(57)【要約】  本発明は、微生物学的に産生された非極性環状オリゴペプチド類を処理する方法であって、ａ）微生物学的産生方法で発生する発酵ブロス全体を、エーテルを含み、水と非混和性の液体抽出剤を使用して抽出するステップであって、抽出剤の量が、発酵ブロス全体とともに２相系を形成するのに十分な量であるステップを含む方法、およびシクロスポリンＡおよびメチル−ｔ−ブチルエーテルの新規な溶媒和物に関する。
2011529476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物学的に産生された非極性環状オリゴペプチド類を処理する方法であって、
ａ）微生物学的産生において蓄積する発酵ブロス全体を、２５℃で水と非混和性の液状エーテル含有抽出剤で抽出するステップを含み、
抽出剤の量は、発酵ブロス全体を使用する２相系を形成するのに十分な量である方法。
【請求項２】
非極性環状オリゴペプチドが、シクロスポリンＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エーテル含有抽出剤は、実質的に、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルからなり、
ｂ）抽出液に溶解している残留含水率を、１重量％未満、好ましくは０．３重量％未満、より好ましくは０．１５重量％未満に低下させるステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）を共沸蒸留により行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
非極性環状オリゴペプチドがシクロスポリンＡであり、
ｃ）シクロスポリンをシクロスポリンＡ−メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル溶媒和物として結晶化するステップをさらに含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
７．０°＋／−０．１°、８．２°＋／−０．１°、１１．０°＋／−０．１°および２０．５°＋／−０．１°の２シータ角度での先端（ピーク）を含み、特に加えて７．３°＋／−０．１°、１１．８°＋／−０．１°、１３．３°＋／−０．１°および１６．５°＋／−０．１°の２シータ角度での先端（ピーク）を含むＸ線粉末回析パターンを有する結晶性シクロスポリンＡ−メチル−ｔ−ブチルエーテル溶媒和物。
【請求項７】
結晶の少なくとも９０％が、１０μｍを超える結晶サイズを有する結晶性シクロスポリンＡ−メチル−ｔ−ブチルエーテル溶媒和物。
【請求項８】
０．０４から０．００５重量％のイソシクロスポリンＡを含有するシクロスポリンＡであって、シクロスポリンＨおよびシクロスポリンＴを追加した総含有率が、０．１から０．４重量％であるシクロスポリンＡ。
【請求項９】
シクロスポリン類の大量産生における、結晶性シクロスポリン−エーテル溶媒和物の使用。
【請求項１０】
副生物であるイソシクロスポリンＡ、シクロスポリンＨおよびシクロスポリンＴを取除く請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学的に産生された非極性環状オリゴペプチド類を処理する方法であって、ａ）微生物学的産生方法において蓄積する発酵ブロスまたはマッシュ全体を、水と非混和性の液状エーテル含有抽出剤で抽出するステップを含み、ここで、抽出剤の量は、全発酵ブロスとともに２相系を形成するのに十分な量である方法、およびシクロスポリンＡとメチル−ｔ−ブチルエーテルとの新規な溶媒和物に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状オリゴペプチド類、特にウンデカペプチド類は、とりわけ微生物学的代謝産物として長い間知られている。ウンデカペプチド類の中でも、特にシクロスポリン類は、重要になってきている。
【０００３】
シクロスポリン類、特にシクロスポリンＡは、貴重な医薬的活性物質であり、特に臓器移植において、免疫抑制剤として使用することができる。また、シクロスポリン類は、糖尿病および乾癬のような疾患、ならびに関節リウマチおよび慢性炎症のような数多くの自己免疫疾患の治療に適している。シクロスポリン類、特にシクロスポリンＡは、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に対する抑制効果があるため、ウィルスによって引き起こされる疾患と闘うのにも適している。さらに、シクロスポリン類、特にシクロスポリンＡは、癌細胞のビンクリスチンまたはダウノルビシンのような化学療法剤に対する感作に関して、薬理作用を持つことが示されている。また、シクロスポリン類、特にシクロスポリンＡの神経保護特性および再生特性は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症およびパーキンソン病のような種々の神経学的な指標にも使用することができる。
【０００４】
先に記載したように、シクロスポリン類のような環状ウンデカペプチド類は、微生物学的方法により産生することができる。
【０００５】
特に、シクロスポリンＡは、真菌種の菌株、即ちシリンドロカルポン・ルシダム・ブース（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｌｕｃｉｄｕｍ  Ｂｏｏｔｈ）、または真菌種の菌株、即ちトリポクラジウム・インフラタム・ガムズ（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｉｎｆｌａｔｕｍ  Ｇａｍｓ）を用いることによって産生することができる。トリポクラジウム真菌種のこの菌株は、元はトリコデルマ・ポリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ）真菌種と言われ、米国農務省（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ），Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．に、番号：ＮＲＲＬ８０４４の下に寄託された。真菌種の先の菌株、即ちシリンドロカルポン・ルシダム・ブースも、米国農務省（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ），Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．に、番号：ＮＲＲＬ５７６０の下に寄託された。さらに、シクロスポリン類、特にシクロスポリンＡの微生物学的産生のための菌株として、真菌種トリポクラジウム・ゲオデス（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｇｅｏｄｅｓ）、トリポクラジウム・シリンドロスポラム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒｕｍ）およびトリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．ＬｅＡ３）の菌株があり、後者の菌株は、ブタペスト条約に従って、オランダにあるＣｅｎｔｒａｌ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓの保管場所に、番号：ＣＢＳ６３０．９２の下に寄託された。
【０００６】
微生物学的方法によるシクロスポリン類の大量産生は、重要な意味がある。このため、微生物学的産生を改善するために、前記真菌種または新規な真菌種の効果のある菌株と発見および培養することによって種々の実験が行われている。先に記載した菌株は、これらの努力の例である。
【０００７】
しかし、シクロスポリン類の大量微生物学的産生に関連して重要なことは、効果的な発酵方法だけがあるということではなく、このようにして得た代謝産物の効果的な処理もあるということである。
【０００８】
例えば、ＤＯＳ２４５５８５９およびＤＤ−Ｂ−２９８２７６で公知の方法により、シクロスポリン類、特にシクロスポリンＡを、発酵ブロス全体、即ち培養ブロスから単離するのに、濾過または遠心分離により培養ブロスから得た産生物を含むバイオマスを分離する、または発酵ブロス全体を、即ちバイオマスを分離することなく加工することが可能である。
【０００９】
最初のプロセス方法によれば、代謝産物を含む分離されたバイオマスを、メタノールまたはアセトンで好ましくは繰り返して抽出し、好ましくは、分離された抽出液を、例えば塩化エチレンまたはクロロホルムで、好ましくは数回抽出するために、水性残渣まで濃縮する。同様に、バイオマスから分離された培養濾液もこれに応じて抽出するのが好ましい。
【００１０】
バイオマスを分離しない第二のプロセス方法によれば、とりわけ、培養ブロス、即ち発酵ブロス全体を、先に記載した溶剤、即ち塩化エチレンまたはクロロホルムで抽出し、分離した有機相を、数回濃縮した後、さらなる処理のために、異なる溶出液を充填した異なる固定カラムを用いて、クロマトグラフィに供する。ここで考慮することは、溶出液としてメタノールを有する固定カラム材料としてＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、および溶出液としてトルエン／酢酸エチルを有するカラム材料として酸化アルミニウムである。
【００１１】
対応するクロマトグラフィによる処理も、先の処理方法で作ることができ、塩化エチレンまたはクロロホルム抽出液から集めた残渣を、カラム材料、即ちクロロホルム溶出液と組み合わせたシリカゲルと、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム材料とによって精製し、さらに所望の産生物、好ましくはシクロスポリンＡに分離する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＤＯＳ２４５５８５９
【特許文献２】ＤＤ−Ｂ−２９８２７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、これらの既知の処理方法と比べて、微生物学的に産生された環状オリゴペプチド類、特にシクロスポリン類のようなウンデカペプチド類を、産生物の非常に良好な収率および純度で、技術的に有利で、環境に配慮し、効率的に処理する方法を提供することであった。本発明の目的は、特に、使用する有機溶剤の数を減らし、とりわけ環境的な点からより有用な処理方法を作るように、有機溶剤の循環使用を達成することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的は、微生物学的に産生された非極性環状オリゴペプチド類を処理する方法であって、ａ）微生物学的産生において蓄積する発酵ブロス全体を、水と非混和性の液状エーテル含有抽出剤で抽出するステップを含み、ここで、抽出剤の量は、発酵ブロス全体とともに２相系を形成するのに十分な量である、本発明による方法を提供することによって達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】結晶性シクロスポリンＡ−メチル−ｔ−ブチルエーテル溶媒和物のＸ線粉末回析パターン。
【図２】結晶性シクロスポリンＡ−メチル−ｔ−ブチルエーテル溶媒和物の赤外線スペクトル。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
微生物学的に産生された非極性環状オリゴペプチド類であって、好ましくは５から１５個のペプチド結合を持つオリゴペプチド類は、本発明の方法により処理することができる。本発明によれば、用語「オリゴペプチド」は、ある一定の数のペプチド結合を含む有機化合物を意味すると理解され、環構造を構成する２個のみの連続する窒素原子は、中間に存在する２個の炭素原子によって離されているのが好ましい。８から１３個のアミノ酸の非極性環状オリゴペプチド類、より好ましくはウンデカペプチド類を、本発明の処理方法によって単離するのが好ましい。この方法は、微生物学的に産生された非極性ウンデカペプチド類、例えばシクロスポリン類、特にシクロスポリンＡを処理するのに特によく適している。
【００１７】
本発明によれば、親油性化合物として、２５℃の水への水溶性が＜０．１ｇ／Ｌである、環状オリゴペプチド類、特にシクロスポリン類のようなウンデカペプチド類は、非極性であると理解しなければならない。
【００１８】
先に記載したある一定の真菌種の菌株を使用する前記産生物の微生物学的産生は、当業者に周知である。ＤＯＳ２４５５８５９では、３から４頁に真菌株ＮＲＲＬ５７６０およびＮＲＲＬ８０４４の培養が開示されているばかりでなく、４から５頁および実施例１に、シクロスポリン類の産生のための発酵方法も開示されている。
【００１９】
この方法は、ＷＯ９４／１６０９１の３から５頁に開示されているトリポクラジウムｓｐ．ＬｅＡ３菌株の培養、およびＷＯ９４／１６０９１の実施例１および２に従う、シクロスポリン類の産生のために、この真菌を使用する発酵方法にも適用される。さらに、微生物学的方法は、とりわけ、ＤＤ−Ｂ−２９８２７６、ＥＰ−Ａ−０５０７９６８、ＵＳ５１５６９６０に開示されている。
【００２０】
本発明によれば、目的産生物は、培養ブロス、即ち微生物学的産生において蓄積する発酵ブロス全体から抽出することによって得ることができる。この目的のため、発酵ブロス全体を、水と非混和性の液状エーテル含有抽出剤と混合する。ここで、抽出剤の量は、発酵ブロス全体とともに２相系を形成するのに十分な量である。２つの共存する液相ともに、発酵プロセスからの固体粒子も先に記載した系に存在し、粒子は水相に含まれていることは、当業者には公知である。
【００２１】
本発明によれば、水と非混和性の液体抽出剤は、２０℃の水で、少なくとも混和ギャップを有する抽出剤を意味すると理解される。前記ギャップで、液体抽出剤は、相分離が起こるように、少なくとも水に対し不完全な相溶性があり、または水に対し不完全な溶解性がある。
【００２２】
本発明により使用され、水と非混和性であるこれらのエーテル含有抽出剤は、２０℃で測定した比重が、多くても０．９ｇ／ｃｍ３、好ましくは０．６から０．８５ｇ／ｃｍ３、より好ましくは０．７から０．８ｇ／ｃｍ３である。
【００２３】
エーテル含有抽出剤は、実質的に１種以上のエーテル類からなるのが好ましく、より好ましくは、一般式：
Ｒ１−Ｏ−Ｒ２
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、直鎖または分岐状のＣ１−Ｃ５アルキル残基を示し、Ｒ１およびＲ２残基の少なくとも１つは、少なくとも３個のＣ原子、好ましくは少なくとも４個のＣ原子を有する。）で表され少なくとも１種のエーテルからなる。
【００２４】
抽出に使用することができる特に好ましいエーテル類は、ジイソプロピルエーテル、ジ−ｎ−プロピルエーテル、ジ−ｔ−ブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔ−ブチルエーテル、プロピル−ｔ−ブチルエーテルおよびｎ−ブチル−ｔ−ブチルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種のエーテルが挙げられ、メチル−ｔ−ブチルエーテルの使用が特に好ましい。
【００２５】
従って、本発明のさらなる主題は、微生物学的産生において蓄積する発酵ブロス全体から、微生物学的に産生する非極性環状オリゴペプチド類、好ましくはウンデカペプチド類、より好ましくはシクロスポリン類、最も好ましくはシクロスポリンＡを抽出する手段として、水と非混和性の液状エーテル含有抽出剤、好ましくは２０℃で測定した比重が多くとも０．９ｇ／ｃｍ３である水と非混和性の液状エーテル含有抽出剤を使用することに関する。先に列挙したエーテル類を、発酵ブロス全体とともに２相系を形成するように表示された量で本発明によるこの用途のために役立たせるのが好ましい。
【００２６】
特にシクロスポリン類、より好ましくはシクロスポリンＡを単離、加工する場合、発酵ブロス全体を、ｐＨ７から９で、好ましくは７．５から８．５で抽出するのが好ましい。
【００２７】
相分離を速めるために、公知の水溶性湿潤剤、例えば、ポリアクリレート系湿潤剤を十分な量で発酵ブロス全体に加えることができる。
【００２８】
抽出は数回行うのが好ましい。より好ましくは、抽出ブロス全体をエーテル含有抽出剤で、２回抽出するのが好ましい。
【００２９】
発酵ブロス全体を、水と非混和性のエーテル含有抽出剤を用い、室温で、より好ましくは、２０から３０℃で抽出するのが好ましい。
【００３０】
発酵ブロス全体の抽出は通常の装置で行うことができ、抽出の間に集められた抽出液は、水相の分離の後、さらなる処理のために、バイオマスと混合する。
【００３１】
従って、方法ステップａ）の次に、抽出液中に存在する残留含水率を、１重量％未満、好ましくは０．３重量％未満に低下させる他の方法ステップｂ）を行うことが好ましい。残留含水率を低下させる前に、抽出液を、水溶液、好ましくは水で洗浄し、場合により存在するバイオマス残渣を取除くのが好ましい。場合によりこの方法で精製された抽出液の残留含水率を低下させるために、共沸蒸留を行うことが可能である。これに関連して、残留含水率が、抽出液中で所望の程度まで低下させられるばかりでなく、微生物学的に産生された産生物、好ましくはシクロスポリン類、より好ましくはシクロスポリンＡの濃度も増加する。好ましくは１０から３５重量％のシクロスポリン含有率は、この濃縮で調整される。
【００３２】
ステップｂ）における共沸蒸留の結果、抽出液中の残留含水率を、目的の低含水率に調整することが可能であるばかりでなく、抽出液濃度を後続の加工された産生物の再結晶に有益なものとすることも可能である。ここで、産生物は、好ましくはシクロスポリン−エーテル溶媒和物として結晶化される。残留含水率が１重量％未満、特に０．３重量％未満の場合、シクロスポリン類のシクロスポリン−エーテル溶媒和物としての結晶化、および特にシクロスポリンＡのシクロスポリンＡ−エーテル溶媒和物としての結晶化が顕著に良好で、簡単に濾過することができる、実質上無色の白色シクロスポリン−エーテル溶媒和物結晶が得られることが見出されている。すでに極めて純度の高いシクロスポリン−エーテル溶媒和物結晶を簡単に行う濾過能力がさらに促進され、全処理方法にかかる時間を短くする。
【００３３】
これに対応して、本発明による、微生物学的に産生された産生物、好ましくはシクロスポリン類、より好ましくはシクロスポリンＡを処理する方法は、さらに、ステップｂ）で濃縮され、残留含水率が大幅に低い抽出液を、エーテル溶媒和物産生物、好ましくはシクロスポリン−エーテル溶媒和物として結晶化させるために、−１０℃から１５℃の温度、好ましくは−５℃から１０℃の温度に冷却する冷却ステップｃ）を含む。よく濾過することができる実質上無色の白色結晶は、濃縮抽出液を冷却することによってすでに得られているので、好ましくは、結晶が溶解しない有機溶剤を残留含水率が大幅に低い濃縮された抽出液へ添加しないことが、シクロスポリン−エーテル溶媒和物結晶を結晶化するために必要である。必要に応じて、結晶、好ましくはシクロスポリン−エーテル溶媒和物結晶を、さらなる精製のために、結晶だけをゆっくり溶解する有機溶剤で洗浄してもよい。
【００３４】
必要に応じて、シクロスポリン−エーテル溶媒和物結晶を、公知の適切なクロマトグラフィによる精製および結晶法、ならびに公知の溶剤によって、シクロスポリン類Ａ−Ｚに分離することができる（この点に関して、ＷＯ９７／４６５７５、ＥＰ０７２５０７６、ＥＰ０８８８３８２も参照）。
【００３５】
これに対応して、本発明のさらなる主題は、シクロスポリン類、好ましくはシクロスポリンＡの大量産生における結晶性シクロスポリン−エーテル溶媒和物の使用である。特に、本発明により得られた結晶性シクロスポリン−エーテル溶媒和物結晶は、この大量産生に適している。
【００３６】
驚くべきことに、本発明による、特に残留含水率を低下させるステップと組み合わせた、エーテル含有抽出剤を使用する発酵ブロス全体は、良好な濾過能と高い純度を有するシクロスポリン−エーテル溶媒和物結晶の結晶化を可能にする。その結果、処理方法全体が著しく促進される。
【００３７】
本発明の特に好ましい実施形態は、微生物学的に産生された非極性シクロスポリン類、好ましくはシクロスポリンＡを処理する方法であって、
ａ）シクロスポリン類の微生物学的産生において蓄積する発酵ブロス全体を、水と非混和性の液状エーテル含有抽出剤で抽出するステップであって、ここで抽出剤の量は、発酵ブロス全体とともに２相系を形成するのに十分な量であるステップと、
ｂ）抽出液中に溶解している残留含水率を、１重量％未満、好ましくは０．３重量％未満に低下させるステップであって、ステップａ）で得られた抽出液を、この残留含水率を低下させる前に、必要に応じて、水溶液で洗浄することができるステップと、
ｃ）シクロスポリン類をシクロスポリン−エーテル溶媒和物として結晶化させるステップであって、好ましくは、結晶化の前にステップｂ）で得られた抽出液のシクロスポリン含有率を、全抽出液に対して１０から２５重量％に濃縮し、および結晶のために、濃縮された抽出液を、−１０℃から１５℃、好ましくは−５℃から１０℃に冷却するステップと、
を含む方法に関する。
【００３８】
同様に、個々の方法ステップでの前記本発明の反応条件は、微生物学的に産生されている非極性シクロスポリン類の、好ましい本発明による処理に適用され、特に、シクロスポリンＡの処理および単離に適用される。また、これは、使用されるエーテル含有抽出剤、好ましくは、先に記載した一般式のエーテル類にも適用される。
【００３９】
これに対応して、容易に濾過することができる、実質上無色の白色シクロスポリン−エーテル溶媒和物結晶が、本発明による好ましい処理方法によって得ることができる。
【００４０】
また、これらの結晶は、特に、さらに公知の方法での結晶化および／または公知の適切な溶出液と組み合わせた公知のカラム材料を用いたクロマトグラフィを使用する処理によって、シクロスポリン類Ａ−Ｚに分離することに適している。
【００４１】
他の方法では分離が困難なイソシクロスポリンＡが、シクロスポリンＡ−エーテル溶媒和物結晶では、顕著に除去されることが観察された。
【００４２】
これに対応して、本発明のさらなる主題は、０．０５重量％未満のイソシクロスポリンＡを含み、好ましくは０．０４から０．０５重量％のイソシクロスポリンＡを含むシクロスポリンＡに関する。
【００４３】
また、本発明の処理方法により得ることができるシクロスポリンＡは、比較的低い含有率のシクロスポリンＨおよびシクロスポリンＴによって区別される。
【００４４】
従って、本発明のさらなる主題は、シクロスポリンＨおよびシクロスポリンＴの合計含有率が０．５重量％未満、好ましくは０．１から０．４重量％であるシクロスポリンＡにも関する。
【００４５】
同様に、本発明のさらなる主題は、０．０４から０．００５重量％のイソシクロスポリンＡを含むシクロスポリンＡであって、シクロスポリンＨおよびシクロスポリンＴを加えた総含有率が０．０１から４重量％であるシクロスポリンＡに関する。
【００４６】
少量の副生物を含むこのシクロスポリンＡは、本発明による処理、および本発明によって得られたシクロスポリンＡ−メチル−ｔ−ブチルエーテル溶媒和物結晶のさらなる処理によって好ましく得ることができる。
【００４７】
従って、本発明の、好ましい非極性の微生物学的に産生されたシクロスポリン類の処理方法によって、シクロスポリン−エーテル溶媒和物結晶を、９０％を超える、好ましくは≧９５％の高い純度および収率で得ることができるばかりでなく、少なくとも９０％の結晶の結晶径が、＞１０μｍであり、粒度分布の中央値が約６０μｍであるので、結晶管理容易性が非常に良好な結晶を得ることもできる。粒度分布を測定するために、１ｇのサンプル３個を、６０ｍＬの水に分散し、分散ユニットＨｙｄｒｏ２０００Ｓを加えた後、２０００ｒｐｍの攪拌速度でＭａｌｖｅｒｎ社の「Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００」測定装置を用いて測定した。装置の製造業者の「Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ」モデルを、評価のために使用した。先に記載した値は、このような測定３回の平均値である。
【００４８】
従って、本発明のさらなる主題は、結晶性シクロスポリンＡ−メチル−ｔ−ブチルエーテル溶媒和物であって、結晶の少なくとも９０％が、＞１０μｍの結晶サイズを有し、好ましくは粒度分布の中央値が３０μｍと１００μｍとの間、好ましくは４０μｍと８０μｍとの間である溶媒和物である。
【００４９】
すでに指摘したように、本発明による方法は、特に、微生物学的に産生されたシクロスポリンＡを、結晶性シクロスポリンＡ−メチル−ｔ−ブチルエーテル溶媒和物として処理するのに適している。このような結晶は、Ｘ線粉末回析パターンによって明確に分析することが可能であった。
【００５０】
Ｘ線粉末回析パターン（ＸＲＰＤ）は、ＡＸＳ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ−８Ｘ線粉末回析計で、以下の記録パラメータを用い、周囲条件で得た。真空管の陽極：Ｃｕ；発生器電圧：４０ｋＶ；発生器電流：４０ｍＡ，初期角度：２°２−シータ；最終角度：４０°２−シータ；増加：０．０１°２−シータ；１増加当たりの時間：２秒。２−シータ値の代表的な精度は、±０．１°２−シータの範囲である。従って、５．０°２−シータで見られる回析ピーク（先端）は、殆どのＸ線回析計で、標準条件下、４．９°と５．１°２−シータの間に現れ得る。
【００５１】
従って、本発明のさらなる主題は、７．０°＋／−０．１°、８．２°＋／−０．１°、１１．０°＋／−０．１°および２０．５°＋／−０．１°の２シータ角度での先端（ピーク）を含む、特に加えて７．３°＋／−０．１°、１１．８°＋／−０．１°、１３．３°＋／−０．１°および１６．５°＋／−０．１°の２シータ角度での先端を含むＸ線粉末回析パターンを有する、結晶性シクロスポリンＡ−メチル−ｔ−ブチルエーテル溶媒和物である。
【００５２】
本発明は、以下の主題にも関する。
【００５３】
１．微生物学的に産生された非極性環状オリゴペプチド類を処理する方法であって、
ａ）微生物学的産生において蓄積する発酵ブロス全体を、２５℃で水と非混和性の液状エーテル含有抽出剤を用いて抽出するステップを含み、抽出剤の量が、発酵ブロス全体とともに２相系を形成するのに十分な量である方法。
【００５４】
２．非極性環状オリゴペプチド類が、非極性ウンデカペプチド類である主題１に記載の方法。
【００５５】
３．非極性ウンデカペプチド類が、シクロスポリン類、好ましくはシクロスポリンＡである主題２に記載の方法。
【００５６】
４．エーテル含有抽出剤が、実質的に１種以上のエーテル類からなる主題１から３のいずれかに記載の方法。
【００５７】
５．エーテル含有抽出剤が、実質的に１種以上のエーテル類からなり、
ｂ）抽出液に溶解している残留含水率を１重量％未満、好ましくは０．３重量％未満に低下させるステップをさらに含む主題３または４に記載の方法。
【００５８】
６．ステップｂ）が共沸蒸留によって行われる主題５に記載の方法。
【００５９】
７．ステップａ）で得られた抽出液を、ステップｂ）のさらなる処理の前に、水溶液で洗浄する主題５または６に記載の方法。
【００６０】
８．シクロスポリン含有抽出液を、総抽出液質量の１０重量％から３５重量％のシクロスポリン含有率に濃縮する主題５から７のいずれかに記載の方法。
【００６１】
９．使用されるエーテルが、少なくとも、一般式：
Ｒ１−Ｏ−Ｒ２
（式中、ＲｌおよびＲ２は、独立して、直鎖または分岐状Ｃ１−Ｃ５アルキル残基を示し、残基Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、少なくとも３個のＣ原子、好ましくは少なくとも４個のＣ原子を含む。）のエーテルである主題１から８のいずれかに記載の方法。
【００６２】
１０．使用されるエーテルは、ジイソプロピルエーテル、ジ−ｎ−プロピルエーテル、ジ−ｔ−ブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル、エチル−ｔ−ブチルエーテル、プロピル−ｔ−ブチルエーテルおよびｎ−ブチル−ｔ−ブチルエーテル．からなる群より選択される少なくとも１種のエーテルである主題９に記載の方法。
【００６３】
１１．ｃ）非極性環状オリゴペプチドをエーテル溶媒和物産生物として結晶化するステップをさらに含む主題５から１０のいずれかに記載の方法。
【００６４】
１２．ｃ）シクロスポリン類をシクロスポリン−エーテル溶媒和物として結晶化するステップをさらに含む主題５から１０のいずれかに記載の方法。
【００６５】
１３．ステップｃ）に関し、濃縮された抽出液を−１０℃から１５℃の温度に冷却する主題１１または１２に記載の方法。
【００６６】
１４．ステップｃ）で得たシクロスポリン−エーテル溶媒和物結晶を、シクロスポリン−エーテル溶媒和物結晶だけをゆっくり溶解する有機溶剤で洗浄する主題１２または１３に記載の方法。
【００６７】
１５．発酵ブロス全体を、エーテル含有抽出剤で数回、好ましくは２回抽出する主題１から１４のいずれかに記載の方法。
【００６８】
１６．抽出において、発酵ブロス全体のｐＨは、７から９、好ましくは７．５から８．５である主題１から１５のいずれかに記載の方法。
【００６９】
１７．抽出を、室温、好ましくは２０から３０℃で、エーテル含有抽出剤を用いて行うことを特徴とする主題１から１６のいずれかに記載の方法。
【００７０】
１８．シクロスポリン−エーテル溶媒和物を、各シクロスポリンＡ−Ｚ中、再結晶および／またはクロマトグラフィを用いる処理によって分離することを特徴とする主題１２から１７のいずれかに記載の方法。
【００７１】
１９．７．０°＋／−０．１°、８．２°＋／−０．１°、１１．０°＋／−０．１°および２０．５°＋／−０．１°の２シータ角度での先端（ピーク）を含み、特に加えて７．３°＋／−０．１°、１１．８°＋／−０．１°、１３．３°＋／−０．１°および１６．５°＋／−０．１°の２シータ角度での先端を含むＸ線粉末回析パターンを有する、結晶性シクロスポリンＡ−メチル−ｔ−ブチルエーテル溶媒和物。
【００７２】
２０．結晶の少なくとも９０％の結晶サイズが、１０μｍを超える（レーザ回析、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００によって測定）結晶性シクロスポリンＡ−メチル−ｔ−ブチルエーテル溶媒和物。
【００７３】
２１．０．０５重量％未満のイソシクロスポリンＡを含み、好ましくは０．０４から０．００５重量％のイソシクロスポリンＡを含むシクロスポリンＡ。
【００７４】
２２．シクロスポリンＨとシクロスポリンＴとの合計含有率が、０．５重量％未満、好ましくは０．１から０．４重量％であるシクロスポリンＡ。
【００７５】
２３．０．０４から０．００５重量％のイソシクロスポリンＡを含むシクロスポリンＡであって、シクロスポリンＨおよびシクロスポリンＴの追加総含有率が、０．１から０．４重量％であるシクロスポリンＡ。
【００７６】
２４．結晶性シクロスポリン−エーテル溶媒和物のシクロスポリン類の大量産生のための使用。
【００７７】
２５．副生物、即ちイソシクロスポリンＡ、シクロスポリンＨおよびシクロスポリンＴを取除くための、主題２４に記載の使用。
【００７８】
２６．微生物学的産生において蓄積する非極性環状オリゴペプチド類、好ましくはシクロスポリン類、より好ましくはシクロスポリンＡを、発酵ブロス全体から抽出するための、２５℃で水と非混和性である液状エーテル含有抽出剤の使用。
【００７９】
実施例
以下の実施例で、本発明の特定の実施形態を詳細に記載するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００８０】
発酵ブロスからのシクロスポリンＡの抽出
例えばトリポクラジウム・インフラタム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｉｎｆｌａｔｕｍ）の発酵によって得ることもできる、シクロスポリンＡを含む発酵ブロス２０００ｇを、２０００ｍｌのメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で２回抽出した。各抽出は、４０００ｐｐｍのクラリアント（Ｃｌａｒｉａｎｔ）ＭＤ０７／０４９ポリアクリレートの存在下で行った。エーテル相を分液漏斗で分離し、合わせた。シクロスポリンＡ含有エーテル相を、分液漏斗内で、ｐＨが約７の水２００ｍｌで１回洗浄し、濾過後、エーテル相を、約５３℃の温度で、シクロスポリン濃度が１５０ｇ／ｋｇとなるように、共沸蒸留により濃縮した。次いで温度を沸点直下の値に下げ、ＭＴＢＥを新しいものと置き換えることにより、ＭＴＢＥを蒸留ヘッドから放出させながら、この温度を２時間保った。その後、シクロスポリン濃度が３００ｇ／ｋｇとなるように、溶液を常圧５３℃で濃縮した。共沸蒸留前、約１．４重量％であった残留含水率は、０．１重量％未満となった。溶液を、１２０分で５３℃から４５℃に、さらに６０分で４０℃に、さらに６０分で３０℃に、およびさらに６０分で０℃に、注意深く冷却した。白色結晶性シクロスポリンＡ−ＭＴＢＥ溶媒和物を、約８２％の理論的総収率で得た。得られた結晶の赤外線スペクトルを図２に示し、得られた結晶の粉末Ｘ線回析パターン（ＸＲＰＤ）を図１に示す。干渉顕微鏡での分析で、平均粒度が約６５μｍの大きな複屈折結晶を持つ、高結晶性物質が示された。
【実施例２】
【００８１】
発酵ブロスからのシクロスポリンＡの大量抽出
５１０ｋｇのシクロスポリンＡを含有する発酵ブロスを、５１０Ｌのメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で２回抽出した。各抽出で、２．６ｋｇのクラリアントＭＤ０７／０４９ポリアクリレートを加えた。エーテル相を、３００Ｌ分離機中、通り送りで分離し、合わせた。シクロスポリンＡ含有エーテル相を、ｐＨ約７の純水７００Ｌで１回洗浄し、相を分離機で再び分離し、エーテル相を、シクロスポリン濃度が１００ｇ／ｋｇとなるように、１０００Ｌ薄層蒸発器中、約５３℃の温度で共沸蒸留によって濃縮した。次いで温度を沸点直下の値に下げ、ＭＴＢＥを新しいものと置き換えることにより、ＭＴＢＥを蒸留ヘッドから放出させながら、この温度を２時間保った。その後、シクロスポリン濃度が３００ｇ／ｋｇとなるように、溶液を常圧５３℃で濃縮した。共沸蒸留前、約１．４重量％であった残留含水率は、０．１重量％未満となった。その後、溶液を、１２０分で５３℃から４５℃に、さらに６０分で４０℃に、さらに６０分で３０℃に、およびさらに６０分で０℃に、注意深く冷却した。８．５５ｋｇの白色結晶性シクロスポリンＡ−ＭＴＢＥ溶媒和物を、約８７％の理論的総収率で得た。イソシクロスポリンＡの含有率は、０．００８重量％であり、シクロスポリンＨおよびシクロスポリンＴの合計含有率は０．２８重量％であり、これらの混入物の含有率は、酢酸ブチルも用いる抽出と比べて、非常に大きく減少していた。
【図１】
2011529476.tif 000003
【図２】
2011529476.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成22年9月22日(2010.9.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物学的に産生された非極性環状オリゴペプチド類を処理する方法であって、
ａ）微生物学的産生において蓄積する発酵ブロス全体を、２５℃で水と非混和性の液状エーテル含有抽出剤で抽出するステップであって、エーテル含有抽出剤は、実質的に１種以上のエーテル類を含み、抽出剤の量は、発酵ブロス全体を使用する２相系を形成するのに十分な量であるステップと、
ｂ）抽出液に溶解している残留含水率を、１重量％未満に低下させるステップとを含む方法。
【請求項２】
非極性環状オリゴペプチドが、シクロスポリンＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エーテル含有抽出剤は、実質的に、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルからなり、
ｂ）抽出液に溶解している残留含水率を、１重量％未満、好ましくは０．３重量％未満、より好ましくは０．１５重量％未満に低下させるステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）を共沸蒸留により行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
非極性環状オリゴペプチドがシクロスポリンＡであり、
ｃ）シクロスポリンをシクロスポリンＡ−メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル溶媒和物として結晶化するステップをさらに含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
０．０４から０．００５重量％のイソシクロスポリンＡを含むシクロスポリンＡ組成物であって、シクロスポリンＨおよびシクロスポリンＴの追加総含有量が０．１から０．４重量％であるシクロスポリンＡ組成物。
【請求項７】
シクロスポリン類の大量産生における、結晶性シクロスポリン−エーテル溶媒和物の使用。
【請求項８】
副生物、イソシクロスポリンＡ、シクロスポリンＨおよびシクロスポリンＴを取除くための、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
微生物学的に産生された非極性シクロスポリン類を処理する方法であって、
ａ）微生物学的産生において蓄積する発酵ブロス全体を、２５℃で水と非混和性の液状エーテル含有抽出剤で抽出するステップであって、エーテル含有抽出剤は、実質的に１種以上のエーテル類を含み、抽出剤の量は、発酵ブロス全体を使用する２相系を形成するのに十分な量であるステップと、
ｂ）抽出液に溶解している残留含水率を、１重量％未満に低下させるステップと、
ｃ）非極性シクロスポリン類を、シクロスポリン−エーテル溶媒和物として結晶化させるステップとを含む方法。
【請求項１０】
さらに請求項２から５のいずれかによることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【国際調査報告】
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