(57)【要約】   がんの治療、予防または緩和のための抗ＴＡＺ剤を提供する。個体におけるまたは個体から採取したサンプルにおけるＴＡＺ発現を検出するための手段を含む、個体における乳がんまたは個体の乳がんへの罹病性を検出するためのキット、ならびにがん細胞の検出方法（この方法は、該細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性の調節を検出することを含む）をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんの治療、予防または緩和のための抗ＴＡＺ剤。
【請求項２】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５６２８７として示されるＴＡＺ配列、またはその配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の発現、量または活性の任意の組み合わせをダウンレギュレートすることができる、請求項１に記載の抗ＴＡＺ剤。
【請求項３】
前記がんが、乳がんを含む、請求項１または２に記載の抗ＴＡＺ剤。
【請求項４】
前記がんが、浸潤または転移がん、例えば、浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）を含む、請求項１、２または３のいずれかに記載の抗ＴＡＺ剤。
【請求項５】
短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含むようなＲＮＡ干渉によってＴＡＺをダウンレギュレートする、前記いずれかの請求項に記載の抗ＴＡＺ剤。
【請求項６】
ｓｈＲＮＡ１（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＧＡＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＣ−３’）、ｓｈＲＮＡ  ６５０（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’）またはｓｈＲＮＡ  ６５２（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’）を含む、前記いずれかの請求項に記載の抗ＴＡＺ剤。
【請求項７】
ＴＡＺのアミノ酸１６０−２２９に対するウサギ抗ＴＡＺ抗体、ウサギ抗ＴＡＺ抗体（カタログ番号２１４９Ｓ、米国、マサチューセッツ州、ダンヴァーズのＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクローナル抗ＴＡＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−５８３５９ＳＳ、米国、コロラド州、リトルトンのＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、マウスモノクローナル抗ＴＡＺ［１Ｂ１０］（カタログ番号Ｈ００００６９０１−Ｍ１２、米国、コロラド州、リトルトンのＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ウサギ抗ヒトＴＡＺポリクローナル抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｂ９４、米国、ワシントン州、シアトルのＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはｐ−ＴＡＺ（Ｓｅｒ  ８９）−Ｒ（カタログ番号ｓｃ−１７６１０−Ｒ、米国、カリフォルニア州、サンタクルーズのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から成る群より選択されるような抗ＴＡＺ抗体を含む、前記いずれかの請求項に記載の抗ＴＡＺ剤。
【請求項８】
ｓｈＲＮＡ６５０（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’）、ｓｈＲＮＡ６５２（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’）、５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’、５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’、もしくはそれらの相補鎖、を含む核酸、またはいずれかのそのような配列に特異的にハイブリダイズすることができる核酸。
【請求項９】
場合によってはＹＡＰ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００６０９７）またはその配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、例えばＧＳＴ−ＹＡＰ、を含むポリペプチドとの組み合わせでの、ＴＡＺのアミノ酸１６０−２２９に対するウサギ抗ＴＡＺ抗体。
【請求項１０】
例えば、浸潤性乳がんなどのがんのためのモデルとして使用するための、ＭＣＦ１０Ａ−ＴＡＺ、ＭＣＦ７−ＫＤ−１、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５０、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５２またはＨｓ５７８Ｔ−ＫＤ−６５２細胞または細胞株。
【請求項１１】
個体における乳がんまたは該個体の乳がんへの罹病性を検出するためのキットであって、該個体におけるまたは個体から採取したサンプルにおけるＴＡＺ発現の検出手段を含む、キット。
【請求項１２】
前記検出手段が、ＴＡＺポリヌクレオチドもしくはその断片；ＴＡＺ核酸もしくはその断片に対する相補ヌクレオチド配列；ＴＡＺポリペプチドもしくはその断片、またはＴＡＺのアミノ酸１６０−２２９に対する抗体を含み得る抗ＴＡＺ抗体、および場合によっては使用のための説示から成る群より選択される、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
請求項１から７のいずれかに記載の抗ＴＡＺ剤をさらに含む、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
タモキシフェンまたはハーセプチンを含むような、乳がんの治療、予防または緩和のための治療薬をさらに含む、請求項１１、１２、または１３に記載のキット。
【請求項１５】
細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性の調節を検出することを含む、がん細胞の検出方法。
【請求項１６】
前記がんが、乳がん、例えば、浸潤または転移がん、例えば浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴＡＺの発現が、非がん性であることがわかっている対照細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性と比較される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞におけるＴＡＺ発現、量または活性のアップレギュレーションを検出することを含む、請求項１５、１６または１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１５４７２として示される配列、またはそのような配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する核酸の、少なくとも一部分を含むプローブによるようなＴＡＺ核酸の検出を含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
請求項７に記載の抗ＴＡＺ抗体によるようなＴＡＺポリペプチドの検出を含む、請求項１５から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＩＧＦＢＰ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、ＦＳＴＬ１、ＦＮ１、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２ＡＸＬ、ＩＴＧＢ２、ＣＲＩＭ１およびＡｌｃａｍから成る群より選択される１つ以上のタンパク質の発現の検出を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｅｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓ改良型Ｓｃａｒｆｆ−Ｂｌｏｏｍ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎグレード分類システム（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＧＳ））を使用することによるような組織学的グレード分類をさらに含む、請求項１５から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性の調節を検出することを含む、細胞の増殖状態を判定する、または細胞が浸潤性または侵襲性になる可能性を判定する方法。
【請求項２４】
がんを有する個体の生存率を予測する方法であって、該個体の細胞におけるＴＡＺの発現の調節を検出することを含む方法。
【請求項２５】
がんを有する個体のための療法を選択する方法であって、該個体の細胞におけるＴＡＺの発現の調節を検出して、該がんの侵襲性に基づき適切な療法を選択することを含む方法。
【請求項２６】
がんを有する個体において特定の療法が成功する可能性を判定する方法であって、該療法と請求項２５に記載の方法によって決定された療法とを比較することを含む方法。
【請求項２７】
請求項１６から２２のいずれかに記載の特徴をさらに含む、請求項２３から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性を調節することを含む、がん細胞を操作する方法。
【請求項２９】
前記がんが、乳がん、例えば、浸潤または転移がん、例えば浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記操作の結果として、前記がん細胞が非がん性になる、または前記浸潤もしくは転移がん細胞が非浸潤性もしくは非転移性になる、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
細胞におけるＴＡＺ発現、量または活性をダウンレギュレートすることを含む、請求項２８、２９または３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ＴＡＺに特異的に結合することができるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡに前記細胞を曝露することを含む、請求項２８から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
ｓｈＲＮＡが、請求項６に記載のｓｈＲＮＡを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項７に記載の抗ＴＡＺ抗体に前記細胞を曝露することを含む、請求項２８から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）細胞において増加したＴＡＺ発現、量または活性を検出する段階；および（ｂ）該細胞におけるＴＡＺのレベルを低下させる段階を含む、細胞を操作する方法。
【請求項３６】
ＫＤ−１（５’−ＧＡＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＣ−３’）、ＫＤ−６５０（５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’）またはＫＤ−６５２（５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’）から選択されるＴＡＺ標的部位のターゲッティングを含む、ＴＡＺの発現を調節する方法。
【請求項３７】
（ａ）ＴＡＺポリペプチドと候補分子を接触させ、該候補分子が該ＴＡＺポリペプチドに結合するかどうかを判定すること；または
（ｂ）細胞と候補分子を接触させ、該細胞のもしくは該細胞におけるＴＡＺの上昇もしくは低下した発現、量もしくは活性を検出すること
を含む、ＴＡＺポリペプチドに結合することができる分子を同定する方法。
【請求項３８】
ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３またはＴＥＡＤ４を含むＴＥＡＤポリペプチドにＴＡＺを結合させること、および候補分子の存在によるそのような結合の調節を検出することを含む、ＴＡＺポリペプチドの調節因子を同定する方法。
【請求項３９】
候補分子が、ＴＡＺ１／ＷＷＴＲまたはそれとの少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストであるかを判定することを含む、がんの治療、予防または緩和に適する分子を同定する方法。
【請求項４０】
前記がんの治療、予防または緩和に適する分子を同定する方法における、ＴＡＺまたはそれとの少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の使用。
【請求項４１】
候補分子をＴＡＺポリペプチドまたはＴＡＺポリペプチドを発現する細胞に曝露して、該候補分子がそのアゴニストまたはアンタゴニストであるかを判定する、請求項３９または４０に記載の方法または使用。
【請求項４２】
がんの治療、予防または緩和に適する分子の同定のための、ＴＡＺポリヌクレオチドまたはそれとの少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の使用。
【請求項４３】
候補分子を動物に投与すること、および該動物が増加または減少したＴＡＺ発現、量または活性を示すかどうかを判定することを含む、ＴＡＺまたはそれとの少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法。
【請求項４４】
レトロウイルスベクターなどの、請求項８に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項４５】
請求項８に記載したような核酸または請求項４４に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４６】
請求項４５に記載の宿主細胞を含む、非ヒト動物。
【請求項４７】
個体の細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性を調節することを含む、個体におけるがんの治療、予防または緩和方法。
【請求項４８】
前記個体の乳房細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性が、減少される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
個体におけるがんまたはがんへの罹病性の診断方法であって、該個体の細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性の調節を検出することを含む方法。
【請求項５０】
がんを有する個体の予後判定方法であって、該個体の細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性の調節を検出することを含む方法。
【請求項５１】
個体における腫瘍が、浸潤性または転移性腫瘍であるかどうか、またはそうである可能性が高いかどうかを判定する方法であって、該個体の腫瘍細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性の調節を検出することを含む方法。
【請求項５２】
個体におけるがんの治療、予防または緩和方法であって、該個体の細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性の調節を検出すること、およびその腫瘍の侵襲性に基づいて該個体に適切な療法を施与することを含む方法。
【請求項５３】
前記がんが、乳がん、例えば、浸潤または転移がん、例えば浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）を含む、請求項４７から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記診断、予後判定または療法選択が、前記腫瘍のサイズもしくはリンパ節病期または両方を、場合によっては他の危険因子と共にまたは併せて評価することにより、さらに判定される、請求項４７から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記診断、予後判定または療法選択が、前記腫瘍のエストロゲン受容体（ＥＲ）状態を評価することによってさらに判定される、請求項４７から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
個体におけるがん、例えば乳がんの治療、予防または緩和方法において使用するためのＴＡＺ。
【請求項５７】
請求項３７から４３のいずれかに記載の方法または使用によって同定されるＴＡＺポリペプチドの分子、アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項５８】
前記がんの治療、予防または緩和において使用するためのＴＡＺの発現を調節、例えばダウンレギュレートすることができる分子。
【請求項５９】
添付の図面の図１から７に関して上に記載したような、および添付の図面の図１から７に示すような、方法または事。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学および遺伝学の分野に関する。本発明は、医薬の分野に関する。詳細には、疾病、より詳細には乳がんの治療および診断、ならびにそのような用途のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＷＴＲ１としても公知のＴＡＺは、ＰＤＺ結合モチーフを有する１４−３−３結合タンパク質である。ＴＡＺ／ＷＷＴＲ１は、間葉幹細胞分化を調節することが知られている。
【０００３】
ＴＡＺ／ＷＷＴＲ１は、Ｋａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）によって初めてクローニングされた。Ｋａｎａｉは、ＴＡＺのＲＮＡがヒト腎臓において最も高度に発現され、それに心臓、胎盤および肺が続くことを証明した。胸腺および末梢血白血球を除いて、試験したすべての組織において発現が検出された。マウス組織のノーザンブロット分析により、転写産物が腎臓、肺、肝臓および心臓において、および精巣においても、最高レベルで発現したことが証明された。ウエスタンブロット分析は、幾つかの上皮および線維芽細胞株におけるＴＡＺの発現を示したが、ジャーカットＴ細胞では示さなかった。
【０００４】
間葉幹細胞は、幾つかの異なる系統に分化することができる多能性細胞タイプである。２つの重要な転写因子、ＲＵＮＸ２（ＯＭＩＭリファレンス６００２１１）およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲＧ；ＯＭＩＭリファレンス６０１４８７）は、それぞれ、間葉幹細胞を骨芽細胞または脂肪細胞のいずれかに分化させる。Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、ＴＡＺ／ＷＷＴＲ１が、ＰＰＡＲＧ依存性遺伝子転写を抑制しつつＲＵＮＸ２依存性遺伝子転写を共活性化することを発見した。
【０００５】
モデル細胞株、マウス胚性線維芽細胞、ならびに培養でのおよびゼブラフィッシュにおけるインビボでの初代間葉幹細胞においてＴａｚ発現を調節することにより、Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、脂肪形成の可能性に対する骨形成の可能性の変化を観察した。Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、ＴＡＺは、間葉幹細胞分化を調節する分子レオスタットとして機能すると結論付けた。
【０００６】
Ｍｕｒａｋａｍｉ（２００５）は、ＴＡＺが、ＴＢＸ５およびヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）タンパク質と物理的に会合してＴＢＸ５依存性遺伝子活性化を媒介する、強力なＴＢＸ５コアクチベーターとして作用することを証明している。Ｍｕｒａｋａｍｉ（２００５）は、ＴＡＺが心臓および四肢発育中のＴＢＸ５依存性遺伝子の制御に重要な役割を果たすことを示唆している。
【０００７】
Ｈｏｓｓａｉｎ（２００７）は、ＷＷＴＲ１が腎臓の線毛の完全性にとって重要であり、マウスにおけるその不在が腎嚢胞の発現をもたらすことを証明している。Ｈｏｓｓａｉｎ（２００７）は、Ｗｗｔｒ１が人間における多発性嚢胞腎の候補遺伝子の代表であり得ると結論づけている。
【０００８】
西側世界およびアジアの先進国において、乳がんは、女性におけるがん関連死の第二の主要原因である（Ｐｏｌｙａｋ，２００１）。乳がんは、シンガポールでは女性のがんリストの首位を占め、毎年７００−８００の新規症例が診断されている（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ｒｅｐｏｒｔ，２０００）。米国では、毎年、１８０，０００人の女性が、乳がんの新規症例と診断されている（Ｐｏｌｙａｋ，２００１）。よりよい診断および常例的スクリーニングにもかかわらず、該症例の約四分の一が、それらの疾病によって死ぬこととなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
それ故、改善された乳がん検出および治療法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第一の態様に従って、本発明者らは、がんの治療、予防または緩和のための抗ＴＡＺ剤を提供する。
【００１１】
該抗ＴＡＺ剤は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５６２８７として示されるＴＡＺ配列またはその配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の発現、量または活性の任意の組み合わせのダウンレギュレーションが可能であり得る。
【００１２】
該がんは、乳がんを含み得る。該がんは、浸潤または転移がん、例えば浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）を含み得る。該抗ＴＡＺ剤は、ＲＮＡ干渉によって、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含むものによって、ＴＡＺをダウンレギュレートすることができる。
【００１３】
該抗ＴＡＺ剤は、ｓｈＲＮＡ１（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＧＡＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＣ−３’）、ｓｈＲＮＡ６５０（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’）またはｓｈＲＮＡ６５２（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’）を含み得る。
【００１４】
該抗ＴＡＺ剤は、例えば、ＴＡＺのアミノ酸１６０−２２９に対するウサギ抗ＴＡＺ抗体、ウサギ抗ＴＡＺ抗体（カタログ番号２１４９Ｓ、米国、マサチューセッツ州、ダンヴァーズのＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクローナル抗ＴＡＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−５８３５９ＳＳ、米国、コロラド州、リトルトンのＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、マウスモノクローナル抗ＴＡＺ［１Ｂ１０］（カタログ番号Ｈ００００６９０１−Ｍ１２、米国、コロラド州、リトルトンのＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ウサギ抗ヒトＴＡＺポリクローナル抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｂ９４、米国、ワシントン州、シアトルのＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）またはｐ−ＴＡＺ（Ｓｅｒ８９）−Ｒ（カタログ番号ｓｃ−１７６１０−Ｒ、米国、カリフォルニア州、サンタクルーズのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から成る群より選択される、抗ＴＡＺ抗体を含み得る。
【００１５】
本発明の第二の態様に従って、ｓｈＲＮＡ６５０（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’）、ｓｈＲＮＡ６５２（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’）、５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’、５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’、もしくはそれらの相補鎖、を含む核酸、またはいずれかのそのような配列に特異的にハイブリダイズすることができる核酸を提供する。
【００１６】
本発明の第三の態様に従って、本発明者らは、ＴＡＺのアミノ酸１６０−２２９に対するウサギ抗ＴＡＺ抗体を、場合によってはＹＡＰ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００６０９７）またはその配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、例えばＧＡＴ−ＹＡＰ、を含むポリペプチドとの組み合わせで、提供する。
【００１７】
本発明の第四の態様として、例えば、浸潤性乳がんなどのがんのためのモデルとして使用するための、ＭＣＦ１０Ａ−ＴＡＺ、ＭＣＦ７−ＫＤ−１、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５０、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５２またはＨｓ５７８Ｔ−ＫＤ−６５２細胞または細胞株を提供する。
【００１８】
本発明の第五の態様に従って、本発明者らは、個体における乳がんまたはその個体の乳がんへのなり易さを検出するためのキットを提供し、このキットは、その個体におけるまたは個体から採取したサンプルにおけるＴＡＺ発現の検出手段を含む。
【００１９】
該検出手段は、ＴＡＺポリヌクレオチドもしくはその断片；ＴＡＺ核酸もしくはその断片に対する相補ヌクレオチド配列；ＴＡＺポリペプチドもしくはその断片から成る群から選択されるか、または例えばＴＡＺのアミノ酸１６０−２２９に対する抗体を含む抗ＴＡＺ抗体、および任意選択的に使用のための説示から選択することができる。該キットは、本発明の第一の態様による抗ＴＡＺ剤をさらに含む場合がある。該キットは、乳がんの治療、予防または緩和のための治療薬をさらに含む場合があり、例えば、タモキシフェンまたはハーセプチンを含む。
【００２０】
第六の態様において、本発明は、がん細胞を検出する方法を提供し、この方法は、その細胞におけるＴＡＺの発現、量、または活性の調節を検出することを含む。該がんは、乳がん、例えば、浸潤または転移がん、例えば浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）を含み得る。ＴＡＺの発現を、非がん性であることがわかっている対照細胞におけるＴＡＺの発現、量、または活性と比較することができる。
【００２１】
該方法は、該細胞におけるＴＡＺ発現、量、または活性のアップレギュレーションの検出を含む場合がある。該方法は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１５４７２として示される配列またはその配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する核酸の少なくとも一部分を含むプローブによるようなＴＡＺ核酸の検出を含む場合がある。該方法は、ＴＡＺポリペプチドの検出を含む場合がある。該ＴＡＺポリペプチドは、上で述べた抗ＴＡＺ抗体によって検出することができる。
【００２２】
該方法は、ＩＧＦＢＰ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、ＦＳＴＬ１、ＦＮ１、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２ＡＸＬ、ＩＴＧＢ２、ＣＲＩＭ１およびＡｌｃａｍから成る群より選択される１つ以上のタンパク質の発現の検出を含む場合がある。
【００２３】
該方法は、例えば、Ｅｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓ改良型Ｓｃａｒｆｆ−Ｂｌｏｏｍ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎグレード分類システム（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＧＳ））を使用する、組織学的グレード分類をさらに含む場合がある。
【００２４】
細胞におけるＴＡＺの発現、量、または活性の調節を検出することを含む、細胞の増殖状態を判定する、または細胞が浸潤性もしくは侵襲性になる可能性を判定する方法。
【００２５】
本発明の第七の態様において、がんを有する個体の生存率を予測する方法を提供し、この方法は、個体の細胞におけるＴＡＺの発現の調節を検出することを含む。
【００２６】
本発明の第八の態様において、本発明者らは、がんを有する個体のための療法を選択する方法を提供し、この方法は、その個体の細胞におけるＴＡＺの発現の調節を検出して、そのがんの侵襲性に基づき適切な療法を選択することを含む。
【００２７】
本発明の第九の態様に従って、本発明者らは、がんを有する個体において特定の療法が成功する可能性を判定する方法を提供し、この方法は、その療法と上で述べた方法によって決定された療法とを比較することを含む。
【００２８】
本発明の第十の態様に従って、がん細胞を操作する方法を提供し、この方法は、その細胞におけるＴＡＺの発現、量、または活性を調節することを含む。
【００２９】
該がんは、乳がん、例えば、浸潤または転移がん、例えば浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）を含み得る。該操作の結果として、該がん細胞は、非がん性になり得、または、該浸潤もしくは転移がん細胞は、非浸潤性もしくは非転移性になり得る。該方法は、該細胞におけるＴＡＺ発現、量または活性のダウンレギュレーションを含む場合がある。該方法は、ＴＡＺに特異的に結合することができるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡに該細胞を曝露することを含む場合がある。該ｓｈＲＮＡは、上で述べたｓｈＲＮＡを含み得る。該方法は、抗ＴＡＺ抗体への該細胞の曝露を含む場合がある。
【００３０】
本発明の第十一の態様として、本発明者らは、細胞を操作する方法を提供し、この方法は、（ａ）細胞において増加したＴＡＺ発現、量、または活性を検出するステップと、（ｂ）その細胞におけるＴＡＺのレベルを低下させるステップとを含む。
【００３１】
ＫＤ−１（５’−ＧＡＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＣ−３’）、ＫＤ−６５０（５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’）またはＫＤ−６５２（５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’）から選択されるＴＡＺターゲット部位のターゲッティングを含む、ＴＡＺの発現を調節する方法。
【００３２】
本発明の第十二の態様に従って、本発明者らは、ＴＡＺポリペプチドに結合することができる分子を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）ＴＡＺポリペプチドと候補分子を接触させ、その候補分子がそのＴＡＺポリペプチドに結合するかどうかを判定するステップを含むか、または（ｂ）細胞と候補分子を接触させ、その細胞のもしくはその細胞におけるＴＡＺの上昇または低下した発現、量、もしくは活性を検出するステップを含む、ＴＡＺの調節因子を同定する方法を含む。
【００３３】
本発明の第十三の態様に従って、本発明者らは、ＴＡＺポリペプチドの調節因子を同定する方法を提供し、この方法は、ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３またはＴＥＡＤ４を含むＴＥＡＤポリペプチドにＴＡＺを結合させるステップと、候補分子の存在によるそのような結合の調節を検出するステップとを含む。
【００３４】
本発明の第十四の態様に従って、がんの治療、予防または緩和に適する分子を同定する方法を提供し、この方法は、候補分子が、ＴＡＺ１／ＷＷＴＲまたはそれとの少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストであるかを判定するステップを含む。
【００３５】
本発明の第十五の態様に従って、本発明者らは、がんの治療、予防または緩和に適する分子を同定する方法における、ＴＡＺまたはそれとの少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の使用を提供する。ＴＡＺポリペプチドまたはＴＡＺポリペプチドを発現する細胞に候補分子を曝露して、その候補分子がそのアゴニストまたはアンタゴニストであるかを判定することができる。
【００３６】
本発明の第十六の態様に従って、本発明者らは、がんの治療、予防または緩和に適する分子の同定のための、ＴＡＺポリヌクレオチドまたはそれとの少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の使用を提供する。
【００３７】
本発明の第十七の態様に従って、本発明者らは、ＴＡＺまたはそれとの少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法を提供し、この方法は、候補分子を動物に投与するステップと、その動物が増加または減少したＴＡＺの発現、量、または活性を示すかどうかを判定するステップとを含む。
【００３８】
本発明の第十八の態様に従って、本発明者らは、レトロウイルスベクターなどの、上で述べたような核酸を含む発現ベクターを提供する。本発明の第十九の態様に従って、本発明者らは、上で述べたような核酸または上で述べたような発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明の第二十の態様に従って、本発明者らは、上で述べたような宿主細胞を含む非ヒト動物を提供する。
【００３９】
本発明の第二十一の態様に従って、本発明者らは、個体におけるがんの治療、予防または緩和方法を提供し、この方法は、個体の細胞におけるＴＡＺの発現、量、または活性を調節するステップを含む。その個体の乳がん細胞におけるＴＡＺの発現、量、または活性を減少させることができる。
【００４０】
本発明の第二十二の態様に従って、本発明者らは、個体におけるがんまたはがんへのなり易さの診断方法を提供し、この方法は、その個体の細胞におけるＴＡＺの発現、量、または活性の調節を検出するステップを含む。
【００４１】
本発明の第二十三の態様に従って、本発明者らは、がんを有する個体の予後判定方法を提供し、この方法は、その個体の細胞におけるＴＡＺの発現、量、または活性の調節を検出するステップを含む。
【００４２】
本発明の第二十四の態様に従って、本発明者らは、個体における腫瘍が、浸潤性または転移性腫瘍であるかどうか、またはそうである可能性が高いかどうかを判定する方法を提供し、この方法は、その個体の腫瘍細胞におけるＴＡＺの発現、量、または活性の調節を検出するステップを含む。
【００４３】
本発明の第二十五の態様に従って、本発明者らは、個体におけるがんの治療、予防または緩和方法を提供し、この方法は、その個体の細胞におけるＴＡＺの発現、量、または活性の調節を検出すること、およびその腫瘍の侵襲性に基づいてその個体に適切な療法を施与するステップを含む。該がんは、乳がん、例えば、浸潤または転移がん、例えば浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）を含み得る。該腫瘍のサイズ、もしくはリンパ節病期、または両方を、場合によっては他の危険因子と共にまたは併せて評価することによって、該診断、予後判定または療法の選択をさらに判定することができる。該腫瘍のエストロゲン受容体（ＥＲ）状態を評価することによって、該診断、予後判定または療法選択をさらに判定することができる。
【００４４】
本発明の第二十六の態様に従って、本発明者らは、個体におけるがん、例えば乳がん、の治療、予防または緩和方法において使用するためのＴＡＺを提供する。
【００４５】
本発明の第二十七の態様に従って、本発明者らは、上で述べたような方法または使用によって同定されるＴＡＺポリペプチドの分子、アゴニストまたはアンタゴニストを提供する。
【００４６】
本発明の第二十八の態様に従って、本発明者らは、該がんの治療、予防または緩和において使用するためのＴＡＺの発現を調節、例えばダウンレギュレートすることができる分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＴＡＺは、高浸潤性乳がん細胞において優先的に過発現される。図１Ａは、１１の乳がん細胞株から得た溶解産物を、ＹＡＰともよく反応する抗ＴＡＺ抗体（上のほうのパネル）または抗ＹＡＰ抗体（下のほうのパネル）を使用してウエスタンブロットによって分析する。抗アクチン抗体によって検出されるアクチンレベルをローディング対照として使用する。図１Ｂは、ＴＡＺおよびＹＡＰの発現レベルを３回の独立した実験で定量し、その平均をアクチンに相対して任意単位として提示する。
【図２】ＴＡＺは、ＭＣＦ１０Ａ細胞の移動および浸潤を促進する。図２Ａは、ＥＧＦＰ（レーン１）、ＴＡＺ（レーン２）またはＦｌａｇ−ＴＡＺ（レーン３）を発現するレトロウイルスを形質導入したＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＴＡＺのレベルをウエスタンブロットによって評価する。Ｈｓ５７８Ｔ（レーン４）およびＢｔ−５４９（レーン５）細胞におけるＴＡＺのレベルを比較対象として評価する。図２Ｂは、ＥＧＦＰを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞（左のパネル）およびＴＡＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞（右のパネル）についての創傷治癒移動アッセイ。時間０、１４時間および２４時間の時点で移動細胞による創傷の治癒を撮像する。ＴＡＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞の方が、ＥＧＦＰを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞より運動性であり、紡錐形線維芽細胞様の外観であり、速く移動する。図２Ｃは、ＥＧＦＰおよびＴＡＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞の移動（左のパネル）および浸潤（右のパネル）をトランスウエルアッセイによって評価する。カラム、３回の独立した実験の平均；バー、ＳＥＭ。
【図３】ＭＣＦ７細胞におけるＴＡＺノックダウンは、上皮の形態を強化し、Ｈｓ５７８Ｔ細胞では細胞移動および浸潤を抑制する。図３Ａは、ＴＡＺのｍＲＮＡの異なる部位をターゲットにするベクター（レーン１）および様々なｓｈＲＮＡ（レーン２−６）を形質導入したＭＣＦ７（左のパネル）およびＨｓ５７８Ｔ（右のパネル）細胞におけるＴＡＺの発現レベルをウエスタンブロットによって評価する。ｓｈＲＮＡ−６５２は、ＭＣＦ７細胞においても、Ｈｓ５７８Ｔ細胞においても、ＴＡＺ発現の抑制に最もよく効く。図３Ｂは、ＭＣＦ７細胞におけるＴＡＺノックダウンは、細胞がより高密度に詰め込まれたクラスターおよび細胞の緻密なシートを生じさせる結果となる。低から中密度でプレーティングすると、ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５細胞も、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞も、細胞のクラスターとして成長した。しかし、それらのクラスターの細胞密度は、ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５細胞（パネルａ）に比べてＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞（パネルｂ）の方が明らかに上昇した。走査電子顕微鏡は、ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５細胞（パネルｃ）に比べてＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞（パネルｄ）の方が細胞間の空間が縮小されることを示した。その結果、ＴＡＺ発現をノックダウンさせたとき、より緊密に配列された／詰め込まれた緻密な上皮の外観を生じた。図３Ｃは、Ｈｓ５７８Ｔ細胞におけるＴＡＺノックダウンは、細胞移動を抑制する。Ｈｓ５７８Ｔ−ＫＤ−７１５（左のパネル）およびＨｓ５７８Ｔ−ＫＤ−６５２（右のパネル）細胞についての創傷治癒移動アッセイを行う。時間０、６時間および１２時間の時点で移動細胞による創傷の治癒を撮像する。ＴＡＺノックダウンを有するＨｓ５７８Ｔ−ＫＤ−６５２細胞の方が、親Ｈｓ５７８Ｔ細胞およびベクター導入Ｈｓ５７８Ｔ細胞と同様に移動を有するＨｓ５７８Ｔ−ＫＤ−７１５細胞と比較して、はるかに低減された運動性を有する。Ｄ、Ｈｓ５７８Ｔ−ＫＤ−７１５およびＨｓ５７８Ｔ−ＫＤ−６５２細胞の移動（左のパネル）および浸潤（右のパネル）をトランスウェルアッセイによって評価する。カラム、独立した３回の実験の平均；バー、ＳＥＭ。
【図４】ＭＣＦ７細胞におけるＴＡＺノックダウンは、軟寒天における足場非依存性成長およびヌードマウスにおける腫瘍形成を抑制する。図４Ａは、ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５（上のパネル）およびＭＣＦ７−ＫＤ−６５２（下のパネル）細胞の軟寒天成長を評価し、写真撮影する。図４Ｂは、ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５（左のパネル）およびＭＣＦ７−ＫＤ−６５２（右のパネル）細胞の軟寒天における生コロニーの外観を、より増殖活性が高い時に写真撮影する。図４Ｃは、ヌードマウスの大腿（左のパネル）または脂肪パッド（右のパネル）におけるＭＣＦ７−ＫＤ−７１５（右側）およびＭＣＦ７−ＫＤ−６５２（左側）細胞の腫瘍形成を評価し、写真撮影する。
【図５】ＴＡＺは、浸潤性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）（浸潤性（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ））乳管がん（ＩＤＣ）の際に過発現される。図５Ａは、ウサギ抗ＴＡＺ抗体の特製付け。ＴＡＺの断片（アミノ酸１６０−２２９）に対して、ＴＡＺ抗原領域に対応する１００Ｘの組換えＹＡＰ断片（アミノ酸２０６−２６２）の不在（左のパネル）または存在下で産生させた、アフィニティー精製したウサギ抗体を使用して、ウエスタンブロットにより、示されている細胞から得られた溶解産物を分析する。該抗体は、ＹＡＰ（左のパネル）と交叉反応したが、過剰な量の組換えＹＡＰ断片の存在下ではＴＡＺを特異的に認識した。図５Ｂは、ＴＡＺは、浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）の際に過発現される。正常乳房組織（左のパネル）または乳がん組織（ＩＤＣ）（右のパネル）をＴＡＺ抗体（１００倍過剰な組換えＹＡＰ断片と共にプレインキュベートしたもの）または対照としてのサイトケラチン抗体、いずれかで染色する。ＴＡＺは、ＩＤＣの際に過発現されるが、正常乳房組織ではされない。
【図６】マウスから切除した腫瘍の定量。図６Ａは、ＭＣＦ−ＫＤ−７１５およびＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞をそれぞれ注射した一対のマウスの脂肪パッドから切除した腫瘍を図示する。図６Ｂは、腫瘍重量の定量。ＭＣＦ−ＫＤ−７１５およびＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞を注射したマウスの脂肪パッドから切除した腫瘍を計量し、提示する。バー、ＳＥＭ。
【図７】ＴＡＺノックダウン細胞、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５２、におけるマウスＴＡＺ（ｍＴＡＺ）の発現は、軟寒天でのＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞の成長を有意に回復させる。ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５およびＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞を、ｐＢＡＢＥヒグロマイシンレトロウイルスベクター（対照）、またはｍＴＡＺを発現するレトロウイルスベクター（Ｆｌａｇ−ｍＴＡＺ）に感染させる。ピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）およびヒグロマイシン（５００μｇ／ｍＬ）の存在下での二重選択後、細胞を免疫ブロット分析（図７Ａ）および軟寒天での２週間の成長（図７Ｂ）によって分析する。ＴＡＺ、ＹＡＰおよびＦｌａｇ−ｍＴＡＺを示す。３回の独立した実験からの軟寒天アッセイにおける細胞のコロニー数の定量を図７Ｃに示す。バー、ＳＥＭ。
【図８】ＴＥＡＤ１−４の固定化Ｃ末端領域によるＴＡＺおよびＹＡＰの保持。図Ａおよび図８Ｂは、ＴＡＺが転写因子（ＴＥＡＤ１、２、３および４）と相互作用することを示す。
【図９】ＴＥＡＤとの相互作用のために重要であるＴＡＺにおける残基の同定を示す図である。
【図１０】ＴＡＺ突然変異体の核内蓄積能力を試験する実験の結果を示す図である。
【図１１】足場非依存性成長の駆動に関するＴＡＺ突然変異体の能力を試験する実験の結果を示す図である。
【図１２】分泌タンパク質および表面膜タンパク質の発現を示すＲＴ−ＰＣＲ実験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の実施は、別の指示がない限り、通常の当業者の能力の範囲内である従来の化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学技術を利用することとなる。そのような技術は、文献において説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．Ｉ  ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（Ｅｄｉｔｏｒ）（１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２），１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０５６２−９）；およびＬａｂ  Ｒｅｆ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ，Ｅｄｉｔｅｄ  Ｊａｎｅ  Ｒｏｓｋａｍｓ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ，２００２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ��ｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−６３０−３参照。これらの一般テキストのそれぞれが参照により本明細書に援用されている。
【００４９】
＜乳がんの治療および診断におけるＴＡＺの使用＞
本発明は、ＴＡＺががんにおいてある一定の役割を果たすという初めての立証に基づく。
【００５０】
具体的には、本発明者らは、ＴＡＺが、乳がん細胞の移動、浸潤および腫瘍形成において重要な役割を果たすことを証明する。本発明者らは、実施例において、ＴＡＺがヒト乳がん細胞株において顕著に発現され、一般に、それらの細胞株におけるその発現レベルがそれらのがん細胞の浸潤性および／または侵襲性と相関することを示す。高浸潤性乳がん細胞株、例えば、Ｈｓ５７８Ｔ、ＢＴ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＤＡ−ＭＢ２３１では、高レベルのＴＡＺが検出される。あまり浸潤性でない乳がん細胞株、例えば、ＭＣＦ１０Ａ、ＢＴ２０、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＺＲ７５．１およびＢＴ４７４では、より低いレベルのＴＡＺが検出される。
【００５１】
それ故、ＴＡＺは、基底様、トリプルネガティブおよびＢＲＣＡ１突然変異がんタイプをはじめとする乳がんの検出のためのマーカーとして使用することができる。ＴＡＺ発現レベルを、がん、特に、乳がん、例えば転移性、侵襲性または浸潤性乳がん、の指標として使用することができる。ＴＡＺ発現レベルは、そのようながんの可能性の指標としても使用することができる。従って、本発明者らは、がん、特に乳がんの診断または検出方法を提供する。本発明者らは、そのようながんの侵襲性もしくは浸潤性もしくは転移状態またはこれらの任意の組み合わせの診断および検出方法をさらに提供する。該方法は、タンパク質レベルの分析（例えば、免疫組織化学）またはＲＮＡレベルの分析（例えば、インサイチューハイブリダイゼーションによる）を含むことがある。そのような診断および検出方法を下でさらに詳細に説明する。
【００５２】
本発明者らは、形質転換されていないが不死化されたＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＴＡＺの過発現が、細胞増殖、細胞移動および浸潤を促進することを証明する。Ｈｓ５７８−ｔおよびＭＣＦ７細胞におけるＴＡＺのｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンは、細胞移動および浸潤を抑制する。ＭＣＦ７細胞の軟寒天における足場依存性成長およびインビボ腫瘍形成は、ＴＡＺノックダウンによって抑制される。ＴＡＺを過発現するＭＣＦ１０Ａ細胞から回収した培養基は、細胞移動を促進する。従って、ＴＡＺの過発現は、がん性表現型の原因となる。
【００５３】
それ故、本発明者らは、がんに罹患している個体の治療または予防方法を提供する。乳房細胞の正常な機能を回復させる手段として、ＴＡＺレベルの正常組織におけるレベルへの回復も用いることができる。従って、本発明者らは、乳がんをはじめとするがんの治療のためのＴＡＺ核酸およびポリペプチドの使用を提供する。本発明者らの方法は、乳がんまたは浸潤がん、例えば浸潤性乳がん、の治療または予防のために用いることができる。
【００５４】
本発明者らは、ＴＡＺが、基底様、トリプルネガティブまたはＢＲＣＡ１突然変異型タイプに属する浸潤性乳がん細胞株において過発現されることを、実施例および図１に示す。図１Ｂは、４つの高浸潤性がん細胞株のうちの３つ（Ｈｓ５７８Ｔ、ＢＴ−５４９、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）が高いＴＡＺ発現レベルを示し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が中等度レベルを発現することを示している。
【００５５】
これらの４つの細胞株は、Ｎｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ（２００６）において、基底様または基底がんタイプに対応することが示され、浸潤性乳がん細胞タイプの代表である。この細胞タイプは、「浸潤性細胞タイプ」または「基底細胞タイプ」とも呼ばれる（ＢＲＣＡ１突然変異型は、ＢＲＣＡ１ネガティブとしても公知である）。それ故、ＴＡＺは、浸潤性細胞タイプまたは基底細胞タイプ乳がんの検出のためのマーカーとして使用することができる。
【００５６】
ＥＲ＋またはＨｅｒ２＋乳がんとは異なり、これら３つの乳がんタイプのいずれかに属する浸潤性乳がんをターゲットにした療法はない。従って、本発明者らは、ターゲッティングされた様式で、浸潤性細胞タイプ、基底様乳がん、トリプルネガティブ乳がんおよびＢＲＣＡ１突然変異型乳がんタイプを治療する方法を初めて開示する。
【００５７】
本発明者らは、がん、特に乳がん、より詳細には浸潤性乳がんに対する薬物についてスクリーニングする際のＴＡＺの使用をさらに提供する。そのようなスクリーニングは、候補分子の存在によるＴＡＺとＴＥＡＤ１／２／３／４との結合の調節を検出することを含む。
【００５８】
本発明者らは、浸潤性乳がんなどの乳がんをはじめとするがんの治療または予防のための分子を同定する方法を提供し、この方法は、ＴＡＺの活性または発現の調節因子を同定することを含む。
【００５９】
本発明者らは、ＴＡＺがＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３およびＴＥＡＤ４と相互作用すること、ならびにこの相互作用がＴＡＺの核内蓄積および発がんに必須であることを実施例において証明する。
【００６０】
それ故、本発明者らは、浸潤性乳がんなどの乳がんをはじめとするがんの治療または予防のための分子を同定する方法を提供し、この方法は、ＴＡＺとＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３および／またはＴＥＡＤ４との結合に対する候補分子の影響を検出することを含む。ＴＡＺ−ＴＥＡＤ結合の小分子阻害剤についてのスクリーニングは、例えば、ライブラリーを用いて行うことができる。
【００６１】
あるいは、または加えて、合理的な設計を用いて、ＴＡＺ−ＴＥＡＤ相互作用の候補阻害剤を生産することができる。それ故、例えば、ＴＥＡＤ（ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３またはＴＥＡＤ４を含む）のＴＡＺ結合領域からペプチドを設計することができる。同様に、ＴＡＺのＴＥＡＤ結合領域（ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３またはＴＥＡＤ４結合領域を含む）からペプチドを設計することができる。そのようなペプチドは、ＴＡＺの突然変異位置５２および５３を含むことがあり、実施例においてこれらの両方がＴＡＺとＴＥＡＤとの結合において重要であることが示される。
【００６２】
核内蓄積アッセイまたは軟寒天アッセイ（これらは両方とも実施例において説明する）をはじめとする多数のアッセイを用いて、推定阻害剤（またはスクリーニングにおいて同定された候補阻害剤）を試験することができる。
【００６３】
本発明者らは、ＴＡＺ−ＴＥＡＤ相互作用に干渉するまたは該相互作用を阻害させることによるがんの治療または予防を、さらに提供する。これは、様々な手段によって、例えば、上で説明したスクリーニングまたは設計から同定された分子などのＴＡＺの調節因子をその必要がある患者に導入することによって、果たすことができる。
【００６４】
本発明者らは、ＴＡＺが、８つの分泌タンパク質（ＩＧＦＢＰ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、ＦＳＴＬｌ、ＦＮ１、ＦＢＮ１およびＦＢＮ２）ならびに４つの表面膜タンパク質（ＡＸＬ、ＩＴＧＢ２、ＣＲＩＭ１、およびＡｌｃａｍ）の発現を誘導またはアップレギュレートすることを、実施例において証明する。従って、これらのタンパク質のそれぞれを発がん性状態のマーカーとして使用することができる。それ故、本発明者らは、がん細胞または発がん性細胞または転移性細胞の検出に備え、この方法は、ＩＧＦＢＰ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、ＦＳＴＬ１、ＦＮ１、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２ＡＸＬ、ＩＴＧＢ２、ＣＲｌＭ１およびＡｌｃａｍから成る群より選択されるポリペプチドの発現を検出することを含む。本発明者らは、がんの治療にも備え、この方法は、ＩＧＦＢＰ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、ＦＳＴＬ１、ＦＮ１、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２ＡＸＬ、ＩＴＧＢ２、ＣＲｌＭ１およびＡｌｃａｍから成る群より選択されるポリペプチドの活性を調節することを含む。
【００６５】
ＴＡＺを過多および過少発現する細胞、ならびにこれらを含む組織、器官および生物は、がんのモデルとして、または抗がん剤についてのスクリーニングの際に、使用することができる。
【００６６】
＜ＴＡＺ＞
ＴＡＺは、ＰＤＺ結合モチーフの転写コアクチベーターまたはＷＷＴＲ１とも呼ばれる。それは、遺伝子マップ遺伝子座３ｑ２４に位置する。
【００６７】
ＴＡＺは、１４−３−３−結合タンパク質（ＯＭＩＭリファレンス６０５０６６）、続いて５つの最良ＲＡＣＥについてのスクリーニングによって、ＨｅＬａのｃＤＮＡ発現ライブラリーからＫａｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）によって最初にクローニングされた。推定されたタンパク質は、４００のアミノ酸を含有し、ＨｅＬａ細胞において４５ｋＤの見かけの分子量を有する。それは、そのＮ末端に推定１４−３−３タンパク質結合モチーフ、中央のＷＷドメイン、ならびにそのＣ末端に推定２本鎖多重らせんおよびＰＤＺ結合モチーフを有する。
【００６８】
ＴＡＺは、マウスＴａｚタンパク質と９１％の配列同一性、およびＹＡＰ（ＯＭＩＭリファレンス６０６６０８）と４５％の同一性を共有する。ノーザンブロット分析によって、腎臓において６ｋｂ転写産物の最高発現、それに心臓、胎盤および肺が続くことが明らかになった。胸腺および末梢血白血球を除いて、試験したすべての組織において発現が検出された。マウス組織のノーザンブロット分析は、５．５ｋｂ転写産物が腎臓、肺、肝臓および心臓において最高レベルで発現されることを示し、２．２ｋｂ転写産物が精巣において検出された。ウエスタンブロット分析は、幾つかの上皮および線維芽細胞株においてＴＡＺの発現を示したが、ジャーカットＴ細胞では示さなかった。
【００６９】
Ｋａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）は、マウスＴａｚを特性づけした。彼らは、Ｔａｚとラット１４−３−３の相互作用が、特定のセリン残基に関するＴａｚリン酸化を必要とすることを発見した。リン酸化は、１４−３−３との相互作用により核からの移出を誘導することによってＴａｚ転写共活性化を減少させた。Ｃ末端ＰＤＺ結合ドメインは、Ｔａｚを異なる核内フォーカスに局在させ、また、Ｔａｚ誘発遺伝子転写に必要であった。ＰＤＺ結合ドメインは、Ｎｈｅｒｆ２（ＯＭＩＭリファレンス６０６５５３）とのＴａｚ相互作用も媒介した。
【００７０】
間葉幹細胞は、幾つかの異なる系統に分化することができる多能性細胞タイプである。２つの重要な転写因子、ＲＵＮＸ２（ＯＭＩＭリファレンス６００２１１）およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲＧ；ＯＭＩＭリファレンス６０１４８７）は、それぞれ、間葉幹細胞を骨芽細胞または脂肪細胞のいずれかに分化させる。Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、ＴＡＺ、１４−３−３結合タンパク質が、ＰＰＡＲＧ依存性遺伝子転写を抑制しつつＲＵＮＸ２依存性遺伝子転写を共活性化することを発見した。モデル細胞株、マウス胚性線維芽細胞、ならびに培養でのおよびゼブラフィッシュにおけるインビボでの初代間葉幹細胞においてＴａｚ発現を調節することによって、Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、脂肪形成の可能性に対する骨形成の可能性の変化を観察した。Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、ＴＡＺは、間葉幹細胞分化を調節する分子レオスタットとして機能すると結論付けた。
【００７１】
Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、ＴＡＺが、強力なＴＢＸ５（ＯＭＩＭリファレンス６０１６２０）トランスアクチベーターであることを発見した。ＴＡＺは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００（ＥＰ３００；ＯＭＩＭリファレンス６０２７００）およびＰＣＡＦ（ＯＭＩＭリファレンス６０２３０３）との相互作用によって、ＴＢＸ５と会合し、ＴＢＸ５依存性プロモーターを刺激した。ホールト・オーラム症候群（ＨＯＳ；ＯＭＩＭリファレンス１４２９００）関連トランケーション突然変異を有するＴＢＸ５は、ＴＡＺによる刺激を受けることができなかったが、ＨＯＳ関連点突然変異を有するＴＢＸ５は、ＴＡＺに応答するその能力が損なわれなかった。
【００７２】
放射線ハイブリッド分析により、Ｋａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）は、ＴＡＺ遺伝子を染色体３ｑ２４に位置づけた。
【００７３】
用語「ＴＡＺ」を用いる場合、これは、ＴＡＺタンパク質またはＴＡＺ核酸およびそれらの任意の断片、変異体、相同体、誘導体、変異体を含む、任意のＴＡＺ配列を指すと解釈するものとする。
【００７４】
ＴＡＺの特性および活性は、本明細書の中で、例えば、参考文献の中で説明されている。
【００７５】
＜ＴＡＺポリペプチド＞
本明細書において説明する方法および組成物は、下で詳細に説明するＴＡＺポリペプチドを使用する。
【００７６】
本明細書において用いる場合、用語「ＴＡＺポリペプチド」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５６２８７、ＮＰ＿５９８５４５、ＮＰ＿００１０３２７８５、ＸＰ＿８７１５０４、ＮＰ＿００１０２００４０を有する配列を指すと解釈する。「ＴＡＺポリペプチド」は、アクセッション番号ＮＰ＿０５６２８７を有する配列などのヒトＴＡＺポリペプチドを含み得る、または、これから成り得る。
【００７７】
これらのポリペプチドのいずれか、一部またはすべての相同体、変異体および誘導体も含まれる。例えば、ＴＡＺは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２９９４３０を含み得る。
【００７８】
ＴＡＺポリペプチドは、様々な手段、例えば、乳がんに罹患しているまたは罹患している疑いがある個体へのその治療のための投与に使用することができる。抗ＴＡＺ剤、例えば、特定のＴＡＺ結合剤、特に抗ＴＡＺ抗体の生産またはスクリーニングのためにそれらを使用することもできる。これらを下でさらに詳細に説明する。がん、特に乳がんの診断または検出のために、ＴＡＺポリペプチドの発現を検出することができる。
【００７９】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質、すなわちペプチド同配体を指す。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短い鎖と、一般にタンパク質と呼ばれる、より長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含有することがある。
【００８０】
「ポリペプチド」は、翻訳後プロセッシングなどの天然プロセス、または当分野において周知である化学修飾技術、いずれかによって修飾されたアミノ酸配列を含む。そのような修飾は、基本テキストにおいて、およびより詳細なモノグラフにおいて、ならびに多数の研究文献において、十分に説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含めて、ポリペプチドのどこででも起こり得る。同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドにおける幾つかの部位に同じまたは様々な程度で存在することがあることは理解される。また、所与のポリペプチドが、多くのタイプの修飾を含有することがある。
【００８１】
ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐している場合もあり、および分岐を伴うまたは伴わない環状である場合もある。環状の分岐した、および分岐した環状のポリペプチドは、翻訳後天然プロセスの結果として生ずる場合もあり、または合成法によって作られる場合もある。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的連結、ヘム部分の共有結合的連結、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的連結、脂質または脂質誘導体の共有結合的連結、ホスホチジルイノシトールの共有結合的連結、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化が挙げられる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３およびＷｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２  ｉｎ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，’’Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：６２６−６４６およびＲａｔｔａｎ  ｅｔ  ａＬ，‘‘Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ，’’Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８−６２参照。
【００８２】
用語「ポリペプチド」は、当分野において公知の様々な合成ペプチド変異形、例えばレトロインベルソＤペプチドを含む。該ペプチドは、抗原決定基および／またはＴ細胞エピトープである場合がある。該ペプチドは、インビボで免疫原性である場合がある。該ペプチドは、インビボで中和抗体を誘導することができる場合がある。
【００８３】
ＴＡＺに適用される場合、結果としてのアミノ酸配列は、ＴＡＺポリペプチド（例えばヒトＴＡＺポリペプチド）と共通する１つ以上の活性（例えば生物活性）を有し得る。例えば、ＴＡＺ相同体は、正常乳房細胞と比較して、乳がん細胞では増加した発現レベルを有し得る。詳細には、用語「相同体」は、結果としてのアミノ酸配列がＴＡＺ活性を有するという条件で、構造および／または機能に関する同一性を包含する。配列同一性（すなわち、類似性）に関しては、少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性がある場合がある。少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性がある場合もある。これらの用語は、ＴＡＺ核酸配列の対立変異形であるアミノ酸から導出されたポリペプチドも包含する。
【００８４】
ＴＡＺなどのポリペプチドの「活性」または「生物活性」に言及する場合、これらの用語は、類似の活性または改善された活性、または望ましくない副作用が低減されたこれらの活性を含めて、ＴＡＺの代謝または生理機能を指すと解釈する。ＴＡＺの抗原性および免疫原性活性も含む。このような活性、ならびにこれらの活性のアッセイおよび定量方法の例は、当分野において公知であり、および本明細書の他の箇所で詳細に説明している。
【００８５】
例えば、そのような活性は、より詳細に下で説明するような次のもののうちのいずれか１つ以上を含み得る：ＳＬＣ９Ａ３Ｒ２への結合、ＹＷＨＡへの結合、１４−３−３への結合、ＲＵＮＸ２依存性遺伝子転写の共活性化、ＴＡＺによるＴＢＸ５のトランス活性化など。
【００８６】
＜他のＴＡＺポリペプチド＞
ＴＡＺ変異体、相同体、誘導体および断片も、本明細書に記載する方法および組成物において有用である。
【００８７】
ＴＡＺに関しての用語「変異体」、「相同体」、「誘導体」または「断片」は、ある配列からのまたはある配列への１つ（以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。その文脈が別様に認めない限り、「ＴＡＺ」への言及は、ＴＡＺのそのような変異体、相同体、誘導体および断片への言及を含む。
【００８８】
本明細書において用いる場合、「欠失」は、それぞれ、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基がそれぞれ不在となる、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列いずれかの変化と定義する。本明細書において用いる場合、「挿入」または「付加」は、天然に存在する物質と比較して、それぞれ、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の追加を生じさせる結果となった、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化である。本明細書において用いる場合、「置換」は、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の、それぞれ、異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による置き換えの結果として生ずる。
【００８９】
本明細書に記載する場合のＴＡＺポリペプチドは、サイレント変化を生じさせ、機能的に等価のアミノ酸配列を生じさせる結果となる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換も有する場合がある。残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性に関する類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負の電荷を有するアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正の電荷を有するアミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられ；ならびに類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。
【００９０】
保存的置換は、例えば下の表に従って、行うことができる。二番目の縦列の中の同じブロック内、および三番目の縦列の中の同じ行内のアミノ酸は、互いに置換することができる。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
ＴＡＺポリペプチドは、非相同アミノ酸配列を、一般にはＮ末端またはＣ末端、例えばＮ末端に、さらに含む場合がある。非相同配列としては、細胞内または細胞外タンパク質ターゲッティングに影響を及ぼす配列（例えばリーダー配列）を挙げることができる。非相同配列としては、ＴＡＺポリペプチドの免疫原性を増加させるならびに／またはポリペプチドの同定、抽出および／もしくは精製を助長する配列も挙げることができる。用いることができるもう１つの非相同配列は、Ｎ末端であり得るポリヒスチジンなどのポリアミノ酸配列である。少なくとも１０のアミノ酸、例えば少なくとも１７のアミノ酸、しかし５０より少ないアミノ酸のポリヒスチジン配列を利用することができる。
【００９３】
ＴＡＺポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態である場合もあり、またはより大きなタンパク質、例えば融合タンパク質、の一部である場合もある。分泌もしくはリーダー配列、プロ配列、精製を助長する配列、例えば多数のヒスチジン残基、または組換え生産中の安定性のための追加の配列を含有する、追加のアミノ酸配列を含むことは有利であることが多い。
【００９４】
本明細書に記載する場合のＴＡＺポリペプチドは、有利には、公知の技術を用いる組換え手段によって作られる。しかし、固相合成などの当業者に周知の技術を用いる合成手段によって作ることもできる。そのようなポリペプチドは、例えば抽出および精製を助長するために、融合タンパク質として生産することもできる。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）ならびにβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質配列の除去を可能にするために、融合タンパク質パートナーと対象となるタンパク質配列の間にタンパク質分解性開裂部位、例えば、トロンビン開裂部位を含めることも適便であり得る。該融合タンパク質は、対象となる配列のタンパク質の機能を妨げないものであり得る。
【００９５】
ＴＡＺポリペプチドは、実質的に単離された形態である場合がある。この用語は、自然の状態からの人の手による改変を指すと解釈する。「単離された」組成物または物質が実際に存在する場合、それは、変更されているか、その元の環境から除去されているか、または両方である。この用語を本明細書において用いる場合、例えば、生きている動物に自然に存在するポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存材料から分離された同じポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは、「単離されている」。
【００９６】
しかし、ＴＡＺタンパク質が、そのタンパク質の所期の目的に干渉しない担体または希釈剤と混合され、それでもなお、実質的に単離されているとみなされる場合があることは、理解される。ＴＡＺポリペプチドは、実質的に精製された形態である場合もあり、この場合、それは、一般に、製剤中のタンパク質を構成し、その製剤中のタンパク質の９０％より多く、例えば９５％、９８％または９９％がＴＡＺポリペプチドである。
【００９７】
異なる種からのＴＡＺ配列をアラインすることにより、アミノ酸配列のどの領域が、異なる種間で保存されるのか（「相同領域」）、およびどの領域が、異なる種間で異なるのか（「非相同領域）を決定することができる。
【００９８】
従って、ＴＡＺポリペプチドは、相同領域の少なくとも一部に対応する配列を含む場合がある。相同領域は、少なくとも２つの種間で高い相同度を示す。例えば、該相同領域は、上で説明した試験を用いて、アミノ酸レベルで少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を示すことができる。相同領域に対応する配列を含むペプチドを、下でさらに詳細に説明するような治療戦略に用いることができる。あるいは、ＴＡＺペプチドは、非相同領域の少なくとも一部に対応する配列を含む場合がある。非相同領域は、少なくとも２つの種間で低い相同度を示す。
【００９９】
＜ＴＡＺ相同体＞
使用のために開示するＴＡＺポリペプチドは、任意の材料、例えば関連ウイルス／細菌タンパク質、細胞相同体および合成ペプチド、ならびにそれらの変異体または誘導体から得られる相同配列を含む。それ故、ポリペプチドは、動物、例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）、特に霊長類、より詳細にはヒトをはじめとする、他の種からのＴＡＺの相同体をコードするものも含む。より詳細には、相同体は、ヒト相同体を含む。
【０１００】
本明細書の文脈において、相同配列は、該当ＴＡＺ配列の配列とアミノ酸レベルで、例えば少なくとも５０または１００、２００、３００、４００もしくは５００のアミノ酸に関して、少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％同一である、例えば少なくとも９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を含むと解釈する。
【０１０１】
詳細には、相同性は、一般に、タンパク質機能に必須ではない隣接配列ではなく、タンパク質機能に必須であることが知られている配列の領域に関して考えるものとする。これは、遠縁の生物からの相同配列を考えるとき、特に重要である。
【０１０２】
相同性は、類似性（すなわち、類似した化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の点から考えることもできるが、本明細書の文脈では相同性を配列同一性によって表現することができる。
【０１０３】
相同性比較は、目視で行うことができ、またはより通常には、容易に利用できる配列比較プログラムを利用して行うことができる。これらの公的に利用できるおよび市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間の同一％を計算することができる。
【０１０４】
同一％は、連続した配列に関して計算することができる。すなわち、１つの配列を他の配列とアラインし、１つの配列内のそれぞれのアミノ酸を他の配列内の対応するアミノ酸、１度に１残基、と直接比較する。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。一般に、そのようなギャップなしアラインメントは、比較的少数の残基（例えば、５０未満の連続アミノ酸）に関してしか行われない。
【０１０５】
これは、非常に単純でばらつきのない方法であるが、例えば、配列の別様の同一ペアの場合、１つの挿入または欠失が、次に続くアミノ酸残基をアラインメントから出させるということを考慮にいれることができず、従って、全体的なアラインメントを行ったとき相同％の大きな低下を生じさせる結果となる可能性を秘めている。それ故に、大部分の配列比較法は、全体にわたる相同性スコアを過度に減点することなく、起こり得る挿入および欠失を考慮に入れる最適なアラインメントを生じさせるように設計される。これは、その配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して局所的な同一性または類似性を最大にするように試みることによって果たされる。
【０１０６】
しかし、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸については、比較する二配列間のより高い関係性を反映して、できる限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多くのギャップを有するものより高いスコアを獲得するように、そのアラインメント内に存在するそれぞれのギャップに対して「ギャップペナルティー」を割り当てる。あるギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、そのギャップ内のそれぞれの後続の残基に対して、より小さいペナルティーを課す、「アファイン・ギャップ・コスト」が、一般に用いられる。これは、最も一般的に用いられているギャップ・スコアリング・システムである。高いギャップペナルティーは、勿論、より少数のギャップを有する最適化されたアラインメントを生じさせる。大部分のアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを変更することができる。しかし、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用するとき、デフォルト値を用いる場合がある。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記参照）を使用するとき、アミノ酸配列についてのデフォルト・ギャップ・ペナルティーは、１つのギャップに対して−１２、およびそれぞれの伸長部に対して−４である。
【０１０７】
従って、最大相同％の計算には、先ず、ギャップペナルティーを考慮に入れて最適なアラインメントを生成する必要がある。そのようなアラインメントを行うために適するコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９９  ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ  １８参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡの両方をオフラインおよびオンライン検索に利用することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９９  ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ  ７−５８  ｔｏ  ７−６０参照）。ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを利用してもよい。
【０１０８】
最終相同％を同一性によって測定することができるが、アラインメントプロセスそれ自体は、一般に、オール・オア・ナッシングのペア比較には基づかない。その代わり、化学的類似性または進化のみちのりに基づきそれぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てる換算類似性スコア行列が一般に用いられる。一般に用いられるそのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムスイートのためのデフォルト行列）である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、公用デフォルト値、または供給されている場合にはカスタムシンボル比較表のいずれかを用いる（さらなる詳細については、ユーザーマニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージについては公用デフォルト値を用いることができ、または他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を用いることができる。
【０１０９】
該ソフトウェアが最適なアラインメントを生じさせると、配列同一％などの相同％を計算することができる。該ソフトウェアは一般に、これを配列比較の一部として行い、数値の結果を生じさせる。
【０１１０】
アミノ酸配列に関して、用語「変異体」または「誘導体」は、その配列からのまたはその配列への１つ（以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加を含むが、但し、結果として得られるアミノ酸配列が、未修飾配列と実質的に同じ活性を保持する、例えば、ＴＡＺポリペプチドと少なくとも同じ活性を有することを条件とする。
【０１１１】
本明細書に開示するＴＡＺアミノ酸配列またはその断片もしくは相同体を有するポリペプチドは、本明細書に記載する方法および組成物において使用するために修飾することができる。一般には、該配列の生物活性を維持する修飾を行う。アミノ酸置換、例えば、１、２または３から１０、２０または３０の置換を行うことができるが、但し、修飾配列が、未修飾配列の生物活性を保持することを条件とする。あるいは、本明細書に記載するポリペプチドの１つ以上の機能性ドメインを意図的に不活性化するように修飾することができる。アミノ酸置換は、例えば治療的に投与されるポリペプチドの血漿半減期を増すために、自然には存在しない類似体の使用を含む場合がある。
【０１１２】
＜ＴＡＺ断片＞
本明細書に記載する方法および組成物において使用するためのポリペプチドは、上で確認したＴＡＺポリペプチドのうちのいずれかの完全長配列の断片も含む。断片は、少なくとも１つのエピトープを含み得る。エピトープを同定する方法は、当分野において周知である。断片は、一般に、少なくとも６のアミノ酸、例えば、少なくとも１０、２０、３０、５０または１００のアミノ酸を含む。
【０１１３】
該当ＴＡＺアミノ酸配列からの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５以上の残基を含む、またはこれらから成る断片を含む。
【０１１４】
本発明者らは、本明細書に記載するようなＴＡＺポリペプチドの一部分を含むペプチドをさらに記載する。従って、ＴＡＺおよびその相同体、変異体または誘導体の断片が含まれる。該ペプチドは、２と２００の間のアミノ酸、例えば４と４０の間のアミノ酸、の長さであり得る。該ペプチドは、例えばトリプシンなどの適する酵素での消化により、本明細書に記載するようなＴＡＺポリペプチドから誘導することができる。あるいは、該ペプチド、断片などは、組換え手段によって作ることができ、または合成的に合成することができる。
【０１１５】
ＴＡＺの断片は、アクセッション番号ＮＰ＿０５６２８７を有する配列のＴＡＺ断片を含む場合がある。ＴＡＺの断片は、ＹＡＰへの低い類似性または同一性を共有するＴＡＺの配列（Ｓｕｄｏｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９５；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００６０９７）を含む場合がある。例えば、ＴＡＺ断片は、ＴＡＺのアミノ酸残基１６０−２２９、すなわち、
ｎ  ｑｐｌｎｈｍｎｌｈｐ  ａｖｓｓｔｐｖｐｑｒ  ｓｍａｖｓｑｐｎｌｖ  ｍｎｈｑｈｑｑｑｍａ  ｐｓｔｌｓｑｑｎｈｐ  ｔｑｎｐｐａｇｌｍｓ  ｍｐｎａｌｔｔｑｑ
を含む場合がある。
【０１１６】
したがって、そのようなＴＡＺ断片は、例えばそのような断片に対して産生させた抗体により、ＴＡＺ発現を優先的に検出するプローブを生成するために使用することができる。これらの抗体は、ＴＡＺに特異的に結合すると予想され、また、本明細書に開示する診断および治療方法において有用である。
【０１１７】
ＴＡＺの他の断片は、ＴＡＺの残基５２もしくは残基５３、すなわちＦ５２もしくはＦ５３を含む断片、またはこれらの位置の一方もしくは両方に突然変異を含む断片を含む場合がある。これに関して、本実施例は、ＴＡＺの位置５２および５３（これらは、両方とも、フェニルアラニン残基によって占有されている）が、ＴＡＺとＴＥＡＤとの結合に重要であることを開示する。それらは、ＴＡＺの核内蓄積およびその発がんの可能性にとって重要であることも証明する。従って、本発明者らは、Ｆ５２の突然変異もしくはＦ５３の突然変異または両方を含む、ＴＡＺの断片を開示する。
【０１１８】
ＴＡＺのそのような断片を、抗ＴＡＺペプチドとして使用することができるペプチドの形態で適切に提供することができる。従って、本発明者らは、これらの位置のいずれかまたは両方に隣接するＴＡＺの配列を含むペプチドを開示する。該ペプチドは、ＴＡＺ配列の５から４０（以上）の間の残基などの、任意の適する長さのものであり得る。該ペプチドは、例えば、
ｌｅａｌｆｎｓｖｍｎ  ｐｋｐｓｓｗｒｋｋｉ  ｌｐｅｓｆｆｋｅｐｄ  ｓｇｓｈｓｒｑｓｓｔ  ｄｓｓｇｇｈｐｇｐｒ  ｌａｇｇ
の配列であり、太字で強調したＦ５２およびＦ５３の一方または両方に突然変異を含む、５、１０、１５、２０、２５などの残基長の配列を含む場合がある。該突然変異は、アラニンなどの任意の適する残基に対してであり得る。
【０１１９】
該ペプチドは、例えば、数ある中でも、ＨＩＶ−１−トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディア・ホメオドメイン・タンパク質（Ａｎｔｐ−ＨＤ）、単純疱疹１ウイルスＶＰ２２タンパク質（ＨＳＶ−ＶＰ２２）、シグナル配列に基づくペプチド、トランスポータン（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）および両親媒性モデルペプチドの全配列またはサブ配列をはじめとする、膜転移配列の使用によるような様々な手段によって、細胞、組織、器官または個体に導入することができる。これらは、ＷＯ  ２００２／００７７５２に詳細に記載されている。
【０１２０】
ＴＡＺおよびその断片、相同体、変異体および誘導体は、組換え手段によって作ることができる。しかし、固相合成などの当業者に周知の技術を用いる合成手段によってそれらを作ることもできる。該タンパク質を、例えば抽出および精製を助長するために、融合タンパク質として生産することもできる。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）ならびにβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質配列を除去できるように、融合タンパク質パートナーと対象となるタンパク質配列の間にタンパク質分解性開裂部位を含めるのも適便であり得る。該融合タンパク質は、対象となる配列のタンパク質の機能を妨げないものであり得る。動物細胞からの細胞抽出物の精製によってタンパク質を得ることもできる。
【０１２１】
本明細書に開示するＴＡＺポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、実質的に単離された形態である場合もある。そのようなポリペプチドが、そのタンパク質の所期の目的に干渉しない担体または希釈剤と混合され、それでもなお、実質的に単離されているとみなされる場合があることは、理解される。ＴＡＺ変異体、相同体、断片または誘導体も実質的に精製された形態である場合があり、この場合、それは、一般に、製剤中のタンパク質を構成し、その製剤中のタンパク質の９０％より多く、例えば９５％、９８％または９９％がタンパク質である。
【０１２２】
本明細書に開示するＴＡＺポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、顕示ラベルで標識することができる。顕示ラベルは、そのポリペプチドなどを検出することができるいずれの適するラベルであってもよい。適するラベルとしては、放射性同位体、例えば１２５Ｉ、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびリンカー、例えばビオチン、が挙げられる。標識されたポリペプチドをイムノアッセイなどの診断手順において使用して、サンプル中のポリペプチドの量を決定することができる。ポリペプチドまたは標識されたポリペプチドは、標準的なプロトコルを用いる動物およびヒトにおける該ポリペプチドに対する免疫反応性の検出のための血清学的または細胞媒介免疫アッセイにおいて使用することもできる。
【０１２３】
場合によっては標識されている、本明細書に開示するＴＡＺポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体を、固相、例えばイムノアッセイウエルまたはディップスティックの表面、に固定することもできる。そのような標識および／または固定化されたポリペプチドを、適する試薬、対照、説示などと共に適する容器に入れたキットに包装することができる。そのようなポリペプチドおよびキットは、イムノアッセイによってポリペプチドまたはそれらの対立または種変異体に対する抗体を検出する方法において使用することができる。
【０１２４】
イムノアッセイ法は、当分野において周知であり、一般に、（ａ）該タンパク質に対する抗体が結合できるエピトープを含むポリペプチドを提供するステップと、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成が可能となる条件下で該ポリペプチドと共に生体サンプルをインキュベートするステップと、（ｃ）該ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されたかどうかを判定するステップとを含む。
【０１２５】
本明細書に開示するＴＡＺポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体をインビトロまたはインビボ細胞培養系において使用して、疾病におけるそれらの機能をはじめとする細胞機能に関するそれらの対応する遺伝子およびそれらの相同体の役割を研究することができる。例えば、短縮または修飾されたポリペプチドを細胞に導入して、その細胞において行われる正常な機能を破壊することができる。該ポリペプチドは、組換え発現ベクター（下記参照）からのそのポリペプチドのインサイチュー発現によって細胞に導入することができる。該発現ベクターは、該ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを場合によっては保有する。
【０１２６】
昆虫細胞または哺乳動物細胞などの適切な宿主細胞の使用は、組換え発現産物に最適な生物活性を付与するために必要であり得るような翻訳後修飾（例えば、ミリストル化、グリコシル化、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、脂質化（ｌａｐｉｄａｔｉｏｎ）およびチロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化）に備えると予想される。本明細書に開示するＴＡＺポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体を発現するそのような細胞培養系をアッセイ系において使用して、細胞内でのそのポリペプチドの機能に干渉するまたは該機能を強化する候補物質を同定することができる。
【０１２７】
＜ＴＥＡＤポリペプチド＞
ＴＥＡドメインファミリーメンバー１としても公知のＴＥＡＤ１は、ＮＭ＿０２１９６１．４またはＮＰ＿０６８７８０．１のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を有する。
【０１２８】
ＴＥＡドメインファミリーメンバー２としても公知のＴＥＡＤ２は、ＮＭ＿００３５９８．１またはＮＰ＿００３５８９．１のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を有する。
【０１２９】
ＴＥＡドメインファミリーメンバー３としても公知のＴＥＡＤ３は、ＮＭ＿００３２１４．３またはＮＰ＿００３２０５．２のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を有する。
【０１３０】
ＴＥＡドメインファミリーメンバー４としても公知のＴＥＡＤ４は、多数のアイソフォームを有する。ＴＥＡＤ４アイソフォーム１は、アクセッション番号ＮＭ＿００３２１３．２またはＮＰ＿００３２０４．２を有する。ＴＥＡＤ４アイソフォーム２は、アクセッション番号ＮＭ＿２０１４４１．１またはＮＰ＿９５８８４９．１を有する。ＴＥＡＤ４アイソフォーム３は、アクセッション番号ＮＭ＿２０１４４３．１またはＮＰ＿９５８８５１．１を有する。
【０１３１】
＜ＴＡＺ核酸＞
本明細書に記載する方法および組成物は、ＴＡＺ、ＴＡＺポリヌクレオチド、ＴＡＺヌクレオチドおよびＴＡＺ核酸、ならびにこれらのうちのいずれかの変異体、相同体、誘導体および断片の発現レベルを検出するための手段として利用することができる。加えて、本発明者らは、本明細書に記載する診断方法に有用な特定のＴＡＺ断片を開示する。該ＴＡＺ核酸は、記載する治療または予防方法にも使用することができる。
【０１３２】
用語「ＴＡＺポリヌクレオチド」、「ＴＡＺヌクレオチド」および「ＴＡＺ核酸」は、同義的に用いることができ、ＴＡＺのｃＤＮＡ配列とゲノム配列の両方を明確に含むと解釈するものとする。これらの用語は、ＴＡＺポリペプチドおよび／またはこの断片、誘導体、相同体もしくは変異体をコードすることができる核酸配列を含むとも解釈する。
【０１３３】
ＴＡＺ核酸に言及する場合、これは、核酸のＴＡＺファミリーの任意のメンバーへの参照と解釈するものとする。ＮＭ＿０１５４７２、ＮＭ＿１３３７８４、ＮＭ＿００１０３７６９６、ＸＭ＿８６６４１１およびＮＭ＿００ｌ０２４８６９から成る群より選択されるＴＡＺ核酸が特に興味深い。
【０１３４】
下に「他のＴＡＺ核酸配列」として述べる核酸配列のいずれか１つ以上も含む。
【０１３５】
例えば、該ＴＡＺ核酸は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５４７２を有するヒトＴＡＺ配列を含む場合がある。
【０１３６】
ＴＡＺ核酸は、様々な手段、例えば、乳がんに罹患しているまたは罹患している疑いがある個体へのそれらの治療のための投与、のために使用することができる。がん、特に乳がん、の診断または検出のために、ＴＡＺ核酸の発現を検出することができる。ＴＡＺ核酸は、ＴＡＺポリペプチドの発現または生産のために使用することもできる。
【０１３７】
「ポリヌクレオチド」は、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡである場合もあり、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡである場合もある、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを一般に指す。「ポリヌクレオチド」は、限定ではないが、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖領域と２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖領域と２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖またはさらに典型的には２本鎖、もしくは１本鎖領域と２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む３本鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性のためにまたは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化された塩基および普通でない塩基、例えばイノシン、を含む。様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ、それ故、「ポリヌクレオチド」は、自然界で一般に見つけられるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、多くの場合オリゴヌクレオチドと呼ばれる、比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【０１３８】
非常に多くのヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者には理解される。
【０１３９】
本明細書において用いる場合、用語「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列ならびにそれらの変異体、相同体、断片および誘導体（例えば、それらの部分）を指す。ヌクレオチド配列は、センス鎖を表そうと、アンチセンス鎖を表そうと、またはそれらの組み合わせを表そうと、２本鎖または１本鎖であり得るゲノムまたは合成または組換え体起源のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。用語ヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術の使用によって作製することができる（例えば、組換えＤＮＡ）。
【０１４０】
用語「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡを意味する場合がある。
【０１４１】
＜他の核酸＞
本発明者らは、ＴＡＺ核酸の断片、相同体、変異体または誘導体である核酸も提供する。ＴＡＺ核酸に関して、用語「変異体」、「相同体」、「誘導体」または「断片」は、ＴＡＺヌクレオチド配列の配列からのまたはこの配列への１つ（以上）の核酸の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。その文脈が別様に認めない限り、「ＴＡＺ」への言及および「ＴＡＺ」は、ＴＡＺのそのような変異体、相同体、誘導体および断片への言及を含む。
【０１４２】
結果として得られるヌクレオチド配列は、任意の１つ以上のＴＡＺ活性を有するポリペプチドをコードし得る。用語「相同体」は、結果として得られるヌクレオチド配列が、ＴＡＺ活性を有するポリペプチドをコードするような、構造および／または機能に関する同一性を包含すると解釈することができる。例えば、ＴＡＺの相同体などは、正常乳房細胞と比較して乳がん細胞では低減された発現レベルを有し得る。配列同一性（すなわち、類似性）に関しては、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の配列同一性がある場合がある。該当配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５４７２を有するＴＡＺ配列）との少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性がある場合もある。これらの用語は、該配列の対立変異形も包含する。
【０１４３】
＜変異体、誘導体および相同体＞
ＴＡＺ核酸変異体、断片、誘導体および相同体は、ＤＮＡを含む場合もあり、またはＲＮＡを含む場合もある。それらは、１本鎖である場合もあり、または２本鎖である場合もある。それらは、合成または修飾ヌクレオチドを中に含むポリヌクレオチドである場合もある。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの修飾が当分野において公知である。これらとしては、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、その分子のアクリジンまたはポリリシン鎖の３’および／または５’末端での付加が挙げられる。本明細書のために、当分野において利用可能な任意の方法によって該ポリヌクレオチドを修飾できることは理解されるはずである。そのような修飾を行って、対象となるポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増すことができる。
【０１４４】
該ポリヌクレオチドが２本鎖である場合、その２本鎖の両方が、個々にまたは組み合わせで、本明細書に記載する方法および組成物に包含される。該ポリヌクレオチドが１本鎖である場合には、そのポリヌクレオチドの相補配列も含まれると理解すべきである。
【０１４５】
ヌクレオチド配列に関して、用語「変異体」、「相同体」または「誘導体」は、その配列からのまたはその配列への１つ（以上）の核酸の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。該変異体、相同体または誘導体は、生物活性を有するポリペプチドをコードし得る。ＴＡＺのそのような断片、相同体、変異体および誘導体は、上で述べたように、調節された活性を含む場合がある。
【０１４６】
配列同一性に関して上で示したように、「相同体」は、該当配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５４７２を有するＴＡＺ配列）との少なくとも５％の同一性、少なくとも１０％の同一性、少なくとも１５％の同一性、少なくとも２０％の同一性、少なくとも２５％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも３５％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも４５％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する場合がある。
【０１４７】
少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性がある場合がある。ヌクレオチド同一性比較は、上で説明したように行うことができる。使用することができる配列比較プログラムは、上で説明したＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。そのデフォルトスコアリング行列は、それぞれの同一ヌクレオチドについて１０、およびそれぞれのミスマッチについて−９のマッチ値を有する。それぞれのヌクレオチドについて、デフォルトギャップ生成ペナルティーは、−５０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティーは、−３である。
【０１４８】
＜ハイブリダイゼーション＞
本発明者らは、本明細書に提示する配列またはそれらの任意の変異体、断片もしくは誘導体のいずれかに、あるいは上記のもののうちのいずれかの相補鎖に、選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をさらに記載する。ヌクレオチド配列は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチドの長さであり得る。
【０１４９】
本明細書において用いる場合の用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が塩基対合によって相補鎖と連結するプロセス」ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術で行われるような増幅プロセスを含むものとする。
【０１５０】
本明細書に提示するヌクレオチド配列またはそれらの相補鎖に選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、本明細書に提示する対応するヌクレオチド配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５４７２を有するＴＡＺ配列）に少なくとも４０％相同性、少なくとも４５％相同性、少なくとも５０％相同性、少なくとも５５％相同性、少なくとも６０％相同性、少なくとも６５％相同性、少なくとも７０％相同性、少なくとも７５％相同性、少なくとも８０％相同性、少なくとも８５％相同性、少なくとも９０％相同性、または少なくとも９５％相同性であり得る。一般に、そのようなポリヌクレオチドは、少なくとも２０、例えば、少なくとも２５または３０、例えば、少なくとも４０、６０もしくは１００以上の連続するヌクレオチドの領域に関して、対応するヌクレオチド配列に少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは９０％または少なくとも９５％もしくは９８％相同性であり得る。
【０１５１】
用語「選択的にハイブリダイズすることができる」は、プローブとして使用するポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドがそのプローブにバックグラウンドより有意に高いレベルでハイブリダイズすることがわかっている条件下で使用することを意味する。該バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えばスクリーニングするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーの中に存在する他のポリヌクレオチドのため、発生し得る。この事象では、バックグラウンドは、該プローブと該ライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの相互作用によって生ずるシグナルのレベルを意味し、これは、ターゲットＤＮＡとで観察される特異的な相互作用と同様の強度の場合、１０倍未満、例えば１００倍未満である。該相互作用強度は、例えば、該プローブを、例えば３２Ｐもしくは３３Ｐで放射性標識することによって、または非放射性プローブ（例えば、蛍光色素、ビオチンもしくはジゴキシゲニン）を用いて、測定することができる。
【０１５２】
ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）において教示されているように、核酸結合複合体の溶融温度（Ｔｍ）に基づき、また、下で説明するような定義された「ストリンジェンシー」をもたらす。
【０１５３】
最大ストリンジェンシーは、一般に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）であり；高ストリンジェンシーは、Ｔｍより約５から１０℃下であり；中ストリンジェンシーは、Ｔｍより約１０℃から２０℃下であり；低ストリンジェンシーは、Ｔｍより約２０℃から２５℃下で発生する。当業者には理解されるように、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために用いることができ、その一方で中（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために用いることができる。
【０１５４】
本発明者らは、ストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１ｘＳＣＣ（１ｘＳＣＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０））のもとでＴＡＺ核酸、断片、変異体、相同体または誘導体にハイブリダイズすることが可能であり得るヌクレオチド配列を提供する。
【０１５５】
＜相同体、変異体および誘導体の生成＞
ＴＡＺの相同体、変異体および誘導体ばかりでなく、該当配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５４７２を有するヒトＴＡＺ配列）と１００％同一でないが同様に含まれるポリヌクレオチドは、多数の方法で得ることができる。該配列の他の変異体は、例えば、ある一定の範囲の個体、例えば異なる集団からの個体から構成されたＤＮＡライブラリーをプローブすることによって、得ることができる。例えば、ＴＡＺ相同体は、他の個体または他の種から同定することができる。本明細書中の他の箇所において説明しているように、相同体内の対応する位置を同定し、その分子を合成または生産することによって、さらなる組換えＴＡＺ核酸およびポリペプチドを生産することができる。
【０１５６】
加えて、ＴＡＺの他のウイルス／細菌、または細胞相同体、特に、哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシおよび霊長類細胞）において見つけられる細胞相同体を得ることができ、そのような相同体およびそれらの断片は、一般に、ヒトＴＡＺに選択的にハイブリダイズすることができる。そのような相同体は、非ヒトＴＡＺ核酸、断片、変異体および相同体を設計するために使用することができる。当分野において公知の手段によって突然変異誘発を行って、さらなる変種を生産することができる。
【０１５７】
ＴＡＺ相同体の配列は、他の動物種から作られたｃＤＮＡライブラリーまたは他の動物種からのゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすること、および中から高ストリンジェンシー条件下で、そのようなライブラリーを、任意のＴＡＺ核酸、断片、変異体および相同体、または他のＴＡＺの断片のすべてまたは一部を含むプローブでプローブすることによって得ることができる。
【０１５８】
本明細書に開示するポリペプチドまたはヌクレオチド配列の種相同体および対立変異体の獲得に同様の考慮が適用される。
【０１５９】
縮重ＰＣＲを用いて、変異体および株／種相同体も得ることができ、これには、ＴＡＺ核酸の配列内の保存アミノ酸配列をコードする変異体および相同体内の配列をターゲットにするように設計されたプライマーが使用されることとなる。保存配列は、例えば、幾つかの変異体／相同体からのアミノ酸配列をアラインすることによって、予測することができる。配列アラインメントは、当分野において公知のコンピューターソフトウェアを使用して行うことができる。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｈｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広範に用いられている。
【０１６０】
縮重ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含有し、また、既知の配列に対する単一配列プライマーで配列をクローニングするために用いられるものより低いストリンジェンシー条件で使用される。遠縁の生物からの配列間での全ヌクレオチド相同性は、非常に低い可能性が高く、従って、これらの状況では、縮重ＰＣＲが、ＴＡＺ配列の標識断片を用いるライブラリーのスクリーニングの代わりに選ばれる方法であり得ることは、当業者には理解される。
【０１６１】
加えて、ＢＬＡＳＴプログラムスイートなどの検索アルゴリズムを用いてヌクレオチドおよび／またはタンパク質データベースを検索することにより、相同配列を同定することができる。
【０１６２】
あるいは、特製づけされた配列、例えばＴＡＺ核酸またはそれらの変異体、相同体、誘導体もしくは断片、の部位特異的突然変異誘発によって、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。これは、例えば、ポリペプチド配列を発現させることとなる特定の宿主細胞に対するコドン選好性を最適化するために配列にサイレントコドン変更が求められる場合、有用である。制限酵素認識部位を導入するために、またはポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの特性もしくは機能を改変するために、他の配列変更が望まれる場合もある。
【０１６３】
本明細書に記載するポリヌクレオチドは、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、代替増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば放射性もしくは非放射性ラベルを使用して従来の手段によって顕示ラベルで標識されたもの、を生産するために使用することができ、または該ポリヌクレオチドをベクターにクローニングすることができる。そのようなプライマー、プローブおよび他の断片は、少なくとも８、９、１０または１５、例えば少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチドの長さであり、それらも本明細書において用いる場合の用語「ポリヌクレオチド」に包含される。
【０１６４】
ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブは、組換え生産することができ、合成生産することができ、または当業者が利用できる任意の手段によって生産することができる。標準的な技術によってそれらをクローニングすることもできる。
【０１６５】
一般に、プライマーは、所望の核酸配列の１度に１ヌクレオチドの段階的製造を含む合成手段によって生産される。自動化技術を用いてこれを遂行するための技術を、当分野では容易に利用することができる。
【０１６６】
ＴＡＺの断片を含むプライマーは、例えば乳がんに伴うようなＴＡＺ発現のダウンレギュレーションなどの、ＴＡＺ発現の検出方法に特に有用である。ＴＡＺの増幅に適するプライマーは、ＴＡＺの任意の適する伸長部から生じさせることができる。使用することができるプライマーとしては、特異的である、すなわち、例えばＹＡＰとの有意な相同性を有さないＴＡＺの配列を増幅することができるものが挙げられる。
【０１６７】
ＴＡＺプライマーは、それら自体で提供することができるが、最も有用には、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマーペアとして提供する。
【０１６８】
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段を用いて、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて生産される。これは、（例えば、約１５から３０ヌクレオチドの）プライマーペアを作ること、動物またはヒト細胞から採取したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとそれらのプライマーを接触させること、所望の領域の増幅を生じさせる条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、増幅された断片を（例えば、アガロースゲルでその反応混合物を精製することによって）単離すること、および増幅されたＤＮＡを回収することを含む。該プライマーは、適する制限酵素認識部位を含有するため、増幅されたＤＮＡを適するクローニングベクターにクローニングすることができるように設計することができる。
【０１６９】
ポリヌクレオチドまたはプライマーは、顕示ラベルを有することがある。適するラベルとしては、放射性同位元素、例えば３２Ｐもしくは３５Ｓ、ジゴキシゲニン、蛍光色素、酵素ラベル、または他のタンパク質ラベル、例えばビオチンが挙げられる。そのようなラベルをポリヌクレオチドまたはプライマーに付加させることができ、それ自体が公知の技術を用いることによってそれらを検出することができる。ヒトまたは動物体内のポリヌクレオチドの検出または塩基配列決定のための核酸ベースの試験において、標識されたまたは未標識のポリヌクレオチドまたはプライマーまたはそれらの断片が当業者によって使用されることがある。
【０１７０】
検出のためのそのような試験は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体サンプルと、ポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させること、そのプローブとそのサンプル内の核酸とで形成された任意の２本鎖を検出することを一般に含む。そのような検出は、ＰＣＲなどの技術を用いて、または固体支持体にプローブを固定化し、プローブにハイブリダイズしていないそのサンプル内の核酸を除去し、そしてその後、そのプローブにハイブリダイズした核酸を検出することによって、果たすことができる。あるいは、サンプル核酸を固体支持体上に固定化してもよく、そしてそのような支持体に結合したプローブの量を検出することができる。このおよび他の形式の適するアッセイ方法は、例えばＷＯ８９／０３８９１およびＷＯ９０／１３６６７において見つけることができる。
【０１７１】
ヌクレオチド（例えばＴＡＺ核酸）の塩基配列決定のための試験は、ターゲットＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体サンプルと、ポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させること、および例えばＳａｎｇｅｒジデオキシ連鎖停止法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．参照）によってその配列を決定することを含む。
【０１７２】
上記の方法は、ターゲットＤＮＡまたはＲＮＡに相補的な鎖を合成することによってプライマーを適する試薬の存在下で伸長させ、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕ残基のうちの１つ以上で伸長反応を選択的に停止させるステップと、鎖伸長および停止反応を発生させるステップと、伸長産物をサイズに従って分離して、選択的停止が発生したヌクレオチドの配列を決定するステップとを一般に含む。適する試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、バッファーならびにＡＴＰが挙げられる。選択的停止にはジデオキシヌクレオチドを使用する。
【０１７３】
＜ＴＡＺ制御領域＞
幾つかの目的のために、ＴＡＺの制御領域を利用または調査する必要がある場合がある。そのような制御領域としては、プロモーター、エンハンサーおよび遺伝子座制御領域が挙げられる。制御領域とは、それに作動可能に連結されているコーディング配列の発現を調節することができる核酸配列または構造を意味する。
【０１７４】
例えば、制御領域は、ＴＡＺを発現するトランスジェニック動物の産生に有用である。さらに、制御領域は、ＴＡＺの発現構築物を生成するために用いることができる。これは、下でさらに詳細に説明する。
【０１７５】
ＴＡＺの制御領域の同定は、簡単であり、多数の方法で行うことができる。例えば、ＴＡＺのコーディング配列は、プローブとしてヒトまたはマウスＴＡＺのｃＤＮＡ配列を使用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、生物から得ることができる。５’配列は、適切なゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、または当分野において公知であるようなプライマー伸長によって、得ることができる。ゲノムデータベースのデータベース検索も利用することができる。特に興味深いそのような５’配列は、非コーディング領域を含む。この５’領域を目視によってまたはコンピュータープログラムを利用して調査して、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の存在を示す配列モチーフを同定することができる。
【０１７６】
さらに、２種以上の生物からのＴＡＺ核酸配列の配列アラインメントを行うことができる。異なる種からのＴＡＺ配列をアラインすることにより、アミノ酸配列のどの領域が、異なる種間で保存されるのか判定することができる。そのような保存領域は、問題の遺伝子（すなわち、ＴＡＺ）のための制御領域を含有する可能性が高い。本明細書に開示するマウスおよびヒトゲノム配列、例えば、マウスＴＡＺゲノム配列をこのために利用することができる。さらに、マウスおよびヒトＴＡＺ配列から生成した適切なプローブを使用する標準的なスクリーニング方法を用いて、他の生物からのＴＡＺ相同体を得ることができる。フグ類（トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ））またはゼブラフィッシュのゲノムをスクリーニングして、ＴＡＺ相同体を同定することもでき；このようにして、ＴＡＺの幾つかのゼブラフィッシュ配列を同定した（上で述べた）。フグ（Ｆｕｇｕ）またはゼブラフィッシュＴＡＺ遺伝子の５’非コーディング領域とマウスまたはヒトゲノムＴＡＺ配列との比較を用いて、制御領域を含有する保存領域を同定することができる。
【０１７７】
欠失調査を行って、ＴＡＺのプロモーターおよび／またはエンハンサー領域も同定することができる。
【０１７８】
候補配列をレポーター遺伝子に連結させ、そのレポーターの発現を検出する分子生物学的実験によって、推定制御領域の同一性を確認することができる。
【０１７９】
［検出および診断方法］
＜ＴＡＺの発現の検出＞
本発明者らは、実施例において、乳がん組織におけるＴＡＺの発現が正常乳房組織と比較してアップレギュレートされることを証明する。
【０１８０】
従って、本発明者らは、転移性、侵襲性または浸潤性乳がんなどの乳がんをはじめとするがんの診断方法を提供し、この方法は、個体の細胞または組織におけるＴＡＺの発現の調節、例えば、ＴＡＺの発現のアップレギュレーションを検出することを含む。
【０１８１】
ＴＡＺ発現、活性または量の検出は、細胞の増殖状態を判定する方法を提供するために用いることができる。例えば、増殖性細胞は、正常細胞と比較して高いＴＡＺ発現、活性または量レベルを伴うものである。同様に、非増殖性細胞は、正常細胞と比較して低いＴＡＺ発現、活性または量レベルを伴うものであり得る。
【０１８２】
そのような検出は、細胞が浸潤性または侵襲性になるかどうか判定するために用いることもできる。例えば、細胞におけるＴＡＺについての高いＴＡＺ発現、量、または活性レベルの検出は、その細胞が、侵襲性、転移性または浸潤性であるまたはそのようになる可能性が高いことを示し得る。同様に、細胞が低いＴＡＺ発現、量または活性レベルを有する場合、その細胞は、侵襲性、転移性もしくは浸潤性でない、または侵襲性、転移性もしくは浸潤性である可能性が低い。
【０１８３】
ＴＡＺのレベルは、腫瘍の侵襲性に伴って変化するので、がんを有する個体の生存率を予測するためにＴＡＺの発現、量、または活性の検出を用いることもできること、すなわち、高いＴＡＺレベルが、より低い生存率または確率を示し、低いＴＡＺレベルが、より高い生存率または確率を示すこと（両方とも、正常なＴＡＺレベルを有する個体または同源集団と比較した場合）は、理解される。従って、ＴＡＺの発現、量、または活性の検出は、がんを有する個体の予後判定方法として用いることができる。
【０１８４】
ＴＡＺの発現、量、またはレベルの検出は、がんを有する個体において特定の療法が成功する可能性を判定するために用いることができる。個体における腫瘍が浸潤性もしくは転移性腫瘍であるのかどうか、または浸潤性もしくは転移性腫瘍である可能性が高いのかどうかを判定する方法においてそれを用いることができる。
【０１８５】
本明細書に記載する診断方法は、記載する治療方法と併用することができる。それ故、本発明者らは、個体におけるがんの治療、予防または緩和方法を提供し、この方法は、その個体の細胞におけるＴＡＺの発現、量、または活性の調節を検出すること、およびその腫瘍の侵襲性に基づいてその個体に適切な療法を施与することを含む。
【０１８６】
一般に、乳がんの検出には、乳がんの身体検査およびＸ線マンモグラフィーが用いられる。乳がんの診断のための組織病理検査のために、一般に、腫瘍の生検材料を採取する。ＴＡＺの発現、量または活性の検出を標準的な組織病理学的手順と共に用いて、乳がんの診断すること、またはさらにその診断の確認をすることができる。これは、組織病理学的分析が明確な結果をもたらさなかったとき、特に有用である。
【０１８７】
下でさらに詳細に説明するように、サンプル中のＴＡＺポリペプチドおよび核酸の存在および量を検出することができる。例えば、乳がんをはじめとするＴＡＺ関連疾患は、被験者から採取したサンプルからＴＡＺポリペプチドまたはＴＡＺのｍＲＮＡの、異常に減少または増加した発現、量、または活性、例えば増加した発現、量、または活性を判定することを含む方法によって診断することができる。
【０１８８】
該サンプルは、発現、量、または活性レベルまたはパターンの空間的または時間的変化を含めて、増加した、減少した、あるいは異常なＴＡＺ発現、量、または活性を伴う疾病に罹患しているまたは罹患している疑いがある生物または個体からの細胞または組織サンプルを含む場合がある。そのような疾病に罹患しているまたは罹患している疑いがある生物におけるＴＡＺの発現、量、または活性レベルまたはパターンは、疾病の診断手段として、正常な生物における発現、量、または活性レベルまたはパターンと有効に比較することができる。
【０１８９】
該サンプルは、乳がんに罹患しているまたは罹患している疑いがある個体からの細胞または組織サンプル、例えば、乳房組織または細胞サンプルを含む場合がある。
【０１９０】
一部の実施形態では、サンプルにおいて増加したＴＡＺの発現、量、または活性レベルが検出される。ＴＡＺのレベルは、正常な細胞またはがん性でないことがわかっている細胞と比較して、有意な程度に増加されていることがある。そのような細胞は、試験している個体から得られる場合もあり、または別の個体、例えば年齢、体重、生活様式などが該被験個体と一致するものから得られる場合もある。
【０１９１】
一部の実施形態において、ＴＡＺの発現、量、または活性レベルは、１０％、２０％、３０％または４０％以上増加される。一部の実施形態において、ＴＡＺの発現、量または活性レベルは、ｃＤＮＡハイブリダイゼーションによって判定して、４５％以上、例えば５０％以上増加される。
【０１９２】
ＴＡＺの発現、量、または活性は、当分野において公知であるような、および下でさらに詳細に説明するような、多数の方法で検出することができる。一般に、個体からの組織のサンプル中のＴＡＺの量を測定し、罹患していない個体からのサンプルと比較する。ＴＡＺ核酸レベルとＴＡＺポリペプチドレベルの両方を測定してもよい。
【０１９３】
ＴＡＺの量、活性または発現の検出は、乳がんをグレード分けするために用いることができる。例えば、高いＴＡＺ量、活性または発現レベルは、侵襲、浸潤または転移がんを示し得る。同様に、低いＴＡＺ量、活性または発現レベルは、非侵襲、非浸潤または非転移がんを示し得る。そのようなグレード分類システムを、確立されたグレード分類システム、例えば、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍグレード分類システム（ＮＧＳ）としても公知である（５、６、Ｈａｙｂｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ，１９８２）Ｅｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓ改良型Ｓｃａｒｆｆ−Ｂｌｏｏｍ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎグレード分類システムと併用することができる。
【０１９４】
このシステムは、最も研究され広範に用いられている乳がんグレード分類法である。ＮＧＳは、細管形成度、核多形性および有糸分裂数をはじめとする腫瘍細胞の形態学的および細胞学的特徴の顕微鏡評価を含む表現型採点手順に基づく（６）。これらのスコアの合計によって、乳がんをグレード１（Ｇ１）（十分に分化、遅成長性）、グレードＩＩ（Ｇ２）（中等度に分化）、およびグレードＩＩＩ（Ｇ３）（分化不良、高増殖性）悪性度に当てはめる。
【０１９５】
ＴＡＺ遺伝子発現レベルは、多数の異なる技術を用いて判定することができる。
【０１９６】
＜ＲＮＡレベルでのＴＡＺの発現の測定＞
ＴＡＺ遺伝子発現をＲＮＡレベルで検出することができる。
【０１９７】
従って、１つの実施形態において、本発明者らは、ＴＡＺ核酸に特異的な少なくとも１つの核酸プローブとサンプルを接触させ、該サンプルを該ＴＡＺ核酸の存在についてモニターすることによる、サンプル中のＴＡＺ核酸を含む核酸の存在を検出する方法を開示する。例えば、該核酸プローブは、ＴＡＺ核酸またはその一部分に特異的に結合することができ、それら２つの間の結合を検出することができ、その複合体それ自体の存在も検出することができる。
【０１９８】
例えば、１つの実施形態では、サンプル中のＴＡＺのｍＲＮＡ形態のＴＡＺ核酸の量を測定することができる。ＴＡＺのｍＲＮＡは、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法および逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応によってアッセイすることができる。核酸配列は、インサイチューハイブリダイゼーション、サザンブロット法、１本鎖配座多形性、特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅およびＤＮＡチップ分析（Ｋａｗａｓａｋｉ，１９９０；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９９２；Ｌｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９０；Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９８９；Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）によって同定することができる。
【０１９９】
ＴＡＺのＲＮＡは、例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、またはＲＮｅａｓｙ−ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）の使用を含む、ＲＮＡ抽出技術を用いて細胞から抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する代表的なアッセイ形式としては、核ランオンアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５）が挙げられる。利用することができる検出方法としては、放射性ラベル、酵素ラベル、化学発光ラベル、蛍光ラベルおよび他の適するラベルを挙げることができる。
【０２００】
これらの方法のそれぞれが、定量の実施を可能にし、また、当分野において周知である。従って、減少または増加したＴＡＺ発現、量、または活性は、ポリヌクレオチドの定量のための当分野において周知の方法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定することができる。ＴＡＺ配列からの任意の適するプローブ、例えば、適するヒトＴＡＺ配列の任意の部分を、プローブとして使用することができる。ＴＡＺプローブを設計するための配列としては、アクセッション番号ＮＭ＿０１５４７２を有する配列またはその一部分が挙げられる。
【０２０１】
一般に、ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡターゲットを増幅するために用いられる。このプロセスでは、逆転写酵素を使用してＲＮＡを相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換し、その後、それを増幅して検出を助長することができる。
【０２０２】
多くのＤＮＡ増幅法が公知であり、それらの大部分が、酵素的連鎖反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、もしくは自家持続配列複製）に依存し、またはクローニングされたベクターのすべてもしくは一部の複製のものである。
【０２０３】
多くのターゲットおよびシグナル増幅法が文献、例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２２９−２３７（１９８８）およびＬｅｗｉｓ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １０：１，５４−５５（１９９０）におけるこれらの方法の一般論評に記載されている。
【０２０４】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてＴＡＺのｍＲＮＡを検出することができる。
【０２０５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、核酸増幅法であり、とりわけ米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。ＰＣＲは、診断状況下で任意の公知の核酸を増幅するために用いることができる（Ｍｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５２：２４７−２５２）。自家持続配列複製（３ＳＲ）は、酵素カクテルおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーによって媒介される逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼおよびヌクレアーゼ活性の逐次ラウンドによる核酸テンプレートの等温増幅を含むＴＡＳの変形である（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１８７４）。ライゲーション増幅反応またはライゲーション増幅系は、ＤＮＡリガーゼおよび４つのオリゴヌクレオチド、ターゲット鎖当たり２つ、を用いる。この技術は、Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．，１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０によって記載されている。１本鎖ＲＮＡを複製するＱβレプリカーゼ技術、バクテリオファージＱβについてのＲＮＡレプリカーゼは、Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７によって記載されているように、ターゲットＤＮＡを増幅するために用いられる。
【０２０６】
ＰＣＲ手順は、基本的に、（１）抽出ＤＮＡを処理して１本鎖の相補鎖を形成するステップと、（２）ペアのオリゴヌクレオチドプライマーを付加させるステップと（この場合、そのペアの一方のプライマーは、そのセンス鎖内の配列の一部に実質的に相補的であり、およびそれぞれのペアの他方のプライマーは、その相補アンチセンス鎖内の同じ配列の異なる部分に実質的に相補的である）、（３）ペアのプライマーをその相補配列にアニールするステップと、（４）それらのアニールされたプライマーをそれぞれのプライマーの３’末端から同時に伸長させて、それぞれのプライマーにアニールされた鎖に相補的な伸長産物を合成するステップと（この場合、該伸長産物は、相補鎖から分離後、それぞれのペアの他方のプライマーについての伸長産物合成のためのテンプレートとして役立つ）、（５）該テンプレートから該伸長産物を分離して、１本鎖分子を生成するステップと、（６）該アニール、伸長および分離段階を少なくとも１回繰り返すことによって該１本鎖分子を増幅するステップとを含む。
【０２０７】
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用することができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲを利用することもできる。そのようなＰＣＲ技術は、当分野において周知であり、また、ＴＡＺ配列からの任意の適するプライマーを利用することができる。
【０２０８】
代替増幅技術を活用することもできる。例えば、ローリングサークル増幅（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９：２２５）は、ＤＮＡポリメラーゼによって駆動される、および等温条件下で線形または幾何学的動態を用いて環状オリゴヌクレオチドプローブを複製することができる、市販の増幅技術（ＲＣＡＴ（商標））である。さらなる技術、鎖置換増幅（ＳＤＡ；Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３９２）は、特定のターゲットに対して一意的な特別定義配列を用いて開始する。
【０２０９】
＜ポリペプチドレベルでのＴＡＺ発現の測定＞
ＴＡＺ発現をポリペプチドレベルで検出することができる。
【０２１０】
従って、さらなる実施形態では、サンプル中のＴＡＺポリペプチドの存在または量を検出することによって、ＴＡＺ発現、量または活性を検出することができる。これは、ＴＡＺポリペプチドに結合する分子を使用することによって果たすことができる。その存在を検出するためにＴＡＺポリペプチドに直接または間接的に結合する、適する分子／薬剤としては、自然に存在する分子、例えば、ペプチドおよびタンパク質、例えば抗体が挙げられ、またはそれらは合成分子である場合もある。
【０２１１】
それ故、本発明者らは、ＴＡＺポリペプチドの存在を検出する方法を開示し、この方法は、そのポリペプチドに結合することができる抗体と細胞サンプルを接触させ、該サンプルをそのポリペプチドの存在についてモニターすることによる。
【０２１２】
例えば、該ＴＡＺポリペプチドは、抗ＴＡＺ抗体を使用して検出することができる。そのような抗体は、（下でさらに詳細に説明するような）当分野において公知の手段によって作ることができる。例えば、抗ＴＡＺ抗体は、ＴＡＺのＴＡＺアミノ酸残基１６０−２２９に対する抗体、例えば抗ペプチド抗体、を含む場合がある。
【０２１３】
これは、該抗体と該ポリペプチドとで形成された複合体の存在をモニターすることによって、または該ポリペプチドと該抗体との結合をモニターすることによって、適便に果たすことができる。２つの構成要素間の結合を検出する方法は当分野において公知であり、それらとしては、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。
【０２１４】
上で説明したような免疫ブロット法などの標準的な実験技術を用いて、同じ細胞集団内の未処理細胞と比較して改変されたＴＡＺタンパク質レベルを検出することができる。
【０２１５】
遺伝子発現は、ＴＡＺポリペプチドの翻訳後プロセッシングまたはＴＡＺ核酸の転写後修飾の変化を検出することによって判定することもできる。例えば、ＴＡＺポリペプチドの特異的リン酸化、ＴＡＺポリペプチドの切断またはＴＡＺのＲＮＡの選択的スプライシングなどを測定することができる。有標タンパク質アッセイまたは技術、例えば２Ｄポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて、ＴＡＺポリペプチドなどの遺伝子産物の発現レベル、ならびにそれらの翻訳後修飾レベルを検出することもできる。
【０２１６】
宿主から採取したサンプル中のＴＡＺタンパク質レベルを判定するために用いることができるアッセイ技術は、当業者に周知である。当分野において公知の任意の方法によって、抗体を免疫特異的結合についてアッセイすることができる。
【０２１７】
用いることができるイムノアッセイとしては、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、相補鎖結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイおよびプロテインＡイムノアッセイなどの技術を用いる、競合および非競合アッセイシステムが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアッセイは、当分野において常例的である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。これらは、その全体が参照により本明細書に援用されている）。
【０２１８】
免疫組織化学的および免疫細胞化学的染色（一般に、Ｓｔｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｒｒ，Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，１９９４参照）、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、機能アッセイおよびタンパク質トランケーション試験によって、検体をポリペプチド／タンパク質についてアッセイすることができる。他のアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【０２１９】
ＥＬＩＳＡアッセイは、当業者に周知である。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方をそれらのアッセイにおいて用いることができる。適宜、当業者に公知であるような他のイムノアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いることができる。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，１９９２参照。
【０２２０】
＜ＴＡＺ誘導ポリペプチドの発現の検出＞
実施例において示すように、ＴＡＺは、ＩＧＦＢＰ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、ＦＳＴＬ１、ＦＮ１、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２ＡＸＬ、ＩＴＧＢ２、ＣＲＩＭ１およびＡｌｃａｍの発現を誘導する。
【０２２１】
ＩＦＧＢＰ３は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ５２７０６を有する。ＡＤＡＭＴＳ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＺ７３０３４を有する。ＣＴＧＦは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ６３２６７を有する。Ｃｙｒ６１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＧ３８７５７を有する。ＦＳＴＬ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００９０１６を有する。ＦＮ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ０５８５８を有する。ＦＢＮ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ９４７２１を有する。ＩＴＧＢ２は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ２１０７７を有する。ＣＲＩＭ１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＱ８８７３７を有する。Ａｌｃａｍは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ５９４９９を有する。
【０２２２】
従って、ＴＡＺ発現は、上で説明したように、これらのタンパク質のうちのいずれか１つ以上の発現を代用品として用いて核酸レベルまたはポリペプチドレベルいずれかで検出することができる。
【０２２３】
より一般的には、これらのタンパク質のうちのいずれか１つ以上の発現を、転移性、侵襲性もしくは浸潤性乳がんなどの乳がんを含むがんまたは発がん性もしくは転移性細胞の診断手段として、検出することができる。そのような発現の検出は、上で説明した方法のいずれかによって行うことができる。
【０２２４】
＜診断キット＞
本発明者らは、個体における乳がん、または個体における乳がんへの罹病性を検出するための診断キットも提供する。
【０２２５】
該診断キットは、本明細書に記載するようないずれかの手段による、個体におけるＴＡＺの発現、量、または活性を検出するための手段を含み得る。従って、該診断キットは、次のもののうちのいずれか１つ以上を含む場合がある：ＴＡＺポリヌクレオチドもしくはその断片；ＴＡＺ核酸もしくはその断片に対する相補ヌクレオチド配列；ＴＡＺポリペプチドもしくはその断片、またはＴＡＺのアミノ酸残基１６０−２２９に対する抗ＴＡＺ抗体、例えば抗ペプチド抗体ヒトＴＡＺ抗体、を含むようなＴＡＺに対する抗体。
【０２２６】
該診断キットは、使用のための説明書、または他の表示を含む場合がある。該診断キットは、乳がんの治療または予防のための手段、例えば、本明細書に記載する組成物のいずれか、または乳がんを治療するための当分野において公知の任意の手段をさらに含む場合がある。詳細には、該診断キットは、例えばスクリーニングによって得られた、記載したような抗ＴＡＺ剤を含む場合がある。該診断キットは、治療薬、例えば、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）もしくはその変異体、例えばタモキシフェン、クエン酸タモキシフェン、または他の抗エストロゲン薬もしくはエストロゲン遮断薬を含む場合がある。該治療薬は、抗ＴＡＺ抗体を含む場合もある。
【０２２７】
＜予防および治療方法＞
本発明者らは、不十分なＴＡＺ発現または活性量に関連した異常な状態、例えば乳がん、を治療する方法を開示する。乳がんを予防する方法（すなわち、予防法）も同じまたは類似のアプローチを適切に利用する。
【０２２８】
一般的に言って、本発明者らの方法は、細胞内のＴＡＺの発現、量または活性を調節する（例えば、ダウンレギュレートする）ことによる、がん細胞の操作を含む。細胞内の調節されたＴＡＺ発現、量または活性を検出する段階は、その操作段階の前に行ってもよいし、または後に行ってもよい。該検出段階は、アップレギュレートされたＴＡＺ発現、量または活性を検出する場合もあり、またはダウンレギュレートされたＴＡＺ発現、量または活性を検出する場合もある。本明細書の他の箇所で詳細に説明するようなＴＡＺの調節またはダウンレギュレート法のうちのいずれを用いてもよい。
【０２２９】
該方法は、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、またはＴＡＺに特異的に結合することができる抗ＴＡＺ抗体に細胞を曝露することを含む場合がある。ＴＡＺは、ＫＤ−１（５’−ＧＡＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＣ−３’）、ＫＤ−６５０（５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’）またはＫＤ−６５２（５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’）から選択されるＴＡＺターゲット部位にターゲッティングすることによって、調節することができる。
【０２３０】
本発明者らの方法によると、該操作の結果として、がん細胞は、非がん性になり、または浸潤性もしくは転移性がん細胞は、非浸潤性もしくは非転移性になる。該がんとしては、特に、乳がんが挙げられる。それは、浸潤または転移がん、例えば、浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）を含み得る。
【０２３１】
ＴＡＺをがんの侵襲性および浸潤性と関係づける場合、がんを有する個体の細胞において、がん細胞または非がん細胞においてＴＡＺのレベルを検出し、がんの侵襲性を評価することができる。正常細胞と比較して高いＴＡＺ量、発現または活性レベルは、侵襲または浸潤がんを示し、従って、より強いまたはより過酷な療法が必要とされまたは選択され得る。同様に、より低いレベルは、あまり侵襲性または浸潤性でない療法を示し得る。
【０２３２】
本明細書に記載するアプローチは、一般に、任意のＴＡＺ関連疾患の療法に用いることができる。ＴＡＺ関連疾患としては、増殖性疾患が挙げられ、特に、がんが挙げられる。例えば、ＴＡＺ関連疾患としては、乳がん、例えば、転移性、浸潤性または侵襲性乳がんを挙げることができる。
【０２３３】
ＴＡＺ関連疾患は、その疾病に随伴する状態が、対照に相対して有意に（すなわち、５０％以上）抑制される場合、「治療される」と定義する。該阻害は、対照に相対して少なくとも７５％、例えば、９０％、９５％または１００％であり得る。該状態は、細胞増殖を含むこともあり、または細胞周期時間、細胞数、細胞移動、細胞浸潤などを含むこともある。用語「治療」は、がんの予防および緩和も含むものとする。
【０２３４】
ＴＡＺポリペプチドは、特に腫瘍細胞および他の増殖性細胞において、治療のためその機能を阻害するターゲットの代表である。
【０２３５】
増殖性疾患という用語は、本明細書では、細胞周期の制御を必要とする任意の疾患を含む広い意味で用いている。詳細には、増殖性疾患は、悪性疾患および新生物発生前の疾患を含む。本明細書に記載する方法および組成物は、腺がん、例えば、小細胞肺がん、ならびに腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸および乳房のがんの治療または診断に関して特に有用である。例えば、治療可能であり得る悪性病変としては、急性および慢性白血病、リンパ腫、骨髄腫、肉腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫（ｌｅｉｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、横紋筋肉腫、結腸がん、卵巣がん、神経膠腫、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、絨毛上皮腫、腎細胞がん、ヘパトーム、胆道がん、精上皮腫、胎児性がん、子宮頚がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｎｅｕｏｍａ）、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、乏突起神経膠腫、メナンジオーマ（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫が挙げられる。
【０２３６】
そのような疾患の治療のための１つの可能なアプローチは、本明細書に記載するようなＴＡＺポリヌクレオチドに対するアンチセンス構築物を発現させ、それらを腫瘍細胞に投与して、遺伝子機能を阻害するおよび腫瘍細胞の成長または発達を防止することである。
【０２３７】
アンチセンス構築物を使用して遺伝子機能を阻害して、増殖性細胞における成長または発達を防止することができる。アンチセンス構築物、すなわち、センス核酸またはｍＲＮＡに相補的な核酸、例えばＲＮＡの構築物は、ＵＳ  ６，１００，０９０（Ｍｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．）およびＮｅｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｇ  ３（１−２）：１７５−２３１に詳細に記載され、これらの教示は、参照により特に援用されている。
【０２３８】
特定の例では、例えばＴＡＺのｍＲＮＡに結合しそれを破壊することができるｓｉＲＮＡにより、ＴＡＺの量、発現、または活性の全部または一部を低下させることによって、乳がんを治療または予防することができる。本発明者らは、ＲＮＡ干渉によってＴＡＺをダウンレギュレートする抗ＴＡＺ剤を特に提供している。この抗ＴＡＺ剤は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む場合がある。
【０２３９】
該抗ＴＡＺ剤は、ｓｈＲＮＡ１（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＧＡＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＣ−３’）、ｓｈＲＮＡ６５０（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’）またはｓｈＲＮＡ６５２（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’）を含む場合がある。そのようなｓｈＲＮＡを生産する方法を下で、および詳細に実施例において説明する。
【０２４０】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の直接導入によって誘導される転写後型遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）法であり、様々な生物において特定の遺伝子の発現をノックアウトする有用なツールとして登場した。ＲＮＡｉは、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１（１９９８）によって説明されている。ＰＴＧＳの他の方法は公知であり、それらとしては、例えば、トランスジーンまたはウイルスの導入が挙げられる。一般に、ＰＴＧＳでは、サイレンシングされた遺伝子の転写産物を合成するが、それは急速に分解するので蓄積しない。ＲＮＡｉをはじめとする、ＰＴＧＳのための方法は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍワールド・ワイド・ウェブ・サイトにおける「ｒｎａｉ」ファイルのディレクトリー「／ｈｏｔｔｏｐｉｃｓ／」において説明されている。
【０２４１】
インビトロでのＲＮＡｉに適する方法を本明細書において説明する。１つのそのような方法は、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）の導入を含む。現行のモデルは、これらの２１−２３ヌクレオチドｄｓＲＮＡがＰＴＧＳを誘導できることを示す。有効なｓｉＲＮＡを設計するための方法は、例えば、上に記載したＡｍｂｉｏｎウェブサイトにおいて説明されている。ＲＮＡ前駆体、例えば短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も、ＴＡＺ核酸配列のすべてまたは一部によってコードされ得る。
【０２４２】
あるいは、２本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、ある範囲の生物における遺伝子発現に干渉する強力な方法であり、哺乳動物においてうまくいくことが近年証明された（Ｗｉａｎｎｙ  ａｎｄ  Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ，２０００，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：７０−７５）。ＴＡＺポリヌクレオチドの配列に対応する２本鎖ＲＮＡを、候補生物の卵母細胞および細胞に導入して、またはそれらの細胞において発現させて、ＴＡＺ活性に干渉することができる。
【０２４３】
ＴＡＺ遺伝子発現を調節する他の方法は、当業者に公知であり、ドミナント・ネガティブ・アプローチを含む。従って、もう１つのアプローチは、機能の阻害を生じさせる結果となる内因性遺伝子産物と競合する、本明細書におけるＴＡＺポリペプチドの非機能性変異体の使用である。
【０２４４】
ＴＡＺ遺伝子発現は、例えば遺伝子発現または機能活性を阻害するペプチドまたは小分子を導入することによって、調節することもできる。それ故、ＴＡＺポリペプチドに結合する、またはＴＡＺポリペプチドの量、活性または発現を調節する、例えばダウンレギュレートする、と本明細書に記載するアッセイによって確認された化合物を腫瘍または増殖性細胞に投与して、ＴＡＺポリペプチドの機能を防止することができる。そのような化合物は、医薬的に許容される担体と共に、ＴＡＺの発現もしくは活性をダウンレギュレートするために有効な量で、またはＴＡＺ発現、活性もしくは量を制御する第二のシグナルを活性化もしくはダウンレギュレートし、それによってその異常な状態を緩和する量で、投与することができる。
【０２４５】
本明細書に記載するようなＴＡＺポリペプチドに対する適する抗体を治療薬として使用することもできる。抗ＴＡＺ抗体は、ＴＡＺのアミノ酸１６０−２２９に対するウサギ抗ＴＡＺ抗体を含む場合がある。さらに、該抗ＴＡＺ抗体は、次のもののうちのいずれか一つ以上を含む場合がある：ウサギ抗ＴＡＺ抗体（カタログ番号２１４９Ｓ、米国、マサチューセッツ州、ダンヴァーズのＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクローナル抗ＴＡＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−５８３５９ＳＳ、米国、コロラド州、リトルトンのＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、マウスモノクローナル抗−ＴＡＺ［１Ｂ１０］（カタログ番号Ｈ００００６９０１−Ｍ１２、米国、コロラド州、リトルトンのＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ウサギ抗ヒトＴＡＺポリクローナル抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｂ９４、米国、ワシントン州、シアトルのＬｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）またはｐ−ＴＡＺ（Ｓｅｒ  ８９）−Ｒ（カタログ番号ｓｃ−１７６１０−Ｒ、米国、カリフォルニア州、サンタクルーズのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【０２４６】
あるいは、遺伝子療法を利用して、被験者における乳房細胞などの該当細胞によるＴＡＺの内因的生産を制御することができる。例えば、ＴＡＺ−ｓｉＲＮＡまたはこの一部分をコードするポリヌクレオチドを、下で説明するように、複製欠損レトロウイルスベクターにおける発現のために遺伝子操作することができる。その後、そのレトロウイルス発現構築物を単離し、抗ＴＡＺ−ｓｉＲＮＡをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターが形質導入されたパッケージング細胞に導入することができるので、今や、そのパッケージング細胞は、対象となる配列を含有する感染性ウイルス粒子を生産する。インビボで細胞を遺伝子操作し、インビボでＴＡＺポリペプチドの発現を調節するために、これらのプロデューサー細胞を被験者に投与することができる。遺伝子療法の全体像については、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２０，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，（およびその中で引用されている参考文献）ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔ  Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ａ  Ｐ  Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ（１９９６）を参照のこと。
【０２４７】
一部の実施形態では、ＴＡＺのレベルを乳房細胞において減少させる。さらに、そのような実施形態では、治療を乳房細胞にターゲッティングすることができ、すなわち治療は乳房細胞特異的であり得る。罹病乳房細胞（すなわち、がん性である細胞）におけるＴＡＺの発現だけを特異的に減少させることができ、他の非罹病乳房細胞では実質的に減少させない。これらの方法では、他の細胞、すなわち乳房細胞でない細胞におけるＴＡＺの発現を実質的に低下させない。したがって、そのような実施形態では、治療の過程でおよび治療後、非乳房細胞におけるＴＡＺのレベルは、実質的に同じまたは同様のままである。
【０２４８】
ＴＡＺレベルの乳房細胞特異的低下は、ターゲッティングされた投与、すなわち、乳房細胞のみに治療を適用し、他の細胞にはしないことによって、果たすことができる。しかし、他の実施形態では、乳房細胞におけるＴＡＺ発現のダウンレギュレーション（および他の細胞または組織タイプにおいては実質的にダウンレギュレーションしない）を用いる。そのような方法は、下でさらに詳細に説明するように、例えばｓｉＲＮＡの乳房特異的発現のために、乳房特異的発現ベクターを有利に使用することができる。
【０２４９】
＜トランスジーン（抗ＴＡＺ−ｓｉＲＮＡ）の乳房特異的発現＞
がん遺伝子療法は、正常な組織における望ましくない副作用を低下させるために腫瘍組織を選択的にターゲッティングしなければならない。悪性組織へのトランスジーン発現のターゲッティングは、腫瘍生物学に基づくプロモーター、組織特異的プロモーターおよび誘導性調節要素（Ａ１）をはじめとする特異的調節要素の使用を必要とする。
【０２５０】
＜腫瘍生物学に基づくプロモーター＞
乳がんの際に一定の遺伝子がアップレギュレートされる。これらの遺伝子のプロモーターは、組換え複製欠損レトロウイルスベクターを使用してトランスジーンを腫瘍選択的に発現させるために、使用することができる。そのような遺伝子の例としては、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子受容体−１（ＶＥＧＦＲ−１）およびＶＥＧＦＲ−２が挙げられ、これらが乳がんの際に腫瘍病期依存様式でアップレギュレートされることは公知である（Ａ２）。ｃ−ｅｒｂＢ２がん遺伝子は、乳がんの際に選択的にアップレギュレートされる（Ａ３、Ａ６）。Ｌ−プラスチン、ヒトアクチン結合タンパク質は、悪性上皮細胞において構成的におよび豊富に発現されるが、成熟造血細胞における低レベルの発現を除いて正常な組織では発現されない（Ａ４）。抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−２は、乳がん細胞においてアップレギュレートされることが判明した（Ａ５）。ヒト乳房腫瘍は、正常乳房組織と比較して高レベルのＭＵＣ１を発現する（Ａ７）。
【０２５１】
＜組織特異的プロモーター＞
一定の遺伝子が乳房組織において特異的に発現される。そのような遺伝子の例は、ヒトα−ラクトアルブミン（ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）（ＡＬＡ）およびヒツジβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）である。そのような遺伝子のプロモーターを使用して、アデノウイルスベクターにおいて乳がん細胞特異的様式でトランスジーンを発現させることができる（Ａ８）。乳がんのための遺伝子療法には、この組織への親和性を有するウイルス、例えばマウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）を作ることによって取り組むことができる。このレトロウイルスの糖質コルチコイド反応性の長い末端反復配列（ＬＴＲ）は、トランスジーンの糖質コルチコイド誘導発現のためのプロモーターとして使用することができる（Ａ９）。
【０２５２】
＜誘導性プロモーター＞
誘導性プロモーターは、一過性トランスジーン発現の媒介因子として使用される。様々なストレス遺伝子が、乳房腫瘍の際、放射線または化学療法治療に基づいてアップレギュレートされる。そのようなストレス遺伝子の例は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）（Ａ１０）および多剤耐性遺伝子−１（ＭＤＲ−１）（Ａ１１）である。従って、これらの遺伝子のプロモーターは、放射線または化学療法に付された乳がんにおいてトランスジーンを腫瘍特異的に発現させるために使用することができる。
【０２５３】
転写ターゲット遺伝子療法は、対象となるトランスジーンを含有する複製欠損アデノウイルス発現ベクターの直接腫瘍内注射によって、通常、果たされる（Ａ６、Ａ１２、Ａ１３）。該トランスジーンは、カチオン性リポソームとの脂質複合体として腫瘍内注射によって送達することもできる（Ａ１４、Ａ１５）。
【０２５４】
＜乳がん＞
本明細書に記載する方法および組成物によると、ＴＡＺは、乳がんの診断または治療に有用である。本明細書が「がん」に言及する場合、これは、転移、侵襲または浸潤がんを含むと解釈するものとする。
【０２５５】
乳がんには幾つかのタイプがある。最も一般的であるのは乳管がんであり、これは、乳房の乳管の裏層で始まる。別のタイプ、小葉がんは、母乳が生産される小葉で始まる。悪性腫瘍が組織近くに浸潤している場合、それは、浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇまたはｉｎｖａｓｉｖｅ）がんとして公知である。乳がんが乳房の外に広がると、多くの場合、がん細胞が腕の下のリンパ節で見つかる。乳がん細胞は、乳房を越えて、例えば他のリンパ節、骨、肝臓または肺へと広がることがある。
【０２５６】
認知されている乳がん病期は、以下を含む。
０期：超早期乳がん。このタイプのがんは、乳房の内部または外部に広がっていない。それは、時として、ＤＣＩＳ、ＬＣＩＳ、または非浸潤性乳がん、または非浸潤がんと呼ばれる。
【０２５７】
Ｉ期：がんは約１インチ以下の大きさのサイズであり、乳房の外部に広がっていない。（早期乳がんとも記述される）。
【０２５８】
ＩＩ期：次のうちのいずれかの所見：がんは１インチ以下の大きさであるが、腕の下のリンパ節に広がっている；がんは１インチと２インチの間である。腕の下のリンパ節に広がっていることもあり、または広がっていないこともある；がんは２インチより大きいが、腕の下のリンパ節に広がっていない。
【０２５９】
ＩＩＩ期およびＩＩＩＡ期：次のうちのいずれかの所見：がんは２インチより小さく、腕の下のリンパ節に広がって、そのがんがさらに他のリンパ節にも広がっている；がんは２インチより大きく、腕の下のリンパ節に広がっている。
【０２６０】
ＩＩＩＢ期：次のうちのいずれかの所見：がんは乳房付近の組織（皮膚、胸壁（胸部の肋骨および筋肉を含む））に広がっている；がんは胸骨に沿って胸壁の内側のリンパ節に広がっている。
【０２６１】
ＩＶ期：がんは身体の他の部分、最も多くの場合、骨、肺、肝臓または脳に広がっている。または腫瘍は、鎖骨付近の、皮膚および首の内側のリンパ節に局所的に広がっている。
【０２６２】
炎症性乳がん：炎症性乳がんは稀であるが、非常に重篤な侵襲タイプの乳がんである。乳房が、赤く見えるまたは熱感を伴うことがある。乳房に稜線、みみずばれまたは蕁麻疹がある場合もあり；または皮膚が、しわがよったように見えることがある。時として、単純な感染症と誤診される。
【０２６３】
再発乳がん：再発疾患は、がんが、治療した後に戻ってきた（再発した）ことを意味する。乳房において、胸（胸壁）の軟組織において、または身体の別の部分において、戻ってくることがある。
【０２６４】
＜非浸潤性乳がん−ＤＣＩＳおよびＬＣＩＳ＞
発見される多くの乳がんは、非浸潤性乳がんまたは非浸潤がんとして公知の非常に早期のがんである。これらのがんの大部分は、マンモグラフィーによって発見される。これらの超早期細胞変化が、浸潤性乳がんになる場合がある。２つのタイプの非浸潤性乳がんとして、以下のものが挙げられる：
異常細胞が乳房の乳管の裏層においてしか見つけられないことを意味する、ＤＩＣＳ（非浸潤性乳管がん）。それらの異常細胞は、その管の外側に広がっていない。乳房内に広がっておらず、乳房を越えて広がっておらず、腕の下のリンパ節に広がっておらず、および身体の他の部分に広がっていない。幾つかのタイプのＤＣＩＳがある。除去しないと、一部のタイプは、時間の経過とともに変化し、浸潤がんになる場合がある。決して浸潤がんにならないものもある。（ＤＣＩＳは、時として、腺管内がんと呼ばれる）。
【０２６５】
異常細胞が乳小葉の裏層において見つけられることを意味する、ＬＣＩＳ（非浸潤性小葉がん）。ＬＣＩＳは、この非浸潤期では実際の乳がんとみなされないが、浸潤がんを発現する危険度増加の警戒徴候である。時として、ＬＣＩＳは、乳房Ｘ線像で発見される別の塊または異常な変化のために生検を行ったときに発見される。ＬＣＩＳを有する患者は、以後２５年の間にいずれかの乳房に乳がんを発現する２５パーセントの可能性を有する。
【０２６６】
微小石灰化は、触知できないが乳房Ｘ線像で見ることができる、カルシウムの微小斑点である。それらは、細胞の急速な分裂によって形成される。それらが乳房の１領域でクラスター化すると、これは、非浸潤性乳がんの早期徴候となり得る。マンモグラフィーによって発見される乳がんの約半分は、微小石灰化のクラスターとして現れる。他の半分は、腫瘍（ｌｕｍｐｓ）として現れる。
【０２６７】
＜診断＞
本発明者らの診断方法は、公知の乳がん遺伝子ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２のいずれかまたは両方における突然変異の検出をはじめとする、任意の公知である乳がん診断方法と併用することができる。あるいは、または加えて、本診断は、Ｈｅｒ２発現の検出によって、例えば抗Ｈｅｒ２抗体の使用によって、行うことができる。
【０２６８】
＜治療＞
公知の乳がん治療は、以下のうちのいずれか一つ以上から成り得る：外科手術、放射線療法、化学療法、高用量化学療法、ホルモン療法および免疫療法。従って、本明細書に記載する治療方法のうちのいずれかを、前述の公知の療法のうちのいずれか１つ以上と併用することができる。加えて、がんの治療または緩和に有効であることが公知である以下の一般療法のうちのいずれか１つ以上を用いることができる。
【０２６９】
＜非特異的免疫調節薬＞
非特異的免疫調節薬は、免疫系を刺激する、または間接的に増加させる物質である。多くの場合、これらの薬剤は、重要な免疫系細胞をターゲットにし、二次応答、例えばサイトカインおよび免疫グロブリンの生産増加、を生じさせる。がん治療に用いられる２つの非特異的免疫調節薬は、カルメット・ゲラン杆菌（ＢＣＧ）およびレバミソールである。本明細書に記載する抗ＴＡＺ剤は、そのような非特異的免疫調節薬のいずれかと併用することができる。
【０２７０】
＜生体応答修飾物質＞
一部の抗体、サイトカインおよび他の免疫系物質は、がん治療において使用するために研究所において生産することができる。これらの物質は、多くの場合、生体応答修飾物質（ＢＲＭ）と呼ばれる。それらは、身体の免疫防御とがん細胞との相互作用を改変して、病気と闘う身体の能力を増進、管理または回復させる。ＢＲＭとしては、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、モノクローナル抗体、およびワクチンが挙げられる。本明細書に記載する抗ＴＡＺ剤は、そのような生体応答修飾物質のいずれかと併用することができる。
【０２７１】
＜インターフェロン（ＩＦＮ）＞
インターフェロンには３つの主要タイプ（インターフェロンアルファ、インターフェロンベータおよびインターフェロンガンマ）があり、がん治療にはインターフェロンアルファが最も広範に用いられている。
【０２７２】
インターフェロンは、がん患者の免疫系ががん細胞に対して作用する方法を改善することができる。加えて、インターフェロンは、それらの成長を遅らせることによって、またはより正常な挙動を有する細胞へのそれらの発達を促進することによって、がん細胞に直接作用することができる。一部のインターフェロンは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞およびマクロファージを刺激して、免疫系の抗がん機能を増強することもできる。
【０２７３】
本明細書に記載する抗ＴＡＺ剤は、そのようなインターフェロンのいずれかと併用することができる。
【０２７４】
＜インターロイキン（ＩＬ）＞
インターフェロンと同様に、インターロイキンは、体内に自然に存在するサイトカインである。多くのインターロイキンが同定され、インターロイキン−２（ＩＬ−２またはアルデスロイキン）ががん治療に関して最も広範に研究されている。ＩＬ−２は、がん細胞を破壊することができる多くの免疫細胞（例えばリンパ球）の成長および活性を刺激する。
【０２７５】
本明細書に記載する抗ＴＡＺ剤は、そのようなインターロイキンのいずれかと併用することができる。
【０２７６】
＜コロニー刺激因子（ＣＳＦ）＞
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（時として、造血成長因子と呼ばれる）は、通常、腫瘍細胞に直接影響を及ぼさず、むしろ、骨髄幹細胞の分裂および白血球、血小板および赤血球への発達を助長する。骨髄は、すべての血液細胞の供給源であるため、身体の免疫系にとって重要である。
【０２７７】
Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）およびＧＭ−ＣＳＦ（サルグラモスチン）は、化学療法を受けている患者において白血球数を増加させ、それによって感染の危険度を低下させることができる。Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦは、幹細胞および骨髄移植片の作製の際に幹細胞の生産を刺激することもでき、エリスロポエチンは、化学療法を受けている患者において赤血球数を増加させ、赤血球輸血の必要を減少させることができ、オプレルベキンは、化学療法を受けている患者における血小板輸血の必要を減少させることができる。
【０２７８】
本明細書に記載する抗ＴＡＺ剤は、そのようなコロニー刺激因子のいずれかと併用することができる。
【０２７９】
＜モノクローナル抗体（ＭＯＡＢ）＞
ハーセプチンは、ＨＥＲ−２と呼ばれるタンパク質の過剰な量を生産する腫瘍を有する患者において、転移性乳がんの治療に用いられる（乳がん腫瘍のおよそ２５％が過剰量のＨＥＲ−２を生産する）。特定の実施形態において、本明細書に記載する治療方法は、該当する個体への抗Ｈｅｒ２抗体（例えばハーセプチン）の投与と併用で用いることができる。
【０２８０】
本明細書に記載する抗ＴＡＺ剤は、そのようなモノクローナル抗体のいずれかと併用することができる。
【０２８１】
＜Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ＞
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ−２）遺伝子産物は、上皮増殖因子の受容体のファミリーに属する１８５ｋＤＡ膜貫通型受容体チロシンキナーゼである。それは、Ｒｅｅｓｅ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１５，１−８（１９９７）に相当詳細に記載され、これは参照により本明細書に援用されている。
【０２８２】
近年、乳がんにおけるＨｅｒ−２／ｎｅｕの重要性に多大な関心が寄せられている。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、ヒト乳がんの２０−３０％において過発現され、その発現増加は、予後不良と関連づけられている。この発見が、ハーセプチンなどのＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する抗体の開発につながり、そのハーセプチンは、試験において、転移性乳がんにおいて寛解期間を延長することが判明した。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、細胞核に成長シグナルを伝達する細胞表面受容体である。ハーセプチンは、これらのシグナルを遮断し、それによって、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕポジティブ乳がんにおいてＨｅｒ−２／ｎｅｕにより媒介される細胞の増殖を明らかに阻害するようである。
【０２８３】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの過発現は、卵巣がん、胃がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、膵臓がん、前立腺がん、結腸直腸がん、および非小細胞肺がんの一部においても発見された。ＨＥＲ−２−ｎｅｕの過発現を随伴する他のがんは、ハーセプチンで治療できる可能性を秘めている。
【０２８４】
従って、本発明者らの診断方法は、個体におけるＨｅｒ２の過発現の検出と併用することができる。同様に、本明細書に記載する治療方法は、ＴＡＺの活性、量または発現を減少させることに加えて、個体へのハーセプチン投与を含む場合がある。従って、本発明者らは、ＴＡＺ核酸またはＴＡＺポリペプチドの抗Ｈｅｒ２抗体との併用を提供する。本発明者らは、抗ＴＡＺ抗体の抗Ｈｅｒ２抗体との併用も提供する。一部の実施形態において、該抗Ｈｅｒ２抗体は、ハーセプチンを含む。
【０２８５】
［抗ＴＡＺ剤のスクリーニング］
＜ＴＡＺ調節因子、アゴニストおよびアンタゴニストの同定＞
アンタゴニスト、特に小分子は、抗ＴＡＺ剤として使用するために、ＴＡＺの特異的阻害に用いることができる。
【０２８６】
従って、本発明者らは、ＴＡＺアンタゴニストおよび小分子ＴＡＺ阻害剤、ならびにこれらをスクリーニングするためのアッセイを開示する。ＴＡＺのアンタゴニストは、結合または他のＴＡＺ活性の調節、例えばダウンレギュレーション、を検出することによってスクリーニングすることができる。ＴＡＺのアンタゴニストは、ＴＡＺとＴＡＺ結合タンパク質、例えばＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３またはＴＥＡＤ４、との結合の調節を検出することによってもスクリーニングすることができる。
【０２８７】
従って、本発明者らは、ＴＡＺポリペプチドの発現、量または活性をダウンレギュレートすることができる化合物を提供する。そのような化合物は、がん、特に乳がんを、治療または予防するための本明細書に記載する方法および組成物に使用することができる。
【０２８８】
従って、ＴＡＺは、例えば細胞、無細胞製剤、化学ライブラリー、および天然産物混合物において、小分子基質とリガンドの結合を評価するために使用することができる。これらの基質およびリガンドは、天然基質およびリガンドである場合もあり、または構造または機能模倣体である場合もある。Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ  ５（１９９１）参照。さらに、特に乳房細胞において、ＴＡＺの発現に影響する因子を同定するためにスクリーニングを行うことができる。
【０２８９】
一般に、アゴニストおよびアンタゴニストについてのアッセイは、ＴＡＺの１つ以上の活性に対する候補分子の効果の判定に依存する。アッセイは、候補分子の存在下および場合によっては候補分子の不在下で、またはＴＡＺ活性を阻害もしくは活性化することがわかっている分子の存在下で、ＴＡＺ活性をアッセイすることを含む場合がある。ＴＡＺの活性のアッセイまたは調節因子は、ＴＡＺと別の構成要素（例えばＴＡＺ結合タンパク質）との結合を検出することによって、検出することができる。ＴＡＺ結合タンパク質の例としては、ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３およびＴＥＡＤ４が挙げられる。従って、ＴＡＺ活性の調節因子（例えばＴＡＺアンタゴニスト）のスクリーニングは、ＴＡＺおよびＴＥＡＤポリペプチドを供給するステップと、候補分子の存在および不在下でそれらの間の結合を検出するステップとによって行うことができる。対象となる分子は、ＴＡＺとＴＥＡＤポリペプチドとの結合を中断する、減少させる、撤廃する、破壊するまたは何らかの方法で調節するものである。
【０２９０】
本発明者らは、ＴＡＺの発現が乳がん細胞において増加されることを実証した。それ故、ＴＡＺ発現の制御は、乳がんおよび他のがんを治療するために利用することができる。従って、ＴＡＺの発現および／もしくは活性を刺激する、またはこのタンパク質の機能を阻害することができる化合物および薬物を見つけることが望ましい。一般に、アゴニストおよびアンタゴニストは、任意の公知のがん、特に乳がん、のための治療および予防のために利用される。
【０２９１】
「ダウンレギュレーション」は、調査する挙動に対する任意の負の効果を含み、これは、全体的である場合もあり、または部分的である場合もある。従って、結合を検出することとなる場合、候補アンタゴニストは、２つの構成要素間の結合を減少させる、改善する、または撤廃することができる。その候補分子によって達成される結合（または任意の他の活性）のダウンレギュレーションは、その候補分子の不在下での結合（またはいずれかの活性）と比較して、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上である。このように、アンタゴニストとしての使用に適する候補分子は、結合または他の活性を１０％より多く減少させることができるものである。
【０２９２】
用語「化合物」は、生体高分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド、もしくは有機分子）などの化合物（自然に存在するものもしくは合成されたもの）、または細菌、植物、真菌もしくは動物（特に哺乳動物）細胞もしくは組織などの生体材料から作られた抽出物、またはさらに無機元素もしくは分子を指す。化合物は、抗体である場合もある。
【０２９３】
ＴＡＺの潜在的アンタゴニストの例としては、抗体、小分子、ヌクレオチドおよびそれらの類似体（プリンおよびプリン類似体を含む）、ＴＡＺの結合パートナーと密接に関係しているオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、例えばその結合パートナーの断片、またはＴＡＺポリペプチドに結合するが応答を惹起せず、そのためそのポリペプチドの活性を防止する小分子、などが挙げられる。
【０２９４】
＜スクリーニングキット＞
そのようなスクリーニングを行うために必要な材料をスクリーニングキットに包装することができる。
【０２９５】
そのようなスクリーニングキットは、ＴＡＺポリペプチドについてのまたはＴＡＺの生産を減少または増進させる化合物についてのアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素などの同定に有用である。該スクリーニングキットは、（ａ）ＴＡＺポリペプチド；（ｂ）ＴＡＺポリペプチドを発現する組換え細胞；（ｃ）ＴＡＺポリペプチドに対する抗体；または（ｄ）ＴＡＺ結合タンパク質、例えばＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３もしくはＴＥＡＤ４を含む場合がある。該スクリーニングキットは、ライブラリーを含む場合がある。該スクリーニングキットは、下で説明するような、スクリーニングに必要な成分のうちのいずれか１つ以上を含む場合がある。該スクリーニングキットは、使用のための説示を場合によっては含むことがある。
【０２９６】
核酸レベルでＴＡＺ発現を検出することができるスクリーニングキットも提供することができる。そのようなキットは、ＴＡＺの増幅のためのプライマー、または増幅のためのプライマーペアを含む場合がある。該プライマー（単数または複数）は、任意の適する配列（例えばＴＡＺ配列の一部分）から選択することができる。プライマー配列を同定する方法は、当分野において周知であり、当業者は、そのようなプライマーを容易に設計することができる。該キットは、本明細書に記載するような、ＴＡＺ発現のための核酸プローブを含む場合がある。該キットは、使用のための説示も場合によっては含むことがある。
【０２９７】
＜合理的設計＞
ＴＡＺと相互作用できる可能性が高い候補化合物の合理的設計は、ＴＡＺポリペプチドの分子形状の構造的研究に基づき得る。
【０２９８】
例えば、本発明者らは、ＴＡＺの残基５２および５３が、ＴＡＺポリペプチドとＴＥＡＤポリペプチドとの結合に関与することを立証した。本実施例は、これらの位置（例えば、Ｆ５２Ａ、Ｆ５３Ａ）のいずれかでのＴＡＺの突然変異体が、ＴＡＺポリペプチドとＴＥＡＤポリペプチドとの結合を壊し、ＴＡＺの核局在を壊し、およびＴＡＺの発がんの可能性を壊すことを示す。
【０２９９】
従って、位置５２および５３周辺のＴＡＺの配列を含む分子は、例えば、ＴＡＺポリペプチドとＴＥＡＤポリペプチドとの結合（例えば競合的結合）を調節することによる、ＴＡＺ活性の調節因子として使用することができる。そのような分子は、ＴＡＺの位置５２もしくは位置５３または両方を含むペプチドを含む場合がある。
【０３００】
さらに、ＴＥＡＤ（ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３またはＴＥＡＤ４を含む）のＴＡＺ結合領域からペプチドを設計し、ＴＡＺ−ＴＥＡＤ結合活性の調節について検査することができる。
【０３０１】
どの部位が特定の他のタンパク質と相互作用するかを判定するさらなる手段は、物理的構造決定、例えば、Ｘ線結晶学または二次元ＮＭＲ技術である。
【０３０２】
これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかについてのガイダンスをもたらす。タンパク質構造決定の詳細な説明については、例えば、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０３０３】
＜ポリペプチド結合アッセイ＞
ＴＡＺ活性または発現の調節因子およびアンタゴニストは、当分野において公知の任意の手段によって同定することができる。
【０３０４】
それらの最も簡単な形態でのアッセイは、単に、候補化合物とＴＡＺポリペプチドを含有する溶液とを混合して混合物を作る段階、その混合物中のＴＡＺポリペプチドの活性を測定する段階、およびその混合物の活性を標準と比較する段階を含み得る。
【０３０５】
さらに、分子は、ＴＡＺとその推定分子との結合を検出するアッセイにおいて、ＴＡＺへのそれらの結合により同定することができる。
【０３０６】
本明細書に記載するＴＡＺポリペプチドに結合する物質を同定するための１つのタイプのアッセイは、固体支持体に固定されているＴＡＺポリペプチドを固定されていない候補物質と接触させて、対象となるＴＡＺポリペプチドと候補物質とが互いに結合するかどうか、および／またはどの程度結合するかを判定することを含む。あるいは、候補物質を固定し、本文書において述べるようなＴＡＺポリペプチドを固定しない場合もある。
【０３０７】
該ＴＡＺポリペプチドへの該物質の結合は、一時的である場合もあり、可逆的である場合もあり、または永久的である場合もある。該物質は、該ポリペプチドに、対照ポリペプチド（例えば、がん成長または進行に関与しないことがわかっているポリペプチド）への結合についてのＫｄ値より低いＫｄ値で結合する場合がある。該物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドへの結合についてのＫｄ値より２倍低い、例えば、対照ポリペプチドへの結合についてのものより１００倍低いＫｄ値もしくは１０００倍低いＫｄである場合がある。
【０３０８】
アッセイ法の一例では、ＴＡＺポリペプチドをアガロースビーズなどのビーズ上に固定することができる。概して、これは、細菌、酵母またはより高等な真核細胞株においてＧＳＴ−融合タンパク質としてＴＡＺポリペプチドを発現させ、グルタチオン−アガロースビーズを使用して粗細胞抽出物からそのＧＳＴ−ＴＡＺ融合タンパク質を精製することによって果たすことができる（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８；Ｇｅｎｅ  ６７（１０）：３１−４０）。対照として、ＧＳＴ融合タンパク質でない候補物質の固定化ポリペプチドへの結合を、ＴＡＺポリペプチド不在下で判定してもよい。その後、その候補物質の固定化ＴＡＺポリペプチドへの結合を判定することができる。このタイプのアッセイは、ＧＳＴプルダウンアッセイとして当分野において公知である。また、候補物質を固定化し、ＴＡＺポリペプチドを固定しない場合もある。
【０３０９】
成分、例えばＮｉ−ＮＴＡアガロースおよびヒスチジンタグ付成分、のうちの１つを固定するために異なるアフィニティー精製システムを用いてこのタイプのアッセイを行うことも可能である。
【０３１０】
該ポリペプチドの候補物質への結合は、当分野において周知の様々な方法によって判定することができる。例えば、非固定化成分を（例えば、放射性ラベル、エピトープタグまたは酵素−抗体コンジュゲートで）標識することができる。あるいは、免疫学的検出技術によって結合を判定することができる。例えば、該反応混合物をウエスタンブロットし、その非固定化成分を検出する抗体でそのブロットをプローブすることができる。ＥＬＩＳＡ技術を用いることもできる。
【０３１１】
候補物質は、概して、１から１０００ｎｍｏｌ／ｍＬ、例えば、１から１００ｎｍｏｌ／ｍＬの最終濃度で添加する。抗体の場合、用いる最終濃度は、概して、１００から５００μｇ／ｍＬ、例えば２００から３００μｇ／ｍＬである。
【０３１２】
ＴＡＺの調節因子およびアンタゴニストは、ＴＡＺとこのポリペプチドが結合する任意の分子との結合の調節、または、そのような結合や放出につながる任意の活性の調節を検出することによって同定することもできる。
【０３１３】
＜細胞ベースのアッセイ＞
候補化合物と直接もしくは間接的に会合しているラベルによって、または標識された競合物質との競合を含むアッセイにおいて、ＴＡＺポリペプチドを保有する細胞への付着を検出する細胞ベースのアッセイは、候補化合物の結合を簡単に検査することができる。
【０３１４】
さらに、これらのアッセイは、候補化合物が、ＴＡＺポリペプチドへの結合によって生成されるシグナルを生じさせる結果となるかどうかを、表面にそのポリペプチドを保有する細胞に適する検出システムを用いて検査することができる。一般に、既知のアゴニストの存在下で活性化の阻害剤をアッセイし、アゴニストによる活性化に対するその候補化合物の存在による影響を観察する。そのようなシグナルは、核内局在を含む場合があり、これは、実施例において説明するように解析することができる。検出することができるもう１つのシグナルは、発がん活性であり、これは、実施例において説明するような軟寒天アッセイによって解析することができる。
【０３１５】
化合物のもう１つのスクリーニング方法は、化合物のライブラリーを発現する組換えＤＮＡ分子で安定的に形質転換されている真核または原核宿主細胞を利用する。そのような細胞は、生細胞形態または固定形態いずれかで、標準的な結合パートナーアッセイのために使用することができる。細胞応答を検出するための感度の高い方法を記載している、Ｐａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：２４３−２４７；およびＯｗｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７；４００７−４０１１も参照のこと。
【０３１６】
化合物のライブラリーを発現する細胞を、ＴＡＺポリペプチドに結合することがわかっている標識抗体、例えば１２５Ｉ−抗体、およびその結合組成物への結合親和性を測定することなる試験サンプル（例えば候補化合物）と接触させる、またはそれらと共にインキュベートする競合アッセイは、特に有用である。その後、ＴＡＺポリペプチドについての結合した標識結合パートナーと遊離している標識結合パートナーを分離して、結合度を評価する。結合した試験サンプルの量は、ＴＡＺポリペプチドに結合する標識抗体の量に逆比例する。
【０３１７】
非常に多数の技術のうちのいずれか１つを用いて、遊離している結合パートナーから結合した結合パートナーを分離して、結合度を評価することができる。この分離段階は、一般に、フィルターへの付着、その後の洗浄、プラスチックへの付着、その後の洗浄、または細胞膜の遠心分離などの手順を含み得る。
【０３１８】
該アッセイは、乳房細胞などの細胞への候補分子の曝露、および任意の適する手段によるＴＡＺの発現のアッセイを含む場合がある。そのようなアッセイにおいてＴＡＺの発現をダウンレギュレートする分子をさらなる研究のために場合によっては選択し、ＴＡＺ発現をダウンレギュレートするための薬物として使用することができる。そのような薬物は、乳がんの治療または予防に有効に使用することができる。
【０３１９】
細胞におけるＴＡＺのｍＲＮＡおよびタンパク質の生産に対する添加化合物の効果を検出するためのアッセイを構成するために、ＴＡＺタンパク質およびそのタンパク質に対する抗体をコードするｃＤＮＡを使用することもできる。例えば、当分野において公知の標準的な方法によってモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用してＴＡＺポリペプチドの分泌または細胞会合レベルを測定するためにＥＬＩＳＡを構成することができ、これは、適切に操作された細胞または組織からのＴＡＺタンパク質の生産を阻害することができる薬剤または増進させることができる薬剤（それぞれ、アンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる）を発見するために用いることができる。スクリーニングアッセイを行うための標準的な方法は、当分野において十分に理解されている。
【０３２０】
＜活性アッセイ＞
調節因子またはアンタゴニストを検出するためのアッセイは、一般に、候補分子の存在下でのＴＡＺの任意の活性の調節の検出を、場合によっては候補分子不在下での活性の調節の検出と共に含む。
【０３２１】
検出することができる活性は、任意のＴＡＺ依存性活性、例えば結合活性を含み得る。ＴＡＺが形質膜においてＰＤＺモチーフによってＳＬＣ９Ａ３Ｒ２に結合することは公知であり、ＴＡＺのＳＬＣ９Ａ３Ｒ２への結合活性は、当分野において公知の手段、例えば、ＧＳＴプルダウンアッセイによってアッセイすることができる。ＴＡＺおよびＳＬＣ９Ａ３Ｒ２の一方を固定化し、他方を放射性標識してもよい。その後、ＴＡＺのＳＬＣ９Ａ３Ｒ２への曝露に基づいて補足された放射能をアッセイすることにより、ＴＡＺのＳＬＣ９Ａ３Ｒ２への結合を検出することができる。
【０３２２】
同様に、ＴＡＺがインビボおよびインビトロでホスホセリン結合モチーフＲＳＨＳＳＰによってＹＷＨＡＺに結合することは公知である。従って、ＴＡＺのＹＷＨＡＺへの結合の検出は、当分野において公知の手段、例えば、上で説明した技術によって検出することができ、そのような結合の調節をアッセイして、ＴＡＺの調節因子またはアンタゴニストを検出することができる。
【０３２３】
ＴＡＺは、ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３およびＴＥＡＤ４をはじめとするＴＥＡＤポリペプチドに結合することは証明されている。従って、ＴＡＺポリペプチドとＴＥＡＤポリペプチドとの結合を、当分野において公知の手段、例えば、本明細書に記載する技術によって検出することができ、そのような結合の調節をアッセイして、ＴＡＺの調節因子またはアンタゴニストを検出することができる。
【０３２４】
ＴＡＺの特異的生物活性を検出するアッセイを用いることもできる。それらのアッセイは、一般に、候補分子（例えば、ライブラリーの形態のもの）を、ポリペプチドの形態、ポリペプチドをコードする核酸の形態、いずれかのＴＡＺと接触させること、またはそれを含む細胞、細胞小器官、抽出物もしくは他の材料を候補調節因子と接触させることを含む。（下で説明するような）ＴＡＺの該当活性を検出して、その候補調節因子の存在が何らかの効果を有するかどうかを立証することができる。
【０３２５】
あるいは、または加えて、Ｋａｎａｉ（２０００）によって記載されたようなＴＡＺと１４−３−３との結合のアッセイを用いて、ＴＡＺの調節因子を検出することができる。Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、ＲＵＮＸ２依存性遺伝子転写のＴＡＺ依存性共活性化を検出するアッセイを記載している。Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、ＴＡＺによるＴＢＸ５のトランス活性化を記載している。
【０３２６】
Ｋａｎａｉ（２０００）、Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００５）またはＭｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）によって記載されたアッセイを候補調節因子の存在または不在下で行い、適切な活性を検出してＴＡＺ活性の調節、ならびに従って、ＴＡＺの候補調節因子および／またはアンタゴニストの同一性を検出することができる。
【０３２７】
ＴＡＺに結合するおよび／またはＴＡＺの転写もしくは発現に影響を及ぼす候補調節因子を検出するためにプロモーター結合アッセイを用いることもできる。その後、候補調節因子をさらなる研究のために選択することができ、または使用のために単離することができる。そのようなスクリーニング手順の詳細は、当分野において公知であり、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ  Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ  Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ  ０−８２４７−０５６２−９）に記載されている。
【０３２８】
本明細書に記載するスクリーニング方法は、インビボアッセイを利用することができるが、インビトロ使用のために構成することもできる。インビボアッセイは、一般に、ＴＡＺを含む細胞を候補分子に曝露することを含む。インビトロアッセイでは、ＴＡＺを候補分子に、場合によっては他の成分、例えば粗製もしくは半精製細胞抽出物または精製タンパク質の存在下で、曝露する。インビトロアッセイを行う場合、これらは、候補分子のアレイ（例えば、アレイ型ライブラリー）を利用することがある。インビボアッセイを利用してもよい。従って、ＴＡＺポリペプチドは、細胞に、例えば異種的に含まれることがある。そのような細胞は、上で説明したような、ＴＡＺを発現するように遺伝子操作されたトランスジェニック細胞である場合もある。
【０３２９】
抽出物を利用する場合、それは、細胞質抽出物または核抽出物を含むことがあり、その調製方法は、当分野において周知である。
【０３３０】
ＴＡＺを含む細胞の任意の成分（例えば細胞小器官）を利用できることは、理解される。１つの実施形態は、例えば、記載するようなＴＡＺを含む細胞核を含む、細胞質または核標本を利用する。該核標本は、１つ以上の核を含む場合があり、それらは、例えば界面活性剤処理によって、透過性または半透過性にすることができる。
【０３３１】
従って、特定の実施形態におけるアッセイ形式は、次のステップを含む場合がある：マルチウエル・マイクロタイター・プレートを準備して、ＴＡＺポリペプチドを発現する１つ以上の細胞をそれぞれのウエルに含めるステップ；例えばライブラリーから得た個々の候補分子、または候補分子のプールを個々のウエルに添加し、ＴＡＺ活性の調節を測定するステップ。プールを使用する場合、これらをさらなるプールに細分し、同じ様式で試験することができる。その後、本明細書の他の箇所で説明するようなＴＡＺ活性、例えば、結合活性または転写共活性化活性をアッセイすることができる。
【０３３２】
あるいは、または上で説明したアッセイ方法に加えて、ＴＡＺの調節因子またはアンタゴニストを同定するために「サブトラクティブ」手順を用いることができる。そのような「サブトラクティブ」手順のもとで、調節因子として機能することができる１つ以上の候補分子（例えば、細胞抽出物、核抽出物、または分子のライブラリーなど）を含む多数の分子を提供し、それらの多数の分子から１つ以上の成分を除去する、枯渇させるまたは減ずる。その後、その「減じた」抽出物などを、説明したようなＴＡＺ（またはその成分）を含む細胞に曝露することにより、活性についてアッセイする。
【０３３３】
従って、例えば、「免疫枯渇（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）」アッセイを行って、次のように調節因子を同定することができる。細胞質または核抽出物は、細胞から調製することができる。例えば適切な抗体での免疫枯渇によって、その抽出物を枯渇させてまたは分画して、推定調節因子を除去することができる。その抽出物から調節因子を枯渇させると、それは、ＴＡＺ機能または活性または発現に影響を及ぼす能力を失う。調節因子またはアンタゴニストを同定するために一連のサブトラクションおよび／または枯渇が必要とされることもある。
【０３３４】
上の「枯渇」または「サブトラクション」アッセイを予備段階として用いて、さらなるスクリーニングのための推定調節因子を同定できることも理解される。さらに、またはあるいは、「枯渇」または「サブトラクション」アッセイを用いて、他の手段（例えば、本明細書の他の箇所で説明するような「ポジティブ」スクリーニング）により推定調節因子として同定された分子の調節活性を、確認することができる。
【０３３５】
該アッセイに付し、対象となるものであることが判明した候補分子を単離し、さらに研究することができる。対象となる分子の単離方法は、用いる分子のタイプ、それがライブラリーの形態であるのかどうか、任意の一時点で幾つの候補分子を試験することとなるのか、バッチ手順に従うことになるのかどうかなどに依存する。
【０３３６】
候補分子は、ライブラリーの形態で提供することができる。１つの実施形態では、１つより多くの候補分子を同時にスクリーニングすることができる。候補分子のライブラリー、例えば、小分子ライブラリー、ポリペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、化合物のライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）、アンチセンス分子（例えばアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）のライブラリー、抗体ライブラリーなどを、当分野において公知の手段によって生成することができる。そのようなライブラリーは、ハイ・スループット・スクリーニングに適する。ＴＡＺを含む異なる細胞を該ライブラリーの個々のメンバーに曝露し、ＴＡＺ活性に対する効果を判定することができる。このためにアレイ技術を利用することもできる。例えばマイクロタイタープレートのウエルにおいて、細胞を空間的に分離することもできる。
【０３３７】
ある実施形態では、小分子ライブラリーを利用する。「小分子」とは、分子量が約５０ｋＤａ未満であり得る分子を指す。特定の実施形態において、小分子は、約３０ｋＤａ未満、例えば、約１５ｋＤａ未満、または１０ｋＤａ未満ほどである分子量を有し得る。本明細書において「小分子ライブラリー」と呼ぶ、そのような小分子のライブラリーは、ポリペプチド、小さなペプチド、例えば、アミノ酸数２０以下、例えばアミノ酸数１５、１０または５のペプチド、単純な化合物などを含む場合がある。
【０３３８】
あるいは、または加えて、下でさらに詳細に説明するようなコンビナトリアルライブラリーをＴＡＺの調節因子またはアンタゴニストについてスクリーニングすることができる。ＴＡＺ活性についてのアッセイは、上で説明している。
【０３３９】
ライブラリー
候補分子のライブラリー、例えば、ポリペプチドまたは核酸のライブラリーを、本明細書に記載するＴＡＺアンタゴニストおよび阻害剤についてのスクリーニングに利用することができる。そのようなライブラリーをＴＡＺタンパク質に曝露し、そのタンパク質の活性に対するそれらの作用を、もしあれば、判定する。
【０３４０】
大きなライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコルは、当分野において公知であり、例えばファージディスプレー技術によって代表される。多様なペプチド配列を糸状バクテリオファージの表面に表示するそのようなシステム（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）上記）は、ターゲット抗原に結合する特定の抗体断片のインビトロ選択および増幅のための、抗体断片（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーの作製に有用であると判明した。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列を、それらを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラスム間隙に向けるリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に連結させ、そして結果として、それらの得られた抗体断片をそのバクテリオファージの表面に、一般にはバクテリオファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）への融合体として表示する。あるいは、抗体断片をラムダファージカプシド（ファージ体）の外面に表示する。ファージ系ディスプレーシステムの利点は、それらが生体システムであるため、選択されたライブラリーメンバーを、細菌細胞においてその選択されたライブラリーメンバーを含有するファージを単に成長させることにより、増幅できる点である。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクター上に含まれているので、配列決定、発現およびその後の遺伝子操作が比較的簡単である。
【０３４１】
バクテリオファージ抗体ディスプレーライブラリーおよびラムダファージ発現ライブラリーの構築方法は、当分野において周知である（参照により本明細書に援用されている、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）上記；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ，１０４：１４７；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｓｕｐｒａ；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ｓｕｐｒａ；Ｈａｗｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：８６７；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７；Ｌｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３１３）。一般にポリペプチドライブラリーの発現のために必要な場合には、そのような技術を修正することができる。
【０３４２】
１つの特に有利なアプローチは、ｓｃＦｖファージライブラリーの使用であった（Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−６，Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６−１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ｓｕｐｒａ；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｓｕｐｒａ；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｓｕｐｒａ；Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：８０；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ｓｕｐｒａ）。バクテリオファージコートタンパク質上に提示されたｓｃＦｖライブラリーの様々な実施形態が記載されている。例えば、ＷＯ９６／０６２１３およびＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｅｔ  ａｌ．）ならびにＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ，ｓｕｐｒａ）（これらは参照により本明細書に援用されている）に記載されているように、ファージ・ディスプレー・アプローチの洗練も公知である。
【０３４３】
代替ライブラリー選択技術としては、バクテリオファージラムダ発現システムが挙げられ、該システムは、バクテリオファージプラークとしてまたは溶原のコロニーとして、両方とも以前に記載されているとおり（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５；Ｃａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：８０９５；Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：２４３２）直接スクリーニングすることができ、ならびに本明細書に記載する方法よび組成物に有用である。これらの発現システムは、約１０６程度またはさらにそれ以上の多数の異なるライブラリーメンバーをスクリーニングするために使用することができる。他のスクリーニングシステムは、例えば、ライブラリーメンバーの直接化学合成に基づく。１つの初期の方法は、ＷＯ８４／０３５６４に記載されているものなどの、１セットのピンまたはロッドを用いるペプチドの合成を含む。ペプチドライブラリーを構成するビーズ（それぞれのビーズが個々のライブラリーメンバーである）を用いるペプチド合成を含む類似の方法が、米国特許第４，６３１，２１１号に記載され、関連した方法が、ＷＯ９２／０００９１に記載されている。ビーズに基づく方法の有意な改善は、オリゴヌクレオチドなどの一意的識別タグをそれぞれのビーズに付けて、それぞれのライブラリーメンバーのアミノ酸配列の同定を助長することを含む。これらの改善された、ビーズに基づく方法は、ＷＯ９３／０６１２１に記載されている。
【０３４４】
もう１つの化学的合成方法は、ペプチド（またはペプチドミメティック）のアレイを、表面で、それぞれの別個のライブラリーメンバー（例えば、一意的ペプチド配列）をそのアレイ内の個別の事前に定義された位置に配置する手法で合成することを含む。それぞれのライブラリーメンバーの同一性は、そのアレイ内のその空間的位置によって決定される。所定の分子（例えば、受容体）と反応性ライブラリーメンバーとの結合相互作用が存在するアレイ内の位置を決定し、それによって、その反応性ライブラリーメンバーの配列を空間位置に基づいて同定する。これらの方法は、米国特許第５，１４３，８５４号；ＷＯ９０／１５０７０およびＷＯ９２／１００９２；Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７；Ｄｏｗｅｒ  ａｎｄ  Ｆｏｄｏｒ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２６：２７１に記載されている。
【０３４５】
ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを生成するための他のシステムは、そのライブラリーメンバーのインビトロ合成のための無細胞酵素的機構の使用を含む。１つの方法では、ターゲットリガンドに対する選択とＰＣＲ増幅の交互ラウンドによってＲＮＡ分子を選択する（Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８）。類似の技術を用いて、所定のヒト転写因子に結合するＤＮＡ配列を同定することができる（Ｔｈｉｅｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｈ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：３２０３；Ｂｅａｕｄｒｙ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：６３５；ＷＯ９２／０５２５８およびＷＯ９２／１４８４３）。同様に、大きなライブラリーを生成するための方法としてインビトロ翻訳を用いて、ポリペプチドを合成することができる。安定化されたポリソーム複合体を一般に含むこれらの方法が、さらにＷＯ８８／０８４５３、ＷＯ９０／０５７８５、ＷＯ９０／０７００３、ＷＯ９１／０２０７６、ＷＯ９１／０５０５８、およびＷＯ９２／０２５３６に記載されている。ファージベースではない代替ディスプレーシステム、例えば、ＷＯ９５／２２６２５およびＷＯ９５／１１９２２（Ａｆｆｙｍａｘ）に開示されているものは、選択のためにポリソームを使用してポリペプチドを提示する。これらおよびすべての上述の文献も参照により本明細書に援用されている。
【０３４６】
該ライブラリーは、詳細には、ジンクフィンガーのライブラリーを含む場合があり；ジンクフィンガーは、当分野において公知であり、転写因子としての役割を果たす。適するジンク・フィンガー・ライブラリーは、例えば、ＷＯ  ９６／０６１６６およびＷＯ  ９８／５３０５７に開示されている。ジンク・フィンガー・ライブラリーの構築は、例えばＷＯ  ９８／５３０５８およびＷＯ  ９８／５３０６０に開示されているような特定のＤＮＡ配列との相互作用を決定するための規則を利用する場合がある。メチル化ＤＮＡと特異的に相互作用することができるジンクフィンガーは、ＷＯ  ９９／４７６５６に開示されている。上のジンク・フィンガー・ライブラリーは、例えばＷＯ  ０１／２５４１７に開示されているように、アレイの形態で固定化することができる。
【０３４７】
＜コンビナトリアルライブラリー＞
ライブラリー、詳細には候補分子のライブラリーは、好適には、コンビナトリアルライブラリー（コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーとしても公知）の形態であり得る。
【０３４８】
「コンビナトリアルライブラリー」は、この用語を本明細書において用いる場合、ランダムに選択されたサブユニットから成る化合物の多数の種のコレクションである。ＴＡＺを阻害することができる分子についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０３４９】
化合物の様々なコンビナトリアルライブラリーを現在利用することができ、それらとしては、数ある中でも、タンパク質分解および非タンパク質分解酵素に対して活性なライブラリー、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニストおよびアンタゴニストのライブラリー、非ＧＰＣＲターゲット（例えば、インテグリン、イオンチャネル、ドメイン相互作用、核受容体、および転写因子）に対して活性なライブラリー、ならびに全細胞腫瘍学および抗感染性ターゲットのライブラリーが挙げられる。コンビナトリアルライブラリーの包括的論評、特にそれらの構築および使用は、Ｄｏｌｌｅ  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ（１９９９），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ  １  Ｎｏ  ４，２３５−２８２に提供されている。Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｈｍｕｅｌ  Ｃａｂｉｌｌｙ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｃｌ９９８．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖ．８７）にも触れておく。特定のコンビナトリアルライブラリーおよびそれらの構築方法は、米国特許第６，１６８，９１４号（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ）に、ならびにＢａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），‘‘Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｇｓ，’’Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５５８８−５５８９、およびそれらの文献の中で言及されている参考文献に開示されている。
【０３５０】
１つの実施形態において、スクリーニングするコンビナトリアルライブラリーは、細胞の成分と相互作用して遺伝子発現に影響を及ぼす分子を潜在的に含むように設計されているものである。例えば、クロマチン構造タンパク質に対するコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることができる。この実施形態のために有用である他のライブラリーとしては、ヒストン修飾酵素（例えば、ヒストンアセチル化もしくはヒストンメチル化酵素）、またはＤＮＡ修飾、例えばＤＮＡメチル化もしくは脱メチル化、に対するコンビナトリアルライブラリーが挙げられる。
【０３５１】
ケミカル・コンビナトリアル・ライブラリー、それらの生産および使用を記載しているさらなる参考文献としては、Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｐａｖｉａ，Ｓｐｈｉｎｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（１９９５年７月発行）；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  −  ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｄｉｓｃｕｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｉｔｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｌａｙｓ  ｉｎ  ｍａｎａｇｉｎｇ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（１９９５年７月発行）；Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｌｅａｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ＳＡＲ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，Ａｄｎａｎ  Ｍ．Ｍ．Ｍｊａｌｌｉ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｙ  Ｅ．Ｔｏｙｏｎａｇａ，Ｏｎｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９９５年７月発行）；Ｎｏｎ−Ｐｅｐｔｉｄｉｃ  Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  Ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｎｏｎ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ．Ｓａｒｖａｊｉｔ  Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ，Ｂａｂｕ  Ｊ．Ｍａｖｕｎｋｅｌ，Ｒｏｂｉｎ  Ａｎｄｙ，Ｄｏｎａｌｄ  Ｊ．Ｋｙｌｅ＊，Ｓｃｉｏｓ  Ｎｏｖａ  Ｉｎｃ．（１９９５年７月発行）；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｋｅｉｔｈ  Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｖｅ  Ｂｒｉａｎｔ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．（１９９５年７月発行）；Ａ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  −  Ｃｒａｉｇ  Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（１９９５年７月発行）；Ａｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｅｉｔｈ  Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｗｈｉｔｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．（１９９５年７月発行）；Ｎｏｖｅｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒ．Ｓ．Ｐｅａｒｌｍａｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ（１９９６年６／７月発行）；Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ａｆｆｏｒｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：Ａｎ  Ｏｐｉｎｉｏｎ，Ｙｖｏｎｎｅ  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ��ｅｓｉｇｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９９６年６／７月発行）；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ：Ａ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，Ａｒｎｏ  Ｆ．Ｓｐａｔｏｌａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  （１９９６年６／７月発行）；Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｐａｖｉａ，Ｓｐｈｉｎｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（１９９６年６／７月発行）；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｔｏ  Ｔｈｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓ．．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｓｏｆｉａ，Ｔｒａｎｓｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（１９９６年６／７月発行）；Ｄａｔａ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｍａｒｙｊｏ  Ｚａｂｏｒｏｗｓｋｉ，Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｉｌａ  Ｈ．ＤｅＷｉｔｔ，Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９５年１１月発行）；およびＴｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  Ｒ＆Ｄ  ｉｎ  Ｂｉｏ−Ｂａｓｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｐ．Ｄｅｖｌｉｎ（１９９６年３月発行）をはじめとする、ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｔｓｃｉ．ｏｒｇ／Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｃｏｍｂｉｃｈｅｍ／から入手できるものが挙げられる。
【０３５２】
コンビナトリアルケミストリーに関する技術は、新たな薬学的糸口を生じさせるための最新の方法の中で広く受け入れられるようになってきている（Ｇａｌｌｏｐ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１）。用いられている１つのコンビナトリアルアプローチは、固相支持体のそれぞれの粒子上の異なる構造を含有するライブラリーの合成、そのライブラリーと可溶性受容体との相互作用、その高分子ターゲットと相互作用する「ビーズ」の同定、および同定された「ビーズ」によって担持された構造の決定を含む戦略に基づく（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）。このアプローチの代案は、その固体支持体からのそれらの化合物の定義されたアリコートの逐次的放出と、溶解状態での活性のその後の判定、活性化合物が放出された粒子の同定、および直接配列決定（Ｓａｌｍｏｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１１７１２）による、またはそのコードの読み取り（Ｋｅｒｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：２５２９−２５３１；Ｎｉｋｏｌａｉｅｖ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６：１６１−１７０；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６）による、その構造の解明である。
【０３５３】
Ｆｕｒｋａによって最初に記載されたペプチドの等モル混合物の生成のための簡単な原理（Ｆｕｒｋａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｘｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ  １９８８；Ｆｕｒｋａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８８，１４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｒａｇｕｅ  １９８８；Ｆｕｒｋａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３）を用いて、可溶性ランダム・コンビナトリアル・ライブラリーを合成することができる。反復スクリーニングのための可溶性ライブラリーの構築も記載されている（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６）。Ｋ．Ｓ．Ｌａｍは、不溶性ランダム・コンビナトリアル・ライブラリーの使用についての新規で予想外に強力な技術を開示した。Ｌａｍは、それぞれの支持体が、均一な分子構造の試験化合物を有するように、固相支持体上のランダム・コンビナトリアル・ライブラリーを合成し、そして固相結合プロトコルによるその支持体からの試験化合物の事前除去なしでそれらのライブラリーをスクリーニングした（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）。
【０３５４】
このように、候補分子のライブラリーは、合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリー）、細胞抽出物、体液（例えば、尿、血液、涙、汗もしくは唾液）または合成生成物もしくは天然産物の他の混合物（例えば、小分子のライブラリーもしくは発酵混合物）であり得る。
【０３５５】
分子のライブラリーとしては、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質の断片；核酸（例えば、アンチセンス；ＤＮＡ；ＲＮＡ；またはペプチド核酸、ＰＮＡ）；アプタマー；または炭水化物もしくは多糖類を挙げることができる。該ライブラリーのそれぞれのメンバーは、個別である場合もあり、または混合物の一部である場合もある（例えば、圧縮ライブラリー）。該ライブラリーは、精製された化合物を含有する場合もあり、または「不純」である（すなわち、有意な量の不純物を含有する）場合もある。
【０３５６】
市販のライブラリー（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＡｒＱｕｌｅ、Ｎｅｏｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｒｃｏ、Ｃｉｄｄｃｏ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐａｎｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、Ｓｉｇｍａ、またはＴｒｉｐｏｓｅからのもの）も、本明細書に記載する方法と共に使用することができる。
【０３５７】
上で説明したライブラリーに加えて、多様性ファイルと呼ばれる特別なライブラリーを用いて、新規方法の特異性、信頼度または再現性を評価することができる。多様性ファイルは、アッセイにおいて結果として非特異的な検出を生じさせる可能性を秘めている多くの化合物クラスを代表する多数の化合物（例えば、１０００以上の小分子）を含有する。多様性ファイルは、市販され、または上に挙げた供給業者から市販されている個々の化合物から組み立てることもできる。
【０３５８】
＜抗ＴＡＺ抗体＞
ＴＡＺのアンタゴニストまたは調節因子を含み、このタンパク質の活性を調節するために（例えば、本明細書に記載するようながんなどの疾病を治療または予防する方法のために）使用することができる抗ＴＡＺ剤は、ＴＡＺタンパク質に対する抗体を含み得る。
【０３５９】
従って、本発明者らは、ＴＡＺポリペプチド、その断片、相同体、変異体もしくは誘導体に結合する抗体を提供している。そのような抗体は、ＴＡＺ発現の検出に、および特に、乳がんなどのＴＡＺ関連疾患の診断に有用である。他の抗体としては、治療活性を有するもの、すなわち、治療的手法で使用して、乳がんをはじめとする任意のＴＡＺ関連疾患を治療、管理または予防することができるものが挙げられる。
【０３６０】
ＴＡＺに結合することができる抗体の例としては、ＴＡＺのアミノ酸１６０−２２９に対するウサギ抗ＴＡＺ抗体、ウサギ抗ＴＡＺ抗体（カタログ番号２１４９Ｓ、米国、マサチューセッツ州、ダンヴァーズのＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクローナル抗ＴＡＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−５８３５９ＳＳ、米国、コロラド州、リトルトンのＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、マウスモノクローナル抗ＴＡＺ［１Ｂ１０］（カタログ番号Ｈ００００６９０１−Ｍ１２、米国、コロラド州、リトルトンのＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ウサギ抗ヒトＴＡＺポリクローナル抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｂ９４、米国、ワシントン州、シアトルのＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）またはｐ−ＴＡＺ（Ｓｅｒ  ８９）−Ｒ（カタログ番号ｓｃ−１７６１０−Ｒ、米国、カリフォルニア州、サンタクルーズのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が挙げられる。
【０３６１】
さらに、ＴＡＺに対して特異的である抗体を、任意の適するエピトープ（例えばＴＡＺタンパク質から採取したエピトープ）に対して産生させることができる。ＴＡＺの適する断片の配列は、ＴＡＺの残基１６０−２２９を含むことができ、この配列からの任意のエピトープを特異的ＴＡＺ抗体の産生に使用することができる。
【０３６２】
本明細書のために、用語「抗体」は、選択されたターゲットに結合することができる完全抗体または抗体断片を指す。相反する指定がない限り、この用語は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体およびヒト化抗体、ならびにファージディスプレーまたは代替技術を用いて生産された人工的に選択された抗体を含めて、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、天然のまたは遺伝子操作された抗体を含むが、これらに限定されない。この用語は、単鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーによって生産された断片も含む。そのような断片としては、ターゲット物質に対するそれらの結合活性を保持する全抗体の断片、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質および他の合成タンパク質が挙げられる。ＦｖおよびＳｃＦｖなどの小さな断片は、それらの小さなサイズおよび結果としての優れた組織分布のために、診断および治療用途に有利な特性を有する。
【０３６３】
該抗体およびそれらの断片は、例えばＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されているような、ヒト化抗体である場合がある。さらに、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号および同第６，０７５，１８１号に記載されているような、完全ヒト可変領域（またはそれらの断片）を有する抗体も使用することができる。中和抗体、すなわち、ＴＡＺの任意の生物活性を阻害するもの、を診断および療法に用いることもできる。
【０３６４】
本明細書に記載する抗体は、ラベルなどのエフェクタータンパク質を含む改変された抗体である場合がある。インビボまたはインビトロで抗体の分布のイメージングを可能にするラベルを使用することができる。そのようなラベルは、胚または細胞集団内で容易に可視化することができる放射性ラベルまたは放射線不透過性ラベル、例えば金属粒子、であってもよい。さらに、それらは、蛍光ラベル、または組織サンプル上で可視化できる他のラベルであってもよい。
【０３６５】
抗体は、標準的な技術によって、例えば免疫処置によって、またはファージ・ディスプレー・ライブラリーを使用することによって、産生することができる。そのような抗体は、ＴＡＺタンパク質または相同体、断片などに特異的に結合することが可能であり得る。
【０３６６】
＜ポリクローナル抗体＞
ポリクローナル抗体が望まれる場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、ＴＡＺポリペプチドまたはペプチドを含む免疫原性組成物で免疫することができる。宿主種に依存して、様々なアジュバントを使用して免疫応答を増加させることができる。そのようなアジュバントとしては、フロイントアジュバント、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、および界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ならびにジニトロフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）は、その物質を精製した場合に利用できる潜在的に有用なヒトアジュバントであり、アミノ酸配列が、全身防御を刺激する目的で免疫不全個体に投与される。
【０３６７】
免疫された動物からの血清を採取し、公知の手順に従って処理する。ＴＡＺポリペプチドから得ることができるエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が、他の抗原に対する抗体を含有する場合には、それらのポリクローナル抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。ポリクローナル抗血清を生産および処理するための技術は、当分野において公知である。そのような抗体を作ることができるように、本発明者らは、動物またはヒトにおける免疫原として使用するための別のアミノ酸配列に、ハプテン化されたＴＡＺアミノ酸配列またはそれらの断片も備えさせる。
【０３６８】
＜モノクローナル抗体＞
ＴＡＺポリペプチドまたはペプチドから得ることができるエピトープに対するモノクローナル抗体も当業者は容易に生産することができる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作るための一般的な方法論は周知である。不死化抗体生産細胞株を細胞融合によって作ることができ、発がん性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン・バーウイルスでのトランスフェクションなどの他の技術によっても作ることができる。ｏｒｂｉｔエピトープに対して産生させたモノクローナル抗体のパネルを様々な特性について、すなわち、アイソタイプとエピトープの親和性について、スクリーニングすることができる。
【０３６９】
モノクローナル抗体は、培養での連続細胞株による抗体分子の生産に備える任意の技術を用いて作製することができる。これらとしては、初めにＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって記載されたハイブリドーマ技術（１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８０：２０２６−２０３０）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０３７０】
組換えＤＮＡ技術を用いて、本明細書に記載するような抗体を改善することができる。例えば、キメラ抗体を構築して、診断または治療用途におけるそれらの免疫原性を減少させることができる。そのような技術は、適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシング（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４）を含む。さらに、ＣＤＲグラフトによる抗体のヒト化［欧州特許出願０  ２３９  ４００（Ｗｉｎｔｅｒ）参照］および、場合によっては、フレームワーク修飾［ＥＰ  ０  ２３９  ４００］によって、免疫原性を最小にすることができる。
【０３７１】
あるいは、単鎖抗体の生産について記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７９号）を、物質特異的単鎖抗体の生産に適応させることができる。
【０３７２】
ＴＡＺポリペプチドまたはペプチドから得ることができるエピトープに対する、モノクローナルとポリクローナルの両方の抗体は、診断に特に有用である。詳細には、モノクローナル抗体を使用して、抗イディオタイプ抗体を産生することができる。抗イディオタイプ抗体は、保護が望まれる物質および／または薬剤の「内部イメージ」を保有す免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を産生するための技術は、当分野において公知である。これらの抗イディオタイプ抗体も療法に有用であり得る。
【０３７３】
抗体は、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：３８３３−３８３７）およびＷｉｎｔｅｒ  Ｇ、およびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９９１；Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９）に開示されているように、リンパ球集団におけるインビボ生産の誘導により、または組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは高特異的結合試薬のパネルのスクリーニングにより、生産することもできる。
【０３７４】
ポリペプチドまたはペプチドの特異的結合部位を含有する抗体断片も作製することができる。例えば、そのような断片としては、抗体分子のぺプシン消化によって生産することができるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製することができるＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定を可能ならしめることができる（Ｈｕｓｅ  ＷＤ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２７５−１２８，１）。
【０３７５】
単鎖抗体の生産方法（米国特許第４，９４６，７７８号）も、ＴＡＺポリペプチドに対する単鎖抗体の生産に適応させることができる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物をはじめとする他の生物を使用して、ヒト化抗体を発現させることができる。
【０３７６】
上で説明した抗体は、該ポリペプチドを発現するクローンを単離もしくは同定するために、またはアフィニティークロマトグラフィーによって該ポリペプチドを精製するために、利用することができる。
【０３７７】
＜抗体生産の組換え技術＞
確立された手順に従って細菌または哺乳動物細胞培養において抗体を生産するために組換えＤＮＡ技術を用いることができる。選択された細胞培養系は、抗体産物を分泌することができる。
【０３７８】
従って、本発明者らは、抗体の生産のためのプロセスを開示し、このプロセスは、該抗体タンパク質をコードする第二のＤＮＡ配列の適当なリーディングフレーム内に連結されたシグナルペプチドをコードする第一のＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むハイブリッドベクターで形質転換された宿主（例えば大腸菌または哺乳動物細胞）を培養すること、および該タンパク質を単離することを含む。
【０３７９】
インビトロでのハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞の増幅は、適する培養基において行い、該培養基は、哺乳動物血清、例えばウシ胎仔血清、または微量元素および成長維持補給物、例えば、フィーダー細胞、例えば正常マウス腹膜滲出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸などを場合によっては補充した、通例の標準的な培養基、例えばダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＰＲＭＩ１６４０培地、である。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増幅は、当分野において公知の適切な培養基において、例えば、細菌についてはＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、テリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴ、またはＭ９最小培地において、および酵母については、ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地または完全最小ドロップアウト培地において同様に行う。
【０３８０】
インビトロ生産は、比較的純粋な抗体製剤をもたらし、また、大量の所望の抗体を生産するようにスケールアップすることができる。細菌細胞、酵母または哺乳動物細胞培養のための技術は、当分野において公知であり、それらとしては、例えばエアリフト反応器におけるもしくは連続攪拌反応器における、均一懸濁培養、または例えば中空繊維内、マイクロカプセル内、アガロースマイクロビーズ上もしくはセラミックカートリッジ上での、固定もしくは捕捉された細胞培養が挙げられる。
【０３８１】
哺乳動物細胞をインビボで増幅することによって、大量の所望の抗体を得ることもできる。このために、所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を組織適合性哺乳動物に注射して、抗体生産性腫瘍を増殖させる。場合によっては、その注射の前に、それらの動物を炭水化物、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）などの鉱物油でプライミングする。１から３週間後、それらの哺乳動物の体液から抗体を単離する。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスからの抗体生産性脾臓細胞と適する骨髄腫細胞の融合によって得られたハイブリドーマ細胞、または所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞株Ｓｐ２／０から誘導されたトランスフェクト細胞を、プリスタンで場合によっては前処置したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、１から２週間後、それらの動物から腹水液を採取する。
【０３８２】
上述のおよび他の技術は、例えば、参照により本明細書に援用されているＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；ＵＳ４，３７６，１１０；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒにおいて論じられている。組換え抗体分子の調製のための技術は、上の参考文献に記載され、および例えば、ＥＰ０６２３６７９；ＥＰ０３６８６８４およびＥＰ０４３６５９７（これらは参照により本明細書に援用されている）にも記載されている。
【０３８３】
ＰＧＣまたは他の多能性細胞、例えばＥＳもしくはＥＧ細胞、の免疫蛍光染色によって、免疫ブロット法によって、酵素イムノアッセイ、例えばサンドイッチアッセイもしくはドット・アッセイ、またはラジオイムノアッセイによって、細胞培養上清を、所望の抗体について選択的にスクリーニングする。
【０３８４】
抗体の単離のために、例えば、硫酸アンモニウムでの沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿性材料に対する透析、選択膜による濾過などによって、培養上清中のまたは腹水液中の免疫グロブリンを濃縮することができる。必要とされるおよび／または所望される場合には、通例のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィーおよび／または（イムノ）アフィニティークロマトグラフィー、例えば抗原もしくはその断片とのまたはプロテインＡとのアフィニティークロマトグラフィーによって、抗体を精製することができる。
【０３８５】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞も提供する。ハイブリドーマ細胞は、遺伝子に安定であり得、所望の特性のモノクローナル抗体を分泌することができ、および解凍および再クローニングによって冷凍保存培養物から活性化することができる。
【０３８６】
適する哺乳動物、例えばＢａｌｂ／ｃマウスを、１つ以上のＴＡＺポリペプチド、またはそれらの抗原性断片で免疫し、その免疫された哺乳動物の抗体生産性細胞を適する骨髄腫細胞株の細胞と融合させ、その融合体から得られたハイブリッド細胞をクローニングし、所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択することを特徴とする、ＴＡＺポリペプチドに対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を調製するためのプロセスも含む。例えば、ＴＡＺで免疫したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を、骨髄腫細胞株ＰＡＩまたは骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞を所望の抗体の分泌についてスクリーニングし、ポジティブハイブリドーマ細胞をクローニングする。
【０３８７】
本発明者らは、ＴＡＺを発現する１０と１０７と１０８の間の細胞および適するアジュバントを数ヶ月にわたって、例えば２ヶ月と４ヶ月の間に、数回、例えば４から６回、皮下および／または腹腔内注射することによってＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、最後の注射の２から４日後、それらの免疫したマウスから脾臓細胞を採取し、ポリエチレングリコールなどの融合プロモーターの存在下で骨髄腫細胞株ＰＡＩの細胞と融合させることを特徴とする、ハイブリドーマ細胞株の調製のためのプロセスを記載する。該骨髄腫細胞は、分子量約４０００のポリエチレングリコールを約３０％から約５０％含有する溶液中で、３から２０倍過剰のそれらの免疫したマウスからの脾臓細胞と融合させることができる。融合後、本明細書中で前に説明したような適切な培養基中で細胞を増幅させ、その培養基に定期的に選択培地（例えばＨＡＴ培地）を補足して、正常な骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞より増殖しないようにする。
【０３８８】
本明細書において前に説明したようなＴＡＺに対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡも開示する。定義により、そのようなＤＮＡは、コード１本鎖ＤＮＡ、該コードＤＮＡからおよびそれらの相補ＤＮＡから成る２本鎖ＤＮＡ、またはこれらの相補（１本鎖）ＤＮＡそれら自体を含む。
【０３８９】
さらに、ＴＡＺに対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする原型ＤＮＡ配列またはその突然変異体を有する、酵素的にまたは化学的に合成されたＤＮＡである場合がある。原型ＤＮＡの突然変異体は、１つ以上のアミノ酸が欠失しているまたは１つ以上の他のアミノ酸と交換されている上述の抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。該修飾（単数または複数）は、該抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲ以外でのものである場合がある。そのような突然変異ＤＮＡは、１つ以上のヌクレオチドが、同じアミノ酸（単数または複数）をコードする新たなコドンを有する他のヌクレオチドによって置換されているサイレント突然変異体であるとも解釈される。そのような突然変異配列は、縮重配列でもある。縮重配列は、無制限な数のヌクレオチドが他のヌクレオチドによって置換されるが、元々コードされているアミノ酸配列を変える結果とならないという遺伝コードの意味の範囲内で縮重されている。そのような縮重配列は、それらの異なる制限部位および／または特定の宿主（特に大腸菌）に好まれる特定のコドンの頻度のため、重鎖マウス可変ドメインおよび／または軽鎖マウス可変ドメインの最適な発現を達成するために有用であり得る。
【０３９０】
突然変異体という用語は、当分野において公知の方法に従って原型ＤＮＡのインビトロ突然変異誘発によって得られたＤＮＡ突然変異体を含むと解釈する。
【０３９１】
完全四量体免疫グロブリン分子の組み立ておよびキメラ抗体の発現のために、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡインサートを、重および軽鎖定常ドメインをコードする対応するＤＮＡと融合させ、その後、例えばハイブリッドベクターへの組込み後、適切な宿主細胞に移入する。
【０３９２】
ヒト定常ドメインｇ、例えばγ１、γ２、γ３またはγ４、例えばγ１またはγ４、に結合したＴＡＺに対する抗体の重鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡも開示する。同様に、ヒト定常ドメインκまたはλ、例えばκ、に結合したＴＡＺに対する抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡも開示する。
【０３９３】
もう１つの実施形態において、本発明者らは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、宿主細胞における抗体のプロセッシングを助長するシグナル配列ならびに／または、抗体の精製を助長するペプチドおよび／もしくは開裂部位および／もしくはペプチドスペーサーおよび／もしくはエフェクター分子をコードするＤＮＡを任意選択的に含む、スペーサー基によって連結された組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを開示する。
【０３９４】
エフェクター分子をコードするＤＮＡは、診断または治療用途において有用なエフェクター分子をコードするＤＮＡであると解釈する。従って、毒素または酵素（特にプロドラッグの活性化を触媒することができる酵素）であるエフェクター分子を特に示す。そのようなエフェクター分子をコードするＤＮＡは、ＤＮＡまたはその突然変異体をコードする、天然の酵素または毒素の配列を有し、また、当分野において周知の方法によって作製することができる。
【０３９５】
＜使用＞
抗ＴＡＺ抗体は、（ａ）抗ＴＡＺ抗体を供給するステップと、（ｂ）生体サンプルと該抗体を、抗体−抗原複合体の形成が可能である条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）該抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを判定するステップとを含む方法による、生体サンプル中に存在するＴＡＺポリペプチドの検出方法において用いることができる。
【０３９６】
適するサンプルとしては、組織、例えば脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉および骨組織の、またはそのような組織に由来する新生物性増殖物からの抽出物が挙げられる。特に、サンプルは、乳房組織、例えば、乳がんに罹患している疑いがある個体からの乳房組織を含み得る。
【０３９７】
抗体は、固体支持体に結合させることができ、および／または適する試薬、対照、説示などと共に適する容器に入ったキットに包装することができる。
【０３９８】
＜抗体送達＞
ＴＡＺタンパク質に対する抗体は、当分野において公知の技術によって、例えば、リポソーム、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ＨＥＭＡ、線状ポリアミドアミンポリマーなど）などの使用によって、細胞に送達することができる。免疫グロブリンおよび／または抗体は、形質膜および／または核膜を横断することができるタンパク質とのタンパク質融合体またはコンジュゲートとして、細胞に送達することもできる。例えば、免疫グロブリンおよび／またはターゲットを、転移活性に関与するそのようなタンパク質からのドメインまたは配列に融合またはコンジュゲートさせることができる。転移ドメインおよび配列としては、ＨＩＶ−１−トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディア・ホメオドメイン・タンパク質および単純疱疹−１ウイルスＶＰ２２タンパク質からのドメインおよび配列を挙げることができる。
【０３９９】
＜医薬組成物および投与＞
ＴＡＺ核酸、そのポリペプチド、断片、相同体、変異体もしくは誘導体、調節因子、アゴニストもしくはアンタゴニスト、構造的に関係のある化合物、またはいずれかの酸塩を含めて、該抗ＴＡＺ剤は、単独で投与することができるが、活性成分を医薬調合剤として調合することができる。
【０４００】
従って、本発明者らは、抗ＴＡＺ剤を含む医薬組成物も開示する。そのような医薬組成物は、記載するような症状の治療または緩和のための個体への該抗ＴＡＺ剤、例えば記載するような組成物の形態の抗ＴＡＺ剤の送達に有用である。
【０４０１】
本明細書の文脈での医薬組成物は、少なくとも抗ＴＡＺ剤を活性成分として含む物質の組成物である。
【０４０２】
該医薬調合剤は、１つ以上の医薬的に許容される担体と共に有効量の抗ＴＡＺ剤を含む。「有効量」は、記載するような疾病の少なくとも１つの症状を緩和するために十分な量である。
【０４０３】
該有効量は、治療または緩和すべき個々の疾病または症候群、ならびに患者の年齢および体重、その疾病などの状態がどれくらい進んでいるのか、患者の全身の健康状態、それらの症状の重症度、およびその抗ＴＡＺ剤を単独で投与するのか、他の治療薬と併用で投与されるのかをはじめとする、他の要因に依存して変わる。
【０４０４】
適する医薬的に許容される担体は、当分野において周知であり、その医薬調合剤の所望の形態および投与方式によって変わる。例えば、それらは、希釈剤または賦形剤、例えば充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤などを含む場合がある。一般に、該担体は、固体、液体もしくは気化可能な担体、またはそれらの組み合わせである。それぞれの担体が、その調合剤の他の成分と相溶性であり、患者にとって有害でないという意味で、「許容される」ものでなければならない。該担体は、宿主に投与されたときに有害な反応（例えば、免疫応答）を惹起することのない、生物学的に許容されるものでなければならない。
【０４０５】
医薬組成物の活性成分（単数または複数）は、例えばがん、腫瘍、新生物および他の関連疾患の緩和に関して、治療活性を示すと考えられる。最適な治療応答を生じさせるように投薬レジメンを調整することができる。例えば、幾つかの分割用量を毎日投与することができ、またはその用量を、治療状態の緊急性による指示に従って比例的に減少させることができる。
【０４０６】
活性化合物は、適便な手法で、例えば、経口、静脈内（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、経鼻、経皮または坐剤経路または体内埋植（例えば、徐放性分子の使用）により、投与することができる。投与経路に依存して、活性成分は、酵素、酸の作用および該成分を不活性化し得る他の自然条件から該成分を保護するための材料でコーティングする必要がある場合がある。
【０４０７】
該抗ＴＡＺ剤は、単独で投与することができ、または他の治療薬と併用で投与することもできる。ここでの使用に適する他の治療薬は、所期の目的に有効である任意の適合性薬物、またはその薬剤調合物を補足する薬物である。併用療法に利用される調合剤は、併用効果が達成されるように、他の治療と同時に、または逐次的に投与することができる。
【０４０８】
＜経口投与＞
一部の実施形態では、ＴＡＺ活性、発現または量についての阻害剤を経口組成物として提供し、しかるべく投与することができる。該ＴＡＺ活性、発現または量についての阻害剤の投薬量は、約１ｍｇ／日から約１０ｍｇ／日の間であり得る。
【０４０９】
該医薬組成物は、錠剤、カプセルまたは液剤の形態の経口調合剤で投与することができる。経口調合剤の有効量を、その疾患の症状が緩和されるまで、１日１から３回、患者に投与する。
【０４１０】
薬剤の有効量は、患者の年齢、体重および状態に依存する。一般に、薬剤の経口日用量は、１２００ｍｇ未満であり、１００ｍｇより多い。該経口日用量は、約３００−６００ｍｇである場合がある。経口調合剤は、単位剤形で適便に提供され、また、薬学技術分野において公知の任意の方法によって調製することができる。該組成物を適する医薬的に許容される担体と共に任意の所望の剤形に調合することができる。代表的な単位剤形としては、錠剤、ピル、粉末、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒、カプセル、坐剤が挙げられる。一般に、該調合剤は、薬剤組成物と液体担体もしくは微粉固体担体または両方とを均一および均質に会合させ、必要に応じてその生成物を成形することによって作製することができる。疾病を治療するために活性成分の有効量を与えるために、液体、粉末、錠剤またはカプセルの形態で様々な基礎材料に活性成分を配合することができる。
【０４１１】
該組成物は、例えば、不活性希釈剤と共に、もしくは同化可能な可食担体と共に、適切に経口投与することができ、またはハードもしくはソフトシェル・ゼラチンカプセルに封入することができ、または錠剤に圧縮することができ、または食物もしくは食事に直接配合することができる。経口治療投与のために、該活性化合物を賦形剤と配合し、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、カシェ剤などの形態で使用することができる。そのような治療に有用な組成物中の活性化合物の量は、適する投薬量が得られるような量である。
【０４１２】
該錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは、次のものも含有することがある：結合剤、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン；賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム；崩壊剤、例えば、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、アルギン酸など；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；ならびに甘味剤、例えば、添加することができるスクロース、ラクトースもしくはサッカリン、または着香剤、例えばペパーミント、ウインターグリーン油もしくはチェリー着香料。投薬単位形がカプセルであるとき、それは、上のタイプの材料に加えて、液体担体を含有することがある。
【０４１３】
様々な他の材料が、コーティングとして、またはその投薬単位の物理的形態を別様に修飾するために、存在する場合がある。例えば、錠剤、ピルまたはカプセルを、セラック、糖または両方でコーティングすることができる。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてスクロース、保存薬としてメチルおよびプロピルパラベン、染料および着香料、例えばチェリーまたはオレンジフレーバーを含有する場合がある。勿論、いずれの投薬単位形を調製する際に使用されるいずれの材料も、製薬学的に純粋であり、且つ、利用される量で実質的に非毒性でなければならない。加えて、該活性化合物は、持続放出性製剤および調合剤に配合することができる。
【０４１４】
＜注射または静脈内投与＞
一部の実施形態では、該抗ＴＡＺ剤を注射用または静脈内組成物として提供し、投与する。該抗ＴＡＺ剤阻害剤の投薬量は、約５ｍｇ／ｋｇ／２週間から約１０ｍｇ／ｋｇ／２週間の間であり得る。該抗ＴＡＺ剤阻害剤は、１０−３００ｍｇ／日の間、例えば、少なくとも３０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日未満、または３０ｍｇ／日から２００ｍｇ／日の間の投薬量で与えることができる。
【０４１５】
注射可能な使用に適する医薬形としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。すべての場合、該医薬形は、無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。製造および保管条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。該担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適する混合物、および植物油を含有する、溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、妥当な流動性を維持することができる。
【０４１６】
＜局所投与＞
本明細書に開示する医薬組成物は、局所および経口投与に適するものを含み、局所調合剤は、罹患した組織が主として皮膚または表皮である場合（例えば、乾癬、湿疹および他の表皮疾患）に好ましい。
【０４１７】
該局所調合剤は、治療すべき皮膚表面との直接接触により組成物を外部から適用する医薬形を含む。局所適用のための従来の医薬形としては、浸漬、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スティック、スプレー、エーロゾル、バスオイル、液剤などが挙げられる。局所療法は、様々なビヒクルによってもたらされ、ビヒクルの選択は重要であり得、一般に、急性疾患を治療することになるのか、慢性疾患を治療することとなるのかに関係する。例として、急性皮膚増殖疾患は、一般に、水性乾燥製剤で治療されるが、慢性皮膚増殖疾患は、水和製剤で治療される。浸漬は、急性湿潤性発疹を乾燥させる最も簡単な方法である。ローション（水懸濁液中の粉末）および液剤（溶媒に溶解した薬物）は、毛髪および間擦領域に理想的である。軟膏および油中水型乳剤は、乾燥落屑性発疹に適する最も有効な水和剤であるが、べとべとして、病変の部位によっては望ましくないときがある。適切な場合、特に、病変への薬剤組成物の浸透を増加させることが望ましいときには、包帯と併用でそれらを適用することができる。クリームまたは水中油型乳剤およびゲルは、吸収性であり、患者に最も美容的に許容される。（Ｇｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，ｐ．１５９３−１５９５０（１９９６））。クリーム製剤は、一般に、石油、ラノリン、ポリエチレングリコール、鉱物油、グリセリン、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸グリセリル、セテアリルアルコール、酢酸トコフェロール、ミリスチン酸イソプロピル、ラノリンアルコール、シメチコン、カルボメン、メチルクロロイソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、シクロメチコンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにこれらの混合物などの成分を含む。
【０４１８】
局所適用のための他の調合剤としては、シャンプー、石鹸、シェイクローションなど、特に、下にある皮膚、例えば頭皮、に残留物を残すように調合されたもの（Ａｒｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：２８３８（１９９３））が挙げられる。
【０４１９】
一般に、局所調合剤における組成物の濃度は、約０．５から５０重量％、例えば約１から３０重量％、約２〜２０重量％、または約５〜１０重量％、の組成物の量でのものである。用いる濃度は、最初のうちはその範囲の高いほうの部分の濃度であり得、治療を続けるにつれて、濃度を低下させることができ、または調合剤の適用をより低頻度にすることができる。局所適用は、多くの場合、１日２回、適用される。しかし、より大きな用量の１日１回の適用、またはより少ない用量のより高頻度の適用が効果的であることがある。角質層は、貯蔵所としての役割を果たし、長期間にわたって薬物を生存皮膚層に徐々に浸透させることができる。
【０４２０】
局所適用の場合、所望の薬理効果を得るために、十分な量の活性成分が患者の皮膚に浸透しなければならない。皮膚への薬物の吸収は、薬物の性質、ビヒクルの挙動、および皮膚の関数であることが一般に理解される。３つの主要変量（ビヒクル中の薬物の濃度、角質層とビヒクルの間の薬物の分配係数、および角質層内の薬物の拡散係数）が、異なる局所薬または異なるビヒクル中の同じ薬の吸収もしくは流出率の相違原因である。治療に有効であるには、薬物が、皮膚のバリア機能に関与する角質層を横断しなければならない。一般に、高いインビトロ皮膚浸透を発揮する局所調合剤がインビボで有効である。Ｏｓｔｒｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６０：１１７５−１１７９（１９７１））は、局所適用されたステロイドのインビボ効力が、インビトロでの採皮した人間の皮膚へのステロイドの浸透率に比例することを論証した。
【０４２１】
皮膚科的に許容され、且つ、薬剤と相溶性である、皮膚浸透増進剤を調合剤に配合して、皮膚表面から表皮ケラチン細胞への活性化合物（単数または複数）の浸透を増加させることができる。皮膚への活性化合物（単数または複数）の吸収を増加させる皮膚用増進剤は、有効な治療に必要な薬剤の量を減少させ、調合剤のより長い持続作用を提供する。皮膚浸透増進剤は、当分野において周知である。例えば、ジメチルスルホキシド（米国特許第３，７１１，６０２号）；オレイン酸、１，２−ブタンジオール界面活性剤（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７３：１１５３−１１５６（１９８４））；エタノールとオレイン酸またはオレイルアルコールの組み合わせ（ＥＰ  ２６７，６１７）、２−エチル−１，３−へキサンジオール（ＷＯ  ８７／０３４９０）；デシルメチルスルホキシドおよびＡｚｏｎｅ．ＲＴＭ．（Ｈａｄｇｒａｆｔ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，２１：１６５−１７３（１９９６））；アルコール、スルホキシド、脂肪酸、エステル、Ａｚｏｎｅ．ＲＴＭ．、ピロリドン、尿素およびポリオール（Ｋａｌｂｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５１：６１９−６３７（１９９６））；テルペン、例えば、１，８−シネオール、メントン、リモネンおよびネロリドール（Ｙａｍａｅ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  ＆  Ｐｈａｒｍｃｏｌｏｇｙ，４７：９７８−９８９（１９９５））；Ａｚｏｎｅ．ＲＴＭ．およびＴｒａｎｓｃｕｔｏｌ（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．１３：５４２−５４６（１９９６））；ならびにオレイン酸、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，５１：７４１−７４４（１９９６））は、活性成分の皮膚浸透を向上させることが知られている。
【０４２２】
薬剤または組成物の浸透レベルは、当業者に公知の技術によって判定することができる。当業者は、試験化合物の皮膚浸透を判定する幾つかの方法のうちのいずれかを用いて、例えば、活性化合物を放射標識し、その後、皮膚によって吸収された放射標識化合物の量を測定することにより、吸収された組成物のレベルを判定することができる。皮膚浸透研究に関する出版物としては、Ｒｅｉｎｆｅｎｒａｔｈ，Ｗ  Ｇ  ａｎｄ  Ｇ  Ｓ  Ｈａｗｋｉｎｓ．Ｔｈｅ  Ｗｅａｎｉｎｇ  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ  Ｐｉｇ  ａｓ  ａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｓｗｉｎｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍ．Ｅ．Ｔｕｍｂｌｅｓｏｎ，Ｅｄ．）Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６、およびＨａｗｋｉｎｓ，Ｇ．Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｋｉｎ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｋｉｎ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｂ  Ｗ  Ｋｅｍｐｐａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｗ  Ｇ  Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９０，ｐｐ．６７−８０；ならびにＷ．Ｇ．Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ，Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  ＆  Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ，１１０：３−９（１９９５）が挙げられる。
【０４２３】
一部の用途については、ポリマーなどの当分野において公知の調合剤を使用して、長期作用形態の薬剤または組成物を投与することができる。当分野において公知の方法に従って該薬剤を皮膚パッチ（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．，ｉｎ  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｎｏｒｄｉｃａ  ４：１１７（１９９２）；Ｔｈａｃｈａｒｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １６：１４５−１４８（１９９５）；Ｎｉｅｄｎｅｒ  Ｒ．，ｉｎ  Ｈａｕｔａｒｚｔ  ３９：７６１−７６６（１９８８））または包帯に組み込んで、治療すべき領域への薬物の送達効率を増加させることができる。
【０４２４】
場合によっては、本明細書に記載する局所調合剤は、追加の賦形剤；例えば、保存薬、例えばメチルパラベン、ベンジルアルコール、ソルビン酸または第四級アンモニウム化合物；安定剤、例えばＥＤＴＡ、抗酸化物質、例えばブチル化ヒドロキシトルエンまたはブチル化ヒドロキシアニソール、ならびに緩衝剤、例えばクエン酸およびホスフェートを有することがある。
【０４２５】
＜非経口投与＞
該活性化合物を非経口または腹腔内投与することもできる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中のならびに油中の分散液を調製することもできる。一部の実施形態において、該分散剤は、３０％  Ｃａｐｓｉｔｏｌ（米国、カンザス州、レネクサのＣｙｄｅｘ，Ｉｎｃ．）で調製することができる。Ｃａｐｓｉｔｏｌは、ブチルエーテルスペーサー基によって親油性キャビティーから分離されたスルホン酸ナトリウム塩、またはスルホブチルエーテル（ＳＢＥ）を有する、ポリアニオン性β−シクロデキストリン誘導体である。該シクロデキストリンは、ＳＢＥ７−β−ＣＤである場合もある。
【０４２６】
＜アジュバント＞
アジュバント中の該組成物を投与することができ、該組成物を酵素阻害剤と共同投与することができ、またはリポソーム中の該組成物を投与することができる。アジュバントは、その最も広い意味で用いて、任意の免疫刺激化合物、例えばインターフェロン、を含む。ここで考えられるアジュバントとしては、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルが挙げられる。酵素阻害剤としては、膵臓トリプシンが挙げられる。リポソームとしては、水中油中水型ＣＧＦ乳剤ならびに従来のリポソームが挙げられる。
【０４２７】
＜微生物成長の防止＞
通常の保管および使用条件下では、これらの製剤は、微生物の成長を防止するために保存薬を含有することがある。
【０４２８】
微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール（ｔｈｉｒｍｅｒｏｓａｌ）などによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることができる。注射用組成物の長期吸収は、組成物における吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン、の使用によってもたらすことができる。
【０４２９】
滅菌注射用溶液は、上に列挙した様々な他の成分を必要に応じて伴う適切な溶媒に必要量の活性化合物を配合し、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒と上に列挙したものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに滅菌した活性成分を配合することによって調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、それらの調製方法は、任意の追加の所望成分を加えた活性成分の粉末をそれらの事前に滅菌濾過した溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥技術を含む場合がある。
【０４３０】
＜医薬的に許容される担体＞
本明細書において用いる場合、「医薬的に許容される担体および／または希釈剤」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当分野において周知である。いずれの従来の媒質または薬剤も、活性成分と不相溶性である場合を除き、治療組成物におけるそれらの使用が考えられる。補助活性成分も該組成物に配合することができる。
【０４３１】
＜投薬単位形＞
投与の容易さおよび投薬量の均一性のため、投薬単位形の医薬組成物を調合することが特に有利である。
【０４３２】
本明細書において用いる場合の投薬単位形は、治療すべき被験者のための単位投薬量として適する物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、所望の治療効果を生じさせるように計算された所定の量の活性材料を必要な製薬用担体と共に含有する。新規投薬単位形についての明細事項は、（ａ）活性材料のユニークな特性および達成され得る特別な治療効果、ならびに（ｂ）調剤技術分野に固有の制限（例えば、身体の健康を害する罹病状態を有する生きている被験者において疾病を治療するための活性材料）によって左右され、それらに直接依存する。
【０４３３】
適便で有効な投与のために、適切な医薬的に許容される担体と共に有効量の主活性成分を投薬単位形に調剤する。補助活性成分を含有する組成物の場合、その投薬量は、該成分の通常の用量および投与様式を参照して決定する。
【実施例１】
【０４３４】
＜細胞株およびプラスミド＞
細胞株ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｈｓ５７８Ｔ、ＺＲ−７５−１は、米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入し、ＭＣＦ１０Ａ細胞以外は推奨培地中で維持し、ＭＣＦ１０Ａ細胞は、５％ウマ血清、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１００ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素、１０μｇ／ｍＬのインスリンおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補足したＤＭＥＭ中で培養する。ＢＴ−５４９細胞は、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ中で培養する。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、Ｔ−４７Ｄ細胞は、Ｌｏ  Ｔｉｎｇ  Ｌｉｎｇ（シンガポール分子生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ））からのものであり、１０％ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍＬのインスリンを補足したＤＭＥＭ中で維持する。ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＢＴ−４７４は、伊藤嘉明（Ｙｏｓｈｉａｋｉ  Ｉｔｏ）（シンガポール分子生物学研究所）によって提供されたものである。ＢＴ−２０細胞は、１０％ＦＢＳを補足したＭＥＭ中で維持する。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞は、１０μｇ／ｍＬのインスリンを補足した１０％ＦＢＳを伴うＤＭＥＭ中で維持する。両栄養性Ｐｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞は、親切にもＧ．Ｎｏｌａｎ（スタンフォード大学）によって提供されたものであり、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で維持する。
【０４３５】
ヒトＴＡＺのｃＤＮＡは、ＭＣＧクローン１９８９１からのものである。完全長ＴＡＺまたはＦｌａｇタグ付ＴＡＺは、ＭＣＧ１９８９１クローンを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって構築し、レトロウイルスベクターｐＢＡＢＥｐｕｒｏのＢａｍＨ１−Ｓａｌ１部位にクローニングする。Ｆｌａｇタグ付マウスＴＡＺは、Ｎａｉｙａｎｇ  Ｆｕ（シンガポール分子生物学研究所）からのマウスｃＤＮＡライブラリーを使用してＰＣＲによって構築し、Ｓｏｆｉｅ  Ｖａｎ  Ｈｕｆｆｅｌ（シンガポール分子生物学研究所）からのレトロウイルスベクターｐＢＡＢＥヒグロマイシンのＳｎａＢ１−Ｓａｌ１部位にクローニングする。ｐＧＥＸ−ＴＡＺ（アミノ酸１６０−２２９）およびｐＥＴ−ＴＡＺ（アミノ酸１６０−２２９）は、指示されたアミノ酸をコードするＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ断片をそれぞれｐＧＥＸ４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏＲ１／Ｘｈｏ１部位にクローニングすることによって構築する。ｐＧＥＸ−ＹＡＰ（アミノ酸２０６−２６２）は、ヒトｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲ増幅断片をｐＧＥＸ４Ｔ−１のＥｃｏＲ１／Ｓａｌ１部位にクローニングすることによって構築する。
【実施例２】
【０４３６】
＜ＧＳＴタグ付タンパク質の精製＞
ｐＧＥＸ−ＴＡＺまたはｐＧＥＸ−ＹＡＰ構築物を保有する１リットルの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地中でＯＤ＝０．８〜１まで増殖させ、０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で一晩、室温で誘導する。遠心分離によって細菌を回収し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中での超音波処理によって溶解させる。その溶解産物を１０，０００ｇで３０分間、４℃でスピンし、その上清を２時間、４℃で０．５ｍＬのグルタチオン−セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合する。それらのビーズをＰＢＳで４回洗浄する。結合したタンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中の１０ｍＭ還元グルタチオン（５容量）で溶離する。
【実施例３】
【０４３７】
＜Ｈｉｓタグ付タンパク質の精製＞
ｐＥＴ−ＴＡＺ融合構築物を保有する１リットルの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＧＥＸ−ＴＡＺとして誘導する。クラッキングバッファー（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからの、１００ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｍＭのＫＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、２ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害剤のカクテル）中での超音波処理によって、細菌を溶解させる。その溶解産物をスピンし、上清を回収し、１ｍＭのＴａｌｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に２時間、４℃でインキュベートする。それらの樹脂を洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭのイミダゾールおよび２ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で４回洗浄し、５容量の溶離バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、２００ｍＭのＫＣｌ、１０％グリセロール、２５０ｍＭのイミダゾールおよび２ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で溶離する。
【実施例４】
【０４３８】
＜抗体＞
市販ＴＡＺ抗体は、ＡｂｃａｍおよびＩｍｇｅｎｅｘから購入する。ＹＡＰ抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入する。アクチン抗体は、Ｓｉｇｍａからのものである。ウサギポリクローナルＴＡＺ特異的抗体は、ＧＳＴ−ＴＡＺ（アミノ酸１６０−２２９）をウサギに３回注射することによって産生させ、その後、Ｈｉｓ−ＴＡＺ（アミノ酸１６０−２２９）を２回、追加ブースト注射し、その後、血清を採取する。固定化Ｈｉｓ−ＴＡＺを使用して、その抗体をアフィニティー精製する。特異的にＴＡＺを検出するために、１００倍過剰のＧＳＴ−ＹＡＰの存在下で抗体を使用する。
【実施例５】
【０４３９】
＜ウエスタンブロット分析＞
指示された細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、その後、氷冷溶解バッファー（プロテアーゼ阻害剤カクテルを補足した、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．２％フッ化ナトリウムおよび０．１％オルトバナジン酸ナトリウム）に溶解する。スピン（１０，０００ｇ、１５分）による浄化後、溶解産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分割し、ニトロセルロース膜にブロットする。フィルターをＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でブロックし、指示された一次抗体、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート型二次抗体（ｐｉｅｒｃｅ）でプローブする。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してシグナルを可視化する。
【実施例６】
【０４４０】
＜レトロウイルス産生および感染＞
リポフェクタミンをその製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説示に従って使用して、指示されたレトロウイルスベクターで両栄養性Ｐｈｏｅｎｉｘパッケージング細胞をトランスフェクトする。４８時間後、レトロウイルス上清を回収し、濾過し（０．４５μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、５μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で６−８時間、ターゲット細胞に添加する。感染を２回行う。感染後、細胞をピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）で１週間、選択し、その後、ウエスタンブロット法によりＴＡＺ発現を分析する。ＭＣＦ−ＫＤ−７１５およびＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞におけるマウスＴＡＺの再発現のために、ｐＢＡＢＥヒグロマイシン−ｍＴＡＺでの両栄養性Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞のトランスフェクトから得たレトロウイルス上清をＭＣＦ−ＫＤ−７１５およびＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞に添加し、それらをヒグロマイシン（５００μｇ／ｍＬ）およびピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）で１週間、選択し、その後、実験を行う。
【実施例７】
【０４４１】
＜ＴＡＺのｓｈＲＮＡ媒介ノックダウン＞
ＤｈａｒｍａｃｏｎからのｓｉＲＮＡ設計プログラムを使用してヒトＴＡＺに対する短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を設計し、ｐＳｕｐｅｒ．Ｒｅｔｒｏ．ｐｕｒｏベクター（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）のＢｇＩＩＩ−Ｘｈｏ１部位にサブクローニングする。ＭＣＦ７およびＨｓ５７８Ｔ細胞への形質導入およびＴＡＺ抗体での全細胞溶解産物のウエスタンブロット分析によってそれらの構築物の効力を検査する。ノックダウン構築物のセンスオリゴヌクレオチドの配列は、ＫＤ−１、５’−ＧＡＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＣ−３’；ＫＤ−６５０、５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’；ＫＤ−６５２、５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’；ＫＤ−７１５、５’−ＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡ−３’；ＫＤ−１３３１、５’−ＡＡＣＡＡＡＣＧＴＴＧＡＣＴＴＡＧＧＡ−３’である。
【実施例８】
【０４４２】
＜創傷治癒アッセイ＞
細胞移動を創傷治癒アッセイにおいて評価する。簡単に言うと、組織培養皿にプレーティングした集密ＭＣＦ１０Ａ−ＧＦＰ、ＭＣＦ１０Ａ−ＴＡＺ、Ｈｓ５７８Ｔ−ＫＤ−７１５およびＨｓ５７８Ｔ−ＫＤ−６５２細胞を、２００μＬピペットの先端で手作業で引掻くことによって傷つけ、ＰＢＳで洗浄し、完全培地中、３７℃でインキュベートする。指示された時点で、特定創傷部位での位相差画像を取得する。
【実施例９】
【０４４３】
＜軟寒天での足場非依存性成長＞
ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳを補足した１．５ｍＬの０．５％寒天（電子グレード超純粋；カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を６ウエルプレートに下層寒天としてプレーティングする。ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳを補足した１．５ｍＬの０．３５％寒天と５０００個の細胞を混合し、凝固した下層寒天上にプレーティングする。１ｍＬの培地を凝固寒天層の上に添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターの中で２から３週間、コロニーを成長させる。倒立顕微鏡で細胞コロニーの画像を取得する。
【実施例１０】
【０４４４】
＜細胞運動性および浸潤アッセイ（トランスウェルアッセイ）＞
細胞運動性は、８μｍ孔のポリカーボネート膜を有する２４ウェルチャンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することによって判定する。それらのチャンバーは、その製造業者によって説明されたとおり無血清培地中で再水和する。１０％ＦＢＳを有する完全培地（７５０μＬ）を化学誘引物質として使用する。０．５％ＦＢＳを有する５００μＬの完全培地中の５ｘ１０４個の細胞の懸濁液をインサートに添加し、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。インサートの膜上面に残存する細胞は綿棒で除去するが、下の面の細胞ならびにウエル内のものはトリプシン処理し、細胞数をカウントする。
【０４４５】
細胞浸潤性は、使用するチャンバーが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘの薄層でプレコートされた８μｍ孔ポリカーボネート膜を有する２４ウエルＭａｔｒｉｇｅｌ浸潤チャンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であることを除き、本質的には細胞移動アッセイと同じように行う。
【実施例１１】
【０４４６】
＜ヌードマウスにおける腫瘍形成＞
週齢４から６週の雌ヌードマウスの左および右後側腹部内または胸部乳房脂肪パッドに、１００μＬのＰＢＳに懸濁させた５ｘ１０６個のＭＣＦ７−ＫＤ−７１５またはＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞を皮下接種し、同時に、０．７２ｍｇのβ−エストラジオールを含有する６０日放出ペレット（オハイオ州、トレドのＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を与える。腫瘍発現をモニターし、腫瘍サイズが５ｍｍより大きくなったらマウスの写真を撮る。
【実施例１２】
【０４４７】
＜免疫組織化学＞
ヒト乳房組織アレイ（ＩｎｎｏＧｅｎｅｘ）を使用して、正常およびがん組織におけるＴＡＺおよびサイトケラチン（Ｃａｍ  ５．２、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の発現を調査する。Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋ  １３９５（カリフォルニア州、カーピンテリアのＤａｋｏ）を使用して、免疫組織化学を行う。新たなキシレン中で５分間、３回、スライドガラスを脱脂し、１００％、９５％、８０％および７５％エタノールならびにＰＢＳで逐次的に再水和し（各段階に５分）、その後、クエン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６中で１２分間、２１００−Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ（ＰｉｃｋＣｅｌｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＢＶ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｔｄ）で抗原を賦活化する。４時間、室温（ＲＴ）で冷却した後、それらのスライドガラスを水、および０．１％ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳですすぎ、その後、暗所で２０分間、０．６％Ｈ２Ｏ２で失活させる。ＰＢＳですすいだ後、それらのスライドガラスを、５％ヤギ血清および２％ＢＳＡを有するＰＢＳで２時間、室温でブロックし、一次抗体と共に一晩、４℃でインキュベートする。その後、それらのスライドガラスを、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳで、続いてビオチニル化二次抗体で２時間洗浄する。洗浄後、それらのスライドガラスをＶＥＣＴＡＳＴＡＴＩＮ  ＡＢＣ試薬と共に６０分間、インキュベートする。ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）ペルオキシダーゼ基質を暗所で３−５分間、スライドガラスに適用し、ＰＢＳでの洗浄によって反応を停止させる。結果を顕微鏡で分析する。
【実施例１３】
【０４４８】
＜乳がん細胞株におけるＴＡＺ発現＞
全細胞溶解産物を使用して免疫ブロット分析により乳がん細胞株におけるＴＡＺの発現を調査する。幾つかの市販ならびに社内産生抗体を試験することによって、すべての抗体がＴＡＺとその相同体ＹＡＰの両方と反応することが明らかになった。市販の抗体（ＩＭＧＥＮＥＸ）によるＴＡＺとＹＡＰの両方の効率的な検出のため、本発明者らは、図５に記載する実験を除き、すべての研究にわたってこの抗体を使用した。
【０４４９】
図１Ａに示す、代表実験から得られた結果は、ＴＡＺが、調査したすべての乳がん細胞株において様々なレベルで発現されることを示している。ＴＡＺとＹＡＰの両方の発現レベルをアクチンのものに対して正規化し、３回の独立した実験から得た定量的結果を、図１Ｂに示す任意単位で提示する。
【０４５０】
乳がん細胞株の中で、高レベル（およそ４任意単位）のＴＡＺがＨｓ５７８Ｔ、ＢＴ−５４９、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞において検出されるが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢＴ−２０、およびＴ−４７Ｄ細胞では中レベル（およそ２任意単位）が観察される。ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＺＲ−７５−１およびＢＴ−４７４細胞は、低レベル（およそ１任意単位）のＴＡＺを発現する。
【０４５１】
４つの高浸潤性がん細胞株のうちの３つ（Ｈｓ５７８Ｔ、ＢＴ−５４９、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）は、有意に高レベルのＴＡＺ発現を示し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、中レベルを発現する。これら４つの細胞株は、Ｎｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ（２００６）において、浸潤性乳がん細胞タイプの代表である基底様または基底Ｂがんタイプに対応することが証明されている。
【０４５２】
弱浸潤性細胞の大部分（７のうち５）は、低レベルのＴＡＺを発現し、２つの細胞株（ＢＴ−２０およびＴ−４７Ｄ）は、中レベルを発現する。これらの結果は、高浸潤性乳房細胞の大部分は高レベルのＴＡＺを発現するが、弱浸潤性細胞の大部分は低レベルのＴＡＺを発現することを示唆している。
【０４５３】
ＹＡＰ発現レベルと乳がん細胞の浸潤性のそのような相関関係は認められない（図１Ｂ）。ＴＡＺ発現レベルと乳がん細胞の浸潤性の相関関係は、ＴＡＺが乳がん細胞の浸潤性を支配するメカニズムの一部であり得ることを示唆している。
【実施例１４】
【０４５４】
＜ＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＴＡＺの過剰発現は、線維芽細胞様形態を誘導し、細胞移動および浸潤を促進する＞
乳がん細胞におけるＴＡＺ発現の機能的因果関係を調査するために、本発明者らは、（低い内因性ＴＡＺレベルを示す）ＭＣＦ１０Ａ細胞において、Ｈｓ５７８ＴおよびＢＴ−５４９などの高発現性浸潤性細胞において見られるものと比較して約２〜３倍であるレベルに、ＴＡＺまたはＦｌａｇタグ付ＴＡＺを過剰発現させた（図２Ａ）。ＭＣＦ１０Ａ細胞は、外因性タンパク質を発現するほどにはトランスフェクトされないため、レトロウイルス媒介形質導入によって実施する。適切なレトロウイルスに感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞のプールを分析して、クローン変異を回避する。ＥＧＦＰ発現細胞（図２Ｂの左のパネル）は、親ＭＣＦ１０Ａ細胞に見られる上皮の外観を保持していた。しかし、ＴＡＺ（図２Ｂの右のパネル）またはＦｌａｇ−ＴＡＺ（データは示さない）を過発現する細胞は、細胞形質転換に特有のより不応性（ｒｅｆｌｅｃｔｏｒｙ）で紡錘形線維芽細胞様形態を発現した。
【０４５５】
ＴＡＺ発現レベルは、乳がん細胞の浸潤性と相関するので、本発明者らは、ＴＡＺ過発現が、細胞移動および浸潤を促進し得るかどうかを調査した。創傷治癒アッセイを用いて、本発明者らは、ＥＧＦＰを発現する細胞に相対してＴＡＺを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞の細胞移動度を比較した（図２Ｂ）。ＴＡＺ発現細胞の移動度は、劇的に増加される。１４時間以内に、移動したＴＡＺ過発現細胞によって創傷面積が有意に回復される。創傷面積は、移動した細胞によって２４時間以内に完全に回復される（右のパネル）。著しく対照的に、ＥＧＦＰを発現するＭＣＦ１０Ａ細胞の創傷閉鎖は、１４時間以内では有意でなく、また、２４時間以内でも部分的でしかない（左のパネル）。トランスウェルアッセイを用いて、これらの細胞の運動性および浸潤性を独立して評価する（図２Ｃ）。ＴＡＺ発現細胞の移動および浸潤性は、ＥＧＦＰを発現する対照細胞と比較して、それぞれ、約５倍および２〜３倍増加した。これらの結果は、ＴＡＺが、細胞移動および浸潤を促進すること、およびこれらの特性が、ＴＡＺを過発現する細胞の改変された形態の一因であり得ることを示唆している。
【実施例１５】
【０４５６】
＜ＭＣＦ７およびＨｓ５７８Ｔ細胞におけるＴＡＺのｓｈＲＮＡ媒介ノックアウトは細胞移動および浸潤を抑制する＞
細胞移動および浸潤についてのＴＡＺの役割を検証するために、遺伝子発現のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介ノックダウンに基づく、補完的だが独立したアプローチを用いる。クローン変異を回避しながら持続ノックダウンについて、本発明者らは、ＴＡＺ  ｍＲＮＡの様々な領域をターゲットにするｓｈＲＮＡを発現するレトロウイルス系ベクターに安定的に感染させた細胞のプールを分析した。１つの報告されているＲＮＡｉターゲット部位（ＫＤ−１）に加えて４つの他のＴＡＺ  ｍＲＮＡ部位を、免疫ブロット分析によって評価して、ＭＣＦ７細胞におけるＴＡＺタンパク質の発現のノックダウンに対するそれらの感受性について検査する。図３Ａ（左のパネル）に示すように、報告されているターゲットに基づくｓｈＲＮＡは、ＴＡＺタンパク質のレベルを著しく低下させた。４つの新規ターゲットに基づくｓｈＲＮＡの中で、２つ（７１５および１３３１）は、ＴＡＺタンパク質レベルに対して有意な効果を有さず、１つ（６５０）は、報告されているものに匹敵するＲＮＡｉ効果を有するが、もう１つ（６５２）は、ＴＡＺ発現の最も効率的な抑制効果を有した。４つのｓｈＲＮＡ発現レトロウイルスを使用してＨｓ５７８Ｔ細胞も感染させ（右のパネル）、安定的に形質導入された細胞のプールをＴＡＺ発現について分析する。重ねて、ｓｈＲＮＡ  ７１５および１３３１は、有意な効果を有さなかったが、ｓｈＲＮＡ  ６５０と６５２の両方は、ＴＡＺのタンパク質レベルを有意に低下させた。従って、本発明者らは、後続の分析にはｓｈＲＮＡ６５２でノックダウンした細胞を、ｓｈＲＮＡ７１５を形質導入した細胞との比較で使用した。すべての分析においてｓｈＲＮＡ７１５を形質導入した細胞は親およびベクター導入細胞と同様に挙動したからである。低下したＴＡＺ発現を随伴する細胞のクラスターは、より高密度に詰め込まれた状態になり、そして緻密な細胞シートになり、クラスターの細胞密度は、ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５細胞と比較してＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞におけるほうが増された（上のパネル、図３Ｂ）。走査電子顕微鏡により、細胞間の空間が、ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５細胞と比較してＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞におけるほうが減少され（下のパネル、図３Ｂ）、その結果、より緊密に配列された／詰め込まれた緻密な上皮の外観が生じることが明らかになった。この観察は、細胞を低または高密度でプレーティングして標準条件下で培養したとき、明白である。殆どのアッセイを用いて、ＭＣＦ７細胞は移動および浸潤しないので、本発明者らは、Ｈｓ５７８Ｔ細胞を使用して移動および浸潤を分析した。創傷治癒アッセイにおいて活発に移動した、検出可能なＲＮＡｉ効果を伴わない、Ｈｓ５７８Ｔ−ＫＤ−７１５細胞（左のパネル、図３Ｃ）に相対して、ＴＡＺのノックダウンは、Ｈｓ５７８Ｔ−ＫＤ−６５２細胞の移動を有意に減少させた（右のパネル、図３Ｃ）。移動および浸潤能力の低下は、トランスウエルアッセイを用いても示される（図３Ｄ）。これらのＲＮＡｉ実験は、ＴＡＺが細胞移動および浸潤の重要な調節因子であるという過発現実験から得た結論をさらに支持する。その発現レベルは、乳房細胞の上皮の外観と負の相関関係があり、移動および浸潤特性と正���相関関係がある。
【実施例１６】
【０４５７】
＜ＴＡＺは足場非依存性成長および腫瘍形成にとって重要である＞
乳がん細胞の腫瘍形成におけるＴＡＺの重要性を調査するために、本発明者らは、ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５細胞との比較でＴＡＺノックダウンＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞の足場非依存性成長能力を先ず評価した。ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５細胞は、軟寒天においてよく成長した（上のパネル、図４Ａ）が、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞についての軟寒天において成長したコロニーの数は、劇的に減少された。ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５細胞の細胞コロニーの十分に発達した球形（上のパネル、図４Ａ）と比較して、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞は、成長することができず、細胞破壊片の小さな凝集体しか観察されない（右のパネル、図４Ｂ）。これらの結果は、ＴＡＺが、ＭＣＦ７の足場非依存性成長に必須であることを示唆している。その後、本発明者らは、ＴＡＺがヌードマウスにおける腫瘍形成に寄与するかどうかを調査した。ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５およびＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞をヌードマウスの大腿および脂肪パッドに別々に注射し、腫瘍の成長をモニターする（図４Ｃ）。ＭＣＦ７−ＫＤ−７１５細胞（右側）と比較して、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５２細胞（左側）は、大腿注射部位（左のパネル）においても、脂肪パッド注射部位（右のパネル）においても、腫瘍形成を起こしやすい。結果として生じた腫瘍の定量分析を補足図Ｓ１に示す。これらの結果は、ＴＡＺがＭＣＦ７細胞のインビボでの腫瘍形成にとっても重要であることを示唆している。
【実施例１７】
【０４５８】
＜乳がんにおけるＴＡＺの過剰発現＞
乳がん細胞の分析から得た本発明者らの所見が、生理学的および臨床的妥当性を有するかどうかを評価するために、本発明者らは、原発性乳がんから採取した組織切片においてＴＡＺ発現を調査した。抗ＴＡＺ抗体とＹＡＰの交叉反応性を克服するために、本発明者らは、ＹＡＰと最も大きく異なるＴＡＺの領域に対するウサギ抗体を産生させた。アフィニティー精製した抗体は、ＴＡＺを優先的に認識したが、より低い効率でＹＡＰとも反応した（左のパネル、図５Ａ）。しかし、それらの抗体は、抗原として使用したＴＡＺ領域に対応する、（それらの抗体より）１００倍過剰の組換えＹＡＰ断片の存在下で、ＴＡＺを特異的に認識した（右のパネル、図５Ａ）。特異的にＴＡＺを検出するこのアプローチを用いることにより、免疫組織化学を用いて原発性乳がんサンプルを調査する。分析した１２６の乳がんサンプルの中で、２７（２１．４％）がＴＡＺを過剰発現し、ＴＡＺ発現性がんの大部分（２１サンプル）が、浸潤性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）（浸潤性（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ））乳管がん（ＩＤＣ）のものであり、これは、ＴＡＺがＩＤＣの有意な割合において過剰発現されることを示唆している。ＩＤＣにおけるＴＡＺの代表的ポジティブ標識を示す（右のパネル、図５Ｂ）。該がんサンプルについての本発明者らの免疫組織学的分析の要約を下の表Ｅ１に示す。これらの結果は、ＴＡＺ過発現が、乳がんのＩＤＣへの進行にとって重要である可能性が高いことを示唆し、および乳がん細胞株に関する本発明者らの所見の生理学的および臨床的妥当性を立証する。
【０４５９】
【表２】
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【０４６０】
表Ｅ１．異なる乳がんタイプにおけるＴＡＺの過発現の分析。
免疫組織化学を用いて、それぞれの乳がんタイプにおけるＴＡＺの発現を調査した。示した数は、それぞれの乳がんタイプの合計サンプル数のうちのＴＡＺを過発現したサンプル数を表す。Ｎｏｒ．Ｂｒｅａｓｔ、正常乳房；ＬＣＩＳ、非浸潤性小葉がん；ＩＤＣ、浸潤性乳管がん；ＩＬＣ、浸潤性小葉がん；ＤＩＣＳ、非浸潤性乳管がん；ＬＮ  ｍｅｔ、リンパ節転移；Ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａ、髄様がん。
【実施例１８】
【０４６１】
＜ＴＡＺは、転写因子ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３およびＴＥＡＤ４と相互作用する＞
本明細書に記載する方法および当分野において公知の方法を用いて、ＴＡＺおよびＧＳＴ−ＴＥＡＤおよびＨＡ−ＴＥＡＤ（細胞において発現されたもの）でのインビトロ結合実験を行う。
【０４６２】
第一の実験では、Ｈｓ５７８ｔ細胞から採取した細胞抽出物を固定化ＧＳＴ−ＴＥＡＤ１（９６−４１２）、ＧＳＴ−ＴＥＡＤ２（１２１−４４８）、ＧＳＴ−ＴＥＡＤ３（１１５−４３６）、ＧＳＴ−ＴＥＡＤ４（１１９−４３５）またはＧＳＴと共にインキュベートする。出発原料と共に、ビーズに保持されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分割し、その後、ＴＡＺとＹＡＰの両方と反応する抗体で免疫ブロットする。
【０４６３】
結果を図８Ａに示す。この図は、ＴＡＺとＹＡＰの両方が、固定化ＧＳＴ−ＴＥＡＤによって効率的に保持されるがＧＳＴではされないことを示している。
【０４６４】
第二の実験では、ＨＡ−ＴＥＡＤ１−４を発現するようにレトロウイルスベクターを安定的に形質導入したｓ５７８Ｔ細胞を溶解し、得られた細胞溶解産物を抗ＨＡ抗体で免疫沈降させた。出発原料と共に、それらの免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分割し、その後、抗ＨＡ抗体またはＴＡＺとＹＡＰの両方と反応する抗体を使用して免疫ブロットする。
【０４６５】
結果を図８Ｂに示す。この図は、内因性ＴＡＺおよびＹＡＰ（はるかに低い効率で）が、安定的に発現されたＨＡ−ＴＥＡＤ１−４と共免疫沈降することを示している。
【実施例１９】
【０４６６】
＜ＴＥＡＤ２への結合に関与するＴＡＺ中のアミノ酸残基の同定＞
標準的な突然変異誘発技術を用いて、ＴＡＺの突然変異体Ｓ８９Ａを作る。この突然変異体は、発がん機能増加型突然変異体であり、さらに詳細に下で説明する。
【０４６７】
標準的な突然変異誘発技術を用いて、ＴＡＺ−Ｓ８９Ａの多数の突然変異体を作る。これらには、ＴＡＺ−Ｓ８９Ａの突然変異Ｆ５２ＡおよびＦ５３Ａ（Ｍ９）などがある。これらをＭ１−Ｍ９と呼ぶ。
【０４６８】
次に、ＦＬＡＧタグ付Ｍ１−Ｍ９突然変異体を発現する構築物を生成する。
【０４６９】
ＭＣＦ１０Ａ細胞をＨＡ−ＴＥＡＤ２およびＴＡＺのＦｌａｇタグ付ＴＥＡＤ結合突然変異体（ＦＬＡＧタグ付Ｍ１−Ｍ９）に感染させる。トランスフェクトされたＭＣＦ１０Ａ細胞の溶解産物を生産する。それらの溶解産物を抗ＨＡで免疫沈降させ、抗Ｆｌａｇ抗体でプローブする。
【０４７０】
結果を図９に示す。図９は、ＴＡＺのＮ末端領域内の残基Ｆ５２およびＦ５３（Ｍ９）が、ＴＥＡＤ２との相互作用にとって重要であることを示している。Ｆ５２ＡおよびＦ５３Ａ突然変異体は、ＴＥＡＤ２と相互作用することができない。
【実施例２０】
【０４７１】
＜ＴＥＡＤ２との相互作用を欠く突然変異体Ｆ５３Ａは核内蓄積から除外される＞
本明細書に記載する方法および当業者に公知の方法を用いて、Ｆｌａｇタグ付ＴＡＺ−Ｓ８９ＡおよびＭ９（すなわち、Ｆ５３Ａ）に感染させたＭＣＦ１０Ａ細胞を抗Ｆｌａｇ抗体で染色する。
【０４７２】
図１０は、それらの結果を示すものである。ＴＥＡＤ結合突然変異体は、核内蓄積することができない。これは、ＴＡＺが核内に蓄積するためにＴＥＡＤが必須であることを示している。
【実施例２１】
【０４７３】
＜ＴＥＡＤ２との相互作用を欠く突然変異体Ｆ５３Ａは、足場非依存型成長を駆動しない＞
本明細書に記載する方法および当業者に公知の方法を用いて、ＴＡＺ−Ｓ８９ＡまたはＭ９（すなわち、Ｆ５３Ａ）突然変異体のいずれかに感染させた２０，０００のＭＣＦ１０Ａ細胞を１ヶ月、軟寒天において成長させ、コロニーを染色する。
【０４７４】
図１１は、それらの結果を示す。ＴＥＡＤ結合突然変異体は、軟寒天において成長することができない。これは、ＴＡＺが発がん性形質転換を誘導するためにＴＥＡＤとの相互作用が必須であることを示している。
【実施例２２】
【０４７５】
＜ＴＡＺは分泌タンパク質および表面膜タンパク質の発現を誘導する＞
ＴＡＺ（Ｓ８９Ａ）は、標準的突然変異誘発技術によって生成されるＴＡＺの突然変異体である。ＴＡＺの位置８９のセリンをアラニンに突然変異させる。それは、発がん機能増加型突然変異体であることを示す。
【０４７６】
ＴＡＺおよびＴＡＺ（Ｓ８９Ａ）を発現する細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲを行って、多数の分泌タンパク質および表面膜タンパク質の発現を証明する。
【０４７７】
図１２に示すように、ＴＡＺは、８つの分泌タンパク質（ＩＧＦＢＰ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、ＦＳＴＬ１、ＦＮ１、ＦＢＮ１およびＦＢＮ２）ならびに４つの表面膜タンパク質（ＡＸＬ、ＩＴＧＢ２、ＣＲＩＭ１、およびＡｌｃａｍ）の発現をアップレギュレートする。
【０４７８】
これらのタンパク質（これらのタンパク質の組み合わせを含む）は、乳がんおよび他のがんのための新たな診断用バイオマーカーをもたらす。さらに、それらの表面膜タンパク質は、抗体療法の候補をもたらし得る。
【実施例２３】
【０４７９】
［考察］
ヒトがん細胞株におけるタンパク質の本発明者らの進行中のプロテオミクス分析において、本発明者らは、浸潤性の高い乳がん細胞ほどＴＡＺの発現レベルが高いことに気づいた。この観察が、本発明者を、乳がんの腫瘍形成のおけるＴＡＺの生理学的／臨床的妥当性および役割の調査に駆り立てた。ＴＡＺは、乳がん細胞において広範に発現される。重要な観察は、大部分の高浸潤性乳がん細胞が、大部分の弱浸潤性乳がん細胞によって発現されるものの約４倍であるレベルでＴＡＺを発現することであり、これは、乳がん細胞の浸潤性におけるＴＡＺについての役割を暗示する。この観察の臨床的妥当性は、ＴＡＺが、乳がんの有意な割合（試験した１２６の市販乳がん細胞サンプルの約２１．４％）において過発現されるという発見によって裏付けられる。がん細胞の浸潤性は、増加される移動および浸潤特性に依存するので、本発明者らは、乳がんおよび細胞株におけるＴＡＺ過発現の作用のメカニズムが、乳がん細胞の移動および浸潤性を促進するものであるという仮説を検証した。（過発現による）機能増加アプローチと（ｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンによる）機能喪失アプローチの両方を用いて、乳がん細胞の移動および浸潤におけるＴＡＺの重要な役割を立証する。高浸潤性細胞において検出されるものの約２〜３倍のレベルへのＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＴＡＺの過発現は、上皮の外観から線維芽細胞様の外観への形態変化を生じさせ、それらの細胞の移動および浸潤特性を劇的に増加させた。さらに、ＭＣＦ７およびＨｓ５７８Ｔ細胞におけるＴＡＺ発現のｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンは、細胞移動および浸潤を減少させた。ＭＣＦ細胞の上皮クラスターは、ＴＡＺ発現がノックダウンされると、細胞がより高密度に詰め込まれた状態になった。これらの結果は、ＴＡＺが上皮の形態／構築の負の調節因子であり、浸潤および移動挙動に対しては正の調節因子であることを示している。乳がんにおけるＴＡＺ過発現は、移動特性（非浸潤性乳管がんがＩＤＣに進むために重要な事象）を促進する上皮の特性の喪失を誘発し得ると考えられる。最後に、ＭＣＦ７細胞においてＴＡＺ発現をノックアウトすると、軟寒天におけるそれらの足場非依存性成長およびヌードマウスにおける腫瘍形成が遅延され、これは、ＴＡＺ過発現が、乳がん発現および進行に関与するプロセスの重要な部分であることを示唆している。本発明者らは、本発明者らの実験が、ｓｈＲＮＡのオフターゲットではなくＴＡＺの役割に直接取り組んだものであると考える。第一に、本発明者らは、幾つかの異なるｓｈＲＮＡを利用し、ノックダウンの程度と細胞挙動に関する観察結果との相関関係を観察した。第二に、ＭＣＦ１０Ａ細胞における過発現から得られる結果は、同様の結論に至る。最後に、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５２（ＴＡＺノックダウン）におけるＦｌａｇタグ付マウスＴＡＺ（ｍＴＡＺ）をコードするＲＮＡｉ耐性マウスｃＤＮＡの再導入は、軟寒天においてコロニーを形成する能力を有意に回復させた。結果を補足図Ｓ２に示す。
【０４８０】
ＴＡＺの機能を支配する分子メカニズムは完全には明らかでないが、ＴＡＺ作用についてのメカニズムの１つは、上皮の形態の喪失を誘発すること、細胞移動および浸潤を促進すること、および足場非依存性成長を支持することであり、これらのすべてが、がんイニシエーション、進行および浸潤にとって重要である。ＴＡＺ過発現は、ＭＣＦ１０Ａ細胞を軟寒天において成長できるようにするには十分でない（未発表の観察）が、ＭＣＦ７細胞の足場非依存性成長にとっては重要である。従って、ＴＡＺは、乳がんの足場非依存性成長に十分なだけでない、重要な役割を果たし得る。ＴＡＺ過発現に起因するＭＣＦ１０Ａの形態変化は、細胞接着の喪失および細胞運動性増加を特徴とする上皮間葉移行（ＥＭＴ）（２１）に類似しているが、ＴＡＺノックダウンに起因するＭＣＦ７細胞の改変形態は、間葉上皮移行（ＭＥＴ）に関係している可能性がある。ＴＡＺは、乳房上皮細胞におけるＥＭＴ／ＭＥＴ事象を支配する調節機構の一部である可能性もあり、その調節が解除された発現は、ＥＭＴを増進して、乳がんの発現および浸潤特性を助長する。予備研究は、ＭＣＶ１０ＡおよびＭＣＦ７細胞におけるＥ−カドヘリンの発現レベルが、ＴＡＺの過発現およびノックアウトのいずれによっても有意に改変されないことを示唆し、これは、ＴＡＺが、Ｅ−カドヘリンのダウンレギュレーションによってＥＭＴを促進することが知られているＴｗｉｓｔ、マキガイ、およびナメクジによって利用されるものとは異なるメカニズム（２２）によって、ＥＭＴ／ＭＥＴを調節し得ることを示している。遺伝子転写のコアクチベーターとしてのＴＡＺに関する本発明者らの現在の知識に基づき、１つの可能性のあるＴＡＺ作用メカニズムは、細胞移動に関与する遺伝子の転写を増進する他の転写アクチベーターとの相互作用である。本発明者らの予備的マイクロアレイ分析は、細胞移動および他の細胞プロセスにことによると関与する多くの遺伝子がＴＡＺによってアップレギュレートされるので、この可能性を支持すると思われる。本発明者らは、これらの結果を評価して、細胞移動に関与するＴＡＺの真の下流ターゲットを同定する過程にある。同時に、ＴＡＺは、そのＰＤＺドメイン、ＷＷドメインまたはコイルド・コイルド（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｅｄ）ドメインにより細胞移動に関与するタンパク質と直接相互作用し得る。ＥＧＦＰタグ付ＴＡＺを発現する細胞についての本発明者らの予備的分析は、一部のＥＧＦＰ−ＴＡＺが膜波打ち部において検出され得ることを示す。これらの可能性を探求するためにさらなる研究が必要である。
【０４８１】
ＹＡＰ（ＴＡＺに高相同性のタンパク質）は、近年、染色体１１ｑ２２アンプリコン上の候補発がん遺伝子として同定されている。非形質転換乳房上皮細胞におけるヒトＹＡＰの過発現は、ＥＭＴを誘導し、アポトーシスを抑制し、ならびに成長因子非依存性増殖および軟寒天における足場非依存性成長を促進する（２３）。従って、ＹＡＰおよびＴＡＺは、類似のまたは重複する機能を共有し得る。しかし、ＹＡＰ発現レベルと乳がん細胞の浸潤性との明らかな相関関係は観察されず、これに対してＴＡＺの発現は、より浸潤性の高い乳がん細胞株において大きく増加される（図１）。ＹＡＰの発現がＴＡＺのｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンによる影響を受けないという観察に関連して、ＴＡＺおよびＹＡＰは、独立して調節されると思われる。幾つかの他の研究は、ＹＡＰが、細胞死経路の適切な執行のために核内の腫瘍抑制因子ｐ７３と相互作用してそれを安定させることによる、腫瘍抑制特性を有し得ることを示唆している（２４）。これらの問題についての完全な理解を得るために、より多くの将来的研究が必要である。
【０４８２】
ＴＡＺが乳がんおよびがん細胞株において過発現されるという発見、ならびに細胞移動、浸潤および腫瘍形成におけるその重要な役割は、有意なことである。第一に、それは、乳がん（特にＩＤＣ）のための新規バイオマーカーとしての役割を果たす可能性があり、本発明者らの発見は、罹患率、臨床的転帰、および様々な治療に対する応答に関しての多数の乳がんにおけるＴＡＺ発現の包括的調査が是認されることを示唆している。第二に、本発明者らの発見は、乳がん細胞移動、浸潤および腫瘍形成におけるその役割ならびに乳がんの発現、進行および転移に関与する他のタンパク質とのその相互作用を支配する分子メカニズムに対するさらなる見識を示すことを目的とする将来の研究の新規で強固な基礎を築いた。さらに、ＴＡＺは、その発現が浸潤性乳がん細胞において優先的に増加され、およびそのレベルが浸潤性と相関するので、乳がんを治療するための新規ターゲットをもたらす可能性がある。ＴＡＺは、マウスの発育および繁殖力にとって明らかに必須ではないが乳がん細胞の腫瘍形成において重要な役割を果たすので、乳がん療法のための選択的だが有効なターゲットになる可能性がある。
【０４８３】
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Ｋａｎａｉ，Ｆ．；Ｍａｒｉｇｎａｎｉ，Ｐ．Ａ．；Ｓａｒｂａｓｓｏｖａ，Ｄ．；Ｙａｇｉ，Ｒ．；Ｈａｌｌ，Ｒ．Ａ．；Ｄｏｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．；Ｈｉｓａｍｉｎａｔｏ，Ａ．；Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔ．；Ｉｔｏ，Ｙ．；Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ；Ｙａｆｆｅ，Ｍ．Ｂ．：ＴＡＺ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  １４−３−３  ａｎｄ  ＰＤＺ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：６７７８−６７９１，２０００．ＰｕｂＭｅｄ  ＩＤ：１１１１８２１３
Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｍ．；Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．；Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．；Ｎａｋａｇａｗａ，Ｏ．：Ａ  ＷＷ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴＡＺ  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｏｒ  ＴＢＸ５，ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｉｎ  ＨｏＩｔ−Ｏｒａｍ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０２：１８０３４−１８０３９，２００５．ＰｕｂＭｅｄ  ＩＤ：１６３３２９６０
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【０４８４】
本明細書において言及したそれぞれの出願および特許それぞれ、ならびにそれらの出願および特許それぞれについての手続き追行中のものを含めて上述の出願および特許それぞれの中で引用または参照されているそれぞれの文献（「出願引用文献」）ならびに該出願および特許それぞれの中でならびに該出願引用文献のいずれかの中で引用または言及されている任意の製品についての任意の製造業者の説示またはカタログは、参照により本明細書に援用されている。さらに、本文の中で引用したすべての文献、および本文の中で引用した文献の中で引用または参照されているすべての文献、および本文の中で引用または言及した任意の製品についての任意の製造業者の説示またはカタログは、参照により本明細書に援用されている。
【０４８５】
本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本発明の記載した方法およびシステムの様々な変形および異形が、当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求の範囲に記載する本発明が、そのような特定の実施形態に必要以上に限定されるはずがないことは、理解されるはずである。実際、分子生物学または関連分野における技術者に明らかである本発明の記載した実施方式の様々な変形は、本特許請求の範囲の範囲内であると解釈する。
【図１Ａ】
2011501741.tif 000004
【図１Ｂ】
2011501741.tif 000005
【図２Ａ】
2011501741.tif 000006
【図２Ｂ】
2011501741.tif 000007
【図２Ｃ】
2011501741.tif 000008
【図３Ａ】
2011501741.tif 000009
【図３Ｂ】
2011501741.tif 000010
【図３Ｃ】
2011501741.tif 000011
【図３Ｄ】
2011501741.tif 000012
【図４Ａ】
2011501741.tif 000013
【図４Ｂ】
2011501741.tif 000014
【図４Ｃ】
2011501741.tif 000015
【図５Ａ】
2011501741.tif 000016
【図５Ｂ】
2011501741.tif 000017
【図６Ａ】
2011501741.tif 000018
【図６Ｂ】
2011501741.tif 000019
【図７Ａ】
2011501741.tif 000020
【図７Ｂ】
2011501741.tif 000021
【図７Ｃ】
2011501741.tif 000022
【図８Ａ】
2011501741.tif 000023
【図８Ｂ】
2011501741.tif 000024
【図９】
2011501741.tif 000025
【図１０】
2011501741.tif 000026
【図１１】
2011501741.tif 000027
【図１２】
2011501741.tif 000028
【図１２Ａ】
2011501741.tif 000029
【図１２Ｂ】
2011501741.tif 000030
【図１２Ｃ】
2011501741.tif 000031
【図１２Ｄ】
2011501741.tif 000032
【図１２Ｅ】
2011501741.tif 000033
【図１２Ｆ】
2011501741.tif 000034
【図１２Ｇ】
2011501741.tif 000035
【図１２Ｈ】
2011501741.tif 000036
【図１２Ｉ】
2011501741.tif 000037
【図１２Ｊ】
2011501741.tif 000038
【図１２Ｋ】
2011501741.tif 000039
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月28日(2009.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５６２８７として示されるＴＡＺ配列もしくは前記配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の発現、量または活性の任意の組み合わせをダウンレギュレートすることができる薬剤の、がんの治療、予防または緩和のための医薬の製造における使用。
【請求項２】
前記がんが、浸潤または転移がん、例えば、浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）などの乳がんを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
（ａ）前記薬剤が、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む、例えば、ｓｈＲＮＡ１（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＧＡＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＣ−３’）、ｓｈＲＮＡ６５０（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’）もしくはｓｈＲＮＡ６５２（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’）を含むようなＲＮＡ干渉によってＴＡＺをダウンレギュレートする、または、
（ｂ）前記薬剤が、ＴＡＺのアミノ酸１６０−２２９に対するウサギ抗ＴＡＺ抗体、ウサギ抗ＴＡＺ抗体（カタログ番号２１４９Ｓ、米国、マサチューセッツ州、ダンヴァーズ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクローナル抗ＴＡＺ抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−５８３５９ＳＳ、米国、コロラド州、リトルトン、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、マウスモノクローナル抗ＴＡＺ［１Ｂ１０］（カタログ番号Ｈ００００６９０１−Ｍ１２、米国、コロラド州、リトルトン、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ウサギ抗ヒトＴＡＺポリクローナル抗体（カタログ番号ＬＳ−Ｂ９４、米国、ワシントン州、シアトル、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）もしくはｐ−ＴＡＺ（Ｓｅｒ８９）−Ｒ（カタログ番号ｓｃ−１７６１０−Ｒ、米国、カリフォルニア州、サンタクルーズ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）からなる群から選択される抗ＴＡＺ抗体を含む、
請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
がん細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性のアップレギュレーションを、非がん性であることがわかっている対照細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性と比較して検出するステップを含む、がん細胞の検出方法。
【請求項５】
下記：
（ａ）前記がん細胞が、乳がん、例えば、浸潤または転移がん、例えば浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）を含む；
（ｂ）前記方法が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１５４７２として示される配列またはそのような配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する核酸の少なくとも一部分を含むプローブによるようなＴＡＺ核酸の検出を含む；
（ｃ）前記方法が、請求項３の（ｂ）に記載の抗ＴＡＺ抗体によるようなＴＡＺポリペプチドの検出を含む；
（ｄ）前記方法が、ＩＧＦＢＰ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、ＦＳＴＬ１、ＦＮ１、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２ＡＸＬ、ＩＴＧＢ２、ＣＲＩＭ１およびＡｌｃａｍから成る群より選択される１つ以上のタンパク質の発現の検出をさらに含む；および
（ｅ）前記方法が、Ｅｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓ改良型Ｓｃａｒｆｆ−Ｂｌｏｏｍ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎグレード分類システム（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＧＳ））を使用することによるような組織学的グレード分類をさらに含む；
のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
下記：
（ａ）がん細胞が浸潤性もしくは侵襲性である可能性または浸潤性もしくは侵襲性になる可能性を判定する方法であって、前記細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性のアップレギュレーションを検出するステップを含む方法であって、ここで、前記細胞において検出されるＴＡＺ発現、量または活性のアップレギュレーションは、前記細胞が浸潤性もしくは侵襲性であること、または浸潤性もしくは侵襲性になることを示す；
（ｂ）がんを有する個体の生存率を予測する方法であって、前記個体の細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性のアップレギュレーションを検出するステップを含む方法であって、ここで、前記細胞において検出されるＴＡＺ発現、量または活性のアップレギュレーションは、がんを有する前記個体が、低い生存率を有する可能性が高いことを示す；
（ｃ）がんを有する個体のための療法を選択する方法であって、本請求項の（ａ）に記載された方法を行うステップと、前記がんの侵襲性に基づいて適切な療法を選択するステップとを含む方法；
（ｄ）がんを有する個体において特定の療法が成功する可能性を判定する方法であって、前記療法と本請求項の（ｃ）に記載の方法によって決定された療法とを比較するステップを含む方法；および、
（ｅ）請求項５の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の特徴をさらに含む、本請求項の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載された方法；
のいずれかを含む方法。
【請求項７】
がん細胞、浸潤がん細胞または転移がん細胞を操作する方法であって、前記細胞におけるＴＡＺの発現、量または活性をダウンレギュレートするステップを含み、前記操作の結果として、前記がん細胞が非がん性になる、または前記浸潤もしくは転移がん細胞が非浸潤性もしくは非転移性になる方法。
【請求項８】
下記：
（ａ）前記がんが、乳がん、例えば、浸潤または転移がん、例えば浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）を含む；
（ｂ）前記方法が、ＴＡＺに特異的に結合することができるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、例えば、請求項３の（ａ）に記載のｓｈＲＮＡに、前記細胞を曝露することを含む；および、
（ｃ）前記方法が、請求項３の（ｂ）に記載の抗ＴＡＺ抗体に前記細胞を曝露することを含む；
のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＫＤ−１（５’−ＧＡＴＧＡＡＴＣＣＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＣ−３’）、ＫＤ−６５０（５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’）またはＫＤ−６５２（５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’）から選択されるＴＡＺ標的部位のターゲッティングを含む、ＴＡＺの発現を調節する方法。
【請求項１０】
候補分子が、ＴＡＺ１／ＷＷＴＲまたはＴＡＺ１／ＷＷＴＲとの少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のアンタゴニストであるかどうかを判定するステップを含む、がんを治療、予防または緩和することができる分子を同定する方法であって、任意選択的に、
（ａ）前記候補分子をＴＡＺポリペプチドもしくはＴＡＺポリペプチドを発現する細胞に曝露して、前記候補分子がそのアンタゴニストであるかを判定するステップ、または、
（ｂ）候補分子を動物に投与し、前記動物が減少したＴＡＺ発現、量もしくは活性を示すかどうかを判定するステップ
を含む方法。
【請求項１１】
がんの治療、予防または緩和方法において使用するための薬剤であって、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５６２８７として示されるＴＡＺ配列もしくはその配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の発現、量または活性の任意の組み合わせをダウンレギュレートすることができる薬剤。
【請求項１２】
前記がんが、浸潤または転移がん、例えば、浸潤性乳管がん（ＩＤＣ）などの乳がんを含む、請求項１１に記載されているとおりの使用のための薬剤。
【請求項１３】
下記：
（ａ）ｓｈＲＮＡ６５０（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’）、ｓｈＲＮＡ６５２（センスオリゴヌクレオチド配列５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’）、５’−ＡＧＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’、５’−ＡＧＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡ−３’またはそれらの相補鎖を含む核酸と、
（ｂ）任意選択的に、ＹＡＰ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００６０９７）またはその配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する配列（例えばＧＳＴ−ＹＡＰ）を含むポリペプチドと組み合わせられる、ＴＡＺのアミノ酸１６０〜２２９に対するウサギ抗ＴＡＺ抗体と、
（ｃ）本請求項の（ａ）に記載された核酸を含む発現ベクター、例えばレトロウイルスベクターと、
（ｄ）本請求項の（ａ）に記載された核酸または本請求項の（ｃ）に記載の発現ベクターを含む宿主細胞と、
（ｅ）本請求項の（ｄ）に記載の宿主細胞を含む非ヒト動物と
から選択される構成要素。
【請求項１４】
浸潤性乳がんなどのがんのためのモデルとして使用するための、ＭＣＦ１０Ａ−ＴＡＺ、ＭＣＦ７−ＫＤ−１、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５０、ＭＣＦ７−ＫＤ−６５２もしくはＨｓ５７８Ｔ−ＫＤ−６５２細胞または細胞株。
【請求項１５】
個体における乳がんまたは前記個体の乳がんへの罹病性を検出するためのキットであって、前記個体におけるまたは個体から採取したサンプルにおけるＴＡＺ発現を検出するための手段であって、ＴＡＺのアミノ酸１６０〜２２９に対するウサギ抗ＴＡＺ抗体を含むＴＡＺ発現を検出するための手段は、任意選択的に、使用のための説明書とを含み、任意選択的に、乳がんの治療、予防または緩和のための治療薬、例えばタモキシフェンまたはハーセプチンをさらに含むキット。
【国際調査報告】
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