(57)【要約】  本発明は、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の基質としてのフタレイン化合物の一リン酸エステルの使用に関する。基質は、骨吸収率、ひいては骨粗鬆症等の状態の可能性の指標としての被験体の試料中のＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るためのアッセイに使用される。また、フタレイン化合物の一リン酸エステルと、必要に応じて、全ＴＲＡＰに結合する抗体とを備えるキットおよび方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）の基質としてのフタレイン化合物の一リン酸エステルの使用。
【請求項２】
試料中のＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るための方法であって、基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用してＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイするステップを含む方法。
【請求項３】
被験体における骨吸収率を測定するための方法であって、基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用してＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイすることにより、被験体からの試料中のＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るステップを含み、試料中に存在するＴＲＡＰ５ｂの量は骨吸収率を反映する方法。
【請求項４】
被験体における骨吸収率の変化に関連した障害に対する感受性を診断するための方法であって、基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用してＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイすることにより、被験体の試料中に存在するＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るステップを含み、ＴＲＡＰ５ｂの異常な量は障害を有する被験体を示す方法。
【請求項５】
骨吸収率の変化に関連した障害の予防または治療用の薬物の、薬物を摂取している被験体における効果をモニターする方法であって、（ａ）基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用してＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイすることにより、被験体の試料中に存在するＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るステップと、（ｂ）試料中のＴＲＡＰ５ｂの量を対照試料中のＴＲＡＰ５ｂの量と比較するステップとを含む方法。
【請求項６】
骨吸収率の変化に関連した障害に対する被験体の感受性をスクリーニングする方法であって、基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用してＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイすることにより、被験体の試料中に存在するＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るステップを含み、ＴＲＡＰ５ｂの異常な量はそのような障害に対する感受性を示す方法。
【請求項７】
（ａ）試料中に存在するＴＲＡＰを、全ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂ）に結合する抗体に結合させるステップと、（ｂ）基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用して抗体に結合したＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイすることにより、試料中のＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るステップとを含む、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイするステップが、ｐＨ６．８から７．６、好ましくはｐＨ６．８から７．４、最も好ましくはｐＨ７で行われる、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＴＲＡＰ５ｂの量の測定値が、ＴＲＡＰ５ｂ活性後の試料の色の測定値として得られる、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
試料中のＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイするステップが、順次的ステップ：
（ｅ）試料をフタレイン化合物の一リン酸エステルとともにインキュベートしてＴＲＡＰ５ｂに基質を代謝させるステップと、
（ｆ）代謝を停止させるステップと、
（ｇ）必要に応じて試料のｐＨを調節するステップと、
（ｈ）ＴＲＡＰ５ｂによる代謝からもたらされる基質の特性の変化を測定するステップと
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
試料の色が、分光光度計を使用して測定される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項のいずれか一項において得られたＴＲＡＰ５ｂの測定値を、較正された標準またはチャートと比較することにより、試料中に存在するＴＲＡＰ５ｂの量の絶対値を得るステップをさらに含む、請求項２から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイするステップが、固体基材、好ましくはプラットフォーム、またはマルチウェルプレートもしくはアレイ上で行われる、請求項２から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
プラットフォームが自動化されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
自動化されたプラットフォームが、磁性ビーズを備える、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
フタレイン化合物の一リン酸エステルと、必要に応じて、全ＴＲＡＰに結合する抗体とを備える、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法を実行するためのキット。
【請求項１７】
ＴＲＡＰ５ｂの基質として作用することによる、骨吸収の指標としてのフタレイン化合物の一リン酸エステルの使用。
【請求項１８】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法における、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
一リン酸エステルを被験体からの試料に接触させるステップと、続いて試料の色を測定するステップとを含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
フタレイン化合物が、フェノールフタレインまたはスルホフタレインである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の使用、方法またはキット。
【請求項２１】
フタレイン化合物が、フェノールスルホフタレインである、請求項１９に記載の使用、方法またはキット。
【請求項２２】
フタレイン化合物が、式Ｉ：
【化１】
2011517571.tif 000009
（式中、
Ａは、置換または非置換Ｏ−リン酸化パラ−フェノールであり、
Ｂは、置換または非置換リン酸パラ−フェノールであり、
Ｘは、ＣＯまたはＳＯ２であり、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ４は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
式中、
ｎは、０、１または２であり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素またはＲ７であり、
Ｒ７は、ヒドロカルビル、−（ＣＨ２）ｋ−ヘテロシクリル、−（ＣＨ２）ｋ−Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクリル（これらのいずれも、必要に応じて、ハロゲン、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨおよびそのエステル（例えば−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル）から独立して選択される１個、２個、３個、４個または５個の置換基で置換されていてもよい）、ホスホルアミダイト、Ｃ１〜６アルキルならびにＣ１〜６アルコキシから選択され、ｋは、０、１、２、３、４、５または６である）；あるいは、
【化２】
2011517571.tif 000010
（式中、
Ｘは、ＣＯまたはＳＯ２であり、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ４は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
各Ｒ８は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
各Ｒ９は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
各Ｒ１０は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
各Ｒ１１は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
式中、
ｎは、０、１または２であり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素またはＲ７であり、
Ｒ７は、ヒドロカルビル、−（ＣＨ２）ｋ−ヘテロシクリル、−（ＣＨ２）ｋ−Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクリル（これらのいずれも、必要に応じて、ハロゲン、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨおよびそのエステル（例えば−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル）から独立して選択される１個、２個、３個、４個または５個の置換基で置換されていてもよい）、ホスホルアミダイト、Ｃ１〜６アルキルならびにＣ１〜６アルコキシから選択され、ｋは、０、１、２、３、４、５または６である）を有する化合物である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の使用、方法またはキット。
【請求項２３】
フタレイン化合物の一リン酸エステルが、フェノールフタレイン一リン酸、クレゾールフタレイン一リン酸、チモールフタレイン一リン酸、ｏ−クロロフェノールフタレイン一リン酸、フェノールレッド一リン酸、ｏ−クレゾールレッド一リン酸、ｍ−クレゾールパープル一リン酸、ブロモクレゾールパープル一リン酸、ブロモクレゾールグリーン一リン酸、ブロモフェノールブルー一リン酸、チモールブルー一リン酸、ブロモチモールブルー一リン酸、キシレノールブルー一リン酸、およびクロロフェノールレッド一リン酸からなる群から選択される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の使用、方法またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）、好ましくはＴＲＡＰ５ｂの基質としてのフタレイン化合物の一リン酸エステルの使用に関する。本発明はまた、骨吸収率の指標としての被験体の試料中のＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得ること、およびそれに関する方法に関する。また、試料中のＴＲＡＰ５ｂの測定値を得ることにおけるフタレイン化合物の一リン酸エステルの使用、および本発明の方法の実行のためのキットが提供される。
【背景技術】
【０００２】
骨は、２つの主要な細胞の種類である、骨形成を担う骨芽細胞、および骨破壊（吸収）を担う破骨細胞からなる。破骨細胞は、石灰化した骨に潜り込んでその構成部分に分解する多核細胞である。吸収プロセスは、骨単位に対する破骨細胞の付着を含む。次いで破骨細胞は、その細胞膜の陥入を誘発し、コラゲナーゼおよび吸収プロセスにおいて重要なその他の酵素を分泌する。骨が吸収されると、高レベルのカルシウム、マグネシウム、ホスフェートおよびコラーゲンの生成物が細胞外液中に放出される。通常、骨芽細胞および破骨細胞は、形成される量と同じ量の骨が吸収されるように平衡を保っている。小児期には骨形成が吸収を上回るが、老化プロセスが生じるにつれて吸収が形成を上回る。
【０００３】
いくつかの病状が骨吸収率の変化と関連していることが知られており、おそらく最も広く発生しているのは骨粗鬆症である。この特定の状態は、破骨細胞の活性の増加の結果であると考えられ、特に更年期後の女性において骨量の低下をもたらす。これは、骨の弱体化および骨折し易さの増加をもたらす。この年齢層の女性における骨折は深刻となる可能性があり、これらの、および骨粗鬆症により引き起こされる他の症状の治療は高額となり得、医療専門家にとって難しいものとなる。骨粗鬆症に感受性の者の診断は、状態が深刻な結果となる可能性を防止するために、長年重要であると認識されている。骨粗鬆症は、例えばエストロゲン補充療法またはビスホスホネート治療により、次第に成功裏に治療されるようになってきている。
【０００４】
骨粗鬆症またはその感受性の指標は、被験体における骨密度の測定値であり、低い骨密度は、骨の過剰な吸収、ひいては骨粗鬆症またはその他の状態の可能性を示唆する。この層の人々は、特に西欧諸国においては商業的に重要な市場であると認識されているため、骨密度を測定するための多くの方法および機器が開発されている。これらのうち、特異的で、迅速で、また安価なものが好ましい。
【０００５】
酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）は、電気泳動移動度による酸性ホスファターゼの５型クラスに属する。ＴＲＡＰは、同定されている７種の酸性ホスファターゼのうち最も酸性であり、唯一酒石酸による阻害に対する耐性を有する。ＴＲＡＰは、分子の活性部位にけるスピン結合鉄単位を含有する塩基性糖タンパク質である。ＴＲＡＰの二核鉄単位は、タンパク質を紫色とする２個の第二鉄イオンを含有し、その結果これは紫色酸性ホスファターゼとしても知られる。このタンパク質は、３２ｋｄの分子量を有する。例えばβ−メルカプトエタノールにより酵素が還元されると、第二鉄イオンの１つが還元され、酵素はピンク色になる。ＴＲＡＰは、インビトロでタンパク質チロシンホスファターゼとして機能することができ、そのアミノ酸配列は、リンタンパク質ホスファターゼの領域と相同性の領域を含有する。しかしながら、ＴＲＡＰの天然基質はまだ未知である。
【０００６】
いくつかの研究は、骨吸収プロセスにおいてＴＲＡＰを関連付けている。マウスにおけるＴＲＡＰ遺伝子の破壊（Ｈａｙｍａｎ，Ａ．Ｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ第１２２巻：３１５１〜３１６２頁、１９９６）は、軟骨内骨化の途絶および軽度の骨粗鬆症をもたらし、これは成長する骨における軟骨の正常な石灰化、ならびに骨基質吸収への重要な寄与による成人骨格の完全性および代謝回転の維持には、ＴＲＡＰが必要であることを示唆している。
【０００７】
ヒトにおいては、ＴＲＡＰが見られる唯一の正常な細胞は、破骨細胞および活性化マクロファージである。骨吸収の間、破骨細胞から血液内にＴＲＡＰが分泌されることが見出されている。したがって、血清中のＴＲＡＰの濃度は骨吸収のマーカーとして提案されており、血清中のＴＲＡＰの濃度は骨吸収率に関連していることが見出されている（Ｋｒａｅｎｚｌｉｎ  Ｍ．Ｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ第７１（２）巻：４４２〜４５１頁、１９９０；Ｃｈｅｕｎｇ  Ｃ．Ｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ第４１（５）巻：６７９〜６８６頁、１９９５；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  Ｐ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．第４１（１０）巻：１４９５〜１４９９頁、１９９５およびＨａｌｌｅｅｎ  Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第１１（１０）巻：１４４４〜１４５２頁、１９９６）。
【０００８】
ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂとして知られる、ＴＲＡＰの２つのアイソフォームが同定されている（Ｌａｍ  Ｗ．Ｋ．Ｗ．ら、（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．第２４（７）巻：１１０５〜１１０８頁、１９７８））。ＴＲＡＰ５ａは、ＴＲＡＰ５ｂよりも低い最適ｐＨで活性であり、それによりＴＲＡＰの各アイソフォームに対する機能アッセイが可能である。例えば骨吸収率の決定を目的としたＴＲＡＰ５ｂの血清または血漿中濃度の測定における大きな課題は、主としてマクロファージおよび樹状細胞により産生される酵素の５ａアイソフォームの存在である。両方のアイソフォームは、ａｃｐ５遺伝子の産物であり、翻訳後の改質における変動の点でのみ異なる。ＴＲＡＰ５ｂは、ＴＲＡＰ５ａに存在するある特定のシアル酸残基（タンパク質の炭水化物基上にある）を欠いている。このアイソフォームはまた、約１４残基セグメントのアミノ酸鎖がＴＲＡＰ５ｂからタンパク質分解により切り離されている点で異なる。その他、コアタンパク質は同一であり、純粋に免疫学的に２つの型を区別する方法は得られていない。結果として、ＴＲＡＰ５ｂに対する現行の商業的イムノアッセイは、２つの型の間の生化学的な差異を利用している。
【０００９】
ＴＲＡＰ活性は、分光光度法により、例えば、その他の酸性ホスファターゼのほとんどを阻害する酒石酸塩の存在下で、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を基質として供給することにより決定することができる。しかしながら、この方法はあまり特異的ではなく、したがってより特異的な方法すなわちイムノアッセイがＴＲＡＰの決定のために開発されている。ポリクローナル抗体を使用したＴＲＡＰの様々なアッセイが開発されている（Ｓｔｅｐａｎ  Ｊ．Ｊら、（Ｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｂｉｏｐｈｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第１６５巻：１０２７〜１０３４頁、１９８９）、Ｋｒａｅｎｚｌｉｎ  Ｍ．Ｅら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ第７１（２）巻：４４２〜４５１頁、１９９０）およびＣｈｅｕｎｇ  Ｃ．Ｋら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．第４１（５）巻：６７９〜６８６頁、１９９５））。ＴＲＡＰに対してポリクローナル抗体を使用した研究では、小児および更年期後の女性が血清中に高濃度のＴＲＡＰを有していたことが示された（Ｈａｌｌｅｅｎ  Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第１１巻（１０：１４４４〜１４５２頁、１９９６）。
【００１０】
Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  Ｐ．ら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．第４１（１０）巻：１４９５〜１４９９頁、１９９５）は、組換えにより生成されたＴＲＡＰに対しモノクローナル抗体を使用したアッセイを説明している。
【００１１】
ＴＲＡＰ５ｂが、全ＴＲＡＰよりも特異的な骨吸収の生化学的マーカーであるという所見に基づき、国際特許出願ＷＯ１９９９／０５０６６２は、ＴＲＡＰ５ａによる干渉を低減しながら５ｂアイソフォームの活性を最大化するために、一般的なホスファターゼ基質であるパラ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を決められたｐＨ域の緩衝液中で使用した、ＴＲＡＰ５ｂのアッセイを記載している。
【００１２】
欧州特許第１５９８６７０号は、ＴＲＡＰ５ｂの測定に好適な酸性ホスファターゼ基質を記載しているが、例示的基質のうちの１つである２−クロロ−４−ニトロフェニルホスフェートの、ＴＲＡＰ５ａを上回るＴＲＡＰ５ｂに対する相対活性は、上述のＷＯ１９９９／０５０６６２において達成された相対活性よりも０．８倍大きいにすぎない。
【００１３】
米国特許第７，０７４，９０３号は、ＴＲＡＰ５ａを上回るＴＲＡＰ５ｂに対する特異性を示すと主張されているモノクローナル抗体を記載している。しかしながら、抗体は、（ヒト血清から単離された）ＴＲＡＰ５ｂよりも天然ＴＲＡＰ５ａにより類似していると考えられる組換えヒトＴＲＡＰ５と同等の交差反応を示す。したがって、記載されたアッセイにおける抗体の機能的特異性は、ＴＲＡＰ５ａと５ｂとを区別する上で、ＷＯ１９９９／０５０６６２または欧州特許第１５９８６７０号に記載の活性アッセイよりも著しく有利であるわけではない。
【００１４】
ＴＲＡＰ５ａの酵素活性は５ｂの酵素活性より著しく低い（臨床的に有用な型）ため、既知の商業的アッセイは、ある特定の臨床的用途における使用に好適である。しかしながら、広範な数多くの研究において公開されているデータを評価すると、正常試料における５ａによる干渉は５０％もの高さとなり得ることが推測され得る。これは、ＴＲＡＰ５ｂレベルの変化が大きいいくつかの臨床的用途では著しい課題となることはないが、既知の方法は、ＴＲＡＰ５ｂレベルのより微妙な変化を区別する能力に欠けている可能性がある。
【００１５】
既知のアッセイにおいて使用される基質ｐＮＰＰおよびその４−ハロ−置換誘導体は、溶液中で安定ではない。アッセイが手作業で行われ、また基質が使用直前に溶解される固体として提供される場合は、これは問題ではない。しかしながら、基質の不安定性は、基質が溶液中で数週間安定であることを必要とする自動化免疫測定プラットフォーム上でのこれらの化合物の使用を困難とする。
【００１６】
米国特許第３，９７５，４０５号は、ｏ−クレゾールフタレインの一リン酸エステルおよび血清試料中のアルカリ性ホスファターゼ測定用の基質としてのその使用を記載しており、ビリルビンによりもたらされる干渉を回避すること、ならびにチモールフタレイン一リン酸よりも腸および胎盤のアルカリ性ホスファターゼのアイソフォームに対し敏感であることの利点を主張している。記載された方法は、アルカリ性ホスファターゼまたは酸性ホスファターゼ酵素の各種アイソフォームを区別せず、またＴＲＡＰ５ｂの基質としてのその使用を記載していない。
【００１７】
米国特許第４，０４５，２９０号は、適切なｐＨ条件下での血清中の全アルカリ性ホスファターゼの測定、および血清中の全酸性ホスファターゼの測定のためのホスファターゼ基質としてのチモールブルー一リン酸の調製および使用を記載している。記載された方法は、アルカリ性ホスファターゼまたは酸性ホスファターゼ酵素の各種アイソフォームを区別しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第１９９９／０５０６６２号
【特許文献２】欧州特許第１５９８６７０号明細書
【特許文献３】米国特許第７，０７４，９０３号明細書
【特許文献４】米国特許第３，９７５，４０５号明細書
【特許文献５】米国特許第４，０４５，２９０号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｈａｙｍａｎ，Ａ．Ｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ第１２２巻：３１５１〜３１６２頁、１９９６
【非特許文献２】Ｋｒａｅｎｚｌｉｎ  Ｍ．Ｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ第７１（２）巻：４４２〜４５１頁、１９９０
【非特許文献３】Ｃｈｅｕｎｇ  Ｃ．Ｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ第４１（５）巻：６７９〜６８６頁、１９９５
【非特許文献４】Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  Ｐ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．第４１（１０）巻：１４９５〜１４９９頁、１９９５
【非特許文献５】Ｈａｌｌｅｅｎ  Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第１１（１０）巻：１４４４〜１４５２頁、１９９６
【非特許文献６】Ｌａｍ  Ｗ．Ｋ．Ｗ．ら、（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．第２４（７）巻：１１０５〜１１０８頁、１９７８）
【非特許文献７】Ｓｔｅｐａｎ  Ｊ．Ｊら、（Ｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｂｉｏｐｈｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第１６５巻：１０２７〜１０３４頁、１９８９）
【非特許文献８】Ｈａｌｌｅｅｎら、ＪＢＭＲ第１５巻１３３５〜１４３４頁（２０００）
【非特許文献９】Ｔｉｓｓｊｅｎ（編集）、Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻第５章）
【非特許文献１０】Ｈａｌｌｅｅｎら、ＪＭＢＲ第１４巻（４６４〜９頁（１９９９））
【非特許文献１１】Ｊａｎｃｋｉｌｌａら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ第１６巻、１７５〜８２頁（１９９７）
【非特許文献１２】Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第３版、ＲＭＣ  Ｄａｗｓｏｎら、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  １９８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、現行のアッセイと比較してＴＲＡＰ５ａによる干渉が実質的に低減され、また自動化方式に容易に適応可能な、ＴＲＡＰ５ｂをアッセイするための方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）の基質としてのフタレイン化合物の一リン酸エステルの使用を提供する。
【００２２】
本明細書において、フタレイン化合物の一リン酸エステルは、下記式：
【００２３】
【化１】
2011517571.tif 000002
【００２４】
（式中、
Ａは、置換または非置換Ｏ−リン酸化パラ−フェノールであり、
Ｂは、置換または非置換リン酸パラ−フェノールであり、
Ｘは、ＣＯまたはＳＯ２であり、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ４は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
式中、
ｎは、０、１または２であり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素またはＲ７であり、
Ｒ７は、ヒドロカルビル、−（ＣＨ２）ｋ−ヘテロシクリル、−（ＣＨ２）ｋ−Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクリル（これらのいずれも、必要に応じて、ハロゲン、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨおよびそのエステル（例えば−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル）から独立して選択される１個、２個、３個、４個または５個の置換基で置換されていてもよい）、ホスホルアミダイト、Ｃ１〜６アルキルならびにＣ１〜６アルコキシから選択され、ｋは０、１、２、３、４、５または６である）の化合物として定義される。
【００２５】
好ましくは、フタレイン化合物の一リン酸エステルは、下記式：
【００２６】
【化２】
2011517571.tif 000003
【００２７】
（式中、
Ｘは、ＣＯまたはＳＯ２であり、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ３は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
Ｒ４は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
各Ｒ８は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
各Ｒ９は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
各Ｒ１０は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
各Ｒ１１は、水素、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、−ＯＲ５、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ｎＲ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）Ｒ６およびＲ７から選択され、
式中、
ｎは、０、１、または２であり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素またはＲ７であり、
Ｒ７は、ヒドロカルビル、−（ＣＨ２）ｋ−ヘテロシクリル、−（ＣＨ２）ｋ−Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクリル（これらのいずれも、必要に応じて、ハロゲン、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、−ＣＯＯＨおよびそのエステル（例えば−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜６アルキル）から独立して選択される１個、２個、３個、４個または５個の置換基で置換されていてもよい）、ホスホルアミダイト、Ｃ１〜６アルキルならびにＣ１〜６アルコキシから選択され、ｋは、０、１、２、３、４、５または６である）の化合物として定義される。
【００２８】
好ましくは、本発明の一リン酸エステルが誘導されるフタレイン化合物は、フェノールフタレインまたはスルホフタレイン、好ましくはフェノールスルホフタレインである。
【００２９】
本発明はまた、試料中のＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るための方法であって、基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用してＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイするステップを含む方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、被験体における骨吸収率を測定するための方法であって、基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用してＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイすることにより、被験体からの試料中のＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るステップを含み、試料中に存在するＴＲＡＰ５ｂの量は骨吸収率を反映する方法を提供する。
【００３１】
本発明はまた、被験体における骨吸収率の変化に関連した障害を診断するための方法であって、基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用してＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイすることにより、被験体の試料中に存在するＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るステップを含み、ＴＲＡＰ５ｂの異常な量は障害を有する被験体を示す方法を提供する。
【００３２】
本発明はまた、骨吸収率の変化に関連した障害の予防または治療用の薬物の、薬物を摂取している被験体における効果をモニターする方法であって、（ａ）基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用してＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイすることにより、被験体の試料中に存在するＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るステップと、（ｂ）試料中のＴＲＡＰ５ｂの量を対照試料中のＴＲＡＰ５ｂの量と比較するステップとを含む方法を提供する。
【００３３】
本発明はまた、骨吸収率の変化に関連した障害に対する被験体の感受性をスクリーニングする方法であって、基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用してＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイすることにより、被験体の試料中に存在するＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るステップを含み、ＴＲＡＰ５ｂの異常な量はそのような障害に対する感受性を示す方法を提供する。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法は、（ａ）試料中に存在する全ＴＲＡＰを、全ＴＲＡＰ、ＴＲＡＰ５ａまたはＴＲＡＰ５ｂに特異的な抗体に結合させるステップと、（ｂ）未結合分画を溶離するステップと、（ｃ）基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用して、抗体に結合したＴＲＡＰ５ｂの活性、または未結合分画中のＴＲＡＰ５ｂの量をアッセイすることにより、試料中のＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るステップとを含む。
【００３５】
好ましくは、試料中のＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイするステップは、順次的ステップ：
（ａ）試料を基質としてのフタレイン化合物の一リン酸エステルとともにインキュベートしてＴＲＡＰ５ｂに基質を代謝させるステップと、
（ｂ）代謝を停止させるステップと、
（ｃ）必要に応じて試料のｐＨを調節するステップと、
（ｄ）ＴＲＡＰ５ｂによる代謝からもたらされる基質の特性の変化を測定するステップとを含む。
【００３６】
また、フタレイン化合物の一リン酸エステルと、必要に応じて全ＴＲＡＰ、ＴＲＡＰ５ａまたはＴＲＡＰ５ｂに特異的な抗体とを備える、本発明の方法を実行するためのキットも提供される。
【００３７】
また、ＴＲＡＰ５ｂの基質として作用することによる、骨吸収率の指標としてのフタレイン化合物の一リン酸エステルの使用も提供される。好ましくは、一リン酸エステルを被験体からの試料と接触させ、続いて前記一リン酸エステルの特性の任意の変化を測定することによる、骨吸収率の指標としてのフタレイン化合物の一リン酸エステルの使用が提供される。好ましくは、本発明の方法において、ＴＲＡＰ５ｂの基質として作用することによる、骨吸収率の指標としてのフタレイン化合物の一リン酸エステルの使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１ａ】ＴＲＡＰ５ａによるＰＴＭＰ加水分解の経過を示す図である。各チャート内の凡例は、アッセイ毎に使用されたＴＲＡＰ５の量を示す。
【図１ｂ】ＴＲＡＰ５ｂによるＰＴＭＰ加水分解の経過を示す図である。各チャート内の凡例は、アッセイ毎に使用されたＴＲＡＰ５の量を示す。
【図１ｃ】ＴＲＡＰ５ａによるＴＴＭＰ加水分解の経過を示す図である。各チャート内の凡例は、アッセイ毎に使用されたＴＲＡＰ５の量を示す。
【図１ｄ】ＴＲＡＰ５ｂによるＴＴＭＰ加水分解の経過を示す図である。各チャート内の凡例は、アッセイ毎に使用されたＴＲＡＰ５の量を示す。
【図２】ＰＴＭＰ基質を使用したＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの、ｐＨ対活性のプロファイルを示す図である。
【図３】ＣＭ−セファロースでのヒト血清由来ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの分画を示す図である。
【図４】ｐＮＰＰベースアッセイにより測定された血清ＴＲＡＰ５濃度とＰＴＭＰベースアッセイにより測定された血清ＴＲＡＰ５濃度との間の相関関係を示す図である。
【図５】基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）およびフェノールフタレイン一リン酸を使用した、ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂのアッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書において、ＴＲＡＰは、酸性ホスファターゼの５型クラスのメンバーである酒石酸耐性酸性ホスファターゼを指す。特に指定されない限り、「ＴＲＡＰ」または全ＴＲＡＰは、酵素の両方のアイソフォーム、すなわちＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂを含む。ＴＲＡＰ５ｂは、その炭水化物鎖においてシアル酸を欠いているＴＲＡＰ酵素のアイソフォームであり、ｐＨ５．７から６．１においてｐＮＰＰ基質に対し最適な酵素活性を示す。ＴＲＡＰ５ａは、その炭水化物鎖においてシアル酸残基を有する酵素の型であり、約ｐＨ４．９においてｐＮＰＰに対し最適な酵素活性を示す。ＴＲＡＰ、ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂという用語は、それぞれ、ＴＲＡＣＰ、ＴＲＡＣＰ５ａおよびＴＲＡＣＰ５ｂと交換可能に使用される。
【００４０】
フタレイン化合物の一リン酸エステルは、上に定義されるような式（Ｉ）または好ましくは式（ＩＩ）を有する化合物として定義される。
【００４１】
一実施形態において、Ｒ１からＲ４およびＲ８からＲ１１のそれぞれは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−Ｃ≡Ｎ、−ＯＨ、−ＮＯ２、−ＳＯ２Ｈまたはそのエステル、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨまたはそのエステル、−ＣＯＮＨ２、−Ｃ１〜４アルキル（例えばＭｅ、Ｅｔ、ＰｒもしくはＢｕ）あるいは−Ｃ１〜４アルコキシ（例えば−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒもしくは−ＯＢｕ）から独立して選択される。好適なエステルには、アルキルエステル、例えばＣ１〜Ｃ４アルキル、および活性化エステル、例えばＮ−ヒドロキシコハク酸イミドが含まれた。
【００４２】
一実施形態において、Ｒ１からＲ４のそれぞれはＨである。
【００４３】
別の実施形態によれば、Ｒ３は、Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、ハロゲンまたはトリフルオロメチルである。別の実施形態によれば、Ｒ３は、Ｈ、ブロモ、クロロ、フルオロ、メトキシ、エトキシ、ｉ−プロポキシおよびｔ−ブトキシから選択される。必要に応じて、Ｒ３はＨである。この段落において言及された実施形態のある特定の化合物において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４はすべてＨである。いくつかの他の化合物において、それらは、Ｈ、ハロゲンおよびＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される。
【００４４】
「ヒドロカルビル」という用語は、１個、２個、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有する基を含む。この用語は、１個、２個、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有する非環式脂肪族基、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有する環式脂肪族基、および６個の炭素原子を有する芳香族基を含む。典型的には、「ヒドロカルビル」という用語は、１個、２個、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。しかしながら、ヒドロカルビルという用語はまた、２個、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有するアルケニルおよびアルキニル基を含むように意図される。
【００４５】
「ヘテロシクリル」という用語は、３個、４個、５個または６個の環員を有する環式基を含み、少なくとも１個はヘテロ原子（例えばＮ、ＯまたはＳ）である。
【００４６】
一実施形態によれば、各Ｒ８は、Ｈ、メチル、エチル、イソ−プロピル、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはメトキシ、エトキシ、ｉ−プロポキシおよびｔ−ブトキシから独立して選択される。必要に応じて、各Ｒ８は、Ｈ、Ｍｅ、Ｂｒ、イソ−プロピル、またはＣｌである。
【００４７】
一実施形態によれば、各Ｒ９は、Ｈ、メチル、エチル、イソ−プロピル、ブロモ、クロロ、フルオロ、メトキシ、エトキシ、ｉ−プロポキシおよびｔ−ブトキシから独立して選択される。必要に応じて、各Ｒ９は、Ｈ、Ｍｅ、またはＢｒである。
【００４８】
一実施形態によれば、各Ｒ１０は、ＨまたはＭｅから独立して選択される。
【００４９】
一実施形態によれば、各Ｒ１１は、ＨまたはＭｅから独立して選択される。
【００５０】
本明細書において、独立してとは、同じかまたは異なる。
【００５１】
Ａが置換Ｏ−リン酸化パラ−フェノールである場合、好適な置換基には、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＯＣＦ３、−Ｃ≡Ｎ、−ＯＨ、−ＮＯ２、−ＳＯ２Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−Ｃ１〜４アルキル（例えばＭｅ、Ｅｔ、ＰｒもしくはＢｕ）または−Ｃ１〜４アルコキシ（例えば−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒもしくは−ＯＢｕ）等が含まれる。
【００５２】
Ｂが置換リン酸パラ−フェノールである場合、好適な置換基には、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＯＣＦ３、−Ｃ≡Ｎ、−ＯＨ、−ＮＯ２、−ＳＯ２Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−Ｃ１〜４アルキル（例えばＭｅ、Ｅｔ、ＰｒもしくはＢｕ）または−Ｃ１〜４アルコキシ（例えば−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒもしくは−ＯＢｕ）等が含まれる。
【００５３】
実施形態の１つのクラスにおいて、化合物は、別の分子、例えば生体分子、タンパク質、ポリペプチド等に直接的または間接的に結合した反応性官能基を含むＲ１からＲ１１から選択される少なくとも１つの置換基を有する。
【００５４】
一実施形態において、Ｒ１からＲ４はそれぞれＨであり、ＸはＣＯであり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、第１表に定義される通りである。別の実施形態において、Ｒ１からＲ４はそれぞれＨであり、ＸはＳＯ２であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、第２表に定義される通りである。
【００５５】
一実施形態において、各Ｒ８基は、独立して、ブロモ、クロロまたはフルオロであり、各Ｒ９基は、独立して、メチル、エチル、イソ−プロピルまたはｔ−ブチルである。必要に応じて、各Ｒ８基は、独立して、ブロモまたはクロロであり、各Ｒ９基は、独立して、メチル、エチルまたはイソ−プロピルである。
【００５６】
一実施形態において、Ｒ１からＲ１１のうちの１つ、２つまたは３つのみが、Ｈ以外である。
【００５７】
一実施形態において、各Ｒ８基は、独立して、ブロモ、クロロまたはフルオロであり、各Ｒ９基は、独立して、ブロモ、クロロまたはフルオロである。必要に応じて、各Ｒ８基は、独立して、ブロモまたはクロロであり、各Ｒ９基は、独立して、ブロモまたはクロロである。
【００５８】
一実施形態において、各Ｒ８基は、独立して、メチル、エチル、イソ−プロピルまたはｔ−ブチルであり、各Ｒ１０基は、メチル、エチル、イソ−プロピルまたはｔ−ブチルである。必要に応じて、各Ｒ８基は、独立して、メチル、エチルまたはイソ−プロピルであり、各Ｒ１０基は、メチル、エチルまたはイソ−プロピルである。
【００５９】
本発明における好ましいフタレイン化合物の一リン酸エステルには、フェノールフタレイン一リン酸、クレゾールフタレイン一リン酸、チモールフタレイン一リン酸、ｏ−クロロフェノールフタレイン一リン酸、フェノールレッド一リン酸、ｏ−クレゾールレッド一リン酸、ｍ−クレゾールパープル一リン酸、ブロモクレゾールパープル一リン酸、ブロモクレゾールグリーン一リン酸、ブロモフェノールブルー一リン酸、チモールブルー一リン酸、ブロモチモールブルー一リン酸、キシレノールブルー一リン酸、およびクロロフェノールレッド一リン酸が含まれる。
【００６０】
また、本発明における基質として、ＴＲＡＰ５ｂによる代謝後に特性の変化を示す、本発明のフタレイン化合物の一リン酸エステルの官能性誘導体または塩が含まれる。
【００６１】
フタレイン化合物の一リン酸エステルは、式Ｉのいずれかのヒドロキシル基のエステル化により生成され得る。フタレイン化合物の一リン酸エステルは、当技術分野において知られた方法、例えば米国特許第３，９７５，４０５号および米国特許第４，０４５，２９０号に記載の方法により調製することができる。
【００６２】
被験体は、任意の脊椎動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであってもよい。実施形態において、被験体は女性である。
【００６３】
被験体からの試料は、被験体から得られた任意の体液試料、好ましくは血液試料、例えば血漿または血清であってもよい。他の好適な体液試料には、滑液、唾液および尿が含まれる。
【００６４】
本発明において使用されるＴＲＡＰに対する抗体には、全ＴＲＡＰに結合し、いずれかのアイソフォームに特異的ではない抗体、およびＴＲＡＰアイソフォームへの優先的な結合を示し、したがってＴＲＡＰ５ａまたはＴＲＡＰ５ｂに特異的と言われる抗体が含まれる。抗ＴＲＡＰ抗体の特異性を決定するための方法は当技術分野において、例えばＨａｌｌｅｅｎら、ＪＢＭＲ第１５巻１３３５〜１４３４頁（２０００）において説明されている。本発明において使用される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよいが、好ましくは後者である。抗体は、任意の種からのＴＲＡＰ５ｂに対して惹起させてもよいが、好ましくはマウス、ラットまたはヒトからのＴＲＡＰ５ｂに対して成長させる。好ましくは、抗体は、免疫原としてネイティブＴＲＡＰ５ｂを使用して、また当技術分野において利用可能な方法を使用して、任意の好適な動物源、例えばマウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギから得られる（Ｔｉｓｓｊｅｎ（編集）、Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻第５章）。本発明における使用に好ましいモノクローナル抗体には、４Ｅ６、０１Ａ、およびＪ１Ｂ（Ｈａｌｌｅｅｎら、ＪＭＢＲ第１４巻（４６４〜９頁（１９９９））、１４Ｇ６および９Ｃ５（Ｊａｎｃｋｉｌｌａら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ第１６巻、１７５〜８２頁（１９９７））が含まれる。
【００６５】
本発明は、被験体における骨吸収率の指標として試料中のＴＲＡＰの量の測定値を得るために、ＴＲＡＰ５ｂの基質としてフタレイン化合物の一リン酸エステルを使用することに基づく。これは、フタレイン化合物の一リン酸エステルがＴＲＡＰ５ａよりもＴＲＡＰ５ｂにより優先的に代謝され、したがって試料中のＴＲＡＰ５ｂ活性の特異的な測定値を得るために使用することができるという観察に基づく。基質に対するＴＲＡＰ５ｂの活性は、ＴＲＡＰ５ｂによる基質の代謝とも呼ばれるが、基質の特性を変化させ、この変化がＴＲＡＰ５ｂの活性の測定値として、ひいては試料中のＴＲＡＰ５ｂの量の測定値として使用される。特性は、任意の測定可能な特性、例えば構造または機能の変化であってもよい。好ましくは、変化は構造的変化であり、好ましくはＴＲＡＰ５ｂによる基質からのリン酸基の除去、好ましくは式（Ｉ）におけるＡまたはＢのリン酸の除去、より特に好ましくは式（ＩＩ）のリン酸エステル基の除去である。この構造的変化は、基質の色の変化をもたらし、これを測定して存在するＴＲＡＰ５ｂの量を示すことができる。
【００６６】
したがって、ＴＲＡＰ５ｂの量の測定値を得るステップは、基質に対するＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイするステップを含む。アッセイは、被験体からの試料を本発明の基質とインキュベートするステップを含む。
【００６７】
好ましくは、アッセイは、まず試料中のＴＲＡＰを抗体に結合させ、試料からＴＲＡＰを単離するステップを含む。使用される抗体の特異性に依存して、全ＴＲＡＰ、ＴＲＡＰ５ａまたはＴＲＡＰ５ｂのいずれかが単離され得る。次いで、使用される抗体の特異性に依存して、試料の未結合分画または結合分画に基質を添加することより、ＴＲＡＰ５ｂ活性を測定することができる。非アイソフォーム特異的抗体が使用される場合、例えばＴＲＡＰ５ｂ活性に有利な条件下で活性アッセイを行う等、ＴＲＡＰ５ｂ活性を特異的に決定するために他の方法が追加的に使用されてもよい。したがって、好ましくは、ＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイするステップは、ｉ）ＴＲＡＰ５ａに特異的な抗体に結合させ、ＴＲＡＰ５ｂを含む非結合分画の基質に対する活性をアッセイするステップ、（ｉｉ）ＴＲＡＰ５ｂに特異的な抗体に結合させ、ＴＲＡＰ５ｂを含む結合分画の基質に対する活性をアッセイするステップ、または（ｉｉｉ）非アイソフォーム特異的なＴＲＡＰ抗体に結合させ、ＴＲＡＰ５ｂ活性に有利な条件下で、ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂを含む結合分画の基質に対する活性をアッセイするステップを含む。好ましい実施形態において、ＴＲＡＰ５ｂ活性のアッセイの特異性をさらに増加させるために、上記（ｉ）および／または（ｉｉ）もまたＴＲＡＰ５ｂ活性に有利な条件下で行ってもよい。
【００６８】
ＴＲＡＰ５ａ活性を上回るＴＲＡＰ５ｂ活性に影響する条件には、ｐＨが含まれる。例えば、ＴＲＡＰ５ａ活性よりもＴＲＡＰ５ｂ活性に優先的なｐＨでアッセイを行うことができる。したがって、好ましくは、ＴＲＡＰ５ｂの活性をアッセイするステップは、ｐＨ６．８から７．６、好ましくはｐＨ６．８から７．４、最も好ましくはｐＨ７から７．２で行われる。
【００６９】
好ましくは、基質の代謝は、反応条件を変更することにより、例えば、水酸化ナトリウム、塩酸、オルトリン酸水素二ナトリウム、オルトリン酸二水素ナトリウムまたは１Ｍグリシン／ＮａＯＨ  ｐＨ１１等の試薬を添加することにより停止される。
【００７０】
ＴＲＡＰ５ｂの代謝に起因した基質の特性の変化は、任意の好適な手段を使用して測定することができる。変化が色の変化となる場合、これは好ましくは分光光度計を使用して測定される。得られた値は、ＴＲＡＰ５ｂによる活性の量の指標として使用することができ、したがって試料中のＴＲＡＰ５ｂの量の測定値として使用することができる。この値は、較正された標準またはチャートとの比較により、ＴＲＡＰ５ｂの量に変換することができる。
【００７１】
分光光度計を使用して基質の色の変化を測定する場合、フタレイン生成物が最大吸光度を有する波長で吸光度を測定する。好ましくは、吸光度は、４５０ｎｍ、５４０ｎｍ、５５０ｎｍ、５９２ｎｍまたは５９５ｎｍで測定される。
【００７２】
いくつかの基質は、試料中の任意の色の変化を観察するために、ｐＨの調節を必要とし得る。したがって、本発明の方法は、試料中の任意の色の変化を測定する前に試料のｐＨを調節するステップを含んでもよい。ｐＨは、適切な量の酸またはアルカリを添加して、試料のｐＨを特定の基質の任意の色の変化が観察されるｐＨにすることにより、調節することができる。基質の色の変化が観察されるｐＨは、「Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第３版、ＲＭＣ  Ｄａｗｓｏｎら、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  １９８９に記載されている。
【００７３】
したがって、本発明の方法は、得られたＴＲＡＰ５ｂの測定値を、較正された標準またはチャートと比較することにより、存在するＴＲＡＰ５ｂの量の絶対値を得ることをさらに提供し得る。絶対値は、１分当たり加水分解される基質のミクロ分子の単位で測定されるＴＲＡＰ５ｂの量である。
【００７４】
好ましくは、例えばアレイ、チップまたはマルチウェルプレート上で、複数の試料を同時にアッセイすることができる。本発明のアッセイは、好ましくは、自動化プラットフォーム上の固定化マトリックス上で行われる。好ましくは、固定化マトリックスは抗体で被覆されている。最も好ましくは、マトリックスが使用される場合、マトリックスは、例えばロボットまたはその他の自動化機器による試料のハイスループットアッセイを可能とするために、抗体が被覆される磁性ビーズを備える。
【００７５】
骨吸収率の変化に関連した障害には、典型的には異常な骨密度をもたらす、骨吸収率が異常な任意の障害を含む。そのような障害には、骨粗鬆症、骨パジェット病、多発性骨髄腫、代謝性骨疾患、転移、骨病変、変形性関節症、関節リウマチおよび心臓血管障害、特に動脈硬化性プラーク形成と関連したものが含まれ得る。骨吸収率の変化は、骨が破壊または吸収される程度の変化を意味し、したがってこれは骨の密度に影響し得る。
【００７６】
骨吸収率は、試料中のＴＲＡＰ５ｂの量またはＴＲＡＰ５ｂの活性と、骨吸収率の較正された標準またはチャートとの比較により決定することができる。得られた骨吸収率は、骨吸収率の変化と関連した障害を診断するため、またはそのような障害に対する感受性を決定するために使用することができる。好ましい実施形態において、本発明の方法は、試料中のＴＲＡＰの測定値をチャートと比較し、前記測定値を特定の障害に対する感受性、またはその存在と直接関連付けるステップを含む。
【００７７】
「障害を診断する」とは、被験体における骨吸収率を評価することにより障害の存在を決定することを意味する。方法はまた、特定の障害または骨吸収率と関連していることが知られている他の症状の存在または不在を特定するステップを含んでもよい。
【００７８】
「障害に対する感受性を決定する」とは、骨吸収率を評価することにより被験体における障害の発症の可能性を決定することを意味する。方法は、追加的に、前記障害の発症の可能性のその他任意の指標を特定するステップを比較してもよい。
【００７９】
異常な骨吸収率と関連した障害の治療または予防における使用のための薬物の有効性をモニターすることに関連する本発明の方法は、薬物が投与された被験体からの試料中のＴＲＡＰ５ｂ活性の量を、薬物が与えられていない被験体からの対照試料と比較するステップを含む。したがって、対照試料は、好ましくはそのＴＲＡＰ５ｂ活性が異常であり、より好ましくは薬物が試験されている被験体と同じ障害を有する、試験される薬物が与えられていない被験体から採取されたものとして定義することができる。被験体は、薬物が投与された被験体と同じであっても異なっていてもよいが、好ましくは同じである。被験体が同じである場合、対照試料は、好ましくは薬物の任意の投与前に被験体から採取される。薬物の有効性をモニターする方法において、対照試料は、好ましくは好適な時間間隔で薬物の投与後に被験体から採取された、１つまたは複数の試料と比較されてもよい。薬物の有効性は、その有効性が決定される被験体からの試料における、薬物の投与後の骨吸収率の任意の変化を評価することにより決定される。
【００８０】
本発明によるキットは、フタレイン化合物の一リン酸エステルと、必要に応じて、ＴＲＡＰ、ＴＲＡＰ５ａおよび／またはＴＲＡＰ５ｂに結合する抗体とを備える。好ましくは、これらは本発明のアッセイにおける使用のための別個の試薬として提供される。キットはまた、本明細書に記載のものを含む本発明の方法における使用のための試薬、使用説明書、較正チャート、その上でアッセイを行う基材、ピペット、ディスペンサ、および／またはキュベットを提供し得る。
【００８１】
本発明の第１の態様に関連して本明細書に記載される実施形態は、必要な変更を加えて他の態様にも適用される。
【００８２】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という単語およびこれらの単語の変化形、例えば「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがそれに限定されない」を意味し、他の部分、添加剤、成分、整数またはステップを除外することは意図されない（かつ除外しない）。
【００８３】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈により他の意味が求められない限り、単数形は複数形を包含する。具体的には、不定冠詞が使用される場合、文脈により他の意味が求められない限り、明細書は、単数形と同様複数形も企図するものとして理解されたい。
【００８４】
本発明の具体的な態様、実施形態または実施例と併せて説明される特徴、整数、特性、化合物、化学部分または基は、不適合でない限り、本明細書に記載のその他任意の態様、実施形態または実施例にも適用されるものと理解されたい。
【００８５】
実施例
以下の形態の置換フェノールフタレイン一リン酸エステルまたは塩
【００８６】
【化３】
2011517571.tif 000004
【００８７】
（式中、Ｘは、ＣＯまたはＳＯ２であり、
Ｒ８は、Ｈ、アルキル（メチル、エチル、イソプロピル）、ハロゲン（ブロモ、クロロ、フルオロ）、またはアルコキシ（メトキシ、エトキシ、ｉ−プロポキシ、ｔ−ブトキシ）から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、アルキル（メチル、エチル、イソプロピル）、ハロゲン（ブロモ、クロロ、フルオロ）、またはアルコキシ（メトキシ、エトキシ、ｉ−プロポキシ、ｔ−ブトキシ）から選択され、
Ｒ１０は、Ｈまたはメチルから選択され、
Ｒ１１は、Ｈまたはメチルから選択され、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン（ブロモ、クロロ、フルオロ）またはアルコキシ（メトキシ、エトキシ、ｉ−プロポキシ、ｔ−ブトキシ）から選択され、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ４は、Ｈである）。
【００８８】
実施例は、置換「フェノールフタレイン様」一リン酸エステルまたは塩を含み、式中、ＸはＣ＝Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４はＨであり、Ｒ３、Ｒ８〜Ｒ１１は第３表に定義される。
【００８９】
【表１】
2011517571.tif 000005
【００９０】
実施例は、置換「フェノールスルホンフタレイン様」一リン酸エステルまたは塩を含み、式中、ＸはＳＯ２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４はＨであり、Ｒ３、Ｒ８〜Ｒ１１は第４表に定義される。
【００９１】
【表２】
2011517571.tif 000006
【００９２】
本発明における使用のための一リン酸エステルは、米国特許第３，９７５，４０５号および米国特許第４，０４５，２９０号に記載のような方法により調製することができる。フェノールフタレイン一リン酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（品番Ｐ５７５８）から購入し、チモールフタレイン一リン酸は、ＴＣＩ社（品番Ｔ０８６３）から購入した。
【実施例１】
【００９３】
フェノールフタレイン一リン酸およびチモールフタレイン一リン酸がＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの基質であることの実証
マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、３．０ｍｇ／Ｌ精製Ｍａｂ  ＩｇＧの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中溶液から、１ウェル当たり１００μＬでマウス抗ＴＲＡＰ５（クローンＯ１Ａ）で被覆し、室温で一晩インキュベートした。被覆したプレートを、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。５％乳糖、０．５％ＢＳＡの安定化試薬を１ウェル当たり２５０μＬで添加し、少なくとも１０分間インキュベートし、次いで液体を吸引した。被覆されたプレートを３５℃で一晩乾燥させ、次いで水分から保護して２〜８℃で保存した。
【００９４】
Ｌａｍら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．第２４（７）巻：１１０５〜１１０８頁、１９７８に記載の手順を修正した手順を用いて、血清由来ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂをイオン交換クロマトグラフィーで分離した。１００〜５００ｍＬのヒト血清を１００％酢酸で約ｐＨ５．０に調節し、必要に応じて等体積の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．９で希釈した。遠心分離および濾過による清澄化の後、酸性化した血清をＣＭ−セファロース（Ｓｉｇｍａ社製、品番ＣＣＦ１００）の１ｃｍ×１００〜１５０ｃｍカラムに適用し、１５０〜８００ｍＭの線形ＮａＣｌ勾配でカラムを展開した。ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂ活性を含有する分画を、原則的にＬａｍら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．第２４（７）巻：１１０５〜１１０８頁、１９７８に記載の非捕捉アッセイを使用して同定した。いくつかの場合において、後述のイムノアッセイにより分画をさらにＴＲＡＰ５に関してアッセイした。ＴＲＡＰ５ａまたはＴＲＡＰ５ｂのピークレベルを含有する分画を、さらなるアッセイのために別個にプールした。
【００９５】
ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂ調製物中のＴＲＡＰ５タンパク質濃度を、サンドイッチイムノアッセイにより決定した。１ウェル当たり１００〜２００μＬの試料をＯ１Ａ被覆マイクロタイタープレートに適用し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、１：４０００の希釈率でウサギ抗ＴＲＡＰ５抗体を含有する溶液１００〜２００μＬをウェル毎に添加した。周囲温度で６０分のインキュベーション後、プレートを上記のように洗浄し、１：５０００の希釈率で抗ウサギＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を含有する溶液１００〜２００μＬを添加し、周囲温度で３０分間インキュベートした。さらに上述のように洗浄した後、ＴＭＢ（ＢｉｏＦｘ  Ｉｎｃ製、品番ＴＭＢＷ−０１００−０１）２００μＬを添加し、周囲温度で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ  ＨＣｌ１００μＬの添加により反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。ＴＲＡＰ５タンパク質濃度は、バキュロウイルス由来組換えヒトＴＲＡＰ５から作成された較正曲線を参照することにより計算した。
【００９６】
基質としてフェノールフタレイン一リン酸（ＰＴＭＰ）およびチモールフタレイン一リン酸（ＴＴＭＰ）を使用するＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの能力を、１ウェル当たり１００μＬの試料をＯ１Ａ被覆マイクロタイタープレートに適用し、周囲温度で６０分間インキュベートしてから１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄することにより実証した。ＰＴＭＰに対する活性を試験するために、１２５ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．０に溶解させた６ｍｇ／ｍＬ  ＰＴＭＰを含有する溶液１００μＬをウェル毎に添加し、３７℃で０〜４０分間インキュベートした。１ウェル当たり５０μＬの１Ｍグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ１１の添加により、示された時間で反応を停止させ、５５０ｍｍでの吸光度を測定した。ＴＴＭＰに対する活性を試験するために、８０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液、１０％エタノール、ｐＨ７．０に溶解させた５ｍｇ／ｍＬ  ＴＴＭＰを含有する溶液１００μＬをウェル毎に添加し、３７℃で０〜４０分間インキュベートした。１ウェル当たり５０μＬの０．２５Ｍ  ＮａＯＨの添加により、示された時間で反応を停止させ、５９２ｍｍでの吸光度を測定した。結果を図１に示す。
【００９７】
酵素活性測定はｐＨ７．０で行ったことから、酸性ホスファターゼのアイソフォームであるＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの両方が、それぞれ５５０ｎｍおよび５９２ｎｍにおける吸光度の時間依存的な増加により判断されるように、中性ｐＨにおいてＰＴＭＰおよびＴＴＭＰ基質を容易に加水分解し得ることが判明したのは驚きであった。すべての場合において、反応速度はアッセイにおいて使用されたＴＲＡＰ５ａまたはＴＲＡＰ５ｂの量とともに増加した。さらに、図１ａのデータを図１ｂのデータと比較すると、基質としてＰＴＭＰをｐＨ７．０で使用することで、ＴＲＡＰ５ｂの比活性がＴＲＡＰ５ａの比活性の約５０倍であることが明らかである。同様に、図１ｃのデータを図１ｄのデータと比較すると、基質としてＴＴＭＰをｐＨ７．０で使用することで、ＴＲＡＰ５ｂの比活性がＴＲＡＰ５ａの比活性の約７０倍であることが明らかである。
【実施例２】
【００９８】
基質としてＰＴＭＰを使用したＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂのｐＨプロファイル
ＴＲＡＰ５は、通常酸性条件下でのみ活性な酸性ホスファターゼであるため、基質としてＰＴＭＰを使用して、ｐＨ値の範囲にわたるＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂ酵素活性と基質ｐＨとの間の関係を調査した。ＴＲＡＰ５アッセイは、原則的に実施例１に関して記載したように行ったが、ＰＴＭＰ基質は、示されたｐＨ値を得るために、一連の１００ｍＭ  ＭＥＳまたは１００ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液中６ｍｇ／ｍＬで溶解させた。結果を図２に示す。
【００９９】
ＴＲＡＰ５ｂは約ｐＨ７．０のｐＨで基質としてのＰＴＭＰとの最大活性を示し、ＴＲＡＰ５ａの対応する値は約ｐＨ６．０であることが判明したのは驚きであった。これらのデータは、ＴＲＡＰ５の両方の型に対して一貫して酸性の最適ｐＨを報告している本分野における以前のすべての研究者の結果とはきわめて対照的である。例えば、ＷＯ１９９９／０５０６６２において開示されているデータは、ｐＮＰＰを使用したＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの最適ｐＨが、それぞれ約４．９および５．９であると示している。同様に、欧州特許第１５９８６７０号に開示されているデータは、２−クロロ−４−ニトロフェニルホスフェートを使用したＴＲＡＰ５ｂの最適ｐＨが６．４であることを示している。
【実施例３】
【０１００】
フタレイン一リン酸ベースのＴＲＡＰｂアッセイと現行の商業的ＴＲＡＰｂアッセイとの比較
ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの調製物を調製し、実施例３に記載のようにＴＲＡＰ５質量に関して定量化した。バキュロウイルス由来組換えヒトＴＲＡＰ２２５μｇを１２Ｕキモトリプシンとともに周囲温度で６時間インキュベートし、この材料から一連の希釈物を調製し、ＷＯ１９９９／０５０６６２に基づき商業的ＴＲＡＰ５ｂイムノアッセイを使用してこれらの希釈物にＴＲＡＰ５濃度（Ｕ／Ｌ）を割り当てることにより、一組のＴＲＡＰ５較正物質を調製した。基質としてｐＮＰＰをｐＨ６．１で使用するＷＯ１９９９／０５０６６２に基づく商業的ＴＲＡＰ５ｂイムノアッセイに、上述のキモトリプシン処理較正物質を製造者により提供されたものと置換するよう修正を加えて、ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの調製物をアッセイした。また、実施例３に記載のＰＴＭＰおよびＴＴＭＰベースイムノアッセイに、上述のキモトリプシン処理較正物質から作成された較正曲線を参照することによりＴＲＡＰ５濃度（Ｕ／Ｌ）を計算するという追加の修正を加えて使用し、ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの調製物をアッセイした。各基質とのＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの調製物のＵ／μｇでの比活性を計算したが、これらを第１表に示す。
【０１０１】
【表３】
2011517571.tif 000007
【０１０２】
ｐＮＰＰ基質に対する結果は、ＷＯ１９９９／０５０６６２に開示されたデータと一致しており、ＴＲＡＰ５ｂの比活性はＴＲＡＰ５ａの比活性より９倍大きく、また結果は、ＰＴＭＰおよびＴＴＭＰベースアッセイにおける対応する値がそれぞれ４７．５倍および６５．３倍であることを明らかにしている。したがって、ＰＴＭＰおよびＴＴＭＰベースアッセイにおけるＴＲＡＰ５ａを上回るＴＲＡＰ５ｂの特異性は、商業的なｐＮＰＰベースアッセイよりも、約４．７５倍および６．５倍高い。第１表の結果はまた、この特異性の改善が、ＴＲＡＰ５ｂの検出量の増加ではなく、ＰＴＭＰおよびＴＴＭＰベースアッセイにより検出されるＴＲＡＰ５ａの量の減少に起因することを示している。
【実施例４】
【０１０３】
ＰＴＭＰベースアッセイの特異性の実証
正常ヒト血清からのＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂをＣＭ−セファロースカラムで分離し、実施例３で説明したｐＮＰＰおよびＰＴＭＰベースアッセイを使用して、分画をＴＲＡＰ５ｂに関して評価した。結果を図３に示す。
【０１０４】
結果は、ｐＮＰＰベースアッセイがＴＲＡＰ５の２つの明確な集団を検出することを示している。分画５３にピークを有する第１の集団はＴＲＡＰ５ａであり、分画６１にピークを有する第２の集団はＴＲＡＰ５ｂである。このデータセットは、相当量のＴＲＡＰ５ａを検出するという現行の商業的ＴＲＡＰ５ｂイムノアッセイの大きな欠点を明確に示しており、本実施例においてはＴＲＡＰ５ｂとして測定された材料の約４０％は実際にはＴＲＡＰ５ａである。しかしながら、ＰＴＭＰベースアッセイは、ｐＮＰＰベースアッセイよりも検出するＴＲＡＰ５ａが実質的に少ないことが明確に認められ、確かに、ＴＲＡＰ５ａ分画５３ピークにおいて測定された量により判断されるように、本実施例において、ＰＴＭＰベースアッセイは、ｐＮＰＰベースアッセイにより検出されたＴＲＡＰ５ａのわずか１６％を検出する。また、ＰＴＭＰおよびｐＮＰＰベースアッセイが、同様の量のＴＲＡＰ５ｂを検出することが明らかである。
【実施例５】
【０１０５】
ｐＮＰＰベースアッセイにより測定された血清ＴＲＡＰ５ｂレベルとＰＴＭＰベースアッセイで測定された血清ＴＲＡＰ５ｂレベルの相関関係
商業的ｐＮＰＰベースアッセイにより測定された血清ＴＲＡＰ５ｂの量と、ＰＴＭＰベースアッセイにより測定された血清ＴＲＡＰ５ｂの量とを、３２血清試料のパネルを使用して比較した。正確に製造者から提供された通りの商業的ｐＮＰＰベースアッセイを用いて、また実施例４で説明したＰＴＭＰベースアッセイを用いて、試料をアッセイした。２つのアッセイの間の相関関係を、図４に示す。
【０１０６】
結果は、ＰＴＭＰベースアッセイとｐＮＰＰベースアッセイとの間に良好な相関関係がある（ｒ２＝０．９６）ことを示している。２つのデータセットの間の関係は、以下の通りである：
（ＰＴＭＰベースアッセイ）＝１．０９×（ｐＮＰＰベースアッセイ）−０．６２。
【０１０７】
これは、ＰＴＭＰベースアッセイで得られた値が、ｐＮＰＰベースアッセイを用いて得られた値よりも、約０．６２Ｕ／Ｌだけ若干低いことを示している。この差は、ＰＴＭＰベースアッセイがｐＮＰＰベースアッセイよりも検出するＴＲＡＰ５ａが少ないことにより説明することができる。したがって、データは、臨床的に関連した試料中のＴＲＡＰ５ｂ濃度の決定におけるＰＴＭＰベースアッセイの実用性を実証している。
【実施例６】
【０１０８】
酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）は、破骨細胞によってのみ分泌される。血清中のＴＲＡＰ５ｂのレベルは、破骨細胞の存在量の測定値であり、したがって骨吸収の間接的指標である。血清中のＴＲＡＰ５ｂの測定は、主にマクロファージおよび樹状細胞により産生される約１０倍過剰（質量で）のＴＲＡＰ５ａの存在により、複雑である。現行の商業的ＴＲＡＰ５ｂイムノアッセイは、固定化抗体によるＴＲＡＰ５の捕捉、続いてＴＲＡＰ５ｂの比活性がＴＲＡＰ５ａの比活性の１０〜１７倍となるｐＨでの活性測定を含む。ＢｏｎｅＴＲＡＰ（商標）アッセイを３×３自動化プラットフォームに移そうとした際、液相中の基質ｐＮＰＰの安定性に関連した問題が生じた。
【０１０９】
このため、ＴＲＡＰ５ｂ基質としてのフタレイン一リン酸の実用性を検査することとなった。血清由来ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂ（ＣＭ−セファロースでのクロマトグラフィーにより分離された）、ならびにバキュロウイルス由来組換えＴＲＡＰ５の、フタレイン一リン酸を加水分解する能力を検査した。すべてのＴＲＡＰ５調製物がフェノールフタレイン一リン酸（ＰＴＭＰ）およびチモールフタレイン一リン酸（ＴＴＭＰ）を加水分解した。ｐＮＰＰを用いて決定されたものと比較して、フタレイン一リン酸基質を用いたこれらの調製物の最適ｐＨの間には、劇的で驚異的な差が観察された。例えば、ＰＴＭＰを使用すると、ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの最適ｐＨは、それぞれ６．０および７．０であった。これらの値は、ｐＮＰＰを使用して得られた値（それぞれ４．９および５．９）より著しく高い。
【０１１０】
次に、ＰＴＭＰをｐＨ７．０で使用して酵素活性を測定するＴＲＡＰ５ｂのイムノアッセイを確立し、これを、ｐＮＰＰをｐＨ６．１で使用するイムノアッセイと比較した。ネイティブＴＲＡＰ５形態に対して得られた典型的な比活性は、ＴＲＡＰ５ａ（ＰＴＭＰ）；０．０３５Ｕ／μｇ：ＴＲＡＰ５ａ（ｐＮＰＰ）；０．１７７Ｕ／μｇ：ＴＲＡＰ５ｂ（ＰＴＭＰ）；１．６８Ｕ／μｇ：ＴＲＡＰ５ｂ（ｐＮＰＰ）；１．６０Ｕ／μｇであった。これらのデータは、ＰＴＭＰおよびｐＮＰＰベースアッセイは同様の量のＴＲＡＰ５ｂを検出するが、ＰＴＭＰベースアッセイはｐＮＰＰベースアッセイにより検出されるＴＲＡＰ５ａのわずか２０％を検出することを示している。３４の患者試料のパネルでは、ＰＴＭＰベースアッセイとｐＮＰＰベースアッセイとの間に良好な相関関係があり、Ｒ２＝０．９６であった。さらに、ＰＴＭＰベースアッセイで得られた値は、ｐＮＰＰベースアッセイを用いて得られた値より若干低かった（ｙ＝１．０９ｘ−０．６２）が、これはこのアッセイがより少ないＴＲＡＰ５ａを検出することに一致する。
【０１１１】
本発明者らの結果は、ＴＲＡＰ５ｂの比活性がＴＲＡＰ５ａの比活性の４７．５倍であるアッセイを提供することにより、フタレイン一リン酸がｐＮＰＰおよび関連化合物よりもＴＲＡＰ５ｂに特異的な基質であることを実証している。この結果はまた、ＴＲＡＰ５が本質的には酸性ホスファターゼではなく、酵素の最適ｐＨは少なくとも部分的に基質の性質により決定されることを明示している。
【実施例７】
【０１１２】
フタレイン一リン酸エステルが市販されていない場合について、ＢｕｌｂｅｎｋｏおよびＷｏｏｄｂｒｉｄｇｅ（米国特許第４，０４５，２９０号）の方法により、適切なフタレイン化合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）とオキシ塩化リン（ＣＡＳ１００２５−８７−３）との反応、続いて加水分解および精製によって一リン酸エステルを調製した。一リン酸エステルは、使用前にＨＰＬＣクロマトグラフィーによりさらに精製して未反応フタレイン染料を除去した。ＨＰＬＣカラムは１０ｍｍ×１５０ｍｍ  ＡＣＥ  ５  Ｃ１８（Ａｄｖａｎｃｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＵＫ）であり、注入溶媒組成は０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する３０％メタノールおよび７０％水であり、生成物は、３０％メタノール０．１％ＴＦＡから１００％メタノール０．１％ＴＦＡの勾配により、３ｍＬ／分で４５分間にわたり溶離した。
【実施例８】
【０１１３】
実施例７で調製したフタレイン一リン酸エステルを、１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ７．４緩衝液中に０．４７ｍｇ／ｍＬまで希釈し、実施例１のようにアッセイに適用した。
【０１１４】
【表４】
2011517571.tif 000008
【図１ａ】
2011517571.tif 000011
【図１ｂ】
2011517571.tif 000012
【図１ｃ】
2011517571.tif 000013
【図１ｄ】
2011517571.tif 000014
【図２】
2011517571.tif 000015
【図３】
2011517571.tif 000016
【図４】
2011517571.tif 000017
【図５】
2011517571.tif 000018
【国際調査報告】
2011517571.tif 000019
2011517571.tif 000020
2011517571.tif 000021