(57)【要約】  本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する単一ドメインタンパク質に関する。本発明はまた、診断、研究および治療用途に使用するための単一ドメインタンパク質に関する。本発明は、さらに、そのようなタンパク質、そのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含む細胞、および革新的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
2011517314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、ここで、Ｆｎ３ドメインは、（ｉ）ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み；（ｉｉ）ヒトＦｎ３ドメインの対応するループの配列と比べて変更されたアミノ酸配列を伴うループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、そして（ｉｉｉ）１０−４Ｍ未満の解離定数でヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する、ポリペプチド。
【請求項２】
Ｆｎ３ドメインは、１０−６Ｍ未満の解離定数でヒトＥＧＦＲに結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ループＢＣおよびループＦＧは、ヒトＦｎ３ドメインの対応するループの配列と比べて変更されたアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｆｎ３ドメインは、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
１０Ｆｎ３ドメインは：
（ｉ）配列番号２０７〜２３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２０７〜２３１のいずれか１つに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ポリオキシアルキレン部分、ヒト血清アルブミン結合タンパク質、シアル酸、ヒト血清アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＧ結合タンパク質、トランスフェリン、およびＦｃフラグメントから選択される１つ以上の薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ＰＫ部分はポリオキシアルキレン部分であり、そして前記ポリオキシアルキレン部分はポリエチレングリコールである、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ＰＫ部分およびＦｎ３ドメインは、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、ポリマー糖、またはポリエチレングリコール部分を介して作動可能に連結されている、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＰＫ部分およびＦｎ３ドメインは、配列番号２３２〜２３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを介して作動可能に連結されている、請求項８のポリペプチド。
【請求項１０】
抗体部分；リポカリンの誘導体；テトラネクチンの誘導体；アビマー；アンキリンの誘導体；および２番目のフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインから選択される第２のドメインをさらに含み、ここで、２番目のドメインは、ヒトタンパク質に結合し、ならびにここで、２番目のＦｎ３ドメインは、（ｉ）ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；およびループＦＧを含み；（ｉｉ）ヒトＦｎ３ドメインの対応するループの配列と比べてランダム化されたアミノ酸配列を伴うループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、そして（ｉｉｉ）ヒトＦｎ３ドメインとは結合しないヒトタンパク質に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
２番目のドメインは、２番目のＦｎ３ドメインであり、そして２番目のＦｎ３ドメインは、１０−４Ｍ未満の解離定数でヒトタンパク質に結合する、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
２番目のドメインは、２番目のＦｎ３ドメインであり、そして２番目のＦｎ３ドメインは、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）である、請求項１０または１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
２番目のドメインと結合するヒトタンパク質は、ＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦＲ、またはＶＥＧＦＲ２から選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
２番目の１０Ｆｎ３ドメインは：
（ｉ）配列番号２〜２３１および２３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
（ｉｉ）配列番号２〜２３１および２３６のいずれか１つに少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
Ｆｎ３ドメインおよび２番目のドメインは、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、ポリマー糖、またはポリエチレングリコール部分を介して作動可能に連結される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドは、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）または上皮増殖因子（ＥＧＦ）のＥＧＦＲへの結合を阻害し、そして細胞ベースアッセイのサブＩＣ５０濃度においてヒトＥＧＦＲを活性化しない、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドは、ＥＧＦＲへの結合について抗ＥＧＦＲ抗体と競合する、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは、１０μＭ未満のＩＣ５０でＥＧＦＲのすべてのＥＧＦ刺激性ホスホチロシン活性化を阻害する、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドは、１０μＭ未満のＩＣ５０でＥＲＫリン酸化を阻害する、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドは、１０μＭ未満のＩＣ５０でＡＫＴリン酸化を阻害する、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドは、脱免疫化されて、１つ以上のＴ細胞エピトープが除去される、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記Ｆｎ３ドメインは下記工程ａ）〜ｄ）を含む方法によって選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド：ａ）それぞれ、ヒトＦｎ３ドメインコード配列とは異なる候補の１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメイン配列を含む候補ＲＮＡ分子の集団を生成する工程であって、前記ＲＮＡ分子は、それぞれ、翻訳開始配列、および前記候補Ｆｎ３ドメインコード配列に作動可能に連結された開始コドンを含み、そしてそれぞれ、３’末端において核酸−ピューロマイシンリンカーに作動可能に連結されている工程；ｂ）前記候補Ｆｎ３ドメインコード配列をインビトロで翻訳して、候補ＲＮＡ−Ｆｎ３融合物の集団を生成する工程；ｃ）候補ＲＮＡ−Ｆｎ３融合物の前記集団とＥＧＦＲとを接触させる工程；ならびにｄ）ＲＮＡ−Ｆｎ３融合物、ＥＧＦＲに対する前記ヒトＦｎ３の結合親和性または特異性と比べて変更されたＥＧＦＲに対する結合親和性または特異性を有するそのタンパク質部分を選択する工程。
【請求項２３】
本質的にエンドトキシンを含まない、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、薬学的に許容できる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年２月１４日に出願されたU.S. Provisional Application Serial No. 61/065,955の利益を主張する。上記で参照した出願のすべての教示は、本明細書において参照により援用される。
【０００２】
本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する単一ドメインタンパク質に関する。本発明はまた、診断、研究および治療用途に使用するための単一ドメインタンパク質に関する。本発明は、さらに、そのようなタンパク質、そのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含む細胞、および革新的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
序論
受容体チロシンキナーゼのＨＥＲファミリーは、細胞増殖、分化および生存の重要なメディエーターである。受容体ファミリーには、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、またはＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含む４つの個別のメンバーが含まれる。
【０００４】
ＨＥＲファミリーは、ヒト悪性疾患の原因として関連付けられている。Ｈｅｒファミリーの受容体の活性の異常は、乳癌に関与する。ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ−３、およびＨｅｒ−４は、卵巣顆粒膜細胞腫において頻繁に発現される（非特許文献１）。特に、乳癌、膀胱癌、肺癌、頭部癌、頚部癌、および胃癌ならびに神経膠芽腫において、ＥＧＦＲの発現の増加が観察されている。
【０００５】
ＥＧＦＲ受容体発現の増加は、自己分泌刺激経路によって受容体活性化を生じる同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンド、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）の産生の増加に関連し得る。非特許文献２。ＥＧＦＲまたはそのリガンドに対するモノクローナル抗体は、そのような悪性疾患の処置における治療用薬剤として評価されている。例えば、非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４を参照のこと。
【０００６】
ＨＥＲ受容体は、一般的に、細胞において様々な組み合わせで存在する。それらのヘテロ二量体化は、多様なＨＥＲリガンドに対する様々な細胞応答を増加すると考えられる（非特許文献５）。ＥＧＦＲは、少なくとも６つの異なるリガンド；上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、βセルリンおよびエピレグリンと結合する（非特許文献６）。
【０００７】
ＥＧＦはＥＧＦＲに結合し、ＨＥＲ２とヘテロ二量体を形成して、ＥＧＦＲを活性化し、そしてＨＥＲのトランスリン酸化を生じる。二量体化および／またはトランスリン酸化は、ＨＥＲ２チロシンキナーゼを活性化する。
【０００８】
治療薬の潜在的な副作用は、治療レジメンを考案する場合に考慮すべき重要な問題である。例えば、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））、抗ＥＧＦＲ抗体は、潜在的に生命を脅かす注入反応に関連する（非特許文献７）。ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標））およびエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））は、両方とも、ＥＧＦＲ特異的小分子インヒビターであり、間質性肺疾患の危険性に関連する（非特許文献８）。個々の患者は、特定のタイプの合併症にかかり易い可能性があり、薬物治療の選択に影響を及ぼす。より幅の広い治療選択が提供されれば、医師は、個々の患者の最良の副作用プロファイルにより治療薬を選択することが可能である。本発明は、治療方法に有用な新規のポリペプチドおよびタンパク質治療薬を提供する。
【０００９】
癌および増殖性障害を含む障害において、ＥＧＦＲシグナル伝達が果たす役割を考慮して、ＥＧＦＲを選択的に調整、阻害または遮断するＥＧＦＲ結合ポリペプチドのような治療薬を作製することが望ましい。
【００１０】
加えて、そのような治療薬は、費用効果的様式で発現され、所望の生物物理特性（例えば、Ｔｍ、実質的に単量体であるか、または良好にフォールディングされる）を所有し、組織を貫通するための小さなサイズを有し、そしてインビボで適切な半減期を有することが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Leibl, S. et al., Gynecol Oncol 101:18-23 (2005)
【非特許文献２】Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994)
【非特許文献３】Masui et al. Cancer Research 44:1002-1007 (1984)
【非特許文献４】Wu et al. J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995)
【非特許文献５】Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)
【非特許文献６】Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994)
【非特許文献７】Thomas, M., Clin J Oncol Nurs. 9(3):332-8 (2005)
【非特許文献８】Sandler A,. Oncology 20(5 Suppl 2):35-40 (2006)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本出願の一態様は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドを提供し、ここで、Ｆｎ３ドメインは、（ｉ）ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み；（ｉｉ）ヒトＦｎ３ドメインの対応するループの配列と比べて変更されたアミノ酸配列を伴うループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、そして（ｉｉｉ）ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０−４Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、もしくは１０−９Ｍ未満のＫＤでＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインの少なくとも２つのループが変更される。いくつかの実施形態では、ループＢＣおよびループＦＧは、ヒトＦｎ３ドメインの対応するループの配列と比べて変更されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインの少なくとも３つのループが変更される。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインの少なくとも２つのループがＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインの少なくとも３つのループがＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される少なくとも１つのループにおける少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が、野生型の配列とは異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が、欠失されるか、またはループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される少なくとも１つのループに付加される。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１０−６Ｍを超える、１０−５Ｍを超える、１０−４Ｍを超える、１０−３Ｍを超える、もしくは１０−２Ｍを超えるＫＤでＨＥＲ２またはＨＥＲ３のような関連受容体に結合する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１つ以上のＥＧＦＲリガンドに結合するＥＧＦＲを阻害する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）である。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３は、配列番号２０７〜２３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３は、配列番号２１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３は、配列番号２０７〜２３１のいずれか１つに少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％同一なアミノ酸配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは：ポリオキシアルキレン部分、ヒト血清アルブミン結合タンパク質、シアル酸、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ、ＩｇＧ結合タンパク質、およびＦｃフラグメントから選択される１つ以上の薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分はポリオキシアルキレン部分であり、そして前記ポリオキシアルキレン部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ＣｙｓまたはＬｙｓアミノ酸を介してＥＧＦＲ結合ポリペプチドに共有結合している。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドはＦｎ３ドメインである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．５ｋＤａと約１００ｋＤａとの間である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、ポリペプチドの１つ以上の薬物動態特性、例えば、バイオアベイラビリティ、血清中半減期、インビボでの安定性、および薬物分布を改善する。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、ＥＧＦＲ結合ポリペプチド単独と比べて、少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、９０、１００、１２０、１５０、２００、４００、６００、８００％か、それ以上、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの血清中半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分をさらに含むＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日間の血清インビボ半減期を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分およびＦｎ３ドメインは、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、ポリマー糖、またはポリエチレングリコール部分を介して作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分およびＦｎ３ドメインは、配列番号２３２〜２３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを介して作動可能に連結される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、２番目のドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、抗体部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体部分は、５０ＫＤａ未満である。いくつかの実施形態では、抗体部分は、４０ＫＤａ未満である。いくつかの実施形態では、抗体部分は、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｖ、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、または全抗体である。いくつかの実施形態では、抗体部分は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、抗体部分は、ヒトタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、抗体部分は、ＩＧＦ−ＩＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｋｉｔ、ヒトｐ１８５受容体様チロシンキナーゼ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ、葉酸受容体、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）Ａ、ＶＥＧＦ  Ｃ、ＶＥＧＦ  Ｄ、ヒトＣＤ２０、ヒトＣＤ１８、ヒトＣＤ１１ａ、ヒトアポトーシス受容体−２（Ａｐｏ−２）、ヒトα４β７インテグリン、ヒトＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａインテグリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＥＧＦＲ、またはヒトＣＤ３に結合する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、リポカリンの誘導体；テトラネクチンの誘導体；アビマー；またはアンキリンの誘導体をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ヒトタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＩＧＦ−ＩＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｋｉｔ、ヒトｐ１８５受容体様チロシンキナーゼ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ、葉酸受容体、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）Ａ、ＶＥＧＦ  Ｃ、ＶＥＧＦ  Ｄ、ヒトＣＤ２０、ヒトＣＤ１８、ヒトＣＤ１１ａ、ヒトアポトーシス受容体−２（Ａｐｏ−２）、ヒトα４β７インテグリン、ヒトＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａインテグリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＥＧＦＲ、またはヒトＣＤ３に結合する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、Ｆｎ３ドメインであり、そして２番目のＦｎ３ドメインをさらに含む。２番目のＦｎ３ドメインは、（ｉ）ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；およびループＦＧを含み；（ｉｉ）ヒトＦｎ３ドメインの対応するループの配列と比べて変更されたアミノ酸配列を伴うループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有し、そして（ｉｉｉ）ヒトＦｎ３ドメインには結合されないヒトタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、２番目のＦｎ３ドメインは、ＩＧＦ−ＩＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｋｉｔ、ヒトｐ１８５受容体様チロシンキナーゼ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ、葉酸受容体、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）Ａ、ＶＥＧＦ  Ｃ、ＶＥＧＦ  Ｄ、ヒトＣＤ２０、ヒトＣＤ１８、ヒトＣＤ１１ａ、ヒトアポトーシス受容体−２（Ａｐｏ−２）、ヒトα４β７インテグリン、ヒトＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａインテグリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＥＧＦＲ、またはヒトＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態では、２番目のＦｎ３ドメインは、１０−４Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、もしくは１０−９Ｍ未満のＫＤでヒトタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、２番目のＦｎ３ドメインのループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される少なくとも１つのループにおける少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が、野生型の配列とは異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が、欠失されるか、またはループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される少なくとも１つのループに付加される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、２番目の１０Ｆｎ３ドメインをさらに含むＥＧＦＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインである。いくつかの実施形態では、２番目の１０Ｆｎ３ドメインは、ＩＧＦ−ＩＲに結合する。いくつかの実施形態では、２番目の１０Ｆｎ３ドメインは、ＶＥＧＦＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、２番目の１０Ｆｎ３ドメインは、ＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、２番目の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２〜１２５、１８４〜２０４、または２３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２番目の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２〜１２５、１８４〜２０４、または２３６のいずれか１つに少なくとも７５、８０、８５、９０、５５、もしくは９８％同一なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２番目の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１２６〜１８３、２０５、または２０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２番目の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号１２６〜１８３、２０５、または２０６のいずれか１つに少なくとも７５、８０、８５、９０、５５、もしくは９８％同一なアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２番目の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２０７〜２３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２番目の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２０７〜２３１のいずれか１つに少なくとも７５、８０、８５、９０、５５、もしくは９８％同一なアミノ酸配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、ポリマー糖、またはポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を介して作動可能に連結された２番目のドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約０．５ｋＤａと約１００ｋＤａとの間である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、ＣｙｓまたはＬｙｓ残基を介してポリペプチドおよび２番目のドメインにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、少なくともＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは２番目のドメインは、単一のＣｙｓまたはＬｙｓのみを有する。いくつかの実施形態では、単一のＣｙｓまたはＬｙｓは、アミノ酸配列における非野生型の局在で局在する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、配列番号２３５を含む。
【００２２】
一態様では、本出願は、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）または上皮増殖因子（ＥＧＦ）のＥＧＦＲへの結合を阻害し、そして細胞ベースアッセイのＩＣ５０より低い濃度においてヒトＥＧＦＲを活性化しないＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１つ以上のＥＧＦＲリガンドに結合するＥＧＦＲを阻害する。
【００２３】
一態様では、本出願は、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドであって、ＥＧＦＲへの結合について、抗ＥＧＦＲ抗体と競合するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、パニツムマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、ＥＭＤ７２０００、およびセツキシマブから選択される。
【００２４】
一態様では、本出願は、１０−５未満、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、もしくは１０−９Ｍ未満のＩＣ５０でＥＧＦＲのすべてのＥＧＦ刺激性ホスホチロシン活性化を阻害するＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。
【００２５】
一態様では、本出願は、１０−５未満、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、もしくは１０−９Ｍ未満のＩＣ５０でＥＲＫリン酸化を阻害するＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。
【００２６】
一態様では、本出願は、１０−５未満、１０−６未満、１０−７未満、１０−８未満、もしくは１０−９Ｍ未満のＩＣ５０でＡＫＴリン酸化を阻害するＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。
【００２７】
一態様では、本出願は、ＥＧＦＲ活性化に依存的な細胞系統での細胞ベースアッセイにおいてアポトーシスを誘導するＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲバインダーは、アポトーシス、リン酸化または二量体化の制御のようなＥＧＦＲ活性を遮断する。
【００２８】
一態様では、本出願は、脱免疫化されて、１つ以上のＴ細胞エピトープが除去されているＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。一態様では、本出願は、脱免疫化されて、１つ以上のＢ細胞エピトープが取り出されているＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。
【００２９】
一態様では、本出願は、ａ）それぞれ、ヒトＦｎ３ドメインコード配列とは異なる候補フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメイン配列を含む候補核酸分子の集団を生成する工程であって、前記核酸分子は、それぞれ、翻訳開始配列、および前記候補Ｆｎ３ドメインコード配列に作動可能に連結された開始コドンを含み、そしてそれぞれ、３’末端において核酸−ピューロマイシンリンカーに作動可能に連結されている工程；ｂ）前記候補Ｆｎ３ドメインコード配列をインビトロで翻訳して、候補核酸−Ｆｎ３融合物の集団を生成する工程；ｃ）候補核酸−Ｆｎ３融合物の前記集団とＥＧＦＲとを接触させる工程；ならびにｄ）核酸−Ｆｎ３融合物、ＥＧＦＲに対する前記ヒトＦｎ３の結合親和性または特異性と比べて変更されたＥＧＦＲに対する結合親和性または特異性を有するそのタンパク質部分を選択する工程を含む方法によって選択されるＥＧＦＲ結合Ｆｎ３ドメインを提供する。いくつかの実施形態では、選択された核酸−Ｆｎ３融合物は、１つ以上の核酸残基を変更し、そしてＥＧＦＲとの融合を再スクリーニングして、改善されたバインダーについて選択することによって、さらに最適化される。いくつかの実施形態では、候補核酸分子はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、候補核酸分子はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸−ピューロマイシンは、ＤＮＡ−ピューロマイシンである。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは１０Ｆｎ３である。
【００３０】
一態様では、本出願は、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを含む薬学的に許容できる組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本質的にエンドトキシンを含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、実質的に微生物の混入がないため、インビボでの投与に適切である。組成物は、例えば、ＩＶ、ＩＰまたは皮下投与のために処方してもよい。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１つ以上のＥＧＦＲリガンドに結合するＥＧＦＲを阻害する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。
【００３１】
本出願の一態様は、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを、単独でまたは他の細胞障害性薬剤または治療用薬剤との組み合わせで投与することによる癌を有する被験体の治療のための方法を提供する。癌は、例えば、乳癌、結腸癌、卵巣癌腫、骨肉腫、子宮頚癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、神経膠芽腫、膵臓癌、またはＥＧＦＲｌレベルが、上昇しているか、アップグレードしているか、変異しているか、または非癌細胞と比較して生理学的に変更されている未だ決定されていない他の癌のうちの１つ以上であり得る。
【００３２】
本出願の一態様は、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを、単独でまたは他の細胞障害性薬剤または治療用薬剤との組み合わせで投与することによる癌を有する被験体の治療のための方法を提供する。特に、好適な細胞障害性薬剤および治療用薬剤として、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エキセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンタイド、ベバシズマブ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ、トシツモマブ、インターフェロンα−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、抗ＥＧＦ受容体抗体（例えば、セツキシマブもしくはパニツムマブ）、イクサベピロン、およびエポチロンまたはその誘導体が挙げられる。より好ましくは、治療用薬剤は、白金薬剤（例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、ゲムシタビン、またはカンプトテシンである。
【００３３】
本出願のもう１つの態様は、本明細書に記載のエレメントの１つ以上、およびそれらのエレメントの使用のための指示書を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを単独でまたは第２の治療剤と共に含む。ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを単独でもしくは第２の治療剤と共に使用して、癌細胞の増殖を阻害するための指示書および／またはそれらを使用して、癌を有する患者を治療する方法のための指示書。
【００３４】
本出願のさらなる態様は、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。そのようなタンパク質に対するポリヌクレオチドを含有するベクターもまた含まれる。配列は、好ましくは、使用する細胞タイプにおける発現を最大限にするように最適化される。好ましくは、発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてである。ＥＧＦＲ結合ポリペプチドはまた、例えば、酵母（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）もしくはセレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））または藍藻を含む真核微生物において発現させることができる。酵母細胞は、所望されるグリコシル化を生じるように操作することができる。本発明の細胞は、哺乳動物細胞であり得る。一態様では、哺乳動物細胞を、グリコシル化を生じるように操作することができる。一態様では、細胞は、フィブロネクチンに基づく足場タンパク質を発現する。一態様では、フィブロネクチンに基づく足場タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、選択された細胞タイプにおける発現に最適化されたコドンである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＥＧＦＲ−結合クローンの単離のための選択プロファイル。各選択ラウンド後のＥＧＦＲ−Ｆｃに結合した実施例１由来のライブラリーの百分率を示す。各ＲＮＡ−タンパク質融合ライブラリーは、５サイクルの選択後に標的に結合した。
【図２】細胞ベースの競合的リガンド結合アッセイ。ＰＢＳ緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液のいずれかに希釈されたＬＡ−１（抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体）および６７９Ｆ０９（ＥＧＦＲ結合クローン）中規模タンパク質調製物を、細胞ベースの競合的リガンド結合アッセイにおいて分析した（詳細については、材料および方法のセクションを参照のこと）。ＬＡ−１（丸）、６７９Ｆ０９中規模ＰＢＳ（四角）および６７９Ｆ０９中規模Ｔｒｉｓ（三角）はすべて、Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲへの結合について、Ｅｕ−ＥＧＦと競合した。ＩＣ５０は：ＬＡ−１（２．２５４ｎＭ）、６７９Ｆ０９中規模ＰＢＳ（１３．０１８ｎＭ）および６７９Ｆ０９中規模Ｔｒｉｓ（２０．００２ｎＭ）であった。
【図３】細胞ベースの競合的リガンド結合アッセイ。ＬＡ−１（抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体）、６７９Ｆ０９（ＥＧＦＲ結合クローン、中規模調製物）および８６７Ａ０１（ＥＧＦＲ結合クローン、ＨＴＰＰ調製物）を、細胞ベースの競合的リガンド結合アッセイにおいて分析した。ＬＡ−１（丸）、６７９Ｆ０９中規模ＰＢＳ（四角）および８６７Ａ０１（三角）はすべて、Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲへの結合について、Ｅｕ−ＥＧＦと競合した。ＩＣ５０は：ＬＡ−１（６．６４１ｎＭ）、６７９Ｆ０９（１４．７２６ｎＭ）および８６７Ａ０１（２５８．２５８ｎＭ）であった。
【図４】細胞ベースの競合的リガンド結合アッセイ。ＬＡ−１（抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体）および６７９Ｆ０３（ＥＧＦＲ結合クローン、中規模調製物）を、細胞ベースの競合的リガンド結合アッセイにおいて分析した。ＬＡ−１（四角）、および６７９Ｆ０３（三角）は、Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲへの結合について、Ｅｕ−ＥＧＦと競合した。ＩＣ５０は：ＬＡ−１（６．９４４ｎＭ）および６７９Ｆ０３（２６．８４７ｎＭ）であった。
【図５Ａ】ＥＧＦＲ特異的クローンの最適化実施例４に記載のＥＧＦＲ結合クローンのさらなる最適化のためのプロセスの概略図。
【図５Ｂ】ＥＧＦＲ特異的クローンの最適化実施例４に記載のＥＧＦＲ結合クローンのさらなる最適化のためのプロセスの概略図。
【図５Ｃ】ＥＧＦＲ特異的クローンの最適化実施例４に記載のＥＧＦＲ結合クローンのさらなる最適化のためのプロセスの概略図。
【図６Ａ】本出願を通して説明する配列を示す。
【図６Ｂ】本出願を通して説明する配列を示す。
【図６Ｃ】本出願を通して説明する配列を示す。
【図６Ｄ】本出願を通して説明する配列を示す。
【図６Ｅ】本出願を通して説明する配列を示す。
【図６Ｆ】本出願を通して説明する配列を示す。
【図６Ｇ】本出願を通して説明する配列を示す。
【図６Ｈ】本出願を通して説明する配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
「ポリペプチド」とは、長さ、翻訳後修飾、または機能にかかわらない２個以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義である。ポリペプチドは、天然アミノ酸、およびU.S. Patent No. 6,559,126（本明細書において参照により援用される）に記載のような非天然アミノ酸を含むことができる。ポリペプチドはまた、多様な標準的な化学的方法のいずれかで修飾することができる（例えば、アミノ酸を保護基で修飾することができる；カルボキシ末端のアミノ酸を、末端アミド基にすることができる；アミノ末端残基を、例えば、親油性を増強するための基で修飾することができる；またはポリペプチドを、化学的にグリコシル化するか、もしくはそれでなければ修飾して、安定性もしくはインビボでの半減期を増加することができる）。ポリペプチド修飾は、環式化合物または他の分子のようなもう１つの構造のポリペプチドへの付着を含むことができ、そしてまた、変更された立体配置（即ち、ＲもしくはＳ；またはＬもしくはＤ）の１個以上のアミノ酸を含有するポリペプチドを含むことができる。
【００３７】
用語「単一のドメインポリペプチド」は、主体ポリペプチドの標的結合活性（例えば、ＥＧＦＲ結合活性）が、例えば、抗体および一本鎖抗体と区別されるように、一本鎖構造のドメイン内に設置されること示すために使用され、ここで、抗原結合活性には、一般的に、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方が寄与する。単一のドメインポリペプチドは、（例えば、融合タンパク質として）蛍光ポリペプチド、標的化ポリペプチドおよび個別の治療効果を有するポリペプチドのような他のポリペプチドのいずれかのメンバーに付着させてもよい。
【００３８】
用語「ＰＫ」は、「薬物動態」の頭字語であり、そして例えば、被験体による吸収、分布、代謝、および排泄を含む化合物の特性を包含する。「ＰＫモジュレーションタンパク質」または「ＰＫ部分」は、生物学的に活性な分子に融合するか、もしくは共に投与する場合、生物学的に活性な分子の薬物動態特性に影響を及ぼす任意のタンパク質、ペプチド、または部分を指す。ＰＫモジュレーションタンパク質またはＰＫ部分の例として、ＰＥＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）バインダー（U.S. Publication Nos. 20050287153および20070003549に開示されている）、ヒト血清アルブミン、ＦｃまたはＦｃフラグメント、および糖（例えば、シアル酸）が挙げられる。
【００３９】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「エフェクター機能」を所有する。例示的な「エフェクター機能」として、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、一般的に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされるべきＦｃ領域を必要とし、そしてそのような抗体エフェクター機能を評価するための当該分野において公知の様々なアッセイを使用して評価することができる。
【００４０】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列を含む。
【００４１】
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸改変によって、天然配列Ｆｃ領域の配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域における約１〜約１０のアミノ酸置換、好ましくは、約１〜約５のアミノ酸置換を有する。本明細書における変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％配列同一性を所有し、そして最も好ましくは、それらと少なくとも約９０％配列同一性、より好ましくは、それらと少なくとも約９５％配列同一性を所有する。
【００４２】
「抗体依存性細胞介在性細胞障害」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞障害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）は、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を生じる細胞仲介反応を指す。ＡＤＣＣを仲介する主な細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、U.S. Patent Nos. 5,500,362または5,821,337に記載のようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、例えば、Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価してもよい。
【００４３】
本明細書における「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列し、そして必要であれば、最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入し、そしていずれの保存的置換も配列同一性の一部として考えなかった場合の選択された配列のアミノ酸残基に同一な候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として同定される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技術の範囲内にある様々な方法で達成することができる。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含むアラインメントを測定するのに適切なパラメータを決定することができる。しかし、本明細書の目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して、下記のように得られる。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作製されたＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）の利用者向けドキュメントのファイルとして保存されており、ここで、それは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７で登録され、そしてＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ）を介して公に利用可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄ上での使用のためにコンパイルすべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、そして変更は行わない。
【００４４】
本明細書に記載の目的のために、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、もしくは所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、もしくは所与のアミノ酸配列Ｂに対する所定のアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現することもできる）は、次のとおりに計算される：分数Ｘ／Ｙの１００倍（ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡおよびＢのそのプログラムのアラインメントにおいて完全な一致として評価されるアミノ酸残基の数であり、そしてここで、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡのＢへのアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡへのアミノ酸配列同一性％に等しくないことが理解されよう。
【００４５】
「単離された」ポリペプチドは、同定されており、そしてその天然環境の成分から分離および／または回収されているポリペプチドである。その天然環境の混入成分は、ポリペプチドの診断または治療用途を妨害する材料であり、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好適な実施形態では、ポリペプチドは、（１）ローリー法によって決定される場合、ポリペプチドのうち９５重量％を超えるまで、そして最も好ましくは、９９重量％を超えるまでか、（２）スピニングカップシーケネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度までか、あるいは（３）クマシーブルー、または好ましくは、銀染色を使用する、還元条件下もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質性が認められるまで、精製される。ポリペプチドの天然環境のうち少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組み換え細胞内におけるインサイチュでのポリペプチドも含まれる。しかし通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００４６】
標的物はまた、前記標的物のフラグメントであってもよい。それ故、標的物はまた、免疫応答を誘発することが可能な前記標的物のフラグメントである。標的物はまた、全長標的物に対して惹起される単一ドメイン抗体に結合することが可能な前記標的物のフラグメントである。
【００４７】
本明細書において使用するフラグメントは、配列の１００％未満（例えば、９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％など）を指すが、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個以上のアミノ酸を含む。フラグメントは、目的の相互作用が１×１０−６Ｍもしくはそれより良好な親和性で維持されるのに十分な長さである。
【００４８】
本明細書に記載のフラグメントはまた、標的物が、野生型標的物に対して惹起される単一ドメイン抗体に結合する能力を実質的に変更しない１個以上のアミノ酸の任意の挿入、欠失および置換を指す。アミノ酸の挿入、欠失または置換の数は、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９もしくは７０個までのアミノ酸である。
【００４９】
「細胞死を誘導する」本発明のタンパク質は、生細胞を非生細胞にするタンパク質である。細胞は、一般的に、タンパク質が結合する抗原を発現する細胞であって、特にここで、細胞は、抗原を過剰発現する。好ましくは、細胞は、癌細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓または膀胱の細胞である。インビトロでは、細胞は、例えば、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ  ３、ＭＤＡ−ＭＢ４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１またはＳＫＯＶ３細胞であってもよい。インビトロでの細胞死は、抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死を識別するために、補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で決定してもよい。それ故、細胞死のアッセイは、熱不活化血清（即ち、補体の非存在下）を使用し、そして免疫エフェクター細胞の非存在下で実施してもよい。本発明のタンパク質が、細胞死を誘導することが可能であるかどうかを決定するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)を参照のこと）または７ＡＡＤの取り込みによって評価される膜完全性の消失を、非処置細胞と比べて評価することができる。
【００５０】
「アポトーシスを誘導する」本発明のタンパク質は、アネキシンＶ、ＤＮＡの断片化、細胞萎縮、小胞体の拡張、細胞の断片化、および／または膜小胞の形成（アポトーシス小体と呼ばれる）のようなアポトーシス関連分子の結合または事象によって決定されるプログラム化された細胞死を誘導するタンパク質である。細胞は、タンパク質が結合する抗原を発現する細胞であり、そして抗原を過剰発現する細胞であってもよい。細胞は、腫瘍細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓または膀胱の細胞である。インビトロでは、細胞は、例えば、ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ  ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１またはＳＫＯＶ３細胞であってもよい。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するための様々な方法が、利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）のトランスロケーションは、アネキシン結合によって測定することができる；ＤＮＡ断片化は、本明細書に記載の実施例において開示するＤＮＡラダーリングを介して評価することができる；そしてＤＮＡ断片化に伴う核／クロマチン凝縮は、低二倍体細胞における任意の増加によって評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘導するタンパク質は、本発明のタンパク質が結合する抗原を発現する細胞を使用するアネキシン結合アッセイにおいて、非処置細胞と比べて、アネキシン結合の約２〜５０倍、好ましくは、約５〜５０倍、最も好ましくは、約１０〜５０倍の誘導を生じるタンパク質である。
【００５１】
用語「治療有効量」は、哺乳動物において疾患または障害を治療するのに有効な薬物の量を指す。癌の場合、治療有効量の薬物は、癌細胞の数を減少する；腫瘍サイズを減少する；周辺器官の癌細胞浸潤を阻害する（即ち、ある程度遅延させる、好ましくは停止する）；腫瘍転移を阻害する（即ち、ある程度遅延させる、好ましくは停止する）；腫瘍増殖をある程度阻害する；および／または異常に関連する１つ以上の症状をある程度軽減することができる。薬物が増殖を防止し得るおよび／または存在する癌細胞を死滅させ得る程度にまで、薬物は、細胞増殖抑制性および／または細胞障害性であり得る。癌治療について、インビボでの効力は、例えば、無増悪期間（ＴＴＰ）を評価するおよび／または奏功率（ＲＲ）決定することによって、測定することができる。
【００５２】
アミノ酸配列または化合物の半減期は、一般的に、例えば、天然の機構による配列もしくは化合物の分解および／または配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）により、インビボでポリペプチドの血清濃度が５０％減少するのに要する時間として定義することができる。半減期は、薬物動態解析によるように、それ自体で既知である任意の様式で決定することができる。適切な技術が当業者に明らかであり、そして例えば、一般的に、霊長類に、適切な用量の処置しようとするアミノ酸配列または化合物を適切に投与する工程；規則的な間隔で前記霊長類から血液サンプルまたは他のサンプルを回収する工程；前記血液サンプルにおける本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定する工程；およびそのようにして得られたデータ（のプロット）から、投与時の初期レベルと比較して、本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が５０％まで減少するまでの時間を計算する工程を要し得る。例えば、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPeters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)のような標準的なハンドブックを参照のこと。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)もまた参照のこと。
【００５３】
半減期は、t１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）のようなパラメータを使用して表現することができる。本明細書では、「半減期の増加」は、これらのパラメータのうち任意の２つ、または本質的にこれらの３つのすべてのパラメータのようなこれらのパラメータのいずれか１つの増加を指す。特に、「半減期の増加」は、ｔ１／２−αおよび／もしくはＡＵＣまたは両方の増加を伴うあるいは伴わないいずれかのｔ１／２−βの増加を指す。
【００５４】
本明細書において使用する用語「ＥＧＦＲ」は、ＨＥＲ−１という用語と同等である。用語「ＥＧＦＲリガンド」は、ＥＧＦＲに結合する天然に存在するタンパク質のような１つ以上のＥＧＦＲリガンドを指す。
【００５５】
用語「ＨＥＲ」は、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３、およびＨｅｒ−４を含むＨｅｒファミリーの受容体のメンバーを指すために本明細書において使用される。好ましくは、本発明において使用されるＨｅｒファミリーメンバーは、ＥＧＦＲである。
【００５６】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチド
一態様では、本出願は、ＥＧＦＲに結合する単一ドメインポリペプチドを提供する。所定の態様では、単一ドメインポリペプチドは、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン様ドメインによって例示されるように、少なくとも２つのβシートの間に分布する少なくとも５〜７つのβまたはβ様鎖を含み得る。β様鎖は、単一ドメインポリペプチドの安定化に関与するが、必ずしもβ鎖コンホメーションをとる必要がないアミノ酸のストリングである。単一ドメインポリペプチドは、少なくとも２つのβシートの間に分布する少なくとも７つのβ鎖またはβ様鎖、および２つのβ鎖またはβ様鎖を接続する少なくとも１つのループ部分（このループ部分はＥＧＦＲへの結合に関与する）を含む構造的構成を有する約８０〜約１５０の間のアミノ酸を含み得る。言い換えれば、ループ部分は、２つのベータ鎖、２つのβ様鎖、または１つのβ鎖と１つのβ様鎖を連結することができる。典型的に、ループ部分のうち１つ以上がＥＧＦＲ結合に関与するが、βまたはβ様鎖部分のうちの１つ以上もまた、ＥＧＦＲ結合に関与することが可能であり、特に、それらのβまたはβ様鎖部分は、ループ部分の最も付近に設置される。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１つ以上のＥＧＦＲリガンドに結合するＥＧＦＲを阻害する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。
【００５７】
一態様では、単一ドメインポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）可変ドメインを含む。Ｉｇ可変ドメインは、例えば、ヒトＶＬドメイン、ヒトＶＨドメインおよびラクダＶＨＨドメインからなる群から選択され得る。Ｉｇ可変ドメインの１つ、２つ、３つまたはそれ以上のループがＥＧＦＲへの結合に関与し得、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３として既知のループのいずれも、ＥＧＦＲ結合に関与する。
【００５８】
一態様では、単一ドメインポリペプチドは、フィブロネクチンに基づく足場タンパク質、即ち、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｆｎ３）に基づくポリペプチドである。フィブロネクチンに基づく足場タンパク質の例には、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（商標）（Ａｄｎｅｘｕｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｒ＆Ｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）がある。フィブロネクチンは、細胞外マトリックスの形成および細胞−細胞相互作用に必須の役割を果たす大きなタンパク質である；それは、３つのタイプ（Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ型）の小さなドメインの多数の反復からなる（Baron et al., 1991）。Ｆｎ３自体は、細胞接着分子、細胞表面ホルモンおよびサイトカイン受容体、シャペロニング、ならびに炭水化物−結合ドメインの部分を含む大きなサブファミリーのパラダイムである。レビューについては、Bork & Doolittle, Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Oct 1;89(19):8990-4；Bork et al., J Mol Biol. 1994 Sep 30;242(4):309-20；Campbell & Spitzfaden, Structure. 1994 May 15;2(5):333-7；Harpez & Chothia, J Mol Biol. 1994 May 13;238(4):528-39)を参照のこと。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本出願は、ＥＧＦＲに結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインを提供する。そのようなドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、βまたはβ様鎖、Ａ；ループ、ＡＢ；βまたはβ様鎖、Ｂ；ループ、ＢＣ；βまたはβ様鎖Ｃ；ループＣＤ；βまたはβ様鎖Ｄ；ループＤＥ；βまたはβ様鎖、Ｅ；ループ、ＥＦ；βまたはβ様鎖Ｆ；ループＦＧ；およびβまたはβ様鎖Ｇを含み得る。ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧのいずれかまたはすべてが、ＥＧＦＲ結合に関与し得る。いくつかの実施形態では、ループＢＣおよびＦＧがＥＧＦＲ結合に関与する。いくつかの実施形態では、ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧがＥＧＦＲ結合に関与する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトＦｎ３ドメインの対応するループの配列と比べて、変更されたアミノ酸配列を伴うループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有するＦｎ３ドメインを提供する。「変更された」とは、テンプレート配列（ヒトフィブロネクチンドメインに対応する）と比べた１個以上のアミノ酸配列の変更を意味し、そしてアミノ酸付加、欠失、および置換を含む。アミノ酸配列の変更は、一般的に、核酸コード配列の意図的な、盲目的な（ｂｌｉｎｄ）、または自発的な配列変動を介して達成してもよく、そして任意の技術、例えば、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、または化学的ＤＮＡ合成によって行うことができる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合Ｆｎ３ドメインは、１つ以上のＥＧＦＲリガンドに結合するＥＧＦＲを阻害する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合Ｆｎ３は、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンから誘導されるＦｎ３ドメイン、特に、配列番号１に示すようなフィブロネクチンの１０番目のＦｎ３ドメイン（１０Ｆｎ３）である。多様な変異１０Ｆｎ３足場が報告されている。一態様では、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９、およびＡｓｐ２３のうちの１つ以上が、例えば、負に荷電していないアミノ酸残基（例えば、Ａｓｎ、Ｌｙｓなど）のようなもう１つのアミノ酸によって置き換えられる。これらの変異は、野生型形態と比較して、中性ｐＨにおいて変異１０Ｆｎ３のより大きな安定性を促進する効果を有することが報告されている（PCT Publication No. WO02/04523を参照のこと）。有益または中立的である１０Ｆｎ３足場のさらなる多様な変更についても開示されている。例えば、Batori et al., Protein Eng. 2002 Dec;15(12):1015-20；Koide et al., Biochemistry 2001 Aug 28;40(34):10326-33を参照のこと。
【００６２】
変異体および野生型１０Ｆｎ３タンパク質の両方とも、同じ構造、即ち、Ａ〜Ｇで示された７つのβ鎖ドメイン配列ならびに７つのβ鎖ドメイン配列を接続する６つのループ領域（ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループ、およびＦＧループ）によって特徴付けられる。Ｎ末端およびＣ末端の最も近くに位置するベータ鎖は、溶液中においてβ様コンホメーションをとり得る。配列番号１では、ＡＢループは残基１５〜１６に対応し、ＢＣループは残基２２〜３０に対応し、ＣＤループは残基３９〜４５に対応し、ＤＥループは残基５１〜５５に対応し、ＥＦループは残基６０〜６６に対応し、そしてＦＧループは残基７６〜８７に対応する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合１０Ｆｎ３ポリペプチドは、配列番号１に示すように、ヒト１０Ｆｎ３ドメインに少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であり得る。多くの可変性が、一般的に、１つ以上のループにおいて生じる。１０Ｆｎ３ポリペプチドのβまたはβ様鎖のそれぞれは、本質的に、配列番号１の対応するβまたはβ様鎖の配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列からなるが、但し、そのような変動が、生理学的条件においてポリペプチドの安定性を破壊しないことが条件である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本開示は、１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインを含むＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供し、ここで、１０Ｆｎ３ドメインは、ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループＥＦ；およびループＦＧを含み；そしてヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比べて変更されたアミノ酸配列を伴うループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有する。「変更された」とは、テンプレート配列（ヒトフィブロネクチンドメインに対応する）と比べた１つ以上のアミノ酸配列の変更を意味し、そしてアミノ酸付加、欠失、および置換を含む。アミノ酸配列の変更は、一般的に、核酸コード配列の意図的な、盲目的な、または自発的な配列変動を介して達成してもよく、そして任意の技術、例えば、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、または化学的ＤＮＡ合成によって行うことができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される１つ以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比べて長さを伸長または短縮することができる。いくつかの実施形態では、ループの長さを、２〜２５個のアミノ酸だけ伸長することができる。いくつかの実施形態では、ループの長さを、１〜１１個のアミノ酸だけ減少することができる。特に、１０Ｆｎ３のＦＧループは１２残基長であるが、抗体重鎖における対応するループは、４〜２８残基の範囲である。従って、抗原結合を最適にするために、１０Ｆｎ３のＦＧループの長さについて、抗原結合において最大の柔軟性および親和性を得るために４〜２８残基のＣＤＲ３範囲を含むように、長さならびに配列を変更することができる。いくつかの実施形態では、インテグリン−結合モチーフ「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」（ＲＧＤ）を、（Ｎ末端からＣ末端の方向で）極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸配列で置き換えてもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドは、配列番号２０７〜２３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。さらなる配列を、Ｎ末端またはＣ末端に付加してもよい。例えば、さらなるＭＧ配列を、Ｎ末端において置き換えてもよい。Ｍは、通常、切り離されて、Ｎ末端においてＧＶＳ．．．配列が残る。いくつかの実施形態では、リンカー配列を、１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端において置くことができる（例えば、配列番号２３３および２３５）。
【００６７】
特定の態様では、本開示は、ＥＧＦＲ結合を仲介する短いペプチド配列を提供する。そのような配列は、単離された形態で、または免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン様ドメインのような特定のタンパク質構造に挿入される場合、ＥＧＦＲ結合を仲介することができる。そのような配列の例として、配列番号２０７〜２３１由来のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループに対応するアミノ酸残基が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満もしくはそれ以下の低いＫＤでＥＧＦＲに結合する。
【００６８】
ＥＧＦＲに結合するポリペプチドは、平衡定数（例えば、解離、ＫＤ）についておよび反応速度定数（例えば、ｏｎ速度定数、ｋｏｎおよびｏｆｆ速度定数、ｋｏｆｆ）について評価することができる。単一ドメインポリペプチドは、典型的に、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満もしくはそれ以下のＫＤでＥＧＦＲに結合するように選択されるが、より高いＫＤ値が許容されてもよく、ここで、ｋｏｆｆが十分に低いか、またはｋｏｎが十分に高い。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１０−６Ｍ以上、１０−５Ｍ以上、１０−４Ｍ以上、１０−３Ｍ以上、１０−２Ｍ以上のＫＤでＨＥＲ２またはＨＥＲ３のような関連受容体に結合する。
【００６９】
一態様では、本出願は、薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含むＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。改善された薬物動態学は、考えられる治療用件に従って評価してもよい。おそらく、投薬後に、タンパク質が、血清中において利用可能であり続ける時間を増加させることによって、バイオアベイラビリティを増加する、および／または、投薬間の時間を増加することがしばしば所望される。場合によっては、経時的なタンパク質の血清濃度の継続性を改善する（例えば、投与直後および投与直前におけるタンパク質の血清濃度の差異を減少する）ことが所望される。ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、非修飾ポリペプチドと比べて哺乳動物（例えば、マウス、ラット、またはヒト）におけるポリペプチドのクリアランス率を１／３未満に減少させる部分に付着させてもよい。改善された薬物動態学の他の測定として、しばしば、α相およびβ相に分けられる血清中半減期が挙げられる。相のいずれか一方または両方が、適切な部分の付加によって、有意に改善され得る。
【００７０】
本明細書において、「ＰＫ部分」と称される、血液からのタンパク質のクリアランスを遅延する傾向がある部分として、ポリオキシアルキレン部分、例えば、ポリエチレングリコール、糖（例えば、シアル酸）、および忍容性が良好なタンパク質部分（例えば、Ｆｃ、Ｆｃフラグメント、トランスフェリン、または血清アルブミン）が挙げられる。U.S. Publication No. 20070048282に記載のように、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント(部分)もしくは変異体に融合させてもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、U.S. Publication Nos. 2007/0178082および2007/0269422に記載のような血清アルブミン結合タンパク質である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、U.S. Publication No. 2007/0178082に記載のような血清免疫グロブリン結合タンパク質である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。１つ以上のＰＥＧ分子を、タンパク質上の異なる位置に付着させてもよく、そしてそのような付着は、アミン、チオールまたは他の適切な反応基との反応によって達成させてもよい。アミン部分は、例えば、ポリペプチドのＮ末端に見出される第一級アミンであってもよく、またはリジンまたはアルギニンのようなアミノ酸に存在するアミン基であってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、次からなる群から選択されるポリペプチド上の位置において付着される：ａ）Ｎ末端；ｂ）Ｎ末端と最もＮ末端側のβ鎖またはβ様鎖との間；ｃ）ＥＧＦＲ−結合部位に対向するポリペプチドの面上に位置するループ；ｄ）Ｃ末端と最もＣ末端側のβ鎖またはβ様鎖との間；およびｅ）Ｃ末端。
【００７４】
ペグ化は、部位特異的ペグ化によって達成してもよく、ここで、適切な反応基が、タンパク質に導入されて、ペグ化が優先的に生じる部位が作製される。いくつかの実施形態では、タンパク質を修飾して、所望の位置にシステイン残基を導入し、システイン上での部位特異的ペグ化を可能にする。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、配列番号２３５のようにリンカーを含有するＣｙｓを含み、これが部位特異的ペグ化を可能にする。ＰＥＧは、分子量のばらつきが大きくてもよく、そして分岐していてもまたは線状であってもよい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、Ｆｎ３ドメインおよびＰＫ部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは１０Ｆｎ３ドメインである。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、Ｆｎ３ドメイン単独と比べて、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％超、１２０％超、１５０％超、２００％超、４００％超、６００％超、８００％超、１０００％超もしくはそれ以上ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの血清中半減期を増加させる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、ポリマー糖、またはポリエチレングリコール部分を介して、Ｆｎ３ドメインに作動可能に連結される。例示的なポリペプチドリンカーとして、ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号２３２）、ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号２３３）、およびＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号２３４）のようなＧＳリンカーならびにそれらの多量体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分はヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分はトランスフェリンである。
【００７７】
所定の態様では、本開示は、第１の哺乳動物由来のＥＧＦＲおよび第２の哺乳動物由来のその相同体に結合するＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。そのようなポリペプチドは、第１の哺乳動物がヒトであり、そして第２の哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、イヌ、または非ヒト霊長類のような前臨床試験を行うのに望ましい哺乳動物である場合、特に有用である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満もしくはそれ以下の低いＫＤで、予め選択されたヒト標的タンパク質およびその相同体の両方に結合する。
【００７８】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＥＧＦＲのいずれの部分に結合してもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＥＧＦＲのリガンド結合ドメインに結合し、そしてＥＧＦＲと、ＴＧＦ−αおよびＥＧＦを含む１つ以上のリガンドとの相互作用を破壊する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＥＧＦＲへの結合について、抗ＥＧＦＲ抗体と競合する。抗ＥＧＦＲ抗体は、パニツムマブ（Ａｍｇｅｎ）、ニモツズマブ（ＹＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ザルツムマブ（Ｇｅｎｍａｂ）、ＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）、およびセツキシマブ（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む任意の既知の抗ＥＧＦＲ抗体から選択してもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドはＥＧＦＲに結合し、そして受容体二量体化を破壊する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに結合するポリペプチドは、細胞ベースアッセイのＩＣ５０より低い濃度において、ＥＧＦＲを活性化しない。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＥＧＦＲの下流のシグナル伝達を阻害する。ＥＧＦＲリガンド結合は、ＥＧＦＲまたはもう１つのＨＥＲファミリーメンバーとのホモもしくはヘテロ二量体受容体二量体化をもたらす。二量体化は、受容体自己リン酸化を促進し、次いで、いくらかのシグナル伝達経路の活性化をもたらす。活性化される１つの経路は、ＭＥＫのリン酸化を含むＭＡＰＫ経路である。もう１つの活性化される経路は、ＡＫＴのリン酸化を含むホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路である。シグナル伝達は、核に伝達され、様々な転写因子の活性化を生じる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満のＩＣ５０で、ＥＧＦＲリガンド仲介ＥＧＦＲリン酸化、ＥＲＫリン酸化、ＡＫＴリン酸化、または他の任意のＥＧＦＲシグナル伝達経路のメンバーを阻害する。
【００８２】
マルチドメイン実施形態
本出願の一態様は、２番目のドメインをさらに含むＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。２番目のドメインは、ＥＧＦＲに結合してもよく、または異なるタンパク質、好ましくは、ヒトタンパク質に結合してもよい。いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ５、ｃ−Ｋｉｔ、ヒトｐ１８５受容体様チロシンキナーゼ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ｃ−Ｍｅｔ、葉酸受容体、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ヒトＣＤ２０、ヒトＣＤ１８、ヒトＣＤ１１ａ、ヒトアポトーシス受容体−２（Ａｐｏ−２）、ヒトα４β７インテグリン、ヒトＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａインテグリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトＣＤ３、ＩＧＦ−ＩＲ、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、またはＴｉｅ２．３から選択される標的に結合する。いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、もしくは１０−９Ｍ未満のＫＤでヒト標的タンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、１０−６Ｍを超える、１０−５Ｍを超える、１０−４Ｍを超える、１０−３Ｍを超える、１０−２Ｍを超えるもしくはそれ以上のＫＤで標的タンパク質に関連するタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、結合標的を阻害する。
【００８３】
本出願の一態様は、腫瘍関連標的または抗原に結合する２番目のドメインをさらに含むＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、抗原標的化は、組織分布または組織もしくは所望される細胞タイプのいずれかにおける局所濃度の増加の影響に関してＥＧＦＲ結合ポリペプチドを局在化するのに役立つ。あるいは、２番目のドメインは、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドと共に癌と闘うためのさらなる作用機序を提供し得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、例えば、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＢｒＥ３−抗原、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＨＣＧおよびそのサブユニット、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ−５）、ＣＥＡＣＡＭ−６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｂａ７３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、マクロファージ阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＡＭ−４−抗原、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＧ−７２、ｐ５３、テネイシン、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インスリン増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、胎盤増殖因子（Ｐ１ＧＦ）、１７−１Ａ−抗原、血管新生マーカー（例えば、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン）、癌遺伝子マーカー、癌遺伝子産物、および他の腫瘍関連抗原のような腫瘍関連標的または抗原に結合する。腫瘍関連抗原に関する最近の報告として、Mizukami et al., (2005, Nature Med. 11:992-97)；Hatfield et al., (2005, Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48)；Vallbohmer et al. (2005, J. Clin. Oncol. 23:3536-44)；およびRen et al. (2005, Ann. Surg. 242:55-63)（それぞれ、本明細書において参照により援用される）が挙げられる。
【００８５】
治療薬の対応する生物学によって、いずれのタイプの腫瘍およびいずれのタイプの腫瘍抗原も、標的にすることができる。癌は、例えば、乳癌、結腸癌、卵巣癌腫、骨肉腫、子宮頚癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、膵臓癌、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、および横紋筋肉腫、またはＥＧＦＲｌレベルが、上昇しているか、アップグレードしているか、変異しているか、または非癌細胞と比較して生理学的に変更されている未だ決定されていない他の癌のうちの１つ以上であり得る。
【００８６】
標的にすることができる他の例示的なタイプの腫瘍として、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆道癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、髄様甲状腺癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎臓癌、卵巣癌、膵臓癌、神経膠腫、黒色腫、肝臓癌、前立腺癌、および膀胱癌が挙げられる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、抗体部分から選択される。
【００８８】
抗体部分は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。従って、抗体部分という用語は、抗体分子全体だけではなく、抗体多量体および抗体フラグメントならびに抗体の変異体（誘導体を含む）、抗体多量体および抗体フラグメントもまた包含する。抗体部分の例として、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、およびＦｖが挙げられるが、これらに限定されない。抗体部分は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体であってもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、抗体部分は、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端において１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂフラグメントであるＦａｂ’フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＣＨ１ドメインのＣ末端においてＶＨおよびＣＨ１ドメインならびに１つ以上のシステイン残基を有するＦｄ’フラグメント；（ｖ）抗体の単腕のＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖフラグメント；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)）；（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’フラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｘ）一本鎖抗体分子（例えば、単一鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Bird et al., Science 242:423-426 (1988)；およびHuston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988))；（ｘ）同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む２つの抗原結合部位を伴う「二重特異性抗体」（例えば、EP Patent Publication No. 404,097；WO93/11161；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照のこと）；ならびに（ｘｉ）相補的軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む「線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」（Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)；およびU.S. Patent No. 5,641,870）から選択される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、抗体部分は、単一ドメイン抗体である。例として、重鎖抗体、天然では軽鎖を含まない抗体、従来の４−鎖抗体から誘導される単一ドメイン抗体、操作された抗体および抗体から誘導される足場以外の単一のドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含むがこれらに限定されない任意の種から誘導することができる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、単一のドメイン抗体は、ＶＨＨドメインのような天然に存在する単一ドメイン抗体である。ＶＨＨは、WO94/04678に記載のように、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ビクーニャ、アルパカおよびグアナコを含む）から誘導されるもののような天然では軽鎖を含まない免疫グロブリンから誘導される重鎖可変ドメインである。ＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子の約１／１０の大きさである。ＶＨＨは、空洞または溝のような「異常な」エピトープに結合することが既知であるため、そのようなＶＨＨの親和性は、治療的処置により適切であり得る（PCT Publication No. WO97/49805）。
【００９２】
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、U.S. Publication No. 20070178082に記載のように、血清タンパク質に結合するＶＨＨである。血清タンパク質は、被験体の血清において見出される任意の適切なタンパク質、またはそのフラグメントであり得る。いくつかの実施形態では、血清タンパク質は、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、サイロキシン結合タンパク質、トランスフェリン、またはフィブリノーゲンである。
【００９３】
本発明において使用される抗体フラグメントを作製するために使用することができる抗体フラグメントの産生のための様々な技術が開発されている。従来的に、これらのフラグメントは、無傷（ｉｎｔａｃｔ）な抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Morimoto et al. , Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは、現在、組み換え宿主細胞によって直接産生させることができる。例えば、抗体フラグメントは、上記で考察した抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、そして化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成させることができる（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。もう１つのアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、組み換え宿主細胞培養物から直接単離することもできる。抗体フラグメントの産生のための他の技術についても、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、好適な抗体は単一鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。WO 93/16185；U.S. Patent No. 5,571,894；およびU.S. Patent No. 5,587,458を参照のこと。例えば、U.S. Patent. No. 5,641,870に記載のように、例えば、抗体フラグメントはまた、「線状抗体」であってもよい。そのような線状抗体フラグメントは、単一特異性であってもまたは二重特異性であってもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、１つ以上のアビマー配列を含む。アビマーは、インビトロエキソンシャッフリングおよびファージディスプレイによって、ヒト細胞外受容体ドメインから開発された。（Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-94；Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24:220）。得られたマルチドメインタンパク質は、単一のエピトープ結合タンパク質と比較して、改善された親和性（ある場合は、ナノモル未満（ｓｕｂ−ｎａｎｏｍｏｌａｒ）)および特異性を示し得る複数の独立した結合ドメインを含み得る。アビマーの構築および使用方法に関するさらなる詳細については、例えば、U.S. Patent Publication Nos. 20040175756、20050048512、20050053973、20050089932および20050221384（それらの全体が、本明細書において参照により援用される）に開示されている。
【００９５】
いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、１つ以上のリポカリン関連配列、例えば、アンチカリンまたはリポカリン誘導体を含む。アンチカリンまたはリポカリン誘導体は、本明細書に記載のものを含む様々な標的分子に対して親和性および特異性を有する結合タンパク質のタイプである。そのようなタンパク質については、US Patent Publication Nos. 20060058510、20060088908、20050106660、およびPCT Publication No. WO2006/056464に記載されている。
【００９６】
いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、１つ以上のテトラネクチンのＣ型レクチン関連配列またはトリネクチン、例えば、テトラネクチンのＣ型レクチンまたはテトラネクチンのＣ型レクチン誘導体を含む。テトラネクチンのＣ型レクチンまたはテトラネクチンのＣ型レクチン誘導体は、本明細書に記載のものを含む様々な標的分子に対して親和性および特異性を有する結合タンパク質のタイプである。異なるテトラネクチンのＣ型レクチンおよび関連タンパク質については、PCT Publication Nos. WO2006/053568、WO2005/080418、WO2004/094478、WO2004/039841、WO2004/005335、WO2002/048189、WO98/056906、およびU.S. Patent Publication No. 20050202043に記載されている。
【００９７】
いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、１つ以上の天然のアンキリンリピートタンパク質、例えば、ＤＡＲＰｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ）を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、１つ以上のＡｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（商標）を含む。Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（商標）は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインから誘導される。新規の結合特性は、プロテインＡドメインの結合表面の近くに局在する残基を変更することによって、達成することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、１つ以上のシステインノットに基づくタンパク質足場、即ち、ミクロボディー（Ｓｅｌｅｃｏｒｅ／ＮａｓｃａＣｅｌｌ）を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、１つ以上のＴｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（商標）を含む。Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（商標）は、トランスフェリン足場（ＢｉｏＲｅｓｉｓ／Ｐｆｉｚｅｒ）に基づく。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、２番目のドメインは、γ−クリスタリンまたはユビキチンに基づく結合タンパク質を含む。これらのいわゆるＡｆｆｉｌｉｎ（商標）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）分子は、タンパク質のβシート設計における結合領域のデノボ設計によって特徴付けられる。Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）分子については、U.S Publication No. 20070248536に記載されている。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、２番目のドメインはＦｎ３ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンから誘導されるＦｎ３ドメイン、特に、フィブロネクチンの１０番目のＦｎ３ドメイン（１０Ｆｎ３）である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、Ｆｎ３ドメインである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択されるＦｎ３ドメインの１つ以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比べて長さを伸長または短縮することができる。いくつかの実施形態では、ループの長さを、２〜２５個のアミノ酸だけ伸長することができる。いくつかの実施形態では、インテグリン−結合モチーフ「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」（ＲＧＤ）を、（Ｎ末端からＣ末端の方向で）極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸配列で置き換えてもよい。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは、ヒトＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦＲ、またはＶＥＧＦＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは、ヒトＩＧＦ−ＩＲに結合し、配列番号２〜１２５、１８４〜２０４、２３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、そしてＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲに結合し、配列番号２０７〜２３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、そしてＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは、ヒトＶＥＧＦＲ２に結合し、配列番号１２６〜１８３、２０５、２０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、そしてＶＥＧＦＲ２シグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態では、Ｆｎ３ドメインは、配列番号２〜２３１または２３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む１０Ｆｎ３ドメインである。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号２〜２３１または２３６のいずれか１つに少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９８％同一なアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
コンジュゲーション
本出願の一態様は、少なくとも１つのジスルフィド結合、ペプチド結合、ポリペプチド、ポリマー糖、またはＰＥＧ部分を介して作動可能に連結されたＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび２番目のドメインを含むポリペプチドを提供する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび２番目のドメインは、ポリペプチドを介して作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは配列番号２３３または２３５である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび２番目のドメインは、血液または標的組織においてプロテアーゼによって切断可能であるプロテアーゼ部位を有するポリペプチドリンカーを介して、作動可能に連結される。そのような実施形態を使用して、そのようなタンパク質を個別に産生させることと比較して、より良好な送達もしくは治療特性、またはより効率的な産生のために、２つ以上の治療用タンパク質を放出させることができる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび２番目のドメインは、ポリマー糖のような生体適合可能なポリマーを介して作動可能に連結される。そのようなポリマー糖として、血液または標的組織中の酵素によって切断可能な酵素切断部位を挙げることができる。そのような実施形態を使用して、そのようなタンパク質を個別に産生させることと比較して、より良好な送達もしくは治療特性、またはより効率的な産生のために、２つ以上の治療用タンパク質を放出させることができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび２番目のドメインは、ポリマーリンカーを介して作動可能に連結される。ポリマーリンカーを使用して、各タンパク質部分間の距離を最適に変動し、タンパク質を作製することができるが、これには、次の特徴の１つ以上を伴う：１）目的のタンパク質に結合させる場合、１つ以上のタンパク質ドメインの結合の立体障害の減少または増加、２）安定性または溶解度（例えば、少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌ、もしくは少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌの溶解度）を増加させるためのさらなるアミノ酸置換を求めないタンパク質安定性または溶解度の増加、３）安定性（例えば、ＳＥＣによって測定される）を減少させるためのさらなるアミノ酸置換を求めないタンパク質凝集の減少、および４）さらなる結合ドメインを付加することによるタンパク質の全体的なアビディティーまたは親和性の増加。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、配列番号２３５のリンカーを含む１０Ｆｎ３ドメインである。ＰＥＧは、リンカー配列におけるシステイン部分にコンジュゲートされ、そしてＥＧＦＲ結合ポリペプチドを２番目のドメインに作動可能に連結する。
【０１１１】
ＰＥＧ化実施形態
本出願の一態様は、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドをを非タンパク質性ポリマーに連結させることを提供する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、U.S. Patent Nos. 4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192または4,179,337に記載のポリエチレングリコール(「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、Ｆｎ３ドメインを含む。いくつかの実施態様では、ポリマーはＰＥＧ部分である。加えて、本出願は、抗体部分（例えば、ラクダ抗体およびそれらの誘導体、ならびに単一鎖およびドメイン抗体；特に微生物から発現されるもの）ならびに抗体様部分（例えば、リポカリン、アンキリン、複数のＣｙｓ−Ｃｙｓドメイン、およびテトラネクチンの誘導体；特に、微生物から発現されるもの）へのＮまたはＣ末端ＰＥＧコンジュゲーションを提供する。
【０１１２】
ＰＥＧは、市販されている周知の水溶性ポリマーであるか、または当該分野において周知の方法に従うエチレングリコールの開環重合によって、調製することができる（Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161）。用語「ＰＥＧ」は、広範に使用されて、ＰＥＧのサイズまたは末端における修飾にかかわらず任意のポリエチレングリコール分子を包含し、そして以下の式によって表すことができる：
Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（１）（式中、ｎは２０〜２３００であり、そしてＸはＨまたは末端修飾、例えば、Ｃ１−４アルキルである）。一実施形態では、本発明のＰＥＧは、ヒドロキシまたはメトキシ（即ち、ＸがＨもしくはＣＨ３である）を伴う１つの末端で終結する（「メトキシＰＥＧ」）。ＰＥＧは、結合反応に必要であるか；分子の化学合成から生じるか；または分子の部分の最適な距離のためのスペーサーであるさらなる化学基を含有する。加えて、そのようなＰＥＧは、共に連結される１つ以上のＰＥＧ側鎖からなり得る。２つ以上のＰＥＧ鎖を伴うＰＥＧは、多数の腕を有する（ｍｕｌｔｉａｒｍｅｄ）ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリトール、およびソルビトールを含む様々なポリオールへのポリエチレンオキシドの付加によって、調製することができる。例えば、４つの腕を有する分岐ＰＥＧは、ペンタエリスリトールおよびエチレンオキシドから調製することができる。分岐ＰＥＧについては、例えば、European Published Application No. 473084AおよびU.S. Patent No. 5,932,462に記載されている。ＰＥＧの一形態として、リジンの第一級アミノ基を介して連結された２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）が挙げられる（Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。
【０１１３】
ペプチドまたはタンパク質へのＰＥＧコンジュゲーションは、一般的に、ＰＥＧの活性化、および活性化されたＰＥＧ−中間体の標的タンパク質／ペプチドへの直接結合、または後に活性化され、そして標的タンパク質／ペプチドに結合されるリンカーへの結合を要する（Abuchowski, A. et al, J. Biol. Chem., 252, 3571 (1977)およびJ. Biol. Chem., 252, 3582 (1977), Zalipsky, et al.、およびHarris et. al., in: Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications; (J. M. Harris ed.) Plenum Press: New York, 1992; Chap.21 and 22を参照のこと）。ＰＥＧ分子を含有する結合ポリペプチドはまた、コンジュゲート型タンパク質として公知であるが、ＰＥＧ分子の付着を欠くタンパク質を、非コンジュゲート型と称することができることが留意される。
【０１１４】
利用されるＰＥＧのサイズは、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの目的の用途を含むいくらかの因子に依存する。より大きなＰＥＧの方が、身体、血液、非血液性の細胞外液体または組織における半減期を増加するのに好適である。インビボでの細胞活性では、約１０〜６０ｋＤａの範囲のＰＥＧが好適であり、ならびに約１００ｋＤａ未満、より好ましくは、約６０ｋＤａ未満のＰＥＧが好適であるが、約１００ｋＤａを超えるサイズもまた、使用することができる。インビボでの画像化用途では、より迅速な分布およびより短い半減期を可能にするように、より大きなＰＥＧほど半減期を増加しない、一般的に約２０ｋＤａ未満のより小さなＰＥＧを使用することができる。本発明の結合ポリペプチドにコンジュゲートするための、例えば、約１，０００ダルトン（Ｄａ）〜１００，０００Ｄａ（ｎは２０〜２３００）のＰＥＧの多様な分子量形態を選択することができる。ＰＥＧにおける反復単位の数「ｎ」は、ダルトンで表される分子量に対して、概算される。活性化されたリンカー上のＰＥＧの組み合わされた分子量は、薬学的用途に適切であることが好ましい。それ故、一実施形態では、ＰＥＧ分子の分子量は１００，０００Ｄａを超えない。例えば、３つのＰＥＧ分子をリンカーに付着させる場合（ここで、各ＰＥＧ分子は、１２，０００Ｄａの同じ分子量を有する（各ｎは約２７０である））、リンカー上のＰＥＧの全分子量は、約３６，０００Ｄａ（合計でｎは約８２０である）である。リンカーに付着したＰＥＧの分子量はまた、異なり得、例えば、リンカー上の３つの分子のうち、２つのＰＥＧ分子は、それぞれ５，０００Ｄａであり得（各ｎは約１１０である）、そして１つのＰＥＧ分子は１２，０００Ｄａであり得る（ｎは約２７０である）。いくつかの実施形態では、１つのＰＥＧ部分が、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ＫＤａである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１つもしくは２つ以上のＰＥＧ部分を含有する。一実施形態では、ＰＥＧ部分は、標的リガンドに接触するタンパク質の表面上に存在する、および／または表面から離れているアミノ酸残基に結合される。一実施形態では、ＰＥＧ−結合ポリペプチドにおけるＰＥＧの組み合わせたまたは合計の分子量は、約３，０００Ｄａ〜６０，０００Ｄａ、または約１０，０００Ｄａ〜３６，０００Ｄａである。１つの実施形態では、ペグ化結合ポリペプチド中のＰＥＧは、実質的に線状、直鎖のＰＥＧである。
【０１１６】
当業者は、例えば、ペグ化結合ポリペプチドが治療上どのように使用されるか、所望される用量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、免疫原性、および他の考慮に基づいて、ＰＥＧの適切な分子量を選択することができる。タンパク質の特性を増強するためのＰＥＧおよびその使用の考察のためには、N. V. Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10: 91-114 (1993)を参照のこと。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、次の式の１つのポリ（エチレングリコール）基に共有結合される：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲ（式中、ポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（即ち、カルボニル）は、結合ポリペプチドのアミノ基の１つとアミド結合を形成する；Ｒは、低級アルキルである；ｘは２または３である；ｍは約４５０〜約９５０である；そしてｎおよびｍは、コンジュゲートから結合ポリペプチドを差し引いたときの分子量が約１０〜４０ｋＤａであるように選択される）。一実施形態では、結合ポリペプチドのリジンのε−アミノ基は、利用可能な（遊離の）アミノ基である。
【０１１８】
１つの特定の実施形態では、ＰＥＧの炭酸エステルを使用して、ＰＥＧ結合ポリペプチドコンジュゲートを形成させる。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）を、ＰＥＧとの反応において使用して、活性な混合型ＰＥＧ−スクシンイミジルカルボネートを形成させてもよく、続いて、リンカーの求核基または結合ポリペプチドのアミノ基と反応させてもよい（U.S. Patent No. 5,281,698およびU.S. Patent No. 5,932,462を参照のこと）。類似のタイプの反応では、１，１’−（ジベンゾトリアゾリル）カルボネートおよびジ−（２−ピリジル）カルボネートを、ＰＥＧと反応させて、それぞれ、ＰＥＧ−ベンゾトリアゾリルおよびＰＥＧ−ピリジル混合型カルボネートを形成させてもよい（U.S. Patent No. 5,382,657）。
【０１１９】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドのペグ化は、従来技術の方法によって、例えば、結合ポリペプチドと、救電子的に活性なＰＥＧ（供給元：Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ，ｗｗｗ．ｓｈｅａｒｗａｔｅｒｃｏｒｐ．ｃｏｍ）との反応によって、実施することができる。本発明の好適なＰＥＧ試薬は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート（ＰＥＧ−ＳＰＡ）、ブタノエート（ＰＥＧ−ＳＢＡ）、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネートまたはｍＰＥＧ２−ＮＨＳのような分岐Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである（Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69）。そのような方法を使用して、結合ポリペプチドのリジンのε−アミノ基または結合ポリペプチドのＮ末端アミノ基でペグ化してもよい。
【０１２０】
もう１つの実施形態では、ＰＥＧ分子は、結合ポリペプチド上のスルフヒドリル基に結合させてもよい（Sartore, L., et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45 (1991)；Morpurgo et al., Biocon. Chem., 7, 363-368 (1996)；Goodson et al., Bio/Technology (1990) 8, 343；U.S. Patent No. 5,766,897）。U.S. Patent Nos. 6,610,281および5,766,897は、スルフヒドリル基に結合することができる例示的な反応性ＰＥＧ種について説明している。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ペグ化されたＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、部位特異的ペグ化によって、特に、Ｎ末端またはＣ末端におけるシステイン部分へのＰＥＧのコンジュゲーションによって、生成される。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＰＥＧ部分に共有結合されたＦｎ３ドメインであり、ここで、前記Ｆｎ３ドメインのループの少なくとも１つが、ＥＧＦＲ結合に関与する。ＰＥＧ部分は、Ｃｙｓ残基への付着のような部位特異的ペグ化によって、Ｆｎ３ポリペプチドに付着させてもよく、ここで、Ｃｙｓ残基は、Ｆｎ３ポリペプチドのＮ末端、またはＮ末端と最もＮ末端側のβもしくはβ様鎖との間、またはＦｎ３ポリペプチドのＣ末端、またはＣ末端と最もＣ末端側のβもしくはβ様鎖との間に位置することができる。Ｃｙｓ残基は、他の位置においても、特に、標的結合に関与しないループのいずれかに設置することもできる。ＰＥＧ部分はまた、アミンへのコンジュゲーションを含む他の化学によって付着させてもよい。
【０１２２】
ＰＥＧ分子が結合ポリペプチド上のシステイン残基にコンジュゲートされるいくつかの実施形態では、システイン残基は、結合ポリペプチドに天然に認められるが、他の実施形態では、１つ以上のシステイン残基が、結合ポリペプチドに操作導入される。変異を結合ポリペプチドコード配列に導入して、システイン残基を作製してもよい。これは、例えば、１つ以上のアミノ酸残基を変異させてシステインにすることによって、達成され得る。システイン残基に変異させるのに好適なアミノ酸として、セリン、スレオニン、アラニンおよび他の親水性残基が挙げられる。好ましくは、システインに変異すべき残基は、表面に露出した残基である。１次配列またはタンパク質に基づいて残基の表面アクセス可能性を推定するためのアルゴリズムは、当該分野において周知である。あるいは、どの結合ポリペプチドを設計し、そして展開させるかに基づくフレームワークの結晶構造が解明されていれば、結合ポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって表面残基を推定することができ（Himanen et al., Nature. (2001) 20-27;414(6866):933-8を参照のこと）、それ故、表面に露出した残基が同定される。一実施形態では、システイン残基は、Ｎ末端および／またはＣ末端上もしくは付近、またはループ領域内の結合ポリペプチドに導入される。システイン残基のペグ化は、例えば、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミド、またはＰＥＧ−オルト−ピリジルジスルフィドを使用して、行ってもよい。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ペグ化結合ポリペプチドは、Ｎ−末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合したＰＥＧ分子を含む。部位特異的Ｎ末端還元的アミノ化については、Pepinsky et al., (2001) JPET, 297,1059、およびU.S. Patent No. 5,824,784に記載されている。他の利用可能な求核アミノ基を利用したタンパク質の還元的アミノ化のＰＥＧ−アルデヒドの使用については、U.S. Patent No. 4,002,531、Wieder et al., (1979) J. Biol. Chem. 254,12579、およびChamow et al., (1994) Bioconjugate Chem. 5, 133に記載されている。
【０１２４】
もう１つの実施形態では、ペグ化結合ポリペプチドは、リンカーに共有結合した１つ以上のＰＥＧ分子を含み、次に、結合ポリペプチドのＮ末端におけるアミノ酸残基のαアミノ基に付着される。そのようなアプローチについては、U.S. Publication No. 2002/0044921およびPCT Publication No. WO94/01451に開示されている。
【０１２５】
一実施形態では、結合ポリペプチドは、Ｃ末端においてペグ化される。特定の実施形態では、タンパク質は、Ｃ末端アジド−メチオニンの導入および以後のシュタウディンガー反応を介するメチル−ＰＥＧ−トリアリールホスフィン化合物のコンジュゲーションによって、Ｃ末端においてペグ化される。このＣ末端コンジュゲーション方法については、Cazalis et al., C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity, Bioconjug Chem. 2004;15(5):1005-1009に記載されている。
【０１２６】
サイズ排除（例えば、ゲルろ過）およびイオン交換クロマトグラフィーのような当該技術分野において公知の従来の分離および精製技術を使用して、ＰＥＧ化結合ポリペプチドを精製することができる。生成物はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離してもよい。分離することができる生成物として、モノ−、ジ−、トリ−、ポリ−および非ペグ化結合ポリペプチド、ならびに遊離のＰＥＧが挙げられる。モノ−ＰＥＧコンジュゲートの百分率は、溶出ピークの周囲のより広範な画分をプールして、組成物中のモノ−ＰＥＧの百分率を増加することによって、制御することができる。約９０パーセントのモノ−ＰＥＧコンジュゲートは、収量および活性の良好なバランスを表す。例えば、コンジュゲートの少なくとも９２パーセントまたは少なくとも９６パーセントがモノ−ＰＥＧ種である組成物が所望され得る。本発明の一実施形態では、モノ−ＰＥＧコンジュゲートの百分率は、９０パーセント〜９６パーセントである。
【０１２７】
本発明の一実施形態では、ペグ化ＥＧＦＲ結合ポリペプチド中のＰＥＧは、ヒドロキシルアミンアッセイ、例えば、８〜１６時間、室温で４５０ｍＭヒドロキシルアミン（ｐＨ６．５）を使用しても、ペグ化アミノ酸残基から加水分解されず、それ故、安定である。一実施形態では、組成物の８０％超、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％超が、安定なモノ−ＰＥＧ−結合ポリペプチドである。
【０１２８】
もう１つの実施形態では、ペグ化ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、好ましくは、非修飾タンパク質に関連する生物活性を、少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％保持する。一実施形態では、生物活性は、ＥＧＦＲに結合するその能力を指し、ＫＤ、ｋｏｎまたはｋｏｆｆによって評価される。１つの特定の実施形態では、ペグ化結合ポリペプチドタンパク質は、非ペグ化結合ポリペプチドと比べて、ＥＧＦＲへの結合が増加する。
【０１２９】
ＰＥＧ−修飾ポリペプチドの血清クリアランス率は、非修飾結合ポリペプチドのクリアランス率と比べて、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはなお９０％減少し得る。ＰＥＧ−修飾ポリペプチドは、非修飾タンパク質の半減期と比べて、増強した半減期（ｔ１／２）を有し得る。ＰＥＧ−結合ポリペプチドの半減期は、非修飾結合ポリペプチドの半減期と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％もしくは５００％、またはなお１０００％増強され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質の半減期は、インビトロで、例えば、緩衝化生理食塩水または血清中で決定される。他の実施形態では、タンパク質の半減期は、インビボでの半減期、例えば、動物の血清または他の体液中のタンパク質の半減期である。
【０１３０】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの脱免疫化
一態様では、本出願は、脱免疫化ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの配列は、１つ以上のＢまたはＴ細胞エピトープを排除するように変更されている。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１０Ｆｎ３ドメインを含む。
【０１３１】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを脱免疫化して、それを、所与の種に対して非免疫原性、またはより低い免疫原性にしてもよい。脱免疫化は、ポリペプチドに対する構造的変更を介して、達成することができる。当業者に公知の任意の脱免疫化技術を用いることができる。例えば、タンパク質を脱免疫化するための１つの適切な技術が、WO 00/34317（その開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。要約すると、その文献に記載の一般的方法内の典型的プロトコルは、以下の工程を含む。
１．ポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程；
２．ペプチドのＭＨＣ分子への結合の判定、ペプチド：ＨＬＡ複合体の治療用タンパク質を受容する種由来のＴ細胞受容体への結合の判定、治療用タンパク質を受容する種のＨＬＡ分子を伴うトランスジェニック動物を使用するポリペプチドもしくはその一部の試験、または治療用タンパク質を受容する種由来の免疫系細胞で再構築されたそのようなトランスジェニック動物の試験を含む任意の方法によって、ポリペプチドのアミノ酸配列内の潜在的Ｔ細胞エピトープを同定する工程；
３．遺伝子操作または他の方法によって修飾されたポリペプチドを産生させ、ポリペプチドを変更して１つ以上の潜在的なＴ細胞エピトープを取り出し、そして試験のためにそのような変更されたポリペプチドを産生させる工程。
【０１３２】
一実施形態では、ポリペプチドの配列を、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの存在について分析することができる。例えば、ｓｉｔｅｗｅｈｉｌ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕのワールドワイドウェブ上の、例えば、「モチーフ」データベースを検索することによるようなＭＨＣ−結合モチーフのデータベースによって、比較を行うことができる。あるいは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、Altuvia et al. (J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995))によって考案されたような計算スレッディング法（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して同定することができ、それによって、ポリペプチド由来の連続重複ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対するそれらの結合エネルギーを試験している。計算結合推定アルゴリズムとして、ｉＴｏｐｅ（商標）、Ｔｅｐｉｔｏｐｅ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（ＥｐｉＶａｘ）、およびＭＨＣｐｒｅｄが挙げられる。ＭＨＣクラスＩＩ−結合ペプチドの同定を支援するために、両親媒性およびＲｏｔｈｂａｒｄモチーフのような首尾よく提示されたペプチド、ならびにカテプシンＢおよび他のプロセシング酵素の切断部位に関連する関連配列特徴を、検索することができる。
【０１３３】
潜在的な（例えば、ヒト）Ｔ細胞エピトープが同定されると、その後、Ｔ細胞エピトープを排除することが必要であれば、これらのエピトープは、１つ以上のアミノ酸の変更によって排除される。通常、これは、Ｔ細胞エピトープ自体内の１個以上のアミノ酸の変更を要する。これは、タンパク質の１次構造においてエピトープに隣接するアミノ酸、または１次構造では隣接しないが、分子の２次構造では隣接するアミノ酸を変更することを要し得る。考慮される通常の変更は、アミノ酸置換であるが、所定の環境下では、アミノ酸の付加または欠失も適切であり得る。すべての変更は、最終的な分子が、例えば、良好に確立された方法によって、組み換え宿主からの発現により調製され得るように、組み換えＤＮＡ技術によって達成することができるが、タンパク質化学または分子変更の他の任意の手段の使用もまた、使用することができる。
【０１３４】
一旦、同定されたＴ細胞エピトープが取り出されたら、脱免疫化された配列を再度分析して、あらたなＴ細胞エピトープが作製されていないこと、およびそれらが作成されていた場合、エピトープを欠失することができることを確実にする。
【０１３５】
計算上同定されたすべてのＴ細胞エピトープを取り出す必要はない。当業者であれば、特定のエピトープの「強度」またはむしろ潜在的な免疫原性の重要性を理解するであろう。様々な計算方法により、潜在的なエピトープのスコアが作成される。当業者であれば、高スコアのエピトープのみを取り出す必要があり得ることを理解するであろう。当業者であれば、潜在的なエピトープを取り出す工程とポリペプチドの結合親和性を維持する工程の間にバランスが存在することもまた、認識するであろう。従って、１つのストラテジーは、置換をポリペプチドに連続的に導入し、次いで、抗原結合および免疫原性について試験することである。
【０１３６】
一態様では、脱免疫化ポリペプチドは、ヒト被験体の本来のポリペプチドよりも免疫原性が低い（または、むしろ減少したＨＡＭＡ応答を誘発する）。免疫原性を決定するためのアッセイは、当業者の知識の範囲内に良好に当てはまる。免疫応答を決定する当該分野において認識された方法を実施して、臨床治験中の特定の被験体においてＨＡＭＡ応答をモニターすることができる。脱免疫化ポリペプチドを投与された被験体は、前記治療の投与開始時および投与を通して、免疫原性評価を行うことができる。ＨＡＭＡ応答は、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）および／または固相ＥＬＩＳＡ分析を含む当該分野において公知の方法を使用して、血清サンプル中の脱免疫化ポリペプチドに対する抗体を検出することによって、測定される。あるいは、Ｔ細胞活性化事象を測定するために設計されたインビトロでのアッセイもまた、免疫原性を示す。
【０１３７】
さらなる修飾
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、グリコシル化される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはＦｎ３ドメインである。Ｆｎ３ドメインは、通常、グリコシル化部位を含有しないが、しかし、そのようなグリコシル化を操作してタンパク質に導入してもよい。
【０１３８】
タンパク質のグリコシル化は、典型的に、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素学的付着のための認識配列である。これらを操作して、本発明のタンパク質、特に、フィブロネクチンに基づく足場タンパク質およびそれらの対応するポリヌクレオチドに導入することができる。それ故、ポリペプチドにおいてこれらのトリペプチド配列のうちいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ−結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはスレオニン（但し、また、５−ヒドロキシプロリンもしくは５−ヒドロキシリジンを使用してもよい）への糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの付着を指す。
【０１３９】
グリコシル化部位のタンパク質への付加は、アミノ酸配列が、上記の（Ｎ−結合型グリコシル化部位のための）トリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される。変更はまた、本来の抗体の（Ｏ−結合型グリコシル化部位のための）配列に１つ以上のセリンまたはスレオニン残基を付加または置換することによって、作製してもよい。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを修飾して、抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を増強させる。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、Ｆｃ領域をさらに含むＦｎ３ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを増強する変異体である。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
【０１４１】
一実施形態では、変異体Ｆｃ領域は、ヒトエフェクター細胞の存在下で、より効果的に抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）を仲介するか、または天然配列のＦｃ領域より良好な親和性でＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合し得る。そのようなＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域の２５６位、２９０位、２９８位、３１２位、３２６位、３３０位、３３３位、３３４位、３６０位、３７８位または４３０位のいずれか１つ以上においてアミノ酸修飾を含み得、ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの番号付けである。
【０１４２】
核酸−タンパク質融合技術
一態様では、本出願は、例えば、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＩＧＦ−ＩＲ、および他のタンパク質のようなヒト標的に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを提供する。特異的結合特性を伴うＦｎ３ドメインを迅速に作製および試験するための１つの方法は、Ａｄｎｅｘｕｓ，  ａ  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｒ＆Ｄ  Ｃｏｍｐａｎｙの核酸−タンパク質融合技術である。本開示は、ＥＧＦＲおよび他のタンパク質への結合に重要な新規のポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定するための核酸−タンパク質融合（ＲＮＡ−およびＤＮＡ−タンパク質融合）を利用する、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）と呼ばれるインビトロでのそのような発現、ならびにタグ付け技術の使用について説明している。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質を、それをコードする遺伝子情報に共有結合する技術である。ＲＮＡ−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンに基づく足場タンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細な説明については、Szostak et al., U.S. Patent Nos.: 6,258,558；6,261,804；6,214,553；6,281,344；6,207,446；6,518,018；PCT Publication Nos. WO00/34784；WO01/64942；WO02/032925；およびRoberts and Szostak, Proc Natl. Acad. Sci. 94:12297-12302, 1997（本明細書において参照により援用される）を参照のこと。核酸−タンパク質融合技術のさらなる考察は、本出願の実施例ならびに材料および方法のセクションにおいて見出すことができる。
【０１４３】
ベクターおよびポリヌクレオチド実施形態
本明細書において開示する様々なタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成することができる。コドン使用は、細胞での発現が改善されるように選択することができる。そのようなコドン使用は、選択される細胞タイプに依存する。特化されたコドン使用パターンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ)および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞について開発されている。例えば：Mayfield et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jan 21;100(2):438-42；Sinclair et al. Protein Expr Purif. 2002 Oct;26(1):96-105；Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 Oct;12(5):446-9；Makrides et al. Microbiol Rev. 1996 Sep;60(3):512-38；およびSharp et al. Yeast. 1991 Oct;7(7):657-78を参照のこと。
【０１４４】
核酸の操作のための一般的技術については、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989、またはF. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)および定期更新物（本明細書において参照により援用される）に記載されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。そのような調節エレメントとして、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。複製開始点によって通常付与される宿主において複製する能力、および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子が、追加的に組み入れられる。
【０１４５】
本明細書に記載のタンパク質は、組み換え的に、直接的のみならず異種ポリペプチド（好ましくは、シグナル配列、または成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端において特異的切断部位を有する他のポリペプチドである）との融合ポリペプチドとして産生させることができる。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識およびプロセスされる(即ち、シグナルペプチダーゼによって切断される)配列である。天然のシグナル配列を認識およびプロセスしない原核生物宿主細胞では、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母の分泌では、天然のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリヴェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α−因子リーダーを含む)、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、またはPCT Publication No. WO90/13646に記載のシグナルによって置換してもよい。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域のＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡのリーディングフレームにライゲートしてもよい。
【０１４６】
発現ベクターおよびクローニングベクターの両方とも、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含有する。一般的に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主の染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にする配列であり、かつ複製開始点または自己複製配列を含む。そのような配列は、多様な細菌、酵母、およびウイルスにおいて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点は、ほとんどのグラム陰性菌に適切であり、２ミクロンプラスミドの起点が、酵母に適切であり、そして様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製開始点の成分は、哺乳動物の発現ベクターには必要ではない（ＳＶ４０起点は初期プロモーターを含有するという理由だけで、ＳＶ４０起点が典型的に使用され得る）。
【０１４７】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有することができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養要求性の欠損を補うか、あるいは（ｃ）複合培地から得ることができない極めて重要な栄養素を供給する（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）タンパク質をコードする。
【０１４８】
酵母に使用するのに適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株の選択マーカーを提供する（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１、Jones, Genetics, 85:12 (1977)）。そこで、酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１損傷（ｌｅｓｉｏｎ）が存在すると、トリプトファンの非存在下での増殖により形質転換を検出するための有効な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ番号２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補われる。
【０１４９】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物体によって認識され、かつ本発明のタンパク質、例えば、フィブロネクチンに基づく足場タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。原核生物宿主との使用に適したプロモーターとして、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、他の既知の細菌プロモーターも適切である。細菌系に使用するためのプロモーターはまた、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
【０１５０】
真核生物のためのプロモーター配列も公知である。実質的にすべての真核生物の遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０個の塩基上流に局在するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始部位から７０〜８０個の塩基上流に見いだされるもう１つの配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここで、Ｎはいずれのヌクレオチドであってもよい。ほとんどの真核生物の遺伝子の３’末端において、コード配列の３’末端にポリＡテイルを付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列が存在する。すべての配列が、真核細胞発現ベクターに適切に挿入される。
【０１５１】
酵母宿主との使用のための適切な促進配列（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の例として、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。
【０１５２】
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース資化を担う酵素のプロモーター領域がある。酵母発現に使用するのに適切なベクターおよびプロモーターについては、EP Patent Publication No. 73,657にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０１５３】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合することを条件として、制御することができる。
【０１５４】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製開始点もまた含有するＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限フラグメントとして簡便に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して、哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるための系については、U.S. Patent No. 4,419,446に開示されている。この系の改変については、U.S. Patent No. 4,601,978に記載されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関しては、Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復を、プロモーターとして使用することができる。
【０１５５】
高等な真核生物による本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。現在、哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン)由来の多くのエンハンサー配列が公知である。しかし、典型的に、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例として、複製起点の後半の部位（ｂｐ１００〜２７０）におけるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半の部位におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、真核生物のプロモーターの活性化のためのエレメントの増強に関しては、Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照のこと。エンハンサーは、多価抗体をコードするコード配列に対し５’または３’の位置でベクターにスプライシングしてもよいが、好ましくは、プロモーターの５’の部位に局在する。
【０１５６】
真核宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有する。そのような配列は、真核生物またはウイルスＤＮＡもしくはｃＤＮＡの５’および場合により、３’非翻訳領域から一般的に入手可能である。これらの領域は、多価抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026およびこの文献において開示される発現ベクターを参照のこと。
【０１５７】
組み換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するのに有用であり得る任意のタイプのタンパク質タグ配列を含むことができる。タンパク質タグの例として、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが挙げられるが、これらに限定されない。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主との使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985)（その関連する開示内容は、本明細書において参照により援用される）において見出すことができる。
【０１５８】
発現構築物は、当業者に理解されるような宿主細胞に適切な方法を使用して、宿主細胞に導入される。エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；および感染(ここで、ベクターは感染因子である)を含むが、これらに限定されない核酸を宿主細胞に導入するための多様な方法が、当該技術分野において公知である。
【０１５９】
適切な宿主細胞として、原核細胞、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が挙げられる。適切な細菌として、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ)またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）が挙げられる。好ましくは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種由来の酵母もまた、ポリペプチドの産生に使用することができる。様々な哺乳動物または昆虫細胞培養系を用いて、組み換えタンパク質を発現させることができる。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系が、LuckowおよびSummers(Bio/Technology, 6:47, 1988)によってレビューされている。適切な哺乳動物宿主細胞系統の例として、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞系統が挙げられる。精製されたポリペプチドは、適切な宿主／ベクター系を培養して、組み換えタンパク質を発現させることによって、調製される。多くの用途について、本明細書において開示された小さなポリペプチドの多くが、発現のための好適な方法として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現される。次いで、タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。
【０１６０】
本発明のグリコシル化タンパク質の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物体から誘導される。無脊椎動物細胞の例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および改変体、ならびにヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（幼虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のような宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための多様なウイルス株、例えば、オートグラファ・カルフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株が好適に利用可能であり、そして特に、ヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、そのようなウイルスを、本発明に従って、本明細書に記載のウイルスとして使用することができる。
【０１６１】
場合によっては、例えば、グリコシル化のために、脊椎動物細胞においてタンパク質を産生させることが所望され、そして培養物（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は日常的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞系統の例には、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）によって形質転換されるサル腎臓ＣＶｌ系統；ヒト胎児腎系統（懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされる２９３または２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59. (1977)）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎細胞（ＣＶｌ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ    ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝癌系統（Ｈｅｐ  Ｇ２）；ならびに骨髄腫またはリンパ腫細胞（例えば、Ｙ０、Ｊ５５８Ｌ、Ｐ３およびＮＳ０細胞）（U.S. Patent No. 5,807,715を参照のこと）がある。ワタ、トウモロコシ、ポテト、ダイズ、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）、トマト、およびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる。
【０１６２】
タンパク質産生
宿主細胞を、タンパク質産物のための本明細書に記載の発現またはクローニングベクターで形質転換し、そしてプロモーターを含むか、形質転換体を選択するか、または所望される配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切であるように改変された従来の栄養培地において培養する。
【０１６３】
本発明のタンパク質を産生させるために使用される宿主細胞は、多様な培地において培養することができる。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適切である。加えて、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)、U.S. Patent Nos. 4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；もしくは5,122,469；WO90/03430；WO87/00195；またはU.S. Patent No. Re. 30,985に記載の培地のいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれも、必要であれば、ホルモンならびに／あるいは他の増殖因子(例えば、インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮増殖因子)、塩(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩)、緩衝液(例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充することができる。他の任意の必要な補充物もまた、当業者に公知である適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ、などのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に先に使用された条件であり、そして当業者には明らかであろう。
【０１６４】
本明細書において開示するタンパク質はまた、細胞−翻訳系を使用して産生させることができる。そのような目的のためには、インビトロ転写を可能にしてｍＲＮＡを産生させ、そして特に、利用する無細胞系におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳（哺乳動物もしくは酵母細胞のような真核細胞を含まない翻訳系または細菌細胞のような原核細胞を含まない翻訳系）を可能にするために、ポリペプチドをコードする核酸を修飾しなければならない。
【０１６５】
本発明のタンパク質はまた、化学合成によって（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, ILに記載の方法によって）産生させることができる。タンパク質に対する修飾もまた、化学合成によって行うことができる。
【０１６６】
本発明のタンパク質は、タンパク質化学の分野において一般的に公知のタンパク質の単離／精製方法によって精製することができる。非制限的例として、抽出、再結晶、（例えば、硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナトリウムによる）塩析、遠心分離、透析、限外ろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。精製後、ろ過および透析を含むが、これらに限定されない当該分野において公知の多様な方法によって、ポリペプチドを、異なる緩衝液へ交換し得る、および／または濃縮し得る。
【０１６７】
精製されたポリペプチドは、好ましくは、少なくとも８５％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、最も好ましくは、少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは、医薬品としての用途に十分に純粋である。
【０１６８】
画像化、診断および他の用途
一態様では、本出願は、検出可能な部分で標識されたＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、多様な診断アプリケーションに使用することができる。検出可能な部分は、直接または間接的いずれかの検出可能なシグナルを生じることが可能な任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、Ｈ３、Ｃ１４もしくは１３、Ｐ３２、Ｓ３５、またはＩ１３１のような放射性同位元素；イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、もしくはルシフェリンのような蛍光化合物または化学発光化合物；あるいはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であってもよい。
【０１６９】
Hunter, et al., Nature 144:945 (1962)；David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974)；Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)；およびNygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)により記載の方法を含むタンパク質を検出可能な部分にコンジュゲートするための当該分野に公知の任意の方法を用いることができる。インビトロ方法は、ＣｙｓおよびＬｙｓのような特定のアミノ酸についての化学のようなタンパク質と適合可能な化学を含む当該分野において周知のコンジュゲーション化学を含む。(ＰＥＧのような)部分を本発明のタンパク質に連結させるために、連結基または反応基が使用される。適切な連結基は、当該技術分野において周知であり、そしてジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、感光基、ペプチダーゼ感受性基（ｌａｂｉｌｅ  ｇｒｏｕｐ）およびエステラーゼ感受性基（ｌａｂｉｌｅ  ｇｒｏｕｐ）を含む。好適な連結基は、用途に依存してジスルフィド基およびチオエーテル基である。Ｃｙｓアミノ酸を伴わないポリペプチドでは、Ｃｙｓは、タンパク質の活性を可能にする場所で操作して、コンジュゲーションのための場所を作製する間、存在させることができる。
【０１７０】
検出可能な部分と連結されたＥＧＦＲ結合ポリペプチドはまた、インビボでの画像化にも有用である。ポリペプチドを、放射線不透過（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）剤または放射性同位元素に連結し、被験体、好ましくは、血流に投与してもよく、そして被験体中の標識タンパク質の存在および局在がアッセイされる。この画像化技術は、悪性腫瘍の病期分類および治療に有用である。タンパク質は、核磁気共鳴、放射線学、または当該分野において公知の他の検出手段のいずれであろうと、被験体において検出可能な任意の部分で標識することができる。
【０１７１】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドはまた、アフィニティー精製因子として有用である。このプロセスでは、ポリペプチドは、当該分野において周知の方法を使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂またはろ紙のような適切な支持体上に固定化される。
【０１７２】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)）のような任意の既知のアッセイ方法に用いることができる。
【０１７３】
所定の態様では、本開示は、サンプル中のＥＧＦＲを検出するための方法を提供する。方法は、サンプルと本明細書に記載のＥＧＦＲ結合ポリペプチドとを接触させる工程（ここで、前記接触工程は、ポリペプチド−ＥＧＦＲ複合体形成を可能にする条件下で行われる）；および前記複合体を検出し、それによって、前記サンプル中の前記ＥＧＦＲを検出する工程を含み得る。検出は、例えば、ラジオグラフィー、免疫学的アッセイ、蛍光検出、質量分析、または表面プラズモン共鳴のような当該分野において公知の任意の技術を使用して、行うことができる。サンプルは、しばしば、生検、特に、腫瘍、疑わしい腫瘍の生検のような生物学的サンプルである。サンプルは、ヒト由来であってもまたは他の哺乳動物由来であってもよい。ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、放射性部分、蛍光部分、発色部分、化学発光部分、またはハプテン部分のような標識部分で標識してもよい。ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、固相支持体上に固定化することができる。
【０１７４】
治療／インビボでの用途
一態様では、本出願は、ＥＧＦＲ関連障害の治療に有用なＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。本出願はまた、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを被験体に投与するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、被験体は、癌のようなＥＧＦＲ関連障害を有する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１つ以上のＥＧＦＲリガンドに結合するＥＧＦＲを阻害する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの動物への投与により、ＥＧＦＲを発現する腫瘍におけるＥＧＦＲレベルが減少する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドにより、受容体レベルが、非処置動物と比較して、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、もしくは８０％以上減少する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを投与すると、インビボでの腫瘍細胞の増殖が阻害される。腫瘍細胞は、制限されないが、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、白血病、肉腫、多発性骨髄腫、または中胚葉細胞を含む任意の細胞タイプから誘導され得る。異種移植腫瘍研究に使用するための一般的腫瘍細胞系統の例として、Ａ５４９（非小細胞肺癌）細胞、ＤＵ−１４５（前立腺）細胞、ＭＣＦ−７（乳）細胞、Ｃｏｌｏ  ２０５（結腸）細胞、３Ｔ３／］ＧＦ−ＩＲ（マウス線維芽細胞）細胞、ＮＣＩ  Ｈ４４１細胞、ＨＥＰ  Ｇ２（肝癌）細胞、ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１（乳）細胞、ＨＴ−２９（結腸）細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ（乳）細胞、Ｕ２６６細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、Ｓｋ−Ｍｅｌ−２細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭ１８２２６、およびＡ４３１細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、非処置動物における腫瘍の増殖と比べて、腫瘍細胞の増殖を阻害する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、非処置動物における腫瘍の増殖と比べて、腫瘍細胞の増殖を、５０、６０、７０、もしくは８０％以上阻害する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞の増殖の阻害は、ポリペプチドによる動物の処置を開始して、少なくとも７日間後または少なくとも１４日間後に測定した。いくつかの実施形態では、もう１つの抗腫瘍薬剤が、ポリペプチドと共に動物に投与される。
【０１７７】
所定の態様では、本開示は、ＥＧＦＲの阻害に応答する病態、即ち、「ＥＧＦＲ関連疾患」を有する被験体を治療するための方法を提供する。そのような方法は、本明細書に記載のＥＧＦＲを阻害するポリペプチドのいずれかの有効量を前記被験体に投与する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１つ以上のＥＧＦＲリガンドに結合するＥＧＦＲを阻害する。
【０１７８】
用語「ＥＧＦＲ関連疾患」は、ＥＧＦＲ活性に依存する病理学的状態を指す。ＥＧＦＲは、増殖、接着および遊走、ならびに分化を含む様々な細胞の活動のシグナル伝達経路に直接または間接的のいずれかで関与する。ＥＧＦＲ活性に関与する疾患として、腫瘍細胞の増殖、固形腫瘍の増殖を促進する病的血管新生、眼の血管新生（糖尿病網膜症、加齢黄班変性など）および炎症（乾癬、関節リウマチなど）が挙げられる。
【０１７９】
所定の態様では、本開示は、腫瘍および／または腫瘍転移の治療ならびに／あるいは予防のために、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを投与するための方法を提供し、ここで、腫瘍は、特に好ましくは、制限されないが、脳腫瘍、尿生殖路の腫瘍、リンパ系の腫瘍、胃腫瘍、咽頭腫瘍、単球性白血病、肺腺癌、小細胞肺癌腫、膵臓癌、神経膠芽腫および乳癌腫からなる群から選択される。
【０１８０】
所定の態様では、本開示は、扁平上皮細胞癌、膀胱癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、大腸癌、乳癌、頭部癌、頚部癌、食道癌、婦人科癌、甲状腺癌、リンパ腫、慢性白血病および急性白血病からなる癌疾患の群から選択される疾患の治療のために、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを投与するための方法を提供する。
【０１８１】
所定の態様では、本開示は、血管新生によって生じる、仲介されるおよび／または増殖する疾患の治療ならびに／あるいは予防のために、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドｔを投与するための方法を提供する。血管新生に関与するこのタイプの疾患は、網膜新血管形成、糖尿病網膜症、加齢黄班変性などのような眼疾患である。
【０１８２】
所定の態様では、本開示は、網膜新血管形成、糖尿病網膜症、加齢黄班変性および／または炎症性疾患からなる群から選択される疾患の治療および／または予防のために、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを投与するための方法を提供する。
【０１８３】
所定の態様では、本開示は、乾癬、関節リウマチ、接触皮膚炎、遅延型過敏反応、炎症、子宮内膜症、瘢痕化、前立腺肥大症、免疫疾患、自己免疫疾患および免疫不全症からなる群から選択される疾患の治療ならびに／あるいは予防のために、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを投与するための方法を提供する。
【０１８４】
所定の態様では、本開示は、骨肉腫、骨関節炎およびくる病からなる群から選択される骨病理の治療ならびに／あるいは予防のために、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを投与するための方法を提供する。
【０１８５】
本出願の一態様は、インビボでのＥＧＦＲチロシンリン酸化もしくは受容体レベルまたは両方を阻害するＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。一実施形態では、ＥＧＦＲ結合バインダーの動物への投与により、ＥＧＦＲを発現する腫瘍におけるＥＧＦＲホスホチロシンシグナルが減少する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲバインダーは、ホスホチロシンシグナルを少なくとも２０％減少する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲバインダーは、ホスホチロシンシグナルを少なくとも５０、６０、７０、８０、もしくは９０％以上減少する。
【０１８６】
本発明の適切な実施形態と共に使用することができるさらなる薬剤
本発明の一態様は、細胞障害性薬剤に連結されたＥＧＦＲ結合ポリペプチドを提供する。そのような実施形態は、適切であれば、インビトロまたはインビボ方法によって調製することができる。インビトロ方法は、ＣｙｓおよびＬｙｓのような特定のアミノ酸についての化学のようなタンパク質と適合可能な化学を含む当該分野において周知のコンジュゲーション化学を含む。細胞障害性薬剤をポリペプチドに連結するために、連結基または反応基が使用される。適切な連結基は、当該技術分野において周知であり、そしてジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、感光基、ペプチダーゼ感受性基（ｌａｂｉｌｅ  ｇｒｏｕｐ）およびエステラーゼ感受性基（ｌａｂｉｌｅ  ｇｒｏｕｐ）を含む。好適な連結基は、ジスルフィド基およびチオエーテル基である。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか、または抗体と細胞障害性薬剤との間にチオエーテル結合を形成することによって、コンジュゲートを構築することができる。好適な細胞障害性薬剤は、マイタンシノイド系薬剤、タキサン系薬剤およびＣＣ−１０６５の類似体である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、細菌毒素、植物毒素、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、プロテアーゼ、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エンドトキシン、ランピルナーゼ（Ｒａｎｐｉｒｎａｓｅ）（Ｒａｐ）、Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）、酵素、または蛍光タンパク質に連結される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、マイタンシノイド系薬剤またはマイタンシノイド類似体に連結される。適切なマイタンシノイド系薬剤の例として、マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体が挙げられる。適切なマイタンシノイド系薬剤については、U.S. Patent Nos. 4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499；および5,846,545に開示されている。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、タキサン系薬剤に連結される。本発明に使用するのに適切なタキサン系薬剤については、U.S. Patent Nos. 6,372,738および6,340,701に開示されている。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、ＣＣ−１０６５またはその類似体に連結される。ＣＣ−１０６５およびその類似体については、U.S. Patent Nos. 6,372,738；6,340,701；5,846,545および5,585,499に開示されている
【０１９１】
そのような細胞障害性コンジュゲートの調製のための魅力的な候補はＣＣ−１０６５であり、これは、ストレプトマイセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離される強力な抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびビンクリスチンのような一般的に使用される抗癌薬より、インビトロで約１０００倍を超えて強力である（B. K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)）。
【０１９２】
メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、およびカリチアマイシンのような細胞障害性薬もまた、本発明のコンジュゲートの調製に適切であり、そして薬物分子はまた、血清アルブミンのような中間のキャリア分子を介してＥＧＦＲ結合ポリペプチドに連結させることができる。
【０１９３】
他の治療的処置または組成物では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、１つ以上のさらなる治療用薬剤と共に同時投与、または順次的に投与される。適切な治療用薬剤として、標的化治療剤、他の標的化生物学的製剤、および細胞障害性薬剤または細胞増殖抑制性薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、液剤を保持する同じまたは個別の治療的に許容できるバイアル、シリンジまたは他の投与デバイスから薬剤を投与することが好ましい。
【０１９４】
癌治療用薬剤は、患者に対しては影響が最小限である一方、癌細胞を死滅させるか、または癌細胞の増殖を制限しようとする薬剤である。それ故、そのような薬剤は、癌細胞特性（例えば、代謝、新血管形成または細胞表面抗原提示）における健康な宿主細胞との差異を利用することができる。腫瘍形態学における差異は、介入のための潜在的部位である：例えば、第２の治療剤は、固形腫瘍の内部の新血管形成を妨げ、それによってその増殖速度を遅延させるのに有用である抗ＶＥＧＦ抗体のような抗体であり得る。他の治療用薬剤として、グラニセトロンＨＣｌのような補助剤、酢酸ロイプロリドのようなアンドロゲンインヒビター、ドキソルビシンのような抗生物質、タモキシフェンのような抗エストロゲン、インターフェロンα−２ａのような代謝拮抗剤、タキソールのような細胞障害性薬剤、ｒａｓファルネシル−トランスフェラーゼインヒビターのような酵素インヒビター、アルデスロイキンのような免疫調節薬、およびメルファランＨＣｌのようなナイトロジェンマスタード誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９５】
改善された抗癌効力のためにＥＧＦＲ結合ポリペプチドと組み合わせることができる治療用薬剤として、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エキセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンタイド、ベバシズマブ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ、トシツモマブ、インターフェロンα−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、抗ＥＧＦ受容体抗体（例えば、セツキシマブもしくはパニツムマブ）、イクサベピロン、エポチロンまたはその誘導体、および細胞障害性薬と細胞表面受容体に対する抗体とのコンジュゲートのような腫瘍学の実践において使用される種々の薬剤（文献: Cancer, Principles & Practice of Oncology, DeVita, V. T., Hellman, S., Rosenberg, S. A., 6th edition, Lippincott-Raven, Philadelphia, 2001）が挙げられる。好適な治療用薬剤は、白金薬剤（例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン）、タキサン系薬剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、ゲムシタビン、およびカンプトテシンである。
【０１９６】
１つ以上のさらなる治療用薬剤を、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの前、同時、または後に投与することができる。当業者であれば、各治療用薬剤について、投与の特定の順序に利点があることを理解するであろう。同様に、当業者であれば、各治療用薬剤について、投与される薬剤と本発明の抗体、抗体フラグメントまたはコンジュゲートとの間の時間の長さは変動することを理解するであろう。
【０１９７】
処方および投与
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを含む治療用処方物は、水溶液、凍結乾燥または他の乾燥した処方物の形態で、所望される程度の純度を有する所望のタンパク質と任意の生理学的に許容できるキャリア、賦形剤または安定剤とを混合することによって、貯蔵のために調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）。許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、用いる用量および濃度においてレシピエントに非毒性であり、そしてリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０１９８】
本明細書に記載の処方物はまた、治療する特定の適応症に必要な１を超える活性化合物、好ましくは、相互に悪影響を及ぼさない相補活性を伴うものを含有してもよい。活性化合物の組み合わせの例を、本明細書に示す。そのような分子は、意図される目的のために有効な量で組み合わされて適切に存在する。
【０１９９】
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセルにおいてか、コロイド薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)においてか、またはマクロエマルジョンにおいて、捕捉され得る。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２００】
インビボ投与に使用すべき処方物は、滅菌状態でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を介するろ過によって容易に達成することができる。
【０２０１】
持続放出製剤を調製することもできる。持続放出製剤の適切な例として、本発明のタンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、造形された物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（U.S. Patent No. 3,773,919）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注入可能な微小球）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーが、１００日間を超える分子の放出を可能にする一方、所定のヒドロゲルは、より短期間の間、タンパク質を放出する。カプセル化された本発明のタンパク質が身体において長時間留まる場合、それらは、３７℃における水分への暴露の結果として変性または凝集し得、生物活性の消失および免疫原性における可能な変化をもたらす。関与する機構に依存する安定化のための合理的なストラテジーを考案することができる。例えば、凝集のメカニズムが、チオ−ジスルフィド相互交換（ｔｈｉｏ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ）を介する分子間Ｓ−−Ｓ結合形成であることが発見される場合、スルフヒドリル残基を改変すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって、安定化を達成してもよい。
【０２０２】
当業者は、各治療用薬剤の用量が薬剤のアイデンティティに依存することを理解する一方、好適な用量は、約１０ｍｇ／平方メートル〜約２０００ｍｇ／平方メートル、より好ましくは、約５０ｍｇ／平方メートル〜約１０００ｍｇ／平方メートルの範囲であり得る。
【０２０３】
治療用途では、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドは、薬学的に許容できる剤形で被験体に投与される。それらは、静脈内に、ボーラスとして、またはある期間の間の連続輸注によって、筋肉内、皮下、関節内、滑膜内（ｉｎｔｒａｓｙｎｏｖｉａｌ）、髄腔内、経口、局所、もしくは吸入経路で投与することができる。タンパク質はまた、局所ならびに全身治療効果を及ぼすために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、または病変周囲経路によって、投与してもよい。適切な薬学的に許容できるキャリア、希釈剤、および賦形剤は、周知であり、そして臨床状況が保証する場合、当業者によって決定することができる。適切なキャリア、希釈剤および／または賦形剤の例として次のものが挙げられる：（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミンを含有するダルベッコのリン酸緩衝食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロース。本発明の方法は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボでも使用することができる。
【０２０４】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチド、および１つ以上のさらなる治療用薬剤の投与は、同時に投与するかまたは順次的に投与するかに依らず、治療用途について上記で説明したように行うことができる。同時投与のための適切な薬学的に許容できるキャリア、希釈剤、および賦形剤は、同時投与される特定の治療用薬剤のアイデンティティに依存することが当業者に理解されよう。
【０２０５】
凍結乾燥ではなく、水性剤形中に存在する場合、タンパク質は、典型的に、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で処方されるが、このような広範な範囲の変動が許容される。疾患の治療のために、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの適切な用量は、上記で定義したように、治療しようとする疾患のタイプ、疾患の重症度および経過（抗体が予防目的かまたは治療目的で投与されるかに依らない）、これまでの治療の経過、患者の既往歴および抗体に対する応答、ならびに担当医の判断に依存する。タンパク質は、１回または一連の処置において患者に適切に投与される。
【０２０６】
本発明はまた、本明細書に記載のエレメントの１つ以上、およびそれらのエレメントの使用のための指示書を含むキットを含む。好適な実施形態では、本発明のキットは、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび治療用薬剤を含む。この好適な実施形態の指示書は、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび治療用薬剤を使用して、癌細胞の増殖を阻害するための指示書、および／またはＥＧＦＲ結合ポリペプチドおよび治療用薬剤を使用して、癌を有する患者を治療する方法のための指示書を含む。
【０２０７】
好ましくは、キット中に使用される治療用薬剤は、ドセタキセル、パクリタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、シクロホスファミド、トラスツズマブ、カペシタビン、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、フルベストラント、エキセメスタン、ゴセレリン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、デキサメタゾン、アンタイド、ベバシズマブ、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ビノレルビン、エストラムスチン、ミトキサントロン、アバレリクス、ゾレドロネート、ストレプトゾシン、リツキシマブ、イダルビシン、ブスルファン、クロラムブシル、フルダラビン、イマチニブ、シタラビン、イブリツモマブ、トシツモマブ、インターフェロンα−２ｂ、メルファラン、ボルテゾミブ、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、抗ＥＧＦ受容体抗体（例えば、セツキシマブもしくはパニツムマブ）、イクサベピロン、およびエポチロンまたはその誘導体からなる群から選択される。より好ましくは、治療用薬剤は、白金薬剤（例えば、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、ゲムシタビン、またはカンプトテシンである。
【０２０８】
本発明のキットの要素は、溶液または凍結乾燥された粉末のようなキットのための適切な形態である。キットの要素の濃度または量は、キットの各要素のアイデンティティおよび目的の用途に依存して変動することが、当業者によって理解されよう。
【０２０９】
キットの指示書において言及される癌およびその細胞として、乳癌、結腸癌、卵巣癌腫、骨肉腫、子宮頚癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌腫、膵臓癌、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、および横紋筋肉腫が挙げられる。
【０２１０】
本明細書に記載の方法で投与される細胞障害性薬剤または治療用薬剤の用量は、当業者によって容易に決定することができる。また、適切な用量を決定する場合、薬剤添付文書から調べてもよい。
【０２１１】
さらなる特許参考文献
以下のさらなる特許出願および特許に記載の方法および組成物もまた、本開示内容に含まれる：
U.S. Publication Nos. 20050186203；20050084906；20050008642；20040202655；20040132028；20030211078；20060083683；20060099205；20060228355；20040081648；20040081647；20050074865；20040259155；20050038229；20050255548；20060246059；ならびにU.S. Patent Nos. 5,707,632；6,818,418；および7,115,396；ならびにPCT International Application Publication Nos. WO2005/085430；WO2004/019878；WO2004/029224；WO2005/056764；WO2001/064942；およびWO2002/032925。
【０２１２】
参照による援用
本明細書に記載の特許文献およびウェブサイトを含むすべての書面および参考文献は、本書面にすべてまたは一部が記載されているが如く、それと同じ程度に、個々に本書面に参照により援用される。
【実施例】
【０２１３】
これより、以下の実施例を参考にして本発明を説明するが、これらの実施例は単なる例示であって、本発明を限定することを意図するものではない。本発明について、詳細に、かつその特定の実施形態を参考にして説明してきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な変更および改変を行うことができることは、当業者に明らかであろう。
【０２１４】
実施例１．ＥＧＦＲ結合分子の初期同定
約１０１３ＲＮＡ−タンパク質融合変異体のライブラリーを、配列番号１（「ＮＮＳ」ライブラリー）に従うアミノ酸番号付けで２３〜２９、５２〜５５および７７〜８６位における３つのランダム化領域を伴うヒトフィブロネクチンの１０番目の３型ドメインの足場に基づいて構築した（Xu et al, Chemistry & Biology 9:933-942, 2002）。縮重コドンの代わりにホスホルアミダイト三量体の混合物を使用した同様のライブラリーを構築して、トリプトファン、フェニルアラニンおよびシステインを欠く（「−ＷＦＣ］ライブラリー）か、またはトリプトファン、フェニルアラニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンを欠く（「ＮＶＨ」ライブラリー）ランダム化領域を得た。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二重鎖への変換後、１兆を超えるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質融合物のライブラリーを、それぞれ、溶液中１００ｎＭのＥＧＦＲ−Ｆｃと共にインキュベートし、そして存在する複合体を、プロテインＧ−被覆磁気ビーズ上で捕捉した。ｃＤＮＡを、高ｐＨでの処置により溶出させ、ＰＣＲによって増幅し、そしてこれを使用して、ＥＧＦＲのバインダーが富化されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質融合物の新たなさらなるフォーカストライブラリーを作製した。５回のサイクルの増幅および選択を、この様式で行い、そして標的結合を、定量的ＰＣＲによってモニターした。ＥＧＦＲ−Ｆｃのｓ５２５変異体（Ｆｃに融合されたＥＧＦＲのアミノ酸１〜５２５）を使用して、またはＥＧＦの存在下でＥＧＦＲ−Ｆｃを使用して、類似の実験を行った。それぞれの場合において、ＲＮＡ−タンパク質融合ライブラリーを、５サイクルの選択後に標的に結合した。
【０２１５】
実施例２．ＥＧＦＲ結合クローンの同定
独立したクローンによってコードされたタンパク質を、単一点直接結合アッセイにおいて、ＥＧＦＲの全長外部ドメインならびにＥＧＦＲ外部ドメインの最初の５２５個のアミノ酸（ＥＧＦＲ５２５）を含有するトランケート型バージョンへの結合について分析した。抗Ｈｉｓ抗体を使用して、配向された方式でタンパク質クローンを捕捉し、続いて、全長ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲ５２５Ｆｃ融合タンパク質と共にインキュベーションを行った。発色の読み取り（即ち、Ａ４５０）により、抗ヒトＦｃ  ＨＲＰコンジュゲートを介して、結合型受容体−Ｆｃを検出した。スクリーニングから得られた代表的な結果（一部）を、表１に示す（ここでは、全長およびトランケート型ＥＧＦＲへの２４個のクローンの相対的結合強度を示す）。コントロール（ＳＧＥ）と比較して、すべてのクローンは、有意なＥＧＦＲ結合を示す。ＳＧＥコントロールは、アミノ酸ＳＧＥで置換されたインテグリン結合ドメイン（ＲＧＤ）を伴う配列番号１に示されるような１０ＦＮ３ドメインである。
【０２１６】
【表１】
2011517314.tif 000003
【０２１７】
実施例３．細胞ベースの競合的リガンド結合アッセイ
細胞ベースの競合的リガンド結合アッセイは、試験サンプルがヒトＡ４３１細胞の表面上のＥＧＦＲに結合し、そしてユウロピウムタグで標識された天然のＥＧＦリガンド（Ｅｕ−ＥＧＦ）の結合と競合する能力を測定する。細胞表面上のＥＧＦＲへの結合に対する試験サンプルとＥｕ−ＥＧＦとの競合は、蛍光シグナルの減少によって測定される。抗ＥＧＦＲ抗体（ＬＡ−１）の競合結合を、図２〜４において、２つのＥＧＦＲ結合クローンと比較する（６７９Ｆ０３、６７９Ｆ０９および８６７Ａ０１）。
【０２１８】
実施例４．ＥＧＦＲ特異的クローンの初期の最適化
改善された親和性および特異性を伴うクローンを同定するために、さらなる変異誘発を実施して、ＥＧＦＲへのループ結合を最適化するためのさらなるフォーカストライブラリーを作製した。
【０２１９】
１回で１つのループをランダム配列で置き換えた３つのライブラリーを構築した。３つのループ中２つにおいてランダム配列を、最適化されるクローンに対応する固定配列で置き換えたことを除いて、材料および方法のセクションに記載のとおりに、ＤＮＡレベルでライブラリーを構築した。
【０２２０】
増幅、ｍＲＮＡ−タンパク質融合物の合成、および親和性選択を、これらの３つのライブラリーによって行った。結合パーセントを、各ラウンドにおいてモニターし、そして各ライブラリーが１％を超える結合を示すまで、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）を継続した。この時点で、ランダムループを各ライブラリーから増幅し、そして再アセンブルして、３つのすべてのループが最適化されたマスターライブラリーを作製した（図５）。
【０２２１】
３つのすべての最適化されたループを含有するマスターライブラリーを、増幅、ｍＲＮＡ−タンパク質融合物の合成、および親和性選択のサイクルを介して、採取した。ＥＧＦＲ−Ｆｃを、漸減濃度で使用して、最も高い親和性のバインダーを選択した。ラウンド１では、ＥＧＦＲ−Ｆｃの濃度は１００ｎＭであった。ラウンド２では、ＥＧＦＲ−Ｆｃの濃度は１ｎＭであった。ラウンド３および４では、ＥＧＦＲ−Ｆｃの濃度は０．１ｎＭであった。
【０２２２】
実施例５．最適化された誘導体クローンを評価するための細胞ベースの競合的リガンド結合アッセイ
選択された最適化されたクローンを、ヒトＡ４３１細胞の表面上のＥＧＦに結合し、そしてユウロピウムタグで標識された天然のＥＧＦリガンド（Ｅｕ−ＥＧＦ）の結合と競合するそれらの能力について、予め最適化されたクローンと比較する。ＨＴＰＰおよび定量後、多くのクローンが、低いｎＭ範囲のＩＣ５０で、出発クローンより優れた阻害を示し得る。
【０２２３】
実施例６．最適化されたＥＧＦＲ競合的ＩＣ５０クローンの熱安定性の試験
選択されたＥＧＦＲ最適化クローンの１リットル大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖物を調製し、そしてタンパク質を精製する。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を実施して、個々のクローンのアンフォールディングのエネルギー性、すなわち融解温度（Ｔｍ）を特徴付けする。
【０２２４】
実施例７．最適化されたＥＧＦＲ競合的クローンの溶解特性の試験
選択された最適化クローンの１リットル大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖物を調製し、そしてタンパク質を精製する。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、単量体の挙動を決定する。Ｍｕｌｔｉ−Ａｎｇｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせたＳＥＣを使用して、単量体性（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃｉｔｙ）を確認する。「古典的な」光散乱（「静的」もしくは「レイリー」散乱またはＭＡＬＬＳとしても公知である）は、分子量の直接測定を提供する。従って、それは、天然の状態のタンパク質が単量体であるか、またはより高度のオリゴマーであるかを決定し、そして凝集体または他の非天然の種の質量を測定するのに極めて有用である。
【０２２５】
実施例８．最適化ＥＧＦＲ競合的クローンの結合親和性および動態の決定
選択された最適化クローンの１リットル大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖物を調製し、そしてタンパク質を精製する。結合動態および結合親和性を決定するために、組み換え、固定化ＥＧＦＲおよび液相クローンを使用して、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析を実施する。
【０２２６】
実施例９．最適化ＥＧＦＲ競合的クローンの他のＨＥＲファミリーメンバーへの結合の決定
選択された最適化クローンの１リットル大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖物を調製し、そしてタンパク質を精製する。ＥＧＦＲ競合的クローンが実際にＥＧＦＲに特異的であることを確実にするために、ＢＩＡｃｏｒｅ方法論を使用して、他のＨＥＲファミリーメンバーまたはもう１つの非関連受容体に対して高濃度でそれらを評価する。非特異的結合のコントロールのためにＨＥＲファミリーメンバーまたはもう１つの非関連受容体を、関連性のないタンパク質であるＢＩＡｃｏｒｅチップ上に固定化する。非特異的結合または特異性を見出すために、クローンを、１０μＭでチップ上を通過させた。
【０２２７】
実施例１０．細胞ベースアッセイにおけるＥＧＦＲクローンの活性
活性を確認するために、精製されたＥＧＦＲクローンを、細胞ベースアッセイで評価する。本実施例では、クローン６７９Ｆ０９（配列番号２１５）の結果について説明する。クローン６７９Ｆ０９を、リガンド刺激ＥＧＦＲ活性化および下流のＭＡＰキナーゼシグナル伝達を直接妨害する能力について、スクリーニングした。免疫細胞化学アッセイ（Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎｓ）を使用して、１）ＥＧＦＲの全リン酸化、２）ＥＧＦＲのチロシン１０６８（サイトゾルシグナル伝達タンパク質の結合を担う機能的に重要な残基）に対するリン酸化、および３）ＥＲＫリン酸化（ＥＧＦＲ活性化に応答して増殖を刺激するＭＡＰキナーゼ経路の成分）を測定した。これらのアッセイを、Ａ４３１類表皮癌腫細胞およびＦａＤｕ頭頚部癌腫細胞の両方において行った。
【０２２８】
ＦａＤｕ細胞では、クローン６７９Ｆ０９は、１．３２μＭのＩＣ５０でチロシン１０６８上のＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化を阻止し、そして２．８μＭのＩＣ５０でＥＧＦ刺激ＥＲＫリン酸化を阻止した。Ａ４３１細胞では、クローン６７９Ｆ０９は、２．４μＭのＩＣ５０でＥＧＦ刺激全ＥＧＦＲリン酸化を阻止し、２．８８μＭのＩＣ５０でチロシン１０６８上のＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化を阻止し、そして３．１μＭのＩＣ５０でＥＧＦ刺激ＥＲＫリン酸化を阻止した。
【０２２９】
ＡＫＴのリン酸化、全ＥＧＦＲリン酸化、チロシン１０６８上のＥＧＦＲリン酸化、およびＥＲＫリン酸化を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＤｉＦｉ結腸癌腫細胞において、これらの同じエンドポイントを評価したが、これは、この細胞系統がＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイに適切ではなかったためである。ＤｉＦｉ細胞では、クローン６７９Ｆ０９は、１．８μＭ〜５．３μＭの間のＩＣ５０でＥＧＦ刺激ＡＫＴリン酸化を阻止し、５．３μＭのＩＣ５０でＥＧＦ刺激全ＥＧＦＲリン酸化を阻止し、１．４９μＭのＩＣ５０でチロシン１０６８上のＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化を阻止し、そして４．４μＭを超えるＩＣ５０でＥＧＦ刺激ＥＲＫリン酸化を阻止した。
【０２３０】
実施例１１．エピトープマッピング
Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイを使用して、ＥＧＦＲクローンが、ＥＧＦＲ細胞外ドメイン上の既知のエピトープへの他のＥＧＦＲ抗体の結合を妨害するかどうかについて決定した。抗体のパネルを、定義された結合領域でアセンブルした（表２）。ＥＧＦＲクローンを、Ａ４３１細胞と共にインキュベートし、非結合型タンパク質を洗浄除去し、そして結合型タンパク質を、ＢＳ３で受容体に架橋させた。細胞を固定化し、そして結合部位が既知である抗体で探索した。ＥＧＦＲクローンが抗体と共通のエピトープを共有する場合、クローンのＥＧＦＲへの結合は、抗体による結合を防止または減少する。
【０２３１】
表２は、ＥＧＦＲ結合クローン６７９Ｆ０９、ならびに抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブおよびパニツムマブによる競合結合研究の結果を示す。
【０２３２】
【表２】
2011517314.tif 000004
Abを1：100に希釈する、弱いバインダーは1：50に希釈することができる。aJBC264(1989)17469 Ala351-Asp364、bJ Immunological Methods 287(2004)147、cMol Biol Med1(1983)511、dマウスEGFRに対するペプチドに対して惹起させた、eInt J Oncol4(1994)277。C−セツキシマブ；P−パニツムマブ。
【０２３３】
実施例１２．クローンの再最適化
貯蔵中に一般的に認められるタンパク質の分解プロセスの１つは、メチオニン、またはトリプトファン、チロシン、もしくはヒスチジンのような他のアミノ酸残基の酸化である。出発クローンの生物活性の所望の特性および生物物理特性を保持するが、所望されないメチオニン残基がループに存在する場合、置換が行われるクローンを選択するために、最適化を実施することができる。ループ内の任意のトリプトファン、チロシン、ヒスチジン残基が、酸化損傷する傾向があると同定される場合、同じアプローチが使用される。
【０２３４】
実施例１３．再最適化された誘導体の直接結合アッセイ
直接結合アッセイを使用して、ＥＧＦＲへの増強された結合について、再最適化された誘導体をスクリーニングする。単一点アッセイにおいて結合を示すクローンを、クローン濃度の勾配を使用して、さらに分析する。
【０２３５】
実施例１４．再最適化されたＥＧＦＲ競合的クローンの溶解特性の試験
再最適化されたＥＧＦＲ競合的クローンについてのＨＴＰＰ材料のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、典型的に単量体の挙動を表し、これはより高いタンパク質濃度で、最適化されたクローンが凝集する傾向を有さないことを示す。
【０２３６】
実施例１５．再最適化ＥＧＦＲ競合的クローンの結合親和性および動態論の決定
選択されたＦＧループ最適化ＥＧＦＲ競合的クローンの１リットル大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖物を調製し、そしてタンパク質を精製する。結合動態および結合親和性を決定するために、組み換え、固定化ＥＧＦＲおよび液相クローンを使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を実施する。典型的に、結合親和性は、クローンについて、２桁〜３桁のｐＭの範囲であり得る。
【０２３７】
実施例１６．再最適化ＥＧＦＲ競合的クローンの他のＨＥＲファミリーメンバーへの結合の決定
選択されたＦＧループ最適化ＥＧＦＲ競合的クローンの１リットル大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖物を調製し、そしてタンパク質を精製する。ＥＧＦＲ競合的クローンが実際にＥＧＦＲに特異的であることを確実にするために、Ｂｉａｃｏｒｅ方法論を使用して、他のＨＥＲ受容体またはもう１つの非関連受容体に対して高濃度でそれらを評価する。典型的に、クローンの大部分はこのような高い濃度で他のＥＧＦＲファミリーメンバーまたは他の非関連受容体への検出可能な結合を示さず、これらのクローンが実際にＥＧＦＲに特異的であることが例示される。
【０２３８】
実施例１７．ＥＧＦＲに対する再最適化されたクローンの熱安定性の試験
選択された再最適化ＥＧＦＲ競合的クローンの１リットル大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖物を調製し、そしてタンパク質を精製する。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を実施して、個々のクローンのアンフォールディングのエネルギー性、すなわち融解温度（Ｔｍ）を特徴付けする。
【０２３９】
実施例１８．Ｆｎ３ドメインのＰＥＧ化
Ｆｎ３ドメインのＰＥＧ化を実施して、薬物動態特性を増強する。最適化クローンを、Ｃ末端システイン置換を伴って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系において産生させる。
【０２４０】
配列番号２３５は、システイン残基を欠くクローンのＮ末端に連結される。配列番号２３５由来のシステイン残基の単一のスルフヒドリルを使用し、標準的なマレイミド化学を使用してＰＥＧ変異体に結合させ、異なる２つのＰＥＧ化形態を得る。線状２０ｋＤａ二官能性ＰＥＧおよび一官能性分岐４０ｋＤａのＰＥＧ（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の両方を、クローンにコンジュゲートする。ＰＥＧ化タンパク質形態を、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによって、非反応タンパク質およびＰＥＧから精製する。２つのＰＥＧ形態の共有結合を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析、および多角レーザー光散乱を備えた分析サイズ排除クロマトグラフィーによって確認する。
【０２４１】
実施例１９．ＰＥＧ化Ｆｎ３ドメインクローン変異体の結合親和性および動態の決定
ＰＥＧ化変異体の結合動態および結合親和性を決定するために、抗ヒト抗体表面上に捕捉された組み換えＥＧＦＲ−Ｆｃおよび液相分析物（ＰＥＧ化クローン）を使用して、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析を実施する。
【０２４２】
実施例２０．ＥＧＦＲ依存性細胞系統における抗増殖活性についてのＥＧＦＲ結合クローンの評価
増殖のためにＥＧＦＲシグナル伝達に依存するＤｉＦｉ結腸癌腫細胞系統における抗増殖活性について、クローンを評価した。１０μＭおよび１μＭにおける２回測定で１次スクリーニングを行って、活性なクローンを同定した。活性なクローンは、いずれの濃度においても５０％を超える阻害を実証し、そして好ましくは、用量応答を示した。３回測定で８段階の濃度の系列希釈を試験することによって、活性なクローンをさらにＩＣ５０決定した。主なアッセイ方法では、新たに合成したＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの組み入れを測定したが、時折、水溶性テトラゾリウム塩の発色副産物への変換を測定する代謝検出アッセイも使用した。アッセイの性能および再現性を確認するために、標準的な化合物を各実験に含めた。
【０２４３】
ＤｉＦｉ細胞における３Ｈ−チミジン組み入れアッセイを使用したところ、クローン６７９Ｆ０９は、１つの実験では増殖を軽度に阻害したが、個別の２回の実験では、増殖しなかった。
【０２４４】
実施例２１．ＥＧＦＲ／ＩＧＦ−ＩＲ  ＰＥＧ化二重特異性分子の作製
ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒの両方に対して指向された二重特異性分子を、二官能性ＰＥＧ分子を使用して、各標的に対して特異的なフィブロネクチンに基づく足場ドメインクローンを共に連結することによって、作製する。二官能性ＰＥＧがマレイミド化学を介して２つのクローンを連結することができるように、システイン残基が、各クローンのＣ末端において置換される。
【０２４５】
本実施例では、配列番号２０３において示されるＩＧＦ−ＩＲ結合クローンおよび配列番号２３１において示されるＥＧＦＲ結合クローンを利用する。２つのアプローチのうちの１つを使用して、適切な二重特異性分子を作製する。ＥＧＦＲクローン、ＩＧＦ−ＩＲクローン、およびマレイミド−ＰＥＧ−Ｘ−ｋＤａ−マレイミドの等モル混合物を、適切な期間、混合し、そして生成物を、ｐＩの差異に基づいて２つの単離されたクローンの分離に最適なｐＨ条件下で、イオン交換クロマトグラフィーによって分離する。理論的生成物およびこの分離からのそれらの割合は、１部の同一特異性（ｈｏｍｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＥＧＦＲ、１部の同一特異性ＩＧＦ−ＩＲ、および２部の二重特異性ＥＧＦＲ／ＩＧＦ−ＩＲである。第２のアプローチは、種のＰＥＧ−リンカーへの逐次付加に根拠を置くものである。過剰のリンカー、例えば、１０倍過剰を、種の１つに付加し、そして反応を、完了まで促進させる。ＰＥＧ化モノ−種（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉｅｓ）を、イオン交換クロマトグラフィーによって、ＰＥＧ−連結ホモ二量体および非反応ＰＥＧ−リンカーから回収する。次いで、単離されたＰＥＧ化モノ−種を、等モル量の他のクローン種と反応させて、二重特異性分子を作製する。
【０２４６】
実施例２２．ＥＧＦＲ／ＶＥＧＦＲ２  ＰＥＧ化二重特異性分子の作製
ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦＲ２の両方に対して指向された二重特異性分子を、二官能性ＰＥＧ分子を使用して、各標的に対して特異的なフィブロネクチンに基づく足場ドメインクローンを共に連結することによって作製する。二官能性ＰＥＧがマレイミド化学を介して２つのクローンを連結することができるように、システイン残基が、各クローンのＣ末端において置換される。
【０２４７】
本実施例では、配列番号１２８において示されるＶＥＧＦＲ２結合クローンおよび配列番号２３１において示されるＥＧＦＲ結合クローンを利用する。２つのアプローチのうちの１つを使用して、適切な二重特異性分子を作製する。ＥＧＦＲクローン、ＶＥＧＦＲ２クローン、およびマレイミド−ＰＥＧ−Ｘ−ｋＤａ−マレイミドの等モル混合物を、適切な期間、混合し、そして生成物を、ｐＩの差異に基づいて２つの単離されたクローンの分離に最適なｐＨ条件下で、イオン交換クロマトグラフィーによって分離する。理論的生成物およびこの分離からのそれらの割合は、１部の同一特異性ＥＧＦＲ、１部の同一特異性ＶＥＧＦＲ２、および２部の二重特異性ＥＧＦＲ／ＶＥＧＦＲ２である。第２のアプローチは、種のＰＥＧ−リンカーへの逐次付加に根拠を置くものである。過剰のリンカー、例えば、１０倍過剰を、種の１つに付加し、そして反応を、完了まで促進させる。ＰＥＧ化モノ−種（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉｅｓ）を、イオン交換クロマトグラフィーによって、ＰＥＧ−連結ホモ二量体および非反応ＰＥＧ−リンカーから回収する。次いで、単離されたＰＥＧ化モノ−種を、等モル量の他のクローン種と反応させて、二重特異性分子を作製する。
【０２４８】
実施例２３．ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ  ＰＥＧ化二重特異性分子の作製
ＥＧＦＲに対して指向された二ドメイン分子を、二官能性ＰＥＧ分子を使用して、ＥＧＦＲに対して特異的なフィブロネクチンに基づく足場ドメインクローンを共に連結することによって作製する。二官能性ＰＥＧがマレイミド化学を介して２つのクローンを連結することができるように、システイン残基が、各クローンのＣ末端において置換される。
【０２４９】
本実施例では、配列番号２３１において示されるＥＧＦＲ結合クローンを利用する。２：１比のＥＧＦＲクローンおよびマレイミド−ＰＥＧ−Ｘ−ｋＤａ−マレイミドを、適切な期間混合し、そして生成物をイオン交換クロマトグラフィーによって分離する。理論的生成物およびこの分離からのそれらの割合は、２部の同一特異性ＥＧＦＲおよび２部のＥＧＦＲ／ＥＧＦＲである。
【０２５０】
実施例２４．ＥＧＦＲ／ＩＧＦ−ＩＲポリペプチド−連結二重特異性分子の作製
ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲの両方に対して指向された二重特異性分子を、ポリペプチドリンカーを介して２つのクローンを接続することによって、作製する。Ｎ末端クローン対Ｃ末端クローンに関する２つのクローンの配向は任意であるが、本実施例では、ＥＧＦＲクローンは、Ｎ末端の位置に存在する。本実施例では、配列番号２１５において示されるＥＧＦＲ結合クローンおよび配列番号２３６において示されるＩＧＦ−ＩＲ結合クローンを利用する。
【０２５１】
従って、本実施例におけるＤＮＡ構築物は、ＥＧＦＲ結合クローン−ポリペプチドリンカー−ＩＧＦＲ結合クローンである。これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現され、そして封入体または可溶性画分のいずれかから通常通りに精製される。
【０２５２】
実施例２５．ＥＧＦＲ／ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド−連結二重特異性分子の作製
ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦＲ２の両方に対して指向された二重特異性分子を、ポリペプチドリンカーを介して２つのクローンを接続することによって、作製する。Ｎ末端クローン対Ｃ末端クローンに関する２つのクローンの配向は任意であるが、本実施例では、ＥＧＦＲクローンは、Ｎ末端の位置に存在する。本実施例では、配列番号２１５において示されるＥＧＦＲ結合クローンおよび配列番号１２９において示されるＶＥＧＦＲ２結合クローンを利用する。
【０２５３】
従って、本実施例におけるＤＮＡ構築物は、ＥＧＦＲ結合クローン−ポリペプチドリンカー−ＶＥＧＦＲ結合クローンである。これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現され、そして封入体または可溶性画分のいずれかから通常通りに精製される。
【０２５４】
実施例２８．ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲポリペプチド−連結二重特異性分子の作製
ＥＧＦＲに対して指向された二ドメイン分子を、ポリペプチドリンカーを介して２つのクローンを接続することによって、作製する。本実施例では、配列番号２１５に示すＥＧＦＲ結合クローンを利用する。従って、本実施例におけるＤＮＡ構築物は、ＥＧＦＲ結合クローン−ポリペプチドリンカー−ＥＧＦＲ結合クローンである。これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現され、そして封入体または可溶性画分のいずれかから通常通りに精製される。
【０２５５】
本明細書において使用する材料および方法
以下の材料および方法を、実施例に記載の実験に使用した。
【０２５６】
組み換えタンパク質：
Ｆｃ融合物としてヒトＥＧＦＲの外部ドメインからなるＥＧＦＲ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を購入し、そしてＢｉａｃｏｒｅによって、ＥＧＦ結合について機能的であることが示された。ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインの最初の５２５個のアミノ酸を、ヒトＩｇＧ１のヒンジおよび定常領域を含有する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。プラスミドの一過性トランスフェクションにより、融合タンパク質、ＥＧＦＲ５２５−Ｆｃを産生させ、続いて、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。全長外部ドメイン融合物でも示されたように、このタンパク質は、同様のＢｉａｃｏｒｅアッセイを使用して、ＥＧＦに結合することが可能であることが示された。
【０２５７】
プライマー：
選択されたクローンのライブラリー構築および変異誘発における究極的使用のために、以下のオリゴヌクレオチドを、化学合成によって調製した。
【０２５８】
Ｔ７ＴＭＶ：５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＴＴＡ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＡＴＧ−３’  （配列番号２３７）
ＦｎＡＢ：５’−ＧＧＧ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＣＧＡ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  Ｇ−３’  （配列番号２３８）
ＦｎＢＣ：５’−ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＣＧＣ  ＡＴＣ  ＡＣＴ−３’  （配列番号２３９）
ＦｎＢＣ８：５’−ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＮＶＨ  ＮＶＨＮＶＨ  ＮＶＨ  ＮＶＨ  ＮＶＨ  ＮＶＨ  ＮＶＨ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＣＧＣ  ＡＴＣ  ＡＣＴ−３’  （配列番号２４０）
ＦｎＢＣ  （三量体）：三量体ホスホルアミダイトを使用して、ＢＣループを構築するための５’−ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＣＧＣ  ＡＴＣ  ＡＣＴ−３’  （配列番号２４１）
ＦｎＣＤ：５’−ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＧＴＡ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＴＣＧ−３’  （配列番号２４２）
ＦｎＤＥ：５’−ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ−３’  （配列番号２４３）
ＦｎＤＥ  （三量体）：三量体ホスホルアミダイトを使用して、ＤＥループを構築するための５’−ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ−３’  （配列番号２４４）
ＦｎＥＦ：５’−ＡＧＴ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＴＧＴ−３’  （配列番号２４５）
ＦｎＦＧ６：６つのランダムアミノ酸を伴うＦＧ  ループを付与するための５’−ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＣ−３’  （配列番号２４６）
ＦｎＦＧ６  （三量体）：三量体ホスホルアミダイトを使用して、６つのランダムアミノ酸を伴うＦＧループを付与するための５’−ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＣ−３’  （配列番号２４７）
ＦｎＦＧ８：８つのランダムアミノ酸を伴うＦＧ  ループを付与するための５’−ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＣ−３’  （配列番号２４８）
ＦｎＦＧ８  （三量体）：三量体ホスホルアミダイトを使用して、８つのランダムアミノ酸を伴うＦＧ  ループを付与するための５’−ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＣ−３’  （配列番号２４９）
ＦｎＦＧ１０：１０つのランダムアミノ酸を伴うＦＧループを付与するための５’−ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＣ−３’  （配列番号２５０）
ＦｎＦＧ１０：三量体ホスホルアミダイトを使用して、１０つのランダムアミノ酸を伴うＦＧループを付与するための５’−ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  Ｘ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＣ−３’  （配列番号２５１）
ＦｎＦＧ１２：１２つのランダムアミノ酸を伴うＦＧ  ループを付与するための５’−ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＣ−３’  （配列番号２５２）
ＦｎＦＧ１４：１４つのランダムアミノ酸を伴うＦＧループを付与するための５’−ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳ  ＮＮＳＣＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＣ−３’  （配列番号２５３）
ＦｎＧ：５’−ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＡＡＴ  ＴＧＧ−３’  （配列番号２５４）
ＦＬＡＧ：５’−  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＧＴＡ−３’  （配列番号２５５）
６７９Ｆ０９ＢＣ：５’  −ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＣＣＧ  ＣＧＴ  ＣＣＧ  ＡＴＧ  ＴＡＣ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＣＧＣ  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＴＡＣ−３’  （配列番号２５６）
６７９Ｆ０９ＤＥ：５’−  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＣＧＴ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  −３’  （配列番号２５７）
６７９Ｆ０９ＦＧ：５’−  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＴＡＣ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＣＣＡ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＣ−３’  （配列番号２５８）
ＦｎＣＤ’：５’−ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＧＣＣ  ＧＴＡ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＡＴＡ−３’  （配列番号２５９）
ＦｎＢ：５’−ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  −３’  （配列番号２６０）
ＦｎＤ：５’−ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  −３’  （配列番号２６１）
ＦｎＦ：５’−ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  −３’  （配列番号２６２）
【０２５９】
１次ライブラリー構築：
ＫＯＤポリメラーゼ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、上に列挙した重複合成オリゴヌクレオチドの伸張によって、種々のライブラリーを構築した。これらのオリゴヌクレオチドの名称において、「Ｎ」は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を示し；「Ｖ」は、Ａ、ＣおよびＧの混合物を示し、「Ｈ」は、Ａ、ＣおよびＴの混合物を示し、そして「Ｓ」は、ＣおよびＧの混合物を示す。ループの定義は、先に記載の定義（Xu et al, 2002）と同一である。ＢＣループを、１ＭのＢｅｔａｉｎｅおよび３％ＤＭＳＯを補充した１００μｌのＫＯＤ反応液中１００ｐｍｏｌのＦｎＣＤによる５０ｐｍｏｌのＦｎＢＣの伸張によって、構築した。９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間および６８℃で１分間の１０回の温度サイクルを介して、反応を行い、フラグメントの完全な伸張を確実にした。ＤＥおよびＦＧループを、ＤＥループでは、１００ｐｍｏｌのＦｎＥＦを伴う２００ｐｍｏｌのＦｎＤＥ、およびＦＧループでは、２００ｐｍｏｌのＦｎＧを伴う１００ｐｍｏｌのＦｎＦＧ１０を使用して、同様の様式で構築した。３つの個々のループの伸張後、ＤＥおよびＦＧループを組み合わせ、そして９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間および６８℃で１分間のさらなる１０回の温度サイクルで共に伸張させた。ＢＣループを、１００ｐｍｏｌのＦｎＡＢにより、同じ様式で伸張させた。ＤＥ／ＦＧ混合物およびＢＣループを、それぞれ、新鮮なＫＯＤ試薬で１０倍に希釈し、そしてそれぞれ、ＦＬＡＧおよびＴ７ＴＭＶにより、９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間および６８℃で１分間の１０回の温度サイクルで伸張させた。最後に、フラグメントを合わせて、そして９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間および６８℃で１分間の１０回の温度サイクルで共に伸張させた。これにより、ＢＣループにおいて７つのランダムアミノ酸、ＤＥループにおいて４つのランダムアミノ酸、およびＦＧループにおいて１０のランダムアミノ酸を伴うライブラリーが生成された。オリゴヌクレオチドＦｎＦＧ６、ＦｎＦＧ８、ＦｎＦＧ１２またはＦｎＦＧ１４をＦｎＦＧ１０の代わりに使用することによって、異なるＦＧループ長で、さらなるライブラリーを構築した。６〜１４個のアミノ酸の間のＦＧループを含有するライブラリーを組み合わせて、「ＮＮＳ」ライブラリーを得た。
【０２６０】
オリゴヌクレオチドＦｎＢＣ、ＦｎＤＥおよびＦｎＦＧを、それぞれ、ＦｎＢＣ（三量体）、ＦｎＤＥ（三量体）およびＦｎＦＧ（三量体）で置き換えたことを除いて、同じ方法を使用して、「ＮＶＨ」および「ＷＦＣ」ライブラリーを作製した。これらのオリゴヌクレオチドでは、Ｘは、「ＮＶＨ」ライブラリーでは１３個のアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ）または「−ＷＦＣ」ライブラリーでは１７個のアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ）をコードする三量体ホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）の混合物を示す。
【０２６１】
ＲＮＡ−タンパク質融合物産生：
本質的に（Xu et al, 2002、Kurz et al, Nuc. Acid Res. 28:83, 2000）に記載されているように、二本鎖ＤＮＡライブラリーを、ＲＮＡ−タンパク質融合物（ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標））に変換した。簡単に説明すると、インビトロ転写キット（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標），Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ）を使用して、ＤＮＡライブラリーを転写し、そして得られたＲＮＡを、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩した。２ｎｍｏｌのＲＮＡを、３１４ｎＭで、２０分間、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１．５倍過剰のピューロマイシン含有リンカー（５’−Ｐｓｏ  ｕ  ａｇｃ  ｇｇａ  ｕｇｃ  ＸＸＸ  ＸＸＸ  ＣＣ  Ｐｕ−３’（Ｐｕ＝ピューロマイシン、Ｐｓｏ＝Ｃ６−ソラレン、ｕ，ａ，ｇ，ｃ＝２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、Ｘ＝９原子ＰＥＧスペーサー））を含有する２００μｌの溶液において、照射により架橋した。
【０２６２】
次いで、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン分子を、３ｍｌウサギ網状赤血球溶解物（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ）中で翻訳した。得られたｍＲＮＡ−タンパク質融合物を、オリゴｄＴセルロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製し、そして製造者の指示に従って、２ｎｍｏｌのプライマーＦＬＡＧおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、逆転写させた。
【０２６３】
ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ−タンパク質融合物を、Ｍ２  Ｆｌａｇアガロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって精製し、そしてＰＣＲによって量を測った。これにより、以後のＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）実験に使用するために、プライマーＴ７ＴＭＶおよびＦＬＡＧを使用するＰＣＲによって、増幅された約１０１２の全長クローンの精製されたライブラリーが得られた。
【０２６４】
ＥＧＦＲへの結合のための親和性選択：
ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を、プロテインＧ−被覆磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に被覆して、ネガティブ選択マトリックスを生成した。ＲＮＡ−タンパク質融合物ライブラリーを、ネガティブ選択マトリックスと混合して、プロテインＧまたは目的のＦｃ領域に結合するクローンを取り出した。ビーズを磁石上で分離し、そして非結合画分を回収し、そして０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０および１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を伴うＰＢＳ中の１００ｎＭのＥＧＦＲ−Ｆｃに添加した。３０分間後、結合タンパク質を、プロテインＧ−被覆磁気ビーズ上で捕捉し、そしてＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ磁性粒子プロセッサ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、６回洗浄した。ｃＤＮＡを１００ｍＭのＫＯＨ中に溶出させ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで中和し、そしてＰＣＲにより増幅して、ＥＧＦＲに結合した分子が富化された第２世代のライブラリーを作製した。増幅、ＲＮＡ−タンパク質融合物の合成、および親和性選択の連続プロセスを合計で５回行い、そして結合分子の量をＰＣＲによって計った。ラウンド４および５後に得られた結合集団を、増幅し、そしてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターおよびインフレームＨｉｓ６タグを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターに、組み換え（ＩｎＦｕｓｉｏｎ（商標），Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によってライゲートした。ライゲートされた混合物を、ＩＰＴＧによる誘導時にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、それによって誘導性タンパク質発現を生じさせた。
【０２６５】
クローン６７９Ｆ０９由来の単一ループランダム化ライブラリーの構築
単一のループがランダム配列で置き換えられた３つのライブラリーを構築した。３つのループのうち２つにおけるランダム配列がクローン６７９Ｆ０９に対応する固定配列で置き換えられたことを除いて、上記のように、ＫＯＤポリメラーゼによる重複伸張によって、ＤＮＡレベルでライブラリーを構築した。固定配列を、オリゴヌクレオチド６７９Ｆ０９ＢＣによってＢＣループに、そしてオリゴヌクレオチド６７９Ｆ０９ＤＥによってＤＥループに、そしてオリゴヌクレオチド６７９Ｆ０９ＦＧによってＦＧループに提供した。ライブラリー構築中に、これらが、対応するランダムオリゴヌクレオチドＦｎＢＣ、ＦｎＤＥ、またはＦｎＦＧ１０に取って代わった。位置ＸＸのランダム化には、ＦｎＣＤの代わりにＦｎＣＤ’、そしてＦｎＢＣの代わりにＦｎＢＣ８のプライマーの使用を必要とした。加えて、「ＮＶＨ」コドンを使用することにより、ライブラリーから疎水性アミノ酸を取り出した。
【０２６６】
クローン６７９Ｆ０９由来のＢＣループがランダムアミノ酸によって置き換えられたライブラリーを、次のオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによって作製した：上記のＴ７ＴＭＶ＋ＦｎＡＢ＋ＦｎＢＣ８＋ＦｎＣＤ’＋６７９Ｆ０９ＤＥ＋ＦｎＥＦ＋６７９Ｆ０９ＦＧ＋ＦｎＧ＋ＦＬＡＧ。クローン６７９Ｆ０９由来のＤＥループがランダムアミノ酸によって置き換えられたライブラリーを、次のオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによって作製した：Ｔ７ＴＭＶ＋ＦｎＡＢ＋６７９Ｆ０９ＢＣ＋ＦｎＣＤ’＋ＦｎＤＥ（三量体）＋ＦｎＥＦ＋６７９Ｆ０９ＦＧ＋ＦｎＧ＋ＦＬＡＧ。クローン６７９Ｆ０９由来のＦＧループがランダムアミノ酸によって置き換えられたライブラリーを、次のオリゴヌクレオチドからアセンブルした：Ｔ７ＴＭＶ＋ＦｎＡＢ＋６６９Ｆ０９ＢＣ＋ＦｎＣＤ’＋６７９Ｆ０９＋ＦｎＥＦ＋ＦｎＦＧ１０（三量体）＋ＦｎＧ＋ＦＬＡＧ。
【０２６７】
クローン６７９Ｆ０９由来の３−ループランダム化ライブラリーの構築
クローン６７９Ｆ０９から誘導された３つの単一ループライブラリーを、上記のようにＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）選択に供した。各ライブラリーにおいてなお存在しているクローンは、親クローン由来の２つのループおよび各クローンの結合と適合するランダム配列由来の１つのループを含有した。３つのランダムループ（各ライブラリーから１つ）を、周囲の足場領域に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、増幅した。ＢＣループを、オリゴヌクレオチドプライマーＦｎＢおよびＦｎＣＤ’を使用して、可変ＢＣループを含有するライブラリーから増幅した。ＤＥループを、オリゴヌクレオチドプライマーＦｎＤおよびＦｎＥＦを使用して、可変ＤＥループを含有するライブラリーから増幅した。ＦＧループを、オリゴヌクレオチドプライマーＦｎＦおよびＦｎＧを使用して、可変ＦＧループを含有するライブラリーから増幅した。３つの切り出されたループを、アガロースゲル電気泳動によって精製し、等しい割合で混合し、そしてプライマーＦｎＡＢおよびＦｎＧ、続いて、Ｔ７ＴＭＶおよびＦＬＡＧでのＫＯＤポリメラーゼによって増幅した。
【０２６８】
３つのランダムループを含有するクローンの最適化：
３−ループランダム化ライブラリーを、上記のように、増幅、ＲＮＡ−タンパク質融合物の合成、および親和性選択のサイクルを介して、採取した。ＥＧＦＲ−Ｆｃを、漸減濃度で使用して、最も高い親和性のバインダーを選択した。４ラウンド後、得られたタンパク質集団を、上記のような分析のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にクローニングした。
【０２６９】
ＥＧＦＲの直接結合ＥＬＩＳＡ
上記の選択から得られるタンパク質集団を、Ｈｉｓ６タグ化タンパク質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させる。直接結合ＥＬＩＳＡは、カゼインブロック緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で１〜２時間、ブロッキングされた抗Ｈｉｓモノクローナル抗体プレート（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上へのＨｉｓ６タグ化クローンの配向された補足に依存する。典型的に、１：５０希釈のＨＴＰＰ材料（０．２〜２μｇ）を１時間捕捉し、続いて、５０ｎＭのＥＧＦＲ−Ｆｃ標的とのインキュベーションを行う。結合ＥＧＦＲ−Ｆｃは、抗ヒトＨＲＰとのインキュベーションによって検出される。結合ＨＲＰコンジュゲートは、製造者の指示に従い、発色基質ＴＭＢ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、検出される。
【０２７０】
細胞ベースの競合的リガンド結合アッセイ
上記の選択から得られるクローンを、細胞ベースの競合的リガンド結合アッセイにおいてアッセイして、クローンが、細胞の表面上に局在するＥＧＦＲへの結合について、ＥＧＦ（天然のリガンド）と競合するかどうかについて決定する。細胞表面上で多数のＥＧＦＲを発現するヒト上皮癌腫細胞、クローンＡ４３１を、９６ウェル組織培養プレートにプレート化し、そして４８時間、接着させた。細胞を無血清培地で洗浄し、そして選択されたクローンの希釈物を、細胞と共に、１５分間、３７℃で、加湿インキュベーター中５％ＣＯ２においてインキュベートする。このインキュベーションは、細胞表面上のＥＧＦＲへのクローンの結合を可能にする。次いで、ユウロピウム標識ＥＧＦ（Ｅｕ−ＥＧＦ）を１０ｎＭの最終濃度で細胞に添加し、そしてさらに３時間、４℃でインキュベートする。インキュベーション後、細胞を、冷ＰＢＳで洗浄して、非結合クローンを取り出し、そしてＥｕ−ＥＧＦおよび５０μｌのＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を細胞に添加し、そして４５分間、３７℃でインキュベートする。この工程により、ユウロピウム標識がＥＧＦリガンドから解離し、時間分解蛍光によって測定される蛍光シグナルを生じる。シグナルの強度は、細胞の表面に結合したＥｕ−ＥＧＦの量と相関する。用量応答によるシグナル強度の減少は、所与のクローンが、ＥＧＦＲへの結合について、ユウロピウム標識された天然のＥＧＦリガンドと競合することを示す。
【０２７１】
ハイスループットタンパク質産生（ＨＴＰＰ）：
ｐＤＥＳＴ−１４ベクターにクローニングされ、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換された選択されたバインダーを、２４ウェル形式で５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有する５ｍｌのＬＢ培地に播種し、３７℃で１晩、増殖させる。１晩培養物から２００μｌを吸引し、そして適切なウェルに分配することによって、誘導性発現用の新鮮な５ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）培養物を調製する。培養物を、Ａ６００  ０．６〜１．０まで、３７℃で増殖させる。１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）とのインキュベーション後、培養物をさらに４時間、３０℃で増殖させ、そして遠心分離により３０分間、３２２０ｇ、４℃で回収した。細胞ペレットを−８０℃で凍結する。
【０２７２】
細胞ペレット（２４ウェル形式中）を、４５０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ−ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、３０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ、２μｇ／ｍｌのアプロチニン、ｐＨ８．０）中への再懸濁によって溶解し、そして室温で１時間、振盪する。溶解物を澄明にし、そして９６ウェルの６５０μｌキャッチプレートを具備する９６ウェルＷｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｄ  Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒに移すことによって９６ウェル形式に再度ラック掛け（ｒｅ−ｒａｃｋｅｄ）し、そして５分間、２００ｇで遠心分離する。澄明にした溶解物を、平衡緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化した９６ウェルＮｉ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｐｌａｔｅに移し、そして５分間、インキュベートする。非結合材料を、減圧によって取り出す。樹脂を、２×０．３ｍｌ／ウェルでＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）により洗浄し、各洗浄で、減圧により取り出す。次に、樹脂を、３×０．３ｍｌ／ウェルでＰＢＳにより洗浄し、各洗浄工程で、減圧により取り出す。溶出前に、各ウェルを、５０μｌ溶出緩衝液（ＰＢＳ＋２０ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、５分間インキュベートし、そしてこの洗浄を、減圧により廃棄する。さらなる１００μｌのＥｌｕｔｉｏｎ緩衝液を各ウェルに適用することによって、タンパク質を溶出させる。室温で３０分間のインキュベーション後、プレートを、５分間、２００ｇで遠心分離し、溶出したタンパク質を、Ｎｉ−プレートの底に固定された５μｌの０．５ＭのＭｇＣｌ２を含有する９６ウェルキャッチプレートに回収する。溶出したタンパク質を、タンパク質標準としてリゾチームを伴うＢＣＡアッセイを使用して、定量する。
【０２７３】
可溶性フィブロネクチンに基づく足場タンパク質バインダーの中規模発現および精製：
発現では、選択されたクローン、続いて、Ｈｉｓ６タグを、ｐＥＴ９ｄ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ベクターにクローニングし、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞において発現させる。２０ｍｌの播種培養物（単一のプレート化コロニーから生じたもの）を使用して、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有する１リットルのＬＢ培地に播種する。培養物を、Ａ６００  ０．６〜１．０まで、３７℃で増殖させる。１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）での誘導後、培養物をさらに４時間、３０℃で増殖させ、そして遠心分離により３０分間、≧１０，０００ｇ、４℃で回収した。細胞ペレットを−８０℃で凍結する。Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ  ｈｏｍｇｅｎｉｚｅｒ（ＩＫＡ  ｗｏｒｋｓ）を氷上で使用して、細胞ペレットを、２５ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ−ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）に再懸濁する。Ｍｏｄｅｌ  Ｍ−１１０Ｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用する高圧均質化（≧１８，０００ｐｓｉ）により、細胞溶解を達成する。可溶性画分を、遠心分離によって、３０分間、２３，３００ｇ、４℃で分離する。上清を、０．４５μｍフィルターを介して澄明にする。澄明にした溶解物を、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で予め平衡化したＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ）に充填する。次いで、カラムを、２５カラム容積の２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、続いて、２０カラム容積の２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾールｐＨ７．４、次いで、３５カラム容積の２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾールｐＨ７．４で洗浄する。タンパク質を、１５カラム容積のカラム容積の２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールｐＨ７．４で溶出させ、画分を、Ａ２８０での吸収に基づいてプールし、そして１×ＰＢＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５または５０ｍＭのＮａＯＡｃ；１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ４．５に対して透析する。０．２２μｍでろ過することによって、あらゆる沈殿物を取り出す。
【０２７４】
ＥＧＦＲ結合クローンのＰＥＧ化
マレイミド化学を介して、Ｃ−バージョンのクローンに対し、２倍過剰のＰＥＧ−４０−ｋＤａ（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用することによって、ＥＧＦＲ結合クローン−ＰＥＧ４０分子を調製する。反応物を、室温で２．５時間、促進させる。陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−ＨｉＴｒａｐ；ＧＥ）によって、遊離のＰＥＧ−４０をクローン−ＰＥＧ−４０から分離する。反応混合物を、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．７で１：１０に希釈し、そしてＥｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ緩衝液（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．７）で予め平衡化したＳＰ−ＨｉＴｒａｐカラムに適用し、Ｅｑｕｉｌｂｒａｔｉｏｎ緩衝液で洗浄し、そして２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．７を使用して溶出させる。溶出した画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいてプールする。ＳＰ−プールした溶出物を、Ｇ２５Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＧＥ）を介してＰＢＳに緩衝液交換する。
【０２７５】
マレイミド化学を介して、ＰＥＧ−２０−ｋＤａ（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に対し、２倍過剰の精製されたクローン−Ｃを使用することによって、ＰＥＧ２０−ＥＧＦＲ結合クローン−ＰＥＧ２０を調製する。反応を室温で１時間行う。２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．７緩衝液中ＳＥＣ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６；ＧＥ）によって、非ペグ化タンパク質を、ＰＥＧ２０−クローン−ＰＥＧ２０から分離する。ＰＥＧ２０−クローン−ＰＥＧ２０を含有する画分をプールし、そしてさらに精製して、モノ−ペグ化クローンを取り出す。これは、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ；ＧＥ）によって達成される。ＳＰ−ＨｉＴｒａｐカラムを、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．７）で予め平衡化し、ＳＥＣ溶出物を適用し、次いで、カラムを緩衝液Ａで洗浄し、次いで、０〜１０％緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．７）の勾配を５カラム容積適用し、そしてさらなる５カラム容積を稼動させるため、保持する。５０％ＢｕｆｆｅｒＢで溶出させることによって、ＳＰ−カラムからＰＥＧ２０−クローン−ＰＥＧ２０を溶出させる。画分を、Ａ２８０によってプールし、そしてＧ２５  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＧＥ）によって、ＰＢＳに緩衝液交換する。
【０２７６】
可溶性フィブロネクチンに基づく足場タンパク質のＢＩＡｃｏｒｅ分析：
フィブロネクチンに基づく足場タンパク質結合タンパク質の標的に対する結合動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００またはＴ１００バイオセンサ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して測定する。製造者の指示に従って、抗ヒト抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を、Ｂｉａｓｅｎｓｏｒ  ＣＭ５チップのフローセル１および２（Ｆｃ１およびＦｃ２）上に直接固定化する。動態解析は、ＥＧＦＲ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）またはＦｃ２における抗ヒトＩｇＧに対するインハウスで作製したトランケート型ＥＧＦＲ５２５−Ｆｃの捕捉、続いて、Ｆｃ１およびＦｃ２に対する溶液中クローンの注入を要する。抗ヒト抗体表面は、３ＭのＭｇＣｌ２の２回連続注入によって再生される。センサグラムを、各濃度において入手し、そして製造者のプログラムＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎまたはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００ソフトウェアを使用して評価し、速度定数ｋａ（ｋｏｎ）およびｋｄ（ｋｏｆｆ）を決定する。解離定数、ＫＤを、速度定数の比ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算する。典型的に、ランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）に希釈した精製されたクローンの濃度系列（０μＭ〜２μＭ）を、抗ヒトＩｇＧ捕捉ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質への結合について評価する。
【０２７７】
ＨＥＲ２またはＨＥＲ３のような他の関連ファミリーメンバーへの結合を決定する実験のために、上記の抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して、組み換え外部ドメイン−Ｆｃ融合物を捕捉する。ヒトＥＧＦＲ、またはＨＥＲ２もしくはＨＥＲ３のような他の関連ファミリーメンバーのいずれかへの特異的結合を、ブランク対照フローセル１に対して観察される結合を差し引くことによって、計算する。ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ、非関連受容体は、さらなる非特異的結合対照としての役割を果たす。ＥＧＦＲ結合クローンを、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）中１０μＭに希釈し、そして２０μＬ／分で５分間、フローセルに２５℃で注入し、そして解離を１０分間、観察する。
【０２７８】
示差走査熱量測定：
中規模クローンの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を実施して、熱安定性を決定する。３ａｔｍ圧下、１分間あたり１℃の速度で、温度を５℃〜９５℃に上昇させることによって、Ｎ−ＤＳＣ  ＩＩカロリーメーター（Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ）で適切なクローンの１ｍｇ／ｍｌ溶液をスキャンする。Ｏｒｇｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＯｒｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐ）を使用する最良適合（ｂｅｓｔ  ｆｉｔ）を使用し、適切な緩衝液のコントロールランに対して、データを分析する。
【０２７９】
サイズ排除クロマトグラフィー：
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、Ａ２１４ｎｍおよびＡ２８０ｎｍにおけるＵＶ検出ならびに蛍光検出（励起＝２８０ｎｍ、発光＝３５０ｎｍ）でＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム上ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ２０００カラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＬＣ）、４．６ｍｍ×３０ｃｍを使用して、実施する。１００ｍＭ硫酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムの緩衝液、ｐＨ６．８を、１００μＬ／分の流速で用いる。サンプル（それぞれ、０．１〜１μｇ）を、約１００μｇ／ｍＬの濃度で個別に注入する。ゲルろ過標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）は、分子量キャリブレーションに有用である。
【０２８０】
クローンのＳＥＣ  ＭＡＬＬＳ分析：
０．６ｍｌ／分の流速で適応される１００ｍＭ硫酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ６．８の移動相を伴うＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器を具備するＷａｔｅｒｓ  Ｂｒｅｅｚｅ  ＨＰＬＣシステム上で、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施する。サンプルを、移動相で約１．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして５０μｌを注入する。Ｍｕｌｔｉ−Ａｎｇｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＭＡＬＬＳ）分析を、ＵＶ検出器の後方に直列に設置されたｍｉｎｉＤＡＷＮ光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＯｐｔｉｌａｂ  ＤＳＰ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、実施する。Ａｓｔｒａ  Ｖバージョン５．１．９．１ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、光散乱データの分析を実施する。２８０ｎｍでの吸収によるクローンの濃度を計算するために、アミノ酸配列に基づく理論モル吸光係数を使用する。屈折率による濃度決定のために、０．１８５ｍＬ／ｇの見積もられた比屈折率の増加（ｄｎ／ｄｃ）を使用する。
【０２８１】
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析：
Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＰＲＯ質量分析計を使用するＭａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計（図１４）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、ＥＧＦＲ結合クローンを分析する。サンプルを、０．１％ＴＦＡで約１．０ｍｇ／ｍｌに希釈する。約１２μｌのサンプルを、Ｃ４  ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に充填し、そして０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で洗浄して、塩および混入物を取り出す。２μｌのシナピン酸マトリックス（７０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍｌ、０．１％ＴＦＡ）を使用して、サンプルを、ＺｉｐＴｉｐから直接標的プレート上に溶出させる。装置の標準化を、既知の質量の２つのタンパク質を使用して実施する：シナピン酸中５μＭの最終濃度に調製され、プレート上に滴下されたシトクロムＣ（１２３６１．９６Ｄａ）およびアポミオグロビン（１６９５２．２７Ｄａ）。スペクトルは、次の装置設定で獲得される：加速電圧２５０００Ｖ、グリッド電圧９１％、ガイドワイヤー０．１％、抽出遅延時間４００ｎｓｅｃ、レーザー強度３８２４。ベースライン補正および９のフィルター幅値を伴うＧａｕｓｓｉａｎ  Ｓｍｏｏｔｈアルゴリズムを適用することによって、Ｄａｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ｖ．４．５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において生スペクトルを処理する。
【０２８２】
３Ｈ−チミジン細胞増殖アッセイ
９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて１ウェルあたり２，５００個の細胞で、細胞をプレート化した。ＰＢＳにおいて可溶化された化合物を、２４時間後に添加し、そして培養物をさらに７２時間、インキュベートした。細胞に４μＣｉ／ｍＬ［３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を３時間追加し、トリプシン処理し、そしてＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６，ＧＦ／Ｂプレート（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）上に回収した。ＤＮＡへの組み入れを、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）上でシンチレーション測定を行うことによって、測定した。結果を、非処置コントロール細胞の増殖に対して５０％だけ細胞増殖を阻害するのに必要な薬物濃度であるＩＣ５０として表す。データは、ＳＥと共に示される３回のウェルの測定の平均である。
【０２８３】
水溶性テトラゾリウム塩増殖アッセイ
細胞を、フェノールレッドを伴わない完全培地に播種し、そして上記のようにＥＧＦＲ結合クローンで処置する。処置期間の終了時に、１０μｌ／ウェルのＷＳＴ−８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）を各ウェルに添加し、そしてプレートを３時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ホルマザン染料蓄積を、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上での４５０ｎｍでの吸収を読み取ることによって、定量した。
【０２８４】
Ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｗｅｓｔｅｒｎアッセイ
細胞を、ポリ−Ｄ−リジン被覆マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に、Ａ４３１類表皮癌腫またはＦａＤｕ頭頚部癌腫細胞について２４，０００個の細胞／ウェルで播種し、そして１晩接着させた。細胞を洗浄し、次いで、２４時間、無血清培地においてインキュベートした。次いで、系列希釈のクローンを細胞に適用し、そして１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで１０分間、刺激する前に、４時間、インキュベートした。刺激後、細胞を、２０分間、３．７％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳにおいて固定化し、次いで、０．１％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含有するＰＢＳにおいて、１５分間、透過させた。細胞を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッカーにおいて１時間、ブロッキングし、そして抗体と共にインキュベートして、チロシン１０６８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびアクチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上でリン酸化されたＥＧＦＲ、またはチロシン２０２／スレオニン２０４上でリン酸化されたＥＲＫ（ＭＡＰキナーゼのいずれか、および全ＥＲＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を検出した。０．１％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した後、第二抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡまたはＲｏｃｋｌａｎｄ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を添加した。  細胞を、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、そしてＬｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）上で画像化した。各クローンを３回測定でアッセイし、そしてＩＣ５０値を、最大シグナル−バックグランドの阻害パーセントの線形回帰分析から計算した。
【０２８５】
ＥＧＦＲ抗体をブロッキングすることによるエピトープマッピング
Ａ４３１細胞を、ポリ−Ｄ−リジン被覆マイクロタイタープレートに、２４，０００細胞／ウェルで播種し、そして１晩、接着させた。翌日、各ウェルを、冷ＰＢＳで１回洗浄し、そして細胞を、様々な濃度のクローンと共に、１時間、４℃でプレインキュベートした。非結合タンパク質を、冷ＰＢＳで洗浄除去し、そしてＰＢＳ、ｐＨ＝８．０中１ｍＭのＢＳ３で、４℃で１時間処置することによって、結合タンパク質を、受容体に架橋した。プレートの中身を捨て、そして１ウェルあたり５０μｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５を添加し、そして１５分間、室温でインキュベートすることによって、架橋反応をクエンチした。プレートを、ＰＢＳ＋０．１％ｔｗｅｅｎ−２０で１回洗浄し、そして２０分間、ＰＢＳ＋３．７％ホルムアルデヒド中で固定化した。プレートを、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッカー中で１時間、室温でブロッキングした。ブロッキング溶液を取り出し、そしてＯｄｙｓｓｅｙブロッカー中で１：１００または１：５０に希釈した様々な第一抗体をプレートに添加し、そして１時間、室温でインキュベートした。プレートを３回洗浄し、そしてＴＯＰＲＯ３対比染色１：３０００と共にＯｄｙｓｓｅｙブロッカー＋０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０中で１：８００に希釈した第二抗体をプレートに添加し、そして室温で１時間、インキュベートした。プレートを３回洗浄し、そしてＬｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ上、１６０μＭの解像度で画像化した。
【０２８６】
ＤｉＦｉ細胞における全ＥＧＦＲホスホチロシンレベルの決定のためのＥＬＩＳＡアッセイ
マイクロタイタープレートの各ウェルにおいて１×１０５個のＤｉＦｉ細胞をプレート化し、そして細胞を１晩接着させることによって、ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害を決定した。翌日、培地を無血清培地に置き換え、そして細胞を１６時間、枯渇させた。ＥＧＦＲ結合クローンまたはコントロール抗体を、細胞と共に３７℃で４時間、インキュベートした。次いで、細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで１０分間、刺激し、そして細胞溶解物を、ＨＮＴＧ［５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、８％グリセロール、２ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ロイペプチン、ベスタチン、ペプスタチン−ＡおよびＥ６４を含有する１ｍＭのＥＤＴＡ］中で調製した。溶解物を、ＥＧＦ受容体のヒト細胞外ドメインに特異的な第一抗体で被覆した捕捉プレートに移した（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。検出抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０，Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）で置き換えた。発色基質、テトラ−メチルベンジジンを使用して、分光光度計における４５０ｎｍでの吸光度を測定した。サンプルを３回測定で試験し、そしてＩＣ５０値を、バックグランドを差し引き、そして各アッセイにおける全最大シグナルの阻害パーセントを計算することによって決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年10月5日(2010.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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