(57)【要約】過剰な炎症反応によって、敗血症を含む多様な疾患が起こりうる。炎症性のチャレンジに応答して放出された細胞外ヒストンは、敗血症の際の内皮の機能障害、臓器不全、および死に寄与するメディエーターであることが本明細書において示される。そのため、細胞外ヒストンを阻害剤によって薬理学的に標的とすることができるのみならず、敗血症および他の疾患の予後に関するバイオマーカーとして用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤を被験体に投与する段階を含む、被験体における細胞外ヒストン細胞障害性を伴う医学的状態を阻害する方法であって、該第一の阻害剤がH2Aペプチドではなく、かつ該状態が全身性紅斑性狼瘡（SLE）ではない、方法。
【請求項２】
第一の阻害剤が、H1、H2B、H3、またはH4ヒストン断片またはペプチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第一の阻害剤がH4ペプチドを含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
H4ペプチドがH4の残基50〜67位を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
ヒストン細胞障害性の第二の阻害剤を被験体に投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
第二の阻害剤が、第一の阻害剤とは異なるH1、H2A、H2B、H3、またはH4ヒストン断片またはペプチドである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
少なくとも3つの異なるヒストン断片またはペプチドのカクテルを被験体に投与する段階をさらに含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
被験体がヒト、イヌ、ネコ、ウマ、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、またはブタである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
被験体に抗炎症剤を投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
被験体に活性化プロテインCを投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤が抗ヒストン抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
抗ヒストン抗体がH1、H2A、H2B、H3、またはH4に結合する、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤が、H1、H2A、H2B、H3、またはH4の3つまたはそれ以上に結合する抗体のカクテルである、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤が、少なくとも1つのヒストン断片またはペプチドと少なくとも1つの抗ヒストン抗体とのカクテルを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤が、グランザイムAもしくはB、プラスミン、第7因子活性化プロテアーゼ、またはヘパリンである、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
医学的状態が、細菌性敗血症、真菌性敗血症、手術、外傷による出血および／もしくは組織損傷、急性膵炎、急性呼吸窮迫症候群、虚血再灌流傷害、心血管疾患、SLE以外の自己免疫疾患、化学療法毒性、放射線療法毒性、サイトカイン療法の毒性、または熱傷である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤を被験体に投与する段階を含む、被験体における細胞外ヒストン細胞障害性を伴う非敗血症性医学的状態を阻害する方法であって、該状態が全身性紅斑性狼瘡（SLE）ではない、方法。
【請求項１８】
以下の段階を含む、被験体の疾患の予後を決定する方法であって：
（a）被験体から血清または血漿試料を得る段階；および
（b）試料の細胞外ヒストン含有量を決定する段階、
ここで、該試料中の細胞外ヒストンの存在が、該被験体が疾患進行のリスクを有することを示す、方法。
【請求項１９】
段階（b）が、抗ヒストン抗体を用いるELISAまたはウェスタンブロッティングを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
抗炎症剤または細胞外ヒストン細胞障害性の阻害剤によって被験体を処置する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
ヒストンH1、H2A、H2B、H3、およびH4の少なくとも3つ由来のペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項２２】
ペプチドがH1、H2A、H2B、H3、およびH4の各々由来のペプチドである、請求項21記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
ヒストンH1、H2A、H2B、H3、およびH4の少なくとも3つに結合する抗体を含む薬学的組成物。
【請求項２４】
抗体がH1、H2A、H2B、H3、およびH4の各々に結合する、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
活性化プロテインCをさらに含む、請求項21または23記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
H2Aペプチドではないヒストン細胞障害性の第一の阻害剤を被験体に投与する段階を含む、被験体における内皮細胞による前炎症性サイトカイン産生を阻害する方法。
【請求項２７】
被験体が全身性紅斑性狼瘡（SLE）を有さない、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前炎症性サイトカインがIL-6またはIL-8である、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
第一の阻害剤がH1、H2B、H3、またはH4ヒストン断片またはペプチドを含む、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
第一の阻害剤がH4ペプチドを含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
H4ペプチドがH4の残基50〜67位を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
ヒストン細胞障害性の第二の阻害剤を被験体に投与する段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項３３】
第二の阻害剤が、第一の阻害剤とは異なるH1、H2A、H2B、H3、またはH4ヒストン断片またはペプチドである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも3つの異なるヒストン断片またはペプチドのカクテルを被験体に投与する段階をさらに含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
被験体がヒト、イヌ、ネコ、ウマ、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、またはブタである、請求項26記載の方法。
【請求項３６】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤が抗ヒストン抗体である、請求項26記載の方法。
【請求項３７】
抗ヒストン抗体が、H1、H2A、H2B、H3、またはH4に結合する、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤が、H1、H2A、H2B、H3、またはH4の3つまたはそれ以上に結合する抗体のカクテルである、請求項26記載の方法。
【請求項３９】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤が、少なくとも1つのヒストン断片またはペプチドと少なくとも1つの抗ヒストン抗体とのカクテルを含む、請求項26記載の方法。
【請求項４０】
被験体が慢性心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、腫瘍の血管新生または外傷に罹患している、請求項26記載の方法。
【請求項４１】
H2Aペプチドではないヒストン細胞障害性の第一の阻害剤を被験体に投与する段階を含む、被験体における内皮の透過性を低減させる方法。
【請求項４２】
被験体が全身性紅斑性狼瘡（SLE）を有さない、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
被験体が炭疽菌に接触したか、または外傷、浮腫、血管漏出、もしくは循環性ショックに罹患している、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
第一の阻害剤が、H1、H2B、H3、またはH4ヒストン断片またはペプチドを含む、請求項41記載の方法。
【請求項４５】
第一の阻害剤がH4ペプチドを含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
H4ペプチドがH4の残基50〜67位を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
ヒストン細胞障害性の第二の阻害剤を被験体に投与する段階をさらに含む、請求項41記載の方法。
【請求項４８】
第二の阻害剤が、第一の阻害剤とは異なるH1、H2A、H2B、H3、またはH4ヒストン断片またはペプチドである、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも3つの異なるヒストン断片またはペプチドのカクテルを被験体に投与する段階をさらに含む、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
被験体がヒト、イヌ、ネコ、ウマ、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、またはブタである、請求項41記載の方法。
【請求項５１】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤が、抗ヒストン抗体である、請求項41記載の方法。
【請求項５２】
抗ヒストン抗体が、H1、H2A、H2B、H3、またはH4に結合する、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤が、H1、H2A、H2B、H3、またはH4の3つまたはそれ以上に結合する抗体のカクテルである、請求項41記載の方法。
【請求項５４】
ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤が、少なくとも1つのヒストン断片またはペプチドと少なくとも1つの抗ヒストン抗体とのカクテルを含む、請求項41記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、2007年11月6日に提出された米国特許仮出願第60/985,886号の恩典を主張する。
【０００２】
I．発明の背景
本発明は、医学、分子および細胞生物学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、細胞毒性のメディエーターとしての細胞外ヒストンの同定、ならびに診断および治療法の双方における標的としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
II．関連技術
感染症に対する過剰な炎症反応は、敗血症に関与する。敗血症の病因に関する現在の理解は、侵入する病原体に応答した宿主細胞による前炎症性サイトカインの放出が、組織の傷害および致死を引き起こすということである。リポ多糖類（LPS）によって刺激されたマクロファージからの腫瘍壊死因子（TNF）およびインターロイキン1β（IL-1β）が、初期メディエーターとして同定され、高移動度box-1タンパク質（HMGB1）が後期メディエーターとして同定された。これらのメディエーターの阻害は、動物モデルにおいて保護的であるが、敗血症における治療標的としてのTNFおよびIL-1βに関する臨床試験は失敗した（Wang et al., 1999（非特許文献1））。HMGB1は、敗血症患者における潜在的治療標的であるが、最近の研究から、HMGB1自身が弱い前炎症性サイトカインであり、市中感染症および敗血症が疑われる患者における他の前炎症性マーカーに対するHMGB1レベルの相関はごく弱いことが示されている（Rouhiainen et al., 2007（非特許文献2）；Gaini et al., 2007（非特許文献3））。
【０００４】
現在のところ、組み換え型ヒト活性化プロテインC（APC）は、臓器不全および高い死亡リスクを有する重度の敗血症患者の処置に関して承認されている唯一の薬理学的物質である（Bernard et al., 2001（非特許文献4）；Baltch et al., 2007（非特許文献5））。APCの抗凝固、抗炎症、および細胞保護機能は、動物モデルにおける保護に関与するように思われるが、APCが臨床転帰を改善する機序は不明である（Russell, 2006（非特許文献6））。プロテインCは、内皮上でトロンボモジュリン（TM）と複合体を形成したトロンビンによってAPCに変換される。APCは、活性化第V因子および第VIII因子を切断して、このようにトロンビン形成を負にダウンレギュレートして、インビボでの恒常性バランスを維持する（Esmon, 2003（非特許文献7））。APCは、動物を大腸菌（E. coli）媒介敗血症致死から保護する（Taylor et al., 1987（非特許文献8））。他の2つの抗凝固剤療法であるアンチトロンビンIIIおよび組織因子経路阻害剤に関する臨床試験は、敗血症患者の生存を改善することができず、このことは、凝固のモジュレーションが敗血症におけるAPC処置による治療的恩恵の基礎となる主な機序ではない可能性があることを示唆している（Russell, 2006（非特許文献6））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wang et al., 1999
【非特許文献２】Rouhiainen et al., 2007
【非特許文献３】Gaini et al., 2007
【非特許文献４】Bernard et al., 2001
【非特許文献５】Baltch et al., 2007
【非特許文献６】Russell, 2006
【非特許文献７】Esmon, 2003
【非特許文献８】Taylor et al., 1987
【発明の概要】
【０００６】
このように、本発明に従って、ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤を被験体に投与する段階を含む、被験体における細胞外ヒストンの細胞障害性を伴う医学的状態を阻害する方法であって、第一の阻害剤がH2Aペプチドではなく、および状態が全身性紅斑性狼瘡（SLE）ではない、方法が提供される。第一の阻害剤は、H4の残基50〜67位を含むH4ペプチドなどのH1、H2B、H3、またはH4ヒストン断片またはペプチドを含んでもよい。方法はさらに、第一の阻害剤とは異なるH1、H2A、H2B、H3、もしくはH4ヒストン断片もしくはペプチドなどのヒストン細胞障害性の第二の阻害剤、またはH3およびH4ペプチドを含むカクテルが含まれる少なくとも3つの異なるヒストン断片もしくはペプチドのカクテルを被験体に投与する段階を含んでもよい。被験体は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、またはブタであってもよい。
【０００７】
方法はさらに、抗炎症剤および／または活性化プロテインCを被験体に投与する段階を含んでもよい。ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤は、H1、H2A、H2B、H3、またはH4に結合する抗体などの抗ヒストン抗体であってもよい。ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤はまた、H1、H2A、H2B、H3、またはH4の3つまたはそれ以上に結合する抗体のカクテルであってもよい。ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤は、少なくとも1つのヒストン断片またはペプチドと、少なくとも1つの抗ヒストン抗体とのカクテルを含んでもよい。ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤は、グランザイムAもしくはB、プラスミン、第7因子活性化プロテアーゼまたはヘパリンであってもよい。疾患は、細菌性敗血症、真菌性敗血症、手術、外傷による出血および／もしくは組織傷害、急性膵炎、急性呼吸窮迫症候群、虚血再灌流傷害、心血管疾患、SLE以外の自己免疫疾患、化学療法毒性、放射線療法毒性、サイトカイン療法毒性、または熱傷であってもよい。
【０００８】
別の態様において、疾患状態が全身性紅斑性狼瘡（SLE）ではない、被験体にヒストン細胞障害性の第一の阻害剤を投与する段階を含む、被験体における細胞外ヒストン細胞障害性を伴う非敗血症性疾患状態を阻害する方法が提供される。
【０００９】
それでもなお別の態様において、（a）被験体から血清または血漿試料を得る段階；および（b）試料中に細胞外ヒストンが存在すれば、被験体が疾患進行のリスクを有することが示される、試料の細胞外ヒストン含有量を決定する段階を含む、被験体の疾患の予後を決定する方法が提供される。段階（b）は、抗ヒストン抗体を用いるELISAまたはウェスタンブロッティングを含んでもよい。方法はさらに、抗炎症剤または細胞外ヒストン細胞障害性の阻害剤によって被験体を処置する段階を含んでもよい。
【００１０】
なお追加の態様において、（a）H1、H2A、H2B、H3、およびH4の各々からのペプチドが含まれる、ヒストンH1、H2A、H2B、H3、およびH4の少なくとも3つからのペプチドを含む薬学的組成物；（b）H1、H2A、H2B、H3、およびH4の各々に結合する抗体が含まれる、ヒストンH1、H2A、H2B、H3、およびH4の少なくとも3つに結合する抗体を含む薬学的組成物；ならびに（c）（a）および（b）において記載される組成物で、活性化プロテインCをさらに含む組成物が提供される。
【００１１】
なおさらなる態様において、H2Aペプチドではないヒストン細胞障害性の第一の阻害剤を被験体に投与する段階を含む、被験体における内皮細胞による前炎症性サイトカイン産生を阻害する方法が提供される。特定の態様において、被験体は、全身性紅斑性狼瘡（SLE）を有さない。前炎症性サイトカインは、IL-6またはIL-8であってもよい。第一の阻害剤は、H1、H2B、H3、またはH4ヒストン断片またはペプチドを含んでもよい。H4ペプチドは、H4の残基50〜67位を含んでもよい。方法はさらに、第一の阻害剤とは異なるH1、H2A、H2B、H3、またはH4ヒストン断片またはペプチドなどのヒストン細胞障害性の第二の阻害剤を被験体に投与する段階を含んでもよい。方法はさらに、少なくとも3つの異なるヒストン断片またはペプチドのカクテルを被験体に投与する段階を含んでもよい。被験体はヒト、イヌ、ネコ、ウマ、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、またはブタであってもよい。ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤は、H1、H2A、H2B、H3、またはH4に結合する抗ヒストン抗体などの抗ヒストン抗体であってもよい。ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤は、H1、H2A、H2B、H3、またはH4の3つまたはそれ以上に結合する抗体のカクテルであってもよい。ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤は、少なくとも1つのヒストン断片またはペプチドと、少なくとも1つの抗ヒストン抗体とのカクテルを含んでもよい。被験体は、アテローム性動脈硬化症などの慢性心血管疾患、または腫瘍の血管新生もしくは外傷に罹患していてもよい。
【００１２】
なそれでもなおさらなる態様において、H2Aペプチドではないヒストン細胞障害性の第一の阻害剤を被験体に投与する段階を含む、被験体における内皮の透過性を低減させる方法が提供される。いくつかの態様において、被験体は、全身性紅斑性狼瘡（SLE）を有さない。他の態様において、被験体は炭疽菌に接触したか、または浮腫、血管漏出、もしくは循環性ショックが含まれるショックに罹患している。第一の阻害剤は、H1、H2B、H3、またはH4ヒストン断片またはペプチドを含んでもよい。H4ペプチドは、H4の残基50〜67位を含んでもよい。方法はさらに、第一の阻害剤とは異なるH1、H2A、H2B、H3、またはH4ヒストン断片またはペプチドなどのヒストン細胞障害性の第二の阻害剤を被験体に投与する段階を含んでもよい。方法はさらに、少なくとも3つの異なるヒストン断片またはペプチドのカクテルを被験体に投与する段階を含んでもよい。被験体はヒト、イヌ、ネコ、ウマ、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、またはブタであってもよい。ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤は、H1、H2A、H2B、H3、またはH4に結合する抗ヒストン抗体などの抗ヒストン抗体であってもよい。ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤は、H1、H2A、H2B、H3、またはH4の3つまたはそれ以上に結合する抗体のカクテルであってもよい。ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤は、少なくとも1つのヒストン断片またはペプチドと、少なくとも1つの抗ヒストン抗体とのカクテルを含んでもよい。
【００１３】
特許請求の範囲および／または明細書において「含む」という用語と共に用いられる場合の「１つの（a）」、または「１つの（an）」という言葉の使用は、「1つ」を意味する可能性があるが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」、および「1つまたは1つより多い」という意味とも一致する。
【００１４】
本明細書において考察されるいかなる態様も、本発明の任意の方法または組成物に関して実行されうる、およびその逆も同じであると企図される。さらに、本発明の組成物およびキットは、本発明の方法を達成するために用いられうる。
【００１５】
本明細書を通して、「約」という用語は、その値を決定するために使用されるデバイスまたは方法に関する誤差の標準偏差が、値に含まれることを示すために用いられる。
【００１６】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみを指すまたは選択肢が相互に排他的であることが明示されている場合を除き、「および／または」を意味するために用いられるが、本開示は選択肢のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。
【００１７】
本明細書および特許請求の範囲において用いられるように、「含む（comprising）」（ならびに「含む（comprise）」および「含む（comprises）」などの含むの任意の形）、「有する（having）」（ならびに「有する（have）」および「有する（has）」などの有するの任意の形）、「含まれる（including）」（ならびに「含まれる（includes）」および「含まれる（include）」などの含まれるの任意の形）、または「含有する（containing）」（ならびに「含有する（contains）」および「含有する（contain）」などの含有するの任意の形）という用語は、包括的または無制限であり、追加の引用されていない要素または方法の段階を除外しない。
【００１８】
本発明の他の目的、特色、および長所は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および特異的実施例は、本発明の特異的態様を示しているが、本発明の趣旨および範囲に含まれる様々な変化および改変が、この詳細な記述から当業者に明らかとなるであろうことから、実例としてのみ与えられることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の一定の局面をさらに証明するために含められる。本発明は、本明細書において紹介される特異的態様の詳細な説明と共に、これらの図面の1つまたは複数を参照することによってよりよく理解される可能性がある。
【図１Ａ】マウス臓器におけるEPCRおよびTMの示差発現。マウス（n＝3）の表記の臓器からのEPCRまたはTM mRNA発現レベルを、リアルタイムPCRによって決定して、EPCRに関して脾臓でのレベルおよびTMに関して肺でのレベルの百分率として表記した。
【図１Ｂ】マウス臓器におけるEPCRおよびTMの示差発現。LPSチャレンジ（10 mg/kg i.v.）後18時間でのマウス（n＝4）の表記の臓器からのEPCRまたはTM mRNA発現レベルを、リアルタイムPCRによって決定して、生理食塩液によって処置したマウス（n＝4）における発現レベルと比較した変化倍率として表記した。
【図１Ｃ】マウス臓器におけるEPCRおよびTMの示差発現。臓器組織抽出物をRMEPCR1560によって免疫沈殿させて、SDSPAGEによって分離して、ビオチン標識RMEPCR1543によってイムノブロットした。
【図２】LPSおよびIFNによるマウスマクロファージにおけるEPCRおよびTMの示差調節。マウス腹腔マクロファージをLPS（1μg/ml）、IFN（20 ng/ml）、または双方によって24時間刺激した。（図2A）EPCRまたは（図2B）TMの表面発現を、抗EPCRまたは抗TM mAbによってフローサイトメトリーによって測定した。
【図３Ａ】LPSおよびIFNによる活性化マクロファージにおけるプロテインC活性化の増強。プロテインC活性化を、LPS（1μg/ml）、IFN（20 ng/ml）、または双方によって24時間刺激したまたは刺激しなかったマウス腹腔マクロファージにおいて、100 nMマウスプロテインCおよび10 nMウシトロンビンによって、200 nM抗EPCR mAbの非存在下または存在下で37℃で30分間測定した。APC活性を、発色基質に対するそのアミド溶解活性によって決定した。
【図３Ｂ】LPSおよびIFNによる活性化マクロファージにおけるプロテインC活性化の増強。トロンビン生成を、10 nMウシトロンビンの代わりに、200 nMウシプロトロンビン、3 nMウシ第V因子および85 nMウシ第X因子を用いることを除き、（図3A）と同じ条件で100 nMマウスプロテインCの非存在下または存在下で測定した。
【図３Ｃ】LPSおよびIFNによる活性化マクロファージにおけるプロテインC活性化の増強。APC活性を、マウスプロテインCの存在下での条件下（図3B）で測定した。
【図４】APCはヒストンH4を切断する。（図4A）APCの非存在下または存在下におけるRAW細胞またはLPSおよびIFNによる活性化RAW細胞の濃縮条件培地のウェスタンブロット。（図4B）精製ヒストンH4をAPCの存在下または非存在下でインキュベートして、SDS-PAGEおよび染色に供した。
【図５Ａ】APCはヒストンH4抗菌活性および細胞障害活性をモジュレートする。ヒストン、ヒストンH4またはAPCによって生成されたH4ペプチド（H4P39）を、大腸菌B7株に対するその殺菌活性に関して測定した。
【図５Ｂ】APCはヒストンH4抗菌活性および細胞障害活性をモジュレートする。ヒストン、ヒストンH4またはAPCによって生成されたH4ペプチド（H4P39）を、M15株に対するその殺菌活性に関して測定した。
【図５Ｃ】APCはヒストンH4抗菌活性および細胞障害活性をモジュレートする。ヒストン、ヒストンH4またはAPCによって生成されたH4ペプチド（H4P39）を、PI染色によるEA.hy926内皮細胞に対するその細胞障害活性に関して測定した。
【図６】H4P39ペプチドは敗血症マウスをレスキューする。マウスに、H4P39ペプチド（10 mg/kg）の非存在下または存在下でLPS（10 mg/kg）を腹腔内注射した。これらの処置マウスの生存率を示した。
【図７】ヒストンは内皮におけるプロテインC活性化をダウンレギュレートする。EA.hy926細胞を、表記の時間、ヒストン（0.1 mg/ml）によって刺激した。洗浄後、細胞に100 nMヒトプロテインCおよび5 nMウシトロンビンを加えた。37℃で15分後、反応培地をヒルジンと混合して、PCa発色基質に対するAPCアミド溶解活性に関してOD405でのVmaxの読みによって測定した。
【図８】ヒストンは内皮からのIL-6産生を誘導する。EA.hy926細胞を、APC（6μg/ml）、抗TLR2、抗TLR4（10μg/ml）の非存在下または存在下で、ヒストン（0.1 mg/ml）またはヒストンH3、ヒストンH4（50μg/ml）によって37℃で24時間刺激した。条件培地をIL-6 ELISAキットによってIL-6産生に関して測定した。
【図９】ヒストンは内皮からのIL-8産生を誘導する。EA.hy926細胞を、APC（6μg/ml）、抗TLR2、抗TLR4（10μg/ml）の非存在下または存在下で、ヒストン（0.1 mg/ml）またはヒストンH3、ヒストンH4（50μg/ml）によって37℃で24時間刺激した。条件培地をIL-6 ELISAキットによってIL-8産生に関して測定した。
【図１０】ヒストンはTLR-2およびTLR-4によるNF-κBシグナル伝達経路を活性化する。NF-κBシグナル伝達経路の制御下で、分泌されたアルカリホスファターゼレポーター遺伝子と共に表記のヒトTLRを発現するHEK293細胞を、ヒストン（0.1 mg/ml）によって16時間刺激した。条件培地をアルカリホスファターゼ活性に関してOD650で測定した。
【図１１】ヒストンは内皮障壁機能障害を引き起こす。EA.hy926細胞を、ヒストン（0.1 mg/ml）の存在下または非存在下でトランスウェルにおいて24時間インキュベートした。内皮障壁機能障害をトランスウェルにおける上室から下室へのエバンスブルー-BSAの漏出に関してOD620によって測定した。
【図１２Ａ】APCによって切断された細胞外ヒストンの同定。LPS（1μg/ml）およびIFN（20 ng/ml）によって24時間刺激された活性化ネズミマクロファージ細胞（RAW264.7）を、Opti-MEM培地において100 nMヒトAPCの存在下または非存在下でさらに24時間培養した。濃縮条件培地を、1時間培養後にヒト内皮細胞（EA.hy926）に対するその細胞障害性に関してPI染色に関するフローサイトメトリーによって測定した。
【図１２Ｂ】APCによって切断された細胞外ヒストンの同定。LPS（1μg/ml）およびIFN（20 ng/ml）によって24時間刺激された活性化ネズミマクロファージ細胞（RAW264.7）を、Opti-MEM培地において100 nMヒトAPCの存在下または非存在下でさらに24時間培養した。濃縮条件培地を、SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色に供した。
【図１２Ｃ】APCによって切断された細胞外ヒストンの同定。LPS（1μg/ml）およびIFN（20 ng/ml）によって24時間刺激された活性化ネズミマクロファージ細胞（RAW264.7）を、Opti-MEM培地において100 nMヒトAPCの存在下または非存在下でさらに24時間培養した。濃縮条件培地を、ヒストンH3に関するDSPAGEおよびウェスタンブロッティングに供した。
【図１３Ａ】内皮に対する細胞外ヒストンの細胞障害性およびヒストンのAPC切断。EA.hy926細胞を仔ウシ胸腺ヒストン（50μg/ml）または仔ウシ胸腺ヒストンH1、H2A、H2B、H3、もしくはH4（20μg/ml）と共に37℃で1時間培養した。細胞の損傷を、PI染色に関するフローサイトメトリーによって測定した。
【図１３Ｂ】内皮に対する細胞外ヒストンの細胞障害性およびヒストンのAPC切断。APC（100 nM）は、上記のアッセイにおいてヒストン、ヒストンH3またはH4と共にインキュベートした際に存在しなかったまたは存在した。
【図１３Ｃ】内皮に対する細胞外ヒストンの細胞障害性およびヒストンのAPC切断。精製仔ウシ胸腺ヒストンH3（上のパネル）またはヒストンH4（下のパネル）（100μg/ml）を、ヒトAPCの表記の濃度と共にOpti-MEM培地において37℃で1時間インキュベートした。試料をSDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色に供した。
【図１３Ｄ】内皮に対する細胞外ヒストンの細胞障害性およびヒストンのAPC切断。精製仔ウシ胸腺ヒストンH3（上のパネル）またはヒストンH4（下のパネル）（100μg/ml）を、10 nMヒトAPCを有するOpti-MEM培地において、0.5 mg/ml PS/PCまたはPE/PS/PCリポソームの非存在下または存在下で37℃で1時間インキュベートした。次に、試料をSDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色に供した。
【図１４Ａ】APCはインビトロおよびインビボの双方でヒストンを切断する。EA.hy926細胞をAPC（10または100 nM）の非存在下または存在下で表記の濃度の仔ウシ胸腺ヒストンと共に37℃で1時間培養した。細胞の損傷をPI染色に関するフローサイトメトリーによって測定して、平均蛍光指数（MFI）として表記した。
【図１４Ｂ】APCはインビトロおよびインビボの双方でヒストンを切断する。Opti-MEM培地における仔ウシ胸腺ヒストンをAPC（100 nM）と共に37℃で表記の時間インキュベートした後、PPACK（10μM）と共に混合してAPCを不活化した。細胞障害性アッセイのために、上記の培地を用いてEA.hy926細胞を1時間培養した。
【図１４Ｃ】APCはインビトロおよびインビボの双方でヒストンを切断する。Opti-MEM培地における仔ウシ胸腺ヒストンをAPC（100 nM）と共に37℃で表記の時間インキュベートした後、PPACK（10μM）と共に混合してAPCを不活化した。細胞障害性アッセイのために、ヒストンH3もしくはH4に関するSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングに供した。
【図１４Ｄ】APCはインビトロおよびインビボの双方でヒストンを切断する。EA.hy926細胞を、プロテインC（100 nM）、トロンビン（T）（10 nM）、またはAPC（100 nM）の非存在下または存在下で仔ウシ胸腺ヒストン（50μg/ml）と共に37℃で30分間培養した。細胞の損傷をPI染色に関するフローサイトメトリーによって測定した。
【図１４Ｅ】APCはインビトロおよびインビボの双方でヒストンを切断する。大腸菌チャレンジまたは大腸菌に加えてAPCをチャレンジ後のヒヒ血漿試料の表記の時点を、ヒストンH3に関してSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングに供した。
【図１５Ａ】内因性のAPCまたは抗ヒストンH4 mAbはマウスをインビボでLPSの致死性から保護する。マウスに、抗ヒストンH4またはマウスIgG対照mAb（20 mg/kg）と共に高用量のLPS（10 mg/kg）を静脈内注射した。各群の生存率を示す。
【図１５Ｂ】内因性のAPCまたは抗ヒストンH4 mAbはマウスをインビボでLPSの致死性から保護する。マウスに、抗PC mAb（2.5 mg/kg）の存在下または非存在下で、抗ヒストンH4またはヒストンH2B mAb（20 mg/kg）と共に、低用量LPS（1 mg/kg）を静脈内注射した。各群の生存率を示す。
【図１５Ｃ】内因性のAPCまたは抗ヒストンH4 mAbはマウスをインビボでLPSの致死性から保護する。LPSチャレンジまたはLPSに加えてmAbのチャレンジ後6時間目にマウス血漿を採取して、ヒストンH3に関するウェスタンブロッティングに供した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
ヒストンは、100年より長いあいだ、遺伝子調節に関係する細胞内DNA結合タンパク質として知られている。ヒストンはまた抗菌活性も有し、ヒストンH3およびH4は、この機能の主な関与物質である（Hirsch, 1958）。本発明者らは、本明細書において、細胞外ヒストン、特にヒストンH3およびH4が内皮に対して細胞障害性であり、ヒストンを注射するとマウスの致死を引き起こすことを示す。このように、細胞外ヒストンは、APCのほかに、敗血症および他の疾患に関する、予後の潜在的バイオマーカーおよび治療の分子標的として見なされるべきである。
【００２１】
最近、好中球細胞外トラップ（NET）によって細胞外で細菌を殺す新規機序がインビトロおよびインビボで観察された（Brinkmann et al., 2004）。NETは、顆粒状タンパク質、DNA、ならびにヒストンH1、H2A、H2B、H3、およびH4で構成される。しかし、この強力な抗菌機序は、内皮および組織に対する傷害という犠牲を払って起こる（Clark et al., 2007）。NETに対する曝露時の内皮のPI陽性染色は、内皮がヒストンに対する曝露時に損傷を受けうるという本発明者らの知見と類似である。大腸菌をチャレンジしたヒヒの循環中のヒストンの増加、ヒストン注射の致死効果、およびLPS誘導敗血症ショックにおける抗ヒストンH4ペプチドのレスキュー効果と共に、本発明者らは細胞外ヒストンが細胞の機能障害、その後の臓器不全および死亡の主な関与物質であると提唱する。
【００２２】
APCは、現在、重度の敗血症の処置のための唯一の薬剤である。本発明者らは、それによってAPCが敗血症患者において保護効果を発揮する追加の機序として細胞障害性ヒストンの破壊を提唱する。致死量の大腸菌をチャレンジしたヒヒにおいて外因性のAPCによって急性腎不全が保護されることは、後天性のプロテインC欠損が、多微生物性敗血症の盲腸結紮穿刺モデルにおける腎機能障害に相関して、APCによる処置が腎機能および組織傷害マーカーを改善する（Gupta et al., 2007）という最近の知見と一貫する。ヒストンが、敗血症および他の腎疾患における腎機能障害の原因メディエーターであるか否かはなおも疑問である。たとえば、全身性紅斑性狼瘡（SLE）において、APCの生成およびリン脂質に対する結合は、しばしばプロテインC経路に関係する成分に対する自己免疫抗体によって損なわれる（Esmon et al., 2000）。ヒストンを切断するAPCの増強のみならず、PE含有脂質による第Va因子の増強を考慮すると、抗リン脂質抗体はAPC抗凝固活性を阻害するのみならず、APCによる細胞障害性ヒストンの破壊を損なう可能性があり、疾患の重症度に関与する可能性がある。ヒトSLE患者において、糸球体アポトーシス性ヌクレオソームは、腎炎原性抗体の中心標的構造として検出され（Kalaaji et al., 2007）、細胞外ヒストンがこの病原性プロセスに関係しうることを示唆している。
【００２３】
I．過剰炎症疾患状態
本発明は、ヒストンの放出およびそれによって得られた細胞外毒性を伴う多様な疾患状態における診断および介入を企図する。多数のこれらの疾患状態を以下に記述する。
【００２４】
A．敗血症（sepsis）
敗血症は、感染症によって引き起こされる全身炎症状態を特徴とする重篤な医学的状態である。従来、敗血症（sepsis）という用語は、敗血症（septicaemiaおよびsepticemia）（「血液中毒（blood poisoning）」）と互換的に用いられてきた。しかし、これらの用語は、もはや同義ではないと見なされ、血液中毒は敗血症のサブセットと見なされている。
【００２５】
敗血症の症状はしばしば、基礎となる感染プロセスに関連する。感染症が敗血症になると、その結果としての症状は、全身炎症反応症候群（SIRS）の症状：全身炎症、発熱、白血球数増加（白血球増加症）、ならびに心拍数上昇（頻拍）および呼吸数上昇（頻呼吸）である。上記に対して二次的に、症状には、インフルエンザ様悪寒も含まれる。
【００２６】
敗血症を引き起こす免疫応答は、炎症および凝固経路の広範囲の活性化を引き起こす全身炎症反応である。これは、循環系の機能障害に進行する可能性があり、最適な処置を行っても、多臓器不全症候群および最終的に死に至る可能性がある。
【００２７】
感染症が高度に疑われるか、または証明されて、以下の全身炎症反応症候群（SIRS）基準の2つまたはそれ以上を満たす場合、敗血症が存在すると考えられる：
心拍数＞90拍/分
体温＜36℃（96.8゜F）または＞38℃（100.4゜F）
過換気（過呼吸）＞20回/分、または血液中の気体、PaCO2が32 mmHg未満
白血球数＜4000個/mm3または＞12000個/mm3（＜4×109または＞12×109個/L）、または10％より多い杆状核球（未成熟白血球）
しかし、合意される定義は進化し続けており、最新版は臨床でのベッドサイドの経験を反映するように敗血症の徴候および症状の一覧を拡大している。
【００２８】
敗血症のより重要なサブセットは、重度の敗血症（急性臓器機能障害を伴う敗血症）および敗血症ショック（難治性動脈低血圧を伴う敗血症）である。または、感染症の証拠がないにもかかわらず全身炎症反応症候群の基準の2つまたはそれ以上を満たす場合、患者は単に「SIRS」と診断される可能性がある。SIRSおよび急性臓器機能障害を有する患者は「重度のSIRS」と呼ばれる可能性がある。
【００２９】
患者は、敗血症に加えて全身低灌流の徴候、すなわち末端臓器機能障害または4 mmol/dLより大きい血清中乳酸塩のいずれかを有する場合に「重度の敗血症」を有すると定義される。患者は、適切な輸液ボーラス（典型的に20 ml/kg晶質液）後でも敗血症に加えて低血圧を有する場合に敗血症ショックを有すると定義される。敗血症を有する成人を診断するための基準は、生後1ヶ月未満の乳児には当てはまらない。乳児の場合、感染症の存在に加えて、感染症に対する全身応答に一貫する徴候および症状の「布置」が診断のために必要である。
【００３０】
敗血症の治療は、抗生物質、感染した体液収集の外科的ドレナージ、体液交換、および臓器機能障害の適切なサポートに基づく。これには、腎不全における血液透析、肺機能障害における機械換気、血液製剤の輸血、および循環不全のための薬物および輸液療法が含まれてもよい。必要であれば非経口栄養による適切な栄養の確保も、長期的な病気の際には重要である。
【００３１】
敗血症患者における適切な管理の問題は、敗血症が認識された後の治療の施与の遅れである。公表された試験から、適切な抗生物質治療の投与が1時間遅れる毎に、死亡率の7％上昇に関連することが証明されている。人々を敗血症に関して教育して、敗血症を有する患者の転帰を改善するために、「敗血症生存キャンペーン（Surviving Sepsis Campaign）」と題する大規模な国際共同研究が確立された。キャンペーンは、その後年に完全なガイドラインの組を公表することをねらいとして、重度の敗血症に関する管理戦略の症候に基づく論評を公表した。
【００３２】
炎症プロセス自身をねらいとしたほとんどの治療は、転帰を改善することができなかったが、ドロトレコジンα（活性化プロテインC、凝固因子の1つ）は、重度の敗血症の死亡率を約31％から約25％に減少させることが示されている。ドロトレコジンαが適当であるか否かを調べるためには、患者は、APACHE IIスコアが25またはそれより大きく、出血のリスクが低い重度の敗血症または敗血症ショックを有さなければならない。低用量ヒドロコルチゾン処置は、ACTH刺激試験によって定義される相対的副腎不全を有する敗血症ショック患者にとって有望であることが示されている。
【００３３】
敗血症が疑われる乳児の標準的な治療は、支持療法、静脈内輸液による体液状態の維持、およびβ-ラクタム系抗生物質（アンピシリンなど）とゲンタマイシンなどのアミドグリコシドとの併用からなる。
【００３４】
B．外傷
身体的外傷は重度の、脚の切除などの体を変化させる身体傷害である。鈍い力による外傷は、尖っていない物体によって適用されたまたは尖っていない物体による衝撃または他の力によって引き起こされるタイプの身体的外傷であり、貫通性の外傷は、皮膚または組織が物体によって貫通されているタイプの身体的外傷である。外傷はまた、事故などの非計画性の外傷、または手術時などの計画性の外傷として記述されうる。いずれも軽度から重度の組織損傷、血液の損失、および／またはショックを特徴としえて、いずれも、敗血症が含まれるその後の感染症に至る可能性がある。本発明は、処置前（医学的技法の場合）および外傷傷害が起こった後の処置の双方が含まれる外傷の処置を提供する。
【００３５】
i．手術
手術は、疾患もしくは傷害などの病理的状態を試験するおよび／もしくは処置するために、体機能もしくは外観の改善に役立つように、または時に何らかの他の理由で、患者に操作的手技および機器技術を用いる。本発明は、以下にさらに定義されるように、手術に起因する外傷に対処することができる。
【００３６】
一般的な規則として、技法は、患者の組織の切断、または既に受けている創傷の閉鎖を伴う場合に、外科的であると見なされる。血管形成術または内視鏡などのこの題目の下に必ずしも入らない他の技法は、それらが無菌的環境、麻酔、防腐状態、典型的な手術機器、および縫合またはステープリングの使用などの、一般的な手術技法または状況を伴う場合に、手術であると見なされてもよい。全ての型の手術は、侵襲性技法であると見なされ；いわゆる非侵襲性の手術は通常、対処される構造を貫通しない切除（たとえば、角膜のレーザー剥離）、または放射線外科技法（腫瘍の放射線照射）を指す。手術は数分から数時間続きうる。
【００３７】
手術技法は一般的に、緊急性、技法のタイプ、関係する体のシステム、侵襲性の程度、および専門的機器によって分類される。待機手術は、生命を脅かさない状態を矯正するために行われ、外科医および手術施設の利用性を条件として、患者の要請時に行われる。緊急手術は、生命、四肢、または機能的能力を救うために速やかに行われなければならない手術である。診査手術は、診断を助けるためまたは確認するために行われる。治療手術は、既に診断された状態を処置する。
【００３８】
切断は、体の一部、通常四肢または指を切り離すことを伴う。再移植は、切断された体の部分を再度付着させることを伴う。再建手術は、傷害を受けた、切断された、または変形した体の部分の再建を伴う。美容手術は、それ以外は正常な構造の外観を改善するために行われる。切除は、臓器、組織、または他の体部分を患者から切り離すことである。移植手術は、異なるヒト（または動物）からの別の臓器または体部分を患者に挿入することによる臓器または体部分の交換である。移植において用いるための、生きているヒトまたは動物からの臓器または体部分の摘出も同様に1つのタイプの手術である。
【００３９】
手術が、1つの臓器系または構造において行われる場合、これを、関係する臓器、臓器系、または組織によって分類してもよい。例には、心臓手術（心臓について行われる）、消化管手術（消化管およびその付属臓器内で行われる）、および整形外科手術（骨および／または筋肉について行われる）が含まれる。
【００４０】
最小侵襲性手術は、腹腔鏡手術または血管形成術の場合のように、縮小された機器を体腔または構造に挿入するためにより小さい外部切開部を伴う。対照的に、開放手術技法は、関心対象領域に近づくために大きい切開部を必要とする。レーザー手術は、メスまたは類似の外科的機器の代わりに組織を切断するためにレーザーを用いることを伴う。マイクロサージャリーは、外科医が小さい構造を見るために手術用顕微鏡を用いることを伴う。ロボット手術は、外科医の指示で機器使用を制御するために、Da VinciまたはZeus手術システムなどの手術ロボットを利用する。
【００４１】
ii．外傷性出血
外傷性出血は、傷害の広範囲に及ぶ国際的影響の多くの原因であり、大きい割合の死亡を引き起こし、傷害者に大きい病的状態を生成する。病院への搬送前のケアの差にもかかわらず、外傷性出血の急性の管理は、世界中で類似であり、よく認容された公表されたガイドラインに従う。極めて重篤に傷害を受けた患者のケアは、4つのしばしば重なり合う区分として起こる：蘇生相、手術相、および集中治療相。出血の診断および制御は外傷ケアの相の全てのあいだで高い優先性であるべきであり、出血性ショック状態の患者においては特に重要である。出血制御の初期の試みには、直接の加圧、圧迫包帯、または止血帯による目に見える重度の出血源の直接制御；長骨および骨盤骨折の安定化；ならびに患者を暖かく維持することが含まれる。蘇生相のあいだ、加温した静脈内輸液、出血の外科的制御の前の低血圧蘇生、ならびに血液および血液製剤の適切な輸血が提供される。手術相では、出血および任意の他の傷害の外科的制御、ならびに追加の輸液が提供される。最後に、集中ケア相は、術後のサポートおよび組織灌流を提供する。
【００４２】
C．急性膵炎
急性膵炎は膵臓の急速に発症する炎症である。その重症度に応じて、重度の合併症を有しえて、処置にもかかわらず高い死亡率を有しうる。軽度の症例はしばしば、保存的手段または腹腔鏡によって首尾よく処置されるが、重度の症例は、疾患のプロセスを阻止するために侵襲性の手術（しばしば複数回の介入）を必要とする。
【００４３】
D．急性呼吸窮迫症候群
急性呼吸窮迫症候群（ARDS）は、呼吸窮迫症候群（RDS）または成人呼吸窮迫症候群（IRDSとは対照的に）としても知られ、肺に対する様々な型の傷害に対する重度の反応である。これは、それによって透過性が増加して肺浮腫に至る最も重要な障害である。
【００４４】
ARDSは、多様な直接および間接的傷害によって引き起こされる重度の肺疾患である。これは、肺実質の炎症を特徴として、それによってガス交換の減損が起こり、同時に炎症メディエータが全身性に放出されて、炎症、低酸素症、を引き起こし、しばしば多臓器不全が起こる。この状態は生命を脅かし、しばしば致死的であり、機械換気および通常集中治療室への入院を必要とする。より重度でない型は、急性肺傷害（ALI）と呼ばれる。
【００４５】
ARDSは、傷害または急性の病気の発症の24〜48時間以内に起こりうる。そのような場合、患者は通常、息切れ、頻呼吸、および基礎となる原因に関連する症状、すなわちショックを呈する。マラリアなどの長期の病気も同様にこれを誘発しうる。ARDSは時に、感染症の、特に急性例の、発生後に起こる可能性がある。
【００４６】
動脈血ガス分析および胸部X線によって、上記の基準を用いて推測することにより正式な診断を行うことができる。重度の低酸素症は一般的に含まれるが、異常なPaO2を定義する適切な閾値はこれまで系統的に研究されていない。肺浮腫のいかなる心原性原因も除外すべきである。これは、肺動脈楔入圧を測定するために肺動脈カテーテルを留置することによって行うことができる。しかし、これは必要ではなく、肺動脈カテーテルを用いても、ARDSが含まれる極めて重症の疾患における患者の転帰が改善しないことを証明する証拠が多数出現したことから、現在ではめったに行われない。症例の大多数において、両側性の肺胞浸潤物を報告するためには単純胸部X線で十分である。CTスキャンは、ARDSにおける肺実質のより正確な画像に至るが、これはARDS患者の臨床での管理においてほとんど有用ではなく、主として研究ツールに留まっている。
【００４７】
急性呼吸窮迫症候群は通常、集中治療室での機械換気によって処置される。換気は通常、口-気管挿管を通して、または長期的な換気（≧2週間）が不可避であると思われる場合には気管切開術を通して送達される。非侵襲性の換気の可能性は、疾患の非常に初期に限定されるか、またはよりよくは、疾患発症のリスクを有する個体（非定型肺炎、肺挫傷、大手術患者）における予防に限定される。基礎となる原因の処置は、それがARDSの像を維持する傾向があることから緊急である。微生物培養の結果が入手でき次第、速やかに適切な抗生物質治療を投与しなければならない。局所微生物調査が有効である場合には経験的な治療が適切である可能性がある。ARDS患者の60％より多くが、肺傷害の発生前後に（院内）肺感染症を経験する。外科的に処置可能である場合には、感染症の起源を手術しなければならない。敗血症が診断される場合、適切な局所プロトコルを行うべきである。
【００４８】
E．虚血再灌流傷害
再灌流傷害は、虚血期間の後に組織に対する血液供給が回復した際に引き起こされる組織に対する損傷を指す。血液からの酸素および栄養がないことにより、循環の回復によって、正常な機能の回復よりむしろ酸化的ストレスの誘導を通して炎症および酸化的損傷が起こる状態が生成される。
【００４９】
再灌流傷害の損傷は、部分的に、損傷組織の炎症反応による。新たに回復した血液によってその領域に運ばれた白血球は、インターロイキンなどの炎症因子のみならず、組織損傷に応答してフリーラジカルを宿主に放出する[1]。回復した血流は、細胞内で酸素を再導入して、これが細胞タンパク質、DNA、および細胞質膜に損傷を与える。細胞膜に対する損傷は次に、より多くのフリーラジカルの放出を引き起こす可能性がある。そのような反応性種はまた、酸還シグナル伝達に間接的に作用してアポトーシスのスイッチを入れる可能性がある。白血球はまた、小さい毛細血管に集められて、それらを閉塞させてより多くの虚血に至る可能性がある。
【００５０】
再灌流傷害は、脳卒中および脳外傷に関係する脳虚血カスケードにおいて役割を果たす。虚血および再灌流傷害の繰り返しは、同様に褥瘡および糖尿病性足潰瘍などの慢性的な創傷の形成および治癒不全に至る要因であるように思われる。持続的な加圧は、血液供給を制限して、虚血を引き起こし、再灌流の際に炎症が起こる。このプロセスが繰り返されると最終的には創傷を引き起こすほど組織に損傷を与える。
【００５１】
持続的な虚血（60分またはそれより長い）において、ATP代謝の切断産物としてヒポキサンチンが形成される。酵素キサンチンデヒドロゲナーゼは、酸素のより高い利用率の結果としてキサンチンオキシダーゼに変換される。この酸化によって、分子酸素は高度に反応性のスーパーオキサイドおよびヒドロキシルラジカルに変換される。キサンチンオキシダーゼはまた、尿酸を産生して、これは酸化促進剤として、および過酸化硝酸塩などの反応性種のスキャベンジャーの双方として作用する可能性がある。再灌流の際に産生された過剰な酸化窒素は、スーパーオキサイドと反応して、強力な反応性種である過酸化硝酸塩を産生する。そのようなラジカルおよび反応性酸素種は、細胞膜脂質、タンパク質、グリコサミノグリカンを攻撃して、さらなる損傷を引き起こす。それらはまた、酸還シグナル伝達によって特異的生物学的プロセスを開始する可能性がある。
【００５２】
F．心血管疾患
心血管疾患は、心臓および血管（動脈および静脈）を伴う疾患のクラスを指す。この用語は技術的に心血管系に影響を及ぼす任意の疾患を指すが、通常、アテローム性動脈硬化症（動脈疾患）に関連する疾患を指すために用いられる。これらの状態は類似の原因、機序、および処置を有する。心血管疾患の処置は、各患者における疾患の特異的型に依存するが、有効な処置には常に、先に考察した予防的なライフスタイルの変化が含まれる。血圧を低下させる薬剤、アスピリン、およびスタチンコレステロール低下剤などの薬剤は有用である可能性がある。いくつかの状況において、手術または血管形成術は、損傷を受けた血管を確実に再度開口、修復、または交換する可能性がある。
【００５３】
ほとんどの西欧諸国は、心血管疾患の高くかつ増加しつつある発生率に直面している。毎年、心疾患により、癌より多くのアメリカ人が死亡している。心疾患単独で全ての死亡の30％を引き起こすが、心血管系の他の疾患は実質的にさらなる死亡および損傷を引き起こす。2005年まで、心血管疾患は米国およびほとんどのヨーロッパ諸国における死亡および能力障害の原因の第一位である。大規模な組織学研究（PDAY）により、血管傷害が思春期から蓄積すること、小児期から一次予防努力が必要であることが示された。
【００５４】
いくつかのバイオマーカーは、心血管疾患のより詳細なリスクを提供すると考えられている。しかし、これらのバイオマーカーの臨床での価値は疑問である。現在のところ、心血管疾患のより高いリスクを反映する可能性があるバイオマーカーには：
より高いフィブリノーゲンおよびPAI-1血中濃度
上昇した、または正常値の上半分のホモシステイン
非対称ジメチルアルギニンの上昇した血中レベル
C反応性タンパク質によって測定した高い炎症
B型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）の上昇した血中レベル
が含まれる。様々な型の心血管疾患には、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心筋症、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、弁疾患、冠動脈疾患、拡張型心筋症、拡張期機能障害、心内膜炎、高い血圧（高血圧症）、肥大性心筋症、僧帽弁逸脱、心筋梗塞、および静脈血栓塞栓症が含まれる。
【００５５】
G．自己免疫／炎症疾患
本発明は、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸疾患に基づく関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、刺激性腸疾患、リウマチ性関節炎、若年性関節リウマチ、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、初期関節炎、ウイルス性関節炎、多発性硬化症、または乾癬などの多様な自己免疫および／または炎症疾患の処置を企図する。これらの疾患の診断および処置は文献において十分に報告されている。
【００５６】
H．化学療法、放射線療法、およびサイトカイン療法毒性
化学療法、放射線療法およびサイトカインが含まれる様々な型の癌治療が、癌患者において毒性、時に重度の毒性に関連している。毒性が少なくとも部分的にヒストンの細胞外作用によって引き起こされるという点で、本発明は、本発明の薬学的組成物を用いてこの毒性を低減させることを追求し、それによって患者に対する不快感を低減または緩和すると共に療法のより高い用量を許容する。
【００５７】
I．熱傷
医学において、熱傷は、熱、低温、電気、化学物質、摩擦、または放射線によって引き起こされる傷害でありうる。第一度の熱傷は通常、傷害部位での発赤（紅斑）、白斑、および軽微な疼痛に限定される。これらの熱傷は通常表皮のみに拡大する。それに加えて透明な液体によって満たされる第二度の熱傷は、皮膚の表層水疱を有し、神経の関与レベルに応じて多少の疼痛を伴いうる。第二度熱傷は、表層（乳頭状）真皮を含み、同様に深部（細網状）真皮層を含む可能性がある。第三度の熱傷は加えて皮膚の炭化を有し、硬く皮様の焼痂を産生する。焼痂は、体の非罹患部分から離れる痂皮である。しばしば、同様に紫色の液体が存在する。これらのタイプの熱傷はしばしば、神経終末が熱傷領域において破壊されていることから無痛である。重度の熱傷、特に体の大きい領域を覆う場合には、死を引き起こしうる；肺に対する熱傷傷害のいかなる暗示（たとえば、煙の吸入を通して）も医学的緊急問題である。
【００５８】
筋肉または骨などの皮膚の基礎となる組織を傷害する熱傷は時に、第四度の熱傷として分類される。これらの熱傷は、三つの追加の段階に分けられる：皮膚が回復できないほど失われる第四度の熱傷、筋肉が回復できないほど失われる第五度の熱傷、および骨が炭化する第六度の熱傷。
【００５９】
「表皮熱傷」、「真皮熱傷」（これは浅達性と深達性のカテゴリーに分けられる）、および「全層熱傷」という新しい分類は、皮膚の表皮、真皮、および皮下層により正確に関連して、処置を誘導して転帰を予測するために用いられる。
【００６０】
化学的熱傷は通常、水酸化ナトリウム（アルカリ液）、硝酸銀などの化学化合物、およびより危険な化合物（硫酸などの）によって引き起こされる。中等度から重度の化学的熱傷を引き起こしうるほとんどの化学物質（しかし全てではない）は強酸または強塩基である。酸化剤としての硝酸は、おそらく最悪の熱傷を引き起こす化学物質の1つである。フッ化水素酸は、骨まで侵食して、その熱傷はしばしば直ちには明らかでない。中等度から重度の化学的熱傷を引き起こしうるほとんどの化学物質は、苛性と呼ばれる。
【００６１】
電気的熱傷は一般的に電気ショック、落雷に打たれる、伝導ゲルなしでの除細動または心変換される等の症状である。認められる「熱傷」が電流の内部と出口の創傷のみであることから、被った内部傷害は、熱傷の大きさに比例しない可能性がある。
【００６２】
熱傷は総体表面積（TBSA）に関して査定され、これは真皮熱傷または全層熱傷によって影響を受ける百分率である（表皮熱傷は計算されない）。9の法則（rule of nines）を迅速かつ有用な様式として用いて、影響を受けるTBSAを推定する。熱傷を有する人を管理する第一段階は、熱傷のプロセスを停止させることである。乾燥粉末熱傷の場合、粉末を最初にブラシで落とすべきである。他の熱傷の場合、異物を除去して、熱傷のプロセスを停止させるために役立つために、影響を受けた領域を大量のきれいな水ですすぐべきである。冷水は熱傷の犠牲者の体温状態を重度に損なう可能性があることから、広範囲の熱傷を有するいかなる人にも、決して冷水を適用してはならない。この管理段階では、気道の状態を査定することも極めて重要である。患者が火に巻き込まれている場合、彼または彼女はそれ以外であると証明されるまで吸入傷害を受けていると仮定しなければならず、それに従って処置を管理すべきである。
【００６３】
熱傷のプロセスが停止した後、気道の状態を確保して、患者を、Parklandの公式に従って輸液蘇生すべきである。この公式は、傷害後最初の24時間に送達すべき乳酸加リンゲル液の量は以下であると述べている：
輸液＝4cc ×TBSA（％）×体重（kg）
TBSA（％）はいかなる第一度の熱傷も除外する
この輸液の半量を、傷害後最初の8時間に与えるべきであり、残りをその後の16時間に与えるべきである。公式は指針に過ぎず、注入は尿量および中心静脈圧に合わせて行われるべきである。不適切な輸液蘇生は、腎不全および死亡を引き起こす。全層熱傷における重度の浮腫は、焼痂切開術によって処置してもよい。
【００６４】
II．ヒストン
A．全般的情報
生物学において、ヒストンは、染色質の主なタンパク質成分である。それらは、その周囲をDNAが取り巻く糸巻きとして作用して、遺伝子の調節において役割を果たす。6個の主要なヒストンのクラスが知られている：H1（時に、リンカーヒストンと呼ばれ、ヒストンH5にも関連する）；H2A；H2B；H3；H4；および原始ヒストン。クラスH2A、H2B、H3、およびH4の2つずつはいわゆるコアヒストンであり、アセンブルして、タンパク質の糸巻きの周囲にDNA 146塩基対を1.65回転の左巻超らせんで巻きつけることによって1つの8量体ヌクレオソームコア粒子を形成する。リンカーヒストンH1は、ヌクレオソームならびにDNAの入口および出口部位に結合して、このようにDNAをその場で固定してより高次の構造を形成させる。最も基本的なそのような形成体は10 nmの線維またはひも状構造のビーズである。これは、各ヌクレオソームのあいだにおよそ50塩基対のDNA（同様にリンカーDNAとも呼ばれる）の間隔をあけて、ヌクレオソームの周囲にDNAを巻きつけることを伴う。アセンブルしたヒストンとDNAは染色質と呼ばれる。高次構造には、30 nm線維（不規則なジグザグを形成する）および100 nm線維が含まれ、これらは正常な細胞において見いだされる構造である。有糸分裂および減数分裂の際に、これらの凝縮染色体は、ヌクレオソームと他の調節タンパク質とのあいだの相互作用を通してアセンブルされる。
【００６５】
ヌクレオソームコアは、2つのH2A-H2B二量体およびH3-H4四量体で形成されて、三次構造による2つのほぼ対称な半分を形成する（C2対称性；1つの高分子が他の高分子の鏡像体である）。H2A-H2B二量体とH3-H4四量体はまた、偽対称性を示す。4つのコアヒストン（H2A、H2B、H3およびH4）は、構造が比較的類似で、進化の際に高度に保存されており、全てが「ヘリックス-ターン-ヘリックス-ターン-ヘリックス」モチーフ（容易な二量体化を許容する）を特色とする。それらはまた、アミノ酸構造の1つの端部に長いテール部を有するという特色を共有し、これは転写後修飾の位置である。
【００６６】
全てにおいて、ヒストンはDNAと5つのタイプの相互作用を行う：（a）H2B、H3、およびH4におけるαヘリックスからのヘリックス双極子は、正味の陽電荷をDNA上の陰性荷電リン酸基との相互作用点に蓄積させる；（b）DNA骨格とヒストンタンパク質の主鎖におけるアミン基とのあいだの水素結合；（c）ヒストンとDNA上のデオキシリボース糖とのあいだの非極性の相互作用；（d）塩基性アミノ酸の側鎖（特にリジンおよびアルギニン）とDNA上のリン酸基酸素とのあいだの塩結合（salt link）および水素結合；ならびにDNA分子上の各々の2つの副溝へのH3およびH2B N末端テールの非特異的副溝挿入。
【００６７】
ヒストンの高度に塩基性の性質は、DNA-ヒストン相互作用を容易にすることの他に、ヒストンの水溶性に関与する。ヒストンは、主にそのN末端テールにおいて酵素による翻訳後修飾を受けるが、その球状ドメインにおいても修飾を受ける。そのような修飾には、メチル化、シトルリン化、アセチル化、リン酸化、スモイル化、ユビキチン化、およびADP-リボシル化が含まれる。これは、ヒストンの遺伝子調節の機能に影響を及ぼす。
【００６８】
一般的に、活性である遺伝子はヒストンにあまり結合しないが、不活性な遺伝子は分裂中期の際にヒストンに高度に会合している。同様に、いかなる有害な変異も重度に不適応であろうことから、ヒストンの構造は、進化的に保存されているように思われる。
【００６９】
先に述べたように、ヒストンは、DNAがその周囲に巻きつく糸巻きとして作用する。これによって、細胞核内部で真核生物の大きいゲノムを適合させるために必要な圧縮が可能となる。圧縮された分子は、非圧縮分子より50,000倍短い。ヒストンは、DNAおよび核タンパク質とのその相互作用を変更する翻訳後修飾を受ける。H3およびH4ヒストンは、いくつかの場所で共有結合的に修飾されうるヌクレオソームから突出する長いテールを有する。テールの修飾には、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、スモイル化、シトルリン化、およびADP-リボシル化が含まれる。ヒストン（H2AおよびH3）のコアも同様に修飾されうる。修飾の組み合わせは、コード、いわゆる「ヒストンコード」を構成すると考えられる。ヒストン修飾は、遺伝子調節、DNA修復、および染色体凝縮（有糸分裂）などの多様な生物学的プロセスにおいて作用する。
【００７０】
ヒストン修飾の一般的な命名は以下のとおりである：ヒストンの名称（たとえば、H3）；一文字アミノ酸省略語（たとえば、リジンの場合K）およびタンパク質におけるアミノ酸の位置；ならびに修飾のタイプ（Me：メチル、P：リン酸塩、Ac：アセチル、Ub：ユビキチン）。つまりH3K4Meは、タンパク質の開始（N末端）から4番目のリジンにおけるH3のメチル化を指す。
【００７１】
B．ヒストンペプチド
その各々が参照により本明細書に組み入れられる、ヒトヒストンのmRNAアクセッション番号は以下のとおりである：H1（NM_005318）、H2A（NM_001017990）、H2B（XM_210048）、H3（A - NM_002107およびB - NM_005324）およびH4（X00038.1）。
【００７２】
本発明は、抗体を生成するために、および過剰炎症障害の処置における治療組成物として用いるために、ヒストンのペプチドおよび断片を用いることを企図する。ヒストンペプチドは、長さが4〜約50残基の分子を含むであろう。特定の長さは、35残基未満、30残基未満、25残基未満、20残基未満、15残基未満、または6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20残基が含まれる13残基未満であってもよい。ペプチドは、合成的にまたは組み換え技術によって生成されてもよく、沈殿（たとえば、硫酸アンモニウム）、HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー（イムノアフィニティクロマトグラフィーが含まれる）、または様々なサイズ分離（沈降、ゲル電気泳動、ゲル濾過）などの公知の方法に従って精製される。
【００７３】
ペプチドは蛍光、発色、または比色物質などの様々な分子を用いて標識してもよい。ペプチドはまた、他の抗炎症剤が含まれる他の分子に連結されてもよい。連結は、直接であってもよく、または異なるリンカー分子を通して行ってもよい。次に、リンカー分子はペプチドから剤を切断して、それによって放出するためのインビボでの主体であってもよい。ペプチドはまた、より大きい、おそらく不活性の担体分子に連結させることによって多量体にされてもよい。
【００７４】
同様に、本発明においてヒストンペプチドの変種または類似体が、ヒストン細胞障害性を遮断する可能性があると企図される。主に保存的アミノ酸置換を作出するヒストンのポリペプチド配列変種は、改善された組成物を提供する可能性がある。置換変種は典型的に、タンパク質における1つまたは複数の部位で1つのアミノ酸と別のアミノ酸との交換を含有して、他の機能または特性を失うことなく、タンパク質分解切断に対する安定性などの、ポリペプチドの1つまたは複数の特性をモジュレートするように設計されてもよい。この種の置換は好ましくは保存的であり、すなわち1つのアミノ酸を類似の形状および電荷の別のアミノ酸に交換する。保存的置換は当技術分野において周知であり、たとえば、アラニンからセリン；アルギニンからリジン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパルテートからグルタメート；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタメートからアスパルテート；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リジンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニン；セリンからトレオニン；トレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化が含まれる。
【００７５】
以下は、同等のまたは改善さえされた第二世代分子を作製するためにペプチドのアミノ酸を変化させることに基づく考察である。たとえば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位などの構造との相互作用結合能を認識可能に失わずに、あるアミノ酸をタンパク質構造における他のアミノ酸のかわりに置換してもよい。ペプチドの生物学的機能的活性を規定するのはペプチドの相互作用能および性質であることから、一定のアミノ酸置換をタンパク質配列およびその基礎となるDNAコード配列に行うことができ、それにもかかわらず、類似の特性を有するペプチドを得ることができる。このように、ペプチドをコードするDNA配列に様々な変化を作出してもよく、それでも以下に考察されるようにその生物学的有用性または活性を認識可能に失わないことは本発明者らによって企図される。
【００７６】
そのような変化を作出する場合、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮してもよい。タンパク質に相互作用生物機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、一般的に当技術分野において理解されている（Kyte and Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特徴が、得られたペプチドの二次構造に関与して、次にこれがペプチドと他の分子との相互作用を規定することは容認されている。
【００７７】
各々のアミノ酸は、その疎水性および電荷特徴に基づいてハイドロパシー指数を割付されており（Kyte and Doolittle, 1982）、これらは：イソロイシン（+4.5）；バリン（+4.2）；ロイシン（+3.8）；フェニルアラニン（+2.8）；システイン／シスチン（+2.5）；メチオニン（+1.9）；アラニン（+1.8）；グリシン（-0.4）；トレオニン（-0.7）；セリン（-0.8）；トリプトファン（-0.9）；チロシン（-1.3）；プロリン（-1.6）；ヒスチジン（-3.2）；グルタメート（-3.5）；グルタミン（-3.5）；アスパルテート（-3.5）；アスパラギン（-3.5）；リジン（-3.9）；およびアルギニン（-4.5）である。
【００７８】
あるアミノ酸を、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換してもよく、それでも類似の生物活性を有するペプチドが得られ、すなわちなおも生物学的に機能的に同等のタンパク質が得られることは当技術分野において公知である。そのような変化を作出する場合、そのハイドロパシー指数が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内であるアミノ酸置換が特に好ましく、および±0.5以内であるアミノ酸置換がさらにより特に好ましい。
【００７９】
同様に、類似のアミノ酸の置換を、親水性に基づいて有効に作出することができることも当技術分野において理解される。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,554,101号は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性が、タンパク質の生物特性と相関すると述べている。米国特許第4,554,101号において詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割付されている：アルギニン（+3.0）；リジン（+3.0）；アスパルテート（+3.0±1）；グルタメート（+3.0±1）；セリン（+0.3）；アスパラギン（+0.2）；グルタミン（+0.2）；グリシン（0）；トレオニン（-0.4）；プロリン（-0.5±1）；アラニン（-0.5）；ヒスチジン（*-0.5）；システイン（-1.0）；メチオニン（-1.3）；バリン（-1.5）；ロイシン（-1.8）；イソロイシン（-1.8）；チロシン（-2.3）；フェニルアラニン（-2.5）；トリプトファン（-3.4）。
【００８０】
1つのアミノ酸を、類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換することができ、それでもなお生物学的に同等で免疫学的に同等のタンパク質を得ることができると理解される。そのような変化において、その疎水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、および±0.5以内であるアミノ酸置換がさらにより特に好ましい。
【００８１】
先に概要したように、アミノ酸の置換は一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、たとえば疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づく。前述の様々な特徴を考慮に入れた例示的置換は当業者に周知であり、これには：アルギニンおよびリジン；グルタメートおよびアスパルテート；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンが含まれる。
【００８２】
本発明に従うポリペプチドを調製するための別の態様は、ペプチド模倣体を用いることである。模倣体は、タンパク質の二次構造の要素を模倣する分子を含有するペプチドである（Johnson et al., 1993）。ペプチド模倣体を用いることの背景にある基礎となる原理は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体と抗原の相互作用などの分子の相互作用を容易にするように主にアミノ酸側鎖を向けるように存在するという点である。ペプチド模倣体は天然の分子と類似の分子の相互作用を容認すると予想される。これらの原理を先に概要した原理と共に用いて、MBPの天然の特性の多くを有するが変更されたおよび改善さえされた特徴を有する第二世代分子を操作してもよい。
【００８３】
本発明はまた、修飾された、非天然のおよび／または珍しいアミノ酸を含むペプチドを使用してもよい。表1は、例示的であるが、制限的ではない修飾された非天然および／または珍しいアミノ酸を提供し、本明細書において以下に提供される。そのようなアミノ酸を関心対象ペプチドに組み入れるために、化学合成を使用してもよい。
【００８４】
（表１）修飾された、非天然のおよび珍しいアミノ酸
2011503012.tif 000002
【００８５】
先に考察した変種に加えて、本発明者らは、本発明のペプチドまたはポリペプチドの重要な部分を模倣するために、構造的に類似の化合物を製剤化してもよいと企図する。ペプチド模倣体と呼ばれる可能性があるそのような化合物を本発明のペプチドと同じ様式で用いてもよく、ゆえにそれらも同様に機能的同等物である。タンパク質二次構造および三次構造の要素を模倣する一定の模倣体は、Johnson et al.（1993）において記述されている。ペプチド模倣体を用いることの背景にある基礎となる原理は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体および／または抗原の相互作用などの分子の相互作用を容易にするように主にアミノ酸側鎖を向けるように存在するという点である。このように、ペプチド模倣体は、天然の分子と類似の分子の相互作用を容認するように設計される。
【００８６】
ペプチド模倣体の概念の適用のいくつかの成功例は、非常に抗原性であることが知られているタンパク質内のβ-ターンの模倣体に集中している。同様に、ポリペプチド内のβ-ターン構造は、本明細書において考察されるようにコンピューターに基づくアルゴリズムによって予測することができる。ターンの成分アミノ酸を決定した後に、アミノ酸側鎖の本質的な要素の類似の空間的方向を達成するように、模倣体を構築することができる。βIIターンは、環状L-ペンタペプチドおよびD-アミノ酸を有するペプチドを用いて首尾よく模倣されている（Weisshoff et al., 1999）。同様に、Johannesson et al.（1999）は、逆ターン誘導特性を有する二環トリペプチドについて報告している。
【００８７】
特異的構造を生成するための方法は当技術分野において開示されている。たとえば、α-ヘリックス模倣体は、米国特許第5,446,128号；第5,710,245号；第5,840,833号；および第5,859,184号において開示されている。これらの構造は、ペプチドまたはタンパク質をより熱安定性にして、同様にタンパク質分解に対する抵抗性を増加させる。6、7、11、12、13、および14員環構造が開示されている。
【００８８】
コンフォメーション拘束βターンおよびβバルジを生成するための方法は、たとえば米国特許第5,440,013号；第5,618,914号；および第5,670,155号において記述されている。β-ターンは、対応する骨格コンフォメーションの変化を有することなく、側鎖置換基の変化を許容して、標準的な合成技法によってペプチドに組み入れるために適切な末端を有する。模倣体ターンの他のタイプには、逆およびγターンが含まれる。逆ターン模倣体は、米国特許第5,475,085号および第5,929,237号において開示され、γターン模倣体は、米国特許第5,672,681号および第5,674,976号において記述されている。
【００８９】
C．融合体
別の変種は融合体である。この分子は一般的に、当初の分子の全てまたは実質的な部分を有し、この場合、ヒストン配列を含むペプチドがNまたはC末端で第二のペプチドまたはポリペプチドの全てまたは一部に連結している。たとえば、融合体は、異種宿主におけるタンパク質の組み換えによる発現を容認するために他の種からのリーダー配列を使用してもよい。別の有用な融合体には、融合タンパク質の精製を容易にするために抗体エピトープなどの免疫学的に活性なドメインの付加が含まれる。融合接合部またはその近傍に切断部位を含めると、精製後の余分のポリペプチドの除去が容易となる。他の有用な融合体には、酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナルまたは膜貫通領域などの機能的ドメインの連結が含まれる。
【００９０】
D．タンパク質の精製
ペプチド、断片、ペプチド模倣体またはその類似体を精製することが望ましい可能性がある。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、1つのレベルで、細胞環境をポリペプチドおよび非ポリペプチド分画に粗分画する段階を伴う。ポリペプチドを他のタンパク質から分離した後、部分的または完全な精製（または均一になるまでの精製）を達成するために、関心対象ポリペプチドを、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に有効な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたはさらにはHPLCである。
【００９１】
本発明の一定の局面は、コードされるタンパク質またはペプチドの精製、特定の態様において、実質的な精製に関する。本明細書において用いられる「精製タンパク質またはペプチド」という用語は、他の成分から単離可能な組成物を指すと意図され、タンパク質またはペプチドはその天然に得ることができる状態に対して任意の程度まで精製される。ゆえに、精製タンパク質またはペプチドは、それが天然に存在する可能性がある環境を含まないタンパク質またはペプチドを指す。
【００９２】
一般的に、「精製された」とは、様々な他の成分を除去するために分画に供されていて、その発現された生物活性を実質的に保持するタンパク質またはペプチド組成物を指す。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この名称は、タンパク質またはペプチドが、組成物におけるタンパク質の約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、またはそれより多くを構成するなどの、組成物の主成分を形成する組成物を指す。
【００９３】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための様々な方法は、本開示に照らして当業者に公知であろう。これらには、たとえば活性分画の比活性を決定する段階、またはSDS/PAGE分析によって分画内のポリペプチドの量を査定する段階が含まれる。分画の純度を査定するための好ましい方法は、分画の比活性を計算すること、最初の抽出物の比活性をそれと比較すること、およびこのように本明細書において「精製倍率」によって査定される純度の程度を計算することである。活性の量を表すために用いられる実際の単位は、当然、精製後に行われるために選ばれる特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存するであろう。
【００９４】
タンパク質精製において用いるために適した様々な技術が当業者に周知であろう。これらにはたとえば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体等による沈殿、または熱変性の後に遠心分離を行う段階；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー段階；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにそのようなおよび他の技術の組み合わせが含まれる。一般的に当技術分野において公知であるように、様々な精製段階を行う順序を変化させてもよく、ある特定の段階を省略してもよく、それでもなお実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを精製するための適した方法が得られると考えられる。
【００９５】
タンパク質またはペプチドが常にその最も精製された状態で提供されることは、一般的に必要ではない。実際に、実質的にあまり精製されていない産物が、ある特定の態様において有用性を有するであろうと企図される。部分的精製は、より少ない精製段階を組み合わせて用いて、または同じ一般的精製スキームの異なる型を利用することによって成就されてもよい。たとえば、HPLC装置を利用して行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによって一般的に、低圧のクロマトグラフィーシステムを利用する同じ技術より大きい「倍率」の精製が得られるであろうと認識される。低い程度の相対的精製を示す方法は、タンパク質産物の総収量において、または発現されたタンパク質の活性の維持において長所を有する可能性がある。
【００９６】
SDS/PAGEの条件が異なれば、ポリペプチドの移動が時に有意に変わりうることは公知である（Capaldi et al., 1977）。ゆえに、異なる電気泳動条件下では、精製または部分精製発現産物の見かけの分子量は変わる可能性があると認識される。
【００９７】
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、ピークの驚くべき分解能を有する非常に迅速な分離を特徴とする。これは、適切な流速を維持するために非常に細かい粒子と高圧とを用いることによって得られる。分離は、およそ数分でまたは多くて1時間で成就されうる。その上、粒子は非常に小さく密に充填されて、空隙容量は床容積の非常に小さい分画であることから、ごく少量の試料が必要であるに過ぎない。同様に、バンドが非常に狭く試料の希釈がほとんどないことから、試料の濃度はそれほど大きい必要はない。
【００９８】
ゲルクロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーは、分子の大きさに基づく特殊なタイプの分配クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィーの背景にある理論は、小さい孔を含有する不活性物質の小さい粒子によって調製されるカラムが、分子が孔の中またはその周囲を通過すると、サイズに応じてより大きい分子をより小さい分子から分離するということである。粒子が作出される材料が分子を吸着しない限り、流速を決定する唯一の要因は大きさである。よって、分子は、形状が比較的一定である限り、大きい順にカラムから溶出される。ゲルクロマトグラフィーは、分離が、pH、イオン強度、温度等などの他の全ての要因とは無関係であることから、異なる大きさの分子を分離する上で卓越している。同様に、実質的な吸着はなく、ゾーンの広がりはより少なく、溶出容積は単純に分子量に関連する。
【００９９】
アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質と、それが特異的に結合することができる分子とのあいだの特異的親和性に頼るクロマトグラフィー技法である。これは、受容体-リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの1つを不溶性マトリクスに共有的にカップリングさせることによって合成される。次に、カラム材料は溶液から物質を特異的に吸着することができる。条件を、結合が起こらない条件に変化させる（pH、イオン強度、温度等を変更する）ことによって、溶出が起こる。
【０１００】
炭水化物含有化合物の精製において有用な特定のタイプのアフィニティクロマトグラフィーは、レクチンアフィニティクロマトグラフィーである。レクチンは、多様な多糖類および糖タンパク質に結合する物質のクラスである。レクチンは通常、臭化シアンによってアガロースにカップリングされる。セファロースにカップリングされたコンカナバリンAは、用いられるこの種の最初の材料であり、多糖類および糖タンパク質の単離において広く用いられている。他のレクチンには、レンズマメレクチン、N-アセチルグルコサミニル残基の精製において有用であるコムギ胚芽アグルチニン、およびヘリックス・ポマチア（Helix pomatia）レクチンが含まれる。レクチン自身は、炭水化物リガンドを有するアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製される。乳糖は、トウゴマおよび落花生からレクチンを精製するために用いられており；マルトースはレンズマメおよびおよびジャックマメからのレクチンを抽出するために有用であり；N-アセチル-Dガラクトサミンは、ダイズからレクチンを精製するために用いられる；N-アセチルグルコサミニルはコムギ胚芽からのレクチンに結合する；D-ガラクトサミンは、ハマグリからレクチンを得るために用いられており；およびL-フコースは、ハスからのレクチンに結合する。
【０１０１】
マトリクスは、それ自身がいかなる有意な程度にも分子を吸着せず、広範囲の化学、物理、および熱安定性を有する物質であるべきである。リガンドは、その結合特性に影響を及ぼさないようにカップリングされるべきである。リガンドはまた、比較的堅固な結合を提供すべきである。試料またはリガンドを破壊することなく、物質を溶出することが可能であるべきである。アフィニティクロマトグラフィーの最も一般的な型の1つは、イムノアフィニティクロマトグラフィーである。本発明に従って用いるために適しているであろう抗体の生成を以下に考察する。
【０１０２】
E．ペプチド合成
ヒストン関連ペプチドは、本発明の様々な態様において用いるために合成によって生成されてもよい。その比較的小さい大きさのために、本発明のペプチドは、従来の技術に従って溶液中または固相支持体上で合成されうる。様々な自動シンセサイザーが市販されており、公知のプロトコルに従って用いることができる。たとえば、その各々が参照により本明細書に組み入れられる、Stewart & Young, (1984)；Tam et al., (1983)；Merrifield, (1986)；Barany and Merrifield (1979)を参照されたい。本明細書において記述される選択された領域に対応する、通常アミノ酸約6個から約35〜50個までの、短いペプチド配列またはオーバーラップペプチドのライブラリを容易に合成することができ、その後、反応性ペプチドを同定するために設計されるスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングすることができる。または、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが発現ベクターに挿入されて、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされて、発現にとって適した条件で培養される、組み換えDNA技術を使用してもよい。
【０１０３】
III．抗体およびイムノアッセイ
ヒストンに対して免疫学的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体が、いくつかの適用において用いられると理解されるであろう。これらには、ヒストンを検出する診断キットおよび方法のみならず、治療介入が含まれる。抗体を調製および特徴付けするための手段は当技術分野において周知である（たとえば、参照により本明細書に組み入れられる、Antibodies: A Laboratory Manual, 1988を参照されたい）。本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために用いられ、これには、Fab'、Fab、F(ab')2、一本鎖抗体（DAB'）、Fv、scFv（一本鎖Fv）等などの抗体断片が含まれる。
【０１０４】
A．ポリクローナル抗血清
ポリクローナル抗血清は、動物を本発明に従う免疫原性組成物によって免疫する段階、および免疫した動物から抗血清を採取する段階によって調製される。広範囲の動物種を抗血清の産生のために用いることができる。典型的に、抗血清の産生のために用いられる動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはヤギである。ウサギの比較的大量の血液のために、ウサギはポリクローナル抗体の産生にとって好ましい選択である。
【０１０５】
当技術分野において周知であるように、所定の組成物は、その免疫原性が多様であってもよい。ゆえに、宿主免疫系を追加免疫することがしばしば必要であり、これはペプチドまたはポリペプチド免疫原を担体にカップリングさせることによって達成される。例示的なおよび好ましい担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびウシ血清アルブミン（BSA）である。卵白アルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンも同様に担体として用いることができる。ポリペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートさせるための手段は当技術分野において周知であり、これには、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンコイル-N-ヒドロキシスクシニミドエステル、カルボジイミド、およびビス-ジアゾ化（biazotized）ベンジジンが含まれる。
【０１０６】
同様に、当技術分野において周知であるように、特定の免疫原組成物の免疫原性を、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激物質を用いることによって増強することができる。例示的なおよび好ましいアジュバントには、フロイントの完全アジュバント（死菌結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含有する免疫応答の非特異的刺激物質）、フロイントの不完全アジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。
【０１０７】
ポリクローナル抗体の産生において用いられる免疫原組成物の量は、免疫原の性質のみならず、免疫のために用いられる動物によって多様である。多様な経路（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および腹腔内）を用いて免疫原を投与することができる。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の様々な時点で免疫動物の血液を採取することによってモニターしてもよい。
【０１０８】
第二の追加免疫注射も同様に与えてもよい。追加免疫および力価測定のプロセスを、適した力価が達成されるまで繰り返す。望ましいレベルの免疫原性が得られれば、免疫した動物から採血して、血清を単離して保存するか、またはその動物を用いてmAb（以下）を生成することができる。
【０１０９】
ウサギポリクローナル抗体を産生するために、耳静脈を通して、または心穿刺によって動物から採血することができる。獲得した血液を凝固させた後、遠心分離して、血清成分を全血球および凝血から分離する。血清を様々な応用のためにそのまま用いてもよく、または望ましい抗体分画を、固相マトリクスに結合させた別の抗体もしくはペプチドを用いる、またはプロテインAの後に精製のために抗原（ペプチド）アフィニティカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーなどの周知の方法によって精製してもよい。
【０１１０】
B．モノクローナル抗体
mAbは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,196,265号において例示される技術などの周知の技術を用いることを通して容易に調製される可能性がある。典型的に、この技術は、選択された免疫原組成物、たとえば精製または部分精製ヒストン、その断片、またはペプチドによって適した動物を免疫する段階を伴う。免疫する組成物は、抗体産生細胞を刺激するために有効な様式で投与される。
【０１１１】
モノクローナル抗体（MAb）を生成するための方法は、一般的にポリクローナル抗体を調製するためと同じ道筋に沿って始まる。マウスおよびラットなどの齧歯類は好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サル細胞を用いることも同様に可能である。ラットを用いることは、一定の長所を提供する可能性があるが（Goding, 1986, pp. 60-61）、マウスが好ましく、BALB/cマウスは、最もルーチンで用いられ、一般的に高い割合の安定な融合体を生じることから最も好ましい。
【０１１２】
一般的に先に記述されたように、動物に抗原を注射する。抗原を、必要であれば、キーホールリンペットヘモシアニンなどの担体タンパク質にカップリングさせてもよい。抗原は典型的に、フロイントの完全または不完全アジュバントなどのアジュバントと混合される。同じ抗原による追加免疫注射は、およそ2週間間隔で行われる。
【０１１３】
免疫後、抗体を産生する可能性がある体細胞、特にBリンパ球（B細胞）を、MAb生成プロトコルにおいて用いるために選択する。これらの細胞は、生検で採取された脾臓またはリンパ節から得られてもよい。脾細胞およびリンパ節細胞が好ましいが、前者は分裂形質芽球期にある抗体産生細胞に富む起源であることから、前者が好ましい。
【０１１４】
しばしば、動物の一団を免疫して、最高の抗体力価を有する動物の脾臓を摘出して、脾臓をシリンジによってホモジナイズすることによって、脾臓リンパ球が得られる。典型的に、免疫したマウスからの脾臓は、リンパ球およそ5×107から2×108個を含有する。
【０１１５】
免疫した動物からの抗体産生Bリンパ球を、一般的に免疫した動物と同じ種の細胞である不死化骨髄腫細胞の細胞と融合させる。ハイブリドーマ産生融合技法において用いるために適した骨髄腫細胞株は、好ましくは非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、かつ望ましい融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成育を支持する一定の選択培地においてそれらを増殖することができなくする酵素欠損を有する。
【０１１６】
当業者に公知であるように、多数の骨髄腫細胞の任意の1つを用いてもよい（Goding, pp. 65-66, 1986；Campbell, pp. 75-83, 1984；各々が参照により本明細書に組み入れられる）。たとえば、免疫した動物がマウスである場合、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7およびS194/5XX0 Bulを用いてもよく；ラットの場合、R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983Fおよび4B210を用いてもよく；ならびにU-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、およびUC729-6は全て、ヒト細胞融合に関連して有用である。1つの特定のマウス骨髄腫細胞は、NS-1骨髄腫細胞株（同様にP3-NS-1-Ag4-1とも呼ばれる）であり、これはNIGMS Human Genetic Mutant Cell Repositoryから細胞株寄託番号GM3573を要請することによって容易に入手可能である。用いられてもよい別のマウス骨髄腫細胞株は、8-アザグアニン抵抗性マウス骨髄腫SP2/0非産生細胞株である。
【０１１７】
抗体産生脾細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを生成するための方法は、一般的に、細胞膜の融合を促進する作用因子または複数の作用因子（化学または電気）の存在下で、体細胞を骨髄腫細胞と2：1の比率で混合する段階を含むが、比率は約20：1〜約1：1まで多様であってもよい。センダイウイルスを用いる融合法は、Kohler and Milstein（1975；1976）によって記述されており、37重量％PEGなどのポリエチレングリコール（PEG）を用いる方法は、Gefter et al.（1977）によって記述されている。電気的に誘導される融合法を用いることも同様に適切である（Goding pp. 71-74, 1986）。
【０１１８】
融合技法は通常、低い頻度で、約1×10-6〜1×10-8で生存ハイブリッドを産生する。しかし、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地において培養することによって親の注入された細胞（特に、通常、無限に分裂し続けるであろう注入骨髄腫細胞）から分化していることから、このことは問題ではない。選択培地は一般的に、組織培養培地においてヌクレオチドのデノボ合成を遮断する剤を含有する培地である。例示的なおよび好ましい剤は、アミノプテリン、メソトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメソトレキセートは、プリンおよびピリミジンの双方のデノボ合成を遮断するが、アザセリンは、プリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメソトレキセートを用いる場合、培地に、ヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンを添加する（HAT培地）。アザセリンを用いる場合、培地にヒポキサンチンを添加する。
【０１１９】
特定の選択培地は、HATである。ヌクレオチドサルベージ経路を操作することができる細胞のみがHAT培地において生存することができる。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の重要な酵素、たとえばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）を欠損しており、それらは生存することができない。B細胞はこの経路を操作することができるが、培養において限られた寿命を有し、一般的に約2週間以内に死滅する。ゆえに、選択培地において生存することができる唯一の細胞は、骨髄腫とB細胞とから形成されたハイブリッドである。
【０１２０】
この培養は、特異的ハイブリドーマが選択されるハイブリドーマ集団を提供する。典型的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートにおいて1クローン希釈によって細胞を培養する段階の後に、個々のクローン上清（約2〜3週間後）を所望の反応性に関して試験する段階によって行われる。アッセイはラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞障害アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイ等のように感受性が高く、単純かつ迅速であるべきである。次に、選択されたハイブリドーマを連続希釈して、個々の抗体産生細胞株にクローニングし、クローンを無限に繁殖させてmAbを得ることができる。細胞株は、2つの基本的な方法でmAb産生のために利用されてもよい。
【０１２１】
ハイブリドーマ試料を、当初の融合のために体細胞および骨髄腫細胞を提供するために用いられたタイプの組織適合性の動物（たとえば、同系のマウス）に（しばしば腹腔に）注入することができる。任意で、動物を注射前に炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの油によってプライミングする。注射された動物は、融合した細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。血清または腹水などの動物の体液を採取して高濃度のmAbを提供することができる。
【０１２２】
個々の細胞株はまた、インビトロでも培養することができ、この場合、mAbは培養培地に天然に分泌され、そこからmAbを高濃度で容易に得ることができる。いずれかの手段によって産生されたmAbを、望ましければ、濾過、遠心分離、およびHPLCまたはアフィニティクロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を用いてさらに精製してもよい。本発明のモノクローナル抗体の断片は、ペプシンまたはパパインなどの酵素による消化が含まれる方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって、精製モノクローナル抗体から得ることができる。または、本発明によって包含されるモノクローナル抗体断片は、自動ペプチドシンセサイザーを用いて合成されうる。
【０１２３】
同様に、分子クローニングアプローチを用いてモノクローナル抗体を生成してもよいと企図される。このため、組み合わせ免疫グロブリンファージミドライブラリを、免疫した動物の脾臓から単離されたRNAから調製して、抗原を発現する細胞および対照細胞、たとえば正常対腫瘍細胞を用いるパニングによって、適切な抗体を発現するファージミドを選択する。従来のハイブリドーマ技術に対するこのアプローチの長所は、1ラウンドでおよそ104倍も多くの抗体を産生およびスクリーニングできること、ならびに新しい特異性がH鎖とL鎖の組み合わせによって生成され、これは適切な抗体を発見する機会をさらに増加させることである。
【０１２４】
C．イムノアッセイ
本発明はこのように、ヒストンに結合する、定量する、または別の方法で一般的に検出するための免疫検出法に関する。様々な有用な免疫検出法の段階は、たとえば参照により本明細書に組み入れられる、Nakamura et al.（1987）などの科学論文において記述されている。その最も単純かつ直接的な意味でのイムノアッセイは結合アッセイである。一定の好ましいイムノアッセイは、様々なタイプの酵素免疫測定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、およびイムノビーズ捕獲アッセイである。しかし、検出はそのような技術に限定されず、ウェスタンブロット、ドットブロット等も同様に本発明に関連して用いてもよいと容易に認識されるであろう。
【０１２５】
一般的に、免疫結合法には、ヒストン、断片、またはペプチドを含有することが疑われる試料を得る段階、および試料（血液、血清、または血漿などの）を、場合によっては免疫複合体を形成させるために有効な条件下で、本発明に従う抗体、タンパク質またはペプチドに接触させる段階が含まれる。
【０１２６】
本発明の免疫結合法には、結合プロセスの際に結合された任意の免疫複合体の検出または定量を必要とする、試料中の反応性成分の量を検出または定量するための方法が含まれる。ここで、細胞外ヒストンを含有することが疑われる試料を得、試料を抗体と接触させ、次いで特異的条件下で形成された免疫複合体を検出またはその量を定量する。
【０１２７】
選ばれた生物試料を、免疫複合体（一次免疫複合体）を形成させるために有効な条件および十分な期間、抗体または抗血清に接触させる段階は、一般的に、試料に組成物を単に加える段階、および抗体が細胞外ヒストンと免疫複合体を形成するために十分に長い期間混合物をインキュベートする段階のことである。この後、試料-抗体組成物は一般的に、非特異的に結合した任意の抗体種を除去するために洗浄され、一次免疫複合体内に特異的に結合した抗体のみが検出される。
【０１２８】
一般的に、免疫複合体形成の検出は当技術分野において周知であり、多数のアプローチの適用を通して達成されてもよい。これらの方法は一般的に、任意の放射活性、蛍光、生物学的、または酵素の、当技術分野において標準的に用いられるタグまたは標識などの、標識またはマーカーの検出に基づく。そのような標識を用いることに関する米国特許には、そのそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる、第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；および第4,366,241号が含まれる。
【０１２９】
ある特定の態様において、一次免疫複合体内で結合するようになる最初に加えられる成分を、コードされるタンパク質、ペプチド、または対応する抗体に対する結合親和性を有する第二の結合リガンドによって検出してもよい。これらの場合、第二の結合リガンドを検出可能な標識に連結してもよい。第二の結合リガンドはそれ自身がしばしば抗体であり、「二次」抗体と呼ばれることがある。一次免疫複合体を、二次免疫複合体を形成させるために有効な条件で十分な期間、標識された二次結合リガンドまたは抗体に接触させる。次に、一般的に、任意の非特異的に結合した標識二次抗体またはリガンドを除去するために、二次免疫複合体を洗浄して、二次免疫複合体において残っている標識を検出する。
【０１３０】
さらなる方法には、2段階アプローチによる一次免疫複合体の検出が含まれる。コードされるタンパク質、ペプチド、または対応する抗体に対して結合親和性を有する抗体などの第二の結合リガンドを用いて、先に記述したように二次免疫複合体を形成する。洗浄後、二次免疫複合体を、この場合も免疫複合体（三次免疫複合体）を形成させるために有効な条件で十分な期間、第二の抗体に対して結合親和性を有する第三の結合リガンドまたは抗体に接触させる。第三のリガンドまたは抗体を検出可能な標識に連結させて、このように形成された三次免疫複合体を検出する。この系は、望ましい場合、シグナル増幅を提供してもよい。
【０１３１】
本発明において特に重要であるのは、ELISAとして知られる酵素免疫測定法である。1つの例示的なELISAにおいて、本発明のコードされるタンパク質に結合する抗体を、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルなどのタンパク質親和性を示す選択された表面に固定する。次に、細胞外ヒストンを含有することが疑われる試験組成物をウェルに加える。結合および非特異的に結合した免疫複合体を除去するための洗浄後、結合抗原を検出してもよい。
【０１３２】
検出は、一般的に、検出可能な標識に連結させた標的タンパク質に対して特異的な二次抗体を加えることによって達成される。このタイプのELISAは、単純な「サンドイッチELISA」である。検出はまた、第二の抗体を加えた後に、第二の抗体に対して結合親和性を有する第三の抗体を加えることによって達成されてもよく、第三の抗体は検出可能な標識に連結される。
【０１３３】
別の例示的なELISAにおいて、細胞外ヒストンを含有することが疑われる試料をウェル表面に固定して、次に、本発明の抗体に接触させる。結合後、非特異的に結合した免疫複合体を除去するために洗浄して、結合した抗体を検出する。初回の抗体が検出可能な標識に連結している場合には、免疫複合体を直接検出してもよい。この場合も、免疫複合体を、第一抗体に対して結合親和性を有する第二の抗体を用いて検出してもよく、第二抗体は検出可能な標識に連結される。
【０１３４】
細胞外ヒストンが固定される別のELISAは、検出において抗体の競合を用いることを伴う。このELISAにおいて、標識抗体をウェルに加えて、細胞外ヒストンに結合させて、その標識によって検出する。次に、コーティングされたウェルと共にインキュベートする前後に、試料を標識抗体と共に混合することによって、未知試料におけるマーカー抗原の量を決定する。試料中のマーカー抗原の存在は、ウェルに対する結合にとって利用可能な抗体の量を低減させるように作用して、このように、最終的なシグナルを低減させる。これは、未知試料において抗体を検出するために適切であり、非標識抗体が抗原コーティングウェルに結合して、標識抗体に結合するために利用可能な抗原の量も低減させる。
【０１３５】
使用されるフォーマットによらず、ELISAは、コーティング、インキュベート、または結合、非特異的結合種を除去するための洗浄、および結合した免疫複合体の検出などの共通の一定の特色を有する。たとえば、プレートを抗原または抗体のいずれかによってコーティングする場合、一般的にプレートのウェルを抗原または抗体の溶液と共に終夜または明記された時間インキュベートする。次にプレートのウェルを洗浄して、不完全に吸着された材料を除去する。いかなる残っている利用可能なウェルの表面も、試験抗血清に関して抗原的に中性である非特異的タンパク質によって「コーティング」される。これらには、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼインおよび乳汁溶液が含まれる。コーティングは、固定表面上の非特異的吸着部位のブロッキングを許容し、それゆえ、表面上への抗血清の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドを低減させる。
【０１３６】
ELISAでは、直接技法よりむしろ二次または三次検出手段を用いるほうがより慣例的である。このように、タンパク質または抗体がウェルに結合して、バックグラウンドを低減させるために非反応性材料によってコーティングし、および非結合材料を除去するための洗浄後に、固定表面を対照および試験される試料に、免疫複合体（抗原／抗体）を形成させるために有効な条件で接触させる。免疫複合体の検出は、標識された二次結合リガンドもしくは抗体、または標識された三次抗体もしくは三次結合リガンドと共に二次結合リガンドもしくは抗体を必要とする。
【０１３７】
「免疫複合体（抗原／抗体）を形成させるために有効な条件」は、条件に、好ましくは抗原および抗体を、BSA、ウシγグロブリン（BGG）およびリン酸緩衝生理食塩液（PBS）／Tweenなどの溶液によって希釈する段階が含まれることを意味する。これらの追加の剤も同様に、非特異的バックグラウンドの低減に役立つ傾向がある。
【０１３８】
「適した」条件はまた、インキュベーションが有効な結合を許容するために十分な温度および期間であることを意味する。インキュベーション段階は典型的に約1〜2から4時間であり、温度は好ましくはおよそ25℃〜27℃であり、または約4℃で終夜等であってもよい。
【０１３９】
ELISAにおける全てのインキュベーション段階の後、非複合体形成材料を除去するために、接触表面を洗浄する。好ましい洗浄技法には、PBS/Tweenまたはホウ酸塩緩衝液などの溶液による洗浄が含まれる。試験試料と当初結合した材料とのあいだに特異的免疫複合体が形成されて、その後洗浄した後、微量の免疫複合体の存在さえも決定される可能性がある。
【０１４０】
検出手段を提供するために、第二または第三の抗体は、検出を許容するために会合した標識を有するであろう。好ましくは、これは、適切な発色基質と共にインキュベートすることによって、色の発生を生成する酵素であろう。このように、たとえば第一または第二の免疫複合体をウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または水素ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体に、さらなる免疫複合体形成の発生にとって都合のよい期間および条件で（たとえば、PBS-TweenなどのPBS含有溶液中で室温で2時間インキュベーション）接触およびインキュベートすることが望ましいであろう。
【０１４１】
標識抗体と共にインキュベートして、非結合材料を除去するために洗浄後、標識の量を、たとえば尿素およびブロモクレゾールパープルまたは2,2'-アジド-ジ-3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸（ABTS）などの発色基質、および酵素標識としてペルオキシダーゼの場合にはH2O2と共にインキュベートすることによって、定量する。次に、定量は、たとえば可視スペクトル分光光度計を用いて、色の生成の程度を測定することによって達成される。
【０１４２】
IV．診断および治療
ある局面において、本発明は、細胞外ヒストンの細胞障害量の産生を構成要素として有する過剰炎症障害の診断および処置に関する。細胞外ヒストンを切断、結合、およびその機能を遮断する剤を用いることによって、本発明者らは、これらの分子の毒性効果を低減および阻害しようと努める。加えて、そのような細胞外ヒストンの存在は、単独でまたは他の診断特色と共に、生命を脅かす過剰炎症反応を発症するリスクを有する被験体を同定する可能性がある。このように、血液、血漿、および血清などの試料中の細胞外ヒストンを検出するためのアッセイも同様に提唱される。
【０１４３】
A．診断／予後
1つの局面において、本発明は、細胞外ヒストンの産生および毒性を伴う過剰炎症状態を有するリスクを有するまたは有することが疑われる患者からの生物試料を得る段階を必然的に伴うであろう。生物試料は典型的に、血液、血漿、または血清を必然的に含むが、唾液、喀痰、および尿などの他の体液も同様に利用してもよい。先に記述した免疫アッセイまたは他の技術（たとえば、MALDI-TOFなどの質量分析）を使用して、試料のヒストン含有量を査定して、ヒストンレベルが上昇すれば過剰炎症障害であることが示される。次に被験体を、以下に考察されるように処置してもよく、または単にその後の進行もしくは回復に関してモニターしてもよい。
【０１４４】
B．治療
本発明は、先に明記された多様な過剰炎症疾患状態を処置するために細胞外ヒストン細胞障害性の阻害剤を用いることを企図する。本発明者らは、ヒストン、特にヒストンH3およびH4からの断片／ペプチドのみならず、ヒストンを切断する酵素（APC、グランザイムA＆B）、およびヒストンに対する抗体を用いることを企図する。同様に、（a）少なくとも1つのヒストンペプチド、少なくとも1つの抗ヒストン抗体、（b）多数のヒストンペプチド、（c）多数のヒストン抗体、および（d）ヒストン切断酵素ならびに少なくとも1つのヒストンペプチドおよび／または抗ヒストン抗体、が含まれる剤の混合物も企図される。特に重要であるのは、H4の残基50〜67位を表すH4ペプチドなどのH4を標的とするペプチドおよび抗体である。
【０１４５】
処置療法は、疾患の重症度およびタイプ、患者の全身健康および年齢、ならびに処置する医師によって考慮されるべき様々な他の状態に応じて多様となるであろう。複数回の投与または処置を適用してもよいのみならず、少量の治療剤が長期間にわたって継続的に提供される「持続的」治療を適用してもよい。剤はまた、1回のボーラス投与で提供されてもよいが、活性型の、遅延放出型、一定期間放出型、または徐放性型に製剤化される。
【０１４６】
加えて、細胞外ヒストン細胞障害性の阻害剤と他の処置との併用は、単一の組成物もしくは双方の多数の剤が含まれる薬理学的製剤の投与、または2つの別個の組成物もしくは製剤を同時に投与することによって用いられてもよい。または、1つの処置が、数分から数週間のあいだの間隔をあけて他の投与の前または後であってもよい。2つの剤が個別に適用される態様において、一般的に、双方の剤がなおも有利な併用効果を発揮できるように、確実に、各送達時間のあいだにかなりの期間が経過しないようにするであろう。そのような場合、典型的に互いに約12〜24時間以内に、より好ましくは互いに約6〜12時間以内に、双方のモダリティを投与するが、約12時間のみの遅延期間が最も好ましいと企図される。何らかの状況において、処置期間をかなり延長することが望ましい可能性があるが、この場合、各々の投与のあいだに数日（2、3、4、5、6、もしくは7日）から数週間（1、2、3、4、5、6、7、もしくは8週間）が経過する。同様に、複数回の薬物の投与が望ましいことも考えられる。
【０１４７】
説明するために、全体で3回および4回の投与に基づく以下の順列を実例に挙げるが、この場合Aは、細胞外ヒストン細胞障害性の第一の阻害剤を表し、Bは第二の薬物（細胞外ヒストン細胞障害性の第二の阻害剤が含まれる）を表す：
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  B/A/A  A/B/B  B/B/B/A  B/B/A/B 
A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A  B/A/B/A  B/A/A/B  B/B/B/A
A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A  A/B/B/B  B/A/B/B  B/B/A/B
他の組み合わせも同様に企図される。
【０１４８】
C．薬学的製剤および患者への投与経路
臨床応用が企図される場合、ヒストンペプチド、断片、および抗ヒストン抗体、ならびにその混合物が含まれる薬学的組成物は、意図される適用にとって適切な剤形で調製されるであろう。一般的に、これは、発熱物質のみならずヒトまたは動物に対して有害でありうる他の不純物を本質的に含まない組成物を調製する段階を必然的に伴うであろう。
【０１４９】
一般的に、送達ベクターを安定にするためにおよび標的細胞によって取り込ませるために、適切な塩および緩衝剤を使用することが望ましいであろう。組み換え型細胞を患者に導入する場合、緩衝剤も同様に使用されるであろう。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性培地に溶解または分散されたベクターまたは細胞の有効量を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という句は、動物またはヒトに投与した場合に有害な、アレルギー、または他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、ヒトに投与するために適した医薬などの医薬を製剤化する場合に用いるために許容される、溶媒、緩衝剤、溶液、分散培地、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に活性な物質に関して、そのような培地および剤を用いることは当技術分野において周知である。いかなる従来の培地または剤も本発明の活性成分と非適合性である場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。補助活性成分も同様に、それらが組成物のベクターまたは細胞を不活化しない限り、組成物に組み入れることができる。
【０１５０】
本発明の活性組成物には、古典的な薬学的調製物が含まれてもよい。本発明に従うこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路によって利用可能である限り、任意の一般的な経路によってもよい。これには、経口、鼻腔内、または口腔内が含まれる。または、投与は皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射であってもよい。そのような組成物は、通常、前記に記述されるように薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
【０１５１】
活性化合物はまた、非経口または腹腔内に投与されてもよい。実例として、遊離の塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水において調製することができる。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物においてならびに油において調製することができる。貯蔵および使用に関する通常の条件下で、これらの調製物は一般的に微生物の成育を防止するために保存剤を含有する。
【０１５２】
注射での使用にとって適した薬学的剤形には、たとえば滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。一般的に、これらの調製物は無菌的で、容易な注入可能性が存在する程度に流動的である。調製物は、製造および貯蔵の条件で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保存されるべきである。適切な溶媒または分散媒体はまた、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適した混合物、および植物油を含有してもよい。適切な流動性はたとえば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサル等によってもたらされうる。多くの場合において、等張剤、たとえば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において用いることによってもたらされうる。
【０１５３】
滅菌注射用溶液は、活性化合物の適切な量を、望ましければ任意の他の成分（たとえば、先に列挙したような）と共に溶媒に組み入れた後に、濾過滅菌することによって調製されてもよい。一般的に、分散剤は、先に列挙したように、塩基性分散媒体および望ましい他の成分を含有する滅菌媒体に様々な滅菌活性成分を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法には、予め濾過滅菌したその溶液から活性成分に加えて任意の追加の望ましい成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術が含まれる。
【０１５４】
本発明の組成物は一般的に、中性型または塩型で製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩には、たとえば無機酸（たとえば、塩酸、またはリン酸）または有機酸（たとえば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等）に由来する酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基によって形成される）が含まれる。タンパク質の遊離のカルボキシル基によって形成される塩も同様に、無機塩基（たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄）または有機塩基（たとえば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等）に由来しうる。
【０１５５】
製剤化されると、溶液は好ましくは、投与製剤と適合性で治療的に有効である量で投与される。製剤は、注射液、薬物放出カプセル等などの多様な投与剤形で投与されてもよい。水溶液の非経口投与の場合、たとえば溶液は一般的にふさわしくは緩衝液を加えられ、たとえば十分な生理食塩液またはグルコースによって液体希釈液を最初に等張にする。そのような水溶液は、たとえば静脈内、動脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与のために用いられてもよい。好ましくは、特に本開示に照らして、当業者に公知である滅菌水性媒質が使用される。実例として、1回量は、等張NaCl溶液1 mlに溶解され、皮下注入溶液1000 mlに加えられるか、または提唱される注入部位に注入される（たとえば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照されたい）。用量の何らかの変動が、処置される被験体の状態に応じて必然的に起こるであろう。投与の責任を有する人は、いずれにせよ個々の被験体に関して適切な用量を決定するであろう。その上、ヒトでの投与の場合、調製物は、FDA生物標準局（FDA Office of Biologics standards）によって必要とされる無菌性、発熱性、全般的安全性および純度標準を満たすべきである。
【実施例】
【０１５６】
V．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含められる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実践において良好に機能するように本発明者らによって発見された技術を表し、このように、その実践にとって好ましい様式を構成すると考えることができることは当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、多くの変化を、開示される特異的態様に行うことができ、それでもなお本発明の趣旨および範囲に含まれる同様または類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
【実施例１】
【０１５７】
材料および方法
材料
マウスプロテインC、ウシ第V因子、第X因子、およびトロンビン、ラット抗マウスEPCR（MEPCR1560）およびマウスTM（MTM1703）は標準的な技法に従って、本研究所において産生した。ヒト組み換え型APC（Xigris）は、Eli Lillyから購入した。仔ウシ胸腺ヒストン（Sigma）、仔ウシ胸腺ヒストンH4（Roche）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）のLPS（Sigma）、マウス組み換え型IFN（Biosource）、合成ヒストンH4ペプチド（GenScript）、大腸菌M15株（Qiagen）も同様に購入した。大腸菌B7株は、Dr. F.B.Taylorから供与された。
【０１５８】
動物
6〜10週齢の雄性C57BL/6マウス（Jackson Lab）をオクラホマ医学研究基金院内動物保護使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committees of the Oklahoma Medical Research Foundation）によって承認されたプロトコルに従って用いた。
【０１５９】
マウス腹腔マクロファージ
マウスに3％チオグリコレート培地2 mlを腹腔内注射した。4日後、10 U/mlヘパリンを含有する冷HBSS 10 mlによる洗浄によって、腹腔浸出細胞を回収した。腹腔細胞を1回洗浄して、10％ウシ胎児血清（FBS）を含有するRPMI 1640培地に浮遊させて、24ウェルプレートにおいて平板培養して、培養2時間後に非接着細胞を洗浄して除去した。接着した腹腔マクロファージを1μg/ml LPS、20 ng/mlマウスIFNまたは双方によって24時間刺激した。これらの処置を行うまたは行わない場合、細胞は0.8〜1.0×106個/ウェルであった。
【０１６０】
細胞培養
マウスマクロファージ細胞株RAW264.7細胞を、10％FBSを添加したRPMI 1640培地において培養した。ヒト内皮EA.hy926細胞を、10％FBSおよびHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加したDMEMにおいて培養した。
【０１６１】
EPCRおよびTM mRNA発現を定量するためのリアルタイムPCR
総RNAを、TRIzol試薬（Invitrogen）を用いてマウス組織から単離した。cDNAをSuperScript First-Strand Synthesis System（Invitrogen）によって総RNAから合成した。リアルタイムPCRを、SYBR Green PCR Core Reagents, ABI Prism 7000 Sequence Detection System（Applied Biosystems）によって以下のプライマーによって実行した：
2011503012.tif 000003
各試料からの相対的EPCRまたはTM mRNA発現レベルを、そのβ-アクチンmRNAによる標準化後に決定した。
【０１６２】
EPCRの免疫沈殿およびウェスタンブロット
マウス臓器組織を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を加えた抽出緩衝液（0.25 M蔗糖、20 mM Tris-HCl、pH 7.5、1％Triton X-100）によってPowerGenホモジナイザー（Fisher Scientific）によってホモジナイズして、4℃で16,000 gで20分間遠心分離した。抽出緩衝液によって1 ml中に10 mgタンパク質となるように希釈した上清を、RMEPCR1560 AbおよびプロテインGセファロース4ファストフロー樹脂（Amersham Biosciences）と共に4℃で2時間混合することによってEPCRに関して免疫沈殿させた。免疫沈殿物を、0.1％Triton X-100を含有する冷TBSによって3回洗浄して、SDS-PAGEローディング緩衝液と共に5分間沸騰させた後にプロテインG樹脂から解離させて、SDS-PAGEによって分離して、ビオチン標識RMEPCR1543 Ab、ストレプトアビジン-HRPおよびECLシステム（Amersham Biosciences）によってウェスタンブロットした。
【０１６３】
フローサイトメトリーによって決定したEPCRおよびTM表面発現
マウス腹腔マクロファージを、マウスEPCRに関して10μg/mlビオチニル化MEPCR 1560によって、TMに関してビオチニル化MTM 1703によって、2％FBS、0.1％NaN3緩衝液を含有するPBS中で10μg/ml抗マウスCD16/32の存在下で氷中で30分間染色して、洗浄し、2μg/ml PE-ストレプトアビジンによって氷中で30分間染色して、再度洗浄し、フローサイトメトリーに供した。
【０１６４】
マウスマクロファージにおけるプロテインC活性化
24ウェルプレートにおけるマウス腹腔マクロファージをPBSによって1回洗浄した後、0.1％BSA、10 nMウシトロンビンおよび100 nMマウスプロテインCを含有するDMEM 0.2 mlを、200 nM MEPCR1560 mAbの存在下または非存在下で加えた。37℃で30分後、上清50μlを96ウェルマイクロプレートに移して、ヒルジン（5 mg/ml）5μlと混合した。APCのアミド溶解活性を、0.1 M NaCl、50 mM HEPES-HCl、pH 7.5緩衝液において0.4 mM Spectrozyme Pca基質50μlを加えることによって、405 nmでのVmaxによって測定した。APC濃度は、精製マウスAPCに関する標準曲線を参照することによって決定した。プロトロンビンおよびプロテインC活性化アッセイに関して、200 nMウシプロトロンビン、3 nMウシ第V因子、および85 nMウシ第X因子を10 nMウシトロンビンの代わりに用いた。トロンビン活性は、Spectrozymeトロンビン基質に対するそのアミド溶解活性によって決定した。
【０１６５】
刺激したマクロファージ条件培地からのヒストンH4のウェスタンブロット
RAW264.7細胞を1μg/ml LPSおよび20 ng/ml IFNによって24時間刺激して、PBSによって洗浄し、Opti-MEM培地（Invitrogen）において100 nMヒトAPCの存在下または非存在下で24時間培養した。条件培地を0.22μmフィルターを通して濾過して、Amicon Ultra 10,000（Millipore）によって80倍濃縮した。濃縮した条件培地をSDS-PAGEに供して、ヒストンH4（BWA-3）に対するマウスモノクローナル抗体によってウェスタンブロットした。
【０１６６】
APCによって生成されたヒストンH4切断部位
0.1 mg/mlヒストンH4を、1 mM CaCl2およびMgCl2を含有するPBSにおいて20 μg/mlヒトAPCと共に37℃で60分間インキュベートした。試料をSDS-PAGEおよびGelCode Blue（PIERCE）染色に供して、分子量を決定するためにUniversity of Oklahoma Health Science Centerのマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型施設に送った。
【０１６７】
ヒストン細胞障害アッセイ
EA.hy926細胞を、Opti-MEM培地において50μg/mlヒストン、ヒストンH4またはヒストンH4ペプチド（H4P39）と共に37℃で60分間インキュベートした後、10μg/mlヨウ化プロピジウム（PI）を加えてRTで5分間インキュベートした。細胞を洗浄して、PBS中で0.526 mM EDTAによって剥離させて、PI（FL3）陽性染色に関するフローサイトメトリーに供した。
【０１６８】
殺菌活性アッセイ
大腸菌を100μg/mlヒストン、ヒストンH4またはヒストンH4ペプチド（H4P39）と共に37℃で30分間、10 mM HEPES、pH 7.5および0.3％トリプチカーゼダイズブロスを含有するHBSSにおいて振とうさせながらインキュベートした。試料をLB寒天培地において平板培養して、37℃で終夜インキュベートした。ヒストン、ヒストンH4、およびH4P39の殺菌活性を、プレートにおける細菌コロニー数を比較することによって決定した。
【実施例２】
【０１６９】
結果
LPSおよびIFNによって活性化されたマクロファージにおけるEPCRのアップレギュレーションおよびプロテインC活性化
マウス肺組織において最高であるが心臓、腎臓、肝臓、脾臓、および胸腺において低いTM mRNA発現パターンとは異なり、EPCR mRNAは脾臓および他の臓器組織（図1A）において高度に発現される。マウス肺および心臓組織におけるTM mRNAのダウンレギュレーションとは対照的に、EPCR mRNAは、本発明者らが調べた全ての臓器組織においてLPSチャレンジによってアップレギュレートされた（図1B）。免疫沈殿およびウェスタンブロットにより、EPCRタンパク質が脾臓および他の臓器組織において高度に発現されることが確認された（図1C）。これらの結果は、EPCRが内皮細胞のほかに、他の細胞タイプにおいて発現されていることを示した。
【０１７０】
様々なマウス免疫細胞におけるEPCR発現の試験において、本発明者らは、EPCRが、TMのダウンレギュレーション（図2B）とは対照的に、LPSおよびIFNによって腹腔マクロファージにおいて劇的にアップレギュレートされうる（図2A）ことを見いだした。EPCR mRNAはまた、LPSおよびIFN刺激後に大きく増加しており（データは示されない）、細胞表面EPCRアップレギュレーションは、デノボタンパク質合成によることを示唆している。本発明者らは、EPCRが、再構成されたリポソームシステムにおいてトロンビン-TM複合体によるプロテインC活性化をEPCR濃度依存的に（10）増強しうることをこれまでに示したが、本発明者らは本明細書において、LPSおよびIFN刺激後の活性化マクロファージにおけるプロテインC活性化の増強が、EPCR発現レベルに相関すること、EPCRモノクローナル抗体がプロテインC活性化を有効に阻害しうることを見いだした（図3A）。興味深いことに、マウス腹腔マクロファージは、血液凝固第VII因子mRNAを構成的に発現し（データは示されていない）、本発明者らが、これらの細胞に血液凝固第V因子、第X因子、プロトロンビン、およびプロテインCを付加すると、トロンビンおよびAPCはいずれも容易に検出され（図3B）、血液凝固の開始、増幅、および停止が、内因性の組織因子および血液凝固第VII因子によってマクロファージの同じ細胞において起こりうることを示唆している。この場合も、この状況下でのプロテインC活性化も同様に、LPSおよびIFNによって刺激された活性化マクロファージにおいて大きく増加した（図3C）。プロトロンビンまたはプロテインC活性化は、第V因子または第X因子（データは示していない）の非存在下では検出されなかった。
【０１７１】
APCは活性化マクロファージから放出されたヒストンH4を切断する。
次に、本発明者らは、APCが、抗凝固剤として以外に活性化マクロファージに対して何らかの役割を果たしうるか否かを問うた。本発明者らは、LPSおよびIFN活性化マウスマクロファージRAW264.7細胞を組み換え型ヒトAPCと共にインキュベートしたところ、ヒストンH4が条件培地に放出されて、APCによって切断されることを見いだした（図4A）。ウェスタンブロットにおいて用いられるmAb BWA3のエピトープは、ヒストンH2AおよびヒストンH4（Monestier et al., 1993）の双方のN末端に存在する。ヒストンH4のみがこの条件で検出され、ヒストンH2Aは検出されなかった（図4A）。精製ヒストンH4も同様にAPCによって切断され、4〜7 KD断片のクラスタをSDS-PAGEにおいて見いだすことができた（図4B）。これらのヒストンH4断片の質量分析により、APCによって生成されたこれらのペプチド切断部位が同定された（表2）。
【０１７２】
（表２）質量分析はAPCによって生成されたヒストンH4切断部位を決定する
2011503012.tif 000004
【０１７３】
APCによるヒストンH4の切断は、ヒストンH4殺菌および細胞障害活性をモジュレートする。
これまでに、核ヒストンタンパク質は、異なる条件で単球および好中球が含まれる様々な細胞の表面上で検出されうることが、多くの報告により示された（Herren et al., 2006；Radic et al., 2004；Emlen et al., 1992；Brinkmann et al., 2004）。本試験において、本発明者らは、ヒストンH4が、LPSおよびIFNによって刺激されたマウスマクロファージから条件培地に放出されうることを見いだした。細胞外ヒストンは、抗菌性であるのみならず、哺乳動物細胞に対して細胞障害性であることから（Hirsch, 1958；Abakushin et al., 1999；Currie et al., 1997；Kleine et al., 1997）、本発明者らは、ヒストンのAPCによる切断がこれらの活性をモジュレートしうるか否かを問うた。本発明者らは、2つの大腸菌株をヒストン、ヒストンH4、およびAPCによって生成された1つのヒストンH4P39ペプチド（残基40〜78位）によって処置して、その殺菌活性を測定した。図5A〜Dは、H4P39が、ヒストンおよびヒストンH4より有効に双方の大腸菌の株を殺すことを示している。対照的に、H4P39ペプチドは、ヒストンおよびヒストンH4より内皮細胞に対してかなり低減された細胞障害性を有した（図5C）。H4P39ペプチドを致死量のLPSと共に同時注射すると、敗血症の致死からマウスを有意にレスキューした（図5D）。これらの結果は、H4P39ペプチドが感染疾患を処置するために、特に抗生物質抵抗性病原体を処置するために潜在的治療薬である可能性があることを示している。この試験はまた、細胞外ヒストン活性のモジュレーションが、その抗凝固活性およびPAR-1媒介シグナル伝達とは無関係にその抗炎症および細胞保護効果をAPCが発揮する追加の機序である可能性があることを示唆している。
【０１７４】
ヒストンによるインターロイキンのアップレギュレーションは、APCによって遮断される。
本発明者らは、ヒストンがプロテインC活性化を劇的にダウンレギュレートすることによって内皮の抗凝固活性を減少させることができること（図7）、ならびにIL-6およびIL-8産生をアップレギュレートすることによって内皮の前炎症活性を増加させること（図8〜9）を示した。ヒストンによるIL-6およびIL-8産生のアップレギュレーションは、ヒストンH3またはH4によって再現することができるが、抗TLR-2および抗TLR-4抗体によって部分的に阻害され、ヒストンがTLR-2およびTLR-4を通してシグナルを伝達する可能性があることを示唆している。しかし、内皮におけるヒストン-TLR媒介シグナル伝達の正確な機序は、LPSおよびPam3CSK4（合成細菌リポタンパク質ペプチド）がこの無血清培養条件で効果を有さないことから、細菌病原体TLRシグナル伝達経路とはおそらく異なる（図8〜9）。この場合も、APCは、IL-6およびIL-8産生に及ぼすヒストンの効果を完全に阻害する（図8〜9）。ヒト胎児腎293細胞はTLRを発現しない。TLR刺激は、所定のTLRを発現する293細胞におけるNF-κB活性化を査定することによって試験することができる。本発明者らは、ヒストンがTLR-2およびTLR-4のみを刺激して、TLR-3およびTLR-5、TLR-7、TLR-8、またはTLR-9を刺激しないことを見いだしている（図10）。これらの結果は、ヒストンがTLR-2およびTLR-4に関する内因性のリガンドである可能性があること、ならびにアテローム性動脈硬化症のような慢性の心血管疾患のみならず腫瘍の血管新生において重要な役割を果たす可能性があることを暗示している。
【０１７５】
ヒストンはまた、インビトロで内皮の透過性を誘導する（図11）。この観察の分子機序は、調査中である。それにもかかわらず、本発明者らは、ヒストン媒介内皮障壁機能障害が、炭疽病が含まれる多くの疾患における、浮腫、血管の漏出、および循環性ショックに関与する可能性があると考えている。
【実施例３】
【０１７６】
材料および方法
方法
ヒトプロテインC、ウシトロンビンおよびラット抗マウスプロテインC mAb（MPC1609）は、標準的な技法に従って本発明者らの研究所において産生された23。ヒト組み換え型APC（Xigris）は、Eli Lillyから購入した。仔ウシ胸腺ヒストン（Sigma）、仔ウシ胸腺ヒストンH1、H2A、H2B、H3、およびH4（Roche）、ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）（Avanti Polar Lipids）、ネズミチフス菌のLPS（Sigma）、マウス組み換え型IFN（Biosource）、ヤギ抗ヒストンH3（Santa Cruz）、およびPPACK（Calbiochem）も同様に購入した。PS/PC（20：80）およびPE/PS/PC（40：20：40）リポソームは、膜押し出し11によって調製した。マウス抗ヒストンH2B（LG2-2）および抗ヒストンH4（BWA-3）mAbは、既に記述されているように24自己免疫マウスから生成された。
【０１７７】
動物
6〜8週齢の雄性C57BL/6マウス（Jackson Lab）をInstitutional Animal Care and Use Committees of the Oklahoma Medical Research Foundationによって承認された動物プロトコルに従って用いた。ヒヒの実験は既に記述されたとおりに行った5。
【０１７８】
細胞培養
マウスマクロファージ細胞株RAW264.7細胞を、10％FBSを添加したRPMI 1640培地において培養した。ヒト内皮細胞株EA.hy926細胞を10％FBSおよびHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加したDMEMにおいて培養した。マウス内皮細胞株bEnd3細胞を10％FBSを添加したDMEMにおいて培養した。
【０１７９】
刺激されたマクロファージからのタンパク質の同定
RAW264.7細胞を1μg/ml LPSおよび20 ng/ml IFNによって24時間刺激して、PBSによって洗浄し、Opti-MEM培地（Invitrogen）において100 nMヒトAPCの存在下または非存在下で24時間培養した。条件培地を0.22μmフィルターを通して濾過して、Amicon Ultra 10,000（Millipore）によって80倍濃縮した。タンパク質のバンドを、SDS-PAGE後にPVDFメンブレン（Immobilon-P、Millipore）に電気的に転写して、GelCode Blue（PIERCE）によって染色して、エドマン分解（Applied Biosystems）によってシークエンシングした。
【０１８０】
ヒストン細胞障害アッセイ
EA.hy926細胞を、Opti-MEM培地において100 nMプロテインC、APC、または10 nMトロンビンと混合してまたは混合せずに、濃縮条件培地または様々なヒストンと共に37℃で表記の時間インキュベートして、10μg/ml PIを加えた後室温で5分間インキュベートした。細胞を洗浄して、PBS中で0.526 mM EDTAによって剥離させて、PI染色に関するフローサイトメトリーに供した。
【実施例４】
【０１８１】
結果
敗血症の病因に関係する潜在的生理的メディエーターおよびそれによってAPCがインビボでその保護効果を発揮する凝固因子以外の分子標的を探索するために、本発明者らは、LPSおよびインターフェロンγ（IFN）活性化ネズミマクロファージRAW264.7細胞を組み換え型ヒトAPCの存在下または非存在下で培養した。内皮に対する細胞障害性を2つの条件培地のあいだで比較した。LPSおよびIFN活性化マクロファージからの条件培地は、ヨウ化プロピジウム（PI）染色によって測定すると、ヒト内皮細胞株EA.hy926に対して毒性であった。APCはこの細胞障害性を低減させた（図12A）。これらの条件培地をSDS-PAGEによって比較すると、APCの存在下で10 kD、13 kD、および15 kDの3つの主要なおよび別個のタンパク質バンドが出現した（図12B）。エドマンシークエンシングにより、10 kDバンドタンパク質のN末端配列として
2011503012.tif 000005
が同定された、これはネズミヒストンH4内部配列（Val21〜Ile34）にマッチする。10 kDタンパク質の最初のアミノ酸（X）は、メチル化リジンとして同定された（データは示していない）。13 kDバンドタンパク質のN末端配列は、KSAPATGGV（SEQ ID NO: 15）であったが、これはネズミヒストンH3内部配列（Lys27〜Lys36）にマッチする。15 kDバンドタンパク質のN末端配列は、直接エドマンシークエンシングによって決定できなかった。ゲルトリプシン消化後、MS/MSにより、このタンパク質バンドにおいて3つのペプチド配列
2011503012.tif 000006
が同定されたが、これはネズミヒストンH2Aタンパク質配列（アミノ酸21〜29、82〜88、および100〜118位）にマッチする。これらのデータは、活性化マクロファージから放出された細胞外ヒストンが内皮に対して細胞障害性であること、およびAPCがこれらのヒストンを切断することによって細胞保護的となりうることを示唆した。ヒストンH3の同定は、抗ヒストンH3抗体を用いてウェスタンブロッティングによって確認した（図12D）。APCと共に培養した活性化マクロファージの条件培地に存在するヒストン断片の明白な増加は、APCが培地中の可溶性細胞外ヒストンを切断するのみならず、活性化細胞に会合したヒストンも切断しうることを示している。
【０１８２】
ヒストンが内皮に対して毒性であるか否か、およびAPCがヒストンの細胞障害性を低減できるか否かを決定するために、本発明者らはヒストンの混合物または個々のヒストン5個によってEA.hy926細胞を処置した。図13Aは、ヒストンの混合物が内皮に対して非常に細胞障害性であること、およびこの毒性が主にヒストンH3およびH4によることを示している。APCを含めると、この細胞障害性を劇的に低減させた（図13D）。
【０１８３】
APCが精製システムにおいてヒストンを切断できるか否かを調べるために、本発明者らは精製ヒストンH3またはH4をAPCと共にインキュベートした。APCはヒストンH3およびH4を用量依存的に切断した（図13C）。ホスファチジルエタノールアミン（PE）を含有するリポソームは、APCによるヒストン切断を劇的に増強し（図13D）、これは血液凝固第Va因子のAPC不活化に及ぼすPEの効果と類似であった（Smirnov & Esmon, 1994）。この脂質混合物はおそらく、傷害または強力なアゴニストに対する曝露後の細胞表面膜の模倣体である。
【０１８４】
ヒストンの細胞障害性は、ヒストン濃度に依存する（図14A）。10 nMおよび100 nM APCはヒストンの低濃度（25μg/ml）の細胞障害性を有効に低減することができるが、50 μg/mlでのヒストンの細胞障害性を有効に低減するのは100 nM APCのみである（図14A）。ヒストン（50μg/ml）およびAPC（100 nM）をわずか5分間プレインキュベートしただけで、ヒストンの細胞障害性のほとんどが消失する（図14B）。ヒストンに対するAPCのこの細胞保護効果は、ヒストンを分解することによって媒介される（図14C）。APCはヒストンとのプレインキュベーション後にPPACKによって不活化されたことから（Riewald et al., 2002）、細胞保護は、内皮におけるAPC媒介PAR1シグナル伝達とは無関係である。プロテインCは内皮におけるトロンボモジュリン-トロンビン複合体によってAPCに変換される。本発明者らは、プロテインCまたはトロンビンのいずれかだけでは内皮細胞がヒストンの細胞障害性から保護されないことを見いだした。保護は、プロテインCとトロンビンの双方が存在する場合に限って観察された。これらの条件下で、プロテインCの約6％が活性化された（図14Dおよびデータは示していない）。完全に活性化されたプロテインCは最善の保護を提供した（図14D）。
【０１８５】
細胞外ヒストンが疾患の病因に関与する可能性があるか否かおよびAPCがこれらのヒストンをインビボで切断できるか否かを調べるために、本発明者らは、ヒヒに致死量の大腸菌をチャレンジした敗血症の非ヒト霊長類モデル（Taylor et al., 1987）からの凍結された保管血漿試料を検査した。APCの注入は、これらの動物をレスキューした（Taylor et al., 1987）。本発明者らは、注入APCの非存在下または存在下で、致死量の大腸菌をチャレンジした動物からの血漿における細胞外ヒストンを測定した。致死量の大腸菌をチャレンジしたヒヒ2例の血漿において、無傷のヒストンH3がウェスタンブロットによって検出され、これはチャレンジ後8時間で約15μg/mlに達した（図14E）。本発明者らは、抗ヒストン抗体が適切な感受性を有さなかったために、同じように他のヒストンを測定することができなかった。ヒストンH3の増加は、チャレンジ後8時間での高い血清クレアチニンレベル、2.65±0.05 mg/dL（正常範囲：0.7〜1.4 mg/dL）によって示されるように急性腎不全の発症を伴った。無傷のおよび切断されたヒストンH3はいずれも、致死量の大腸菌をチャレンジされてAPCを投与された動物2例の血漿において観察され、APCがインビボで細胞外ヒストンを切断することができ、おそらくその細胞障害性を減少させることができることを示している（図14E）。APCの同時注入は、チャレンジ後8時間での正常な血清クレアチニンレベル1.15±0.15 mg/dLによって示されるように、腎機能を保護した。循環中の細胞外ヒストンのAPCによる切断は、それによって内皮をヒストン細胞障害性から保護し、敗血症におけるその有益な効果に関与する新しい機序であるように思われる。
【０１８６】
インビボでのヒストンの毒性効果を調べるために、本発明者らは、75 mg/kgヒストンをマウスに静脈内注射した。マウスは全て（n＝5）、注射の1時間以内に死亡した。組み換え型APC（APC 5 mg/kg）を同時注射すると、同じ致死量のヒストンをチャレンジした全てのマウス（n＝5）をレスキューした（データは示していない）。致死量のヒストンを注射されたマウスの循環中における計算されたヒストンH3濃度は、大腸菌をチャレンジした8時間後にヒヒの血漿において検出されたヒストンH3レベルより約5倍高い。注射された外因性のヒストンは、半減期1分未満で急速に消失し（データは示していない）、注入において用いられるより高いレベルは、1分より長いあいだ病理的に観察されるレベルを維持することができないであろうことを意味している。インビボでマウスをレスキューするために用いられるAPC対ヒストンH3の比は、インビトロで内皮細胞保護実験において用いられるAPC対ヒストンH3の比と類似である。
【０１８７】
敗血症応答の進行における細胞外ヒストンの病理学的重要性を調べるために、本発明者らは、抗ヒストンH4 mAbを高用量のLPSと共に同時注入した（図15A）。抗ヒストンH4 mAbはLPSに対する致死応答からマウスを保護して、ヒストンH4が敗血症における傷害の主要なメディエーターであることを示している。内因性のAPCによるヒストン細胞障害性の阻害が、敗血症モデルにおける死亡からの保護において重要な役割を実際に果たしているか否かを調べるために、本発明者らは、抗マウスプロテインC mAbの非存在下または存在下で低用量のLPSをマウスにチャレンジした。このmAbはプロテインC活性化をインビトロおよびインビボの双方で遮断して（データは示していない）、非致死量のLPSを致死量のLPS量に変換した（図15B）。この結果は、重度のプロテインC欠損に対して遺伝的に素因を有するマウスでは急性炎症が悪化するという最近の知見（Lay et al., 2007）、および重度のプロテインC欠損症が敗血症患者における早期の死亡に関連するという臨床での観察（Macias & Nelson, 2004）と一貫する。抗ヒストンH4 mAbの同時注入は、LPSおよびプロテインC活性化の遮断によって引き起こされる致死からマウスを有効にレスキューし（図15B）、細胞外ヒストンのターゲティングが、それによって内因性のAPCがこの敗血症モデルにおいてマウスを保護する追加の機序であることを暗示している。対照的に、抗ヒストンH2B mAbは、マウスをレスキューすることができず、ヒストンH4がこのモデルにおけるヒストン細胞障害性の主要な関与因子であることを示唆しており、これはインビトロで他のヒストンよりヒストンH4の強い細胞障害性と一貫する（図13A）。ヒストンH3は、LPSに加えてプロテインC mAbをチャレンジしたマウスからの血漿において検出されたが、LPS単独では検出されず（図15C）、インビボでの細胞外ヒストンレベルの調節におけるAPCの極めて重要な役割をさらに証明している。
【実施例５】
【０１８８】
ヒヒモデルにおける敗血症の処置
細胞外ヒストンの阻害による敗血症の処置を、ヒヒを抗ヒストンH4 mAb（BWA-3）によって前処置したヒヒモデルにおいて調べた。ヒヒに、感染の開始前に抗ヒストンH4（10 mg/kg）を30分間注入した。注入の30分後、ヒヒに致死量の大腸菌（大腸菌2×1010個/kg）を2時間注入して、その後感染症の徴候に関してモニターした。致死量にもかかわらず、ヒヒは7日間生存して、その後病理試験のために屠殺した。病理報告書は、いくつかの軽度から最小の変化を除き、評価した臓器は本質的に正常であるように思われることを示した。敗血症プロセスの証拠は認められなかった。
【０１８９】
本明細書において開示および特許請求された組成物および方法は全て、本開示に照らして過剰な実験を行うことなく作出され、実行されうる。本発明の組成物および方法を、好ましい態様に関して記述してきたが、組成物および方法に、ならびに本明細書において記述される方法の段階または段階の順序に、変化を適用してもよく、それらも本発明の概念、趣旨、および範囲に含まれることは当業者に明らかであろう。より具体的に、化学的および生理学的に関連する特定の剤を、本明細書において記述される剤の代わりに用いてもよく、それでも同じまたは類似の結果が達成されるであろうことは明らかであろう。当業者に明らかであるそのような類似の置換および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、および概念に含まれると思われる。
【０１９０】
VI．参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書において記載した内容に対する補助として例示的な技法または他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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