌｉ株の中のオルトログについての複数の配列が得られた。ＩＨＥ３０３４の中で見られるアミノ酸配列はまた、ＡＰＥＣＯ１株およびＵＴＩ８９株の中でも見られたが、１４種類のさらに別の配列も見られた（配列番号３〜配列番号１６）。図１は、配列番号２〜配列番号１６のアラインメントを示す。複数の配列の間で保存されているストレッチがいくつかある（配列番号１７〜配列番号９５）。３０個のＮ末端アミノ酸は１００％保存されており、これらには、天然のリポタンパク質のシグナルペプチド（ａａ１〜２３）とＮ末端システインが含まれる。
【０２４０】
いくつかの株は、ＡｃｆＤ遺伝子の中にフレームシフト変異を有しており、これによって、ポリペプチドの発現が起こらなかった。ａｃｆＤ遺伝子は、ＣＦＴ０７３株、ＥＤＬ９３３株、Ｓａｋａｉ株、およびＢ１７１株からは完全に失われていた。
【０２４１】
図２は、アミノ酸配列間での同一性の割合（％）を示す。標識は、株の名称を使用したＭＧ１６５５、ＲＳ２１８、ＤＨ１０Ｂ、ＡＰＥＣＯ１、およびＵＴＩ８９を除き、配列番号である。最も低い同一性のレベル（図２の中で四角で囲った）は、配列番号２と配列番号４（いずれもＥｘＰＥＣ株）との間での８５．９％であった。
【０２４２】
ＩＨＥ３０３４株由来のＡｃｆＤ配列をクローニングし、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主の中で、リーダーペプチドを持たない組み換え体Ｈｉｓタグ付きタンパク質として、プラスミドから発現させた。タンパク質を精製し、分析した。ゲル濾過は、アミノ酸配列だけに基づいて予想したよりもはるかに大きな分子量を示した。ＤＴＴの非存在下でのゲル分析は、ＤＴＴの存在下とは異なり、このタンパク質のより大きな分子量の形態を示す（図３）。したがって、このタンパク質はオリゴマーを形成するようである。
【０２４３】
ＡｃｆＤに対して惹起させた血清を、全細胞溶解物（図４（Ａ））または６０％のＴＣＡで沈殿させた培養上清（図４（Ｂ））に対するウェスタンブロットにおいて使用した。この血清は、病原性株および片利共生的株の両方に由来する溶解物中の約１５０ｋＤａのタンパク質を認識した。これらは、ＣＦＴ０７３由来の溶解物、またはＩＨＥ３０３４のＡｃｆＤノックアウト突然変異体由来の溶解物の中のこのバンドとは反応しなかった。上清中のタンパク質との反応性は、このタンパク質が分泌され得ることを示している。
【０２４４】
ＣＤ１マウス（５週齢）を、２０μｇの抗原およびフロイトのアジュバント（または以下に示す他のアジュバント）を使用して皮下に免疫化した。このマウスに、０日目、２１日目、および３５日目に接種した。３回目の接種の１４日後、マウスに、致死量（ＬＤ８０）の病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株を抗原投与した。血液を抗原投与後２４時間で尾から採血し、菌血症を評価した。致死率を、抗原投与後４日間モニターした。防御率は、（対照グループ（予防接種しなかった）の中での死亡率（％）−実験グループ（免疫化した）の中での死亡率（％））／対照グループの中での死亡率（％）×１００として計算され得る。
【０２４５】
タンパク質を完全に吸着させたアルミニウム塩アジュバントを使用したさらなる実験においては、対照グループにおいては０％が防御されたのに対して、７５％のマウスが防御された。いずれのグループにおいても、致死量の抗原投与の１日以内に起こった。
【０２４６】
さらなる実験では、組み換え体宿主を、発現の際に２種類のｐＯ２条件下で増殖させた。いずれの条件下でも、タンパク質は、異なる電荷を持つ２つのプールの中で見ることができた。４種類のタンパク質のプールの防御効率に有意な差は見られなかった。
【０２４７】
高い溶解度
予想外に、ＡｃｆＤタンパク質は、タンパク質が分泌型タンパク質であった場合にもなお、低い溶解度を示した。図５（Ｂ）に示すように、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域全体の、ＡｃｆＤのＮ末端の除去は、２５℃で発現させると、溶解度を有意に増大させた（ｐＫ１−３５２６−ＤＧ  図５（Ｂ）を参照のこと）。同様に、プロリンリッチ領域全体の、ＡｃｆＤのＮ末端の除去も、２５℃で発現させた場合には、溶解度を有意に増大させた。（ｐＫ１−３５２６−ＤＰ  図５（Ｂ）を参照のこと）。
【０２４８】
両方の断片が、全長のＡｃｆＤと実質的に同じ免疫原性を有していることを確認するために、これらの断片を精製した。精製した断片を、フロイトの完全なアジュバントでアジュバント化した、マウスでの３回の免疫化実験に使用した。免疫化したマウスに、その後、致死量のＥ．ｃｏｌｉを抗原投与した。ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域全体が除去されたＮ末端を持つＡｃｆＤでの免疫化は、マウスを死から１００％防御したが、免疫化しなかった対照グループにおいては、動物の９０％が死亡した。プロリンリッチ領域全体が除去されたＮ末端を持つＡｃｆＤでの免疫化によっては、マウスの９０％が死から防御されたが、免疫化しなかった対照グループにおいては、動物の９０％が死亡した。
【０２４９】
発現および精製
ＡｃｆＤのヒスタグ付き変異体を発現する３種類の構築物の１種類を持つ細菌を、３０ｍｌの培地の中で培養し、２５℃でＡｃｆＤ変異体を発現するように誘導した（リーダーペプチドを持たないＡｃｆＤ（３５２６）、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域全体が除去されたＮ末端を持つＡｃｆＤ（ΔＧ３５２６）、およびプロリンリッチ領域全体が除去されたＮ末端を持つＡｃｆＤ（ΔＧ３５２６））。細菌を回収し、そして超音波処理によって溶解させた。可溶性画分を単離し、そしてＩＭＡＣカラムにロードした。このカラムを２０ｍＭのイミダゾール緩衝液で３回洗浄した。ＡｃｆＤ変異体を、その後、５００ｍＭのイミダゾール緩衝液で３回洗浄して溶離させた。図６に示すように、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたはｇｌｙ−ｓｅｒ領域全体の、ＡｃｆＤのＮ末端の除去により、溶解度と精製されたタンパク質の収量が有意に増大した。得られた収量を、以下のようにＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって評価した：０．１８ｍｇの３５２６、および２．３４ｍｇのΔＧ３５２６。
【０２５０】
本発明は例として記載されているにすぎず、本発明の範囲および精神の範囲内に含まれるように改変が行われ得ることが理解されるであろう。
【０２５１】
【数１】
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【０２５２】
【数２】
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【０２５３】
【数３】
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【０２５４】
【数４】
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【０２５５】
【数５】
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【０２５６】
【数６】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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