(57)【要約】  ヒトを含む一又は複数の種においてＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体の双方のＩＬ２０媒介活性化を低減しうる抗ヒトＩＬ２０モノクローナル抗体、並びに抗原結合分子、例えば、このような抗体から設計され又は誘導された抗原結合断片、抗体誘導体、及び多重特異的分子、及びそのような抗体又は他の抗原結合分子を製造する方法が記載される。そのような抗体又は他の抗原結合分子は、自己免疫又は炎症性疾病又は疾患を含む様々な疾病又は疾患を治療するために使用することができる。
2011526591.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＨ１＿０３、Ｄ３−１０、及びＪＨ６遺伝子を含むヒト遺伝子のセットから誘導される重鎖可変領域を含んでなる単離された抗ヒトＩＬ２０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
重鎖可変領域が、それぞれＫａｂａｔ残基５０−６５、９５−１０２、及び３１−３５に対応する、配列番号：８のＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と、場合によってはＣＤＲ１配列を含む、請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項３】
ＶＫＩ＿Ｌ１８及びＪＫ４遺伝子を含むヒト遺伝子のセットから誘導される軽鎖可変領域を含んでなる請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号：９の軽鎖可変配列と配列番号：６又は配列番号：７の重鎖可変配列を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項５】
ヒトＩＬ２０に結合し、
（ａ）ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のＩＬ２０−媒介活性化を低減させる；
（ｂ）ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２を組換え的に発現するＢａＦ−３細胞のＩＬ２０媒介増殖を低減させる；
（ｃ）ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２を組換え的に発現するＢａＦ−３細胞のＩＬ１９−又はＩＬ２４−媒介増殖を低減させない；
（ｄ）約１ｎＭ以下のＫＤでヒトＩＬ２０に結合する；
（ｅ）約ｐＨ７．４で水性緩衝溶液中において少なくとも約８０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する
から選択される一又は複数の性質を有するヒト抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
ヒトＩＬ２０への結合において、配列番号：９を含む軽鎖可変領域と配列番号：６又は配列番号：７を含む重鎖可変領域を有する抗体と競合する、請求項５に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項７】
成熟ヒトＩＬ２０（配列番号：１）のＨ７９−Ｈ１０３から選択される少なくとも一つの残基を含むエピトープに結合する請求項６に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項８】
エピトープがＨ７９−Ｌ９３から選択される少なくとも一つの残基を含む請求項７に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項９】
配列番号：６又は配列番号：７のＫａｂａｔ残基３１−３５、５０−６５、及び９５−１０２をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含んでなる、請求項５から８の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１０】
配列番号：９のＫａｂａｔ残基２４−３４、５０−５６及び８９−９７をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含んでなる、請求項９に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１１】
ＩｇＧ４アイソタイプである請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れか一項に記載の少なくとも約８０ｍｇ／ｍｌの抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体を含有してなる薬学的組成物。
【請求項１３】
炎症性又は自己免疫疾患の治療において使用するための請求項１から１２の何れか一項に記載の抗体、抗原結合断片、又は薬学的組成物。
【請求項１４】
関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、又はその組合せの治療において使用するための請求項１３の抗体、抗原結合断片、又は薬学的組成物。
【請求項１５】
抗ＩＬ２０抗体又は抗原結合断片を生産する方法において、請求項１から１１の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を産生する宿主細胞を適切な条件下で培養し、上記抗体及び抗原結合断片を回収することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトモノクローナル抗ＩＬ２０抗体を含むヒトインターロイキン−２０（ＩＬ２０）に対する抗体、並びにその生産方法、組成物、及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１９（ＩＬ１９）、ＩＬ２０、及びインターロイキン−２４（ＩＬ２４）はインターロイキン−１０（ＩＬ１０）サイトカインファミリーのメンバーである。３種全てのインターロイキンはＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２ヘテロ二量体レセプターに結合し、これを通してシグナル伝達する。ＩＬ２０及びＩＬ２４（ＩＬ１９はそうではない）はＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１からなるレセプター複合体のリガンドでもある（Parrish-Novak等, J Biol Chem 2002; 277: 47517-47523; Dumoutier等, J Immunol 2001;167:3545-3549）。ＩＬ１９及びＩＬ２０は、他のＩＬ１０ファミリーメンバーと共に、ヘリックスサイトカインの明確なサブファミリーを形成し、そこでは少なくともＩＬ１９及びＩＬ２０が類似の三次元構造を有していることが提案されている（Chang等, J Biol Chem 2003; 278: 3308-13）。
【０００３】
ＩＬ２０及びそのレセプターは乾癬性病巣（Wei等, Clin Immunol (2005) 117: 65-72；Romer等, J Invest Dermatol 2003; 121, 1306-1311；Wang等, J Invest Dermatol 2006; 126: 1590-1599；Otkjar等, Br J Dermatol 2005; 153: 911-918）及び関節リウマチ患者の滑液（Hsu等, Arthritis Rheum 2006; 54: 2722-2733; Kragstrup等, Cytokine 2008; 41: 16-2）に高いレベルで存在している。従って、レセプター断片又はモノクローナル抗体を使用するＩＬ２０活性の拮抗は、様々な炎症性症状の治療のための有望なアプローチ法として記載されている（例えばＷＯ９９２７１０３，ＷＯ０１４６２６１，ＷＯ２００３０５１３８４，ＷＯ２００４０８５４７５，及びＷＯ２００６０８６３９６）。例えば、ポリクローナル抗ＩＬ２０抗体は乾癬の移植片モデルにおいて治療的に効果的であることが見出されている（Stenderup等, Br J Dermatol 2006; 154: 11-35, Abstract P-12; Stenderup等 Br J Dermatol 2009;160(2):284-96）。
【０００４】
ヒトＩＬ２０（ｈＩＬ２０）、並びにｈｕＩＬ２０に結合するラット又はマウスモノクローナル抗体の抗原性エピトープがまた記載されている（例えばＷＯ２００５０５２０００，ＵＳ２００６０１４２５５０，及びＷＯ２００７０８１４６５）。しかしながら、患者の治療に適した抗体はこれまでもたらされてこなかった。本発明は従来技術におけるこれらのまた他の必要性に対処するものである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ヒトを含む一又は複数の種においてＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のＩＬ２０−媒介活性化を低減しうる抗ｈＩＬ２０モノクローナル抗体を提供する。典型的には、抗体は、患者に投与される場合に抗体に対する免疫反応のリスクを最小にするために、完全にヒトか又はヒト化される。本発明はまたそれを高濃度で製剤化することを可能にする改善された溶解性特性を有する抗ｈＩＬ２０抗体を提供する。ここに記載されるように、他の抗原結合分子、例えば抗原結合断片、抗体誘導体、及び多重特異性分子を、そのような抗体から設計し又は誘導することができる。
ＩＬ１９中のヘリックスＥに対応するｈＩＬ２０分子の特定のセグメントに結合する抗体もまた提供される。一実施態様では、抗体のエピトープは、成熟ｈＩＬ２０（配列番号：１）中における、場合によってはＤ７８を除くＤ７８−Ｌ９３に対応するセグメント中の一又は複数のアミノ酸残基、例えばＨ７９、Ｒ８３、Ｓ８５、Ｎ９０、Ｆ９２、Ｌ９３、又はその任意の組合せを含む。
【０００６】
本発明のある抗ｈＩＬ２０抗体は、また、１５Ｄ２及び５Ｂ７を含む、ここに記載された特定のヒト抗ｈＩＬ２０抗体の一又は複数と同じエピトープに競合し、及び／又は結合し、又は同じｈＩＬ２０上の結合界面を有する。例えば、一実施態様では、本発明の抗体は、既知の抗ｈＩＬ２０抗体との場合よりも１５Ｄ２及び／又は５Ｂ７とより競合可能である。
他の態様では、本発明の抗体は、１５Ｄ２又は５Ｂ７と同じヒトＶ、Ｄ、又はＪセグメントの一又は複数から誘導される抗原結合配列を含む。抗体は、例えば、ここに記載された１５Ｄ２及び／又は５Ｂ７抗原結合配列と同一又は実質的に同一である一又は複数の抗原結合配列を含みうる。
【０００７】
他の態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸、かかる核酸を含む発現ベクター、かかる核酸を含む宿主細胞、本発明の抗体を産生する宿主細胞、及びかかる宿主細胞を適切な条件下で培養することにより抗ｈＩＬ２０抗体を製造する方法を提供する。また提供されるものは、かかる抗体の抗原結合断片、及びかかる抗体又は抗原結合断片を含む分子、例えば遺伝子操作抗体断片、抗体誘導体、二重特異性抗体及び他の多重特異性分子である。かかる抗体又は分子を含む薬学的組成物及びキット又は他の物品もまた提供されうる。更に提供されるものは、そのような抗体を使用して、ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のＩＬ２０−媒介活性化を低減させ又は阻害する方法、及び限定するものではないが、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、又はその組合せを含む自己免疫又は炎症性疾病又は疾患を治療し又は予防する方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】成熟ｈＩＬ２０のアミノ酸配列（配列番号：１）（Ａ）を示す。（Ａ）では、番号を付した残基はＩＬ１９中のヘリックスＥに対応し、太字の残基は１５Ｄ２及び５Ｂ７の重要なエピトープセグメントを表す。太字と下線の残基は１５Ｄ２及び５Ｂ７の結合に最も重要なものであり、太字で二重下線の残基は１５Ｄ２及び／又は５Ｂ７の結合に対して重要であることが見出されている。
【図１Ｂ】ｈＩＬ２０の前躯体型（配列番号：２）、ヒトＩＬ１９（配列番号：３）、マウスＩＬ２０（配列番号：４）、及びカニクイザルＩＬ２０（配列番号：５）のアラインメントを示す（Ｂ）。（Ｂ）では、ｈＩＬ２０中の下線を付したセグメントはシグナル配列であり、他の標識は（Ａ）におけるものと同じである。
【図２】図２は、ｈＩＬ１９の１Ｎ１Ｆ．ｐｄｂのテンプレートからChemical Computing Group's Molecular Operating Environment （ＭＯＥ）ソフトウェアを使用して構築したｈＩＬ２０（ＩＬ１９命名を使用）のモデルを示す。１Ｎ１Ｆ．ｐｄｂにおいてｈＩＬ１９／ｈＩＬ２０配列アラインメント及びヘリックス割当を使用し、Ｃｏｒｅｌ Ｄｒａｗ（Corel Corporation）を使用して図を作成した。
【図３Ａ】１５Ｄ２重鎖可変（ＶＨ）領域（配列番号：６）（Ａ）の解析を示す。各抗体配列は対応する生殖細胞系列配列とアラインされ、各アミノ酸位置の対応するＫａｂａｔ番号付けを示している。各配列では、Ｋａｂａｔスキームによる対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）配列が太字で下線を付して示されている。ＶＨ１＿０３、Ｄ３−１０、及びＪＨ６は配列番号：１０、１２及び１４を含む配列にそれぞれ対応し、ＶＫＩ＿Ｌ１８／ＪＫ４は配列番号：１５及び１７を含む配列にそれぞれ対応する。Ｄ３−１０、ＪＨ６、及びＪＫ４のコード配列はぞれぞれ配列番号：１１、１３、及び１６に提供される。
【図３Ｂ】５Ｂ７ＶＨ領域（配列番号：７）の解析を示す。各抗体配列は対応する生殖細胞系列配列とアラインされ、各アミノ酸位置の対応するＫａｂａｔ番号付けを示している。各配列では、Ｋａｂａｔスキームによる対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）配列が太字で下線を付して示されている。ＶＨ１＿０３、Ｄ３−１０、及びＪＨ６は配列番号：１０、１２及び１４を含む配列にそれぞれ対応し、ＶＫＩ＿Ｌ１８／ＪＫ４は配列番号：１５及び１７を含む配列にそれぞれ対応する。Ｄ３−１０、ＪＨ６、及びＪＫ４のコード配列はぞれぞれ配列番号：１１、１３、及び１６に提供される。
【図３Ｃ】１５Ｄ２／５Ｂ７軽鎖可変（ＶＬ）領域（配列番号：９）（Ｃ）の解析を示す。各抗体配列は対応する生殖細胞系列配列とアラインされ、各アミノ酸位置の対応するＫａｂａｔ番号付けを示している。各配列では、Ｋａｂａｔスキームによる対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）配列が太字で下線を付して示されている。ＶＨ１＿０３、Ｄ３−１０、及びＪＨ６は配列番号：１０、１２及び１４を含む配列にそれぞれ対応し、ＶＫＩ＿Ｌ１８／ＪＫ４は配列番号：１５及び１７を含む配列にそれぞれ対応する。Ｄ３−１０、ＪＨ６、及びＪＫ４のコード配列はぞれぞれ配列番号：１１、１３、及び１６に提供される。
【図３Ｄ】コンセンサス配列（配列番号：８）に沿った１５Ｄ２及び５Ｂ７ ＶＨ領域のアラインメント（Ｄ）の解析を示す。各抗体配列は対応する生殖細胞系列配列とアラインされ、各アミノ酸位置の対応するＫａｂａｔ番号付けを示している。各配列では、Ｋａｂａｔスキームによる対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）配列が太字で下線を付して示されている。ＶＨ１＿０３、Ｄ３−１０、及びＪＨ６は配列番号：１０、１２及び１４を含む配列にそれぞれ対応し、ＶＫＩ＿Ｌ１８／ＪＫ４は配列番号：１５及び１７を含む配列にそれぞれ対応する。Ｄ３−１０、ＪＨ６、及びＪＫ４のコード配列はぞれぞれ配列番号：１１、１３、及び１６に提供される。
【図４Ａ】各アミノ酸位置の対応するＫａｂａｔ番号付けでのＩｇＧ４アイソタイプの幾つかのヒト抗ＩＬ２０抗体のＶＨ（Ａ）領域配列のアラインメントを示す。各配列において、Ｋａｂａｔスキームによる対応するＣＤＲ配列は太字下線で示す。（Ａ）２Ｆ６（配列番号：１８）、Ｃ３（配列番号：２０）、Ｆ１８（配列番号：２２）、Ｆ５６及びＦ５６／Ｆ１８（配列番号：２３）、５Ｂ７（配列番号：７）、及び１５Ｄ２（配列番号：６）に対する重鎖可変配列。
【図４Ｂ】各アミノ酸位置の対応するＫａｂａｔ番号付けでのＩｇＧ４アイソタイプの幾つかのヒト抗ＩＬ２０抗体のＶＬ（Ｂ）領域配列のアラインメントを示す。各配列において、Ｋａｂａｔスキームによる対応するＣＤＲ配列は太字下線で示す。（Ｂ）２Ｆ６（配列番号：１９）、Ｃ３（配列番号：２１）、Ｆ５６＿タイプ１、１５Ｄ２、及び５Ｂ７（配列番号：９）、及びＦ５６＿タイプ２（配列番号：２４）に対する軽鎖可変配列。
【図５Ａ】３通りの異なったサイトカイン濃度でｈＩＬ２０Ｒ１／ｈＩＬ２０Ｒ２が形質移入されたＢａＦ−３細胞のｈＩＬ２０−（Ａ）誘発性増殖を阻害する１５Ｄ２の能力を示す。（Ａ）用量依存的応答を、ｈＩＬ２０−誘発増殖の阻害について検出した。
【図５Ｂ】３通りの異なったサイトカイン濃度でｈＩＬ２０Ｒ１／ｈＩＬ２０Ｒ２が形質移入されたＢａＦ−３細胞のｈＩＬ１９−（Ｂ）誘発性増殖を阻害する１５Ｄ２の能力を示す。ｈＩＬ１９−（Ｂ）誘発増殖の阻害は、使用した１５Ｄ２−濃度範囲（６６ｎＭまで）では観察されなかった。
【図５Ｃ】３通りの異なったサイトカイン濃度でｈＩＬ２０Ｒ１／ｈＩＬ２０Ｒ２が形質移入されたＢａＦ−３細胞のｈＩＬ２４−（Ｃ）誘発性増殖を阻害する１５Ｄ２の能力を示す。ｈＩＬ２４−（Ｃ）誘発増殖の阻害は、使用した１５Ｄ２−濃度範囲（６６ｎＭまで）では観察されなかった。
【図６Ａ】１５Ｄ２（Ａ）に対するｈＩＬ２０の一次ペプチドアレイの結果を示す。Ｙ軸は光学密度（ＯＤ，蛍光強度の測定値）を示す。幾つかのＯＤ値は検出限界以下であったので、必ずしも全てのペプチドが図に存在しているものではないことに留意のこと。（Ａ）では、配列番号：１の残基６９−８６（８５）、７３−９０（８６）、７７−９４（８７）、８１−９８（８８）、及び８５−１０２（８９）に対応するペプチドが示されている。ペプチド８７が最も高い結合活性を持つペプチドであるという結果になった。
【図６Ｂ】５Ｂ７（Ｂ）に対するｈＩＬ２０の一次ペプチドアレイの結果を示す。Ｙ軸は光学密度（ＯＤ，蛍光強度の測定値）を示す。幾つかのＯＤ値は検出限界以下であったので、必ずしも全てのペプチドが図に存在しているものではないことに留意のこと。（Ｂ）では、残基４９−６６（１９）、５３−７０（２０）、５７−７４（２１）、６９−８６（２４）、７３−９０（２５）、及び７７−９４（２６）に対応するペプチドが示されている。
【図７Ａ】１５Ｄ２（Ａ）に対する二次ペプチドアレイ解析を示す。抗体を、Ｃ及びＮ末端からのトランケ−ションを持つコンストラクトに対して試験した。Ｎ末端から生じる正の電荷を避けるためにペプチドを全てアシル化した。（Ａ）では、配列番号：１のＹ７４からＫ９６→Ｓ８６及びＫ８４に対応するペプチド（それぞれペプチド１−１２）が左の欄に示され、配列番号：１のＱ７５→Ｉ８５からＫ９６に対応するペプチド（それぞれペプチド１３−２４で、ここでペプチド２２及び２３は同一である）が右欄に示されている。
【図７Ｂ】５Ｂ７（Ｂ）に対する二次ペプチドアレイ解析を示す。抗体を、Ｃ及びＮ末端からのトランケ−ションを持つコンストラクトに対して試験した。Ｎ末端から生じる正の電荷を避けるためにペプチドを全てアシル化した。（Ｂ）では、配列番号：１のＹ７４からＫ９６→Ｓ８６及びＫ８４に対応するペプチド（それぞれペプチド１−１２）が左欄に示され、Ｑ７５→Ｓ８４からＫ９６に対応するペプチド（それぞれペプチド１３−２４で、ペプチド２２及び２３が同一）が右欄に示されている。
【図８Ａ】（Ａ）１５Ｄ２に対する、配列番号：１の残基Ｙ７４からＫ９６に対応する長いエピトープＹＱＴＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴＩＫのＡｌａスキャンを示す。（Ａ）では、示されたペプチドは配列番号：１の残基７８−９６に対応し、それぞれアラニン置換７８−９６位、ペプチド４０−６１である。
【図８Ｂ】（Ｂ）５Ｂ７に対する、配列番号：１の残基Ｙ７４からＫ９６に対応する長いエピトープＹＱＴＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴＩＫのＡｌａスキャンを示す。（Ｂ）では、示されたペプチドは配列番号：１の残基７８−９６に対応し、それぞれアラニン置換７８−９６位、ペプチド１−２２である。
【図９】図９は、ルシフェラーゼアッセイにより明らかにされているマウスＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプターのマウスＩＬ２０活性化の１５Ｄ２中和を示す。マウスＩＬ２０レセプター複合体ｍＩＬ２０Ｒ１／ｍＩＬ２２Ｒ１をＢＨＫ細胞に形質移入し、１０ｎＭのマウスＩＬ２０で刺激した。刺激の中和を、１マイクログラム／ｍｌ、１０マイクログラム／ｍｌ又は５０マイクログラム／ｍｌの１５Ｄ２を使用して調査した。
【図１０Ａ】ルシフェラーゼアッセイによって明らかにされているヒトＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター（Ａ）のカニクイザルＩＬ２０活性化の１５Ｄ２中和を示す。
【図１０Ｂ】ルシフェラーゼアッセイによって明らかにされているカニクイザルＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２（Ｂ）のカニクイザルＩＬ２０活性化の１５Ｄ２中和を示す。
【図１１】図１１は、ルシフェラーゼアッセイによって明らかにされているヒトＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２のヒトＩＬ２０−媒介活性化の１５Ｄ２中和を示す。
【図１２】図１２は、ＩＬ１９がＩＬ２０−誘発増殖の１５Ｄ２ブロッキングを復帰させたことを示しており、これは、１５Ｄ２がＩＬ２０の可溶型に結合するがレセプター結合型には結合せず、レセプターに対するＩＬ１９の接近をブロック等することを明らかにしている。
【図１３】図１３は、１５Ｄ２結合界面を決定するためのアミド水素／重水素交換（ＨＸ）−質量分析（ＭＳ）実験において使用されるｈＩＬ２０の一次配列を示している。一次ｈＩＬ２０配列（成熟Ｍｅｔ−１番号付けを使用しており、よって、配列番号：１の対応残基とは＋１異なる）は、ＨＸ解析ペプチド上に示されている（水平なバーとして示している）。１５Ｄ２の存在下及び不在下の双方で類似した交換パターンを示すペプチドは灰色のバーで示す一方、１５Ｄ２結合時に減少した重水素取り込みを示すペプチドは黒いバーで示している。
【図１４】図１４は、ＨＸ−ＭＳ研究においての個々のペプチドからの重水素標識のサブ局在化を示している。（Ａ）ＩＬ２０一次構造の領域６０−９３の拡大図。１５Ｄ２の存在及び不存在下の双方において類似の交換パターンを示すペプチドを灰色で着色する一方、１５Ｄ２結合時に減少した重水素取り込みを示すペプチドを黒で着色している。数は、１５Ｄ２結合時に個々のＩＬ２０領域で観察された重水素レベルの差を示す。（Ｂ）ペプチドからの情報は、Ｎ末端及び第一ペプチド結合アミドの完全なオフエクスチェンジを仮定して簡単な減算によって小さい残基伸展にサブ局在化されている。ついで、重水素レベルを９１％の重水素を含むだけの標識化反応に対して修正し、全残基の割合として報告した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
他に定義されていないか又は内容的に矛盾しない限り、「ＩＬ２０」又は「ＩＬ−２０」なる用語は、Ｚｃｙｔｏ１０としても知られているヒトインターロイキン−２０（ｈＩＬ２０）を意味し、その未加工の前駆体（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＮＹＹ１；配列番号：２）、成熟型（配列番号：１，ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＮＹＹ１で残基１−２４のシグナル配列を含まないもの）、及び／又は天然に生じる変異体又はそのオルソログ、例えばマウスＩＬ２０（ｍＩＬ２０）前駆体（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＪＫＶ９；配列番号：４）、又はカニクイザルＩＬ２０（ｃＩＬ２０）前駆体（配列番号：５）、又は前駆体ｈＩＬ２０の残基１−２４に対応するシグナル配列を欠くその成熟型（配列番号：２）を含む。
【００１０】
ここでの「抗体」なる用語は、最も広義に使用され、特に、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び別の定義がないか又は内容が矛盾しない限り、抗原結合断片、抗体変異体、及び所望の特異性及び／又は生物学的活性を示す限り、その多重特異性分子を含む。一般に、完全長抗体は、ジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、又はその抗原結合部分を含む糖タンパク質である。各重鎖は重鎖可変領域（ここではＶＨと略記）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（ここではＶＬと略記）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域はＣＬという一つのドメインからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存されている領域が散在した相補性決定領域（ここではＣＤＲと略記）と呼ばれる高頻度可変性の領域に更に再分化される。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の生産に関する様々な技術は、例えばHarlow及びLane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)に提供されている。
【００１１】
抗体の「抗原結合断片」は、抗原に検出可能に結合しうる完全長抗体の一部を含む分子である。抗原結合断片は、抗体の一、二、三以上の抗原結合部分を含む多価分子、及びＶＬ及びＶＨ領域、又はその選択された部分が合成リンカーによって又は組換え法によって結合されて機能性抗原結合分子を形成する単鎖コンストラクトを含む。
「抗体誘導体」及び「免疫コンジュゲート」なる用語は、完全長抗体又は、例えば抗体を第二分子に結合させるために一又は複数のアミノ酸が例えばアルキル化、ペグ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などによって化学的に修飾されているその抗原結合断片を含む分子を意味するようにここでは交換可能に使用される。例示的な修飾は、ペグ化、システイン−ペグ化、ビオチン標識、放射標識、及び細胞傷害剤のような第二の薬剤とのコンジュゲーションを含む。
【００１２】
「多重特異性分子」は、少なくとも二つの異なった結合部位又は標的分子に結合する分子を産生するために少なくとも一つの他の機能的分子（例えば、他のペプチド又はタンパク質、例えば他の抗体又はレセプターのリガンド）に関連し又は結合する抗体、又はその抗原結合断片を含む。例示的な多重特異性分子は、二重特異的抗体及びレセプター断片又はリガンドに結合した抗体を含む。
ここで使用される「ヒト抗体」なる用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から誘導されている可変領域を有する抗体を含むものである。更に、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もまたヒト免疫グロブリン配列から誘導される。ヒト生殖細胞系列配列の収集物は、例えばＮＣＢＩウェブサイトで入手できる。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含みうる（例えばインビトロでのランダム又は部位特異的変異誘発により又はインビボでの体細胞変異により導入される変異）。しかしながら、ここで使用される「ヒト抗体」なる用語は、例えばマウスのような他の哺乳動物種の生殖細胞系列から誘導されたＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むことは意図しない。
【００１３】
「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むヒト／非ヒトのキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又は実質的に全てのＦＲ残基がヒト免疫グロブリン配列の残基である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた場合によっては免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。更なる詳細については、例えばJones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、国際公開第９２／０２１９０号、米国特許出願公開第２００６００７３１３７号、及び米国特許第６７５０３２５号、同第６６３２９２７号、同第６６３９０５５号、同第６５４８６４０号、同第６４０７２１３号、同第６１８０３７０号、同第６０５４２９７号、同第５９２９２１２号、同第５８９５２０５号、同第５８８６１５２号、同第５８７７２９３号、同第５８６９６１９号、同第５８２１３３７号、同第５８２１１２３号、同第５７７０１９６号、同第５７７７０８５号、同第５７６６８８６号、同第５７１４３５０号、同第５６９３７６２号、同第５６９３７６１号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号及び同第５２２５５３９号を参照のこと。
【００１４】
ここで用いられる場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；（Kabat等 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）及び／又は「高度可変ループ」の残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 1987; 196:901-917)及び／又は抗体抗原相互作用において最も重要である残基である特異性決定残基（ＳＤＲｓ）（Kashmiri等, Methods 2005;36:25-34）を含んでなる。ＳＤＲｓは、例えば抗体抗原相互作用の３Ｄ構造解析を使用して、又は既知の技術を使用する変異解析によって決定されうる。典型的には、この領域でのアミノ酸残基の番号付けは、上掲のKabat等に記載の方法によって実施される。ここでの「カバット位置」、「カバットに記載の可変ドメイン残基番号付け」及び「カバットによる」などの語句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインのためのこの番号付けシステムを指す。カバット番号付けシステムを用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に応じてアミノ酸が減っていても又は増えていてもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入(カバットによる残基５２ａ)を含んでいてもよいし、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)を含んでいてもよい。残基のカバット番号付けは、抗体の配列の相同性領域に「標準の」カバット番号付けした配列と整列させて所定の抗体について決定してもよい（図３及び４を参照）。
【００１５】
ポリペプチドの「変異体」は、参照ポリペプチド、典型的には天然又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、天然のアミノ酸配列内の特定の位置に一又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよいが、少なくとも一つの点で親ペプチドとは異なる。
抗体の「エピトープ」又は「抗原決定基」なる用語は、抗体が結合する予め定まった抗原の部分であり、通常はアミノ酸又は糖鎖の化学的に活性な表面グループ分けからなる。タンパク質エピトープを定める特定のアミノ酸は相対的に数が少ない場合があり、典型的には抗体への結合に直接関与するアミノ酸を含むが、但し、抗体への結合に直接には関与しない他のアミノ酸はそれでもなお抗体が結合するときにブロックされうる。タンパク質エピトープ中のアミノ酸は互いに接近しているか、又は抗原の長さに沿って広く分散しており、折り畳みによって正しいエピトープ立体構造にされうる。「立体構造エピトープ」は正しく折り畳まれている予め定まった抗原に依存するエピトープを意味する一方、「直線状エピトープ」はまた例えば変性形態又はエピトープを含む断片の形態に正しく折り畳まれていない場合に抗体によって認識されうる。
【００１６】
ここで使用される「特異的結合」は、例えばＩＬ２０のように、予め定まった抗原に結合する抗体の能力を意味する。典型的には、抗体は、１０−８以下の解離定数（Ｋｄ）をもって結合し、予め定まった抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ）又は密接に関連した分子（例えばオルソログ）に結合するそのＫｄよりも少なくとも２倍少ないＫｄで予め定まった抗原に結合する。
２つのアミノ酸配列の関係において「実質的に同一」なる用語は、例えば初期設定のギャップ加重を用いたプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴ−ＦＩＴによって、最適に整列させられた場合に、配列が少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約９８又は少なくとも約９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。
２つの実質的に同一のアミノ酸配列における「対応する」アミノ酸位置は、典型的には初期設定パラメーターを用いたここで言及したタンパク質分析ソフトウェアの何れかによって整列されるものである。
【００１７】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関係に配されている場合、「作用可能に連結」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関わっているプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのＤＮＡと作用可能に結合しており；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合はコード化配列と作用可能に連結しており；あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように位置されている場合はコード配列と作用可能に連結している。一般に、「作用可能に連結」とは、連結しているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合は連続して読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は都合のよい制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、常套的な慣行に従って使用される。
【００１８】
「単離された」分子は、それが属する分子のクラスに関して見出される組成物中の主な種である分子である（すなわち、それは、組成物中の分子のタイプの少なくとも約５０％を占め、典型的には組成物中の分子、例えばペプチドの種の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれ以上を占める）。通常は、抗体分子の組成物は、組成物中の全ての存在するペプチド種の関係において、又は少なくとも提案された用途の関係において実質的に活性なペプチド種に対して、抗体分子の９８％、９８％又は９９％の均一性を示すであろう。
【００１９】
本発明の前後関係において、前後関係によって否定されない限り、「処置」又は「処置する」は、疾患又は疾病の一又は複数の症状又は臨床的に関連する徴候を予防するか、緩和するか、管理するか、治癒するか、又は低減することを指す。例えば、症状又は疾患ないし疾病の臨床的に関連する兆候が同定されていない患者の「処置」は予防又は防止的な治療であるのに対して、症状又は疾患ないし疾病の臨床的に関連する兆候が同定されている患者の「処置」は一般的に予防又は防止的な治療を成さない。
明示的に別の定義がなされるか又は文脈から明らかに矛盾することがない限り、ここでの「又は」なる用語は「及び／又は」の意味で使用される。
【００２０】
レセプター又はレセプター複合体の「活性化」は、コントロールと比較した、正常な生理学的又は病態生理学的条件下でのレセプター又はレセプター複合体へのリガンド結合後のレセプター又はレセプター複合体に関連する任意の又は全ての細胞内シグナル伝達エレメントの増加した又は減少した活性を意味する。IL20R1/IL20R2 及びIL22R1/IL20R2レセプター複合体の場合、レセプター活性化は、例えば実施例９に記載されたものと同様のルシフェラーゼアッセイを使用して分析することができる。レセプター又はレセプター複合体の「活性化の低減」は、レセプターの活性化が、コントロール（例えば抗体のない場合の活性化のレベル）と比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、最も好ましくは少なくとも約５０％又はそれ以上、低減されることを意味する。
【００２１】
ここに記載の抗体又は他の抗原結合分子を評価するための幾つかのアッセイは、一又は複数の「コントロール」を用いる。「コントロール」は、教科書から取り出された標準値；リガンド(例えばIL20)、レセプター (例えばIL20R1/IL20R2及び／又はIL22R1/IL20R2)、又は抗体の不在下で；又は非特異的分子（例えば非特異的抗体）の存在下で、同アッセイを実施して得られる値；又は従来から使用されている幾つかの他の参照値でありうる。例えばレセプターの活性化を低減する抗体の能力を試験するレセプター活性化アッセイの場合、適切なコントロール値は、抗体の不存在下で、又はリガンド、レセプター複合体、又はレセプター活性化に関与する他の成分に特異的に結合しない抗体の存在下でアッセイを実施して得ることができる。
【００２２】
発明の説明
本発明は、薬学的製剤、診断用途、及び治療用途に適したヒト抗ＩＬ２０抗体を提供する。実施例に記載されるように、新規なエピトープは２つのヒト抗ＩＬ２０抗体に対して１５Ｄ２及び５Ｂ７と命名された。ｈＩＬ１９中のヘリックスＥに対応するｈＩＬ２０の領域に対して重要なエピトープ残基をマッピングした（Chang等, J Biol Chem 2003; 278: 3308-13）。ｈＩＬ１９命名法を使用するｈＩＬ２０の予想モデルは図１に示され、ヘリックスＥは成熟ｈＩＬ２０配列中の残基Ｄ７８からＨ１０３に対応する（配列番号：１）。新規なｈＩＬ２０エピトープに結合する抗体は、ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプターの双方のｈＩＬ２０−媒介活性化を低減させ、また増殖アッセイにおいて、ＩＬ２０媒介レセプター活性を低減させたが、ＩＬ１９−又はＩＬ２４媒介レセプター活性化を低減させなかったことが見出された。エピトープは、ｈＩＬ２０抗原の天然及び変性形態の双方と、並びにマウス及びカニクイザルＩＬ２０の双方に存在していることが更に見出された。１５Ｄ２及び５Ｂ７の双方がまた少なくとも約８０ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶性であり、ヒト生殖細胞系列遺伝子の同じセットから誘導されていることが見出された（実施例３及び図３）。
【００２３】
よって、本発明は、一又は複数の機能的性質、一又は複数の構造的性質を組み合わせる抗体、及び／又は以下のセクション及び実施例に記載された一又は複数の構造的性質と一又は複数の機能を組み合わせる抗体を提供する。
一態様では、本発明は、ｈＩＬ２０と、場合によっては一又は複数のｈＩＬ２０オルソログに特異的に結合し、ｈＩＬ２０Ｒ１／ｈＩＬ２０Ｒ２及びｈＩＬ２２Ｒ１／ｈＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体双方及び／又はそのオルソログのｈＩＬ２０媒介活性化を特異的に低減させ、及び／又は高い溶解性を有している抗体、例えばモノクローナルヒト又はヒト化抗体、又はその抗原結合断片を提供する。一実施態様では、抗体の重鎖又は軽鎖可変領域配列は、１５Ｄ２及び５Ｂ７生殖細胞系列及び／又はＶ、Ｄ、又はＪセグメントの一又は複数から誘導される。一実施態様では、本発明の抗体のＣＤＲ及び／又は可変配列は、１５Ｄ２及び／又は５Ｂ７の抗原結合配列の一又は複数に実質的に同一である。一実施態様では、抗体は、ｈＩＬ２０配列（配列番号：１）中のセグメントＨ７９からＨ１０３中の一又は複数の残基と相互作用し、例えばＨ７９、Ｒ８３、Ｓ８５、Ｎ９０、Ｆ９１、Ｌ９２、又はその組合せに結合しうる。抗体は治療的応用に適した任意の形態、例えば完全長抗体又はその断片でありうる。
【００２４】
一態様では、本発明は、ＶＨ１＿０３、Ｄ３−１０、及びＪＨ６遺伝子を含むヒト遺伝子のセットから誘導される重鎖可変領域を含む単離された抗ｈＩＬ２０抗体、又はその抗原結合断片を提供する。一実施態様では、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ残基５０−６５、９５−１０２、及び３１−３５にそれぞれ対応する配列番号：８のＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、及び場合によってはＣＤＲ１配列を含む。一実施態様では、軽鎖可変領域は、ＶＫＩ＿Ｌ１８及びＪＫ４遺伝子を含むヒト遺伝子のセットから誘導される配列を含む。特定の実施態様では、軽鎖可変領域は、配列番号：９の配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号：６又は配列番号：７の配列を含む。他の特定の実施態様では、抗体はＩｇＧ４アイソタイプである。
【００２５】
一態様では、本発明は、ｈＩＬ２０に結合し、（ａ）ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のＩＬ２０−媒介活性化を低減させ；（ｂ）ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２を組換え的に発現するＢａＦ−３細胞のＩＬ２０−媒介増殖を低減させ；（ｃ）ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２を組換え的に発現するＢａＦ−３細胞のＩＬ１９−又はＩＬ２４−媒介増殖を低減させず；（ｄ）約１ｎＭ以下のＫＤでｈＩＬ２０に結合し；及び（ｅ）場合によっては１５０ｍＭのＮａＣｌを含む約ｐＨ７．４の緩衝水溶液中に少なくとも約８０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する、から選択される一又は複数の機能的性質を有するヒト抗体、又はその抗原結合断片を提供する。一実施態様では、抗体は性質（ａ）から（ｄ）を有する。一実施態様では、抗体は性質（ａ）から（ｅ）の全てを有する。一実施態様では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号：９を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６又は配列番号：７を有する重鎖可変領域を含んでなる抗体とｈＩＬ２０への結合において競合する。一実施態様では、抗体又は抗原結合断片は、成熟ｈＩＬ２０（配列番号：１）のＨ７９−Ｈ１０３から選択される少なくとも一つの残基を含むエピトープに結合する。一実施態様では、エピトープは、Ｈ７９−Ｌ９３から選択される少なくとも一つの残基を含む。一実施態様では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号：６又は配列番号：７のＫａｂａｔ残基の残基３１−３５、５０−６５、及び９５−１０２をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号：９のＫａｂａｔ残基２４−３４、５０−５６及び８９−９７をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を更に含む。一実施態様では、抗体重鎖及び軽鎖可変配列は、１５Ｄ２及び／又は５Ｂ７の各重鎖及び軽鎖可変配列と実質的に同一であり、例えば少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有している。特定の実施態様では、抗体はＩｇＧ４アイソタイプである。
【００２６】
一態様では、本発明は、薬学的組成物において使用するために十分に可溶性であるようなヒト抗ｈＩＬ２０抗体を提供する。一実施態様では、本発明は、有効量、例えば少なくとも約８０ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌの濃度の本発明の抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体を含有する薬学的組成物を提供する。一実施態様では、抗体はＩｇＧ４アイソタイプであり、ＶＨ１＿０３、Ｄ３−１０、及びＪＨ６遺伝子を含むヒト遺伝子のセットから誘導される重鎖可変領域及び／又はＶＫＩ＿Ｌ１８及びＪＫ４遺伝子を含むヒト遺伝子のセットから誘導される配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の一実施態様では、軽鎖可変領域は配列番号：９の配列を含み、重鎖可変領域は配列番号：６の配列を含む。特定の一実施態様では、軽鎖可変領域は配列番号：９の配列を含み、重鎖可変領域は配列番号：７の配列を含む。
【００２７】
一態様では、本発明は、医薬として使用される本発明の抗体, 抗原結合断片、又は薬学的組成物を提供する。
一態様では、本発明は、炎症性又は自己免疫疾患の治療に使用される本発明の抗体, 抗原結合断片、又は薬学的組成物を提供する。
一態様では、本発明は、炎症性又は自己免疫疾患の治療のための医薬の調製における本発明の抗体, 抗原結合断片、又は薬学的組成物の使用を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の抗体, 抗原結合断片、又は薬学的組成物を投与することにより、炎症性又は自己免疫疾患に罹っているか又はそのリスクがある患者を治療する方法を提供する。
【００２８】
このような使用に適した炎症性又は自己面免疫疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、又はループス腎炎、又はその任意のものの組合わせ、並びにこれらの疾患に関連する併存疾患を含み、循環器疾患は該併存疾患の非限定的な例である。
一態様では、本発明は、本発明の抗体又は抗原結合断片を産生する宿主細胞を適した条件下で培養し抗体又は抗原結合断片を回収することを含む、抗ＩＬ２０抗体又は抗原結合断片を組換え的に生産する方法を提供する。宿主細胞は、典型的には、本発明の抗体又は抗原結合断片の重鎖及び／又は軽鎖配列をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。
【００２９】
ｈＩＬ２０に特異的に結合し、及びこれらの性質の幾つか又は全てを有する抗体、抗原結合断片、又は他の分子の生産、特徴付け、及び使用を、以下のセクションで更に詳細に記載する。
【００３０】
抗ＩＬ２０抗体
本発明の抗体は、抗体の特定の機能的及び／又は構造的特徴又は性質により特徴付けられる。抗ＩＬ２０抗体の機能的活性を評価するためのアッセイは、別個のセクション及び実施例に詳細に説明され、構造的性質、例えばアミノ酸配列は以下に記載される。
【００３１】
機能的性質
本発明の抗体は、ｈＩＬ２０に特異的に結合する。抗体は好ましくはｈＩＬ２０に高親和性で、例えば１０−７Ｍ以下のＫＤ、１０−８Ｍ以下のＫＤ、１ｎＭ以下のＫＤ、約０．３ｎＭ以下のＫＤ、又は約０．２ｎＭ以下のＫＤ、又は約０．１ｎＭ以下のＫＤでｈＩＬ２０に結合する。酢酸ナトリウムバッファー中で組換え的に生産される抗ＩＬ２０抗体は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおいて、約０．１ｎＭ以下の親和性、場合によっては約０．０１−０．０５ｎＭの親和性で、組換えＩＬ２０抗体に結合しうる（例えば実施例１２を参照）。また、抗体は、マウス（例えば、ハツカネズミ）及び／又はカニクイザル（Macaca fascicularis）を含む一又は複数の非ヒト哺乳動物由来のＩＬ２０に検出可能に結合しうる（例えば実施例２を参照）。更に、本発明の抗体は、ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のＩＬ２０−媒介活性化をインビトロ及び／又はインビボで低減させることができる。これは、ここに記載の（例えば実施例１，２，及び９−１１を参照）又は当該分野で知られている一又は複数のアッセイで試験されうる。適切なアッセイを使用して、本発明の抗体は、コントロール（例えば如何なる抗ｈＩＬ２０抗体も存在しない）と比較して、ヒトＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のｈＩＬ２０−媒介活性化を少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも２０％、更により好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、減少させることができる。抗体は更に対応するリガンド及びレセプター複合体オルソログを使用して、他の種、例えばマウス及びカニクイザルにおけるＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のＩＬ２０−媒介活性化を低減させることができる（実施例９を参照）。
【００３２】
本発明の抗体は、ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２を組換え的に発現するＢａＦ−３細胞のＩＬ２０−媒介増殖を低減させるが、典型的にはＩＬ１９−及び／又はＩＬ２４−誘導増殖には有意な効果を持たない（例えば実施例２を参照）。このようなアッセイでは、本発明の抗体は、典型的には、約５０μＭ以下、約５μＭ以下、約１μＭ以下、約０．５μＭ以下、約０．１μＭ以下、約０．０５μＭ以下、又は約０．０２μＭ以下のＥＣ５０で増殖を低減させる。例えば、実施例１０に記載された増殖アッセイにおいて、組換え的に生産されたヒト抗体１５Ｄ２は０．０２μＭ未満のＥＣ５０を有している。
【００３３】
本発明の抗ＩＬ２０抗体は、任意の機序によって又は異なった機序の組合せによってｈＩＬ２０−媒介レセプター複合体活性化を阻害しうる。典型的には、抗ｈＩＬ２０抗体は、細胞付随ｈＩＬ２０レセプター又は完全に形成されたレセプター複合体へのｈＩＬ２０結合を減少させ又は防止しうる。加えて又は別に、本発明の抗体は、細胞付随ｈＩＬ２０単鎖レセプター分子に結合しうるが、レセプター複合体の形成を防止しうる。加えて又は別に，本発明の抗体は、細胞付随ｈＩＬ２０単鎖レセプター分子及び完全に形成されたレセプター複合体に結合しうるが、レセプター複合体活性化に必要な構造的変化を低減又は阻害しうる。どの一又は複数の機序が関連しているのかは、例えば抗体がヒトＩＬ２０Ｒ１、ＩＬ２０Ｒ２、ＩＬ２２Ｒ１レセプター分子、又はＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及び／又はＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体を発現する細胞にｈＩＬ２０の存在下で結合するかどうかを試験することによって、同定することができる。特定の実施態様では、抗体は、ｈＩＬ２０のｈＩＬ２０Ｒ２への結合を低減する。他の特定の実施態様では、抗体は、ヒトＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体の少なくとも一つへのｈＩＬ２０の結合を低減させない。本発明の特定の抗体は、場合によってはＤ７８を除き、ＩＬ１９中のヘリックスＥに対応するセグメントに少なくとも部分的にオーバーラップするか、又は該セグメントに少なくとも一つの残基を含むｈＩＬ２０エピトープに結合する。理論に限定されるものではないが、このセグメントは、ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２への結合及び／又は活性化に関与するＩＬ２０中のヘリカル構造を含むか、又はその一部でありうる。ｈＩＬ２０−ｈＩＬ１９配列アラインメント及び構造的ＩＬ１９情報を使用して構築されたｈＩＬ２０のモデルについては、図２を参照のこと。ｈＩＬ２０配列では、このセグメントは成熟ｈＩＬ２０（配列番号：１）の残基Ｄ７８−Ｈ１０３を含む。一実施態様では、本発明の抗体又は抗原結合断片はよって成熟ｈＩＬ２０（配列番号：１）のＤ７８−Ｈ１０３から選択される少なくとも一つの残基を含むエピトープに結合する。他の特定で別個の実施態様では、エピトープはＤ７８−Ｈ１０３セグメントに２、３、４、５、６、７又はそれ以上の残基を含む。
【００３４】
他の態様では、本発明は、成熟ｈＩＬ２０中の残基Ｄ７８−Ｋ９６又はＨ７９−Ｋ９６に対応するセグメント中に１、２、３、４、５、６、７又はそれ以上の残基を含むエピトープに結合する抗体を提供する。このセグメントは、抗ＩＬ２０抗体５Ｂ７の高親和性をもたらすエピトープを含む。Ｔｈｅ抗体はあるいは、１５Ｄ２エピトープの重要な残基を含む残基Ｄ７８−Ｌ９３又はＨ７９−Ｌ９３に対応するセグメント中に１、２、３、４、５、６、７又はそれ以上の残基を含むエピトープに結合しうる。例えば、抗体は、Ｈ７９−Ｌ９３から選択される少なくとも一つの残基を含むエピトープに結合する。抗体は、あるいは、５Ｂ７エピトープの重要な残基を含む残基Ｈ７９−Ｎ９０に対応するセグメント中に１、２、３、４、５、６、７又はそれ以上の残基を含むエピトープに結合しうる。特定の別の実施態様では、エピトープの全ての重要な残基は、場合によってはＤ７８を除く、残基Ｄ７８−Ｈ１０３、Ｄ７８−Ｋ９６、Ｄ７８−Ｌ９３、又はＤ７８−Ｎ９０に対応するセグメントにある。
【００３５】
他の態様では、抗体は、成熟ＩＬ２０の残基Ｈ７９、Ｒ８３、Ｓ８５、Ｎ９０、Ｆ９１、及びＬ９２の少なくとも一つを含むエピトープに結合する。別の特定の実施態様では、抗体は、Ｄ７８、Ｈ７９、Ｒ８３、Ｓ８５、Ｎ９０、Ｆ９１、及びＬ９２の２、３、４、５、６、又は全てに結合する。他の実施態様では、エピトープは少なくとも残基Ｈ７９及びＮ９０を含む。更なる実施態様では、エピトープは残基Ｒ８３を更に含む。更に他の実施態様では、エピトープはＤ７８、Ｓ８５、Ｆ９１、及びＬ９２の１、２、３、又は全てを更に含む。他の態様では、本発明は、以下に記載される５Ｂ７又は１５Ｄ２の何れかのＶＨ及びＶＬ配列を含む抗体と同じｈＩＬ２０上のエピトープに競合し、及び／又は結合する抗体を提供する。かかる抗体は、よって配列番号：９を含む軽鎖可変領域及び配列番号：６又は配列番号：７を含む重鎖可変領域を含む抗体と、ｈＩＬ２０への結合において競合する。このような抗体は、ここに記載された標準的なｈＩＬ２０結合アッセイにおいて１５Ｄ２及び／又は５Ｂ７と競合するその能力に基づいて同定されうる（例えば実施例４又は以下に「結合アッセイ」と題されたセクションを参照）。ｈＩＬ２０への１５Ｄ２及び／又は５Ｂ７の結合を減少させ又は阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がｈＩＬ２０への結合について１５Ｄ２及び／又は５Ｂ７と競合し得、よって５Ｂ７及び／又は１５Ｄ２と同じｈＩＬ２０セグメント又はエピトープに結合し得ることを証明している。好ましい実施態様では、５Ｂ７及び／又は１５Ｄ２と同じｈＩＬ２０のセグメント又はエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、ここに記載されるように、当該分野で既知の方法に従って調製され単離されうる。
【００３６】
特定の実施態様では、抗体は、国際公開第２００５０５２０００号に記載されたラット抗体（２６２．４．１．２．２．１，２６２．５．１．６．４．４，及び２６２．７．１．３．２．４），及び／又は米国特許出願公開第２００６０１４２５５０号及び国際公開第２００７０８１４６５号に記載されたマウス抗体（７Ｅ）の何れかが結合したものとは異なるｈＩＬ２０セグメント又はエピトープに結合し、列挙されたマウス又はラット抗体の何れかとよりもｈＩＬ２０への結合において１５Ｄ２及び／又は５Ｂ７とより競合する。他の特定の実施態様では、抗体は、ＩＬ２０前駆体（配列番号：２）の残基４２−１０２に対応するセグメントに結合しないヒト抗体である。
上述の機能的特徴、実施例に記載された他の機能的特徴、及び／又は次のセクションに記載する構造的特徴の任意の組合せは本発明の抗体によって示されうる。
【００３７】
構造的性質
一態様では、本発明は、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｍｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で水性製剤中に処方されるために適した安定性及び／又は溶解性特性を持つヒト抗ＩＬ２０抗体を提供し、該水性製剤が薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体を更に含有し得、典型的には中性又は生理学的ｐＨに近いｐＨを有している。一実施態様では、抗ＩＬ２０抗体は、場合によっては２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー及び１５０ｍＭのＮａＣを含有し、約７．４のｐＨを有する水性製剤中で少なくとも８０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有している。一実施態様では、抗ＩＬ２０抗体は、場合によっては２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー及び１５０ｍＭのＮａＣを含有し、約７．４のｐＨを有する水性製剤中で少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの溶解性を有している。ある生殖細胞系列配列から誘導されるヒト抗ＩＬ２０抗体は他のものよりもより可溶性であり、よって水溶液中で高濃度を達成することが今見出された（例えば実施例３を参照）。このような実施態様を以下に更に詳細に記載する。
【００３８】
好ましい本発明の抗体は、ここで記載されたように特徴付けられているヒトモノクローナル抗体１５Ｄ２又は５Ｂ７を含む。これらの抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメイン及びＣＤＲ配列を以下にまた図３に提供する。
１５Ｄ２（配列番号：６）の重鎖可変ドメインは、配列番号：６のＫａｂａｔ残基３１−３５（ＣＤＲ１）、５０−６５（ＣＤＲ２）及び９５−１０２（ＣＤＲ３）にそれぞれ対応する次のＣＤＲｓを含む：
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＮＤＩＩＨ
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＷＩＮＡＧＹＧＮＴＱＹＳＱＮＦＱＤ
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＥＰＬＷＦＧＥＳＳＰＨＤＹＹＧＭＤＶ
５Ｂ７（配列番号：７）の重鎖可変ドメインは、配列番号：７のＫａｂａｔ残基３１−３５（ＣＤＲ１）、５０−６５（ＣＤＲ２）及び９５−１０２（ＣＤＲ３）にそれぞれ対応する次のＣＤＲｓを含む：
ＶＨ  ＣＤＲ１：  ＳＨＩＭＨ
ＶＨ  ＣＤＲ２：  ＷＩＮＡＧＹＧＮＴＫＹＳＱＮＦＱＤ
ＶＨ  ＣＤＲ３：  ＥＰＬＷＦＧＥＬＳＰＨＤＹＹＧＭＤＶ
１５Ｄ２及び５Ｂ７（配列番号：９）の軽鎖可変ドメインは、配列番号：９のＫａｂａｔ残基２４−３４（ＣＤＲ１）、５０−５６（ＣＤＲ２）及び８９−９７（ＣＤＲ３）にそれぞれ対応する次のＣＤＲｓを含む：
ＶＬ  ＣＤＲ１：  ＲＡＳＱＧＩＳＳＡＬＡ
ＶＬ  ＣＤＲ２：  ＤＡＳＳＬＥＳ
ＶＬ  ＣＤＲ３：  ＱＱＦＮＳＹＰＬＴ
【００３９】
１５Ｄ２及び５Ｂ７の双方がＩＬ２０に結合するので、ＶＨＣＤＲ配列は、他の抗ｈＩＬ２０結合分子をつくり出すために「混合され、マッチされ」うる。このような「混合されマッチされた」抗体のｈＩＬ２０−結合性は、ここに記載の結合アッセイを使用して（例えばフローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡｓ）及び／又はここに記載のレセプター活性化アッセイを使用して、試験されうる。本発明はよって１５Ｄ２又は５Ｂ７の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１ｓ、ＣＤＲ２ｓ及び／又はＣＤＲ３ｓ、又はその組合せを含む抗体を提供する。ＣＤＲ領域はＫａｂａｔ系を使用して描写される（図３）。これら抗体の各々が、実質的にオーバーラップするエピトープを有するｈＩＬ２０に結合し得、また抗原結合特異性がＣＤＲ１、２及び３領域によって種としてもたらされるので、ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３配列を「混合し、マッチさせて」（つまり、各抗体はＶＨ ＣＤＲ１、２及び３及びＶＬ ＣＤＲ１、２及び３を含むが、異なった抗体からのＶＨ ＣＤＲｓを混合し、マッチさせうる）、本発明の他の抗ｈＩＬ２０結合分子を作製する。１５Ｄ２及び５Ｂ７ ＶＨ ＣＤＲｓは実質的な構造類似性を共有しており、よって混合及びマッチングに受け入れられる。
【００４０】
従って、一態様では、本発明は、配列番号：９のＶＬ ＣＤＲｓを含むＶＬ配列と場合によっては組み合わされて、（ａ）５Ｂ７又は１５Ｄ２由来のＶＨ ＣＤＲ１、（ｂ）５Ｂ７又は１５Ｄ２由来のＶＨ ＣＤＲ２、及び（ｃ）５Ｂ７又は１５Ｄ２由来のＶＨ ＣＤＲ３を含む単離されたモノクローナル抗体を提供する。これはまた以下のようにコンセンサスＶＨ ＣＤＲｓを使用して例証することができる。
５Ｂ７／１５Ｄ２のコンセンサス可変重鎖ドメインは、配列番号：８のＫａｂａｔ残基３１−３５（ＣＤＲ１）、５０−６５（ＣＤＲ２）及び９５−１０２（ＣＤＲ３）にそれぞれ対応する次のＣＤＲｓを含み、Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは以下に列挙されたもの又はその保存的置換を表す）：
ＶＨ ＣＤＲ１：  Ｘ２Ｘ３ＩＸ４Ｈ（Ｘ２：Ｎ又はＳ；Ｘ３：Ｄ又はＨ；Ｘ４：Ｉ又はＭ、又はその何れかの保存的置換）
ＶＨ ＣＤＲ２：  ＷＩＮＡＧＹＧＮＴＸ５ＹＳＱＮＦＱＤ（Ｘ５はＫ、Ｑ、又はその何れかの保存的置換である）
ＶＨ ＣＤＲ３：  ＥＰＬＷＦＧＥＸ７ＳＰＨＤＹＹＧＭＤＶ（Ｘ７はＳ、Ｌ、又はその何れかの保存的置換である）、
ここで、Ｘ２−Ｘ５及びＸ７は、配列番号：８の残基３１、３２、３４、５９、及び１０６にそれぞれ対応する。
【００４１】
従って、他の態様では、本発明は、場合によっては配列番号：８のＣＤＲ１と組み合わされる、重鎖可変領域ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号：８の配列を含む。一態様では、抗体は、場合によっては配列番号：６のＣＤＲ１と組み合わされる、重鎖可変領域ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。一実施態様では、抗体は配列番号：６の配列を含む。一態様では、抗体は、場合によっては配列番号：７のＣＤＲ１と組み合わされる、重鎖可変領域ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。一実施態様では、抗体は配列番号：７の配列を含む。これらの態様又は実施態様の何れかにおいて、抗体は、場合によっては、配列番号：９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又は全配列を更に含みうる。
【００４２】
ある実施態様では、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系列  Ｈ  鎖免疫グロブリン遺伝子由来のＶＨ領域、又は特定の生殖細胞系列Ｈ鎖免疫グロブリン遺伝子の組合せ；及び／又は特定の生殖細胞系列Ｌ鎖免疫グロブリン遺伝子由来のＶＬ領域、又は特定の生殖細胞系列Ｌ鎖免疫グロブリン遺伝子の組合せを含む。
例えば、一実施態様では、本発明は、ＶＨ１＿０３、Ｄ３−１０、及びＪＨ６遺伝子を含むヒト遺伝子のセットから誘導される重鎖可変領域を含む単離された抗ｈＩＬ２０抗体を提供する。重鎖可変領域は、例えば、Ｋａｂａｔ残基５０−６５、９５−１０２、及び３１−３５にそれぞれ対応する配列番号：８のＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、及び場合によってはＣＤＲ１配列を含みうる。他の実施態様では、抗体は、ＶＫＩ＿Ｌ１８及びＪＫ４遺伝子を含むヒト遺伝子のセットから誘導される軽鎖可変領域を更に含む。軽鎖可変領域は、例えば配列番号：９のＣＤＲ１−ＣＤＲ３配列を含みうる。
【００４３】
一実施態様では、本発明は、単離された抗ｈＩＬ２０モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を提供し、ここで、抗体は、（ａ）ヒトＤ３−１０遺伝子及びＪＨ６遺伝子で組換えられたヒトＶＨ１＿０３遺伝子由来のＶＨドメインを含み、（ｂ）ヒトＪＫ４遺伝子で組換えられたヒトＶＫＩ＿Ｌ１８遺伝子由来のＶＬドメインを含み、及び（ｃ）抗体はｈＩＬ２０に特異的に結合する。例えば、抗体は、配列番号：９の軽鎖可変配列及び配列番号：６又は配列番号：７の重鎖可変配列を含みうる。ここで使用される場合、ヒト抗体は、抗体の可変領域が、ト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子を使用するシステムから得られる場合、特定の生殖細胞系列配列「の」又は「から誘導された」又は「の産物」の重鎖又は軽鎖可変領域を含む。このようなシステムは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを興味ある抗原で免疫し、又は興味ある抗原でファージ上にディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子をスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の」又は「から誘導された」又は「の産物」であるヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列 免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列に対して配列が最も近い（つまり最大の％同一性）ヒト生殖細胞系列 免疫グロブリン配列を選択することによって、同定されうる。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の」又は「から誘導された」又は「の産物」であるヒト抗体は、例えば天然に生じる体細胞変異又は部位特異的変異の意図的な導入のために、生殖細胞系列配列と比較してアミノ酸差を含みうる。
【００４４】
しかしながら、選択されたヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％アミノ酸配列が同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えばマウス生殖細胞系列配列）と比較される場合、ヒト抗体をヒトであるとして同定するアミノ酸残基を含む。ある場合には、ヒト抗体可変配列は、組換えられた生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列が少なくとも９５％、又は更には少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％同一でありうる。
【００４５】
典型的には、特定のヒト生殖細胞系列配列から誘導されたヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列 免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは１０アミノ酸以下の差を示す。ある場合には、ヒト抗体は、組換えられた生殖細胞系列 免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは、８以下、５以下、又は更には４、３、２、又は１のアミノ酸以下の差を示しうる。
【００４６】
また他の態様では、本発明の抗体は、ここに記載された好ましい15D2 及び5B7抗体のアミノ酸配列に相同であるか又は同一であるアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含み、ここで、抗体は本発明の抗ｈＩＬ２０抗体の所望される機能的特性を保持している。例えば、本発明は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む単離されたモノクローナル抗体を提供し、ここで、（ａ）ＶＨドメインは配列番号：６、７、及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み；（ｂ）ＶＬ領域は、配列番号：９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み；及び（ｃ）抗体はｈＩＬ２０に特異的に結合し、ここに記載の機能的特性の少なくとも一つ、好ましくはここに記載の機能的特性の幾つかを示す。
【００４７】
他の実施態様では、ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、上で示される配列に８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一でありうる。上で示される配列のＶＨ及びＶＬ領域に対して高い（すなわち８０％以上の）同一性を有するＶＨ及びＶＬ領域を有する抗体が、配列番号６−９をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的又はＰＣＲ媒介変異誘発）と、その後のここに記載の機能的アッセイを使用してのコードされた改変抗体の保持された機能（例えばｈＩＬ２０結合親和性又はそのレセプター複合体のｈＩＬ２０媒介活性化の低減）についての試験により得られうる。
【００４８】
２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち同一性％＝同一位置の数／位置の全体数×１００）であり、２つの配列の最適なアラインメントに対して導入される必要がある。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、配列解析ソフトウェアにおいて数学的アルゴリズムを用いて達成されうる。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の修飾に割り当てられた類似性の基準を使用して類似の配列をマッチさせる。
【００４９】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) アルゴリズムを用いて決定可能であり、該アルゴリズムは、ブロッサム（Ｂｌｏｓｓｕｍ）６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスの何れかと、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重量及び１、２、３、４、５もしくは６の長さ重量を用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラム中に含まれている。
ポリペプチド配列はまたＦＡＳＴＡを使用し、初期設定又は推奨パラメータを適用して比較することができる。ＧＣＧバージョン６．１．，ＦＡＳＴＡ中のプログラム（例えばＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー及び検索配列間での最良のオーバーラップ領域のアラインメントとパーセント配列同一性を提供する（Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98；Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219）。
【００５０】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 1988;11-17）を用いてまた決定することができ、これは、ＰＡＭ１２０重み残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入されている。
データベース中に含まれる他の配列と配列を比較するための他のアルゴリズムは、初期設定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐである。例えばそれぞれが出典明示によりここに援用されているAltschul等, J. Mol. Biol. 1990;215:403-410；Altschul等, Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997)を参照のこと。本発明のタンパク質配列は、そこでは、例えば関連する配列を同定するために、公的データベースに対して検索を実施するために「クエリー配列」として使用されうる。そのような検索は、Altschul,等 1990 (上掲)のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施されうる。BLASTタンパク質検索は、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施されうる。比較目的のためのギャップアラインメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴを、Altschul等, 1997 (上掲)に記載されているようにして利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム(例えばXBLAST 及びNBLAST)の初期設定パラメータを使用することができる。 http://www. ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
【００５１】
ある実施態様では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域を含み、ここで、これらＣＤＲ配列の一又は複数はここに記載された好ましい抗体；１５Ｄ２及び５Ｂ７、又はその保存的修飾に基づく特定のアミノ酸配列を含み、抗体は本発明の抗ｈＩＬ２０抗体の所望の機能的特性を保持する。従って、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を提供し、ここで、（ａ）ＶＨ領域ＣＤＲ３配列は、配列番号：６及び７のＣＤＲ３とその保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；（ｂ）ＶＬ領域ＣＤＲ３配列は配列番号：９のＣＤＲ３のアミノ酸配列又はその保存的修飾を含み；及び（ｃ）抗体はｈＩＬ２０に特異的に結合し、ここに記載された機能的特性の少なくとも一つ、より好ましくはここに記載された機能的特性の幾つかを示す。
【００５２】
更なる実施態様では、ＶＨ領域ＣＤＲ２配列は、配列番号：６又は７のＣＤＲ２及びその保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域ＣＤＲ２配列は配列番号：９のＣＤＲ２又はその保存的修飾を含む。
更なる実施態様では、ＶＨ領域ＣＤＲ１配列は、配列番号：６又は７のＣＤＲ１、及びその保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域ＣＤＲ１配列は配列番号：９のＣＤＲ１又はその保存的修飾を含む。
【００５３】
ここで用いられる場合、「保存的配列修飾」なる用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響を及ぼし又は改変することのないアミノ酸修飾を示すものである。かかる保存的修飾は、アミノ酸置換、付加及び欠失を含む。修飾は、当該分野で既知の標準的技術、例えば部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発により本開示の抗体中に導入されうる。
【００５４】
「保存的」アミノ酸置換とは、典型的には、アミノ酸残基が類似の物理化学的特性を有する側鎖を持つアミノ酸残基に置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定められている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β分岐側鎖(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。
【００５５】
よって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の一又は複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換され得、改変された抗体はここに記載の機能的アッセイを使用して保持されている機能（つまり上記の（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）に記載の機能）について試験されうる。
【００５６】
抗原結合断片
ここに記載の本発明の抗ｈＩＬ２０抗体は、完全長抗体又はその抗原結合断片として調製されうる。完全長抗体は、例えばＩｇＧ及びＩｇＭを含む任意の適切なクラスのものでありうる。抗体の特定のクラス及び／又はアイソタイプは意図される治療的用途に応じて選択されうる。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４アイソタイプは例えば白血球上で発現されるＦｃレセプターに対して異なった親和性を有しており、ＩｇＧ４及びＩｇＧ２はＩｇＧ１及びＩｇＧ３より低い親和性を有する。
抗原結合断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（典型的には抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン）、単鎖Ｆｖ（scFv; 例えばBird等, Science 1988;242:423-426；及びHuston等 PNAS 1988;85:5879-5883を参照）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（典型的にはＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、及びｄＡｂ（典型的にはＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、及びＶ−ＮＡＲドメイン；単一のＶＨ及び単一のＶＬ鎖を含む一価分子；ミニボディ；ダイアボディ；トリアボディ、及びカッパボディ（例えばIll等, Protein Eng 1997;10:949-57を参照）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；並びに一又は複数の単離されたＣＤＲｓ又は機能的パラトープを含み、ここで、単離されたＣＤＲｓ又は抗原結合残基又はポリペプチドが機能的抗体断片を形成するように互いに関連又は結合されうる。様々なタイプの抗体断片が、例えばHolliger 及びHudson, Nat Biotechnol 2005;23:1126-1136；国際公開第２００５０４０２１９号、及び米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号及び第２００２０１６１２０１号に記載され又は概説されている。
【００５７】
抗体断片は、一般的な組換え又はタンパク質工学技術を使用して得ることができ、また断片をインタクトな抗体と同じ形で抗原結合又は他の機能についてスクリーニングできる。
様々な技術が抗体断片の生産のために開発されている。伝統的には、これらの断片は完全長抗体のタンパク分解的消化を介して誘導されている（例えばMorimoto等, Journal of Biochemical 及びBiophysical Methods, 24:107-117 (1992)；及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照）。しかしながら、これらの断片は今は組換え宿主細胞により直接製造されうる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収され、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter等, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)）。他のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離されうる。他の実施態様では、選択される抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第１９９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。抗体断片はまた例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」でもありうる。このような直鎖状抗体断片は単一特異的又は二重特異的でありうる。
【００５８】
多重特異性分子
他の態様では、本発明は、本発明の抗ｈＩＬ２０抗体、又その抗原断片を含む多重特異性分子に注目する。このような多重特異性分子は、ｈＩＬ２０に対して少なくとも一つの結合特異性を有し、第二の標的エピトープに対して第二の結合特異性を有する二重特異性分子を含む。
二重特異性分子の一つのタイプは二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なったエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体を作製するための方法は当該分野で知られており、完全長二重特異性抗体の伝統的生産は、通常は、二つの鎖が異なった特異性を有している二つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現に基づく（Millstein等, Nature, 305: 537-539 (1983)）。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）又はここに記載の任意の他の抗原結合断片として調製されうる。
【００５９】
他の多重特異性分子は、一又は複数の他の非抗体タンパク質へのｈＩＬ２０−結合抗体の融合から生産されるものを含む。このような多重特異性タンパク質及びそれらの構築方法は当該分野で記載されている。例えばDreier等 (Bioconjug. Chem. 9(4): 482-489 (1998))；国特許第６０４６３１０号；米国特許出願公開第２００３０１０３９８４号；欧州特許出願１４１３３１６；米国特許出願公開第２００４００３８３３９号；von Strandmann等, Blood (2006;107:1955-1962.)、及び国際公開第２００４０５６８７３号を参照のこと。
二を越える価数の多重特異性分子もまた考えられる。三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J. Immunol, 147: 60 (1991)。
【００６０】
本発明の多重特異性分子は、当該分野で知られている方法を使用して構成の結合特異性をコンジュゲートすることにより調製されうる。例えば、多重特異性分子の各結合親和性を別個に生成し、ついで互いにコンジュゲートさせることができる。結合親和性がタンパク質又はペプチドである場合、様々なカップリング又は架橋剤を共有的コンジュゲーションのために使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及び４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えばKarpovsky等 (1984) J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MA等 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照)。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132；Brennan等 (1985) Science 229:81-83), 及びGlennie等 (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)に記載されたものを含む。好ましいコンジュゲーション剤はＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣであり、双方ともＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Rockford, IL）から入手できる。
【００６１】
結合親和性が抗体である場合、それらは、二つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して結合されうる。特に好ましい実施態様では、コンジュゲーションの前に、ヒンジ領域を奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは一つの該残基を含むように修飾する。
別法では、双方の結合親和性を同じベクターにコード化し、同じ宿主細胞で発現させ、組み立てることができる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性分子は、一つの単鎖抗体と結合決定基を含む単一鎖分子、又は二つの結合決定基を含む単鎖二重特異性分子でありうる。二重特異性分子は少なくとも二つの単鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製する方法は、例えば米国特許第５２６０２０３号；米国特許第５４５５０３０号；米国特許第４８８１１７５号；米国特許第５１３２４０５号；米国特許第５０９１５１３号；米国特許第５４７６７８６号；米国特許第５０１３６５３号；米国特許第５２５８４９８号；米国特許第５４８２８５８号；米国特許出願公開第２００３００７８３８５号、Kontermann等, (2005) Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9; Kostelny等, (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger等, (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448; 及びGruber等 (1994) J. Immunol. 152: 5368に記載され、概説されている。
【００６２】
抗体変異体
本発明の抗体は更にここに開示されたＶＨ及び／又はＶＬ配列の一又は複数を有する抗体を出発材料として使用して、修飾された抗体又は抗体「変異体」を操作して調製することができ、この修飾された抗体は親抗体とは改変された特性を有しうる。抗体は、一方又は双方の可変領域（つまり、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば一又は複数のＣＤＲ領域内、及び／又は一又は複数のフレームワーク領域内の一又は複数の残基を修飾することによって、操作されうる。加えて又は別に、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することによって操作されうる。また、抗体の抗原結合部分から、他のコンストラクト、例えば抗原結合断片、抗体誘導体、免疫コンジュゲート、及び多重特異性分子を調製することができる。
【００６３】
標準的な分子生物学技術を使用して改変された抗体配列を調製し発現させることができる。
抗体変異体又は誘導体は典型的には、「親」抗体と比較して少なくとも一つの改変された特性を有し、該抗体変異体又は誘導体は、ここに記載の抗ｈＩＬ２０抗体の機能的特性の一つ、幾つか又は殆どを保持し得、この機能的特性は、限定しないが、（ａ）ヒトＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のｈＩＬ２０−媒介活性化を低減し、（ｂ）好ましくは実質的に類似の効能又は親和性で、マウス及びカニクイザルＩＬ２０オルソログに結合し；（ｃ）ｈＩＬ２０への結合において１５Ｄ２及び５Ｂ７の一又は複数と競合し、及び（ｄ）ヘリックスＥに対応するセグメント中のエピトープに結合する（図２）ことを含む。上述の機能的特徴、及び／又は実施例に記載された機能的特徴の任意の組合せが本発明の抗体によって示されうる。
【００６４】
抗体変異体及び誘導体の機能的特性は、当該分野で利用でき及び／又はここに記載された標準的なアッセイを使用して評価することができる。例えば、ｈＩＬ２０に結合する抗体の能力は、実施例に記載されたもののような標準的な結合アッセイ（例えばＢｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、又はＥＬＩＳＡ）を使用して決定することができる。
【００６５】
可変領域の修飾
実施することができる可変領域操作の一つのタイプはＣＤＲグラフティングである。抗体は、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を主に通して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列は殆どの抗体抗原相互作用の原因であるので、異なった性質を有する異なった抗体からのフレームワーク配列上にグラフトされた特異的な天然に生じる抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特異的な天然に生じる抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることができる（例えばRiechmann, L.等 (1998) Nature 332:323-327；Jones, P.等 (1986) Nature 321:522-525；Queen, C.等 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033；Winterの米国特許第5,225,539号、及びQueen等の米国特許第5, 530,101号;第5,585,089号;第5,693,762号及び第6,180,370号を参照）。従って、本発明の他の実施態様は、モノクローナル抗体１５Ｄ２又は５Ｂ７のＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含む単離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。
【００６６】
フレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベース又は公開された文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列ＤＮＡ配列は「ｄＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（インターネットサイトwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能）、並びにKabat, E. A.等 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, ５版, U.S. Department of Health 及びHuman Services, NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson, I. M.,等 (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hyper可変 Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798；及びCox, J. P. L.等 (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836に見出すことができ、これらの各々の内容は出典明示によりここに明示的に援用される。
【００６７】
本発明の抗体で使用される好ましいフレームワーク配列は、本発明の選択された抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似しているもの、例えば１５Ｄ２又は５Ｂ７のＶＨ１＿０３、Ｄ３−１０、ＪＨ６、ＶＫＩ＿Ｌ１８、及び／又はＪＫ４配列に類似しているものである。１５Ｄ２又は５Ｂ７のＶＨ ＣＤＲ１、２及び３配列は、フレームワーク配列が誘導される生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子に見出されるものと同じ配列を有しているフレームワーク領域上にグラフトされ得、又はＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して一又は複数の変異を含むフレームワーク領域へグラフトされうる。例えば、ある例では、抗体の抗原結合能を維持し又は亢進させるためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出された（例えばQueen等の米国特許第５５３０１０１号；同第５５８５０８９号；同第５６９３７６２号及び同第６１８０３７０号を参照）。
【００６８】
本発明の他の態様では、本発明の抗ｈＩＬ２０抗体、例えば１５Ｄ２及び５Ｂ７の構造的特徴を使用して、ｈＩＬ２０への結合のような、本発明の抗体の少なくとも一つの機能的特性を持する構造的に関連した抗ｈＩＬ２０抗体を作製する。例えば、５Ｂ７又は１５Ｄ２、又はその変異体の一又は複数のＣＤＲ領域を、既知のフレームワーク領域及び／又は他のＣＤＲと組換え的に組み合わせて、本発明の更なる組換え的に操作された抗ｈＩＬ２０抗体をつくることができる。該操作方法の出発材料は、ここに提供されたＶＨ及び／又はＶＬ配列の一又は複数、又はそのＣＤＲ領域の一又は複数である。操作された抗体をつくるために、ここに提供されたＶＨ及び／又はＶＬ配列の一又は複数、又はそのＣＤＲ領域の一又は複数を有する抗体を実際に調製（つまり、タンパク質として発現させる）ことは必要ではない。むしろ、配列に含まれる情報が、出発材料として使用されて、元の配列から誘導された「第二世代」配列を作製し、ついで「第二世代」配列をタンパク質として調製し発現させる。
【００６９】
従って、他の実施態様では、本発明は、抗ｈＩＬ２０抗体を調製するための方法であって、（ａ）（ｉ）配列番号：６又は７からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列、及び（ｉｉ）配列番号：９からのＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供し；（ｂ）第一抗体配列及び／又は第二抗体配列内の少なくとも一つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも一つの改変された抗体配列をつくり；及び（ｃ）改変された抗体配列を調製し；及び（ｄ）改変された抗体配列をタンパク質として発現させることを含む方法を提供する。
【００７０】
可変領域修飾の他のタイプは、ＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それによって関心のある抗体の一又は複数の結合特性（例えば親和性）を改善することである。部位特異的変異誘発又はＰＣＲ媒介変異誘発を実施して変異を導入することができ、抗体結合性又は関心のある他の機能的特性についての効果を、ここに記載され、実施例に提供されているようにインビトロ及びインビボアッセイで評価することができる。好ましくは、（上で検討したような）保存的修飾が導入される。変異はアミノ酸置換、付加又は欠失でありうる。 更に、典型的には、８以下、より典型的には５残基以下が単一のＣＤＲ領域内で改変される。
【００７１】
従って、他の実施態様では、本発明は、配列番号：６又は７のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、又はこれらのＣＤＲｓの一又は複数において１、２、３、４、５、６、７、又は８のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：９からのＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、又はこれらのＣＤＲｓの一又は複数において１、２、３、４、５、６、７、又は８のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離された抗ｈＩＬ２０モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を提供する。
【００７２】
本発明の遺伝子操作された抗体は、例えば抗体の性質を改善するために、VH及び／又はVL内においてのフレームワーク 残基に対して修飾が行われたものを含む。典型的には、かかるフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるようになされる。例えば、一つのアプローチは、対応する生殖細胞系列配列に一又は複数のフレームワーク 残基を「復帰突然変異させる(backmutate)」ことである。より詳細には、体細胞突然変異を経ている抗体は、抗体が誘導される生殖細胞系列配列とは異なるフレームワーク残基を含みうる。かかる残基は、抗体フレームワーク配列を抗体が誘導される生殖細胞系列配列と比較することにより同定されうる。
【００７３】
例えば、１５Ｄ２及び５Ｂ７では、対応する生殖細胞系列配列とは異なるＶＨ残基は図３では、「＊」によって示している。例えばフレームワーク領域配列をその生殖細胞系列構造に戻すためには、ＣＤＲｓの外側の体細胞変異を、例えば部位特異的変異誘発又はＰＣＲ媒介変異誘発によって生殖細胞系列配列に「復帰突然変異」させることができる（例えば１５Ｄ２ＶＨドメインの残基１３、６８、及び／又は８２Ａ又は５Ｂ７ ＶＨドメインの残基１３、３０及び／又は８２Ａを、ＶＨアミノ酸から生殖細胞系列アミノ酸に「復帰突然変異」させることができる。このような「復帰突然変異」抗体もまた本発明によって包含されることが意図される。
【００７４】
フレームワーク修飾の他のタイプは、フレームワーク領域内、又は更に一又は複数のＣＤＲ領域内で一又は複数の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは、「脱免疫(deimmunization)」とも称され、Carr等の米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号に更に詳細に記載されている。
【００７５】
Ｆｃ修飾
フレームワーク又はＣＤＲ領域内でなされる修飾に加え又はその代替として、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内での修飾を含み、典型的には抗体の一又は複数の機能的特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃレセプター結合性及び／又は抗原依存性の細胞傷害性、又はその欠如を変化させるように操作されうる。更に、本発明の抗体は、化学的に修飾されうる（例えば一又は複数の化学的部分が抗体に付着されうる）か、又は修飾されてそのグリコシル化が改変され、再び抗体の一又は複数の機能的特性が改変されうる。これらの実施態様の各々を以下に更に詳細に記載する。Ｆｃ領域内の残基はＫａｂａｔに従って番号付けした。
【００７６】
所望される場合、抗体のクラスは既知の技術によって「切替え」られうる。かかる技術は、例えば直接的組換え技術（例えば米国特許第４８１６３９７号を参照）及び細胞間融合技術（例えば米国特許第５９１６７７１号を参照）の使用を含む。例えば、ＩｇＭ分子として元々は生産された抗体をＩｇＧ抗体にクラス切替えしうる。クラス切替え技術をまた使用してあるＩｇＧサブクラスを他のものに、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に転換させることができる。よって、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用途に対して、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体にアイソタイプ切替えによって変化させられうる。定常領域の例示的なｃＤＮＡ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋを介して入手でき、その全体が出典明示により援用されるその各々は次の通りである：
ヒトＩｇＧ１定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ００２２８；
ヒトＩｇＧ２定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ００２３０；
ヒトＩｇＧ３定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ０４６４６；
ヒトＩｇＧ４定常重鎖領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｋ０１３１６；及び
ヒトカッパ軽鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ００２４１。
【００７７】
一実施態様では、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が改変され、例えば増加又は減少するように修飾される。このアプローチは、Bodmer等の米国特許第５６７７４２５号に更に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数を変化させて、例えば軽鎖及び重鎖の構築を容易にし又は抗体の安定性を増大又は低下させる。
他の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域が突然変異されて、抗体の生物学的半減期が減少させられる。より詳細には、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に対するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を損なうように、一又は複数のアミノ酸変異をＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域中に導入する。このアプローチは、ワードWard等の米国特許第６１６５７４５号に更に詳細に記載されている。他の実施態様では、抗体が修飾されてその生物学的半減期が増大される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardの米国特許第６２７７３７５号に記載されているように、一又は複数の対の変異、すなわちＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆが導入されうる。あるいは、Presta等の米国特許第５８６９０４６号及び同第６１２１０２２号に記載されているように、生物学的半減期を増加させるため、抗体を、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージレセプター結合エピトープを含むようにＣＨ１又はＣＬ領域内で改変させることができる。更に他の実施態様では、Ｆｃ領域は少なくとも一つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０及び３２２から選択される一又は複数のアミノ酸が、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有しているが親抗体の抗原結合能を保持するように異なるアミノ酸残基と置換されうる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えばＦｃレセプター又は補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは、共にWinter等の米国特許第５６２４８２１号及び同第５６４８２６０号に更に詳細に記載されている。他の例では、アミノ酸残基３２９、３３１及び３２２から選択される一又は複数のアミノ酸が、抗体がＣ１ｑ結合を改変し及び／又は補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣ）を低減又は根絶するように異なるアミノ酸残基と置換されうる。このアプローチは、Idusogie等の米国特許第６１９４５５１号に更に詳細に記載されている。他の例では、アミノ酸位置２３１及び２３９内の一又は複数のアミノ酸残基が改変され、それによって抗体の補体を固定する能力が改変される。このアプローチは、Bodmer等のＰＣＴ公報の国際公開第９４／２９３５１号に更に記載されている。更に他の例では、次の位置、すなわち２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８もしくは４３９の一又は複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させ及び／又はＦｃｙレセプターに対する抗体��親和性を増加させる。このアプローチは、PrestaのＰＣＴ公報の国際公開第００／４２０７２号に更に記載されている。更に、ヒトＩｇＧ１上のＦｃｙＲ１、ＦｃｙＲＩＩ、ＦｃｙＲＩＩＩ及びＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、また結合が改善された変異体が記載されている（Shields, R.L.等 (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４及び３３９での特異的変異がＦｃＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。また、次の組合わせ変異体、すなわちＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ及びＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡがＦｃｙＲＩＩＩ結合を改善することが示された。
【００７８】
定常領域を更に修飾して、例えば二価抗体が二つの一価ＶＨ−ＶＬ断片に分離するリスクを低減するために、抗体を安定化させることができる。例えば、ＩｇＧ４定常領域において、Ｋａｂａｔ番号付け系による２４１位のセリン（Ｓ，Ｓｅｒ）残基をプロリン（Ｐ，Ｐｒｏ）残基に変異させて、ヒンジに完全なジスルフィド架橋形成を可能にする（例えばAngal等, Mol Immunol. 1993;30:105-8を参照）。ＥＵ指数番号付け系によれば、Ｋａｂａｔ残基２４１は残基２２８に対応する。
【００７９】
グリコシル化修飾
更に他の実施態様では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、無グリコシル化（aglycoslated）抗体を作製することができる（つまり、抗体がグリコシル化を欠く）。グリコシル化を、例えば抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化させることができる。かかる糖鎖の修飾は、例えば抗体配列内で一又は複数のグリコシル化部位を改変することにより達成され得る。例えば、一又は複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位を消失させ、それによってその部位でのグリコシル化を消失させる一又は複数のアミノ酸置換を行いうる。かかる無グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させうる。かかるアプローチは、Ｃｏ等の米国特許第５７１４３５０号及び同第６３５０８６１号に更に詳細に記載されている。加えて又は別に、例えば、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体又は二分岐性ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体のような、改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することができる。かかる改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を増加させることが証明されている。かかる糖鎖修飾は、例えば改変されたグリコシル化機構を持つ宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は当該分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させて、それによって改変されたグリコシル化の抗体を産生させる宿主細胞として用いることができる。例えばHanai等の欧州特許出願公開第１１７６１９５号には、かかる細胞株中で発現された抗体が低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されている。PrestaのＰＣＴ公報国際公開第０３／０３５８３５号は、Ａｓｎ（２９７）結合糖鎖にフコースを結合させる能力が低下した変種ＣＨＯ細胞株のＬｅｃ１３細胞を開示し、その宿主細胞において発現した抗体のフコシル化が低下する結果となっている（Shields, R.L.等(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740もまた参照のこと）。Umana等のＰＣＴ公報国際公開第９９／５４３４２号は、操作された細胞で発現された抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加を生じさせる二分岐性ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように（Umana等(1999)Nat. Biotech. 17：176-180もまた参照のこと）、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ ＩＩＩ））を発現させるように操作された細胞株を記載している。
【００８０】
本発明の抗体を遺伝子操作する方法の所定の実施態様では、変異を、抗ｈＩＬ２０抗体コード配列（例えば１５Ｄ２又は５Ｂ７コード配列）の全て又は一部に無作為に又は選択的に導入することができ、得られた修飾抗体を、結合活性及び／又はここに記載された他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。変異方法は当該分野で開示されている。例えば、ShortのＣＴ公報国際公開第０２／０９２７８０号は、飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、又はその組合せを使用して抗体変異を創製し、スクリーニングする方法を記載している。
別法では、Lazar等のＰＣＴ公報国際公開第０３／０７４６７９号は抗体の物理化学的性質を最適化するために計算的スクリーニング法を記載している。
【００８１】
抗体誘導体
本発明の範囲内の抗体誘導体（又は免疫コンジュゲート）は、第二の薬剤にコンジュゲートされ又は共有的に結合された抗ｈＩＬ２０抗体を含む。
例えば、一態様では、本発明は、細胞傷害剤にコンジュゲートされ又は共有的に結合された抗体を含む免疫コンジュゲートを提供する。 ここで使用される「細胞傷害剤」なる用語は、例えば細胞表面ｈＩＬ２０レセプターへのＩＬ２０結合を介してそれが付随するようになる細胞を死滅させることができる分子である。細胞傷害性又は細胞阻害効果を伴う部分の任意のタイプを本発明の抗体にコンジュゲートさせ、本発明の細胞傷害性コンジュゲートを形成することができ、放射性同位元素、毒性タンパク質、毒性小分子、例えば、薬物、毒素、免疫調節物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素インヒビター、治療用放射性核種、血管新生インヒビター、化学療法薬、ビンカアルカロイド類、アントラサイクリン系薬剤、エピドフィルロトキシン類、タキサン系薬剤、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ−２インヒビター、ＳＮ−３８、有糸分裂阻害剤、抗血管新生及びアポトーシス誘導剤、特にドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン類（camptothecans）、ナイトロジェンマスタード、ゲムシタビン、アルキルスルホン酸、ニトロソウレア類、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、シュードモナス（Pseudomonas）外毒素、リシン、アブリン、５−フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌（Staphylococcal）エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ（pokeweed）抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、シュードモナス外毒素、及びシュードモナス内毒素などを含む（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19版 (Mack Publishing Co. 1995)；Goodman 及びGilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001)；Pastan等 (1986) Cell 47:641; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43；米国特許第６０７７４９９号を参照；これらの開示内容全体を出典明示によりここに援用する）。毒素は、動物、植物、真菌、もしくは微生物由来であり得るか、又は化学合成によりデノボ創製されうることが理解される。
【００８２】
他の実施態様では、抗体は、治療用放射性核種又は検出目的に適した放射性核種のような放射性同位元素で誘導体化される。多くの適切な放射性同位元素の何れかを使用することができ、限定しないが、インジウム−１１１、ルテチウム−１７１、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、銅−６２、銅−６４、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、リン−３２、リン−３３、スカンジウム−４７、銀−１１１、ガリウム−６７、プラセオジム−１４２、サマリウム−１５３、テルビウム−１６１、ジスプロシウム−１６６、ホルミウム−１６６、レニウム−１８６、レニウム−１８８、レニウム−１８９、鉛−２１２、ラジウム−２２３、アクチニウム−２２５、鉄−５９、セレン−７５、ヒ素−７７、ストロンチウム−８９、モリブデン−９９、ロジウム−１０５、パラジウム−１０９、プラセオジム−１４３、プロメチウム−１４９、エルビウム−１６９、イリジウム−１９４、金−１９８、金−１９９、及び鉛−２１１を含む。一般に、放射性核種は、好ましくは、オージェ放射体については、２０から６０００ｋｅＶの範囲、好ましくは、６０〜２００ｋｅＶの範囲で、β放射体については１００−２５００ｋｅＶ、及びα放射体については４０００−６０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。α粒子の発生に伴って実質的に崩壊する放射性核種もまた好適である。
【００８３】
本発明の抗体コンジュゲートを使用して、所定の生物学的応答を改変することができ、ここで、薬剤部分は古典的な化学療法剤に限定されると解釈されてはならない。例えば、薬剤部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドでありうる。かかるタンパク質は、例えば酵素的に活性な毒素、又はその活性な断片、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素；タンパク質、例えば腫瘍壊死因子又はインターフェロン−ｙ；又は生物学的応答修飾因子、例えば、リンホカイン、インターロイキン−ｌ（「ＩＬ１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、又は他の増殖因子を含みうる。
【００８４】
第二の薬剤は、多数の利用可能な方法の任意のものを使用し、直接的又は間接的に、抗体に結合させることができる。例えば、薬剤は、Ｎ-スクシニル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)等の架橋剤を使用し、ジスルフィド結合形成を介して、又は抗体のＦｃ領域内の糖鎖部分を介して、還元された抗体成分のヒンジ領域に結合させることができる(例えば、Yu等 (1994) Int. J. Cancer 56: 244；Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991)；Upeslacis等, "Modification of Antibodies by Chemical Methods,", Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch等編, pp 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)；Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,", Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter等編, pp60-84 (Cambridge University Press 1995)、Cattel等 (1989) Chemistry today 7:51-58、Delprino等 (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704；Arpicco等 (1997) Bioconjugate Chernistry 8:3；Reisfeld等 (1989) Antihody, Immunicon. Radiopharrn. 2:217を参照；それぞれの全ての開示を出典明示によりここに援用する)。また、例えばArnon等, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld等編, pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom等, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2版), Robinson等編, pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera等編, pp. 475-506 (1985)；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin等編, pp. 303-16 (Academic Press 1985)、及びThorpe等, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)を参照のこと。
【００８５】
細胞毒のタイプ、リンカー及び抗体に治療剤をコンジュゲートさせる方法の更なる検討については、またSaito, G.等 (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215；Trail, P.A.等 (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763；Pastan, I. 及びKreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091；Senter, P.D. 及びSpringer, C.J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264を参照のこと。
【００８６】
他の実施態様では、第二の薬剤は検出可能な部分であり、定量的又は定性的に観察されるか又は測定されうる任意の分子でありうる。本発明のコンジュゲート抗体に有用な検出可能なマーカーの例は、放射性同位体、蛍光色素、又は相補的な結合対のメンバー、例えば抗原／抗体(ＩＬ２０に対する抗体以外)、レクチン／糖質；アビジン／ビオチン；レセプター／リガンド；又は分子的にインプリントされたポリマー／プリント分子系の何れか一のメンバーである。
【００８７】
第二の薬剤は、またないしはあるいは、例えば抗体又はその抗原結合断片の循環半減期を増加させることを目的とするポリマーであってもよい。例示的なポリマー及び該ポリマーをペプチドに結合させる方法は、例えば米国特許第４７６６１０６号；同第４１７９３３７号；同第４４９５２８５号；及び同第４６０９５４６号に例示される。更なる例示的なポリマーには、ポリオキシエチレン化ポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が含まれる。ここで使用される場合、「ポリエチレングリコール」なる用語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態の任意のもの、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドを包含することを意図している。例えば、完全長抗体又は抗体断片は、約１０００から約４００００、例えば約２０００から約２００００、例えば約３０００−１２０００の間の分子量を有する一又は複数のＰＥＧ分子にコンジュゲートさせることができる。抗体又はその断片をペグ化するためには、抗体又は断片を、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体と、一又は複数のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に結合されるようになる条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実施される。ある実施態様では、ペグ化される抗体はグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当該分野で知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えば国際公開第２００４０９９２３１号、国際公開第２００３０３１４６４号、欧州特許出願公開第１５４３１６号（Nishimura等）及び欧州特許出願公開第４０１３８４号（ Ishikawa等）を参照のこと。
【００８８】
核酸
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に、細胞溶解液中に又は部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該分野で周知のその他を含む標準技術により、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から除去精製される場合、「単離される」か又は「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel等編 (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照。本発明の核酸が例えばＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含むか又は含まない場合がある。好ましい実施態様では、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【００８９】
本発明の核酸は、標準の分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、下記に更に記載のヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）によって発現される抗体では、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準のＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得られうる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた（例えばファージディスプレイ技術を用いて）抗体では、抗体をコードする核酸がライブラリーから回収されうる。本発明の好ましい核酸分子は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプの１５Ｄ２又は５Ｂ７モノクローナル抗体、より好ましくはＩｇＧ４の重鎖及び軽鎖配列をコードするものである。
【００９０】
ひとたびＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片を標準の組換えＤＮＡ技術により更に操作することで、例えば可変領域遺伝子が完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換されうる。これらの操作では、ＶＬもしくはＶＨをコードするＤＮＡ断片が、別のタンパク質、例えば抗体の定常領域又はフレキシブルリンカーをコードする別のＤＮＡ断片に作用可能に連結される。これに関連して用いられる「作用可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味するものである。
【００９１】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結することにより完全長重鎖遺伝子に変換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該分野で知られており（例えばKabat, E. A.等 (l 991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health 及びヒトServices, NIH Publication No. 91-3242を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅により得ることが可能である。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域でありうるが、最も好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡが、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結されうる。
【００９２】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結することにより完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該分野で知られており（例えばKabat, E. A.,等 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health 及びヒトServices, NIH Publication No. 91-3242を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅により得ることが可能である。軽鎖定常領域はカッパ又はラムダ定常領域でありうるが、最も好ましくはカッパ定常領域である。
【００９３】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片がフレキシブルリンカー、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作用可能に連結されることで、ＶＨ及びＶＬ配列はフレキシブルリンカーで連結されたＶＬ及びＶＨ領域を有する隣接した一本鎖タンパク質として発現されうる（例えばBird等 (1988) Science 242:423-426; Huston等 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty等, (1990) Nature 348:552-554を参照）。
【００９４】
抗体の産生
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばKohler 及びMilstein (1975) Nature 256: 495の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術により産生可能である。原理上、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス性又は発癌性の形質転換を用いることができる。
【００９５】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。融合のために免疫された脾細胞を単離するための免疫化プロトコル及び技術は当該分野で知られており、融合対（例えばマウスミエローマ細胞）及び融合方法についても知られている。本発明のキメラ又はヒト化抗体は、確立された技術を使用してマウスモノクローナル抗体の配列に基づいてまた調製されうる。例えば、重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスハイブリドーマから得られ、標準の分子生物学技術を用いて非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を有するように操作されうる。例えば、キメラ抗体を作製するため、マウス可変領域は当該分野で知られている方法を用いてヒト定常領域に連結されうる（例えばCabilly等の米国特許第４８１６５６７号）。ヒト化抗体を作製するため、マウスＣＤＲ領域を当該分野で知られている方法を用いてヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、Winterの米国特許第５２２５５３９号、及びQueen等の米国特許第５５３０１０１号；米国特許第５５８５０８９号；米国特許第５６９３７６２号及び米国特許第６１８０３７０号を参照）。
【００９６】
好ましい実施態様では、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ｈＩＬ２０に対するかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を有するトランスジェニック又はトランスクロモゾームマウスを用いて産生されうる。これらのトランスジェニック及びトランスクロモゾームマウスは、ここでは各々ＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスと称されるマウスを含み、ここでは総称して「ヒトＩｇマウス」と称される。ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性ｕ及びＫ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された変異と共に未転位のヒト重鎖（ｐ及びｙ）及びＫ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む（例えばLonberg,等 (1994) Nature 368: 856-859を参照）。従って、マウスは、マウスＩｇＭまたはＫの発現の低下を示し、免疫に応答し、導入されたヒト重鎖及び軽鎖トランス遺伝子がクラススイッチ及び体細胞突然変異を受け、高親和性のヒトＩｇＧＫモノクローナルが産生される（上掲のLonberg, N.等 (1994)；Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101に概説；Lonberg, N. 及びHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93、及びHarding, F. 及びLonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭａｂマウスの調製及び使用、及びかかるマウスにより保有されるゲノム修飾は、Taylor, L.等 (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen, J.等 (1993)International Immunology 5: 647-656；Tuaillon等 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724；Choi等 (1993) Nature Genetics 4: 117-123；Chen, J.等 (1993) EMBO J. 12: 821-830；Tuaillon等 (1994) J. Immunol. 152:2912 2920；Taylor, L.等 (1994) International immunology 6: 579-591；及びFishwild, D.等 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851に更に記載され、これら全ての内容はその全体が出典明示によりここに特に援用される。更に、米国特許第５５４５８０６号；米国特許第５５６９８２５号；米国特許第５６２５１２６号；米国特許第５６３３４２５号；米国特許第５７８９６５０号；米国特許第５８７７３９７号；米国特許第５６６１０１６号；米国特許第５８１４３１８号；米国特許第５８７４２９９号；及び米国特許第５７７０４２９号（全てLonberg及びKay）、Surani等の米国特許第５５４５８０７号；ＰＣＴ国際公開公報第９２／０３９１８号、国際公開第９３／１２２２７号、国際公開第９４／２５５８５号、国際公開第９７／１３８５２号、国際公開第９８／２４８８４号及び国際公開第９９／４５９６２号（全てLonberg及びKay）、及びＫｏｒｍａｎ等のＰＣＴ国際公開公報第０１／１４４２４号を参照のこと。他の実施態様では、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を有するマウスのような導入遺伝子及び導入染色体にヒト免疫グロブリン配列を有するマウスを使用して産生させることができる。「ＫＭマウス」とここでは称されるこのようなマウスは、Ishida等のＰＣＴ公報国際公開第０２／４３４７８号に詳細に記載されている。また更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスジェニック動物が当該分野で入手でき、本発明の抗ｈＩＬ２０抗体を産生させるために使用できる。例えば、Xenomouse (Abgenix, Inc.)と称される他のトランスジェニック系を使用することができる； かかるマウスは、 例えばKucherlapati等の米国特許第５９３９５９８号；第６０７５１８１号；第６１１４５９８号；第６１５０５８４号及び第６１６２９６３号に記載されている。更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他の導入染色体動物系が当該分野で入手でき、本発明の抗ｈＩＬ２０抗体を産生させるために使用できる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれるヒト重鎖導入染色体とヒト軽鎖導入染色体の双方を有するマウスを使用することができ；tこのようなマウスはTomizuka等 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。更に、cows carryingヒト重鎖及び軽鎖導入染色体を有する雌ウシが当該分野で開示されており（Kuroiwa等 (2002) Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明の抗ｈＩＬ２０抗体を産生させるために使用できる。
【００９７】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いて調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、当該分野で確立されている。例えば、Ladner等の米国特許第５２２３４０９号；米国特許第５４０３４８４号；及び米国特許第５５７１６９８号；Dower等の米国特許第５４２７９０８号及び米国特許第５５８０７１７号；McCafferty等の米国特許第５９６９１０８号及び米国特許第６１７２１９７号；及びGriffiths等の米国特許第５８８５７９３号；米国特許第６５２１４０４号；米国特許第６５４４７３１号；米国特許第６５５５３１３号；米国特許第６５８２９１５号及び米国特許第６５９３０８１号を参照のこと。本発明のヒトモノクローナル抗体は、また、ヒト抗体応答が免疫時に生じうるようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを用いて調製することができる。かかるマウスは、例えばWilson等の米国特許第５４７６９９６号及び米国特許第５６９８７６７号に記載されている。
【００９８】
ヒトＩｇマウスを用いて本発明のヒト抗体が産生される場合、かかるマウスは、Lonberg, N.等 (1994) Nature 368(6474): 856-859；Fishwild, D.等 (1996) NatureBiotechnolo,gy 14: 845-851；及びＰＣＴ公報国際公開第98/24884号及び国際公開第01/14424号に記載のように、ｈＩＬ２０抗原の精製もしくは濃縮調製物を用いて免疫化されうる。好ましくは、マウスは１回目の注入時に６−１６週齢になる。例えば、ｈＩＬ２０抗原の精製又は組換え調製物（５−５０μｇ）を使用して、ヒトＩｇマウスを腹腔内及び／又は皮下的に免疫できる。
投与される抗原（例えばｈＩＬ２０ポリペプチド）の形態及び量、並びに投与スケジュール及び例えば完全フロイントアジュバント又は不完全フロイントアジュバントのようなアジュバントの使用可能性が、典型的には、当該分野で確立された方法に従って各抗原−マウス系に対して最適化される。
【００９９】
免疫応答を、後眼窩出血によって得られる血漿試料を用いた免疫化プロトコルの過程でモニターすることができ、血漿又は血清をＥＬＩＳＡ（以下に記載）によってスクリーニングされ得、十分な力価の抗ｈＩＬ２０ヒト免疫グロブリンのマウスを融合に対して使用できる。マウスは、犠牲にし脾臓を除去する３日前に抗原で静脈内的に追加免疫することができる。各免疫に対して２−３の融合を実施することが必要とされうると予想される。
【０１００】
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生産するため、免疫されたマウス由来の脾細胞及び／又はリンパ節細胞を単離し、適切な不死化細胞系、例えばマウスミエローマ細胞系に融合されうる。産生されたハイブリドーマは、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニングされうる。例えば、免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液が、５０％ＰＥＧと共にＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）の数の１／６に融合されうる。あるいは、細胞は電気融合法を用いて融合されうる。細胞を、平底マイクロタイタープレートに約２×１０５でプレーティング後、２０％胎仔クローン血清、１８％の「６５３」馴化培地、５％のオリゲン（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴは融合の２４時間後に添加される）を含む選択培地内で２週間インキュベートされる。約２週間後、細胞はＨＡＴがＨＴと交換された培地内で培養されうる。ついで、個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができる。ひとたび多数のハイブリドーマの増殖が生じると、培地は通常１０−１４日後に観察されうる。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再びスクリーニングし、依然としてヒトＩｇＧ陽性である場合、モノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローニングされうる。ついで、特徴付けのため、安定なサブクローンをインビトロで培養して、組織培地内に少量の抗体が産生せしめうる。ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマはモノクローナル抗体精製用の２リットルのスピナーフラスコ内で増殖されうる。プロテインＡ−セファロース（Pharmacia, Piscataway, N.J.）でのアフィニティクロマトグラフィー前に、上清が濾過され、濃縮される。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィーで検査することで純度が確保されうる。バッファー溶液はＰＢＳに交換でき、濃度は分光計により判定可能である。モノクローナル抗体は、一定量に分割され、−８０℃で保存されうる。
【０１０１】
本発明の抗体は、例えば当該分野で周知のように、組換えＤＮＡ技術と遺伝子形質移入方法を併用し、宿主細胞のトランスフェクトーマ内で産生させることもできる（例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202）。
例えば、抗体又はその抗体断片を発現するため、部分長又は完全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡが標準の分子生物学技術（例えば目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いるＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング）により得られ、ＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作用可能に連結されるように発現ベクターに挿入されうる。この文脈で、「作用可能に連結される」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するというその意図された機能を果たすようにベクターにライゲートされることを意味するものである。
【０１０２】
発現ベクター及び発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞と適合可能であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入されうるか又は、より典型的には、両遺伝子が同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準の方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上での相補的制限部位のライゲーション又は制限部位が存在しない場合での平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。ここに記載の抗体の軽鎖及び重鎖可変領域を用い、それらを、所望のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクター中に、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作用可能に連結され、ＶＫセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作用可能に連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製することができる。加えて又は別に、組換え発現ベクターは、抗体鎖の宿主細胞からの分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクターにクローニングされうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種のシグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でありうる。
【０１０３】
抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有している。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。かかる調節配列は、例えばGoeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）に記載されている。
【０１０４】
調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの因子に依存しうることが当業者により理解されるであろう。哺乳類宿主細胞の発現に対して好ましい調節配列は、哺乳類細胞内で高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス因子、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えばアデノウイルスメジャー後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列、例えばユビキチンプロモーター又はｐ−グロビンプロモーターが用いられうる。また更に、異なる供給源由来の配列からなる調節因子、例えばＳＲａプロモーター系は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１のＳＶ４０初期プロモーター及び長末端リピートに由来する配列を含む（Takebe, Y.等 (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。
【０１０５】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加え、本発明の組換え発現ベクターは、更なる配列、例えば宿主細胞内でのベクターの複製（例えば複製起点）を調節する配列及び選択可能マーカー遺伝子を有しうる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てAxel等の米国特許第４３９９２１６号、米国特許第４６３４６６５号及び米国特許第５１７９０１７号を参照）。例えば典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上で薬物、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセートに耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、（メトトレキセートの選択／増幅の場合にｄｈｆｒ−宿主細胞内で用いられる）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子及び（Ｇ４１８の選択用の）ネオ遺伝子を含む。
【０１０６】
軽鎖及び重鎖の発現に対しては、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターが、標準技術により宿主細胞に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡの原核又は真核宿主細胞への導入のための一般に用いられる多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−リン酸塩沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入などを包含することが意図される。原核又は真核宿主細胞の何れかにおいて本発明の抗体を発現させることは理論的に可能であるが、真核細胞内、最も好ましくは哺乳類宿主細胞内での抗体の発現が、かかる真核細胞、特定の哺乳類細胞が適切に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を構築し分泌する可能性が原核細胞よりも高いことから最も好ましい。原核生物での抗体遺伝子の発現は、高収量の活性抗体の産生にとって有効ではないことが報告されている（Boss, M. A. 及びWood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13）。
【０１０７】
本発明の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばR. J. Kaufman 及びP. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載のように、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に用いられるUrlaub 及びChasin, (1980) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯミエローマ細胞の場合の使用では、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号及び欧州特許出願公開第３３８８４１号に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現又はより好ましくは宿主細胞が増殖される培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて培養培地から回収されうる。
【０１０８】
抗体の特徴付け
生産又は精製後に、又はスクリーニング又は選択手順の一部として、本発明の抗ｈＩＬ２０抗体の機能的特性を研究することができる。関心のある機能的特性は、例えばｈＩＬ２０への抗体の結合特異性、ｈＩＬ２０オルソログへの抗体の結合性、参照抗体（例えば５Ｂ７及び１５Ｄ２）との抗体の競合性、抗体が結合するエピトープ、抗体抗原相互作用の親和性、抗体のアンタゴニスト特性、及び溶解性を含む。
【０１０９】
次は抗体特徴付けのための例示的なアッセイの簡単な説明である。幾つかは他のセクション及び／又は実施例において更に記載される。
【０１１０】
結合アッセイ
本発明は、ｈＩＬ２０に結合する抗体、及びその抗原結合断片、変異体、及び免疫コンジュゲートを提供する。多種多様なアッセイの何れかを用いてｈＩＬ２０に対する抗体の結合を評価することができる。とりわけ、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、ＢＩＡＣＯＲＥ、及び他の競合アッセイに基づくプロトコルが用途に適しており、当該分野で周知である。更に、競合アッセイを含む幾つかの結合アッセイは実施例に記載する。
【０１１１】
例えば、試験抗体を標的タンパク質又はエピトープ（例えばＩＬ２０又はその一部）の存在下でインキュベートし、結合しなかった抗体を洗い流し、例えば放射性標識、質量分析などの物理学的方法、又は例えば細胞蛍光測定分析法（例えばＦＡＣスキャン）を用いて直接ないし間接的に蛍光標識を検出することによって、結合した抗体の存在を評価する、単純な結合アッセイを用いることができる。このような方法は当業者にとって周知である。コントロールの非特異的抗体で見られる量を上回る任意の結合量は、抗体が標的に特異的に結合することを示している。
【０１１２】
このようなアッセイでは、試験抗体の標的細胞又はタンパク質に結合する能力を、(ネガティブ)コントロールタンパク質、例えば構造的に関係のない抗原に対する抗体又は非Ｉｇペプチド又はタンパク質が同じ標的に結合する能力と比較することができる。任意の好適なアッセイを用いたときの抗体又は断片の標的細胞又はＩＬ２０への結合親和性がコントロールタンパク質よりも２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％又はそれ以上に増加している場合には、標的「に特異的に結合する」又は「と特異的に相互作用する」と言い、以下に記載の治療方法での使用に好ましい。また、ＩＬ２０、例えば１５Ｄ２又は５Ｂ７に対する(ポジティブ)コントロール抗体の結合に影響する試験抗体の能力を評価することもできる。
一態様では、本発明は、生物学的特徴及び／又は実質的なＶＨ及び／又はＶＬ配列同一性を１５Ｄ２又は５Ｂ７と共有している抗ｈＩＬ２０抗体を提供する。ある例示的な生物学的特徴は、１５Ｄ２又は５Ｂ７エピトープ、又は１５Ｄ２又は５Ｂ７抗体が結合するｈＩＬ２０の細胞外ドメインの各領域への結合である。１５Ｄ２又は５Ｂ７エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のような常法の交差ブロックアッセイを行うことができる。
【０１１３】
例示的な交差ブロック又は競合アッセイでは、１５Ｄ２又は５Ｂ７（コントロール）抗体と試験抗体が混合され（又は予め吸着され）、ＩＬ２０を含む試料に適用される。ある実施態様では、ＩＬ２０含有試料に適用する前の所定時間、コントロール抗体を様々な量の試験抗体（例えば１：１０又は１：１００）とプレミックスしてもよい。他の実施態様では、コントロールと様々な量の試験抗体を、抗原／標的試料への曝露中に単に混合することができる。遊離の抗体と結合した抗体を（例えば、分離法又は洗浄技術を用いて未結合抗体を取り除くことによって）、また試験抗体からコントロール抗体を（例えば、種特異的又はアイソタイプ特異的な二次抗体を用いることによって、コントロール抗体を検出可能な標識で特異的に標識することによって、又は異なる化合物を区別するために質量分析のような物理的な方法を用いることによって）区別することができる限りにおいて、試験抗体が抗原へのコントロール抗体の結合を低減するかどうかを決定することができ、該試験抗体はコントロールと実質的に同じエピトープを認識することが示される。このアッセイにおいて、完全に無関係な抗体の存在下での（標識した）コントロール抗体の結合が、コントロールの高い値である。コントロールの低い値は、標識した(ポジティブ)コントロール抗体を非標識コントロール抗体とインキュベートすることによって得られ、このとき競合が生じ、標識抗体の結合を低減させる。
【０１１４】
試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下で標識抗体の反応性が有意に低減すると、試験が抗体がコントロール抗体と競合するか、又は同じエピトープに実質的に結合することを示している。約１：１０から約１：１００の間のコントロール：試験抗体又は化合物の何れかの比で、抗原／標的への標識コントロールの結合を少なくとも５０％又はより好ましくは７０％低減する任意の試験抗体又は化合物は、コントロールと競合し又は実質的に同じエピトープ又は決定基に結合する抗体又は化合物であると考えられる。好ましくは、このような試験抗体又は化合物は、抗原／標的へのコントロールの結合を少なくとも９０％低減するであろう。にもかかわらず、コントロール抗体又は化合物の結合を測定可能な程度に低減する任意の化合物又は抗体を、本発明で使用することができる。
【０１１５】
一実施態様では、競合を、フローサイトメトリー試験によって評価することができる。ｈＩＬ２０を有する細胞が、最初に、ｈＩＬ２０レセプターに特異的に結合することが知られているコントロール抗体と共に、ついで、例えば、蛍光色素又はビオチンで標識されていてもよい試験抗体と共にインキュベートされる。飽和量のコントロール抗体とのプレインキュベーションで得られる結合がコントロールとのプレインキュベーションを伴わない抗体によって得られる結合（蛍光の平均）の８０％、好ましくは、５０％、４０％もしくはそれ以下である場合、試験抗体はコントロールと競合すると言われる。あるいは、飽和量の試験抗体と共にプレインキュベートした細胞上の（蛍光色素又はビオチンにより）標識されたコントロールにより得られる結合が、抗体とのプレインキュベーションを伴わずに得られる結合の８０％、好ましくは５０％、４０％、もしくはそれ以下である場合、試験抗体はコントロールと競合すると言われる。例示的な抗体競合アッセイについては実施例４を参照のこと。
【０１１６】
機能的アッセイ
本発明の抗体は、インビトロ及び／又はインビボでのＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のＩＬ２０−媒介活性化を低減することができる。様々な適切なアッセイが当該分野で知られている。
例えば、実施例は次の原理に基づいてレセプター複合体活性化を検出するルシフェラーゼアッセイを記載する。簡潔に述べると、ＩＬ２０結合及びレセプター複合体形成時に、関連したＪＡＫキナーゼが自己リン酸化され、ＳＴＡＴ３タンパク質をリン酸化させうる。リン酸化ＳＴＡＴ３は、核内に入り、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の隣に配されているプロモータの特異的にＤＮＡエレメントに結合する。ついで、ルシフェラーゼは発現され、基質のルシフェリンを光に転換させ得、これをついで検出し定量することができる。
【０１１７】
ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター活性化を試験するためのインビトロアッセイの他のタイプは、ヒト又は他の種由来のＩＬ２０レセプター複合体が形質移入された例えばＢａＦ−３細胞の増殖に基づいている。このようなアッセイは、例えばｈＩＬ２０Ｒ１／ｈＩＬ２０Ｒ２又はｈＩＬ２２Ｒ１／ｈＩＬ２０Ｒ２が形質移入されたＢａＦ−３細胞のＩＬ２０−誘発増殖の中和効果を試験することができる。ＢａＦ−３細胞はＩＬ３依存的であり、その増殖培地中へのＩＬ３の添加後にインビトロで増殖する。ＩＬ３が利用できない場合、細胞は数日で死滅し、数時間のＩＬ３飢餓後に既にアポトーシスの兆候を示す。形質移入されたＢａＦ−３細胞がそのＩＬ２０レセプター複合体を通じて刺激されると、それらは分裂を開始し、ＩＬ３を必要としない。増殖の阻害のための特定のアッセイは実施例に記載される。
【０１１８】
溶解性アッセイ
溶解性、つまり溶液中で達成できる抗体の濃度を試験するための適切なアッセイは実施例３及びHarris, E.L.V. (1989) In Harris, E.L.V. 及びAngal,S.編, Protein Purification Methods. A Practical Approach. IRL Press, New York（例えばpp. 131-133参照）に記載されている。
【０１１９】
薬学的製剤
一実施態様では、本発明は、一又は複数の担体と共にここに記載された抗ｈＩＬ２０抗体を含有する薬学的組成物を提供する。１５Ｄ２及び５Ｂ７を含む本発明のヒト抗体は、例えば皮下投与で使用される場合、高濃度がしばしば有利か又は必要である薬学的製剤に適している。
出典明示によりその全体がここに援用される国際公開第２００６００３１７９号に記載された製剤及び投与様式を、本発明の抗体及び適用に対して使用することができる。
【０１２０】
本発明の一目的は、典型的には水性又は凍結乾燥製剤（再構成用）中に１ｍｇ／ｍｌから１５０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから２００ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌから５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する本発明の抗体を含有する薬学的製剤であって、該製剤が２．０から１０．０のｐＨ、典型的にはおよそ中性のｐＨを有しているものを提供することにある。好ましくは、水性製剤中に、抗体は、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｍｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶性形態で存在している。製剤は、一又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、及び／又は担体を更に含みうる。これらは、例えばバッファー形、並びに一又は複数の保存料、等張化剤、キレート剤、安定剤及び／又は界面活性剤を含みうる。適切な担体は当該分野で知られており、例えばRemington: The Science 及びPractice of Pharmacy, 19版, 1995に記載されている。
【０１２１】
適切な抗体製剤は、他の既に開発されているモノクローナル抗体での経験を調べることによって決定することもできる。幾つかのモノクローナル抗体は臨床状況において有効であることが示されており、例えばリツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ゾレア（オマリズマブ）、べキサール（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリム、ヒュミラ及び類似の製剤を本発明の抗体と共に使用できる。例えば、モノクローナル抗体は、９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び注射用滅菌水で製剤化された１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の一回使用バイアルで１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給されうる。ｐＨは６．５に調節される。あるいは、抗体は、リン酸バッファー、又はヒスチジン、スクロース、及びポリソルベート８０を含む溶液で製剤化されうる。
【０１２２】
診断用途
本発明のhIL20-抗体はまた非治療的用途を有している。例えば、抗ｈＩＬ２０抗体は、例えば特定の組織、組織試料（例えば滑液）又は血清中におけるその存在を検出する、ＩＬ２０タンパク質の診断アッセイにもまた有用である。
【０１２３】
診断への適用では、抗体は典型的には検出可能部分で標識されるであろう。一般に次の範疇にグループ分けすることができる多くの標識が利用可能である：
（ａ）放射性同位体、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ。抗体を、例えばCurrent Protocols in Immunology, Volumes 1 及び2, Coligen等編 Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)に記載の技術を使用して放射性同位体で標識することができ、放射能はシンチレーションカウンティングを使用して測定することができる。
（ｂ）蛍光標識、雇えば希土類キレート（ユウロピウムキレート）又はフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、及びテキサスレッドが利用可能である。蛍光標識を、例えば、上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を使用して抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は蛍光光度計を使用して定量することができる。
（ｃ）様々な酵素−基質標識が利用可能であり、米国特許第４２７５１４９号は、これらの幾つかの概説を提供する。酵素は、一般に、種々の技術を使用して測定することができる発色基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、基質の変色を触媒し、これを分光光度法で測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変化させることができる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ、米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体へ酵素をコンジュゲートさせるための技術は、O'Sullivan等, "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology (J. Langone及びH. Van Vunakis編), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【０１２４】
抗体を、インビボ診断アッセイに使用することもできる。一般に、抗体は、例えば核磁気共鳴又は当該分野で知られている他の手段によって検出可能な放射性核種又は非放射性指示薬で標識される。好ましくは、標識は放射標識、例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ、又は１１１Ｉｎである。標識された抗体は、好ましくは血流を介して宿主に投与され、宿主中の標識抗体の存在と位置がアッセイされる。この画像化技術は、滑液及び膜中のＩＬ２０の可視化によって、当該疾病又は疾患、例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス及び／又はループス腎炎の検出、段階分け、又は治療において好適に使用される。放射性同位体は、ヨウ素化のための金属キレート化合物ヨードゲン技術を含む任意の手段によってタンパク質にコンジュゲートされる。
【０１２５】
便宜上、本発明の抗体はキット、つまり予め定まった量の試薬と、診断アッセイを実施するための説明書との組み合わせを包装したもので提供されうる。抗体が酵素で標識される場合、キットは、酵素が必要とする基質及び補因子（例えば、検出可能な発色団又はフルオロフォアをもたらす基質前駆体）を含むであろう。また、安定剤、バッファー（例えば、ブロックバッファー又は溶解バッファー）などの他の添加剤を含めることができる。様々な試薬の相対量を広範囲にわたって変化させて、アッセイの感度を実質的に最適にする溶液中の試薬濃度を得ることができる。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液をもたらす賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供されうる。
【０１２６】
治療的用途
ここに記載されたヒト又はヒト化抗ｈＩＬ２０抗体を使用する患者の治療方法もまた本発明によって提供される。一実施態様では、本発明は、ヒト患者に投与するための薬学的組成物の調製におけるここに記載のヒト又はヒト化抗体の使用を提供する。典型的には、患者は、自己免疫又は炎症性疾病又は疾患に罹っているか又はそのリスクがある。
【０１２７】
一態様では、本発明の抗体及び他の化合物で治療される症状又は疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎及びクローン病、全身性エリテマトーデス、又はループス腎炎、及びその任意の組合せ、並びにこれらの疾病に関連している併存疾患であり、心臓血管疾患が該併存疾患の非限定的な例である。更なる態様では、他の例示的症状は、限定されないが、若年性慢性関節炎、変形性関節症、強直性脊椎炎以外の脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、脈管炎、全身脈管炎、側頭動脈炎、アテローム性動脈硬化症、サルコイドーシス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、悪性貧血、自己免疫血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、２型糖尿病、免疫媒介性腎臟病（腎炎、尿細管間質性腎炎、自己免疫卵巣炎）、膵臓炎、自己免疫睾丸炎、自己免疫ブドウ膜炎、抗リン脂質症候群、多発性硬化症に加えての中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発性神経炎又はギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発性神経炎、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝臓指向性ウイルス）、自己免疫慢性活動性肝炎、ウイルス性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、ウェゲナー肉芽腫症、ベーチェット病、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、例えば小児脂肪便症、グルテン過敏性腸症、及びホイップル病、自己免疫又は免疫媒介性皮膚疾患、例えば水疱性皮膚病、多形性紅斑及び接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ヘルペス状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑症（白斑）、アレルギー疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食品性過敏症及びじんま疹、敗血症、エンドトキシン血症、肺の免疫学的疾患、例えばエオジン好性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、臓器又は骨髄移植関連疾患、例えば移植片拒絶及び移植片対宿主疾患を含む。
【０１２８】
例えば、一態様では、抗ＩＬ２０抗体は、限定しないが、免疫抑制剤（例えば、Ｂ細胞−又はＴ細胞アンタゴニスト、例えばＢ細胞枯渇剤及びＴ細胞抑制剤；補体抑制剤）、コルチコステロイド、及び抗ＴＮＦα剤又は他の抗サイトカイン又は抗サイトカインレセプター剤、及び抗血管新生剤を含む一又は複数の他の抗炎症剤との併用で使用される。特定の例は、メトトレキセート、ＴＳＧ−６、リツキサン（登録商標）又は他のＢ細胞治療剤、抗ＩＬ１２抗体、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質、ＩＬ１−レセプターアンタゴニスト、ＩＬ１抗体、ＩＬ１５抗体、ＩＬ１８抗体、及び抗ＩＬ６Ｒ抗体を含む。併用療法の更なる例は以下に提供する。
【０１２９】
一又は複数の他の薬剤又はアプローチ法が本治療法と併用される場合、併用の結果が各治療を別個に行う場合に観察された効果の相加でなければならないという必要性はない。少なくとも相加効果が一般には望ましいが、単独治療法のものを越えるＩＬ２０活性の減少又は他の有益な効果があれば有益であろう。また、併用治療が相乗効果を示す必要性は特にないが、それは確かに可能であり、有益である。ＩＬ２０ベースの治療は、例えば数分から数週間の範囲の間隔で、他の治療に先んじても又は後になってもよい。抗ＩＬ２０組成物又は他の薬剤の何れかの一回を越える投与が利用されることも考えられる。薬剤は、日ごとに又は週毎に交互に交換可能に投与されてもよく；又はあるサイクルの抗ＩＬ２０治療を与えた後、他の薬剤での治療サイクルを続けてもよい。とにかく、要求されることは、投与の回数にかかわらず、治療的に有益な効果を得るのに効果的な併用量で双方の薬剤を送達させることである。
【０１３０】
関節リウマチ
関節リウマチ（ＲＡ）は、主に複数の関節の滑膜に関連する慢性全身性自己免疫炎症疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存性であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成に付随し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体を生成する。関節中のこれらの複合体は、滑膜中へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発し；多数の好中球の添加により同様の細胞で関節空間は浸潤される。冒されている組織は、多くの場合対称的なパターンで、主に関節である。しかしながら、二つの主な形態の関節外疾患もまた生じる。一形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の典型的病巣、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発生である。関節外疾患の第二の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、これは、ＲＡ疾患過程の末期、時には関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これには、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う複数の器官において血管炎が付随する。多くの場合、患者には、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；その小結節は、末期には混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡにおいて生じる可能性のある他の徴候には、心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。ＩＬ２０は関節リウマチ滑液中に示され（Hsu等 (2006) Arthritis Rheum. 54, 2722-2733; Kragstrup等, (2008) Cytokine 41, 16-23）、ＩＬ２０レセプター発現は関節リウマチ滑膜に示されている（Hsu等, (2006) Arthritis Rheum. 54, 2722-2733；Sakurai等, (2008) Rheumatology (Oxford) 47, 815-820）。
【０１３１】
従って、一態様では、本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）を治療し及び／又は予防するための方法を提供する。該方法は、ＲＡを有するか又はＲＡを発症する実質的なリスクがあると同定／診断された患者に有効量の抗ｈＩＬ２０抗体を、ＲＡが治療され又は予防されるように送達することを含む。更なる態様では、抗体は、ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のＩＬ２０−媒介活性化を検出可能に低減可能である。一態様では、該方法は、ＲＡの治療又は予防（適用可能な場合）に一致した形での一又は複数のバイオマーカー（例えば血清ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ１、ＶＥＧＦ、ＴＩＦＦ Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ｓｈｅｄＣＤ４、ｓｈｅｄＣＤ８、及び／又はＣ反応性タンパク質）の調節をもたらす。本発明の抗体を場合によっては試験することができるＲＡのインビボモデルは米国特許第６４１４２１８号及び米国特許出願公開第２００３０００５４６９号（関連した原理及びモデルは、例えばWooley, P. H., Animal Models of Arthritis編 J. H. Klippel 及びP. A. Dieppe, Mosby Publishers (London), 1998；Erning等, Arthritis Res, 4 Suppl 3:S 133-40, 2002；Holmdahl等, Ageing Res Rev, 1(1): 135-47, 2002；Anthony等, Clin Exp Rheumatol, 17(2) :240-4,1999；Durie等, Clin Immunol Immunopathol, 73(1):11-8, 1994；及びMuller-Ladner等, Drugs Today (Bare), 35(4-5):379-88, 1999）に記載されている）。
【０１３２】
他の態様では、本方法の実施により、患者／宿主の末梢関節中の滑液炎症の検出可能な低下が生じる。一態様では、該方法は、例えば患者又は宿主におけるＸ線検査による進行の減少、膨脹及び圧痛関節（許容可能な分析基準で決定）、及び／又は有意に改善された生活の質（例えばＲＡのHealth Assessment Questionnaireでの障害スコアの減少によって決定）によって示される患者又は宿主におけるＸ線検査の悪化の防止及び身体的機能の改善を生じる。抗体は単独で又は一又は複数の他の抗ＲＡ剤、例えば非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＣＯＸ−２インヒビター、鎮痛剤、コルチコステロイド（例えばプレドニソン、ヒドロコルチゾン），金、免疫抑制剤（例えばメトトレキセート）、Ｂ細胞枯渇剤（例えばリツキサン（登録商標））、Ｂ細胞アゴニスト（例えばＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−Ｂ（登録商標））及び抗ＴＮＦα剤（例えばＥｍｂｒｅｌ（登録商標）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）及びＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、抗ＩＬ１レセプターアンタゴニスト（例えばＫｉｎｅｒｅｔ（登録商標））、抗ＩＬ１５抗体、又は疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）との併用で使用されうる。
【０１３３】
脱随性疾患
中枢及び末梢神経系の脱髄性疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）；特発性脱髄性多発性神経炎又はギランバレー症候群；及び慢性炎症性脱髄性多発性神経炎は、自己免疫にベースがあり、乏突起神経膠細胞又は直接ミエリンに生じた損傷の結果として神経脱髄を生じると信じられている。ＭＳでは、疾患誘導及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠がある。ＭＳは、Ｔリンパ球依存性であり、再発寛解過程又は慢性進行過程の何れかを有する脱随疾患である。病因は知られていない；しかしながら、ウイルス性感染症、遺伝的素因、環境、及び自己免疫全てが寄与する。病変は、主にＴリンパ球媒介、ミクログリア細胞及び浸潤性マクロファージの浸透を含む；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病巣の優勢な細胞型である。
よって、他の態様では、本発明は、ＭＳを治療し、及び／又は予防するための方法を提供する。該方法は、ＭＡを有するか又はＭＡを発症する実質的なリスクがあると同定／診断されたヒト患者に有効量の抗ｈＩＬ２０抗体を、患者又は宿主においてＭＳが治療され又は予防されるように送達することを含む。該抗体は単独で又はＴｙｚａｂｒｉ（登録商標）のような他の抗ＭＳ剤と組み合わせて使用される。
【０１３４】
炎症性腸疾患
他の態様では、本発明は、クローン病又は潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療し、及び／又は予防するための方法を提供する。
該方法は、ＩＢＤを有するか又はＩＢＤを発症する実質的なリスクがあると同定／診断されたヒト患者に有効量の抗ｈＩＬ２０抗体を、患者においてＩＢＤが治療され又は予防されるように送達することを含む。該抗体は単独で又は他の抗ＩＢＤ剤、例えばメサラミン（５−パラアミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）、例えばオルサラジン及びバルサラジドを含むスルファサラジン及び他の薬剤を含む）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、コルチコステロイド（例えばプレドニソン、ヒドロコルチゾン）、ＴＮＦ−インヒビター（アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、エタネルセプト（ＥｎｂｒｅｌＲ及びインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、抗ＩＬ１２抗体、免疫抑制剤（例えば６−メルカプトプリン、アザチオプリン及びシクロスポリンＡ）、及び抗生物質と組み合わせて使用される。
【０１３５】
乾癬
乾癬はＴリンパ球媒介性炎症性疾患である。病巣は、Ｔリンパ球、マクロファージ、抗原プロセシング細胞、及び幾らかの好中球の浸潤物を含む。ＩＬ２０及びそのレセプターは乾癬病巣に高いレベルで存在している（Wei等, Clin Immunol (2005) 117: 65-72；Romer等, J Invest Dermatol 2003; 121, 1306-1311；Wang等, J Invest Dermatol 2006; 126: 1590-1599; Otkjar等, Br J Dermatol 2005; 153: 911-918）。
【０１３６】
よって、他の態様では、本発明は、乾癬を治療し、及び／又は予防するための方法を提供する。該方法は、乾癬を有するか又は乾癬を発症する実質的なリスクがあると同定／診断されたヒト患者に有効量の抗ｈＩＬ２０抗体を、患者において乾癬が治療され又は予防されるように送達することを含む。抗体は単独で又は一又は複数の他の抗乾癬剤、例えば光線療法、局所治療（例えばタール、局所糖質コルチコイド）、又は全身治療（例えばメトトレキセート、合成レチノイド、シクロスポリン）、抗ＴＮＦαインヒビター（例えばＥｍｂｒｅｌ（登録商標）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、Ｔ細胞インヒビター（例えばＲａｐｔｉｖａ（登録商標））、ビタミンＤアナログ、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）インヒビター、並びに生物学的薬剤（例えばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））との併用で使用されうる。
【０１３７】
乾癬性関節炎
乾癬性関節炎は、皮膚、関節、腱の挿入部位、靭帯、及び筋膜を罹患させる慢性的な炎症性関節炎症状であり、通常は乾癬に付随している（乾癬患者のおよそ７％が乾癬性関節炎を発症する）。多くの証拠は、T細胞媒介プロセスが乾癬性関節炎の病態生理を推進することを示唆している。単球もまた乾癬性関節炎である役割を果たしており、乾癬性関節炎の患者の関節に破壊的な変化を媒介しうるマトリックスメタロプロテイナーゼの産生の原因となる。
【０１３８】
よって、他の態様では、本発明は、乾癬性関節炎を治療し、及び／又は予防するための方法を提供する。該方法は、乾癬性関節炎を有するか又は乾癬性関節炎を発症する実質的なリスクがあると同定／診断されたヒト患者に有効量の抗ｈＩＬ２０抗体を、患者において乾癬性関節炎が治療され又は予防されるように送達することを含む。抗体は単独で又は一又は複数の他の抗乾癬性関節炎剤、例えば非ステロイド系抗炎症薬（アスピリン、イブプロフェン）、メトトレキセート、合成レチノイド、サイクロスポリン、コルチコステロイド、抗ＴＮＦαインヒビター（例えばＥｍｂｒｅｌ（登録商標）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））との併用で使用されうる。
【０１３９】
全身性エリテマトーデス
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）では、疾患の中心媒介物は、自身のタンパク質／組織に対して自己反応性の抗体の産生と続く免疫媒介性炎症の発生である。抗体は、組織損傷を直接的に又は間接的に媒介する。Ｔリンパ球は組織損傷に直接関与していることは示されていないが、自己反応性抗体の発現にはＴリンパ球が必要とされる。疾患の起源は、よってＴリンパ球依存性である。腎臓、肺、筋骨格系、皮膚粘膜、目、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む多数の臓器と系が臨床的に罹患する。
【０１４０】
よって、他の態様では、本発明は、ＳＬＥを治療し、及び／又は予防するための方法を提供する。該方法は、ＳＬＥを有するか又はＳＬＥを発症する実質的なリスクがあると同定／診断されたヒト患者に有効量の抗ｈＩＬ２０抗体を、患者においてＳＬＥが治療され又は予防されるように送達することを含む。抗体は単独で又は一又は複数の他の抗ＳＬＥ剤、例えば非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、鎮痛剤、コルチコステロイド（例えばプレドニソン、ヒドロコルチゾン）、免疫抑制剤（例えばシクロホスファミド、アザチオプリン、及びメトトレキセート）、抗マラリア剤（例えばヒドロキシクロロキン）及びｄｓＤＮＡ抗体の産生を阻害する生物学的薬剤（例えばＬＩＰ３９４）と組み合わせて使用される。
【０１４１】
糖尿病
Ｉ型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は、膵島Ｂ細胞の自己免疫破壊である；この破壊は、自己抗体と自己反応性Ｔ細胞によって媒介される。インスリン又はインスリンレセプターに対する抗体は、またインスリン非反応性の表現型を生じうる。
【０１４２】
よって、他の態様では、抗ＩＬ２０抗体が、Ｉ型糖尿病を有するか又はＩ型糖尿病を発症する実質的なリスクがある患者に、その症状を治療し又は防止するのに十分な量及び条件下で送達される。抗体は単独で又は他の抗糖尿病薬、例えばインスリン又はβ細胞増殖又は生存因子、又は免疫調節性抗体、例えば抗ＣＤ３抗体と組み合わせて使用されうる。
【０１４３】
移植
移植片拒絶及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患は、Ｔリンパ球依存性であり、Ｔリンパ球の機能の阻害は寛解性である。
【０１４４】
よって、他の態様では、本発明は、移植片拒絶の可能性を低下させ（又は移植片拒絶に関連した症状の重篤度を低減させるか又はその発症までの時間を長引かせる、つまり移植片生着を延長す）る方法を提供する。該方法は、組織／臓器移植のレシピエントとなるか、又は最近までレシピエントであったヒト患者に有効量の抗ｈＩＬ２０抗体を、（例えばコントロールと比較して）拒絶の可能性が検出可能に低減されるように送達することを含む。治療されうる組織移植の例は、限定しないが、肝臓、肺、腎臓、心臓、小腸、及び膵臓膵島細胞、並びに骨髄移植の処置、及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の処置を含む。該抗体は単独で又は移植片拒絶を抑制するための他の薬剤、例えば免疫抑制剤（例えばサイクロスポリン、アザチオプリン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス、ラパマイシン、タクロリムス）、抗感染剤（例えばアシクロビル、クロトリマゾール、ガンシクロビル、ナイスタチン、トリメトプリム・スルファメトキサゾール、利尿薬（例えばブメタニド、フロセミド、メトラゾン）及び潰瘍薬物（例えばシメチジン、ファモチジン、ランソプラゾール、オメプラゾール、ラニチジン、スクラルフェート）と組み合わせて使用される。造血移植では、造血増殖因子（例えばエリスロポイエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＩＬ１１、トロンボポエチン等）又は抗菌剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬）を補助治療として投与されうる。
【０１４５】
他の自己免疫又は炎症性疾患
他の別の態様では、本発明は、他の自己免疫又は炎症性疾病又は疾患を治療し、及び／又は予防するための方法であって、疾病又は疾患を有するか又は疾病又は疾患を発症する実質的なリスクがあると同定／診断されたヒト患者に有効量の抗ｈＩＬ２０抗体を、患者において疾病又は疾患が治療され又は予防されるように送達することを含み、該疾病又は疾患が以下に記載のものである方法を提供する。抗体は単独で又は疾病又は疾患を治療するために使用される一又は複数の他の治療剤と組み合わせて使用されうる。
【０１４６】
若年性慢性関節炎は、多くは１６歳未満の年齢で始まる慢性の特発性検証性疾患である。その表現型はＲＡに幾分の類似性を持ち：リウマチ因子ポジティブの患者の中には若年性慢性関節炎に分類される者もある。該疾患は３つの主要なカテゴリー：少数関節(pauciarticular)、多数関節(polyarticular)、及び全身性に更に分類される。関節炎は重篤な、典型的には破壊的であり得、関節強直及び成長遅延を導く。他の徴候は、慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイドーシスを含みうる。
【０１４７】
脊髄関節症は、幾つかの共通する臨床的特徴及び共通してＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子産物の発現に関連する一群の疾患である。この疾患は、強直性脊椎炎、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性膀胱疾患に関連する関節炎、乾癬を伴う脊髄炎、脊髄関節症の若年発病及び未分化脊髄関節症を含む。区別できる特徴は、脊髄炎有又は無の仙腸骨炎；炎症性非対称性関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７（クラスＩのＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ位置の血清学的に決定された対立遺伝子）関連；眼の炎症；及び他のリウマチ性疾患に関連する自己抗原の欠如を含む。疾患の誘発に最も鍵となると考えられる細胞は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、クラスＩのＭＨＣ分子に提示される抗原を標的とする細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞はクラスＩのＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７に対して、ＭＨＣクラスＩ分子によって発現された外来ペプチドであるように反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープは、細菌性又は他の微生物性の抗原性エピトープに類似し、よってＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘発する。
【０１４８】
全身性硬化症（強皮症）は病因が知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬結であり；これは活性な炎症性プロセスによって誘発されるようである。強皮症は局所性又は全身性であり、血管損傷が多く発生し、毛細血管系の上皮細胞損傷が全身性強皮症進行の初期の重要な事象であり；血管損傷は免疫媒介されうる。免疫学的な基礎は、皮膚損傷いおける単核細胞浸潤の存在、及び多くの患者における抗-核抗体の存在によって示される。ＩＣＡＭ-１は皮膚損傷における繊維芽細胞の細胞表面でしばしばアップレギュレートされ、これらの細胞とＴ細胞の相互作用がこの疾患の病理で役割を担うことを示唆している。他の器官は、胃腸管：異常な蠕動／運動性をもたらす平滑筋萎縮及び線維症；腎臓：小弓状及び小葉間動脈に影響して結果的に腎臓皮質血流を減少させ、タンパク尿症、高窒素血症及び高血圧をもたらす求心的皮下内膜増殖；骨格筋：萎縮、腸線維症、炎症；肺：間質性肺炎及び間質性線維症；及び心臓：収縮帯壊死、瘢痕化／線維症を含む。
【０１４９】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他を含む特発性炎症性ミオパシーは、未知の病因の慢性筋肉炎症であり、筋肉の弱体化をもたらす。筋肉損傷／炎症は対称的で進行性であることが多い。自己抗体は最大の形を伴う。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に含まれる成分、タンパク質及びＲＮＡの機能に対して産生され、それらを阻害する。
【０１５０】
シェーグレン症候群は、免疫媒介性炎症とそれに続く涙腺及び唾液腺の機能的破壊による。該疾患は、炎症性結合組織疾患に関連し、それを付随することがる。該疾患は、共に小さなＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する自己抗体生産に関連する。損傷は、乾燥性角結膜炎、口内乾燥をもたらし、タンパク質及び徴候又は関連は胆汁性肝硬変、末梢又は感覚神経障害、及び触知可能紫斑病を含む。
【０１５１】
全身性脈管炎は、一次病巣が炎症及びそれに続く血管への損傷であり、罹患した血管によって供給される組織への虚血／壊死／変性とある場合には最終的な末端組織の機能障害をもたらす。また脈肝炎は、二次病巣又は続発症として、他の免疫-炎症媒介疾患、例えば、慢性関節リウマチ、全身性硬化症などを起こし、特に疾患において免疫複合体の形成を伴う。原発全身性脈管炎の群は、全身性壊死性脈管炎：多発性動脈炎結節、アレルギー性血管炎及び肉芽腫症、多発性血管炎；ヴェーゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症；及び巨細胞性動脈炎を含む。その他の脈管炎は、粘膜皮膚リンパ節症候群（ＭＬＮＳ又は川崎病）、孤立性ＣＮＳ脈管炎、ベーチェット病、閉塞性血栓性血管炎（バーガー病）及び皮膚壊死性脈管炎を含む。列挙した脈管炎の殆どの型の病原機構は、主に血管壁での免疫グロブリン複合体の沈積及びそれに続くＡＤＣＣ、複合体形成の何れか又はその両方を介する炎症反応の誘発による。
【０１５２】
サルコイドーシスは、未知の病因の症状であり、身体の任意の組織近傍における類上皮肉芽腫の存在を特徴とし；肺が含まれるのが最も通常である。病原は活性化マクロファージ及び疾患部位のリンパ細胞の持続を含み、これらの細胞型によって放出される局所性又は全身性の生成物の放出からもたらされる慢性的な後遺症を持つ。
【０１５３】
自己免疫性溶血性貧血、免疫性汎血球減少症、及び発作性夜間血色素尿症を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞（ある場合には血小板などを含む他の血液細胞）の表面に表現される抗原と反応する抗体の産生の結果であり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介機構を介するこれらの抗体で被覆された細胞の除去を反映する。
【０１５４】
血小板減少性紫斑病、及び他の臨床的設定では免疫媒介血小板減少症、血小板破壊／除去を含む自己免疫性血小板減少症では、抗体又は補体の血小板への接着及びそれに続く補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ−レセプター媒介機構による除去の結果として生ずる。
【０１５５】
グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果であり、甲状腺に存在し、多くはそれに特異的であるタンパク質と反応する抗体の産生を伴う。存在する実験的モデルは、自発性モデル：ラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びニワトリ（肥満ニワトリ株）；誘発性モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）での動物の免疫化を含む。
【０１５６】
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫媒介腎疾患は、腎臓抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞の産生の結果として直接的な、あるいは他の非腎臓抗原に対して反応性の抗体及び／又は免疫複合体の腎臓内での沈積の結果として間接的な腎臓組織への抗体又はＴリンパ球媒介傷害の結果である。よって、免疫複合体の形成をもたらす他の免疫媒介疾患も免疫媒介腎疾患を後遺症として誘発しうる。直接的及び間接的免疫機構の両方とも病変の進行を生ずる／誘発する免疫反応をもたらし、結果的に器官機能の障害、或る場合には腎不全の進行を生ずる。体液性及び細胞性免疫機構は共に、病巣の病原に含まれる。
【０１５７】
好酸球性肺炎、特発性肺性線維症、及び過敏性肺炎を含む炎症性及び線維症性肺疾患は、制御不能な免疫反応を含みうる。その反応の阻害は治療的に有益である。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触皮膚炎を含む自己免疫性又は免疫媒介皮膚疾患は、自己抗体に媒介され、その病因はＴリンパ球依存性である。
【０１５８】
喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びじんま疹を含むアレルギー性疾患はＴリンパ球依存性である。これらの疾患は、主にＴ細胞誘発性炎症、ＩｇＥ媒介炎症、又はこれら両方の組みわせによって媒介される。
【０１５９】
IL20抗体の有効量、並びに全体の投薬計画は、疾患及び患者の臨床状態に応じて変動し得、これがついで臨床的に許容される疾患スコアのような一又は複数の臨床パラメータに反映されうることが理解されるであろう。例えば、関節リウマチでは、疾患の重篤度及び／又は治療の結果は、関節膨脹の数；疼痛；運動性；及び／又は公定の疾患スコアACR 20/50又は70をモニターすることによって評価することができる。1型糖尿病では、疾患の重篤度及び／又は治療の結果は、血糖値又はその変動、HblC量、必要なインスリン量等を測定することによって評価されうる。多発性硬化症では、脳炎を脳のスキャンによって評価することができる。造血系移植拒絶では、疾患の重篤度（生着の失敗）及び／又は治療の結果は、延長された好中球減少症、血小板減少症及び骨髄破壊的前処置を受けた患者における赤血球輸血依存性の証拠、及び骨髄非破壊的前処置を受けた患者におけるキメラ現象の観察の失敗によって評価されうる。一般に、本発明の方法及び組成物を使用しての治療結果に対する検出可能な効果は、他の治療の必要性の減少（例えば他の薬剤又は治療の量及び／又は期間の減少を含む）、入院の回数及び／又は期間の減少、病気により失われる労働日数の減少等を含む。有効量は値のマトリックスを構築し、マトリックスにおける種々の点を試験することにより、常套的な実験によって当業者が決定することができることが更に理解される。
【０１６０】
抗体の投与では、用量は約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は、０．０１から５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は約０．３ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重又は約１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例示的な治療レジメンは１週間に１回、１週間に２回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、１月に１回、３月毎に１回又は３から６月毎に１回の投与を必要とする。本発明の抗ｈＩＬ２０抗体のための例示的投与レジメンは静脈内投与又は皮下注射による１、３又は１０ｍｇ／ｋｇ体重を含み、抗体は次の投与スケジュールの一つを使用して投与される：（ｉ）１−３週毎に２−４回の投与の負荷投与後に二ヶ月毎；（ｉｉ）４週毎；（ｉｉｉ）毎週又は任意の他の最適な投与。幾つかの方法では、異なった結合親和性を持つ二以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、その場合、投与される各抗体の投与量は示した範囲に入る。抗体は通常は複数の機会に投与される。単一投与間の間隔は、例えば週毎、月毎、３ヶ月毎又は１年毎でありうる。間隔はまた患者における標的抗原の血中レベルを測定することによって示されるように不規則でありうる。ある方法では、投与量は、約１−１０００μｇ／ｍｌの血漿中抗体濃度を達成するように調節され、ある方法では、約２５−３００μｇ／ｍｌである。抗体はあるいは必要とされる投与頻度が少ない徐放性製剤として投与されうる。投与量及び頻度は患者における抗体の半減期に依存して変動する。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体が続く。投与の用量及び頻度は、治療が予防的か治癒的かに応じて変動しうる。予防的な投与では、相対的に低い投薬量が長い期間にわたって比較的少ない頻度で投与される。残りの生存期間にわたって治療を受け続ける患者もいる。治療的投与では、疾患の進行が減少するか終わるまで、また好ましくは患者が疾患の兆候の部分的な又は完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量がしばしば必要とされる。その後、患者には予防的レジメンで投与されうる。
【０１６１】
当業者には理解されるように、抗癌剤の適切な用量は、抗癌剤が単独で又は他の薬剤との併用で投与される臨床的治療に既に用いられているものに近似する。投与量の変動は治療される条件に応じて生じる可能性が高い。治療を担当する医師が個々の患者に対して適した用量を決定することができるであろう。
【０１６２】
製造品
本発明の他の実施態様では、上述の疾患の治療に有用な物質を含む製造品が提供される。例えば、該製造品は、ここに記載されたヒト又はヒト化抗ｈＩＬ２０抗体を含む容器を、自己免疫又は炎症性疾病又は疾患のような疾患を有効量の抗体で治療する指示を使用者に与える指示書と共に含みうる。該製造品は典型的には容器と該容器上に又は該容器に付随せしめられたラベル又はパッケージ挿入物を含む。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも一種の活性剤はここでのヒト又はヒト化抗ｈＩＬ２０抗体又は抗原結合断片又はかかる抗体を含む抗体誘導体（例えば免疫コンジュゲート）である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が、選択した症状、例えば関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、又はその組合せの治療に使用されることを示している。
【０１６３】
更に、製造品は、（ａ）組成物がそこに収容され、該組成物がここに記載されたヒト又はヒト化抗体を含む第一の容器と、（ｂ）組成物がそこに収容され、該組成物がヒト又はヒト化抗体以外の治療剤を含む第二の容器を含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二の組成物が自己免疫又は炎症性疾病又は疾患の治療のために併用できることを示すパッケージ挿入物を更に含みうる。かかる治療剤は先のセクションに記載した補助療法剤の任意のものでありうる。あるいは、又は加えて、製造品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含有する第二（又は第三）の容器を更に含みうる。他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
【実施例】
【０１６４】
本発明の更なる詳細を次の非限定的な実施例によって例示する。
実施例１：  ヒト抗ｈＩＬ２０抗体によるＩＬ２０−誘発増殖の阻害
ＩＬ２０Ｒ１＋ｈＩＬ２０Ｒ２（ここでは「ｈＩＬ２０Ｒ」）が形質移入されたＢａＦ−３細胞のｈＩＬ２０誘発増殖の効果を中和するヒト抗ｈＩＬ２０モノクローナル抗体の能力を調査するために一連の試験を実施した。
【０１６５】
材料及び方法
培地及びバッファー。培養培地：Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％の熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒカタログ番号ＤＥ１７−６０２Ｅ）、１ｍｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯカタログ番号１０１３１−０１９）、２００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ４５−０４３０）、１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−３（ＴｒｉＣｈｅｍ ＡｐＳカタログ番号２１３−１３）、５０μＭの２−メルカプト−エタノール（Ｇｉｂｃｏカタログ番号３１３５０−０１０）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ １６４０）。アッセイ培地：Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％の熱不活化ＦＢＳ、１％のＰ／Ｓ（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒカタログ番号ＤＥ１７−６０２Ｅ）、１ｍｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯカタログ番号１０１３１−０１９）、２００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ４５−０４３０）、５０μＭの２−メルカプト−エタノール（Ｇｉｂｃｏカタログ番号３１３５０−０１０）を含むＲＰＭＩ１６４０。アラマーブルー：（ＢｉｏＳｃｏｕｒｃｅ、Ｄａｌ１１００）を用いて増殖を評価した。蛍光強度を、励起５５５−１２ｎｍ及び発光５９０ｎｍでの分光蛍光光度計（ｂｍｇ ＰＯＬＡＲｓｔａｒ＋Ｇａｌａｘｙ）で測定した。
【０１６６】
抗体、細胞及びサイトカイン。ＦＣＡ中の２０μｇのヒトＩＬ−２０を皮下注射しついでＦＩＡ中の２０μｇのｈＩＬ２０を２回の注射してマウスを免疫化した。高レスポンダーマウスに２５μｇのｈＩＬ２０を静脈内注射して追加免役し、脾臓を３日後に収集した。脾臓細胞にミエローマ細胞株（Kohler、Go及びMilstein C. (1976), European J. Immunology, 6:511-19）を融合させた。上清を間接的なｈＩＬ２０−特異的ＥＬＩＳＡでヒトＩＬ−２０抗体の生産についてスクリーニングし、精製した。ウサギ抗ｈＩＬ２０ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を、ウサギに５０μｇのｈＩＬ２０を１４日間隔で４回免役し、１０μｇ／ｍｌのｈＩＬ２０を５回、月一回で免役して産生させた。血清を精製した（２３１３Ｂ）。ＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）細胞は、シグナル伝達及び転写タンパク質（ＳＴＡＴ）−プロモータエレメントの制御下でｈＩＬ２０Ｒ１（Ｚｃｙｔｏｒ７）及びｈＩＬ２０Ｒ２（Ｄｉｒｓ１）のための遺伝子とルシフェラーゼ担持プラスミドをトランスフェクトしたＢａＦ−３細胞株由来である。ＢａＦ−３細胞株はピロマイシン（Ｚｃｙｔｏｒ７）及びゼオジン（Ｄｉｒｓ１）中での選択によって産生され、Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから受け取った。
【０１６７】
刺激アッセイ。阻害アッセイにおいて使用されるｈＩＬ２０のレベルを評価するために初期の刺激アッセイを行った。ＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）細胞をアッセイ培地で十分に洗浄して残留するＩＬ−３を取り除いた。ついで、細胞を１０４−５×１０４細胞／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレート（平らなウェルの透明なプレートＰａｃｋａｒｄカタログ番号Ｓ００１９０）中に播種した。ｈＩＬ２０（１０−７Ｍから１０−１３Ｍ）の連続希釈物をウェルに加え、細胞を含むがｈＩＬ２０を含まない更なるウェルをネガティブコントロールとした。細胞を３日間３７℃で５％のＣＯ２中で培養した。培養期間の最後の６時間に、１０μｌのアラマーブルーを各ウェルに加えた。細胞について、励起５５５−１２ｎｍ及び発光５９０ｎｍにて分光蛍光光度計（ｂｍｇ ＰＯＬＡＲｓｔａｒ＋Ｇａｌａｘｙ）で蛍光強度を分析した。阻害分析では、一定濃度のＩＬ２０を用いて、細胞を刺激した。この濃度は、増殖アッセイにおいて最大刺激のおよそ９０％を元にして選択されたもので、我々のアッセイの殆どでは１０−９ＭのｈＩＬ２０に対応した。
【０１６８】
阻害アッセイ。１×１０４−５×１０４細胞／ウェルの洗浄したＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）  細胞を、アッセイ培地中のマイクロタイターウェルに加え、細胞だけを含むネガティブコントロールとして使用されるウェルを除いて、１０−９ＭのｈＩＬ２０（最終濃度）を各ウェルに加えた。この濃度はｈＩＬ２０サイトカインでの最大刺激のおよそ９０％に相当した。抗体（つまり、１００μｇ及び２倍の希釈）の連続希釈を、細胞及びサイトカインを既に含むウェルに加えた（細胞＋ｈＩＬ２０だけを含むポジティブコントロールに使用したウェルを除く）。細胞、サイトカイン及び抗体の混合物を３７℃で５％のＣＯ２中、１００μｌ／ウェル中で７２時間インキュベートした。インキュベーションの最後の６時間は１０μｌ／ウェルのアラマーブルーを含めた。プレートについて、励起５５５−１２ｎｍ及び発光５９０ｎｍにて分光蛍光光度計（ｂｍｇ ＰＯＬＡＲｓｔａｒ＋Ｇａｌａｘｙ）で蛍光強度を分析した。Ｐｒｉｓｍ４（GraphPad PRISM software Inc.）を使用して曲線を引き、作用強度（半数阻害濃度（ＩＣ５０））を計算した。作用強度は、１−（抗体の最大阻害／（サイトカインの初期刺激−サイトカインの刺激なし））＊１００％として計算した。
【０１６９】
結果
１０−９ＭのｈＩＬ２０でのＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）の初期刺激を用量応答曲線から選択した。一連の阻害アッセイの結果を表１に示す。作用強度（ＩＣ５０）は異なった阻害抗体間で様々であった。１５Ｄ２が最も強力な阻害剤の一つであり、アッセイ間変動は最も低かった。１５Ｄ２もまたポリクローナルウサギ抗ｈＩＬ２０抗体調製物と比較して高い親和性を有していた。
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【０１７０】
実施例２：  ＩＬ２０−、ＩＬ１９−又はＩＬ２４−誘発増殖の比較阻害
ヒト抗体１５Ｄ２を、カニクイザルＩＬ２０及びマウスＩＬ２０を中和するその能力について試験した。マウス及びカニクイザルＩＬ２０の双方ともＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）細胞において増殖を誘導することができる。１５Ｄ２をまたＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）においてｈＩＬ１９又はｈＩＬ２４によって誘導される増殖の阻害について試験した。ｈＩＬ２４及びｈＩＬ１９共ｈＩＬ２０Ｒ１＋ｈＩＬ２０Ｒ２レセプターに結合した。
【０１７１】
材料及び方法
培地とバッファー。実施例１を参照。
抗体、細胞及びサイトカイン。実施例１を参照。ヒト及びカニクイザルＩＬ２０を大腸菌中で産生させた。マウスＩＬ２０はＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  から得た。ヒトＩＬ１９  及びＩＬ２４はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから得た。
【０１７２】
刺激アッセイ。実施例１に記載されたものと同じ初期刺激アッセイを使用して、阻害アッセイで使用されるｈＩＬ２０、カニクイザルＩＬ２０及びマウスＩＬ２０の初期濃度を評価するために初期刺激アッセイを行った。ｈＩＬ１９及びｈＩＬ２４での初期刺激を同じ方法で評価した。阻害アッセイにおいて３通りの異なった初期濃度のＩＬ１９及びｈＩＬ２４を使用することに決めた。
【０１７３】
阻害アッセイ。（１）カニクイザルＩＬ２０及びマウスＩＬ２０誘発増殖に対する抗ｈＩＬ２０ｍＡｂの効果：１×１０４−５×１０４細胞／ウェルの洗浄したＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）細胞をアッセイ培地中のマイクロタイターウェルに加え、細胞だけを含むネガティブコントロールとして使用されるウェルを除いて、１０−９ＭのｈＩＬ２０、カニクイザルＩＬ２０又はマウスＩＬ２０（最終濃度）を各ウェルに加えた。この濃度はサイトカインでの最大刺激のおよそ９０％に相当した。抗体１４００−２５０−１５Ｄ２の連続希釈物（つまり、１００μｇ及び２倍希釈物）を、細胞及びサイトカインを既に含むウェルに加えた（細胞＋サイトカインだけを含むポジティブコントロールに使用したウェルを除く）。
（２）ｈＩＬ１９及びｈＩＬ２４誘発増殖に対する抗ｈＩＬ２０ｍＡｂの効果：１×１０４−５×１０４細胞／ウェルの洗浄したＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）細胞をアッセイ培地中のマイクロタイターウェルに加え、ネガティブコントロールとして使用され、細胞だけを含むウェルを除いて、３通りの異なった濃度のサイトカイン（１０８Ｍ、１０−９Ｍ及び１０−１０Ｍの最終濃度）を各ウェルに加えた。この濃度はサイトカインでの最大刺激のおよそ９０％に相当した。抗体１５Ｄ２（１００μｇ及び２倍の希釈物）の連続希釈を、細胞及びサイトカインを既に含むウェルに加えた（細胞＋サイトカインだけを含むポジティブコントロールに使用したウェルを除く）。
【０１７４】
双方のアッセイに対して、細胞、サイトカイン及び抗体の混合物を３７℃で５％のＣＯ２中、１００μｌ／ウェル中で７２時間インキュベートした。インキュベーションの最後の６時間は１０μｌ／ウェルのアラマーブルーを含めた。プレートについて、励起５５５−１２ｎｍ及び発光５９０ｎｍにて分光蛍光光度計（ｂｍｇ ＰＯＬＡＲｓｔａｒ＋Ｇａｌａｘｙ）で蛍光強度を分析した。Ｐｒｉｓｍ４（GraphPad PRISM software Inc.）を使用して曲線を引き、作用強度（半数阻害濃度（ＩＣ５０））を計算した。
作用強度は、１−（抗体の最大阻害／（サイトカインの初期刺激−サイトカインの刺激なし））＊１００％として計算した。
【０１７５】
結果
カニクイザルＩＬ２０及びマウスＩＬ２０誘発増殖に対する抗ｈＩＬ２０ｍＡｂの効果。  ＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）細胞をヒト、カニクイザル又はマウスＩＬ２０で刺激した場合、細胞は増殖し、この増殖は抗ｈＩＬ２０ｍＡｂ１５Ｄ２によって用量依存的に阻害することができた。１５Ｄ２の作用強度は３種全てのサイトカインに対して６６ｍＭのＩＬ２０でほぼ１００％近くであった。ｈＩＬ２０Ｒに対する親和性が３種のサイトカインに対して異なっていたので、抗体の作用強度は直接比較できなかった。
【０１７６】
ｈＩＬ１９及びｈＩＬ２４誘発増殖に対する抗ｈＩＬ２０ｍＡｂの効果。ＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）細胞を３通りの異なった濃度のｈＩＬ２０、ｈＩＬ１９又はｈＩＬ２４で刺激した（図５）。用量依存的応答がｈＩＬ２０誘発増殖の阻害に対して検出された（図５Ａ）。この実験は次のｈＩＬ１９及びｈＩＬ２４の実験に対するポジティブコントロールとなった。ＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）細胞が最初にｈＩＬ１９で刺激された場合、１５Ｄ２は、３通りの初期濃度のｈＩＬ１９のどれを使用したかにかかわらず増殖を阻害することができなかった（図５Ｂ）。同じ結果が、細胞を最初にｈＩＬ２４で刺激したときに得られた（図５Ｃ）。
【０１７７】
従って、１５Ｄ２は、ＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）細胞のカニクイザルＩＬ２０−誘導並びにマウスＩＬ２０−誘発増殖を阻害したが、ＢａＦ−３（ｈＩＬ２０Ｒ）のｈＩＬ１９又はｈＩＬ２４−誘発増殖は１５Ｄ２によっては阻害されなかった。
【０１７８】
実施例３：溶解性
ＨＥＫ２９３細胞中で生産され、同じプロセスで精製されたＩＬ２０に対する７つの異なったヒトＩｇＧ４抗体を、５０ｋＤのカットオフ量で、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（Millipore Corp, MA）タイプの遠心フィルターを使用して、溶液中の高濃度に達するその能力について比較した。全ての試料は１時間製造者の指示書に従って遠心分離した。抗体の初期濃度は０．５から１．８ｍｇ／ｍｌの範囲であり、全ての抗体を、２０ｍＭのリン酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に処方した。試験した抗体のＶＨ及びＶＬ配列をそれぞれ図４Ａ及び４Ｂに示す。
【０１７９】
表２は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ５０ｋＤ遠心フィルターを使用してヒト抗ＩＬ２０ＩｇＧ４抗体の濃縮後に得られた濃度及び回収率を示す。１５Ｄ２では、最も高い濃度（１００ｍｇ／ｍｌを越える）に至り、５Ｂ７では８０ｍｇ／ｍｌを越え、その双方がまた高い回収率を有していた。全ての抗体は、二量体化の増加サインを示した２Ｆ６を除いて、動的光散乱解析で見られるように、高濃度でその単量体構造を保持していた。
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【０１８０】
抗体重鎖及び軽鎖可変領域の可変領域アミノ酸及び／又は核酸配列の解析により、表３に示された生殖細胞系列配列が明らかになった。更なる抗体のＣ１１（実施例１を参照）をまた配列決定し、ＨＣが配列番号：２５の配列と、Ｆ５６タイプ１と同じＶＬを有していることが明らかになった。
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【０１８１】
実施例４：ｈＩＬ２０への抗体の結合
々のヒト抗ｈＩＬ２０抗体が組換えｈＩＬ２０に同時に結合することができたかどうかを決定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験をＢｉａｃｏｒｅＴ１００で実施した。比較のため、２６２．４．１．２．２．１、２６２．５．１．６．４．４及び２６２．７．１．３．２．４と命名され、国際公開第２００５／０５２０００号に記載された３つのＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２−中和ラット抗ｈＩＬ２０ｍＡｂｓを含めた。同時の結合不能性は共通の又はオーバーラップしているエピトープを示しているが、立体傷害又は高次構造変化が寄与しているかも知れない。
【０１８２】
材料と方法
該実験は固定された抗ｈＩＬ２０抗体を含むＣＭ５チップで実施した。各抗体を、標準的なアミンカップリングによって〜１０００ＲＵのレベルで別個のチップに固定した。全ての試料を流通バッファーＨＢＳ−ＥＰ（ｐＨ７．４）（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔ Ｐ２０）に希釈した。組換えｈＩＬ２０（１０μｇ／ｍｌ）を１８０秒注入し、ついで１５Ｄ２（１０μｇ／ｍｌ）を１８０秒注入した。
【０１８３】
結果
ヒト抗体１５Ｄ２及び５Ｂ７は組換えｈＩＬ２０に同時には結合することができず、共通又はオーバーラップするエピトープを示した。これに対して、１５Ｄ２は２６２．４．１．２．２．１、２６２．５．１．６．４．４又は２６２．７．１．３．２．４ｍＡｂｓの各々と同時に結合することができ、１５Ｄ２のエピトープが２６２．４．１．２．２．１、２６２．５．１．６．４．４及び２６２．７．１．３．２．４のものとは異なっていることを示している。
【０１８４】
実施例５：変性されたｈＩＬ２０への抗体の結合
この実験は、ヒト抗ＩＬ２０抗体がまた完全に重水素化された抗原に結合するかどうかを決定するために行われた。結合活性が検出されなかった場合、ペプチドアレイはエピトープマッピングには適していないであろう（以下参照）。重水素化抗原への結合を試験するために、天然及び変性ｈＩＬ２０調製物にＳＤＳ−ＰＡＧＥを施し、ついで検出のために１５Ｄ２及び５Ｂ７を使用してウェスタンブロットを続けた。
【０１８５】
材料と方法
組換えｈＩＬ２０を、５０ｍＭのＤＴＴを含む試料バッファー（ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１０分煮沸させることによって変性させた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（試料バッファーを含む２０ｕｌ／ウェル）に流し、ニトロセルロース膜にブロットした。膜を一次ｍＡｂ（ブロッティングバッファー中１０μｇ／ｍｌ（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と共にインキュベートした後、ＨＲＰ−結合ウサギ抗ヒトＩｇＧポリクローナルＡｂ（ＤＡＫＯ）と共にインキュベートした。ＴＭＢ−基質（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃｈ）を使用してバンドを可視化した。
【０１８６】
結果
１５Ｄ２及び５Ｂ７の双方が抗原の天然及び変性形態を認識し、エピトープが連続（線状）であることを示した。
【０１８７】
実施例６：ペプチド結合の表面プラズモン共鳴解析
ＳＰＲ実験を、抗ｈＩＬ２０抗体１５Ｄ２の２６２．４．１．２．２．１、２６２．５．１．６．４．４又は２６２．７．１．３．２．４が、成熟ｈＩＬ２０（配列番号：１）の残基１８−７８に対応するｈＩＬ２０（配列番号：２）の未加工前駆体の残基４２−１０２に対応する領域に結合するかどうかを決定するために実施した。抗体はｈＩＬ２０の天然及び変性形態の双方を認識することが示された（１５Ｄ２については、上記を参照）。
【０１８８】
材料と方法
１０残基のフレームシフトを持つ５つの２０ｍｅｒペプチドを合成した：
１）  ＩＲＮＧＦＳＥＩＲＧＳＶＱＡＫＤＧＮＩＤ（配列番号：１の残基１８−３７）
２）  ＳＶＱＡＫＤＧＮＩＤＩＲＩＬＲＲＴＥＳＬ（配列番号：１の残基２８−４７）
３）  ＩＲＩＬＲＲＴＥＳＬＱＤＴＫＰＡＮＲＳＳ（配列番号：１の残基３８−５７）
４）  ＱＤＴＫＰＡＮＲＳＳＬＬＲＨＬＬＲＬＹＬ（配列番号：１の残基４８−６７）
５）  ＬＬＲＨＬＬＲＬＹＬＤＲＶＦＫＮＹＱＴＰＤ（配列番号：１の残基５８−７８）
Ｎ末端ビオチンを含むペプチドを、ストレプトアビジン被覆（ＳＡ）チップ上での個々のフローセルに固定化させた（５００ＲＵ）。個々の抗体（５μｇ／ｍｌ）を全てのフローセルに１２０秒注入し、ついで１８０秒の解離相を続けた。実験はＢｉａｃｏｒｅ３０００及びＢｉａｃｏｒｅＴ１００機器で実施した。結果はＳｃｒｕｂｂｅｒ２ソフトウェア（BioLogic Software Pty Ltd）を使用して評価した。
【０１８９】
結果
ペプチドへの１５Ｄ２、２６２．５．１．６．４．４又は２６２．７．１．３．２．４の結合は検出されなかった。ラット抗ｈＩＬ２０ｍＡｂ２６２．４．１．２．２．１はペプチド４及び５への結合が証明され、これは、その共有された配列ＬＬＲＨＬＬＲＬＹへの結合を示している。全てのｍＡｂｓは固定化されたインタクトなビオチン標識ＩＬ２０へ結合することが証明された。
【０１９０】
実施例７：一次ペプチドアレイ（「ペプチドウォーク」）
４残基のフレームシフトを持つ１８ｍｅｒのｈＩＬ２０ペプチドからなるペプチドアレイを作製し、蛍光標識抗ｈＩＬ２０抗体１５Ｄ２又は５Ｂ７に対してスクリーニングした。
【０１９１】
材料と方法
エピトープアレイの合成。アレイ合成機（Multipep Spot、Intavis、Germany）で、製造者から提供されたプロトコルを本質的に使用し、エピトープマッピングアレイをセルロースシート（Aims-Scientific、Germany）上に合成した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸をＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、０．３Ｍのヒドロベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を含むＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）に溶解させて０．３Ｍの最終濃度とした。カップリングを、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）で活性化をすることによって行い、Ｆｍｏｃ基の脱保護を、ＮＭＰ中の２０％のピペリジンによって行った。個々の配列はアレイ合成機に付随するソフトウェアによって設計した。合成後、保護基を、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）を含むトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９５％でシートを６０分処理することによって除去した。ついで、ジクロロメタン（ＤＣＭ）及びＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）と、最後に水で洗浄した。
【０１９２】
抗体の標識。スクリーニングを蛍光標識抗体を使用して行った。標識は、ＮＡＰ５カラム（GE Healthcare）を製造者のマニュアルに従って使用して１％のＮａＨＣＯ３に対して抗体原液をゲル濾過することによって行った。この後、ＤＭＳＯに溶解させた２５モル当量の５（６）−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ、Ｃ１６０９）を添加した。カップリングを２時間継続させた後、ＴＲＩＳ洗浄バッファー（５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ＝７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＡｒｇＨＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）に対してゲル濾過を未結合フルオレセインを除去するために行った。
【０１９３】
アレイのスクリーニング及び分析。アレイのスクリーニングを、１０μｌの抗体を３０ｍｌのインキュベーションバッファー（０．５％のＢＳＡ、５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ＝７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＡｒｇＨＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）に添加することによって行った。シートを１−２時間インキュベートした後、洗浄バッファーで５回洗浄した。ついで、シートをレーザースキャナー（Typhoon 9410、GE Healthcare）を使用してスキャンし、イメージファイル（．ｇｅｌフォマット）を、専用のアレイソフトウェアＡｒｒａｙＰｒｏアナライザー（Media Cypernetics, USA）を使用して解析した。蛍光強度を測定し、数字に変換し、これを更なる解析のためにＰｒｉｓｍ５（GraphPad Software、USA）にエクスポートした。
【０１９４】
結果
図６に示された一次ペプチドアレイ解析からの結果は、１５Ｄ２及び５Ｂ７の双方が、前駆体（配列番号：２）の残基９７−１２０に対応する成熟ｈＩＬ２０（配列番号：１）中の残基７３−９６に対応する領域に位置する線形エピトープに結合することを明確に特定している。
【０１９５】
実施例８：二次ペプチドアレイ解析−末端欠失
エピトープの長さを狭くしてどの残基が抗ＩＬ２０抗体１５Ｄ２及び５Ｂ７の結合に重要であるのかを評価するために、様々なトランケーションのアレイを作製した。ａｌａ−スキャンをまた含めた（セクション５）。
材料と方法については、実施例７を参照のこと。
【０１９６】
結果
ｈＩＬ２０のＣ末端からのトランケーションは、ペプチド４から７の１５Ｄ２の結合に徐々の減少を明らかにした（図７Ａ）。結合活性におけるより急な低下が、Ｄ（Ａｓｐ）及びＨ（Ｈｉｓ）の除去が親和性を劇的に低減させたＮ末端トランケーションで見られた。総括すると、結果は、最小のエピトープが、配列番号：１の残基７８から９３に対応する配列ＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬを有していた。
【０１９７】
５Ｂ７では、トランケーションは、Ｎ末端から欠失させた場合に結合が急に低下することを明らかにした（図７Ｂ）。結合活性の約５０％の低下が、Ｄ（Ａｓｐ）を除去する場合のＮ末端トランケーションに見られたが、Ｈ（Ｈｉｓ）の除去は親和性を結合が検出できなくなるまで劇的に低下させた。Ｃ末端からの除去は、Ｎ（Ａｓｎ）の除去までは、それほど急ではない親和性の低下を生じた。総括すると、結果は、最小の５Ｂ７エピトープは配列ＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮ（配列番号：１の残基７８−９０）を有していたが、より長いエピトープＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦＬＴＩＫ（配列番号：１の残基７８−９６）はより高い親和性を提示したことを示している。これは、ある種の構造的要件、例えばα−ヘリックス依存性の存在を示している。
【０１９８】
Ａｌａスキャンの結果は、１５Ｄ２の場合、配列番号：１の３つの残基Ｈ７９（Ｈｉｓ−７９）、Ｒ８３（Ａｒｇ−８３）及びＮ９０（Ａｓｎ−９０）が結合に対して最も重要であったことを明らかに示している（図８Ａ）。またより少ない度合いではあるが感受性であるのは残基Ｄ７８（Ａｓｐ−７８）、Ｓ８６（Ｓｅｒ−８６）、Ｆ９２（Ｐｈｅ−９２）及びＬ９３（Ｌｅｕ−９３）であった。残基Ｈ７９及びＮ９０はまた５Ｂ７の結合に最も重要である一方、Ｒ８３（Ａｒｇ）はかなり重要に見えた（図８Ｂ）。
【０１９９】
結論として、ヒト抗ｈＩＬ２０抗体１５Ｄ２及び５Ｂ７は共に図１に示された類似の長さ及び特異性の線形のエピトープ（機能的）に結合する。ｈＩＬ２０前駆体（配列番号：２）中のＨ１０３、Ｒ１０７、及びＮ１１４に対応する成熟ｈＩＬ２０（配列番号：１）の残基Ｈ７９、Ｒ８３及びＮ９０（太字で一重下線）は最も重要であることが見出され、，残基Ｄ７８、Ｓ８６、Ｆ９２及びＬ９３（太字で二重下線）が中程度に重要である。二つの抗体間の主要な差は、Ｒ８３は、１５Ｄ２結合と比較して５Ｂ７結合に対して僅かに少ない重要度であった。
【０２００】
１５Ｄ２／５Ｂ７エピトープの位置及び最も重要な残基の部位は相同なタンパク質ＩＬ１９の結晶構造を使用して明らかにされている（Chang等 J Biol Chem 2003; 278: 3308）。エピトープの位置はＩＬ１９中のヘリックスＥに対応しており、ｈＩＬ２０中の最も重要な残基の配列番号：１のＨ７９、Ｒ８３、及びＮ９０は溶媒に暴露されていることが見出された。ｈＩＬ２０の残基Ｈ７９はｈＩＬ１９のプロリンであることに留意のこと。
【０２０１】
実施例９：ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のＩＬ２０活性化の中和
この実施例は、ヒト抗体１５Ｄ２が、組換え的に発現されたＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のマウス、カニクイザル、及びｈＩＬ２０活性化を中和できることを示す。
材料と方法
ＩＬ２０レセプターのクローニング。ヒトＩＬ２０レセプターのＩＬ２２Ｒ１（ＥＭＢＬＢＣ０２９２７３）、ＩＬ２０Ｒ１（ＥＭＢＬ ＡＦ１８４９７１）及びＩＬ２０Ｒ２（ＥＭＢＬ ＡＹ３５８３０５）をＮＨＥＫ（正常なヒト表皮角化細胞）ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ３，１＋（ゼオシン）（ＩＬ２２Ｒ１及びＩＬ２０Ｒ１）及びｐｃＤＮＡ３，１＋（ハイグロ）（ＩＬ２０Ｒ２）にクローニングした。マウスＩＬ２０レセプターのｍＩＬ２２Ｒ１（ＥＭＢＬ ＡＹ１０３４５４）、ｍＩＬ２０Ｒ１（ＥＭＢＬ ＡＫ０５４２１５）及びｍＩＬ２０Ｒ２（ＥＭＢＬ ＢＣ１０７２６４）を、それぞれ鋳型としてマウス肝臓、精巣及び皮膚ｃＤＮＡを使用してＰＣＲによってクローニングした。これらのＩＬ２０Ｒ配列の各々をその全体について出典明示により援用する。ｍＩＬ２２Ｒ１及びｍＩＬ２０Ｒ１ ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３，１＋（ゼオ）中に、ｍＩＬ２０Ｒ２をｐｃＤＮＡ３，１＋（ハイグロ）中にクローニングした。カニクイザルＩＬ２０レセプターのｃｙｎｏＩＬ２２Ｒ１（配列番号：２８）、ｃｙｎｏＩＬ２０Ｒ１（配列番号：２６）及びｃｙｎｏＩＬ２０Ｒ２（配列番号：２７）を、カニクイザル皮膚ｃＤＮＡを使用してＰＣＲによってクローニングした。ｃｙｎｏＩＬ２０Ｒ１及びｃｙｎｏＩＬ２２Ｒ１レセプターをｐｃＤＮＡ３，１＋（ゼオシン）中に挿入し、ｃｙｎｏＩＬ２０Ｒ２をｐｃＤＮＡ３，１＋（ネオマイシン）中に挿入した。
【０２０２】
次の５’及び３’プライマーをコード化ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用した。
ヒトＩＬ２２Ｒ１：ａｇａａｔｔｃｃａｃｃａｔｇａｇｇａｃｇｃｔｇｃｔｇａｃｃａ及びｇｃｔｃｇａｇａｃａｇｇｇａｇｇａａｇｃａｃｃａａｇ（配列番号：２９及び３０）
ヒトＩＬ２０Ｒ１：ｃｇａａｔｔｃｃｃｔｔｇｇｔｔｔｃｔｇｇｇｇａａｇ及びｇｃｔｃｇａｇｃａｃａｇｇａａａｃａａａａｇｇｃａａａ（配列番号：３１及び３２）
ヒトＩＬ２０Ｒ２：ａｇａａｔｔｃｔｇｇａａａｇａａａｃａａｔｇｔｔｃｔａｇｇｔｃａａ及びｇｃｔｃｇａｇｃｔｔｃａｃｃｔｇｇｇｃｃｃｔｔｃｃ（配列番号：３３及び３４）
マウスＩＬ２２Ｒ１：ｃｃｇａａｔｔｃｇｃｃａｃｃａｔｇａａｇａｃａｃｔａｃｔｇａｃｃａｔｃ及びｃｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａｇｇａｔｔｃｃｃａｃｔｇｃａｃａｇｔｃ（配列番号：３５及び３６）
マウスＩＬ２０Ｒ１：ｔｔｇａａｔｔｃｇｃｃａｃｃａｔｇｃａｃａｃｔｃｃｃｇｇｇａ及びｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔａｇｃｔｔｔｃｃａｔｔｔｇｔａｃａｔｇｔａａｃｃ（配列番号：３７及び３８）
マウスＩＬ２０Ｒ２：ｔｔｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇａｔｔｔｃｃｃａｇｇｇａｇｔｃｔｇ及びｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａａｇｔｃｔｇｔｇａｇａｔｃｃａｇａｃ（配列番号：３９及び３０）
カニクイザルＩＬ２２Ｒ１：ａｇａａｔｔｃｃａｃｃａｔｇａｇｇａｃｇｃｔｇｃｔｇａｃｃａ及びｇｃｔｃｇａｇａｃａｇｇｇａｇｇａａｇｃａｃｃａａｇ（配列番号：４１及び４２）
カニクイザルＩＬ２０Ｒ１：ｇｔｇｇｇａｃｔｇａｇｃａｇｔｃｔｇｃｔｇ及びａｇｇｃａａａａｇｇａａｇｔｇｔｔｇｇｃａ（配列番号：４３及び４４）
カニクイザルＩＬ２０Ｒ２：ａｇａａｔｔｃｔｇｇａａａｇａａａｃａａｔｇｔｔｃｔａｇｇｔｃａａ及びｇｃｔｃｇａｇｃｔｔｃａｃｃｔｇｇｇｃｃｃｔｔｃｃ（配列番号：４５及び４６）
ＳＴＡＴ−レポーターＫＺ１３６は、ＳＴＡＴ−エレメント及び血清応答配列（ＳＲＥ）を含むルシフェラーゼレポーターである（Poulsen-LK等 J Biol Chem 1998; 273:6228-6232）。
【０２０３】
一過性形質導入でのルシフェラーゼアッセイ。０日目：ＢＨＫ細胞をＴ８０フラスコ中に４０％のコンフルエンシーになるまで播種した。１日目：７．５マイクログラムのＤＮＡを、製造者のマニュアルに従って３６マイクロリットルのＦｕＧｅｎｅ（Roche Applied Science）と、２．５マイクログラムのレセプター鎖１（ＩＬ２０Ｒ１又はＩＬ２２Ｒ１）及び２．５マイクログラムの鎖２（ＩＬ２０Ｒ２）及び２．５マイクログラムのルシフェラーゼレポーター（ＫＺ１３６）を使用して形質導入した。２日目：細胞をＶｅｒｓｅｎｅ使用して剥離し、ウェル当たり２０，０００細胞を暗い色のプレートに播種した。細胞がウェル表面に再び付着した後、培地を無血清培地に交換した。３日目：２０マイクロリットルの１０ｍＭのＩＬ２０又は２０マイクロリットルの無血清培地の何れかをウェルに加えた。４時間後、ルシフェラーゼ活性を決定した；培地を取り除き、１００マイクロリットルの１×ＰＢＳを各ウェルに加えた後、１００マイクロリットルのＬｕｃｌｉｔｅ基質（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を加えた。プレートを３０分インキュベートした。発光をＴｏｐｃｏｕｎｔ ＮＸＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって検出した。ここで使用されるＩＬ２０は、大腸菌中で生産された組換え的に生産されたｈＩＬ２０か、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅから購入したマウスＩＬ２０の＃ＰＭＣ０２０１、又はＨＥＫ２９３ ６Ｅ細胞中で一過性発現によって生産され精製されたカニクイザルＩＬ２０の何れかである。
【０２０４】
結果
マウスＩＬ２０の中和。マウスＩＬ２０レセプターをクローニングし、一過性ルシフェラーゼレポーターアッセイをＢＨＫ細胞において設定した。二つのヒトレセプター複合体と二つのマウスレセプター複合体の双方を１ｎＭのマウスＩＬ２０で刺激した。マウスＩＬ２０はヒト及びマウスＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体の双方を活性化させることができた。１５Ｄ２による中和をレセプター複合体．の一つで試験した。マウスＩＬ２０Ｒ２／ＩＬ２２Ｒ１複合体を、ＳＴＡＴ３レポーターコンストラクトと共にＢＨＫ細胞に形質移入した。レセプター複合体を１ｎＭのマウスＩＬ２０で刺激し、１、１０及び５０マイクログラム／ｍｌの用量で１５Ｄ２抗体に暴露した（図９）。最も低い用量の１マイクログラム／ｍｌが効果を殆ど完全に中和した。
【０２０５】
カニクイザルＩＬ２０の中和。カニクイザルＩＬ２０レセプター配列ＩＬ２０Ｒ１、ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１を、ヒト配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、カニクイザル皮膚組織ｃＤＮＡからクローニングした。カニクイザル及びヒトレセプター配列間のそれぞれの配列同一性は、ＩＬ２０Ｒ１に対して９６．８％、ＩＬ２０Ｒ２に対して９８．９％、及びＩＬ２２Ｒ１に対して９５．５％であった。ＢＨＫ細胞に二つのレセプター複合体のＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２又はＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２をＫＺ１３６（ＳＴＡＴ３ルシフェラーゼレポーター）プラスミドと共に形質移入した。カニクイザルＩＬ２０Ｒ２／ＩＬ２２Ｒ１複合体を、１ｎＭのｃｙｎｏＩＬ２０を使用して３−４倍誘導した。カニクイザル由来のＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２複合体を約２倍刺激した。１５Ｄ２の量の増加はＩＬ２０活性を減少させ、１５Ｄ２がカニクイザルＩＬ２０を中和できることを示している（図１０）。
【０２０６】
ｈＩＬ２０の中和。ヒトＩＬ２０レセプターのＩＬ２０Ｒ１、ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１をＮＨＥＫ（正常なヒト表皮角化細胞）ｃＤＮＡからクローニングした。ＩＬ２０レセプターをコードする発現プラスミドを、ルシフェラーゼレポーターベクターＫＺ１３６と共にＢＨＫ細胞に形質移入した。１ｎＭのｈＩＬ２０を使用して刺激を行い、約３倍の誘導が見られた。１５Ｄ２抗体の量の増加はＩＬ２０活性を減少させた（図１１）。
【０２０７】
実施例１０：ｈＩＬ２０−誘発増殖の阻害
この実施例は、ＩＬ２０Ｒ１及びＩＬ２０Ｒ２（ここでは「ｈＩＬ２０Ｒ」）、及び１５Ｄ２が結合したＩＬ２０の形態を発現するＢａＦ−３細胞のＩＬ２０−誘発増殖に対する１５Ｄ２及びラット抗ｈＩＬ２０ｍＡｂｓの阻害効果を評価する。
【０２０８】
材料と方法
３組の独立した実験（「１４８」、「１４９」及び「１５０」）では、４つの試験したａｂｓのＥＣ５０値を比較した。最初に、抗体を３倍連続希釈して培地中に５０ｕｌ／ウェルで加えた。同時に１０μｌのｈＩＬ２０を各ウェルに加え、最後に４０μｌの細胞懸濁液を加えた。抗体を３倍連続希釈し（１００＋２００）、該アッセイでの最初の希釈は２０μｇ／ｍｌである。ｈＩＬ２０調製物を希釈して１０−７Ｍとし、アッセイで１０−８Ｍまで希釈した。コントロールとして、次の刺激曲線を作成した：ｈＩＬ２０を１０−６Ｍまで希釈し、これから１０倍希釈列を得た。アッセイにおける最初の希釈は１０−７Ｍであった。
【０２０９】
ヒトＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２を組換え的に発現するＢａＦ−３細胞を遠心分離し、ＩＬ３を含まない培地に再懸濁させ、計数した。ついでそれらをＩＬ３を含まない培地で２回洗浄し、１０４ｃ／ウェルの濃度及び４０μｌで９６ウェルの平底の透き通ったプレートに加えた。細胞の希釈：１０４ｃ／４０μｌ、２，５×１０６ｃ／１０ｍｌ（２プレートで十分）。ＣＯ２インキュベータでの３日間のプレートのインキュベーション（５％ＣＯ２、３７℃）。アラマーブルー１０μｌ／ｗを添加し、６時間のインキュべーション後に、プレートを、Ｐｏｌａｒｓｔａｒ蛍光計、励起５５０−１２ｎｍ及び発光５９０ｎｍで測定した。
【０２１０】
１５Ｄ２がＩＬ２０の可溶性型又はＩＬ２０のレセプター結合型に結合したかどうかを調べるために、５Ｄ２が３倍連続希釈で加えられた実験の設定が設計された。同時に、１０μｌのｈＩＬ２０をウェルに加え、続いて４０μｌのＢａＦ３（ｈＩＬ２０Ｒ＝ｈＩＬ２０Ｒ１及びｈＩＬ２０Ｒ２）細胞懸濁液を加えた。最後に、ｈＩＬ１９を同時に（ｔ＝０）又は１分後に（ｔ＝１）加えた。
【０２１１】
結果
示されたｈＩＬ２０の濃度の関数としての増殖を試験する最初の実験から、１０−８ＭのｈＩＬ２０での抗体のＥＣ５０値を測定することが選択された。
３組の独立した実験はＩＬ２０誘発増殖に対する抗体の阻害効果を試験した。ＥＣ５０値を、上値及び下値を伴い、また伴わないで計算した。後者は３組の独立した実験間で良好な相関を与えており、阻害効果を比較するために使用した（曲線はＰｒｉｓｍで「可変の傾きを持つシグモイド用量応答」によってフィットさせた）。以下の表４は、ＩＬ２０Ｒ１及びＩＬ２０Ｒ２を発現するＢａＦ−３細胞のＩＬ２０−誘発増殖の阻害のためのＥＣ５０値を比較する３つの実験のＥＣ５０値を示す。
2011526591.tif 000006
【０２１２】
ＥＣ５０値をチューキーポスト検定で一方向ＡＮＯＶＡによって解析した。１５Ｄ２、２６２．４．１．２．２．１及び２６２．７．１．３．２．４の全てが、２６２．５．１．６．４．４よりも有意に良好にＩＬ２０Ｒ形質移入ＢａＦ−３細胞においてＩＬ２０誘発増殖を阻害した。２６２．４．１．２．２．１及び２６２．７．１．３．２．４に対する平均ＥＣ５０値は１５Ｄ２のものよりも低いが、差は統計的には有意ではなかった（Ｐ＜０．０５）。１５Ｄ２がＩＬ２０の可溶性又はレセプター結合形態に結合したかどうかを調べるアッセイに関しては、結果は、ＩＬ１９の添加がＩＬ２０−誘発増殖の１５Ｄ２によるブロックを復帰させたことを示している（図１２）。これは、１５Ｄ２はｈＩＬ２０ＲへのＩＬ２０の結合を防止したが、１５Ｄ２はレセプターへのＩＬ１９の結合を防止しなかったことを意味している。よって、１５Ｄ２はＩＬ２０の可溶型に結合したが、レセプター結合型に結合せず、これはレセプターへのＩＬ１９のアクセスをブロック等する。
【０２１３】
実施例１１：ＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２のＩＬ２０活性化の中和
この実施例は、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるヒトＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体を介したＩＬ２０−誘導シグナル伝達に対するヒト抗体１５Ｄ２及びラット抗ｈＩＬ２０ｍＡｂｓの阻害効果を示す。
【０２１４】
材料と方法
ヒトＩＬ２０レポーター細胞株の生成。ｐｃＤＮＡ３，１＋（ハイグロ）プラスミド中のヒトＩＬ２０Ｒ２、ｐｃＤＮＡ３，１＋（ゼオシン）プラスミド中のＩＬ２２Ｒ１及びＳＴＡＴ３レポータープラスミドＫＺ１３６（ネオマイシン）をＢＨＫ細胞に形質移入し、２００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシン、４００ｕｇ／ｍｌのゼオシン及び６００ｕｇ／ｍｌのジェネテシンによって選択した。クローンを取り上げ、最大のＩＬ２０応答性のクローンを選択し、「ＢＨＫ １−Ｂ４」とした。ＢＨＫ１−Ｂ４細胞株は、基底レベル（刺激なし）と比較して１０ｎＭのＩＬ２０にルシフェラーゼの読み取り値でおよそ１０倍応答する。
【０２１５】
安定なＢＨＫ１−Ｂ４細胞におけるルシフェラーゼアッセイ。ＢＨＫ１−Ｂ４を９６ウェルプレートに２００００細胞／ウェルで播種した。播種から１６時間後に、細胞を、１０ｎＭのＩＬ２０又は１０ｎＭのＩＬ２０と抗体又はそのままの培地との混合物で刺激した。細胞を４時間刺激し、培地を取り除き、１００ｕｌのＰＢＳ（Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋を含む）及び１００ｕｌのルシフェラーゼ基質（Ｓｔｅａｄｙ−ＧＬＯ）をウェルに添加した。プレートを３０分インキュベートした。発光をＴｏｐｃｏｕｎｔＮＸＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって検出した。
【０２１６】
結果
抗ＩＬ２０抗体によるｈＩＬ２０の中和。安定な細胞株ＢＨＫ１−Ｂ４を、ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒを発現するプラスミド及びＳＴＡＴ３ルシフェラーゼレポータープラスミドＫＺ１３６の安定な形質移入によって産生した。細胞に添加する前に抗体をＩＬ２０と混合した。ＩＬ２０濃度は１０ｎＭに維持する一方、抗体を３倍希釈で１３３ｎＭから０．１９ｎＭの範囲で添加した。用量応答曲線を４種の抗体に対して得て、ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで「可変の傾きのシグモイド用量応答」にフィットさせた曲線に基づいて計算した（表４）。１５Ｄ２は、２６２．４．１．２．２．１と同じほど効果的に、また２６２．５．１．６．４．４及び２６２．７．１．３．２．４より良好にｈＩＬ２２Ｒ１／ｈＩＬ２０Ｒ２を介してのシグナル伝達を中和した。
2011526591.tif 000007
【０２１７】
実施例１２：動態パラメータの決定
タンパク質相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析を使用してリアルタイムでモニターすることができる。この実施例は、組換えｈＩＬ２０に対する親和性についてハイブリドーマ産生及び／又は組換え的に発現されたヒト抗ＩＬ２０抗体の１５Ｄ２及び５Ｂ７を特徴付けるためのＢｉａｃｏｒｅ３０００及びＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器でのＳＲＰ分析を記載する。
アフィニティ実験は、センサーチップ表面のカルボキシメチル化デキストラン膜（ＣＭ５）へ遊離のアミン基を介して共有的にカップリングさせたモノクローナル抗体を用いて、直接的結合手順を使用して実施した。組換えｈＩＬ２０を様々な濃度で注入し、センサーチップ表面上に一定のバッファー流を流して解離期間を続けた。この実験の設計を使用し、固定されたモノクローナル抗体に対するｈＩＬ２０の結合を、一つの抗体結合部位に一つのｈＩＬ２０分子が結合する１：１結合とみなした。相互作用の動態パラメータは１：１の相互作用ラングミュアフィッティングモデルを使用して計算することができた。
【０２１８】
材料と方法
ハイブリドーマ細胞によって発現された１５Ｄ２野生型（ｗｔ）、ＨＥＫ２９３細胞中で発現された１５Ｄ２−ｗｔ、ＨＥＫ２９３細胞中で発現されたＳ２４１Ｐ変異を有する１５Ｄ２、ＣＨＯ細胞中で発現された１５Ｄ２−Ｓ２４１Ｐ、及びハイブリドーマ細胞によって発現された５Ｂ７−ｗｔを分析した。精製されたモノクローナル抗体をＣＭ５タイプセンサーチップ上の個々のフローセルに固定化した。固定化は標準的なアミンカップリング手順を使用して実施し、１０００共鳴単位（ＲＵ）の固定化レベルを目標とした。抗体を５μｇ／ｍｌまで１０ｍＭのＮａＡｃ ｐＨ５．０に希釈した。ＨＰＳ−ＥＰ ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のポリソルベートＰ２０）をランニングバッファーとして使用し、組換え体ｈＩＬ２０に対して希釈剤とした。組換え体の精製ｈＩＬ２０を１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び３．１２５ｎＭに希釈した。結合（注入）は３分で、それに３０分の解離（洗浄）期間が続いた。流量は３０μｌ／分であった。実験は２５℃で実施した。各サイクル後の表面の再生は、３０ｕｌ／分の流量で１０ｍＭのＧｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ（ｐＨ１．８）のパルスを３０秒注入することにより達成した。全フローセル中の検出は同時であった。フローセル１番は固定化抗体を含んでおらず、バックグラウンド及びバルクの減算に使用した。動態パラメータは、１：１のラングミュア結合モデルを使用する所定の抗体・抗原の組合せに対してデータを局所的にフィッティングさせることによって計算した。動態パラメータの計算の前に物質輸送の制限に対してデータを検査した。実験はＢｉａｃｏｒｅ３０００及びＴ１００機器で実施した。データは、Ｂｉａｅｖａｌ４．１及びＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを使用して評価した。
【０２１９】
結果
個々の抗体に対する組換えｈＩＬ２０の結合に対して計算された親和性を、以下の表６に列挙し、個々の抗ＩＬ２０モノクローナル抗体の速度定数と親和性を示す。親和性はモル濃度単位（Ｍ）、（１／Ｍｓ）での結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅｓ）及び（１／ｓ）での解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅｓ）で列挙する。速度定数は親和性の下に括弧で（結合速度／解離速度）のように列挙する。
抗原の組換え体を用いて、使用されたバッファーで有効な親和性の定量は、１５Ｄ２−ｗｔＨＥＫ２９３及び１５Ｄ２−Ｓ２４１ＰＣＨＯ双方のＫＤ値が低いｐＭ範囲にあることを証明した。更に、ハイブリドーマにより発現された抗体の親和性は１５Ｄ２−ｗｔ及び５Ｂ７−ｗｔの約０．５ｎＭのＫＤを示した。
2011526591.tif 000008
実施例１３：ＩＬ２０上の１５Ｄ２結合界面
この実施例は、ＨＸ−ＭＳ技術を使用してｈＩＬ２０上の１５Ｄ２結合界面を同定する。他の定義を示さない限り、この実施例におけるｈＩＬ２０アミノ酸残基の番号付けは、Ｎ末端Ｍｅｔ（Ｍ）残基を持つ配列番号：１（つまり、この実施例中の残基Ｙ６７が配列番号：１の残基Ｙ６６に対応する）のことを言う。
ＨＸＭＳは、インビボ条件を模倣できる可能性を提供する（例えば、Wales及びEngen, Mass Spectrom. Rev. 25, 158 (2006)、及びCoales等, Rapid Commun. Mass Spectrom. 23, 639 (2009)を参照）。ここで使用されるＨＸ−ＭＳ技術は、ＩＬ２０中のどの表面暴露アミド水素が１５Ｄ２抗体結合時に溶媒との交換からシールドされるようになったかについての情報を提供し、それによって結合界面のマッピングを容易にした。更に、該方法はまたＩＬ２０における多くの間接的な構造的効果を明らかにしうる。ここでは幾つかの領域で見られるように１５Ｄ２結合時の構造の僅かな安定化として観察される。
アミド水素／重水素交換（ＨＸ）は、対応する重水素化バッファー（つまり２５ｍＭのＭＥＳ、８０ｍＭのＮａＣｌ、９６％のＤ２Ｏ、ｐＨ６．４（未修正値））中に１５Ｄ２（Ｆａｂ断片）の存在又は不存在下でＩＬ２０を２３倍希釈させることによって開始した。非重水素化コントロールは、同一のプロトン化バッファー中への希釈によって調製した。全ＨＸ反応は２０℃で実施し、５μＭの１５Ｄ２の不存在又は存在下で４μＭのＩＬ２０を含めた。予備データはこれらのタンパク質濃度でＩＬ２０結合が十分に飽和することを証明した。
適切な時間間隔で、ＨＸ反応の一定分量を、等容量の氷冷クエンチングバッファー（ＮａＯＨを使用してｐＨ２．５に調節した１．３５Ｍのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）によってクエンチし、２．６の最終ｐＨ（未修正値）とした。クエンチした試料を、ペプシン消化、迅速な脱塩及び質量分析のために冷却された超高圧液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）−質量分析システム（以下に詳細に記載）に直ぐに注入した。
全ての試料調製、ハンドリング及び注入は、ＨＤ−ｘＰＡＬ自動サンプラー（LEAP Technologies Inc.）によって実施した。タンパク質及びクエンチ溶液は２℃に保ち、重水素化バッファー及び標識反応物は２０℃に保持した。１５℃に温度制御したクーリングボックスには、注入及び切替え弁、管材、ポンプ及びカラムを含めた。ペプシンカラム（Applied Biosystems）、ＶａｎＧｕａｒｄ Ｃ１８トラッピングカラム（Waters）及びＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７ｕｍ、２．１×１００ｍｍの分析カラム（Waters Inc）を使用した。ＬＣ流を、Ｈ２Ｏ中の０．１％ギ酸及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸を使用してＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣポンプから移送した。Ｑ−ＴｏＦプレミアを質量分析に使用した（Waters Inc）。
【０２２０】
消化性ペプチドは、標準的なＭＳ／ＭＳ法を使用する別個に実験で同定した。ペプチド同位体エンベロープの平均質量は、ソフトウェアＨＸＥｘｐｒｅｓｓ（Weis等、J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17、1700 (2006)）を使用して、ロックマス修正重心法データ（ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア、Waters Inc.を使用して処理）から決定した。
【０２２１】
ＩＬ２０の一次配列の９３％をカバーする２２のペプチドのＨＸ時間過程を、１５Ｄ２の存在下及び不在下でモニターした（図１３）。観察されたＩＬ２０交換パターンは二つの異なった群に分けることができた。一つの群のペプチドは、１５Ｄ２の結合によって殆ど影響されなかった交換パターンを示した。例えば、ペプチド１２７−１４５は、１５Ｄ２の結合によって影響されなかったＩＬ２０の領域を表した。しかしながら、あるものは、１５Ｄ２結合時のタンパク質構造の僅かな安定化のために３０秒で僅かな交換の減少を示した。例えば、ペプチド１７−３８、６０−６６及び１４６−１５３は、結合エピトープの外側であっるが１５Ｄ２結合時に僅かな構造的安定化を示すかも知れない領域を表した。これに対して、ペプチドＩＬ２０の他の群は、１５Ｄ２結合時の交換から、３を越える重水素の強い保護を示す。ペプチド６７−８３、６７−９３、６９−８９、６９−９３及び８４−９３は、１５Ｄ２の結合エピトープの一部であったペプチドを表した。よって、１５Ｄ２結合時に保護を示す領域は、残基６７−９３からのペプチドを包含した。例えば、Ｄ２Ｏとの３０秒の交換で、およそ１０のアミドが、１５Ｄ２結合時の領域６９−９３における交換から保護された。１５Ｄ２結合時の交換からシールドされた特定のペプチド及び重水素の数を図１４に示すが、図中、Ｄ２Ｏでの３０秒の交換後に得られた情報はより少ない残基にサブ局在化された。
【０２２２】
１５Ｄ２結合界面は、よって、配列ＶＦＫＮＹＱＴＰＤＨＹＴＬＲＫＩＳＳＬＡＮＳＦを含み、配列番号：１の残基７０−９２に対応する残基７１−９３に局在化されていた。しかしながら、残基７１−８３を含む領域は、１５Ｄ２結合時に重水素交換から少ない度合いで保護されていた。これは、この領域における全体の１５Ｄ２結合が堅固ではなく、これらの残基の一部分だけが１５Ｄ２結合に関与していた可能性が高いことを示している。残基８４−８５は１５Ｄ２結合時に交換から完全に保護されたことが示されており、配列番号：１の残基８３−９２に対応する領域８６−９３はまた１５Ｄ２結合によって非常に影響を受けていた。
【０２２３】
ここに引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が個々にかつ特に出典明示により援用され、その全体がここに記載されているのと同じ程度に、出典明示によりここに援用される。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、決して本発明を限定するものとは解してはならない。
本明細書中で特段明記又は明らかに矛盾しない限り、全ての考えられる変更において上記の要素の何れの組み合わせも本発明に包含される。
発明を記述する際に使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」なる用語及び同様の指示対象は、ここで別の記載がなされていないか、文脈上はっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーしていると解されるものである。
【０２２４】
本明細書中の値の記載は単に、その範囲内にあるそれぞれ別々の値を個々に示す方法を短縮して示すことを意図しているだけであって、本明細書中で明記されない限り、それぞれ別々の値は、個別に挙げられているものとして本明細書中に組み込まれている。特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である（例えば、特定の因子又は測定に対して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる）。
本明細書中で特段明記又は明らかに矛盾しない限り、本明細書中に記載のすべての方法は任意の好適な順序で行われうる。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語（例えば「等」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に別段の記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も、明示的に記載していない限り、如何なる要素も本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
【０２２５】
ここでの特許文献の引用及び援用は便宜上のものであって、このような特許文献の有効性、特許性及び／又は権利行使性についての見解を反映するものではない。
他に言及しない又は前後関係ではっきりと矛盾していない限りは、要素又は要素群に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含んでいる」等の用語を使用する本発明の任意の態様又は実施態様のここでの記載は、その特定の要素又は要素群「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含む」本発明の類似した態様又は実施態様をサポートすることを意図したものである（例えば、特定の要素を含むものとしてここに記載されている組成物は、他に言及しない限り又は前後関係ではっきりと矛盾していないならば、その要素からなる組成物をまた記載しているものと理解すべきである）。
本発明は、適用される法律によって許容される最大の範囲で、ここに提示された態様又は特許請求の範囲に記載された主題事項のあらゆる変形例及び均等物を含む。
【０２２６】
例示的実施態様
次は本発明の例示的な非限定的実施態様である。
１．ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のＩＬ２０媒介活性化を低減させる単離された抗ヒトＩＬ２０抗体又はその抗原結合断片。
２．ヒトＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のヒトＩＬ２０媒介活性化を低減させる実施態様１の抗体又はその抗原結合断片。
３．カニクイザルＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のカニクイザルＩＬ２０媒介活性化を低減させる先の実施態様の何れかの抗体又は抗原結合断片。
４．マウスＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のマウスＩＬ２０媒介活性化を低減させる先の実施態様の何れかの抗体又は抗原結合断片。
５．ＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２及び／又はＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体へのＩＬ２０の結合を低減させる先の実施態様の何れかの抗体又は抗原結合断片。
６．ＩＬ２０Ｒ２へのＩＬ２０の結合を低減させる先の実施態様の何れかの抗体又は抗原結合断片。
７．ＩＬ１９又はＩＬ２４のＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２又はＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体への結合を低減させない実施態様１−４の何れかの抗体又は抗原結合断片。
８．場合によってはＤ７８を除く、成熟ヒトＩＬ２０（配列番号：１）のＤ７８−Ｈ１０３から選択される少なくとも一つの残基を含むエピトープに結合する、先の実施態様の何れかの抗体又は抗原結合断片。
９．エピトープが、Ｄ７８−Ｋ９６から選択される少なくとも一つの残基を含む実施態様８の抗体又は抗原結合断片。
１０．エピトープが、Ｄ７８−Ｌ９３又はＲ８３−Ｆ９２から選択される少なくとも一つの残基を含む実施態様９の抗体又は抗原結合断片。
１１．エピトープが、Ｈ７９−Ｎ９０から選択される少なくとも一つの残基を含む実施態様９の抗体又は抗原結合断片。
１２．エピトープが、Ｄ７８−Ｈ１０３から選択される少なくとも３つの残基を含む実施態様８の抗体又は抗原結合断片。
１３．エピトープが、Ｄ７８−Ｋ９６から選択される少なくとも３つの残基を含む実施態様１２の抗体又は抗原結合断片。
１４．エピトープが、Ｄ７８−Ｌ９３又はＲ８３−Ｆ９２から選択される少なくとも３つの残基を含む実施態様１３の抗体又は抗原結合断片。
１５．エピトープが、Ｈ７９−Ｎ９０から選択される少なくとも３つの残基を含む実施態様１４の抗体又は抗原結合断片。
１６．エピトープが、Ｄ７８−Ｈ１０３から選択される少なくとも３つの残基を含む実施態様８の抗体又は抗原結合断片。
１７．エピトープが、Ｄ７８−Ｋ９６又はＲ８３−Ｆ９２から選択される少なくとも五つの残基を含む実施態様１６の抗体又は抗原結合断片。
１８．エピトープが、Ｄ７８−Ｌ９３から選択される少なくとも３つの残基を含む実施態様１７の抗体又は抗原結合断片。
１９．エピトープが、Ｈ７９−Ｎ９０から選択される少なくとも３つの残基を含む実施態様１８の抗体又は抗原結合断片。
２０．エピトープが、残基Ｄ７８−Ｈ１０３に対応するセグメントに存在する実施態様８の抗体又は抗原結合断片。
２１．エピトープが、Ｄ７８−Ｋ９６に対応するセグメントに存在する実施態様２０の抗体又は抗原結合断片。
２２．エピトープが、Ｄ７８−Ｌ９３に対応するセグメントに存在する実施態様２１の抗体又は抗原結合断片。
２３．エピトープが、Ｄ７８−Ｎ９０に対応するセグメントに存在する実施態様２２の抗体又は抗原結合断片。
２４．エピトープが、残基Ｈ７９及びＮ９０を含む実施態様８の抗体又は抗原結合断片。
２５．エピトープが、残基Ｒ８３を更に含む実施態様２４の抗体又は抗原結合断片。
２６．エピトープが、Ｓ８５、Ｆ９１、及びＬ９２の一又は複数を更に含む実施態様２５の抗体又は抗原結合断片。
２７．ヒト又はヒト化抗体である先の実施態様の何れかに記載の抗体。
２８．ＶＨ１＿０３、Ｄ３−１０、及びＪＨ６遺伝子を含むヒト遺伝子のセットの産物又はそれから誘導された重鎖可変領域を含む、先の実施態様の何れかの抗体又は抗原結合断片。
２９．ＶＫＩ＿Ｌ１８及びＪＫ４遺伝子を含むヒト遺伝子のセットの産物又はそれから誘導された軽鎖可変領域を含む、先の実施態様の何れかの抗体又は抗原結合断片。
３０．完全長抗体である、先の実施態様の何れかの抗体又は抗原結合断片。
３１．ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３アイソタイプのヒト抗体である実施態様３０の抗体。
３２．ＩｇＧ４アイソタイプである実施態様３０の抗体。
３３．Ｓ２４１Ｐ変異を含む実施態様３２の抗体。
３４．実施態様１−３３の何れかの抗体又は抗原結合断片を含んでなる抗体誘導体又は多重特異的抗体分子。
３５．配列番号：８の重鎖可変領域ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含んでなる、単離された抗ｈＩＬ２０抗体又はその抗原結合断片。
３６．配列番号：８の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含んでなる、実施態様３５の抗体又は抗原結合断片。
３７．配列番号：８の配列を含む重鎖可変領域を含んでなる、実施態様３６の抗体又は抗原結合断片。
３８．配列番号：６の重鎖可変領域ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含んでなる、実施態様３５の抗体又はその抗原結合断片。
３９．配列番号：６の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含んでなる、実施態様３８の抗体又はその抗原結合断片。
４０．配列番号：６の配列を含む重鎖可変領域を含んでなる、実施態様３９の抗体又は抗原結合断片。
４１．配列番号：７の重鎖可変領域ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含んでなる、実施態様３５の抗体又はその抗原結合断片。
４２．配列番号：７の重鎖可変領域ＣＤＲ１を含んでなる、実施態様４１の抗体又はその抗原結合断片。
４３．配列番号：７の配列を含む重鎖可変領域を含んでなる、実施態様４２の抗体又は抗原結合断片。
４４．配列番号：９の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含んでなる、実施態様３５−４３の何れかの抗体又は抗原結合断片。
４５．配列番号：９の配列を含む軽鎖可変領域を含んでなる、実施態様４４の抗体又は抗原結合断片。
４６．成熟ヒトＩＬ２０（配列番号：１）への結合において、配列番号：６及び／又は７を含むＶＨ領域、及び配列番号：９を含むＶＬ領域を含む抗体と競合する単離されたヒト抗ＩＬ２０抗体。
４７．ｍＩＬ２０（配列番号：４）、ｃＩＬ２０（配列番号：５）、又は双方への結合において、配列番号：６及び／又は７を含むＶＨ領域、及び配列番号：９を含むＶＬ領域を含む抗体と更に競合する実施態様４６の抗体。
４８．場合によってはＤ７８を除く、成熟ヒトＩＬ２０（配列番号：１）の残基Ｄ７８−Ｈ１０３に対応するセグメントに少なくとも一つの残基を含むエピトープに結合する実施態様４６の抗体。
４９．残基Ｈ７９、Ｒ８３、Ｓ８５、Ｎ９０、Ｆ９１及び／又はＬ９２を含むエピトープに結合する実施態様４８の抗体。
５０．ｈＩＬ２０（配列番号：１）における配列番号：６及び／又は７を含むＶＨ領域と配列番号：９を含むＶＬ領域を含む抗体と同じエピトープに結合する実施態様４６の抗体。
５１．実施態様４６−５０の何れかの抗体の抗原結合断片。
５２．抗ＩＬ２０抗体又は抗原結合断片を生産する方法において、先の実施態様の何れかの抗体又は抗原結合断片を産生する宿主細胞を適切な条件下で培養し、上記抗体又は抗原結合断片を回収することを含む方法。
５３．先の実施態様の何れかの抗体又は抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体を含有する組成物。
５４．第二の抗炎症剤を更に含有する実施態様５３の組成物。
５５．第二の抗炎症剤が、免疫抑制剤、鎮痛剤、抗血管新生剤、コルチコステロイド、Ｂ細胞枯渇剤、Ｂ細胞アンタゴニスト、Ｔ細胞アンタゴニスト、補体阻害剤、抗サイトカイン剤、及び抗サイトカインレセプター剤、及びその組合せから選択される実施態様５４の組成物。
５６．炎症性又は自己免疫疾患を治療するための方法において、抗ＩＬ２０抗体又は抗原結合断片の有効量を投与することを含み、該抗体又は抗原結合断片が、ヒトＩＬ２０Ｒ１／ｈＩＬ２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒ１／ｈＩＬ２０Ｒ２レセプター複合体のヒトＩＬ２０媒介活性化を低減させる方法。
５７．抗体又は抗原結合断片を含む組成物の投与前、投与と同時に、又は投与後に第二の抗炎症剤を投与することを含む実施態様５６の方法。
５８．第二抗炎症剤が、免疫抑制剤、鎮痛剤、抗血管新生剤、コルチコステロイド、Ｂ細胞枯渇剤、Ｂ細胞アンタゴニスト、Ｔ細胞アンタゴニスト、補体阻害剤、抗サイトカイン剤、及び抗サイトカインレセプター剤、及びその組合せから選択される実施態様５７の方法。
５９．第二の抗炎症剤がメトトレキセートである実施態様５８の方法。
６０．炎症性又は自己免疫疾患が関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、又はその何れかの組合せである実施態様５６−５９の何れかの方法。
６１．炎症性又は自己免疫疾患が関節リウマチである実施態様６０の方法。
６２．炎症性又は自己免疫疾患が乾癬である実施態様６０の方法。
６３．炎症性又は自己免疫疾患が乾癬性関節炎である実施態様６０の方法。
６４．炎症性又は自己免疫疾患が多発性硬化症である実施態様６０の方法。
６５．炎症性又は自己免疫疾患が炎症性腸疾患である実施態様６０の方法。
６６．炎症性又は自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである実施態様６０の方法。
６７．炎症性又は自己免疫疾患がループス腎炎である実施態様６０の方法。
６８．炎症性又は自己免疫疾患を治療するために使用される実施態様１−５１の何れかの抗体又は抗原結合断片。
６９．炎症性又は自己免疫疾患を治療するために使用される第二の抗炎症剤との、実施態様１−５１の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片の組合せ。
７０．第二の抗炎症剤が、抗体又は抗原結合断片の前、同時、又は後に投与される実施態様６９に記載の組合せ。
７１．第二の抗炎症剤がメトトレキセートである実施態様７０の組合せ。
７２．炎症性又は自己免疫疾患を治療するための医薬の調製における実施態様１−５１の何れかの抗体又は抗原結合断片の使用。
７３．炎症性又は自己免疫疾患が関節リウマチである実施態様６８−７２の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片、組合せ、又は使用。
７４．炎症性又は自己免疫疾患が乾癬である実施態様６８−７２の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片、組合せ、又は使用。
７５．炎症性又は自己免疫疾患が乾癬性関節炎である実施態様６８−７２の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片、組合せ、又は使用。
７６．炎症性又は自己免疫疾患が多発性硬化症である実施態様６８−７２の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片、組合せ、又は使用。
７７．炎症性又は自己免疫疾患が炎症性腸疾患である実施態様６８−７２の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片、組合せ、又は使用。
７８．炎症性又は自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである実施態様６８−７２の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片、組合せ、又は使用。
７９．炎症性又は自己免疫疾患がループス腎炎である実施態様６８−７２の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片、組合せ、又は使用。
８０．炎症性又は自己免疫疾患が若年性関節リウマチである実施態様６８−７２の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片、組合せ、又は使用。
８１．炎症性又は自己免疫疾患が強直性脊椎炎である実施態様６８−７２の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片、組合せ、又は使用。
８２．炎症性又は自己免疫疾患がシェーグレン症候群である実施態様６８−７２の何れかに記載の抗体又は抗原結合断片、組合せ、又は使用。
【図１Ａ】
2011526591.tif 000009
【図１Ｂ】
2011526591.tif 000010
【図２】
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【図３Ａ】
2011526591.tif 000012
【図３Ｂ】
2011526591.tif 000013
【図３Ｃ】
2011526591.tif 000014
【図３Ｄ】
2011526591.tif 000015
【図４Ａ】
2011526591.tif 000016
【図４Ｂ】
2011526591.tif 000017
【図５Ａ】
2011526591.tif 000018
【図５Ｂ】
2011526591.tif 000019
【図５Ｃ】
2011526591.tif 000020
【図６Ａ】
2011526591.tif 000021
【図６Ｂ】
2011526591.tif 000022
【図７Ａ】
2011526591.tif 000023
【図７Ｂ】
2011526591.tif 000024
【図８Ａ】
2011526591.tif 000025
【図８Ｂ】
2011526591.tif 000026
【図９】
2011526591.tif 000027
【図１０Ａ】
2011526591.tif 000028
【図１０Ｂ】
2011526591.tif 000029
【図１１】
2011526591.tif 000030
【図１２】
2011526591.tif 000031
【図１３】
2011526591.tif 000032
【図１４】
2011526591.tif 000033
【配列表】
2011526591000001.app
【国際調査報告】
2011526591.tif 000034
2011526591.tif 000035
2011526591.tif 000036
2011526591.tif 000037