(57)【要約】  本発明は、フリーフロー電気泳動法におけるＭＳ適合性界面活性剤の使用であって、差別化された電気泳動移動度を有する分析物の分離が可能な使用に関する。界面活性剤は、好ましくは、ＰＰＳなどの開裂性界面活性剤である。
2011503598.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フリーフロー電気泳動によってサンプル中の分析物を分離するための方法であって、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含むフリーフロー電気泳動分離を行うステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記サンプルの少なくとも一部は、電気泳動分離後に１つまたは複数の画分に収集されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、サンプル媒体中に含まれることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、少なくとも１種の分離媒体中に含まれることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記フリーフロー電気泳動は、連続モードで操作されることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記フリーフロー電気泳動は、静止インターバルモードで操作されることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記フリーフロー電気泳動は、サイクリックインターバルモードで操作されることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分離は、フリーフロー等電点電気泳動（ＦＦ−ＩＥＦ）によって実施されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記分離は、フリーフローゾーン電気泳動（ＦＦ−ＺＥ）によって実施されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離は、フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ−ＩＴＰ）によって実施されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
全ての両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、ＭＳ適合性であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、開裂性界面活性剤であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記開裂性界面活性剤は、酸に不安定であり、塩基に不安定であり、化学反応性であり、または光に不安定であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記開裂性界面活性剤は、｛２−［（ジメチル−オクチル−シラニル）−エトキシ］−２−ヒドロキシ−エチル｝−トリメチルアンモニウムブロミド、３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）アクリル酸オクチルエステル、および３−［３−（１，１−ビスアルコキシエチル）ピリジン−１−イル］プロパン−１−スルホネートからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記開裂性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤の、開裂した部分の少なくとも１つは、ＭＳ適合性であることを特徴とする請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
開裂した両性イオン性または非イオン性界面活性剤の部分の少なくとも１つは、遠心分離によって、蒸発によって、および／または濾過によって除去することができることを特徴とする請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１種の開裂性界面活性剤は、フリーフロー電気泳動分離後に少なくとも１つの画分に開裂されることを特徴とする請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記開裂性界面活性剤の開裂は、酸に不安定な開裂性界面活性剤を含むＦＦＥ分離後に少なくとも１つの画分を酸性化することによって、または塩基に不安定な開裂性界面活性剤を含むＦＦＥ分離後に少なくとも１つの画分をアルカリ性化することによって実施されることを特徴とする請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記開裂性界面活性剤の開裂は、少なくとも１種の光に不安定な開裂性界面活性剤を含むＦＦＥ分離後に、少なくとも１つの画分について照射を行うことによって実施されることを特徴とする請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記開裂性界面活性剤の開裂は、ＦＦＥ分離後に、少なくとも１つの画分に化学反応性の界面活性剤中の結合を破壊することが可能な試薬を添加することによって実施されることを特徴とする請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記試薬はフッ化物であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
サンプルの少なくとも一部について、タンパク質消化ステップを行うことを特徴とする請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質消化ステップは、フリーフロー電気泳動による分離の前に実施されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質消化ステップは、フリーフロー電気泳動による分離の後に実施されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質消化ステップは、フリーフロー電気泳動分離から収集された少なくとも１つの画分で、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の開裂の前または後に実施されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から２５のいずれか一項に記載のフリーフロー電気泳動分離と、その後に行われる、フリーフロー電気泳動分離から得られたサンプルの少なくとも一部の分析とを含むことを特徴とする分析物を分析するための方法。
【請求項２７】
前記その後に行われる分析は、フリーフロー電気泳動、ゲル電気泳動、１Ｄ−および２Ｄ−ＰＡＧＥ、ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ、ＳＥＬＤＩ  ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＩＲ分光法、ＵＶ分光法、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、エドマン分解法、ＮＭＲ分光法、表面プラズモン共鳴、Ｘ線回折、核酸配列決定、エレクトロブロッティング、アミノ酸配列決定、フローサイトメトリー、円偏光二色性、および任意のこれらの組合せからなる群から選択される技法を含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記分析物は、有機分子、無機分子、生体粒子、バイオポリマー、または生体分子、およびこれらの任意の組合せの群から選択されることを特徴とする請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記分析物は、タンパク質、特に膜結合性タンパク質、内在性膜タンパク質および親油性タンパク質、タンパク質凝集体、タンパク質複合体、ペプチド、疎水性ペプチド、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ、膜、膜断片、脂質、糖およびその誘導体、多糖およびその誘導体、ホルモン、リポソーム、ウイルス粒子、抗体、抗体複合体、ナノ粒子、プラスチックの構成成分、ラテックス塗料粒子、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、デキストラン、セルロース誘導体、ポリ酸、医薬品、プロドラッグ、薬物の代謝産物、爆発物、毒素、発癌物質、毒物、アレルゲン、感染因子、または前述のいずれかの混合物から選択されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
開裂性作用剤を含む向流媒体は、開裂性界面活性剤を含むフリーフロー電気泳動分離の後にサンプルの画分の少なくとも一部と接触し、および／または混合されることを特徴とする請求項１２から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
向流媒体は、内部に含まれる開裂性界面活性剤がフリーフロー電気泳動分離後に安定化するように、媒体条件を適合させるのに使用されることを特徴とする請求項１２から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
精製ステップを実施して、開裂性界面活性剤の部分の濾過、遠心分離、および蒸発からなる群から選択される開裂性界面活性剤の部分の除去を行うことを特徴とする請求項１２から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法は、界面活性剤を除去するのに、透析、クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、界面活性剤交換、タンパク質沈殿、親和性クロマトグラフィ、エレクトロブロッティング、液液相抽出、および／または固液相抽出から選択される精製ステップを必要としないことを特徴とする請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含み、請求項１から３３のいずれか一項に記載のフリーフロー電気泳動分離に適切であることを特徴とする分離媒体。
【請求項３５】
少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤含む前記媒体は、Ａ／Ｂ分離媒体、揮発性媒体、および相補的多対緩衝媒体からなる群から選択されることを特徴とする請求項３４に記載の分離媒体。
【請求項３６】
少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１から３３のいずれか一項に記載のサンプル中の分析物のフリーフロー電気泳動分離を実施するためのキット。
【請求項３７】
前記少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の開裂性界面活性剤であることを特徴とする請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
１種の分離媒体または複数の分離媒体をさらに含むことを特徴とする請求項３６または請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
分離媒体の数は、２から１５の間または３から１２の間または４から９の間であることを特徴とする請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記１種または複数の分離媒体は、Ａ／Ｂ緩衝媒体、揮発性緩衝媒体、および相補的多対緩衝媒体からなる群から選択されることを特徴とする請求項３８または請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記分離媒体は、電気泳動中の分離ゾーン内の最小ｐＨと最大ｐＨとの間の差が約０．２ｐＨ単位未満、好ましくは０．１ｐＨ単位未満である分離ゾーンを形成することが可能なＡ／Ｂ媒体であることを特徴とする請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記分離ゾーンのｐＨは、電気泳動中に本質的に一定であることを特徴とする請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
フリーフローゾーン電気泳動で使用されることを特徴とする請求項４０から４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
前記分離媒体は、ｐＨが電気泳動中に分離チャンバ内の電極間に本質的に線形の勾配を形成する、分離ゾーンを形成することが可能なＡ／Ｂ媒体であることを特徴とする請求項４０に記載のキット。
【請求項４５】
前記分離媒体は、ｐＨが電気泳動中の分離チャンバ内で本質的に非線形である、分離ゾーンを形成することが可能なＡ／Ｂ媒体であることを特徴とする請求項４０に記載のキット。
【請求項４６】
フリーフロー等電点電気泳動で使用されることを特徴とする請求項４０、４４、および４５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
前記分離媒体は、少なくとも１種の緩衝化合物を含む揮発性緩衝媒体であることを特徴とする請求項４０に記載のキット。
【請求項４８】
前記揮発性緩衝媒体は、減圧下で揮発性である少なくとも１種の緩衝化合物を含むことを特徴とする請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記揮発性緩衝媒体は、高温で揮発性である少なくとも１種の緩衝化合物を含むことを特徴とする請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
前記揮発性緩衝媒体は、照射を行ったときに揮発性である少なくとも１種の緩衝化合物を含むことを特徴とする請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
前記揮発性緩衝媒体は、質量分析作業条件下で揮発性である少なくとも１種の緩衝化合物を含むことを特徴とする請求項４７に記載のキット。
【請求項５２】
アノードおよび／またはカソード安定化媒体をさらに含むことを特徴とする請求項３６から５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
前記安定化媒体は、分離媒体よりも高い電気伝導度を有し、好ましくは前記伝導度は、前記安定化媒体に隣接する分離媒体の電気伝導度に比べて少なくとも２倍、最も好ましくは少なくとも３倍増加することを特徴とする請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記安定化媒体の高い伝導度は、分離媒体に比べて緩衝化合物の濃度を増加させることにより実現されることを特徴とする請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記カソード安定化媒体の高い伝導度は、前記カソード安定化媒体に強塩基を添加することによって実現され、前記アノード安定化媒体の高い伝導度は、前記アノード安定化媒体に強酸を添加することによって実現されることを特徴とする請求項５３または請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
前記強塩基はＮａＯＨであり、前記強酸はＨ2ＳＯ4であることを特徴とする請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記アノード安定化媒体は、前記アノード安定化媒体に隣接する分離媒体のｐＨに等しいまたは前記ｐＨよりも低いｐＨを有することを特徴とする請求項５２から５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
前記カソード安定化媒体は、前記カソード安定化媒体に隣接する分離媒体のｐＨに等しいまたは前記ｐＨよりも高いｐＨを有することを特徴とする請求項５２から５７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
少なくとも１種の焦点媒体をさらに含むことを特徴とする請求項３６から５８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
少なくとも１種の開裂性界面活性剤を開裂させるための作用剤をさらに含むことを特徴とする請求項３７から５９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６１】
前記キットの構成成分は、請求項１から３３のいずいれか一項に記載のフリーフロー電気泳動法で使用できる状態の水溶液として存在することを特徴とする請求項３６から６０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６２】
前記キットの構成成分は、請求項１から３３のいずいれか一項に記載のフリーフロー電気泳動法で使用するのに適切な濃度まで希釈される濃縮水性原液として存在することを特徴とする請求項３６から６０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６３】
各原液は、互いに独立して、１．５×、２×、２．５×、３×、４×、５×、６×、１０×、２０×、２５×、５０×、７５×、１００×、１５０×、２００×、および１０００×からなる群から選択される濃度を有することを特徴とする請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
前記キットの構成成分は、請求項１から３３のいずれか一項に記載のフリーフロー電気泳動法で使用するのに適切な濃度まで、溶媒、好ましくは水で溶解される、乾燥または凍結乾燥形態で存在することを特徴とする請求項３６から６０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６５】
１つまたは複数の実験プロトコルおよび任意選択で構成成分の貯蔵条件について記述する製品マニュアルをさらに含むことを特徴とする請求項３６から６４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６６】
前記キットの各構成成分、各乾燥成分、および／または各原液は、密封容器内に別々に配置されることを特徴とする請求項３６から６５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６７】
フリーフロー電気泳動における、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のＭＳ適合性の両性イオン性もしくは非イオン性界面活性剤またはＭＳ適合性の両性イオン性もしくは非イオン性開裂性界面活性剤の使用。
【請求項６８】
フリーフロー電気泳動における、請求項３４または請求項３５に記載の分離媒体の使用。
【請求項６９】
フリーフロー電気泳動における、請求項３６から６６のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項７０】
フリーフロー電気泳動によるサンプル中の分析物を分離するための方法であって、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含むフリーフロー電気泳動分離を行うステップを含み、前記界面活性剤は、サンプル媒体中および／または少なくとも１種の分離媒体中に含まれることを特徴とする方法。
【請求項７１】
前記サンプルの少なくとも一部は、電気泳動分離後に１つまたは複数の画分に収集されることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記分析物は、有機分子、無機分子、生体粒子、バイオポリマー、または生体分子、特にタンパク質、特に膜結合タンパク質、内在性膜タンパク質、および親油性タンパク質、タンパク質凝集体、タンパク質複合体、ペプチド、疎水性ペプチド、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ、膜、膜断片、脂質、糖およびその誘導体、多糖およびその誘導体、ホルモン、リポソーム、ウイルス粒子、抗体、抗体複合体、ナノ粒子、プラスチックの構成成分、ラテックス塗料粒子、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、デキストラン、セルロース誘導体、ポリ酸、医薬品、プロドラッグ、薬物の代謝産物、爆発物、毒素、発癌物質、毒物、アレルゲン、感染因子、およびこれらの混合物の群から選択されることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記フリーフロー電気泳動の操作モードは、連続モード、インターバルモード、およびサイクリックインターバルモードからなる群から選択され、これとは独立して、前記フリーフロー電気泳動分離は、フリーフロー等電点電気泳動（ＦＦ−ＩＥＦ）、フリーフローゾーン電気泳動（ＦＦ−ＺＥ）、またはフリーフロー等速電気泳動（ＦＦ−ＩＴＰ）からなる群から選択される分離モードによって実現されることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、修飾のないＭＳ適合性界面活性剤であるか、または酸に不安定、塩基に不安定、化学反応性、もしくは光に不安定であり、ＭＳ適合性部分と、遠心分離もしくは濾過によって除去することができる部分とに開裂可能な開裂性界面活性剤であることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、開裂性のＭＳ適合性界面活性剤であり、前記開裂性のＭＳ適合性界面活性剤は、｛２−［２−（ジメチル−オクチル−シラニル）−エトキシ］−２−ヒドロキシ−エチル｝−トリメチルアンモニウムブロミド、３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）アクリル酸オクチルエステル、および３−［３−（１，１−ビスアルコキシエチル）ピリジン−１−イル］プロパン−１−スルホネートからなる群から選択されることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
画分の少なくとも一部またはサンプルの少なくとも一部について、フリーフロー電気泳動による分離の前または後にタンパク質消化ステップを行い；前記タンパク質消化ステップがＦＦＥ分離後に実施される場合、前記タンパク質消化ステップは任意選択の界面活性剤開裂ステップの前または後に実施されることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
開裂剤を含む向流媒体は、開裂性界面活性剤を含むフリーフロー電気泳動分離の後に、サンプルの画分の少なくとも一部と接触し、および／または混合されることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
向流媒体を使用して、フリーフロー電気泳動分離後に内部に含まれる開裂性界面活性剤が安定化するように媒体条件を適合させることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤の使用を含み、前記界面活性剤はサンプル緩衝液中および／または少なくとも１種の分離緩衝液中に含まれたものである、フリーフロー電気泳動ステップと、
その後に行われる、フリーフロー電気泳動から得られた少なくとも１つの画分の分析であって、前記その後に行われる分析が、フリーフロー電気泳動、ゲル電気泳動、１Ｄ−および２Ｄ−ＰＡＧＥ、ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ、ＳＥＬＤＩ  ＭＳ、ＥＬＩＳＡ、ＬＣ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＩＲ分光法、ＵＶ分光法、ＨＰＬＣ、エドマン分解法、ＮＭＲ分光法、表面プラズモン共鳴、Ｘ線回折、核酸配列決定、エレクトロブロッティング、アミノ酸配列決定、フローサイトメトリー、円偏光二色性、および任意のこれらの組合せからなる群から選択されるものである、分析と
を含むことを特徴とする分析物を分析するための方法。
【請求項８０】
前記サンプルの少なくとも一部は、電気泳動分離後に１つまたは複数の画分に収集されることを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記分析物は、有機分子、無機分子、生体粒子、バイオポリマー、または生体分子、特にタンパク質、特に膜結合性タンパク質、内在性膜タンパク質、および親油性タンパク質、タンパク質凝集体、タンパク質複合体、ペプチド、疎水性ペプチド、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ、膜、膜断片、脂質、糖およびその誘導体、多糖およびその誘導体、ホルモン、リポソーム、ウイルス粒子、抗体、抗体複合体、ナノ粒子、プラスチックの構成成分、ラテックス塗料粒子、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、デキストラン、セルロース誘導体、ポリ酸、医薬品、プロドラッグ、薬物の代謝産物、爆発物、毒素、発癌物質、毒物、アレルゲン、感染因子、およびこれらの混合物の群から選択されることを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記フリーフロー電気泳動の操作モードは、連続モード、インターバルモード、およびサイクリックインターバルモードからなる群から選択され、これとは独立して、前記フリーフロー電気泳動分離は、フリーフロー等電点電気泳動（ＦＦ−ＩＥＦ）、フリーフローゾーン電気泳動（ＦＦ−ＺＥ）、またはフリーフロー等速電気泳動（ＦＦ−ＩＴＰ）からなる群から選択される分離モードによって実現されることを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、修飾のないＭＳ適合性界面活性剤であるか、または酸に不安定、塩基に不安定、化学反応性、もしくは光に不安定であり、ＭＳ適合性部分と、遠心分離、濾過、および蒸発によって除去することができる部分とに開裂可能な開裂性界面活性剤であることを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、開裂性のＭＳ適合性界面活性剤であり、前記開裂性のＭＳ適合性界面活性剤は、｛２−［２−（ジメチル−オクチル−シラニル）−エトキシ］−２−ヒドロキシ−エチル｝−トリメチルアンモニウムブロミド、３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）アクリル酸オクチルエステル、および３−［３−（１，１−ビスアルコキシエチル）ピリジン−１−イル］プロパン−１−スルホネートからなる群から選択されることを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
画分の少なくとも一部またはサンプルの少なくとも一部について、フリーフロー電気泳動による分離の前または後にタンパク質消化ステップを行い；前記タンパク質消化ステップがＦＦＥ分離後に実施される場合、前記タンパク質消化ステップは任意選択の界面活性剤開裂ステップの前または後に実施されることを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８６】
開裂剤を含む向流媒体は、開裂性界面活性剤およびサンプルの少なくとも一部を含むフリーフロー電気泳動画分と、前記開裂剤とを接触させるのに使用されることを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
開裂剤を含む向流媒体は、開裂性界面活性剤を含むフリーフロー電気泳動分離の後に、サンプルの画分の少なくとも一部と接触し、および／または混合されることを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８８】
フリーフロー電気泳動によってサンプル中の分析物を分離するのに適切な分離媒体であって、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする分離媒体。
【請求項８９】
少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含む前記媒体は、Ａ／Ｂ分離媒体、揮発性媒体、および相補的多対緩衝媒体からなる群から選択されることを特徴とする請求項８８に記載の分離媒体。
【請求項９０】
フリーフロー電気泳動によってサンプル中の分析物を分離するためのキットであって、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性オンまたは非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とするキット。
【請求項９１】
前記少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、少なくとも１つのＭＳ適合性部分と、遠心分離、濾過、または蒸発によって除去することができる少なくとも１つの部分とに開裂可能であることを特徴とする請求項９０に記載のキット。
【請求項９２】
１種および複数の分離媒体からなる群から選択される少なくとも１種の構成成分をさらに含み、前記分離媒体は、Ａ／Ｂ緩衝媒体、揮発性緩衝媒体、および相補的多対緩衝媒体からなる群から選択され；任意選択で、アノードおよび／またはカソード安定化媒体、焦点媒体、開裂性界面活性剤、１つまたは複数の実験プロトコルについて記述している製品マニュアル、構成成分の貯蔵条件、および／または向流媒体をさらに含むことを特徴とする請求項９０に記載のキット。
【請求項９３】
前記キットの構成成分は、フリーフロー電気泳動法に使用できる状態の水溶液、フリーフロー電気泳動で使用するのに適切な濃度まで希釈される濃縮水性原液、およびフリーフロー電気泳動法で使用するのに適切な濃度まで溶媒、好ましくは水で溶解される乾燥もしくは凍結乾燥形態からなる群から選択される形態またはそれらの任意の組合せで提供されることを特徴とする請求項９０に記載のキット。
【請求項９４】
前記キットの、使用できる状態の各構成成分、各乾燥成分、および／または各原液は、密封容器内に別々に配置されることを特徴とする請求項９０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物、特に、溶けにくいタンパク質またはほぼ疎水性の物質を含むサンプルの、効率的、選択的、および再現可能なフリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）分離を実施するための方法、キット、および媒体に関する。本発明によるＦＦＥ分離は、ＭＳ適合性の非イオン性または両性イオン性界面活性剤の使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
無機分子または有機分子、特に、ペプチドやタンパク質、ＤＮＡ、例えば薬物として有用な天然物などの、代謝中間体、および脂質などの生体分子を分析するために、有用な分析データが得られるよう、下流分析の前に、問題の化合物を混合物から単離することが通常は求められる。
【０００３】
例えば、タンパク質の単離および後続の分析／特徴付けは、複合タンパク質混合物に適用される高分解能分離技法と、質量分析（ＭＳ）などの最先端の同定方法とを組み合わせることによって、試みられてきた。一般に、既存の分離および同定方法は、それ自体で、タンパク質組成物または複合混合物（例えば、生体マトリックス、生体液、例えば血清、血漿、滑液、脳脊髄液、尿、細胞全体、細胞画分、細胞可溶化物、または組織抽出物）中のタンパク質発現に関する詳細を明らかにすることができないことが、認められている。しかしこの制約は、特にタンパク質の存在もしくは非存在またはタンパク質の発現レベルを疾患状態に関連付けることができる場合、広範なタンパク質に関する価値ある情報を提供するために、既存の方法（またはいくつかの既存の技法の組合せ）の使用を阻むものではない。
【０００４】
広く適用可能な、例えば生体サンプルのＭＳ分析、ＮＭＲ分析、円偏光二色性分析、結晶化後のＸ線回折パターンの決定、またはＵＶ分光法分析に対する主な壁の１つは、これらの後続の分析に適切なものにするための、問題の分子の首尾良い精製または少なくとも実質的な濃縮である。タンパク質その他の化合物の探索段階で克服すべきハードルは、ＭＳなどのプロセスチェーン（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈａｉｎ）の終わりに使用される分析ツールが、タンパク質（または、タンパク質から得られたペプチド）の有限量に対して明らかな検出限界を有することである。例えばＭＳによるペプチド同定の感度限界および精製要件を完全に活用するには、問題のタンパク質を、タンパク質の混合物その他の生物有機混合物から分離および／または濃縮することが必要である。
【０００５】
電気泳動は、直流電流の影響下にある荷電粒子の移行に基づいて粒子を分離するための、十分に確立された技術である。等電点電気泳動（ＩＥＦ）、ゾーン電気泳動（ＺＥ）、等速電気泳動（ＩＴＰ）などのいくつかの異なる操作モードが、上述の分離方式の変形例として開発されており、これらは一般に、当業者に公知である。
【０００６】
フリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）は、固定相（または固体支持材料）が存在しない状態で分析物の分離が液体媒体中で行われる技術である。ＦＦＥは、無担体偏向電気泳動またはマトリックスフリー偏向電気泳動としばしば呼ばれる。
【０００７】
プロテオミクスの分野において、ＦＦＥは、複合タンパク質サンプルの規定の分離に関し、それらの様々な等電点（ｐＩ）値の観点から選択される技術である。ＦＦＥを使用すると、有機および無機分子、生体粒子、バイオポリマー、および生体分子を、これらの電気泳動移動度に基づいて分離することができる。これに相当する原理は、既に記述されている［例えば、非特許文献１参照］。
【０００８】
ＦＦＥプロセスは、例えば安定化媒体および向流媒体によって、近年改善されてきた。これは例えば、参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれている文献（例えば、特許文献１参照）に反映されている。この特許によれば、向流媒体は、電極間を移動するバルク分離媒体およびサンプルの連続流方向に対向して、分離スペースに導入される。両媒体（分離媒体および向流媒体）は、分画出口を通して、マイクロタイタープレートなどの適切な収集デバイス内に放出されまたは溶出され、その結果、低ボイド容量を有する分画プロセスが行われる。さらに、分画出口の領域にある媒体の層流は、維持される（即ち、乱流が非常に少なくまたは存在しない。）。
【０００９】
インターバルＦＦＥと呼ばれる特定のＦＦＥ技法が、例えば文献（例えば、特許文献２参照）に開示されている。この特許では、サンプルおよび分離媒体は共に電気泳動チャンバ内に導入され、サンプル中の分析物は、ゾーン電気泳動（ＺＥ）、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、または等速電気泳動（ＩＴＰ）などの電気泳動モードを使用して分離され、この分析物は、最終的にはチャンバから分画出口を通して排出される。文献（例えば、特許文献２参照）の実施形態は、分離媒体およびサンプルの移動が一方向性となって、チャンバの入口端部から出口端部に向かって移動し、このとき有効電が印加されて電気泳動が引き起こされ、その間、サンプルおよび媒体が装置内を通過しながら電界内で分離される当技術分野で一般に使用される技法（一般に、連続ＦＦＥと呼ぶ。）とは対照的に、サンプルおよび媒体は入口端部から出口端部に向かって流体的に押し遣られない状態となることについて記述している。
【００１０】
本明細書で使用されるＦＦＥのコンテクストにおけるいわゆるサイクリックモードまたはサイクリックインターバルモードは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる文献（例えば、特許出願３（文献４および５の優先権を主張する。）参照）に記載されている。まとめると、サイクリックインターバルモードは、少なくとも１回、可能なら多数回、バルク流方向が反転することによって特徴付けられ、このときサンプルは、細長い電極間の電気泳動電界内に保持されている。静止インターバルモードとは対照的に、サンプルは常に動いており、それによって、より高い電界強度が可能になり、したがってより良好な（より速い）分離が行われる。さらに、細長い電極間のサンプルのバルク流を反転させることによって、電界内の分析物の滞留時間を著しく延ばすことができ、それによって、長い分離時間および／またはより高い分離効率と、より良好な分解能がもたらされる。細長い電極に平行などちらかの方向へのバルク流の反転（サイクルと呼ぶ。）は、特定の状況で求められるたびに繰り返すことができるが、実際上の理由および短時間での分離を得るための望みが、このモードで実施されるサイクル数を典型的には制限することになる。
【００１１】
生体粒子やバイオポリマーなどの分析物を分離するための、いくつかの分離媒体が、当技術分野で公知である。例えば、Ｋ．ＨａｎｎｉｇおよびＫ．Ｈ．Ｈｅｉｄｒｉｃｈによって出版された書籍（例えば、非特許文献２参照）は、ＦＦＥ、特にフリーフローＺＥ（ＦＦ−ＺＥ）に適切な分離媒体のリストを報告している。
【００１２】
文献（例えば、特許文献６参照）は、自由溶液中で機能的に安定なプレキャスト狭小ｐＨゾーン勾配を形成することによる等電点電気泳動によって分析物を分離するための、ｐＨ緩衝系である別の分離媒体を開示している。この媒体は、緩衝成分を、相補的な緩衝対として用いる。
【００１３】
文献（例えば、特許文献７参照）は、ＦＦＥに適切な揮発性緩衝系について言及している。揮発性緩衝系は、ＦＦＥステップの後およびＭＳなどの下流分析の前にこの揮発性緩衝系を容易に除去することができるという利点をもたらし、またはこの揮発性緩衝系は、下流分析を妨害しない。
【００１４】
残念ながら、最近になって今日の研究の焦点が当てられるようになった様々なタンパク質は、水溶液に不溶またはほとんど不溶である。例えば電気泳動中にタンパク質が沈殿しないように、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素、またはトリトンＸ−１００が一般に使用されるこれらの方法において、この界面活性剤は、質量分析検出の感度を妨害するので、ＭＳなどの後続の分析の前に除去しなければならない。この問題に対処するために、そのような妨害物質を除去する古典的な方法は、通常、首尾良く行われた電気泳動の後および例えば下流ＭＳ分析の前に使用される。これらの大規模でしばしば困難な清浄化および／または精製手順は、分析時間の全体の長さを延ばし、典型的にはサンプルの損失をもたらす。さらに、これらの労力のかかる手順は、自動化に対する障害となる。したがって、サンプル調製は、今日の首尾良く行われる生体分子分析プロジェクトにおいて、１つの極めて重要な、しばしば技術的に困難を伴う仕事である。問題の（１種または複数の）分析物を、分離ステップ後に前記界面活性剤を除去するのに長時間およびサンプル消費精製ステップを必要とすることなく、分析物の混合物から分離できるようにする界面活性剤が求められている。質量分光分析に本質的に適切な、当技術分野で知られている界面活性剤がある。オクチル−β−グルコピラノシドなどの非イオン性界面活性剤は、質量分析の適用例に使用されてきた（例えば、非特許文献３参照）。しかし、電気泳動分離は依然としてＳＤＳを必要とし、時間のかかる界面活性剤の交換ステップが求められている。
【００１５】
文献（例えば、非特許文献４参照）は、３−［３−（ビスアルキルオキシエチル）ピリジン−１−イル］プロパン−１−スルホネート（ＰＰＳ）と呼ばれる酸に不安定な「開裂性洗浄剤」の性質と、タンパク質の抽出中およびＭＳ分析でのこの化合物の使用について記述しているが、この分析は、分離されまたは少なくとも部分的に実質的な、問題の分析物が得られるように、分離方法を用いることなく、粗製抽出物を用いて実施された。
【００１６】
２００５年に、Ｎｏｒｒｉｓらは（例えば、非特許文献５参照）、タンパク質の溶解度を増大させかつ酸に不安定である代わりに光に不安定でありまたはフッ化物開裂性の、その他の「開裂性洗浄剤」について述べている。洗浄剤の開裂後、その部分は沈殿する可能性があり、ＭＳ分析をもはや妨害せず、またはＭＳ分析前に容易に除去することができる。
【００１７】
Ｎｏｒｒｉｓらによる文献（例えば、特許文献８参照）は、切除腫瘍の切除縁からの組織を分析するための方法について記述しており、また、細胞内部に含有されるタンパク質を抽出するための開裂性洗浄剤３−［３−（ビスアルキルオキシエチル）ピリジン−ｌ−イル］プロパン−ｌ−スルホネート（ＰＰＳ）の使用と、その後に行われるそのＭＳ分析について記述している。
【００１８】
２００５年のＮｏｒｒｉｓらの第２の刊行物（例えば、非特許文献６参照）は、質量分析での開裂性洗浄剤の使用を対象とし、前記洗浄剤は、洗浄剤の開裂後、ＭＳマトリックスとして働くことができる部分を含む。
【００１９】
文献（例えば、特許文献９および１０参照）には、開裂性組成物と、そのような組成物を、特に疎水性タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析で用いる方法とが、記載されている。
【００２０】
文献（例えば、特許文献１１参照）は、分析物の溶解度を増大させることができるＭＳ適合性可溶化剤と、その使用について記述している。可溶化剤は、ＬＣ／ＭＳに適切であると記述されている。
【００２１】
文献（例えば、特許文献１２および１３参照）は、脆弱な界面活性剤と、その使用方法について記述している。界面活性剤は、酸性条件下で界面活性剤を破壊することができるジオキソランまたはジオキサン官能基を含有する。本明細書に記述される界面活性剤は陰イオン性であり、そのためＦＦＥ法にとって、特にフリーフロー等電点電気泳動（ＩＥＦ）にとっては、分離されるサンプル中の粒子に付加された電荷の観点から魅力あるものではなくなる。
【００２２】
文献（例えば、非特許文献７参照）は、タンパク質の溶液内酵素消化のための、酸に不安定な陰イオン性界面活性剤について記述する。界面活性剤は、ＨＰＬＣ−ＭＳに適切である。界面活性剤の陰イオン特性により、この界面活性剤はＦＦＥ法に適切ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第５２７５７０６号明細書
【特許文献２】米国特許第６３２８８６８号明細書
【特許文献３】国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９０１０号明細書
【特許文献４】米国特許仮出願第６０／８２３８３３号明細書
【特許文献５】米国特許仮出願第６０／８８３２６０号明細書
【特許文献６】米国特許第５４４７６１２号明細書
【特許文献７】米国係属仮出願第６０／９４５２４６号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００６／０２９２６０７号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００６／０２４０５６２号明細書
【特許文献１０】国際公開第０２／０９７３９３号パンフレット
【特許文献１１】国際公開２００６／０４７６１４号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第００／７０３３４号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第０３／１０２５３６号パンフレット
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００４／０５０６９７号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００４／０５０６９８号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００４／０４５８２６号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００４／０２６２５１号明細書
【特許文献１８】国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５６１６７号明細書
【特許文献１９】米国特許仮出願第６０／８０５２４８号明細書
【特許文献２０】米国特許仮出願第６０／８２１４９１号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２００４／０１０１９７３号明細書
【特許文献２２】欧州特許出願公開第１３２０７４７号明細
【特許文献２３】米国特許仮出願第６０／８８５７９２号明細書
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Bondy B. et al. (1995), "Sodium chloride in separation medium enhances cell compatibility of free-flow electrophoresis", Electrophoresis 16: 92-97
【非特許文献２】"Free-flow Electrophoresis",(ISBN 3-921956-88-9)
【非特許文献３】Hatt,P et al., 1997
【非特許文献４】Norris et al.(Anal Chem. 75(23), 6642-7, 2003)
【非特許文献５】Norris et al.(J.Mass Spectrom., 1319-1326, 2005)
【非特許文献６】Norris et al.(Anal.Chem., 77, 5036-5040, 2005)
【非特許文献７】Ying-Qing Yu et al.(Anal.Chem., 75, 6023-6028, 2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
今日では、当技術分野において、分離ステップの後および下流分析の前に前記界面活性剤を除去するのに長時間およびサンプル消費精製ステップを必要とすることなく、問題の（１種または複数の）分析物を分析物の混合物から分離するのを可能にする、利用可能な方法を有することが求められている。
【００２６】
本発明の目的は、水溶液に対して不溶なまたはごく限られた可溶性の分析物の分離に適切であるが、通常なら後続の分析を妨害する可能性のある界面活性剤を除去するための古典的な時間およびしばしばサンプル消費精製手順が回避される、方法およびキットを提供することである。本発明の実施形態は、妨害する界面活性剤を除去するのに時間がかかりかつサンプル損失をもたらす清浄化ステップを必要とすることなく、分離された分析物の後続のＭＳ分析を可能にする界面活性剤を使用したＦＦＥによって分析物を分離するための、有利な方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
その結果、本発明の実施形態は、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤の使用を含む、フリーフロー電気泳動によってサンプル中の分析物を分離するための方法に関する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、本発明によるフリーフロー電気泳動分離と、その後に行われる、前記フリーフロー電気泳動分離から得られたサンプルの少なくとも一部の分析とを含む、分析物を分析するための方法を提供する。
【００２９】
本発明の別の態様は、本発明のフリーフロー電気泳動法に適切な、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含む、分離媒体に関する。
【００３０】
本発明のさらに別の態様は、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含む、本発明によるサンプル中の分析物のフリーフロー電気泳動分離を実施するためのキットに関する。
【００３１】
さらに別の態様は、フリーフロー電気泳動における、本発明によるＭＳ適合性の両性イオン性もしくは非イオン性界面活性剤またはＭＳ適合性の両性イオン性もしくは非イオン性の開裂性界面活性剤の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】アフリカニシキヘビ（ｐｙｔｈｏｎ  ｓｅｂａｅ）から得た血清サンプルの揮発性緩衝系を使用した、等電点電気泳動によるフリーフロー電気泳動分離から得られた画分の、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図であって、この分離が３−［３−（ｌ，ｌ−ビスアルキルオキシエチル）ピリジン−ｌ−イル］プロパン−ｌ−スルホネート（ＰＰＳ）の存在下で（第１のゲル）またＰＰＳが存在しない状態で（第２のゲル）実施された状態を示す図である。
【図２】ＰＰＳ含有サンプルの画分２６のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルを示す図である。
【図３】分離ゾーン内に０．１％ＰＰＳを含む緩衝系のそれぞれのｐＩマーカーの分布を可視化する、λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、および５９５ｎｍでの、ＦＦＥ画分の吸光度を示す図である。
【図４】分離ゾーン内に０．１％ＰＰＳを含まない緩衝系のそれぞれのｐＩマーカーの分布を表す、λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、および５９５ｎｍでの、ＦＦＥ画分の吸光度を示す図である。
【図５】ＨＥＬＡ細胞からの全細胞抽出物（ＰＰＳでＨＢＳ緩衝液に抽出された。）を含有するサンプルの、フリーフローゾーン電気泳動画分の銀染色ＳＤＳ  Ｐａｇｅを示す図である。
【図６】ＰＰＳで抽出された膜タンパク質を含有するサンプルの、フリーフロー電気泳動画分の銀染色ＳＤＳ  Ｐａｇｅを示す図である。
【図７】分離ゾーン内に０．１％ＰＰＳを含む緩衝系のそれぞれのｐＩマーカーの分布を可視化する、λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、および５９５ｎｍでのＦＦＥ画分の吸光度によって表された、ＦＦＥ分離溶出プロファイルを示す図である。
【図８】分離ゾーン内にＰＰＳを含まない緩衝系のそれぞれのｐＩマーカーの分布を可視化する、λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、および５９５ｎｍでのＦＦＥ画分の吸光度によって表された、ＦＦＥ分離溶出プロファイルを示す図である。
【図９】本発明の方法を実施するための適切なＦＦＥ装置を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の実施形態は、実質的に水性の媒体における、例えば疎水性の、ごくわずかに水溶性の、または水不溶性の分析物の可溶化を支援する、非イオン性または両性イオン性のＭＳ適合性界面活性剤を含む水溶性、わずかに水溶性、および本質的に水不溶性の分析物の、効率的、選択的、および再現可能なフリーフロー電気泳動分離を実施するための方法、分離媒体、およびキットに関する。さらに、前記界面活性剤は、水溶性分析物を含むサンプルにも同様に役立てることができるが、これは例えば、ある条件下で前記分析物の沈殿を防止するのに必要である可能性があるからである。
【００３４】
本発明の実施形態は、下記の事項、即ち：
ａ）電気泳動分離と後続の分析すなわちＭＳ適合性界面活性剤が分析方法を妨害してはならない分析との間で、妨害する界面活性剤を除去するのに、時間がかかり、および／またはサンプル損失をもたらす精製ステップが要求されない；
ｂ）フリーフロー電気泳動は、ゲル電気泳動、特に２Ｄゲル電気泳動に比べて短い分離時間を有し、不安定な界面活性剤が通常ならより長い滞留時間で開裂する分離条件の使用を可能にする；
ｃ）例えば向流媒体によって、フリーフロー電気泳動分離の最中または直後に緩衝成分を変化させることができるために、不安定な界面活性剤の即座の安定化または開裂が可能になる；および
ｄ）高速分離と後続の分析との組合せによって、分析物混合物からの分析物の、より高速な、より良好な、自動化された、分離および同定が可能になる；
という事項の１つまたは複数を含むがこれらに限定するものではない、いくつかの利点を有する方法を含む。
【００３５】
本発明の実施形態は、例えば、膜結合性タンパク質分離を改善するために、特に水性溶解産物中のその低溶解度および濃度の観点から検出するのがただでさえ難しいタンパク質または分析物の分離を改善するために、使用することができる。
【００３６】
したがって、本発明の１つの主な態様は、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含むフリーフロー電気泳動分離を行うステップを含む、フリーフロー電気泳動によってサンプル中の分析物を分離するための方法に関する。
【００３７】
好ましい実施形態では、サンプルの少なくとも一部は、電気泳動分離後に１つまたは複数の画分に収集される。
【００３８】
本発明の有利な方法は、多くの下流分析物を妨害する界面活性剤を除去するのに時間がかかりかつサンプル損失をもたらす清浄化ステップを必要とすることなく、タンパク質その他の化合物の分離を可能にするだけではなく、例えば質量分析による後続の分析も可能にする。任意選択で、問題の分析物がタンパク質である場合、前記タンパク質をより小さいペプチドに切断する消化ステップは、フリーフロー電気泳動の前または後に行うことができる。前記消化ステップを行うために、フリーフロー電気泳動で使用されるＭＳ適合性界面活性剤を除去することも必要とせず、それどころか前記界面活性剤の存在によって消化をさらに改善することができるのに対して、例えば尿素などの一般に使用される界面活性剤については、その濃度を、前記消化ステップ前にある程度低下させなければならずまたはさらに完全に排除しなければならない。
【００３９】
したがって、本発明の別の態様は、本発明によるフリーフロー電気泳動分離と、その後に行われる、フリーフロー電気泳動から得られたサンプルの少なくとも一部の分析とを含む、分析物を分析するための方法に関する。
【００４０】
本出願のコンテクストにおいて、「分離する」および「分離」という用語は、電界でのそれらの種々の挙動に基づいた２種以上の分析物の混合物の、任意の空間的分配を意味するものとする。したがって分離は、限定するものではないが、サンプル中に含有されるある画分または分析物の、分画ならびに特異的および選択的濃縮または枯渇、濃縮および／または単離を含む。しかし分画は一般に、分析物の残りの部分から得たサンプル中のある分析物の分配または濃縮を意味し、前記その他の分析物が電気泳動ステップ中にさらに分離されるか否かには無関係なものであると理解されることがわかるであろう。分画および分離という用語の間に明瞭な区別はないことが容易に明らかにされるが、後者は、サンプル中の様々な分析物のより微細なまたはより詳細な空間的分配を意味する。このように、本出願が「分離する」または「分離」という用語に言及するときはいつでも、分離、分画、単離、濃縮、または枯渇を含めた前述の意味の少なくとも１つを含むものとする。
【００４１】
分離は、主に、ある画分が引き続き収集されるように調製的手法で実施することができ、または単に分析的に実施することができ、この場合問題の分析物またはある画分中のその存在は適切な手段によって検出されるだけであるが、例えばさらなる使用のために収集されない。
【００４２】
本明細書で使用される「サンプル」という用語は、その少なくとも一部について、フリーフロー電気泳動分離および／または分析が行われる任意の組成物を指す。典型的には、サンプルは、問題の少なくとも１種の分析物を含みまたは含むと考えられる。
【００４３】
本発明のコンテクストにおける「分画サンプル」は、サンプル中の様々な分析物がＦＦＥ中に分離され、したがってサンプルを、ＦＦＥ分離ステップ後にいくつかの画分に分割することができるサンプルを意味する。当業者なら、ＦＦＥに適切な装置の分離チャンバから多数の収集出口を通して出て行った、一般に個々のチュービングを通して任意の適切なタイプの個々の収集容器（例えば９６ウェルプレート、場合によっては異なるサイズ、例えば９６、３８４、１５３６、またはされにそれ以上のウェルのプレート）にもたらされた個々の画分を、どのように収集するのか理解されよう。フリーフロー電気泳動分離法が行われたサンプルの少なくとも一部は、前記電気泳動分離後に１つまたは複数の画分に収集されることが理解されよう。
【００４４】
「分析物」、「問題の分析物」、および「問題の分子」という用語は、分離し、単離し、検出し、定量し、またはその他の方法で試験をし、研究をし、または分析をしようとする分子を示すために、本明細書では同義に使用される。このように、本明細書における「分析物」という用語の使用は、問題の分子のタイプを決定することのみに限定されず；むしろ、例えばリガンド間相互作用、および前記問題の分子の３Ｄ構造または構造変化などに関するその他の知見を包含する。本発明の実施形態によるＦＦＥ法によって分離することができる典型的な分析物には、無機および有機分子、生体粒子、バイオポリマー、および生体分子、またはこれらの任意の組合せが含まれる。問題の分析物、特に生体粒子、バイオポリマー、および生体分子の非限定的な例は、タンパク質、特に膜結合性タンパク質、内在性膜タンパク質および親油性タンパク質、タンパク質凝集体、タンパク質複合体、ペプチド、疎水性ペプチド、ＤＮＡ−タンパク質複合体（例えば、クロマチン）、ＤＮＡ、膜、膜断片、脂質、糖、およびこれらの誘導体、多糖およびその誘導体、ホルモン、リポソーム、ウイルス粒子、抗体、抗体複合体、ナノ粒子、または前述のいずれかの混合物である。本発明のある実施形態により分離することができる無機または有機分子には、プラスチックのある構成成分、ラテックス塗料粒子、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、デキストラン、セルロース誘導体、ポリ酸、医薬品、プロドラッグ、薬物の代謝産物、爆発物（ｅｘｐｌｏｓｉｖｅ）、毒素、発癌物質、毒物、アレルゲン、感染因子、ナノ粒子などの、疎水性ポリマーが含まれる。
【００４５】
本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、限定するものではないが、ペプチド、酵素、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、成長因子、タンパク質複合体、タンパク質凝集体など、約２０以上のアミノ酸を有するものを含めた任意のタンパク質を指す。タンパク質は、約２０超のアミノ酸、約５０超のアミノ酸残基、約１００超のアミノ酸残基、または約２００超のアミノ酸残基で構成されたポリペプチドを含み、これらは任意選択で、例えばグリコシル化、硫酸化、またはリン酸化によって修飾することができるものである。
【００４６】
本明細書で使用される「親油性タンパク質」という用語は、少なくとも１つの親油性領域を有するタンパク質を指す。生体内でファンデルワールス力を用いて膜と相互に作用することができる膜結合性タンパク質は、親油性タンパク質の非限定的な例である。任意選択で、親油性タンパク質は、例えば膜の極性頭部と相互に作用する極性またはイオン基を含有するタンパク質を包含してもよい。非限定的な例は、Ｋセグメントまたは受容体を含むデヒドリンである。受容体分子は、当技術分野で認められており、一般に、細胞外、細胞内、および／または膜貫通ドメインを有する。
【００４７】
本明細書で使用される「内在性膜タンパク質」という用語は、生体内で生体膜に永久に結合したタンパク質分子（またはタンパク質のアセンブリ）に関する。内在性膜タンパク質の最も一般的なタイプは、生体膜全体に及ぶ種類の膜貫通タンパク質である。構造的に、内在性膜タンパク質の領域は、膜のリン脂質二重層の疎水性領域を貫通する。この相互作用により、内在性膜タンパク質は、通常、二重層の疎水性相互作用を乱す界面活性剤を使用することによってのみ、膜から除去することができる。
【００４８】
本明細書で使用される「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つのペプチド結合を含む任意の実体を指し、Ｄおよび／またはＬアミノ酸を含むことができる。ペプチドは、約２から約１５０、好ましくは約２から約１００、より好ましくは約２から約５０、最も好ましくは約２から約２０アミノ酸を有することができる。
【００４９】
「疎油性」および「親水性」という用語は、本明細書で同義に使用することができ、水に溶解し、水と混合され、または水に濡れる傾向がある分析物、化合物、および物質を指す。親水性または疎油性の分析物、化合物、および物質は、帯電し極性になる傾向があり、したがってその他の荷電および極性溶媒または分子環境を好む。
【００５０】
「親油性」および「疎水性」という用語は、本明細書では同義に使用することができ、水に溶解せず、水と混合せず、または水に濡れない傾向がある分析物、化合物、および物質を指す。疎水性または親油性の分析物、化合物、および物質は、電気的中性および無極性になる傾向があり、したがって、その他の中性または無極性溶媒または分子環境を好む。
【００５１】
本明細書で使用される「ａ」という用語は、「１つ」、「少なくとも１つ」、または「１つまたは複数」と理解しなければならない。
【００５２】
「界面活性剤」、「洗浄剤」、「湿潤剤」、および「乳化剤」という用語は、本明細書では同義に使用することができ、水中で表面張力を低下させることが可能な分子または組成物を指す。界面活性剤は、典型的には両親媒性の有機化合物であり、疎水性基（化合物の「尾部」）と親水性基（化合物の「頭部」）との両方を含有することを意味する。したがって界面活性剤は、有機溶媒と水の両方に可溶である。例えば界面活性剤は、水溶液中での疎水性ペプチドまたはタンパク質の保持を促進させる。
【００５３】
本明細書で使用される「ＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤」という用語は、両性イオン性または非イオン性にすることができるＭＳ適合性界面活性剤を意味する。いくつかの実施形態では、両性イオン性または非イオン性界面活性剤は要するに、２つの電極間の個別の領域のｐＨに応じて負または正に帯電していてもよいが、非イオン性のＭＳ適合性界面活性剤は、いずれにおいてもそのｐＨ範囲内で帯電せず、問題の分析物は、フリーフロー電気泳動に適切な装置に挿入されまた装置から溶出される。さらに、本発明で使用される両性イオン性のＭＳ適合性界面活性剤の等電点は、一般に、分離ゾーンのｐＨ範囲内にあることを理解すべきである。本明細書で使用される「ＭＳ適合性界面活性剤」および「ＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤」という用語は、ＦＦＥに適切な界面活性剤が分離ゾーン分離のｐＨ範囲内で両性イオン性または非イオン性でなければならないので、同義に使用することができる。
【００５４】
界面活性剤のコンテクストにおいて本明細書で使用される「両性イオン性」という用語は、電気的に中性であるが正式には正および負の電荷を異なる原子上に保持する化合物を指す。限定すると理解すべきではない例は、例えば、ベタイン誘導体であり、好ましくは３−（トリメチルアンモニウム）−プロピルスルホナトなどのスルホベタインまたはホスホベタインである。典型的には、本発明で使用される両性イオン性界面活性剤の等電点（ｐＩ）は、分離ゾーンのｐＨ範囲内にあり、好ましくは、両性イオン性界面活性剤のｐＩは、装置のサンプル導入点のｐＨ値と問題の分析物の溶出点のｐＨ値との間のｐＨ範囲内にある。いくつかの実施形態では、両性イオン性界面活性剤のｐＩは、問題の分析物の溶出ｐＨ値から１．５以下、１以下、０．７５以下、０．５以下、または０．２５以下のｐＨ単位離れている。
【００５５】
界面活性剤のコンテクストにおいて本明細書で使用される「非イオン性」という用語は、（双）極性化合物を指す。この例には、限定するものではないが、Ｃ6、Ｃ7、Ｃ8、Ｃ9、Ｃ10、Ｃ11、Ｃ12~30−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−アラルキル、または−アリールなどの少なくとも１個の疎水性置換基を有する糖誘導体が含まれる。特に、アセチルピラノシドおよび単に疎水性置換基を有する他の糖誘導体は、非イオン性界面活性剤には属さない。典型的に、非イオン性界面活性剤は、ｐＨ範囲内で帯電しておらず、問題の分析物は、フリーフロー電気泳動に適切な装置に挿入されこの装置から溶出され、非イオン性界面活性剤は、分離ゾーンのｐＨ範囲内で帯電していないことが好ましい。しかし、前記ゾーンのｐＨ範囲に応じて、非イオン性化合物はそれにも関わらず、問題の分析物を分離するのに使用されるｐＨ範囲の外のあるｐＨで帯電するようになることが起こり得る。
【００５６】
本明細書で使用される「ＭＳ適合性」という用語は、ＭＳ分析で使用することができる界面活性剤を示す。「ＭＳ適合性界面活性剤」という用語は、それ自体がＭＳ分析に適切な、即ち修飾のない界面活性剤を包含し、その非開裂状態ではＭＳ適合性ではなく、少なくとも１カ所で少なくとも２つの部分に開裂することができる、「開裂性」界面活性剤も包含する。前記部分は、ＭＳ適合性または非ＭＳ適合性にすることができる。本発明による開裂性界面活性剤の非ＭＳ適合性部分は、例えば遠心分離、濾過、または蒸発によって容易に除去することができ、それに対してＭＳ適合性部分は、溶液中に留まることができ、下流分析中に存在することができ、またはある条件下で同様に、遠心分離、濾過、または蒸発によって除去することができる。好ましい実施形態では、結果的に得られた複数の部分がＭＳ適合性である。そのようなＭＳ適合性の開裂性界面活性剤は、例えばタンパク質消化ステップを含む方法に適切である。タンパク質は、水に不溶であってもよいが、消化から得られたその断片または断片の一部は可溶であってもよく、例えばＭＳによって分析することができる。
【００５７】
本発明の開裂性界面活性剤によってもたらされる利点の非限定的な例として、適切なＭＳ適合性界面活性剤の存在下での分析物の質量分析検出の感度は、例えばＳＤＳの存在下での分析物の質量分析検出の感度よりも非常に高い。ほとんどの場合、ＳＤＳを含むサンプルの質量スペクトルは、ＳＤＳで処理された分析物によりまたは前記分析物の分解生成物が原因で、シグナルを全く示さずまたはごく弱いシグナルしか示さない。これとは対照的に、前記分析物を含みＳＤＳの代わりにＭＳ適合性界面活性剤の存在下で質量分光分析が行われるサンプルは、分析物および前記分析物の分解生成物に関連したシグナルを示す。
【００５８】
したがってＭＳ適合性界面活性剤は、質量分光分析が行われる定められた濃度を有する可溶性対照分析物を含むサンプル（Ｓサンプル）中にこの界面活性剤が存在することによって、同じように定められた濃度で前記対照分析物を含むが界面活性剤を含まないサンプル（Ｃ（対照）サンプル）の質量スペクトルに比べ、本質的に少なくとも同じ質量ピーク（同様のまたはさらに高い強度で）を含む質量スペクトルをもたらす界面活性剤であると、即ち質量スペクトルが本質的に同一である界面活性剤であると理解することができる。いくつかの実施形態では、Ｓサンプルから得られたＭＳスペクトルは、Ｃサンプルから得られたＭＳスペクトルに比べ、例えば対照分析物が質量分光分析前に消化され分解生成物が疎水性であり質量分光分析前にＣサンプル中に沈殿する場合、対照分析物の分解生成物に起因してより多くの質量ピークをさらに含んでもよい。
【００５９】
ＭＳ適合性界面活性剤を同定する適切な手順は、例えば、文献（例えば、特許文献１１参照）に記載されている。ＢＳＡ、一般に利用される試験タンパク質は、例示的な無傷のタンパク質として使用することができ、β−ガラクトシダーゼのトリプシン消化物（ｔ−β−ｇａｌ）を例示的なペプチド混合物として使用することができる。β−ガラクトシダーゼトリプシン断片は、親水性から疎水性までの溶解度範囲を有する。さらに、多くのその他の物質も、ＭＳスペクトルが得られるように水に対して十分可溶性である限り、対照分析物として働くことができる。
【００６０】
非限定的な例として、β−ガラクトシダーゼＳ−サンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を、同等のＣサンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析と比較することができる。９００〜３７００ｍ／ｚ範囲でのイオン化抑制は、ＳおよびＣサンプルで同定された質量−イオンの一致を比較することによって、決定することができる。当業者なら、有用なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析をどのように行うか、わかるであろう。
【００６１】
好ましくは、Ｓサンプルの位置合わせされた質量ピークのそれぞれの強度は、Ｃサンプルの同一の質量ピークの強度に対して２５％以上であり、より好ましくは、Ｃサンプルの同じピークの強度と本質的に同じであり、または最も好ましくは、Ｃサンプルの同じピークの強度よりもさらに高い。
【００６２】
ごくわずかしか溶解せずまたは不溶性の（１種または複数の）分析物または（対照）分析物の消化生成物に関し、前記ごくわずかしか溶解せずまたは不溶性の分析物／消化生成物とＭＳ適合性界面活性剤とを含むサンプルの質量スペクトル内の質量ピークの強度は、界面活性剤を全く含有しないサンプルに関して得られた質量スペクトルの同一の質量ピークの強度よりも、少なくとも１、１．５、３．５、１０、１００、または１０００倍高いことが好ましい。
【００６３】
本明細書で使用される「本質的に同一な」は、Ｃサンプルの対照分析物の分解生成物による質量ピークの少なくとも６０％、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは約１００％が、Ｓサンプルのスペクトル内にも存在することを意味する。ＭＡＳＣＯＴ（登録商標）などのサーチエンジンを使用して、例えば消化されたｔ−β−ｇａｌまたはＢＳＡのＭＳスペクトルと、ｔ−β−ｇａｌの消化物の理論上のＭＳスペクトルまたはＢＳＡの理論上のＭＳスペクトルとを比較することができる。本発明の目的で、９００から２６００ｍ／ｚの範囲を典型的に考慮すべきである。
【００６４】
言い換えれば、本発明のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤の存在下で得られた質量スペクトルは、Ｃサンプルの対照分析物の分解生成物による質量ピークの少なくとも６０％、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％を含む。
【００６５】
Ｃサンプルの質量シグナルと、Ｓサンプルの同一の質量シグナルとの間の質量差は、使用される方法または装置に従属する測定誤差の範囲内で変化する可能性がある。当業者なら、そのような測定誤差をどのように決定するかが理解されよう。例えば、イオントラップ質量分析計の質量測定精度は、典型的には０．５から２．５ダルトンの間で計算されるのに対し、誤差が５０ｐｐｍ未満またはさらに２５ｐｐｍ未満の質量測定精度は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの適用例で約９００から３７００ダルトンに及ぶ質量シグナルを測定することによって実現することができる。
【００６６】
本発明の界面活性剤の適合性とは無関係に、フリーフロー電気泳動およびその後の分析（ＭＳなど）での界面活性剤の濃度はやはり可能な限り低くあるべきであり、好ましくはその臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）付近であるべきことが理解されよう。界面活性剤のＣＭＣを決定するのに当技術分野で適切な方法は、当業者に公知である。さらに、多くの界面活性に関し、そのＣＭＣは既に公知である。
【００６７】
ＭＳ適合性界面活性剤は、典型的には、１００ｍＭよりも低い濃度で使用される。界面活性剤に応じて、５０ｍＭよりも低く、３０ｍＭよりも低く、１５よりも低く、５よりも低く、１よりも低く、さらに０．１ｍＭよりも低い濃度が適切と考えられる。例えば、本発明で使用される、フリーフロー電気泳動が行われるサンプル内の開裂性界面活性剤ＰＰＳの量は、０．１％（ｗ／ｖ）であった。この量は、２から１０ｍＭの間の濃度（ＰＰＳのアルキル鎖の組合せに応じて）に相当する。
【００６８】
当業者なら、それぞれが対照分析物を異なる濃度で含むＣサンプルおよびＳサンプルの質量スペクトルを比較することによって、本発明による典型的なＭＳ適合性界面活性剤を容易に同定することができる。この方法により、当業者は、界面活性剤がＭＳ適合性であるか否かを決定することが可能になる。特に、水にほぼ不溶性のまたは不溶性の（界面活性剤を含まない）分析物は、サンプル調製が界面活性剤の使用を含まない場合、分析可能な質量スペクトルを全く示さない可能性があることが予測される。したがって、ＭＳ適合性界面活性剤の存在下での、フリーフロー電気泳動による問題の分析物の分離は、そのような分析物を下流分析で同定し特徴付けるのに適切なサンプルをもたらす。前記下流分析は、質量分析または当技術分野で知られている任意のその他の適切な分析にすることができる。
【００６９】
好ましい実施形態では、本発明による方法は、サンプル媒体中および／または少なくとも１種の分離媒体中に含まれる、本発明による少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含む、フリーフロー電気泳動分離を行うステップを含む。別の好ましい実施形態は、ＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含む、本発明によるフリーフロー電気泳動分離を行うのに適切な分離媒体に関する。さらに、その他の別の好ましい実施形態は、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含んだフリーフロー電気泳動分離を行うステップを含み、前記界面活性剤がサンプル媒体中および／または少なくとも１種の分離媒体中に存在するものである、フリーフロー電気泳動によってサンプル中の分析物を分離するための方法に関する。ＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、サンプル媒体中または分離媒体中に１種しか存在しないことが好ましいが、サンプル媒体中および／または分離媒体中での、多数のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤の任意の組合せが可能である。１つの好ましい実施形態では、本発明の方法で使用される全ての両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、ＭＳ適合性界面活性剤である。界面活性剤のそれぞれは、サンプル媒体および／または少なくとも１種の分離媒体中に含めることができる。
【００７０】
さらに、本明細書で使用されるＭＳ適合性界面活性剤は、フリーフロー電気泳動分離中にそれ自体をＭＳ適合性にすることができ、または界面活性剤の開裂を通してＭＳ適合性にすることができる。後者の場合、ＭＳ適合性界面活性剤は、ＭＳ適合性の開裂性界面活性剤である。本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤が開裂性界面活性剤である方法であるが、任意選択で他のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を存在させてもよいことが理解されよう。別の好ましい実施形態では、サンプル媒体および／または分離媒体中の全てのＭＳ適合性界面活性剤が開裂性である。
【００７１】
「ＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性の開裂性界面活性剤」、「ＭＳ適合性の開裂性界面活性剤」、または「開裂性界面活性剤」という用語は、本明細書で同義に使用され、特定の条件下で少なくとも２つの部分に開裂することができる界面活性剤を指す。ある実施形態で、開裂性界面活性剤の開裂部分の少なくとも１つは、上記にて定義されたＭＳ適合性である。そのようなＭＳ適合性部分は、質量分光分析中に存在させることができ、または存在させなくてもよく、例えばＭＳ分析前に蒸発させることができる。非ＭＳ適合性部分は、開裂後に沈殿し、またはＭＳ分析前に蒸発させることができる。
【００７２】
以下に述べるように、３つ以上の部分は開裂ステップから得られることが理解されよう。本発明の方法に適切な開裂性界面活性剤に関する制約として理解すべきではない例として、ＭＳ適合性の開裂性界面活性剤は、ＭＳ適合性であり溶液中に存在したままの親水性頭部基と、遠心分離または濾過によってサンプルから容易に除去することができる疎水性の非ＭＳ適合性尾部とに開裂することができる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、開裂したＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤の部分の少なくとも１つを、濾過、遠心分離、および／または蒸発によって、サンプルからまたは分画サンプルの少なくとも一部から除去することができる。
【００７３】
好ましくは問題の分析物が本質的に安定でありかつ得られた全ての非ＭＳ適合性部分を遠心分離、濾過、または蒸発によって容易に除去することができる条件下で開裂剤によって破壊することができる、疎水性部分（尾部）と親水性部分（頭部基）とを組み合わせる結合を含む任意の界面活性剤は、ＭＳ適合性の開裂性界面活性剤として適切である。本発明によれば、そのような結合は、開裂性結合と呼ばれることになる。好ましくは、そのような結合は、問題の分析物が本質的に安定な条件下で開裂する。開裂性界面活性剤を開裂させるのに適切な条件下、本質的に安定な分析物は、開裂ステップ中に存在する前記分析物の少なくとも約８０％、約９０％、好ましくは約９７％、より好ましくは約９９％、最も好ましくは１００％が開裂ステップ後に未変性である問題の分析物であり、即ち分析物は主に、好ましくは完全に、開裂ステップ中の特定の条件下で化学反応に不活性であることを理解すべきである。このコンテクストで化学反応に不活性とは、分析物中の共有結合が、界面活性剤の開裂ステップ中に破壊されずまたは確立されないことを意味する。
【００７４】
本明細書で使用される「開裂剤」は、開裂性界面活性剤中の結合を選択的に開裂させるのに適切な任意の形をとる、任意の手段または化合物または化合物の混合物を指す。開裂性界面活性剤を選択的に開裂させるのに適切な化合物に関する非限定的な例は、開裂性界面活性剤中の酸または塩基に不安定な結合を選択的に開裂させる、酸または塩基またはこれらの溶液／混合物と考えられる。この例およびその他の例は、以下により詳細に記述する。さらに、「開裂剤」という用語は、開裂性界面活性剤中の結合を選択的に開裂させるのに適切な手段を包含する。そのような手段は、例えば、光に不安定な開裂性界面活性剤を開裂させるために離散波長の光を放出する発光手段にすることができる。
【００７５】
本明細書で使用される、「開裂性界面活性剤を開裂させるための溶液」という用語は、リンカーと開裂性界面活性剤中の部分との間の１つまたは複数の結合を選択的に開裂させ、それによって少なくとも２つの部分をもたらすのに適切な、作用剤または組成物を含む任意の溶液を指し、但しこれらの部分の中で非ＭＳ適合性部分は遠心分離、濾過、または蒸発によってサンプルから容易に除去できるものであり、ＭＳ適合性部分は、溶液中に存在したままでもよくまたは遠心分離、濾過、もしくは蒸発によって同様に除去することができるものである。
【００７６】
ＭＳ適合性の開裂性界面活性剤は、複数の開裂性結合、例えば１つまたは複数の開裂ステップから３つの部分をもたらす２つの開裂性結合を含んでもよい。各開裂性結合は独立して、共有結合、イオン結合、水素結合、または錯結合からなる群から選択することができる。１つまたは複数の共有結合が、本発明のコンテクストでは好ましい。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明によるフリーフロー電気泳動分離によって分離されたサンプルの少なくとも１つの画分中の、少なくとも１種の開裂性のＭＳ適合性両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、電気泳動分離後に開裂し、即ち少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、少なくとも１つのＭＳ適合性部分と、濾過、蒸発、または遠心分離によって容易に除去することができる部分とに開裂する。この場合も、ＭＳ適合性部分は後で行われる分析の前に蒸発によって除去することもでき、即ち開裂ステップから得られた非ＭＳ適合性部分については前記下流分析が行われないのに対し、ＭＳ適合性部分は下流分析で存在してもよくまたは任意選択で存在しなくてもよいことがわかる。
【００７８】
ＭＳ適合性の開裂性界面活性剤は、少なくとも１つの酸に不安定な結合を含んでもよく、即ち界面活性剤は、酸に不安定であり、または少なくとも１つの塩基に不安定な結合を含んでもよく、即ち界面活性剤は塩基に不安定であり、または少なくとも１つの光に不安定な結合を含んでもよく、即ち界面活性剤は光に不安定であり、または少なくとも１つの化学反応性結合を含んでもよく、即ち界面活性剤は化学反応性である。
【００７９】
酸および塩基に不安定な開裂性界面活性剤は、分画サンプル／画分の少なくとも一部のｐＨを変化させることによって、例えば、酸または塩基に不安定な開裂性界面活性剤を含む本発明によるＦＦＥ分離後に分画サンプルの少なくとも一部／少なくとも１つの画分を酸性化またはアルカリ性にすることによって、開裂させてもよい。光に不安定な開裂性界面活性剤は、照射によって開裂させてもよく、即ち、開裂性界面活性剤の開裂は、少なくとも１種の光に不安定な開裂性界面活性剤を含むＦＦＥ分離後に、分画サンプルの少なくとも一部／少なくとも１つの画分について、リンカーと前記界面活性剤の部分との間の結合を選択的に破壊するのに適切な定義された波長を含みまたはそのような波長からなる光の照射を行うことによって、実施される。化学反応性の開裂性界面活性剤は、反応性作用剤を添加することによって開裂させてもよく、即ち、開裂性界面活性剤の開裂は、ＦＦＥ分離後に、分画サンプルの少なくとも一部／少なくとも１つの画分に化学反応性界面活性剤中の結合を破壊することが可能な試薬を添加することによって実施される。例えば、ジスルフィド結合などを開裂させるのに適切な反応物は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、または下記の一般式のシラン化合物を開裂させるのに適切な反応物である
【００８０】
【化１】
2011503598.tif 000003
【００８１】
（式中、Ｒ１は、Ｃ7〜Ｃ20アルキルまたはＣ7〜Ｃ30アルキルアリールから選択され、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立してＣ1〜Ｃ5アルキルであり、
ＡはＮまたはＰであり、
Ｘ-はハロゲン化物であり、
ｎは１〜５である。）。
【００８２】
好ましい実施形態では、フリーフロー電気泳動に使用される化学反応性の開裂性界面活性剤が、｛２−［（ジメチル−オクチル−シラニル）−エトキシ］−２−ヒドロキシ−エチル｝−トリメチルアンモニウムブロミドである。
【００８３】
例示的な光に不安定な界面活性剤は、例えば、３−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）アクリル酸オクチルエステルなどの桂皮酸エステルである。
【００８４】
別の好ましい実施形態では、酸に不安定な開裂性界面活性剤は、３−［３−（１，１−ビスアルコキシエチル）ピリジン−１−イル］プロパン−１−スルホネート（ＰＰＳ）である。
【００８５】
化学反応性の開裂性界面活性剤の場合、特に酸または塩基に不安定な開裂性界面活性剤の場合、本発明のＦＦＥ法は、他の電気泳動法／技法に優る、明らかな利点を提供する。事実、ＦＦＥは、他の電気泳動技法では不可能な、広く様々な開裂性界面活性剤の使用を可能にする。例えば、ＰＰＳなどの酸に不安定な界面活性剤は、極めて吸湿性が高く、中性ｐＨでは水によってゆっくりと、また酸性もしくは塩基性ｐＨでは加速された速度で開裂する。ＰＰＳの製造業者であるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙによれば、パッケージを空気中で開封したら、その内容物を水性緩衝液（ｐＨ７〜８）で即座に元に戻し、高温から保護し、１２時間以内に使用することが推奨される。これは、特にｐＨに不安定な開裂性界面活性剤を、実験の持続時間が比較的短い電気泳動でしか使用できないことを意味する。実験の最長持続時間は、ｐＨが低下しまたは上昇した場合、さらに短くなる。したがって、非中性ｐＨでは、電気泳動実験を、さらにより短い時間枠内で実施しなければならない。ＦＦＥの利点は、電気泳動分離、例えばフリーフローＩＥＦを、界面活性剤の安定性を確かなものにするのに必要とされるこの短い時間枠内で行うことができることである。対照的に、２Ｄゲル電気泳動の１次元で（または、オフゲル手段で）行われるＩＥＦは、典型的には５時間以上の、またはさらに長い（最長７〜９時間、またはそれ以上）実験時間を必要とする。このように、開裂性界面活性剤は、かなりの程度まで、特に非常に低くまたは非常に高いｐＨで分解する可能性がある。
【００８６】
さらに、分析物を分離するためのフリーフロー（インターバル）ゾーン電気泳動は、界面活性剤が十分に長い時間にわたって安定な、一定のｐＨで行うことができる。
【００８７】
さらに、本発明に記述される向流媒体の使用は、分離が生じた直後に開裂性界面活性剤を安定化させることができる。これにより、高い酸性または塩基性ｐＨでの分析物の分離が非常に短い時間枠（例えば、約５分まで短くなる。）で可能になり、その後すぐに、さらなる処理に向けて前記開裂性界面活性剤の安定性を増大させるため、向流媒体を通して開裂性界面活性剤が本質的に安定である元のｐＨ値にまでｐＨを調節することが可能になる。
【００８８】
したがって本発明の一実施形態は、例えば、フリーフロー電気泳動分離ステップの後に明らかな画分のｐＨを調節することによって、フリーフロー電気泳動後に内部に含まれる開裂性界面活性剤が安定化するように、向流媒体を媒体条件に適合させるのに使用されるＦＦＥ法に関する。
【００８９】
上記非限定的な例に記述されるこれらの原理は、限られた時間の長さに関してのみ、ある分離条件下で安定な、その他のタイプの開裂性界面活性剤にまで拡げることができることが理解されよう。
【００９０】
向流媒体は、例えば、ＦＦＥ画分について即座に別の処理を行われるよう界面活性剤を開裂させる開裂剤を導入するために、異なる方法で使用することもできる。
【００９１】
したがって本発明の別の実施形態は、開裂剤を含む向流媒体が、前記開裂性界面活性剤を開裂させるため、開裂性界面活性剤を含むフリーフロー電気泳動分離後のサンプルの画分の少なくとも一部と接触し、および／または混合される、フリーフロー電気泳動法に関する。
【００９２】
ＭＳ適合性界面活性剤の使用はＭＳ適用例に限定されず、ＭＳ適合性界面活性剤は、本発明のフリーフロー電気泳動法のいずれかの後にその他の分析適用例で存在させてもよいことが理解されよう。したがって本発明は、本明細書に記述されるフリーフロー電気泳動分離と、その後に行われる、限定するものではないがフリーフロー電気泳動、ゲル電気泳動、１Ｄ−および２Ｄ−ＰＡＧＥ、ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ、ＳＥＬＤＩ  ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＥＬＩＳＡ、ＩＲ分光法、ＵＶ分光法、ＨＰＬＣ、エドマン分解法、ＮＭＲ分光法、表面プラズモン共鳴、Ｘ線回折、核酸配列決定、エレクトロブロッティング、アミノ酸配列決定、フローサイトメトリー、円偏光二色性、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される技法を含むフリーフロー電気泳動から得られた少なくとも１つの画分の分析とを含む、分析物を分析するための方法も提供する。好ましい実施形態は、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤の使用を含むフリーフロー電気泳動分離であって、前記界面活性剤がサンプル媒体中および／または少なくとも１種の分離媒体中に含まれている、フリーフロー電気泳動分離と、その後に行われる、フリーフロー電気泳動から得られた少なくとも１つの画分の分析であって、前述の、その後に行われる分析が、フリーフロー電気泳動、ゲル電気泳動、１Ｄ−および２Ｄ−ＰＡＧＥ、ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ、ＳＥＬＤＩ  ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（／ＭＳ）、ＥＬＩＳＡ、ＩＲ分光法、ＵＶ分光法、ＨＰＬＣ、エドマン分解法、ＮＭＲ分光法、表面プラズモン共鳴、Ｘ線回折、核酸配列決定、エレクトロブロッティング、アミノ酸配列決定、フローサイトメトリー、円偏光二色性、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されものである、分析とを含む、分析物を分析するための方法に関する。
【００９３】
問題の分析物がタンパク質またはポリペプチドである場合、前記タンパク質またはポリペプチドの消化ステップは、フリーフロー電気泳動ステップの前または後に実施してもよい。当業者なら、タンパク質消化ステップをどのように実施するのか、例えばトリプシンを使用して実施するのか知っている。また、前記消化ステップを行うために、フリーフロー電気泳動で使用されたＭＳ適合性界面活性剤を除去する必要もない。対照的に、前記界面活性剤の存在によって消化をさらに改善することができ、それに対して例えば尿素は、前記消化ステップの前に少なくとも部分的に除去しなければならない。
【００９４】
本発明の１つの好ましい実施形態では、画分の少なくとも一部またはサンプルの少なくとも一部について、タンパク質消化ステップが行われる。前記消化ステップは、本発明によるフリーフロー電気泳動分離によって、分離の前または後に実施することができる。
【００９５】
ある実施形態では、タンパク質消化ステップは、本発明による開裂性界面活性剤の開裂ステップの前または後にフリーフロー電気泳動ステップから収集された少なくとも１つの画分で実施される。
【００９６】
典型的には、非ＭＳ適合性部分の除去は、サンプル損失のないまたは本質的にない方法によって、容易に実現される。本発明による精製ステップは、典型的には、蒸発、濾過、および遠心分離からなる群から選択され、それによって、開裂性界面活性剤の沈殿部分が除去される。本明細書で使用された「本質的にサンプル損失がない」という用語は、問題の分析物の５％未満、好ましくは１％未満、より好ましくは０．２％未満、最も好ましくは０．１％未満が、例えば、開裂性界面活性剤の沈殿部分を除去するのに使用されるフィルタに粘着し得ることを意味し、または、遠心分離によって除去された開裂性界面活性剤の沈殿部分のペレット内に残留し得ることを意味し、または、開裂性界面活性剤の部分または揮発性緩衝化合物と一緒に気化し得ることを意味する。
【００９７】
それ自体がＭＳ適合性であり、または少なくとも１つのＭＳ適合性部分および任意選択で容易に除去することができる非ＭＳ適合性部分をもたらすよう開裂することができるＭＳ適合性界面活性剤の存在は、時間がかかりおよび／またはサンプル損失をもたらす精製ステップを必要としないので、有利である。したがって、本発明の好ましい実施形態は、透析、クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、界面活性剤交換、タンパク質沈殿、親和性クロマトグラフィ、エレクトロブロッティング、液液相抽出、および固液相抽出からなる群から選択される、界面活性剤を除去するのに精製ステップを必要としない方法に関する。言い換えれば、本発明によるＦＦＥ分離から得られた画分について、そのような精製ステップを、後で行われる下流分析の前に行うことを必要としない。
【００９８】
（装置およびその要素）
フリーフロー電気泳動分離を行うのに適切な装置は、少なくとも分離チャンバと２個の電極（アノードおよびカソード）とを含む。分離されるサンプルは、ＦＦＥ装置の（１個または複数の）アノードと（１個または複数の）カソードとの間の分離スペースに存在する分離媒体に添加され、または好ましくは、ＦＦＥ装置の分離スペースに、典型的にはＦＦＥ装置に設けられた専用のサンプル入口を通して別々に導入される。ＦＦＥに適切な装置を、図９に概略的に示す。図中、Ｓ１〜Ｓ４と称されるサンプル入口の適切な位置は、例えば、流動方向で電極と分離媒体入口（１２〜１６）との間、および流動方向に直角に、安定化緩衝入口（１１および１７）の間に定められる。ＦＦＥ分離を行うのに適切な装置は、向流入口（Ｃ１〜Ｃ３）をさらに含む。
【００９９】
分離媒体に導入されるサンプル中の様々な分析物は、電界を印加し、それと共にＦＦＥ装置の出口端部に向けて流動的に押し遣ることによって分離される。個々の分析物は、多数の収集出口／サンプル出口を通して分離チャンバから出て行き、一般に、個々のチュービングを通して任意の適切なタイプの個々の収集容器に導かれる。収集容器では、分析物が、分離媒体および任意選択で向流媒体と共に収集される。収集出口のアレイの個々の収集出口の間の距離は、一般に、適切な分画／分離を行うために可能な限り小さくあるべきである。収集出口の中心から測定された、個々の収集出口の間の距離は、約０．１ｍｍから約２ｍｍ、より典型的には約０．３ｍｍから約１．５ｍｍにすることができる。
【０１００】
様々な実施形態において、分離媒体入口の数は、装置の設計によって制限され、実際には、例えば１から７個、１から９個、１から１５個、１から４０個、またはさらにそれ以上に及ぶ。サンプル入口の数は、例えば１から３６個、１から１１個、１から５個、１から４個、または１から３個に及び、それに対して収集出口の数は、例えば３から３８４個、または３から９６個に及ぶが、任意の都合のよい数を、分離デバイスに応じて選択することができる。向流媒体入口の数は、典型的には例えば２から９個、または３から７個に及ぶ。設けられた入口および出口の数は、一般に、分離デバイスおよび分離スペースの形状および寸法に依存する。したがって、種々の数の分離媒体入口および出口が可能であることも理解されよう。
【０１０１】
図９では、分離媒体が、両電極の間および長さに沿って（大きな矢印）、層流として（好ましくは傾斜または水平分離チャンバの底部から上方に向けて）流動する。いくつかの実施形態では、分離媒体は、出口付近で向流によって減速し（小さい矢印）、したがって、出口を介して画分中に分離チャンバから出て行き、即ちいくつかの実施形態では、向流媒体が、電極間を移動するバルク分離媒体およびサンプルの連続流方向とは反対の方向で分離スペースに導入される。両媒体（分離媒体および向流媒体）は、分画出口を通して放出されまたは溶出される。
【０１０２】
例えば分離されるタンパク質のサンプルは、サンプル入口を介して分離媒体に導入され、分離媒体の層流によって輸送される。連続操作条件下で操作する場合、タンパク質混合物は、電気泳動によって連続的に分離され、分離媒体の性質と、分離媒体中の電極間で発生した電界から生じたサンプル中の分析物の空間分離とに従って、別の画分に収集される。バッチ式または不連続の操作モード下で、例えば静止インターバルモードで操作する場合、サンプルは、電気泳動プロセスの特徴および要求に応じて調節することができる可変チャンバサイズにより、別々の画分中に収集することができる。
【０１０３】
適切なＦＦＥデバイスは、当技術分野で公知であり、例えばＢＤ（商標）フリーフロー電気泳動システム（ＢＤ  ＧｍｂＨ、ドイツ）という名称で販売されている。さらに、本発明の分離および安定化媒体と共に使用することができる適切なＦＦＥデバイスは、参照によりそれら全ての全体が本明細書に組み込まれる文献（例えば、特許文献１、２、係属中の１４、１５、１６、および１７、および３（特許文献４および５の優先権を主張する。）参照）を含めたいくつかの特許出願に記載されている。
【０１０４】
（ＦＦＥ法およびモード）
いくつかのＦＦＥ操作法が、当業者に公知であり、本発明のコンテクストにおいて企図される。例えばサンプルは、サンプル中に含まれる分析物のｐＩに応じて（等電点電気泳動（ＩＥＦ））、分析物の正味の電荷密度に応じて（ゾーン電気泳動（ＺＥ））、または分析物の電気泳動移動度に応じて（等速電気泳動（ＩＴＰ））分離することができる。
【０１０５】
さらに、いくつかのＦＦＥ操作モードが、当業者に公知であり、本発明のコンテクストにおいて企図される。例えば、サンプルおよび分離媒体は、ＦＦＥ装置のアノードとカソードとの間に電界を印加しながら、出口端部に連続的に押し遣ることができる（「連続モード」）。ＦＦＥにおける連続モードは、注入ステップならびに分離ステップが連続的にかつ同時に生ずることを意味すると理解すべきである。電気泳動分離は、媒体および分析物が電気泳動チャンバ内を通過する間に生じ、異なる種がそれらのｐＩ（ＩＥＦ）、正味の電荷密度（ＺＥ）、または電気泳動移動度（ＩＴＰ）に応じて分離される。連続モードＦＦＥによって、いくつかの独立した「実験操作」（１つの実験操作は、サンプル注入、分離、およびその後に続く収集および／または検出が１つの流れになったものと理解される。）の実施を必要とすることなく、分析物の連続注入および回収が可能になる。連続モードＦＦＥは、分析物が、分離時間を延ばすために電極間の分離スペースを通過する間、初期バルク流量に比べてバルク流量が低下する（しかし停止しない）分離技法を含むことが理解されよう。しかし後者の場合、バルク流量の低下は限られた量のサンプルにしか意味をなさないので、真の連続モードについてもはや述べることはできない。
【０１０６】
ＦＦＥ適用例に関連した、いわゆる「インターバルモード」または「静止インターバルモード」として知られている別のＦＦＥ操作モードも、当技術分野で記述されている。例えば、不連続（即ち、インターバル）偏向電気泳動のプロセスは、その開示が参照により本明細書に組み込まれている文献（例えば、特許文献２参照）に示されている。この特許では、サンプルおよび分離媒体が共に、電気泳動チャンバに導入され、次いでゾーン電気泳動、等速電気泳動、または等電点電気泳動などの電気泳動モードを使用して分離され、最後に分画出口を通してチャンバから排出される。この文献（例えば、特許文献２参照）の実施形態は、分離媒体およびサンプルの運動が一方向であり、チャンバの入口端部から出口端部に向かって移動することについて記述している。この方向は、伝統的なキャピラリー電気泳動とは異なって、細長い電極の向きと共通である。記述される静止インターバルモードでは、例えば文献（例えば、特許文献２参照）に記載されているように、ポンプまたはいくつかのその他の流動置換要素によって引き起こされた電極間のサンプルの加速は、電界がオフの場合または少なくとも電圧が電気泳動での移動に関して無効である場合、即ちサンプルのどの部分も有効電界に曝されない場合にしか生じない。
【０１０７】
言い換えれば、インターバルプロセスは、サンプルおよび媒体が電気泳動装置の分離チャンバに導入される投入段階と、その後に続く、電界印加中にサンプルを含んだ媒体のバルク流が停止して分離が実現される分離プロセスによって、特徴付けられる。サンプルの分離／分画後、電界をオフにしまたは低下させて無効にし、バルク流を再び流すことによって、分画サンプルが出口端部に向かって押し遣られるようにし、その後、適切な容器、例えばマイクロタイタープレートに収集／検出されるようにする。
【０１０８】
本明細書で使用されるＦＦＥのコンテクストにおける、いわゆるサイクリックまたはサイクリックインターバルモードは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる文献（例えば、特許文献３（特許文献４および５の優先権を主張するものである。）参照）に記述されている。まとめると、サイクリックインターバルモードは、サンプルが細長い電極間の電界に保持されている間の、少なくとも１回の、可能なら多数回のバルク流方向の反転によって特徴付けられる。静止インターバルモードとは対照的に、サンプルは常に動いており、それによってより高い電界強度、したがってより良好な（または、より速い）分離が可能になる、さらに、細長い電極間のサンプルのバルク流を反転させることにより、電界内の分析物の滞留時間を著しく延ばすことができ、それによって、長い分離時間および／またはより高い分離効率とより良好な分解能が得られる。細長い電極に平行ないずれかの方向へのバルク流の反転（サイクルと呼ぶ。）は、特定の状況で必要となるたびに繰り返すことができるが、分離を短時間で行うための実際の理由および要求が、典型的にこのモードで実施されるサイクル数を制限することになる。
【０１０９】
したがって、好ましい実施形態では、本発明によるフリーフロー電気泳動分離が等電点電気泳動、ゾーン電気泳動、または等速電気泳動によって実現され、操作モードは、好ましくは連続モード、静止インターバルモード、またはサイクリックインターバルモードから選択される。言い換えれば、各組合せ（ＩＥＦ、ＺＥ、ＩＴＰ、および連続モード、静止インターバルモード、またはサイクリックインターバルモード）が本明細書では特に企図される。
【０１１０】
電界が印加されている間の典型的な分離時間（媒体中の分析物の移行時間）は、ＦＦＥ分離の１回の実験操作当たり２〜３分から約１時間に及ぶが、最長２時間というより長い分離も、ある条件下では可能と考えられる。サンプル中の分析物の移行時間は、ＦＦＥチャンバの設計およびＦＦＥ装置内を通過するバルク分離媒体の流量に依存することになり、通常は少なくとも１０分である。大まかに言えば、ＺＥモードで行われる分離は、典型的にはＩＥＦモードで行われる場合よりも短くなり、特に、移行時間を主として求められる限り延ばすことができるサイクリックインターバルモードで操作された場合、分離スペースの条件が分離中に十分一定のままであることを条件として、より短くなる。
【０１１１】
サンプル中の分析物の所望の分離または分画が実現された後、電界を通常はオフにし、分離／分画された問題の分析物を引き続き、ＦＦＥデバイス（調製適用例）から典型的には適切な数の画分に収集し、または、適切な手段（分析的用例）によって適切な容器内で、例えばマイクロタイタープレート内で少なくとも検出する。容易に明らかにされるように、特に調製適用例では（このコンテクストでは、（１種または複数の）分析物の存在が必要とされるＭＳなどの、下流分析適用例を含むことを意味する。）、ＭＳ適合性の両性イオン性または極性界面活性剤は、収集されたサンプルを後続の分析用に都合良くかつ迅速に調製することができるという利点をもたらす。
【０１１２】
本発明の別の態様は、フリーフロー電気泳動での、ＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤の使用にも関する。いくつかの実施形態では、ＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤は、ＭＳ適合性の開裂性両性イオン性または非イオン性界面活性剤である。
【０１１３】
本発明のさらに別の態様は、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含む、本発明によるフリーフロー電気泳動分離に適切な分離媒体の使用に関する。好ましい実施形態では、分離媒体は、限定するものではないがＡ／Ｂ分離媒体、揮発性媒体、および相補的多対緩衝媒体からなる群から選択される。
【０１１４】
（フリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）に適切な緩衝系）
様々な緩衝系は、本発明の実施形態によるｐＨ関数プロファイルを形成するのに有用である。緩衝系は、限定するものではないが市販の両性電解質（例えば、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ、ドイツからＳｅｒｖａｌｙｔ（登録商標）という名称で販売されている。）、相補的多対緩衝系（例えば、ＢＤ  ＧｍｂＨ、ドイツから販売されているＢＤ  ＦＦＥ分離媒体１および２）、揮発性緩衝系、およびＡ／Ｂ媒体と呼ばれる２成分緩衝系からなる群から選択することができる。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含む分離媒体の緩衝系は、Ａ／Ｂ媒体、揮発性媒体、および相補的多対媒体であって以下により詳細に記述されるものからなる群から選択される。
【０１１６】
特に、文献（例えば、特許文献７参照）に記載されている揮発性分離媒体およびＭＳ適合性界面活性剤を含む方法は、フリーフロー電気泳動ステップによって分離されたサンプルを、開裂したＭＳ適合性界面活性剤の非ＭＳ適合性部分の任意選択の容易な除去および／または緩衝化合物の蒸発以外、任意の精製ステップを必要とすることなく、ＭＳなどの後続の分析用に直接使用することができるという利点を提供する。
【０１１７】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、揮発性緩衝系およびＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン極性界面活性剤を含む方法である。前記組合せを含む画分は、蒸発などの単純な手段を通して揮発性緩衝化合物を除去することによって、容易にさらに濃縮することができ、または、必要なら開裂したＭＳ適合性界面活性剤の非ＭＳ適合性部分を除去することを除き、さらに精製することなく引き続き使用するために、例えばＭＳ分析で使用するために、直接調製することができる。
【０１１８】
本明細書で使用される「緩衝系」という用語は、少量の酸または塩基を添加することによって、または希釈することによって、本質的に一定のｐＨ値で溶液を維持することができる、モノ、ジ、またはトリプロトン性／塩基性化合物の混合物を指す。
【０１１９】
本明細書で使用される「緩衝化合物」は、単独でまたは第２のもしくは別の（１種または複数の）化合物と一緒に緩衝系を形成する化合物を意味する。
【０１２０】
各媒体成分は、好ましくは約４０×１０-9ｍ2／Ｖ／秒以下、より好ましくは３０、２５、またはさらに２０×１０-9ｍ2／Ｖ／秒未満の電気泳動移動度を有する陰イオンおよび陽イオンを含む。
【０１２１】
本明細書で使用される「分離媒体」という用語は、フリーフロー電気泳動法を行うのに適切な装置内に分離ゾーンを形成するのに適切な緩衝媒体を指す。いくつかの有用な分離媒体を、本明細書に記述する。
【０１２２】
本明細書で使用される「分離ゾーン」は、フリーフロー電気泳動分離を行うのに適切な装置の２個の電極間に位置付けられると理解すべきである。分離ゾーンは、少なくとも１種の分離媒体によって形成される。典型的な分離ゾーンは、安定化媒体、焦点媒体、または電極媒体によって、両側に包含され得る。
【０１２３】
本明細書で使用される「向流媒体」という用語は、典型的には、分離媒体またはその一部（例えば、単に水）などの水性媒体であるが、界面活性剤などの添加剤をさらに含んでもよい。さらに、そのような添加剤は、本発明による界面活性剤を開裂させる物質、例えば塩基もしくは酸、フッ素もしくはフッ化物含有化合物、または開裂性界面活性剤を開裂させることが可能な任意のその他の化合物などであってもよい。別の実施形態では、向流媒体は、分離媒体とは異なるｐＨを有することができる。異なるｐＨは、例えば、分離媒体中に使用される前記（１種または複数の）緩衝化合物の濃度に対して、向流媒体中の少なくとも１種の緩衝化合物の濃度を変化させることにより、実現することができる。さらに、ｐＨは、強酸または塩基を添加することによって変化させることができる。好ましい実施形態では、向流媒体に使用される緩衝系は、Ａ／Ｂ媒体、揮発性媒体、および相補的多対媒体からなる群から選択される。異なるｐＨは、開裂性界面活性剤の開裂を引き起こすことができ、または分離媒体のｐＨを、酸または塩基に不安定な界面活性剤がそれほど不安定ではなくなるｐＨに変化させることができ、即ち、分離媒体のｐＨに比べて本質的に開裂せずまたはよりゆっくりと開裂するｐＨに変化させることができる。
【０１２４】
いわゆる「安定化媒体」は、通常なら電気泳動分離プロセス中に、特にフリーフロー電気泳動中に観察され得る望ましくない作用またはアーチファクトを防止することによって、分離チャンバ内の電気化学的状態を安定化させる働きをする。安定化媒体は、一般に、電極付近に、即ちアノード／カソードと分離ゾーンとの間にそれぞれ位置付けられる。本明細書に開示される安定化媒体は、一般に、安定化媒体と一緒に使用される分離媒体よりも高い電気伝導度を有するべきである。より高い伝導度は、電気泳動デバイスの分離領域と電極区画との間の相互汚染を防止し、電極での分離粒子または分析物の望ましくない蓄積を回避する働きをする。さらに、分離媒体中に必要とされるイオンおよび添加剤などの全ての化合物は、それぞれカソードおよびアノード付近に存在する安定化媒体から供給されまたは補充することができる。
【０１２５】
安定化媒体は、一般に、前記安定化媒体に隣接する分離媒体の伝導度に比べて高い電気伝導度を有することにより、特徴付けられる。伝導度は、２倍、好ましくは３倍、最も好ましくは３倍超増大させることができる。分離媒体と安定化媒体との間の伝導度の差は、様々な方法によって、例えばさらなる電気伝導性イオンを安定化媒体に添加することによって、または、本明細書でさらに上に詳述される分離媒体中の前記緩衝化合物の濃度に比べて安定化媒体中の緩衝化合物の濃度を増大させることによって、または、強酸もしくは強塩基を添加することによって実現される。例えば、カソード安定化媒体の高い伝導度は、強塩基を添加することによって実現することができ、またはアノード安定化媒体の高い伝導度は、強酸を添加することによって実現することができる。そのような強酸または塩基は、限定するものではないがＮＡＯＨ、ＫＯＨ、Ｈ2ＳＯ4、またはＨ3ＰＯ4から選択することができる。
【０１２６】
安定化媒体の電気伝導度は、隣接する分離媒体の伝導度よりも高くなるが、安定化媒体のｐＨは、分離問題の状況に応じて、隣接する分離媒体のｐＨよりも高く、またはこのｐＨにほぼ等しく、またはこのｐＨよりもさらに低くすることができる。例えば、アノード安定化媒体は、前記アノード安定化媒体に隣接する分離媒体のｐＨに等しいもしくはそれ以下のｐＨを有し、またはカソード安定化媒体は、前記カソード安定化媒体に隣接する分離媒体のｐＨに等しいもしくはそれ以上のｐＨを有する。安定化媒体の緩衝化合物は、分離媒体の緩衝化合物と同一にすることができ、または異ならせることができる。
【０１２７】
本発明のある実施形態では、少なくとも１種の分析物の分離を並行モードで実施することができ、即ち２種のサンプルを、フリーフロー電気泳動を行うのに適切な装置の分離チャンバ内で同時に分離することができる。後者の場合、電極間安定化媒体に基づいてフリーフロー電気泳動を実施するのに適切な装置内の分離ゾーンを物理的に分離する必要がある。本明細書で用いられる「電極間安定化媒体」という用語は、２種の必須の成分：１種のカソード電極間安定化媒体および１種のアノード電極間安定化媒体で構成された媒体を指す。アノードおよびカソードという用語の使用は、それぞれ分離ゾーンとアノードおよびカソードとの間で相応に名称が付された電極間安定化媒体の相対的な位置を指すことが容易に明らかにされる。例えば、典型的な順序（ＦＦＥ装置のアノードからカソード）は、安定化媒体、分離ゾーン、次いでカソード電極間安定化媒体、その後にアノード電極間安定化媒体、第２の分離ゾーン、最後に（カソード）安定化媒体となる。上述の例示的なセットアップでは、カソード電極間安定化媒体はこのように、アノード電極間安定化媒体よりもＦＦＥ装置の物理的なアノードに近い。そのような並行モードは、例えば、文献（例えば、特許文献１８（特許文献１９および２０の優先権を主張するものである。）参照）に開示されている。
【０１２８】
本発明の上記実施形態を実施する場合、電極間安定化ゾーンは、電極間安定化媒体の２成分を、複数の分離ゾーンの間でＦＦＥ装置に導入することによって、都合良く確立することができる。
【０１２９】
典型的には、電極間安定化媒体は、前記電極間安定化媒体に隣接する第１および第２の分離ゾーンよりも高い伝導度を有することになり、それによって、分離ゾーンの間でのイオン種の交差、ならびに隣接する分離ゾーンへのアノードおよびカソード電極間安定化媒体の陰イオンおよび陽イオン種の交差が防止される。
【０１３０】
本明細書で使用される「焦点媒体」という用語は、隣接するｐＨ関数、ｐＨ勾配、またはｐＨ分離プラトーに関する伝導度ステップを形成する、アノード焦点媒体用の酸またはカソード焦点媒体用の塩基を含む媒体を指し、アノードまたはカソードに向かう分析物の動きが伝導度ステップによって本質的に０に低下する焦点ゾーンを形成するものである。酸および塩基の濃度は、隣接するｐＨ分離プラトー、ｐＨ勾配、またはｐＨ関数に対して好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、少なくとも５倍またはそれ以上、前記焦点媒体の伝導度を増大させるのに十分になるよう選択されることになる。媒体の電気伝導度のこの急激な増大は、異なる伝導度の値を有する２種の媒体の境で、ｐＨ分離プラトー上で分離される分析物のｐＩとは異なるｐＩを有する分析物を蓄積するのに有用であるが、それはアノードまたはカソードに移動する分析物の移動度が、それぞれ本質的に０に低下するからである。
【０１３１】
（相補的多対緩衝系）
本発明のある実施形態では、ｐＨ勾配を発生させるのに使用される緩衝混合物は、電流が緩衝系内を流れるときにこの混合物が滑らかなｐＨ勾配をもたらすことができるように、慎重に対応させた酸および塩基で構成することができる。低分子量有機酸および塩基の混合物は、市販の高分子量両性電解質に比べて高い緩衝能を可能にするものが選択される。慎重に対応させた酸および塩基のこれらの混合物は、分子量、ｐＩ、純度、および毒性に関して極めて十分に特徴付けられる。一般に、酸および塩基は、市販の両性電解質よりも小さい分子量を有する。適切な相補的多対緩衝系は、当技術分野で公知である。特に、３から５のｐＨ範囲を有する混合物はＢＤ  ＦＦＥ分離媒体１として販売されており、一方、５から８のｐＨ範囲を有する混合物はＢＤ  ＦＦＥ分離媒体２としてＢＤ  ＧｍｂＨ、ドイツから販売されている。これらの緩衝系は、例えば一般的な形で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる文献（例えば、特許文献２１および２２参照）に記載されている。上述の相補的多対緩衝系を、本明細書では「ＣＭＰＢＳ」または「ＣＭＰＢＳ媒体」と呼ぶ。
【０１３２】
（揮発性緩衝系）
本発明のその他の実施形態では、揮発性緩衝系を使用して、サンプルのフリーフロー電気泳動分離を行うことができる。これらの緩衝系は、文献（例えば、特許文献７参照）に開示されており、ＦＦＥ分離ステップの後に回収された分画サンプルから残留物を含まない状態で除去することができ、またはそれ自体がＭＳ適合性であり、サンプル中に留まることができるという特定の利点をもたらす。
【０１３３】
本発明による揮発性分離媒体は、すぐに使用できるその形で組成物を、好ましくは少なくとも１種の緩衝酸と少なくとも１種の緩衝塩基とを含んでこれら緩衝化合物の全てが揮発性である緩衝系を含む、水性組成物を表すと理解すべきである。任意選択で、緩衝化合物の少なくとも１種は、質量分析用に、特にＭＡＬＤＩ適用例で、（揮発性）マトリックスとして機能することが可能である。
【０１３４】
本明細書で緩衝化合物に関連して使用される「揮発性」という用語は、適切な条件下で水性サンプルから完全に除去可能である緩衝化合物の能力を指すと理解すべきであり、即ち緩衝化合物は、いかなる残留化合物（例えば、塩）も残すことなく、即ち残留物を残さない状態で、蒸発することができると理解すべきである。その最も広い意味において、本発明の実施形態による揮発性緩衝化合物は、限定するものではないが低い気圧、高温、照射（例えば、ＵＶ光、またはレーザ光の適用による）によるエネルギーの供給、またはこれらの任意の組合せの群から選択される条件下、残留物を残さない状態で除去することができるが、揮発性緩衝化合物は、ＦＦＥ作業条件下（即ち、上述のように、大気圧、および典型的には０から４０℃の間の温度範囲）では本質的に不揮発性でなければならないことが理解されよう。
【０１３５】
このコンテクストにおいて、当業者なら、本発明の一実施形態では、揮発性緩衝化合物を含むサンプル中に存在する（１種または複数の）分析物が前述の条件下では不揮発性になること、即ち（１種または複数の）分析物は本質的に変性せず（例えば、断片化または酸化によって）、溶液中にまたはその（それらの）固体状態であり続けることが理解されよう。ある実施形態では、特に質量分析作業条件下では、（１種または複数の）分析物は揮発性になり、イオン化可能になる（ＭＳによる検出に必要とされる。）。
【０１３６】
本明細書で使用される「ＦＦＥ作業条件下では不揮発性」という用語は、緩衝化合物の揮発性によって、作業条件下およびＦＦＥの分離期間中にもたらされる、分離媒体中のそれぞれの緩衝化合物の濃度低下が５％ｗ／ｖ未満、または好ましくは２％ｗ／ｖであることを意味する。最も好ましくは、全ての作業条件下およびＦＦＥ分離期間において、濃度低下が観察されない。
【０１３７】
本発明の意味において、「残留物を含まない」という用語は、揮発性化合物そのものは完全に蒸発するが、例えば使用された物質の不純物によって生じた残留物は不揮発性であり得ると理解される。しかし、入手可能な最高純度級を有する化合物だけを分析目的で、特に質量分光分析に使用すべきことが、当業者に周知である。
【０１３８】
本明細書で使用される、「蒸発」による溶媒および緩衝化合物の除去は、化合物を気相に移行させ、その後に適切な手段によって気相を排除することによる、問題の分析物からの除去を指すと理解すべきである。このように、本明細書で定義される蒸発は、カラムクロマトグラフィ、透析、またはカットオフ濾過法、または固相抽出もしくは分析物沈殿として知られている技法を含めた、一般に緩衝交換と呼ばれる（時々、「脱塩」とも呼ばれる。）技法による緩衝化合物の排除とは異なる。あるいは、蒸発と用語に含まれないある適用例では、塩の形で存在する緩衝化合物は、水で洗い落とされるだけであるが、これは明らかに、望ましくないサンプル材料の損失をもたらし、さらに、緩衝化合物の非定量的除去をもたらす。当業者なら、本明細書に定義される揮発性緩衝化合物は、少なくとも原理上はそのような緩衝交換または固相抽出技法によって除去することもできるが、これは当然ながら、緩衝液の揮発性によって得られる明らかな利点を無視する可能性があることが理解されよう（緩衝交換技法に関連した潜在的な問題、例えば取扱いの難しさおよびサンプル回収率の低さといった問題の観点から意味をなさない。）。
【０１３９】
溶媒および揮発性緩衝化合物を、蒸発によってＦＦＥ分離から収集されたサンプルから除去するのに適切な例示的な技法には、限定するものではないが、遠心蒸発機や真空遠心分離機などであって例えばＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）という名称で知られているような適切なデバイスを使用した真空遠心分離、凍結乾燥によるもの、または水性サンプルの（穏やかな）加熱によるものが含まれる。溶媒および緩衝化合物を蒸発させるその他の可能性には、サンプルを減圧条件下に置くことによる蒸発、例えば質量分光分析で使用される標的プレート上に配置されたサンプルに真空を印加することによる蒸発が含まれる。当業者なら、ほとんどの質量分光法は真空条件下で作動し（例えば、真空ＭＡＬＤＩ）、したがって揮発性緩衝化合物は、サンプルをＭＳ機器に導入した後であってイオン化の前に、都合良く除去されることが理解されよう。
【０１４０】
好ましくは、揮発性緩衝化合物は、減圧および／または高温の条件下で除去可能である。さらにその他の実施形態では、揮発性緩衝化合物は、周囲温度および大気圧条件下でも蒸発することができ、特に揮発性緩衝液含有サンプルが小容量で存在する場合に（例えば、質量分光分析のため）蒸発することができる。しかしほとんどの場合、少なくとも一部の緩衝溶液は、これらの条件下で容易に蒸発しなくなる。さらにその他の実施形態では、揮発性緩衝化合物は、より過酷な条件下（例えば、真空中および／または高温で、任意選択で照射がなされ、例えば質量分析作業条件下などである。）でしか除去することができない。
【０１４１】
本発明のある実施形態では、ＦＦＥ分離媒体が揮発性緩衝化合物を含み、この揮発性緩衝化合物の少なくとも１種は、質量分光分析用に（揮発性）マトリックスとして働くことができ、即ち化合物は、質量分析作業条件下でのみ除去することができる。本明細書で使用される質量分析（ＭＳ）のコンテクストにおいて、マトリックスという用語は、電気泳動のコンテクストで使用される「マトリックス」という用語（例えば、ポリアクリルアミドまたはアガロース）と異なることが理解されよう。したがって、下流分析が例えばＭＡＬＤＩ適用例であるいくつかの実施形態では、ＭＡＬＤＩ分析用のマトリックス成分を、質量分光分析前に分析物緩衝溶液に添加する。
【０１４２】
揮発性緩衝系の例には、限定するものではないがＴＲＩＳ／酢酸、ジエタノールアミン／ピコリン酸、ジメチルアミノプロプリオニトリル／酢酸、２−ピリジンエタノール／ピコリン酸、ベンジルアミン／２−ヒドロキシピリジン、トリ−ｎ−プロピルアミン／トリフルオロエタノールなどの組合せが含まれる。
【０１４３】
（２成分緩衝系（Ａ／Ｂ媒体））
以下に定義される２成分緩衝系は、本明細書では「Ａ／Ｂ媒体」と呼ばれ、文献（例えば、同時係属の特許文献２３参照）に詳細に開示されている。分離媒体は、少なくとも１種の緩衝酸と少なくとも１種の緩衝塩基とを含み、但し緩衝酸のｐＫａ値は分離媒体のｐＨよりも高くなければならず、かつ緩衝塩基のｐＫａは分離媒体のｐＨよりも低いことを条件とする。言い換えれば、緩衝酸のｐＫａは、緩衝塩基のｐＫａよりも高くなる。
【０１４４】
分離媒体によって示されるｐＨプロファイルは、本質的に線形であってもよい（即ち、電気泳動分離中には大きなｐＨステップが全くない。）。用いられる安定化媒体、ならびに緩衝酸と緩衝塩基との間のｐＫａ差に応じて、本発明のこの態様によるＡ／Ｂ分離媒体は、本質的に一定の（即ち、フラットな）ｐＨプロファイルまたはやや穏やかな／フラットなｐＨ勾配を分離チャンバ内にもたらすことになる。電極間の分離チャンバ内で、本質的に一定のｐＨを有するゾーンをもたらす前記分離媒体は、本明細書に記述される方法によるｐＨ分離プラトーの生成に、特に有用であることが理解されよう。しかし、Ａ／Ｂ媒体は、フラットなまたは超フラットなｐＨ勾配を形成することもできるので、本明細書で定義されるｐＨ関数またはｐＨ勾配の生成に使用することもできる。
【０１４５】
好ましくは、本発明の上記態様で少なくとも１種の緩衝酸および１種の緩衝塩基を用いるＡ／Ｂ媒体は、約０．５から４ｐＨ単位の間の、少なくとも１種の緩衝酸と少なくとも１種の緩衝塩基との間のｐＫａ差によって特徴付けられ、但しこの酸のｐＫａは、上述のように塩基のｐＫａよりも高くなくてはならない。好ましい実施形態では、ΔｐＫａは、１．２から１．８の間であり、これは、ＦＦＥ装置の分離チャンバ内で一定のｐＨを有するｐＨ分離プラトーに特に有用である。その他の好ましい実施形態では、ΔｐＫａは、約２．５から３．３の間になり、後者は、フラットｐＨ勾配に特に適切である。
【０１４６】
Ａ／Ｂ媒体の１つの特徴は、媒体の電気伝導度が比較的低いことであるが、この伝導度は、妥当な長さの時間で分析物の許容できる分離を実現するのに十分高くなければならないことが理解されよう。このように、Ａ／Ｂ媒体の伝導度は、典型的には５０から１０００μＳ／ｃｍの間であり、より好ましくは５０から５００μＳ／ｃｍの間であるが、当業者なら、分離媒体の正確な伝導度は、当然ながら分離／分画問題の詳細、媒体中のその他の荷電種の存在（例えば、サンプル／分析物の安定性に必要とされるイオン）、および分析物の電気化学的性質に左右されることに気付くであろう。
【０１４７】
好ましくは、Ａ／Ｂ媒体は、１種の緩衝酸および１種の緩衝塩基のみ含む。言い換えれば、そのような分離媒体は、化合物の１種の酸官能基および同じかまたは別の化合物の１種の塩基官能基が、本質的に、所望のｐＨおよび伝導度プロファイルを有する分離媒体を確立するように働く、２成分媒体を表す。良好な結果は、分離媒体中の２種以上の緩衝酸および緩衝塩基で実現することもできるが、調製し易くかつおそらくはより安価に使用できるからだけではなく、分離チャンバ内に存在する荷電種の数が増加した場合には媒体の電気化学的性質がより複雑になるので、典型的にはできる限り少ない成分を使用することが有利である。
【０１４８】
Ａ／Ｂ媒体の概念は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている文献（例えば、同時係属の特許文献２３参照）に詳述されている。このコンテクストで適切な緩衝塩基は、例えば、タウリン、グリシン、２−アミノ−酪酸、グリシルグリシン、β−アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、クレアチニン、ピリジン−エタノール、ピリジン−プロパノール、ヒスチジン、ＢＩＳＴＲＩＳ、モルホリノエタノール、トリエタノールアミン、ＴＲＩＳ、アメジオール、ベンジルアミン、ジエチルアミノエタノール、トリアルキルアミンなどである。適切な緩衝酸は、例えば、ＨＩＢＡ、酢酸、ピコリン酸、ＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、α−アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、４−ヒドロキシピリジン、２−ヒドロキシピリジンなどであり、但し、緩衝酸と上述の緩衝塩基との間のｐＫａの関係は、一致していることを条件とする。
【０１４９】
さらに、本発明の方法では、ＦＦＥによって分析物を分離するために文献（例えば、特許文献６参照）に開示されている２成分緩衝系も、用いることができる。これらの２成分媒体は、０．４から１．２５ｐＨ単位の間で比較的フラットなｐＨ勾配を形成するのに適切であってもよい。
【０１５０】
（添加剤）
本発明の方法に適切な分離媒体は、１種または複数の添加剤をさらに含んでもよい。本発明の実施形態による添加剤は、緩衝酸および緩衝塩基によって与えられた緩衝能に寄与しない（または少なくとも著しく寄与しない）化合物またはイオンである。一般に、添加剤の数および濃度は最小限に保持されるべきであるが、ある分析物または分離の問題は、分析物を完全に維持するためにまたは媒体の所望の性質（例えば、様々な分離媒体の間での粘度の順応）を実現するために、追加の化合物の存在を必要とすることが理解されよう。
【０１５１】
可能な添加剤は、好ましくは、その他の酸および／または塩基、いわゆる「必須」１価および２価陰イオンおよび陽イオン、粘度増強剤、および親和性リガンドなどから選択される。
【０１５２】
必須な１価および２価陰イオンおよび陽イオンは、本出願の意味において、サンプル中の分析物の構造的および／または機能的完全性を維持するのに必要とされ得るイオンである。そのような必須陰イオンおよび陽イオンの例には、限定するものではないがマグネシウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、Ｆｅ（ＩＩ）イオン、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、またはＥＤＴＡやＥＧＴＡなどの錯化剤、またはアジドイオン（例えば、細菌汚染を回避するため）などが含まれる。
【０１５３】
可能な酸および塩基の例には、溶液中に完全に溶解した少量の強酸もしくは塩基（例えば、ＮａＯＨ、ＮＣｌなど）、または、媒体中で本質的に非解離種として存在する非常に弱い酸もしくは塩基（即ち、媒体のｐＨから約４単位超離れたｐＫａを有する。）が含まれる。
【０１５４】
分離媒体中に一般に使用される粘度増強剤には、グリセロールや様々なＰＥＧなどの多価アルコール、ＨＰＭＣなどの親水性ポリマー、スクロースやヒアルロン酸などの炭水化物を含めてもよい。粘度増強剤は、サンプルと媒体との間または異なる隣接媒体の間の密度または粘度の差によって生成された乱流を回避するために、分離媒体の粘度を、分離スペースに導入されたサンプルの粘度に適応させるのに、またはその他の分離チャンバ内の分離および／または安定化媒体の粘度に適応させるのに必要とされ得る。
【０１５５】
存在してもよい追加の添加剤には、シクロデキストリンを含めたある種のデキストリンなどのキラル選択剤、またはレクチンなどの親和性リガンドが含まれる。
【０１５６】
ある場合には、溶液中の分析物の酸化を防止するのに、還元剤を添加することが必要とされ得る。サンプルおよび／または分離媒体に添加することができる適切な還元剤には、メルカプトエタノール、メルカプトプロパノール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウムもしくはカリウムなどが含まれる。
【０１５７】
いずれにせよ、前述の添加剤の多くは帯電するので、それらの濃度は必要な限り高く保持されるべきであるが、同時に、所望の（低）範囲内に分離媒体の電気伝導度が維持されるよう、できる限り低く保持されるべきである。
【０１５８】
揮発性緩衝液のセクションで記述された、任意の条件下で揮発性ではない添加剤、または後続の分析、例えばＭＳ分析を妨げる可能性がある添加剤は、とにかく避けるべきであることに留意すべきである。
【０１５９】
（キット）
当業者なら、本明細書で企図される方法に使用される界面活性剤は、サンプル媒体の一部としておよび／または少なくとも１種の分離媒体の一部として使用してもよいことが理解されよう。
【０１６０】
したがって、本発明の一態様は、本発明の実施形態によるサンプル中の分析物のＦＦＥ分離（ＩＥＦ、ＺＥ、およびＩＴＰなど）を実施するためのキットにも関し、このキットは、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を含むものである。一実施形態では、少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤が、開裂性界面活性剤である。
【０１６１】
１種または複数の界面活性剤は、媒体の一部としてまたは別々に１個または複数の容器に送出されることが理解されよう。
【０１６２】
少なくとも１種のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤に加え、キットはさらに、分離媒体または複数の分離媒体を含むことができる。１種または複数の媒体は、一度に送出することができ、または別々に複数の容器に送出することができる。複数の容器が提供される場合、少なくとも２個の容器が同じ媒体を含有することができ、または全てのバッチは個々に、異なる媒体を含有することができる。分離媒体の数は、１から１５種の間、または３から１２種の間、または４から９種の間にすることができる。
【０１６３】
本発明の好ましい実施形態では、キット内の分離媒体は、限定するものではないがＡ／Ｂ緩衝媒体、揮発性緩衝媒体、および相補的緩衝対媒体からなる群から選択される。キットは、いくつかの異なる媒体の組合せ、例えば揮発性緩衝媒体と多対緩衝媒体との組合せを含んでもよい。さらに、分離媒体は、界面活性剤、粘度増強剤、「必須」陰イオンおよび陽イオンなどの添加剤を追加として含む。
【０１６４】
キットが、Ａ／Ｂ媒体を含んだ分離媒体を含む場合、一実施形態では、Ａ／Ｂ媒体は、電気泳動中のＦＦＥ装置の分離チャンバ内の最小ｐＨと最大ｐＨとの間の差が約０．２未満であり、好ましくは０．１未満のｐＨ単位である分離ゾーンを形成可能であることが好ましい。さらに、ｐＨは、電気泳動中に本質的に一定であるべきことが好ましい。そのようなＡ／Ｂ媒体を含むキットは、特に、フリーフローゾーン電気泳動を行うためのアジュバントであり、即ちそのようなキットは、フリーフローゾーン電気泳動で使用することが可能である。
【０１６５】
本発明の別の実施形態では、Ａ／Ｂ媒体は、電気泳動中に分離チャンバ内の電極間でｐＨが本質的に線形勾配を形成する分離ゾーンを形成可能であることが好ましく、さらに別の実施形態では、Ａ／Ｂ媒体は、電気泳動中の分離チャンバ内でｐＨが本質的に非線形である分離ゾーンを形成可能であることが好ましい。そのようなキットは、フリーフロー等電点電気泳動で使用するのに適切と考えられる。
【０１６６】
キットが、揮発性緩衝媒体を含有する分離媒体を含む場合、少なくとも１種の緩衝化合物は減圧下で揮発性であり、高温で揮発性であり、照射されたときに揮発性であり、または質量分析作業条件下で揮発性であることが好ましい。
【０１６７】
本発明による１種または複数の分離媒体および少なくとも１種の界面活性剤に加え、本発明の実施形態によるＦＦＥ法を実施するためのキットは、上記にて定義された少なくとも１種の安定化媒体をさらに含む。安定化媒体は、カソード安定化媒体および／またはアノード安定化媒体であってもよい。これらの媒体は一般に、アノード／カソードと分離媒体との間にそれぞれ位置付けられる。
【０１６８】
アノードおよびカソードの安定化はどちらも、首尾良く行われる電気泳動適用例で、特にＦＦＥで特に有用であるので、キットは、分離媒体の他に、好ましくは本明細書で定義された１種のアノードおよび１種のカソード安定化媒体を含むことになる。
【０１６９】
本発明のいくつかの実施形態では、安定化媒体は、２つのｐＨ関数プロファイルの間に位置付けられ、２個の電極を含むＦＦＥ装置内で同時に２つの異なるサンプルの並行分離が可能になる。
【０１７０】
他の実施形態では、キットはさらに、上記にて定義された少なくとも１種の焦点媒体を含んでもよい。
【０１７１】
さらにその他の実施形態では、キットは、１種または少なくとも１種の開裂性のＭＳ適合性の両性イオン性または非イオン性界面活性剤を選択的に開裂させるのに有用な作用剤をさらに含んでもよい。そのような作用剤は、固体化合物もしくは固体化合物の混合物に、または、例えばサンプルもしくはサンプルの一部を含む溶液内のｐＨを変化させるための溶液、もしくは本発明による開裂性界面活性剤を開裂させるのに適切な化合物を含有する溶液にすることができる。
【０１７２】
本発明によるある実施形態では、キットは、好ましくは、所与の電気泳動分離に必要とされる全ての媒体または化合物、例えばアノードおよびカソード安定化媒体、ならびに分離媒体（上述のいくつかの細画分からなる。）、および／または開裂性界面活性剤を開裂させる作用剤を含むことが理解される。そのような実施形態では、分離媒体および安定化媒体は、当然ながら、意図されるプロトコルに有用であるように選択されることになる。
【０１７３】
キットは、本発明によるフリーフロー電気泳動ですぐに使用できる１種または複数の水溶液として、様々な媒体を含んでもよく（即ち、全ての成分は、電気泳動分離の問題に関して所望の濃度で存在する。）、またはキットは、その使用前に所定量の溶媒で希釈される濃縮溶液の形で１種または複数の媒体を含有してもよい。好ましくは、そのような原液は、本発明によるフリーフロー電気泳動で使用されるよりも１．５×、２×、２．５×、３×、４×、５×、６×、１０×、２０×、２５×、５０×、７５×、１００×、１５０×、２００×、および１０００×高い濃度を有する。
【０１７４】
あるいはキットは、１種または複数の媒体および／または成分を、本発明によるフリーフロー電気泳動法で使用される適切な濃度にまで、溶媒に、好ましくは水に溶解する乾燥形態でまたは凍結乾燥形態で含んでもよい。
【０１７５】
本発明によるキットは、いくつかの、しかし好ましくは１つの容器内に媒体の様々な成分を含み、次いでこれらの成分を所定量の溶媒で元に戻した後、電気泳動分離プロセスに使用する。
【０１７６】
本明細書に記述される好ましい分離媒体の全て、ならびに好ましいカソードおよび／またはアノード安定化媒体および焦点媒体を、本発明のキットに含めてもよいことが理解されよう。
【０１７７】
各媒体（分離媒体、カソード安定化媒体、アノード安定化媒体、向流媒体など）は、個別の容器内に存在させることが一般に好ましく、即ち、前記キットの各成分、各乾燥成分、および／または各原液は、密封容器内に別々に置かれるが、その他の組合せおよび包装の選択肢が、ある状況では可能でありかつ有用になり得ることが、当業者に明らかにされよう。例えば、ＩＥＦ適用例の分離媒体は、電気泳動装置内に予め形成されたｐＨ勾配を生成するために、異なる濃度の成分（それによって、異なるｐＨ）を有する異なる数の「細画分」からなるものであってもよい。一実施形態では、勾配の形成に使用される各分離媒体のｐＨは、異なっている。ＩＥＦ適用例で用いられる細画分の数は、分離の問題、分離媒体によって実現される所望のｐＨスパン、および分離に使用される電気泳動装置に左右されることになる。ＦＦＥ適用例では、装置は、典型的にはいくつかの媒体入口（例えば、Ｎ＝７、８、または９個の入口）を含むことになり、したがって、装置内に分離スペースを生成するサブ媒体を、少なくとも１個から最大Ｎ−２個の入口に導入することができる（両面にそれぞれ存在する少なくとも１個の入口は、通常、存在する場合には安定化媒体用に確保される）。このようにＦＦＥに適切な装置に挿入される分離媒体の数は、典型的には、２から１５種の間、または３から１２種の間、または４から９種の間である。
【０１７８】
特に好ましい実施形態では、キットの分離媒体は、１種の緩衝酸および１種の緩衝塩基のみ含む２成分緩衝系によって形成されることになる。本明細書に記述される分離媒体の全ては、好ましいか否かに関わらず、本発明のキットに含むことができると考えられる。
【０１７９】
様々な数および送出形態にある適切な媒体および／またはその他の化合物に加え、キットは、１つまたは複数の実験プロトコルおよび任意選択で成分の貯蔵条件について記述する製品マニュアルを含むことができる。
【０１８０】
一般に、本発明によるキットは、本明細書に記述されるフリーフロー電気泳動分離プロトコルで有用である。
【０１８１】
本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記述される実施形態の多くの修正例および変形例が可能であることが、当業者に明らかにされよう。本発明およびその利点について、以下の非限定的な実施例でさらに説明する。
【実施例１】
【０１８２】
ＰＰＳを用いたおよび用いないアフリカニシキヘビからの血清の分離
血清を、アフリカニシキヘビから得た。血清サンプルを、分離媒体中に１：１０に希釈した。分離媒体は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに適合することが周知の緩衝成分のみ含有していた。さらに、１つの実験は、ＰＰＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ適合性の開裂性界面活性剤を使用して、サンプルならびに分離媒体に関して行った。
【０１８３】
サンプルの分離は、フリーフロー等電点電気泳動（ＦＥ−ＩＥＦ）モードのＢＤ（商標）フリーフロー電気泳動システムで実施した。９個の媒体入口（Ｅ１〜Ｅ９）および４個のサンプル入口（Ｓ１〜Ｓ４）を含む装置を設定した。アノード安定化媒体を入口Ｅ１に導入した。カソード安定化媒体を入口Ｅ９に導入し、サンプルを、サンプル入口Ｓ２を介して導入した。印加した電圧は５５０Ｖであり、電流は１０５ｍＡであった。サンプルおよび媒体を、それぞれ２ｍｌ／時および１５０ｍｌ／時の流量で導入した。
【０１８４】
ＦＦＥ装置内の分離および安定化媒体：
【０１８５】
【表１】
2011503598.tif 000004
【０１８６】
アノード安定化媒体：１５６７ｍＭ  ＨＡｃ／４５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝４．１１；伝導度：６６１０μＳ／ｃｍ）（Ｅｌ）
【０１８７】
カソード安定化媒体：４５０ｍＭ  ＨＡｃ、９００ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ＝８．２３；伝導度：６２２０μＳ／ｃｍ）（Ｅ９）
【０１８８】
向流媒体：水（ＣＦ１〜ＣＦ３）
【０１８９】
上述の分離媒体は揮発性分離媒体であり、即ち緩衝化合物はＭＳ適合性であり、またはＭＳ分析前に蒸発によって除去することができる。
【０１９０】
９６の画分を、２つの実験のそれぞれで収集した。各画分の０．２ｍＬを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に採取した。分離したサンプル（１つのサンプルはＰＰＳを含み、１つのサンプルはＰＰＳを含まない。）の毎秒ごとのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像（銀染色されたもの）を、図１に示す。
【０１９１】
分離パターンは実に類似しているよう見えるが、分離媒体中に界面活性剤を含まない分離チャンバでは、若干の沈殿が観察された。これは、分離媒体中に０．１％ＰＰＳを使用した場合、それほど顕著ではなかった。
【０１９２】
分離媒体は、グリセロールおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定を妨げることが知られているその他の成分を完全に含まなかった。したがって画分は、ＭＡＬＤＩ標的に直接適用された。画分２６の２５ｋＤａタンパク質の質量スペクトルを、図２に示す。
【実施例２】
【０１９３】
ＰＰＳを用いたおよび用いないＨＥＬＡ細胞から生成されたペプチドの分離
ＦＦＥ用のＰＰＳなど、両性イオン性界面活性剤の適切性を確認するために、ＰＰＳを含有するサンプル（およびＦＦＥ法）の分離プロファイルを、ＰＰＳを含有しないサンプル（およびＦＦＥ法）の分離プロファイルと比較した。ある例では、１０8ＨｅＬａ細胞の２つのサンプルのそれぞれを、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＫＣｌ＋プロテアーゼ阻害剤コンプリートミニ錠剤（１０ｍｌに対して１錠；Ｒｏｃｈｅ＃１１８３６１５３００１））中で超音波処理した。可溶性タンパク質を、超遠心分離によって、膜および膜タンパク質などの不溶性細胞断片から分離した。
【０１９４】
１００ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液を上澄み（可溶性タンパク質３ｍｇ／ｍｌ）に添加し、最終濃度５ｍＭまでＴＣＥＰ（塩酸トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を添加し（６０分間インキュベーション）、次いでＩＡＡ（ヨードアセトアミド）を１５ｍＭの最終濃度まで添加した（インキュベーション６０分）。トリプシン（修飾済み、シーケンシンググレード、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、最終比１：３７．５の酵素：タンパク質に添加し、最短でも４時間、３７℃でインキュベートした。消化を、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で溶液を酸性化することによって停止させた。
【０１９５】
ペプチドを、ＳｅｐＰａｋ（登録商標）Ｖａｃ  １  ｃｃｔ  Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して精製した。この手順は、アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡによるカートリッジの洗浄、サンプルの投入、０．１％ＴＦＡによるサンプルの洗浄、アセトニトリルによるペプチドの溶出、および真空遠心分離による蒸発乾固を含む。第１のサンプルは、３〜８勾配の１ｍｌの分離媒体で元に戻し、第２のサンプルは、３〜８勾配および０．１％ＰＰＳの、１ｍｌの分離媒体で元に戻した。
【０１９６】
本明細書で使用した３〜８勾配は、上述の相補的多対緩衝系である。
【０１９７】
等電点電気泳動を、ＥＦ−ＩＥＦモードのＢＤ（商標）フリーフロー電気泳動システムで実施した。７個の媒体入口（Ｅ１〜Ｅ７）および４個のサンプル入口（Ｓ１〜Ｓ４）を含む装置を設定した。アノード安定化媒体を、入口Ｅ１およびＥ２に導入した。カソード安定化媒体はＥ５からＥ７に導入し、サンプルは、サンプル入口Ｓ２を介して導入した。印加された電圧は４００Ｖであり、電流は２９ｍＡであった。サンプルおよび媒体は、それぞれ２ｍｌ／時および５０ｍｌ／時の流量で導入した。
【０１９８】
ＦＦＥ装置内の分離および安定化媒体：
【０１９９】
分離媒体（Ｅ３〜Ｅ４）：２５０ｍＭマンニトール、３５ｇ／２００ｍｌ  Ｐｒｏ  ３−８
【０２００】
Ｐｒｏ  ３−８は、典型的には下記の組成物である：
【０２０１】
【表２】
2011503598.tif 000005
【０２０２】
アノード安定化媒体：１００ｍＭ  Ｈ2ＳＯ4、３０ｍＭアセチルグリシン、２００ｍＭタウリン、５０ｍＭベタイン（ｐＨ＝１．２；伝導度：２４６００μＳ／ｃｍ）（Ｅ１およびＥ２）；
【０２０３】
カソード安定化媒体：１５０ｍＭ  ＮａＯＨ、７５ｍＭエタノールアミン、１５０ｍＭ  ＡＭＰＳＯ（（Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、７５ｍＭ  ＴＡＰＳ（（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、および３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ｐＨ＝９．２；伝導度：７７７０μＳ／ｃｍ）（Ｅ５からＥ７）；
【０２０４】
向流媒体：マンニトールの２５０ｍＭ水溶液（ＣＦ１〜ＣＦ３）。
【０２０５】
ＦＦＥ画分のそれぞれのｐＨを、ｐＨ電極を使用して決定し、図３および４にグラフによって示す。着色ｐＩマーカーを分けて、追加のＰＰＳを含むおよび含まない相補的多対緩衝系の、緩衝系分離性能を評価した。ｐＨ曲線同士でまたは着色ｐＩマーカーの分離パターンで、著しい相違は観察されなかった。０．１％ＰＰＳを含む緩衝系のそれぞれのｐＩマーカーの吸光度を表す、λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、および５９５ｎｍでの画分の吸光度を、図３に報告する。図４は、ＰＰＳを含まない緩衝系の、ｐＩマーカー吸光度分布を示す。
【０２０６】
ＰＰＳおよび相補的多対緩衝系の使用を含むフリーフロー電気泳動の後、タンパク質の同定を実証するために、ＰＰＳ含有サンプルの画分を消化し、次いでＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【０２０７】
各分離画分１５０μｌに、ＴＣＥＰ（塩酸トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を最終濃度５ｍＭまで添加し（インキュベーション６０分間）、次いでＩＡＡ（ヨードアセトアミド）を最終濃度１５ｍＭまで添加した（インキュベーション６０分間）。５μｇのトリプシン（修飾済み、シーケンシンググレード、Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、混合物を一晩３７℃でインキュベートした。消化を、２００ｍＭ  ＨＣｌで溶液を酸性化することによって停止させた。
【０２０８】
各消化混合物８μｌを、精製およびサンプル濃縮せずに採取して、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った。
【０２０９】
ＥＳＩベースのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＨＣＴｕｌｔｒａ、Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）分析を、７５μｍ×１５ｃｍの石英ガラスマイクロキャピラリー逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を使用して実施した。サンプル量をプレカラム（逆相（Ｃ１８）カラム、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）に投入した。サンプル投入後、サンプルを、勾配が２％Ｂから４０％Ｂである２００ｎｌ／分の流量で、３０分にわたり分析した。カラムを、スプレーニードル（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、ＵＳＡ）に直接連結した。
【０２１０】
移動相Ａは０．１％ギ酸であり、移動相Ｂは０．１％ギ酸を含有する１００％アセトニトリルであった。キャピラリーカラムから溶出されるペプチドは、１回のＭＳスキャン（３００〜１５００ｍ／ｚ）と３回のＭＳ／ＭＳスキャンとを交互に繰り返すプロトコルを使用して、質量分析計により、ＣＩＤに合わせて選択した。各調査スキャンで最も豊富な３種の前駆体イオンは、前駆体イオンピークの強度が１００００個のイオン数を超えた場合、ＣＩＤに合わせて選択した。エレクトロスプレー電圧は、１．８ｋＶに設定し、ＣＩＤによって断片化されたペプチドの特定のｍ／ｚ値は、２分間、再分析から除外した。質量分析計スキャンが機能し、ＨＰＬＣ溶媒勾配は、ＨｙＳｔａｒバージョン３．２データシステム（Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）によって制御した。
【０２１１】
各ＭＳ／ＭＳスペクトルを、Ｍａｓｃｏｔソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、Ｕ．Ｋ．）を使用して、ＩＰＩヒューマンデータベース、リリースＮｏ．３．１８に対して検索した。このソフトウェアによって計算された確率スコアを、正しい同定の基準として使用した。０．０５未満の期待値が、同定に必要とされた。個々のペプチドのイオンスコアは、１５よりも高いことが必要であった。さらに、ペプチドは、１つの不完全な内部開裂部位が存在する状態で、完全にトリプシン性であることが必要であった。メチオニン酸化は可変修飾として含まれ、質量許容度はＭＳに関して１．５Ｄａであり、ＭＳ／ＭＳに関して０．５Ｄａであった。これらの基準にパスした少なくとも１種のペプチドを有するタンパク質を、可能な同定として受け入れた。
【０２１２】
表１に示されるように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用した、ＰＰＳおよび相補的多対緩衝系の存在下でのタンパク質の同定は、首尾良く行われた。
【０２１３】
【表３−１】
2011503598.tif 000006
【０２１４】
【表３−２】
2011503598.tif 000007
【０２１５】
【表３−３】
2011503598.tif 000008
【０２１６】
【表３−４】
2011503598.tif 000009
【０２１７】
【表３−５】
2011503598.tif 000010
【０２１８】
【表３−６】
2011503598.tif 000011
【０２１９】
【表３−７】
2011503598.tif 000012
【実施例３】
【０２２０】
ＰＰＳを使用したＨＥＬＡ細胞からの膜タンパク質の分離および同定
第１のステップでは、ＰＰＳの存在下、全細胞抽出および膜タンパク質抽出のサンプルを調製した。
【０２２１】
全細胞抽出のサンプル（可溶性タンパク質および膜タンパク質を含む溶液）を調製するために、１０8個のＨｅＬａ細胞を、１．５ｍｌ  ＨＢＳ緩衝液＋４％ＰＰＳ（３−３［−（１，１−ビスアルキルオキシエチル）ピリジン−ｌ−イル］プロパン−ｌ−スルホネート）＋１μｌベンゾナーゼ中で超音波処理した。サンプルに遠心分離を行う（６０００ｇ）、上澄みをＦＦＥ分離用に回収した。
【０２２２】
膜タンパク質抽出のサンプルを調製するために、１０8個のＨｅＬａ細胞を、１．５ｍｌ  ＨＢＳ緩衝液＋１μｌベンゾナーゼ中で超音波処理し、遠心分離を行った（６０００ｇ）。上澄みを収集し、さらに１．５ｍｌのＨＢＳ緩衝液をペレットに添加し、これを超音波処理し、６００ｇで遠心分離を行った。上澄みを合わせ、超遠心分離を行った（１２５０００ｇ）。ペレットをＮａ2ＣＯ3緩衝液に再懸濁し（最終タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）、氷上で３０分間インキュベートし、超遠心分離を行った（１２５０００ｇ）。ペレットをＨＢＳ緩衝液で１回洗浄し、再び超遠心分離を行った。ペレットを、４％ＰＰＳ（３−３［−（１，１−ビスアルキルオキシエチル）ピリジン−ｌ−イル］プロパン−ｌ−スルホネート）を含有するＨＢＳ緩衝液中に再懸濁し、超音波処理し、氷上で２０分間インキュベートし、超遠心分離を行った。上澄みを収集し、ＦＦＥ分離用に調製した。
【０２２３】
インターバルゾーンフリーフロー電気泳動（ＩＺＥ）を、ＢＤ（商標）フリーフロー電気泳動システムで、サイクリックインターバルモードで実施した。７個の媒体入口（Ｅ１〜Ｅ７）および４個のサンプル入口（Ｓ１〜Ｓ４）を含む装置を設定した。アノード安定化媒体を入口Ｅ１に導入した。カソード安定化媒体を入口Ｅ７に導入し、サンプルは、サンプル入口Ｓ３を介して導入した。本明細書で使用した緩衝系は、上述のＡ／Ｂ媒体であった。印加された電圧は９５０Ｖであり、電流は５０ｍＡであった。サンプルおよび媒体を、それぞれ２．５ｍｌ／時および２５０ｍｌ／時の流量で導入した。媒体流量は、それぞれインターバル中が９０ｍｌ／時であり、画分収集中は３００ｍｌ／時であった。
【０２２４】
ＦＦＥ装置内の分離および安定化媒体：
【０２２５】
【表４】
2011503598.tif 000013
【０２２６】
向流媒体：水
【０２２７】
ＩＺＥを使用して分離されたＨｅＬａ細胞の全細胞抽出物を含むサンプルの、分離画分の銀染色ゲルを、図５に示す。図６は、ＩＺＥを使用して分離されたＨｅＬａ細胞の膜タンパク質を含有するサンプルの、分離画分の銀染色ゲルを示す。
【０２２８】
画分は、分離した画分についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行う前に、実施例２で記述したように調製した。
【０２２９】
ＥＳＩベースのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＨＣＴｕｌｔｒａ、Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）は、実施例２で記述したように実施した。
【０２３０】
各ＭＳ／ＭＳスペクトルを、実施例２で記述したように、Ｍａｓｃｏｔソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、Ｕ．Ｋ．）を使用してＩＰＩヒューマンデータベース、リリースＮｏ．３．１８に対して検索した。
【０２３１】
粗製非分離ＨｅＬａ膜タンパク質サンプルからの、十分に同定された合計９６種のタンパク質は、その中の５４種が膜タンパク質であった。同定されたタンパク質を、表２にまとめる。非限定的な例として、ＦＦＥ分離の画分２２について、質量分光分析を行った。合計で１５種の膜タンパク質および５種のサイトゾルタンパク質が、画分２２で同定された。結果を表３にまとめる。とりわけ、ＦＦＥ分離の画分２２で同定された２０種のタンパク質のうち３種は、粗製非分離サンプルで同定されなかった。３種の追加として見出されたタンパク質を、太字で強調する。
【０２３２】
【表５−１】
2011503598.tif 000014
【０２３３】
【表５−２】
2011503598.tif 000015
【０２３４】
【表５−３】
2011503598.tif 000016
【０２３５】
【表５−４】
2011503598.tif 000017
【０２３６】
【表５−５】
2011503598.tif 000018
【０２３７】
【表５−６】
2011503598.tif 000019
【０２３８】
【表５−７】
2011503598.tif 000020
【０２３９】
【表５−８】
2011503598.tif 000021
【０２４０】
【表５−９】
2011503598.tif 000022
【０２４１】
【表５−１０】
2011503598.tif 000023
【０２４２】
【表５−１１】
2011503598.tif 000024
【０２４３】
【表６−１】
2011503598.tif 000025
【０２４４】
【表６−２】
2011503598.tif 000026
【０２４５】
【表６−３】
2011503598.tif 000027
【０２４６】
本明細書で実証されるように、本発明によるＦＦＥ分離は、それほど複雑ではない質量スペクトルをもたらす。このように、複雑さが低減したスペクトルは、より容易な分析を可能にし、さらに、通常ならより複雑なスペクトル内で抑制されている可能性がある追加のシグナルの検出を可能にするが、これは例えば、前記シグナルに寄与する分析物が単に低濃度であることに起因する。
【実施例４】
【０２４７】
ＰＰＳを用いておよび用いずに調製されたＨＥＬＡ細胞からのペプチドの分離およびタンパク質の同定
１０8ＨｅＬａ細胞のサンプルを、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＫＣｌ＋プロテアーゼ阻害剤（１錠剤コンプリートミニ、Ｒｏｃｈｅ＃１１８３６１５３００１  １０ｍｌ））中で超音波処理し、並行して１０００００ｇで超遠心分離を行った。上澄みは可溶性タンパク質を含有していた。
【０２４８】
上澄みを２つに分け、以下の通り同等に処理した：１００ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液を添加した。ＴＣＥＰを添加して、最終濃度５ｍＭにし（インキュベーション６０分間）、次いでＩＡＡを添加して、最終濃度１５ｍＭにした（インキュベーション６０分）。トリプシン（修飾済み、シーケンシンググレード、Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、酵素：タンパク質の最終比１：３７．５にし、混合物を一晩３７℃でインキュベートした。消化は、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸で）溶液を酸性化することによって停止させた。
【０２４９】
並行して２種のサンプルのペプチドを、ＳｅｐＰａｋ（登録商標）Ｖａｃ  １ｃｃ  ｔＣ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して精製した。この手順は、アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡによるカートリッジの洗浄、サンプルの投入、０．１％ＴＦＡによるサンプルの洗浄、アセトニトリルによるペプチドの溶出、真空遠心分離によるサンプルの蒸発乾固、および入口Ｓ２に導入された１ｍｌの分離媒体で元の戻すことを含有していた。
【０２５０】
等電点泳動は、ＦＦ−ＩＥＦ静止インターバルモードにあるＢＤ（商標）フリーフロー電気泳動システムで実施した。９個の媒体入口（Ｅ１〜Ｅ９）および４個のサンプル入口（Ｓ１〜Ｓ４）を含む装置を設定した。アノード安定化媒体は、入口Ｅ１に導入した。カソード安定化媒体は入口Ｅ９に導入し、サンプルは、サンプル入口Ｓ３を介して導入した。印加された電圧は５００Ｖであり、電流は１３０ｍＡであった。サンプルおよび媒体は、それぞれ３ｍｌ／時および１５０ｍｌ／時の流量で導入した。
ＦＦＥ装置内の分離および安定化媒体：
【０２５１】
【表７】
2011503598.tif 000028
【０２５２】
向流媒体：水
【０２５３】
２種のサンプルのＦＦＥ分離は、上述の設定および媒体を使用して実施した。
【０２５４】
ＰＰＳ実験の場合、ＰＰＳを、濃度０．１％の媒体（Ｅ１〜Ｅ９）に添加した。
【０２５５】
ＰＰＳを用いたおよび用いないＦＦＥ分離溶出プロファイルを、それぞれ図７および図８に示す。
【０２５６】
ＦＦＥ分離の各画分１００μｌを、ＳｐｅｅｄＶａｃを使用して蒸発乾固し、２５μｌの０．１％ＴＦＡに溶解し、その５μｌをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験に使用した。タンパク質を、実施例２で述べたように同定した。とりわけ、より多くのタンパク質は、分離媒体がＰＰＳを含有している場合にサンプルの画分で同定した。例として、ＰＰＳを含まないサンプルの画分３２では、４８種のタンパク質がＬＣ  ＭＳ／ＭＳによって同定されたのに対し、ＰＰＳを含む分離媒体を含有した実験の画分３２では、７０種のタンパク質を同定することができた。引き続き行われるＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析の結果を、それぞれ表４および表５にまとめる。
【０２５７】
【表８−１】
2011503598.tif 000029
【０２５８】
【表８−２】
2011503598.tif 000030
【０２５９】
【表８−３】
2011503598.tif 000031
【０２６０】
【表８−４】
2011503598.tif 000032
【０２６１】
【表８−５】
2011503598.tif 000033
【０２６２】
【表８−６】
2011503598.tif 000034
【０２６３】
【表８−７】
2011503598.tif 000035
【０２６４】
【表９−１】
2011503598.tif 000036
【０２６５】
【表９−２】
2011503598.tif 000037
【０２６６】
【表９−３】
2011503598.tif 000038
【０２６７】
【表９−４】
2011503598.tif 000039
【０２６８】
【表９−５】
2011503598.tif 000040
【０２６９】
【表９−６】
2011503598.tif 000041
【０２７０】
【表９−７】
2011503598.tif 000042
【０２７１】
【表９−８】
2011503598.tif 000043
【０２７２】
【表９−９】
2011503598.tif 000044
【０２７３】
【表９−１０】
2011503598.tif 000045
【０２７４】
【表９−１１】
2011503598.tif 000046
【０２７５】
【表９−１２】
2011503598.tif 000047
【図１】
2011503598.tif 000048
【図２】
2011503598.tif 000049
【図３】
2011503598.tif 000050
【図４】
2011503598.tif 000051
【図５】
2011503598.tif 000052
【図６】
2011503598.tif 000053
【図７】
2011503598.tif 000054
【図８】
2011503598.tif 000055
【図９】
2011503598.tif 000056
【国際調査報告】
2011503598.tif 000057
2011503598.tif 000058
2011503598.tif 000059
2011503598.tif 000060
2011503598.tif 000061
2011503598.tif 000062