(57)【要約】治療有効量のＲｈｏアンタゴニストを対象に投与することにより、治療を要する対象の骨障害を治療する方法が開示される。
2011513434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨細胞とＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性を調節する量のＲｈｏアンタゴニストとを接触させることを含む、骨細胞中のＲｈｏ  ＧＴＰアーゼを調節する方法。
【請求項２】
前記ＲｈｏアンタゴニストがＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＲｈｏアンタゴニストがＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記複合体がＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記複合体が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記骨細胞が骨再形成細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記骨再形成細胞が骨芽細胞または骨芽前駆細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記骨再形成細胞が破骨細胞または破骨前駆細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
治療有効量のＲｈｏアンタゴニストを対象に投与し、それによって前記対象の骨再形成を促進することを含む、対象の骨再形成を促進する方法。
【請求項１０】
前記ＲｈｏアンタゴニストがＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲｈｏアンタゴニストがＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記複合体がＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記複合体が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
治療有効量のＲｈｏアンタゴニストを対象に投与し、それによって骨損傷を治療することを含む、対象の骨損傷を治療する方法。
【請求項１５】
前記骨損傷が骨折である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記骨損傷が脊柱損傷である、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記骨損傷が転移性の腫瘍から起こる骨量減少である、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｒｈｏアンタゴニストが骨損傷の部位に局所的に投与される、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｒｈｏアンタゴニストが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｒｈｏアンタゴニストが約０．０００１μｇ／ｃｍ3組織から約１００μｇ／ｃｍ3組織の用量で投与される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｒｈｏアンタゴニストがフィブリンシーラント中で投与される、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
前記フィブリンシーラントがＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｒｈｏアンタゴニストが薬剤溶出装置を用いて骨組織に直接投与される、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
骨芽前駆細胞とＲｈｏアンタゴニストとを接触させ、それによって前記前駆細胞の分化を刺激することを含む、骨芽前駆細胞を刺激して骨芽細胞に分化させる方法。
【請求項２５】
前記ＲｈｏアンタゴニストがＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記ＲｈｏアンタゴニストがＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記複合体がＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記複合体が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
Ｒｈｏアンタゴニストを対象に投与し、それによって骨吸収を阻害することを含む、対象における骨吸収を阻害する方法。
【請求項３０】
前記ＲｈｏアンタゴニストがＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記ＲｈｏアンタゴニストがＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記複合体がＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記複合体が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
対象から骨芽前駆細胞を得るステップ；
前記前駆細胞をＲｈｏアンタゴニストと接触させ、それによって前記前駆細胞の骨芽細胞への分化を刺激するステップ；
および前記骨芽細胞を前記対象に移植するステップ
を含む、対象の骨損傷を治療する方法。
【請求項３５】
前記ＲｈｏアンタゴニストがＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記ＲｈｏアンタゴニストがＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記複合体がＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記複合体が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本明細書は２００８年３月７日に出願された米国仮特許出願第６１／０３４，６６８号の利益を主張するものであり、参照によりその内容全体が本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、医学と細胞生物学分野に属する。特に、本発明はＲｈｏアンタゴニストによる骨細胞、および骨折および骨粗鬆症などの骨障害の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨格の機械的な健全性の維持は骨再形成に依存する。骨の恒常性には骨芽細胞、破骨細胞、および骨細胞が主な細胞として関与し、これらは骨細胞および他の細胞および組織から分泌される一群のサイトカインの制御下にある。骨格の維持には骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収の間に十分に調整されたバランスが求められる。
【０００４】
破骨細胞は、骨再形成において決定的な役割を果たす骨を吸収する主要な細胞である。刺激を受けた骨芽細胞は破骨前駆細胞を破骨細胞に転換し、破骨細胞が融合して形成した巨大破骨細胞が骨を溶解する。破骨細胞は、Ｆ−アクチンおよびその他の細胞骨格タンパク質からなる「ポドソーム」と呼ばれる特殊な分離構造を介して骨表面に接着する。骨吸収の開始に先行して破骨細胞内でアクチン環が形成され、骨吸収の明帯と正確に対応する末梢領域にポドソ−ムの環構造が出現する。
【０００５】
骨芽細胞と破骨細胞との共役作用は、多数の局所および血中のホルモンおよび因子の作用で制御されている。骨吸収が骨形成を超えるなどで作用の脱共役がもし起こると、骨量減少、骨粗鬆症への進行、および脆弱性骨折が結果として引き起こされることもある。
【０００６】
各種の病態は、外傷の結果として発生する骨形成の必要性が特徴であり、損傷した骨構造の適切かつ完全な回復のために十分な骨形成活性がきわめて重要となる。骨粗鬆症を予防する療法は存在するものの、これらの療法では骨形成を改善または増強する能力は限られている。したがって、骨形成を刺激することにより骨量に正の影響を及ぼす薬剤に大きな関心が持たれている。
【発明の概要】
【０００７】
一態様において、本発明は骨細胞中のＲｈｏタンパク質を調整する方法であることを特徴とする。この方法は骨細胞とＲｈｏタンパク質の発現または活性レベルを調節するＲｈｏアンタゴニストとを接触させることを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である。他の実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である。たとえば、この複合体はＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である。さらに他の実施形態では、この複合体は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、骨細胞は骨再形成細胞、たとえば骨芽細胞または骨芽前駆細胞である。他の実施形態では、骨再形成細胞は破骨細胞または破骨前駆細胞である。
【００１０】
別の態様では、本発明は対象の骨形成を促進または刺激する方法であることを特徴とし、この方法は治療有効量のＲｈｏアンタゴニストを対象に投与し、それによって対象の骨形成を促進または刺激することを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である。他の実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である。たとえば、この複合体はＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である。さらに他の実施形態では、この複合体は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重、たとえば、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｎｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１μｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約１ｎＭから１Ｍ、たとえば、約１μＭから１００ｍＭ、約０．１ｍＭから約１００ｍＭ、約０．１ｍＭから約１０ｍＭ、または約０．１ｍＭから２ｍＭの濃度で投与される。いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、または約５００ｍＭの濃度で投与される。
【００１３】
他の実施形態では、この方法はＲｈｏアンタゴニストを１つ以上の追加薬剤、たとえば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦｓ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦｓ）、骨形成タンパク質、オステオゲニン（osteogenin）、ＮａＦ、エストロゲン、ビスフォスフォネート、および／またはカルシトニンと組み合わせて投与することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、対象は骨損傷を有する。ある実施形態では、骨損傷は骨折である。他の実施形態では、骨損傷は脊柱損傷である。さらに他の実施形態では、骨損傷は転移性の腫瘍から起こる骨量減少である。
【００１５】
別の態様では、本発明は対象の骨損傷の治療法であることを特徴とし、この方法は治療有効量のＲｈｏアンタゴニストを対象に投与し、それによって対象の骨損傷を治療することを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である。他の実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である。たとえば、この複合体はＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である。さらに他の実施形態では、この複合体は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重、たとえば、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｎｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１μｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約１ｎＭから１Ｍ、たとえば、約１μＭから１００ｍＭ、約０．１ｍＭから約１００ｍＭ、約０．１ｍＭから約１０ｍＭ、または約０．１ｍＭから約２ｍＭの濃度で投与される。いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、または約５００ｍＭの濃度で投与される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、骨損傷は骨折である。他の実施形態では、骨損傷は脊柱損傷である。さらに他の実施形態では、骨損傷は転移性の腫瘍から起こる骨量減少である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは骨損傷の部位に局所的に投与される。いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは組織シーラント、たとえば、フィブリンシーラントを用いて局所的に投与される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．００１μｇ／ｃｍ3組織から約５０μｇ／ｃｍ3組織の用量で投与される。他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．０００１μｇ／ｃｍ3組織から約１００μｇ／ｃｍ3組織の用量で投与される。さらに他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約１μｇ／ｃｍ3組織から約１０μｇ／ｃｍ3組織の用量で投与される。さらに他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約５０μｇ／ｃｍ3組織の用量で投与される。
【００２１】
ある実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストはフィブリンシーラント中に約１μｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、フィブリンシーラントはＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）である。さらに他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは薬剤溶出医療装置を用いて骨組織に直接投与される。
【００２２】
他の実施形態では、この方法はＲｈｏアンタゴニストを１つ以上の追加薬剤、たとえば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦｓ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦｓ）、骨形成タンパク質、オステオゲニン、ＮａＦ、エストロゲン、ビスフォスフォネート、および／またはカルシトニンと組み合わせて投与することを含む。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は骨芽前駆細胞を刺激して骨芽細胞に分化させる方法であることを特徴とし、この方法は骨芽前駆細胞とＲｈｏアンタゴニストとを接触させ、それによって前駆細胞の分化を刺激することを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である。他の実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である。たとえば、この複合体はＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である。さらに他の実施形態では、この複合体は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
別の態様では、本発明は対象の骨吸収を阻害する方法であることを特徴とし、この方法はＲｈｏアンタゴニストを対象に投与し、それによって骨吸収を阻害することを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である。他の実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である。たとえば、この複合体はＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である。さらに他の実施形態では、この複合体は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重、たとえば、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｎｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１μｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約１ｎＭから１Ｍ、たとえば、約１μＭから１００ｍＭ、約０．１ｍＭから約１００ｍＭ、約０．１ｍＭから約１０ｍＭ、または約０．１ｍＭから約２ｍＭの濃度で投与される。いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、または約５００ｍＭの濃度で投与される。
【００２８】
他の実施形態では、この方法はＲｈｏアンタゴニストを１つ以上の追加薬剤、たとえば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦｓ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦｓ）、骨形成タンパク質、オステオゲニン、ＮａＦ、エストロゲン、ビスフォスフォネート、および／またはカルシトニンと組み合わせて投与することを含む。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は対象の骨損傷の治療法であることを特徴とし、この方法は骨芽前駆細胞を得るステップ；前駆細胞をＲｈｏアンタゴニストと接触させ、それによって前駆細胞の骨芽細胞への分化を刺激するステップ；および骨芽細胞を対象に移植するステップを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である。他の実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である。たとえば、この複合体はＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である。さらに他の実施形態では、この複合体は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重、たとえば、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｎｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１μｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約１ｎＭから１Ｍ、たとえば、約１μＭから１００ｍＭ、約０．１ｍＭから約１００ｍＭ、約０．１ｍＭから約１０ｍＭ、または約０．１ｍＭから約２ｍＭの濃度で投与される。いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、または約５００ｍＭの濃度で投与される。
【００３２】
別の態様では、本発明は対象の軟骨細胞分化を促進または刺激する方法であることを特徴とし、この方法は治療有効量のＲｈｏアンタゴニストを対象に投与し、それによって対象の軟骨細胞分化を促進または刺激することを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片である。他の実施形態では、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合体である。たとえば、この複合体はＣ３ポリペプチド、Ｃ３様ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む融合タンパク質である。さらに他の実施形態では、この複合体は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重、たとえば、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｎｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０１μｇ／ｋｇ体重から約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約１ｎＭから１Ｍ、たとえば、約１μＭから１００ｍＭ、約０．１ｍＭから約１００ｍＭ、約０．１ｍＭから約１０ｍＭ、または約０．１ｍＭから約２ｍＭの濃度で投与される。いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、または約５００ｍＭの濃度で投与される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、対象は軟骨再生を必要としている。たとえば、対象は軟骨異形成症などの軟骨に関連する障害、または外傷またはたとえば関節リウマチまたは変形性関節症などの疾患により損傷した軟骨を有する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．００１μｇ／ｃｍ3組織から約５０μｇ／ｃｍ3組織の用量で投与される。他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約０．０００１μｇ／ｃｍ3組織から約１００μｇ／ｃｍ3組織の用量で投与される。さらに他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約１μｇ／ｃｍ3組織から約１０μｇ／ｃｍ3組織の用量で投与される。さらに他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは約５０μｇ／ｃｍ3組織の用量で投与される。
【００３７】
ある実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストはフィブリンシーラント中約１μｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、フィブリンシーラントはＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）である。さらに他の実施形態では、Ｒｈｏアンタゴニストは薬剤溶出医療装置を用いて骨組織に直接投与される。
【００３８】
別の態様では、本発明は本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストおよびＲｈｏアンタゴニストを骨障害、たとえば本明細書記載の骨障害の治療に用いるための指示を含むキットであることを特徴とする。いくつかの実施形態では、このキットは骨障害治療用の追加の治療薬を含む。
【００３９】
別の態様では、本発明は本明細書記載の骨障害を治療する薬物の製造におけるＲｈｏアンタゴニストの使用であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、この薬物は骨障害治療用の追加の治療薬を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
本発明の前述および他の目的、本発明の様々な特徴、および本発明それ自体は、以下の説明を添付図面と合わせて読むとより完全に理解できるであろう。
【００４１】
【図１】図１は、対照または種々濃度のＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）で処理した後の、ラット胎児頭蓋冠由来骨芽細胞の初代培養物によるチミジン取り込みをグラフで表したものである。
【図２Ａ】図２Ａは、対照または種々濃度のＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）で処理した後の、ラット胎児頭蓋冠由来骨芽細胞の初代培養物の顕微鏡写真を表したものである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、対照または種々濃度のクエン酸緩衝液で処理した後の、ラット胎児頭蓋冠由来骨芽細胞の初代培養物の顕微鏡写真を表したものである。
【図３】図３は、対照または種々濃度のＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）で処理した後の、ＭＣＴ３Ｔ−Ｅ１骨芽細胞様培養物によるチミジン取り込みをグラフで表したものである。
【図４】図４は、対照または種々濃度のＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）で処理した後の、活発に増殖しているラット胎児頭蓋冠由来骨芽細胞の初代培養物によるチミジン取り込みをグラフで表したものである。
【図５Ａ】図５Ａは、対照または種々濃度のＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）で処理した後の、活発に増殖しているラット胎児頭蓋冠由来骨芽細胞の初代培養物の顕微鏡写真を表したものである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、対照または種々濃度のクエン酸緩衝液で処理した後の、活発に増殖しているラット胎児頭蓋冠由来骨芽細胞の初代培養物の顕微鏡写真を表したものである。
【図６】図６は、対照または種々濃度のＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）および種々量のＦＣＳで処理した後の、ラット胎児頭蓋冠由来骨芽細胞の初代培養物によるチミジン取り込みをグラフで表したものである。
【図７】図７は、対照または種々濃度のＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）で処理した後の、マウス骨髄培養物から生じた破骨細胞の数をグラフで表したものである。
【図８】図８は、対照または種々濃度のＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）で処理した後の、マウス骨髄培養物の顕微鏡写真を表したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本明細書に言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図しない。別に定義しない限り、本明細書において用いられるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書記載のものと類似または同等の方法および材料が本発明の実施または試験に使用可能であるが、適切な方法および材料を以下に記載する。
【００４３】
本発明はＲｈｏアンタゴニストを用いた骨障害の治療に関する。
【００４４】
（定義）
便宜的に、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語がここに収集される。別に定義しない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技能を有する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における語群もしくは用語に与えられる最初の定義は、特に断りがない限り、本明細書を通じて個別にまたは他の語群の一部として、その語群もしくは用語に対して適用される。
【００４５】
本明細書で「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」の冠詞は、１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）のその冠詞がついた目的語を指すために用いる。例として、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００４６】
本明細書で「または（ｏｒ）」という用語は、文脈上明白な断りがない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語を意味し、同義的に用いられる。
【００４７】
本明細書で「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、与えられた数値の−または＋２０％の値を意味するために用いられる。したがって、「約６０％」は６０−（６０の２０％）と６０＋（６０の２０％）（すなわち、４８から７０の間）の値を意味する。
【００４８】
本明細書で「単離された」という用語は、自然に存在する状態を超えて精製された状態を意味するために用いられる。たとえば、単離された化合物は実質的に細胞物質もしくはその化合物が由来した細胞からの他の混入物質を含まない、または化学合成された時に実質的に化学的前駆体もしくは他の化学物質を含まない状態でありえる。いくつかの実施形態では、細胞からの混入物質、または化学的前駆体を約５０％未満（乾燥重量にて）有する化合物の調製物は、実質的に純粋であるとみなされる。他の実施形態では、細胞からの混入物質、または化学的前駆体を約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約１％（乾燥重量にて）未満有する化合物の調製物は、実質的に純粋であるとみなされる。
【００４９】
本明細書で用いられる「Ｒｈｏアンタゴニスト」という用語は、直接的または間接的にＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性を阻害する、および／またはＲｈｏ  ＧＴＰアーゼポリペプチドの発現レベルを減少させる薬剤を意味する。
【００５０】
本明細書で用いられる「Ｃ３ポリペプチド」という用語は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼＣ３ポリペプチドを指す。細胞外酵素Ｃ３トランスフェラーゼは、選択的にＲｈｏをリボシル化して不活性にするＡＤＰリボシルトランスフェラーゼである。このようなＣ３ポリペプチドは当技術分野において知られており、たとえばボツリヌス菌（Clostridium Botulinum）、クロストリジウム・リモサム（Clostridium limosum）、セレウス菌（Bacillus cereus）または黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のＣ３ポリペプチドを含む。「Ｃ３ポリペプチド」という用語は、組み換え型のＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼＣ３ポリペプチドもまた含む。
【００５１】
本明細書で用いられる「Ｃ３様ポリペプチド」という用語は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼＣ３ポリペプチドに類似（たとえば実質的に類似または同一）の生物活性を有する任意のポリペプチドを指す。「Ｃ３様ポリペプチド」は、ＲｈｏをＡＤＰ−リボシル化する能力を保持したＣ３ポリペプチドの類縁体および誘導体を含む。通常は、この用語は天然のＣ３ポリペプチド配列および構造を有し、Ｃ３様ポリペプチドがＣ３ポリペプチドの活性、たとえばＡＤＰ−リボシル化活性を保持する限りで、天然ポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸が付加、置換および／または欠失したポリペプチドを指す。Ｃ３様ポリペプチドは変異Ｃ３ポリヌクレオチド配列から作製できる。Ｃ３様ポリペプチドの例は、たとえば米国特許出願第１１／６４３，９４０号および同第１１／８０８，７３３号記載のものを含む。
【００５２】
本明細書で「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同義的に用いられる。
【００５３】
本明細書で用いられる「複合体」という用語は、異種ポリペプチドに化学的に結合した第一のポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）、または異種ポリペプチドに融合した第一のポリペプチド（またはその生物学的に活性な断片）（たとえば融合タンパク質）を含むＲｈｏアンタゴニストを意味する。
【００５４】
本明細書で用いられる「異種ポリペプチド」という用語は、第一のポリペプチドとは異なるポリペプチドである。
【００５５】
「骨細胞」という用語は、骨の形成、維持および恒常性、再形成、および構造健全性に関与する細胞を指す。骨細胞の例は、限定されないが、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞（osteocyte、 すなわち休眠状態の骨芽細胞）、および骨芽前駆細胞を含む。
【００５６】
「骨再形成」という用語は、コラーゲンおよびカルシウム塩の基質である類骨の形成、維持および恒常性、再形成、および構造の健全性を含み、第一に骨吸収（破骨細胞活性）、および第二にそれに反応した骨形成（骨芽細胞活性）に関する。「骨再形成」という用語は、通常の骨の恒常性維持および様々なストレス、外傷、損傷、および骨疾患（たとえば骨折、骨移植、歯周のびらん（periodontal erosion）に対応した骨の産生を指してもよい。
【００５７】
「骨再形成細胞」という用語は、コラーゲンおよびカルシウム塩の基質である類骨の形成、維持および恒常性、再形成、および構造の健全性に関与する細胞を指し、第一に骨吸収、および第二にそれに反応した骨形成に関する。骨再形成細胞の例は、限定されないが、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、および骨芽前駆細胞を含む。
【００５８】
「骨障害」もしくは「骨格障害」という用語は、骨格系の発達および／または構造に影響する任意の状態を指す。骨障害には、骨形成と骨吸収の比率の不均衡を生じ、たとえば、もし是正されなければ、対象は望ましい量よりも少ない骨量を示すか、もしくは対象の骨が望ましい状態よりも不完全および稠密でなくなるかもしれない任意の障害を含めることができる。骨障害は骨の障害、疾患、たとえば骨折、骨粗鬆症、変形性関節症などの状態または外傷、または癌を指すこともある。たとえば、骨障害は骨折、外科的処置、または歯科もしくは歯周疾患に起因することもある。これらの疾病は当技術分野において公知の様々な原因および症状を有する。骨障害は新生児から高齢の成人までいかなる年代の人にも発症しうる。しかし、ある年齢群ではある種の疾病により罹患しやすい。
【００５９】
本明細書で用いられる「前駆細胞」という用語は、分化することになっているが、通常は成熟して完全に分化した細胞としての標識または機能を発現しない細胞を指す。
【００６０】
「薬学的有効量」または「治療有効量」という用語は、本明細書記載の障害または状態を有する患者の治療に効果的な量（たとえば投与量）を指す。本明細書中では、「薬学的有効量」は、一回の投与量または任意の用量もしくは経路での摂取、単独または他の治療薬と組み合わせての摂取のいずれかで、望ましい治療効果を与える量と解釈することができるということもまた理解されるべきである。たとえば、「薬学的有効量」はＲｈｏアンタゴニスト、たとえばＣ３もしくはＣ３様ポリペプチドが、たとえばＲｈｏ活性、たとえばＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性を阻害しうる量と理解することができる。
【００６１】
本明細書で用いられる「治療」または「治療すること」という用語は、統計的に有意な程度もしくは当業者に認められる程度のいずれかで、状態、症状、または障害もしくは状態に関連する数値を効果的に改善する、または障害もしくは状態の進行を効果的に防止もしくは抑制する量、方法、および／または様式で療法を施すことを指す。効果的な量、方法、または様式は対象によって変動可能で、また対象にあわせて調整してもよい。
【００６２】
本明細書で用いられる「対象」という用語は、治療を必要とする対象を意味する。たとえば、対象は哺乳類、たとえばヒトまたは非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、もしくはシカであってよい。
【００６３】
（Ｒｈｏアンタゴニスト）
本明細書記載の方法は、投与などのＲｈｏアンタゴニストの使用に関する。Ｒｈｏアンタゴニストは低分子、タンパク質（たとえば抗体）、ペプチド、核酸、アプタマー、ｓｉ（低分子干渉）ＲＮＡ、またはＲｈｏファミリーのメンバーに結合してＲｈｏのシグナル経路を不活性化するか、またはＲｈｏファミリーのメンバーの発現を抑制する任意の薬剤であってよい。
【００６４】
低分子量ＧＴＰアーゼであるＲｈｏファミリーは、少なくとも２６個の異なるタンパク質（たとえばＢｕｓｔｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２９：３５６−３７０，  ２００７を参照されたい）をコードするヒトの２３個の遺伝子を含む。Ｒｈｏファミリーは、限定されないが、ｒｈｏ、ｒａｃ、ｃｄｃ４２のほかＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、およびＲｈｏＣといったアイソタイプを含む。Ｒｈｏファミリーのメンバーはよく特性化されている（たとえばＴａｋｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ８１：１５３−２０８，  ２００１；Ｂｉｓｈｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３４８：２４１−２５５，  ２０００；Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６３：５４−１０５，  １９９９；Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１７：１３０１−１３１２，  ２００４；Ｂｕｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１６：１６７−１７９，  ２００４を参照）；またこれらの配列も公知である（たとえばＣｈａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：２７１７，  １９８８；Ｙｅｒａｍｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：１８６９，  １９８７を参照されたい）。
【００６５】
場合によっては、ＲｈｏアンタゴニストはＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性を調節するために使用される。Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの活性を調節するＲｈｏアンタゴニストの量は当技術分野において知られた標準的な分析で測定できる（たとえば、Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉａｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ６：４０９−４１８（２００３）を参照されたい）。
【００６６】
（細菌タンパク質のアンタゴニスト）
本明細書記載の方法で有用なＲｈｏアンタゴニストは、限定されないが、Ｒｈｏ阻害で知られる細菌タンパク質を含む。たとえば、Ｃ３トランスフェラーゼである細菌のＡＤＰリボシルトランスフェラーゼはＲｈｏをリボシル化して不活性化させる（たとえば、Ｔｏｍｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２５６：２９０−２９７，  １９９５；Ｂｏｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２５６：２９７−３０６，  １９９５；Ｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２５６：  ３２０−３２７，  １９９５；Ｓｔａｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２５６：３２７−３３６，  １９９５を参照されたい）。Ｃ３ポリペプチドはボツリヌス菌、クロストリジウム・リモサム、セレウス菌または黄色ブドウ球菌由来のＣ３ポリペプチドを含む。任意の公知のＣ３ポリペプチドを本明細書記載の方法で使用できる。同様に、トキシンＡおよびＢなどのＲｈｏ阻害活性に関連する他の細菌毒素も本明細書記載の方法でＲｈｏアンタゴニストとして使用できる。
【００６７】
場合によっては、Ｒｈｏアンタゴニストは、たとえばＣ３ポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な断片、Ｃ３様ポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な断片、およびＣ３もしくはＣ３様ポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な断片を含む複合タンパク質（たとえばＣ３ポリペプチドの融合タンパク質）を含む。
【００６８】
たとえば、限定するものではないがいくつかの場合には、ＲｈｏアンタゴニストはＣ３もしくはＣ３様ポリペプチド（またはそれらの生物学的に活性な断片）と異種ポリペプチドとを含む複合体である。いくつかの例では、異種ポリペプチドは複合体の細胞取り込みを促進する輸送剤である。典型的な複合体は、米国特許出願第１１／６４３，９４０号および同第１１／８０８，７３３号に記載されているが、これらに限定されない。
【００６９】
限定するものではないが他の典型的な複合体はＢＡ−２１０（Ｃ３−１１）融合タンパク質であり、米国特許出願第１１／６４３，９４０号および同第１１／８０８，７３３号の配列番号１０として記載されている。ＢＡ−２１０は２３２個のアミノ酸で構成され、理論分子量は２５，８５８ダルトンで、理論等電点（ｐＩ）は９．６である。ＢＡ−２１０はＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）（ＢｉｏＡｘｏｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｎｔｒｅａｌ，  Ｃａｎａｄａ）の医薬有効成分であり、プロリンに富むペプチド性輸送配列（ｐｅｐｔｉｄｉｃ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のＣ３細胞外酵素配列への付加を通じて部分的に操作されている（Ｗｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：３２８２０−３２８２９，  ２００２を参照されたい）。ＢＡ−２１０の様々な類縁体および誘導体もまた本明細書記載の方法において有用である。
【００７０】
（アンチセンスとリボザイム）
本明細書記載の方法で有用な他のＲｈｏアンタゴニストは核酸アンタゴニストで、ＲｈｏファミリーのメンバーをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンス分子もしくは触媒核酸分子（たとえばリボザイム）を含む。アンチセンス構造は、ＲｈｏファミリーのメンバーをコードするｃＤＮＡコード配列もしくはｍＲＮＡの少なくとも一部の逆相補鎖、ＲｈｏファミリーのメンバーのｃＤＮＡ、または遺伝子配列もしくはその隣接領域を含み、したがってｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。
【００７１】
導入された配列は完全長のｃＤＮＡまたは遺伝子またはそれらの逆相補鎖である必要はなく、形質転換される細胞タイプ内に見られる対応する配列と完全に相同である必要もない。アンチセンス分子は当技術分野において既知の技術を利用して作成できる（たとえばＡｇｒａｗａｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  １９９３，  Ｖｏｌ．  ２０（“Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ”）を参照されたい）。
【００７２】
アンチセンス分子は、たとえばペプチド、ハイブリダイゼーションに誘発される架橋剤、輸送剤、アプタマー、またはハイブリダイゼーションに誘発される開裂剤などの他の分子と複合していてもよい。また、たとえば骨細胞などの細胞による分子の取り込みを増進する標的部分もまた含んでもよい。標的部分は、たとえば骨細胞などの細胞表面に存在する分子を認識する抗体もしくはその断片などの、特定の結合分子であってよい。
【００７３】
あるいは、Ｒｈｏアンタゴニストはリボザイム（高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有する合成ＲＮＡ分子）のような、触媒作用を有する核酸である。リボザイムの製造と使用については、たとえば米国特許第４，９８７，０７１号および米国特許第５，５４３，５０８号で開示されている。リボザイムは合成でき、細胞および対象に投与でき、または標的細胞内でリボザイムを合成させるための発現ベクターにコードできる（たとえば、国際公開公報第９５２３２２５号、およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：４４３４−４２，  １９９５を参照されたい）。触媒活性を有するオリゴヌクレオチドの例は、たとえば国際公開公報第９５０６７６４号および国際公開公報第９０１１３６４号、およびＳａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５，  １９９０に記載されている。アンチセンスＲＮＡ中にリボザイム配列を含めることは、たとえば、アンチセンスＲＮＡに結合した内因性ｍＲＮＡ分子が開裂し、次に増強された内因性遺伝子発現のアンチセンス阻害につながるＲＮＡ開裂活性をアンチセンスＲＮＡに与えるために利用できる。
【００７４】
（ＲＮＡ干渉）
Ｒｈｏファミリーのメンバーをコードする遺伝子の発現を抑制する二本鎖核酸分子は、Ｒｈｏアンタゴニストとして利用できる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、目的の遺伝子（または翻訳領域）に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞または生体内に導入し、その結果対応するｍＲＮＡの分解を引き起こす転写後遺伝子サイレンシング機構である。ＲＮＡ干渉の効果は、遺伝子発現が回復する前の複数回の細胞分裂にわたって持続する。すなわちＲＮＡｉはＲＮＡレベルでの標的ノックアウトまたは「ノックダウン」を行うのに効果的な方法である。ＲＮＡｉはヒト胎児由来腎臓細胞およびＨｅＬａ細胞を含むヒト細胞内で成功することが証明されている（たとえば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８，２００１を参照されたい）。たとえば、遺伝子サイレンシングはヘアピン型ＲＮＡの内因性発現により、哺乳類細胞内で誘導することができる（Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）  ９９：１４４３−１４４８，  ２００２を参照されたい）。他の場合では、小さい（２１−２３ヌクレオチド（ｎｔ））ｄｓＲＮＡの形質移入は特異的に遺伝子発現を阻害する（Ｃａｐｌｅｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：４９−５１，  ２００２で概説）。
【００７５】
簡潔にいえば、ＲＮＡｉは次のように作用すると考えられる。抑制される遺伝子の一部に対応するｍｉＲＮＡ、プレ−ｍｉＲＮＡ（pre-miRNA）、プリ−ｍｉＲＮＡ（pri-miRNA）またはｄｓＲＮＡが細胞内に導入される。ｄｓＲＮＡは消化されて２１から２３個のヌクレオチドであるｓｉＲＮＡ、すなわち低分子干渉ＲＮＡになる。二本鎖のｓｉＲＮＡはヌクレアーゼ複合体と結合し、この結合体はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体、すなわちＲＩＳＣとして知られている。ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ鎖の一本と内因性ｍＲＮＡとの間の塩基対形成相互作用により相同的転写を標的とする。次にＲＩＳＣはｍＲＮＡをｓｉＲＮＡの３’末端側から約１２ヌクレオチドで開裂する（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １５：４８５−４９０，  ２００１；およびＨａｍＭｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎ．  ２：１１０−１１９，  ２００１で概説）。
【００７６】
遺伝子サイレンシングにおけるＲＮＡｉ技術は標準的な分子生物学の方法を使用する。不活性化される標的遺伝子由来の配列に対応するｄｓＲＮＡは標準的な方法、たとえばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用した鋳型ＤＮＡ（標的配列に対応する）の両方の鎖の同時転写で作成できる。ＲＮＡｉで使用するｄｓＲＮＡの作成キットは、たとえばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．から市販されている。ｄｓＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡを産生するように操作されたプラスミドの形質移入の方法は当技術分野において慣用である。
【００７７】
ＲＮＡｉの効果に類似した遺伝子サイレンシング効果が、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッド構築物を形質移入した哺乳類細胞において報告されており（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  ＣｏｍＭｕｎ．  ２８１：６３９−６４４，  ２００１を参照されたい）、遺伝子サイレンシングの他の方法として利用できる。治療におけるＲＮＡｉの適用は、たとえばＳｈｕｅｙ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  ７：１０４０−１０４６，  ２００２に記載されている。
【００７８】
（アプタマー）
場合によっては、ＲｈｏアンタゴニストはＲｈｏファミリーのメンバーを標的とするアプタマーである。アプタマーはタンパク質リガンドに特異的に結合可能な三次構造を有する核酸分子である（たとえば、Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １：５−９，  １９９７；およびＰａｔｅｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １：３２−４６，  １９９７を参照されたい）。アプタマーはｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと複合体を作ることもできる（国際公開第２００７／１４３０８６号を参照されたい）。
【００７９】
Ｒｈｏを標的とするアプタマーは、選択された標的に結合するランダムに生成された核酸配列に対する、インビトロにおける自然選択様式を用いて作られてもよい。この方法は「ＳＥＬＥＸ」（すなわちＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と名付けられている。ＳＥＬＥＸ法（以下、ＳＥＬＥＸとする）および関連する応用は、たとえば米国特許第５，４７５，０９６号、米国特許第６，０８３，６９６号、米国特許第６，４４１，１５８号および米国特許第６，４５８，５５９号に記載されている。ＳＥＬＥＸ工程は核酸リガンドと呼ばれる部類の生産物を供給し、これらのリガンドは特異配列を有し、標的化合物または分子に特異的に結合する性質を持つ。ＳＥＬＥＸで識別されたそれぞれの核酸分子リガンドは、与えられた標的化合物または分子に特異的なリガンドである。ＳＥＬＥＸは、核酸は各種の二次元および三次元構造を取れる十分な能力を持ち、単量体であろうと重合体であろうと実質的に任意の化合物に対してリガンドとして作用する（特異的に結合する対を構成する）のに十分な化学的万能性が核酸の単量体には存在するという見識に基づいている。
【００８０】
簡潔にいえば、ＳＥＬＥＸ法は、候補化合物の混合物からの選抜、並びに結合、分別、および増幅の段階を追っての反復を含み、同じ普遍的な選抜主眼を用いて実質的に任意の望ましい結合親和性および選択性の基準を達成する。この方法は、好ましくはランダム化配列の切片を含む核酸の混合物から開始して、結合に適した条件下で核酸混合物と標的とを接触させ、標的分子に結合した核酸を未結合の核酸から分別し、核酸と標的の対を分離させ、核酸と標的の対から分離した核酸を増幅してリガンドが豊富な核酸混合物を得て、その後結合、分別、分離、増幅の段階を所望の周回数で反復する。貯留された核酸中から混合物中の大部分の核酸よりも標的に対する高い親和性を有する構成要素を分別するには様々な技法が利用できる。
【００８１】
一方で理論に拘束されることなく、ＳＥＬＥＸは、候補となりうる多数の配列および構造物を含む核酸混合物中には、与えられた標的に対する広範囲の結合親和性が存在するという知見に基づく。たとえば、２０ヌクレオチドからなるランダム化切片を含む核酸混合物は可能性のある候補を４２０個有しうる。標的に対してより高い親和性定数を持つ候補がもっとも標的に結合しやすい。分別、分離および増幅工程の後、より高い結合親和性を有する候補に富む第二の核酸混合物が生成される。追加の一連の選別工程は、結果として得る核酸混合物が主に一種のみ、または数種の配列から構成されるまで、最適なリガンドを累進的に優先していく。これらの候補は純粋なリガンドとしてクローン化し、配列を決定し、個別に親和性を試験することができる。
【００８２】
選別、分別、および増幅のサイクルは望ましい目標に達するまで繰り返される。一般的な大部分の例では、選別、分別、および増幅は、サイクルの反復中に結合強度の著しい改善が見られなくなるまで繰り返される。この方法では、約１０１８個までの異なる核酸種を試料として使用しうる。試験混合物中の核酸は効率的な増幅に必要となる保存配列に加えて、好ましくはランダム化配列部分を含む。核酸配列の変異体は、ランダム化核酸配列の合成およびランダムに開裂させた細胞核酸からのサイズ選択を含む、いくつかの方法で生産できる。可変配列部分は全部または一部にランダム化配列を含んでいてもよい；また可変配列部分はランダム化配列に取り込まれた保存配列のサブ部分（subportions）を含んでいてもよい。試験核酸中の配列変異は選別、分別および増幅の反復前または最中の突然変異誘発により導入または増加させることもできる。
【００８３】
基本のＳＥＬＥＸ法は特定の目的を達成するために変更されてもよい。たとえば、米国特許第５，７０７，７９６号は湾曲ＤＮＡなどの特異な構造特性を有する核酸分子を選別するためのゲル電気泳動と併用したＳＥＬＥＸ使用方法を記載する。米国特許第５，７６３，１７７号では、標的分子を結合および／または光架橋および／または光不活性化できる光反応基を含む核酸リガンドを選別するためのＳＥＬＥＸを基礎とした方法を記載する。米国特許第５，５８０，７３７号は、近縁種である分子をそれぞれ識別できる高度に特異的な核酸リガンドを同定する、「カウンターＳＥＬＥＸ」と名付けられた方法を記載する。米国特許第５，５６７，５８８号は、標的分子に対して高度および低度の親和性を有するオリゴヌクレオチド間で効率の高い選別を達成できる、ＳＥＬＥＸを基礎とする方法を記載する。
【００８４】
ＳＥＬＥＸ法はインビボでの安定性または輸送性の改善など、改善された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような
修飾の例はリボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置の化学的置換を含む。修飾ヌクレオチドを含み、ＳＥＬＥＸで同定される特定の核酸リガンドは、たとえば米国特許第５，６６０，９８５号に記載され、この特許はピリミジンの５位および２’位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド、および２’位のアミノ修飾を含む、トロンビンに対する特定のＲＮＡリガンドを記載する。２’位のアミノ（２’−ＮＨ2）、２’位のフルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’位のＯ−メチル（２’−ＯＭｅ）が修飾された１つ以上のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドもまた含まれる。
【００８５】
（ドミナントネガティブ変異体）
場合によっては、本明細書記載の方法で有用なＲｈｏアンタゴニストはＲｈｏファミリーのメンバーのドミナントネガティブ変異体である。一般に、ドミナントネガティブタンパク質は天然タンパク質の変異体または他の変性を受けた誘導体で、天然タンパク質の機能を妨害する能力を有する。ドミナントネガティブなＲｈｏアンタゴニストは、変異Ｒｈｏファミリー遺伝子、および／または野生型のＲｈｏファミリータンパク質活性を欠損しているが、野生型のタンパク質とともに発現した時に、野生型のＲｈｏファミリータンパク質活性を阻害するコード化された変異Ｒｈｏファミリータンパク質を指す。
【００８６】
Ｒｈｏファミリータンパク質のドミナントネガティブ型は当技術分野において公知であり、限定されないが、ＲｈｏＡ（Ｎ１９）（たとえば、Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：６４４３−６４５３，  １９９５を参照されたい）；ＲｈｏＢ（Ｎ１９）（たとえば、Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０：２２８９−２２９６，  １９９５を参照されたい）；およびＲａｃｌ（Ｎ１７）（たとえば、Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：６４４３−６４５３，  １９９５；およびＱｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：４５７−４５９，  １９９５を参照されたい）を含む。他のＲｈｏアンタゴニストは変異エフェクタードメインＡ−３７を有し、ＧＴＰ交換を阻害するＲｈｏである。
【００８７】
他のＲｈｏアンタゴニストは、細胞外ドメインを取り込んだＲｈｏファミリーのメンバーの断片を含み、このタンパク質断片は細胞外ドメインそれ自体、および他のＮ末端および／またはＣ末端が切断されたＲｈｏファミリーのメンバーの断片、またはアミノ酸たとえば１から１０個のアミノ酸が特に保存的に置換された細胞外ドメインならびにその類縁体、およびＮ末端および／もしくはＣ末端残基が化学的な安定化基で誘導体化されたＲｈｏファミリーのメンバーまたはＲｈｏファミリーのメンバーの断片の誘導体を含む。Ｒｈｏファミリーの断片は、ペプチド合成、もしくは切断されたＲｈｏタンパク質または後にランダムまたは部位選択的な様式で酵素消化される無処理のＲｈｏタンパク質のいずれかの組み換えＤＮＡの発現（標準的な組み換え手順を用いる）のいずれかで生産できる。ＲｈｏファミリーのメンバーまたはＲｈｏファミリーのメンバーの断片の類縁体も、組み換えＤＮＡ技法、またはペプチド合成によって生成でき、１つ以上、たとえば１から５個の、Ｌ型またはＤ型アミノ酸置換を取り込める。Ｒｈｏファミリーのメンバー、Ｒｈｏファミリーのメンバーの断片およびＲｈｏファミリーのメンバーの類縁体の誘導体は、構造内の物質または標的アミノ酸を遮蔽または安定化する効果を有する、Ｎ末端、Ｃ末端、および内部残基を修飾する基など所望の誘導体化基を取り込むことで、Ｒｈｏタンパク質の化学反応により生成できる。
【００８８】
Ｒｈｏファミリーの誘導体、類縁体、および断片は当技術分野において公知のさまざまな方法で生産できる。これらを生産する操作は遺伝子またはタンパク質レベルで行える。たとえば、ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼによる適切な部位での切断、所望であれば酵素修飾、単離、およびインビトロにおける結合による方法など、当技術分野において公知である多数の戦略（たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ，  １９８２を参照されたい）のいずれでも修飾できる。
【００８９】
（抗体アンタゴニスト）
本明細書記載の方法で使用できるＲｈｏアンタゴニストは、Ｒｈｏファミリータンパク質に対するアンタゴニスト抗体もまた含む。アンタゴニスト抗体は、たとえば、ポリクローナル抗体；モノクローナル抗体またはその抗原結合断片；キメラ抗体、再構成抗体、ヒト化抗体などの修飾抗体またはそれらの断片（たとえばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2）；または生合成抗体、たとえば、単鎖抗体、シングルドメイン抗体（ＤＡＢ）、可変領域フラグメント、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）などでもよい。
【００９０】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を製造および使用する方法は、たとえばＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｉ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １，  １９９８）に記載されている。修飾抗体および抗体断片、たとえば、キメラ抗体、再構成抗体、ヒト化抗体またはそれらの断片（たとえばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2断片）；または生合成抗体、たとえば、単鎖抗体、シングルドメイン抗体（ＤＡＢ）、可変領域フラグメント、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）などを製造する方法は当技術分野において公知であり、たとえば、Ｚｏｌａ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １５，  ２０００；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）などに見られる。
【００９１】
（低分子アンタゴニスト）
Ｒｈｏファミリーのメンバーの活性を阻害する低分子は、本明細書記載の方法においてＲｈｏアンタゴニストとして利用できる。これらの低分子は当技術分野において公知であり、限定されないが、ＣＣＧ−１４２３（たとえば、Ｅｖｅｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ６：２２４９−２２６０，  ２００７を参照されたい）を含む。他の低分子アンタゴニストはたとえば、Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  ６：４０９−４１８，  ２００３に記載されたような慣用法を使用して同定できる。
【００９２】
（障害および損傷におけるＲｈｏアンタゴニストの使用）
本明細書記載のある方法では、Ｒｈｏアンタゴニストは骨障害または損傷の治療、または予防のために使用される。骨障害または損傷の例は、限定されないが、骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症、閉経期の骨量減少、骨減少症、骨形成不全症、骨軟骨腫、骨腫瘍、骨巨細胞腫、類骨骨腫、骨肉腫、骨壊死、骨棘、頭蓋骨癒合症、内軟骨腫、線維性骨異形成、感染性関節炎、クリッペル・フェイユ症候群、四肢長の不均衡、骨炎、硬化性腸骨炎、離断性骨軟骨症、骨髄炎、大理石骨病、腎性骨ジストロフィ、骨嚢胞、単房性骨嚢胞、頭蓋骨癒合症、脊柱側彎症、骨溶解、骨軟化症、骨膜炎、骨切断、骨折、骨移植、変性関節疾患、変形性関節症、骨形成不全症、関節炎、続発性変形性関節症、ぺージェット病、フライバーグ病、ケーラー病、およびくる病を含む。
【００９３】
場合によっては、骨折は完全な破砕、たとえば、骨片が完全に分離した破砕である。他の場合、骨折は不完全な破砕、たとえば、骨片が一部でまだ接合している破砕である。さらなる骨折のタイプは、限定されないが、線状骨折、たとえば、骨の長軸に平行な骨折；横骨折、たとえば、骨の長軸に対して直角な骨折；斜骨折、たとえば、骨の長軸に対して斜方向の骨折；圧迫骨折、たとえば、通常は椎骨に起こる骨折；らせん骨折、たとえば、少なくとも骨の一部がねじれている骨折；粉砕骨折、たとえば、多数の骨片を生ずる骨折；圧縮骨折、たとえば、骨片が互いにぶつかり合った時に起こる骨折；および開放骨折、たとえば、骨が皮膚に達した骨折を含む。
【００９４】
他の場合には、本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストは、形成外科的治療における骨の治癒促進；セメントを使用しない人工関節および歯科インプラントにおける骨成長の刺激；閉経前の女性における最大骨量の上昇；発育不全の治療；歯周疾患および歯科欠陥、およびその他の歯の修復工程における治療；仮骨延長術中の骨形成の増加；および加齢による骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症または廃用性骨粗鬆症および関節炎などの、その他の骨格障害の治療、または骨形成の刺激が有用である任意の状態に使用できる。本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストは先天性、外傷由来または外科的な骨切除（たとえば癌の治療用）、および美容整形の修復にもまた使用できる。
【００９５】
本明細書記載の方法で治療しうる他の骨損傷は脊柱損傷から起こる損傷である。たとえば、いくつかの脊椎損傷に対する現在の治療法は外科的に２つ以上の脊椎骨を融合することを含む。本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストは、このような脊椎骨を融合する治療の代替として、または追加として投与できる。
【００９６】
さらに他の場合には、骨量減少はたとえば、細菌感染、タバコからの物質を含む有害物質の摂取または吸入に由来する炎症による、歯周組織の骨量減少である。たとえば、本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストは、たとえば、歯、および歯科インプラント周辺を囲む骨の復元および健全性を刺激するために、歯根の周辺に投与できる。
【００９７】
他の場合には、本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストは軟骨形成異常などの軟骨に関係した状態の治療または予防、および／または軟骨再生の刺激（たとえば、Ｗａｎｇ  ｅｔ
ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９：１３２０５−１３２１４，  ２００４；Ｗｏｏｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８１：１３１３４−１３１４０，  ２００６を参照されたい）を目的として、軟骨細胞分化を誘導または促進するために使用できる。Ｒｈｏアンタゴニストは、たとえば変形性関節症および他の関節炎の治療および対象の自家骨および自家関節移植の促進を目的として、軟骨修復の可能性を有する軟骨細胞を刺激するために使用できる。軟骨は異常に発達することがあり、または関節リウマチまたは変形性関節症などの疾患により、または外傷により損傷を受けることがあり、いずれも身体の異常および衰弱につながりうる。Ｈｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，１９９０）；およびＫｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  ｅｄ．（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  １９８９）で概説されているように、軟骨が外傷により損傷する場合も先天異常の場合も、軟骨の臨床的な再生は成功したとしても、最良でもしばしば予後不良である。本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストは損傷した軟骨の再生に使用できる。
【００９８】
（骨細胞と軟骨細胞の治療）
本明細書記載のいくつかの方法では、Ｒｈｏアンタゴニストは骨芽細胞の分化、または骨芽前駆細胞の骨芽細胞への分化を刺激するために使用する。当業者は、公知の方法および識別マーカーを使用して骨芽細胞および骨芽前駆細胞を識別できる。
【００９９】
たとえば、骨芽細胞は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（たとえば、Ｏｎｇｐｈｉｐｈａｄｈａｎａｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １３３：２５０２−２５０７，  １９９３；Ｃｈｉｐｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  １９：１８５０−１８６１，  ２００４を参照されたい）；アルファ１（Ｉ）プロコラーゲン（たとえば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  ９：１４８９−９９，１９９４を参照されたい）；骨Ｇｌａ（γ−カルボキシグルタミン酸含有タンパク質）タンパク質（ＢＧＰ）（たとえば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  ９：１４８９−９９，  １９９４を参照されたい）；骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）（たとえば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｌｃｉｆ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．  ６０：２８３−９０，  １９９７；Ｃｈｉｐｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  １９：１８５０−１８６１，  ２００４を参照されたい）；Ｃｂｆａ１／Ｏｓｆ２（たとえば、Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｎｅ  ３１：２０５−２１１，  ２００２を参照されたい）；Ｉ型コラーゲン（たとえば、Ｏｎｇｐｈｉｐｈａｄｈａｎａｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １３３：２５０２−２５０７，  １９９３：Ｄａｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  １６：１２２８−３６，  ２００１を参照されたい）；Ｅ１１（たとえば、Ｗｅｔｔｅｒｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｎｅ  １８：１２５−１３２，  １９９６を参照されたい）；オステオカルシン（たとえば、Ｏｎｇｐｈｉｐｈａｄｈａｎａｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １３３：２５０２−２５０７，  １９９３；Ｃｈｉｐｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  １９：１８５０−１８６１，  ２００４を参照されたい）；オステオポンチン（たとえば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  ９：１４８９−９９，  １９９４；Ｏｎｇｐｈｉｐｈａｄｈａｎａｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １３３：２５０２−２５０７，  １９９３を参照されたい）；Ｐｈｅｘ（たとえば、Ｅｃａｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １４０：１１９２−１１９９，  １９９９を参照されたい）；およびＲＰ５９（たとえば、Ｋｒｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｄｙｎ．  ２２３：４１４−４１８，  ２００２を参照されたい）などの、公知のタンパク質マーカーを示す。
【０１００】
破骨細胞は、公知のマーカー、たとえば酸性ＡＴＰアーゼ（acid  ATPase）（たとえば、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｎｅｃｔ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．  ２０：１５１−１５８，  １９８９を参照されたい）；カルシトニン（ＣＴ）受容体（ＣＴＲ）（たとえば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １３６：４５７２−４５８１，  １９９５；Ｒｏｕｌｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  １：５４３−５５３，  １９８６を参照されたい）；Ｉ型コラーゲンＣ末端テロペプチド（１ＣＰＴ）（たとえば、Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔ．  Ｍｅｄ．  １４：５２７−５３１，  １９９７を参照されたい）；カテプシンＫ（たとえば、Ｄｏｄｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｆｕｎｃｔ．  ２１：２３１−２３４，  ２００３；Ｄｏｄｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  １６：４７８−４８６，  ２００１を参照されたい）；クレアチンキナーゼＢＢ（ＣＫＢＢ）（たとえば、Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  １１：１４３８−１４４３，  １９９６；Ｂｏｌｌｅｒｓｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｏｒｔｈｏｐ．  Ｒｅｌａｔ．  Ｒｅｓ．  ３７７：２４１−２４７，  ２０００を参照されたい）；強酸性（acidotrophic）のアミン  ３−（２，４−ジニトロアニリノ）−３’−アミノ−Ｎーメチルジプロピルアミン（ＤＡＭＰ）（たとえば、Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．  ２９８：５２７−５３７，  １９９９を参照されたい）；ＥＤ１（たとえば、Ｗｉｌｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６：４０３５−４０４０，  ２００５；Ｍｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ，  Ｄｉｓｏｒｄ．  ３：１６，  ２００２を参照されたい）；Ｋａｔ１−抗原（Ｋａｔ１−Ａｇ）（たとえば、Ｋｕｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１５：２１５−２２２，  ２００１を参照されたい）；プロコラーゲンＣ末端ペプチド（ＰｌＣＰ）（たとえば、Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔ．  Ｍｅｄ．  １４：５２７−５３１，  １９９７を参照されたい）；ＲＡＮＫ（たとえば、Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．  Ｒｅｓ．  ２１：１３３９−１３４９，  ２００６を参照されたい）；酒石酸耐性酸性ＡＴＰアーゼ（たとえば、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ３７：１１５−１１７，  １９８９を参照されたい）；酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）（たとえば、Ｂａｌｌａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ，  Ｉｎｔ．  ７：３９−４３，  １９９７；Ｍｉｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｌｃｉｆ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．  ３４：２８５−２９０，  １９８２を参照されたい）；液胞型プロトンポンプ（Ｅ１１）（たとえば、Ｋｕｒｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １２７：３２１５−３２２１，  １９９０を参照されたい）；およびビトロネクチン受容体（ＶＲ、ＶＮＲ）（たとえば、Ｓａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ��ｒ．  Ｍｅｔａｂ．  １９：２２０−２２７，  ２００１；Ｋｕｒｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １２７：３２１５−３２２１，  １９９０を参照されたい）を使用して識別できる。
【０１０１】
骨芽細胞もしくはその前駆体は、骨芽細胞特異的因子−２（ＯＳＦ−２）、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ；ＲＡＮＫＬ）、オステオポンチン（ＯＰ）、オステオカルシン（ＯＣ）、Ｉ型コラーゲン、酒石酸耐性アルカリホスファターゼ、骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）、および間質幹細胞マーカー−１（ＳＴＲＯ−１）を含むマーカーによって識別可能である。
【０１０２】
本明細書記載の他の方法では、Ｒｈｏアンタゴニストは軟骨細胞分化を刺激するために使用される。当業者は、公知の方法および識別マーカーを使用して軟骨細胞を識別できる。軟骨細胞のマーカーは、限定されないが、１１−ｆｉｂｒａｕ（たとえば、ｖａｎ  Ｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２８０：８０６−８１２，  ２００１を参照されたい）；アグリカン（たとえば、Ｓｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ５５：９１−９７，  ２００２を参照されたい）；アネキシンＶＩ（たとえば、Ｐｆａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５９：１７７７−１７８３，  ２００１を参照されたい）；ベータ１インテグリン（ＣＤ２９）（たとえば、Ｓａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ４３：４４７−４５７，  １９９５を参照されたい）；ＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質）（たとえば、Ｚａｕｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３５８：１７−２４，  ２００１を参照されたい）；カテプシンＢ（たとえば、Ｂａｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ．  ４７：６８４−６９１，  １９８８を参照されたい）；ＣＥＰ−６８（たとえば、Ｓｔｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３５３：１６９−１７４，  ２００１を参照されたい）；ＩＩ型コラーゲン（たとえば、Ｓｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ５５：９１−９７，  ２００２を参照されたい）；ＩＸ型コラーゲン（たとえば、Ｚａｕｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３５８：１７−２４，  ２００１を参照されたい）；Ｘ型コラーゲン（たとえば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．  ２５６：３８３−３９１，  ２０００を参照されたい）；ＭＭＰ１３（たとえば、Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７７：６７８−６９３，  ２０００を参照されたい）；ｓｏｘ９（たとえば、Ｓｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ５５：９１−９７，  ２００２を参照されたい）；およびシンデカン−３（たとえば、Ｐｆａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５９：１７７７−１７８３，  ２００１を参照されたい）を含む。
【０１０３】
（医薬組成物と投与）
本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストは、本明細書記載の方法で使用するために医薬組成物中に組み込むことができる。これらの組成物は、典型的にはＲｈｏアンタゴニストと薬学的に許容できる担体とを含む。
【０１０４】
本明細書で用いられる「薬学的に許容できる担体」は、本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストとともに対象に投与でき、その薬理学的活性を損なわない担体を意味する。薬学的に許容できる担体は、たとえば、溶解剤、分散剤、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤など、薬学的な投与に適合した担体を含む。補完的な活性化合物もまた組成物中に組み込んでよい。
【０１０５】
限定するものではない使用可能な薬学的に許容できる担体の例は、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ＰＶＡ、一部が加水分解されたエチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−酢酸ビニル−ビニルアルコール共重合体、架橋エチレン−酢酸ビニル共重合体、一部が加水分解された架橋されたエチレン−酢酸ビニル共重合体、架橋エチレン−酢酸ビニル−ビニルアルコール共重合体、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、ＰＧＡ、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンとポリエチレングリコールとの共重合体、ポリ乳酸とポリエチレングリコールとの共重合体、ポリエチレングリコール；およびこれらの組み合わせおよびブレンドを含む。
【０１０６】
他の担体は、たとえば水溶性ゼラチン、水溶性タンパク質、高分子担体、架橋剤、またはこれらの組み合わせを含む。他の場合には、担体は基質である。さらに他の場合には、担体は水、薬学的に許容できる緩衝塩、薬学的に許容できる緩衝液、薬学的に許容できる酸化防止剤、アスコルビン酸、１つ以上の薬理学的に許容できる低分子量ポリペプチド、２から１０アミノ酸残基からなるペプチド、１つ以上の薬学的に許容できるタンパク質、１つ以上の薬学的に許容できるアミノ酸、ヒトの必須アミノ酸、１つ以上の薬学的に許容できる炭水化物、１つ以上の薬学的に許容できる炭水化物由来の材料、非還元糖、グルコース、スクロース、ソルビトール、トレハロース、マンニトール、マルトデキストリン、デキストリン、シクロデキストリン、薬学的に許容できるキレート剤、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、二価金属イオンに対するキレート剤、三価金属イオンに対するキレート剤、グルタチオン、薬学的に許容できる非特異的血清アルブミン、および／またはこれらの組み合わせを含む。
【０１０７】
Ｒｈｏアンタゴニストを含む医薬組成物は、当業者に公知の意図した投与経路に適合するように処方できる。限定するものではない投与経路の例は、たとえば静脈内、皮内、皮下などの非経口、経口（たとえば吸入）、経皮（外用）、経粘膜、経膣および経直腸投与を含む。非経口、皮内、または皮下での適用に使用する溶液または懸濁液は下記の成分を含んでよい：注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの無菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ソーダなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張力調整剤。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整できる。非経口製剤はアンプル、使い捨てシリンジ、またはガラス製またはプラスチック製の複数回投与バイアルに封入できる。
【０１０８】
注射用の使用に適した医薬組成物は、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌注射用溶液または分散液を用時調製するための無菌粉体を含む。静脈内投与では、適した担体は生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，  ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。いずれの場合も、組成物は必ず無菌であり、注射容易性（easy syringability）を有するという点で流体であるべきである。組成物は製造および貯蔵の条件下で安定であるべきで、細菌および真菌などの微生物の汚染活動から保護されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、たとえば、レクチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合は必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持できる。微生物活動の防止は、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗細菌剤および抗真菌剤の利用で達成される。組成物は、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、もしくは塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい場合もある。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことで成し遂げられる（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１st  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．  （２００６）を参照されたい）。
【０１０９】
無菌注射用溶液は、必要な量のＲｈｏアンタゴニストを、必要に応じて上で列挙した成分を１つまたは組み合わせて含む適当な溶媒中に取り込み、続いて濾過滅菌して調製できる。一般的に、分散液は基本的な分散媒および上で列挙したその他の必要な成分を含む無菌の溶媒に有効成分を取り込んで調製する。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉体の場合は、調製方法は、これらに限定されることなく、有効成分に任意の所望の成分を加えて濾過滅菌した溶液からこれらの粉体を得る真空乾燥および凍結乾燥を含む。
【０１１０】
経口用組成物は一般的に不活性希釈剤または可食担体を含む。経口投与治療の目的では、Ｒｈｏアンタゴニストは賦形剤に取り込まれ、錠剤、丸薬、トローチ剤、またはたとえばゼラチンカプセルなどのカプセルで使用できる。経口用組成物はうがい薬として利用するために流体の担体でも調製できる。薬学的に適合する結合剤、および／または補助材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ剤などは任意の下記成分、または類似の性質の化合物を含むことができる：結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモジェル（Primogel）、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Sterotes）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースおよびサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香味料などの香味料。
【０１１１】
吸入による投与では、Ｒｈｏアンタゴニストは、たとえば二酸化炭素などのガスなどの適切な噴霧剤を含む加圧容器またはディスペンサー、または噴霧器からのエアゾールスプレーの形態で送達できる。
【０１１２】
経粘膜的もしくは経皮的な手法による全身投与もまた行える。経粘膜的もしくは経皮的な投与では、透過すべき障壁に適した浸透剤が製剤中に使用される。これらの浸透剤は当技術分野において周知であり、限定されないが、たとえば、経粘膜的投与では界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸の誘導体を含む。経粘膜的投与は点鼻薬または坐剤の使用を通じて達成できる。経皮的な投与では、有効成分は当技術分野において周知のように、たとえば軟膏、膏薬、ゲル、もしくはクリームの中に製剤化される。
【０１１３】
Ｒｈｏ阻害剤を含む医薬組成物は坐剤（たとえば、カカオバターおよびその他のグリセリドなど従来の坐剤基剤を用いる）、または直腸送達用の停留浣腸剤の形態でも調製できる。
【０１１４】
それらの代わりに、または追加として、Ｒｈｏアンタゴニストは、たとえば患部に直接適用したり、たとえば骨腫瘍を切除した後に残った周辺部分に直接適用したりなど、骨または周囲の組織に局所的に適用できる。たとえば、Ｒｈｏアンタゴニストは当技術分野において公知の薬剤溶出または送達装置で適用できる。
【０１１５】
いくつかの医薬組成物は、急速な体内からの排出に対してＲｈｏアンタゴニストを保護する、埋め込みおよびマイクロカプセル化送達系（たとえば、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ，  Ｒｅｓ．  ２４：２２９７−２３０８，  ２００７に記載されている）を含む放出制御製剤などの担体とともに調製できる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生分解性で生体適合性のある高分子が使用できる。これらの処方の調製方法は当業者には明らかである。材料は市販されている（たとえば、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡより）。リポソーム懸濁液（細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を有し、特定の細胞を標的とするリポソームを含む）も薬学的に許容できる担体として利用できる。これらは、たとえば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者に公知の方法にしたがって調製できる。
【０１１６】
投与を容易にし、用量を均一にするために、経口または注射用組成物を用量単位（dosage unit）の形態で製剤化することは利点となりうる。本明細書での用量単位形態は、治療を受ける対象に対する単位用量として適した、物理的に分離した単位を指す；各単位は望ましい治療効果を生じるように計算された所定量の有効成分とそれに伴って必要な薬学的担体とを含む。
【０１１７】
これらの化合物の毒性および治療効果は、たとえばＬＤ５０（集団の５０％が死亡する投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療効果が見られる投与量）の決定など、培養細胞または実験動物での標準的な薬学的手順で決定できる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数で、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。毒性の副作用を示す化合物を使用できるが、罹患していない細胞に対する潜在的な損傷を最小化するために、そのような化合物の標的を患部組織部位に定め、それによって副作用を軽減する送達系の設計に注意を払うべきである。
【０１１８】
培養細胞試験および動物実験で得られたデータは、ヒトでの使用における用量の範囲を策定する際に使用できる。一般的に化合物の用量はまったく毒性がないか、または毒性がごくわずかであるＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。用量は、使用する投与形態および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変化してよい。本発明の方法で使用される任意の化合物に対して、最初に培養細胞試験で治療有効投与量を推定できる。動物モデルにおいて、投与量は培養細胞で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿の濃度域を達成するように処方できる。このような情報はヒトにおける有用な投与量をさらに正確に決定するために使用できる。血漿中のレベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィーで測定できる。これらの化合物を調製および試験するための情報は当技術分野において公知である（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１st  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．（２００６）を参照されたい）。
【０１１９】
いくつかの場合に、組織１ｃｍ3あたり約０．１μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約１０，０００μｇのＲｈｏアンタゴニストの治療有効量が投与され、この量はたとえば、組織１ｃｍ3あたり約０．１μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約１，０００μｇのＲｈｏアンタゴニスト、組織１ｃｍ3あたり約０．１μｇの
Ｒｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約５００μｇのＲｈｏアンタゴニスト、組織１ｃｍ3あたり約０．５μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約５００μｇのＲｈｏアンタゴニスト、組織１ｃｍ3あたり約１μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約５００μｇのＲｈｏアンタゴニスト、組織１ｃｍ3あたり約１０μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約１００μｇのＲｈｏアンタゴニスト、組織１ｃｍ3あたり約２０μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約８０μｇのＲｈｏアンタゴニスト、または組織１ｃｍ3あたり約５０μｇのＲｈｏアンタゴニストである。
【０１２０】
他の場合には、組織１ｃｍ3あたり約０．００１μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約１，０００μｇのＲｈｏアンタゴニストが投与され、この量はたとえば、組織１ｃｍ3あたり約０．０１μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約５００μｇのＲｈｏアンタゴニスト、組織１ｃｍ3あたり約０．０５μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約５００μｇのＲｈｏアンタゴニスト、組織１ｃｍ3あたり約０．１μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約５００μｇのＲｈｏアンタゴニスト、組織１ｃｍ3あたり約０．２μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約２５０μｇのＲｈｏアンタゴニスト、組織１ｃｍ3あたり約０．５μｇのＲｈｏアンタゴニストから組織１ｃｍ3あたり約２００μｇのＲｈｏアンタゴニスト、または組織１ｃｍ3あたり約１μｇのＲｈｏアンタゴニストから約１００μｇのＲｈｏアンタゴニストである。
【０１２１】
他の場合には、約０．０００５μＭのＲｈｏアンタゴニストから約５０μＭのＲｈｏアンタゴニストが投与され、この量はたとえば約０．００５μＭのＲｈｏアンタゴニストから約５０μＭのＲｈｏアンタゴニスト、約０．０１μＭのＲｈｏアンタゴニストから約５０μＭのＲｈｏアンタゴニスト、約０．０２μＭのＲｈｏアンタゴニストから約５０μＭのＲｈｏアンタゴニスト、約０．０３μＭのＲｈｏアンタゴニストから約５０μＭのＲｈｏアンタゴニスト、約０．０４μＭのＲｈｏアンタゴニストから約５０μＭのＲｈｏアンタゴニスト、約０．０５μＭのＲｈｏアンタゴニストから約５０μＭのＲｈｏアンタゴニスト、約０．１μＭのＲｈｏアンタゴニストから約５０μＭのＲｈｏアンタゴニスト、約０．１μＭのＲｈｏアンタゴニストから約２５μＭのＲｈｏアンタゴニスト、約０．２μＭのＲｈｏアンタゴニストから約２０μＭのＲｈｏアンタゴニスト、約０．５μＭのＲｈｏアンタゴニストから約２０μＭのＲｈｏアンタゴニスト、または約１μＭのＲｈｏアンタゴニストから約１０μＭのＲｈｏアンタゴニストである。
【０１２２】
さらに他の場合には、Ｒｈｏアンタゴニストの治療有効量すなわち用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、たとえば約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ体重から約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲でありうる。
【０１２３】
他の場合には、Ｒｈｏアンタゴニストの治療有効量すなわち用量は、全量で約０．００１ｍｇから約５０ｍｇ、たとえば、全量で約０．０１ｍｇから約４０ｍｇ、全量で約０．０２５ｍｇから約３０ｍｇ、全量で約０．０５ｍｇから約２０ｍｇ、全量で約０．１ｍｇから約１０ｍｇ、または全量で約１ｍｇから約１０ｍｇの範囲でありうる。
【０１２４】
医師は、疾患または障害の重症度、先行した治療、全体的な健康、および／または対象の年齢、および現在罹患している他の疾患を含むがこれらに限定されないある種の要因が、対象を効果的に治療するために必要な用量に影響しうることを認識するであろう。さらに、治療有効量のＲｈｏアンタゴニストを用いた対象の治療は、１回の治療もしくは一連の治療を含むことができる。１つの実施例では、対象は約０．０６ｍｇから１２０ｍｇの範囲内のＲｈｏアンタゴニストを用いて、週に１回、約１から１０週間、あるいは、２から８週間、約３から７週間、または、約４、５、もしくは６週間にわたって治療された。治療で使用する、有効用量のＲｈｏアンタゴニストは、特定の治療の過程で増量または減量してもよいこともまた認識されるであろう。
【０１２５】
医薬組成物は投与指示書とともに容器、パック、またはディスペンサーに入れることができる。
【０１２６】
本明細書記載の医薬組成物が局所的に適用される時、そのような医薬組成物は組織接着剤および／またはフィブリンを含むことができ、これらは組織またはフィブリンシーラント、たとえばＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）であってよい。たとえば、医薬組成物は、Ｒｈｏアンタゴニスト、たとえばＢＡ−２１０を、たとえば組織接着剤、たとえばフィブリン接着剤またはコラーゲンゲルなど、インビボでの治療に許容できる基質を形成できる流動性の担体成分と混合することにより調製できる。
【０１２７】
フィブリンシーラントは３つの基本的な成分を有する：フィブリノゲン濃縮物、塩化カルシウムおよびトロンビン（米国特許第７，１４１，４２８号を参照されたい）。ゲル組成の性状に変化を与えるために、たとえば、可溶性成分からフィブリンゲルを形成するのにかかる時間を調整するために、形成されるタンパク質ネットワークのサイズを変えるために、およびゲルの強度を変えるために、他の成分を加えることができる。体内設置後のゲルの除去を遅らせるために、プロテアーゼ阻害剤を加えることもできる。
【０１２８】
一般的に、成分が混合された時、トロンビンの作用によりフィブリノゲン分子が開裂してフィブリン単量体を生成し、このフィブリン単量体が自発的に重合して大部分が水素結合で結束されているフィブリンの三次元ネットワークを構築することで、フィブリンの凝塊が形成される。これは使用されるトロンビン濃度に凝固率が依存する、自然な血液凝固カスケードの最終段階に相当する。引張り強度を改善するために、シーラント組成物中に第ＸＩＩＩ因子を含めることでフィブリン鎖間に共有結合の架橋が供される。カルシウムイオン存在下で、トロンビンは第ＸＩＩＩ因子を第ＸＩＩＩａ因子に活性化する。活性化した第ＸＩＩＩａ因子はトロンビンとともにフィブリンの架橋を触媒し、血餅の強度を増す。フィブリン血餅の強度は、生成したフィブリンネットワークに架橋で結合するフィブロネクチンを組成物に加えることでさらに改善される。傷が治癒する間に血餅の材料は徐々に溶解を受け、完全に吸収される。線維素溶解によるフィブリン血餅の分解が早く起こりすぎることを防ぐために、フィブリンシーラント組成物はアプロチニンなどのプラスミノーゲン活性化因子阻害剤もしくはプラスミン阻害剤を含むことができる。これらの阻害剤は、フィブリノゲン組成物中にいくらか残存するプラスミノーゲンによる線維素溶解活性もまた減少させる。同様に、組成物はヒアルロン酸（もしくは他の多糖類）を含むことができ、周辺の組織に常時存在するヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸成分の分解を防止する（すなわち、存在期間を延長する）ために、１つ以上のフラボノイド（または他の多糖類に対する相当する阻害剤）などのヒアルロニダーゼ阻害剤もまた含むことができる。ヒアルロン酸は架橋を作ることができ、市販品の例はＨｙｌａｎ（登録商標）である（Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ，  Ｒｉｔｃｈｆｉｅｌｄ，  Ｎ．Ｙ．，  ＵＳＡより入手できる）。ヒアルロン酸組成物は、たとえばゲルまたは溶液であってよい。
【０１２９】
場合によっては、フィブリン血餅はＲｈｏアンタゴニストの投与に使用できる。たとえば、本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストを組織接着剤に組み込むことで、組織接着剤の投与で形成されるフィブリンネットワーク中にアンタゴニストが取り込まれる。これにより、制御可能な形でフィブリンネットワークから放出されている間、アンタゴニストが投与部位にとどまることを確実にする。
【０１３０】
フィブリンシーラントの使用は当技術分野において公知である（たとえば、米国特許第５，７１４，３７０号；米国特許第５，７５０，６５７号；米国特許第号５，７７３，４１８号；米国特許第５，９６２，４０５号；米国特許第５，９６２，４２０号；米国特許第６，１１７，４２５号；米国特許第６，１６２，２４１号；および米国特許第６，２６２，２３６号を参照されたい）。一般的に、フィブリンゲルを作るには、可溶性のトロンビンおよびフィブリノゲンを塩化カルシウム存在下で混合する。成分を混合すると、フィブリノゲン分子がトロンビンで開裂されてフィブリン単量体を生成し、フィブリンの接着性ゲルが生成する。フィブリン単量体は自発的に重合してフィブリンの三次元ネットワークを構築するが、この反応は凝固カスケードの最終共通経路を模したもので、すなわち、フィブリノゲンからフィブリンシーラントへの変換である。調製にあたっては、対象への投与の前または後の所望のタイミングで重合を制御できるように、フィブリノゲンおよびトロンビン成分は使用時まで別々に保管されるべきである。
【０１３１】
本明細書記載の医薬組成物の製剤化／輸送に使用される一つの模範的なフィブリンシーラントは、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｒｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが製造する、ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨ  ２成分型フィブリンシーラントキット  蒸気加熱処理（ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨフィブリンシーラント）である。ＴＩＳＳＥＥＬ  ＶＨフィブリンシーラントキットはフィブリノゲン（シーラー(Sealer)タンパク質濃縮物）およびトロンビンを主な有効成分として含む。また、塩化カルシウム溶液、および線維素溶解阻害剤溶液（ウシ由来のアプロチニン）をも含む。シーラータンパク質溶液およびトロンビン溶液の二つの再構成された成分は、混合されて局所的に適用される。シーラータンパク質溶液およびトロンビン溶液を混合すると、急速に弾性の凝塊となる粘性溶液が生ずる。トロンビンは、シーラータンパク質溶液に含まれるフィブリノゲンをフィブリンに変換する高度に特異的なプロテアーゼである。大部分のトロンビンは生成するフィブリンに吸収される。過剰なトロンビンがあれば、血中のプロテアーゼ阻害剤で不活性化される。線維素溶解阻害剤溶液（アプロチニン）は、フィブリンの早期分解を防止する多価プロテアーゼ阻害剤である。
【０１３２】
本明細書記載の医薬組成物の製剤化／輸送に使用できる他のフィブリンシーラントは、たとえばＣｅｂｕｓ（商標）、Ａｔｅｌｅｓ（商標）およびＰｒｏｌｅｕｓ（商標）（ＰｌａｓｍａＳｅａｌ）；Ｖｉｖｏｓｔａｔ（登録商標）（Ｖｉｖｏｌｕｔｉｏｎ）；ＣｒｙｏｓＳｅａｌ  ＦＳ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ）；ＣｏＳｅａｌ（商標）（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ）；Ｄｕｒａｓｅａｌ（登録商標）（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ）；Ｐｏｌｉｐｈａｓｅ（登録商標）（Ａｖａｌｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ）；Ｂｉｏｇｌｕｅ（登録商標）（Ｃｒｙｏｌｉｆｅ  Ｉｎｃ．）；Ａｖｉｔｅｎｅ  Ｆｌｕｏｒ（商標）（Ｄａｖｏｌ）；Ｄｅｒｍａｂｏｎｄ（商標）（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）；Ｈｅｍａｓｓｅｌ、Ｈｅｍａｓｓｅｌ−ＨＭＮおよびＨｅｍａｓｓｅｌ−Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（Ｈｅｒｍａｃｕｒｅ）；Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ−Ｐ（登録商標）（Ａｖｅｎｔｉｓ）；Ｆｉｂｒｏｃａｐｓ（登録商標）（Ｐｒｏｆｉｂｒｉｘ）；およびＣｒｏｓｓｅａｌ（商標）、Ｅｖｉｃｅｌ（商標）およびＴｈｒｏｍｂｉｎ（Ｏｍｒｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む。
【０１３３】
本明細書記載の方法および組成物で使用できるさらに他のフィブリンシーラントは、米国再発行特許第３９，２９８号；米国再発行特許第３９，３２１号；米国特許第４，４２７，６５０号；米国特許第４，４２７，６５１号；米国特許第４，４１４，９７６号；米国特許第４，６４０，８３４号；米国特許第５，２９０，５５２号；米国特許第５，６０７，６９４号；米国特許第５，７１４，３７０号；米国特許第５，７５０，６５７号；米国特許第５，７７３，４１８号；米国特許第５，９６２，４０５号；米国特許第５，９６２，４２０号；米国特許第６，１１７，４２５号；米国特許第６，１６２，２４１号；米国特許第６，２６２，２３６号；米国特許第６，７８０，４１１号；米国特許出願第１１／１１２１５６号；および欧州特許第０  ８０４  ２５７号に記載されているものである。組織接着剤の処方もまた米国特許第７，１４１，４２８号に記載されている。
【０１３４】
これらのフィブリンシーラントは例として名前を挙げたもので、限定的なものではないことは理解されるべきである。任意の薬学的に許容できる細胞接着剤、たとえばフィブリンまたはコラーゲンゲルが本明細書記載の方法において使用できることを理解されるべきである。
【０１３５】
当業者は、本明細書記載の医薬組成物が単回投与バイアルとして処方できることを認識するであろう。たとえば、単回投与バイアルは本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストを含む医薬組成物を約２５μｇ、約４０μｇ、約６０μｇ、約１００μｇ、約１５０μｇ、約２００μｇ、約３００μｇ、または約５００μｇ含んで生産できる。さらなる実施例では、単回投与バイアルは本明細書記載の医薬組成物を約０．５ｍＭまたは約１．０ｍＭの濃度で含んで生産できる。
【０１３６】
本明細書記載の治療有効量のＲｈｏアンタゴニストを含む医薬組成物を用いた対象の治療は、１回の治療、継続治療、または複数の投与量に分けられた一連の治療であってよい。治療は１回の投与、継続投与、または１年以上の定期的な投与を含むことができる。多くの場合に慢性で長期にわたる投与が指示されうる。場合によっては、対象は１年間までの間治療される。他の場合には、対象は６ヶ月までの間治療される。さらに他の状況では、対象は１００日間までの間治療される。１つの実施例で、対象は１週間に１回、約１から１０週間、あるいは２から８週間、約３から７週間、または約４、５、または６週間の時間枠でＲｈｏアンタゴニストにて治療される。他の場合には、対象は実質的に連続的に治療されうる。他の状況では、対象は１日に１回、１日に２回、１週間に１回、または１ヶ月に１回治療されうる。
【０１３７】
一般的に、各処方は本明細書記載の骨障害または状態による有害な影響や症状を、抑制または軽減または除去するのに十分な量で投与される。
【０１３８】
既存の骨障害の治療に加えて、本明細書記載の方法はこれらの障害の予防または発症を遅らせることができる。たとえば、本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストは、たとえば骨障害に罹患しやすい、さもなければ罹患するおそれがある対象に対して投与するなど、予防的な適用として投与することができる。場合によっては、Ｒｈｏアンタゴニストは、既存の骨障害を持ち、さらなる骨障害の影響をうけやすい、さもなければ受けるおそれのある対象に投与することができる。
【０１３９】
骨障害の抑制は、骨吸収が遅滞されたかまたは減弱されたかを測定する任意の公知の方法で評価できる。これらの方法は、たとえば自覚症状もしくは客観的な生理的指標、または骨造影法、または骨生検、または血清マーカー、たとえばリン酸、カルシウム、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＩＰ）、未変性オステオカルシン（ＯＣ）、もしくはＩ型コラーゲンカルボキシ末端ピリジノリン架橋テロペプチド（ＩＣＴＰ）により評価される、たとえば直接観察および間接評価を含む。治療効果は、たとえば、上で与えられた個別の指標またはこれらの任意の組み合わせで評価される、骨量減少の防止または骨の修復に基づいて評価できる。
【０１４０】
他の場合には、本明細書記載の医薬組成物は、限定されないが、たとえばステント、ケージ、骨、ねじ、棒、柱、プレート、歯科インプラント、メッシュ、ワイヤ、くぎ、アンカー、人工関節、スポンジ、高分子、またはゲルを含む医療装置向けの薬剤溶出コーティング剤として使用される。
【０１４１】
（組み合わせ療法）
場合によっては、本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストは１つ以上の治療薬、たとえば本明細書記載の骨障害または状態の治療に有用な治療薬と組み合わせて投与される。たとえば、成長因子などのある種の第二の治療薬は組織の成長または浸潤を促進できる。この目的に対して模範的な成長因子は、限定されないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦｓ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦｓ）を含む。他の第二の治療薬、たとえば骨形成タンパク質（米国特許第４，７６１，４７１号；国際公開公報第９０／１１３６６号）、オステオゲニン（Ｓａｍｐａｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８７）  ８４：７１０９  １３）およびＮａＦ（Ｔｅｎｃｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔ．  Ｒｅｓ．（１９８９）  ２３：５７１  ８９）なども、骨成長を促進することができる。
【０１４２】
他の場合には、本明細書記載のＲｈｏアンタゴニストは、エストロゲン、ビスホスホネート、カルシトニン、ＰＴＨ、およびＢＭＰを含むがこれらに限定されない再吸収阻害薬など、骨吸収を阻害する薬剤と組み合わせて使用できる。
【０１４３】
場合によっては、Ｒｈｏアンタゴニストは１つ以上のＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤と組み合わせて投与できる。ＲＯＣＫ阻害剤は当技術分野において公知であり、限定されないが、Ｆａｓｕｄｉｌ、Ｙ２７６３２、ＷＦ−５３６、ＳＣ−３５３６、Ｈ−８９、ＭＬ−９、ＨＡ−１０７７、およびＨ−１１５２（たとえばＳｏｍｉｙｏ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：９０８−９１０，  １９９７；Ｕｅｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：９９０−９９４，  １９９７；米国特許第４，９９７，８３４号を参照されたい）を含む。他のＲＯＣＫ阻害剤は米国特許出願公開第２００４／０１３８２７２号および同第２００５／０２７２７５１号に記載されている。
【０１４４】
本発明は以下の実施例によりさらに例示される。実施例は説明目的のために示されるにすぎない。実施例はいかなる意味でも本発明の範囲または内容の限定として解釈されるものではない。
【実施例】
【０１４５】
［実施例１］  頭蓋冠器官培養（骨吸収およびＤＮＡ合成）
（手順）
２０匹のマウスに生後１から３日齢において、滅菌生理食塩水溶液２５μｌ中の３μＣｉ45Ｃａを皮下注射する。３０ｍｍのペトリ皿に３ｍｌの培地（０．１％ＢＳＡ／培地１９９）を加え、３７℃で培養する。マウスを断頭し、半頭蓋冠（hemi-calvariae）を頭部から切開して格子に置く（表面張力で骨の下から培地を引き上げる）。骨を２４時間前培養する。培地を３ｍｌの新鮮な培地で置換し、３０μｌ／ウェルのＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）を加えて骨を４８時間培養する。
【０１４６】
それぞれの皿から３００μｌの培地を５ｍｌのプラスチックバイアルに入れ、そこに３−４ｍｌのシンチラント（scintillant）を加えてボルテックスする。バイアル中の45Ｃａをベータカウンター中で計数する。培地５００μｌ中に２μＣｉの3Ｈ−チミジンをすべての皿に加え、４時間培養する。試料骨を新鮮な培地中ですすぎ、１ｍｌの５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を含む個々のガラスチューブに入れる。骨を４℃で１２〜２４時間培養する。１００μｌのＴＣＡ溶液をそれぞれのチューブから取り、５ｍｌのプラスチックバイアルにいれて３〜４ｍｌのシンチラントを加えてボルテックスする。バイアル中の45
Ｃａをベータカウンター中で計数する。
【０１４７】
骨吸収の量は、骨から放出された45Ｃａの百分率を次の式を用いて計算することにより測定する：
【数１】
2011513434.tif 000003
【０１４８】
破骨細胞の活性を測定するために、骨試料中のＤＮＡの合成量を測定する。一定分量のＴＣＡを取り、ＴＣＡをチップにより除き、１ｍｌのアセトンを加え、試料をドラフト中に室温（ＲＴ）で１〜２時間放置する。アセトンが除去され、１ｍｌのエーテルを１〜２時間加えておく。エーテルが除去され、骨を完全に乾燥する。それから骨重量（μｇ）を量る。骨を２０ｍｌのガラス製シンチレーションバイアルに入れ、１ＭのＫＯＨを５００μｌ加える。バイアルを密栓して８０℃で約１０分間培養する。すべてのバイアルに１ＭのＨＣｌを５００μｌ加え、溶液を中和する。それぞれのバイアルに１０ｍｌのシンチラントを加え、完全にボルテックスして3Ｈの量を計数する。ＤＮＡの合成量は以下の式を使用して計算する：
【数２】
2011513434.tif 000004
【０１４９】
（結果）
Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）での骨処理は、Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）で処理しない骨と比較して骨吸収が減少する結果となる。骨吸収の減少は破骨細胞活性のレベルが減少したことによる。
【０１５０】
［実施例２］  ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のミネラル化
（手順）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は培地中（ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋ピルビン酸ナトリウム（原液１ｍｌ／培地１００ｍｌ））で維持する。細胞がよく成長し、播種の準備ができたら、チロシナーゼを加えて標準的な方法を用いて細胞を洗浄する。それから細胞を計数し、５×１０4細胞／ウェルの密度で６−ウェルのプレートまたは３５ｍｍの皿に播種する。コンフルエントになるまで細胞を培地中で生育し（約３日間）、それから培地をミネラル化培地（αＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２−リン酸、および１０ｍＭのβ−グリセロリン酸）で置換し、Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）を加える。培地とＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）は週２回交換する。１８から２１日間のミネラル化の後に、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色またはアリザリンレッドで細胞を染色する。
【０１５１】
（結果）
ミネラル化培地中でのＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）の使用は、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色またはアリザリンレッドを用いる新しい骨の染色で測定したところ、Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）が存在しない場合と比べてミネラル化が増進する結果となる。
【０１５２】
［実施例３］  骨芽細胞の増殖試験
（手順）
全体の手順は下記のとおりである：第１日目に、初代ラット胎児頭蓋冠由来骨芽細胞をＭＥＭ／５％ＦＣＳに播種した。第２日目に、細胞をＭＥＭ／０．１％ＢＳＡで血清欠乏状態（serum-starved）にした。第３日目に、新鮮なＭＥＭ／０．１％ＢＳＡおよびＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）を加えた。第４日目に、3Ｈチミジンを加え、細胞を６時間培養した。それからプレートを洗浄し、ＴＣＡを加えた。第５日目に、プレートを計数処理した。
【０１５３】
以下のように２４−ウェルのプレートに播種した：４ｍｌのＰＢＳでフラスコを２回すすいだ。フラスコに４ｍｌのトリプシンを加え、インキュベーターに入れておよそ５分間培養した。細胞が持ち上げられたら、８ｍｌのＭＥＭ＋５％ＦＢＳを１５ｍｌの遠心管に加え、遠心管を１２００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を廃棄し、細胞を５ｍｌの培地で洗浄した。細胞を再度遠心し、５ｍｌの培地で再懸濁した。
【０１５４】
細胞計数は１：２０の希釈液（すなわち、エッペンドルフチューブ中に５０μｌの細胞＋９５０μｌの培地）で行った。血球計算器の８つの大きな正方形中で細胞を計数し、平均値を決定した。２４ウェルのプレートに、５×１０4細胞／ｍｌ  ＭＥＭ＋５％ＦＢＳの密度で、ウェルあたり０．５ｍｌ使用して細胞を加えた。６−ウェルのプレートに、５×１０4細胞／ｍｌ  ＭＥＭ＋５％ＦＢＳの密度で、ウェルあたり３ｍｌ使用して細胞を加えた。
【０１５５】
バキュセット（vacuset）を使って培地を取り除き、１．０ｍｌのＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡを各ウェルに加えた：（ＭＥＭ１００ｍｌ中にＢＳＡ原液３３３μｌ）。細胞を３７℃で終夜培養した。
【０１５６】
翌日、［3Ｈ］チミジンをウェルに加えた。ウェルあたりの最終濃度は０．５μＣｉ／５０μｌ（原液５０μｌ（５ｍＣｉ）＋培地５ｍｌ）を使用し、この濃度は４×２４ウェルプレートに十分であった。５０μｌの［3Ｈ］チミジン（原液５０μｌ＋培地５ｍｌ）を各ウェルに加え、３７℃で６時間培養した。それからウェルを１ｍｌの無血清培地で洗浄した。培地を取り除き、１ｍｌの１０％ＴＣＡを各ウェルに加えた。
【０１５７】
ＴＣＡを取り除き、各ウェルを１ｍｌのエタノール／エーテル（３：１）ですすいだ。その後エタノール／エーテルを完全に蒸発させた。２ＭのＫＯＨを２００μｌ加え、ウェルを５５℃で３０分間培養した。それから１ＭのＨＣｌを４００μｌ各ウェルに加えた。それぞれの試料を３００μｌずつシンチレーションバイアルに入れ、シンチレーション液を加えてシンチレーションを行った。
【０１５８】
（結果）
Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）は、上で述べた手順で活発に増殖していない細胞を使用した対照と比較して、用量依存的にチミジンの取り込みを減少させた（図１）。細胞に影響を与えなかったクエン酸塩緩衝液の対照（図２ｂ）と比較して、細胞は用量応答的に凝集し、死滅したようであった（図２ａ）。この結果は、骨芽細胞の培養細胞株ＭＣＴ３Ｔ−Ｅ１でも確認され、ここでもＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）が対照と比較して、用量依存的にチミジンの取り込みを阻害した（図３）。同様の結果は、血清欠乏状態ではなくて、０．１％ＢＳＡではなく１％ＦＣＳを添加した培地に移された、活発に増殖しているラット胎児頭蓋冠由来骨芽細胞でも見られた（図４、５ａおよび５ｂ；クエン酸塩緩衝液は活発に増殖している細胞に影響を与えなかった）。５％または１０％ＦＣＳを培地に加えたとき、Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）は２４時間でチミジンの取り込みを阻害した（図６）。６時間では、対照と比較してチミジンの取り込みに著しい違いは見られなかった。（図６）。
【０１５９】
Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）は用量依存的に骨芽細胞を減少させ、培地へのＦＣＳの添加は細胞の減少を救助しなかった。Ｒｈｏは細胞骨格系の制御に関与することが知られているので、細胞が「凝集」したように見受けられても驚くに値しない。それに加えて、骨結節／ミネラル化の段階まで生育させる、骨芽細胞の予備的な長期培養は、Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）が骨芽細胞の分化を助長するかもしれないことを示す。
【０１６０】
［実施例４］  破骨細胞形成のためのマウス骨髄培養
（手順）
麻酔後、各マウスを頸椎脱臼で屠殺した。脚をエタノールで消毒し、股関節にて取り外した。足を足首の上で切断し、１００％エタノール中ですすいだ。臀部末端から足首の関節に向けて皮膚を剥いで除去した。メスとピンセットを使って別の皿に筋肉を削り取り、骨（大腿骨もしくは脛骨）の全長を露出した。２３ＧＡの針を挿入するのに十分な直径を与えるように、大腿骨および脛骨のそれぞれの端から骨端を切り落とした。骨をαＭＥＭ中に入れた。２３ＧＡの針およびαＭＥＭを充填した５ｍｌのシリンジを使用して両方の末端から骨を洗い流し、骨髄を取り出した。５０ｍｌのコニカルチューブに培地と骨髄を集めた。αＭＥＭおよび骨髄切開から集めた髄を使用して、チューブを１２００ｒｐｍで２分間遠心した。培地を捨ててペレットをおよそ１５ｍｌの１０％ＦＣＳ／αＭＥＭ中に再懸濁した。
【０１６１】
７．５ｍｌの細胞懸濁液を２つの９ｃｍペトリ皿に蒔き、３７℃、５％ＣＯ2下で２時間培養した。２時間後、両方の皿から培地および付着していない細胞を取り出し、１５ｍｌの遠心管に入れた。遠心管を１２００ｒｐｍで２分間遠心した。培地をおだやかに流し出し、およそ４〜５ｍｌの１０％ＦＣＳ／αＭＥＭを加え、培地を吸引した。５０μｌの各細胞懸濁液に、９５０μｌの培地をエッペンドルフチューブ中にて加えた。細胞を血球計算器のチャンバー中で計数した（細胞計数：平均細胞数×希釈度×１０4細胞／ｍｌ）。培地５００μｌ中の５×１０5個の細胞を各ウェル中に播種した。「ビタミンなし」の対照以外の各ウェルに１０-6ＭのビタミンＤ3を５μｌ加えた。Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）を適当なウェルに指示されたように加え、各プレートを３７℃、５％ＣＯ2下で４８時間培養した。
【０１６２】
第２日目に、「ビタミンなし」の対照ウェルに１０％ＦＣＳ／αＭＥＭを５００μｌ加えた。それ以外のウェル全てに、ビタミンＤ3を含む１５％ＦＣＳ／αＭＥＭを５００μｌ加えた。１０μｌの処理薬物を適当なウェルにそれぞれ加え、３７℃、５％ＣＯ2下で４８時間培養した。第４日目に、各ウェルからリバースピペッティングで５００μｌを取り出し、３７℃、５％ＣＯ2下で７２時間培養した。第７日目に、ＴＲＡＰｉ細胞を目的としてウェルを染色した。
【０１６３】
（結果）
Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）は破骨細胞の発達を減少させた（図７）。間質細胞の生育は（上記の骨芽細胞培養と比較して）阻害されず、顕微鏡写真に示されるように、ＴＲＡＰ陽性の多核破骨細胞を取り囲むかなり多くの間質細胞が見られた（図８；「*」は破骨細胞（多核細胞）を示す；「＃」は間質細胞（骨芽細胞を含む）を示す）。
【０１６４】
Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）は特異的に破骨細胞形成を阻害し、間質細胞は阻害されない。
【０１６５】
［実施例５］  Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）  ウサギ橈骨欠損の研究
（手順）
この実施例の目的は、外科的に作られた骨欠陥部位に局所的に適用するフィブリンシーラント基質中のＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）が、長い骨における臨床的な程度の欠損の治癒を刺激する能力を評価することである。試験では、Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）で処理した骨の治癒と自家移植した骨の治癒とを比較し、もっとも効果的なＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）の投与量を予測する用量反応曲線を作成する。
【０１６６】
評価に使用する試験系は、骨格が成熟したメスのニュージーランドシロウサギの橈骨における、臨床的な程度の部分欠損の縮小である。
【０１６７】
３０匹の骨格が成熟した（≧２６週齢、証明付）メスのニュージーランドシロウサギはランダムに５つの群に割り当てられ（Ｎ＝６／群）、次の処理を受けた：フィブリン基質媒体対照（群１）、フィブリン基質中に１μｇのＢＡ−２１０（群２）、フィブリン基質中に１０μｇのＢＡ−２１０（群３）、フィブリン基質中に１００μｇのＢＡ−２１０（群４）、および陽性対照として、小片化した腸骨稜移植（ＩＣＢＧ）（群５）。
【０１６８】
【表１】
2011513434.tif 000005
【０１６９】
外科手術当日、ウサギに麻酔をかけて、両方の前肢の前後方向および側方向のＸ線写真を撮影する。左前肢を剪毛し、ポビドンヨードおよびアルコールで交代にこすって外科手術に備え、無菌的に覆う。予防的抗生剤（セファゾリン、２０ｍｇ／ｋｇ）を、フェンタニルの経皮貼布（２５μｇ／時間）として手術前に投与する。橈骨の頭方内側表面にわたっておよそ３ｃｍの皮膚切開を行い、表面下にある組織を引き離し、開創する。洗浄下で、振動のこぎりを使用して橈骨の２箇所を横切断し、橈骨手根関節から２．５ｃｍに位置する遠位縁に１．５ｃｍの部分欠損を得る。欠損を創出したら、割り当てられた治療材料を骨欠損に配置し、皮下軟部組織および皮膚をＶｉｃｒｙｌ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，  ＮＪ）で閉じる。術後痛はフェンタニルの経皮貼布（２５μｇ／時間）、およびカルプロフェン（４ｍｇ／ｋｇ）の１日１回注射で３日間管理する。ＲｈｏＡ阻害剤で処理する動物に関しては、ＢＡ−２１０溶液（２５μｌ）を６００μｌのフィブリン血餅（３００μｌのフィブリノゲンおよび３００μｌのトロンビン）に入れて与える。一定分量のＢＡ−２１０（１μｇ、１０μｇ、および１００μｇ）は、３０ｍｇ／ｍｌの原液からクエン酸塩緩衝液での希釈を経て外科手術時に調製する。陰性対照動物（群１）には６００μｌのフィブリンを単独で（２５μｌのクエン酸塩緩衝液とともに）与え、一方陽性対照（群５）には、小片化した腸骨稜由来の皮質海綿質の自家移植片を０．３ｃｍ3与える。
【０１７０】
陽性対照となる動物に関して、部分欠損手術に先だって腸骨稜から移植骨を採取する。これらの動物において、尾側の背領域を剪毛し、ポビドンヨードおよびアルコールで交代にこすって外科手術に備え、無菌的に覆う。正中線上に４〜６ｃｍの皮膚切開を行い、鈍的、鋭的、および電気焼灼的な剥離を経て、腸骨稜の頭方部分を覆う皮下組織に接近する。腸骨稜上の付着筋肉は骨膜下を持ち上げて取り除き、皮質海綿質の骨を採取し、骨鉗子で小片化する。深い皮下組織は４−０  Ｖｉｃｒｙｌで閉じ、皮膚は止め金で閉じる。
【０１７１】
治癒を観察し、新たな骨形成を検出するために、前肢の平面Ｘ線写真を２週間の間隔で撮影する。動物は全て術後８週間で安楽死させる。安楽死させる際に、術前のＸ線写真と比較する目的で、前肢の前後方向および側方向のＸ線写真をｉｎ  ｓｉｔｕで撮影する。それから橈骨および尺骨を一括で採取し、冷固定液（１０％ホルマリン）につける。骨の近接端部および遠位端部を整形し、マイクロコンピュータ化された断層撮影システム（μＣＴ４０，Ｓｃａｎｃｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＧ，  Ｓｃａｎｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  ＣＨ）を使用して、欠損部位の高解像度３−Ｄボリューム画像（３０μｍ3等大ボクセルサイズ）を生成する。スキャンは５５ｋＶｐおよび１４５μＡにて実行する。欠損の架橋および新しい骨形成は、Ｂｏｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  ８５Ａ：２０６−２１７（２００８））およびＨｅｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：１３５６−１３６７（２００５））によって記載された５点の評点方式を使用して、定性的に点数化する。それから欠損の新しい骨の体積を、欠損部位を中心とした標準化された５００枚のスライス（１５ｍｍ）の体積から定量化する。尺骨は体積から手動の分割で取り除く。骨の体積は、固定フィルタリングおよびσ＝１．０、サポート＝１、および閾値＝３１５の分割パラメータを備えた、μＣＴ４０に組み込まれたイメージ処理手順を使用して計算する。ミネラル密度（立方センチメートルあたりのヒドロキシアパタイト（ｍｇ）、ｍｇ  ＨＡ／ｃｍ3）を、分割された画像の密度較正を経て計算する。Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法の事後検定とともに一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、統計的な比較を行う。
【０１７２】
μＣＴ造影後、骨を脱灰してパラフィンに埋め込み、連続した正中矢状切片をミクロトームで切り取る。切片をスライドガラスに載せて、交互の連続切片をトルイジンブルーおよびマッソン・トリクロームで慣用の光学顕微鏡分析用に染色する。
【０１７３】
（結果）
フィブリンシーラント基質中のＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）の局所投与は、フィブリンシーラント単独での適用と比較して、骨欠損部位の新しい骨の形成を加速する。
【０１７４】
［実施例６］  ウサギの橈骨欠損に対するＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）およびＢＭＰの投与
他の研究で、ウサギを実施例５に記載されたように準備および処理する。しかしながら、Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）およびＢＭＰを同時に投与する。Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）はフィブリンシーラント中で局所的に投与し、ＢＭＰはＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）とともに局所的、もしくは全身的のどちらかで投与する。
【０１７５】
ＢＭＰおよびＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）を組み合わせた投与は、フィブリンシーラント中のＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）単独での適用と比較して、骨欠損部位の新しい骨の形成の加速に相乗的または付加的に影響する結果となる。
【０１７６】
［実験例７］  骨芽前駆細胞のエクスビボ処理
破骨前駆細胞をオステオポンチンなどのマーカーによって同定し、常用の方法を使用して対象から単離する。破骨前駆細胞をエクスビボで維持してＣｅｔｈｒｉｎ（登録商標）で処理する。それから処理した細胞を対象の骨損傷部位に移植する。
【０１７７】
Ｃｅｔｈｒｉｎ（登録商標）を用いた骨芽前駆細胞のエクスビボ処理は骨芽細胞の形成と成熟を助長し、対象に移植した時に骨形成を促進する。
【０１７８】
（同等性）
本発明はその詳細な説明とともに記載されているが、前述の説明は例示することを意図したもので本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲で定められると理解されるべきである。他の態様、利点、および変形例は以下の特許請求の範囲内である。
【０１７９】
[配列表]
2011513434.tif 000006
【図１】
2011513434.tif 000007
【図２Ａ】
2011513434.tif 000008
【図２Ｂ】
2011513434.tif 000009
【図３】
2011513434.tif 000010
【図４】
2011513434.tif 000011
【図５Ａ】
2011513434.tif 000012
【図５Ｂ】
2011513434.tif 000013
【図６】
2011513434.tif 000014
【図７】
2011513434.tif 000015
【図８】
2011513434.tif 000016
【国際調査報告】
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2011513434.tif 000018
2011513434.tif 000019