(57)【要約】  本発明は、免疫応答を誘起するための、特に癌細胞により発現される少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘起するための組成物、特に癌を処置および防止するための方法およびキットに関する。
2011526923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞により発現される少なくとも１つの抗原に対して個体に免疫応答を誘起する方法であって；
個体に、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を投与することを含んでなり、ここで製薬学的に許容され得る組成物は、個体に投与された時に少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘起する、上記方法。
【請求項２】
製薬学的に許容され得る組成物が、個体の癌を防止または処置するために十分な予防または治療に有効な量で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸が、胚性幹細胞に由来する抗原または抗原をコードする核酸に対応する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数の抗原をコードする核酸が発生細胞に由来する全ＲＮＡまたはｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数の抗原をコードする核酸が発生細胞ｃＤＮＡライブラリーに由来するｃＤＮＡから転写されたＲＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
複数の抗原が発生細胞の全細胞ライセートである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複数の抗原をコードする核酸が、（ｉ）正常な分娩後組織中で転写されなかった：または（ｉｉ）発生細胞に関して実質的に低下したレベルで正常な分娩後組織中で転写された転写産物について濃縮されているＲＮＡを含んでなる請求項４に記載の方法。
【請求項８】
製薬学的に許容され得る組成物がさらに少なくとも１つのアジュバント、またはアジュバントをコードする核酸を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アジュバントがＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−αおよびＭ−ＣＳＦからなる群から選択されるサイトカインである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アジュバントが不完全フロイントアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１）またはコリネバクテリウム  グラニュロサム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）  Ｐ４０を含んでなる請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
発生細胞が個体に対して異種である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
発生細胞により発現される複数の抗原または複数の抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物であって、製薬学的に許容され得る組成物が個体に投与された時、癌細胞により発現される少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘起する上記製薬学的に許容され得る組成物。
【請求項１３】
さらに生理学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでなる請求項１２に記載の製薬学的に許容され得る組成物。
【請求項１４】
さらにアジュバントを含んでなる請求項１２に記載の製薬学的に許容され得る組成物。
【請求項１５】
アジュバントがサイトカインである請求項１４に記載の製薬学的に許容され得る組成物。
【請求項１６】
アジュバントがＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−αおよびＭ−ＣＳＦからなる群から選択されるサイトカインである、請求項１４に記載の製薬学的に許容され得る組成物。
【請求項１７】
請求項１２ないし１６のいずれか１項に記載の製薬学的に許容され得る組成物の予防または治療に有効な量。
【請求項１８】
癌細胞により発現される少なくとも１つの抗原に対して個体に免疫応答を誘起する方法であって：
個体に、有効量の抗原提示細胞、Ｔ−リンパ球または両方を含んでなる組成物を投与することを含んでなり、ここで抗原提示細胞およびＴリンパ球は発生細胞により発現された複数の抗原の感作有効量ですでにインビトロで感作されており、ここで有効量の抗原提示細胞、Ｔリンパ球または両方は少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘起するために十分である、上記方法。
【請求項１９】
抗原提示細胞またはＴリンパ球がオートロガスである請求項１９に記載の方法。
【請求項２０】
癌抗原に感作された抗原提示細胞の作成法であって：
抗原提示細胞を、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸と、複数の発生細胞抗原が抗原提示細胞により提示されるために十分な条件下でインビトロで接触させる
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２１】
複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸と、複数の発生細胞抗原が抗原提示細胞により提示されるために十分な条件下でインビトロで接触させた抗原提示細胞を含んでなる組成物。
【請求項２２】
癌抗原特異的リンパ球の作成法であって：
ａ）抗原提示細胞を、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸と、複数の発生細胞抗原が抗原提示細胞により提示されるために十分な条件下でインビトロで接触させ；そして
ｂ）リンパ球を工程ａ）の抗原提示細胞と、癌細胞に対する免疫応答を誘起できる癌抗原特異的リンパ球を生産するために十分な条件下で接触させる、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２３】
リンパ球がＴリンパ球である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
癌細胞に対する免疫応答を誘起できる癌抗原特異的リンパ球を生産するために十分な条件下で抗原提示細胞と接触させたＴリンパ球を含んでなる組成物であって、抗原提示細胞が、複数の発生細胞抗原、または複数の発生細胞抗原をコードする核酸と、複数の発生細胞抗原が抗原提示細胞により提示されるために十分な条件下インビトロで接触されている、上記組成物。
【請求項２５】
個体の癌を処置または防止する方法であって：
個体に治療または予防に有効な量の請求項１２ないし１７、２１または２４のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２６】
癌細胞により発現される少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を個体に誘起する方法であって：
個体に、複数の発生細胞抗原、または複数の発生細胞抗原をコードする核酸をエクスビボで負荷した樹状細胞を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を投与することを含んでなり、ここで製薬学的に許容され得る組成物は、個体に投与された時、少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘起する上記方法。
【請求項２７】
癌細胞に対する免疫応答を個体に誘起する方法であって：
複数の発生細胞抗原に対して生じた抗体を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を個体に投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２８】
抗体が有毒部分に結合され、これにより抗体が細胞傷害用量の有毒部分を癌細胞に効果的に送達する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
有毒部分が放射性同位体であり、これにより抗体が細胞傷害用量を粒子放射線として癌細胞に送達する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
発生細胞により発現される複数の抗原、または複数の抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を含んでなるキットであって、ここで製薬学的に許容され得る組成物は個体に投与された時、癌細胞により発現される少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘起する上記キット。
【請求項３１】
さらにアジュバントを含んでなる請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
さらに化学療法剤を含んでなる請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、３５ＵＳＣ  §１１９の下、２００８年７月３日に出願された米国特許仮出願第６１／０７７，９２２号の優先権を主張し、これは引用することにより全部、本明細書に編入する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、免疫応答を誘起するための、特に癌細胞により発現される少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘起するための組成物、方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌を処置する方法は、化学療法、放射線療法および手術の使用を含む。多数の腫瘍抗原の同定が、細胞に基づく治療を開発する試みを導いた。幾つかの方法は、腫瘍抗原、すなわち非腫瘍細胞よりは腫瘍細胞で優先的に発現されるポリペプチドを最初に同定することに依存した。例えば数種のヒト腫瘍抗原が黒色腫患者から単離され、そして同定および特性決定された。
【０００４】
手術、放射線および化学療法を含む積極的な集学的治療にもかかわらず、癌患者の予後は比較的良くないままである。さらに癌に関する従来の治療の非特異的性質が、周辺の正常な、そして全身組織に対して無力化傷害を生じることが多い。したがって腫瘍細胞を標的とする効果的な治療および予防法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要約
一つの観点では、本発明は癌細胞により発現される少なくとも一つの抗原に対して個体に免疫応答を誘起する方法を提供する。この方法は、個体に、複数の発生細胞（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌ）抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を投与することを含んでなり、ここで製薬学的に許容され得る組成物は、個体に投与された時に少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘起する。
【０００６】
別の観点では、本発明は発生細胞により発現される複数の抗原または複数の抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を提供する。この製薬学的に許容され得る組成物は、個体に投与された時、癌細胞により発現される少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘起する。
【０００７】
他の観点では、本発明は予防または治療に有効な量の製薬学的に許容され得る組成物を提供し、ここで製薬学的に許容され得る組成物は、発生細胞により発現される複数の抗原または複数の抗原をコードする核酸を含んでなり、ここで製薬学的に許容され得る組成物は個体に投与された時、癌細胞により発現される少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘起する。
【０００８】
一つの観点では、本発明は癌細胞により発現される少なくとも一つの抗原に対して個体に免疫応答を誘起する方法を提供する。この方法は個体に、有効量の抗原提示細胞、Ｔ−リンパ球または両方を含んでなる組成物を投与することを含んでなり、ここで抗原提示細胞およびＴリンパ球は発生細胞により発現された複数の抗原の感作有効量でインビトロで
すでに感作されており、ここで有効量の抗原提示細胞、Ｔリンパ球または両方は少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘起するために十分である。
【０００９】
幾つかの観点では、本発明は癌抗原に感作された抗原提示細胞の作成法を提供し、この方法は抗原提示細胞を、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸と、複数の発生細胞抗原が抗原提示細胞により提示されるために十分な条件下でインビトロで接触させることを含んでなる。
【００１０】
一つの観点では、本発明は複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸と、複数の発生細胞抗原が抗原提示細胞により提示されるために十分な条件下でインビトロで接触させた抗原提示細胞を含んでなる組成物を提供する。
【００１１】
他の観点では、本発明は癌抗原特異的リンパ球の作成法を提供する。この方法は：
ａ）抗原提示細胞を、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸と、複数の発生細胞抗原が抗原提示細胞により提示されるために十分な条件下でインビトロで接触させ；そして
ｂ）リンパ球を工程ａ）の抗原提示細胞と、癌細胞に対する免疫応答を誘起できる癌抗原特異的リンパ球を生産するために十分な条件下で接触させる、
ことを含んでなる。
【００１２】
一つの観点では、本発明は癌細胞に対する免疫応答を誘起できる癌抗原特異的リンパ球を生産するために十分な条件下で抗原提示細胞と接触させたＴリンパ球を含んでなる組成物を提供し、ここで抗原提示細胞は複数の発生細胞抗原、または複数の発生細胞抗原をコードする核酸と、複数の発生細胞抗原が抗原提示細胞により提示されるために十分な条件下でインビトロですでに接触されている。
【００１３】
別の観点では、本発明は個体の癌を処置または防止する方法を提供し、この方法は、個体に本明細書に記載の組成物を治療または予防に有効な量で投与することを含んでなる。
【００１４】
幾つかの観点では、本発明は、癌細胞により発現される少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を個体に誘起する方法を提供し、この方法は個体に、複数の発生細胞抗原、または複数の発生細胞抗原をコードする核酸をエクスビボで負荷した樹状細胞を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を投与することを含んでなり、ここで製薬学的に許容され得る組成物は、個体に投与された時、少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘起する。
【００１５】
他の観点では、本発明は癌細胞に対する免疫応答を個体に誘起する方法を提供し、この方法は複数の発生細胞抗原に対して生じた抗体を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を個体に投与することを含んでなる。
【００１６】
別の観点では、本発明に従いキットが提供される。このキットは、発生細胞により発現される複数の抗原、または複数の抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を含んでなり、ここで製薬学的に許容され得る組成物は個体に投与された時、癌細胞により発現される少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘起する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】全腫瘍ＲＮＡでワクチン接種した悪性星状細胞腫を持つマウスの生存パーセントに及ぼす効果を示すグラフである。
【図２】全胚ＲＮＡまたは全腫瘍ＲＮＡでワクチン接種した悪性神経膠腫を持つマウスの生存パーセントに及ぼす効果を比較するグラフである。
【図３】（ａ）増幅産物；および（ｂ）インビトロ転写ＲＮＡを示すアガロースゲル電気泳動である。
【図４】ＣＤ１３３（−）ＲＮＡを用いた差引きハイブリダイゼーションを使用して、ＣＤ１３３（＋）星状細胞腫中の癌幹細胞抗原を濃縮を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
出願人は、個体の癌細胞、特に癌幹細胞を、発生細胞により発現される抗原のコホートを使用することにより、または抗原をコードする核酸を使用することにより免疫的に標的化できることを見いだした。腫瘍の発生は、胎児発生中の胚細胞のように細胞の増殖的および侵襲状態を思い起こさせる組織分化の初期状態への先祖返りに似ている。すなわち広い種類の腫瘍でも発現される可能性がある特定の発生的に調節された抗原は、汎用的な腫瘍拒絶抗原として、例えば悪性疾患に対する免疫療法で役立つ可能性がある。本発明はこのように腫瘍抗原の単離および同定の必要性を回避することができる。
【００１９】
例えば本発明は、限定するわけではないが脳の癌（例えば神経膠腫）、肺癌、肝臓癌、頚癌、軟部肉腫、内分泌腫瘍、造血器癌、黒色腫、膀胱癌、乳癌、すい臓癌、前立腺癌、結腸癌および卵巣癌の治療の開発に応用することができる。
【００２０】
Ｉ．定義
本明細書において、用語「免疫応答」とは抗原または抗原決定基に対する免疫系による任意の応答を称する。例示的な免疫応答には体液性免疫応答（例えば抗原特異的抗体（中和化または別の様式の）の生産）および細胞媒介型免疫応答（例えばリンパ球増殖）を含む。
【００２１】
本明細書において、用語「発生細胞」とは、胚細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、胎児細胞、胎生幹細胞、胎盤細胞、胎盤前駆細胞、臍帯幹細胞、臍帯血由来の胚様細胞、および出生後、組織特異的前駆細胞を称する。「発生細胞」は、初代細胞またはそれらから得られた細胞株であることができ、増殖、形質転換、クローニングおよび／または他の任意の種類の操作を用いて、もしくは用いずに得られた安定な細胞株を含む。
【００２２】
本明細書において、用語「発生細胞抗原」は、発生細胞により発現された抗原に相当する抗原を称する。
【００２３】
ＩＩ．方法および組成物
一つの観点では、本発明は癌細胞により発現される少なくとも一つの抗原に対して個体に免疫応答を誘起する方法を提供する。この方法は個体に、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を投与することを含んでなり、ここで組成物は個体に投与された時に少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘起する。
【００２４】
一般に免疫応答には体液性免疫応答、細胞媒介型免疫応答、または双方を含むことができる。例えばＭＨＣＩＩタンパク質が関与する免疫経路を介する抗原提示または直接的なＢ細胞刺激は、体液性応答を生じることができ、そしてＭＨＣＩタンパク質が関与する経路を介した抗原提示は、免疫系の細胞性部門（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｒｍ）を誘起することができる。
【００２５】
体液性応答は、製薬学的に許容され得る組成物を受容している個体に由来する血清サンプル中の抗体レベルに関する標準的イムノアッセイにより測定することができる。細胞性免疫応答はＴ細胞が関与する応答であり、そしてインビトロもしくはインビボで測定することができる。例えば全身的な細胞性免疫応答は、製薬学的に許容され得る組成物の投与
後の適切な時間に、個体からサンプリングした細胞中（例えば末梢血白血球（ＰＢＬ））のＴ細胞増殖活性として測定することができる。例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と刺激物とを適切な期間インキュベーションした後、［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定することができる。増殖しているＴ細胞のサブセットは、フローサイトメトリーを使用して測定することができる。Ｔ細胞傷害性（ＣＴｈ）も測定することができる。
【００２６】
一つの態様では、誘起される免疫応答は新形成疾患またはそれに随伴する症状、特に癌（例えば腫瘍）の予防的または治療的処置に十分である。したがって製薬学的に許容され得る組成物の有利な効果は、一般に少なくとも一部は免疫媒介型となるが、本明細書に記載する組成物および方法が本発明の範囲に入るために免疫応答が陽性に示される必要はない。
【００２７】
ヒトおよびヒト以外の脊椎動物の両方への投与が本発明の範囲では企図されている。獣医学的応用も企図される。一般に個体は、免疫応答を誘起することができる任意の生物である。個体の例には限定するわけではないが、ヒト、家畜、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種を含む。
【００２８】
個体は新形成疾患（例えば腫瘍）を有するか、あるいは新形成疾患発症の危険性があるいずれかであることができる。個体は臨床的基準により、例えば進行した新形成疾患または臨床的に測定可能な腫瘍を現している高い全身腫瘍組織量を有するものについて特徴付けることができる。臨床的に測定可能な腫瘍は腫瘍塊に基づき検出できるものである（例えば触診、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、Ｘ線による）。このように例えば本発明による製薬学的に許容され得る組成物は、個体の状態を緩和する目的で進行した疾患を有する個体に投与することができる。好ましくは腫瘍塊の減少が本発明の製薬学的に許容され得る組成物の投与の結果として起こるが、任意の臨床的改善が利益を構成する。臨床的改善には、例えば進行の危険性もしくは速度の低下、または病理学的結果としての腫瘍の減少を含む。
【００２９】
別の例として、個体は癌の病歴があり、そして別の治療法に反応してきた者であることができる。この他の療法には例えば、外科的切除、放射線療法、化学療法および他の免疫療法の様式を含んだかもしれない。そしてこの他の治療による結果として個体は臨床的に測定できる腫瘍を示さない。しかし個体は元の腫瘍の部位の近くに、または転移によるいずれかにより癌の再発または進行の危険性があると診断された個体であることができる。そのような個体はさらに高リスクおよび低リスク個体と分類することができる。この細分は初期の処置前または後に観察される特徴に基づき作成することができる。これらの特徴は臨床分野では知られており、そしてそれぞれ異なる癌について適切に定められる。高リスクのサブグループに典型的な特徴は、腫瘍が近接した組織に浸潤しているか、またはリンパ節への関与を示すものである。すなわち例えば本発明の製薬学的に許容され得る組成物は、再発に対する予防的手段として主に抗癌応答を誘起するために個体に投与することができる。好ましくは組成物の投与は癌の再発を遅らせ、あるいはさらに好ましくは再発の危険性を減らす（すなわち治癒率の向上）。そのようなパラメーターは、他の患者集団および他の治療様式と比較して測定することができる。
【００３０】
製薬学的に許容され得る組成物は、適切な任意の時期に投与することができる。例えば投与は、全身腫瘍組織量を有する個体の従来の治療前またはその最中に行い、そして腫瘍が臨床的に検出できなくなった後まで続けることができる。また投与は再発の兆候を示す個体に続けることができる。
【００３１】
癌細胞は任意の種類の癌であることができ、限定するわけではないが脳の癌（すなわち神経膠腫）、肺癌、肝臓癌、頚癌、軟部肉腫、内分泌腫瘍、造血器癌、黒色腫、膀胱癌、
乳癌、すい臓癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、皮膚癌およびそれらの組み合わせを含む。また癌は良性または悪性と特徴付けることができる。一つの態様では、癌は悪性度が高い神経膠腫である。別の態様では、悪性度が高い神経膠腫は多形性神経膠芽腫、未分化神経膠星状細胞腫または希突起神経膠腫である。
【００３２】
製薬学的に許容され得る組成物は、治療または予防に有効な量で投与されることができ、ここで製薬学的に許容され得る組成物は複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸を単独、または１もしくは複数の他の抗原と組み合わせて含んでなる。本発明の製薬学的に許容され得る組成物の個体への投与は、既知の手法を使用して、そして所望する効果を達成するために十分な投薬用量および期間で行うことができる。例えば製薬学的に許容され得る組成物の治療または予防に有効な量は、個体の年齢、性別および体重といった因子に従い変動することができる。投薬計画は、治療または予防効果を提供する免疫応答を含む所望の免疫応答を誘起するために、当業者により調整され得る。
【００３３】
製薬学的に許容され得る組成物は、個体の任意の適切な部位に、例えば原発腫瘍に対して遠位または近位部位に投与することができる。投与経路は非経口、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、鼻内、静脈内（留置カテーテルの仲介を含む）に、輸入リンパ管を介して、または処置する新形成疾患および個体の状態の点から適切な他の経路によることができる。好ましくは用量は所望の応答をもたらすために効果的な量および期間で投与され、それは免疫応答、または新形成疾患またはそれに随伴する症状の予防的もしくは治療的処置を誘起する。
【００３４】
製薬学的に許容され得る組成物は、個体に免疫応答を誘起する治療を含む他の治療に引き続いて、その前にまたはそれと同時存在的にも与えることができる。例えば個体は化学療法（例えばテモゾロミドのようなアルキル化剤）、放射線療法、および本発明の組成物の免疫原性を妨害しないように好ましく提供される他の治療のような他の形態の免疫療法により前以て、または同時に処置されることができる。
【００３５】
投与は介護者（例えば医師、獣医師）により正しく時期を決められ、そして個体の臨床的状態、投与の目的および／または企図されるか、または投与される他の治療に依存することができる。幾つかの態様では、初期用量が投与され、そして個体は免疫的または臨床的応答のいずれか、好ましくは両方について監視される。免疫的監視の適切な手段には、患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を応答物として、そして新形成細胞を刺激物として使用することを含む。また免疫反応は投与部位の遅延型炎症応答により測定することもできる。初期投与に続いて１もしくは複数回の投与を、適切に、典型的には毎月、半月毎に、または好ましくは週単位で所望の効果に達するまで与えることができる。その後、追加免疫感作または維持用量を必要に応じて、特に免疫または臨床的利益が消えた（ｓｕｂｓｉｄｅ）と思われる時に与えることができる。
【００３６】
胎児発生中および胚性幹細胞内に発現される多くの発生的に調節されるタンパク質は、哺乳動物種間（および場合によってはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）においても）で保存されており、そしてヒトのタンパク質および核酸レベルで高度な相同性を表す。したがって異種の胚組織抗原および胚性幹細胞抗原は、本発明による使用のためにヒトの胚抗原の適切な代替物を表すことができる抗原の例である。一つの態様では、複数の発生細胞抗原は個体に対して異種系、同種系、またはオートロガスである。別の態様では、複数の発生細胞抗原は、個体に対して異種系であり、この複数の発生細胞抗原は、個体に対して異種の発生細胞により発現される抗原に対応する。
【００３７】
以下にさらに具体的に説明するように、製薬学的に許容され得る組成物は、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸を含んでなる。
【００３８】
Ａ．核酸
一般に個体は、核酸を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を任意の非経口経路を介して接種されることができる。例えば個体は静脈内、腹腔内、皮内、皮下、吸入または筋肉内経路により、あるいは遺伝子銃を使用した粒子衝撃により接種されることができる。好ましくは筋肉組織はポリヌクレオチドの送達および発現の部位となることができる。ポリヌクレオチドの用量は、例えば長期間にわたり投与を延長するために多数回および／または反復注射により筋肉内に投与することができる。すなわち筋肉細胞は、複数の発生細胞抗原をコードするポリヌクレオチドを注射されることができ、そして発現した抗原は、発生細胞抗原に対する免疫応答を誘起するために、主要組織適合性遺伝子複合体の抗原の状態で、筋肉細胞により提示されることができる。
【００３９】
表皮は、例えば直接的注射または粒子衝撃のいずれかによるポリヌクレオチドの送達および発現のための別の有用な部位となることができる。ポリヌクレオチドの用量は、長期間にわたり投与を延ばすために、例えば多回注射または衝撃により表皮に投与することができる。例えば皮膚細胞に複数の発生細胞抗原をコードするポリヌクレオチドを注射することができ、そして発現した抗原は、発生細胞抗原に対する免疫応答を誘起するために、主要組織適合性遺伝子複合体の抗原の状態で、皮膚細胞により提示されることができる。
【００４０】
また個体は粘膜経路により接種されることもできる。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド含有点鼻剤、吸入薬、座薬、微小球カプセル化ポリヌクレオチドを含むさまざまな方法により、またはポリヌクレオチドを被覆した金粒子の衝撃により粘膜表面に投与することができる。例えば複数の発生細胞抗原をコードする核酸は、呼吸粘膜表面に投与することができる。
【００４１】
注射のための塩水、または粒子衝撃のための金粒子のような適切な生理学的に適合する媒体がポリヌクレオチドを個体に導入するために適切している。
【００４２】
１．ＲＮＡ
幾つかの態様では、製薬学的に許容され得る組成物は複数の発生細胞抗原をコードする核酸を含んでなる。一つの態様では、複数の抗原をコードする核酸はＲＮＡ、例えば細胞の全ＲＮＡおよび／またはｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを含んでなる。ＲＮＡは、複数の発生細胞抗原を提供するアミノ酸鎖の細胞内合成を導くために、転写可能なＲＮＡ鋳型を含んでなる。複数の発生細胞抗原をコードするＲＮＡは、インビトロで転写されることもでき、例えば逆転写されてｃＤＮＡを生産し、これは次に所望によりＰＣＲにより増幅され、所望により引き続きｃＤＮＡのクローニングを使用して、または使用せずにインビトロで転写され得る。
【００４３】
また含まれるのは、タンパク質、脂質および／またはＤＮＡのような非ＲＮＡ成分の濃度を下げ、それによりＲＮＡの調製物の濃縮するために、非ＲＮＡ成分（１もしくは複数）に関する分別調製物として提供されるＲＮＡである。すなわちＲＮＡがＲＮＡおよび非ＲＮＡ成分を含んでなる調製物から提供される場合、この調製物は分画または別の方法で処理されて調製物中に存在する可能性があるタンパク質、脂質および／またはＤＮＡの濃度を下げ、そして調製物中のＲＮＡを濃縮することができる。例えば当業者に知られているＲＮＡ精製法を使用して少なくとも部分的にＲＮＡを精製することができる。任意にＲＮＡ調製物はプロテアーゼまたはＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼを用いて処理される。
【００４４】
場合によりＲＮＡ調製物は、例えば癌幹細胞特異的ＲＮＡが提供されるように、ＲＮＡに関して分画されることもできる（例えば差引きハイブリダイゼーションにより）。発生
細胞と発現プロファイルを共有することができる腫瘍細胞の幹細胞画分内で発現される抗原は、この取り組みにより効率的に標的とされることができる。癌幹細胞は、標準的治療に対してより耐性であり、そして腫瘍の再発に貢献することができる。したがって差引きハイブリダイゼーションのような技術は、癌幹細胞のサブセットで特異的に発現される抗原を濃縮するために利用することができ、したがって差引きハイブリダイゼーションを使用して例えば正常な分娩後組織中で発現される抗原をコードするＲＮＡを含まないＲＮＡ調製物を提供することができる。そのような分画は、正常組織で発現され得る抗原をコードするＲＮＡの少なくとも一部を除去することにより、悪性細胞中で発現される共有（ｓｈａｒｅｄ）発生細胞抗原をコードするＲＮＡを提供することができる。
【００４５】
このように例えば正常な成人組織由来のＲＮＡを使用して差引きハイブリダイゼーションを行うことができる。したがって一つの態様では、複数の発生細胞抗原をコードする核酸は、成人細胞では転写されないか、または成人細胞中で転写されるならば、発生細胞に比べて実質的に低下したレベルで発現されるＲＮＡ転写産物について濃縮される。
【００４６】
複数の発生細胞抗原をコードするＲＮＡを調製するために、当業者は多くの方法を利用することができる。例えば放出された全ＲＮＡを含んでなる発生細胞調製物は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）のような哺乳動物細胞の培養基またはリン酸緩衝化生理食塩水のようなバッファー中で発生細胞を超音波処理することにより調製することができる。細胞を破壊するための他の方法も、その方法がＲＮＡを完全に分解しなければ適している。例えばＲＮＡは、イソシアン酸グアニジニウム法および／またはｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを単離するためのオリゴｄＴクロマトグラフィー法のような通例のＲＮＡ精製法を使用することにより調製することもできる。また、例えば発生細胞から調製されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写させることができ、次いでこれは通常のＰＣＲ法により増幅させて、抗原をコードするＲＮＡに対応するｃＤＮＡの本質的に非限定的供給を提供することができる。通常のインビトロ転写技術および細菌ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写されたＲＮＡを生産するか、あるいはインビトロで転写されたＲＮＡは複数の発生細胞抗原をコードするクローン化ＤＮＡ配列から合成することができる。
【００４７】
２．ＤＮＡ
別の態様では、複数の発生細胞抗原をコードする核酸は、複数の発生細胞抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＤＮＡを含んでなる。例えば複数の発生細胞抗原をコードするＤＮＡのオープンリーディングフレームを有する発現ベクターを含んでなる製薬学的に許容され得る組成物は、個体に投与されることができる。
【００４８】
複数の発生細胞抗原をコードするオープンリーディングフレームを含んでなるゲノムＤＮＡフラグメントおよび／またはｃＤＮＡを、本発明の方法に使用することができる。ｃＤＮＡは、複数の発生細胞抗原をコードする上記ＲＮＡから当業者に知られている技術を使用して調製することができる。
【００４９】
ＤＮＡは例えば物理的な断片化により、または好ましくは酵素的分解により、すなわち制限エンドヌクレアーゼの使用により断片化され得る。断片化法は当業者には周知であり、そしてサイズおよび組成が異なるフラグメントを得るために変えることができる（例えば異なる制限エンドヌクレアーゼまたは組み合わせ、および消化時間を使用することによる）。複数の発生細胞抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するＤＮＡまたはそのフラグメントは、当該技術分野で既知の方法および試薬により発現ベクターにクローン化することができる。例えば発現ベクターのライブラリーまたはそのサブ−ライブラリーを含んでなる製薬学的に許容され得る組成物は、個体に投与されることができる。
【００５０】
ＤＮＡ発現ライブラリーの調製は、周知方法により行うことができる。選択可能なマー
カー（例えばアンピシリン）および好ましくは複製起点（例えばｏｒｉ）および適切なプロモーターを有する標準的なクローニングベクターを使用することができる。次いで細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または他の適切な宿主がベクターにより形質転換され、そして形質転換体が標準的手順により培養され、そしてプラスミドＤＮＡがクロマトグラフィーまたは有機分離のような方法により単離される。例えばプラスミドは、オープンリーディングフレームにより発現される複数の抗原を、ＭＨＣＩまたはＩＩに向けることができる部位へクローニングするために利用できる。免疫応答を誘起するために使用される発現ベクターおよびその使用法は、米国特許出願公報第２００４０２４１１４０号明細書に記載され、これは免疫応答を誘起するために使用される発現ベクターおよびその使用法の教示に関して本明細書に編入される。
【００５１】
細胞に取り込まれた場合（例えば筋肉細胞、樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）、マクロファージ等）、ＤＮＡ分子は染色体外分子として細胞中に存在でき、かつ／または染色体に組み込まれることができる。ＤＮＡはプラスミドの状態で細胞に導入されることができ、これは別個の遺伝子物質として留まることができる。あるいは染色体に組み込まれることができる線状ＤＮＡを細胞に導入することができる。場合によっては、ＤＮＡを細胞に導入する場合、ＤＮＡの染色体への組み込みを促進する試薬を加えることができる。
【００５２】
このように好ましくはＤＮＡは、オープンリーディングフレームの発現に必要な調節要素を含む。そのような要素には例えば、プロモーター、開始コドン、終止コドンおよびポリアデニレーションシグナルを含むことができる。さらに、エンハンサーを含むことができる。当該技術分野で知られているように、これらの要素は好ましくは発生細胞抗原をコードする配列に操作可能に連結される。調節要素は好ましくは、それらが投与される個体の種で操作可能であるように選択される。コーディング配列を含むフレイム内に開始コドンおよび終止コドンが含まれることが好ましい。
【００５３】
プロモーターの例には限定するわけではないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶ長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、モロニーウイルス、ＣＭＶ前初期プロモーターのようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）に由来するプロモーター、ならびにヒト  アクチン、ヒト  ミオシン、ヒト  ヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインのようなヒトの遺伝子に由来するプロモーターを含む。適切なポリアデニレーションシグナルの例には、限定するわけではないがＳＶ４０ポリアデニレーションシグナルおよびＬＴＲポリアデニレーションシグナルがある。
【００５４】
ＤＮＡ発現に必要な調節要素に加えて、他の要素もＤＮＡ分子に含んでよい。そのような追加の要素にはエンハンサーがある。エンハンサーには上記プロモーターを含む。好適なエンハンサー／プロモーターには、例えばヒト  アクチン、ヒト  ミオシン、ヒト  ヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶに由来するもののようなウイルスエンハンサーがある。
【００５５】
任意にＤＮＡは担体または送達ベクターに操作可能に取り込まれることができる。有用な送達ベクターには限定するわけではないが、生分解性マイクロカプセル、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）またはリポソーム、およびウイルスまたは細菌のように遺伝的に工作されて弱毒化された生担体がある。
【００５６】
任意にまたＤＮＡは、細胞による遺伝物質の取り込みを改善する試薬を提供されることができる。例えばＤＮＡは安息香酸エステル、アニリド、アミジンおよびウレタンからな
る群から選択される取り込み促進試薬と一緒に配合されるか、またはそれと一緒に投与されることができる。
【００５７】
Ｂ．抗原
他の態様では、製薬学的に許容され得る組成物は複数の発生細胞抗原を含んでなる。複数の発生細胞抗原は、例えば全細胞ライセート、タンパク質またはペプチド抽出物、細胞物質（例えば生または不活化細胞）、限定するわけではないが細胞屑、アポトーシス細胞のような粒状物質、リポソーム、膜小胞、微小球等のような脂質凝集物を含む任意の形態であることができる。
【００５８】
一つの態様では、複数の発生細胞抗原は発生細胞を含んでなる。発生細胞は製薬学的に許容され得る組成物中に存在し得る他の成分と直接的に組み合わせることができる。所望により、発生細胞はいったん個体に投与されれば増殖を最小にするか、または防ぐために不活性化されることができる。不活性化のための任意の物理的、化学的または生物学的手段を使用することができ、それらには限定するわけではないが、放射線照射およびマイトマイシンＣでの処理を含む。また発生細胞は、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドまたはホルマリンのような化学品で固定することができる。またそれらは、デオキシコレートまたはオクチルグルコシドのようなイオン性または非イオン性界面活性剤中にあることができ、あるいは例えばウイルスを使用して処理することができる。
【００５９】
所望により、発生細胞の可溶化細胞懸濁液を清澄化するか、または任意の数の標準的な生化学分離法にかけて、例えば免疫沈降またはアフィニティ精製スキームを使用して複数の抗原を濃縮することができる。複数の抗原の濃縮度は、少なくとも全細胞ライセートの２、３、４、６、８、１０倍以上、またはさらに好ましくは１００倍以上である。一つの態様では、発生細胞の外膜に付随する抗原が濃縮される。
【００６０】
製薬学的に許容され得る組成物の他の成分と合わせる前に、発生細胞からそれらを処理するために使用した化学品を、例えば遠心および固定した細胞の洗浄、または可溶化懸濁物の透析により激減させることができる。好ましくは細胞を培養するために使用してよい成長培地および／または因子は、少なくとも一部が細胞調製物から除去される。例えば培養基中の血清（例えばウシ胎児血清、ウシ血清）成分、または他の生物的補充物は、そのような成分に対する免疫学的副作用を回避するために除去することができる。
【００６１】
例えば製薬学的に許容され得る組成物の細胞成分は、反復遠心によるように、適切な薬理学的に適合性のある賦形剤中へと洗浄することができる。適合性のある賦形剤には、リン酸塩もしくはＨＥＰＥＳのような生理学的に適合性のあるバッファー、およびデキストロースのような栄養、生理学的に適合性のあるイオン、またはアミノ酸を含むか、または含まない等張性塩水、ならびに発生細胞群、特に他の免疫原性成分を含まないものを含む使用に適する種々の培養基がある。アルブミンおよび血漿画分のような運搬試薬（ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）、および不活性増粘剤も使用できる。製薬学的に許容され得る組成物中に存在する限り、不活性生物成分は好ましくは同じ種に由来し、そしてさらに一層好ましくは投与する個体から事前に得られる。
【００６２】
Ｃ．樹状細胞療法
当業者は、樹状細胞（ＤＣ）をインビトロで生成する能力も、本発明にしたがい複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸をＤＣにエクスビボで負荷し、そして癌細胞により発現される少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘起するための戦略としての「ＤＣワクチン」の投与に使用することができると認識している。臨床前実験では、ＤＣがＢおよびＴリンパ球でデノボおよびリコール応答（ｒｅｃａｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の有力なアクチベーターになることが示された。
【００６３】
幾つかの態様では、本発明は癌細胞により発現される少なくとも一つの抗原に対して個体に免疫応答を誘起する方法を提供し、この方法は個体に、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸をエクスビボで負荷した樹状細胞を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を個体に投与することを含んでなり、ここで製薬学的に許容され得る組成物は、個体に投与された時に少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘起する。
【００６４】
したがって、本発明の発生細胞抗原に感作した抗原提示細胞およびこれらの抗原提示細胞で生成した発生抗原特異的Ｔリンパ球は、予防または治療的応用のための免疫調節組成物において活性化合物として使用することができる。以下に記載するように、幾つかの態様では、本発明の抗原に感作した抗原提示細胞は、個体への養子免疫伝達のための細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（例えばＣＤ８＋またはＣＤ４＋ＣＴＬ）の生成に使用することができる。
【００６５】
Ｄ．組成物
他の観点では、本発明は発生細胞により発現される複数の発生細胞抗原または複数の抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容され得る組成物を提供する。この製薬学的に許容され得る組成物は、個体に投与された時、発生細胞の少なくとも一つの抗原に対する免疫応答を誘起することができる。本発明の製薬学的に許容され得る組成物は新形成疾患またはその症状の予防的または治療的処置、特に個体の癌（または腫瘍）の防止または処置のためのワクチン組成物として有用となることができる。
【００６６】
発生細胞により発現される複数の抗原、または複数の抗原をコードする核酸は上記の通りである。幾つかの態様では、製薬学的に許容され得る組成物はさらに生理学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでなる。配合および投与に関する技法は、レミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，）イーストン、ペンシルバニア州の最新版に見いだすことができる。
【００６７】
当該技術分野で知られている製薬学的に許容され得る担体には、限定するわけではないが滅菌水、塩水、グルコース、デキストロースまたは緩衝液がある。希釈剤、安定化剤（例えば糖およびアミノ酸）、保存剤、浸潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、粘度を強める添加剤等の作用物質。好ましくは培地および担体は最小の副作用を生じるか、または副作用がない。
【００６８】
他の態様では、製薬学的に許容され得る組成物はさらに生理学的に許容され得るアジュバントを含んでなる。好ましくは使用するアジュバントは免疫原性の上昇を提供する。アジュバントは抗原の遅延型放出（ｓｌｏｗ  ｒｅｌｅａｓｅ）を提供できるものであることができるか（例えばアジュバントはリポソームであることができる）、または本来免疫原性であり、それにより抗原と相乗的に機能することができるアジュバントであり得る。例えばアジュバントは核酸の取り込みを促進し、免疫系の細胞を投与の部位に補充し、または応答するリンパ節細胞の免疫賦活化を促進する既知のアジュバントまたは他の物質であることができる。アジュバントには限定するわけではないが、免疫調節分子（例えばサイトカイン）、油と水のエマルジョン、水酸化アルミニウム、グルカン、硫酸デキストラン、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、Ｂａｃｔｏ−アジュバント、ポリアミノ酸のような合成ポリマーおよびアミノ酸のコポリマー、サポニン、パラフィン油およびムラミルジペプチドがある。
【００６９】
幾つかの態様では、アジュバントは不完全フロイントアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄ
ｅ  ＩＳＡ  ５１）またはコリネバクテリウム  グラニュロサム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）Ｐ４０を含んでなる。
【００７０】
一つの態様では、アジュバントは免疫調節分子を含んでなる。例えば免疫調節分子は組換えタンパク質サイトカイン、ケモカイン、または免疫刺激剤、または免疫応答を強化するように設計されたサイトカイン、ケモカインもしくは免疫刺激剤をコードする核酸であることができる。アジュバントは、複数の抗原または複数の抗原をコードする核酸と組み合わせるか、またはそれらに結合させることができる。ベクターから発現できないアジュバントは、同時に、または任意の順序で順次投与することができる。
【００７１】
免疫調節サイトカインの例には、インターフェロン（例えばＩＦＮα、ＩＦＮβおよびＩＦＮγ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１２およびＩＬ−２０）、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦαおよびＴＮＦβ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＬＴ−３リガンド、ｇＩｐ１０，ＴＣＡ−３，ＭＣＰ−１，ＭＩＦ，ＭＩＰ−１α，ＭＩＰ−１β，ランテス、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ならびに前記の任意の機能的フラグメントがある。ケモカイン受容体、すなわちＣＸＣ，ＣＣ，ＣまたはＣＸ３Ｃケモカイン受容体に結合する任意の免疫調節サイトカインも本発明の内容において使用することができる。ケモカインの例には限定するわけではないが、Ｍｉｐ１α，Ｍｉｐ−１β，Ｍｉｐ−３α（Ｌａｒｃ），Ｍｉｐ−３β，ランテス，Ｈｃｃ−１，Ｍｐｉｆ−１，Ｍｐｉｆ−２，Ｍｃｐ−１，Ｍｃｐ−２，Ｍｃｐ−３，Ｍｃｐ−４，Ｍｃｐ−５，Ｅｏｔａｘｉｎ，Ｔａｒｃ，Ｅｌｃ，Ｉ３０９，ＩＬ−８，Ｇｃｐ−２  Ｇｒｏ−α，Ｇｒｏ−β，Ｇｒｏ−γ，Ｎａｐ−２，Ｅｎａ−７８，Ｇｃｐ−２，Ｉｐ−１０，Ｍｉｇ，Ｉ−Ｔａｃ，Ｓｄｆ−１およびＢｃａ−１（Ｂｌｃ）、ならびに前記の任意の機能的フラグメントがある。
【００７２】
別の態様では、アジュバントは：ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−７，ＩＬ−１２，ＩＬ−１５，ＩＬ−２１，ＴＮＦ−αおよびＭ−ＣＳＦからなる群から選択されるサイトカインを含んでなる。幾つかの態様では、アジュバントはフロイントアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１）またはコリネバクテリウム  グラニュロサム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）Ｐ４０を含んでなる。例えば一つの態様では、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−７をコードする配列は、発生細胞抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するベクターに、あるいは抗原が投与される時と同時またはその時期に投与される別のベクターに含むことができる。別の態様では、製薬学的に許容され得る組成物は、発生細胞または細胞株の状態で発生細胞により発現される複数の抗原を含んでなり、ここで発生細胞または細胞株は、免疫刺激を提供するためにサイトカインを生産するように遺伝的に改変されて、複数の抗原に対して特異的免疫応答を生じる。幾つかの態様では、製薬学的に許容され得る組成物は、発生細胞または細胞株の状態で発生細胞により発現される複数の抗原；および１もしくは複数のサイトカイン発現細胞株を含んでなる。そのような組成物は、適切な数のサイトカイン生産細胞を含めることにより、または複数のサイトカインを適切な比率で生産するような細胞のカクテルを用いて、各タイプの癌に、または各個体用に誂えることができる。
【００７３】
当業者は本発明の方法および組成物が、例えば限定するわけではないが化学療法剤、免疫療法剤、免疫調節物質、抗−血管形成剤、およびホルモン剤のような１もしくは複数の他の作用物質を含んでなる方法および／または組成物のような併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）の一部として使用することができることを知っている。様々な態様において、１もしく複数の他の作用物質は、例えば「癌の化学療法剤（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ）」、アメリカ化学学会、１９９
５，Ｗ．Ｏ．Ｆｏｙｅ編集により記載されているように、天然または合成の化学療法剤であることができる。
【００７４】
一つの態様では、化学療法剤は、低分子低分子受容体アンタゴニスト、例えばａｕｓバタラニブ、ＳＵ  １１２４８またはＡＺＤ−６４７４、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２アンタゴニスト、例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＩ−１０３３またはヘルセプチン、抗体、例えばベバシズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ＤＮＡアルキル化剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチンまたはカルボプラチン、アントラサイクリン、例えばドキソルビシンまたはエピルビシン、代謝拮抗物質、例えば５−ＦＵ、ペメトレクスド、ゲムシタビンまたはカペシタビン、カンプトテシン、例えばイリノテカンまたはトポテカン、抗癌剤、例えばパクリタキセルまたはドセタキセル、エピドフィロトキシン、例えばエトポシドまたはテニポシド、プロテアソームインヒビター、例えばボルテゾミブ、あるいは抗炎症剤、例えばセレコキシブまたはロフェコキシブを、場合によっては製薬学的に許容され得る塩の状態で、水和物および／または溶媒和物の状態で、そして場合によっては個々の光学異性体の状態で、それらの個々のエナンチオマーまたはラセミ体の混合物でなる群から選択される。
【００７５】
別の態様では、化学療法剤は、低分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えばバタラニブ（ＰＴＫ−７８７／ＺＫ２２２５８４），ＳＵ−５４１６，ＳＵ−６６６８，ＳＵ−１１２４８，ＳＵ−１４８１３，ＡＺＤ−６４７４，ＡＺＤ−２１７１，ＣＰ−５４７６３２，ＣＥＰ−７０５５，ＡＧ−０１３７３６，ＩＭ−８４２またはＧＷ−７８６０３４、二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２アンタゴニスト、例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＩ−１０３３またはＧＷ−２０１６、ＥＧＦＲアンタゴニスト、例えば、イレッサ（ＺＤ−１８３９）、タルセバ（ＯＳＩ−７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２またはヘルセプチン、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト、例えばＢＡＹ−４３−９００６またはＢＡＹ−５７−９００６、キナゾリン誘導体、例えば、４−〔（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ〕−６−｛〔４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−オキソ−２−ブテン−１−イル〕アミノ｝−７−（（Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）−キナゾリンまたは４−〔（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）アミノ〕−６−｛〔４−（ホモモルホリン−４−イル）−１−オキソ−２−ブテン−１−イル〕アミノ｝−７−〔（Ｓ）−（テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ〕−キナゾリン、またはこれらの製薬学的に許容され得る塩、合成小分子のもとに分類されないタンパク質キナーゼ受容体アンタゴニスト、例えばアトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、アバスチン．ＴＭ．（ベバシズマブ）、ＩＭＣ−１Ｃ１１、エルビツクス（Ｃ−２２５）、ＤＣ−１０１、ＥＭＤ−７２０００、ビタキシン、イマチニブ、タンパク質チロシンキナーゼインヒビター（これは融合タンパク質である）、例えばＶＥＧＦトラップ、アルキル化剤または白金化合物、例えばメルファラン、シクロホスファミド、オキサザホスホリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、テトラプラチン、イプロプラチン、マイトマイシン、ストレプトゾシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、イフォスファミド、ストレプトゾシン、チオテパ、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネート、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームのドキソルビシン（ドキシル）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ダクチノマイシン、ジスタマイシンまたはそれらの誘導体、ネトロプシン、ピメンジモール、マイトマイシン、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン、ミトラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシン、フタラニリド、例えばプロパミジンまたはスチルバミジン、アントラマイシン、アジリジン、ニトロソウレアまたはその誘導体、ピリミジンまたはプリン類似体またはヌクレオシドジホスフェートレダクターゼのアンタゴニストもしくはインヒビター、例えば、シタラビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ペメトレキセド、テガフル／ウラシル、ウラシルマスタード、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、クラドリビン、チオグアニン、メトトレキセート、ペントスタチン、ヒドロキシウレア、または葉酸、フレオマイシン、ブレオマイシンまたはその誘導体もしくは塩、ＣＨＰＰ、ＢＺＰＰ、ＭＴＰＰ、ＢＡＰＰ、リブロマイシン、アクリジンまたはその誘導体、リファマイシン、アクチノマイシン、アドラマイシン、カンプトテシン、例えばイリノテカン（カンプトサー）またはトポテカン、アムサクリンまたはその類似体、三環式カルボキサミド、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、例えばＳＡＨＡ、ＭＤ−２７５、トリコスタチンＡ、ＣＢＨＡ、ＬＡＱ８２４、またはバルプロ酸、植物由来の抗癌剤、例えばパクリタキセル（タキソール）、ドセタキセルまたはタキソテール、ビンカアルカロイド、例えばナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビン、トロポロンアルカロイド、例えばコルヒシンまたはその誘導体、マクロリド、例えばマイタンシン、アンサミトシンまたはリゾキシン、抗有糸分裂ペプチド、例えばフォモプシンまたはドラスタチン、エピポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシンの誘導体、例えばエトポシドまたはテニポシド、ステガナシン、抗有糸分裂カルバメート誘導体、例えばコムブレタスタチンまたはアンフェチニル、プロカルバジン、プロテアソームインヒビター、例えばボルテゾミブ、酵素、例えばアスパラギナーゼ、ペギル化アスパラギナーゼ（ペガスパルガーゼ）またはチミジン−ホスホリラーゼインヒビター、ゲスタゲンまたはエストロゲン、例えばエストラムスチン（Ｔ−６６）またはメゲストロール、アンチアンドロゲン、例えばフルタミド、カソデクス、アナンドロンまたはシプロテロンアセテート、アロマターゼインヒビター、例えばアミノグルテチミド、アナストロゾール、ホルメスタンまたはレトロゾール、ＧＮｒＨ類似体、例えばリュープロレリン、ブセレリン、ゴセレリンまたはトリプトレリン、アンチエストロゲン、例えばタモキシフェンまたはそのクエン酸塩、ドロロキシフェン、トリオキシフェン、ラロキシフェンまたはジンドキシフェン、１７β−エストラジオールの誘導体、例えばＩＣＩ  １６４，３８４またはＩＣＩ  １８２，７８０、アミノグルテチミド、ホルメスタン、ファドロゾール、フィナステリド、ケトコナゾール、ＬＨ−ＲＨアンタゴニスト、例えばロイプロリド、ステロイド、例えばプレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ブデノシド、フルオコルトロンまたはトリアムシノロン、インターフェロン、例えばインターフェロンβ、インターロイキン、例えばＩＬ−１０またはＩＬ−１２、抗ＴＮＦα抗体、例えばエタネルセプト、免疫調節剤、例えばサリドマイド、そのＲ−鏡像体及びＳ−鏡像体およびにその誘導体、またはレビミド（ＣＣ−５０１３）、ロイコトリエンアンタゴニスト、マイトマイシンＣ、アジリドキノン、例えばＢＭＹ−４２３５５、ＡＺＱまたはＥＯ−９、２−ニトロイミダゾール、例えばミソニダゾール、ＮＬＰ−１またはＮＬＡ−１、ニトロアクリジン、ニトロキノリン、ニトロピラゾロアクリジン、“二重機能”ニトロ芳香族化合物、例えばＲＳＵ−１０６９またはＲＢ−６１４５、ＣＢ−１９５４、ナイトロジェンマスタードのＮ−オキサイド、例えばニトロミン、ナイ��ロジェンマスタードの金属錯体、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ２５抗体、トレランス誘導剤、ビホスホネートまたはその誘導体、例えばミノドロン酸またはその誘導体（ＹＭ−５２９、Ｏｎｏ−５９２０、ＹＨ−５２９）、ゾレドロン酸一水和物、イバンドロネートナトリウム水和物またはクロドロネート二ナトリウム、ニトロイミダゾール、例えばメトロニダゾール、ミソニダゾール、ベンズニダゾールまたはニモラゾール、ニトロアリール化合物、例えばＲＳＵ−１０６９、ニトロキシルまたはＮ−オキサイド、例えばＳＲ−４２３３、ハロゲン化ピリミジン類似体、例えばブロモデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、チオホスフェート、例えばＷＲ−２７２  １、光化学活性化剤、例えばポルフィマー、フォトフリン、ベンゾポルフィリン誘導体、フェオホルビド誘導体、メロシアニン５４０（ＭＣ−５４０）またはスズエチオポルプリン、アンチテンプレートまたはアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、例えばオブリメルセン、非ステロイド炎症薬、例えばアセチルサリチル酸、メサラジン、イブプロフェン、ナプロキセン、フルビプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、チアプロフェン酸、フルプロフェン、インドメタシン、スリンダック、トルメチン、ゾメピラック、ナブメトン、ジクロフェナック、フェンクロフェナック、アルクロフェナック、ブロムフェナック、イブフェナック、アセクロフェナック、アセメタシン、フェンチアザック、クリダナック、エトドラック、オキシピナック、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルミン酸、トルフェナム酸、ジフルニサール、フルフェニサール、ピロキシカム、テノキシカム、ロモキシカム、ニメスリド、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、または非ステロイド炎症剤の製薬学的に許容され得る塩、細胞傷害抗生物質、癌細胞の表面分子を標的とする抗体、例えばアポリズマブまたは１Ｄ０９Ｃ３、メタロプロテイナーゼのインヒビター、例えばＴＩＭＰ−１またはＴＩＭＰ−２、亜鉛、オンコジーンのインヒビター、例えばＰ５３およびＲｂ、希土類元素の錯体、例えばランタニドの複素環錯体、光化学治療薬、例えばＰＵＶＡ、転写因子複合体ＥＳＸ／ＤＲＩＰ１３０／Ｓｕｒ−２のインヒビター、ＨＥＲ−２発現のインヒビター、例えば熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０モジュレーターゲルダナマイシンおよびその誘導体１７−アリルアミノゲルダナマイシンまたは１７−ＡＡＧ、またはＩＭ−８４２、テトラチオモリブデート、スクアラミン、コンブレスタチンＡ４、ＴＮＰ−４７０、マリマスタット、ネオバスタット、ビカルタミド、アバレリクス、オレゴボマブ、ミツモマブ、ＴＬＫ−２８６、アレムツズマブ、イブリツモマブ、テモゾロミド、デニロイキンジフチトクス、アルデスロイキン、デカルバジン、フロクスウリジン、プリカマイシン、ミトタン、ピポブロマン、プリカマイシン、タムロキシフェンおよびテストラクトンから選択される治療薬からなる群から選択される。好適な好ましい化合物には、小分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えばバタラニブ（ＰＴＫ−７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＳＵ−５４１６、ＳＵ−６６６８、ＳＵ−１１２４８、ＳＵ−１４８１３、ＡＺＤ−６４７４、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２アンタゴニスト、例えばＣＩ−１０３３またはＧＷ−２０１６、ＥＧＦＲアンタゴニスト、例えばイレッサ（ゲフェチニブ、ＺＤ−１８３９）、タルセバ（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２またはヘルセプチン、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト、例えばＢＡＹ−４３−９００６またはＢＡＹ−５７−９００６、アトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、アバスチン．ＴＭ．（ベバシズマブ）、ＩＭＣ−１Ｃ１１、エルビツクス（Ｃ−２２５）、ＤＣ−１０１、ＥＭＤ−７２０００、ビタキシン、イマチニブ、アルキル化剤または白金化合物、例えばメルファラン、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームのドキソルビシン（ドキシル）、エピルビシン、イダルビシン、ピリミジンまたはプリン類似体あるいはヌクレオシドジホスフェートレダクターゼのアンタゴニストまたはインヒビター、例えばシタラビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ペメトレキセド、テガフル／ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、メトトレキセート、抗癌剤、例えばパクリタキセル（タキソール）またはドセタキセル、ビンカアルカロイド、例えばナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビン、抗有糸分裂ペプチド、例えばドラスタチン、エピポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシンの誘導体、例えばエトポシドまたはテニポシド、非ステロイド炎症薬、例えばメロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、癌細胞の表面分子を標的とする抗体、例えばアポリズマブまたは１Ｄ０９Ｃ３あるいは熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０モジュレーターゲルダナマイシンおよびその誘導体１７−アリルアミノゲルダナマイシンまたは１７−ＡＡＧがある。
【００７６】
別の態様では、化学療法剤はチューブリンと相互作用するか、または結合する化合物、合成低分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、低分子増殖因子受容体アンタゴニスト、合成低分子に分類されないＥＧＦ受容体および／またはＶＥＧＦ受容体および／またはインテグリン受容体、または任意の他のタンパク質チロシンキナーゼ受容体のインヒビター、融合タンパク質であるＥＧＦ受容体および／またはＶＥＧＦ受容体および／またはインテグリン受容体、または任意の他のタンパク質チロシンキナーゼ受容体に向けられたインヒビター、ＤＮＡインターカレーターとして、またはＤＮＡ架橋剤として、ＤＮＡ小溝結合化合物を含め核酸と相互作用し、そしてアルキル化剤または白金化合物に分類される化合物、核酸と相互作用し、そしてアントラサイクリンに分類される化合物、代謝拮抗物質、天然の半合成または合成ブレオマイシン型抗生物質、ＤＮＡ転写酵素のインヒビター、そして特にトポイソメラーゼＩもしくはトポイソメラーゼＩＩインヒビター、クロマチン修飾剤、有糸分裂インヒビター、抗有糸分裂剤、細胞周期インヒビター、プロテアソームインヒビター、酵素、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ホルモンインヒビター、ステロイド生合成のインヒビター、ステロイド、サイトカイン、低酸素−選択的サイトトキシン、サイトカインのインヒビター、リンホカイン、サイトカインに対する抗体、経口および非経口耐容導入剤、補助剤、化学的放射線増感剤および保護剤、光化学的に活性化される薬剤、合成ポリ−またはオリゴヌクレオチド、任意に修飾された、または結合された非コテロイド抗炎症剤、細胞傷害性抗体、癌細胞の表面分子を標的とする抗体、増殖因子またはその受容体の標的とする抗体、メタロプロティナーゼのインヒビター、金属、癌遺伝子のインヒビター、遺伝子転写またはＲＮＡ翻訳またはタンパク質発現のインヒビター、希土類元素の錯体および光化学治療剤からなる群から選択される。
【００７７】
別の態様では、化学療法剤はパクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル、ビンカアルカロイド、例えばナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビン、アルキル化剤または白金化合物、例えば、メルファラン、シクロホスファミド、オキサザホスホリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、テトラプラチン、イプロプラチン、マイトマイシン、ストレプトゾシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、イフォスファミド、ストレプトゾシン、チオテパ、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード、例えばメクロレタミン、免疫調節剤、例えばサリドマイド、そのＲ−鏡像体およびＳ−鏡像体ならびにその誘導体、またはレビミド（ＣＣ−５０１３）、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネート、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームのドキソルビシン（ドキシル）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ダクチノマイシン、ジスタマイシンまたはその誘導体、ネトロプシン、ピメンジモール、マイトマイシン、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン、ミトラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシン、フタラニリド、例えばプロパミジンまたはスチルバミジン、アントラマイシン、アジリジン、ニトロソウレアまたはその誘導体、ピリミジンまたはプリン類似体またはヌクレオシドジホスフェートレダクターゼのアンタゴニストもしくはインヒビター、例えばシタラビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ウラシルマスタード、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、クラドリビン、チオグアニン、メトトレキセート、ペントスタチン、ヒドロキシウレア、または葉酸、アクリジンまたはその誘導体、リファマイシン、アクチノマイシン、アドラマイシン、カンプトテシン、例えばイリノテカン（カンプトサー）またはトポテカン、アムサクリンまたはその類似体、三環式カルボキサミド、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、例えばＳＡＨＡ、ＭＤ−２７５、トリコスタチンＡ、ＣＢＨＡ、ＬＡＱ８２４、またはバルプロ酸、プロテアソームインヒビター、例えばボルテゾミブ、小分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えばバタラニブ（ＰＴＫ−７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＳＵ−５４１６、ＳＵ−６６６８、ＳＵ−１１２４８、ＳＵ−１４８１３、ＡＺＤ−６４７４、ＡＺＤ−２１７１、ＣＰ−５４７６３２、ＣＥＰ−７０５５、ＡＧ−０１３７３６、ＩＭ−８４２またはＧＷ−７８６０３４、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト、例えばＢＡＹ−４３−９００６またはＢＡＹ−５７−９００６、二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２アンタゴニスト、例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＩ−１０３３またはＧＷ−２０１６、ＥＧＦＲアンタゴニスト、例えばイレッサ（ＺＤ−１８３９）、タルセバ（ＯＳＩ−７７４）、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２またはヘルセプチン、キナゾリン誘導体、例えば４−〔（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ〕−６−｛〔４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−オキソ−２−ブテン−１−イル〕アミノ｝−７−（（Ｓ）−テトラヒドロフラン−３−イルオキシ）−キナゾリンまたは４−〔（３−クロロ−４−フルオロ−フェニル）アミノ〕−６−｛〔４−（ホモモルホリン−４−イル）−１−オキソ−２−ブテン−１−イル〕アミノ｝−７−〔（Ｓ）−（テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ〕−キナゾリン、またはこれらの製薬学的に許容され得る塩、転写因子複合体ＥＳＸ／ＤＲＩＰ１３０／Ｓｕｒ−２のインヒビター、ＨＥＲ−２発現のインヒビター、例えば熱ショックタンパク質ＨＳＰ９０モジュレーターゲルダナマイシンおよびその誘導体１７−アリルアミノゲルダナマイシンまたは１７−ＡＡＧ、合成小分子のもとに分類されないタンパク質キナーゼ受容体アンタゴニスト、例えばアトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、アバスチン．ＴＭ．（ベバシズマブ）、ＩＭＣ−１Ｃ１１、エルビツクス（Ｃ−２２５）、ＤＣ−１０１、ＥＭＤ−７２０００、ビタキシン、イマチニブ、および癌細胞の表面分子を標的とする抗体、例えば、アポリズマブもしくは１Ｄ０９Ｃ３からなる群から選択される。
【００７８】
幾つかの態様では、化学療法剤は１もしくは複数のＡＢＣトランスポーターにより媒介されるヒアルロナンの輸送を減少する化合物、または薬剤輸送インヒビター、例えばＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）インヒビター分子またはインヒビターペプチド、ＭＲＰ１インヒビター、ＡＢＣトランスポーターに対して向けられ、かつそれをブロックすることができる抗体、アンチセンスオリゴマー、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは１もしくは複数のＡＢＣトランスポーターに対し向けられたアプタマーである。本発明のＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）インヒビター分子の例は、ゾスキダー（ＬＹ３３５９７３）、その塩（特にその三塩化物塩）及びその多形、シクロスポリンＡ（またシクロスポリンとして知られている）、ベラパミルまたはそのＲ−異性体、タモキシフェン、キニジン、ｄ−アルファトコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシネート、ＶＸ−７１０、ＰＳＣ８３３、フェノチアジン、ＧＦ１２０９１８（ＩＩ）、ＳＤＺ  ＰＳＣ  ８３３、ＴＭＢＹ、ＭＳ−０７３、Ｓ−９７８８、ＳＤＺ２８０−４４６、ＸＲ（９０５１）ならびにこれらの機能性誘導体、類似体および異性体である。
【００７９】
一つの態様では、本発明は癌を処置する薬剤を調製するための本明細書で定義する製薬学的組成物の使用に関する。
【００８０】
Ｅ．養子免疫療法
様々な他の観点において、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸も、癌抗原で感作した抗原提示細胞を提供するための組成物および方法に提供することができ、そしてこれらの抗原提示細胞を用いて生成された癌抗原特異的Ｔリンパ球は、例えば癌の予防的または治療的応用のための免疫調節組成物および方法における活性化合物としての用途に提供できる。
【００８１】
したがって一つの観点では、本発明は癌抗原で感作した抗原提示細胞の作成法を提供し：この方法は
抗原提示細胞を、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸と、複数の発生細胞抗原が抗原提示細胞により提示されるために十分な条件下でインビトロで接触させることによる。
【００８２】
複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸は上記の通りである。
【００８３】
複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸は、抗原提示細胞を含んでなる均一な、実質的に均一な、または異質な組成物と接触させることができる。例えば組成物には限定するわけではないが、全血、新鮮血またはそれらの画分、例えば限定するわけではないが末梢血単核細胞、全血の軟膜画分、充填赤血球、照射血液、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、リンパ球、ナチュラルキラー細胞およびナチュラルキラ
ーＴ細胞を含むことができる。場合により抗原提示細胞の前駆細胞が使用される場合、前駆細胞は前駆細胞を抗原提示細胞に分化させるために十分な適切な培養条件下で培養することができる。好ましくは抗原提示細胞（または場合により前駆細胞）は、単球、マクロファージ、ミエロイド系統の細胞、Ｂ細胞、樹状細胞またはランゲルハンス細胞から選択される。
【００８４】
抗原提示細胞との接触に置かれる複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸の量は、日常的な実験により当業者が定めることができる。一般に抗原提示細胞は、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸と、Ｔ細胞のモジュレーションのためにプロセッシングした形態の抗原を提示するために十分な期間接触させる。一つの態様では、抗原提示細胞は複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸の存在下で、約１週間未満、具体的説明としては約１分から約４８時間、約２分から約３６時間、約３分から約２４時間、約４分から約１２時間、約６分から約８時間、約８分から約６時間、約１０分から約５時間、約１５分から約４時間、約２０分から約３時間、約３０分から約２時間、そして約４０分から約１時間、インキュベーションされる。抗原提示細胞が抗原をプロセッシングし、そして提示するために必要な時間および抗原または抗原をコードする核酸の量は、例えばパルス−チェイス法を使用して決定することができ、ここで接触の次に洗浄期間、そして読み取り系（例えば抗原反応性Ｔ細胞）への暴露が続く。
【００８５】
典型的には抗原提示細胞がその表面に抗原を提示するために必要な時間の長さは、使用する抗原または抗原の形態（例えばペプチド対コードするポリヌクレオチド）、その用量および使用する抗原提示細胞、ならびに抗原の負荷が行われる条件を含む多くの因子により変動し得る。これらのパラメーターは日常的な手順を使用して当業者が決定できる。抗原提示細胞の感作効率は、Ｔ細胞の細胞傷害活性をインビトロでアッセイすることにより、またはＣＴＬの標的として抗原提示細胞を使用することにより測定することができる。抗原提示細胞の表面上の抗原の存在を検出できる他の方法も、本発明により企図される。
【００８６】
抗原を抗原提示細胞の内因性プロセッシング経路に送達する多くの方法が知られている。そのような方法には限定するわけではないが、ｐＨ感受性リポソーム、抗原の有力アジュバントへのカップリング、アポトーシス細胞送達、樹状細胞上への細胞のパルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）、抗原を含んでなる組換えキメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）の樹状細胞株のＭＨＣクラスＩのプロセッシング経路への送達が関与する方法がある。
【００８７】
一つの態様では、可溶化された発生細胞抗原が抗原提示細胞とインキュベーションされる。別の態様では、ＭＨＣクラスＩ経路への送達のために、発生細胞抗原を細胞溶解酵素にカップリングして抗原の抗原提示細胞の細胞質への転移を強化することができる。細胞溶解酵素の例には、サポニン化合物、例えばサポニン含有免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、孔形成トキシン（例えばアルファ−トキシン）、およびグラム陽性細菌の天然細胞溶解酵素、例えばリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）、ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）およびパーフリンゴリシンＯ（ＰＦＯ）がある。
【００８８】
別の例として、他の態様では抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞およびマクロファージを当該技術分野で知られている方法にしたがい単離し、そして複数の抗原をコードする核酸をＡＰＣに導入するために当該技術分野で知られている方法によりポリヌクレオチドでトランスフェクトすることができる。トランスフェクション試薬および方法（例えばＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標））も市販されている。例えば複数の抗原をコードするＲＮＡを適切な培地（例えばＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標））中に準備し、そして脂質（例えばカチオン性脂質）と合わせた後にＡＰＣと接触させることができる。脂質の非限定的例にはＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＤＯＤＡＣ／ＤＯＰＥおよびＣＨＯＬ／ＤＯＰＥがある。次いで生じたポリヌクレオチド−脂質複合体をＡＰＣと接触させることができる。あるいはポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウムトランスフェクションのような技法を使用してＡＰＣに導入されることができる。次いでポリヌクレオチドを負荷したＡＰＣを使用して、インビボまたはエクスビボで細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の増殖を刺激することができる。一つの態様では、エクスビボで拡張したＣＴＬが養子免疫療法の方法で個体に投与される。ポリヌクレオチドを負荷した抗原提示細胞がＣＴＬ応答を刺激する能力は、例えば標的細胞を分解するエフェクター細胞の能力をアッセイすることにより既知の方法で測定することができる。例えばＲＮＡを負荷した抗原提示細胞を使用する方法および組成物が、Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第６，３０６，３８８号明細書に記載され、これはＲＮＡを負荷したＡＰＣの作成法および使用の教示に関して引用により本明細書に編入する。
【００８９】
別の観点では、本発明は複数の発生細胞抗原が抗原提示細胞により提示されるために十分な条件下で、複数の発生細胞抗原または複数の発生細胞抗原をコードする核酸とインビトロで接触させた抗原提示細胞を含んでなる組成物を提供する。
【００９０】
別の観点では、本発明は癌細胞の少なくとも１つの抗原に特異的なリンパ球の調製法を提供する。この方法はリンパ球を上記抗原提供細胞と、癌細胞に対する免疫応答を誘起することができる少なくとも１つの癌抗原特異的リンパ球を生産するために十分な条件下で接触させることを含んでなる。このように抗原提示細胞は、癌細胞の少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘起するために、Ｔリンパ球およびＢリンパ球を含むリンパ球を提供するために使用することもできる。
【００９１】
一つの態様では、Ｔリンパ球の調製物は上記の抗原提示細胞と一定期間、好ましくは少なくとも２４時間、Ｔリンパ球を抗原提示細胞により提示される発生細胞抗原に対して感作するために接触させる。
【００９２】
例えば別の態様では、抗原提示細胞集団は、複数の発生細胞抗原または複数の抗原を含んでなる核酸と一緒の末梢血Ｔリンパ球の異質集団と同時培養することができる。この細胞は、複数の抗原またはそれらのプロセッシングされた形態が抗原提示細胞により提示され、そして抗原提示細胞がＴリンパ球の集団を感作して癌細胞の少なくとも１つの抗原に対して応答するために十分な時間および条件で同時培養することができる。したがって癌細胞の少なくとも１つの抗原に応答するように感作されたＴリンパ球およびＢリンパ球
を調製することができる。
【００９３】
本明細書に記載するように、リンパ球が免疫応答を現すように誘導する能力は、限定するわけではないがＴリンパ球の細胞溶解（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ）活性を、インビトロで例えば発生細胞抗原特異的抗原提示細胞を発生細胞抗原特異的細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の標的として使用することにより測定すること；発生細胞抗原特異的Ｔ細胞の増殖をアッセイすること；および例えばＥＬＩＳＡ法を使用して、発生細胞抗原に対するＢ細胞応答を測定することを含む任意の方法により測定することができる。
【００９４】
Ｔリンパ球は末梢血、脾臓およびリンパ節のような任意の適切な供給源から得ることができる。Ｔリンパ球は粗調製物または部分精製物または実質的に精製された調製物として使用することができ、これらは限定するわけではないが、抗体を使用した免疫磁気またはフローサイトメトリー法が関与する方法を含む標準的技術により得ることができる。
【００９５】
また本発明の範囲において意図されるのは、細胞の特異的認識のために遺伝的に修飾された細胞（例えばそれらの表面に細胞特異的抗体を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞）である。幾つかの態様では、抗原特異的Ｔ細胞は１もしくは複数の異種遺伝子、例え
ばマーカー遺伝子、または遺伝子産物が抗原特異的Ｔ細胞の特定の表現型もしくは機能を強化もしくは付与できる遺伝子を発現するために、当該技術分野で知られている遺伝子導入技法により修飾される。このように例えばマーカー遺伝子は抗原をパルスした樹状細胞に応答して活性化Ｔ細胞内で発現でき、そして抗原特異的Ｔ細胞の選択的濃縮および修飾が可能になる。別の例として抗原特異的Ｔ細胞は、受容体（例えばケモカイン受容体）を発現するように修飾されて、インビトロおよびインビボで受容体のリガンドに向かって移動することができる。選択的濃縮またはターゲッティングのために修飾された抗原特異的Ｔ細胞は、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９：５１１（２００８）に記載され、これは修飾Ｔ細胞の教示に関して引用により本明細書に編入される。別の観点では、本発明は上記抗原提示細胞またはリンパ球、ならびに製薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤を含んでなる組成物を提供する。幾つかの態様では、組成物はさらに上記のようなアジュバントを含んでなる。
【００９６】
別の観点では、本発明は癌細胞の少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘起する方法を提供し、この方法は個体に、免疫応答を誘起するために十分な有効量の上記抗原提示細胞またはリンパ球を投与することを含んでなる。幾つかの態様では、本発明は新形成疾患またはそれに随伴する症状の処置または予防のための方法を提供し、この方法は個体に有効量の前記抗原提示細胞またはリンパ球を投与することを含んでなる。一つの態様では、抗原提示細胞またはリンパ球は、好ましくは注射により全身的に投与される。あるいは例えば組織への直接注射を介して、好ましくはデポーもしくは徐放性配合物で全身的というよりは局所的に投与できる。さらに標的化された薬剤送達系で、例えば組織特異的抗体を被覆したリポソームで投与することができる。リポソームは組織に標的化されそしてそれにより選択的に取り込まれることができる。別の態様では本発明は、癌細胞の少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘起するための、好ましくは癌を処置または防止するための薬剤の調製における抗原提示細胞またはリンパ球の使用を提供する。
【００９７】
したがって本発明の抗原を感作した抗原提示細胞およびこれら抗原提示細胞により生成された抗原特異的Ｔリンパ球は、癌の予防的または治療的応用の免疫調節組成物に活性化合物として使用することができる。幾つかの態様では、本発明の発生細胞抗原を感作した抗原提示細胞は、個体への養子免疫伝達用のためのＣＤ８＋、ＣＤ４＋、ＣＴＬまたはＢ細胞リンパ球の生成に使用することができる。このように例えば発生細胞抗原に特異的なＣＴＬは、神経膠腫のような悪性腫瘍に罹患している個体に治療目的のために養子免疫的に導入することができる。
【００９８】
上記の発生細胞抗原提示細胞およびリンパ球は、免疫応答を誘起するために、特に癌細胞の少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を誘起するために、それらのみで、または組み合わせたいずれかで個体に投与することができる。ゆえにそのような細胞に基づく組成物は癌の処置または防止に有用である。細胞は、癌細胞の少なくとも１つの抗原に対する所望の免疫応答を誘起する任意の様式により個体に導入されることができる。さらに細胞はその個体に由来でき（すなわちオートロガス細胞）、またはその個体とＭＨＣが合っているか、または合っていない異なる個体（例えば同種異系）に由来できる。注射部位は皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、静脈内またはリンパ球内から選択することができる。
【００９９】
細胞の単回または多回投与を、介護者（例えば医師）により選択される細胞数および処置で行うことができる。好ましくは細胞は製薬学的に許容され得る担体中で投与される。適切な担体は細胞が成長した成長培地、またはリン酸緩衝化生理食塩水のような任意の適切な緩衝媒質であることができる。細胞は単独また他の治療と一緒にした補助的療法として投与することができる。
【０１００】
したがって本発明は、癌の処置および／または予防のための方法を企図し、この方法は
そのような処置または予防が必要な個体に治療／予防に有効な量の本明細書に記載の組成物を投与することを含んでなる。
【０１０１】
配合および投与に関する技法は、レミングトンの製薬科学、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州、最新版に見いだすことができる。適切な経路には例えば経口、直腸、経粘膜または腸管投与があり；非経口的送達、筋肉内、皮下、骨髄注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内または眼内注射を含むことができる。注射に関して、本発明の治療／予防組成物は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的塩緩衝液のような生理学的に適合性のある緩衝液中に配合することができる。
【０１０２】
Ｆ．抗体
本発明の組成物は、癌細胞により発現される少なくとも１つの抗原に対する抗体を生じるためにも使用することができる。したがって他の観点では、本発明の組成物および方法は、癌細胞の少なくとも１つの抗原に対する１もしくは複数の抗体を提供し、これらの抗体はそれら自体が例えば受動免疫感作またはエフェクターのための標的特異的送達のような多くの用途、ならびに免疫学的結合に基づく診断試験およびキットのための用途を有することができる。このように幾つかの態様では、本発明は治療および／または診断的応用に使用できる癌細胞特異的抗体を提供する。
【０１０３】
本発明の癌細胞特異的抗体は、スクリーニングまたは診断的応用に使用できる。本発明の癌細胞特異的抗体は、インビトロおよびインビボでの診断目的に価値がある。例えば癌細胞特異的は、ウエスタンブロット、免疫沈降、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、間接的免疫蛍光顕微鏡、免疫組織化学（ＩＨＣ）等で使用することができる。一つの態様では、本発明は癌細胞を決定する免疫学的方法を提供し、この方法は細胞を本明細書で記載する少なくとも１つの癌細胞特異的抗体と接触させることを含んでなる。
【０１０４】
例えば癌細胞特異的抗体は、癌を発現している細胞を検出するためのアッセイの診断薬として使用できる。本発明の癌に結合する抗体は、それらの癌に対する結合親和性を考慮すれば診断薬として特に適するはずである。本質的に癌を発現する細胞（例えば癌細胞）を含有することが疑われるサンプルは、免疫学的相互作用が起こることを可能とするために十分な時間、抗体とインキュベーションされる。当業者はこれら基本的手順に多くの変更が存在すると認識するだろう。これらの変更には例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、沈殿、凝集、補体固定および免疫蛍光がある。好ましくは個体の抗体は、抗体−癌の免疫複合体の検出を可能とするために標識される。さらに本発明の癌細胞特異的抗体は、他の細胞の精製の一段階として、混合細胞集団から癌を発現している細胞を殺すか、または排除するために、インビトロで癌の検出および定量にも有用である。
【０１０５】
抗体の標識化物を作成するために使用される標識には、放射線および蛍光色素のように直接検出できる部分、ならびに検出されるために反応または誘導化させなければならない酵素のような部分がある。放射線標識には限定するわけではないが９９Ｔｃ，２０３Ｐｂ，６７Ｇａ，６８Ｇａ，７２Ａｓ，１１１Ｉｎ，１１３ｍＩｎ，９７Ｒｕ，６２Ｃｕ，６４１Ｃｕ，５２Ｆｅ，５２ｍＭｎ，５１Ｃｒ，１８６Ｒｅ，１８８Ｒｅ，７７Ａｓ，９０Ｙ，６７Ｃｕ，１６９Ｅｒ，１２１Ｓｎ，１２７Ｔｅ，１４２Ｐｒ，１４３Ｐｒ，１９８Ａｕ，１９９Ａｕ，１６１Ｔｂ，１０９Ｐｄ，１６５Ｄｙ，１４９Ｐｍ，１５１Ｐｍ，１５３Ｓｍ，１５７Ｇｄ，１５９Ｇｄ，１６６Ｈｏ，１７２Ｔｍ，１６９Ｙｂ，１７５Ｙｂ，１７７Ｌｕ，１０５Ｒｈ，および１１１Ａｇがある。放射線標識は現在利用可能な任意のカウンティング法により検出することができる。
【０１０６】
酵素標識は、任意の現在使用されている熱量測定法、分光法、蛍光分光法、またはガス
定量技法により検出できる。酵素はカルボジイミド、過ヨウ素酸塩、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等のような結合分子を用いて抗体と結合させる。これらの手法では使用できる多くの酵素が知られており、そして利用できる。例はペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ  プラス  ペルオキシダーゼ、ガラクトース  オキシダーゼ  プラス  ペルオキシダーゼおよび酸性フォスファターゼである。使用できる蛍光物質は、例えばフルオロセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、オーラミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリア、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リソチームおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼがある。抗体は既知の方法によりそのような標識でタグを付けることができる。例えばアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミデート、スクシンイミド、ビス−ジアゾ化ベンザジン等のようなカップリング剤を使用して、抗体に上記の蛍光、化学発光および酵素標識を付けることができる。種々の標識化法がＭｏｒｒｉｓｏｎのＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（１９７４），３２Ｂ，１０３；Ｓｙｖａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９７３），２８４，３７６２；およびＢｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，（１９７３），１３３，５２９に記載されている。
【０１０７】
抗体および標識化抗体は、患者の癌の存在を検出するか、またはすでに癌を有すると診断された患者のそのような癌の状態を監視するために様々なイムノイメージング（ｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ）またはイムノアッセイ手順で使用することができる。癌の状態を監視するために使用する場合、定量的イムノアッセイ法が使用されなければならない。そのようなモニタリングアッセイが周期的に行われ、そして結果が比較される場合、測定は患者の全身腫瘍組織量が増加または減少したかどうかに関して行うことができる。使用できる一般的なアッセイ技法には直接的および間接的アッセイを含む。
【０１０８】
例えば治療的応用の場合では、抗体は疾患の進行に関与する標的を阻害するために、または標的細胞の細胞傷害的死をもたらすために使用することができる。またそのような治療的抗体はシグナル伝達回路を阻害するか、抗体依存的細胞媒介型の細胞傷害性、補体依存的細胞傷害性等を誘導することができる。
【０１０９】
本発明の癌細胞特異的抗体は、このようにかならずしもではないが一過性または永久的にエフェクターに結合でき（これによりハイブリッド分子またはキメラ分子を形成する）、そしてエフェクターを特定の標識細胞（例えば癌細胞）に向けるために使用できる効果的な標的化部分を提供する。
【０１１０】
エフェクター分子は標的細胞に特異的に輸送されるべき分子または分子群を称する。エフェクター分子は典型的には標的細胞に送達されるべき特徴的な活性を有する。エフェクター分子には限定するわけではないが、サイトトキシン、標識、放射性核種（例えば２１１Ａｔ）、リガンド、抗体、薬剤、リポソーム、エピトープタグ等を含む。好適なエフェクターにはサイトトキシン（例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシン、ゲロニン、リシン、アブリン、ジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）トキシン等）、免疫調節物質（例えばＩＬ２，ＴＮＦ−α，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｂ  ７．１，Ｈ６０）、または細胞傷害性薬剤またはプロドラッグを含み、これらの場合、ハイブリッド分子はサイトトキシンを、癌標的を有する細胞に特異的に標的する有力な殺細胞剤として使用することができる。
【０１１１】
さらにエフェクター細胞の例には、限定するわけではないが、グランザイム、ルシフェラーゼ、血管内皮増殖因子、ｂ−ラクタマーゼ、Ｔｒ−ａｐｏ−１、Ａｎｇ  ＩＩ、ＴＡＴ、アルキル化剤、ダウノマイシン、アドリアマイシン、クロラムブシル、代謝拮抗物質
（例えばメトトレキセート）、モダクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ダイアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ，ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア  オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ミトゲリン、レストリクトコイン、フェノマイシンおよびエノマイシンがある。
【０１１２】
さらに別の態様では、エフェクターは薬剤（例えば、ドキシルビシン、ビンブラスチン、タキソールまたは本明細書に記載する他の化学療法剤のような抗癌剤）をカプセル化するリポソーム、免疫系の成分により結合した細胞の認識を刺激する抗原、および免疫系の成分に特異的に結合し、そしてそれらを癌を持つ細胞に向ける抗体などを含むことができる。
【０１１３】
他の適切なエフェクター分子には、薬理学的作用物質または様々な薬理学的作用物質を含有するカプセル化系がある。このようにハイブリッド分子の標的化分子は、腫瘍に直接送達されるべき薬剤に直接付けてもよい。そのような薬剤は当業者には知られており、そして限定するわけではないが、ドキシルビシン、ビンブラスチン、ゲニステイン、アンチセンス分子等、本明細書に記載する様々な他の化学療法剤などがある。
【０１１４】
あるいはエフェクター分子は、ウイルスカプシド、リポソームまたはミセルのようなカプセル化系でよく、薬剤、核酸（例えばアンチセンス核酸）、または好ましくは循環系への直接的暴露から遮蔽された他の治療用部分といった治療用組成物を含む。これら抗体に結合するリポソームの調製法は当業者には公知である。例えば米国特許第４，９５７，７３５号明細書；Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２８：３４１−３６５を参照にされたい。
【０１１５】
ＩＩＩ．キット
本発明の組成物は、単位剤形またはキットの形態で供給させることができる。キットは別個の容器に提供される製薬学的に許容され得る組成物またはそのワクチンの種々の成分、ならびに種々の他の有効成分または化学治療剤を含む薬剤を含んでなることができる。例えば容器は、発生細胞により発現される複数の抗原または複数の抗原をコードする核酸がキットの他の成分と合わせられた時、単位剤形または多回剤形の状態の製薬学的に許容され得る組成物を一緒に構成するように、それらを別個に含んでなることができる。好適なキットは少なくとも別個の容器に抗原の供給源（例えば発生細胞により発現される複数の抗原または複数の抗原をコードする核酸）；および１もしくは複数のアジュバント（例えばサイトカイン）を含んでなる。さらにキットは生理学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤を別個の容器に含んでなることができる。場合によりキットはさらにナノ粒子またはトランスフェクション試薬のような送達剤を含んでなることができる。また本発明の包装された組成物およびキットは、保管、調製および投与に関する使用説明書を含むことができる。
【０１１６】
本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されないことに注意されい。
【実施例】
【０１１７】
実施例１
ＲＮＡを用いたワクチン接種は悪性星状細胞腫の増殖に対する防御に効果的である
腫瘍細胞株および動物モデル
ＳＭＡ５６０細胞株は、ＶＭ／Ｄｋマウス（Ｈ−２ｂ）由来の自然発生星状細胞腫の大
脳内移植片から誘導し、そして５％（容量／容量）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する亜鉛オプション培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、ゲイサースバーグ、メリーランド州）で増殖させた。すべての細胞株はマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の混入が無いことが示された。すべての実験に６〜１２週齢のメスＶＭ／Ｄｋマウス交配種を使用し、そしてラボラトリー  アニマル  リソース  コミッション  スタンダード（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ）に従いウイルスを含まない環境で管理した。
【０１１８】
ＲＮＡ−ＮＰ複合体
全腫瘍ＲＮＡは、標準法（例えばＡｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８６：１１７７（１９９７））を使用してＳＭＡ５６０腫瘍細胞から単離した。胚の発生日１０（Ｅ１０）（Ｚｙａｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または１８日（Ｅ１８）のマウス胚（Ａｍｂｉｏｎ，オースチン、テキサス州）、胚性脳全ＲＮＡ（Ｚｙａｇｅｎ，サンディエゴ，カリフォルニア州）からの胚ＲＮＡを購入した。ＲＮＡとＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）デンドリマーナノ粒子（Ｑｉａｇｅｎ，バレンシア、カリフォルニア州）との複合化（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ）を製造元の使用説明に従い室温で行った。
【０１１９】
インビトロＲＮＡのワクチン接種
ＶＭ／Ｄｋマウスは未処置、または１もしくは３回、１週間の間隔で両耳の付け根の皮内にＮＰ−ＲＮＡ（７５μｇ  ＮＰ：２５μｇ  ＲＮＡ）複合体を１００μＬ容量で免疫感作した（各耳の付け根に５０μＬ）。３回目の免疫感作から１週間後、マウスの頭蓋内に５０００の同系の自然派生した星状細胞腫（ＳＭＡ５０）で対抗（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）した。幾つかの実験では、１μｇのＧＭ−ＣＳＦ（１０μｌのＰＢＳ中）をＮＰ−ＲＮＡ複合体に加えることにより、皮内注射の直前に１μｇのマウスＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ロッキーヒル、ニュージャージー州）をＮＰ−ＲＮＡ複合体と同時に注射した。
【０１２０】
頭蓋内腫瘍対抗
腫瘍細胞を回収し、等容量の１０％メチルセルロース（ＰＢＳ中）と混合し、そして２５０μｌのハミルトンシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、レノ、ネバダ州）に充填した。マウス（ＶＭ／Ｄｋまたは無胸腺ＢＡＬＢ／ｃ）にキシラジン／ケタミン混合物で麻酔をかけ、そして定位固定フレイム（Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ツジュンガ、カリフォルニア州）に配置した。注射針をブレグマの右２ｍｍそして頭蓋面の下４ｍｍに配置した。５μＬ容量中の細胞（１．０  ｘ  １０４）を、右大脳半球に送達した。注射後、頭蓋孔をボーンワックスで閉じ、そして傷を外科用ステープルで閉じた（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．，ウッドダーレ、イリノイ州）。マウスは毎日監視し、そしてラボラトリー  アニマル  リソース  コミッション  スタンダードに従い瀕死状態となった時に屠殺した。生存能をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法に従い分析した。
【０１２１】
頭蓋内腫瘍の処置
腫瘍細胞は回収し、そして上記のように移植した。ＮＰ−ＲＮＡ複合体での処置は、腫瘍の移植から４日後に開始し、そしてマウスの生存を毎日監視した。マウスはラボラトリー  アニマル  リソース  コミッション  スタンダードに従い瀕死状態となった時に屠殺した。生存能をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法に従い分析した。
【０１２２】
実施例２
樹立された悪性神経膠腫の処置において、全胚ＲＮＡのワクチン接種は、全腫瘍ＲＮＡよりも効果的である
２５μｇの全腫瘍ＲＮＡ（ＴＴＲＮＡ）、および２５μｇまたは７５μｇのＧＭ−ＣＳ
Ｆ  ＲＮＡのどちらかを、７５μｇのデンドリマーナノ粒子（ＮＰ）と複合化した。ＲＮＡ：ナノ粒子複合体（ＴＴＲＮＡ−ＮＰ）は、同系の星状細胞腫株ＳＭＡ−５６０を致死量で頭蓋内対抗する１週間前に、耳の付け根に皮内注射することによりＶＭ／Ｄｋマウスに送達した。図１に示すように、全腫瘍ＲＮＡおよびＧＭ−ＣＳＦでのワクチン接種は、悪性の星状細胞腫の増殖に対する防御において効果的であった。
【０１２３】
ＳＭＡ−５６０星状細胞腫に由来する２５μｇの胚日１８（Ｅ１８）の全胚ＲＮＡ（Ｅ１８  ＲＮＡ）または全腫瘍ＲＮＡ（ＴＴＲＮＡ）を、７５μｇのデンドリマーナノ粒子（ＮＰ）と複合化した。このＲＮＡ：ナノ粒子複合体は、４日目の頭蓋内星状細胞腫を有するマウスに単回の皮内注射として送達した。全腫瘍ＲＮＡナノ粒子（ＮＰ−ＴＴＲＮＡ）を用いた２回のワクチン接種を与えた。図２に見られるように、すべて未処置マウスは腫瘍移植から３０日以内に死んだ。全胚ＲＮＡ（ＮＰ−Ｅ１８  ＲＮＡ）を１回ワクチン接種したマウスの５０％では１回のワクチン接種で樹立した腫瘍が治癒したが、全腫瘍ＲＮＡナノ粒子（ＮＰ−ＴＴＲＮＡ）の２回ワクチン接種では３３％のマウスが治癒した。この結果は、胚抗原が悪性神経膠腫に対する発生抗原の効果的供給源として使用できることも示す。胚組織のＲＮＡが容易に入手できること、およびそそれを増幅する能力により、これらの結果はまた脳腫瘍および発生細胞と発現パターンが共通する多くの他の癌に対するワクチン接種の汎用的プラットホームとして胚ＲＮＡワクチンの理論的解釈も支持している。
【０１２４】
実施例３
オートロガスＤＣのエクスビボ生成
白血球搬出産物（ＬＰ）バックの内容物を、１リットルの滅菌コーニングボトルに入れ、そしてＬＰを希釈するために等容量のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を加えた。遠心管を使用して、２０ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（商標）（Ｓｉｇｍａ＃１０７７−１）を３０ｍＬの希釈ＬＰに静かに上層し、そして１３００ｘｇで２５分間、遠心した。界面（管あたり１界面）を取り出し；ＰＢＳを５０ｍＬになるように加え；そして細胞を５分間、５００ｘｇで室温（ＲＴ）にてペレット化した。上清をデカントし、そしてペレットを５０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、そして上記のようにペレット化した。上清をデカントし、そして２つのペレットを５０ｍＬのＰＢＳ中で合わせ、次いで上記のようにペレット化した。再び上清をデカントし、そして２つのペレットを５０ｍＬのＰＢＳ中で合わせ、次いで上記のようにペレット化した。ペレットを合わせ、そしてすべての細胞が１つの管に合わせられるまでＰＢＳで洗浄した。
【０１２５】
トリパンブルー排除法を行って、血球計で生きているおよび死んだ細胞数を測定した。細胞は２％ヒトＡＢ  Ｓｅｒａ（ＨＡＢＳ）（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＃ＨＰ１０２２）を含むＡＩＭ  Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃８７０１１２ｄｋ）にｍＬあたり２  ｘ  １０８で再懸濁した。２％  ＨＡＢＳおよび１ｍＬのＰＢＭＣ細胞懸濁液を含有する２９ｍＬのＡＩＭ  Ｖ培地を、Ｔ−１５０細胞培養フラスコに加えた。すべての細胞培養フラスコは、１つの専用加湿インキュベーター中に３７℃、５％ＣＯ２で２時間置かれ、単球前駆細胞が付着できるようにした。付着期間の後、非付着細胞を取り出し、そして残る単層をＰＢＳで１回洗浄した。付着細胞には、８００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）および５００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２０４−ＩＬ／ＣＦ）を補充したＡＩＭ−Ｖをフラスコあたり３０ｍｌで補充し、そして加湿インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２にて７日間インキュベーションした。
【０１２６】
７日間の培養期間の後、付着ＤＣを冷ＰＢＳで洗浄した。１０ｍｌのディソシエーションバッファーエンザイムフリー（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｆｒｅｅ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１３１５０−０１６）を加え
、そしてＤＣを４℃で１０分間インキュベーションした。付着ＤＣの残りをフラスコから洗い流し、そして前に回収したＤＣと合わせ、次いで５００ｘｇで１０分間、４℃でペレット化した。冷ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を数および生存能についてチェックした。
【０１２７】
実施例４
ＲＮＡまたはペプチドの負荷および樹状細胞の成熟
上記のように生成した樹状細胞を、１ｍＬのＶｉａＳｐａｎ（Ｂｅｌｚｅｒ  ＵＷ−ＣＳＳ，ＤｕＰｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ウィルミントン、デラウエア州）あたり２．５ｘ１０７個の細胞で再懸濁する。次いで２００μＬの懸濁液を、約２５μｇの胚日１８（Ｅ１８）の全胚ＲＮＡ、発生細胞ＲＮＡまたは発生細胞から抽出された安定濃度のペプチドと一緒にキュベット（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＃１６５−２０８６）に入れ、そして細胞を３００ボルトで５００μ秒間、電気穿孔する（ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ  ＃ＥＣＭ８３０）。約１ｘ１０８の電気穿孔した細胞を、５０ｍＬのＡＩＭ  Ｖ（８００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）および５００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２０４−ＩＬ／ＣＦ）を補充した）含有するＴ２２５フラスコに移し、次いで３７℃、５％ＣＯ２にて１時間インキュベーションする。インキュベーション期間の終わりに、成熟サイトカインを含む適当量の培地を、成熟カクテル中のサイトカインの最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２１０−ＴＡ／ＣＦ）；１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２０１−ＩＢ／ＣＦ）；および１０００単位／ｍｌ  ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２０８−ＩＬ／ＣＦ）で加える。細胞は３７℃および５％ＣＯ２にて一晩インキュベーションした。
【０１２８】
成熟期間の終わりに、上清を取り出し、そして冷蔵した５０ｍｌのコニカル管（氷上）に入れる。残りの単層は、氷冷ＰＢＳで洗浄し；上清と合わせ；次いで５００ｘｇで５分間、４℃にてペレット化する。ペレットは１０ｍｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁し、そして氷上に維持する。１０〜２０ｍｌのディソシエーションバッファーエンザイムフリー（（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１３１５０−０１６）を加え、そして細胞を４℃に維持し、そして細胞が剥がれる様子を５分毎に監視する。フラスコを２回、１０ｍｌの氷冷ＰＢＳで洗浄し、ディソシエーションバッファーからの細胞と合わせ、そして５００ｘｇを使用してペレット化する。細胞を他の細胞と合わせ、そして５０ｍｌとし、そしてカウントした。
【０１２９】
実施例５
ワクチン接種のための樹状細胞の調製
５０ｍＬのコニカル遠心管中の成熟抗原負荷樹状細胞、そして２５ｍｌのＰＢＳをゆっくり加え、そして細胞を２００ｘｇで５分間、２２℃でペレット化する。細胞は２ｍｌのピペットを使用して１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、１００μｌの懸濁液サンプルを取り出し、そして細胞を血球計およびトリパンブルーを使用して上記のようにカウントする。細胞は始める前に７０％以上が生きていると測定される。細胞を５００ｘｇで５分間、２２℃でペレット化し、そして０．９％塩化ナトリウム中に５ｘ１０４細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を１ｃｃのシリンジに２５Ｇ  ５／８ゲージ針で充填する。サンプルは投与前にグラム染色およびエンドトキシン試験に送る。
【０１３０】
実施例６
Ｔ細胞の活性化
ＤＣは正常な有志および癌がある個体から生成し、そしてＡＩＭ−Ｖ培地−２％ヒトＡＢ血清中の発生細胞ペプチド抽出物で３７℃にて３時間パルスした（ｐｕｌｓｅｄ）。あるいは複数の発生細胞抗原をコードするｍＲＮＡを負荷するために、ＤＣを洗浄し、そし
て電気穿孔のためにＯｐｔｉ−ＭＥＭに再懸濁する。ＤＣ量あたり複数の発生細胞抗原をコードする適当濃度のｍＲＮＡを、ＢＴＸ  ＥＣＭ８３０で電気穿孔する。ＤＣは４５ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地で１回洗浄し、そしてオートロガスの応答リンパ球を１：１０比（ＤＣ：Ｔ細胞）で加える。Ｔリンパ球の供給源として、非付着（ＮＡ）細胞は、個体（例えば悪性神経膠腫を有する）および正常な個人に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から生成する。末梢血由来の単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配分離（ＬＳＭ：ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ソロン、オハイオ州）により単離する。
【０１３１】
容量を約２ｘ１０６細胞／ｍｌに調整し、そして細胞は３７℃で５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気でインキュベーションする。３日後、等量のＡＩＭ−Ｖ培地（２％プールしたヒトＡＢ血清に加えてＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）を含む）を加え、そして細胞を１ｍｌ／ウェルの容量で２４−ウェルプレートに移す。その後、２〜３日毎に細胞を増殖について評価し、そして約１ｘ１０６細胞／ｍｌに調整する。パルス化ＤＣとの同時培養から８〜１１日後、Ｔ細胞を回収する。
【０１３２】
実施例７
ワクチンのナノ粒子／脂質送達
胚または胎児組織、多能性幹細胞、または組織由来前駆細胞に由来する発生細胞ＲＮＡ、タンパク質またはペプチドライセートは、ヒト個体へのインビボ送達のために、それぞれ臨床的等級のナノ粒子または脂質配合物と複合化される。適切な複合化剤の例には、限定するわけではないがＧＭＰ−級ＤＯＴＡＰ  ＆  ＤＯＴＡＰ：コレステロール（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、ｃＧＭＰ級インビボ−ｊｅｔＰＥＩ（商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．ニューヨーク、ニューヨーク州）、およびデンドリマーナノ粒子がある。ＲＮＡは遺伝子銃技法により皮内投与するために、金または銀ナノ粒子上に沈殿させる。複合化トランスフェクション剤に対して適切な比率のＲＮＡ、タンパク質またはペプチドライセートが、インビトロで混合されてペプチドまたはＲＮＡ：ナノ粒子／リポソーム複合体を形成し、次いで発生細胞抗原および共通する癌抗原に対する免疫応答を誘導するために、静脈内、皮内、皮下または筋肉内送達を介してヒト個体に送達される。発生細胞抗原を用いたワクチン接種前、それと同時および後にアジュバント送達が行われる（例えばワクチン接種の２４時間前、それと同時および後に１５０マイクログラムのＧＭ−ＣＳＦが送達される）。
【０１３３】
実施例８
連続的ＲＮＡ生産のための増幅ｃＤＮＡ鋳型の生成
様々な応用に使用する連続的ＲＮＡ生産のために（例えばＤＣの負荷）、量が限定された分類（ｓｏｒｔｅｄ）細胞からＲＮＡを臨床的規模にまで増幅できることを証明するために、増幅したｍＲＮＡがＦＤＡに認可された臨床級の細胞プロセッシング施設でわずか５００個のＣＤ１３３＋癌幹細胞およびＣＤ１３３−分類腫瘍細胞から成功裏に生成された。４つのハウスキーピング遺伝子（すなわち１８Ｓ、β−アクチン、ＧＡＤＰＨ，ＨＰＲＴ）およびＣＤ１３３遺伝子が、完全長またはほぼ完全長の増幅ｃＤＮＡ産物の検出のために、遺伝子の５’末端でエキソンの連結領域にひろがる遺伝子特異的プローブおよびプライマーを包含するリアル−タイム比較ＰＣＲを使用する増幅中、５サイクル毎に測定された。ＣＤ１３３遺伝子発現は、ＣＤ１３３−細胞から単離されたＲＮＡ中に観察されなかった。
【０１３４】
個々のハウスキーピング遺伝子に対するＣＤ１３３  ＲＮＡの比較ＰＣＲ定量を表１に示す。４種の各ハウスキーピング遺伝子に対して標準化された１０００個のインプット細胞に対して、５００個の細胞を使用して検出されたＣＤ１３３  ＲＮＡの比は、約２であった。
【０１３５】
【表１】
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【０１３６】
増幅産物はアガロースゲル電気泳動を使用して視覚化された（図３ａ）。遺伝子の相対比率は、最初のｃＤＮＡライブラリー合成後３０サイクルの増幅まで一定であり、その後、ハウスキーピング遺伝子に対してＣＤ１３３の漸次的減少が観察された。ＲＮＡ合成の停止点として２５サイクルのｃＤＮＡライブラリーの増幅を使用して、試験した２つの患者サンプル中、５００個のＣＤ１３３＋細胞から１０μｇより多くの鋳型ｃＤＮＡが生成された。
【０１３７】
８μｇの鋳型からのＲＮＡ合成で、９８０μｇより多くのインビトロ転写されたｍＲＮＡが生じた（ＩＶＴ−ＲＮＡ）（図３ｂ）。ＩＶＴ−ＲＮＡをゲル電気泳動で分析し、そして１００ｂｐからの核酸種の範囲は４．０ｋｂの長さを越えることが示された。より少ない量でより大きなＲＮＡ種を見ることができたが、過度な暴露が豊富でより小さいＲＮＡの写真による評価を排除した。これらの結果は、限定された数の分類細胞（例えばＣＤ１３３＋腫瘍細胞）からＲＮＡを臨床的規模（例えばＤＣの負荷に）に増幅する能力を示している。
【０１３８】
実施例９
差引きハイブリダイゼーションによる抗原の濃縮
場合により正常な成人組織に共通の抗原を除去することが、自己免疫の危険性を減らし、そして所望する標的抗原に対する免疫を強化する可能性がある。発生細胞抗原の濃縮は多くの技法、例えば差引きハイブリダイゼーションにより発生細胞抗原をコードする核酸を濃縮することにより行うことができる。例えば稀におよび／または差別的に発現されるｍＲＮＡのスクリーニングおよび単離のために、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して差引きｃＤＮＡプローブを生産することができる。ビーズに結合したｏｌｉｇｏ−ｄＴ配列は、特定の細胞型または組織に特異的なｃＤＮＡを生産するために、ｃＤＮＡ合成をプライムするために使用することができる。
【０１３９】
癌幹細胞抗原は、例えば正常な脳ＲＮＡおよび悪性脳腫瘍検体中の癌ではない幹細胞のＲＮＡの差引きハイブリダイゼーションを使用して濃縮することができる。発生細胞で特異的に発現される抗原をコードするＲＮＡの鋳型を生成するための差引きハイブリダイゼーションおよびｃＤＮＡライブラリー合成に関するプロトコールは、例えば市販されている差引きハイブリダイゼーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して行われる。また差引きハイブリダイ
ゼーションは例えばＨａｎｓｅｎ−Ｈａｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（４）：ｅ２０（２００１）；Ｐｒａｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：２３１６−２３２５（２００２）；ａｎｄ  Ｌａｖｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（９）：ｅ３８（２００２）に記載され、これらはそれぞれ差引きハイブリダイゼーションの教示について引用により編入する。
【０１４０】
例えば標的ｍＲＮＡは全発生細胞または胚性幹細胞ＲＮＡのいずれかを含んでなり；そして差引きｍＲＮＡは、標的組織（すなわち脳）に由来する正常ＲＮＡ、または全身的な交差反応を下げるためにヒト臓器に由来する正常ＲＮＡのプールを含んでなる。最終的なハイブリダイゼーション段階の後、発生細胞から差引かれたｍＲＮＡは、ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，マウンテンビュー、カリフォルニア州）を使用して、１０μＬの全反応容量中、修飾ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマー（５’−ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＡ  Ｃ（Ｔ）６４ＶＮ−３’）およびＴ１７鎖スイッチプライマー（５’−ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＧＣＣ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＧＣＣ  ｒＧｒＧｒＧ／３ＡｍＭＣ６−３’）を用いてプライミングすることにより完全長のｃＤＮＡライブラリーに逆転写され；そしてリアル−タイムＰＣＲを使用して増幅される。
【０１４１】
神経膠腫由来のわずか５００個の癌幹細胞（ＣＤ１３３＋腫瘍細胞と定義される）からのＲＮＡの増幅の結果を、図４に示す。ＲＮＡは、発生細胞の既存のｃＤＮＡライブラリー（すなわち胚性幹細胞ｃＤＮＡライブラリー）から調製できるか、あるいは初代発生細胞または樹立された細胞株から調製することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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