(57)【要約】本発明は、B. subtilisの野生型または変異型ｄａｐＡ遺伝子を含むEscherichia細菌、特にE. coliを使用して高収率でＬ−リシンを製造する方法を提供する。本発明は、また、Ｌ−リシンの製造に使用するための関連するリコンビナントEscherichia細菌、特にE. coliを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含む、Escherichia coli細菌において自律的に複製可能な、リコンビナントＤＮＡ。
【請求項２】
ｄａｐＡ遺伝子が、配列番号１と少なくとも９０％同一の核酸配列を有する、請求項１記載のリコンビナントＤＮＡ。
【請求項３】
核酸配列が配列番号１と同一である、請求項２記載のリコンビナントＤＮＡ。
【請求項４】
核酸配列が、配列番号１のヌクレオチド残基３５５にＧからＴへの、およびヌクレオチド残基３６０にＴからＣへの二つの突然変異を含む、請求項２記載のリコンビナントＤＮＡ。
【請求項５】
ｄａｐＡ遺伝子が、配列番号２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列を有する、請求項１記載のリコンビナントＤＮＡ。
【請求項６】
アミノ酸配列が配列番号２と同一である、請求項５記載のリコンビナントＤＮＡ。
【請求項７】
アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸残基１１９にヒスチジンからチロシンへの突然変異を含む、請求項５記載のリコンビナントＤＮＡ。
【請求項８】
Ｌ−リシンを産生する、B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含む、Escherichia coli細菌。
【請求項９】
ｄａｐＡ遺伝子が、配列番号１と少なくとも９０％同一の核酸配列を有する、請求項８記載の細菌。
【請求項１０】
ｄａｐＡ遺伝子が、配列番号２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列を有する、請求項８記載の細菌。
【請求項１１】
アミノ酸配列が、配列番号２と同一である、請求項１０記載の細菌。
【請求項１２】
China General Microbiological Culture Collection Centerに寄託されたＣＧＭＣＣナンバー２９２３のアクセッションナンバーを有する、請求項８記載の細菌。
【請求項１３】
アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸残基１９９にヒスチジンからチロシンへの突然変異を含む、請求項１０記載の細菌。
【請求項１４】
China General Microbiological Culture Collection Centerに寄託されたＣＧＭＣＣナンバー２９２４のアクセッションナンバーを有する、請求項８記載の細菌。
【請求項１５】
培地中に少なくとも５０g/LのＬ−リシンを産生する、請求項８記載の細菌。
【請求項１６】
B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むEscherichia coli細菌を培地中で成長させること、および該培地からＬ−リシンを収集することを含む、Ｌ−リシンを製造する方法。
【請求項１７】
ｄａｐＡ遺伝子が、配列番号１と少なくとも９０％同一の核酸配列を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ｄａｐＡ遺伝子が、配列番号２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
アミノ酸配列が、配列番号２と同一である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸残基１１９にヒスチジンからチロシンへの突然変異を含む、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年３月３日に出願された米国仮出願第６１／０３３，０９９号の優先権を主張し、その仮出願の開示全体は、参照により本明細書に明白に組み入れられる、
【０００２】
配列表
本明細書は、さらに、本明細書と共に提出された配列表を参照により組み入れる。米国特許法施行規則１．５２条（ｅ）（５）項により、0786680106seqlist.txtと識別される配列表のテキストファイルは、１５，３４９バイトであり、２００９年２月２６日に作成された。
【０００３】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、トランスフォーメーションされたEscherichia細菌、特にE. coliを成長させることによりＬ−リシンを製造するための方法を提供し、その細菌は、野生型または変異型Bacillus subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含む。
【０００４】
発明の背景
Ｌ−リシンは、動物では合成されない必須アミノ酸である。多数の野生型および突然変異型細菌株は、Ｌ−リシンを産生することが見い出された。試料添加剤、医薬、化学薬剤および食品成分として広く使用されることから、Ｌ−リシンは、主にコリネ型細菌またはEscherichia細菌を使用した大規模発酵により製造されてきた。
【０００５】
大部分の細菌では、Ｌ−リシンは、メチオニンおよびトレオニンの生合成経路により共有される２段階を含む、９段階の酵素経路でアスパラギン酸から自然に合成される（Anastassiadis, S., Recent patents on Biotechnology 2007, 1(1): 11-24; Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13):9448-66）。リシン生合成のレギュレーションメカニズムは複雑であり、異なる細菌種で大きく異なる（Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13): 9448-66）。例えば、リシン生合成の分岐部に入るように第１段階を触媒する酵素であるジヒドロジピコリン酸シンターゼ（「ＤＤＰＳ」）は、グラム陽性細菌（例えば、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Bacillus cereus、およびBacillus lactofermentum）ではなく、グラム陰性細菌（例えば、E. coli、Bacillus sphaericusおよびMethanobacterium thermoautotrophicum）においてＬ−リシンによるフィードバック阻害を受ける（Dobson, R. et al., Acta Cryst. 2005, D61:1116-24）。さらに、Bacillus subtilis（「B. subtilis」）におけるリシン生合成経路のレギュレーションは、リシンおよびその前駆体の一つであるジアミノピメリン酸による二重コントロールを伴うことで独特である（Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13): 9448-66）。
【０００６】
Ｌ−リシンによるＤＤＰＳのフィードバック阻害に対する多様な感受性に一致して、異なる属由来の細菌株の間で、ＤＤＰＳタンパク質の配列およびその対応する遺伝子ｄａｐＡにおける限られた相同性が見られる。B. subtilisにおけるＤＤＰＳは、それぞれE. coliおよびCorynebacterium Glutamicum（「C. Glutamicum」）におけるＤＤＰＳと、それぞれ約４３％および４０％同一のアミノ酸配列を有する（Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13):9448-66）。同じ細菌属の中であっても、異なる細菌株は中程度の相同性だけを示す。例えば、Bacillus methanolicus(「B. methanolicus」）におけるｄａｐＡ遺伝子は、以前から公知のB. subtilisにおけるｄａｐＡ遺伝子とヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が約６５％同一である（米国特許第６，８７８，５３３号）。
【０００７】
Escherichia細菌によるＬ−リシン製造を改善する一方法は、Ｌ−リシンによるＤＤＰＳのフィードバック阻害を克服することである。ＤＤＰＳをＬ−リシンに対して感受性低下させるために。Escherichia細菌の野生型ｄａｐＡ遺伝子に突然変異が加えられた（米国特許第６，０４０，１６０号）。対応するＤＤＰＳがＬ−リシンによるフィードバック阻害を受けない非Escherichia細菌の野生型ｄａｐＡ遺伝子をEscherichia細菌に導入するための試みもなされてきたが、一貫した満足のいく結果を生むことはできなかった。
【０００８】
韓国のグループが、リシン過剰産生性C. glutamicum株由来の野生型ｄａｐＡ遺伝子をリシン産生性突然変異型E. coli株（ＴＦ１）に導入することが、リシン感受性ＤＤＰＳ活性およびリシン産生の並行する増加を導くことを報告した（Oh, J. et al., Biotech. Ltrs. 1991, 13(10):727-32；韓国特許出願公開第１０−１９９２−０００８３８２号）。しかし、二つの他のE. coli株（ＴＦ１３およびＴＦ２３）における同じ野生型ｄａｐＡ遺伝子の発現は、高いリシン産生収率をもたらすことができなかった。この一貫性のない結果について、リシン生合成に関与するレギュレーションメカニズムはコリネ型細菌よりもE. coliの方が複雑であるという事実が引用された。
【０００９】
外来ｄａｐＡ遺伝子の発現は難しい。それは、対応する外来ＤＤＰＳタンパク質がEscherichia細菌におけるプロテアーゼによる分解および不溶性封入体の形成を受けやすいと思われるからである（米国特許第６，０４０，１６０号）。加えて、C. GlutamicumまたはB. methanolicusについての最適培養温度は、E. coliから約１０℃以上外れることから、C. glutamicum（Oh, J. et al., Biotech. Ltrs., 1991, 13(10): 727-32；韓国特許出願公開第１０−１９９２−０００８３８２号）またはB. methanolicus（米国特許第６，８７８，５３３号）のＤＤＰＳが、E. coliにおいてその好都合な活性を、すなわち高いリシン産生収率を導くリシン非感受性ＤＤＰＳ活性を示すとは予想されない。
【００１０】
B. subtilisにおいてリシン生合成に関与する遺伝子が発現されたE. coli細胞において、リシン合成の極めて複雑なレギュレーションが観察された（Shevchenko, T. N. et al., Tsitol Genet. 1984, 18(1):58-60）。具体的には、E. coli細胞における外来ｄａｐＡ遺伝子を含むこれらの外来遺伝子の発現は、リシン産生を高く満足なレベルに増加させることができなかった。リシンおよびジアミノピメリン酸によるフィードバック阻害を解除するために、リシン生合成に関与する天然遺伝子に突然変異を有するE. coliまたはB. subtilisを使用することによって、リシン生合成のかなりの増加が達成されることが示唆された。
【００１１】
今のところ、野生型または変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むEscherichia細菌を使用してＬ−リシンを製造するための有効な方法は全くない。特に動物飼料用のＬ−リシンの需要は、世界人口の増大と共に絶えず増加していることから、Escherichia細菌株を使用したＬ−リシン製造を改善するための新規で有効な方法を開発する必要がある。
【００１２】
発明の概要
本発明によると、B. subtilisの野生型または変異型ｄａｐ  Ａ遺伝子をEscherichia細菌に導入することにより、Escherichia細菌によるＬ−リシン製造が工業レベルまで改善する。さらに、トランスフォーメーションされたEscherichia細菌は、培地中に高い収率でＬ−リシンを製造するために使用することができる（例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５または１５０g/L）。
【００１３】
本発明は、Escherichia細菌において自律的に複製可能で、B. subtilisの野生型または変異型ｄａｐＡ遺伝子を含むリコンビナントＤＮＡを提供する。変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、野生型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子と非同一であるが、実質的に（例えば、９０％、９５％、または９９％）同一の配列を有する。リコンビナントＤＮＡは、Escherichia細菌にB. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を導入してＬ−リシン産生を増加させるために使用することができる。
【００１４】
B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、GenBankアクセッションナンバーＬ０８４７１（配列番号１）およびChen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13): 9448-66に示されるようなB. subtilis ｄａｐＡ遺伝子と同一または実質的に（例えば、９０％、９５％、または９９％）同一の核酸配列を有しうる。変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、配列番号１に一つまたは複数のヌクレオチド改変を含みうる。具体的な非限定的な一態様では、変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド残基３５５にＧからＴ、およびヌクレオチド残基３６０にＴからＣへの二つの突然変異を含む。
【００１５】
さらに、B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、GenBankアクセッションナンバーＬ０８４７１（配列番号２）およびChen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13): 9448-66に示されるようなB. subtilis ｄａｐＡ遺伝子の推定アミノ酸配列と同一または実質的に（例えば、９０％、９５％、または９９％）同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしうる。このタンパク質は、配列番号２に一つまたは複数のアミノ酸改変を含むアミノ酸配列を有しうる。具体的で非限定的な一態様では、変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、配列番号２のアミノ酸残基１１９にヒスチジンからチロシンへの突然変異を含むアミノ酸配列を有するタンパク質（「Ｈ１１９Ｙ変異体」）をコードする。B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、ＤＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードしうる。
【００１６】
本発明は、また、培地にＬ−リシンを製造するための野生型または変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むEscherichia細菌を提供する。そのEscherichia細菌は、培地に少なくとも５０g/LのＬ−リシンを産生しうる。具体的で非限定的な一態様では、野生型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むEscherichia細菌が、L-リシンを製造するために提供される。別の具体的で非限定的な態様では、Ｈ１１９Ｙ変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むEscherichia細菌が、Ｌ−リシンを製造するために提供される。
【００１７】
本発明は、さらに、培地にEscherichia細菌を成長させることによりＬ−リシンを製造し、その培地からＬ−リシンを収集するための方法を提供し、ここで、その細菌は、野生型または変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含む。Ｌ−リシンを蓄積させた後に、それを培地から採取または収集する。Ｌ−リシンが少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５または１５０g/L、好ましくは少なくとも５０g/Lに達したときに、Ｌ−リシンを培地から収集することができる。具体的で非限定的な一態様では、野生型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むEscherichia細菌を培地中で成長させ、Ｌ−リシンをその培地から収集する。別の具体的な非限定的な態様では、Ｈ１１９Ｙ変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むEscherichia細菌を培地中で成長させ、Ｌ−リシンをその培地から収集する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、好都合には、発酵によりＬ−リシンを製造するための方法、Escherichia属に属するトランスフォーメーションされた細菌およびリコンビナントＤＮＡを提供する。B. subtilisの野生型または変異型ｄａｐＡ遺伝子を含むEscherichia細菌により、Ｌ−リシンを高収率で製造できることが今回発見された。
【００１９】
説明を明確にするために、そして限定するつもりはなく、本発明を以下の小区分：
（１）リコンビナントＤＮＡ、
（２）トランスフォーメーションされたEscherichia細菌、および
（３）Ｌ−リシンの製造方法
に分けて詳細に説明する。
【００２０】
（１）リコンビナントＤＮＡ
本発明のリコンビナントＤＮＡは、B. subtilis株の野生型または変異型ｄａｐＡ遺伝子を保有し、Escherichia細菌株で自律的に複製する。それは、B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントをEscherichia細菌株において複製可能な発現ベクターに挿入することにより得ることができる。
【００２１】
B. subtilis株において、ｄａｐＡ遺伝子は発現され、対応するＤＤＰＳは、Ｌ−リシンによる実質的な（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれを超える）フィードバック阻害を受けない。B. subtilis株は、Ｌ−リシン産生株のこともあるし、そうでないこともある。好ましいB. subtilis株はＷ１６８であり、その株はリシン産生株ではない。この株は、Bacillus Genetic Stock Center（Ohio State University, U.S.A）から入手することができる。
【００２２】
野生型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子(「ＢｓｄａｐＡ遺伝子」)を含むＤＮＡフラグメントは、野生型B. subtilis株の染色体ＤＮＡから得ることができる。その染色体ＤＮＡは、当技術分野で公知の標準的な技法を使用して、B. subtilis株から調製することができる。ＤＮＡフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を使用して染色体ＤＮＡから野生型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を増幅することによって得ることができる。適切なＰＣＲプライマーは、B. subtilisまたは他の細菌株（例えば、E. coliおよびC. glutamicum）において以前に公表されたｄａｐＡ遺伝子配列に基づき調製することができる（Chen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13): 9448-66）。例えば、一本鎖２１塩基長のプライマー対であるＤａｐＡ−Ｆ（配列番号３）およびＤａｐＡ−Ｒ（配列番号４）を使用することができる。
【００２３】
配列番号３および４の核酸配列を下に示す：
【００２４】
【表１】
2011512823.tif 000002
【００２５】
変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、同様に、in vivoで突然変異させたB. subtilis株の染色体ＤＮＡから得ることができる。変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、また、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発などの、当技術分野で公知の標準技法によりin vitroで野生型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子に改変を導入することにより得ることができる。
【００２６】
結果として生じたＤＮＡフラグメントの配列は、適切なプライマー（例えば、ＤａｐＡ−ＦおよびＤａｐＡ−Ｒ）を使用して、一般に公知の方法により決定することができる。
【００２７】
B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、GenBankアクセッションナンバーＬ０８４７１（配列番号１）およびChen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13): 9448-66に示されたようなB. subtilis ｄａｐＡ遺伝子と同一または実質的に（例えば、９０％、９５％、または９９％）同一の核酸配列を有しうる。野生型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、配列番号１と同一の核酸配列を有しうる。変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、配列番号１に一つまたは複数のヌクレオチド改変を含みうる。例えば、変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド残基３５５にＧからＴ、およびヌクレオチド残基３６０にＴからＣへの二つの突然変異を含みうる。配列の同一率は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアにより決定することができる。
【００２８】
さらに、B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、GenBankアクセッションナンバーＬ０８４７１（配列番号２）およびChen, N. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268(13): 9448-66に示されたようなB. subtilis ｄａｐＡ遺伝子の推定アミノ酸配列と同一または実質的に（例えば、９０％、９５％、または９９％）同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしうる。野生型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、配列番号２と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしうる。B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、また、配列番号２に一つまたは複数のアミノ酸改変を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしうる。例えば、変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、配列番号２のアミノ酸残基１１９にヒスチジンからチロシンへの突然変異を含むアミノ酸配列を有するタンパク質（「Ｈ１１９Ｙ変異体」）をコードしうる。
【００２９】
アミノ酸改変には、アミノ酸置換、付加および欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発などの、当技術分野で公知の標準技法により導入することができる。アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換された置換を含みうる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【００３０】
アミノ酸置換には、また、Ｌ−リシンに対して対応するＤＤＰＳを感受性低下させることが公知の、Escherichia細菌の野生型ｄａｐＡ遺伝子におけるアミノ酸置換と関連する置換が含まれうる。
【００３１】
ｄａｐＡ遺伝子を含むリコンビナントＤＮＡを産生させるために、続いて、B. subtilisの野生型または変異型ｄａｐＡ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを適切な発現ベクターとライゲーションすることができる。適切なＤＮＡ発現ベクターは、Escherichia細菌株において自律的に複製し、選択遺伝子マーカーを含む。選択遺伝子マーカーは、トランスフォーメーションされていないホストからトランスフォーメーションされたホストを識別できる抗生物質耐性（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンおよびネオマイシン）、色変化または任意の他の性質を検出することができる。適切なベクターの例には、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８およびｐＳＴＶ２８などのE. coli発現ベクターが含まれる。ｄａｐＡ遺伝子がE. coliの強力なプロモーターのコントロール下にあるように、ＤＮＡフラグメントをＤＮＡ発現ベクターに挿入することが好ましい。適切なプロモーターの例には、ｔｒｃ、ｔａｃ、ｌａｃおよびＴ７、好ましくはｔｒｃが含まれる。
【００３２】
B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子は、ＤＤＰＳ活性を有するタンパク質をコードしうる。B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むリコンビナントＤＮＡの存在は、リコンビナントＤＮＡでトランスフォーメーションされた細菌株におけるＤＤＰＳ活性のレベル上昇またはリコンビナントＤＮＡでトランスフォーメーションされたＤＤＰＳ欠損細菌株（例えば、E. coli ＪＥ７６２７株）における栄養要求性の回復により確認することができる。
【００３３】
（２）トランスフォーメーションされたEscherichia細菌
Escherichia細菌は、当技術分野で公知の標準技法を使用して、B. subtilisの野生型または変異型ｄａｐＡ遺伝子を含むリコンビナントＤＮＡでトランスフォーメーションすることができる。親（トランスフォーメーションされていない）Escherichia細菌は、野生型または突然変異型天然ｄａｐＡ遺伝子を保有して、対応する野生型または突然変異型天然ＤＤＰＳを発現しうる。天然ＤＤＰＳの酵素活性は、Ｌ−リシンによるフィードバック阻害を受けることがある。親Escherichia細菌は、Ｌ−リシン産生株でありうる。リシン生合成に関与する別の天然酵素の活性が高まることがある。例えば、Ｌ−リシンによるフィードバック阻害を解除する突然変異を有する天然アスパルトキナーゼＩＩＩをコードするＤＮＡを含むE. coli株（米国特許第６，０４０，１６０号）を使用することができる。Escherichia細菌株はE. coliであることが好ましい。Escherichia細菌は、Ｌ−リシンの工業製造に通常使用されるE. coli株であることがさらに好ましい。
【００３４】
トランスフォーメーション後に、Escherichia細菌は、B. subtilisの野生型または変異型ｄａｐＡ遺伝子を内部に有する。トランスフォーメーションされた細菌におけるB. subtilis ｄａｐＡ遺伝子の存在は、当技術分野で公知の標準技法により決定することができる。B. subtilisのｄａｐＡ遺伝子は、プラスミド上に保有することができる。その遺伝子は、また、トランスフォーメーションされたEscherichia細菌の染色体に組み込むことができる。トランスフォーメーションされたEscherichia細菌は、高収率（例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５または１５０g/L）でＬ−リシンを産生する。
【００３５】
一態様では、単独のプラスミドｐＶＩＣ４０を追放した後に、野生型ｄａｐＡ遺伝子を含むリコンビナントＤＮＡ（例えばｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡ）でE. coli株Ｂ−３９９６（Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breedingから登録番号ＲＩＡ１８６７で入手できる）をトランスフォーメーションして（米国特許第６，０４０，１６０号）、トランスフォーメーションされた細菌株Ｂ−３９９／ｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡを作製する。対照株Ｂ−３９９／ｐＴｒｃ９９Ａは、ＢｓｄａｐＡを有さない対応するリコンビナントＤＮＡ（例えばｐＴｒｃ９９Ａ）を用いたトランスフォーメーションにより同様に調製する。培地は、無菌溶液（１６g/L (ＮＨ４）２ＳＯ４、１g/L ＫＨ２ＰＯ４、１g/L ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１g/L ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１g/L ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、２g/L酵母エキス（Difco）、０．５g/L Ｌ−メチオニン、０．１g/L Ｌ−トレオニン、および０．０５ g/L Ｌ−イソロイシン（ｐＨ７．０）を含有する）を無菌２０％グルコースと４：１の比で混合することにより調製する。Ｌ−リシン産生を改善するためにグルコースを補給してもよい。続いて、無菌の局方ＣａＣＯ３をその混合物に加え、溶解させて終濃度３０g/Lにする。適切な抗生物質（例えば、１５μg/mlテトラサイクリンおよび５μg/mlカナマイシン）もまた加えることができる。両株を１１４〜１１６rpmで振盪しながら３７℃で４８時間培養する。Ｌ−リシンを採取し、培養液から分析する。細菌株Ｂ−３９９／ｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡは、Ｌ−リシンを少なくとも１０g/L産生すると予想され、それは、対照株Ｂ−３９９／ｐＴｒｃ９９Ａよりも有意に大きいであろう。
【００３６】
別の態様では、Global Bio-Chem Technology Group Company LimitedからのE. coli細菌株ＤＣ０３７を使用して、それぞれ１５０、１８０および２０g/LのＬ−リシンを産生した、B. subtilisの野生型ｄａｐＡ遺伝子を含むリコンビナントE. coli（ＤＣ０５１）、B. subtilisのＨ１１９Ｙ変異型ｄａｐＡ遺伝子を含むリコンビナントE. coli（ＤＣ２３１）、およびリコンビナントE. coli対照（ＤＣ０７３）を調製した。これらのリコンビナントE. coli株の調製および試験は、実施例３および４に説明する。
【００３７】
細菌株ＤＣ０５１およびＤＣ２３１は、ブダペスト条約に基づきChina General Microbiological Culture Collection Center（ＣＧＭＣＣ）に２００９年２月２６日に寄託され、それぞれＣＧＭＣＣナンバー２９２３およびＣＧＭＣＣナンバー２９２４のアクセッションナンバーを与えられた。
【００３８】
トランスフォーメーションされたEscherichia細菌におけるＤＤＰＳ活性は、Ｌ−リシンにより実質的な（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、またはそれを超える）フィードバック阻害を受けることができない。トランスフォーメーションされたEscherichia細菌のＤＤＰＳ活性は、１０mM Ｌ−リシンの存在下でわずか５０％に減少しうる。
【００３９】
細菌におけるＤＤＰＳ活性は、Yugari, Y. and Gilvarg C., J. Biol. Chem., 1965, 240(12): 4710-16に記載された方法または任意の他の適切な方法に準じて測定することができる。例えば、細菌抽出物を５０mMイミダゾールＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０mM Ｌ−アスパラギン酸セミアルデヒドおよび２０mMピルビン酸ナトリウムを含有する反応溶液に加え、３７℃で１０分間インキュベーションする。ピルビン酸ナトリウムを有さない反応溶液を空試料として使用することができる。反応により発生したジヒドロジピコリン酸の量によりＤＤＰＳを測定し、その量は、分光光度計により波長２７０nmで検出する。様々な量のＬ−リシンを反応混合物に加えてＤＤＰＳ活性のリシン感受性を評価する。
【００４０】
（３）Ｌ−リシンの製造方法
Ｌ−リシンは、野生型または変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むEscherichia細菌を培地中で成長させることにより製造することができる。Escherichia細菌の最適な成長に適した培地が望ましい（Anastassiadis, S., Recent Patents On Biotechnology 2007, 1(1): 11-24）。トランスフォーメーションされたEscherichia細菌の選択性および安定性を保つために、抗生物質（例えばアンピシリン）が培地中に望ましい。
【００４１】
例えば、培地は、無菌溶液（１６g/L （ＮＨ４）２ＳＯ４、１g/L ＫＨ２ＰＯ４、１g/L ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１g/L ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１g/L ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、２g/L酵母エキス（Difco）、０．５g/L Ｌ−メチオニン、０．１g/L Ｌ−トレオニン、および０．０５g/L Ｌ−イソロイシン（ｐＨ７．０）を含有）を無菌２０％グルコースと４：１の比で混合することにより調製する。Ｌ−リシン産生を改善するためにグルコースを補給することができる。続いて、無菌の局方ＣａＣＯ３をその混合物に加え、溶解させて終濃度３０g/Lにする。適切な抗生物質（例えば、１５μg/mlテトラサイクリンおよび５μg/mlカナマイシン）もまた加えることができる。
【００４２】
Escherichia細菌に最適な培養条件が望ましい（Anastassiadis, S., Recent Patents On Biotechnology 2007, 1(1): 11-24）。培養は、好ましくは、２５℃〜４５℃の温度および５〜８のｐＨの好気的条件で好ましくは実施される。Ｌ−リシンの濃度は、約２〜１０日間の培養後に最大に達する。細菌の成長は、分光光度計により測定された培養液の細胞密度に基づきモニターすることができる。
【００４３】
本発明に従って培養された、トランスフォーメーションされたEscherichia細菌の培地中にＬ−リシンを蓄積させる。Ｌ−リシンは、遠心分離による細胞分離および培地の濾過の前または後に、Ｌ−リシンＨＣｌを製造するための様々な方法（例えばイオン交換クロマトグラフィー法）により採取することができるか、またはペレット化工程によりＬ−リシン硫酸塩を製造するためにＬ−リシンのブロスを採取することができる（Anastassiadis, S., Recent Patents On Biotechnology 2007, 1(1): 11-24；中国特許第２００４１００５００１７．４号）。Ｌ−リシンは、大規模発酵工程でＬ−リシンが少なくとも５〜１０g/L、または少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５または１５０g/Lに、好ましくは少なくとも５０g/Lに達したときに培地から採取または収集することができる。Ｌ−リシンの量は、当技術分野で公知の様々な分析法（例えばＨＰＬＣ）により決定することができる。
【００４４】
実施例
本発明を以下に全般的に説明するが、単に本発明のある局面および態様を例示するために含められ、本発明を限定する意図がない以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解されよう。
【００４５】
実施例１．  プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡの構築
プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡは、野生型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むように構築した。染色体DNAは、一般に公知の方法を使用して野生型B. subtilis株Ｗ１６８（Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State University, U.S.A.）から調製した。それぞれ配列番号３および４に示される核酸配列を有するプライマー対ＤａｐＡ−Ｆ（配列番号３）およびＤａｐＡ−Ｒ（配列番号４）を使用して、染色体ＤＮＡ中の野生型ｄａｐＡ遺伝子を増幅することによって０．８８kbのＤＮＡフラグメントを得た。ＤＮＡフラグメントを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同制限酵素で予め消化されたｐＴｒｃ９９ＡプラスミドとライゲーションしてｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡプラスミドを作製した。プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡは配列番号１の核酸配列を含んだ。その核酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００４６】
実施例２．  プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡＨ１１９Ｙの構築
プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡＨ１１９Ｙは、Ｈ１１９Ｙ変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むように構築した。突然変異は、ＰＣＲテンプレートとしてｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡプラスミドを使用して、プライマー対ｂｓｄａｐａ１１９ｍｕｔｓ（配列番号５）およびｂｓｄａｐａ１１９ｍｕｔａｓ（配列番号６）を用いて増幅することにより導入した。配列番号５および６の核酸配列を以下に示す：
【００４７】
【表２】
2011512823.tif 000003
【００４８】
プライマー上の突然変異部位を太字の斜体字で示す。
【００４９】
ＤｐｎＩにより消化された一定分量のＰＣＲ産物でE. coli ＤＨ５αコンピテント細胞をトランスフォーメーションした。プラスミドをトランスフォーマントから抽出し、制限酵素DraIで消化して所望の突然変異型プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡＨ１１９Ｙを確認した。そのプラスミドは、配列番号１のヌクレオチド残基３５５にＧからＴ、およびヌクレオチド残基３６０にＴからＣへの二つの突然変異を含む核酸配列を含んだ。核酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基１１９にヒスチジンからチロシンへの突然変異を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００５０】
実施例３．  野生型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むリコンビナントE. coli
野生型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むリコンビナントE. coli（ＤＣ０５１）をE. coli細菌株ＤＣ０３７から調製したが、その細菌株はGlobal Bio-Chem Technology Group Company Limitedから受け取ったものである。ＤＣ０３７は、それぞれE. coliの突然変異型ｄａｐＡ遺伝子およびテトラサイクリンまたはカナマイシン耐性遺伝子を有する二つの異なるプラスミドを保有した。これらの二つのプラスミドをノックアウトさせ、それぞれ以下に示すようなＢｓｄａｐＡ遺伝子およびテトラサイクリンまたはカナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＤＣｔｅｔＢＳｄａｐＡおよびｐＤＣｋａｎＢＳｄａｐＡａｓと交換した。
【００５１】
ＢｓｄａｐＡ遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＤＣｔｅｔＢＳｄａｐＡを構築した。ＢｓｄａｐＡは、それぞれ下記の配列番号７および８に示す核酸配列を有するプライマー対ｐｔｒｃＢＳｄａｐＡｌ−ＦおよびｐｔｒｃＢＳｄａｐＡｌ−Ｒを使用することによってｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡから得た。１．６kbのＤＮＡフラグメントを回収し、制限酵素Ｔｔｈ１１１ＩおよびＳｐｅＩで消化し、同制限酵素で予め消化されたプラスミドｐＤＣｔｅｔｄａｐＡとライゲーションして、プラスミドｐＤＣｔｅｔＢＳｄａｐＡを調製した。
【００５２】
ＢｓｄａｐＡ遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＤＣｋａｎＢＳｄａｐＡを構築した。ＢｓｄａｐＡは、それぞれ下記の配列番号９および１０に示す核酸配列を有するプライマー対ｐｔｒｃＢＳｄａｐＡ２−ＦおよびｐｔｒｃＢＳｄａｐＡ２−Ｒを使用することによって、ｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡから得られた。１．６kbのＤＮＡフラグメントを回収し、制限酵素ＮｏｔＩおよびＰｓｈＡＩで消化し、同制限酵素で予め消化したプラスミドｐＤＣｋａｎｄａｐＡとライゲーションしてプラスミドｐＤＣｋａｎＢＳｄａｐＡを調製した。
【００５３】
ＤＣ０４５は、ＤＣ０３７から調製した。ＤＣ０３７を８００μg/ml ＥＢで２４時間処理し、続いて５μg/mlテトラサイクリンおよび５０μg/mlカナマイシンによりそれぞれスクリーニングして、ｐＤＣｋａｎｄａｐＡが除去されてｐＤＣｔｅｔｄａｐＡが残されたＤＣ０３９を調製した。
【００５４】
それぞれ下記の配列番号１１および１２に示す核酸配列を有するプライマー対ＬＤＣｕｐおよびｆｌＤＮを用いてE. coli Ｗ３１１０を増幅することにより２．８kbのフラグメントを得た。このフラグメントをｐＭＤ１８ｓｉｍｐｌｅ  ＴベクターにサブクローニングしてｐＭＤｌ８ｓｗｔＬＤＣを得た。
【００５５】
それぞれ下記の配列番号１３および１４に示す核酸配列を有するプライマー対ＦＲＴ５およびＨＰＡ１ＦＲＴ３を用いてｐＩＪ７７３を増幅することによって１．５kbのアプラマイシン耐性遺伝子を得た。ベクターとしてｐＭＤ１８ｓｗｔＬＤＣをＨｐａＩにより消化し、１．５kbのアプラマイシン耐性遺伝子フラグメントとライゲーションしてｐＭＤ１８ｓｗｔＬＤＣ−ａｐｒａを得た。ＰｖｕＩＩでｐＭＤ１８ｓｗｔＬＤＣ−ａｐｒａを消化することによって４．５kbのフラグメントを単離し、ＤＣ０３９（ｐＩＪ７９０）をトランスフォーメーションするためのリコンビナントフラグメントとして使用して、野生型ＬＤＣがＤＣ０３９のゲノムにおける切断型ＬＤＣと交換されたＤＣ０４３を得た。プラスミドｐＣＰ２０の助けを借りてＤＣ０４３のゲノムからアプラマイシン耐性遺伝子の除去後に、野生型ＬＤＣおよびプラスミドｐＤＣｔｅｔｄａｐＡを有するＤＣ０４５を得た。
【００５６】
次に、ＤＣ０４５中のプラスミドｐＤＣｔｅｔｄａｐＡを駆逐するためにｐＤＣａｍＢＳｄａｐＡを構築した。
【００５７】
プラスミドｐＩＪ７７３を抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化した。１．３kbのフラグメントを単離した。制限酵素ＰｖｕＩＩでｐＤＣｔｅｔＢＳｄａｐＡを消化することにより３．４kbのフラグメントを得て、続いて、同じ制限酵素で予め消化したプラスミドｐＭＤ１８ｓｉｍｐｌｅとライゲーションし、ｐＭＤ１８ｓ（ＢＳｔｅｔ）を構築した。ｐＭＤ１８ｓ（ＢＳｔｅｔ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩで消化して、ベクターとして使用するための４．５kbのフラグメントを得た。ｐＩＪ７７３から得られた１．３kbのフラグメントを４．５kbのベクターフラグメントとライゲーションした。コンピテントＤＨ５α細胞をライゲーション混合物でトランスフォーメーションし、アンピシリン／アプラマイシン含有プレート上で成長させた。トランスフォーメーションされた細菌からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、３．５kbのフラグメントを長腕リコンビナントフラグメントとして得た。
【００５８】
ｐＤＣｔｅｔＢＳｄａｐＡでトランスフォーメーションされたＢＷ２５１１３（ｐＩＪ７９０）を、長腕リコンビナントフラグメントでさらにトランスフォーメーションした。トランスフォーメーションされた細菌からリコンビナントプラスミドｐＤＣａｍＢＳｄａｐＡを抽出し、それをＤＣ０４５のトランスフォーメーションに使用した。トランスフォーメーションされたＤＣ０４５は、二つのプラスミドｐＤＣｔｅｔｄａｐＡおよびｐＤＣａｍＢＳｄａｐＡを有した。二つの複製起点の反発が原因で、ｐＤＣｔｅｔｄａｐＡが除去され、ｐＤＣａｍＢＳｄａｐＡが残ったＤＣ０４９−１が得られた。ＤＣ０４９−１をｐＤＣｔｅｔＢＳｄａｐＡおよびｐＤＣｋａｎＢＳｄａｐＡでトランスフォーメーションした後にＤＣ０５１が得られた。
【００５９】
細菌株ＤＣ０５１は、ブダペスト条約に基づき２００９年２月２６日にChina General Microbiological Culture Collection Center（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、ＣＧＭＣＣナンバー２９２３のアクセッションナンバーを与えられた。
【００６０】
発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａを有するＤＣ０７３を対照と同様に調製した。ＤＣ０５１とは異なり、ＤＣ０７３はｐＢｓｄａｐＡを含まない。
【００６１】
配列番号７〜１４の核酸配列を以下に示す：
【００６２】
【表３】
2011512823.tif 000004
【００６３】
アンピシリンを有する培地中で３７℃で３日間ＤＣ０５１およびＤＣ０７３を成長させ、培地中にそれぞれ１５０および２０g/LのＬ−リシンを製造した。
【００６４】
実施例４．  Ｈ１１９Ｙ変異型B. subtilis ｄａｐＡ遺伝子を含むリコンビナントE. coli
B. subtilisのＨ１１９Ｙ変異型ｄａｐＡ遺伝子を含むリコンビナントE. coli（ＤＣ２３１）は、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡと置き換えるためにプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＢｓｄａｐＡＨ１１９Ｙを使用したこと以外は実施例３に記載した方法を使用して調製した。ＤＣ０４９−１をｐＤＣｋａｎＢＳｄａｐＡＨ１１９ＹおよびｐＤＣｔｅｔＢＳｄａｐＡＨ１１９Ｙでトランスフォーメーションした後に、ＤＣ２３１が得られた。
【００６５】
細菌株ＤＣ２３１は、ブダペスト条約に基づき２００９年２月２６日にChina General Microbiological Culture Collection Center（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、ＣＧＭＣＣナンバー２９２４のアクセッションナンバーを与えられた。
【００６６】
実施例３に記載した方法を使用して、ＤＣ２３１を培地中で成長させた。Ｌ−リシンは、培地中に１８０g/L産生した。
【００６７】
参照により組み入れ
本明細書に挙げた全ての刊行物および特許は、各個別の刊行物または特許が具体的かつ個別に参照により組み入れられると示されるかの如く、本明細書においてそれらの全体が参照により組み入れられる。抵触する場合は、本明細書における任意の定義を含む本出願がコントロールする。
【００６８】
主題発明の具体的な態様を論じたが、上記明細書は例証であり、限定的ではない。本発明の多数の変形は、本明細書および下記特許請求の範囲を再検討すると当業者に明らかになろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲をそれらの等価物の全範囲と共に、そして明細書を該変形と共に参照することにより決定されるはずである。
【００６９】
【表４】
2011512823.tif 000005
2011512823.tif 000006
2011512823.tif 000007
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【配列表】
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【国際調査報告】
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