(57)【要約】  本発明は、肉ベース食品におけるコルステロール量を減少させ、及び／又はテクスチャーを向上させ、及び／又は重量減を縮小させ、及び／又は脂肪安定性を向上させる方法を提供する。かかる方法は、ａ）肉を脂質アシルトランスフェラーゼと接触させ、ｂ）前記脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を温度約１℃〜約７０℃でインキュベートし、ｃ）前記肉から食品を製造するステップを含み、ステップｂ）はステップｃ）の前、途中、後のいずれかに行う。本発明はまた、肉ベース食品中のコレステロールを減少させるための脂質アシルトランスフェラーゼの使用にも関する。
2011517945.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肉ベース食品におけるコルステロール量を減少させ、及び／又はテクスチャーを向上させ、及び／又は重量減を縮小させ、及び／又は脂肪安定性を向上させる方法において、
ａ）肉を脂質アシルトランスフェラーゼと接触させ、
ｂ）前記脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を温度約１℃〜約７０℃でインキュベートし、
ｃ）前記肉から食品を製造する
ステップを含む方法であって、前記ステップｂ）がステップｃ）の前、途中、後で行われる方法。
【請求項２】
脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を約１時間〜２４時間インキュベートする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を温度約１℃〜約９℃でインキュベートする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を温度約１℃〜約６℃でインキュベートする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を約１０時間〜約２４時間インキュベートする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を温度約６０℃〜約７０℃でインキュベートする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を温度約６０℃〜約６８℃でインキュベートする、請求項１、２又は６に記載の方法。
【請求項８】
脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を約３０分間〜約２時間インキュベートする、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を約１時間〜約１．５時間インキュベートする、請求項６、７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉及び／又は前記肉に由来する食品を、酵素を不活性化する温度まで、かつ、酵素を不活性化するのに十分な時間、さらに加熱する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉及び／又は前記肉に由来する食品を約８０℃〜約１４０℃の温度範囲まで加熱する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
脂質アシルトランスフェラーゼと接触させる肉が挽肉である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
食品が乳化肉食品である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
食品が肉を少なくとも１５％含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
肉ベース食品を製造するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
【請求項１６】
技術効果が、脂質アシルトランスフェラーゼで肉を処理しなかった比較肉ベース食品に比べ、肉ベース食品中のコレステロール量が減少していることである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
技術効果が、肉ベース食品において、脂質アシルトランスフェラーゼで肉を処理しなかった比較肉ベース食品に比べてテクスチャーを向上させ、及び／又は重量減を縮小させ、及び／又は脂肪安定性を向上させることのうちの１又は２以上である、請求項１５又は１６に記載の使用。
【請求項１８】
脂質アシルトランスフェラーゼが、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、かつ、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含む酵素であることを特徴とし、Ｘが、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、Ｓの１又は２以上である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法又は請求項１５若しくは１７に記載の使用。
【請求項１９】
「トランスフェラーゼ活性（％）の測定プロトコル」を用いて試験したときの、脂質アシルトランスフェラーゼの肉ベース食品中におけるトランスフェラーゼ活性が、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法又は請求項１５若しくは１７に記載の使用。
【請求項２０】
脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、配列番号２１、配列番号４７、配列番号２５、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６で示されるヌクレオチド配列のうちいずれか１つのヌクレオチド配列、又はこれら配列と７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を発現させることにより得られる、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法又は請求項１５若しくは１７に記載の使用。
【請求項２１】
脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、
ａ．配列番号２６で示される配列、若しくは配列番号２６と７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｂ．配列番号１５で示されるポリペプチド配列若しくは配列番号３７で示されるポリペプチド配列と、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸、又は
ｃ．配列番号２６で示されるヌクレオチド配列を含む核酸プローブと中程度のストリンジェンシー条件下でバイブリダイズする核酸
を発現させることにより得られる、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法又は請求項１５若しくは１７に記載の使用。
【請求項２２】
脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであり、前記ポリペプチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号４１、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４２、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号３７で示されるアミノ酸配列のうちいずれか１つのアミノ酸配列、又はこれら配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法又は請求項１５若しくは１７に記載の使用。
【請求項２３】
脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号３７で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３７と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法又は請求項１５若しくは１７に記載の使用。
【請求項２４】
脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号３７と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法又は請求項１５若しくは１７に記載の使用。
【請求項２５】
脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法又は請求項１５若しくは１７に記載の使用。
【請求項２６】
脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号３７で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法又は請求項１５若しくは１７に記載の使用。
【請求項２７】
コルステロールが減少した、又はコレステロールフリーの肉ベース食品であって、肉を少なくとも３０％と不活性化脂質アシルトランスフェラーゼとを含む肉ベース食品。
【請求項２８】
請求項１〜１４又は請求項１８〜２７のいずれかに記載の方法により得られる（例えば、得られた）肉ベース食品。
【請求項２９】
実施例及び図面に関連して本明細書で一般的に定義されている方法、使用又は肉ベース食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
以下の関連出願を参照する。米国特許出願公開第２００２／０００９５１８号明細書、米国特許出願公開第２００４−００９１５７４号明細書、国際公開第２００４／０６４５３７号明細書、国際公開第２００４／０６４９８７号明細書、国際公開第２００５／０６６３４７号明細書、国際公開第２００５／０６６３５１号明細書、２００６年２月２日に出願された米国特許出願第６０／７６４４３０号明細書、国際公開第２００６／００８５０８号明細書、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００５５８号明細書、米国特許出願第１１／６７１９５３号明細書、英国特許出願第０７１６１２６．８号明細書、英国特許出願第０７２５０３５．０号明細書、米国特許出願第１１／８５２２７４号明細書、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００６７６号明細書。これらの出願、及びこれらの出願で引用された各書類（出願引用書類）、並びに明細書中における又はそれら出願の審査過程における出願引用書類で参照若しくは引用された各書類、並びにそれらの審査過程で提出された特許性を裏付ける全ての意見、これら全てを本明細書で参照として援用する。
【０００２】
本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを用いて肉ベース食品のコレステロール含量を減少させる方法及び／又は肉ベース食品の特性を向上させる方法、並びにかかる方法から得られる肉ベース食品に関する。
【背景技術】
【０００３】
肉及びソーセージ製品の製造における主要な目標の一つは、添加した脂肪を乳化し、添加した水を肉マトリックスの活性タンパク質と結合（若しくは固定化）させることである。例えば、調理済ソーセージの製造技術では、リン酸及び塩等の添加剤を機械エネルギーに衝突させ、放出タンパク質を活性化する。そうして得られる最終品は、均一で、細かく切り刻まれ、滑らかなテクスチャーを有し、脂肪又は水を分離しなくても処理に耐え得、しっかりしたテクスチャーと噛み応えの良い製品となる（Feiner 2006 Meat products handbook. CRC Press, 239-312）。
【０００４】
肉製品の乳化を形成・安定化するための技術的対策、すなわち、原料品質のばらつき（例：肉色が淡く（Pale）、軟らかく（Soft）、水っぽい（Exudative）（ＰＳＥ）肉、肉色が濃く（Dark）、硬く（Firm）、乾燥している（Dry）（ＤＦＤ）肉）、レシピ、並びに時間や温度等の加工条件に関する技術的対策が好適に順守されない場合、不安定な製品が製造されることになり、もはや消費者の要求に応えることができない（Fischer et al., 1991 Finely comminuted liver sausage - How the normal commercial emulsifiers work. Fleischwirtsch 71, 780-783）。
【０００５】
このような肉原料における品質のばらつきを補うために肉及びソーセージの加工に乳化剤を使用することにより、最終品の品質の統一性を確保し、工業生産に伴う技術プロセスを容易にする（Nau & Adams, 1992 Emulsifiers for use in sausage and meat products. Food marketing & technology June, 13-20）。
【０００６】
滑らかなペースト状（fine paste）のソーセージやパテ等の高脂肪含量の乳化肉製品では、脂肪損失量を最小化し、目に見える脂肪の量を減らすために脂肪安定性をもたせることが望ましい。さらに、肉汁の損失量が少なく、風味、テクスチャー及び外観が許容範囲にあることが望ましい。これらの効果を得るために乳化剤を添加してもよく、最もよく知られている乳化剤として大豆タンパクやカゼイン塩ナトリウム等の単離タンパク質又はタンパク質濃縮物がある。しかし、これらのタンパク質の特徴として、比較的高価であり、また、肉製品に加えてもよい量が制限されているということがある。モノグリセリド、ジグリセリド及びクエン酸エステル等の添加剤もまた乳化剤として使用できるが（Varnam & Sutherland, 1995 Meat and meat products. Technology, chemistry and microbiology. Chapman & Hall Vol 3, 244-250）、それらを利用することは価格又は表示（すなわち、肉製品に添加剤無添加であると表示すること）の点から望ましくないことが多い。
【０００７】
酵素は食品への適用に有利であることが知られている。例えば脂質アシルトランスフェラーゼは、食品中で顕著なアシルトランスフェラーゼ活性を呈することが見い出されている。その活性は、食品の調製法に驚くほど有益に適用される（例えば国際公開第２００４／０６４５３７号を参照）。
【０００８】
肉ベース食品の調製において、一部の酵素では、それらを使用することにより不都合な結果が生じることがある。なぜなら、約１０℃〜約５５℃の間で酵素処理を行わないと酵素が不活性化し、又は最適に作用しないからである。しかし、かかる温度では、主要な腐敗細菌、病原体及び真菌（fungi）が増殖可能性である。したがって、風味、テクスチャー及び外観に伴う課題に対し、肉ベース食品加工中の腐敗細菌、病原体及び真菌の増殖を低減させる解決法を見い出すことが望ましい。
【０００９】
肉の消費及びコレステロール含量に関するデータから、一日あたりの推奨コレステロール摂取量の１／３〜１／２が肉でまかなわれていると推測される（Chizzolini et al., 1999 Calorific value and cholesterol content of normal and low-fat meat and meat products. Trends in food science and technology, 10, 119-128）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００４／０６４５３７号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Feiner 2006 Meat products handbook. CRC Press, 239-312
【非特許文献２】Fischer et al., 1991 Finely comminuted liver sausage - How the normal commercial emulsifiers work. Fleischwirtsch 71, 780-783
【非特許文献３】Nau & Adams, 1992 Emulsifiers for use in sausage and meat products. Food marketing & technology June, 13-20
【非特許文献４】Varnam & Sutherland, 1995 Meat and meat products. Technology, chemistry and microbiology. Chapman & Hall Vol 3, 244-250
【非特許文献５】Chizzolini et al., 1999 Calorific value and cholesterol content of normal and low-fat meat and meat products. Trends in food science and technology, 10, 119-128
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の一目的は、肉ベース食品中のコレステロールを減少させることである。コレステロールを減少させる他にも、または減少させることに加え、以下の特徴の１又は２以上の維持及び／又は向上が望ましい。かかる特徴とは、肉ベース食品中の脂肪損失量を最小化し、目に見える脂肪を減らせるような脂肪安定性、並びに風味、テクスチャー、重量減及び外観である。
【００１３】
別の目的は、腐敗細菌、病原体及び真菌の増殖能が低下した肉ベース食品を調製することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の態様は、特許請求の範囲及び以下の記載に示される。  
【００１５】
肉ベース食品調製用の肉に脂質アシルトランスフェラーゼを添加することにより、肉ベース食品中のコレステロール含量の顕著な減少が達成できることが驚くべきことに見い出された。さらに、そのような肉ベース食品中のコレステロール含量の減少が、テクスチャー、重量減、脂肪安定性（脂っぽさ及び／又は熱加工中の脂肪分離の低減を含む）、風味及び外観の１又は２以上に悪影響を及ぼすことなく達成されることが驚くべきことに見い出された。
【００１６】
さらに驚くべきことに、肉ベース食品調製用の肉に脂質アシルトランスフェラーゼを添加することにより、肉ベース食品中のコレステロール含量を顕著に減少させられるだけでなく、テクスチャーの向上、重量減の縮小、脂肪安定性の向上（脂っぽさ及び／又は熱加工中の脂肪分離の低減を含む）、風味、及び外観のうちの１又は２以上も達成されることが見い出された。
【００１７】
さらに驚くべきことに、肉ベース食品調製用の肉に脂質アシルトランスフェラーゼを添加することにより、その肉を低温（例えば１０℃未満）又は高温（例えば６５℃超）で、すなわち、腐敗細菌、病原体及び真菌の増殖が生じにくい温度で加工することができる。その結果、肉ベース食品の最終品に含まれる腐敗菌、病原体及び真菌を減少させ得る。
【００１８】
本発明の一実施形態では、
ａ）肉を脂質アシルトランスフェラーゼと接触させ、
ｂ）前記脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を温度約１℃〜約７５℃でインキュベートし、
ｃ）前記肉から食品を製造する
ステップを含み、ステップｂ）がステップｃ）の前、途中、後で行われる肉ベース食品の製造方法を提供する。  
【００１９】
本発明の別の実施形態では、肉ベース食品におけるコルステロール量を減少させ、及び／又は肉ベース食品における１又は２以上の特徴（例えばテクスチャーの向上、及び／又は重量減の縮小、及び／又は脂肪安定性の向上、及び／又は風味の向上、及び／又は外観の向上の１又は２以上）を向上させる方法において、
ａ）肉を脂質アシルトランスフェラーゼと接触させ、
ｂ）前記脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を約１℃〜約７５℃でインキュベートし、
ｃ）前記肉から食品を製造する
ステップを含み、ステップｂ）がステップｃ）の前、途中、後で行われる方法を提供する。
【００２０】
さらなる実施形態で本発明は、肉ベース食品を製造するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
【００２１】
さらなる実施形態で本発明は、肉ベース食品を製造するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用であって、その技術的効果が、肉ベース食品中のコレステロール量が、脂質アシルトランスフェラーゼで肉を処理しなかった比較肉ベース食品に比べて減少していることである使用を提供する。
【００２２】
さらなる実施形態で本発明は、肉ベース食品を製造するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用であって、その技術的効果が、肉ベース食品中のコレステロール量が脂質アシルトランスフェラーゼで肉を処理しなかった比較肉ベース食品に比べて減少していること、並びに／又は、脂質アシルトランスフェラーゼで肉を処理しなかった比較肉ベース食品に比べて前記肉ベース食品におけるテクスチャーが向上、及び／又は重量減が縮小、及び／又は脂肪安定性が向上、及び／又は風味が向上、及び／又は外観が向上しているうちの１又は２以上である使用を提供する。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態では、コルステロールが減少した、又はコレステロールを含まない肉ベース食品であって、少なくとも肉を３０％と不活性化脂質アシルトランスフェラーゼとを含む肉ベース食品を提供する。
【００２４】
本発明はまた、本発明の方法により得られる（例えば得られた）肉ベース食品を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
一実施形態では、肉を脂質アシルトランスフェラーゼ存在下で約３０分間〜２４時間インキュベートすることが好適であり、約１時間〜２１時間インキュベートすることが好適である。
【００２６】
別の実施形態では、約１０℃未満、例えば約１℃〜約９℃、好適には約１℃〜約６℃、好適には約２℃〜約６℃、好ましくは約２℃〜約５℃の温度で肉を脂質アシルトランスフェラーゼ存在下でインキュベートすることができる。
【００２７】
約１０℃未満、例えば約１℃〜約９℃、好適には約１℃〜約６℃、好適には約２℃〜約６℃、好ましくは約２℃〜約５℃の温度において脂質アシルトランスフェラーゼ存在下で肉をインキュベートする場合、かかる脂質アシルトランスフェラーゼは約１０時間〜約２４時間インキュベートすることが好ましい。
【００２８】
さらなる実施形態では、約６０℃〜約７５℃、好適には約６２℃〜約７０℃、好適には約６０℃〜約７８℃、好適には約６５℃〜約７０℃の温度において脂質アシルトランスフェラーゼ存在下で肉をインキュベートすることができる。
【００２９】
約６０℃〜約７５℃、好適には約６２℃〜約７０℃、好適には約６０℃〜約７８℃、好適には約６５℃〜約７０℃の温度において脂質アシルトランスフェラーゼ存在下で肉をインキュベートする場合、かかる脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉を約３０分間〜約２時間、好ましくは約１時間〜１．５時間インキュベートすることが好ましい。
【００３０】
一実施形態では、脂質アシルトランスフェラーゼと接触させた肉、及び／又はかかる肉から得た食品を、酵素を不活性化する温度まで（例えば約８０℃〜約１４０℃、好ましくは９０℃〜約１２０℃）、かつ、酵素を不活性化するのに十分な時間、さらに加熱する。
【００３１】
本明細書で使用される「インキュベートした／される（incubated）」又は「インキュベートする（incubating）」という用語は、酵素が活性な、すなわち、酵素が脂質アシルトランスフェラーゼ反応を行える（特に、酵素が脂肪酸をリン脂質供与体からコレステロール受容体に転移させることができる）条件下で肉と脂質アシルトランスフェラーゼとを保持することを意味する。本明細書で使用される「インキュベートした／される（incubated）」又は「インキュベートする（incubating）」という用語は、酵素が不活性な条件下、酵素が不活性化された条件下、及び／又は酵素が不活性化若しくは変性される過程にある条件下で肉及び酵素を保持することは包含しないものとする。
【００３２】
本発明のいくつかの態様では、「増加した／される（increased）」又は「減少・縮小した／される（reduced）」又は「向上した／される（improved）」（又は本明細書で使用されている他の相対的用語）という用語は、本発明に基づいて脂質アシルトランスフェラーゼで処理した肉又は肉ベース食品を、本発明に基づいて脂質アシルトランスフェラーゼで処理していない比較用肉又は比較用肉ベース食品（すなわち、同じ成分から同じ方法で作製したもの）と比較する用語である。
【００３３】
例えば本発明の一実施形態では、「コレステロール量を減少させる（reducing the amount of cholesterol）」又は「コレステロールが減少した（cholesterol reduced）」とは、同じ肉又は肉ベース食品（すなわち、同じ成分から同じ方法で作製したもの）だが本発明に基づいて脂質アシルトランスフェラーゼを加えなかったものと比べ、本発明に基づいて脂質アシルトランスフェラーゼで処理した肉又は肉ベース食品に含まれるコレステロールの量が減少していること又は低いことを意味する。
【００３４】
本発明に基づき脂質アシルトランスフェラーゼで処理していない同等の肉ベース食品と比較し、本発明の肉ベース食品ではコレステロールが少なくとも約１５％減少していることが好ましく、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、好適には少なくとも５０％若しくは少なくとも６０％減少していることが好ましい。
【００３５】
一実施形態では、肉ベース食品中のコレステロールが約４０％〜約７０％減少していることが好適である。  
【００３６】
本明細書で「コレステロール」に言及する場合、「遊離の非エステル化コレステロール」を意味する。したがって本明細書でコレステロール量の減少と言う場合、遊離の非エステル化コレステロールの量の減少のことを意味する。
【００３７】
一部の実施形態において、本発明による肉ベース食品は、「コレステロールフリー」であるとみなされ得る。「コレステロールフリー」という用語により、肉又は肉ベース食品中の全てのコレステロール若しくは実質的に全てのコレステロールがコレステロールエステルに転換されていることを意味する。一部の実施形態では、好適には８０％超、好適には９０％超の遊離の非エステル化コレステロールがコレステロールエステルに転換されていてよい。一実施形態では、「コレステロールフリー」製品は、遊離の非エステル化コレステロールの少なくとも９０％がコレステロールエステルに転換されている製品であってよい。  
【００３８】
一実施形態では、リン脂質（大豆及び／又は卵からのリン脂質等）を肉又は肉ベース食品に加えてもよい。リン脂質は、脂質アシルトランスフェラーゼによる処理の前、処理と同時に、又は処理の後に添加することができる。リン脂質の添加により、肉ベース食品中のコレステロール値がさらに低下することが好適である。
【００３９】
一部の実施形態では、本明細書で使用される相対的用語は、本発明に基づき脂質アシルトランスフェラーゼで処理した肉又は肉ベース食品を、脂質アシルトランスフェラーゼ以外の酵素で処理した同等の肉又は同等の肉ベース食品と比較する用語、例えば、Lecitase Ultra（登録商標）（デンマーク、Novozymes A/S社製）又はLipomod 699L（英国、Biocatalyst社製）等の従来のホスホリパーゼ酵素で処理した同等の肉又は同等の肉ベース食品と比較する用語である。
【００４０】
参照を容易にするために項目毎に適当な見出しをつけ、本発明における上述の態様、並びにさらなる態様を説明する。しかしながら各項目における教示は、各々特定の項目に必ずしも限定されるものではない。
【００４１】
トランスフェラーゼ活性（ＴｒＵ）を測定するためのトランスフェラーゼアッセイ（コレステロール：リン脂質）
基質：コレステロール（Sigma C8503）５０ｍｇ及び大豆ホスファチジルコリン（ＰＣ）（Avanti #441601）４５０ｍｇをクロロホルムに溶解し、このクロロホルムを４０℃で真空蒸発させた。
【００４２】
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに、ＰＣ及びコレステロールを９：１で３００ｍｇ、４０℃下で分散させた。
【００４３】
酵素法（Enzymation）
基質２５０μｌを蓋付グラスに４０℃下で加える。
酵素溶液２５μｌを加え、撹拌しながら４０℃で１０分間インキュベートする。
【００４４】
本アッセイでは、添加した酵素によりコレステロールの２〜５％がエステル化されるものとする。
【００４５】
また、酵素溶液の代わりに水２５μｌを用いたブランクを分析する。
【００４６】
１０分後、ヘキサンとイソプロパノールを３：２の割合で５ｍｌ加える。
【００４７】
ステアリン酸コレステリル（Sigma C3549）を較正標準に用いるＨＰＴＬＣにより、コレステロールエステルの量を分析する。
【００４８】
トランスフェラーゼ活性は、アッセイ条件下における１分あたりのコレステロールエステル形成量として計算する。
【００４９】
１トランスフェラーゼユニット（ＴｒＵ）は、前記トランスフェラーゼアッセイに基づき、４０℃及びｐＨ７において１分間あたりに産出されるコレステロールエステルのμｍｏｌ量と定義する。
【００５０】
本発明の方法及び使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼの酵素１ｍｇあたりの特異的トランスフェラーゼユニット（ＴｒＵ）は、酵素タンパク質１ｍｇあたり少なくとも２５ＴｒＵであることが好ましい。
【００５１】
本発明で用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、肉ベース食品１ｇあたり０．０５〜５０ＴｒＵの量で投与されることが好適であり、肉ベース食品１ｇあたり０．５〜５ＴｒＵの量で投与されることが好適である。
【００５２】
インキュベーション時間は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、２０％、２５％、２６％、２８％、３０％、４０％、５０％、６０％又は７５％のトランスフェラーゼ活性を確保するのに有効な時間であることが好適である。
【００５３】
トランスフェラーゼ活性（％）（% transferase activity：すなわち、全酵素活性に対する割合としてのトランスフェラーゼ活性）は以下のプロトコルに従って測定できる。
【００５４】
トランスフェラーゼ活性（％）の測定プロトコル
肉試料を凍結乾燥し、乾燥試料をコーヒーミルで粉砕した。クロロホルム−メタノール（２：１）を用い、乾燥肉パウダー０．５ｇを３０分間抽出した。有機相を分離し、ＧＬＣ分析に供した。
【００５５】
ＧＬＣ分析
ＷＣＯＴ融合シリカカラム１２．５ｍ×０．２５ｍｍ（ＩＤ：内径）×０．１μ（フィルム厚）、５％フェニル−メチル−シリコン（CP Sil 8 CB、Chrompack社製）を備えたPerkin Elmer Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph。
キャリアガス：ヘリウム
インジェクター：ＰＳＳＩコールドスプリット注入（初期温度５０℃から３８５℃に昇温）、容積１．０μｌ
検出器ＦＩＤ：３９５℃
オーブンプログラム（２００３年１０月３０日以来使用）：１    ２     ３
オーブン温度、℃：                                    ９０  ２８０  ３５０
等温、時間、分：                                      １     ０     １０
温度率、℃／分：                                      １５   ４  
【００５６】
試料の調製：内部標準としてヘプタデカン０．５ｍｇ／ｍｌを含有するヘプタン−ピリジン（２：１）０．５ｍｌに肉試料から抽出した脂質を溶解した。試料溶液３００μｌをクリンプバイアルに移し、ＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセアミド）３００μｌを加え、６０℃で２０分間反応させる。
【００５７】
計算：遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、コレステロール、パルミチン酸コレステリル及びステアリン酸コレステリルの反応係数を純粋基準材料から測定した。
【００５８】
遊離脂肪酸、コレステロール及びコレステロールエステルの反応係数に基づき、肉試料中のこれら成分の量（％）を計算した。
【００５９】
肉製品中の脂質アシルトランスフェラーゼのトランスフェラーゼ活性（％）は、酵素処理肉におけるコレステロール減少量を、酵素で処理しなかった同じ肉製品におけるコレステロール量に対する割合（％）として計算した。
【００６０】
例：
対照肉製品：０．０７５％コレステロール
脂質アシルトランスフェラーゼ処理した肉製品：０．０３０％コレステロール
トランスフェラーゼ活性＝（０．０７５−０．０３０）×１００／０．０７５＝６０％トランスフェラーゼ活性。
【００６１】
肉ベース食品
本発明の肉ベース食品は肉を原料（based on meat）とする任意の製品である。  
【００６２】
肉ベース食品は、食物及び／又は飼料としてヒト及び／又は動物が摂取するのに適している。本発明の一実施形態において肉ベース食品は、ペットフード製品等、動物に給餌するための餌製品である。本発明の別の実施形態において肉ベース食品は、ヒト用の食品である。
【００６３】
肉ベース食品は、例えば、水、塩、小麦粉、乳タンパク質、植物性タンパク質、澱粉、タンパク質加水分解物、リン酸、酸、スパイス、着色剤、及び／又はテクスチャー化剤等の肉以外の成分を含んでいてもよい。
【００６４】
本発明の肉ベース食品は、肉を５〜９０％（重量／重量）含むことが好ましい。一部の実施形態で肉ベース食品は、少なくとも３０％（重量／重量）、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％の肉を含むことができる。
【００６５】
一部の実施形態で肉ベース食品は、例えば、ハム、ロイン、ピクニックショルダー、ベーコン及び／又は豚三枚肉といった調理済み肉である。  
【００６６】
肉ベース食品は、以下の１又は２以上であってよい。
乾燥又は半乾燥塩漬肉−発酵製品など、乾燥塩漬けしてスターターカルチャーと共に発酵させた、例えば、ドライソーセージ、サラミ、ペパロニ、ドライハム；
モルタデッラ、フランクフルトソーセージ、ランチョンミート及びパテといった乳化肉製品（例えば冷温摂取用又は高温摂取用）；
海老、サーモン、改質された（reformulated）魚製品、冷凍保冷魚等の魚及び魚介類；
全注入肉筋等の新鮮肉筋、例えばロイン、ショルダーハム、マリネ肉；
新鮮挽肉及び／又は再構成された新鮮肉−又は低温硬化ジェル又は低温硬化結合剤によりアップグレードされたカット肉等の改質肉、例えば、生で未調理のロインチョップ、ステーキ、ロースト、フレッシュソーセージ、ビーフバーガー、ミートボール、ペルメニ；
鶏肉製品−鶏胸肉、七面鳥胸肉又は改質鶏肉、例えば、チキンナゲット及び／又はチキンソーセージ；
レトルト製品−加熱殺菌された肉製品、例えば、ピクニックハム、ランチョンミート、乳化製品。
【００６７】
本発明の一実施形態において、肉ベース食品は、例えばソーセージ、ボローニャ、ミートローフ、粉砕肉製品、挽肉、ベーコン、ポロニー、サラミ又はパテなどの加工肉製品である。
【００６８】
加工肉製品は、例えば肉ベースエマルジョンから製造された乳化肉製品であり、例えば、モルタデッラ、ボローニャ、ペペロニ、レバーソーセージ、チキンソーセージ、ウィンナー、フランクフルトソーセージ、ランチョンミート、ミートパテである。  
【００６９】
肉ベースエマルジョンは、例えば焼型に入れて、或いはプラスチック、コラーゲン、セルロース若しくは天然ケーシング等のケーシングに詰めて、調理、殺菌、又は焼成してもよい。加工肉製品は、例えば再構成ハムのような再構成肉製品であってもよい。本発明の肉製品は、例えば、振り塩（dry salting）等の塩処理、塩水による塩漬け等の塩漬処理、乾燥処理、スモーク処理、発酵処理、調理、缶詰加工、レトルト加工、スライス処理、及び／又は破砕処理といった加工工程に供してもよい。
【００７０】
一実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼと接触させる肉は、挽肉であってもよい。
【００７１】
別の実施形態において、食品は乳化肉製品である。
【００７２】
肉
本明細書で用いる「肉（meat）」という用語は、任意の種類の動物の任意の種類の組織を意味する。
【００７３】
本明細書で用いる肉という用語は、動物に由来する筋繊維を含む組織であってもよい。肉は動物の筋肉であってもよく、例えば、動物の全筋、又は動物の筋肉から切除するピースでもよい。
【００７４】
別の実施形態では、肉には動物の体内臓器、例えば心臓、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺及び脳といった動物の体内臓器が含まれていてもよい。
【００７５】
肉という用語は、当技術分野で知られている何らかの他の手法により、挽き砕かれ、挽肉にされ、又は細かいピースに切り分けられた肉を包含する。
【００７６】
肉は、牛、豚、ラム、羊、山羊、鶏、七面鳥、オーストリッチ、キジ、鹿、ヘラジカ、トナカイ、バッファロー、バイソン、アンテロープ、ラクダ、カンガルー等の任意の種類の動物、スプラット、タラ、コダラ、マグロ、アナゴ、サケ、ニシン、イワシ、サバ、アジ、サンマ、ウルメイワシ、タラコ、ヒラメ／カレイ（flatfish）、アンチョビ、マイワシ、ブタスダラ（blue whiting）、パシフィックホワイティング、トラウト、ナマズ、スズキ、カラフトシシャモ、マカジキ、レッドスナッパー、ノルウェーポウト（Norway pout）及び／又はメルルーサ等の任意の種類の魚、アサリ、ムール貝、ホタテ、ザルガイ、タマキビ、カタツムリ、カキ、エビ、ロブスター、アカザエビ、カニ、ザリガニ、コウイカ、イカ及び／又はタコ等の任意の種類の甲殻類に由来することができる。
【００７７】
一実施形態において肉は、牛肉、豚肉、鶏肉、ラム肉及び／又は七面鳥である。  
【００７８】
脂質アシルトランスフェラーゼ
いくつかの態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘモチーフ及び／又はＧＡＮＤＹモチーフを含んでいてもよい。  
【００７９】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素はアシルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含む酵素として特徴付けられ、かかるＧＤＳＸモチーフにおいてＸは、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ及びＳの１又は２以上である。
【００８０】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列又は脂質アシルトランスフェラーゼが、アエロモナス（Aeromonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、ラクトコッカス（Lactococcus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、デサルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、バチルス（Bacillus）、カンピロバクター（Campylobacter）、ビブリオナシエ（Vibrionaceae）、キシレラ（Xylella）、スルフォロブス（Sulfolobus）、アスペルギルス（Aspergillus）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、リステリア（Listeria）、ナイセリア（Neisseria）、メソルヒゾビウム（Mesorhizobium）、ラルストニア（Ralstonia）、ザントモナス（Xanthomonas）及びカンジダ（Candida）のうちの１又は２以上の属の生物から得ることができ、好ましくは得られたことが好適である。脂質アシルトランスフェラーゼが、アエロモナス属の生物から得ることができる、好ましくは得られたことが好ましい。      
【００８１】
本発明のいくつかの態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０で示されるアエロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列におけるＮ−８０に対応する位置にアスパラギン酸残基を有する脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【００８２】
本発明のいくつかの態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号２０で示されるアエロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列におけるＮ−８０に対応する位置にアスパラギン酸残基を有する脂質アシルトランスフェラーゼである。
【００８３】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号３７、配列番号１５、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号４１、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４２、配列番号１９及び配列番号２０で示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又はこれら配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００８４】
さらに、又はそれに代わり、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７で示されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と７５％以上の相同性（homology）を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることが好適である。  
【００８５】
さらに、又はそれに代わり、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列と７５％以上の相同性を有するアミノ酸を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることが好適である。
【００８６】
一実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３７又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又はかかるアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性（identity）を有するアミノ酸配列を含む。
【００８７】
一実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号２６で示されるヌクレオチド配列によりコードされるか、かかる配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる。
【００８８】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、天然の脂質アシルトランスフェラーゼ又は脂質アシルトランスフェラーゼ変異体をコードする。
【００８９】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、天然の脂質アシルトランスフェラーゼ又は脂質アシルトランスフェラーゼ変異体であってよい。
【００９０】
例えば、本発明で用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、国際公開第２００４／０６４５３７号、同２００４／０６４９８７号、同２００５／０６６３４７号、又は同２００６／００８５０８号に記載の配列であってよい。これらの書類は参照として本明細書に援用される。
【００９１】
本明細書で用いる「脂質アシルトランスフェラーゼ」という用語は、アシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素（一般的にE.C.2.3.1.x（例えば2.3.1.43）として分類される）を意味することが好ましく、かかる酵素は、脂質のアシル基をコレステロール等のステロールに転移させることができる。
【００９２】
好ましくは、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質（本明細書中で定義）のアシル基をステロール（例えばコレステロール）に転移させることができる脂質アシルトランスフェラーゼである。
【００９３】
別の形態では、本発明の方法及び／又は使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質のアシル基をステロール（例えばコレステロール）に転移させることができるだけでなく、さらに、脂質のアシル基を炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット及びグリセロールのうちの１又は２以上に転移させることもできる。
【００９４】
好ましくは、脂質アシルが作用する脂質基質は、レシチン（例えばホスファチジルコリン及び／又はホスファチジルエタノールアミン）等のリン脂質のうちの１又は２以上の脂質である。
【００９５】
かかる脂質基質は、本明細書において「脂質アシル供与体」として言及される場合がある。本明細書で使用するレシチンという用語は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン及びホスファチジルグリセロールを包含する。
【００９６】
上述したとおり、本発明の方法に用いるのに適したその他のアシルトランスフェラーゼは、ｐＦａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号１）とアラインメントさせることにより、及び／又はＧＤＳｘアシルトランスフェラーゼ（例えば配列番号２８）とアラインメントさせることにより、ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴ各ブロックの存在を同定することにより同定できる。そのようなアシルトランスフェラーゼが本発明で用いることに適しているかどうかを評価するため、すなわち、全酵素活性の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、並びにより好ましくは少なくとも９８％が、トランスフェラーゼ活性である酵素を同定するため、上述した「トランスフェラーゼ活性（％）の測定プロトコル」を使ってこれらのアシルトランスフェラーゼを試験する。
【００９７】
いくつかの態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリド及び／又は２−モノグリセリドに作用し得ない、又は実質的に作用し得ない脂質アシルトランスフェラーゼであることが好ましい。
【００９８】
いくつかの態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリアシルグリセロールリパーゼ活性を示さない脂質アシルトランスフェラーゼ（E.C.3.1.1.3）、又は顕著なトリアシルグリセロールリパーゼ活性を示さない脂質アシルトランスフェラーゼ（E.C.3.1.1.3）であることが好ましい。
【００９９】
トリグリセリドに対する加水分解能（E.C.3.1.1.3の活性）は、食品化学規格（Food Chemical Codex（3rd Ed., 1981, pp492-493））に基づき、この規格のオリーブ油とｐＨ６．５をヒマワリ油とｐＨ５．５に変更し、リパーゼ活性により測定できる。リパーゼ活性は、ＬＵＳ（lipase units sunflower）として測定し、１ＬＵＳは、上記アッセイ条件下においてヒマワリ油から１分間あたり１ｍｏｌの脂肪酸を放出できる酵素の量として定義される。或いは、国際公開第９８／４５４５３号で定義されているＬＵＴアッセイを使用してもよい。この文献は参照として本明細書で援用される。
【０１００】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドに実質的に作用することができず、そのＬＵＳ／ｍｇが、１０００未満、例えば５００未満、３００未満、好ましくは２００未満、より好ましくは１００未満、より好ましくは５０未満、より好ましくは２０未満、より好ましくは１０未満、５未満、２未満、より好ましくは１未満である脂質アシルトランスフェラーゼである。或いは、ＬＵＴ／ｍｇ活性は、ＬＵＴ／ｍｇとして５００未満、３００未満、好ましくは２００未満、より好ましくは１００未満、より好ましくは５０未満、より好ましくは２０未満、より好ましくは１０未満、５未満、２未満、より好ましくは１未満である。
【０１０１】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、モノグリセリドに実質的に作用することができない脂質アシルトランスフェラーゼである。これは、ＬＵＳアッセイにおけるヒマワリ油の代わりにモノオレイン酸（Ｍ７７６５、１−オレオイル−ｒａｃ−グリセロール ９９％）を用いて測定できる。１ＭＧＨＵは、上記アッセイ条件下においてモノグリセリドから１分間あたり１ｍｏｌの脂肪酸を放出できる酵素の量として定義される。
【０１０２】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、好ましくは実質的にトリグリセリドに作用することができず、そのＭＧＨＵ／ｍｇが、５０００未満、例えば１０００未満、例えば５００未満、３００未満、好ましくは２００未満、より好ましくは１００未満、より好ましくは５０未満、より好ましくは２０未満、より好ましくは１０未満、５未満、２未満、より好ましくは１未満である脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１０３】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、ホスホリパーゼＡ２（E.C.3.1.1.4）の活性及び／又はホスホリパーゼＡ１（E.C.3.1.1.32）の活性のうちの１又は２以上のホスホリパーゼ活性を示すことができる脂質アシルトランスフェラーゼであることが好適である。脂質アシルトランスフェラーゼは、ホスホリパーゼＢ（E.C.3.1.1.5）の活性も有していてよい。
【０１０４】
したがって、一実施形態において本発明の「アシル受容体」は、植物ステロール／スタノール、好ましくはコレステロールである。
【０１０５】
脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の基準によって特徴付けることが好ましい。
脂質アシル供与体が元々有するエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新たなエステルを形成するエステル転移活性として定義されるアシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素であり、かつ、
アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、Ｘが、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳのうちの１又は２以上である酵素であること。
【０１０６】
ＧＤＳＸモチーフは、４個の保存アミノ酸で構成されている。当該モチーフ内のセリンは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の触媒セリンであることが好ましい。ＧＤＳＸモチーフのセリンが、Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064)に教示されるアエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＳｅｒ−１６に対応する位置に存在していることが好適である。
【０１０７】
タンパク質が、本発明のＧＤＳＸモチーフを有しているかどうかを決定するには、その配列を、本明細書に参照として援用される国際公開第２００４／０６４５３７号又は同２００４／０６４９８７号において教示されている手順に従い、ｐｆａｍデータベースの隠れマルコフモデルプロフィール（ＨＭＭプロフィール）と比較することが好ましい。
【０１０８】
脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を用いてアラインメントさせることができることが好ましい（詳細な説明については国際公開第２００４／０６４５３７号又は同２００４／０６４９８７号を参照のこと）。
【０１０９】
ｐｆａｍ００６５７ドメインファミリーの隠れマルコフモデルプロフィール（ＨＭＭプロフィール）とのポジティブマッチは、本発明によるＧＤＳＬ又はＧＤＳＸドメインの存在を示すことが好ましい。
【０１１０】
本発明の方法又は使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼをＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列とアラインメントさせたときに、かかる脂質アシルトランスフェラーゼが、ＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック、ＨＰＴブロックのうち少なくとも１個、好ましくは２個以上、好ましくは３個以上を有することが好ましい。脂質アシルトランスフェラーゼはＧＤＳｘブロック及びＧＡＮＤＹブロックを有することが好適である。或いは、脂質アシルトランスフェラーゼはＧＤＳｘブロック及びＨＰＴブロックを有することができる。脂質アシルトランスフェラーゼは少なくともＧＤＳｘブロックを含むことが好ましい。詳細については国際公開第２００４／０６４５３７号又は同２００４／０６４９８７号を参照されたい。
【０１１１】
ＧＡＮＤＹモチーフの残基は、ＧＡＮＤＹ、ＧＧＮＤＡ、ＧＧＮＤＬから選択されることが好ましく、ＧＡＮＤＹであることが最も好ましい。
【０１１２】
ｐｆａｍ００６５７ＧＤＳＸドメインは特殊な識別子であり、このドメインを有するタンパク質を他の酵素から識別する。
【０１１３】
ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を図３に配列番号２として示す。この配列は、ｐｆａｍファミリー００６５７（データベースバージョン６）の同定に基づき、本明細書ではｐｆａｍ００６５７．６とも記す。
【０１１４】
このコンセンサス配列は、ｐｆａｍデータベースからの今後の公開を受けて更新することができる（例えば国際公開第２００４／０６４５３７号又は同２００４／０６４９８７号を参照のこと）。
【０１１５】
一実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の基準によって特徴付けられる脂質アシルトランスフェラーゼである。
（ｉ）脂質アシル供与体が元々有するエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新たなエステルを形成するエステル転移活性として定義されるアシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である
（ii）アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、Ｘが、アミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ及びＳのうちの１又は２以上である酵素である
（iii）Ｈｉｓ−３０９を含み、又は図２及び４（配列番号１又は３）に示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を有する酵素である。  
【０１１６】
ＧＤＳＸモチーフのアミノ酸残基がＬであることが好ましい。  
【０１１７】
配列番号３又は配列番号１において、最初の１８個のアミノ酸残基はシグナル配列を構成している。完全長配列、すなわちシグナル配列を含むタンパク質のＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、すなわちシグナル配列を含まない配列のＨｉｓ−２９１と同じである。
【０１１８】
一実施形態において、本発明の方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６及びＨｉｓ−３０９からなる触媒的３つ組を含む脂質アシルトランスフェラーゼ、或いは図４（配列番号３）又は図２（配列番号１）で示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素中のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６及びＨｉｓ−３０９に対応する位置にそれぞれセリン残基、アスパラギン酸残基及びヒスチジン残基を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。上述したとおり、配列番号３又は配列番号１で示される配列中、最初の１８個のアミノ酸残基はシグナル配列を構成する。完全長配列、すなわちシグナル配列を含むタンパク質のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６及びＨｉｓ−３０９は、かかるタンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＳｅｒ−１６、Ａｓｐ−２８８、及びＨｉｓ−２９１と同じである。図３（配列番号２）に示すｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列における活性部位の残基は、Ｓｅｒ−７、Ａｓｐ−３４５及びＨｉｓ−３４８に対応している。
【０１１９】
一実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の基準によって特徴付けられる脂質アシルトランスフェラーゼである。
第１の脂質アシル供与体が元々有するエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移して新たなエステルを形成するエステル転移活性として定義されるアシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素であり、かつ、
少なくともＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９を含み、又は配列番号３若しくは配列番号１で示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素中のＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６及びＨｉｓ−３０９にそれぞれ対応する位置にグリシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸及びヒスチジンの各残基を有する酵素であること。
【０１２０】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号２１、配列番号４７、配列番号２５、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号５２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６で示されるヌクレオチド配列のいずれか１つ、又はこれら配列と７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を発現させることにより得られるポリペプチドであることが好適である。
【０１２１】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされることが好適である。
（ａ）配列番号２１で示されるヌクレオチド配列（図２１参照）
（ｂ）配列番号４７で示されるヌクレオチド配列（図６０参照）
（ｃ）配列番号２５で示されるヌクレオチド配列（図２５参照）
（ｄ）配列番号４８で示されるヌクレオチド配列（図５０参照）
（ｅ）配列番号５０で示されるヌクレオチド配列（図６３参照）
（ｆ）配列番号５１で示されるヌクレオチド配列（図６４参照）
（ｇ）配列番号２６で示されるヌクレオチド配列（図３９参照）
（ｈ）配列番号２７で示されるヌクレオチド配列（図４０参照）
（ｉ）配列番号２８で示されるヌクレオチド配列（図４１参照）
（ｊ）配列番号３８で示されるヌクレオチド配列（図５１参照）
（ｋ）配列番号３９で示されるヌクレオチド配列（図５２参照）
（ｌ）配列番号４０で示されるヌクレオチド配列（図５３参照）
（ｍ）配列番号２９で示されるヌクレオチド配列（図４２参照）
（ｎ）配列番号３０で示されるヌクレオチド配列（図４３参照）
（ｏ）配列番号３１で示されるヌクレオチド配列（図４４参照）
（ｐ）配列番号５２で示されるヌクレオチド配列（図６５参照）
（ｑ）配列番号３２で示されるヌクレオチド配列（図４５参照）
（ｒ）配列番号３３で示されるヌクレオチド配列（図４６参照）
（ｓ）配列番号３４で示されるヌクレオチド配列（図４７参照）
（ｔ）配列番号３５で示されるヌクレオチド配列（図４８参照）
（ｕ）配列番号３６で示されるヌクレオチド配列（図４９参照）
（ｖ）配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１又は配列番号５２で示される配列のいずれか１つと、７０％以上、好ましくは７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
（ｘ）配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１又は配列番号５２で示される配列のいずれか１つと遺伝コード同一性の縮重によって関連付けられる核酸。
【０１２２】
ヌクレオチド配列が、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１又は配列番号５２で示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有することが好適である。
【０１２３】
一実施形態において、本発明の方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３５及び配列番号３６で示される配列のいずれか１つと７０％以上、好ましくは７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。かかるヌクレオチド配列が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３５及び配列番号３６で示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有することが好適である。
【０１２４】
一実施形態において、本発明の方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２６で示される配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。
【０１２５】
好適には、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のアミノ酸配列の１又は２以上を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
（ｉ）配列番号３７で示されるアミノ酸配列
（ii）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（iii）配列番号３で示されるアミノ酸配列
（iv）配列番号４で示されるアミノ酸配列
（ｖ）配列番号５で示されるアミノ酸配列
（vi）配列番号６で示されるアミノ酸配列
（vii）配列番号７で示されるアミノ酸配列
（viii）配列番号８で示されるアミノ酸配列
（ix）配列番号９で示されるアミノ酸配列
（ｘ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列
（xi）配列番号１１で示されるアミノ酸配列
（xii）配列番号１２で示されるアミノ酸配列
（xiii）配列番号１３で示されるアミノ酸配列
（xiv）配列番号１４で示されるアミノ酸配列
（xv）配列番号１５で示されるアミノ酸配列
（xvi）配列番号１８で示されるアミノ酸配列
（xvii）配列番号１９で示されるアミノ酸配列
（xviii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列
（xix）配列番号２１で示されるアミノ酸配列
（xx）配列番号２２で示されるアミノ酸配列
（xxi）配列番号２３で示されるアミノ酸配列
（xxii）配列番号２４で示されるアミノ酸配列
（xxiii）配列番号４１で示されるアミノ酸配列
（xxiv）配列番号３７、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４又は配列番号４１で示される配列のいずれか１つと７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【０１２６】
好適には、本発明の方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３７、配列番号３、配列番号４、配列番号１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１９又は配列番号２０で示されるアミノ酸配列、或いは配列番号３７、配列番号３、配列番号４、配列番号１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１９又は配列番号２０で示されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１２７】
好適には、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３７、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号４１、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１９又は配列番号２０で示されるいずれか１つの配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１２８】
好適には、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のアミノ酸配列の１又は２以上を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
（ａ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基１〜１００で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基１０１〜２００で示されるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基２０１〜３００で示されるアミノ酸配列
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）で定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【０１２９】
好適には、本発明の方法及び使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のアミノ酸配列の１又は２以上を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
（ａ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基２８〜３９で示されるアミノ酸配列  
（ｂ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基７７〜８８で示されるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基１２６〜１３６で示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基１６３〜１７５で示されるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基３０４〜３１１で示されるアミノ酸配列
（ｆ）前記（ａ）〜（ｅ）で定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【０１３０】
一態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、欧州特許第１２７５７１１号に教示されるカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）から得る脂質アシルトランスフェラーゼである。したがって、一態様において本発明の方法及び使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４２に教示されるアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１３１】
より好ましくは、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１５又は配列番号３７で示されるアミノ酸配列、或いは配列番号１５又は配列番号３７と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、又はさらにより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。かかる酵素は、酵素変異体であるとみなすことができる。
【０１３２】
一態様において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）又はその変異体（例えば分子進化法により作製された変異体）である脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１３３】
好適なＬＣＡＴは当技術分野で公知であり、例えば、哺乳動物、ラット、マウス、ニワトリ、キイロショウジョウバエ、植物（シロイヌナズナ、コメ等）、線虫、真菌、酵母のうち１又は２以上の生物から得ることできる。
【０１３４】
一実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、pPet12aAhydro及びpPet12aASalmoを保持する大腸菌ＴＯＰ１０株から得ることができる、好ましくは得られた脂質アシルトランスフェラーゼである。かかるプラスミドpPet12aAhydro及びpPet12aASalmoは、Danisco  A/S（ＤＫ−１００１デンマーク国コペンハーゲン市Ｋランゲブロガード１）により、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき２００３年１２月２２日に、National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria（ＮＣＩＭＢ、英国スコットランド アバディーン市マハルストリート２３）にそれぞれ受託番号ＮＣＩＭＢ４１２０４及びＮＣＩＭＢ４１２０５として寄託された。
【０１３５】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、リン脂質グリセロールアシルトランスフェラーゼである。リン脂質グリセロールアシルトランスフェラーゼには、アエロモナスｓｐｐ、好ましくはアエロモナス・ヒドロフィラ又はアエロモナス・サルモニシダ、最も好ましくはアエロモナス・サルモニシダ又はその変異体から単離されるものが含まれる。
【０１３６】
本発明で用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１、３、４、１４、１９及び２０によってコードされる。当業者には、トランスフェラーゼの発現過程においてアシルトランスフェラーゼのシグナルペプチドが開裂されていることが好ましいと理解されるであろう。配列番号１、３、４及び１４のシグナルペプチドは、１〜１８位のアミノ酸である。したがって、最も好ましい領域は、配列番号１及び３（アエロモナス・ヒドロフィラ）では１９〜３３５位のアミノ酸であり、配列番号４及び１４（アエロモナス・サルモニシダ）では１９〜３３６位のアミノ酸である。アミノ酸配列同士の同一性のホモロジー判定に用いる場合、本明細書に記載されるアラインメントについては成熟配列を用いることが好ましい。
【０１３７】
したがって、相同性（同一性）を判定する上で最も好ましい領域は、配列番号１及び３（アエロモナス・ヒドロフィラ）では１９〜３３５位のアミノ酸であり、配列番号４及び１４（アエロモナス・サルモニシダ）では１９〜３３６位のアミノ酸である。配列番号１９及び２０は、アエロモナス・ヒドロフィラ及びアエロモナス・サルモニシダからそれぞれ得られる脂質アシルトランスフェラーゼ成熟タンパク質配列である。これら配列にはさらなる翻訳後修飾が加えられていても、加えられていなくてもよい。
【０１３８】
本発明の方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、サーモビフィダ、好ましくはサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）からも単離される脂質アシルトランスフェラーゼである。配列番号４３にコードされる脂質アシルトランスフェラーゼであることが最も好ましい。
【０１３９】
本発明及び／又は本発明の方法に基づいて使用される好適な脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、及び／又は以下のヌクレオチド配列にコードされる脂質アシルトランスフェラーゼである。
ａ）脂質アシルトランスフェラーゼ活性を示し、配列番号１５又は配列番号３７で示されるポリペプチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するポリペプチドをコードする核酸；
ｂ）配列番号１５又は配列番号３７で示されるアミノ酸配列、或いは配列番号１５又は配列番号３７と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む（からなる）（単離された）ポリペプチド；
ｃ）脂質アシルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、配列番号２６で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２６で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む（からなる）核酸；
ｄ）配列番号２６で示されるヌクレオチド配列を含む核酸プローブと中程度又は高度なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸であって、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードする核酸；
ｅ）前記ａ）、ｃ）又はｄ）で特定された核酸配列の断片である核酸；又は
ｆ）前記ｂ）で特定されたポリペプチドの断片であるポリペプチド。
【０１４０】
本発明の方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、ストレプトミセス、好ましくはストレプトミセス・アベリミチリス（S. avermitilis）であってもよく、配列番号３２にコードされる脂質アシルトランスフェラーゼであることが最も好ましい。ストレプトミセスから得られ、本発明で使用できるその他の酵素としては、配列番号５、６、９、１０、１１、１２、１３、３１、３３及び４１にコードされるものが含まれる。
【０１４１】
本発明で用いる酵素は、コルネバクテリウム、好ましくはコルネバクテリウム・エフィシエンス（C. efficiens）から単離されるものでもよく、配列番号１８にコードされる酵素であることが最も好ましい。
【０１４２】
好適には、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号２２、２３、２４、４８、４４、５０若しくは５３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又はこれらアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼ、或いは配列番号３６、３９、４２、４４、４６若しくは４８で示されるヌクレオチド配列のいずれか１つ、又はかかるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１４３】
さらなる実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号２２、２３、２４、４３、４５、４９若しくは５３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又はかかるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼ、或いは配列番号２５、４７、４８、５０若しくは５１で示されるヌクレオチド配列のいずれか１つ、又はかかるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するヌクレオチド配列にコードされる脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１４４】
さらなる実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、本明細書記載の使用に用いるため、配列番号２３、２４、４５、４９若しくは５３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又はかかるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１４５】
さらなる実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、本明細書記載の使用に用いるため、配列番号２３、４５若しくは５３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又はかかるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１４６】
より好ましくは一実施形態において、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１４７】
一実施形態において本発明の脂質アシルトランスフェラーゼは、ストレプトミセス株Ｌ１３０又はＬ１３１から得ることができる、好ましくは得られた脂質アシルトランスフェラーゼである。ストレプトミセス株Ｌ１３０又はＬ１３１は、Danisco  A/S（ＤＫ−１００１デンマーク国コペンハーゲン市Ｋランゲブロガード１）により、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき２００４年６月２５日に、National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria（ＮＣＩＭＢ、英国スコットランド アバディーン市マハルストリート２３）にそれぞれ受託番号ＮＣＩＭＢ４１２２６及びＮＣＩＭＢ４１２２７として寄託された。
【０１４８】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いるのに適した脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Align X（デフォルト設定を用いるVectorNTI、Clustal Wペアワイズアラインメントアルゴリズム）を使用してＬ１３１配列（配列番号２２）とアラインメントさせることにより同定できるアミノ酸配列である。
【０１４９】
Ｌ１３１と、ストレプトミセス・アベリミチリス及びサーモビフィダ・フスカから得られるホモログとをアラインメントさせることにより、ＧＤＳｘモチーフ（Ｌ１３１、ストレプトミセス・アベリミチリス及びサーモビフィダ・フスカのＧＤＳＹ）、ＧＡＮＤＹボックス（ＧＧＮＤＡ又はＧＧＮＤＬのいずれか）、並びにＨＰＴブロック（保存触媒ヒスチジン）が保存されていることが示される。図２６中、これら３つの保存ブロックが強調されている。
【０１５０】
ｐｆａｍのＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列（国際公開第０４／０６４９８７に記載のとおり）及び／又は本明細書で開示されているＬ１３１配列（配列番号２２）とアラインメントさせることにより、３つの保存領域、すなわちＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック及びＨＴＰブロックを同定することができる（詳細については国際公開第０４／０６４９８７を参照のこと）。
【０１５１】
ｐｆａｍのＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列（国際公開第０４／０６４９８７に記載のとおり）及び／又は本明細書で開示されているＬ１３１配列（配列番号２２）とアラインメントさせる場合、
ｉ）本発明の方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、ＧＤＳｘモチーフ、より好ましくはＧＤＳＬ及びＧＤＳＹモチーフから選択されるＧＤＳｘモチーフを有する脂質アシルトランスフェラーゼである。及び／又は
ii）本発明の方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、ＧＡＮＤＹブロック、より好ましくはＧＧＮＤｘ（より好ましくはＧＧＮＤＡ又はＧＧＮＤＬ）を含むＧＡＮＤＹブロックを有する脂質アシルトランスフェラーゼである。及び／又は
iii）本発明の方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、好ましくはＨＴＰブロックを有する脂質アシルトランスフェラーゼである。好ましくは、
iv）本発明の方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、ＧＤＳｘ又はＧＤＳＹモチーフ、アミノＧＧＮＤｘ（好ましくはＧＧＮＤＡ又はＧＧＮＤＬ）を含むＧＡＮＤＹブロック、並びにＨＴＰブロック（保存ヒスチジン）を好ましくは有する脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１５２】
一実施形態において本発明の酵素は、E.C.3.1.1.32に分類されるホスホリパーゼＡ１、又はE.C.3.1.1.4に分類されるホスホリパーゼＡ２等のホスホリパーゼ酵素ではないことが好ましい。
【０１５３】
［発明の効果］
本発明の利点の一つは、本発明に従い脂質アシルトランスフェラーゼを使用すると、肉ベース食品中のコレステロールを減少させることができる点にある。
【０１５４】
本発明のさらなる利点は、肉ベース食品中の脂肪損失量を最小化して目に見える脂肪を減らせるような脂肪安定性、風味、テクスチャー、重量減、及び外観のうち１又は２以上の特性を維持及び／又は向上させつつ、肉ベース食品中のコレステロールを減少させることにある。
【０１５５】
本発明のさらなる目標は、脂肪安定性が向上し（すなわち目に見える脂肪の量の減少、及び／又は脂っぽさの低減、及び／又は熱加工中の脂肪分離の低減）、及び／又はテクスチャーが向上し、及び／又は重量減が縮小した肉ベース食品を製造することにある。
【０１５６】
本発明の別の利点は、肉及び／又は肉ベース食品中の腐敗細菌、病原体及び真菌の加工過程における増殖が低減若しくは最小限に保たれるような方法であることである。
【０１５７】
本発明のさらなる利点として（例えば滑らかなペースト状のソーセージやパテ等の脂肪含有量の高い乳化肉製品と共に用いる場合）、脂肪安定性が向上して脂肪損失量が最小化され、目に見える脂肪の量が減少する点があげられる。また、肉汁の損失量も少なく保たれ、及び／又は風味、テクスチャー及び／又は外観が受け入れられるものである。
【０１５８】
脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質及び／又はトリグリセリド及び／又はガラクトリピドのｓｎ−２エステル結合をコレステロール等のアシル受容体に転移させ、その結果、リゾリン脂質及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリド及び／又はリゾガラクトリピドのそれぞれと、コレステロールエステルとが形成される（ホスホリパーゼを例にとり、図６７で説明）。このトランスフェラーゼにより、疎水性リゾリン脂質の放出が減少して水溶性リゾリン脂質の放出が増え（基質がリン脂質の場合）、水性相中のユニマー（unimer）濃度が高くなるために動的表面活性が亢進する。
【０１５９】
脂質アシルトランスフェラーゼは、その乳化性の他にも、コレステロールエステルを産生することにより、肉中のコレステロール値を減少させることもできる（すなわち、コレステロールをアシル受容体として用いてコレステロールエステルを形成し、「遊離の」コレステロールの量を減少させる）。ポリ不飽和脂肪酸及びコレステロールは、肉製品の調製中及び長期貯蔵中に酸化する可能性がある。かかる酸化により、多数の化合物（ヒドロペルオキシド、アルデヒド、ケトン、オキシステロール等のコレステロール酸化物）が産生し、その一部は、突然変異作用、発癌作用及び細胞毒性を示すと考えられている（Jimenez-Colmenero et al 2001: Healthier meat and meat products: their role as functional foods. Meat science 59, 5-13）。したがって、コレステロールを減少させると、コレステロールが酸化するときに形成される潜在的に有害な化合物を減少させることができるので有利である。さらに、肉ベース食品は、健康的な食事として推奨されることの多い低コレステロール製品となるため、コレステロールを減少させるための食事療法の一部として用いることができる。
【０１６０】
本発明のさらなる利点は、熱安定性が向上（強化）した肉又は肉ベース食品が得られる点にある。
【０１６１】
宿主細胞
本発明で用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、宿主細胞又は宿主生物中で組換え法により作製できる。
【０１６２】
宿主生物は、原核生物又は真核生物であってよい。
【０１６３】
本発明の一実施形態において、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼは、バチルスｓｐｐ（例えばバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）宿主細胞）などの細菌細胞等の宿主細胞において発現される。
【０１６４】
その他の宿主細胞としては、真菌、酵母、又は植物が例示できる。
【０１６５】
バチルス・リケニホルミス宿主細胞を使用すると、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等の他の生物を用いるときに比べ、脂質アシルトランスフェラーゼの発現量が増えることが見い出されている。
【０１６６】
アエロモナス・サルモニシダの脂質アシルトランスフェラーゼは、バチルス・ズブチリス、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）及びアスペルギルス・ツビゲンシス（Aspergillus tubigensis）のそれぞれの発現に最適なように設計された数多くの従来の発現ベクターに挿入されてきた。しかし、ハンセヌラ・ポリモルファ、シゾサッカロミセス・ポンベ及びアスペルギルス・ツビゲンシスで検出された発現レベルは非常に低かった。その発現レベルは、１μｇ／ｍｌ未満であり、商業製造を開始するために十分量のタンパク質を生成する細胞を選択することは不可能だった（結果は示さず）。他方、バチルス・リケニホルミスを使用すると、経済的に実現可能な製造という点で魅力的な量のタンパク質を生産することができた。
【０１６７】
特に、バチルス・リケニホルミスにおける発現は、ａｐｒＥプロモーターの制御下でバチルス・ズブチルスにおける発現の約１００倍のレベルであり、Ａ４プロモーターの制御下でセルロースに融合させたときのストレプトミセス・リビダンス（S.lividans）における発現の約１００倍のレベルであることが示されている（結果は本明細書に示さず）。
【０１６８】
宿主細胞は、バチルス・ズブチルス以外の任意のバチルス細胞であってよい。かかるバチルス宿主細胞は、バチルス・リケニホルミス、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・クラウシ（B. clausii）、バチルス・コアグランス（B. coagulans）、バチルス・ファームス（B. firmus）、バチルス・ロータス（B. lautus）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・プミルス（B. pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）のいずれかの種であることが好ましい。
【０１６９】
本発明に関連して「宿主細胞」という用語には、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む任意の細胞、或いは本明細書で定義される発現ベクターであって、本明細書で定義する具体的特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼの組換え法による産生に用いられる発現ベクターを含む任意の細胞が含まれる。
【０１７０】
宿主は、プロテアーゼ欠損株若しくはプロテアーゼマイナス株及び／又はα−アミラーゼ欠損株若しくはα−アミラーゼマイナス株であることが好適である。
【０１７１】
本明細書で用いられる「異種（heterologous）」という用語は、別の遺伝源又は別の種に由来する配列を意味する。異種配列は、非宿主配列、修飾配列、異なる宿主細胞株からの配列、又は宿主細胞の異なる染色体位置からの同種（homologous）配列である。
【０１７２】
「同種配列」は、同じ遺伝源又は同じ種における配列、すなわち宿主細胞と関連のある種で天然に生じる配列である。
【０１７３】
本明細書で用いる「組換え脂質アシルトランスフェラーゼ」という用語は、かかる脂質アシルトランスフェラーゼが遺伝子組換え法により作製されたことを意味する。例えば、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列をクローニングベクターに挿入し、異種脂質アシルトランスフェラーゼが存在することにより特徴付けられるバチルス・リケニホルミス細胞を得る。
【０１７４】
調節配列
一部の適用例において、本発明の方法及び／又は使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼ配列は、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を調節配列に作動可能に連結（operably linking）させることにより得られる。調節配列は、例えば選択した宿主細胞（バチルス・リケニホルムス細胞等）により、ヌクレオチド配列を発現させることができる。
【０１７５】
例えば、そのような調節配列に作動可能に連結した本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、すなわち発現ベクターが用いられる。
【０１７６】
「作動可能に連結」という用語は、記載の各要素が、その意図どおりに機能できるような関係で並置されていることを示す。コード配列に「作動可能に連結」した調節配列は、そのコード配列が制御配列と同等の条件下で発現されるような方法でライゲーションされる。
【０１７７】
「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現調節シグナルが含まれる。
【０１７８】
「プロモーター」という用語は、当技術分野の通常の意味で使用され、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０１７９】
本明細書で定義する具体的特性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の発現増強は、調節領域を選択することによっても、もたらされる。かかる調節領域の例としては、前記酵素を天然状態でコードするヌクレオチド配列における調節領域ではないプロモーター領域、分泌リーダー領域、及びターミネーター領域が挙げられる。
【０１８０】
本発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動可能に結合していることが好適である。
【０１８１】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ターミネーター配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していることが好適である。本発明のベクター、宿主細胞、方法及び／又は使用のいずれか１つに用いるのに好適なターミネーター配列の例としては、α−アミラーゼターミネーター配列（例えば、CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTTCATAAA−配列番号５７）、アルカリプロテアーゼのターミネーター配列（例えば、CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA−配列番号５８）、グルタミン酸特異的ターミネーター配列（例えば、ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTATTATTGT−配列番号５９）、レバナーゼ（levanase）ターミネーター配列（例えば、TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT−配列番号６０）、及びズブチリシンＥターミネーター配列（例えば、GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG−配列番号６１）が挙げられる。
【０１８２】
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼターミネーター等のα−アミラーゼターミネーターに作動可能に連結することが好適である。
【０１８３】
プロモーター
本発明に基づいて用いるプロモーター配列は、脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列と異種又は同種であってよい。
【０１８４】
プロモーター配列は、選択した宿主細胞において脂質アシルトランスフェラーゼの発現を誘導できるものであれば任意のプロモーター配列でよい。
【０１８５】
プロモーター配列は、バチルス・リケニホルミス等のバチルス種と同種であることが好適である。プロモーター配列が、選択した宿主細胞と同種であることが好ましい。
【０１８６】
プロモーター配列が宿主細胞と同種であることが好適である。「宿主細胞と同種である」とは、宿主生物内で発生することを意味する。すなわちプロモーター配列が宿主生物に天然に備わっていることを意味する。
【０１８７】
好適には、プロモーター配列は、α−アミラーゼプロモーター、プロテアーゼプロモーター、ズブチリシンプロモーター、グルタミン酸特異的プロテアーゼプロモーター及びレバンスクラーゼプロモーターをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される。
【０１８８】
好適には、プロモーター配列は、ＬＡＴ（例えばバチルス・リケニホルミスから得るα―アミラーゼプロモーター、ＡｍｙＬとしても知られる）、ＡｐｒＬ（例えばズブチリシンCarlbergプロモーター）、ＥｎｄｏＧｌｕＣ（例えばバチルス・リケニホルミスのグルタミン酸特異的プロモーター）、ＡｍｙＱ（例えばバチルス・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼプロモーター）及びＳａｃＢ（例えばバチルス・ズブチリスのレバンスクラーゼプロモーター）をコードするヌクレオチド配列である。
【０１８９】
本発明の方法において核酸配列の転写を誘導するのに適した他のプロモーターの例としては、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）のアルカリプロテアーゼ遺伝子プロモーター（ａｐｒＨ）、バチルス・ズブチルスのα−アミラーゼ遺伝子プロモーター（ａｍｙＥ）、バチルス・ステアロサーモフィルスのマルトジェニックアミラーゼ遺伝子プロモーター（ａｍｙＭ）、バチルス・リケニホルミスのペニシリナーゼ遺伝子プロモーター（ｐｅｎＰ）、バチルス・ズブチリスのｘｙｌＡ遺伝子プロモーター及びｘｙｌＢ遺伝子プロモーター、及び／又はバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）亜種テネブリオニス（tenebrionis）のＣｒｙIIIＡ遺伝子プロモーターが挙げられる。
【０１９０】
好ましい実施形態においてプロモーター配列は、α−アミラーゼプロモーターである（バチルス・リケニホルミスのα−アミラーゼプロモーター等）。好ましくは、プロモーター配列は、バチルス・リケニホルミスのα−アミラーゼプロモーターにおける−３５〜−１０配列を含む（図５３及び５５を参照）。
【０１９１】
「−３５〜−１０配列」は、転写開始部位に対する位置を示す。「−３５」と「−１０」は何れもボックス、すなわち各々６個のヌクレオチドを含む複数のヌクレオチドであり、これらのボックスの間には１７個のヌクレオチドがある。これら１７個のヌクレオチドは、通常「スペーサー」と呼ばれる。上記に関し、図５５中、−３５と−１０のボックスに下線を付して示す。疑義を生じさせないため、本明細書中で、「−３５〜−１０配列」という用語を用いる場合、それは、−３５ボックスの開始点から−１０ボックスの終点までを指し、すなわち−３５ボックスと、１７ヌクレオチド長のスペーサーと、−１０ボックスとが含まれる。
【０１９２】
シグナルペプチド
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を発現させることにより宿主細胞で産生される脂質アシルトランスフェラーゼは、用いる配列及び／又はベクターに応じ、分泌されてもよく、或いは細胞内で保持されていてもよい。
【０１９３】
シグナル配列は、コード配列の特定の細胞膜を通過する分泌誘導に用いられる。シグナル配列は、天然配列又は脂質アシルトランスフェラーゼコード配列に対する外来配列であってよい。例えば、シグナルペプチドコード配列は、バチルス種、好ましくはバチルス・リケニホルミスのアミラーゼ遺伝子又はプロテアーゼ遺伝子から得ることができる。
【０１９４】
好適なシグナルペプチドコード配列は、マルトジェニックα−アミラーゼ遺伝子、ズブチリシン遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、中性プロテアーゼ遺伝子、ｐｒｓＡ遺伝子、及び／又はアシルトランスフェラーゼ遺伝子のうち１又は２以上から得ることができる。
【０１９５】
シグナルペプチドは、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ、アエロモナスアシルトランスフェラーゼ（例えば、mkkwfvcllglialtvqa−配列番号５４）、バチルス・ズブチルスのズブチリシン（例えば、mrskklwisllfaltliftmafsnmsaqa−配列番号５５）、又はバチルス・リケニホルミスのズブチリシン（例えば、mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa−配列番号５６）のシグナルペプチドであることが好ましい。シグナルペプチドが、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼのシグナルペプチドであることが好適である。
【０１９６】
しかし、発現された脂質アシルトランスフェラーゼを、選択したバチルス宿主細胞（好ましくはバチルス・リケニホルミス宿主細胞）の分泌経路に誘導できるシグナルペプチドコード配列であれば任意の配列を使用してよい。
【０１９７】
本発明の一部の実施形態において、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、選択した脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結させてもよい。
【０１９８】
選択した脂質アシルトランスフェラーゼは、融合タンパク質として本明細書で定義する宿主細胞中で発現させてもよい。
【０１９９】
発現ベクター
「発現ベクター」という用語は、in vivo又はin vitroでの発現が可能な構築物を意味する。
【０２００】
発現ベクターは、バチルス・リケニホルミス宿主等の生物のゲノム中に組み込まれることが好ましい。「組み込まれる（incorporated）」という用語は、好ましくはゲノム中への安定な組込みを包含する。
【０２０１】
本明細書で定義する脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列はベクター内に存在させてもよく、そのベクター内で前記ヌクレオチド配列を調節配列に作動可能に連結させ、その調節配列が適切な宿主生物（バチルス・リケニホルミス等）でかかるヌクレオチド配列を発現させる。すなわち、かかるベクターは発現ベクターである。
【０２０２】
本発明のベクターは、上述したように適切な宿主細胞に形質転換され、本明細書で定義する脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現させる。
【０２０３】
プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージベクター又はゲノムインサート等、ベクターの選択は、ベクターを導入する宿主細胞に応じて決定されることが多い。本発明は、同等な機能をもち、当技術分野で公知の又は公知になった他の形態の発現ベクターも包含する。
【０２０４】
ベクターが選択した宿主細胞に形質転換されると、そのベクターは宿主細胞のゲノムとは無関係に複製し、機能する。或いは、ベクターはゲノム自体に組み込まれる。
【０２０５】
ベクターは、１又は２以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んでいてもよい。マーカー遺伝子は、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリンへの耐性など、抗生物質耐性を付与する遺伝子等である。或いは、かかる選択は、同時形質転換によっても行うことができる（国際公開第９１／１７２４３号に記載のとおり）。
【０２０６】
ベクターは、例えば、ＲＮＡを産生するためにin vitroで、又は宿主細胞にトランスフェクト又は形質転換させるために用いることができる。
【０２０７】
ベクターはさらに、対象の宿主細胞内におけるベクターの複製を可能とするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。かかる配列としては、pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1及びpIJ702の各プラスミドの複製起点が例示できる。
【０２０８】
脂質アシルトランスフェラーゼ変異体
一実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼ、又は本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、脂質アシルトランスフェラーゼ変異体をコードする配列であるか、又は脂質アシルトランスフェラーゼ変異体である。
【０２０９】
リン脂質に対するトランスフェラーゼ活性が亢進しているなど、リン脂質に対する活性が亢進した変異体が用いられる。
【０２１０】
脂質アシルトランスフェラーゼ変異体を作製するために脂質アシルトランスフェラーゼを改変（modify）する好適な方法は、国際公開第２００５／０６６３４７号（本明細書に参照として組み込まれている）に教示されている。
【０２１１】
改変の好ましい一例はＮ８０Ｄである。特に、配列番号２０の配列をバックボーンとして用いるときに好ましい。したがって配列は、配列番号１５又は配列番号３７でもよい。この改変は、１又は２以上のさらなる改変と組み合わせてもよい。
【０２１２】
上述したとおり、本明細書で具体的なアミノ酸残基に言及する場合、その番号は、配列番号１９又は配列番号２０で示される基準配列と変異配列をアラインメントさせたときに得られる番号である。
【０２１３】
より好ましくは、本発明の方法及び使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列、配列番号３７で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１６若しくは配列番号６８と、７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質をコードすることができる。この酵素は、酵素変異体とみなされる。
【０２１４】
定義
本明細書で用いる「トランスフェラーゼ」という用語は、「脂質アシルトランスフェラーゼ」という用語と置き換えることができる。  
【０２１５】
本明細書で定義する脂質アシルトランスフェラーゼは、エステル交換反応（interesterification）、エステル転移反応（transesterification）、アルコール分解反応、加水分解反応のうち、１又は２以上の反応を触媒することが好適である。
【０２１６】
「エステル交換反応」という用語は、アシル基が酵素に触媒されて脂質供与体と脂質受容体との間で転移することを指し、ここで脂質供与体は遊離のアシル基ではない。
【０２１７】
本明細書で用いる「エステル転移反応」という用語は、アシル基が、酵素に触媒されて脂質供与体（遊離脂肪酸以外）からアシル受容体（水以外）に転移することを意味する。本発明の方法及び／又は使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、好ましくは脂質（好ましくはリン脂質）とステロール（好ましくはコレステロール）とのエステル転移反応が生じるような脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０２１８】
本明細書で用いる「アルコール分解」という用語は、酸誘導体の共有結合が、アルコールＲＯＨとの反応により酵素的に開裂し、一方の産物がアルコールのＨと結合し、他方の産物がアルコールのＯＲ基と結合することを指す。
【０２１９】
本明細書で用いる「加水分解」という用語は、アシル基が、酵素に触媒されて脂質から水分子のＯＨ基に転移することを指す。
【０２２０】
他の酵素との組合せ
好ましい一実施形態では、脂質アシルトランスフェラーゼを、グリコリパーゼ（E.C.3.1.1.26）活性、ホスホリパーゼＡ２（E.C.3.1.1.4）活性、ホスホリパーゼＡ１（E.C.3.1.1.32）活性の酵素活性のうち１又は２以上を有するリパーゼと組み合わせて用いる。好適には、リパーゼ酵素は当技術分野で周知であり、例えば、ホスホリパーゼＡ１LECITASE（登録商標）ULTRA（デンマーク、Novozymes A/S社製）、ホスホリパーゼＡ２（例えば、Biocatalysts社製LIPOMOD（登録商標）２２ＬのホスホリパーゼＡ２、Genecor社製LIPOMAX（登録商標）及びLYSOMAX PLA2（登録商標））といったリパーゼが挙げられる。
【０２２１】
一部の実施形態では、脂質アシルトランスフェラーゼをホスホリパーゼと併用することが有益であり得る。ホスホリパーゼとしては、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣ及び／又はホスホリパーゼＤ等が挙げられる。
【０２２２】
併用は、連続して、又は同時に行うことができ、例えば、さらなる酵素処理の前に、又は処理の間に脂質アシルトランスフェラーゼ処理を行うことができる。
【０２２３】
或いは、さらなる酵素処理は、脂質アシルトランスフェラーゼ処理の前に、又は後で行うことができる。
【０２２４】
連続酵素処理の場合、一部の実施形態では、使用した第１の酵素を除去することが有利であり、例えば第２（及び／又は第３など）の酵素による処理の前に、熱不活化により、又は固定化酵素を使用することにより除去する。
【０２２５】
転写後及び翻訳後修飾
本発明の脂質アシルトランスフェラーゼは、本明細書で教示するヌクレオチド配列のいずれか１つにコードされることが好適である。
【０２２６】
転写後及び／又は翻訳後修飾は、使用した宿主細胞の種類に応じて行う。本発明の方法及び／又は使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、転写後及び／又は翻訳後修飾を受けた脂質アシルトランスフェラーゼを包含する。
【０２２７】
単なる例として、本明細書において配列番号２６（図３９を参照）で示されるヌクレオチド配列を宿主細胞（例えばバチルス・リケニホルミス）で発現させることにより、転写後及び／又は翻訳後修飾が生じ、本明細書において配列番号３７（図５０を参照）で示されるアミノ酸配列がもたらされる。
【０２２８】
配列番号３７は、翻訳後及び／又は転写後修飾を受けて３８個のアミノ酸が除去されている以外は、配列番号１５（本明細書中の図１）と同じである。
【０２２９】
単離
一態様において脂質アシルトランスフェラーゼは、回収／単離された脂質アシルトランスフェラーゼである。したがって、産生された脂質アシルトランスフェラーゼは単離形態の脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０２３０】
別の態様において、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、単離形態の脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０２３１】
「単離された」という用語は、配列又はタンパク質が、天然状態で見い出されるときに天然状態では生来会合（associated）している少なくとも１つの他の成分を、少なくとも実質的に含んでいないことを意味する。
【０２３２】
精製
一態様において脂質アシルトランスフェラーゼは、精製形態の脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０２３３】
別の態様において、本発明で用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、精製形態のヌクレオチド配列である。
【０２３４】
「精製された」という用語は、配列が比較的純粋な、例えば少なくとも約５１％純粋な、少なくとも約７５％純粋な、少なくとも約８０％純粋な、少なくとも約９０％純粋な、少なくとも約９５％純粋な、又は少なくとも約９８％純粋な状態にあることを意味する。
【０２３５】
本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のクローニング
本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチド、又は改変に適したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、かかるポリペプチドを産生する任意の細胞又は生物から単離することができる。ヌクレオチド配列を単離する方法としては多くの方法が当技術分野で周知である。
【０２３６】
例えば、ゲノムＤＮＡライブラリー及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、そのポリペプチドを産生する生物の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを使用して構築することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列が公知の場合は、標識化オリゴヌクレオチドプローブを合成し、このプローブを使用して前記生物から調製したゲノムライブラリーの中から前記ポリペプチドをコードするクローンを同定する。或いは、ポリペプチドをコードするクローンを同定するために、別の公知のポリペプチド遺伝子と相同であり、かつ、標識化オリゴヌクレオチドプローブを含む配列を使用することもできる。後者の場合、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件には低いストリンジェンシー条件を用いる。
【０２３７】
或いは、ポリペプチドをコードするクローンは、ゲノムＤＮＡの断片をプラスミド等の発現ベクターに挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーを酵素陰性バクテリアに形質転換し、次に形質転換したバクテリアを前記ポリペプチドによって阻害される酵素を含む寒天上に播種し、同定すべきポリペプチドをクローンを用いて発現させることにより同定できる。
【０２３８】
さらに或いは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、確立している標準的な方法により合成的に調製することができる。かかる標準的な方法としては例えば、Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869に記載のホスホロアミダイト法、又はMatthes et al (1984) EMBO J. 3, p 801-805に記載の方法がある。ホスホロアミダイト法では、ＤＮＡ自動合成装置などを用いてオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、アニーリングを行い、ライゲーションを行い、適切なベクターにクローニングする。
【０２３９】
ヌクレオチド配列は、標準的手法により合成、ゲノム又はｃＤＮＡに起源をもつ断片を（適宜）ライゲーションすることによって調製されたゲノム−合成起源混合、合成−ｃＤＮＡ起源混合、又はゲノム−ｃＤＮＡ起源混合とすることができる。ライゲーションされた各断片は、ヌクレオチド配列全体の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列は、例えば米国特許第４６８３２０２号又はSaiki R K et al （Science (1988) 239, pp 487-491）に記載のとおり、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって調製することもできる。
【０２４０】
ヌクレオチド配列
本発明は、本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本明細書で使用される「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及びその変異体、ホモログ、断片及び（その一部であるなどの）誘導体を意味する。ヌクレオチド配列は、ゲノム起源、合成起源又は組換え起源とすることができ、２本鎖であっても、センス鎖又はアンチセンス鎖いずれかの１本鎖であってもよい。
【０２４１】
本発明に関して「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。この用語はＤＮＡ、より好ましくはコード配列のｃＤＮＡを意味する。
【０２４２】
好ましい実施形態において、天然環境にある天然ヌクレオチド配列が生来関連している配列（やはり天然環境にある）に連結している場合、そのような天然ヌクレオチド配列は、本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列自体に含まれない。参照を容易にするために、本発明者らはこの好ましい実施形態を「非天然（non-native）ヌクレオチド配列」と称する。この点で、「天然（native）ヌクレオチド配列」という用語は、その天然環境にあるヌクレオチド配列全体を意味し、それが生来関連しているプロモーター全体に動作可能に連結されるときには、そのプロモーターも天然環境にあることになる。したがって、ヌクレオチド配列が天然の生物内にあっても、そのヌクレオチド配列が前記生物内でそのヌクレオチド配列が生来関連しているプロモーターの制御下にない場合には、そのヌクレオチド配列によって本発明のポリペプチドを発現させることができる。
【０２４３】
ポリペプチドは、天然ポリペプチドではないことが好ましい。この点で、「天然ポリペプチド」という用語は、天然環境にあり、その天然ヌクレオチド配列によって発現されたポリペプチド全体を意味する。
【０２４４】
一般に、本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ法を用いて調製される（すなわち、組換えＤＮＡ）。しかし、本発明の別の実施形態においては、かかるヌクレオチド配列は、当分野で周知の化学的方法によって全体的又は部分的に合成することができる（Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23及びHorn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232参照）。
【０２４５】
分子進化
酵素をコードするヌクレオチド配列が単離されると、又は酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が同定されると、選択したヌクレオチド配列を改変することが望ましい場合もあり、例えば、本発明による酵素を調製するために配列を突然変異させることが望ましい場合もある。
【０２４６】
突然変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
【０２４７】
適切な方法は、Morinaga et al （Biotechnology (1984) 2, p646-649）に開示されている。酵素をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入する別の方法は、Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)に記載されている。
【０２４８】
上述したような部位特異的突然変異誘発の代わりに、例えば、Stratagene社製のGeneMorph PCR突然変異誘発キット、Clontech社製Diversify PCRランダム突然変異誘発キット等の市販キットを用いて、突然変異をランダムに導入することができる。欧州特許第０５８３２６５号は、ＰＣＲに基づく突然変異誘発の最適化法に関し、この方法は欧州特許第０８６６７９６号に記載されているような突然変異原性ＤＮＡアナログの使用と組み合わせることもできる。変異性ＰＣＲ（error prone PCR）法は、好ましい特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼ変異体の作製に適している。国際公開第０２０６４５７号は、リパーゼの分子進化について言及している。
【０２４９】
新規配列を得る第３の方法は、任意数の制限酵素又はDnaseI等の酵素を用いて、異なるヌクレオチド配列を断片化し、機能タンパク質をコードする完全ヌクレオチド配列を再構築する方法である。或いは、１又は２以上の異なるヌクレオチド配列を用い、完全ヌクレオチド配列が再構築される間に突然変異を導入することができる。ＤＮＡシャフリング及びファミリーシャフリング法は、好ましい特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼ変異体を作製するのに適している。「シャフリング」を実施する適切な方法は、欧州特許第０７５２００８号、同第１１３８７６３号、同第１１０３６０６号に示されている。シャフリングは、米国特許第６１８０４０６号及び国際公開第０１／３４８３５号に記載された別の形態のＤＮＡ突然変異誘発と組み合わせることもできる。
【０２５０】
したがって、多数の部位特異的又はランダムな突然変異をヌクレオチド配列中にin vivo又はin vitroでもたらし、続いて、コードされたポリペプチドにおける改良された機能性を種々の手段によってスクリーニングすることができる。例えば、コンピュータ（in silico）及びエキソ媒介（exo mediated）による組換え法（国際公開第００／５８５１７号、米国特許第６３４４３２８号、米国特許第６３６１９７４号参照）を用い、作製された変異体が公知の酵素又はタンパク質に対して極めて低い相同性を有する分子進化を行うことができる。そうして得られる変異体は、公知のトランスフェラーゼ酵素と構造が著しく類似しているものの、極めて低いアミノ酸配列相同性を有することができる。
【０２５１】
また、非限定的な例として、ポリヌクレオチド配列の突然変異体又は自然変異体を、野生型又は他の突然変異体又は自然変異体と組み換えることにより、新しい変異体を作製することができる。このような新規変異体も、コードされたポリペプチドにおける改良された機能性をスクリーニングすることができる。
【０２５２】
前記及び類似の分子進化方法を採用することにより、タンパク質の構造又は機能の予備知識がなくても、好ましい特性を有する本発明における酵素の変異体の同定及び選択を行うことができ、予測不可能であるが有益な突然変異体又は変異体を作製することができる。当技術分野では、酵素活性を最適化又は変化させるために分子進化法を採用した多数の例がある。このような例としては、宿主細胞中又はin vitroにおける最適化された発現及び／又は活性、酵素活性の亢進、基質及び／又は産物の特異性の変化、酵素安定性又は構造安定性の増大又は低下、好ましい環境条件（例えば温度、ｐＨ、基質等）における酵素活性／酵素特異性の変化のうち１又は２以上が挙げられるが、これらに限定されることはない。  
【０２５３】
当業者には明らかなことであるが、分子進化ツールを使用して酵素を変化させることにより、酵素の機能を改善することができる。  
【０２５４】
本発明において使用される脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、脂質アシルトランスフェラーゼ変異体をコードすることが好適である。すなわち、脂質アシルトランスフェラーゼは、親酵素と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸の置換、欠失又は付加を含むことが好適である。変異体酵素は、親酵素と少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の相同性を保持する。適切な親酵素としては、エステラーゼ又はリパーゼ活性を有する任意の酵素が含まれる。親酵素は、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列とアラインメントさせることが好ましい。  
【０２５５】
好ましい実施形態において脂質アシルトランスフェラーゼ酵素変異体は、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列中のＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロック中のアミノ酸残基の少なくとも１又は２以上を保持し、又は組み込む。
【０２５６】
本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、極性脂質、好ましくはリン脂質及び／又は糖脂質に対する酵素活性が親酵素に比べて高い変異体である脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることが好適である。このような変異体は、リゾ極性脂質に対しては低い活性を有するか、又は活性を有さないことが好ましい。
【０２５７】
脂質アシルトランスフェラーゼ変異体は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対する活性が親酵素に比べて低くてもよい。
【０２５８】
酵素変異体は、トリグリセリド及び／又はモノグリセリド及び／又はジグリセリドに対して活性を有さないことが好適である。
【０２５９】
或いは、酵素変異体は、熱安定性が亢進していてもよい。  
【０２６０】
酵素変異体は、極性脂質、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、糖脂質、ジガラクトシルモノグリセリド、モノガラクトシルモノグリセリドのうち１又は２以上に対しても高い活性を有していてもよい。
【０２６１】
脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は公知であり、かかる変異体の１又は２以上は、本発明の方法及び使用、及び／又は本発明の酵素組成物に用いるのに適している。単なる例として、脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は、以下の参考文献、Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269(3):2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996 Apr; 178 (7): 2060-4; Peelman et al Protein Sci. 1998 Mar; 7(3):587-99に記載されており、本発明に用いることができる。
【０２６２】
アミノ酸配列
本発明はまた、本発明の方法及び／又は使用のいずれか１つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の使用も包含する。
【０２６３】
本明細書において「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語、及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である場合もある。
【０２６４】
アミノ酸配列は適切な起源から調製／単離してよく、又は合成してもよく、又は組換えＤＮＡ法を用いて調製してもよい。
【０２６５】
アミノ酸配列は、本明細書に教示される単離ポリペプチドから標準的な手法によって得ることが好適である。
【０２６６】
単離ポリペプチドからアミノ酸配列を決定する適切な方法の１つに以下の方法がある。
【０２６７】
精製ポリペプチドは凍結乾燥させることができ、その凍結乾燥材料１００μｇを８Ｍのウレアと０．４Ｍの炭酸水素アンモニウムとの混合物（ｐＨ８．４）５０μｌに溶解させる。溶解したタンパク質に、窒素オーバーレイを行い、４５ｍＭのジチオスレイトール５μｌを添加した後に、１５分間５０℃で変性及び還元する。室温まで冷却し、１００ｍＭのヨードアセトアミド５μｌを添加し、窒素下、暗所にて室温で１５分間システイン残基を誘導体化する。
【０２６８】
水１３５μｌ、及びエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ ５μｇの水溶液（５μｌ）を上記反応混合物に添加し、窒素下３７℃で２４時間消化することができる。
【０２６９】
得られたペプチドは、逆相ＨＰＬＣによって、VYDAC C18カラム（０．４６×１５ｃｍ；１０μｍ；The Separation Group社（米国カリフォルニア））上で、溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、及び溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液を用いて分離することができる。選択されたペプチドについて、同じ溶媒系を用い、Develosil C18カラム上にて再度クロマトグラフィーを行い、その後、Ｎ末端の配列決定を行う。配列決定は、Applied Biosystems 476Aシークエンサーを用い、製造者（Applied Biosystems社、米国カリフォルニア）の指示に従ってパルス液体高速サイクル（pulsed liquid fast cycles）によって実施することができる。
【０２７０】
配列同一性又は配列相同性
本明細書において、「ホモログ（homologue）」という用語は、対象となるアミノ酸配列及びヌクレオチド配列と一定の相同性を有する実体（entity）を意味する。本明細書において「相同性（homology）」という用語は、「同一性（identity）」という用語と意味するところが同じである。
【０２７１】
相同なアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、機能的活性を保持しているポリペプチド及び／又は酵素活性を亢進させるポリペプチドを提供及び／又はコードする。
【０２７２】
本明細書では、相同配列は、対象配列と少なくとも７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むと解釈される。通常、ホモログは対象アミノ酸配列と同じ活性部位等を含む。相同性は類似性として捉えることもできるが（すなわち、類似の化学特性・機能を有するアミノ酸残基）、本発明においては配列同一性の観点から相同性を記すことが好ましい。  
【０２７３】
本明細書では、相同配列には本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）と少なくとも７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％又は９８％同一であるヌクレオチド配列が含まれると解釈される。通常、ホモログは、活性部位等をコードする配列として対象配列と同じ配列を含む。相同性は類似性として捉えることもできるが（すなわち、類似の化学特性・機能を有するアミノ酸残基）、本発明においては配列同一性の観点から相同性を記すことが好ましい。
【０２７４】
相同性比較は、目視によって、さらに一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを利用して実施することができる。これらの市販コンピュータプログラムにより、２個以上の配列間における相同性率（％）を計算することができる。
【０２７５】
相同性率は、隣接しあう配列に基づいて計算される。すなわち、一方の配列を他方の配列と並べ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップのない（ungapped）」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップのないアラインメントは、比較的残基数の少ない場合に行われる。
【０２７６】
この方法は、非常に簡便かつ堅実な方法であるが、例えば、１つの挿入部又は欠失部以外は同一な２つの配列において、かかる挿入部又は欠失部以降のアミノ酸残基がアラインメントから排除され、その結果、全体のアラインメントが終了したときの相同性率が大きく低下してしまう可能性があることを考慮していない。結果的に殆どの配列比較法は、全体としての相同性スコアを不当に損なうことなく、起こり得る挿入又は欠失を考慮した最適化アラインメントを作成するように設計されている。これは、局所相同性を最大化するために「ギャップ」を配列アラインメントに挿入することにより実現される。
【０２７７】
しかし、より複雑なこれらの方法では、同じ数の同じアミノ酸に対して、２個の比較配列間の高い関連性を反映して、ギャップができるだけ少ない配列アラインメントが、ギャップが多い配列アラインメントよりも高いスコアが得られるように、アラインメント中に存在する各ギャップに「ギャップペナルティ（gap penalties）」を割り当てる。ギャップの存在に対しては比較的高いコストを課し、ギャップにおける各後続残基に対してはペナルティを減少させる「アフィンギャップコスト」が一般に使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。ギャップペナルティが高いと、ギャップのより少ない最適なアラインメントが作成できることは言うまでもない。殆どのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティの変更が可能である。しかし、このようなソフトウエアを配列比較に用いるときにはデフォルト値を使用することが好ましい。
【０２７８】
したがって、相同性率の最大値を計算するには、まず、ギャップペナルティを考慮して、最適なアラインメントを作成する必要がある。このようなアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、Vector NTI（Invitrogen社製）である。配列比較を行うことができる他のソフトウエアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4thEd-Chapter 18参照）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）などが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡの両方ともオフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58 to 7-60参照）。しかし、一部の適用例では、Vector NTIプログラムを使用することが好ましい。BLAST 2 Sequencesと呼ばれる新しいツールは、タンパク質及びヌクレオチド配列の比較にも使用できる（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8及びtatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照）。
【０２７９】
最終的な相同性率は、同一性として測定することができるが、アラインメントプロセス自体は、通常、全か無かの対比較（all-or-nothing pair comparison）に基づいてはいない。その代わり、化学的類似性又は進化距離に基づいて各ペアワイズ比較に対してスコアが割り当てられるスケールドシミラリティースコアマトリックス（scaled similarity score matrix）が一般に使用される。通常使用されるマトリックスとしては、ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスが例示できる。一般的にVector NTIプログラムは、公開デフォルト値、又はもし提供されていれば個別のシンボル比較表を使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照のこと）。一部の適用例では、Vector NTIパッケージにデフォルト値を使用することが好ましい。
【０２８０】
或いは、相同性率は、CLUSTAL（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）に類似したアルゴリズムに基づくVector NTI（Invitrogen社製）の複数アラインメント機能を用いて計算してもよい。
【０２８１】
このソフトウエアが最適なアラインメントを作成したら、相同性率、好ましくは配列同一性率（％）を計算することが可能になる。このソフトウエアは、通常、配列比較の一部としてこれを実行し、数値結果を作成する。
【０２８２】
配列同一性の決定にギャップペナルティを使用する場合、以下のパラメターをペアワイズアラインメントに用いることが好ましい。
【０２８３】
【表１】
2011517945.tif 000003
【０２８４】
【表２】
2011517945.tif 000004
【０２８５】
一実施形態において、ヌクレオチド配列の配列同一性は、前記に示したギャップペナルティ及びギャップ延長を用い、ＣＬＵＳＴＡＬを使用して決定することが好ましい。
【０２８６】
好適には、ヌクレオチド配列に対する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個、好ましくは少なくとも４０個、好ましくは少なくとも５０個、好ましくは少なくとも６０個、好ましくは少なくとも１００個の連続するヌクレオチドにわたって決定する。
【０２８７】
ヌクレオチド配列に対する同一性の程度は、配列全体にわたって決定することが好適である。
【０２８８】
一実施形態において、本発明におけるアミノ酸配列の同一性の程度は、Vector NTI 10（Invitrogen社製）等の当技術分野で公知のコンピュータプログラムによって好適に決定できる。ペアワイズアラインメントに用いるマトリックスとしては、ギャップオープンペナルティが１０．０でギャップ延長ペナルティが０．１のＢＬＯＳＵＭ６２を用いることが好ましい。
【０２８９】
好適には、アミノ酸配列に対する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも３０個、好ましくは少なくとも４０個、好ましくは少なくとも５０個、好ましくは少なくとも６０個の連続するアミノ酸にわたって決定する。
【０２９０】
アミノ酸配列に対する同一性の程度は、配列全体にわたって決定することが好適である。
【０２９１】
配列は、サイレントな変化をもたらし機能的に同等の物質を生じさせるような、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を含み得る。物質の二次結合活性が保持される限りにおいて、残基の極性、荷電性、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負荷電アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあり、正荷電アミノ酸としては、リジン、アルギニンなどがあり、親水性レベルが類似している非荷電性の極性頭基を含むアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン等がある。
【０２９２】
保存的置換は、例えば下表に従って実施することができる。第２列の同じブロック、及び好ましくは第３列の同じ行中のアミノ酸を互いに置換することができる。
【０２９３】
【表３】
2011517945.tif 000005
【０２９４】
本発明は、生じ得る相同置換（本明細書では、置換と交換のいずれも既存のアミノ酸残基と別の残基との交換を意味する）、すなわち、塩基性残基と塩基性残基、酸性残基と酸性残基、極性残基と極性残基などの同種（like-for-like）置換も包含する。非相同置換も生じることがあり、すなわち、ある分類の残基から別の分類の残基への非相同置換、或いはオルニチン（以後、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以後、Ｏと称する）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の介在も含む非相同置換も生じ得る。
【０２９５】
交換は、非天然アミノ酸によっても行うことができる。
【０２９６】
変異アミノ酸配列には、配列中の任意のアミノ酸残基２個の間に挿入される適切なスペーサー基が含まれ、かかるスペーサー基としては、グリシン又はβ−アラニン残基等のアミノ酸スペーサー以外にもメチル基、エチル基又はプロピル基などのアルキル基が含まれる。変異のさらなる形態では、１又は２以上のアミノ酸残基がペプトイド型で存在しているが、これは当業者には十分に理解されるであろう。疑義を生じさせないために述べると、「ペプトイド型」とは、α−炭素置換基が残基のα炭素上ではなく窒素原子上にあるアミノ酸残基変異体を指すために使用される。ペプトイド型ペプチドを調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134に示されている。
【０２９７】
本発明に使用されるヌクレオチド配列、又は本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、合成ヌクレオチド又は改変ヌクレオチドをその配列中に含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドに対する種々のタイプの改変が当分野では数多く知られている。これらの改変には、メチルホスホネートバックボーン及びホスホロチオエートバックボーン、並びに／又は分子の３’末端及び／又は５’末端へのアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明では、本明細書記載のヌクレオチド配列は、当技術分野で利用可能な任意の方法によって改変できることを理解されたい。このような改変は、ヌクレオチド配列のin vivoでの活性を高め、又は寿命を延ばすために行われる。
【０２９８】
本発明は、本明細書に記載の配列、その誘導体、断片若しくはその断片の誘導体に相補的であるヌクレオチド配列の使用も包含する。配列がその断片に相補的である場合には、その配列をプローブとして使用して他の生物等における類似のコード配列を同定することができる。
【０２９９】
本発明の配列に１００％相同ではないが、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドは、数々の方法で得ることができる。本明細書記載の配列の他の変異体は、様々な個体、例えば種々の集団における個体に基づいて作成されたＤＮＡライブラリーを探索するなどによって得ることができる。また、他のウイルス／細菌又は細胞のホモログ、特に哺乳動物細胞（例えばラット、マウス、ウシ及び霊長類の細胞）で見い出される細胞のホモログを得ることができ、このようなホモログ及びその断片は、一般に、本明細書の配列表中の配列と選択的にハイブリダイズし得る。このような配列は、他の動物種に基づいて作成されたｃＤＮＡライブラリー又は他の動物種に基づくゲノムＤＮＡライブラリーを探索することによって、また、添付配列表中のいずれか１つの配列の全部又は一部を含むプローブを用い、中程度〜高いストリンジェンシー条件下で前記ライブラリーを探索することによって得ることができる。同様のことが、本発明のポリペプチド配列又はヌクレオチド配列の種ホモログ及び対立遺伝子変異体を得るためにも適用される。
【０３００】
変異体及び系統／種ホモログは、縮重ＰＣＲ法を用いても得ることができ、かかる縮重ＰＣＲ法では、本発明の配列中の保存アミノ酸配列をコードする変異体及びホモログにおける配列を標的とするように設計されたプライマーを用いる。保存配列は、例えば、いくつかの変異体／ホモログから得られるアミノ酸配列をアラインメントさせることによって予測することができる。配列アラインメントは、当技術分野で知られているコンピュータソフトウエアを使用して実施することができる。例えば、GCG Wisconsin PileUpプログラムが広く用いられている。
【０３０１】
縮重ＰＣＲ法で使用されるプライマーは、１又は２以上の縮重位置を含み、既知の配列に対して単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするために用いるストリンジェンシーよりも低いストリンジェンシー条件下で使用される。
【０３０２】
或いは、このようなポリヌクレオチドは、特徴付けされている配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞のコドン優先度を最適化するためにコドン配列のサイレントな変化が必要な場合に有用なことがある。ポリペプチド制限認識部位を導入するために、或いはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの特性又は機能を変えるために別の配列変化が望まれる場合もある。
【０３０３】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）を使用して、プライマー（ＰＣＲプライマー、選択的増幅反応用プライマー等）、プローブ（放射性又は非放射性標識を用いる従来法により露出標識（revealing label）で標識されたプローブ等）を作製することができ、或いはこのポリヌクレオチドをベクターにクローン化することができる。このようなプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチド長であり、これらもまた本明細書において使用される本発明のポリヌクレオチドという用語に包含される。
【０３０４】
本発明におけるＤＮＡポリヌクレオチド及びプローブ等のポリヌクレオチドは、組換え法、合成法、又は当業者に利用可能な任意の手法によって作製することができ、また、標準的な手法によりクローニングすることもできる。
【０３０５】
一般に、プライマーは合成手法によって作製され、かかる手法には所望の核酸配列を一ヌクレオチドずつ作製するステップワイズ法が含まれる。自動化技術により前記方法を行う技術は当技術分野では容易に利用できる。
【０３０６】
一般的に長いポリヌクレオチドは、組換え手段、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング法により作製される。ＰＣＲクローニング法は、脂質ターゲティング配列においてクローニングすることを所望する領域に隣接する１対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、これらプライマーを動物細胞又はヒト細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させ、前記所望の領域を増幅させる条件下でＰＣＲを実施し、増幅された断片を単離し（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することにより）、増幅されたＤＮＡを回収するものである。これらプライマーは、増幅されたＤＮＡが適切なクローニングベクターにクローニングされるように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。
【０３０７】
ハイブリダイゼーション
本発明はまた、本発明の配列に相補的な配列、又は本発明の配列若しくは本発明の配列に相補的な配列にハイブリダイズ可能な配列の使用も包含する。
【０３０８】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸の鎖が塩基対形成によって相補鎖と連結されるプロセス」、並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法において実行される増幅プロセスを含むものとする。
【０３０９】
本発明はまた、本明細書に記載の対象配列、その誘導体、断片若しくはその断片の誘導体に相補的である配列とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列の使用も包含する。
【０３１０】
本発明はまた、本明細書に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な配列と相補的な配列も包含する。
【０３１１】
ハイブリダイゼーション条件は、Berger and Kimmel（1987、Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA）に教示されているように、ヌクレオチド結合複合体の溶解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に述べる所定の「ストリンジェンシー」を用いる。
【０３１２】
最大のストリンジェンシーは、通常、Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い温度）程度で生じ、高ストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低い温度で生じ、中程度のストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度で生じ、低ストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度で生じる。当業者には理解されるように、最大のストリンジェンシー下でのハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定又は検出するために使用でき、中程度（若しくは低い）ストリンジェンシー下でのハイブリダイゼーションは、類似又は関連ポリヌクレオチド配列を同定又は検出するために使用できる。
【０３１３】
好ましくは、本発明は、高ストリンジェンシー条件又は中程度のストリンジェンシー条件下で、本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な配列と相補的な配列の使用を包含する。
【０３１４】
より好ましくは、本発明は、高ストリンジェンシー条件（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）｝）において、本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な配列に相補的な配列の使用を包含する。
【０３１５】
本発明はまた、本明細書に記載のヌクレオチド配列（本明細書に記載の相補配列を含む）とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列の使用にも関する。
【０３１６】
本発明はまた、本明細書に記載のヌクレオチド配列（本明細書に記載の相補配列を含む）とハイブリダイズ可能な配列と相補的なヌクレオチド配列の使用にも関する。
【０３１７】
また、本発明の範囲には、本明細書に記載のヌクレオチド配列と中程度〜最大のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列の使用も含まれる。
【０３１８】
好ましい態様において本発明は、本明細書に記載のヌクレオチド配列又はその相補配列とストリンジェントな条件下（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ）でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列の使用も包含する。
【０３１９】
より好ましい態様において本発明は、本明細書に記載のヌクレオチド配列又はその相補配列と高度なストリンジェンシー条件下（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ）でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列の使用を包含する。
【０３２０】
ポリペプチドの発現
本発明に使用されるヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の具体的特性を有するポリペプチドをコードするために使用されるヌクレオチド配列は、組換え複製ベクターに組み込むことができる。かかるベクターを使用して、ヌクレオチド配列を適合宿主細胞において及び／又は適合宿主細胞からポリペプチドの形で複製・発現させることに用いることができる。発現は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む制御配列を用いて制御し得る。原核生物プロモーター、及び真核細胞中で機能するプロモーターを使用してもよい。組織特異的又は刺激特異的プロモーターを使用してもよい。２種以上の異なる上記プロモーターから得た配列エレメントを含むキメラプロモーターも使用することができる。
【０３２１】
前記ヌクレオチド配列を発現させることにより、宿主組換え細胞によって作製されるポリペプチドは、使用する配列及び／又はベクターに応じて分泌されてもよく、又は細胞内に存在していてもよい。コード配列は、物質をコードする配列の分泌を特定の原核細胞膜又は真核細胞膜を介して誘導するシグナル配列を用いて設計することができる。
【０３２２】
構築物
「構築物（construct）」という用語は、「コンジュゲート」、「カセット」及び「ハイブリッド」等の用語と同義であり、本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードし、本発明においてプロモーターに直接又は間接的に結合させて使用するヌクレオチド配列が含まれる。間接的な結合の例としては、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列との間に介在するイントロン配列（Ｓｈ１−イントロン、ＡＤＨイントロン等）等の適切なスペーサー基を提供することが挙げられる。本発明に関しては、直接又は間接的結合を含む「融合」という用語にも同じことが該当する。これらの用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列と野生型遺伝子プロモーターとの間で通常生じ、それらがいずれも天然環境にある場合の天然の組合せは包含しない場合がある。
【０３２３】
構築物には、遺伝子構築物の選択を可能にするマーカーを含んでもよく、又はかかるマーカーを発現させてもよい。
【０３２４】
一部の適用においては、少なくとも本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書で定義される具体的特性を有するポリペプチドをコードし、プロモーターに作動可能に連結したヌクレオチド配列が構築物に含まれることが好ましい。
【０３２５】
生物
本発明に関して「生物」という用語には、本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び／又はそれら配列から得られる産物を含み得る任意の生物が含まれる。
【０３２６】
本発明に関して「トランスジェニック生物」という用語には、本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、及び／若しくはかかる配列から得られる産物を含む任意の生物であって、並びに／又は本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の前記生物内におけるプロモーターによる発現が可能である任意の生物が含まれる。ヌクレオチド配列は、前記生物のゲノムに組み込まれていることが好ましい。
【０３２７】
「トランスジェニック生物」という用語には、天然環境に存在する天然ヌクレオチドコード配列が、やはり天然環境下にあるその天然プロモーターの制御下にあるとき、そのような天然ヌクレオチドコード配列は含まれない。
【０３２８】
したがって、本発明のトランスジェニック生物には、本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本明細書で定義する構築物、本明細書で定義するベクター、本明細書で定義するプラスミド、本明細書で定義する細胞、又はそれらの産物のいずれか１つ、又はそれらの組合せを含む生物が含まれる。例えば、トランスジェニック生物には、天然状態において脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列には付随しないプロモーターの制御下において本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含まれ得る。  
【０３２９】
宿主細胞／生物の形質転換
宿主細胞は、原核生物又は真核生物であり得る。
【０３３０】
適切な原核生物宿主としては、大腸菌及びバチルス・リケニホルミス等の細菌が例示され、バチルス・リケニホルミスが好ましい。
【０３３１】
当技術分野では原核生物宿主の形質転換に関する教示が数多くの文献に示されている。例えば、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照のこと。原核生物宿主を使用する場合、形質転換を行う前にイントロンを除去するなどの適切な改変をヌクレオチド配列に施す必要があることがある。
【０３３２】
別の実施形態では、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
【０３３３】
糸状真菌細胞の形質転換は、当技術分野で知られている種々の方法により行うことができる。それらの方法としては、既知の方法によるプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、その後の細胞壁の再生を含むプロセス等が挙げられる。宿主微生物としてアスペルギルスを使用することは、欧州特許第０２３８０２３号に記載されている。
【０３３４】
別の宿主生物としては植物を用いることができる。植物の形質転換に用いられる一般技術の総説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)の論文にある。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許公開第Ａ−０４４９３７５号に見い出せる。
【０３３５】
真菌、酵母及び植物の形質転換に関する全般的な教示を以下の項に示す。
【０３３６】
形質転換真菌
宿主生物としては、糸状真菌等の真菌を用いることができる。かかる適切な宿主としては、サーモマイセス（Thermomyces）属、アクレモニウム（Acremonium）属、アスペルギルス属、ペニシリウム（Penicillium）属、ムコール（Mucor）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、トリコデルマ（Trichoderma）属等に属する任意のメンバーが例示される。
【０３３７】
米国特許（ＵＳ−Ａ）第５７４１６６５号に糸状真菌の形質転換に関する教示が概説されており、糸状真菌の形質転換及びその培養に関する標準技術が当分野で周知であることが示されている。N. crassaに適用された技術について、例えば、Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143において多様な観点から概説されている。
【０３３８】
糸状真菌の形質転換に関するさらなる教示が米国特許（ＵＳ−Ａ）第５６７４７０７号に概説されている。
【０３３９】
一態様において宿主生物は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等のアスペルギルス属のものとすることができる。
【０３４０】
本発明のトランスジェニックアスペルギルスは、例えば、Turner G. 1994（Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S. D., Kinghorn J.R. (Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666）の教示に従って調製することもできる。
【０３４１】
糸状真菌における遺伝子発現は、Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20(5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4): 273-306に概説されている。
【０３４２】
形質転換酵母
別の実施形態においては、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
【０３４３】
酵母における異種遺伝子発現の原理に関する概説は、例えば、Methods Mol Biol (1995), 49: 341-54、及びCurr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8(5): 554-60に示されている。
【０３４４】
この点に関し、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）といった種（FEMS Microbiol Rev (2000 24(1): 45-66参照)等の酵母を異種遺伝子発現用の媒体（vehicle）として使用することができる。
【０３４５】
サッカロミセス・セレビシエにおける異種遺伝子発現、及び遺伝子産物の分泌の原理に関する概説が、E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.)に示されている。
【０３４６】
酵母を形質転換するための形質転換プロトコルがいくつか開発されてきた。例えば、本発明のトランスジェニックサッカロミセスは、Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75,1929)、Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104)、及びIto, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168)の教示に従って調製することができる。
【０３４７】
形質転換酵母細胞は、栄養要求性マーカー、優性抗生物質耐性マーカー等の種々の選択マーカーを使用して選択することができる。
【０３４８】
適切な酵母宿主生物は、ピキア（Pichia）属菌、ハンセヌラ（Hansenula）属菌、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ヤロウイニア（Yarrowinia）属菌、サッカロミセス属菌（S. セレビシエ等）及びシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyce）属菌（シゾサッカロミセス・ポンベ等）から選択される酵母種などの生物工学的に関連する酵母種から選択することができるが、これらの酵母種に限定されることはない。
【０３４９】
メチロトローフ酵母種であるピキア・パストリス（Pichia pastoris）の系統を宿主生物として使用することができる。
【０３５０】
一実施形態において宿主生物は、ハンセヌラ・ポリモルファ（H. polymorpha）（国際公開第０１／３９５４４号に記載）等のハンセヌラ種とすることができる。
【０３５１】
形質転換植物／植物細胞
本発明に適した宿主生物としては植物も挙げられる。一般的な技術の概説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)の論文、又は国際公開第０１／１６３０８号に見い出せる。トランスジェニック植物では、例えば、フィトステロールエステル及びフィトスタノールエステルのレベルが亢進し得る。
【０３５２】
したがって本発明はまた、レベルが亢進したフィトステロールエステル及びフィトスタノールエステルを含むトランスジェニック植物を製造する方法にも関する。この方法は、本明細書で定義する脂質アシルトランスフェラーゼを植物細胞に形質転換し（特に、本明細書で定義する脂質アシルトランスフェラーゼを含む発現ベクター又は構築物を用いて形質転換する）、その形質転換された植物細胞から得た植物を成長させるステップを含む方法である。
【０３５３】
分泌
発現宿主から、酵素をより容易に回収することができる培地中へとポリペプチドが分泌されることが望ましいことが多い。本発明では、分泌リーダー配列は所望の発現宿主に基づいて選択することができる。ハイブリッドシグナル配列もまた本発明において使用することができる。
【０３５４】
天然状態で脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列に付随しない分泌リーダー配列の典型的な例としては、真菌のアミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（アスペルギルス等に由来するｇｌａＡの１８アミノ酸型及び２４アミノ酸型）、α因子遺伝子（サッカロミセス、クルイベロミセス及びハンゼヌラ等の酵母）又はα−アミラーゼ遺伝子（バチルス）を起源とする分泌リーダー配列が挙げられる。
【０３５５】
検出
アミノ酸配列の発現を検出・測定するプロトコルとしては当技術分野で数多く知られている。例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０３５６】
当業者には、多種多様な標識法及びコンジュゲーション法が知られており、それらの手法は様々な核酸アッセイ及びアミノ酸アッセイに用いることができる。
【０３５７】
Pharmacia Biotech（ニュージャージー州ピスカタウエイ）、Promega（ウイスコンシン州マディソン）及びUS Biochemical Corp（オハイオ州クリーブランド）等、多くの企業がこれらの手法用の市販キット及びプロトコルを供給している。
【０３５８】
適切なレポーター分子又は標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤又は発色剤や、基質、補因子、阻害剤、磁気粒子等が挙げられる。このような標識の使用を教示している特許としては、米国特許（ＵＳ−Ａ）第３８１７８３７号、同第３８５０７５２号、同第３９３９３５０号、同第３９９６３４５号、同第４２７７４３７号、同第４２７５１４９号、及び同第４３６６２４１号が挙げられる。
【０３５９】
また、組換え免疫グロブリンは、米国特許（ＵＳ−Ａ）第４８１６５６７号に示されるようにして作製できる。
【０３６０】
融合タンパク質
本発明で用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、融合タンパク質として作製し、例えば、その抽出及び精製に役立てることができる。融合タンパク質のパートナーとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合ドメイン及び／又は転写活性化ドメイン）及びβ−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。融合タンパク質パートナーと目的タンパク質配列との間にタンパク質分解開裂部位を設けて、融合タンパク質配列の除去を可能にすることが好都合な場合もある。融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げないことが好ましい。
【０３６１】
大腸菌における遺伝子融合発現系は、Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5): 501-6に概説されている。
【０３６２】
本明細書で定義する具体的特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を非天然配列にライゲーションして融合タンパク質をコードさせてもよい。例えば、物質活性に影響し得る薬剤をペプチドライブラリーからスクリーニングするために、市販抗体に認識される非天然エピトープを発現するキメラ物質をコードすることが有用な場合がある。
【０３６３】
以下の図及び実施例を例としてのみ参照しつつ、本発明を以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０３６４】
【図１】Ａｓｎ８０Ａｓｐ（なお、８０位のアミノ酸は成熟配列中に存在する）の突然変異があるアエロモナス・サルモニシダ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）変異体のアミノ酸配列（配列番号１５）を示す図である。
【図２】アエロモナス・ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ＃７９６５）から得られる脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図３】データベースバージョン６からのｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号２）を示す図である。
【図４】生物アエロモナス・ヒドロフィラ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から得られるアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図５】生物アエロモナス・サルモニシダ（ＡＡＧ０９８４０４；ＧＩ：９９６４０１７）から得られるアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
【図６】生物ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）から得られるアミノ酸配列（配列番号５）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号:ＮＰ＿６３１５５８）を示す図である。
【図７】生物ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）から得られるアミノ酸配列（配列番号６）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号:ＣＡＣ４２１４０）を示す図である。
【図８】生物サッカロミセス・セレビシエから得られるアミノ酸配列（配列番号７）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ４１７３４）を示す図である。
【図９】生物ラルストニア（Ralstonia）から得られるアミノ酸配列（配列番号８）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ６４６０５２）を示す図である。
【図１０】配列番号９を示す図である。Ｓｃｏｅ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８の保存された仮想タンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）] である。
【図１１】配列番号１０を示す図である。Ｓｃｏｅ２ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＣ０１４７７．１ ＧＩ：９７１６１３９の保存された仮想タンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）] である。
【図１２】アミノ酸配列（配列番号１１）を示す図である。Ｓｃｏｅ４ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８９４５０．１ ＧＩ：７６７２２６１の推定分泌タンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］である。
【図１３】アミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。Ｓｃｏｅ５ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ６２７２４．１ ＧＩ：６５６２７９３の推定リポタンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］である。
【図１４】アミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。Ｓｒｉｍ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＡＡＫ８４０２８．１ ＧＩ：１５０８２０８８ ＧＤＳＬ−リパーゼ［ストレプトミセス・リモサス］である。
【図１５】アエロモナス・サルモニシダ亜種サルモニシダ（Salmonicida）（ＡＴＣＣ＃１４１７４）から得られる脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１４）を示す図である。
【図１６】アエロモナス・ヒドロフィラから得られ、キシラナーゼシグナルペプチドを含む酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す図である。
【図１７】アエロモナス・ヒドロフィラの脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子における突然変異誘発に用いる融合構築物のアミノ酸配列（配列番号１７）を示す図である。下線を引いたアミノ酸はキシラナーゼシグナルペプチドである。
【図１８】コルネバクテリウム・エフィシエンスから得られる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のＧＤＳｘを含むアミノ酸３００個からなるポリペプチド（配列番号１８）を示す図である。
【図１９】生物アエロモナス・ヒドロフィラ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から得られるアミノ酸配列（配列番号１９）を示す図である（なお、この配列は成熟配列である）。
【図２０】アエロモナス・サルモニシダの成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す図である（なお、この配列は成熟配列である）。
【図２１】ストレプトミセス・サーモサッカライ（Streptomyces thermosacchari）から得られるヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す図である。
【図２２】ストレプトミセス・サーモサッカライから得られるアミノ酸配列（配列番号２２）を示す図である。
【図２３】サーモビフィダ・フスカから得られ、ＧＤＳｘを含むアミノ酸５４３個からなるアミノ酸配列（配列番号２３）を示す図である。
【図２４】コルネバクテリウム・エフィシエンスから得られ、ＧＤＳｘを含むアミノ酸３００個からなるアミノ酸配列（配列番号２４）を示す図である。
【図２５】コルネバクテリウム・エフィシエンスから得られるヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す図である。
【図２６】Ｌ１３１と、ストレプトミセス・アベリミチリス及びサーモビフィダ・フスカから得られるホモログとをアラインメントさせることにより、ＧＤＳｘモチーフ（Ｌ１３１、ストレプトミセス・アベリミチリス及びサーモビフィダ・フスカのＧＤＳＹ）、ＧＡＮＤＹボックス（ＧＧＮＤＡ又はＧＧＮＤＬ）、並びにＨＰＴブロック（保存的触媒ヒスチジンと考えられる）が保存されていることを示す図である。これら３つの保存ブロックを強調表示している。
【図２７】活性部位にグリセロールを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造のリボン表示を示す図である。この図は、Deep View Swiss-PDB viewerを使用して作成した。
【図２８】Deep View Swiss-PDB viewerを用いて作成した活性部位にグリセロールを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造の側面図を示す図である。活性部位のグリセロールから１０Å以内の距離にある残基を黒で塗りつぶして示す。
【図２９】Deep View Swiss-PDB viewerを用いて作成した活性部位にグリセロールを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造の上面図を示す図である。活性部位のグリセロールから１０Å以内の距離にある残基を黒で塗りつぶして示す。
【図３０】アラインメント１を示す図である。
【図３１】アラインメント２を示す図である。
【図３２Ａ】図３２Ａ−Ｂは、１ＩＶＮとＰ１０４８０（Ｐ１０４８０はアエロモナス・ヒドロフィラ酵素のデータベース上の配列である）のアラインメントを示す図である。このアラインメントはＰＦＡＭデータベースから得て、モデルビルディングプロセスに使用した。
【図３２Ｂ】図３２Ａ−Ｂは、１ＩＶＮとＰ１０４８０（Ｐ１０４８０はアエロモナス・ヒドロフィラ酵素のデータベース上の配列である）のアラインメントを示す図である。このアラインメントはＰＦＡＭデータベースから得て、モデルビルディングプロセスに使用した。
【図３３】１ＩＶＮとＰ１０４８０（Ｐ１０４８０はアエロモナス・ヒドロフィラ酵素のデータベース上の配列である）のアラインメントを示す図である。このアラインメントはＰＦＡＭデータベースから得て、モデルビルディングプロセスに使用した。
【図３４】Ｐ１０４８０がアエロモナス・ヒドロフィラのデータベース上の配列である場合のアラインメントを示す。この配列はモデル構築及び部位選択に用いられる。なお、完全タンパク質（配列番号３）が表され、成熟タンパク質（配列番号１９に相当）は第１９残基から始まり、A.salはアエロモナス・サルモニシダ（配列番号４）ＧＤＳＸリパーゼであり、A.hydはアエロモナス・ヒドロフィラ（配列番号１９）ＧＤＳＸリパーゼを表している。コンセンサス配列中、記載された配列間における相違箇所に＊を付した。
【図３５】実施例１で使用した遺伝子構築物を示す図である。
【図３６】実施例１で使用したコドンが最適化された遺伝子構築物（no. 052907）を示す図である。
【図３７】ＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子を含むXhoI挿入物の配列を示す図である。−３５及び−１０の各ボックスに下線を付した。
【図３８】１％トリブチリン寒天培地上、３７℃下で４８時間培養した後のＢＭＬ７８０−ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０（配列番号１５を含む−図上のコロニー）及びＢＭＬ７８０（空の宿主株−図下のコロニー）を示す図である。
【図３９】アエロモナス・サルモニシダから得られ、シグナル配列（ｐｒｅＬＡＴ−１〜８７位）を含むヌクレオチド配列（配列番号２６）を示す図である。
【図４０】生物アエロモナス・ヒドロフィラから得られ、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号２７）を示す図である。
【図４１】生物アエロモナス・サルモニシダから得られ、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す図である。
【図４２】生物ラルストニアから得られ、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）を示す図である。
【図４３】ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８の保存された仮想タンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］をコードし、配列番号３０で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図４４】Ｓｃｏｅ２ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＣ０１４７７．１ ＧＩ：９７１６１３９の保存された仮想タンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］をコードし、配列番号３１で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図４５】Ｓｃｏｅ４ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８９４５０．１ ＧＩ：７６７２２６１の推定分泌タンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］をコードし、配列番号３２で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図４６】Ｓｃｏｅ５ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ６２７２４．１ ＧＩ：６５６２７９３の推定リポタンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］をコードし、配列番号３３で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図４７】Ｓｒｉｍ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＡＡＫ８４０２８．１ ＧＩ：１５０８２０８８ ＧＤＳＬ−リパーゼ［ストレプトミセス・リモサス]をコードし、配列番号３４で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図４８】アエロモナス・ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ ＃７９６５）から得られる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３５）を示す図である。
【図４９】アエロモナス・サルモニシダ亜種サルモニシダ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）から得られる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す図である。
【図５０】Ａｓｎ８０Ａｓｐ（なお、８０位のアミノ酸は成熟配列中に存在する）の突然変異を有するアエロモナス・サルモニシダの成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）変異体のアミノ酸配列（本明細書における配列番号１５）を、翻訳後修飾を経た後に配列番号３７として示す図である。成熟ポリペプチドである配列番号１５の翻訳後修飾としては、２３５−Ａ位から２７３−Ｒ位まで（この位置を含む）の開裂切断が含まれる。よって、３８個のアミノ酸が欠失している。配列番号３７の２３５位及び２３６位のアミノ酸残基は、翻訳後修飾がされた後に共有結合していない。形成されたこれら２個のペプチドは、１又は２以上のＳ−Ｓ架橋によって結合している。配列番号３７の２３６位のアミノ酸は、本明細書における配列番号１５の２７４位のアミノ酸残基に対応している。
【図５１】生物ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）から得られる本発明の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３８）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３８８８．１：８３２７４８０．８３２８３６７）を示す図である。
【図５２】生物ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）から得られる本発明の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３９）を示す図である（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ９３９１３１．１：２６５４８０．２６６３６７）。
【図５３】生物サッカロミセス・セレビシエから得られる本発明の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号４０）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｚ７５０３４）を示す図である。
【図５４】Ｓｃｏｅ３ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８８８３３．１ ＧＩ：７６３５９９６の推定分泌タンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］のアミノ酸配列（配列番号４１）を示す図である。
【図５５】カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）から得られる脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である配列番号４２を示す図である。
【図５６】サーモビフィダから得られる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列（配列番号４３）を示す図である。
【図５７】ノボスフィンゴビウム・アロマチシボラン（Novosphingobium aromaticivorans）から得られる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸２８４個からなるポリペプチド（配列番号４４）を示す図である。
【図５８】ストレプトミセス・コエリコラーから得られる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸２６８個からなるポリペプチド（配列番号４５）を示す図である。
【図５９】ストレプトミセス・アベリミチリスから得られる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の、ＧＤＳｘを含むアミノ酸２６９個からなるポリペプチド（配列番号４６）を示す図である。
【図６０】サーモビフィダ・フスカから得られるヌクレオチド配列（配列番号４７を示す図である。
【図６１】ストレプトミセス・コエリコラーから得られるヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す図である。
【図６２】ストレプト・アベリミチリスから得られるアミノ酸配列（配列番号４９）を示す図である。
【図６３】ストレプト・アベリミチリスから得られるヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す図である。
【図６４】サーモビフィダ・フスカから得られ、ＧＤＳｘを含むヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す図である。
【図６５】Ｓｃｏｅ３ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８８８３３．１ ＧＩ：７６３５９９６の推定分泌タンパク質［ストレプトミセス・コエリコラーＡ３（２）］をコードし、配列番号５２で示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図６６】サーモビフィダ・フスカから得られるアミノ酸配列（配列番号５３）を示す図である。
【図６７】ホスファチジルコリン及びコレステロールを基質とし、脂質アシルトランスフェラーゼにより触媒される反応のスキームを示す図である。
【図６８】滑らかなペースト状ミートバッター（meat batter）を４０℃で１時間（濃色のブロックを参照）或いは２℃で２０時間（薄色のブロックを参照）インキュベートし、その後７５℃で１時間、熱処理することによるテクスチャー測定の結果を示す図である。♯１）は酵素無添加の対照群、♯２）は酵素ＫＬＭ３’を０．８４ＴｒＵ／ｇで添加した群、♯３）は酵素ＫＬＭ３’を４．２ＴｒＵ／ｇで添加した群、♯４）はホスホリパーゼLipomod（登録商標）を３ＬＥＵ／ｇで添加した群である。
【図６９】肉試料から得た脂質に対して行ったＴＬＣ分析（溶媒６）の結果を示す図である。ＰＥ＝ホスファチジルエタノールアミン、ＰＡ＝ホスファチジン酸、ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール、ＰＣ＝ホスファチジルコリン。
【図７０】肉試料から得た脂質に対して行ったＴＬＣ分析（溶媒５）の結果を示す図である。ＣＨＬ＝コレステロール、ＦＦＡ＝遊離脂肪酸。
【図７１】対照乳化剤のCitrem又は本発明の脂質アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’）で処理したドイツレバーソーセージ、或いは負の対照（酵素処理も乳化剤処理も行わず）としてのドイツレバーソーセージの写真である。
【図７２】レバーソーセージに対して行ったＨＰＴＬＣ分析による遊離コレステロール値を示す図である。１＝対照、２＝ＫＬＭ３−脂質アシルトランスフェラーゼ（実施例３のとおりに添加）、３＝Citrem。割合（％）は全て乾燥重量ベースである。［実施例］
【実施例１】
【０３６５】
バチルス・リケニホルミスにおける脂質アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’）の発現
脂質アシルトランスフェラーゼ（配列番号１５、以下ＫＬＭ３’）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４９）を、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ（ＬＡＴ）のシグナルペプチドとの融合タンパク質としてバチルス・リケニホルミスにおいて発現させた（図３５及び３６参照）。バチルス内での発現を最適化するため、コドン最適化遺伝子構築物（ｎｏ．０５２９０７）をGeneart社（Geneart AG、ドイツ、レジェンスバーグ）に注文した。
【０３６６】
構築物ｎｏ．０５２９０７では、ＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子の前に不完全ＬＡＴプロモーター（−１０配列のみ）が含まれ、そのＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子の下流にはＬＡＴ転写（Ｔｌａｔ）が含まれる（図３５及び３６参照）。完全ＬＡＴプロモーターが隣接するＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子を５’末端に含み、３’末端にＬＡＴターミネーターを含むXhoI断片を作製するために、プライマーとしてPlat5XhoI_FW及びEBS2XhoI_RV、鋳型として遺伝子構築物０５２９０７を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅法を行った。 
Plat5XhoI_FW: 
ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattc
ggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaagggg
EBS2XhoI_RV:  tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc
【０３６７】
Phusion High Fidelity DNA polymerase（Finnzymes OY社製、フィンランド、エスプー）を製造者インストラクションに従って使用し、サーマルサイクラーでＰＣＲを行った（アニーリング温度５５℃）。
【０３６８】
得られたＰＣＲ断片を制限酵素XhoIで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを供給者（Invitrogen社製、米国カリフォルニア州カールスバッド）のインストラクションに従って使用し、XhoIで消化したｐｌＣａｔＨに前記ＰＣＲ断片をライゲーションした。
【０３６９】
前記ライゲーション混合物を、米国特許出願ＵＳ２００２０１８２７３４（国際公開第０２／１４４９０号）に記載のとおりにしてバチルス・ズブチリスＳＣ６．１株に形質転換した。ＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子を含むXhoI挿入物の配列をＤＮＡシークエンシング（BaseClear社製、オランダ、ライデン）により確認し、正しいプラスミドクローンのうちの１つをｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１）（図５３）と命名した。ｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１）を、許容温度（３７℃）下にてバチルス・リケニホルミスＢＭＬ７８０株（ＢＲＡ７及びＢＭＬ６１２の派生体、国際公開第２００５／１１１２０３号）に形質転換した。
【０３７０】
ネオマイシン耐性（ｎｅｏＲ）で、かつ、クロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）の形質転換体を１種選択し、ＢＭＬ７８０（ｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１））と命名した。バチルス・リケニホルミスＢＭＬ７８０株をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）含有培地中、非許容温度（５０℃）下で培養することにより、ＢＭＬ７８０（ｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１））のプラスミドをバチルス・リケニホルミスゲノムのｃａｔＨ領域に組み込んだ。ＣｍＲ耐性クローンを一種選択し、ＢＭＬ７８０−ｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１）と命名した。ＢＭＬ７８０−ｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１）を抗生物質不在下で許容温度にて数継代にわたって再度培養し、ベクター配列をループアウト（loop-out）し、ネオマイシン感受性（ｎｅｏＳ）であるＣｍＲクローン一種を選択した。このクローンにおいて、染色体上のｐｌＣａｔＨのベクター配列を切除し（ネオマイシン耐性遺伝子を含む）、ｃａｔＨ−ＬＡＴＫＬＭ３’カセットだけを残す。次に、この株を漸増濃度のクロラムフェニコールを加えた培地中／上にて培養することにより、染色体上のｃａｔＨ−ＬＡＴＫＬＭ３’カセットを増幅させた。増幅サイクルを多数回行い、クローン一種（５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに耐性）を選択し、ＢＭＬ７８０−ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０と命名した。ＫＬＭ３’の発現を実証するため、ＢＭＬ７８０−ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０とＢＭＬ７８０（空の宿主株）とを１％トリブチリンを加えたHeart Infusion（Bacto社製）アガープレート上、３７℃で４８時間培養した。脂質アシルトランスフェラーゼ活性を示す透明ゾーン（clearing zone）は、ＢＭＬ７８０−ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０のコロニー周囲では明確に目視されたが、宿主株ＢＭＬ７８０の周囲では認められなかった（図３８参照）。この結果から、バチルス・リケニホルミス株ＢＭＬ７８０−ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０において相当量のＫＬＭ３’が発現され、これらＫＬＭ３’分子が機能的であることが示される。翻訳後修飾で短縮された配列中で発現されたＫＬＭ３’タンパク質は、翻訳後修飾による短縮後は配列番号３７で示されるアミノ酸配列を有する。
【実施例２】
【０３７１】
肉ベース食品（すなわち滑らかなペースト状ソーセージ）のコレステロール量を減少させる（重量減、テクスチャー及び脂肪安定性を維持又は向上させつつ）ための脂質アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’）の使用
試験した酵素：
・本発明の脂質アシルトランスフェラーゼであって、配列番号３７を有するＫＬＭ３’（３１５８ＴｒＵ／ｇ）
・BioCatalysts社製（英国）Lipomod（登録商標）699L（パンクレアチンホスホリパーゼ）（供給者に従い、１０,０００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）−比較目的のために試験した。
【０３７２】
レシピ
【０３７３】
【表４】
2011517945.tif 000006
2011517945.tif 000007
【０３７４】
方法
１．３ｍｍプレート（MAD MEW 512D）を用いて肉を別々に挽き、混合し、２℃で冷却する。
２．３％食塩水１００ｍｌに、酵素（ＫＬＭ３’（０．８４ＴｒＵ／ｇ肉分、若しくは４．２ＴｒＵ／ｇミートバッターで添加）又はLipomod（登録商標）（３ＬＥＵ／ｇ肉分で添加）を溶解する。
３．肉を塩漬用塩及びリン酸と共にStephan cutter（ＵＭＣ５）に入れ、氷／水の１／３を加え、６００Ｕ／分で１５秒間、そして１５００Ｕ／分で１５秒間のカッティングを開始する。
４．氷／水の１／３、酵素を添加した３％ＮａＣｌ溶液（対照の場合は酵素無添加）、並びにその他全成分の乾燥混合物を加え、６００Ｕ／分で１５秒間、１５００Ｕ／分で１５秒間、次いで５℃になるまで３０００Ｕ／分でカッティングを続ける。
５．脂肪／脂肪エマルジョン、及び残りの氷／水を加え、６００Ｕ／分で１５秒間及び１５００Ｕ／分で１５秒間。
６．ボールから中身を残さずスクレイプし、真空（８０％）にし、６００Ｕ／分で１５秒間、１５００Ｕ／分で１５秒間、次いで１２℃になるまで３０００Ｕ／分で切り刻み続ける。
７．加工処理終了時の温度は、１２．５℃とする。
８．プラスチックカップにミートバッターを詰め（合計６試料×約２２０ｇ）、プラスチックホイルでカップを密封する。
９．試料は、ａ）一晩（すなわち２０時間）２℃でインキュベートする、又はｂ）４０℃で１時間インキュベートする。
１０．貯蔵後、スチーマーを用いて試料を７５℃で１時間調理し、酵素を不活性化する。
１１．調理（９９％ ＨＲ−７５℃で中心部温度が７０℃に達するまで）後、肉試料を冷蔵庫で５℃以下にて貯蔵する。
１２．一晩冷却した後、調理済み肉を吸収紙で乾燥させ、その検量する。
１３．テクスチャーを計測する。
１４．試料を真空パックし、１週間の貯蔵試験（２℃以下）に供し、検量する（貯蔵損失）。
【０３７５】
重量減
標準化した肉試料の重量減を以下のように記録した。
重量減（％）＝（熱処理前の試料（ｇ）−熱処理後の試料（ｇ））／熱処理前の試料（ｇ）
【０３７６】
テクスチャーの測定
機器によるテクスチャーの測定を、テクスチャー分析器（ＴＡＸＴ）を用いて行った。O２５プローブを速度０．５ｍｍ／秒及びトリガー力５ｇで肉試料の１５ｍｍ深に位置させ、浸透試験を行った。各バッチについてレプリケート３個を測定した。
【０３７７】
ＴＬＣ分析
材料：
ＴＬＣ分析の標準
Ｓｔ１６．：SpectraLipids社（ドイツ）製の０．５％大豆レシチンミックス規格番号ＳＬＭ４５
Ｓｔ１７．：０．１％コレステロール、Sigma C3292；０．１％オレイン酸、Sigma O1008；０．１％コレステロールエステル
ステアリン酸コレステロール（Sigma C3549）
脂質抽出：
肉試料を冷凍し、凍結乾燥させた。この乾燥試験試料をコーヒーミルで粉砕した。
乾燥肉パウダー０．５ｇをクロロホルム：メタノール＝２：１で３０分間抽出した。
有機相を単離し、ＨＰＴＬＣ分析に供した。
【０３７８】
ＨＰＴＬＣ
ＨＰＴＬＣにより、肉試料中のコレステロール（ＣＨＬ）及びリン脂質の含量を測定した。
アプリケーター：ＣＡＭＡＧアプリケーターＡＳＴ４
ＨＰＴＬＣプレート：２０×１０ｃｍ（Merck no. 1.05641）
このプレートを使用する前に、１６０℃のオーブンで２０〜３０分間乾燥させて活性化した。
塗布：抽出した脂質６．０μｌをＣＨＣｌ３：メタノール（２：１）に溶解し、ＡＳＴ４アプリケーターを使用してＨＰＴＬＣプレートに塗布した。
標準成分を既知濃度で含む標準溶液０．１μｌ、０．３μｌ、０．５μｌ、０．８μｌ及び１．５μｌもまたＨＰＴＬＣプレートに塗布した。
ランニングバッファー５：ヘキサン：ＭＴＢＥ（７０：３０）
ランニングバッファー６：水中に、クロロホルム：１−プロパノール：酢酸メチル：メタノール：０．２５％ＫＣｌを２５：２５：２５：１０：９で含む。
溶出：このプレートを、Camag社製のAutomatic Developing Chamber ADC2を用いて７ｃｍ溶出した。
溶出長：７ｃｍ
現像液：１６％Ｈ３ＰＯ４中に６％Cupriacetate
【０３７９】
溶出後、前記プレートを１６０℃のオーブンで１０分間乾燥させ、冷却し、現像液に浸し（１０秒間）、そして１６０℃で６分間さらに乾燥させた。このプレートを目視で評価し、その密度をスキャンした（Camag TLC スキャナー）。
【０３８０】
結果：
重量減
滑らかなペースト状のバッターを４０℃で１時間インキュベートし、その後７５℃で１時間熱処理したときの重量減を以下の表に示す。
【０３８１】
【表５】
2011517945.tif 000008
【０３８２】
滑らかなペースト状のミートバッターを２℃で１週間貯蔵し、４０℃で１時間又は２℃で２０時間インキュベートし、その後７５℃で１時間熱処理したときの重量減を以下の表に示す。
【０３８３】
【表６】
2011517945.tif 000009
【０３８４】
熱処理した滑らかなペースト状のミートバッターにおける重量減から、対照（酵素無添加）及びLipomod（登録商標）（ホスホリパーゼ）試料と比べ、ＫＬＭ３’で処理した試料の重量減が最も少ないことが示された。  
【０３８５】
１週間の貯蔵試験の結果から、ＫＬＭ３’で処理し、その後２℃でインキュベートした試料では、貯蔵後の重量減が最も少なかったことが認められた。
【０３８６】
テクスチャー
図６８にテクスチャー測定の結果を示す。ＫＬＭ３’で処理した滑らかなペースト状のミートバッターのテクスチャーが、対照及びLipomod（登録商標）で処理した試料のテクスチャーと比べ、最もしっかり（firmest）していた（最も向上していた）。
【０３８７】
外観及び脂っぽさ（脂肪安定性）
肉試料の外観及び脂っぽさの評価結果を以下の表に示す。
【０３８８】
【表７】
2011517945.tif 000010
【０３８９】
ＨＰＬＣ分析
分析から得たＴＬＣクロマトグラムを図６９及び７０に示す。
【０３９０】
標準混合物に基づき、脂質成分の検量線を作成し、脂質成分を計算した結果を以下の表に示す。
【０３９１】
【表８】
2011517945.tif 000011
【０３９２】
図６９、図７０及び上記の表から得た結果から、肉試料中のＫＬＭ３’及びLipomod（登録商標）の活性が確認される。リン脂質に対するＫＬＭ３’の活性により、リン脂質が分解してリゾリン脂質となる。前記の結果からは、ＫＬＭ３’が触媒するトランスフェラーゼ反応によって遊離コレステロールが減少することも確認される。しかし、Lipomod（登録商標）は、コレステロール値を顕著に減少させることはなかった。加水分解反応が生じたことを示す肉試料中の遊離脂肪酸の量も増加していることから、ＫＬＭ３’はトランスフェラーゼ反応を触媒しただけではなかった。
【０３９３】
酵素反応は５℃と４０℃の両方の温度で行ったが、その結果からＫＬＭ３’の活性は５℃で確認されたが、それにより、肉製品における低温での微生物増殖の制御がより簡単になることから、一部の適用分野において関心がもたれる。
【０３９４】
概要
この実験で得た結果から、対照と比べ、ＫＬＭ３’で処理した滑らかなペースト状の肉試料では、重量減及びテクスチャーについて有益な効果が観察された。
【０３９５】
酵素処理によるリン脂質分解を分析したところ、ＫＬＭ３’では非常に高い活性が示されたが、Lipomod（登録商標）では同程度の活性は観察されなかった。
【０３９６】
脂質アシルトランスフェラーゼは、対照及びLipomod（登録商標）で処理した試料に比べ、肉製品中のコレステロールを顕著に減少させた。
【実施例３】
【０３９７】
レバーソーセージの風味及び／又はテクスチャー（口当たり（mouthfeel）及び／又はスプレダビリティ（spreadability）等）を向上させるための脂質アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’）の使用
レバーソーセージの製造には、熱加工の過程で脂肪が分離するリスクを低減させるため、通常、乳化剤を使用する。
【０３９８】
かかる肉への適用において、ＫＬＭ３’の乳化効果を試験し、レバーソーセージに従来使用されている乳化剤であるCitrem（登録商標）Ｎ１２と比較する。
【０３９９】
レバーソーセージは、レバータンパク質マトリックスの乳化力を重視し、レバーの含有量が少なく、脂肪／水の含有量が多いレシピに基づく。  
【０４００】
材料
・シトレム（Citrem；登録商標）N12 veg（Danisco A/S社製、デンマーク）
・配列番号３７を有する本発明の脂質アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’）  
【０４０１】
【表９】
2011517945.tif 000012
【０４０２】
【表１０】
2011517945.tif 000013
【０４０３】
方法
１．予め、肉と脂肪を７５℃の湯中で４５分間、調理する。
２．肉と脂肪を入れたボウルチョッパー（bowl chopper）に湯（６５℃）の１／２量を加える。
３．その上から乳化剤又は酵素を噴霧し、最高速にてチョッピング（chopping）を開始し、蒸気を出してスラリー（滑らかで均一）を得る。約３０サイクル行う（約１０分間）。
４．６５℃に達するまでチョッピングを続けて滑らかなペーストを得る。
５．蒸気とチョッパーを停止して蓋をスクレイプしてから、チョッピングを続ける。
６．残りの乾燥成分を加える。
７．温度が５０℃未満になったら、レバー及び残りの成分を加える。
８．４０℃になったら、チョッピングを停止する。
９．ケーシング（F-plus Kal.60）に肉混合物を詰める。
１０．ケーシング、缶及びカップを温度７６℃で１時間、調理する。
【０４０４】
結果
ボウルチョッパーの粘度
ＫＬＭ３’を加えたミートバッターの粘度は、対照（酵素無添加）又は陽性対照（従来の乳化剤シトレムを添加）のいずれと比較しても高かった。
【０４０５】
最終製品
図７１に示すレバーソーセージの目視検査を行ったところ、ＫＬＭ３’で処理したレバーソーセージは、対照及びシトレム（登録商標）で処理したものと比べて脂肪抽出量が遥かに少なかった。
【０４０６】
レバーソーセージの色についても、ＫＬＭ３’で処理したレバーソーセージは、対照及びシトレム（登録商標）で処理したものと比べて遥かに色が薄かった（より良い）。
【０４０７】
ＫＬＭ３’で処理したレバーソーセージの口当たりは、対照よりも良かった。
【０４０８】
また、ＫＬＭ３’で処理したレバーソーセージのスプレダビリティも対照と比べて遥かに良かった。
【０４０９】
コレステロール値
実施例３のレバーソーセージについてコレステロール分析を行ったところ、レバーソーセージ試料中コレステロールについて以下のとおりのＨＰＴＬＣ分析の結果を得た。割合（％）は乾燥重量に基づく。
【０４１０】
【表１１】
2011517945.tif 000014
【０４１１】
上記の結果の統計分析からは、対照とシトレムとの間に顕著な差は認められない。
【０４１２】
概要
脂質アシルトランスフェラーゼを使用することにより、脂肪抽出量の減少やスプレダビリティの亢進といった特性の向上がレバーソーセージに得られた。
【０４１３】
上記明細書で言及した刊行物は全て参考文献として本明細書に援用する。当業者には、本発明の範囲や精神から逸脱することなく本発明に記載の方法やシステムに様々な修正や変更を加えることは自明である。本発明は具体的な好ましい実施形態との関連で記載しているが、特許請求の範囲に記載する本発明は、かかる具体的実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、本発明を実施するためにここに記載した方法に加える、生化学及びバイオテクノロジー又はそれらの関連分野における当業者に自明の様々な修正は以下に記載する特許請求の範囲に含まれるものとする。  
【図１】
2011517945.tif 000015
【図２】
2011517945.tif 000016
【図３】
2011517945.tif 000017
【図４】
2011517945.tif 000018
【図５】
2011517945.tif 000019
【図６】
2011517945.tif 000020
【図７】
2011517945.tif 000021
【図８】
2011517945.tif 000022
【図９】
2011517945.tif 000023
【図１０】
2011517945.tif 000024
【図１１】
2011517945.tif 000025
【図１２】
2011517945.tif 000026
【図１３】
2011517945.tif 000027
【図１４】
2011517945.tif 000028
【図１５】
2011517945.tif 000029
【図１６】
2011517945.tif 000030
【図１７】
2011517945.tif 000031
【図１８】
2011517945.tif 000032
【図１９】
2011517945.tif 000033
【図２０】
2011517945.tif 000034
【図２１】
2011517945.tif 000035
【図２２】
2011517945.tif 000036
【図２３】
2011517945.tif 000037
【図２４】
2011517945.tif 000038
【図２５】
2011517945.tif 000039
【図２６】
2011517945.tif 000040
【図２７】
2011517945.tif 000041
【図２８】
2011517945.tif 000042
【図２９】
2011517945.tif 000043
【図３０】
2011517945.tif 000044
【図３１】
2011517945.tif 000045
【図３２Ａ】
2011517945.tif 000046
【図３２Ｂ】
2011517945.tif 000047
【図３３】
2011517945.tif 000048
【図３４】
2011517945.tif 000049
【図３５】
2011517945.tif 000050
【図３６】
2011517945.tif 000051
【図３７】
2011517945.tif 000052
【図３８】
2011517945.tif 000053
【図３９】
2011517945.tif 000054
【図４０】
2011517945.tif 000055
【図４１】
2011517945.tif 000056
【図４２】
2011517945.tif 000057
【図４３】
2011517945.tif 000058
【図４４】
2011517945.tif 000059
【図４５】
2011517945.tif 000060
【図４６】
2011517945.tif 000061
【図４７】
2011517945.tif 000062
【図４８】
2011517945.tif 000063
【図４９】
2011517945.tif 000064
【図５０】
2011517945.tif 000065
【図５１】
2011517945.tif 000066
【図５２】
2011517945.tif 000067
【図５３】
2011517945.tif 000068
【図５４】
2011517945.tif 000069
【図５５】
2011517945.tif 000070
【図５６】
2011517945.tif 000071
【図５７】
2011517945.tif 000072
【図５８】
2011517945.tif 000073
【図５９】
2011517945.tif 000074
【図６０】
2011517945.tif 000075
【図６１】
2011517945.tif 000076
【図６２】
2011517945.tif 000077
【図６３】
2011517945.tif 000078
【図６４】
2011517945.tif 000079
【図６５】
2011517945.tif 000080
【図６６】
2011517945.tif 000081
【図６７】
2011517945.tif 000082
【図６８】
2011517945.tif 000083
【図６９】
2011517945.tif 000084
【図７０】
2011517945.tif 000085
【図７１】
2011517945.tif 000086
【図７２】
2011517945.tif 000087
【配列表】
2011517945000001.app
【国際調査報告】
2011517945.tif 000088
2011517945.tif 000089
2011517945.tif 000090