(57)【要約】  本発明は、生物の株を選択するための方法であり、生物の参照株と比較して、２つ以上の炭素源を含む混合基質の改善された消費が可能な生物の株を選択するための方法であって、生物の参照株の集団を２つ以上の炭素源の存在下で成長させるステップであって、ここで前記炭素源の各々の上での前記集団の成長の世代の数は、生物による最も好ましい炭素源の上での成長の世代の数の少なくとも約５０％であるステップと；得られた生物の株を選択し、それにより、２つ以上の炭素源を含む混合基質の、生物の参照株と比較して改善された消費が可能な生物の株を選択するステップと、を含む、方法に関する。本発明はまた、かかる方法を用いて選択される生物の株に関する。本選択方法を用いて同定される生物の株は、混合基質が使用される発酵プロセスにおいて使用してもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の株を選択するための方法であり、前記生物の参照株と比較して、２つ以上の炭素源を含む混合基質の改善された消費が可能な生物の株を選択するための方法であって、
前記生物の前記参照株の集団を、前記２つ以上の炭素源の存在下で成長させるステップであって、ここで前記炭素源の各々の上での前記集団の成長の世代の数は、前記生物の前記参照株による最も好ましい前記炭素源上での成長の世代の数の少なくとも約５０％であるステップと、
前記生物の得られた株を選択し、
それにより、前記２つ以上の炭素源を含む混合基質の、前記生物の前記参照株と比較して改善された消費が可能な前記生物の株を選択するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
各炭素源上での成長の世代の数がほぼ等しい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炭素源の各々の上での成長の世代の数が少なくとも約３０である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物が、前記２つ以上の炭素源の各々を連続的に消費する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記炭素源の１つ以上が糖である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記糖の１つ以上が、単糖または二糖である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記単糖が、ヘキソース糖またはペントース糖である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘキソース糖が、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノースまたはタロースである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ペントース糖が、アラビノース、リキソース、リボースまたはキシロースである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物が、キシロースおよびアラビノースを含む組み合わされた炭素源上で成長する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物の前記集団が、グルコース、キシロースおよびアラビノースを含む組み合わされた炭素源上で成長する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物の前記集団の前記成長が、連続バッチ反応器（ＳＢＲ）内での培養によってなされる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
嫌気性条件下で実施される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
好気性条件下で実施され、好ましくは酸素制限条件下で実施される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物が真核生物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記真核生物が酵母である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵母が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、スキゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、スクワンニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵母が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバラム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ディアスタティクス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）またはＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）種である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記真核生物が糸状菌類である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記糸状菌類が、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）またはアカカビ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記糸状菌類が、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、またはリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）種である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物が、前記炭素源を所望産物まで発酵させる能力がある、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記発酵産物が、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法に従って同定される生物の株。
【請求項２５】
少なくとも約０．４ｇｈ−１（ｇ乾燥重量）−１のアラビノースおよび少なくとも約０．２ｇｈ−１（ｇ乾燥重量）−１のキシロースの比消費速度が可能な酵母株。
【請求項２６】
少なくとも約０．４ｇｇ−１のエタノール収率をもたらす、キシロースおよびアラビノース、また場合によってグルコースを含む基質を発酵させる能力がある酵母株。
【請求項２７】
登録番号ＣＢＳ１２２７０１下でセントラルビュロー・フォール・シンメルクルツーレス（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株。
【請求項２８】
発酵産物を生成するための方法であって、２つ以上の炭素源を含有する基質を、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の生物の株で、細胞が前記前記炭素源を前記発酵産物まで発酵させるように発酵させるステップを含む、方法。
【請求項２９】
前記生物の前記株が、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のものであり、かつ、前記基質が、キシロースおよびアラビノース、また場合によってグルコースを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
発酵産物を生成するための方法であって、
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法を用いて、２つ以上の炭素源を含む混合基質を消費する能力がある生物の株を選択するステップと、
前記２つ以上の炭素源を含有する培地を発酵させるステップであって、その上で、前記生物の前記株は、前記生物の前記株が前記２つ以上の炭素源を前記発酵産物まで発酵するように選択された前記生物の前記株で選択されるステップと、
を含む、方法。
【請求項３１】
前記発酵産物を回収するステップを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記発酵産物が、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンである、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
嫌気性である、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
好気性であり、好ましくは酸素制限条件下で実施される、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、混合基質の改善された消費が可能な生物の株を選択するための方法に関する。本発明はまた、かかるプロセスによって選択されている生物の株および、発酵プロセスにおいて選択方法によって同定される生物の株の使用に関する。
【０００２】
［背景技術］
コーンストーバー、木材廃棄物、サトウキビバガスなどのリグノセルロース系供給原料は、大量であっても概して未開発の再生可能な炭素源の例である。多くの再生可能な供給原料における主要なポリマーはセルロースであり、それは加水分解時にグルコースを生成する。しかし、問題の供給原料に依存し、ヘミセルロースおよびペクチン、たとえばキシロースおよびアラビノースが加水分解される場合、他の６つおよび５つの炭素源の大量の画分が放出される。これには混合基質発酵が必要とされる。
【０００３】
混合糖発酵は、標準の純粋な基質プロセスより複雑である。輸送の競合または阻害、誘導、抑制およびカタボライト不活性化などの調節事象は、ジオキシック（ｄｉａｕｘｉｃ）成長によって発酵時間を増加させ、二次基質からの産物の収率を遅延させ、減少させることが可能である。しかし、対照的に、大部分の発酵研究は、単一の基質からの産物形成を最適化することを重視している。
【０００４】
したがって、複数の基質からの産物形成を最適化可能な方法を開発するという需要がある。同時的または連続的な混合基質の使用を促進し、高い産物収率をもたらすのに有望な発酵方法は、環境操作（たとえば、ｐＨ、培地組成物、基質比）；大規模発酵前の予備誘導；代謝誘導体の同定および供給；新規反応器構成、たとえば２段階フェドバッチプロセス（たとえば、低濃度での誘導物質に対する好気性成長および高い細胞密度の生成とその後の産物形成のための混合糖の制御された供給）；ならびに専ら混合基質上での成長に適合した微生物の使用を含みうる。
【０００５】
［発明の概要］
本発明は、混合基質、すなわち２つ以上の炭素源を含む基質上で、効率的に、特に参照株と比較してより効率的に成長できる生物の株の選択を可能にする選択方法の開発に基づくものである。特に、本方法を用い、かかる基質上で改善された成長を可能にする生物の株、すなわちかかる基質の改善された／より速やかな消費を示す株を選択することが可能である。すなわち、本発明を使用し、混合基質を、より低い速度でしかないが、既に使用することができる生物の改善された株を選択することが可能である。
【０００６】
本発明の選択方法が施される生物の出発株は、本明細書中で、たとえば、「出発」株、「参照」株または「初期」株またはそれに類するものとして称される場合がある。
【０００７】
本方法では、生物の出発（または参照）集団は、混合基質上での成長を意図して選択または作成される。次いで、その出発集団は本発明の選択方法にかけられる。選択方法は、混合基質中の炭素源の各々の上での生物の集団の成長の世代の数が、最も好ましい炭素源上での生物の集団の成長の世代の数の少なくとも約５０％であるように行われる。
【０００８】
本明細書中に記載の選択方法は、グルコース、キシロースおよびアラビノースを含む混合基質上で成長される場合、改善された消費を示す酵母の株の同定を可能にしている。
【０００９】
したがって、本発明によると、生物の株を選択するための方法であり、生物の参照株に対し、２つ以上の炭素源を含む混合基質の改善された／より速やかな消費が可能な生物の株を選択するための方法であって、
２つ以上の炭素源の存在下で、生物の参照株の集団を成長させるステップであって、ここで前記炭素源の各々の上での前記集団の成長の世代の数は、生物の参照株による最も好ましい炭素源上での成長の世代の数の少なくとも約５０％であるステップと、
得られる生物の株を選択し、
それにより、生物の参照株に対し、２つ以上の炭素源を含む混合基質の改善された消費が可能な生物の株を選択するステップと、
を含む、方法が提供される。
【００１０】
本発明はまた、
−先行する請求項のいずれか１項に記載の方法によって同定される生物の株；
−少なくとも約０．４ｇｈ−１（ｇ乾燥重量）−１のアラビノースおよび少なくとも約０．２ｇｈ−１（ｇ乾燥重量）−１のキシロースの比消費速度を可能にする酵母株、たとえばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株；
−少なくとも約０．４ｇｇ−１のエタノール収率をもたらす、キシロースおよびアラビノース、場合によってグルコースを含む基質を発酵可能な酵母株、たとえばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株；
−登録番号ＣＢＳ  １２２７０１の下、セントラルビュロー・フォール・シンメルクルツーレス（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株；
−発酵産物を生成するための方法であって、細胞が前記炭素源を発酵産物まで発酵するように、２つ以上の炭素源を含有する基質を上記の生物の株で発酵させるステップを含む、方法；
−発酵産物を生成するための方法であって、
本発明に従う方法を用い、２つ以上の炭素源を含む混合基質の消費が可能な生物の株を選択するステップと、
２つ以上の炭素源を含有する培地を発酵させるステップであって、その上で、生物の株は、生物の株が２つ以上の炭素源を発酵産物まで発酵するように選択される生物の株で選択されるステップと、を含む方法
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を使用する、改変されたキシロースおよびアラビノースの選択的ケモスタット培養の間でのＣＯ２生成特性および残留糖濃度を示す。ＣＯ２生成特性（実線）；キシロース（塗りつぶした□）；アラビノース（塗りつぶした○）。
【図２Ａ】株ＩＭＳ０００３（Ａ）、株ＩＭＳ０００７（Ｂ）、ＳＢＲ  Ｉの１００ｍＬの試料（Ｃ）、および株ＩＭＳ００１０（Ｄ）の３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロース、および１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースの混合物を含有するＭＹ中での嫌気性バッチ培養を示す。実線；ＣＯ２生成特性；グルコース（塗りつぶした○）；キシロース（塗りつぶした□）；アラビノース（○）。
【図２Ｂ】株ＩＭＳ０００３（Ａ）、株ＩＭＳ０００７（Ｂ）、ＳＢＲ  Ｉの１００ｍＬの試料（Ｃ）、および株ＩＭＳ００１０（Ｄ）の３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロース、および１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースの混合物を含有するＭＹ中での嫌気性バッチ培養を示す。実線；ＣＯ２生成特性；グルコース（塗りつぶした○）；キシロース（塗りつぶした□）；アラビノース（○）。
【図２Ｃ】株ＩＭＳ０００３（Ａ）、株ＩＭＳ０００７（Ｂ）、ＳＢＲ  Ｉの１００ｍＬの試料（Ｃ）、および株ＩＭＳ００１０（Ｄ）の３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロース、および１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースの混合物を含有するＭＹ中での嫌気性バッチ培養を示す。実線；ＣＯ２生成特性；グルコース（塗りつぶした○）；キシロース（塗りつぶした□）；アラビノース（○）。
【図２Ｄ】株ＩＭＳ０００３（Ａ）、株ＩＭＳ０００７（Ｂ）、ＳＢＲ  Ｉの１００ｍＬの試料（Ｃ）、および株ＩＭＳ００１０（Ｄ）の３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロース、および１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースの混合物を含有するＭＹ中での嫌気性バッチ培養を示す。実線；ＣＯ２生成特性；グルコース（塗りつぶした○）；キシロース（塗りつぶした□）；アラビノース（○）。
【図３】ＳＢＲ  Ｉの設定の略図を示す。バッチ培養の新しいサイクルは、培養物の約９０％を、２０ｇｌ−１のグルコース、または２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノースのいずれかを含有する合成培地と手動または自動のいずれかで代置することによって開始された。
【図４】２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノースを含有するＭＹ中での繰り返しバッチ培養（ＳＢＲ  Ｉ）のＣＯ２生成特性（実線）を示す。空化と充填のレジーム（ｅｍｐｔｙ−ｆｉｌｌ  ｒｅｇｉｍｅ）は、バッチ４および６の後、２つの場合で、反応器を２０ｇｌ−１のグルコースを含有するＭＹで充填することによって中断された。すべてのバッチにおいて、比成長速度がＣＯ２生成から計算された（塗りつぶした○）。
【図５】２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノースを含有するＭＹ中、ＳＢＲの実行Ｉの間での繰り返しバッチのＣＯ２生成特性のオーバーレイを示す。バッチ２（灰色実線）；バッチ４、８、１２（点線）；バッチ１６（黒色実線）。
【図６】ＳＢＲ  ＩＩの設定の略図を示す。バッチ培養の新しいサイクルは、培養物の約９０％を、２０ｇｌ−１のグルコース、２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース、または２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース、または２０ｇｌ−１のアラビノースのいずれかを含有する合成培地と手動または自動のいずれかで代置することによって開始された。
【図７】２０ｇｌ−１のグルコース、２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース、または２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース、または２０ｇｌ−１のアラビノースを含有するＭＹ中での繰り返しバッチ培養の１つの単一サイクルの典型的なＣＯ２生成特性を示す。
【図８】２０ｇｌ−１のグルコース、２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース（円）、または２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース（四角）、または２０ｇｌ−１のアラビノース（三角）を含有するＭＹ中でのＳＢＲ  ＩＩの間での比成長速度を示す。
【図９】２０ｇｌ−１のグルコース、２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース（Ａ）、または２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース（Ｂ）、または２０ｇｌ−１のアラビノース（Ｃ）を含有するＭＹ中、ＳＢＲの実行ＩＩの間での繰り返しバッチのＣＯ２生成特性のオーバーレイを示す。バッチサイクル１（灰色実線）；バッチサイクル７（点線）；バッチサイクル１３（ストライプ線）；バッチサイクル２０（黒色実線）。
【図１０】株ＩＭＳ００１０の、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロース、および１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースの混合物を含有するＭＹ中での嫌気性バッチ培養を示す。実線はＣＯ２の累積生成；グルコース（塗りつぶした○）；キシロース（塗りつぶした□）；アラビノース（○）；エタノール（塗りつぶした△）。生成されるエタノールの量は、ＣＯ２の累積生成の測定値から、バイオマス合成によって生じたＣＯ２生成および酢酸塩形成に関連したＣＯ２を差し引いたものに等しいと仮定された。
【００１２】
［発明の詳細な説明］
本明細書およびその特許請求の範囲では、動詞「含む」およびその活用形は、その非限定的な意味で使用され、用語に後続する項目が含まれるが、詳述されない項目が除外されないことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及では、唯一の要素があることを文脈上明確に必要としない場合、要素の２つ以上が存在するという可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、常に「少なくとも１つ」を意味する。
【００１３】
本発明は、２つ以上の炭素源を含む混合基質の消費が可能な生物の株を選択するための方法に関する。典型的には、本方法を用い、生物の出発または参照株に対し、混合基質の、本方法が適用される対象の生物の出発または参照株と比較して改善された消費を示す生物の株が同定される。すなわち、本方法を用い、生物の既存の株の性能を、混合基質を消費するその能力について改善し、たとえば混合基質中で炭素源のより速やかな消費を示す生物の株を選択することが可能である。
【００１４】
典型的には、本方法を用い、混合基質上での改善された消費を有する生物の株が、改善された発酵特性を示すように選択される。したがって、本発明に従って選択されている生物の株は、問題の発酵産物の、たとえば容量を基準とした生産性の増大の観点から改善された性能を示しうる。それに加え、またはその代わりに、本発明の方法を用いて選択される生物の株はまた、（それが選択された元の株と比較して）発酵産物の収率の増大を示しうる。
【００１５】
本発明の方法では、生物の集団は、２つ以上の炭素源の存在下で成長し、すなわち選択される。必要に応じて、本方法は、３つ、４つ、５つもしくはそれより多くの炭素源を使用して実施することが可能である。
【００１６】
典型的には、各炭素源は、炭水化物（多糖）の加水分解から得られる産物、たとえば、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、リグノセルロース、ペクチンまたはかかる炭水化物を含有する材料に由来する加水分解産物となる。かかる炭素源は、オリゴ糖、二糖および単糖を含む。後の２つは、本明細書中で糖と称される。
【００１７】
本発明において使用可能な単糖は、トリオース、たとえばグリセルアルデヒドなどのアルドトリオース、またはジヒドロキシアセトンなどのケトトリオース；テトロース、たとえばエリトロースもしくはトレオースなどのアルドテトロース、またはエリトルロースなどのケトテトロース；ペントース、たとえば、アラビノース、リキソース、リボースもしくはキシロースなどのアルドペントース、またはリブロースもしくはキシルロースなどのケトペントース；ヘキソース、たとえば、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノースもしくはタロースなどのアルドヘキソース、またはフルクトース、プシコース、ソルボースもしくはタガトースなどのケトヘキソース、またはガラクツロン酸などの糖酸；ヘプトース、たとえばマンノヘプツロースもしくはセドヘプツロースなどのケトヘプトース；オクトース、たとえばオクトロース（ｏｃｔｏｌｏｓｅ）もしくは２−ケト−３−デオキシ−マンノ−オクトナート（ｏｃｔｏｎａｔｅ）；あるいはシアロース（ｓｉａｌｏｓｅ）などのノノースを含む。
【００１８】
本発明において使用可能な二糖は、スクロース、乳糖、麦芽糖、トレハロース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、コジビオース、ラミナリビオース、マンノビオース、メリビオース、ニゲロース、ルチノースまたはキシロビオースを含む。
【００１９】
本発明は、好ましくは、２つ以上の単糖、たとえば２つ、３つ、４つ、５つもしくはより多くの単糖の組み合わせを使用して実施することが可能である。好ましくは、２つ以上の単糖はすべて、ヘキソース、またはペントースまたは単糖のそれら２つの種類の組み合わせとなる。糖の好ましい組み合わせは、キシロースおよびアラビノースの組み合わせ、またはキシロース、アラビノースおよびグルコースの組み合わせである。これらの組み合わせは、リグノセルロース系供給原料の加水分解において放出される主要な糖を示す。
【００２０】
所望される炭素源の上での生物の集団の成長は、集団に対して選択圧を発揮する。したがって、集団内の突然変異体は、炭素源上での最大比成長速度（μｍａｘ）の増加が伴えば、選択されうる。選択圧が、たとえばバッチ式で成長した培養物を新しいバッチに連続的に移すことによって維持される場合、最終的に、比成長速度がより高い（突然変異体）細胞は、比成長速度がより低い他の全細胞よりもよく成長することになる。
【００２１】
微生物を成長させるプロセスは、たとえば、供給が一定のフェドバッチ発酵または連続発酵として、バッチ培養において操作可能である。１つ以上の単糖の存在下でのこれらの操作モードは、以下により詳細に説明される。
【００２２】
［単一の炭素源（単糖）上での成長］
バッチ培養における指数関数的成長
ここでの世代の定義は、酵母バイオマスの倍加である。バイオマスの量の倍加は、次の方程式：
Ｃｘ（ｔ）＝Ｃｘ（０）＊ｅ（μ＊ｔ）  （方程式１）
によって与えられる所与の時間でのＣｘ（バイオマス濃度）によって記述することが可能である。
【００２３】
倍加時間（時間でのＴｄ）または世代時間（Ｔｇ時間）は、Ｃｘ（ｔ）＝２＊Ｃｘ（０）の置換による方程式から導くことが可能である。
Ｔｄ＝ＬＮ（２）／μ（時間）  （方程式２）
（式中、μ＝ｇｒバイオマス／ｇｒバイオマス／時間または１／時間での比成長速度）
【００２４】
バイオマス成長速度は、さまざまな手段によって測定可能である。すなわち、バイオマス量の増加は、次の方法のいずれかまたは好適な他の方法を用いて、培養物の重量または容量単位あたりの細胞の量を測定することによって分析可能である。
・混濁度
・培養物の可視光スペクトル（通常範囲：６００ｎｍ〜７００ｎｍ）における光学密度
・遠心分離後のペレット容量
・１０５℃、一定重量での乾燥後の乾燥重量含量
・細胞数／容量（顕微鏡的）、
・固形寒天培地上でのプレーティングおよび単一の細胞からのプレート上でのコロニーの成長後のコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）
【００２５】
あるいは、
・二酸化炭素生成速度（一般にｍｍｏｌ  ＣＯ２／Ｌ／時間として表される、ＣＰＲ二酸化炭素生成速度またはＣＥＲ二酸化炭素発生速度）
・酸素消費速度（ＯＵＲ酸素取り込み速度ｍｍｏｌ  Ｏ２／Ｌ．時間）
・基質取り込み速度（ｒｓ＝グルコース、キシロース、アラビノースまたはアンモニアの取り込み速度ｇ／Ｌ．時間での基質取り込み速度）
など、閉じた反応器系内で測定される代謝活性からバイオマスの量を導くことができる。
【００２６】
Ｌｎ（Ｃｘ）またはＬＮ（ＣＰＲ）、ＬＮ（ＯＵＲ）またはＬＮ（ｒｓ）が、指数関数的成長実験（栄養素制限がなく、毒性産物が全く形成されない）において時間に対してプロットされる場合、傾きが比成長速度μである直線が得られる。μおよび方程式２を用いて倍加時間を計算し、成長時間を用いて倍加の量または世代の数を計算することができる。
【００２７】
［非指数関数的成長］
非指数関数的成長実験、たとえば供給が一定のフェドバッチ発酵または連続発酵では、世代の量は、
Ｍｘ＝Ｃｘ＊容量（ｇ／Ｌでのバイオマス濃度＊ｇｒバイオマスで生成される培養液のリットル）（方程式３）
を計算し、酵母バイオマスの全質量を全ＣＦＵ（＝生成される培養物のＣＦＵ／ｍｌ＊ｍｌ、またはＯＤ＊容量）のｇｒ乾燥物質で得ることによって判定される。
【００２８】
Ｍｘの２倍の増加は１世代を意味する。
【００２９】
非指数関数的成長の主なもの（ｐｒｉｎｃｉｐａｌ）は、上記の指数関数的成長系にも適用可能である。
【００３０】
［混合炭素源上での成長］
単一の炭素源に対する上記の世代の数を説明し、計算するための系はまた、混合基質、たとえばグルコース、キシロースおよびアラビノースの混合物に適用することが可能である。しかし、個別の基質の各々の上での世代の数を判定するため、消費される個々の糖の各々の総量に対する生成されるバイオマスの総量の増加で補正する必要がある。したがって、これらの実験では、バイオマスの増加が消費される糖のいずれに対応するかを推定する必要がある。表２では、最初にグルコース、２番目にキシロースおよび３番目にアラビノースが消費されるという仮定に基づくと、発生が図２ｂに示されるようにその初期段階にある場合に、いずれが、発生がより少ない場合に該当するかという計算系についての例が与えられる。
【００３１】
所与の基質上での世代の数の通常の正確な計算値を得るため、非常に高い頻度、たとえば１時間間隔または２時間間隔でサンプリングする場合、バイオマスの増加（ｄＭＸ／ｄｔ＝時間間隔にわたって生成されるバイオマス乾燥重量の総量）および基質消費（ｄＭｘｙｌ＝ｇｒでの消費されるキシロースの総量、ｄＭａｒａ＝ｇｒでの消費されるアラビノースの総量またはｄＭｇｌｕｃ＝ｇｒでの消費されるグルコースの総量）に対して均衡させることにより、各発生実験において消費される各個別の糖の量を正確に測定することができる。次いで、個別の糖の各々に寄与する生成比は、キシロース、アラビノースおよびグルコースの相対的消費によるＭｘのあらゆる倍加に対して計算される必要がある。
【００３２】
たとえば、キシロース上でのバイオマス（Ｍｘ）の倍加における世代の数＝全糖消費またはｄＭｘｙｌ、ｄＭｇｌｕｃおよびｄＭａｒａの合計に対するキシロースの相対的糖消費＝ｄＳ／ｄｔまたはバイオマスの比倍加と同じ時間間隔にわたって消費される糖の総量
【００３３】
ｄＭｘｙｌ／（（ｄＭｘｙｌ＋ｄＭｇｌｕｃ＋ｄＭａｒａ）。この方法で、バッチ実験において、一方の基質から他方への転換点（ｓｗｉｔｃｈ  ｐｏｉｎｔ）を正確に判定することができ、それは、この実験において説明されるように混合基質上でのＳＢＲの設定に関連があるが、たとえば糖制限下での繰り返しフェドバッチまたは連続培養システムにおける混合糖濃度に対する発生にはあまり関連がない。
【００３４】
本発明の方法では、前記炭素源の各々の上での生物の集団の成長の世代の数が、生物による、最も好ましい炭素源上での成長の世代の数の、少なくとも約５０％、たとえば少なくとも約６０％、たとえば少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも５０％、たとえば少なくとも６０％、たとえば少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％少なくとも２５０％もしくは少なくとも３００％であることが重要である。
【００３５】
すなわち、集団が各個別の炭素源との関連で受ける選択圧であれば、集団が最も好ましい炭素源との関連で受ける選択圧の場合の少なくとも約半分である必要がある。これは、炭素源すべての使用の改善を促進することになる。
【００３６】
したがって、混合基質中のありとあらゆる炭素源上での成長の世代の数は、世代の最大数での成長が生じる炭素源上での成長の世代の数の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９８％であってもよい。
【００３７】
本発明の方法では、成長の世代の最小数は、典型的には、生物の出発集団によって最も好ましい炭素源上で生じる。次いで、成長の世代の２番目に少ない数は、２番目に好ましい炭素源などの上で生じる場合がある。したがって、成長の世代の最大数は、典型的には、生物によって最も好ましくない炭素源上で生じることになる。
【００３８】
本発明の方法は、各炭素源上での生物の集団の成長の世代の数がほぼ等しいように実施することが可能である。すなわち、生物の集団は、ありとあらゆる炭素源との関連でほぼ等しい選択圧を受ける。
【００３９】
あるいは、本方法は、各炭素源上での生物の集団の成長の世代の数が、最も好ましい炭素源上での成長の世代の数に少なくともほぼ等しいように実施することが可能である。
【００４０】
ありとあらゆる炭素源と関連して、生物の集団に対して発揮される選択圧は、より多数の世代を意図して前記のありとあらゆる炭素源において集団を成長させることにより、増大しうる。
【００４１】
本発明との関連での成長の世代の数についての用語「ほぼ等しい（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ  ｅｑｕａｌ）」または「ほぼ等しい（ａｂｏｕｔ  ｅｑｕａｌ）」またはそれに類するものは、成長の世代の最小数が生じる炭素源の存在下での成長の世代の数が、成長の世代の最大数が生じる炭素源の存在下で、成長の世代の数の少なくとも約９０％、たとえば少なくとも約９５％であることを示すように解釈される。
【００４２】
たとえば、キシロースおよびアラビノース（アラビノースよりキシロースの方が好ましいことが示される）を使用可能な酵母株、たとえばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株の場合、本方法は、アラビノース上での選択の世代の数が、キシロース上での選択の世代の数に対し、ほぼ等しいかまたはより大きいように実施することが可能である。
【００４３】
典型的には、本発明の方法は、２つ以上の炭素源の各々を連続的に消費する生物に対して実施される。
【００４４】
本発明の方法は、任意の好適な形式で実施することが可能である。しかし、本方法は、連続バッチ反応器（ＳＢＲ）プロトコルを用い、便益的に実施することが可能である。かかる方法では、バッチ式に成長された培養物は、新しいバッチに連続的に移すことが可能である。かかる方法では、細胞は、培養物と新しい培地の繰り返される、たとえば自動化された代置により、繰り返しバッチで培養することが可能である。
【００４５】
典型的には、培養物の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％が、新しい培地と代置される。
【００４６】
炭素源のすべてが通常、培養物を補充するため使用される培地中に存在する場合に、生物の集団にかかる技術を用いる場合、なされる選択の結果、最も好ましいかまたはより好ましい炭素源上で、より大きい世代の数での成長をもたらすことになる。
【００４７】
したがって、本発明の方法においては、成長のさらなる世代が最も好ましいかまたはより好ましい炭素源において生じるようにさらなる選択が行われる。これは、あまり好ましくない炭素源における成長の世代の数が、最も好ましい炭素源における成長の世代の数の少なくとも約５０％であることを保証する。このプロトコルは、あまり好ましくない炭素源における成長の世代の数が、最も好ましい炭素源における成長の世代の数に少なくともほぼ等しいかまたはほぼ等しいように実施することが可能である。
【００４８】
たとえば、２つの炭素源ＡおよびＢの場合（ここでＡはＢより好ましい）、初期選択はＡおよびＢの存在下で実施され（その選択の間、集団は、ＢよりＡの上でより多くの世代において成長することになる）、次いでＢ単独での選択が実施されうる（その選択の間、生物の集団は、Ｂ上で多くの世代において成長することになる）。これは、Ｂ上での成長の世代の数が、Ａ上での成長の世代の数とほぼ一致するかまたはそれを上回ることを可能にする。
【００４９】
３つの炭素源Ａ、ＢおよびＣが使用される場合（ＡはＢより好ましく、ＢはＣより好ましい）、選択はＡ＋Ｂ＋Ｃ、次いでＢ＋Ｃ、次いでＣの存在下で実施されうる。これは、ＢおよびＣ上での成長の世代の数が、Ａ上での成長の世代の数とほぼ一致するかまたはそれを上回ることを可能にする。
【００５０】
本発明の方法は、選択の繰り返されるサイクルで実施することが可能である。したがって、３つの炭素源を伴う上記の方法は、選択の複数のサイクル、たとえばＡ＋Ｂ＋Ｃ、次いでＢ＋Ｃ次いでＣの複数のサイクルで実施することが可能である。
【００５１】
本発明の方法は、上記の選択の約５〜約５０もしくはより多くのサイクル、たとえば選択の約１０〜約３０サイクル、たとえば選択の約２０サイクルを用いて実施することが可能である。
【００５２】
本発明の方法では、生物は、約１０〜約２００もしくはより多くの、各炭素源上での成長の世代、たとえば各炭素源上での少なくとも約２０、３０、４０、５０、１００、１５０もしくは２００もしくはより多くの成長の世代を経る場合がある。選択の複数のサイクルが上記のように用いられる場合、各サイクルにおける各炭素源上での生物の成長の世代の数は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９もしくは１０もしくはより多くてもよい。
【００５３】
本方法は、典型的にはほぼ等しい濃度の炭素源上での選択を用いて実施される。すなわち、炭素源のすべての濃度は、ともに約２０％以内、たとえば約１０％、たとえば約５％である。
【００５４】
炭素源の濃度は、約１０ｇｌ−１〜約５０ｇｌ−１もしくはそれ以上、たとえば約２０ｇｌ−１でありうる。
【００５５】
本発明における選択は、典型的には、発酵プロセスとして行われることになる。かかる発酵プロセスは、好気性または嫌気性発酵プロセスであってもよい。嫌気性発酵プロセスは、本明細書中で、酸素の不在下で、または酸素が実質的に全く消費されず、好ましくは約５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満もしくは約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ消費される（すなわち酸素消費が検出不能である）場合に実施される発酵プロセスとして定義され、ここで有機分子が電子ドナーおよび電子アクセプタの双方として役立つ。酸素の不在下で、解糖およびバイオマス形成において生成されるＮＡＤＨは、酸化的リン酸化によって酸化できない。この問題を解決するため、多数の微生物は、電子および水素アクセプタとしてピルビン酸塩またはその誘導体の１つを用い、それによってＮＡＤ＋を再生する。したがって、かかるプロセスでは、ピルビン酸塩は電子（および水素）アクセプタとして使用される。
【００５６】
あるいは、本発明に従う方法は、酸素制限条件下で実施することが可能である。酸素制限条件は、溶解酸素濃度および／または酸素可用性があまりに低いため、糖代謝の呼吸モードを完全に持続させられず、それゆえに追加的な電子（および水素）アクセプタとしてのピルビン酸塩の使用につながる条件として、本明細書で定義することが可能である。
【００５７】
本発明の方法は、原則として、培養可能な任意の生物を使用して実施することが可能である。したがって、本発明の方法における選択に適した生物は、原核生物、たとえば細菌、または真核細胞、たとえば酵母または糸状菌類であってもよい。本明細書における用語「細胞」または「宿主細胞」は、本発明の方法における使用に適した生物を示すように使用することが可能である。
【００５８】
酵母は、真核微生物として本明細書で定義され、主として単細胞形態で成長するユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全種（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ  Ｃ．Ｊ．、１９６２年、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））を含む。
【００５９】
酵母は、単細胞葉状体の出芽によって成長しうるか、または生物の分裂によって成長しうる。本発明の細胞として好ましい酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、スキゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、スクワンニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属に属する場合がある。好ましくは、酵母は、嫌気性発酵ができるもの、より好ましくは嫌気性アルコール発酵ができるものである。
【００６０】
糸状真菌は、真核微生物として本明細書で定義され、ユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門のすべての糸状形態を含む。これらの真菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖からなる栄養菌糸によって特徴づけられる。
【００６１】
本発明の細胞としての使用に好適な種の糸状真菌は、形態学的、生理学的、かつ遺伝的に酵母とは異なる。糸状真菌細胞は、大部分の真菌が増殖において無菌条件を必要とせず、バクテリオファージ感染には感受性がないことから、有利に使用することが可能である。糸状真菌による栄養成長は菌糸伸長によるものであり、大部分の糸状真菌の炭素異化は偏性好気性である。
【００６２】
本発明の方法における使用に適した好ましい糸状真菌は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アカカビ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）またはアオカビ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する場合がある。より好ましくは、糸状真菌細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、またはリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）細胞であってもよい。
【００６３】
本発明を用い、バイオマス、たとえば植物バイオマスを所望される発酵産物、たとえばエタノールに発酵させる能力がある生物の選択が可能である。長年にわたり、糖料作物（ｃｒｏｐ  ｓｕｇａｒｓ）からのバイオエタノールの生成を目的としたさまざまな生物の導入について、数々の提案がなされている。しかし、実際は、すべての主要なバイオエタノール生成プロセスは、エタノール生産体として、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母の使用を続けている。これは、産業プロセスに対するサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種の多数の興味深い特徴、すなわち、酸、エタノールおよび浸透圧への高い耐性、嫌気性成長の能力、また当然のことながらその高いアルコール発酵能力に起因している。宿主細胞として好ましい酵母種は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｓ．バルネッチ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、Ｓ．エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、Ｓ．ウバラム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｓ．ディアスタティクス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）またはＫ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）を含む。
【００６４】
上記のように、本発明の方法での使用のために選択される生物は、典型的には、炭素源を所望される産物に発酵することが可能なものである。
【００６５】
発酵産物は、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質またはセファロスポリンであってもよい。
【００６６】
本発明はまた、本発明の方法に従って同定されるかまたは同定可能な生物の株に関する。
【００６７】
典型的には、本方法を使用し、たとえば炭素源を所望される産物に発酵させるその能力に関し、生物の性能を改善することが可能である。
【００６８】
本発明は、細胞に対し、Ｌ−アラビノースを使用し、および／またはＬ−アラビノースをＬ−リブロースに、および／またはキシルロース５−リン酸に、および／またはエタノールなどの所望される発酵産物に変換する能力を与えるヌクレオチド配列を発現することができる真核細胞に選択的に適用することが可能である。これらの細胞のタイプは、同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２４６号明細書中に詳述されている。
【００６９】
かかる細胞は、アラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）をコードするヌクレオチド配列、Ｌ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）をコードするヌクレオチド配列、およびＬ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）をコードするヌクレオチド配列を発現する。
【００７０】
ａｒａＡをコードするヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物のいずれかのａｒａＡ、すなわち原核生物または真核生物において天然に生じるａｒａＡの場合と同一のアミノ酸配列を有するａｒａＡをコードしうる。同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２４６号明細書においては、ａｒａＢおよびａｒａＤと同時発現される場合、宿主細胞に対し、アラビノースを使用し、ならびに／あるいは、アラビノースをＬ−リブロース、および／またはキシルロース５−リン酸に、および／またはエタノールなどの所望される発酵産物に変換する能力を与える特定のａｒａＡが記載されている。これは、ａｒａＡが原核生物または真核生物由来であるか否かに特に依存しない。これはむしろ、ａｒａＡのアミノ酸配列と、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）配列である、国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２４６号明細書に記載の配列番号１に開示された特定の配列との関係に依存する。
【００７１】
ａｒａＢをコードするヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物のいずれかのａｒａＢ、すなわち原核生物または真核生物において天然に生じるａｒａＢの場合と同一のアミノ酸配列を有するａｒａＢをコードしうる。同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２４６号明細書においては、ａｒａＡおよびａｒａＤと同時発現される場合、宿主細胞に対し、アラビノースを使用し、ならびに／あるいは、アラビノースをＬ−リブロース、および／またはキシルロース５−リン酸に、および／または所望される発酵産物に変換する能力を与える特定のａｒａＢが記載されている。これは、ａｒａＢが原核生物または真核生物由来であるか否かに特に依存しない。これはむしろ、ａｒａＢのアミノ酸配列と、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）配列である、同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２４６号明細書に記載の配列番号３に開示された特定の配列との関係に依存する。
【００７２】
ａｒａＤをコードするヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物のいずれかのａｒａＤ、すなわち原核生物または真核生物において天然に生じるａｒａＤの場合と同一のアミノ酸配列を有するａｒａＤをコードしうる。同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２４６号明細書においては、ａｒａＡおよびａｒａＢと同時発現される場合、宿主細胞に対し、アラビノースを使用し、ならびに／あるいは、アラビノースをＬ−リブロース、および／またはキシルロース５−リン酸に、および／または所望される発酵産物に変換する能力を与える特定のａｒａＤが記載されている。これは、ａｒａＤが原核生物または真核生物由来であるか否かに特に依存しない。これはむしろ、ａｒａＤのアミノ酸配列と、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）配列である、同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２４６号明細書に記載の配列番号５に開示された特定の配列との関係に依存する。
【００７３】
コドンバイアス指数は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子の発現が、酵母における発現において、欧州特許第１４９９７０８号明細書に記載の原核生物のａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子より好ましいことを示す。
【００７４】
Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、食品登録当局（ｆｏｏｄ  ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）によって安全であると認められた、Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ）の生物である。したがって、好ましいヌクレオチド配列は、同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２４６号明細書において定義されるように、個別に配列番号１、３、または５の配列に関連したアミノ酸配列をそれぞれ有するａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤをコードする。好ましいヌクレオチド配列は、それぞれ真菌のａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤ（たとえば担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ）由来）、より好ましくはそれぞれ嫌気性菌類由来のａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤをコードし、ここでたとえば嫌気性菌類は、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、カエコミセス（Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、オルピノミセス（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ）、またはルミノミセス（Ｒｕｍｉｎｏｍｙｃｅｓ）ファミリーに属する。あるいは、好ましいヌクレオチド配列は、それぞれ、細菌、好ましくはグラム陽性細菌、より好ましくは乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、最も好ましくはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）種に由来するａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤをコードする。好ましくは、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤヌクレオチド配列の１つ、２つまたは３つは、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、より好ましくはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）種に由来する。あるいは、本発明での使用に適した細胞内で発現される細菌ａｒａＡは、欧州特許第１４９９７０８号明細書に開示され、配列番号９として与えられる枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｒａＡでありうる。配列番号１０は、配列番号９をコードするヌクレオチド酸配列を示す。あるいは、本発明の細胞内で発現される細菌のａｒａＢおよびａｒａＤは、欧州特許第１４９９７０８号明細書に開示され、配列番号１１および配列番号１３として与えられる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）のものでありうる。配列番号１２は、配列番号１１をコードするヌクレオチド酸配列を示す。配列番号１４は、配列番号１３をコードするヌクレオチド酸配列を示す。
【００７５】
（細菌）ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ酵素がそれぞれ、酵母などの真核宿主細胞内で活性型で発現される可能性を高めるため、対応するコードヌクレオチド配列は、そのコドン使用を選択される真核宿主細胞の場合まで最適化するように適合されうる（ＷｉｅｄｅｍａｎｎおよびＢｏｌｅｓ  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８年；０：ＡＥＭ．０２３９５−０７ｖ１−印刷前の電子出版）。選択される宿主細胞のコドン使用に対する、ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤ酵素（または本発明の他の酵素、下記参照）をコードするヌクレオチド配列の適合性は、コドン適合指数（ｃｏｄｏｎ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）（ＣＡＩ）として表すことが可能である。コドン適合指数は、高度に発現された遺伝子のコドン使用に対する、遺伝子のコドン使用の相対的適合性の尺度として本明細書で定義される。各コドンの相対的適合性（ｗ）は、同じアミノ酸における最も豊富なコドンの場合に対する各コドンの使用の比である。ＣＡＩ指標は、これらの相対的適合性の値の幾何平均として定義される。非同義コドンおよび終止コドン（遺伝子コードに依存）は除外される。ＣＡＩ値は、０〜１の範囲であり、ここでより高い値は最も豊富なコドンのより高い割合を示す（ＳｈａｒｐおよびＬｉ、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１２８１−１２９５頁を参照し、Ｊａｎｓｅｎら、２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（８）：２２４２−５１頁も参照のこと）。適合されたヌクレオチド配列は、好ましくは、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６もしくは０．７のＣＡＩを有する。
【００７６】
ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤをコードするヌクレオチド配列の発現は、細胞に対し、アラビノースを使用し、ならびに／あるいは、それをＬ−リブロース、および／またはキシルロース５−リン酸に変換する能力を与える。任意の理論に縛られたくないが、Ｌ−アラビノースは、最初にＬ−リブロースに変換され、次いでペントースリン酸経路に入る主要な分子であるキシルロース５−リン酸に変換されることが想定される。本発明との関連における「Ｌ−アラビノースを使用する」は、好ましくは、少なくとも２０日間、少なくとも０．５％のＬ−アラビノースの存在下での好気性または嫌気性条件下で培養される形質転換細胞の６６０ｎｍで測定された光学密度（ＯＤ６６０）が約０．５から１．０以上まで増加することを意味する。より好ましくは、ＯＤ６６０は０．５から１．５以上まで増加する。より好ましくは、細胞は、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％のＬ−アラビノースの存在下で培養される。最も好ましくは、細胞は、約２％のＬ−アラビノースの存在下で培養される。
【００７７】
典型的には、細胞は、検出可能な量のＬ−リブロースが、好適なアッセイを使用し、少なくとも２０日間、Ｌ−アラビノース（先のパラグラフと同様の好ましい濃度）の存在下での好気性または嫌気性条件下で培養される細胞内で検出される場合、「Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースに変換する」ことが可能である。好ましくは、アッセイはＬ−リブロースに対するＨＰＬＣである。
【００７８】
典型的には、細胞は、キシルロース５−リン酸の少なくとも２％の増加が、好適なアッセイを使用し、少なくとも２０日間、Ｌ−アラビノース（先のパラグラフと同様の好ましい濃度）の存在下での好気性または嫌気性条件下で培養される細胞内で検出される場合、「Ｌ−アラビノースをキシルロース５−リン酸に変換する」ことが可能である。好ましくは、キシルロース５−リン酸に対するＨＰＣＬに基づくアッセイは、Ｚａｌｄｉｖａｒ  Ｊ．らにおいて記載されている（（２００２年）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５９：４３６−４４２頁）。このアッセイは、実験のパートに略記されている。より好ましくは、増加は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％以上である。
【００７９】
本明細書で先に定義されたａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤをコードするヌクレオチド配列の発現はまた、少なくとも１か月から１年に至る間、Ｌ−アラビノース（先のパラグラフと同様の好ましい濃度）の存在下での好気性または嫌気性条件下で培養される場合、細胞に対し、Ｌ−アラビノースを所望される発酵産物に変換する能力を与えることが可能である。より好ましくは、細胞は、検出可能な量の所望される発酵産物が好適なアッセイを使用して検出される場合、また細胞が先のパラグラフにおいて与えられる条件下で培養される場合、Ｌ−アラビノースを所望される発酵産物に変換することが可能である。さらにより好ましくは、アッセイはＨＰＬＣである。さらにより好ましくは、発酵産物はエタノールである。
【００８０】
上記のように、ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤ酵素をそれぞれコードするヌクレオチド配列を有する形質転換のための細胞は、好ましくは、細胞へのキシロースの能動または受動輸送および細胞内でのキシロース異性化の能力がある宿主細胞である。細胞は、好ましくは能動解糖（ａｃｔｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）が可能である。キシロースから異性化されるキシルロースがピルビン酸塩に代謝されうるように、細胞は、内因性ペントースリン酸経路をさらに有し、かつ内因性キシルロースキナーゼ活性を有する場合がある。
【００８１】
細胞は、さらに好ましくは、ピルビン酸塩を、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質またはセファロスポリンなどの所望される発酵産物に変換するための酵素を有する。国際公開第２００７／０４１２６９号パンフレットに開示されるように、細胞は、ブタノール経路の１つ以上の遺伝子の導入により、ブタノールを生成できるようになる場合がある。
【００８２】
宿主細胞は、上で定義されるように、ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤ酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトで形質転換されている。かかる宿主細胞は、３つの核酸コンストラクト（各核酸コンストラクトはａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤをコードするヌクレオチド配列を含む）で同時形質転換することが可能である。ａｒａＡ、ａｒａＢ、および／またはａｒａＤコード配列を含む核酸コンストラクトは、宿主細胞内で、ａｒａＡ、ａｒａＢ、および／またはａｒａＤ酵素を発現することができる。このため、核酸コンストラクトは、たとえば国際公開第０３／０６２４４３０号パンフレットに記載のように作成することが可能である。宿主細胞は、単一のコピーを含みうるが、好ましくは各核酸コンストラクトの複数のコピーを含む。核酸コンストラクトは、エピソームによって維持され、それにより自己複製のための配列、たとえばＡＲＳ配列を含みうる。好適なエピソーム核酸コンストラクトは、たとえば酵母２μまたはｐＫＤ１（Ｆｌｅｅｒら、１９９１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５頁）プラスミドに基づく場合がある。しかし、好ましくは、各核酸コンストラクトは、１つ以上のコピーにおいて、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。宿主細胞のゲノムへの組み込みは、非正統的組換えによってランダムに生じうるが、好ましくは核酸コンストラクトは、真菌分子遺伝学の当該技術分野で周知の相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれる（たとえば国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書および米国特許第６，２６５，１８６号明細書を参照）。
【００８３】
したがって、本発明の選択方法における使用に適した細胞は、ａｒａＡ、ａｒａＢ、および／またはａｒａＤコード配列を含む核酸コンストラクトを含む場合があり、かつ、ａｒａＡ、ａｒａＢ、および／またはａｒａＤ遺伝子産物を発現することができる。さらにより好ましい実施形態では、ａｒａＡ、ａｒａＢ、および／またはａｒａＤコード配列はそれぞれ、細胞内での対応するヌクレオチド配列の十分な発現を引き起こし、細胞に対し、Ｌ−アラビノースを使用し、ならびに／あるいは、Ｌ−アラビノースをＬ−リブロース、および／またはキシルロース５−リン酸に変換する能力を与えるプロモーターに作動可能に連結される。好ましくは、細胞は酵母細胞である。したがって、さらなる態様では、本発明はまた、本明細書で先に概説された核酸コンストラクトを包含する。好ましくは、核酸コンストラクトは、ａｒａＡ、ａｒａＢおよび／またはａｒａＤをコードする核酸配列を含む。ａｒａＡ、ａｒａＢ、またはａｒａＤをコードする核酸配列はすべて、本明細書で先に定義されている。
【００８４】
さらにより好ましくは、細胞内での対応するヌクレオチド配列の発現は、本明細書中で後に定義されるように、細胞に、Ｌ−アラビノースを所望される発酵産物に変換する能力を与える。さらにより好ましい実施形態では、発酵産物はエタノールである。さらにより好ましくは、細胞は酵母細胞である。
【００８５】
用語「作動可能に連結される」は、本明細書で使用される場合、機能的関係におけるポリヌクレオチド要素（またはコード配列または核酸配列）の連結を示す。核酸配列は、別の核酸配列との機能的関係の中に置かれる場合、「作動可能に連結される」。たとえば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に作用する場合、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されるは、連結されている核酸配列が典型的には隣接し、２つのタンパク質コード領域を連結させる必要がある場合には、隣接し、リーディングフレーム内にあることを意味する。
【００８６】
用語「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、遺伝子の転写開始部位での転写の指令に対して上流に位置する、１つ以上の遺伝子の転写を制御するように機能する核酸断片を示し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位、転写開始部位および任意の他のＤＮＡ配列、たとえば限定はされないが、転写因子結合部位、リプレッサーおよび活性化因子タンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写の量を調節するように直接的または間接的に作用することが当業者に公知である任意の他のヌクレオチド配列の存在によって構成的に同定される。「構成的」プロモーターは、大部分の環境および発生条件下で活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境および発生調節下で活性があるプロモーターである。
【００８７】
ａｒａＡ、ａｒａＢおよび／またはａｒａＤをコードするヌクレオチド配列の発現を行うために使用可能なプロモーターは、発現されるべき酵素をコードするヌクレオチド配列に対して天然でなくてもよい、すなわちプロモーターは、作動可能に連結される対象のヌクレオチド配列（コード配列）に対して異種であってもよい。プロモーターは好ましくは作動可能に連結される対象のコード配列に対して異種であるが、プロモーターが相同である、すなわち宿主細胞に対して内因性であることも好ましい。好ましくは、（ヌクレオチド配列に対する）異種プロモーターは、好ましくはアラビノース、またはアラビノースおよびグルコース、またはキシロースおよびアラビノース、またはキシロースおよびアラビノースおよびグルコースが、炭素源、より好ましくは主要な炭素源として（すなわち使用可能な炭素源の５０％超が、アラビノース、またはアラビノースおよびグルコース、またはキシロースおよびアラビノース、またはキシロースおよびアラビノースおよびグルコースからなる）、最も好ましくは唯一の炭素源として使用可能である場合の条件下での、コード配列に対して天然のプロモーターより高い定常状態レベルのコード配列を含む転写産物を生成することが可能である（または時間の単位あたりで、より多くの転写産物分子、すなわちｍＲＮＡ分子を生成することが可能である）。これに関連する好適なプロモーターは、構成的および誘導性の双方の天然プロモーター、ならびに改変プロモーターを含む。本発明での使用にとって好ましいプロモーターは、カタボライト（グルコース）抑制に対してさらに感受性がなく、および／または好ましくは誘導に対してアラビノースおよび／またはキシロースを必要としないことになる。
【００８８】
これらの特性を有するプロモーターは、広く使用可能であり、当業者にとって公知である。かかるプロモーターの好適な例として、たとえば解糖系遺伝子由来のプロモーター、たとえば、酵母または糸状真菌由来の、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターがあげられ、酵母由来のかかるプロモーターについてのさらなる詳細は、（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）に見出すことが可能である。他の有用なプロモーターは、リボソームタンパク質をコードする遺伝子プロモーター、ラクトースの遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨ１、ＡＤＨ４など）、エノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）、グルコース−６−リン酸イソメラーゼプロモーター（ＰＧＩ１、Ｈａｕｆら、２０００年）またはヘキソース（グルコース）トランスポータープロモーター（ＨＸＴ７）またはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）である。ＰＧＩ１プロモーターの配列は、配列番号５１で示される。ＨＸＴ７プロモーターの配列は、配列番号５２で示される。ＴＤＨ３プロモーターの配列は、配列番号４９で示される。構成的および誘導性の双方の他のプロモーター、ならびにエンハンサーまたは上流活性化配列は、当業者には公知であろう。本発明の宿主細胞内で使用されるプロモーターは、必要に応じて修飾し、その制御特性に影響を与えることが可能である。
【００８９】
本発明の好ましい細胞は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子で形質転換された真核細胞である。より好ましくは、真核細胞は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子で形質転換された酵母細胞、さらにより好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株である。最も好ましくは、細胞は、ＣＢＳ  １２０３２７またはＣＢＳ  １２０３２８のいずれか（いずれも２００６年９月２７日にＣＢＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（オランダ）に寄託された）である。
【００９０】
用語「相同の」は、所与の（組換え）核酸またはポリペプチド分子と所与の宿主生物または宿主細胞の間の関係を示すように使用される場合、事実上、核酸またはポリペプチド分子が、同じ種、好ましくは同じ亜種または株の宿主細胞または生物によって生成されることを意味するように理解されている。ポリペプチドをコードする核酸配列は、宿主細胞に対して相同である場合、典型的には、その天然環境における場合に対し、別のプロモーター配列または、適用可能な場合、別の分泌シグナル配列および／またはターミネーター配列に作動可能に連結されることになる。用語「相同の」は、２つの核酸配列の関係を示すように使用される場合、１つの一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズしうることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、先に提示したように、配列間での同一性の量ならびに温度および塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含む多数の要素に依存しうる。好ましくは同一性の領域は約５ｂｐより大きく、より好ましくは同一性の領域は１０ｂｐより大きい。
【００９１】
用語「異種の」は、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはタンパク質と関連して使用される場合、生物、細胞、ゲノムまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の一部として天然に生じない核酸またはタンパク質を示し、ここでそれは、天然に見出される場合とは異なる細胞、あるいはゲノムまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列における１つ以上の位置において存在するかまたは見出される。異種核酸またはタンパク質は、それが導入される細胞に対して内因性でなく、別の細胞から得られているかまたは合成的もしくは組み換え的に生成されている。一般に、かかる核酸は、必ずしも必要でないが、ＤＮＡが転写または発現される細胞によって通常生成されないタンパク質をコードする。同様に、外因性ＲＮＡは、外因性ＲＮＡが存在する細胞内で通常発現されないタンパク質をコードする。異種の核酸およびタンパク質はまた、外来の核酸またはタンパク質と称される場合がある。当業者が、発現される細胞に対して異種または外来であると理解する任意の核酸またはタンパク質は、異種の核酸またはタンパク質という用語によって本明細書中に包含される。異種という用語はまた、核酸またはアミノ酸配列の非天然の組み合わせ、すなわち組み合わされた配列のうち少なくとも２つが相互にとって外来である場合の組み合わせに適用される。
【００９２】
ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを発現する本発明の選択方法における使用に適した細胞は、Ｌ−アラビノースを使用し、ならびに／あるいは、それをＬ−リブロース、および／またはキシルロース５−リン酸および／または本明細書で先に定義された所望される発酵産物に変換することが可能であり、さらにキシロースを使用し、および／またはキシロースをキシルロースに変換する能力を示す。キシロースのキシルロースへの変換は、好ましくは１ステップの異性化ステップ（キシロースのキシルロースへの直接異性化）である。したがって、細胞のこのタイプは、Ｌ−アラビノースおよびキシロースの双方を使用することが可能である。キシロースの「使用」は、本明細書で先に定義されるように、好ましくはＬ−アラビノースの「使用」と同じ意味を有する。
【００９３】
酵素の定義は、キシロースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．５）、キシルロースキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１７）、リブロース５−リン酸エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．１）、リブロース５−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．６）、トランスケトラーゼ（ＥＣ２．２．１．１）、トランスアルドラーゼ（ＥＣ２．２．１．２）、およびアルドースレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２１）として、国際公開第０６／００９４３４号パンフレットで使用される通りである。
【００９４】
好ましくは、本明細書で先に定義される、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを発現する、本発明の選択方法の使用に適した細胞は、たとえば国際公開第０３／０６２４４３０号パンフレットまたは国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載のように、キシロースをキシルロースに異性化する能力を有する。キシロースをキシルロースに異性化する能力は、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトでの宿主細胞の形質転換によって宿主細胞に与えられる。形質転換宿主細胞のキシロースをキシルロースに異性化する能力は、キシロースのキシルロースへの直接異性化である。これは、キシロースのキシルロースへのキシリトール中間体を介した２ステップ変換（それぞれキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼによって触媒される）と異なり、キシロースがキシロースイソメラーゼによって触媒される単一の反応においてキシルロースに異性化されることを意味するように理解されている。
【００９５】
ヌクレオチド配列は、好ましくは、本発明の形質転換宿主細胞内で活性型で発現されるキシロースイソメラーゼをコードする。したがって、宿主細胞内でのヌクレオチド配列の発現は、３０℃で１ｍｇのタンパク質あたり少なくとも約０．５Ｕ、好ましくは３０℃で少なくとも約１、２、５、１０、２０、２５、３０、５０、１００、２００、３００もしくは５００Ｕ／ｍｇのキシロースイソメラーゼ活性の比活性で、キシロースイソメラーゼを生成する。形質転換宿主細胞内で発現されるキシロースイソメラーゼの比活性は、本明細書で、宿主細胞の無細胞溶解物、たとえば酵母無細胞溶解物のキシロースイソメラーゼ活性単位／ｍｇタンパク質の量として定義される。キシロースイソメラーゼ活性の単位（Ｕ）は、本明細書で、Ｋｕｙｐｅｒらによって記載の条件下で（２００３年、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４、６９−７８頁）、１ｎｍｏｌのキシルロース／分を生成する酵素の量として定義される。
【００９６】
好ましくは、宿主細胞内でのキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現により、キシロースイソメラーゼが５０、４０、３０もしくは２５ｍＭ未満のキシロースにおけるＫｍで生成され、より好ましくは、キシロースにおけるＫｍは約２０ｍＭ以下である。
【００９７】
キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物のいずれかのキシロースイソメラーゼ、すなわち原核生物または真核生物において天然に生じるキシロースイソメラーゼの場合と同一のアミノ酸配列を有するキシロースイソメラーゼをコードしうる。本発明者らは、真核宿主細胞にキシロースをキシルロースに異性化する能力を与える特定のキシロースイソメラーゼの能力が、イソメラーゼが原核生物由来であるかまたは真核生物由来であるかにあまり依存しないことを見出している。それに対し、これは、イソメラーゼのアミノ酸配列とピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）配列のそれ（同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２４６号明細書における配列番号７）との関連性に依存する。驚くべきことに、真核生物ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）のイソメラーゼは、他の公知の真核生物のイソメラーゼより原核生物のイソメラーゼと関連性がある。したがって、好ましいヌクレオチド配列は、上で規定されるピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）配列に関連性があるアミノ酸配列を有するキシロースイソメラーゼをコードする。好ましいヌクレオチド配列は、真菌のキシロースイソメラーゼ（たとえば担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ）由来）、より好ましくは嫌気性菌類由来のキシロースイソメラーゼ、たとえばネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、カエコミセス（Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、オルピノミセス（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ）、またはルミノミセス（Ｒｕｍｉｎｏｍｙｃｅｓ）のファミリーに属する嫌気性菌類由来のキシロースイソメラーゼをコードする。あるいは、好ましいヌクレオチド配列は、細菌、好ましくはグラム陰性細菌のキシロースイソメラーゼ、より好ましくはバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）クラス由来、またはバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属由来、最も好ましくはバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）（配列番号１５）由来のイソメラーゼをコードする。
【００９８】
キシロースイソメラーゼが酵母などの真核宿主細胞内で活性型で発現される可能性を高めるため、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書で先に規定されるように、そのコドン使用を、真核宿主細胞の場合まで最適化するように適合されうる。
【００９９】
本発明の選択方法における使用に好適であり、かつ上記のキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、好ましくは、キシロースを細胞内に能動または受動輸送可能な宿主である。宿主細胞は、好ましくは能動解糖を有する。宿主細胞は、内因性ペントースリン酸経路をさらに有し、キシロースから異性化されるキシルロースがピルビン酸塩まで代謝されうるように内因性キシルロースキナーゼ活性を有する場合がある。宿主は、さらに好ましくは、ピルビン酸塩を、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質またはセファロスポリンなどの所望される発酵産物に変換するための酵素を有する。好ましい宿主細胞は、天然に、アルコール発酵、好ましくは嫌気性アルコール発酵を行うことが可能な宿主細胞である。宿主細胞は、さらに好ましくは、エタノールに対する高い耐性、低いｐＨ（すなわち５、４、３、もしくは２.５より低いｐＨで成長可能）と、乳酸、酢酸またはギ酸などの有機酸およびフルフラールおよびヒドロキシ−メチルフルフラールなどの糖分解産物に対する高い耐性、ならびに温度上昇に対する高い耐性を有する。宿主細胞のこれらの特性または活性のいずれかは、宿主細胞内に天然に存在しうるか、あるいは遺伝的修飾によって導入または修飾されうる。好適な細胞は、たとえば菌類のような真核微生物であるが、酵母または糸状真菌が宿主細胞として最も好適である。好ましい酵母および糸状真菌は、本明細書で既に定義されている。
【０１００】
宿主細胞という用語は、本明細書で使用される場合、細胞と同じ意味を有する。また、宿主細胞および細胞という用語は、生物という用語と交換可能に使用してもよい。
【０１０１】
本発明の選択方法における使用に適した細胞は、好ましくは、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトで形質転換される。好ましくは使用される核酸コンストラクトは、使用される、ａｒａＡ、ａｒａＢまたはａｒａＤをコードするヌクレオチド配列を含むものと同じである。
【０１０２】
国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載のように、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを発現し、かつキシロースをキシルロースに直接異性化する能力を示す、本発明の選択方法における使用に適した細胞は、本明細書で先に定義されるように、ペントースリン酸経路の流れを増大する遺伝的修飾をさらに含んでもよい。特に、遺伝的修飾は、ペントースリン酸経路の非酸化部分の流れの増大を引き起こす。ペントースリン酸経路の非酸化部分の流れの増大を引き起こす遺伝的修飾は、本明細書で、流れの増大を引き起こす遺伝的修飾を除いて遺伝的に同一である株における流れに対し、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０もしくは２０の倍数で流れを増大させる修飾を意味するように理解されている。ペントースリン酸経路の非酸化部分の流れは、唯一の炭素源としてのキシロースに対する修飾された宿主を成長させ、キシロース比消費速度を測定し、何らかのキシリトールが生成される場合、キシリトール比生成速度をキシロース比消費速度から差し引くことにより、測定することが可能である。しかし、ペントースリン酸経路の非酸化部分の流れは、唯一の炭素源としてのキシロースに対する成長速度、好ましくは唯一の炭素源としてのキシロースに対する嫌気性成長速度に比例する。唯一の炭素源としてのキシロースに対する成長速度（μｍａｘ）とペントースリン酸経路の非酸化部分の流れとの間に線形関係がある。キシロース比消費速度（Ｑｓ）は、糖に対するバイオマスの収率が一定である（所与の条件セット下：嫌気性、成長培地、ｐＨ、株の遺伝的背景など；すなわちＱｓ＝μ／Ｙｘｓ）ことから、糖に対するバイオマスの収率（Ｙｘｓ）で除した成長速度（μ）に等しい。したがって、ペントースリン酸経路の非酸化部分の流れの増大は、これらの条件下での最大成長速度の増加から推定することが可能である。好ましい実施形態では、細胞は、ペントースリン酸経路の流れを増大させる遺伝的修飾を含む。
【０１０３】
ペントースリン酸経路の流れを増大させる遺伝的修飾は、さまざまな方法で、宿主細胞に導入することが可能である。これらは、たとえば、キシルロースキナーゼおよび／またはペントースリン酸経路の非酸化部分の１種以上の酵素のより高い定常状態活性レベル、ならびに／あるいは非特異的なアルドースレダクターゼ活性の定常状態レベルの低下を得ることを含む。定常状態活性レベルにおけるこれらの変化は、（自発的かまたは化学物質または放射線によって誘発される）突然変異体の選択および／または組換えＤＮＡ技術、たとえば酵素をコードする遺伝子の各々の過剰発現もしくは不活性化またはこれらの遺伝子を調節する因子によって生じうる。
【０１０４】
本発明の選択方法における使用のためのより好ましい細胞では、遺伝的修飾は、（非酸化部分）ペントースリン酸経路の少なくとも１つの酵素の過剰発現を含む。好ましくは、酵素は、国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載のように、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする酵素からなる群から選択される。
【０１０５】
（非酸化部分）ペントースリン酸経路の酵素のさまざまな組み合わせは、過剰発現されうる。たとえば、過剰発現される酵素は、少なくとも酵素のリブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸エピメラーゼ；または少なくとも酵素のリブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスケトラーゼ；または少なくとも酵素のリブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素のリブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスケトラーゼ；または少なくとも酵素のリブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素のトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素のリブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素のリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素のリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、およびトランスアルドラーゼ；または少なくとも酵素のリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、およびトランスケトラーゼでありうる。本発明の一実施形態では、酵素のリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼの各々は、宿主細胞内で過剰発現される。遺伝的修飾が少なくとも酵素のトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼの双方の過剰発現を含む宿主細胞が、既にキシロース上での嫌気性成長が可能であることから、より好ましい。実際、いくつかの条件下で、発明者らは、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼのみを過剰発現する宿主細胞が、酵素のうち４つ、すなわちリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼの全部を過剰発現する宿主細胞の場合と同じの、キシロース上での嫌気性成長速度を既に有することを見出している。さらに、酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸エピメラーゼの双方を過剰発現する宿主細胞は、これらの酵素のうち１つのみの過剰発現によって代謝不均衡がもたらされうることから、イソメラーゼのみまたはエピメラーゼのみを過剰発現する宿主細胞よりも好ましい。
【０１０６】
本発明の選択方法における使用に適した細胞内での酵素の過剰発現については、当該技術分野で利用可能なさまざまな手段がある。特に、酵素は、宿主細胞内の酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させることにより、たとえば遺伝子の追加的コピーを宿主細胞のゲノム内に組み込むことにより、エピソームの複数のコピーの発現ベクターから遺伝子を発現させるか、または遺伝子の複数のコピーを含むエピソーム発現ベクターを導入することにより、過剰発現されることが可能である。
【０１０７】
あるいは、本発明の方法における使用に適した宿主細胞内での酵素の過剰発現は、過剰発現されるべき酵素をコードする配列に対して天然でないプロモーター、すなわち作動可能に連結される対象のコード配列に対して異種のプロモーターを使用することによって行うことが可能である。この末端に対して好適なプロモーターは、本明細書で既に定義されている。
【０１０８】
酵素の過剰発現のために使用されるコード配列は、好ましくは本発明の方法における使用に適した宿主細胞に対して相同である。しかし、本発明の方法における使用に適した宿主細胞に対して異種のコード配列は、同様に国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記述されるように適用してもよい。
【０１０９】
本発明の方法における使用に適した宿主細胞内でのリブロース−５−リン酸イソメラーゼの過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列は、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１７と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、またはここでヌクレオチド配列は、穏やかな条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、配列番号１８のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能である。
【０１１０】
本発明の方法における使用に適した宿主細胞内でのリブロース−５−リン酸エピメラーゼの過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列は、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１９と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、またはここでヌクレオチド配列は、穏やかな条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、配列番号２０のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能である。
【０１１１】
本発明の宿主細胞内でのトランスケトラーゼの過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列は、トランスケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２１と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、またはここでヌクレオチド配列は、穏やかな条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、配列番号２２のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能である。
【０１１２】
本発明の宿主細胞内でのトランスアルドラーゼの過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列は、トランスアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２３と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、またはここでヌクレオチド配列は、穏やかな条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、配列番号２４のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能である。
【０１１３】
酵素の過剰発現は、遺伝子組み換え宿主細胞内での酵素の生成を参照する場合、酵素が、同一の条件下で未修飾宿主細胞と比較してより高いレベルの比酵素活性で生成されることを意味する。通常、これは、酵素活性があるタンパク質（またはマルチサブユニット酵素の場合でのタンパク質）が、同一の条件下で未修飾宿主細胞と比較してより多量でかまたはむしろより高い定常状態レベルで生成されることを意味する。同様に、これは通常、酵素活性があるタンパク質をコードするｍＲＮＡが、同一の条件下で未修飾宿主細胞と比較してより多量でかまたはやはりむしろより高い定常状態レベルで生成されることを意味する。したがって、酵素の過剰発現は、好ましくは、宿主細胞内での酵素の比活性のレベルを、本明細書中に記載の好適な酵素アッセイを使用して測定することによって判定される。あるいは、酵素の過剰発現は、酵素タンパク質に特異的な定常状態レベルを、たとえば酵素に対して特異的な抗体を使用して定量することにより、または酵素をコードするｍＲＮＡに特異的な定常レベルを定量することにより、間接的に判定することが可能である。後者は、ペントースリン酸経路の酵素にとって特に好適でありえ、その場合の酵素アッセイは、酵素における基質が市販されていないことから、容易に実現できない。好ましくは、本発明の宿主細胞内では、過剰発現されるべき酵素は、遺伝的修飾が過剰発現をもたらすことを除いて遺伝的に同一である株に対し、少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０もしくは２０の倍数だけ過剰発現される。過剰発現のこれらのレベルが、酵素の活性の定常状態レベル、酵素のタンパク質の定常状態レベル、ならびに酵素をコードする転写産物の定常状態レベルに適用可能であることは理解されるべきである。
【０１１４】
本発明の選択方法における使用に適し、かつａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを発現し、かつキシロースをキシルロースに直接異性化する能力を示し、また場合によって、本明細書で先に定義されるようにペントース経路の流れを増大させる遺伝的修飾を含む細胞は、特異的なキシルロースキナーゼ活性を増大させる遺伝的修飾をさらに含んでもよい。好ましくは、遺伝的修飾は、たとえばキシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現により、キシルロースキナーゼの過剰発現をもたらす。キシルロースキナーゼをコードする遺伝子は、宿主細胞に対して内因性であってもよく、または宿主細胞に対して異種であるキシルロースキナーゼであってもよい。本発明の方法における使用に適した宿主細胞内でのキシルロースキナーゼの過剰発現のために使用されるヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２５と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、またはここでヌクレオチド配列は、穏やかな条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、配列番号２６のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能である。
【０１１５】
特に好ましいキシルロースキナーゼは、国際公開第０３／０６２４４３０号パンフレットに記載のように、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）由来のキシルロースキナーゼｘｙｌＢに関連したキシルロースキナーゼである。本発明の方法における使用に適した宿主細胞内でのキシルロースキナーゼの過剰発現における使用にとってより好ましいヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２７と少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、またはここでヌクレオチド配列は、穏やかな条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、配列番号２８のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能である。
【０１１６】
本発明の宿主細胞においては、特異的なキシルロースキナーゼ活性を増大させる遺伝的修飾は、上記のペントースリン酸経路の流れを増大させる修飾のいずれかと組み合わせることが可能であるが、この組み合わせは本発明として必須ではない。したがって、本明細書で先に定義されるように、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ酵素の発現に加え、特異的なキシルロースキナーゼ活性を増大させる遺伝的修飾を含む本発明の宿主細胞は、本発明中に具体的に含められる。本発明の宿主細胞内でのキシルロースキナーゼの過剰発現を行い、分析する当該技術分野で利用可能なさまざまな手段は、ペントースリン酸経路の酵素について上記したものと同じである。好ましくは、本発明の宿主細胞においては、過剰発現されるべきキシルロースキナーゼは、過剰発現をもたらす遺伝的修飾を除いて遺伝的に同一である株と比較して少なくとも１．１、１．２、１．５、２、５、１０もしくは２０の倍数だけ過剰発現される。過剰発現のこれらのレベルが、酵素の活性の定常状態レベル、酵素のタンパク質の定常状態レベル、ならびに酵素をコードする転写産物の定常状態レベルに適用可能であることは理解されるべきである。
【０１１７】
さらに好ましい実施形態では、
−ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤを発現し、かつキシロースをキシルロースに直接異性化する能力を示し、また場合によって
−ペントース経路の流れを増大させる遺伝的修飾を含み、および／または
−本明細書で先に定義されるように、特異的なキシルロースキナーゼ活性のすべてを増大させる遺伝的修飾をさらに含む、本発明の選択方法における使用に適した細胞は、宿主細胞内での非特異的なアルドースレダクターゼ活性を低下させる遺伝的修飾をさらに含んでもよい。好ましくは、非特異的なアルドースレダクターゼ活性は、国際公開第０６／００９４３４号パンフレットに記載のように、非特異的なアルドースレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させるかまたはそれを不活性化する１つ以上の遺伝的修飾により、宿主細胞内で低下する。好ましくは、遺伝的修飾は、宿主細胞内での非特異的なアルドースレダクターゼをコードする遺伝子の各内因性コピーの発現を低下または不活性化する。宿主細胞は、２倍性、倍数性または異数性の結果として、非特異的なアルドースレダクターゼをコードする遺伝子の複数のコピーを含んでもよく、および／または宿主細胞は、アミノ酸配列が異なるアルドースレダクターゼ活性を有する数種の異なる（イソ）酵素（それぞれ、異なる遺伝子によってコードされる）を含んでもよい。また、かかる例では、好ましくは、非特異的なアルドースレダクターゼをコードする各遺伝子の発現は、低下するかまたは不活性化される。好ましくは、同遺伝子は、遺伝子の少なくとも一部の欠失または遺伝子の破壊によって不活性化され、ここで遺伝子という用語はまた、これに関連し、コード配列の上流または下流の任意の非コード配列を含み、その（部分的）欠失または不活性化は、宿主細胞内での非特異的なアルドースレダクターゼ活性の発現の低下をもたらす。活性が本発明の宿主細胞内で低下されるべきアルドースレダクターゼをコードするヌクレオチド配列は、アルドースレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで好ましくは、ポリペプチドは、配列番号２９と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０もしくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、またはここでヌクレオチド配列は、穏やかな条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、配列番号３０のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能である。
【０１１８】
本発明での使用に適した細胞においては、本明細書で定義されるａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ酵素の発現は、非特異的なアルドースレダクターゼ活性を低下させる遺伝的修飾と組み合わされる。非特異的なアルドースレダクターゼ活性の低下につながる遺伝的修飾は、ペントースリン酸経路の流れを増大させる修飾のいずれかおよび／または上記の宿主細胞内での特異的なキシルロースキナーゼ活性を増大させる修飾のいずれかと組み合わせてもよいが、これらの組み合わせは本発明にとって必須ではない。したがって、非特異的なアルドースレダクターゼ活性を低下させる追加的な遺伝的修飾を含む、ａｒａＡ、ａｒａＢ、およびａｒａＤを発現する宿主細胞は、本発明中に具体例として含められる。
【０１１９】
好ましい実施形態では、本発明の選択方法における使用に適した細胞は、ＣＢＳ（セントラルビュロー・フォール・シンメルクルツーレス（Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ  ８，３５８４  ＣＴ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））に２００６年９月２７日に寄託されたＣＢＳ  １２０３２７、ＣＢＳに２００６年９月２７日に寄託されたＣＢＳ  １２０３２８、ＣＢＳに２００７年９月２０日に寄託されたＣＢＳ  １２１８７９、またはＣＢＳに２００８年３月１１日に寄託されたＣＢＳ  １２２７００である。これらの株のすべては、Ｄｅｌｆｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって寄託された。最初から３つの株は、同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２４６号明細書に記載されている。最後の株は、実施例において詳述される。寄託された株のすべては、それらがアラビノースおよびキシロースを消費可能なように改変されているサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株である。
【０１２０】
上記の細胞のすべてを使用し、キシロースおよび／またはアラビノースの使用に関して改善された特性を示す株を選択することが可能である。
【０１２１】
本発明の選択プロセスは、必要な限り、継続することが可能である。この選択プロセスは、好ましくは約１週間から約１年間かけて実施される。しかし、選択プロセスは、必要に応じてより長い期間実施してもよい。
【０１２２】
選択プロセスの間、細胞は、好ましくは、約２０ｇ／ｌのＬ−アラビノースおよび／または約２０ｇ／ｌのキシロースの存在下で培養される。この選択プロセスの終わりに得られる株は、Ｌ−アラビノースおよび／またはキシロースを使用し、ならびに／あるいは、Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／またはエタノールなどの所望される発酵産物に変換するその能力について改善されることが想定される。
【０１２３】
この文脈での「改善された細胞」または「改善された生物」は、得られる細胞が、炭素源（その上でそれが選択される）、たとえばＬ−アラビノースおよび／またはキシロースを、それが由来する細胞に対してより効率的方法で使用することが可能であることを意味しうる。たとえば、得られる細胞は、より多く成長する（同じ条件下でそれが由来する細胞に対して比成長速度の少なくとも２％の増加）、または炭素源をより速やかに消費することが想定される。好ましくは、かかる増加は、少なくとも約４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％もしくはそれ以上である。比成長速度は、当業者に公知のように、ＯＤ６６０から計算できる。したがって、ＯＤ６６０のモニタリングにより、比成長速度を推定することができる。
【０１２４】
この文脈での「改善された細胞」はまた、得られる細胞が、炭素源（その上でそれが選択されている）、たとえばＬ−アラビノースを、Ｌ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／またはエタノールなどの所望される発酵産物に、それが由来する細胞に対してより効率的方法で変換することを意味しうる。たとえば、得られる細胞は、より大量の、Ｌ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸および／またはエタノールなどの所望される発酵産物などの変換産物または発酵産物を生成する（同じ条件下でそれが由来する細胞に対してこれらの化合物の少なくとも１つの少なくとも２％の増加）ことが想定される。好ましくは、増加は、少なくとも４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％もしくはそれ以上である。この文脈での「改善された細胞」または「改善された生物」はまた、得られる細胞が、キシロースを、キシルロースおよび／またはエタノールなどの所望される発酵産物に、それが由来する細胞に対してより効率的方法で変換することを意味しうる。たとえば、得られる細胞／生物は、より大量の、キシルロースおよび／またはエタノールなどの所望される発酵産物を生成する（同じ条件下でそれが由来する細胞に対してこれらの化合物の少なくとも１つの少なくとも２％の増加）ことが想定される。好ましくは、増加は、少なくとも４％、６％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％もしくはそれ以上である。
【０１２５】
本発明の方法を用いて選択される生物の株では、上記の遺伝的修飾、選択によって得られる修飾の少なくとも１つは、改善された株に、炭素源、好ましくは唯一の炭素源としてのＬ−アラビノースおよび場合によってキシロース上で、また好ましくは嫌気性条件下で成長する能力を与えることが可能である。好ましくは、改善された株は、本質的にキシリトールを全く生成せず、たとえば生成されるキシリトールは、検出限界未満であるか、またはたとえば、モルを基準として消費される炭素の５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、もしくは０．３％未満である。
【０１２６】
好ましくは、改善された株は、好気性条件下で、少なくとも０．００１ｈ−１、０．００５ｈ−１、０．０１ｈ−１、０．０３ｈ−１、０．０５ｈ−１、０．１ｈ−１、０．２ｈ−１、０．２５ｈ−１もしくは０．３ｈ−１の速度、または適用可能な場合、嫌気性条件下で、少なくとも０．００１ｈ−１、０．００５ｈ−１、０．０１ｈ−１、０．０３ｈ−１、０．０５ｈ−１、０．０７ｈ−１、０．０８ｈ−１、０．０９ｈ−１、０．１ｈ−１、０．１２ｈ−１、０．１５ｈ−１もしくは０．２ｈ−１の速度で、唯一の炭素源としてのＬ−アラビノースおよび場合によってキシロース上で成長する能力を有する。好ましくは、改善された株は、好気性条件下で、少なくとも０．００１ｈ−１、０．００５ｈ−１、０．０１ｈ−１、０．０３ｈ−１、０．０５ｈ−１、０．１ｈ−１、０．２ｈ−１、０．２５ｈ−１もしくは０．３ｈ−１の速度、または適用可能な場合、嫌気性条件下で、少なくとも０．００１ｈ−１、０．００５ｈ−１、０．０１ｈ−１、０．０３ｈ−１、０．０５ｈ−１、０．１ｈ−１、０．１２ｈ−１、０．１５ｈ−１、もしくは０．２ｈ−１の速度で、唯一の炭素源としてのグルコースとＬ−アラビノースおよび場合によってキシロースとの混合物（１：１の重量比）上で成長する能力を有する。
【０１２７】
好ましくは、改善された株は、特定のＬ−アラビノース、好ましくはキシロースの、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３４６、３５０、４００、５００、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００もしくは１０００ｍｇ／ｇ細胞／ｈの消費速度を有する。好ましくは、修飾された宿主細胞は、グルコース上での宿主細胞の発酵産物（エタノールなど）の収率の少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、８５、９０、９５もしくは９８％である、Ｌ−アラビノース、好ましくはキシロース上での発酵産物（エタノールなど）の収率を有する。より好ましくは、Ｌ−アラビノース、好ましくはキシロース上での修飾された宿主細胞の発酵産物（エタノールなど）の収率は、グルコース上での宿主細胞の発酵産物（エタノールなど）の収率に等しい。同様に、Ｌ−アラビノース、好ましくはキシロース上での修飾された宿主細胞のバイオマス収率は、好ましくはグルコース上での宿主細胞のバイオマス収率の少なくとも５５、６０、７０、８０、８５、９０、９５もしくは９８％である。より好ましくは、Ｌ−アラビノース、好ましくはキシロース上での修飾された宿主細胞のバイオマス収率は、グルコース上での宿主細胞のバイオマス収率に等しい。グルコースと、Ｌ−アラビノース、好ましくはキシロース上での収率の比較において、両方の収率が好気性条件下または両方とも嫌気性条件下で比較されることは理解される。
【０１２８】
本発明の選択方法を用い、改善された酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））株が、単離され、登録番号ＣＢＳ  １２２７０１の下、２００８年３月１１日にＣＢＳ（セントラルビュロー・フォール・シンメルクルツーレス（Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ  ８，３５８４  ＣＴ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））に寄託されている。寄託者は、Ｄｅｌｆｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙであった。
【０１２９】
好ましい実施形態では、本発明に従って選択される細胞は、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される少なくとも１つの発酵産物を生成する能力を細胞に与える１つ以上酵素を発現する。より好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、エタノールを生成するための宿主細胞である。別の好ましい実施形態では、本発明は、エタノール以外の発酵産物を生成するための形質転換宿主細胞に関する。かかる非エタノール発酵産物は、原則として、酵母または糸状菌類などの真核微生物によって生成可能な任意のバルクまたはファインケミカルを含む。かかる発酵産物として、たとえば、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンがあげられる。非エタノール発酵産物を生成するための本発明の好ましい宿主細胞は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性の低下および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の低下をもたらす遺伝的修飾を有する宿主細胞である。
【０１３０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法を用いて選択される生物の株が、２つ以上の炭素源を含む混合基質、たとえばＬ−アラビノースの供給源および場合によってキシロースの供給源を含む基質の発酵のために使用される発酵方法に関する。
【０１３１】
好ましくは、Ｌ−アラビノースの供給源およびキシロースの供給源は、Ｌ−アラビノースおよびキシロースである。さらに、発酵培地中の炭素源はまた、グルコースの供給源を含んでもよい。Ｌ−アラビノース、キシロースまたはグルコースの供給源は、そのようなＬ−アラビノース、キシロースまたはグルコースであってもよく、あるいは任意の炭水化物、Ｌ−アラビノース、キシロースもしくはグルコース単位を含むオリゴまたはポリマー、たとえば、リグノセルロース、キシラン、セルロース、デンプン、アラビナンなどであってもよい。かかる炭水化物からのキシロースまたはグルコース単位の放出においては、好適なカルボヒドラーゼ（キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなど）は、発酵培地に加えるか、または修飾された宿主細胞によって生成してもよい。後者の場合、修飾された宿主細胞に遺伝子操作を行い、かかるカルボヒドラーゼを生成、分泌させることが可能である。グルコースのオリゴまたはポリマー供給源を使用するさらなる利点は、それが、たとえば律速量（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔｓ）のカルボヒドラーゼを使用し、発酵の間に低い（より低い）濃度の遊離グルコースを維持することを可能にする点である。これは、ひいては、キシロースなどの非グルコース糖の代謝および輸送にとって必要とされる系の抑制を阻止することになる。好ましい方法では、修飾された宿主細胞は、Ｌ−アラビノース（場合によってキシロース）およびグルコースの双方を好ましくは同時に発酵させ、その場合、好ましくは修飾された宿主細胞は、ジオキシック成長を阻止するためのグルコース抑制に対して感受性を示さないように使用される。炭素源としてのＬ−アラビノース、場合によってキシロース（およびグルコース）の供給源に加え、発酵培地は、修飾された宿主細胞の成長にとって必要とされる好適な成分をさらに含むことになる。酵母または糸状真菌などの微生物の成長のための発酵培地の組成物は、当該技術分野で周知である。
【０１３２】
好ましい方法では、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される発酵産物を生成するための方法であって、
（ａ）２つ以上の炭素源を含有する培地を、本発明の方法を用いて選択される生物の株で発酵させるステップと、場合によって、
（ｂ）発酵産物を回収するステップと、
を含む、方法が提供される。
【０１３３】
発酵プロセスは、たとえば、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質、たとえばペニシリンＧもしくはペニシリンＶおよびその発酵誘導体、および／またはセファロスポリンなどの発酵産物を生成するためのプロセスである。発酵プロセスは、好気性または嫌気性発酵プロセスであってもよい。嫌気性発酵プロセスは、本明細書で、酸素の不在下で、または酸素が実質的に全く消費されず、好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満もしくは１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ消費される（すなわち酸素消費が検出不能である）場合に実施される発酵プロセスとして定義され、ここで有機分子が電子ドナーおよび電子アクセプタの双方として役立つ。酸素の不在下で、解糖およびバイオマス形成において生成されるＮＡＤＨは、酸化的リン酸化によって酸化できない。この問題を解決するため、多数の微生物は、電子および水素アクセプタとしてピルビン酸塩またはその誘導体の１つを用い、それによってＮＡＤ＋を再生する。したがって、好ましい嫌気性発酵プロセスでは、ピルビン酸塩は、電子（および水素）アクセプタとして使用され、エタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム抗生物質およびセファロスポリンなどの発酵産物に還元される。好ましい実施形態では、発酵プロセスは嫌気性である。嫌気性プロセスは、それが好気性プロセスより安価であり、特別な機器があまり必要でないことから有利である。さらに、嫌気性プロセスは、好気性プロセスより多くの産物収率をもたらすことが想定される。好気性条件下での通常のバイオマス収率は、嫌気性条件下の場合より多い。結果として、好気性条件下での通常の予想される産物収率は、嫌気性条件下の場合より少ない。
【０１３４】
別の好ましい実施形態では、発酵プロセスは酸素制限条件下である。より好ましくは、発酵プロセスは、好気性であり、かつ酸素制限条件下である。酸素制限発酵プロセスは、酸素消費が気体から液体への酸素の移動によって制限されるプロセスである。酸素制限の程度は、流入する気流の量および組成物ならびに使用される発酵機器の実際の混合／物質移動特性によって判定される。酸素制限条件下でのプロセスでは、酸素消費の速度は、少なくとも約５．５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ、たとえば少なくとも約６ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈもしくは少なくとも約７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈでありうる。
【０１３５】
発酵プロセスは、好ましくは、修飾された細胞にとって最適な温度で実施される。したがって、大部分の酵母または真菌細胞においては、発酵プロセスは、４２℃より低い温度、好ましくは３８℃より低い温度で実施される。酵母または糸状真菌宿主細胞においては、発酵プロセスは、好ましくは、３５、３３、３０もしくは２８℃より低い温度および２０、２２、もしくは２５℃より高い温度で実施される。
【０１３６】
好ましいプロセスは、エタノールを生成するためのプロセスであって、（ａ）２つ以上の炭素源、たとえばＬ−アラビノースおよび場合によってキシロースを含有する培地を、本発明の方法を用いて選択される生物の株で発酵させるステップと、ここで宿主細胞は炭素源をエタノールに発酵し、場合によって（ｂ）エタノールを回収するステップと、を含む、プロセスである。
【０１３７】
発酵培地はまた、エタノールにさらに発酵されるグルコースの供給源を含みうる。好ましい実施形態では、エタノールを生成するための発酵プロセスは嫌気性である。嫌気性は、既に、本明細書中で先に定義されている。別の好ましい実施形態では、エタノールを生成するための発酵プロセスは好気性である。別の好ましい実施形態では、エタノールを生成するための発酵プロセスは、酸素制限条件下、より好ましくは好気性かつ酸素制限条件下である。酸素制限条件は、既に、本明細書中で先に定義されている。
【０１３８】
本プロセスにおいては、容量でのエタノール生産性は、好ましくは、少なくとも０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、５．０もしくは１０．０ｇ／Ｌ／時間のエタノールである。本プロセスにおけるＬ−アラビノースおよび場合によってキシロースおよび／またはグルコース上でのエタノール収率は、好ましくは、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは９８％である。エタノール収率は、理論最大収率（グルコースおよびＬ−アラビノースおよび場合によってキシロースにおいては、０．５１ｇエタノール／ｇ．グルコースまたはキシロースである）の百分率として本明細書で定義されるが、それは絶対項で表すことが可能である。したがって、本発明はまた、キシロースおよびアラビノース、ならびに場合によってグルコースを含む基質を発酵させる能力がある酵母株、たとえばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株に関し、それは少なくとも約０．２ｇｇ−１、少なくとも約０．３ｇｇ−１もしくは少なくとも約０．４ｇｇ−１もしくはそれ以上のエタノール収率をもたらす。
【０１３９】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【０１４０】
［実施例］
［材料および方法］
［株および維持］
本試験で使用するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を表１にあげる。振とうフラスコ、ケモスタットまたは（連続）バッチ培養のいずれかから得られる培養試料を、３０％（ｖ／ｖ）グリセロールの添加によってストックし、２ｍｌの一定分量で−８０℃で保存した。
【０１４１】
［培地および振とうフラスコ培養］
振とうフラスコ培養を、５ｇｌ−１の（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｇｌ−１のＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇｌ−１のＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０５ｍｌＬ−１のシリコーン系消泡剤および微量元素を含有する合成培地（ＭＹ）中で、３０℃で行った（Ｖｅｒｄｕｙｎ，  Ｃ．、Ｅ．Ｐｏｓｔｍａ、  Ｗ．Ａ．Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ、およびＪ．Ｐ．Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ．  １９９２年  「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｌｕｘｅｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ：  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．」  Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７頁）。振とうフラスコ内での培養においては、培地のｐＨを、滅菌前に２Ｍ  ＫＯＨで６．０に調整した。加熱滅菌（１２１℃、２０分）後、フィルター滅菌したビタミン溶液（Ｖｅｒｄｕｙｎら、１９９２年、上記）と好適な炭素およびエネルギー源を加えた。振とうフラスコ培養物を、５００ｍｌの振とうフラスコ内の好適な糖を含有する１００ｍｌの培地に凍結ストック培養物を接種することによって調製し、オービタルシェーカー（２００ｒｐｍ）内、３０℃でインキュベートした。
【０１４２】
２０ｇｌ−１のキシロース（ＭＹＸ）または２０ｇｌ−１のアラビノース（ＭＹＡ）を含有する固体ＭＹプレートを、１．５％の寒天をＭＹプレートに加えることによって調製した。プレートを成長が認められるまで、３０℃でインキュベートした。
【０１４３】
［ケモスタット培養］
嫌気性ケモスタット培養を、２Ｌの実験室発酵槽（Ａｐｐｌｉｋｏｎ（Ｓｃｈｉｅｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））内で、１Ｌの作動容積（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）で３０℃で行った。培養物を、エタノール中に溶解した０．０１ｇｌ−１のエルゴステロールおよび０．４２ｇｌ−１のＴｗｅｅｎ  ８０（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ、Ａ．Ａ．およびＴ．Ｊ．Ｓｔｉｅｒ．  １９５３年  「Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｉ．Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ．」  Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１：２３−３６頁；およびＡｎｄｒｅａｓｅｎ、Ａ．Ａ．およびＴ．Ｊ．Ｓｔｉｅｒ．  １９５４年  「Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  ＩＩ．  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ．」  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：２７１−２８１頁）、シリコーン系消泡剤および微量元素（Ｖｅｒｄｕｙｎら、１９９２年、上記）、ならびに炭素およびエネルギー源としての２０ｇｌ−１のキシロースおよびアラビノースを補充した合成培地中で行い、２Ｍ  ＫＯＨの自動添加によってｐＨ５．０で維持した。培養物を、８００ｒｐｍで撹拌し、０．５ｌ／分の窒素ガス（＜１０ｐｐｍの酸素）を散布した。酸素の拡散を最小にするため、発酵槽にＮｏｒｐｒｅｎｅ管（Ｃｏｌｅ  Ｐａｌｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｃｏｍｐａｎｙ（ＶｅｒｎｏｎＨｉｌｌｓ，ＵＳＡ））を装備した。溶解した酸素を酸素電極（Ａｐｐｌｉｓｅｎｓ（Ｓｃｈｉｅｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））でモニタリングした。バッチ式成長の完了後、ケモスタット培養を、２０ｇｌ−１のキシロースおよびアラビノースを含有する合成培地を発酵槽に一定の希釈速度で加えることによって開始した。培養物の作動容積を、電気式レベルセンサによって制御される廃液ポンプを使用して一定に保持した。
【０１４４】
［連続バッチ培養］
嫌気性連続バッチ培養（ＳＢＲ）においては、ケモスタット培養の場合と同じ発酵槽設定および培地組成物を使用した。新たなサイクルのバッチ培養を、培養物の約９０％を好適な炭素およびエネルギー源を含有する合成培地と手動または自動のいずれかで代置することによって開始した。電気式レベルセンサによって制御される供給ポンプを使用し、発酵槽を１リットルの作動容積まで充填した。ＣＯ２の発生ピーク後のＣＯ２の百分率の０．０５％未満への低下よって示される、炭素およびエネルギー源の減少時、新たなサイクルを、培養物の約９０％を好適な炭素およびエネルギー源を含有する新しい合成培地と手動または自動のいずれかで代置することによって開始した。各サイクルにおいては、最大比成長速度をＣＯ２特性から評価した。
【０１４５】
バッチ培養
長期ケモスタットおよび連続バッチ培養物から選択される単一のコロニー単離物を特徴づけるため、嫌気性バッチ培養を、ケモスタットおよび連続バッチ培養物の場合と同様の発酵槽設定を使用し、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロースおよび１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースを含有する１リットルの合成培地中で行った。バッチ発酵を接種するための培養物を、２０ｇｌ−１のアラビノースを補充したＭＹを含有する振とうフラスコ内で成長させた。
【０１４６】
［単一のコロニーの単離培養物の調製］
ケモスタットまたは連続バッチ培養（ＳＢＲ  ＩおよびＩＩ）のいずれかから得られる培養試料を、希釈し、２０ｇｌ−１のＬ−アラビノースを含有する固体ＭＹ上に広げ、コロニーが出現するまで３０℃でインキュベートした。別々のコロニーを、２０ｇｌ−１のＬ−アラビノースを含有する固体ＭＹ上で２回再ストリークした。単一のコロニーを、２０ｇｌ−１のＬ−アラビノースを補充した１００ｍｌのＭＹを含有する振とうフラスコ内で、３０℃で培養した。凍結ストック培養物を、定常生育期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ）で無菌グリセロールを３０％（ｖ／ｖ）まで添加し、２ｍｌの一定分量で−８０℃で保存することによって調製した。
【０１４７】
［バイオマス乾燥重量の測定］
培養試料（１０．０ｍｌ）を、予め秤量したニトロセルロースフィルター（孔サイズ０．４５μｍ；Ｇｅｌｍａｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＵＳＡ））上で濾過した。培養液の濾過後、バイオマスを、脱ミネラル水で洗浄し、３６０Ｗでの電子レンジ内で２０分間乾燥させ、秤量した。２通りの測定値は１％未満で変動した。
【０１４８】
［ガス分析］
嫌気性発酵槽培養からの排気ガスを、凝縮器（２℃）で冷却し、ＰｅｒｍａｐｕｒｅドライヤータイプＭＤ−１１０−４８Ｐ−４（Ｐｅｒｍａｐｕｒｅ（Ｔｏｍｓ  Ｒｉｖｅｒ，ＵＳＡ））で乾燥させた。酸素および二酸化炭素濃度を、ＮＧＡ２０００アナライザー（Ｒｏｓｅｍｏｕｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ（Ｏｒｒｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ））で測定した。排気ガスの流速および二酸化炭素の比生成速度を上記のように測定した（Ｖａｎ  Ｕｒｋ，  Ｈ．、Ｐ．Ｒ．Ｍａｋ、Ｗ．Ａ．Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ、およびＪ．Ｐ．Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  １９８８年  「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＢＳ  ８０６６  ａｎｄ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ  ＣＢＳ  ６２１  ｕｐｏｎ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｅｘｃｅｓｓ．」  Ｙｅａｓｔ  ４：２８３−２９１頁；およびＷｅｕｓｔｈｕｉｓ  Ｒ．Ａ．、Ｗ．Ｖｉｓｓｅｒ、Ｊ．Ｔ．Ｐｒｏｎｋ、Ｗ．Ａ．Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ、およびＪ．Ｐ．Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  １９９４年  「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｕｇａｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｙｅａｓｔｓ−ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｌｕｙｖｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ．」  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０：７０３−７１５頁）。二酸化炭素の累積生成の計算においては、培養試料の回収によって引き起こされる容量変化を考慮に入れた。
【０１４９】
［代謝産物分析］
グルコース、キシロース、アラビノース、キシリトール、有機酸、グリセロールおよびエタノールを、ＢｉｏＲａｄ  ＨＰＸ  ８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ））、Ｗａｔｅｒｓ  ２４１０屈折率検出器およびＷａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器を具備したＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０  ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ））を使用し、ＨＰＬＣによって分析した。カラムを、０．６ｍｌ分−１の流速での０．５ｇｌ−１の硫酸で、６０℃で溶出した。
【０１５０】
［速度計算］
アラビノース消費およびエタノール生成の比速度を計算するため、時間依存性のアラビノースおよびエタノールのデータを、Ｂｏｌｔｚｍａｎｎシグモイド方程式（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）で近似した。各時点において、アラビノース比消費速度およびエタノール比生成速度を、近似曲線の微分／勾配を乾燥重量で除することによって計算した。
【０１５１】
［炭素回収］
炭素回収を、消費される糖炭素の総量によって除される、形成される産物中の炭素として計算し、４８％のバイオマスの炭素含有率を基準とした。発酵の間でのエタノール蒸発について訂正するため、生成されたエタノールの量を、ＣＯ２の累積生成の測定値から、バイオマス合成によって生じたＣＯ２生成（１ｇバイオマスあたり５．８５ｍｍｏｌのＣＯ２（Ｖｅｒｄｕｙｎら、１９９０年、上記））および酢酸塩形成に関連したＣＯ２を差し引いたものに等しいと仮定した。速度計算  アラビノースおよびキシロース消費の比速度を計算するため、時間依存性のアラビノースおよびキシロースのデータを、シグモイド方程式で近似した。
【数１】
2011512854.tif 000002
（式中、
Ａ１＝初期値（左側の水平漸近線）
Ａ２＝最終値（右側の水平漸近線）
ｘ０＝中心（変曲点）
τ＝幅（ｙ軸における最も有意な変化に対応するｘの変化）
ＢおよびＣ＝τ時間依存性にするパラメータ
【０１５２】
各時点において、糖比消費速度を、近似曲線の微分／勾配を乾燥重量で除することによって計算した。
【０１５３】
［実施例１］
［ケモスタット培養による選択］
同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０００２４６号明細書において、キシロースおよびアラビノースを発酵するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＩＭＳ０００３（ＣＢＳ  １２１８７９）を、キシロースを含有する固体ＭＹ上での培養と、それに続く２０ｇｌ−１のアラビノースを補充したＭＹ中での振とうフラスコ培養の後、単離した。この振とうフラスコ培養物の凍結ストックから、１００ｍＬの振とうフラスコ培養物を、２０ｇｌ−１のアラビノースを含有するＭＹ中で、３０℃で４８時間培養することによって調製し、２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノースを含む９００ｍＬのＭＹを含有する嫌気性発酵槽に接種するため使用した。バッチ段階の完了後、ケモスタット培養を、２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノースを含有する合成培地を０．０３ｈ−１の一定の希釈速度で発酵槽に加えることによって開始した。ケモスタット培養の間、試料を培養物から回収し、バイオマス乾燥重量、キシロースおよびアラビノース濃度を測定した。最初に、キシロースおよびアラビノース濃度を、１９０時間目から約２５０時間目まで、それぞれ６９および２６ｍｍｏｌＬ−１で安定化させた（図１を参照）。２５０時間目〜６００時間目の培養の間、連続培養における残留キシロース濃度が６９ｍｍｏｌＬ−１から約８．５ｍｍｏｌＬ−１に減少する一方、アラビノース濃度の減少はわずかにすぎず、１７〜１９ｍｍｏｌＬ−１のレベルで保持された。結果は、ケモスタット培養のキシロースに対する（μｍａｘ／Ｋｓとして定義される）親和性が増大しており、アラビノースに対する親和性が実質的に変化しなかったことを示す。
【０１５４】
ケモスタットから得られる単一のコロニー単離物を、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のキシロースおよび１５ｇｌ−１のアラビノースの混合物を含有する嫌気性バッチ発酵を行うことにより、キシロースおよびアラビノースの同時消費について試験した。図２Ｂは、ケモスタット培養（株ＩＭＳ０００７）から得られる単一のコロニー単離物の１つのかかるバッチ発酵の間でのＣＯ２生成特性とキシロースおよびアラビノースの消費を示す。選択的ケモスタット培養の結果、グルコース／キシロース／アラビノース混合物の全発酵時間が約７０時間（株ＩＭＳ０００３、図２Ａを参照）から約５５時間に減少した。改善されたキシロース消費を主に示すこれらの結果に伴い、残りの課題は、キシロースおよびアラビノースの改善された同時消費である。
【０１５５】
ＩＭＳ０００７は、登録番号ＣＢＳ  １２２７００の下、２００８年３月１１日にＣＢＳ（セントラルビュロー・フォール・シンメルクルツーレス（Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ  ８，３５８４  ＣＴ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））に寄託されている。寄託者はＤｅｌｆｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙであった。
【０１５６】
［実施例２］
［連続バッチ培養による選択］
株ＩＭＳ０００７に対し、キシロースおよびアラビノースの同時消費がさらに改善されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を得るため、ケモスタット選択培養から得られる試料を、嫌気性ＳＢＲ発酵槽に接種するために使用した。このシステムを、増加する最大比成長速度（μｍａｘ）での突然変異体の選択のために使用可能である。バッチ式成長培養物を新しいバッチに連続的に移すことにより、最高の比成長速度を有する（突然変異体）細胞は、より低い比成長速度を有する細胞よりも最終的によく成長することになる。１回目のＳＢＲの実行（ＳＢＲ  Ｉ）では、細胞を、繰り返しバッチ内で、培養物の約９０％を２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノースを含有する合成培地と自動で繰り返し代置することによって培養した（図３）。最初のバッチを、１リットルのこの培地を含有する嫌気性ＳＢＲに、上記のケモスタット選択培養から得られる１００ｍｌの培養試料を接種することによって開始した。細胞を、繰り返しバッチ内で、２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノースを含有するＭＹで、自動的な充填と空化のレジームを使用して培養した。嫌気性同時消費対象のキシロースおよびアラビノースの構成性表現型を有する細胞を選択するため、レジームを、バッチ４および６の後、２つの場合で、反応器を２０ｇｌ−１のグルコースを含有するＭＹで充填することによって中断した（図４を参照）。各サイクルにおいては、最大比成長速度をＣＯ２特性から評価した（図４を参照）。キシロースおよびアラビノースを補充した培地上での１６サイクル後、嫌気性の比成長速度が０．０８ｈ−１から０．１３ｈ−１に増加した。二酸化炭素生成特性および推定される比成長速度は、キシロース−アラビノース混合物上でのバッチ培養の第１段階が、連続バッチの実行の過程で次第に加速されることを示す。上清試料中の糖の分析によると、認められた加速がキシロース消費速度の増加の結果であることが示された（データは示さず）。しかし、アラビノース消費速度は、ＳＢＲの選択の間に減少し、キシロースおよびアラビノースの改善された同時消費ではなく２つの二酸化炭素生成ピークによって表される、キシロースおよびアラビノース消費の分離がもたらされた。繰り返しバッチのＣＯ２生成特性のオーバーレイは、単一のＣＯ２生成ピークから２つの相のＣＯ２生成特性への変化を明示する（図５を参照）。
【０１５７】
キシロースおよびアラビノース発酵株ＩＭＳ０００７の場合の発酵特性を比較するため、１００ｍＬの試料をバッチ１３の間でのＳＢＲ培養物から回収し、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロース、および１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースを補充したＭＹを含有する嫌気性バッチ発酵槽に接種するために使用した。この嫌気性バッチ発酵のＣＯ２生成特性および糖消費プロット（図２Ｃを参照）は、キシロース消費が加速しており、アラビノース消費が同じ糖混合物を含有するＭＹ培地中で培養される株ＩＭＳ０００７に対して遅延したことを示す（図２Ｂ）。
【０１５８】
キシロースおよびアラビノースの同時消費からのＳＢＲの選択の間に認められた変化は、細胞にはアラビノースよりもキシロースの方が好ましいという事実による可能性が高く、結果として細胞は、両方の糖の混合物中で、キシロース上でアラビノースより多くの世代にわたり成長した（表２を参照、３．２対０．９世代）。アラビノース消費に対する選択圧を高めるため、アラビノース上で成長する細胞の世代の数を増加させる必要がある。これを達成するため、新しいＳＢＲの実行（ＳＢＲ  ＩＩ）を開始した。ＳＢＲ  ＩＩにおいては、細胞を、繰り返しバッチ内で、培養物の約９０％を、２０ｇｌ−１のグルコース、２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース、または２０ｇｌ−１のキシロースおよび２０ｇｌ−１のアラビノース、または２０ｇｌ−１のアラビノースのいずれかを含有する合成培地と自動で繰り返し代置することによって培養した（図６を参照）。表２は、この設定では、キシロースおよびアラビノース上での世代の数が同じ範囲内にあり、それは両方の糖の使用の改善をもたらすべきであることを示す（４．２対４．６世代）。
【０１５９】
これらの３つのバッチ培養の単一のサイクルは、図７に示されるように、典型的なＣＯ２生成特性をもたらす。サイクルを、この特定の順序で２０時間繰り返した。
【０１６０】
ＳＢＲ  ＩＩの実行中、グルコース／キシロース／アラビノースのバッチの間での比成長速度が０．１９ｈ−１から約０．２３ｈ−１に増加した（図８）。これらのバッチの間での成長速度を、グルコース消費段階で測定した。また、キシロース／アラビノースのバッチにおける比成長速度も増加した。しかし、アラビノースのバッチ間での成長速度は変化しなかった。
【０１６１】
別々のバッチのＣＯ２生成特性から（図９）、ＳＢＲ  Ｉとは対照的に、キシロースおよびアラビノースを同時に使用する能力がＳＢＲ  ＩＩの間に保護されたことが推定できると思われる。さらに、最終の（ｔａｉｌ  ｅｎｄ）ＣＯ２生成ピークの形状は、キシロース／アラビノースおよびアラビノースのバッチの間でのアラビノースに対する親和性の増大を示す。さらに、３つすべてのバッチにおいて糖の全発酵時間が、ＳＢＲの実行中に減少した。
【０１６２】
約３０００時間の培養後にＳＢＲ  ＩＩから得られた単一のコロニー単離物を、それらのキシロースおよびアラビノースを同時消費する能力について試験した。このため、アラビノースで成長し、再ストリークした単一のコロニーを、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロース、および１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースの混合物を含有するＭＹ中で嫌気的に培養した。単一のコロニー単離物（株ＩＭＳ００１０）の１つのかかるバッチ発酵の間でのＣＯ２生成特性とキシロースおよびアラビノースの消費を図２Ｄに示す。グルコース／キシロース／アラビノース混合物の全発酵時間は、ＳＢＲの選択により、予め選択した株ＩＭＳ０００３およびＩＭＳ０００７と比較して、約４０時間まで大きく減少した。株ＩＭＳ００１０とＩＭＳ０００７の糖消費特性の比較から、ＳＢＲＩＩにおける選択の間にアラビノースの使用が特に加速している一方、キシロース消費が実質的に変化しなかったことが推定できる。
【０１６３】
ＩＭＳ００１０は、登録番号ＣＢＳ  １２２７０１の下、２００８年３月１１日にＣＢＳ（セントラルビュロー・フォール・シンメルクルツーレス（Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ  ８，３５８４  ＣＴ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））に寄託されている。寄託者はＤｅｌｆｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙであった。
【０１６４】
［実施例３］
［株ＩＭＳ００１０の特徴づけ］
株ＩＭＳ００１０を、３０ｇｌ−１のグルコース、１５ｇｌ−１のＤ−キシロース、および１５ｇｌ−１のＬ−アラビノースの混合物を含有するＭＹ中で嫌気的に培養した。かかるバッチ発酵の間でのＣＯ２の累積生成特性、エタノール生成とキシロースおよびアラビノースの消費を図１０に示す。この実験では、１５３ｍｍｏｌＬ−１のグルコース（２７．６ｇｌ−１）、９８ｍｍｏｌＬ−１のキシロース（１４．９ｇｌ−１）および１０７ｍｍｏｌＬ−１のアラビノース（１６．０ｇｌ−１）が約４０時間以内に完全に消費された。この実験で認められる最大比消費速度は、アラビノースに対して０．４９ｇｈ−１（ｇ乾燥重量）−１、およびキシロースに対して０．２１ｇｈ−１（ｇ乾燥重量）−１であった。ＣＯ２の累積生成から評価すると、５５１ｍｍｏｌＬ−１のエタノール（２５ｇｌ−１）が生成され、それは全糖の０．４３ｇｇ−１の全エタノール収率に対応する。グルコース／キシロース／アラビノース混合物の全発酵時間は、ＳＢＲの選択により、予め選択した株ＩＭＳ０００３およびＩＭＳ０００７と比較して、約４０時間まで大きく減少した。株ＩＭＳ００１０とＩＭＳ０００７の糖消費特性の比較から、ＳＢＲ  ＩＩにおける選択の間にアラビノースの使用が特に加速している一方、キシロース消費が実質的に変化しなかったことが推定できる。
【０１６５】
本発明者らの知る限りでは、ＳＢＲ培養を介した糖混合物中での連続的に使用される糖（各糖に対する世代の数が等しい）の同時消費を改善するための上記の方法については、いまだ記載されていない。結果として、より高い比成長速度、改善された親和性および全発酵時間の減少を伴う細胞を得た。
【０１６６】
【表１】
2011512854.tif 000003
【０１６７】
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
2011512854.tif 000009
【図１】
2011512854.tif 000010
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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