(57)【要約】本発明はapsB、apsB の相同体、cpsA、cpsAの相同体及びそれらの組み合わせより選択される少なくとも一つの不活性化された遺伝子を含む糸状菌細胞（例えば、アスペルギルス種）に関する。関心の対象である内因性の非相同タンパク質の改変された生成のため細胞の生成のみならず、核酸及び前記不活性化された変異遺伝子細胞を生成する方法が提供される。
2011517943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの不活性化された遺伝子を含む糸状菌細胞であって、前記不活性化された遺伝子（不活性化遺伝子）はapsB、apsB の相同体、cpsA、cpsAの相同体及びそれらの組み合わせより選択される、前記糸状菌細胞。
【請求項２】
前記不活性化遺伝子がcpsAの相同体であり、前記相同体は配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を持つ、請求項１の糸状菌細胞。
【請求項３】
前記不活性化遺伝子がapsBの相同体であり、前記相同体は配列番号９と少なくとも８５％の配列同一性を持つ、請求項１の糸状菌細胞。
【請求項４】
前記糸状菌はアスペルギルス種、リゾプス種、トリコデルマ種及びムコール種から選択される、請求項１の糸状菌細胞。
【請求項５】
前記糸状菌はアスペルギルス  オリゼ、アスペルギルス  ニガー、 アスペルギルス アワモリ、アスペルギルス  ニデュランス、アスペルギルス  ソーエ、アスペルギルス  ジャポニクス、アスペルギルス カワチ、及びアスペルギルス アクレアツスから選択されるアスペルギルス種である、請求項４の糸状菌細胞。
【請求項６】
前記糸状菌はアスペルギルス  ニガーである、請求項５の糸状菌細胞。
【請求項７】
前記不活性化遺伝子はapsB（配列番号９）である、請求項１の糸状菌細胞。
【請求項８】
前記糸状菌細胞はapsB, cpsA, dpp4, dpp5及びその相同体から選択される少なくとも一つの第二の不活性化遺伝子を含む、請求項７の糸状菌細胞。
【請求項９】
前記不活性化遺伝子はcpsA（配列番号１）である、請求項１の糸状菌細胞。
【請求項１０】
前記糸状菌細胞はapsB, dpp4, dpp5, 及びその相同体から選択される少なくとも一つの第二の不活性化遺伝子を含む、請求項９の糸状菌細胞。
【請求項１１】
前記不活性遺伝子が選択可能なマーカー遺伝子による分断により不活性化される、請求項１の糸状菌細胞。
【請求項１２】
前記細胞による内因性タンパク質の生成は、糸状菌細胞の対応する親株での内因性タンパク質の生成より少なくとも約１０％から６０％大きい、請求項１の糸状菌細胞。
【請求項１３】
前記内因性タンパク質はグルコース生成酵素である、請求項１２の糸状菌細胞。
【請求項１４】
前記内因性タンパク質がα―アミラーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼ、ラッカーゼ、中性プロテアーゼ及びアルカリ  プロテアーゼから選択される酵素である、請求項１２の糸状菌細胞。
【請求項１５】
前記細胞が非相同タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項１の糸状菌細胞。
【請求項１６】
前記非相同タンパク質の生成は、糸状菌細胞の対応する親株での同じタンパク質の生成に比べて改変されている、請求項１５の糸状菌細胞。
【請求項１７】
前記非相同タンパク質の生成が、前記糸状菌細胞の対応する親株での同じタンパク質の生成より少なくとも約10%から約60％大きい、請求項１５の糸状菌細胞。
【請求項１８】
前記全乾燥細胞重量が、糸状菌細胞の対応する親株の全乾燥細胞重量よりも約25%, 20%, 15%, 10%, 5%小さい、又はさらにそれより小さい割合で異なる、請求項１５の糸状菌細胞。
【請求項１９】
前記非相同タンパク質が酵素である、請求項１５の糸状菌細胞。
【請求項２０】
前記酵素がα―アミラーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼ、ラッカーゼ、中性プロテアーゼ及びアルカリ  プロテアーゼから選択される、請求項１９の糸状菌細胞。
【請求項２１】
前記酵素がラッカーゼである、請求項１９の糸状菌細胞。
【請求項２２】
前記非相同タンパク質はプロテアーゼ阻害剤である、請求項１５の糸状菌細胞。
【請求項２３】
前記非相同タンパク質は抗体又は抗体断片である、請求項１５の糸状菌細胞。
【請求項２４】
前記不活性化遺伝子が細胞内タンパク質をコードする、請求項１の糸状菌細胞。
【請求項２５】
前記細胞内タンパク質はプロテアーゼである、請求項２４の糸状菌細胞。
【請求項２６】
前記糸状菌細胞は少なくとも２つの不活性化遺伝子を含む、請求項１の糸状菌細胞。
【請求項２７】
前記糸状菌細胞がderA, derB, htmA, mnn9, mnn10, ochA, dpp4, dpp5, pepAa, pepAb, pepAc, pepAd, pepB, pepC, pepD, pepF及びその相同体から選択される一つの不活性化遺伝子をさらに含む、請求項１の糸状菌細胞。
【請求項２８】
少なくとも一つの不活性化遺伝子を糸状菌細胞であって、前記不活性化遺伝子は細胞内タンパク質をコードし、前記細胞による少なくとも一つの他のタンパク質の生成は、糸状菌細胞の対応する親株での他のタンパク質の生成より少なくとも約１０％から約６０％大きい、前記糸状菌細胞。
【請求項２９】
前記細胞内タンパク質はプロテアーゼである、請求項２８の糸状菌細胞。
【請求項３０】
前記細胞内タンパク質はアミノペプチダーゼである、請求項２８の糸状菌細胞。
【請求項３１】
前記細胞内タンパク質はapsBである、請求項２８の糸状菌細胞。
【請求項３２】
タンパク質を生成する方法であって、
（a）タンパク質をコードする核酸を糸状菌細胞に導入し、前記細胞は前記不活性化遺伝子はapsB, apsBの相同体, cpsA, cpsAの相同体及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも一つの不活性化遺伝子を含み、そして
(b)タンパク質を生成するのに好適な条件下で細胞を生長させる、
ことを含む前記方法。
【請求項３３】
前記方法がタンパク質を回収することを含む、請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記不活性化遺伝子はcpsAの相同体であり、前記相同体は配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を持つ,請求項３２の方法。
【請求項３５】
前記不活性化遺伝子はapsBの相同体であり、前記相同体は配列番号９と少なくとも８５％の配列同一性を持つ,請求項３２の方法。
【請求項３６】
前記不活性化遺伝子はcpsA（配列番号１）である、請求項３２の方法。
【請求項３７】
前記不活性化遺伝子はapsB（配列番号９）である、請求項３２の方法。
【請求項３８】
前記糸状菌がアスペルギルス  オリザエ、アスペルギルス  ニガー、 アスペルギルス アワモリ、アスペルギルス  ニデュランス、アスペルギルス  ソジャエ、アスペルギルス  ジャポニクス、アスペルギルス カワチ、及びアスペルギルス アクレアツスから選択されるアスペルギルス種である、請求項３２の方法。
【請求項３９】
前記アスペルギルス種がアスペルギルス  ニガーである、請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記タンパク質がプロテアーゼ阻害剤である、請求項３２の方法。
【請求項４１】
前記タンパク質が抗体又は抗体断片である、請求項３２の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質が酵素である、請求項３２の方法。
【請求項４３】
タンパク質生成のための糸状菌株を作る方法であって、
(a)糸状菌細胞を分断配列により形質転換し、前記分断配列はapsB, apsBの相同体, cpsA, cpsAの相同体及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも一つの非相同不活性化遺伝子を含み、そして
(b) 前記分断配列の染色体が一体化している形質転換された細胞を選択することを含む、
前記方法。
【請求項４４】
前記不活性化遺伝子はcpsAの相同体であり、前記相同体は配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を持つ、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記不活性化遺伝子はapsBの相同体であり、前記相同体は配列番号９と少なくとも８５％の配列同一性を持つ、請求項４３の方法。
【請求項４６】
前記糸状菌がアスペルギルス種、リゾプス種、トリコデルマ種及びムコール種から選択される、請求項４３の方法。
【請求項４７】
前記糸状菌がアスペルギルス  オリゼ、アスペルギルス  ニガー、 アスペルギルス アワモリ、アスペルギルス  ニデュランス、アスペルギルス  ソーエ、アスペルギルス  ジャポニクス、アスペルギルス カワチ、及びアスペルギルス アクレアツスから選択されるアスペルギルス種である、
請求項４３の方法。
【請求項４８】
前記糸状菌がアスペルギルス  ニガーである、請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記不活性化遺伝子がapsB（配列番号９）である、請求項４３の方法。
【請求項５０】
前記糸状菌細胞はcpsA, dpp4, dpp5, 及びその相同体から選択される少なくとも一つの第二の不活性化遺伝子を含む、請求項４９の方法。
【請求項５１】
前記不活性化遺伝子がcpsA（配列番号１）である、請求項４３の方法。
【請求項５２】
前記糸状菌細胞がapsB, dpp4, dpp5, 及びその相同体から選択される少なくとも一つの第ニの不活性化遺伝子を含む、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記細胞が非相同タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項４３の方法。
【請求項５４】
前記分断配列が、不活性化遺伝子のコード領域配列の制限部位に逆方向に挿入された選択可能なマーカー遺伝子を含む、請求項４３の方法。
【請求項５５】
前記選択マーカー遺伝子はamdSである、請求項５４の方法。
【請求項５６】
遺伝子の分断配列を含む単離された核酸であり、前記遺伝子はcpsA, cpsAの相同体であり、前記分断配列は、遺伝子のコード領域配列の制限部位に逆方向に挿入された選択可能なマーカー遺伝子を含む、前記核酸。
【請求項５７】
前記遺伝子は配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を持つcpsAの相同体である、請求項５６の単離された核酸。
【請求項５８】
前記遺伝子はcpsA (配列番号1)である、請求項５６の単離された核酸。
【請求項５９】
前記選択マーカー遺伝子はamdSである、請求項５６の単離された核酸。
【請求項６０】
請求項５６の核酸を含むベクター。
【請求項６１】
遺伝子の分断配列を含む単離された核酸であり、前記遺伝子はapsB又はcpsAの相同体から選択され、及び前記分断配列は、前記遺伝子のコード領域配列の制限部位に逆方向に挿入された選択可能なマーカー遺伝子を含む、前記核酸。
【請求項６２】
前記遺伝子が配列番号９と少なくとも８５％の配列同一性を持つapsBの相同体である、請求項６１の単離された核酸。
【請求項６３】
前記遺伝子はapsB (配列番号9)である、請求項６１の単離された核酸。
【請求項６４】
前記選択マーカー遺伝子はamdSである、請求項６１の単離された核酸。
【請求項６５】
請求項６１の核酸を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は例えば、アスペルギルス（Aspergillus）種の様な糸状菌微生物であって、改変されたタンパク質の生成をする様に不活性化された一以上のプロテアーゼ遺伝子を持つ様に操作された糸状菌微生物に関する。
【０００２】
本発明は2008年4月8日に出願された米国特許出願番号61/043,284に基づく優先権を主張するものであり、同出願は参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子工学により工業バイオリアクター、細胞工場及び食品発酵分野において用いられる微生物の改良が可能となった。操作された微生物により生成される重要な酵素及びタンパク質はグルコアミラーゼ、アルファアミラーゼ、セルラーゼ、中性プロテアーゼ、及びアルカリ（又はセリン）プロテアーゼ、ホルモン及び抗体を含む。しかし、ある遺伝子操作で起きるタンパク質分解及び修飾は効果的な生成と抵触する。
【０００４】
糸状菌（例えば、アスペルギルス及びトリコデルマ種）及びあるバクテリア（例えば、バチルス種）は多くの有用なタンパク質及び代謝体を生成しそして分泌するように遺伝子操作された（例えば、Bio/Technol. 5: 369 - 376, 713 - 719及び1301 - 1304 [1987] 及びZukowski, 「商業的に価値のある製品の生産」（“Production of commercially valuable products,"）Doi及びMcGlouglin （編纂) 「バチルスの生物学」（Biology of Bacilli）: 工業への応用（Applications to Industry）, Butterworth-Heinemann, Stoneham. Mass 311 -337ページ [1992])。
【０００５】
WO 97/22705は、この文献は参照により本明細書に組み入れられるが、あるプロテアーゼを生成せず、通常生成されるプロテアーゼによるタンパク質分解の影響を受けやすいタンパク質生成の宿主として使用することのできる菌に関する。
【０００６】
米国特許出願第5,840,570号及び第6,509,171号はキモシンの様な非相同ポリペプチドの生成のための有用な宿主であるアスパラギン酸タンパク質のための遺伝子に欠けている変異糸状菌に関するものであり、これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００７】
米国特許出願公報第2006/0246545号は、derA, derB, htmA, mnn9, mnn10, ochA, dpp4, dpp5, pepAa, pepAb, pepAc, pepAd, pepF及びそれらの組み合わせに対応する不活性化された染色体遺伝子を持つ組み換え糸状菌細胞に関し、本文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【発明の概要】
【０００８】
ある実施の態様において、本発明は少なくとも一つの不活性化された遺伝子（不活性化遺伝子）を含む糸状菌細胞を提供し、前記不活性化遺伝子はapsB、apsB の相同体、cpsA、cpsAの相同体及びそれらの組み合わせより選択される。ある実施の態様においては、不活性化遺伝子はcpsAの相同体であり、前記相同体は配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を持ち、又は配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。ある実施の態様において、不活性化された遺伝子はapsBの相同体であり、前記相同体は配列番号９と少なくとも８５％の配列同一性を持ち、又は配列番号１０と少なくとも８５％の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。ある実施の態様においては、不活性化遺伝子はcpsA（配列番号１）又はapsB（配列番号１）である。
【０００９】
ある実施の態様では、不活性化遺伝子は細胞内タンパク質をコードし、前記細胞内タンパク質はタンパク質の分解及び修飾に関わる（例えば、プロテアーゼ遺伝子、小胞体（ER）分解経路遺伝子及びグリコシド化遺伝子）。特に、不活性化遺伝子によりコードされた細胞内タンパク質はN-末端プロテアーゼ（例えば、apsBの様なアミノペプチダーゼ）又は細胞内C末端プロテアーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼ）である。
【００１０】
他の実施の態様においては、本発明の糸状菌細胞はプロテアーゼの様な分泌されたタンパク質をコードする不活性化遺伝子を含む。
【００１１】
ある実施の態様においては、本発明の糸状菌細胞はアスペルギルス種、リゾプス種、トリコデルマ種及びムコール種から選択された糸状菌の細胞である。ある特徴では、糸状菌はアスペルギルス  オリゼ、アスペルギルス  ニガー、 アスペルギルス アワモリ、アスペルギルス  ニデュランス、アスペルギルス  ソーエ、アスペルギルス  ジャポニクス、アスペルギルス カワチ、及びアスペルギルス アクレアツスから選択されるアスペルギルス種である。
【００１２】
ある実施の態様においては、糸状菌細胞は少なくとも一つの第一の不活性化遺伝子を含み、それはapsB, apsBの相同体, cpsA, cpsAの相同体から選択され、少なくとも一つの第ニの不活性化遺伝子はapsB, cpsA, derA, derB, htmA, mnn9, mnnW, ochA, dpp4, dpp5, pepAa, pepAb, pepAc, pepAd, pepB, pepC, pepD, pepF及びその相同体から選択される。ある特徴において、第ニの不活性化遺伝子はapsB, cpsA, dpp4, dpp5, 及びその相同体から選択される。
【００１３】
ある実施の態様において、不活性化遺伝子は選択可能なマーカー遺伝子による分断により不活性化される。したがって、ある実施の態様においては、糸状菌細胞はさらに不活性化遺伝子の核酸配列コード領域に挿入された選択可能なマーカー遺伝子をコードする核酸配列を含む。ある実施の態様においては選択可能なマーカー遺伝子はamdSである。
【００１４】
ある実施の態様において、本発明の糸状菌細胞はまた内因性タンパク質を生成し、この細胞による内因性タンパク質の生成は、糸状菌細胞の対応する親株での内因性タンパク質の生成より少なくとも約０％から約２００％（又はこれを超える）大きい。したがって、ある実施の態様において、内因性タンパク質の生成は、糸状菌細胞の対応する親株の内因性タンパク質の生成より少なくとも約０％から１００％大きく、ある実施の態様において、少なくとも約１０％から６０％大きく、これには少なくとも約10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,及び55%大きいことを含む。ある実施の態様においては、内因性タンパク質はグルコース生成酵素、又はα―アミラーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、中性プロテアーゼ及びアルカリ  プロテアーゼから選択される酵素である。
【００１５】
ある実施の態様において、本発明の糸状菌細胞は、非相同タンパク質をコードする核酸をさらに含む。ある実施の態様においてこの非相同タンパク質の生成は、糸状菌細胞の対応する親株での同じタンパク質の生成に比べて改変されている。ある実施の態様において、非相同タンパク質は酵素であり、特にα―アミラーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼ、ラッカーゼ、中性プロテアーゼ及びアルカリ  プロテアーゼから選択される酵素である。他の実施の態様においては、前記非相同タンパク質はプロテアーゼ阻害剤、抗体又は抗体断片から選択される。
【００１６】
ある実施の態様においては、本発明の糸状菌細胞による非相同タンパク質の生成は糸状菌細胞の対応する親株中での非相同タンパク質の生成よりも少なくとも約０％から約２００％（これを超える）大きい。したがって、ある実施の態様においては、非相同タンパク質の生成は、糸状菌細胞の対応する親株での非相同タンパク質の生成より少なくとも約０％から約１００％大きく、ある実施の態様においては少なくとも約１０％から６０％大きく、少なくとも約10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,及び55%大きい実施の態様を含む。さらに、ある実施の態様においては、本発明の糸状菌細胞の全乾燥細胞の重量は、糸状菌細胞の対応する親株の全乾燥細胞重量よりも約25%, 20%, 15%, 10%, 5%より小さい割合、又はさらにそれより小さい割合で異なる。
【００１７】
他の実施の態様において、本発明は少なくとも一つの不活性化遺伝子を含む糸状菌細胞を提供し、前記不活性化遺伝子は細胞内タンパク質をコードし、そして少なくとも一つの他のタンパク質を前記細胞により生成することは、糸状菌細胞の対応する親株での前記他のタンパク質の生成より少なくとも約10%から60％（少なくとも約10％, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,及び55%を含み又はこれを超える）大きい。その生産が増加する前記他のタンパク質は内因性（すなわち、天然の）タンパク質又は非相同タンパク質であっても良く、及び/又は細胞内又は分泌されたタンパク質であっても良い。
【００１８】
他の実施の態様においては、本発明は少なくとも一つの不活性化遺伝子を含む糸状菌細胞を提供し、内因性及び/又は関心の対象である非相同タンパク質の生成は糸状菌細胞の対応する親株中の内因性及び/又は非相同タンパク質の生成よりも少なくとも約0％から100％、又はそれよりもさらに少ない。ある実施の態様においては、タンパク質の生成は対応する親株での内因性及び/又は非相同タンパク質の生成より少なくとも約１０％から６０％少なく、少なくとも約10％, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,及び55%少ないことを含む。
【００１９】
他の実施の態様においては、本発明はタンパク質を生成する方法を提供し、前記方法は（a）タンパク質をコードする核酸を糸状菌細胞に導入し、前記細胞は少なくとも一つの不活性化遺伝子を含み、前記不活性化遺伝子はapsB, apsBの相同体, cpsA, cpsAの相同体及びこれらの組み合わせから選択され、そして(b)タンパク質を生成するのに好適な条件下で細胞を生長させる、ことを含む。ある実施の態様において、前記方法はタンパク質を回収することを含む。
【００２０】
本発明のタンパク質を生成する方法は、任意の真菌細胞を使用することができ、ある実施の態様においては、本明細書で開示された任意の糸状菌を使用することができる。
【００２１】
他の実施の態様において、本発明はタンパク質の生成のための糸状菌株を作る方法を提供し、前記方法は(a)糸状菌細胞を分断配列により形質転換し、前記分断配列はapsB, apsBの相同体, cpsA, cpsAの相同体及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも一つの非相同不活性化遺伝子を含み、そして(b) 前記分断配列の染色体が一体化している形質転換された細胞を選択することを含む。
【００２２】
本発明のタンパク質の生成のための糸状菌株を生成する方法では本明細書に開示された任意の糸状菌細胞の実施の態様を用いることができる。
【００２３】
タンパク質生成のための糸状菌株を作る方法のある実施の態様においては、分断配列は不活性化遺伝子のコード領域配列中の制限部位に逆方向に挿入された選択可能なマーカー遺伝子を含む。この方法のある実施の態様においては、選択マーカー遺伝子はamdSである。ある実施の態様においては、制限部位は不活性化遺伝子中に一を超える部位を含む。
【００２４】
ある実施の態様においては、本発明は遺伝子分断配列を含む線形分断プラスミド断片を提供し、前記遺伝子はcpsA, cpsAの相同体, apsB, 及びapsBの相同体から選択され、及び前記分断配列は、遺伝子のコード領域配列の制限部位に逆方向に挿入された選択可能なマーカー遺伝子を含む、ある実施の態様においては、前記遺伝子はcpsA (配列番号1)である。ある実施の態様においては、前記遺伝子はcpsAの相同体であり、前記相同体は配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を持ち、又は配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。ある実施の態様において本発明は、線形分断プラスミド断片を提供し、前記分断配列は配列番号８と少なくとも９５％の配列同一性を持つ。ある実施の態様において、前記遺伝子はapsB (配列番号9)である。ある実施の態様において、前記遺伝子はapsBの相同体であり、前記相同体は配列番号９と少なくとも８５％の配列同一性を持ち、又は配列番号１０と少なくとも８５％の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。ある実施の態様においては、本発明は線形分断プラスミド断片を提供し、前記分断配列は配列番号１５と少なくとも９５％（又はそれを超える）の配列同一性を持つ。
【００２５】
他の実施の態様においては、本発明は遺伝子の分断配列を含むベクターを提供し、前記遺伝子はcpsA, cpsAの相同体, apsB, 及びapsBの相同体から選択され、前記分断配列は遺伝子のコード領域配列中の制限部位において逆方向に挿入された選択可能なマーカー遺伝子を含む。ある実施の態様においては、ベクターは分断配列を含み、前記分断配列は配列番号８と少なくとも９５％（又はそれを超える）の配列同一性を持つ。他の実施の態様においては、ベクターは分断配列を持ち、前記分断配列は配列番号１５と少なくとも９５％（又はそれを超える）の配列同一性を持つ。
【００２６】
発明の他の特徴として、本発明はapsB, cpsA, これらの相同配列及びこれらの組み合わせから選択される染色体性遺伝子と組み換えDNA構築体を糸状菌細胞に導入することを含み、前記染色体性遺伝子は不活性化される、組み換え糸状菌細胞を作る方法に関する。ある実施の態様においては、不活性化された遺伝子は分断され、他の実施の態様においては、不活性化された遺伝子は欠失を持つ。
【００２７】
発明の他の特徴として、本発明は糸状菌細胞の不活性化された突然変異体を生成するために有用なDNA構築体に関し、前記DNA構築体はapsB, cpsA, これらの相同体及びこれらの組み合わせの遺伝子配列の一部分を含み、介在遺伝子配列により分断されている。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１はアスペルギルス  ニガーcpsA遺伝子の2188 bpゲノムDNA配列（配列番号１）を表す。
【図２】図２はアスペルギルス  ニガーcpsAゲノムDNA（配列番号１）によりコードされた552アミノ酸配列（配列番号２）を表す。
【図３】図３は不活性化されたcpsA株を生成するのに使用されるW1単位複製配列のDNA配列（配列番号１２）を表す。
【図４】図４はNrul制限により線形にされ、アスペルギルス  ニガーを形質転換しcpsA不活性化株であるΔcpsAを生成するために使用されたpBSΔcpsA-amd分断プラスミドのプラスミドマップを表す。
【図５】図５はNrul制限により線形にされ、アスペルギルス ニガー株GICC2733を形質転換するために使用されたpBSAcpsA-amd分断プラスミドの部分のDNA配列（配列番号８）を表す。
【図６】図６は不活性化株ΔcpsAから染色体性DNAのRPC増幅に続く1378 bp単位複製配列の存在を示す電気泳動ゲルの画像を表す。レーン１は100 bp DNAラダーマーカー;  レーン２は増幅テンプレートとして使用されたアスペルギルス  ニガーΔcpsA株染色体性DNA；  レーン３は増幅テンプレートとして使用されたアスペルギルス ニガーΔdpp4/Δdpp5株染色体性DNAである。
【図７】図７はアスペルギルスニガー  アミノペプチダーゼ遺伝子apsBの3352 bpゲノムDNA配列（配列番号９）を表す。
【図８】図８は配列番号９のapsBゲノムDNA配列によりコードされる881アミノ酸配列（配列番号１０）を表す。
【図９】図９は不活性化されたapsB株を生成するのに使用されたW2単位複製配列のDNA配列（配列番号１４）を表す。
【図１０】図１０はHindlll及びPvull制限により線形にされ、アスペルギルス  ニガーを形質転換しapsBの不活性化株ΔapsBとするために使用されたpBSΔapsB-amd分断プラスミドのプラスミドマップを表す。
【図１１】図１１はHindlll及びPvull制限により線形にされ、アスペルギルス  ニガー株GICC2733を形質転換するために使用されたpBSAapsB-amd分断プラスミド部分DNA配列（配列番号１５）を表す。
【図１２】図１２は不活性化株ΔapsBの染色体性DNAのRPC増幅に続く1604 bp単位複製配列の存在を示す電気泳動ゲルの画像を表す。レーン１は100 bp DNAラダーマーカー;  レーン２は増幅テンプレートとして使用されたアスペルギルス  ニガーΔapsB株クローン＃28染色体性DNA；レーン３は増幅テンプレートとして使用されたアスペルギルス  ニガーΔapsB株クローン＃87染色体性DNA；  レーン４は増幅テンプレートとして使用されたアスペルギルス  ニガーΔapsB株クローン＃93染色体性DNA；レーン５は増幅テンプレートとして使用されたアスペルギルス  ニガーの対応する親株染色体性DNAを表す。
【発明の詳細な説明】
【００２９】
本発明は例えば、アスペルギルス細胞の様な組み換え糸状菌細胞であって、不活性化された一以上のプロテアーゼ遺伝子を持つ糸状菌細胞に関する。ある実施の態様においては、不活性化された遺伝子は、他の非相同又は内因性タンパク質を生成するために糸状菌細胞の改変された能力を持つ。ある実施の態様においては、一以上の不活性化された遺伝子を持つ細胞は非相同又は内因性タンパク質を、糸状菌細胞の対応する親株（すなわち、不活性化されていない株）により同じタンパク質を生成するよりも少なくとも約10から約６０％（又はそれより多く）生成する。
【００３０】
１．     定義
全ての特許及び公報は、その様な特許及び公報に開示されているすべての配列を含み、本明細書に引用されているものは参照により明示的に本明細書に組み入れられる。本明細書で他の意味を持つと規定されない限り、本明細書で用いられる全ての技術上及び科学上の用語は、本発明が属する技術分野の通常の知識を持ったものにより通常了解される意味と同じ意味を持つ。（例えば、Singleton他,「微生物学及び分子生物学辞典」（DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY）、第２版, John Wiley and Sons, New York [1994]; 及びHale及びMarham, 「Harper Collins 生物学辞典」（THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY）、Harper Perennial, NY [1991]）を参照。両文献は本明細書で用いられる用語の多くについて一般的な辞書を提供する）。本明細書に記載される、種々の実施の態様に類似する又は同等な方法及び材料は全て本発明の実施又は試験において使用することができる。
【００３１】
本明細書に開示されている各最大（又は最小）の数値限界値は、その様な低い（又は高い）数値限界値が、本明細書に記載されているかの様に、各低い（又は高い）数値限界値を含むことを意図している。さらに、本明細書に開示されている各数値範囲は、その様なより狭い数値範囲が明らかに本明細書に記載されているかの様に、その様な広い数値範囲に入る、各々のより狭い数値範囲を含むものとする。
【００３２】
本明細書で用いる単数形冠詞（a an）及び定冠詞（the）は、文意より明らかに他の意味に解される場合を除き、その複数の場合を含む。したがって、例えば、単数形の「宿主細胞」（a host cell）は「宿主細胞」の複数形を含む。
【００３３】
特に断らない限り、核酸は左から右ヘ、５’末端から３’末端方向に、アミノ酸配列は左から右ヘ、アミノ基からカルボキシ基方向へ各々記載される。本明細書に掲げる表題は、明細書を全体として参照することにより理解される本発明の種々の特徴又は実施の態様を限定するものではない。したがって、以下に続いて定義される用語は明細書の全体を参照することにより、より適正に定義される。
【００３４】
本明細書で用いる「不活性化」の用語は一以上の遺伝子、断片又はその相同体の機能の発現を実質的に阻害する任意の方法を言い、その場合前記遺伝子又は遺伝子製品はその知られた機能を発揮できない。欠失、タンパク質コード配列の分断、挿入、付加、変異、遺伝子抑制（例えば、RNAi遺伝子アンチセンス）等を含む遺伝子の不活性化の方法を全て含むことを意図している。したがって、「不活性化された」の用語は上に記載した「不活性化する」結果を指す。ある実施の態様においては、「不活性化する」ことによって、不活性化された遺伝子に対応する遺伝子又は遺伝子製品の検出可能な活性を持たない細胞となる。ある実施の態様においては、「不活性化する」ことは遺伝子の機能的発現が殆ど又は全く生じないが、まだ遺伝子の相同体の機能の発現を起こす。その結果「不活性化された株」は相同遺伝子により部分的に活性を示す表現型を表すこともある。
【００３５】
本明細書で用いる「不活性化された突然変異体」又は「不活性化された株」は一以上の不活性化された遺伝子を持つ宿主生物（例えば、アスペルギルスニガー細胞）を言う。この用語は不活性化された突然変異体又は不活性化された株の子孫を含むことを意図しており、元の不活性化手段に付された細胞に限定されない（例えば、当初に形質転換された細胞）。
【００３６】
ある実施の態様においては、「不活性化する」は遺伝子の欠失の結果でありこれらの不活性化された突然変異体は時には「欠失変異体」と呼ばれる。他の実施の態様においては、不活性化するは遺伝子のタンパク質コード配列の分断の結果であり、これらの不活性化された突然変異体は時には「分断変異体」と呼ばれる。ある実施の態様においては、不活性化は復帰不可能である。
【００３７】
本明細書で用いる遺伝子の「欠失」は全コード配列の欠失、コード配列の一部の欠失又は隣接領域を含むコード配列の欠失を言う。
【００３８】
本明細書で用いる「分断」は一以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基をそれぞれ挿入することによる親又は自然発生の配列に比べた場合のヌクレオチド又はアミノ酸配列変化を言う。したがって、本明細書で用いる「分断配列」又は「分断突然変異体」は核酸又はアミノ酸配列、典型的にはヌクレオチド又はアミノ酸の挿入を含むコード領域配列を言う。
【００３９】
本明細書で用いる「挿入」又は「付加」は配列について言う場合、内生する染色体配列又はタンパク質産物に比較して、一以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基が付加された核酸又はアミノ酸配列の変化を言う。
【００４０】
本明細書で用いる「復帰不可能な」（付可逆の）はその対応する親株に自然に復帰する頻度が１０-7より小さい株を言う。
【００４１】
本明細書で用いる「対応する親株」は不活性化された突然変異体が由来する宿主株を言う（例えば、元の及び/又は野生型株）。
【００４２】
本明細書で用いる「株の生存能力」は再生能力を言う。ある実施の態様においては、遺伝子の不活性化は、実験室条件では不活性化された突然変異体の分裂及び生存に有害な影響を与えない。
【００４３】
本明細書で用いる「コード領域」はタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子の領域を言う。
【００４４】
本明細書で用いる「アミノ酸」はペプチド又はタンパク質の配列又はその部分を言う。「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は相互交換的に用いられる。
【００４５】
本明細書で用いる「非相同タンパク質」又は「外生的タンパク質」は宿主細胞中で天然に発生しないタンパク質又はポリペプチドを言い、自然に生ずる内生的タンパク質が遺伝子工学により操作されたものを含む。
【００４６】
本明細書で用いる「内生的タンパク質」又は「天然のタンパク質」は細胞中で自然に生じるタンパク質又はポリペプチドを言う。
【００４７】
本明細書で用いる「宿主」、「宿主細胞」又は「宿主株」は細胞中に導入され
るDNAを発現させることのできる細胞を言う。本発明のある実施の態様におい
ては、宿主細胞はアスペルギルス種である。
【００４８】
本明細書で用いる「糸状菌細胞」は多細胞糸状鎖として成長する任意の種類の微小な真菌の細胞を言い、アスペルギルス種、リゾプス種、トリコデルマ種及びムコール種を含むがこれに限定されるものではない。
【００４９】
本明細書で用いる「アスペルギルス」又は「アスペルギルス種」は当業者に知られたアスペルギルス属内の全ての種を含み、A.  ニガー、A. オリザ、A.アワモリ、A.  カワチ及びA.  ニデュランスを含むがこれに限定されるものではない。
【００５０】
本明細書で用いる「核酸」の用語は、センス又はアンチセンス鎖を表すかを問わず、二重鎖であるか又は単鎖であるゲノム又は合成されたDNA, cDNA及びRNAのみならず、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列及びそれらの断片を指す。遺伝子コードの退化の結果として、多くのヌクレオチド配列があるタンパク質をコードすることもあると理解される。
【００５１】
本明細書で用いる「遺伝子」はポリペプチドを生成することに関与するDNAのセグメントを意味し、個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）のみならず、コード領域（例えば、プロモータ、ターミネータ、５’非翻訳配列（５’UTR）又はリーダー配列及び３’非翻訳配列（３’UTR）又はトレーラー配列に先行し及び続く領域）を含むことができる。
【００５２】
本明細書で用いる「相同遺伝子」又は「遺伝子相同体」又は「相同体」は相同配列を持ち、同一又は類似の機能を持つタンパク質となる遺伝子を言う。この用語は種の分科により分離される遺伝子（すなわち、新種の発育）（例えば、オ‐ソロガス遺伝子）並びに遺伝子の複製（例えば、パラロガス遺伝子）により分離された遺伝子を含む。
【００５３】
本明細書で用いる「相同配列」は、比較のため最適にアラインされた場合、主題のヌクレオチド又はアミノ酸配列と少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８８％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％配列同一性を持つ核酸又はポリペプチド配列を言う。ある実施の態様においては、相同配列は約８０％から約１００％配列同一性を持ち、ある実施の態様においては、約９０％から約１００％配列同一性を持ち、またある実施の態様においては、約９５％から約１００％配列同一性を持つ。
【００５４】
配列の相同は技術分野で知られている標準技術を用いて決定することができる（例えば、Smith及びWaterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981 ]; Needleman 及びWunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson 及びLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; Wisconsin Genetics Software PackageにおけるGAP, BESTFIT, FASTA, TFASTAの様なプログラム(Genetics Computer Group, Madison, Wl); 及びDevereux他, Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984]を参照)。
【００５５】
配列の相同性を決定する有用なアルゴリズムには以下を含む：PILEUP及びBLAST (Altschul他, J. Mol. Biol., 215:403-410, [1990];  及びKarlin他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993])。PILEUPはFeng 及びDoolittleの漸進的 アラインメント法を単純化したものを用いる(Feng及びDoolittle, J. Mol. Evol., 35:351 -360 [1987])。この方法はHiggins及び Sharp (Higgins及びSharp, CABIOS 5:151 -153 [1989])が記述するものに類似する。
【００５６】
有用なPILEUPパラメーターはデフォールト  ギャップ  ウエイト３．００、ギャップ  長さ０．１０及び加重末端ギャップを含む。
【００５７】
特に有用なBLASTプログラムはWU-BLAST-2プログラムである（Altschul他, Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996]を参照)。WU-BLAST-2はいくつかのサーチパラメーターを用いるが、その大半はディフォールト値に設定される。調整可能なパラメーターは以下の値に設定される：重複スパン（overlap span）＝１、重複分画(overlap fraction)＝０．１２５、ワード限界値（word threshold）(T)=11。HSP及びHSP  S2パラメーターは動的な値であり、特定の配列の組成物及び関心の対象となる配列が調査される特定のデータベースの組成物に基づくプログラム自体により決められる。しかし、その値は感度を増す様に調整しても良い。A％のアミノ酸配列の同一性の値はアラインされた領域中のマッチする同一である残基の数を「より長い」配列の全残基の数で除して決定される。「より長い」配列はアライン領域で最も活性のある残基を持つものである（アラインスコアー数を最大にするためにWU-BLAST-2により導入されたギャップは無視した）。
【００５８】
本明細書で用いる「ベクター」の用語は細胞で複製することができ、そして新しい遺伝子又はDNAセグメントを細胞に運ぶことのできる全ての核酸を言う。したがって、この用語は異なる宿主細胞間を移動する様に設計された核酸構築体を言う。「発現ベクター」は非相同DNA断片（例えば、非天然DNA）を細胞に組み入れ且つ発現させる能力をもつベクターを言う。多くの原核及び真核発現ベクターは市場で購入が可能である。適当な発現ベクターは当業者が容易に選択することが可能である。
【００５９】
本明細書で用いる「DNA構築体」、「発現カセット」及び「発現ベクター」は標的細胞中で特定の核酸の転写を許す一連の特定の核酸要素を用いて（すなわち、上で述べたベクター又はベクター要素）組み換えにより又は合成により生成された核酸分子を言う。例えば、発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウイルス、又は核酸断片に組み入れることもできる。通常発現ベクターの発現カセット部分は、他の配列中でも、転写される核酸配列、プロモータ及びターミネーターを含む。ある実施の態様においては、DNA構築体はまた標的細胞中で特定の核酸の転写を許す一連の特定の核酸要素を含む。ある実施の態様においては、本発明のDNA構築体は選択可能なマーカーを含む。
【００６０】
また本明細書で用いる「DNA構築体」（及び「形質転換DNA」及び「形質転換配列」）は宿主細胞又は有機体に配列を導入する（すなわち、宿主細胞を形質転換する）ために用いられるDNAを言う。このDNA構築体はPCR又は任意の他の好適な技術によりインビトロで生成しても良い。ある実施の態様においては、形質転換DNAは入ってくる配列を含み及び/又はホモロジーボックス（homology box）が側面に位置する、入ってくる配列を含んでも良い。さらにある実施の態様においては、形質転換DNAはその末端に加えられている、他の非相同配列を含む（例えば、スタッファー配列又は隣接部分）末端は閉じたものでもよく、それによって形質転換DNAは、例えば、ベクターへの挿入の様に閉じた回路（例えば、プラスミド）を形成する。
【００６１】
本明細書で用いる「プラスミド」の用語はクローニングベクターとして使用される環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築体を言い、多くのバクテリア及び幾つかの真核生物において染色体外の自己複製遺伝要素を形成する。ある実施の態様においては、プラスミドは宿主細胞のゲノムに組み入れられる。
【００６２】
本明細書で用いる「単離された」及び「精製された」の用語はその分子が天然に関連する少なくとも一つの他の成分から除去された分子（例えば、核酸又はポリペプチド）又は他の成分を指すのに使用される。
【００６３】
本明細書で用いる「改変された発現」は、対応する改変されていない親株（すなわち、本質的に同じ条件で成長させた場合）からの通常のレベルの生産と比較した改変された（すなわち、操作された）細胞株による、関心の対象であるタンパク質の生産の増加又は減少を含むと理解される。
【００６４】
本明細書で用いる「増強された発現」の用語は、対応する改変されていない親株（すなわち、本質的に同じ条件で成長させた場合）での通常のレベルの生産と比較して、改変された（すなわち、操作された）細胞株により、関心の対象であるタンパク質の生産の増加を含むと理解される。
【００６５】
本明細書で用いる「発現」はポリペプチドが生成されるプロセスを言う。このプロセスは遺伝子の転写及び翻訳の両方を含む。ある実施の態様においては、前記プロセスはまたポリペプチドの分泌を含む。
【００６６】
本明細書で用いる「細胞に核酸配列を導入する」の文意における「導入する」（及び過去形の「導入した」）の用語は核酸配列を細胞に移入するために好適な任意の方法を言い、形質転換、電気穿孔法、核ミクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション（例えば、リポフェクション介在及びDEAE-デキストリン介在トランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物による培養、ＤＮＡ被覆ミクロ発射体による高速度衝撃、アグロバクテリウム介在形質転換及びプロトプラスト融合を含むがこれに限定されるものではない。
【００６７】
本明細書で用いる「安定的に形質転換された」の用語は、ゲノムに統合された非天然（非相同）ポリヌクレオチド配列又は少なくとも２代に渡り維持されたエピトームプラスミドとして統合された細胞を言う。
【００６８】
本明細書で用いる「入ってくる配列」の用語は宿主細胞に導入されつつあるＤＮＡ配列を言う。入ってくる配列はＤＮＡ構築体の一部であり、関心の対象である一以上のタンパク質（例えば、非相同タンパク質）をコードすることができ、機能的又は機能を持たない遺伝子及び/又は変異した又は修飾された遺伝子、及び/又は選択可能なマーカー遺伝子であっても良い。例えば、入ってくる配列はapsB, cpsA, derA, derB, htmA, mnn9, mnn10, ochA, dpp4, dpp5, pepAa, pep Ab, pepAc, pepAd, pepF, pepB, pepC, pepD,  それらの断片及び相同配列から選択される機能的又は機能を持たない（例えば、分断された）遺伝子を含んでも良い。ある実施の態様においては、入ってくる配列は２つのホモロジーボックスを含む。
【００６９】
本明細書で用いる「ホモロジーボックス」は糸状菌細胞の染色体の遺伝子配列に相同の核酸配列を言う。より具体的にはホモロジーボックスは、本発明の不活性化される遺伝子又は遺伝子の一部の直接隣接するコード領域と約８０から１００％の配列同一性、約９０から１００％の配列同一性、約９５から１００％の配列同一性を持つ上流又は下流領域である。これらの配列は染色体の何処にＤＮＡ構築体、又は入ってくる配列が統合されるかを指示し、また染色体のどの部分がＤＮＡ構築体又は入ってくる配列により置換されるかを指示する。本発明の範囲を限定するものではないが、ホモロジーボックスは約１塩基ペアー（ｂｐ）から２００キロ塩基（ｋｂ）の間の塩基ペアーを含むこともある。通常、ホモロジーボックスは略1 bp及び10.0 kbの間; 1 bp及び5.0 kbの間; 1 bp及び2.5 kbの間; 1 bp及び1 .0 kbの間, 並びに0.25 kb及び2.5 kbの間の塩基ペアーを含む。ホモロジーボックスはまた約10.0 kb, 5.0 kb, 2.5 kb, 2.0 kb, 1 .5 kb, 1 .0 kb, 0.5 kb, 0.25 kb 及び0.1 kbを含むこともある。ある実施の態様においては、選択マーカーの5' 及び3'末端はホモロジーボックスが隣接しており、そこではホモロジーボックスは遺伝子のコード領域にすぐ隣接する核酸配列を含む。
【００７０】
他の代替的な実施の態様においては、形質転換するＤＮＡ配列には入ってくる配列が存在しないホモロジーボックスを含む。この実施の態様においては、２つのホモロジーボックスの間の内因性ＤＮＡ配列を取り除くことが望ましい。さらに、ある実施の態様においては、形質転換配列は野生型であり、他の実施の態様においては、それらは変異体又は修飾された配列である。さらにある実施の態様においては、形質転換配列は相同であり、他の実施の態様においては、それらは非相同である。
【００７１】
本明細書で用いる「標的配列」の用語は入ってくる配列が宿主細胞ゲノムに挿入されることが好ましい配列をコードする宿主細胞のＤＮＡ配列を言う。ある実施の態様においては、標的配列は機能的野生型遺伝子又はオペロンをコードし、他の実施の態様においては、標的配列は機能的突然変異体遺伝子又はオペロン又は非機能的遺伝子又はオペロンをコードする。
【００７２】
本明細書で用いる「フランキング配列」（隣接配列）は、議論対象とする配列の上流又は下流にある任意の配列を言う（例えば、Ａ−Ｂ−Ｃ遺伝子において、Ｂ遺伝子はＡ及びＣ遺伝子が隣接している）。ある実施の態様においては、入ってくる遺伝子の両側にホモロジーボックスが隣接する。他の実施の態様においては、入ってくる配列及びホモロジーボックスは両側にスタッファー配列が隣接するユニットを含む。ある実施の態様においては、フランキング配列は唯一つの側（３’又は５’）に存在し、他の実施の態様においては、フランキング配列はその隣接する両側にある。各ホモロジーボックスの配列はアスペルギルス染色体中の配列に相同である。これらの配列はアスペルギルス染色体中で新しい構築体が統合される場所及びアスペルギルス染色体の一部であって入ってくる配列により置換される部分を示す。ある実施の態様においては、これらの配列はアスペルギルス染色体中で新しい構築体が、前記染色体のいずれの部分も入ってくる配列により置換されずに統合される場所を示す。ある実施の態様においては、選択マーカーの５’及び３’末端は不活性化する染色体セグメントのある部分を含むポリヌクレオチド配列が隣接する。ある実施の態様においては、フランキング配列は唯一つの側（３’又は５’）に存在し、他の実施の態様においては、フランキング配列はその隣接される配列の両側にある。
【００７３】
本明細書で用いる「染色体が統合された」の用語は、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み入れられた配列、典型的には突然変異体遺伝子（例えば、天然遺伝子の分断された形）を言う。典型的には、染色体の統合は「相同的組換え」のプロセスを経て起き、その場合導入された（形質転換する）ＤＮＡの相同領域は宿主染色体の相同領域とアラインする。続いて相同領域の間の配列はダブルクロスオーバーで入ってくる配列により置換される。この様に「染色体が統合された」の用語は本明細書では「相同的組換え」又は「相同的統合」と相互交換的に用いられる。
【００７４】
本明細書で用いる「選択可能なマーカー」及び「選択マーカー」は宿主細胞中で発現可能な核酸を言い、それはマーカーを含むこれらの宿主の選択を容易にする。このように「選択可能なマーカー」は、宿主細胞が、入ってくる関心の対象である核酸（例えば、不活性化された遺伝子）を取り上げた（例えば、それによって形質転換が旨くなされた）こと又は他の反応が起きたことを示す指標を提供する遺伝子を言う。通常、選択可能なマーカーは抗菌耐性又は代謝上の有利な点を宿主細胞に与え、外来性ＤＮＡを含む細胞を、形質転換中にいずれの外因性配列も受け取らなかった細胞から区別する。本発明で有用な選択マーカーは抗菌耐性マーカー（例えば、ampR; phleoR; specR; kanR; eryR; tetR; cmpR; hygroR 及びneoR; 例えば、Guerot-Fleury, Gene, 167:335-337 [1995]; Palmeros 他 Gene 247:255-264 [2000];及びTrieu-Cuot 他, Gene, 23:331 -341 [1983]を参照)、栄養要求性マーカー、例えば、トリプトファン、pyrG及びamdS及び検出マーカー、例えば、β―ガラクトシダーゼを含むが、これに限定されるものではない。
【００７５】
「在住する選択可能なマーカー」は、形質転換される微生物の染色体に位置する選択可能なマーカーである。在住する選択可能なマーカーは形質転換ＤＮＡ構築体上の選択可能なマーカーと異なる遺伝子をコードする。
【００７６】
本明細書で用いる「プロモータ」の用語は下流の遺伝子の転写を指揮する機能を持つ核酸配列を言う。ある実施の態様においては、プロモータは所望の遺伝子が発現される宿主細胞に適している。プロモータは他の転写及び翻訳調節核酸配列（また「制御配列」とも呼ばれる）とともにある遺伝子を発現させるために必要である。一般的に転写及び翻訳調節配列は、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終了配列、翻訳開始及び終了配列、及びエンハンサー又は活性化配列を含むがこれに限定されるものではない。
【００７７】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係に置かれた場合「動作可能にリンクされた」状態である。例えば、分泌リーダー（すなわち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、もしそれがポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのDNAに動作可能にリンクされており；プロモータ又はエンハンサーは、もしそれが配列の転写に影響する場合、コード配列に動作可能にリンクされており；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を促進する様に位置している場合は、コード配列に動作可能にリンクされている。一般的に「動作可能にリンクされた」の意味は、リンクされたDNA配列が連続していることを言い、分泌リーダーの場合、連続しそして読み取り相にある。しかし、エンハンサーは連続である必要はない。リンクは都合の良い制限部位において結紮により完了する。もしその様な部位が存在しない場合は、通常の慣例に倣って合成オリゴヌクレオチド  アダプター又はリンカーが使用される。
【００７８】
本明細書で用いる「ハイブリッド形成（ハイブリダイゼ‐ション）」の用語は、技術分野で知られている様に、核酸鎖が塩基ペアーを通して相補鎖と結合するプロセスを言う。
【００７９】
２つの配列が中程度から高度に厳格なハイブリダイゼ‐ション及び洗浄条件で特異にお互いにハイブリダイズする場合、核酸配列が参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」と考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Tm）に基づく。例えば、「最高度に厳格」は通常約Tm−５℃（プローブのTmより５℃低い）；「高度に厳格」はTmより約５−１０°低く；「中程度に厳格」はTmより約１０−２０°低く；そして「低レベルの厳格」はTmより約２０−２５℃低い温度で起きる。機能的には最高度に厳格な条件はハイブリダイゼーションプローブと厳格な同一性又は厳格に近い同一性を持つ配列を同定するのに使用されることもあり、一方中程度に厳格又は低レベルの厳格なハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列相同体の同定又は検出に使用することができる。
【００８０】
中程度及び高度に厳格なハイブリダイゼーション条件は技術分野で良く知られている。高度に厳格なハイブリダイゼーション条件の例は、約42℃で、50%ホルムアルデヒド、5X SSC, 5X デンハ‐ト溶液、0.5% SDS及び100 μg/ml変性したキャリアーDNAでハイブリダイゼーションさせることを含み、続いて2X SSC及び0.5% SDSで室温で２度洗浄し、さらに0.1 X SSC及び0.5% SDS 中で42℃で２度洗浄する。中程度に厳格なハイブリダイゼーション条件の例は、20%ホルムアルデヒド, 5 x SSC (150mM NaCl, 15 mM クエン酸三ナトリウム), 50 mMリン酸ナトリウム (pH 7.6), 5 x デンハ‐ト溶液, 10%硫酸デキストラン及び20 mg/mlで変性され、せん断した鮭の精子DNAを含む溶液中において３７℃で一夜培養することを含み、続いて約37 - 50℃の1 x SSCでろ過洗浄する。当業者は温度、イオン強度などを必要に応じてプローブ長さなどに応じてどのように調整するが知っている。
【００８１】
本明細書で用いる細胞又はベクターに関して用いる「組み換え」の用語は、非相同核酸配列の導入により修飾されること又はその様に修飾された細胞に由来する細胞について言う。このように、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然にある形式（非組み換え）と同一の形式に見られない遺伝子を発現させ、又は、異常に発現し、発現不足であり、過度に発現し、又は全く発現しない天然の遺伝子を人が人為的に介入することにより発現させる。「組み換え」、「組み換える」又は「組み換えられた」核酸を生成することは、通常２以上の核酸の断片を組み立てることを言い、この組み立てることによりキメラ遺伝子を生みだす。
【００８２】
本明細書で用いる「プライマー」の用語は、精製された制限消化で天然に発生するか、又は合成で生成されるかを問わず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長製品の合成が誘発される条件（すなわち、ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼの様な誘発剤の存在及び好適な温度及びｐHで）に置かれた場合に、合成の開始点として作動することのできるオリゴヌクレオチドを言う。通常プライマーは増幅で最大の効率を得るために単一鎖である。プライマーがオリゴデオキシリボヌクレオチドであることが最も多い。
【００８３】
本明細書で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）の用語は一対のプライマー、DNAポリメラーゼを用いてDNA鎖を増幅し、そしてDNAポリメリゼーション、融解及びアニーリングのサイクルを繰り返す方法を言う（例えば、米国特許番号第4,683,195号、第4,683,202号及び第4,965,188号を参照願いたい。これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。）
本明細書で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」の用語は細菌酵素を言い、それらはいずれも特定のヌクレオチド配列において又はその近辺において二重鎖を切断する。
【００８４】
「制限部位」は、ある制限エンドヌクレアーゼにより認識されそして開裂されたヌクレオチド配列を言い、そして、それはしばしばDNA断片の挿入部位である。本発明のある実施の態様においては、制限部位は遺伝子操作によって選択マーカー及びDNA構築体の5' 及び3'末端に挿入される。
【００８５】
II．本発明の一般的方法及び実施の態様
本発明は、関心の対象であるタンパク質を生成することのできる、不活性化された突然変異体（例えば、欠失変異体及び分断変異体）を提供する。特に、本発明は関心の対象であるタンパク質が改変された発現をするアスペルギルス種の様な組み換え糸状菌微生物に関し、その場合一以上の染色体遺伝子が不活性化され、そして典型的には、一以上の染色体遺伝子がアスペルギルス染色体から欠失されており、又は一以上の染色体遺伝子のタンパク質コード領域が分断されている。事実、本発明は単一又は複数遺伝子を欠失させる方法を提供する。ある実施の態様においては、その様な欠失は関心の対象であるタンパク質の改良された生成の様な有利な点を提供する。
【００８６】
本発明のある特徴は、本発明は遺伝子工学及び分子生物学の分野の通常の技術及び方法をベ‐スにしていることである。以下の資料は本発明で有用な一般的な方法についての記載を含む：Sambrook他,  「分子クローニング：実験室マニュアル」（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL） (第２版, 1989); Kreigler, 遺伝子導入及び発現：実験室マニュアル（GENE TRANSFER AND EXPRESSION; A LABORATORY MANUAL） (1990)及びAusubel他編纂、 分子生物学における現代のプロトコール（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY） (1994)。これらの一般的な参照文献は技術分野で知られている各定義及び方法を提供する。しかし、方法、プロトコール及び挙げられた試薬は変わりうるため、本発明はこれらの特定のものに限定されるものではない。
【００８７】
不活性化遺伝子
上で示したように、本発明は単一又は複数のプロテアーゼ遺伝子不活性化を持つ糸状菌細胞を含み、不活性化された遺伝子はapsB, apsBの相同体, cpsA, cpsAの相同体,及びこれらの組み合わせから選択される。遺伝子は遺伝子の欠失又は遺伝子の分断を用いて不活性化しても良い。ある実施の態様においては、不活性化された遺伝子は不可逆である。
【００８８】
ある実施の態様においては、不活性化された遺伝子はapsBの相同体又はcpsAの相同体である。本発明で有用な相同体はapsB又はcpsAと同じ又は同様の機能を持ち、少なくとも99%、少なくとも98%、少なくとも97%、少なくとも96%、少なくとも95%、少なくとも94%、少なくとも93%、少なくとも92%、少なくとも91 %、少なくとも90%、少なくとも88%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも70% 又は少なくとも60%の配列同一性を持つ。
【００８９】
cpsA 遺伝子（配列番号 1 ) は、分泌されたタンパク質と信じられているアミノ酸配列（配列番号２）を持つアスペルギルス  ニガー  カルボキシペプチダーゼ酵素をコードする。
【００９０】
apsB遺伝子（配列番号９）は、細胞内タンパク質（すなわち、細胞により分泌されたものではない）であるアミノ酸配列（配列番号１０）を持つアスペルギルス  ニガー  アミノペプチダーゼをコードする。
【００９１】
ある実施の態様においては、糸状菌細胞は追加の不活性化遺伝子を持つこともある。追加の不活性化遺伝子はER分解経路のタンパク質の様な、タンパク質分解又はタンパク質修飾に関与する遺伝子、プロテアーゼ遺伝子、例えば、分泌されたセリン及びアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子、グリコシル化遺伝子及びグリコタンパク質分解遺伝子を含むがこれに限定されるものではない。
【００９２】
ある実施の態様においては、追加の不活性化遺伝子は次の一以上のものから選択しても良い：derA, derB, htmA, mnn9, mnn10, ochA, dpp4, dpp5, pepF, pep Aa, pepAb, pepAc及びpepAd。一以上のこれらの不活性化された遺伝子を持つ糸状菌細胞を生成し、そして使用する方法のみならず、これらの遺伝子の種々のコード配列及び機能は米国特許出願公開公報2006/0246545に記載されており、本文献は参照により本明細書に組み入れられる（また Wang他、「アスペルギルス  ニガーの４つのペプシン類似のプロテアーゼ遺伝子の単離及び非相同ラッカーゼ発現での分断の効果の分析」（Isolation of four pepsin-like protease genes from Aspergillus niger and analysis of the effect of disruptions on heterologous laccase expression）、Fungal Genet. Biol. 45(1 ): 17-27 (2008年１月）を参照。本文献は参照により本明細書に組み入れられる)。
【００９３】
ある実施の態様においては、本発明の不活性化された遺伝子を持つ糸状菌細胞は２以上（例えば、２，３又は４）の不活性化遺伝子を含むこともある。
【００９４】
ある実施の態様においては、糸状菌細胞は追加の不活性化遺伝子を持つこともある。追加の不活性化遺伝子はER分解経路のタンパク質の様な、タンパク質分解又はタンパク質修飾に関与する遺伝子、プロテアーゼ遺伝子、例えば、分泌されたセリン及びアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子、グリコシル化遺伝子及びグリコタンパク質分解遺伝子含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様においては、追加の不活性化遺伝子は次の一以上のものから選択しても良い：derA, derB, htmA, mnn9, mnnW, ochA, dpp4, dpp5, pepF, pepAa, pepAb, pepAc 及びpepAd。一以上のこれらの不活性化された遺伝子を持つ糸状菌細胞を生成し、そして使用する方法のみならず、これらの種々のコード配列及び機能は米国特許出願公開公報2006/0246545に記載されており、本文献は参照により本明細書に組み入れられる（また Wang他、「アスペルギルス  ニガーの４つのペプシン類似のプロテアーゼ遺伝子の単離及び非相同ラッカーゼ発現での分断の効果の分析」（Isolation of four pepsin-like protease genes from Aspergillus niger and analysis of the effect of disruptions on heterologous laccase expression）、Fungal Genet. Biol. 45(1 ): 17-27 (2008年１月）を参照。本文献は参照により本明細書に組み入れられる)。
【００９５】
ある実施の態様においては、本発明の不活性化遺伝子を持つ糸状菌細胞は２以上（例えば、２、３又は４）の不活性化遺伝子を持つ。
【００９６】
ある実施の態様においては、本発明の不活性化遺伝子を持つ糸状菌細胞はapsB, apsBの相同体, cpsA, 及びcpsAの相同体から選択された少なくとも一つの遺伝子及びderA, derB, htmA, mnn9, mnn10, ochA, dpp4, dpp5, pepF, pepAa, pepAb, pepAc及びpepAd及びそれらの組み合わせから選択された少なくとも一つの遺伝子を含み、それと機能的に相同の配列は、それらと少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８８％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約６０％配列同一性を持つ。
【００９７】
さらに不活性化遺伝子derA, derB, htmA, mnn9, mnn10, ochA, dpp4, dpp5, pepF, pepAa, pepAb, pepAc及びpepAdで、特に米国特許出願公報2006/0246545に開示されたものは、本明細書に開示された不活性化apsB及び/又はcpsA遺伝子と組み合わせて、２以上の不活性化遺伝子を持つ糸状菌細胞を提供することができる。ある実施の態様においては、糸状菌細胞は、不活性化apsB及び/又はcpsAプロテアーゼ遺伝子に加えて不活性化ジペプチドープロテアーゼ遺伝子dpp4及びdpp5を持っても良い。ある実施の態様においては、本発明の糸状菌細胞は不活性化apsB及び/又はcpsAプロテアーゼ遺伝子に加えて、一以上の不活性化ペプシン類似のアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子pepAa, pepAb, pepAc及び/又はpepAdを含んでも良い。ある実施の態様においては、本発明の糸状菌細胞は不活性化遺伝子を持つ糸状菌細胞はapsB, apsBの相同体, cpsA, 及びcpsAの相同体から選択された少なくとも一つの遺伝子、及びderA, derB, htmA, mnn9, mnn10, ochA, dpp4, dpp5, pepF, pepAa, pepAb, pepAc及びpepAd及びそれらの組み合わせから選択された少なくとも一つの遺伝子を含み、それと機能的に相同の配列は、それらと少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８８％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約６０％配列同一性を持つ。
【００９８】
さらに、不活性化遺伝子derA, derB, htmA, mnn9, mnn10, ochA, dpp4, dpp5, pepF, pepAa, pepAb, pepAc及びpepAdで、特に米国特許出願公報2006/0246545に開示されたものは、本明細書に開示された不活性化apsB及び/又はcpsA遺伝子と組み合わせて、２以上の不活性化遺伝子を持つ糸状菌細胞を提供することができる。ある実施の態様においては、糸状菌細胞は、不活性化apsB及び/又はcpsAプロテアーゼ遺伝子に加えて不活性化ジペプチドープロテアーゼ遺伝子dpp4及びdpp5を持っても良い。ある実施の態様においては、本発明の糸状菌細胞は不活性化apsB及び/又はcpsAプロテアーゼ遺伝子に加えて、一以上の不活性化ペプシン類似のアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子pepAa, pepAb, pepAc及び/又はpepAdを含んでも良い。
【００９９】
ある実施の態様においては、糸状菌細胞に見いだされるapsB及びcpsAに相同な遺伝子は本発明で使用される。特に本発明に開示される不活性化遺伝子を持つ糸状菌細胞を生成する方法は、不活性化されたapsB及びcpsAこれらの天然の相同体で突然変異体株を不活性化するために使用しても良い。ある実施の態様においては、apsB及びcpsAのこれらの相同遺伝子は配列番号１（cpsA）又は配列番号８（apsB）と少なくとも約60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%又はそれを超えるパーセントの配列同一性を持つ。
【０１００】
不活性化の方法及びＤＮＡ構築体
遺伝子不活性化（例えば、分断配列）のためのＤＮＡ構築体の生成及び遺伝子不活性化を検出するために糸状菌細胞（例えば、アスペルギルスニガー）において遺伝子を同定して不活性化にするための有用な方法は２００６年１１月２日に公開された米国特許出願公報20060246545 A1に開示されている。同文献は参照により本明細書に組み入れられる（また、Wang他による「アスペルギルス  ニガーから4つのペプシン類似のプロテアーゼ遺伝子の単離及び非相同ラッカーゼ発現における分断の効果の分析」（Isolation of four pepsin-like protease genes from Aspergillus niger and analysis of the effect of disruptions on heterologous laccase expression）Fungal Genet. Biol. 45(1 ): 17-27 （2008年１月)を参照。同文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０１】
宿主細胞から相同配列を決定する方法は技術分野で良く知られており、本明細書に開示されている核酸配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを構築することを含み、前記プローブはコードされたタンパク質の約６−２０のアミノ酸に対応する。前記プローブはその後相同体遺伝子をクローンするために使用しても良い。糸状菌宿主ゲノムＤＮＡは適当な制限酵素により単離されそして消化される。断片は分離され、標準的方法を用いてタンパク質分解配列から生成されたオリゴヌクレオチドプローブによりプローブされる。オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより同定されたＤＮＡセグメントに対応する断片が単離され、適当なベクターに結紮され、そしてその後宿主に形質転換されDNAクローンを生成する。
【０１０２】
ある実施の態様においては、本発明で有用なapsB又はcpsAの遺伝子相同体は、糸状菌細胞（例えば、アスペルギルス種）中に見いだされるタンパク質であっても良く、各apsB (配列番号10)又はcpsA (配列番号2)とアミノ酸配列が少なくとも約60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%、又はそれより大きい同一性を持つ。ある実施の態様においては、機能的に相同なヌクレオチド又はアミノ酸配列は連する糸状菌種（例えば、アスペルギルス  ニガー、アスペルギルス  オリゼ）に見出され、apsB (配列番号９又は10) 又はcpsA (配列番号１又は2)と少なくとも約80%, 85%, 90%、又は、また少なくとも約95%の配列同一性を持つ。また他の実施の態様においては、本発明で有用な遺伝子相同体は、配列番号10又は配列番号2とアミノ酸配列において、一以上の保存アミノ酸配列が置換されている点で異なっている配列を持つことがある。その様な実施の態様においては、保存アミノ酸配列の置換はグリシン及びアラニンのグループ、イソロイシン及びロイシンのグループ、アスパラギン酸及びグルタミン酸のグループ、アスパラギン及びグルタミンのグループ、セリン及びトレオニンのグループ、トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンのグループ、並びにリシン及びアルギニンのグループを含むがこれに限定されるものではない。
【０１０３】
ある実施の態様においては、本発明は入ってくる配列（例えば、分断配列）を含むDNA構築体を含む。DNA構築体はインビトロで組み立てられ、続いて構築体を有能な宿主（例えば、アスペルギルス宿主）に直接クローニングするため、DNA構築体は宿主染色体に組み込まれる。例えば、PCR融合及び/又は結紮がDNA構築体をインビトロで組み立てるために用いることができる。
【０１０４】
ある実施の態様においては、DNA構築体は非プラスミド構築体であり、他の実施の態様においては、それはベクター（例えば、プラスミド）に組み入れられる。ある実施の態様においては、環状プラスミドが使用される。他の実施の態様においては、環状プラスミドは適当な制限酵素（すなわち、DNA酵素を分断しない酵素）を用いる様にデザインされる。この様に、線形プラスミドは本発明で使用される。
【０１０５】
ある実施の態様においては、入ってくる配列はapsB 遺伝子, cpsA遺伝子, apsB又はcpsAと相同配列, apsB又はcpsAの遺伝子断片; 及び/又は染色体コード領域に直接隣接する配列を含む。相同体配列は、apsB又はcpsAと類似又は同等の機能を持つタンパク質をコードし、且つapsB又はcpsA遺伝子又はその遺伝子断片と少なくとも約99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94% 93%, 92%, 91 %, 90%, 88%, 85%, 80%, 70%,又は60%の配列同一性を持つ核酸配列である。
【０１０６】
ある実施の態様においては、ゲノムDNAが既に知られている場合、欠失を受ける遺伝子の５’隣接断片及び３’隣接断片は２つのPCR反応でクローンされ、前記遺伝子が分断されている実施の態様においては、前記DNA断片は一つのPCR反応によりクローンされる。
【０１０７】
ある実施の態様においては、コード領域隣接配列は約1 bpから2500 bp; 約1 bpから1500 bp, 約1 bpから1000 bp, 約1 bpから500 bp, 及び1 bpから250 bp
の範囲を含む。コード領域隣接配列を含む核酸配列の数は遺伝子コード配列の各末端で異なる。例えば、ある実施の態様においては、コード配列の５’末端は２５未満のｂｐであり、コード配列の３’末端は１００を超えるｂｐである。
【０１０８】
ある実施の態様においては、入ってくる配列は遺伝子配列の断片を持つ５’末端及び３’末端に隣接する選択マーカーを含む。他の実施の態様においては、選択マーカー及び遺伝子を含むDNA構築体、遺伝子断片又はそれに相同する配列が宿主細胞に形質転換される場合、選択マーカーの位置は遺伝子をその意図される目的のために機能しない様にする。ある実施の態様においては、入ってくる配列は遺伝子のプロモータ領域にある選択マーカーを含む。他の実施の態様においては、入ってくる配列は遺伝子のプロモータ領域の後に位置する選択マーカーを含む。
【０１０９】
さらに他の実施の態様においては、入ってくる配列は遺伝子のコード領域に位置する選択マーカーを含む分断配列である。さらなる実施の態様では、入ってくる配列は両端にホモロジーボックスが隣接する選択マーカーを含む。さらに他の実施の態様においては、入ってくる配列はコード配列の転写及び/又は翻訳を中断する配列を含む。さらに他の実施の態様においては、DNA構築体は構築体の上流及び下流で操作される制限部位を含む。
【０１１０】
ある実施の態様においては、アスペルギルス  ニデュランスamdS遺伝子は本発明で有用な糸状菌の形質転換のための選択マーカーシステムを提供する。amdS遺伝子はアスペルギルス株に欠けているアセトアミダーゼ酵素をコードし、アセトアミド培養体で成長させた形質転換体にプラスの選択圧を与える。amdS遺伝子は内因性amdS遺伝子は又は相同体を含むと知られている菌、例えば、アスペルギルス  ニデュランス(Tilburn 他、1983, Gene 26: 205- 221) 及びアスペルギルス  オリゼ(Gomi他、1991 , Gene 108: 91 -98)においてさえ選択マーカーとして使用することができる。非形質転換体の背景amdS活動は選択媒体にCsClを含むことにより抑制されうる。
【０１１１】
工業的に重要な糸状菌の形質転換においてamdSマーカーシステムを用いる方法は技術分野で確立されている（例えば、アスペルギルス  ニガー（例えば、Kelly及びHynes 1985, EMBO J. 4: 475-479; Wang他, Fungal Genet. Biol. 45(1 ): 17-27 (2008年１月)を参照);  ペニシリウム・クリソゲナムにおいて(例えば、Beri and Turner 1987, Curr. Genet. 1 1 : 639-641 を参照); トリコデルマ  リーセイにおいて (例えば、Pentilla他、1987, Gene 61 : 155-164); アスペルギルス  オリゼにおいて (例えば、Christensen他. 1988, Bio/technology 6: 1419-1422); トリコデルマハリジアナム (Pe'er他、1991 , Soil Biol. Biochem. 23: 1043-1046); 及び米国特許6,548,285を参照。）各文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１２】
入ってくる配列を含むDNA構築体はベクター（例えば、プラスミドにおいて）に組み入れても良く、又は糸状菌細胞を形質転換するために直接用いても良く、それにより不活性化された突然変異体が生成される。通常、DNA構築体は安定的に形質転換され、非可逆的である不活性化遺伝子の染色体への組み入れが起きる。インビトロでのDNA構築体の構築及び好適なベクターに挿入する方法は技術分野で良く知られている。
【０１１３】
配列の欠失及び/又は挿入は通常都合の良い制限部位における結紮により完成される。その様な部位が存在しない場合、従来の慣例に従い合成オリゴヌクレオチドリンカーが生成され、用いられる。（上記のSambrook (1989) 及びBennett及びLasure, 「糸状菌における進んだ遺伝子の操作」（MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI） Academic Press, San Diego (1991 ) 70 - 76ページを参照。)  さらに、ベクターは知られた組み換え技術を用いて構築することができる（例えば、Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology)。本発明の実施に使用されうる好適な発現及び/又は組込みベクターの例は上記のSambrook他、(1989)、上記のAusubel (1987)、van den Hondel他、(1991 ) Bennett及びLasure (編纂)、「糸状菌における進んだ遺伝子の操作」（MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI）, Academic Press 396-428ページ及び米国特許第5,874,276号に記載されている。本発明で有用な代表的なベクターはpBS-T, pFB6, pBR322, pUC18, pUC100及びpENTR/Dを含む。
【０１１４】
ある実施の態様においては、少なくとも一つのDNA構築体のコピーは宿主染色体に組み入れられる。ある実施の態様においては、本発明の一以上のDNA構築体は宿主細胞を形質転換するために用いられる。例えば、あるDNA構築体はapsB遺伝子を不活性化するために用いられ、他の構築体はcpsA遺伝子を不活性化するために用いても良い。もちろん本発明では追加の組み合わせが考慮され、そして提供される。
【０１１５】
不活性化は、核酸遺伝子配列での欠失、置換（例えば、突然変異体）、分断、挿入及び/又はRNA干渉（RNAi）の様に遺伝子抑制機構を含む任意の好適な手段により起きる。ある実施の態様においては、不活性化遺伝子の発現製品は、タンパク質の生物活性において対応する変化を持つ短縮タンパク質である。ある実施の態様においては、組み換え真菌細胞中の不活性化遺伝子の生物活性は事実上ゼロ（すなわち、測定不可能）である。ある実施の態様においては、ある残留活性が残ることもあるが、対応する親株中の同じ又は相同遺伝子の生物活性に比べて、しばしば25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 及び2%より低く、又はそれより低い。
【０１１６】
ある実施の態様においては、不活性化は欠失により起き、そして他の実施の態様においては、不活性化は遺伝子のタンパク質コード領域の分断により起きる。ある実施の態様においては、遺伝子は相同組み換えによる不活性化される。
【０１１７】
ある実施の態様においては、欠失は、染色体中に残された配列が遺伝子を機能的に不活性にする限り部分的であっても良い。ある実施の態様においては、欠失突然変異体は安定的かつ非可逆欠失となる一以上の遺伝子の欠失を含む。コード配列の隣接領域は５‘末端及び３’末端において約1 bpから約500 bpを含んでも良い。隣接領域は500 bpより大きいこともあるが、典型的には本発明により不活性化され又は欠失される領域中に他の遺伝子を含まない。最終的結果は、欠失遺伝子は事実上非機能的である。ある実施の態様においては、不活性化で用いられる本発明を限定することを意図するものではないが、apsB及び/又はcpsA及び相同遺伝子は欠失により不活性化されても良い。
【０１１８】
ある実施の態様においては、分断配列は選択可能なマーカー遺伝子をタンパク質コード領域に挿入することを含む。典型的には、この挿入はインビトロで遺伝子配列を、開裂しそして制限部位で結紮することにより不活性化された遺伝子のコード領域配列に遺伝子配列を逆挿入することにより実施される。コード配列の隣接領域は5'末端及び3'末端で約１bpから約500 bp含んでも良い。隣接領域は500 bpより大きくても良いが、通常その領域に他の遺伝子を含まない。DNA構築体は、宿主染色体の相同体配列とアラインし、そしてダブルクロスオーバーの場合、遺伝子の翻訳又は転写が分断される。例えば、apsB染色体遺伝子は遺伝子又は遺伝子コード配列の部分及び選択マーカーを含むプラスミドとアラインする。ある実施の態様においては、選択マーカー遺伝子は遺伝子コード配列又は遺伝子とは別のプラスミドの部分にある。ベクターは染色体が宿主に組み入れられ、宿主遺伝子はその後コード配列に挿入されたマーカーの存在により不活性化される。
【０１１９】
不活性化のための方法を限定するものではないが、ある実施の態様においては、apsB及び/又はcpsA及び相同配列はこの方法により不活性化しても良い。
【０１２０】
ある実施の態様においては、遺伝子の不活性化はプラスミドをベクターとしてシングルクロスオーバーにより挿入されることより起きる。例えば、ベクターは宿主細胞染色体に統合され、遺伝子は遺伝子のタンパク質コード配列、又は遺伝子の調節領域でベクターを挿入することで不活性化される。
【０１２１】
ある代替的実施の態様においては、不活性化は遺伝子の突然変異による。遺伝子を突然変異させる方法は技術分野で良く知られており、部位特異的突然変異、ランダム突然変異体の生成、及びギャップ二本鎖アプローチを含むがこれに限定されるものではない（例えば、米国特許第4,760,025号; Moring他、Biotech. 2:646 [1984]; 及びKramer他, Nucleic Acids Res., 12:9441 [1984]を参照)。
【０１２２】
宿主糸状菌細胞
本発明においては、宿主細胞は糸状菌細胞であっても良い（Alexopoulos, C. J. (1962), 「菌類学の初歩」（INTRODUCTORY MYCOLOGY）、Wiley, New Yorkを参照)。糸状菌細胞の種類は決定的な要素ではない。本発明で有用な糸状菌細胞には、アスペルギルス種（例えば、アスペルギルス  オリゼ、アスペルギルス  ニガー、アスペルギルス  アワモリ、アスペルギルス  ニデュランス、アスペルギルス  ソーエ（sojae）、アスペルギルス  ジャポニクス、アスペルギルス  カワチ、及びアスペルギルス  アクレアツス（akuleatus）、リゾプス種、トリコデルマ種（例えば、トリコデルマ  リーセイ（以前はトリコデルマ  ロンギブラキアツム及び現在ヒポクリア  ジェコリアとして知られる）トリコデルマ  ビリデ、トリコデルマ  コニンギ及びトリコデルマ  ハルジアナム）及びムコール種（例えば、ムコール  ミーヘイ及びムコール  プシルス）を含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様では、宿主細胞はアスペルギルス ニガー細胞である。
【０１２３】
ある実施の態様においては、本発明はATCC 22342 (NRRL 31 12), ATCC 44733及び ATCC 14331及びこれらに由来の株を含むアスペルギルス  ニガーの特別の株を使用することができる。ある実施の態様においては、宿主細胞は非相同遺伝子を発現させることができる。例えば、宿主細胞は組み換え細胞であっても良く、それは非相同タンパク質を生成する。他の実施の態様においては、宿主は細胞に導入されたタンパク質を過剰に発現させるものである。
【０１２４】
ある実施の態様においては、宿主株はapsB及びcpsA遺伝子以外のプロテアーゼ遺伝子に対応する遺伝子の様な一以上の遺伝子が欠ける突然変異株である。例えば、アスペルギロペプシンの様な主要な分泌アスパルチルプロテアーゼをコードする遺伝子を欠失させたアスペルギルス  ニガー宿主細胞が用いられることが想定されている。（例えば、米国特許第5,840,570号及び第6,509,171号を参照願いたい。これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。）このように本発明は糸状菌細胞のapsB及びcpsA不活性化された突然変異株を提供し、その場合、対応する親株は一以上の不活性化遺伝子を持つ不活性化された突然変異体である。
【０１２５】
関心の対象であるタンパク質
ある実施の態様においては、本発明に含まれる不活性化突然変異体は、対応する糸状菌の親株による同じタンパク質の発現及び翻訳に比べて、関心の対象である一以上の内因性及び/又は非相同タンパク質の改変された発現及び翻訳（すなわち、タンパク質の生成）状態を示す。
【０１２６】
ある実施の態様においては、本発明に含まれる糸状菌細胞の不活性化突然変異体は対応する親株での同じタンパク質の生成よりも少なくとも約０から約２００％（又はそれより大きい）の量で関心の対象である内因性及び/又は非相同タンパク質を生成する。このようにある実施の態様においては、不活性化された突然変異体による関心の対象であるタンパク質の生成は、対応する親株での内因性及び/又は非相同タンパク質の生成よりも少なくとも約0%から100%大きく、及びある実施の態様においては、少なくとも約10%から60%大きく、対応する親株での内因性及び/又は非相同タンパク質の生成よりも少なくとも約10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 及び55%大きい実施の態様を含む。
【０１２７】
他の実施の態様においては、関心の対象であるタンパク質の生産が減少することが望ましい場合もある。したがって、本発明はまた関心の対象である内因性及び/又は非相同タンパク質の生成は少なくとも約０から１００％であり、又はそれより、前記糸状菌の対応する親株での内因性及び/又は非相同タンパク質の生成よりも少ないことのある、糸状菌細胞の不活性化突然変異体を提供する。ある実施の態様においては、タンパク質の生成は、対応する親株での内因性及び/又は非相同タンパク質の生成より少なくとも約10%から60%少なく、少なくとも約10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 及び55%少ない実施の態様を含む。
【０１２８】
本発明のある実施の態様においては、糸状菌細胞の不活性化された突然変異体により生成された関心の対象であるタンパク質は細胞内で生成されたタンパク質である（すなわち、細胞内、非分泌ポリペプチド）。他の実施の態様においては、関心の対象であるタンパク質は分泌ポリペプチドである。さらに、関心の対象であるタンパク質は融合又はハイブリッドタンパク質である。ある実施の態様においては、不活性化された突然変異体は複数のタンパク質を改変して生成し、その幾つかは細胞内タンパク質であり、その幾つかは分泌されたものである。
【０１２９】
本発明で有用な関心の対象であるタンパク質は技術分野で知られている酵素を含み、以下のものから選択された酵素を含むがこれに限定されるものではない：デンプン分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ酵素及び植物細胞壁分解酵素である。より具体的には、これらの酵素はアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノール  オキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ペリオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼ及びキチナーゼを含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様においては、酵素は、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、フェノール  オキシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、グルコオキシダーゼ、及びフィターゼを含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様においては、関心の対象であるポリペプチドはプロテアーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼ又はアミラーゼである。
【０１３０】
例えば、本発明のある実施の態様においては、アスペルギルス  ニガー中でのapsBの不活性化は内因性グルコース生成酵素のみならず非相同ラッカーゼの生成を増大させる。
【０１３１】
ある実施の態様においては、関心の対象であるタンパク質は分泌された
ポリペプチドであり、それはシグナルペプチドに融合される（すなわち、分泌されるタンパク質上のアミノ末端の伸長）。殆どすべての分泌されたタンパク質はアミノ末端タンパク質伸長を使用するが、これは膜上に前駆体タンパク質を標的とし、及び転座で重要な役割を果たす。この伸長は、膜転写の間又はその直後にシグナルペプチダーゼによりタンパク質分解により除去される。
【０１３２】
本発明のある実施の態様においては、関心の対象であるポリペプチドはプロテアーゼの活動を抑制するプロテアーゼ抑制剤の様なタンパク質である。プロテアーゼ抑制剤は技術分野で良く知られており、例えば、プロテアーゼ抑制剤は、トリプシン、カテプシンＧ、トロンビン及び組織カリクラインを抑制することが知られているセリンプロテアーゼ抑制剤のファミリーに属する。本発明で有用なプロテアーゼ抑制剤にはボーマンバーク（Bowman-Birk）抑制剤及び大豆トリプシン抑制剤がある（Birk, Int. J. Pept. Protein Res. 25:113-131 [1985]; Kennedy, Am. J. Clin. Neutr. 68:1406S-1412S [1998] and Billings他、Proc. Natl. Acad. Sci. 89:3120 - 3124 [1992]を参照)。
【０１３３】
本発明のある実施の態様においては、関心の対象であるポリペプチドはホルモン、抗体、成長因子、受容体、サイトカイン等から選択される。本発明に含まれるホルモンは、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質放出因子、ソマトスタチン、ゴナドトロピンホルモン、パソプレシン、オキシトシン、エリスロペチン、インシュリン等を含むがこれに限定されるものではない。成長因子は血小板由来成長因子、インシュリン類似成長因子、表皮性成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子、インターロイキンの様なサイトカイン（例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１３）、インターフェロン、コロニー刺激因子等を含むがこれに限定されるものではない。抗体は抗体を生成するのが望ましい任意の種から直接得られる免疫グロブリンを含むがこれに限定されるものではない。さらに、本発明は修飾された抗体を含む。多クローン性及びモノクローン抗体はまた本発明に含まれる。ある実施の態様においては、それらの抗体又は断片はキメラ抗体又はヒト化抗体であり、p185Her2抗体、HulD10-、トラスツズマブ、ベバシズマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、ダクリズマブ、及びリッキシマブを含むがこれに限定されるものではない。
【０１３４】
さらなる実施の態様においては、関心の対象であるタンパク質をコードする核酸は好適なプロモータに動作可能にリンクされ、前記プロモータは真菌宿主細胞中で転写活性を示す。プロモータは内因性又は宿主細胞に非相同であるタンパク質をコードする遺伝子に由来することもある。前記プロモータは先端を切った又はハイブリッドプロモータであっても良い。さらにプロモータは誘導性プロモータであっても良い。通常プロモータはトリコデルマ宿主又はアスペルギルス宿主で有用である。好適なプロモータの例にはcbh1, cbh2, egl1, egl2及びxyn1を含むがこれに限定されるものではない。ある実施の態様においては、プロモータは宿主細胞が原産であるプロモータである。有用なプロモータの他の例には、アスペルギルス  アワモリ、及びアスペルギルスニガーグルコアミラーゼ遺伝子(glaA) (Nunberg他(1984) Mol. Cell Biol. 4:2306-2315 and Boel他, (1984) EMBO J. 3:1581 -1585);  アスペルギルスオリゼ、ＴＡＫＡアミラーゼ；リゾムコ−ル  ミーヘイアスパルギン酸プロテイナーゼ；アスペルギルス  ニガー中性アルファアミラーゼ；アスペルギルス  ニガー酸安定アルファアミラーゼ；トリコデルマ  リーセイstp1及びセロビオヒドロラーゼ１遺伝子プロモータ（例えば、EP 0 137 280 A1を参照願いたい。本文献は参照により本明細書に組み入れられる）及びそれの、突然変異した、先端を切られた、及びハイブリッドプロモータ由来のプロモータを含む。
【０１３５】
ある実施の態様においては、ポリペプチドコード配列は、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向付けるシグナル配列に動作可能にリンクされる。コード配列の５’末端は翻訳リーディングフレームにおいて分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントに天然にリンクされたシグナル配列を当然含んでもよい。シグナル配列をコードするＤＮＡは通常、発現されるポリペプチドと天然に関連する配列である。通常シグナル配列はアスペルギルス  ニガー  アルファアミラーゼ、アスペルギルス  ニガー中性アミラーゼ、又はアスペルギルス  ニガー  グルコアミラーゼによりコードされる。ある実施の態様においては、シグナル配列はcdh1プロモータに動作可能にリンクされているトリコデルマcdh1シグナル配列である。
【０１３６】
糸状菌細胞の形質転換
ＤＮＡ構築体又はベクターの宿主細胞への導入には、形質転換、電気穿孔法、核ミクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション（例えば、リポフェクション介在及びDEAE-デキストリン介在トランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物による培養、ＤＮＡ被覆ミクロ投射物による高速衝撃、アグロバクテリウム介在形質転換及び原形質融合の様な技術を含む。一般的な形質転換技術は技術分野で知られている(例えば、Ausubel他、 (1987), 同上、第9章; 及びSambrook (1989)同上, Campbell他, (1989) Curr. Genet. 16:53-56及び「糸状菌のバイオ技術)（THE BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI）第6章、編纂、Finkelstein及びBall (1992) Butterworth及びHeinenmannを参照。これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。）
糸状菌細胞発現システムにおける非相同タンパク質の生成も知られている。例えば、トリコデルマでの非相同タンパク質の発現はHarkki 他、(1991 ); Enzyme Microb. Technol. 13:227-233; Harkki他、(1989) Bio Technol. 7:596-603; EP 244,234; EP 215,594; 及びNevalainen他、「トリコデルマの分子生物学及びその相同及び非相同遺伝子の発現への応用」（The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes）、「分子菌学」（MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY）編纂. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) 129 - 148ページ;及び米国特許第6,022,725 号及び第6,268,328号に記載されている。これらの各文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３７】
アスペルギルス種における非相同タンパク質の発現はCao他、(2000) Sci. 9:991 - 1001 ; 及び米国特許第6,509,171号に記載されおり、これらの各文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３８】
本発明の形質転換体は既知の技術を用いて精製することができる。
【０１３９】
遺伝子の不活性化を検出する方法
当業者は種々の方法を用いて遺伝子が不活性化されたか否かを決定する。本発明を限定する意図ではないが、使用可能な一つの方法は、Zhu (Zhu他、Acat Mycologica Sinica 13:34-40 [1994]、本文献は参照により本明細書に組み入れられる) に記載されているフェノール/クロロフォルム法がある。端的に言えば、この方法ではゲノムＤＮＡがＰＣＲ反応のテンプレートとして用いられる。プライマーは、一つのプライマーが選択可能なマーカー遺伝子（例えば、amdS遺伝子）にアニールするようにデザインされ、第２のプライマーは遺伝子の３‘末端において、ＤＮＡ相同断片由来の配列の３’末端にアニールする。そのゲノムＤＮＡがテンプレートとして使用された場合ＰＣＲ断片を生成しない対応する親株（非不活性化遺伝子を持つ）に対向するＰＣＲ反応テンプレートとして使用される場合、不活性化された変異体は特異な製品を生成する。さらに不活性化変異体のＰＣＲ断片はＤＮＡ配列決定に付され不活性化遺伝子であるか否かが確認される。他の有用な方法にはサザン解析を含み、上記Sambrook (1989)を参照願いたい。
【０１４０】
細胞培養
糸状菌細胞は従来の培養媒体で成長させることができる。形質転換された細胞の培養媒体はプロモータを活性化しそして形質転換体を選択するのに適するように修飾されることもある。温度、ｐＨ等の様な特定の培養条件は当業者に明らかである。本発明で有用な糸状菌の典型的な培養条件は良く知られており、上記のSambrook, (1982)及びアメリカン・タイプ・カルチャー。コレクション（American Type Culture Collection）の様な科学文献に見出すことができる。さらに、非相同タンパク質の生成のための発酵手順はそれ自体技術分野で知られている。例えば、タンパク質は、バッチ、流加培養法、及び連続フロープロセスを含む固体培養又は液内培養により生成することができる。発酵温度は幾らか変動させることができるが、アスペルギルス  ニガーの様な糸状菌にとっては温度は通常約20℃から40℃、典型的には約28℃から37℃であり選択される微生物株による。水性微生物発酵（発酵添加物）のｐＨの範囲は代表的には約2.0から8.0である。糸状菌ではｐＨは通常約2.5から8.0の範囲である。アスペルギルス  ニガーではｐＨは通常約4.0から6.0の範囲であり、典型的には約4.5から5.5の範囲である。発酵槽での発酵添加物の平均保持時間は、一部は発酵温度及び使用される培養体により大きく変わるが、通常は約24から500時間、典型的には約24から400時間の範囲である。本発明では糸状菌を培養するために有用な任意の発酵槽を使用しても良い。本発明で有用な一つの実施の態様は１５ＬBiolafitte (Saint-Germain-en-Laye, フランス)を用いて実施することである。
【０１４１】
発現したタンパク質活性の決定方法
細胞内及び細胞外で発現されるポリペプチドの検出及び活性の測定のための技術は当業者に知られている。宿主細胞中において関心の対象であるタンパク質の分泌レベルを決定し、発現したタンパク質を検出するための手段にはタンパク質に特異の多クローン性又は単クローン性抗体による免疫アッセイの使用を含む。この例には酵素免疫測定吸着法（ELISA）、放射性免疫分析（ＲＳＡ），蛍光免疫測定法（ＦＩＡ），蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を含む。しかし他の方法が技術分野で知られており関心の対象であるタンパク質の評価に用いられる (例えば、 Hampton他、「血清学的方法、実験質マニュアル」（SEROLOGICAL METHODS, A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, MN [1990]; 及びMaddox他, J. Exp. Med., 158:121 1 [1983]を参照。これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。）ある実施の態様において、関心の対象であるタンパク質の発現及び/又は分泌は不活性化突然変異体中で高まる。ある実施の態様においては、関心の対象であるタンパク質の生成は、対応する親株に比べて不活性化中の突然変異体中で少なくとも100%, 少なくとも95%, 少なくとも90%, 少なくとも80%, 少なくとも70%, 少なくとも60%, 少なくとも50%, 少なくとも40%, 少なくとも30%, 少なくとも20%, 少なくとも15%, 少なくとも10%, 少なくとも5% 及び少なくとも2%大きい。
【０１４２】
タンパク質の回収
所望のタンパク質が発現され、そして任意選択的に分泌された関心の対象であるタンパク質が回収されそして精製されることもある。発酵ブロスからの関心の対象であるタンパク質の回収及び精製は技術分野で知られた手順により実施することができる。発酵ブロスは通常所望のタンパク質製品のみならず、細胞、細胞残屑、種々の浮遊固体及び他のバイオマス汚染物質を含む細胞組織片を含む。
【０１４３】
それらを除去するための好適なプロセスには、細胞を含まないろ過液体を生成するために、従来の固体―液体分離技術、例えば、遠心分離、ろ過、透析、精密ろ過、回転真空ろ過又は他の知られたプロセスを含む。しばしば、限外ろ過、蒸発又は沈殿の様な技術を用いて結晶化させる前にさらに発酵ブロス又は細胞を含まないろ過された液体を濃縮することが有用であることもある。
【０１４４】
上澄み又はろ過された液体のタンパク質成分を沈殿させることは、塩による手段により実行され、それに続いて種々のクロマトグラフ法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は類似の広く認められた手順により完遂される。発現された所望のポリペプチドが分泌されるとポリペプチドを培養基から精製しても良い。通常発現宿主細胞はポリペプチドの精製の前に媒体から除去される。
【０１４５】
発現され、組み換えられた所望のポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合は、通常宿主細胞は分断されて、そしてポリペプチドは第一段階の精製である水性「抽出」液中に放出される。通常発現宿主細胞は細胞分断の前に媒体から回収される（例えば、遠心分離による）。
【０１４６】
本発明を実行する様式及び方法は以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるが、実施例中の記載は本発明の範囲又は特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１４７】
実施例
以下の実施例は本発明の特定の実施の態様及び特徴を示すと共に、さらに明らかにするために記載するものであって、その範囲を限定するものと解してはならない。
【０１４８】
以下の実験での開示においては以下の略称が用いられる：
℃（摂氏温度）；H2O (水);dH2O (脱イオン水); HCL(塩酸)；aa (アミノ酸); bp (塩基対); kb (キロ塩基対); kD (キロダルトン); g (グラム); μg(ミクログラム); mg (ミリグラム);μl(ミクロリットル); ml (ミリリットル); mm (ミリメーター);μm (ミクロメーター); M (モル); mM (ミリモル); μM (ミクロモル); MW (分子量); sec (秒); min(s) (分); h(s)及びhr(s) (時間); NaCl(塩化ナトリウム)；PBS（リン酸緩衝生理食塩水）[150 mM NaCI, 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.2]); PCR (ポリメラーゼ連鎖反応)； SDS (ドデシル硫酸ナトリウム);w/v(重量対容量比)；v/v（容量対容量比）；ATCC (アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション Rockville, MD); BD BioSciences (以前はCLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA);及びSigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)。
【０１４９】
実施例１
不活性化されたcpsA遺伝子を持つアスペルギルス  ニガー細胞
a.     不活性化されたcpsA  ＤＮＡ構築体を持つ「分断されたプラスミド」の生成
図１はアスペルギルスcpsA遺伝子の2188 bpゲノムDNA配列を示す（配列番号１）。図２は配列番号１の cpsAゲノムDNA配列によりコードされる552アミノ酸配列（配列番号２）を示す。カルボキシペプチダーゼはポリペプチドのＣ末端からアミノ酸を切り取るプロテアーゼである
cpsA「分断プラスミド」はアスペルギルス  ニガー細胞を形質転換し、それによりcpsA不活性化変異体微生物を生成するために用いられる不活性化cpsA遺伝子を含むＤＮＡ構築体である。本発明において用いられるcpsA（及びapsB)分断プラスミドを生成する一般的戦略及び方法は2006年11月2日に公開された米国特許出願第20060246545 A1号に記載のものと同じであり、本文献は参照により本明細書に組み入れられる（またWang他の「アスペルギルス  ニガー由来の4つのペプシン類似のプロテアーゼの単離及び非相同ラッカーゼ発現上での分断の効果の分析」（Isolation of four pepsin-like protease genes from Aspergillus niger and analysis of the effect of disruptions on heterologous laccase expression）Fungal Genet. Biol. 45(1): 17-27 (2008年1月)を参照。これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。）
以下の表１は不活性化されたcpsA分断プラスミド構築体を生成するために用いられ、形質転換された細胞において分断された遺伝子構築体を検出するために用いられるプライマー配列を示す。
【数１】
2011517943.tif 000003
【０１５０】
「Ｐａ」（配列番号３）と表示されたプライマーはcpsA遺伝子のプロモータ領域を増幅する。「Ｔａ」（配列番号４）と表示されたプライマーはcpsAのターミネーター領域を増幅する。これらのプライマーを用いて2495 bp断片が以下のＰＣＲ条件で増幅された：
（１）ＰＣＲ管がテンプレートDNAを変性させるために94℃で4分加熱された、（２）PCR反応は94℃で1分、60℃で2分及び72℃で2分30秒実施された、及び
（３）このサイクルが30回繰り返された。PCR反応は、管が４℃で培養される前に７２℃で１０分間延長された。W１と呼ばれるこの単位複製配列は1986 bpコード領域及びcpsAの509 bp領域を含み、図３に示す（配列番号７）。
【０１５１】
pBS-W1 (cpsA)プラスミドを構築するために、W1単位複製配列がpBlue-script  (Tian Wei Biotech. Co. Ltd)由来のTAベクター、pBS-Tにクローンされた。アスペルギルス  ニデュランスamdS発現カセットを含む2.7 kb DNA断片が、分断プラスミド、図４に示すプラスミドマップにより示されるpBSΔcpsA-amdを生成するためにcpsA遺伝子のコード領域のユニークなEcoRV部位に逆方向で挿入された。
【０１５２】
pBSΔcpsA-amdプラスミドはNrul制限酵素消化により線形にされ、図５（配列番号８）に示すDNA配列を持つ線形分断プラスミド断片となった（すなわち、「分断配列」）。
【０１５３】
ｂ．線形分断プラスミドによるアスペルギルス  ニガーの形質転換
線形pBSAcpsA-amd分断配列（配列番号８）が、AP-4アスペルギルス  ニガー株の誘導体である受容株GICC2773を形質転換するために使用された（Ward他、Appli. Microbiol. Biotechnol 39:738-743 (1993)を参照)。GICC2773は、pepA遺伝子の分断変異体及びグルコアミラーゼ  プロモータ及びターミネータコントロール下で非相同酵素、ラッカーゼ（ホウロウタケ属虹色ラッカーゼ遺伝子のlｃｃ１）を発現させる組み込みプラスミドを含む。GICC2773株はValkonen他による「変性タンパク質反応の構成的誘導によるアスペルギルス  ニガー変異体アワモリでの異種タンパク質生成の改良（Improvement of foreign-protein production in Aspergillus niger var. awamori by constitutive induction of the unfolded-protein response）、Appl. Environ. Microbiol. 69(12); 6979-6986 (2003)に非常に詳しく記載されており、本文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５４】
使用された形質転換プロトコールはキャンベル法（Campbell method） (Campbell 他、Curr. Genet. 16:53-56 (1989)を参照。本文献は参照により本明細書に組み入れられる。)をベータD-グリシナーゼG(InterSpex Products, Inc. San Mateo, CA )を用いてプロトプラストを生成し、ｐHを５．５に調整するように変形したものである。簡単に言うと、プロトプラストの生成及びアスペルギルス  ニガー形質転換は次の様に実施された：
（a) 新しい斜面培養から作られた1-2ml胞子懸濁液が50ml液体媒体（可溶性でんぷん３％、酵母エキス２％、KH2PO4 0.5%, コーンミール0.5%, 自然のpH)に振とうフラスコ中で播種され、回転振とう培養機で200ｒｐｍ、３０℃で１３−１４時間培養された；
(b)  培養液をガーゼを通してろ過し菌糸体を回収し、水で３度及び0.8M MgSO4 (pH 5.8)１度洗浄した。
【０１５５】
(c) 洗浄された菌糸体は１００mlフラスコに入れて、150 mgの溶解酵素を含む15 ml 0.8M MgSO4及び15 mgのセルラーゼR-10 (Yakult Biochemical Co., Ltd., Nishinomiya, Japan)で懸濁させた；
(d)  菌糸体細胞をフラスコで80ｒｐｍ振動させ、30℃で１−２時間消化させ、プロトプラスト形成が顕微鏡によりモニターされ；
(e)  細胞組織片を除去するために細胞可溶化液を２層の200メッシュナイロン膜によりろ過してプロトプラストを採取し；
(f)  プロトプラストが回収されソルビトール液(1 .2 M ソルビトール、50 mM CaCl2, 10mM Tris pH 7.4)で2度洗浄し、６−８分間７００ｇで遠心分離した；
(g)  プロトプラストは200 μl のソルビトール液で再懸濁され、血球計数器により計測され濃度が決定された；
(h) 10 μg 形質転換体DNA (すなわち、線形pBSΔcpsA-amd分断プラスミド)が2-4 x 107プロトプラストと混合された；
(i) 上の混合物に、50 μlのPEG6000 (又はPEG4000)溶液(PEG 50%, 50 mM  CaCl2, 10mM Tris pH 7.4)が加えられ、ゆっくりとではあるが完全に混合され、30分氷上に置かれ；
(j) 1 ml PEG 溶液が加えられ、十分混合され室温で20分置かれ；
(k)  1 mlソルビトール溶液が加えられ、56-58°Cの溶融した軟寒天とよく混合され、混合物すべてが直ちに形質転換媒体プレートに注がれ；及び
(l)  プレートが30℃で４−８日間培養された。
【０１５６】
全ての溶液及び媒体は加圧滅菌器で処理し又は0.2ミクロンろ過によりろ過殺菌された。
【０１５７】
ｃ．アスペルギルス  ニガー不活性化cpsA変異体の検出
フェノール/クロロフォルム法により、無作為に取り出した形質転換体からＤＮＡが抽出された（Zhu他、Nucleic Acid Res. 21 :5279-80 (1993)を参照。本文献は参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１５８】
旨く形質転換されたコロニーがプライマーPamds (配列番号5)及びPP.Outa (配列番号6)を用いてＰＣＲ増幅により検出された。線形分断プラスミドがアスペルギルスニガーゲノムに相同的に組み入れられる場合、これらのプライマーは、ゲノムＤＮＡから1378 bp単位複製配列を生成するようにデザインされた。
【０１５９】
図6に示す様に、ＰＣＲが旨く形質転換されたアスペルギルス  ニガー株、ΔcpsA（これは予測された1378 bp単位複製配列を持つものであったが）を同定するのに使用された。予想された様に、形質転換されないアスペルギルス  ニガー親株はＰＣＲにより検出される製品の特徴を示さなかった。
【０１６０】
1378 bp単位複製配列の配列決定により、また不活性化cpsA遺伝子であることが確認された。
【０１６１】
ｄ. cpsA不活性化アスペルギルス  ニガー中の非相同ラッカーゼの生成。
【０１６２】
上に述べた様に、対応する親株GICC2773は、グルコアミラーゼ  プロモータ及びターミネーター コントロールの下に虹色ホウロクタケ属(Tramete versicolor)由来の非相同酵素、ラッカーゼを発現させる組み入れプラスミドを含む。不活性化株、ΔcpsAによる非相同ラッカーゼ生成のレベルが対応する親株に比較してアッセイされた。
【０１６３】
ラッカーゼ活性がpH 4.6酢酸ナトリウム緩衝液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中で酸素によりABTS (2,2'-アジノ‐ビス（3‐エチルベンゾチアゾリンー６−スルホン酸） (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)の酸化に基づく標準手順に従いアッセイされた。株はまず、ラッカーゼ生産に適した50 ml のPromosoy成長媒体(Central Soya, Fort Wayne, IN)を含む250 mlバフルフラスコで培養された。不活性化された及び非不活性化（すなわち、対応する親株）アスペルギルス  ニガー株を振とうフラスコで120時間成長させた。培養体上澄みが、遠心分離により菌糸体を除去して、得られた。上澄みは、ラッカーゼタンパク質を含むものであるが、37℃の酢酸ナトリウム緩衝液中で30分ABTSにより培養され、色彩形成が420nMの高い光学密度で測定された。さらに全細胞外タンパク質がFolinフェノール法により測定された（Lowry他、[1951 ] J. Biol. Chem. 193:265-275を参照)。
【０１６４】
cpsA不活性化ｂ変異体株、ΔcpsAは、非不活性化GICC2773親株に比べてラッカーゼの生成が14.2%低下し、変異体の糸状菌乾燥重量パーセントが35.7%増大した。このように、非相同ラッカーゼの生成はカルボキシペプチダーゼ遺伝子cpsAの不活性化により否定的な影響を受けた。しかし、本明細書でアッセイされていない他の非相同（又は内因性）タンパク質は、cpsAの不活性化により生産が増大することを示している（又は、示すであろう）。
【０１６５】
実施例２
不活性化apsB遺伝子を持つアスペルギルス  ニガー細胞
特に断らない限り実施例１の方法と同じ方法が不活性化apsB遺伝子を持つアスペルギルス  ニガー株を生成するために使用された。
【０１６６】
a.     不活性化apsB構築体を持つ「分断プラスミド」の生成
図７はアスペルギルスニガー  アミノペプチダーゼ遺伝子apsB (配列番号9)の3352 bpゲノムDNA配列を示す。図８は翻訳されたapsBタンパク質(配列番号１０)の８８１アミノ酸配列を示す。アミノペプチダーゼはポリペプチドのＮ末端からアミノ酸を除去するプロテアーゼである。apsBの製品は細胞内酵素（すなわち、分泌されたものでないタンパク質）であり、そしてその結果、その活性は細胞内のタンパク質に影響することに限られると考えられる。
【０１６７】
以下の表２は不活性化apsB分断プラスミド構築体を作るために使用されるプライマー配列を表す。
【数２】
2011517943.tif 000004
【０１６８】
プロモータ領域を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーは表２で「Pb」 (配列番号1 1 )と、またターミネーター領域を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーは表２で「Tb」 (配列番号1 ２ )と表される。これらのプライマーを用いて、3370 bp apsB 遺伝子の3078 bpコード領域及び222 bp プロモータ領域が増幅された。
【０１６９】
図9にその配列(配列番号14)を示す3300bp PCR単位増幅配列W2が
pBS-T ベクター(Tian Wei Biotech Co. Ltd.)にクローンされ、apsBプラスミドpBS-W2(apsS)を構築した。アスペルギルス  ニデュランス遺伝子amdSを含むＤＮＡ断片がNdel-Ndel (1628 -2168 bp)部位のapsB遺伝子のコード領域に挿入され、図１０に示すapsB分断プラスミド、pBSΔapsB-amdSを生成した。プラスミドは制限酵素消化(Hindlll 及びPvull)により線形にされ、図１１（配列番号１５）に示す配列を持つ線形分断プラスミドＤＮＡ断片（すなわち、「分断配列」）となった。
【０１７０】
b.     線形分断プラスミドによるアスペルギルス  ニガーの形質転換
線形pBSΔapsB-amdS分断配列（配列番号１５）がアスペルギルス  ニガーG I CC2773株を形質転換するために使用され、ゲノムＤＮＡが上の実施例１に記載の様に形質転換体から抽出された。
【０１７１】
c.     アスペルギルス  ニガー不活性化apsB変異体の検出
全９０の形質転換体が無作為に選ばれた。pBSΔapsB-amdSにより旨く形質転換されたクローンが2つのプライマーPamds (配列番号5)及びPT outb (配列番号13)を用いてＰＣＲにより検出された。不活性化株由来のゲノムＤＮＡがＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用される場合、これらのプライマーは特異に1604 bp単位増幅配列となるようにデザインされた。図１２に示す様に、染色体性ＤＮＡのゲル電気泳動法により、不活性化apsB遺伝子により旨く形質転換されたことを示す1604 bp 単位増幅配列を表す3つのクローン（#28, #87及び#93）が同定された。DNAが分断プラスミドにより形質転換されてないアスペルギルス  ニガーの対応する親株由来のものである場合、1604 bp 単位増幅配列は観測されなかった。1604 bp 単位増幅配列の配列決定はさらにこの結果が正しいことを示した。
【０１７２】
d.     apsB不活性化アスペルギルス  ニガー中の非相同ラッカーゼの生成
3つのapsB不活性化変異体クローン#28, #87及び#93が、実施例１に示す非相同ラッカーゼ活性についてアッセイされ、その結果を以下の表３に示す。
【数３】
2011517943.tif 000005
【０１７３】
3つのクローンの各々は非不活性化親株に比べてラッカーゼの生成が極めて大きく増大し(21.5%〜25.8%)、付随して糸状菌乾燥重量が15％減少していることを示す。このように、細胞内プロテアーゼapsBの不活性化により、非相同遺伝子製品ラッカーゼを生成するアスペルギルス  ニガーの糸状菌細胞の能力を極めて大きく増大させる。
【０１７４】
実施例３
トリプル遺伝子不活性化するアスペルギルス  ニガー細胞
amdS選択マーカーにより分断された2つの不活性化ジペプチドペプチダーゼ遺伝子、dpp4及びdpp5を持つアスペルギルス  ニガーのダブル変異体株、Δdpp4/Δdpp5 amdの生成については、2006年11月2日に公開された米国特許出願20060246545 A1に記載されており、本文献は参照により本明細書に組み入れられる。このダブル不活性化株は以下に述べる様にアスペルギルス  ニガーのトリプル不活性化変異体を生成する開始材料として使用された。
【０１７５】
a.     不活性化されたcpsA, dpp4及びdpp5
実施例１に示す様に構築され及び線形のcpsA分断プラスミドが、グルコアミラーゼ  プロモータ及びターミネーター  コントロールの下にホウロクタケ属(Tramete)ラッカーゼを発現させるダブル不活性化アスペルギルス  ニガー株(Δdpp4/Δdpp5 amd)を形質転換するために用いられた。
【０１７６】
形質転換が旨く進んだことによるトリプル不活性化株がプライマーの3つの対、−3つの不活性化遺伝子のそれぞれの遺伝子に対して各1対を用いてPCRにより検出された。上の実施例1に示す様に、配列番号５及び６のプライマー対が単独のcpsA分断を検出するのに用いられた。ダブル不活性化株Δdpp4/Δdpp5 amdを検出するために用いられたプライマー対は米国特許出願公開第20060246545 A1号に開示された配列番号37及び６７及び配列番号64及び９６であり、本文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７７】
一つのクローン（＃44）ができたトリプル分断株ΔcpsA/Δdpp4/Δdpp5から単離され、非相同ラッカーゼ生成（実施例1に示すラッカーゼ活性アッセイに基づき）、及び親ΔcpsA/Δdpp4/Δdpp5株と比べた菌糸体乾燥重量がアッセイされた。表４に示す様に、トリプル不活性化株はラッカーゼ活性が減少し(8.4%)全乾燥重量がわずかに増加(104.8%)を示した。
【数４】
2011517943.tif 000006
【０１７８】
b.     不活性化apsA, dpp4及びdpp5遺伝子
実施例３aで述べた様に、apsBにより不活性化されたトリプル不活性化変異体株は実施例２で構築され線形とされたapsB分断プラスミドを用いて生成され、2006年11月2日に公開された米国特許出願公開第20060246545 A1号に記載に様に、ダブル不活性化アスペルギルス  ニガー株（Δdpp4/Δdpp5 amd）を形質転換した。本文献配列番号参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７９】
旨く形質転換されたトリプル不活性化アスペルギルス  ニガー株ΔapsB/Δdpp4/Δdpp5は3対のプライマーを用いて検出された。apsB分断の存在を確認するために使用されたプライマー対は配列番号５及び１３（実施例2にある様に）であった。ダブル不活性化株Δdpp4/Δdpp5 amdを研修するために使用されたプライマー対は米国特許出願公開第20060246545 A1号に記載の配列番号37及び６７、及び配列番号６４及び９６であった。本文献は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８０】
トリプル不活性化株ΔapsB/Δdpp4/Δdpp5が単離され、実施例１のラッカーゼ活性アッセイを用いた非相同ラッカーゼの生成及び対応する親Δdpp4/Δdpp5 amd株と比較した全菌糸体乾燥重量がアッセイされた。表4に示す様に、ΔapsB/Δdpp4/Δdpp5株はラッカーゼ活性の減少(23.4%)を示し及び全乾燥重量がわずかに減少(98.6%)していた。
【０１８１】
実施例４
apsB不活性化アスペルギルス  ニガーにおける天然グルコース生成酵素生成の増大
内因性酵素の生成に対するapsB不活性化の効果を決定するために、実施例2に記載の3つの変異体クローン(クローン#28, #87及び#93)が、対応する親株GICC2773と比べた全グルコース生成酵素活性がアッセイされた。アッセイは実際に幾つかのグルコース生成酵素の活性の集合について測定したものであるが、測定された全グルコース生成酵素活性は、不活性化株による天然グルコアミラーゼの発現の測定基準を示す。
【０１８２】
本発明のアッセイは、Wang他(Fungal Genet. Biol. 45(1 ): 17-27 (Jan. 2008))（本文献は参照により本明細書に組み入れられる）による記載の内容とは異なる不活性化変異体アスペルギルスニガー株がアッセイされたことを除き、
同記載の通りに実施された。
【０１８３】
ΔapsBは#28, #87及び#93クローン及び対応する親株GICC2773を振とうフラスコのS3Y2媒体中で30℃及び２００ｒｐｍで成長させた。120時間後、１mlの培養液が遠心分離され、60 μlの培養濾液上澄みのサンプルが回収された。各60 μlのサンプルが140 μl H2O及び2.8 ml 2%可溶デンプン基質(0.1 M HOAc 緩衝液、pH 4.65)と混合された。37℃で30分培養した後に、反応が沸騰により停止された。20 μlの反応溶液が市販のグルコースアッセイ  キット(Zhongsheng Biotechnology Co. Ltd., Beijing, China)の2mlのオキシダーゼ/ペロキシダーゼ試薬と混合された。遊離グルコースがグルコースアッセイ  キットの手順により、525nmでの光学密度を測定することにより決定された。全グルコース生成酵素活性が、グラム当たりの菌糸体の乾燥重量につき分泌された酵素活性国際単位（IU/g）として算出された。
【０１８４】
上のアッセイの結果は次の通りである：クローン#28, #87及び#93は（GICC2773親株に比べて）全グルコース生成酵素活性が81.0%, 40.5%,及び71 .7%の増大を示した。このように、アスペルギルス  ニガー内の細胞内プロテアーゼapsBの不活性化は天然グルコース生成酵素活性を極めて大きく増大させる。
【０１８５】
その技術分野の当業者であれば、本発明に固有のものに限らず、本発明を、本明細書に記載の目的を実施するために容易に改変されうることを、直ちに理解し、本明細書に記載の目的と利益を達成するであろう。本明細書に記載の組成物及び方法は好ましい実施の形態の代表例であり、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【０１８６】
本願発明の特定の実施の態様が説明及び記載されているが、当業者であれば本願発明の精神及び範囲から外れることなく種々の改変及び修飾が可能であることは明らかであろう。したがって、特許請求の範囲においては本願発明の範囲にある全ての改変及び修飾を含むことを意図するものである。
【０１８７】
本明細書に説明により記載された発明は、特にそこで記載されていない要素、限定が含まれていない場合においても適切に実施しうると考える。用いられた用語、及び表現は記載のために用いられるもので、限定の意味に解してはならない。そのようは用語及び表現は、その特徴を持つ同等物及びその部分を除外するものではない。
【０１８８】
本発明は、広く又一般的な表現により記載されている。一般的な開示に含まれるより狭い範囲の種類、亜属のグループの夫々もまた本発明の部分を構成する。したがって、これは、排除された材料が特に本明細書に記載されているか否かを問わず、その属からあるものを除外するという条件又は否定的限定を持つ本発明の一般的な記載についても同様に適用される。
【０１８９】
本明細書に記載の全ての特許及び刊行物は、もし個々の刊行物が特定され及び個別に参照により本明細書に組み入れられることが示されると同様の範囲において参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2011517943.tif 000007
【図２】
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【図３】
2011517943.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１１−１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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