(57)【要約】生体液をウイルス不活化する方法であって、（ａ）当該生体液を、リン酸トリ（ｎ−ブチル）およびポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチル−フェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ＝５；Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５）の混合物で処理する工程と、（ｂ）油抽出工程であって、リン酸トリ（ｎ−ブチル）およびポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチル−フェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ＝５）を当該生体液から大豆油へと移動させるために、当該リン酸トリ（ｎ−ブチル）およびポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチル−フェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ＝５）を含有する生体液が、この生体液の体積に対して５〜１５体積％の大豆油で処理される工程と、（ｃ）工程（ｂ）の後に回収される生体液を活性炭フィルターに通す工程と、（ｄ）工程（ｃ）の後に回収される生体液を細菌フィルターに通す工程とを含むが、ただしこの大豆油抽出工程は当該方法の唯一の油抽出工程である、方法。【選択図】図１
2011515170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体液をウイルス不活化する方法であって、
（ａ）前記生体液を、リン酸トリ（ｎ−ブチル）およびポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチル−フェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ≒５）の混合物で処理する工程と、
（ｂ）油抽出工程であって、リン酸トリ（ｎ−ブチル）およびポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチル−フェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ≒５）を前記生体液から大豆油へと移動させるために、前記リン酸トリ（ｎ−ブチル）およびポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチル−フェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ≒５）を含有する生体液が、前記生体液の体積に対して５〜１５体積％の大豆油で処理される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の後に回収される生体液を活性炭フィルターに通す工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の後に回収される生体液を細菌フィルターに通す工程と
を含むが、ただし、前記大豆油抽出工程は前記方法の唯一の油抽出工程である、方法。
【請求項２】
前記リン酸トリ（ｎ−ブチル）および前記ポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチル−フェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ≒５）の各々は、前記生体液の体積に対して１体積％の量で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記大豆油は、前記生体液の体積に対して５〜１５体積％、好ましくは８〜１２体積％、さらにより好ましくは約１０体積％の量で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）における濾過は重力により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）における濾過は重力により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）の前に、工程（ｂ）の後に回収される生体液を輸液フィルターに通す工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記輸液フィルターを通す濾過は重力により行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、工程（ａ）が実施される溶媒／界面活性剤処理バッグと、工程（ｂ）が実施される油抽出バッグとを含む一組の使い捨てバッグを使用して実施され、前記第２のバッグは、漏斗バッグの出口設備と合う漏斗様の下部を有する内部区画を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記一組の使い捨てバッグは、活性炭フィルターおよび細菌フィルターをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生体液のミニプールのウイルス不活化のための、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１１】
血漿、脱クリオ血漿、およびクリオプレシピテートからなる群から選択されるウイルス不活化された生体液であって、前記生体液は実質的に脂質を含まず、かつ血液細胞および細胞片を含まない、生体液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体液のウイルス不活化、特に血漿および血漿製剤のウイルス不活化に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよび動物の血漿および血漿画分は、現代の医学において重要な役割を果たしている。それらは主に、出血のエピソード、血栓のエピソード、線維素溶解、感染性のエピソードの処置における輸液目的のため、または予防のため、または特定の臨床状況において手術に先立って患者を前処置するために使用される。
【０００３】
ヒトまたは動物の血漿もしくは血漿画分の使用における主な欠点は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、およびウエストナイルウイルスなどの血液由来のウイルス、またはデングウイルス、チクングニアウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、およびトリインフルエンザウイルスなどの可能性のある新興ウイルス（これらはすべて脂質エンベロープ型ウイルスである）の伝染の危険性である。ウイルスの危険性は、組換え哺乳類細胞株および遺伝子導入動物から得られる産物からも存在する。
【０００４】
それゆえ、メチレンブルーを用いた処理ならびにその後の可視光を用いた照射および溶媒／界面活性剤または溶媒単独の処理など、血漿および／もしくは血漿画分ならびに／または組換え産物のウイルス不活化のための様々な方法が開発されてきた。特許文献１および特許文献２は、例えば有機溶媒と界面活性剤の組み合わせ（Ｓ／Ｄ方法）または溶媒単独を使用して、血漿および血漿製剤の中に含有されるまたはそれらに添加される肝炎ウイルスまたは他のエンベロープ型ウイルスの感染力を数桁低下させることを記載する。
【０００５】
試薬濃度、温度および接触時間の適切な条件下での溶媒／界面活性剤または溶媒単独処理は、脂質に関連するエンベロープタンパク質を有するウイルスを効果的に分解するが、他方で、感受性の血漿タンパク質の分子の高次構造および生物活性に対してはほとんど影響を与えない。
【０００６】
今日、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）方法は、輸液のための血漿を含めて、市場にある多くの血漿およびバイオテクノロジー産物（哺乳類細胞または哺乳動物由来の、組換えまたは遺伝子導入産物）の主要なウイルス不活化処理である。この手順は一般に、タンパク質溶液を、タンパク質溶液の体積に対して０．３〜１体積％の有機溶媒、リン酸トリ（ｎ−ブチル）（ＴｎＢＰ）、および１つまたはいくつかの界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎ−８０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、またはデオキシコール酸ナトリウム）とともに１〜６時間インキュベーションすることにある。血漿または血漿製剤は多くの提供物の大プール（ｌａｒｇｅ−ｐｏｏｌ）（１００〜５０００リットル、またはこれより多く）で処理され、これには大きくかつ高価な医薬品製造設備が必要になる。
【０００７】
この処理は、病原性の脂質エンベロープ型の血液由来のウイルスについての優れた殺ウイルス効率の記録を伴って、広い範囲の凝固因子および他の不安定な血漿タンパク質の機能活性を保存する（非特許文献１）。
【０００８】
さらに、そのＳＤ処理後、輸液用の大プールＳＤ（ＬＰ／ＳＤ）血漿は、このＳＤ剤を取り除くために疎水性相互作用クロマトグラフィにかけられる。しかしながら、この疎水性相互作用クロマトグラフィ工程には高価なクロマトグラフィ材料、比較的大きい緩衝液消費量が伴い、そしてその設備は再使用されるため、各処理単位後に設備の洗浄および衛生化が必要であり、こうしてＳＤ除去はかなり費用がかかりかつ時間がかかるものとなる。さらに、設備の再使用のため、その設備の表面に付着する傾向があるウイルスおよびプリオンによる処理単位ごとの汚染の危険性がある。
【０００９】
さらに、例えば非特許文献２に記載されるように生体液の重量に対して１体積％のＴｎＢＰおよび生体液の重量に対して１重量％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリオキシエチレン（９−１０）  ｐ−ｔ−オクチルフェノール；分子式ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）Ｘ、ｘ＝９〜１０）とのインキュベーション、油抽出、遠心分離、および疎水性相互作用クロマトグラフィにかけられた輸液用の大プールＳＤ（ＬＰ／ＳＤ）血漿は、α２−抗プラスミン（α２−ＡＰまたはＳＥＲＰＩＮＦ２）などの特定のセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン類）、またはプロテインＳなどの抗凝固薬の低い機能活性を生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，４８１，１８９号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５４０，５７３号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ＢｕｒｎｏｕｆおよびＲａｄｏｓｅｖｉｃｈ、Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ  ２０００年、第１４巻、９４−１１０頁
【非特許文献２】Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １９９２年、第７９巻、８２６−３１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
先行技術の上記の欠点を考慮すれば、ＳＤ化学物質を満足できる程度に取り除くために疎水性相互作用クロマトグラフィを必要とせずかつα２−ＡＰおよび／またはプロテインＳの高い機能活性を生じる、ＳＤ処理を使用するウイルス不活化方法に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
長期かつ集中的な研究の後、本発明者らは、この目標は、生体液をウイルス不活化する方法であって、
（ａ）当該生体液を、リン酸トリ（ｎ−ブチル）（ＴｎＢＰ）およびポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチル−フェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ≒５；Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５）の混合物で処理する工程と、
（ｂ）油抽出工程であって、当該リン酸トリ（ｎ−ブチル）およびポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチル−フェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ≒５）を大豆油へと移動させるために、当該リン酸トリ（ｎ−ブチル）およびポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチル−フェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ≒５）を含有する生体液が、５〜１５％、好ましくは８〜１２％、さらにより好ましくは約１０体積％の大豆油で処理される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の後に回収される生体液を、重力により活性炭フィルターに通す工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の後に回収される生体液を、重力により細菌フィルターに通す工程と、
を含むが、ただし、この大豆油抽出工程は当該方法の唯一の油抽出工程である、方法によって到達されるということを、驚きをもってそして予想外にも、本発明において見出した。
【００１４】
このリン酸トリ（ｎ−ブチル）（ＴｎＢＰ）は、生体液の体積に対して０．１〜２体積％、好ましくは０．３〜１．５体積％、さらにより好ましくは０．５〜１体積％、例えば１体積％の量で使用されるのが有利である。
【００１５】
有利なことに、このポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチルフェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ≒５）（Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−４５）は、この生体液の体積に対して０．１〜２体積％、好ましくは０．３〜１．５体積％、さらにより好ましくは０．５〜１体積％、例えば１体積％の量で使用される。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、このリン酸トリ（ｎ−ブチル）およびポリオキシエチレン（４−５）  ｐ−ｔ−オクチル−フェノール（ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ≒５）の各々は、当該生体液の体積に対して１体積％の量で使用される。
【００１７】
本発明に係る生体液は、哺乳類の血液、血漿、血清、血漿画分、血液画分からの沈殿物および血液の分画（ｂｌｏｏｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）からの上清、乏血小板血漿、多血小板血漿、脱クリオ血漿（ｃｒｙｏ−ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）（クリオ上清（ｃｒｙｏｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ））、組換えおよび遺伝子導入産物を含む。好ましい生体液は血漿であり、この血漿には、回収血漿（ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｐｌａｓｍａ）（全血からの血漿）およびアフェレーシス血漿、脱クリオ血漿、血漿画分（プロトロンビン複合体、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、抗トロンビン、α２−ＡＰ、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１（ＰＡＩ−１）、Ｃ１−阻害剤の精製用の画分など）、血漿からの沈殿物（ポリエチレングリコール、カプリル酸、または硫酸アンモニウムで沈殿させた画分など）、およびそれらの対応する上清、または血漿の分画から得られるいずれかの他の沈殿物または上清、上清Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、沈殿物Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、上清ＩＩ＋ＩＩＩ、沈殿物ＩＩ＋ＩＩＩ、上清Ｉ＋ＩＩＩ、上清ＩＶ、沈殿物Ｖ、または沈殿物ＩＩが含まれる。血漿画分、沈殿物および上清は回収血漿（全血からの血漿）から、およびアフェレーシス血漿から得てもよい。
【００１８】
特に好ましい生体液は、アフェレーシス血漿、回収血漿、アフェレーシス血漿からのクリオプレシピテート、回収血漿からのクリオプレシピテート、および脱クリオ血漿（アフェレーシスおよび回収）である。
【００１９】
工程（ａ）のＳＤ処理後の大豆油を用いた１回の抽出の能力は、ＴｎＢＰ含有量を最初のＴｎＢＰ含有量（１０，０００ｐｐｍ）の１０％未満まで、すなわち約１０００ｐｐｍ未満まで、好ましくは最初のＴｎＢＰ含有量（１０，０００ｐｐｍ）の５％未満まで、すなわち約５００ｐｐｍ未満まで減少させ、および（ｂ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５含有量を最初のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５含有量（１０，０００ｐｐｍ）の３０％未満まで、すなわち３０００ｐｐｍ未満まで、好ましくは最初のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５含有量（１０，０００ｐｐｍ）の２５％未満まで、すなわち２５００ｐｐｍ未満まで減少させることを可能にする。
【００２０】
さらに、まったく予想しておらずしかも驚いたことには、本発明の方法に従って得られたウイルス不活化された生体液の中のフタル酸ジ（２−エチルヘキシル）（ＤＥＨＰ）含有量は、最初の生体液におけるよりも著しく低い。最初の生体液の中のＤＥＨＰは、生体液（例えば血漿、脱クリオ血漿、またはクリオプレシピテート）に対して一般に使用される保存用バッグの材料の中に含まれるＤＥＨＰの拡散に由来する。血液および血液成分などの生体液についての保存用バッグおよび採取バッグは、通常、ＰＶＣ（ポリ塩化ビニル）からできている。ＤＥＨＰはＰＶＣポリマーに化学結合されない可塑剤であり、ＰＶＣ製医療装置が液体と接触すると漏出する可能性がある。新生児、小児、妊婦、または肝機能障害を抱える患者のような特別の患者群における毒性の可能性についての懸念があるため、可能な限り低いＤＥＨＰ含有量を有する生体液、特に輸液用の生体液に対するニーズが存在する。予想しておらずしかも驚いたことには、油抽出および濾過はともに、最初の血漿のレベル未満、および他のグループ（例えばＩｎｏｕｅ，Ｋ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ  ２００５；３５８（１−２）：１５９−６６；Ｃｏｌｅ  ＲＳら、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  １９８１；４０（５）：３１７−２２；Ｌｏｆｆ  Ｓら  Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．  ２０００；３５（１２）：１７７５−８１；Ｂｕｃｈｔａ  Ｃ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２００５；４５（５）：７９８−８０２を参照）によって輸液用の血漿および血小板濃縮物で見出されたレベル未満のレベルまでＤＥＨＰを減少させることが見出された。
【００２１】
もっとも重要なことは、さらなる付加的な処理（遠心分離など）なしに濾過することができる、それゆえ直接の効率的な濾過を可能にする透明な／濁っていない生体液溶液を得るために、大豆油抽出が必要とされることである。非常に驚くべきことに、しかも予想していなかったことに、透明な／濁っていない溶液は、当該方法がただ１回の単一の大豆油抽出工程を含むときのみ得られる。複数の大豆油抽出または他の油（ヒマシ油など）を用いた抽出は、活性炭フィルターを通して重力濾過することができない濁った溶液を常に生じる。
【００２２】
従って、好ましい実施形態では、大豆油抽出後の濾過工程、特に活性炭フィルターを通した濾過は重力により行われてもよい。
【００２３】
活性炭濾過工程（ｃ）は、ＴｎＢＰ含有量を１０ｐｐｍ未満までまたは検出不能なレベルまでさらに低下させ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５含有量を５０ｐｐｍ未満まで、または１０ｐｐｍ未満まででさえ低下させ、油抽出の間の混合の結果としてその生体液溶液の中に依然として存在する可能性がある油滴を取り除き、そして細胞片、微視的凝集体、残留脂質を取り除くことによりその生体液溶液をさらに清澄化することを可能にし、それゆえその後の細菌フィルターの容量を増加させ、そしてＣｕｎｏ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＶＲフィルターなどの吸着フィルター、または１５−７５μｍの範囲の細孔径を有するフィルター、または同等品（Ｐａｌｌ  ＤＶフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅもしくは、Ａｓａｈｉ  Ｐｌａｎｏｖａフィルターシリーズなど）を使用する濾過および／またはナノ濾過により（例えば非エンベロープ型ウイルスを取り除くために）ウイルス／プリオン除去工程を実施することを、より容易に可能にする。
【００２４】
小プールの生体液、すなわち約５００ｍｌ未満の濾過のための適切な活性炭フィルターの例としては、ポール・コーポレーション（ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって商品化されているＰａｌｌ  Ｓｕｐｒａｃａｐ  ６０フィルターカプセルシリーズ（ＡＫＳ６、ＡＫＳ７、ＡＫＳ４、およびＡＫＳ１など）；ならびにキュノ（Ｃｕｎｏ  Ｉｎｃ．）によって商品化されているＢＩＯＣＡＰ  ３０−Ｒ３２ＳＰ、ＢＩＯＣＡＰ  ３０−Ｒ３３ＳＰ、ＢＩＯＣＡＰ  ３０−Ｒ３４ＳＰ、ＢＩＯＣＡＰ  ３０  Ｒ３５ＳＰ、および新しく導入されたＢＩＯＣＡＰ  ２５  Ｒ３２ＳＰ、ＢＩＯＣＡＰ  ３０−Ｒ３３ＳＰ、ＢＩＯＣＡＰ  ３０−Ｒ３４ＳＰ、およびＢＩＯＣＡＰ  ２５  Ｒ３５ＳＰなどのＣｕｎｏ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＺｅｔａＣａｒｂｏｎシリーズが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明の有利な実施形態では、この細菌フィルターは約０．２μｍのサイズの孔を具える。細菌濾過工程（ｄ）の容量に関する最良の結果は、例えば０．６５μｍ〜０．２μｍのその多孔性の漸次性（ｇｒａｄｕａｔｉｏｎ）を有する細菌フィルターを使用するときに得られる。このような漸次的な多孔性は、だんだんと小さくなる多孔性の繊維上での当該材料の漸進的な濾過を確実にする。小プールの生体液（すなわち１．５Ｌ未満）の濾過のための適切な細菌フィルターの例は、ＰＡＬＬ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって商品化されているＣａｐｓｕｌｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）  ＥＫＶ  （参照番号  ＫＭ５ＥＫＶＰ２Ｓ）である。
【００２６】
好ましい実施形態では、工程（ｄ）における細菌濾過は重力により行われる。
【００２７】
処理中に細菌による偶発的な汚染が起こったとしても、細菌濾過のため、当該生体液溶液の細菌に関する安全性は確保される。さらに、ＴｎＢＰ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、または大豆油などの処理の間に使用される種々の化学物質の滅菌は回避され、これにより、時間および費用が節約され、この方法は滅菌装置が容易には利用できない環境でも適用できるようになる。
【００２８】
当該生体液が血漿、クリオプレシピテート、または脱クリオ血漿である場合には、細菌濾過は、（例えば、提供者の腕の不適切な洗浄に起因する）血液／血漿採取の時に導入され、かつ上記ＳＤ処理によって破壊されなかったことになるいずれかの血液由来の細菌の除去をさらに確実にする。さらに、細菌濾過は、とりわけ、非常に新しいおよび未凍結の血漿が出発物質として使用されかつそれらが予想外にも当該ＳＤ処理により破壊されていなかったとしても、血液由来の寄生虫（例えばバベシア症に関与するネズミバベシア；マラリアに関与するマラリア原虫；リーシュマニア症に関与するリーシュマニア；シャーガス病に関与するクルーズ・トリパノソーマ）に関する血漿／クリオプレシピテート／脱クリオ血漿溶液の安全性の余裕度を高める。０．２μｍ膜での細菌濾過もまた血液細胞片の除去を可能にし、従って残留リンパ球または細胞凝集体に起因する免疫学的な輸血反応の危険性を低下させる。
【００２９】
さらに、本発明者らの知る限りでは、これは、血液事業者によって製造される輸液用の血漿または他の血漿成分（クリオプレシピテートまたは脱クリオ血漿など）を０．２μｍフィルターに通して濾過することが可能である最初の例である。約０．２μｍのサイズの孔を有するフィルターを通す濾過は、何らの血液細胞（白血球、血小板、赤血球）および細胞片も含まず、加えて細菌および寄生虫を含まない製剤をもたらすという利点を有する。血液細胞および細胞片の完全な除去は、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、またはプリオンなどの白血球関連の病原体の除去または減少のため、輸液用血漿または他の血漿成分（クリオプレシピテートもしくは脱クリオ血漿など）の改善された安全性に寄与することもできる。本発明とは対照的に、通常の単一ドナーの血漿は無菌的に処理され、かなりのレベルの血液細胞を含有する。白血球除去した単一ドナーの血漿は低いレベルの白血球しか含有しないが、依然として血小板を含有する可能性がある。単一ドナーのメチレンブルー血漿、またはソラレン血漿などのウイルス不活化された血漿ユニットは、それぞれメチレンブルーまたはソラレン吸着フィルターに通されるが、依然として血液細胞または血液細胞片を含有する。
【００３０】
加えて、本発明に従って得られる血漿および脱クリオ血漿は減少した脂質含有量を有し、これはＴＲＡＬＩ（輸血関連急性肺傷害）の危険性を低下させる可能性がある。
【００３１】
最後に、本発明に従って得られる血漿およびクリオプレシピテートは、第ＶＩＩＩ因子および凝固性フィブリノーゲン（ｃｌｏｔｔａｂｌｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）含有量の良好な保存を示すが、他方、メチレンブルーで処理された血漿、ソラレンで処理された血漿、およびリボフラビンで処理された血漿に関しては２０〜３０％の減少が起こる。
【００３２】
結論として、本発明の方法により、（ａ）ウイルス不活化され、（ｂ）第ＶＩＩＩ因子および凝固性フィブリノーゲンの良好な保存を有し、（ｃ）脂質を実質的に含まず、（ｄ）血液細胞および細胞片を実質的に含まず、かつ（ｅ）最初の血漿、脱クリオ血漿、またはクリオプレシピテートよりも低いフタル酸ジ（２−エチルヘキシル）（ＤＥＨＰ）含有量を有する血漿、脱クリオ血漿、およびクリオプレシピテートの調製が可能になる。
【００３３】
有利な実施形態では、本発明の方法は、工程（ｃ）の前に、工程（ｂ）の後に回収される生体液を重力により輸液フィルターに通す工程を含む。この付加的な濾過工程は、生体液の濁度には影響を与えないが、大豆油抽出の後の生体液の中に潜在的に存在する可能性がある目に見える血塊を取り除き、そして安全性の尺度としての役割をはたす。好ましくは、この濾過工程は重力により行われる。
【００３４】
本発明の方法は、大プールのＳＤ処理された生体液（血漿および血漿製剤など）の工業的な処理、ならびにいわゆるミニプール（ｍｉｎｉｐｏｏｌ）（ＭＤ−ＳＤ）の処理に適用されてもよい。少量の血漿が閉鎖バッグ系で処理される、生体液のミニプール（血漿および血漿製剤など）に適用される溶媒／界面活性剤方法（ＭＰ／ＳＤ）は、国際特許出願、国際公開第２００６／０８２１１５号パンフレット（これを、参照により本願明細書に援用したものとする）に記載されている。
【００３５】
インバッグ（ｉｎ−ｂａｇ）ウイルス不活化システムに関しては、本発明の方法は特に興味深い。なぜなら、濾過は蠕動ポンプなどの特別の装置を必要とすることなく重力により行うことができ、従ってそのシステムは使い勝手がよくかつ安価なものとなるからである。使い捨てフィルターの使用により、当該方法はこのインバッグ・システムと特に適合したものとなる。なぜなら、バッグおよびフィルターのシステム全体は、使用後に簡単に廃棄してもよいからである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の１つの実施形態に係る、血漿（または脱クリオ血漿）ミニプールのＳＤ処理のためのインバッグ・システムの概略図である。
【図２】本発明の１つの実施形態に係る、クリオプレシピテートミニプールのＳＤ処理のためのインバッグ・システムの概略図である。
【図３Ａ】Ｓ／Ｄ−Ｆ処理（溶媒／界面活性剤処理およびその後の大豆油抽出および濾過）前後における、血漿およびクリオプレシピテートミニプールの非還元条件下での電気泳動パターンの写真である。
【図３Ｂ】Ｓ／Ｄ−Ｆ処理（溶媒／界面活性剤処理およびその後の大豆油抽出および濾過）前後における、血漿およびクリオプレシピテートミニプールの還元条件下での電気泳動パターンの写真である。
【図４】実施例２０に係るアフェレーシス血漿および回収血漿のＳ／Ｄ処理後、油抽出後および濾過後のＴｎＢＰの平均含有量を示す。
【図５】実施例２０に係るアフェレーシス血漿および回収血漿のＳ／Ｄ処理後、油抽出後および濾過後のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の平均含有量を示す。
【図６】実施例２０に係るアフェレーシス血漿または回収血漿の処理の種々の工程に沿ったＤＥＨＰ測定の結果を図示する。
【図７】本発明に係るＳ／Ｄ−Ｆ処理前後におけるクリオプレシピテートミニプールのＶＷＦ多量体プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
図１に示されるインバッグ・システム（１）は、本発明の方法に従って血漿（または脱クリオ血漿）ミニプールを処理するのに適したシステムの１つの特定の構成を表す。このシステムは、第１のウイルス不活化バッグ（２）、第２のウイルス不活化バッグ（３）、漏斗形状のバッグ（４）、回収バッグ（５）、輸液フィルター（６）、活性炭フィルター（７）、細菌フィルター（８）、およびウイルス不活化され精製された血漿もしくは脱クリオ血漿を回収するための２つの採取バッグ（９）を具える。代替の実施形態では、このシステムは輸液フィルター（６）を具えない。このインバッグ・システムは、採取バッグ（９）に分配するまでウイルス不活化され精製された血漿をプールするためのさらなる採取バッグも、細菌フィルターと採取バッグ（９）との間に具えてもよい。
【００３８】
有利な実施形態では、このウイルス不活化バッグは、成分の混合を容易にするため、および血漿材料がＳ／Ｄ剤と接触しないであろうデッドポイント（ｄｅａｄ  ｐｏｉｎｔ）の存在を回避するために、卵形または丸い形状である。
【００３９】
ウイルス不活化バッグ（２、３）、漏斗形状のバッグ（４）、回収バッグ（５）、フィルター（６、７、８）、およびウイルス不活化され精製された血漿または脱クリオ血漿を回収するための採取バッグ（９）は、血液および血液製剤の輸液の分野で使用される最新の連結部を介して互いに一直線に連結される。
【００４０】
処理されるべきではない血漿または脱クリオ血漿は、１以上の血漿採取または保存用バッグ（１０）から第１のウイルス不活化バッグ（２）の第１の入口（１１）へと直接移される。次いで当該プロセス化学物質（ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５およびＴｎＢＰ）が、例えばシリンジを用いて第２の入口（１２）を介して第１のバッグ（２）に加えられる。このシリンジは、この第２の入口へと直接連結されてもよいし、またはチューブを用いて連結されてもよい。
【００４１】
第１のウイルス不活化バッグ（２）の中での第１のインキュベーション後、プロセス化学物質含有血漿または脱クリオ血漿は、さらなるインキュベーションのために、第１のバッグ（２）の出口（１３）および第２のバッグ（３）の入口（１４）を介して第２のウイルス不活化バッグ（３）へと移される。
【００４２】
第２のインキュベーション工程の終了後、プロセス化学物質含有血漿または脱クリオ血漿は、油抽出のために、第２のウイルス不活化バッグ（３）から漏斗形状のバッグ（４）へと、第２のバッグ（３）の出口（１５）および漏斗形状のバッグ（４）の第１の入口（１６）を介して移される。
【００４３】
油抽出のための大豆油は、例えばシリンジ（１８）を用いて漏斗形状のバッグ（４）の第２の入口（１７）を介して加えられる。シリンジ（１８）は、この第２の入口へと直接連結されてもよいし、またはチューブを用いて連結されてもよい。
【００４４】
油抽出工程の間、プロセス化学物質含有血漿または脱クリオ血漿および大豆油はまずよく混合され、次いで重力による相分離に供される。
【００４５】
重力による相分離の終了後、下側の血漿または脱クリオ血漿相および上側の大豆油相が得られる。次いでこの下側の相は、漏斗形状のバッグ（４）の出口（１９）および回収バッグ（５）の入口（２０）を介して回収バッグ（５）に移される。
【００４６】
次いで、この回収血漿または脱クリオ血漿は、輸液フィルター（６）（存在する場合）、活性炭フィルター（７）および細菌フィルター（８）に連続的に通される。細菌フィルター（８）を通った後、このウイルス不活化され精製された血漿または脱クリオ血漿は採取バッグ（９）の中に回収される。
【００４７】
図２に示されるインバッグ・システム（１ａ）は、本発明の方法に従ってクリオプレシピテートミニプールを処理するのに適したシステムの１つの特定の構成を表す。このシステムはその処理されたクリオプレシピテートを混合しかつ細菌フィルター（８）と採取バッグ（９）との間で分注する（２１）のに先立って均一な溶液を得るためのさらなる採取バッグをさらに具えるという点で、このシステムは図１のシステムと異なる。代替の実施形態では、このシステムは輸液フィルター（６）を具えない。
【００４８】
図２に示されるインバッグ・システム（１ａ）の中でのクリオプレシピテートのウイルス不活化の場合には、３０〜５０単位（約１０ｍｌ／ユニット）が、それらの保存用バッグから第１のウイルス不活化バッグ（２）の第１の入口（１１）まで直接移される。
【００４９】
この後の手順は、血漿または脱クリオ血漿についての手順と実質的に同じである。
【００５０】
ＳＤ処理された生体液、特に血漿および分画された血漿製剤（イムノグロブリンＧなど）の大プールの工業的処理に適用する場合、上記の製造順序により、収量の改善および複数の点での製造プロセスの単純化が可能になる。第一に、工業規模で使用されるＳＤ剤を取り除くための費用のかかる疎水性相互作用工程（通常Ｃ１８またはＳＤＲ−ｈｙｐｅｒ  Ｄ充填材料）は、使い捨ての活性炭フィルターに置き換えられる。これにより、（再使用される）クロマトグラフィ材料の検証、洗浄および衛生化の必要性が回避され、緩衝液の消費が減少し／回避され、これによりこのプロセスはより安価でかつより速くなり、そしてクロマトグラフィ装置の表面に付着する傾向があるウイルスおよびプリオンによる処理単位ごとの汚染の懸念が回避される。
【００５１】
第二に、上記大豆油の後に透明な材料を得るために必要とされるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用によって、α２−ＡＰ、α１−ＡＴ、プロテインＳ（ＰＳ）、および他のプロテアーゼ阻害剤または抗凝固薬の良好な含有量を有するより良質の血漿が提供される。
【００５２】
本発明の別の目的は、血漿、脱クリオ血漿、およびクリオプレシピテートからなる群から選択されるウイルス不活化された生体液であって、この生体液は実質的に脂質を実質的に含まず、血液細胞および細胞片を実質的に含まない、生体液である。この生体液、つまり血漿およびクリオプレシピテート、は有利なことに第ＶＩＩＩ因子および凝固性フィブリノーゲンを良好に保存する。
【００５３】
当該生体液中に脂質、血液細胞および細胞片が存在しないことで、ＴＲＡＬＩ（輸血関連急性肺傷害）などの残留する脂質、またはリンパ球または細胞凝集体に起因する免疫学的な輸血反応のリスクを著しく低下させることができる。それは、血液細胞または血液細胞膜に関連する病原体からのリスクを低下させることもできる。
【００５４】
本発明の本質およびその実施の態様をより十分に例証するために、以下の限定を意図しない実施例が提示される。すべての実施例はミニプールを伴いかつ閉鎖バッグ系で実施されるが、とりわけ活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通した濾過に関して、当該方法は容易に規模拡大することができるということを理解されたい。適切な大スケールのフィルターは市販されている。
【実施例】
【００５５】
実施例全体にわたり、すべての百分率は、特段の記載がない限り、体積百分率である。
【００５６】
（実施例１）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））で処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による１回の抽出にかけたアフェレーシス血漿
【００５７】
２つの血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイスエタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【００５８】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【００５９】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ（Ｆｏｎｔｅｎａｙ−ｓｏｕｓ−ｂｏｉｓ））およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））の５０％／５０％混合物を、この４００ｍｌの血漿に慎重に加え、当該血漿の重量に対して１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【００６０】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。次いでこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【００６１】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を、少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【００６２】
透明な血漿相を回収した。３７０ｍｌ超の血漿を輸液フィルターに通したところ、ポール（Ｐａｌｌ）製の０．２μｍ細菌フィルター（Ｍｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）  ２０、参照番号  ＫＭ５ＥＫＶＰ２Ｓ）に直列に連結したＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して（ポンプによって加えられる圧力なしに）重力により濾過することができた。
【００６３】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後の大豆油による１回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過をして上記ＳＤ剤、油残留分、血液細胞片、細菌および寄生虫を取り除くことができる３５０ｍｌ超の透明な血漿を得ることができる。
【００６４】
（実施例２）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））で処理し大豆油（参照番号  ８５４７１、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）由来、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による１回の抽出にかけたアフェレーシス血漿
【００６５】
２つの血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイスエタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【００６６】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【００６７】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））の５０％／５０％混合物をこの４００ｍｌの血漿に慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【００６８】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。次いでこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【００６９】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  ８５４７１、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）由来、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【００７０】
透明な血漿相を回収した。３７０ｍｌ超の血漿を輸液フィルターに通したところ、ポール（Ｐａｌｌ）製の０．２μｍ細菌フィルター（Ｍｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）  ２０、参照番号  ＫＭ５ＥＫＶＰ２Ｓ）に直列に連結したＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して（ポンプによって加えられる圧力なしに）重力により濾過することができた。
【００７１】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後の大豆油による１回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過をして上記ＳＤ剤、油残留分、血液細胞片、細菌および寄生虫を取り除くことができる３５０ｍｌ超の透明な血漿を得ることができる。
【００７２】
（実施例３）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））で処理し、大豆油（参照番号  １９−４２５００、ペンタ・インターナショナル・コーポレーション（Ｐｅｎｔａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））による１回の抽出にかけたアフェレーシス血漿
【００７３】
２つの血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイスエタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【００７４】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【００７５】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））の５０％／５０％混合物をこの４００ｍｌの血漿に慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【００７６】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。次いでこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【００７７】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  １９−４２５００、ペンタ・インターナショナル・コーポレーション（Ｐｅｎｔａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国）をこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【００７８】
透明な血漿相を回収した。３７０ｍｌ超の血漿を輸液フィルターに通したところ、ポール（Ｐａｌｌ）製の０．２μｍ細菌フィルター（Ｍｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）  ２０、参照番号  ＫＭ５ＥＫＶＰ２Ｓ）に直列に連結したＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して（ポンプによって加えられる圧力なしに）重力により濾過することができた。
【００７９】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後の大豆油による１回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過をして上記ＳＤ剤、油残留分、血液細胞片、細菌および寄生虫を取り除くことができる３５０ｍｌ超の透明な血漿を得ることができる。
【００８０】
（実施例４）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））で処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による２回の抽出にかけたアフェレーシス血漿
【００８１】
２つの血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【００８２】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【００８３】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））の５０％／５０％混合物をこの４００ｍｌの血漿に慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【００８４】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。次いでこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【００８５】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【００８６】
血漿相を回収し、上記油抽出手順を１回繰り返し、約３６０ｍｌの血漿を得た（合計：２回の大豆油による抽出）。
【００８７】
輸液フィルターを通ることができない非常に濁った血漿相を回収した。約３０ｍｌだけがＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して重力濾過することができたが、このフィルターは詰まり始め、この濾過プロセスは停止した。
【００８８】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後の大豆油による２回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過することができない非常に濁った血漿が得られる。
【００８９】
（実施例５）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））で処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による３回の抽出にかけたアフェレーシス血漿
【００９０】
２つの血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【００９１】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【００９２】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））の５０％／５０％混合物をこの４００ｍｌの血漿に慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【００９３】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。次いでこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【００９４】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【００９５】
血漿相を回収し、この油抽出手順を２回繰り返し、約３５０ｍｌの血漿を得た。
【００９６】
わずかに濁った血漿相を回収した。３５０ｍｌの血漿を輸液フィルターに通した。約８０ｍｌだけがＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して重力濾過することができたが、このフィルターは詰まり始め、この濾過プロセスは停止した。
【００９７】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後の大豆油による３回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過することができないわずかに濁った血漿が得られる。
【００９８】
（実施例６）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｘ４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−４５、シグマ（Ｓｉｇｍａ））で処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による１回の抽出にかけたアフェレーシス血漿
【００９９】
２つの血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０１００】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【０１０１】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｘ４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−４５、シグマ（Ｓｉｇｍａ））の５０％／５０％混合物を、この４００ｍｌの血漿に慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【０１０２】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。次いでこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０１０３】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０１０４】
透明な血漿相を回収した。３７０ｍｌ超の血漿を輸液フィルターに通したところ、ポール（Ｐａｌｌ）製の０．２μｍ細菌フィルター（Ｍｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）  ２０、参照番号  ＫＭ５ＥＫＶＰ２Ｓ）に直列に連結したＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して（ポンプによって加えられる圧力なしに）重力により濾過することができた。
【０１０５】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（別のブランドのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５を使用する）の使用およびその後の大豆油による１回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過をして上記ＳＤ剤、油残留分、血液細胞片、細菌および寄生虫を取り除くことができる３５０ｍｌ超の透明な血漿を得ることができる。
【０１０６】
（実施例７）
２％  ＴｎＢＰで処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による１回、２回、または３回の抽出にかけたアフェレーシス血漿
【０１０７】
２つの血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０１０８】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【０１０９】
８ｍｌのＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）を、この４００ｍｌの血漿に慎重に加え、２％  ＴｎＢＰの最終濃度に到達させた。
【０１１０】
この血漿−ＴｎＢＰ混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３７℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。この血漿−ＴｎＢＰ混合物を、次いで第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０１１１】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を、この血漿−ＴｎＢＰ混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０１１２】
回収した血漿相は非常に濁っており、活性炭フィルターを通した濾過は不可能であった（ＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター；ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）。
【０１１３】
この油抽出手順を２回繰り返した。各々の場合において、この血漿は非常に濁っており、上述の濾過工程は不可能であった。
【０１１４】
結論：２％  ＴｎＢＰの使用およびその後の大豆油による１回、２回、または３回の抽出の組み合わせによって、各々の場合において、ＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して重力濾過することはできず、ましてや細菌フィルターを通して濾過することはできない非常に濁った血漿が得られる。
【０１１５】
（実施例８）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））で処理し、ヒマシ油による１回、２回、または３回の抽出にかけたアフェレーシス血漿
【０１１６】
２つの血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０１１７】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【０１１８】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））５０％／５０％混合物を、この４００ｍｌの血漿に慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【０１１９】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。次いでこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０１２０】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌのヒマシ（＝トウゴマ）油（参照番号  ８３９１２、フルカ（Ｆｌｕｋａ））をこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０１２１】
回収した血漿相は濁っており、活性炭フィルターを通した濾過は不可能であった（ＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター；ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）。
【０１２２】
この油抽出手順を２回繰り返した。各々の場合において、この血漿は濁っており、上述の濾過工程は不可能であった。
【０１２３】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後のヒマシ油による１回、２回、または３回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過することができない濁った血漿が得られる。
【０１２４】
（実施例９）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による１回、２回、または３回の抽出にかけたアフェレーシス血漿
【０１２５】
２つの血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０１２６】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【０１２７】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ドイツ、ダルムシュタット）の５０％／５０％混合物を、この４００ｍｌの血漿に慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の最終濃度に到達させた。
【０１２８】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００混合物を、次いで第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０１２９】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０１３０】
回収した血漿相は濁っており、活性炭フィルターを通した濾過は不可能であった（ＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター；ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）。
【０１３１】
この油抽出手順を２回繰り返した。各々の場合において、この血漿は濁っており、上述の濾過工程は不可能であった。
【０１３２】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の使用およびその後の大豆油による１回、２回、または３回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過することができない濁った血漿が得られる。
【０１３３】
（実施例１０）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０で処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による１回、２回、または３回の抽出にかけたアフェレーシス血漿
【０１３４】
２つの血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０１３５】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は±４００ｍｌであった。
【０１３６】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｗｅｅｎ−８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ−８０としても知られる）（参照番号  ５９９２４、フルカ（Ｆｌｕｋａ））の５０％／５０％混合物を、この４００ｍｌの血漿に慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｗｅｅｎ−８０の最終濃度に到達させた。
【０１３７】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｗｅｅｎ−８０混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｗｅｅｎ−８０混合物を、次いで第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０１３８】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｗｅｅｎ−８０混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｗｅｅｎ−８０／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０１３９】
回収した血漿相は濁っており、活性炭フィルターを通した濾過は不可能であった（ＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター；ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）。
【０１４０】
この油抽出手順を２回繰り返した。各々の場合において、血漿は濁っており、上述の濾過工程は不可能であった。
【０１４１】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｗｅｅｎ−８０の使用およびその後の大豆油による１回、２回、または３回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過することができない濁った血漿が得られる。
【０１４２】
（実施例１１）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））で処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による１回の抽出にかけた回収血漿
【０１４３】
２ユニットの回収血漿を全血から調製し、ＣＰＤ抗凝固薬／防腐剤（比：１４ｍｌ／１００ｍｌの血液）の中に採取した。血液を、採取後４時間以内に３６００ｇで１２分間遠心分離した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０１４４】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【０１４５】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））の５０％／５０％混合物をこの４００ｍｌの血漿に慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【０１４６】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。次いでこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０１４７】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０１４８】
透明な血漿相を回収した。３７０ｍｌ超の血漿を輸液フィルターに通したところ、ポール（Ｐａｌｌ）製の０．２μｍ細菌フィルター（Ｍｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）  ２０、参照番号  ＫＭ５ＥＫＶＰ２Ｓ）に直列に連結したＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して（ポンプによって加えられる圧力なしに）重力により濾過することができた。
【０１４９】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後の大豆油による１回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過をして上記ＳＤ剤、油残留分、血液細胞片、細菌および寄生虫を取り除くことができる３５０ｍｌ超の透明な回収血漿を得ることができる。
【０１５０】
（実施例１２）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））で処理し、大豆油（参照番号  １９−４２５００、ペンタ・インターナショナル・コーポレーション（Ｐｅｎｔａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））による１回の抽出にかけた回収血漿
【０１５１】
２ユニットの回収血漿を全血から調製し、ＣＰＤ抗凝固薬／防腐剤（比：１４ｍｌ／１００ｍｌの血液）の中に採取した。血液を、採取後４時間以内に３６００ｇで１２分間遠心分離した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０１５２】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【０１５３】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））の５０％／５０％混合物をこの４００ｍｌの血漿に慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【０１５４】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。次いでこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０１５５】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  １９−４２５００、ペンタ・インターナショナル・コーポレーション（Ｐｅｎｔａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国）をこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）と血漿相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０１５６】
透明な血漿相を回収した。３７０ｍｌ超の血漿を輸液フィルターに通したところ、ポール（Ｐａｌｌ）製の０．２μｍ細菌フィルター（Ｍｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）  ２０、参照番号  ＫＭ５ＥＫＶＰ２Ｓ）に直列に連結したＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して（ポンプによって加えられる圧力なしに）重力により濾過することができた。
【０１５７】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後の大豆油による１回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過をして上記ＳＤ剤、油残留分、血液細胞片、細菌および寄生虫を取り除くことができる３５０ｍｌ超の透明な血漿を得ることができる。
【０１５８】
（実施例１３）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｘ４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−４５、シグマ（Ｓｉｇｍａ））で処理したが、大豆油抽出にかけなかったアフェレーシス血漿
【０１５９】
２つの血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０１６０】
この２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中、３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【０１６１】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｘ４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−４５、シグマ（Ｓｉｇｍａ））の５０％／５０％混合物を、この４００ｍｌの血漿に慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【０１６２】
この血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。
【０１６３】
次いでこの血漿−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０１６４】
ＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して濾過できない非常に濁った血漿相を回収した。
【０１６５】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５後の大豆油を用いた抽出は、当該血漿を清澄化して活性炭濾過を可能にするために必要とされる。
【０１６６】
下記の表１は、５つの処理単位についてそれぞれの最初の血漿（「開始」とラベルした）と比較して、実施例１に記載したように処理した血漿（「最終」とラベルした）の質の比較を示す。結果は、１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５を使用するプロセス、ならびにその後の１回の大豆油抽出、およびＡＫＳ６活性炭フィルターおよび細菌フィルター上での濾過プロセスは、血漿のタンパク質の質を変えず、イオンバランスの改変にもつながらないということを示す。ＴｎＢＰおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５含有量は、１回の油抽出および活性炭濾過の後の最終の血漿では検出不能なレベルまで減少している。
【表１】
2011515170.tif 000003
【０１６７】
（実施例１４）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｘ４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−４５、シグマ（Ｓｉｇｍａ））で処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による１回の抽出にかけたアフェレーシス血漿からのクリオプレシピテートのミニプール
【０１６８】
血漿を、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）（バクスター・ヘルスケア（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ）、米国、ディアフィールド）  オートフェレーシス（ａｕｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）  Ｃ  血液細胞分離装置を使用するアフェレーシス手順によって、製造業者の説明書に従って採取した。血漿を、ＡＣＤＡ溶液（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。
【０１６９】
クリオプレシピテートを、凍結した血漿がスラリー状になるまでその凍結した血漿を４℃で一晩解凍することにより調製した。次いでこの血漿バッグを３８５０×ｇおよび−４℃で３０分間遠心分離にかけた（モデル  ＫＲ４ｉ、ジュアン（Ｊｏｕａｎ）、フランス、サンテルブラン（Ｓｔ  Ｈｅｒｂｌａｉｎ））。この遠心分離の完結後、「乾燥」クリオプレシピテートを得るために、このバッグをさかさまにして置き、実質的にすべての脱クリオ血漿を排出した。
【０１７０】
次いで、このクリオプレシピテート採取バッグを−２０℃以下でただちに凍結し、最長２ヶ月間保った。
【０１７１】
ウイルス不活化処理の当日、クリオプレシピテートの提供物を、温度制御された水槽の中で３５±１．５℃で１０分間、その採取バッグの中で解凍した。
【０１７２】
８ｍｌの滅菌したグルコース／生理食塩水溶液を各ユニットに無菌的に加え、各バッグを手作業で混合して、クリオプレシピテートを完全に再懸濁させた。クリオプレシピテート溶液（約１０ｍｌ／バッグ）を、第１のＳＤ処理バッグの中に、４０個の提供物の群にしてプールした。このクリオプレシピテートプールの容積は４００ｍｌであった。
【０１７３】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））の５０％／５０％混合物をこの４００ｍｌのクリオプレシピテートに慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【０１７４】
このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、次いで第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０１７５】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を、このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）とクリオプレシピテート相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０１７６】
透明なクリオプレシピテート相を回収した。３７０ｍｌ超のクリオプレシピテートを輸液フィルターに通したところ、Ｃｕｎｏ  ＢｉｏＣａｐ  ３０  ＢＣ００３０  Ａ  Ｒ３２ＳＰフィルター、次いでポール（Ｐａｌｌ）製の０．２μｍ細菌フィルター（Ｍｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）  ２０、参照番号  ＫＭ５ＥＫＶＰ２Ｓ）を通して（ポンプによって加えられる圧力なしに）重力により濾過することができた。
【０１７７】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後の大豆油による１回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過をして上記ＳＤ剤、油残留分、血液細胞片、細菌および寄生虫を取り除くことができる、アフェレーシス血漿から製造される３５０ｍｌ超の透明なクリオプレシピテートを得ることができる。
【０１７８】
（実施例１５）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｘ４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−４５、シグマ（Ｓｉｇｍａ））で処理し、大豆油（参照番号  １９−４２５００、ペンタ・インターナショナル・コーポレーション（Ｐｅｎｔａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））による１回の抽出にかけた回収血漿からのクリオプレシピテートのミニプール
【０１７９】
回収血漿を、ＣＰＤ抗凝固薬／防腐剤（比：１４ｍｌ／１００ｍｌの血液）の中に採取した全血から得た。血液を、採取後４時間以内に３６００ｇで１２分間遠心分離した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０１８０】
クリオプレシピテートを、凍結した血漿がスラリー状になるまでその凍結した血漿を４℃で一晩解凍することにより調製した。次いでこの血漿バッグを３８５０×ｇおよび−４℃で３０分間遠心分離にかけた（モデル  ＫＲ４ｉ、ジュアン（Ｊｏｕａｎ）、フランス、サンテルブラン）。この遠心分離の完結後、「乾燥」クリオプレシピテートを得るために、このバッグをさかさまにして置き、実質的にすべての脱クリオ血漿を排出した。
【０１８１】
次いで、このクリオプレシピテート採取バッグを−２０℃以下でただちに凍結し、最長２ヶ月間保った。
【０１８２】
ウイルス不活化処理の当日、クリオプレシピテートの提供物を、温度制御された水槽の中で３５±１．５℃で１０分間、その採取バッグの中で解凍した。
【０１８３】
８ｍｌの滅菌したグルコース／生理食塩水溶液を各ユニットに無菌的に加え、各バッグを手作業で混合して、クリオプレシピテートを完全に再懸濁させた。クリオプレシピテート溶液（約１０ｍｌ／バッグ）を、第１のＳＤ処理バッグの中に、４０個の提供物の群にしてプールした。このクリオプレシピテートプールの容積は４００ｍｌであった。
【０１８４】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  １９−４２５００、ペンタ・インターナショナル・コーポレーション（Ｐｅｎｔａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））の５０％／５０％混合物を、この４００ｍｌのクリオプレシピテートに慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【０１８５】
このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、次いで第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０１８６】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を、このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）とクリオプレシピテート相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０１８７】
透明なクリオプレシピテート相を回収した。３７０ｍｌ超のクリオプレシピテートを輸液フィルターに通したところ、Ｃｕｎｏ  ＢｉｏＣａｐ  ３０  ＢＣ００３０  Ａ  Ｒ３２ＳＰフィルターに通し、次いでポール（Ｐａｌｌ）製の０．２μｍ細菌フィルター（Ｍｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）  ２０、参照番号  ＫＭ５ＥＫＶＰ２Ｓ）に通して（ポンプによって加えられる圧力なしに）重力により濾過することができた。
【０１８８】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後の大豆油による１回の抽出の組み合わせによって、活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過をして上記ＳＤ剤、油残留分、血液細胞片、細菌および寄生虫を取り除くことができる、回収血漿から製造される３５０ｍｌ超の透明なクリオプレシピテートを得ることができる。
【０１８９】
（実施例１６）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｘ４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−４５、シグマ（Ｓｉｇｍａ））で処理され、かつヒマシ油（参照番号  ８３９１２、フルカ（Ｆｌｕｋａ））による１回、２回、または３回の抽出にかけた回収血漿からのクリオプレシピテートのミニプール
【０１９０】
回収血漿を、ＣＰＤ抗凝固薬／防腐剤（比：１４ｍｌ／１００ｍｌの血液）の中に採取した全血から得た。血液を、採取後４時間以内に３６００ｇで１２分間遠心分離した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０１９１】
クリオプレシピテートを、凍結した血漿がスラリー状になるまでその凍結した血漿を４℃で一晩解凍することにより調製した。次いでこの血漿バッグを３８５０×ｇおよび−４℃で３０分間遠心分離にかけた（モデル  ＫＲ４ｉ、ジュアン（Ｊｏｕａｎ）、フランス、サンテルブラン）。この遠心分離の完結後、「乾燥」クリオプレシピテートを得るために、このバッグをさかさまにして置き、実質的にすべての脱クリオ血漿を排出した。
【０１９２】
次いで、このクリオプレシピテート採取バッグを−２０℃以下でただちに凍結し、最長２ヶ月間保った。
【０１９３】
ウイルス不活化処理の当日、クリオプレシピテートの提供物を、温度制御された水槽の中で３５±１．５℃で１０分間、その採取バッグの中で解凍した。
【０１９４】
８ｍｌの滅菌したグルコース／生理食塩水溶液を各ユニットに無菌的に加え、各バッグを手作業で混合して、クリオプレシピテートを完全に再懸濁させた。クリオプレシピテート溶液（約１０ｍｌ／バッグ）を、第１のＳＤ処理バッグの中に、４０個の提供物の群にしてプールした。このクリオプレシピテートプールの容積は４００ｍｌであった。
【０１９５】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  １９−４２５００、ペンタ・インターナショナル・コーポレーション（Ｐｅｎｔａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））の５０％／５０％混合物を、この４００ｍｌのクリオプレシピテートに慎重に加え、１％  ＴｎＢＰおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の最終濃度に到達させた。
【０１９６】
このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３１℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物を、次いで第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０１９７】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を、このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５混合物に加えた。このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）とクリオプレシピテート相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０１９８】
回収したクリオプレシピテート相は濁っており、活性炭フィルター（Ｃｕｎｏ  ＢｉｏＣａｐ  ３０  ＢＣ００３０  Ａ  Ｒ３２ＳＰフィルター）を通した濾過は不可能であった。
【０１９９】
この油抽出手順を２回繰り返した。各々の場合において、このクリオプレシピテートは濁っており、上述の濾過工程は不可能であった。
【０２００】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後のヒマシ油による１回の抽出の組み合わせは、活性炭フィルター−細菌フィルターの順序を通して重力濾過することができない、回収血漿から製造される濁ったクリオプレシピテートをもたらした。
【０２０１】
（実施例１７）
２％  ＴｎＢＰで処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による１回、２回、または３回の抽出にかけたアフェレーシス血漿からのクリオプレシピテートのミニプール
【０２０２】
４０の血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０２０３】
クリオプレシピテートを、４０の凍結した血漿ユニットがスラリー状になるまでその４０の凍結した血漿ユニットを４℃で一晩解凍することにより調製した。次いでこの血漿バッグを３８５０×ｇおよび−４℃で３０分間遠心分離にかけた（モデル  ＫＲ４ｉ、ジュアン（Ｊｏｕａｎ）、フランス、サンテルブラン）。この遠心分離の完結後、「乾燥」クリオプレシピテートを得るために、このバッグをさかさまにして置き、実質的にすべての脱クリオ血漿を排出した。
【０２０４】
次いで、このクリオプレシピテート採取バッグを−２０℃以下でただちに凍結し、最長２ヶ月間保った。
【０２０５】
ウイルス不活化処理の当日、クリオプレシピテートの提供物を、温度制御された水槽の中で３５±１．５℃で１０分間、その採取バッグの中で解凍した。
【０２０６】
８ｍｌの滅菌したグルコース／生理食塩水溶液を各ユニットに無菌的に加え、各バッグを手作業で混合して、クリオプレシピテートを完全に再懸濁させた。クリオプレシピテート溶液（約１０ｍｌ／バッグ）を、第１のＳＤ処理バッグの中に、４０個の提供物の群にしてプールした。このクリオプレシピテートプールの容積は４００ｍｌであった。
【０２０７】
８ｍｌのＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）を、この４００ｍｌのクリオプレシピテートを慎重に加え、２％  ＴｎＢＰの最終濃度に到達させた。
【０２０８】
このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３７℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ混合物を、次いで第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０２０９】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をこのクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ混合物に加えた。このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）とクリオプレシピテート相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０２１０】
回収したクリオプレシピテート相は非常に濁っており、活性炭フィルター（Ｃｕｎｏ  ＢｉｏＣａｐ  ３０  ＢＣ００３０  Ａ  Ｒ３２ＳＰフィルター）を通した濾過は不可能であった。
【０２１１】
この油抽出手順を２回繰り返した。各々の場合において、このクリオプレシピテートは非常に濁っており、上述の濾過工程は不可能であった。
【０２１２】
結論：２％  ＴｎＢＰの使用およびその後の大豆油による１回、２回、または３回の抽出の組み合わせによって、各々の場合において、Ｃｕｎｏ  ＢｉｏＣａｐ  ３０  ＢＣ００３０  Ａ  Ｒ３２ＳＰフィルターを通して重力濾過することができず、ましてや細菌フィルターを通して濾過することはできない非常に濁ったクリオプレシピテートが得られる。
【０２１３】
（実施例１８）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による１回、２回、または３回の抽出にかけたアフェレーシス血漿からのクリオプレシピテートのミニプール
【０２１４】
４０の血漿ユニットを、製造業者の説明書に従ってアフェレーシス手順によって採取し、ＡＣＤＡ（比：８ｍｌ／１００ｍｌの血液）で抗凝固剤処置した。血漿は、処理に先立って白血球除去しなかった。血漿をドライアイス−エタノール槽の中で凍結させ、冷凍庫の中で−３０℃で最長３ヶ月間保存した。
【０２１５】
クリオプレシピテートを、４０の凍結した血漿ユニットがスラリー状になるまでその４０の凍結した血漿ユニットを４℃で一晩解凍することにより調製した。次いでこの血漿バッグを３８５０×ｇおよび−４℃で３０分間遠心分離にかけた（モデル  ＫＲ４ｉ、ジュアン（Ｊｏｕａｎ）、フランス、サンテルブラン）。この遠心分離の完結後、「乾燥」クリオプレシピテートを得るために、このバッグをさかさまにして置き、実質的にすべての脱クリオ血漿を排出した。
【０２１６】
次いで、このクリオプレシピテート採取バッグを−２０℃以下でただちに凍結し、最長２ヶ月間保った。
【０２１７】
ウイルス不活化処理の当日、クリオプレシピテートの提供物を、温度制御された水槽の中で３５±１．５℃で１０分間、その採取バッグの中で解凍した。
【０２１８】
８ｍｌの滅菌したグルコース／生理食塩水溶液を各ユニットに無菌的に加え、各バッグを手作業で混合して、クリオプレシピテートを完全に再懸濁させた。クリオプレシピテート溶液（約１０ｍｌ／バッグ）を、第１のＳＤ処理バッグの中に、４０個の提供物の群にしてプールした。このクリオプレシピテートプールの容積は４００ｍｌであった。
【０２１９】
８ｍｌの、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ドイツ、ダルムシュタット）の５０％／５０％  混合物をこの４００ｍｌのクリオプレシピテートに慎重に加え、１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の最終濃度に到達させた。
【０２２０】
このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００混合物を５分間激しく振盪し、この種々の成分の良好な混合を確実にした。次いでこの処理バッグを、振盪機−インキュベーターの中で３７℃でインキュベーションし、次いで一定のゆっくりとした撹拌（１５０ｒｐｍ）のもとで３０分間処理した。このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００混合物を、次いで第２のＳＤ処理バッグの中へと移し、同じ条件で１時間３０分間インキュベーションした。
【０２２１】
次いでこの混合物を油抽出バッグに移した。４０ｍｌの大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））をこのクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００混合物に加えた。このクリオプレシピテート−ＴｎＢＰ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１０体積％油懸濁液を少なくとも１分間激しく振盪し、次いで上記振盪機−インキュベーターの上に置き、少なくとも１５分間、ゆっくりとした撹拌を確保した。次いでこのバッグを吊り下げて、油相（上層）とクリオプレシピテート相（下層）との間の４５分間のデカンテーションを確保した。
【０２２２】
回収したクリオプレシピテート相は濁っており、ＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して濾過できなかった。
【０２２３】
この油抽出手順を２回繰り返した。各々の場合において、このクリオプレシピテートは非常に濁っており、上述の濾過工程は不可能であった。
【０２２４】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の使用およびその後の大豆油による１回、２回、または３回の抽出の組み合わせによって、各々の場合において、Ｃｕｎｏ  ＢｉｏＣａｐ  ３０  ＢＣ００３０  Ａ  Ｒ３２ＳＰフィルターを通して重力濾過することができず、ましてや細菌フィルターを通して濾過することはできない濁ったクリオプレシピテートが得られる。
【０２２５】
（実施例１９）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（Ｘ４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−４５、シグマ（Ｓｉｇｍａ））で処理し、大豆油（参照番号  Ｓ７３８１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））による１回の抽出およびＣｕｎｏ  ＢｉｏＣａｐ  ２５  Ｒ３２ＳＰ上での濾過にかけたアフェレーシス血漿からのクリオプレシピテートのミニプール
【０２２６】
クリオプレシピテートを実施例１４に記載したように処理したが、使用した活性炭フィルターはＣｕｎｏ  ＢｉｏＣａｐ  ２５  ＢＣ００２５  Ｌ  Ｒ３２ＳＰであった。
【０２２７】
３８０ｍｌ超のクリオプレシピテートを輸液フィルターに通したところ、このＣｕｎｏ  ＢｉｏＣａｐ  ２５  ＢＣ００２５  Ｌ  Ｒ３２ＳＰフィルターに通し、次いでポール（Ｐａｌｌ）製の０．２μｍ細菌フィルター（Ｍｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）  ２０、参照番号  ＫＭ５ＥＫＶＰ２Ｓ）に通して（ポンプによって加えられる圧力なしに）重力により濾過することができた。
【０２２８】
結論：１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の使用およびその後の大豆油による１回の抽出の組み合わせによって、ＢｉｏＣａｐ  ２５  ＢＣ００２５  Ｌ  Ｒ３２ＳＰ活性炭フィルターおよび細菌フィルターを通して重力濾過をして上記ＳＤ剤、油残留分、血液細胞片、細菌および寄生虫を取り除くことができる、アフェレーシス血漿から製造される３５０ｍｌ超の透明なクリオプレシピテートを得ることができる。
【０２２９】
下記の表２は、２つの処理単位についてそれぞれの最初のクリオプレシピテート（「開始」とラベルした）と比較して、実施例１４に記載したように処理したクリオプレシピテート（「最終」とラベルした）の品質の比較を示す。結果は、１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５を使用するプロセス、ならびにその後の１回の大豆油抽出、ならびにＣｕｎｏ  ＢｉｏＣａｐ  ３０  ＢＣ００３０  Ａ  Ｒ３２ＳＰおよび細菌フィルター上での濾過プロセスは、クリオプレシピテートのタンパク質の質を変えないということを示す。ＴｎＢＰおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５は、１回の油抽出および活性炭濾過の後の最終のクリオプレシピテートでは検出不能なレベルまで減少している。
【表２】
2011515170.tif 000004
【０２３０】
下記の表３は、１つの処理単位についてそれぞれの最初のクリオプレシピテート（「開始」とラベルした）と比較して、実施例１９に記載したように処理したクリオプレシピテート（「最終」とラベルした）の品質の比較を示す。結果は、１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５を使用するプロセス、ならびにその後の１回の大豆油抽出、ならびにＣｕｎｏ  ＢｉｏＣａｐ  ２５  ＢＣ００２５  Ｌ  Ｒ３２ＳＰおよび細菌フィルター上での濾過プロセスはクリオプレシピテートのタンパク質の質を変えないということを示す。
【表３】
2011515170.tif 000005
【０２３１】
（実施例２０）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５で処理し、大豆油による１回の抽出にかけた血漿
【０２３２】
Ｓｈａｂｒａｗｉｓｈｉ病院血液バンク（エジプト、カイロ、ギーザ）において、インフォームドコンセントを受けた定期的なボランティアの血漿ドナーから血漿を採取した。血漿をアフェレーシス手順により得るかまたは全血から回収するかし、Ｂｕｒｎｏｕｆら、ＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮ、第４６巻、２００６年１２月、２１００−８に記載されるようにして−２０℃以下で凍結した。
【０２３３】
２つの血漿提供物を、温度制御された水槽の中で３５℃で１０分間解凍し、次いで第１のＳＤ処理バッグの中へとプールした。この血漿プールの容積は４００ｍｌであった。
【０２３４】
この血漿プールを、図１に係るバッグシステム（輸液フィルターは含まないが、細菌フィルターと採取バッグとの間にさらなるプール用バッグを具える）の中で、ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（参照番号  ９３４１９、フルカ・シグマアルドリッチ（Ｆｌｕｋａ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））の５０％／５０％混合物で処理し、次いでプロセス化学物質を、実施例１に記載したようにして大豆油で抽出した。
【０２３５】
透明な血漿相を回収した。３７０ｍｌ超を、ポール（Ｐａｌｌ）製の０．２μｍ細菌フィルター（Ｍｉｎｉ  ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）  ２０、参照番号  ＫＭ５ＥＫＶＰ２Ｓ）に直列に連結したＡＫＳ６  Ｐａｌｌ活性炭フィルター（ＳＵＰＲＡｃａｐ  ６０  ＳＣ０６０ＸＡＫ６）を通して（ポンプによって加えられる圧力なしに）重力濾過した。
【０２３６】
濾過した血漿をプール用バッグの中で混合し、次いで２つの個々の２００ｍＬバッグの中に分注した。すべてのバッグを、各工程間の隔離を確実にするために破壊できる弁によって分離する。ひとたび使用すると、バッグをこのシステムから切断し、廃棄する。
【０２３７】
（実施例２１）
１％  ＴｎＢＰ−１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５で処理し、大豆油による１回の抽出にかけたクリオプレシピテートのミニプール
【０２３８】
クリオプレシピテートを、凍結した血漿がスラリー状になるまでその凍結した血漿を４℃で一晩解凍することにより調製した。
【０２３９】
３８５０×ｇおよび−４℃での３０分間の遠心分離（モデル  ＫＲ４ｉ、ジュアン（Ｊｏｕａｎ）、フランス、サンテルブラン）後、ＣＰＰをほぼ完全に取り除き、少量のクリオプレシピテートを残した。次いで、このクリオプレシピテート採取バッグを−２０℃以下でただちに凍結し、最長２ヶ月間保った。
【０２４０】
３２〜４０の少量のクリオプレシピテートユニットを層流下で４００ｍＬバッグの中にプールし、３１℃での１％  ＴｎＢＰ（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ）、ＶＷＲ、フランス、フォントネー＝スー＝ボワ）および１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５（シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ミズーリ州、セント・ルイス）を使用するＳ／Ｄ処理およびその後の、（輸液フィルターを用いない）図２に係る処理システムを使用する実施例１５に記載した大豆油を用いたプロセス化学物質の抽出にかけた。
【０２４１】
得られたクリオプレシピテートをプール用バッグの中で混合し、次いでいくつかの４０ｍＬバッグへ分注する。すべてのバッグを、各工程間の隔離を確実にするために、破壊できる弁によって分離する。ひとたび使用すると、バッグをこのシステムから切断し、廃棄する。
【０２４２】
この実施例からの何らかの結論は？
【０２４３】
（実施例２３）
実施例２０および実施例２１で得た血漿およびクリオプレシピテートの分析
【０２４４】
１．アッセイ
血球数および細胞マーカーの測定
血小板、白血球細胞（ＷＢＣ）、および赤血球細胞の数を、細胞計数器（Ｃｅｌｌ  Ｄｙｎ、アボット（Ａｂｂｏｔｔ））を使用して測定した。白血球についての血液細胞抗原マーカーＣＤ４１、血小板についてのＣＤ６１およびＲＢＣについてのグリコホリンＡをフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））によって測定した。
【０２４５】
タンパク質アッセイ
複数の１ｍＬ試料を最初の血漿およびクリオプレシピテートミニプールならびに最終プールに対して採取し、タンパク質の評価まで−８０℃で凍結した。ほとんどのタンパク質測定は、これまでに記載された手順を使用して実施した。フォンウィルブランド因子  リストセチンコファクター（ＷＪＦ：ＲＣｏ）およびコラーゲン結合（ＶＷＦ：ＣＢ）アッセイ、およびＶＷＦ多量体電気泳動分離をこれまでに記載されたように行った。第ＸＩＩＩ因子機能活性はＢｅｒｉｃｈｒｏｍ  ＦＸＩＩＩ（シーメンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ））によって、および抗トロンビン機能活性はＣｏａｍａｔｉｃ  ＡＴ（クロモジェニックス（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ））によって測定した。アッセイの変動を制限するために、すべての試料を、最初の血漿材料および処理血漿材料を含む均一なシリーズで分析した。
【０２４６】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
Ｓ／Ｄ処理の前および後の血漿およびクリオプレシピテートのタンパク質プロファイルを、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって研究した。０．５μｌの非還元試料を２．５μｌのＮＵＰＡＧＥ  ＬＤＳ  ４Ｘ（インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国、カリフォルニア州、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））試料緩衝液および６μｌ  ＲＩＰＡと混合し、７０℃で１０分間加熱し、ＭＥＳ（インビトロジェン）緩衝液の中で４−１２％ポリアクリルアミド勾配ゲル上で分離した。還元試料も、１μｌのＮｕＰＡＧＥ還元剤（インビトロジェン）をこの混合物に加えたことを除いて同じ条件下で調製した。分離は、一定の２００Ｖ、初期１５０ｍＡ／ゲル、３５分間で実施した。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）  Ｓｈａｒｐ  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（インビトロジェン）を、分子量評価のために使用した：２６０、１６０、１１０、８０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、および３．５ＫＤａ。ゲルは、クマシー・ブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）を使用して染色した。
【０２４７】
ＴｎＢＰおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５アッセイ
ＴｎＢＰおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５を血漿およびクリオプレシピテート試料から抽出し、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）および高性能液体クロマトグラフィによって、以前にＢｕｒｎｏｕｆら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２００６；４６（１２）：２１００−８）に記載されたようにして分析した。
【０２４８】
フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）（ＤＥＨＰ）アッセイ
フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）（ＤＥＨＰ）を、開始および最終の血漿ならびにクリオプレシピテートミニプールに対して評価した。１ｍＬの血漿またはクリオプレシピテートをガラスチューブの中で０．１２５ｍｌの１．５Ｎ  過塩素酸（リーデル・デ・ハーエン（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａｅｕｎ）、ドイツ、ゼールツェ（Ｓｅｅｌｚｅ））と混合し、３７℃で１５分間インキュベーションした。このインキュベーション期間の最後のあとで、このガラスチューブの内容物を、氷冷したエタノール（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ドイツ）：クロロホルム（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、フランス、イルキルシュ（Ｉｌｌｋｉｒｃｈ））と１：１：０．０９２ｍｌの比率で混合し、−２０℃より低い温度で２時間インキュベーションした。この試料を１０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清をきれいなガラスチューブへと慎重に移した。４ｍＬのｎ−ヘキサン（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ドイツ）をこの上清に加え、激しく振盪し、次いで５分間静置して２つの層を分離させた。上側のヘキサン層を、界面を乱すことなくきれいなガラスチューブへと移した。最後の工程を２回繰り返し、このヘキサン部分を同じガラスチューブの中に集めた。このヘキサンを乾固するまでエバポレーションし、次いでＨＰＬＣ（ラブスキャン（ＬａｂＳｃａｎ）、イングランド）用に１ｍＬのアセトニトリルに溶解した。ＤＥＨＰは、分析用ポンプ（ＳＦＤ  ９４１４）および２０２ｎｍの波長のＵＶ／ＶＩＳ検出器（Ｓ  ３２１０）およびＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ  １８−５μ、（２５０ｍｍ×４、６ｍｍ）カラム（シーエス・クロマトグラフィー（ＣＳ−Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ）、ドイツ）を具えたＨＰＬＣ（ＳＦＤ、シェムバック（Ｓｃｈｅｍｂａｃｋ  ＧｍｂＨ）、ドイツ）によって測定した。アセトニトリルおよびメタノールの８５：１５の混合物（メルク（Ｍｅｒｋ）、ドイツ）を１．５ｍｌ／分で移動相として使用し、８分間の分析時間を使用した。
【０２４９】
コレステロール含有量
コレステロール含有量は、ヒューマン・ディアグノスティック（Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）（ｗｗｗ．ｈｕｍａｎ．ｄｅ）からの酵素による比色分析法、液体清浄化因子を伴う一試薬（ｍｏｎｏ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）（ＣＨＯＤ−ＰＡＰ）を使用して測定した。このアッセイは、スピンリアクト（Ｓｐｉｎｒｅａｃｔ）（スペイン）製の分光光度計により波長５４６でおよび１ｍｇ／ｄｌの感度で読み取った。
【０２５０】
毒性アッセイ
（油抽出後、Ｓ／Ｄ吸着フィルター、および滅菌濾過後の）ＳＤ処理した血漿およびＳＤ処理したクリオプレシピテートの毒性をスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットにおいて評価し、未処理の血漿およびクリオプレシピテートならびに対照の生理食塩水と比較した。体重８０〜１００ｇの３６匹のラットを、各々２匹の雄および２匹の雌を含む４匹のラットの９つの群に分けた。これらのラットを実験環境に７日間順化させ、それらの体重を記録した。各ラットに、６．５ｍｌ／ｋｇ体重の用量で当該血漿画分または生理食塩水を静脈内注入した。次いでこれらのラットを１４日間観察し、異常な行動または臨床徴候、体重、ならびに水および食料の毎日の消費量について毎日チェックした。
【０２５１】
統計解析
すべてのシリーズの実験についてのデータを、平均、標準偏差および最小値および最大値として報告する。統計的な比較は、対応のある両側スチューデント検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔｅｓｔ）を用いて行った。上記手順の異なる工程における血小板調製物間の平均ＰＧＦ濃度の差の有意性を評価するために、０．０５未満のｐ値を使用した。値は、有意でない（ＮＳ；＜０．０５）、＜０．０１、または＜０．００１として提示する。０．０５に近い場合は正確なｐ値を示す。
【０２５２】
２．結果
血漿
下記の表２は、実施例２０に係るＳ／Ｄ−Ｆ処理（溶媒／界面活性剤処理およびその後の大豆油抽出および濾過）の前および後の、回収した（Ａ）またはアフェレーシス（Ｂ）血漿（各群において連続８回の実施の分析データを示す。血漿の特徴の優れた保存が観察された。ほとんどの凝固因子およびプロテアーゼ阻害剤および抗凝固薬の機能活性の９０超〜９５％の回復率があり、最初の血漿とＳＤ−Ｆ血漿との間の有意差はなかった。第Ｖ因子については、唯一の有意な活性の減少を観察し、回収およびアフェレーシス血漿においてそれぞれ８８％および８２％回復率（ｐ＜０．０１）であり、そしてα２−抗プラスミンは回収血漿においては９１％回収率であった。回収（ｐ＜０．０１）およびアフェレーシス（ｐ＜０．０５）ＳＤ−Ｆ血漿の両方においてＰＴの、ならびにＳＤ−Ｆアフェレーシス血漿においてＰＴＴ（ｐ＜０．０５）の小さな、しかし有意な増加があった。全タンパク質、アルブミン、ＩｇＧ、およびＩｇＭの含有量は、この処理によっては有意には改変されなかった。このＳＤ−Ｆ血漿は、ＦＦＰ（新鮮凍結血漿）のすべての品質基準を満たした。
【０２５３】
ＴｎＢＰおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５は、すべての血漿ユニットにおいて１０ｐｐｍ未満および５０ｐｐｍ未満であった。これは当該油抽出プロセスの効率を示す。
【０２５４】
クリオプレシピテート
表３Ａは、上記Ｓ／Ｄ−Ｆ処理（溶媒／界面活性剤処理およびその後の大豆油抽出および濾過）の前および後のクリオプレシピテートミニプールの分析のデータを示し、図７は、５つの異なる処理単位の最初のクリオプレシピテート（レーンＣｓ１、Ｃｓ２、Ｃｓ３、Ｃｓ４、およびＣｓ５）および最終のクリオプレシピテート（レーンＣｆ１、Ｃｆ２、Ｃｆ３、Ｃｆ４、およびＣｆ５）、ならびに基準血漿（シーメンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ）から入手した標準血漿、レーンＮ）についてのＶＷＦ多量体プロファイルを示す。このＳ／Ｄ−Ｆクリオプレシピテートミニプールの平均第ＶＩＩＩ因子含有量は９ＩＵ／ｍＬに近く、平均フィブリノーゲンは１５ｍｇ／ｍＬに近かった。平均ＶＷＦ：Ａｇ、ＶＷＦ：ＲＣｏ、およびＶＷＦ：ＣＢ含有量は、このＳ／Ｄ−Ｆクリオプレシピテートミニプールにおいては、それぞれ１７．５、１４．６、および１３．５ＩＵ／ｍｌであった。最初のクリオプレシピテートミニプールで見出した値に関しては、有意差はなかった。平均ＲＣｏ／Ａｇ（０．８４）およびＣＢＡ／Ａｇ（０．８７）比は、このＳ／Ｄ処理によって影響を受けなかった。このＳ／Ｄ−Ｆクリオプレシピテートの中の多量体分布は、最初のクリオプレシピテートミニプールの多量体分布とは区別できなかった。Ｓ／Ｄ−Ｆ処理の前および処理後の各々の個々の実施における１５量体より大きい多量体（＞１５量体）および１０量体より大きい多量体（＞１０量体）の百分率、ならびにＮＰ多量体に対するそれぞれの比を表３に示す。＞１５量体の平均百分率は約７．８％であり（ＮＰと比較した比が０．８に相当する）、＞１０量体の平均百分率は約２３．５％（ＮＰと比較したそれぞれの比は０．９２）（図示せず）であった。ＣＢ活性および＞１５量体の含有量はよく相関していた。抗Ａおよび抗Ｂ同種凝集素における力価は、Ｓ／Ｄ処理の前および後で、当該クリオプレシピテートミニプールにおいてそれぞれ０〜１、および０〜１／８の範囲にあることが判明した。
【０２５５】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
非還元（図３Ａ）および還元（図３Ｂ）条件下での電気泳動パターンは、最初の血漿（レーン１および３）およびクリオプレシピテートミニプール（レーン５）と、対応するＳ／Ｄ−Ｆ（溶媒／界面活性剤処理およびその後の大豆油抽出および濾過）処理した血漿（レーン２および４）およびクリオプレシピテートミニプール（レーン６）との間で検出できる差をまったく示さなかった。
【０２５６】
ＴｎＢＰおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５含有量
図４および図５は、Ｓ／Ｄ処理後、油抽出後および濾過後の血漿中のＴｎＢＰおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の平均含有量を示す。１回の油抽出は、平均の残留ＴｎＢＰを２６１±１４６（アフェレーシス血漿）および３９３±４９５ｐｐｍ（回収血漿）にまで低下させ、濾過後１ｐｐｍ未満まで低下させた（アフェレーシス血漿および回収血漿）。それぞれのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の残留レベルは、油抽出後２２４８±１１８９および１９０６±６６０であり、濾過後１８±２５および１２±１４ｐｐｍであった。同様の値が当該クリオプレシピテートに対して得られた。
【０２５７】
ＤＥＨＰ
表４は、実施例２０に係るアフェレーシス血漿または回収血漿の処理の種々の工程に沿ったＤＥＨＰ測定の結果を示す。この結果は図６にも示す。最初のアフェレーシス血漿および回収血漿においてそれぞれ１４．３±１６．３および９．９±６．６ｐｐｍであったＤＥＨＰの平均含有量は、ＳＤ処理後１０７．７±１４０．２および７０．６±４５まで増加し、血漿中のＤＥＨＰレベルは、油抽出（それぞれ３３．０±２５．５；２１．６±２０．１）および濾過（それぞれ５．１±３．４；４．７±３．９）の両方によって低下した。同様の値が当該クリオプレシピテートに対して得られた。
【０２５８】
毒性
生理食塩水を投与された群（対照）における平均体重増加と、Ｓ／Ｄ−Ｆ血漿を投与された群（Ｇ８）における平均体重増加と、クリオプレシピテートを投与された群（Ｇ９）における平均体重増加との間に有意差はなかった。体重増加は、未処理の血漿およびクリオプレシピテートを投与された群の体重増加よりも高かった。結果を表５に提示する。示した体重の変動はグラムで提示している。
【０２５９】
結論：ＴｎＢＰおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５の平均残留レベルはそれぞれ１０ｐｐｍ未満および５０ｐｐｍ未満であり、ある範囲のＳＤ処理した血漿誘導体および他の生物製剤に対して承認された限界を満たした。９０％超および７０？％のＴｎＢＰおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５は当該油抽出によって取り除かれ、残りの化学物質はフィルター上で吸着された。このような油抽出／濾過の組み合わせは、生成物の品質の点で多くの利点を有する。第一に、それは、ＰＶＣバッグの製造で使用される可塑剤であるＤＥＨＰを、最初の血漿で見出されるレベルよりも低いレベルまで減少させる。第二に、コレステロールおよびトリグリセリドの含有量の減少がある。これは、最終生成物を劇的に清澄にし、そして高コレステロール血症患者の治療のための臨床的有利性を提供する可能性がある。脂質の除去は、脂質に関連するＴＲＡＬＩの危険性を低下させるための有益な効果を有する可能性もある。第三に、当該材料上での血漿の予めの清澄化により、０．２μｍ膜上での一体的なオンライン濾過を実施することが可能になる。結果として、最初の血漿またはクリオプレシピテートがわずかに濁っているかまたはオパール様の光沢を有しているとしても、最終生成物は極めて透明であり、光沢を有している。この０．２μｍ濾過はまた、採取時、血漿画分のプーリング、または当該プロセスの間の起こりうる偶発的な細菌による汚染に対する防御を確保する。それはまた、本願明細書で実証されたように血液細胞片を、および微小凝集体、または血漿によって伝播する可能性があるいずれかの仮想的な血液由来の細胞内細菌または寄生虫をも除去する。本発明者らが知る限り、これは、血液バンクの血漿成分を０．２μｍ滅菌濾過に成功裏にかけることを可能にした初めての方法である。
【０２６０】
【表４】
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【０２６１】
【表５】
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【０２６２】
【表６】
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【０２６３】
【表７】
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【０２６４】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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