(57)【要約】本発明は、肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)の保護ペプチドまたは保護ペプチドの機能的に活性な変種; 少なくとも二つの保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種を含む組成物; i) 第一のタイプの保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種、ii) 第二のタイプの保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種およびiii) 支持ペプチドまたは機能的に活性なその変種からなる群より選択される少なくとも二つのタンパク質を含む組成物; 保護ペプチドもしくは機能的に活性なその変種または組成物中に含まれる少なくとも二つのタンパク質をコードする一つまたは複数の核酸; 保護ペプチドもしくは機能的に活性なその変種、組成物または核酸を含む薬学的組成物; 保護ペプチドもしくは機能的に活性なその変種または組成物を用いて抗体を産生する方法; 対象の免疫または処置のための医薬の製造のための、保護ペプチドもしくは機能的に活性なその変種および/または組成物および/または核酸の使用; 保護ペプチドもしくは機能的に活性なその変種、組成物、または核酸に特異的なプライマーおよび/もしくはプローブを用いて肺炎連鎖球菌感染を診断する方法; 保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種に結合できるリガンドを同定するための方法; ならびに保護ペプチドの相互作用パートナーの単離および/または精製および/または同定のための保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列からなる保護ペプチドまたは保護ペプチドの機能的に活性な変種。
【請求項２】
a) 保護ペプチドの配列の少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む、保護ペプチドの機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換および/もしくは欠失によって保護ペプチドから得られ、保護ペプチドに対してもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対して、少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; かつ/または
c) 保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種と、さらに保護ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸とからなる、
請求項1記載の保護ペプチドの機能的に活性な変種。
【請求項３】
請求項1または2記載の保護ペプチドまたはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる保護タンパク質からなる群より選択される少なくとも二つのタンパク質を含む、組成物。
【請求項４】
i) 請求項1または2記載の保護ペプチドまたはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる保護タンパク質;
ii) SEQ ID NO:6もしくは7のアミノ酸配列からなるさらなる保護ペプチド、またはさらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなるさらなる保護タンパク質、ならびに
iii) SEQ ID NO:8の支持ペプチドまたは支持ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる支持タンパク質
からなる群より選択される少なくとも二つのタンパク質を含む、組成物であって、
少なくとも二つのタンパク質が、サブグループi)、ii)およびiii)の少なくとも二つから選択される、組成物。
【請求項５】
i) 請求項1または2記載の保護ペプチドまたはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる保護タンパク質;
ii) SEQ ID NO:6もしくは7のアミノ酸配列からなるさらなる保護ペプチド、またはさらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなるさらなる保護タンパク質、ならびに
iii) SEQ ID NO:8の支持ペプチドまたは支持ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる支持タンパク質
からなる群より選択される少なくとも三つのタンパク質を含む、組成物であって、
少なくとも三つのタンパク質がサブグループi)、ii)およびiii)の少なくとも二つから選択される、組成物。
【請求項６】
少なくとも一つのタンパク質がサブグループi)から選択され、かつ少なくとも二つのタンパク質がサブグループii)および/またはiii)から選択される、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも三つのタンパク質が三つのサブグループi)、ii)およびiii)から選択される、請求項5記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも二つのタンパク質の二つまたはそれ以上のタンパク質が一つの融合タンパク質へ組み合わされる、請求項3〜7のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびii)に定義の少なくとも一つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびiii)に定義の少なくとも一つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびii)に定義の少なくとも二つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびiii)に定義の少なくとも二つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびii)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびiii)に定義の少なくとも一つのタンパク質
を含む、請求項4〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質
を含む、請求項4〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
さらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種が、
a) さらなる保護ペプチドの配列の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む、さらなる保護ペプチドの機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/もしくは欠失によってさらなる保護ペプチドから得られ、かつさらなる保護ペプチドに対しもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; かつ/または
c) さらなる保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種と、さらなる保護ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸とからなる、
請求項4〜10のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
支持ペプチドの機能的に活性な変種が、
a) 支持ペプチドの配列の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む、支持ペプチドの機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/もしくは欠失によって支持ペプチドから得られ、かつ支持ペプチドに対しもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; かつ/または
c) 支持ペプチドもしくはその機能的に活性な変種と、支持ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸とからなる、
請求項4〜11のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
請求項1もしくは2記載の保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種、または請求項3〜12のいずれか一項記載の組成物中に含まれる一つもしくは複数の保護タンパク質のいずれかをコードする、一つまたは複数の核酸。
【請求項１４】
ベクターまたは肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)以外の細胞に位置する、請求項13記載の一つまたは複数の核酸。
【請求項１５】
請求項1もしくは2記載の少なくとも一つの保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種または請求項3〜12のいずれか一項記載の組成物と、任意で薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、薬学的組成物、特にワクチン。
【請求項１６】
(i) 請求項13もしくは14記載の一つもしくは複数の核酸またはそれに相補的な一つもしくは複数の核酸、および
(ii) 任意で薬学的に許容される担体または賦形剤
を含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
(a) 請求項1もしくは2記載の少なくとも一つの保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または請求項3〜12のいずれか一項記載の組成物の有効量を、動物に投与する段階、ならびに
(b) 段階(a)の投与に反応して動物により産生された抗体を動物から単離する段階
によって特徴付けられる、抗体を産生するための方法。
【請求項１８】
(a) 請求項1もしくは2記載の少なくとも一つの保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または請求項3〜12のいずれか一項記載の組成物の有効量と、B細胞を接触させる段階、
(b) 段階(a)のB細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を得る段階、ならびに
(c) 培養ハイブリドーマ細胞により産生された抗体を単離する段階
によって特徴付けられる、抗体を産生するための方法。
【請求項１９】
単離された抗体がさらに精製される、請求項17または18記載の方法。
【請求項２０】
好ましくは肺炎連鎖球菌に対する、より好ましくは肺炎連鎖球菌によって引き起こされた肺炎、菌血症、中耳炎、髄膜炎、副鼻腔炎、腹膜炎および/または関節炎に対する、対象の免疫または処置のための医薬の製造のための、請求項1もしくは2記載の保護ペプチドおよび/または請求項3〜12のいずれか一項記載の組成物および/または請求項13もしくは14記載の一つもしくは複数の核酸の使用。
【請求項２１】
(a) 対象から得られたサンプルを、請求項1もしくは2記載の保護ペプチドおよび/または請求項3〜12のいずれか一項記載の組成物と接触させる段階、ならびに
(b) サンプル中の保護ペプチド、機能的に活性な変種、および/または組成物に対する抗体の存在を検出する段階
を含む、肺炎連鎖球菌感染を診断する方法であって、
抗体の存在が肺炎連鎖球菌感染を示す、方法。
【請求項２２】
(a) 対象から得られたサンプルを、請求項13または14記載の一つまたは複数の核酸に特異的なプライマーおよび/またはプローブと接触させる段階、ならびに
(b) サンプル中の請求項13または14記載の一つまたは複数の核酸の存在を検出する段階
を含む、肺炎連鎖球菌の感染を診断するための方法であって、
一つまたは複数の核酸の存在が肺炎連鎖球菌感染を示す、方法。
【請求項２３】
(a) ペプチドおよび/または組成物を含む試験系を提供する段階、
(b) 試験系を試験化合物と接触させる段階、ならびに
(c) ペプチドおよび/または組成物との試験化合物の結合に応じて生じたシグナルを検出する段階
を含む、請求項1もしくは2記載の保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または請求項3〜12のいずれか一項記載の組成物に結合できるリガンドを同定するための方法。
【請求項２４】
ペプチドの相互作用パートナーの単離および/または精製および/または同定のための、請求項1もしくは2記載の保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または請求項3〜12のいずれか一項記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae(S. pneumoniae))の保護ペプチドまたは保護ペプチドの機能的に活性な変種; 少なくとも二つの保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種を含む組成物; i) 第一のタイプの保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種、ii) 第二のタイプの保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種、およびiii) 支持ペプチドまたは機能的に活性なその変種からなる群より選択される少なくとも二つのタンパク質を含む組成物; 保護ペプチドもしくは機能的に活性なその変種または組成物中に含まれる少なくとも二つのタンパク質をコードする、一つまたは複数の核酸; 保護ペプチドもしくは機能的に活性なその変種、組成物または核酸を含む薬学的組成物; 保護ペプチドもしくは機能的に活性なその変種または組成物を用いて抗体を産生する方法; 対象の免疫または処置のための医薬の製造のための、保護ペプチドもしくは機能的に活性なその変種および/または組成物および/または核酸の使用; 保護ペプチドもしくは機能的に活性なその変種、組成物、または核酸に特異的なプライマーおよび/もしくはプローブを用いて肺炎連鎖球菌感染を診断する方法; 保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種に結合できるリガンドを同定する方法; ならびに保護ペプチドの相互作用パートナーの単離および/または精製および/または同定のための保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎連鎖球菌(肺炎球菌(Pneumococcus))は、槍状の、グラム陽性の、通性嫌気性細菌である。それはヒトおよび実験動物に対して病原性の唯一の被包性生物である。被膜は抗原性であり、血清型により肺炎球菌を分類するための基礎となる。90種の血清型が、型特異的抗血清によるその反応に基づいて同定されている。肺炎連鎖球菌のゲノムにはおよそ2.16 Mbが含まれる。それは39.7%の平均GC含量を有する。肺炎連鎖球菌は厳密にヒト病原体である。TIGR4と名付けられている(本出願においてTIGR4_Tettelinといわれる)肺炎連鎖球菌の莢膜血清型4分離株の完全なゲノム配列が、ランダムショットガン配列決定戦略によって決定された(GenBankアクセッション番号AE005672)。この臨床分離株はノルウェーのコングスビンゲル在住の30歳男性患者の血液から採取されたものであり、マウスの感染モデルにおいて侵襲性かつ病毒性が高い。
【０００３】
ほとんどの肺炎連鎖球菌の血清型は重篤な疾患を引き起こすことが示されており、10種の最も一般的な血清型は世界中の侵襲性疾患の約62%の原因であると評価されている。順位および血清型有病率は年齢群および地理的領域によって異なる。
【０００４】
肺炎球菌は気道でよく見られる生息菌であり、健常な成人の5%〜70%の上咽頭から単離することができる。無症候性保菌者の率は、年齢、環境、および上気道炎の存在によって異なる。子供のない成人では5%〜10%のみが保菌者である。学校および児童養護施設においては、学生および住人の27%〜58%が保菌者でありうる。軍事施設では、人員の50%〜60%もが保菌者でありうる。保菌期間はさまざまであるが、一般に成人よりも子供の方が長い(Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases、7th Edition-Second Printing、The Pink Bookに概説されている)。
【０００５】
保菌と自然免疫の発達との関係および保菌者において疾患を発生させる免疫学的機構はよく分かっていない。
【０００６】
肺炎連鎖球菌は高齢者および基礎疾患を有する者においてはヒト疾患の重要な病原体である。肺炎球菌疾患は、その他のワクチンで予防できる疾患の全てを合わせたよりも多くの人の命を奪っており、米国では毎年40,000人以上の命を奪っている。肺炎球菌疾患の主な臨床症候群には、肺炎、菌血症、および髄膜炎が含まれる。疾患は、素因となる異常、特に肺疾患が存在する場合に起こることが最も多い。それは、インフルエンザおよび麻疹のような先行ウイルス気道感染、ならびに慢性閉塞性肺疾患、糖尿病、うっ血性心不全、腎不全、喫煙およびアルコール依存症のような慢性症状でよく見られる細菌性合併症である。肺炎球菌感染症は、呼吸器疾患が流行している冬の間および春先にいっそう多く見られる。免疫不全(脾臓機能不全、医原性など)が致死的な肺炎球菌感染症の発達の危険因子である。というのは、細菌の排除力が低下し、抗体が欠損するからである。潜伏期間は短く、1〜3日間である。症状には、突然の発熱および悪寒戦慄または硬直、喀痰を伴う咳、胸膜炎性胸痛、呼吸困難、頻脈および低酸素症が含まれる。
【０００７】
肺炎連鎖球菌は、米国における菌血症感染の88%の原因である。肺炎は最も一般的な形態の侵襲性肺炎球菌疾患であり、1年に150,000〜570,000の症例(米国)がある。成人市中肺炎の36%および院内肺炎の50%が肺炎連鎖球菌によって引き起こされている(米国)。年齢65歳およびそれ以上の成人の発病率は、約60/100,000症例であると報告されている。この疾患の症例致死率は、年齢2歳またはそれ以下の者では1.4%であるが、年齢80歳またはそれ以上の者では20.6%にまで上昇する。インフルエンザおよび肺炎球菌によって引き起こされる疾患はともに、年齢65歳およびそれ以上の者では死因の第5位である。これら病原体に起因する死亡率はこの年齢群では90%を超える。菌血症は、肺炎を有する患者の約25〜30%において起こる。菌血症の全死亡率は約20%であるが、老人においては60%にもなりうる。1998年には、全死因の51%が、65歳超の年齢群に起こった侵襲性肺炎球菌疾患によるものであった。肺炎球菌は米国における細菌性髄膜炎の全症例の13%〜19%を引き起こしている。肺炎球菌髄膜炎の症例は、毎年3,000〜6,000起こると評価される。肺炎球菌髄膜炎を有する患者の4分の1が肺炎も患っている。臨床症状、髄液プロファイルおよび神経学的合併症は、化膿性細菌性髄膜炎の別の形態に類似している(Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases, 7th Edition-Second Printing, The Pink Bookに概説されている)。
【０００８】
小児においては、肺炎球菌は急性中耳炎の一般的な原因であり、中耳吸引液の28%〜55%において検出される。12ヶ月齢までに、小児の62%が急性中耳炎の少なくとも1回の発症を経験する。中耳感染症は米国において小児科受診で最も多い理由であり、毎年2000万件を超える受診がある。肺炎球菌中耳炎の合併症には、乳様突起炎および髄膜炎が含まれうる。公知の感染部位のない菌血症は年齢2歳未満の小児の中で最も一般的な侵襲性の臨床所見であり、この年齢群における侵襲性疾患のおよそ70%を占める。菌血症肺炎は年齢2歳未満の小児の中で侵襲性肺炎球菌疾患の12%〜16%を占める。侵襲性Hib疾患の減少と共に、肺炎連鎖球菌は米国における年齢5歳未満の小児の中で細菌性髄膜炎の主因になった。1歳未満の小児は肺炎球菌髄膜炎の率が最も高く、100,000人につきおよそ10症例である。年齢5歳未満の小児の中で肺炎球菌疾患による負担はかなりのものである。毎年17,000症例の侵襲性疾患が起きていると推定されており、そのうち13,000症例が公知の感染部位のない菌血症であり、約700症例が髄膜炎である。侵襲性肺炎球菌疾患の結果、毎年200人の小児が死亡していると推定されている。急性中耳炎は侵襲性疾患とは考えられていないものの、毎年500万の症例が年齢5歳未満の小児に起きていると推定されている(Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases, 7th Edition-Second Printing, The Pink Bookに概説されている)。
【０００９】
肺炎連鎖球菌による感染の確定診断は、血液または他の通常は無菌の身体部位からのその生物の単離に一般的に依存する。体液中の莢膜多糖類抗原を検出する試験も利用可能である。
【００１０】
ペニシリンは処置のための選択薬である。しかし、抗感染療法の実現の成功は広範な抗菌薬耐性のためにますます難しくなっている。ペニシリンに対する耐性が高まっており、最近の報告によれば米国ではおよそ25%に達する(Whitney, C., et al. (2000), N Engl J Med 343: 1917-24)。マクロライド耐性株の割合はおよそ20%に達した(Hyde, T., et al. (2001), JAMA 286: 1857-62)。抗菌薬の使用は、β-ラクタムおよびマクロライドに対する肺炎連鎖球菌の耐性の上昇と大いに関係している(McCormick, A., et al. (2003), Nat Med 9: 424-30)。
【００１１】
しかし、有効な抗生物質治療(感受性株)を用いてさえも、侵襲性疾患の症例致死率は先進国世界において平均10%と高く、老齢患者ではおよび菌血症または髄膜炎の場合には、ある種の血清型ではるかに高く(最大80%までに)なりうる。
【００１２】
このように、肺炎球菌感染症を予防または改善するために有効な処置の必要性が依然として存在する。ワクチンは連鎖球菌による感染症を予防できるだけでなく、宿主組織への(特に鼻咽頭中の)定着をより特異的に予防または改善し、それによって、上気道炎および他の化膿性感染症、例えば中耳炎の発生率を低下させることもできる。侵襲性疾患 - 肺炎、菌血症および髄膜炎、ならびに敗血症の排除は、急性感染の発生率および生物の保菌を直接の結果として減少させるであろう。ヒト感染症を引き起こす肺炎連鎖球菌株の大多数に対して交差保護を示すことができるワクチンはまた、その他全ての連鎖球菌種、すなわち群A、B、CおよびGによって引き起こされる感染症を予防または改善するのに有用であろう。
【００１３】
ワクチンはいろいろな種類の異なる抗原を含みうる。抗原の例は全死滅生物または弱毒化生物、これらの生物/組織の細画分、タンパク質、またはその最も単純な形態では、ペプチドである。抗原はグリコシル化タンパク質またはペプチドの形態で免疫系によって認識されることもあり、多糖類または脂質であってもまたはそれらを含んでもよい。短いペプチドを使用することができる。というのは例えば、細胞障害性T細胞(CTL)は主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)とともに短い、通常は8〜11アミノ酸長のペプチドの形態で抗原を認識するからである。B細胞は4〜5アミノ酸ほどの短い直鎖状エピトープ、および三次元構造(高次構造エピトープ)を認識することができる。ある状況下においては、抗原特異的な免疫応答を持続するためにアジュバントが有用でありうる。主として、アジュバントはその作用機序に限定されず、いわゆる抗原提示細胞(APC)に作用する。これらの細胞は通常まず抗原に遭遇し、次いで処理抗原または未修飾抗原を免疫エフェクター細胞に提示する。中間細胞タイプも関与しうる。適切な特異性を有するエフェクター細胞のみが生産的免疫応答において活性化される。アジュバントは、抗原および共注入された他の因子を局所的に保持することもできる。さらに、アジュバントは他の免疫細胞に対する化学誘引物質として作用することもでき、または免疫系の刺激剤として局所的におよび/もしくは全身的に作用することもできる。
【００１４】
有効な肺炎球菌ワクチンを開発する努力は早くも1911年に始まった。しかし、1940年代におけるペニシリンの出現によって、抗生物質での処置にもかかわらず多くの患者が依然として死亡していることが認められるまでは、ワクチンに関する興味は低下した。60年代後半から、多価ワクチンを開発するために再び努力が行われた。最初の肺炎球菌ワクチンは、異なる14種類の肺炎球菌細菌からの精製された莢膜多糖類抗原を含むものであった。1983年には、23価の多糖類ワクチン(PPV23)が認可され、14価のワクチンに取って代わった。このため14価のワクチンはもう生産されていない。PPV23は、88%の菌血症肺炎球菌疾患を引き起こす23種類の肺炎球菌細菌由来の多糖類抗原を含む。さらに、交差反応性が、菌血症疾患のさらに8%の原因となるいくつかの莢膜型に対して起こる。米国においては2種の多糖類ワクチンが利用可能である(Pneumovax 23, MerckおよびPnu-Immune 23, Wyeth-Lederle)。どちらのワクチンも接種1回につき各抗原25μgを含み、フェノールまたはチメロサールのいずれかを保存料として含む。
【００１５】
最初の肺炎球菌結合体ワクチン(PCV7, プレべナー(Prevnar))は米国において2000年に認可された。それはCRM197として公知のジフテリア毒素の非毒性変種と結合させた肺炎連鎖球菌の7種の血清型(4、9V、14、19F、23F、18Cおよび6B)の精製莢膜多糖類を含む。プレべナーに含まれる血清型は、1978〜1994年に米国では年齢6歳未満の小児で菌血症の86%、髄膜炎の83%および急性中耳炎の65%を占めていた(Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases, 7th Edition-Second Printing, The Pink Bookに概説されている)。肺炎連鎖球菌の9種および11種の血清型を含むさらなる肺炎球菌多糖類結合体ワクチンが開発されている。ワクチンは筋肉内に投与される。プレべナーワクチンの4回接種の後に、実質的に全ての健常乳児で、ワクチンに含まれる全7種の血清型に対する抗体が生じる。プレべナーは鎌状赤血球病およびHIV感染症を有する者を含め、乳児および小児において免疫原性であることも示されている。大規模な臨床試験で、プレべナーはワクチン血清型によって引き起こされる侵襲性疾患を低減し、ワクチンに含まれない血清型を含め、全ての血清型によって引き起こされる侵襲性疾患を低減することが示された。プレべナーを受けた小児では、ワクチン接種が施されていない小児よりも急性中耳炎の発症が少なく、中耳腔換気用チューブの留置が少なかった。プレべナー接種後の保護の持続期間は現在不明である。プレべナーによる免疫化は、ワクチン血清型の鼻咽頭保菌率を低下させるが、全保菌率は影響を受けない。残念なことに、血清型再分布、すなわちプレべナーによって網羅されない菌株によるワクチン血清型の置換を誘導することも示されている(Pelton, S., et al. (2003), Vaccine 21: 1562-71)。
【００１６】
肺炎球菌ワクチンは、(i) 定期的な小児期免疫化スケジュールの一部として全小児、(ii) 年齢65歳およびそれ以上の成人、ならびに(iii) 心血管疾患、肺疾患、糖尿病、アルコール依存症、肝硬変、または脳脊髄液漏出を含めて、慢性疾患を有する正常免疫系の年齢2歳超の者に定期的に投与されるよう推奨されている。高齢者人口では、肺炎球菌ワクチンおよびインフルエンザワクチンに対する標的群は重複する。これらのワクチンは、副作用を増大させないで異なる部位に同時に与えることができる。
【００１７】
有効な抗生物質処置によってさえも危険性の高い個体(基礎疾患、主にウイルス気道感染を有する、免疫不全の個体)では高い死亡率が認められている。mAb法では重篤な疾患を有する患者を標的とし、細菌の排除のために即時の免疫増強をもたらす。オプソニン作用を通じて、細菌は食細胞内で殺処理され、抗生物質によっては血中で溶解されない。この作用機構は、敗血症患者の臨床症状を悪化させる毒素(肺炎球菌溶血素および他の細胞毒素のような)の放出をなくすのに役立ちうる。モノクローナル抗体産生の技術における最近の進展は、血清療法に関連する毒性を回避しながらも、ヒト抗体医薬の作製および抗体療法の再導入のための手段をもたらしている。免疫グロブリンは、新興感染症を予防および処置するために使用できる極めて用途の広い抗微生物タンパク質のクラスである。抗体療法は、(Burnie, J., et al. (1998), J Antimicrob Chemother 41: 319-22)に概説されている種々の多様な微生物に対して有効であった。
【００１８】
莢膜特異的な抗体は高度に保護的であることが示されているが、これらの血清型特異的な抗体のどの濃度が疾患を防ぐかは不明なままであり、最近になって、これらの抗体の濃度よりもオプソニン活性および結合活性がより重要な保護決定因子であることが明らかになった。
【００１９】
タンパク質結合体ワクチンは、疑いなく肺炎球菌疾患に対する戦いにおいてアマルマトリウム(amarmatorium)に追加される強力な新兵器であるが、ワクチンは限られた数の肺炎球菌血清型しか含まず、適当な生態学的圧力を与えられると、非ワクチン血清型による置換疾患が現実的な脅威として残り、疾患の負荷が非常に高い領域では特にそれが残る。
【００２０】
ここ10年間にいくつかの肺炎球菌タンパク質の免疫原性および保護能力が動物モデルにおいて報告されており、現在では種共通のタンパク質に基づくワクチンの開発が求められている。そのようなタンパク質は肺炎球菌表面タンパク質A (PspA, McDaniel, L., et al. (1991), Infect Immun 59: 222-8; Roche, H., et al. (2003), Infect Immun 71: 1033-41)、肺炎球菌表面アドヘシンA (PsaA, Talkington, D., et al. (1996), Microb Pathog 21: 17-22)、コリン結合タンパク質A (CbpA, Rosenow, C., et al. (1997); Mol Microbiol 25: 819-29)、LytBグルコサミニダーゼ、LytCムラミダーゼ、PrtAセリンプロテアーゼ、PhtA (ヒスチジントリアッドA)および肺炎球菌ワクチン抗原A (PvaA) (Wizemann, T., et al. (2001); Infect Immun 69: 1593-8; Adamou, J., et al. (2001); Infect Immun 69: 949-58)である。
【００２１】
グラム陽性生物の表面に提示されるある種のタンパク質または酵素は、病原性にかなり寄与しており、これらの病原体によって引き起こされる疾患過程に関与している可能性がある。多くの場合、これらのタンパク質は、宿主組織との直接的な相互作用に関与しており、または宿主防御機構からの細菌表面の保護に関与している(Navarre, W., et al. (1999); Microbiol Mol Biol Rev 63: 174-229)。肺炎連鎖球菌はこの点で例外ではない。いくつかの表面タンパク質がJedrzejas, M. (2001); Microbiol Mol Biol Rev 65: 187-207に概説されているように肺炎球菌病原性に重要な、病毒性因子として特徴付けられている。これらのタンパク質に対する抗体がより良好な保護をヒトに付与するなら、それらはより伝統的な莢膜多糖類ワクチンとともに用いられる、またはそれに代わって用いられる、タンパク質に基づく新規肺炎球菌ワクチンの供給源となりうる。潜在的ワクチンに向けた抗原としての上記タンパク質の一部の、およびDi Guilmi, A., et al. (2002); EMBO Rep 3: 728-34に概説されているいくつかのさらなる候補の使用は、同定の容易性または入手の機会に基づいた選択によって主に得られたものである。肺炎連鎖球菌に関連性のある抗原をさらに包括的なやり方で同定するという要求を満たすために、特定の病原体由来の、特に黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)および表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)由来の過免疫血清反応抗原の同定、単離および産生のための方法(WO 02/059148)が開発された。さらに、反応抗原および肺炎連鎖球菌の反応抗原の同定のための方法も提供されている(WO 04/092209)。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の根底にある問題は、肺炎連鎖球菌感染に対するワクチンなどの医薬の開発のための代替手段を提供することであった。より詳しくは、問題は、その医薬の製造に使用できる肺炎連鎖球菌由来の、代替的な保護ペプチドまたはその組み合わせ、とりわけより有効なタンパク質またはその組み合わせを提供することであった。
【００２３】
驚いたことに、その目的は、
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4および/またはSEQ ID NO:5; ならびに
- 任意でSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7および/またはSEQ ID NO:8
のアミノ酸配列からなる一つまたは複数のペプチドによって解決された。
【００２４】
しかしながら、これらの配列の機能的に活性な変種を本発明との関連で用いることもできる。
【００２５】
それゆえ、本発明の第一の主題は、SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列からなる保護ペプチドまたは保護ペプチドの機能的に活性な変種である。これらのペプチド(SEQ ID NO:1、2、3、4または5のアミノ酸配列の保護ペプチドおよびその機能的に活性な変種)は、サブグループi)の抗原ペプチドといわれる。
【００２６】
SEQ ID NO:1、2、3、4または5のアミノ酸配列からなる保護ペプチドは、肺炎連鎖球菌株TIGR4_Tettelin (Tettelin et al. (2001), Science 293: 498-506)に由来し、それぞれ、SP0498、SP0609、SP0749、SP2027およびSP2194で示されている。SEQ ID NO:1、2、3、4および5のアミノ酸配列からなる保護ペプチドが由来する完全長タンパク質のアミノ酸およびDNA配列は、WO 04/092209に開示されている。
【００２７】
SEQ ID NO:1、2、3、4および5のアミノ酸配列は、実施例および添付の配列表に開示されている。SEQ ID NO:1、2、3、4および5のペプチドは、敗血症および/または肺炎モデルにおいて肺炎連鎖球菌に対する保護免疫応答を誘導することが示された(実施例および図面を参照のこと)。
【００２８】
機能的に活性な変種は、下記に定義の保護ペプチドの配列を変化させることによって得ることが可能であり、例えば敗血症および/または肺炎モデルにおいて、肺炎連鎖球菌に対する保護免疫応答を誘導するおよび/または保護を示す能力を含め、変種が由来するSEQ ID NO:1、2、3、4または5の配列の保護ペプチドによって示されるものと類似の生物学的活性を有することによって特徴付けられ、いずれの変種も実施例に記載される試験のいずれかで試験することができる。
【００２９】
保護ペプチドの機能的に活性な変種は、保護ペプチド中の配列変化によって得ることが可能であり、この配列変化を有するペプチドは、未変化の保護ペプチドの機能を保持している、例えば、未変化の保護ペプチド(上記参照)によって示されるものと類似の生物学的活性を有する。そのような配列変化は(同類)アミノ酸置換、欠失、突然変異および挿入を含むことができるが、これらに限定されることはない。
【００３０】
本発明の好ましい態様において、SEQ ID NO:1、2、3、4または5のアミノ酸配列からなる保護ペプチドの機能的に活性な変種は、
a) 保護ペプチドの機能的に活性な断片であって、保護ペプチドの配列の少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換および/もしくは欠失によって保護ペプチドから得られ、この機能的に活性な変種は保護ペプチドに対しもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; ならびに/または
c) 保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種、好ましくはa)および/もしくはb)の変種、ならびにさらに保護ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸からなる。
【００３１】
本発明の機能的に活性な変種は、例えば敗血症および/または肺炎モデルにおいて、肺炎連鎖球菌に対する保護免疫応答を誘導するおよび/または保護を示す能力を含め、保護ペプチドによって示されるものと類似の生物学的活性を有することにより特徴付けられる。保護ペプチドの変種は、変種の活性が、配列変化なしの保護ペプチドの活性の少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも80%、特に少なくとも90%、とりわけ少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%に達するなら、本発明との関連で機能的に活性である。変種の活性は、実施例に記載されるように決定されまたは測定され、次いで、SEQ ID NO:1、2、3、4または5のアミノ酸配列の保護ペプチドに対して得られた活性と比較されることができる。
【００３２】
保護ペプチドの機能的に活性な断片はSEQ ID NO:1、2、3、4または5の保護ペプチドから、保護ペプチドの配列の少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%または99%を含むペプチドをもたらす一つまたは複数のアミノ酸欠失によって得られることにより特徴付けられる。配列同一性は下記のように決定することができる。アミノ酸欠失はC末端に、N末端におよび/または内部にあってもよい。好ましくは断片は1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個、より好ましくは1、2、3、4または5個、さらにより好ましくは1、2または3個、さらにより好ましくは1または2個、最も好ましくは1個のアミノ酸欠失によって得られる。
【００３３】
あるいはまたさらには、変種は保護ペプチドから、少なくとも一つのアミノ酸置換および/または欠失によって得ることが可能であり、この機能的に活性な変種は保護ペプチドに対しまたはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%または99%の配列同一性を有する。配列同一性は下記のように決定することができる。アミノ酸置換および/または欠失はC末端に、N末端に、および/または内部にあってもよい。好ましくは、機能的に活性な変種は保護ペプチドまたは断片、好ましくは保護ペプチドから、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個、より好ましくは1、2、3、4または5個、さらにより好ましくは1、2または3個、さらにより好ましくは1または2個、最も好ましくは1個のアミノ酸置換および/または欠失によって得られる。
【００３４】
さらに、変種は保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種、好ましくはa)および/またはb)の変種、ならびにマーカータンパク質など、保護ペプチドまたはその変種に対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸残基からなることができる。「異種アミノ酸」または「保護ペプチドもしくはその変種に対して異種性のアミノ酸」という特徴は、肺炎連鎖球菌の任意の天然タンパク質において保護タンパク質に隣接して位置するそのアミノ酸とは異なる、詳しくは肺炎連鎖球菌株TIGR4_Tettelinのアミノ酸とは異なる、特に上記に言及した配列とは異なる任意のアミノ酸をいう。それゆえ、少なくとも一つの異種アミノ酸を包含する本発明のタンパク質は、肺炎連鎖球菌の任意の天然タンパク質とは異なる、詳しくは肺炎連鎖球菌株TIGR4_Tettelinのものとは異なるタンパク質をいう。一つまたは複数のさらなるアミノ酸は、保護ペプチドまたはその変種に対してC末端に、N末端に、またはC末端とN末端にあってもよい。
【００３５】
以下の詳細は、サブグループi)の保護ペプチド、下記に定義のさらなる保護ペプチドのほかに下記に定義の支持ペプチドおよびこれらの変種もいうよう意図される。
【００３６】
上記に定義の置換されたまたは付加的な配列またはアミノ酸残基は、任意のアミノ酸残基であってよい、天然のおよびそれ以外の、L-アミノ酸および/またはD-アミノ酸のいずれかであってよいアミノ酸残基からなる。好ましくは、アミノ酸はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンなどの任意の天然アミノ酸である。
【００３７】
しかしながら、アミノ酸残基は修飾アミノ酸または異常アミノ酸であってもよい。それらの例は2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-ジアミノ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ-ヒドロキシリジン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、6-N-メチルリジン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシンまたはオルニチンである。さらに、アミノ酸は翻訳後修飾などの修飾に供されてもよい。修飾の例としてはアセチル化、アミド化、遮断、ホルミル化、γ-カルボキシグルタミン酸ヒドロキシル化、グリコシル化、メチル化、リン酸化および硫酸化が挙げられる。二つ以上の置換されたまたは付加的な異種アミノ酸残基がペプチドに存在するなら、アミノ酸残基は互いに同じでもまたは異なってもよい。
【００３８】
本発明の一つの好ましい態様において、本発明のペプチドの機能的に活性な変種は、サブグループi)の保護ペプチド、下記に定義のさらなる保護ペプチドまたは下記に定義の支持ペプチドと本質的に同一であるが、肺炎連鎖球菌の異なる血清型の相同配列に由来するという点で、それぞれ、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7または8のペプチドと異なる。上記に詳述のように、肺炎球菌の90超の異なる血清型がこれまでに同定されている。したがって、これらの血清型のいずれも機能的に活性な変種の基礎でありうる。しかしながら、菌株はR6、TIGR4_TettelinまたはTIGR4 ICであることが好ましい。血清型は、好ましくは1、2、3、4、5、6 (特に6Aもしくは6B)、7 (特に7F)、8、9 (特に9Nもしくは9V)、10 (特に10A)、11 (特に11A)、12 (特に12F)、14、15 (特に15B)、17 (特に17F)、18 (特に18C)、19 (特に19Aもしくは19F)、20、22 (特に22F)、23 (特に23F)または33 (特に33F)である。好ましい態様において、血清型は4、6B、14、19Aおよび19Fまたは23Fである。
【００３９】
肺炎連鎖球菌の他の菌株または血清型に由来するSEQ ID NO:1、2、3、4および5のペプチドの変種の例は、表2、表4〜8および表9に、ならびに配列表に示されている。
【００４０】
肺炎連鎖球菌の他の菌株または血清型に由来するSEQ ID NO:6のペプチドの変種の例は、配列表中のSEQ ID NO:206〜218に示されている。
【００４１】
肺炎連鎖球菌の他の菌株または血清型に由来するSEQ ID NO:7のペプチドの変種の例は、配列表中のSEQ ID NO:219〜317に示されている。
【００４２】
肺炎連鎖球菌の他の菌株または血清型に由来するSEQ ID NO:8のペプチドの変種の例は、配列表中のSEQ ID NO:318〜331に示されている。
【００４３】
異なる血清型および/または異なる肺炎連鎖球菌株の相同配列のさらなる例は、下記に詳述されており、添付の配列データにも開示されている。
【００４４】
表9にいくつかの異なる肺炎連鎖球菌株およびその血清型が記載されている。それらの菌株の大部分から、5つの完全長タンパク質SP0498、SP0609、SP0749、SP2027およびSP2194の一つまたは複数が配列決定された; 「n.d.」は、配列が決定されなかった場合を示す。
【００４５】
表9に記載されている各菌株由来のSP0498の完全長アミノ酸配列がDNA配列決定によって確認されており、TIGR4_Tettelin由来のSP0498の完全長アミノ酸配列と同一であるなら、これは表9の第二列中に「IDENT.」と表示されている。各菌株由来のSP0498の完全長アミノ酸配列が、TIGR4_Telletin由来のSP0498の完全長アミノ酸配列とは異なる、すなわち、少なくとも一つのアミノ酸置換、挿入または欠失を有するなら、該菌株の完全長SP0498の各配列番号(配列表に記載の)が表9の第二列中に示されている。したがって、TIGR4_Tettelinと比べて少なくとも一つのアミノ酸の相違を有する菌株由来のSP0498の完全長アミノ酸配列は、SEQ ID NO:45〜93として示されている。
【００４６】
表9に記載されている各菌株由来のSP0609の完全長アミノ酸配列がDNA配列決定によって確認されており、TIGR4_Tettelin由来のSP0609の完全長アミノ酸配列と同一であるなら、これは表9の第三列中に「IDENT.」と表示されている。各菌株由来のSP0609の完全長アミノ酸配列が、TIGR4_Tettelin由来のSP0609の完全長アミノ酸配列とは異なる、すなわち、少なくとも一つのアミノ酸置換、挿入または欠失を有するなら、該菌株の完全長SP0609の各配列番号(配列表に記載の)が表9の第三列中に示されている。したがって、TIGR4_Tettelinと比べて少なくとも一つのアミノ酸の相違を有する菌株由来のSP0609の完全長アミノ酸配列は、SEQ ID NO:94〜136として示されている。
【００４７】
表9に記載されている各菌株由来のSP0749の完全長アミノ酸配列がDNA配列決定によって確認されており、TIGR4_Tettelin由来のSP0749の完全長アミノ酸配列と同一であるなら、これは表9の第四列中に「IDENT.」と表示されている。各菌株由来のSP0749の完全長アミノ酸配列が、TIGR4_Tettelin由来のSP0749の完全長アミノ酸配列とは異なる、すなわち、少なくとも一つのアミノ酸置換、挿入または欠失を有するなら、該菌株の完全長SP0749の各配列番号(配列表に記載の)が表9の第四列中に示されている。したがって、TIGR4_Tettelinと比べて少なくとも一つのアミノ酸の相違を有する菌株由来のSP0749の完全長アミノ酸配列は、SEQ ID NO:137〜172として示されている。
【００４８】
表9に記載されている各菌株由来のSP2027の完全長アミノ酸配列がDNA配列決定によって確認されており、TIGR4_Tettelin由来のSP2027の完全長アミノ酸配列と同一であるなら、これは表9の第五列中に「IDENT.」と表示されている。各菌株由来のSP2027の完全長アミノ酸配列が、TIGR4_Tettelin由来のSP2027の完全長アミノ酸配列とは異なる、すなわち、少なくとも一つのアミノ酸置換、挿入または欠失を有するなら、該菌株の完全長SP2027の各配列番号(配列表に記載の)が表9の第五列中に示されている。したがって、TIGR4_Tettelinと比べて少なくとも一つのアミノ酸の相違を有する菌株由来のSP2027の完全長アミノ酸配列は、SEQ ID NO:173〜186として示されている。
【００４９】
表9に記載されている各菌株由来のSP2194の完全長アミノ酸配列がDNA配列決定によって確認されており、TIGR4_Tettelin由来のSP2194の完全長アミノ酸配列と同一であるなら、これは表9の第六列中に「IDENT.」と表示されている。各菌株由来のSP2194の完全長アミノ酸配列が、TIGR4_Tettelin由来のSP2194の完全長アミノ酸配列とは異なる、すなわち、少なくとも一つのアミノ酸置換、挿入または欠失を有するなら、該菌株の完全長SP2194の各配列番号(配列表に記載の)が表9の第六列中に示されている。したがって、TIGR4_Tettelinと比べて少なくとも一つのアミノ酸の相違を有する菌株由来のSP2194の完全長アミノ酸配列は、SEQ ID NO:187〜205として示されている。
【００５０】
異なる肺炎連鎖球菌株由来のゲノム配列は、以下の情報源から得ることができる。
a) 肺炎連鎖球菌TIGR4 (Tettelin et al. (2001), Science 293: 498-506に記載されているように、TIGR4_Tettelinともいわれる)
(GenBankアクセッション番号: AE005672; 注釈: 完全)
http://cmr.tigr.org/tigr-scripts/CMR/GenomePage.cgi?org=bsp
b) 肺炎連鎖球菌R6
(GenBankアクセッション番号: AE007317; 注釈: 完全)
http://cmr.tigr.org/tigr-scripts/CMR/GenomePage.cgi?org=ntsp02
c) 肺炎連鎖球菌血清型2 菌株D39
(GenBankアクセッション番号: CP000410; 注釈: 完全)
d) 肺炎連鎖球菌G54
(GenBankアクセッション番号: -; 注釈: 不完全)
http://cmr.tigr.org/tigr-scripts/CMR/GenomePage.cgi?org=ntsp05
【００５１】
「機能的に活性な変種」という用語は、天然に存在する対立遺伝子多型、および変異体またはその他任意の天然に存在しない変種を含む。当技術分野において公知であるように、対立遺伝子多型は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない一つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するものと特徴付けられる(ポリ)ペプチドの別形態である。「生物学的機能」とは、ペプチドが天然に存在する細胞におけるペプチドの機能を、たとえその機能が細胞の増殖または生存に必要でなくとも、意味する。例えば、ポリンの生物学的機能は、細胞外培地中に存在する化合物の細胞への移行を可能にすることである。生物学的機能は抗原機能とは異なる。ポリペプチドは二つ以上の生物学的機能を持ちうる。
【００５２】
したがって、本発明は同様に、異なる肺炎連鎖球菌分離株の、任意で下記に定義の一つもしくは複数のさらなる保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種との組み合わせでの、および/または任意で下記に定義の一つもしくは複数の支持ペプチドもしくはその機能的に活性な変種との組み合わせでの、抗原ペプチド、すなわち保護ペプチドおよびその機能的に活性な変種に関する。そのようなホモログは、本明細書において開示される核酸およびアミノ酸配列に基づき容易に同定および単離することができる。異なる血清型の相同保護ペプチド、さらなる保護ペプチドまたは支持ペプチドは、例えば、配列アライメントによって同定してもよい。相同配列は、一つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および/または付加によって、それぞれ、SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、または8の配列の、サブグループi)の保護ペプチド、下記に定義のさらなる保護ペプチド、または下記に定義の支持ペプチドと異なってもよい。
【００５３】
配列同一性の割合は、例えば、配列アライメントによって判定することができる。比較のための配列のアライメントの方法は当技術分野において公知である。さまざまなプログラムおよびアライメントアルゴリズムは、例えば、Smith and Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2: 482またはPearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444-48に記載されている。
【００５４】
NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215 : 403-10)は、配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxとの関連で用いる場合、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI, Bethesda, MD)を含め、いくつかの情報源からおよびインターネット上で利用可能である。例えばSEQ ID NO:1〜8の配列のいずれかの保護ペプチド、さらなる保護ペプチドまたは支持ペプチドの変種は、通常、デフォルトパラメータに設定されたNCBI Blast 2.0, gapped blastpを用いて特徴付けられる。例えば少なくとも35アミノ酸のアミノ酸配列の比較の場合、デフォルトパラメータ(ギャップ存在コストが11、および残基当たりのギャップコストが1)に設定された、デフォルトのBLOSUM62マトリックスを用いて、Blast 2配列機能を利用することができる。
【００５５】
好ましい態様において、上記に定義のペプチドからアミノ酸交換、欠失または挿入によって得られる機能的に活性な変種は同様に、活性(上記に定義の)を維持する、またはより好ましくは改善することができる。さらに、これらのペプチドは同様に、同一のまたは好ましくは一層のT細胞応答を誘発するエピトープを網羅することができる。これらのエピトープは「ヘテロクリティック」といわれる。それらはMHC/HLA分子に対して類似のまたは好ましくは高い親和性を有し、および元のエピトープに向けられるT細胞受容体(TCR)を類似のまたは好ましくはいっそう強い形で刺激する能力を有する。ヘテロクリティックエピトープは合理的デザインにより、すなわち例えば(Rammensee, H. et al. (1999), Immunogenetics. 50: 213-19)によって記載されているように個々の残基のMHC/HLAとの結合への寄与を、潜在的にTCRと相互作用する残基の系統的交換と組み合わせて考慮し、得られた配列を元のエピトープに対するT細胞を用いて試験することにより得ることができる。そのようなデザインは当業者が多大な実験を行うことなく可能である。
【００５６】
同類置換は、アミノ酸のファミリーのなかで行われるものであり、かつその側鎖および化学的特性に関連するものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、非極性脂肪族側鎖を有するアミノ酸、非極性芳香族側鎖を有するアミノ酸、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、小さな側鎖を有するアミノ酸、大きな側鎖を有するアミノ酸などである。一つの態様において、一つの同類置換がペプチドに含まれる。別の態様において、二つの同類置換またはそれ以下がペプチドに含まれる。さらなる態様において、三つの同類置換またはそれ以下がペプチドに含まれる。
【００５７】
同類アミノ酸置換の例としては、以下に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されることはない。
2011514167.tif 000002
【００５８】
本発明の別の態様において、上記に定義のペプチドを種々の化学的技術の一つまたは複数により修飾して、修飾ペプチドと(断片および変種に関して上記に定義したのと)本質的に同じ活性を有する、ならびに他の望ましい特性を任意で有する、誘導体を作製してもよい。例えば、タンパク質のカルボン酸基は、C末端のものであれ側鎖のものであれ、薬学的に許容される陽イオンの塩の形態で提供されても、エステル化されてエステルを形成しても、またはアミドに変換されてもよい。ペプチドのアミノ基は、アミノ末端のものであれ側鎖のものであれ、HCl塩、HBr塩、酢酸塩、安息香酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩および他の有機酸塩などの、薬学的に許容される酸付加塩の形態であっても、またはアミドに変換されてもよい。ペプチド側鎖のヒドロキシル基は、よく知られた技術を用いてアルコキシにまたはエステルに変換されてもよい。ペプチド側鎖のフェニルおよびフェノール環は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素などの、一つまたは複数のハロゲン原子で置換されても、またはアルキル、アルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、もしくはそのようなカルボン酸のアミドで置換されてもよい。チオールはアセトアミド基などの、いくつかのよく知られた保護基のいずれか一つで保護することができる。
【００５９】
本発明のペプチドは外表面タンパク質または他のタンパク質もしくは他のタンパク質の抗原との組み合わせであってもよい。そのような組み合わせにおいて、ペプチドは一つまたは複数の融合タンパク質の形態であってもよい。本発明の抗原ペプチドまたは支持ペプチドは、他の微生物に由来する選択されたペプチドまたはタンパク質に任意で融合されてもよい。例えば、本発明のペプチドまたはタンパク質はそのN末端またはC末端で、別の病原体由来のポリペプチドにまたは二つ以上のポリペプチドに順に融合されてもよい。この目的に有用でありうるペプチドは、先行技術によって同定されたポリペプチドを含む。
【００６０】
本発明の好ましい態様において、本発明のペプチドは、抗タグ物質が選択的に結合できるエピトープを供与するエピトープタグに融合される。エピトープタグは一般に、ペプチドのN末端またはC末端に置かれるが、生物学的活性の許す限り内部の挿入または置換として組み入れられてもよい。ペプチドのそのようなエピトープタグ付き型の存在は、タグ付きペプチドに対する抗体などの物質を用いて検出することができる。同様に、エピトープタグを供与することで、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別のタイプの親和性マトリックスを用いた親和性精製によりペプチドを容易に精製できるようになる。種々のタグポリペプチドおよびその各抗体は、当技術分野において公知である。例としてはポリヒスチジン(ポリ-his)タグ、例えば実施例に記載のヘキサ-ヒスチジンタグ、ポリ-ヒスチジン-グリシン(ポリ-his-gly)タグ、HAタグポリペプチド、c-mycタグ、StrepタグおよびFLAGタグが挙げられる。
【００６１】
融合体は脂質および糖質を含め、アミノ酸以外の成分に融合またはカップリングされた本発明のペプチドを含むこともできる。さらに、本発明のペプチド/タンパク質/組成物を、先行技術によって記載されている他のワクチン剤と組み合わせておよび他の微生物に由来する他の種のワクチン剤と組み合わせて、利用することもできる。そのようなタンパク質は、広範囲の連鎖球菌分離株によって引き起こされる疾患の予防、処置および診断において有用である。
【００６２】
これらの融合タンパク質は、本発明の方法および組成物で用いるために構築される。これらの融合タンパク質または多量体タンパク質は、組み換えにより産生されてもよく、または化学的に合成されてもよい。
【００６３】
本明細書において記載されるペプチドおよびタンパク質は、いくつかの従来技術のいずれかによって調製することができる。望ましいペプチドは化学的に合成することができる。代替的アプローチは、酵素消化により、例えば、特定のアミノ酸残基によって規定される部位でタンパク質を切断することが公知の酵素でタンパク質を処理することにより、または適当な制限酵素でDNAを消化し、消化されたDNAを発現させ、所望の断片を単離することにより、公知のペプチドの断片を作製することを伴う。別の適当な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、所望のペプチド断片をコードするDNA断片を単離することおよび増幅することを伴う。PCRのなかではDNA断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドを5'および3'プライマーとして利用する。DNAにおいて、それゆえ、公知の配列を有するタンパク質において所定の部位に、欠失、挿入および置換などの突然変異を作製する技術は周知である。当業者はPCRなどの従来技術を用い、本明細書において提供されるペプチド、タンパク質および組成物を容易に使用して、他の類似のタンパク質を同定および単離することができる。本明細書において提供される情報を考慮すれば、そのような方法は日常的であって、過度の実験を要するものとは考えられない。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的突然変異誘発法(Carter et al. (1985), Nucl. Acids Res. 13:4431; Zoller et al. (1987), Nucl. Acids Res. 10:6487) 、カセット式突然変異誘発法(Wells et al. (1985), Gene, 34:315) 、制限選択突然変異誘発法(Wells et al. (1986), Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415) 、PCR突然変異誘発法を用いて変異を作製してもよく、またはクローン化DNAに他の公知の技術を行って、本発明のペプチドもしくは組成物を産生してもよい。
【００６４】
本発明の別の主題は、上記の保護ペプチドまたはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる保護タンパク質からなる群より選択される少なくとも二つのタンパク質を含む組成物に関する。
【００６５】
本発明の別の主題は、
少なくとも二つのタンパク質がサブグループi)、ii)およびiii)の少なくとも二つから選択される、
i) サブグループi)の抗原ペプチドを含むまたはそれからなる保護タンパク質;
ii) SEQ ID NO:6もしくは7のアミノ酸配列からなるさらなる保護ペプチド、またはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなるさらなる保護タンパク質、ならびに
iii) SEQ ID NO:8の支持ペプチドまたはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる支持タンパク質
からなる群より選択される少なくとも二つのタンパク質を含む組成物に関する。
【００６６】
SEQ ID NO:6または7のアミノ酸配列のさらなる保護ペプチドおよびその機能的に活性な変種は、サブグループii)の抗原ペプチドといわれる。サブグループi)およびii)の抗原ペプチドは、抗原ペプチドといわれる。
【００６７】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列の支持ペプチドおよびその機能的に活性な変種は、サブグループiii)の支持ペプチドといわれる。
【００６８】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列からなるさらなる保護ペプチドは、肺炎連鎖球菌血清型4菌株TIGR4_Tettelinに由来し、SP2216-1で示されている。SEQ ID NO:7のアミノ酸配列からなるさらなる保護ペプチドは、肺炎連鎖球菌血清型6B菌株Pj-1259に由来し、SP1732-3で示されている。SEQ ID NO:6および7のアミノ酸からなるさらなる保護ペプチドが由来する完全長タンパク質のアミノ酸およびDNA配列はWO 04/092209において、それぞれ、SEQ ID NO:243および99、ならびにSEQ ID NO:214および70として開示されている。しかしながら、WO 04/092209に開示されているSEQ ID NO:214および70の配列は、肺炎連鎖球菌株TIGR4_Tettelinに関連し、その一方で本発明のSEQ ID NO:7は肺炎連鎖球菌血清型6B菌株Pj-1259に関連している。本発明のSEQ ID NO:7は、SEQ ID NO:7の279位にWO 04/092209の配列でのA (アラニン)と比較してV (バリン)が存在するという点でWO 04/092209のものとは異なることに留意されたい。
【００６９】
SEQ ID NO:6および7のアミノ酸配列は、実施例および添付の配列表に開示されている。SEQ ID NO:6および/または7のペプチドは、敗血症および/または肺炎モデルにおいて肺炎連鎖球菌に対する保護免疫応答を誘導することが示された(実施例および図面を参照のこと)。
【００７０】
機能的に活性な変種は、本明細書において定義のさらなる保護ペプチドの配列を変化させることによって得ることが可能であり、例えば敗血症および/または肺炎モデルにおいて、肺炎連鎖球菌に対する保護免疫応答を誘導するおよび/または保護を示す能力を含め、変種が由来するSEQ ID NO:6または7の配列のさらなる保護ペプチドによって示されるものと類似の生物学的活性を有することによって特徴付けられ、いずれの変種も実施例に記載される試験のいずれかで試験することができる。
【００７１】
さらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種は、上記のように得ることができる。
【００７２】
本発明の好ましい態様において、SEQ ID NO:6または7のアミノ酸配列からなるさらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種は、
a) さらなる保護ペプチドの機能的に活性な断片であって、さらなる保護ペプチドの配列の少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/もしくは欠失によってさらなる保護ペプチドから得られ、この機能的に活性な変種はさらなる保護ペプチドに対しもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; ならびに/または
c) さらなる保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種、好ましくはa)および/もしくはb)の変種、ならびにさらにさらなる保護ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸からなる。
【００７３】
本発明によるさらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種は、例えば敗血症および/または肺炎モデルにおいて、肺炎連鎖球菌に対する保護免疫応答を誘導するおよび/または保護を示す能力を含め、さらなる保護ペプチドによって示されるものと類似の生物学的活性を有することにより特徴付けられる。さらなる保護ペプチドの変種は、変種の活性が、配列変化なしのさらなる保護ペプチドの活性の少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも80%、特に少なくとも90%、とりわけ少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%に達するなら、本発明との関連で機能的に活性である。さらなる保護ペプチドの変種の活性は、実施例に記載されるように決定されまたは測定され、次いで、SEQ ID NO:6または7のアミノ酸配列のさらなる保護ペプチドに対して得られた活性と比較されることができる。
【００７４】
さらなる保護ペプチドの機能的に活性な断片はSEQ ID NO:6または7の保護ペプチドから、さらなる保護ペプチドの配列の少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%または99%を含むペプチドをもたらす一つまたは複数のアミノ酸欠失によって得られることにより特徴付けられる。配列同一性は下記のように決定することができる。アミノ酸欠失はC末端に、N末端におよび/または内部にあってもよい。好ましくは断片は1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個、より好ましくは1、2、3、4または5個、さらにより好ましくは1、2または3個、さらにより好ましくは1または2個、最も好ましくは1個のアミノ酸欠失によって得られる。
【００７５】
あるいはまたさらには、変種はさらなる保護ペプチドから、少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/または欠失によって得ることが可能であり、この機能的に活性な変種はさらなる保護ペプチドに対しまたはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%または99%の配列同一性を有する。配列同一性は下記のように決定することができる。アミノ酸置換、付加および/または欠失はC末端に、N末端におよび/または内部にあってもよい。好ましくは、機能的に活性な変種はさらなる保護ペプチドまたは断片、好ましくはさらなる保護ペプチドから、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個、より好ましくは1、2、3、4または5個、さらにより好ましくは1、2または3個、さらにより好ましくは1または2個、最も好ましくは1個のアミノ酸置換、付加および/または欠失によって得られる。
【００７６】
さらに、変種はさらなる保護ペプチドまたは機能的に活性なその変種、好ましくはa)および/またはb)の変種、ならびにマーカータンパク質など、さらなる保護ペプチドまたはその変種に対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸残基からなることができる。「異種アミノ酸」または「さらなる保護ペプチドもしくはその変種に対して異種性のアミノ酸」という特徴は、肺炎連鎖球菌の任意の天然タンパク質においてさらなる保護タンパク質に隣接して位置するそのアミノ酸とは異なる、詳しくは肺炎連鎖球菌株TIGR4_Tettelinまたは血清型6Bのアミノ酸とは異なる、特に上記に言及した配列とは異なる任意のアミノ酸をいう。それゆえ、少なくとも一つの異種アミノ酸を包含する本発明のタンパク質は、肺炎連鎖球菌の任意の天然タンパク質とは異なる、詳しくは肺炎連鎖球菌株TIGR4_Tettelinまたは血清型6Bのものとは異なるタンパク質をいう。一つまたは複数のさらなるアミノ酸は、さらなる保護ペプチドまたはその変種に対してC末端に、N末端にまたはC末端およびN末端にあってもよい。
【００７７】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列からなる支持ペプチドは、肺炎連鎖球菌血清型6B菌株Pj-1259由来の肺炎球菌表面アドヘシンA (PsaA)に由来する。SEQ ID NO:8のアミノ酸配列からなる支持ペプチドが由来する完全長タンパク質のアミノ酸およびDNA配列は、米国特許第5,854,416号にSEQ ID NO:2および1 (GenBankアクセッション番号: AAE22907およびAR069091)として開示されている。本発明の記載全体(図面を含む)を通じて、PsaAはさらにSP1650として示されることもある。
【００７８】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列は、実施例および添付の配列表に開示されている。SEQ ID NO:8のペプチドは、本発明の抗原ペプチドと組み合わせて用いられるなら、敗血症および/または肺炎モデルにおいて肺炎連鎖球菌に対する保護免疫応答の誘導を支持することが示された(実施例および図面を参照のこと)。
【００７９】
機能的に活性な変種は、本明細書において定義の支持ペプチドの配列を変化させることによって得ることが可能であり、本発明の一つまたは複数の抗原ペプチドと組み合わせて、例えば敗血症および/または肺炎モデルにおいて、肺炎連鎖球菌に対する保護免疫応答を誘導するおよび/または保護を示す能力を含め、変種が由来するSEQ ID NO:8の配列の支持ペプチドによって示されるものと類似の支持的活性を有することによって特徴付けられ、いずれの変種も実施例に記載される試験のいずれかで試験することができる。
【００８０】
支持ペプチドの機能的に活性な変種は、支持ペプチド中の配列変化によって得ることが可能であり、この配列変化を有するペプチドは、未変化の保護ペプチドの機能を保持している、例えば、未変化の支持ペプチド(上記参照)によって示されるものと類似の生物学的活性を有する。そのような配列変化は(同類)アミノ酸置換、欠失、突然変異および挿入を含むことができるが、これらに限定されることはない。変化および変種に関するさらなる詳細については、上記を参照されたい。
【００８１】
好ましい態様において、支持ペプチドの機能的に活性な変種は、
a) 支持ペプチドの機能的に活性な断片であって、支持ペプチドの配列の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/もしくは欠失によって支持ペプチドから得られ、支持ペプチドに対しもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; ならびに/または
c) 支持ペプチドもしくはその機能的に活性な変種、好ましくはa)および/もしくはb)の変種、ならびにさらに支持ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸からなる。
【００８２】
本発明による支持ペプチドの機能的に活性な変種は、本発明の抗原ペプチドと組み合わせて用いられるなら、敗血症および/または肺炎モデルにおいて異なる血清型に対する保護免疫応答および/または肺炎連鎖球菌に対する保護の誘導を支持する能力を含め、支持ペプチドによって示されるものと類似の生物学的活性を有することによって特徴付けられる。
【００８３】
支持ペプチドの変種は、本発明の抗原ペプチドとの組み合わせでの変種の活性が、配列変化なしの本発明の抗原ペプチドとの組み合わせでの支持ペプチドの活性の少なくとも10%、好ましくは少なくとも25%、より好ましくは少なくとも50%、さらにより好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも80%、特に少なくとも90%、とりわけ少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも99%に達するなら、本発明との関連で機能的に活性である。本発明の抗原ペプチドとの組み合わせでの支持ペプチドの変種の活性は、実施例に記載されるように決定されまたは測定され、次いで、本発明の抗原ペプチドとの組み合わせでのSEQ ID NO:8のアミノ酸配列の支持ペプチドに対して得られた活性と比較されることができる。
【００８４】
支持ペプチドの機能的に活性な断片は、SEQ ID NO:8の支持ペプチドから、支持ペプチドの配列の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%または99%を含むペプチドをもたらす一つまたは複数の欠失によって得られることにより特徴付けられる。配列同一性は上記のように決定することができる。欠失は、C末端に、N末端におよび/または内部にあってもよい。好ましくは断片は、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個、より好ましくは1、2、3、4または5個、さらにより好ましくは1、2または3個、さらにより好ましくは1または2個、最も好ましくは1個の欠失によって得られる。
【００８５】
あるいはまたさらには、変種は支持ペプチドから、少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/または欠失によって得ることが可能であり、この機能的に活性な変種は、支持ペプチドに対しまたはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%または99%の配列同一性を有する。配列同一性は上記のように決定することができる。置換、付加および/または欠失は、C末端に、N末端におよび/または内部にあってもよい。好ましくは、機能的に活性な変種は、支持ペプチドまたは断片、好ましくは支持ペプチドから、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個、より好ましくは1、2、3、4または5個、さらにより好ましくは1、2または3個、さらにより好ましくは1または2個、最も好ましくは1個のアミノ酸置換、付加および/または欠失によって得られる。
【００８６】
さらに、変種は、支持ペプチドまたは機能的に活性なその変種、好ましくはa)および/またはb)の変種、ならびにマーカータンパク質など、支持ペプチドまたはその変種に対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸残基からなることができる。「異種アミノ酸」または「支持ペプチドもしくはその変種に対して異種性のアミノ酸」という特徴は、肺炎連鎖球菌の任意の天然タンパク質において支持タンパク質に隣接して位置するそのアミノ酸とは異なる、特に上記に言及した配列とは異なる任意のアミノ酸をいう。一つまたは複数のさらなるアミノ酸は、支持ペプチドまたはその変種に対してC末端に、N末端にまたはC末端およびN末端にあってもよい。
【００８７】
本発明の別の主題は、
少なくとも三つのタンパク質がサブグループi)、ii)およびiii)の少なくとも二つから選択される、
i) サブグループi)の抗原ペプチドを含むまたはそれからなる保護タンパク質;
ii) サブグループii)の抗原ペプチドを含むまたはそれからなるさらなる保護タンパク質、ならびに
iii) サブグループiii)の支持ペプチドを含むまたはそれからなる支持タンパク質
からなる群より選択される少なくとも三つのタンパク質を含む組成物に関する。
【００８８】
一つの好ましい態様において、本発明の組成物は、サブグループi)から選択される少なくとも一つのタンパク質、ならびにサブグループii)および/またはiii)から選択される少なくとも二つのタンパク質を含む。
【００８９】
別の好ましい態様において、本発明の組成物は、三つのサブグループi)、ii)およびiii)から選択される少なくとも三つのタンパク質を含む。
【００９０】
別の好ましい態様において、本発明の組成物は、少なくとも二つのタンパク質の二つまたはそれ以上のタンパク質が一つの融合タンパク質へ組み合わされるという点において定義される。したがって、二つまたはそれ以上のタンパク質は一つまたは複数の融合タンパク質へ組み合わせることができる。得られる融合タンパク質は、上記に定義のサブグループi)、ii)および/またはiii)のタンパク質の二つまたはそれ以上を包含することができる。
【００９１】
融合タンパク質は、上記に定義の二つまたはそれ以上のタンパク質を含むまたはそれからなることができる。さらに、融合タンパク質は、二つもしくはそれ以上のタンパク質またはさらなるC末端配列もしくはN末端配列、例えば、融合タンパク質を精製するためのタグなどを連結するため、タンパク質リンカーなど、リンカーを包含することもできる。融合タンパク質の基礎をなす核酸配列を調製する場合に、遺伝子操作および適当な制限部位の使用から、さらなる配列が生じることもある。
【００９２】
SEQ ID NO:1〜8のタンパク質は、上記に定義の、それぞれ、SEQ ID NO:1〜8のペプチドを含むまたはそれからなる保護タンパク質/さらなる保護タンパク質/支持タンパク質に関するよう意図される。SEQ ID NO:1〜8のタンパク質の変種は、上記に定義の、それぞれ、SEQ ID NO:1〜8の機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる保護タンパク質/さらなる保護タンパク質/支持タンパク質に関するよう意図される。
【００９３】
融合タンパク質において組み合わされるサブグループi)、ii)および/またはiii)のタンパク質は、互いと直接的に連結されてもよく、またはリンカー越しに組み合わされてもよい。リンカーは、例えば短いアミノ酸配列であってよい。リンカーは適当な融合タンパク質の遺伝子操作から得られてもよく、または単一のタンパク質を有効に機能させるように導入されてもよい。
【００９４】
本発明の別の態様において、組成物は上記に詳述の融合タンパク質に加えてサブグループi)、ii)および/またはiii)の少なくとも一つのさらなるタンパク質を含むことができる。
【００９５】
別の好ましい態様において、本発明の組成物は
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびii)に定義の少なくとも一つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびiii)に定義の少なくとも一つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびii)に定義の少なくとも二つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびiii)に定義の少なくとも二つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびii)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびiii)に定義の少なくとも一つのタンパク質
を含む。
【００９６】
より好ましくは、上記の態様のいずれかに定義の本発明の組成物は、
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質
を含む。
【００９７】
最も好ましい組成物の例では、以下のタンパク質を含む:
- SEQ ID NO:1のタンパク質、SEQ ID NO:6のタンパク質およびSEQ ID NO:7のタンパク質;
- SEQ ID NO:2のタンパク質、SEQ ID NO:6のタンパク質およびSEQ ID NO:7のタンパク質;
- SEQ ID NO:3のタンパク質、SEQ ID NO:6のタンパク質およびSEQ ID NO:7のタンパク質;
- SEQ ID NO:4のタンパク質、SEQ ID NO:6のタンパク質およびSEQ ID NO:7のタンパク質;
- SEQ ID NO:5のタンパク質、SEQ ID NO:6のタンパク質およびSEQ ID NO:7のタンパク質;
- SEQ ID NO:1のタンパク質、SEQ ID NO:7のタンパク質およびSEQ ID NO:8のタンパク質;
- SEQ ID NO:2のタンパク質、SEQ ID NO:7のタンパク質およびSEQ ID NO:8のタンパク質;
- SEQ ID NO:3のタンパク質、SEQ ID NO:7のタンパク質およびSEQ ID NO:8のタンパク質;
- SEQ ID NO:4のタンパク質、SEQ ID NO:7のタンパク質およびSEQ ID NO:8のタンパク質; または
- SEQ ID NO:5のタンパク質、SEQ ID NO:7のタンパク質およびSEQ ID NO:8のタンパク質。
【００９８】
好ましい態様において、本発明の組成物は、機能的に活性な変種が
a) さらなる保護ペプチドの機能的に活性な断片であって、支持ペプチドの配列の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/もしくは欠失によってさらなる保護ペプチドから得られ、さらなる保護ペプチドに対しもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; ならびに/または
c) さらなる保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種およびさらなる保護ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸からなる、
さらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種を含む。
【００９９】
好ましい態様において、本発明の組成物は、機能的に活性な変種が
a) 支持ペプチドの機能的に活性な断片であって、支持ペプチドの配列の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/もしくは欠失によって支持ペプチドから得られ、支持ペプチドに対しもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; ならびに/または
c) 支持ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および支持ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸からなる、
支持ペプチドの機能的に活性な変種を含む。
【０１００】
本発明の別の主題は、上記に定義のサブグループi)の抗原ペプチドまたは上記に定義の本発明の組成物中に含まれる一つもしくは複数の保護タンパク質のいずれかをコードする一つまたは複数の核酸に関する。
【０１０１】
本発明の核酸分子は、mRNAもしくはcRNAなど、RNAの形態であっても、あるいは例えばクローニングにより得られるまたは化学的合成技術によりもしくはその組み合わせにより産生される、例えばcDNAおよびゲノムDNAを含め、DNAの形態であってもよい。DNAは三本鎖、二本鎖または一本鎖であってよい。一本鎖DNAはセンス鎖としても知られるコード鎖であってよく、またはそれはアンチセンス鎖ともいわれる非コード鎖であってもよい。本明細書において用いられる核酸分子は同様に、とりわけ、一本鎖および二本鎖のDNA、一本鎖と二本鎖のRNAとの混合物であるDNA、ならびに一本鎖と二本鎖の領域の混合物であるRNA、一本鎖または、より典型的には、二本鎖もしくは三本鎖、あるいは一本鎖および二本鎖の領域の混合物でありうるDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子をいう。さらに、本明細書において用いられる核酸分子は、RNAもしくはDNAを、またはRNAもDNAもともに含む三本鎖領域をいう。
【０１０２】
核酸は、肺炎連鎖球菌において、特に肺炎連鎖球菌株R6およびTIGR4_Tettelinにおいて天然に存在する核酸の断片であってよい。血清型は、好ましくは1、2、3、4、5、6 (特に6Aもしくは6B)、7 (特に7F)、8、9 (特に9Nもしくは9V)、10 (特に10A)、11 (特に11A)、12 (特に12F)、14、15 (特に15B)、17 (特に17F)、18 (特に18C)、19 (特に19Aもしくは19F)、20、22 (特に22F)、23 (特に23F)または33 (特に33F)である。好ましい態様において、血清型は4、6B、14、19Aおよび19Fまたは23Fである。
【０１０３】
核酸は同様に、遺伝暗号の縮重の結果である配列を含む。20種の天然アミノ酸が存在しており、これらの大部分が二つ以上のコドンによって指定される。それゆえ、上記に定義のペプチドをコードする、全てのヌクレオチド配列が本発明に含まれる。
【０１０４】
好ましくは、一つまたは複数の核酸は、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:13からなる群より選択される少なくとも一つの核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０１０５】
さらに、核酸は一つまたは複数の修飾塩基を含有してもよい。そのような核酸は、例えばリボースリン酸骨格の中に修飾を含有し、生理的環境でのそのような分子の安定性および半減期を増大してもよい。すなわち、安定性のためにまたは他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたはRNAは、その特徴が本明細書において意図される「核酸分子」である。さらに、二例を挙げると、イノシンなどの非通常塩基、またはトリチル化塩基などの修飾塩基を含むDNAまたはRNAは、本発明の文脈内で核酸分子である。当業者に公知の多くの有用な目的にかなう多種多様の修飾がDNAおよびRNAになされていることが理解されよう。核酸分子という用語は、本明細書において利用される場合、核酸分子のそのように化学的に、酵素的にまたは代謝的に修飾された形態、ならびにとりわけ、単純型細胞および複雑型細胞を含め、ウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。例えば、核酸によってコードされる本発明のペプチドもしくはタンパク質または組成物に影響を与えないヌクレオチド置換をなすことが可能であり、したがって抗原ペプチドもしくは機能的に活性なその変種または上記に定義の本発明の組成物をコードする任意の核酸分子が本発明によって包含される。
【０１０６】
さらに、本発明の抗原ペプチドまたは組成物をコードする核酸分子のいずれも、標準的なクローニング技術などの標準的な技術を用い、肺炎連鎖球菌調節配列であれ異種調節配列であれ、任意の所望の調節配列、異種リーダー配列、異種マーカー配列または異種コード配列に機能的に連結して、融合タンパク質を作製することができる。
【０１０７】
本発明の核酸は、一般に、エンドヌクレアーゼおよび/もしくはエキソヌクレアーゼおよび/もしくはポリメラーゼおよび/もしくはリガーゼおよび/もしくはリコンビナーゼ、または核酸を産生するための当業者に公知の他の方法による核酸の操作により、インビトロにおいてまたは培養細胞において、もともと形成されうる。
【０１０８】
本発明の一つの態様において、本発明の一つまたは複数の核酸は、ベクターまたは肺炎連鎖球菌以外の細胞に位置する。
【０１０９】
ベクターは、複製起点など、宿主細胞中で複製するのを可能にする核酸配列、一つまたは複数の所望の遺伝子および/または選択可能なマーカー遺伝子、ならびにコードされるペプチドまたはタンパク質の転写、翻訳、および/または分泌を指令する調節要素など、当技術分野において公知の他の遺伝要素をさらに含んでもよい。ベクターを用いて細胞に形質導入し、形質転換し、または感染させ、それによって細胞に固有のもの以外の挿入された核酸および/またはタンパク質を細胞に発現させてもよい。ベクターは任意で、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティングなどのような、細胞への核酸の移行の達成を助ける材料を含んでもよい。標準的な分子生物学技術によるタンパク質発現に適した発現ベクターの多くのタイプが当技術分野において公知である。そのようなベクターは昆虫、例えば、バキュロウイルス発現系、または酵母発現系、真菌発現系、細菌発現系もしくはウイルス発現系を含め、従来のベクタータイプの中から選択される。多くのタイプが当技術分野において公知の、他の適した発現ベクターをこの目的に使用することもできる。そのような発現ベクターを得るための方法は周知である(例えば、Sambrook et al (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照のこと)。一つの態様において、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターはレトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターを含むが、これらに限定されることはない。
【０１１０】
この方法によるトランスフェクションに適した宿主細胞または細胞株は、細菌細胞を含む。例えば、大腸菌(E. coli)の各種菌株が生命工学の分野において宿主細胞として周知である。枯草菌(B. subtilis)、シュードモナス菌(Pseudomonas)、ストレプトマイセス菌(Streptomyces)および他の桿菌(bacilli)などの各種菌株をこの方法において利用することもできる。当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株も本発明のペプチドの発現用の宿主細胞として利用可能である。他の真菌細胞またはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugipedera) (Sf9)細胞などの昆虫細胞を発現系として利用することもできる。あるいは、HeLa、C127、BHK、Bowes黒色腫細胞、ヒト293細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、サルCOS-1細胞株、Vero細胞、PER.C6(登録商標)またはSwiss、BALB/cもしくはNIHマウスに由来するマウス3T3細胞など、哺乳類細胞が使用されてもよい。さらに他の適当な宿主細胞、ならびにトランスフェクション、培養、増幅、スクリーニング、産生、および精製のための方法は、当技術分野において公知である。
【０１１１】
本発明の抗原ペプチドもしくは組成物またはその成分は、本発明の核酸を適当な宿主細胞中で発現させることによって産生することができる。宿主細胞に、例えばエレクトロポレーションなどの従来の手段により、転写調節配列の制御下に本発明の核酸を含有する少なくとも一つの発現ベクターをトランスフェクトすることができる。トランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞を次いで、タンパク質の発現を可能にする条件の下で培養する。発現されたタンパク質は、当業者に公知の適切な手段によって、細胞から(または細胞外に発現されるなら、培地から)回収され、単離され、かつ任意で精製される。例えば、タンパク質は細胞溶解後に可溶型で単離され、または例えば塩化グアニジン中、公知の技術を用いて抽出される。必要に応じて、本発明のペプチドまたは断片は融合タンパク質として産生される。そのような融合タンパク質は上記のものである。あるいは、例えば、選択された宿主細胞でのタンパク質の発現を促進するためにまたは精製を改善するために融合タンパク質を産生することが望ましいこともある。本発明のペプチドおよび組成物を含む分子は、HPLC、FPLCなどを用いる、順相または逆相のような液体クロマトグラフィー; 親和性クロマトグラフィー(無機リガンドまたはモノクローナル抗体を用いるような); サイズ排除クロマトグラフィー; 固定化金属キレートクロマトグラフィー; ゲル電気泳動などを含むが、これらに限定されない、さまざまな従来の方法のいずれかを用いてさらに精製されてもよい。当業者は本発明の範囲から逸脱することなく、最も適した単離および精製技術を選択することができる。そのような精製は、微生物の他のタンパク質性材料および非タンパク質性材料を実質的に含まない形でペプチド/タンパク質/組成物をもたらす。
【０１１２】
本発明のさらなる主題は、本発明による少なくとも一つの保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種または本発明による組成物、および任意で薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物、とりわけワクチンに関する。
【０１１３】
本発明の抗原ペプチドまたは組成物は、肺炎連鎖球菌の感染によって引き起こされた疾患を有するヒトおよび/または動物を免疫するまたは処置するための方法に使用することができる。それゆえ、抗原ペプチドまたは組成物を薬学的組成物のなかで使用することができる。本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体および/または賦形剤をさらに包含してもよい。本発明において有用な薬学的に許容される担体および/または賦形剤は、従来のものであり、緩衝液、安定剤、希釈剤、保存剤および可溶化剤を含むことができる。E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)によるRemington's Pharmaceutical Sciencesには、本明細書において開示される(ポリ)ペプチド/タンパク質の薬学的送達に適した組成物および処方物が記載されている。
【０１１４】
薬学的組成物が本発明の成分を含むなら、サブグループi)、ii)および/またはiii)のタンパク質を一つまたは複数の薬学的組成物に処方することができる。さらに、二つまたはそれ以上の薬学的組成物をともに、同時にまたは連続的に投与してもよい。
【０１１５】
一般に、担体または賦形剤の性質は、利用される特定の投与方法に依るであろう。例えば、薬学的処方物は、通常、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどのような薬学的におよび生理学的に許容される流体を媒体として含む注射可能な流体を含む。固体組成物(例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル形態)の場合、従来の無毒性の固体担体は、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性の担体に加えて、湿潤剤または乳化剤、保存剤およびpH緩衝剤などのような、少量の無毒性の補助物質、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有することができる。
【０１１６】
好ましい態様において、薬学的組成物はアジュバントのような免疫刺激性の物質をさらに含む。アジュバントは投与の方法に基づいて選択することが可能であり、フロインドの完全および不完全アジュバントなどのミネラルオイルに基づくアジュバント、ISAなどのモンタニド不完全Seppicアジュバント、Ribiアジュバント系などの水中油型乳剤アジュバント、ムラミルジペプチドを含有するシンタックスアジュバント処方物、またはアルミニウム塩アジュバント含むことができる。
【０１１７】
より好ましい態様において、免疫刺激性の物質はポリカチオン性の重合体、とりわけポリアルギニンなどのポリカチオン性のペプチド、免疫刺激性のデオキシヌクレオチド(ODN)、とりわけオリゴ(dIdC)13、少なくとも二つのLysLeuLysモチーフを含有するペプチド、とりわけKLKLLLLLKLK、神経活性化合物、とりわけヒト成長ホルモン、ミョウバン、アジュバント、およびそれらの組み合わせを含む群より選択される。それらの組み合わせは、ポリカチオン性の重合体と免疫刺激性のデオキシヌクレオチド、または少なくとも二つのLysLeuLysモチーフを含有するペプチドと免疫刺激性のデオキシヌクレオチドのいずれかであることが好ましい。さらにより好ましい態様において、ポリカチオン性の重合体は、ポリカチオン性のペプチドである。
【０１１８】
本発明において用いられる「オリゴ(dIdC)13」という用語は、[オリゴ-d(IC)13]という用語によっても定義される、13デオキシ(イノシン-シトシン)モチーフを含有するホスホジエステル骨格の一本鎖DNA分子を意味する。正確な配列は
2011514167.tif 000003
である。オリゴ(dIdC)13は、例えばWO 01/93903およびWO 01/93905に明記されているように、(オリゴ-dIC26); オリゴ-dIC26-mer; オリゴ-デオキシIC, 26-mer; またはオリゴ-dIC, 26-merという用語によっても定義することができる。
【０１１９】
本発明のさらにより好ましい態様において、免疫刺激性の物質は、少なくとも一つの免疫刺激性の核酸である。免疫刺激性の核酸は、例えば、天然もしくは人工のCpG含有核酸、無脊椎動物に由来する短い核酸ストレッチ、または規定の塩基に即して非メチル化シトシン-グアニンジヌクレオチド(CpG)を含有する短いオリゴヌクレオチド(ODN)の形態(例えばWO 96/02555に記載)のものである。あるいは、同様に、例えばWO 01/93903に記載のイノシンおよびシチジンに基づく核酸、またはデオキシ-イノシンおよび/もしくはデオキシウリジンを含有するデオキシ核酸(WO 01/93905およびWO 02/095027に記載されている)を、好ましくは、本発明のなかで免疫刺激性の核酸として使用することもできる。異なる免疫刺激性の核酸の混合物が、本発明において使用されることが好ましい。さらに、上記のポリカチオン性の化合物を、上記の免疫刺激性の核酸のいずれかと組み合わせることもできる。そのような組み合わせは、WO 01/93905、WO 02/32451、WO 01/54720、WO 01/93903、WO 02/13857、WO 02/095027、およびWO 03/047602に記載されているものによることが好ましい。
【０１２０】
さらにまたあるいは、そのようなワクチン組成物は、神経活性化合物を含んでもよい。好ましくは、神経活性化合物は、例えばWO 01/24822に記載されている、ヒト成長因子である。同様に好ましくは、神経活性化合物は上記に定義のポリカチオン性の化合物および/または免疫刺激性の核酸のいずれかと組み合わされる。
【０１２１】
本発明の非常に好ましい態様において、アジュバントは、実施例において使用のもの、例えば、完全フロインドアジュバント、水酸化アルミニウムである。本発明の別の非常に好ましい態様において、アジュバントは、IC31(登録商標) (Intercell; ペプチドモチーフKLK [WO 02/32451]およびオリゴヌクレオチド[WO 01/93905]を含む合成アジュバント)である。
【０１２２】
例えば対象の免疫または処置に、本組成物を使用することができる。薬学的組成物は、本発明の少なくとも一つの抗原ペプチドまたは組成物を包含する; しかしながら、それは、任意で支持ペプチドもしくはタンパク質または他の病原体の異なる抗原ペプチドもしくはタンパク質と混合されてもよい、本発明の異なる抗原ペプチド(断片および変種を含む)もしくはタンパク質または組成物を含有するカクテル(すなわち、単純混合物)を含有してもよい。これらのペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくは断片、またはその変種のそのような混合物は、例えば広範囲の肺炎連鎖球菌分離株に対する所望の抗体の作製において有用である。本発明の(ポリ)ペプチド/組成物を、薬学的に許容される塩の形態で使用することもできる。本発明のペプチドと塩を形成できる適当な酸および塩基は、当業者に周知であり、無機および有機の酸および塩基を含む。
【０１２３】
あるいは、薬学的組成物は
(i) 本発明の一つもしくは複数の核酸またはそれに相補的な一つもしくは複数の核酸、および
(ii) 任意で薬学的に許容される担体または賦形剤
を含む。
【０１２４】
核酸配列を、単独で、またはペプチド/タンパク質/組成物もしくは他の病原微生物に向けられる抗体をコードする他の核酸配列との組み合わせで、薬学的組成物の成分としてさらに使用することができる。肺炎連鎖球菌の感染によって引き起こされた疾患を有するヒトおよび/または動物を免疫するまたは処置するために、組成物を使用することができる。
【０１２５】
薬学的に許容される担体または賦形剤は上記に定義の通りでありうる。
【０１２６】
別の態様において、本発明の核酸配列を、単独で、または他の病原微生物由来の他の抗原もしくは抗体をコードする核酸配列との組み合わせで、対象において病原体に対する保護免疫応答を積極的に誘導することに向けられた組成物にさらに使用することができる。本発明のこれらの成分は、肺炎連鎖球菌の感染に対するヒトおよび/または動物での保護免疫応答を誘導する方法において有用である。
【０１２７】
治療組成物またはワクチン組成物の調製で用いる場合、核酸送達の組成物および方法が有用であり、これらは当業者に公知である。本発明の核酸またはそれに相補的な一つもしくは複数の核酸は、本発明の方法でまたはDNA配列として本明細書において記載の組成物で利用され、裸のDNAとして投与されるか、薬学的に許容される担体と結び付けるかされ、抗原、ペプチドまたはポリペプチドのインビボでの発現をもたらしうる。いわゆる「裸のDNA」は、患者においてインビボで本発明の抗原ペプチドまたは組成物を発現させるために使用することができる。(例えば、Cohen, J. (1993), Science 259: 1691-2を参照されたく、これには「裸のDNA」の類似の用途が記載されている)。例えば、調節配列と結び付いた「裸のDNA」を治療的にまたはワクチン組成物の一部として、例えば、注射により投与することができる。
【０１２８】
あるいは、本発明の抗原ペプチドもしくは組成物をコードする核酸またはそれに相補的な核酸を、例えば、抗体を誘導するため、例えば本発明の抗原ペプチドまたは組成物をインビボにおいて発現させるために、薬学的組成物中に使用してもよい。
【０１２９】
本発明の好ましい態様は、核酸がベクターおよび/または肺炎連鎖球菌以外の細胞に含まれる、薬学的組成物に関する。本発明との関連で適当なベクターおよび細胞は先に記載されている。ベクターはDNAワクチンに特に利用される。当業者は送達に適したベクターを容易に選択することができる。インビボでの遺伝子送達のための例示的なベクターは、さまざまな学術的および商業的供給源から容易に入手可能であり、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター(WO 91/18088)、アデノウイルスベクター(Kay, M. et al (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2353; Ishibashi, S. et al (1993), J. Clin. Invest. 92: 883)、または他のウイルスベクター、例えば、種々のポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどを含む。レトロウイルスまたはアデノウイルスのような、組み換えウイルスのベクターは、外来性DNAを細胞の染色体に組み入れるのに好ましい。
【０１３０】
本発明の範囲のなかに同様に含まれるのは、本発明による抗原ペプチドまたは組成物に対する抗体の産生である。これには、例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ならびにヒト化抗体のほかに、Fab断片、またはFab発現ライブラリの産物も含まれ、これらは本発明による抗原ペプチドまたは組成物に特異的に結合することができる。
【０１３１】
好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体、または機能的に活性なそれらの断片である。別の好ましい態様において、機能的に活性な断片はFab断片を含む。
【０１３２】
本発明による抗原ペプチドまたは組成物に対して作製される抗体は、本発明による抗原ペプチドもしくは組成物の動物への直接注射により、または本発明による抗原ペプチドもしくは組成物の動物、好ましくはヒト以外の動物への投与により得ることができる。そのようにして得られた抗体はその結果、本発明による抗原ペプチドまたは組成物を結合するであろう。次にそのような抗体を用いて、反応性の抗原、ペプチドまたはタンパク質を、それらを発現する組織から単離することができる。
【０１３３】
モノクローナル抗体の調製の場合、細胞株、例えばハイブリドーマ細胞株の連続培養による抗体の産生をもたらす、当技術分野において公知の任意の技術を使用することができる。
【０１３４】
本発明による抗原ペプチドまたは組成物に対する一本鎖抗体を産生するために、一本鎖抗体の産生のために記載されている技術(米国特許第4,946,778号)を適合することができる。同様に、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の生物を用いて、本発明による抗原ペプチドまたは組成物に対するヒト化抗体を発現させることができる。
【０１３５】
抗体はハイブリドーマ細胞株を用いて産生することもできる。所望のモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株は、周知の従来技術によって作製される。ハイブリドーマ細胞は、正常な活性化抗体産生B細胞を骨髄腫細胞と融合することにより作製することができる。本発明との関連で、ハイブリドーマ細胞は、本発明による抗原ペプチドまたは組成物に特異的に結合する抗体を産生することができる。
【０１３６】
同様に、望ましい高力価抗体は、公知の組み換え技術を、これらのペプチド/タンパク質/組成物に対して開発されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体に適用することにより作製される(例えば、WO 86/01533; 英国特許出願公開公報第GB2188638A号; Amit et al. (1986), Science 233: 747-53; Queen et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-33; WO 90/07861; Riechmann et al. (1988), Nature 332: 323-7; Huse et al. (1988), Science 246: 1275-81を参照のこと)。
【０１３７】
したがって、本発明の別の主題は、
(a) 上記に定義の本発明の少なくとも一つの保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または上記に定義の本発明の組成物の有効量を動物に投与する段階、ならびに
(b) 段階(a)の投与に反応して動物により産生された抗体を動物から単離する段階
によって特徴付けられる、抗体を産生する方法である。
【０１３８】
抗体を産生するための本発明の代替方法は、
(a) B細胞を上記に定義の本発明の少なくとも一つの保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または上記に定義の本発明の組成物の有効量と接触させる段階、
(b) 段階(a)のB細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を得る段階、ならびに
(c) 培養ハイブリドーマ細胞により産生された抗体を単離する段階
によって特徴付けられる。
【０１３９】
詳しくは、ヒト以外の動物において本発明の抗原ペプチドまたは組成物を動物に投与することによって免疫応答を惹起し、抗体を含有する体液を前記の動物から取り出し、および前記の抗体を含有する体液をさらなる精製段階に供することによって抗体を産生することにより、抗体を産生することができる。あるいは、ヒト以外の動物において本明細書において定義の、抗原ペプチドまたは組成物を前記の動物に投与することによって免疫応答を惹起し、脾臓もしくは脾臓細胞を前記の動物から取り出しおよび/または前記の脾臓もしくは脾臓細胞のハイブリドーマ細胞を産生し、本発明による抗原ペプチドまたは組成物に特異的なハイブリドーマ細胞を選択してクローニングし、かつ前記のクローニングされたハイブリドーマ細胞の培養によって抗体を産生することにより、抗体を産生することもできる。好ましい態様において、本発明の方法によって産生された抗体は、さらに精製される。精製の方法は当業者に公知である。
【０１４０】
抗体は感染を予防または処置する方法において使用することができる。したがって、本発明の別の主題は、本発明により産生された抗体を含む、薬学的組成物、特にワクチンに関する。薬学的組成物は上記に詳述のさらなる成分を包含することができる。組成物は、T細胞を刺激するその能力を高める物質をさらに包含することができる。これらにはTヘルパー細胞エピトープ、脂質もしくはリポソームまたはWO01/78767に記載の好ましい修飾が含まれる。エピトープのT細胞刺激能を高める別の方法は、免疫刺激物質、例えば、インターロイキン-2、-7、-12、-18、クラスIおよびIIインターフェロン(IFN)、特にIFN-γ、GM-CSF、TNF-α、flt3-リガンドなどのようなサイトカインまたはケモカインとのその配合である。
【０１４１】
本発明のさらなる主題は、好ましくは肺炎連鎖球菌に対する、より好ましくは肺炎連鎖球菌によって引き起こされた肺炎、菌血症、中耳炎、髄膜炎、副鼻腔炎、腹膜炎および/または関節炎に対する、対象の免疫または処置のための医薬の製造のための上記に定義の本発明の保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または上記に定義の本発明の組成物および/または上記に定義の本発明の核酸の使用に関する。
【０１４２】
本発明のペプチド、タンパク質、組成物または核酸は概して、対象において免疫応答を誘導するのに有用である。免疫に使用されるワクチンは、経口、局所、鼻腔内、筋肉内、リンパ節内、皮内、腹腔内、皮下およびそれらの組み合わせを含め、任意の従来の方法で、ただし最も好ましくは筋肉内注射を通じて、肺炎連鎖球菌による感染を起こしやすい対象、好ましくは哺乳動物、およびさらにより好ましくはヒトに投与することができる。筋肉内投与のための用量は、好ましくは最大約5 mlまで、さらにより好ましくは0.5 ml〜3 ml、および最も好ましくは約1〜2 mlである。皮下注射が選択された投与経路である場合の用量体積は、好ましくは最大約5 mlまで、さらにより好ましくは0.5 ml〜3 ml、および最も好ましくは約1〜2 mlである。各用量中の物質の量は、そのワクチン接種を受ける対象に対して、肺炎連鎖球菌の感染に対する有効な免疫を与えるのにおよび肺炎連鎖球菌の感染から生じる臨床的兆候を発現するリスクを減らすのに、十分とすべきである。好ましくは、タンパク質の単位用量は、最大約5μgタンパク質/kg体重、より好ましくは約0.2〜3μgタンパク質/kg体重、さらにより好ましくは約0.3〜1.5μgタンパク質/kg体重、より好ましくは約0.4〜0.8μgタンパク質/kg体重、およびさらにより好ましくは約0.6μgタンパク質/kg体重とすべきである。別の好ましいタンパク質の単位用量は、最大約6μgタンパク質/kg体重、より好ましくは約0.05〜5μgタンパク質/kg体重、さらにより好ましくは約0.1〜4μgでありうる。この用量は、例えば1〜4週の間隔で、1〜3回投与されることが好ましい。1用量あたりの好ましいタンパク質の量は、およそ1μg〜およそ1 mg、より好ましくはおよそ5μg〜およそ500μg、さらにより好ましくはおよそ10μg〜およそ250μgおよび最も好ましくはおよそ25μg〜およそ100μgである。
【０１４３】
本発明の別の局面において、本発明により産生された抗体またはその機能的断片は、感染、好ましくは肺炎連鎖球菌感染の処置のための医薬の製造に使用される。この処置は抗体の有効量を対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与することを伴う。このように、本発明の保護ペプチドもしくはその変種または組成物に対する抗体を利用して、感染、とりわけ細菌感染および特に肺炎連鎖球菌から生じる感染を阻害するおよび/または処置することができる。
【０１４４】
本発明のペプチド、タンパク質、組成物もしくは核酸または本発明により産生された抗体の「有効量」は、インビボでの効果を示すことが可能な、例えば感染、とりわけ肺炎連鎖球菌感染の兆候または徴候を予防するまたは改善することが可能なその量として計算することができる。当業者はそのような量を決定することができる。そのような物質は、経口、局所、鼻腔内、筋肉内、リンパ節内、皮内、腹腔内、皮下およびその組み合わせを含め、任意の従来の方法で、ただし好ましくは筋肉内にまたは皮下に投与することができる。しかしながら、それは経口的にまたは局所的になど、その他任意の経路によって投与されるように処方されてもよい。そのような治療組成物の送達経路および投与量の選択は、当技術分野の技術の範囲内である。
【０１４５】
本発明との関連で処置は、治療的処置も予防的手段もともにいい、その目的は、標的とする病的状態または障害を防ぐまたは抑える(軽くする)ことである。処置を必要とするものには、障害を既に有するもの、および障害を有する傾向があるものまたは障害を予防すべきものが含まれる。
【０１４６】
本発明のさらなる主題は、
(a) 対象から得られたサンプルを上記に定義の本発明の保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または上記に定義の本発明の組成物と接触させる段階、ならびに
(b) サンプル中の保護ペプチド、機能的に活性な変種および/または組成物に対する抗体の存在を検出する段階
を含み、
抗体の存在が肺炎連鎖球菌感染を示す、
肺炎連鎖球菌感染を診断する方法に関する。
【０１４７】
本発明の抗原ペプチドまたは組成物を肺炎連鎖球菌の検出に使用することができる。好ましくはそのような検出は、診断のためであり、より好ましくは疾患の診断のためであり、最も好ましくは肺炎連鎖球菌感染の診断のためである。抗原ペプチドまたは組成物を用いて、例えば対象から得られたサンプル中での、肺炎連鎖球菌特異的な抗体またはその断片の存在を検出することができる。サンプルは例えば血液サンプルでありうる。あるいは、本発明の方法によって調製された抗体を用いて、肺炎連鎖球菌特異的な保護ペプチドの存在を検出することもできる。
【０１４８】
本発明は同様に、正常および異常レベルの決定を含め、細胞および組織または体液中の本発明のペプチド、タンパク質または抗体のレベルを検出するための定量アッセイ法および診断アッセイ法などの診断アッセイ法に関する。宿主に由来するサンプル中のペプチド、組成物または抗体のレベルを決定するために使用できるアッセイ技術は、当業者に周知である。そのようなアッセイ法は放射免疫アッセイ法、競合的結合アッセイ法、ウエスタンブロット分析およびELISAアッセイ法を含む。これらのなかで、ELISAが好ましいことが多い。ELISAアッセイ法は初めに、ペプチドまたは組成物、特に保護ペプチドに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。さらに、モノクローナル抗体に結合する、通常、レポーター抗体が調製される。レポーター抗体は放射性試薬、蛍光試薬または西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素などの酵素試薬のような、検出可能な試薬に付着される。
【０１４９】
本発明の抗原ペプチドまたは組成物はアレイの目的でまたはアレイに関連して使用することもできる。より詳しくは、本発明の抗原ペプチドまたは組成物の少なくとも一つを支持体に固定化することができる。この支持体は、通常、本発明のペプチドまたは組成物の一つまたはいくつかを用いることにより多様性をもたらしうる種々のペプチド/タンパク質を含む。そのようなアレイを、および任意のアレイを特徴付ける特徴は、一般に、支持体またはその表面上の異なるまたは所定の領域または位置に、異なるペプチドが固定化されるという事実である。アレイの異なる位置または領域でのこの任意の活性のために、特定のポリペプチドと関連付けることができる。支持体上に固定化される本発明の異なるペプチドまたは抗体の数は、本発明のわずかに10種から数1000種の異なるペプチドまたは組成物に及びうる。あるいは、本発明により産生される抗体を用いて、本発明の抗原ペプチドまたは組成物を検出することもできる。
【０１５０】
そのようなアレイの製造は当業者に公知であり、例えば、米国特許第5,744,309号に記載されている。アレイは、好ましくは、少なくとも第一の表面を有する平面的な、多孔性または非多孔性の固体支持体を含む。好ましい支持体材料は、数ある中で、ガラスまたはセルロースである。本明細書において記載される診断的適用のいずれにもアレイが使用されることも本発明の範囲内である。本発明のペプチドまたは抗体は別として、同様に、本発明による核酸分子を上記のアレイの作製に使用することができる。
【０１５１】
肺炎連鎖球菌の感染を診断する代替方法は、
(a) 対象から得られたサンプルを本発明の一つまたは複数の核酸に特異的なプライマーおよび/またはプローブと接触させる段階、ならびに
(b) サンプル中の本発明の一つまたは複数の核酸の存在を検出する段階
を含み、
一つまたは複数の核酸の存在が肺炎連鎖球菌感染を示す。
【０１５２】
特異的なプライマーおよび/またはプローブを用いることによりプローブ中の核酸を検出する一連の方法は、当技術分野において公知である。一般に、これらの方法は、対象とする核酸とのプライマーまたはプローブの特異的結合に基づいている。この方法は、実際の検出段階の前に、核酸、例えばRNAまたはDNAの増幅を伴うことがある。それゆえ、検出可能な量の核酸をもたらすために、RNAまたはDNAの転写および/または増幅を特異的に誘導するようにプライマーを使用することができる。適当な周知の技術は、PCRおよびRT-PCRでありうる。本発明の方法に適したプライマーおよびプローブは、本出願において示される配列情報に基づいて作製することができる。特定の核酸に対するプライマーおよびプローブをデザインするためのガイドラインおよびコンピュータ支援プログラム(例えばPrimer Express(登録商標), Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)は、当業者に公知である。
【０１５３】
増幅段階の後、増幅された核酸、一般にDNAは、例えば、そのサイズ(例えばアガロースゲル電気泳動を伴うこと)により、または、増幅された核酸に特異的に結合する標識プローブを用いることにより検出することができる。プローブは色素、放射性マーカー、蛍光マーカー、酵素結合マーカーまたはその他任意のマーカーで標識することができる。
【０１５４】
例えば、FRET (Forster共鳴エネルギー転移)を、本発明の核酸の検出に使用することができる。FRETでは、供与体フロオロフォア分子が励起エネルギーを吸収し、双極子間相互作用を介してこれをすぐ近くの受容体フロオロフォア分子に渡す。この過程は、供与体および受容体分子がお互いに十分に近い場合にだけ起こる。供与体および受容体成分の最適な物理的配置を決定するためのいくつかの異なる戦略は、当業者に公知である。このため、蛍光供与体はその特定の蛍光励起波長で励起される。長距離に達する双極子間カップリング機構により、この励起状態は次いで、第二の分子である受容体に非放射的に転移される。供与体は電子基底状態に戻る。記載のエネルギー転移機構は、「Forster共鳴エネルギー転移」(FRET)と呼ばれる。この過程は、DNAハイブリダイゼーションの結果としてFRETの供与体および受容体成分が結び付けられる際の蛍光を測定することを伴う。例えば、適当なマーカーで各々が標識された二つのプローブは、FRETが起きるのを可能にする距離の範囲内で本発明の核酸とハイブリダイズする。適当なマーカーの中には、Cyan 500、Cy5、Cy3、SYBR Green I、フルオレセイン、HEX、Red 610およびRed 640があり、含まれる二つのマーカーは、当業者によって知られるように、それらの励起および発光スペクトルに基づいて選択されなければならない。核酸の検出に適した系はLightCycler(登録商標) (Roche Diagnostics)である。
【０１５５】
本発明のさらなる主題は、以下の段階を含む、本発明による保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または本発明による組成物に結合できるリガンドを同定する方法に関する:
(a) ペプチドおよび/または組成物を含む試験系を提供する段階、
(b) 試験系を試験化合物と接触させる段階、ならびに
(c) ペプチドおよび/または組成物との試験化合物の結合に応じて生じたシグナルを検出する段階。
【０１５６】
より詳しくは、この方法は、本発明による単離されたまたは固定化された抗原ペプチドまたは組成物を、候補リガンドと、ペプチドとの候補リガンドの結合を可能にする条件の下で接触させる段階（試験系には前記ペプチドとの候補リガンドの結合に応じて検出可能なシグナルを供与できる成分が含まれている）と、ペプチドとのリガンドの結合に応じて生じたシグナルの有無を検出する段階とによって行うことができる。リガンドはアゴニストまたはアンタゴニストであってよい。
【０１５７】
リガンドの結合の検出のための試験系は当業者に公知であり、例えば、放射性リガンド、蛍光標識リガンドまたは酵素標識リガンドなどの標識リガンドを用いた結合アッセイ法を含む。
【０１５８】
試験化合物は、天然に存在するか、化学的に合成されるかのいずれかの任意の試験化合物であってよい。天然に存在する試験化合物は、とりわけ抗体、好ましくは本発明の抗体に類似性を示すものを含む。本発明の一つの好ましい態様において、試験化合物は化合物ライブラリの形態で提供される。化合物ライブラリは複数個の化合物を含み、化学的に合成された分子および天然産物を含め、複数の供給源のいずれかより構築されており、または組み合わせ化学技術により作製されている。それらは高速大量処理スクリーニングに特に適している。それらは特定の構造の化合物または植物などの特定の生物の化合物から構成されてもよい。
【０１５９】
本発明のさらなる主題は抗原ペプチドおよび/または組成物の相互作用パートナーの単離および/または精製および/または同定のための、本発明による保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種または本発明による組成物の使用に関する。リガンドの単離および/または精製および/または同定は、上記に詳述のようにまたは当業者に公知のように行うことができる。本発明の好ましい態様において、親和性装置を使用することができる。親和性装置は、少なくとも支持体材料、および支持体材料に付着した本発明による任意の抗原ペプチドまたは組成物を含みうる。本発明による抗原ペプチドおよび/または組成物のその標的細胞もしくは標的分子またはその相互作用パートナーに対する特異性のために、抗原ペプチドおよび/または組成物は、結合のための条件が合えば、支持体材料に適用されたどんな種類のサンプルからでもその相互作用パートナーの選択的除去を可能にする。サンプルは発酵ブロス、細胞残屑、細胞調製物、組織調製物、臓器調製物、血液、尿、リンパ液、溶液(liquor)などを含むがこれらに限定されない、生物学的または医学的サンプルであってよい。ペプチドまたは組成物は、マトリックスに共有結合的にまたは非共有結合的に付着されてもよい。適当な支持体材料は、当業者に公知であり、セルロース、シリコン、ガラス、アルミニウム、常磁性ビーズ、デンプン、およびデキストランを含む群より選択することができる。
【０１６０】
本発明は以下の図面、実施例および配列表によってさらに例証され、それによりさらなる特徴、態様および利点が解釈されうる。本実施例は例証としてのみ与えられており、本開示の限定として与えられるものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】選択された肺炎連鎖球菌抗原での能動免疫によりマウス致死性モデルにおいて達成された保護を示す。C3H/HeNマウス(1群あたりマウス10匹)を、血清型4肺炎連鎖球菌株TIGR4_ICからクローニングされた組み換え抗原で免疫し、血清型6B菌株Pj-1259で抗原投与した。抗原投与後2週間、生存をモニターした。マウスの皮下に、水酸化アルミニウム(ALUM) (A)またはCFA/IFA (B)のいずれかのアジュバントを添加した各組み換えタンパク質50μgを免疫した。次にマウスを、104 cfuの肺炎連鎖球菌6Bで腹腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)を陽性対照とした。抗原投与後15日間生存をモニターし、全動物の割合として描いた。
【図２】SP1732-3とSP2216-1との組み合わせにおける選択された肺炎連鎖球菌抗原の組み合わせでの能動免疫によりマウス致死性モデルにおいて達成された保護を示す。C3H/HeNマウス(1群あたりマウス10匹)を、血清型4肺炎連鎖球菌株TIGR4_ICからクローニングされた組み換え抗原の組み合わせで免疫し、血清型6B菌株Pj-1259で抗原投与した。抗原投与後2週間、生存をモニターした。マウスの皮下に、水酸化アルミニウム(ALUM)のアジュバントを添加した各組み換えタンパク質抗原50μgの混合物を免疫した。次にマウスを、104 cfuの肺炎連鎖球菌6Bで腹腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)を陽性対照とした。抗原投与後15日間、生存をモニターし、全動物の割合として描いた。(AおよびBには二つの異なる実験が描いてある)。
【図３】SP1732-3とSP1650 (PsaA)との組み合わせにおける選択された肺炎連鎖球菌抗原の組み合わせでの能動免疫によりマウス致死性モデルにおいて達成された保護を示す。C3H/HeNマウス(1群あたりマウス10匹)を、血清型4肺炎連鎖球菌株TIGR4_ICからクローニングされた組み換え抗原の組み合わせで免疫し、血清型6B菌株Pj-1259で抗原投与した。抗原投与後2週間、生存をモニターした。マウスの皮下に、水酸化アルミニウム(ALUM)のアジュバントを添加した各組み換えタンパク質抗原50μgの混合物を免疫した。次にマウスを、104 cfuの肺炎連鎖球菌6Bで腹腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)を陽性対照とした。抗原投与後15日間、生存をモニターし、全動物の割合として描いた。(AおよびBには二つの異なる実験が描いてある)。
【図４】選択された肺炎連鎖球菌抗原での能動免疫により肺炎モデルにおいて達成された保護を示す。CD-1マウス(1群あたりマウス10匹)の皮下に、ALUMのアジュバントを添加したタンパク質抗原50μgを免疫した。(A)マウスを105 cfuの肺炎連鎖球菌WU2 (血清型3)で鼻腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)および溶解物(WU2)を陽性対照とした。(B)マウスを、5×107 cfuの肺炎連鎖球菌EF3030で鼻腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)およびプレべナーを陽性対照とした。肺炎の読み取りとして、肺を3日目に無菌条件下で取り出し、ホモジナイズし、肺ホモジネートの培養物を、血液寒天プレート上に定量的にプレーティングした。各個々のマウス(マウス10匹/群)に対してcfu/臓器を決定した。
【図５】SP1732-3とSP2216-1との組み合わせにおける選択された肺炎連鎖球菌抗原の組み合わせでの能動免疫により肺炎モデルにおいて達成された保護を示す。CD-1マウス(1群あたりマウス10匹)の皮下にALUMのアジュバントを添加したタンパク質抗原50μgを免疫した。(A)マウスを105 cfuの肺炎連鎖球菌WU2 (血清型3)で鼻腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)および溶解物を陽性対照とした。(B)マウスを、5×107 cfuの肺炎連鎖球菌EF3030 (血清型19F)で鼻腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)およびプレべナーを陽性対照とした。肺炎の読み取りとして、肺を3日目に無菌条件下で取り出し、ホモジナイズし、肺ホモジネートの培養物を、血液寒天プレート上に定量的にプレーティングした。各個々のマウス(マウス10匹/群)に対してcfu/臓器を決定した。
【図６】選択された肺炎連鎖球菌抗原での能動免疫によりマウス致死性モデルにおいて達成された保護を示す。C3H/HeNマウス(1群あたりマウス10匹)を、TIGR4_ICまたはPj-1259肺炎連鎖球菌株からクローニングされた組み換え抗原で免疫し、血清型6B菌株Pj-1259で抗原投与した。抗原投与後14日間、生存をモニターした。マウスの皮下に、水酸化アルミニウム(ALUM)またはIC31(登録商標) (100 nmol KLKLLLLLKLK; 4 nmol ODN1a ([dIdC]13))のいずれかのアジュバントを添加したSP2216-1、SP1732-3、PsaAまたはこれらの抗原の組み合わせ50μgを免疫した。次にマウスを、104 cfuの肺炎連鎖球菌6Bで腹腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)を陽性対照とした。生存の割合を7日目(A)または14日目(B)のいずれかにて描いてある。アジュバントとして水酸化アルミニウムを用いた二回の独立した実験(黒棒)またはIC31(登録商標)を用いた二回の独立した実験(白棒)を描いてある。
【図７】SP1732-3およびSP2216-1での能動免疫により鼻腔内マウス敗血症モデルにおいて達成された保護を示す。NMRIマウス(1群あたりマウス10匹)の皮下に、CFA/IFAのアジュバントを添加したタンパク質抗原50μgを免疫した。マウスを5×106 cfuの肺炎連鎖球菌6301 (血清型1)で鼻腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)を陽性対照とした。抗原投与後16日間生存をモニターし、全動物の割合として描いた。
【図８】SP1732-3およびSP2216-1での能動免疫により静脈内マウス敗血症モデルにおいて達成された保護を示す。CBA/Nマウス(1群あたりマウス10匹)の皮下に、CFA/IFAのアジュバントを添加したタンパク質抗原50μgを免疫した。マウスを、5×104 cfuの肺炎連鎖球菌TIGR4_DB (血清型4)で静脈内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)を陽性対照とした。抗原投与後12日間、生存をモニターし、全動物の割合として描いた。
【図９】SP1732-3およびSP2216-1での能動免疫により肺炎モデルにおいて達成された保護を示す。CBA/Nマウス(1群あたりマウス10匹)の皮下に、CFA/IFAのアジュバントを添加したタンパク質抗原50μgを免疫した。マウスを、107 cfuの肺炎連鎖球菌EF3030 (血清型19F)で鼻腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)を陽性対照とした。肺炎の読み取りとして、抗原投与後6日目に無菌条件下で肺を取り出し、ホモジナイズし、肺ホモジネートの培養物を血液寒天プレート上に定量的にプレーティングした。各個々のマウス(マウス5〜10匹/群)に対してcfu/臓器を決定した。
【図１０】SP1732-3、SP2216-1、およびSP1650 (PsaA)、ならびにSP1732-3、SP2216-1 (およびSP1650)の組み合わせでの能動免疫により肺炎モデルにおいて達成された保護レベルを示す。CD-1マウス(1群あたりマウス10匹)の皮下に、水酸化アルミニウム(ALUM)のアジュバントを添加したタンパク質抗原50μgを免疫した。マウスを、(A) 105 cfuの肺炎連鎖球菌WU2 (血清型3)または(B) 5×107 cfuの肺炎連鎖球菌EF3030 (血清型19F)で、鼻腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)、プレべナーおよび/または溶解物を陽性対照とした。肺炎の読み取りとして、抗原投与後3日目に無菌条件下で肺を取り出し、ホモジナイズし、肺ホモジネートの培養物を血液寒天プレート上に定量的にプレーティングした。各個々のマウスに対してcfu/臓器を決定した。2回または3回の実験の概要を示してある(マウス10匹/群/実験)。統計的有意性(マン・ホイットニー(Mann-Whitney)二標本順位検定)を星印で示してある。
【図１１】SP1732-3とSP2216-1との組み合わせでの、またはSP1732-3、SP2216-1とSP1650 (PsaA)との組み合わせでの能動免疫によりマウス致死性モデルにおいて達成された保護レベルを示す。C3H/HeNマウス(1群あたりマウス10匹)の(A)皮下にまたは(B)筋肉内に、ALUMのアジュバントを添加した組み換え抗原の各組み合わせを免疫した。マウスを、104 cfuの肺炎連鎖球菌6Bで腹腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)を陽性対照とした。生存を抗原投与後12日間モニターし、全動物の割合として描いた。
【図１２】SP1732-3とSP2216-1との組み合わせでの、またはSP1732-3、SP2216-1とSP1650 (PsaA)との組み合わせでの能動免疫により鼻腔内マウス敗血症モデルにおいて達成された保護レベルを示す。NMRIマウス(1群あたりマウス10匹)の皮下に、ALUMのアジュバントを添加したタンパク質抗原50μgを免疫した。マウスを5×106 cfuの肺炎連鎖球菌6301 (血清型1)で鼻腔内から抗原投与した。アジュバント対照マウスを陰性対照として使用し、PspA (SP0117)を陽性対照とした。抗原投与後10日間、生存をモニターし、全動物の割合として描いた。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１６２】
実施例1: 組み換え肺炎球菌抗原のクローニングおよび発現、それらの配列解析ならびに保存された抗原の同定
実験手順
遺伝子/DNA断片のクローニング: 関心対象の遺伝子/DNA断片を肺炎連鎖球菌血清型6B菌株Pj-1259または血清型4菌株TIGR4_ICのゲノムDNAから、遺伝子特異的なプライマーを用いてPCRにより増幅した。プライマーには、遺伝子特異的な部分とは別に、増幅されたPCR産物の方向性クローニングに役立つ制限部位を持たせた。プライマーの遺伝子アニーリング(特異的)部分は、長さが15〜30塩基に及んだ。得られたPCR産物を適切な制限酵素で消化し、Hisタグ付のタンパク質を得るためpET28b (+)ベクター(Novagen)にクローニングした。これらの構築体を表1に記載する。組み換えプラスミドが関心対象の遺伝子を含有すると確認されたら、発現宿主としての役割を果たす、大腸菌BL21 Star(登録商標)細胞(Invitrogen)を形質転換した。
【０１６３】
(表１) 発現用に選択した遺伝子の一覧表。遺伝子の命名および付番は、肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelinの公開されたゲノムに由来する。単位複製配列のクローニングに用いた制限部位(RE)および位置(開始/停止)を構築体ごとに示してある。＊, 天然タンパク質に対して50位の残基セリンは発現構築体の配列確認によればプロリンに変化していた。＊＊, 天然タンパク質に対して9位の残基グルタミン酸は発現構築体の配列確認によればグリシンに変化していた。どちらの突然変異もPCR増幅によるものでありうる、またはPCR増幅に使われた特定のTIGR4_IC菌株における突然変異でありうる。
2011514167.tif 000004
【０１６４】
タンパク質の発現および精製:
組み換えプラスミドを内部に持つ大腸菌BL21 star(登録商標)細胞を、必要な培養量のなかで対数期に増殖させた。OD600 nm 0.6に達したら、培養物を37℃で3時間0.5 mM IPTGにより誘導した。細胞を遠心分離によって収集し、凍結融解法に続いて「Bug-buster(登録商標)」、(Novagen)での細胞の破壊の組み合わせによって溶解した。遠心分離によって溶解物を可溶性(上清)および不溶性(ペレット)画分に分離した。タンパク質の場所に応じて、異なる精製戦略を適用した。
【０１６５】
A) Hisタグ付のタンパク質が可溶性画分にあれば、上清をNi-Sepharoseビーズ(Ni-Sepharose(商標) 6 Fast Flow, GE Healthcare)に結合させることによってタンパク質の精製を行った。発現されたタンパク質のC末端のヘキサヒスチジン(6×HIS)の存在により、これはNi-Sepharoseに結合したのに対し、その他の混入タンパク質は洗浄用緩衝液によってカラムから洗浄された。20 mM NaH2PO4、0.5 mM NaCl緩衝液pH 7.4中500 mMのイミダゾールによってタンパク質を溶出した。溶出液を濃縮し、タンパク質濃度についてBradfordまたはBCAによってアッセイし、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットにより調べた。
【０１６６】
B) タンパク質が不溶性画分にあれば、8 M尿素を含有する適当な緩衝液中でペレットを可溶化し、上記と同じ材料および手順を用いて、変性条件下(8 M尿素を含有する緩衝液中)でNi-NTAカラムにアプライした。尿素を含まない洗浄用緩衝液によってカラムから混入タンパク質を洗浄した。Hisタグ付のタンパク質の再折り畳みが行われ、タンパク質がNi-NTAマトリックスに固定化された。復元後、500 mMイミダゾールの添加によってタンパク質を溶出した。溶出液を透析して微量の尿素を除去し、容量が大きければ濃縮し、SDS-PAGEによって調べ、Bradford法またはBCA法によって測定した。
【０１６７】
連鎖球菌ゲノムDNAの調製
Todd-Hewitt Broth培地5 mlに凍結スタッブ(frozen stab)からの肺炎連鎖球菌の各菌株を接種し、終夜37℃で振盪させずに増殖させた。次に培養液4 mlを5分間、biofuge fresco (Heraeus)中、13,000 rpmで遠心分離することによって収集し、上清を除去した。Wizard(登録商標) Genomic DNA Purification Kit (Promega)のプロトコルにしたがって細菌細胞のペレットからDNAを単離した。DNAペレットを最後に外気にて乾燥し、ddH2O 70μlに溶解した。
【０１６８】
肺炎球菌抗原のPCR増幅
関心対象の遺伝子に特異的なプライマーを用いて、一連の独立した肺炎連鎖球菌分離株(表2)に対しPCRを行った。三つのワクチン候補用に公開プログラムPrimer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www_slow.cgi)を用いて、プライマーとしてのオリゴヌクレオチド配列をデザインした。完全な遺伝子を増幅することができるように選択された抗原に向けてPCR用のプライマーとしてのオリゴヌクレオチド配列をデザインした。全ての肺炎連鎖球菌株のゲノムDNAを上記のように調製した。Taqポリメラーゼ(1 U)、200 nM dNTP、10 pMolの各オリゴヌクレオチド、DNAおよそ10〜20 ng、およびキットを、製造元の使用説明書(Invitrogen, The Netherlands)にしたがって用い、反応容量25μl中でPCRを行った。条件を個々のプライマー対に適合させなければならなかった場合を除き、基準として、30サイクル(1回: 95℃で5分、30回: 95℃で30秒、56℃で30秒、72℃で120秒、1回: 72℃で4分)を行った。PCR増幅はBiometra T3 Thermocycler中で行った。
【０１６９】
最初の増幅ラウンドにおける全ての陰性PCR反応は、以下の条件を適用して繰り返した:
ゲノムDNA (ddH2Oに33分の1希釈した; およそ10〜20 ng) 5μl
10×緩衝液(Invitrogen Taq Polymerase I) 2.5μl
50 mM MgCl2 1.0μl
2 mM dNTP 2.5μl
10 pMオリゴヌクレオチド各1μl
Invitrogen Taq Polymerase I (5 U/μl) 0.2μl
ddH2O 11.8μl。
【０１７０】
その後、DNAサンプルを1%アガロースゲル上での電気泳動によって可視化し、臭化エチジウム(EtBr)で染色した。可能なら、オリゴヌクレオチドのデザインは、抗原性と同定された全ての領域を組み入れるように行った。遺伝子が1,000 bpよりも小さかった場合には、全遺伝子を分析に用いた。全てのオリゴヌクレオチドを表3に記載する。
【０１７１】
表1に記載した二つの点突然変異(＊および＊＊で印を付けた)は、PCR増幅によるものでありうる。したがって、これらの点突然変異がないSP0609およびSP2194の保護ペプチドの各配列は、それぞれ、SEQ ID NO:17および18として示してある。
【０１７２】
(表２) 本研究に利用された肺炎連鎖球菌株。＊, The TIGR4_DB株(Ren, B., et al. (2003), Infect Immun. 71: 75-85)およびTIGR4_IC株は、ゲノムデータベースにおいて公的に入手可能な、配列比較のために用いたTIGR4_Tettelin株(Tettelin et al. (2001), Science 293: 498-506)とは異なる。
2011514167.tif 000005
2011514167.tif 000006
2011514167.tif 000007
【０１７３】
(表３) 配列保存解析に用いたオリゴヌクレオチド。示したのは、ORFおよびプライマー名、配列番号、遺伝子に対するプライマーの方向、配列、ならびに遺伝子に対する位置である。オリゴヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子断片のPCR増幅にもその後の配列解析にも使用した。
2011514167.tif 000008
2011514167.tif 000009
【０１７４】
肺炎連鎖球菌遺伝子の配列解析
多様な肺炎連鎖球菌株由来の抗原の配列を決定するために、上記のように関心対象の遺伝子に特異的なプライマーでPCRを行った。これらの解析に用いた肺炎連鎖球菌株を表2に示す。PCR産物を鋳型として用い、専用プライマーで配列決定を行った。オリゴヌクレオチドの配列を表3に記載する。全ての肺炎連鎖球菌株のゲノムDNAは、上記のように調製した。条件を個々のプライマー対に適合させなければならなかった場合を除き、上記のように反応容量25μl中でPCRを行った。PCRサンプルを表3に記載のオリゴヌクレオチドで配列決定した。配列決定はAgowa (Germany)で行われた。
【０１７５】
結果
選択された肺炎球菌抗原は高度に保存されている
5つの選択遺伝子のPCRおよび配列決定は、方法の項に記載されているように行った。表2は配列決定に用いた菌株を示し、表3はPCRおよび配列決定解析に利用したオリゴヌクレオチドを記載している。全体として、表9は、各遺伝子の配列が決定された全ての菌株を記載している。それらの菌株を、本明細書においてTIGR4_Tettelinと表した、基準菌株の肺炎連鎖球菌TIGR4 (Tettelin et al. (2001), Science 293: 498-506)と比較した。したがって、表4〜8中の基準位置は肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelinの各位置を指す。
【０１７６】
SP0498の配列解析
配列を51種の肺炎球菌株から得た。アミノ酸配列同一性のレベルは、肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelin由来のSP0498の配列と比較して、98.2%から100%にまで及んでいた。表4は、基準菌株の肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelin由来のSP0498と比較して、異なるアミノ酸を示した全119アミノ酸の位置を記載している。
【０１７７】
(表４) SP0498の遺伝子保存。1,2、各肺炎連鎖球菌株の配列決定済み遺伝子のいずれかにおいて各位置に認められたアミノ酸。-、アミノ酸欠失。菌株Pj-1298は、基準菌株の肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelin株に対して788位の後続の36アミノ酸
2011514167.tif 000010
の挿入を示す。
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【０１７８】
SP0609の配列解析
配列を54種の肺炎球菌株から得た。アミノ酸配列同一性のレベルは、肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelin由来のSP0609の配列と比較して、90.3%から100%にまで及んでいた。表5は、基準菌株の肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelin由来のSP0609と比較して、異なるアミノ酸を示した全42アミノ酸の位置を記載している。
【０１７９】
(表５) SP0609の遺伝子保存。1,2、各肺炎連鎖球菌株の配列決定済み遺伝子のいずれかにおいて各位置に認められたアミノ酸。n.p.、対応するアミノ酸が存在しない。
2011514167.tif 000017
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【０１８０】
SP0749の配列解析
配列を53種の肺炎球菌株から得た。アミノ酸配列同一性のレベルは、肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelin由来のSP0749の配列と比較して、99%から100%にまで及んでいた。表6は、基準菌株の肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelin由来のSP0749と比較して、異なるアミノ酸を示した全13アミノ酸の位置を記載している。
【０１８１】
(表６) SP0749の遺伝子保存。1、各肺炎連鎖球菌株の配列決定済み遺伝子のいずれかにおいて各位置に認められたアミノ酸。菌株Pj-1229は、基準菌株のTIGR4_Tettelinに対して294位の後続の2アミノ酸(AK)の挿入を示す。
2011514167.tif 000019
【０１８２】
SP2027の配列解析
配列を53種の肺炎球菌株から得た。アミノ酸配列同一性のレベルは、肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelin由来のSP2027の配列と比較して、97.8%から100%にまで及んでいた。表7は、基準菌株の肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelin由来のSP2027と比較して、異なるアミノ酸を示した全7アミノ酸の位置を記載している。
【０１８３】
(表７) SP2027の遺伝子保存。1、各肺炎連鎖球菌株の配列決定済み遺伝子のいずれかにおいて各位置に認められたアミノ酸。
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【０１８４】
SP2194の配列解析
配列を18種の肺炎球菌株から得た。アミノ酸配列同一性のレベルは、肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelin由来のSP2194の配列と比較して、99.3%から100%にまで及んでいた。表8は、基準菌株の肺炎連鎖球菌TIGR4_Tettelin由来のSP2194と比較して、異なるアミノ酸を示した全17アミノ酸の位置を記載している。
【０１８５】
(表８) SP2194の遺伝子保存。1、各肺炎連鎖球菌株の配列決定済み遺伝子のいずれかにおいて各位置に認められたアミノ酸。
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【０１８６】
(表９) 各種菌株における肺炎連鎖球菌遺伝子の配列保存。
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【０１８７】
実施例2: 致死性の敗血症および肺炎モデルにおいて肺炎連鎖球菌に対する保護免疫応答を誘導する肺炎球菌抗原および組み合わせ
実施例2.1: 致死性の敗血症および肺炎モデルでの保護に関する5種の新規肺炎球菌抗原の評価
実験手順
組み換え肺炎球菌タンパク質の発現および精製: 実施例1に記載した通り。
【０１８８】
動物保護試験
動物: C3H/HeNおよびCD-1雌性マウスを用いた。
【０１８９】
能動免疫: 完全フロインドアジュバント(CFA)または水酸化アルミニウム(ALUM)のアジュバントを添加して、組み換えタンパク質50μgを皮下注射した。動物を14日目および28日目に、同量のタンパク質およびアジュバント(CFAを除き、不完全フロインドアジュバント(IFA)を用いた)で2回追加免疫した。公表されている保護抗原PspA (SP0117)、溶解物またはプレべナーを陽性対照として使用し、アジュバントのみで免疫したマウスを陰性対照とした。各組み換えタンパク質を用いてELISAにより、35日目に抗体力価を測定した。
【０１９０】
細菌抗原投与: 肺炎連鎖球菌の血清型6B菌株Pj-1259、血清型19F菌株EF3030、または血清型3菌株WU2の凍結グリセロールストックを調製し、全ての実験に使用した。細菌接種材料に存在する生存細胞数を決定するため、血液寒天プレート上にプレーティングすることによってcfuを決定した。個々のマウスへの抗原投与として、腹腔内にまたは鼻腔内に1×104〜5×107 cfuを適用した。鼻腔内に適用する場合、処置の前にマウスを麻酔した。免疫による保護を敗血症および肺炎の両方のモデルで測定した。腹腔内敗血症モデル(血清型6B菌株Pj-1259)では、抗原投与後2週間、生存率を追跡し、生存を動物全数(マウス10匹/群)の割合として表現した。肺炎モデル(血清型19F菌株EF3030、血清型3菌株WU2)の場合、抗原投与後3日目に無菌条件下で肺を取り出し、ホモジナイズし、肺ホモジネートの培養物を血液寒天プレート上に定量的にプレーティングした。各個々のマウス(マウス5〜10匹/群)に対してcfu/臓器を決定した。
【０１９１】
結果
本発明ではマウス敗血症/致死性モデルにおいておよび肺炎モデルにおいて、高い保護レベルを示す単一の抗原および異なる肺炎球菌抗原の組み合わせが同定された。初期実験では、最初のAIPスクリーニングおよびインビトロでの検証によって選択された、さらに19種の抗原を、敗血症モデルでのその保護について評価するために選抜した。二つの実験を行ったが、一方の実験ではタンパク質にALUMのアジュバントを添加し、もう一方の実験ではタンパク質をCFA/IFAと混合して最大の抗体力価を誘導した。ALUMと組み合わせて試験した19種のタンパク質のうち5つ、すなわちSP0498、SP0609、SP0749、SP2027、およびSP2194が、敗血症モデルにおいて少なくとも部分的な保護を示した(図1A)。CFA/IFAによる反復実験において、試験した19候補のうち最初の実験でも保護的であった3候補、すなわちSP0749、SP2027、およびSP2194が、この場合もある程度の保護を示した(図1B)。
【０１９２】
それら5種の単一のタンパク質を、SP1732-3 + SP2216-1とまたはSP1732-3 + SP1650 (PsaA)と組み合わせた。SP1732-3およびSP2216-1との組み合わせに含まれた全5種のタンパク質(図2)が、陰性対照と比べて保護レベルの増加を示した。これと同じことを、それら5種の候補抗原をSP1732-3およびPsaAと組み合わせた場合に認めることができた(図3)。
【０１９３】
敗血症モデルでの抗原による保護の試験と並行して、実験を肺炎モデルでも行った。これは、肺炎が疾患の主な原因であるような高齢者ワクチンにとりわけ関連しうる。
【０１９４】
WU2肺炎モデルを用いた免疫および抗原投与実験により、単一のタンパク質からは、SP0609、SP2027 (1〜2 logの低下)だけが抗原投与後3日目にコロニー形成に影響を及ぼすことが示された(図4A)。最も有効なのは、同種菌株由来の粗溶解物であった(4 logの低下)。その同じタンパク質をEF3030肺炎モデルでも試験した。前の実験で既に認められたように、実験内でのばらつきは、WU2モデルの場合よりもずっと広範であった。SP2027およびSP2194の場合に、約4 logの顕著な低下を認めることができた。SP0609、PspAおよびプレべナーの場合、わずかな低下を認めた(1〜2 logの低下; 図4B)。
【０１９５】
WU2肺炎モデルにおいて、新しい候補をSP1732-3およびSP2216-1と組み合わせて試験した場合(図5A)、SP0749、SP2027、またはSP2194を含む組み合わせにより、肺中の細菌数が約2 logだけ低減した。SP0498およびSP0609の組み合わせでは、わずかな低下(およそ1 logの低下)を認めることができた。EF3030モデル(図5B)では、SP2027を含む組み合わせでまたはプレべナーで、最良(およそ4 log)の低下を認めた。SP2027との組み合わせの場合、マウスは肺中に高い細菌数を有したか、または3日目までにそれが完全に除去されたかのいずれかであった。SP0609、SP0749、およびSP2194を含む組み合わせでは、抗原投与後3日目に、およそ2 logの肺コロニー形成の中度の低下を示した。
【０１９６】
実施例2.2: 致死性の敗血症および肺炎モデルでの保護に関するさらに3種の肺炎球菌抗原の評価
実験手順
組み換え肺炎球菌タンパク質の発現および精製: 実施例1に記載した通り。
【０１９７】
動物保護試験
動物: C3H/HeN、CBA/NおよびNMRI雌性マウスを用いた。
【０１９８】
能動免疫: 完全フロインドアジュバント(CFA)、水酸化アルミニウム、またはIC31(登録商標)のアジュバントを添加して、組み換えタンパク質50μgを皮下注射した。動物を14日目および28日目に、同量のタンパク質およびアジュバント(CFAを除き、不完全フロインドアジュバント(IFA)を用いた)で2回追加免疫した。公表されている保護抗原PspA (SP0117)を陽性対照として使用し、アジュバントのみで免疫したマウスを陰性対照とした。免疫が適切な免疫応答を誘導したことを確認するため、各組み換えタンパク質を用いてELISAにより、35日目に抗体力価を測定した。
【０１９９】
細菌抗原投与: 肺炎連鎖球菌の血清型6B菌株Pj-1259、菌株EF3030、または菌株TIGR4_DBの凍結グリセロールストックを調製し、これらの菌株を含め全ての実験に使用した。他の肺炎連鎖球菌株(例えば6301)の場合、新たに増殖した細菌を使用した。細菌接種材料に存在する生存細胞数を決定するため、血液寒天プレート上にプレーティングすることによってcfuを決定した。個々のマウスへの抗原投与として腹腔内に、静脈内に、または鼻腔内に、102〜108 cfuを適用した。鼻腔内に適用する場合、処置の前にマウスを麻酔した。免疫による保護を敗血症および肺炎の両方のモデルで測定した。敗血症モデルでは、抗原投与後およそ2週間、生存率を追跡し、生存を動物全数(マウス10匹/群)の割合として表現した。肺炎モデルの場合、抗原投与後3日目に無菌条件下で肺を取り出し、ホモジナイズし、肺ホモジネートの培養物を血液寒天プレート上に定量的にプレーティングした。各個々のマウス(マウス5〜10匹/群)に対してcfu/臓器を決定した。
【０２００】
結果
マウス敗血症/致死性モデルにおいて、個々のタンパク質だけでよりも大きな保護レベルを示す異なる肺炎球菌抗原の組み合わせが同定された(図6)。最良の保護レベルが、3種の組み換えタンパク質SP2216-1、SP1732-3、およびPsaAの組み合わせでの免疫によって達成されたのに対し、2種だけのタンパク質の組み合わせでは低い保護レベルを認めた(SP2216-1 + SP1732-3はSP2216-1 + PsaAよりも優れ、SP2216-1 + PsaAはSP1732-3 + PsaAよりも優れていた)。PsaAだけでは有意な保護レベルを示さなかったが、その他2種のタンパク質との組み合わせでは保護レベルが顕著に増した。保護レベルに及ぼすマイナスの影響は、試験したタンパク質のいずれにも認められなかった。水酸化アルミニウムアジュバントまたはIC31(登録商標)アジュバント(Intercell AG, Vienna, Austria)のどちらを用いても、保護の相違は見られなかったので、保護レベルの増大は、使用したアジュバントと無関係であった。
【０２０１】
SP2216-1およびSP1732-3は、肺炎連鎖球菌6Bに対して保護的であることが示されただけでなく(図6)、それらは肺炎連鎖球菌の異なる血清型に対する保護を与えることも実証することができた。腹腔内経路に比べてより生理学的な抗原投与経路に当たる鼻腔内適用の後に、肺炎連鎖球菌株6301 (血清型1)に対する敗血症からの保護を示すことができた。SP2216-1は、このモデルで敗血症に対して相当の保護レベルを実証し、それは陽性対照タンパク質PspAの保護能よりも高かった。SP1732-3はPspAに匹敵しかつ陰性対照を優に上回る相当の保護レベルを示した(図7)。
【０２０２】
CBA/Nマウスはxid遺伝子において自然突然変異を有し、それゆえ、多糖類に対する抗体を産生する能力がなく、肺炎球菌テイコ酸のホスホコリン決定基に対する血清抗体がない。SP2216-1およびSP1732-3での免疫は、CBA/Nマウスにおいて肺炎連鎖球菌TIGR4_DB株(血清型4)での抗原投与からの保護をもたらした。保護効果は、それゆえ、細菌性多糖類に対してでなく、免疫されたタンパク質に対して作製された抗体に明らかに起因するものであった。TIGR4_DB株は、肺炎連鎖球菌の病毒性の高い菌株であることが周知であるが、マウスは両タンパク質でのワクチン接種後に部分的に保護された。保護レベルは、PspAのもの程には高くなかったが、陰性対照を優に上回っていた(図8)。
【０２０３】
また、肺炎連鎖球菌の種々の血清型を有するさらなる敗血症モデルにおいて顕著な保護を、SP2216-1およびSP1732-3の両タンパク質での免疫後に認めた(データ不掲載)。
【０２０４】
敗血症に加えて、肺炎は患者での肺炎球菌による主な死因である。それゆえ、ワクチン候補SP1732-3およびSP2216-1によって、細菌コロニー形成の防護または低減を誘導できると示すことは適切である。本明細書で本発明者らは、肺炎に対する肺炎球菌抗原の保護効果を実証する。SP2216-1を免疫したマウスは、肺炎連鎖球菌株EF3030 (血清型19F)での抗原投与から6日後に、コロニー形成について肺ホモジネートを試験した場合に、コロニー形成レベルの低減を示した(図9)。SP2216-1ワクチン接種動物は、肺中での細菌負荷の低減(2〜3 logの低減)を明らかに促進した。
【０２０５】
実施例2.3: 保護に関するさらに3種の肺炎球菌抗原のさらなる評価
実験手順
組み換え肺炎球菌タンパク質の発現および精製: 実施例1に記載した通り。
【０２０６】
動物保護試験
動物: C3H/HeN、CD-1およびNMRI雌性マウスを用いた。
【０２０７】
能動免疫: 水酸化アルミニウム(ALUM)のアジュバントを添加して、組み換えタンパク質50μgを、皮下または筋肉内注射した。動物を14日目および28日目に、同量のタンパク質およびアジュバントで2回追加免疫した。公表されている保護抗原PspA (SP0117)、プレべナー、または各溶解物を、陽性対照として使用し、アジュバントのみで免疫したマウスを陰性対照とした。各組み換えタンパク質を用いてELISAにより、35日目に抗体力価を測定した。
【０２０８】
細菌抗原投与: 肺炎連鎖球菌の血清型6B菌株Pj-1259、菌株WU2 (血清型3)、または菌株EF3030 (血清型19F)の凍結グリセロールストックを調製し、これらの菌株を含め全ての実験に使用した。他の肺炎連鎖球菌血清型(例えば肺炎連鎖球菌6301 - 血清型1)の場合、新たに増殖した細菌を全ての実験に使用した。細菌接種材料に存在する生存細胞数を決定するため、血液寒天プレート上にプレーティングすることによってcfuを決定した。個々のマウスへの抗原投与として、腹腔内にまたは鼻腔内に、104〜108 cfuを適用した。鼻腔内に適用する場合、処置の前にマウスを麻酔した。免疫による保護を敗血症および肺炎の両方のモデルで測定した。敗血症モデルでは、抗原投与後2週間、生存率を追跡し、生存を動物全数(マウス10匹/群)の割合として表現した。肺炎モデルの場合、抗原投与後3日目に、無菌条件下で肺を取り出し、ホモジナイズし、肺ホモジネートの培養物を血液寒天プレート上に定量的にプレーティングした。各個々のマウス(マウス10匹/群)に対してcfu/臓器を決定した。
【０２０９】
結果
マウス肺炎モデルにおいて、個々のタンパク質だけでよりも大きなまたは同様な保護レベルを示す異なる肺炎球菌抗原の組み合わせが同定された(図10)。ALUMを用いて免疫することで、WU2 (血清型3)によるコロニー形成の最大の低減が、溶解物対照のほか、2種または3種の組み換えタンパク質SP2216-1、SP1732-3 (およびSP1650 (PsaA))の組み合わせでの免疫によって達成されたのに対し、単一のタンパク質でおよびもう一つの陽性対照PspAでは、それよりも低い保護レベルが認められた(図10A)。SP1650 (PsaA)だけでは顕著な保護レベルを示さなかったが、SP2216-1およびSP1732-3を含む組み合わせを用いた保護にマイナスの影響を及ぼすことはなかった。
【０２１０】
ALUMアジュバントと組み合わせてEF3030肺炎モデル(血清型19F)を用いた免疫および抗原投与実験では、特にSP1732-3、SP2216-1 + SP1732-3、SP2216-1 + SP1732-3 + SP1650、およびプレベナーが、実質的に3日目までに(3〜5 logだけ)肺コロニー形成を低下させることが示された(図10B)。またPspAは、コロニー形成の低減(1〜4 log)に有益な効果を及ぼした。SP1650は、肺コロニー形成を全く低減しなかった。SP1732-3およびSP2216-1との組み合わせで、SP1650は概して、実質的に結果を変化させることはなかった。
【０２１１】
これまで、全ての実験は、皮下の免疫経路を用いて行った。それがマウスで最も効果的な経路であるかどうかを明確にするため、実験を行って6B敗血症/致死性モデルで皮下経路 vs 筋肉内経路を比較した。全3種のタンパク質(SP2216-1、SP1732-3、およびSP1650)を含む組み合わせを、SP2216-1およびSP1732-3の組み合わせと比較した。図11に見られるように、全3種のタンパク質の組み合わせに有意差は認められなかった。2種のタンパク質での組み合わせの場合、皮下経路はわずかに良好な保護を示した。
【０２１２】
タンパク質SP2216-1、SP1732-3、およびSP1650 (PsaA)の組み合わせは、肺炎連鎖球菌6B、WU2、およびEF3030に対して保護的であることが示されただけでなく(図10、11)、それらは肺炎連鎖球菌のさらなる血清型に対する保護を与えることも実証することができた。腹腔内経路に比べてより生理学的な抗原投与経路に当たる鼻腔内適用の後に、肺炎連鎖球菌株6301 (血清型1)に対する敗血症からの保護を得ることができた。最良の保護は、全3種のタンパク質を含む組み合わせまたはSP1732-3およびSP2216-1のみの組み合わせで認められた(図12)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年12月2日(2010.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列からなる保護ペプチドまたは保護ペプチドの機能的に活性な変種。
【請求項２】
a) 保護ペプチドの配列の少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む、保護ペプチドの機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換および/もしくは欠失によって保護ペプチドから得られ、保護ペプチドに対してもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対して、少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; かつ/または
c) 保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種と、さらに保護ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸とからなる、
請求項1記載の保護ペプチドの機能的に活性な変種。
【請求項３】
請求項1または2記載の保護ペプチドまたはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる保護タンパク質からなる群より選択される少なくとも二つのタンパク質を含む、組成物。
【請求項４】
i) 請求項1または2記載の保護ペプチドまたはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる保護タンパク質;
ii) SEQ ID NO:6もしくは7のアミノ酸配列からなるさらなる保護ペプチド、またはさらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなるさらなる保護タンパク質、ならびに
iii) SEQ ID NO:8の支持ペプチドまたは支持ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる支持タンパク質
からなる群より選択される少なくとも二つのタンパク質を含む、組成物であって、
少なくとも二つのタンパク質が、サブグループi)、ii)およびiii)の少なくとも二つから選択される、組成物。
【請求項５】
i) 請求項1または2記載の保護ペプチドまたはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる保護タンパク質;
ii) SEQ ID NO:6もしくは7のアミノ酸配列からなるさらなる保護ペプチド、またはさらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなるさらなる保護タンパク質、ならびに
iii) SEQ ID NO:8の支持ペプチドまたは支持ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる支持タンパク質
からなる群より選択される少なくとも三つのタンパク質を含む、組成物であって、
少なくとも三つのタンパク質がサブグループi)、ii)およびiii)の少なくとも二つから選択される、組成物。
【請求項６】
少なくとも一つのタンパク質がサブグループi)から選択され、かつ少なくとも二つのタンパク質がサブグループii)および/またはiii)から選択され、特に少なくとも三つのタンパク質が三つのサブグループi)、ii)およびiii)から選択される、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも二つのタンパク質の二つまたはそれ以上のタンパク質が一つの融合タンパク質へ組み合わされる、請求項3〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
さらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種が、
a) さらなる保護ペプチドの配列の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む、さらなる保護ペプチドの機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/もしくは欠失によってさらなる保護ペプチドから得られ、かつさらなる保護ペプチドに対しもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; かつ/または
c) さらなる保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種と、さらなる保護ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸とからなる、
請求項4〜7のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
支持ペプチドの機能的に活性な変種が、
a) 支持ペプチドの配列の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む、支持ペプチドの機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/もしくは欠失によって支持ペプチドから得られ、かつ支持ペプチドに対しもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; かつ/または
c) 支持ペプチドもしくはその機能的に活性な変種と、支持ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸とからなる、
請求項4〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
請求項1もしくは2記載の保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種、または請求項3〜9のいずれか一項記載の組成物中に含まれる一つもしくは複数の保護タンパク質のいずれかをコードする、一つまたは複数の核酸。
【請求項１１】
好ましくは肺炎連鎖球菌に対する、より好ましくは肺炎連鎖球菌によって引き起こされた肺炎、菌血症、中耳炎、髄膜炎、副鼻腔炎、腹膜炎および/または関節炎に対する、対象の免疫または処置のための、請求項1もしくは2記載の少なくとも一つの保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種または請求項3〜9のいずれか一項記載の組成物と、任意で薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、薬学的組成物、特にワクチン。
【請求項１２】
(i) 請求項10記載の一つもしくは複数の核酸またはそれに相補的な一つもしくは複数の核酸、および
(ii) 任意で薬学的に許容される担体または賦形剤
を含む、好ましくは肺炎連鎖球菌に対する、より好ましくは肺炎連鎖球菌によって引き起こされた肺炎、菌血症、中耳炎、髄膜炎、副鼻腔炎、腹膜炎および/または関節炎に対する、対象の免疫または処置のための、薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
本発明は以下の図面、実施例および配列表によってさらに例証され、それによりさらなる特徴、態様および利点が解釈されうる。本実施例は例証としてのみ与えられており、本開示の限定として与えられるものではないことを理解されたい。
[請求項1001]
SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列からなる保護ペプチドまたは保護ペプチドの機能的に活性な変種。
[請求項1002]
a) 保護ペプチドの配列の少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む、保護ペプチドの機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換および/もしくは欠失によって保護ペプチドから得られ、保護ペプチドに対してもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対して、少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; かつ/または
c) 保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種と、さらに保護ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸とからなる、
請求項1001記載の保護ペプチドの機能的に活性な変種。
[請求項1003]
請求項1001または1002記載の保護ペプチドまたはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる保護タンパク質からなる群より選択される少なくとも二つのタンパク質を含む、組成物。
[請求項1004]
i) 請求項1001または1002記載の保護ペプチドまたはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる保護タンパク質;
ii) SEQ ID NO:6もしくは7のアミノ酸配列からなるさらなる保護ペプチド、またはさらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなるさらなる保護タンパク質、ならびに
iii) SEQ ID NO:8の支持ペプチドまたは支持ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる支持タンパク質
からなる群より選択される少なくとも二つのタンパク質を含む、組成物であって、
少なくとも二つのタンパク質が、サブグループi)、ii)およびiii)の少なくとも二つから選択される、組成物。
[請求項1005]
i) 請求項1001または1002記載の保護ペプチドまたはその機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる保護タンパク質;
ii) SEQ ID NO:6もしくは7のアミノ酸配列からなるさらなる保護ペプチド、またはさらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなるさらなる保護タンパク質、ならびに
iii) SEQ ID NO:8の支持ペプチドまたは支持ペプチドの機能的に活性な変種を含むまたはそれからなる支持タンパク質
からなる群より選択される少なくとも三つのタンパク質を含む、組成物であって、
少なくとも三つのタンパク質がサブグループi)、ii)およびiii)の少なくとも二つから選択される、組成物。
[請求項1006]
少なくとも一つのタンパク質がサブグループi)から選択され、かつ少なくとも二つのタンパク質がサブグループii)および/またはiii)から選択される、請求項1005記載の組成物。
[請求項1007]
少なくとも三つのタンパク質が三つのサブグループi)、ii)およびiii)から選択される、請求項1005記載の組成物。
[請求項1008]
少なくとも二つのタンパク質の二つまたはそれ以上のタンパク質が一つの融合タンパク質へ組み合わされる、請求項1003〜1007のいずれか一項記載の組成物。
[請求項1009]
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびii)に定義の少なくとも一つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびiii)に定義の少なくとも一つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびii)に定義の少なくとも二つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびiii)に定義の少なくとも二つのタンパク質; または
- i)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびii)に定義の少なくとも一つのタンパク質およびiii)に定義の少なくとも一つのタンパク質
を含む、請求項1004〜1008のいずれか一項記載の組成物。
[請求項1010]
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質; または
- SEQ ID NO:1、2、3、4もしくは5のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる少なくとも一つのタンパク質
を含む、請求項1004〜1009のいずれか一項記載の組成物。
[請求項1011]
さらなる保護ペプチドの機能的に活性な変種が、
a) さらなる保護ペプチドの配列の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む、さらなる保護ペプチドの機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/もしくは欠失によってさらなる保護ペプチドから得られ、かつさらなる保護ペプチドに対しもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; かつ/または
c) さらなる保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種と、さらなる保護ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸とからなる、
請求項1004〜1010のいずれか一項記載の組成物。
[請求項1012]
支持ペプチドの機能的に活性な変種が、
a) 支持ペプチドの配列の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%を含む、支持ペプチドの機能的に活性な断片であり;
b) 少なくとも一つのアミノ酸置換、付加および/もしくは欠失によって支持ペプチドから得られ、かつ支持ペプチドに対しもしくはa)に定義の機能的に活性な断片に対し、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも97%、98%もしくは99%の配列同一性を有し; かつ/または
c) 支持ペプチドもしくはその機能的に活性な変種と、支持ペプチドに対して異種性の少なくとも一つのアミノ酸とからなる、
請求項1004〜1011のいずれか一項記載の組成物。
[請求項1013]
請求項1001もしくは1002記載の保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種、または請求項1003〜1012のいずれか一項記載の組成物中に含まれる一つもしくは複数の保護タンパク質のいずれかをコードする、一つまたは複数の核酸。
[請求項1014]
ベクターまたは肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)以外の細胞に位置する、請求項1013記載の一つまたは複数の核酸。
[請求項1015]
請求項1001もしくは1002記載の少なくとも一つの保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種または請求項1003〜1012のいずれか一項記載の組成物と、任意で薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、薬学的組成物、特にワクチン。
[請求項1016]
(i) 請求項1013もしくは1014記載の一つもしくは複数の核酸またはそれに相補的な一つもしくは複数の核酸、および
(ii) 任意で薬学的に許容される担体または賦形剤
を含む、薬学的組成物。
[請求項1017]
(a) 請求項1001もしくは1002記載の少なくとも一つの保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または請求項1003〜1012のいずれか一項記載の組成物の有効量を、動物に投与する段階、ならびに
(b) 段階(a)の投与に反応して動物により産生された抗体を動物から単離する段階
によって特徴付けられる、抗体を産生するための方法。
[請求項1018]
(a) 請求項1001もしくは1002記載の少なくとも一つの保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または請求項1003〜1012のいずれか一項記載の組成物の有効量と、B細胞を接触させる段階、
(b) 段階(a)のB細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を得る段階、ならびに
(c) 培養ハイブリドーマ細胞により産生された抗体を単離する段階
によって特徴付けられる、抗体を産生するための方法。
[請求項1019]
単離された抗体がさらに精製される、請求項1017または1018記載の方法。
[請求項1020]
好ましくは肺炎連鎖球菌に対する、より好ましくは肺炎連鎖球菌によって引き起こされた肺炎、菌血症、中耳炎、髄膜炎、副鼻腔炎、腹膜炎および/または関節炎に対する、対象の免疫または処置のための医薬の製造のための、請求項1001もしくは1002記載の保護ペプチドおよび/または請求項1003〜1012のいずれか一項記載の組成物および/または請求項1013もしくは1014記載の一つもしくは複数の核酸の使用。
[請求項1021]
(a) 対象から得られたサンプルを、請求項1001もしくは1002記載の保護ペプチドおよび/または請求項1003〜1012のいずれか一項記載の組成物と接触させる段階、ならびに
(b) サンプル中の保護ペプチド、機能的に活性な変種、および/または組成物に対する抗体の存在を検出する段階
を含む、肺炎連鎖球菌感染を診断する方法であって、
抗体の存在が肺炎連鎖球菌感染を示す、方法。
[請求項1022]
(a) 対象から得られたサンプルを、請求項1013または1014記載の一つまたは複数の核酸に特異的なプライマーおよび/またはプローブと接触させる段階、ならびに
(b) サンプル中の請求項1013または1014記載の一つまたは複数の核酸の存在を検出する段階
を含む、肺炎連鎖球菌の感染を診断するための方法であって、
一つまたは複数の核酸の存在が肺炎連鎖球菌感染を示す、方法。
[請求項1023]
(a) ペプチドおよび/または組成物を含む試験系を提供する段階、
(b) 試験系を試験化合物と接触させる段階、ならびに
(c) ペプチドおよび/または組成物との試験化合物の結合に応じて生じたシグナルを検出する段階
を含む、請求項1001もしくは1002記載の保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または請求項1003〜1012のいずれか一項記載の組成物に結合できるリガンドを同定するための方法。
[請求項1024]
ペプチドの相互作用パートナーの単離および/または精製および/または同定のための、請求項1001もしくは1002記載の保護ペプチドもしくはその機能的に活性な変種および/または請求項1003〜1012のいずれか一項記載の組成物の使用。
【国際調査報告】
2011514167.tif 000036
2011514167.tif 000037
2011514167.tif 000038
2011514167.tif 000039
2011514167.tif 000040