(57)【要約】  本発明は、野生型と比較して、増加されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合アフィニティー、及び阻害された又は低下調節されたＧＰＣＲ活性を呈する、ヒトストローマ細胞誘導因子−１の新たな突然変異体、該突然変異体を製造する方法、並びに癌の治療のための薬剤を製造するためのそれらの使用に関する。
2011501675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＦ−１突然変異体タンパク質であって、該ＳＤＦ−１タンパク質が、構造維持法で、少なくとも２つの塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸の挿入、又は少なくとも２つの非塩基性アミノ酸の置換によって、少なくとも２つの塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸によって改質され、かつ野生型ＳＤＦ−１タンパク質のＮ末端領域の最初の１〜１０のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換によって改質されることを特徴とする、野生型ＳＤＦ−１タンパク質と比較して増加させたＧＡＧ結合アフィニティー及び低減させたＧＰＣＲ活性を有するＳＤＦ−１突然変異体タンパク質。
【請求項２】
構造維持法での改質が、遠赤外線ＣＤ分光法によって測定される、３０％未満、有利には２０％未満の野生型のＳＤＦ−１構造からの改質された構造のずれであることを特徴とする、請求項１に記載のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質。
【請求項３】
前記の塩基性アミノ酸が、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質。
【請求項４】
前記の電子供与性アミノ酸が、Ａｓｎ又はＧｌｎからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質。
【請求項５】
前記のＳＤＦ−１タンパク質のＮ末端領域が、８つのアミノ酸の切断によって改質されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質。
【請求項６】
前記のＳＤＦ−１タンパク質のＮ末端領域が、最初の２つのアミノ酸の置換及び／又は欠失によって改質されることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質。
【請求項７】
前記の最初の２つのＮ末端のアミノ酸が、リジン、アルギニン、プロリン、又はグリシンからなる群から選択されるアミノ酸によって置換されることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質。
【請求項８】
Ｎ末端Ｍｅｔを含有することを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項に記載のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質。
【請求項９】
位置２９又は３９での少なくとも１つのアミノ酸が改質されることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項に記載のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質。
【請求項１０】
前記の改質されたＳＤＦ−１分子のアミノ酸配列が、一般式
（Ｍ）n（Ｘ１）m（Ｘ２）pＶＳＬＳＹＲＣＰＣＲＦＦＥＳＨＶＡＲＡＮＶＫＨＬＫＩ（Ｘ３）ＮＴＰＮＣＡＬＱＩ（Ｘ４）ＡＲＬＫＮＮＮＲＱＶＣＩＤＰＫＬＫＷＩＱＥＹＬＥＫＡＬＮＫ（ＧＲＲＥＥＫＶＧＫＫＥＫＩＧＫＫＫＲＱＫＫ ＲＫＡＡＱＫＲＫＮ）o
［式中、Ｘ１は、Ｋ又はＲ残基であり、
Ｘ２は、Ｐ又はＧ残基であり、
Ｘ３は、Ｙ又はＡ残基からなる群から選択され、有利にはＡであり、
Ｘ４は、Ｓ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ又はＱ残基からなる群から選択され、有利にはＫであり、かつ
ｎ及び／又はｍ及び／又はｐ及び／又はｏは、０又は１であってよく、かつ
少なくとも２つの位置Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３又はＸ４が改質される］によって記載されることを特徴とする、ＳＤＦ−１突然変異体タンパク質。
【請求項１１】
構造Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１ Δ８ Ｌ２９Ｋ Ｖ３９Ｋであることを特徴とする、ＳＤＦ−１突然変異体タンパク質。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか１項に記載のタンパク質に関してコードすることを特徴とする、単離された多核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の単離されたＤＮＡ分子を含有することを特徴とするベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターで形質移入させることを特徴とする、組換え細胞。
【請求項１５】
請求項１から１１までのいずれか１項に記載のタンパク質、又は請求項１２又は１３に記載の多核酸、又は請求項１４に記載のベクター及び製剤学的に認容性のキャリヤーを含有することを特徴とする、医薬品組成物。
【請求項１６】
請求項１から１１までのいずれか１項に記載のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質、又は請求項１２に記載の多核酸、又は請求項１３に記載のベクターの、癌の治療のための薬剤を製造するための方法における使用。
【請求項１７】
腫瘍の成長及び広がりの過程を、少なくとも部分的に阻害することを特徴とする、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ｉ）増加させたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合アフィニティー、及び（ｉｉ）野生型ＳＤＦ−１と比較して阻害させた又は低下調節させたＧＰＣＲ活性を呈する、ヒトストローマ細胞−誘導因子−１、すなわちＳＤＦ−１αもしくはＳＤＦ−１βもしくはＳＤＦ−１γ又はそれらのあらゆる変異体の新たな突然変異体に、並びにガンの治療のためのそれらの使用に関する。
【０００２】
ケモカインは、小さな（８〜１１ｋＤ）可溶性化学誘因物質のサイトカインである。該ケモカインは、それらのシステイン残基の相対位置に依存する、４つのファミリーからなる。α−ケモカインは、最初の２つのシステイン残基を分離する１つの非保存性アミノ酸を有する（ＣＸＣ−モチーフ）のに対し、β−ケモカインは、互いに隣接している最初の２つのシステインを有する（ＣＣ−モチーフ）。フラクタルカインは、最初の２つのシステイン残基を分離する、３つの非保存性アミノ酸を有するケモカインファミリー（ＣＸ３−モチーフ）の唯一の代表であり、かつリンホタクチンは、合計２つだけのシステインを有するファミリー（Ｃ−モチーフ）の唯一の群であり、他の３つのファミリーにおける４つのシステインと比較される（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，．５５，９７ １７９（１９９４））。ストローマ細胞−誘導因子−１α（ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１２）は、α−ケモカインに属するが、この種類の典型的な代表ではない。他のヒトＣＸＣ−及びＣＣ−ケモカインに対する配列相同性は、それぞれ２７％及び２１％のみである。双方の大きなケモカインファミリーに対するこの同様に異なる関係にもかかわらず、成熟ＳＤＦ−１は、種々の種類間の非常に高い類似性を示す。ヒトとマウスとの間の約９９％の配列相同性、及びヒトと猫のＳＤＦ−１との間の１００％のアミノ酸配列相同性に関しては、今までのところは公知の最も保存性のあるサイトカインである（Ｓｈｉｒｏｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２８，４９５−５００（１９９５））。オーソログは、実際に、無顎類の最も原始の脊椎動物枝において見出されている。ＳＤＦ−１の他の特徴は、染色体１０に位置するその遺伝子ＳＣＹＢ１２であるのに対して、全ての他のＣＸＣケモカイン及びほとんどのＣＣケモカインは、染色体４及び染色体１７に密集する。
【０００３】
ＳＣＹＢ１２は、４つのエキソンを含む。最も一般的なスプライスアイソフォームのＳＤＦ−１αは、エキソン１〜３から誘導され、一方ＳＤＦ−１βは、Ｃ末端で４つの追加のアミノ酸をもたらすエキソン４からの追加の配列も含む。ＳＤＦ−１の三次元構造は、３つの逆平行β−ストランドのコア、及びＣ末端α−ヘリックスを示す（Ｃｒｕｍｐ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１６，６９９６−７００７（１９９７））。
【０００４】
三次元の特徴と対照的に、四次元構造は、常に問題がある。説明の対立は、ＮＭＲ−研究におけるモノマー形、結晶学的測定におけるダイマー形、又は沈降回転数超遠心及び動的光散乱による想定されたモノマー−ダイマー平衡を明らかにした。実際にＳＤＦ−１αが、モノマー−ダイマー平衡において存在し、かつダイマー会合が、安定な対イオンと溶液ｐＨとの双方の存在に強く依存することが後に見出されている。さらに、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が、ＳＤＦ−１αダイマー形成を促進することが見出されている（Ｖｅｌｄｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１４，１０７１−１０８１（２００５））。
【０００５】
ＧＡＧは、連鎖、組成物、並びにＮ−及びＯ−硫酸化パターンにおいて変動する、反復二糖単位を含有する、直鎖多糖である（Ｃａｐｉｌａ & Ｌｉｎｈａｒｄｔ， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ４１， ３９１−４１２ （２００２））。それらのほとんどは、いわゆるプロテオグリカンを形成するそれらによってタンパク質コアと連結される。ＧＡＧの例は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン、ケラチン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、及びヒアルロン酸である。スルフェート及びカルボキシレート基の存在のために、ＧＡＧは、より高い負の電荷を帯びている。これは、可溶性グリコサミノグリカン、及び細胞表面又は細胞外マトリックスに付着させたＧＡＧに結合する正に電荷されたケモカインの結合を行う。ヘパリンに類似するがしかしほとんど電荷帯びていない、ヘパラン硫酸は、ケモカインの生物活性に対する基本であると考える。ヘパリン硫酸は、ほとんどの細胞型及びいくつかのコアタンパク質運搬ＨＳ−鎖によって製造される。例えば、細胞表面でシンデカン及びグリピカン、並びに細胞外マトリックスにおいてアグリン及びパールカン。ＳＤＦ−１αは、シンデカン−４と結合するが、シンデカン−１、シンデカン−２、ＣＤ４４又はベータ−グリカンとは結合しないことが注意に値する。Ｌｙｓ２４、Ｌｙｓ２７、並びにより小さい程度に対してＡｒｇ４１及びＬｙｓ４３が、ＳＤＦ−１をＨＳに結合するために必要であることが示されている（Ｓａｄｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，８２８８−８２９６（２００１））。それらの塩基性アミノ酸は、ＳＤＦ−１αダイマーのβ−ストランド間の小さな開口部に位置される（Ｌｏｒｔａｔ−Ｊａｃｏｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９９， １２２９−１２３４（２００２））。
【０００６】
ＧＡＧは、細胞表面上にケモカインの保持を導き、その結果、血流によって生じる剪断力にもかかわらず、ケモカインの局所濃度を増加する。この相互作用がなければ、ケモカインは、洗い流され、かつ続く白血球又は幹細胞のための走化性勾配を確立することができない。ＧＡＧ結合は、生体内活性のために事前の要求である。ＧＡＧ結合部位での突然変異を有するケモカインは、生体内で細胞を補充することができない。例えばオリゴマー化を導くケモカインの構造変化は、ＧＡＧへの結合によって生じる。ＨＳ又はヘパリンへの結合は、タンパク質分解性の開裂からも、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）／ＣＤ２６によって生体内でＳＤＦ−１を保護することができる。
【０００７】
ＳＤＦ−１のための唯一の公知のレセプターは、ＣＸＣケモカインレセプター４（ＣＸＣＲ４）である（Ｙ． Ｒ． Ｚｏｕ， Ａ． Ｈ． Ｋｏｔｔｍａｎｎ， Ｍ． Ｋｕｒｏｄａ， Ｉ． Ｔａｎｉｕｃｈｉ， Ｄ． Ｒ． Ｌｉｔｔｍａｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ３９３， ５９５−５９９ （１９９８））。相互に、ＳＤＦ−１は、ＣＸＣＲ４のための唯一の公知の内因性リガンドである（Ｍ． Ｋ． Ｓｃｈｗａｒｚ， Ｔ．Ｎ． Ｗｅｌｌｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ３， ４０７−４１７ （１９９９））。ＣＸＣＲ４は、７つの膜内外ドメインによって特徴付けられる、百日咳毒素感受性Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）に属する。ＳＤＦ−１及びＣＸＣＲ４のための２工程結合モデルが提案されている（Ｍ． Ｋ． Ｓｃｈｗａｒｚ， Ｔ．Ｎ． Ｗｅｌｌｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ３， ４０７−４１７ （１９９９））。
【０００８】
分子動力学シミュレーションは、さらに、ＳＤＦ−１のＣＸＣＲ４への二工程結合機構を確認した。ＳＤＦ−１は、非常に効力のあるケモカインであり、かつ白血球及び単球、並びに造血幹細胞及び始原細胞を引きつける（Ｋ． Ｈａｔｔｏｒｉ， Ｂ． Ｈｅｉｓｓｉｇ， Ｋ． Ｔａｓｈｉｒｏ， Ｔ． Ｈｏｎｉｏ， Ｍ． Ｔａｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ９７， ３３５４−３３６０ （２００１））。
【０００９】
ケモカイン引力並びにリンパ球及び単球引力におけるＳＤＦ−１の役割、並びに癌治療のための新薬のための一定の要求を考慮して、本発明の目的は、ケモカインレセプター相互作用を改質するための新たなタンパク質を提供することである。
【００１０】
本発明は、ＳＤＦ−１αもしくはＳＤＦ−１βもしくはＳＤＦ−１γ又はそれらのあらゆる変異体であってよいヒトＳＤＦ−１中へのより高いＧＡＧ結合アフィニティーを設計すること、並びに同時にＧＰＣＲ活性、特にケモカインのＣＸＣＲ４活性をノックアウト又はダウンレギュレーションすることに基づく。これは、ＧＡＧ結合アフィニティーを増加するためにＳＤＦ−１のＧＡＧ結合部位中に塩基性アミノ酸を導入することによって、及び８つのアミノ酸の切断によって又は最初の２つのアミノ酸を置換／欠失することによってケモカインのＮ末端を改質することによって達成される。前記のＳＤＦ−１突然変異体は、標準ＧＡＧ（ヘパリン又はヘパラン硫酸）に関する最小で５倍改質されたＫｄを呈し、かつそれは、標準単球のボイデンチャンバー中で低減された走化性活性を示す。それらの特徴のための生物物理学的な及び細胞生物学的な証明を提供する。
【００１１】
本発明の主題は、ＣＸＣＲ４陽性細胞遊走、より詳述すれば幹細胞及び転移性細胞を、腫瘍成長及び拡散方法の本記載内容におけるＳＤＦ−１を基礎とした突然変異体とのＧＡＧ相互作用を拮抗することによって、阻害することである。抗−腫瘍形成の特徴は、ヒト乳癌細胞を使用するネズミの異種移植モデルにおいて示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＳＤＦ−１突然変異体の配列を示す図（野生型のケモカインに関する突然変異に下線を引く）。
【図２】ＨＳに結合するｗｔＳＤＦ−１及びＭｅｔ−ＳＤＦ−１Δ８Ｌ２９ＫＶ３９Ｋの恒温蛍光滴定を示す図。
【図３】ｗｔＳＤＦ−１、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−Ｉ、及びＭｅｔ−ＳＤＦ−１Δ８Ｌ２９ＫＶ３９Ｋによって誘発された単球（Ｔｈｐ−１）走化性を示す図。
【図４】ネズミの異種移植モデルにおいて測定されたＭｅｔ−ＳＤＦ−１Δ８Ｌ２９ＫＶ３９Ｋ（"突然変異体"として設計された）による肝臓へのヒト乳癌細胞遊走の阻害を示す図。
【００１３】
増加されたＧＡＧ結合アフィニティーは、天然ＧＡＧ結合タンパク質との競合者として作用する改質されたタンパク質を導く、ＧＡＧ結合領域における塩基性アミノ酸の相対量を増加することによって導入されうる（ＷＯ ０５／０５４２８５号、参照によって全て本明細書に組み込まれたものとする）ことを示している。これは、特に、インターロイキン−８に関して示している。ＧＡＧ結合領域の特定の位置、及び塩基性アミノ酸を選択的に導入することによるそれらの改質は、ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）タンパク質に関して記載されていない。
【００１４】
ＷＯ ０１／８５１９６号は、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、及び造血細胞の治療のためのそれらの可能な使用を開示しているが、ＳＤＦ−１分子のＧＡＧ結合アフィニティーを改良する指摘はない。ＷＯ ０１／８５１９６号は、ＳＤＦ−１由来のペプチドを開示しており、その際それらの一部は、リンカー配列によってＧＡＧに結合するＳＤＦ−１のそれらのドメインを含むＳＤＦ−１のＣ末端断片に共有的に連結されることができ、従って該ペプチドの拮抗作用を増加しうる。この文献において、あらゆる方法によってＳＤＦ−１のＧＡＧ結合アフィニティーを増加することについては言われていない。この文献において述べられているＧＡＧ結合タンパク質の他の例と同様に、この方法によって、タンパク質−ＧＡＧ結合の一般原理を参照でき、及びＳＤＦ−１へのより高いＧＡＧ−結合アフィニティーを導入する特定の技術は参照できない。
【００１５】
本発明は、ＳＤＦ−１タンパク質が、構造維持法で、有利にはＧＡＧ結合部位内での少なくとも２つの塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸の挿入、又は少なくとも２つの非塩基性アミノ酸の置換によって、又は天然のＧＡＧ結合部位の構造付近で少なくとも２つの塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸によって改質され、かつ野生型ＳＤＦ−１タンパク質のＮ末端領域の最初の１〜１０のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸が、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換によって改質されることを特徴とする、野生型ＳＤＦ−１タンパク質と比較して増加させたＧＡＧ結合アフィニティー及び低減させたＧＰＣＲ活性を有するＳＤＦ−１突然変異体タンパク質を提供する。
【００１６】
本発明によって定義される"付近"という用語は、ＧＡＧ結合部位の立体構造的近傍の範囲内で位置されるが、しかし、ＧＡＧ結合部位において直接配置されない、アミノ酸残基を含む。立体構造的近傍は、タンパク質のアミノ酸配列に関するＧＡＧ結合アミノ酸残基に隣接して位置されるアミノ酸残基、又はタンパク質の三次元構造（又は折り畳み）の結果としてＧＡＧ結合アミノ酸残基に隣接して位置されるアミノ酸として定義されうる。
【００１７】
それらの生物学的機能を作用することを可能にするために、タンパク質は、１つ又はそれ以上の特定の空間的立体構造、いわゆるドメイン中に折り畳まれ、多くの非共有的相互作用、例えば水素結合、イオン相互作用、ファンデルワールス力、及び疎水性充填によって生じる。三次元構造は、Ｘ線結晶学又はＮＭＲ分光法のような公知の方法によって測定されうる。
【００１８】
天然のＧＡＧ結合部位の同定は、例えば突然変異誘発実験によって達せられうる。タンパク質のＧＡＧ結合部位は、主にタンパク質の表面に配置された塩基性残基によって特徴付けられる。それらの領域がＧＡＧ結合部位を定義しているかどうかを試験するために、それらの塩基性アミノ酸残基は、例えばアラニン残基の置換によって突然変異を起こすことができ、かつヘパリン結合アフィニティーの減少を測定することができる。これは、当業者に公知のあらゆるアフィニティー測定技術によって実施されうる。
【００１９】
塩基性又は電子供与性アミノ酸の挿入又は置換によって合理的に設計された突然変異誘発は、ＧＡＧ結合部位の増加されたサイズを及びＧＡＧ結合アフィニティーの増加をもたらしうる天然のＧＡＧ結合部位の付近に異なるアミノ酸を導入するために実施されうる。
【００２０】
ＧＡＧ結合部位又は該部位の付近は、
（ａ）タンパク質及びＧＡＧリガンド分子、例えば該タンパク質に結合するヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヘパリン、ケラチン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及びヒアルロン酸等を含有する複合体を提供すること、
（ｂ）前記複合体と、タンパク質の開裂を可能にするプロテアーゼ、例えばトリプシンのような開裂試薬とを接触すること、その際、該ＧＡＧリガンド分子は、ＧＡＧリガンド分子に結合するタンパク質の領域におけるタンパク質の開裂を妨げ、かつそれによって該タンパク質を、該結合ＧＡＧリガンド分子によって阻害されない領域において開裂し、並びに
（ｃ）開裂させたペプチドを分離及び検出すること、その際、タンパク質の領域における開裂の事象の不在は、該ＧＡＧリガンド分子がその領域に結合していることを示す
を含む、ＵＳ ６１／０７５６５号（参照をもって本明細書に取り込まれたものとする）において詳細に記載されているような方法を使用することによっても測定されることができる。検出は、例えば、ＬＣ−ＭＳ、ｎａｎｏＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ又は質量分析法によってできる。
【００２１】
ＧＡＧ結合部位を導入又は改良するためのプロトコルは、例えば部分的に、ＷＯ ０５／０５４２８５号において記載されており、かつ以下：
− ＧＡＧ結合中に含まれるタンパク質の領域の同定、
− 塩基性又は電子供与性アミノ酸、有利にはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＧｌｎ残基を、あらゆる位置に導入する（置換又は挿入する）ことによる、又はＧＡＧ結合と干渉するアミノ酸を欠失することによる新たなＧＡＧ結合部位の設計、
− 得られた突然変異体タンパク質の立体構造安定性のシリカ中での検査、
− 野生型タンパク質ｃＤＮＡのクローン（代わりに：ｃＤＮＡを得る）、
− ＰＣＲ関連突然変異誘発に関する鋳型として前記ｃＤＮＡを使用して、前記の変化をアミノ酸配列に導入すること、
− 突然変異体遺伝子の好適な発現系へのサブクローン（生物学的に要求される転写後改質に依存する原核生物又は真核生物）、
− 生体外での突然変異体タンパク質の発現、精製及び特徴付け、
増加させたＧＡＧ結合アフィニティーに関する診断基準：ＫdGAG（突然変異体）≦１０μＭ
− 遠赤外線ＣＤ分光法又は１−ＤＮＭＲ分光法による構造維持に関する検査
であってよい。
【００２２】
３０％未満、有利には２０％未満の野生型構造からの遠赤外線ＣＤ分光法によって測定された改質された構造のずれは、本発明による構造維持改質として定義される。
【００２３】
電子供与性アミノ酸は、電子又は水素原子を供与するアミノ酸である（Ｄｒｏｅｎｓｔｅｄｔ定義）。有利には、該アミノ酸は、Ａｓｎ又はＧｌｎであってよい。塩基性アミノ酸は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ又はＨｉｓからなる群から選択されうる。
【００２４】
前記の塩基性又は電子供与性アミノ酸で置き換えられた天然アミノ酸が、塩基性アミノ酸である場合に、置換アミノ酸は、有利には、より塩基性のアミノ酸であり、又は多かれ少なかれ、天然タンパク質構造中に構造可撓性を導入する。
【００２５】
本発明による構造可撓性は、ＧＡＧリガンド結合の結果として誘発された適合に対する適用の程度によって定義される。
【００２６】
本発明の特定の一実施態様によって、塩基性及び／又は電子供与性アミノ酸によって置き換えられた天然アミノ酸は、非塩基性又は全く塩基性でないアミノ酸である。
【００２７】
本発明によって、ＳＤＦ−１突然変異体タンパク質は、構造維持法における改質を含むことができ、その際、野生型ＳＤＦ−１構造からの遠赤外線ＣＤ分光法による測定として改質された構造のずれは、３０％未満、有利には２０％未満、有利には１０％未満である。
【００２８】
代わりの一実施態様によって、構造維持改質は、ＳＤＦ−１タンパク質のＮ末端内に位置しない。
【００２９】
本発明は、増加されたＧＡＧ結合アフィニティー及び低減されたＧＰＣＲ活性を有するＳＤＦ−１突然変異体タンパク質を含み、ＳＤＦ−１タンパク質の非構造領域が、少なくとも２つの塩基性アミノ酸の挿入又は置き換えによって改質され、かつ該ＳＤＦ−１タンパク質のＮ末端領域が、８つのアミノ酸の切断によって又は最初の２つのアミノ酸を置換／欠失することによって改質することを特徴とする。
【００３０】
特定の一実施態様によって、Ｎ末端アミノ酸は、リジン、アルギニン、プロリン又はグリシンからなる群から選択されてよい。
【００３１】
さらに、位置２９又は３９での少なくとも１つのアミノ酸は、本発明のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質において改質されうる。代わりに、アミノ酸欠失、置換又は挿入は、位置２４、２５、２６、２７、及び／又は４１、４２、４３のアミノ酸でも可能である。
【００３２】
代わりに、本発明のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質のアミノ酸配列は、以下の一般式
（Ｍ）n（Ｘ１）m（Ｘ２）pＶＳＬＳＹＲＣＰＣＲＦＦＥＳＨＶＡＲＡＮＶＫＨＬＫＩ（Ｘ３）ＮＴＰＮＣＡＬＱＩ（Ｘ４）ＡＲＬＫＮＮＮＲＱＶＣＩＤＰＫＬＫＷＩＱＥＹＬＥＫＡＬＮＫ（ＧＲＲＥＥＫＶＧＫＫＥＫＩＧＫＫＫＲＱＫＫ  ＲＫＡＡＱＫＲＫＮ）o
［式中、Ｘ１は、Ｋ又はＲ残基であり、
Ｘ２は、Ｐ又はＧ残基であり、
Ｘ３は、Ｙ及び／又はＡ残基からなる群から選択され、有利にはＡであり、
Ｘ４は、Ｓ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱ残基からなる群から選択され、有利にはＫであり、かつ
ｎ及び／又はｍ及び／又はｐ及び／又はｏは、０又は１であってよく、かつ
少なくとも２つの位置Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３又はＸ４が改質される］によって記載されうる。
【００３３】
本発明の代わりの実施態様によって、ＳＤＦ−１突然変異体タンパク質は、Ｎ末端のＭｅｔを含むことができる。
【００３４】
本発明の他の観点は、前記の本発明のタンパク質をコードする単離された多核酸分子である。前記多核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。その結果、本発明のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質を導く改質は、ＤＮＡ又はＲＮＡレベルで実施される。本発明の単離された多核酸分子は、診断法、並びに遺伝子治療、及び大量の本発明のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質の製造に好適である。
【００３５】
さらに好ましくは、単離された多核酸分子は、厳しい条件下で、前記の本発明の多核酸分子とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に依存して、相補的二重鎖は、完全にマッチすること、又はミスマッチの塩基も含むことによって、２つのＤＮＡ又はＲＮＡ分子を形成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． １９８９を参照）。約５０ヌクレオチドよりも長いプローブは、ミスマッチの塩基の２５〜３０％まで到達してよい。より小さなプローブは、より少ないミスマッチを達成する。ミスマッチの塩基対を含有する二重鎖を形成する標的及びプローブの傾向は、それ自体が因子の機能であるハイブリダイゼーション条件、例えばハイブリダイゼーション緩衝液中の塩又はホルムアミドの濃度、ハイブリダイゼーションの温度、及びハイブリダイゼーション後の洗浄条件の厳しさによって制御される。雑種二重鎖の形成をもたらすよく知られている原理を適用することによって、所望の厳しさを有する条件は、当業者によって、種々のハイブリダイゼーション緩衝液、温度及び洗浄条件の中から選択することによって達成されうる。従って、条件は、完全にマッチした又は部分的にマッチした雑種二重鎖の検出を可能にすることが選択されうる。二重鎖の溶融温度（Ｔｍ）は、適切なハイブリダイゼーション条件を選択するために有用である。長さ２００ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチド分子のための厳しいハイブリダイゼーション条件は、典型的に、期待された二重鎖の溶融温度未満の温度１５〜２５℃でハイブリダイズすることを含む。より長いプローブよりも安定してない二重鎖を形成する３０ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドプローブのために、厳しいハイブリダイゼーションは、通常、Ｔｍ未満の５〜１０℃でハイブリダイズすることによって達せられる。核酸二重鎖のＴｍは、核酸中で含有されるパーセントＧ＋Ｃに基づく式を使用して計算されることができ、かつ鎖長を考慮に入れ、例えば式は、Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ［ＮＡ+］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ））であり、その際Ｎは鎖長である。
【００３６】
他の観点は、前記のような、本発明による単離されたＤＮＡ分子を含有するベクターに関する。該ベクターは、効率的な形質移入、及びタンパク質の効率的な発現に必要な全ての調節要素を含有する。かかるベクターは、当業者によく知られており、かつあらゆる好適なベクターは、この目的のために選択されうる。
【００３７】
本発明の他の側面は、前記のような本発明のベクターで形質移入させた組換え細胞に関する。細胞の形質移入及び組換え細胞の培養法は、当業者によく知られているように実施されうる。かかる組換え細胞及びそれらからのあらゆる子孫細胞は、ベクターを含有する。従って、細胞系列は、連続的に又はベクターに依存する活性に対して、ＳＤＦ−１突然変異体タンパク質を発現することを提供する。
【００３８】
本発明の他の側面は、前記のような本発明によるＳＤＦ−１α突然変異体タンパク質、多核酸又はベクター、並びに製剤学的に認容性のキャリヤーを含有する医薬品組成物に関する。もちろん、該医薬品組成物は、さらに、通常医薬品組成物に存在する追加の物質、例えば塩、緩衝液、乳化剤、着色剤等を含有してよい。
【００３９】
本発明の他の観点は、前記のような本発明によるＳＤＦ−１タンパク質、多核酸又はベクターの、それぞれの野生型の生物学的活性を阻害又は抑制するための方法における使用に関する。前記のように、本発明のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質は、特異的なアンタゴニストとして作用し、それによって、公知の組換えタンパク質で生じる副作用は、本発明のＳＤＦ−１突然変異体タンパク質で生じない。ＧＡＧ結合アフィニティーを増加することによって、改質されたＳＤＦ−１タンパク質は、特異的なアンタゴニストとして作用し、かつＧＡＧ結合に関して野生型のＧＡＧ結合タンパク質と競合する。
【００４０】
この場合において、これは、特に、癌発達において含まれる生物学的活性である。
【００４１】
従って、前記の本発明によるＳＤＦ−１タンパク質、多核酸又はベクターのさらなる使用は、癌の治療のための薬剤を製造するための方法である。特に、それは、副作用のないアンタゴニストとして作用し、かつ癌疾患の治療に特に好適である。従って、本発明の他の観点は、癌疾患の治療のための方法でもあり、その際、本発明によるＳＤＦ−１突然変異体タンパク質、本発明による単離されたポリ核酸分子もしくはベクター、又は本発明による医薬品配合物が、患者に投与される。
【００４２】
本発明は、次の実施例によってさらに説明されるが、しかしそれらに制限されることはない。
【００４３】
実施例：
実施例１：ＧＡＧ結合アフィニティーの増加
ｗｔＳＤＦ−１ａに対してＳＤＦ−１ａ突然変異体の設計した増加させたＧＡＧ結合アフィニティーを、恒温の蛍光滴定によって測定した（図２を参照）。定常状態の蛍光測定を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｂａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、ＵＫ）ＬＳ５０Ｂ蛍光計で実施した。ＰＢＳ（ｐＨ７．２、１２５ｍＭ ＮａＣｌ）中でＳＤＦ−１ａ野生型又は突然変異体の１８０ｎＭの前平衡した溶液の、２８２ｎｍでの励起に対する発光を、３００〜３９０ｎｍの範囲にわたって記録した。結合等温線を、キュベットホルダーをサーモスタットに取り付けることによって、及び２分間の平衡を可能にするヘパラン硫酸のアリコートの添加によって得た。スリット幅を、励起及び発光のために１２ｎｍに調整し、そしてそのスペクトルを、２００ｎｍ／分で記録した。２９０ｎｍカットオフを、迷光を避けるために挿入した。蛍光スペクトルを、バックグラウンドで収集し、そしてそれぞれの範囲を、３００〜３９０ｎｍで一体化した。３つの独立した実験から得られた蛍光強度（−ΔＦ／Ｆ０）における標準化された平均変化を、リガンド濃度に対してプロットした。得られた結合等温線を、プログラムＯｒｉｇｉｎ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＵＳＡ）を使用する非線形回帰によって、以前に出版されている二分子会合反応を記載している次の化学反応式に適合させた（Ｆａｌｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２８５， １１８０−５）。ｗｔＳＤＦ−１ａに対する約１０のＭｅｔ−ＳＤＦ−１ Δ８ Ｌ２９Ｋ Ｖ３９Ｋ突然変異体の因子によるＨＳアフィニティーにおける明らかな改良を観察した。
【００４４】
実施例２：ＧＰＣＲ活性のノックダウン
細胞遊走を方向付けたＳＤＦ−１ａ野生型及び突然変異体を、５μｍＰＶＰで被覆したポリカルボネート膜を装備した４８ウェルのボイデンチャンバー系（神経プローブ）を使用して調べた。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３及び１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有するＲＰＭＩ１６４０中で５ｎＭから２０ｎＭの範囲のｗｔＳＤＦ−ａ１及び突然変異体希釈を、緩衝液のみを有するウェルを含む、３倍でチャンバーのより低いウェル中に置いた。ＴＨＰ−１細胞懸濁液５０μｌ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を、同様の培地中で、２×１０6細胞／ｍｌで、上部のウェル中に置いた。３７℃で５％ＣＯ2で２時間のインキュベート後に、フィルターの上部表面を、Ｈａｎｋの平衡させた塩溶液中で洗浄した。その遊走細胞を、メタノールで固定し、そしてＨｅｍａｃｏｌｏｒ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）で染色した。５つの４００×倍／ウェルの該遊走細胞を計数し、そして３つの独立して実施した実験の平均を、バックグラウンドで収集し、そしてケモカイン濃度に対してプロットした（図３を参照、ＰＡ５１７＝Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１ Δ８ Ｌ２９Ｋ Ｖ３９Ｋ）。前記のＭｅｔ−ＳＤＦ−１ Δ８ Ｌ２９Ｋ Ｖ３９Ｋ突然変異体は、生体外で明らかに低減した走化性を呈した。
【００４５】
実施例３：乳癌転移の阻害
癌転移に対するＳＤＦ−１ａ突然変異体の阻害活性を検査する目的のために、ネズミの異種移植モデルを使用した。１０週齢の雌の免疫欠損ＳＣＩＤマウスを、生体内実験のために使用した。それらを、実験の全過程中で単離処理で維持した。その動物を、実験を開始する前に落ち着けた後に、数日間放置した。
【００４６】
ＬＭＤ−２３１細胞を、この異種移植モデルにおいて使用した。それらを、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１で接種したマウスの肺転移から培養した。それらの細胞は、ＣＸＣＲ４の高いレベルを表現するために公知であり、かつ異種移植実験において常に使用されている。それらの粘着細胞を、完全最小必須培地中で培養し、そして５０：５０の比でＲＰＭＩの混合を完了し、そして細胞フラスコを、１：３の比で分けた。その細胞を、加湿大気中で３７℃、５％ＣＯ2で培養した。
【００４７】
生体内試験のために、１２００００ ＬＭＤ−２３１細胞を、それぞれのマウスの尾の静脈中に注入した。注入の直前に、その細胞を、対照群に関してＰＢＳと、又は所望の濃度における突然変異体ケモカインと混合した。（細胞及びケモカインを、形式的にインキュベートせず、注入前に共に混合させる継続時間は、平均して５〜１０分であった。）１００μｌの合計量を、それぞれのマウスに注入した。
【００４８】
２８日目に、その動物を、人道的に屠殺し、そして臓器を採取した。それぞれのマウスからの肝臓の半分及び１つの肺を、今後の研究のために急冷凍した。残りの半分の肝臓及び１つの肺を、ホルマリンで固定し、そしてその後パラフィンワックスで包埋した。そして切片を、肝臓（及び肺）から切った。それぞれのマウスからの２つの切片を、ヒト上皮細胞（乳癌）に特異的なサイトケラチンマーカーのカクテルで染色した。
【００４９】
肝臓転移の評価を、ＬＣＭレーザーキャプチャー顕微鏡及びいわゆる統合したソフトフェアを使用してそれぞれの切片の合計範囲を計算することによって達成した。そして、それぞれの切片における転移の合計数を計数し、そして平均Ｍｅｔ／平方ｍｍを計算した（図４）。Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１ Δ８ Ｌ２９Ｋ Ｖ３９Ｋ突然変異体は、２０μｇ／投与量での肝臓中への転移遊走に対する明らかな阻害効果を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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