(57)【要約】  本発明は、特有の構造と特定の生物学的活性で特徴付けられたサブナノ粒子サイズのケイ酸の低モル質量凝縮誘導体に関する。生体分子と相互作用して、その構造と生物学的機能を改変するこの開示されたサブナノケイ酸（ＳＮＳＡ）の調製方法および適用方法が開示された。本発明のケイ酸誘導体の好ましい適用分野は、構造および生体信号の伝達または膜輸送プロセスを調整することである。この物質の構造、調製および安定化の方法、またはこの物質からなる薬剤の組成および疾病の予防および診断への適用方法が開示される。
2011529973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
［ＳｉＯx（ＯＨ）4-2x］n
で示される物質であって、この式で
Ｓｉ原子はＱ1，Ｑ2，Ｑ3及びＱ4タイプのＳｉ原子であり、
ｎは１２−２０００の範囲の整数を示し、
ｘは１．２−１．８の範囲の数を示し、さらに、
上記物質が内部コアと外部シェルによって構成され、
Ｑ4タイプのＳｉ原子の７５％以上が上記内部コアに含まれ、Ｑ1，Ｑ2，Ｑ3タイプのＳｉ原子の７５%以上が外部シェルに含まれている物質。
【請求項２】
回転楕円形あるいはほぼ回転楕円形の形状を有する、請求項１記載の物質。
【請求項３】
直径が０．３ｎｍ−５．０ｎｍの範囲である、請求項１または２記載の物質。
【請求項４】
直径が０．６ｎｍ−３．０ｎｍの範囲である、請求項３記載の物質。
【請求項５】
モル質量が０．７−１４０ｋＤａである、請求項１−４のいずれか１項記載の物質。
【請求項６】
モル質量が１．４−２０ｋＤａである、請求項５記載の物質。
【請求項７】
上記外部シェルのＱ1，Ｑ2，Ｑ3タイプのＳｉ原子に取り付けられているＳｉ−ＯＨ基が高濃度で均等に分散されている、請求項１−６のいずれか１項記載の物質。
【請求項８】
ｎが２０−３００の範囲の整数である、請求項１−７のいずれか１項記載の物質。
【請求項９】
分布範囲が好ましいｎ値前後で、最大分布範囲がｎ−０．２５ｎからｎ＋０．２５ｎの範囲であり、ｎが請求項１で定義されている値の平均値である、請求項１−８のいずれか１項記載の物質。
【請求項１０】
Ｑ3およびＱ2タイプのＳｉ原子の合計とＱ4タイプのＳｉ原子との数値比率が１．５−２．５の間の範囲にある、請求項１−９のいずれか１項記載の物質。
【請求項１１】
固体あるいは非揮発性液体形態の中性ポリヒロロキシル化基質上に蒸着させるか、あるいは固体あるいは非揮発性液体形態の薬学的に許容される基質上に直接蒸着させることで安定化される、請求項１−１０のいずれか１項記載の物質。
【請求項１２】
少なくとも室温で３ヶ月間保存した場合にその生物学的活性が８５％以上保持される長期的安定性を有する、請求項１−１１のいずれか１項記載の物質。
【請求項１３】
一般式（Ｉ）
［ＳｉＯx（ＯＨ）4-2x］n
で示される物質を調製する方法であって、この式で、
ｎは１２−２０００の範囲の整数を示し、
ｘは１．２−１．８の範囲の数を示し、さらに
ａ）無機シリカ化合物あるいはアルキルまたはその他の加水分解可能なオルトケイ酸塩を水あるいは水と溶剤の混合物内に混入するステップと、
ｂ）６０分間未満の時間で攪拌しながら６．２−４．５のｐＨ値で誘導を実行するステップと、
ｃ）反応系のｐＨを４．５−３．８の範囲に減少するように制御しつつ凝縮を行うステップと、
d)  その溶液のｐＨ値を２．１±０．３か８．４以上に急速に変えることによって安定化させるステップ
から構成され、調製中の温度を４℃から８０℃の範囲に制御する方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法で入手可能な物質。
【請求項１５】
治療、予防、および診断における生物学的活性剤としての、請求項１−１２及び請求項１４のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項１６】
キナーゼ、フォスファターゼ、薄膜ＡＴＰアーゼ、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ、Ｃａ−ＡＴＰアーゼ、Ｈ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ、及びＡＢＣトランスポータ蛋白質の活性を調整する、請求項１−１２及び請求項１４のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項１７】
高血圧、糖尿病、骨不全、心臓血管関連疾病、神経変性病態、癌、胃酸過多、骨粗鬆症、歯石、アルツハイマー症、クロイツフェルトヤコブ病の治療及び傷治癒のための薬剤を調製するための、請求項１−１２及び請求項１４のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項１８】
高血圧、糖尿病、骨不全、心臓血管関連疾病、神経変性病態、癌、胃酸過多、骨粗鬆症の予防のための薬剤を調製のための、請求項１−１２及び請求項１４のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項１９】
高血圧、糖尿病、骨不全、心臓血管関連疾病、神経変性病態、癌、胃酸過多、骨粗鬆症の診断のための組成物を調製するための、請求項１−１２及び請求項１４のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項２０】
医学応用分野でのペプチド類及び蛋白質の生物学的利用能および治療効果を改善するための、請求項１−１２及び請求項１４のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項２１】
骨、軟骨、及び腱の改善と骨粗鬆症治するための、請求項１−１２及び請求項１４のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項２２】
皮膚、毛髪及び爪の健康の改善するための、請求項１−１２及び請求項１４のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項２３】
火傷、創傷、あるいは病原体の作用さらには刺激性化学品によって悪影響を受けた皮膚の健康状態を回復するための、請求項１−１２及び請求項１４のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項２４】
高齢者の体内に生物学的ケイ素を補給するための、請求項１−１２及び請求項１４のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項２５】
少なくとも１つの、薬学的に許容される基質、補助剤および／または溶剤と共に、請求項１−１２及び請求項１４のいずれか１項記載の少なくとも１つ物質で構成される薬剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．技術分野
本発明は、特殊な構造と顕著な生物学的活性の特徴を有するケイ酸の低モル質量凝縮誘導体に関する。ここで開示されケイ酸の出願は生体分子に相互作用してその構造および生体機能を顕著に改善することを開示する。この発明のケイ酸の好ましい適用分野は蛋白質の構造と生体機能を改善することであり、これには特に生物学的情報伝達または膜輸送過程での可逆的なリン酸化が含まれる。この物質の構造、製造方法および安定化、この物質からなる薬剤の組成および疾患の予防、診断および治療の適用方法が開示される。
２．背景技術
タンパク質のリン酸化は、情報伝達、膜輸送または筋肉収縮などのような生物過程において極めて重要な過程である。リン酸化は、リン酸分子をタンパク質鎖の(チロシンやセリンのような)ヒドロキシアミノ酸と結合させることで達成される。リン酸化は、常にリン酸分子の脱結合で元の構造に戻される可逆的な方法でタンパク質構造と生物活動を改善する。
【０００２】
特定の蛋白質リン酸化促進物資は、リン酸基をアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）からリン酸基を蛋白質基質に転移する蛋白質キナーゼ（ＰＫ）である。蛋白質フォスファターゼ（ＰＰ）は、反対に蛋白質結合リン酸基を分離するように作用する。これら蛋白質キナーゼとフォスファターゼの逆方向の機能は平衡し、情報伝達と膜輸送のような幾つかの複合細胞過程を規制する。
【０００３】
ある種の蛋白質リン酸化工程とそれにつながるシグナルカスケードの機能障害は幾つかの疾病において重要な因子であると認められている。可逆的なリン酸化工程の目的を持った調節は癌のような疾病に対する新しい治療法を見つけるために期待される手法であると考えられる。
【０００４】
この概念は肺癌における腫瘍成長を促進する蛋白質キナーゼのＨＥＲ−２およびＨＥＲ−３を阻止する単一クローン抗体での腫瘍治療における最近の成功によって確認されている。しかしこの抗体による腫瘍抑制作用は、時が経つに従って、宿主の器官がそれを抗原性蛋白質と認識してそれを無効化する抗−抗体を生成するためにその有効性に制限がある。医療ニーズに合わないある蛋白質キナーゼまたはフォスファターゼの抑制または調節を目的とした非抗原性薬剤が提供されている。
【０００５】
Ｐ型−ＡＴＰアーゼ(アデノシンー３フォスファターゼ)のスーパーファミリーのメンバーは、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の加水分解から得られるエネルギーを用いて生体膜を横切って輸送することを含んだ構造的に関連した蛋白質である。従ってこれらＡＴＰアーゼは膜を横切る「イオンポンプ」膜として類別される。実際に、各ポンプ周期はＡＴＰアーゼ蛋白質のリン酸化とそれに続く非リン酸化が含まれる。
【０００６】
幾つかの疾患がある種のＡＴＰアーゼポンプの不都合な機能に関係しており、この酵素を抑制したり調整する医薬物質での治療可能性の開発を示唆している。ＡＴＰアーゼの構造的解明のかなりの進歩にも拘わらず、その作用メカニズムや医薬物質による調節については十分に解明されていない。
【０００７】
１つの典型的なＰ型―ＡＴＰアーゼはＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼまたはナトリウムポンプであり、これは、イオン恒常性および薄膜の電位、ＰＨ、温度または水の浸透性のような細胞機能の広い範囲を制御する。このナトリウムポンプには、筋肉収縮、神経シグナル伝達、腎臓のナトリウム保持率、または血管緊張のような重要な生理的過程の調節が含まれている。ナトリウムポンプの厳しい機能障害は、重大な高血圧や心疾患のような幾つかの病状態に明白に関与している。
【０００８】
従来技術におけるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの阻害剤として、心不全の治療に長時間適用されるハーブ由来の強心ステロイドがある。しかし、致命的な毒性がヒトの体重Ｋｇあたり０.１−０．２５ｍｇの範囲のＬＤ５０服用致死量を持った高い毒性があり、治療のための服用範囲が著しく狭い。従って強心剤のステロイドダイオキシンは患者１日当たり４−５ｍｇの服用が適当であり、患者１日あたり８−１０ｍｇでは致死毒性となる。非毒性ナトリウムポンプ阻害剤を見つけることが心不全症、高血圧および関連疾病の治療においては治療の大きな関心事である。
【０００９】
ナトリウムポンプの心臓非毒性調節剤は、内因性のジギタリス様の要素（ＥＤＬＦｓ）であろうと推定される。その存在は実験データの一致体によって指示されるが、ＥＤＬＦｓの構造は現在に至るまで開示されていない。最近のデータは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの役割は細胞膜のレベルでシグナルトランスデューサーであることを確信的に示しており、それはナトリウムポンプ調節剤の潜在的治療応用の新しい分野であることを暗示している。(Xie,z,Askihari,A;Eur.J,Biochem.2002,269,2434-2439)
Ｈ+/Ｋ−ＡＴＰアーゼ又はプロトンポンプは、ＡＴＰアーゼファミリーの他の１つのメンバーであり、胃の空腔から回収された１個のカリウムイオン(Ｋ+)を交換するに際して細胞質から水素イオン(Ｈ+)を輸送するものである。Ｈ+/Ｋ−ＡＴＰアーゼに直接結合して不活性化するプロトンポンプ阻害剤(ＰＰＩ)は、従来技術において胃における胃酸過多症の処置のための治療剤、例えば、オメブラゾール、エソメプラゾール、ランソプラゾール、パントプラゾールおよびラベプラゾール（ＵＳ５２３２７０６）として開示されている。しかしながら、これらＰＰＩ剤の過剰摂取は、便秘、咳、めまいまたは背痛のような副作用をもたらす。
【００１０】
真核細胞内のカルシウムの恒常性は偏在して存在するカルシウムポンプとして知られＣａ−ＡＴＰアーゼによって維持される。形質膜のＣａ−ＡＴＰアーゼはカルシウムチャンネルを通した遊離Ｃａ2+イオンの流入を妨げ、酵素的反応と細胞内シグナリング過程の広範なスペクトルを制御する重要な役割を果たす。筋肉細胞において、Ｃａ−ＡＴＰアーゼは、筋肉の弛緩中にＣａを貯える筋質網状筋小胞体内にＣａ2+イオンを戻す。このデータは、Ｃａ-ポンプ調節物質は、例えば、筋肉収縮病における治療への応用可能性を強く示唆しており、しかしサプシガージンのような従来技術の阻害剤は、高度の細胞毒性のために使用が制限される。
【００１１】
幾つかのバナジウム化合物は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ、Ｈ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ、Ｃａ−ＡＴＰアーゼの阻害剤および他のＰ型ＡＴＰアーゼ酵素の従来技術での阻害剤として確認されている。最も多く使用されるのはメタバナジン酸塩(ＶＯ3)n-またはデカバナジン酸［Ｖ10Ｏ28］6-であり、それはマイクロモル範囲およびサブマイクロモル範囲においてＩＣ50(半抑制濃度)値でＡＴＰアーゼを阻害するが、その結果はバナジン塩の瞬時の構造改変のために再現性がない。生化学関連のバナジウムオリゴマーであると考えられているデカバナジン酸は、生理学的なｐＨでは、安定ではないが、一旦形成されると、その効果を調査することができるほどその崩壊が遅い。その問題ある構造にも拘わらず、バナジン酸またはその過酸化物誘導体の過バナジン酸は、蛋白質フォスファターゼの非常に効率的な阻害のために実験室使用が広まっており、それは補完的なキナーゼの研究において一義的に重要である。
【００１２】
バナジン酸は、多くの細胞型においてインシュリンの迅速な作用に驚くほど似ている。高血糖のねずみに経口投与すると、バナジン酸は糖分摂取と新陳代謝を刺激して、正常血糖状態に導く。加えて、バナジン酸は、インシュリンに対する組織反応と肝臓の血糖レベルを回復させると共に糖質の新陳代謝のための鍵となる酵素の新規の合成を促進する。糖尿病治療におけるバナジン酸化合物の臨床的な効果は、ヒトにおいては短時間の実施のみで確認されている。
【００１３】
糖尿病におけるバナジン酸化合物のインシュリン類似使用に対する新しい興味にも拘わらず、バナジン酸誘導体の毒物学は興味を起こしている。ヒトにおいては高い胃腸障害が通常の毒性効果として報告されており、多量摂取を施した動物実験においては腎臓および肝臓に強毒性の厳しい徴候が現れることが報告されている。バナジン酸の長期使用は、多くは腎臓、脾臓、睾丸  肝臓および骨における進行性の組織蓄積と毒性効果の生成に大きく関与する。毒性はバナジンの酸化状態および過バナジン酸＞バナジン酸＞バナジルの順でのバナジンの配位および投与方法も依存している。［Domingo,J.L：「バナジン酸および糖尿病  バナジン酸の毒性とは何か？」  Mol.Cell. Biochemistry 2000,302,185-187］
ＡＢＣ(ＡＴＰ結合カセット)輸送体蛋白質は体内異物の排除を含む多くの細胞機能に関連した膜蛋白質の重要な分野を形成する。これらのＡＴＰ−駆動放出ポンプは通常細胞の恒常性にとって必須のものであるが、例えば癌患者の化学療法ではそれほど望まれない。これは制癌剤に抵抗がある腫瘍を造るＡＢＣ型多剤放出ポンプ（ＭＤＲ）の過剰発現に対する癌細胞の生き残り戦略である。細胞成長阻害剤を大量に適用することは、毒性の副作用を顕著に強めるので、単に一時的な解決策に過ぎない。ある種のＡＴＰ−アーゼ駆動多剤放出ポンプの選択的な阻害は、癌治療において重要な利点を示すが、しかし従来技術によるＭＤＲ阻害剤は効果が小さい。
【００１４】
本発明の目的は、高血圧、糖尿病、骨不全、心臓血管関連疾病、神経変性病態、癌、胃酸過多、骨粗鬆症、歯石、アルツハイマー症、クロイツフェルトヤコブ病、および創傷治癒のような種々の疾患の予防、診断および治療に有効な新しい薬剤的活性物質を提供することにある。
【００１５】
この目的は、独立の請求項の開示によって解決される。好ましい態様は、本明細書の記述、従属する請求項、図面および実施例中に開示されている。
３．ケイ酸の説明
シリコンと酸素の結合物であるシリカは、まさに最も豊富な地殻成分である。広い意味合いで「シリカ」はすべての化学的結合形式において二酸化ケイ素を含み、それにおいてシリコン分子は、酸素分子により囲まれている。通常、結晶質石英として発見される二酸化ケイ素のＳｉＯ2は、実際には、化学式Ｓｉ（ＯＨ）4を持つオルトケイ酸の無水物である。生物界におけるオルトケイ酸の至るところでの存在にも拘わらずシリコンを含み又は同元素を必要とする単一の生物分子は認められていない。
【００１６】
オルトケイ酸は、アルカリケイ酸塩を陰イオン交換樹脂と共に処理するか、テトラエチルオルトケイ酸塩（ＴＥＯＳ）のようなテトラアルキルオルトケイ酸塩の加水分解によって得られる。新しくつくられたケイ酸溶液は極めて不安定であるが一方において速やかに重合してコロイド粒子、非結晶ゲルおよび、最終的には多孔性または凝縮固体物質が得られる。図１に示されるように、ケイ酸とその同族誘導体環の水を連続的に排除することによって線型、分枝、環状あるいは多環状凝縮生成物が得られる。低モル質量ｎ≦２０の凝縮生成物は、ｎがＳｉＯｘ単位体の数として示される同族体として分類される。この単純なオルトケイ酸の同族凝縮生成物は古典的な化学式によって記載されるが、これらを個々に分離することは非常に難しい課題である。
【００１７】
これらの凝縮生成物の一般式は［ＳｉＯx(ＯＨ)4-2x］nであり、ここで"ｎ"は、凝縮されたＳｉＯx(ＯＨ)4-2x単位の数を表し、ｘは、１−２間の値を採る。従ってシクロトリシリシックのような単純なシクロシリカ誘導体の式においてx＝１であるとき、n＝３で［Ｓｉ3Ｏ3(ＯＨ)6］であり、シクロテトラシリシックはｎ＝４で［Ｓｉ4Ｏ4(ＯＨ)4］であり、シクロペンタシリシックはｎ＝５で［Ｓｉ5Ｏ5(ＯＨ)10］である。個々の種における構造は、29ＳｉＮＭＲスペクトルおよび安定した誘導体の変化により定められる。図１はｘ＝１．５ときの角柱状の６量体［Ｓｉ6Ｏ9(ＯＨ)6］、立方体状の８量体［Ｓｉ8Ｏ12(ＯＨ)8］、角柱状の１０量体［Ｓｉ10Ｏ20(ＯＨ)10］のような多凝縮ケイ酸ケージ体を含む従来技術による少モル質量のケイ酸種の概要を示すものである。
【００１８】
さらに進んだ（ｎ＞１０）のケイ酸の凝縮生成物は、シリカ粒子と非結晶ゲルの形成で瞬間的にさらなる重合が進行するので一般的に非常に不安定であると考えられる(図２参照)。より高いオリゴマーまたはサブ粒子サイズの低重合シリカの中間生成物が推定されるが、その詳細は余り徹底的には研究されていない。実際に、多凝縮生成物は、濃度、温度およびｐＨに依存した分布を持ったある種の平衡混合物を形成する。組成の著しい不安定さと低制御性のためにサブコロイド状（Φ＜５ｎｍ)の重合ケイ酸種の実用重要性は限られたものであると考えられる。
【００１９】
ケイ酸のさらに進んだｎ＞２，０００を持った重合生成物はΦ＞５ｎｍの直径を持ったナノ粒子である。これらは固体のナノまたはマイクロ粒子として記載され、特有の物理化学特性によって特徴付けられている。水媒質でシリカナノ粒子は拡張された技術的用途を持ったコロイド状の懸濁液を形成する［US 3,702,866；US 3,707,979;US 4,061,724］。同様にゼオライトのような狭く制御された内部空孔を持った固体シリカ粒子は広い技術的応用を持っている。
【００２０】
Φ＞１０ｎｍのシリカナノ粒子は、一般に蛋白質を付着する不活性固体担体粒子として評価されている。この大きいシリカナノ粒子に対する蛋白質の物理的な吸着又は化学的結合は、免疫細胞とエフェクターの相互作用によって顕著な効果を示す。大きいシリカ粒子に対する幾つかの抗原性蛋白質の秩序ある結合は、引き出される免疫反応を顕著に促進させることができる［Tan，W．et al  「シリカナノ粒子に基づくバイオ技術」、Medical Research Review 2004, 24,621-638 ］。
【００２１】
しかしながら、この先行技術の大きいシリカナノ粒子への蛋白質の結合は、異種核生成によって蛋白質の好ましくない凝縮が起こる、集合プロセスおよび凝縮による構造変化は蛋白質の生物的性質を失わせる原因となる。蛋白質の制御されない凝縮は、主としてアルツハイマー病におけるアミロイド斑の形成のような幾つかの病跡に関係する。
【００２２】
日本臓器による特許群［US 5,534,509; 5,685,896および5,807,951］は、20,000-1,000,000ｇ/モル（ＤＡ）の範囲における好ましいモル重量質量を持ち、490-16,500の範囲の重合度で平衡する重合シリカについての生理的調整機能を特許請求している。しかしながら、引用発明の好ましい分子重量範囲では、記載された化合物は殆どコロイド状シリカ粒子又は不溶性ゲルである。このような大きい寸法のコロイド状粒子および不溶性ゲルが請求された生物制御活性を提供するには大きな疑問がある。最初に出願して以来１５年間、これら請求されたシリカ重合体の生物活性を確認する科学論文もなくまた実際使用もされていない。
４．発明の概要
本発明は、特別に構成された寸法がナノ寸法以下のシリカ粒子を持ち、従ってサブナノケイ酸(ＳＮＳＡ)として分類される生物活性ケイ酸に関するものである。この分類は下記一般式１中のサイズΦおよび重合度ｎで示され、それは直径Φ＞５ｎｍおよびｎ＞２，０００ナノサイズのシリカ粒子である。
【００２３】
本発明のケイ酸ＳＮＳＡの一般式Ｉは以下の通りである。
［ＳｉＯx（ＯＨ）4-2x］n            (1)
ここで、
Ｓｉは、Ｑ1，Ｑ2，Ｑ3およびＱ4タイプのＳｉ原子であり、
ｎは、１２から２，０００の間の整数を示し、また
ｘ  は、１．２から１．８の間の数を示し、また
そこでは、物質は内部コアと外部シェルからなり、また
そこでは、内部コア中には７５％以上のＱ4タイプのケイ素が含まれまた外部シェル中には７５％以上のＱ2およびＱ3およびＱ4タイプのケイ素が含まれる。
【００２４】
本発明の物質は構造的に分子直径（Φ）が０．３＜Φ＜５ｎｍ、好ましくは０．６＜Ф＜３ｎｍの範囲のケイ酸分子として記述される。本発明の生物学的活性ケイ酸における凝縮シリカ(ＳｉＯx)ユニットまたはより詳細に記述された［ＳｉＯx（ＯＨ）4-2x］nユニットの数ｎは、１２＜ｎ＜２０００，好ましくは２０＜ｎ＜３００である。従って本発明の生物活性サブナノケイ酸は、０．７−１４０ｋｇ／ｍｏｌ(ＫＤ)の範囲、好ましくは１．４−２０ｋｇ／ｍｏｌ(ＫＤａ)の範囲でモル質量を有する。
【００２５】
本発明の物質において必須の構造形態は、分子の「外部シェル」に配列され、稠密かつ均等に分布された遊離ＳｉＯＨ(シラノール)基を持った分子の回転楕円形または殆ど回転楕円形状にある。本発明の物質の外部シェルにおける異常に多い遊離ＳｉＯＨは水中で高い溶解度（＞５％m/m）を示し、オルトケイ酸の酸性度に比べて著しく高い酸性度の故にケイ「酸」としての分類が正当化される。本発明によればこの外部シェル上の夥しい数の遊離ＳｉＯＨ(シラノール)を持ったほぼ回転楕円形構造は、凝縮された(ＳｉＯx)nの「ｎ」の値を驚異的に狭くすることで最適に達成される。シラノール結合の最高の表面密度を持ったほぼ回転楕円形の構造の安定性を得るための最適な範囲は１２から２，０００の範囲、好ましくは１６から１，０００、または１９から４００の範囲、最も好ましく最高の安定範囲としては２８から１２８の範囲のｎ数の個別の「ｎ」数値を持った凝縮［ＳｉＯx（ＯＨ）4-2x］nにより達成される。
【００２６】
さらにまた、本発明は、式(Ｉ)の生物活性ケイ酸を好ましくは大規模入手が可能な先駆体からの合成によって製造する方法、および生物活性を有する本発明の物質の安定化と化学的な導出をする方法を提供するものである。
【００２７】
本発明の物質においては、好ましくはそのシグナル伝達および膜輸送プロセスを含む蛋白質の構造および活性の改変が可能である。本発明のケイ酸の適用分野は一定のシグナル蛋白質および輸送ＡＴＰアーゼ又はＡＴＰ駆動放出ポンプにおける可逆的なリン酸化の離脱機能に起因するかまたは関係する。本発明の物質は蛋白質のリン酸化を調節するかまたはＰ型ＡＴＰアーゼおよびヒトにおけるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを忌避する強心ステロイドを忌避するために用いられるバナジン酸のような従来技術による薬剤に比べて相当程度の技術進歩を提供する。その機能は類似しているが本発明のシリカ製品は、毒性においても、従来技術のバナジン酸や強心剤に比べて医薬用途において決定的な利点がある。
【００２８】
本発明の化合物は、ＡＴＰ−アーゼポンプおよび幾つかの結合イオン好ましくは陽イオンと相互作用をする。ＡＴＰアーゼ蛋白質の強力な忌避作用を通して、本発明の物質は、ＡＴＰアーゼにより調整された胃酸過多やＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの強く関係した高血圧のような種々の心臓血管関連疾病の場合のようにこれらの薄膜ポンプでの機能障害に起因するかまたは関連する病状の診断に新しい方法を提供する。ＡＴＰ制御の輸送蛋白質の影響によって、本発明の物質は、ABC輸送体の場合のような代謝物や身体異物の排除を調節することができる。
【００２９】
本発明の物質の重要な適用は、蛋白質との相互作用および蛋白質の特有の構造範囲に対する独特の能力によってもたらされる。本発明のケイ酸物質による生体分子、好ましくは蛋白質またはグリコ蛋白質の構造および分子内または分子間の相互作用を変化させる。
【００３０】
本発明のケイ酸物質の外表面または外部シェルにおける遊離シラノール基の高密度かつ均等な分布によって、本発明の物質の化学的または生体的特性は、ｐＨやイオン強度に強く影響される。この本発明の物質のアルカリイオンの濃度からの構造依存性は、ここで記載される回収メカニズムによる細胞内又は細胞間のイオン濃度を調節するための生物学的活性ケイ酸物質のメカニズムを与える。本発明のケイ酸物質の蛋白質との独特な相互作用とその三次構造および生物学的性状調節によって本発明の物質は、すべてではないが、例示した高血圧、胃酸過多または糖尿病のような疾病の診断、予防、診察に応用することができる。さらに本発明の物質の治療への適用分野としては骨疾患、心疾患および神経変性病がある。
【００３１】
本発明の物質の実際的な適用としては、蛋白質、好ましくは膜蛋白質、受容体蛋白質、シグナル蛋白質との相互作用により生化学および生理学的プロセスの改変が関係する。特定の蛋白質キナーゼまたはフォスファターゼの構造および特性を改変することによって、可逆的なリン酸化を与える。ここに記載された本発明の物質の性能は欠点のあるリン酸化プロセスに起因するか関連する特定の疾患の治療に利用できる。このメカニズムはここに開示された本発明の能力は糖尿病の病気の徴候をこの疾病の治療のための新しい提案を提供することにより低下させることで説明できる。
【００３２】
本発明の構造と生物学的活性を持った一般式(Ｉ)のサブナノケイ酸(ＳＮＳＡ)をみるために個々に提供された一貫した実験的立証は、有毒性のバナジウム誘導体またはＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼまたはＨ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害性抗酸剤のための強心ステロイドのような先行技術によるＡＴＰアーゼポンプ阻害物質と比較して顕著な技術的進歩が得られる。
５．好ましい実施の態様の詳細な説明
本発明の目的は構造と生物的機能に対する特定の調節に起因した蛋白質のような生体分子に特定的に相互作用をする物質を提供することにある。ここに記載された本発明の物質の対象とする主な目標は、好ましくは細胞内シグナリングと膜輸送をする可逆的リン酸化プロセスを含むような蛋白質である。
【００３３】
溶液は、直径Φ＞５を持つナノ粒子の直径よりも小さい直径を持った多凝縮(重合)させた水溶性ケイ酸である本発明の物質により提供され、それ故に本発明の物資はサブナノケイ酸(ＳＮＳＡ)として類別される。本発明の物質の特有のサイズおよび分子構造は、特に大きい生体分子、好ましくは、蛋白質とその構造および生物学的機能を改質することによって相互作用させる。この発見は、これまでの構造特定の生物学的作用が単一ケイ酸になく、そのオリゴまたは重合凝縮誘導体にもないことが確認されていないのでさらに以外である。本発明は、一般式(Ｉ)の物質の構造および特性、その製造法および安定化法、少なくとも１個の一般式(Ｉ)の物質からなる薬剤の組成および疾病の予防、診断および治療における適用方法を開示するものである。
【００３４】
本発明のケイ酸物質はバナジン酸、強心ステロイド、抗酸剤、抗癌剤、ＡＴＰ-アーゼ阻害剤、薬剤放出ポンプ阻害剤およびモノクローン抗体に基づく治療剤のような先行技術による化合物の欠点を克服するものであることを述べることは重要なことである。これらの先行技術による化合物は、蛋白質、好ましくはリン酸化によって含まれる物質と相互作用および蛋白質キナーゼやフォスファターゼのような膜輸送プロセスによって含まれる化合物あるいはＡＴＰ-アーゼのＡＴＰ-駆動ＡＢＣ薬剤放出ポンプと相互作用すると述べられている。現状のＳＮＳＡの毒性潜在力（ＡＴ）は従来剤の毒性潜在力よりもその大きさが少なくとも１桁低く、現在に至るまで本発明のケイ酸ＳＮＳＡについては望まれない影響は確認されていない。
５．１構造
本発明の物質の詳細な記述のためには、通常は記号ＱS (ｓ＝０−４)が個々のＳｉ原子の結合型を表すために適用される。この類別において、Ｑ4タイプのＳｉ原子は、近接する酸素原子（ｓ）を介して４個の隣接するＳｉ原子が連結し、Ｑ3では３個、Ｑ2では２個、Ｑ1では１個のＳｉ原子が近接する酸素原子を通して連結する。残りのＳｉ原子の価はＳｉ−ＯＨ（シラノール)結合（ｓ）に含まれる。従ってＱ3タイプのＳｉ原子は単一のＳｉ−ＯＨ結合中に含まれ、Ｑ2タイプのＳｉは２個並列型Ｓｉ(ＯＨ)2に結合される。Ｑ1タイプのＳｉ原子は３個の−ＯＨ結合−Ｓｉ（ＯＨ）3を随伴し、Ｑ0タイプのＳｉ原子を持ったケイ酸は、４個のＳｉ（ＯＨ）4 であるが、一方においてＱ4タイプＳｉ原子は−ＯＨ基を持たない。
【００３５】
本発明は下記一般式(Ｉ)で示される物質に関するものである。
［ＳｉＯx（ＯＨ）4-2x］n          (１)
ここで、
Ｓｉは、Ｑ1，Ｑ2，Ｑ3およびＱ4タイプのＳｉ原子であり、
ｎは、１２から２，０００の間の整数を示し、また
ｘは、１．２から１．８の間の数を示し、また
そこでは、物質は内部コアと外部シェルからなり、また
そこでは、内部コア中には７５％以上のＱ4タイプのケイ素が含まれまた外部シェル中には７５％以上のＱ2およびＱ3およびＱ4タイプのケイ素が含まれる。
【００３６】
これは、一般式(Ｉ)の本発明の物質は、全Ｑ4タイプのＳｉ原子の７５％以上からなる内部コアおよび全Ｑ3およびＱ2およびＱ1タイプのＳｉ原子一切の７５％以上からなる内部コアまたは外部シェルによって構成されることが本発明の物質にとって必須であることを意味する。
【００３７】
従って、本発明の物質は、７５％以上のＱ4タイプＳｉ原子からなる内部コア構成物と７５％以上のＱ3およびＱ2およびＱ1タイプのＳｉ原子からなる外部シェル構成物の層状構造として組み立てられる。
【００３８】
結局、ＳＮＳＡ物質の内部は、７５％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは８５％以上のＱ4タイプのＳｉ原子を含む内部コアとして規定される。
従って、外部シェルは、Ｑ3およびＱ2およびＱ1タイプのＳｉ原子全体の７５％以上からなるＳＮＳＡ物質の一部として規定される。
【００３９】
Ｑ4タイプのＳｉ原子で占められた内部コアとＱ3およびＱ2タイプのＳｉ原子の外部シェルからなる回転楕円体形状を持った本発明のＳＮＳＡ の構造設計は図３に示される。
本発明の物質は、長期安定性と低レベルの毒性によって特徴付けられた低モル質量凝縮ケイ酸として組み立てられている。オルトケイ酸および誘導体の連続したオリゴ化と重合により得られた他の物質の背景における局所的特性は、図４に示される。この図面は、単純なオリゴマー分子から高モル質量の重合シリカ粒子およびゲルの凝縮生成物の成長の大きさを概観的に示したものである。
【００４０】
特性(寸法、モル質量、重合度、溶解度)によるケイ酸凝縮生成物の分類別を表１に示す。
【００４１】
【表１】
2011529973.tif 000003
【００４２】
これらの構造的限定値は主として一般的に受容可能な限界値に相当するが、正確にはサブナノ粒子領域では正確性は低い。
従って本発明の生物活性物質はΦ≦０．３ｎｍ、好ましくはΦ≦０．６ｎｍを持ったオリゴマー凝縮シリカ種およびΦ＞５ｎｍ、好ましくはΦ＞３ｎｍのシリカナノ粒子の間の中間領域のサブナノケイ酸(ＳＮＳＡ)として規定される大きい分類に属する(表１)。
【００４３】
従って、本発明のサブナノサイズのシリカ粒子は、０．３ｎｍから１０ｎｍ、好ましくは０．３ｎｍから５ｎｍ、および最も好ましくは０．６ｎｍから３ｎｍの直径を有する。
実際に非常に多数の可能性のある同族体と増加する重合度「ｎ」を持った等比数列での構造異性体からなる１２＜ｎ＜３００、さらに２０＜ｎ＜３００を持ったサブナノ粒子領域について注目することは重要なことである。ここに記載された本発明の生物学的活性ＳＮＳＡ物質は、サブナノ粒子領域において、考えられほとんど無限の構造選択の個々に非常に狭い下位集合のうちから構成される。
【００４４】
本発明のサブナノ粒子寸法の凝縮ケイ酸分子種は、１２＜ｎ＜２，０００、好ましくは１４＜ｎ＜１，５００、さらに好ましくは１８＜ｎ＜５００、さらにより好ましくは１９＜ｎ＜４００、最も好ましくは２０＜ｎ＜３００の重合度で、ｘは１．０および２．０の間の数で示される、化学式［ＳｉＯｘ（ＯＨ）4-2x］nを有する。
【００４５】
本発明の化合物については、ｘは１．２から１．８の範囲、好ましくは１．３から１．７の範囲、さらに好ましくは１．４から１．６の範囲、最も好ましくは１．４５から１．５５の範囲である。最適なケースは、ｘ＝１．５であり、化学式［ＳｉＯ1.5（ＯＨ）］nが得られる。
【００４６】
「本発明の物質」は、安定した生物学的活性を有し、かつここで開示されるような構造基準（Ｃ１−Ｃ１２）によって示すことができる分子種によってのみで分類別することができる。Φ≦５ｎｍ、好ましくはΦ≦３ｎｍ、モル質量≦１２０ｋｇ/ｍｏｌ(ｋＤａ)、好ましくは、≦２０ｋｇ/ｍｏｌ(ｋＤａ)の境界よりも低い領域における意外に安定した生物学的活性種の発見は、先行技術で述べられたこの領域において非常に不安定なシリカ種に比べて重要な技術的進歩である。
【００４７】
一般式(Ｉ)の本発明のＳＮＳＡの分類に適用され、非常に変化に富んだ不規則な構造を持ったシリカから識別される種構造基準（Ｃ１−Ｃ１２）は、本発明によって規定され、以下のように述べられる。
Ｃ１    ０．３≦Φ≦５ｎｍ、 好ましくは０．６≦Φ≦３ｎｍの範囲の分子直径Φ（ｎｍ）を持った回転楕円形もしくはほぼ回転楕円形である。回転楕円形もしくはほぼ回転楕円形への近似は、対称もしくは均一なＳｉ−Ｏ−ＳｉおよびＳｉ−ＯＨ結合の配置への傾向を反映している。本発明の物質は厳密な構造対象性を持つものではないが、その構造要素は好ましくは外部シェル上でのＳｉ−ＯＨ基の規則的な交互分布を含めほぼ対称的である。図５は外部シェルにおいて遊離Ｓｉ−ＯＨ基の均等化された分布を持った本発明のケイ酸分子の回転楕円体の形状を示したものである。
Ｃ２    ０．７−１４０ｋｇ/ｍｏｌ(ｋＤａ)の範囲、好ましくは、１．０−１００ｋｇ/ｍｏｌ(ｋＤａ)の範囲、さらに好ましくは１．２−７０ｋｇ/ｍｏｌ(ｋＤａ)の範囲、またさらに好ましくは、１．３−４０ｋｇ/ｍｏｌ(ｋＤａ)の範囲、最も好ましくは１．４−２０ｋｇ/ｍｏｌ (ｋＤａ)、の範囲あるいは本発明の物質が分子種として特徴付けられるのを正当化する領域におけるモル質量。
Ｃ３    １２≦ｎ≦２，０００の範囲、好ましくは１６≦ｎ≦１２００の範囲、さらに好ましくは１７≦ｎ≦７００、更により好ましくは、１９≦ｎ≦４００の範囲、最も好ましくは、２０≦ｎ≦３００の範囲の凝縮シリカユニットの数「ｎ」である。さらに一般式（Ｉ）の可溶性物質が好ましい。水中溶解度はｎ＝１６からｎ＝１２００範囲の物質によって提供された。
【００４８】
ここに開示されたケイ酸の分子寸法および安定性は、本出願の実施例によって示されるように、動的光散乱法(ＤＳＬ)、核磁気共鳴装置(ＮＭＲ)、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、粘度計、赤外線(ＩＲ)およびラマン分析器、蛍光スペクトル分析記、透過型電子顕微鏡装置（ＴＥＭ）、Ｎ２吸収等温吸着曲線その他の技術のような物理的な方法によって特徴付けられる。
Ｃ４    Ｑ3、Ｑ2、Ｑ1タイプのＳｉ原子すべての合計値とＱ4タイプのＳｉ 原子の比率値は１．５および２．５の間、好ましくは１．７５および２．２５の間、さらに好ましくは、１．９および２．１の間、最も好ましくはほぼ２である。
【００４９】
Ｑ1タイプのＳｉ原子のほとんどが外部シェル中に含まれるＱ1タイプのＳｉ原子のＱ2タイプのＳｉ原子に対する割合は、３０％以下、好ましくは、２０％以下、さらに好ましくは１２％以下、最も好ましくは６％以下である。従って、もし別の指定がなければ、Ｑ1タイプのＳｉ 原子はＱ2タイプのＳｉ原子の合計中に含まれる。
【００５０】
Ｑ3タイプとＱ2タイプ（Ｑ1タイプを含む）のＳｉ原子の比率値は０．５と１．５との間、好ましくは０．６５と１．３５との間、さらに好ましくは、０．８と１．２との間、最も好ましくは、０．９と１．１との間である。
【００５１】
Ｑ4タイプのＳｉ原子の少なくとも７５％、好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％が内部コア中に含まれる。
Ｑ3およびＱ2タイプのＳｉ原子のすべての少なくとも７５％、好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％は外部シェル中に含まれる。
Ｃ５  Ｑ4、Ｑ3、Ｑ2タイプのＳｉ原子の平衡した比率が、本発明のシリカ構造および生物学的活性の好ましい実施態様において考慮されている。平衡とはＱ4、Ｑ3、Ｑ2タイプのＳｉ原子が等しいか、１：１：１に極めて近いことを意味し、近いとは、理想的な平衡である１：１：１の比率から最大３０％、好ましくは２０％さらに好ましくは１０％の偏差があるとして定義される。従って、Ｑ4、Ｑ3、Ｑ2タイプのＳｉ原子の理想的な平衡比率から容認される偏差は、最大１：０．７：０．７から１：１．３：１．３、好ましくは１：０．８：０．８から１：１．２：１．２、さらに好ましくは１：０．９：０．９から１：１．１：１．１である。１：１：１に近いＱ4：Ｑ3：Ｑ2タイプのＳｉ原子の平衡分布は29ＳｉＮＭＲスペクトルによって裏付けられている。
Ｃ６  ほぼ（１：１：１）の理想的な平衡比率を持った本発明の生物学的活性分子種の化学式は［ＳｉＯ1.5（ＯＨ）n］で表される。この一般式は、ｎ≦１０の領域におけるプリズム型６量体での［Ｓｉ6Ｏ9（ＯＨ）6］、立方体型８量体での、［Ｓｉ8Ｏ12（ＯＨ）8］またはプリズム型での１０量体での［Ｓｉ10Ｏ20（ＯＨ）10］のような多凝縮シリカケージの一般式に類似している(図１参照)。類似の一般式を持ったこれらの先行技術の多環状シリカケージ種は、重要な技術進歩を達成する１２＜ｎ＜２０００の領域におけるここで示されるような生物学的活性サブナノケイ酸のような生物学的活性を示さない。
【００５２】
最適な比率(１:１：１)の平衡によって、相当量の遊離シラノール(Ｓｉ−ＯＨ) 基はＳＩ原子の全量とほぼ等しくなる。本発明の大量のシラノ基は本発明の物質の「ケイ酸」を決定的に正当化する。さらにこの遊離(Ｓｉ)−ＯＨの「ｎ」の高い値は、本発明のサブナノ回転楕円体ケイ酸の好ましい構造的態様を可能にする。この条件はＳＮＳＡ 物質の生体分子、好ましくはプロテンとの本発明の最適な相互作用にとってさらに必須である。
Ｃ７  本発明の構造の内殻は多かれ少なかれ、Ｑ4Ｓｉ原子の小型のシリカ骨組み（ＳｉＯ2）によって形成される。この内殻の組立は、モノケイ酸または３個から６個のＳｉ原子、好ましくは４個または５個のＳｉ原子を持ったその単純な線型または環状誘導体である中央種ユニットによって始められる。もしくは、プリズム型６量体、立方体型８量体もしくはプリズム型１０量体ケイ酸骨組みのようなケージ型多環状シリカユニットが種ユニットとして使用される。
Ｃ８  同様にＱ4タイプのＳｉ原子の内部シェルは種ユニットの近傍に形成されている。シクロシリカ種ユニットで始められ、各Ｑ2タイプのＳｉ元素は、いずれも２つのケイ酸ユニットで凝縮され、従って各連続したシェルは等比級数的に先のレベルのＳｉ原子の２倍を含む。Ｑ3Ｓｉ原子を持った種としてケージ型シリカで始めると、近傍のシェルは同数のＳｉ原子を持つようになる。直線的に凝縮されたケイ酸オリゴマーはそれらの混合Ｑ2およびＱ3タイプＳｉ原子に基づいて異なる発展をする。ここにアウトラインを示すＱ4タイプのＳｉ原子を持った内部シェルの概略的な成長パターンを図６に示す。本発明の構造の殆どすべての態様において、層中のＳｉ原子の数とタイプは以前の層におけるＳｉ原子の数とタイプによって特定される。Ｑ3およびＱ2のＳｉ原子を持った外部シェルの構造によって同様の数値的制限が存在する。これはいくらかの数値的な値、例えば比例級数を形成する数値は実施例に開示されたように層の構造において予定される。
【００５３】
従って、１２と２０００との間のｎの領域のすべての整数からの１つの計算値は、本発明のＣ１−Ｃ１２の構造基準の達成のために好ましい。それは２０から３００の最小範囲または最大範囲の１２から２０００における凝縮されたケイ酸のｎ値の１つの好ましい計算値は他のものよりも一層好ましいことを意味する。
【００５４】
意外なことに、生物学的活性を有する本発明のＳＮＳＡは、動的光分散(ＤＬＳ)スペクトルでの鋭いピークによる立証として分子直径値の狭い分布が特徴付けられている。これは本発明の方法によって得られた生成物がサイズ排除クロマトグラフィによってさらに確認されたように、モル質量の非常に狭い分散に対応していることを意味している。「ｎ」の計算値に対する本発明の構造の態様は分子構造の更なる規則性を示す実施例により述べられる。
【００５５】
上述の構造的な特徴は、合成段階での特定の準備条件(濃度、ＰＨ値、温度、攪拌度)による幾つかの要因による本発明によって定められる。これらのパラメータはＳＮＳＡの種が発生する合成の「誘導」段階において区別してセットされ、これによって分子の制御的な成長が行われる。この段階内での操作パラメータの値と活動力（段階の持続時間により変化)は、ＳＮＳＡ の生成の結果が、一般的な操作条件のもとで、熱力学的に好ましい計算値付近の「ｎ」凝縮度のきわめて狭い分布によって特徴付けられる。
【００５６】
「安定」段階での条件は、ＳＮＳＡの成長を停止し、生成物に当業者の認識よりも決定的に高い安定度を与えるように変性される。個々で開示される準備方法は、従来の方法とは著しく異なる方法であって、非常に大きいモル質量とシリカユニットの凝縮度「ｎ」のより広いガウス分布が得られる。
【００５７】
ここに開示された本発明の合成法によれば常に本発明の物質の混合物が生成し、これらの生成物は、請求項１に開示された制限によって規定される。従って、単一のｎ値を持った単一の化合物が合成されるのみではないことは当業者にとって明らかである。本発明の物質は、ｎが１２から２０００の最大範囲内、好ましくは、ｎが１６から１２００の範囲内、さらに好ましくは、ｎが１８から５００の範囲内、なおさらに好ましくは、１９から４００の範囲内、最も好ましくは２０から３００の範囲内のｎ値の狭い分布の混合物として分類される。
【００５８】
従って、本発明の重要な態様は、従来技術による不活性な重合物および/またはコロイド状シリカ粒子に比べて、本発明の物質は、ここに開示された範囲内のｎ値の狭い分布を有する。本発明の物質は、明らかにｎが１２から２０００の最大範囲を超えるガウス分布を持つものではない。もし本発明の物質の分析に動的光散乱(ＤＬＳ)またはサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）のような分析方法を使用した場合は、個々に開示された範囲内に入る単一のｎ計算値に相当する本発明の物質の分子直径Φおよびモル質量Ｍｒの狭い分布が検出され、ｎ値は特有の好ましいｎ値付近の２５％、好ましくは２０％、さらに好ましくは１５％異なる。従ってｎが１２から２０００の最大範囲内において、本発明の物質は単一のｎ計算値の付近で２５％、好ましくは２０％、さらに好ましくは１５％の比較的狭い分布で合成される。本発明の物質に本発明の合成を実施するとき、例えば、ｎ値は３６，４５，９２，９６、１８０，１９２，２８８，３６０，４５０，５５２，６５４，７２０，８１０，９９０が本発明の物質の混合物における最も好ましい化合物であり、一方本発明の混合物の他の化合物は、同様には分布されないか１２≦ｎ≦２０００の範囲内のガウス分布であり、むしろｎ値が、好ましいｎ値を持った化合物から２５％以上、好ましくは２０％、さらに好ましくは１５％以上異ならない範囲内のｎ値を持った化合物が見られる。例えば、本発明の混合物においては、最も好ましい値が９６で、すべての発明物質の約２５％がこのｎ値を持ち、例えば本発明の混合物が最も好ましいｎ値が９６ですべての発明物質の約２５％がこのｎ値を持ち、残りの７５％が１２から２０００のｎ値を持たない場合には、代わりにｎ値は好ましいｎ値の９６付近を狭く分布する。「狭い分布」とは、ｎ値が最も好ましいｎ値の約±２５％、好ましくは±２０％、さらに好ましくは±１５％であることを意味する。上記の例に関しては、本発明の物質の２５％についてｎ値が９６であり、残りの７５％の本発明の物質は７２と１２０との間のｎ値(２５％分布)、好ましくは７７と１１５との間のｎ値(２０％分布)、さらに好ましくは８２と１１０との間のｎ値(１５％分布)を持つ。
【００５９】
従ってここで使用される用語「狭い分布（ＲＯＤ）」とはＲＯＤ＝ｎ−０．２５ｎからＲＯＤ＝ｎ＋０．２５ｎ、好ましくはＲＯＤ＝ｎ−０．２０ｎからＲＯＤ＝ｎ＋０．２０ｎ、さらに好ましくはＲＯＤ＝ｎ−０．１５ｎからＲＯＤ＝ｎ＋０．１５ｎの分布（ＲＯＤ）範囲内の１つの個別の最も好ましいｎ値付近での本発明の物質の分布を云う。またさらに絶対数で定義することが好ましい場合には、分布の範囲はｎ値が６００から２０００の範囲では、ＲＯＤ＝ｎ−１２５からｎ＋１２５、好ましくはＲＯＤ＝ｎ−１００からｎ＋１００、さらに好ましくはＲＯＤ＝ｎ−７５からｎ＋７５、またｎ値が３００から６００の範囲では、ＲＯＤ＝ｎ−６０からｎ＋６０、好ましくはＲＯＤ＝ｎ−４０からｎ＋４０、さらに好ましくはＲＯＤ＝ｎ−２０からｎ＋２０、またｎ値が３０から３００の範囲では、ＲＯＤ＝ｎ−３０からｎ＋３０、好ましくはＲＯＤ＝ｎ−２０からｎ＋２０、さらに好ましくはＲＯＤ＝ｎ−１０からｎ＋１０である。
【００６０】
さらに、特有でかつ好ましい個々のｎ値を持った物質は反応パラメータによって支持され、さらに反応時間や温度および濃度によってｎ＝１２からｎ＝３００の低い範囲で好ましいｎ値を持った物質が形成され、一方、他の反応パラメータはｎ＝３００からｎ＝１０００又は１５００又は２０００の高い範囲の好ましいｎ値に導くことを述べなくてはならない。
【００６１】
しかし、特定の好ましいｎの数とは関係なく、ここに開示され、規定された範囲内で本発明の混合物は実例をもたらし、本明細書で述べかつ実証されたように開示され立証された活性を示す。
Ｃ９  シクロシリカリングを含む４個または５個のＳｉ原子を持った構成パターンユニットは、本発明の物質の構成において内部または外部シェルの構築に好ましい。他のパターンについては排除されないが、しかし３個のＳｉ原子を持ったシクロシリカは構造に著しい稠密化と張力を与える。６個のＳｉ原子を含むリングは排除されないが、しかしより大きいシクロシリカは全体の構造枠を緊密さと安定性を低下させる。構造的組立体の緊密な構成は、張力構造要素を欠くとともに内部空分子の選択的な全体的安定性を与える。
Ｃ１０  稠密で均一に分布した高い遊離性のＳｉ−ＯＨ基を持った外部表面は、本発明のＳＮＳＡ種の生体分子、好ましくはプロテンとの相互作用を完成させるための決定的な構造的な要求である。遊離ＯＨ基はＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合によって連結されたＱ3およびＱ2タイプのＳｉ原子によって作り上げられたシリカの枠組と結合する。Ｑ3タイプのＳｉ原子は１個の−ＯＨ基を、またＱ2タイプのＳｉ原子は２個の−ＯＨ基を持つので、Ｓｉ−ＯＨ（シラノール）基の全数は、外部シェルにおけるＳｉ原子のＳｉ−ＯＨの数より５０％ほど高い。すべてのサブナノシリカ分子にとってシラノール基の数は最も好ましい一般式［ＳｉＯ1.5（ＯＨ）n］に従ったＳｉ「ｎ」原子と等しい。
【００６２】
本発明のＳＮＳＡの表面におけるＳｉ−ＯＨ基の密度は、表面の平方ナノメータ（ｎｍ2）当たりのＳｉ−ＯＨ基の数で表されるαOHによって規定される。ここに提示されたデータは、外部Ｓｉ原子によって規定された領域の表面積Ａ＝Ｒ2４πで計算された。ＶｄＷ(ファン デル  ワールス（Van der Waals）)表面での計算は分子サイズの評価には十分であるが、ＳｉＯＨの密度には十分でない。
【００６３】
本発明のケイ酸の外部シェルにおけるシラノール基の密度は、αOH＞２．５、好ましくはαOH＞３．５の遊離Ｓｉ−ＯＨ基/ｎｍ2の平均値で与えられる。非結晶シリカαOH＞2のシラノール基の値は、遊離のシラノール基の化学誘導体化によって決められ３．０から６．０基/ｎｍ2の密度値が得られている。しかしながら、固体粒子によるこれらのαOH値は内部および外部Ｓｉ−ＯＨ基の合計を反映するものであり、従って外部表面における遊離ＯＨ基の密度は相当に低い。
【００６４】
非結晶シリカ粒子と内部および外部Ｓｉ−ＯＨ基と比較すると、本発明のケイ酸分子における内部Ｓｉ−ＯＨ基の貢献度はむしろ低い。外部シェルのＱ3、Ｑ2およびＱ1に結合される遊離のＳｉ−ＯＨ基の稠密で均一な配置によって(図７参照)本発明の生物学的活性ケイ酸は高い比率の内部シラノール基を持った先行技術のシリカ粒子に比べて決定的な技術的進歩を提供する。
【００６５】
コンピュータのモデルデータは、外部表面において規則的にＱ3およびＱ2タイプのＳｉ−ＯＨ基を変えるＳｉ−ＯＨ基の分離はその不規則で無作為な配置として好ましいことを指摘している。さらに、この構造的特殊性は、生体分子、好ましくはプロテンとの相互作用の最適な態様に重要な貢献をしている。本発明の分子が外部Ｑ3および表面におけるＱ3およびＱ2タイプのＳｉ−ＯＨ基の比率は実施例に開示するようにＩＲスペクトルによって走査される。
Ｃ１１  ｎの計算値は、外部シェルのＳｉ原子によって規定された外部表面におけるＳｉ−ＯＨ基/ｎｍ2の表面密度の計算によって示される。重合度の関数としてのＳｉ−ＯＨ基の密度は一定の値ではなく、あるいは直線的な変化を示さない本発明は、幾つかの個々の重合度値「ｎ」の意外な存在を開示する。高いシラノール密度を持ったこれらのｎ値は、本発明の記述における実施例に開示されている
Ｃ１２  主な構造基準Ｃ１−Ｃ１０の達成は、ここに開示したような範囲において第一の安定なケイ酸化合物が確認された一般式（Ｉ）の本発明の物質の安定性にとって必須であることを述べることは重要である。
【００６６】
Ｑ4：Ｑ3およびＱ2Ｓｉ原子のほぼ平衡な比率のための本発明のケイ酸の外部シェルにおけるシラノール密度の計算は、一般式(Ｉ)におけるｎ値の関数として非線型変化を示す。このことは幾つかの「ｎ」値が１８＜ｎ＜３００の範囲からの他のものと同様に、シラノール基の稠密な分布と言う基準によく適合していることを示す。
５．２  調製と特性
物質の調製は以下の一般式（Ｉ）で示される。
【００６７】
［ＳｉＯx（ＯＨ）4-2X］n
ここで、
ｎは１２−２０００の範囲の整数を示し、
ｘは１．２−１．８の数を示す。
【００６８】
物質の調製は以下のステップを含む：
ａ）無機シリコン化合物またはテトラ・アルキル・オルトケイ酸塩を水または水溶剤混合液と混合するステップ、
ｂ）６０分間未満撹拌しながらｐＨ値６．２−４．５で誘導段階を行うステップ、
ｃ）直線的勾配で徐々にｐＨを減らしながら微調整してｐＨ値４．５−３．８で凝縮段階を行うステップと、
ｄ）ｐＨ値２．１±０．３またはｐＨ＞８．４に溶液のｐＨ値を急速に変えて安定段階を行うステップ
を含み、
完全な調製を行うために必要な温度は４℃から８℃の範囲とすべきである。
【００６９】
ステップＣ直線的勾配でｐＨ値を徐々に減少させる操作が少なくとも５分間行われる。
本発明のさらなる態様は上記の方法で入手可能な物質である。
本発明の重要な実施態様は、好ましくは多く利用できるシリコン化合物から生物学的活性ＳＮＳＡ誘導体の選択的合成をすることである。また本発明は、大量にランダムに凝縮された低モル質量ケイ酸合成混合物または生物学的抽出物から生物学的活性ＳＮＳＡ因子を分離するための方法を提供することからなる。
【００７０】
本発明の活性ケイ酸の調製はシリカ、アルカリケイ酸塩または４塩化ケイ素のようなシリコンハロゲン化物などの大量に入手可能な無機シリコン化合物から合成方法で行うことができる。合成のための別のタイプの出発物質は、テトラ・エチル・オルトケイ酸塩（ＴＥＯＳ）またはテトラ・メチル・オルトケイ酸塩（ＴＭＯＳ）に例示されるテトラ・アルコキシ・オルトケイ酸塩、またあるいはポリヒドロキシ化合物を持つ加水分解可能なシリコン複合体などのいくつかのシリコン有機誘導体である。
【００７１】
１つの好ましい実施態様は、本発明の物質への「in situ」で合成されたモノケイ酸の変換を制御する多パラメータである。しかし先行技術の方法、すなわちアルカリケイ酸塩のプロトン付加反応や類似の方法で得られたモノケイ酸は、先行技術の文献に記載されるように高重合化生成物へ瞬時に変換される。
【００７２】
本発明は、出発物質が瞬時に重合化されることを防ぎつつ、高い収率で、in situ で調製されたケイ酸を、本発明の生物学的活性サブナノケイ酸ＳＮＳＡに変換する方法を開示する。本発明の各方法は、（i）目的ある低モル質量凝縮へと誘導する「誘導段階」（ii）制御されていない不規則な重合化せずに、本発明のＳＮＳＡの選択的で高意収率で調製を行う「凝縮段階」（iii）生成物が十分に安定される「安定段階」からなる。
【００７３】
本発明のＳＮＳＡの調製方法の選択性と高生産性は厳密に制御された濃度、ｐＨ，温度、各反応ステップの所要時間により達成される。作業パラメータは、製造の各段階で区別して定められた。従って、本発明のＳＮＳＡのテトラ・アルキル・オルトケイ酸塩Ｓｉ（ＯＲ）4の選択加水分解と変換は、厳密に実施され制御される「誘導段階」、「凝縮段階」および「安定段階」からなる。
【００７４】
１つの好ましい実施態様は、式中のＲがメチル、エチル、プロピルまたは出発物質が０．０２−０．６モル＝Ｌ-1の範囲に凝縮されたブチルを示す式Ｓｉ（ＯＲ）4を持ったテトラ・アルキル・オルトケイ酸塩の変換である。Ｓｉテトラ・アルキル・オルトケイ酸塩からの本発明の調製はここに述べているように本発明に従って行われ、この「in situ」で生成されたケイ酸は本発明の物質へ目的ある変換を行い制御されない重合化を防ぐ。
【００７５】
テトラ・アルキル・オルトケイ酸塩と水またはアルコールが入った水の反応の「誘導段階」では、４．５−６．２のｐＨ値、好ましくは５．４±０．４のｐＨ値が適用される。この誘導段階は短い期間であり、好ましくは１０分間の長さで６０分間より長くはかからず、その間強力に撹拌することが推奨される。次の「凝縮段階」では、４．５−３．８のｐＨ値で微調整が必要であり、直線勾配に沿って少なくとも５分間で徐々に減少させる必要がある。
【００７６】
本発明の重要な特徴は、本発明の物質の合成と安定におけるすべての段階で温度が厳密に制御されていることである。誘導段階の好ましい温度範囲は４℃から５０℃で好ましくは１５℃から４０℃である。規定のｐＨ値や温度値からの偏差と依存は、生成物の組成と活性により大きく変化する。本発明のシリカのより高い重合化を妨げるために凝縮プロセスを取りやめることは、溶液のｐＨ値を２．１±０．３またはｐＨ≧８．５に急速に変化させることで達成される。
【００７７】
アルカリケイ酸塩、好ましくはケイ酸ナトリウムなどの別の大きいシリコン化合物あるいはアモルファスシリコンやケイ酸塩鉱物から本発明のサブナノケイ酸を調製することにおいても誘導、重合および安定に類似した段階が述べられている。
５．３  特徴
ＤＬＳとゼータ電位
本発明の凝縮ケイ酸種の動的光散乱（ＤＬＳ）測定は、好ましい直径範囲０．６＜Φ＜３．０ｎｍで安定種が存在することを示した。動的光散乱とゼータ電位を適用してＳＮＳＡの大きさを測定することで、ｐＨと濃度に依存するシステムの安定性が詳細に確立された。ゼータ電位アセスメントと組み合わせたＤＬＳ技術は、大きさがΦ＞３．０ｎｍより大きい連合/凝集粒子の形成を制御するためにうまく適用された。
【００７８】
凝縮に関するナノサイズ粒子の安定性はLondon-Van der Waals引力と静電反発力の平衡に依存することが知られている。静電反発はイオン強度と表面電位（ネルンスト電位）に依存し、懸濁液のｐＨ値を調整することで変更できる。ネルンスト電位は、実験的に利用できないが、ゼータ（ζ）電位であるせん断面における界面動電位はモニターすることができる。ゼータ電位がおよそl３０ｍＶlより大きい場合には分散は一般的には安定であると見做され、一方粒子は等電点近くで凝集する傾向があり、それはゼータ電位がゼロのｐＨとして定義される。そのため、ＳＮＳＡを含む懸濁液中のゼータ電位の測定は制御されたｐＨ値で調べられた。
【００７９】
本発明の凝縮ケイ酸種の動的光散乱（ＤＬＳ）測定は、好ましい直径範囲０．６＜Φ＜３．０ｎｍで安定種のが存在することを示した。
サイズ排除クロマトグラフィは溶液中のケイ酸オリゴマーとポリマーを分子サイズに基づいて分離することに基づいている。この方法は単量体および重合ケイ酸サンプルと比較して本発明の物質を特徴づけるために利用された。シリカベースのゲルは、生物学的活性ケイ酸との非常に強い不可逆の相互作用のために使用は勧められない。高性能サイズ排除クロマトグラフィ装置で固定相としての有機ポリマーベースのゲルを使って非常に良好で再現性のある結果が得られた。本発明の物質は紫外線、可視光領域で測定可能な吸収がないので、検知システムに基づく屈折率が適用された。
【００８０】
本発明で開示された低モル質量凝縮ケイ酸種は、よく水に溶け、溶液はコロイド状で特定のｐＨ値で室温で長期間非常に安定している。８．５から１３．０の範囲の基準ｐＨの安定性はさらなる凝縮を妨げる陰イオン化されたＳｉ−Ｏ基の反発により起こる。生物学的活性ＳＮＳＡの実験的ゼータ電位測定は、種が非常に安定して凝集しない表面陰電荷であることを確認するおよそ（−５０ｍＶ）のゼータ電位値を提供した。
【００８１】
意外にも本発明のサブナノ回転楕円形凝縮ケイ酸は、好ましくはｐＨ１．８−２．２の酸性の範囲でもまた非常に安定する。特定の酸性ｐＨ範囲における重合化傾向は低く、ｐＨが〜２．０でおよそゼロ荷電ポイントで凝縮傾向が低減されることで説明できる。上記で特定されるような基準および狭い酸性範囲の両方における安定性によれば、不溶性シリカ粒子とシリカゲルに自発的に重合する低分子濃度不安定ケイ酸種の先行技術と比較して、ここに開示されたサブナノケイ酸誘導体は明白な技術的進歩を有していることを意味する。
【００８２】
ここに記載されたケイ酸の電荷依存安定性は、遊離Ｓｉ−ＯＨ基の外部表面の処理にとりわけ影響される。基準ｐＨ値が塩基性の場合、媒体は外部表面に陰電荷の対称で密集した隔壁を提供する。従ってすべての分子は互いに反発し溶液は非常に安定を維持する。陰電荷カバーは本発明の物質の粒子の凝集と変換を防ぐのに非常に効果的な保護的役割を果たす。
【００８３】
上に概要的に示した静電気因子の他に、本発明の物質は際立った熱力学安定性に対するさらに重大な構造的根拠を有している。実際には、本発明のケイ酸は主にＱ４タイプのＳｉ−Ｏ結合の小型内部シリカコアにより形成され、好ましくは表面に表れる遊離Ｓｉ−ＯＨ基の最大数を持つ外部シェルにより囲まれている。遊離シラノール（Ｓｉ−ＯＨ）結合と凝縮（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）基の相互交換は、分子内で行われるが、これはＳｉ−ＯＨ基の外部処理よりも回転楕円形の好ましい安定性全体にはあまり影響しない。
【００８４】
低い負のゼータ値（−５０ｍＶ）は粒子が非常に安定し負の表面電荷を持つことを示す。ゼータ値が０に近づくと、粒子が安定せず凝集する傾向にあることを意味する。しかしこの現象は本発明の生物学的活性ＳＮＳＡケイ酸の場合には生じない。ゼータ値が大きくなると粒子サイズも大きくなる。ゼータ値は溶剤の種類、測定溶液のｐＨおよび固体粒子の濃度と種類に依存する。本発明の場合には、ゼータ値は大きく負でｐＨは約９−９．５である。サンプルは定常濃度または定常ｐＨで比較された。測定されたゼータ値の完全な再生およびＳＮＳＡ粒子の流体力学的径は達成された。これは上に特定する状況で粒子が表面陰電荷されていて非常に安定しており、凝集しないことを意味する。
不活性支持物質の安定
加熱、先進的な真空乾燥、凍結乾燥や他の手続きにより本発明の水溶液から水を強力に除去することは生物学的活性の大きな損失となる。予想される原因は、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ共有結合を構築し２０００よりもｎ倍大きな粒子を形成することで水の多分子間排出（縮合）を起こしてしまうことである。
【００８５】
本発明は不活性支持物質を用いて、あるいは不活性支持物質の上で乾燥が行われる場合、本発明のＳＮＳＡ物質の活性は十分に維持することができることを示している。本発明の適切な支持物質は水溶性で医薬的に中性の固体または非揮発性の液体である。好ましい支持物質は、エチレン・グリコール、プロピレン・グリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、ズルシトール、ペンタエリスリトールに例示されるポリオールのような多ヒドロキシル化有機物質である。最も好ましい支持物質は、中性物質としてすでに医薬品製剤に許可されたもので、本発明の「医薬品製剤」の章に記載されている。Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉの同時形成下で、脱水を開始、支持または触媒しない、いかなる適切な基質も使用できることが好ましい。このような好ましい支持物質は中性物質で、正負電荷を持つ官能基のないことが好ましい。
【００８６】
水溶液中または中性物質上での本発明のケイ酸の長期間の安定は、ＤＬＳとゼータ電位の定期的な評価およびＡＴＰアーゼ阻害測定により調査された。ＳＮＳＡ溶液は室温での数か月間の貯蔵で安定することが確認された。さらに、本発明の支持物質上でのＳＮＳＡの活性は少なくとも２４か月完全に保存される。この本発明の不活性物質上での本発明の物質の長期間の安定は、疾病を予防または治療する際に本発明を適用する最適な形を提供する。
凝集
初期種が物理的処置(加熱、超音波)を施された場合または化学薬品（ｐＨ変化、希釈、塩）により改善される場合には可逆性と考えられるが、、本発明のサブナノ凝縮シリカ種は凝集をすることができる。シラノール基の新規の結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）によりＳＮＳＡをより高いモル質量種へ変換することで、不溶性シリカ粒子を形成する場合には不可逆性とすることができる。このプロセスは溶液のイオン濃度を上昇させる、すなわち無機塩類を添加により促進される。
粘性
粘性はオリゴマーとポリマー中のモノケイ酸を変換させる非常に高感度の方法である。ゾルとして分類されるシリカのコロイド溶液中の分散粒子の大きさを確立することが可能である。
ＮＭＲ
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法は、外部磁場での核スピンの電波への反応に基づき、特定の型の原子の第一と第二の配位圏の研究にとりわけ応用することができる。ＮＭＲはノンゼロスピンを持つこれらの原子核のみに観察される。しかし各化学要素のほとんどにはこの要求に合う同位元素がある。マジック角回転技術は液体のみではなく固体でもＮＭＲ分光法をうまく適用させることができる。従って、ナノ粒子の凝固プロセスにおける中間種の構造、外部と内部表面活性部位多孔性ナノ物質、原子配位およびホストゲスト相互作用を研究するのにＮＭＲは広く利用されている。Ｓｉ原子の結合性についての情報は29ＳｉＮＭＲスペクトルの測定により得ることができる。
【００８７】
これは、「ｓ」がシロキサン（Ｏ−Ｓｉ)結合で「４−ｓ」がいくつかのＳｉ−ＯＨ（シラノ−ル）基である因子Ｑ5で表される。29ＳｉＮＭＲスペクトルには、Ｑ4、Ｑ3，Ｑ2およびＱ1タイプのＳｉ原子に対応する生物学的活性ケイ酸化学シフト値が見出されている。このデータにより本発明の構造は好ましくは４次（Ｑ4）Ｓｉ原子により形成された内部コアと、Ｑ3，Ｑ2およびＱ1タイプのＳｉ原子により形成された外部シェルを持つことが確認されている。ガウス曲線を積分した割合によりＱ4、Ｑ3，Ｑ2型Ｓｉ原子のバランス比を求める。
ＩＲとラマン分光法
フーリエ変換型赤外（ＦＴＩＲ）分光法とラマン分光法は電磁放射線を使った振動分光法の２つの別の理論である。ＦＴＩＲ分光法は、赤外線の吸収に基づき、一方ラマン分光法は原子振動による非弾性の可視光線またはほぼ可視光線を含むものである。両分光法技術は、短い範囲と中間範囲の配列に関する情報、すなわちシリカの相対位置などの、最隣接原子やより大きな集団での多面体の結合方法を示す情報を提供する。
【００８８】
フーリエ変換型赤外（ＦＴＩＲ）分光法とラマン分光法は、サブナノメートルスケールで識別可能な指標となる原子クラスタから入射放射に対する異なる応答に基づくもので、シリカナノ粒子の構造分析に優れたツールである。様々な分光法の中で比較すると、ラマン分光法は非結晶性物質を検知して異なる結晶性シリカ物質を明らかにするという能力において有利である。さらに水は非弾性光散乱に乏しいが有機分子のラマン散乱断面積は非常に大きいので、ラマン分光法を水中で安定化された結晶性ナノ粒子の構造を証明するための方法として利用することが期待される。
【００８９】
ラマン分光法は、密ナノ粒子のミクロンサイズの自己集合の構造的障害の度合を証明するものである。構造的な欠陥に関する実態はサンプルから集められたスペクトルから得られる。９６０ｃｍ-1の近くででのラマン散乱は、シリコン‐酸素点欠陥(破壊されたＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合)を示し、ナノ粒子の領域構造は２５０−６５０ｃｍ-1の範囲でＳｉＯ4環状に形成された複数要素バンドの形状に適合することで定量化されている。非結晶性シリカの主要なスペクトラルの特徴は、６，４，３それぞれの員環により形成された帯域はほぼ４５０ｃｍ-1であり、信号は４９５ｃｍ-1と６０６ｃｍ-1である。
【００９０】
ＦＴＩＲ分光法のみで、表面ヒドロキシル基の様々なタイプを明らかに確認することができ、従って対応活性部位の数を定量化することができる。一般に、酸性部位を分析するために表面ＯＨ基のＯ−Ｈ結合延伸モードが使用される。急激なＩＲピークが３５５０−３８００ｃｍ-1で観察され、ほぼ３７４５ｃｍ-1のピークが末端シラノ基で、またほぼ３６１５ｃｍ-1がＳｉ（ＯＨ）酸性部位で生じる。
蛍光性
本発明のケイ酸の調剤は蛍光分光法によりモニターされた。このアッセイは、特定のインジケータＰＤＭＰＯ[２−（４−ピリジル）−５−（（４−２−カルバモイルジメチルアミノエチル）メトキシ）−フェニルーオキサゾール]のスペクトル中に蛍光シフトと強度の増加をつくりだすシリカの重合化を観察することに基づく。これは蛍光シフトがＰＤＭＰＯと高分子ケイ酸の相互作用によるものであると思われる。
【００９１】
実際には、本発明の物質の製剤中にケイ酸の重合化をモニターするために、ＰＤＭＰＯの蛍光発光強度５１０ｎｍ（３３８ｎｍ exc.）が使用される。
安全性
本発明のケイ酸誘導体は、静脈内と腹腔内に単回投与したマウスとラットから判断すると体重１ｋｇあたり２４０から３００ｍｇ/ｋｇの範囲のＬＤ50値を持つ。強心ステロイド急性毒性値は大変高く、Ｄｉｇｏｘｉｎは例えば体重１ｋｇあたりＬＤ50＝０．１ｍｇ/ｋｇである。ジギタリス配糖体の致死量は維持量の約２０倍であるが、それは治療量と中毒量の狭い範囲を示す。
【００９２】
先行技術のバナジン酸塩または強心ステロイドと比べて、本発明のケイ酸が毒性を減らすことは開示された物質の主要な利点である。先行技術のバナジン酸塩と比べて本発明の物質の明らかなより低い毒性は、新規の化合物のヒトの治療への適用に重要な利点を提供する。
５．４  生物学的活性
蛋白質との相互作用
ここに開示されている本発明のサブナノ凝縮ケイ酸の１つの重要な実際的な実施態様は、蛋白質、すなわち図８と図９に示す特定の構造領域を持つ蛋白質と相互作用する本発明の能力を結果の結果としてもたらされるものである。この相互作用は標的蛋白質の構造を修正して生物学的な特徴を変更する。あり得るメカニズムの１つとして、酵素の活性部位への作用薬のアクセスを妨げたり、または蛋白質の開不安定構造に近接することである。本発明のＳＮＳＡは、例えばリン酸の一部分を添加することを防いで暴露されていない活性部位を持つ閉鎖構造を安定させることにより、ＡＴＰフューエル酵素を抑制することができる(図８)。
【００９３】
本発明の好ましい実施態様は、ここに記載されるＳＮＳＡと信号導入と膜輸送における可逆リン酸化プロセスに直接含まれる蛋白質の直接的な相互作用である。ＳＮＳＡを持つ領域の分子間の相互作用により生成される蛋白質の内部構造の調整は、特に特定の生物学的活性を変更することができる。構造と生物学的活性についての本発明の調整は、先行技術である大きな直径を持つシリカナノ粒子の相互作用と比較して、確実な技術的進歩をもたらす。さらに重要な進歩は、先行技術の大きな非溶性シリカ粒子の異種相互作用とは異なる本発明の同種の相互作用である。
【００９４】
とりわけ凝縮されたケイ素の重要な構造的な特徴は、図５に示すように、ほぼ回転楕円形で分子表面上でＳｉ−ＯＨ結合のほとんどすべてが遊離結合を示すことである。０．６＜Φ＜３ｎｍの範囲の好ましい直径を持つ本発明のサブナノケイ酸分子は、外面上でほとんどすべてがＳｉ−ＯＨ基を示すことができる。小型内部シリカコア(Ｓｉ−ＯＨ結合のない)と外表面上の密集した外側を向いたＳｉ−ＯＨ結合により、本発明の物質は生体高分子、好ましくは蛋白質と相互作用するように最適に設計されている。
【００９５】
好ましい分子直径Φ≦３ｎｍを持つことで、本発明の凝縮ケイ酸はほぼすべての蛋白質よりもかなり小さい。ＳＮＳＡがより大きな蛋白質分子と相互作用することは、例えばＳＮＳＡが蛋白質の確定された内部領域に結合しあるいは同一の分子内の２つ以上の領域に架橋する場合に分子内として分類することができる。別の好ましい実施態様は、例えば２つの類似または異なる蛋白質分子を架橋することで「分子内に」相互作用するＳＮＳＡ分子が提供されることである。図１０に示す固体基質としての大きなシリカナノ粒子（Φ＞１０ｎｍ）を持つ蛋白質の相互作用の従来技術と比較して、上に述べた両方の好ましい実施態様は大きな技術的進歩を意味する。本発明の物質のΦ＜５ｎｍの大きさは、通常相互作用する蛋白質よりも小さい。従って物質ＳＮＳＡは、蛋白質のよく確定された構造領域であるいは構造領域間での、分子内相互作用にむしろ関与しているのである。相互作用の本発明の様態は、蛋白質のシリカナノ粒子の先行技術の相互作用と比べて明白な技術的な進歩を含んでいる。
【００９６】
小型内部コアと外部シェル上に高密度の遊離Ｓｉ−ＯＨ結合を持つ小さな回転楕円形は、蛋白質や他の生体高分子の本発明の相互作用の基本的な前提条件である。図８は、Ｐ型ＡＴＰアーゼの領域Ｐと領域Ｎを持つ本発明の分子の仮定される相互作用を示す。
【００９７】
蛋白質と相互作用するように用いられる可逆リン酸化反応シリカナノ粒子を含む蛋白質と相互作用する先行技術のバナジン酸塩は、基質(キャリア)として分類されるが、それはバナジン酸塩の大きさΦ（＞＞５ｎｍ）は同等であるが、通常分子間ヒト炭酸脱水酵素ＩＩＩ(ｈＣＡＩＩＩ)を排除する単純蛋白質の大きさよりも極めて大きいからである。単純蛋白質は蛋白質変異体の最も安定したものであり、結合と非結合蛋白質間の動的平衡が確立し、そして次にシリカ粒子と混合を可能にしてくれる。
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ
ここに開示されるサブナノケイ酸ＳＮＳＡは、サブマイクロモル範囲のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとＩＩ型のＰ型ＡＴＰアーゼによる効力のある無機阻害剤として認識された。ＳＮＳＡ因子は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの細胞内部位に結合することが見いだされ、この抑制はウアバイン結合には優位性がない。サブナノケイ酸と蛋白質領域「Ｎ」(ヌクレオチド結合)と領域「Ｐ」（リン酸結合）の相互作用についての本発明のメカニズムは、図８に示される。本発明のＳＮＳＡは、イオンポンプのＥ１構造のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと相互作用し、最初の２つの細胞間カチオン結合部位の１つに平衡解離定数の変更を引き起こす構造的再配置が生じる。本発明のＳＮＳＡがＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのリン酸化サイクルへ介入するメカニズムは図９に示される。ＭＣＳ抑制状態では、２つの非特定結合部位の１つに１つのカチオン（Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋）が結合されていることが見出された。また高Ｎａ＋濃度では、別のＮａ＋イオンが高Ｎａ＋選択イオン結合部位に結合された。
Ｃａ−ＡＴＰアーゼ
本発明の物質ＳＮＳＡは、５０−８０ｎＭのＩＣ50で小胞体（ＳＥＲＣＡ）のＣａ−ＡＴＰアーゼポンプを抑制する。これは先行技術の例えばシクロピアゾン酸、２，５−（ｔブチル）―１，４−ベンゾヒドロキノン（ｔＢｕＢＨＱ）またはシクロオキシゲナーゼー２阻害剤であるセレコキシブ、クルクミンおよびメリチンなどのＳＥＲＣＡ阻害剤がマイクロモル(μＭ)範囲であることと比べて大きな進歩となる。本発明のケイ酸は先行技術のＳＥＲＣＡ阻害剤のタプシガルギン（thapＳｉgargin）（ＩＣ50がサブナノモル範囲）ほど効力はないが、ここに開示するＳＮＳＡは、実際の毒性が１０００倍低い利点を有する。
【００９８】
ＳＮＳＡによるＳＲ Ｃａ−ＡＴＰアーゼの抑制は本発明の物質の蛋白質領域との相互作用と類似している。しかし、ヒル関数に当てはめると、ヒル係数ｎH＝２．５６は、異なる抑制メカニズムが生じることを示すＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの場合と比べてかなり高い。
【００９９】
ナトリウムポンプの抑制メカニズムの相違は、含まれるアルカリイオンと本発明のＳＮＳＡに小さいが重要な相互作用を起こすことである。
Ｈ−ＡＴＰアーゼ
本発明の物質ＳＮＳＡは、効力（ＩＣ50が８０ｎＭまで）で胃Ｈ+/Ｋ+−ＡＴＰアーゼ（胃プロトンポンプ)を抑制する。この酵素は電気的中性を交換する際に胃腺の内腔にＨ+を隠している壁細胞に集中している。本発明のケイ酸ＳＮＳＡは、最近の抗酸化薬候補となる高い効力を持つ可逆Ｈ+/Ｋ+−ＡＴＰアーゼ阻害剤として開示されている。  膜ポンプとの可逆相互作用によりその薬理作用は、標的蛋白質と結合した後胃液酸度を低下させることができる。これは、例えば、オメプラゾールや、酵素に共有反応し特に可逆であるいは酵素に非共有結合する置換ベンゾイミダゾールなどの先行技術の合成プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）に比べて重要な技術的進歩を示す。
蛋白質フォスファターゼＰＴＥＮの抑制
ここに開示されるサブナノケイ酸ＳＮＳＡは、腫瘍抑制ＰＴＥＮ（ｐＨosｐＨatase and tenＳｉn homologue deleted on chromosome 10）を阻害する。このサブナノケイ酸ＳＮＳＡは、二重活性を持つチロシンフォスファターゼで、蛋白質と脂質の両物質を脱リン酸化する。また例えばＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ，ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２，ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３などの３−リン酸化ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）に対して高い特異性を持つ。細胞内のＰｔｄＩｎｓ （３，４，５）Ｐ３レベルを減少させることで、ＰＴＥＮはＰＩ３Ｋの影響を弱めるので、それによりアポトーシスの原因となる特定の下流信号経路を終端させる。
【０１００】
これらの効果をもたらすＰＩ３Ｋ/ＰＴＥＮ信号の１つの作用因子は、ウイルス遺伝子蛋白質ｖ−ａｋｔの哺乳動物相同物である蛋白質キナーゼＢ（ＰＫＢ/Ａｋｔ）である。ＰＫＢは、リン酸化反応を引き起こすＰＨ領域にＰＩ(３,４,５)Ｐ３を結合して成長因子の促進に応じてプラズマ膜により補強される。ＰＫＢは２つの別の部位、トレオニンー３０８(Ｔ３０８)とセリンー４７３（Ｓ４７３）を含み、これらはキナーゼによりリン酸化され、換言するとＰＩ(３,４,５)により活性化される。ＰＫＢのリン酸化反応は、ＬＹ２９４００２とWortmanninなどのＰＩ３Ｋ阻害剤の影響を受けやすい。他方、ＰＴＥＮ阻害化合物は結果としてＰＫＢのリン酸化反応を増大させる。
【０１０１】
実施例に開示されるように、ＳＮＳＡ１２０μｇ/ｍｌは、蛋白質フォスファターゼＰＴＥＮの抑制効果として説明されるＰＫＢリン酸化反応を促進する。この効果はバナジン酸塩による効果と非常に類似しているが、本発明の物質は極めて毒性が低いという重要な利点を持つ。
ＳＮＳＡの生物学的アッセイ
ここに開示される生物活性サブナノケイ酸ＳＮＳＡは、とりわけヒトＩｇＧとプロテインＡなどの免疫グロブリン間相互作用に対して、固有のそして用量に依存した影響を及ぼす。この非常に驚くべき反応は、０．２から４μｇ/ｍｌの濃度のＩｇＧ蛋白質で被覆されたプレートを使ってＥＬＩＳＡ技術により立証される。これらのプレートをアルカリ性フォスファターゼと結合させた蛋白質Ａで処理し、ＰＤＮＰでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄すると、４０５ｎｍのところに発色反応が認められ、これは比較対象としての定常的な定率光学濃度（ＯＤ）値と考えられる。
【０１０２】
ＩｇＧが被覆され洗浄されたプレートにＳＮＳＡの増加させながら１時間処理して、次に制御と同じ工程(洗浄、ＢＳＡで飽和、プロテインＡの被覆)を施すことで、添付の実施例に示されるような測定光学濃度値の用量依存の効果の増大が認められる。この増加は、１０−３００ｎｇ/ｍｌ領域で線形であり、生物流体を含む本発明のＳＮＳＡ物質のための高感度アッセイに適切な方法を提供する。
５．５  治療への適用
本発明の物質と本発明の物質を含む医薬製剤は医薬的に活性剤または活性成分として非常に有用であり、医学の分野において医療、予防、診断に使用することができる。
【０１０３】
さらに、一般式（Ｉ）の本物質は、ＡＴＰアーゼ、特にＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ、Ｃａ−ＡＴＰアーゼまたはＨ/Ｋ−ＡＴＰアーゼを抑制したりあるいは蛋白質キナーゼＢ/ＰＴＥＮシステムのようなキナーゼとフォスファターゼの作用を調節するのに有用である。さらに述べると、一般式（Ｉ）の本物質は、現在の医学で深刻な問題である抗生物質や細胞静止薬などの薬物に対して、生物が発達させた抵抗性の増大に本質的に関わっているＡＴＰ結合カセット蛋白質に作用する。
【０１０４】
これらの活性により本発明の物質は、高血圧、糖尿病、骨不全、心臓血管関連疾病、神経変性病態、癌、胃酸過多、骨粗鬆症、歯石、アルツハイマー症、クロイツフェルトヤコブ病、創傷治癒などの治療のための高い効力を持つ薬物と診断用化合物として有用である。
【０１０５】
さらに本発明の物質は、食欲をコントロールしたり創傷治癒に有用であり、さらに高血圧、糖尿病、骨不全、心臓血管関連疾病、神経変性病態、癌、胃酸過多、骨粗鬆症の予防および高血圧、糖尿病、骨不全、心臓血管関連疾病、神経変性病態、癌、胃酸過多の診断用に組成を調製するのにも有用である。
胃酸過多
本発明の物質は、ＩＣ50＝０．８μｇ/ｍｌのＨ/Ｋ−ＡＴＰアーゼを抑制するのに非常に効力の高い非毒性阻害剤である。ＳＮＳＡは４−メチルヒスタアミンにより胃酸分泌反応を減少させることが知られている。本発明の物質ＳＮＳＡは、０．０１から２５ｍｇ/ｋｇの範囲の投与量でラットやイヌなどの哺乳動物に経口および非経口投与により作用する。本発明の物質は、抗コリンメカニズムでは作用しないので、ドライマウスや視力障害などの現在の抗酸薬の副作用は予期されない。そのため本発明の物質は、胃酸過多の管理や治療に有効である。
【０１０６】
胃食道逆流障害（ＧＥＲＤ）は、食事と関連する頻繁にみられる病気であり、下部食道括約筋が閉鎖されたまま腹部からの酸が食道に逆流または押し戻される場合に起こる。その原因はしばしばはっきりしないが、恐らく胃酸の逆流の最も一般的な原因は胃酸の過剰生成である。本発明のサブナノケイ酸ＳＮＳＡを好ましくは食事後に体重１ｋｇあたり０．１−８０ｍｇ/ｋｇ摂取すると、胃食道逆流障害（ＧＥＲＤ）の発現を非常に効果的に抑えることができる。
高血圧
高血圧は医療従事者にとって治療の難しい主要な疾病である。高血圧は、心臓疾患、心不全、心臓麻痺、脳卒中および腎不全などの主要なリスク要因である。降圧療法は、高血圧にともなう疾病率や死亡率の上昇を低減または排除するのに効果的である。
【０１０７】
本発明のケイ酸物質は、本態性高血圧症を治療するために明白な治療の可能性を持つことが開示されている。この物質の高血圧の病理生理学における相互作用の主要なターゲットは、心臓血管と腎臓レベルでのＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼであり、これらは従来あまり注目されていなかった。
【０１０８】
実験的観察によれば、ＳＮＳＡは、プラズマ中にナトリウムイオンを回復する腎臓のナトリウムポンプを抑制するＮａ＋を尿排泄することを高める。高血圧患者にとって、腎臓のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの抑制とその後の利尿は正常なプラズマ量と血圧を回復させるものである。
【０１０９】
血管と心臓のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを並列して抑制することは、それぞれナトリウムの排泄を増加させ利尿により血圧を低下させる効果に匹敵する高血圧への効果を結果として得る。
【０１１０】
本発明のケイ酸は、高血圧ラットの動脈血圧を低下させることを開示している。ケイ酸が血管あるいは心臓のナトリウムポンプに作用すると、腎臓のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに選択的に作用するという結論を導くことができる。
糖尿病
インシュリンは標的細胞のプラズマ膜上の受容体に結合し、このインシュリン受容複合体が形成される場合には、ブドウ糖が標的細胞中に入ることができ、ブドウ糖はエネルギー源として使用されるか、またはエネルギー貯蔵のためにグリコーゲンに転換される。インシュリン受容体は蛋白質である。アルファとベータの２つの異なるペプチドユニットの２つの複製物からなる。１つのインシュリン分子は、各アルファサブユニットに結合する必要があり、この結合の後に、次にベータサブユニットが受容体の蛋白質の細胞質末端の形状を変化させる信号を送信する。この変化により細胞質蛋白質キナーゼ活性部位が露出され、ブドウ糖の摂取につながる他の反応を始めるインシュリン受容体物質のリン酸化を引き起こす。
【０１１１】
本発明の物質を糖尿病のマウスに投与することで、抗糖尿病の顕著な可能性が明らかにされた。ビスーＬ−グルタミンーバナジン酸塩複合体ＶＧｌｕ２と治療に使用された糖尿病治療薬ロシグリタゾンとを比較する試験が行われた。本発明のケイ酸誘導体ＳＮＳＡは、糖尿病治療薬ロシグリタゾン（Rosglitazone)と同様にブドウ糖レベルを著しく減少させ、また使用されるバナジウムーグルタミン酸塩複合体ＶＧｌｕ２を著しく減少させる。このデータは本発明の物質が可能性のある抗糖尿病薬として無機塩類より有効であることを示している。
【０１１２】
ＳＮＳＡの可能なメカニズムは、添付の実施例で示唆するように、インシュリン受容体（ＩＲ）と相互作用するインシュリン擬似作用である。これにはインシュリン受容体と結合するフォスフォチロシン  フォスファターゼ  ＰＴＰ１Ｂの抑制を含めることができる。このフォスファターゼは、インシュリン信号とインシュリン感性を低下させるインシュリン受容体のリン酸化反応の程度を低下させる。ＰＴＰ１Ｂはインシュリンの効果を模倣する。
食欲のコントロール
本発明のケイ酸は対照実験と比べて実験動物(ラット）で食糧摂取量を減らすことが見いだされている。観察される生理学的効果の作用メカニズムは、ＳＮＳＡが胃中のグレリンの生成を減らすことができることである。あるいは、ＳＮＳＡの生物活性はグレリン−ＮＰＹ回路中の重要な信号化合物であるＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ(ＡＭＰＫ)に影響を及ぼす。このＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼの修正あるいは信号回路の規定に関わる結合フォスファターゼの内の１つを修正することが、非常に効果的に食欲をコントロールするためにこの新規な治療戦略の目的であることが示唆されている。
【０１１３】
とりわけ動物実験の結果は、グルコース耐性を向上させ体重減少を促進する両方に対して非常に有望な戦略を提供し、また体重増加を促進する２型糖尿病のための現在ある他のほとんどの薬物に対して潜在的な有利性を提供することを示している。
癌
本発明のサブナノ凝縮ケイ酸は、様々なタイプの細胞培養のｉｎ  ｖｉｔｒｏで示されたように毒性が低レベルであることが認められている。Jurkat細胞、ヒトとネズミのＴ−リンパ球、樹状細胞およびマクロファージの生存可能性は、５０μモル濃度までＳＮＳＡにより著しくは変更されない。
【０１１４】
培養中の癌細胞は本発明のＳＮＳＡ物質と異なる方法で反応する。標準ＨｅＬａ細胞またはマウスＭＰ細胞は、半数阻害濃度が０．１から２０モルの範囲で抑制される。
これまでの研究では、細胞内遊離Ｃａ2+(Ｃａi)レベルを増加させる薬剤は、アンドロゲン非依存転移性前立腺がん細胞においてもアポトーシスを活性化させることができることが示されている。ここに開示されるＳＮＳＡは、カルシウムホメオスタシスを維持するために極めて重要なカルシウムＡＴＰアーゼポンプに対して有効な阻害剤であり、それ自体ではすべての細胞のタイプにアポトーシスを引き起こすことができる。比較実験のマウスの腫瘍の量が１２日後に１６５％に増えるに対して、ＳＮＳＡを処方したマウスの腫瘍は最初の量から４５％減少した。
【０１１５】
蛋白質チロシンフォスファターゼ（ＰＴＰｓ）などの蛋白質フォスファターゼは癌関連信号プロセスに阻害効果と刺激効果の両方を示すことができる。さらに蛋白質フォスファターゼは、癌細胞の付着、血管への輸送、拡散や転移を制御するのに非常に重要な役割を持つ。このプロセスをさらに理解すると新規の治療のターゲットを確認することができる。本発明のサブナノケイ酸が攻撃的な癌細胞の分岐や拡散を効果的に減少させることが見出された。これは致命的な結果となるがんの転移を予防して制御するための新規の治療的アプローチを提供する。
薬剤排出ポンプ
ここに開示するケイ酸ＳＮＳＳは、Ｐ糖蛋白質のようなＡＴＰ駆動多剤排出ポンプを非常に効果的に抑制する。これは過剰発現された排出ポンプが癌細胞から蛍光染色を取り除くことを調べることでin vitroで確認された。排出ポンプを効果的に抑制することは、細胞毒性薬に対する獲得耐性を減少させて本発明の物質を癌の化学療法に適切に利用するものである。耐性に内在するメカニズは、細胞ホメオスタシスの制御に関連する機能を利用していると考えられる。ＡＴＰ結合カセットトランスポーターファミリに属する形質膜薬剤排出トランスポータであるＰ−糖蛋白質が過剰発現することで腫瘍が多剤耐性するというのは１つの重要なメカニズムを示している。
【０１１６】
また細胞質と細胞内細胞小器官のｐＨ勾配は抗腫瘍薬剤への耐性に関係する。酸性の細胞小器官内でまたは細胞外の環境内で薬物を隔離して中和することは１つのメカニズムとして提案されている。Ｐ−蛋白質のような多剤排出トランスポータを過剰発現する細胞と排出トランスポータを発現しない細胞の両方に、酸性の小胞体のターンオーバーが増えることは化学耐性のメカニズムのさらなる重要な特徴である。細胞毒性薬に耐性のある酸性の小胞体は、酸性の細胞小器官から薬剤を隔離するリソソーム型小胞体の酸性化を上昇させること、および分泌経路で細胞から薬剤を押出すことの両方に関与する。
骨粗鬆症、歯石
本発明のケイ素は物質として水酸アパタイト核形成を含むシリカ鉱化作用のための基質として作用することができる。この発見は骨の再生や歯石の形成を促進するために本発明のＳＮＳＡを適用する道を開くものである。
アルミニウム拮抗性によるアルツハイマー症
本発明の物質の好ましい実施態様は、アルツハイマー症におけるアミロイド斑の形成のような病状に含まれる蛋白質の好ましくない凝集やクロイツフェルトヤコブ病におけるプリオンの凝集の予防に関するものである。アルミニウム元素（Ａｌ）とアルミニウム塩は神経毒として認識され、アルツハイマー症を助長すると考えられる原因要素の１つであると見做されている。体重１ｋｇあたり０．１から１５ｍｇ/ｋｇ量の本発明のサブナノケイ酸ＳＮＳＡを日常的に摂取すると、動物実験では消化管へのアルミニウムの取り込みを減らすことができるので、従ってこの金属を、脳細胞組織を含む体内に蓄積することを遅らせることができる。経口摂取によりＳＮＳＡを使用することでアルミニウムの尿中排泄（８７．０から５４．２ｎモル/ｍモルのクレアチニン）は著しく減少する（ｐ＝０．０２１）。尿中のアルミニウムの低減は、アルツハイマー病においてアルミニウムの体内蓄積を減らすために非侵襲的な治療として本発明のケイ酸を将来長期間にわたり使用することの有用性を裏付けるものである。この結果により、ここに開示されるＳＮＳＡが、アルツハイマー症やクロイツフェルトヤコブ病などの神経変性の病気を予防したり、治療するための防御要素が得られるシリコンの栄養補給の適切な生体利用形態であることが確認される。
創傷治癒
上皮成長因子（ＥＧＦ）のようないくつかの成長因子は、成長因子受容体に結合し受容体の構造を変えることで、創傷治癒において重要な役割を果たす。この変更はＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のような多くの細胞内蛋白質のリン酸化反応を起こす蛋白質キナーゼを活性化する。
【０１１７】
本発明の物質ＳＮＳＡは主にファスファターゼの結合を抑制することでＰＩ３キナーゼの作用を改善することが証明された。これによりここに開示されたケイ酸ＳＮＳＡを、未対処の医療ニーズである創傷治癒を促進するために適用することができる。
５．６  医薬品製剤
治療と予防におけるここで開示されているケイ酸ＳＮＳＡの発明的な適用事例においては、それを安定した医薬品形態で提供することが必要である。本発明の好ましい実施態様においては、無機あるいは有機のいずれでもよい不活性基質上でＳＮＳＡを使用する。好ましい基質材料はいくつかの脂肪族ポリオール類（マニトール、ソルビトール、キシリトール、ペンタエリスリトール及びスレイトール等）、糖類、澱粉などである。
【０１１８】
ここで開示されているケイ酸ＳＮＳＡの発明的な適用に用いられるのに適している基質としては、ラクトース、サクロース、マニトール、及びソルビトールなどの糖類や小麦、コーンライス、及びジャガイモなどから得られる澱粉、そして微結晶性セルロースなどのセルロース類が含まれる。組成物中の基質の量は組成物全体の約５−約９５重量％で、好ましくは約２５−約７５重量％、より好ましくは約３０−約６０重量％、そして最も好ましくは約４０−約５０重量％である。
【０１１９】
他の本発明による医薬品製剤は本発明による物質ＳＮＳＡとアミノ酸、アミノ糖類、あるいはアミノ−アルコールなどの有機窒素含有化合物との結合に基づいている。
一般式(1)で示される化合物は、オプションとして基本的に非毒性の薬学的に許容される基質、賦形剤、補助剤、あるいは希釈剤を用いて薬学的活性塩として投与することもできる。本発明による医薬品は公知の方法で、適切な投与量レベルで、通常の固体あるいは液体基質あるいは希釈剤と通常の薬学的に作られる補助剤内でつくられる。好ましい薬剤及び製剤は経口投与あるいは皮膚あるいは経皮投与に適した投与形態で提供される。これらの投与形態には、例えば、錠剤、タブレット、フィルム・タブレット、被覆タブレット、カプセル、粉末あるいはデポジット剤などの形状が含まれる。その他の経口投与形態も可能である。
【０１２０】
本発明によるケイ酸物質あるいは医薬品製剤あるいはそれらの物質を含む剤形は、吸入、注射（静脈、腹膜内、筋肉内、皮下）、上皮あるいは粘膜ライニング（口腔粘膜、直腸、及び子宮上皮ライニング、鼻咽腔粘膜、腸粘膜）を介しての吸収、経口、経腸、経皮、局所的、皮内、胃腸内、子宮内、血管内、鼻腔内、口内、舌下経由、あるいは薬学技術で利用可能なその他の手段で投与することができる。
【０１２１】
これらの開示されている方法を用いて、一般式(1)で示される少なくとも１つの物質あるいはその薬学的に許容される塩を活性成分として含んでいる本発明の医薬品組成物は、通常、意図する投与形態、つまり、経口用タブレット、カプセル（固体充填、準固体充填あるいは液体充填）、粉末、経口ゲル、座薬、分散性顆粒、シロップなどの剤形に対して適切に選択されると共に、通常の薬剤規範に合致して選択される適切な基材物質と共に投与される。例えば、タブレットあるいはカプセルの形態で経口投与するためには、活性成分をいずれかの経口用非毒性の薬学的に許容される不活性基質、例えばラクトース、澱粉、サクロース、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、タルク、マニトール、エチルアルコール（液体形態）などと組み合わせることができる。さらに、望ましい、あるいは必要な場合は、適切な結合剤、潤滑剤、分解剤、及び発色剤をその混合物に組み込むこともできる。粉末及び錠剤は本発明の組成物を約５−約９５％の割合で含むことができる。
【０１２２】
適切な結合剤は澱粉、ゼラチン、天然糖、コーン甘味剤、アカシアやアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレン・グリコール及びロウなどの天然あるいは人工のガムなどがある。これらの投与形態で使用するために用いられる潤滑剤としては、ホウ酸、ナトリウムベンゾエート、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがある。分解剤としては、澱粉、メチルセルロース、グアールガムなどがある。必要な場合、甘味剤や香料及び保存剤も含むこともできる。上に述べた用語のいくつか、つまり、分解剤、希釈剤、潤滑剤、結合剤などについてはより以下により詳細に述べる。
【０１２３】
さらに、本発明の組成物は、治療効果、つまり抗ヒスタミン活性などを最適化するために、１つあるいは複数の成分あるいは活性成分の放出量を管理しながら放出するように抑制放出形態で調製することができる。抑制放出用に適した形状としては、それぞれの層の分解速度が異なっており、活性成分を含浸させた制御放出ポリマー性基材を含み、そうした含浸あるいはカプセル化多孔ポリマー性基質を含んでいる複数の層で構成される層状タブレットなどがある。
【０１２４】
液状製剤としては溶液、懸濁液、及びエマルジョンがある。一例としては、非経口注射用の水あるいは水−プロピレン溶液や、甘味剤や経口溶液ようの混濁剤、懸濁剤、エマルジョンの添加などがある。液体形状の製剤としては鼻腔内投与のための溶液も含まれる。
【０１２５】
吸入に適したエアロゾル製剤は溶液や粉末形態の固体を含んでいてもよく、それらは例えば窒素などの不活性圧縮ガスなどの薬学的に許容される基剤と組み合わせてもよい。
座薬をつくるためには、ココアバターなどの脂肪酸とグリセリドの混合物などの低温溶解性ロウを最初に溶解して、活性成分を攪拌などの混合方式で均等に分散させる。解けた均等の混合物を適切なサイズの型に注ぎ込み、冷却して固化する。
【０１２６】
使用直前に、経口投与あるいは非経口投与用の液状製剤に変えられることを意図した液状製剤も含まれる。そうした液状製剤には溶液、懸濁液、及びエマルジョンが含まれる。
１つの好ましい形態は皮膚あるいは経皮用パッチ（貼付剤）である。本発明による物質は経皮的にも投与可能である。経皮用組成物はクリーム、エアロゾル及び／又はエマルジョンの形態をとることができ、この目的のために従来の技術で用いられているマトリックスあるいはレザーバー・タイプの経皮用パッチに含めることが出来る。
【０１２７】
本発明のパッチ剤に適した溶媒は、浄水、アセトンやブタノンや２−ペンタノン及び３−ペンタノンなどのケトン類；エタノールやプロパノールやイソプロパノールやブタノールやイソブタノールやセク−ブタノールやテルト・ブタノールなどのアルコール類；酢酸エチル・エステル、酢酸プロピルエステルなどのエステル類から選択することができる。さらに、上記溶媒の混合物を用いることもできる。上に述べた溶媒あるいは溶媒混合物と共に適切な共溶媒を用いることもでき、その共溶媒は乳酸、サリチル酸、サクシン酸、尿素、マギリョール(登録商標)８１２（Chemische Werke Huls, Mari,ドイツ）、トリグリセリド類、エチルオレエート、グリセリルモノドデカノエート、オレイン、オレエート、マクロゴル(登録商標)６０００、及びレシチンで構成される群から選択することができる。
【０１２８】
接着剤内での溶媒の量あるいは溶媒と共溶媒の総量は重量ベースでその接着剤の０．５−７０％の範囲であればよく、好ましくは重量ベースでその接着剤の約３−約６０％、より好ましくは約１０−約５０重量％、さらに好ましくは約２０−約４０重量％、そして最も好ましくは重量ベースでその接着剤の約１０−約３０％の範囲である。
【０１２９】
カプセルという用語は、上記活性成分で構成される組成物を保持あるいは包むための、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、あるいは変性ゼラチン、あるいは澱粉でできた特別のコンテナーあるいは容器を意味している。硬いシェルのカプセルは、通常、ゲル強度が比較的高い骨あるいは豚皮ゼラチンの混合物でつくられる。このカプセル自体は少量の染料、不透明化剤、可塑剤、及び保存剤などを含んでいてもよい。
【０１３０】
タブレットとは活性成分と適切な希釈剤を含んだ、圧縮あるいは成型された容量形態を意味する。タブレットは湿式造粒法、乾式造粒法、あるいは当業者に公知の成形方法で得られる混合物や顆粒を圧縮することでつくることができる。
【０１３１】
経口用ゲルとは親水性の準固体基質内に分散あるいは溶解された活性成分を意味する。
構成用粉末とは活性成分と水や果汁内に懸濁させることができる適切な希釈剤を含む粉末混合体を意味する。
【０１３２】
分解剤という用語は組成物に加えてそれがバラバラになって（分解して）医薬成分を放出できるようにするための物質を意味する。適切な分解剤には澱粉、「ナトリウム・カルボキシメチル澱粉などの「冷水可溶性」修正澱粉、イナゴマメ、カラヤ、グアル、トラガカント及び寒天などの天然及び人造ガム、メチルセルロース及びナトリウム・カルボキシメチルセルロース、微結晶性セルロース、それにナトリウム・クロスカルメローズなどのナトリウム・セルロースなどのセルロース誘導体、アルギニン酸及びアルギン酸ナトリウム、ベントナイトなどの粘土、そして沸騰性混合物などである。組成物内の分解剤の量はその組成物に対して重量ベースで約１−約４０％の範囲であってよく、好ましくは２−約３０％、より好ましくは約３−２０％、そして最も好ましくは約５−約１０％である。
【０１３３】
結合剤とは粉末を結合あるいは「接着」して顆粒を形成することにより接着性にし、その剤形内での「接着剤」として機能する物質を意味する。結合剤は希釈剤や充填剤にすでに存在する接着力を増強する。
【０１３４】
本発明の一般式(I)による物質の製剤及び投与に関する技術は「Remington's ＰＨarmaceutical Sciences」 Mack Publishing Co., Easton PAに見出すことができる。本発明の少なくとも１つの物質及び／又は薬学的に許容できるその塩を含む適切な組成物は、適切な液体薬学基質内にその組成物を溶解した溶液でもよいし、タブレット、錠剤、フィルム・タブレット、被覆タブレット、糖衣錠、カプセル、粉末及びデポジット、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、エマルジョンなどでもよい。
ＳＮＳＡは蛋白質に基づく治療の効果を向上させる
治療用蛋白質は特に抗リューマチ及び抗癌治療領域で医薬品市場のかなりの部分を占めるに至っている。その高度に個別的な生物活性と厳密に定義された治療特性は非蛋白質性薬剤物質と比較して非常に大きな利点を有している。しかしながら、蛋白質製剤には重要な欠陥があり、それはそれらの薬品の生化学的性質と強い関連性がある。オリゴペプチドやポリペプチドなどのモル質量が小さな蛋白質は、生きている生物の酵素ネットワークによって急速に分解されてしまうので、その利用可能性はかなり低減されてしまう。抗リューマチ薬などのモル質量が大きな蛋白質の適用は感染や悪影響の頻度の増大という傾向と関連している。蛋白質に基づく癌治療の重大な欠陥はそれらの免疫原性、つまり、それらがホスト生物による抗−抗体を生成して蛋白質製剤の効果を徐々に無効にしてしまう傾向と関連している。
【０１３５】
サイズがナノ以下のケイ酸はペプチド及び蛋白質とこれまでになかった反応を行うことで、いくつかのペプチドと蛋白質の構造と性質をかなり修正することができる。これらの相互作用は治療用蛋白質の利用可能性と生分解性に相当程度の影響を及ぼすことができ、それらの治療目的での適用において実際的な利点をもたらしてくれる。
【０１３６】
蛋白質治療の効果を改善するための本発明によるＳＮＳＡの適用には、ＳＮＳＡ
とインシュリンや血管腸ペプチド(ＶＩＰ)などの小型ペプチド、あるいは抗リューマチ治療におけるAbatacept、Adalimumab、Certolizumab、Etanercent、Golinumab、Infliximabなどとの組み合わせ、あるいはCetuximab、Gemtuzumab、herceptin、Ibritumomab、あるいはTituximabとの組み合わせなども可能である。
微量要素ケイ素のための栄養補助剤としてのＳＮＳＡ
ケイ素は生物系内には普遍的に存在しており、その濃度は生きている生物の(０．０５−３．５％)の範囲である。種々の形態のケイ素、そしてＳｉとＯの組み合わせはいくつかの藻類スポンジ及び植物の固体構造の基本的な成分である。ケイ素は接続組織合成と骨結晶化において不可欠の役割を果たしているが、そのメカニズムはまだそれほど理解されていない。ヒトの通常の栄養摂取における一日あたりのシリカの摂取量はほぼ２０−５０ｍｇの範囲で、同じ量のケイ素が主として尿によって排出される。栄養性ケイ素の主な供給源は水を含む植物やその他の飲料物である。
【０１３７】
高齢の人々のケイ素がケイ素を取り込む能力が低下していく傾向は、骨収縮や接続組織関連の疾病の頻度の増大と関連していると思われる。ヒトにおいてはケイ素欠乏が臨床的にどのような影響を及ぼすかについてはまだ明らかではないが、高齢の生物の栄養素からケイ素を取り込む能力の低下については、十分に明らかにされている。本発明によるナノサイズ以下のケイ酸（ＳＮＳＡ）は、細胞膜を透過し、ほとんどのタイプの細胞で、細胞内濃度が細胞外の環境と均衡するので、生物学的に利用可能な天然のケイ酸を豊富に提供することができる。
６．
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】先行技術の化学構造：ケイ酸の線形、分岐環状、多重環状ケージ型凝縮オリゴマー性の誘導体。
【図２】不安定な低モル質量オリゴマーと固体粒子あるいはアモルファス・ポリマー（シリカゲル）に急速に変換される水溶性高級オリゴマーをつくりだすオルトケイ酸のポリマー化（多重凝縮）のスキーム。
【図３】内部コアが主としてＱ4タイプのＳｉ原子で構成され、外部シェルがＱ3及びＱ2タイプのＳｉ原子及び隣接−ＯＨ基で構成されている、本発明の物質の構造的実施例。
【図４】ＳＮＳＡが低モル質量ケイ酸種と５ｎｍ以上の大きさのシリカ粒子の間で示してある、凝縮ケイ酸誘導体の全容を示す三次元図。。
【図５】内径１．４５ｎｍに対応する間隔を充填した分子モデルで示してある、本発明によるサブナノケイ酸ＳＮＳＡ構造の球面形状。
【図６】シクロテトラ・ケイ酸単位からの本発明のＳＮＳＡ分子の内部シェル形成のスキームであり、最初の２つの層は４＋８＝１２個のＱ4タイプのＳｉ原子を含んでおり、形状的に変化していき、全部で２４個のＱ3及びＱ4タイプのＳｉ原子で完了させることができる。
【図７】本発明によるサブナノケイ酸分子を示すボール−スティック・モデルであり、球体の外面上でのＳｉ−ＯＨ基の均等な分布を示している。Ｑ3及びＱ2タイプのＳｉ原子と隣接−ＯＨ基はランダムに分布しているが、統計的に見れば均等分布で、特定の空間グループ形成についての偏りは示されていない。
【図８】本発明におけるケイ酸ＳＮＳＡとＡＴＰアーゼ蛋白質のヌクレオチド（Ｎ）及びフォスファターゼ(Ｐ)との相互作用のメカニズム。
【図９】本発明によるサブナノケイ酸ＳＮＳＡ(直径：１６ｎｍ)のＣＡＩＩＩ蛋白質（２９ｋＤａ）との分子内相互作用への関与。
【図１０】従来技術における直径１２ｎｍのシリカナノ粒子とヒト免疫グロブリンＩｇＧとの相互作用と本発明におけるＳＮＳＡとＩｇＧの相互作用の比較。
【図１１】式Ｓｉ36Ｏ90Ｈ36で示される本発明のサブナノケイ酸のスティック・ボール・モデルで示す構造式。
【図１２】式Ｓｉ46Ｏ115Ｈ46で示される本発明のケイ酸ＳＮＳＡの空間充填モデルで示す分子モデル。
【図１３】式Ｓｉ42Ｏ100Ｈ32で示される本発明のサブナノケイ酸のボール・スティック・モデルで示す分子構造。
【図１４】直径２．２ｎｍを有しモル質量６．２ｋＤａに対応するＳＮＳＡ b−１１８の動的光散乱ＤＬＳ図とゼータ電位。
【図１５】標準曲線値から推定されるモル質量４．２ｋＤａのＳＮＳＡ(ｂ−１０１)のサイズ排除クロマトグラフィ図。
【図１６】ＰＥＧ標準によるサイズ排除クロマトグラフィ標準曲線。
【図１７】ＰＴＥチューブ内で記録された水中の本発明によるケイ酸ＳＮＳＡ(ｂ１０１)の29Ｓｉ ＮＭＲスペクトル。
【図１８】半数阻害濃度(ＩＣ５０)値の測定によるＳＮＳＡによるウサギ骨髄Ｎａ+、Ｋ+−ＡＴＰアーゼの濃度依存阻害。
【図１９】半数阻害濃度(ＩＣ５０)値の測定によるＳＮＳ ｂ−１０１によるＳＲ  Ｃａ2+−ＡＴＰアーゼの濃度依存阻害。
【図２０】半数阻害濃度(ＩＣ５０)値の測定によるＳＮＳ ｂ−１０１によるＨ+／Ｋ+ＡＴＰアーゼの濃度依存阻害。
【図２１】ＳＮＳＡとリン酸化−脱リン酸化プロセスのメカニズムをＡＫＴ１及びＡＫＴ２としても知られている蛋白質キナーゼＰＫＢで示す。
【図２２】ＴＨＰ１癌細胞内のＰＫＢリン酸化に対するＳＮＳＡの影響をバナジン酸ナトリウムと過バナジン酸ナトリウムと比較。
【図２３】蛋白質フォスファターゼＰＴＥＮ／ＡＫＴシステムに対するＳＮＳＡの影響と、Ｆｃと蛋白質Ａ間の相互作用に対するＳＮＳＡのＥＬＩＳＡで評価した影響による光学密度のウォートマンニン（Wortmanin）(ＡＫＴ阻害剤として知られる)の薬物依存増大効果との比較。
【図２４】ＴＨＰ１癌細胞内のＥＲＫリン酸化に対するＳＮＳＡの影響をバナジン酸塩とそのペルヒドロール複合体と比較。
【図２５】ＩｇＧと酵素ラベル蛋白質Ａとの間の相互作用に対する本発明のＳＮＳＡの薬物依存影響度に基づくＥＬＩＳＡアッセイ方式。
【図２６】ＩｇＧと蛋白質Ａとの間の相互作用に対するＳＮＳＡの影響をＥＬＩＳＡで評価した光学密度の薬物依存の増大。
【図２７】Ｆｃと蛋白質Ａ間の相互作用に対するＳＮＳＡの影響をＥＬＩＳＡで評価した光学密度の薬物依存の増大。
【図２８】フィリップス社ＣＭ ２０ ＴＥＭで記録したＳＮＳＡ(ｂ−１１９)の透過電子顕微鏡画像であり、加速：２００ｋＶ、倍率：４８０，０００倍。
【図２９】BRUKERのTensor 37スペクトロメータを用いてＡＲＴ技術で記録したＳＮＳＡサンプルｂ−１３１のフーリエ変換赤外線(ＦＴＩＲ)スペクトル。
【図３０】ｐＨ２で固体基質上でのＳＮＳＡ溶液の長期保存における安定性。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの阻害によるアセスメント（実施例２２）。
【図３１】ラットでの糖尿病モデルで誘発されたストレプトゾトシンで評価されたＳＮＳＡの抗糖尿病効果（実施例２３）。
【図３２】擬似インシュリンあるいはＰＴＰ１Ｂ阻害剤としてのＳＮＳＡの抗糖尿病メカニズム。
【図３３】乳癌細胞ＭＢ−４３５の分岐に対する２つの用量でのＳＮＳＡの効果。
【発明を実施するための形態】
【０１３９】
実施例
実施例１
Ｓｉ36Ｏ90Ｈ36で示される本発明によるサブナノケイ酸の構造は図１のボール・スティック・モデルで示されている。大きなボールは酸素元素への中間のＳｉ原子、小さな白いボールは水素原子への中間のＳｉ原子を示している。
実施例２
空間充填モデル（図１２）で示す式Ｓｉ46Ｏ115Ｈ46の本発明によるサブナノケイ酸の構造。大きな球はＳｉ原子であり、中間のＯと白い小さな球は水素。
実施例３
式Ｓｉ40Ｏ100Ｈ32で示される本発明のサブナノケイ酸の構造。図１３にボール・スティック・モデルで示してある。大きな球はＯ原子への中間にあるＳｉ原子で、小さな白い球はＨ原子への中間のＳｉ原子。
実施例４Ａ
テトラ−アルキル−オルソ−シリケートからのＳＮＳＡの調製
ＡＢＣＲから購入した２９．５ｍｌ (２００ｍＭｏｌ)のテトラメトキシシランＳｉ（ＯＭｅ）4を５００ｍｌ丸底ボトルPTE容器内で１００ｍｌの蒸留水と混合した。誘導段階で、少量の希釈酢酸をゆっくり加えてｐＨは６．２から４．１に調整した。誘導段階での温度は５分未満の時間で４２℃に上昇された。凝縮段階では、溶液のｐＨを４．１から３．９に調整し、温度を４２℃から２５℃に低下させた。凝縮段階の継続時間はサイズ排除クロマトグラフィＳＥＣによる工程管理データに基づいて、４０−５０分の間に設定された。安定化段階の始めの時点で、溶液のｐＨを１Ｎ ＮａＯＨを用いて９．０に急速に上昇させた。ＴＭＯＳの加水分解で得られたメタノールをゆっくり加熱される水槽（４０−４５℃）を用いて真空回転蒸発器（Buchi Rotavap）で取り除いた。最終的に得られた溶液のｐＨは０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を用いて８．９−９．１の範囲に調整した。
【０１４０】
最終生成物のサブナノケイ酸内における含有量を、モル質量がより高いポリマー性副産物を確認するサイズ排除クロマトグラフィで評価した。動的光散乱(ＤＬＳ)によってＳＮＳＡの量アセスメントを行ったところ、１．６ｎｍで鋭いピークが存在していることが示され、モル質量がより高い関連要素は存在しなかった。
実施例４Ｂ
水溶性アルカリケイ酸塩からのＳＮＳＡの調製
市販のケイ酸ナトリウム（試薬グレード、Sigma -Aldrich）１０ｍｌを水で１：１０で希釈してＳｉＯ2溶液（含有量：２．７％）を得た。この希釈溶液１００ｍｌをポリプロピレン・フラスコに入れて、外部バスで冷却して、同様に冷却した１Ｎ  ＨＣｌ溶液で処理して、誘導段階の最後に１０分間かけて、８−１０℃から２０℃への温度勾配でｐＨを急速に２とした。ｐＨを４．０として３８±２℃の温度で、凝縮段階を３０分間行った。１ＮＮａＯＨを用いてｐＨを９．２以上に急速に上げることで安定化が達成された。
実施例５
６ｇの粉末シリカゲル６０（Sigma Aldrich）を５０ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨに懸濁させた。ろ過し、冷却した（８−１０℃）の最終溶液をゆっくり加えて事前に中性洗浄したタイプAmberite 120Aの陽イオン樹脂で攪拌したところ、溶液のｐＨは４．１±０．２に上昇した。真空ろ過で上澄液を急速に分離した。この誘導段階の後、溶液の温度を８−１０℃から４０±２℃で非線形勾配で加熱した。凝縮段階は３２−３５℃の温度範囲で６０分間行った。最終的に得られた溶液を１Ｎの塩酸を加えて安定化させたところ、ｐＨは２．１となった。
実施例６
ＳＮＳＡの動的光散乱及びゼータ電位
Malvern Instruments社のZetaster装置を用いて、ＳＮＳＡ(バッチ１１６)の動的光散乱及びゼータ電位についての評価を行った。合成バッチ１１６によって提供された濃度２４．０ｍｇ／ｍｌのＳＮＳＡストック溶液から、測定サンプルを希釈した。分子直径が１．６ｎｍでモル質量４．１ｋＤａのサンプルが得られた。
実施例７
ＳＮＳＡの動的光散乱及びゼータ電位
Malvern Instruments社のZetaster装置を用いて、ＳＮＳＡ（バッチ１１８）の動的光散乱及びゼータ電位についての評価を行った。合成バッチ１１８によって提供された濃度２４．０ｍｇ／ｍｌのＳＮＳＡストック溶液から、測定サンプルを希釈した。分子直径が１．６ｎｍでモル質量４．１ｋＤａのサンプルが得られた。このＳＮＳＡサンプルに対してデータは分子直径が２．２ｎｍであること、そしてモル質量が６．２ｋｇ／ｍｏｌ（ｋＤａ）であることを示した（図１４）。
実施例８
ＳＮＳＡのサイズ排除クロマトグラフィ分析
図１５のサイズ排除クロマトグラフィをＳＮＳＡサンプル・バッチ１１８に対して行った。使用機材：Kontron Instruments Pump System 525、TSKゲルG2500  ＰＷＸＬカラム（寸法：300ｘ7.8mm）、溶媒：水、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：Jasco屈折率検出装置・RI−2031プラス、ＳＥＣでの測定保持時間１１．２分値とポリエチレン・グリコール標準曲線との相関性。図１６は本発明による物質サンプルＳＮＳＡ−１１８が６．２ｋＤａに相当することを示している。ＳＥＣ法は製造プロセスと長時間保存における生成物の安定性に対する厳密な管理を可能にしてくれる。
【０１４１】
これらのデータは図１４に示されているサンプルＳＮＳＡ ｂ−１１８のＤＬＳ図との相関性を持っており、分子直径は２．２ｎｍという狭い範囲で示されており、これはモル質量６．２ｋＤａにほぼ相当し、ｎ値は９２−９６の範囲である。
実施例９
サイズ排除クロマトグラフィ標準曲線
図１６に示す保持時間とモル質量の関係を示しているサイズ排除クロマトグラフィ標準曲線は以下の条件で得たものである。使用機材：Kontron Instruments Pump System 525、TSKゲルG2500  ＰＷＸＬカラム（寸法：300ｘ7.8mm）、溶媒：水、流速：0.5 ml/min、検出：Jasco屈折率検出装置・RI−2031プラス。
【０１４２】
標準曲線を作成するために、市販のポリ−エチレン−グリコール（ＰＥＧ）、ポリ−スチロール−スルホネート、あるいはポリアクリル酸のサンプルをそれぞれ２０−８０μlのサンプルを用いた。図１６はＰＥＧ標準の基づくデータを示している。
実施例１０
ＳＮＳＡの２９Ｓｉ  ＮＭＲスペクトル調査
液体サンプルのＮＭＲスペクトルを１００．６ＭＨｚで作動するJEOL Eclipse 400ＮＭＲスペクトロメータで集めた。比較のために、それらのサンプルの固体状態29Ｓｉ ＣＰ−ＭＳＡＳ  ＮＭＲスペクトルを４ｍｍプローブを用いて、５９．６ＭＨｚで作動するBruker MSL 300 スペクトロメータに記録した。クロス分極測定のために、5.1μsのn/2パルス遅延、１０ｍｓの接触時間、そして１２ｓの循環遅延を用いた。通常のＮＭＲの共通「ガラス・ヒル」を回避するために、ＰＴＥＦ(テフロン)チューブで測定を行った。
【０１４３】
図１７は、水中２４ｍｇ／ｍｌの濃度でのＳＮＳＡサンプルｂ−１０９の29Ｓｉ ＮＭＲスペクトルを示している。
実施例１１
ＳＮＳＡはウサギ骨髄Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを抑制する
高濃度のＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼによる薄膜はラビットエンザイムに対して３７℃で２，０００から２，４００μmol Ｐ1／ｈ／ｍｇ蛋白質の範囲の特殊なＡＴＰアーゼ活性を提供する外側骨髄からから生成された。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの酵素活性は２５ｍＭのイミダゾール(ｐＨ ７．２)、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１．５ｍＭのＮａ2ＡＴＰ、５ｎＭのＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ、２ｍＭのＰＥＰ、４５０単位/ｍｌのピルビン酸ＩＣ５０ｎａｓｅ及び乳酸デハイドロデジェナーゼ、さらに最初に８０μＭ  ＮＡＤＨを含む緩衝液内で判定された。すべての実験は３７℃の温度で行われた。
【０１４４】
阻害剤がない場合の酵素活性を基準として用いた。ＳＮＳプローブによるラビットＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの抑制を図１８に示してある。この酵素活性の濃度依存抑制効果を用いてＳＮＳの半抑制濃度ＩＣ50を計算したところ、０．３２−０．５μg/ｍＬの値が得られた。ＳＮＳＡサンプル（ｂ−１１８）に対してサイズ排除クロマトグラフィでモル質量Mrは６．２ｋＤａと計算され、また、ＩＣ50は０．４５μg/ｍＬの値が得られた。結果として、このサンプルのＩＣ50は７２ナノモル/Ｌと判定された。ＳＮＡのこの抑制ポテンシャルはバナジン酸塩のそれとほぼ同じで、同じ酵素に対して１．０μMOL/LのＩＣ50を示す２つの水溶性心臓グリコシドであるウアバイン及びヘレブリンよりは１０倍以上高かった。
【０１４５】
ホスホエノルピルビエート(ＰＥＰ)、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロジェナーゼ、ＮＡＤＨ及びＡＴＰ(ジナトリウム塩)はRoche社から提供を受けた。その他の試薬はすべてMerck (Darmstadt)あるいはSigma-Aldrich (Deisenhofen)から購入したもので、最高品質のものであった。ピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロジェナーゼ・アッセイはＳＮＳＡによっては影響を受けなかった。ＳＮＳ化合物の抑制作用は阻害剤溶液を加えた（１−１０μl）のキュベットに上記緩衝液を混合している際に十分に発揮された。ウアバインが過剰に存在していると、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼが十分に抑制され、このことはＳＤＳ電気泳動でさらに制御されたのでその酵素製剤の純度が高かったことを示した（データは示さず）。標準化個別活性はＳＮＳＡを少しづつ増やしながら追加した場合の残留活性と基準活性との比率で計算した。
実施例１２
ＳＮＳＡによるウサギ骨髄Ｃａ−ＡＴＰアーゼの抑制
Ｃａ−ＡＴＰアーゼはウサギ腰筋筋肉から作成し、すべての手順は４℃以下の温度で行われた。生成された薄膜内の蛋白質含有率は前に述べた手順で判定され、最終密度勾配分離後に、２−３ｍｇ／ｍｌの範囲であることが分かった。固有酵素活性は２０℃で約２μmol Ｐ1／ｈ／ｍｇ蛋白質であった。
【０１４６】
酵素活性は、25mM HEPES、1mM MgCl2、50mM KCl、及び0.2mM Ca2+を含む緩衝液を用いて、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの場合と同様に、結合ピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロジェナーゼ・アッセイによって判定された（図１９）。ホスホエノルピルビエート(ＰＥＰ)、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロジェナーゼ、ＮＡＤＨ及びＡＴＰ(ジナトリウム塩)はRoche社(Mannheim)から提供を受けた。その他の試薬はすべてMerck (Darmstadt)あるいはSigma-Aldrich (Deisenhofen)から購入したもので、最高品質のものであった。
【０１４７】
単離された試料のバックグランド酵素活性は１μＭのtharpＳｉgarginを加えて得られた。Ｃａ−ＡＴＰアーゼ試料の固有活性は２０℃及びｐＨ７．５でほぼ１．８単位/ｍｇであった（加水分解されたＡＴＰの１．８μMol/mg蛋白質/分に相当）。
実施例１３
ＳＮＳＡによるブタ胃Ｈ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの抑制
これまでに公開されている方法を用いて豚胃粘膜から胃Ｈ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを得た。この方法では分画及び密度勾配遠心分離が用いられた。胃から粗胃粘膜薄膜を集めて０．２５Ｍサクロース、５ｎｍ  ＰＩＰＥＳ／Ｔｒｉｓ及び１ｍＭ  ＥＧＴＡを含みｐＨが６．８の溶液内に均一に分散した。この均一化されたのもをSrovall GSAロータ内で４５分間、１１，０００ｒｐｍの回転速度で遠心分離した。上澄液をBeckman (Fullerton，CA)のタイプ３０ロータで１時間、３０，０００ｒｐｍの回転速度で遠心分離した。ミクロソーム・ペレットを０．２５Ｍサクロース、５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ／Ｔｒｉｓ及び１ｍＭ ＥＧＴＡを含む溶液（ｐＨ６．８）に再懸濁させた。
【０１４８】
このミクロソーム懸濁液をＺ−６０帯状ロータを用いて精製した。単離された粒子内で、Ｈ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの９０％は細胞質を上側に向けた体側壁細胞の方向を向いていた。Ｈ，Ｋ−ＡＴＰアーゼの固有ＡＴＰアーゼ活性をピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロジェナーゼ・アッセイによって判定した。ホスホエノルピルビエート(PEP)、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロジェナーゼ、ＮＡＤＨ及びＡＴＰ(ジナトリウム塩)はRoche社(Mannheim)から提供を受けた。その他の試薬はすべてMerck (Darmstadt)あるいはSigma -Aldrich (Deisenhofen)から購入したもので、最高品質のものであった。Ｈ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ含有粒子試料の固有活性は３７℃で１時間経過した後、総蛋白質1ミリグラムあたり８０−１００ｍｍｏｌ  Ｐｉの範囲であった。ＩＣ50値はＫによって刺激されたＡＴＰアーゼ活性を５０％抑制する阻害剤濃度に基づいて定義した。０．７８μｇ/mlというＩＣ50値はOriginTM 5.0を用いて得られた実験データにＳ字状結腸の機能に関する非線形最小二乗を適用することによって計算された。サンプル・サイズは３回のアッセイに基づいて判定され、それぞれのアッセイは各化合物の３つのサンプルを用いて測定された。
【０１４９】
０．７８μｇ/mlという図形的に判定された半抑制濃度ＩＣ50を図20に示す。
実施例１４
ＰＴＥＮ（クロモソーム１０上でのホスフェート及びテンシン）に対するＳＮＳＡの活性
試料：  NIH3T3線維芽細胞(LGC Promochem, ATCC)、Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM: Sigma社提供)、新生子牛の血清（NCS: GIBCO Invitrogen社提供）、ウォートマンニン（Wortmannin、Calbiochem社提供）、抗P-PKB (S373)抗体(Cell Ｓｉgnalling社提供)、抗Mass-PKB抗体（Upstate社提供）及びECLウェスターン・ブロッティング分析システム(Amersham Biosciences社提供)
方法：  線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３を密度が十分になるまで６ウェル・プレート内で成長させた。その後、それらの細胞をその蛋白質キナーゼＢ（ＰＫＢ）代謝機能と０%ＤＭＥＭ内で一昼夜枯渇させた。テストを開始する前に、培養液を取り除いて、ＰＫＢの化を刺激するために新生子牛の血清（ＮＣＳ）を加えた。１．５％血清を加えた後、細胞を5分間培養した後、２００ｎｍウォートマンニン、ＰＩ３Ｋ阻害剤、あるいはＳＮＳＡ ｂ−１０１（１２０μｇ/ml）を線維芽細胞に加えて、２５分間培養してから、ＰＢＳで洗浄して取り除いた。最終的に、細胞を4xSDSゲル付加緩衝液で溶解して、１０分間煮沸した。
【０１５０】
すべての細胞溶解物サンプルを９％SDS-PAGE (Laemmli et al,)にかけて、ニトロセルロース膜に移してから、TBST緩衝液内に５％の濃度でミルク粉末を溶かしたもので30分間ブロックした。抗ＰＫＢ抗体（１：１０００）あるいは抗ホスホＰＫＢ(Ｓ４７３)抗体（１：２０００）をＴＢＳＴ内に３％のミルクを溶かした溶液で４℃の温度で一昼夜その薄膜を培養することで、ウェスターン・ブロット分析を行った。その後、その薄膜をＴＢＳＴ緩衝液で１０分間、少なくとも３回洗浄した。最後に、ＴＢＳＴ内に３％の濃度でミルク粉末を溶かした溶液内で、ホースラディッシュ・ペロキシダーゼ(BIORAD)(1:1000)と結合させた二次抗マウス血清を用いて、室温で１時間培養した。薄膜をＴＢＳＴ緩衝液で３回、各１０分間洗浄した。最後に、ＥＣＬ溶液（Amersham Biosciences）でウェスターン・ブロットが形成され、信号を富士フィルム社のデジタル・ブラック・ボックスで検出した。
【０１５１】
結果：  本発明のケイ酸ＳＮＳＡを１２０μｇ/ml用いたところ、ＰＫＢ脱リン酸化が明確に促進された（図２１）。このことは、ＰＩ３Ｋ抑制標準ウォートマンニン（Wortmanin）と比較してほぼ類似した実験で証明されたＰＴＥＮ(図２２)に対する抑制効果として説明できるであろう（図２３）。
実施例１５
ＴＰＨ１内でのＥＲＫ−フォスファターゼに対するＳＮＳＡの活性
白血病細胞下部ＴＨＰ１を処理した後、ＳＮＳＡは信号発信を増幅させ、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２活性化（リン酸化）をもたらした。ＳＮＳＡ (ｂ−１０１)の効果はＥＲＫ１およびＥＲＫ２の活性化によるバナジン酸塩の効果と非常に類似している。Ｈ2Ｏ2によるバナジウム酸ナトリウムのペロキシ化はＥＲＫ１およびＥＲＫ２の活性化を協力に促進する（図２４）。逆に、Ｈ2Ｏ2でＳＮＳＡを処理するとＥＲＫに対する影響は弱まり、このことはＳＮＳＡがバナジン酸塩と比較してペロキシ化に対してそれほど影響を受けないことを示している。
【０１５２】
ＳＮＳＡによる処理後のＴＨＰ１細胞の増殖は、２４時間後及び４８時間後にもそれほどの変化は認められなかった。観察を開始してから９６時間後に増殖のわずかな抑制が観察された。ＳＮＳＡは癌ＴＨＰ１細胞の生存可能性を抑止しない（Ｃ＝成長培養液ｍｌあたり１６０μｌ）。  バナジン酸塩と比較して、ＳＮＳＡは細胞に対して毒性を示さないことははっきりしている。
【０１５３】
ＳＮＳＡで処理された癌細胞ＢＣ細胞株ＢＴ２０はＥＧＦＲリン酸化を若干増大させた。
実施例１６
ＳＮＳＡと蛋白質との相互作用
生物活性ケイ酸ＳＮＳＡとヒトＩｇＧ蛋白質との相互作用を、以下の手順でＥＬＩＳＡ技術で定量的に評価した。
【０１５４】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをヒトＩｇＧ(Sigma 14506)の１μｇ/ml溶液２００μｌを炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ９．５ (４０ｍＭ  ＮａＣＯ3および６０ｍＭ ＮａＨＣＯ3)に溶かしたもので被覆し、４℃で一昼夜培養した。翌日、溶液を取り除いて、プレートをＰＢＳ＆０．０５％  Tween２０で３回洗浄した。そして次に、ＰＢＳ内で２００μｌの２％ＢＳＡを用いて室温で培養して、遊離結合サイトを飽和させた。1時間後にＢＳＡ溶液を取り除いて、プレートをＰＢＳ＆０．０５％ Tween２０で３回、さらにＰＢＳで３回洗浄した。ウェルは事前に希釈したＳＮＳＡのストック溶液（ｂ−１１８）を１０００−１０ｎｇ／ｍｌの割合で処理した。室温で２時間ＳＮＳＡで培養して、取り除いたあと、ＰＢＳ＆０．０５％ Tween２０で３回、ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１５５】
１ウェルあたり１００μｌの蛋白質Ａを用いて室温で２時間培養し、アルカリ性フォスファターゼ共役(Sigma P-7488)  をＰＢＳに１：２０００の割合で希釈した。溶液を取り除いて、プレートをＰＢＳ＆０．０５％ Tween２０で３回、Ｈ2Ｏで３回洗浄した。各ウェルで１００μｌの基質溶液ｐＮＰＰ (Sigma N1891)を用いて室温で１２０分間培養し、４０５ｎｍでの光学密度(ＯＤ)をMRX Microplate Reader (Dynatech Laboratories)を用いて測定した。
【０１５６】
ＳＮＳＡの精密なアッセイを行うための方法を、ＥＬＩＳＡ法で得られた結果と共に図２５にします。これらのウェルを蛋白質Ａと選択的に反応するＩｇＧ(２０μg/ウェル)を用いて培養したので、すべてのウェルで同じ強度の発色反応がもたらされるだろうと予想された。驚くべきことに、溶液に加えられる本発明のケイ酸の量に比例して発色反応の強度が増大した。明らかに、ＯＤ曲線はＳＮＳＡの１ｍｌあたり１０ｎｇから３００ｎｇの範囲で濃度に比例して増大し（図２６）、ＳＮＳＡの濃度がより高くなったときだけ変化の割合が減少した。ＩｇＧ分子と蛋白質Ａとの相互作用の、このＳＮＳＡの容量に依存した増大に関する観察は、高い応用可能性を示すものである。というのは、それは生物由来のものを含めて種々のサンプルでのナノグラム範囲での本発明のＳＮＳＡ の非常に精密はアッセイを可能にしてくれるからである。
実施例１７
ＳＮＳＡのアッセイ
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＣｈｒｏｍｅＰｕｒｅヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメント（Dianova）１００μg/ml溶液を炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５)  (40mM Na2CO3および60mM NaHCO3)に溶かしたもの２００μｌで被覆して、４℃で一昼夜培養した。翌日に溶液を取り出して、プレートをＰＢＳ＆０．０５％ Tween２０で３回洗浄した後、さらにＢＳＡを２％の濃度でＰＢＳに溶かしたもの２００μｌで室温で培養して、結合サイトを飽和させた。１時間後にＢＳＡ溶液を取り除いて、プレートをＰＢＳ＆０．０５％ Tween２０で３回洗浄して、さらにＰＢＳで３回洗浄した。これらのウェルを１０００−１０ｎｇ／ｍｌの範囲で事前に希釈したストック溶液ＳＮＳＡ(b−118)100μｌで処理した。ＳＮＳＡで室温で２時間で培養した後、取り出してＰＢＳ＆０．０５％ Tween２０で３回、そしてＰＢＳで３回洗浄した。蛋白質Ａ−アルカリ性フォスファターゼ共役(Ｓｉgma P−7488)をＰＢＳ内に1：2000の割合で希釈させたものを１ウェルあたり１００μｌ用いて室温で２時間培養した。溶液を取り出し、プレートをＰＢＳ＆０．０５％ Tween２０で３回、そしてＨ2Ｏで３回洗浄した。各ウェルを１００μｌの基質溶液ｐＮＰＰ（Sigma N1891)を用いて室温で１２０分間培養し、４０５ｎｍでの光学密度(OD)をMRX Microplate Reader (Dynatech laboratories)で測定した。
【０１５７】
図２７に示す図はヒトＦｃフラグメントを用いてＥＬＩＳＡ法で得た結果を示している。ウェルを蛋白質Ａと選択的に反応する同じ量のＦｃ(２０μｇ)を用いて培養した後、すべてのウェル内で同じ強度の発色反応が起きることが予想された。驚くべきことに、溶液に加えられる本発明のケイ酸の量に比例して発色反応の強度が増大した。明らかに、ＯＤ曲線はＳＮＳＡの１ｍｌあたり１０ｎから３００ｎｇの範囲で濃度に比例して増大した。知られている濃度のＳＮＳＡで得られた標準曲線で、１−１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の未知の濃度でのＳＮＳＡの定量アッセイを行うことができた。
実施例１８
糖尿モデルへのＳＮＳの適用
糖尿病マウスｄｂ／ｄｂに体重１ｋｇあたり２４ｍｇの用量でＳＮＳＡ(ｂ−１１８)を投与したところ、投与から２時間以内に血液グルコース・レベルが４８％低下し、さらにバナジン酸塩はさらに減少し(５２．５％)、そして糖尿病薬は２２％低下した。ＳＮＳＡによる血液グルコース・レベルの長期的減少は賦形剤だけで措置した個体と比較して、投与から２４時間及び４８時間後にそれぞれ19％及とわずかなものであった。このテストでのＳＮＳＡの長期効果は４８時間後にでもＢＧＬを３２％低下させるｂｉｓ−Ｌ−バナジウム酸グルタミルより弱かった。
実施例２０
透過電子顕微鏡(ＴＥＭ)によるＳＮＳＡの特徴づけ
サブナノケイ酸溶液の標本をドロップ・コーティングして、４００メッシュ銅グリッド（Ted Pella）上に支承されたカーボン被覆パルロディオン・フィルム上に沈着させて、制御された条件下で乾燥させた。ＴＥＭ測定はPhillips社ＣＭ透過電子顕微鏡で行われ、磁界はナノ・ケイ酸フィルム表面と平行にかけられた。
【０１５８】
２００ｋＶの加速電圧で調査されたＳＮＳＡ標本の特徴的なTEM画像（図２８）が得られた。倍率は４８０，０００倍であった。この図は、回転楕円形のシリカ種の存在を示しており、その分子直径は２．５−４．０ｎｍの範囲で、分子直径が５．０ｎｍより大きい通常のシリカナノ粒子よりはっきりと小さかった。
【０１５９】
用いられた透過電子顕微鏡技術は、溶媒液を急速に蒸発させた後、実際に「固体」粒子を示した。実際に、ＳＮＳＡ溶液を急速に「脱水」すると、溶媒液分子を取り除くだけでなく、凝縮されたケイ酸分子内及び分子間の水も除去した。これたの分子内及び分子間の水の凝縮は通常の種と比較してＳＮＳＡ誘導体を構造的に改変して団粒化させた。
実施例２１
フーリエ変換ＩＲ顕微鏡によるＳＮＳＡの特徴づけ
フーリエ変換インフラ・レッド（ＦＴＩＲ）顕微鏡を用いて、本発明によるサブナノ・ケイ酸の特徴づけを行った。スペクトルはBRUCKER-Optics社（Rosenheim, Germany）のTensor 37 FTIRスペクトロメータを用い、４００００−４００ｃｍ-1の範囲で、解像度４cm-1でATR Miracle Pike法を用いて記録した。
【０１６０】
サンプルは水１ｍｌあたり２４ｍｇの濃度のＳＮＳＡ(ｂ１３０およびｂ１３１)ストック溶液から、２枚のポリエチレン・フォイルに鋏まれた薄い液体フィルムとして得られた。PEフォイルと溶媒のスペクトルは別々に測定され、バックグランドとして差し引かれた。ガウス−ローレンツＳＵＭ関数を用いてピーク曲線あてはめ（fitting）を行った。
【０１６１】
結果：水性溶液内でＳＮＳＡ(ｂ−１３０)標本のＦＴＩＲスペクトルを図２９に示す。このスペクトルは、本発明で開示されているような構造を有する溶解ＳＮＳＡに関して予想されたように、１３００と８００／ｃｍの間に主要赤外線吸収帯を含んでいる。
【０１６２】
１１３０／ｃｍでの最も主要な帯は本発明で示されているＱ4タイプのケイ素原子に対応する内部のＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合の非対称伸縮振動のせいであろうと判断される。この吸収帯はいくつかの個別ピークが重なったものである。１１３０／ｃｍでのこの帯を１１９２／ｃｍ、１１６０／ｃｍ、及び１１１９／ｃｍでのピークに当てはめることは満足すべきものと判断された。
【０１６３】
１０１７／ｃｍの強いピークは１０８７／ｃｍでの非対称伸縮振動Ｔ０３と９４２／ｃｍでのシランール基の伸縮振動の間にある。サイズが５ｎｍより大きなコロイド状シリカ粒子を含んだシリカ・ゾルにおいては、この帯の強度はより低く、そのピークは１０６０／ｃｍに移動しており、ＳＮＳＡのスペルトルには示されていない。同様に、固体シリカ粒子の外面のＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合に対応する１０６０／ｃｍでのＩＲ吸収帯も存在していない。
【０１６４】
回転楕円形表面上の遊離Ｓｉ−ＯＨ基が高密度で存在している本発明のＳＮＳＡ分子の構造を証明するさらなる証拠は、８８０／ｃｍの位置にさらにＩＲ帯が高頻度で存在していることである。本発明によるサブナノケイ酸のフーリエ変換赤外線スペクトルはここで述べられているそれらの構造と一致している。これには、Ｑ4：Ｑ3及びＱ2タイプのケイ素原子間の仮想均衡比及び回転楕円形状分子の外部シェル上に高密度で存在している遊離シラノール基が含まれる。
実施例２２
長期保存におけるＳＮＳＡの安定性
本発明のケイ酸（ＳＮＳＡ）サンプルを長期間保存した場合の安定性をウサギの骨髄から単離されたＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼに対する抑制ポテンシャルについて実験的に判定することで調べた。このテスト法は本願明細書の実施例１１に詳細に述べてある。
【０１６５】
３つの異なったＳＮＳＡ試料を８ヶ月室温で保存した場合の安定性について調べ、それぞれの測定セット用に作成されたばかりの標準ウアベイン８Ｈ2Ｏ(Sigma-Munich)サンプルの抑制ポテンシャルと比較した。心臓ステロイド・ウアベインの平均IC50は０．７２μg/mlでのもので、この標準のＩＣ50の１．３６あるいは１μmol/Lに相当する。
【０１６６】
１）  ＳＮＳＡ  (ｂ１０９)  ２３．８ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ=２．０−２．１
２）  ＳＮＳＡ  (ｂ１１１)  ２４．２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ=８．９−９．１
３）  ＳＮＳＡ  (ｂ１０２)   固体基盤としてのSorbitol (Sigma)上に４．８％ｍ／ｍの割合で沈着
これらのサンプルの抑制ポテンシャルは実施例１１で定義したようにＩＣ50として各測定セットに対して示されている。固体基盤上に沈着されたＳＮＳＡの場合、ＩＣ50はその溶液の実際のＳＮＳＡ含有量に基づいて計算された。
【０１６７】
図３０の図はこの研究の結果を示している。やや酸性のｐＨ２．０の場合の本発明によるサブナノケイ酸の安定性は非常に高い。４−５ヶ月保存した場合だけ、活性のかなりの低減が観察される。ｐＨが９．０以上の塩基性の場合も、本発明によるＳＮＳＡの安定性について、同様のことが言える。本発明による固体基板上に沈着された本発明によるＳＮＳＡ物質の安定性が実質的に変わらない点も注目に値する。
実施例２３
ＳＮＳＡは糖尿病モデルＳＴＺの血液グルコースを減少させる
本発明によるサブナノケイ酸の経口投与がストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で誘発させた糖尿病ラット・モデルでの上昇した血液グルコースを低減できるかどうかをどうかを調べた。ＳＮＳＡの推定効果をこの糖尿病モデルで事前に確認されているバナジウム酸Lグルタミン複合体の効果と比較した。
【０１６８】
２０匹の糖尿病にかかっていないウィスター(Wister)ラット（体重：１８５−２０５ｇ）を各個体に体重１ｋｇあたり５０ｍｇの用量でストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を静脈注射を１回注射した。
【０１６９】
ＳＴＺ投与から５日目に、措置されたラットはそれらの糖尿病の病状に対応した血液グルコース・レベルの上昇（＞２５０ｍｇ／ｄＬ）を示した。ＳＴＺで誘発された糖尿病を有するラットは適用された治療法に応じて、ＳＮＳＡグループ（６匹）、バナジン酸塩グループ（３匹）、トリグリタゾン・グループ（４匹）、比較対象グループ（３匹）の４つのグループに分けられた。毎日の用量は、ＳＮＳＡグループの場合は体重１ｋｇあたり１２．５ｍｇ、トリグリタゾン・グループの場合は体重１ｋｇあたり２０ｍｇ、バナジン酸塩−bis−L−グルタミン複合体[VO3(Glm)2]グループの場合は体重１ｋｇあたり２５ｍｇであった。比較対象グループには同じ量の賦形剤を与えた。ＳＮＳＡグループのうちの１匹は「糖尿病」レベル以下で、研究対象から外された。
【０１７０】
結果：  治療の開始から１２２４、及び４８時間後に評価された平均グルコース・レベル値を図３１に示す。
ＳＴＺ誘発糖尿病モデルに関する実験は、本発明によるケイ酸ＳＮＳＡが糖尿病を持った個体での血液グルコース・レベルをかなり低下させた。バナジン酸塩及び比較対象として用いられた糖尿病トリグリタゾンと比較して、ＳＮＳＡ の場合はかなり低い用量で抗糖尿病効果がもたらされたことは注目に値する。バナジン酸塩と比較して二桁以上ＳＮＳＡの毒性が低いことは、糖尿病治療における本発明の生物活性ケイ酸の適用の有用性を支えるさらに有力な根拠であろう。
【０１７１】
ＳＮＳＡで想定可能なメカニズムは図３２に示してあるように、インシュリン・レセプタ(ＩＲ)との相互作用によるインシュリン模倣作用として理解することができるかもしれない。これには、インシュリン・レセプタに結合したホスホチロシン・フォスファターゼＰＴＰ１Ｂの抑制は関係している可能性もある。このフォスファターゼはインシュリン信号発信及びインシュリン選択性を低下させるインシュリン・レセプタのリン酸化の程度を低下させる。
実施例２４
十二指腸潰瘍の治療へのＳＮＳＡの適用
本発明によるＳＮＳＡはＨ／Ｋ−ＡＴＰアーゼとも記載されるプロトン・ポンプの非常に強力な抑制因子である。この薬学的作用は胃/十二指腸潰瘍の重要な原因の一つである胃酸過多の治療に実際的な重要性を持っている。
【０１７２】
標準的な実験室での餌と生水に自由にアクセスできる初期体重が２００±１０ｇの雌のウィスター・ラット２４匹を実験に用いた。１０％システアミン−塩化水素水溶液(Ｓｉgma-Aldrich)を１日に３−４時間の間隔をおいて３回皮下注射した。この投与形態は高度の潰瘍反応と低い死亡率をもたらすものであった。
【０１７３】
供試動物は以下の通り３通りに措置された。
−  ＳＮＳＡ−５グループ：  ８匹のラットに対して、３時間毎に０．５ｍｌの水に５ｍｇのＳＮＳＡを溶かしたものを与えた。
−  ＳＮＳＡ−５グループ：  ８匹のラットに対して、３時間毎に０．５ｍｌの水に３ｍｇのＳＮＳＡを溶かしたものを与えた。
−  比較グループ：  ８匹のラットに対して賦形剤だけを与えた。
【０１７４】
【表２】
2011529973.tif 000004
【０１７５】
結論として、ＳＮＳＡで措置した動物は比較グループの動物と比較して、十二指腸潰瘍の発症率がかなり低かった。解剖病理検査の結果、本発明のケイ酸が胃酸過多を低下させることで、非常に強力な予防的役割を果たしている証拠が得られた。
実施例２５
癌細胞の分岐及び伝播に対するＳＮＳＡの影響
Invitrogen 社（Bremen DE）から入手したダルベッコ修正イーグルの高グルコース培養液内で、MDA−MB−435細胞を９５％空気、５％二酸化炭素の環境下で３７℃の温度で培養した。移行及び侵入アッセイを行うために、最終濃度が１・１０５細胞／ｍｌの無血清細胞培養液を用いた。化学誘引剤として１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含んでいる培養液を２４ウェル・プレートのすべてのウェルに加えた。
【０１７６】
０．８ｍｍの孔サイズの薄膜を有するフルオブロック(FluoBlok)挿入物を上記化学誘引剤を含んだ各ウェルに入れて、上側のチェンバーと下側のチェンバーをつくった。細胞(５・１０４)を上側のチェンバーに入れて３７℃の温度で24時間培養した。侵入に関する研究は細胞培養液に希釈させた６２．５ｍｇ／ｍｌのマトリゲル(Matrigel)(Bioscience, Canaan, CT)で事前に被覆したフルオブロック(FluoBlok)薄膜を用いて４８時間の時間をかけて行った。挿入された薄膜は事前に被覆され、細胞と培養液を加える前に１時間組織培養器内で安定化させた。
【０１７７】
細胞移行及び侵入の程度を調べるために、薄膜の上面と底面の両方に附着している細胞をHank社の均衡化塩溶液（HBSＳＩnvitrogen）で洗浄した。細胞はHemaColor溶液１定着液で固定した。デジタルCCDカメラ（Hamamatsu ＰＨotonics, 日本）を備えたライカ（Leica）社の顕微鏡を用いて、ランダム・デジタル画像（１０枚はフィルターの上面から、１０枚はその底面から）を得た。
【０１７８】
調査されたセグメントの顕微鏡画像（図３３）は措置を受けなかった乳癌細胞が分岐していることを証拠付けている。細胞の分岐の抑制あるいは阻止は、ＳＮＳＡで措置した細胞のスライドで明らかである。ＳＮＳＡの用量が低くても分岐の抑制傾向が認められるが、本願の生物活性ケイ酸の用量を高くすると、分岐は行われない。
実施例２６
骨粗鬆症モデルにおける本発明のＳＮＳＡの適用
本発明の研究の目的は卵巣切除した（Ｏｖｘ）ラットにおける骨粗鬆症モデルを用いて、骨の健康に対する本発明のサブナノケイ酸の効果を調べることであった。Ｏｖｘラットは閉経後の女性における骨喪失を阻止するための薬剤の研究に適していることが分かっている。この研究の目的は毎日ＳＮＳＡを投与した場合の動物における骨形成に対する効果を比較対象グループとの比較において調べることであった。
【０１７９】
生後６ヶ月のウィスター・ラット18匹を通常の手術手順で卵巣切除あるいは卵巣摘出した。卵巣摘出手術は卵巣切除と同じだが、卵巣は切り離されなかった。卵巣を摘出されたラットは比較対象グループの個体と同様に苦痛やストレスに苦しむので、これら２つのグループの比較は重要であった。
【０１８０】
この研究はランダムに３つのグループに分けた１８匹の個体において行われた。３つのグループとは、卵巣切除した２つのグループと、卵巣摘出した１つのグループである。
−  Ｏｖｘ−ＳＮＳグループの個体（８匹）には日常の餌と水に加えて、体重１ｋｇあたり５．０ｍｇのＳＮＳＡを経口投与した。
−  卵巣切除した5匹のラットで構成されるOvx-比較対象グループには研究全期間を通じて通常の餌と水が与えられた。
−  卵巣摘出されたラット（５匹）の場合、卵巣は切り離されなかった。研究は手術から10日後に開始され、１２週間続いた。すべての個体は研究終了後に致死された。血液の化学的組成、体重、各器官の重量が測定されて、他のグループと比較された。骨密度計ODR-1000/W(Hologic Inc.)を用いて、二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）技術で腰椎のＬ２−Ｌ５で骨鉱物密度（ＢＭＤ）を測定した。軟組織を取り除いた後、第三腰椎の石灰質を取り除いていないサンプルを調べた。
【０１８１】
結果：  我々が得たデータは、Ｏｖｘグループでの１７β−エスタジオール・レベルが、実験の終了時においては、摘出グループよりかなり低かったことを示している。卵巣切除されたラットは、卵巣摘出グループと比較して体重が増えた。
【０１８２】
ＳＮＳＡで措置した個体では、骨形成が増大したことが明らかになった。これは比較対象グループと比較して類骨表面が増大していること（ＯＳ／ＢＳ）によって裏づけられている。ＳＮＳＡで措置した個体では卵巣摘出グループで観察されたような脾柱骨体積の減少（ＢＶ／ＴＶ）が観察されなかった。ＯＶＸ比較対象グループで骨形成に関するパラメータが低下したしたのと違って、ＳＮＳＡ措置グループは卵巣摘出グループをほぼ同様の値を示した。
【０１８３】
ＳＮＳＡを個体に対して１日５ｍｇ投与すると、卵巣切除によってもたらされる骨形成の劣化をかなりおぎなってくれた。結論として、本発明によるサブナノケイ酸は骨粗鬆症の予防と治療のための有益な薬剤であり、骨の健康に相当程度貢献するものである。
実施例２７
硫黄マスタード・モデルにおけるＳＮＳＡの傷治癒効果
侵攻性の化学物質によってつくりだされる重篤な皮膚損傷を治療するための局所的使用における本発明のサブナノケイ酸の効果を標準的な動物モデルでテストした。化学名がｂｉｓ−（２−クロロエチル）硫化物（省略名：ＨＤ）である皮膚に水ぶくれをつくる戦争用化学薬剤を乳離れしたばかりのブタでテスト物質として用いた。
【０１８４】
乳離れしたばかりの２匹の雌ブタを液体ＨＤに２時間暴露して、腹部皮膚面に直径３−４ｃｍの十分な厚みの皮膚損傷をつくりだした。ＨＤへの露出から２−６時間後にははっきりとした紅斑がつくられ、それが水疱に変化した。第１の個体の損傷をＡ１−Ａ６とし、第２の個体の損傷をＢ１−Ｂ６とした。調査対象の製品による局所的な治療はＨＤへの露出から24時間後に開始し、以下に述べる用量で１日に３回適用した。
−  Ａ１−Ａ３は0.5mlのＳＮＳＡ (1.5mg/ml)を局所用組成物として適用した。
−  Ａ４−Ａ５は0.5ml賦形剤（偽薬）で処置した。
−  Ｂ１−Ｂ３は0.5mlのＳＮＳＡ (2.5mg/ml)を局所用組成物として適用した。
−  Ｂ４−Ｂ６は緩衝液にマフェナイドを溶かしたもの(50mg/ml)で処置した。
【０１８５】
動物達は８週間臨床的に観察され、水疱の直径、病理的経過、そして治癒状態を測定された。最初の１２日間に尿検査とガス・クロマトグラフィ/質量分光分析アッセイを組み合わせて主要ＨＤ代謝産物（チオジグリコール、ＴＤＧ）の尿による分泌及び臨床病理検査が行われた。皮膚の回復と経皮水分ロス（ＴＥＷＬ）に対するバリアー機能の復活を観察した。
【０１８６】
結果：  露出後3あるいは４日目には経皮水分ロスが激しく、処方しても効き目はなかった。皮膚障害の十分な買う服は露出後３６日から４６日の期間に観察された。皮膚回復に要する時間は本発明によるサブナノケイ酸ＳＮＳＡを適用することにより好適に短縮され、その用量が高い（２．５ｍｇ）の場合に最も良い結果が得られた。
【０１８７】
１日あたり２．５ｍｇの用量で本発明のＳＮＳＡを適用すると皮膚回復に要する期間が２３％短縮された（４６．３日ではなく３５．７日）。ＳＮＳＡ適用から４１．３日目にはＴＥＷＬバリアー機能の復活し、偽薬を与えた場合の５３．３日と比較して、復活に要する時間が２２．５％短縮された。
【０１８８】
２．５ｍｇ用量で本発明のＳＮＳＡを適用すると、５％酢酸マフェナイドによる標準的な措置よりはるかに好成績であった。２０倍の用量で用いられる従来の製品と比較して、本発明によるＳＮＳＡは著しい技術的進歩をもたらすことが確認された（５０ｍｇ対２．５ｍｇ）。
【０１８９】
【表３】
2011529973.tif 000005
【０１９０】
結論として、本発明によるサブナノケイ酸は損傷した皮膚を効率的に回復させ、皮膚回復及び皮膚機能の復活に要する時間を短縮させる。
実施例２８
日焼け治療に対する局所処方用サブナノケイ酸の適用
太陽に長期間、遮蔽物なしで露出した場合、特にタイプＵＶ−Ａ（３００−４００ｎｍ）およびＵＶ−Ｂ（２６０−２９０ｎｍ）の紫外線照射への露出によって起こされた日焼けに対して局所処方によって本発明のサブナノケイ酸をテストした。
【０１９１】
フィッツパトリック分類でタイプＩＩの若い男性（２３歳）と若い女性（２３歳）は胸部の皮膚領域にグレートＩの（受動的）日焼けを示していた。日焼けの原因は、ババリアの高度９５０ｍの場所で夏季に真昼の太陽に１．５時間遮蔽物なしで露出したことである。
【０１９２】
彼らの皮膚は濃い赤色に変わり、痛みがあり、男性の方は日焼けした箇所に布が触ることさえ耐えられなかった。
０．５％ｍ／ｖＳＮＳＡ、１．５％ｍ／ｖ重炭酸ナトリウム、及び１５％ｍ／ｖグリセリン及び蒸留水を含む局所処方をテストした。本発明によるＳＮＳＡの局所処方用製剤を赤くなった領域の75％に薄く均一に層状に塗布し、残りの２５％には処置をほどこさなかった。
【０１９３】
太陽に露出してから２．５時間後に最初の適用がなされた。適用された用量は皮膚表面面積１００ｃｍ2に対して２．５ｍｇＳＮＳＡであった。痛みの緩和はすぐ明らかになり、テストされた人達は日焼け感覚が緩和したと語った。その組成物を含むＳＮＳＡ製剤を第１日目に３回、翌日に2回処方した。皮膚温度はデジタル接触温度計で＋０．１５℃の精度で測定され、痛みについては視覚アナログ・スケール（ＶＡＮ）によって、そして皮膚の色は溶液の熱量分析で用いられる標準カラー・スケールとの比較で測定された。
【０１９４】
ＳＮＳＡの最初の適用後、皮膚温度は１．８−２．４℃低下した。ＳＮＳＡで措置した痛み、色、及び温度測定の合計スコアをその胸部領域の未措置領域の合計パラメータと比較した。
【０１９５】
上記の痛み、温度、及び色の測定結果によれば、ＳＮＳＡによる治療は比較対象としての未措置領域と比較して６２−７６％の改善を示した。
【図１】
2011529973.tif 000006
【図２】
2011529973.tif 000007
【図３】
2011529973.tif 000008
【図４】
2011529973.tif 000009
【図６】
2011529973.tif 000010
【図７】
2011529973.tif 000011
【図８】
2011529973.tif 000012
【図１０】
2011529973.tif 000013
【図１１】
2011529973.tif 000014
【図１２】
2011529973.tif 000015
【図１３】
2011529973.tif 000016
【図１４】
2011529973.tif 000017
【図１５】
2011529973.tif 000018
【図１６】
2011529973.tif 000019
【図１８】
2011529973.tif 000020
【図１９】
2011529973.tif 000021
【図２０】
2011529973.tif 000022
【図２６】
2011529973.tif 000023
【図２７】
2011529973.tif 000024
【図２８】
2011529973.tif 000025
【図２９】
2011529973.tif 000026
【図５】
2011529973.tif 000027
【図９】
2011529973.tif 000028
【図１７】
2011529973.tif 000029
【図２１】
2011529973.tif 000030
【図２２】
2011529973.tif 000031
【図２３】
2011529973.tif 000032
【図２４】
2011529973.tif 000033
【図２５】
2011529973.tif 000034
【図３０】
2011529973.tif 000035
【図３１】
2011529973.tif 000036
【図３２】
2011529973.tif 000037
【図３３】
2011529973.tif 000038
【国際調査報告】
2011529973.tif 000039
2011529973.tif 000040
2011529973.tif 000041