(57)【要約】本発明は腫瘍の予防または治療用医薬の製造における茶ポリフェノールの使用に関する。前記茶ポリフェノールはＥＧＣＧ、ＥＧＣ及びＥＣＧを含む茶葉エキスまたはＰＨＡＲＭＡＮＥＸ社の緑茶カプセルＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）である。
2011513340.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の予防または治療用医薬の製造における、茶ポリフェノールもしくはその薬学的に許容可能な塩、またはそれらのうちのいずれか１種を含む医薬組成物の使用。
【請求項２】
前記茶ポリフェノールが、エピガロカテキンガラート、エピカテキンガラート及びエピガロカテキンを含むカテキン類物質を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記茶ポリフェノールが茶葉エキスであることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
抽出する場合、前記茶ポリフェノールにおける主要活性成分エピガロカテキンガラート、エピカテキンガラート及びエピガロカテキンがさらに分離精製する必要がなく、直接使用できることを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記茶ポリフェノールにおけるカフェインの含有量が０．２重量％以下であることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
抽出する場合、前記茶ポリフェノールから茶葉に含有されるタンニン酸が除去されることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記茶ポリフェノールにおいて、エピガロカテキンガラート、エピカテキンガラート及びエピガロカテキンがそれぞれ前記カテキン類物質重量の５０〜６０％、２０〜２５％及び８〜１０％であることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記カテキン類物質の総含有量が前記茶ポリフェノール重量の６０〜７０％であることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記医薬が前記茶ポリフェノールを含み、１０００ｍｇの該製剤毎の前記カテキン類物質の含有量が６４８ｍｇで、そのうち、エピガロカテキンガラート、エピカテキンガラート及びエピガロカテキンがそれぞれ３８０ｍｇ、１４８ｍｇ及び６０ｍｇであることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記茶ポリフェノールが米国Ｐｈａｒｍａｎｅｘ社の緑茶カプセルＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記緑茶カプセルＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）カプセルが、１カプセル毎の重量が２５０ｍｇであり、前記カテキン類物質１６２ｍｇが含まれ、そのうち、エピガロカテキンガラート、エピカテキンガラート及びエピガロカテキンがそれぞれ９５ｍｇ、３７ｍｇ及び１５ｍｇであることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬がさらに薬学的に許容可能な賦形剤または担体を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
前記茶ポリフェノールが単独に使用できることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬の剤形が錠剤、カプセル剤、トローチ錠、バッカル錠、口腔内崩壊錠、口腔内速溶解錠、分散錠、咀嚼剤、顆粒剤、懸濁剤、注射剤、液剤、徐放剤、制御放出剤または速放性製剤であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍の予防または治療用医薬の製造における茶ポリフェノールもしくはその薬学的に許容可能な塩またはそれらのうちのいずれか１種を含む医薬組成物の使用に係る。
【背景技術】
【０００２】
現在薬物で腫瘍を治療する方法は、主に細胞毒素、分化・アポトーシス誘導及び生物学的標的治療などを含む。
【０００３】
天然植物及び鉱物からの一部の成分、例えばビンクリスチン、ホモハリントニン、ヒドロキシカンプトテシン、パクリタキセル及び亜ヒ酸などは、前記２つの方法において重要な役割を果しているが、正常細胞の増殖及び成長に対する異なる程度での抑制、末梢神経毒性、重要臓器機能への損傷などの毒性・副作用はこれらの薬物の使用を制限する重要な要因であり、且つその薬物経済学も考えなければいけない重要な要因である。
【０００４】
生物学的標的治療は、腫瘍の発症メカニズムに基づいて「テーラーメイド」薬物を使用しており、イマチニブメシル酸塩（Ｉｍａｔｉｎｉｂ、チロシンキナーゼ阻害薬、慢性骨髄性白血病に対する）、リツキサンなどを含み、その普及的な使用を制限する主な障害が薬価であり、一方、標的突然変異による薬剤耐性がその致命的弱点である。
【０００５】
前記要因によって、現在、腫瘍治療用薬物はほぼ併用方法を使用しているが、一部の薬物の半数致死量（ＬＤ５０）が最小有効濃度と近づくため、顕著な骨髄抑制、重要臓器機能損傷などの毒性・副作用を引き起こしやすく、耐性が比較的悪く、且つ複数種の薬物間の毒性・副作用が相乗作用を有するため、医療効果をある程度高めることはできるが、なお一部の患者には薬剤耐性がみとめられ、治療が難しく、再発しやすい。一方、比較的高いレベルのバイオテクノロジー技術が応用されている一部の製品において、その治療効果に限りがあるにもかかわらず、価格が高く、且つ保存に対する要求が厳しく、使用に不便があるなどの諸素因は、人類が、腫瘍治療用新成分、新たな治療方法を絶えず探求することを促す根本的な要因である。
【０００６】
中国ではよく見かける植物茶葉にはビタミンＣ、葉緑素、カロチン、茶ポリフェノールなどの栄養素が多く含まれており、また、茶ポリフェノールにはカテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎｓ）類物質が含有されており、カテキン類物質はエピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキンガラート（ＥＣＧ）及びエピカテキン（ＥＣ）を含み、そのうち、ＥＧＣＧは含量が最も多く、生物活性が最も広いが、ＥＧＣの耐酸化性の方がＥＧＣＧよりも強い。また、強い疫学的証拠によっても、体内の茶ポリフェノール濃度を増加させれば強い保護作用が提供され、酸素ラジカルによる人体の損傷を除去でき、腫瘍を予防する効果があることが示された。お茶を飲むことは抗毒殺菌、ガンの予防、長寿などを促進でき、その健康に役立つ機能は周知であるが、どの程度まで、どのような方面に役立つかはまださらなる研究・検証がされていなかった。
【０００７】
また、様々な茶葉植物に含有されているカテキンの成分及び含量はそれぞれ異なっており、生産プロセスの非標準化に加えて、現在摂取できるカテキン類の製品は品目が多く、その含量及び品質は確定されておらず、概して保健用品の範疇に属している。国外におけるＥＧＣＧの腫瘍増殖の抑制に対する研究は主に体外試験であり、研究された細胞株には前立腺ガン、胃ガン、結腸直腸ガン、皮膚ガン、乳ガン、肺ガン、平滑筋肉腫などの充実性腫瘍細胞が含まれるが、その腫瘍増殖に対する抑制活性はあまり強くなく、且つＥＧＣＧ、ＥＧＣの純製品の価格は極めて高いため、体内研究に関する更なる報告はまだ無かった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来技術における前記の欠陥を克服するため、本発明の目的は、コストが低く、使用しやすくて且つ毒性・副作用がほとんどない腫瘍治療用医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の主な特徴は下記通りであり、従来の研究によってエピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）などのカテキン類が抗腫瘍効果を備えることが示されているにもかかわらず、植物抽出物茶ポリフェノールから精製を行うことによって各種のカテキン純製品を得るにはコストが非常に高いため、未精製でもＥＧＣＧなどのカテキン類物質を豊富に含有する茶ポリフェノールを抗腫瘍薬物として直接使用すれば、生産コストを大幅に下げることができる点にある。
【００１０】
そのため、本発明は腫瘍の予防または治療用医薬の製造における茶ポリフェノールもしくはその薬学的に許容可能な塩またはそれらのうちのいずれか１種を含む医薬組成物の使用を提供する。
【００１１】
前記茶ポリフェノールは、茶葉エキスであり、エピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）、エピカテキンガラート（ＥＣＧ）及びエピガロカテキン（ＥＧＣ）から主に構成されるカテキン類物質を含む。
【００１２】
本発明の実施態様において、前記医薬の剤形は、錠剤、カプセル剤、トローチ錠、バッカル錠、口腔内崩壊錠、口腔内速溶解錠、分散錠、咀嚼剤、顆粒剤、懸濁剤、注射剤、液剤、徐放剤、制御放出剤または速放性・徐放性製剤などの薬学的に許容可能ないずれかの剤形であってもよい。
【００１３】
本発明の実施態様において、前記医薬組成物はさらに薬学的に許容可能な添加剤または担体を含む。
【００１４】
本発明の好適な実施態様において、前記茶ポリフェノールから茶葉に含有されるタンニン酸が除去され、且つ製造された薬剤における望ましくない成分であるカフェインの含有量は０．２重量％より小さい。
【００１５】
本発明の実施態様において、前記茶ポリフェノール中において、ＥＧＣＧ、ＥＣＧ及びＥＧＣが、それぞれ、前記カテキン類物質重量の５０〜６０％、２０〜２５％及び８〜１０％を占める。
【００１６】
本発明の具体的な実施例において、前記カプセルは米国Ｐｈａｒｍａｎｅｘ社の緑茶カプセルＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の前記薬剤はその他の薬物と併用して腫瘍治療に使用する必要がなく、単独で使用できる。
【００１８】
本発明は茶葉エキス茶ポリフェノールから抗腫瘍薬剤を直接製造することになっており、複雑・高価な精製プロセスを経由して茶ポリフェノールからＥＧＣＧ、ＥＧＣ、ＥＣＧなどの有効成分の純製品を分離して得る必要がないため、薬剤の生産コストを大幅に下げることができる。
【００１９】
また、細胞レベルにおける薬理試験から、本発明に係る茶ポリフェノールは複数種のヒト腫瘍細胞、特に造血系の悪性腫瘍細胞に対して顕著な抑制作用を有し、一部の血液腫瘍の初代細胞に対しても良好な抑制作用を有することが発見され、このことは、悪性腫瘍の治療のための治療効果が高く、毒性作用が低い新しい薬物を増やすだけでなく、細胞毒性薬を長期的に静脈注射した後に血管炎を患った患者がその他の経路で続けて治療することにも可能性をもたらした。マウス腫瘍モデルの治療効果試験から、本発明に係る薬剤がマウス腫瘍に対して顕著な治療効果を有し、腫瘍の成長を減少させ、腫瘍モデルマウスの生存時間を延長させることができることが発見された。また、前記茶ポリフェノールの使用においては、その他の支持対症治療はほぼ必要なく、すなわち単独使用で前記薬学的効果を達成できる。
【００２０】
また、本発明に係る茶ポリフェノールは前記従来の薬物が備える毒性・副作用をほぼ持たず、且つ該茶ポリフェノールの起源植物は分布が広範で、原料供給が豊富で、経済学的な効果が明らかである。
【００２１】
また、前記薬剤はカプセル剤であっても良く、使用するときに非常に便利で、従来の注射剤形細胞毒性薬が組織及び血管に対して損傷及び刺激を与えることを防止した。
【００２２】
また、前記茶ポリフェノールは植物から抽出されたものであるが、その生産プロセスが標準化されたため、該抽出物における主要成分の含有量が安定に維持され、異なるロット製品間の成分含有量のバラツキを克服したことによって、関連する研究は良好な再現性及び比較可能性を有することになり、腫瘍を治療するための前途有望な製品である。前記茶ポリフェノールからなる腫瘍治療用薬剤はその他の薬物と併用しても毒性・副作用の増加に相乗作用を伴わず、特に骨髄の正常造血に対する抑制作用がないため、その他の薬物との併用での治療効果の相乗的な向上に前途有望な薬物を提供した。
【００２３】
本発明を十分に理解するように、以下は添付図面に合わせて本発明の技術効果に対してさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は異なる濃度の茶ポリフェノール薬液が１日間作用して複数種の細胞株の増殖に及ぼす抑制作用を表す曲線図である。
【図２】図２は１２９．６μｍｏｌ／Ｌ濃度の茶ポリフェノール薬液が１〜３日間作用して複数種の細胞株の増殖に及ぼす抑制作用を表す曲線図である。
【図３】図３は光学顕微鏡で観察された細胞形態の写真であり、異なる濃度の茶ポリフェノール薬液が１日間作用してＲＰＭＩ８２２６細胞株の形態に及ぼす影響を表す。
【図４】図４ａ〜図４ｃは異なる濃度薬液が１日間作用してＲＰＭＩ８２２６細胞株のアポトーシス率に及ぼす影響を表す散布図である。
【図５】図５ａ〜図５ｃは異なる濃度薬液が２．５日間作用してＵ９３７細胞株のアポトーシス率に及ぼす影響を表す散布図である。
【図６】図６ａ〜図６ｄは異なる濃度薬液が２日間作用してＲＰＭＩ８２２６細胞株の細胞周期に及ぼす影響を表すピークシグナルである。
【図７】図７は異なる濃度薬液が異なる時間作用してＲＰＭＩ８２２６細胞株のミトコンドリア膜電位に及ぼす影響を表す散布図である。
【図８】図８は光学顕微鏡下での細胞形態の写真であり、異なる濃度薬液が１．５日間作用してＡＬＬ‐Ｌ２初代細胞形態に及ぼす影響を表す。
【図９】図９は異なる濃度薬液が１．５日間作用してＡＬＬ‐Ｌ２初代細胞のアポトーシス率に対する影響を表す散布図である。
【図１０】図１０は顕微鏡下でのマウス腫瘍組織切片における細胞形態の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は植物エキス天然茶ポリフェノールを抗腫瘍薬とする新用途を提供する。本発明に係る茶ポリフェノールはカテキン類物質を豊富に含有する茶葉エキスで、該カテキン類物質はエピガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）、エピカテキンガラート（ＥＣＧ）及びエピガロカテキン（ＥＧＣ）を含む。
【００２６】
茶ポリフェノールからなる抗腫瘍薬は薬学的に許容可能ないずれかの剤形、例えば錠剤、カプセル剤、トローチ錠、バッカル錠、口腔内崩壊錠、口腔内速溶解錠、分散錠、咀嚼剤、顆粒剤、懸濁剤、注射剤、液剤、徐放剤、制御放出剤または速放性・徐放性製剤であってもよい。
【００２７】
該茶ポリフェノールにおけるカテキンの含有量が変化してもその抗腫瘍効果に顕著に影響しないが、通常、各ロット製品の安定性と使用効果の比較可能性を確保するため、生産プロセスを制御することによって、本発明の実施態様において、茶ポリフェノールからなる抗腫瘍固体薬剤におけるカテキン類物質の含有量を６０〜７０重量％にする。
【００２８】
また、カテキン類物質は主にＥＧＣＧ、ＥＣＧ及びＥＧＣの３種から構成され、３つはともにある程度の抗腫瘍作用を有するため、本発明は使用される茶ポリフェノールにおけるＥＧＣＧ、ＥＣＧ及びＥＧＣの間の割合に対して特に限定しない。通常、ＥＧＣＧが３つのうちの主要部分であり、例えば３つの総重量の５０％以上を占め、ＥＧＣが最も少なく、例えば３つの総重量の約１０％またはそれ以下である。しかし、各ロット製品の安定性と使用効果の比較可能性を確保するため、生産プロセスを制御することによって、本発明に使用される茶ポリフェノールまたはそれからなる腫瘍治療用薬剤におけるＥＧＣＧ、ＥＣＧ及びＥＧＣはそれぞれ３つの総重量の５０〜６０％、２０〜２５％及び８〜１０％を占めることにする。
【００２９】
前記茶ポリフェノールからなる薬剤の適用性を増大させるため、茶ポリフェノールの生産プロセスにおいて、茶葉におけるタンニン酸、カフェインなどの望ましくない成分を除去することができ、且つ好ましくは、最終的に製造された腫瘍治療用薬剤におけるカフェインの含有量が、ほぼ全ての人間が耐えられるカフェインレベルである０．５ｍｇ／２５０ｍｇ薬剤より小さいことを保証する。
【００３０】
本発明に使用される茶ポリフェノールは、従来の製薬方法によって、各種の医薬品製剤、例えば粉剤、錠剤、カプセル剤または液剤に製造され得る。薬剤を使用するとき、直接経口服用してもよく、水に溶解させた後使用してもよい。
【００３１】
このような茶ポリフェノール混合剤はインビトロで複数種の腫瘍細胞の増殖をよく抑制でき、そのメカニズムはｃａｓｐａｓｅ‐３などの経路によって細胞アポトーシスを誘導するかもしれず、且つＥＧＣＧ純製品、一部の細胞毒性薬と比べて、増殖を抑制するその作用は同程度以上である。該混合剤は一部の腫瘍の初代細胞に対してすら良好な抑制作用を有する。このような茶ポリフェノール製剤を経口服用することで腫瘍を抑制する有効な濃度を達成でき、ヌードマウスの体内におけるヒト多発性骨髄腫ＲＰＭＩ８２２６細胞、リンパ腫Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｓｕｄｈｌ‐４細胞などの増殖をよく抑制できる。
【実施例】
【００３２】
実施例
試験材料の由来
１．細胞株ＮＢ４、ＮＢ４‐Ｒ１、ＮＢ４‐Ｒ２、Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６が上海交通大学医学院付属瑞金医院、上海血液研究所によって贈呈された。
使用された腫瘍細胞株の名称は以下の通りである。
ＮＢ４：ヒト急性前骨髄球性白血病細胞株
ＮＢ４‐Ｒ１：オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）耐性ヒト急性前骨髄球性白血病細胞株１
ＮＢ４‐Ｒ２：オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）耐性ヒト急性前骨髄球性白血病細胞株２
Ｕ９３７：ヒト急性単球性白血病細胞株
Ｋ５６２：ヒト慢性骨髄性白血病細胞株
ＲＰＭＩ８２２６：ヒト多発性骨髄腫細胞株
２．試験用マウス、ヌードマウスは、上海交通大学医学院実験動物科学部に委託して上海斯莱克実験動物有限責任公司（ＳＣＸＫ（滬）２００３‐０００３）から購入した。
３．緑茶エキス茶ポリフェノールから腫瘍治療薬剤を作り、該薬剤は米国Ｐｈａｒｍａｎｅｘ社製の緑茶カプセルＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）である。該カプセル内には茶ポリフェノール粉末が含有され、カプセルごとの総重量は２５０ｍｇで、そのうち、カテキン類物質は１６２ｍｇ（ＥＧＣＧ  ９５ｍｇ、ＥＣＧ  ３７ｍｇ、ＥＧＣ  １５ｍｇを含有し、分子量はそれぞれ４５８．４、４４２．４、３０６．３である）で、カフェインは０．５ｍｇより少ない（より詳しい成分は米国の医師用卓上参考書Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ'  ｄｅｓｋ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）：Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｔｅｇｒｅｅｎ９７（登録商標）．  Ｐｈａｒｍａｎｅｘ，２００５，５９Ｅｄｉｔｉｏｎ：２７８２．を参照する）。
【００３３】
以下試験に言及された薬剤の分量は緑茶カプセルＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）におけるＥＧＣＧ含有量を標準としたものであり、分量３２．４μｍｏｌ／Ｌ、６４．８μｍｏｌ／Ｌ、１２９．６μｍｏｌ／Ｌ及び２５９．２μｍｏｌ／Ｌは、１カプセルの内容物を１：６４００、１：３２００、１：１６００、１：８００で希釈した後の上澄み液濃度にそれぞれ相当する。
【００３４】
該緑茶カプセルＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）により調製された茶ポリフェノール溶液を用いて以下の抗腫瘍試験を行った。
（一）ＮＢ４、ＮＢ４‐Ｒ１、ＮＢ４‐Ｒ２、Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６細胞株に対する影響
１．細胞生長抑制試験：ＭＴＴによって細胞生存率を測定する。
２．ライト染色：細胞の形態学的変化を観察する。
３．ＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識：アポトーシス率を定量測定する。
４．細胞周期、細胞核内ＤＮＡ濃度分析：細胞アポトーシスを誘導する可能なメカニズムを明らかにする。
５．ミトコンドリア膜電位分析：細胞アポトーシスを誘導する可能なメカニズムを明らかにする。
（二）急性リンパ球性白血病、急性単球性白血病患者の初代細胞に対する影響
１．ライト染色：細胞の形態学的変化を観察する。
２．ＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識：アポトーシス率を定量測定する
（三）緑茶カプセルＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）により調製された茶ポリフェノール溶液のヌードマウス腫瘍モデルに対する治療効果。
【００３５】
以下は前記各試験及び試験結果に対して詳しく説明する。
（一）ＮＢ４、ＮＢ４‐Ｒ１、ＮＢ４‐Ｒ２、Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６細胞株に対する影響
１．細胞生長抑制試験：ＭＴＴによって細胞生存率を測定する。
図１は３２．４μｍｏｌ／Ｌ、６４．８μｍｏｌ／Ｌ、１２９．６μｍｏｌ／Ｌ、２５９．２μｍｏｌ／Ｌ分量のＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）カプセル茶ポリフェノールが１日間作用して複数種の細胞株の増殖に対する抑制作用を表す曲線図である。
図２は１２９．６μｍｏｌ／Ｌ分量が１〜３日間作用して複数種の細胞株の増殖に対する抑制作用を表す曲線図である。
結果によると、１２９．６及び２５９．２μｍｏｌ／Ｌ分量が２〜３日間作用して各細胞株の増殖に対する抑制作用は顕著であることが分かった。
【００３６】
２．ライト染色：細胞の形態学的変化を観察する。
ライト染色によって、細胞アポトーシスの形態学的変化を観察する（光学顕微鏡×１００倍）。
図３に示すように、異なる濃度の茶ポリフェノール溶液を多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６に１日間作用させた場合において、対照群（０μｍｏｌ／Ｌ）の細胞核は均一で薄く染色され、染色質が比較的少なく、細胞質の割合が正常であり、３２．４μｍｏｌ／Ｌ、６４．８μｍｏｌ／Ｌ、１２９．６μｍｏｌ／Ｌ、２５９．２μｍｏｌ／Ｌの茶ポリフェノールが１日間作用した後では、ＲＰＭＩ８２２６細胞には細胞膜萎縮、染色質凝集、細胞核濃縮及びアポトーシス小体がみとめられた。
結果によると、茶ポリフェノールはＲＰＭＩ８２２６細胞株のアポトーシスを誘導でき、且つ該作用は濃度の増大に伴って顕著になることが分かった。
【００３７】
３．ＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識：アポトーシス率を定量測定する。
多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６
フローサイトメトリー（ＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識法）によって細胞アポトーシス率を定量測定する。
ＦＩＴＣ、すなわち蛍光色素イソチオシアネートにより標識されたＡｎｎｅｘｉｎ‐Ｖと外在化された膜ホスファチジルセリン（ＰＳ）とが結合され、アポトーシス細胞がＡｎｎｅｘｉｎ‐Ｖ陽性を示す。
ＰＩ、すなわちヨウ化プロピジウムと核酸とが結合され、死亡細胞がＰＩ陽性を示す。
図４ａ〜図４ｃは該フローサイトメトリーにより示された蛍光散布図であり、散布図において、左下の象限がＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識陰性細胞（正常細胞）で、右下の象限がＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ単一標識陽性細胞（早期アポトーシス細胞）で、右上の象限がＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識陽性細胞（晩期アポトーシス細胞）で、左上の象限がＰＩ単一標識陽性細胞（死亡細胞）である。
結果によると、異なる濃度の茶ポリフェノールを多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６に１日間作用させた場合において、対照群（０μｍｏｌ／Ｌ）では９５％が正常細胞であり、６４．８μｍｏｌ／Ｌ、１２９．６μｍｏｌ／Ｌの茶ポリフェノールを１日間作用させ後では、早期アポトーシス及び晩期アポトーシス細胞が顕著に増加したことが分かった。
ヒト急性単球性白血病細胞株Ｕ９３７
フローサイトメトリー（ＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識法）によって細胞アポトーシス率を定量測定する。
図５ａ〜図５ｃはフローサイトメトリーにより示された蛍光散布図で、散布図において、左下の象限がＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識陰性細胞（正常細胞）で、右下の象限がＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ単一標識陽性細胞（早期アポトーシス細胞）で、右上の象限がＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識陽性細胞（晩期アポトーシス細胞）で、左上の象限がＰＩ単一標識陽性細胞（死亡細胞）である。
結果によると、異なる濃度の茶ポリフェノールをヒト急性単球性白血病細胞株Ｕ９３７に２．５日間作用させた場合において、対照群（０μｍｏｌ／Ｌ）では９４．７％が正常細胞であり、１２９．６μｍｏｌ／Ｌ、２５９．２μｍｏｌ／Ｌの茶ポリフェノールを２．５日間作用させた後では、早期アポトーシス及び晩期アポトーシス細胞が顕著に増加したことが分かった。
【００３８】
４．細胞周期、細胞核内ＤＮＡ濃度分析：細胞アポトーシスの可能なメカニズムを明らかにする。
フローサイトメトリーの測定によると、異なる濃度の薬液をヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６に２日間作用させた後では、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２期の割合は特に顕著に異ならなかった（それぞれ３２％、６４．４％及び３．５％である）。
図６ａ〜図６ｄはフローサイトメトリーにより示されたピークシグナルで、図中、ＦＬ３及び細胞数（ｃｏｕｎｔ）が低二倍体性細胞のパーセンテージを示し、それは細胞アポトーシスの１つの指標を反映する。核内のＤＮＡ含有量を分析した結果、薬液濃度の増大に伴い、低二倍体性細胞の割合が多くなる（対照群、ならびに３２．４μｍｏｌ／Ｌ、６４．８μｍｏｌ／Ｌ、および１２９．６μｍｏｌ／Ｌの茶ポリフェノールを２日間作用させた後では、低二倍体性細胞の割合がそれぞれ０．５％、８．３％、１５．７％、９４．１％である）。
結果、茶ポリフェノールは細胞アポトーシスの経路を誘導することによってヒト多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制し、且つ濃度に関連することが明らかとなった。
【００３９】
５．ミトコンドリア膜電位分析：細胞アポトーシスを誘導する可能なメカニズムを明らかにする。
フローサイトメトリー（ローダミンＲｈ１２３蛍光標識法）によって細胞内ミトコンドリア膜電位を定量測定し、細胞増殖抑制の可能なメカニズムを検討する。
図７中のＧ〜Ｒは異なる薬剤分量及び異なる作用時間におけるヒト多発性骨髄腫細胞の増殖及びアポトーシス状況を示している。対照群（０μｍｏｌ／Ｌ）と比べると、６４．８μｍｏｌ／Ｌ、１２９．６μｍｏｌ／Ｌ、２５９．２μｍｏｌ／Ｌの茶ポリフェノールをヒト多発性骨髄腫細胞に３時間作用させた後では、ミトコンドリア膜電位が下がり始め、且つ時間依存性を有する。
結果によると、茶ポリフェノールがヒト多発性骨髄腫細胞の増殖を抑制するメカニズムは細胞アポトーシスを誘導することに関連し、且つミトコンドリアの損傷と関連する可能性があることが分かった。
【００４０】
（二）急性リンパ球性白血病、急性単球性白血病患者の初代細胞に対する影響。
１．ライト染色：細胞の形態学的変化を観察する。
ライト染色によって、細胞の形態学的変化を観察する。
図８に示すように、異なる濃度の茶ポリフェノール溶液を急性単球性白血病患者の初代細胞に１．５日間作用させた場合において、対照群（０μｍｏｌ／Ｌ）の細胞核は均一で薄く染色され、染色質が比較的少なく、細胞質の割合は正常であり、１２９．６μｍｏｌ／Ｌ、１９４．４μｍｏｌ／Ｌ、２５９．２μｍｏｌ／Ｌの茶ポリフェノールを１．５日間作用させた後では、初代細胞には細胞膜萎縮、染色質凝集、細胞核濃縮及び好酸性小体（アポトーシス小体）がみとめられた。
結果によると、茶ポリフェノールは急性単球性白血病患者の初代細胞のアポトーシスを誘導でき、且つ該作用は濃度の増大に伴って顕著になることが分かった。
２．ＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識：アポトーシス率を定量測定する。
フローサイトメトリー（ＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識法）によって細胞アポトーシス率を定量測定する。
図９に示されるように、散布図において、左下の象限がＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識陰性細胞（正常細胞）で、右下の象限がＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ単一標識陽性細胞（早期アポトーシス細胞）で、右上の象限がＡｎｎｅｘｉｎＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識陽性細胞（晩期アポトーシス細胞）で、左上の象限がＰＩ単一標識陽性細胞（アポトーシス死亡細胞）である。
結果によると、異なる濃度の茶ポリフェノールを急性単球性白血病初代細胞に１．５日間作用させた場合において、対照群（０μｍｏｌ／Ｌ）では８６．８％が正常細胞であり、１２９．６μｍｏｌ／Ｌ、１９４．４μｍｏｌ／Ｌ、２５９．２μｍｏｌ／Ｌの茶ポリフェノールを１．５日間作用しさせ後では、早期アポトーシス及び晩期アポトーシス細胞が顕著に増加し、正常に増殖した細胞が顕著に減少し、それぞれ６７．１％、２１％及び５．７６％であったことが分かった。
【００４１】
（三）緑茶カプセルＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）により調製された茶ポリフェノール溶液のヌードマウス腫瘍モデルに対する治療効果
４×１０８個細胞／ｍＬのＲＰＭＩ８２２６細胞株を調製し、マウスごとに対して背部皮膚に０．５ｍＬを注入し、１０日後腫瘍が生じ、接種した後１６日目から５日連続してマウスにカプセル茶ポリフェノール溶液の上澄み液を経口服用させる（ＥＧＣＧ濃度は４８ｍｇ／ｍＬで、経口服用し、１回／日）。対照群には生理塩水を飲ませる。１６日目から、マウスの腫瘍を毎日測定する。結果は下表に示す。
【表１】
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対照群において、１６日目後腫瘍大きさが増大し続け、且つ１８日目に死亡した。投与群において、１６日目から投与した後、腫瘍は増大する代わりに持続的に縮小し、マウスの死亡時間が対照群より３〜４日間遅延した。茶ポリフェノールの腫瘍治療効果が顕著であることを明らかにした。
異なる茶ポリフェノール分量を投与されたマウスの腫瘍組織を取って、パラフィン切片を作成し、ＨＥ染色し、顕微鏡で細胞形態変化を観察した。
図１０に示すように、０ｍｇ／ｋｇ・ｄ茶ポリフェノールを投与されたマウス体内の腫瘍組織細胞核は均一で薄く染色され、染色質が比較的少なく、細胞質の割合は正常であり、１２ｍｇ／ｋｇ・ｄ、２４ｍｇ／ｋｇ・ｄ茶ポリフェノールを投与された後では、腫瘍細胞には細胞膜萎縮、染色質凝集、細胞核濃縮及び好酸性小体（アポトーシス小体）がみとめられた。
結果によると、茶ポリフェノールはマウス体内において腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことができ、且つ該作用は濃度の増大に伴って顕著になることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年5月13日(2010.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血系悪性腫瘍の予防または治療用医薬の製造における茶ポリフェノールもしくはその薬学的に許容可能な塩またはそれらのうちのいずれか１種を含む医薬組成物の使用であって、該茶ポリフェノールは、エピガロカテキンガラート、エピカテキンガラートおよびエピガロカテキンを含むカテキン類物質を含み、且つ該茶ポリフェノールにおいて、エピガロカテキンガラート、エピカテキンガラートおよびエピガロカテキンがそれぞれ該カテキン類物質重量の５０〜６０％、２０〜２５％および８〜１０％である、該使用。
【請求項２】
前記茶ポリフェノールが茶葉エキスであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
抽出する場合、前記茶ポリフェノールの主要活性成分エピガロカテキンガラート、エピカテキンガラート及びエピガロカテキンがさらに分離精製する必要がなく、直接使用できることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記茶ポリフェノールにおけるカフェインの含有量が０．２重量％以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
抽出する場合、前記茶ポリフェノールから茶葉に含有されるタンニン酸が除去されることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記カテキン類物質の総含有量が前記茶ポリフェノール重量の６０〜７０％であることを特徴とする請求項１または５に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬が前記茶ポリフェノールを含み、１０００ｍｇの製剤毎の前記カテキン類物質の含有量が６４８ｍｇで、そのうち、エピガロカテキンガラート、エピカテキンガラート及びエピガロカテキンがそれぞれ３８０ｍｇ、１４８ｍｇ及び６０ｍｇであることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記茶ポリフェノールが米国Ｐｈａｒｍａｎｅｘ社の緑茶カプセルＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記緑茶カプセルＴｅｇｒｅｅｎ  ９７（登録商標）カプセルが、１カプセル毎の重量が２５０ｍｇであり、前記カテキン類物質１６２ｍｇが含まれ、そのうち、エピガロカテキンガラート、エピカテキンガラート及びエピガロカテキンがそれぞれ９５ｍｇ、３７ｍｇ及び１５ｍｇであることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬が薬学的に許容可能な添加剤または担体をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記茶ポリフェノールが単独に使用することができることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬の剤形が、錠剤、カプセル剤、トローチ錠、バッカル錠、口腔内崩壊錠、口腔内速溶解錠、分散錠、咀嚼剤、顆粒剤、懸濁剤、注射剤、液剤、徐放剤、制御放出剤または速放性製剤であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
前記造血系悪性腫瘍が、ＲＰＭＩ８２２６細胞の多発性骨髄腫、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＳｕｄｈｌ−４細胞を含めたリンパ腫、ＮＢ４細胞、ＮＢ４−Ｒ１細胞およびＮＢ４−Ｒ２細胞を含めた急性前骨髄球性白血病、Ｕ９３７細胞の急性単球性白血病、Ｋ５６２細胞の慢性骨髄性白血病、初代培養細胞の急性リンパ球性白血病、ならびに初代培養細胞の急性単球性白血病を含むことを特徴とする請求項１に記載の応用。
【国際調査報告】
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