(57)【要約】  哺乳動物被験体において誘導されたＰＧＥ2経路を阻害することにより呼吸障害を処置する方法、被験体由来のサンプルにおけるＰＧＥ2またはその代謝産物レベルが対照レベルよりも上昇していることを検出することにより無呼吸、低酸素性虚血性脳症または周産期仮死を評価する方法、ならびに呼吸障害を処置するための医薬のインビトロおよびインビボスクリーニング方法が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象における呼吸障害の処置方法であって、Ｅプロスタノイド受容体サブタイプ３（ＥＰ３Ｒ）阻害剤、ミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ１（ｍＰＧＥＳ−１）阻害剤および／またはシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）選択的阻害剤を含む組成物を対象に投与することを含む、上記方法。
【請求項２】
組成物がＥＰ３Ｒ阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＥＰ３Ｒ阻害剤が、ＥＰ３Ｒポリペプチドに結合する特異的結合物質またはＥＰ３Ｒコード遺伝子の発現をダウンレギュレートする核酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＥＰ３Ｒ阻害剤が、（２Ｅ）−Ｎ−［（５−ブロモ−２−メトキシフェニル）スルホニル］−３−［５−クロロ−２−（２−ナフチルメチル）フェニル］アクリルアミド（Ｌ８２６２６６）または薬学的に許容できるその塩である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
組成物がｍＰＧＥＳ−１阻害剤を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ｍＰＧＥＳ−１阻害剤が、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドに結合する特異的結合物質またはｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子の発現をダウンレギュレートする核酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｍＰＧＥＳ−１阻害剤が、３−［ｔｅｒｔ−ブチルチオ−１−（４−クロロベンジル）−５−イソプロピル−１Ｈ−インドール−２−イル］−２，２−ジメチルプロピオン酸（ＭＫ−８８６）または薬学的に許容できるその塩である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
組成物がＣＯＸ−２選択的阻害剤を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＣＯＸ−２選択的阻害剤が、ＣＯＸ−２ポリペプチドに結合する特異的結合物質またはＣＯＸ−２コード遺伝子の発現をダウンレギュレートする核酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＯＸ−２選択的阻害剤が、４−（５−メチル−３−フェニルイソキサゾール−４−イル）ベンゼンスルホンアミド（バルデコキシブ）もしくは薬学的に許容できるその塩、４−［５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）ピラゾール−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（セレコキシブ）もしくは薬学的に許容できるその塩、または４−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−フェニル−５Ｈ−フラン−２−オン（ロフェコキシブ）もしくは薬学的に許容できるその塩である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物対象における呼吸障害に対する感受性またはその存在の評価方法であって、対象由来のサンプル中のプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）またはその代謝産物のレベルを検出すること、およびＰＧＥ2またはその代謝産物の対照レベルとサンプル中のレベルを比較することを含み、ここでＰＧＥ2またはその代謝産物の対照レベルと比較してサンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物の高レベルが、対象における呼吸障害に対する感受性またはその存在を指示する、上記方法。
【請求項１２】
サンプルが尿サンプルまたは脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象由来のサンプル中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルを検出すること、およびＣＲＰの対照レベルとサンプル中のレベルを比較することをさらに含み、ここでＣＲＰの対照レベルと比較して高レベルのサンプル中のＣＲＰレベルの高レベルが、対象における呼吸障害に対する感受性またはその存在を指示する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
呼吸障害が、無呼吸、周期性呼吸または低酸素イベント後の自然蘇生不全である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
呼吸障害が、睡眠中に起きる呼吸障害、特に閉塞性睡眠時無呼吸症候群である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
呼吸障害が感染性呼吸障害である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
感染性呼吸障害がＩＬ−１β関連呼吸障害である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
呼吸障害が低酸素イベント後の無呼吸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
無呼吸が低酸素イベントにより誘発される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物対象がヒト対象である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト対象が５歳未満である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
呼吸障害が、乳児突然死症候群（ＳＩＤＳ）を引き起こすまたはその尤度を高める障害である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
低酸素イベントが周産期仮死である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト対象が１８歳以上である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
呼吸障害が成人の睡眠時無呼吸である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物対象における低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）に対する感受性またはその存在の評価方法であって、対象由来のサンプル中のプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）またはその代謝産物のレベルを検出すること、およびＰＧＥ2またはその代謝産物の対照レベルとサンプル中のレベルを比較することを含み、ここでＰＧＥ2の対照レベルと比較してサンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物の高レベルが、対象におけるＨＩＥに対する感受性またはその存在を指示する、上記方法。
【請求項２７】
ＰＧＥ2またはその代謝産物の対照レベルと比較してサンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物レベルの上昇度を測定することによって対象におけるＨＩＥの重症度を類別することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物対象が周産期仮死に罹患していることを評価する方法であって、対象由来のサンプル中のプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）またはその代謝産物のレベルを検出すること、およびＰＧＥ2またはその代謝産物の対照レベルとサンプル中のレベルを比較することを含み、ここでＰＧＥ2の対照レベルと比較してサンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物の高レベルが、対象が周産期仮死に罹患していることを指示する、上記方法。
【請求項２９】
ＰＧＥ2またはその代謝産物の対照レベルと比較してサンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物レベルの上昇度を測定することによって対象が罹患している周産期仮死の重症度を類別することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
サンプルが対象の出生７日以内に採取された脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿または血液サンプルである、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
サンプルが対象の出生２４時間以内に採取される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳動物対象がヒト対象である、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ヒト対象のアプガールスコアを出生３０分以内に測定することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
アプガールスコアが出生から約１、５、１０、１５および／または２０分後に測定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質を同定する方法であって、
（ａ）ＣＯＸ−２により仲介されるＰＧＨ2の合成、
（ｂ）ｍＰＧＥＳ−１により仲介される、ｍＰＧＥＳ−１の環状エンドペルオキシド基質から基質の９−ケト，１１αヒドロキシ型である生産物への変換、および
（ｃ）ＥＰ３Ｒアゴニストにより仲介されるＥＰ３Ｒの活性化、
の一つまたはそれ以上を阻害する能力について試験物質をアッセイすることを含み、
ここで（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の一つまたはそれ以上の阻害は、試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用するための物質であることを指示する、上記方法。
【請求項３６】
ＣＯＸ−２ポリペプチドと試験物質およびアラキドン酸を、アラキドン酸が試験物質の非存在下でＣＯＸ−２によってＰＧＨ2に変換される条件下で接触させること、および
試験物質の非存在下でのＰＧＨ2生産の対照レベルと比較される試験物質の存在下でのＰＧＨ2生産レベルを決定することを含み、
ここで試験物質の存在下でのＰＧＨ2生産レベルが上記対照レベルとの比較でより低いことは、試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用するための物質であることを指示する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
試験物質の存在下でのＰＧＨ2生産レベルが対照レベルとの比較でより低いことを検出すること、およびそれによって試験物質を哺乳動物における呼吸障害の処置に使用するための物質であると同定することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドと試験物質およびｍＰＧＥＳ−１の環状エンドペルオキシド基質を、ｍＰＧＥＳ−１の環状エンドペルオキシド基質が試験物質の非存在下でｍＰＧＥＳ−１によって基質の９−ケト，１１αヒドロキシ型である生産物に変換される条件下で接触させること、および
試験物質の非存在下での生産物生産の対照レベルと比較される試験物質の存在下での生産物の生産レベルを決定することを含み、
ここで試験物質の存在下での生産物の生産レベルが上記対照レベルとの比較でより低いことは、試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用するための物質であることを指示する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
試験物質の存在下での生産物の生産レベルが対照レベルより低いことを検出すること、およびそれによって試験物質を、哺乳動物における呼吸障害の処置に使用するための物質であると同定することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＥＰ３Ｒポリペプチドと試験物質およびＥＰ３Ｒアゴニストを、ＥＰ３Ｒアゴニストが試験物質の非存在下でＥＰ３Ｒポリペプチドを活性化する条件下で接触させること、および
試験物質の非存在下でのＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化の対照レベルと比較される当該試験物質の存在下でのＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化レベルを決定することを含み、
ここで試験物質の存在下でのＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化レベルが対照レベルとの比較でより低いことは、試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用するための物質であることを指示する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
試験物質の存在下でのＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化レベルが対照レベルとの比較でより低いことを検出すること、およびそれによって試験物質を、哺乳動物における呼吸障害の処置に使用するための物質であると同定することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質の同定方法であって、試験物質を試験哺乳動物に投与すること、ここで試験物質はＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤および／またはＣＯＸ−２選択的阻害剤である、および
試験物質を投与していない対照の哺乳動物における徴候または症状と比較される試験哺乳動物における呼吸障害の徴候または症状の重症度を決定することを含み、
ここで試験哺乳動物における呼吸障害の徴候または症状の重症度が上記対照哺乳動物のそれらよりも低いことは、試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用するための物質であることを指示する、上記方法。
【請求項４３】
徴候または症状が、呼吸抑制、呼吸頻度の減少、１回換気量の減少および低酸素に応答するあえぎ呼吸の減少から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
徴候または症状の重症度を決定する前にＩＬ−１βまたはＬＰＳを投与することを含む、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用するための物質であると同定され、そしてここで試験物質を、薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物に製剤化することをさらに含む、請求項３５〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
ヒト対象における低酸素および／または無呼吸の存在および／またはそれらの重症度の評価方法であって、対象から採取した尿サンプル中の一つまたはそれ以上のＰＧＥ2代謝産物のレベルを検出すること、および
該一つまたはそれ以上のＰＧＥ2代謝産物の対照レベルとサンプル中のレベルを比較することを含み、
ここでサンプル中の該一つまたはそれ以上のＰＧＥ2代謝産物のレベルが該一つまたはそれ以上のＰＧＥ2代謝産物の対照レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％または少なくとも２００％高いことが、対象における低酸素および／または無呼吸の存在および／またはそれらのより高い重症度を指示する、上記方法。
【請求項４７】
ヒト対象が、閉塞性睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡＳ）、自律神経機能障害、例えばプラダー・ウィリー症候群、先天性低換気症候群またはレット症候群を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ヒト対象が１６歳以上である、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
ヒト対象が１〜１６歳である、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項５０】
ヒト対象が０〜１歳である、請求項４６または４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸障害（breathing disorder）、例えば無呼吸の処置方法、診断およびスクリーニング方法、ならびにこのような方法において使用する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
無呼吸および乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ）は、新生児の大きな医学的懸案事項であり、これらの病因には感染が重要な役割を果たしている可能性がある。無呼吸は、新生児における感染の際に一般的にみられる徴候であり、ＳＩＤＳ患者の大部分において死の前に軽度のウイルスまたは細菌感染が確認される（１、２、１１１）。
【０００３】
脳幹の呼吸調節に非最適性または遅延がみられる小児、例えば未熟児（すべてがその生後初年度に、一部は小児初期以降も）、先天性中枢性低換気症候群（ＣＣＨＳ）（７９）、レット症候群およびプラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）（８０）を発症した小児は、無呼吸を伴う周期性の不規則な呼吸を行い、それは睡眠中および感染エピソード時に増え、その際、その無呼吸は、外的蘇生または自然蘇生（autoresuscitation）がなされない場合、致命的となる可能性があり、時に致命的となる。
【０００４】
ＳＩＤＳで死亡する小児においてしばしば死の前に軽度の感染が確認され、最新の研究成果は、脳幹機能障害および低酸素イベントからの自然蘇生不全がこれらの原因不明の死の大部分と関連していることを示している（８１、８２）。
【０００５】
呼吸調節に後天的または先天的な欠陥がある、例えばレット症候群およびＰＷＳを発症した小児および成人は、潜在的に致死性の呼吸機能障害（respiratory dysfunction）の危険が高いが、睡眠時無呼吸症候群の小児および成人ならびにパーキンソン病の成人もまた、呼吸調節を故障し、しばしば感染を伴い死亡する（８３）。呼吸系の障害（呼吸不全または感染）は、ＰＷＳ児における最大の死因であることが明らかにされた（１０７）。さらに、小児期のいびきおよび閉塞性睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡＳ）は、睡眠を妨害し、神経認知学的発達を妨げ、それによって長期的な機能障害を引き起こす可能性がある。これは、呼吸器感染および後発的な危険因子、例えば社会生活における喫煙および喘息の出現によって悪化する（１０８−１１１）。
【０００６】
潜在的に危険であり生命の脅威となる呼吸障害は、成人でもみられる。したがって、低酸素に対する換気応答の故障は、成人期のパーキンソン病、睡眠に関係する呼吸障害、例えば睡眠時無呼吸症候群およびＯＳＡＳで重要な役割を果たしている可能性がある。
【０００７】
炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン１β（ＩＬ−１β）は、これらのイベントのカギとなるメディエーターの可能性がある（３）。ＩＬ−１βは、感染および炎症に対する急性免疫反応の際に産生され、様々な病的挙動を誘起する（レビューには（４）を参照されたい）。これまでの研究から、この免疫調節因子は呼吸および自然蘇生をも変化させることが示されている（５〜１０）。ＩＬ−１βは、脳幹の呼吸関連領域、例えば弧束核（ＮＴＳ）および吻側延髄腹外側（ＲＶＬＭ）において前初期遺伝子ｃ−ｆｏｓの発現を誘導する（１１）。しかし、ＩＬ−１βは巨大な疎油性タンパク質であり、血液脳関門をまたいで容易に拡散しない。さらに、ＮＴＳおよびＲＶＬＭはＩＬ−１受容体のｍＲＮＡを発現していないようであり（１２）、かつＩＬ−１βはインビトロで脳幹の呼吸関連ニューロン活動を変化させない（５）。
【０００８】
我々はこれまでに、非特異的ＣＯＸ阻害剤であるインドメタシンがＩＬ−１βにより誘導される呼吸抑制を軽減することを示している（５）。ＰＧＥ2それ自体は、インビボで、ヒツジの胎仔および新生仔において呼吸を抑制し（１７〜１９）、かつインビトロで、呼吸関連ニューロンを阻害する（５）。早産児および満期産児において新生児尿中プロスタノイド排出が調査され（１１２）、早産児においてＰＧＥ−Ｍと無呼吸の関係が確認されている（１１３）。
【０００９】
インドメタシンは、これまで、未熟児の無呼吸を処置するのに使用されている（４５）。しかし、インドメタシンは、新生児において多くの副作用を引き起こす（４６）。新生児におけるインドメタシンの利用に関連する副作用には、腎臓、腸および脳における薬物誘発性の血流減少が含まれる（４６）。呼吸機能障害の処置にはカフェインが使用され、持続的気道陽圧法（ＣＰＡＰ）および酸素補給も同様である。さらに、ナロキソン（オピオイド受容体アンタゴニスト）による急性期処置もまた利用されている。それでもなお、呼吸障害の処置方法、特に無呼吸の処置に関する要望は確実に存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは今回、誘導されたＰＧＥ2経路が感染および低酸素に対する呼吸応答のカギとなる調節因子であることを発見した（合わせて１１４も参照されたい）。誘導されたＰＧＥ2経路は図６に示されている。
【００１１】
ＩＬ−１βは、血液脳関門の血管内皮細胞のＩＬー１受容体に結合して、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）およびミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ１（ｍＰＧＥＳ−１）の活性を誘導する（レビューには（１３）を参照されたい）。ＣＯＸ−２はアラキドン酸からのプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）の生成を触媒し、ｍＰＧＥＳ−１は、引き続く、ＰＧＨ2からのプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）の生成を触媒する。その後ＰＧＥ2は脳実質に放出され、そこでＩＬ−１βのいくつかの中枢的作用、例えば熱誘導（１４）、行動反応（１５）および神経内分泌変化（１６）を媒介することが最近報告されている。本願明細書にさらに記載されるように、プロスタグランジンは、ＩＬ−１βの換気作用も媒介する（５４）。さらに、ＰＧＥ2受容体であるＥプロスタノイド受容体サブタイプ３（ＥＰ３Ｒ）が、脳幹の呼吸関連領域：ＮＴＳおよびＲＶＬＭに局在する（２０、２１）。
【００１２】
本願明細書に記載されるように、ＩＬ−１βは、ｍＰＧＥＳ−１の活性化およびＰＧＥ2の脳幹ＥＰ３Ｒへの結合を通じて中枢呼吸に悪影響を及ぼし、無呼吸頻度の増加および低酸素イベント後の自然蘇生不全を引き起こす。したがって、誘導されたＰＧＥ2経路に関連する呼吸障害は、一またはそれ以上の場所でこの経路を狙い撃ちすることによって、例えばＣＯＸ−２を阻害することによって、ｍＰＧＥＳ−１を阻害することによって、および／またはＥＰ３Ｒを阻害することによって軽減され得る。
【００１３】
したがって、一つの局面において、本発明は、哺乳動物対象における呼吸障害の処置方法であって、Ｅプロスタノイド受容体サブタイプ３（ＥＰ３Ｒ）阻害剤、ミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ１（ｍＰＧＥＳ−１）阻害剤および／またはシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）選択的阻害剤を含む治療有効量の組成物を処置が必要な対象に投与することを含む、方法、を提供する。
【００１４】
本願明細書に記載される誘導性のＰＧＥ2経路における一つまたはそれ以上のステップを標的とする組成物を用いて呼吸障害、例えば無呼吸の誘導に関与する適当な経路を遮断することにより、選択性の低い治療法に付随する有害な影響を最小限に抑えることができると考えられる。例えば、ＣＯＸ−２を選択的に、ｍＰＧＥＳ−１を、および／またはＥＰ３Ｒを標的化することによって、本願明細書中に記載されるような呼吸障害は、有害な副作用、例えば非選択的ＣＯＸ阻害剤インドメタシンの使用時にみられる副作用を最小限に抑えつつ軽減することができる。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、ＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤および／またはＣＯＸ−２選択的阻害剤を含む、哺乳動物被験体における呼吸障害の処置に使用できる組成物を提供する。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物被験体における呼吸障害の処置するための医薬の製造における、ＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤および／またはＣＯＸ−２選択的阻害剤を含む組成物の使用を提供する。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物対象における呼吸障害に対する感受性またはその存在の評価方法であって、当該哺乳動物由来のサンプル中のプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）またはその代謝産物のレベルを検出すること、およびＰＧＥ2またはその代謝産物の対照レベルと当該サンプル中のレベルを比較することを含み、ＰＧＥ2またはその代謝産物の対照レベルと比較して当該サンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物レベルが高いことが、当該対象における呼吸障害に対する感受性またはその存在を指示する、方法、を提供する。
【００１８】
本発明者らは、本願において、呼吸障害、例えば無呼吸および低酸素後の脆弱な自然蘇生におけるＰＧＥ2の中枢的役割に関する証拠を提供する。具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）および／または尿中のＰＧＥ2および／またはその代謝産物レベルの上昇が、無呼吸頻度の増加および低酸素後に自然蘇生する能力の低下に関連している。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル、ＰＧＥ2レベルと無呼吸の間の相関関係は、ＰＧＥ2および／もしくはその代謝産物のレベルを単独でまたは感染マーカー、例えばＣＲＰと組み合わせてモニタリングすることで、呼吸障害およびそれに対する感受性に関する診断的利益を得ることができることを示している。ＰＧＥ2はサイトカインおよび低酸素刺激に反応して迅速に生成されるため、そのモニタリングは、感染および仮死が疑われる哺乳動物における呼吸障害、例えば乳幼児における無呼吸の増加の診断および監視に特に有用である。
【００１９】
驚くべきことに、本発明者らは、尿プロスタグランジン代謝産物（ｕ−ＰＧＥＭ）のレベルが、感染の進行および随伴性の無呼吸がみられる乳幼児、ＰＷＳ児および睡眠時無呼吸がみられる一部の成人（高い無呼吸インデックスを有する成人を含む）において上昇することを発見した。特異的かつ高感度のアッセイを用いて尿中のＰＧＥ2レベルの測定することで、呼吸障害（特に無呼吸）の予見および評価のための非侵襲的方法が実現し、これは驚くほど広い患者年齢層に適用できると考えられる。感染および随伴性の無呼吸がみられる乳幼児において、ｕ−ＰＧＥＭレベルの上昇は、ＣＲＰレベルの上昇よりも早い段階で生じるようである。したがって、生物学的サンプル（例えば、尿、血液またはＣＳＦ）中のＰＧＥ2および／またはその代謝産物レベルの評価は、感染随伴性の炎症および呼吸機能障害患者の診断、処置および管理の面で、ＣＲＰレベルの評価よりも優れている。
【００２０】
したがって、本発明は、ヒト対象における無呼吸の存在および／またはその重症度の評価方法であって、当該対象から採取した尿サンプル中の一つまたはそれ以上のＰＧＥ2代謝産物のレベルを検出すること、および当該一つまたはそれ以上のＰＧＥ2代謝産物の対照レベルと当該サンプル中のレベルを比較することを含み、当該サンプル中の一つまたはそれ以上のＰＧＥ2代謝産物のレベルが当該一つまたはそれ以上のＰＧＥ2代謝産物の対照レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％または少なくとも２００％高いことが、当該対象における無呼吸の存在および／またはその重症度の高さを指示する、方法、を提供する。特定の例において、ヒト対象は、閉塞性睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡＳ）、プラダー・ウィリー症候群、先天性低換気症候群および／またはレット症候群に罹患している。特定の例において、ヒト対象は、１６歳以上、１〜１６歳、または０〜１歳である。
【００２１】
本発明者らは、本願において、出生時仮死後の被験体におけるＰＧＥ2の上昇およびＰＧＥ2と低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の相関関係について記載している。これらの結果は、ＰＧＥ2およびその代謝産物が、周産期の脳における酸素供給の欠陥に起因する神経学的損傷の強力な診断マーカーとなることを示している。さらに、これらの結果は、被験体が罹患した低酸素の程度が、サンプル（例えばＣＳＦ、尿または血液サンプル）中で検出されるＰＧＥ2およびその代謝産物のレベルに反映されることを示している。
【００２２】
したがって、さらなる局面において、本発明は、哺乳動物対象における低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）に対する感受性またはその存在の評価方法であって、当該対象由来のサンプル中のプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）またはその代謝産物のレベルを検出すること、およびＰＧＥ2またはその代謝産物の対照レベルと当該サンプル中のレベルを比較することを含み、ＰＧＥ2の対照レベルと比較して当該サンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物レベルが高いことが、当該対象におけるＨＩＥに対する感受性またはその存在を指示する、方法、を提供する。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物被験体が罹患した低酸素または重度の低酸素仮死（例えば周産期仮死）の評価方法であって、当該対象由来のサンプル中のプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）またはその代謝産物のレベルを検出すること、およびＰＧＥ2またはその代謝産物の対照レベルと当該サンプル中のレベルを比較することを含み、ＰＧＥ2の対照レベルと比較して当該サンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物レベルが高いことが、当該対象が低酸素または重度の低酸素仮死（例えば周産期仮死）を罹患したことを指示する、方法、を提供する。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質の同定方法であって、誘導されたＰＧＥ2経路を阻害する能力について試験物質をアッセイすること、例えば、
（ａ）ＣＯＸ−２により媒介されるＰＧＨ2の生成、
（ｂ）ｍＰＧＥＳ−１により媒介される、ｍＰＧＥＳ−１の環状エンドペルオキシド基質から当該基質の９−ケト，１１αヒドロキシ型である生産物への変換、および
（ｃ）ＥＰ３Ｒアゴニストにより媒介されるＥＰ３Ｒの活性化、
の一つまたはそれ以上を阻害する能力について試験物質をアッセイすることを含み、誘導されたＰＧＥ2経路の阻害、例えば、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の一つまたはそれ以上の阻害は、当該試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質であることを指示する、方法、を提供する。
【００２５】
誘導されたＰＧＥ2経路を阻害する能力を有することが見出された試験物質は、一つまたはそれ以上のさらなる成分、例えば薬学的に許容できる補助成分（excipient）を含む組成物に配合され得る。このような組成物は、哺乳動物における呼吸障害の処置方法において使用され得る。
【００２６】
誘導されたＰＧＥ2経路の中枢的な重要性およびその呼吸障害、例えば無呼吸に対する寄与（図６参照）の認識は、呼吸障害の処置において治療的有用性を有し得る物質を同定する上での基礎となる。特に、
（ａ）ＣＯＸ−２により媒介されるＰＧＨ2の生成、
（ｂ）ｍＰＧＥＳ−１により媒介される、ｍＰＧＥＳ−１の環状エンドペルオキシド基質から当該基質の９−ケト，１１αヒドロキシ型である生産物への変換、および
（ｃ）ＥＰ３Ｒアゴニストにより媒介されるＥＰ３Ｒの活性化、
の一つまたはそれ以上を阻害する能力について試験物質をスクリーニングする方法が、一つまたはそれ以上のインビトロアッセイを用いて実行され得る。阻害活性についての試験物質のスクリーニングは、呼吸障害の動物モデルに対する試験物質の効果の測定に基づくスクリーニング法よりも容易にスケールアップすることができる。このことは、呼吸障害の動物モデルを用いて試験物質をスクリーニングする前にイニシャルインビトロスクリーニングが行われる場合に有益である。このようにして、適当なインビトロ薬理活性を有する見込みのある物質が、その後のインビボ試験のために選択され得る。
【００２７】
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質の同定方法であって、試験物質を試験哺乳動物に投与すること、ここで、当該試験物質は、誘導されたＰＧＥ2経路の阻害剤、例えば、ＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤および／またはＣＯＸ−２選択的阻害剤である、および当該試験物質を投与しなかった対照の哺乳動物における徴候または症状との比較で、当該試験哺乳動物における呼吸障害の徴候または症状の重症度を決定することを含み、当該試験哺乳動物における呼吸障害の徴候または症状の重症度が対照哺乳動物のそれらよりも低いことは、当該試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質であることを指示する、方法、を提供する。
【００２８】
本発明のこの局面の方法はさらに、試験物質が誘導されたＰＧＥ2経路を阻害する能力を有するかどうか、例えばＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤および／またはＣＯＸ−２選択的阻害剤として機能する能力を有するかどうかを決定する前段階を含み得る。
【００２９】
呼吸障害の徴候または症状の重症度を低下させ、それによって呼吸障害を処置する能力を有することが見出された試験化合物は、一つまたはそれ以上の別の成分、例えば薬学的に許容できる補助成分を含む組成物に配合され得る。このような組成物は、哺乳動物における呼吸障害の処置方法において使用され得る。
【００３０】
さらなる局面において、本発明は、ＰＧＥ2以外のＥプロスタノイド受容体サブタイプ３（ＥＰ３Ｒ）アゴニスト、ミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ１（ｍＰＧＥＳ−１）活性化剤および／またはシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）選択的活性化剤を含む有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における呼吸抑制の誘導方法を提供する。
【００３１】
哺乳動物における呼吸抑制の誘導は、呼吸障害の研究に特に有用であり得る。例えば、哺乳動物における呼吸抑制の誘導は、呼吸障害、例えば無呼吸、低酸素および／または脆弱な自然蘇生の動物モデルの作製に有用であり得る。このようなモデルは、ＥＰ３ＲまたはｍＰＧＥＳ−１の活性化が無呼吸、例えば睡眠時無呼吸およびパーキンソン病、例えばパーキンソン病に付随する呼吸機能障害の動物モデルにおいて見られるかどうかを試験するのに有用であり得る。
【００３２】
低酸素下で放出されるＰＧＥ2は、例えば、ＥＰ３Ｒ−Ｇi活性化の刺激ならびにそれに続くｃＡＭＰの減少およびニューロン活動の低下による脳の急性低酸素抵に対する耐性の強化を通じて急性的な神経保護効果を有し得る。
【００３３】
本発明は、明らかに不可能な場合および明示的に回避される旨の説明がある場合を除いて、記載される局面および好ましい特徴の組み合わせを包含する。本発明のこれらおよびさらなる局面および実施態様については、実施例および添付図面を参照しつつ以下でより詳細に説明されている。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＩＬ−１βおよび無酸素によって迅速に誘導される脳幹のｍＰＧＥＳ−１を示す。皮質および脳幹のミクロソームフラクション（血液脳関門（ＢＢＢ）の内皮細胞を含む）におけるｍＰＧＥＳ−１活性は、ＩＬ−１βまたはビヒクルで処置した９日齢マウス（ｎ＝３３）および酸素正常状態または正常酸素および無酸素（１００％Ｎ2、５分間）に曝した同じマウスにおいて分析した。Ａ）野生型マウスにおいて、ｍＰＧＥＳ−１活性は、ＮａＣｌ（対照）処置の９０分後またはＩＬ−１β処置の９０分後および１８０分後に測定した。対照ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスにおける内因性ｍＰＧＥＳ−１活性は、皮質よりも脳幹において高いことを観察した。加えて、ＩＬ−１βは、時間依存的な様式でｍＰＧＥＳ−１活性を誘導した。Ｂ）９０分の時点で、ＩＬ−１β処置マウスは、脳幹において、生理食塩水処置マウスよりもおよそ２倍高い活性を示した。無酸素もまた、ｍＰＧＥＳ−１活性を有意に誘導した。さらに、ＩＬ−１βの効果と一過的な無酸素暴露の効果は加算的なものであった。ＩＬ−１β処置マウスを無酸素に曝すと、脳幹において、対照マウスよりも４倍高い活性を観察した。しかし、ｍＰＧＥＳ−１遺伝子を欠失したマウスは、ＩＬ−１βおよび無酸素に対して無視できる程度の活性しか示さなかった。データは、平均±ＳＥＭで示されている。**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１
【図２】ＩＬ−１βによる、ｍＰＧＥＳ−１の活性化を通じた呼吸の抑制を示す。全身フロープレチスモグラフィーを使用し、ＩＬ−１β（ｎ＝５２）またはＮａＣｌ（ｎ＝４８）のいずれかのｉ．ｐ．投与後の９日齢ｍＰＧＥＳ−１  ＷＴマウス（ｎ＝６６）およびｍＰＧＥＳ−１  ＫＯマウス（ｎ＝３４）において、基準呼吸および過酸素に対する換気反応を試験した。Ａ）プレスチモグラフ記録は、ＮａＣｌまたはＩＬ−１βを与えた野生型マウスにおける正常酸素および過酸素下での呼吸を示している（５秒間、呼吸の振幅１μｌ／ｓ）。Ｂ、Ｃ）全てのマウスが過酸素に反応し、呼吸頻度（ｆR、呼吸／分）を減らした。ＩＬ−１βは、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスにおいて、ＮａＣｌよりも大きくｆRを減少させたが、ｍＰＧＥＳ−１-/-マウスにおいては、正常酸素または過酸素下での呼吸を変化させなかった。ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスは、ｍＰＧＥＳ−１-/-マウスよりも大きな、過酸素下での呼吸抑制を示した。データは、平均±ＳＥＭで示されている。*ＮａＣｌを与えたｍＰＧＥＳ−１+/+マウスとの比較でＰ＜０．０５。
【図３】ＩＬ−１βによる、ｍＰＧＥＳ−１を通じた無酸素下生存率の低下を示す。９日齢のｍＰＧＥＳ−１+/+マウス（ｎ＝３７）およびｍＰＧＥＳ−１-/-マウス（ｎ＝２０）を、ＩＬ−１β（ｎ＝２９）またはビヒクル（ｎ＝２８）の末梢投与から８０分後に、５分間の無酸素（１００％  Ｎ2）に曝した。Ａ）ＮａＣｌを与えたｍＰＧＥＳ−１+/+マウスのプレスチモグラフ記録は、無酸素に対する初期の過呼吸およびその後のあえぎ呼吸を示している。このマウスは、１００％  Ｏ2を与えた後に自然蘇生した。Ｂ）ＩＬ−１βを与えたｍＰＧＥＳ−１+/+マウスのプレスチモグラフ記録は、無酸素に対する短い過呼吸期間およびその後のあえぎ呼吸を示している。このマウスは、１００％  Ｏ2を与えた後の自然蘇生に失敗した。あえぎ回数（Ｃ）は、グループ間で相違する傾向があった（ウィルコクソンＸ2、Ｐ＝０．０６）。各遺伝子型内で処置の効果を比較すると、ＩＬ−１βは野生型マウスにおいてあえぎ回数を減らしたが、その効果はｍＰＧＥＳ−１を欠くマウスにおいては観察されなかった。Ｄ）ＩＬ−１βは、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスにおいて、ＮａＣｌよりも、無酸素下での生存率を低下させたが、ｍＰＧＥＳ−１-/-マウスにおいてはそうならなかった。データは、平均±ＳＥＭで示されている。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１
【図４】ＰＧＥ2による脳幹呼吸活動の抑制および脳幹ＥＰ３受容体を通じた無呼吸の誘導を示す。呼吸は、遺伝子型がＥＰ３Ｒ+/+（ｎ＝１３）およびＥＰ３Ｒ-/-（ｎ＝２５）の新生仔マウスにおいて、ＰＧＥ2（ｎ＝１９）またはＮａＣｌ（ｎ＝１９）投与後に試験した。Ａ）新生仔ＥＰ３Ｒ+/+（■）およびＥＰ３Ｒ-/-（□）マウスにおいて、０分時にＰＧＥ2を注射（ｉｃｖ）し、その後、正常酸素および１分間の過酸素チャレンジを行った。ＥＰ３Ｒ+/+マウスは、正常酸素および過酸素下で、無呼吸に起因する少ない呼吸頻度（ｆR、呼吸／分）および変動係数（Ｃ．Ｖ．）の高い不規則な呼吸律動を示した。ＥＰ３Ｒ-/-マウスにおいては、麻酔期間後も基準ｆRが変化せず、呼吸パターンの変動が小さかった。ＰＧＥ2のｉｃｖ投与後の最初の２０分間の間に、温度変化または温度依存性は見られなかった。Ｂ）プレスチモグラフ記録（１０秒間、呼吸の振幅１μｌ／ｓ）は、ＥＰ３Ｒ+/+マウスにおいて正常酸素下でＰＧＥ2により無呼吸エピソードが誘導されたが、ＥＰ３Ｒ-/-マウスにおいては誘導されなかったことが実証されている。Ｃ）ＥＰ３Ｒ+/+マウスにおいて、ＰＧＥ2は、正常酸素および過酸素下で、ビヒクルよりも多くの無呼吸を誘導した。このＰＧＥ2の効果は、ＥＰ３Ｒ-/-マウスにおいては観察されなかった。Ｄ）２〜３日齢ＥＰ３Ｒ+/+仔（■、ｎ＝５）由来の脳幹脊髄「全（en bloc）」調製物において、ＰＧＥ2（２０μｇ／ｌ）は、呼吸律動の形成を、対照頻度（ｆR）の６４±５％まで可逆的に抑制した（ＡＮＯＶＡ反復測定法、Ｐ＜０．０１）。ＰＧＥ2は、ＥＰ３Ｒ-/-マウス由来の調製物（□、ｎ＝６）の呼吸活動に影響しなかった。Ｅ）横延髄切片において、疑核（ＮＡ）の腹側の吻側延髄腹外側（ＲＶＬＭ）内に存在し、プレベッツィンガー複合体を含む呼吸関連ニューロンが、ＮＫ１ＲおよびＥＰ３Ｒを共発現している。ＮＫ１ＲおよびＥＰ３Ｒの両方の発現が示されている。矢印は、いくつかのＲＶＬＭ呼吸関連ニューロンにおけるＥＰ３ＲおよびＮＫ１Ｒの共存を示している。Ｆ）ＥＰ３Ｒ-/-マウスにおいて、ＮＫ１Ｒは発現するがＥＰ３Ｒは発現しないことが確認された。スケールバーは１００μｍを表す。データは、平均±ＳＥＭで示されている。*ＮａＣｌを与えたＥＰ３Ｒ+/+マウスとの比較でＰ＜０．０５。
【図５】新生児における脳脊髄液中のＰＧＥ2と無呼吸インデックスの相関関係を示す。脳脊髄液（ＣＳＦ）は、腰椎穿刺の臨床評価を行った新生児集中治療室の乳幼児（ｎ＝１２、生後平均１６±４日、在胎齢平均３２±２週）から得た。次いで、乳幼児の心拍呼吸の記録を行った（９．２±２．４時間）。ＣＳＦ中のＰＧＥ2濃度は、標準化された酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）プロトコルを用いて分析し、感染マーカーであるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および無呼吸インデックス（＃無呼吸／時間）との相関関係を得た。中枢ＰＧＥ2濃度は、血中ＣＲＰレベルと正の相関関係があった（Ｐ＝０．０１）。さらに、中枢ＰＧＥ2濃度と無呼吸インデックスとの間で決定的な関係が観察された（Ｐ＜０．０５）。図５において、我々は、検出不可能なレベルのＰＧＥ2（０±０ｐｇ／ｍｌ）と高レベルのＰＧＥ2（５２±２２ｐｇ／ｍｌ）を区別した。データは、平均±ＳＥＭで示されている。
【図６】ＩＬ−１βにより誘導される、プロスタグランジンＥ2を経由する経路を通じた呼吸抑制および自然蘇生不全の模式図を示す。全身免疫反応の際、炎症性サイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ−１β）は末梢血流中に放出される。ＩＬ−１βは、血液脳関門（ＢＢＢ）の内皮細胞上に存在するその受容体（ＩＬ−１Ｒ）に結合する。ＩＬ−１Ｒの活性化は、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）を通じたアラキドン酸（ＡＡ）からのプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）の合成および律速酵素ミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ１（ｍＰＧＥＳ−１）を通じたＰＧＨ2からのプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）の合成を誘導する。ＰＧＥ2は脳の実質に放出され、脳幹の呼吸調節領域、例えば例えば弧束核（ＮＴＳ）および吻側延髄腹外側（ＲＶＬＭ）に存在するそのＥＰ３受容体（ＥＰ３Ｒ）に結合する。その結果、中枢呼吸関連ニューロンおよび呼吸活動が抑制され、これによって、低酸素イベント下でのあえぎ呼吸および自然蘇生能力が致死的に低下し得る。
【図７】Ａ）は、ヒト乳幼児における、ＣＳＦ中のＰＧＥ2代謝産物濃度と仮死の程度および有害な結果との相関関係を示す。ＣＳＦ中のＰＧＥ2代謝産物は、生後２４時間以内に行った腰椎穿刺の中で獲得し、これは低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）と相関する。Ｂ）は、ヒト乳幼児の出生５分後のアプガールスコアとＣＳＦ中のＰＧＥ2代謝産物濃度の相関関係を示す。
【図８】対照の健常な成人ｖｓ閉塞性睡眠時無呼吸症候群を患っている成人の尿プロスタグランジン代謝産物（ｕ−ＰＧＥＭ）レベルを示す。測定は、三重項四重極質量分析・テトラノルＰＧＥＭ法により行った（ＰＧＥ代謝産物は、ｐｍｏｌＰＧＥＭ／μｇクレアチンで表される）。無呼吸群は、対照よりも数値のばらつきがずっと大きく、その中にはＰＧＥＭレベルが極めて高い部分集団（点線の円）が含まれる。
【図９】対照の健常な小児ｖｓプラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）を患っている小児（３〜１６歳）の尿プロスタグランジン（ｕ−ＰＧＥＭ）レベルを示す。測定は、三重項四重極質量分析・テトラノルＰＧＥＭ法により行った（ＰＧＥ代謝産物は、ｐｍｏｌＰＧＥＭ／μｇクレアチンで表される）。ＰＷＳ群は、対照よりも有意に高いｕ−ＰＧＥＭレベルを示す。
【図１０】対照の健常な乳幼児（１月〜１歳）ｖｓ進行中の炎症、ウイルス性細気管支炎および随伴性の無呼吸がみられる乳幼児の尿プロスタグランジン（ｕ−ＰＧＥＭ）レベルを示す。測定は、三重項四重極質量分析・テトラノルＰＧＥＭ法により行った（ＰＧＥ代謝産物は、ｐｍｏｌＰＧＥＭ／μｇクレアチンで表される）。無呼吸および炎症群は、対照よりも有意に高いｕ−ＰＧＥＭレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
呼吸障害
本発明は、呼吸および／または換気の中枢調節の異常が関与する一群の呼吸障害を想定している。特に、呼吸障害は、異常な、例えば不規則または少ない呼吸頻度、少ないおよび／もしくは短いあえぎ呼吸、少ない１回換気量ならびに／または低酸素に対する呼吸反応の弱体化であり得る。呼吸障害は周期性呼吸であり得る。
【００３６】
無呼吸
呼吸障害は無呼吸であり得る。無呼吸は呼吸の停止を意味し、これは一時的または恒久的なものであり得る。無呼吸は、例えば、インピーダンスニューモグラフィーによって確認され、本明細書中に記載されるようなイベントモニタリングシステムを通じて記録され得る。無呼吸頻度は、規定の無呼吸閾値を超えるイベント数と定義され得る。定義は、対象となる対象の年齢に応じて異なることが知られている。いくつかの実施態様において、例えば、哺乳動物が５歳未満のヒト乳幼児の場合、無呼吸は、直前の０．５秒間における平均インピーダンス信号振幅の≧１０秒の減少から直前の２５秒間に測定される平均振幅の１６％未満の減少と定義され得る。他の実施態様において、例えば、哺乳動物がヒト成人の場合、無呼吸は、＞１０秒の呼吸停止と定義され得る。特定の実施態様においては、無呼吸は、２回の呼吸サイクルを上回る呼吸停止と定義され得る。
【００３７】
睡眠関連呼吸障害
呼吸障害は睡眠中に起こる障害であり得る。乳幼児における睡眠時無呼吸は、重症例では、乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ）の危険度上昇と関連する。成人の睡眠時無呼吸もまた本発明において想定されており、これにはいびきが含まれ得る。
【００３８】
周期性呼吸
睡眠時の呼吸障害は、周期性呼吸、低酸素のエピソードおよび反復的な睡眠からの覚醒によって特徴付けられ、その症状には、過剰な日中の眠気、記憶力、学習力および注意力の低下が含まれる。間欠的な低酸素および睡眠の断片化は、それぞれ独自に、海馬および前頭前皮質、記憶および実行機能の神経処理と関係が深い領域におけるニューロンの故障の原因となり得る。
【００３９】
周期性呼吸または過呼吸と無呼吸の交互出現は、未熟児に共通する呼吸パターンである。臨床的に重要な未熟児の無呼吸はほとんど常に周期性呼吸に関連するものである。呼吸低下期にはＰａＯ2が減少し、これは、初期の小児または過去に脳幹呼吸中枢を損傷している患者において呼吸を減少させ得る。これは、低酸素により誘導される脳幹呼吸中枢の抑制により起こり、部分的にはアデノシンおよびＰＧＥ２の放出により媒介される（５４、８５）。過呼吸期または過換気期にはＰａＣＯ2が減少して呼吸刺激が減少し、それによって無呼吸が引き起こされ得る。
【００４０】
後期早産児（late preterm infant）は、ＣＯ2に対して比較的鈍い換気応答を続け、睡眠時間の５０％超をＲＥＭに費やし、かつ無呼吸および周期性呼吸を示し続け、その有病率は、１５００ｇ未満で誕生した乳幼児における６０％に対して１０％である。
【００４１】
真の周期性呼吸または無呼吸は、呼吸サイクルにおいて呼吸深度が最低の部分が実際に休止点となった場合に出現する（無呼吸の場合）。
【００４２】
新生児、小児、および成人において、睡眠障害性周期呼吸および間欠的低酸素は神経の故障と関連し、そのような損傷は認知機能障害を引き起こし得る（９２、９３）。
【００４３】
自然蘇生不全
呼吸障害は、低酸素イベント後の自然蘇生不全であり得る。自然蘇生は、睡眠または重度の低酸素による呼吸動作の抑制から自己を呼び戻す脳の能力であり、長期の低酸素下では強制的な規則性・吸息性のあえぎ呼吸がみられる。これにより体および血液がその酸素供給を取り戻し飽和することができる。
【００４４】
哺乳動物は典型的に、無酸素に対して二相反応を示し、まず換気を増加させ（すなわち過呼吸）、その後に低酸素型の換気抑制を行う（すなわち一次無呼吸、あえぎ呼吸、二次無呼吸）。次いで、低酸素後の酸素供給により自然蘇生が導かれる。低酸素後の自然蘇生不全は、介入がないと死に至る場合もある。
【００４５】
ＳＩＤＳ
呼吸障害は、乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ）を引き起こす障害であり得る。ＳＩＤＳ（「ゆりかご死」とも呼ばれる）は、概ね２歳未満で起きる乳幼児の予期せぬ突然死である。睡眠中に起こり得る呼吸停止および自然蘇生不全が、ＳＩＤＳと呼ばれる死をもたらし得る。したがって、特に重度の呼吸障害は、予期せぬ突然死を導く可能性がある。特定の実施態様において、本発明は特に、予期せぬ突然死を十分にもたらし得る重度の呼吸障害を想定している。
【００４６】
感染性呼吸障害
呼吸障害はウイルスおよび／または細菌感染に関係し得る。様々な感染マーカー、例えば、ＣＲＰ、白血球数およびＩＬ−１βを含む炎症性サイトカインが、感染時に増大し、これらは、呼吸障害が感染要因を有することを示唆する。
【００４７】
本発明の特定の実施態様において、呼吸障害は、ＩＬ−１β関連呼吸障害であり得る。ＩＬ−１βは、感染および炎症に対する急性免疫反応の際に産生される。本明細書中に開示されているように、ＩＬ−１βは血液脳関門の血管内皮細胞上のＩＬ−１受容体に対して作用し、ＣＯＸ−２を誘導し、誘導されたＰＧＥ2経路を刺激し、そして最終的には無呼吸頻度の増加および低酸素イベント後の自然蘇生不全の原因となる中枢呼吸の抑制をもたらす。ＩＬ−１βの血中レベルが対照レベルよりも上昇していることは、呼吸障害がＩＬ−１β関連呼吸障害であることを示唆する。
【００４８】
特定の実施態様において、哺乳動物または哺乳動物対象は、自律神経機能障害（autonomic dysfunction）、例えばプラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）、先天性中枢性低換気症候群（「ＣＣＨＳ」、「オンディーヌの呪い」とも呼ばれる）および／またはレット症候群を含む獲得性または先天性の呼吸調節障害に罹患したヒトであり得る。ＰＷＳ、ＣＣＨＳまたはレット症候群を患った乳幼児は、感染イベントの際、呼吸機能障害に起因する死亡の危険性が高くなる。
【００４９】
低酸素性虚血性脳症
低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）は、周産期の脳における酸素供給に故障が生じ、脳のエネルギー代謝が妨害された正期産児の状態を表すのに使用される用語である（９７）。この状態は、死亡または重度の神経学的後遺症を引き起こし得る。
【００５０】
磁気共鳴分光法を用いた脳エネルギー代謝の研究は、脳細胞への酸素供給の一次妨害の後に、数時間または数日遅れることがある二次段階として神経脱落が起こるとの仮説を打ち立て（９８、９９）、これは動物研究においても示されている（１００）。この神経損傷の遅延は、部分的には、炎症メディエーターがその傷害に反応して近辺の環境に放出されることが原因であると考えられている。
【００５１】
神経系と免疫系の間の相互作用は、疾患の多くの局面において重要である。ＨＩＥは、病態生理も病因も十分に理解されていない。最近、低酸素虚血以外の原因、例えば子宮内または新生児期の炎症（１０１、１０２）が脚光を浴びており、傷害のメディエーターとしてサイトカインが注目されている（１０３）。虚血性脳傷害の病因における炎症カスケードの関与を示す証拠も存在する（１０４）。星状細胞および小グリア細胞により分泌されるサイトカインはこの炎症反応のメディエーターとして特に重要な役割を果たしており、これらは周産期仮死後の脳においてアポトーシスを誘発し神経細胞死に寄与し得る多様なシグナルの一種であると考えられている。しかし、体内の別の場所と同様、ＣＮＳにおいても特定のサイトカインは、当初は疾患プロセスを増幅し、後にそれを軽減するよう機能し得る。ＰＧＥ2は、サイトカインおよび低酸素刺激に応じて迅速に生成されることから、出生児仮死を罹患した乳幼児の診断および調査において特に有用となり得る。
【００５２】
本明細書でさらに記載されるように（特に以下の実施例７を参照されたい）、ＰＧＥ2が周産期仮死の結果として脳で放出されることが見出された。このことは、ｍＰＧＥＳ−１が、迅速に活性化され、哺乳動物、例えばヒトおよびマウスにおける重度の低酸素に対する応答に関与することを示唆している。低酸素、例えば周産期仮死に対する応答における誘導されたＰＧＥ2経路の役割の発見は、治療的介入における標的および診断ツール、特に周産期仮死を罹患した新生児に対する治療標的および診断ツールを提供する。
【００５３】
哺乳動物
本発明の任意の局面において、哺乳動物または哺乳動物対象は、成人（成体）、小児（仔）または乳幼児（仔）、例えば新生児（仔）であり得る。哺乳動物または哺乳動物対象は、好ましくはヒトである。特定の実施態様において、ヒトは、任意の年齢または一定範囲の年齢、例えば１６歳未満、１０歳未満、０〜５歳および０〜２４月であり得る。特定の例において、対象は、自律神機能経障害、例えばＰＷＳ、ＣＣＨＳまたはレット症候群を患ったヒトの小児である。したがって、本発明の任意の局面において、対象は家族性自律神経失調症を患ったヒト（乳幼児、小児もしくは成人）または脳幹から生じる原因未知の呼吸系およびそれに関連する自律神経障害を患ったヒト（乳幼児、小児もしくは成人）であり得る。
【００５４】
特定の例において、対象は、ＯＳＡＳに罹患したヒト小児（０〜１８歳）である。対象は、産後齢０〜２５週および在胎齢２８〜３６週のヒト乳幼児であり得る。特定の実施態様において、ヒトは成人、例えば１８歳以上であり得る。哺乳動物は、睡眠時無呼吸（例えばＯＳＡＳ、いびき）および／またはパーキンソン病に罹患したヒト成人であり得る。本明細書中に記載される研究の結果として、ｕ−ＰＧＥＭの増加が、ＯＳＡＳを患いボディマスインデックス（ＢＭＩ）が３０未満の成人からなる部分集団における無呼吸（睡眠時無呼吸を含む）の感受性および／または重症度の上昇に特に重要となり得る、ということが示唆される。ＢＭＩは、対象のｋｇ体重を彼または彼女のメートル身長の２乗で割ることによって算出される。したがって、ＢＭＩ＞３０の対象は、典型的には肥満体とみなされる。本発明の任意の局面に従う特定の実施態様において、対象は、ＢＭＩ＞３０のヒト成人であり得る。
【００５５】
誘導されたＰＧＥ2経路
本発明は、本明細書で定義されるような呼吸障害の治療的処置のために、誘導されたＰＧＥ2経路を操作することを想定している。本発明者らは、誘導されたＰＧＥ2経路が、無呼吸頻度の増加および低酸素イベント後の自然蘇生不全を引き起こす要因となることを発見した。誘導されたＰＧＥ2経路は図６で説明されている。全身免疫反応の際、炎症性サイトカインＩＬ−１βは末梢血流中に放出される。ＩＬ−１βは、血液脳関門の内皮細胞上に存在するその受容体（ＩＬ−１Ｒ）に結合する。ＩＬ−１Ｒの活性化は、ＣＯＸ−２を通じたアラキドン酸からのＰＧＨ2の生成および律速酵素ｍＰＧＥＳ−１を通じたＰＧＨ2からのＰＧＥ2の生成を誘導する。ＰＧＥ2は脳の実質に放出され、脳幹の呼吸調節領域、例えば例えば弧束核（ＮＴＳ）および吻側延髄腹外側（ＲＶＬＭ）に存在するＥＰ３Ｒに結合する。
【００５６】
本発明は、脳幹呼吸調節領域への波及効果を遮断または軽減するために、一つまたはそれ以上の場所で誘導されたＰＧＥ2経路を操作、例えば薬理学的操作を行うことを想定している。誘導されたＰＧＥ2経路は、脳幹の呼吸調節領域への波及効果を遮断または軽減する効果を有する任意の点で阻害され得る。特に、誘導されたＰＧＥ2経路は、本明細書にさらに記載されるように、ＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１および／またはＥＰ３Ｒを阻害することによって遮断され得る。
【００５７】
誘導されたＰＧＥ2経路の阻害剤
誘導されたＰＧＥ2経路の阻害剤は、脳幹の呼吸調節領域への波及効果を遮断または軽減する能力を有する。この阻害剤は、誘導されたＰＧＥ2経路の任意の点で、直接的または間接的に作用し得る。例えば、この阻害剤は、
（ａ）この経路に関与するポリペプチド（「誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチド」）、例えばＣＯＸ−２ポリペプチド、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドおよび／もしくはＥＰ３Ｒポリペプチドと直接的に相互作用し得る；
（ｂ）この経路に関与するポリペプチドと間接的に相互作用し得る、例えばＣＯＸ−２ポリペプチド、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドおよび／もしくはＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化因子に結合しそれを阻害することによって相互作用し得る；ならびに／または
（ｃ）誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を妨害し得る、例えばＣＯＸ−２コード遺伝子、ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子および／もしくはＥＰ３Ｒコード遺伝子の発現（例えば転写および／もしくは翻訳）をダウンレギュレートし得る。
【００５８】
ＥＰ３Ｒ
Ｅプロスタノイド受容体サブタイプ３（ＥＰ３Ｒ）ポリペプチドは、ＥＰ３Ｒアゴニスト、例えばＰＧＥ2に結合し、下流へシグナルを伝達する、例えばＧタンパク質を通じてシグナル伝達する能力を有する。ヒトおよびマウスのＥＰ３Ｒアミノ酸配列は、すでに報告されている（８４、その開示内容を参照により本明細書で援用することを明記する）。ヒトＥＰ３Ｒヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されている（アクセッション番号Ｌ２６９７６、その開示内容を参照により本明細書で援用することを明記する）。ＥＰ３Ｒポリペプチドは、好ましくは配列番号２のヒトＥＰ３Ｒアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。しかし、ＥＰ３Ｒポリペプチドは、非ヒト哺乳動物、例えばマウスまたは他のげっ歯類由来のホモログであってもよい。ＥＰ３Ｒポリプチドは、一つまたはそれ以上のアミノ酸が挿入、欠失または置換によって変更されたヒトＥＰ３Ｒタンパク質の変異体または誘導体であってもよい。好ましくは、ＥＰ３Ｒポリペプチドは、配列番号２の全長アミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９９％のアミノ酸同一性を有し、かつＥＰ３Ｒアゴニスト、例えばＰＧＥ2に結合し、下流へシグナルを伝達する能力を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、ＥＰ３Ｒポリペプチドは単離されている。
【００５９】
ヒトＥＰ３Ｒの活性化は、［ｃＡＭＰ］iを低下させ、［Ｃａ++］iをやや上昇させる（８４）。ｃＡＭＰの減少は、呼吸に関連する脳幹ニューロンにおける発火度および発火頻度を減少させる、従って呼吸活動を低下させることが示されている（８５）。ニューロンにおいて、ＥＰ３Ｒの活性化はプロテインキナーゼＣ非依存性Ｒｈｏ活性化経路を通じた神経突起の伸展を妨げ得る（８６、８７）。さらに、ＥＰ３Ｒは腎臓で高度に発現され、腎臓におけるＥＰ３Ｒの活性化は血管収縮作用を示す（８８）。
【００６０】
ＥＰ３Ｒポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する全長ＥＰ３Ｒポリペプチドより短いが、その本来の生物学的活性を保持している活性部分であってもよい。特に、この活性部分は、ＥＰ３Ｒアゴニスト、例えばＰＧＥ2に結合し、下流へシグナルを伝達する、例えばＧタンパク質を通じてシグナル伝達することができるものである。
【００６１】
ＥＰ３Ｒコード遺伝子は、本明細書で定義されるＥＰ３Ｒポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。ＥＰ３Ｒコード遺伝子は、配列番号１の全長ヌクレオチド配列と少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００６２】
ＥＰ３Ｒ阻害剤
ＥＰ３Ｒ阻害剤は、脳幹の呼吸調節領域に対するＥＰ３Ｒ媒介性の効果を阻止または減少、例えばＥＰ３Ｒ媒介性の無呼吸、呼吸抑制および／または自然蘇生不全を阻止または減少させる。
【００６３】
本発明は、多くの異なるタイプのＥＰ３Ｒ阻害剤の使用を想定している。例えば、ＥＰ３Ｒ阻害剤は、本明細書で定義されるＥＰ３Ｒポリペプチドに結合し、アゴニストによる誘導される（例えばＰＧＥ2誘導性の）下流へのシグナル伝達（Ｇタンパク質共役シグナル伝達を含む）を阻止または減少させるアンタゴニストであり得る。さらに、この阻害剤は、ＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化因子に結合しこれを阻害することによって間接的に作用するものであり得る。本明細書で定義されるＥＰ３Ｒコード遺伝子の発現を（例えば、ＥＰ３Ｒコード遺伝子の転写および／または翻訳を阻害することによって）ダウンレギュレートするＥＰ３Ｒ阻害剤もまた想定されている。
【００６４】
ＥＰ３Ｒポリペプチドに結合する阻害剤の例には、特異的結合物質、例えば抗体分子、およびＥＰ３Ｒポリペプチドへの結合においてＰＧＥ2と競合する低分子が含まれる。ＥＰ３Ｒコード遺伝子の発現をダウンレギュレートする阻害剤の例には、ＥＰ３Ｒコード遺伝子またはその一部と相補的な核酸分子およびＥＰ３Ｒをコードする遺伝子またはそのフラグメントの配列に対応する二本鎖ＲＮＡが含まれる。ＥＰ３Ｒコード遺伝子の発現をダウンレギュレートする阻害剤には、リボザイムおよび／または三重らせん因子も含まれる。低分子、特異的結合物質および核酸を含む、多くの異なるクラスの阻害剤のさらなる詳細は本明細書中に記載されている。
【００６５】
ＥＰ３Ｒの低分子阻害剤
本発明は、ＥＰ３Ｒポリペプチドに結合しアゴニストにより誘導される（例えばＰＧＥ2誘導性の）下流へのシグナル伝達、例えばＧタンパク質系シグナル伝達を阻止または減少させる、約２０００ダルトン以下、例えば５０〜１０００ダルトンの有機化合物または無機化合物の使用を想定している。ＥＰ３Ｒの低分子阻害剤は、ＥＰ３Ｒポリペプチドに競合的に結合し、ＰＧＥ2と同じ部位への結合において競合する、または非競合的に結合するアンタゴニストであり得る。この低分子性ＥＰ３Ｒアンタゴニストは、好ましくは、中枢作用性の（すなわち血液脳関門を通過することができる）ものである。しかし、血液脳関門を通過できない低分子性ＥＰ３Ｒアンタゴニストもまた想定されており、これらは、例えば脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与により中枢に送達され得る。
【００６６】
低分子性ＥＰ３Ｒアンタゴニストは、（２Ｅ）−Ｎ−［（５−ブロモ−２−メトキシフェニル）スルホニル］−３−［５−クロロ−２−（２−ナフチルメチル）フェニル］アクリルアミド（Ｌ８２６２６６）または薬学的に許容できるその塩を含み得る。
【００６７】
さらなる低分子性ＥＰ３Ｒアンタゴニストは、本明細書に記載されるスクリーニング法を用いて同定され得る。
【００６８】
ＥＰ３Ｒの特異的結合阻害剤
いくつかの実施態様において、ＥＰ３Ｒ阻害剤は、本明細書で定義されるＥＰ３Ｒポリペプチドに結合しアゴニストにより誘導される（例えばＰＧＥ2誘導性の）下流へのシグナル伝達、例えばＧタンパク質系シグナル伝達を阻止または減少させる特異的結合物質であり得る。
【００６９】
いくつかの実施態様において、特異的結合物質は抗体分子であり得る。他の実施態様において、特異的結合物質は、非抗体分子内に抗原結合部位、例えば非抗体タンパク質スキャホールド上にＣＤＲのセットを含み得る。
【００７０】
「抗体分子」は、天然由来であるか部分合成または完全合成であるかに関係なく、免疫グロブリンを意味する。全長抗体のフラグメントがその抗原結合機能を発揮できることが示されている。従って、抗体分子への言及は、全長抗体に及ぶし、抗体結合フラグメントを含む任意のポリペプチドまたはタンパク質にも及ぶ。
【００７１】
結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（５５）、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆａｂフラグメントが二つ連結された二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインがペプチドリンカーによって連結されこの二つのドメインが連携して抗原結合部位を形成している、短鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（５６〜５７）、（ｖｉｉｉ）二特異性短鎖Ｆｖ二量体（ＷＯ９３／１１１６１）および（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価または多特異性フラグメントである「ダイアボディ（diabody）」（ＷＯ９４／１３８０４；５８）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインをつなぐジスルフィド架橋を導入することによって安定化され得る（５９）。ｓｃＦｖにＣＨ３ドメインが連結されたミニボディも作製することができる（６０）。
【００７２】
ＥＰ３Ｒの核酸阻害剤
本発明はまた、ＥＰ３Ｒ遺伝子の発現のダウンレギュレーションに関する当該分野で公知の技術を使用する。これらには、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用が含まれる。
【００７３】
ヒトにおいて、ＥＰ３Ｒは、配列番号１のヌクレオチド配列を有する遺伝子によってコードされている。ヒトＥＰ３Ｒのアミノ酸配列は配列番号２に示されている。このヌクレオチド配列は、本明細書にさらに記載されるように、ＥＰ３Ｒコード遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる核酸分子を設計するのに利用され得る。
【００７４】
低分子ＲＮＡも、遺伝子発現の調節に利用され得る。これらには、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるｍＲＮＡの特異的分解、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧ）、マイクロｍＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によるｍＲＮＡの発生学的に調節された配列特異的翻訳抑制および特異的転写遺伝子サイレンシングが含まれる。
【００７５】
ヘテロクロマチン複合体の標的化および特定の染色体部位での後成的な遺伝子サイレンシングにおけるＲＮＡｉ機構および低分子ＲＮＡの役割についても実証されている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）としても知られている、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）依存的な転写後サイレンシングは、ｄｓＲＮＡ複合体が短期的なサイレンシングのために特定の相同遺伝子を狙い撃ちする現象である。ＲＮＡ干渉は、配列同一性を有するｍＲＮＡの分解を促進するシグナルとして機能する。一般的に、２０ｎｔ  ｓｉＲＮＡは、遺伝子特異的なサイレンシングを誘導するのに十分長く、宿主反応を回避するのに十分短い。標的化された遺伝子産物の発現減少は顕著で、少数のｓｉＲＮＡ分子によって９０％サイレンシングを誘導することができる。
【００７６】
当該分野において、これらのＲＮＡ配列は、それらの起源によって、「短鎖または低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）または「マイクロＲＮＡ」（ｍｉＲＮＡ）と称される。両タイプの配列は、相補的なＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡ分解を誘導する（ＲＮＡｉ）かまたはｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を停止させることによって遺伝子発現をダウンレギュレートするのに使用され得る。ｓｉＲＮＡは、長い二本鎖ＲＮＡのプロセシングによって生じ、自然環境で見出される場合典型的には外因性である。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、内因的にコードされる小さな非コーディングＲＮＡであり、ショートヘアピンのプロセシングにより生じる。ｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡは両方とも、部分的に相補的な標的配列を有するｍＲＮＡの翻訳をＲＮＡの切断を行わずに阻害することができ、かつ完全に相補的な配列を有するｍＲＮＡを分解することができる。
【００７７】
ｓｉＲＮＡリガンドは典型的には二本鎖であり、ＲＮＡ媒介性の標的遺伝子機能のダウンレギュレーションの効果を最適化するためには、ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡ標的の認識を媒介するＲＩＳＣ複合体によるｓｉＲＮＡの正確な認識を確実にし、かつ宿主反応を減らせる程度にｓｉＲＮＡが短くなるよう、ｓｉＲＮＡ分子の長さを選択するのが好ましい。
【００７８】
ｍｉＲＮＡリガンドは典型的には一本鎖であり、ヘアピンを形成できる部分的に相補的な領域を有する。ｍｉＲＮＡはＤＮＡから転写されるがタンパク質に翻訳されないＲＮＡ遺伝子である。ｍｉＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ配列はｍｉＲＮＡよりも長い。このＤＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡ配列およびほぼ逆の相補鎖を含む。このＤＮＡ配列が一本鎖ＲＮＡ分子に転写されると、ｍｉＲＮＡ配列およびその逆相補性塩基は対をなして部分的に二本鎖のＲＮＡセグメントを形成する。マイクロＲＮＡ配列の設計については（６１）で説明されている。
【００７９】
典型的には、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの効果を模倣するためのＲＮＡリガンドは、１０〜４０リボヌクレオチド（またはその合成アナログ）、より好ましくは１７〜３０リボヌクレオチド、より好ましくは１９〜２５リボヌクレオチドおよび最も好ましくは２１〜２３リボヌクレオチドを有する。二本鎖ｓｉＲＮＡを利用する本発明のいくつかの実施態様において、この分子は、対称な３’オーバーハング、例えば一つまたは二つの（リボ）ヌクレオチドのオーバーハング、典型的にはＵＵまたはｄＴｄＴの３’オーバーハングを有し得る。本明細書の開示に基づき、当業者は、適当なｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ配列を容易に、例えばＡｍｂｉｏｎ社のｓｉＲＮＡファインダー（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlを参照されたい）等のリソースを用いて容易に設計することができる。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ配列は、合成的に作製しこれを外的に導入することにより遺伝子をダウンレギュレートすることもできるし、発現系（例えばベクター）を用いて生成させることもできる。好ましい実施態様において、ｓｉＲＮＡは合成される。
【００８０】
ｓｉＲＮＡを生成するために長鎖の二本鎖ＲＮＡを細胞中でプロセシングさせることができる（例えば（６２）を参照されたい）。この長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、対称な３’または５’オーバーハング、例えば一つまたは二つの（リボ）ヌクレオチドからなるオーバーハングを有していてもよいし、平滑末端であってもよい。この長鎖ｄｓＲＮＡ分子は２５ヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。好ましくは、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は２５〜３０ヌクレオチド長である。より好ましくは、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は２５〜２７ヌクレオチド長である。最も好ましくは、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は２７ヌクレオチド長である。３０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さのｄｓＲＮＡを、ベクターｐＤＥＣＡＰを用いて発現される場合もある（６３）。
【００８１】
代替手段は、細胞内でのショートヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）の発現である。ｓｈＲＮＡは合成性のｓｉＲＮＡよりも安定である。ｓｈＲＮＡは、小さなループ配列によって隔てられた短い逆位反復配列からなる。逆位反復配列の一つは遺伝子標的に相補的である。ｓｈＲＮＡは、細胞内で、ＤＩＣＥＲによってｓｉＲＮＡへのプロセシングを受け、このｓｉＲＮＡが標的遺伝子であるｍＲＮＡを分解し、発現を抑制する。好ましい実施態様において、ｓｈＲＮＡは、ベクター、例えば本発明のアデノウイルスベクターからの転写によって内因的に（細胞内で）生成される。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばヒトＨ１または７ＳＫプロモーター、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にｓｈＲＮＡ配列をコードするベクターを細胞にトランスフェクトすることによって細胞内で生成される場合もある。あるいは、ｓｈＲＮＡは、ベクターからの転写によって外因的に（インビトロで）生成され得る。ｓｈＲＮＡは次いで、細胞に直接的に導入され得る。好ましくは、ｓｈＲＮＡ分子は、ＥＰ３Ｒコード遺伝子の部分配列を含む。好ましくは、ｓｈＲＮＡ配列は、４０〜１００塩基長、より好ましくは４０〜７０塩基長である。ヘアピンの幹部分は、好ましくは１９〜３０塩基対である。この幹部分は、ヘアピン構造を安定化させるＧＵ対を含み得る。
【００８２】
ｓｉＲＮＡ分子、長鎖ｄｓＲＮＡ分子またはｍｉＲＮＡ分子は、核酸配列、好ましくはベクターに含まれる核酸配列の転写により組換え生成されることができる。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子、長鎖ｄｓＲＮＡ分子またはｍｉＲＮＡ分子は、ＥＰ３Ｒコード遺伝子の部分配列を含む。
【００８３】
一つの実施態様において、ｓｉＲＮＡ、長鎖ｄｓＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、ベクターからの転写により内因的に（細胞内で）生成される。ベクターは、当該分野で公知の任意の方法で細胞に導入され得る。場合により、ＲＮＡ配列の発現は、組織特異的プロモーターを用いて調節され得る。さらなる実施態様において、ｓｉＲＮＡ、長鎖ｄｓＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、ベクターからの転写により外因的に（インビトロで）生成される。
【００８４】
一つの実施態様において、ベクターは、センス方向およびアンチセンス方向の両方に、ＥＰ３Ｒコード遺伝子の全長または部分核酸配列を含み得、それらのセンスおよびアンチセンス部分は、ＲＮＡとして発現されると集合して二本鎖ＲＮＡを形成する。好ましくは、ベクターは配列番号１の核酸配列またはその変異体もしくはフラグメントを含む。別の実施態様において、センスおよびアンチセンス配列は、異なるベクターにより提供される。好ましくは、ベクターは、配列番号１の核酸配列またはその変異体もしくはフラグメントを含む。
【００８５】
あるいは、ｓｉＲＮＡ分子は、当該分野で公知の標準的な固相または液相合成技術を用いて合成することができる。ヌクレオチド間の結合は、ホスホジエステル結合またはその代替手段として、例えば、式Ｐ（Ｏ）Ｓ、（チオエート）；Ｐ（Ｓ）Ｓ、（ジチオエート）；Ｐ（Ｏ）ＮＲ’２；Ｐ（Ｏ）Ｒ’；Ｐ（Ｏ）ＯＲ６；ＣＯ；またはＣＯＮＲ’２の連結基であり得る（式中、ＲはＨ（もしくは塩）またはアルキル（１〜１２Ｃ）であり、Ｒ６はアルキル（１〜９Ｃ）であり隣接するヌクレオチドに−Ｏ−または−Ｓ−を通じて接続される）。天然の塩基に加えて修飾ヌクレオチド塩基を使用することができ、これらを含むｓｉＲＮＡ分子に有益な特性を付与することができる。
【００８６】
例えば、修飾塩基は、ｓｉＲＮＡ分子の安定性を向上し、それによってサイレンシングに必要となる量を減らすことができる。修飾塩基の導入はまた、非修飾ｓｉＲＮＡよりも安定性の高いまたは低いｓｉＲＮＡ分子を実現し得る。
【００８７】
用語「修飾ヌクレオチド塩基」には、共有結合性の修飾がなされた塩基および／または糖を有するヌクレオチドが含まれる。例えば、修飾ヌクレオチドには、３’位にヒドロキシル基以外および５’位にリン酸基以外の低分子量有機基が共有結合により付加された糖を有するヌクレオチドが含まれる。この種の修飾ヌクレオチドには、２’置換型の糖、例えば２’−Ｏ−メチル−；２−Ｏ−アルキル；２−Ｏ−アリル；２’−Ｓ−アルキル；２’−Ｓ−アリル；２’−フルオロ−；２’−ハロまたは２’−アジド−リボース、炭素環系糖アナログα−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、およびセドヘプツロースも含み得る。
【００８８】
修飾ヌクレオチドは当該分野で公知であり、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンおよびピリミジン、ならびにその他の複素環系が含まれる。これらのクラスのピリミジンおよびプリンは当該分野で公知であり、プソイドイソシトシン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンチル−アデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、−Ｄ−マンノシルケオシン、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル（psueouracil）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ケオシン（queosine）、２−チオシトシン、５−プロピルウラシル、５−プロピルシトシン、５−エチルウラシル、５−エチルシトシン、５−ブチルウラシル、５−ペンチルウラシル、５−ペンチルシトシン、および２，６−ジアミノプリン、メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルシトシンが含まれる。
【００８９】
ＲＮＡｉを使用して線虫（C.elegans）、ショウジョウバエ（Drosophila）、植物および哺乳動物において遺伝子を抑制する方法は当該分野で公知である（ＷＯ０１／２９０５８；ＷＯ９９／３２６１９；６４〜７４、これら全てを参照により本明細書で援用することを明記する）。
【００９０】
ＥＰ３Ｒコード遺伝子の発現をダウンレギュレートするリボザイムは、好ましくは、ＥＰ３Ｒコード遺伝子、例えば配列番号１のＤＮＡ配列を有するＥＰ３Ｒコード遺伝子、のＲＮＡ配列に特異的なものである。リボザイムは、一本鎖ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを規定の配列で特異的に切断する核酸分子、実際はＲＮＡ、であり、それらの特異性は操作することができる。ハンマーヘッド型リボザイムは、約１１〜１８塩基長の塩基配列を認識し、したがって約４塩基長の配列を認識するテトラヒメナ型のリボザイムよりも高い特異性を有する点で好ましい場合があるが、後者のタイプのリボザイムも特定の状況で有用である。リボザイムの利用に関する参考文献には、Ｍａｒｓｃｈａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ，１９８８およびＣｅｃｈ，１９８８が含まれる。
ｍＰＧＥＳ−１  ミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ１（ｍＰＧＥＳ−１）ポリペプチドは、グルタチオンの存在下でＰＧＨ2からのＰＧＥ2の合成を触媒する能力を有する。ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドは、好ましくは配列番号４のヒトｍＰＧＥＳ−１アミノ酸配列を含むまたはそれからなる。しかし、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドは、非ヒト動物、例えばマウスまたは他のげっ歯類由来のホモログであってもよい。ｍＰＧＥＳ−１ポリプチドは、一つまたはそれ以上のアミノ酸が挿入、欠失または置換によって変更されたヒトｍＰＧＥＳ−１タンパク質の変異体または誘導体であってもよい。好ましくは、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドは、配列番号４の全長アミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９９％のアミノ酸同一性を有し、かつグルタチオンの存在下でＰＧＨ2からのＰＧＥ2の合成を触媒する能力を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドは単離されている。
【００９１】
ヒトｍＰＧＥＳ−１  ｃＤＮＡのコード配列は、以下では配列番号３として示される。５’および３’非翻訳末端を含む全長ｃＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４８７８．３の下で入F手可能である。
【００９２】
ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有する全長ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドより短いが、その本来の生物学的活性を保持する活性部分であってもよい。特にこの活性部分は、グルタチオンの存在下でＰＧＨ2からのＰＧＥ2の合成を触媒する能力を有するものである。
【００９３】
ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子は、本明細書で定義されるｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子は、配列番号３の全長ヌクレオチド配列と少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００９４】
ｍＰＧＥＳ−１阻害剤
ｍＰＧＥＳ−１阻害剤は、ｍＰＧＥＳ−１により媒介されるＰＧＥ2の合成を阻止または減少させる。ｍＰＧＥＳ−１阻害剤は、ｍＰＧＥＳ−１により媒介されるＰＧＥ2レベル、特に血液脳関門の内皮細胞および／または脳の実質におけるＰＧＥ2レベルの上昇を阻止または減少させる。ＰＧＥ2合成を阻止または減少させることにより、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤は、誘導されたＰＧＥ2経路により媒介される無呼吸、呼吸抑制および／または自然蘇生不全を軽減し得る。
【００９５】
本発明は、多くの異なるタイプのｍＰＧＥＳ−１阻害剤の使用を想定している。例えば、阻害剤は、本明細書で定義されるｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドに結合してその触媒機能を妨害し得るものであり、そのような阻害剤には、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドの触媒活性部位に結合する競合的阻害剤および触媒活性部位から離れた部位でｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドと結合するアロステリック阻害剤が含まれる。さらに、この阻害剤は、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドの活性化因子に結合しこれを阻害することによって間接的に作用するものであり得る。ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子の発現を（例えば、ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子の転写および／または翻訳を阻害することによって）ダウンレギュレートするｍＰＧＥＳ−１阻害剤もまた想定されている。
【００９６】
ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドに結合する阻害剤の例には、特異的結合物質、例えば抗体分子、およびｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドと競合的または非競合的に結合する低分子が含まれる。ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子の発現をダウンレギュレートする阻害剤の例には、ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子またはその一部と相補的な核酸分子およびｍＰＧＥＳ−１をコードする遺伝子またはそのフラグメントの配列に対応する二本鎖ＲＮＡが含まれる。ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子の発現をダウンレギュレートする阻害剤には、リボザイムおよび／または三重らせん因子も含まれる。低分子、特異的結合物質および核酸を含む、多くの異なるクラスの阻害剤のさらなる詳細は本明細書中に記載されている。
【００９７】
ｍＰＧＥＳ−１の低分子阻害剤
低分子性のｍＰＧＥＳ−１阻害剤は、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドと結合して、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドによる環状エンドペルオキシド基質から当該基質の９−ケト，１１αヒドロキシル型である生産物への変換を阻止または制限し得る。この低分子は、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドの活性部位に結合するものでもその遠位部位に結合するものでもよく、可逆的に結合するものでも不可逆的に結合するものでもよい。
【００９８】
ロイコトリエンＣ４、ＮＳ−３９８、スリンダク硫化物を含む多くの化合物がｍＰＧＥＳ−１酵素を阻害することが見出されており、これらのＩＣ50値はそれぞれ５、２０および８０μＭである（７５、その開示を参照により本明細書で援用することを明記する）。また、１５−デオキシ−Δ１２，１４−ＰＧＪ2、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸および３−［ｔｅｒｔ−ブチルチオ−１−（４−クロロベンジル）−５−イソプロピル−１Ｈ−インドール−２−イル］−２，２−ジメチルプロピオン酸（ＭＫ−８８６）はすべて、０．３μＭという同様のＩＣ50値でｍＰＧＥＳを阻害することが報告されている（７６−７７）。
【００９９】
さらなる低分子性ｍＰＧＥＳ−１阻害剤は、本明細書に記載されるスクリーニング法を用いて同定され得る。
【０１００】
ｍＰＧＥＳ−１の特異的結合阻害剤
いくつかの実施態様において、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤は、本明細書で定義されるｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドに結合し、ｍＰＧＥＳ−１により媒介される環状エンドペルオキシド基質から当該基質の９−ケト，１１αヒドロキシル型である生産物への変換を阻止または減少させる特異的結合物質であり得る。
【０１０１】
ｍＰＧＥＳ−１の特異的結合阻害剤は抗体分子であり得る。様々なタイプの抗体分子が、ＥＰ３Ｒの特異的結合阻害剤に関連して記載されている。抗体分子は、それがＥＰ３ＲポリペプチドではなくｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドに結合することを除いては上述の通りである。
【０１０２】
ｍＰＧＥＳ−１の核酸阻害剤
本発明はまた、ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子の発現をダウンレギュレートする阻害剤を想定している。
【０１０３】
ヒトにおいて、ｍＰＧＥＳ−１は、配列番号３のヌクレオチド配列を有する遺伝子によってコードされる。ヒトｍＰＧＥＳ−１のアミノ酸配列は配列番号４に示されている。このヌクレオチド配列は、ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる核酸分子を設計するのに利用され得るが、これについては、その核酸分子がＥＰ３Ｒコード遺伝子ではなくｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを除いてＥＰ３Ｒ阻害剤に関連して説明した通りである。したがって、ＥＰ３Ｒコード遺伝子の配列、部分配列または相補配列に関する言及は、必要な修正を加えた上で、ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子の配列、部分配列または相補配列にも適用される。
【０１０４】
ＣＯＸ−２
シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）ポリペプチドは、アラキドン酸からのＰＧＨ2の合成を触媒する能力を有する。ヒトＣＯＸ−２のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００９５４の下で寄託されており（これを参照により本明細書で援用することを明記する）、また、以下では配列番号６として示されている。ＣＯＸ−２ポリペプチドは、好ましくは配列番号６のヒトＣＯＸ−２アミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。しかし、ＣＯＸ−２ポリペプチドは、非ヒト動物、例えばマウスまたは他のげっ歯類由来のホモログであってもよい。ＣＯＸ−２ポリプチドは、一つまたはそれ以上のアミノ酸が挿入、欠失または置換によって変更されたヒトＣＯＸ−２タンパク質の変異体または誘導体であってもよい。好ましくは、ＣＯＸ−２ポリペプチドは、配列番号６の全長アミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９９％のアミノ酸同一性を有し、かつアラキドン酸からのＰＧＨ2合成を触媒する能力を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、ＣＯＸ−２ポリペプチドは単離されている。
【０１０５】
ＣＯＸ−２ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を有する全長ＣＯＸ−２ポリペプチドより短いが、その本来の生物学的活性を保持する活性部分であってもよい。特にこの活性部分は、アラキドン酸からのＰＧＨ2合成を触媒する能力を有するものである。
【０１０６】
ヒトＣＯＸ−２のｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されており（アクセッション番号ＮＭ＿０００９６３、これを参照により本明細書で援用することを明記する）、以下では配列番号５として示される。そのコード配列は、太字で示されたヌクレオチド１３５〜１９４９である。
【０１０７】
ＣＯＸ−２コード遺伝子は、本明細書で定義されるＣＯＸ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。ＣＯＸ−２コード遺伝子は、配列番号５またはそのコード領域（配列番号５のヌクレオチド１３５〜１９４９）のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０８】
ＣＯＸ−２の選択的阻害剤
ＣＯＸ−２の選択的阻害剤は、ＣＯＸ−２によって媒介されるＰＧＨ2合成を阻止または減少させる。ＣＯＸ−２選択的阻害剤は、ＣＯＸ−２によって媒介されるＰＧＨ2レベルの上昇を阻止または減少させ、それによって誘導されたＰＧＥ2経路により媒介される無呼吸、呼吸抑制および／または自然蘇生不全を軽減し得る。
【０１０９】
さらに、ＣＯＸ−２選択的阻害剤は、ＣＯＸ−１に対する阻害活性よりも大きな阻害活性をＣＯＸ−２に対して有する。ＣＯＸ−２阻害剤の選択性は、一般に、非選択的なＣＯＸ阻害に伴う有害な影響、例えば重要な構成性のＣＯＸ−１活性の阻害によって引き起こされる影響を軽減する。ＣＯＸ−２選択的阻害剤は、ＣＯＸ−１の２倍またはそれ以上、例えば５倍または１０倍高い阻害活性をＣＯＸ−２に対して有し得る。したがって、ＣＯＸ−２選択的阻害剤のＩＣ50値は、同じ阻害剤のＣＯＸ−１に対するＩＣ50値よりも２倍低い、好ましくは５倍または１０倍低い場合がある。
【０１１０】
本発明は、多くの異なるタイプのＣＯＸ−２選択的阻害剤の使用を想定している。例えば、阻害剤は、本明細書で定義されるＣＯＸ−２ポリペプチドに結合してその触媒機能を妨害するものであり、そのような阻害剤には、ＣＯＸ−２ポリペプチドの触媒活性部位に結合する競合的阻害剤および触媒活性部位から離れた部位でＣＯＸ−２ポリペプチドと結合するアロステリック阻害剤が含まれる。さらに、さらに、この阻害剤は、ＣＯＸ−２ポリペプチドの活性化因子に結合しこれを阻害することによって間接的に作用するものであり得る。ＣＯＸ−２コード遺伝子の発現を（例えば、ＣＯＸ−２コード遺伝子の転写および／または翻訳を阻害することによって）ダウンレギュレートするＣＯＸ−２阻害剤もまた想定されている。
【０１１１】
ＣＯＸ−２ポリペプチドに結合する阻害剤の例には、特異的結合物質、例えば抗体分子、およびＣＯＸ−２ポリペプチドと競合的または非競合的に結合する低分子が含まれる。ＣＯＸ−２コード遺伝子の発現をダウンレギュレートする阻害剤の例には、ＣＯＸ−２コード遺伝子またはその一部と相補的な核酸分子およびＣＯＸ−２ポリペプチドをコードする遺伝子またはそのフラグメントの配列に対応する二本鎖ＲＮＡが含まれる。ＣＯＸ−２コード遺伝子の発現をダウンレギュレートする阻害剤には、リボザイムおよび／または三重らせん因子も含まれる。低分子、特異的結合物質および核酸を含む、多くの異なるクラスの阻害剤のさらなる詳細は本明細書中に記載されている。
【０１１２】
ＣＯＸ−２の低分子阻害剤
ＣＯＸ−２の低分子性選択的阻害剤は、ＣＯＸ−２ポリペプチドに結合し、ＣＯＸ−２により媒介されるアラキドン酸からＰＧＨ2への変換を阻止または減少させ得る。この低分子は、ＣＯＸ−２ポリペプチドの触媒活性部位に結合するものでもその遠位部位に結合するものでもよく、可逆的に結合するものでも不可逆的に結合するものでもよい。
【０１１３】
ＣＯＸ−２選択的阻害剤として作用する多くの化合物が記載されている。ＣＯＸ−２選択的阻害剤の一例は、「コキシブ類（ｃｏｘｉｂｓ）」として知られている薬物である。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、ＣＯＸ−２の低分子性選択的阻害剤は、４−（５−メチル−３−フェニルイソキサゾール−４−イル）ベンゼンスルホンアミド（バルデコキシブ）もしくは薬学的に許容できるその塩、４−［５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）ピラゾール−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（セレコキシブ）もしくは薬学的に許容できるその塩、および／または４−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−フェニル−５Ｈ−フラン−２−オン（ロフェコキシブ）もしくは薬学的に許容できるその塩を含み得る。
【０１１５】
本発明において有用な多くのＣＯＸ−２阻害剤はこれまでに報告されている（ＣＯＸ阻害、特にＣＯＸ−２阻害の薬理のレビューについては９４を参照されたい。この文献の開示内容を参照により本明細書で援用することを明記する）。
【０１１６】
さらなるＣＯＸ−２の低分子性選択的阻害剤は、本明細書に記載されるスクリーニング法を用いて同定され得る。
【０１１７】
ＣＯＸ−２の特異的結合阻害剤
いくつかの実施態様において、ＣＯＸ−２の選択的阻害剤は、本明細書で定義されるＣＯＸ−２ポリペプチドに結合し、ＣＯＸ−２により媒介されるアラキドン酸からＰＧＨ2への変換を阻止または減少させる特異的結合物質であり得る。
【０１１８】
ＣＯＸ−２の特異的結合阻害剤は抗体分子であり得る。様々なタイプの抗体分子が、ＥＰ３Ｒの特異的結合阻害剤に関連して記載されている。抗体分子は、それがＥＰ３ＲポリペプチドではなくＣＯＸ−２ポリペプチドに結合することを除いては上述の通りである。好ましくは、ＣＯＸ−２の特異的結合阻害剤はＣＯＸ−１ポリペプチドと交差反応しないものである。
【０１１９】
ＣＯＸ−２の核酸阻害剤
本発明はまた、ＣＯＸ−２コード遺伝子の発現をダウンレギュレートする阻害剤を想定している。
ヒトにおいて、ＣＯＸ−２は、配列番号５のヌクレオチド配列を有する遺伝子によってコードされる。ヒトＣＯＸ−２のアミノ酸配列は配列番号６に示されている。このヌクレオチド配列は、ＣＯＸ−２コード遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる核酸分子を設計するのに利用され得るが、これについては、その核酸分子がＥＰ３Ｒコード遺伝子ではなくＣＯＸ−２コード遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを除いてＥＰ３Ｒ阻害剤に関連して説明した通りである。したがって、ＥＰ３Ｒコード遺伝子の配列、部分配列または相補配列に関する言及は、必要な修正を加えた上で、ＣＯＸ−２コード遺伝子の配列、部分配列または相補配列にも適用される。
【０１２０】
治療
本発明は、本明細書で定義される呼吸障害の治療的処置および予防的処置の両方を想定している。この処置は、呼吸障害に対する哺乳動物の感受性を低下させる、および／または哺乳動物における呼吸障害の一つまたはそれ以上の臨床的側面を完全にもしくは部分的に好転させるものであり得る。例えば、本発明は、無呼吸を罹患した患者の呼吸を正常化させることを想定している。低酸素イベント後の自然蘇生の改善もまた想定されている。
好ましい実施態様において、哺乳動物は、本明細書で定義される呼吸障害の危険があると判断された患者であり得る。例えば、感染、特にＩＬ−１βレベルを上昇させる感染がみられるヒト乳幼児が、無呼吸の可能性およびその重症度を低下させるために、ＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤、および／またはＣＯＸ−２選択的阻害剤を含む薬剤で処置され得る。
【０１２１】
処方
本発明は、本明細書で定義される阻害剤の様々な薬学的組成物を想定している。薬学的組成物は、一般に、一つ又はそれ以上の薬学的に許容できる塩、担体または補助成分を含む。さらに、本明細書で定義される阻害剤を一つ以上含む薬学的組成物が想定される。例えば、組成物は、ＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤およびＣＯＸ−２選択的阻害剤から選択される二つまたはそれ以上の薬剤を含み得る。あるいは、一つ以上の阻害剤が用いられる場合、その薬剤は、同時または連続投与用の別々の組成物に配合され得る。
【０１２２】
投与方法
本発明にしたがい適当な投与経路が利用され得る。典型的には、本明細書で定義される阻害剤を含む組成物は、口腔から、直腸から、鼻腔内に、静脈内注射、筋内注射、皮下注射、腹腔内注射もしくは脳室内注射によって、経皮パッチまたは小型ポンプによって投与され得る。血液脳関門を通過することができないＥＰ３Ｒ阻害剤を含む組成物の場合、脳室内注射が好ましい。
【０１２３】
評価および診断
本発明は、哺乳動物由来のサンプル中の一つまたはそれ以上の誘導されたＰＧＥ2経路のマーカーを検出することによって哺乳動物における呼吸障害の感受性またはその存在を評価する方法を想定している。呼吸障害に罹患していることまたは呼吸障害の危険が高いことが確認された対象は、次いで、本明細書で定義される阻害剤により処置され得る。
【０１２４】
患者において誘導されたＰＧＥ2経路の活性が上昇しているかどうかを評価する多くの方法が想定されている。いくつかの実施態様において、ＰＧＥ2またはその代謝産物のレベルが対象由来のサンプルにおいて検出され、対照レベルと比較される。対照レベルは、好ましくは既定の「正常」範囲である。例えば、対照レベルは、健常な対照由来の類似サンプルにおいて見られるＰＧＥ2またはその代謝産物のレベルであり得る。対照レベルは、過去に健常な対照対象に関して測定または報告された値であり得るし、ある集団から得られた平均値でもあり得る。
【０１２５】
ＰＧＥ2および／または一つもしくはそれ以上のその代謝産物は、本明細書にさらに記載されるような生物学的サンプルにおいて測定され得る。ＰＧＥ2代謝産物は数が多いが、その大部分はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー三重項四重極質量分析器）によって検出することができる（１０５、その開示内容全体を参照により本明細書で援用することを明記する）。
【０１２６】
本発明におけるＰＧＥ2代謝産物の例には、７α−ヒドロキシ−５，１１−ジケト−２，３，４，５，２０−ペンタ−１９−カルボキシプロスタン酸およびＥ系よびＦ系の１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト代謝産物が含まれる。ＰＧＥ2および／または一つもしくはそれ以上のその代謝産物（７α−ヒドロキシ−５，１１−ジケト−２，３，４，５，２０−ペンタ−１９−カルボキシプロスタン酸およびＥ系よびＦ系の１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト代謝産物を含む）は、対象サンプルに適した任意の技術によって測定され得る。本発明におけるＰＧＥ2代謝産物ならびにその検出および測定技術については（１０６、その開示内容全体を参照により本明細書で援用することを明記する）にも記載されている。
【０１２７】
ＰＧＥ2およびその代謝産物の測定アッセイの具体例には酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）が含まれ、これについては以下の実施例の節でさらに詳細に記載されている。ＥＩＡキットは商業的に入手可能であり、個々の化合物の高感度検出を実現する。
【０１２８】
さらなる例として、ＰＧＥ2および／または一つもしくはそれ以上のその代謝産物（７α−ヒドロキシ−５，１１−ジケト−２，３，４，５，２０−ペンタ−１９−カルボキシプロスタン酸およびＥ系よびＦ系の１３，１４−ジヒドロ−１５−ケト代謝産物を含む）の測定または検出は、ＬＣ．ＭＳ／ＭＳおよび／または三重項四重極質量分析（三重項四重極法（ＱＱＱ）としても知られている）を用いるものであり得る。三重項四重極質量分析の使用は、この分析法がフェムト／ピコモル濃度の化合物を検出する能力を有することから、特定状況下で好ましい。タンデム四重極（三重項四重極）機器は、既知の代謝産物およびペプチド（例えばＰＧＥ2および／または一つもしくはそれ以上のその代謝産物）の定量に利用される。この機器は、アラキドン酸カスケードの量的経路分析に使用することができる。さらに、この機器は、臨床材料におけるペプチドの量的検証および臨床材料間での相違が代謝学的に確認された代謝産物の量的検証に使用され得る。推奨される機器は、電子スプレーイオン化インターフェース（ＥＳＩ）を経由して超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）に接続され得る。液体クロマトグラフィーにおいてサイズの小さい粒子（＜１．８μｍ）を使用することで、クロマトグラフピーク幅を劇的に、典型的には３０〜６０秒（従来型ＬＣ）から３〜５秒（ＵＰＬＣ）に狭めることができる。これにより分離能が向上し、したがってより多くの化合物をより短時間で分離することができる。三重項四重極質量分析器において、特定の代謝産物の分子イオンが第一の四重極で選択され、代謝産物の断片化がコリージョンガスを含むコリージョンセル中で誘導される。第二の四重極では電子遷移痕を生じる特定の「娘イオン（daughter ion）」が選択される（反応モニタリング）。代謝産物／ペプチドは個別に断片化するため、この娘イオンは極めて化合物特異的なトレーサーとなる。典型的には、約１００のトレースを同時にモニタリング（多重反応モニタリング、ＭＲＭ）、一つの分析物中の多くの代謝産物を特異的かつ高感度で定量することができる。好ましくは、本発明の方法は、尿サンプル中の一つまたはそれ以上のＰＧＥ2代謝産物の測定を含み、三重項四重極質量分析を利用するものである。特に好ましい尿ＰＧＥ2代謝産物（ｕ−ＰＧＥＭ）測定アッセイは実施例８に記載されている。いくつかの例において、本発明の方法は、尿サンプル中の一つまたはそれ以上のＰＧＥ2代謝産物の測定を含み、この方法はさらに、ＰＧＥ2の尿中レベルが尿クレアチニンレベルに対する相対レベルである場合、尿サンプル中のクレアチニン濃度の測定を含む。
【０１２９】
サンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物のレベルと対照レベルとの比較は、既定の対照値または対照値の範囲を記録した図表、データベースまたは文献を調べることによって行える。いくつかの例において、例えば既定の対照値が入手できない場合、サンプルレベルと対照レベルの比較は、調査対象の対象由来のサンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物レベルの検出に続いてまたはそれと平行して、健常な対象由来の対照サンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物レベルを検出することを含むことになる。
【０１３０】
ＰＧＥ2レベルまたはＰＧＥ2代謝産物レベルが対照レベルと比較して上昇していることは、呼吸障害の存在またはその危険が高いこと、例えば無呼吸頻度が増えていることを示すと考えられる。
【０１３１】
以下に記載されるデータは、ＰＧＥ2代謝産物が、乳幼児が出生時に罹患した仮死（「周産期仮死」）の程度および／または哺乳動物対象における低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の存在もしくは重症度を推測する上で有用な指標として使用できる証拠となる。ＰＧＥ2レベルまたはＰＧＥ2代謝産物レベルが対照レベルと比較して上昇、特に対象の出生から数日以内、例えば９６、４８、２４、１２、６、４、３もしくは２時間以内または６０、３０、２０、１０または５分以内に対象から採取したサンプルにおいて上昇していることは、哺乳動物対象におけるＨＩＥの存在を示唆すること、および／または対象が周産期仮死を罹患したことを示すことが見出された。対照レベルとの比較の上でのＰＧＥ2またはＰＧＥ2代謝産物の増加率は、周産期仮死の程度および／またはＨＩＥの重症度の程度と相関し、したがって対象の可能性のある神経学的結果と相関することが見出された。
【０１３２】
したがって本発明の方法は、予後および長期的な神経学的結果の推測に有用であり、したがって処置に関する迅速な決断を補助できる点で価値がある。
【０１３３】
実験結果は、ＰＧＥ2の半減期が、いくつかの例において、約１２〜１８時間であることを示している。ＰＧＥ2およびその代謝産物は、７２時間以上経過した後でさえ存在し測定できる場合もある。ＰＧＥ2分解のハーフタイムはその細胞環境に依存して大きく変化する。ＰＧＥ2の半減期は、数分から数時間まで変化し得る。体内で産生されたＰＧＥ2および尿またはその他の体液中に分泌されたＰＧＥ2を評価する場合、その代謝産物も合わせて測定するのが重要である。
【０１３４】
いくつかの実施態様において、サンプル中のＰＧＥ2またはその代謝産物レベルは、ＰＧＥ2またはその代謝産物の参考レベルと比較される。参考レベルは対照レベルとは別も
のであり得る。例えば、参考レベルは、本明細書で定義される呼吸障害または哺乳動物被験体における周産期仮死もしくはＨＩＥを示す値または値の範囲であり得る。このような例において、ＰＧＥ2またはその代謝産物レベルがほぼ参考レベルまたは参考値の範囲内であることは、本明細書で定義される呼吸障害の存在もしくはその危険が高いこと、乳幼児が出生時に罹患した仮死の程度、および／または被験体におけるＨＩＥの存在もしくはその重症度を示す。参考レベルは、呼吸障害、乳幼児が出生時に罹患した仮死および／または被験体におけるＨＩＥの特定の重症度または段階に関連する値または一定範囲の値であり得る。
【０１３５】
いくつかの実施態様において、本発明の方法は、患者において誘導されたＰＧＥ2経路の活性が高まっているかどうかを、ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子の発現を検出することによって評価することを含む。これには、ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定、例えば定量的、準定量的またはリアルタイムＰＣＲベースの方法を用いて測定することが含まれる。ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子の発現の上昇は、呼吸障害の危険の上昇を示唆する。患者において誘導されたＰＧＥ2経路の活性が高まっているかどうかを評価するその他の方法には、ＰＧＨ2レベルの上昇、ＣＯＸ−２遺伝子発現の増大および／またはＩＬ−１βレベルの上昇を検出することが含まれる。本発明は、一つまたはそれ以上の、誘導されたＰＧＥ2経路の活性の増加に関するマーカーを検出することを想定している。例えば、ＰＧＥ2レベルの検出は、ＰＧＨ2レベル、ｍＰＧＥＳ−１発現、ＣＯＸ−２発現および／またはＩＬ−１βレベルの検出と組み合わされ得る。
【０１３６】
いくつかの実施態様において、本発明の方法は、ｍＰＧＥＳ−１、ＣＯＸ−２および／またはＥＰ３Ｒをコードする遺伝子における一つまたはそれ以上の変異を同定することを含み得る。例えば、ｍＰＧＥＳ−１、ＣＯＸ−２および／またはＥＰ３Ｒをコードする遺伝子における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、本明細書で定義される呼吸障害に対する感受性の上昇と関連し得る。
【０１３７】
サンプル
サンプルは、液体サンプル、例えばＣＳＦサンプル、血液サンプル、尿サンプル、または非液体サンプル、例えば組織検体サンプルであり得る。好ましくは、サンプルはＣＳＦ、尿または血液サンプルである。特定の実施態様において、尿サンプルが特に好ましい。
サンプルは、本明細書で詳述される状態の実際の原因もしくは疑われる原因またはその状態の発症の後の既定の時点で哺乳動物被験体、例えばヒト被験体から採取され得る。例えば、サンプルは、被験体の出生後または入院後もしくは医師との面会後９６、４８、２４、１２、６、４、３もしくは２時間以内または６０、３０、２０、１０もしくは５分以内にヒト乳幼児から採取され得る。いくつかの例において、サンプルは、低温で（例えば４℃付近でまたは−８０℃〜−２０℃で）保存されたヒト尿サンプルであり得る。
【０１３８】
感染マーカー
本発明者らは、ＰＧＥ2レベル、ＣＲＰおよび無呼吸インデックスが相関していることを発見した（図５を参照されたい）。いくつかの実施態様において、診断方法は、追加的に、感染に関連するマーカーのレベルを検出することを含み得る。例えば、ＣＲＰレベルが、患者由来のサンプル、好ましくは血液または尿サンプルにおいて評価され得る。感染マーカーのレベルが対照レベルと比較して上昇していることは、特にＰＧＥ2レベルまたは誘導されたＰＧＥ2経路の活性の増加に関する他のマーカーのレベルの上昇と組み合わせた場合に、呼吸障害の危険が高いことを示唆する。
【０１３９】
対照レベルは、好ましくは既定の「正常」範囲である。例えば、対照レベルは、健常な対照由来の類似のサンプルにおいて見出されるＣＲＰのレベルであり得る。対照レベルは、過去に健常な対照対象に関して測定または報告された値であり得るし、ある集団から得られた平均値でもあり得る。
【０１４０】
サンプル中のＣＲＰレベルと対照レベルとの比較は、既定の対照値または対照値の範囲を記録した図表、データベースまたは文献を調べることによって行える。いくつかの例において、例えば既定の対照値が入手できない場合、サンプルレベルと対照レベルの比較は、調査対象の対象由来のサンプル中のＣＲＰレベルの検出に続いてまたはそれと平行して、健常な対象由来の対照サンプル中のＣＲＰレベルを検出することを含むことになる。
【０１４１】
ＣＲＰレベルが対照レベルと比較して上昇していることは、呼吸障害の存在またはその危険が高いこと、例えば無呼吸頻度が増えていることを示すと考えられる。
【０１４２】
いくつかの実施態様において、サンプル中のＣＲＰレベルは、ＣＲＰの参考レベルと比較される。参考レベルは対照レベルとは別ものであり得る。例えば、参考レベルは、本明細書で定義される呼吸障害を示す値または値の範囲であり得る。このような例において、ＣＲＰレベルがほぼ参考レベルまたは参考値の範囲内であることは、本明細書で定義される呼吸障害の存在またはその危険が高いことを示す。参考レベルは、本明細書で定義される呼吸障害の特定の重症度または段階に関連する値または値の範囲であり得る。
【０１４３】
さらに、ＰＧＥ2またはその代謝産物の測定が、炎症マーカーとしてのＣＲＰまたは高感受性ＣＲＰ（ｈｓＣＲＰ）の測定の補足としてまたはその代わりに使用され得る。
【０１４４】
スクリーニング法
本発明は、哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質の同定を想定している。したがって、哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質の同定方法は、誘導されたＰＧＥ2経路を阻害する能力について試験物質をアッセイすること、例えばＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤および／またはＣＯＸ−２選択的阻害剤として機能するかどうかについて試験物質をアッセイすることを含み得る。誘導されたＰＧＥ2経路の阻害は、試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質であることを示す。試験物質、これは候補化合物または候補組成物であり得る、は、
（ａ）この経路に関係するポリペプチド（「誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチド」）、例えばＣＯＸ−２ポリペプチド、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドおよび／もしくはＥＰ３Ｒポリペプチドと直接的に相互作用することによって、
（ｂ）この経路に関係するポリペプチドと、例えばＣＯＸ−２ポリペプチド、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドおよび／もしくはＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化因子に結合しこれを阻害することにより、間接的に相互作用することによって、ならびに／または
（ｃ）誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることによって、例えば、ＣＯＸ−２コード遺伝子、ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子および／もしくはＥＰ３Ｒコード遺伝子の発現（例えば転写および／もしくは翻訳）をダウンレギュレートすることによって、
誘導されたＰＧＥ2経路を阻害し得る。
【０１４５】
ポリペプチドの阻害剤のスクリーニング
誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドと相互作用および／または結合する試験物質の能力の測定は、その試験物質が、誘導されたＰＧＥ2経路の潜在的阻害剤であることを同定するのに使用され得る。この方法は、相互作用または結合を検出または観察すること、次いで、その試験物質を、それが誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドの活性、例えば酵素活性または受容体を媒介するシグナル伝達を阻害するかどうかを決定するさらなるアッセイ法において使用することを含み得る。
【０１４６】
本発明アッセイの細部は慣用的な技術および知識を用いて当業者によって変更され得る。例えば、ポリペプチドまたはペプチド間の相互作用は、その一方を検出標識で標識してこれを固相に固定したもう一方と接触させることによって、インビトロで試験され得る。適当な検出標識には35Ｓメチオニンが含まれ、これは組み換え法で作製されたペプチドおよびポリペプチドに組み込まれ得る。組み換え法で作製されたペプチドおよびポリペプチドはまた、抗体で標識することができるエピトープを含む融合タンパク質として発現され得る。
【０１４７】
固相に固定されるタンパク質またはペプチドは、固相に結合されたそのタンパク質に対する抗体を用いて、または公知の他の技術を通じて固定され得る。好ましいインビトロ相互作用は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質を利用するものである。これは、グルタチオンアガロースビーズ上に固定され得る。上記タイプのインビトロアッセイフォーマットにおいて、試験化合物は、固定されたＧＳＴ融合ポリペプチドに結合する標識ペプチドまたはポリペプチドの量を減少させる能力を測定することによってアッセイされ得る。これは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によってグルタチオンアガロースビーズを分画することによって測定され得る。あるいは、ビーズは未結合タンパク質を除去するために洗浄され、結合したタンパク質の量は、例えば適当なシンチレーションカウンター内に存在する標識の量を計測することによって測定することができる。
【０１４８】
一般的に、誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドと結合または相互作用する試験物質の能力の同定およびその潜在的なＰＧＥ2経路阻害剤としての同定に続いて、試験物質が誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドの活性を阻害できるかできないかの測定を含む一つまたはそれ以上のアッセイが行われる。通常、誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドを阻害する試験物質の能力の測定を含むアッセイは、その試験物質が誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドと結合または相互作用することができるかどうかが不明な状況下で行われ得るが、多数の試験化合物を試験するためのスクリーンとして以前の結合／相互作用アッセイを使用し、誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドの活性を阻害する能力の測定を含む機能アッセイを実行可能なレベルまで、潜在的阻害剤の数を削減することができる。
【０１４９】
試験物質が誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドの阻害剤として機能するかどうかを測定するアッセイ法、特にＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１およびＥＰ３Ｒアッセイが本明細書中でさらに記載されている。
【０１５０】
コンビナトリアルライブラリ技術（７８）は、ポリペプチドの活性を調節する能力について潜在的に膨大な数の異なる物質を試験するのに効果的な手法を提供する。
【０１５１】
本発明のアッセイに投入され得る試験物質または試験化合物の量は、通常、使用する化合物の種類に基づく試行錯誤により決定され得る。典型的には、約０．１ｎＭ〜１０μＭ濃度の試験化合物（例えば推定阻害剤）が使用され得る。ペプチドが試験物質である場合は、それよりも高い濃度が使用され得る。使用され得る化合物は、天然化合物であってもドラッグスクリーニングプログラムで使用される合成化合物であってもよい。複数の既知または未知成分を含有する植物抽出物もまた使用され得る。他の阻害剤または阻害剤候補は、ポリペプチドまたはペプチドフラグメントの３次元構造のモデリングに基づくもの、ならびに特定の分子形状、サイズおよび電荷特性を有する潜在的阻害化合物を生み出す合理的なドラッグデザインの使用に基づくものであり得る。
【０１５２】
遺伝子発現の阻害剤のスクリーニング
誘導されたＰＧＥ2経路の阻害剤は、誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドをコードする遺伝子、例えばＣＯＸ−２コード遺伝子、ｍＰＧＥＳ−１コード遺伝子および／またはＥＰ３Ｒコード遺伝子の発現を妨げることによってこの経路を阻害し得る。したがって、本発明のアッセイ法は、試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質であることを同定することを含み得、この方法は、誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を減少または阻害することができる物質をスクリーニングすることを含み、このスクリーニングは、
（ａ）上記遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡと試験物質を接触させ（プロモーターは遺伝子に機能的に連結されている）、
（ｂ）このプロモーターからの遺伝子発現のレベルを決定し、そして
（ｃ）試験物質の存在下での遺伝子発現レベルと、同条件かつ試験物質の非存在下での遺伝子発現レベルを比較する、
ことを含み、試験物質の存在下で遺伝子発現レベルが低下することは、その試験物質が、誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害できることを示す。
【０１５３】
この方法はさらに、試験物質が、誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドをコードする遺伝子の発現の阻害剤であること、すなわち哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質であることを同定することを含み得る。
【０１５４】
したがって工程（ｃ）は、試験物質の存在下での遺伝子発現レベルが同条件かつ試験物質の非存在下での遺伝子発現レベルと比較して低下していることを検出し、それによってその試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質であることを同定することを含み得る。
【０１５５】
この方法は、試験物質と発現系、例えば遺伝子に機能的に連結された遺伝子プロモーターを含む宿主細胞を接触させること、および遺伝子発現を測定することを含み得る。この遺伝子は、誘導されたＰＧＥ2経路ポリペプチドをコードする遺伝子であってもよいし、異種遺伝子、例えばレポーター遺伝子であってもよい。「レポーター遺伝子」は、自身のコードする生産物が発現された後にアッセイされ得る遺伝子、すなわちプロモーター活性に関する「レポート」を行う遺伝子である。
【０１５６】
「プロモーター」は、機能的に連結されたＤＮＡの下流に（すなわち、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖における３’方向に）向かう転写の開始点となるヌクレオチド配列を意味する。遺伝子のプロモーターは、ヒト染色体においてその遺伝子の５’側に存在するヌクレオチド配列または別の種、例えばラットまたはマウスにおける等価な配列を含むかまたは本質的にそれからなるものでよい。
【０１５７】
プロモーター活性のレベルは、例えば、そのプロモーターからの転写によって生成されるｍＲＮＡの量の評価またはそのプロモーターからの転写によって生成されたｍＲＮＡの翻訳によって生成されるタンパク質産物の量の評価によって定量可能である。発現系内に存在する特定のｍＲＮＡの量は、例えば、そのｍＲＮＡとハイブリダイズすることができかつ標識されているかまたは特定の増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用できる特定のオリゴヌクレオチドを用いて測定され得る。
【０１５８】
レポーター遺伝子の使用は、タンパク質産物に基づくプロモーター活性の測定を容易にする。レポーター遺伝子は、好ましくは、検出シグナル、好ましくは視覚的に検出可能なシグナル、例えば有色生成物を生じる反応を触媒する酵素をコードする。βガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼを含む多くの例が知られている。βガラクトシダーゼ活性は、基質の青色化によってアッセイされ得、このアッセイは肉眼により、または分光光度計を使用して吸光度を測定することにより行われる。蛍光、例えばルシフェラーゼ活性の結果として生じる蛍光は、分光光度計を用いて定量され得る。放射能アッセイは、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを用いて行われ得る。ただしこの化合物は、非放射能アッセイにおいても使用され得る。レポーター遺伝子からの発現により生じる遺伝子産物の存在および／または量は、その生成物に結合できる分子、例えば抗体またはそのフラグメントを用いて測定され得る。結合性分子は、任意の標準技術を用いて直接的または間接的に標識され得る。
【０１５９】
プロモーター構築物は任意の適当な技術を用いて細胞株に導入され、そのゲノムにレポーター構築物が統合された安定な細胞株が作製され得る。その細胞は、様々な時間、試験化合物と共に培養およびインキュベートされ得る。その細胞は、多数の化合物の分析を容易にするため、９６ウェルプレート上で培養され得る。次いでその細胞は洗浄され、レポーター遺伝子の発現が分析され得る。一部のレポーター、例えばルシフェラーゼについては、細胞は溶解された後に分析される。
【０１６０】
当業者は、多くの利用可能なレポーター遺伝子およびアッセイ技術が遺伝子の活性を測定するのに使用できることを認識している。さらなる例については、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
【０１６１】
ＣＯＸ−２アッセイ
本発明は、試験物質、これは候補化合物または候補組成物であり得る、がＣＯＸ−２選択的阻害活性を有するかどうかを測定し、それによってＣＯＸ−２選択的阻害活性を有することが確認された試験物質を、呼吸障害の処置に使用できる物質として同定するアッセイ法を想定している。
【０１６２】
いくつかの実施態様において、このアッセイ法は、ＣＯＸ−２ポリペプチドと試験物質およびアラキドン酸を、アラキドン酸が当該試験物質の非存在下でＣＯＸ−２によってＰＧＨ2に変換される条件下で接触させること、および当該試験物質の非存在下でのＰＧＨ2合成の対照レベルとの比較で当該試験物質の存在下でのＰＧＨ2合成レベルを決定することを含み、当該試験物質の存在下でのＰＧＨ2合成レベルが上述の対照レベルよりも低いことは、当該試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質であることを示す。
【０１６３】
ＣＯＸ−２阻害剤の同定方法には、これまでに報告されている方法が含まれる（８９、９０、９１、その開示内容を参照により本明細書で援用することを明記する）。ＣＯＸ−２を阻害することが見出された候補化合物または候補組成物は、その化合物または組成物が哺乳動物における呼吸障害を処置する能力を有するかどうかを確認するため、本明細書に記載されるさらなる試験、例えばインビボ試験に供され得る。
【０１６４】
多くのＣＯＸ−２阻害剤用スクリーニングキットが市販されている。例えば、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社の製品番号５６０１３１「ＣＯＸ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙ」は、必要なヒトＣＯＸ−２補因子を提供し、その検出はＳｎＣｌ2によるＰＧＨ2から主としてＰＧＦ２αへの還元に基づくものである（http://www.caymanchem.com/app/template/Product.vm/catalog/560131/a/zを参照されたい）。
【０１６５】
これ以外にも、生成したＰＧＨ2を検出するための代替法がいくつか存在する。例えば、ＰＧＨ2は、塩化鉄処理後に１２−ＨＨＴおよびマロンジアルデヒドに変換でき、両者は高スループットで測定できる。また、ＣＯＸ−２のペルオキシダーゼ活性は、例えば、これもＣａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製のキットに記載されるようにして使用することができる（http://www.caymanchem.com/app/template/Product.vm/catalog/760111/a/zを参照されたい）。
【０１６６】
この方法は、通常、試験物質を、または酵素および酵素基質と共に試験物質をインキュベートすることを含む。基質は、生理学的基質、例えばアラキドン酸であってもよいし、修飾されているかまたは非生理学的な基質、例えばその酵素反応の中で検出可能な（例えば有色の）生成物を生じるよう設計された基質であってもよい。
【０１６７】
ＣＯＸ−２ポリペプチドを試験物質および基質、例えばアラキドン酸と接触させる順序は変更され得る。例えば、ＣＯＸ−２ポリペプチドは最初に試験物質と共にインキュベートされ、次いで基質と接触され得るし、その逆でもよい。
【０１６８】
このようにして、試験物質の存在下での生成物の生成は、試験物質の非存在下での生成物の生成と比較され得る。生成物レベルが低いまたは生成物の形成速度が遅いことは、試験物質が酵素活性を阻害していることを示す。
【０１６９】
阻害剤のアッセイのさらなる可能性は、ＣＯＸ−２を（生来的にまたは組み換え的に）発現する適当な細胞株によるＰＧＨ2生成に影響を及ぼす物質の能力の試験である。本発明のアッセイは、導入された一つまたはそれ以上のベクターから関連ポリペプチドまたはペプチドを発現する細胞株、例えば酵母株において実施され得る。
【０１７０】
それ以外のさらなるアッセイの可能性は、ＣＯＸ−２を含む不均一タンパク質調製物（ヒトでもそれ以外の哺乳動物でもよい）によるＰＧＨ2生成に影響を及ぼす物質の能力の試験である。本発明の好ましいアッセイは、単離された／精製されたＣＯＸ−２ポリペプチド（全長ＣＯＸ−２またはその活性部分を含む）のＣＯＸ−２活性を阻害する試験物質の能力を測定することを含む。
【０１７１】
本発明のアッセイ法において、生成物の生成は、基質レベルを定量することにより、および／または生成物レベルを定量することにより測定することができる。残存する基質レベルが高ければ、生成物の生成レベルは低いということである。
【０１７２】
いくつかの実施態様において、アッセイ法は、ＣＯＸ−２阻害についての試験物質の選択性を他のポリペプチド、例えばＣＯＸ−１と比較の上で測定することを含み得る。例えば、このアッセイ法は、試験物質のＣＯＸ−１に対する阻害活性、例えばＩＣ50、および試験物質のＣＯＸ−２に対する阻害活性、例えばＩＣ50を測定することを含み得る。好ましくは、ＣＯＸ−２選択的阻害剤として同定される試験物質は、ＣＯＸ−１に対する阻害活性の２倍またはそれ以上、例えば５倍または１０倍高い阻害活性をＣＯＸ−２に対して有する。したがって、ＣＯＸ−２阻害に関する試験物質のＩＣ50値は、ＣＯＸ−１阻害に関する同じ試験物質のＩＣ50値よりも２倍またはそれ以上、例えば５倍または１０倍低い。
【０１７３】
生成物の測定には、ＨＰＬＣ、ＵＶ分析、放射能測定、またはＲＩＡ（例えば、市販のＰＧＥ検出用ＲＩＡキット）を利用することができる。生成物の形成は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）または質量分析（ＭＳ）、またはＴＬＣおよび放射能走査により分析することができる。
【０１７４】
ＣＯＸ−２タンパク質を使用する本発明の方法において、完全（全長）ＣＯＸ−２タンパク質配列を使用する必要はない。二分子間の結合を試験するまたはＣＯＸ−２酵素活性を試験する本発明のアッセイは、フラグメントまたは変異体を使用することができる。フラグメントは、当業者に公知の任意の適当な方法によって作製および使用され得る。適当なフラグメント作製法には、コードＤＮＡからのフラグメントの組み換え発現が含まれるがこれに限定されない。このようなフラグメントは、コードＤＮＡを入手し、発現される部分のいずれかの側にある適当な制限酵素認識部位を確認し、ＤＮＡからその部分を切り出すことによって作製され得る。この部分は、次いで、標準的な市販の発現系内の適当なプロモーターに機能的に連結され得る。別の組み換えアプローチは、ＤＮＡの関連部分を適当なＰＣＲプライマーを用いて増幅することである。小フラグメント（例えば、約２０または３０アミノ酸未満）はまた、当該分野で周知のペプチド合成法を用いて作製され得る。ＣＯＸ−２の活性部分は、アッセイ法に使用され得る。
【０１７５】
ＣＯＸ−２ポリペプチドの「活性部分」は、本発明の方法において使用することができる。活性部分は、全長ポリペプチドより短いがその本来の生物学的活性を保持しているペプチドを意味する。特に、活性部分は、適当な条件下でアラキドン酸からのＰＧＨ2合成を触媒する能力を保持しているものである。
【０１７６】
ｍＰＧＥＳ−１アッセイ
本発明は、試験物質、これは候補化合物または候補組成物であり得る、がｍＰＧＥＳ−１阻害活性を有するかどうかを測定し、ｍＰＧＥＳ−１阻害活性を有することが確認された試験物質を、哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質として同定するアッセイ法を想定している。
【０１７７】
いくつかの実施態様において、このアッセイ法は、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドと試験物質およびｍＰＧＥＳ−１の環状エンドペルオキシド基質を、当該ｍＰＧＥＳ−１の環状エンドペルオキシド基質が当該試験物質の非存在下でｍＰＧＥＳ−１によって当該基質の９−ケト，１１αヒドロキシ型である生産物に変換される条件下で接触させること、および当該試験物質の非存在下での当該生産物の対照生成レベルとの比較で当該試験物質の存在下でのＰＧＨ2またはその非酵素的分解産物（ＰＧＥ2、ＰＧＤ2またはＰＧＦ2α）のレベルを測定することを含み、当該試験物質の存在下での当該生産物の生成レベルが上述の対照レベルよりも低いことは、当該試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質であることを示す。
【０１７８】
この方法は、通常、試験物質を、または酵素および酵素基質と共に試験物質をインキュベートすることを含む。基質は、生理学的基質、例えばＰＧＨ2であってもよいし、修飾されているかまたは非生理学的な基質、例えばその酵素反応の中で検出可能な（例えば有色の）生成物を生じるよう設計された基質であってもよい。
【０１７９】
ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドを試験物質および基質、例えばＰＧＨ2と接触させる順序は変更され得る。例えば、ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドは最初に試験物質と共にインキュベートされ、次いで基質と接触され得るし、その逆であってもよい。
【０１８０】
このようにして、試験物質の存在下での生成物の生成は、試験物質の非存在下での生成物の生成と比較され得る。生成物レベルが低いまたは生成物の形成速度が遅いことは、試験物質が酵素活性を阻害していることを示す。
【０１８１】
阻害剤アッセイのさらなる可能性は、ｍＰＧＥＳ−１を（生来的にまたは組み換え的に）発現する適当な細胞株によるＰＧＥ2生成に影響を及ぼす物質の能力の試験である。本発明のアッセイは、導入された一つまたはそれ以上のベクターから関連ポリペプチドまたはペプチドを発現する細胞株、例えば酵母株において実施され得る。
【０１８２】
それ以外のさらなるアッセイの可能性は、ｍＰＧＥＳ−１を含む不均一タンパク質調製物（ヒトでもそれ以外の哺乳動物でもよい）によるＰＧＥ2生成に影響を及ぼす物質の能力の試験である。本発明の好ましいアッセイは、単離された／精製されたｍＰＧＥＳ−１ポリペプチド（全長ｍＰＧＥＳ−１またはその活性部分を含む）のｍＰＧＥＳ−１活性を阻害する試験物質の能力を測定することを含む。
【０１８３】
ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドの活性を阻害する物質（すなわちｍＰＧＥＳ−１阻害剤）のスクリーニング方法は、適当な反応媒体中で一つまたはそれ以上の試験物質と当該ポリペプチドを接触し、処理されたポリペプチドの活性を試験し、その活性を試験物質で処理していない同等の反応媒体中での当該ポリペプチドの活性と比較することを含み得る。処理されたポリペプチドと未処理のポリペプチドとの間の活性の違いは、関係する試験物質の調節効果を示唆する。
【０１８４】
このアッセイ法は、
（ａ）ＰＧＥ2が正常に生成される条件の下、還元型グルタチオンおよびＰＧＨ2の存在下でｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドおよび試験化合物をインキュベートし、そして
（ｂ）ＰＧＥ2の生成を測定すること、
を含み得る。
【０１８５】
ｍＰＧＥＳ−１のＰＧＨ2基質は、ＣＯＸ−２およびＡＡのインキュベーションによって提供され得、したがってこれらがＰＧＨ2を提供するためにアッセイ媒体中に提供されてもよい。さらに、ｍＰＧＥＳ−１は環状エンドペルオキシドからの９−ケト，１１αヒドロキシプロスタグランジンの立体特異的な形成を触媒するので、適当な生成物を測定することにより、他のｍＰＧＥＳ−１基質を、ｍＰＧＥＳ−１活性およびその活性に対する試験化合物の効果の測定に使用することもできる。
【０１８６】
基質 生成物
ＰＧＨ2          ＰＧＥ2
ＰＧＨ1          ＰＧＥ1
ＰＧＨ3          ＰＧＥ3
ＰＧＧ2          １５（Ｓ）ヒドロペルオキシＰＧＥ2
ＰＧＧ1          １５（Ｓ）ヒドロペルオキシＰＧＥ1
ＰＧＧ3          １５（Ｓ）ヒドロペルオキシＰＧＥ3
【０１８７】
上記の通り、基質は、これまでに議論してきた基質のいずれかであってもよいし、任意の他の適当な基質でもよく、これは当業者の自由である。基質はＰＧＨ2であり得、その場合生成物はＰＧＥ2である。
【０１８８】
本発明のアッセイ法において、生成物の生成は、基質レベルを定量することにより、および／または生成物レベルを定量することにより測定することができる。アッセイ終了時にまたはアッセイ反応が終了した時点で残存する基質は、塩化鉄または塩化スズを添加することによって、それぞれ、１２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸およびマロンジアルデヒドまたはＰＧＦ２αに変換することができる。したがって、これらの化合物の量は、ＰＧＥ2の形成を間接的に反映するものである。これらの化合物の定量は、残存する基質量の定量により生成物の生成を測定する手段である。残存基質のレベルが高ければ、生成物の生成レベルが低いということである。
【０１８９】
ｍＰＧＥＳ−１阻害剤は、ＰＧＥ2または他の生成物（使用する基質に依存する）の生成量が、試験物質を用いない対照実験と比較して減少していることを測定することによって同定され得る（またはｍＰＧＥＳ−１阻害剤であると推定される候補物質が実際にそうであると確認され得る）。したがって、試験物質の存在下での生成物の生成は、試験物質の非存在下での生成物の生成と比較され得る。生成物レベルが低いことまたは生成物の形成速度が遅いことは、試験物質がｍＰＧＥＳ−１活性を阻害していることを示す。このようにして、試験物質は、哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる薬剤であることが確認され得る。
【０１９０】
生成物の測定には、ＨＰＬＣ、ＵＶ分析、放射能測定、またはＲＩＡ（例えば、市販のＰＧＥ検出用ＲＩＡキット）を利用することができる。生成物の形成は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）または質量分析（ＭＳ）、またはＴＬＣおよび放射能走査により分析することができる。
【０１９１】
ｍＰＧＥＳ−１タンパク質を使用する本発明の方法において、完全（全長）ｍＰＧＥＳ−１タンパク質配列を使用する必要はない。二分子間の結合を試験するまたはＰＧＥシンターゼ活性を試験する本発明のアッセイは、フラグメントまたは変異体を使用することができる。フラグメントは、当業者に公知の任意の適当な方法によって作製および使用され得る。適当なフラグメント作製法には、コードＤＮＡからのフラグメントの組み換え発現が含まれるがこれに限定されない。このようなフラグメントは、コードＤＮＡを入手し、発現される部分のいずれかの側にある適当な制限酵素認識部位を確認し、ＤＮＡからその部分を切り出すことによって作製され得る。この部分は、次いで、標準的な市販の発現系内の適当なプロモーターに機能的に連結され得る。別の組み換えアプローチは、ＤＮＡの関連部分を適当なＰＣＲプライマーを用いて増幅することである。小フラグメント（例えば、約２０または３０アミノ酸未満）はまた、当該分野で周知のペプチド合成法を用いて作製され得る。ｍＰＧＥＳ−１の活性部分は、アッセイ法に使用され得る。
【０１９２】
ｍＰＧＥＳ−１ポリペプチドの「活性部分」は、本発明の方法において使用することができる。活性部分は、全長ポリペプチドより短いがその本来の生物学的活性を保持しているペプチドを意味する。特に、活性部分は、グルタチオンの存在下でのＰＧＨ2からのＰＧＥ2合成を触媒する能力を保持しているものである。
【０１９３】
ＥＰ３Ｒアッセイ
本発明は、試験物質、これは候補化合物または候補組成物であり得る、がＥＰ３Ｒ阻害活性を有するかどうかを測定し、ＥＰ３Ｒ阻害活性を有することが確認された試験物質を、呼吸障害の処置に使用できる物質として同定するアッセイ法を想定している。
【０１９４】
いくつかの実施態様において、このアッセイ法は、ＥＰ３Ｒポリペプチドと試験物質およびＥＰ３Ｒアゴニストを、ＥＰ３Ｒアゴニストが当該試験物質の非存在下でＥＰ３Ｒポリペプチドを活性化する条件下で接触させること、および当該試験物質の非存在下でのＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化の対照レベルとの比較で当該試験物質の存在下でのＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化レベルを測定することを含み、当該試験物質の存在下でのＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化レベルが上述の対照レベルよりも低いことは、当該試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質であることを示す。
【０１９５】
ＥＰ３Ｒアゴニストは、天然アゴニスト、例えばＰＧＥ2であってもよいし、合成アゴニストでもよい。多くのＥＰ３Ｒアゴニストが市販、例えばＢｉｏｍｏｌ社から販売されている。一つの十分に特徴付けられている例は、Ｓｕｌｐｒｏｓｔｏｎｅである（http://www.caymanchem.com/app/template/Product.vm/catalog/14765を参照されたい）。ＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化は、受容体タンパク質におけるコンホメーション変化であり得、それによってＧタンパク質との結合がもたらされる。ＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化は、アデニリルシクラーゼ活性に対する効果をモニタリングすることによって検出され得る。例えば、細胞ベースのアッセイにおいて、細胞表面に存在するＥＰ３Ｒポリペプチドの活性化は、その細胞内のｃＡＭＰ濃度の増加または減少をモニタリングすることによって検出され得る。
【０１９６】
いくつかの実施態様において、ＥＰ３Ｒポリペプチドは細胞表面に存在し、そこでＥＰ３Ｒはレポート手段と結合する。このレポート手段は、受容体活性化の指標となる。例えば、レポート手段は、ＥＰ３Ｒにより媒介されるシグナル伝達経路においてＥＰ３Ｒより下流の物質を含み得る。そのような下流物質のレベルにおける何らかの変化をモニタリングすることによって、ＥＰ３Ｒの活性化をモニタリングすることができる。レポート手段は、蛍光または放射能標識の検出を含む多くの技術のいずれかによってモニタリングされ得る。特定の実施態様において、ＥＰ３ＲはＧタンパク質を通じてアデニリルシクラーゼに結合し、それによってｃＡＭＰ生成を調節し得る。試験化合物の存在下および非存在下でＥＰ３Ｒアゴニストに反応するｃＡＭＰレベルをモニタリングすることによって、ＥＰ３Ｒポリペプチドのアンタゴニストとして機能する試験化合物の能力が測定され得る。ヒトＥＰ３Ｒの活性化は、［ｃＡＭＰ］iを低下させ、［Ｃａ++］iをやや上昇させ得る。したがって、ＥＰ３Ｒアゴニストは、細胞内［ｃＡＭＰ］の低下および／または細胞内［Ｃａ++］の上昇を誘導し得る。これは、例えば、ＦＬＩＰＲベースのアッセイを用いてモニタリングされ得る。ＥＰ３Ｒのアンタゴニストは、任意のＥＰ３Ｒアゴニストにより誘導される細胞内［ｃＡＭＰ］の低下および／または細胞内［Ｃａ++］の上昇を阻止または制限し得る。
【０１９７】
インビボスクリーニング
本発明は、哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質の同定方法を想定している。この方法は、誘導されたＰＧＥ2経路を阻害することが知られているまたは阻害すると期待される一つまたはそれ以上の物質を使用し得る。
【０１９８】
したがって、本発明は、哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質の同定方法であって、試験物質を試験哺乳動物に投与すること、ここで、当該試験物質は、ＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤および／またはＣＯＸ−２選択的阻害剤である、および当該試験物質を投与しなかった対照の哺乳動物における徴候または症状との比較で、当該試験哺乳動物における呼吸障害の徴候または症状の重症度を決定することを含み、当該試験哺乳動物における呼吸障害の徴候または症状の重症度が当該対照哺乳動物のそれらよりも低いことは、当該試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質であることを示す、方法、を想定している。
【０１９９】
例えば、試験物質は、
（ａ）ＣＯＸ−２により媒介されるＰＧＨ2の合成、
（ｂ）ｍＰＧＥＳ−１により媒介される、ｍＰＧＥＳ−１の環状エンドペルオキシド基質から当該基質の９−ケト，１１αヒドロキシ型である生産物への変換、および
（ｃ）ＥＰ３Ｒアゴニストにより媒介されるＥＰ３Ｒの活性化、
の一つまたはそれ以上を阻害する能力を有することが見出された物質であり得る。
【０２００】
ＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤またはＣＯＸ−２選択的阻害剤である試験物質の同定方法については、本明細書にさらに記載されている。試験物質をＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤またはＣＯＸ−２選択的阻害剤として同定することは、インビボスクリーニングよりも前の初期段階で行われ得る。このようにして、複数の化合物が、所望の薬理学的活性についてインビトロでスクリーニングされ、次いでその所望の薬理学的活性を有することが見出された化合物がインビボでスクリーニングされ得る。ＥＰ３Ｒ阻害剤、ｍＰＧＥＳ−１阻害剤およびＣＯＸ−２選択的阻害剤については本明細書にさらに詳細に記載されている。
【０２０１】
呼吸障害の徴候または症状には、呼吸抑制、無呼吸頻度、低酸素後の自然蘇生の脆弱さ、呼吸頻度の減少、１回換気量の減少および／または低酸素に対するあえぎ呼吸の減少が含まれ得る。徴候または症状の重症度の決定は、試験／対照哺乳動物を低酸素圧、低酸素に曝した後、および／または試験／対照哺乳動物にＩＬ−１β、リポ多糖（ＬＰＳ）またはＰＧＥ2を投与した後に、その徴候または症状を決定することを含み得る。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、呼吸障害の徴候または症状の重症度が低いことは、その徴候または症状が哺乳動物に害を及ぼす可能性が低いことを意味する。例えば、本発明の方法が、ＩＬ−１β投与後の無呼吸頻度を決定することを含む場合、無呼吸頻度の少なさおよび／または無呼吸エピソードの短さが、徴候または症状の重症度の低さとみなされるであろう。
【０２０３】
呼吸障害の徴候または症状をモニタリングするのに適した技術については本明細書にさらに記載されている。例えば、本発明の方法は、プレチスモグラフィーまたはインピーダンスニューモグラフィーを利用し得る。この方法は、内部酸素圧を変えることができる空気管理チャンバーを利用し得る。好ましくは、このチャンバーは温度管理がなされているものである。
【０２０４】
あるいは、呼吸障害の徴候または症状の決定は、脳幹の呼吸活動を、例えば試験／対照哺乳動物から単離された脳幹・脊髄調製物を用いてモニタリングすることを含み得る。脳幹呼吸活動は電極を用いてモニタリングされ得るが、これについては本明細書にさらに記載されている。本発明の方法が試験／対照哺乳動物から単離された脳幹・脊髄調製物を用いて脳幹呼吸活動をモニタリングすることを含む場合、試験物質は、脳幹・脊髄の単離前に投与されてもよいし、試験／対照哺乳動物からの単離後に脳幹・脊髄調製物に対して直接投与されてもよい。
【０２０５】
本発明の方法は、エクスビボ脳幹脊髄全調製物または脳幹スライス調製物を利用し得る。このような調製物は、アゴニストおよび／またはアンタゴニスト、例えば誘導されたＰＧＥ2経路のアゴニストおよび／またはアンタゴニスト、ならびに環境変化の細胞、ネットワークおよび行動への効果の平行モニタリングを実現する。この方法は、本明細書で定義されるようなインサイチュおよびインビボ法と組み合わせることができる。無呼吸の誘導は、環境変化、例えばＯ2濃度の低下、例えば低酸素によって達成され得る。あるいはまたは加えて、無呼吸の誘導は、薬学的または麻酔処置、例えばオピオイド受容体アゴニストおよび／またはフォースコリンを含むｃＡＭＰ濃度上昇薬によって達成され得る。
【０２０６】
試験哺乳動物および対照哺乳動物はげっ歯類であり得、各々好ましくはマウスまたはラットである。本発明の方法は、好ましくは、ヒトにおける呼吸障害の処置に使用できる薬剤を同定する方法である。
【０２０７】
本発明の方法は、バロメーター技術またはフロープレチスモグラフィー技術を用いて呼吸障害の徴候または症状の重症度を決定することを含み得る。このような技術は、試験哺乳動物および対照哺乳動物がげっ歯類、例えばマウスまたはラットである場合に好ましい。特定の実施態様において、試験哺乳動物はヒトである。このような場合、呼吸障害の徴候または症状の重症度の決定は、睡眠ポリグラフ記録法の使用を含み得る。
【０２０８】
試験哺乳動物および対照哺乳動物は、好ましくは、対照動物に試験物質を与えない点を除いて同一条件下に置かれる。好ましくは、対照投与、例えば生理食塩水が対照哺乳動物に与えられ、そしてそれは、好ましくは、試験物質を試験哺乳動物に投与するのと同一経路によって対照哺乳動物に投与される。
【０２０９】
特定の実施態様において、試験哺乳動物および対照哺乳動物は、同じ動物であり得る。この場合、試験物質を投与されなかった対照哺乳動物における徴候または症状との比較で試験哺乳動物における呼吸障害の徴候または症状の重症度を決定することは、まず、試験物質の投与前に哺乳動物における呼吸障害の徴候または症状の重症度を決定し（「対照記録」）、次に、試験物質の投与後に哺乳動物における呼吸障害の徴候または症状の重症度を決定する（「試験記録」）ことにより実行され得る。次いで、対照記録および試験記録は比較され、対照記録の重症度よりも試験記録の重症度が低いことが、試験物質が哺乳動物における呼吸障害の処置に使用できる物質であることを示す。同じ動物を試験哺乳動物および対照哺乳動物として使用することは、哺乳動物がヒト、例えば臨床研究下にあるヒトである場合に好ましい。
【０２１０】
以下は実施例であり、特許請求の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２１１】
材料および方法
動物
ＤＢＡ／１ｌａｃＪ純系（ｎ＝１５８）（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）およびＣ５７ＢＬ／６系（ｎ＝７５）（Beverly Koller博士、University of North Carolina, Chapel Hill, NCの厚意により寄贈された）の新生仔を使用した。ミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ１（ｍＰＧＥＳ−１）およびＥＰ３受容体（ＥＰ３Ｒ）の遺伝子を以前に記載されたようにしてノックアウトマウスにおいて選択的に欠失させた（４７、４８、両方の開示内容を参照により本明細書で援用することを明記する）。全ての動物を実験後直ちに断頭により屠殺し、ＰＣＲおよびサザンブロット分析を用いてジェノタイピングを行った。野生型ＤＢＡ／１ｌａｃＪマウスの一部から得たデータを、新生仔ＤＢＡ／１ｌａｃＪマウスにおける呼吸活動の特徴付けに利用した（６）。全てのマウスを、１２時間明：１２時間暗サイクルという標準化された条件下で飼育した。餌および水分は自由にとらせた。
【０２１２】
ヒト被験者
カロリンスカ大学病院の新生児集中治療室の乳児（平均在胎齢３２±２週）に協力していただいた（生後年齢平均１６±４日）（ｎ＝１２）。その乳児のうち、臨床適応のための腰椎穿刺を受け、書面上のインフォームドコンセントが得られたものを適格者とした。これらの研究は、欧州共同体のガイドラインに従って行ない、内部の倫理委員会による承認を受けた。乳児のうち、臨床適応、例えば感染の疑い、神経学的変化および心拍呼吸上の問題について腰椎穿刺を受けたものを実験適格者とした。脳室内出血（等級≧２）、白質病変（ＰＶＬ、脳室周囲白質軟化症）、発作、出血後水頭症または先天性異常が見られた乳児は除外した。新生児分娩データ、医学的状態、感染マーカー、呼吸治療および投薬を含む関連医学情報（pertinent medical information）を記録した。心拍呼吸の記録は、腰椎穿刺後１２時間以内に行った（平均４．８±１．７時間）。
【０２１３】
薬物
組換えマウスインターロイキン１β（ＩＬ−１β）（Nordic Biosite AB, Taby, Sweden）を滅菌したＮａＣｌで再構成し、１μｇ／ｍｌ溶液とした。プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）（Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI,USA）は、合成ＣＳＦ（ａＣＳＦ）に希釈して、インビボ実験用に２ｎｍｏｌ／μｌ、インビトロ実験用に２０μｇ／ｌ（６０ｎＭ）の濃度とした。
【０２１４】
非拘束全身フロープレチスモグラフィー
プレシキグラスチャンバー（３５ｍｌ）を高感度ダイレクトエアフローセンサー（０〜２００ｍｌ／分；TRN3100、 Kent Scientific Corporation, Litchfield, CT, USA）に接続した。フローシグナルは４チャンネル増幅器（P/N 770 S/N 5; SENSElab, Somedic Sales, Horby, Sweden）によって増幅し、デジタルデータに変換し、ＤａｓｙＬａｂソフトウェア（Datalog GmbH & Co.KG, Monchengladbach, Germany）を用いてオンラインコンピュータにより１００Ｈｚで記録した。呼吸頻度（ｆR、呼吸／分）１回換気量（ＶT、μｌ／呼吸）および毎分換気量（ＶE、μｌ／分）を算出した。チャンバー温度は、チャンバーをサーモスタット付水浴に沈めることによって、記録されている新生仔マウスの温熱中間範囲に従い３０．１±０．１℃で維持した（４９）。以前に記述されているように、プリセット高精度シリンジ（Hamilton Bonaduz AG, Switzerland）を用いて標準化された量の空気（５〜２００μｌ）を繰り返し注入することによってチャンバーをキャリブレートした（６）。ガス交換の９５％が投与の３５秒以内に行われたことを、ＣＯ2濃度分析（Metek CD-3AおよびS-3A, PA, USA）によって確認した。
【０２１５】
インピーダンスニューモグラフィー
乳児の心拍呼吸活動を、インピーダンスニューモグラフィーを用いて非侵襲的に測定し、イベントモニタリングシステム（KIDS, Hoffrichter GmbH, Schwerin, Germany）を介して記録した。ベースライン呼吸速度および無呼吸閾値を超えるイベントを記録するようモニターをプログラムした。無呼吸は、直前の０．５秒間における平均インピーダンス信号振幅の≧１０秒の減少から直前の２５秒間に測定される平均振幅の１６％未満の減少と定義した。このイベント前後の６０秒間もモニターのメモリに保存した。
【０２１６】
ＩＬ−１βまたはＮａＣｌのｉ．ｐ．注射後のプレチスモグラフィー
ｍＰＧＥＳ−１およびＥＰ３Ｒを様々に発現する、それぞれ、９日齢ＤＢＡ／１ｌａｃＪマウス（ｎ＝１４３）およびＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１６）における呼吸を、フロープレチスモグラフィーを用いて試験した。各マウスに、ＩＬ−１β（１０μｇ／ｋｇ）またはビヒクルの腹腔内注射（０．０１ｍｌ／ｇ）を行った。７０分後に、マウスを、プレスチモグラフチャンバーに誘導した。４分間の正常酸素（２１％  Ｏ2）およびその後の１分間の過酸素（１００％  Ｏ2）の間の呼吸を評価した。正常酸素下での５分間の回復期間の後、無酸素（１００％  Ｎ2）に対する呼吸応答を試驗した。最後に、１００％  Ｏ2を８分間与え、自然蘇生の能力を評価した。ベースライン、７０分、およびチャンバーから出た後の皮膚温度を記録した。直腸温度は、直腸プローブの設置が呼吸行動を変化せる可能性を考慮して測定しなかった。性別を推定するために肛門生殖突起間距離を測定した。
【０２１７】
ＰＧＥ2またはビヒクルのｉｃｖ注射後のプレチスモグラフィー
ＥＰ３Ｒを様々に発現する、９日齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３８）における呼吸を、フロープレチスモグラフィーを用いて試験した。約６０秒間のセボフルラン麻酔投与を行った後、ＰＧＥ2（４ｎｍｏｌ、２〜４μｌ  ａＣＳＦ）またはビヒクルを、ポリエチレンチューブに取り付けた先細ガラスピペットを用いて側脳室にゆっくりと注入した。次いでマウスを直ちにプレスチモグラフチャンバーに入れた。１０分間の正常酸素下での回復期間の後、マウスを前記のような過酸素および無酸素チャレンジに暴露した。ベースラインおよびその後の各時点での動物の皮膚温度を、サーミスタ温度プローブを用いて記録した。
【０２１８】
脳幹呼吸活動
脳幹脊髄標本は、以前に記載されるようにして（５０、５１、両方の開示内容を参照により本明細書で援用することを明記する）、ＥＰ３Ｒ+/+およびＥＰ３Ｒ-/-の遺伝型を有する２日齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１１）から素早く単離した。Ｃ４前根における吸息律動に対応する呼吸関連活動を、ガラス吸引電極を用いて追跡し、記録し（５ｋＨｚ）、オフラインで分析した。対照の記録は、ＰＧＥ2を含有するａＣＳＦの灌流およびその後のａＣＳＦ洗浄前少なくとも２０分間行った。
【０２１９】
ｍＰＧＥＳ−１活性の測定
新生仔マウスの脳（ｎ＝３３）を、０．２５Ｍスクロース、１×コンプリートプロテアーゼインヒビター（Roche Diagnostics）および１ｍＭ還元型グルタチオンを含有する０．１Ｍ  ＫＰｉ（無機リン酸カリウム）緩衝液中でホモジナイズし、その後に超音波処置した。膜画分は、細胞成分分画法によって単離した。膜画分におけるｍＰＧＥＳ−１活性は、以前に記載されたようにして測定した（５２、その開示内容を参照により本明細書で援用することを明記する）。
【０２２０】
免疫組織化学
９日齢野生型およびＥＰ３Ｒノックアウト仔から脳幹を断頭後に素早く切り出し、４％パラホルモアルデヒドで固定し、１５％スクロース含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中で一晩凍結保護した。次いでこの脳幹を素早く凍結し、１４μｍの横断切片をクリオスタット（Leica CM3050 S, Leica Microsystems Nussloch GmbH）に逐次集めた。切片を風乾し、ＰＢＳで再度水和させ、そして０．３％過酸化水素を使用して内因性ペルオキシダーゼを１０分間阻害した。その後のＰＢＳ洗浄の後、この切片を５％ヤギ血清（Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA）、１％ウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）および０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）を含有するＰＢＳ中、４５分間ブロックおよび透過処理を行い、ウサギＮＫ−１Ｒ抗体（１：２０，０００希釈；Sigma-Aldrich）と共に一晩インキュベートした。次いでこの切片をＰＢＳ中で洗浄し、１：５０希釈のビオチニル化二次抗体（ヤギ抗ウサギ；Vector Laboratories, Burlingame, CA）と共にインキュベートした。１時間のインキュベーション後、切片をリンスし、ペルオキシダーゼ結合型Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ（１：１００希釈；Vector Laboratories）と３０分間、次いでＣｙ３結合型Ｔｙｒａｍｉｄｅシグナル増幅液（ＴＳＡ、１：５０、PerkinElmer, Boston, MA）と２分間インキュベートした。反応をＰＢＳ中停止させ、５％ロバ血清（Jackson）、１％ウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）および０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Sigma-Aldrich）を含有するＰＢＳで４５分間ブロックした。次いで切片を、１：５０希釈のウサギＥＰ３Ｒ抗体（Cayman Chemical, MI）と共に４℃（Ｃ）で一晩インキュベートした。次の日、切片をＰＢＳ中でリンスし、Ａｌｅｘａ４８８結合型二次抗体（ロバ抗ウサギ；Molecular probes）と共に１時間インキュベートした。その後のＰＢＳ洗浄の後、切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｈａｒｄ  Ｓｅｔマウンティングメディウム（Vector Laboratories）にマウントした。潜在的な交差反応の危険性を除去するため、一次抗体を滴定して最適な希釈を決め、各一次抗体が除かれた対照スライドをインキュベートした。さらに、ＥＰ３Ｒノックアウトマウス（ｎ＝４）由来の脳幹スライスを、通常のＮＫ１Ｒ染色による上記のプロトコルを用いて研究したが、ＥＰ３Ｒは検出されなかった。画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（NIH, Bethesda, MD）で処理した。
【０２２１】
ＣＳＦ分析および心拍呼吸の記録
脳脊髄液サンプルを、標準化された酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）プロトコル（Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA）を用いて、ＰＧＥ2およびＰＧＥ2代謝産物について分析した。腰椎穿刺の後できるだけ早く乳児の心拍呼吸の記録を行った（平均記録時間：９．２±２．４時間）。腰椎穿刺前１２時間以内に測定した感染マーカー（例えば、Ｃ反応性タンパク質、白血球）の血中濃度も記録した。
【０２２２】
プレチスモグラフィーデータの分析
動きアーチファクトを伴わない平穏状態下呼吸の期間を分析に使用した。正常酸素および過酸素ならびに無酸素応答（すなわち、過呼吸、一次無呼吸、あえぎ呼吸、二次無呼吸および自然蘇生）の平均ｆR、ＶTおよびＶE値を以前に記載されているようにして分析した（６、その開示内容を参照により本明細書で援用することを明記する）。全ての動物について生存を記録した。無呼吸は≧３回の呼吸サイクル分の呼吸停止と定義した。呼吸の規則性は、変動係数（Ｃ．Ｖ．）（すなわち、ＳＤを、６０秒の間の呼吸と呼吸の間隔の平均で割ったもの）を用いて定量した。
【０２２３】
乳児の心拍呼吸データの分析
モニタリングソフトウェアを使用してベースライン呼吸速度を記録し、全ての心拍呼吸イベントを可視化した。無呼吸インデックス（Ａ．Ｉ．、無呼吸数／記録時間）を決定した。心拍呼吸活動、感染状況およびＣＳＦ中のＰＧＥ2レベルの間の相関関係を評価した。全ての動きアーチファクトを分析から除外した。
【０２２４】
脳幹脊髄標本
脳幹は、橋が除去されるように第ＶＩ脳神経根と台形体の下境界部の間で吻側から取り出した。この標本を、合成脳脊髄液（ａＣＳＦ）：１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．３ｍＭ  ＫＣｌ、０．８ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、０．８ｍＭ  ＣａＣｌ2、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3および３０ｍＭ  Ｄ−グルコースを入れた１．５ｍｌチャンバー中、２８℃で連続的に灌流させた（流速３〜４ｍｌ／分）。この溶液を９５％Ｏ2および５％ＣＯ2で連続的に平衡化してｐＨ７．４とした（５０、５１）。
【０２２５】
プレスチモグラフデータの分析
無酸素に対する応答は年齢によって変わるので（５３）、我々はＰ９齢の時にすべての記録をとるようにした；しかし、問題となる年齢による影響を最小限に抑えるため、年齢の関連値として体重を使用し、集団平均体重の１ＳＤ以内の体重を有する動物のみ無酸素および生存分析に含めた（６）。
【０２２６】
動物の特徴
ＩＬ−１βまたはＮａＣｌのｉ．ｐ．注射後のプレチスモグラフィー実験において、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスはｍＰＧＥＳ−１-/-マウスよりも体重が軽かった（それぞれ、４．４±０．１ｇ  ｖｓ  ４．９±０．１ｇ）。動物の性別に違いはなかった。ベースラインにおける動物の皮膚温度（３４．７±０．１℃）および注射７０分後の温度（３４．８±０．１℃）はグループ間で類似していた。無酸素後、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスはｍＰＧＥＳ−１-/-マウスよりも皮膚温度が高かった（それぞれ、３２．２±０．１℃  ｖｓ  ３１．４±０．２℃）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、動物の体重（４．５±０．１ｇ）、動物の性別、ベースライン温度（３４．４±０．２℃）、７０分の温度（３４．５±０．５℃）または無酸素後の温度（３０．４±０．１℃）に違いはなかった。ＰＧＥ2またはビヒクルのｉｃｖ注射後のプレチスモグラフィー実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、動物の性別および麻酔後温度（３１．０±０．２℃）において違いを示さなかった。しかし、ＥＰ３Ｒ+/+マウスは、ＥＰ３Ｒ-/-マウスよりも体重が重かった（それぞれ、４．９±０．１ｇ  ｖｓ  ４．１±０．１ｇ）。９日齢のＥＰ３Ｒ+/+マウス（ｎ＝１３）およびＥＰ３Ｒ-/-マウス（ｎ＝２６）の皮膚温度を、ベースラインならびにＰＧＥ2またはビヒクルのｉｃｖ注射後の正常酸素、過酸素および無酸素下での各時点で測定した。注射２３分後の無酸素暴露まで温度の違いはみられなかった。この時点で、ＥＰ３Ｒ-/-マウスは、ＥＰ３Ｒ+/+マウスよりも皮膚温度が低かった（それぞれ、３０．９±０．３℃  ｖｓ  ３１．８±０．３℃）。温度類似性は、３０〜３１分の無酸素後期間で異なった（それぞれ、２９．８±０．２℃  ｖｓ  ３０．４±０．１℃）。
【０２２７】
統計
１要因のＡＮＯＶＡにより、正規分布および等分散のパラメータを比較した。スチューデントｔ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定を用いて多重比較を行った。ノンパラメトリックな測定および非ガウス分布型のデータについては、ウィルコクソンχ2テストを使用した。変数の経時的変化は、ＭＡＮＯＶＡ反復測定デザインを使用して試験した。スピアマンのＲｈｏ相関テストにより変数間の相関関係を決定した。データは平均±ＳＥＭで示されている。Ｐ＜０．０５の値を統計的に有意であるとした。
【０２２８】
実施例１：内因性の脳幹ｍＰＧＥＳ−１活性および呼吸強壮効果
我々はまず、９日齢のｍＰＧＥＳ−１+/+マウスおよびｍＰＧＥＳ−１-/-マウスにおけ
る内因的なＰＧＥ2産生およびその換気に対する効果を試験した。野生型マウスの示した基準となるミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ１（ｍＰＧＥＳ−１）活性は、ホモジナイズした皮質よりもホモジナイズした脳幹において高かった（図１）。正常酸素下での呼吸は遺伝子型間で類似したが、ｆRはｍＰＧＥＳ−１-/-マウスよりもｍＰＧＥＳ−１+/+マウスの方が低い傾向があった（クラスカル・ウォリス、Ｐ＝０．０３；スチューデントｔ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定、Ｐ＝０．１８）（表１）。中枢呼吸の駆動を、１分間の過酸素チャレンジ（１００％  Ｏ2、１分間）によって試験した。両方の遺伝子型のマウスは、呼吸頻度（ｆR）を減らすことで、過酸素に対して応答した（図２）。しかし、呼吸抑制は、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスの方が、ｍＰＧＥＳ−１-/-マウスよりも大きかった（それぞれ、２７±２％  ｖｓ  １９±３％）。
【０２２９】
【表１】
2011503164.tif 000002
【０２３０】
正常酸素および過酸素（１００％  Ｏ2）下での呼吸頻度（ｆR、呼吸／分）、１回換気量（ＶT、μｌ／呼吸／ｇ）および毎分換気量（ＶE、μｌ／分／ｇ）を、ＩＬ−１βまたはビヒクルの腹腔内注射後の９日齢ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスおよびｍＰＧＥＳ−１-/-マウスにおいて試験した。各遺伝子型内での処置の効果を比較すると、ＩＬ−１βは、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスにおいて基準ｆRを減らす傾向があり（ウィルコクソンχ2、Ｐ＝０．１７）、それはｍＰＧＥＳ−１-/-マウスではみられなかった。全てのマウスは、ｆRを減らすことで過酸素に応答した。ＩＬ−１βは、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスにおける過酸素下でｆRを抑制したが、この効果は、ｍＰＧＥＳ−１-/-マウスではみられなかった。ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスは、ｍＰＧＥＳ−１-/-マウスと比較して、過酸素下での呼吸抑制の程度が大きかった。データは平均±ＳＥＭで示されている。*Ｐ＜０．０５、#Ｐ＜０．０５（体重で正規化した場合）。
【０２３１】
この結果は、ｍＰＧＥＳ−１活性の内因的な発現、特に脳幹における発現を実証している。ｍＰＧＥＳ−１は、主として、血液脳関門（ＢＢＢ）付近の内皮細胞によって発現される（２５）。重要な呼吸中枢付近の、脳幹を覆う内皮細胞におけるｍＰＧＥＳ−１の構成的および急速誘導性発現は、呼吸の調節におけるＰＧＥ2の重要な役割を示唆している。ｍＰＧＥＳ−１を欠くマウスよりも野生型マウスにおいて過酸素下で有意な呼吸抑制がみられたこともまた、内因的なＰＧＥ2が周産期における呼吸律動形成に対して強壮効果を有することの証拠を与える。
【０２３２】
これまでの研究は、内因的なプロスタグランジン産生を遮断するプロスタグランジン合成阻害剤が、産後初期に胎児の呼吸動作および中枢呼吸を増加させることを報告している（２６〜２８）。プロスタグランジンの調節効果には、周産期の換気の初期阻害を含む発生学的変化が見られるが（１８、２６、２７、２９）、その後年齢の増加と共に呼吸における変化は小さくなる（１９）。しかし、ＰＧＥ2は、加齢後にも無呼吸の誘導により通常の呼吸を妨害する可能性がある（１９）。ＥＰ３Ｒの遺伝子およびタンパク質はげっ歯類成体のＲＶＬＭにおいても発現されるが（２０、２１、３０）、発生学的変化は、周産期にとどまらない脳幹でのＰＧＥ2受容体発現の変化の副産物的なものである可能性がある。さらに、プロスタグランジンの結合密度は減少するものの、これは全年齢にわたって同じ脳幹領域に局在する（３１）。ＥＰ３Ｒ発現の個体発生（ｏｎｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびＰＧＥ2の呼吸効果における潜在的な発生学的変化の根底にあるメカニズム、例えばＥＰ３Ｒの翻訳後修飾、橋上側（ｓｕｐｒａｐｏｎｔｉｎｅ）への影響、のさらなる調査が必要とされる。
【０２３３】
実施例２：ＩＬ−１βおよび無酸素はマウス脳幹におけるｍＰＧＥＳ−１活性を誘導する
我々は、９日齢ｍＰＧＥＳ−１+/+、ｍＰＧＥＳ−１-/-およびＥＰ３Ｒ+/+マウスのホモジナイズした脳幹および皮質におけるｍＰＧＥＳ−１活性に対する、ＩＬ−１βおよび短期間の無酸素暴露（１００％  Ｎ2、５分間）の効果も測定した（図１）。ＩＬ−１βは、時間依存的なｍＰＧＥＳ−１活性の増加を、特に脳幹において誘導した。特に、脳幹のｍＰＧＥＳ−１活性は、ＩＬ−１β投与９０分後および１８０分後にそれぞれ２倍および４倍増加したが、皮質における活性は９０分と１８０分の間で変化しなかった。無酸素暴露もまた、脳幹および皮質の両方においてｍＰＧＥＳ−１活性を誘導した。注目すべきは、ｍＰＧＥＳ−１活性に対するＩＬ−１βおよび短期間の無酸素暴露の相加的効果であり、これは脳幹においてより顕著であった。ＥＰ３Ｒ野生型マウスは、ＩＬ−１β投与９０分後に、ｍＰＧＥＳ−１野生型マウスと類似のｍＰＧＥＳ−１活性を示した。さらに、ＥＰ３Ｒマウスはまた、脳幹において、皮質よりも高いｍＰＧＥＳ−１活性を有していた（それぞれ、ＰＧＥ2：１１１１±４９および７１０±４４ｐｍｏｌ／分／ｍｐタンパク質）。
【０２３４】
ＰＧＥ2は、無酸素に応答する呼吸においても重要な役割を果たすようである。短期間の無酸素暴露は、ホモジナイズしたマウスの脳においてｍＰＧＥＳ−１活性を増加させた。このインビボでのｍＰＧＥＳ−１活性の迅速な増加は新しい知見である。これまでの研究は、無酸素が、エクスビボでのマウス皮質片におけるＰＧＥ2産生およびブタの脳におけるプロスタグランジンＨシンターゼ２  ｍＲＮＡの発現を誘導することを示していた（３２、３３）。一過性の仮死も同様に、新生仔モルモットの脳においてＰＧＥ2濃度を増加させ、この効果はインドメタシン処置によって阻害される（３４）。
【０２３５】
既知のｍＰＧＥＳ−１酵素調節メカニズムはいずれも、本願において実証されたｍＰＧＥＳ−１活性の迅速な変化を説明できるものではない。遺伝子発現の誘導は、このような短期間の無酸素イベントの間に起こりそうにない。しかし、構成的に発現されるｍＰＧＥＳ−１の転写後調節、例えばリン酸化は、考えられる原因であろう。それ以外の可能性は、以前にヒト細胞系においてＣＯＸ−２  ｍＲＮＡを用いて示され（３５）、最近では心筋細胞において示されたような（３６）、ｍＰＧＥＳ−１  ｍＲＮＡの安定化である。基礎をなすメカニズムを明らかにするためさらなる研究が必要である。
【０２３６】
実施例３：ＩＬ−１βは、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスにおいて呼吸を抑制するが、この効果はｍＰＧＥＳ−１-/-またはＥＰ３Ｒ-/-マウスにおいてはみられない
ＩＬ−１βの換気効果を仲介するＰＧＥ2の役割を試験するため、我々は、９日齢のｍＰＧＥＳ−１+/+、ｍＰＧＥＳ−１-/-およびＥＰ３Ｒ-/-マウスにおいて、ＩＬ−１βまたはビヒクルをｉ．ｐ．投与した後の正常酸素および過酸素（１００％  Ｏ2、１分間）下での呼吸を、フロープレチスモグラフィーを用いて分析した（図２、表１）。全てのマ
ウスが、処置に関係なく、ｆRを減らすことで過酸素チャレンジに対して応答したが、ＩＬ−１β処置した野生型マウスは、ビヒクル処置した野生型マウスよりも大きな呼吸抑制を示した。ＩＬ−１βはまた、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスにおいて基準ｆRを減少させる傾向があった（クラスカル・ウォリス、Ｐ＝０．０３；スチューデントｔ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定、Ｐ＝０．１７）。逆に、ＩＬ−１βは、ｍＰＧＥＳ−１-/-またはＥＰ３Ｒ-/-マウスにおいて正常酸素または過酸素下で換気を変化させなかった。
【０２３７】
この結果は、ＩＬ−１βが中枢呼吸を抑制するのにｍＰＧＥＳ−１の活性化が必要とされることを指示している。第一に、ＩＬ−１βは、時間依存的な様式で脳幹のｍＰＧＥＳ−１活性を増加させた。第二に、ＩＬ−１βは、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスにおいて呼吸を抑制したが、ｍＰＧＥＳ−１-/-マウスにおいては抑制しなかった。インドメタシンは、プロスタグランジン合成を遮断することによって、基準呼吸に対するＩＬ−１βの効果を同じように軽減することが示されている（５）。
【０２３８】
実施例４：ＩＬ−１βは野生型マウスの無酸素下生存率を悪化させるが、この効果はｍＰＧＥＳ−１またはＥＰ３Ｒを欠くマウスにおいてはみられない
次に、我々は、ＩＬ−１βが、ＰＧＥ2を仲介するメカニズムを通じて、低酸素換気応答および低酸素性無呼吸後の自然蘇生に影響するかどうかを調査した。フロープレチスモグラフィーを用いて、無酸素（１００％  Ｎ2、５分間）およびその後の過酸素（１００％  Ｏ2、８分間）下での呼吸を、ｍＰＧＥＳ−１+/+、ｍＰＧＥＳ−１-/-およびＥＰ３Ｒ-/-マウスへのＩＬ−１βまたはビヒクルのｉ．ｐ．注射の８０分後から試験した（図３、表２）。全てのマウスは、初期の換気亢進（すなわち、過呼吸）およびそれに続く低酸素型換気抑制（すなわち、一次無呼吸、あえぎ呼吸、二次無呼吸）という、無酸素に対する二相性の応答を示した。ＩＬ−１βは、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスにおいてあえぎ数を減少させたが、この効果はｍＰＧＥＳ−１-/-マウスにおいてはみられなかった。ＩＬ−１β処置したｍＰＧＥＳ−１+/+マウスはまた、ＩＬ−１β処置したｍＰＧＥＳ−１-/-マウスよりもあえぎの持続時間が短い傾向があった（クラスカル・ウォリス、Ｐ＝０．１９；スチューデントｔ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定、Ｐ＝０．００３）。あえぎ数の少なさおよびあえぎ持続時間の短さは、無酸素下生存率の低下と相関していた。ＩＬ−１βは、ｍＰＧＥＳ−１+/+マウスにおいて無酸素下生存率を有意に低下させたが、ｍＰＧＥＳ−１またはＥＰ３Ｒ遺伝子を欠くマウスの生存率は低下しなかった。ＩＬ−１βは、ＥＰ３Ｒ-/-マウスの低酸素型換気応答に影響しなかった。
【０２３９】
【表２】
2011503164.tif 000003
【０２４０】
ミクロソームプロスタグランジンＥシンターゼ１（ｍＰＧＥＳ−１）の発現が様々な新生仔マウスにＩＬ−１βまたはビヒクルを末梢投与してから８０分後に無酸素に暴露した。マウスは、過呼吸期にｆR、ＶTおよびＶEの初期増加およびおよびそれに続く低酸素型換気抑制期にあえぎ応答を示した。各遺伝子型内で処置効果を比較すると、ＩＬ−１βは野生型マウスにおいてあえぎ数を減少させたが、この効果はｍＰＧＥＳ−１の発現が少ないマウスにおいては観察されなかった。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で示されている。**Ｐ＜０．０１
【０２４１】
この研究は、ＰＧＥ2が、ＩＬ−１βの無酸素下換気効果を仲介する上でも重要な役割を果たしていることを実証している。ＩＬ−１βは、野生型マウスにおいて低酸素無呼吸後の自然蘇生を阻害したが、この効果はｍＰＧＥＳ−１またはＥＰ３Ｒを欠くマウスにおいてはみられなかった。これまでの研究は、インドメタシンが、新生仔ラットにおける低酸素下でのあえぎ呼吸および無酸素下生存率に対するＩＬ−１βの有害な効果を軽減することを示している（５）。
【０２４２】
実施例５：ＰＧＥ2は脳幹の呼吸関連活動を低下させ、ＥＰ３Ｒを通じて無呼吸を誘発する
ＰＧＥ2が脳幹ＥＰ３受容体に特異的に結合することにより呼吸を抑制するかどうかをより正確に把握するために、人工脳脊髄液またはＰＧＥ2を投与した２〜３日齢のＥＰ３Ｒ+/+およびＥＰ３Ｒ-/-マウスの脳幹脊髄のひとかたまりの標本を用いて中枢呼吸活動を測定した。対照条件下では、同様の呼吸活動をＥＰ３Ｒ+/+およびＥＰ３Ｒ-/-マウス由来の標本において記録した。しかし、ＰＧＥ2はＥＰ３Ｒ+/+標本における呼吸頻度を可逆的に阻害したが、ＥＰ３Ｒ-/-標本に対しては影響しなかった（図４）。
【０２４３】
ＥＰ３Ｒを通じて呼吸を変化させるＰＧＥ2の能力を、フロープレチスモグラフィーを用いてさらに評価した。ＥＰ３Ｒ+/+およびＥＰ３Ｒ-/-マウスにおけるＰＧＥ2またはビヒクルのｉｃｖ注射後、正常酸素および過酸素下での呼吸を分析した（図４および表３）。ＰＧＥ2は、ＥＰ３Ｒ+/+マウスにおいて、正常酸素および過酸素下で有意に多い無呼吸頻度および不規則な呼吸パターンを誘発したが、この効果はＥＰ３Ｒ-/-マウスにおいてはみられなかった。次に、このマウスを、無酸素およびそれに続いき過酸素に曝し、自然蘇生を試みさせた。全てのマウスは５分間の無酸素暴露期間を超えてあえぎ呼吸を継続し、３８匹のうちの一匹のみが自然蘇生に失敗した（ＰＧＥ2処置したＥＰ３Ｒ-/-マウス）。ＰＧＥ2は、ビヒクルと比較して、ＥＰ３Ｒ+/+またはＥＰ３Ｒ-/-マウスのあえぎ応答または無酸素下生存率を変化させなかった。最後に、我々は、吻側延髄腹外側（ＲＶＬＭ）の呼吸関連ニューロンがＥＰ３Ｒを発現しているかどうかを調査した。特に、疑核の腹側に位置しプレベッツィンガー複合体を含むＲＶＬＭに局在する呼吸関連ニューロンを同定するツールとしてＮＫ１Ｒの免疫標識を使用した（２２〜２４）。我々は、これらのニューロンが、ＮＫ１ＲおよびＥＰ３Ｒを共発現していることを証明した（図４）。
【０２４４】
【表３】
2011503164.tif 000004
【０２４５】
正常酸素、過酸素（１００％  Ｏ2）および無酸素（１００％  Ｎ2）下での呼吸頻度（ｆR、呼吸／分）、１回換気量（ＶT、μｌ／呼吸／ｇ）および毎分換気量（ＶE、μｌ／呼吸／ｇ）を、ＰＧＥ2またはビヒクルの脳室内（ｉｃｖ）注射後の９日齢ＥＰ３Ｒ+/+マウス（ｎ＝１３）およびＥＰ３Ｒ-/-マウス（ｎ＝２５）において試験した。各遺伝子型内で処置効果を比較すると、ＰＧＥ2は、ＥＰ３Ｒ+/+マウスにおいて正常酸素および過酸素下でのｆRを有意に抑制したが、この効果はＥＰ３Ｒ-/-マウスにおいてはみられなかった。ＰＧＥ2はまた、ＥＰ３Ｒ+/+マウスにおいて過酸素下でのｆRを減少させる傾向があった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．１１）が、この傾向はＥＰ３Ｒ-/-マウスにおいてはみられなかった。データは平均±ＳＥＭで示されている。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１
【０２４６】
先の実施例において示された結果は、ｍＰＧＥＳ−１の活性化後、新たに合成されるＰＧＥ2がＩＬ−１βの中枢呼吸作用を発揮させることの証拠を与えている。我々は、本願において、ＰＧＥ2が野生型マウスにおける呼吸を妨げることを証明しているが、これは、ＰＧＥ2が動物胎仔および新生仔における呼吸を抑制することを実証する研究と矛盾するものではない（１８、２９、３７）。さらに、ＰＧＥ2はインビボで末梢での化学的感受性を変化させず、インビトロで脳幹呼吸活動を直接的に阻害することから、これらの効果は中枢において生じていると言える。これまでの研究は、ＰＧＥ2が、新生仔ラットにおける呼吸関連ニューロンを阻害し（５）、かつ頸動脈洞および迷走神経の疑似手術または除神経後のヒツジにおける胎仔の呼吸動作も同様に阻害することを示している（３８）。
【０２４７】
さらに、このＰＧＥ2の調節効果は、脳幹ＥＰ３受容体への結合を通じて起こる。ＩＬ−１βは、ＥＰ３Ｒ-/-マウスにおける呼吸を変化させることができなかった。ＰＧＥ2は、ＥＰ３Ｒ+/+マウスにおいてインビボで無呼吸および不規則な呼吸を誘発したが、この効果はＥＰ３Ｒ-/-マウスにおいてはみられなかった。最後に、ＥＰ３受容体の存在は、インビトロでの脳幹の呼吸関連律動活動を阻害するのに必要であった。特定のプロスタグランジン受容体であるサブタイプＥＰ３ＲはＮＴＳおよびＲＶＬＭに局在するが（２０、２１）、プロスタグランジンの呼吸への効果がこれらの受容体における挙動を通じて生じることおよびこれらが呼吸関連ニューロンにおいて発現されることを示す先行技術は存在しない。
【０２４８】
この実施例の結果は、ＩＬ−１βにより誘導されるＰＧＥ2および低酸素が、プレベッツィンガー複合体（ｐｒｅＢｏｔＣ）を含むＲＶＬＭにおける呼吸関連ニューロンを、ＥＰ３Ｒを通じて選択的に調節することを示唆している。ＰＧＥ1を含む他の神経モジュレーターが、ｐｒｅＢｏｔＣニューロンを阻害し、呼吸関連律動を弛緩させることが示されており（２２、２３）、ｐｒｅＢｏｔＣの病変は、無酸素下でのあえぎ呼吸を妨げ、中枢性無呼吸および運動失調呼吸を惹起する可能性がある（３９、４０）。さらに、これらの呼吸関連ニューロンは最近、低酸素に対する十分な応答、あえぎ呼吸および自然蘇生による脳幹のホメオスタシスの維持、したがって酸素レベルの回復に重要であることが示されている（４１）。この生きている脳幹の神経網のＰＧＥ2誘導性の抑制、例えば感染反応時抑制は、あえぎ呼吸および自然蘇生の不全ならびに究極的には死を引き起こし得る。
【０２４９】
実施例６：中枢ＰＧＥ2濃度はヒト乳児における無呼吸頻度と相関する
ヒト新生児における感染と無呼吸の間の関係の根底にあるメカニズムをさらに解明するため、我々は、新生児において、感染マーカーＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、脳脊髄液ＰＧＥ2レベルおよび無呼吸イベントの間の関係を試験した。ＣＲＰは、中枢ＰＧＥ2と正の相関をし、ＣＳＦ中のＰＧＥ2濃度と無呼吸頻度の間には正の関係があった（図５）。
【０２５０】
無呼吸は、新生児における敗血症の一般的にみられる徴候であるが（１）、この関係の基礎となるメカニズムは未だ解明されていない。我々は、本願において、感染マーカーＣＲＰがヒト新生児のＣＳＦにおけるＰＧＥ2レベルの上昇と相関関係にあることを証明する。重要なことは、我々は、ＰＧＥ2が無呼吸頻度の増加と関連することも実証していることである。これらの発見は、ヒト新生児において、感染が、サイトカインの全身放出ならびにその後のＰＧＥ2の生合成および中枢作用を通じて呼吸を抑制することを示唆している。本明細書に記載されるメカニズムは、睡眠時無呼吸を患った小児におけるＣＲＰレベルと無呼吸／呼吸低下インデックスの間の独立的関係（４２）およびヒト乳児の咽頭分泌物中のＩＬ−１β濃度と無呼吸の臨床的重症度との間の正の相関（８）を示す以前の報告を説明することができる。一過性の無呼吸もまた、ヒト新生児におけるプロスタグランジン処置の一般的な副作用であり（４３）、これは脳幹の呼吸中枢におけるＥＰ３受容体の活性化に起因するものであり得る。さらに、我々のデータは、新生児における中枢性無呼吸と尿中ＰＧＥ代謝産物の間の正の相関（４４）を説明するものである。
【０２５１】
炎症メディエーターは、新生児において感染および仮死を検出する上で重要なマーカーとして提案されている。サイトカインおよび低酸素刺激に対するＰＧＥ2の迅速な合成は、感染または仮死に起因する可能性のある無呼吸が増加している乳児の診断およびサーベイランスに利用できる。ＰＧＥ2モニタリングの潜在的な診断的利益を、他の感染マーカー、例えばＣＲＰとの比較で評価する研究が必要とされる。
【０２５２】
この結果は、ＩＬ−１βの有害な効果がｍＰＧＥＳ−１およびＥＰ３Ｒ遺伝子の選択的欠失によって軽減されたというものであり、感染に関連する新生児無呼吸の処置に関する重要な示唆を含んでいる。これまで、未熟児の無呼吸を処置するのにインドメタシンが使用されていた（４５）。しかし、インドメタシンは新生児において多数の副作用を引き起こし（４６）、したがって、ｍＰＧＥＳ−１またはＥＰ３受容体を選択的に標的にする処置様式は有用性が高いと考えられる。
【０２５３】
先の実施例は、全身性のインターロイキン１βが、脳幹の呼吸関連領域におけるｍＰＧＥＳ−１の活性化およびＥＰ３受容体へのＰＧＥ2の結合を介して呼吸および自然蘇生を抑制することを実証している（図６）。さらに、重度の低酸素はｍＰＧＥＳ−１活性を迅速に誘導し、これにより内因的なＰＧＥ2が新生児期の低酸素条件下で脳幹の呼吸ニューロンを調節し得ることが示唆されている。最後に、ヒト新生児における感染、中枢ＰＧＥ2および無呼吸イベントの間の相関が明らかにされた。
【０２５４】
実施例７：ＰＧＥ2の代謝産物と出生時仮死およびＨＩＥの程度に対する相関
本発明者らは、ヒト乳児における周産期仮死がＰＧＥ2の迅速な放出および神経学的損傷を引き起こすという仮説を調査した。
患者
ストックホルムのカロリンスカ病院で処置をうけている６３名の乳児（妊娠＞３７週）を、１９９９年１０月から２００４年９月の間、親の同意を得て本研究に登録した。４３名の乳児が出生時仮死に関する以下の基準を充足した：１）後期の減速というカルディオトコグラフィーパターン、変動の不存在または徐脈、羊水の胎便染色、頭皮のｐＨ＜７．２または乳酸＞４．８ｍｍｏｌによって示される胎児仮死の徴候、２）５分後のアプガールスコア＜６および分娩室で＞３分間の蘇生を行う必要性または生後６０分以内に採取した患者由来の臍帯血または静脈血におけるｐＨ＜７．１、ＢＥ＜−１５（または乳酸＞４．８ｍｍ／Ｌ）により示される生後ストレス、３）生後６時間以内の脳症の神経学的徴候。
除外基準は、先天性奇形、染色体異常および仮死に関係のない脳症、代謝病、髄膜炎が確認された子宮内／周産期感染であった。
対照群は、感染の疑いがあるが血液およびＣＳＦからの細菌およびウイルス培養が陰性であった、ＣＳＦ中に白血球がみられずかつ正常のタンパク量である、およびＣＮＳ病を示唆する所見がない、２０名の新生児からなるものであった。
【０２５５】
臨床評価
最初にこれらの患者を本研究に登録する数時間前、次いで出産約１２、３６および７２時間後ならびに新生児集中治療室の患者については第７日目に、神経学的評価（９５、その開示内容を参照により本明細書で援用することを明記する）を行った。低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）は、サルナットおよびサルナットの基準（９６、その開示内容を参照により本明細書で援用することを明記する）に従い、軽度（mild）、中等度（moderate）または重度（severe）に分類した。全ての患者を出産直後の数日の間に評価するために連続振幅表示型ＥＥＧ（continuous amplitude-integrated EEG）を使用した。生後３日目および最初の週におけるＥＥＧ登録日に、中等度および重度のＨＩＥを有する全ての患者に対して、脳のＣＴおよびＭＲＩスキャンを行った。
生存患者の神経学的評価は、生後３、６および１８月に、小児神経科医が行った。その評価に基づいて、小児を（１）正常アウトカム（normal outcome）、（２）軽度の運動障害（mild motor impairment）；軽度の異常な筋緊張もしくは運動発達遅延の症状、または（３）有害事象（adverse outcome）；脳性麻痺（両麻痺、片麻痺、四肢麻痺）、精神遅滞、痙攣もしくは死、に分類した。
【０２５６】
アプガールスコア
アプガールスコアは、出産直後の新生児の身体的状態を評価するための実用的方法である。アプガールスコアは、心拍数、呼吸努力、筋緊張、皮膚の色および刺激（例えば外鼻孔へのカテーテル挿入または足裏の摩擦）に対する反応を採点することによって得られる数値である。これらの対象となる各徴候には、０、１または２点が付与される。アプガールスコア最高点である１０点は、乳児が考えうる限り最高の状態にあることを意味する。アプガールスコア０〜３点の乳児は、直ちに蘇生が必要である。アプガールスコアは、通常、乳児の出産６０秒後に行われ（アプガー１分）、次いで、一般的には、出産５分後に繰り返される（アプガー５分）。困難な蘇生の場合、アプガールスコアは、１０、１５および２０分後に再度行われることもある。生後２０分時のアプガールスコア０〜３点は、高い罹患率（病気）および死亡率（死）を示唆するものである。
【０２５７】
ＣＳＦのサンプリング
生後最初の２４時間（１３．９＋／−５．８）および／または３０〜８０時間の間（５７．８＋／−９．９）にＣＳＦスピナルタブ（Spinal tab）を行った。各スピナルタブにより１〜２ｍｌの量のＣＳＦを集めた。このサンプルを３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、その上清を、分析するまで０．５ｍｌずつ−８０℃で保存した。
【０２５８】
ＰＧＥ2アッセイ
脳脊髄液サンプル中のＰＧＥ2およびＰＧＥ2代謝産物は、標準化された酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）プロトコル（Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA）を用いて分析した。
【０２５９】
タンパク質の分析（ＢＣＡアッセイ）
サンプル中のタンパク質レベルを決定するためにＢＣＡアッセイを行った。
【０２６０】
統計学的分析
臨床データは、そうでないことが明記されない限り、記載される目的についての中央値および四分位範囲で示されている。患者と対照の間の差を分析するのにマン・ホイットニー検定トを用いた。ＰＧＥ２代謝産物またはサイトカインレベルとＨＩＥまたは臨床評価の程度の間の関係を決定するのにクラスカル・ウォリス検定を使用した。
【０２６１】
結果
患者群（ｎ＝４３）を、ＨＩＥのサルナットおよびサルナットの分類に従い３つの下位グループに分けた。この分類によれば、１３名の乳児が軽度のＨＩＥ（ＨＩＥ  Ｉ）であり、その全員が正常アウトカムであった。１６名の乳児は中等度のＨＩＥ（ＨＩＥ  ＩＩ）であり、そのうちの８名の乳児が脳性麻痺、精神運動遅滞および痙攣の問題がある有害の神経学的アウトカムであり、さらに、２名の乳児は軽度の運動障害、６名は正常アウトカムであった。１４名の乳児は重度のＨＩＥ（ＨＩＥ  ＩＩＩ）であり、そのうちの８名は出産直後〜１２日目に死亡し、６名の患者は生存した上で、有害の神経学的アウトカム；痙性四肢麻痺性脳性麻痺、精神運動遅滞、小頭症および複雑型痙攣を有した。
【０２６２】
患者群および対照群の臨床データは以下の表４に示されている。在胎齢および出産時体重に関しては患者と対照の間に差がなかったが、５分アプガールスコアおよび臍動脈または初期患者ｐＨに関して差がみられた（ｐ＜０．００１）。アプガールスコアを、刺激（例えば乳児の鼻へのカテーテル挿入または乳児の足裏の摩擦）に対して得た。いずれの臨床データについても、患者群の間で差がみられなかった。血中ＣＲＰレベルは、対照および患者の両方において有意ではなかった。
【０２６３】
図７Ａに示されるように、出生時仮死の程度（５分および１０分アプガールスコア）および神経学的評価は、正期産児におけるＣＳＦ  ＰＧＥ2代謝産物レベルに相関する。
【０２６４】
同様に、図７Ｂに示されるように、ＰＧＥ２代謝産物はまた、新生児の状態の指標である出産５分後のアプガールスコアに相関し、したがって出生時の仮死の程度に相関する可能性がある。
【０２６５】
これらの結果は、ＰＧＥ2がヒト乳児における重度の低酸素（仮死）時に迅速に放出されること、したがって、新生児仮死を罹患した赤ん坊における診断ツールおよび／または治療的介入の標的として使用できることを示唆している。
【０２６６】
【表４】
2011503164.tif 000005
【０２６７】
実施例８−尿プロスタグランジン代謝産物、炎症および呼吸機能障害との相関
本発明者らは、三連四重極質量分析・テトラノルＰＧＥＭプロトコルを用いる尿プロスタグランジンＥ代謝産物（ｕ−ＰＧＥＭ）の高感度かつ特異的な検出方法を開発した。
バリデーション研究は、この三連四重極質量分析・テトラノルＰＧＥＭ法が、同じ被験者から採取したサンプル間で＜５％の実験内変動を示すことを示している。室温で保存した尿サンプルではＰＧＥ代謝産物が分解されることが見出され、そのｔ1/2をおよそ２時間と概算した。対照的に、４℃での直接保存は、サンプルの分解を有意に減少させた。−２０℃〜−８０℃で保存したサンプルは、サンプル間で比較した場合、見かけ上、ＰＧＥ代謝産物の分解を実質的に示さなかった。
【０２６８】
サンプルの調製
尿サンプルを、２％（ｖ／ｖ）の１Ｍクエン酸の添加によりｐＨ３．０付近まで酸性化した。次いで、１４５μｌの酸性尿アリコートを、エタノール中に９ｐｍｏｌ／μｌテトラノルＰＧＥＭ−ｄ６および０．４５ｐｍｏｌ／μｌ  １１β−ＰＧＦ２α−ｄ４を含有する５μｌの内部標準溶液でスパイクした。１００μｌをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ機器に注入した。標準曲線用および品質管理用のサンプルを、２％（ｖ／ｖ）の１Ｍクエン酸で酸性にしたＰＢＳを用いて準備した。次いで、１４０μｌの酸性ＰＢＳアリコートを、５μｌの内部標準溶液（上記参照）および５μｌの標準溶液（３０〜９００ｐｍｏｌ／μｌテトラノルＰＧＥＭおよび３〜９０ｐｍｏｌ／μｌ  １１β−ＰＧＦ２α）を用いてスパイクした。１００μｌをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ機器に注入し、１００〜３０００ｐｍｏｌテトラノルＰＧＥＭおよび１０〜３００ｐｍｏｌ  １１β−ＰＧＦ２αの標準曲線を得た。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件：分析物は、０．０００５％ＦＡを含むＨ2Ｏおよび移動相として０．０
００５％ＦＡを含むＡＣＮを用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ  ＲＰカラム（１００ｍｍ×２ｍｍ  ｉ．ｄ．、２．５μｍ粒子径および１００Å孔径）上で分離した。サンプル注入の直後に、１５〜６０％  ＡＣＮ、０．０００５％ＦＡの直線勾配を１５分間適用し、その後、９５％ＡＣＮ、０．０００５％  ＦＡで洗浄し、再平衡化した。総泳動時間は２１分間であった。質量分析器は、陰イオンモード、電気スプレー電圧−３０００Ｖ、３５０℃で作動させた。プロスタグランジン代謝産物の検出および定量のために、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用して、テトラノルＰＧＥＭについての３２７．１＞２５５．３およびテトラノルＰＧＥＭ−ｄ６の３３３．１＞２６３．３（分裂エネルギー７０Ｖ、衝突エネルギー−２０Ｖ、滞留時間１００ｍ秒）ならびに１１β−ＰＧＦ２α、−ＰＧＦ２αの３５３．３＞３０９．３および１１β−ＰＧＦ２α−ｄ４の３５７．３＞３１３．３（分裂エネルギー１５０Ｖ、衝突エネルギー−１５Ｖ、滞留時間１００ｍ秒）の遷移を記録した。全ての四重極は、最高感度を得る単一解像度で作動させた。
【０２６９】
本明細書に記載される結果は、成人、小児（１〜１６歳）および乳児（０〜１歳）から得られたｕ−ＰＧＥＭレベルの上昇が炎症の指標として信頼でき、呼吸機能障害（無呼吸を含む）と有意に関連することを示している。
【０２７０】
健常な成人対照由来の尿サンプル（ｎ＝１０）を、「閉塞性」睡眠時無呼吸症候群（ＯＳＡＳ）患者から得た尿サンプル（ｎ＝２４、２２〜５５歳）と比較した。睡眠に関係する無呼吸症候群（「閉塞性睡眠時無呼吸症候群」（ＯＳＡＳ）−いびき）は、成人女性の３％程度および成人男性の５％程度でみられると見積もられる。この結果は図８に示されており、ｙ軸は尿中のＰＧＥ代謝産物をピコモルＰＧＥＭ／μｇクレアチニンの単位で示している。閉塞性睡眠時無呼吸症候群と診断された全ての患者に対して、夜間睡眠ポリグラフ記録実験（night-time sleep polysomnographic recording Laboratory test）を行い、この中で、尿サンプルを睡眠ポリグラフ記録（呼吸および飽和を含む）後の朝に採取した。
【０２７１】
睡眠時無呼吸（いびき）群は、対照群よりもｕ−ＰＧＥＭレベルの多様性が有意に大きかった（大きな値の分散を観察した）。本発明者らは、ｕ−ＰＧＥＭレベルの上昇が無呼吸インデックス、すなわち無呼吸数／時間と相関する明確な傾向を観察した。さらに、重度のＯＳＡＳ患者は、無呼吸インデックスとＣＲＰ（炎症およびＰＧＥ2の間接的マーカー）の間で有意な相関を有した。
【０２７２】
睡眠時無呼吸を示した３名の成人のおよそ１名でｕ−ＰＧＥＭが上昇しており、これが無呼吸の重症度と相関していた。図８に示されるグループ間の比較はｐ＝０．１２を示した。しかし、重度の無呼吸問題を抱える患者のみを含め、閉塞性の問題（ＢＭＩ値＞過体重）を抱える患者を排除した場合、無呼吸とｕ−ＰＧＥＭレベルの間に有意な関連性がみられる。
【０２７３】
本発明者らは、無呼吸インデックスが高い個体を、ｕ−ＰＧＥＭが高い被験者（すなわち、対照レベルよりも高い対象、図８の点線の囲みを参照されたい）と重ねることができることを発見した。
【０２７４】
本発明者らは、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）の小児（３〜１６歳）におけるｕ−ＰＧＥＭレベルについても調査した。プラダー・ウィリー症候群（１５ｑ１１〜ｑ１３の欠失）の患者は、呼吸および心血管調節系に故障があり、特に睡眠中に無呼吸がみられる（１１５）。心肺の障害に起因する死は通常睡眠中に起こり、原因となる要因は特定されていないものの、３つの死亡例のうつ２つで軽度の感染エピソードが関係している（１０７）。
【０２７５】
我々は、ｍＰＧＥＳ−１経路の活性化が感染時に起こる潜在的に致死性の過度の呼吸の故障に関与しているという仮説をたてた（合わせてNature Medicine 2007, Vol.13, No.7, p.789, Research Highlights:“Baby's breath”も参照されたい）。
【０２７６】
既知の感染および炎症マーカーであるｈｓ−ＣＲＰ、ＣＲＰ、ＷＢＣおよびサイトカイン（ＩＬ−１β）ならびにＰＧＥ2の尿中代謝産物を、循環器疾患登録（cardiovascular registration）と平行して試験した。これを、プラダー・ウィリー症候群を患った乳児および成人に対して、１）定期年次身体検査時、２）感染の徴候（体温＞３８．５℃）から２４時間後および３）臨床的感染からの回復から少なくとも１週間後に行った。分析は主たる臨床研究室およびカロリンスカ・コアプロテオミクス施設の研究室において行い、三連四重極質量分析機器を用いて既知の代謝産物およびペプチドの定量を行った。
【０２７７】
ＰＷＳ小児は呼吸パターンおよび自律調節に故障があり、しばしば軽度の上気道感染を伴い突然死することが知られている（年間罹患率２〜３％）。図９に示されるように、ＰＷＳ小児（ｎ＝６）における尿中ＰＧＥＭレベルは、健常な対照小児と比較して有意に上昇することが見出された。図９において、ｙ軸は尿中のＰＧＥ代謝産物をピコモルＰＧＥＭ／μｇクレアチニンの単位で示している。この患者群（ＰＷＳ）におけるｕ−ＰＧＥＭレベルの上昇は、呼吸障害（特に無呼吸）、炎症およびＰＧＥ2（例えばｕ−ＰＧＥＭレベル）の間の関連性のさらなる証拠となる。これにより、（ＰＷＳを患ったまたは患っていない）小児から得たサンプル中のプロスタグランジン代謝産物（例えばｕ−ＰＧＥＭ）の増加が、呼吸障害、例えば無呼吸、ＯＳＡＳ、ＳＩＤＳおよび／もしくは炎症関連呼吸障害を患っているまたはそれらを発症する可能性が高いことを示すものであると考えることができる。さらに、感染に関連する呼吸機能障害を患った小児の部分集団は特に、呼吸障害とサンプル中のプロスタグランジン代謝産物（例えばｕ−ＰＧＥＭ）の増加の間で有意な相関を示す。この部分集団は、ａ）ＯＳＡＳおよび／またはｂ）自律神経機能障害の徴候、例えばＰＷＳ、レット症候群またはＣＣＨＳ（先天性中枢性低換気症候群、「オンディーヌの呪い」とも呼ばれる）と関連する徴候を有する小児を含む。
【０２７８】
さらに、本発明者らは、進行中の炎症、ウイルス性細気管支炎および随伴性の無呼吸がみられる乳児（ｎ＝１０）におけるｕ−ＰＧＥＭレベルを調査した。その結果は図１０に示されており、ｙ軸は尿中のＰＧＥ代謝産物をピコモルＰＧＥＭ／μｇクレアチニンの単位で示している。進行中の炎症および随伴性の無呼吸がみられる乳児群は、対照（ｎ＝１０、進行中の炎症または無呼吸がみられない乳児および小児）と比較して非常に高いｕ−ＰＧＥＭレベルを示した。さらに、日常的な臨床ケアにおいて感染の評価に広く使用されているＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）レベルはわずかに上昇したにすぎなかった。したがって、ｕ−ＰＧＥＭレベルの測定は、進行中の炎症を評価する上で、ＣＲＰの測定よりも有用であり、一部の乳児に見られる失調性の呼吸調節の潜在的なメカニズムを明らかにする。生後１〜６月の過敏な小児における炎症は、主として睡眠中の不規則な呼吸および無呼吸に関係しているようである。
【０２７９】
ウイルス感染（例えば、ウイルス性細気管支炎）は、重度の呼吸妨害および脳幹における「呼吸ペースメーカー」の中枢的抑制を引き起こす。しかし、このような感染は、典型的には、進行中の炎症障害の存在についての従来的なマーカーであるＣＲＰのわずかな増加しか引き起こさない。したがって、プロスタグランジン代謝産物（例えば、ｕ−ＰＧＥＭレベル）の測定は、感染の初期段階において潜在的な炎症および／または呼吸障害の示唆を提供すると考えられる。したがって、プロスタグランジン代謝産物レベルのアッセイは臨床の場で有益であり、医師が炎症の重症度、予後および可能な治療的介入を「ベッドの上で」決定することを可能にする。
【０２８０】
本明細書において引用した全ての参考文献は、個々の刊行物または特許または特許出願について特別かつ個別にその全体が参照により援用されることが示されているのと同程度に、それら全体をすべての目的のために参照により援用する。
【０２８１】
本明細書に記載される具体的な実施態様は例示の目的で提供されるものであり、限定を意図していない。本明細書中のあらゆる副題は利便性のためのみに含まれるのであり、いかなる様式によってもその開示内容を限定するものとみなすべきではない。
【０２８２】
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【０２８６】
本明細書中で参照された配列
【化１】
2011503164.tif 000006
【０２８７】
【化２】
2011503164.tif 000007
【０２８８】
【化３】
2011503164.tif 000008
【０２８９】
【化４】
2011503164.tif 000009
【０２９０】
【化５】
2011503164.tif 000010
【図１】
2011503164.tif 000011
【図２】
2011503164.tif 000012
【図３】
2011503164.tif 000013
【図４】
2011503164.tif 000014
【図５】
2011503164.tif 000015
【図６】
2011503164.tif 000016
【図７】
2011503164.tif 000017
【図８】
2011503164.tif 000018
【図９】
2011503164.tif 000019
【図１０】
2011503164.tif 000020
【配列表】
2011503164000001.app
【国際調査報告】
2011503164.tif 000021
2011503164.tif 000022
2011503164.tif 000023
2011503164.tif 000024
2011503164.tif 000025
2011503164.tif 000026
2011503164.tif 000027
2011503164.tif 000028
2011503164.tif 000029
2011503164.tif 000030