(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表される水溶性カンプトテシン誘導体およびその薬学的に許容される塩：
0005826933.tif 000022
（式中、Ｍは、ヒドロキシルを表し、Ａは、ペントースおよび／または塩基の炭素−水素結合、窒素−水素結合、もしくはヒドロキシル基の水素原子の１個もしくは複数が置換されている（デオキシ）ヌクレオシドまたはその類似体である、あるいはＡは、塩基誘導体を含む（デオキシ）ヌクレオシド類似体であって、前記塩基誘導体が、１〜３個の単環式環または縮合環および１〜３個のＮ、ＯまたはＳ原子を有し、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニン以外のヘテロアリール基またはヘテロ脂環式基である、およびＡは、リン酸基と縮合する）。
【請求項２】
式ＩＩの化学構造
0005826933.tif 000023
（式中、Ｒ１が水素、Ｃ１〜Ｃ４アシルを表し、
Ｒ２およびＲ３が、同一である、または異なっており、独立に、水素、ハロ、ヒドロキシル、またはアルコキシ基を表し、
Ｂは、任意選択により置換されたチミン、任意選択により置換されたアデニン、任意選択により置換されたシトシン、任意選択により置換されたグアニン、任意選択により置換されたウラシル、５−フルオロウラシル、５−アザシトシン、２−フルオロアデニン、２−クロロアデニン、または３，４，７，８−テトラヒドロイミダゾ［１，３］−ジアゼピン−８−オールである、あるいは
Ｂは、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニン以外のヘテロ芳香族またはヘテロ脂環式基である）
を有する、請求項１に記載のカンプトテシン誘導体。
【請求項３】
Ｂは、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニン以外のヘテロ芳香族またはヘテロ脂環式基であり、１〜３個の単環式環または縮合環および１〜３個のＮ、ＯまたはＳ原子を有する、請求項２に記載のカンプトテシン誘導体。
【請求項４】
Ｂが、置換チミン、置換アデニン、置換ウラシル、置換シトシン、または置換グアニンであり、置換基が、アルキル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロ脂環式基であり、ヘテロアリールまたはヘテロ脂環式基が、１〜３個の単環式環または縮合環および１〜３個のＮ、ＯまたはＳ原子を含む、請求項２に記載のカンプトテシン誘導体。
【請求項５】
Ｒ１がＣ１〜Ｃ４アシルである、請求項２に記載のカンプトテシン誘導体。
【請求項６】
Ｒ１がアセチルである、請求項５に記載のカンプトテシン誘導体。
【請求項７】
Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＨ、Ｂ＝チミン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、または５−アザシトシンである、請求項２に記載のカンプトテシン誘導体。
【請求項８】
Ｒ１＝Ａｃ、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ、Ｂ＝チミン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、５−アザシトシン、または２−クロロアデニンであって、アミノ基の水素１個がアセチル基で置換されている、請求項２に記載のカンプトテシン誘導体。
【請求項９】
Ｒ１＝Ａｃ、Ｒ２＝Ｆ、Ｒ３＝Ｈ、Ｂ＝２−クロロアデニンであって、アミノ基の水素１個がアセチルで置換されている、請求項２に記載のカンプトテシン誘導体。
【請求項１０】
Ｒ１＝Ａｃ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝ＯＡｃ、Ｂ＝２−フルオロアデニンであって、アミノ基の水素１個がアセチルで置換されている、請求項２に記載のカンプトテシン誘導体。
【請求項１１】
Ｒ１＝Ａｃ、Ｒ３＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＡｃ、Ｂ＝チミン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、５−アザシトシンであって、アミノ基の水素１個がアセチルで置換されている、請求項２に記載のカンプトテシン誘導体。
【請求項１２】
式ＩＩのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＢが、以下の表：
0005826933.tif 000024
に列挙される組合せを有する、請求項２に記載のカンプトテシン誘導体。
【請求項１３】
以下のステップ：
（１）ＰＣｌ３をＲＨのアゾールと反応させて、式ＩＶのホスフィントリアミン反応物を生成するステップ、
0005826933.tif 000025
である。
（２）式ＩＶのホスフィントリアミン反応物をＣＰＴと反応させて、式ＶのＣＰＴ−２０（Ｓ）−Ｏ−ホスホルアミダイトモノエステル中間体を生成するステップ、
0005826933.tif 000026
（３）式ＶのＣＰＴ  ２０（Ｓ）−Ｏ−ホスホルアミダイト中間体を、式ＩＩＩの好適に保護された化合物と反応させて、式ＶＩの２０（Ｓ）−Ｏ−ホスホルアミダイトジエステル前駆体を生成するステップ
0005826933.tif 000027
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、またはＣ１〜Ｃ４アシルを表し、Ｒ１はＨであり、Ｈは、式ＩＩＩの化合物と反応する前に、好適な保護基で置換されており、
Ｒ２およびＲ３は、同一である、または異なっており、それぞれが、水素、ハロ、ヒドロキシル、またはアルコキシを表し、Ｒ２またはＲ３は、ヒドロキシルであり、ヒドロキシル基は、式ＩＩＩの化合物と反応する前に、適切に保護されており、
Ｂは、任意選択により置換されたチミン、任意選択により置換されたアデニン、任意選択により置換されたシトシン、任意選択により置換されたグアニン、任意選択により置換されたウラシル、５−フルオロウラシル、５−アザシトシン、２−フルオロアデニン、２−クロロアデニンまたは３，４，７，８−テトラヒドロイミダゾ［１，３］ジアゼピン−８−オールである、あるいは
Ｂは、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニン以外のヘテロ芳香族またはヘテロ脂環式基であり、１〜３個の単環または縮合環および１〜３個のＮ、ＯまたはＳ原子を有しており、
Ｂは、アミノを含み、アミノ基は、式ＩＩＩの化合物と反応する前に、適切に保護されている）、
（４）式ＶＩの２０（Ｓ）−Ｏ−ホスホルアミダイトジエステル前駆体を加水分解した後、酸化およびアンモノリシスを経て保護基を外し、式ＩＩのＣＰＴ  ２０（Ｓ）−Ｏ−ヌクレオチドＣＰＴ誘導体を生成するステップ、ならびに
（５）任意選択により、式ＩＩの化合物を、対応する塩に転換するステップ
を含む、請求項２に記載の化合物を調製する方法。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか一項の少なくとも１種のカンプトテシン誘導体および薬学的に許容される担体または希釈液を含む、医薬製剤。
【請求項１５】
がんが、肺がん、乳がん、結腸がん、前立腺がん、メラノーマ、膵臓がん、胃がん、肝臓がん、脳腫瘍、腎臓がん、子宮がん、頸がん、卵巣がん、尿路がん、消化管がん、白血病、小細胞性肺がん、固形腫瘍または血液感染性の腫瘍であり、前記がんの治療用の医薬の調製における請求項１４に記載の製剤の使用方法。
【請求項１６】
前記がんが小細胞性肺がんである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが結腸がんである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤学の分野、特に抗がん剤の分野、より具体的にはカンプトテシン誘導体の医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンプトテシン（「ＣＰＴ」）は、Ｗａｌｌとその共同研究者によって、中国原生の植物、カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ  ａｃｃｕｍｉｎａｔａ）（ヌマミズキ科）の葉および樹皮から最初に単離され、特性決定された細胞毒性アルカロイドである（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８８、３８８８、１９６６）。ＣＰＴにとっての第一の細胞内標的は、Ｉ型トポイソメラーゼ（トポＩ）であり、これはＤＮＡ二重らせんの一時的な一本鎖への開裂、巻き戻しおよび再アニーリングによるＤＮＡ複製の間の超らせん染色体ＤＮＡの弛緩化に関与する酵素である。ＣＰＴは、トポＩ−ＤＮＡ二者共有結合複合体の界面で結合し、安定な三者複合体が形成され、これが再アニーリングまたは再結合を妨げ、その結果として複製を介した二本鎖切断およびＤＮＡ損傷を招く。ＣＰＴ阻害は、細胞周期のＳ期中に細胞死をもたらし得るため、ＣＰＴは抗がん剤開発の広範な研究の焦点となってきた（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ／Ｃａｎｃｅｒ、２００６年１０月、第６巻、７８９〜８０２頁；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００４、１２、１５８５〜１６０４頁）。
【０００３】
天然のＣＰＴは、キノリン環（環ＡおよびＢ）、ピロリジン環（環Ｃ）、α−ピリドン環（環Ｄ）、および６員ラクトン環（環Ｅ）の縮合環系からなる５環構造を有する。ＣＰＴは、２０位に不斉中心を１つだけ有し、第３級ヒドロキシル基のＳ体立体配置に起因して右旋性を示す。ＰＨ７以上で、ラクトン環は加水分解されてカルボン酸誘導体を生じ、加水分解プロセスは、Ｅ環の２０（Ｓ）−ＯＨ基とカルボニル基との間の水素結合相互作用によって促進される。Ｅ環の不安定性は、カルボン酸誘導体がヒト血清アルブミンに選択的（１５０倍強）に結合する生理的条件で悪化し、抗がん化学療法剤としてのＣＰＴの臨床応用における大きな制約である。ＣＰＴのカルボン酸誘導体は、生物学的に不活性であるだけでなく、臨床的に非常に有毒でもある。ＣＰＴの薬物分子としての別の欠点は、その難水溶性にある。天然のＣＰＴは、非経口投与に適した水または他の水性媒体に不溶性である。上述の理由から、ＣＰＴを水溶性カルボン酸誘導体とすることは実現可能ではない。上の考察から明白であるように、ＣＰＴのラクトン環のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性および水溶性の改良は、ＣＰＴをベースとする抗がん剤開発における医薬品化学活動の中心となっている（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００４、１２、１５８５〜１６０４頁；Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、２００９、１０９（１）、２１３〜２３５頁）。
【０００４】
Ｅ環ラクトンの加水分解は、２０（Ｓ）−ヒドロキシル基と隣接するカルボニル基との間の水素結合相互作用によって促進されると考えられている。過去の実験は、２０（Ｓ）−ヒドロキシル基を他の基、例えばメチル基に置き換える、または２０（Ｓ）−ヒドロキシル基を官能基、例えばエステルで保護すると、生理的条件で安定したＥ環ラクトンが得られることを示した。しかし、２０（Ｓ）−ヒドロキシル基は、カンプトテシンの薬理学的活性に必須である。このような２０（Ｓ）−ヒドロキシル基の保護は、薬物が人体において抗がん活性を発揮するのを困難にしてしまうと思われる。
【０００５】
プロドラッグ戦略は、イオン性官能基を導入して、結果として得られるプロドラッグ分子の水溶性を改良するのに良いアプローチである。このような場合、プロドラッグアプローチは、水に不溶性のＣＰＴを水溶性ＣＰＴプロドラックに転換できる。水溶性ＣＰＴプロドラッグは、血流中に投与後、短時間で速やかに身体中に分配されると思われるため、ＣＰＴプロドラッグは、分解する時点では非常に低い濃度で存在し、ＣＰＴが血流中で沈降することはないと思われる。明らかに、プロドラッグアプローチは、ラクトンの安定性、水溶性、および好都合な薬物投与をもたらし、ＣＰＴ抗がん剤開発を促進する可能性を有する。
【０００６】
主として、２０（Ｓ）−ヒドロキシル基をエステル化して、脂溶性およびイオン性官能基を含む様々な保護官能基を導入することによってＣＰＴおよびＣＰＴベースの化合物のプロドラッグを調製する報告がある（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、２００９、１０９（１）、２１３〜２３５頁）。プロドラッグエステルの天然ＣＰＴへの転換は、ヒトを含む多くの動物の血液中に存在するエステラーゼと呼ばれる酵素の群を介してもたらされる。プロドラッグエステルの弱点は、エステル結合が、人体中の生理的条件で非常に安定しているわけではなく、エステラーゼによっていとも簡単に壊れてしまう点であり、結果としてＣＰＴプロドラッグエステルの臨床結果は不満足である。（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、２００９、１０９（１）、２１３〜２３５頁）。ＣＰＴ  ２０（Ｓ）−Ｏ−ホスフェートまたはリン酸モノエステルも、水溶性およびラクトンのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を向上させるために調製された。しかし、実験結果で示されるように、２０（Ｓ）−Ｏ−ホスフェートまたはリン酸エステルは、生理的条件でＣＰＴに転換できず、これをＣＰＴのプロドラッグとして使用することは不可能とした（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔ．、２００４、６（３）、３２１〜３２４頁）。ＣＰＴの２０（Ｓ）−Ｏ−ホスフェートまたはリン酸モノエステル誘導体はそれ自体で抗がん活性を持たない。
【０００７】
したがって、ＣＰＴの活性成分または特性を遊離または促進させるために、生理的条件で許容される水溶性および許容される酵素活性を有するＣＰＴプロドラッグを発見することが依然として望まれている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一目的は、許容されるラクトン安定性および水溶性を有する新規なＣＰＴ誘導体を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、生理的条件で、ＣＰＴの抗がん活性成分を放出できる新規なＣＰＴ誘導体を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、ＣＰＴを含む２種の抗がん活性成分を生理的条件で放出して、相乗効果を生むことができる新規なＣＰＴ誘導体を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、上記の２０（Ｓ）−Ｏ−ヌクレオチドＣＰＴ誘導体を、ホスホルアミダイトエステル化学によって調製する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、ある形態のがんを治療する改良された方法を提供することである。
【００１３】
目的を実現するために、また本発明の趣旨にしたがって、実施形態として本明細書に広範に記載されているように、本発明は、式Ｉの化合物およびその薬学的に許容される塩に関する。
0005826933.tif 000002
【００１４】
式中、Ｍは、ヒドロキシルまたはチオールを表し、Ａは、リボースまたはデオキシリボースまたはリボース誘導体を表し、Ａは、ヒドロキシル基の酸素を介してリンに結合している。
【００１５】
好ましくは、本発明のＣＰＴ誘導体は、式ＩＩ’の化学構造を有する。
0005826933.tif 000003
式中、Ｍは、ヒドロキシルまたはチオールを表し、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アシル、または酵素反応部を表し；
Ｒ２およびＲ３は、同一である、または異なっており、独立に、水素、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、または酵素反応部を表し；
Ｂは、水素、置換もしくは非置換チミン、置換もしくは非置換アデニン、置換もしくは非置換シトシン、置換もしくは非置換グアニン、置換もしくは非置換ウラシル、５−フルオロウラシル、５−アザシトシン、２−フルオロアデニン、または２−クロロアデニンである；あるいは
Ｂは、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニン以外のヘテロアリール基またはヘテロ脂環式基であり、好ましくは１〜３個の単環式環および１〜３個のＮ、ＯもしくはＳ原子を有する。
【００１６】
好ましくは、Ｂは、置換チミン、置換アデニン、置換ウラシル、置換シトシン、または置換グアニンであり、置換基は、以下の基：アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基またはヘテロ脂環式基の１つであり、ヘテロアリール基またはヘテロ脂環式基は１〜３個の単環式環または多環式環および１〜３個のＮ、ＯまたはＳ原子を有する。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、Ｍは、ヒドロキシルである。以下の本発明の１つまたは複数の実施形態を説明する実施例において、別段明記しない限り、Ｍは、式ＩＩに示すように、ヒドロキシルである：
0005826933.tif 000004
【００１８】
一実施形態において、Ｒ１は、アシル、より好ましくはアセチルである。
【００１９】
別の好ましい実施形態において、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ、Ｂ＝水素、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、５−フルオロウラシル、５−アザシトシン、３，４，７，８−テトラヒドロイミダゾ［１，３］ジアゼピン−８−オール、２−フルオロアデニン、または２−クロロアデニンである。
【００２０】
別の好ましい実施形態において、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＨ、Ｂ＝Ｈ、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、または５−アザシトシンである。
【００２１】
別の好ましい実施形態において、Ｒ１＝Ａｃ、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ、Ｂ＝Ｈ、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、５−アザチミン、または２−クロロアデニンであり、アミノ基の水素１個はアセチルによって置換されている。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、Ｒ１＝Ａｃ、Ｒ２＝Ｆ、Ｒ３＝Ｈ、Ｂ＝２−クロロアデニンであり、アミノ基の水素１個はアセチルによって置換されている。
【００２３】
別の好ましい実施形態において、Ｒ１＝Ａｃ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝ＯＡｃ、Ｂ＝２−フルオロアデニンであり、アミノ基の水素１個はアセチルによって置換されている。
【００２４】
別の好ましい実施形態において、Ｒ１＝Ａｃ、Ｒ３＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＡｃ、Ｂ＝Ｈ、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、または５−アザチミンであり、アミノ基の水素１個はアセチルによって置換されている。
【００２５】
本発明は、上記の式Ｉを含む化合物を１種または複数含む有効量の組成物を投与することを含む、哺乳類における悪性腫瘍またはがんを治療する方法にも関する。
【００２６】
本発明のカンプトテシン誘導体は、薬物投与および身体中の運搬に適した水溶性を持つだけでなく、カンプトテシンのラクト環の安定性を強化し、薬物毒性も低下させる。
【００２７】
本発明の追加の目的および利点を、部分的に以下の詳述の中で説明していき、一部は記述から明らかになり、固有のものとなるであろう、または本発明の応用によって実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ｄｉｘ−９０５が、Ｈ１６９３細胞において、ＣＰＴよりも良好に殺細胞反応を引き起こしたことを示すグラフである。
【図２】Ｄｉｘ−９０５処理が、Ｈ１６９３において、相乗効果のために、ＣＰＴ、フロクシウリジン、およびエトポシドよりも効果的に殺細胞をもたらしたことを示すグラフである。
【図３】Ｄｉｘ−９０５が、Ｈ１６９３において、カスパーゼ活性化（アポトーシス経路）を介して、時間および用量に依存的な細胞死を引き起こしたことを示すグラフである。
【図４】Ｄｉｘ−９０５が、Ｈ１４６において、ＣＰＴよりも良好に殺細胞反応を引き起こしたことを示すグラフである。
【図５】Ｄｉｘ−９０５が、Ｈ１４６において、ＣＰＴ、フロクシウリジン、およびエトポシドよりも効果的に殺細胞を引き起こしたことを示すグラフである。
【図６】Ｄｉｘ−９０５が、Ｈ１４６において、カスパーゼ活性化（アポトーシス経路）を介して、時間および用量に依存的な細胞死を引き起こしたことを示すグラフである。
【図７】Ｄｉｘ−９０５が、ＨＣＴ１１６結腸細胞において、ＣＰＴ、５−ＦＵおよびエトポシドよりも細胞死を引き起こす上で高い効果があったことを示すグラフである。
【図８】ＨＣＴ１１６細胞におけるＤｉｘ−９０５およびＣＰＴによる用量依存的な細胞死を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
「リボース誘導体」という用語は、リボースまたはデオキシリボースの骨格を有する誘導体であって、該誘導体中で、環に結合する１個もしくは複数の水素、または１個もしくは複数のヒドロキシル水素が他の基で置換されている誘導体を指す。本明細書における該他の基は、アルケニル、アルキニル、アルコキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシル、アミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニルアミノ、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、ケト、チオカルボニル、カルボキシル、カルボキシアルキル、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、複素環チオール、チオール、アルキルチオ、アリール、アリールオキシル、ヘテロアリール、アミノスルホニル、アミノカルボニル  アミノ、ヘテロアリールオキシ、複素環、ヘテロシクロキシル、ヒドロキシアミノ、アルコキシルアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、塩基、および塩基類似体からなる群から選択される。
【００３０】
別段明記されていない限り、「塩基」という用語は、プリンおよびピリミジン、例えばアデニン、グアニン、チミン、シトシン、またはウラシルを含む、通常の生物学的意味を有する。
【００３１】
「塩基類似体」という用語は、１〜３個の単環式環および１〜３個のＮ、ＯまたはＳ原子を有する塩基を指し、該塩基の環骨格はアデニン、チミン、シトシンまたはウラシルとは異なり、好ましくは単環式または２個の縮合ヘテロアレーンである。単環式ヘテロアレーンの例には、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、フラン、［１，２，４］オキサジアゾール、［１，３，４］オキサジアゾール、［１，２，４］チアジアゾール、［１，３，４］チアジアゾールが含まれる。２個の縮合ヘテロアレーンの例には、インダゾール、キナジン、イソキナリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キノリジンが含まれる。単環および２個の縮合ヘテロ脂環式炭化水素の例には、上に列挙した化合物の完全にまたは部分的に水素化された生成物が含まれる。「ヌクレオシド」という用語は、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドなど、リボースまたはデオキシリボースのＣ−１’に結合している塩基によって形成されるグルコシドを指す。
【００３２】
「ヌクレオシド類似体」という用語は、ペントース部分の炭素上の水素および／または塩基の炭素−水素結合、窒素−水素結合、もしくはヒドロキシル基中の水素の１個または複数が置換されている、あるいは塩基類似体が以下のような特徴：１〜３個の単環式環および１〜３個のＮ、ＯもしくはＳ原子を有し、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニン以外のヘテロアリール基またはヘテロ脂環式基を持っている、ヌクレオシド誘導体を指す。
【００３３】
「アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルなどの、１〜５個の炭素原子を含む分岐または非分岐の飽和炭化水素鎖を指す。
【００３４】
「アルコキシル」という用語は、Ｒ−Ｏ−を指し、式中、Ｒは、上記のアルキルであり、任意選択によりハロ、ヒドロキシルまたはアミノで置換されている。アルコキシルの例には、これらに限定されないが、メトキシル、エトキシル、ｎ−プロポキシル、イソプロポキシル、ｎ−ブトキシル、ｔｅｒｔ−ブトキシル、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、１−メチルブトキシ、２−メチルブトキシ、３−メチルブトキシ、ネオペンチルオキシ、トリフルオロメチルオキシなどが含まれる。
【００３５】
「アリール」は、単環式環（例えばフェニル）、多重環（例えばビフェニル）または縮合環（例えば、ナフチルおよびアントリル）を有するＣ６〜Ｃ１８芳香族環基を指す。好ましいアリールとしては、フェニルおよびナフチルなどが挙げられる。
【００３６】
「ヘテロアリール」という用語は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の炭素原子を有し、少なくとも１個の環の１、２、３または４個の環員がＯ、ＮおよびＳ原子から選択される、芳香族（すなわち完全に不飽和の）基から誘導される基を指す。ヘテロアリール基は、単環基（例えば、ピリジルもしくはフリル）または縮合環（例えば、インドリジニル、ベンゾチアゾリルもしくはベンゾチエニル）を有してもよい。ヘテロアリールの例には、これらに限定されないが、［１，２，４］オキサジアゾール、［１，３，４］オキサジアゾール、［１，２，４］チアジアゾール、［１，３，４］チアジアゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キノリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロジン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリンなど、ならびにヘテロアリール含有化合物のＮ−オキシドおよびＮ−アルコキシル誘導体、例えばピリジン−Ｎ−オキシド誘導体が含まれる。
【００３７】
「ヘテロ脂環式」という用語は、１〜５個の環炭素原子がＮ、Ｓ、Ｐおよび／またはＯから選択されるヘテロ原子、好ましくは１〜３個のヘテロ原子で置換され、１個もしくは複数の縮合環による実施形態において、官能基が１６個以下の炭素原子を含む、Ｃ３〜Ｃ７単環式環または２もしくは３個の縮合環の飽和基または部分的不飽和基を指す。ヘテロ脂環式の例には、テトラヒドロフリル、モルホリニル、ピペリジル、ピペラジニル、ジヒドロピリジニルなどがある。
【００３８】
「ヌクレオチド」という用語は、５’−ヒドロキシル基がリン酸に結合しているヌクレオシドを指す。
【００３９】
「ポリヌクレオチド」という用語は、リン酸によって５’−３’配列で連結される２個超のヌクレオシドであって、末端５’−ヒドロキシル基がリン酸に結合する該ヌクレオシドの手段を指す。
【００４０】
「酵素反応部」という用語は、生理的条件で、酵素反応によってヒドロキシル基を生成できる官能基を指すが、典型例はヒドロキシ保護基、例えばヌクレオチド、ポリ（ジヌクレオチド）、アシル、アシルアミノである。
【００４１】
「カンプトテシンプロドラッグ」および「ＣＰＴプロドラッグ」という用語は、生物学的に分解可能な２０（Ｓ）−ヒドロキシ保護基を有するカンプトテシン誘導体を指す。２０（Ｓ）−ヒドロキシ保護基は、生理的条件で、特定の酵素によってゆっくり開裂させて、薬学的に活性なカンプトテシンを放出させることができる。
【００４２】
本発明は、２０（Ｓ）−ヒドロキシを特定の官能基で保護する戦略に基づいており、これによりＥ環ラクトンに好適な度合の安定性を付与し、得られるプロドラッグが酵素分解（生分解）を通して開裂を経て、ＣＰＴ成分を放出できる。本発明は、式Ｉの化学構造を有する新規な水溶性２０（Ｓ）−Ｏ−ヌクレオチドＣＰＴ誘導体およびその薬学的に許容される塩に関する。
0005826933.tif 000005
式中、Ｍはヒドロキシルまたはチオールを表し、Ａはヌクレオシドまたはその類似体を表す。
【００４３】
本発明の一実施形態において、２０（Ｓ）−Ｏ−ヌクレオチドＣＰＴ誘導体は、式ＩＩ’の化学構造を有する。
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式中、Ｍはヒドロキシルまたはチオール、好ましくはヒドロキシルを表し、Ｒ１はＨ、Ｃ１〜Ｃ４アシル、好ましくはアセチル、任意選択により置換されたポリヌクレオチド、好ましくは、任意選択により置換されたポリジヌクレオチド、または酵素反応（特に、開裂可能）部、例えば−ＲＣＯＯＲ’および−ＮＨＣＯＲ（式中、ＲおよびＲ’はＣ１〜Ｃ４アルキルまたはアルケニル、例えばＣ２もしくはＣ３アルケニルである）を表し；
Ｒ２およびＲ３は、同一でも異なっていてもよく、独立に水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、または酵素的に反応性な（特に、開裂可能な）部分（例えば、アセチル）によって保護されているヒドロキシル基を表し；
Ｂは、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、５−フルオロウラシル、５−アザシトシン、２−フルオロアデニン、２−クロロアデニン、水素、任意選択により置換されたチミン、任意選択により置換されたアデニン、任意選択により置換されたシトシン、または任意選択により置換されたグアニンであり、本明細書における任意選択の置換基は、好ましくは、アルキル、アリール、またはヘテロアリールもしくはヘテロ脂環式基であり、該ヘテロアリールまたはヘテロ脂環式基は、好ましくは、１〜３個の単環式環または縮合環を有し、各環の中に１〜３個のＮ、ＯまたはＳ原子を含む。別法として、または代替の実施形態において、Ｂは、１〜３個の単環式環および１〜３個のＮ、ＯまたはＳ原子を有するが、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニン以外のヘテロアリールまたはヘテロ脂環式基である。式Ｉおよび式ＩＩにおいて、Ａ部分のアミノおよびヒドロキシは、当技術分野で知られている保護基によって保護することができる。好ましいアミノ保護基としては、アセチル、ベンゾイル、イソブチリル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ホルミル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、トリチルなどが挙げられる。好ましいヒドロキシ保護基としては、アセチル、トルフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイル、アルキルカルボニル、アルキル、メチル、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリルなどが挙げられる。当業者に知られているその他の好適な保護基は、その開示が本明細書に参照によって組み込まれるＧｒｅｅｎｅ、Ｔ．、Ｗｕｔｓ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗｉｌｅｙ（１９９９）に開示されている。ヒドロキシルおよびアミノに好ましい保護基としては、アミド、エステルなど、酵素反応（特に、開裂可能）部が挙げられる。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、式Ｉおよび式ＩＩにおけるヌクレオシド部分は、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（フロクシウリジン）、チミジン、シチジン、グアノシン、アデノシン、１’，２’−デオキシリボース、デシタビン、アザシチジン、ゲムシタビン、、クロファラビン、クラドリビン、ペントスタチンを表し、ヌクレオシド類似体の５’−酸素はリン原子に共有結合している。式ＩＩにおいて、ヌクレオシド部分は、好ましくは、表１に列挙されているように、Ｒ２、Ｒ３およびＢを組み合わせてまたはその配列順で含む。本明細書に列挙されているヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体のいくつか、例えばチミジン、シチジン、グアノシン、アデノシンなどは、薬物の有効用量レベルでヒトに害を及ぼさないことが証明されており、その他のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体、例えばフロクシウリジン、クロファラビン、クラドリビン、ペントスタチンなどは、抗がん剤として臨床的に用いられてきている。
【００４５】
より好ましくは、本発明において、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、表１に列挙される配列にしたがって組み合わされる。
【００４６】
表１の配列を有する本発明の組成物のさらに好ましい実施形態において、式ＩＩのＲ１は水素またはアセチルである。
0005826933.tif 000007
【００４７】
表１に記載の好ましい実施形態において、式Ｉ中のヒドロキシの水素および／または部分Ａのアミノは、置換されていなくてもよく、アセチル、塩化物およびフッ化物などの、アシルまたはハロゲンによって置換されていてもよい。したがって、式ＩＩの本発明の好ましい化合物は、以下の化学物質を含む：
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【００４８】
上記の式Ｉおよび式ＩＩのＣＰＴ誘導体は、ＣＰＴのプロドラッグとして使用することができる。式Ｉおよび式ＩＩのプロドラッグの、対応するＣＰＴおよび５’−ホスフェートヌクレオチドへの転換は、哺乳類におけるホスホジエステラーゼとして知られている酵素の群を介して行うことができる。本発明の式Ｉおよび式ＩＩの化合物は、血流中に投与された後、短時間のうちに速やかに身体全体に分布し、次いでホスホジエステラーゼを介してＣＰＴおよび５’−ホスフェートヌクレオチドに転換される（Ｂが水素でない場合）。
【００４９】
上記の本発明のＣＰＴ誘導体は、優れた水溶性およびＣＰＴラクトン安定性を有し、生理的条件で代謝してＣＰＴを生成することができる。本発明の誘導体は、血流中でＣＰＴの沈降を回避し、結果的に毒性が低くなり、効果が高くなる。
【００５０】
好ましくは、Ｂがヌクレオシド類似体である場合、本発明のＣＰＴ誘導体は、生理的条件で第２の生物活性化合物を生成することができる。これらに限定されないが、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（フロクシウリジン）、デシタビン、アザシチジン、ゲムシタビン、クロファラビン、クラドリビン、ペントスタチンを含む多くのヌクレオシド類似体が抗腫瘍活性を有することが知られ、抗がん剤として臨床上使用されている。これらのヌクレオシドは全て、有効になるためにはリン酸化反応を必要とし、主に代謝拮抗物質およびＤＮＡ複製阻害剤として働く。したがって、本発明のＣＰＴ誘導体中に上記のヌクレオシド素子を１種または複数有すると、治療効果を高めることができる。
【００５１】
式ＩＩの２０（Ｓ）−Ｏ−ヌクレオチド・カンプトテシン誘導体の調製は、好ましくは、スキーム１に示すように、ホスホルアミダイト化学によって行われる。ここで、Ｍはチオールであり、合成後、最終ステップにおいてＢｅａｕｃａｇｅ試薬を使う以外は同様のアプローチが行われる。
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【００５２】
スキーム１において、ＣＰＴ  ２０（Ｓ）−Ｏ−ホスホルアミダイト中間体を介して、合成は以下のステップを含む：
（１）ＰＣｌ３をＲＨのアゾールと反応させ、式ＩＶのホスフィントリアミン反応物を生成する：
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である。
（２）式ＩＶのホスフィントリアミン反応物をＣＰＴと反応させて、式ＶのＣＰＴ  ２０（Ｓ）−Ｏ−ホスホルアミダイトモノエステル中間体を生成する：
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（３）式ＶのＣＰＴ  ２０（Ｓ）−Ｏ−ホスホルアミダイトモノエステル中間体を、好適に保護された式ＩＩＩの化合物と反応させ、式ＶＩの２０（Ｓ）−Ｏ−ホスホルアミダイトジエステル前駆体を生成する：
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式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、前記の通りであり、Ｒ１はＨであり、これはスキーム１の合成プロセス間で式ＩＩＩの化合物と反応させる前に好適な保護基で置換され、Ｒ２またはＲ３はヒドロキシであり、前記ヒドロキシはスキーム１の合成プロセス間で式ＩＩＩの化合物と反応させる前に保護基で保護されており、Ｂはアミノを含み、アミノは、スキーム１の合成プロセス間で式ＩＩＩの化合物と反応させる前に保護基で保護される。
（４）式ＶＩの２０（Ｓ）−Ｏ−ホスホルアミダイトジエステル前駆体を加水分解した後、酸化およびアンモノリシスによって保護基を除去して、式ＩＩのＣＰＴ  ２０（Ｓ）−Ｏ−ヌクレオチドＣＰＴ誘導体を生成する。
（５）式ＩＩの化合物を塩基と反応させることによって、前記化合物を対応する塩に転換し、対応する塩を得る。このステップで使用できる塩基としては、これらに限定されないが、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＫＯＨ、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＬｉＯＨ、ＬｉＨＣＯ３、Ｌｉ２ＣＯ３、ＮＨ４ＨＣＯ３、Ｃａ（ＯＨ）２、ＣａＣＯ３、Ｃａ（ＨＣＯ３）２、Ｍｇ（ＨＣＯ３）２、Ｚｎ（ＨＣＯ３）２、Ｚｎ（ＯＨ）２、およびＦｅ（ＯＨ）３が挙げられ、第四級アンモニウム塩が所望される場合、好適な第四級アンモニウム塩基が使用される。
【００５３】
スキーム１に例示される本発明の方法の実施形態によれば、無水トリアゾール（３当量）および新たに蒸留したピリジンを、不活性ガスの保護下で、乾燥した反応容器の中に加えた後、氷浴中で冷却しながら三塩化リン（１．５当量）を加える。次いで氷浴を外す。室温で０．２〜５時間撹拌した後、新たに蒸留したピリジンに溶かした無水ＣＰＴ（１．５当量）を添加する。ＣＰＴが完全になくなるまでまたは転換されるまで、この混合液を室温で１〜１２時間撹拌し続ける。次いで、新たに蒸留したピリジンに事前に溶かしておいた、適切に保護された５’−ＯＨヌクレオシド（１〜３当量）を添加する。０．２〜０．５時間撹拌した後、式ＶＩの２０（Ｓ）−Ｏ−ホスホルアミダイトジエステルが生成し、次いで、これを含水ＴＨＦ中のヨウ素（２〜１０当量）または過酸化物（例えば過酸化水素、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド）で１０分間酸化して、好適な保護基を有するＣＰＴ  ２０（Ｓ）−Ｏ−ヌクレオチド誘導体を生成する。ＣＰＴ  ２０（Ｓ）−Ｏ−ヌクレオチドのヌクレオシド部分の保護基は、昇温（３０〜６０℃）でアンモニアまたはメチルアミン／エタノール（＞１０当量）で処置することによって除去することができる。溶媒を蒸発させた後、水溶性の未精製生成物または粗生成物を、抽出によって精製し、さらにＣ１８クロマトグラフィーおよび／または脱塩によって精製した後、凍結乾燥して、淡黄色の固体の最終生成物を生じる。
【００５４】
５’−ヒドロキシル基が得られる任意のヌクレオシド類似体が、上記のスキームにおけるヌクレオチドの出発物質として使用することができる。本発明において使用する好ましいヌクレオシドは、式ＩＩＩの構造を有しており、これらに限定されないが、チミジン、シチジン、グアノシン、アデノシン、１’，２’−デオキシリボース、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（フロクシウリジン）、デシタビン、アザシチジン、ゲムシタビン、クロファラビン、クラドリビン、およびペントスタチンが挙げられる。出発物質として使用する前に、上記の式ＩＩＩのヌクレオシドの５’−ヒドロキシルを除けば、アミノ基または他のヒドロキシル基は、好適な保護基で保護されている。
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【００５５】
式ＩＩＩにおいて、アミノおよびヒドロキシルを、当技術分野で知られている保護基で保護することができることが理解されている。アミノ基に好ましい保護基としてはアセチル、ベンゾイル、イソブチリル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ホルミル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、トリチルなどが挙げられる。ヒドロキシル基に好ましい保護基としては、アセチル、トリフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイルカルボニル、アルキル、メチル、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリルなどが挙げられる。当業者に知られているその他の好適な保護基は、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎｅ、Ｔ．、Ｗｕｔｓ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗｉｌｅｙ（１９９９）に開示されている。ヒドロキシル基およびアミノ基に好ましい保護基としては、酵素反応（特に、開裂可能）部、例えばアミド、エステルなどが挙げられる。
【００５６】
本発明の式Ｉの化合物は、これらに限定されないが、悪性腫瘍およびその他の形態のがんを含むがんを治療する上で有効である。本明細書で使用される場合、「悪性腫瘍」という用語は、低分化型、中分化型、および高分化型で生じる、あらゆる形態のヒトの癌腫、肉腫、およびメラノーマを包含することを意図する。このような治療を必要とする患者を対象とする本発明の化合物の投与において、有効量の化合物または本発明の化合物を１種もしくは複数含む製剤が患者に投与される。本明細書で使用される場合、本発明の化合物の「有効量」とは、がんの増殖を抑制する、またはがんを遅延させる、またはがんもしくは悪性細胞を死滅させる、ならびに／または悪性腫瘍などのがんの退縮および／もしくは緩和を引き起こす、即ちこのような腫瘍の体積もしくはサイズを減らす、または腫瘍を完全に除去する化合物の量を意味すると意図される。
【００５７】
本発明の化合物および本発明の製剤は、ヒトの肺がん、乳がん、結腸がん、前立腺がん、メラノーマ、膵臓がん、胃がん、肝臓がん、脳腫瘍、腎臓がん、子宮がん、頸がん、卵巣がん、尿路がん、消化管がん、および血流以外の解剖学的部位において増殖するその他の固形腫瘍、ならびに白血病などの血液感染性の腫瘍などのがんを含めるが、これらに限定されない様々な腫瘍および／またはがんの治療に使用することができる。本発明に適したその他の固形腫瘍としては、これらに限定されないが、結腸腫瘍および直腸腫瘍が挙げられる。本発明の化合物は、酵素トポイソメラーゼＩの阻害剤としても有用である。本発明のカンプトテシン類似体のいくつかは、これらに限定されないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、および硝酸塩などの無機酸と反応させることによって、薬学的に許容される塩に転換される。カンプトテシン類似体は、これらに限定されないが、酢酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびステアリン酸塩などの有機酸を有する塩に転換させることもできる。その他の酸を、本発明の化合物およびその薬学的に許容される塩の調製の間の中間体として使用することができる。
【００５８】
本発明は、薬学的に有効な量の本発明の化合物を投与することを含む、患者を治療する方法も提供する。化合物は、例えば、がんおよび／または白血病を患う患者に投与することができる。本発明の化合物は、抗ウイルス薬（例えば、抗ＨＩＶ薬）および駆虫剤としても作用し得る。薬学的に有効な量または用量は、好ましくは、体重１ｋｇ当たり０．１〜１００ｍｇの式Ｉの化合物である。より好ましくは、薬学的に有効な量または用量は、好ましくは、体重１ｋｇ当たり０．１〜４０ｍｇの式Ｉの化合物である。一般に、薬学的に有効な量または用量は、ある特定の抗白血病特性および／または抗腫瘍特性を有効に示す化合物量を含む。薬学的に許容される担体または希釈剤と関連して、薬学的に許容される塩を含む本発明の化合物のうち１種を活性成分として含む医薬組成物も、本発明の範囲内である。
【００５９】
本発明の化合物は、酵素トポイソメラーゼＩを阻害するのに有効な用量、概ね１週間当たり約０．１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは１週間当たり約０．１〜４０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
【００６０】
本発明の化合物は、化合物および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬製剤として投与することができる。医薬製剤は、所望の作用を損なわない、および／または所望の作用を補う、その他の活性成分を含むこともできる。本発明による化合物（／活性成分）は、任意の好適な経路、例えば、経口、経鼻、非経口、静脈内、経皮、皮下、または局所的に、液体もしくは固体の形態で、投与することができる。
【００６１】
非経口による治療的投与のために、活性成分を溶液または懸濁液中に含ませてもよい。溶液または懸濁液は、以下のような構成成分も含んでもよい：水などの無菌希釈剤（注射用）；安定な活性薬物成分を、リポソーム粒子のコア内にｐＨ制御され保護された環境で含む、またはリポソーム粒子の外側もしくはリポソーム粒子の任意の二層に関連する活性薬物成分を含む、リポソーム粒子の懸濁液；生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセテート、シトレートまたはホスフェートなどの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張化剤。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器または複数回投与バイアル（これらは全てガラス製またはプラスチック製でよい）の中に封入することができる。
【００６２】
本発明の化合物の別の投与法は経口である。経口用組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食担体を含むであろう。これらは、ゼラチンカプセルに封入しても、錠剤に圧縮してもよい。経口による治療的投与のために、前述の化合物を、好適な添加剤と一緒に、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエハース、チューインガムなどに製剤化してもよい。
【００６３】
錠剤、丸薬、カプセルなどは、以下のような成分を含むことができる：微結晶性セルロース、トラガカントもしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの添加剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、コーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、およびスクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ風味などの香味剤を添加してもよい。投与単位がカプセルの形態である場合、上記の成分に加えて、脂肪油などの液体担体を含めてもよい。その他の剤形は、剤形の物理的な形を変更する他の成分、例えばコーティングを含むことができる。いくつかの好ましい錠剤または丸薬は、糖、セラック、または他の腸溶性コーティング剤でコーティングしてもよい。シロップ製剤は、活性化合物に加えて、甘味剤としてのスクロースおよびある保存料、染料ならびに着色剤および香味剤を含むことができる。これらの様々な製剤に使用する成分は、人間医学および獣医学上での使用に許容される、または好適であり、使用する量で無毒であるべきである。
【００６４】
上記の「２０（Ｓ）−Ｏ−ヌクレオチド・カンプトテシン誘導体」という用語は、式Ｉの化合物を指す。
【００６５】
特定の実施形態の前述の記述は、現知識を利用することによって、一般概念から逸脱することなく、誰でも容易に、該特定の実施形態の様々な用途のために、改変および／または適合できるという、本発明の一般的性質を完全に表し、したがって、このような適合および改変は、開示される実施形態の同等のものの意味および範囲内であると理解されるまたは意図される。本明細書で用いられる用語が、限定するものというよりは、単に説明するものであることを理解されたい。以下の実施例は、本発明の様々な実施形態をさらに説明するために提示するものであり、本発明の範囲を限定するものであるとは決して意図されない。
【実施例１】
【００６６】
Ｄｉｘ−９０５の合成および抗がん評価
本発明の式Ｉの化合物は、以下の化学構造の化合物Ｄｉｘ−９０５を含む：
0005826933.tif 000016
【００６７】
（ａ）Ｄｉｘ−９０５の合成
（氷浴に入れてある）乾燥した１００ｍＬ丸底フラスコの中に無水トリアゾール３１７．５ｍｇ（４．５９ｍｍｏｌ）、Ａｒの保護下の新たに蒸留したピリジン２０ｍｌ、および三塩化リン０．２ｍｌ（２．２９ｍｍｏｌ）を添加した。氷浴を取り外した後に次いで、室温で０．５時間撹拌し、２０ｍＬの新たに蒸留したピリジン中の無水ＣＰＴ５００ｍｇ（１．４３ｍｍｏｌのＣＰＴ）を添加し、次いで室温で２時間撹拌し続けた。ＣＰＴを完全に消費または転換させた後、２０ｍＬの新たに蒸留したピリジン中の３’Ｂｚ−５−ＦｄＵ  １．２４ｇ（３．６０ｍｍｏｌ）を添加し、混合液を０．５時間撹拌し続けた。前のステップで生成した物質を完全に消費した後、アルゴン保護を外し、５ｍＬの０．４Ｍ  Ｉ２／ＴＨＦ溶液を添加した。反応は約１分のうちに完了し、溶液は赤紫色に変化した。溶媒を減圧蒸留法により除去し、黄色の固形生成物を得、次いでこれを５ｍＬの濃縮アンモニアに溶解し、黄褐色の溶液を生成した。溶液を６０℃で３時間撹拌して鮮やかな黄色に変化させ、その後、大部分の溶媒を減圧蒸留法により除去し、次いで、逆相カラムに通した。採集される標的溶離液を集め、大部分の溶媒を減圧蒸留法によって除去した後、希釈ＨＣｌ溶液でｐＨを１に調節し、１５ｍＬのジクロロメタンで３回抽出した。抽出液からの有機相を採集し、一緒に組み合わせた。組み合わせた有機相を水で抽出し、抽出液からの水相を採集し濃縮した。濃縮した水相を逆相カラムに通し、やや黄色で固形の標的生成物４２０ｍｇ（０．６４ｍｍｏｌｅ）を生成し、ＴＬＣおよびＮＭＲの結果は、該生成物が９０％を超える純度でＣＰＴ  ２０（Ｓ）−ヌクレオチドを含んでいたことを示した。ＥＳ−ＭＳ（陰性検出モード）：Ｃ２９Ｈ２５ＦＮ４Ｏ１１Ｐ（６５５）、ｆｏｕｎｄ  ６５５。1H NMR (400MHz, D2O): δ 9.195(s, 1H), 8.567(s, 1H), 8.377-8.308(d, 1H), 8.207(s, 1H), 8.107-8.094(d, 1H), 7.954-7.887(t, 1H), 7.690-7.584(t, 1H), 7.524(s, 1H), 5.742-5.691 (m, 1H), 5.521-5.418(m, 2H), 4.665-4.618(d, 1H), 4.493-4.445(d, 1H), 4.370(s, 1H), 3.959-3.915(m, 2H), 3.800 (s, 1H), 2.386-2.289(m, 2H), 2.221-2.014(m, 2H), 1.064-1.027(t, 3H), 13C : δ 172.228, 159.579, 158.645, 151.554, 150.864, 148.157, 147.211, 145.426, 140.157, 131.415, 129.875, 128.754, 128.542, 128.225, 127.660, 126.547, 120.519, 110.875, 105.512, 99.588, 85.645, 85.245, 77.514, 71.655, 67.251, 50.255, 39.224, 11.245, 7.241. 31P: δ -2.324。
【００６８】
（ｂ）抗がん評価
化合物Ｄｉｘ−９０５（化合物９０５とも呼ばれる）のがん細胞を死滅させる能力を測定するために、本発明者らは、様々な細胞株を用いて、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）による細胞の生死判別試験を実施した。キットは、酵素的ルシフェラーゼアッセイによってＡＴＰレベルを測定する。正常な新陳代謝率を有し、正常なレベルのＡＴＰを生成する生存細胞は、ルシフェラーゼ基質の代謝回転率が高く、これは酵素反応のためにＡＴＰを要し、発光シグナルを発する。一方、死んでいく細胞は、その代謝機能が減退しているため、発光シグナルをあまり出さない。発した発光シグナルは、次いで照度計によって捕獲されることになる。
【００６９】
生死判別試験を実施するために、小細胞性肺がん細胞（ＡＴＣＣカタログ番号Ｈ１４６）、乳がん細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＭＤＡＭＢ２３１）または結腸がん細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＣＴ１１６）を、９６個のウェルに播種し、２４、４８、７２時間の時間帯の中で化合物Ｄｉｘ−９０５およびその他の抗がん剤によって処置した。各時点で、細胞を１時間Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏｗ試薬と混合し、発光シグナルを評価した。
【００７０】
カスパーゼ活性化のために、様々な時点で、細胞を各薬剤で処置した後、Ｐｒｏｍｅｇａ製のカスパーゼ−Ｇｌｏ  ３／７キットを使用して、同様の試験を実施することができた。カスパーゼ３／７  Ｇｌｏｗアッセイの機構は、活性カスパーゼ３／７によって開裂可能になるルシフェラーゼ基質と融合させたカスパーゼ３／７基質を使用することによる。放出されたルシフェラーゼ基質は、次いで、酵素反応に進み、発光シグナルを発する。生死判別試験と対照的に、この試験の律速段階は、カスパーゼ活性化である。活性カスパーゼを有する死んでいく細胞は、照度計で高い発光シグナルが読み出されるであろう。
【００７１】
（ｃ）Ｄｉｘ−９０５の抗がん活性を図１〜８に要約する。
図１  Ｄｉｘ−９０５は、Ｈ１６９３細胞において、ＣＰＴよりも良好に殺細胞反応を引き起こした。
図２  Ｄｉｘ−９０５処理は、Ｈ１６９３において、相乗効果のために、ＣＰＴ、フロクシウリジン、およびエトポシドよりも効果的に殺細胞をもたらした。
図３  Ｄｉｘ−９０５は、Ｈ１６９３において、カスパーゼ活性（アポトーシス経路）を介して、時間および用量に依存的な細胞死を導いた。
図４  Ｄｉｘ−９０５は、Ｈ１４６において、ＣＰよりも良好に殺細胞反応を導いた。
図５  Ｄｉｘ−９０５は、Ｈ１４６において、ＣＰＴ、フロクシウリジン、およびエトポシドよりも効果的に殺細胞を引き起こした。
図６  Ｄｉｘ−９０５は、Ｈ１４６において、カスパーゼ活性（アポトーシス経路）を介して、時間および用量に依存的な細胞死を導いた。
図７  Ｄｉｘ−９０５は、ＨＣＴ１１６結腸細胞において、ＣＰＴ、５−ＦＵおよびエトポシドよりも殺細胞に効果的だった。
図８  ＨＣＴ１１６細胞におけるＤｉｘ−９０５およびＣＰＴによる用量依存的な細胞死。
【実施例２】
【００７２】
実施例１の手順を使用することによって、表２に列挙されるように、その他いくつかの式Ｉの代表的化合物を得た。これらは、溶解度が＞１０ｍｇ／ｍＬで、容易には分解しない、室温で安定な、黄色の固形生成物である。
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【００７３】
実施例２−１、２−２および２−３：Ｄｉｘ−９０２、Ｄｉｘ−９０４およびＤｉｘ−９０６の抗がん評価。
実施例１の手順を使用することによって、Ｄｉｘ−９０２、Ｄｉｘ−９０４およびＤｉｘ−９０６の抗がん活性を測定し、試験結果を表３、４および５にそれぞれまとめた。
【００７４】
表３は、化合物Ｄｉｘ−９０２、Ｄｉｘ−９０４およびＤｉｘ−９０６が、Ｈ１４６（小細胞性肺がん）細胞において、用量依存的に細胞死を引き起こしたことを示す。「ＣＰＴ」基において、Ｈ１４６（小細胞性肺がん）細胞を、４つの濃度（それぞれ０、０．１、１．０、１０μＭ）のＣＰＴ（ＤＭＳＯに溶解している）で４８時間処理した。Ｄｉｘ−９０２、Ｄｉｘ−９０４およびＤｉｘ−９０６基において、Ｈ１４６（小細胞性肺がん）細胞は、４つの濃度（それぞれ０、０．１，１．０、１０μＭ）の対応する化合物（生理食塩溶液に溶解している）で４８時間それぞれ処理された。
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【００７５】
結果は、水溶性Ｄｉｘ−９０２、Ｄｉｘ−９０４およびＤｉｘ−９０６の、Ｈ１４６（小細胞性肺がん）細胞において用量依存的に細胞死を引き起こす能力は、ＣＰＴと同様またはそれよりやや良好であることを明示している。
【００７６】
表４は、化合物Ｄｉｘ−９０２、Ｄｉｘ−９０４およびＤｉｘ−９０６が、ＭＤＡＭＢ２３１（乳がん）細胞において、用量依存的に細胞死を引き起こしたことを示す。「ＣＰＴ」基において、ＭＤＡＭＢ２３１（乳がん）細胞を、４つの濃度（それぞれ０，０．１，１．０，１０μＭ）のＣＰＴ（ＤＭＳＯに溶解している）で４８時間処理した。Ｄｉｘ−９０２、Ｄｉｘ−９０４およびＤｉｘ−９０６基において、ＭＤＡＭＢ２３１（乳がん）細胞を、４つの濃度（それぞれ０、０．１、１．０、１０μＭ）の対応する化合物（生理食塩溶液に溶解している）で４８時間それぞれ処理した。
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【００７７】
結果は、水溶性Ｄｉｘ−９０２、Ｄｉｘ−９０４およびＤｉｘ−９０６の、ＭＤＡＭＢ２３１（乳がん）細胞において用量依存的に細胞死を引き起こす能力は、ＣＰＴと同様であることを示す。
【００７８】
表５は、化合物Ｄｉｘ−９０２、Ｄｉｘ−９０４およびＤｉｘ−９０６が、ＨＣＴ１１６（結腸がん）細胞において、用量依存的に細胞死を引き起こしたことを示す。「ＣＰＴ」基において、ＨＣＴ１１６細胞を、４つの濃度（それぞれ０，０．１，１．０、１０μＭ）のＣＰＴ（ＤＭＳＯに溶解している）で４８時間処理した。Ｄｉｘ−９０２、Ｄｉｘ−９０４およびＤｉｘ−９０６基において、ＨＣＴ１１６細胞を、４つの濃度（それぞれ０，０．１，１．０，１０μＭ）の対応する化合物（生理食塩溶液に溶解している）で４８時間それぞれ処理した。
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【００７９】
結果は、水溶性Ｄｉｘ−９０２、Ｄｉｘ−９０４およびＤｉｘ−９０６の、ＨＣＴ１１６（結腸がん）細胞において用量依存的に細胞死を引き起こす効果は、そのＣＰＴより高いことを示す。
【００８０】
特定の実施形態の前述の記述は、現知識を利用することによって、一般概念から逸脱することなく、誰でも容易に、該特定の実施形態の様々な用途のために、改変および／または適合できるという、本発明の一般的性質を完全に表し、したがって、このような適合および改変は、開示される実施形態の同等のものの意味および範囲内で理解されるまたは意図される。本明細書で用いられる表現または用語が、限定するものというよりは、説明するものであることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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