(57)【要約】本発明は、交番磁界を用いて磁気ビーズまたは磁性粒子を少なくとも１つの所定のターゲット温度に加熱することによって、少なくとも１つの温度依存性の酵素反応を、磁性粒子、特にナノ粒子または磁気ビーズの存在下で、インビトロで温度制御する方法に関する。本発明に係わる方法で温度制御可能な酵素反応は、好ましくはＰＣＲ反応、あるいはＤＮＡ，ＲＮＡまたは両者のハイブリッドまたは誘導体を含む核酸を伸長または増幅するための他の反応であり、官能性磁気ビーズ上で直接生じる。本発明の他の側面は、この方法を実行する反応器および分析および診断における方法または反応器の使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
交番磁界を用いて磁気ビーズまたは磁性粒子を少なくとも１つの所定のターゲット温度に加熱することによって、少なくとも１つの温度依存性の酵素反応を、磁性粒子、特にナノ粒子または磁気ビーズの存在下で、インビトロで温度制御する方法であって、前記温度依存性の酵素反応は、ＰＣＲ反応、あるいはＤＮＡ，ＲＮＡまたは両者のハイブリッドまたは誘導体を含む核酸を伸長または増幅するための他の反応であり、前記磁気ビーズは官能性磁気ビーズであり、前記反応は前記ビーズ上で直接行なわれる方法。
【請求項２】
前記ビーズの官能基化は、プライマー配列の結合を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、加熱および冷却の複数のサイクルを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記温度依存性の酵素反応は、ビーズ上のＰＣＲ反応であることを特徴とする請求項1ないし３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記交番磁界は、１ないし１０００、特に５０−５００ｋＨｚの周波数範囲の周波数を有することを特徴とする請求項１ないし４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記磁気ビーズまたは磁性粒子は、調整可能なキュリー温度を有する粒子を含むことを特徴とする請求項1ないし５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
調整可能なキュリー温度を有する前記粒子のキュリー温度を、粒子の組成物の選択によって、交番磁界による加熱工程中に制御される反応の際に加熱が超えるべきでない所定の温度範囲が調整されるように、かように決定することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記磁気ビーズまたは磁性粒子は、Ｆｅ，Ｎｉ，Ｃｏ，Ｃｕ，Ｍｎ，Ｃｒ，Ｍｇ，Ｚｎ，ＬａおよびＳｒの金属、金属酸化物および金属合金からなる群から選択されている組成物を有する磁性粒子を含みまたは構成することを特徴とする請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記磁性粒子の組成物は、Ｃｕ／Ｎｉ合金、Ｌａ１−ＸＳｒＸＭｎＯ３（０＜ｘ＜１）、Ａ１−ＸＺｎＸ＋Ｆｅ２Ｏ４（Ａ＝Ｎｉ，ＭｎまたはＣｕ；０＜ｘ＜１）およびＡＸＢｙ＋Ｆｅ２＋ＺＯ４（Ａ，Ｂ＝Ｎｉ，Ｍｎ，Ｍｇ，ＣａまたはＣｕ；ｘ＋ｙ＋ｚ＝１）から選択されていることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記磁気ビーズは、天然のまたは合成のポリマーマトリックス中に埋め込まれた磁性粒子を有することを特徴とする請求項1ないし９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記磁気ビーズは、無機または有機の多孔質の担体マトリックスに埋め込まれた前記磁性粒子を有することを特徴とする請求項１ないし９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記磁気ビーズは、シリカコーティングまたは他のコーティングを有する磁性粒子を含むことを特徴とする請求項１ないし１１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記磁性粒子は、１０ｎｍないし５００ｎｍの範囲のサイズを有し、前記磁気ビーズは５００ｎｍないし５μｍの範囲のサイズを有することを特徴とする請求項１ないし１２のいずれか1項の方法。
【請求項１４】
交番磁界を発生させるための装置（１）と、反応物および官能性磁気ビーズ（２１）を有する反応空間（２）とを具備する、請求項１ないし１３のいずれか1項に記載の方法を実施するための反応器。
【請求項１５】
測定および制御装置（３）および必要な場合には冷却装置（４）を更に有する請求項１４に記載の反応器。
【請求項１６】
前記反応器は、ＰＣＲのためのサーモサイクラーまたは他の核酸増幅反応のための類似の装置であることを特徴とする請求項１４または１５に記載の反応器。
【請求項１７】
診断用カートリッジを有する、請求項１４ないし１６のいずれか1項に記載の反応器。
【請求項１８】
請求項１４ないし１７のいずれか1項に記載の反応器を有するインビトロ検査システム。
【請求項１９】
診断用カートリッジを有する、請求項１８に記載のインビトロ検査システム。
【請求項２０】
請求項１ないし１３のいずれか1項に記載の方法の、または請求項１４ないし１７のいずれか1項に記載の反応器の、分析および診断における使用。
【請求項２１】
サンプルの調製（Aufarbeitung）または精製、標的構造および／または標的分子の分離、および標的分子の増幅および／または識別を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
ビーズ上のＰＣＲ反応またはビーズ上のプライマー伸長を温度制御するための、官能性磁気ビーズの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の説明】
【０００１】
特に、サンプルの処理、標的の構造および／または分子の分離、標的分子の増幅および標的分子の検出のために用いられる分析的または診断的方法は、適用範囲の幅が広く、常に拡大する領域である。遺伝子工学および分子生物学の分野の進歩に伴って、特に、反応相手または標的分子としての核酸との生物学的および化学的反応が、重要な役割を果たしてなる方法が、最近では、ますます重要性を増している。
【０００２】
核酸（ＲＮＡ，ＤＮＡ）における特定配列の増幅および検出のためには、種々の増幅法が用いられる。最も一般的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction;ＰＣＲ）に基づいている。ポリメラーゼ連鎖反応によって、ＤＮＡ鎖（テンプレート）内の特定の核酸配列を増幅することができる。ＰＣＲを、核酸分析の一部として、またはスタンド・アロンの方法として用いることができる。この場合、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、テンプレートにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド配列（プライマー）に遊離デオキシヌクレオチドを加える。得られた増幅産物は、再度熱的に分離され、他の反応のためのテンプレートとして用いられることができる。かようにして、ＤＮＡサンプル中に低濃度で存在する標的配列を、指数関数的に増幅することができる。
【０００３】
ＰＣＲを実行するため、増幅される領域を定める短いセンスおよびアンチセンス・オリゴヌクレオチドを、低濃度のテンプレート、耐熱性のポリメラーゼおよび個々のヌクレオチドを伴う反応混合物に添加する。一般的に、反応混合物は、この目的のために適切な閉じた容器（毛細管または管）の中で、複数の温度サイクルに晒される（使用されたポリメラーゼに応じて、変性  約９５−１００℃、ハイブリダイゼーション  ４０−６５℃、伸長  ７０−８０℃、好ましくは約７２℃）。温度サイクルは、一般的に、サーモブロックとしてのペルチェ素子またはホットエア（ライト・サイクラー）によって生み出される。この目的のために、容器壁部とペルチェ素子との間の、または毛細管壁部と循環するホットエアとの間の直接的な接触を行なわねばならない。ＰＣＲ反応混合物と熱媒体（ペルチェ素子、ホットエア）との間の効率的な熱伝達の達成は、しばしば問題になることがあり、温度勾配を最適に実現化することができない。特に、例えばＰＣＲによる増幅段階を必要とする、完全に統合された診断システムのような自動化されたプロセスの場合、更に、ペルチェ要素またはホットエアノズルの、ディスポーザブル（試薬カートリッジ）への直接的な連結が必要である。この目的のために、一般的には、高い機械的な費用が必要である。
【０００４】
従って、このような核酸増幅反応、例えば、ＰＣＲの必要な温度サイクルの場合の温度が、容易なかつ効果的な方法で非接触式に制御されることは、非常に好都合である。基本的には、生物的なおよび化学学的な反応の非接触式の温度制御のための一連の知られた方法、例えば、マイクロ波、赤外光、レーザビーム、ハロゲン光、ホットエア、誘導加熱、化学的な加熱法等（例えばBiotechnology Advances 24 （2006）pp. 243-284を参照）があるが、これらの方法の大部分は、装置に関する比較的高い費用を必然的に伴い、および／または他の欠点に結びついている。特に、これらの方法の温度制御は、比較的不正確である。それ故に、正確な調整のためには、温度センサの使用が必要であり、これらの温度センサは、反応空間に、またはこの反応空間と直接接触して設置されねばならない。
【０００５】
本発明は、反応体積の磁気ビーズが、交番磁界によって、所定のターゲット温度に非常に正確にかつ迅速に加熱されることができ、従って、核酸の増幅または伸長のための反応、特にＰＣＲの温度制御が、従来の加熱要素または加熱媒体を必要とすることなく、便利なかつ効率的な方法で、達成されることができるという驚くべき観察に基づいている。磁性の粒子／ビーズの種類および数量による加熱条件の正確な予備調整で、多くの場合、温度センサの使用を省略することができる。
【０００６】
核酸と磁気ビーズとの組み合わせは、基本的には知られている。
【０００７】
少し以前から、磁性粒子（ナノ粒子およびビーズ）は、核酸およびタンパク質、しかしまたウイルス、細菌および哺乳動物細胞のような巨大分子の精製のために、使用される。この目的のために、例えば、生体分子上の特定の表面構造に向けられた捕捉分子（例えば、抗体、ハプテン、核酸）が、磁気ビーズの表面に固定される。その代わりに、磁気ビーズの表面に、分子の或る種類に対し高い親和性を有する特殊なコーティング、例えばシランを備えることができる。標的分子の吸収は、このとき、特定の緩衝条件下でなされる。緩衝媒体の交換によって、表面に結合された分子を、再度分離（溶出）することができる。
【０００８】
標的構造または標的分子の、サンプルの残りのものからの分離、およびサンプルの続きの精製が、磁界の印加によってなされる。この磁界は、懸濁液の磁気ビーズを任意の或る領域に集中しかつ可逆的に固定する。上澄み液を、破棄し、例えば洗浄緩衝液で交換することができる。その目的は、ビーズに結合された標的分子を洗浄するためである。外部磁界の除去によって、ビーズが、再度、再懸濁される。
【０００９】
核酸をベースにした精製法では、主に、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）のプラスに電荷されたバックボーンに対する高い結合親和性を有するシラン処理された磁気ビーズを用いる。緩衝液中でイオンとの親水性の相互作用を減じる、いわゆるカオトロピック塩を高濃度で使用する際に、核酸は、ビーズの表面に可逆的に結合する。この結合は、塩の濃度の低減または温度の増加によって、再度解除される。
【００１０】
最近では、単鎖の核酸（オリゴヌクレチド、ｃＤＮＡまたはＰＣＲ産物）は、リンカー分子を介して、ビーズ表面に結合される。その目的は、サンプルに含まれている相補的な核酸ストランドとの特異的なハイブリッド化を可能にするためである。
【００１１】
最近、直接にまたはスペーサを介して磁気ビーズ担体に結合されているオリゴヌクレチドの伸長が可能なアプローチが記述された。Liu等〔Liu et al. (2001)〕は、磁性ナノ粒子に結合されているプライマーを用いるＰＣＲを記述しており、ＰＣＲ産物は直接、ナノ粒子上で増幅される（Biotechnol. J. 2007 Apr. 2(4):508-11）。
【００１２】
ビーズに結合されたプライマーは、取り分け、ハイスループットスクリーニング方法でも、用いられる。このようなことから、この方法は、ＰＣＲ増幅を用いて転写因子をスクリーニングするために、Kojima等〔Kojima et al. (2005)   Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 17〕によって使用される。
【００１３】
所定の周波数内の外部交番磁界の適用によって、懸濁液中の磁性粒子の加熱が引き起こされることが知られている。この効果は、腫瘍疾患の場合の、特に磁性粒子の温熱療法に適用される。腫瘍組織への磁性粒子の注入後に、外部電磁石による交番磁界の起動に続いて、腫瘍組織の局所的な加熱および破壊が生じる（U. Gneveckow, A. Jordan, R. Scholz et al., Biomed. Technol. 50 (2005) 92およびM. Suzuki, M. Shinkai, M. Kamihara  et al.,Biotechnol. Appl. Biochem.21(1995) 1179）。この効果は、インビボで標的化制御のため、および治療上効果的な物質の局所的な放出のための「ドラッグ・ターゲッティング」の場合にも活用される〔E. Viroconchatapan, H. Sato, M. Ueno et al., Life Sci.(1996) 58(24);2251-61〕。
【００１４】
WO 2008/027090 A2には、対応の物質が埋め込まれる孔を有する多孔質の磁性粒子が記載されている。粒子および対応の物質を、電磁界によって加熱することができ、粒子および物質の結合性および／または他の性質を、加熱によって制御することができる。
【００１５】
DE 198 00 294 A1は、誘導的に加熱可能な磁性ポリマー粒子、ならびに磁性ポリマー粒子を製造するための、および種々の親和性リガンドによる官能基化のための方法、および、一般的な形態では、特に生物医学的分析において種々の使用可能性を記載している。
【００１６】
WO 2004/052527 A1は、高周波磁界を介してビーズで媒介して加熱がなされてなる、ＰＣＲ反応のための循環式のフローリアクタを開示している。
【００１７】
しかしながら、温熱療法〔Hyperthermie〕は、例えば、ビーズ上のＰＣＲおよび類似の反応の、（プライマー）官能性ビーズ上で直接に実行される、核酸増幅またはプライマー伸長の、その制御では、従来使用されなかった。
【００１８】
従って、本発明の課題は、温度依存性の酵素反応をインビトロで非接触性（beruhrungsfreien）に温度制御する新規な方法であって、特に、核酸増幅反応、例えばＰＣＲまたは「ビーズ上の」核酸伸長反応の制御のために、特にそのために適切であり、かつ、装置に関する低コストを要する方法を提供することである。
【００１９】
この課題は、本発明によれば、請求項１に記載の方法および請求項１４に記載の反応器を提供することによって解決される。本発明の他の側面および／または本発明の好ましい実施の形態は、他の請求項の主題である。
【００２０】
本発明に係わる方法では、磁性粒子またはビーズを反応空間で磁気交番磁界によって少なくとも一つのターゲット温度に加熱することによって、当該の反応をインビトロで非接触で温度制御する。
【００２１】
本発明の好ましい実施の形態では、ビーズ上のＰＣＲの温度サイクルは、粒子の加熱をもたらす外部交番磁界によって発生される。この目的のために、磁気ビーズは、該磁気ビーズが、熱的に安定的であり、オリゴヌクレオチドが、磁気ビーズの表面に、安定的に（共有的に）結合することができ、外部交番磁界によって、加熱（温熱療法）が生じるように、励起可能であるように、デザインされる。熱の発生は、磁気特性およびビーズのサイズに従って、交番磁界〔Wechselmagnetfelds〕によって、好ましくは５０−５００ｋＨｚの周波数帯域にある周波数で、引き起こされる。
【００２２】
ＰＣＴまたは他の反応の温度制御のための磁性粒子またはビーズの加熱を、ナノ粒子のために使用される合金のキュリー温度、ビーズ毎の粒子の含有量および（ＰＣＲ）の反応体積あたりのビーズの数によって、校正することができる。反応混合物の加熱は、最適な温度勾配を発生させるために、所定の磁界強度および周波数の外部の交番磁界によってなされる。反応混合物の冷却は、空気の冷却または熱伝導材料への結合によって、受動的にまたは能動的になされる。加熱およびその後の冷却は、その間に磁気熱ポンプ〔magnetischen Warmepumpen〕および冷蔵庫において用いられるいわゆる磁気熱量効果〔magnetokalorische Effekt〕に基づいている。
【００２３】
適切な磁界強度は、典型的には、１ないし１０００ｋＡ／ｍ、好ましくは１ないし２００ｋＡ／ｍ、例えば１ないし２０ｋＡ／ｍ、または、より高い熱出力のためには、１０ないし１００ｋＡ／ｍ、より好ましくは５０ないし１００ｋＡ／ｍの範囲にあり、強磁性の、常磁性の、または超常磁性の粒子が使用されているか否か、および、主として、ブラウン機構またはニール機構によって引き起こされた加熱効果が有効か否かに依存している。適切な周波数は、典型的には、１−１０００ｋＨｚ、好ましくは５０−５００ｋＨｚの範囲、より好ましくは１００ないし４００ｋＨｚの範囲にある。交番磁界を発生させるためには、例えば、ｋＨｚ範囲、例えば３００ｋＨｚにおいて１．６ｋＡ／ｍの磁界強度が適切である。このことによって、約５ｋＷの熱出力が磁界において達成可能である。
【００２４】
磁界強度および周波数を、特殊な適用例のために、通常の当業者による通常の実験によって、容易に最適化することができる。
【００２５】
反応体積における磁気ビームまたは磁性粒子による達成可能な温度上昇は、電磁界における消費電力Ｑｓから生じ、所定量の磁性粒子が周囲の媒体（例えば、水または水溶液）に移る。この計算は、交番磁界における消費電力が、実際に、完全に熱に変換されること（実際の経験値によって確認される）を前提とする。 
上記の、典型的な、磁界強度および周波数の条件下では、（ＢＥＴ窒素吸着によって決定される）１３ｎｍないし１００ｎｍの粒子の比消費電力は、一般的には、約１００ないし６００Ｗ／ｇまたはｋＪ／ｋｇ  ｓの範囲にある。
【００２６】
この消費電力を種々のビーズまたは磁性粒子のために容易に経験的に決定することができ、サイズおよび組成に関して所望の熱出力のため適切な粒子を選択することができる。
【００２７】
磁性粒子（Ｆｅ３Ｏ４）に関して、以下の式が適用される：
加熱速度ΔＴ＝Ｑｓｍ（Ｆｅ３Ｏ４）／ｃ（Ｈ２Ｏ）×ｍ（Ｈ２Ｏ）
熱容量ｃ（Ｈ２Ｏ）＝４．１８ｋＪ／ｋｇ  Ｋ 
２５ｎｍの直径を有する粒子の比消費電力：約２５０ｋＪ／ｋｇ  ｓ
核酸のＰＣＲまたは他の酵素反応のための典型的な反応バッチは、約５μｌないし１ｍｌ、よりしばしば１０μｌないし５００μｌ、典型的には５０μｌないし１００μｌの容量を有する。例1の反応バッチにおけるような、５０ないし１００μｌ（０．０５ｇないし０．１ｇ）の容量および０．００２５ｇないし０．００５ｇの粒子量（標準懸濁液中の５重量％の濃度）の場合には、従って、例えば、加熱速度ΔＴ＝２．９９Ｋ／ｓが生じる。
【００２８】
１ないし１０重量％の範囲にある粒子濃度の変更は、０．６ないし６．０ｋ／ｓの加熱速度の変化をもたらす。
【００２９】
これらの加熱速度は、典型的なＰＣＲ反応または他の核酸増幅反応または核酸伸長反応の加熱および温度制御のために、十分に適切である。所定の状況で、他の加熱速度が万一必要である場合、該加熱速度を、例えば、粒子の数、サイズおよび種類の変化によって、所望通りに調整することができる。
【００３０】
ここで本発明の文脈で用いられる、「ビーズ」、特に「磁気ビーズ」という用語の意味は、この分野での通常の当業者の通常の理解に対応している。ビーズは、一般的に、典型的には約１００ｎｍないし約１０μｍ、好ましくは約５００ｎｍないし５μｍの範囲のサイズの担体粒子である。担体粒子は、官能基化されていても、またはされていなくてもよいが、好ましくは官能基化されており、しばしば、ほぼ球状をなし、磁気ビーズの場合に、通常は、磁性ビーズより小さい磁性ナノ粒子を有する。該磁性ナノ粒子は、例えばマトリックスに埋め込まれておりおよび／またはコーティングを有する。 
これらの磁性ナノ粒子は、典型的には、約１０ｎｍないし約９００ｎｍ、好ましくは約２０ｎｍないし５００ｎｍの範囲にあるサイズを有し、特に磁気ビーズにおける使用に関して以下に詳述するように、組成物の広い範囲を有することができる。これらの磁性ナノ粒子自体は、酵素反応を本発明に基づいて温度制御するために、あるいは、以下に詳述するような、粒子より大きな磁気ビーズの成分として使用されることができる。種々の磁性ナノ粒子の混合物、あるいは磁性ナノ粒子と磁気ビーズとの混合物も、必要な場合には使用することができる。
【００３１】
本発明に係わる方法で使用するための磁気ビーズとしては、原則として、文献に記述されたおよび／または市販のすべてのビーズが考えられる。適切なビーズを、所望のまたは必要なキュリー温度、および必要な場合に所望の更なる表面特性および官能性に従って、市販のビーズの広い範囲から、選択し、あるいは、知られた方法で製造することができる。
【００３２】
専門文献（F. Schueth, et al., Angew. Chem. 2007, 119, 1242-1266）に記載の、あるいは、市販の（http://www.magneticmincrosphere.com）種々の磁気ビーズは、ＦｅおよびＣｏのような純金属、ＣｏＰｔ３，ＣｏＰｔ，ＦｅＰｔ等のような合金、あるいはγ-Ｆｅ２Ｏ３，ＦｅＯ，ＮｉＯのような酸化物相〔oxidischen Phasen〕、および、特に、スピネルＦｅ３Ｏ４、あるいは、一般的には、ＭＩＩＭＩＩＩ２Ｏ４（Ｍ＝Ｆｅ，Ｎｉ，Ｃｏ，Ｍｎ，Ｃｒ，Ｍｇ，Ｚｎ等）からなる粒子に基づいている。大抵の市販の磁気ビーズでは、純金属、および取り分け種々の酸化鉄が好ましい。
【００３３】
各々の粒子を製造するためには、種々の方法が用いられる。ここでは、取り分け、共沈、熱分解および／または先駆物質の分子の還元、ミセルの合成および熱水合成が好ましい。
【００３４】
共沈は、取り分け酸化鉄（例えば、Ｆｅ３Ｏ４、γ-Ｆｅ２Ｏ３）を、水溶性のＦｅ２＋／Ｆｅ３＋溶液（塩化物、硝酸化物、硫酸化物等）および塩基（アルカリ水酸化物、アンモニア溶液、有機アミン等）から、高収率でかつ比較的狭い粒径分布で得るための、非常に単純な方法である。反応条件（Ｆｅ２＋／Ｆｅ３＋比率、ｐＨ値および媒体のイオン強度、塩の種類、温度：２０−９０℃、不活性ガス雰囲気）は、粒子の種類、質およびサイズも決定し、これに応じて、正確に再現される必要がある。
【００３５】
界面活性剤（脂肪酸、オレイン酸、ヘキサデシルアミン）を含有する高沸点有機溶剤（石油エーテル、トリオール、長鎖エーテル等）の中で、金属有機前駆体（金属カルボニル、金属アセチルアセトンまたは金属クペロン酸塩（Ｎ-ニトロソフェニルヒドロキシルアミン複合体）を熱分解することによって、全く容易に制御されるわけではない反応（１００−３２０℃、不活性ガス雰囲気、短時間での核生成  〜  数時間および数日に亘る成長）において、高品質であって、非常に狭い範囲に分布された（単分散の）粒子の、良好な収率が得られる。還元雰囲気（Ｈ２）の中で、かくして、純金属または合金（Ｆｅ，Ｃｏ，ＦｅＰｔ，ＣｏＰｔ３）のナノ粒子を得ることができる。他方、酸化条件（空気、Ｏ２，（ＣＨ３）３ＮＯ）は、金属酸化物（Ｆｅ３Ｏ４，Ｃｏ３Ｏ４，ＭｎＯ，ＮｉＯ，Ｃｒ２Ｏ３）を利用する。しかしながら、長い成長期間によって、通常、比較的短い（２−２０ｎｍ）粒子が発生される。
【００３６】
マイクロエマルジョンの（逆）ミセルでは、取り分け、種々のスピネルが得られ、そのサイズ（１−５０ｎｍ、狭い分布）および形状は、水と「油相」（取り分けトリオール）の比率に、しかしまた界面活性剤の安定化に依存している。この場合、ミセルは、塩基による金属塩溶液の沈殿のためのナノ反応器である。しかし、このようなバッチは、一般的に、低収率しか提供せず、容易にはスケールアップされない。何故ならば、水の成分と比較して、常に、大量の有機溶剤が必要だからである。
【００３７】
本発明に係わる方法で使用するための磁気ビーズは、好ましくは磁性粒子、通常はナノ粒子を有し、その組成はＦｅ，Ｎｉ，Ｃｏ，Ｃｕ，Ｍｎ，Ｃｒ，Ｍｇ，Ｚｎ，ＬａおよびＳｒの金属、金属酸化物および金属合金からなる群から選択される。しかしながら、用途に応じて、他の組成物（例えば、上記の従来の技術に開示されている）の粒子も適切であり得る。
【００３８】
本発明に係わる方法で用いられる磁気ビーズまたは磁性ナノ粒子は、更に、調整可能なキュリー温度を有する粒子を含むことは好ましい。磁性粒子の適切な組成物の幾つかの限定されない例は、Ｃｕ／Ｎｉ合金、Ｌａ１−ＸＳｒＸＭｎＯ３（０＜ｘ＜１）、Ａ１−ＸＺｎＸ＋Ｆｅ２Ｏ４（Ａ＝Ｎｉ、ＭｎまたはＣｕ；０＜ｘ＜１）およびＡＸＢＹ＋Ｆｅ２＋ＺＯ４（Ａ，Ｂ＝Ｎｉ、Ｍｎ、Ｍｇ、ＣａまたはＣｕ；ｘ＋ｙ＋ｚ＝１）である（表１を参照せよ）。 
かくして、磁性粒子の合金の選択によって、比エネルギ吸収率(specific power absorption rate)が変更してキュリー温度を、予め定めることができる。このことは、例えば、交番磁界による加熱工程中に制御される反応の際に加熱が超えてはならない所定の温度範囲を設定するために、用いられることができる。
【表１】
2011517558.tif 000003
【００３９】
本発明に係る方法で使用される磁気ビーズは、天然または合成のポリマーマトリックスに埋め込まれた磁性粒子を有することができる。
【００４０】
このようなビーズを、例えば、磁性粒子を、天然物（例えば、デキストラン、セファロースのような多糖類、ポリ-Ｌ-アスパラギン酸、ポリ-Ｌ-グルタミン酸のようなポリペプチド、ポリ-Ｐ、Ｌ-ラクチドのようなポリラクチド）または合成のポリマーマトリックス（例えば、ポリビニルアルコール、ポリスチレン（誘導体）、ポリ(メタ)アクリレートおよびポリ（メタ）アクリルアミド、ポリピロール、ポリエステル、ポリ-s-カプロラクタム等ならびに共重合体および天然重合体を有する共重合体）へ埋め込むことによって、または、無機コーティング（例えば、ＳｉＯ２、Ａｕ、カーボン）によって得ることができる。
【００４１】
磁性粒子のカプセル化の場合に、小さな粒子（例えば磁性流体の）が、担体マトリックスの中で均一に分布されることができるか、あるいは、大きな粒子がコアシェル粒子の形態で構成されることができる。他の可能性は、非常に小さな磁性ナノ粒子またはＦｅ２＋および他の金属イオン（Ｆｅ３＋，Ｃｏ３＋，Ｎｉ２＋，Ｍｎ２＋等）による（有機／無機の）多孔質材料の浸潤と、マトリックスにおける磁性粒子（例えばフェライト）の後続の形成とにある。無機または有機の多孔質担体マトリックスに埋め込まれた磁性粒子を有するこのような磁気ビーズも、本発明の方法で有利に使用することができる。
【００４２】
特に、マトリックス分散粒子（「ポリマービーズ」）の場合に、ビーズのサイズ（最大限５または１０μｍ）は、通常、含有される磁性粒子のサイズ（しばしばわずか数ｎｍ）と何ら関係はない。このことは、磁化曲線の測定によって、容易に確認される。小さな粒子は、狭いヒステリシスを示す。
【００４３】
ポリマーのみならず、ＳｉＯ２でコーティングされた磁性粒子も、異なった官能性を有するために適切である。Ｓｉ０２層（コーティング）には、官能化されたクロロシランまたはアルコキシシランが結合される。かようにして、（例えばＡＴＲＰのための）重合開始剤を粒子に結合することができる。その目的は、磁気コアおよびポリマーシェル〔Polymerschale（polymer shell）〕を有する典型的なコアシェル粒子を発生させるためである。これらの磁気ビース（大抵は、ポリマー粒子および重合体に埋め込まれた酸化鉄粒子またはシリカ・コーティングを有する酸化鉄粒子）を、例えば、バングスラボラトリーズ社、ビオメリュー・ゲーエムベーハー、ヒェマーゲン・ビオポリマー・テクノロジー、ケミセル・ゲーエムベーハー、インビトロジェン・ダイナール、マグナメディクス・ゲーエムベーハー、メルク・カーゲーアーアーおよびＥＭＤケミカルズ、プロメガ社、キアゲン社等のメーカーから調達することができる。サイズは、数１０ナノメータないし約３μｍの範囲にあり、１０ないし＞９０％のマグネタイトの含有量を有する。
【００４４】
このようなコーティングされたかつ必要な場合には官能基化されたビーズは、本発明における使用のためには、特に好ましい。 
構造と、磁化可能な粒子（全磁化性）と、官能基化とに応じて、これらのビーズは、種々の用途のために適切である。生命科学および診断の分野における重要な従来の用途は、核酸の手動のおよび自動的な精製と、組み換えタンパクまたは他の生体分子の親和性精製と、抗体に被覆された磁気ビーズを用いた細胞分離とにある。例えば、カルボキシまたはアミノ官能基を有するベースの粒子を、リガンド（例えば、ストレプトアビジン、タンパク質Ａ、抗体、レクチン、酵素、例えばトリプシン、ベンゾナーゼ）の、ユーザ固有の、共有結合性の固定化のために用いることができる。かようにして、単鎖核酸、例えば、ＰＣＲ産物、合成オリゴヌクレチド、ｃＤＮＡまたはＲＮＡをビーズ表面上に固定化することが可能である。 
本発明に係わる方法の例に記載のポリメラーゼによる「ビーズ上の伸長」の場合、単鎖核酸の５’から３’への方向づけが必要である（５’末端がビーズに固定化されており、他方、３’の末端が自由である）。この目的のために、市販のキットの使用が役立つ。このようなキットは、磁気ビーズの表面の、ユーザが使いやすい官能基化を可能にする。これには、例えば、ビオツューム・サイエンティフィック・ゲーエムベーハーのＵＬＳ１Ｍ-システム（universal linkage system）および種々のリンカーシステム（例えば、アミノ-、チオール-、ホスフェート-、ビオチン-、スペーサＣ３リンカーシステム）が含まれる。これらのリンカーシステムは、例えばbiomers.net ゲーエムベーハーによって提供される。
【００４５】
本発明に係わる方法は、外部交番磁界を用いて、核酸増幅反応、例えば、ＰＣＲ、または、閉じたチャンバでの、温度調節を要する他の生物学的および化学的反応において、温度制御を引き起こす。従って、（例えば加熱またはペルチェ素子との）直接的な熱接続なしに反応を制御しかつ影響を与えることが可能となる。利点は、取り分け、閉じた反応系内で、例えば、診断用カートリッジ内で加熱工程を非接触で磁気制御することにある。複数の同一の磁石が、例えば、細胞分離、サンプル調製および標的分子の検出の際に、標的分子の担体としての磁性ナノ粒子（ビーズ）を動かすために、用いられることができる。このことが、診断用測定システムの簡単化および小型化に、大幅に貢献する。更に、従来の方法を用いたカートリッジの直接的な接触の原因のおよび物質の拡散による汚染の危険性ならびに解析システムにおけるコンポーネントの機械的磨耗が、減少される。
【００４６】
幾つかの近代的な分析システムは、ビーズ上のＰＣＲに続いて、変性したＤＮＡ単鎖の検出が、その単鎖にあってかつそのときマーカーとして機能する磁気ビーズ担体によって、生じるように、設計されている。この検出は、例えば、マイクロチップ（生体素子）上の磁気抵抗のセンサ素子によって、なされるだろう。そのチップには、単鎖に相補的な捕捉分子が結合されている。ここでは、通常は常磁性体のビーズが、外部磁界の影響下で、磁気抵抗の測定磁界（Messfeld）の付近で検出されることができる漂遊磁界を発生させる。磁界抵抗の測定要素（ＧＭＲまたはＴＭＲセンサ）の抵抗の変化は、ここでは、センサ素子に接続された磁気ビーズの数に比例している。このことは、ビーズにあるＤＮＡ分子の定量化を可能にする。 
検出される核酸の、大抵の場合に必要である増幅は、通常、ＰＣＲ反応によってなされ、これまで、従来の方法では、熱電対（ペルチェ）あるいはホットエア（またはマイクロ波）によって制御されており、上記の欠点を有していた。本発明に係る方法の利点は、取り分け、すべての重要な工程、すなわち、サンプル調製、ビーズ上のターゲット核酸の増幅（ＰＣＲ）、およびカートリッジ上での引き続くの検出を、外部磁界（永久磁石または電磁石）によって、統合的にかつ非接触で制御することができることにある。
【００４７】
本発明に係る方法は、基本的に、温度制御を必要とする化学的なまたは生物学酵素的な反応のために適切である。このことは、特に、サンプルの調製、標的構造または標的分子の単離、標的分子の増幅および標的分子の検出のために用いられる。分子生物学で最も頻繁に用いられる核酸の増幅法として知られたＰＣＲのほかに、日常的に用いられる代替方法は、例えば、「鎖置換増幅法（Strand displacement amplification）」、「リガーゼ連鎖反応（ligase chain reaction）」、「ローリングサークル増幅（rolling circle amplification）」、「核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence-based amplification）」、「分岐ＤＮＡ（branched DNA）」、「転写媒介性増幅（transcription-mediated amplification）」、「ハイブリッド・キャプチャー（hybrid capture）」、「インベーダー（Invader）」である。増幅された配列を検出するための現在の方法は、蛍光マーカー、酵素、放射性同位元素および磁性粒子の使用も含む。 
更に、他の酵素反応、例えば、核酸合成反応および核酸伸長反応、制限酵素での消化、基質の転換、またハイブリダイゼーションおよび結合相互作用（バイオチップ、免疫学的検定）を、本発明に係る方法で制御することができる。
【００４８】
本発明の第２の側面は、少なくとも一つの交番磁界を発生させるための装置（１）、例えばコイルと、反応物および磁気ビーズ（２１）を有する反応空間（２）とを具備する、本発明に係わる方法を実行するために適切である反応器を有する。この反応器は、更に、他のコンポーネント、例えば、測定および制御装置（３）および／または冷却装置（４）を有することができる。 
特殊な例では、反応器は、ＰＣＲまたは他の核酸増幅反応のためのサーモサイクラーである。 
本発明の一般的な側面は、このような反応器を有するインビトロ検査システムに関する。インビトロシステムまたは反応器は、構成要素として、診断ユニット（カートリッジ）を有することができる。この診断ユニットは、例えば分析および評価のための、更なるコンポーネントを有することができ、一回の使用のための交換可能なユニットとしても形成されていてもよい。 
このような診断用カートリッジは、一般的には、プラスチック材料からなる。プラスチック材料部分には、マイクロ流体流路および反応チャンバが組み入れられており、そこで化学的な、生物学的なおよび物理学的な反応、例えば、サンプル調製、標的分子の分離および精製、（核酸の場合の）標的分子の増幅および標的分子の検出がマイクロアレイへの結合によって生じることが可能である。これらの診断用カートリッジは、大抵がサンプル分析のための使い捨ての製品として使用され、診断用カートリッジが導入される装置によって制御される。製造は、ラピッドプロトタイピング法、打ち抜き法、フライス切削法または射出成形法の援助のもと行なわれる。一般的にラボオンチップシステムとも呼ばれる診断用カートリッジの例は、DE102005029809A1またはDE102005049976A1のような特許公報に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ビーズで結合されたプライマーとのＰＣＲ反応のプロセスの略図を示す。
【図２】磁気ビーズの加熱による温度制御を実行するための本発明に係る反応器の二つの変形例を略示する。この場合、Ａは、他の構成要素とは関係なく、実行のための重要なコンポーネントのみを示し、他方、Ｂは、反応空間が診断装置の構成要素（カートリッジ）であってなる変形例を示す。
【００５０】
以下の例が、本発明を詳述することが意図される。しかしながら、本発明は、そこに開示された、実験の詳細に限定されない。
【００５１】
［例1］
ＰＣＲ反応のための典型的なバッチは、以下のものを含む：
ＤＮＡテンプレート（約１００ｎｇ／μｌ）を有する１．０μｌの水溶液
プライマー(センス／アンチセンス)（１０μＭ）あたり２．０μｌ
１．０μｌのＰｆｕ，Ｔａｇまたは他の耐熱性のポリメラーゼ(１-５Ｕ／μｌ)
１．０μｌのデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰそれぞれ１０ｍＭ）
５．０μｌの１０倍に濃縮されたポリメラーゼ緩衝液
４０．０μｌの蒸留水
５０．０μｌの全容量。
【００５２】
交番磁界を発生させるために、例えば３００ｋＨｚのｋＨｚの範囲において、例えば１．６ｋＡｍ−１の磁界強度が選択される。
【００５３】
このような条件下で、２５ｎｍの直径を有するマグネタイト粒子（Ｆｅ３Ｏ４）の比消費電力〔Spezifische Verlustleistung〕は、約２５０ｋＪ／ｋｇ  ｓである。
【００５４】
本願の7頁上に記載の式を用いる際には、５０μｌ（０．０５ｇ）の水分および０．００２５ｇの粒子含量（標準懸濁液中の５重量％の濃度）に対して、加熱速度ΔＴ＝２．９９Ｋ／ｓが、上記のバッチにおいて生じる。
【００５５】
この加熱速度は、このようなＰＣＴ反応のための従来の加熱要素によって達成される通常の加熱速度に対応し、上記ＰＣＲ反応の温度制御を可能にする。
【００５６】
ＰＣＲ反応の温度サイクルのための典型的な温度は、変性のためには約９５−１００℃であり、ハイブリダイゼーションのためには４０−６５℃であり、伸長のためには７０−８０℃（ポリメラーゼ依存型で、例えば、Ｔａｇポリメラーゼのためには好ましくは７２℃）である。このような温度は、本発明に係る方法によって容易に達成される。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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