(57)【要約】  合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼによって認識および切断することができる二本鎖ＤＮＡを切断する方法が提供される。このような組換え核酸を含む組換え核酸、細胞、および生物体、ならびにこのようなメガヌクレアーゼを用いて作製される細胞および生物体もまた提供される。カスタム設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼビジネスを行う方法もまた提供される。【選択図】図２
2011527906.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＤＮＡを切断するための方法であって、
（ａ）Ｉ−ＣｒｅＩに対して変化した特異性を有する合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの少なくとも１つの認識部位を前記ＤＮＡ内に同定することであって、前記認識部位が天然のＩ−ＣｒｅＩによって切断されず、前記認識部位がＴＴＧＴ、ＴＴＡＴ、ＴＣＴＴ、ＴＣＧＴ、ＴＣＡＴ、ＧＴＴＴ、ＧＴＣＴ、ＧＧＡＴ、ＧＡＧＴ、ＧＡＡＴ、ＡＴＧＴ、ＴＴＴＣ、ＴＴＣＣ、ＴＧＡＣ、ＴＡＡＣ、ＧＴＴＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＧＧＣ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＣＴＧＣ、ＡＣＡＡ、ＡＴＡＡ、ＡＡＧＡ、ＡＣＧＡ、ＡＴＧＡ、ＡＡＡＣ、ＡＧＡＣ、ＡＴＣＣ、ＡＣＴＣ、ＡＴＴＣ、ＡＣＡＴ、ＧＡＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＴＣＡ、ＧＴＴＡ、ＧＡＡＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＣＣＣ、ＧＣＧＴ、ＧＣＧＧ、およびＧＣＡＧからなる群から選択される４塩基対中央配列を有することと、
（ｂ）前記合理的設計されたメガヌクレアーゼを提供することと、
（ｃ）前記ＤＮＡを前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼと接触させることと
を含み、
それにより前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼが前記ＤＮＡを切断する、二本鎖ＤＮＡを切断するための方法。
【請求項２】
二本鎖ＤＮＡを切断するための方法であって、
（ａ）Ｉ−ＣｒｅＩに対して変化した特異性を有する合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの認識部位を前記ＤＮＡに導入することであって、前記認識部位が天然のＩ−ＣｒｅＩによって切断されず、前記認識部位が、ＴＴＧＴ、ＴＴＡＴ、ＴＣＴＴ、ＴＣＧＴ、ＴＣＡＴ、ＧＴＴＴ、ＧＴＣＴ、ＧＧＡＴ、ＧＡＧＴ、ＧＡＡＴ、ＡＴＧＴ、ＴＴＴＣ、ＴＴＣＣ、ＴＧＡＣ、ＴＡＡＣ、ＧＴＴＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＧＧＣ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＣＴＧＣ、ＡＣＡＡ、ＡＴＡＡ、ＡＡＧＡ、ＡＣＧＡ、ＡＴＧＡ、ＡＡＡＣ、ＡＧＡＣ、ＡＴＣＣ、ＡＣＴＣ、ＡＴＴＣ、ＡＣＡＴ、ＧＡＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＴＣＡ、ＧＴＴＡ、ＧＡＡＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＣＣＣ、ＧＣＧＴ、ＧＣＧＧ、およびＧＣＡＧからなる群から選択される４塩基対中央配列を有することと、
（ｂ）前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼを提供することと、
（ｃ）前記ＤＮＡを前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼと接触させることとを含み、
それにより前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼが前記ＤＮＡを切断する、二本鎖ＤＮＡを切断するための方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ切断がインビトロである、請求項１から請求項２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡが、ＰＣＲ産物、人工染色体、細菌、真菌、植物、または動物細胞から単離されたゲノムＤＮＡ、およびウイルスＤＮＡからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ切断がインビボである、請求項１から請求項２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡが、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される細胞内に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡが、プラスミド、プロファージ、および染色体からなる群から選択される核酸内に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記４塩基対ＤＮＡ配列が、ＧＴＧＴ、ＧＴＡＴ、ＴＴＡＧ、ＧＴＡＧ、ＴＴＡＣ、ＴＣＴＣ、ＴＣＡＣ、ＧＴＣＣ、ＧＴＡＣ、ＴＣＧＣ、ＡＡＧＣ、ＧＡＧＣ、ＧＣＧＣ、ＧＴＧＣ、ＴＡＧＣ、ＴＴＧＣ、ＡＴＧＣ、ＡＣＡＣ、ＡＴＡＣ、ＣＴＡＡ、ＣＴＡＣ、ＧＴＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＴＧＡ、ＧＧＡＣ、ＧＴＡＣ、ＧＣＧＡ、ＧＣＴＴ、ＧＣＴＣ、ＧＣＧＣ、ＧＣＡＣ、ＧＣＴＡ、ＧＣＡＡ、およびＧＣＡＴからなる群から選択される、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記認識部位を認識するように、前記Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを合理的に設計することをさらに含む、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを製造することをさらに含む、請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
核酸で形質転換された細胞であって、
ａ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第１のドメインによって結合されうる第１の９塩基対ＤＮＡ配列と、
ｂ）ＧＴＧＴ、ＧＴＡＴ、ＴＴＡＧ、ＧＴＡＧ、ＴＴＡＣ、ＴＣＴＣ、ＴＣＡＣ、ＧＴＣＣ、ＧＴＡＣ、ＴＣＧＣ、ＡＡＧＣ、ＧＡＧＣ、ＧＣＧＣ、ＧＴＧＣ、ＴＡＧＣ、ＴＴＧＣ、ＡＴＧＣ、ＡＣＡＣ、ＡＴＡＣ、ＣＴＡＡ、ＣＴＡＣ、ＧＴＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＴＧＡ、ＧＧＡＣ、ＧＴＡＣ、ＧＣＧＡ、ＧＣＴＴ、ＧＣＴＣ、ＧＣＧＣ、ＧＣＡＣ、ＧＣＴＡ、ＧＣＡＡ、およびＧＣＡＴからなる群から選択される４塩基対ＤＮＡ配列と、
ｃ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第２のドメインによって結合されうる第２の９塩基対ＤＮＡ配列であって、第１に対して逆配向にある第２の９塩基対ＤＮＡ配列と、をこの順番で含む、細胞。
【請求項１２】
細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸配列を含む細胞であって、
ａ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第１のドメインによって結合されうる第１の外因性９塩基対ＤＮＡ配列と、
ｂ）ＧＴＧＴ、ＧＴＡＴ、ＴＴＡＧ、ＧＴＡＧ、ＴＴＡＣ、ＴＣＴＣ、ＴＣＡＣ、ＧＴＣＣ、ＧＴＡＣ、ＴＣＧＣ、ＡＡＧＣ、ＧＡＧＣ、ＧＣＧＣ、ＧＴＧＣ、ＴＡＧＣ、ＴＴＧＣ、ＡＴＧＣ、ＡＣＡＣ、ＡＴＡＣ、ＣＴＡＡ、ＣＴＡＣ、ＧＴＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＴＧＡ、ＧＧＡＣ、ＧＴＡＣ、ＧＣＧＡ、ＧＣＴＴ、ＧＣＴＣ、ＧＣＧＣ、ＧＣＡＣ、ＧＣＴＡ、ＧＣＡＡ、およびＧＣＡＴからなる群から選択される外因性４塩基対ＤＮＡ配列と、
ａ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第２のドメインによって結合されうる第２の外因性９塩基対ＤＮＡ配列であって、第１に対して逆配向にある第２の９塩基対ＤＮＡ配列と、をこの順番で含む、細胞。
【請求項１３】
前記核酸がプラスミドである、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１４】
前記核酸が人工染色体である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１５】
前記核酸が細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１６】
前記核酸がウイルス核酸である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１７】
ヒト細胞、非ヒト動物細胞、植物細胞、細菌細胞、および真菌細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１８】
前記４塩基対ＤＮＡ配列が、ＴＴＧＴ、ＴＴＡＴ、ＴＣＴＴ、ＴＣＧＴ、ＴＣＡＴ、ＧＴＴＴ、ＧＴＣＴ、ＧＧＡＴ、ＧＡＧＴ、ＧＡＡＴ、ＡＴＧＴ、ＴＴＴＣ、ＴＴＣＣ、ＴＧＡＣ、ＴＡＡＣ、ＧＴＴＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＧＧＣ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＣＴＧＣ、ＡＣＡＡ、ＡＴＡＡ、ＡＡＧＡ、ＡＣＧＡ、ＡＴＧＡ、ＡＡＡＣ、ＡＧＡＣ、ＡＴＣＣ、ＡＣＴＣ、ＡＴＴＣ、ＡＣＡＴ、ＧＡＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＴＣＡ、ＧＴＴＡ、ＧＡＡＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＣＣＣ、ＧＣＧＴ、ＧＣＧＧ、およびＧＣＡＧからなる群から選択される、請求項１１から請求項１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
前記４塩基対ＤＮＡ配列が、ＧＴＧＴ、ＧＴＡＴ、ＴＴＡＧ、ＧＴＡＧ、ＴＴＡＣ、ＴＣＴＣ、ＴＣＡＣ、ＧＴＣＣ、ＧＴＡＣ、ＴＣＧＣ、ＡＡＧＣ、ＧＡＧＣ、ＧＣＧＣ、ＧＴＧＣ、ＴＡＧＣ、ＴＴＧＣ、ＡＴＧＣ、ＡＣＡＣ、ＡＴＡＣ、ＣＴＡＡ、ＣＴＡＣ、ＧＴＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＴＧＡ、ＧＧＡＣ、ＧＴＡＣ、ＧＣＧＡ、ＧＣＴＴ、ＧＣＴＣ、ＧＣＧＣ、ＧＣＡＣ、ＧＣＴＡ、ＧＣＡＡ、およびＧＣＡＴからなる群から選択される、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
カスタム設計されるＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼビジネスを行う方法であって、
（ａ）合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼにより二本鎖切断が導入されることになっているＤＮＡ配列を受け取ることと、
（ｂ）Ｉ−ＣｒｅＩに対して変化した特異性を有する合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの少なくとも１つの認識部位を前記ＤＮＡ配列内に同定することであって、前記認識部位が天然のＩ−ＣｒｅＩによって切断されず、前記認識部位が、ＴＴＧＴ、ＴＴＡＴ、ＴＣＴＴ、ＴＣＧＴ、ＴＣＡＴ、ＧＴＴＴ、ＧＴＣＴ、ＧＧＡＴ、ＧＡＧＴ、ＧＡＡＴ、ＡＴＧＴ、ＴＴＴＣ、ＴＴＣＣ、ＴＧＡＣ、ＴＡＡＣ、ＧＴＴＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＧＧＣ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＣＴＧＣ、ＡＣＡＡ、ＡＴＡＡ、ＡＡＧＡ、ＡＣＧＡ、ＡＴＧＡ、ＡＡＡＣ、ＡＧＡＣ、ＡＴＣＣ、ＡＣＴＣ、ＡＴＴＣ、ＡＣＡＴ、ＧＡＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＴＣＡ、ＧＴＴＡ、ＧＡＡＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＣＣＣ、ＧＣＧＴ、ＧＣＧＧ、およびＧＣＡＧからなる群から選択される４塩基対中央配列を有する、同定することと、
（ｃ）前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼを提供することと
を含む、カスタム設計されるＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼビジネスを行う方法。
【請求項２１】
前記認識部位を認識するように、前記Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを合理的に設計することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼを製造することをさらに含む、請求項２０から請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼが、前記ＤＮＡが受け取られている同じ当事者に提供される、請求項２０から請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および組換え核酸テクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、非天然の合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来ホーミングエンドヌクレアーゼにより認識および切断することができるＤＮＡ配列ならびにそれを用いる方法に関する。本発明はまた、このようなＤＮＡ部位を切断するこのようなメガヌクレアーゼを用いて、組換え核酸、細胞、および生物体を作製する方法に関する。本発明はさらに、カスタム設計されるＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼビジネスを行う方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年７月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／０８０，４５３号の優先権の恩典を主張し、その米国仮特許出願の全開示は全体として本明細書に参照により組み入れられている。
【背景技術】
【０００３】
ゲノム工学は、ゲノム内の特定の遺伝子配列を挿入する、欠失させる、置換する、および別の方法で操作する能力を必要とし、多数の治療的およびバイオテクノロジー的適用がある。ゲノム改変のための効果的手段の開発は、依然として、遺伝子治療、農業科学技術、および合成生物学における主な目標である（Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３、Ｔｚｆｉｒａら（２００５）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５６７−９、ＭｃＤａｎｉｅｌら（２００５）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４７６−８３）。ＤＮＡ配列を挿入または改変するための通常の方法は、ゲノム標的に相同である配列に隣接したトランスジェニックＤＮＡ配列を導入することと、成功した相同組換え事象を選択またはスクリーニングすることを含む。トランスジェニックＤＮＡでの組換えはめったに起こらないが、標的部位のゲノムＤＮＡにおける二本鎖切断によって刺激することができる。ＤＮＡ二本鎖切断を生じさせるのに、照射および化学的処理を含む多数の方法が用いられている。これらの方法は組換えを効率的に刺激するが、二本鎖切断は、ゲノム中でランダムに散在し、それが高い変異原性および毒性でありうる。現在、遺伝子改変を染色体バックグラウンド内の特異部位を標的にできないことが、ゲノム工学成功への主な障害である。
【０００４】
この目標を達成するための一つのアプローチは、ゲノム内の単一部位のみに存在するのに十分大きい配列に対する特異性を有するヌクレアーゼを用いて、標的座位中の二本鎖切断での相同組換えを刺激することである（例えば、Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３参照）。このストラテジーの有効性は、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ制限酵素の非特異的ヌクレアーゼドメインとの間のキメラ融合を用いて様々な生物体で実証されている（Ｐｏｒｔｅｕｓ（２００６）、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：４３８−４６、Ｗｒｉｇｈｔら（２００５）、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４４：６９３−７０５、Ｕｒｎｏｖら（２００５）、Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−５１）。これらの人工ジンクフィンガーヌクレアーゼは、部位特異的組換えを刺激するが、それらは、そのヌクレアーゼドメインの制御下に起因する残存の非特異的切断活性を保持し、意図せぬ部位で切断することが多い（Ｓｍｉｔｈら（２０００）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３３６１−９）。このような意図せぬ切断は、処理された生物体に突然変異および毒性を引き起こしうる（Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３）。
【０００５】
植物および真菌のゲノムによく見出される１５〜４０塩基対の切断部位を認識する一群の天然ヌクレアーゼは、毒性の少ないゲノム工学の代替法を提供する可能性がある。このような「メガヌクレアーゼ」または「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、グループ１自己スプライシングイントロンおよびインテインなどの寄生性ＤＮＡエレメントと関連していることが多い。それらは、自然には、染色体において二本鎖切断を起こし、それが細胞ＤＮＡ修復機構を漸加することによって宿主ゲノム中の特定の位置に相同組換えまたは遺伝子挿入を促進する（Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６）、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９−９５）。メガヌクレアーゼは一般に、以下の４つのファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリー、およびＨＮＨファミリー。これらのファミリーは、触媒活性および認識配列に影響する構造モチーフによって特徴づけられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの１つかまたは２つのいずれかのコピーを有することによって特徴づけられる（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７−３７７４参照）。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの単一のコピーを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、ホモ二量体を形成し、一方、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの２つのコピーを有するメンバーは単量体として見出される。
【０００６】
主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来の、天然メガヌクレアーゼは、植物、酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、哺乳類細胞、およびマウスにおいて部位特異的ゲノム改変を効果的に促進するために用いられているが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同遺伝子か（Ｍｏｎｎａｔら（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５：８８−９３）かまたは認識配列が導入されているあらかじめ操作されたゲノムかのいずれかの改変に限定されている（Ｒｏｕｅｔら（１９９４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８０９６−１０６、Ｃｈｉｌｔｏｎら（２００３）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３３：９５６−６５、Ｐｕｃｈｔａら（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５０５５−６０、Ｒｏｎｇら（２００２）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：１５６８−８１、Ｇｏｕｂｌｅら（２００６）、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．８（５）：６１６−６２２）。
【０００７】
ヌクレアーゼ刺激型遺伝子改変の系統的な実行は、ＤＮＡ切断をゲノム中の既存の部位にターゲットするカスタマイズされた特異性を有する操作された酵素の使用を必要とし、それゆえに、医学的またはバイオテクノロジー的に関連した部位に遺伝子改変を促進するようにメガヌクレアーゼを適応させることに大きな関心が集まっている（Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３、Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１、Ｅｐｉｎａｔら（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２）。
【０００８】
Ｉ−ＣｒｅＩ（配列番号：１）は、葉緑体染色体中の２２塩基対の認識配列を認識および切断し、かつメガヌクレアーゼ再設計のための魅力的な標的を提供するＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーである。遺伝子選択技術は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識部位優先度を改変するために用いられている（Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１、Ｃｈａｍｅｓら（２００５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８、Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３８７０−９、Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−５８）。最近になって、Ｉ−ＣｒｅＩおよび他のこのようなメガヌクレアーゼを、哺乳類、酵母、植物、細菌、およびウイルスのゲノム内の部位を含む幅広く多岐にわたるＤＮＡ部位を標的にするように包括的に再設計する能力がある、モノＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記載された（国際公開第２００７／０４７８５９号）。
【０００９】
Ｉ−ＣｒｅＩによって認識されるＤＮＡ配列は、長さが２２個の塩基対である。天然Ｉ−ＣｒｅＩ認識部位の一つの例は、配列番号：２および配列番号：３に提供されているが、その酵素は、様々な関連配列に様々な親和性で結合するであろう。その酵素は、ＤＮＡをホモ二量体として結合し、そのホモ二量体において、各単量体が９塩基対の「半分部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）」と直接的に接触しており、２つの半分部位が、酵素と直接的には接触しない４個の塩基対で隔てられている（図１Ａ）。全てのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーメガヌクレアーゼのように、Ｉ−ＣｒｅＩは、４塩基対の３’−オーバーハングの生成を結果として生じる、その認識配列の中央にねじれ型二本鎖切断を生じる（配列番号１ａ）。本発明は、Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列中の中央の４個の塩基対（すなわち、Ｉ−ＣｒｅＩ切断後に３’オーバーハングになる４個の塩基対、または図１Ｂの「中央配列」）に関する。コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子内の天然Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列の場合、この４塩基対配列は５’−ＧＴＧＡ−３’である。野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列から逸脱するＤＮＡ配列を認識する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを作製するために、４塩基対の中央配列が野生型配列から逸脱しうる程度を知ることが望ましい。Ｉ−ＣｒｅＩまたはその誘導体に関するいくつかの発表された研究は、天然の５’−ＧＴＧＡ−３’中央配列かまたはパリンドローム配列５’−ＧＴＡＣ−３’かのいずれかを使用するＤＮＡ基質を用いて、野生型かまたは遺伝子操作されたかのいずれかのその酵素を評価した。最近、Ａｒｎｏｕｌｄら（Ａｒｎｏｕｌｄら（２００７）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７１：４９−６５）は、Ｉ−ＣｒｅＩ由来の１セットの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、基質配列が５’−ＧＴＡＣ−３’、５’−ＴＴＧＡ−３’、５’−ＧＡＡＡ−３’、または５’−ＡＣＡＣ−３’（切断効率：ＧＴＡＣ＞ＡＣＡＣ＞＞ＴＴＧＡ≒ＧＡＡＡ）を中央とするかどうかに依存する様々な効率でＤＮＡ基質を切断することを報告した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００７／０４７８５９号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３
【非特許文献２】Ｔｚｆｉｒａら（２００５）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５６７−９
【非特許文献３】ＭｃＤａｎｉｅｌら（２００５）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４７６−８３
【非特許文献４】Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３
【非特許文献５】Ｐｏｒｔｅｕｓ（２００６）、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：４３８−４６
【非特許文献６】Ｗｒｉｇｈｔら（２００５）、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４４：６９３−７０５
【非特許文献７】Ｕｒｎｏｖら（２００５）、Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−５１
【非特許文献８】Ｓｍｉｔｈら（２０００）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３３６１−９
【非特許文献９】Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３
【非特許文献１０】Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６）、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９−９５
【非特許文献１１】Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７−３７７４
【非特許文献１２】Ｍｏｎｎａｔら（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５：８８−９３
【非特許文献１３】Ｒｏｕｅｔら（１９９４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８０９６−１０６
【非特許文献１４】Ｃｈｉｌｔｏｎら（２００３）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３３：９５６−６５
【非特許文献１５】Ｐｕｃｈｔａら（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５０５５−６０
【非特許文献１６】Ｒｏｎｇら（２００２）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：１５６８−８１
【非特許文献１７】Ｇｏｕｂｌｅら（２００６）、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．８（５）：６１６−６２２
【非特許文献１８】Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３
【非特許文献１９】Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１
【非特許文献２０】Ｅｐｉｎａｔら（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２
【非特許文献２１】Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１
【非特許文献２２】Ｃｈａｍｅｓら（２００５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８
【非特許文献２３】Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３８７０−９
【非特許文献２４】Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−５８
【非特許文献２５】Ａｒｎｏｕｌｄら（２００７）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７１：４９−６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ（以下、「Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ」）による切断の効率的な基質として働くことができるＤＮＡ認識配列のサブセットの同定および特徴づけに一部、基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様において、本発明は、Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼによって切断することができ、かつＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼによるより効率的な切断に寄与する４塩基対ＤＮＡ中央配列の限定されたセットの１つをそれらの中央に有する、２２塩基対ＤＮＡ配列のセットを同定する方法を提供する。本発明はまた、Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの基質として認識配列を利用することによって組換え核酸、細胞、および生物体を作製するためにこのようなＤＮＡ配列を用いる方法、ならびにこのようなＤＮＡ配列を組み入れた産物を提供する。
【００１４】
したがって、一態様において、本発明は、二本鎖ＤＮＡを切断するための方法であって、（ａ）Ｉ−ＣｒｅＩに対して変化した特異性を有する合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの少なくとも１つの認識部位を前記ＤＮＡ内に同定することであって、前記認識部位が天然のＩ−ＣｒｅＩによって切断されず、前記認識部位が、ＴＴＧＴ、ＴＴＡＴ、ＴＣＴＴ、ＴＣＧＴ、ＴＣＡＴ、ＧＴＴＴ、ＧＴＣＴ、ＧＧＡＴ、ＧＡＧＴ、ＧＡＡＴ、ＡＴＧＴ、ＴＴＴＣ、ＴＴＣＣ、ＴＧＡＣ、ＴＡＡＣ、ＧＴＴＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＧＧＣ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＣＴＧＣ、ＡＣＡＡ、ＡＴＡＡ、ＡＡＧＡ、ＡＣＧＡ、ＡＴＧＡ、ＡＡＡＣ、ＡＧＡＣ、ＡＴＣＣ、ＡＣＴＣ、ＡＴＴＣ、ＡＣＡＴ、ＧＡＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＴＣＡ、ＧＴＴＡ、ＧＡＡＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＣＣＣ、ＧＣＧＴ、ＧＣＧＧ、およびＧＣＡＧからなる群から選択される４塩基対中央配列を有する、同定することと、（ｂ）前記合理的設計されたメガヌクレアーゼを提供することと、（ｃ）前記ＤＮＡを前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼと接触させることと、を含み、それにより前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼが前記ＤＮＡを切断する、二本鎖ＤＮＡを切断するための方法を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、二本鎖ＤＮＡを切断するための方法であって、（ａ）Ｉ−ＣｒｅＩに対して変化した特異性を有する合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの認識部位を前記ＤＮＡに導入することであって、前記認識部位が天然のＩ−ＣｒｅＩによって切断されず、前記認識部位が、ＴＴＧＴ、ＴＴＡＴ、ＴＣＴＴ、ＴＣＧＴ、ＴＣＡＴ、ＧＴＴＴ、ＧＴＣＴ、ＧＧＡＴ、ＧＡＧＴ、ＧＡＡＴ、ＡＴＧＴ、ＴＴＴＣ、ＴＴＣＣ、ＴＧＡＣ、ＴＡＡＣ、ＧＴＴＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＧＧＣ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＣＴＧＣ、ＡＣＡＡ、ＡＴＡＡ、ＡＡＧＡ、ＡＣＧＡ、ＡＴＧＡ、ＡＡＡＣ、ＡＧＡＣ、ＡＴＣＣ、ＡＣＴＣ、ＡＴＴＣ、ＡＣＡＴ、ＧＡＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＴＣＡ、ＧＴＴＡ、ＧＡＡＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＣＣＣ、ＧＣＧＴ、ＧＣＧＧ、およびＧＣＡＧからなる群から選択される４塩基対中央配列を有する、導入することと、（ｂ）前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼを提供することと、ならびに（ｃ）前記ＤＮＡを前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼと接触させることと、を含み、それにより前記合理的に設計されたメガヌクレアーゼが前記ＤＮＡを切断する、二本鎖ＤＮＡを切断するための方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、４塩基対ＤＮＡ配列は、ＧＴＧＴ、ＧＴＡＴ、ＴＴＡＧ、ＧＴＡＧ、ＴＴＡＣ、ＴＣＴＣ、ＴＣＡＣ、ＧＴＣＣ、ＧＴＡＣ、ＴＣＧＣ、ＡＡＧＣ、ＧＡＧＣ、ＧＣＧＣ、ＧＴＧＣ、ＴＡＧＣ、ＴＴＧＣ、ＡＴＧＣ、ＡＣＡＣ、ＡＴＡＣ、ＣＴＡＡ、ＣＴＡＣ、ＧＴＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＴＧＡ、ＧＧＡＣ、ＧＴＡＣ、ＧＣＧＡ、ＧＣＴＴ、ＧＣＴＣ、ＧＣＧＣ、ＧＣＡＣ、ＧＣＴＡ、ＧＣＡＡ、およびＧＣＡＴからなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ切断はインビトロである。他の実施形態において、ＤＮＡ切断はインビボである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ＰＣＲ産物、人工染色体、細菌、真菌、植物、または動物細胞から単離されたゲノムＤＮＡ、およびウイルスＤＮＡからなる群から選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される細胞内に存在する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、プラスミド、プロファージ、および染色体からなる群から選択される核酸内に存在する。
【００２１】
特定の実施形態において、方法は、認識部位を認識するようにＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを合理的に設計することをさらに含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、方法は、合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを製造することをさらに含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は、核酸で形質転換された細胞であって、ａ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第１のドメインによって結合されうる第１の９塩基対ＤＮＡ配列と、ｂ）ＧＴＧＴ、ＧＴＡＴ、ＴＴＡＧ、ＧＴＡＧ、ＴＴＡＣ、ＴＣＴＣ、ＴＣＡＣ、ＧＴＣＣ、ＧＴＡＣ、ＴＣＧＣ、ＡＡＧＣ、ＧＡＧＣ、ＧＣＧＣ、ＧＴＧＣ、ＴＡＧＣ、ＴＴＧＣ、ＡＴＧＣ、ＡＣＡＣ、ＡＴＡＣ、ＣＴＡＡ、ＣＴＡＣ、ＧＴＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＴＧＡ、ＧＧＡＣ、ＧＴＡＣ、ＧＣＧＡ、ＧＣＴＴ、ＧＣＴＣ、ＧＣＧＣ、ＧＣＡＣ、ＧＣＴＡ、ＧＣＡＡ、およびＧＣＡＴからなる群から選択される４塩基対ＤＮＡ配列と、ｃ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第２のドメインによって結合されうる第２の９塩基対ＤＮＡ配列であって、第１に対して逆配向にある第２の９塩基対ＤＮＡ配列と、をこの順番で含む、形質転換された細胞を提供する。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸配列を含む細胞であって、ａ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第１のドメインによって結合されうる第１の外因性９塩基対ＤＮＡ配列と、ｂ）ＧＴＧＴ、ＧＴＡＴ、ＴＴＡＧ、ＧＴＡＧ、ＴＴＡＣ、ＴＣＴＣ、ＴＣＡＣ、ＧＴＣＣ、ＧＴＡＣ、ＴＣＧＣ、ＡＡＧＣ、ＧＡＧＣ、ＧＣＧＣ、ＧＴＧＣ、ＴＡＧＣ、ＴＴＧＣ、ＡＴＧＣ、ＡＣＡＣ、ＡＴＡＣ、ＣＴＡＡ、ＣＴＡＣ、ＧＴＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＴＧＡ、ＧＧＡＣ、ＧＴＡＣ、ＧＣＧＡ、ＧＣＴＴ、ＧＣＴＣ、ＧＣＧＣ、ＧＣＡＣ、ＧＣＴＡ、ＧＣＡＡ、およびＧＣＡＴからなる群から選択される外因性４塩基対ＤＮＡ配列と、ａ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第２のドメインによって結合されうる第２の外因性９塩基対ＤＮＡ配列であって、第１に対して逆配向にある第２の９塩基対ＤＮＡ配列と、をこの順番で含む、外因性核酸配列を含む細胞を提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、核酸は、プラスミド、人工染色体、またはウイルス核酸である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、細胞は、非ヒト動物細胞、植物細胞、細菌細胞、または真菌細胞である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、４塩基対ＤＮＡ配列は、ＴＴＧＴ、ＴＴＡＴ、ＴＣＴＴ、ＴＣＧＴ、ＴＣＡＴ、ＧＴＴＴ、ＧＴＣＴ、ＧＧＡＴ、ＧＡＧＴ、ＧＡＡＴ、ＡＴＧＴ、ＴＴＴＣ、ＴＴＣＣ、ＴＧＡＣ、ＴＡＡＣ、ＧＴＴＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＧＧＣ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＣＴＧＣ、ＡＣＡＡ、ＡＴＡＡ、ＡＡＧＡ、ＡＣＧＡ、ＡＴＧＡ、ＡＡＡＣ、ＡＧＡＣ、ＡＴＣＣ、ＡＣＴＣ、ＡＴＴＣ、ＡＣＡＴ、ＧＡＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＴＣＡ、ＧＴＴＡ、ＧＡＡＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＣＣＣ、ＧＣＧＴ、ＧＣＧＧ、またはＧＣＡＧである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、４塩基対ＤＮＡ配列は、ＧＴＧＴ、ＧＴＡＴ、ＴＴＡＧ、ＧＴＡＧ、ＴＴＡＣ、ＴＣＴＣ、ＴＣＡＣ、ＧＴＣＣ、ＧＴＡＣ、ＴＣＧＣ、ＡＡＧＣ、ＧＡＧＣ、ＧＣＧＣ、ＧＴＧＣ、ＴＡＧＣ、ＴＴＧＣ、ＡＴＧＣ、ＡＣＡＣ、ＡＴＡＣ、ＣＴＡＡ、ＣＴＡＣ、ＧＴＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＴＧＡ、ＧＧＡＣ、ＧＴＡＣ、ＧＣＧＡ、ＧＣＴＴ、ＧＣＴＣ、ＧＣＧＣ、ＧＣＡＣ、ＧＣＴＡ、ＧＣＡＡ、またはＧＣＡＴである。
【００２９】
さらに別の態様において、本発明は、カスタム設計されるＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼビジネスを行う方法であって、（ａ）合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼにより二本鎖切断が導入されることになっているＤＮＡ配列を受け取ることと、（ｂ）Ｉ−ＣｒｅＩに対して変化した特異性を有する合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの少なくとも１つの認識部位をＤＮＡ配列内に同定することであって、前記認識部位が天然のＩ−ＣｒｅＩによって切断されず、前記認識部位が、ＴＴＧＴ、ＴＴＡＴ、ＴＣＴＴ、ＴＣＧＴ、ＴＣＡＴ、ＧＴＴＴ、ＧＴＣＴ、ＧＧＡＴ、ＧＡＧＴ、ＧＡＡＴ、ＡＴＧＴ、ＴＴＴＣ、ＴＴＣＣ、ＴＧＡＣ、ＴＡＡＣ、ＧＴＴＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＧＧＣ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＣＴＧＣ、ＡＣＡＡ、ＡＴＡＡ、ＡＡＧＡ、ＡＣＧＡ、ＡＴＧＡ、ＡＡＡＣ、ＡＧＡＣ、ＡＴＣＣ、ＡＣＴＣ、ＡＴＴＣ、ＡＣＡＴ、ＧＡＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＴＣＡ、ＧＴＴＡ、ＧＡＡＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＣＣＣ、ＧＣＧＴ、ＧＣＧＧ、およびＧＣＡＧからなる群から選択される４塩基対中央配列を有する、同定することと、（ｃ）合理的に設計されたメガヌクレアーゼを提供することと、を含む、カスタム設計されるＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼビジネスを行う方法を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、方法は、前記認識部位を認識するようにＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを合理的に設計することをさらに含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、方法は、合理的に設計されたメガヌクレアーゼを製造することをさらに含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ配列が受け取られている同じ当事者に提供される。
【００３３】
これらを始めとする本発明の態様および実施形態は、以下の発明の詳細な説明、図、および添付された特許請求の範囲から当業者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】結晶学的データに基づいた、天然のＩ−ＣｒｅＩホモ二量体と二本鎖認識配列との間の相互作用の概略図である。この概略表示は、２つの長円形として示されたホモ二量体によって結合される、図解目的として、巻かれていないように示された１つの認識配列（配列番号：２および配列番号：３）を示す。それぞれのＤＮＡ半分部位の塩基は−１から−９まで番号づけられ、認識表面を形成するＩ−ＣｒｅＩのアミノ酸残基は、一文字アミノ酸表記によって示され、数字は残基位置を示している。中央配列を含む４個の塩基対は＋１から＋４まで番号づけられている。黒色の実線：ＤＮＡ塩基への水素結合。
【図１Ｂ】逆位の半分部位および中央配列の位置を示す１つの野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列（配列番号：２および配列番号：３）である。
【図２Ａ】中央配列優先度を決定するために評価されるプラスミド基質の概略図である。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼＤＪ１の可能性のある認識配列を有する１セットのｐＵＣ−１９プラスミドを作製した。これらの可能性のある認識配列は、下記のように、様々な異なる（＋１から＋４まで番号づけられた）４塩基対中央配列によって隔てられた１対の逆位ＤＪ１半分部位を含んだ。
【図２Ｂ】（Ａ）に記載されたプラスミド基質のＤＪ１メガヌクレアーゼ切断を示すゲル電気泳動データの例である。「切断しない」の矢印は、ＸｍｎＩ直線化プラスミド基質を示す。「切断する」の矢印は、ＤＪ１によっても切断に成功しているＸｍｎＩ直線化プラスミド基質を示す。
【図３Ａ】実施例１に記載されているように、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ゲノムへ安定的に組み込まれたＴ−ＤＮＡの概略図である。このＴ−ＤＮＡ構築物において、遺伝子操作されたＢＲＰ２メガヌクレアーゼ（ＢＲＰ２）（配列番号：８）をコードするコドン最適化遺伝子は、Ｈｓｐ７０プロモーター（ＨＳＰ）およびＮＯＳターミネータ（ＴＥＲＭ）の制御下にある。１対の可能性のあるＢＲＰ２認識配列（部位１、部位２）は、ターミネータに隣接して、ＰｓｔＩ制限酵素部位（ＰｓｔＩ）を含む７個の塩基対によって隔てられて収容されている。カナマイシン抵抗性マーカー（Ｋａｎ）もまた、安定な形質転換体の選択を可能にするためにＴ−ＤＮＡ上に収容されている。
【図３Ｂ】介在する７塩基対断片およびＰｓｔＩ制限酵素部位の喪失を示す、部位１および部位２のＢＲＰ２メガヌクレアーゼ切断後の予想される生成物である。矢印は、Ｔ−ＤＮＡの切断についてスクリーニングするために用いられるＰＣＲプライマーの位置を示す。
【図３Ｃ】ＧＴＡＣ構築物（ＧＴＡＣ）またはＴＡＧＡ構築物（ＴＡＧＡ）のいずれかに収容されたＢＲＰ２認識配列の配列であり、中央配列は下線が引かれている。
【図３Ｄ】ＧＴＡＣ構築物で形質転換された植物からの電気泳動データの例である。ＢＲＰ２発現を誘導するための２時間の「熱ショック」の前および後に、いずれもＧＴＡＣ  Ｔ−ＤＮＡ構築物で安定的に形質転換されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）実生の葉からゲノムＤＮＡを単離した。その後、（Ｂ）に示されたプライマーを用いるＰＣＲ反応にＤＮＡ試料を加えた。ＰＣＲ反応物をＰｓｔＩで消化し、ゲル電気泳動によって可視化した。Ｃ：ＰｓｔＩを欠く対照レーンである。４４、４５、および４６：熱ショック前に採取された試料におけるＰｓｔＩによるほとんど完全な消化（−レーン）、および熱ショック後採取された試料におけるＰｓｔＩによるわずかな消化（＋レーン）を示す、３つの代表的な植物由来のＰＣＲ試料。これらの結果は、ＢＲＰ２メガヌクレアーゼが、ＧＴＡＣ中央配列を組み入れたＢＲＰ２認識配列をインビボで切断することができたことを示している。
【図４Ａ】実施例２に記載されているように、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ゲノムへ安定的に組み込まれたＴ−ＤＮＡの概略図である。このＴ−ＤＮＡ構築物において、ＢＲＰ１２−ＳＣメガヌクレアーゼ（ＢＲＰ１２−ＳＣ）（配列番号：１５）をコードするコドン最適化遺伝子は、Ｈｓｐ７０プロモーター（ＨＳＰ）およびＮＯＳターミネータ（ＴＥＲＭ）の制御下にある。１対の可能性のあるＢＲＰ１２−ＳＣ認識配列（部位１、部位２）は、ターミネータに隣接して、ＰｓｔＩ制限酵素部位（ＰｓｔＩ）を含む７個の塩基対によって隔てられて収容されている。カナマイシン抵抗性マーカー（Ｋａｎ）もまた、安定な形質転換体の選択を可能にするためにＴ−ＤＮＡ上に収容されている。
【図４Ｂ】介在する７塩基対断片およびＰｓｔＩ制限酵素部位の喪失を示す、部位１および部位２のＢＲＰ１２−ＳＣメガヌクレアーゼ切断後の予想される生成物である。矢印は、Ｔ−ＤＮＡの切断についてスクリーニングするために用いられるＰＣＲプライマーの位置を示す。
【図４Ｃ】ＧＴＡＣ構築物（ＧＴＡＣ）またはＴＡＧＡ構築物（ＴＡＧＡ）のいずれかに収容されたＢＲＰ１２−ＳＣ認識配列の配列であり、中央配列は下線が引かれている。
【図５】メガヌクレアーゼ濃度および中央配列の、インビトロでのメガヌクレアーゼ切断への効果のグラフ表示である。中央配列ＧＴＡＣを有するＢＲＰ２認識配列かまたは中央配列ＴＡＧＡを有するＢＲＰ２認識配列かのいずれかを有する０．２５ピコモルのプラスミド基質を含む消化反応に、示された濃度でＢＲＰ２メガヌクレアーゼ（配列番号：８、実施例１参照）を加えた。反応物は、ＳＡ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＥＤＴＡ）中で２５マイクロリットルであった。反応物を３７℃で２時間、インキュベートし、その後、ゲル電気泳動によって可視化し、メガヌクレアーゼによって切断されたプラスミド基質のパーセントを、メガヌクレアーゼ濃度の関数としてプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
１．１  序論
本発明は、合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼによってより効率的に切断される特定のＤＮＡ配列の同定および特徴づけに一部、基づいている。具体的には、本発明は、特定の４塩基対ＤＮＡ配列が、合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ認識配列の中央の４個の塩基対として組み入れられた場合、メガヌクレアーゼが結晶構造の分析に基づいて中央の４個の塩基対に接触しないように思われるが、対応するメガヌクレアーゼによる切断を著しく影響を及ぼすことができるという発見に基づいている。４個のＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）があるので、長さが４個の塩基対である４４個、すなわち２５６個の可能なＤＮＡ配列がある。Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼによってより効率的に切断される配列のサブセットを決定するためにこれらの可能な配列の全てを調べた。この分析の結果により、長さが２２個の塩基対の特定の二本鎖ＤＮＡ部位がＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼによってより効率的に切断されうるかどうかのより正確な予測が可能になる。
【００３６】
１．２  参考文献および定義
本明細書に参照された特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立している。本明細書に引用されているＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む、登録された米国特許、認可された出願、公開された外国出願、および参考文献は、あたかもそれぞれが具体的かつ個々に示されて、参照により組み入れられているかのように同じ程度で参照により本明細書に組み入れられている。
【００３７】
本明細書に用いられる場合、用語「Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ」は、Ｉ−ＣｒｅＩに由来している、合理的に設計された（すなわち、遺伝子操作された）メガヌクレアーゼを指す。本明細書に用いられる場合、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼという用語は、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、および／または二量体形成の性質の１つまたは複数に影響する１つまたは複数のアミノ酸挿入、欠失、または置換によって改変されているＩ−ＣｒｅＩホーミングエンドヌクレアーゼの組換え変異体を指す。いくつかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが当技術分野において知られており（例えば、Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３、Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１、Ｅｐｉｎａｔら（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２参照）、このような変異体を合理的に設計するための一般的な方法は、国際公開第２００７／０４７８５９号に開示されている。このような変異体を遺伝子操作するためのさらなる方法は、国際公開第０４／０６７７３６号、国際公開第０７／０６０４９５号、国際公開第０６／０９７８５３号、国際公開第０７／０４９０９５号、国際公開第０８／１０２１９８号、国際公開第０８／０１００９３号、国際公開第０８／０１０００９号、国際公開第０７／０９３９１８号、国際公開第０７／０９３８３６号、国際公開第０８／１０２２７４号、国際公開第０８／０５９３１７号、国際公開第０９／０１３６２２号、国際公開第０９／０１９６１４号、国際公開第０９／０１９５２８号、国際公開第０８／１５２５２３号、国際公開第０４／０６７７５３号、国際公開第０３／０７８６１９号、国際公開第０６／０９７７８４号、国際公開第０７／０３４２６２号、国際公開第０７／０４９１５６号、国際公開第０７／０５７７８１号、国際公開第０８／０９３１５２号、国際公開第０８／１０２１９９号、国際公開第０８／１０２２７４号、国際公開第０８／１４９１７６号、国際公開第０９／０１３５５９号、国際公開第０９／０１３６２２号、および国際公開第０９／０１９５２８号に開示されている。
【００３８】
メガヌクレアーゼは、野生型Ｉ−ＣｒｅＩの場合のように、二本鎖ＤＮＡにホモ二量体として結合することもあるし、ＤＮＡにヘテロ二量体として結合することもある。メガヌクレアーゼはまた、Ｉ−ＣｒｅＩ由来の１対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを用いて単一のポリペプチドに連結されている「一本鎖ヘテロ二量体」でもありうる。用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、用語「メガヌクレアーゼ」と同義である。
【００３９】
本明細書に用いられる場合、用語「合理的に設計された」は、天然に存在しないこと、および／または遺伝子操作されたことを意味する。本発明の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、それらのアミノ酸配列または一次構造の点で野生型または天然のメガヌクレアーゼと異なり、それらの二次構造、三次構造、または四次構造の点で異なる場合もある。加えて、本発明の合理的に設計されたメガヌクレアーゼはまた、認識配列特異性および／または活性の点で野生型または天然のメガヌクレアーゼと異なる。
【００４０】
本明細書に用いられる場合、タンパク質に関して、用語「組換え」は、タンパク質をコードする核酸、およびタンパク質を発現する細胞または生物体に遺伝子工学技術の適用の結果として変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、用語「組換え」は、遺伝子工学技術の適用の結果として変化した核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術には、ＰＣＲおよびＤＮＡクローニングテクノロジー、トランスフェクション、形質転換、および他の遺伝子移入テクノロジー、相同組換え、部位特異的突然変異誘発、ならびに遺伝子融合が挙げられるが、それらに限定されない。この定義に従って、天然のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主におけるクローニングおよび発現によって産生されるタンパク質は、組換えとみなされない。
【００４１】
本明細書に用いられる場合、用語「遺伝子改変された」は、ゲノムＤＮＡ配列が組換えテクノロジーにより計画的に改変されている、細胞もしくは生物体、またはその祖先を指す。本明細書に用いられる場合、用語「遺伝子改変された」は、用語「トランスジェニック」を含む。
【００４２】
本明細書に用いられる場合、用語「野生型」は、メガヌクレアーゼの任意の天然型を指す。用語「野生型」は、天然でのその酵素の最も一般的な対立遺伝子多型を意味するように意図されるものではなく、むしろ、天然で見出される任意の対立遺伝子多型を意味する。野生型メガヌクレアーゼは、組換えまたは非天然のメガヌクレアーゼと区別される。
【００４３】
本明細書に用いられる場合、用語「認識配列半分部位」または単に「半分部位」は、二量体メガヌクレアーゼの場合にはメガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖メガヌクレアーゼの１つのドメインによって、認識される９塩基対ＤＮＡ配列を意味する。
【００４４】
本明細書に用いられる場合、用語「認識配列」は、メガヌクレアーゼによって結合および切断される１対の半分部位を指す。認識配列は、４個の塩基対によって隔てられた、１対の逆位の９塩基対半分部位を含む。したがって、認識配列は、長さが２２個の塩基対である。各半分部位の塩基対は、−９〜−１と名づけられ、−９位は切断部位から最も遠位であり、−１位が４塩基対中央配列に隣接しており、その４塩基対中央配列の塩基対は、＋１〜＋４と名づけられる。−９から−１へ（すなわち、切断部位の方へ）の方向において５’から３’へ配位されている各半分部位の鎖は「センス」鎖と名づけられ、逆の鎖は、「アンチセンス鎖」と名づけられるが、どちらの鎖もタンパク質をコードしない場合がある。このように、一方の半分部位の「センス」鎖は、他方の半分部位のアンチセンス（逆）鎖である。例えば、図１Ａ参照。
【００４５】
本明細書に用いられる場合、用語「中央配列」は、メガヌクレアーゼ認識配列において半分部位を隔てる４個の塩基対を指す。これらの塩基は、図１Ａにおいて＋１〜＋４と番号づけられている。中央配列は、メガヌクレアーゼ切断後に３’一本鎖オーバーハングになる４個の塩基を含む。「中央配列」は、センス鎖の配列またはアンチセンス（逆）鎖を指しうる。
【００４６】
本明細書に用いられる場合、用語「特異性」は、全ての可能な認識配列の特定のサブセットにおいてのみ二本鎖ＤＮＡ分子を認識および切断するメガヌクレアーゼの能力を指す。認識配列のセットは、特定の保存された位置または配列モチーフを共有するだろうが、１つまたは複数の位置において縮重している場合がある。より特異的なメガヌクレアーゼは、可能な認識配列のより小さなサブセットを結合および切断する能力があるが、より特異性の低いメガヌクレアーゼは、可能な認識配列のより大きなサブセットを結合および切断する能力がある。
【００４７】
本明細書に用いられる場合、用語「パリンドロームの」は、同一の半分部位の逆方向反復からなる認識配列を指す。しかしながら、この場合、パリンドローム配列は、酵素と接触しない中央配列に関してパリンドロームである必要はない。二量体メガヌクレアーゼの場合、パリンドロームＤＮＡ配列は、ホモ二量体によって認識され、そのホモ二量体における２つの単量体が同一の半分部位と接触する。
【００４８】
本明細書に用いられる場合、用語「偽パリンドローム」は、非同一の、または不完全にパリンドロームの半分部位の逆方向反復からなる認識配列を指す。この場合、偽パリンドローム配列は、中央配列に関してパリンドロームである必要はなく、２つの半分部位間の完全なパリンドローム配列から逸脱することもできる。偽パリンドロームＤＮＡ配列は、野生型ホモ二量体メガヌクレアーゼによって認識される天然ＤＮＡ部位の典型であり、その野生型ホモ二量体メガヌクレアーゼにおける２つの同一の酵素単量体が異なる半分部位と接触する。
【００４９】
本明細書に用いられる場合、用語「非パリンドロームの」は、メガヌクレアーゼの２つの関連していない半分部位で構成される認識配列を指す。この場合、非パリンドローム配列は、中央配列または２つの単量体半分部位のいずれに関してもパリンドロームである必要はない。非パリンドロームＤＮＡ配列は、ヘテロ二量体メガヌクレアーゼか、または非同一の半分部位を認識する１対のドメインを含む一本鎖メガヌクレアーゼかのいずれかによって認識される。
【００５０】
本明細書に用いられる場合、用語「活性」は、本発明のメガヌクレアーゼが特定の認識配列を切断する率を指す。このような活性は、二本鎖ＤＮＡのホスホジエステル結合の加水分解を含む測定可能な酵素反応である。特定のＤＮＡ基質に作用するメガヌクレアーゼの活性は、その特定のＤＮＡ基質についてのメガヌクレアーゼの親和性または結合活性によって影響され、その親和性または結合活性は、ＤＮＡとの配列特異的相互作用と非配列特異的相互作用の両方によって影響される。
【００５１】
本明細書に用いられる場合、用語「相同組換え」は、二本鎖ＤＮＡ切断が、相同ＤＮＡ配列を修復鋳型として用いて修復される、天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６参照）。相同ＤＮＡ配列は、内因性染色体配列、または細胞に送達された外因性核酸でありうる。それゆえに、いくつかの適用について、メガヌクレアーゼは、ゲノム中の標的配列内の認識配列を切断するために用いられ、標的配列との相同性または実質的な配列類似性を有する外因性核酸が細胞へ送達され、相同組換えによる修復のための鋳型として用いられる。それにより、標的配列と有意に異なりうる外因性核酸のＤＮＡ配列は、染色体配列に組み入れられる。相同組換えのプロセスは、主に真核生物で起こる。用語「相同性」は、「配列類似性」の同義語として本明細書で用いられ、家系または系統発生的関係による同一性を必要とするものではない。
【００５２】
本明細書に用いられる場合、用語「非相同末端連結」は、二本鎖ＤＮＡ切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接的連結によって修復される、自然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６参照）。非相同末端連結によるＤＮＡ修復は、誤りがちであり、修復の部位においてＤＮＡ配列の非鋳型の付加または欠失を生じることが多い。したがって、いくつかの適用について、メガヌクレアーゼを用いて、ゲノム中の標的配列内のメガヌクレアーゼ認識配列で二本鎖切断を生じさせ、非相同末端連結によって（例えば、塩基挿入、塩基欠失、またはフレームシフト突然変異を導入することにより）遺伝子を乱すことができる。他の適用について、標的配列と相同性または実質的な配列類似性を欠く外因性核酸は、非相同末端連結によりメガヌクレアーゼ刺激型二本鎖ＤＮＡ切断の部位で捕獲することができる（例えば、Ｓａｌｏｍｏｎら（１９９８）、ＥＭＢＯＪ．１７：６０８６−６０９５参照）。非相同末端連結のプロセスは、真核生物、および細菌などの原核生物の両方で起こる。
【００５３】
本明細書に用いられる場合、用語「対象となる配列」は、メガヌクレアーゼタンパク質を用いてゲノムへ挿入することができ、またはゲノムＤＮＡ配列を置換するために用いることができる任意の核酸配列を意味し、それがコードするのがタンパク質か、ＲＮＡか、または制御エレメント（例えば、エンハンサー、サイレンサー、またはプロモーター配列）かに関わらない。対象となる配列は、対象となる配列から発現するタンパク質またはＲＮＡにタグを付けることを可能にする異種ＤＮＡ配列を有することができる。例えば、タンパク質は、限定されるわけではないが、エピトープ（例えば、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ）または他のリガンド（例えば、ポリＨｉｓ）を含むタグでタグを付けることができる。さらに、対象となる配列は、当技術分野において知られた技術により、融合タンパク質をコードすることができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  １９９９参照）。いくつかの適用について、対象となる配列は、切断のためにメガヌクレアーゼによって認識されるＤＮＡ配列に隣接している。したがって、隣接配列は切断され、メガヌクレアーゼによって切断されたゲノム認識配列へ対象となる配列の適切な挿入を可能にする。いくつかの適用について、相同組換えが、標的配列を対象となる配列と効果的に置換するように、対象となる配列全体は、ゲノム中の標的配列と相同であり、または実質的な配列類似性を有する。他の適用について、相同組換えが、ゲノム内で標的配列の座位に対象となる配列を挿入するように、対象となる配列は、標的配列との相同性または実質的な配列類似性を有するＤＮＡ配列と隣接している。いくつかの適用について、メガヌクレアーゼが、標的配列が対象となる配列によって改変された後で標的配列を切断することができないように、対象となる配列は、メガヌクレアーゼ認識配列における突然変異または他の改変を除いて、標的配列と実質的に同一である。
【００５４】
本明細書に用いられる場合、用語「一本鎖メガヌクレアーゼ」は、リンカーによって連結された１対のメガヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。一本鎖メガヌクレアーゼは、構成：Ｎ末端サブユニット−リンカー−Ｃ末端サブユニットを有する。それぞれがＩ−ＣｒｅＩ由来である２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般的に、アミノ酸配列において非同一であり、非同一の半分部位を認識するであろう。したがって、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、偽パリンドロームまたは非パリンドロームの認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼは、実際、二量体ではないにもかかわらず、「一本鎖ヘテロ二量体」または「一本鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれる場合がある。
【００５５】
本明細書に用いられる場合、特に他の指示がない限り、「または」という語は、「および／または」の包括的意味で用いられ、「いずれか／または」の排他的意味で用いられない。
【００５６】
２．１  Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼについての優先される中央配列
本発明は、Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼによって優先される、可能な４塩基対中央配列のサブセットの同定に一部、基づいている。野生型酵素は、中央配列内の塩基と有意に接触しないため、野生型Ｉ−ＣｒｅＩホーミングヌクレアーゼの同じ中央配列優先度が、例えば、半分部位優先度、ＤＮＡ結合親和性、および／またはヘテロ二量体形成能力に関して再設計されている合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼにあてはまる。したがって、本発明は、特定の２２塩基対ＤＮＡ配列が適切なＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ認識配列であるかどうかを決定することにおいて考慮されうる重要な基準を提供する。
【００５７】
中央配列の優先されるセットは、「ＤＪ１」と呼ばれる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（配列番号：４）を用いて決定された。このメガヌクレアーゼの作製は、国際公開第２００７／０４７８５９号に記載されている。ＤＪ１は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩに対して半分部位あたり４個の位置で異なるパリンドロームメガヌクレアーゼ認識配列（配列番号：５、配列番号：６）を認識するように設計されたホモ二量体Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼである。半分部位特異性におけるこの変化は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩへの６つのアミノ酸置換（Ｋ２８Ｄ、Ｎ３０Ｒ、Ｓ３２Ｎ、Ｑ３８Ｅ、Ｓ４０Ｒ、およびＴ４２Ｒ）の導入によって達成された。
【００５８】
様々な認識配列に関して切断活性を試験するために、国際公開第２００７／０４７８５９号の実施例１に記載されているように、ＤＪ１を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、精製した。その後、２５ピコモルの精製メガヌクレアーゼタンパク質を、２５マイクロリットル反応においてＳＡ緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＥＤＴＡ）中の１０ｎＭのプラスミドＤＮＡ基質の溶液に加えた。プラスミド基質を直線化するために、１マイクロリットルのＸｍｎＩ制限酵素を加えた。反応を、３７℃で４時間、インキュベートし、その後、それぞれがＤＪ１メガヌクレアーゼによって切断された程度を決定するためにゲル電気泳動によって可視化した。
【００５９】
これらの実験に用いられるプラスミド基質は、可能性のあるメガヌクレアーゼ認識配列がポリリンカー部位（ＳｍａＩ部位）に挿入されたｐＵＣ−１９プラスミドを含んだ。それぞれの可能性のあるメガヌクレアーゼ認識部位は、異なる中央配列によって隔てられた１対の逆位ＤＪ１半分部位（配列番号：７）を含んだ。したがって、中央配列だけ異なる複数のＤＮＡ基質のＤＪ１切断を評価することによって、どの中央配列がメガヌクレアーゼ切断を最も受け入れられるかを決定することが可能であった（図２）。
【００６０】
最初に、Ｎ＋２塩基およびＮ＋３塩基の影響のみを評価した。天然ＤＮＡ部位と複合したＩ−ＣｒｅＩのＸ線結晶構造は、ＤＮＡがこれらの中央の２個の塩基対で歪められていることを示す（Ｊｕｒｉｃａら（１９９８）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２：４６９−７６）。コンピュータモデリングにより、Ｎ−２のプリン（ＧまたはＡ）がＮ＋３のピリミジン（ＣまたはＴ）と適合しないことが示唆される。これは、Ｉ−ＣｒｅＩ結合によって導入された歪みが、Ｎ＋２のプリン塩基と、Ｎ＋３のピリミジンと対の第２のプリン塩基との間に立体的衝突を引き起こすためである。この予想された不適合性を、Ａ＋１Ｘ＋２Ｘ＋３Ｔ＋４（Ｘは任意の塩基である）の型の全ての可能な中央配列を有するメガヌクレアーゼ認識部位をもつプラスミド基質とＤＪ１タンパク質をインキュベートすることによって実験的に検証した。結果は表１に要約されている。表１〜５について、「活性」は以下を参照する：
−：４時間で切断なし
＋：４時間で１％〜２５％切断
＋＋：４時間で２６％〜７５％切断
＋＋＋：４時間で７５％〜１００％切断
【表１】
2011527906.tif 000003
【００６１】
コンピュータモデリングと一致して、Ｎ＋２のプリン塩基およびＮ＋３のピリミジン塩基を有する４つのプラスミド基質（配列番号２、４、１０、および１２）はＤＪ１によって効率的には切断されないことが見出された。
【００６２】
次に、中央配列優先度のより包括的な評価を実施した。４４個、すなわち２５６個の可能な中央配列がある。これらのうち、２５％、すなわち６４個は、Ｎ＋２にプリン塩基およびＮ＋３にピリミジンを有し、したがって、上記の実験に基づいて中央配列として排除した。メガヌクレアーゼが対称性であり、センス鎖とアンチセンス鎖の両方において等しく塩基を認識するため、残りの１９２個のうち、９２個は重複である。例えば、センス鎖上の配列Ａ＋１Ａ＋２Ａ＋３Ａ＋４は、アンチセンス鎖上のＴ＋１Ｔ＋２Ｔ＋３Ｔ＋４としてメガヌクレアーゼによって認識され、したがって、Ａ＋１Ａ＋２Ａ＋３Ａ＋４およびＴ＋１Ｔ＋２Ｔ＋３Ｔ＋４は機能的に等価である。前述のＮ＋２／Ｎ＋３衝突に加えてこれらの重複を考慮すると、１００個の可能な中央配列が残っていた。これらのうちのどれがメガヌクレアーゼによって優先されるかを決定するために、本発明者らは、ＤＪ１メガヌクレアーゼの逆位認識半分部位に隣接したこれらの１００個の中央配列をもつ１００個のプラスミド基質を作製した。その後、ＤＪ１を１００個のプラスミドのそれぞれとインキュベートし、切断活性を上記のように評価した。これらの結果は表２に要約されている。
【表２】
2011527906.tif 000004
2011527906.tif 000005
2011527906.tif 000006
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【００６３】
明確にするために、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼがその認識配列を対称性ホモ二量体として結合するという事実により、表２に列挙された中央配列のそれぞれは、その逆鎖配列と等価である。したがって、表２の配列番号１００、Ｃ＋１Ｔ＋２Ｇ＋３Ｃ＋４は、その逆鎖配列Ｇ＋１Ｃ＋２Ａ＋３Ｇ＋４と等価である。これらのデータから、中央配列優先度規則の一般的なセットが浮かび上がる。これらの規則は、表１または表２に取って代わるわけではないが、以下を含む：
１．Ｎ＋２のプリン塩基およびＮ＋３のピリミジン塩基を有する中央配列は、切断されるのは、たとえあったとしても非常に乏しい。
２．ＧがＮ＋１で優先される。これはＮ＋４のＣと等価である。最も優先される中央配列の全ては、Ｎ＋１のＧおよび／またはＮ＋４のＣを有する。
３．ＣがＮ＋２で優先される。これはＮ＋３のＧと等価である。
４．Ｎ＋２のピリミジン塩基およびＮ＋３のプリン塩基を有する中央配列が優先される。
５．中央配列内に少なくとも１個のＡ−Ｔ塩基対を有する配列が優先される。
【００６４】
したがって、一般的に、優先される中央配列は、Ｇ＋１Ｙ＋２Ｒ＋３Ｘ＋４（Ｙはピリミジン（ＣまたはＴ）であり、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）であり、Ｘは任意の塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）である）の型を有する。
【００６５】
２．２  優先される中央配列を用いるインビトロでの適用
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、制限酵素マッピングおよびクローニングを含む多数の可能性のあるインビトロでの適用がある。これらの適用は当技術分野において知られており、国際公開第２００７／０４７８５９号に論じられている。
【００６６】
クローニングなどの適用について通常の制限酵素よりむしろ遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを用いることの一つの利点は、ＤＮＡを切断して、例えば、対象となる特定のベクターを切断することによって生じる３’オーバーハングと適合する、幅広い範囲の異なる３’オーバーハング（「付着末端」）を残す可能性である。したがって、所望のオーバーハングを生じるために最適以下の中央配列を有するメガヌクレアーゼ認識配列を切断することが望ましい場合がある。
【００６７】
インビトロでのＤＮＡ切断条件は、一般的に、インビボでの条件より厳密性が低いため、最適以下の中央配列の使用は、このような適用に受け入れられることができる。例えば、インビボでの適用と比較して、操作されたメガヌクレアーゼを用いるインビトロでの消化は、ＤＮＡに対するメガヌクレアーゼのより高い比率で実行することができ、典型的には、メガヌクレアーゼにおいて競合する非特異的（ゲノム）ＤＮＡがより少なく、溶液条件は、メガヌクレアーゼ切断に有利であるように（例えば、上記のようにＳＡ緩衝液を用いて）最適化することができる。したがって、多数の中央配列が、インビボでの適用よりインビトロでの適用に適している。表２に列挙された中央配列の全ては、インビトロでの適用に適しているが、インビトロでの適用についての優先される中央配列および最も優先される中央配列は、それぞれ、それらの逆鎖配列と共に、表３および表４に列挙されている。
【表３】
2011527906.tif 000008
【表４】
2011527906.tif 000009
【００６８】
明らかに、優先される、または最も優先される中央配列を有する２２塩基対ＤＮＡ配列全てがインビトロでメガヌクレアーゼ認識配列でありうるわけではない。中央配列に隣接する半分部位の配列もまた、メガヌクレアーゼ認識および切断を受け入れられなければならない。あらかじめ決定された半分部位を認識するようにＩ−ＣｒｅＩを含むメガヌクレアーゼを操作するための方法は、当技術分野において知られている（例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号参照）。したがって、インビトロでの適用に優先されるＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ認識配列は以下を含むであろう：（１）メガヌクレアーゼ単量体（または一本鎖メガヌクレアーゼの第１のドメイン）による認識を受け入れられる第１の９塩基対の半分部位、（２）表２または表３からの優先される、または最も優先される中央配列、および（３）第１の半分部位に対して逆配向での、メガヌクレアーゼ単量体（または一本鎖メガヌクレアーゼの第２のドメイン）による認識を受け入れられる第２の９塩基対の半分部位。
【００６９】
したがって、一態様において、本発明は、（ａ）少なくとも１つのＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの少なくとも１つの可能性のある認識部位をＤＮＡ内に同定することであって、前記可能性のある認識部位が、表２の中央配列の群から選択される４塩基対中央配列を有する、同定することと、（ｂ）ＤＮＡにおけるその認識部位を認識するＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを同定することと、（ｃ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼをＤＮＡと接触させることと、を含み、それによりＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼがＤＮＡを切断する、インビトロで二本鎖ＤＮＡを切断するための方法を提供する。
【００７０】
別の態様において、本発明は、（ａ）表２の中央配列からなる群から選択される４塩基対中央配列を有するＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの認識部位をＤＮＡに導入することと、（ｂ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼをＤＮＡと接触させることとによる方法であって、それによりＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼがＤＮＡを切断する、インビトロで二本鎖ＤＮＡを切断するための方法を提供する。
【００７１】
特に、いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ＰＣＲ産物、人工染色体、細菌、真菌、植物、または動物細胞から単離されたゲノムＤＮＡ、およびウイルスＤＮＡから選択される。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、プラスミド、プロファージ、および染色体から選択される核酸内に存在する。
【００７３】
前述の実施形態の一部において、４塩基対ＤＮＡ配列は、表３から選択される。他の実施形態において、４塩基対ＤＮＡ配列は表４から選択される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼは、方法において選択された認識部位と共に用いるために特別に設計することができる。
【００７５】
２．３  優先される中央配列を用いるインビボでの適用
遺伝子治療、細胞工学、および植物工学などの適用は、生細胞の内部でメガヌクレアーゼ機能を必要とする（明確にするために、いかなる細胞内適用も、このような細胞が多細胞生物から単離され、または多細胞生物の一部であるかどうかに関わらず、「インビボ」での適用と呼ぶことにする）。これらの適用は当技術分野において知られており、例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号に記載されている。インビボでの適用は、中央配列に関してインビトロでの適用と比較して著しく制限される。これは、細胞内条件が、メガヌクレアーゼ活性に有利であるようにいかなる程度にも操作することができないため、および／または大量のゲノムＤＮＡがメガヌクレアーゼ結合において競合するためである。したがって、最適な中央配列を有するメガヌクレアーゼ認識配列のみがインビボでの適用に優先される。このような配列は、それらの逆鎖配列と共に表５に列挙されている。
【表５】
2011527906.tif 000010
【００７６】
明らかに、優先される中央配列を有する２２塩基対ＤＮＡ配列全てがインビボでメガヌクレアーゼ認識配列でありうるわけではない。中央配列に隣接する半分部位の配列もまた、メガヌクレアーゼ認識および切断を受け入れられなければならない。あらかじめ決定された半分部位を認識するようにＩ−ＣｒｅＩを含むメガヌクレアーゼを操作するための方法は、当技術分野において知られている（例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号参照）。したがって、優先されるインビボでのメガヌクレアーゼ認識配列は、（１）メガヌクレアーゼ単量体（または一本鎖メガヌクレアーゼの第１のドメイン）による認識を受け入れられる第１の９塩基対の半分部位と、（２）表５からの優先される中央配列と、（３）第１の半分部位に対して逆配向での、メガヌクレアーゼ単量体（または一本鎖メガヌクレアーゼの第２のドメイン）による認識を受け入れられる第２の９塩基対の半分部位とを含むであろう。
【００７７】
したがって、一態様において、本発明は、（ａ）少なくとも１つのＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの少なくとも１つの可能性のある認識部位をＤＮＡ内に同定することであって、可能性のある認識部位が、表２の中央配列の群から選択される４塩基対中央配列を有する、同定することと、（ｂ）ＤＮＡにおけるその認識部位を認識するＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを同定することと、（ｃ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼをＤＮＡと接触させることとによる方法であって、それによりＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼがＤＮＡを切断する、インビボで二本鎖ＤＮＡを切断するための方法を提供する。
【００７８】
別の態様において、本発明は、（ａ）表２の中央配列からなる群から選択される４塩基対中央配列を有するＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの認識部位をＤＮＡに導入することと、（ｂ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼをＤＮＡと接触させることとによる方法であって、それによりＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼがＤＮＡを切断する、インビボで二本鎖ＤＮＡを切断するための方法を提供する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、および動物細胞から選択される細胞内に存在する。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、プラスミド、プロファージ、および染色体から選択される核酸内に存在する。
【００８１】
前述の実施形態の一部において、４塩基対ＤＮＡ配列は、表３から選択される。他の実施形態において、４塩基対ＤＮＡ配列は表４から選択される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼは、本発明の方法において選択された認識部位と共に用いるために特別に設計される。
【００８３】
前述の実施形態の一部において、方法は、選択された認識部位を認識するようにＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを合理的に設計するさらなるステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、前記のＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを製造することをさらに含む。
【００８４】
別の態様において、本発明は、（ａ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第１のドメインによって結合されうる第１の９塩基対ＤＮＡ配列と、（ｂ）表２から選択される４塩基対ＤＮＡ配列と、（ｃ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第２のドメインによって結合されうる第２の９塩基対ＤＮＡ配列であって、第１に対して逆配向にある第２の９塩基対ＤＮＡ配列とを含む核酸で形質転換された細胞を提供する。
【００８５】
別の態様において、本発明は、細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸配列を含む細胞であって、（ａ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第１のドメインによって結合されうる第１の外因性９塩基対ＤＮＡ配列と、（ｂ）表２から選択される外因性４塩基対ＤＮＡ配列と、（ｃ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第２のドメインによって結合されうる第２の外因性９塩基対ＤＮＡ配列であって、第１に対して逆配向にある第２の９塩基対ＤＮＡ配列と、をこの順番で含む、細胞を提供する。
【００８６】
別の態様において、本発明は、細胞のゲノムに組み込まれた外因性核酸配列を含む細胞であって、（ａ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第１のドメインによって結合されうる第１の外因性９塩基対ＤＮＡ配列と、（ｂ）２個の塩基対が表２から選択された４塩基対ＤＮＡ配列の塩基Ｎ＋１およびＮ＋２に対応する、外因性２塩基対ＤＮＡ配列と、（ｃ）細胞で発現するコード配列を含む外因性ＤＮＡ配列と、（ｄ）２個の塩基対が表２から選択された４塩基対ＤＮＡ配列の塩基Ｎ＋３およびＮ＋４に対応する、外因性２塩基対ＤＮＡ配列と、（ｅ）Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ単量体によって、または一本鎖Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ由来の第２のドメインによって結合されうる第２の外因性９塩基対ＤＮＡ配列であって、第１に対して逆配向にある第２の外因性９塩基対ＤＮＡ配列と、をこの順番で含む、細胞を提供する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、核酸はプラスミドである。他の実施形態において、核酸は人工染色体である。他の実施形態において、核酸は細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている。他の実施形態において、核酸はウイルス核酸である。
【００８８】
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、植物細胞、細菌細胞、および真菌細胞からなる群から選択される。
【００８９】
前述の実施形態の一部において、４塩基対ＤＮＡ配列は、表３から選択される。他の実施形態において、４塩基対ＤＮＡ配列は、表４から選択される。
【００９０】
いくつかの実施形態において、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼは、本発明の方法において選択された認識部位と共に用いるために特別に設計される。
【００９１】
２．４  カスタム設計されるＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼビジネスを行う方法
メガヌクレアーゼビジネスは、Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼに基づいて行うことができる。例えば、このようなビジネスは、以下のとおり運営できる。ビジネスは、二本鎖切断が、合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼによって導入されることになっているＤＮＡ配列を受け取った。ビジネスは、Ｉ−ＣｒｅＩに対して変化した特異性を有する合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの少なくとも１つの認識部位をＤＮＡ配列内に同定し、前記認識部位は天然のＩ−ＣｒｅＩによって切断されず、前記認識部位はＴＴＧＴ、ＴＴＡＴ、ＴＣＴＴ、ＴＣＧＴ、ＴＣＡＴ、ＧＴＴＴ、ＧＴＣＴ、ＧＧＡＴ、ＧＡＧＴ、ＧＡＡＴ、ＡＴＧＴ、ＴＴＴＣ、ＴＴＣＣ、ＴＧＡＣ、ＴＡＡＣ、ＧＴＴＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＧＧＣ、ＡＣＧＣ、ＣＣＧＣ、ＣＴＧＣ、ＡＣＡＡ、ＡＴＡＡ、ＡＡＧＡ、ＡＣＧＡ、ＡＴＧＡ、ＡＡＡＣ、ＡＧＡＣ、ＡＴＣＣ、ＡＣＴＣ、ＡＴＴＣ、ＡＣＡＴ、ＧＡＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＴＣＡ、ＧＴＴＡ、ＧＡＡＣ、ＡＴＡＴ、ＴＣＧＡ、ＴＴＡＡ、ＧＣＣＣ、ＧＣＧＴ、ＧＣＧＧ、およびＧＣＡＧからなる群から選択される４塩基対中央配列を有する。その後、ビジネスは、ＤＮＡ内の認識部位を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼを提供する。
【００９２】
任意で、ビジネスは、ＤＮＡ内の認識部位を切断するＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを合理的に設計する。任意で、ビジネスは、合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼを製造する。
【００９３】
２．５  特に排除される中央配列
中央配列ＧＴＡＣ、ＡＣＡＣ、およびＧＴＧＡは、インビトロおよびインビボでの適用について効果的な中央配列であることが以前に示されている。これらの中央配列は、本発明のいくつかの態様から特に排除される。加えて、中央配列ＴＴＧＡおよびＧＡＡＡは、インビボでの適用について不十分な中央配列であることが以前に示されている（Ａｒｎｏｕｌｄら（２００７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７１：４９−６５）。
【実施例】
【００９４】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、その実施例を限定として解釈されるべきではない。当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書に記載された特定の物質および手順の多数の等価物を認識し、または確認することができるであろう。このような等価物は、実施例の下に続く特許請求の範囲に含まれるものとする。実施例１および２は、モデル植物系においてインビボで最適化メガヌクレアーゼ認識部位を切断する操作されたメガヌクレアーゼに言及する。実施例３は、インビトロで最適化メガヌクレアーゼ認識部位を切断する操作されたメガヌクレアーゼに言及する。
【実施例１】
【００９５】
インビボでの合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼホモ二量体による最適化メガヌクレアーゼ認識部位の切断
ＢＲＰ２と呼ばれる操作されたメガヌクレアーゼ（配列番号：８）を、国際公開第２００７／０４７８５９号に開示された方法を用いて作製した。このメガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩ由来であり、野生型Ｉ−ＣｒｅＩにより認識されないＤＮＡ部位を認識するように操作された（例えば、ＢＲＰ２認識配列は、配列番号：９および配列番号：１０、または配列番号：１１および配列番号：１２を含む）。操作されたメガヌクレアーゼの核局在化を促進するために、ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ、配列番号：１３）をそのタンパク質のＮ末端に付加した。通常のアグロバクテリウム媒介性形質転換手順を用いて、コドン最適化ＢＲＰ２コード配列（配列番号：１４）を含むＴ−ＤＮＡでシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）を形質転換した。ＢＲＰ２メガヌクレアーゼの発現は、Ｈｓｐ７０プロモーターおよびＮＯＳターミネータの制御下であった。１対のＢＲＰ２認識配列は、ＰｓｔＩ制限酵素部位を含む７個の塩基対によって隔てられ、同じＴ−ＤＮＡ上に収容された（図３Ａ）。この構築物におけるＢＲＰ２認識配列の対のＢＲＰ２切断は、認識配列の間の領域を切除し、それによってＰｓｔＩ制限酵素部位を除去することが予想された（図３Ｂ）。ＰｓｔＩ制限酵素部位に隣接するメガヌクレアーゼ認識配列の中央配列を変化させた２つのこのようなＴ−ＤＮＡ構築物を作製した（図３Ｃ）。第１の構築物（「ＧＴＡＣ構築物」）において、メガヌクレアーゼ認識部位は、中央配列ＧＴＡＣ（優先されるインビボでの中央配列、表５、配列９、配列番号：９および配列番号：１０）を有した。第２の構築物（「ＴＡＧＡ構築物」）は中央配列ＴＡＧＡ（優先されない中央配列、表２の逆鎖配列、配列７７、配列番号：１１および配列番号：１２）を有した。
【００９６】
各構築物を有する安定的に形質転換されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を、Ｔ−ＤＮＡ上に収容されたカマナイシン抵抗性マーカーについての選択によって作製した。その後、ＢＲＰ２メガヌクレアーゼ発現を誘導するための熱ショックの前および後に、ゲノムＤＮＡを形質転換植物から（葉穿孔器により）単離した。メガヌクレアーゼ認識配列を収容するＴ−ＤＮＡの領域を増幅するプライマーを用いるＰＣＲ反応にゲノムＤＮＡ試料を加えた。その後、ＰＣＲ産物をＰｓｔＩで消化し、ゲル電気泳動によって可視化した（図３Ｄ）。結果は表６に要約されている。有意なパーセンテージ（＞２５％）の産物がＰｓｔＩに対して抵抗性であることが見出されたいかなるＰＣＲ試料も、その特定の植物におけるインビボでのメガヌクレアーゼ切断を示すとみなし、表６において「切断する」としてスコア化した。熱ショック前、いずれの構築物を有する植物由来のＰＣＲ試料も大部分、ＰｓｔＩ部位を保持した。しかしながら、熱ショック後、ＧＴＡＣ構築物で形質転換された植物から採取された試料の大きなパーセンテージがＰｓｔＩ部位を喪失していたが、ＴＡＧＡ構築物は喪失していなかった。ＰｓｔＩ部位を欠くＧＴＡＣ構築物で形質転換された植物由来のＰＣＲ産物をｐＵＣ−１９プラスミドにクローニングし、シークエンシングした。シークエンシングされたクローンの１００％が、（図３Ｂに図示されているような）２つのＢＲＰ２切断部位の間の領域の正確な欠失があった。これらの結果は、操作されたメガヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ認識部位を、それが最適化中央配列を有するとの条件で、インビボで切断することができることを示している。
【表６】
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【実施例２】
【００９７】
インビボでの合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼ一本鎖ヘテロ二量体による最適化メガヌクレアーゼ認識部位の切断
操作されたメガヌクレアーゼＢＲＰ１２−ＳＣ（配列番号：１５）を、このメガヌクレアーゼが一本鎖ヘテロ二量体であることを除き、国際公開第２００７／０４７８５９号に従って作製した。国際公開第２００７／０４７８５９号に論じられているように、野生型Ｉ−ＣｒｅＩはＤＮＡをホモ二量体として結合および切断する。結果として、Ｉ−ＣｒｅＩの天然認識配列は偽パリンドロームである。しかしながら、ＢＲＰ１２−ＳＣ認識配列は、非パリンドロームである（例えば、配列番号：１６および配列番号：１７、または配列番号：１８および配列番号：１９）。これは、それぞれが完全長認識配列内の１つの半分部位を認識する、１対のサブユニットを含む操作されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体の使用を必要とする。ＢＲＰ１２−ＳＣの場合、２つの操作されたメガヌクレアーゼ単量体は、アミノ酸リンカーを用いてお互いに物理的に連結され、一本鎖ヘテロ二量体を生じる。このリンカーはＢＲＰ１２−ＳＣのアミノ酸１６６〜２０４（配列番号：２０）を含む。リンカー配列は、（野生型Ｉ−ＣｒｅＩのＬ１５５と対応する）Ｌ１６５で終結するＮ末端メガヌクレアーゼサブユニットを、（野生型Ｉ−ＣｒｅＩのＫ７と対応する）Ｋ２０４で開始するＣ末端メガヌクレアーゼサブユニットと連結する。この新規のリンカーを用いて２つのメガヌクレアーゼ単量体を物理的に連結する利点は以下の２つの面がある：第１に、メガヌクレアーゼ単量体は、ＢＲＰ２認識配列と異なるパリンドロームまたは偽パリンドロームＤＮＡ部位を認識することができるホモ二量体を同様に形成することよりむしろ、お互いに会合して（ヘテロ二量体化して）、非パリンドロームＢＲＰ１２−ＳＣ認識配列を切断することができるのみであることを保証する。第２に、メガヌクレアーゼ単量体の物理的連結は、所望のヘテロ二量体を得るために２つの単量体を同じ細胞内で同時に発現する必要性を取り除く。これは、ベクター構築を、単一の遺伝子発現カセットを必要とするのみである点で、著しく単純化する。実施例１に論じられたＢＲＰ２メガヌクレアーゼの場合のように、ＢＲＰ１２−ＳＣメガヌクレアーゼは、そのＮ末端にＳＶ４０核局在化シグナル（配列番号：１３）を有する。
【００９８】
通常のアグロバクテリウム媒介型形質転換手順を用いて、コドン最適化ＢＲＰ１２−ＳＣコード配列（配列番号：２１）を含むＴ−ＤＮＡでシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）を形質転換した。ＢＲＰ１２−ＳＣメガヌクレアーゼの発現は、Ｈｓｐ７０プロモーターおよびＮＯＳターミネータの制御下であった。１対のＢＲＰ１２−ＳＣ認識配列は、ＰｓｔＩ制限酵素部位を含む７個の塩基対によって隔てられ、同じＴ−ＤＮＡ上に収容された（図４Ａ）。この構築物におけるＢＲＰ１２−ＳＣ認識配列の対のＢＲＰ１２−ＳＣ切断は、認識配列の間の領域を切除し、それによってＰｓｔＩ制限酵素部位を除去することが予想された（図４Ｂ）。ＰｓｔＩ制限酵素部位に隣接するメガヌクレアーゼ認識配列の中央配列においてのみ変化させた２つのこのようなＴ−ＤＮＡ構築物を作製した（図４Ｃ）。第１の構築物（「ＧＴＡＣ構築物」）において、メガヌクレアーゼ認識部位は、中央配列ＧＴＡＣ（優先されるインビボでの中央配列、表５、配列９、配列番号：１６および配列番号：１７）を有した。第２の構築物（「ＴＡＧＡ構築物」）は中央配列ＴＡＧＡ（優先されない中央配列、表２の逆鎖配列、配列７７、配列番号：１８および配列番号：１９）を有した。
【００９９】
各構築物を有する安定的に形質転換されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を、Ｔ−ＤＮＡ上に収容されたカマナイシン抵抗性マーカーについての選択によって作製した。その後、ＢＲＰ１２−ＳＣメガヌクレアーゼ発現を誘導するための熱ショックの前および後に、ゲノムＤＮＡを形質転換植物から（葉穿孔器により）単離した。メガヌクレアーゼ認識配列を収容するＴ−ＤＮＡの領域を増幅するプライマーを用いるＰＣＲ反応にゲノムＤＮＡ試料を加えた。その後、ＰＣＲ産物をＰｓｔＩで消化し、ゲル電気泳動によって可視化した。この分析結果は表７に示されている。有意なパーセンテージ（＞２５％）の産物がＰｓｔＩに対して抵抗性であることが見出されたいかなるＰＣＲ試料も、インビボでのメガヌクレアーゼ切断を示すとみなし、表７において「切断する」としてスコア化した。熱ショック前、いずれの構築物を有する植物由来のＰＣＲ試料も大部分、ＰｓｔＩ部位を保持した。しかしながら、熱ショック後、ＧＴＡＣ構築物で形質転換された植物から採取された試料の大きなパーセンテージがＰｓｔＩ部位を喪失していたが、ＴＡＧＡ構築物は喪失していなかった。ＰｓｔＩ部位を欠くＧＴＡＣ構築物で形質転換された植物由来のＰＣＲ産物をｐＵＣ−１９プラスミドにクローニングし、シークエンシングした。シークエンシングされたクローンの１００％が、（図４Ｂに図示されているような）２つのＢＲＰ１２−ＳＣ切断部位の間の領域の正確な欠失があった。これらの結果は、操作された一本鎖メガヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ認識部位を、それが最適化中央配列を有するとの条件で、インビボで切断することができることを示している。
【表７】
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【実施例３】
【０１００】
インビトロでの合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼホモ二量体による最適化メガヌクレアーゼ認識部位の切断
実施例１に記載されたＢＲＰ２メガヌクレアーゼ（配列番号：８）を大腸菌で発現させ、国際公開第２００７／０４７８５９の実施例１においてのように精製した。その後、ＧＴＡＣまたはＴＡＧＡのいずれかの中央配列を有するＢＲＰ２認識配列を有するプラスミドを含む反応物（２５マイクロリットルのＳＡ緩衝液：２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＥＤＴＡ中、０．２５ピコモルのプラスミド基質）に、精製されたメガヌクレアーゼを様々な濃度で加えた。反応物を３７℃で２時間、インキュベートし、その後、ゲル電気泳動によって可視化し、メガヌクレアーゼによって切断された各プラスミド基質のパーセンテージを、メガヌクレアーゼ濃度の関数としてプロットした（図５）。ＴＡＧＡ中央配列を有するプラスミド基質は、インビトロでメガヌクレアーゼによって切断されるが、この基質の切断は、ＧＴＡＣ基質の切断を行うよりはるかに高い濃度のＢＲＰ２メガヌクレアーゼを必要とすることが見出された。
【０１０１】
配列表
配列番号：１（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＰＯ５７２５）
配列番号：２（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列）
配列番号：３（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列）
配列番号：４（ＤＪ１アミノ酸配列）
配列番号：５（ＤＪ１認識配列−ＧＴＧＡ中央配列）
配列番号：６（ＤＪ１認識配列−ＧＴＧＡ中央配列）
配列番号：７（ＤＪ１半分部位）
配列番号：８（ＢＲＰ２アミノ酸配列）
配列番号：９（ＢＲＰ２認識配列−ＧＴＡＣ中央配列）
配列番号：１０（ＢＲＰ２認識配列−ＧＴＡＣ中央配列）
配列番号：１１（ＢＲＰ２認識配列−ＴＡＧＡ中央配列）
配列番号：１２（ＢＲＰ２認識配列−ＴＡＧＡ中央配列）
配列番号：１３（ＳＶ４０核局在化シグナルアミノ酸配列）
配列番号：１４（ＢＲＰ２コドン最適化ＤＮＡ配列）
配列番号：１５（ＢＲＰ１２−ＳＣアミノ酸配列）
配列番号：１６（ＢＲＰ１２−ＳＣ認識配列−ＧＴＡＣ中央配列）
配列番号：１７（ＢＲＰ１２−ＳＣ認識配列−ＧＴＡＣ中央配列）
配列番号：１８（ＢＲＰ１２−ＳＣ認識配列−ＴＡＧＡ中央配列）
配列番号：１９（ＢＲＰ１２−ＳＣ認識配列−ＴＡＧＡ中央配列）
配列番号：２０（ＢＲＰ１２−ＳＣリンカーアミノ酸配列）
配列番号：２１（ＢＲＰ１２−ＳＣコドン最適化ＤＮＡ配列）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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