(57)【要約】  本発明は、ＳＩＶＡのスプライス変異体、ＳＩＶＡ３、およびその使用に関する。
2011517280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含むＳＩＶＡ３；またはそのムテイン；アイソフォーム；融合タンパク質；機能的誘導体；断片；活性画分；もしくは円順列変異誘導体をコードするポリヌクレオチド；（ｂ）中程度にストリンジェントな条件下で配列番号２のヌクレオチド１１９〜３２４までの範囲のポリヌクレオチド配列またはその断片にハイブリダイズできる配列を含むポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号２の１１９〜３２４に含まれるポリヌクレオチド配列由来の、少なくとも１０、１１〜２９、３０〜５０、および５０〜１９９の連続したヌクレオチド、および２００〜２０５の連続したヌクレオチドの断片を含むポリヌクレオチドから選択される単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２記載の配列を含む請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
中程度にストリンジェントな条件下で配列番号２のヌクレオチド１１９〜３２４までの範囲のポリヌクレオチド配列またはその断片にハイブリダイズできる配列であって、該ポリヌクレオチドがＳＩＶＡ３特異的リボザイム、アンチセンス配列、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、プローブまたはプライマーである請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターまたはＳＩＶＡ３ポリペプチドの内因性遺伝子活性化を可能にすることができる細胞において機能的なＤＮＡ調節配列を有するベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
細胞が哺乳類、昆虫および酵母細胞から選択される真核細胞である請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
哺乳類細胞がＨｅＬａ、２９３Ｔ  ＨＥＫおよびＣＨＯ細胞から選択される請求項６記載の宿主細胞。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の宿主細胞を育成すること、および産生されたＳＩＶＡ３ポリペプチドを単離することを含むＳＩＶＡ３ポリペプチドの産生方法。
【請求項９】
請求項１または２記載のポリヌクレオチドにコードされるＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩、配列番号１のアミノ酸４０〜１０８由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも２０％、または５０％、８０％、９０％および９５％同一性を有するＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩、または配列番号２記載のヌクレオチド配列によりコードされるＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩。
【請求項１０】
ＳＩＶＡ３ポリペプチドを用いて製造され、配列番号１のアミノ酸４０〜１０８の範囲のポリペプチドを結合することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体、キメラ抗体、完全ヒト化抗体、抗−抗Ｉｄ抗体、またはその断片。
【請求項１１】
トランスジェニック動物の作出および該動物の体液から産生されたタンパク質を単離することを含むＳＩＶＡ３ポリペプチドの産生方法。
【請求項１２】
発達障害；黒色腫、肉腫、腎腫瘍、結腸腫瘍のような腫瘍性疾患などの細胞増殖性障害；遺伝性障害；神経系障害；代謝異常；感染症および他の病的症状；変形性関節炎、自己免疫疾患、自己免疫性心筋炎Ｉ、リウマチ性関節炎、乾癬、全身性多発性硬化症、およびエリテマトーデスなどの免疫性障害；糸球体腎炎、鼻炎、ＨＣＶ介在慢性肝炎、Ａ型胃炎などの慢性胃炎、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、結膜炎、ブドウ膜炎、糖尿病、消化器系炎症、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、原発性オリゴデンドログリオパチーを伴う多発性硬化症、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性大腸炎、重症筋無力症、髄炎、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、筋肉痛、強直性脊椎炎、喘息、気道炎症などの炎症性疾患；創傷治癒；皮膚疾患；老化；原虫感染、細菌感染およびウイルス感染などの感染症から選択される疾患、障害または症状の治療のための医薬の製造における、請求項９〜１１のいずれかに記載のＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩；請求項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列；請求項４記載のベクター；請求項５〜７のいずれかに記載の宿主細胞；および／または請求項１２または１３記載の抗体の使用。
【請求項１３】
疾患、障害または症状が、細胞における不適切なＮＦ−κＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）介在活性により特徴付けられる請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
疾患、障害または症状が、細胞における不適切なＮＩＫ−介在ＮＦ−κＢ活性により特徴付けられる請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
疾患、障害または症状が、宿主免疫、免疫応答および／または細胞増殖の増加により特徴付けられる請求項１３または１４記載の使用。
【請求項１６】
疾患、障害または症状が、宿主免疫応答および／または細胞増殖の減少により特徴付けられる請求項１３または１４記載の使用。
【請求項１７】
生物学的サンプルにおけるＳＩＶＡ３ポリペプチド発現の検出方法；ＳＩＶＡ３のアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングする方法；ＳＩＶＡ３のレベルと関連した疾患の診断方法、ＳＩＶＡ３のレベルと関連した治療をフォローアップするための方法および／またはＳＩＶＡ３のレベルと関連した疾患、障害または症状を同定するための方法の開発における、請求項９〜１１のいずれかに記載のＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩；請求項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列；請求項４記載のベクター；請求項５〜７のいずれかに記載の宿主細胞；および／または請求項１２または１３記載の抗体の使用。
【請求項１８】
前記方法が、体液、細胞抽出物およびＤＮＡ発現ライブラリから選択されたサンプルからＳＩＶＡ３を結合する、ＳＩＶＡ３のアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするためのものであり、ＳＩＶＡ３を請求項１２または１３記載の抗体で免疫沈降すること、および共沈したタンパク質を同定すること、または酵母ツーハイブリット法においてプレイもしくはベイトとしてＳＩＶＡ３を用い、ＳＩＶＡ３結合タンパク質をクローニングすることを含む請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
対象における増殖性障害または免疫障害の診断方法における請求項１７記載の使用であって、（ａ）対象由来の生物学的サンプルを得ること；および（ｂ）健常な対象におけるレベルと比較した該サンプル中のＳＩＶＡ３の変化したレベルを検出することを含み、該変化したレベルが、対象における増殖性障害または免疫障害の診断である使用。
【請求項２０】
患者における増殖性障害または免疫障害のための治療のフォローアップ方法における請求１７記載の使用であって、（ａ）治療を受ける前後の患者由来の生物学的サンプルを得ること；および（ｂ）治療中または治療後の患者のサンプルにおけるＳＩＶＡ３のレベルを検出すること、および（ｃ）治療の前後の患者におけるＳＩＶＡ３のレベルを比較することを含み、治療後のＳＩＶＡ３のレベルの変化が患者における治療の有効性の指標となる使用。
【請求項２１】
薬学的に許容され得る担体および請求項９〜１１のいずれかに記載のＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩；請求項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列；請求項４記載のベクター；請求項５〜７のいずれかに記載の宿主細胞；および／または請求項１２または１３記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
ＳＩＶＡ３に拮抗するペプチドまたは低分子またはＳＩＶＡ３作動性のペプチドまたは低分子をスクリーニングする方法であって、ＳＩＶＡ３介在ＮＩＫ分解、ＮＩＫ介在ＮＦ−κＢ活性化；およびＳＩＶＡ３ポリペプチドとアポトーシスタンパク質１の細胞阻害剤（ｃＩＡＰ１）またはＴＮＦ−レセプター関連アダプタタンパク質２（ＴＲＡＦ２）との相互作用を阻害することができる分子をスクリーニングし選択することを含む方法。
【請求項２３】
必要とするヒト患者の所望の部位でＳＩＶＡ３ポリペプチドの発現を誘導することを含む、免疫疾患または癌を治療するための遺伝子治療方法。
【請求項２４】
ＣＮＣＭに受託番号Ｉ−３８８０で寄託されたＳＩＶＡ３のＤＮＡ配列を有するクローン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＩＶＡのスプライス変異体、ＳＩＶＡ３およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのメンバーは、ほとんど全ての種類の細胞において発現され、広範囲に渡る多様な細胞活性をモジュレートしている。それらは、タンパク質合成とは独立した細胞の変化、最もよく知られているものとしてはカスパーゼ介在性細胞死（外因性細胞死経路）を誘導する能力、ならびに転写および転写後レベルの両方において遺伝子発現パターンをモジュレートする能力の両方を有する。これらの効果は、免疫防御のほとんどすべての態様や胚発生および組織恒常作用の制御に貢献する。それらは、細胞の種類および活性化レセプターの正体ならびに多数の他の決定因子に依存し、いくつかの作用は他のものと対立さえし得る。この広範囲に及ぶ活性は、むしろ少ない数のシグナル伝達タンパク質により媒介される。そのうち最も特徴付けられているのが、２つのデスドメイン含有アダプター、ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１およびＴＲＡＤＤ、インデューサーカスパーゼ、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−１０、ＴＲＡＦリング−フィンガータンパク質のメンバー、ならびにアポトーシスタンパク質１の細胞阻害剤（ｃＩＡＰ１）およびｃＩＡＰ２（ＩＡＰモチーフを有するリング−フィンガータンパク質）である。（Wallachら、Annu Rev Immunol. 1999; 17:331-67. Review）（Locksleyら、Cell. 2001 Feb 23;104(4):487-501）。この限られたタンパク質がレセプターの多方面にわたる様々な作用をどのように媒介するのか、また誘導された作用の性質をどのように必要に応じたものに調整するのかは、まだほとんど理解されていない。
【０００３】
ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのメンバーの近位シグナル伝達活性に関与することが示唆されている付加的なタンパク質であるＳＩＶＡは、イーストツーハイブリッド試験におけるＣＤ２７レセプターへのその結合に基づいて同定された（Prasadら、1997）。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーのいくつかの他のメンバーとのＳＩＶＡの関連性については、いくつかの証拠も示された（NocentiniおよびRiccardi、2005）。ＳＩＶＡの存在は、数年間にわたり知られており、長期間過剰発現した場合このタンパク質が細胞を殺すことが示された（Prasadら、1997）。しかしながら、これがＳＩＶＡの真の唯一の活性かどうかは知られていない。ＳＩＶＡは、他の既知のタンパク質のいずれとも、近接した構造的類似性は有していない。初めにデスドメインと類似していると思われたＳＩＶＡ内のある領域は、そのドメインとして特徴付けられるような構造的特徴は有していない。その領域のＣ末端では、タンパク質はシステイン残基が比較的豊富であり、これは明らかにいくつかの亜鉛イオンの結合に寄与している（Nestlerら、2006）。しかしながら、この領域のアミノ酸配列は、既知の亜鉛結合モチーフのいずれとも厳密には適合しない。このタンパク質の中心の短いα−へリックス領域は、抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ−ＸLに結合するが（Xueら、2002）、そのシステインリッチ領域（ＣＲＲ）により保存される機能は知られていない。
【０００４】
ＳＩＶＡは、２つの択一的スプライスアイソフォームまたはスプライス変異体、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２として存在することが知られている。ＳＩＶＡ１はより長く、その中心部分に推定両親媒性へリックスを有するデスドメインホモロジー領域（ＤＤＨＲ）を含む。ＳＩＶＡ２はより短く、ＤＤＨＲを欠く。両アイソフォーム共にＢ−ボックス様リング−フィンガーとＣ−末端にジンクフィンガー様ドメインを含む。ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の両方の強制発現は、アポトーシスを誘導することが示されている（Prasadら、1997、Yoonら、1998、Spinicelliら、2003、Pyら、2004）。ＳＩＶＡ１誘導アポトーシスは、その両親媒性へリックス領域を介する抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーへの結合と阻害によりなされると示唆されている（Chuら、2005；Chuら、2004；Xueら、2002）。そのアポトーシス促進的役割と一致して、ＳＩＶＡは、腫瘍サプレッサーｐ５３およびＥ２Ｆ１の直接的な転写ターゲットである（Fortinら、2004）。証拠における様々な点から、ＳＩＶＡがストレス誘導タンパク質であり、急性虚血性傷害において（Padanilamら、1998）、コクサキーウイルス感染において（Henkeら、2000）、およびシスプラチン治療によって（Qinら、2002）、ならびにアポトーシスを誘導するＴＩＰ３０の発現によって（Xiaoら、2000）もアップレギュレートされるということが示唆される。近年、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２のデスドメインではない共通Ｎ−およびＣ−末端が、カスパーゼ依存性ミトコンドリア経路の活性化によりリンパ系細胞におけるアポトーシスを媒介するのに十分可能であることが示された（Pyら、2004）。
【０００５】
最近、ＳＩＶＡがＮＦ−κＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）に結合し、その機能を制御し（Ramakrishnanら、2004）、ユビキチン化関連活性を有し、自己ユビキチン化、ＴＲＡＦ２（ＴＮＦレセプター関連アダプタータンパク質２）のユビキチン化を直接誘導することができること、およびＳＩＶＡ２がＥ３リガーゼである（国際公開第２００７／７０８０５９３号パンフレット）ということが見出された。
【０００６】
ユビキチン化は、タンパク質がユビキチンという名の小さいタンパク質（本来は、ユビキタスイムノポイエティックポリペプチド（ＵＢＩＰ））の共有結合により翻訳後修飾される真核生物に特有のプロセスを意味する。ユビキチンリガーゼは、ユビキチンを標的タンパク質のリジン残基に共有結合させるタンパク質である。ユビキチンリガーゼは、通常、ポリユビキチン化、すなわち二番目のユビキチンが一番目のユビキチンに結合し；三番目のユビキチンが二番目のユビキチンに結合するなどのポリユビキチン化に関与している。ユビキチンリガーゼは、「Ｅ３」と呼ばれ、ユビキチン活性化酵素（本明細書では「Ｅ１」という）およびユビキチン複合酵素（本明細書では「Ｅ２」という）と共に機能する。１つの主要なＥ１酵素は、すべてのユビキチンリガーゼによって共有され、ＡＴＰを用いて結合のためにユビキチンを活性化し、Ｅ２酵素にユビキチンを引き渡す。Ｅ２酵素は、特異的Ｅ３パートナーと相互作用し、ユビキチンを標的タンパク質に移す。多重タンパク質複合体でもあり得るＥ３は、ユビキチン化を特定の基質タンパク質へ標的化しなければならない。Ｅ３は、Ｅ２酵素からユビキチンを受け取り、標的タンパク質または基質タンパク質にそれを渡す場合もあれば、他のケースでは、Ｅ３はＥ２酵素と基質との両方と相互作用することにより作用する場合もある。
【０００７】
ＮＩＫ（ＭＡＰ３Ｋ１４）は、ＴＲＡＦ２に結合するタンパク質のスクリーニングにおいて発見された（Malininら、1997）。ＮＩＫの過剰発現の際のＮＦ−κＢの著しい活性化と、触媒的に不活性なＮＩＫ突然変異体の発現の際の多様な誘導薬剤に応答するＮＦ−κＢ活性化の効果的な阻害は、ＮＩＫがＮＦ−κＢ活性化のシグナル伝達に関与していることを示唆した（Malininら、1997）。
【０００８】
リンパ器官におけるＮＦ−κＢ種のパターン評価から、Ｒｅｌタンパク質およびＩκＢを含むＮＦ−κＢ複合体の制御におけるその役割とは別に、ＮＩＫは、他のＮＦ−κＢ種の発現／活性化の制御にも関与しているということが示唆された。実際、ＮＩＫは、ｐ１００の部位特異的リン酸化に関与していることが示されており、ｐ１００のユビキチン化およびｐ５２を形成するための活性なプロセッシングを誘発する分子としての機能を果たす。このｐ１００プロセッシング活性は、ＮＩＫのａｌｙ変異により除去されることが見出された（Xiaoら、2001b）。
【０００９】
胸腺ストローマにおいてＮＩＫは、免疫寛容を維持するのに必須なＴｒｅｇ細胞の正常な産生にとって重要である。ＮＩＫの突然変異は、ａｌｙマウスにおける、胸腺構造の破壊、Ｔｒｅｇ細胞の産生障害をもたらす（Kajiuraら、2004）。一貫して、ＮＩＫ−欠損マウスの研究は、Ｔｒｅｇ細胞の成長および拡大の制御におけるＮＩＫの役割も示唆している（Luら、2005）。この知見は、ストローマ依存的な自己寛容確立におけるＮＩＫの必須の役割を示唆している。ＮＩＫは、ウイルス感染の結果としてＮＦ−κＢ活性化にも参加する。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳウイルス）感染は、ＮＩＫのキナーゼ活性の増加、胞（alveolus）様ａ５４９細胞における活性化ＮＩＫ、ＩＫＫ１、ｐ１００および処理ｐ５２を含む複合体の形成をもたらす。この場合、ＮＩＫ自体はｐ５２に結合した核に移行し、驚くべきことに、この事象は正準ＮＦ−κＢ経路活性化の活性化に先行する（Choudharyら、2005）。この知見は、ＮＩＫが実際にＮＦ−κＢのメディエータとしての機能を果たすが、他の機能も果たし得るということ、ならびにＮＩＫが細胞およびレセプター特異的にこれらの機能を発揮するということを示している。
【００１０】
ＮＩＫは、ＮＩＫ分子内の「活性化ループ」のリン酸化の結果として活性化される。実際、このループ内のリン酸化部位（Ｔｈｒ−５５９）の変異により、ＮＩＫ過剰発現時のＮＦ−κＢの活性は妨げられる（Linら、1999）。加えて、ＮＩＫの活性は、そのキナーゼモチーフの上流および下流領域が互いに結合する能力を通して制御されているようである。ＮＩＫのキナーゼモチーフの下流のＣ−末端領域は、直接ＩＫＫ１（Regnierら、1997）ならびにｐ１００（Xiaoら、2001b）に結合できることが示されており、これらの相互作用は、ＮＦ−κＢシグナル伝達におけるＮＩＫ機能に必要とされるようである。ＮＩＫのＮ末端領域は、塩基性のモチーフ（ＢＲ）およびプロリンリッチ繰り返しモチーフ（ＰＲＲ）から成る、負の調節ドメイン（ＮＲＤ）を含む（XiaoおよびSun、2000）。Ｎ−末端ＮＲＤは、ＮＩＫのＣ−末端領域とシスで相互作用し、それによりＮＩＫのその基質（ＩＫＫ１およびｐ１００）への結合を阻害する。異所的に発現したＮＩＫは、自発的にオリゴマーを形成し、このオリゴマーにおいては、各ＮＩＫ分子におけるＮ−末端領域のＣ−末端領域へのこれらの結合が崩壊するようであり、高レベルの構造的活性化が示される（Linら、1999）。ＮＩＫのＣ−末端領域のＴＲＡＦ２（ならびに他のＴＲＡＦ類）への結合が、最も活性化プロセスに関与するようである。しかしながら、その関与の正確な様式は知られていない。
【００１１】
近年、ＮＩＫ調節の新規な機序が大きな注目を集めている。これは、ＮＩＫのプロテアソーム介在性分解を導く、ＮＩＫとＴＲＡＦ３との動的相互作用に関する。興味深いことに、ＣＤ４０およびＢＬｙＳのようなＮＦ−κＢの代替的経路の誘導因子は、ＴＲＡＦ３の分解とＮＩＫ発現の同時増強を誘導することが示されている（Liaoら、2004）。
【００１２】
ＮＩＫ作用における下流の機序はかなり限定された情報しかない。ＮＩＫは、そのＣ−末端領域のＩＫＫ１への結合を通して、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体を活性化できるということを示す証拠が提示されている。実際、ＩＫＫ１の活性化ループにおいけるセリン−１７６をリン酸化し、それにより活性化できることが示されている（Lingら、1998）。
【００１３】
ＮＩＫは、正準ＮＦ−κＢ経路には全く関与せず、むしろ代替的経路を活性化するためにもっぱら機能するということが示唆された（総説としてPomerantzおよびBaltimore参照）。しかしながら、リンパ球におけるＴＮＦによるＩκＢ分解の誘導はＮＩＫと無関係であるが、いずれもＮＦ−κＢ２／ｐ１００プロセッシングも誘導する、ＣＤ７０、ＣＤ４０リガンドおよびＢｌｙＳ／ＢＡＦＦによるＩκＢ分解の誘導は、ＮＩＫ機能に依存するということが最近示された（Ramakrishnanら、2004）。ＣＤ７０およびＴＮＦの両方は、ＩＫＫキナーゼ複合体のそのレセプターへの動員を誘導する。ＣＤ７０の場合、ＴＮＦとは異なり、このプロセスはＮＩＫ動員と関連しており、その後にまさにＩＫＫ１とＮＩＫとの長期に渡るレセプター会合が続く。ＩＫＫ複合体のＣＤ７０への動員は、ＮＩＫの動員とは異なり、ＮＩＫキナーゼ機能に依存する。この知見から、ＮＩＫは、標準および非標準ＮＦ−κＢ二量体の両方を活性化する特異的誘導因子により開始される独自の近位シグナル伝達事象に関与することが示される。
【００１４】
YamamotoおよびGaynorは、ヒト疾患の原因におけるＮＦ−κＢの役割を概説している（YamamotoおよびGaynor、2001）。ＮＦ−κＢ経路の活性化は、喘息、リウマチ性関節炎（TakおよびFirestein、this perspectiveseries ref. Karinら、2000参照）および炎症性大腸炎などの慢性炎症性疾患の原因に関係している。加えて、ＮＦ−κＢ調節の改変は、アテローム性動脈硬化症（CollinsおよびCybulsky、this series, ref. Leonardら、1995参照）、アルツハイマー病（Mattson Camandola、this series, ref. Linら、1999参照）などの炎症性応答が少なくとも部分的に関与している他の疾患に関係し得る。また、ＮＦ−κＢ経路の異常は、しばしば多様なヒト癌にも見られる。
【００１５】
いくつかの系統の証拠が、サイトカイン遺伝子のＮＦ−κＢ活性が、肺における炎症の浸潤と多くのサイトカインおよびケモカインの脱制御に特徴付けられる喘息の病因への重要な一因であるということを示唆している（Lingら、1998）。同様に、ＮＦ−κＢ経路の活性化も、リウマチ性関節炎の病因において役割を果たしているようである。ＴＮＦ−などのサイトカインは、ＮＦ−κＢを活性化し、リウマチ性関節炎の患者の滑液中で増加し、慢性炎症性変化およびこれらの患者の間接に見られる滑膜の過形成の一因となる（Malininら、1997）。ＴＮＦ−に対する抗体や、ＴＮＦ−に結合する切断型ＴＮＦ−レセプターの投与は、リウマチ性関節炎の患者の症状を顕著に改善できる。
【００１６】
リンパ球およびマクロファージの両方による炎症性サイトカインの産生の増加も、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性大腸炎の病因に関係があるとされている（Matsumotoら、1999）。ＮＦ−κＢ活性化は、活性クローン病の患者および潰瘍性大腸炎の患者由来の粘膜生検標本に見られる。炎症性大腸炎の患者のステロイドによる治療は、生検標本におけるＮＦ−κＢ活性を減少させ、臨床症状を軽減する。これらの結果から、ＮＦ−κＢ経路の刺激は、これらの疾患に関連して増強される炎症性応答に関与し得るということを示唆する。
【００１７】
アテローム性動脈硬化症は、損傷した血管壁の内皮および平滑筋に対するおびただしい数の傷害（insults）によって誘発される（Matsushimaら、2001）。内皮細胞、平滑筋、マクロファージおよびリンパ球から放出される多数の成長因子、サイトカインおよびケモカインは、この慢性の炎症性線維増殖性プロセスに関与している（Matsushitaら、2001）。炎症性応答および細胞増殖の制御に関与する遺伝子のＮＦ−κＢ調節は、アテローム性動脈硬化症の開始および進行において重要な役割を果たすようである。
【００１８】
また、ＮＦ−κＢ経路の調節異常は、アルツハイマー病の病因にも関与し得る。たとえば、ＮＦ−κＢの免疫反応性は、大部分はアルツハイマー病の初期の老人斑型中または周囲に見られ、一方、成熟斑型は非常に減少したＮＦ−κＢ活性を示す（Mercurioら、1999）。したがって、ＮＦ−κＢ活性化は、アルツハイマー病の初期段階のあいだの老人斑および神経細胞アポトーシスの開始に関与し得る。これらのデータから、ＮＦ−κＢ経路の活性化は、病因に関係した炎症性要素を有する多数の疾患においてある役割を果たし得る。
【００１９】
宿主免疫および免疫応答の増加により特徴付けられる疾患の病因における役割に加え、ＮＦ−κＢ経路の構造的活性化は、いくつかのヒト癌の病因にも関係する。ＮＦ−κＢ経路の調節異常は、白血病、リンパ腫、および固形腫瘍などの多種多様なヒト悪性腫瘍に頻繁に見られる（Miyawakiら、1994）。これらの異常は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および結腸癌などの多様な腫瘍の核における構造的に高いレベルのＮＦ−κＢをもたらす。これらの変画の大部分は、ＮＦ−κＢ経路の活性化を誘導するシグナル伝達経路を活性化する調節タンパク質における変化によるもののようである。しかしながら、ＮＦ−κＢファミリーメンバーをコードする遺伝子の増幅および再配列に加え、ＩＢタンパク質を不活性化する突然変異は、いくつかの腫瘍で見られるＮＦ−κＢの核レベルを増強させることができる。
【００２０】
免疫系の発達および機能の調節への寄与とは別に、ＮＩＫは、乳腺発達などの様々な非免疫機能の調節にも関与していると思われる（Miyawakiら、1994）。ＮＩＫは、リンパ系器官の発達にもある役割を有する（Shinkuraら、1999）。インビトロ研究は、骨格筋細胞分化を導くシグナル伝達（Canicioら、2001）、およびニューロンの生存および分化（Foehrら、2000）にＮＩＫが関係しているとみなされた。
【００２１】
悪性腫瘍疾患や、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、免疫性疾患および移植関連疾患などの病的免疫応答と関連付けられる疾患などの、ＮＩＫおよび／またはＮＦ−κＢ分子の調節を欠いた活性と関連付けられる多数の命に関わる病気および／または消耗性疾患のための満足のいく治療が必要とされている。
【発明の概要】
【００２２】
１つの側面において、本発明は、（ａ）配列番号１（図３）記載のアミノ酸配列を含むＳＩＶＡ３；またはそのムテイン；アイソフォーム；融合タンパク質；機能的誘導体；断片；活性画分；もしくは円順列変異誘導体をコードするポリヌクレオチド；（ｂ）中程度にストリンジェントな条件下で配列番号２のヌクレオチド１１９〜３２４までの範囲のポリヌクレオチド配列またはその断片にハイブリダイズできる配列を含むポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号２の１１９〜３２４に含まれるポリヌクレオチド配列由来の、少なくとも１０、１１〜２９、３０〜５０、および５０〜１９９の連続したヌクレオチド、および２００〜２０５の連続したヌクレオチドの断片を含むポリヌクレオチド（ｄ）配列番号２（図２）の配列を有する受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３８８０のクローンから選択される単離ポリヌクレオチドに関する。
【００２３】
１つの実施態様では、本発明は、配列番号２記載の配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００２４】
本発明の別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、中程度にストリンジェントな条件下で配列番号２のヌクレオチド１１９〜３２５までのポリヌクレオチド配列またはその断片にハイブリダイズできる配列を含み、該ポリペプチドがＳＩＶＡ３特異的リボザイム、アンチセンス配列、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、プローブまたはプライマーである。
【００２５】
別の側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターまたはＳＩＶＡ３ポリペプチドの内因性遺伝子活性化を可能にすることができる細胞において機能的なＤＮＡ調節配列を有するベクター、およびそのようなベクターを含む哺乳類（たとえばＨｅＬａ、２９３Ｔ  ＨＥＫおよびＣＨＯ細胞）、昆虫および酵母細胞から選択される真核細胞などの宿主細胞に関する。
【００２６】
別のさらなる側面において、本発明は、本発明の宿主細胞を育成すること、および産生されたＳＩＶＡ３ポリペプチドを単離することを含むＳＩＶＡ３ポリペプチドの産生方法を提供する。また、ＳＩＶＡ３ポリペプチドの産生方法は、トランスジェニック動物の産出および該動物の体液から産生されたタンパク質を単離することを含み得る。
【００２７】
別のさらなる側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩；配列番号１のアミノ酸４０〜１０８由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも２０％、または５０％、８０％、９０％および９５％同一性を有するＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩、または配列番号２記載のヌクレオチド配列によりコードされるＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩を提供する。
【００２８】
なお別のさらなる側面において、本発明は、ＳＩＶＡ３ポリペプチドを用いて製造され、配列番号１のアミノ酸４０〜１０８の範囲のポリペプチドを結合することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体、キメラ抗体、完全ヒト化抗体、抗−抗Ｉｄ抗体、またはその断片を提供する。
【００２９】
本発明の１つの目的は、発達障害；たとえば黒色腫、肉腫、腎腫瘍、結腸腫瘍のような腫瘍性疾患などの細胞増殖性障害；遺伝性障害；神経系障害；代謝異常；感染症および他の病的症状；変形性関節炎、自己免疫疾患、自己免疫性心筋炎Ｉ、リウマチ性関節炎、乾癬、全身性多発性硬化症、およびエリテマトーデスなどの免疫性障害；糸球体腎炎、鼻炎、ＨＣＶ介在慢性肝炎、Ａ型胃炎などの慢性胃炎、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、結膜炎、ブドウ膜炎、糖尿病、消化器系炎症、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、原発性オリゴデンドログリオパチーを伴う多発性硬化症、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性大腸炎、重症筋無力症、髄炎、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、筋肉痛、強直性脊椎炎、喘息、気道炎症などの炎症性疾患；創傷治癒；皮膚疾患；老化；原虫（plasmodium）感染、細菌感染およびウイルス感染などの感染症から選択される疾患、障害または症状の治療のための医薬の製造における、本発明のＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩；本発明のポリヌクレオチド配列；本発明のベクター；本発明の宿主細胞；および／または本発明の抗体の使用を提供することである。
【００３０】
本発明の１つの実施態様において、その使用は、細胞における不適切なＮＩＫ介在活性またはＮＩＫ−介在ＮＦ−κＢ活性のために増加された宿主免疫、免疫応答および／または細胞増殖により特徴付けられる疾患、障害または症状のためのものである。
【００３１】
本発明の別の実施態様において、その使用は、細胞における不適切なＮＩＫ介在活性またはＮＩＫ−介在ＮＦ−κＢ活性のために減少された宿主免疫応答および／または細胞増殖により特徴付けられる疾患、障害または症状のためのものである。
【００３２】
本発明の別の目的は、生物学的サンプルにおけるＳＩＶＡ３ポリペプチド発現の検出方法；ＳＩＶＡ３のアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングする方法；ＳＩＶＡ３のレベルと関連した疾患の診断方法、ＳＩＶＡ３のレベルと関連した治療をフォローアップするための方法および／またはＳＩＶＡ３のレベルと関連した疾患、障害または症状を同定するための方法の開発における、本発明のＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩；本発明のポリヌクレオチド配列；本発明のベクター；本発明の宿主細胞；および／または本発明の抗体の使用を提供することである。
【００３３】
本発明の１つの実施態様において、その方法は、体液、細胞抽出物およびＤＮＡ発現ライブラリから選択されたサンプルから、ＳＩＶＡ３を結合する、ＳＩＶＡ３のアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするためのものであり、ＳＩＶＡ３を本発明の抗体で免疫沈降すること、および共沈したタンパク質を同定すること、または酵母ツーハイブリット法においてプレイもしくはベイトとしてＳＩＶＡ３を用い、ＳＩＶＡ３結合タンパク質をクローニングすることを含む。
【００３４】
本発明の別の実施態様において、その方法は、対象における増殖性障害または免疫障害の診断のためのものであり、（ａ）対象由来の生物学的サンプルを得ること；および（ｂ）健常な対象におけるレベルと比較した該サンプル中のＳＩＶＡ３の変化したレベルを検出することを含み、該変化したレベルが、対象における増殖性障害または免疫障害の診断となる。
【００３５】
本発明の別のさらなる実施態様において、その方法は、患者における増殖性障害または免疫障害のための治療のフォローアップのためのものであり、（ａ）治療を受ける前後の患者由来の生物学的サンプルを得ること；および（ｂ）治療前後の患者のサンプルにおけるＳＩＶＡ３のレベルを検出すること、および（ｃ）治療の前後の患者におけるＳＩＶＡ３のレベルを比較することを含み、治療後のＳＩＶＡ３のレベルの変化が患者における治療の有効性の指標となる。
【００３６】
本発明はまた、医薬的に許容され得る担体および本発明のＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩；本発明のポリヌクレオチド；本発明のベクター；本発明の宿主細胞；および／または本発明の抗体を含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
ＳＩＶＡ３に拮抗するポリペプチドまたは低分子またはＳＩＶＡ３作動性のポリペプチドまたは低分子をスクリーニングする方法であって、ＳＩＶＡ３介在ＮＩＫ分解を阻害することができる、ＮＩＫ介在ＮＦ−κＢ活性化を阻害することができる；およびＳＩＶＡ３ポリペプチドとアポトーシスタンパク質１の細胞性阻害剤（ｃＩＡＰ１）またはＴＮＦ−レセプター関連アダプタタンパク質２（ＴＲＡＦ２）との相互作用を阻害することができる分子をスクリーニングし選択することを含む方法もまた、本発明により提供される。
【００３８】
また、必要とするヒト患者の所望の部位でＳＩＶＡ３ポリペプチドの発現を誘導することを含む、免疫疾患または癌を治療するための遺伝子治療方法も本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】ＳＩＶＡの更なるアイソフォーム（ＳＩＶＡ３）が末梢血単球細胞（ＰＢＭＣｓ）において発現されることを示す。逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の使用により、ＳＩＶＡ１、ＳＩＶＡ２およびＳＩＶＡ３の発現が静止ＰＢＭＣにおいて検出された。Ｍ＝分子量マーカー。
【図１Ｂ】ＳＩＶＡの更なるアイソフォーム（ＳＩＶＡ３）が末梢血単球細胞（ＰＢＭＣｓ）において発現されることを示す。ＰＢＭＣから増幅された全長ＳＩＶＡ３。
【図２】ＳＩＶＡ３のヌクレオチド配列を示す。
【図３】ＳＩＶＡ３のアミノ酸配列を示す。
【図４】細胞におけるＮＩＫ、ｐ１００およびｐ５２のレベルに対する増加されたＳＩＶＡ３発現の効果を示す。Ｍｙｃタグ化ＮＩＫ発現ベクターは、ＨｅＬａ細胞においてＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ３発現ベクターの濃度の増加を伴って同時トランスフェクトされ、細胞においてＮＩＫおよびｐ１００／ｐ５２の細胞レベルがトランスフェクションの３０時間後に評価された。ＷＢ＝ウェスタンブロット、ＴＬＣ＝全細胞ライセート。
【図５】ＳＩＶＡ３はＮＩＫと共免疫沈降しないということを示す。ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２またはＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ３発現ベクターは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中にＮＩＫ発現ベクターと同時トランスフェクトされる。２４時間後、細胞が溶解され、ＮＩＫは抗−ＮＩＫ抗体と免疫沈降し、共沈したＳＩＶＡはウェスタンブロッティングによりモニターされた。ＷＢ＝ウェスタンブロット、ＴＬＣ＝全細胞ライセート、ＩＰ＝免疫沈降。
【図６】ＳＩＶＡ２およびＳＩＶＡ３が内因性のアポトーシスタンパク質１の細胞阻害剤（ｃＩＡＰ１）と共免疫沈降することを示す。ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２またはＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ３発現ベクターは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトされた。２４時間後、細胞が溶解され、内因性ｃＩＡＰ１は抗−ｃＩＡＰ１抗体と免疫沈降し、共沈したＳＩＶＡはウェスタンブロッティングにより検出された。
【図７】ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２またはＨＩＳ−ＳＩＶＡ３は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中にＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２と同時トランスフェクトした。２４時間後、細胞が溶解され、ＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２は抗−ＦＬＡＧ抗体と免疫沈降し、共沈したＳＩＶＡはウェスタンブロッティングにより検出された。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の知見によれば、本明細書で「ＳＩＶＡ３」と名付けられたＳＩＶＡの新しいスプライス変異体は、単球細胞において発現された。ＳＩＶＡ３は、ＳＩＶＡ２アイソフォームと異なり、ＮＦ−κＢ誘導キナーゼ（ＮＩＫ）に結合しないが、ＳＩＶＡ２と類似して細胞におけるＮＩＫレベルをダウンレギュレートし、そしてアポトーシスタンパク質１の細胞阻害剤（ｃＩＡＰ１）およびＴＮＦ−レセプター関連アダプタタンパク質２（ＴＲＡＦ２）を結合することができる。
【００４１】
本発明は、１つの側面において、特にＮＩＫが炎症および細胞生存経路などのＮＦ−κＢ誘導のモジュレーションおよびメディエーションに関与する場合、ＮＩＫの細胞内レベルをモジュレートすることができるＳＩＶＡ３ポリペプチドに関する。したがって、本発明は、ＳＩＶＡ３またはＳＩＶＡ３ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、断片、円順列変異誘導体および塩に関する。配列番号１に示す配列のＳＩＶＡ３、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、断片、および円順列変異誘導体は、本明細書において「ＳＩＶＡ３ポリペプチド」と総称される。ＳＩＶＡ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、または図３における配列４０〜１０８の範囲のアミノ酸配列の少なくとも１部を有する。本発明の１つの実施態様において、ＳＩＶＡ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸４０〜１０８由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも２０％、または５０％、８０％、９０％および９５％同一性を有する。本発明の別の実施態様において、ＳＩＶＡ３ポリペプチドは、配列番号２（図２）記載のヌクレオチド配列の全部または１部によりコードされる。本発明の別のさらなる実施態様において、ＳＩＶＡ３ポリペプチドは、配列番号２の１１９〜３２４のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によりコードされる。
【００４２】
ＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩の使用に加え、本発明は、該ポリペプチドをコードする核酸配列；該核酸配列を含むベクター；該核酸配列またはベクターを含む宿主細胞；組織内の該ポリペプチドレベルを変えるために有効な化合物；および／またはＳＩＶＡ３を認識し特異的に結合する抗体の、診断；治療、治療法のフォローアップ；および／またはＳＩＶＡ３のアゴニストまたはアンタゴニストの同定のためのスクリーニング方法における使用に関する。
【００４３】
その塩；機能的誘導体：アイソフォーム；活性画分；円順列変異体；前駆体および断片ならびにそのムテイン（すなわち、構造の１つ以上のアミノ酸が削除または他のアミノ酸により置換され、または１つ以上のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質を得るために付加された他のタンパク質またはポリペプチド）を含むＳＩＶＡ３ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドと実質的に同じ活性を有するべきである。このようなポリペプチドは、対応する「融合タンパク質」、すなわち配列番号１のアミノ酸配列またはその突然変異体が他のタンパク質、たとえば免疫グロブリンと融合され、体液における長く続く半減期を有するポリペプチドも含む。
【００４４】
本発明のＳＩＶＡ３ポリペプチドは以下に規定するような本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含むことも理解されるべきである。
【００４５】
配列番号１に示されるＳＩＶＡ３の活性の例としては、細胞または組織におけるＮＩＫレベルのダウンレギュレーション；細胞または組織におけるＮＩＫ介在ＮＦ−κＢ活性化のダウンレギュレーション；ｃＩＡＰ１結合およびＴＲＡＦ２結合などがあるがそれらに限定されるものではない。したがって、本発明のＳＩＶＡ３ポリペプチドは、配列番号１に示されるＳＩＶＡ３のこれらの活性の少なくとも１つを有する。
【００４６】
本明細書中において用語「塩」は、本発明のポリペプチドのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、本技術分野において既知の手段により形成することができ、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛の塩などの無機塩、ならびにたとえばトリエタノールアミン、アルギニン、リジンなどのアミン、ピペラジン、プロカインと形成されるものなどの有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩は、たとえば、塩酸または硫酸などの塩鉱物酸との塩、酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩が挙げられる。もちろん、いずれの塩もＳＩＶＡ３と実質的に同様の活性を有さなければならない。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語「断片」は、ポリペプチド分子の一部または一部分（part or fraction）を意味し、ただし、そのより短いペプチドは、ＳＩＶＡ３の所望の生物学的活性を保持することを条件とする。断片は、ポリペプチドのいずれかの末端からアミノ酸を除去し、得られた断片の生物学的活性、たとえばｃＩＡＰ１への結合、ＴＲＡＦ３への結合、ＮＩＫ分解の誘導、および／またはＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化を細胞において試験することにより容易に調製され得る。一度に１つのアミノ酸をポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかから除去するプロテアーゼは当技術分野において知られており、所望の生物学的活性を保持する断片は、そのようなプロテアーゼにより通常の実験で得ることができる。
【００４８】
タンパク質の「活性画分」として、本発明は、その化合物自体のポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体単独、またはそこに結合された関連分子または残基との組合せであって、このような断片または前駆体が、医薬としてＳＩＶＡ３と同じ活性を示す、たとえば糖またはリン酸エステルの残基、またはポリペプチド分子の集合体を意味する。「前駆体」は、ヒト体内または動物体内においてＳＩＶＡ３に変換できる化合物である。
【００４９】
本明細書において使用する場合、定義「機能的誘導体」は、既知の方法によりアミノ酸部分の側鎖に、または末端Ｎ−またはＣ−基上に存在する官能基から製造される誘導体を意味し、それらが薬学的に許容され得る、すなわちそれらがタンパク質の活性を破壊することなく、それらを含む医薬組成物に毒性を与えることのない場合本発明に包含される。このような誘導体は、たとえば、カルボキシル基のエステルまたは脂肪族アミド、およびたとえばアルカノイル−もしくはアロイル−基などのアシル基と形成される、遊離のアミノ基のＮ−アシル誘導体もしくは遊離のヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含む。ＳＩＶＡ３は、安定性、半減期、バイオアベイラビリティー、人体による寛容、または免疫原性などのタンパク質の性質を改善するためにポリマーと結合されても良い。したがって、本発明の１つの実施態様は、アミノ酸残基の１つ以上の側鎖として存在する１つ以上の官能基に結合された少なくとも１つの部分を含むＳＩＶＡ３の機能的誘導体に関する。本発明の１つの実施態様は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合されたＳＩＶＡ３ポリペプチドに関する。ＰＥＧ化は、たとえば、国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載された方法などの既知の方法により実施され得る。
【００５０】
本明細書において使用される場合、用語「円順列変異誘導体」は、直鎖状分子を意味し、終端が、直接またはリンカーを介して一緒に連結されて環状分子を生成し、ついでその環状分子が別の位置で開環され、元の分子とは異なる終端を有する新しい直鎖状分子を生成する。環状変異は、構造が環化され、ついで開環された分子と等価である分子を含む。したがって、円順列変異分子は、直鎖状分子として、環化および開環工程を経ることなくデノボ合成されてもよい。円順列変異誘導体の製造法は国際公開第９５／２７７３２号パンフレットに記載されている。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「ムテイン」は、ＳＩＶＡ３の類似体を意味する。本発明は、本発明の前記ＳＩＶＡ３タンパク質の類似体であって、本質的にＳＩＶＡ３の天然に存在する配列のみを有するＳＩＶＡ３タンパク質と同じ生物学的活性を本質的に保持する類似体にも関する。そのような「類似体」は、約３０個までのアミノ酸残基が、この種の修飾が実質的にタンパク質自体に関するタンパク質類似体の生物学的活性を変化しないように、ＳＩＶＡ３タンパク質において欠失、付加または他のアミノ酸残基によって置換されているものであっても良い。したがって、元のＳＩＶＡ３と比較した場合に得られた生成物の活性が大幅に変化させることなく、ＳＩＶＡ３の天然に存在する構成成分の１つ以上のアミノ酸残基は、異なるアミノ酸残基により置換されるかまたは欠失され、または１つ以上のアミノ酸残基がＳＩＶＡ３の元の配列に付加される。これらのムテインは、既知の合成技術および／または部位特異的突然変異誘発法、または任意のほかの好適な技術により製造される。
【００５２】
あらゆるそのようなムテインは、好ましくは、基本のＳＩＶＡ３と実質的に同様の活性を有するように、基本のＳＩＶＡ３と充分に重複したアミノ酸配列を有する。したがって、任意の所定のムテインが、本発明の基本のＳＩＶＡ３と実質的に同じ活性を有するかどうかを、そのような類似体を以下の実施例に説明する生物学的活性試験に付すこと、たとえばｃＩＡＰ１への結合、ＴＲＡＦ２への結合、ＮＩＫ分解の誘導、および／または細胞におけるＮＩＫ媒介ＮＦκＢ活性化の阻害などを含む日常の実験により決定することができる。
【００５３】
本発明にしたがって使用することができるＳＩＶＡ３タンパク質のムテイン、またはそれをコードする核酸は、日常的に過度の実験を伴うことなく、本願明細書に示された教示および助言に基づき当業者により得ることができる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとして、実質的に対応する配列の有限集合を含む。タンパク質の化学および構造の詳しい説明については、Schulz, G.E.ら、Principle of Protein Structure, Spring-Verlag, New York, 1978; およびCreighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983を参照。これらの文献は参考文献として本明細書に組み込まれる。コドン選択などのヌクレオチド配列置換の提示については、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene PublicationsおよびWiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989参照。
【００５４】
本発明によれば、ムテインの好ましい変化は、「保存的」置換として知られるものである。本質的に天然に存在するＳＩＶＡ３配列を有するＳＩＶＡ３タンパク質における保存的なアミノ酸置換は、充分同様の物理化学的性質を有するグループ内の同義アミノ酸を含み、そのグループのメンバー間の置換はその分子の生物学的機能を保存する（Granthem, Science, Vol. 185, pp. 862-864（1974））。アミノ酸の挿入および欠失は、特に挿入または欠失が、数個のアミノ酸、たとえば３０個以下および好ましくは１０個以下を伴い、また機能的コンフォメーションに絶対不可欠な、たとえばシステイン残基などのアミノ酸を除去または取換えない場合、前記定義された配列においてその機能を変化させることなくなされ得るということが明らかである（Anfinsen, “Principles That Govern The Folding of Protein Chains”, Science, Vol. 181, pp. 223-230（1973））。そのような欠失および／または挿入により作製された類似体は本発明の範囲に入る。
【００５５】
好ましくは、同義的アミノ酸のグループは表Ｉに定義されるものである。より好ましくは、同義的アミノ酸のグループは表IIに定義されるものであり、最も好ましくは、同義的アミノ酸のグループは表IIIに定義されるものである。
【００５６】
【表１】
2011517280.tif 000003
【００５７】
【表２】
2011517280.tif 000004
【００５８】
【表３】
2011517280.tif 000005
【００５９】
ＳＩＶＡ３のムテインを得るために使用することができるタンパク質におけるアミノ酸置換の製造例には、Markらの米国特許ＲＥ３３，６５３号明細書、米国特許第４，９５９，３１４号明細書、米国特許第４，５８８，５８５号明細書および米国特許第４，７３７，４６２号明細書；Kothsらの米国特許第５，１１６，９４３号明細書；Namenらの米国特許第４，９６５，１９５号明細書、Chongらの米国特許第４，８７９，１１１号明細書；およびLeeらの米国特許第５，０１７，６９１号明細書に示されたもの；ならびに米国特許第４，９０４，５８４号明細書（Strawら）に示されたリジン置換タンパク質などのあらゆる既知の方法工程が含まれる。
【００６０】
本発明のもう１つの好ましい実施態様において、本発明において使用するためのＳＩＶＡ３タンパク質のあらゆるムテインは、本発明の前記ＳＩＶＡ３タンパク質の配列と本質的に対応するアミノ酸配列を有する。用語「本質的に対応する」とは、特に、ＳＩＶＡ３に対するその影響が懸念される限りにおいてその基本の特徴に影響しない、基本のＳＩＶＡ３タンパク質の配列に対して変化の少ないムテインを包含することが意図される。通常、「本質的に対応する」という言葉に該当するとみなされる変化の種類は、本発明のＳＩＶＡ３タンパク質をコードするＤＮＡの従来の突然変異誘発技術から生じるものであり、数個の重要でない修飾、および所望の活性について前述した方法でスクリーニングに帰着する。
【００６１】
本発明の１つの実施態様において、このムテインはいずれも、配列番号１に示すＳＩＶＡ３の配列と少なくとも４０％の同一性を有し、より好ましくは、ＳＩＶＡ３の配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有する。本発明のさらなる実施態様において、任意のこのようなムテインは、ＳＩＶＡ３のアミノ酸４０〜１０８の配列と少なくとも２０％の同一性を有し、より好ましくは、ＳＩＶＡ３のアミノ酸４０〜１０８の配列と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。
【００６２】
本発明はまた、ＳＩＶＡ３アイソフォームまたはＳＩＶＡ１および２以外のスプライス変異体を包含する。様々な形のタンパク質が、異なってはいるが関連した遺伝子から産生され得るか、または選択的スプライシングにより同じ遺伝子から生まれ得る。また、アイソフォームは、単一ヌクレオチド多型、同じ遺伝子のアレル間の小さな遺伝的相違により形成される。タンパク質アイソフォームは、同じタンパク質の別のアイソフォームとほんのわずかな相違を有するタンパク質の型である。本発明の１つの実施態様において、ＳＩＶＡ３アイソフォームは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも５０％および８０％のアミノ酸同一性を有するものであり、より好ましいアイソフォームは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも９０％の同一性を有するものであり、最も好ましい変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも９５％の同一性を有するものである。本発明のさらなる実施態様において、ＳＩＶＡ３アイソフォームは、配列番号１のアミノ酸４０〜１０８のアミノ酸配列に少なくとも２０％、または５０％、８０％、９０％および９５％の同一性を有するものである。
【００６３】
同一性は、配列を比較することにより決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を示す。概して、同一性とは、比較される配列の長さにわたって、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの、それぞれヌクレオチド対ヌクレオチドのまたはアミノ酸対アミノ酸の正確な一致を意味する。
【００６４】
正確に一致していない配列に対して、「％の同一性」が決定され得る。概して、比較すべき２つの配列は、配列間の最大の相関が生じるように並べられる。これには、アライメントの程度を高めるために、配列の片方または両方どちらかに「ギャップ（gap）」の挿入を含んでもよい。％同一性は、比較される配列それぞれの長さ全体にわたって決定され得（いわゆるグローバルアラインメント）、これは同一かかなり類似した配列に特に適しており、またはより短い定義された長さにわたって決定され得（いわゆるローカルアラインメント）、これは不揃いな長さの配列に適している。
【００６５】
本明細書において使用される場合、用語「配列同一性」は、アミノ酸配列が、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アラインメントプログラムのウインドウズインターフェースである（Thompsonら、1994）、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムを用いる低ホモロジー領域の改良版で、HanksおよびQuinn（1991）によるアライメントにより比較されるということを意味する。Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムは、ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/clustalx/でインターネットにより利用可能である。もちろん、このリンクが使えなくなった場合は、当業者は過度の実験をすることなく標準的なインターネット検索技術を用いて他のリンクからこのプログラムのバージョン類を見つけることができるということが理解されるべきである。他に特段の定めがない限り、本明細書において引用されるプログラムはいずれも、本願の有効出願日現在で、最新バージョンが本発明を実施するために使用されるものである。
【００６６】
「配列同一性」を決定するための前記方法が、何らかの理由により有効でないと判断される場合、次の技術により配列同一性を決定することができる。配列は、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ’ｓ  ＧＤＡＰ（グローバルアライメントプログラム）のバージョン９を用いて、−１２のギャップオープンペナルティー（ギャップの最初の空値について）と−４のギャップ拡張ペナルティー（ギャップにおける付加的な連続した空値それぞれ毎に）とを有する初期値（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリックス（−４〜＋１１の値）を用いて整列される。アラインメント後、％同一性が一致数を請求する配列におけるアミノ酸数の割合として表現することにより計算される。
【００６７】
本発明によるムテインは、ストリンジェントな条件下で本発明によるＳＩＶＡ３タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズし、本質的にＳＩＶＡ３をコードする天然に存在する配列の全てを含むＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされるものを含む。たとえば、そのようなハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡは、図２および配列番号１に示される配列などを有する本発明の同じタンパク質をコードするものであるが、しかしそのヌクレオチドは、遺伝コードの縮重のために天然由来のヌクレオチド配列とはヌクレオチド配列が異なる、すなわち、多少異なるヌクレオチド配列がなお、この縮重により同じアミノ酸配列をコードし得る。
【００６８】
本明細書中で使用される用語「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の１つの鎖を塩基対を介して相補鎖と結びつける任意のプロセスを含むものとする（Coombs J, 1994, Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY）。「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの産生として定義され、通常、本技術分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて行われる（DieffenbachおよびDveksler, 1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）。
【００６９】
「ストリンジェンシー」は、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブの融解温度より５℃低い）〜Ｔｍより約２０〜２５℃低い範囲で見られる。
【００７０】
用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が通常「ストリンジェント」と呼ぶハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄条件をいう。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995；Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）参照。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション実験において使用される温度の関数、ハイブリダイゼーション溶液における一価の陽イオンのモル濃度およびホルムアミドの割合である。所定の条件の組に関連したストリンジェンシーの程度を決定するために、まずＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度Ｔｍとして表現される１００％同一性のハイブリット安定性を決定するためのMeinkothら（1984）の方程式を使用する。
Ｔｍ＝81.5Ｃ＋16.6(ＬｏｇＭ)＋0.41(％ＧＣ)−0.61(％ホルム)−500/Ｌ
式中、Ｍは一価の陽イオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のＧおよびＣヌクレオチドの割合であり、％ホルムは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアルデヒドの割合であり、Ｌは、塩基対におけるハイブリッドの長さである。Ｔｍが、１００％同一性ハイブリッドに対して計算されるＴｍから減少される１Ｃにつき、許容されるミスマッチの量は約１％ずつ増加する。したがって、特定の塩およびホルムアルデヒド濃度での任意の所定のハイブリダイゼーション実験に対して使用されるＴｍがMeinkothの方程式による１００％ハイブリッドの計算Ｔｍより１０Ｃ低い場合、ハイブリダイゼーションは約１０％までミスマッチがあっても生じるであろう。
【００７２】
本明細書において使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」とは、上記方程式により計算されるか、正確に測定されるかのいずれかの場合に、標的配列との完全な二本鎖に対するＴｍより１０Ｃ以下低いＴｍを提供するものである。「中程度にストリンジェントな条件」とは、上記方程式により計算されるか、正確に測定されるかのいずれかの場合に、標的配列との完全な二本鎖に対するＴｍより２０Ｃ以下低いＴｍを提供するものである。非限定的な高度にストリンジェント（ハイブリッドの計算または測定Ｔｍより５〜１０Ｃ低い）および中程度にストリンジェント（ハイブリッドの計算または測定Ｔｍより１５〜２０Ｃ低い）な条件の例は、ハイブリッドの計算されたＴｍより適切に低い温度で、２×ＳＳＣ（標準生理食塩水クエン酸塩）および０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の洗浄条件を使用する。条件の究極のストリンジェンシーは、使用されるハイブリダイゼーション条件が、安定性の低いハイブリッドが安定したハイブリッドを伴い形成できる条件である場合特に、主に洗浄条件による。高度なストリンジェンシーでの洗浄条件は、その結果安定性の低いハイブリッドを除外する。上述の高度にストリンジェントな洗浄条件から中程度にストリンジェントな洗浄条件で使用できる一般的なハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ（標準生理食塩水−リン酸−ＥＤＴＡ））、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性し断片化したサケ精子ＤＮＡの溶液におけるＴｍより約２０〜２５Ｃ低い温度でのハイブリダイゼーションである。混合プローブを用いる場合、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい（Ausubel, 1987, 1999）。
【００７３】
ＳＩＶＡ３のＤＮＡ配列（配列番号２）およびその対応する推定アミノ酸配列（配列番号１）は、本発明により確立され、図２および３にそれぞれ開示される。ＳＩＶＡ３スプライス変異体はエクソン１および４によりコードされ、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２にほとんど相同性をもたないことが見出された。実際、ＳＩＶＡ３は、ＳＩＶＡ２に約３５％（１１０中３９アミノ酸）同一であり、ＳＩＶＡ１への同一性は２２％（１７５アミノ酸中３９アミノ酸）を下回る。
【００７４】
したがって、本発明は、（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、断片、活性画分、円順列変異誘導体から選択されるＳＩＶＡ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）中程度にストリンジェントな条件下で配列番号２のヌクレオチド１１９〜３２４までの範囲のポリヌクレオチド配列またはその断片にハイブリダイズできる配列を含むポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号２の１１９〜３２４ヌクレオチド残基由来の、少なくとも１０、１１〜２９、３０〜５０、および５０〜１９９の連続したヌクレオチド、および２００〜２０５の連続したヌクレオチドの断片を含むポリヌクレオチドなどの精製または単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００７５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする精製された核酸分子またはポリヌクレオチドを提供する。本発明は、高度にストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子とハイブリダイズする精製された核酸分子またはポリヌクレオチド；本発明のポリペプチドをコードする精製された核酸分子またはポリヌクレオチド；中程度にストリンジェントな条件下で配列番号１のアミノ酸残基４０〜１０８をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする精製された核酸分子またはポリヌクレオチド；または中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号２のヌクレオチド残基１１９〜３２４のポリヌクレオチド断片にハイブリダイズする精製された核酸分子またはポリヌクレオチド；または配列番号２の配列を有する受託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３８８０のクローンも提供する。
【００７６】
本明細書において使用される場合、用語「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態でのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、特段の定めがない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で機能できる天然に存在するヌクレオチドの既知の類似体を含むポリヌクレオチドを包含する。核酸分子をＤＮＡ配列により表す場合、「Ｕ」（ウリジン）が「Ｔ」（チミジン）に取って代わった対応するＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子をも含むことは理解されるであろう。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドは、縮重コドンを含むポリヌクレオチドおよび／または高度にストリンジェントな条件下で上記に示す配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドも含む。
【００７８】
ＳＩＶＡ３のポリヌクレオチドは、たとえばノーザンブロット分析またはＰＣＲによりサンプル中のＳＩＶＡ３ポリペプチドの発現レベルを検出するためのプローブおよび／またはプライマーとして使用できる。少なくとも１０、好ましくは１９〜２９の連続したヌクレオチドのＳＩＶＡ３ポリヌクレオチドがプライマーとして使用でき（図１にまとめられた１つの実施例に示されるように）、そして２００〜２５００の連続ヌクレオチドにおよぶ断片がプローブとして使用できる。1つの実施態様において、本発明は、配列番号２のヌクレオチド残基１１９〜３２４から、少なくとも１０、好ましくは１９〜２９、および３０〜５０の連続ヌクレオチドにおよぶ断片、および５０〜２００の連続ヌクレオチドにおよぶ断片を提供する。
【００７９】
以下のプライマー、CGCGGATCCACCATGCCCAAGCGGAGCTGCCCC（配列番号３）、およびリバース：CCGCTCGAGGCCAGCCTCAGGTCTCGAACATGG（配列番号４）がＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の元の終止コドンでＰＣＲによりＳＩＶＡ３発現を検出するために使用することができる。しかし、全長ＳＩＶＡ３発現を排他的にモニターするためには、元の終止コドンの後、フレームシフト後に生じる最初の終止コドンで、以下のプライマーが使用できる。
フォワード：CGCGGATCCACCATGCCCAAGCGGAGCTGCCCC（配列番号５）
リバース：CCGCTCGAGAGAGGTTTATTCATTCTGTCATTAGG（配列番号６）
【００８０】
また、本発明のポリヌクレオチドは、細胞においてＳＩＶＡ３をサイレンスまたは阻害するための低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として使用してもよい。したがって、本発明は、配列番号２の配列にＲＮＡレベルで同一である核酸配列の１５と３０との間の連続ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを提供する。１つの実施態様において、本発明は、配列番号２のヌクレオチド残基１１９〜３２４からの配列にＲＮＡレベルで同一である核酸配列の１５と３０との間の連続ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを提供する。本発明は、ＳＩＶＡ１またはＳＩＶＡ２の核酸配列における一続きのヌクレオチドとして存在する配列を含む任意の断片含むことを意図するものではなく、含まないことに留意すべきである。
【００８１】
ｓｉＲＮＡは、特定のｍＲＮＡ標的の転写後のサイレンシングのために広く使用される。ｓｉＲＮＡは、１５および３０ｂｐ長の、典型的には９〜２１ｂｐ長の、各３’末端に突出する２つのヌクレオチドを有する二本鎖ＲＮＡで構成される。あるいは、２７−ｍｅｒ平滑末端ヌクレオチドが使用され得る。たとえば、特定のｓｉＲＮＡは、特定のｍＲＮＡ標的の転写後のサイレンシングに使用することができる（DorsettおよびTuschl, 2004）。ＲＮＡｉにおける標的特異性は、ＲＮＡ−ＲＮＡ配列認識および塩基対形成により達成される。ｓｉＲＮＡは、通常１９〜２１塩基対長の、各３’末端に突出する２つのヌクレオチドを有する二本鎖ＲＮＡで構成される。あるいは、２７−ｍｅｒ平滑末端ヌクレオチドが、遺伝子サイレンシングにおいて改善された有効性を示すので使用され得る（Kim, Behlkeら、Nat Biotechnol. 2005 Feb;23(2):222-6. Epub 2004 Dec 26）。ｓｉＲＮＡの細胞中への輸送は、リポソーム中への封入により、または高い脂溶性薬剤への共有結合により増進してもよい。Soutschekら、（2004）。
【００８２】
ＳＩＶＡ３ポリペプチド発現の阻害剤の別の例としては、特異的低分子ヘアピン型ＲＮＡ（short hairpin RNA）（ｓｈＲＮＡ）がある。ｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築するための設計およびクローニング戦略は、本技術分野において公知である（McIntyreおよびGregoryら、BMC Biotechnology 2006, 6:1）。
【００８３】
遺伝子の既知のｍＲＮＡ配列が与えられれば、該ｍＲＮＡ配列に特異的に結合し切断するＲＮＡ分子であるリボザイムが設計され得る（たとえば、Chenら、Ann N Y Acad Sci. 1992 Oct 28;660:271-3; Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11;20(17):4581-9, ZhaoおよびPick, Nature. 1993 Sep 30;365(6445):448-51., Shoreら、Oncogene. 1993 Nov;8(11):3183-8., JosephおよびBurke, J Biol Chem. 1993 Nov 25;268(33):24515-8, Shimayamaら、Nucleic Acids Symp Ser. 1993;(29):177-8参照）。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよび該ベクターを有する宿主細胞も本発明により提供される。
【００８５】
１つの実施態様において、本発明は、転写および翻訳調節エレメントなどの１つ以上の他のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＳＩＶＡ３のポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリヌクレオチドは、ベクター中に含有させることができ、該ベクターは発現ベクターであり得、そしてその核酸分子またはベクターは、宿主細胞中に含有させることができる。ベクターの例としては、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミドベクター、およびウイルスベクターが挙げられるがそれらに限定されるものではない。通常、本発明のポリヌクレオチドのほかに、ベクターは、選択可能なマーカー、プロモーターやポリアデニル化シグナル配列などの転写調節エレメント、リボソーム結合部位などの翻訳調節エレメントを含むことができる。プロモーター配列は、そこに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの組織特異的発現を提供できる。
【００８６】
ベクターは、通常所望により原核または真核宿主系、またはその両方における複製に必要とされるエレメントを含む。そのようなベクターには、プラスミドベクター、ならびにバクテリオファージ、バキュロウイルスベクターおよび特定の宿主系、特に哺乳動物系での使用のために開発されたウイルスベクターなどのウイルスベクターがあり、たとえばレトロウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくものなどのレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどがある。これらのウイルスベクターは周知であり、商業的に入手できる。
【００８７】
発現ベクターは、ＳＩＶＡ３ポリペプチドの発現のために組換え宿主細胞中にトランスフェクトできる。宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞、酵母また哺乳類細胞などの真核細胞である。宿主細胞は、たとえば大量の単離タンパク質を得るために高レベルの発現に対して選択される。宿主細胞は、細胞培養培地中に維持されるか、または生物中のインビボの細胞でもあり得る。
【００８８】
本発明は、ＳＩＶＡ３ポリペプチドの産生方法も提供する。
【００８９】
本発明のポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを含有する宿主細胞を好適な条件下で培養し該ポリペプチドを発現させ、任意にはその培養培地からポリペプチドを単離することにより産生できる。
【００９０】
さらに、本発明は、原核細胞または哺乳類、昆虫類および酵母細胞などの真核細胞から選択される宿主細胞を提供する。本発明の１つの実施態様において、その細胞は、ＨｅＬａ、２９３ＴＨＥＫまたはＣＨＯ細胞であり、本発明のポリペプチドを産生する方法において本発明のポリペプチドをコードする発現ベクターを含む。あるいは、本発明は、トランスジェニック動物の作製および該動物の体液からの産生されたタンパク質の単離を含む本発明のポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００９１】
ＳＩＶＡ３ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするベクターによりトランスフェクト、形質導入または感染された細菌または真核宿主細胞において、またはトランスジェニック動物において産生され得る。トランスジェニック動物を用いる場合、その乳中に異種ポリペプチドを産生することが特に有利である。
【００９２】
哺乳類細胞におけるＳＩＶＡ３ポリペプチドの発現は、そのポリペプチドをコードするＤＮＡを、プロモーター、任意にはイントロン配列およびスプライシングドナー／アクセプターシグナル、およびさらに任意には終止配列および分泌シグナルペプチドを含むベクターに、周知の技術（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、１６章に記載されている）により挿入することにより実施してもよい。
【００９３】
哺乳類細胞におけるＳＩＶＡ３ポリペプチドの発現は、たとえばＳＩＶＡ３ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現の増加を誘導することにより実施してもよい。内因性のＳＩＶＡ３の発現を変化させることも、疾患、障害または症状を治療するために採用することができる。本発明は、本発明の内因性ポリペプチドのレベルを有効に変化できる、または内因性ポリペプチドの活性を調節することができる化合物を包含する。必要に応じて、本発明の化合物は、遺伝子の発現レベルまたは内因性ポリペプチドの活性を増加または減少させ得る。そのような化合物は、充分でない量のポリペプチドを発現する細胞においてＳＩＶＡ３ポリペプチドの内因性産生を誘導するためのベクターであり得る。そのベクターは、ＳＩＶＡ３ポリペプチドの発現を望まれる細胞において機能する調節配列を含み得る。そのような調節配列は、たとえば、プロモーターまたはエンハンサであり得る。ついで、調節配列は、相同組換えによりゲノムの正しい遺伝子座に導入され、調節配列は、発現の誘導または増強が必要とされる遺伝子と作動可能に連結され得る。その技術は、通常、「内因性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）と呼ばれ、国際公開第９１／０９９５５号パンフレットに記載されている。
【００９４】
当業者には、内因性ＳＩＶＡ３ポリペプチドが過剰発現され、細胞中に過剰量のポリペプチドが生じた場合、直接的にＳＩＶＡ３ポリペプチド発現を閉鎖することも可能であるということが理解されるであろう。そうするために、サイレンシングエレメントなどの負の調節エレメントがＳＩＶＡ３の遺伝子座に導入され、ゆえにＳＩＶＡ３発現のダウンレギュレーションまたは抑制を導く。当業者は、そのようなＳＩＶＡ３発現のダウンレギュレーションまたはサイレンシングは、疾患を予防および／または治療するためにＳＩＶＡ３アンタゴニストの使用と同じ効果を有するということを理解するであろう。
【００９５】
本発明は、ＳＩＶＡ３のアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングする方法も提供する。
【００９６】
ＳＩＶＡ３ポリペプチドの機能の同定は、疾患の治療および／または診断において使用できる化合物の同定のためのスクリーニング方法の設計への道を開く。本発明により、ＨｅＬａ細胞におけるＳＩＶＡ３レベルの増加がこれらの細胞でのＮＩＫの分解を誘導するということが見出された。ゆえに、本発明により、ＳＩＶＡ３により媒介されるＮＩＫ分解に続いてｐ１００／ｐ５２の細胞レベルが変化するので、ＳＩＶＡ３はＮＩＫのレベルおよび代替的経路を経て誘導されるＮＦ−κＢ活性を調節する能力があることが見出された。本発明により、ＳＩＶＡ３とＳＩＶＡ２との間の配列の違いにもかかわらず、そしてＳＩＶＡ２と異なりＳＩＶＡ３はＮＩＫに結合しないけれども、ＳＩＶＡ３はＳＩＶＡ２同様ＮＩＫ分解を誘導することができる。ゆえに、内因性スプライス変異体、またはアイソフォームＳＩＶＡ３は、ＮＩＫに結合せず、細胞中のＮＩＫレベルをダウンレギュレートし、ＮＩＫ介在ＮＦκＢ活性化に影響を及ぼし、ｃＩＡＰ１およびＴＲＡＦ２に結合する能力を有しそれを調節し得る。したがって、ＳＩＶＡ３に特異的に結合し（かつＳＩＶＡ１またはＳＩＶＡ２には結合せず）、本発明のＳＩＶＡ３ポリペプチドの機能を調節するＳＩＶＡ３のアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書中「ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物」と名付けられ、同定された。ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物は、酵素などのタンパク質、抗体、天然または修飾基質、レセプター、２５００ダルトンまで、好ましくは８５０ダルトンまたはそれ以下までの有機分子であり得る低有機分子、ペプチド類似物、無機分子、前述したものの構造的または機能的模倣物がある。ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物は、ＳＩＶＡ３ポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変えることができるか、またはＳＩＶＡ３ポリペプチドの活性を調節できるということで同定することができる。
【００９７】
ＳＩＶＡ３の発現および／または活性を変更する能力を有するＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物は、スクリーニング法においてＳＩＶＡ３の前記活性を用いて同定してもよい。たとえば、スクリーニング法は、たとえば細胞におけるＮＩＫレベルのＳＩＶＡ３介在調節、ＮＦ−κＢ活性化のＳＩＶＡ３介在阻害、ＳＩＶＡ３のｃＩＡＰ１への結合およびＳＩＶＡ３のＴＲＡＦ２への結合に対する候補化合物の効果を検査することを含み得る。そのようなスクリーニング法は、本発明の態様として含まれる。
【００９８】
本発明の１つの実施態様において、本発明は、ＳＩＶＡ３に拮抗するまたはＳＩＶＡ３作動性のペプチドまたは低分子をスクリーニングする方法であって、（ｉ）ＮＩＫの分解を許容する条件下で、候補薬剤の存在下または非存在下にＳＩＶＡ３およびＮＩＫを接触すること、（ii）該候補薬剤の存在下または非存在下にＮＩＫおよび／またはｐ１００／ｐ５２のレベルを測定すること、（iii）該候補薬剤の存在下および非存在下におけるＮＩＫおよび／またはｐ１００／ｐ５２のレベルを比較することを含み、該候補薬剤の存在下におけるＮＩＫおよび／またはｐ１００／ｐ５２の変化が、候補薬剤がＮＩＫおよび／またはＮＩＫ介在ＮＦ−κＢのレベルをモジュレートする能力があることの指標となり、ＮＩＫの分解および／またはｐ１００の分解阻害を増加させる場合にアゴニストとして使用でき、ＳＩＶＡ３により介在されるＮＩＫの分解および／またはｐ１００の分解阻害を阻害する場合にアンタゴニストとして使用できることの指標となる方法を提供する。
【００９９】
さらなる実施態様において、スクリーニングアッセイは、細胞に基づくアッセイであり、前記接触は細胞内部で実施される。細胞は、タグ付１−ＮＩＫ発現ベクターおよびタグ付２−ＳＩＶＡ３発現ベクターを発現する組換え細胞であり得、ＮＩＫおよび／またはｐ１００／ｐ５２の細胞レベルは、下記に例示するようなタグ１に特異的な抗体および／またはｐ１００および／またはｐ５２に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングにより評価される。
【０１００】
１つの付加的な実施態様において、本発明は、ＳＩＶＡ３に拮抗するまたはＳＩＶＡ３作動性のペプチドまたは低分子のスクリーニング方法であって、（ｉ）ＳＩＶＡ３のＴＲＡＦ２またはｃＩＡＰ１への結合を許容する条件下で、候補薬剤の存在下または非存在下にＳＩＶＡ３をＴＲＡＦ２またはｃＩＡＰ１と接触させること、（ii）候補薬剤の存在下または非存在下でＳＩＶＡ３−ＴＲＡＦ２またはＳＩＶＡ３−ｃＩＡＰ１複合体のレベルを測定すること、（iii）候補薬剤の存在下または非存在下でＳＩＶＡ３−ＴＲＡＦ２またはＳＩＶＡ３−ｃＩＡＰ１複合体のレベルを比較することを含み、該候補薬剤の存在下におけるＳＩＶＡ３−ＴＲＡＦ２またはＳＩＶＡ３−ｃＩＡＰ１複合体のレベルの変化が、候補薬剤がＳＩＶＡ３−ＴＲＡＦ２またはＳＩＶＡ３−ｃＩＡＰ１複合体のレベルをモジュレートする能力があるということおよびＳＩＶＡ３のアゴニストまたはアンタゴニストであるということの指標となる方法を提供する。
【０１０１】
１つの実施態様において、ＳＩＶＡ３アゴニストまたはアンタゴニスト化合物は、体液、細胞抽出物およびＤＮＡ発現ライブラリから選択されるサンプルから誘導され得る。アゴニストアンタゴニストタンパク質は、限定されるものではないが、後述の実施例に示すようにＳＩＶＡ３ポリペプチドと特異的抗体との共免疫沈降；ＳＩＶＡ３ポリペプチドをプレイまたはベイトとして使用する本技術分野で周知の（および米国特許第７，１８９，５３５号明細書に記載されている）ツーハイブリット法；および固定化されたＳＩＶＡ３ポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーなどのスクリーニング法により単離することができる。
【０１０２】
本発明はまた、配列番号１のアミノ酸配列、特に４０〜１０８のアミノ酸におよぶ配列を含むＳＩＶＡ３ポリペプチドを用いて製造されるポリクローナルまたはモノクローナル抗体、キメラ抗体、完全ヒト化抗体、抗−抗−Ｉｄ抗体またはそれらの断片を提供する。この定義は、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２  にも結合することができる抗体を排除するものである。
【０１０３】
「完全ヒト化抗体」は、ヒトイムノグロブリンの可変領域および定常領域の両方を含有する分子である。完全ヒト化抗体は、自己免疫疾患などの慢性および再発性疾患のために繰り返し治療が必要とされる治療用途に使用できる可能性がある。完全ヒト化抗体の１つの製造方法は、マウス体液性免疫システムの「ヒト化」、すなわち、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウスへ導入することによりヒトＩｇ（キセノマウス）を産生することができるマウス系統を作製することからなる。Ｉｇ遺伝子座は、それらの物理的構造と、広い免疫応答を最終的に生み出すために必要とされる遺伝子再配列および発現プロセスとの両方の点から極めて複雑である。抗体の多様性は、主にＩｇ遺伝子座に存在する種々のＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子間のコンビナトリアル再配列により作り出される。これらの遺伝子座はまた、抗体の発現、対立遺伝子排除、クラススイッチおよび親和性成熟を制御する、散在調節エレメントを含む。未再配列ヒトＩｇトランス遺伝子のマウスへの導入により、マウス組換え機構は、ヒト遺伝子と競合するということが証明されている。さらに、種々のイソ型の抗原特異的ｈｕ−ｍＡｂｓを分泌するハイブリドーマが抗原とのキセノマウス免疫により得られる。
【０１０４】
完全ヒト化抗体およびその製造方法は、本技術分野において公知である（Mendezら、Nature Genetics 15:146-156(1997); Buggemannら、Eur. J. Immunol. 21:1323-1326(1991); Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727(2000); 特許国際公開第９８／２４８９３号パンフレット ）。
【０１０５】
抗体の別の種類は、抗−イディオタイプの抗体である。抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は、通常抗体の抗原結合部位と関連した固有の抗原決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗−Ｉｄが製造されるＭａｂの源として種および遺伝子型が同じ動物（たとえば、マウス系統）を免疫することにより製造できる。免疫された動物は、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することにより、これに応答する。たとえば、米国特許第４，６９９，８８０号明細書参照、これは参考文献として本明細書に全体が組み込まれる。
【０１０６】
また、抗Ｉｄ抗体は、さらに別の動物において免疫応答を誘導し、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生させるための「免疫原」として使用され得る。抗−抗Ｉｄは、抗−ｉｄを誘導した元のｍＡｂとエピトープが同一であり得る。したがって、ＭＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することにより、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。
【０１０７】
用語「抗体」は、完全な分子と、抗原に結合できるその断片、たとえばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２の両方を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、完全な抗体のＦｃ断片を欠き、より迅速に循環から消え、完全な抗体よりも非特異的組織結合が少ない（Wahlら、1983）。
【０１０８】
本発明に有用なＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２および抗体のほかの断片は、完全な抗体分子について本明細書開示される方法にしたがい、ＳＩＶＡ３ポリペプチドの検出および定量のために使用してもよい。そのような断片は、通常パパイン（Ｆａｂ断片の製造）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片の製造）などの酵素を用いて、タンパク質の開裂により製造される。
【０１０９】
抗体は、これが、分子と特異的に反応することができ、それにより、該分子が抗体に結合する場合、分子に「結合することができる」と言える。用語「エピトープ」は、任意の分子の抗体によって結合され得、また該抗体によって認識され得る部分を指すことを意図する。エピトープまたは「抗原決定基」は、通常、分子の化学的に活性な表面基（たとえば、アミノ酸または糖側鎖など）からなり、特異的な三次元の構造的特徴および特異的な帯電特性を有する。
【０１１０】
本発明において有用な抗体（またはその断片）はＳＩＶＡ３のインサイチュ検出のために、免疫蛍光顕微鏡法または免疫電子顕微鏡法などの場合に組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は、患者から組織学的試験片を取り出し、かかる試験片に対して本発明の標識抗体を提供することによりなされ得る。抗体（または断片）は、好ましくは、標識抗体（または断片）を生物学的サンプルに適用することにより、またはこの上に重層することにより提供される。このような手順の使用により、ＳＩＶＡ３ポリペプチドの存在のみならず、試験した組織上での分布もまた調べることが可能である。本発明を用い、当業者には、このようなインサイチュ検出を達成するために、任意の多種多様な組織学的方法（染色手順など）を改変し得ることが容易にわかるであろう。
【０１１１】
本発明のＳＩＶＡ３ポリペプチドのレベルの検出のためのこのようなアッセイは、通常、生物学的液体、リンパ球もしくは白血球などの採取したての細胞由来の組織抽出物、または組織培養物中でインキュベートされている細胞などの生物学的サンプルを、ＳＩＶＡ３ポリペプチドを同定することができる検出可能な標識抗体の存在下でインキュベートすること、および本技術分野で周知の多数の技術のいずれかにより抗体を検出することを含む。
【０１１２】
「生物学的液体」、または生物学的サンプルは、細胞、細胞成分または細胞製品由来のまたは含有する任意の液体を示す。生物学的液体は、限定されるものではないが、細胞培養上清、細胞ライセート、除去処理細胞ライセート（cleared cell lysates）、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清、乳およびそれらの画分を含む。
【０１１３】
生物学的サンプルは、固相支持体もしくは担体（たとえば、ニトロセルロースなど）または細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固体支持体もしくは担体と処理され得る。該支持体または担体を、次いで、適当なバッファーで洗浄した後、上記のようにして、本発明による検出可能な標識抗体で処理し得る。固相支持体または担体を、次いで、該バッファーでの２回目の洗浄を行ない、未結合抗体を除去する。次いで、固体支持体または担体上の結合標識の量を、慣用的な手段により検出し得る。
【０１１４】
「固相支持体」、「固相担体」、「固体支持体」、「固体担体」、「支持体」または「担体」は、抗原または抗体を結合することができる任意の支持体または担体を意図する。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンアミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩ならびにマグネタイトが挙げられる。担体の性状は、本発明の目的のために、ある程度可溶性のあるもの、または不溶性であり得る。支持体材料は、結合された分子が抗原または抗体に結合することができるものであれば、事実上任意の可能な構造的構成を有し得る。したがって、支持体または担体の構成は、ビーズのような球状、テストチューブの内側表面または棒状物の外側表面のような円柱であり得る。あるいはまた、表面は、シート、試験細片などの平坦なものであってもよい。好ましい支持体または担体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者には、抗体または抗原に結合させるための他の好適な担体がわかるだろうし、または常套的な実験法の使用により、これを確認することができるだろう。
【０１１５】
本発明の所与のロットの抗体の結合活性は、上記のように、周知の方法にしたがって測定され得る。当業者は、常套的な実験法を用いることによる各測定のための作業条件および最適なアッセイ条件を決定することができよう。
【０１１６】
通例、または特定の状況に必要であるように、洗浄、攪拌、振とう、濾過など他の工程をアッセイに追加してもよい。
【０１１７】
本発明による抗体が検出可能に標識され得る方法の１つは、これを酵素に連結することによるものであり、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）において使用され得る。この酵素は、今度は、後に適切な基質に曝露した場合、たとえば分光測光的手段、蛍光分析的手段により、または可視化手段により検出可能な化学的部分を生じるような様式で基質と反応する。抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素としては、限定されるものではないが、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ（glucoamylase）およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。検出は、酵素用の発色性基質を用いる比色分析方法によってなされ得る。検出はまた、同様に調製された標準品と比較した基質の酵素的反応の程度の視覚による比較によってもなされ得る。
【０１１８】
検出は、任意の多様な他のイムノアッセイを用いてなされ得る。たとえば、抗体または抗体断片を放射能で標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用によってＲ−ＰＴＰアーゼを検出することが可能である。ＲＩＡの充分な記載は、Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology,(Work, T. S.らによる), North Holland Publishing Company, NY (1978)（具体的な記載は、Chard, T.による表題“An Introduction to Radioimmne Assay and Related Techniques”の章になされている）に見出され得、参考文献として本明細書に組み込まれる。放射性同位体は、ｇカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【０１１９】
本発明による抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光により標識された抗体を適切な波長の光に曝露すると、その存在が、蛍光によって検出され得る。中でも、最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、ピコシアニン、アロピコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンである。
【０１２０】
抗体はまた、１５２Ｅなどの蛍光発光性金属、またはランタノイド系の他のものを用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＥＴＰＡ）などの金属キレート化基を用いて抗体に結合させることができる。
【０１２１】
抗体はまた、化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識することもできる。次いで、化学発光タグ化抗体の存在を、化学的反応の過程で生じる発光の存在を検出することによって調べる。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【０１２２】
同様に、生物発光化合物も、本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる生物学的な系において見られる化学発光の１種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって調べる。標識の目的に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０１２３】
本発明の抗体分子は、イムノメトリックアッセイ（「２部位」または「サンドイッチ」アッセイとしても知られる）における利用に適合したものであり得る。典型的なイムノメトリックアッセイにおいて、ある量の非標識抗体（または抗体の断片）を固体支持体または担体に結合させ、ある量の検出可能に標識された可溶性抗体を添加し、固相抗体、抗原および標識抗体間で形成される三元複合体の検出および／または定量を可能にする。
【０１２４】
典型的かつ好ましいイムノメトリックアッセイとしては、「フォワード」アッセイ（これは、固相に結合した抗体をまず試験対象試料と接触させ、抗原を試料から二元固相抗体−抗原複合体の形成によって抽出する）が挙げられる。適当なインキュベーション期間の後、固体支持体または担体を洗浄し、未反応抗原（あれば）を含む液体サンプルの残渣を除去し、次いで、未知量の標識抗体（これは「レポーター分子」としての機能を果たす）を含む溶液と接触される。標識抗体が、非標識抗体により固体支持体または担体に結合した抗原と複合体形成するのを可能にするための第２のインキュベーション期間後、固体支持体または担体に２回目の洗浄を行ない、未反応標識抗体を除去する。
【０１２５】
別の型の「サンドイッチ」アッセイ（これもまた本発明の抗原について有用であり得る）において、いわゆる「同時」および「逆」アッセイが使用される。同時アッセイは、固体支持体または担体に結合した抗体および標識抗体の両方が試験対象試料に同時に添加されるため、単一のインキュベーション工程を伴う。インキュベーションが完了した後、固体支持体または担体を洗浄し、液体サンプルの残渣および非複合体化標識抗体を除去する。次いで、固体支持体または担体に結合した標識抗体の存在を、慣用的な「フォワード」サンドイッチアッセイのようにして、調べる。
【０１２６】
「逆」アッセイでは、まず標識抗体の溶液の液体サンプルへの添加、続いて、適当なインキュベーション期間後での固体支持体または担体に結合した非標識抗体の添加の段階的添加を用いる。第２のインキュベーション後、固相を慣用的な様式で洗浄し、試験対象試料の残余および未反応標識抗体溶液を除く。次いで、固体支持体または担体に結合した標識抗体の測定を、「同時」および「フォワード」アッセイのようにして調べる。
【０１２７】
ＲＩＡやＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイの創造は、多くの文献や教科書、およびその他の刊行物に記載されている。参考文献は、国際公開第９７／０３９９８号パンフレットの４８頁４行〜５２頁２７行に述べられている。本発明のイムノアッセイは、２つの一般型とするならば、第１は、固定化されたＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその等価ペプチドを用いるイムノアッセイがＳＩＶＡ３の定量化に使用され得る。第２は、ＳＩＶＡ３ポリペプチドのエピトープに対する固定化された抗体を用いるイムノアッセイがＳＩＶＡ３ポリペプチドの定量に使用され得る。
【０１２８】
そのようなアッセイは、アポトーシスおよび／または免疫に関する経路に関与するＳＩＶＡ３および他のポリペプチドのレベルが、そのような経路の関与の可能性がある多くの疾患、障害または症状において評価されることを必要とする場合、診断における使用を見出し得る。
【０１２９】
用語、タンパク質およびポリペプチドは本明細書において互換性がある。
【０１３０】
本発明はまた、対象における増殖性障害または免疫障害などの疾患の診断方法であって、（ａ）対象由来の生物学的サンプルを得ること；および（ｂ）健常な対象におけるレベルと比較した該サンプル中のＳＩＶＡ３の変化したレベルを検出することを含み、該変化したレベルが、該疾患の診断である方法における、本発明の以下の薬剤、たとえばＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩；ポリヌクレオチド配列；ベクター；本発明の宿主細胞；および／または抗体の使用を提供する。
【０１３１】
同様のアッセイが、患者における増殖性障害または免疫障害のための特定の療法の有効性のフォローアップのために使用することができる。したがって、患者における増殖性障害または免疫障害のための治療のフォローアップのための方法であって、（ａ）対象由来の生物学的サンプルを得ること；および（ｂ）健常な対象におけるレベルと比較した該サンプル中のＳＩＶＡ３のレベル、または治療前、治療中または治療後の患者のＳＩＶＡ３のレベルを検出することを含み、該レベルが健常者に近接している、または治療後または治療中の患者におけるより正常なレベルへの変化が患者における治療の有効性の指標となる方法において、ＳＩＶＡ３ポリペプチドまたはその塩；ポリヌクレオチド配列；ベクター；本発明の宿主細胞；および／または抗体を使用することができる。
【０１３２】
ＳＩＶＡ３のＮＩＫに対する効果は、いくつかの結果を招く。第１はＮＩＫ活性の分解である。これは本明細書中で、過剰発現されたＳＩＶＡ３はＮＩＫの分解を誘導するという細胞に基づくアッセイにおいて証明されている。第２はＮＦ−κＢの阻害である。これは、本明細書中で、過剰発現されたＳＩＶＡ３が、ＮＩＫの過剰発現により誘導されるＮＦ−κＢ活性化を減少させる細胞に基づくアッセイにおいて証明されている。結論として、ＳＩＶＡ３ポリペプチド、抗体または核酸分子、または本発明のベクター、ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物または宿主細胞は、たとえば不適切なＮＩＫ介在活性またはＮＩＫ介在ＮＦ−κＢ活性により特徴付けられる疾患、障害または症状（たとえば、発達障害、細胞増殖性障害および免疫性障害など）におけるＮＩＫおよびＮＦ−κＢの活性のモジュレーティングにおいて有用である。本発明の１つの実施態様において、疾患、障害または症状は、増加されたＮＩＫおよびＮＦκＢ活性により介在される宿主免疫の増加、炎症性応答および／または細胞増殖の増加に特徴付けられ、ゆえにＳＩＶＡ３ポリペプチドまたは任意の他のアゴニストは、該疾患、障害または症状の治療に使用され得る。別の実施態様では、疾患、障害または症状は、減少されたＮＩＫおよびＮＦκＢ活性により介在される宿主免疫応答および／または細胞増殖の減少により特徴付けられ、ゆえに、たとえば特異的ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ，リボザイム、抗体または任意の他のアンタゴニストによるＳＩＶＡ３ポリペプチドのサイレンシングを使用することができる。
【０１３３】
したがって、ＳＩＶＡポリペプチド、抗体または核酸分子、ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物、本発明のベクターまたは宿主細胞は、ＳＩＶＡ３のレベルまたは活性に関連する状況の療法（予防または治療）または診断において使用することができる。このような状況には、発達障害；たとえば癌、黒色腫、肉腫、腎腫瘍、結腸腫瘍などの腫瘍性疾患などの細胞増殖性障害；遺伝性障害；神経系障害；代謝異常；感染症および他の病的症状；変形性関節症、自己免疫疾患、リウマチ性関節症、乾癬、全身性多発性硬化症、およびエリテマトーデスなどの免疫障害；糸球体腎炎、アレルギー、鼻炎、結膜炎、ブドウ膜炎、消化系炎症、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性大腸炎、重症筋無力症、膵炎、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、筋肉痛、強直性脊椎炎、喘息、気道炎症などの炎症性障害；創傷治癒；皮膚病；老化；ならびに、原虫（plasmodium）、細菌感染症およびウイルス感染症などの感染症がある。したがって、ＳＩＶＡポリペプチドまたは核酸分子、または本発明のベクターまたは宿主細胞、またはＳＩＶＡ３結合化合物は、そのような状況の治療のための医薬の製造において使用することができる。
【０１３４】
本発明の１つの実施態様において、ＳＩＶＡ３の減少、ＮＩＫ活性および／またはＮＦ−κＢ活性の増加が関係する、原発腫瘍および転移の両方を含む悪性腫瘍などの疾患、障害または症状は、ＮＩＫの活性および／またはＮＦ−κＢ活性をダウンレギュレーション／阻害できる本発明のポリペプチドを投与することにより治療され得る。
【０１３５】
本発明の別の実施態様において、ＳＩＶＡ３の減少、ＮＩＫ活性および／またはＮＦ−κＢ活性の増加が関係する、炎症性疾患、障害または症状などの疾患、障害または症状は、ＮＩＫの活性および／またはＮＦ−κＢ活性をダウンレギュレーション／阻害できる本発明のポリペプチドを投与することにより治療され得る。
【０１３６】
本発明は、細胞におけるＳＩＶＡ３レベルまたは活性を変化させるため、そしてＳＩＶＡ３が、直接的またはこの経路の他のモジュレータ／メディエータを介して間接的に関与する炎症、細胞死または細胞生存経路に対する細胞内効果をモジュレート／媒介するための、ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物、本発明のベクターまたは宿主細胞およびＳＩＶＡ３の活性またはレベルを変えることができる他の化合物の使用を提供する。その使用は、該細胞を１つ以上の以下の分子：ＳＩＶＡ３ポリペプチド、ＳＩＶＡ３特異的抗体または核酸分子、ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物、ＳＩＶＡ３コーディングベクター、およびＳＩＶＡ３の活性またはレベルを変えることができる化合物で治療することを含み、該細胞の治療は、該細胞内にその１つ以上の分子を導入することを含む。本発明の１つの実施態様において、本発明のＳＩＶＡ３ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入を、該配列が該細胞において発現されるようにできる好適なベクターに担持される。そのベクターは、治療されるべき細胞の表面上の特定の細胞表面レセプターに結合する能力があるウイルス表面タンパク質（リガンド）をコードする配列および該細胞において発現されるとＳＩＶＡ３の活性を変える能力がある本発明のポリペプチドをコードする第２配列も担持するウイルスベクターであってよい。
【０１３７】
細胞中のＳＩＶＡ３レベルおよび活性をＳＩＶＡ３ポリペプチド、抗体または核酸分子、ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物、本発明のベクターまたは宿主細胞を用いて変えることは、該細胞をＳＩＶＡ３ポリペプチド、ＳＩＶＡ３特異的抗体または核酸分子、ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物、ＳＩＶＡ３コーディングベクター、ＳＩＶＡ３ポリペプチドを発現する細胞およびＳＩＶＡ３の活性またはレベルを変えることができる化合物で治療することを含み、該治療が、それらが該細胞における細胞外表面に露出している好適な化合物の適用により実施される場合、該組成物は、細胞外適用のために製剤化され、あるいは該治療が、該細胞において細胞内法によりなされる場合、該組成物は、細胞内適用のために製剤化される。
【０１３８】
ＳＩＶＡ３ポリペプチド、ＳＩＶＡ３特異的抗体または核酸分子、ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物、およびＳＩＶＡ３コーディングベクターは、細胞においてＳＩＶＡ３により直接的または間接的にモジュレート／媒介されるプロセスをモジュレートするために使用できる。その使用は、該細胞を、ＳＩＶＡ３ポリペプチド、抗体または核酸分子、ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物、本発明のベクターまたは宿主細胞およびＳＩＶＡ３の活性またはレベルを変えることができる他の化合物で治療することを含み、該細胞の該治療は、該細胞中にＳＩＶＡ３ポリペプチド、抗体または核酸分子、ＳＩＶＡ３モジュレーティング化合物、本発明のベクターまたは宿主細胞およびＳＩＶＡ３の活性またはレベルを変えることができる他の化合物を導入することを含む。１つの実施態様において、ＳＩＶＡ３により媒介／モジュレートされるモジュレーティングプロセスには、細胞におけるＮＩＫ活性およびＮＦ−κＢ活性が含まれる。治療することのできる細胞の非限定的な例は、腫瘍細胞、ＨＩＶ感染細胞または単核細胞の異常細胞などの他の異常細胞がある。本発明の１つの実施態様において、その腫瘍またはＨＩＶ感染細胞または他の異常細胞は、特定の腫瘍細胞表面レセプターまたはＨＩＶ感染細胞表面レセプターまたは以上単核細胞などの他の異常細胞にあるレセプターに結合することができるウイルス表面タンパク質をコードする配列と、該腫瘍細胞ＨＩＶ感染細胞または他の異常細胞において発現されるとＳＩＶＡ３レベルを増強させ、直接または間接的に該細胞を殺すことができるＳＩＶＡ３ポリペプチドをコードする配列とを担持する組換え動物ウイルスベクターで感染される。
【０１３９】
ＳＩＶＡ３ポリペプチド、抗体または核酸分子、ＳＩＶＡ３結合化合物、本発明のベクターまたは宿主細胞は、重要な診断ツールとして役に立つことができる。これらのツールを用い、特にＳＩＶＡ３を調べるために設計されたアッセイおよびキットが設計される。診断キットまたはアッセイにおける試薬の例としては、限定されるものではないが、ＳＩＶＡ３発現の検出を可能にする、ＳＩＶＡ３に対する抗体、ＳＩＶＡ３特異的プローブまたはＰＣＲおよび配列決定プライマーなどのＳＩＶＡ３ポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１４０】
したがって、本発明は対象における疾患を診断するための方法および／またはキットであって、該対象由来の組織における本発明のＳＩＶＡ３ポリペプチドの発現または活性のレベルを評価し、その発現または活性のレベルを対照レベルと比較することを含む方法および／またはキットを提供する。対照レベルは健常者のレベルである。その対照レベルと異なる対象におけるＳＩＶＡ３ポリペプチドまたは活性のレベルが疾患の指標となる。また、本発明は、患者における疾患の治療的処置を、その治療的処置の前、後および／または中で患者由来の組織中の本発明のＳＩＶＡ３ポリペプチドの発現または活性のレベルをモニターすることによりモニターする方法を提供する。治療的処置前の患者のＳＩＶＡ３ポリペプチドのレベルまたは活性と異なる治療的処置後の患者におけるＳＩＶＡ３ポリペプチドのレベルまたは活性が、治療の有用性の指標となる。組織におけるＳＩＶＡ３ポリペプチドの発現のレベルは、後述の実施例に示すように、たとえば特異的プローブによるハイブリダイゼーション；特異的抗体；ＳＩＶＡ３に特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより、測定することができる。本発明の特定の方法およびキットを用い、ＳＩＶＡ３は、ＳＩＶＡ３のレベルとヒトの疾患、障害または症状との関係を見つけるために使用され得、その後該疾患、障害または症状はＳＩＶＡ３のレベルを調節することができる薬剤を投与することにより予防、治療または軽減し得る。
【０１４１】
さらに、本発明は、ＳＩＶＡ３ポリペプチド、抗体または核酸分子、ＳＩＶＡモジュレーティング化合物、本発明のベクターまたは宿主細胞およびＳＩＶＡ３の活性またはレベルを変えることができる他の化合物を、疾患、障害または症状の診断または治療のための医薬の製造において使用するために提供する。
【０１４２】
また、本発明は、患者における疾患の治療方法であって、必要とする患者に治療的に有効量のＳＩＶＡ３ポリペプチド、抗体または核酸分子、ＳＩＶＡモジュレーティング化合物、本発明のベクターまたは宿主細胞およびＳＩＶＡ３の活性またはレベルを変えることができる他の化合物を投与することを含む方法を提供する。さらなる実施態様において、本発明は、ＮＩＫにより生じる、またはＮＩＫと関連する疾患、障害または症状の治療および／または予防方法であって、必要とする対象に治療的に有効量のＳＩＶＡ３ポリペプチド、抗体または核酸分子、ＳＩＶＡ結合化合物、本発明のベクターまたは宿主細胞およびＳＩＶＡ３の活性またはレベルを変えることができる他の化合物を投与することを含む方法に関する。ＳＩＶＡ３の活性またはレベルを変えることは、ＳＩＶＡ３の活性またはレベルを増加させることまたは減少させることである。
【０１４３】
ＳＩＶＡ３ポリペプチドまたは核酸分子、またはベクターまたは宿主細胞、またはＳＩＶＡ３ポリペプチドのレベルまたは活性を増加させることができる本発明の化合物などのＳＩＶＡ３のアゴニストは、たとえば、ＳＩＶＡ３をコードする天然の遺伝子の発現が、またはＳＩＶＡ３ポリペプチドの活性が、健常患者における発現または活性のレベルと比較した場合、異常患者においてより低い疾患、障害または症状において使用され得る。対して、アンチセンス核酸分子、ｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびリガンドなどの、抗体およびＳＩＶＡ３結合タンパク質などのＳＩＶＡ３のアンタゴニストは、ＳＩＶＡ３をコードする天然の遺伝子の発現が、またはＳＩＶＡ３ポリペプチドの活性が、健常患者における発現または活性のレベルと比較した場合、異常患者においてより高い疾患、障害または症状において使用され得る。
【０１４４】
１つの態様において、本発明は、ＳＩＶＡ３をコードする天然の遺伝子の発現が、またはＳＩＶＡ３ポリペプチドの活性が、健常患者における発現または活性のレベルと比較した場合、異常患者においてより低く、またはＮＩＫまたはＮＦκＢの活性が健常患者における発現または活性のレベルと比較した場合、異常患者においてより高い疾患の治療のための遺伝子治療の方法であって、ＳＩＶＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用することにより、または「内因性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）により、必要とするヒト患者の所望の部位にＳＩＶＡ３またはムテイン、断片の発現を誘導することを含む方法を提供する。内因性遺伝子活性化は、国際公開第９１／０９９５５号パンフレットに記載されている。
【０１４５】
別の態様において、本発明は、ＳＩＶＡ３をコードする天然の遺伝子の発現が、またはＳＩＶＡ３ポリペプチドの活性が、健常患者における発現または活性のレベルと比較した場合、異常患者においてより高い、またはＮＩＫまたはＮＦκＢの活性が健常患者における発現または活性のレベルと比較した場合、異常患者においてより低い疾患のための遺伝子治療の方法であって、異常細胞に特異的ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、ＳＩＶＡ３に対する細胞内発現抗体すなわちイントラボディ、またはＳＩＶＡ３の他のアンタゴニストを導入することを含む方法を提供する。
【０１４６】
当業者は、ＳＩＶＡ３発現のダウンレギュレーションまたは抑制を細胞内で導く特異的サイレンシングｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムなどの負の調節エレメントを導入することにより、疾患を予防および／または治療するためにＳＩＶＡ３発現を停止することが可能であるということを理解するであろう。当業者は、このようなＳＩＶＡ３発現のダウンレギュレーションまたはサイレンシングがＳＩＶＡ３阻害剤またはアンタゴニストの使用と同じ効果を招くことを理解するであろう。
【０１４７】
これらのツールのいくつかの、治療にまたは診断にまたは調査に関連した使用は、生きている生物の細胞中へのそれらの導入を余儀なくさせる。この目的のために、ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドの膜透過性を改善することが望まれる。新油性構造との誘導体化は、増強された膜透過性を有するペプチドおよびタンパク質の作製に使用され得る。たとえば、前述のように既知の膜向性ペプチドの配列が、ペプチドまたはタンパク質の配列に追加され得る。さらに、ペプチドまたはタンパク質は、少なくとも１つの極性または荷電された基で置換されている、前記炭化水素鎖などの部分的に新油性の構造により誘導体化され得る。たとえば、ペプチドのラウロイル誘導体は、Muranishiら１９９１年に説明されている。ペプチドおよびタンパク質のさらなる修飾には、Zachariaら１９９１年により説明されているように、スルホキシド基を作り出すメチオニン残基の酸化が含まれる。Zachariaおよび共同研究者らは、比較的疎水性のペプチド結合がそのケトメチレンイソエステル（ＣＯＣＨ2）に置き換えられたペプチドまたは誘導体も記載している。これらの修飾そしてタンパク質およびペプチド化学の分野において当業者に知られた他の修飾が、膜透過性を向上させる。
【０１４８】
膜透過性を向上させる別の方法には、ペプチドまたはタンパク質の細胞取り込みを誘導するために細胞表面上のウイルスレセプターなどのレセプターの使用がある。この機序は、ウイルスにより頻繁に使用され、特定の細胞表面分子に特異的に結合する。結合すると、細胞はウイルスをその内部に取り込む。細胞表面分子は、ウイルスレセプターと呼ばれる。たとえば、インテグリン分子ＣＡＲおよびＡｄＶは、アデノウイルスに対するウイルスレセプターとして記載されている、Hemmiら１９９８年およびその参考文献参照。ＣＤ４、ＧＰＲ１１、ＧＰＲ１５およびＳＴＲＬ３３分子は、ＨＩＶに対するレセプター／コレセプターとして同定されている、Edingerら、１９９８年およびその参考文献参照。
【０１４９】
したがって、細胞表面レセプターに結合することが知られている分子へ、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドをコンジュゲートすることは、該ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの膜透過性を向上させる。コンジュゲートを形成するための好適な群の例は、糖、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質などの分子である。Lowら（米国特許第５，１０８，９２１号明細書）は、ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドの膜透過性を向上させる目的でのこれらの分子の使用とそのコンジュゲートの製造方法を記載している。
【０１５０】
Lowおよび共同研究者は、さらに葉酸またはビオチンなどの分子がそのコンジュゲートを生物における多数の細胞への標的とするために使用することができる。これは、これらの分子のレセプターが豊富にかつ非特異的に発現しているためである。
【０１５１】
本発明のペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの膜透過性を向上させるための非細胞表面タンパク質の前記使用は、本発明の該ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを特定の種類の細胞または組織に標的化するのにも使用され得る。たとえば、癌細胞を標的化したい場合、それらの細胞の表面により豊富に発現される細胞表面タンパク質を使用することが好ましい。そのような例としては、葉酸レセプター、ムチン抗原ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５ＢおよびＭＵＣ７、糖タンパク質抗原ＫＳＡ、癌胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン−ベータがある。前記Wangら、１９９８年には、癌細胞を標的化するための葉酸の使用が教示されており、そしてZhangら、１９９８年には、様々な種類の癌および正常細胞において前述の他の各抗原の相対存在量が記載されている。
【０１５２】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは化合物は、したがって、前記コンジュゲーション技術を用い、要望通りに特定の細胞種に標的化され得る。たとえば、リンパ球系統の細胞においてＮＩＫを阻害したい場合、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは化合物が、たとえばこれらの細胞上に発現されるＭＨＣクラスII分子を用いることによってそのような細胞を標的とし得る。これは、前記ＭＨＣクラスII分子の定常領域に対する抗体またはその抗原結合部位を本発明のタンパク質またはペプチドとカップリングさせることにより達成される。さらに、様々なサイトカインに対する多数の細胞表面レセプターおよび他の細胞コミュニケーション分子が記載されており、これらの分子の多くは、多かれ少なかれ組織または細胞の種類に制限された様式で発現される。したがって、Ｔ細胞のサブグループを標的化したい場合、ＣＤ４  Ｔ細胞表面分子を本発明のコンジュゲートの生産に使用してもよい。ＣＤ４−結合分子はＨＩＶウイルスにより提供され、その表面抗原ｇｐ４２はＣＤ４分子に特異的に結合することができる。
【０１５３】
１つの実施態様において、ペプチドおよびポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを使用することにより細胞に導入し得る。この目的のためのワクシニアベクターの使用は、Current Protocols in Molecular Biologyの第１６章に詳しく述べられている。アデノウイルスベクターの使用は、たとえばTeohら（Blood. 1998 Dec 15;92(12):4591-601）、Narumiら、１９９８年（Blood. 1998 Aug 1;92(3):822-33およびAm J Respir Cell Mol Biol. 1998 Dec;19(6):936-41）、Pedersonら、１９９８年（J Gastrointest Surg. 1998 May-Jun;2(3):283-91）、Guang-Linら、１９９８年（Transplant Proc. 1998 Nov;30(7):2923-4）およびそのなかの参考文献、Nishidaら、１９９８年（Spine. 1998 Nov 15;23(22):2437-42）、Schwarzenbergerら、１９９８年（J Immunol. 1998 Dec 1;161(11):6383-9）、ならびにCaoら、１９９８年（Gene Ther.1998 Aug;5(8):1130-6）により説明されている。アンチセンス配列のレトロウイルス導入は、Danielら、１９９８年（J Biomed Sci.1998 Sep-Oct;5(5):383-94）により説明されている。
【０１５４】
ベクターとしてウイルスを使用する場合、ウイルス表面タンパク質が通常そのウイルスの標的化に使用される。上記のアデノウイルスなどの多くのウイルスはその向細胞性がかなり非特異的であるため、細胞型または組織特異的プロモーターを使用することによりさらに特異性を与えることが望ましい。Griscelliら、１９９８年は、導入がアデノウイルスにより媒介される遺伝子の心臓特異的標的化のための心室特異的心臓ミオシン軽鎖２プロモーターを教示している。
【０１５５】
あるいは、ウイルスベクターは、その表面に付加的タンパク質を発現するように設計されてもよく、またはウイルスベクターの表面タンパク質は所望のペプチド配列を組み込むように変更してもよい。したがって、ウイルスベクターは、該ウイルスベクターを標的化するために使用され得る１つ以上の付加的なエピトープを発現するように設計されていても良い。たとえば、サイトカインエピトープ、ＭＨＣクラスII−結合ペプチド、またはホーミング分子由来のエピトープは、本発明の教示に従い、ウイルスベクターを標的化するために使用することができる。
【０１５６】
さらなる態様において、本発明は、ＳＩＶＡ３ポリペプチド、抗体または核酸分子、ＳＩＶＡ３結合化合物、本発明のベクター、または宿主細胞およびＳＩＶＡ３の活性またはレベルを変えることができる他の化合物および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１５７】
本発明の医薬組成物は、意図する目的を達成するために、治療的に有効量の本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＳＩＶＡ３結合化合物を含む。さらに、医薬組成物は、本技術分野において周知なように、活性化合物の製剤への処理を促進し、この製剤を安定化できる薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどの賦形剤および助剤を含む適切な薬学的に許容され得る担体を含んでもよい。
【０１５８】
本発明の組成物は、多種多様な方法で患者に投与することができる。肝臓内、皮内、経皮（たとえば徐放製剤などで）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所および鼻腔内投与などの任意の好適な投与経路が本発明により予想されるが、これらに限定されるものではない。組成物は、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することもできる。
【０１５９】
「薬学的に許容され得る」との定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、かつ投与される宿主に対して毒性がない、あらゆる担体を包含することを意味する。たとえば、非経口投与については、本発明の物質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液などのビヒクル中で注射用単位剤形に製剤され得る。
【０１６０】
「治療的に有効量」とは、その量が投与されると、本発明の物質が治療に有益な効果を誘導する量である。単回投与または複数回投与として個体に投与される投薬量は、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、および大きさ）、症状の範囲と重症度、併用療法、治療の頻度および所望の効果などの様々な因子によって変わり得る。確立された投与量の調整と取り扱いは、十分当業者の能力の範囲内である。
【０１６１】
用語「投薬量（dosage）」は、投与頻度および投与回数の決定および制御と関係する。
【０１６２】
本明細書において引用される、論文、要約、公開もしくは未公開特許出願、発行特許または他のあらゆる参考文献を含むすべての参考文献は、本明細書に参考文献として完全に組み込まれる。
【０１６３】
ここで、本発明を以下の非制限的な実施例により説明する。
【実施例】
【０１６４】
材料および方法
抗体：ｐ５２に対する抗体は、アップステート（Upstate）からｐ５２およびｐ１００の両方を認識する抗ｐ５２を購入した。抗−ＦＬＡＧ、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２−ビーズはシグマから購入した。抗−ＮＩＫモノクローナル抗体、ＮＩＫ−８１は、ＮＩＫキナーゼドメイン内の配列（CRLGRGSFGEVHRMEDK−アミノ酸４０５〜４２０  配列番号７）に相当するＫＬＨ−結合ペプチドでマウスを免疫することにより作出した。抗−ＮＩＫ、および抗ｍｙｃ（クローン−９Ｅ１０）モノクローナル抗体は、それらの対応するペプチドが結合されたアフィニティーカラム上でマウスの腹水液から精製した。抗−ｃＩＡＰ１はＲ＆Ｄシステムズから購入した。ヒトＳＩＶＡ２に対するモノクローナル抗体は、細菌で産生されたＧＳＴ−ＳＩＶＡ２により免疫することによりマウスで作出し、Ｔｒｘ−ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２でアフィニティー精製した。この抗体はＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２の両方を認識した。
【０１６５】
哺乳類発現ベクター
ＳＩＶＡ３は、末梢血単球細胞からＰＣＲによりクローン化された。ＳＩＶＡ２はＥＳＴからＰＣＲによりクローン化された。ＳＩＶＡ配列は、ＮＣＢＩ配列  ＮＭ＿０２１７０９（ＳＩＶＡ２）で検証した。６つのｍｙｃタグにＮ末端で融合した野生型ＮＩＫ用のｐＣＳ３ＭＴＮＩＫ発現ベクターは、Michael Kracht博士（ドイツ）から入手した。Flag−ＳＩＶＡ２、Flag−ＳＩＶＡ３、ＨＩＳ−ＳＩＶＡ３およびFlag−ＴＲＡＦ２は、ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（インビトロジェン）にクローン化した。
【０１６６】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡは、製造業者の取扱説明書にしたがい、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて製造された。ＳＩＶＡ２メッセージに対する半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＭＭＬＶ逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマー（プロメガ）でおこなった。ＳＩＶＡ１、ＳＩＶＡ２、およびＳＩＶＡ３は、以下のプライマー：ＢａｍＨＩ部位を含むセンス鎖、5'-cgcggatccaacatgcccaagcggagctgcccc-3'、およびＸｈｏＩ部位を含むアンチセンス鎖5'-ccgctcgaggccagcctcaggtctcgaacatgg-3'を用いて増幅された。ＩＬ−６およびＢＬＣメッセージの誘導は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ ７０００配列検出システムにおいてアッセイ−オン−デマンド  リアルタイムＰＣＲにより定量された。図１ＡのＰＣＲ増幅用に使用されたプライマー配列は、フォワード：CGCGGATCCACCATGCCCAAGCGGAGCTGCCCC（配列番号３）、リバーズ：CCGCTCGAGGCCAGCCTCAGGTCTCGAACATGG（配列番号４）である。全長ＳＩＶＡ３（図１Ｂ）のＰＣＲ増幅用に使用されたプライマーは、フォワード：CGCGGATCCACCATGCCCAAGCGGAGCTGCCCC（配列番号５）、リバーズ：CCGCTCGAGAGAGGTTTATTCATTCTGTCATTAGG（配列番号６）である。フォワードプライマーは、開始コドンの前にＢａｍＨＩ部位を有するように設計され、そしてＸｈｏＩ部位を有するリバースプライマーが設計された。フレームシフトから生じる最初の終止コドンで現実の終止コドンの下流。
【０１６７】
細胞
付着性細胞ＨＥＫ−２９３ＴおよびＨｅＬａ（図４）は、ダルベッコ改変イーグル培地で培養した。両培養培地には、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを追加した。
【０１６８】
プラスミドトランスフェクション、イムノブロッティング、および免疫沈降：
イムノブロッティングおよび免疫沈降は、（Ramakrishnanら、2004）に記述されたように行った。
【０１６９】
イムノブロッティングおよび免疫沈降は、（Ramakrishnanら、2004）に記述されたように行った。通常、１．５×１０6細胞が１０ｃｍプレートに播種された。２４時間インキュベーションした後、培養物を別々のプラスミドでトランスフェクトする一方、空のベクターを添加することによりプレートにつき１５μｇの総ＤＮＡ濃度を維持した。
【０１７０】
通常、細胞は９０ｍｍプレート上に播かれ（１．５×１０6細胞／プレート）、リン酸カルシウム沈殿法（Sambrookら、1989）を用いて、１日後に１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ培地１０ｍｌ中にＤＮＡ総量１０μｇを用いてトランスフェクトされた。同時トランスフェクトについては、特段の定めがない限り、試験タンパク質をコードするプラスミドの１：１混合物を使用した。トランスフェクションの２４時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回すすぎ、１×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Complete Protease Inhibitor Cocktail）（ロッシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ）を含む溶解緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）１ｍｌ中で溶解した。あらかじめ除去処理されたライセートを４℃で２時間、タンパク質−Ｇ−セファロースビーズ（アマシャム  バイオサイエンス）にあらかじめ吸着された抗−ｍｙｃまたは抗−ＨＩＳ抗体２μｇとインキュベートした。つぎにビーズを溶解緩衝液ですすぎ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、指示抗体で調べた。抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合二次抗体で、エンハンスド化学発光（ＥＣＬ）ウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム）を用いて製造者の取扱説明書にしたがい可視化した。
【０１７１】
細胞のライセートを調製するために、通常細胞をトランスフェクションの２４時間後に回収し、ついで１％トリトンＸ−１００溶解緩衝液［１％トリトンＸ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス−ｃｌ（ｐＨ７．６）および１×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロッシュ）］中に溶解した。全ての免疫沈降は、４℃で４時間、特異的抗体とタンパク質−Ｇ−セファロースビーズ（アマシャム  バイオサイエンス）とでインキュベーションすることにより行われた。
【０１７２】
溶解条件は核抽出物および細胞質抽出物が分離される場所で異なる（Schreiberら、1989）。
【０１７３】
実施例１：ＳＩＶＡ３、内因性ＳＩＶＡスプライス変異体の同定
末梢血単球細胞（ＰＢＭＣｓ）におけるＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４度で３分変性、５０度で１分アニーリング、７２度で１分伸長、最終伸長５分、全３５サイクル）によるＳＩＶＡ発現の詳しい実験に際して、スプライス変異体ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２両方の転写が見られ、その上さらに短い変異体（本明細書において「ＳＩＶＡ３」と名付ける）も見られた（図１Ａ）。全長のＳＩＶＡ３転写産物を増幅した（図１Ｂ）。
【０１７４】
ＳＩＶＡ３のヌクレオチド配列（配列番号１および図２）は、ワイズマン  インスティチュート  オブ  サイエンス  ＤＮＡ配列決定機関（Weizmann Institute of Science DNA facility）において、ｐｃＤＮＡＨＩＳｃベクター（インビトロジェン）にクローン化されたＰＣＲ産物を配列決定することにより同定し、ＳＩＶＡ３のアミノ酸配列（配列番号２および図３）は、ソフトウェアＤＮＡ striderで得られたＤＮＡ配列を翻訳することにより推定した。ＳＩＶＡ３配列は、ＳＩＶＡ２に約３５％（１１０中３９アミノ酸）同一であり、ＳＩＶＡ１への同一性は２２％（１７５アミノ酸中３９アミノ酸）を下回る。ＳＩＶＡ３転写産物は、ＳＩＶＡ１およびＳＩＶＡ２のエクソン１および４を含むが、エクソン１とエクソン４との接合部でのフレームシフトにより、エクソン４の端部の元々の終止コドンを通過して読まれ、ＳＩＶＡの３’非コード領域由来の付加的６８アミノ酸を追加する結果となる。
【０１７５】
ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes）でのＳＩＶＡ３の受託番号は、ＣＮＣＭ  Ｉ−３８８０である。
【０１７６】
実施例２：ＳＩＶＡ３はＮＩＫの分解とＮＦ−κＢ活性化の阻害を誘導する。
ＳＩＶＡ３の機能をさらに調べた。このために、ｍｙｃ−ＮＩＫ発現ベクター（０．５μｇ）をＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ３発現ベクターの濃度を増加させながら（１．５μｇおよび３．０μｇ）ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３０時間後、細胞を回収し、ＮＩＫおよびｐ１００／ｐ５２の細胞レベルをウェスタンブロッティングにより評価した。
【０１７７】
図４にまとめた結果から、ＳＩＶＡ３レベルの増加が、ＮＩＫの分解と、ｐ５２を生成するためのｐ１００の活性なプロセッシングの減少に反映されるようにＮＩＫにより介在されるＮＦ−κＢの活性化の阻害とを誘導することが示される。
【０１７８】
次に、ＳＩＶＡ３がＮＩＫと結合するかどうかを調べた。ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２（８μｇ）またはＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ３（８μｇ）をｍｙｃ−ＮＩＫ（７μｇ）とＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした（１．５×１０6  ９０ｍｍプレートに播種され、カルシウムリン酸法を用いてトランスフェクトされた）。２４時間後、細胞を溶解し、ＮＩＫを抗−ＮＩＫ抗体で免疫沈降し、共沈したＳＩＶＡをウェスタンブロッティングにより検出した。図５の結果は、ＳＩＶＡ３はＮＩＫに結合しないことを示す。
【０１７９】
実施例３：ＳＩＶＡ３はアポトーシスタンパク質１の内因性細胞阻害剤（ｃＩＡＰ１）に結合する。
次に、ＳＩＶＡ２およびＳＩＶＡ３が内因性細胞阻害剤（ｃＩＡＰ１）に結合できるかどうか検査した。このために、ＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ２およびＦＬＡＧ−ＳＩＶＡ３をＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。２４時間後、細胞溶解し、内因性ｃＩＡＰ１を抗−ｃＩＡＰ１抗体で免疫沈降し、共沈したＳＩＶＡをウェスタンブロッティングにより検出した。
図６および７にまとめた結果から、ＳＩＶＡ２およびＳＩＶＡ３が共にｃＩＡＰ１に結合することが示される。
【０１８０】
実施例４：ＳＩＶＡ３ＳＩＶＡ３はＴＲＡＦ２に結合する。
本発明の発明者らは、ＳＩＶＡ２がＴＲＡＦ２に結合してＴＲＡＦ２のレベルを調節することを見出していた（国際公開第２００７／０８０５９３）ので、ＳＩＶＡ３もＴＲＡＦ２に結合するかどうか調べた。このために、ＨＩＳ−ＳＩＶＡ２またはＨＩＳ−ＳＩＶＡ３発現プラスミドをＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２とＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。２４時間後、細胞溶解し、ＦＬＡＧ−ＴＲＡＦ２を抗−ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、共沈したＳＩＶＡを抗ＨＩＳを用いてウェスタンブロッティングにより検出した。図８および９にまとめた結果から、ＳＩＶＡ３がＴＲＡＦ２に結合することが示される。
【０１８１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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