(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系前駆細胞(MPC)の同定および/または濃縮のためのマーカーとしてのHSP-90ベータの使用。
【請求項２】
間葉系前駆細胞(MPC)を濃縮するための方法であって、組織源由来の細胞試料を調製するステップおよびHSP-90ベータマーカーを発現する細胞を濃縮するステップを含む方法。
【請求項３】
HSP-90ベータマーカーを発現する細胞を濃縮するステップは、
細胞試料をHSP-90ベータ結合剤と接触させるステップ、および
HSP-90ベータ結合剤に結合した細胞をHSP-90ベータ結合剤に結合しない細胞から分離するステップ
を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
細胞試料中の間葉系前駆細胞(MPC)の存在を同定するための方法であって、HSP-90ベータマーカーを発現する、試料中の細胞を同定するステップを含む方法。
【請求項５】
HSP-90ベータマーカーを発現する試料中の細胞を同定するステップは、
組織源由来の細胞試料を得るステップ、
HSP-90ベータのHSP-90ベータ結合剤への結合に適した条件下で細胞試料をHSP-90ベータ結合剤と接触させるステップ、および
試料中の細胞に結合したHSP-90ベータ結合剤の存在を検出するステップであって、間葉系前駆細胞(MPC)の存在は、HSP-90ベータ結合剤に結合する細胞によって示されるステップ
を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
細胞試料は、胎盤、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、卵巣、膵臓、骨、靱帯、骨髄、腱、または骨格筋に由来する、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
HSP-90ベータ結合剤は、HSP-90ベータに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
HSP-90ベータ結合剤は、
(i)ATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4モノクローナル抗体、
(ii)ATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域ならびにヒト重鎖および軽鎖定常領域を含むキメラ抗体、ならびに
(iii)ATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4抗体由来の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)ならびにヒトフレームワークおよび定常領域配列を含むヒト化抗体
から成る群から選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
HSP-90ベータ結合剤は、STRO-4抗体の抗原結合断片である、請求項7または8に記載の方法。
【請求項１０】
ブダペスト条約の規定に基づき2008年7月10日にATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたSTRO-4ハイブリドーマ細胞株。
【請求項１１】
(i)ATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4モノクローナル抗体、
(ii)ATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域ならびにヒト重鎖および軽鎖定常領域を含むキメラ抗体、ならびに
(iii)ATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4抗体由来の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)ならびにヒトフレームワークおよび定常領域配列を含むヒト化抗体
から成る群から選択されるHSP-90ベータ結合剤またはその抗原結合断片もしくは誘導体。
【請求項１２】
ブダペスト条約の規定に基づき2008年7月10日にATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4抗体。
【請求項１３】
ブダペスト条約の規定に基づき2008年7月10日にATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4抗体と同一の、間葉系前駆細胞(MPC)上のエピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性細胞を同定および/または単離するためのマーカーとしての熱ショックタンパク質-90ベータ(HSP-90ベータ)の使用に関する。より詳細には、本発明は、ヒトおよびヒツジHSP-90ベータに特異的に結合するモノクローナル抗体(STRO-4と称される)の同定に関する。本発明はまた、本発明の方法によって濃縮される細胞集団およびこれらの細胞の治療上の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血支持骨髄間質および関連する骨格組織を含む細胞成分は、多能性間葉系幹細胞(MSC)およびそれらの前駆型(間葉系前駆細胞(MPC))を含む、多能性細胞の集団に由来する。MPCは、主として、血管を取り囲む血管周囲のニッシェに位置する骨髄空間内に存在する(Gronthos Sら、2003およびShi Sら、2003)。最近の20年間にわたり、研究は、異なるヒト間質/間葉系細胞集団が、脂肪、骨、軟骨、および筋肉を再構成する再生可能性に注目してきた(Gronthos Sら、2003およびSimmons PJら、1991)。しかしながら、これらの技術の適用の成功は、MPCの精製集団を単離し、続いて、ex vivoにおいてそれらの成長および分化を操作する能力に依存する。さらに、ヒト疾患を代表する、適切で大きな前臨床動物モデルにおいて、MPC調製物の安全性および有効性を評価することによって、幹細胞ベースの療法と関連することが多い、様々な技術的な安全性の懸念を克服するための必要性がある。ヒトの整形外科および心臓病/外傷のヒツジモデルは、ヒツジが、ヒトの解剖、生理、免疫、および胚発生と類似性を共有するので、広く使用されてきた。(Airey JAら、2004、Liechty KWら、2000、およびMackenzie TCら、2001)。
【０００３】
STRO-I、CD106、CD146などのいくつかのヒト多能性細胞特異的マーカーが、文献において記載されてきたが(Gronthos Sら、2003およびShi Sら、2003)、ヒト疾患のヒツジモデルにおいて多能性細胞の治療上の可能性を検査するにあたっての著しい進歩は、ヒツジ組織中の等価な多能性細胞集団の単離および特徴づけを可能にする特異的な試薬の不足により、限られてきた。ヒツジおよびヒト多能性細胞の両方と反応性の、モノクローナル抗体などの生物学的試薬の開発は、それぞれ、前臨床および臨床試験において、ヒツジおよびヒト多能性細胞集団の両方の機能的特性をモニターし、同一視するための性能を大いに促進するであろう。
【０００４】
本明細書において含まれている文献、行為、材料、デバイス、物品などに関するいかなる議論も、単に、本発明についての状況を提供する目的のためのものである。それが、本出願のそれぞれの請求項の優先日の前に存在したかのように、これらの物のいずれかまたはすべてが、先行技術の基礎の一部を形成する、または本発明に関連する分野の共通の一般知識であったという自認として解釈されるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第4,816,567号
【特許文献２】米国特許第4,554,101号
【特許文献３】米国特許第5,656,503号
【特許文献４】WO94/29438
【特許文献５】WO97/21824
【特許文献６】WO97/21825
【特許文献７】WO95/27071
【特許文献８】米国特許第5,693,531号
【特許文献９】米国特許第5,691,176号
【特許文献１０】米国特許第5,226,914号
【特許文献１１】米国特許第5,837,539号
【特許文献１２】米国特許第5,591,625号
【特許文献１３】米国特許第5,827,735号
【特許文献１４】米国特許第5,643,192号
【特許文献１５】米国特許第5,651,982号
【特許文献１６】PCT出願PCT/US95/15876
【特許文献１７】PCT公開WO96/17633
【特許文献１８】米国特許第4,983,393号
【特許文献１９】米国特許第3,089,815号
【特許文献２０】米国特許第6,468,527号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)
【非特許文献２】J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)
【非特許文献３】T.A. Brown (編)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、第1巻および第2巻、IRL Press (1991)
【非特許文献４】D.M. GloverおよびB.D. Hames (編)、DNA Cloning: A Practical Approach、第1〜4巻、IRL Press (1995および1996)
【非特許文献５】F.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現在までのすべての更新を含む)
【非特許文献６】Ed HarlowおよびDavid Lane (編) Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory、(1988)
【非特許文献７】J.E. Coliganら(編) Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons (現在までのすべての更新を含む)
【非特許文献８】HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory、New York (1988)
【非特許文献９】Morrisonら(1984) Proc. Natl Acad. Sci USA 57:6851〜6855頁
【非特許文献１０】Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD. (1991)
【非特許文献１１】ChothiaおよびLesk (1987) J. MoI Biol. 196:901〜917頁
【非特許文献１２】J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons (1984)
【非特許文献１３】Coliganら、Unit 9、Current Protocols in Immunology、Wiley Interscience、1991
【非特許文献１４】Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、N.Y. (第3版、2000)
【非特許文献１５】Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.、New York (1999)
【非特許文献１６】Coffinら、「Retroviruses」、第9章437〜473頁、Cold Springs Harbor Laboratory Press、1997
【非特許文献１７】Chatterjeeら、1996
【非特許文献１８】Stem Cell Biology and Gene Therapy、Quesenberryら編、John Wiley & Sons、1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、未分画ヒツジおよびヒト骨髄由来の多能性細胞を同定し、単離する、STRO-4と称される新規なモノクローナル抗体(mAb)の生成および特徴づけを記載する。特に、STRO-4抗体は、両方の種において、本質的にすべてのクローン化可能多能性細胞(CFU-F:線維芽細胞コロニー形成単位)を単離することができる。単離多能性細胞は、高い増殖の可能性および多系列分化を示す。
【０００８】
驚いたことに、本発明の発明者らは、熱ショックタンパク質-90ベータ(HSP-90ベータ)タンパク質が、in vivoにおいて多能性細胞の細胞表面上に発現されることを見つけ、モノクローナル抗体STRO-4は、HSP-90ベータ上に発現される特有のエピトープを同定することが分かった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、一実施形態では、本発明は、多能性細胞の同定および/または濃縮のためのマーカーとしてのHSP-90ベータの使用を提供する。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、多能性細胞を濃縮するための方法であって、組織源由来の細胞試料を調製するステップおよびHSP-90ベータマーカーを発現する細胞を濃縮するステップを含む方法を提供する。
【００１１】
本発明の一実施形態では、多能性細胞は、成体多能性細胞である。
【００１２】
一実施形態では、本発明の濃縮細胞集団は、in vitroにおいて培養されていない。
【００１３】
他の実施形態では、本発明の濃縮細胞集団は、クローン化可能CFU-Fを誘発することができる。
【００１４】
他の実施形態では、濃縮細胞集団は、HSP-90beta+/STRO-4+細胞について均質である。
【００１５】
一例では、多能性細胞を濃縮するための方法は、
細胞試料をHSP-90ベータ結合剤と接触させるステップ、および
HSP-90ベータ結合剤に結合した細胞をHSP-90ベータ結合剤に結合しなかった細胞から分離するステップ
を含む。
【００１６】
他の実施形態では、本発明はまた、細胞試料中の多能性細胞の存在を同定するための方法であって、HSP-90ベータマーカーを発現する、試料中の細胞を同定するステップを含む方法をも提供する。
【００１７】
一例では、細胞試料中の多能性細胞の存在を同定するための方法は、
組織源由来の細胞試料を得るステップ、
HSP-90ベータのHSP-90ベータ結合剤への結合に適した条件下で細胞試料をHSP-90ベータ結合剤と接触させるステップ、および
試料中の細胞に結合したHSP-90ベータ結合剤の存在を検出するステップであって、多能性細胞の存在は、HSP-90ベータ結合剤に結合する細胞によって示されるステップ
を含む。
【００１８】
細胞試料は、多能性細胞を含有していると思われる任意の組織源に由来してもよい。たとえば、組織源は、胎盤、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、卵巣、膵臓、骨、靱帯、骨髄、腱、または骨格筋であってもよい。好ましい実施形態では、組織源は、骨髄である。
【００１９】
多能性細胞が濃縮される細胞の源は、ヒトまたはヒツジ起源であってもよい。しかしながら、本発明はまた、ウシ、ウマ、ネズミ、ブタ、イヌ、またはネコを含む他の動物種に由来する細胞に適用可能である。
【００２０】
本発明はまた、本発明の多能性細胞のin vitro培養物から産生される子孫の細胞に関する。本発明の増殖細胞は、培養条件(培養培地中の刺激因子の数および/またはタイプを含む)、継代の数、ならびにその他同種のものに依存して種々様々の表現型を有していてもよい。
【００２１】
さらなる実施形態では、本発明の濃縮集団の培養は、また、STRO-I、STRO-3(TNSAP)、LFA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-I、P-セレクチン、L-セレクチン、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、インテグリンベータ、6〜19、トロンボモジュリン、CD1O、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、レプチン-R、(STRO-2=レプチン-R)、RANKL、STRO-1bπght、およびCD146またはこれらのマーカーの任意の組み合わせから成る群から選択される1つまたは複数のマーカーをも発現する多能性細胞をもたらす。
【００２２】
本発明の他の実施形態では、本発明の多能性細胞は、培養に際して造血細胞を誘発することができない。
【００２３】
本発明による方法はまた、第1の濃縮ステップの前に多能性細胞の源を採取するステップを含んでいてもよい。これは、たとえば、対象から組織を外科的に摘出するステップおよび単一細胞浮遊液を形成するために組織の細胞を分離するステップを含んでいてもよい。この分離は、物理的なまたは酵素による手段によって達成されてもよい。そのような手段は、本発明の当業者らによく知られているであろう。本発明の一例では、このステップは、知られている技術を使用して、骨髄細胞を採取することを含む。
【００２４】
本発明の方法において使用されるHSP-90ベータ結合剤は、HSP-90ベータに対する結合親和性を有するとして同定される、任意のポリペプチドまたは化合物とすることができる。
【００２５】
好ましくは、HSP-90ベータ結合剤は、HSP-90ベータに特異的に結合する。
【００２６】
好ましくは、HSP-90ベータ結合剤は、HSP-90ベータ上のエピトープに特異的に結合し、HSP-90ベータは、配列番号1の配列(図5)と少なくとも約75%同一の、配列番号1と好ましくは少なくとも約78%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一の配列を含む。
【００２７】
一実施形態では、HSP-90ベータ結合剤は、ペプチド、ペプチド模倣薬、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、デンドリマー、および小さな有機分子から成る群から選択される。
【００２８】
一例では、HSP-90ベータ結合剤はオリゴヌクレオチドである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは標識オリゴヌクレオチドである。
【００２９】
他の実施形態では、HSP-90ベータ結合剤は、精製抗HSP-90ベータ抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体である。抗HSP-90ベータ抗体は、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であってもよい。
【００３０】
本発明の一実施形態では、抗HSP-90ベータモノクローナル抗体は、2008年7月10日にブダペスト条約の規定に基づきATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4抗体である。
【００３１】
本発明の方法において使用される他の適した抗HSP-90ベータモノクローナル抗体は、マウス抗ヒトHsp90Beta mAbクローンH9010(Invitrogen)、マウス抗Hsp90b mAbクローンEMD-5E12(Calbiochem)、マウス抗ヒトHSP90ベータmAbクローンK3725B(Cosmo Bio Co., Ltd)、およびマウス抗ヒトHsp90ベータmAbクローンK3705(Assay Designs/Stressgen Bioreagents)などの市販で入手可能な抗体を含む。上記に言及されない他の市販で入手可能な抗体もまた、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００３２】
他の実施形態では、本発明は、
(i)STRO-4モノクローナル抗体、
(ii)STRO-4由来の重鎖および軽鎖可変領域ならびにヒト重鎖および軽鎖定常領域を含むキメラ抗体、ならびに
(iii)STRO-4由来の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)ならびにヒトフレームワークおよび定常領域配列を含むヒト化抗体
から成る群から選択されるHSP-90ベータ結合剤またはその抗原結合断片もしくは誘導体を提供する。
【００３３】
他の実施形態では、ヒト化抗体は、STRO-4由来の6つのCDRをすべて含む。
【００３４】
他の実施形態では、HSP-90ベータ結合剤は、ブダペスト条約の規定に基づき2008年7月10日にATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4抗体の配列に実質的に同一の配列を含む組換え抗体である。
【００３５】
本発明の一実施形態では、HSP-90ベータ結合剤は標識されている。
【００３６】
一例では、標識は蛍光標識である。他の例では、標識は酵素標識である。
【００３７】
他の実施形態では、HSP-90ベータ結合剤に結合した細胞の分離は、機械的なセルソーターによって実行される。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態では、HSP-90ベータ結合剤は、蛍光標識化合物に結合させられる。この場合、HSP-90ベータ結合剤に結合した細胞の分離は、好ましくは、蛍光活性化セルソーター(FACS)を使用して実行される。
【００３９】
本発明のさらなる実施形態では、HSP-90ベータ結合剤は、固体粒子に連結される。好ましくは、固体粒子は、磁性粒子である。本発明のこの実施形態では、HSP-90ベータ結合剤に結合した細胞の分離は、好ましくは、液相から粒子の相を分離することによって実行される。
【００４０】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、分離ステップ前に、細胞試料は、固体粒子に連結された、HSP-90ベータ結合剤に対して向けられる抗体と接触させられ、HSP-90ベータ結合剤に結合した細胞の分離は、液相から粒子の相を分離することによって実行される。
【００４１】
本発明のさらなる実施形態では、細胞試料の細胞は、固体支持体上で培養される接着細胞であり、非結合HSP-90ベータ結合剤の除去は、水洗によって実行される。
【００４２】
本発明のさらなる実施形態では、細胞試料の細胞は、浮遊液中で培養され、非結合HSP-90ベータ結合剤の除去は、細胞試料を遠心分離し、結果として生じる上清を分離することによって実行される。
【００４３】
さらなる実施形態では、細胞試料は、少なくとも1つのさらなる多能性細胞マーカーを発現する細胞の細胞集団を濃縮し、または減らすためにさらなるセルソーティング手順にかけられる。多能性細胞マーカーは、STRO-I、STRO-3(TNSAP)、CD106、CD146、LFA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-I、P-セレクチン、L-セレクチン、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、インテグリンベータ、6〜19、トロンボモジュリン、CD1O、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、レプチン-R、(STRO-2=レプチン-R)、RANKL、またはこれらのマーカーの任意の組み合わせから成る群から選択される1つまたは複数のマーカーであってもよい。
【００４４】
本発明はまた、本発明による方法によって得られる多能性細胞の濃縮集団を提供する。
【００４５】
本発明はまた、HSP-90ベータ+多能性細胞の濃縮集団を提供する。
【００４６】
好ましくは、濃縮細胞集団全体の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または95%は、表現型HSP-90ベータ+を有する多能性細胞である。
【００４７】
好ましくは、多能性細胞の濃縮集団は、本発明による方法によって得られる。
【００４８】
本発明はまた、本発明によって濃縮される多能性細胞の集団を培養することによって得られる増殖(expanded)細胞集団を提供する。
【００４９】
一実施形態では、本発明の濃縮細胞集団または本発明の増殖細胞集団は、遺伝的に改変されている、少なくともいくつかの細胞を含む。
【００５０】
本発明はまた、組織特異的委任細胞(committed cell)集団を生成するための方法であって、
本発明の多能性細胞の集団を1つまたは複数の刺激因子の存在下で培養するステップ、および
上述の培養集団を、多能性細胞の特異的な組織型への分化に偏らせる条件にさらすステップ
を含む方法をも提供する。
【００５１】
本発明のこの方法の一実施形態では、組織型は、胎盤組織、心筋、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神経組織、平滑筋、および内皮組織から成る群から選択される。
【００５２】
本発明はまた、本発明による濃縮多能性細胞および/または本発明による増殖細胞集団を含む組成物を提供する。
【００５３】
好ましい実施形態では、組成物は刺激因子をさらに含む。そのような組成物は、おそらく治療上有益であり、したがって、薬学的に許容される形態で調製されるであろう。
【００５４】
他の実施形態では、組成物は、本発明の多能性細胞のある特異的な組織型への分化に偏らせるための因子をさらに含む。好ましくは、組織型は、心筋、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神経組織、胎盤、平滑筋、および内皮組織から成る群から選択されるが、これらに限定されない。
【００５５】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は、フィブリン糊をさらに含む。
【００５６】
本発明はまた、対象において組織を生成または修復するための方法であって、本発明の濃縮および/または増殖された多能性細胞集団を対象に投与するステップを含む方法をも提供する。
【００５７】
本発明はまた、対象において組織を生成または修復するための方法であって、本発明の組成物を対象に投与するステップを含む方法をも提供する。
【００５８】
本発明はまた、対象において組織を生成または修復するための医薬の製造のための、本発明の濃縮および/または増殖された多能性細胞集団の使用をも提供する。
【００５９】
対象において組織を生成または修復するための医薬の製造のための、本発明の組成物の使用もまた提供される。
【００６０】
好ましくは、本発明に従って生成または修復される組織は、心筋、血管組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、神経組織、胎盤、平滑筋、および内皮組織から成る群から選択されるが、これらに限定されない。
【００６１】
好ましくは、本発明による多能性細胞は、ヒト起源のものである。
【００６２】
本発明はまた、本発明の方法によって得られた単離細胞またはその子孫の細胞であって、細胞は、遺伝的に改変された単離細胞またはその子孫の細胞をも提供する。
【００６３】
本発明はまた、ブダペスト条約の規定に基づき2008年7月10日にATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたSTRO-4ハイブリドーマ細胞株をも提供する。
【００６４】
本発明はまた、ブダペスト条約の規定に基づき2008年7月10日にATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4抗体をも提供する。
【００６５】
本発明はまた、ブダペスト条約の規定に基づき2008年7月10日にATCCに寄託受託番号PTA-9362として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるSTRO-4抗体と同一の、多能性細胞上のエピトープに結合する単離抗体をも提供する。
【００６６】
本発明はまた、HSP-90ベータ結合剤またはその抗原結合断片もしくは誘導体を含む組成物をも提供する。好ましくは、組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体および/または適した補助剤もしくは添加剤をさらに含む。
【００６７】
本明細書の全体にわたって、単語「含む(comprise)」または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変形は、指定されるエレメント、整数、もしくはステップまたはエレメント、整数、もしくはステップの群の包含を暗示するが、いかなる他のエレメント、整数、もしくはステップまたはエレメント、整数、もしくはステップの群の排除をも暗示しないことが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】STRO-4抗原が、本質的にすべてのクローン化可能MPCを含むヒツジおよびヒトBM MNCの小さな集団によって発現されることを示す図である。単色免疫蛍光法およびフローサイトメトリーは、STRO-4抗原の発現を検査するために、Ficollを用いて分離されたヒツジおよびヒトBM MNCの検体に対して実行された。ヒツジ(A)およびヒト(B)BMMNC試料中のSTRO-4+細胞の平均発生率は、それぞれの集団について、それぞれ、4.0%±1.2および3.0%±1.0(n=3)であった。データは、リストモードデータとして収集された1×104光散乱ゲート制御イベントの単一パラメーター蛍光(フィコエリトリン(PE))ヒストグラムとして示される。IgG対照(点線)、mAb STRO-3(実線)。未分画BMならびにMACS選択STRO-4+およびSTRO-4-ヒツジ(C)ならびにヒト(D)BMMNCの単一細胞浮遊液が、それぞれの細胞分画における接着性コロニー形成細胞の発生率を評価するために、通常の増殖培地の中へ平板培養された。12日間の培養後に、コロニー(50以上の細胞の集合体)が、方法において記載されるように、染色され、スコア化された。棒グラフは、3つの別個の実験から平均された、それぞれの細胞分画について平板培養された105細胞当たりのクローン化可能コロニーの数を表す。これらのデータは、大多数のクローン化可能MPCが、BMのSTRO-4+分画に独占的に限られることを実証する。
【図２】ex vivo増殖MPCが、高レベルのSTRO-4抗原を発現することを示す図である。継代の2つのヒツジMPC(A)およびヒトMPC(B)およびMG63細胞(C)の単一細胞浮遊液は、トリプシン/EDTA消化によって得られ、次いで、単色フローサイトメトリーのために処理された。細胞は、引き続いて、STRO-4上清と共にインキュベートされ、次いで、PEに結合されたヤギ抗ネズミIgGを用いて間接的に標識された。ヒストグラムは、リストモードデータとして収集された2×104イベントを示す。STRO-4についての陽性(水平線の統計マーカーによって強調される)は、アイソタイプが一致する非結合対照抗体(1B5、黒線)の場合に観察されたものの99%を超える蛍光のレベルとして定義された。結果は、大多数のex vivo増殖ヒツジおよびヒトMPCが、STRO-4を発現することを実証した(太線)。
【図３】STRO-4抗原によって選択されたヒツジおよびヒトMPCの発達の可能性を示す図である。STRO-4抗原によって選択されたヒツジおよびヒトMPCに由来する細胞の二次培養物は、脂肪細胞、骨形成、または軟骨形成条件下で誘発された。脂質含有脂肪細胞の塊の存在は、ヒトMPC(A)およびヒツジMPC(B)培養物において脂肪生成の誘発の2週間以内にオイルレッド-0染色(矢印)によって検出された(200×)。アリザリンレッド試薬を用いて陽性に染色された石灰化沈着物(矢印)は、ヒトMPC(C)およびヒツジMPC(D)培養物において骨誘発性条件下で培養の4週間以内に形成された(200×)。集合体の培養物において、プロテオグリカンについてのトルイジンブルー陽性染色は、ヒトMPC(E)およびヒツジMPC(F)培養物(矢印)において、軟骨形成誘発の3週間後に、細胞集団が取り囲む軟骨細胞様細胞(矢印)の全体にわたって存在した(200×)。
【図４】STRO-4抗体が、90kDa分子量タンパク質を同定することを示す図である。形質膜溶解物は、方法において記載されるように、培養増殖STRO-4+ヒトMPCの単一細胞浮遊液から調製された。細胞溶解物は、STRO-4上清またはアイソタイプが一致する対照抗体、1B5と共にインキュベートされ、次いで、磁気ビーズによる分離によって免疫沈降された。免疫沈降物は、10%(w/v) SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析され、クーマシーブルー染色後に可視化された。
【図５】STRO-4抗体が、熱ショックタンパク質-90ベータを同定することを示す図である。形質膜溶解物は、方法において記載されるように、培養増殖STRO-4+ヒトMG63の単一細胞浮遊液から調製された。細胞溶解物は、STRO-4上清と共にインキュベートされ、次いで、磁気ビーズによる分離によって免疫沈降された。免疫沈降物は、10%(w/v) SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析され、クーマシーブルー染色後に可視化された。90kDaバンドは、ゲルから切り取られ、トリプシン消化にかけられ、MSモードにおいて、TOF/TOF光学機器と共に、Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyserを用いて質量分析法によって分析された。マイクロシークエンシングペプチド分析は、ヒト熱ショックタンパク質-90ベータ(NCBI、受託番号、P08238)に一致した(太字)STRO-4配列決定ペプチドを実証した。
【図６】熱ショックタンパク質-90ベータに対するSTRO-4抗体の特異的な反応性の確認を示す図である。培養増殖STRO-4+ヒトMPCは、全細胞溶解物としてのみ調製されたまたは方法において記載されるようにSTRO-4または1B5免疫沈降物を生成するために使用された。全細胞溶解物およびSTRO-4または1B5免疫沈降物は、10%(w/v) SDS-ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分析された。タンパク質は、PVDF膜に転写され、次いで、フィルターが、HSP-90ベータに対する市販で入手可能なポリクローナル抗体と共にインキュベートされる前に、5%脱脂粉乳-0.05% Tween-20を用いてブロックされた。免疫反応性タンパク質は、ImageQuantソフトウェア(Molecular Dynamics)を使用して、Fluorlmager(Molecular Dynamics、Sunnyvale、CA)を使用して可視化された。抗HSP-90ベータ抗体は、対照全細胞溶解物調製物およびSTRO-4免疫沈降物試料の両方において特徴的な90kDaバンドを検出した。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
用語「および/または」、たとえば「Xおよび/またはY」は、「XおよびY」または「XまたはY」を意味することが理解され、両方の意味または一方の意味に対して明示的な支持を提供するように解釈されるものとする。
【００７０】
微生物寄託についての詳細
STRO-4と称される、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、American Type Culture Collection(ATCC)に2008年7月10日に受託番号PTA-9362として寄託された。
【００７１】
この寄託は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際承認についてのブダペスト条約の規定およびその下の規則に基づき成された。これは、寄託の日付から30年間、生存可能な培養物の維持を保証する。生物は、関連性のある特許の発行に際して公衆に対する培養物の子孫の永続的で無制限の入手可能性を保証するブダペスト条約の条項に基づきATCCによって入手可能となるであろう。
【００７２】
本出願の譲受人は、万が一、培養寄託物が、適した条件下で培養された場合に、死滅したまたは失われたまたは破壊された場合、それは、同じ培養物の生存可能な検体と通知と同時に速やかに交換されることに同意している。寄託された株の入手可能性は、その特許法に従って任意の政府の当局の下で与えられた権利を違反して本発明を実施するための実施権として解釈されるものではない。
【００７３】
一般的な技術
その他に特に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有するように解釈されるものとする(たとえば細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生化学において)。
【００７４】
その他に示されない限り、本発明において利用される組換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的技術は、当業者らによく知られている標準の手順である。そのような技術は、J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T.A. Brown (編)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、第1巻および第2巻、IRL Press (1991)、D.M. GloverおよびB.D. Hames (編)、DNA Cloning: A Practical Approach、第1〜4巻、IRL Press (1995および1996)、ならびにF.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現在までのすべての更新を含む)、Ed HarlowおよびDavid Lane (編) Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory、(1988)、ならびにJ.E. Coliganら(編) Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons (現在までのすべての更新を含む)などの情報源において文献の全体にわたって記載され、説明される。
【００７５】
多能性細胞
多能性細胞は、いくつかの成熟細胞型のいずれかを誘発することができる細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、成体組織に由来する。この用語は、たとえば、間葉系前駆細胞(MPC)、間葉系幹細胞(MSC)、および多能性増殖MPC子孫(MEMP)を包含する。
【００７６】
間葉系前駆細胞(MPC)は、骨髄、血液、真皮、および骨膜中に見つけられる細胞であり、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋組織、および線維性結合組織を含む、特異的なタイプの間葉系組織または結合組織に分化することができる。これらの細胞が入る、特異的な系列委任(commitment)経路および分化経路は、機械的な影響および/または増殖因子、サイトカインなどの内因的な生理活性因子および/または宿主組織によって確立される局所的な微小環境条件由来の様々な影響に依存する。間葉系前駆細胞は、高度に分化しておらず、限界を伴わないで分裂することができ、分裂してやがて不可逆的に分化して表現型的におよび/または機能的に別の細胞型を得るであろう幹細胞または前駆細胞である娘細胞を得ることができる細胞として定義される。MPCは、多数の多能性細胞を形成することができる非造血前駆細胞である。
【００７７】
多能性細胞の濃縮
用語「濃縮された(enriched)」、「濃縮(enrichment)」、またはその変形は、1つの特定の細胞型の割合またはいくつかの特定の細胞型の割合が処理していない集団と比較して増加している、細胞の集団を記載するために本明細書において使用される。
【００７８】
本発明に従って多能性細胞を濃縮するための方法は、HSP-90ベータマーカーの存在を単独で、または1つもしくは複数のさらなるマーカーと組み合わせて検出することに基づくものであってもよい。たとえば、多能性細胞を濃縮するための方法はまた、STRO-I、STRO-3(TNSAP)、CD106、CD146、LFA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-I、P-セレクチン、L-セレクチン、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、インテグリンベータ、6〜19、トロンボモジュリン、CD1O、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、レプチン-R、(STRO-2=レプチン-R)、RANKL、またはこれらのマーカーの任意の組み合わせから成る群から選択される1つまたは複数のマーカーについて陽性である細胞を濃縮することに基づくものであってもよい。したがって、本発明の多能性細胞の濃縮集団はまた、1つもしくは複数のこれらのマーカーまたはその組み合わせについて陽性であってもよい。
【００７９】
所与のマーカーについて「陽性である」細胞への言及は、それが、マーカーが細胞表面上に存在する程度に依存して、そのマーカーの低(Ioもしくはdim)または高(明るい、bri)発現体(expresser)である可能性があることを意味し、用語は、細胞の色ソーティングプロセスにおいて使用される蛍光または他の色の強度に関する。Io(またはdimまたはdull)およびbriの区別は、ソートされている特定の細胞集団上に使用されるマーカーとの関連において理解されるであろう。
【００８０】
用語「明るい」は、本明細書において使用される場合、検出可能に標識された場合に比較的高いシグナルを生成する、細胞表面上のマーカーを指す。理論に拘束されることを望むものではないが、「明るい」細胞は、試料中の他の細胞よりもより多くの標的マーカー抗原(たとえばSTRO-Iによって認識される抗原)を発現することが提唱される。たとえば、STRO-1bπ細胞は、明るくない細胞(STRO-1dull/dim)よりも、FACS分析によって決定されるように、蛍光コンジュゲートSTRO-I抗体を用いて標識された場合、大きな蛍光シグナルを生成する。
【００８１】
他の例では、STRO-1bπght細胞は、STRO-I表面発現の2対数規模(log magnitude)高い発現を有する。これは、アイソタイプが一致するネガティブ対照と比較して計算される。比較すると、STRO-1dimおよび/またはSTRO-1Intermediate細胞は、アイソタイプが一致するネガティブ対照に対して、STRO-I表面発現の2対数規模未満高い発現、典型的に約1対数未満の発現を有する。
【００８２】
たとえば、方法は、第1の多能性細胞特異的マーカーの発現を濃縮することによって、細胞の第1の部分的に濃縮されたプールを作製するステップ、その後に続く、細胞の部分的に濃縮されたプールからHSP-90ベータの発現を濃縮するステップを含んでいてもよい。他の例では、方法は、HSP-90ベータを発現する細胞の選択に基づく最初の濃縮ステップ、その後に続く、異なる多能性細胞マーカーを濃縮することを含むステップを含んでいてもよい。他の例では、方法は、HSP-90ベータおよび1つまたは複数のさらなる多能性細胞マーカーを発現する細胞を同時に選択することを含む。
【００８３】
かなりの割合の多能性細胞が少なくとも2つの委任細胞型に分化することができることが好ましい。多能性細胞が分化してもよい系列の非限定的な例は、骨前駆細胞;胆管上皮細胞および肝細胞に分化可能である肝細胞前駆体;希突起膠細胞および星状細胞に進行するグリア細胞前駆型を生成することができる神経に限られた細胞;ニューロンに進行するニューロン前駆型;心筋および心筋細胞、グルコース応答性インスリン分泌膵臓ベータ細胞株についての前駆型を含む。他の系列は、象牙芽細胞、象牙質産生細胞、および軟骨細胞、ならびに以下の前駆細胞:網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトなどの皮膚細胞、樹状細胞、毛包細胞、尿細管(renal duct)上皮細胞、平滑筋細胞および骨格筋細胞、精巣の前駆体、血管内皮細胞、腱、靱帯、軟骨、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管、上皮、グリア、ニューロン、星状細胞、ならびにオリゴデンドロサイト細胞を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、多能性細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、および/または軟骨細胞を産生するために、in vivoまたはin vitroにおいて少なくとも培養することができる。
【００８４】
細胞表面HSP-90ベータを発現する細胞の分離は、多くの異なる方法によって達成することができるが、これらの方法はすべて、HSP-90ベータ結合剤への細胞の結合、その後に続く、高レベルの結合または低レベルの結合または結合なしのいずれかである結合を示すそれらの細胞の分離にいくつかのポイントで依存することが理解されるであろう。
【００８５】
HSP-90ベータ/STRO-4抗原
HSP-90ベータは、細胞の細胞質上に通常、存在し、それは、分子シャペロンとして作用して、正常なフォールディング、細胞内沈着、ならびに出生後の細胞増殖および分化の多くの重要なレギュレーターのタンパク分解性の代謝回転を促進する。それは、ストレス応答タンパク質の高度に保存されたファミリーの一部である。HSPは、典型的に、正常な生理学的条件下では低レベルで発現されるが、細胞のストレスに応じて劇的に増加した発現を示す。
【００８６】
用語「HSP-90ベータ」は、ヒトまたはヒツジ起源の配列に限定されず、任意の源から得られる相同配列、たとえば相同体、特にオルソログ(つまりヒト以外の種から得られる相同体)、対立遺伝子変異体、ならびにその断片および合成ペプチドまたは誘導体をも含むことが理解される。
【００８７】
ポリペプチドの配列同一性(%同一性)は、デフォルト設定および長さが少なくとも50アミノ酸のクエリー配列を使用してFASTA(PearsonおよびLipman、(1988))分析(GCGプログラム)によって決定され、FASTA分析は、少なくとも50アミノ酸の領域にわたり2つの配列をアライメントする。より好ましくは、FASTA分析は、少なくとも100アミノ酸の領域にわたり2つの配列をアライメントする。より好ましくは、FASTA分析は、少なくとも250アミノ酸の領域にわたり2つの配列をアライメントする。より好ましくは、FASTA分析は、少なくとも350アミノ酸の領域にわたり2つの配列をアライメントする。
【００８８】
用語「HSP-90ベータ」はまた、HSP-90ベータ配列の断片を含む、上記の言及される完全長ポリペプチドおよびその変異体の断片をも包含する。好ましい断片は、エピトープを含むものを含む。適した断片は、長さが少なくとも約6または7アミノ酸、たとえば、長さが少なくとも10、12、15、または20アミノ酸となるであろう。それらはまた、長さが200、100、または50アミノ酸未満であってもよい。
【００８９】
HSP-90ベータ結合剤
本明細書において使用される場合、語句「HSP-90ベータ結合剤」は、HSP-90ベータを認識し、および/またはそれに特異的に結合する成分を指す。
【００９０】
「特異的に結合する」によって、HSP-90ベータを発現する細胞の選択的な濃縮のための有用なツールを提供するために、HSP-90ベータ結合剤が、適した親和性および/または結合活性でHSP-90ベータに結合することができることを意味する。すなわち、それは、それが代わりの標的(たとえば非HSP-90ベータ)と結合するよりも長い期間および/または高い親和性で、HSP-90ベータとより頻繁に、より急速に、結合する。たとえば、HSP90ベータまたはそのエピトープもしくは免疫原性断片に特異的に結合するHSP90ベータ結合剤は、それが他の非HSP90ベータ標的に結合するよりも高い親和性、結合活性で、容易に、および/または長い期間、結合する。
【００９１】
好ましいHSP-90ベータ結合剤は、HSP-90ベータに対する結合親和性を有するとして同定されるポリペプチドまたは化合物である。
【００９２】
非抗体ベースの結合剤
本発明のHSP-90ベータ結合剤は、ペプチド、ペプチド模倣薬、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、デンドリマー、および小さな有機分子を含む。
【００９３】
核酸アプタマー(適応可能なオリゴマー)は、分子標的に結合するための能力を提供する二次および/または三次構造を形成することができる核酸分子である。アプタマーライブラリーは、たとえば、ベクター(またはRNAアプタマーの場合、発現ベクター)の中にランダムなオリゴヌクレオチドをクローニングすることによって産生され、ランダム配列には、PCRプライマーが結合する部位を提供する、知られている配列が側面に位置する。増加した活性を有するアプタマーは、たとえばSELEX(Sytematic Evolution of Ligands by Exponential濃縮)を使用して選択される。アプタマーライブラリーを産生および/またはスクリーニングするのに適した方法は、たとえばElloingtonおよびSzostak、Nature 346:818〜22頁、1990において記載されている。
【００９４】
小さな有機化合物を合成するための技術は、化合物に依存してずいぶん変わるであろうが、そのような方法は、当業者らによく知られているであろう。一実施形態では、情報科学は、コンビナトリアルライブラリーを産生するために、知られている化合物から適した化学的構成要素を選択するために使用される。たとえば、QSAR(Quantitative Structure Activity Relationship)モデリングアプローチは、適合性を決定するために、化合物の構造の線形回帰または回帰ツリーを使用する。Chemical Computing Group, Inc.(Montreal、Canada)のソフトウェアは、リード化合物を選択するために続いて使用される確率QSARモデルを作るために、活性および不活性化合物に対するハイスループットスクリーニング実験データを使用する。Binary QSAR法は、特定の化合物が、必要とされる機能:部分的な電荷、モル屈折率(結合相互作用)、およびlogP(分子の親油性)を果たすまたは果たさないであろうという見込みの「ディスクリプタ」を形成する、化合物の3つの特性に基づく。それぞれの原子は、分子においてある表面積を有し、それは、それと関連するこれらの3つの特性を有する。ある範囲において部分的な電荷を有する化合物のすべての原子が、決定され、表面積(ファンデルワールス表面積ディスクリプタ)が、合計される。次いで、binary QSARモデルは、活性モデルまたはADMETモデルを作製するために使用され、これらは、コンビナトリアルライブラリーを構築するために使用される。したがって、最初のスクリーニングにおいて同定されたリード化合物は、スクリーニングされている化合物のリストを増やすために使用し、それによって、高度に活性な化合物を同定することができる。
【００９５】
抗体ベースの結合剤
特に好ましいHSP-90ベータ結合剤は、抗HSP-90ベータ抗体またはその抗原結合断片もしくはその誘導体/変異体(任意の源由来の自然発生のまたは組換えの)である。
【００９６】
本明細書において使用されるように、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する、少なくとも1つのエピトープ認識部位を通して、HSP-90ベータならびに/またはそのエピトープおよび/もしくはその免疫原性断片および/もしくはその修飾形態(たとえばグリコシル化、グリコシル化など)などの標的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。この用語は、完全なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、変異体、必要とされる特異性のエピトープ認識部位を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、および必要とされる特異性のエピトープ認識部位を含む、免疫グロブリン分子の任意の他の修飾立体構造をも包含する。
【００９７】
本明細書において使用される用語「抗体結合断片」は、HSP-90ベータに結合するための、好ましくは、HSP-90ベータに特異的に結合するための能力を保持する、抗体の任意の断片を意味するように解釈されるものとする。これは、以下のものを含む。
(1)Fab。抗体分子の一価の抗原結合断片を含有するこの断片は、完全な軽鎖および1本の重鎖の一部を得るために、完全抗体を酵素パパインで消化することによって産生することができる。
(2)Fab'。この抗体分子の断片は、完全な軽鎖および重鎖の一部を得るために、完全抗体をペプシンで処理し、続いて還元することによって得ることができる。抗体１分子当たり2つのFab'断片が得られる。
(3)(Fab')2。この抗体の断片は、完全抗体を酵素ペプシンで処理し、続いて還元しないことによって得ることができる。F(ab)2は、2つのジスルフィド結合によって結合した、2つのFab'断片の二量体である。
(4)Fv。2本の鎖として発現される、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された断片として定義される。
(5)一本鎖抗体(「SCA」)。遺伝的に融合された一本鎖分子として、適したポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含有する、遺伝子操作された分子として定義される。
(6)単一ドメイン抗体、好ましくは軽鎖が欠けている可変重鎖ドメイン。
【００９８】
これらの断片を作製するための方法は、当技術分野において知られている(たとえば、参照によって本明細書において組み込まれるHarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory、New York (1988)を参照されたい)。
【００９９】
用語「モノクローナル抗体」は、同じ抗原に、好ましくは、抗原内の同じエピトープ決定基に結合することができる均質な抗体集団を指す。この用語は、抗体の源またはそれが作製される方法に限定されるようには意図されない。
【０１００】
用語「キメラ抗体」は、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種(たとえばマウスなどのネズミ)に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一またはそれに相同であり、残りの鎖が、他の種(たとえばヒトなどの霊長動物)に由来する、または他の抗体クラスもしくはサブクラスおよびそのような抗体の断片に属する抗体中の対応する配列と同一またはそれに相同である抗体を、それらが所望の生物学的活性を示す限り指す(米国特許第4,816,567号およびMorrisonら(1984) Proc. Natl Acad. Sci USA 57:6851〜6855頁)。
【０１０１】
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種由来の免疫グロブリンに由来するエピトープ結合部位ならびにヒト免疫グロブリンの構造および/または配列に基づく分子の残りの免疫グロブリン構造を有する、一般に組換え技術を使用して調製されるキメラ分子を指すように理解されるものとする。抗原結合部位は、好ましくは、ヒト抗体の可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植される非ヒト抗体由来の相補性決定領域(CDR)およびヒト抗体由来の残りの領域を含む。エピトープ結合部位は、野生型であってもよいまたは1つもしくは複数のアミノ酸置換によって修飾されてもよい。重鎖および軽鎖の両方の可変領域は、所与の種において比較的保存されており、CDRのための足場材料を推定上、提供する4つのフレームワーク領域(FR)が側面に位置する、論議されているエピトープに応じて変わり、結合能を決定する、3つの相補性決定領域(CDR)を含有することが知られている。非ヒト抗体が、特定のエピトープに関して調製される場合、可変領域は、修飾されることとなるヒト抗体中に存在するFR上に、非ヒト抗体に由来するCDRを移植することによって、「再構築」または「ヒト化」することができる。このアプローチの適用は、当技術分野において知られている、および/またはより詳細に本明細書において記載されている。
【０１０２】
本明細書において使用される定常領域(CR)という用語は、エフェクター機能を与える、抗体分子の部分を指す。対象ヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖定常領域は、5つのアイソタイプのいずれかから選択することができる:アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー。さらに、様々なサブクラスの重鎖(重鎖のIgGサブクラスなど)は、異なるエフェクター機能を担い、したがって、所望の重鎖定常領域を選ぶことによって、所望のエフェクター機能を有する抗体を、産生することができる。好ましい重鎖定常領域は、ガンマ1(IgG1)、ガンマ2(IgG2)、ガンマ3(IgG3)、およびガンマ4(IgG4)である。軽鎖定常領域は、カッパ型またはラムダ型、好ましくはカッパ型とすることができる。
【０１０３】
「フレームワーク領域」は、CDR残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。自然発生の抗体のそれぞれの可変ドメインは、典型的に、FR1、FR2、FR3、およびFR4として同定される4つのFRを有する。CDRがKabatに従って定義される場合、軽鎖FR残基は、約残基1〜23(LCFR1)、35〜49または40〜54(LCFR2)、57〜88または62〜93(LCFR3)、および98〜107または103〜112(LCFR4)に位置し、重鎖FR残基は、重鎖残基において、約残基約1〜30または1〜30(HCFR1)、36〜49(HCFR2)、66〜94または67〜96(HCFR3)、および103〜113または109〜119(HCFR4)に位置する。CDRが超可変ループ由来のアミノ酸残基を含む場合、軽鎖FR残基は、軽鎖において、約残基約1〜25(LCFR1)、33〜49(LCFR2)、53〜90(LCFR3)、および97〜107(LCFR4)に位置し、重鎖FR残基は、重鎖残基において、約残基約1〜25(HCFR1)、33〜52(HCFR2)、56〜95(HCFR3)、および102〜113(HCFR4)に位置する。いくつかの実例では、CDRがKabatによって定義されるCDRおよび超可変ループのCDRの両方由来のアミノ酸を含む場合、FR残基は、それに応じて調節されるであろう。当業者は、たとえば突然変異(たとえば欠失および/または挿入)、たとえば5までの残基変異または4までの残基変異または2までの残基変異または1までの残基変異の結果としてのFRの位置決めにおけるいくつかの変異に気づくであろう(たとえば本明細書において例示される抗体として)。
【０１０４】
本明細書において使用されるように、用語「相補性決定領域」(同義語CDR、つまりCDR1、CDR2、およびCDR3)は、これらの存在が抗原結合に必要である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。それぞれの可変ドメインは、典型的に、CDR1、CDR2、およびCDR3として同定される3つのCDR領域を有する。それぞれの相補性決定領域は、Kabatによって定義される、「相補性決定領域」(つまり、軽鎖可変ドメインにおける約残基24〜34もしくは24〜39(L1)、50〜56もしくは55〜61(L2)、および89〜97もしくは93〜102(L3)ならびに重鎖可変ドメインにおける31〜35もしくは26〜35(H1)、50〜65もしくは50〜66(H2)、および95〜102もしくは97〜108(H3);Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD. (1991))ならびに/または「超可変ループ」由来のそれらの残基、つまり、軽鎖可変ドメインにおける約残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、および91〜96(L3)ならびに重鎖可変ドメインにおける26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3);ChothiaおよびLesk (1987) J. MoI Biol. 196:901〜917頁)由来のアミノ酸残基を含んでいてもよい。いくつかの実例では、相補性決定領域は、Kabatに従って定義されるCDR領域および超可変ループの両方由来のアミノ酸を含むことができる。当業者は、たとえば突然変異(たとえば欠失および/または挿入)、たとえば5までの残基変異または4までの残基変異または2までの残基変異または1までの残基変異の結果としてのFRの位置決めにおけるいくつかの変異に気づくであろう(たとえば本明細書において例示される抗体として)。
【０１０５】
本明細書において使用される用語「誘導体」は、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含む抗HSP-90ベータ抗体またはその抗原結合断片を指すように意図される。用語「保存的置換」は、Table 1(表1)中に記載されるアミノ酸置換を意味するように解釈されるものとする。
【０１０６】
【表１】
0005826629.tif 000002
【０１０７】
用語「保存的置換」はまた、類似する疎水性親水性指標インデックスまたはスコアを有するアミノ酸の置換をも包含する。それぞれのアミノ酸は、それらの疎水性および電荷の特徴に基づいて疎水性親水性指標インデックスを以下のように割り当てられている:イソロイシン(+4.5)、バリン(+4.2)、ロイシン(+3.8)、フェニルアラニン(+2.8)、システイン/シスチン(+2.5)、メチオニン(+1.9)、アラニン(+1.8)、グリシン(-0.4)、トレオニン(-0.7)、セリン(-0.8)、トリプトファン(-0.9)、チロシン(-1.3)、プロリン(-1.6)、ヒスチジン(-3.2)、グルタミン酸(-3.5)、グルタミン(-3.5)、アスパラギン酸(-3.5)、アスパラギン(-3.5)、リシン(-3.9)、およびアルギニン(-4.5)。疎水性親水性指標インデックスに基づいて変更が成される際に、その疎水性親水性指標インデックスが±0.2以内にあるアミノ酸の置換が好ましい。より好ましくは、置換は、±0.1以内の、より好ましくは約±0.05以内の疎水性親水性指標インデックスを有するアミノ酸を含むであろう。
【０１０８】
用語「保存的アミノ酸置換」はまた、親水性に基づいて成される、同様のアミノ酸の置換を包含し、特に、それによって作られる生物学的機能的等価タンパク質またはペプチドは、本発明の場合におけるように、免疫学的な実施形態における使用を意図する。たとえば、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最も大きな局所的な平均親水性は、その免疫原性および抗原性と相関する。米国特許第4,554,101号において詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0)、リシン(+3.0)、アスパラギン酸(+3.0±0.1)、グルタミン酸(+3.0±0.1)、セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、グリシン(0)、トレオニン(-0.4)、プロリン(-0.5±0.1)、アラニン(-0.5)、ヒスチジン(-0.5)、システイン(-1.0)、メチオニン(-1.3)、バリン(-1.5)、ロイシン(-1.8)、イソロイシン(-1.8)、チロシン(-2.3)、フェニルアラニン(-2.5)、トリプトファン(-3.4)。類似する親水性値に基づいて変更が成される際に、互いに約±0.2以内の、より好ましくは約±0.1以内の、より好ましくは約±0.05以内の親水性値を有するアミノ酸と置換することが好ましい。
【０１０９】
本発明のおよび/または本発明で使用されるアミノ酸配列に関しての用語「誘導体」は、配列からのまたはそれへの1つ(または複数)のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を含む、ただし、結果として生じたアミノ酸配列は、好ましくは、自然発生のHSP-90ベータと少なくとも50%の生物学的活性、より好ましくは少なくとも実質的に同じ活性を有することを条件とする。
【０１１０】
本明細書において使用される用語「誘導体」はまた、抗体または抗原結合断片に直接または間接的に連結される、さらなる成分を含む。たとえば、誘導体は、抗体の半減期をin vivoにおいて増強または増加させる化合物、たとえばポリエチレングリコールまたはアルブミンを含む。他の例では、誘導体は、たとえば、検出および/または画像化を促進するために、検出可能な化合物、たとえば蛍光化合物または放射性化合物または酵素をさらに含む。さらなる例では、誘導体は、毒性化合物、たとえば放射性化合物または細胞毒素をさらに含む。
【０１１１】
抗体を組換えで産生するための方法は、当業者らによく知られているであろう。そのような技術は、J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T.A. Brown (編)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、第1巻および第2巻、IRL Press (1991)などの情報源において文献の全体にわたって記載され、説明される。
【０１１２】
本発明の抗体は、免疫抗原として完全長HSP-90ベータまたはその断片を発現する細胞を使用して調製することができる。動物を免疫するために使用されるペプチドは、翻訳されたcDNAまたは化学合成に由来し得、所望の場合、精製され、担体タンパク質にコンジュゲートされる。ペプチドに化学的に結合されるそのような一般に使用される担体は、キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)、チログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、および破傷風トキソイドを含む。次いで、結合されたペプチドは、動物(たとえばマウスまたはウサギ)を免疫するために使用されてもよい。
【０１１３】
所望の場合、ポリクローナル抗体は、たとえば、抗体が産生されるペプチドが結合するマトリックスへの結合およびそれからの溶離によって、さらに精製することができる。当業者らは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製および/または濃縮のための免疫技術において共通の様々な技術を知っているであろう(たとえば、参照によって組み込まれるColiganら、Unit 9、Current Protocols in Immunology、Wiley Interscience、1991を参照されたい)。
【０１１４】
モノクローナル抗体は、たとえばハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術などの、培養中の連続細胞株によって抗体分子の産生をもたらす、任意の技術を使用して調製されてもよい(Kohlerら、1975;Kozborら、1985;Coteら、1983;Coleら、1984)。
【０１１５】
当技術分野において知られている方法はまた、HSP-90ベータへの結合を示す抗体が同定され、抗体発現ライブラリーから単離されることを可能にする。
【０１１６】
mAb STRO-4と同一である、またはそれに類似するエピトープ特異性を有する抗体は、HSP-90ベータへの(たとえばMPCなどのHSP-90ベータを運ぶ細胞へのまたは単離HSP-90タンパク質もしくはその断片への)結合についてその特定のmAbと競合する、それらの能力によって同定することができる。受容体キメラ(Ruckerら、1996)または当業者らに知られている他の技術を使用して、STRO-4 mAbの結合部位は、マッピングされてもよい。
【０１１７】
モノクローナル抗体がSTRO-4 mAbと同じ特異性を有する場合、後者のHSP-90ベータへの結合を前者が予防するかどうかを確かめることによって不必要な実験を伴わないで決定することもまた可能である。STRO-4 mAbによる結合の減少によって示されるように、試験されているモノクローナル抗体がSTRO-4 mAbと競合する場合、2つのモノクローナル抗体は、同じまたは密接に関係するエピトープに結合する。
【０１１８】
モノクローナル抗体がSTRO-4 mAbの特異性を有するかどうかを決定するための他の方法は、試験されているモノクローナル抗体をHSP-90ベータとあらかじめインキュベートし、次いで、STRO-4 mAbのHSP-90ベータに結合するその能力が阻害されるかどうかを決定するためにSTRO-4 mAbを追加することである。STRO-4 mAbの結合が阻害される場合、多分、試験されているモノクローナル抗体は、STRO-4 mAbと同じまたは機能的に等価なエピトープ特異性を有する。
【０１１９】
本発明において有用なモノクローナル抗体は、抗体のアイソタイプを変化させるように操作することができる。たとえば、IgG2Aアイソタイプは、IgG1、IgG2B、または他のアイソタイプとして操作することができる。
【０１２０】
本発明の抗体などのHSP-90ベータ結合剤は、たとえば細胞分離、治療上の、または診断上の適用において有用な化合物にコンジュゲートされてもよいことが十分に理解されるであろう。一例では、本発明の抗体は、標識にコンジュゲートされる。標識は、その存在を容易に検出することができる、任意の実体であってもよい。たとえば、標識は、Mayら、米国特許第5,656,503号において詳細に記載されるものなどの直接的な標識であってもよい。直接的な標識は、それらの自然状態において、肉眼または光学フィルターおよび/もしくは適用される刺激、たとえば蛍光を促進するためのUV光の助けで容易に目に見える実体を含むが、これらに限定されない。例として、放射性、化学発光、電気活性(酸化還元標識など)、および蛍光化合物を含む。色素ゾル、金属ゾル(たとえば金)、および有色ラテックス粒子などの直接的な粒子の標識もまた、非常に適しており、蛍光化合物と共に好ましい。これらの選択肢のうち、有色ラテックス粒子および蛍光化合物は、最も好ましい。小さなゾーンまたは容量の中への標識の濃縮は、容易に検出可能なシグナル、たとえば強く有色されたエリアを誘発するはずである。目に見えるシグナルを検出することができる前に、基質などの1つまたは複数の現像試薬の追加を通常、必要とするが、酵素、たとえばアルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼなどの間接的な標識もまた、使用することができる。
【０１２１】
本発明の抗体などの結合剤への標識のコンジュゲーションは、共有結合もしくは非共有結合(疎水性を含む)によるものまたは吸着によるものとすることができる。
【０１２２】
そのようなコンジュゲーションのための技術は、当技術分野において常套的なものであり、用いられる特定の試薬に容易に適応されてもよい。
【０１２３】
本発明の抗体などの、本発明の方法で使用される結合剤はまた、固体支持体上にコートされてもよい。たとえば、抗体は、合成プラスチック材料、磁性粒子、マイクロタイターアッセイプレート、マイクロアレーチップ、ラテックスビーズ、セルロースまたは合成重合材料を含むフィルター、ガラスまたはプラスチックスライド、ディップスティック、キャピラリーフィルデバイス(capillary fill device)、およびその他同種のものの上にコートすることができる。
【０１２４】
HSP-90ベータ結合剤は、粗雑な分離を可能にするために固体支持体に結合されてもよい。分離技術は、好ましくは、収集されることとなる分画のバイアビリティーの保持を最大限にする。異なる有効性の様々な技術は、比較的粗雑な分離物を得るために用いられてもよい。用いられる特定の技術は、分離の効率、関連する細胞毒性、作業の容易性および速度、ならびに高性能な設備および/または技術的熟練の必要性に依存するであろう。分離のための手順は、抗体コート磁気ビーズを使用する磁気分離、親和性クロマトグラフィー、および固体マトリックスに結合された抗体を用いる「パンニング」を含むが、これらに限定されない。正確な分離を提供する技術は、MACS、Dynal磁気ビーズ選択、およびFAGSを含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
セルソーティング技術
抗HSP-90ベータ抗体などのHSP-90ベータ結合剤を用いて間葉系前駆細胞を認識するための能力は、組織試料中のこれらの細胞の同定および定量を可能にするだけではなく、浮遊液におけるそれらの分離および濃縮もまた可能にする。これは、細胞が、細胞抗体複合体または抗体に結合された標識と関連する特性に対する参照によって物理的に分離される、多くのセルソーティング技術によって達成することができる。この標識は、磁性粒子または蛍光分子であってもよい。抗体は、それらが多数の細胞の集合体を形成するように架橋されてもよく、これらは、それらの密度によって分離可能である。その代わりに、抗体は、所望の細胞が接着する静止マトリックスに結合されてもよい。
【０１２６】
非結合細胞から抗体結合細胞を分離するための様々な方法が知られている。たとえば、細胞に結合した抗体(または抗アイソタイプ抗体)は、標識することができ、次いで、細胞は、標識の存在を検出する機械的なセルソーターによって分離することができる。蛍光活性化セルソーターは、当技術分野においてよく知られている。
【０１２７】
一実施形態では、抗HSP-90ベータ抗体は、固体支持体に結合される。アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空糸膜、ポリマー、およびプラスチックペトリ皿を含むが、これらに限定されない様々な固体支持体は、当業者らに知られている。抗体が結合する細胞は、細胞浮遊液から固体支持体を単に物理的に分離することによって細胞浮遊液から取り出すことができる。
【０１２８】
超常磁性微粒子は、細胞分離に使用されてもよい。たとえば、微粒子は、抗HSP-90ベータ抗体を用いてコートされてもよい。次いで、抗体タグつき超常磁性微粒子は、対象の細胞を含有する溶液と共にインキュベートされてもよい。微粒子は所望の多能性細胞の表面に結合し、次いで、これらの細胞は、磁場中で収集することができる。
【０１２９】
他の例では、細胞試料は、たとえば固相連結抗HSP-90ベータモノクローナル抗体に物理的に接触させることが可能である。固相連結は、たとえば、プラスチック、ニトロセルロース、または他の表面への抗体の吸着を含むことができる。抗体は、中空糸膜の大きな孔(細胞の流入(flow-through)を可能にするのに十分に大きな)の壁上に吸着させることができる。その代わりに、抗体は、Pharmacia Sepharose 6 MBマクロビーズなどの表面またはビーズに共有結合することができる。多能性細胞含有浮遊液との固相連結抗体についてのインキュベーションの正確な条件および期間は、用いられた系に特異的ないくつかの因子に依存するであろう。しかしながら、適切な条件の選択は、十分に、当技術分野の技術の範囲内である。
【０１３０】
非結合細胞は、次いで、多能性細胞が結合するのに十分な時間を考慮した後に、生理緩衝液を用いて溶離または洗浄される。非結合細胞は、回収し、所望の分離が達成されたことを確実にするために適切な試験が行われた後に、他の目的のために使用または廃棄することができる。次いで、結合細胞は、主に固相および抗体の性質に依存して任意の適切な方法によって固相から分離される。たとえば、結合細胞は、激しい撹拌によってプラスチックペトリ皿から溶離することができる。その代わりに、結合細胞は、固相および抗体の間の酵素感受性の「スペーサー」配列に酵素で「切れ目を入れる」または消化することによって溶離することができる。アガロースビーズに結合したスペーサーは、たとえばPharmaciaから市販で入手可能である。
【０１３１】
次いで、細胞の溶離され濃縮された分画は、遠心分離によって緩衝液を用いて洗浄されてもよく、上述の濃縮分画または非結合分画は、従来の技術に従って、後の使用のために生存可能な状態において凍結保存されてもよいまたは移植レシピエントの中に導入されてもよい。
【０１３２】
多能性細胞の分化
本発明の多能性細胞の骨前駆細胞または骨への分化に偏らせる条件は、たとえば、10%FCS、100μM L-アスコルビン酸-2-リン酸、デキサメタゾン10-7M、および3mM無機リン酸が補足されたαMEM中での培養を含んでいてもよい。これらの条件は、in vitroにおいて、ヒト骨髄間質細胞を誘発して、石灰化骨基質を発達させることが示された(Gronthosら、1994)。
【０１３３】
本発明の多能性細胞を骨芽細胞に分化させるのに適した条件は、I型コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブリン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、オステオカルシン、またはオステオネクチンの存在下における細胞の培養を含んでいてもよい。特定の一例では、細胞は、I型コラーゲン、フィブリノーゲン、およびフィブリンの存在下において培養される。代わりの例では、細胞は、I型コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブリン、オステオカルシン、およびオステオネクチンの存在下において培養される。この方法との関連において、I型コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブリン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、オステオカルシン、またはオステオネクチンは、単独でまたは増殖因子の存在下において使用されてもよい。本段落において上記に列挙される化合物の任意の組み合わせが、本発明によって企図されることが理解されるであろう。
【０１３４】
遺伝的に改変された細胞の産生
一実施形態では、本発明は、遺伝的に改変された細胞、特に、本発明の遺伝的に改変された多能性細胞に関する。好ましくは、細胞は、異種タンパク質を産生するために遺伝的に改変される。典型的に、細胞は、異種タンパク質が細胞から分泌されるように、遺伝的に改変されるであろう。異種タンパク質は、対象の任意のタンパク質であってもよい。たとえば、異種タンパク質は、血小板由来増殖因子(PDGF)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターロイキン-1β(IL-1β)、および間質由来因子1α(SDF-Iα)であってもよい。
【０１３５】
他の例では、異種タンパク質は、特異的な組織型への多能性細胞の分化を加速する生理活性因子である。生理活性因子は、たとえば合成グルココルチコイドまたはBMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6、もしくはBMP-7などの骨形態形成タンパク質であってもよい。
【０１３６】
一実施形態では、細胞は、dsRNA(典型的にRNAサイレンシングのため)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または触媒核酸(リボザイムもしくはDNAザイムなど)などの機能的な非タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現するように改変することができる。
【０１３７】
遺伝的に改変された細胞は、改変された細胞の成長を支持するのに十分な量の、少なくとも1つのサイトカインの存在下において培養されてもよい。したがって、得られた、遺伝的に改変された細胞は、直ちに(たとえば移植において)使用され、培養され、in vitroにおいて増殖されてもよいまたは後の使用のために保存されてもよい。改変された細胞は、当技術分野においてよく知られている方法によって保存されてもよい、たとえば、液体窒素中で冷凍されてもよい。
【０１３８】
本明細書において使用される遺伝的改変は、多能性細胞の中への外因性もしくは外来性ポリヌクレオチドの導入または多能性細胞内の内因性遺伝子の改変を含む、任意の遺伝的改変方法を包含する。遺伝的改変は、形質導入(in vitroもしくはin vivoにおける宿主もしくはドナーからのレシピエントへの宿主DNAのウイルス媒介性移入)、トランスフェクション(単離ウイルスDNAゲノムを用いる細胞の形質転換)、リポソーム媒介性移入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、または共沈およびその他を含むが、これらに限定されない。形質導入の方法は、プロデューサー細胞との細胞の直接的な同時培養(Bregniら、1992)または適切な増殖因子およびポリカチオンとだけでまたはそれらを用いないでウイルス上清と共に培養すること(Xuら、1994)を含む。
【０１３９】
外因性ポリヌクレオチドは、好ましくは、ベクターにおいて宿主細胞に導入される。ベクターは、好ましくは、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む。そのようなベクターを構築するために使用される方法は、当技術分野においてよく知られている。たとえば、適した発現ベクターを構築するための技術は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、N.Y. (第3版、2000);およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.、New York (1999)において詳細に記載されている。
【０１４０】
ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスなどのウイルスベクター;コスミド;プラスミドベクター;合成ベクター;ならびに当技術分野において典型的に使用される他の組換え媒介物を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドが作動可能に連結することができるプロモーターおよびクローニング部位の両方を含有するベクターは、当技術分野においてよく知られている。そのようなベクターは、in vitroまたはin vivoにおいてRNAを転写することができ、Stratagene(La Jolla、Calif.)およびPromega Biotech(Madison、Wis.)などの供給源から市販で入手可能である。特定の例は、StratageneからのpSG、pSV2CAT、pXtl;ならびにPharmaciaからのpMSG、pSVL、pBPV、およびpSVK3を含む。
【０１４１】
好ましいベクターは、レトロウイルスベクターを含む(Coffinら、「Retroviruses」、第9章437〜473頁、Cold Springs Harbor Laboratory Press、1997を参照されたい)。本発明において有用なベクターは、当技術分野においてよく知られている手順によって組換えで産生することができる。たとえば、WO94/29438、WO97/21824、およびWO97/21825は、レトロウイルスパッケージングプラスミドおよびパッキング細胞株(packing cell line)の構築を記載する。例示的なベクターは、pCMVβbおよびpCMVβcなどのpCMV哺乳動物発現ベクター(Chiron Corp.)、pSFFV-Neo、ならびにpBluescript-Sk+を含む。有用なレトロウイルスベクターの非限定的な例は、ネズミ、トリ、または霊長動物レトロウイルスに由来するものである。一般的なレトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV-ベクター)に基づくものを含む。他のMoMLV由来ベクターは、Lmily、LINGFER、MINGFR、およびMINTを含む。さらなるベクターは、テナガザル白血病ウイルス(GALV)およびモロニーマウス肉腫ウイルス(MOMSV)および脾フォーカス形成ウイルス(SFFV)に基づくものを含む。ネズミ幹細胞ウイルス(MESV)に由来するベクターは、MESV-MiLyを含む。レトロウイルスベクターはまた、レンチウイルスに基づくベクターをも含み、非限定的な例は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV-IおよびHIV-2)に基づくベクターを含む。
【０１４２】
レトロウイルスベクター構築物を産生する際に、ウイルスgag、pol、およびenv配列は、ウイルスから除去することができ、外来性DNA配列の挿入の場所を作ることができる。外来性DNAによってコードされた遺伝子は、末端反復配列(LTR)において強力なウイルスプロモーターの制御下で通常、発現される。適切な制御調節配列の選択は、使用される宿主細胞に依存し、選択は、当技術分野における選択の技術の範囲内である。多数のプロモーターが、LTRのプロモーターに加えて知られている。非限定的な例は、ファージラムダPLプロモーター、ヒト-サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター;モロニーマウス肉腫ウイルス(MMSV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、または脾フォーカス形成ウイルス(SFFV)のU3領域プロモーター;グランザイムAプロモーター;およびグランザイムBプロモーターを含む。さらに、誘発性エレメントまたは多重制御エレメント(multiple control element)が、使用されてもよい。適したプロモーターの選択は、当業者らに明らかとなるであろう。
【０１４３】
そのような構築物は、gag、pol、およびenv機能が、パッキング細胞株によってトランスにおいて提供される場合、ウイルス粒子に効率的にパッキングすることができる。そのため、ベクター構築物が、パッケージング細胞の中に導入される場合、細胞によって産生されるgag-polおよびenvタンパク質は、ベクターRNAと組み合わさって、培養培地の中に分泌される感染性バイロンを産生する。このように産生されたウイルスは、標的細胞に感染し、そのDNAの中に統合することができるが、それが不可欠なパッケージング配列を欠いているので、感染性ウイルス粒子を産生しない。現在、使用されているほとんどのパッキング細胞株は、複製コンピテントウイルス(replication competent virus)を産生することができる前に、多数の組換えイベントが必要なように、それぞれが必要なコード配列の一方を含有している別個のプラスミドを用いてトランスフェクトされている。その代わりに、パッケージング細胞株は、プロウイルスを含む。プロウイルスは、それが、感染性ウイルスを組み立てるのに必要とされるタンパク質をすべて産生してもよいが、それ自体のRNAがウイルスの中にパッケージすることができないように、弱められている。その代わりに、組換えウイルスから産生されたRNAは、パッケージされる。そのため、パッケージング細胞から放出されるウイルスストック(virus stock)は、組換えウイルスのみを含有している。レトロウイルスパッケージング株の非限定的な例は、PA12、PA317、PE501、PG13、PSI.CRIP、RDI 14、GP7C-tTA-G10、ProPak-A(PPA-6)、およびPT67を含む。Millerら、1986;Danosら、1988;Pearら、1993;およびFinerら、1994を参照されたい。
【０１４４】
他の適したベクターは、アデノウイルスベクター(Freyら、1998;およびWO95/27071を参照されたい)ならびにアデノ随伴ウイルスベクターを含む。これらのベクターはすべて、たとえば、Chatterjeeら、1996;およびStem Cell Biology and Gene Therapy、Quesenberryら編、John Wiley & Sons、1998;ならびに米国特許第5,693,531号および第5,691,176号において記載されているように、当技術分野においてよく知られている。アデノウイルス由来ベクターの使用は、それらが非分裂細胞に感染することができないので、ある状況下で有利であるかもしれない。レトロウイルスDNAとは異なり、アデノウイルスDNAは、標的細胞のゲノムの中に統合されない。さらに、外来性DNAを運搬する性能は、レトロウイルスベクターよりもアデノウイルスベクターにおいてはるかに大きい。アデノ随伴ウイルスベクターは、他の有用な送達系である。このウイルスのDNAは、非分裂細胞の中に統合されてもよく、多くのポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルスベクターを使用して、異なる細胞型の中に導入されることに成功してきた。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、構築物またはベクターは、2つ以上の異種ポリヌクレオチド配列を含むであろう。好ましくは、さらなる核酸配列は、選択マーカー、構造遺伝子、治療用遺伝子、またはサイトカイン/ケモカイン遺伝子をコードするポリヌクレオチドである。
【０１４６】
選択マーカーは、遺伝的改変の成功をモニターする目的のためにおよびDNAが統合された細胞の選択のために、構築物またはベクターにおいて含まれていてもよい。非限定的な例は、G418(硫酸ネオマイシン)またはハイグロマイシンなどの薬剤抵抗性マーカーを含む。さらに、たとえば、マーカーがHSV-tk遺伝子であるネガティブ選択が使用されてもよい。この遺伝子は、細胞を、アシクロビルおよびガンシクロビルなどの作用物質に対して感受性にするであろう。NeoR(ネオマイシン/G418抵抗性)遺伝子は、一般に使用されるが、遺伝子配列が標的細胞中に既に存在していない、任意の好都合なマーカー遺伝子が使用されてもよく、使用することができる。さらに、非限定的な例は、低親和性神経増殖因子(NGFR)、増強された蛍光緑タンパク質(EFGP)、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(DHFR)、細菌hisD遺伝子、ネズミCD24(HSA)、ネズミCD8a(lyt)、ピューロマイシンまたはフレオマイシンおよびβ-ガラクトシダーゼに対する抵抗性を与える細菌遺伝子を含む。
【０１４７】
さらなるポリヌクレオチド配列は、同じベクター上で宿主細胞の中に導入されてもよいまたは第2のベクター上で宿主細胞の中に導入されてもよい。好ましい実施形態では、選択マーカーは、ポリヌクレオチドと同じベクター上に含まれるであろう。
【０１４８】
本発明はまた、内因性遺伝子の発現がアップレギュレートされて、野生型多能性細胞と比較して、コードタンパク質の産生の増加をもたらすように、内因性遺伝子のプロモーター領域を遺伝的に改変することをも包含する。
【０１４９】
濃縮された多能性細胞組成物の使用
MPCなどの多能性細胞の濃縮は、様々な治療目的のために望ましい。これらは、失われたまたは損傷を受けた骨格組織の再生、骨髄由来間葉系細胞の活性化および続く分化に際して、自然な骨架橋をもたらす、プロテーゼデバイス(prosthetic device)の多孔性表面上への単離または培養増殖骨髄由来間葉系細胞の結合を通しての様々なプラスチックまたは金属プロテーゼデバイスの移植の増強を含む。
【０１５０】
培養された間葉系細胞の複合移植片は、骨髄移植の間の造血細胞の蓄えの速度を強化するために使用されてもよい。
【０１５１】
本発明の多能性細胞から増殖された、培養骨髄由来間葉系細胞によって修復されてもよい欠損のクラスは、外傷によって引き起こされ、または腫瘍に罹病した骨の大きな部分の除去によってもたらされる、骨中の大きな骨格欠損のクラスである。正常な環境下で、このタイプの欠損は、治癒せず、骨の癒着不能を引き起こす。このタイプの欠損は、リン酸カルシウムセラミック媒介物中に含有される培養間葉系細胞の欠損部位の中への移植によって治療されてもよい。
【０１５２】
本発明の多能性細胞から増殖された、培養骨髄由来間葉系細胞によって修復されてもよい欠損の他のクラスは、外傷によってまたは変形性関節症および関節リウマチなどの疾患によって生成される、損傷を受けた関節軟骨である。
【０１５３】
本発明に従って得られる多能性細胞の濃縮または増殖細胞集団は、たとえば、骨の形成および修復において、使用されてもよく、そのため、多能性細胞および適した支持体の組み合わせは、骨形成を必要とする部位の中に導入されてもよい。したがって、たとえば、骨損傷または腫瘍が浸潤した骨の部分の除去によって引き起こされる骨格欠損は、リン酸カルシウムセラミック媒介物中に含有される培養または増殖多能性細胞を欠損部位の中に移植することによって修復されてもよい。適切な方法および技術については、Caplanら、米国特許第5,226,914号および米国特許第5,837,539号を参照されたい。これらの両方は、本発明と比較した場合、幹細胞の、より粗雑な調製物を使用する。
【０１５４】
さらに、濃縮細胞集団または組成物は、プロテーゼデバイスを固着させるのを支援するために使用されてもよい。したがって、股関節部、膝、および肩部交換において使用されるものなどのプロテーゼデバイスの表面は、移植前に濃縮多能性細胞を用いてコートされてもよい。次いで、多能性細胞は、骨形成原細胞に分化し、それによって、骨内部成長(bony ingrowth)およびプロテーゼデバイスの組み込みのプロセスを速めてもよい(Caplanら、米国特許第5,226,914号および米国特許第5,837,539号を参照されたい)。
【０１５５】
濃縮細胞集団または組成物はまた、遺伝子療法において使用されてもよく、たとえば、濃縮集団は、それに形質転換された外因性核酸を有していてもよく、次いで、そのような集団は、疾患または状態を治療するために患者の体の中に導入されてもよい。その代わりに、それは、治療薬の放出に使用されてもよい。適切な技術については発明者らは、本発明と比較した場合、幹細胞の、より粗雑な調製物を使用する、Gersonらによる米国特許第5,591,625号を参照する。
【０１５６】
その代わりに、濃縮集団または組成物は、骨髄移植を強化するために使用されてもよく、濃縮多能性細胞を含有する組成物は、骨髄全体の導入前に、骨髄移植を受けている患者に注射することができる。このように、造血の速度は、特に放射線照射または化学療法後に増加されてもよい。組成物はまた、放射線療法または化学療法において有用であってもよい、多能性細胞および造血性細胞の混合物を包含してもよい。
【０１５７】
細胞組成物
MPCなどの多能性細胞を含むものなどの、本発明の細胞組成物は、骨、軟骨、腱、靱帯、筋肉、皮膚、および他の結合組織ならびに神経、心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、脳、および他の器官組織を含む、様々なタイプの組織の再生に有用である。
【０１５８】
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」または「添加剤」は、生理学的に適合性である、任意のならびにすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、ならびにその他同種のものを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、担体は、非経口投与に適している。その代わりに、担体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下、または経口投与に適していてもよい。薬学的に許容される担体は、滅菌注射液または分散剤の即時調製のための滅菌水溶液または分散剤および滅菌粉末剤を含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野においてよく知られている。いかなる従来の媒体または作用物質も、活性化合物と不適合性である場合以外は、本発明の医薬組成物におけるその使用は、企図される。補充性の活性化合物もまた、組成物の中に組み込むことができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、たとえば、細胞を支持し、骨、軟骨、筋肉、神経、表皮、および/または他の結合組織の成長のための表面を提供するために、適切なマトリックスと組み合わせて投与されてもよい。マトリックスは、従来のマトリックス生体材料の形態をしていてもよい。マトリックスは、細胞の徐放および/またはその提示に適切な環境を提供してもよい。いくつかの実施形態では、様々なコラーゲン性および非コラーゲン性タンパク質は、アップレギュレートされ、細胞から分泌されることが期待される。この現象は、マトリックス沈着を増強することによって組織再生を加速する。マトリックスタンパク質はまた、遺伝的に操作された細胞において発現させることができ、移植エリアの中への移植細胞の移植および結合を増強することができる。
【０１６０】
本発明の細胞組成物は、単独でまたは他の細胞との混合剤として投与されてもよい。本発明の組成物と共に投与されてもよい細胞は、他の多分化能または多能細胞または軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、造骨細胞、破骨細胞、骨裏打ち細胞(bone lining cell)、幹細胞、または骨髄細胞を含むが、これらに限定されない。異なる型の細胞は、投与前に、本発明の組成物と直ちにもしくは簡単に混合されてもよいまたはそれらは、投与前にある期間の間、共に同時培養されてもよい。
【０１６１】
本発明の細胞組成物は、他の有益な薬剤または生体分子(増殖因子、栄養因子)と共に投与されてもよい。多能性細胞が他の作用物質と共に投与される場合、それらは、他の作用物質と同時にまたはそれに引き続いて(他の作用物質の投与の後もしくはその前に)、単一の医薬組成物においてまたは別個の医薬組成物において共に投与されてもよい。同時投与されてもよい生理活性因子は、抗アポトーシス剤(たとえばEPO、EPOミメティボディ(mimetibody)、TPO、IGF-I、およびIGF-II、 HGF、カスパーゼ阻害剤);抗炎症剤(たとえばp38 MAPK阻害剤、TGF-ベータ阻害剤、スタチン、IL-6およびIL-I阻害剤、PEMIRO LAST、TRANILAST、REMICADE、SIROLIMUS、ならびにNSAID(非ステロイド性抗炎症薬剤;たとえばTEPOXALIN、TOLMETIN、SUPROFEN);免疫抑制/免疫修飾剤(たとえばシクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤;mTOR阻害剤(たとえばSIROLIMUS、EVEROLIMUS);抗増殖剤(たとえばアザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル);コルチコステロイド(たとえばプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン);モノクローナル抗-IL-2Rアルファ受容体抗体などの抗体(たとえばバシリキシマブ、ダクリズマブ)、ポリクローナル抗T細胞抗体(たとえば抗胸腺細胞グロブリン(ATG);抗リンパ球グロブリン(ALG);モノクローナル抗T細胞抗体OKT3));抗血栓剤(たとえばヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、PPack(デキストロフェニルアラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン(dextrophenylalanine proline arginine chloromethylketone))、抗トロンビン化合物、血小板受容体アンタゴニスト、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害剤、および血小板阻害剤);ならびに抗酸化剤(たとえばプロブコール、ビタミンA、アスコルビン酸、トコフェロール、コエンザイムQ-I0、グルタチオン、L‐システイン、N-アセチルシステイン)および局所麻酔薬を含む。他の例として、細胞は、参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第5,827,735号において記載されるように瘢痕阻害因子と同時投与されてもよい。
【０１６２】
一実施形態では、本発明の細胞組成物は、未分化細胞として、つまり、増殖培地中で培養された未分化細胞として投与される。その代わりに、細胞組成物は、所望の表現型、たとえば骨形成表現型への分化を刺激する状態への培養中の曝露後に投与されてもよい。
【０１６３】
フィブリン糊
フィブリン糊は、様々な臨床の場において使用されてきた、あるクラスの外科用密封材である。当業者が気づくであろうが、多数の密封材は、本発明の組成物において有用である。しかしながら、本発明の好ましい実施形態は、本発明の細胞と共にフィブリン糊を使用することに関する。
【０１６４】
本明細書において使用される場合、用語「フィブリン糊」は、カルシウムイオンの存在下においてフィブリンポリマーの架橋によって形成される不溶性マトリックスを指す。フィブリン糊は、フィブリノーゲンまたはその誘導体もしくは代謝産物、生物学的組織に由来するフィブリン(可溶性モノマーもしくはポリマー)および/またはその複合体、またはフィブリンマトリックスを形成する液体から形成されてもよい。その代わりに、フィブリン糊は、組換えDNA技術によって産生されるフィブリノーゲンまたはその誘導体もしくは代謝産物またはフィブリンから形成されてもよい。
【０１６５】
フィブリン糊はまた、フィブリン糊形成の触媒(トロンビンおよび/または第XIII因子など)とのフィブリノーゲンの相互作用によって形成されてもよい。当業者らによって十分に理解されるであろうが、フィブリノーゲンは、触媒(トロンビンなど)の存在下においてタンパク質分解され、フィブリンモノマーに変換される。次いで、フィブリンモノマーは、架橋して、フィブリン糊マトリックスを形成してもよいポリマーを形成してもよい。フィブリンポリマーの架橋は、第XIII因子などの触媒の存在によって増強されてもよい。フィブリン糊形成の触媒は、血漿、寒冷沈降物、またはフィブリノーゲンもしくはトロンビンを含有している他の血奬分画に由来してもよい。その代わりに、触媒は、組換えDNA技術によって産生されてもよい。
【０１６６】
クロットが形成する速度は、フィブリノーゲンと混合されるトロンビンの濃度に依存する。酵素依存性の反応であるので、温度が高いほど(37℃まで)、クロット形成速度は速い。クロットの引張り強さは、使用されるフィブリノーゲンの濃度に依存する。
【０１６７】
その調製および使用のためのフィブリン糊の使用および方法は、米国特許第5,643,192号においてHirshらによって記載されている。Hirshは、1人のドナーからのフィブリノーゲンおよびトロンビンの成分の抽出ならびにフィブリン糊として使用されるこれらの成分のみの組み合わせを開示する。Marx、米国特許第5,651,982号は、フィブリン糊に使用される他の調製および方法を記載する。Marxは、哺乳動物において局部密封材として使用するためのリポソームを有するフィブリン糊を提供する。創傷治癒のための局部フィブリノーゲン複合体(TFC)の調製および使用は、本分野において知られている。American Red CrossのPCT出願PCT/US95/15876、PCT公開WO96/17633は、たとえば、PCT公開WO96/17633の16〜18頁で、フィブリノーゲン、トロンビン、および塩化カルシウムを含有しているTFC調製について議論している。
【０１６８】
いくつかの刊行物は、治療剤の送達のためのフィブリン糊の使用を記載する。たとえば、米国特許第4,983,393号は、アガロース、寒天、食塩水、グリコサミノグリカン、コラーゲン、フィブリン、および酵素を含む、腟内挿入物として使用するための組成物を開示する。さらに、米国特許第3,089,815号は、フィブリノーゲンおよびトロンビンから構成される注射医薬調製物を開示し、米国特許第6,468,527号は、体内の特異的な部位への様々な生物学的および非生物学的作用物質の送達を促進するフィブリン糊を開示する。
【０１６９】
広く記載されるように、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態において示されるように、多数の変更および/または修飾が本発明に対して成されてもよいことが当業者らによって十分に理解されるであろう。そのため、本発明の実施形態は、すべての点において、制限的なものではなく、例示的なものとして考えられる。
【実施例】
【０１７０】
本発明は、次に、以下の非限定的な実施例に関してより詳細に記載される。
【０１７１】
(実施例1)
材料および方法
マウスの免疫および抗体分泌ハイブリドーマ細胞株の産生
VCAM-I/CD106陽性免疫選択ヒツジMPCは、採取し、補助剤として20μgムラミルジペプチド(Sigma Chemical Company、St. Louis、MO)を補足した300μl PBS中に再懸濁した。BALB/cマウスは、5×106 BMSSCを用いて腹腔内で免疫し、続いて、免疫応答の適切な親和性成熟を確実にするために、3週間の間隔でさらに3回、追加免疫した。融合の3日前に、100μl PBS中に再懸濁した5×106細胞は、尾静脈を介して投与した。融合の直前に、マウスは、犠牲死させ、それらの脾臓は、無菌的に摘出した。培養BMSSCと反応性の抗体を分泌するハイブリドーマは、NS1-Ag4-1ネズミ骨髄腫細胞株およびトリプシン処理培養ヒツジMPCを用いて免疫されたBALB/cマウスに由来する脾臓細胞を融合することによって作製した。脾細胞および骨髄細胞の融合は、本質的に以前の報告のとおりに(Filshie RJら、1998およびZannettino ACら、1996)実行した。
【０１７２】
ハイブリドーマは、骨髄単核細胞とのそれらの低い反応性ならびに一次免疫原(培養ヒツジMPC)およびヒト培養MPCとの反応性についてスクリーニングした。STRO-4ハイブリドーマはまた、ヒツジおよびヒトコロニー形成MPC(CFU-F)についてのその反応性および濃縮についても選択した。
【０１７３】
骨髄試料
正常なヒト成体骨髄穿刺液は、Royal Adelaide HospitalのHuman Ethics Committeeの承認されたガイドラインに基づき得た。ヒツジ骨髄穿刺液は、Institute of Medical and Veterinary ScienceのAnimal ethic committeeの承認されたガイドラインに基づき得た。ヒツジおよびヒト骨髄単核細胞(BMMNC)は、本質的に以前の報告のとおりに(Gronthos Sら、2003)、密度勾配分離によって調製した。BMMNC調製物は、下記のとおりに、免疫磁気または免疫蛍光活性化セルソーティングに使用した。
【０１７４】
MPC細胞培養
コロニー効率アッセイは、以前の報告のとおりに、三通りのウェルにおいて、12日間の期間にわたり、三通りの6ウェルプレートにおいて、cm2当たり0.1〜1×104未分画または免疫選択BMMNCの範囲の平板培養密度で実行した。細胞は、以前の報告のとおりに(Gronthos Sら、2003)、37℃加湿大気において、5%CO2において、20%ウシ胎仔血清、2mM L-グルタミン、および100μM L-アスコルビン酸-2-リン酸、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンを補足したα-MEM中で成長させた。コロニー(>50細胞の細胞塊)は、4%パラホルムアルデヒドを用いる固定後にカウントし、次いで、0.1%トルイジンブルーを用いて染色した。一次BMSSC培養物は、cm2当たり1〜5×104未分画またはSTRO-4+免疫選択BMMNCを平板培養することによって確立し、次いで、上記に記載されるようにα-MEM中で成長させた。
【０１７５】
分化アッセイ
骨形成を誘発するために、MPCは、10%FCS、100μM L-アスコルビン酸-2-リン酸、デキサメタゾン10-7M、および3mM無機リン酸を補足したα-MEM中で培養し、石灰化沈着物は、アリザリンレッド染色によって同定した(Gronthos Sら、2003)。脂肪生成は、0.5mMイソメチルブチルメチルキサンチン(IBMX)、0.5μMヒドロコルチゾン、および60μMインドメタシンの存在下において誘発し、オイルレッドO染色は、以前の報告のとおりに(Gronthos Sら、2003)、脂質を含む脂肪細胞を同定するために使用した。軟骨形成分化は、10ng/ml TGF-β3を用いて処理した集合体の培養物において評価し、プロテオグリカン合成を検出するために一晩、0.1%トルイジンブルー染色によって評価した(Gronthos Sら、2003)。
【０１７６】
磁気活性化セルソーティング(MACS)
これは、以前の報告のとおりに(Gronthos Sら、2003)実行した。手短に言えば、約1〜3×108正常ヒツジまたはヒトBMMNCは、氷上で1時間、抗VCAM-1/CD106またはSTRO-4の純粋な上清と共にインキュベートした。次いで、細胞調製物は、メーカーの指示に従って、Mini MACS磁気カラム(Miltenyi Biotec Inc.、Auburn、CA)上で分離する前に、氷上で30分間、ヤギ抗マウスIgGストレプトアビジンマイクロビーズと共にインキュベートし、最後にストレプトアビジンFITC(1/50;Caltag Laboratories、Burlingame、CA)と共にインキュベートした。
【０１７７】
間接免疫蛍光法およびフローサイトメトリー分析
免疫標識前に、培養細胞(ヒツジMPC、ヒトMPC、MG63、HOS、SAOSは、氷上で20分間、ブロッキング緩衝液(HBSS+20mM Hepes、1%正常ヒトAB血清、1%ウシ血清アルブミン(BSA:コーン分画V、Sigma Aldrich Pty Ltd、NSW、Australia)、および5%FCS中でインキュベートした。1×105細胞の一定分量は、氷上で45分間、100μLのどちらかのSTRO-4の上清中で再懸濁した。アイソタイプが一致する非結合対照抗体、抗体、IgGi(1B5)(Professor L.K. Ashman、University of Newcastle、AUSによって親切にも提供された)は、同一条件下で培養上清として使用した。次いで、細胞は、5%FCSを有するHBSS中で洗浄し、氷上で45分間、ヤギ抗マウスIgG(γ-鎖特異的)フィコエリトリン(PE)(1/50;Southern Biotechnology Associates、Birmingham AL)と共にインキュベートした。分析前に、細胞は、5%FCSを有するHBSS中で2回洗浄し、PBS/1%パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。フローサイトメトリー分析は、Coulter Excelフローサイトメーターを使用して実行した(Coulter Corp.、Hialeah、FL)。それぞれの抗体についての陽性は、アイソタイプが一致する非結合対照抗体を使用した場合に観察されたものである99%を超える蛍光のレベルとして定義した。20,000イベントを、リストモードデータとして、試料当たりに収集し、Coulter ELITEソフトウェアを使用して分析した。
【０１７８】
免疫沈降およびウェスタンブロッティング
細胞溶解物は、以前の報告のとおりに調製した。ヤギ抗マウスIg結合Dynabeads(Dynal、Oslo、Sweden)は、純粋なSTRO-4上清およびアイソタイプが一致する非結合対照(1B5)の追加前に、1%(v/v) NP40-50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA[TSE]中で2回洗浄した。次いで、この混合物は、回転させながら、最低6時間、4℃でインキュベートした。結果として生じる、あらかじめ備えられた(pre-armed)Dynabeadsは、1%NP40 TSE中で2回洗浄し、ビーズは、磁性粒子コレクター(MPC-I、Dynal)を使用して収集した。これらに、1.0ml一定分量の適切なNP40細胞溶解物を追加した。試料は、回転させながら、4℃で2時間インキュベートした。次いで、免疫沈降物は、1%(v/v)NP40-TSE中で2回洗浄し、0.1%(v/v)NP40-TSE中で1回、TSE、pH8.0中で1回洗浄した。次いで、上清は除去し、試料は、-20℃で保存したまたは電気泳動に直ちに使用した。それぞれの免疫沈降物は、5×106細胞等価物からの材料に相当した。試料は、以前の報告のとおりに(Zannettino ACら、1996)、25μL 還元試料緩衝液(reducing sample buffer)(62.5mM Tris、3%(w/v)SDS、10%(v/v)グリセロール、および5%(v/v) 2-メルカプトエタノール)中で3分間煮沸し、クーマシーブルーを使用して、10%(w/v)SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１７９】
質量分析法およびタンパク質配列決定については、切り取ったバンドを、37℃で、16時間のトリプシン消化にかけた。次いで、試料は、脱塩し、Millipore C18 ZipTipを使用して濃縮し、1μL一定分量を、試料プレート上に、1μLのマトリックス(α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、70%v/v AcN、1%v/v TFA中、8mg/mL)と共にスポットし、風乾させた。Matrix assisted laser desorption ionisation(MALDI)質量分析法は、MSモードにおいて、TOF/TOF光学機器と共に、Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyserを用いて実行した。Nd:YAGレーザー(355nm)は、試料を照射するために使用した。スペクトルは、750〜3500Thの質量範囲においてリフレクトロンモードで得た。データは、データベース検索プログラムMascotへの送信に適したフォーマットでエクスポートした(Matrix Science Ltd、London、UK)。
【０１８０】
免疫ブロットについては、非染色ゲル上のタンパク質は、ウェットブロッティング装置(Hoefer Scientific Instruments、San Francisco、CA、USA)において、一晩、30mAでポリビニルジフルオロアセテート(PVDF;MSI Membranes、Geneworks、Adelaide、Australia)に転写した。PBS中5%脱脂粉乳-0.05% Tween-20を用いて2時間ブロックした後、フィルターは、室温で、1時間、HSP-90(Santa Cruz Biotechnologies)に対するポリクローナル抗体と共にインキュベートした。一次抗体は、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲート(Amersham Biosciences、Poole、UK)を用いて続いて検出し、免疫反応性タンパク質は、メーカーによって推奨されるように、ImageQuantソフトウェア(Molecular Dynamics)を使用してFluorlmager(Molecular Dynamics、Sunnyvale、CA)上で可視化した(Zannettino ACら、1996およびShi Sら、2001)。
【０１８１】
(実施例2)
ヒツジおよびヒトMPCを同定するモノクローナル抗体STRO-4の生成
ヒツジMPCと反応性のマウスモノクローナル抗体(mAb)のパネルは、方法において記載されるように、骨髄腫細胞株、NS1-Ag4-1との、培養VCAM-I/CD 106陽性由来ヒツジMPCを用いて免疫したマウスに由来する脾細胞の融合後に生成した。予備スクリーニングは、ヒツジおよびヒトクローン化可能MPC(CFU-F)と反応したmAbを同定するように設計した。そのような1つのハイブリドーマ、STRO-4は、それがヒツジおよびヒト骨髄単核細胞の小さなサブセットを同定し(図IAおよびB)、ヒツジおよびヒトCFU-Fを効率的に単離した(図1CおよびD)ので、さらなる分析のために選択した。ex vivo増殖ヒツジおよびヒトMPCは、STRO-4によって同定される抗原の高い細胞表面発現を維持し(図2AおよびB)、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞への多系列分化のための性能を示した(図3)。第3のハイブリドーマ上清由来のSTRO-4の免疫グロブリンアイソタイプは、方法において記載されるように、アイソタイプ検出キットを使用して、IgGiであることが決定された。
【０１８２】
(実施例3)
STRO-4によって認識される抗原の特徴づけ
免疫沈降は、高い細胞表面レベルのSTRO-4抗原を発現した未成熟ヒト骨肉腫細胞株、MG63由来のSTRO-4抗原を精製するために使用した(図2C)。ヒトMG63形質膜タンパク質は、方法において記載されるように1%NP40を用いて抽出し、STRO-4抗体と共にインキュベートした。STRO-4免疫沈降タンパク質は、磁気Dynalビーズにコンジュゲートされたヒツジ抗マウスIgG抗体を使用して回収し、方法において記載されるように、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分析した。分析した免疫沈降物のクーマシーブルー染色により、90kDaの見かけ上の分子量を有する特異的なペプチドバンドが明らかにされた(図4)。90kDaタンパク質断片をゲルから切り取り、質量分析法およびアミノ酸配列分析のために調製した。結果として生じたSTRO-4ペプチド配列は、National Center for Biotechnology Informationのタンパク質データベースを調査するために使用し、ヒト熱ショックタンパク質-90ベータ(受託番号、P08238)と相同性を示すことが分かった(図5)。
【０１８３】
STRO-4反応性90kDaペプチドがHSP-90ベータであったことを確認するために、全細胞溶解物およびSTRO-4免疫沈降抽出物をSDS-PAGEによって分析した。ウェスタンブロット分析は、方法において記載されるように、ヒトHSP-90ベータと反応性の、市販で入手可能なウサギポリクローナル抗体を使用して実行した。STRO-4免疫沈降物は、90kDaの適切な分子量でHSP-90特異的抗体と特異的な反応性を示した(図6)。
【０１８４】
本発明の研究では、STRO-4細胞表面発現に基づいて選択されるヒツジおよびヒトMPC集団により、骨、軟骨、および脂肪組織への分化のためのそれらの性能を保持しながらの、in vitroにおける広範囲な増殖が実証された。これまで、異なる種の間で交差反応性を示す抗体試薬は、ほとんどなかった。
【０１８５】
したがって、STRO-4に対する抗体は、MPCを単離および濃縮するための有効な手段として使用されてもよい。
(参考文献)
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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