(57)【要約】  脂肪酸とエステル化された二塩基アミノ酸との縮合から、例えば、ラウリン酸とアルギニンとから誘導されたカチオン性界面活性剤、特に、アルギニン一塩酸塩のラウリン酸アミドのエチルエステル（ＬＡＥ）は、胞子に感染する対象の処理に用いることができる。胞子は細菌またはカビから発生する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
2011526593.tif 000018
（１）
［式中、Ｘ−は、有機酸または無機酸から誘導される対イオン、好ましくはＢｒ−、Ｃｌ−またはＨＳＯ４−、またはフェノール化合物に基づくアニオンであり；Ｒ１は、アミド結合を介してα−アミノ酸基に連結した炭素数８〜１４の飽和脂肪酸またはヒドロキシ酸に由来する直鎖状のアルキル鎖であり；Ｒ２は、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル鎖または芳香族基であり；Ｒ３は、
【化２】
2011526593.tif 000019
【化３】
2011526593.tif 000020
または
【化４】
2011526593.tif 000021
であり；ｎは０〜４である］
で示される、脂肪酸とエステル化された二塩基アミノ酸との縮合から誘導されたカチオン性界面活性剤の殺胞子処理への使用。
【請求項２】
式（１）で示されるカチオン性界面活性剤が下記式（２）：
【化５】
2011526593.tif 000022
（２）
で示されるアルギニン一塩酸塩のラウリン酸アミドのエチルエステル（ＬＡＥ）である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
細菌から発生する胞子の処理への請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
カビから発生する胞子の処理への請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
溶液の調製用溶媒が、水、プロピレングリコール、エタノール、グリセリンまたはこれら液体の混合物である請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
前記溶液が、保存料、酸化防止剤、界面活性剤、増粘剤、酵素阻害剤、有機および無機塩、有機および無機酸、ならびに、液状および固形担体などの成分をさらに含有する請求項５に記載の使用。
【請求項７】
製剤中における前記カチオン性界面活性剤の濃度が０．０００１〜５質量％の範囲内である請求項３〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記カチオン性界面活性剤が、１０〜１００，０００ｐｐｍ、好ましくは１００〜１０，０００ｐｐｍの範囲内の用量レベルのポリソルベートと組み合わせられる前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記カチオン性界面活性剤がさらなる殺胞子剤と組み合わされる前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記さらなる殺胞子剤が、１０〜１０，０００ｐｐｍ、好ましくは１００〜１，０００ｐｐｍの範囲内の用量レベルのトリポリリン酸ナトリウムである請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
胞子が、食品、化粧品の中、および、機器の表面に存在する前記請求項のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カチオン性界面活性剤の新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
カチオン性界面活性剤は、食品、化粧品および医薬品の産業界において、保存料として知られている。カチオン性界面活性剤は、微生物の増殖に対して非常に有効であることが判明していると同時に、一般的に、ヒトや哺乳類が摂取しても安全である。これらのことから、カチオン性界面活性剤は、産業界において魅力的なツールである。
【発明の概要】
【０００３】
脂肪酸とエステル化された二塩基アミノ酸との縮合から誘導された式（１）：
【０００４】
【化１】
2011526593.tif 000002
（１）
【０００５】
［式中、Ｘ−は、有機酸または無機酸から誘導される対イオン、好ましくはＢｒ−、Ｃｌ−またはＨＳＯ４−、またはフェノール化合物に基づくアニオンであり；Ｒ１は、アミド結合を介してα−アミノ酸基に連結した炭素数８〜１４の飽和脂肪酸またはヒドロキシ酸に由来する直鎖アルキル鎖であり；Ｒ２は、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル鎖または芳香族基であり；Ｒ３は、
【０００６】
【化２】
2011526593.tif 000003
【０００７】
【化３】
2011526593.tif 000004
または
【０００８】
【化４】
2011526593.tif 000005
であり；ｎは０〜４である］
【０００９】
で示されるカチオン性界面活性剤は、微生物に対して非常に有効な防御物質であることが実証されている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
対イオンＸ−の起源である有機酸としては、クエン酸、乳酸、酢酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸、プロピオン酸、ソルビン酸、安息香酸、炭酸、グルタル酸または他のアミノ酸、ラウリン酸ならびに脂肪酸、例えば、オレイン酸およびリノレン酸などが挙げられるのに対し、無機酸としては、リン酸、硝酸およびチオシアン酸が挙げられる。
【００１１】
アニオンＸ−の基礎であるフェノール化合物としては、例えば、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）および関連するブチル化ヒドロキシトルエン、第３ブチルヒドロキノンおよびパラベン、例えば、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベンおよびブチルパラベンなどが挙げられる。
【００１２】
上記の化合物群のうち最も好ましい化合物は、アルギニン一塩酸塩のラウリン酸アミドのエチルエステルであり、以下、ＬＡＥと称する（ＣＡＳ番号６０３７２−７７−２）。この化合物は、現在のところ、抗菌剤としての使用が公知である。実際の使用時に、ＬＡＥは、ヒトが充分に耐性を有し、また、ヒトに対する毒性が非常に低いことが判明している。ＬＡＥは、下記式（２）：
【００１３】
【化５】
2011526593.tif 000006
（２）
で示される化学構造を有する。
【００１４】
化合物ＬＡＥは、食品中（ＷＯ０３／０３４８４２）、また、化粧品および製剤中（ＷＯ０３／０１３４５３、ＷＯ０３／０１３４５４およびＷＯ０３／０４３５９３）に存在し得る様々な微生物、例えば、細菌、カビおよび酵母に対して、その活性が顕著である。
【００１５】
上記のカチオン性界面活性剤の一般的な調製は、スペイン特許ＥＳ５１２６４３および国際特許出願ＷＯ９６／２１６４２、ＷＯ０１／９４２９２およびＷＯ０３／０６４６６９に記載されている。
【００１６】
ＬＡＥは、ラウリン酸アルギナートとしても知られており、ラボラトリオス・ミレ，エス．ア．（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏｓ  Ｍｉｒｅｔ，Ｓ．Ａ．）（ラミルザ（ＬＡＭＩＲＳＡ），スペイン）により製造されている。ラウリン酸アルギナートは、ＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局）により、ＧＲＡＳ物質（一般に安全であると認められる）であるとして、ＧＲＮ０００１６４でリストに記載されている。ＵＳＤＡ（アメリカ農務省）は、獣鳥肉中における使用を承認しており（ＦＳＩＳ（アメリカ食品安全検査局）指令７１２０．１）、また、新鮮な獣鳥肉の製品用の加工助剤としても承認している。
【００１７】
上記式（２）で示されるカチオン性界面活性剤のラットにおける代謝が研究されている；これらの研究は、急速に吸収され、天然に存在するアミノ酸および脂肪酸のラウリン酸に代謝され、最終的には二酸化炭素および尿素として排出されることを示している。毒物学的な研究は、ＬＡＥが動物およびヒトに対して完全に無害であることを実証している。
【００１８】
それゆえ、ＬＡＥおよび関連化合物は、すべての腐敗しやすい食品の保存に使用するのに特に適している。ＬＡＥおよび関連化合物は、同様に、化粧品に使用するのに適している。
【００１９】
上述したように、上記のカチオン性界面活性剤は、様々な微生物、例えば、細菌、カビおよび酵母の増殖に対する阻害作用が顕著である。ＬＡＥの最低阻害濃度を下記の表１に示す。
【００２０】
【表１】
2011526593.tif 000007
【００２１】
上記の化合物は、使用前に、下記の食品グレードの好ましい溶媒の１つに溶解することが好ましい：水、エタノール、プロピレングリコール、イソプロピルアルコール、他のグリコール、グリコールの混合物、および、グリコールと水との混合物、ジアセチン、トリアセチン、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、ならびに、キシリトール。特定のｐＨ値で処理を行うのであれば、対応する緩衝液の使用が推奨される。他方、上記の化合物は、固形状で容易に使用することができるし、あるいは、塩、糖、マルトデキストリン、ヒドロコロイドおよびソルビトールなどの固形担体を用いて、容易に製剤化することもできる。
【００２２】
上記式（１）で示されるカチオン性界面活性剤について、他の微生物、例えば、カビおよび酵母に対する抗菌活性および生物活性が充分に実証される。
【００２３】
細菌感染の有効な処理は、通常、ある種の細菌が内生胞子を産生する能力により限定される。
【００２４】
内生胞子は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ  ｐｈｙｌｕｍに属する少数の細菌により産生される休眠中の頑丈で非再生性の構造体である。大部分の内生胞子の第一の機能は、環境からストレスを受ける期間を通じて、細菌の生存を確実にすることである。それゆえ、内生胞子は、紫外線やγ線、乾燥、リゾチーム、温度、飢餓および化学的消毒剤に対して耐性を有する。内生胞子は、通常、長期間にわたり生存しうる土壌中や水中に見出される。また、内生胞子は、食品、化粧品の中、および、機器の表面に見出される。外生胞子または嚢胞を産生する細菌も存在する。
【００２５】
内生胞子は、それらが形成される増殖性細胞を通常死滅させる大部分の薬剤に対して、耐性を有する。家庭用の洗浄剤は、一般に全く効果を有しないし、大部分のアルコール、４級化合物および洗剤も、全く効果を有しない。しかし、アルキル化剤、例えば、エチレンオキシドは、内性胞子に対して有効である。
【００２６】
内生胞子は、極端な熱および放射線に対して耐性を有する反面、焼却または加圧殺菌により死滅させることができる。充分な長時間にわたり極端な熱に曝露すれば、一般に、ある程度の効果を有するが、沸騰または調理の時間では、多くの内生胞子は生存することができる。高エネルギーの放射線、例えば、Ｘ線およびγ線に長時間曝露しても、大部分の内生胞子を死滅させることができる。
【００２７】
本発明の目的は、内生胞子を死滅させるためのさらなる薬剤を提供することにある。
【００２８】
上記式（１）で示されるカチオン性界面活性剤が殺胞子活性を示すことは、本発明者らにより行われた研究の驚くべき結果である。これまで、カチオン性の保存料が殺胞子活性を示すことは、知られていなかった。
【００２９】
上記のカチオン性界面活性剤の活性は、細菌およびカビの胞子、例えば、細菌およびカビの内生胞子に対して観察される。また、上記のカチオン性界面活性剤は、カビにより産生された内生胞子に対して殺胞子活性を示すという、さらに驚くべき観察が本発明者らによりなされている。
【００３０】
このことは、様々な起源に由来する胞子の存在に感染しうる対象の非常に活性の高い処理を可能にする。
【００３１】
本発明に使用される上記のカチオン性界面活性剤は、上記式（１）で示される、脂肪酸とエステル化された二塩基アミノ酸との縮合物から誘導される。式（１）で示されるカチオン性界面活性剤のうち最も好ましい種は、上記式（２）で示される、ラウリン酸アルギナートのエチルエステルである。
【００３２】
上記のカチオン性界面活性剤は、最も簡便には、適当な溶媒に溶解させた溶液として投与すればよいが、固形状または固形製剤の適用により、洗浄される対象の処理を行うこともできる。
【００３３】
上記のカチオン性界面活性剤が溶液として適用され、かつ、洗浄されるべき対象がヒトまたは動物により摂取されることを意図した製品であるなら、溶液の液体ベースは、食品を調製するのに適したいかなる液体であってもよい。このような液体としては、水、プロピレングリコール、エタノールまたはグリセリンなどが挙げられる。これら液体の混合物も同様に可能である。
【００３４】
ここで、水とは、水道水、脱塩水、蒸留水、または、水に適当な塩を溶解させた溶液を意味する。
【００３５】
上記のカチオン性界面活性剤を水溶液に溶解させることが好ましい。溶液の媒体としては、水道水および脱塩水などの水が最も適しており、食塩水の溶液も可能である。
【００３６】
さらなる溶媒、例えば、有機溶媒を添加することは、さらに添加された溶媒が摂取者のヒトにより後に摂取される際に悪影響を及ぼさない限り可能である。一般に、さらなる溶媒を添加しても、何ら明確な利点はなく、通常の目的では、水道水の溶液を投与することで充分である。
【００３７】
処理がヒトまたは動物により摂取されることを直接的に意図しない対象に向けられるなら、同様に厳格な要件を満たす必要はなく、より積極的な溶液を選択すればよい。このような対象としては、内生胞子を産生する細菌およびカビで汚染されうる産業界の環境における表面などが挙げられる。
【００３８】
胞子に対して所望の効果を発揮するには、充分な濃度の式（１）で示されるカチオン性界面活性剤が必要とされる。このような充分な濃度は、溶液が式（１）で示されるカチオン性界面活性剤を、特に、好ましい実施態様では、ＬＡＥを０．００１〜５質量％の濃度で含有する場合に達成される。より好ましい濃度は、０．０１〜２．５質量％の範囲内であり、最も好ましい濃度は、０．０５〜０．１質量％の範囲内である。
【００３９】
表面上に固体状に塗布すれば、処理された表面上における、式（１）で示されるカチオン性界面活性剤の濃度は、特に、好ましい実施態様では、このような表面で所望の生物学的作用を達成するのに充分なレベルのＬＡＥとなるはずである。このような充分なレベルの濃度は、１０〜２０，０００ｐｐｍ、より好ましくは２００〜１５，０００ｐｐｍ、さらに好ましくは５００〜１２，０００ｐｐｍの範囲内であると期待される。これらの濃度は、処理すべき表面に塗布される上記のカチオン性界面活性剤を含有する溶液の濃度により与えられる。表面が上記式（１）で示されるカチオン性界面活性剤の固形製剤で処理されるなら、適用される量は、上記式（１）で示されるカチオン性界面活性剤の量が０．０５〜２００ｍｇ／ｄｍ２、好ましくは０．５〜１５０ｍｇ／ｄｍ２、より好ましくは１〜１００ｍｇ／ｄｍ２、最も好ましくは５〜８０ｍｇ／ｄｍ２の範囲内であるような量である。
【００４０】
他の製品、例えば、リン酸塩、ポリソルベート、キレート剤、ナイシン、リゾチーム、および、殺胞子剤として、すでに認識されている他の製品との組合せも可能である。例えば、殺胞子処理用の水性組成物は、適当量のトリポリリン酸ナトリウムを含有することができる。このような適当量は、１０〜１０，０００ｐｐｍであり、好ましい範囲は、１００〜１，０００ｐｐｍである。ポリソルベートとの組合せの場合、適当量は、１０〜１００，０００ｐｐｍであり、ポリソルベート２０は、好ましいポリソルベートである。ナイシンとの組合せの場合、適当量は、１０〜６００ｐｐｍであり、リゾチームとの組合せの場合、適当量は、２０〜４００ｐｐｍの範囲内である。
【実施例】
【００４１】
実施例１
欧州標準ＥＮ１３７０４：２００２：「化学的殺菌剤−食品、産業界、家庭および機関の領域で使用される化学的殺菌剤の殺胞子活性を評価するための定量的懸濁試験−試験法および要件」に従って、ＬＡＥの殺胞子活性の測定を行った。
【００４２】
本実施例の目的は、試験微生物である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の細菌性内生胞子に対するＬＡＥの活性を実証することにある。
【００４３】
枯草菌ＡＴＣＣ６６３３由来の内生胞子を含有する試験懸濁液を栄養寒天培地上で増殖させた培養物から調製し、これに付加的な胞子形成増強成分を添加した。プレートを滅菌水で採取し、繰り返しの遠心分離および水中への再懸濁により、内生胞子を精製した。
【００４４】
中和剤：中和剤混合物は、１２．７％ポリソルベート８０、６．０％Ｔａｍｏｌ（登録商標）ＳＮ（ナフタレン−ホルムアルデヒド縮合物のナトリウム塩の商品名）、１．７％レシチン、１％ペプトンおよび０．１％シスチンから構成されていた。この溶液は、化学薬品がその後の細菌の増殖に悪影響を与えないように、これらの化学薬品を中和することを意図するものであった。
【００４５】
与えられた製品の殺胞子活性は、この方法で設定された条件下で、懸濁液中における枯草菌の細菌性胞子の量を少なくとも１０３だけ減少させる能力により定義される。
【００４６】
ＬＡＥは、ラミルザ（Ｌａｍｉｒｓａ）により製造されている。
【００４７】
上記の製品を細菌性胞子の懸濁液と設定時間である６０分間にわたり接触させた。干渉物質を懸濁液に添加した。この場合、蒸留水中の０．３％ウシ血清アルブミンであった。次いで、生存胞子数をカウントする前に、予め選択された中和剤を添加することにより、上記の製品の影響を中和した。
【００４８】
手法：
１．枯草菌の胞子培養物から胞子懸濁液を得る。
２．枯草菌の胞子懸濁液をカウントする。
３．上記の製品の非存在下で、胞子に対する中和剤の毒性効果を評価する。
４．上記の製品について、中和剤の中和効果を評価する。
５．上記の製品の阻害効果を評価する。
６．結果を計算する。
【００４９】
結果：
結果は、下記の項目について、胞子懸濁液の生存率の減少として表される：
−上記の製品を中和することの有効性確認
−中和剤が非毒性であることの有効性確認
−上記の製品の殺胞子活性
【００５０】
【表２】
2011526593.tif 000008
【００５１】
有効性確認試験の結果は、両方の場合に、生存胞子数が各試験に使用した溶液と同様であることから、使用した中和剤（ポリソルベート８０の２％水溶液）が毒性を有さず、上記の製品の影響を中和することを示している。
【００５２】
殺胞子活性は、以下のように計算される：
Ｒ＝Ｎ×０．１／Ｎａ
Ｎは、胞子懸濁液のｃｆｕ／ｍＬである。
Ｎａは、殺胞子活性のｃｆｕ／ｍＬである。
【００５３】
溶液の計算された減少は、以下のとおりである：
５０ｐｐｍのＬＡＥは、Ｒ＝３．５×１０２ｃｆｕ／ｍＬ
１００ｐｐｍのＬＡＥは、Ｒ＝３．４×１０２ｃｆｕ／ｍＬ
１５０ｐｐｍのＬＡＥは、Ｒ＝４．３×１０２ｃｆｕ／ｍＬ
２５０ｐｐｍのＬＡＥは、Ｒ＞１０３ｃｆｕ／ｍＬ
【００５４】
このデータは、５０ｐｐｍのＬＡＥ濃度から胞子の発芽が阻害されていることを示す。
【００５５】
ある製品は、それを使用した結果、ＥＮ１３７０４：２０００に規定される条件下で６０分間接触させた後、枯草菌の細菌性胞子数が１０３以上減少していれば、殺胞子性であると見なされる。
【００５６】
それゆえ、ＬＡＥは２５０ｐｐｍ以上の濃度で、枯草菌の内生胞子に対して殺胞子活性を示す。この種は、殺胞子活性の試験における通常の種である。この種は、炭疽病を引き起こす細菌と同じ属に属する。属が同様であることから、枯草菌の胞子は、炭疽病を引き起こす細菌である炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の胞子の非病原性置換物として使用されている。これらの結果は、炭疽菌に適用可能であると考えられる。
【００５７】
実施例２
欧州標準ＵＮＥ−ＥＮ１２７５：「化学的殺菌剤および消毒剤。殺カビ活性。試験方法および要件」に従って、ＬＡＥの殺カビ活性を調べた。
【００５８】
与えられた製品の殺カビ活性は、この方法で設定された条件下で、懸濁液中におけるクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のカビ性胞子の量を少なくとも１０４だけ減少させる能力により定義される。
【００５９】
ＬＡＥは、ラミルザにより製造されている。
【００６０】
上記の製品をカビ性胞子の懸濁液と設定時間（６０分間）にわたり接触させた。この時間の後、生存胞子数をカウントする前に、ポリソルベート８０の２％水溶液を添加することにより、上記の製品の影響を中和した。
【００６１】
手法：
１．クロコウジカビの胞子培養物から胞子懸濁液を得る。
２．クロコウジカビの胞子懸濁液をカウントする。
３．上記の製品の非存在下で、胞子に対する中和剤の毒性効果を評価する。
４．上記の製品について、中和剤の中和効果を評価する。
５．上記の製品の殺カビ効果を評価する。
６．結果を計算する。
【００６２】
結果：
結果は、下記の項目について、胞子懸濁液の生存率の減少として表される：
−上記の製品を中和することの有効性確認
−中和剤が非毒性であることの有効性確認
−上記の製品の殺胞子活性
【００６３】
【表３】
2011526593.tif 000009
【００６４】
殺カビ活性は、以下のように計算される：
Ｒ＝Ｎ×０．１／Ｎａ
Ｎは、胞子懸濁液のｃｆｕ／ｍＬである。
Ｎａは、殺胞子活性のｃｆｕ／ｍＬである。
【００６５】
溶液の計算された減少は、以下のとおりである：
１００μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＝３．１×１０２ｃｆｕ／ｍＬ
２００μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＝１．３×１０３ｃｆｕ／ｍＬ
３００μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＝１．４×１０３ｃｆｕ／ｍＬ
４００μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＝１．７×１０３ｃｆｕ／ｍＬ
５００μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＞１０４ｃｆｕ／ｍＬ
【００６６】
このデータから分かるように、１００ｐｐｍからカビ性胞子の発芽が阻害されている。
【００６７】
５００ｐｐｍから、カビ性胞子の発芽が全体的に阻害されることが観察された。
【００６８】
ある製品は、それを使用した結果、ＵＮＥ−ＥＮ１２７５に規定される条件下で６０分間接触させた後、クロコウジカビのカビ性胞子数が１０４以上減少していれば、殺カビ性であると見なされる。
【００６９】
それゆえ、ＬＡＥは５００ｐｐｍ以上の濃度で、殺カビ活性を示す。
【００７０】
実施例３
欧州標準ＥＮ１３７０４：２００２：「化学的殺菌剤−食品、産業界、家庭および機関の領域で使用される化学的殺菌剤の殺胞子活性を評価するための定量的懸濁試験−試験法および要件」に従って、ＬＡＥの殺胞子活性の測定を行った。
【００７１】
本実施例の目的は、試験微生物であるゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の細菌性内生胞子に対するＬＡＥの活性を実証することにある。
【００７２】
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＡＴＣＣ１２９８０由来の内生胞子を含有する試験懸濁液を栄養寒天培地上で増殖させた培養物から調製し、これに付加的な胞子形成増強成分を添加した。プレートを滅菌水で採取し、繰り返しの遠心分離および水中への再懸濁により、内生胞子を精製した。
【００７３】
中和剤：中和剤混合物は、３０ｇ／Ｌポリソルベート８０水溶液から構成されていた。この溶液は、化学薬品がその後の細菌の増殖に悪影響を与えないように、これらの化学薬品を中和することを意図するものであった。
【００７４】
与えられた製品の殺胞子活性は、この方法で設定された条件下で、懸濁液中におけるゲオバチルス・ステアロサーモフィルスの細菌性胞子の量を少なくとも１０３だけ減少させる能力により定義される。
【００７５】
ＬＡＥは、ラミルザにより製造されている。
【００７６】
上記の製品を細菌性胞子の懸濁液と設定時間である６０分間にわたり接触させた。干渉物質を懸濁液に添加した。この場合、水であった。次いで、生存胞子数をカウントする前に、予め選択された中和剤を添加することにより、上記の製品の影響を中和した。
【００７７】
手法：
１．ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスの胞子培養物から胞子懸濁液を得る。
２．ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスの胞子懸濁液をカウントする。
３．上記の製品の非存在下で、胞子に対する中和剤の毒性効果を評価する。
４．希釈−中和法の有効性を確認する。
５．上記の製品の阻害的殺胞子効果を評価する。
６．結果を計算する。
【００７８】
結果：
結果は、下記の項目について、胞子懸濁液の生存率の減少として表される：
−上記の製品を中和することの有効性確認
−中和剤が非毒性であることの有効性確認
−上記の製品の殺胞子活性
【００７９】
【表４】
2011526593.tif 000010
【００８０】
有効性確認試験の結果は、両方の場合に、生存胞子数が各試験に使用した溶液と同様であることから、使用した中和剤（３０ｇ／Ｌポリソルベート８０水溶液）が毒性を有さず、上記の製品の影響を中和することを示している。
【００８１】
殺胞子活性は、標準ＥＮ１３７０４：２００２の基準に従って計算される：
Ｒ＝Ｎ×０．１／Ｎａ
Ｎは、胞子懸濁液のｃｆｕ／ｍＬである。
Ｎａは、殺胞子活性のｃｆｕ／ｍＬである。
【００８２】
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスに対してＬＡＥの様々な濃度で計算された減少（Ｒ）は、以下のとおりである：
５８μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＜１０３ｃｆｕ／ｍＬ
１１５μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＜１０３ｃｆｕ／ｍＬ
１７３μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＞１０３ｃｆｕ／ｍＬ
２３０μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＞１０３ｃｆｕ／ｍＬ
４６０μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＞１０３ｃｆｕ／ｍＬ
【００８３】
ある製品は、それを使用した結果、ＥＮ１３７０４：２００２に規定される条件下で６０分間接触させた後、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスの細菌性胞子数が１０３以上減少（Ｒ）していれば、殺胞子性であると見なされる。
【００８４】
それゆえ、ＬＡＥは１７３μｇ／ｍＬ以上の濃度で、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスの内生胞子に対して殺胞子活性を示す。
【００８５】
実施例４
欧州標準ＥＮ１３７０４：２００２：「化学的殺菌剤−食品、産業界、家庭および機関の領域で使用される化学的殺菌剤の殺胞子活性を評価するための定量的懸濁試験−試験法および要件」に従って、ＬＡＥの殺胞子活性の測定を行った。
【００８６】
本実施例の目的は、試験微生物であるサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の細菌性内生胞子に対するＬＡＥの活性を実証することにある。
【００８７】
サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカムＡＴＣＣ７９５６由来の内生胞子を含有する試験懸濁液を栄養寒天培地上で増殖させた培養物から調製し、これに付加的な胞子形成増強成分を添加した。プレートを滅菌水で採取し、繰り返しの遠心分離および水中への再懸濁により、内生胞子を精製した。
【００８８】
中和剤：中和剤混合物は、３０ｇ／Ｌポリソルベート８０水溶液から構成されていた。この溶液は、化学薬品がその後の細菌の増殖に悪影響を与えないように、これらの化学薬品を中和することを意図するものであった。
【００８９】
与えられた製品の殺胞子活性は、この方法で設定された条件下で、懸濁液中におけるサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカムの細菌性胞子の量を少なくとも１０３だけ減少させる能力により定義される。
【００９０】
ＬＡＥは、ラミルザにより製造されている。
【００９１】
上記の製品を細菌性胞子の懸濁液と設定時間である６０分間にわたり接触させた。干渉物質を懸濁液に添加した。この場合、水であった。次いで、生存胞子数をカウントする前に、予め選択された中和剤を添加することにより、上記の製品の影響を中和した。
【００９２】
手法：
１．サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカムの胞子培養物から胞子懸濁液を得る。
２．サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカムの胞子懸濁液をカウントする。
３．上記の製品の非存在下で、胞子に対する中和剤の毒性効果を評価する。
４．希釈−中和法の有効性を確認する。
５．上記の製品の阻害的殺胞子効果を評価する。
６．結果を計算する。
【００９３】
結果：
結果は、下記の項目について、胞子懸濁液の生存率の減少として表される：
−上記の製品を中和することの有効性確認
−中和剤が非毒性であることの有効性確認
−上記の製品の殺胞子活性
【００９４】
【表５】
2011526593.tif 000011
【００９５】
有効性確認試験の結果は、両方の場合に、生存胞子数が各試験に使用した溶液と同様であることから、使用した中和剤（３０ｇ／Ｌポリソルベート８０水溶液）が毒性を有さず、上記の製品の影響を中和することを示している。
【００９６】
殺胞子活性は、標準ＥＮ１３７０４：２００２の基準に従って計算される：
Ｒ＝Ｎ×０．１／Ｎａ
Ｎは、胞子懸濁液のｃｆｕ／ｍＬである。
Ｎａは、殺胞子活性のｃｆｕ／ｍＬである。
【００９７】
溶液の計算された減少は、以下のとおりである：
３２μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＜１０３ｃｆｕ／ｍＬ
５１μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＜１０３ｃｆｕ／ｍＬ
１０２μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＞１０３ｃｆｕ／ｍＬ
２０５μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＞１０３ｃｆｕ／ｍＬ
【００９８】
ある製品は、それを使用した結果、ＥＮ１３７０４：２００２に規定される条件下で６０分間接触させた後、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカムの細菌性胞子数が１０３以上減少（Ｒ）していれば、殺胞子性であると見なされる。
【００９９】
それゆえ、ＬＡＥは１０２μｇ／ｍＬ以上の濃度で、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカムの内生胞子に対して殺胞子活性を示す。
【０１００】
実施例５
欧州標準ＥＮ１３７０４：２００２：「化学的殺菌剤−食品、産業界、家庭および機関の領域で使用される化学的殺菌剤の殺胞子活性を評価するための定量的懸濁試験−試験法および要件」に従って、ＬＡＥの殺胞子活性の測定を行った。
【０１０１】
本実施例の目的は、試験微生物であるクロストリジウム スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）由来の細菌性内生胞子に対するＬＡＥの活性を実証することにある。
【０１０２】
クロストリジウム スポロゲネスＡＴＣＣ７９５５由来の内生胞子を含有する試験懸濁液を栄養寒天培地上で増殖させた培養物から調製し、これに付加的な胞子形成増強成分を添加した。プレートを滅菌水で採取し、繰り返しの遠心分離および水中への再懸濁により、内生胞子を精製した。
【０１０３】
中和剤：中和剤混合物は、３０ｇ／Ｌポリソルベート８０水溶液から構成されていた。この溶液は、化学薬品がその後の細菌の増殖に悪影響を与えないように、これらの化学薬品を中和することを意図するものであった。
【０１０４】
与えられた製品の殺胞子活性は、この方法で設定された条件下で、懸濁液中におけるクロストリジウム スポロゲネスの細菌性胞子の量を少なくとも１０３だけ減少させる能力により定義される。
【０１０５】
ＬＡＥは、ラミルザにより製造されている。
【０１０６】
上記の製品を細菌性胞子の懸濁液と設定時間である６０分間にわたり接触させた。干渉物質を懸濁液に添加した。この場合、水であった。次いで、生存胞子数をカウントする前に、予め選択された中和剤を添加することにより、上記の製品の影響を中和した。
【０１０７】
手法：
１．クロストリジウム スポロゲネスの胞子培養物から胞子懸濁液を得る。
２．クロストリジウム スポロゲネスの胞子懸濁液をカウントする。
３．上記の製品の非存在下で、胞子に対する中和剤の毒性効果を評価する。
４．希釈−中和法の有効性を確認する。
５．上記の製品の阻害的殺胞子効果を評価する。
６．結果を計算する。
【０１０８】
結果：
結果は、下記の項目について、胞子懸濁液の生存率の減少として表される：
−上記の製品を中和することの有効性確認
−中和剤が非毒性であることの有効性確認
−上記の製品の殺胞子活性
【０１０９】
【表６】
2011526593.tif 000012
【０１１０】
有効性確認試験の結果は、両方の場合に、生存胞子数が各試験に使用した溶液と同様であることから、使用した中和剤（３０ｇ／Ｌポリソルベート８０水溶液）が毒性を有さず、上記の製品の影響を中和することを示している。
【０１１１】
殺胞子活性は、標準ＥＮ１３７０４：２００２の基準に従って計算される：
Ｒ＝Ｎ×０．１／Ｎａ
Ｎは、胞子懸濁液のｃｆｕ／ｍＬである。
Ｎａは、殺胞子活性のｃｆｕ／ｍＬである。
【０１１２】
溶液の計算された減少（Ｒ）は、以下のとおりである：
１３μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＜１０３ｃｆｕ／ｍＬ
２６μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＜１０３ｃｆｕ／ｍＬ
５１μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＞１０３ｃｆｕ／ｍＬ
６４μｇ／ｍＬのＬＡＥは、Ｒ＞１０３ｃｆｕ／ｍＬ
【０１１３】
ある製品は、それを使用した結果、ＥＮ１３７０４：２００２に規定される条件下で６０分間接触させた後、クロストリジウム スポロゲネスの細菌性胞子数が１０３以上減少（Ｒ）していれば、殺胞子性であると見なされる。
【０１１４】
それゆえ、ＬＡＥは５１μｇ／ｍＬ以上の濃度で、クロストリジウム スポロゲネスの内生胞子に対して殺胞子活性を示す。
【０１１５】
実施例６
欧州標準ＥＮ１３７０４：２００２：「化学的殺菌剤−食品、産業界、家庭および機関の領域で使用される化学的殺菌剤の殺胞子活性を評価するための定量的懸濁試験−試験法および要件」に従って、ＬＡＥとトリポリリン酸ナトリウムとの組合せの殺胞子活性の測定を行った。
【０１１６】
本実施例の目的は、試験微生物であるゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の細菌性内生胞子に対するＬＡＥとトリポリリン酸ナトリウムとの組合せの活性を実証することにある。
【０１１７】
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＡＴＣＣ１２９８０由来の内生胞子を含有する試験懸濁液を栄養寒天培地上で増殖させた培養物から調製し、これに付加的な胞子形成増強成分を添加した。プレートを滅菌水で採取し、繰り返しの遠心分離および水中への再懸濁により、内生胞子を精製した。
【０１１８】
中和剤：中和剤混合物は、３０ｇ／Ｌポリソルベート８０水溶液から構成されていた。この溶液は、化学薬品がその後の細菌の増殖に悪影響を与えないように、これらの化学薬品を中和することを意図するものであった。
【０１１９】
与えられた製品の殺胞子活性は、この方法で設定された条件下で、懸濁液中におけるゲオバチルス・ステアロサーモフィルスの細菌性胞子の量を少なくとも１０３だけ減少させる能力により定義される。
【０１２０】
ＬＡＥは、ラミルザにより製造されている。
【０１２１】
以下の溶液を試験した：
（１）ＬＡＥ（１％）とポリソルベート２０（７．５％）との溶液
（２）トリポリリン酸ナトリウム（５％）とポリソルベート２０（１０％）との溶液
（３）ＬＡＥ（１％）とトリポリリン酸ナトリウム（０．２％）とポリソルベート２０（７．５％）と塩化ナトリウム（０．４％）とを含有する溶液
（４）ＬＡＥ（１％）とトリポリリン酸ナトリウム（５．０％）とポリソルベート２０（７．５％）とを含有する溶液。
【０１２２】
上記の製品を細菌性胞子の懸濁液と設定時間である６０分間にわたり接触させた。干渉物質を懸濁液に添加した。この場合、蒸留水中の０．３％ウシ血清アルブミンであった。次いで、生存胞子数をカウントする前に、予め選択された中和剤を添加することにより、上記の製品の影響を中和した。
【０１２３】
手法：
１．ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスの胞子培養物から胞子懸濁液を得る。
２．ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスの胞子懸濁液をカウントする。
３．上記の製品の非存在下で、胞子に対する中和剤の毒性効果を評価する。
４．希釈−中和法の有効性を確認する。
５．上記の製品の阻害的殺胞子効果を評価する。
６．結果を計算する。
【０１２４】
結果：
結果は、下記の項目について、胞子懸濁液の生存率の減少として表される：
−上記の製品を中和することの有効性確認
−中和剤が非毒性であることの有効性確認
−上記の製品の殺胞子活性
【０１２５】
【表７】
2011526593.tif 000013
【０１２６】
有効性確認試験の結果は、両方の場合に、生存胞子数が各試験に使用した溶液と同様であることから、使用した中和剤（３０ｇ／Ｌポリソルベート８０水溶液）が毒性を有さず、上記の製品の影響を中和することを示している。
【０１２７】
殺胞子活性は、標準ＥＮ１３７０４：２００２の基準に従って、下記式を用いて計算される：
Ｒ＝Ｎ×０．１／Ｎａ
Ｎは、胞子試験懸濁液のｃｆｕ／ｍＬ数値である。
Ｎａは、上記の製品の殺胞子活性に関する試験後の試験胞子のｃｆｕ／ｍＬ数値である。
【０１２８】
ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスに対して様々な濃度で試験された上記の製品について見出された生存率の減少は、以下のとおりである：
【０１２９】
【表８】
2011526593.tif 000014
【０１３０】
【表９】
2011526593.tif 000015
【０１３１】
【表１０】
2011526593.tif 000016
【０１３２】
【表１１】
2011526593.tif 000017
【０１３３】
標準ＥＮ１３７０４：２００２に従って、少なくとも１０３ｃｆｕ／ｍＬの減少が見出される場合に、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＡＴＣＣ１２９８０に対する上記の製品の殺胞子活性を評価する。
【０１３４】
Ｆ．１は、濃度２５．５ｍｇ／ｍＬ、２０℃で１時間接触させた後に殺胞子活性を有する。これは、２０４μｇ／ｍＬのＬＡＥである。
Ｆ．２は、濃度２．５６ｍｇ／ｍＬ、２０℃で１時間接触させた後に殺胞子活性を有する。これは、１０２μｇ／ｍＬのトリポリリン酸ナトリウムである。
Ｆ．３は、濃度６．３７ｍｇ／ｍＬ、２０℃で１時間接触させた後に殺胞子活性を有する。これは、５１μｇ／ｍＬのＬＡＥである。
Ｆ．４は、濃度２．５６ｍｇ／ｍＬ、２０℃で１時間接触させた後に殺胞子活性を有する。これは、２０μｇ／ｍＬのＬＡＥである。
【国際調査報告】
2011526593.tif 000023
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