(57)【要約】  幹細胞分化の改善を含む細胞増殖の改善を提供する、ナノパターン化された表面を提供する。パターン化された表面は、生物学的に活性な部分のフィールドのアレイを含むことができ、かつフィールド間のピッチおよびフィールドのサイズを含むパラメータによって制御することができる。ナノパターン化は、ディップペンナノリソグラフ印刷、マイクロコンタクトプリンティング、およびナノインプリントリソグラフィを使用して実施され得る。2011527888.tif 000005
2011527888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着された基材を含む細胞増殖材料であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されており、フィールドおよび領域が、該生物学的に活性な官能基のフィールドのピッチが実質的に一定であるドメインを画成している、細胞増殖材料。
【請求項２】
生物学的に活性な官能基が、メチル基;イソプロピル基;シクロヘキシル基;アリール基;アリル基;アルキニル基;ヒドロキシル（アルコール）基;エーテル基;モルホリノ基;エチレングリコシル化基;ポリエチレングリコシル化基;単糖、例えば、グルコース、リボース、ヘパロース、またはマンノースなど;カルボキシレート基;スルフェート基;ホスフェート基;フェノキシド基;アミノ基;ジアルキルアミノ基;アルキルアミノ基;ホスフィン基;およびアミノ酸から成る群より選択される、請求項1記載の材料。
【請求項３】
生物学的に活性な官能基のフィールド間のピッチが、およそ75nm〜2,000nmである、請求項1記載の材料。
【請求項４】
生物学的に活性な官能基のフィールド間のピッチが、およそ140nm〜1,000nmである、請求項3記載の材料。
【請求項５】
基材が、シリカ;ガラス;ニトロセルロース;ポリカプロラクトン（PCL）;ポリ乳酸（PLLA）;ポリグリコール酸（PGA）;ポリ（ウレタン）;ヒドロキシアパタイト;リン酸三カルシウム;チタン;チタン合金;形状記憶合金;およびステンレス鋼から成る群より選択される、請求項1記載の材料。
【請求項６】
生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、生体細胞の接着を阻害するための材料であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、材料。
【請求項７】
医薬として使用するための、請求項1〜6のいずれか一項記載の材料。
【請求項８】
メチル官能基を含む複数のフィールドが付着されている基材を含む、幹細胞集団または前駆細胞集団の増幅のための細胞増殖材料であって、該メチル官能基のフィールドが、メチル官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離され、かつフィールド間のピッチがおよそ200nm〜750nmである、細胞増殖材料。
【請求項９】
フィールド間のピッチが、およそ280nmである、請求項8記載の細胞増殖材料。
【請求項１０】
カルボキシル基;メチル基;およびヒドロキシル基から成る群より選択される生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、軟骨形成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、細胞増殖材料。
【請求項１１】
アミノ基およびカルボキシル基から成る群より選択される生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、骨形成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、細胞増殖材料。
【請求項１２】
アミノ基およびヒドロキシル基から成る群より選択される生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、神経形成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、細胞増殖材料。
【請求項１３】
アミノ基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、筋原細胞の産生のための細胞増殖材料であって、該アミノ基のフィールドが、アミノ基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、細胞増殖材料。
【請求項１４】
ヒドロキシル基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、脂質生成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、該ヒドロキシル基のフィールドが、ヒドロキシル基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、細胞増殖材料。
【請求項１５】
フィールドおよび領域が、生物学的に活性な官能基のフィールドのピッチが実質的に一定であるドメインを画成している、請求項6〜14のいずれか一項記載の材料。
【請求項１６】
生物学的に活性な官能基が、孤立した官能基である、請求項1〜15のいずれか一項記載の細胞増殖材料。
【請求項１７】
生物学的に活性な官能基の複数のフィールドを作成するために、複数の生物学的に活性な官能基を基材上に堆積する工程を含む方法であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されるように配置される、請求項1〜16のいずれか一項記載の材料を製造する方法。
【請求項１８】
堆積されたフィールドおよび領域が、生物学的に活性な官能基のフィールドのピッチが実質的に一定であるドメインを画成している、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
生物学的に活性な官能基がナノリソグラフィ技術によって堆積される、請求項17または請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ナノリソグラフィ技術が、ディップペンナノリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ、直接原子間力顕微鏡、エッチング斜め堆積法、レーザーアブレーション、レーザー堆積法、X線リソグラフィマスターのレプリカ成形、マイクロコンタクトプリンティング、およびエッチング電子ビーム直接描画リソグラフィから成る群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
ナノリソグラフィ技術がディップペンナノリソグラフィを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
生物学的に活性な官能基が、インク構成物の形態で堆積される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
幹細胞または前駆細胞を請求項8記載の細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、増幅された集団が産生されるまで培養する工程とを含む、幹細胞集団または前駆細胞集団を増幅する方法。
【請求項２４】
幹細胞または前駆細胞を請求項10記載の細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、軟骨形成細胞が産生されるまで培養する工程とを含む、軟骨形成細胞を産生する方法。
【請求項２５】
幹細胞または前駆細胞を請求項11記載の細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、骨形成細胞が産生されるまで培養する工程とを含む、骨形成細胞を産生する方法。
【請求項２６】
幹細胞または前駆細胞を請求項12記載の細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、神経形成細胞が産生されるまで培養する工程とを含む、神経形成細胞を産生する方法。
【請求項２７】
幹細胞または前駆細胞を請求項13記載の細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、筋原細胞が産生されるまで培養する工程とを含む、筋原細胞を産生する方法。
【請求項２８】
幹細胞または前駆細胞を請求項14記載の細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、脂質生成細胞が産生されるまで培養する工程とを含む、脂質生成細胞を産生する方法。
【請求項２９】
ディップペンナノリソグラフにより基材に印刷する工程と、続いて基材上の少なくとも1種類の細胞の増殖を改善する工程とを含む、方法。
【請求項３０】
前記細胞が幹細胞であり、前記改善が幹細胞分化の改善または幹細胞集団もしくは前駆細胞集団の増幅の改善である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
基材上に生物学的に活性な化合物の複数の離散したフィールドを形成するために、チップを使用して少なくとも1種類の生物学的に活性な化合物を基材上に堆積させる工程、
増幅された細胞集団が産生されるまで、複数の離散したフィールドを含む基材上で少なくとも1種類の細胞を増殖させる工程
を含む方法であって、
該離散したフィールドが、離散したフィールドを有さない基材上で増殖させる場合と比較して、細胞集団の均質性または再現性を改善する、方法。
【請求項３２】
離散したフィールドを有さない基材が、少なくとも1種類の生物学的に活性な化合物を含む実質的に均質な表面を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
離散したフィールドが、細胞集団の均質性を改善する、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
増殖が、インビボまたはインビトロでの増殖である、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
増殖が、細胞の分化を誘導する、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
増殖が、細胞の分化を誘導しない、請求項31記載の方法。
【請求項３７】
細胞が、幹細胞または前駆細胞である、請求項31記載の方法。
【請求項３８】
複数の離散したフィールドを含む基材が、75nm〜2,000nmの、フィールド間のピッチを含む、請求項31記載の方法。
【請求項３９】
複数の離散したフィールドを含む基材が、140nm〜1,000nmのピッチを含む、請求項31記載の方法。
【請求項４０】
基材が、ドメインを形成する複数の離散したフィールドを含み、かつ該ドメインが、実質的に一定のピッチを含む、請求項31記載の方法。
【請求項４１】
離散したフィールドが、100nm未満の少なくとも1つの寸法を有し、かつ100nm未満の平均直径を有するドットである、請求項31記載の方法。
【請求項４２】
基材が、2次元または3次元基材である、請求項31記載の方法。
【請求項４３】
離散したフィールドが、ドット形状を有する、請求項31記載の方法。
【請求項４４】
生物学的に活性な化合物が、少なくとも1種類の孤立した生物学的に活性な基を含む、請求項31記載の方法。
【請求項４５】
チップが、走査型プローブチップである、請求項31記載の方法。
【請求項４６】
堆積工程が、ナノリソグラフィを使用して実施される、請求項31記載の方法。
【請求項４７】
堆積工程が、ディップペンナノリソグラフィを使用して実施される、請求項31記載の方法。
【請求項４８】
増幅された細胞集団中の不均質性のレベルが40％以下となるように、均質性を改善する、請求項31記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも24時間の増殖試験において均質性または再現性を測定するか、または少なくとも28日間の増殖試験において均質性または再現性を測定する、請求項31記載の方法。
【請求項５０】
基材上に生物学的に活性な化合物の複数の離散したフィールドを提供する工程、
増幅された細胞集団が産生されるまで、複数の離散したフィールドを含む基材上で少なくとも1種類の細胞を増殖させる工程
を含む方法であって、
該離散したフィールドが、離散したフィールドを有さない基材上で増殖させる場合と比較して、細胞集団の均質性または再現性を改善する、方法。
【請求項５１】
基材上に生物学的に活性な化合物の複数の離散したフィールドを形成するために、チップを使用して少なくとも1種類の生物学的に活性な化合物を基材上に堆積させる工程、
分化した細胞集団が産生されるまで、複数の離散したフィールドを含む基材上で少なくとも1種類の細胞を増殖させる工程
を含む方法であって、
該離散したフィールドが、該離散したフィールドを有さない基材上で増殖させる場合と比較して、細胞集団の均質性または再現性を改善する、方法。
【請求項５２】
基材、
基材上の、生物学的に活性な分子の複数のフィールド、
フィールド間の、生物学的に活性な分子を含有しない領域
を含む、細胞を培養するための物品であって、
その上で培養された細胞集団が、フィールドを有さない生物学的に活性な分子の表面上で培養された細胞集団よりも、より均質または再現可能である、物品。
【請求項５３】
請求項52記載の物品を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、（i）ULive Enterprises Limitedの名前において2008年7月12日に出願された「Materials and Methods for Cell Growth」なる名称の英国仮特許出願第0812789.6号、および（ii）2008年9月22日に出願された米国仮出願第61／099，182号の優先権を主張するものであり、なお当該出願は、図面、例示、および実施例、特許請求の範囲、並びに他の裏付けとなる態様を含めて、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【背景技術】
【０００２】
背景
生体細胞の研究および使用は、いくつかの臨床上および研究上の適用において非常に興味深い。これらの適用の多くにおいて、選択的に細胞の挙動に影響を及ぼすことが可能であることが望ましい。これは、細胞接着、細胞増殖、細胞構造に影響を及ぼすこと（内部および外部細胞構造の成長に影響を及ぼすことを含む）、並びに細胞分化に影響を及ぼすことを含み得る。
【０００３】
細胞挙動に影響を及ぼし得る多種多様の手段が、先行技術において記載されている。これらの中から、達成すべき目的に応じて好適な手段を選択することができる。使用される最も一般的なアプローチの1つは、増殖因子または他の生物学的活性な可溶性剤の細胞培養物への添加である。これらは、効果的に細胞挙動に影響を及ぼし得るが、複数の欠点を抱えていることも知られている。多くの細胞培養添加物、および特に増殖因子は、高価であり、生理活性物質を得るためには、複雑な精製および／または発現手法を必要とする。さらに、多くの増殖因子および添加物は多面的であり、したがって、使用濃度、およびこれらの因子が提供される細胞に応じて、様々な不明確な効果を生じ得る。
【０００４】
細胞増殖基材上に提供される官能基を使用して、細胞挙動に影響を及ぼすことができることが最近示された。しかしながら、このアプローチも、注目に値する欠点を抱えている。特に、この方法において使用される官能基によって細胞に影響を及ぼす生物学的作用は、制御が困難であることがわかっている。結果として、生物学的に活性な官能基の単一の種でさえ、それに接触して増殖した細胞集団では、かなりのレベルの不均質性が生じる傾向にある。これは、臨床目的または研究目的のいずれにおいても、実質的に純粋な細胞集団を得ることが所望される場合に問題となる。
【０００５】
Curran et al.，Biomaterials，27（2006），4783-4793（非特許文献1）;Curran et al.，Biomaterials 26（2005），7057-7067（非特許文献2）を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Curran et al.，Biomaterials，27（2006），4783-4793
【非特許文献２】Curran et al.，Biomaterials 26（2005），7057-7067
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明のある特定の局面および態様の目的は、先行技術に関連する少なくともいくつかの問題を取り除くかまたは緩和することである。
【０００８】
本発明は、細胞増殖材料に関する。本発明はさらに、細胞の生物学的活動に影響を及ぼす方法、細胞増殖材料を製造する方法、およびそのような材料の医学的利用に関する。
【０００９】
第一の局面において、本発明は、生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着された基材を含む細胞増殖材料であって、当該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない当該基材の領域によってお互いに分離されており、フィールドおよび領域が、生物学的に活性な官能基のフィールドのピッチが実質的に一定であるドメインを画成している、細胞増殖材料を提供する。
【００１０】
第2の局面において、本発明は、生体細胞の活動に影響を及ぼす方法であって、本発明の第一の局面による材料に生体細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
【００１１】
本発明者らは、本発明の第一の局面による材料が、当該材料と接触する生体細胞に影響を及ぼすことができることを見出した。生物学的に活性な官能基が生体細胞の活動に影響を及ぼす能力は、以前に文献において報告されているが、この能力は大きく変動する傾向があり、よって、低レベルの再現性を伴い得る。これは、先行技術材料上で増殖した細胞が、高い頻度において不均質な集団を生じるという欠点に関連している。
【００１２】
多くの研究上または臨床上の適用において、実質的に均質な細胞集団を利用することが望ましい。そのような均質な集団は、不均質な集団よりも、より完全に特徴付けることができ、かつより再現可能な生物学的反応を提供し得る。これは、不均質性を排除することによって科学的結果のより良好な再現性が得られるような科学的適用において重要であり、かつ臨床上の適用、例えば細胞ベースの治療において、特に重要である。
【００１３】
本発明者らは、生体細胞の分化に影響を及ぼすことができる生物学的に活性な官能基を含む先行技術の材料では、不均質性のレベルが40％以内（すなわち、生じる主要な細胞集団が、全細胞集団の少なくとも60％を占める）であり得る細胞集団が生じるということを見出した。本発明者らは、本発明による細胞増殖材料およびそのような材料を利用する方法では、不均質性のレベルが非常に低減された細胞集団を生じることができると考えている。したがって、本発明の材料および方法は、臨床上および研究上の適用の両方において著しく有益である。
【００１４】
細胞ベースの治療は、現在、重要な臨床上の関心対象である代表的な分野である。そのような治療は、通常、エキソビボにおいて増殖させた生体細胞が、患者に投与された場合に増加するかまたは病変組織もしくは損傷組織と置き換わる能力を活用する。細胞療法では、欠損組織または損傷組織を置き換えるために、実質的に分化した細胞（最終分化またはほぼ最終分化のもの）を使用し得るが、その場合、投与される細胞は、通常、置き換えることが所望される細胞と同じ型となる。あるいは、細胞療法は、分化して必要なタイプの細胞を生じることができる実質的に未分化の細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞など）を使用し得る。この場合、利用される細胞は、要求される臨床結果を達成するために必要な細胞型を、分化によって生じることができなければならない。
【００１５】
幹細胞または前駆細胞は、細胞ベースの治療のために特に有用である代表的な候補である。全能性幹細胞もしくは多分化能性幹細胞、または多能性前駆細胞はすべて、治療上有用な細胞集団を生じることができる。幹細胞は、エキソビボまたはインビボのいずれかにおいて、細胞に加えられる外部刺激に応答して、分化して治療上有用な細胞を生じるように誘導され得る。この種類の幹細胞は、身体内のすべてまたはほとんどすべての細胞型を生じることができるため、好適な分化刺激が加えられるまで実質的に未分化の状態が維持され得る限り、好適な代替細胞を提供することが期待され得る。当該分化刺激は、その後患者に投与することができる細胞集団を得るためにエキソビボにおいて提供されてもよく、あるいは、自然発生的または外因的に増加した幹細胞が局所環境または人工的な作用物質（例えば、本発明の細胞増殖材料など）によって分化へと誘導され得る場合では、インビボにおいて提供されてもよい。
【００１６】
前駆細胞の場合、これらは、既にある程度の分化を受けていると考えられ、したがって、それらが生じ得る可能な系列も制限されると考えられる。したがって、必要な型の代替細胞を生じることができる前駆細胞を産生できること、および選択できることが重要である。本発明の材料および方法は、（例えば、本発明の材料が、損傷組織または病変組織の部位に移植された場合に）好適な前駆細胞の実質的に均質な集団を成長させること、および前駆細胞が関心対象の経路に沿って確実にそれらの分化を継続させることにおいて有用であり得る。
【００１７】
上記の観点から、全体のうちのある特定の亜集団の部分的または完全な分化を生じ得る細胞集団の不均質性は、細胞の治療可能性を制限することから、重大な欠点であるということが認識されるであろう。実際に、ある集団内の不均質性は、有用でないか、または有害でさえある、治療効果を何ら有さない細胞型を産生する傾向を有する細胞の産生の原因となり得る。
【００１８】
本発明者らは、先行技術のこれらの欠点が、本発明による細胞増殖材料によって克服され得ることを見出した。これらの材料は、官能基が不在の領域によって分離される離散したフィールドにおいて提供される生物学的に活性な官能基を活用する。読者の視覚化を補助するため、（図1および図1aに示されているような）特定の態様において、これは、被覆されていない基材上に、官能基の「ドット」（「フィールド」）を生じ得る（被覆されていないエリアは、フィールド間の「領域」を提供する）。これらの材料が、先行技術において見出される材料よりも、より再現可能な結果およびより均質な細胞集団が得られる様式で細胞の生物学的活動に影響を及ぼすことが可能であるということは、非常に驚くべき研究結果である。細胞が接触し得る表面の官能基の不均等な分布によって、生物学的に活性な官能基の作用が細胞集団に対してより均等に影響を及ぼし得るということは、直観と相いれないように感じられる。
【００１９】
上記において言及したように、本発明の材料が、エキソビボまたはインビボにおいて治療的に有用な細胞型を生じる能力も、注目に値する利点である。したがって、本発明はさらに、医薬としての、本発明の第一の局面およびそれに続く局面による細胞増殖材料の使用も提供する。そのような医薬は、移植可能な材料の形態を取り得る。本発明による移植可能な細胞増殖材料を使用して、治療上有利な細胞型が、そこを通って増殖し移動するように誘導され得るような「導管」を提供することができる。本発明の移植可能な細胞増殖材料は、治療的に有用な細胞型が、その上またはその中において成長するように誘導され得るような材料を提供することによって、損傷組織の置き換えまたは再生を「刺激する」ためにも使用され得る。本発明の材料および方法の医学的利用のさらなる詳細については、本明細書の他の箇所において説明する。
【００２０】
本発明の細胞増殖材料は、概して、特異的表現型で規定された細胞による当該材料への結合を制御するために役立つ。細胞接着にプラスの影響を及ぼす材料は、細胞結合を促進するために使用され得るが、さらに、そのような細胞の分化、表現型、または機能を含む接着した細胞の挙動に影響を及ぼすためにも使用され得る。細胞接着に関する様々な特性、例えば、細胞集塊または個々の細胞の接着を促進する能力は、生体細胞がそれに沿って分化する経路の決定において重要であり得る。例えば、細胞集塊は、潜在的な軟骨細胞分化の兆候と見なされ、一方、強く接着した細長い細胞（特に、広範囲の細胞骨格要素、例えばストレスファイバーなど、を含有するもの）の成長は、潜在的な神経発生分化または筋形成分化の兆候であり得る。接着点の有無は、細胞集塊化に寄与し得る特徴の1つである。
【００２１】
細胞分化に影響を及ぼす能力は、本発明の材料および方法の特に有益な特性を表す。どのような様式で細胞分化に影響を及ぼすことが所望されるかは、状況によって変わり得るということは理解されるだろう。ある状況では、本発明の材料に接着した細胞の集団において生じる分化のレベルを減じることによって細胞分化に影響を及ぼすことが所望される場合もある。これは、細胞集団が、その分化の状態を変えることなく、維持または増幅されることを効果的に可能にするであろう。これは、未分化または実質的に未分化の細胞（例えば、全能性または多能性幹細胞など）の集団を維持または増幅することが望まれる場合において特に好都合であり得る。成体組織では幹細胞は比較的少ないので、多数の幹細胞の産生は有益である。これらの未分化または実質的に未分化の細胞のより大きな集団を産生するために幹細胞数を増幅する能力は、幹細胞の治療適用において非常に有益であろう。
【００２２】
ヒト幹細胞の培養における本発明の材料または方法の使用は、概して、そのような細胞またはそのような細胞から誘導される細胞集団の潜在的治療有用性に起因して、本発明のそのような局面の好ましい態様を表し得る。しかしながら、これらの好ましい態様に従って使用されるヒト幹細胞からヒト胚性幹細胞を除外することが望ましいこともある。
【００２３】
他の状況では、関心対象の細胞系列を産生する分化を促進することによって、細胞分化に影響を及ぼすことが所望され得る。この様式で細胞分化に影響を及ぼすことも、いくつかの臨床上および研究上の適用において有益である。
【００２４】
細胞分化に影響を及ぼして所望の細胞型を産生する能力の特に有益な点は、傷害または疾病によってある細胞型（または複数の細胞型）が失われた組織または器官を処置するために使用され得る代替細胞を産生することである。本発明者らは、本発明の材料および方法が、造骨性系列、軟骨形成系列、神経原性系列、脂質生成系列、筋原性系列を含むいくつかの系列に沿った分化の誘導において有用であり得ると考えている。本発明の材料および方法は、実質的に未分化の細胞からそのような系列を誘導するために、あるいは、既に関心対象の1種類以上の系列への傾向を有する細胞からこのような系列の産生をさらに促進するために、使用され得る。
【００２５】
造骨性系列の産生が、骨に対する疾病または傷害の処置における関心対象であることは理解されるだろう。したがって、造骨性系列を生じることが可能な本発明の材料または方法は、骨傷害または骨疾病の処置において特定の用途を有するであろう。
【００２６】
軟骨形成系列の産生は、軟骨の疾病または傷害に対する細胞ベースの治療における発展において特に有利であろう。したがって、軟骨形成系列を生じることができる本発明の材料または方法は、この種類の疾病または傷害への治療適用において特に有益であろう。
【００２７】
神経原性系列を産生するための分化の促進は、神経細胞を増加または置換するために細胞を産生することが所望される場合に有益であろう。したがって、神経原性系列を生じることができる本発明の材料または方法は、神経組織が損傷している傷害または疾病の処置において有益であり得る。
【００２８】
本発明の材料または方法を使用した筋原性系列の産生は、筋肉細胞（ミオサイト）を生じることができる細胞を産生することが所望される場合に有益である。したがって、筋原性系列を生じることができる本発明の材料または方法は、筋肉を侵す傷害または疾病の処置において特に有用であろう。
【００２９】
本発明の材料または方法を使用した脂質生成系列の産生は、いくつかの治療用途を有し得る脂肪細胞の産生を可能にする。例えば、脂肪細胞は、傷害または疾病のために失われた構造体の再構成において使用され得る。このことが有益であり得る状況としては、豊胸または乳房の再造形において使用される代替組織、および（例えば、火傷または類似の傷害の後の）皮膚移植術に関連して使用される皮下脂肪層の産生が挙げられる。本発明の材料または方法を使用して産生される脂肪細胞は、自然な脂肪組織産生が不足するポーランド症候群などの先天性欠損の処置においても有用であり得る。
【００３０】
以下、添付の図面を参照しながら、本発明についてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の細胞増殖材料の概略図。
【図２】本発明の細胞増殖材料の断面を高度に拡大した概略図。
【図３】本発明の実験材料の水平力顕微鏡画像を示す。
【図４−１】生物学的に活性な官能基を含む先行技術材料上で増殖した細胞の集団における、様々な細胞成分の蛍光標識化の結果を示す。
【図４−２】生物学的に活性な官能基を含む先行技術材料上で増殖した細胞の集団における、様々な細胞成分の蛍光標識化の結果を示す。
【図４−３】生物学的に活性な官能基を含む先行技術材料上で増殖した細胞の集団における、様々な細胞成分の蛍光標識化の結果を示す。
【図５】本発明による細胞増殖材料上で増殖した細胞の集団における、様々な細胞成分の蛍光標識化の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
導入
ここで、本発明を説明するために本開示において使用される様々な用語について、さらに説明する。以下において提供される定義および手引きは、適切に、かつ文脈に応じて、本明細書の他の箇所にも適用され得る。
【００３３】
本明細書において引用されたすべての参考文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００３４】
細胞、細胞の増殖、細胞分化、および幹細胞は、当技術分野において一般的に公知である。例えば、Essentials of Stem Cell Biology，（Ed.R.Lanza），2006;Cell Biology，2nd Ed.，Pollard and Earnshaw，2008;Gilbert，Developmental Biology，5th ed.，1997;Cell Lineage Specification and Patterning of the Embryo，（ed.Etkin，Jeon），2001を参照されたい。
【００３５】
「細胞増殖材料」
本発明の目的のために、細胞増殖材料は、その上またはその中において生体細胞が増殖し得る任意の材料を含み得る。細胞増殖材料は、そのような増殖を支援することができるように適合され得る。細胞増殖材料は、例えば、細胞または組織培養に関連して、インビトロにおいて細胞を増殖するために使用され得るか、あるいは、例えば、本発明の細胞増殖材料が患者に移植されるような治療適用において、インビボでの細胞の増殖のために使用され得る。
【００３６】
細胞増殖材料は、細胞増殖を支援することができると考えられる。本文脈において、細胞増殖は、個々の細胞（個々の細胞は、分化、伸長、または拡散のプロセスによって増殖する）の増殖および／または細胞数の増大（細胞集団は、細胞複製によって増殖する）を包含すべきである。好ましい細胞増殖材料は、細胞集団の増幅、およびそのような集団内での個々の細胞の増殖の両方を促進することができる。
【００３７】
概して、細胞増殖材料は、細胞毒性剤あるいは細胞の生存に悪影響を及ぼすであろう他の剤を組み入れないことが好ましくあり得るが、それは、これらが、接触する細胞の増殖を害し得るためであることは理解されるであろう。
【００３８】
本発明による細胞増殖材料は、例えば、組織培養容器またはビーズを含み得る。細胞増殖材料は、細胞培養物の汚染リスクまたは当該材料が移植された部位での感染を避けるために、滅菌可能で有り得る。ある状況下においては、本発明による細胞増殖材料は、「濡れ可能（wettable）」であること、すなわち、当該材料による細胞または組織培養液の容易な受け入れを可能にするように適合していることが好ましい場合もある。濡れ性は、本発明の材料または方法において利用される官能基によって影響され得る。様々な先行技術の刊行物において開示されているように、細胞増殖材料の濡れ性は、細胞接着および機能性に影響を及ぼし得る。細胞接着および機能性への濡れ性の影響は、本発明の材料の本来の特性を増加させるため、あるいは、本来の特性の制御された減少を可能にすることによって「抑制する」ために使用することができるということは理解されるであろう。
【００３９】
「基材」
基材は、官能基が付着している本発明の材料の構成要素である。本発明の細胞増殖材料の場合、基材は、その上で細胞が増殖し得る表面、および／またはその中を通ってもしくはその上で細胞が増殖し得るマトリックスもしくは足場材（例えば、固体またはゲル状マトリックス）を提供し得る。これらの態様は、参照しやすいように、それぞれ「二次元」基材または「三次元基材」と呼ばれる場合もある。基材が、その上で細胞が増殖し得る表面を提供する場合、官能基のフィールドおよび補完的な領域が提供される必要があるのは、細胞に曝露される表面上のみである。基材中または基材を通って細胞が増殖し得る場合、フィールドおよび領域は、基材マトリックス内、および状況に応じて当該マトリックス表面において画成される必要があるであろう。
【００４０】
本発明者らは、本発明の材料において使用され得るいくつかの基材を特定しており、そのような基材としては、金、シリカ、ガラス、ニトロセルロース、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリ乳酸（PLLA）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリ（ウレタン）、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、チタンおよびその合金、形状記憶合金、並びにステンレス鋼から成る群より選択されるもの（これらに限定されるわけではない）が挙げられる。
【００４１】
好適な基材は、当該材料の意図される目的に基づいて選択され得る。細胞または組織培養における使用が意図される本発明の材料は、通常、これらの分野において常用されている二次元基材を利用してもよい。そのような基材は、比較的硬くてよく、例えば、金、シリカ、ガラス、またはプラスチックが挙げられる。これらの使用が意図される本発明の材料は、培養容器（例えば、フラスコ、プレート、皿など）あるいは分散培養での使用に好適なビーズの形態を取り得る。
【００４２】
医学的利用（例えば、移植可能な薬剤など）が意図される本発明の材料は、上記において列挙された種類の二次元基材、あるいは三次元基材を利用し得る。一般的に、医学的利用が意図される本発明の材料（特に、移植されることが意図されるもの）は、体内において良好な忍容性を示しかつ慢性炎症反応を生じないような基材を利用することが好ましくあり得る。この種類の材料において用いるのに好適な基材は、生体内吸収性であり得（すなわち、当該基材および／または材料は、一定期間をかけて体内で崩壊し）、最終的には体自身の組織で置き換えられ得る。
【００４３】
再生医療に使用されるための材料では、三次元基材を使用することが一般的に好ましくあり得る。そのような基材は、例えば、骨、軟骨、脂肪、筋肉、および神経組織などの代替組織を形成するための足場材として機能し得る。
【００４４】
代替骨の産生において使用される本発明の材料または方法（例えば、骨形成細胞の産生に関連する材料または方法）の場合、粗面化された表面を有する基材を使用することが好ましくあり得る。粗面化された表面は、骨接触用途、並びに機能的骨芽細胞、前駆細胞、および幹細胞による造骨性分化マーカーの発現においてより効率的であることが示されている。
【００４５】
二次元または三次元基材は、細胞付着および細胞機能に影響を及ぼすために、先行技術によって示されているいくつかのパラメータに基づいて選択され得る。これらのパラメータとしては、有孔率および孔径、表面化学および表面エネルギー、圧縮率、ヤング率、孔径、並びに、繊維状基材の場合には、繊維の方向、繊維サイズ、および相互接続性が挙げられる。
【００４６】
「フィールド」
官能基の「フィールド」は、本発明の目的のために、1種類以上の生物学的に活性な官能基を有する材料の任意のエリアまたは容積を包含すべきであり、当該エリアまたは容積は、実質的に当該官能基を含有しない少なくとも1つの領域によって隣接されている。フィールドの1つ以上のさらなる境界は、本発明の材料の端部によって提供され得る。フィールドは、生物学的に活性な単一の官能基だけを含んでもよいし、あるいは複数の官能基を含んでもよい。フィールドが複数の官能基を含む場合には、当該フィールドのサイズおよび形状並びに当該フィールド内の官能基の密度は、本明細書の他の箇所で説明するように制御され得る。
【００４７】
驚くべきことに、単一の官能基のみを含むフィールドは、当該フィールドよりはるかに大きい細胞の接着、分化、および他の生物学的特性に影響を及ぼすことができる。単一の官能基を含むフィールドは、あまりに低すぎて生物学的に有効ではない濃度を表すことが予想され得る。しかしながら、本発明者らは、いかなる仮説にも束縛されることを望むわけではないが、生物学的に活性な個々の官能基を含むフィールドは、インテグリンのパターンに影響を及ぼすには十分であり、これが、細胞にさらなる影響を及ぼすことができると考えている。
【００４８】
概して、本定義による任意の所定のフィールドは、実質的に、単一の種の官能基のみを含有することが好ましくあり得る。例えば、生物学的に活性な官能基のフィールドは、単一の種で少なくとも95％、好ましくは少なくとも96％、より好ましくは97％、さらにより好ましくは少なくとも98％、または最も好ましくは99％〜100％構成されていることが好ましくあり得る。
【００４９】
本発明の材料において、フィールドの2つ以上のセットを利用することが所望され得、各セットは、官能基の異なる種を含むか、あるいは官能基の混合種を含む。したがって、本発明による材料は、官能基の第1の種（または官能基の第1の混合種）で構成されているフィールドの第1のセット、並びに官能基の第2の種（または官能基の第2の混合種）で構成されているフィールドの第2のセットを含み得る。本発明の材料または方法は、必要に応じて、フィールドの第3のセットまたはさらなるセットを使用してもよい。
【００５０】
官能基のフィールドは、官能基の2つ以上の異なる種を含んでもよいことが理解されるであろう。この場合、官能基の種の組み合わせは、本明細書の別の箇所で説明される各単一の種に起因する特性に基づいて選択され得る。同じフィールドにおいて組み合わされる生物学的に活性な官能基の異なる種は、自己組織化することができるような、したがって、異なる種が組み入れられた一貫性のあるフィールドの形成を促進するようなインク構成物の一部として（他の箇所において説明されるようにして）堆積されることが好ましくあり得る。
【００５１】
本発明のフィールドは、ドット、カンマ、線、三角形、正方形、半月形、および星形から成る群より選択される形状（これらに限定されるわけではない）を含む、任意の形状を有し得る。本発明者らは、フィールドの様々な形状は、本発明の材料または方法のいくつかの潜在的な用途において有益であり得ると考えている。
【００５２】
例えば、本発明者らは、円形パターンを有するフィールドは、細胞骨格の成分の制御において有益であり得、したがって、そのようなフィールドを備える材料に曝露される細胞の分化に、影響を及ぼすと考えている。本発明者らは、線状または列状のフィールドは、単一の細胞の形態に影響を及ぼすことが可能であり、かつ細胞の集団に影響を与えることも可能であると考えている。線状または列状のフィールドを用いる材料または方法の使用は、神経細胞系列および筋原細胞系列の産生において有用であり得る。そのような細胞系列の産生において利用され得る好ましい官能基については、本明細書の別の箇所において説明するが、神経性または筋原性系列の成長に寄与することが示されている官能基を含むこのような形状のフィールドを利用することは、特に好ましくあり得る。線状または列状のフィールドはさらに、細胞外マトリックスの産生にも影響を及ぼし得、したがって、腱または靱帯を生じることができる細胞の産生においても有益であり得る。
【００５３】
本発明による材料または方法は、単一の形状のみを有するフィールドを使用してもよいし、あるいは複数の形状の混合物を有するフィールドを利用してもよい。
【００５４】
生物学的に活性な官能基のフィールドは、概して、それらの寸法の少なくとも1つ（実質的に平面な材料上のフィールドの場合には、幅または長さのいずれか、あるいは細胞がその中または上において増殖し得る材料のフィールドの場合には、幅、長さ、または深さのいずれか）が、本発明の材料に曝露され得る細胞より小さいサイズであろう。
【００５５】
概して、任意の所定のフィールドの少なくとも1つの寸法が、100nm未満であることが好ましくあり得る。例えば、任意の所定のフィールドの少なくとも1つの寸法は、90nm未満、80nm未満、70nm未満、60nm未満、あるいは50nm未満であってもよい。いくつかの態様において、フィールドは、40nm未満、30nm未満、20nm未満、または10nm未満の少なくとも1つの寸法を有する。本発明者らは、約65nm〜75nm、（最も好ましくは）およそ70nmの直径を有するドット形状のフィールドを利用する本発明の材料または方法が、本明細書の別の箇所に記載される生物学的効果を結果として達成するために、非常に好適であるということを見出した。平均ドット直径を含む平均寸法も、例えば、100nm未満、または90nm未満、または80nm未満、または70nm未満、または60nm未満、または50nm未満、または40nm未満、または30nm未満、または20nm未満、または10nm未満、または、例えば、65nm〜75nm、あるいはおよそ70nmであってよい。
【００５６】
本発明者らは、100nm未満の寸法を有するフィールドの使用は、細胞から誘発される生物学的効果の観点、並びにこれにより本発明の材料の製造時間を短縮できるということの両方から、有利であると考えている。製造時間の短縮は、それによって所定の時間内に非常に多くの材料を製造することが可能となるためだけでなく、フィールド間のエリアに生物学的に活性な官能基の堆積がもたらす、制御されない拡散の発生を低減するためにおいても、有益である。
【００５７】
線状または列状のフィールドの場合、これらのフィールドが、100nmよりも大幅に長く、かつ材料に曝露される細胞よりも長くてよい少なくとも1つの寸法を有し得るということは理解されるであろう。
【００５８】
「実質的に官能基を含有しない基材の領域」
本発明の目的では、「実質的に官能基を含有しない基材の領域」（簡潔にするために「領域」とも呼ばれる）は、本発明の材料の中に存在する1つ以上のフィールドを形成する官能基を実質的に含有しない任意の領域であり得る。好ましい態様において、そのような領域は、任意の官能基または生物学的に活性な官能基を実質的に含有し得ない。あるいは、そのような領域は、材料のフィールド中に見出される官能基でない限り（すなわち、領域が、上記において規定されるような個々のフィールドを形成する任意の官能基を実質的に含有しない限り）、1つ以上の官能基を含有していてもよい。
【００５９】
領域は、少なくとも95％が官能基を含有しない場合、好ましくは少なくとも96％が官能基を含有しない場合、より好ましくは少なくとも97％が官能基を含有しない場合、さらにより好ましくは少なくとも98％が官能基を含有しない場合、並びに最も好ましくは少なくとも99％〜最高100％までが官能基を含有しない場合、所定の官能基を実質的に含有しないと見なすことができる。
【００６０】
本発明の材料または方法において使用され得るこの定義によれば、領域の好適な寸法は、官能基のフィールド間に設けることが所望される「ピッチ」に応じて選択され得る。フィールド間のピッチを計算する方法、並びに本発明の材料または方法における使用のために好ましいピッチについては、以下においてさらに説明する。
【００６１】
「生物学的に活性な官能基」
本開示の目的では、「官能基」は、それを組み入れた化合物または分子に対して再現可能な化学官能性を付与する任意の原子または原子団を含むと考えられ得る。
【００６２】
本発明による生物学的に活性な官能基は、それらが接触する生体細胞の活動に影響を及ぼすことができる官能基である。生物学的に活性な官能基は、細胞接着のレベルを増加または減少させることによって、生体細胞の接着に影響を及ぼすことが可能であり得る。生物学的に活性な官能基は、分化の生じるレベルを促進または減少させることによって、生体細胞の分化に影響を及ぼすことが可能であり得る。いかなる仮説にも束縛されることを望むわけではないが、本発明者らは、本発明の材料において見出される生物学的に活性な官能基が細胞分化に影響を及ぼす能力は、これらの官能基が、例えば、細胞接着、接着点形成、細胞分布、細胞骨格の特徴の配置、数、および分布などの因子に影響を及ぼす能力の結果として生じ得ると考えている。
【００６３】
本発明の材料または生物学的に活性な官能基が、活動（例えば、生体細胞の分化など）を促進するまたは減少させる能力は、関心対象の活動が対照細胞集団（例えば、関心対象の官能基の不在下において、特に関心対象の官能基を含む本発明の材料の不在下において増殖した集団）において生じる程度を基準にして評価され得る。
【００６４】
本発明者らが、本発明の材料または方法における使用のために好適であると特定した生物学的に活性な官能基の例としては、メチル基;イソプロピル基;シクロヘキシル基;アリール基;アリル基;アルキニル基;ヒドロキシル（アルコール）基;エーテル基;モルホリノ基;エチレングリコシル化基;ポリエチレングリコシル化基;単糖、例えば、グルコース、リボース、ヘパロース（heparose）、またはマンノースなど;カルボキシレート基;スルフェート基;ホスフェート基;フェノキシド基;アミノ基;ジアルキルアミノ基;アルキルアミノ基;ホスフィン基;およびアミノ酸から成る群より選択されるものが挙げられる。
【００６５】
本発明の材料または方法における使用のために好適な、孤立した生物学的に活性な官能基は、メチル基;イソプロピル基;シクロヘキシル基;アリール基;アリル基;アルキニル基;ヒドロキシル（アルコール）基;エーテル基;モルホリノ基;エチレングリコシル化基;ポリエチレングリコシル化基;カルボキシレート基;スルフェート基;ホスフェート基;フェノキシド基;アミノ基;ジアルキルアミノ基;アルキルアミノ基;およびホスフィン基から成る群より選択され得る。
【００６６】
本発明の材料または方法において、疎水性官能基を利用することが好ましい場合がある。好適な生物学的に活性な疎水性官能基の例は、メチル基;イソプロピル基;シクロヘキシル基;アリール基;アリル基;およびアルキニル基から成る群より選択され得る。
【００６７】
本発明のある特定の態様では、親水性官能基を利用することが好ましい場合がある。本発明の材料または方法における使用に適した、好適な生物学的に活性な親水性官能基の例は、ヒドロキシル（アルコール）基;エーテル基;モルホリノ基;エチレングリコシル化基;ポリエチレングリコシル化基;並びに単糖、例えば、グルコース、リボース、ヘパロース、またはマンノースなど、から成る群より選択され得る。
【００６８】
本発明の材料または方法において、負に帯電した官能基を使用することが好ましい場合がある。本発明の材料または方法において使用され得る負に帯電した生物学的に活性な官能基の例としては、カルボキシレート基;スルフェート基;ホスフェート基;およびフェノキシド基から成る群より選択されるものが挙げられる。
【００６９】
あるいは、またはさらに、正に帯電した官能基を使用することが好ましい場合がある。本発明の材料または方法において使用され得る正に帯電した生物学的に活性な官能基の例は、アミノ基;ジアルキルアミノ基;アルキルアミノ基;ホスフィン基;およびアミノ酸から成る群より選択され得る。
【００７０】
生物学的に活性な官能基は、当該材料に接触する細胞が好適な官能基を利用できるようにする任意の好適な化合物を使用して、本発明の材料における基材上に堆積され得る。単なる一例として、カルボキシル基は、メルカプトンヘキサデカン酸（MHA）に基材を曝露することによって堆積させることができ、メチル基は、ヘキサデカンチオール（HDT）に基材を曝露することによって堆積させることができ、アミノ基は、11-アミノ-1-ウンデカンチオール（AUT）に基材を曝露することによって堆積させることができ、並びにヒドロキシル基は、11-メルカプト-1-ウンデカノール（MUOH）に基材を曝露することによって堆積させることができる。
【００７１】
「孤立した生物学的に活性な官能基」
概して、本発明の材料または方法において使用される生物学的に活性な官能基は、孤立した生物学的に活性な官能基であることが好ましくあり得る。本開示の目的では、「孤立した生物学的に活性な官能基」は、他の官能基から「孤立した」形態で提供されるものである。これは、孤立していなければ生物学的に活性な官能基の複数の異なる種が存在する場合に生じるであろう「相反（conflicting）」刺激を、細胞が受けないという注目に値する利点を提供する。したがって、孤立した生物学的に活性な官能基を利用する本発明の材料または方法は、均質な細胞集団の産生において特に有用である。そのような孤立した生物学的に活性な官能基の使用により提供されるさらなる利点については、以下において考察する。
【００７２】
この定義によれば、孤立した生物学的に活性な官能基は、原子、原子団、分子、または化合物によって提供される唯一の生物学的に活性な官能基を含む、任意の生物学的に活性な官能基であってよい。したがって、孤立した生物学的に活性な官能基は、それ自身において提供される（すなわち、より大きい分子または化合物の一部でない）生物学的に活性な官能基であってよい。あるいは、より大きい分子または化合物の一部である生物学的に活性な官能基であっても、それが、より大きい分子または化合物によって細胞に提供される唯一の官能基であるなら、孤立した生物学的に活性な基であると見なすことができる（この定義は、官能基のすべてが同じ種である限り、分子または化合物上のいくつかの官能基のうちの1つとして提供される生物学的に活性な官能基も包含し得ることが理解されるであろう）。
【００７３】
本発明の目的では、分子、例えば、アミノ酸など、または巨大分子、例えば、ペプチドまたは核酸など、の上に存在する複数の生物学的に活性な官能基の混合物の一部である生物学的に活性な官能基は、「孤立している」と見なすべきでない。これらの場合、分子、巨大分子、または化合物によって提供される複数の生物学的に活性な官能基の混合物は、相反する可能性のあるいくつかの生物学的刺激を細胞に提供し、これは、高いレベルの不均質性を含有する細胞集団を生じる原因となり得る。
【００７４】
本発明者らは、本発明の材料または方法において孤立した官能基を使用することは、上記において説明したもの以外にも、いくつかの利点を提供すると考えている。孤立した官能基の使用による利点の1つは、そのような孤立した基は、アミノ酸およびタンパク質などの分子または巨大分子よりも小さいので、アミノ酸またはペプチドなどの上の生物学的に活性な官能基に比べて、フィールド内、およびフィールド間のピッチにおけるそのような官能基の密度を、より容易にかつより正確に制御することができることである。このサイズの差は、アミノ酸またはペプチドにおいて生じる官能基が、孤立した官能基よりも、それらが付着されている基材から離れて広がり得、したがって、孤立した官能基は、孤立していないそれらの相当物よりも、細胞結合をより良好に促進し得るという点において、さらなる利点を提供し得る。
【００７５】
孤立した官能基を使用することで、利用可能な官能基の範囲が、アミノ酸またはペプチドなどにおいて天然に見出されるものに制限されないために、使用される官能基の種の範囲が広がる。
【００７６】
孤立した官能基の使用による別の利点としては、孤立した官能基は、より大きな生物学的分子の一部として見出される官能基よりも分解する傾向が少ない形態で提供され得るので、これらの基を組み入れた材料の寿命が延びるということが挙げられる。これらは、それら自体において提供される（すなわち、より大きい分子の一部ではない）孤立した官能基、または生物学的分子または巨大分子よりも良好な安定性を有する、より大きな分子の一部として提供される孤立した官能基を含み得る。
【００７７】
本発明の材料に孤立した官能基を使用することは、より大きい分子（例えば、アミノ酸、ペプチド、または核酸鎖など）に見出される官能基とは対照的に、孤立した官能基は細胞培養液の成分の非特異性結合を生じる傾向があまりないという点において、更なる利点を有する。通常、官能基を含み得るアミノ酸またはペプチドは、多くの場合、培地成分、例えば、ウシ胎児血清（一般的に使用される培養添加物）において見出されるものなどに結合する。この非特異的結合により、生物学的に活性な官能基が、それらが影響を及ぼすことを意図される細胞から「マスクされる」ために、アミノ酸またはペプチドなどの分子の有効性は大幅に減少し得る。生じる非特異的結合の程度は予測できず、そのため、これらの状況において生じ得る官能基のマスクの程度も、大きく変動し得る。これは、細胞に対して利用可能となるアミノ酸またはペプチドの量を正確に制御することが困難であることを意味し、並びに官能基に曝露される細胞集団における不均質な反応に寄与し得る。本発明者らは、孤立した官能基は、非特異的結合を比較的生じないため、結果として、制御された予測可能な様式で生体細胞に対してより良好に影響を及ぼすことができ、したがって、不均質な集団をあまり生じない、ということを見出した。
【００７８】
孤立した官能基の使用は、自然発生的な分子または巨大分子において見出される官能基とは対照的に、孤立した官能基は、それらが付着する基材に対してより良好に接着し得るという点においても、有益であり得る。
【００７９】
官能基と本発明の材料の基材との付着を促進することができる、官能基、または官能基を有する分子もしくは化合物の修飾については、本明細書の別の箇所において説明する。
【００８０】
「ピッチ」
本発明の材料上の官能基のフィールドの配置に寄与するパラメータの1つは、そのようなフィールドのピッチであり、これは、材料上のフィールド間または材料上の同じ官能基のフィールド間の距離を意味する測定値である。本発明者らは、様々なピッチを使用することで、本発明の材料によって提供される驚くべき利点が達成され得るということを見出した。
【００８１】
一般的に、本発明の材料または方法において使用されるべきピッチは、生体細胞のサイズより小さくてもよい。本発明の材料または方法で使用するための、生物学的に活性な官能基のフィールド間の好ましいピッチは、75nm〜2000nmであってよい。フィールドの間のピッチは、およそ100nm〜1500nm、最も好ましくは140nm〜1000nmであることが好ましい。本発明者らは、本明細書の別の箇所においてより詳細に説明するように、本発明の材料において、140nm、280nm、または1000nmなどのピッチの使用が、先行技術に優るいくつかの顕著な利点を提供するということを見出した。本発明の細胞増殖材料または方法において、フィールド間で280nmのピッチを使用することが特に有用であることが見出された。このピッチは、これまでに調査されたすべての生物学的に活性な官能基における好ましい細胞接着活動に関連していると考えられる。いかなる仮説にも束縛されることを望むわけではないが、本発明者らは、280nm付近（例えば、約250nm〜350nmなど）のピッチを有するフィールドの使用は、達成された官能基の分配の「ばらつき」により、そのような材料に接触する細胞の集団において極めて均質な反応がもたらされるので、特に有効であり得ると考えている。対照的に、より小さいピッチまたはより大きいピッチでは、生体細胞から得られる反応が減少し得る（フィールドが、あまりに密集しているかあるいはあまりにまばらすぎると、特に強い反応を誘発する）。
【００８２】
ピッチは、生物学的に活性な官能基の同じ組成物を有する隣接したフィールドの中心点の間の距離として計算され得、2つ以上のフィールドセットを含む（それぞれのフィールドセットが、生物学的に活性な官能基の異なる組成物を有する）材料の場合、異なるフィールドセットのピッチは、お互いに同じであってもまたはお互いに異なっていてもよい。
【００８３】
ピッチは、原子間力顕微鏡（AFM）およびX線光電子分光法（XPS）などの技術を用いて測定され得る。
【００８４】
「ドメイン」
本発明の材料は、ドメイン内の生物学的に活性な官能基のフィールドのピッチが実質的に一定であるような1つ以上のドメインを含有する。そのような各ドメインは、いくつかのフィールド、好ましくは4、5、10、またはそれ以上のフィールドを含み得る。あるドメインが実質的に本発明の材料の全体に広がっていてもよいし、または所定の材料はいくつかの異なるドメインを含んでもよい。後者の場合、各ドメイン内のピッチは実質的に一定であるが、一方で、異なるドメインは、同じピッチを共有していてもよいしまたは異なるピッチを有していてもよい。
【００８５】
本開示の目的では、細胞増殖材料のエリア、例えばドメインなど、は、エリア内のピッチがお互いに15％を超えて異ならない場合には、一定のピッチを有するフィールドを含有すると見なされ得る。好ましくは、そのようなエリア内のピッチは、お互いに、10％以下まで、より好ましくは5％以下まで、さらにより好ましくは4％以下まで、なおより好ましくは3％以下まで、なお一層好ましくは2％以下まで、最も好ましくは1％以下まで異なるであろう。
【００８６】
製造方法
上述の段落において、本発明による材料の製造において考えられるいくつかの因子の詳細について言及した。第3の局面において、本発明は、細胞増殖材料を製造する方法を提供するが、当該方法は、生物学的に活性な官能基の複数のフィールドを作成するために、複数の生物学的に活性な官能基を基材上に堆積する工程を含み、この場合、当該生物学的に活性な官能基のフィールドは、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されるように配置される。
【００８７】
本発明の材料は、必要なフィールドおよび領域を作製するのに十分な正確さで基材上に官能基を堆積することができる任意の好適な技術を使用して（例えば、上記の第3の局面による方法によって）製造され得る。官能基のフィールド間の好ましいピッチが、典型的に75nm〜2000nmであり、当該フィールドが、典型的に100nm付近以下の最少寸法を有する場合、本発明の材料を製造するためにナノスケール技術を利用することが好ましくあり得る。
【００８８】
本発明の材料の製造に使用され得る好ましい方法は、ディップペンナノリソグラフィ（DPN）である。DPNは、走査型プローブリソグラフィ技術であり、この技術では、分子（例えば、本発明による生物学的に活性な官能基など）を基材に移動させるために原子間力顕微鏡のチップを使用する。原子間力顕微鏡のチップは、「インク」（例えば、選択された官能基）を「紙」（この場合は、細胞増殖基材）の上に堆積させる「ペン」のように効果的に機能する。この技術の主な利点は、（１次元または2次元配列において）数多くの「ペン」ヘッドをDPN装置に組み入れることができ、その結果、基材の比較的大きなエリアの、ナノスケールでのパターン化が可能になるということである。
【００８９】
好ましい態様において、インクは、官能基を基材に付着させるのに役立つと同時に、本発明の材料に接触して配置された生体細胞に対して官能基を利用可能にする、より大きな分子（「インク構成物」）の一部として官能基を含んでもよい。この種類のインクは、「官能基提示インク（functional group-presenting ink）」と呼ばれ得る。官能基提示インクは、生体細胞に対して効率的に官能基を提示するそれらの能力と、基材上への正確で制御された再現可能な官能基の堆積を可能にするインクとして機能するそれらの能力とに基づいて選択され得る。
【００９０】
正確かつ再現可能に堆積されるインクの能力に寄与するであろう特性としては、粘度、揮発性、および蒸気圧が挙げられる。これらの特性は、インクをDPNペンに適用する能力、並びに基材上にペンによって正確に堆積されるインクの能力の両方において重要である。DPNペン上へのインク構成物のコーティングの適用は、通常、均一な適用範囲を好適に提供するために、気化または同様の技術を使用して達成され得る。これは、本発明の材料の製造の際に基材上に堆積され得るインク（したがって、生物学的に活性な官能基を含むインク構成物）の貯蔵容器を備える。
【００９１】
ペンから基材へのインクの堆積は、2つの部材の間の接点で形成された水のメニスカスを介して生じる。この堆積が、制御された様式で生じ、メニスカスからの望ましくない拡散が、最小に維持されることが重要である。これは、好適な特性を有するインクおよびインク構成物を選択することによって達成され得る。望ましい特性、並びにそのような特性を付与することのできるインク構成物の特徴については、以下においてより詳細に説明する。
【００９２】
好ましいインクは、比較的低い温度（およそ22℃の室温付近）および比較的低い湿度での堆積が可能であるように選択され得る。低温および低湿は、通常、ペン-基材界面での小さい水メニスカスの生成を可能にし、これは、小さくて、輪郭が明確な、制御されたフィールドへの、インク構成物（したがって、生物学的に活性な官能基）の堆積を容易にする。これらの条件、特に低温は、そうでなければペンから基材へ生じるであろう制御されない空中拡散の発生を減少させる。
【００９３】
DPNが、上記において言及した低温および低湿条件下において、メルカプトンヘキサデカン酸インク構成物を用いて実施される場合、インクの拡散係数は、0.041μm2／sであることがわかっている。本発明者らは、この範囲の低い拡散係数を有するインクは、そのようなインクによって生物学的に活性な官能基のフィールドの正確で再現可能な堆積が可能となることから、および、そうでなければ正確さを減じるであろう制御されない拡散の傾向が減少させることから、有益であると考えている。これらの利点は、堆積されるべき生物学的に活性な官能基に関係なく望ましいことは理解されるであろう。
【００９４】
本発明の材料の製造での使用に適した好ましいインクはさらに、比較的短い「停止時間」（これは、インクの必要な量が堆積されるのを可能にするために、ペンが基材のエリアと接触して費やさなければならない時間である）の間に基材上へ堆積されるという能力に基づいて選択され得る。短い停止時間の使用は、それによって望ましくない拡散が生じる機会が減少するためと、本発明の材料のより迅速な製造を可能にするための両方の理由から有利である。短い停止時間によるこの利点は、断続的な接触モードで実施されるDPNおよび接触モードで実施されるDPNの両方に適用可能である。
【００９５】
インク構成物と、ペンと基材の間に形成されるメニスカスとの相互作用は、インク構成物にポリエチレングリコール基を導入することによって増加し得る。本発明者らは、このことが、（特に、そうでなければチップから緩徐な移動を示すであろうインクにおいて）ペンから基材へのそのようなインク構成物の効率的で一貫した堆積を容易にするということを見出した。それは、インク構成物の揮発性も有利に増加させ得る。これは、DPNにおいて使用するためのペンのコーティング、および制御された再現可能な様式での基材上へのインク（したがって、官能基）の堆積の両方において有益であり得る。
【００９６】
インク構成物中に存在する炭素-炭素結合の数（例えば、官能基を基材に固定するための炭素鎖）を変えることによっても、本発明の材料の製造において使用されるインク構成物の揮発性に影響を及ぼし得る。一般的に、炭素-炭素結合の数を増加させることによって揮発性は減少し、炭素-炭素結合の数を減少させることによって揮発性は増加する。本発明者らは、10〜20の炭素-炭素結合を有する炭素鎖を含むインク構成物が、概して、DPNを使用する本発明の材料の製造に良く適していることを見出した。16〜18個の炭素-炭素結合を有する炭素鎖を含むインク構成物は、アルキル官能基の堆積に非常に有益であり、一方で、およそ12個の炭素-炭素結合を有する構成物は、アミノ官能基またはヒドロキシル官能基の堆積のためのインクにおいて好ましいことが見出された（これらの基は、それらが組み入れられているインク構成物の揮発性を自然に減少させ得るため）。
【００９７】
各フィールドが複数の官能基を含む場合、本発明の材料の製造において使用される好ましいインクは、基材に付着されるインク構成物（したがって、生物学的に活性な官能基）の安定した単層を作製するために自己組織化が可能であり得る。この様式での自己組織化は、生物学的に活性な官能基、したがってそれらが組み入れられている材料の安定性を促進する。自己組織化は、インク構成物中の鎖と基との間の相互作用の存在によって促進される（例えば、アルキル鎖と酸性基は酸性インクにおいて相互作用し得る。酸性インクとヒドロキシル基を含むインクの混合物も、水素結合によって相互作用し得るが、ただし、これは、アルキル鎖が同様の長さである場合にのみ生じ得る）。したがって、非常に安定したフィールドを含む本発明の材料を製造することが望まれる状況においては、上記において言及した範囲の上限の数の炭素-炭素結合の炭素鎖を有するインク構成物を利用することが好ましくあり得る。
【００９８】
上記から、本発明の材料の製造において使用するためのインク構成要素を選択する場合、自己組織化することができるインク構成要素の作製に寄与する因子と、明確で再現可能な様式でインクの堆積を支援するような様式でインクの揮発性および粘度を調整する因子との間でバランスが取られることは認識されるであろう。
【００９９】
DPNで使用するための構成物との関係において上記において説明した基準の多くが、本発明の材料を製造し得る他の方法においても関連し得るということは理解されるだろう。
【０１００】
DPNは、本発明の材料の製造において使用される好ましい代表的な技術であるが、好適なフィールドおよび領域を作製するために必要な様式で官能基を堆積することができる任意のナノリソグラフィ法も使用することができる。単なる一例として、採用され得る他の好適な技術としては、ナノインプリントリソグラフィ、電子ビーム直接描画リソグラフィ、および直接原子間力顕微鏡（AFM）が挙げられる。
【０１０１】
他の態様
本発明の材料および方法は、先行技術を用いて達成され得る様式よりも再現可能で制御された様式で分化などの細胞活動に影響を及ぼすことができるその能力により、広範囲の臨床、治療、または研究への適用において有用であり得、その上、本発明者らは、本発明の材料および方法に対するいくつかの特に好ましい適用を同定したので、これらについて、以下においてさらに詳細に説明する。
【０１０２】
特に好ましい態様において、本発明の細胞増殖材料および方法は、幹細胞または前駆細胞を増幅させることが可能であり得、並びに細胞の分化（または、前駆細胞の場合は、さらなる分化）を実質的に誘導することなしに、それらをなし得る。分化を誘導しない幹細胞または前駆細胞メンバーの増幅は、当初の少ない数の細胞から治療に有用な多くの細胞を産生することが可能となるので、大いに有益である。しかしながら、有益ではあるものの、この目的は、今までのところ、先行技術において公知である方法を使用して達成することは困難であることがわかっている。細胞生存率を維持するために幹細胞培養物に提供される多くの増殖因子または補助剤も、細胞に分化系列の決定および分化をもたらす原因となる。分化を生じさせることなく細胞集団の増幅を可能にする、これまでに特定されている数少ない細胞増殖条件は、非常に高価なサイトカイン（例えば、FGF2など）あるいはサイトカインの「カクテル」を使用する傾向にある（その結果、さらに関連費用が増加する）。
【０１０３】
本発明者らは、メチル（-CH3）官能基のフィールドをおよそ280nmのピッチにおいて利用する本発明の材料が、幹細胞または前駆細胞を未分化の状態に維持することにおいて特に有用であることを見出した。この方法において維持される細胞の集団はさらに、増幅によって細胞メンバーを増加させることができる。この態様による本発明の材料は、（複雑な発現および再フォールディングあるいは増殖因子に関連する精製を伴わないため）前述において開示された条件よりはるかに安価に製造することができ、並びに基材および孤立した官能基はさらに、サイトカインなどの複雑な生物学的分子よりも分解に対してより抵抗性であるため、非常に長い「有効期間」を有する。この点において、本発明者らの研究結果は、本発明のさらなる局面をもたらすため、非常に有利である。
【０１０４】
第4の局面において、本発明は、メチル官能基を含む複数のフィールドが付着されている基材を含む、幹細胞集団または前駆細胞集団の増幅のための細胞増殖材料であって、当該メチル官能基のフィールドが、メチル官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離され、かつフィールド間のピッチがおよそ200nm〜750nmである、細胞増殖材料を提供する。ピッチは、好ましくはおよそ280nmであってよい。
【０１０５】
本発明の第5の局面において、幹細胞または前駆細胞を本発明の第4の局面による細胞増殖材料に接触させる工程、および増幅された集団が産生されるまで細胞を培養する工程を含む、幹細胞集団または前駆細胞集団を増幅する方法を提供する。
【０１０６】
本発明者らの研究結果は、PCL基材が幹細胞集団または前駆細胞集団の増幅に対して有益な効果を有していることを示しているため、本発明者らは、本発明の第4または第5の局面の材料または方法において、PCL基材を有利に使用できると考えている。
【０１０７】
本発明者らは、本発明の細胞増殖材料は、軟骨形成細胞を産生するように生体細胞の分化に影響を及ぼすために使用することができることを見出した。これは、軟骨形成系列を生じる可能性を保有する幹細胞または前駆細胞を使用することで達成され得る。軟骨形成細胞を産生する能力は、いくつかの研究上または治療上の適用において（例えば、軟骨への損傷に関係する傷害または疾病の検査または処置において）有用であることは理解されるであろうし、かつ、この能力はさらに、本発明のさらなる局面をもたらす。
【０１０８】
本発明の第6の局面において、カルボキシル基、メチル基、およびヒドロキシル基から成る群より選択される生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、軟骨形成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、生物学的に活性な官能基のフィールドが、当該生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている細胞増殖材料を提供する。
【０１０９】
そのような材料の好ましい態様において、個々のフィールドは各々、実質的にまたは完全に、列挙された官能基の単一の種のみから構成され得る。しかしながら、列挙された官能基の2つ以上の種を含むフィールドも、これらの材料の有用な態様において採用され得る。
【０１１０】
完全にまたは実質的にカルボキシル基から成るフィールドを使用するこれらの材料の態様において、フィールド間のピッチは、約280nmが好ましくあり得る。完全にまたは実質的にヒドロキシル基から成るフィールドを使用するこれらの材料の態様において、フィールド間のピッチは、およそ140nm〜およそ1000nmの範囲であることが好ましくあり得る。
【０１１１】
第7の局面において、本発明はさらに、本発明の第6の局面による細胞増殖材料に幹細胞または前駆細胞を接触させる工程を含む、軟骨形成細胞を産生する方法も提供する。当該方法は、任意で、軟骨形成細胞が産生されるまで細胞を培養する工程を含んでもよい。
【０１１２】
本発明の材料および方法は、骨形成細胞を産生するように生体細胞（特に、幹細胞または前駆細胞）の分化に影響を及ぼすために使用され得る。この能力は、臨床上および研究上の重要な効用（例えば、骨への損傷に関係する傷害または疾病の検査または処置において）でもあり、かつ、骨形成細胞を産生するように細胞分化に影響を及ぼす能力は、本発明のさらなる局面をもたらす。
【０１１３】
本発明の第8の局面において、アミノ基およびカルボキシル基から成る群より選択される生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、骨形成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、生物学的に活性な官能基のフィールドが、当該生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている細胞増殖材料を提供する。
【０１１４】
本発明の第8の局面による材料の好ましい態様において、個々のフィールドは各々、実質的にまたは完全に、アミノ官能基またはヒドロキシル官能基の単一の種のみから構成され得る。しかしながら、列挙された官能基の2つ以上の種を含むフィールドも、これらの材料の有用な態様において採用され得る。
【０１１５】
本発明のこの第8の局面による材料は、およそ140nm〜およそ1000nmの、生物学的に活性な官能基のフィールド間のピッチを利用することが好ましくあり得る。
【０１１６】
第9の局面において、本発明は、本発明の第8の局面による細胞増殖材料に幹細胞または前駆細胞を接触させる工程を含む、骨形成細胞を産生する方法を提供する。当該方法は、任意で、骨形成細胞が産生されるまで細胞を培養する工程を含んでもよい。
【０１１７】
本発明の材料または方法は、神経形成細胞を産生するように生体細胞の分化に影響を及ぼすことができることも見出された。これは、神経原性系列を生じる可能性を保有する幹細胞または前駆細胞を使用することで達成され得る。神経形成細胞を産生する能力は、いくつかの研究上または治療上の適用において（例えば、神経への損傷に関係する傷害または疾病の検査または処置において）有用であることは理解されるであろうし、かつ、この能力は、本発明のさらなる局面をもたらす。
【０１１８】
本発明の第10の局面において、アミノ基およびヒドロキシル基から成る群より選択される生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、神経形成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、生物学的に活性な官能基のフィールドが、当該生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている細胞増殖材料を提供する。
【０１１９】
本発明のこの第10の局面による材料の好ましい態様は、上記の第8の局面に関連して説明した好ましい態様と一致し得る。
【０１２０】
本発明のさらなる第11の局面は、本発明の第10の局面による細胞増殖材料に幹細胞または前駆細胞を接触させる工程を含む、神経形成細胞を産生する方法を提供する。当該方法は、任意で、神経形成細胞が産生されるまで細胞を培養する工程を含んでもよい。
【０１２１】
本発明者らは、本発明の材料および方法が、筋原細胞が産生されるように生体細胞の分化に影響を及ぼすことができることを見出した。この効果は、筋原性系列を生じることができる幹細胞または前駆細胞を増殖させるために、当該材料または方法が使用される場合に達成され得る。筋原細胞を産生する能力は、いくつかの研究上または治療上の適用、例えば、筋肉細胞が損傷している傷害または疾病の検査または処置において有益であろう。筋原細胞を産生する本発明の材料および方法の能力は、以下のようなさらなる局面をもたらす。
【０１２２】
本発明の第12の局面において、アミノ基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、筋原細胞の産生のための細胞増殖材料であって、アミノ基のフィールドが、アミノ基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている細胞増殖材料を提供する。
【０１２３】
この第12の局面の好ましい態様において、アミノ基のフィールドは、アミノ基のみ、または実質的にアミノ基のみで構成される。しかしながら、本発明のこの局面の他の態様は、他の官能基と組み合わせてアミノ基を含むフィールドを使用してもよい。
【０１２４】
本発明のこの第12の局面による材料は、およそ140nm〜およそ1000nmの、アミノ基のフィールド間のピッチを利用することが好ましくあり得る。
【０１２５】
本発明はさらに、第13の局面として、本発明の第12の局面による細胞増殖材料に幹細胞または前駆細胞を接触させる工程を含む、筋原細胞を産生する方法も提供する。当該方法は、任意で、筋原細胞が産生されるまで細胞を培養する工程を含んでもよい。
【０１２６】
本発明の第15の局面において、ヒドロキシル基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、脂質生成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、ヒドロキシル基のフィールドが、ヒドロキシル基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている細胞増殖材料を提供する。
【０１２７】
本発明のこの第15の局面による材料は、およそ140nm〜およそ1000nmの、ヒドロキシル基のフィールド間のピッチを利用することが好ましくあり得る。
【０１２８】
本発明はさらに、第16の局面として、本発明の第15の局面による細胞増殖材料に幹細胞または前駆細胞を接触させる工程を含む、脂質生成細胞を産生する方法も提供する。当該方法は、任意で、脂質生成細胞が産生されるまで細胞を培養する工程を含んでもよい。
【０１２９】
本発明の第15または第16の局面の材料または方法を使用した脂質生成系列の細胞を産生する能力は、いくつかの治療用途に適している。これらの材料または方法を使用して産生される脂肪細胞は、傷害または疾病のために失われた構造体の再構成において、または自然な脂肪組織産生が不足している先天性欠損症の処置において使用され得る。そのような使用のさらなる例については、本明細書の別の箇所において考察する。
【０１３０】
本発明者らは、ポリエチレングリコール（PEG）基を含む本発明の材料はさらに、様々な使用において有益であり得ると考えている。PEG基は、6-PEG酸、3-PEG酸、または6-PEG-OHなどの様々なインク構成物を使用して堆積され得る。本発明者らは、各「PEG」上の「末端」官能基（例えば、ヒドロキシル基または酸性基など）が、細胞挙動に影響を及ぼすことにおいて役割を果たしていると考えている。PEG基の存在は、より局所的な水和領域の産生に寄与し得る。
【０１３１】
本発明者らは、ある特定の生物学的に活性な官能基が、特定のピッチで配置された当該官能基のフィールドを有する材料において提供される場合、当該官能基が、当該材料への生体細胞の結合を阻止することを見出した。この研究結果は、細胞接着を防ぐこと、よって細胞増殖およびコロニー形成を防ぐことにおいて有用であり得る材料の開発に役立ち得る。実際に、非常に有用なことに、この研究結果は、生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、生体細胞の接着を阻害するための材料であって、生物学的に活性な官能基のフィールドが、当該生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている材料を提供する、本発明の第16の局面を提供する。本発明のこの第16の局面による材料は、細胞の結合および増殖を防ぐことが所望される「マスク」エリアに使用され得る。
【０１３２】
本発明者らは、およそ200nm以下のピッチ、またはおよそ350nm以上のピッチにおいてカルボキシル基またはメチル基のフィールドを使用することにより、本発明のこの第16の局面による材料を製造することができることを見出した。
【０１３３】
本発明の第17の局面は、生体細胞の接着を阻害する方法であって、本発明の第16の局面による材料に生体細胞を接触させる工程を含む方法を提供する。
【０１３４】
本発明のこの第16の局面による材料、および／または本発明の第17の局面での使用に好適な材料は、細胞増殖材料の製造に関連して上記において説明した技術（例えば、ディップペンナノリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ、または電子ビーム直接描画リソグラフィ）を使用して製造され得る。
【０１３５】
本発明の第16の局面による材料は、上記の他の箇所において考察したように、ドメイン中の生物学的に活性な官能基のフィールドのピッチが実質的に一定であるドメインを画成するフィールドおよび領域も含み得る。
【０１３６】
図面の説明
図1は、細胞培養皿の形態の細胞増殖材料1を示す。当該細胞増殖材料1は、4つのドメイン2を含む。これらのドメインのうちの1つの一部分の拡大図を図1aに示す。
【０１３７】
図1aでは、ドメイン2が、生物学的に活性な官能基の複数のフィールド3で構成されていることが見て取れる。これらのフィールド3は、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域4によって分離されている。当該フィールド3のピッチは、ドメイン2内において実質的に一定である。
【０１３８】
図2は、本発明の好ましい態様による増殖材料1の断面を高度に拡大した概略図を示す。当該材料は、インク構成物6がいくつか付着されている基材5を含む。それぞれのインク構成物6は、官能基7と、基材5に官能基7を付着させるために役立つ炭素鎖8とを含む。隣接するインク構成物6の炭素鎖8はお互いに相互作用し（点線9によって表される相互作用）、それにより、単層として自己組織化する。当該単層は、細胞増殖材料1の上方のエリア10に導入された生体細胞に対して当該官能基7が提示されるように自己組織化する。
【０１３９】
図3は、インク構成物MHAを使用して堆積されたカルボキシル官能基のフィールドを含む、本発明の3つの材料を示す。各パネルは、本発明の材料の5μm×5μmの領域を示している。フィールドは、およそ65nm〜70nmの平均直径を有し、140nm、280nm、および1000nmのピッチを有する（それぞれ図の3a、3b、および3c）。画像は、水平力顕微鏡（LFM）を使用して取得した。
【０１４０】
以下に、97個のさらなる態様を提供する。
態様1.  生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着された基材を含む細胞増殖材料であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されており、フィールドおよび領域が、該生物学的に活性な官能基のフィールドのピッチが実質的に一定であるドメインを画成している、細胞増殖材料。
態様2.  生物学的に活性な官能基が、メチル基;イソプロピル基;シクロヘキシル基;アリール基;アリル基;アルキニル基;ヒドロキシル（アルコール）基;エーテル基;モルホリノ基;エチレングリコシル化基;ポリエチレングリコシル化基;単糖、例えば、グルコース、リボース、ヘパロース、またはマンノースなど;カルボキシレート基;スルフェート基;ホスフェート基;フェノキシド基;アミノ基;ジアルキルアミノ基;アルキルアミノ基;ホスフィン基;およびアミノ酸から成る群より選択される、態様1による材料。
態様3.  生物学的に活性な官能基のフィールド間のピッチが、およそ75nm〜2000nmである、態様1による材料。
態様4.  生物学的に活性な官能基のフィールド間のピッチが、およそ140nm〜1000nmである、態様3による材料。
態様5.  基材が、シリカ;ガラス;ニトロセルロース;ポリカプロラクトン（PCL）;ポリ乳酸（PLLA）;ポリグリコール酸（PGA）;ポリ（ウレタン）;ヒドロキシアパタイト;リン酸三カルシウム;チタン;チタン合金;形状記憶合金;およびステンレス鋼から成る群より選択される、態様1による材料。
態様6.  生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、生体細胞の接着を阻害するための材料であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、材料。
態様7.  医薬として使用するための、態様1〜6のいずれか1つによる材料。
態様8.  メチル官能基を含む複数のフィールドが付着されている基材を含む、幹細胞集団または前駆細胞集団の増幅のための細胞増殖材料であって、該メチル官能基のフィールドが、メチル官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離され、かつフィールド間のピッチが約200nm〜750nmである、細胞増殖材料。
態様9.  フィールド間のピッチが、およそ280nmである、態様8による細胞増殖材料。
態様10.  カルボキシル基;メチル基;およびヒドロキシル基から成る群より選択される生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、軟骨形成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、細胞増殖材料。
態様11.  アミノ基およびカルボキシル基から成る群より選択される生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、骨形成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、細胞増殖材料。
態様12.  アミノ基およびヒドロキシル基から成る群より選択される生物学的に活性な官能基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、神経形成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、細胞増殖材料。
態様13.  アミノ基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、筋原細胞の産生のための細胞増殖材料であって、該アミノ基のフィールドが、アミノ基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、細胞増殖材料。
態様14.  ヒドロキシル基の複数のフィールドが付着されている基材を含む、脂質生成細胞の産生のための細胞増殖材料であって、該ヒドロキシル基のフィールドが、ヒドロキシル基を実質的に含有しない基材の領域によってお互いに分離されている、細胞増殖材料。
態様15.  フィールドおよび領域が、生物学的に活性な官能基のフィールドのピッチが実質的に一定であるドメインを画成している、態様6〜14のいずれか1つによる材料。
態様16.  生物学的に活性な官能基が、孤立した官能基である、態様1〜15のいずれか1つによる細胞増殖材料。
態様17.  生物学的に活性な官能基の複数のフィールドを作成するために、複数の生物学的に活性な官能基を基材上に堆積する工程を含む方法であって、該生物学的に活性な官能基のフィールドが、生物学的に活性な官能基を実質的に含有しない基材上の領域によってお互いに分離されるように配置されている、態様1〜16のいずれか1つによる材料を製造する方法。
態様18.  堆積されたフィールドおよび領域が、生物学的に活性な官能基のフィールドのピッチが実質的に一定であるドメインを画成している、態様17による方法。
態様19.  生物学的に活性な官能基がナノリソグラフィ技術によって堆積される、態様17または18による方法。
態様20.  ナノリソグラフィ技術が、ディップペンナノリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ、直接原子間力顕微鏡、エッチング斜め堆積法、レーザーアブレーション、レーザー堆積法、X線リソグラフィマスターのレプリカ成形、マイクロコンタクトプリンティング、およびエッチング電子ビーム直接描画リソグラフィから成る群より選択される、態様19による方法。
態様21.  ナノリソグラフィ技術が、ディップペンナノリソグラフィを含む、態様20による方法。
態様22.  生物学的に活性な官能基が、インク構成物の形態で堆積される、態様21による方法。
態様23.  幹細胞または前駆細胞を態様8による細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、増幅された集団が産生されるまで培養する工程とを含む、幹細胞集団または前駆細胞集団を増幅する方法。
態様24.  幹細胞または前駆細胞を態様10による細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、軟骨形成細胞が産生されるまで培養する工程とを含む、軟骨形成細胞を産生する方法。
態様25.  幹細胞または前駆細胞を態様11による細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、骨形成細胞が産生されるまで培養する工程とを含む、骨形成細胞を産生する方法。
態様26.  幹細胞または前駆細胞を態様12による細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、神経形成細胞が産生されるまで培養する工程とを含む、神経形成細胞を産生する方法。
態様27.  幹細胞または前駆細胞を態様13による細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、筋原細胞が産生されるまで培養する工程とを含む、筋原細胞を産生する方法。
態様28.  幹細胞または前駆細胞を態様14による細胞増殖材料に接触させる工程と、該細胞を、脂質生成細胞が産生されるまで培養する工程とを含む、脂質生成細胞を産生する方法。
態様29.  ディップペンナノリソグラフにより基材に印刷する工程と、続いて基材上の少なくとも1種類の細胞の増殖を改善する工程とを含む、方法。
態様30.  前記細胞が幹細胞であり、前記改善が幹細胞分化の改善または幹細胞集団もしくは前駆細胞集団の増幅の改善である、態様29の方法。
態様31.  
基材上に生物学的に活性な化合物の複数の離散したフィールドを形成するために、チップを使用して少なくとも1種類の生物学的に活性な化合物を基材上に堆積させる工程、
増幅された細胞集団が産生されるまで、複数の離散したフィールドを含む基材上で少なくとも1種類の細胞を増殖させる工程
を含む方法であって、
該離散したフィールドが、離散したフィールドを有さない基材上で増殖させる場合と比較して、細胞集団の均質性または再現性を改善する、方法。
態様32.  離散したフィールドを有さない基材が、少なくとも1種類の生物学的に活性な化合物を含む実質的に均質な表面を含む、態様31の方法。
態様33.  離散したフィールドが、細胞集団の均質性を改善する、態様31の方法。
態様34.  増殖が、インビボでの増殖である、態様31の方法。
態様35.  増殖が、インビトロでの増殖である、態様31の方法。
態様36.  増殖が、細胞の分化を誘導する、態様31の方法。
態様37.  増殖が、細胞の分化を誘導しない、態様31の方法。
態様38.  細胞が、幹細胞または前駆細胞である、態様31の方法。
態様39.  細胞が、幹細胞である、態様31の方法。
態様40.  細胞が、間葉系幹細胞である、態様31の方法。
態様41.  複数の離散したフィールドを含む基材が、75nm〜2,000nmの、フィールド間のピッチを含む、態様31の方法。
態様42.  複数の離散したフィールドを含む基材が、140nm〜1,000nmのピッチを含む、態様31の方法。
態様43.  複数の離散したフィールドを含む基材が、250nm〜350nmのピッチを含む、態様31の方法。
態様44.  基材が、ドメインを形成する複数の離散したフィールドを含み、かつ該ドメインが、実質的に一定のピッチを含む、態様31の方法。
態様45.  離散したフィールドが、100nm未満の少なくとも1つの寸法を有する、態様31の方法。
態様46.  離散したフィールドが、75nm未満の少なくとも1つの寸法を有する、態様31の方法。
態様47.  離散したフィールドが、100nm未満の平均直径を有するドットである、態様31の方法。
態様48.  離散したフィールドが、65nm〜75nmの平均直径を有するドットである、態様31の方法。
態様49.  離散したフィールドが、少なくとも65nmの平均直径を有するドットである、態様31の方法。
態様50.  増殖が、個々の細胞の増殖を含む、態様31の方法。
態様51.  増殖が、細胞数の増大を含む、態様31の方法。
態様52.  基材が、2次元基材である、態様31の方法。
態様53.  基材が、3次元基材である、態様31の方法。
態様54.  基材が、シリカ;ガラス;ニトロセルロース;ポリカプロラクトン（PCL）;ポリ乳酸（PLLA）;ポリグリコール酸（PGA）;ポリ（ウレタン）;ヒドロキシアパタイト;リン酸三カルシウム;チタン;チタン合金;形状記憶合金;またはステンレス鋼の基材である、態様31の方法。
態様55.  基材が、粗面化された表面を含む、態様31の方法。
態様56.  離散したフィールドが、単一の生物学的に活性な化合物を少なくとも95％含む、態様31の方法。
態様57.  離散したフィールドが、ドット形状を有する、態様31の方法。
態様58.  離散したフィールドが、生物学的に活性な化合物を実質的に含有しない基材の領域によって分離されている、態様31の方法。
態様59.  離散したフィールドが、任意の官能基を実質的に含有しない基材の領域によって分離されている、態様31の方法。
態様60.  離散したフィールドが、生物学的に活性な化合物において見出される任意の官能基を実質的に含有しない基材の領域によって分離されている、態様31の方法。
態様61.  生物学的に活性な化合物が、少なくとも1種類の疎水基、親水基、負に帯電した基、または正に帯電した基を含む、態様31の方法。
態様62.  生物学的に活性な化合物が、メチル基;イソプロピル基;シクロヘキシル基;アリール基;アリル基;アルキニル基;ヒドロキシル（アルコール）基;エーテル基;モルホリノ基;エチレングリコシル化基;ポリエチレングリコシル化基;単糖、例えば、グルコース、リボース、ヘパロース、またはマンノースなど;カルボキシレート基;スルフェート基;ホスフェート基;フェノキシド基;アミノ基;ジアルキルアミノ基;アルキルアミノ基;ホスフィン基;またはアミノ酸基である少なくとも1種類の官能基を含む、態様31の方法。
態様63.  生物学的に活性な化合物が、少なくとも1種類の孤立した生物学的に活性な基を含む、態様31の方法。
態様64.  チップが、走査型プローブチップである、態様31の方法。
態様65.  チップが、原子間力顕微鏡チップである、態様31の方法。
態様66.  増殖が、少なくとも1種類の軟骨形成細胞を産生する、態様31の方法。
態様67.  増殖が、少なくとも1種類の骨形成細胞を産生する、態様31の方法。
態様68.  増殖が、少なくとも1種類の神経形成細胞を産生する、態様31の方法。
態様69.  増殖が、少なくとも1種類の筋原細胞を産生する、態様31の方法。
態様70.  増殖が、少なくとも1種類の脂質生成細胞を産生する、態様31の方法。
態様71.  増殖が、骨形成細胞の実質的に均質な集団を産生する、態様31の方法。
態様72.  増殖が、神経形成細胞の実質的に均質な集団を産生する、態様31の方法。
態様73.  増殖が、筋原細胞の実質的に均質な集団を産生する、態様31の方法。
態様74.  増殖が、脂質生成細胞の実質的に均質な集団を産生する、態様31の方法。
態様75.  基材の少なくとも一部が、細胞の接着を阻害する材料を含む、態様31の方法。
態様76.  堆積工程が、ナノリソグラフィを使用して実施される、態様31の方法。
態様77.  堆積工程が、ディップペンナノリソグラフィを使用して実施される、態様31の方法。
態様78.  増幅された細胞集団中の不均質性のレベルが40％以下となるように、均質性を改善する、態様31の方法。
態様79.  少なくとも24時間の増殖試験において、均質性または再現性を測定する、態様31の方法。
態様80.  少なくとも28日間の増殖試験において、均質性または再現性を測定する、態様31の方法。
態様81.  
基材上に生物学的に活性な化合物の複数の離散したフィールドを提供する工程、
増幅された細胞集団が産生されるまで、複数の離散したフィールドを含む基材上で少なくとも1種類の細胞を増殖させる工程
を含む方法であって、
該離散したフィールドが、離散的なフィールドを有さない基材上で増殖させる場合と比較して、細胞集団の均質性または再現性を改善する、方法。
態様82.  提供する工程が、ナノリソグラフィを使用して実施される、態様81の方法。
態様83.  提供する工程が、ディップペンナノリソグラフィを含む、態様81の方法。
態様84.  提供する工程が、ナノインプリントリソグラフィを含む、態様81の方法。
態様85.  提供する工程が、マイクロコンタクトプリンティングを含む、態様81の方法。
態様86.  提供する工程が、電子ビームリソグラフィを含む、態様81の方法。
態様87.  提供する工程が、走査型プローブ機器の使用を含む、態様81の方法。
態様88.  提供する工程が、原子間力顕微鏡の使用を含む、態様81の方法。
態様89.  離散したフィールドが、実質的に一定のピッチによって分離されている、態様81の方法。
態様90.  提供する工程が、生物学的に活性な化合物を含むインク組成物を使用して実施される、態様81の方法。
態様91.  
基材上に生物学的に活性な化合物の複数の離散したフィールドを形成するために、チップを使用して少なくとも1種類の生物学的に活性な化合物を基材上に堆積させる工程、
分化した細胞集団が産生されるまで、複数の離散したフィールドを含む基材上で少なくとも1種類の細胞を増殖させる工程
を含む方法であって、
該離散したフィールドが、離散したフィールドを含まない基材上で増殖させる場合と比較して、細胞集団の均質性または再現性を改善する、方法。
態様92.  
基材、
基材上の、生物学的に活性な分子の複数のフィールド、
フィールド間の、生物学的に活性な分子を含有しない領域
を含む、細胞を培養するための物品であって、
該物品上で培養された細胞集団が、フィールドを含まない生物学的に活性な分子の表面上で培養された細胞集団よりも、より均質または再現可能である、物品。
態様93.  生物学的に活性な分子のフィールドとの接触が、細胞集団の分化を誘導する、態様92の物品。
態様94.  生物学的に活性な分子のフィールドとの接触が、細胞集団の分化を誘導しない、態様92の物品。
態様95.  フィールドとの接触が、最終分化した骨形成細胞、神経形成細胞、脂質生成細胞、軟骨形成細胞、または筋原細胞への分化を誘導する、態様92の物品。
態様96.  態様92の物品を含むキット。
態様97.  前記物品を使用するための使用説明書を含む、態様96のキット。
以上が、適用についてのこの節に関する、97個の態様である。
【実施例】
【０１４１】
本発明の材料の製造および使用方法については、以下の「実験プロトコルおよび結果」の節において、さらに説明する。
【０１４２】
実験プロトコルおよび結果
1  研究1
以下の研究では、本発明の材料の生体細胞への効果を、先行技術材料の生体細胞への効果と比較した。結果は、本発明の細胞増殖材料上で培養された細胞集団は、先行技術材料上で培養された細胞集団よりも、はるかに良好なレベルの均質性（したがって、より少ない不均質性）を表したことを示している。
【０１４３】
プロトコル
先行技術の細胞増殖材料の調製
カルボキシル、アミノ、またはヒドロキシル官能基のいずれかを含む先行技術材料は、以前に公開された方法を使用して調製した。
【０１４４】
簡潔には、ガラス製カバーガラスを、5％のNaOH溶液に1時間浸漬し、続いて濃HNO3溶液に1時間浸漬した。次いで、当該カバーガラスを、超純水および100％エタノールで洗浄し、乾燥させ、必要な生物学的に活性な官能基を付着させるまで減圧下で保存した。
【０１４５】
メチル基を含む先行技術材料は、清浄なカバーガラスをジメチルジクロロシランに15秒間浸漬し、続いてトルエンで洗浄し、その後エタノールで洗浄して調製した。次いで、洗浄したカバーガラスを乾燥させ、使用まで減圧下で保存した。
【０１４６】
アミノ基を含む先行技術材料は、清浄なカバーガラスを0.5％の3-アミノプロピルトリメトキシシランイソプロピルアルコール溶液に浸漬し、次いで、水を加え、30分間還流して調製した。次いで当該カバーガラスを水で洗浄し、次にエタノールで洗浄し、乾燥させて、使用まで減圧下で保存した。
【０１４７】
ヒドロキシル基を含む先行技術材料は、最初に、前述の段落において説明した方法を用いて、カバーガラスをビニル基トリメトキシ-ビニルシランでコーティングすることによって調製した。次いで、ビニル表面を、窒素下において、1Mのボラン-テトラドヒドロフラン溶液で2時間処理した。次に、当該カバーガラスを無水テトラヒドロフランで洗浄し、0.4％のNaOH／30％のH2O2溶液で3分間処理した。当該カバーガラスを超純水で洗浄し、続いてエタノールで洗浄し、乾燥させ、使用まで減圧下で保存した。
【０１４８】
本発明による材料の調製
本発明の材料である、実験的細胞増殖材料、ならびに金基材および以下に記載した官能基を使用して細胞増殖を阻害することができる材料はいずれも、以下のとおり調製した（使用される試薬についてのさらなる詳細は、付録1に記載する）。
【０１４９】
実験的細胞増殖材料
軟骨形成細胞の増殖を誘導することができる実験的細胞増殖材料は、280nmのピッチを有するフィールドにおいてカルボキシル基のフィールドを堆積させることによって調製した。カルボキシル基は、0.1秒の停止時間を使用してディップペンナノリソグラフィ（DPN）技術によって適用されるインク構成物メルカプトンヘキサデカン酸（MHA）の一部として堆積させた。各フィールドは、およそ65nmの直径を有する「ドット」形状の、末端カルボキシル基を提示する分子の自己組織化したエリアを含んだ。
【０１５０】
分化を誘導することなく幹細胞または前駆細胞の増殖を支援することができる本発明の実験的細胞増殖材料は、280nmのピッチでフィールドにメチル官能基を堆積させて調製した。メチル官能基は、0.1秒の停止時間を使用してDPN技術によって適用されるインク構成物ヘキサデカンチオール（HDT）の一部として堆積させた。各フィールドは、およそ75nmの直径を有する「ドット」形状の、メチル（アルキル鎖）基を提示する自己組織化した分子のエリアを含んだ。
【０１５１】
本発明の細胞増殖材料は、3つの異なるピッチで提供されるアミノ基のフィールドを含むように調製した。これにより、それぞれ1000nm、280nm、および140nmのピッチを有する材料を得た。アミノ官能基は、0.2秒の停止時間を使用してDPN技術を用いて適用されるインク構成物11-アミノ-1-ウンデカンチオール（AUT）の一部として堆積させた。各フィールドは、およそ65nmの直径を有する「ドット」形状の、末端アミノ基を提示する自己組織化した分子のエリアを含んだ。
【０１５２】
異なるピッチのフィールド中にヒドロキシル基を含む細胞増殖材料も作成した。それぞれ1000nm、280nm、および140nmのピッチを有する3つの材料を調製した。アミノ基は、0.2秒の停止時間を使用してDPN技術を用いて適用されるインク構成物11-メルカプト-1-ウンデカノール（MUOH）の一部として堆積させた。各フィールドは、およそ65nmの直径を有する「ドット」形状の、末端ヒドロキシル基を提示する自己組織化した分子のエリアを含んだ。
【０１５３】
異なるピッチのフィールド中にポリエチレングリコシル化基を含む細胞増殖材料は、0.2秒の停止時間を用いてDPNを使用して1-（メルカプトウンデカ-11-イル）ヘキサエチレングリコール（6-PEG-OH）を堆積させて製造した。それぞれ1000nm、280nm、および140nmのピッチを有する3つの材料を調製した。各フィールドは、およそ70nmの直径を有する「ドット」形状の、ヒドロキシル末端ポリエチレングリコール基を提示する分子の自己組織化したエリアを含んだ。
【０１５４】
細胞増殖を阻害するための実験的材料
細胞増殖を阻害することができる材料は、1000nmまたは140nmのいずれかのピッチで（DPNによって適用されるインク構成物MHAの一部として提供される）カルボキシル基のフィールドを堆積することによって調製した。各フィールドは、およそ65nmの直径を有する「ドット」形状の、カルボキシル基を提示する分子の自己組織化したエリアを含んだ。
【０１５５】
細胞増殖を阻害することができる本発明のさらなる実験的材料は、1000nmまたは140nmのピッチを有するフィールドにメチル官能基を堆積することによって調製した。メチル基は、DPNを使用したインク構成物HDTの適用によって堆積した。各フィールドは、およそ75nmの直径を有する「ドット」形状の、メチル末端アルキル鎖を提示する分子の自己組織化したエリアを含んだ。
【０１５６】
細胞培養
市販の骨髄由来成人ヒト間葉系幹細胞は、FACS分析を使用して特徴付けた。この特徴付けにより、幹細胞が、CD90、CD173、CD29、CD44、STRO-1、およびCD105に対して陽性であり、CD34、CD24、CD14、CD19、およびCD3に対しては陰性であることが示された。
【０１５７】
次いで、特徴付けした幹細胞の集団を、5×104細胞／ml（合計）の播種密度で、上記において説明した本発明の実験的材料上に播種した。当該細胞を、商業的に合成された基礎培地の存在下において当該材料上で24時間培養した。次に、培養した細胞を、細胞接着、接着点形成、細胞骨格成分の形成、および全体的な形態について分析した。
【０１５８】
細胞成分の可視化
上記において概説したプロトコルによる先行技術材料上で培養された細胞の成分を、蛍光顕微鏡により可視化した。細胞骨格の主要成分であるF-アクチンは、緑色のフルオロフォアを使用して標識し、細胞核は青色の核染色剤Hoechstを使用して可視化し、表現型において関連するタンパク質は、赤色のフルオロフォアを使用して標識した。調査された、選択された表現型に関連するタンパク質は、メチル基を含む先行技術材料上で増殖させた細胞におけるSTRO1（幹細胞マーカー）またはヌクレオステミン（幹細胞増殖マーカー）、アミノ基を含む先行技術材料上で増殖させた細胞におけるCBFA1（骨芽細胞分化のマーカー）、ヒドロキシル基を含む先行技術材料上で増殖させた細胞におけるコラーゲンII（軟骨細胞分化または活性な軟骨細胞のマーカー）であった。
【０１５９】
上記において概説したプロトコルによる本発明の材料上で培養された細胞の成分も、蛍光顕微鏡によって可視化した。同じマーカーおよび蛍光標識を、以下のように、それぞれの実験的細胞増殖材料上で増殖させた細胞に対して使用した：すなわち、ビンキュリン（接着点の主要成分）は赤色のフルオロフォアを使用して標識し、F-アクチン（細胞骨格の主要成分）は緑色のフルオロフォアを使用して標識し、細胞核は青色の核染色剤Hoechstを使用して可視化した。
【０１６０】
結果
これらの研究の結果は、上記に列挙した様々な細胞成分の共局在化を示す代表的な画像を記載した図4および図5に示し、なお、それについては以下においてさらに詳細に説明する。図4は、先行技術材料上で増殖させた細胞を示し、図5は、本発明の細胞増殖材料上で増殖させた細胞を示す。
【０１６１】
カルボキシル基を含む本発明の増殖材料上で増殖させた細胞での標識化
カルボキシル基を含む細胞増殖材料の表面に接着している細胞は、小さい細胞集塊の形態を取った。これらの集塊は、個々の細胞内の整列した個々のストレスファイバーが見られる明確な個々の細胞を含む。接着した細胞は、当該材料の表面上に広がっており、かつ細胞間の整列を示した。接着点は、細胞体全体に見られた。これらは、ストレスファイバーおよびストレスファイバーの末端と整列しており、この場合、細胞体の最外側の突出は、細胞増殖材料の表面に接触している。
【０１６２】
アクチンは、個々の細胞内において「リング／ハロ」の形態を有し、かつ細胞間のアクチン配列が見られる。
【０１６３】
これらの結果は、カルボキシル基を含む細胞増殖材料は、外因性の生物学的刺激を必要とせずに、幹細胞の軟骨細胞分化を促進するであろうということを示している。
【０１６４】
メチル基を含む先行技術材料上で増殖させた細胞での標識化
メチル基を含む先行技術材料上で増殖させた細胞の集団は、幹細胞マーカーSTRO1または幹細胞増殖ヌクレオステミンのマーカーのいずれかに関して不均質であった。これらの結果は、これらの材料上で培養された幹細胞の集団が分化しているか（したがって、それらの幹細胞体質を失っているか）、および／または増殖する能力を失っていることを示した。
【０１６５】
メチル基を含む本発明の細胞増殖材料上で増殖させた細胞での標識化
メチル基を含む本発明の細胞増殖材料に接着した細胞は、細胞集塊の形態を取り、その個々の細胞は、完全な細胞骨格網目構造および良好な接着点形成を示した。
【０１６６】
細胞集塊内の各細胞は核を有し、かつ各接触点において細胞集塊が本発明の材料の表面と相互作用するような接着点が当該集塊全体に存在していた。これらの接着点によって細胞集塊は本材料の表面に付着していると考えられる。細胞集塊内の個々の細胞の形態は、各細胞が、その下にある表面に良好に付着していることを示している。
【０１６７】
線維状の細胞骨格網目構造が、細胞全体に存在し、個々のストレスファイバーが、個々の細胞内において明確である。
【０１６８】
アミノ基を含む先行技術材料上で増殖させた細胞での標識化
アミノ基を含む先行技術材料上で増殖させた細胞は、骨芽細胞分化マーカーCBFA1の一貫性のない発現を示すことが見出された。細胞の総数の10％〜20％が、このマーカーに対して陰性であった。このことは、先行技術材料上で培養された幹細胞が、造骨性系列に沿った分化の誘導が不完全であり、そのような培養後に形成された細胞集団では、不均質性の程度が高いことを示している。
【０１６９】
アミノ基を含む本発明の増殖材料上で増殖させた細胞での標識化
作成された各実験的細胞増殖材料（140nm、280nm、または1000nmのピッチで提供されたアミノ基を含む）に接着している細胞は、接着点形成の膨大な増加および細胞体全体における良好に組織化されたストレスファイバーの存在を示していた。これらの材料に接着した細胞は集塊化せず、細胞核の分布は、単一の細胞が当該材料の表面に良好に広がり付着していることを裏付けている。これらの材料は、細胞の配向性に影響を及ぼす可能性、したがって、造骨性、神経原性、および筋原性分化に影響を及ぼす可能性を示している。フィールドのピッチは、これらの経路のうちの1つに有利となるように、並びに分化反応全体の動態を増強するように制御され得る。
【０１７０】
すべてのピッチにおいて、細胞は、個々の細胞として、下にある表面に直接接触して付着していた。付着している細胞ごとに1つの細胞核が明確であり、広がった細胞は、細胞体全体にわたる明確な個々のストレスファイバーを有している。接着点は、個々のストレスファイバーと密接に関連して、細胞体全体において、および細胞体の末梢において、さらに細胞の最外側の突出が該表面と相互作用している箇所において、豊富である。
【０１７１】
280nmのピッチでの細胞は、優先的な方向に整列する兆候を示すが、全体的な形態は、依然としてすべてのNH2修飾について説明したものと同様である。
【０１７２】
ヒドロキシル基を含む先行技術材料上で増殖させた細胞での標識化
ヒドロキシル基を含む先行技術材料上で培養された幹細胞によってもたらされた細胞集団は、その大部分が軟骨形成マーカーのコラーゲン2に対して陽性であるが、細胞の最大40％まではこのマーカーを示さなかった。したがって、ヒドロキシル基を含む先行技術材料は、軟骨細胞分化の促進において非常に低い効率を示し、不均質性の高い集団を生じることが見て取れる。
【０１７３】
ヒドロキシル基を含む本発明の細胞増殖材料上で増殖させた細胞での標識化
すべてのピッチにおいてヒドロキシル基を含む本発明の細胞増殖材料に付着した細胞について調査した。接着した細胞は、接着点形成の兆候をわずかしか示さなかったが、細胞体全体においては良好な細胞骨格形成の兆候があった。これらの結果は、わずかな接着点形成による細胞の付着が、主に、本発明の材料中のヒドロキシルの存在によって媒介され得るということ、およびフィールドのピッチの変化は、細胞の全体的な形態／配向性を制御するということを示している。ヒドロキシル基を含む本発明の材料は、細胞接着を支援するであろうし、分化に影響を及ぼすであろうし、外因性の生物学的刺激の不在下において軟骨形成、脂質生成、造骨性、または神経性分化を誘導するであろう。これらの反応の効率は、フィールドのピッチによって制御され得る。
【０１７４】
すべてのピッチにおいて接着点の兆候はわずかであるが、F-アクチン細胞骨格成分はすべてのピッチにおいて細胞体全体に良好に形成される。140nmまたは1000nmのピッチの材料に接着している細胞は、細胞体のある特定の部分にF-アクチン成分の濃縮および「出芽」の明確な兆候を示した。出芽は、細胞の末端の周りの構造に似たハロを形成するストレスファイバーによって、および細胞体全体にわたって平行に延びる明確なストレスファイバーの不在によって表される。細胞は、個々に付着しており、前述においてHDT表面について説明したような集塊化した形態を形成しない。細胞数は、280nmのピッチでこの官能基を含む材料上において最も多い。これらの表面上で増殖させた細胞は、前述において説明した「出芽」現象の兆候を全く示さない。
【０１７５】
PEGを含む本発明の細胞増殖材料上で増殖させた細胞での標識化
接着点の兆候は、これらの表面上においてわずかしか形成されないが、OH表面より多い。良好な平行アクチンストレスファイバーは、280nmおよび1ミクロンのピッチにおいて見られた。ストレスファイバー形成は、主に、140nmピッチでの細胞体の末端に局在するが、当該ストレスファイバーは依然としてこれらの領域において線維である。細胞は、集塊化しないが、すべてのピッチ上に付着している。接着点は、280nmおよび1ミクロンのピッチにおける個々のストレスファイバーによって、より明らかである（ある特定の部位で付着している2つの個々の細胞）。
【０１７６】
細胞増殖を阻害するための本発明の材料
細胞は、細胞増殖を阻害するための本発明の実験的材料に接着することはなく、または当該材料上で増殖もしなかった（結果は示さず）。
【０１７７】
2  研究2
市販の骨髄由来ヒト間葉系幹細胞、ならびにヒト血液および歯髄に主に由来する幹細胞を、本発明による細胞増殖材料上で培養する。当該細胞増殖材料は、様々なピッチにおける様々な異なる生物学的に活性な官能基を含む。
【０１７８】
細胞は、基礎培地において最長28日間の時点までインビトロにおいて培養し、様々なマーカーの発現について分析する。調査されたマーカーは、以下の群:コラーゲンI、コラーゲンII、コラーゲンX、オステオカルシン、CBFA1、STRO-1、ヌクレオステミン、βIIIチューブリン、MAP-2、神経フィラメント CD90、シナプトフィジン、および平滑筋アクチンから選択する。これらのマーカーに加え、以下の群:von-Kossa（石灰化過剰細胞マトリックス）、オイルレッド-o（脂肪組織）、およびグリコサミノ-グリカン（GAG軟骨形成過剰細胞マトリックス）からの染色剤による細胞集団の染色について調査する。
【０１７９】
選択されたマーカーおよび染色剤により、様々な細胞増殖材料上で培養された細胞の分化能の評価および分析が可能となる。
【０１８０】
幹細胞の分化能に直接関連するタンパク質の産生は、ウェスタンブロット、ELISA、およびリアルタイムPCRを使用してさらに確認し定量化する。リアルタイムPCRに使用されるマーカーのパネルは、上記に列挙されたものから選択され得、さらにオステオポンチン、Sox-9、オステオネクチン、CHOP（相同タンパク質）、アディポネクチン、およびPPARγも含み得る。
【０１８１】
さらに、基礎条件下の28日間のインビトロ試験期間において幹細胞表現型を誘導／維持するという本発明の細胞増殖材料の能力は、歯髄に由来する幹細胞および市販の骨髄由来ヒト間葉系幹細胞を培養し、OCT4、SOX2（成体の歯髄由来の胚性幹細胞では発現しない、胚性幹細胞の可塑性に関連するマーカー）、およびSTRO-1（成体幹細胞および胚性幹細胞によって発現される）をトランスフェクトすることによってさらに確認されるであろう。これらのマーカーの発現に対する本発明の細胞増殖材料の影響はモニターされ、並びにこれは、幹細胞表現型を誘導する官能基とピッチの様々な組み合わせの、選択されたレベルの可塑性を維持する能力に関連する情報を提供し、任意の分化反応を引き起こす効率および均質性に関する情報も提供すると考えられる。トランスフェクトされた細胞は、GFP標識化することができ、それにより、所定の時点において特定のタンパク質産生のマーカーによって対比染色することができる。
【０１８２】
付録1
DNP材料技術データ
【０１８３】
アルキル官能基:
HDT 1-ヘキサデカンチオール  674514-500MG[2917-26-2]（ODTのさらに揮発性のバージョン）
CH3（CH2）15SH
屈折率
n20／D1.462（文献値）
沸点:
184〜191℃／7mmHg（文献値）
融点:
18〜20℃（文献値）、20〜24℃
密度
25℃において0.84g／mL（文献値）
ODT 1-オクタデカンチオール  O1858-100ML[2885-00-9]
CH3(CH2)17SH
アッセイ
98％
沸点
204〜210℃／11mmHg（文献値）
融点
30〜33℃（文献値）
密度
25℃において0.847g／mL（文献値）
【０１８４】
OH官能基:
OH 1-メルカプト-1-ウンデカノール  674249-250MG[73768-94-2]
HS(CH2)11OH
アッセイ
99％
融点
33〜37℃（文献値）
【０１８５】
アミノ官能基:
NH3: 11-アミノ-1-ウンデカンチオール HCl塩  674367[143339-58-6]
特性
アッセイ
99％
融点
120〜170℃
【０１８６】
酸性官能基:
MHA: 16-メルカプトヘキサデカン酸  674435[69839-68-5]
アッセイ
99％
融点
65〜69℃
【０１８７】
PEG官能基:
PEG-P:（PEG不動態剤（passifier））1-（メルカプトウンデカ-11-イル）ヘキサエチレングリコール  675105[130727-44-5]
2011527888.tif 000003
屈折率
n20／D1.474
密度
25℃において1.0154g／mL
PEG-SC:（幹細胞のためのPEG-ドット形成）（11-メルカプトウンデシル）トリ（エチレングリコール）673110[130727-41-2]
2011527888.tif 000004
アッセイ
95％
屈折率
n20／D1.476
密度
25℃において0.995g／mL
【０１８８】
さらに、例えば、チオクト酸、様々な鎖／PEG長さを修飾したPEGなど、他のいくつかの準備した（bespoke）分子を使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【国際調査報告】
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