(57)【要約】  本発明は、Aβペプチドに関連した疾患に関係したトランスジェニック非ヒト動物、特にAβペプチドタンパク質をコードするトランスジェニックマウスを提供する。本発明は、加えて、Aβペプチドをコードする導入遺伝子を含む細胞、及び株化細胞を提供する。本発明は、Aβペプチドに関連した疾患の治療のための組成物に使用するための、Aβペプチドに影響を及ぼす薬剤を評価するための方法、及び組成物を更に提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
AβペプチドをコードするDNA導入遺伝子を含む細胞を含む、Aβペプチドを過剰発現するためのトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
前記動物が前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項1記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
前記記動物が前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項1記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
前記動物がマウスである、請求項1〜3のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
前記導入遺伝子がマウス起源である、請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
前記導入遺伝子がヒト起源である、請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
前記導入遺伝子が組換遺伝子である、請求項1〜6のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
前記組換え導入遺伝子がキメラ、又はヒト化されたポリペプチドをコードする、請求項7記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、AβN3Q-42（配列番号：2）、AβN3E-40（配列番号：3）、及びAβN3Q-40（配列番号：4）の少なくとも1つをコードする、請求項1〜8のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１０】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、及びAβN3Q-42、（配列番号：2）の少なくとも1つをコードする、請求項1〜8のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１１】
前記導入遺伝子が組織特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項1〜10記載のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１２】
加えて、グルタミニルシクラーゼ、又はグルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ様タンパク質をコードするDNA導入遺伝子を含む細胞を含む、請求項1〜11記載のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１３】
前記グルタミニルシクラーゼ、又はグルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ様タンパク質が、ヒトisoQC（配列番号：14、又は15）、マウス（配列番号：20）、カニクイザル（配列番号：16）、アカゲザル（配列番号：17）、ネコ（配列番号：18）、ラット（配列番号：19）、ウシ（配列番号：21）、又は少なくとも50%／75%の配列同一性／類似性を有するその類似体から選択される、請求項12記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１４】
前記グルタミニルシクラーゼ、又はグルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ様タンパク質が配列番号：13〜15、22、又は23に記載のヒトQC、若しくはイソQCのアイソフォーム、又はスプライスフォーム；ラットQC（配列番号：19）、又はマウス（配列番号：20）である、請求項12、又は13記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１５】
前記グルタミニルシクラーゼ、又はグルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ様タンパク質が配列番号：13、又は配列番号：20の1つである、請求項12〜14のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１６】
インビボでAβペプチド効果を阻害し、又は促進する生物学的に活性な薬剤をスクリーニングする方法であって：
a）請求項1〜15のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に試験薬剤を投与すること、及び、
b）産生されたAβペプチドの効果に対する薬剤の効果を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記導入遺伝子がマウス起源である、請求項16〜19のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記導入遺伝子がヒト起源である、請求項16〜19のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記導入遺伝子が組換遺伝子である、請求項16〜21のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記組換え導入遺伝子がキメラ、又はヒト化されたポリペプチドをコードする、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、AβN3Q-42（配列番号：2）、AβN3E-40（配列番号：3）、及び／又はAβN3Q-40（配列番号：4）をコードする、請求項16〜23のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、及び／又はAβN3Q-42（配列番号：2）をコードする、請求項16〜24のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項1〜15のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に由来する細胞、又は株化細胞。
【請求項２７】
プロモーターに作動可能に連結されたAβペプチドをコードするトランスジェニックヌクレオチド配列を、マウスのゲノムに組み込んで含むトランスジェニックマウスであって、Aβペプチド効果のAβペプチド阻害剤で逆転させ、又は寛解させることができる表現型を示す、前記マウス。
【請求項２８】
前記マウスがAβペプチドを過剰発現する、請求項27記載のマウス。
【請求項２９】
前記マウスがAβペプチドに対してヘテロ接合性である、請求項27、又は28記載のマウス。
【請求項３０】
前記マウスがAβペプチドに対してホモ接合性である、請求項27、又は28のマウス。
【請求項３１】
前記トランスジェニック配列がマウスAβペプチドをコードする、請求項27、又は28記載のマウス。
【請求項３２】
前記トランスジェニック配列がヒトAβペプチドをコードする、請求項27、又は28記載のマウス。
【請求項３３】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、AβN3Q-42（配列番号：2）、AβN3E-40（配列番号：3）、及び／又はAβN3Q-40（配列番号：4）をコードする、請求項27〜32のいずれかに記載のマウス。
【請求項３４】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、及び／又はAβN3Q-42（配列番号：2）をコードする、請求項27〜33のいずれかに記載のマウス。
【請求項３５】
Aβペプチド効果を阻害し、又は促進する治療薬をスクリーニングする方法であって、
a）請求項27〜34のいずれかに記載のトランスジェニックマウスに試験薬剤を投与すること、
b）マウスの神経性表現型に対する試験薬剤の効果を評価すること、及び、
c）Aβペプチド効果を阻害し、又は促進する試験薬剤を選択すること、
を含む、前記方法。
【請求項３６】
Aβペプチドに関連した疾患の治療、又は予防の方法であって、
a）請求項35記載の選択された試験薬剤を投与すること；及び、
b）Aβペプチドに関連した疾患についての臨床インデックスの減少について患者をモニターすること、
を含む、前記方法。
【請求項３７】
前記Aβペプチドに関連した疾患がアルツハイマー病である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
請求項36記載の選択された試験薬剤を含む、医薬組成物。
【請求項３９】
Aβペプチドに関連した疾患の治療、及び／又は予防のための医薬の製造のための請求項36に従って選択された試験薬剤の使用。
【請求項４０】
Aβペプチド産生によって影響を受ける標的化合物をスクリーニングする方法であって、可能性のある標的化合物に対する、請求項1〜15のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物、又は請求項27〜34のいずれかに記載のトランスジェニックマウスを使用したインビボにおけるAβペプチドの効果の評価を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、トランスジェニック動物に、並びに特にAβペプチドに関連した疾患をスクリーニングし、及び治療するための方法、及び組成物に関する。
【０００２】
特に、本発明は、Aβペプチド、及びQPCT（すなわち、グルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ）、並びにアンモニアの遊離下におけるN末端グルタミン残基のピログルタミン酸（5-オキソ-プロリン、pGlu*）への分子内環化、及び水の遊離下におけるN末端グルタミン酸残基のピログルタミン酸への分子内環化を触媒するグルタミニルシクラーゼ（QC、EC 2.3.2.5）とも命名されたQPCT様酵素（QPCTL）に関する。
【０００３】
アルツハイマー病（AD）において見いだされるプラークにおいて、わずかな比率のAβペプチドのみが、N末端アスパラギン酸（AβN1D）で始まる。大多数は、位置3にてピログルタミン酸（AβN3（pGlu））で開始する（Kuo, Y.M., Emmerling, M.R., Wood, A.S., Cotter, R.J. 及びRoher, A.E.の文献、神経突起プラーク、及び血管アミロイド沈着からのAβ3-ピログルタミルペプチドの単離、化学的特性付け、及び定量化（Isolation, chemical characterization, and quantitation of Abeta 3-pyroglutamyl peptide from neuritic plaques and vascular amyloid deposits.）Biochem Biophys Res Commun 237, 188-191. （1997）；Saido, T.C.らの文献、老人斑における異なるβ-アミロイドペプチド種、AβN3（pE）の優勢、及び差動的沈着（Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, AbetaN3(pE), in senile plaques）、Neuron 14, 457-466（1995））、位置42にて終わる。N末端グルタミンで開始するAβ（AβN3Q）は、N末端グルタミン酸で開始するAβ（AβN3E）よりも優れたグルタミニルシクラーゼ（QC）による環化のための基質である（Schilling, S., Hoffmann, T., Manhart, S., Hoffmann, M. 及びDemuth, H.U.の文献、グルタミニルシクラーゼは、穏やかな酸性条件下でグルタミルシクラーゼ活性を展開する（Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions.）FEBS Lett 563、191-196（2004）；Cynis, H.らの文献、グルタミニルシクラーゼの阻害は、哺乳動物細胞におけるピログルタミン酸形成を変化させる（Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells.）Biochim Biophys Acta 1764、1618-1625（2006））。
【０００４】
Aβ（N3pGlu）は、より高い凝集性向（He, W. 及びBarrow, C.J.の文献、老人斑において見いだされるAβ 3-ピログルタミル、及び11-ピログルタミルペプチドは、インビトロにおいて全長Aβよりも優れたβシート形成性向、及び凝集性向を有する（Abeta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length Abeta） Biochemistry, 38, 10871-10877（1999）；Schilling, S.らの文献、pGlu-アミロイドペプチドの播種、及びオリゴマー形成について（インビトロ）（On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides (in vitro)）、Biochemistry, 45, 12393-12399（2006）、並びに安定性（Kuo, Y.M., Webster, S., Emmerling, M.R., De Lima, N. 及びRoher, A.E.の文献、 不可逆的二量体化／四量体化、及び翻訳後修飾は、アルツハイマー病のAβペプチドのタンパク質分解を阻害する（Irreversible dimerization/tetramerization and post-translational modifications inhibit proteolytic degradation of Abeta peptides of Alzheimer's disease.） Biochim Biophys Acta 1406、291-298（1998））を有し、かつ全長Aβと比較して毒性の増大を示す（Russo, C.らの文献、ピログルタミン酸修飾されたアミロイド-ペプチド-AN3（pE)-は、培養されたニューロン、及びアストロサイトの生存に強い影響がある（Pyroglutamate-modified amyloid-peptides - AβN3(pE) - strongly affect cultured neuron and astrocyte survival）、Neurochemistry 82, 1480-1489（2002））。しかし、Aβ（N3pGlu-40）、及びAβ（N3pGlu-42）の毒性は、Aβ（N1D-40）、及びAβN1D-42のものと同様であり（Tekirian, T.L., Yang, A.Y., Glabek, C. 及びGeddes, J.W.の文献、ポリグルタミン化されたアミロイドβペプチド3（pE)-40、及び-42の毒性は、Aβ1-40、及び-42のものと同様である（Toxicity of pyroglutaminated amyloid beta-peptides 3(pE)-40 and -42 is similar to that of Abeta1-40 and -42）、J Neurochem 73、1584-1589（1999））、並びにAβ（N3pGlu）は、AD脳における主要な変異体ではない（Lemere, C.A.らの文献、ダウン症候群における不均一なアミロイドβペプチド、及びアポEの沈着の順序：アミロイドプラーク形成における初期イベントについての意味（Sequence of deposition of heterogeneous amyloid beta-peptides and APO E in Down syndrome: implications for initial events in amyloid plaque formation）、Neurobiol Dis 3, 16-32（1996））というその他の研究が報告された。Schillingらの文献は、ピログルタミン酸修飾されたペプチドがAβ凝集の初期形成における250倍までの加速を示すことを証明し（Schilling, S.らの文献、pGlu-アミロイドペプチドの播種、及びオリゴマー形成について（インビトロ）（On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides (in vitro)）、Biochemistry, 45, 12393-12399（2006））、かつAβの位置3におけるグルタミン酸の環化がグルタミニルシクラーゼ（QC）によって酵素的に駆動されるというインビトロの証拠を示した（Schilling, S., Hoffmann, T., Manhart, S., Hoffmann, M. 及びDemuth, H.U.の文献、グルタミニルシクラーゼは、穏やかな酸性条件下でグルタミルシクラーゼ活性を展開する（Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions）、FEBS Lett 563、191-196（2004）；Cynis, H.らの文献、グルタミニルシクラーゼの阻害は、哺乳動物細胞におけるピログルタミン酸形成を変化させる（Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells）、Biochim Biophys Acta 1764、1618-1625（2006））。QC阻害は、有意にAβ（N3pGlu）形成の減少へと導き、ピログルタミン酸含有ペプチドの細胞成熟の間のQC活��の重要性を示している（Cynis, H.らの文献、グルタミニルシクラーゼの阻害は、哺乳動物細胞におけるピログルタミン酸形成を変化させる（Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells）、Biochim Biophys Acta 1764、1618-1625（2006））。全脳可溶化液の2次元ゲル電気泳動によって（Casas, C.らの文献、新規アルツハイマートランスジェニックモデルにおける神経細胞内、及びN末端が切断されたA｛β｝42の蓄積を伴う大量のCA1/2ニューロンの喪失（Massive CA1/2 Neuronal Loss with Intraneuronal and N-Terminal Truncated A{beta}42 Accumulation in a Novel Alzheimer Transgenic Model.）Am J Pathol 165, 1289-1300（2004））、並びにニューロン、及びプラーク内の免疫組織化学によって（Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T.C. 及びBayer, T.A.の文献、アルツハイマーマウスモデルにおける年齢依存的な軸索の変性（Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model）、Neurobiol Aging 8, オンラインバージョン（2006））、かなりの量のAβ（N3pGlu）を有することが検出されるAPP／PS1KIマウスとは対照的に、APPトランスジェニックマウスモデルは、Aβ（N3pGlu）レベルを全く示さないこと（Kuo, Y.M.らの文献、トランスジェニックマウス、及びアルツハイマー病脳のアミロイド-β化学構造、並びにアミロイドプラーク形態の比較解析（Comparative analysis of amyloid-beta chemical structure and amyloid plaque morphology of transgenic mouse and Alzheimer's disease brains.）J Biol Chem 276、12991-12998（2001））、又は低いAβ（N3pGlu）レベルを示すこと（Guntert, A., Dobeli, H. 及びBohrmann, B.の文献、ヒト、及びPS2APPマウス脳からのアミロイド沈着におけるアミロイド-βペプチド組成物の高感度解析（High sensitivity analysis of amyloid-beta peptide composition in amyloid deposits from human and PS2APP mouse brain.）Neuroscience. 143, 461-475（2006））が報告されている。APP／PS1KIマウスは、脳、及び脊髄における年齢依存的な軸索の変性（Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T.C. 及びBayer, T.A.の文献、アルツハイマーマウスモデルにおける年齢依存的な軸索の変性（Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model）、Neurobiol Aging 8, オンラインバージョン（2006））、生後10箇月にてCA1における50%のニューロン喪失（Casas, C.らの文献、新規アルツハイマートランスジェニックモデルにおける神経細胞内、及びN末端が切断されたA｛β｝42の蓄積を伴う大量のCA1/2ニューロンの喪失（Massive CA1/2 Neuronal Loss with Intraneuronal and N-Terminal Truncated A{beta}42 Accumulation in a Novel Alzheimer Transgenic Model.）Am J Pathol 165, 1289-1300（2004））、並びに生後6箇月にて作業記憶、及び運動行為の欠陥（Wirths, O., Breyhan, H., Schafer, S., Roth, C. 及びBayer, T.A.の文献、アルツハイマー病のためのAPP／PS1kiマウスモデルにおける作業記憶、及び運動行為の欠陥（Deficits in working memory and motor performance in the APP/PS1ki mouse model for Alzheimer's disease）、Neurobiol Aging 8, 8（2007）を発症する。生後2〜6箇月の間、Aβ（N3pGlu）凝集の割合は、修飾されていないAβ（N1D）の割合よりも高かった。示唆的ではあるが、N切断されたAβペプチドのより大きな不均一性のため、このモデルでは、Aβ（N3pGlu）沈着と観察されたCA1ニューロン喪失との間を相関させることは困難である（Casas, C.らの文献、新規アルツハイマートランスジェニックモデルにおける神経細胞内、及びN末端が切断されたA｛β｝42の蓄積を伴う大量のCA1/2ニューロンの喪失（Massive CA1/2 Neuronal Loss with Intraneuronal and N-Terminal Truncated A{beta}42 Accumulation in a Novel Alzheimer Transgenic Model.）Am J Pathol 165, 1289-1300（2004））。
【０００５】
グルタミニルシクラーゼ（QC、EC 2.3.2.5）は、付随するアンモニアの遊離下で、N末端グルタミン残基のピログルタミン酸（pGlu*）への分子内の環化を触媒する。QCは、Messerによって1963年に熱帯植物パパイアのラテックスから最初に単離された（Messer, M.の文献、1963 Nature 4874、1299）。24年後、対応する酵素活性が動物下垂体において発見された（Busby, W. H. J.らの文献、1987 J Biol Chem 262、8532-8536；Fischer, W. H. 及びSpiess, J.の文献 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84、3628-3632）。哺乳動物QCについては、QCによるN末端GlnのpGluへの変換が、TRH、及びGnRHの前駆体について示されている（Busby, W. H. J.らの文献、1987 J Biol Chem 262、8532-8536；Fischer, W. H. 及びSpiess, J.の文献、1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84、3628-3632）。加えて、QCの初期の局在化実験では、ウシ下垂体におけるその推定上の触媒作用の産物との共局在、示唆されたペプチドホルモン合成における機能を更に改善することが明らかになった（Bockers, T. M.らの文献、1995 J Neuroendocrinol 7、445-453）。対照的に、植物QCの生理機能は、あまり明らかではない。C.パパイア由来の酵素の場合、病原微生物に対する植物防御における役割が示唆された（El Moussaoui, A.らの文献、2001 Cell Mol Life Sci 58、556-570）。その他の植物由来の推定上のQCが、配列比較によって最近同定された（Dahl, S. W.らの文献、2000 Protein Expr Purif 20、27-36）。しかし、これらの酵素の生理機能は、いまだあいまいである。
【０００６】
植物、及び動物由来の公知のQCは、基質のN末端の位置のL-グルタミンに対して厳密な特異性を示し、これらの動力学的挙動は、ミカエリス‐メンテンの式に従うことが見いだされた（Pohl, T.らの文献、1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88、10059-10063；Consalvo, A. P.らの文献、1988 Anal Biochem 175、131-138；Gololobov, M. Y.らの文献、1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377、395-398）。しかし、C.パパイア由来のQCの一次構造と哺乳類由来の高度に保存されたQCのものとの比較では、何ら配列相同性は明らかにならなかった（Dahl, S. W.らの文献、2000 Protein Expr Purif 20、27-36）。植物QCは、新たな酵素ファミリーに属すると思われるのに対して（Dahl, S. W.らの文献、2000 Protein Expr Purif 20、27-36）、哺乳動物QCは、細菌アミノペプチダーゼに対して明白な配列相同性を有することが見いだされ（Bateman, R. C.らの文献、2001 Biochemistry 40、11246-11250）、植物、及び動物由来のQCが異なる進化の起源を有するという結論に至った。
【０００７】
EP 02 011 349.4は、昆虫グルタミニルシクラーゼをコードするポリヌクレオチド、並びにこれによりコードされるポリペプチドを開示する。この出願は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を更に提供する。単離されたポリペプチド、及び昆虫QCを含む宿主細胞は、グルタミニルシクラーゼ活性を減少させる薬剤をスクリーニングする方法に有用である。このような薬剤は、殺虫薬として有用であることが記述されている。
【０００８】
本発明の主題は、特にAβに関連した疾患の分野において有用であり、その例の1つは、アルツハイマー病である。アルツハイマー病（AD）は、異栄養性ニューロン、反応性アストロサイト、及びミクログリアと密接に関連した細胞外アミロイド性プラークの異常な蓄積によって特徴づけられる（Terry, R. D. 及びKatzman, R.の文献、1983 Ann Neurol 14、497-506；Glenner, G. G. 及びWong, C. W.の文献、1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890；Intagaki, S.らの文献、1989 J Neuroimmunol 24、173-182；Funato, H.らの文献、1998、J Pathol 152, 983-992； Selkoe, D. J.の文献、2001 Physiol Rev 81、741-766）。アミロイド-β（Aβと略記される）ペプチドは、老人斑の主要構成要素であり、遺伝的研究によって支持される仮説である、ADの病原性、及び進行に直接関与するものと考えられる（Glenner, G. G. 及びWong, C. W.の文献、1984 Biochem Biophys Res Comm 120、885-890；Borchelt, D. R.らの文献、1996 Neuron 17, 1005-1013；Lemere, C. A.らの文献、1996 Nat Med 2, 1146-1150；Mann, D. M. 及びIwatsubo, T.の文献、1996 Neurodegeneration 5, 115-120；Citron, M.らの文献、1997 Nat Med 3, 67-72；Selkoe, D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741-766）。Aβは、β-アミロイド前駆体タンパク質（APP）のタンパク質分解性プロセシングによって産生され（Kang, J.らの文献、1987 Nature 325,733-736；Selkoe,D. J.の文献、1998 Trends Cell Biol 8, 447-453）、これがAβのN末端にてβ-セクレターゼによって、及びC末端にてγ-セクレターゼによって連続して切断される（Haass,C. 及びSelkoe,D. J.の文献、1993 Cell 75,1039-1042；Simon, M.らの文献、1996 J Neurosci 16 899-908）。N末端（Aβ1-42／40）にてL-Aspで開始する優勢なAβペプチドに加えて、N末端で切断された形態の多数の不均一性が、老人斑において生じる。このような短くなったペプチドは、全長アイソフォームよりもインビトロにおいて神経毒性があり、かつ迅速に凝集することが報告されている（Pike, C. J.らの文献、1995 J Biol Chem 270、23895-23898）。N切断されたペプチドは、早発性家族性AD（FAD）対象において過剰産生されること（Saido,T. C.らの文献、1995 Neuron 14、457-466；Russo, Cらの文献、2000 Nature 405、531-532）、早期に現われること、及びダウン症候群（DS）脳において年齢と共に増加すること（Russo,C.らの文献、1997 FEBS Lett 409,411-416,Russo,C.らの文献、2001 Neurobiol Di 8,173-180；Tekirian,T. L.らの文献、1998 J Neuropathol Exp Neurol 57、76-94）が知られている。最後に、これらの量は、進行性の疾患の重症度を反映する（Russo, C.らの文献、1997 FEBS Lett 409、411-416；Guntert, A.らの文献、2006 Neuroscience143、461-475）。さらなる翻訳後プロセスでは、位置1、及び7におけるアスパラギン酸の異性化、又はラセミ化によって、及び残基3、及び11におけるグルタミン酸の環化によって、N末端を更に修飾し得る。位置3にピログルタミン酸を含むアイソフォーム[AβN3（pGlu)-40/42］は、-総Aβ量のおよそ50%が-老人斑におけるN切断された種の顕著な形態を表し（Mori, H.らの文献、1992 J Biol Chem 267、17082-17086、Saido, T. C.らの文献、1995 Neuron 14、457-466；Russo, C.らの文献、1997 FEBS Lett 409、411-416；Tekirian, T. L.らの文献、1998 J Neuropathol Exp Neurol 57、76-94；Geddes, J. W.らの文献、1999 Neurobiol Aging 20、75-79；Harigaya, Y.らの文献、2000 Biochem Biophys Res Commun 276、422-427）、これらは、またプレアミロイド病変にも存在する（Lalowski, M.らの文献、1996 J Biol Chem 271、33623-33631）。AβN3（pE）ペプチドの蓄積は、凝集を増強し、かつ大部分のアミノペプ��ダーゼに対する耐性を与える構造変更に起因する可能性が高い（Saido, T. C.らの文献、1995 Neuron 14、457-466；Tekirian, T. L.らの文献、1999 J Neurochem 73、1584-1589）。この証拠は、AD病原性におけるAβN3（pE）ペプチドの中心的役割についての手掛かりを提供する。しかし、これらの神経毒性、及び凝集特性については、ほとんど知られていない（He, W. 及びBarrow, C. J.の文献、1999 Biochemistry 38, 10871-10877；Tekirian, T. L.らの文献、1999 J Neurochem 73, 1584-1589）。その上、グリア細胞に対するこれらのアイソフォームの作用、及びこれらのペプチドに対するグリアの反応は、完全に未知であるが、活性化されたグリア細胞は、老人斑に厳密に関連しており、アミロイド沈着の蓄積に能動的に寄与するかもしれない。最近の研究では、Aβ1-42、Aβ1-40、[pGlu3］Aβ3-42、[pGlu3］Aβ3-40、[pGlu11］Aβ11-42、及び[pGlu11］Aβ11-40ペプチドの毒性、凝集特性、並びに異化反応は、ニューロン、及び膠細胞培養において調査されており、ピログルタミン酸修飾は、Aβペプチドの毒性特性を増悪して、更に培養された星状細胞によるこれらの分解を阻害することが示された。Shirotaniらの文献では、インビトロにおいてシンドビスウイルスに感染した初代皮質ニューロンにおける[pGlu3］Aβペプチドの産生を調査した。彼らは、アミノ酸置換、及び欠失によって[pGlu3］Aβの潜在的前駆体をコードするアミロイド前駆体タンパク質相補DNAを構築した。天然の前駆体のグルタミン酸の代わりにN末端グルタミン残基で開始する1つの人工の前駆体については、グルタミニルシクラーゼによるピログルタミン酸への自然変換、又は酵素変換が示唆された。[pGlu3］Aβの天然の前駆体の位置3におけるN末端グルタミン酸の環化メカニズムは、インビトロでも、インサイチューでも、又はインビボでも決定されなかった（Shirotani、K.らの文献、2002 Neurosci Lett 327, 25-28）。
【発明の概要】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、Aβペプチドに関連した疾患のための非ヒトトランスジェニック、特に哺乳類モデルのための方法、及び組成物を含む。具体的には、本発明は、Aβペプチドを過剰発現する非ヒトトランスジェニック動物モデルを含む。
【００１０】
本発明の発明者は、配列番号：1のAβ3E-42（tgN3E-42）、又は配列番号：2のAβN3Q-42（tgN3Q-42）のいずれかを発現するトランスジェニックマウス系統を作製した。最も高いAβN3（pGlu）レベルは、tgN3Q-42マウス脳において観察された。強力な発現は、海馬CA1ニューロンを含む種々の脳領域において、及びtgN3Q-42については、小脳プルキンエ細胞において観察された。TgN3Q-42マウスは、大量のプルキンエ細胞変性、アストロ、及びミクログリアの活性化、並びに重篤な神経学的表現型を発症し、これは、未熟死を生じた。若い（生後4週間目まで）tgN3E-42ホモ接合性マウスは、明らかな神経病態を示さないが、tgN3E-42ホモ接合性マウス（3月齢）では、2つの異なる抗体を使用する免疫組織化学により、Aβの強力な発現が種々の脳領域において観察された。これらの領域には、海馬CA1領域、同様に種々の脳幹領域を含んだ。ホモ接合性、及び野生型動物において、Aβに向けた抗体4G8を使用して、プルキンエ細胞染色が見いだされたが、Aβに向けた抗体6E10で標識した切片は、ここでは何ら免疫反応性を示さなかった。Aβ（N3pGlu-42）の免疫組織化学的解析により、CA1、及び脳幹における同様の染色パターンを明らかになったが、加えて、CA3において標識も示した。これらのデータは、CA1形態の明らかな変化を実証する。
グリア、及びAβ（N3pGlu-42）の二重免疫蛍光染色により、tgN3E-42マウスのCA1領域内における非常に多数のグリアが明らかになった（図3）。ホモ接合性tgN3E-42マウスは、情動の変化（図8）、認知の低下（図9A、図9B、及び図9C）、及び運動欠陥によって生じる体重増加の障害（図10）と合わせて、神経変性を伴う進行性の表現型を示す。これらの知見は、Aβ（N3pGlu-42）の形成と組織病態との関係を明らかに示している。最も重要なことに、本明細書に記述したモデルは、数週間の年齢にて、ニューロンの喪失を伴うAβ（N3pGlu-42）の有意な蓄積をもつ最初のものである。これらの独特の結果は、トランスジェニックマウスにおいて適用されるトランスジェニックストラテジーを、異なるアミロイドペプチドの神経毒性の特性を調査するための優れたアプローチへと昇格する。従って、本明細書に記述したプレプロストラテジーは、ADan、Abri、又はまたAβに関連したペプチドのようなその他のペプチド様に対して適用されるかもしれない。
【００１１】
ヘテロ接合性tgN3E-42マウスにおけるAβ（N3pGlu-42）のレベルは、マウスグルタミニルシクラーゼ（QC）についてのトランスジェニックマウスとの交雑後に有意に上昇し、原則として、QCがインビボでグルタミン酸のピログルタミン酸への変換を触媒することができることを示している。これらのデータは、Aβ（N3pGlu-42）の神経細胞内蓄積の増加が変性、及び運動失調を生じるのに十分であることを示しており、かつピログルタミン酸形成によって生じる神経変性のためのマウスモデルを確立することができることを証明する。
【００１２】
本発明は、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病（AD）、大脳アミロイド血管障害、レビ小体痴呆症、ダウン症候群における神経変性、アミロイド症（オランダ型）を伴う遺伝性脳溢血、家族性デンマーク人痴呆症、家族性英国人痴呆症、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）感染を伴う、又は伴わない潰瘍疾患、及び胃癌、病原性精神病状態、統合失調症、不妊症、新形成、炎症性宿主反応、癌、乾癬、リウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、後天性免疫不全症候群、移植片拒絶、舞踏病ハンチントン（HD）、体液性、及び細胞を媒介免疫応答の障害、内皮における白血球接着、及び遊走プロセス、摂食障害、睡眠-覚醒状態、エネルギー代謝の恒常性制御の障害、自律神経機能の障害、ホルモンバランスの障害、並びに体液の制御の障害、並びにグアムパーキンソン-痴呆症症候群を含むが、限定されないAβペプチドに関連した疾患を調整する生物学的に活性な薬剤のスクリーニングのための組成物、並びに方法を更に含む。本発明の別の態様は、QC、及び／又はQPCTL阻害剤をスクリーニングするための方法、並びに組成物を含む。
【００１３】
加えて、本発明は、Aβペプチドに関連した疾患の治療、及び／又は予防のために方法、並びに組成物、特にAβペプチドに関連した毒性、及び／又は凝集性向を阻害する方法、並びに組成物を含む。
【００１４】
従って、本発明の目的は、特定のAβペプチドを過剰発現するトランスジェニック動物を提供することである。
本発明の別の目的は、特定のAβペプチドをコードするDNA構築物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、プロモーターに連結されたAβペプチドをコードするDNA構築物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、非ヒトトランスジェニック動物モデル系を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、特異的な組織型におけるAβペプチドのインビボ、及びインビトロでの制御、並びに効果を研究するための非ヒトトランスジェニック動物モデル系を提供することである。
本発明のさらなる目的は、アミロイドペプチドADan、及びABriを過剰発現するトランスジェニック動物の作成のための方法論を提供することである。
【００１６】
加えて、阻害研究によって、ヒト、及びマウスQCが金属依存的トランスフェラーゼであることが以前に示された。QCアポ酵素は、亜鉛イオンによって最も効率的に再活性化することができたし、亜鉛依存的アミノペプチダーゼの金属結合モチーフは、ヒトQCにも存在する。活性部位に結合した金属と相互作用する化合物は、強力な阻害剤である。
【００１７】
組換えヒトQC、並びに脳抽出物からのQC活性は、両方ともとN末端グルタミニル、並びにグルタミル環化を触媒することが以前に示された。最も際だっているのは、QCで触媒されるGlu1変換は、pH 6.0周辺を好むが、pGlu誘導体へのGln1変換は、約8.0の最適pHで生じるという知見である。pGlu-Aβ関連ペプチドの形成は、組換えヒトQC、及びブタ下垂体抽出物からのQC活性の阻害によって抑制することができるので、酵素QCは、例えばアルツハイマー病の治療のための薬物開発の標的である。
【００１８】
Aβペプチド活性のエフェクターを哺乳類に投与することにより、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病（AD）、大脳アミロイド血管障害、レビ小体痴呆症、ダウン症候群における神経変性、アミロイド症（オランダ型）を伴う遺伝性脳溢血、家族性デンマーク人痴呆症、家族性英国人痴呆症、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）感染を伴う、又は伴わない潰瘍疾患、及び胃癌、病原性精神病状態、統合失調症、不妊症、新形成、炎症性宿主反応、癌、乾癬、リウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、後天性免疫不全症候群、移植片拒絶、舞踏病ハンチントン（HD）、体液性、及び細胞を媒介した免疫応答の障害、内皮における白血球接着、及び遊走プロセス、摂食障害、睡眠-覚醒状態、エネルギー代謝の恒常性制御の障害、自律神経機能の障害、ホルモンバランスの障害、並びに体液の制御の障害から選択される状態を予防し、又は軽減し、又は治療することが可能性であり得る。
【００１９】
更に、Aβペプチド活性のエフェクターの哺乳類に対する投与により、胃腸管細胞増殖、好ましくは胃粘膜細胞、上皮細胞の増殖、急性酸分泌、並びに酸を産生する壁細胞、及びヒスタミンを分泌する腸クロム親和性細胞様細胞の分化を刺激することが可能であり得る。
【００２０】
更に、Aβペプチド活性のエフェクターの哺乳類に対する投与により、骨髄球性前駆細胞の増殖を抑制することが可能であり得る。
加えて、Aβペプチド阻害剤の投与は、雄の受精能の抑制を引き起こすとができる。
本発明は、Aβペプチドの少なくとも1つエフェクターを、任意に慣習的な担体、及び／又は賦形剤と組み合わせて含む、非経口的、経腸、又は経口投与のための医薬組成物を提供する。
本発明のこれらの、及びその他の態様のさらなる理解が、以下に示す図を参照することにより得られるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】トランスジェニックマウスを産生するための構築物、及び生後2箇月の脳における発現プロフィール。（a）.AβN1-42は、位置1にてアスパラギン酸（D）で、AβN3E-42は、位置3にてグルタミン酸（E）で、及びAβN3Q-42は、グルタミン（Q）で開始する。N切断されたAβN3E-42、及びAβN3Q-42ペプチドは、両方ともAβN3（pE)-42を産生するようにQC活性によって変換することができる。（b）トランスジェニックベクターの略図。Thy1プロモーターの制御下でAβ（N3E-42）、又はAβ（N3Q-42）を発現し、かつマウスTRHのプレプロペプチド（アミノ酸：メチオニン1-アルギニン76）に融合されているtgN3E-42、及びtgN3Q-42トランスジェニックマウス。QCトランスジェニックマウスは、CAGプロモーターの制御下でマウスQCミニ遺伝子（mQPCT）を発現する。WT（N=6）、QC（N=6）、tgN3E-42（N=9）、tgN3E-42/QC（N=9）、及びtgN3Q-42（N=4）マウス（c-e）の脳脳半球可溶化液におけるAβ（x-42）、及びAβ（N3pGlu-42）のELISA解析。（c）WT対照と比較した、Aβ（x-42）レベルの有意な増大がtgN3E-42マウスにおいて見いだされた（P＜0.0001）。TgN3Q-42は、tgN3E-42（P＜0.0001、不対t検定）、及びtgN3E-42-QC二重トランスジェニックマウス（P＜0.0001、不対t検定）と比較して、最高レベルのAβ（x-42）を示した。（d）tgN3E-42-QC二重トランスジェニックマウスは、tgN3E-42発現単独と比較してレベルの増加を有した。tgN3Q-42マウスは、tgN3E-42（P＜0.0001、不対t検定）、及びtgN3E-42-QC二重トランスジェニック（P＜0.0001、不対t検定）マウスと比較して、最高レベルのAβ（N3pGlu-42）を示した。（e）Aβ（N3pGlu-42）対総Aβ（x-42）の比についても同様に真であった。全てのマウスは、生後2箇月であった。値は、平均±s.e.m.として示してあり、*P＜0.05、***P ＜0.001。
【図２】tgN3Q-42トランスジェニックマウスの特性付け。（a）,（b）tgN3Q-42マウスが一般に小さいこと、及びそれらがゆがんだ姿勢（b）を示すことを示す野生型（WT）、及びtgN3Q-42マウスの写真。（c）tgN3Q-42脳の巨視的検査により、年齢がマッチしたWT同腹仔（2月齢のマウス）と比較して、萎縮性小脳を明らかにした。（d）雌性、及び雄のtgN3Q-42マウスは、両方とも、それらの年齢がマッチしたWT同腹仔（2月齢のマウス）と比較して、体重の減少を示した（不対t検定）。（e）tgN3Q-42マウスは、WT同腹仔と比較して、有意に生存率の減少を示した（P = 0.0002；ログランク検定）。値は、平均±s.e.m.として示してあり、***P＜0.001。
【図３】図3A  tgN3Q-42マウスの免疫組織化学的染色。（a）抗体4G8での免疫染色により、海馬のCA1ピラミッド形層における強力なAβ蓄積を明らかにしたが（挿入画は、低拡大での海馬概要を示す）、限られた免疫反応性のみが、Aβ（N3pGlu）に対する抗体で検出された（b）。（c）4G8染色によって示される視床における細胞外散に散在するAβ沈着。（d-e）脳におけるAβ染色（4G8）は、プルキンエ細胞に制限される。（f-g）Aβ（N3pGlu）に対する抗体によって示されるように、ほとんどのプルキンエ細胞は、ピログルタミン酸で開始するN切断されたAβを蓄積した。（h）GFAP染色により、tgN3Q-42マウスにおけるバーグマングリアの顕著な染色を明らかになったが、野生型動物（i）は、一貫してネガティブであった。ミクログリアマーカーIba1により、tgN3Q-42マウス（j）において、プルキンエ細胞を囲んでいるミクログリアクラスター、及び白質路において明らかになったが、野生型同腹仔（k）では明らかとならなかった。（l）4G8、及びユビキチンに対するものでのプルキンエ細胞の二重染色。4G8-ポジティブプルキンエ細胞における変性ついてのマーカーである大量のユビキチン免疫反応性に注目すされたい。  図3B  ホモ接合性tgN3E-42を発現するマウスの免疫組織化学的、及び免疫蛍光染色。（a)-(d）：海馬CA1領域の4G8染色では、トランスジェニックマウスのみのCA1層における蓄積を示す。（a）、及び（c）野生型マウス、（b）、（d）tgN3E-42ホモ接合性マウス。（e）、（f）：Aβ（N3pGlu）に対する抗体により、トランスジェニックマウスのみにおいて海馬CA1ピラミッド形層における強力なAβ蓄積が明らかになった。（e）、tgN3E-42ホモ接合性マウス；（f）野生型マウス）。tgN3E-42hom、及びwtマウスにおけるCA1形態の比較では、この領域における深在性ニューロンの喪失を示す（g）、（h）トランスジェニックマウス、（g）野生型マウス；（h）tgN3E-42ホモ接合性トランスジェニックマウスにおいて）。二重免疫蛍光染色では、大規模にtgN3E-42hom対wtのグリア番地 CA1を増加させた（i）、（j）。
【図４】位置3にてピログルタミン酸で開始するAβ（AβN3（pE））の形成は、グルタミニルシクラーゼ（QC）によって触媒される。位置3にてグルタミン酸（AβN3E）、又はグルタミン（AβN3Q）で開始するAβのN末端は、両方ともAβN3（pE）を産生するためのQCのために基質として役立ち得る。速い酵素過程であるグルタミンからのピログルタミン酸形成とは対照的に、N末端グルタミン酸からのピログルタミン酸の変換が遅いことが、インビトロにおいて示されている（Schilling, S., Hoffmann, T., Manhart, S., Hoffmann, M. 及びDemuth, H.U.の文献、グルタミニルシクラーゼは、穏和な酸性条件下でグルタミルシクラーゼ活性を展開する。（Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions.）FEBS Lett 563, 191-196（2004））。この観察は、また細胞培養において（Cynis, H.らの文献、グルタミニルシクラーゼの阻害は、哺乳動物細胞におけるピログルタミン酸形成を変化させる。（Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells.）Biochim Biophys Acta 1764, 1618-1625（2006））、及び脳において本発明に従ってインビボで生じることが検証されている。その上、細胞培養におけるQCの薬理学的阻害は、AβN3（pE）レベルの減少を引き起こす（Cynis, H.らの文献、グルタミニルシクラーゼの阻害は、哺乳動物細胞におけるピログルタミン酸形成を変化させる。（Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells.）Biochim Biophys Acta 1764, 1618-1625（2006））。
【図５】2月齢のtgN3Q-42マウス脳切片におけるAβ抗体4G8を使用する免疫組織化学的染色の概要。大量の染色が、海馬CA1ニューロン、小脳プルキンエ細胞、皮質、及び皮質下領域において観察される。
【図６】前核注射のための断片を調製するために使用した制限ストラテジーを示す。導入遺伝子を含む7170-bp断片を産生するために使用したEcoRI制限部位の位置でのtgN3Q-42プラスミドの概略図（TRH-AβN3Q（3-42）、又はTRH-AβN3E（3-42）導入遺伝子+ Thy1プロモーター）。図は、一定の比率で示されていない。
【図７】PCR遺伝子タイピング方法論を示す：ランダムな組込み、及び導入遺伝子完全性の検出のために使用したプライマーの局在。対応する増幅産物サイズを示してある。太線は、プラスミドバックボーン配列を表す。半矢印は、プライマーの局在を図示する。図は、一定の比率で示されていない。TRH-AβN3E（3-42）導入遺伝子構築物は、同一構造を有する。
【図８】明暗ボックス装置における7週齢のtgN3E-42マウスの行動を図示する：tgN3E-42マウスは、野生型の同腹仔と比較して、明るい領域への侵入の数が有意に減少したことを示し（p＜0,01異種接合体、及びp＜0,05ホモ接合性マウス）、tgN3E-42における情動の変化を示している。
【図９】図9Aは、恐怖条件づけ装置における3月齢のtgN3E-42マウスの行動を示す：ホモ接合性マウスは、ヘテロ接合性マウス、及び野生型の同腹仔と比較して、活動の増加、及びすくみ行動の減少を伴って恐怖状況（contextual fear）に反応する。  図9Bは、恐怖条件づけ装置における3月齢のtgN3E-42マウスの行動を示す：ホモ接合性tgN3E-42マウスは、同腹仔と比較して、活動の増加を伴って与えられた恐怖条件付けに反応する。  図9Cは、恐怖条件づけ装置における3月齢のtgN3E-42マウスの行動を示す：ホモ接合性tgN3E-42マウスは、本状況において、有意に短いすくみ期間を示す。図9A、図9B、及び図9Cの結果は、トランスジェニックtgN3E-42マウスの認知の減退を証明する。
【図１０】3月齢におけるtgN3E-42マウスの体重を示す。ヘテロ接合性、及びホモ接合性マウスにおいて観察された体重の減少があり、これは、ホモ接合性マウスに関して統計的有意性に達した。体重の減少は、同種tgN3E-42マウスの運動欠陥によって生じ、これは、pGlu-A3-42の蓄積、及びニューロンの喪失のために、若年にて発症する。
【図１１】ヘテロ接合性、及びホモ接合性tgN3E-42マウスの脳に添加したA（x-42）（上の図）、及びpGlu-Aβ（3-42）（下の図）を示す。  脳からの抽出後、Aβ濃度をELISAによってSDS、及びギ酸画分において決定した。Aβの総量を算出して、脳湿重量に対して規準化した。雄動物のみを解析した（N=2-6）。ホモ接合性動物は、有意により高濃度のpGlu-Aβを蓄積し、これには、ニューロン喪失、記憶、及び行動の機能障害を伴う。
【図１２】ヘテロ接合性、及びホモ接合性tgN3E-42マウス、tgN3Q-42、及びAPPswマウスの脳に添加したpGlu-Aβ（3-42）（上の図）、及びAx-42（下の図）を示す。  脳からの抽出後、Aβ濃度をELISAによってSDS、及びギ酸画分において決定した。Aβの総量を算出して、脳湿重量に対して規準化した。ホモ接合性tgN3E-42、及びヘテロ接合性tgN3Q-42動物は、有意により高い濃度のpGlu-Aβを蓄積し、これには、ニューロン喪失、記憶、及び行動の機能障害を伴う。
【図１３】強力な強縮の適用後（時点0）のEPSPの長期活性化を示す。  tgN3E-42ホモ接合性マウスのLTPは、WTマウスと比較して有意に減弱された（WTマウス対tg.マウス：p=0.007；tg.マウス：n=18；WT：n=12；繰り返し計測でのANOVA）。アナログ追跡は、筋強縮の10分前（1）、及び筋強縮の240分後（2）に行った一回の実験の典型的な記録を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明のその他の目的、利点、及び特徴は、以下の詳細な説明を考慮することにより明らかになるであろう。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、Aβペプチドに関連した疾患の研究のためのトランスジェニック動物モデルの作成方法、及び組成物、並びにトランスジェニック非ヒト動物それ自体を含む。本発明は、特に、Aβペプチドを過剰発現するトランスジェニック動物モデルを作成する方法、及び組成物、並びにトランスジェニック非ヒト動物それ自体を含む。本発明は、Aβペプチド阻害剤を試験するための方法、及び組成物、並びにAβペプチド阻害剤により予防／治療の方法、及び医薬組成物を更に含む。
【００２４】
また、本発明は、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、家族性デンマーク人痴呆症（FDD）、家族性英国人痴呆症（FBD）、及びダウン症候群における神経変性の治療のための新たな方法を提供する。アルツハイマー病、及びダウン症候群脳に沈着したアミロイドβペプチドのN末端、並びに家族性デンマーク人痴呆症、及び家族性英国人痴呆症に沈着したアミロイドペプチドADan、及びABriは、ピログルタミン酸を有する。修飾されたアミロイドβペプチド、ADan、及びABriは、アミロイド凝集、及び毒性に向かう傾向の増強を示し、疾患の発病、及び進行を悪化させる可能性が高いので、FDDにおけるADan、及びFBDにおけるABri、並びにアルツハイマー病、及びダウン症候群におけるAβのN末端におけるpGlu形成は、それぞれの疾患の発症、及び進行における重要なイベントであることが示された（Russo, C.らの文献、2002 J Neurochem 82, 1480-1489；Ghiso, J.らの文献、2001 Amyloid 8, 277-284）。
【００２５】
（定義）
「導入遺伝子」という用語は、宿主ゲノムに組み込まれ、又は宿主細胞において自律増殖ができ、かつ1つ以上の細胞産物の発現を生じさせることができるDNAのセグメントを意味する。例示的な導入遺伝子は、対応する非形質転換細胞、又は動物に関して新規表現型もつ、宿主細胞、又はそこから発生した動物を提供するであろう。
【００２６】
「トランスジェニック動物」という用語は、その細胞の一部に染色体外因子として存在するか、又はその生殖系列DNAに安定に組み込まれた非内因性核酸配列を有する非ヒト動物、通常は哺乳類を意味する。
【００２７】
「構築物」という用語は、特定のヌクレオチド配列（群）の発現のために産生されたか、又はその他の組換えヌクレオチド配列の構築に使用される組換え核酸、一般に組換えDNAを意味する。組換え核酸は、例えばキメラ、又はヒト化ポリペプチドをコードすることができる。
【００２８】
ポリペプチドは、本明細書では、10を超えるアミノ酸を含む全ての可能なアミノ酸配列に属するものをいう。
「作動可能に連結された」という用語は、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が制御配列（群）に結合されるときに、DNA配列、及び制御配列（群）が遺伝子形質発現を可能にするような方法で連結されていることを意味する。
【００２９】
「機能的に挿入された」という用語は、関心対象のヌクレオチド配列が関心対象の導入されたヌクレオチド配列の転写、及び翻訳を指揮するヌクレオチド配列に隣接して位置することを意味する。
【００３０】
（導入遺伝子）
本発明の導入遺伝子を含むAβペプチドポリヌクレオチドには、AβペプチドcDNAを含み、かつ修飾されたAβペプチドcDNAも含むものとする。本明細書に使用される、核酸の「修飾」には、参照配列に関して1つ、又はいくつかのヌクレオチド付加、欠失、又は置換を含み得る。核酸の修飾には、遺伝暗号の縮重のためにコードされたアミノ酸配列を変化しないか、又は保存的置換を生じる置換を含み得る。このような修飾は、ポリA尾部の付加などの、故意に作製された変異、又は核酸複製の間に突然変異として生じる変異に対応することができる。
【００３１】
本明細書に使用される「実質的に同じヌクレオチド配列という用語」は、参照ポリヌクレオチドに対して十分な同一性を有し、その結果適度にストリンジェントか、又はより高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で参照ヌクレオチドにハイブリダイズするであろうDNAをいう。参照ヌクレオチド配列と「実質的に同じヌクレオチド配列」を有するDNAは、参照ヌクレオチド配列に関して、少なくとも60%〜少なくとも95%にの範囲の同一性を有し得る。
【００３２】
「適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、相補核酸が標的核酸に結合するのを可能にする条件をいう。ハイブリダイズされた核酸は、一般に少なくとも約60%〜少なくとも約95%の範囲の同一性を有するだろう。適度にストリンジェントな条件は、42℃にて50%のホルムアミド、5×デンハート溶液、5×生理食塩水リン酸ナトリウムEDTA緩衝液（SSPE）、約0.2%のSDS（Aldrich）におけるハイブリダイゼーション、続く約42℃にて0.2×SSPE、0.2% SDS（Aldrich）における洗浄に匹敵する条件である。
【００３３】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、約65℃にて0.018M NaClにおいて安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件をいい、例えば、ハイブリッドが約65℃にて0.018M NaC1において安定でない場合、本明細書において想定されるように、それは、高ストリンジェンシー条件下で安定ではないだろう。高ストリンジェンシー条件は、例えば、約42℃にて50% ホルムアミド、5×デンハート溶液、5×SSPE、0.2% SDSにおけるハイブリダイゼーション、続く約65℃にて0.1×SSPE、及び0.1% SDSにおける洗浄によって提供することができる。
【００３４】
その他の適切な適度なストリンジェンシー、及び高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション緩衝液、並びに条件は、当業者に周知であり、例えば、Sambrookらの文献、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、第2版、Cold Spring Harbor、N. Y., （1989）；及びAusubelらの文献、分子生物学の現在のプロトコル（Current Protocols of Molecular Biology）（Supplement 47）, John Wiley 及びSons, New York（1999））。
【００３５】
本発明の導入遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、ヒトからのAβペプチド配列、又は任意の種からの、好ましくはマウス種からのAβペプチド相同体であることができる。また、本発明の導入遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、断片が全長Aβペプチド配列のいくつかの、又は全部の機能を保持する限り、Aβペプチドアミノ酸配列の断片であることができる。また、配列は、修飾されたAβペプチド配列であってもよい。個々の置換、欠失、又は付加、これは、単一アミノ酸、又はアミノ酸の少数パーセント（典型的には10%未満、より典型的には5%未満、及びなお典型的には1%未満）を変化させ、付加し、又は欠失させる。アミノ酸配列の「修飾」には、アミノ酸配列の保存的置換を包含する。機能的に同等なアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。以下の6つの群は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含む：
1）アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（1）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；及び、
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）。
【００３６】
その他の軽微な修飾も、ポリペプチドがAβペプチドポリペプチドの構造的、及び／又は機能的な特徴のいくつか、又は全てを保持する限り、配列の範囲内に含まれる。例示的な構造的、又は機能的な特徴には、配列同一性、又は実質的類似性、抗体反応性、RNA結合ドメイン、又は酸性ドメインなどの保存された構造的ドメインの存在を含む。
【００３７】
（DNA構築物、及びベクター）
本発明は、上記のとおりのAβペプチド導入遺伝子を含むDNA構築物を更に提供する。本明細書に使用される「DNA構築物」という用語は、DNA分子における遺伝因子の具体的な配置をいう。ヒトAβペプチド、又はその変異形に加えて、本発明は、また、その他の種からのポリペプチド、並びに非ヒト哺乳類からの突然変異体Aβペプチドを使用するDNA構築物を提供する。
【００３８】
望まれる場合、DNA構築物は、プロモーター、又はエンハンサーなどの適切な発現エレメントに機能的に連結されるように操作して、適切な細胞、又は組織においてDNA構築物の遺伝因子を発現させることができるとができる。発現調節メカニズムの使用により、関心対象の遺伝子のターゲットされた送達、及び発現ができる。例えば、本発明の構築物は、5'-3'方向の転写のものを含む発現カセット、脳組織における遺伝子発現と関連した転写、及び翻訳開始領域、突然変異体、又は野生型AβペプチドをコードするDNA,並びに宿主動物における機能的な転写、及び翻訳終結領域を使用して構築してもよい。また、1つ以上のイントロンが存在することもできる。転写開始領域は、宿主動物に対して内因性であるか、若しくは宿主動物に対して外来性、又は外因性であることができる。
【００３９】
本明細書に記述されるDNA構築物は、Aβペプチドを過剰発現する突然変異体非ヒト哺乳類を作成するために適した細胞内での増殖、又はトランスフェクションのためのベクターに組み込まれてもよく、また、本発明によって含まれる。当業者であれば、所望の特性に基づいて、例えば、哺乳動物細胞、又は細菌細胞などの特定の細胞におけるベクターの産生のためにベクターを選択することができる。
【００４０】
ベクターには、機能的に連結された核酸の組織特異的、又は誘導性の発現を提供する調節エレメントを含むことができる。当業者であれば、所望の組織においてAβペプチドを発現することができる適切な組織特異的プロモーター、又はエンハンサーを容易に決定することができる。本明細書に記述したような組織特異的発現には、好ましい組織以外の組織において完全に発現がないことは必要ではないことに留意するべきである。その代わり、「細胞特異的」、又は「組織特異的」発現は、好ましい細胞タイプ、又は組織における関心対象の特定の遺伝子の大部分の発現をいう。
【００４１】
また、任意の種々の誘導性プロモーター、又はエンハンサーを、調節することができるAβペプチド、又は核酸の発現のためのベクターに含めることができる。このような誘導性の系には、例えば、以下を含む：テトラサイクリン誘導性の系（Gossen、及びBizard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：5547-5551（1992）；Gossenらの文献、Science, 268：17664769（1995）；Clontech, Palo Alto、Calif.）；重金属によって誘導されるメタロチオネインプロモーター；エクジソン、又はムリステロン（muristerone）などの関連したステロイドに応答する昆虫ステロイドホルモン（Noらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93：3346-3351（1996）；Yaoらの文献、Nature, 366：476-479（1993）；Invitrogen、Carlsbad、Calif.）；糖質コルチコイド、及びエストロゲンなどのステロイドによって誘導されるマウス乳癌ウイルス（MMTV）（Leeらの文献、Nature, 294：228-232（1981）；並びに温度変化によって誘導性の熱ショックプロモーター；ラットニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター（Forss-Petterらの文献、Neuron 5；197-197 （1990））；ヒトβ-アクチン遺伝子プロモーター（Rayらの文献、Genes and Development（1991）5：2265-2273）；ヒト血小板由来成長因子B（PDGF-B）鎖遺伝子プロモーター（Sasaharaらの文献、Cell（1991）64：217-227）；ラットナトリウムチャネル遺伝子プロモーター（Maueらの文献、Neuron （1990）4：223-231）；ヒト銅-亜鉛スーパオキシドジスムターゼ遺伝子プロモーター（Ceballos-Picotらの文献、Brain Res.（1991）552：198-214）；並びに哺乳動物POU-ドメイン調節遺伝子ファミリーのメンバーのためのプロモーター（Xiらの文献、（1989）Nature 340：35-42）。
【００４２】
プロモーター、又はエンハンサーを含む調節エレメントは、調節の性質に応じて、構成的であるか、又は調節することができ、かつ種々の組織、又は1つ、又は少数の特異的組織において調節することができる。制御配列、及び調節エレメントは、ポリヌクレオチド配列と制御配列との間の物理的、又は機能的関係により、ポリヌクレオチド配列の転写が可能なように、本発明のポリヌクレオチド配列の1つに機能的に連結される。真核細胞における発現のために有用なベクターには、例えば、CAGプロモーター、SV40初期プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（MMTV）ステロイド-誘導性プロモーター、Pgtf、モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）プロモーター、thy-1プロモーター等を含む調節エレメントを含むことができる。
【００４３】
望まれる場合、ベクターには、選択可能マーカーを含むことができる。本明細書に使用される「選択可能マーカー」とは、選択可能マーカーが導入された細胞に選択可能な表現型を提供する遺伝因子をいう。選択可能マーカーは、一般に、その遺伝子産物が細胞増殖を阻害するか、又は細胞を死滅させる薬剤に対する耐性を提供する遺伝子である。例えばAusubelらの文献（分子生物学の現在のプロトコル（Current Protocols of Molecular Biology）（Supplement 47）, John Wiley 及びSons, New York（1999））、及び米国特許第5,981,830号に記述されたような、例えば、Neo, Hyg、hisD、Gpt、及びBle遺伝子を含む種々の選択可能マーカーを本発明のDNA構築物に使用することができる。選択可能マーカーの存在についての選択のために有用な薬物には、例えば、NeoのためのG418、Hygのためのハイグロマイシン、hisDのためのヒスチジノール、Gptのためのキサンチン、及びBleのためのブレオマイシンを含む（上記Ausubelらの文献（1999）；米国特許第5,981,830号を参照されたい）。本発明のDNA構築物には、ポジティブ選択可能マーカー、ネガティブ選択可能マーカー、又は両方を組み込むことができる（例えば、米国特許第5,981,830号を参照されたい）。
【００４４】
以下のDNA構築物、及び融合タンパク質が、本発明では好まれる：mTRH-Aβ（N3E-42）mTRH-Aβ（N3Q-42）。
好ましいクローニングベクターは、Thy-1配列を含むpUC18である。
【００４５】
（非ヒトトランスジェニック動物）
本発明は、主に、そのゲノムがAβペプチドをコードする導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。DNA断片は、任意の周知の方法によってトランスジェニック動物のゲノムに組み込むことができる。所望の遺伝子配列を含むDNA分子は、導入された分子がその相同領域において組換えを受けることができるであろう任意の方法によって、ES細胞などの、多能性細胞に導入することができる。使用することができる技術には、以下を含むが、限定されない：リン酸カルシウム／DNA共沈物、核へのDNAの微量注入、電気穿孔法、無処置細胞との細菌プロトプラスト融合、トランスフェクション、及びポリカチオン（例えば、ポリブレン、ポリオルニチン、その他）。DNAは、一本鎖、又は二本鎖DNA、直鎖状、又は環状であることができる。（例えば、Hoganらの文献、マウス胚を操作する：実験室マニュアル（Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual） Cold Spring Harbor Laboratory （1986）；Hoganらの文献、マウス胚を操作する：実験室マニュアル（Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual）、第2版、Cold Spring Harbor ory（1994）、米国特許第5,602,299号；第5,175,384号；第6,066,778号；第4,873,191号、及び第6,037,521号を参照されたい；レトロウイルスを媒介した生殖系列への遺伝子導入（Van der Puttenらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：6148-6152（1985））；胚性幹細胞における標的遺伝子組換え（Thompsonらの文献、Cell 56：313-321（1989））；胚の電気穿孔法（Loの文献、Mol Cell. Biol. 3：1803-1814（1983））；及び精子を媒介した遺伝子導入（Lavitranoらの文献、Cell 57：717-723（1989））。
【００４６】
例えば、接合体は、微量注入のための優れた標的であり、接合体を微量注入する方法は周知である（US4,873,191を参照されたい）。
また、胚性細胞を種々の発生時期に使用して、トランスジェニック動物の産生のための導入遺伝子を導入することができる。胚性細胞の発生の段階に応じて、異なる方法が使用される。このようなトランスフェクトされた胚性幹（ES）細胞は、その後に、胚にコロニー形成し、続いて胚盤胞-段階胚の胞胚腔にこれらを導入し、生じるキメラ動物の生殖系列に寄与する（Jaenischの文献、Science 240：1468-1474（1988）において概説される）。導入遺伝子がこのような選択のために手段を提供する場合、トランスフェクトされたES細胞の胞胚腔への導入の前に、トランスフェクトされたES細胞を種々の選択プロトコルに供して、導入遺伝子が組み込まれたES細胞の比率を濃縮することができる。或いは、PCRを使用して導入遺伝子を組み込んだES細胞をスクリーニングすることができる。
【００４７】
加えて、レトロウイルス感染も、導入遺伝子を非ヒト動物に導入するために使用することができる。発生中の非ヒト胚は、インビトロで胚盤胞段階まで培養することができる。この間、割球は、レトロウイルス感染のための標的となり得る（Jaenischの文献、Proc. Nati. Acad. Sci. USA 73：1260-1264 （1976））。割球の効率的感染は、透明帯を除去するための酵素処理によって得ることができる（上記Hoganらの文献、1986）。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は、典型的には、導入遺伝子を有する複製欠陥のあるレトロウイルスである（Jahnerらの文献、Proc. Natl. Acad Sci. USA 82：6927-6931（1985）；Van der Puttenらの文献、Proc. Natl. Acad Sci. USA 82：6148-6152（1985））。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上で割球を培養することによって容易かつ効率的に行われる（Van der Putten 1985、上記；Stewartらの文献、EMBO J. 6：383-388（1987））。或いは、感染は、後期段階に行うことができる。ウイルス、又はウイルス産生細胞を胞胚腔に注射することができる（Jahner D.らの文献、Nature 298：623-628（1982））。組み込みは、トランスジェニック動物を形成する細胞のサブセットのみにおいて生じるので、大部分の創立細胞（founder）は、導入遺伝子についてモザイクであるだろう。更に、創立細胞は、ゲノムの異なる位置にて、一般に子孫において分離するであろう種々の導入遺伝子のレトロウイルス挿入を含むことができる。加えて、導入遺伝子は、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルスの感染によって生殖系列に導入してもよい（Jahnerらの文献、1982、上記）。当業者に公知のトランスジェニック動物を作製するためのレトロウイルス、又はレトロウイルスベクターを使用するさらなる手段には、レトロウイルス粒子の微量注入、又は受精卵、若しくは初期胚の囲卵腔にレトロウイルスを生じるマイトマイシンC処理した細胞を含む（WO 90/08832（1990）；Haskell、及びBowenの文献、Mal. Reprod. Dev. 40: 386（1995））。
【００４８】
また、導入遺伝子を非ヒト動物に導入するための任意のその他の技術、例えばノックイン、又はレスキュー技術を、本発明の問題を解決するために使用することができる。ノックイン技術は、例えばCasasらの文献、Am J Pathol 165, 1289-1300（2004）に記述されているように、当該技術分野において周知である。
【００４９】
一旦創設動物が産生されたら、特定の動物の群体を産生するためにこれらを繁殖させ、同系交配させ、異系交配させ、又は交雑させることができる。このような繁殖ストラテジーの例には、以下を含むが、限定されない：分離した系統を確立するための、複数の組込み部位をもつ創設動物の異系交配；それぞれの導入遺伝子の付加発現の効果のため、高レベルにて導入遺伝子を発現する化合物トランスジェニクス（compound transgenics）を産生するための、分離した系統の同系交配；発現を増大し、及びDNA鑑定による動物のスクリーニングのための必要を除去するための両方のための、所与の組込み部位についてホモ接合性マウスを産生するためのヘテロ接合性トランスジェニックマウスの交雑；複合のヘテロ接合性、又はホモ接合性系統を産生するための、分離したホモ接合性系統の交雑；導入遺伝子の発現、及び発現の効果に対する対立遺伝子を修飾する効果を調べるための、異なる近交系の遺伝的背景への動物の繁殖。
【００５０】
トランスジェニック動物は、関心対象の表現型を有する動物を選択するためにスクリーニングされ、及び評価される。初期スクリーニングを、例えばサザンブロット分析、又はPCR技術を使用して行い、動物組織を解析して、導入遺伝子の組込みが起こったことを検証することができる。また、トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のmRNA発現のレベルは、動物から得られる組織試料のノーザンブロット解析、インサイチューハイブリダイゼーション解析、及び逆転写酵素-PCR（rt-PCR）を含むが、限定されない技術を使用して評価することができる。適切な組織の試料を、導入遺伝子に対して特異的な抗体を使用して免疫細胞化学的に評価することができる。本発明の方法に有用な表現型を有する動物を同定するために、トランスジェニック非ヒト哺乳類を更に特徴づけることができる。特に、導入遺伝子（例えばQPCT、又はQPCTL）を過剰発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類は、本明細書に開示した方法を使用してスクリーニングすることができる。例えば、組織切片では、リポーター遺伝子の存在を示す蛍光の小立方体の存在（die present）を蛍光顕微鏡下で見ることができる。
【００５１】
Aβペプチドの組織特異的発現に影響を及ぼす別の方法は、組織特異的プロモーターを使用することによる。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、以下を含む：アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkertらの文献、（1987）Genes Dev. 1：268-277）；リンパ系特異的プロモーター（Calame、及びEatonの文献、（1988）Adv. Immunol. 43：235-275）、特にT細胞受容体（Winoto、及びBaltimoreの文献、（1989）EMBO J. 8：729-733）、及び免疫グロブリン（Banerjiらの文献、（1983）Cell 33：729-740；Queen、及びBaltimoreの文献、（1983）Cell 33：741-748）のプロモーター、ニューロン-特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター、Thy-1プロモーター、又はBri-タンパク質プロモーター；Sturchler-Pierratらの文献、（1997）Proc. Natl. Acad Sci. USA 94：13287-13292、Byrne、及びRuddleの文献、（1989）PNA 86：5473-5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlundらの文献、（1985）Science 230：912-916）、心臓特異的発現（αミオシン重鎖プロモーター、Subramaniam, A, Jones WK, Gulick J, Wert S, Neumann J, 及びRobbins J.の文献、トランスジェニックマウスにおけるα-ミオシン重鎖遺伝子プロモーターの組織特異的制御。（Tissue-specific regulation of the alpha-myosin heavy chain gene promoter in transgenic mice.）、J Biol Chem 266：24613-24620、1991。）、並びに乳腺特異的プロモーター、（例えば、乳清プロモーター；米国特許第4,873,316号、及び欧州出願公開第264,166号）。
【００５２】
本発明は、本発明のDNA構築物を含む単離された細胞を更に提供する。DNA構築物は、任意の周知のトランスフェクション方法によって細胞に導入することができる（Sambrookらの文献、Sambrookらの文献、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、第2版、Cold Spring Harbor、N. Y., （1989）；Ausubelらの文献、上記、（1999））。或いは、細胞は、本明細書に記述したように作製した突然変異体非ヒト哺乳類から細胞を単離することによって得ることができる。従って、本発明は、本発明のAβペプチド突然変異体非ヒト哺乳類、特にAβペプチド突然変異体マウスから単離された細胞を提供する。細胞は、ホモ接合性Aβペプチド突然変異体のマウスなどの非ヒト哺乳類、又はヘテロ接合性Aβペプチド突然変異体のマウスなどの非ヒト哺乳類からを得ることができる。
【００５３】
（エフェクター）
エフェクターは、この用語が本明細書に使用されるときに、酵素に結合し、かつインビトロ、及び／若しくはインビボでこれらの活性を増大させ（≒促進する）、又は減少させる（≒阻害する）分子として定義される。いくつかの酵素は、それらの触媒活性に影響を及ぼす分子に対する結合部位を有し；刺激分子は、活性化因子と呼ばれている。酵素は、更に複数の活性化因子、又は阻害剤を認識するための多重サイトを有していてもよい。酵素は、種々の分子の濃度を検出することができ、それ自体の活性を変化させるためにその情報を使用することができる。
酵素は、活性、及び不活性な高次構造の両方を想定することができるので、エフェクターは、酵素活性を調整することができ：活性化因子は、ポジティブエフェクターであり、阻害剤は、ネガティブエフェクターである。エフェクターは、酵素の活性部位においてだけでなく、調節部位、又は調節部位が触媒部位とは異なる酵素のエレメントであるとを強調するために、及び触媒部位における基質と阻害剤との間の競合による制御のこの形態を区別するために使用される用語であるアロステリック部位においても作用する。（Darnell, J., Lodish, H. 、及びBaltimore, D.の文献、1990, 分子細胞細胞生物学（Molecular Cell Biology）第2版、Scientific American Books, New York, page 63）。
【００５４】
（酵素阻害剤）
（可逆的酵素阻害剤）：競合阻害剤、非競合的可逆的阻害剤、緩慢（slow）結合、又は緊密（tihgt）結合阻害剤、遷移状態類似体、及び多基質類似体を含む。
（競合阻害剤）は、
酵素との非共有結合性の相互作用、
酵素活性部位に対する基質との競合、
を示す。
【００５５】
可逆的酵素阻害剤の主要な作用機序、及び解離定数の定義は、以下の通りに視覚化することができる。
【化１】
2011501652.tif 000002
【００５６】
酵素阻害剤[E-I］複合体の形成により、基質の結合を妨げ、従って、反応は、正常な生理学的産物Pへ進むことができない。阻害剤濃度[I］が高いほど、より高い[E-I］を生じて、基質が結合することができる遊離酵素が少しか残らなくなる。
【００５７】
（非競合的可逆的阻害剤）は、
活性部位以外の部位（アロステリックな結合部位）に結合し、触媒活性を減少し、又は止める酵素の高次構造上の変化を生じさせる。
【００５８】
（緩慢結合、又は緊密結合阻害剤）は、
阻害剤と酵素との間の平衡がゆっくりと達成される競合阻害剤であり、（konが、緩徐である）おそらく、酵素、又は阻害剤において生じなければならない高次構造上の変化に起因し、たいてい遷移状態類似体であり、酵素濃度と同様の濃度にて有効であり（nM以下のKD値）、koff値が非常に低いため、この種の阻害剤は、「ほぼ」不可逆的である。
【００５９】
（遷移状態類似体）は、
酵素で触媒される反応の遷移状態を模倣する競合阻害剤である。従って、酵素触媒作用は、遷移状態のエネルギーの低下によって生じ、従って、基質結合よりも遷移状態結合が選択される。
【００６０】
（多基質類似体）は、
2つ以上の基質を含む反応については、2つ以上の基質に似ている構造的特徴を含む競合阻害剤、又は遷移状態類似体をデザインすることができる。
【００６１】
（不可逆的酵素阻害剤）：結合していない酵素、及び阻害剤と酵素阻害剤複合体との間の平衡（E + I＜---＞EI）を完全に共有結合で右にドライブし（〜100 kcal/モル）、不可逆的阻害を生じる。
【００６２】
（親和標識薬剤）
（活性部位定方向（directed）不可逆阻害剤）（競合的不可逆阻害剤）は、酵素（可逆的な、特異的結合）によって、続いて共有結合形成によって認識され、かつ、
基質、遷移状態、又は産物に構造的に類似し、薬物と標的酵素との間で特異的に相互作用することができ、
反応性官能基（例えば、求核試薬、-COCH2Br）を含み、共有結合を形成することができる。
【００６３】
下記の反応スキームは、その標的酵素との活性部位定方向試薬を記述し、式中、KDは、解離定数であり、かつkinactivationは、共有結合形成の速度である。
【化２】
2011501652.tif 000003
【００６４】
（メカニズムに基づいた酵素不活性化剤（自殺阻害剤とも呼ばれる））は、これが酵素の触媒の能力によって反応性の形態（活性化される）に形質転換される酵素活性部位に結合する活性部位定方向試薬（非反応性）である。一旦活性化されたら、阻害剤と酵素との間に共有結合が形成される。
【００６５】
下記の反応スキームは、メカニズムに基づいた酵素不活性化剤の作用機序を示し、式中KDは、解離複合体であり、k2は、一旦酵素に結合した阻害剤の活性化の速度であり、k3は、活性化された阻害剤Pの酵素からの（産物は、なおも反応性であり得る）酵素からの解離の速度であり、かつk4は、活性化された阻害剤と酵素との間の共有結合形成の速度である。
【００６６】
【化３】
2011501652.tif 000004
【００６７】
不活性化（共有結合形成、k4）は、解離（k3）の前に生じなければならず、さもなければ、ここで、反応性の阻害剤は、環境に放出される。分配比、k3/k4：不活性化に対する放出された産物の比は、系の効率的な不活性化、及び最小の望ましくない副反応のために最小化されるべきである。
大きな分配比では（解離を選択する）、非特異的反応を引き起こす。
【００６８】
不競合的酵素阻害剤：不競合的阻害剤（ES複合体に対してのみ結合する阻害剤）の定義から、以下の平衡方程式を書くことができる：
【化４】
2011501652.tif 000005
【００６９】
該ES複合体は、Ksと同じ解離定数で基質を分離するが、ESI複合体は、それを分離しない（すなわち、ゼロに等しいKs値を有する）。ミカエリス-メンテン型酵素のKmは、低下されることが予想される。基質濃度を増加するとESI濃度の増加を引き起こし（反応産物へと進行することができない複合体）、従って、阻害は、除去することができない。
【００７０】
競合的酵素阻害剤が、本発明では好ましい。
競合的可逆的酵素阻害剤は、最も好ましい。
【００７１】
「Ki」、又は「KI」、及び「KD」という用語は、酵素に対する阻害剤の結合、及びその後の遊離を記述する結合定数である。別の尺度は、「IC50」値であり、これは、阻害剤濃度を反映し、かつ所与の基質濃度にて、50%の酵素活性を生じる。
【００７２】
グルタミニルシクラーゼ活性を示す酵素の阻害剤が、本発明では好ましい。より好ましくは、グルタミニルシクラーゼ活性を示す酵素の阻害剤は、競合阻害剤である。小分子であるグルタミニルシクラーゼ活性を示す酵素の競合阻害剤が、本発明ではより好ましい。特に好ましくは、グルタミニルシクラーゼの活性部位金属イオンに結合するグルタミニルシクラーゼ活性を示す酵素の小分子阻害剤である。
【００７３】
本明細書に使用される「QC」という用語は、グルタミニルシクラーゼ（QC、QPCT）、及びQC様（QPCTL）酵素を含む。QC、及びQC様酵素は、同一、又は同様の酵素活性を有し、QC活性として更に定義される。この点に関しては、QC様酵素は、それらの分子構造において基本的にQCとは異なり得る。
【００７４】
本明細書に使用される「QC活性」という用語は、アンモニアの遊離下で、N末端グルタミン残基のピログルタミン酸（pGlu*）への、又はN末端L-ホモグルタミン、若しくはL-β-ホモグルタミンの環状ピロ-ホモグルタミン誘導体への分子内環化として定義される。従って、スキーム1、及び2を参照されたい。
【００７５】
【化５】
2011501652.tif 000006
【００７６】
【化６】
2011501652.tif 000007
本明細書に使用される「EC」という用語は、EC活性として更に定義される、グルタミン酸シクラーゼ（EC）としてのQC、及びQC様酵素の副活性を含む。
本明細書に使用される「EC活性」という用語は、QCによるピログルタミン酸（pGlu*）へのN末端グルタミン酸残基の分子内環化として定義される。従って、スキーム3を参照されたい。
【００７７】
【化７】
2011501652.tif 000008
【００７８】
「QC阻害剤」、「グルタミニルシクラーゼ阻害剤」という用語は、一般に当業者に公知であり、グルタミニルシクラーゼ（QC）、又はそのグルタミルシクラーゼ（EC）活性の触媒活性を阻害する、一般に上記で定義されるとおりの酵素阻害剤を意味する。
【００７９】
（グルタミニルシクラーゼ阻害剤の能力）
QC阻害との相関を考慮すると、好ましい実施態様において、本方法、及び医療用途では、10μM以下の、より好ましくは1μM以下の、更により好ましくは0.1μM以下、若しくは0.01μM以下の、又は最も好ましくは0.001μM以下のQC阻害に対するKi、をもつ薬剤を利用する。実際に、マイクロモル、好ましくはナノモル、及び更により好ましくはピコモルの範囲以下のKi値をもつ阻害剤が、想定される。従って、便宜のために、「QC阻害剤」として活性薬剤が本明細書に記述されているが、このような命名法は、本発明の主題を特定の作用機序に限定することは意図されないことが理解されるであろう。
【００８０】
（QC阻害剤の分子量）
一般に、本方法、又は医療用途のQC阻害剤は、例えば1000g/モル以下、500g/モル以下、好ましくは400g/モル以下、及び更により好ましくは350g/モル以下、及び更に300g/モル以下の分子量をもつ小分子であるだろう。
【００８１】
（ペプチド）
ペプチド、又はアミノ酸が、本発明において言及される場合、それぞれのアミノ酸残基は、以下の従来の一覧に従って、アミノ酸の慣用名に対応する1文字、又は3文字命名によって表される：
【表１】
2011501652.tif 000009
【００８２】
本明細書に使用される「Aβペプチド」という用語は、配列番号：1のAβ3E-42、配列番号：2のAβN3Q-42、Aβ（N3pGlu-42）、配列番号：3のAβ3E-40、配列番号：4のAβN3Q-40、及びAβ（N3pGlu-42）から選択されるAβペプチドをいう。
本明細書に使用される「Aβペプチドに関連した疾患」という用語は、Aβペプチドによって特徴づけられ、及び／又は媒介される全ての疾患、障害、又は状態をいう。
【００８３】
（治療薬のアッセイ法、及び同定）
本発明の方法、及び組成物は、Aβペプチドのエフェクターの評価に、並びに軽度認知障害、アルツハイマー病、ダウンにおける神経変性症候群、家族性デンマーク人痴呆症、及び家族性英国人痴呆症などのアミロイドに関連した疾患の治療、及び予防のための薬物、並びに治療薬の開発のために、特に有用である。
【００８４】
本発明のトランスジェニック動物、又はトランスジェニック動物の細胞は、多様なスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、Aβペプチド蓄積に影響を及ぼすことが疑われる任意の種々の潜在的薬剤、並びに適切なアンタゴニスト、及びブロッキング治療薬を、トランスジェニック動物に投与すること、並びに細胞の機能、及び表現型に対する、及びトランスジェニック動物の（神経学的）表現型に対するこれらの薬剤の効果を評価することによってスクリーニングすることができる。
【００８５】
また、運動技術、学習、及び記憶欠損を評価するためにデザインされた研究などの、行動研究を潜在的治療薬を試験するために使用してもよい。このような試験の例は、モリス水迷路である（Morris（1981）Learn Motivat 12：239-260）。加えて、行動研究には、ローター-ロッド、及びオープンフィールドでのものなどの歩行活動の評価を含んでいてもよい。
【００８６】
本発明の方法は、アミロイド蓄積を研究するために、並びに潜在的な治療的化合物を試験するためにホモ接合性、又はヘテロ接合性のAβペプチド突然変異体非ヒト哺乳類から単離された細胞を都合よく使用することができる。また、本発明の方法が、トランスフェクト株化細胞などのAβペプチドを発現する細胞と共に使用することができる。
【００８７】
Aβペプチドを過剰発現する細胞は、Aβに関連した疾患を治療するための潜在的治療薬としての化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法に使用することができる。このような方法では、化合物を、Aβペプチド突然変異体非ヒト動物に由来するAβペプチドを過剰発現する細胞、トランスフェクト細胞、又は細胞と接触させて、Aβペプチドの発現に関連した表現型の変化についてスクリーニングする。細胞アッセイ、及びトランスジェニック動物におけるAβ産生の変化は、当業者に周知の方法によって評価することができる。
【００８８】
Aβペプチドの発現は、蛍光強度によってモニターすることができるので、AβペプチドなどのAβ融合ポリペプチドは、特にこのようなスクリーニング法のために有用であり得る。その他の例示的な融合ポリペプチドには、その他の蛍光性タンパク質、又はその修飾、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、マルトースを結合タンパク質、ポリHis、フラグ等、又はエピトープタグの任意のタイプを含む。このような融合ポリペプチドは、例えば、融合ポリペプチドに特異的な抗体を使用して検出することができる。融合ポリペプチドは、ポリペプチド、又は機能的部分が所望の特性、例えば抗体結合活性、又は蛍光活性を保持する限り、その機能的部分であることができる。
【００８９】
本発明は、上で述べたような疾患を治療する際に使用するための潜在的治療薬を同定する方法を更に提供する。本方法は、Aβペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むDNA構築物を含む細胞を化合物と接触させる工程、及びAβペプチド産生の減少について細胞をスクリーニングする工程を含み、これにより、Aβペプチドに関連した疾患を治療する際に使用するための潜在的治療薬を同定する。細胞は、AβペプチドDNA構築物を含む有核細胞を有するトランスジェニック非ヒト哺乳類から単離することができる。或いは、細胞は、Aβペプチドと共に緑色蛍光タンパク質融合ポリペプチド、又はその他の融合ポリペプチドをコードする核酸を含むDNA構築物を含むことができる。
【００９０】
加えて、Aβペプチドを発現する細胞は、Aβペプチド発現に関連した表現型を変化させる活性を有する潜在的治療薬として化合物を同定するための予備的なスクリーンに使用することができる。Aβペプチド突然変異体非ヒト哺乳類を使用するインビボでのスクリーンと同様に、適切な対照細胞を、スクリーンの結果を比較するために使用することができる。望まれる場合、Aβペプチドを発現する細胞を使用する初期のインビトロでのスクリーンによって同定された化合物の有効性は、本発明のAβペプチド突然変異体非ヒト哺乳類を使用してインビボで更に試験することができる。従って、本発明は、細胞に基づいたアッセイを使用して、例えば高スループットスクリーニング、並びに、Aβに関連した障害の動物モデルにおける治療薬としての化合物を更に試験する方法を使用して、多数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００９１】
QCは、アミロイドβペプチドの凝集を優勢にするピログルタミン酸の形成に関与する。従って、QCの阻害は、環化が生じることによるメカニズムとは独立して、アルツハイマー病、及びダウン症候群の発病、並びに進行を生じさせるプラーク形成[pGlu3］Aβ3-40／42/43、又は[pGlu11］Aβ11-40／42/43の析出の予防を引き起こす。
【００９２】
グルタミン酸は、アミロイドβペプチドの位置3、11、及び22において見いだされる。これらの中で、位置22のグルタミン酸（E）からグルタミン（Q）への突然変異（アミロイド前駆体タンパク質APP770のアミノ酸693に対応する、Swissprotエントリー：P05067）は、いわゆるオランダ型脳動脈アミロイド症突然変異として記述されている。
【００９３】
位置3、及び11にピログルタミン酸残基をもつβ-アミロイドペプチドは、Aβ1-40/4243よりも細胞毒があり、及び疎水性であることが記述されている（Saido T.C.の文献2000 Medical Hypotheses 54（3）：427-429）。
【００９４】
複数のN末端の変異を、異なる部位にてβ-セクレターゼ酵素β-部位アミロイド前駆体タンパク質-切断酵素（BACE）により（Huse J.T.らの文献、2002 Biol. Chem. 277（18）：16278-16284）、及び／又はアミノペプチダーゼプロセシングにより、産生することができる。
【００９５】
未知のグルタミルシクラーゼ（EC）によるpGlu-ペプチドへのGlu1-ペプチドの酵素変換を裏付ける実験証拠はなかった（Garden, R. W., Moroz, T. P., Gleeson, J. M., Floyd, P. D., Li, L. J., Rubakhin, S. S., 及びSweedler, J. V.の文献 (1999) J Neurochem 72, 676-681; Hosoda R.らの文献、(1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57, 1089-1095）。N-末端でプロトン化されており、かつ穏やかなアルカリ性、又は中性のpH条件下で負に荷電したGlu1γ-カルボキシラート部分を有するGlu1-ペプチドを環化することができるような酵素活性は、同定されていない。
【００９６】
Gln1基質に対するQC活性は、pH 7.0よりも下では激減する。対照的に、Glu1変換は、酸性反応条件にて生じ得るようである（例えば、Iwatsubo, T., Saido, T. C., Mann, D. M., Lee, V. M. 及びTrojanowski, J. Q.の文献（1996）J Pathol 149、1823-1830）。
【００９７】
以前に、QCが、緩やかな酸性条件下でアミロイドβ由来ペプチドを認識すること、及び代謝回転することができるかどうかは調査されている（WO 2004/098625）。従って、酵素の潜在的基質としてのペプチド[Gln3］Aβ1-11a、Aβ3-11a、[Gln3］Aβ3-11a、Aβ3-21a、[Gln3］Aβ3-21a、及び[Gln3］Aβ3-40を合成して調査した。これらの配列は、天然のN末端で、及びC末端で切断された[Glu3］Aβペプチド、並びに翻訳後のGlu-アミド化のために生じ得る[Gln3］Aβペプチドを模倣するために選択した。
【００９８】
パパイア、及びヒトQCは、グルタミニル、及びグルタミル環化を触媒することが示された。明らかなように、QCの一次生理機能は、ホルモン分泌過程の前に、又は間に、グルタミン環化による内分泌細胞におけるホルモン成熟を終えることである。このような分泌小胞は、pHが酸性であることが知られている。従って、5.0〜7.0の狭いpH範囲における酵素の副活性は、Glu-Aβペプチドをも環化するその新たに発見されたグルタミルシクラーゼ活性であり得る。しかし、Gln変換と比較して非常により遅く生じるGlu環化のため、グルタミル環化が有意な生理学的役割を果たすかどうかは、疑問である。しかし、神経変性障害の病態において、グルタミル環化は、関連性がある。
【００９９】
この酵素反応のpH依存性を調査すると、プロトン化されていないN末端は、Gln1-ペプチドの環化のために必須であったこと、従って基質のpKa値は、QC触媒作用のためのpKa値と同一であったことが示された。従って、QCは、γ-カルボニル炭素に対するプロトン化されていないα-アミノ部分の分子内求核攻撃を安定化する。
【０１００】
N末端グルタミン含有ペプチドに存在する一価の電荷とは対照的に、Glu含有ペプチドにおけるN末端Glu残基は、主に中性pHにて二価に荷電される。グルタミン酸は、それぞれγ-カルボン酸部分について、及びα-アミノ部分について、約4.2、及び7.5のpKa値を示し、すなわち中性pH以上の状態にあり、α-アミノ態窒素は、部分的に、又は完全にプロトン化されず、かつ求核性であり、γ-カルボン酸基は、プロトン化されず、そして求電子性カルボニル活性を働かせない。それ故、分子内環化は、不可能である。
【０１０１】
しかし、約5.2〜6.5のpH範囲において、これらのそれぞれのpKa値の間では、2つの官能基は、両方とも非電離型で、総N末端Glu含有ペプチドの約1〜10%（-NH2）、又は10〜1%（-C00H）の濃度で存在する。その結果、緩やかな酸性pH範囲以上では、両方とも無電荷の基を有するN末端Gluペプチドの種が存在し、従って、QCがpGlu-ペプチドへの分子内環化の中間体を安定化することができるかもしれず、すなわちγ-カルボン酸基がプロトン化される場合、カルボニル炭素は、プロトン化されていないα-アミノ基による求核攻撃ができるど十分に求電子性である。このpHにて、水酸化イオンは、脱離基として機能する。これらの仮定は、Glu-βNAのQCで触媒される変換について得られたpH依存性データによって補強される。QCによるGln-βNAのグルタミン変換とは対照的に、触媒の最適pHは、pH 6.0周辺の酸性範囲に、すなわち基質分子種が同時に、プロトン化されたγ-カルボキシル、及びプロトン化されていないアミノ基を豊富に有するpH範囲に変化する。更に、動力学的に決定される7.55+/-0.02のpKa値は、滴定によって決定されたα-Glu-β3NAのアミノ基のもの（7.57 ± 0.05）と良好に一致する。
【０１０２】
生理的には、pH 6.0にて、QCで触媒されるグルタミン酸環化の二次速度定数（又は特異定数、kcat／KM）は、グルタミン環化についてのものよりも1*105〜1*106倍遅い範囲であるかもしれない。しかし、両モデルの基質であるGlu-βNA、及びGln-βNAの非酵素的代謝回転は、ごくわずかであり、観察されたごくわずかなpGluペプチド形成と一致する。それ故、QCによるpGlu形成については、少なくとも108の加速を、酵素対非酵素速度定数の比から見積もることができる（酵素触媒についての二次速度定数を非酵素環化一次反応定数と比較して、触媒プロフィシェンシー因子（proficiency factor）は、それぞれGln、及びGlu変換について、109-1010M-1である）。これらのデータからの結論は、インビボにおいて、pGlu形成を生じる酵素経路だけが考えられるようである。
【０１０３】
QCは、脳において非常に豊富であり、30μMの（Gln-）TRH様ペプチドの成熟について最近見いだされた0.9/分の高い代謝回転率を考慮すると（Prokal, L., Prokai-Tatrai, K., Ouyang, X., Kim, H. S., Wu, W. M., Zharikova, A. 及びBodor, N.の文献（1999）J Med Chem 424563-4571）、同様の反応条件が提供された場合、適切なグルタミン酸基質について約100時間の環化半減期を予測することができる。その上、分泌経路における脳QC／ECの区画化、及び局在化を考慮すると、実際のインビボの酵素、及び基質濃度、及び反応条件は、無処置の細胞における酵素環化に更に好都合かもしれない。また、N末端GluがGlnに変換される場合、QCによって媒介される非常に迅速なpGlu形成を予想することができる。インビトロでは、両反応は、QC／EC活性の阻害剤を適用することによって抑制された。
【０１０４】
要約すると、脳において非常に豊富であるヒトQCは、アルツハイマー病において見いだされるプラーク沈着の50%より多くを構成する、Glu-Aβ、及びGln-Aβ前駆体からのアミロイド形成性pGlu-Aβペプチドの形成の触媒であった可能性が高いことが示された。これらの知見により、老人斑形成におけるプレーヤーとして、及び従って、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性デンマーク人痴呆症、及び家族性英国人痴呆症の治療における新規薬物標的として、QC／ECを同定する。
【０１０５】
位置1（AβN1D）にてアスパラギン酸で開始するAβとは別に、AD脳における大部分のアミロイドβペプチドは、これらのN末端に大きな不均一性を誘発する。上で述べたように、優勢種は、位置3にてピログルタミン酸（AβN3（pGlu））で始まる。pGlu残基は、酵素グルタミニルシクラーゼ（QC）により、N末端グルタミン酸の環化から生じる。しかし、QCは、天然においてN-グルタミン基質を変換するので（図1、及び図4）、pGluへのN-グルタミン酸残基の変換は、むしろ遅い。その中で、tgN3E-42におけるAβ（N3E-42）、及びtgN3Q-42トランスジェニックマウスにおけるAβ（N3Q-42）は、マウス甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（mTRH）（図1b）のプレ-プロ-配列との融合タンパク質として発現されて、分泌経路を介して輸送される（Cynis, H.らの文献、グルタミニルシクラーゼの阻害は、哺乳動物細胞におけるピログルタミン酸形成を変化させる（Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells）、Biochim Biophys Acta 1764、1618-1625（2006））。野生型（WT）、QC、tgN3E-42、tgN3E-42-QC二重トランスジェニック、及びtgN3Q-42マウスの脳可溶化液のAβ（x-42）、及びAβ（N3pGlu-42）のELISA定量化により、有意な相違が明らかとなった（図1 c-e）。WT、及びQCトランスジェニックマウスは、少量の内因性Aβ（x-42）を産生したが（WT、1.29±0.91；QC、1.36±0.61pg/mg w.w.）、tgN3E-42マウスは、32.57±2.27 Aβx-42（pg/mg w.w.）を誘発し、それは、WTマウスと比較して有意に高かった（P＜0.0001）。Aβ（x-42）の増加の傾向は、tgN3E-42-QC二重トランスジェニックマウスにおいて、53.29±10.13（pg/mg w.w.）で検出された。TgN3Q-42は、tgN3E-42（P＜0.0001）と、及びtgN3E-42-QC二重トランスジェニックマウス（P＜0.0001）と比較して、Aβ（x-42）（410.2±21.52pg/mg w.w）の12倍の上昇を示した（図1c）。WT、及びQCマウスにおいて、AβN3（pGlu）は、ELISAによって検出不可能であった（図1d）。面白いことに、tgN3E-42（1.89±0.16pg/mg w.w.）とtgN3E-42-QC二重トランスジェニックマウス（2.34±0.14pg/mg w.w.）との間に有意差があった。tgN3E-42-QC二重トランスジェニックマウスは、1.2倍の増加した量のAβ（N3pGlu-42）（P＜0.05）を誘発した。これは、QCで触媒されるN-グルタミン酸形成最近の知見を実証する（Cynis, H.らの文献、グルタミニルシクラーゼの阻害は、哺乳動物細胞におけるピログルタミン酸形成を変化させる（Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells）、Biochim Biophys Acta 1764、1618-1625（2006））。tgN3Q-42マウスは、tgN3E-42よりも有意に高いAβ（N3pGlu-42）レベル（53.23±4.59pg/mg w.w）を示した（28倍以上；P＜0.0001）。総Aβ（x-42）に対するAβ（N3pGlu-42）の比率も、同様の結果を示した。TgN3E-42マウスは、0.05±0.005（P = 0.25）であるtgN3E-42-QC二重トランスジェニックマウスと比較して、0.06±0.005の比率を有した。TgN3Q-42マウスは、0.11 0.015（P＜0.0001）の比率の著しい増加を示した（図1e）。
【０１０６】
面白いことに、tgN3Q-42トランスジェニックマウスは、運動協調性の喪失、及び運動失調によって特徴づけられる成長遅延、小脳萎縮、未熟死表現型（図2）、及び著しい神経欠陥を含む、明白な巨視的異常を示した。生後2箇月における体重は、対照と比較して（雌、19.90±0.40g；雄、24.43±1.23g；両方とも有意：P＜0.001）、tgN3Q-42マウスにおいて有意に減少された（雌、12.20±0.95g；雄、17.60±0.51g）。神経表現型は、プルキンエ細胞変性をもつマウスモデルのものと似ている。TgN3Q-42脳切片は、Aβに対する抗体4G8（エピトープ：アミノ酸17-24）を使用して、主にCA1すい体神経において、及びプルキンエ細胞において（図3、及び5）、強力な免疫反応性を示した。また、その他の脳領域のニューロンは、ポジティブであったが、あまり豊富ではなかった。細胞外Aβ沈着は、最も顕著な染色パターンではないが、皮質、海馬、小脳、視床、及びその他の皮質下領域において散在性プラークとしても生じた。プラークは、小脳の分子状、梨状、及び顆粒状の層において検出されず、その代わりにAβ免疫反応性は、もっぱらプルキンエ細胞内で見いだされた（図3e、f）。最も、全てではないにしても、プルキンエ細胞は、またAβ（N3pGlu）についてポジティブであった（図3f、g）。tgN3Q-42マウスの神経病理学的解析により、プルキンエ細胞の神経変性を検証し、これは、タンパク質分解のためのマーカーであるユビキチンについてポジティブであったし（図3l）、かつ脳の分子層、及び白質路（図3h〜k）において大量のミクログリオシス、及びアストログリオシスを伴った。これは、年齢依存的な運動機能障害、及び小脳萎縮と十分に相関する（図2c）。
【０１０７】
導入遺伝子の発現を増加させるために、ホモ接合性tgN3E-42動物（tgN3E-42hom）をヘテロ接合性tgN3E-42（tgN3E-42 het）から産生した。実際に、tgN3E-42homマウスは、tgN3E-42hetと比較して、有意に多い量のpGlu-Aβ（3-42）を蓄積する。Aβの蓄積、及び沈着は、海馬のCA1層において最も顕著である（図3B）。4週齢にて、pGlu-Aβ形成は、ELISAによる定量化によると最大に到達し、その後により低い濃度に減少する、（図11）。対照的に、総Aβ濃度は、3月齢まで増大する。従って、Aβ（N3pGlu）の形成は、その他のAβ種の沈着を促進する。従って、齧歯類Aβに対する抗体を適用して、CA1層の染色が観察された。実施例2において記述し、及び図8、9A、図9B、及び図9Cに図示した行動アッセイにおいて観察されるとおり、pGlu-Aβ産生の増加により、認知の減退を生じる。従って、tgN3E-42homは、QCによって形成されるpGlu修飾されたアミロイドペプチドの役割を調査するための、及び例えばQC阻害により、Aβ（N3pGlu）を減少することに狙った治療ストラテジーの評価のための、優れているマウスモデルである。
【０１０８】
tgN3E-42 het、tgN3E-42 hom、及びtgN3Q-42 hetマウスの脳におけるpGlu-Aβ含量の比較により、有意差が明らかになる。ホモ接合性tgN3E-42、及びヘテロ接合性tgN3Q-42マウスにおいて、スウェーデン突然変異を有するアミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するtgN3E-42 hetトランスジェニックマウス（APPswマウス）とは対照的に（図12）、Aβ3（pE)-42の迅速な形成が、これらの生命の第1週において観察された。比較では、tgN3E-42、及びtgN3Q-42系統の別の重要かつ独特な特色を示す：脳におけるpGlu-Aβ含量は、数週で、技術水準であるその他のマウスモデル、例えばAPPswマウスでは決して到達されない量に達する。例えば、16月齢のAPPswマウスにおいて、脳におけるAβ（N3pGlu）は、1-2箇月のtgN3Q-42、又はtgN3E-42homマウスにおけるよりも、およそ4-5倍低い。しかし、これらのAPPswマウスに添加した総Aβは、tgN3E-42hom、及びtgN3Q-42のもの100倍以上上回る（図12）。
この実施例により、トランスジェニックストラテジーがAD病態における異なるペプチド、例えばAβ（N3pGlu）の役割を調査するための優れた機会を提供することがわかる。従って、導入遺伝子を適合させることにより、その他のN、及びC末端Aβ種をニューロン特異的に発現すること、並びにこれらの神経毒性の可能性を調査することもできる。
最後に、pGlu-Aβ（3-42）の蓄積は、ニューロンの喪失、長期増強、及び認識における機能障害を伴うので、tgN3E-42、及びtgN3Q-42マウスは、pGlu修飾されたAβペプチドの神経毒性を証明する。これらの特色の組み合わせは、これらの動物モデルに独特であり、従って、アルツハイマー型のような病態を持つ齧歯類モデルにおける大幅な前進ということになる。
【０１０９】
行動機能障害の生理学的基礎を調査するために、海馬長期活性化（LTP）を、ホモ接合性tgN3E-42マウス、及び野生型同腹仔において評価した。5月齢にて、tgN3E-42ホモ接合性、及び野生型同腹仔を屠殺して、海馬薄片を、エキソビボでのLTPの測定のために調製した。LTPは、tgN3E-42ホモ接合性マウスからの薄片では有意に減少された（図13）。最初の一連のテタヌスの適用の直後に、fEPSP勾配は、wtマウスのfEPSP-勾配（時点1にて251.4±18.8%）と比較して、有意に減弱した（時点1にて205.3±13.2%）。tgマウスからのfEPSPsの増強の障害は、全時間にわたって持続し、LTP測定の4時間後も著しく減少したままであった（tgN3E-42マウス：114.0±6.8 %；WTマウス：時点240にて157.1±14.0%）。刺激強度、及び生じるシグナルサイズ（fEPSP-勾配）の関係を解析することにより、wtマウスと比較して、tgN3E-42マウスにおけるEPSP勾配の有意な減少が明らかになった（tgN3E-42homマウスの最大EPSP勾配：3.7±0.4 mV/ms；WTマウスの最大EPSP勾配：5.6±0.5mV/ms、両方とも3mVの刺激強度にて）。入力-出力-曲線の値は、平均±S.E.M.として示してある。
該データは、tgN3E-42マウスの遺伝子改変により、ベースラインシナプス伝達、及び従って、正常ニューロン機能の両方、更にはシナプスの可塑性（LTP）が障害されたことを示す。LTP破壊は、学習と記憶の細胞相関がマウス脳のその領域において妨げられるため、海馬依存的な記憶機能の障害に寄与する。EPSP振幅の減少は、シナプスの喪失を反映し、これは、tgN3E-42ホモ接合性マウスにおいて観察されるニューロン変性と明らかに一致する。
【０１１０】
進行性のAβの大脳沈着は、ADの病原性において種子の役割を果たすことを長年の証拠が示している。従って、APPのタンパク質分解プロセシング、及びAβ領域のN、及びC末端における切断を担うそのプロテアーゼを理解することに多大な関心がもたれる。Aβの位置4にてフェニルアラニンで開始する主要な種での断片ペプチドは、Mastersらの文献、（Masters, C.L.らの文献、アルツハイマー病、及びダウン症候群におけアミロイドプラークコアタンパク質（Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome）、Proc Natl Acad sci U S A 82, 4245-4249（1985））によって、1985にすでに報告されている。この知見は、N末端配列をドデシル硫酸ナトリウム含有緩衝液中で精製されたコアから得ることができず、N末端がブロックされているという示唆に高まったため、争われた（Selkoe, D.J., Abraham, C.R., Podlisny, M.B. 及びDuffy, L.K.の文献、アルツハイマー病におけるアミロイドプラーク線維からの低分子量タンパク質の単離（Isolation of Low-Molecular-Weight Proteins from Amyloid Plaque Fibers in Alzheimer's Disease）、Journal of Neurochemistry 46, 1820-1834（1986）；Gorevic, P.D.らの文献、アルツハイマー病における神経原線維変化、及びアミロイドプラークコアの単離、及び部分的特徴付け：免疫組織学的な研究（Isolation and partial characterization of neurofibrillary tangles and amyloid plaque core in Alzheimer's disease）、J Neuropathol Exp Neurol 45, 647-664（1986））。1992に、Moriらの文献は、AD脳から精製したAβタンパク質の質量分析を使用してAβ（N3pGlu）の存在を最初に記述し、それは、アミノ末端をシーケンスすることの困難さを説明している（Mori, H., Takio, K., Ogawara、M. 及びSelkoe, D.J.の文献、アルツハイマー病における精製されたアミロイドβタンパク質の質量分析。（Mass spectrometry of purified amyloid beta protein in Alzheimer's disease.）J Biol Chem. 267, 17082-17086（1992））。彼らは、この方法によって単離された総Aβのわずか10-15%が位置3にてAβ（N3pGlu）で開始することを報告した。後に、Aβ（N3pGlu）がAD、及びダウン症候群脳におけるAβペプチドの優勢画分を表すことが、明らかになった（Kuo, Y.M., Emmerling, M.R., Wood, A.S., Cotter, R.J. 及びRoher, A.E.の文献、神経突起プラーク、及び血管アミロイド沈着からのAβ3-ピログルタミルペプチドの単離、化学的特性付け、及び定量化（Isolation, chemical characterization, and quantitation of Abeta 3-pyroglutamyl peptide from neuritic plaques and vascular amyloid deposits）、Biochem Biophys Res Commun 237, 188-191（1997）；Saido, T.C.らの文献、老人斑における、異なるβ-アミロイドペプチド種であるAβN3（pE）の優勢、及び差動的沈着（Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Abeta N3(pE), in senile plaques）、Neuron 14、457-466（1995）；Piccini, A.らの文献、｛β｝-アミロイドは正常な老化において、及びアルツハイマー病において異なる（{beta}-Amyloid Is Different in Normal Aging and in Alzheimer Disease）, J. Biol. Chem. 280, 34186-34192（2005）；Saido, T.C., Yamao-Harigaya, W., Iwatsubo, T. 及びKawashima, S.の文献 ヒト脳において沈着したβ-アミロイドペプチドのアミノ末端、及びカルボキシル末端不均一性（Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain）、Neurosci Lett 215, 173-176（1996）；Kuo, Y.M.らの文献、トランスジェニックマウス、及びアルツハイマー病脳のアミロイド-β化学構造、並びにアミロイドプラーク形態の比較解析（Comparative analysis of amyloid-beta chemical structure and amyloid plaque morphology of transgenic mouse and Alzheimer's disease brains）、J Biol Chem 276, 12991-12998（2001）；Hosoda、R.らの文献、アルツハイマー病、及びダウン症候群脳における修飾されたアミロイドβペプチドの定量化（Quantification of modified amyloid beta peptides in Alzheimer disease and Down syndrome brains）、J Neuropathol Exp Neurol 57, 1089-1095（1998）；Harigaya, Y.らの文献、位置3にてピログルタミン酸で開始するアミロイドβタンパク質が、アルツハイマー病脳におけるアミロイド沈着の主成分である（Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer's disease brain）、Biochem Biophys Res Commun 276, 422-427（2000）； Iwatsubo, T., Saido, T.C., Mann, D.M., Lee, V.M. 及びTrojanowski J.Q.の文献、全長アミロイド-β（1-42（43））、及びアミノ末端に修飾され、かつ切断されたアミロイドβ42（43）は、散在するプラークに沈着する（Full-length amyloid-beta (1-42(43)) and amino-terminally modified and truncated amyloid-beta 42(43) deposit in diffuse plaques）、J Pathol 149, 1823-1830（1996）； Miravalle, L.らの文献、アミノ末端に切断されたAβペプチド種が脱脂綿プラークの主要構成要素である（Amino-Terminally Truncated Abeta Peptide Species Are the Main Component of Cotton Wool Plaques）、Biochemistry 44, 10810-10821（2005）； Piccini, A.らの文献、新規アルツハイマー病分子表現型をもつプレセニリン1 S170F突然変異の会合（Association of a Presenilin 1 S170F Mutation With a Novel Alzheimer Disease Molecular Phenotype）、Arch Neurol. 64, 738-745. （2007）；Russo, C.らの文献、アルツハイマー病、及びダウン症候群脳における水溶性アミロイドβペプチドの不均一性（Heterogeneity of water-soluble amyloid beta-peptide in Alzheimer's disease and Down's syndrome brains）、FEBS Lett 409, 411-416. （1997）；Guntert, A., Dobeli, H. 及びBohrmann, B.の文献、ヒト、及びPS2APPマウス脳からのアミロイド沈着におけるアミロイド-βペプチド組成物の高感度解析（High sensitivity analysis of amyloid-beta peptide composition in amyloid deposits from human and PS2APP mouse brain）、Neuroscience, 143、461-475（2006）；Tekirian, T.L.らの文献、実質、及び脳血管のAβ沈着のN末端不均一性（N-terminal heterogeneity of parenchymal and cerebrovascular Abeta deposits）、J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94（1998））。N末端の欠失は、一般にインビトロにおけるβ-アミロイドペプチドの凝集を増強する（Pike, C.J., Overman, M.J. 及びCotman, C.W.の文献、アミノ末端欠失は、インビトロにおけるβ-アミロイドペプチドの凝集を増強する（Amino-terminal Deletions Enhance Aggregation of beta-Amyloid Peptides in Vitro）、J. Biol. Chem. 270, 23895-23898（1995））。
【０１１１】
従って、本発明者らは、N末端に天然のグルタミン酸をもつ配列番号：1のAβ（N3E-42）を発現するAβ3-42トランスジェニックマウス（tgN3E-42）、及びグルタミンで開始する配列番号：2のAβ（N3Q-42）を発現するマウス（tgN3Q-42）を作製した。グルタミンによるN末端のグルタミン酸の置換により、Aβペプチドは、少なくとも5オーダー分だけ速くQC活性によってピログルタミン酸に変換される（Schilling, S., Hoffmann, T., Manhart, S., Hoffmann、M. 及びDemuth, H.U.の文献、グルタミニルシクラーゼは、穏やかな酸性条件下でグルタミルシクラーゼ活性を展開する。（Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions.） FEBS Lett 563, 191-196（2004）；Cynis, H.らの文献、グルタミニルシクラーゼの阻害は、哺乳動物細胞におけるピログルタミン酸形成を変化させる（Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells）、Biochim Biophys Acta 1764, 1618-1625（2006））。更にまた、グルタミン酸のピログルタミン酸への環化は、pH依存的過程である。酵素のグルタミン変換は、pH 7.5を好むが、一方で、グルタミン酸変換は、pH 6.5にて最適にて生じる。この知見は、ADにおける非常に有毒なピログルタミン酸ペプチドの沈着を引き起こすイベントを解読するために重要であるかもしれない。明らかに、Aβペプチドの軸索輸送に沿って、QC、及びその基質は、N-グルタミン酸基質の環化を好む酸性コンパートメント内に共存している。更にまた、軸索輸送は、AD脳において障害されることを示されており、神経毒性Aβ（N3pGlu）種の産生を補助している。加えて、QC特異的阻害剤によるQC活性の薬理学的阻害は、有意に、インビトロにおけるAβ（N3pGlu）のレベルを減少させた（Cynis, H.らの文献、グルタミニルシクラーゼの阻害は、哺乳動物細胞におけるピログルタミン酸形成を変化させる（Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells）、Biochim Biophys Acta 1764, 1618-1625（2006））。結論として、本発明者らは、第1に、Aβ（N3pGlu）が重篤な神経変性を誘導する神経毒性アミロイドカスケードにおける優勢ペプチドであること、第2に、この毒性が神経細胞内Aβ（N3pGlu）凝集によって生じる可能性が最も高いこと、及び最後に、QC活性が脳におけるAβ（N3pGlu）形成を調整し、これによりQCがADにおける有害なAβ（N3pGlu）ペプチドの形成を予防するための理想的な治療標的となることを示した。
【０１１２】
この点に関して、図1、及び図6に図示したようなプレプロペプチド発現ストラテジーの使用は、この分野において完全に新規である。マウス甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンプレプロ配列を使用して、Aβ3E-42、及びAβ3Q-42について示したように、トランスジェニック動物において異なるAβ種を作製して、本発明の実施例、及び図面のpGlu形成を生じることができる。Aβ配列は、これらのペプチドの病態生理学的機能を特徴づけるために、アミロイドペプチドのその他の配列によって交換されるかもしれない。正常なAPP代謝の間に、代わりのβ、及びγセクレターゼ切断によって生じる様々なAβペプチドが形成される。本ストラテジーに従って、本明細書に記述したプレプロタンパクプロセシングストラテジーに基づいて、図1、6、及び7にて図示するように、TRHをそれぞれのアミロイドペプチド配列によって交換することにより、アルツハイマー疾患、家族性英国人痴呆症、及び家族性デンマーク人痴呆症のためのモデルである、さらなるトランスジェニック動物を開発することが可能性である。
【０１１３】
さらなる実施態様において、本発明は、Aβ（N3pGlu-40）の形成を生じる配列番号：3のAβ3E-40（tgN3E-40）、又は配列番号：4のAβN3Q-40（tg.-N3Q-40）のいずれかを発現するトランスジェニックマウス系統を含む。
【０１１４】
本発明に従って、発現構築物にAβ3E-42（配列番号：9）、Aβ3Q-42（配列番号：10）、Aβ3E-40（配列番号：11）、及びAβ3Q-40（配列番号：12）から選択される少なくとも1つヌクレオチド配列を含む、動物モデルが好ましく、Aβ3E-42（配列番号：9）、及びAβ3Q-42（配列番号：10）から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列がより好ましい。
【０１１５】
更に好ましい実施態様において、本発明に従った動物モデルは、mTRH-Aβ3E-42（配列番号：6）、及びmTRH-Aβ3Q-42（配列番号：8）から選択される少なくとも1つヌクレオチド配列を含む。
【０１１６】
更に好ましい実施態様において、本発明に従った動物モデルは、Thy-1-mTRH-Aβ3E-42（配列番号：5）、及びThy-1-mTRH-Aβ3Q-42、（配列番号：7）から選択される少なくとも1つヌクレオチド配列を含む。
【０１１７】
好ましい動物モデルは、Thy-1-mTRH-Aβ3E-42（配列番号：5）、Thy-1-mTRH-Aβ3Q-42（配列番号：7）、mTRH-Aβ3E-42（配列番号：6）、mTRH-Aβ3Q-42（配列番号：8）、Aβ3E-42（配列番号：9）、Aβ3Q-42（配列番号：10）、Aβ3E-40（配列番号：11）、及びAβ3Q-40（配列番号：12）から選択される少なくとも1つヌクレオチド配列についてヘテロ接合性である。
【０１１８】
Thy-1-mTRH-Aβ3E-42（配列番号：5）、Thy-1-mTRH-Aβ3Q-42（配列番号：7）、mTRH-Aβ3E-42（配列番号：6）、mTRH-Aβ3Q-42（配列番号：8）、Aβ3E-42（配列番号：9）、Aβ3Q-42（配列番号：10）、Aβ3E-40（配列番号：11）、及びAβ3Q-40（配列番号：12）から選択される少なくとも1つヌクレオチド配列についてホモ接合性である動物モデルが特に好ましい。
【０１１９】
更にまた、本発明は、配列番号：1のAβ3E-42、配列番号：2のAβN3Q-42、配列番号：4のAβ3E-40、又は配列番号：4のAβN3Q-40から選択される組換えグルタミニルシクラーゼ、及び少なくとも1つのAβペプチドを発現するトランスジェニックマウス系統を含む。このような動物は、組換えグルタミニルシクラーゼを発現するトランスジェニックマウス系統と配列番号：1のAβ3E-42、配列番号：2のAβN3Q-42、配列番号：3のAβ3E-40、又は配列番号：4のAβN3Q-40から選択される少なくとも1つAβペプチドを発現するマウス系統の異種交配によって得ることができる。
【０１２０】
好ましい交雑マウス系統は、哺乳動物QC、特にヒト、若しくはマウスQC、又はパパイアQCを発現する。これらのスクリーニング法によって同定されるエフェクターは、哺乳類における、特にヒトにおける疾患治療のために使用されるだろうため、特に好ましくは、哺乳動物QCである。
更に好ましい交雑マウス系統は、QCのアイソザイムを発現する。
【０１２１】
これらのアイソザイムは、グルタミニルシクラーゼに対して有意な配列相同性を示し、ヒト（更に、ヒトisoQCと命名される）（GenBankアクセッション番号NM_017659）、マウス（GenBankアクセッション番号NM_027455）、カニクイザル（Macaca fascicularis）（GenBankアクセッション番号AΒ168255）、アカゲザル（Macaca mulatta）（GenBankアクセッション番号XM_001110995）、ネコ（GenBankアクセッション番号XM_541552）、ラット（GenBankアクセッション番号XM_001066591）、ウシ（GenBankアクセッション番号BT026254）からのグルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ様タンパク質（QPCTLs）、又は少なくとも50%／75%の配列同一性／類似性、好ましくは70%／85%の配列同一性／類似性、最も好ましくは90%／95%の配列同一性／類似性を有するこれらの類似体である。
【０１２２】
該配列は、配列番号：13〜23に示してある。これらのQPCTL類をコードする核酸配列も更に開示されている（配列番号：24〜34）。
本発明に従って、配列番号：13〜15、22、及び23で示される、そのアイソフォーム、及びスプライスフォームを含むヒトQPCTL類；ラット（配列番号：19）、及びマウス（配列番号：20）からなる群から選択されるQPCTL類を発現する交雑マウス系統が好ましい。
【０１２３】
本発明に従って、配列番号：13〜15で示される、アイソフォームを含むヒトQPCTL；及びマウス（配列番号：20）からなる群から選択されるQPCTLsを発現する交雑マウス系統がより好ましい。
【０１２４】
本発明に従って、ヒト（配列番号：13）、及びマウス（配列番号：20）からなる群から選択されるQPCTL類を発現する交雑マウス系統が最も好ましい。
この点に関して、QPCTL-アイソザイムの具体的なさらなる開示について、US 60/846,244に対して具体的に参照がなされる。この出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
組換えグルタミニルシクラーゼを発現するトランスジェニックマウス系統は、US 60/885,649に記述された手順に従って産生することができる。この出願は、組換えグルタミニルシクラーゼを発現するトランスジェニックマウス系統の産生、及び試験に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
好ましい実施態様において、本発明は、軽度認知障害、アルツハイマー病、ダウン症候群、家族性デンマーク人痴呆症、及び家族性英国人痴呆症における、本発明の動物モデルを使用して選択されるAβペプチドの効果の阻害剤の使用を提供する。
【０１２７】
さらなる実施態様において、本発明は、胃腸管細胞増殖、特に胃粘膜細胞増殖の刺激、上皮細胞増殖、酸を産生する壁細胞、及びヒスタミンを分泌する腸クロム親和性細胞様（ECL）細胞の分化、並びにECL細胞におけるヒスタミン合成、及び貯蔵に関連した遺伝子の発現のための、並びに活性[pGlul］-ガストリンの濃度を維持し、又は増加させることによって哺乳類における急性酸分泌の刺激のための、本発明の動物モデルを使用して選択されるAβペプチドの効果のプロモーターの使用を提供する。
【０１２８】
さらなる実施態様において、本発明は、不活性[Gln1］ガストリンの活性[pGlul］ガストリンへの変換速度を減少させることにより、哺乳類においてヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）感染を伴う、又は伴わない十二指腸潰瘍疾患、及び胃癌の治療のための、本発明の動物モデルを使用して選択されるAβペプチド効果の阻害剤の使用を提供する。
【０１２９】
ニューロテンシン（NT）は、神経伝達物質系を特異的に調整する統合失調症の病態生理に関係する神経ペプチドであり、この障害において誤調節されることが以前に証明されている。脳脊髄液（CSF）NT濃度を測定した臨床研究により、有効な抗精神病薬治療によって回復されるCSF NT濃度の減少を伴う統合失調症患者のサブセットが明らかにされた。また、抗精神病薬の作用機序におけるNT系の関与と一致するかなりの証拠が存在する。中枢に投与されたNTの行動的、及び生化学的な効果は、全身投与された抗精神病薬のものに著しく似ており、抗精神病薬は、NT神経伝達を増大する。この知見の結びつきにより、NTは、内因性抗精神病薬として機能するという仮説に至った。その上、典型的、及び非典型的な抗精神病薬は、黒質線条体、及び中脳辺縁系のドーパミン末端領域におけるNT神経伝達を差動的に変化させ、これらの効果は、それぞれ予測的な副作用の傾向、及び有効性である（Binder, E. B.らの文献、2001 Biol Psychiatry 50 856-872）。
【０１３０】
別の実施態様において、本発明は、抗精神病薬の製造のための、及び／又は哺乳類における統合失調症の治療のための、本発明の動物モデルを使用して選択されるAβペプチドエフェクターのプロモーターの使用を提供する。Aβペプチド効果のエフェクターは、活性な[pGlul］ニューロテンシンの濃度を維持し、又は増加させる。
【０１３１】
甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）に関連するトリペプチドである、受精促進ペプチド（FPP）は、精漿において見いだされる。インビトロ、及びインビボで得られた最近の証拠は、FPPが精子受精能を調節する際に重要な役割を果たすことを示した。具体的には、FPPは、最初に、非受精（受精能をなくした）精子を刺激して「スイッチを入れ」、より急速に受精可能になるが、その時に精子が自発的な先体喪失を受けず、従って受精能を失わないように、受精能獲得を停止する。これらの反応は、アデニリルシクラーゼ（AC）／cAMPシグナル伝達経路を調節することが知られているアデノシンによって模倣され、実際に増大される。FPP、及びアデノシンは両方とも、受精能をなくした細胞におけるcAMP産生を刺激するが、受精能を獲得した細胞においてそれを阻害することが示されており、FPP受容体は、どういうわけかアデノシン受容体、及びGタンパク質と相互作用してACの制御を達成する。これらのイベントは、種々のタンパク質のチロシンリン酸化状態に影響を及ぼし、いくつかは、最初の「スイッチを入れている」のに重要であり、その他は、おそらくそれ自体が先体反応に関与している。カルシトニン、及びアンジオテンシンIIは、精漿においても見いだされ、受精能をなくした精子に対してインビトロにおいて同様の効果を有し、FPPに対する反応を増大することができる。これらの分子は、インビボでも同様の効果を有し、受精能を刺激し、次いで維持することによって受精能に影響を及ぼす。FPP、アデノシン、カルシトニン、及びアンジオテンシンIIの利用能の減少、又はこれらの受容体の欠損は、いずれも雄不妊症に寄与する（Fraser, L.R. 及びAdeoya-Osiguwa, S. A.の文献 2001 Vitam Horm 63, 1-28）。
【０１３２】
さらなる実施態様において、本発明は、受精抑制薬の製造のための、及び／又は哺乳類における受精能を減少させるための、本発明の動物モデルで選択されるAβペプチド効果の阻害剤の使用を提供する。Aβペプチド効果の阻害剤は、活性[pGlu1］FPPの濃度を減少させて、受精能獲得の予防、及び精細胞の非活性化を引き起こす。対照的に、Aβペプチド効果のプロモーターは、雄における受精能を刺激して、不妊症を治療することができることが示され得る。
【０１３３】
別の実施態様において、本発明は、骨髄球性前駆細胞の増殖の抑制、新形成、炎症性宿主反応、癌、悪性転移、メラノーマ、乾癬、リウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、移植片拒絶、後天性免疫不全症候群、体液性、及び細胞を媒介した免疫応答の障害、内皮における白血球接着、及び遊走プロセスなどの病態生理学的状態の治療のための医薬の製造のための、本発明の動物モデルを使用して選択されるAβペプチド効果の阻害剤／プロモーターの使用を提供する。
【０１３４】
さらなる実施態様において、本発明は、摂食障害、及び睡眠-覚醒状態、エネルギー代謝の恒常性制御の障害、自律神経機能の障害、ホルモンバランスの障害、並びに体液の制御の障害の治療のための医薬の製造のための、本発明の動物モデルを使用して選択されるAβペプチド効果の阻害剤／プロモーターの使用を提供する。
【０１３５】
いくつかのタンパク質におけるポリグルタミン増大は、舞踏病ハンチントン、パーキンソン病、及びケネディ病などの神経変性障害を引き起こす。従って、メカニズムは、主に未知のままである。ポリグルタミンリピートの生化学的特性は、1つの可能性のある説明を示唆する：グルタミニル-グルタミニル結合の内溶解性（endolytic）切断、続くピログルタミン酸形成は、ポリグルタミニルタンパク質の異化安定性、疎水性、アミロイド形成、及び神経毒性を増大することにより、病原性に寄与し得る（Saido, T.C.の文献；Med Hypotheses（2000）Mar； 54（3）：427-9）。
【０１３６】
従って、さらなる実施態様において、本発明は、パーキンソン病、及びハンチントン病の治療のための医薬の製造のための、本発明の動物モデルで選択されるAβペプチドエフェクターの阻害剤／プロモーターの使用を提供する。
【０１３７】
ADan、及びABriは、AN3pE（3-42）pGluアミロイド形成ペプチドのように、家族性デンマーク人痴呆症（FDD）、又は家族性英国人痴呆症（FBD）に罹患する患者の脳において沈着する。これらの痴呆症は、遺伝性障害であり、第13染色体上でコードされるBriタンパク質の終止コドンにおける突然変異に基づく（Vidal, R., Frangione, B., Rostagno, A., Mead, S., Revesz、T., Plant, G. 及びGhiso, J.の文献（1999）Nature 399, 776-781。Ghiso, J., Revesz, T., Holton, J., Rostagno, A., Lashley, T., Houlden, H., Gibb, G., Anderton, B., Bek, T., Bojsen-Moller, M.らの文献（2001）Amyloid. 8, 277-284.）。本疾患の病理学的特徴は、アルツハイマー病に非常ににており、大脳アミロイド血管障害、及びニューロ炎症を含む（Rostagno, A., Revesz, T., Lashley, T., Tomidokoro, Y., Magnotti, L., Braendgaard、H., Plant, G., Bojsen-Moller, M., Holton, J., Frangione, B.らの文献（2002）J Biol Chem 277、49782-49790.）。重要なことに、沈着するアミロイドペプチドは、N末端にpGlu修飾され、FDDにおけるプラークは、pGlu修飾されたADan、及びAβからなる（Tomidokoro, Y., Lashley, T., Rostagno, A., Neubert, T. A., Bojsen-Moller、M., Braendgaard, H., Plant, G., Holton, J., Frangione, B., Revesz, T.らの文献（2005）J. Biol. Chem. 280, 36883-36894。）可溶性ADanは、N末端のpGluを含まないことが記述されているため、pGlu修飾は、明らかに凝集体形成の速度を上げる。（Tomidokoro, Y., Lashley, T., Rostagno, A., Neubert, T. A., Bojsen-Moller, M., Braendgaard, H., Plant, G., Holton, J., Frangione, B., Revesz, T.らの文献、（2005）J. Biol. Chem. 280, 36883-36894。）。
【０１３８】
さらなる実施態様において、本発明は、家族性英国人痴呆症、及び／又は家族性デンマーク人痴呆症の治療のための医薬の製造のための、本発明の動物モデルで選択されるAβペプチド効果の阻害剤／プロモーターの使用を提供する。
【０１３９】
走化性サイトカイン（ケモカイン）は、白血球を誘引して活性化するタンパク質であり、炎症において基本的役割を担うと考えられる。ケモカインは、N末端のシステイン残基の様相によって分類される4群に分けられる（「C」-；「CC」-；「CXC」-、及び「CX3C」-ケモカイン）。「CXC」-ケモカインは、好中球に対して優先して作用する。対照的に、「CC」-ケモカインは、優先して単球を炎症部位に誘引する。単球浸潤は、多数の疾患状態における重要なイベントであると考えられる（Gerard, C. 及びRollins, B.の文献 （2001）J. Nat. Immunol 2、108-115；Bhatia, M.らの文献（2005）Pancreatology. 5, 132-144；Kitamoto, S., Egashira K. 及びTakeshita, A.の文献（2003）J Pharmacol Sci. 91, 192-196）。ケモカインの1つのファミリーとしてのMCPファミリーは、4つのメンバー（MCP-1〜4）からなり、単球を誘引することに対して好性を示すが、それらの潜在性に相違を示す（Luini, W.らの文献（1994）Cytokine 6、28-31；Uguccioni, M.らの文献、（1995）Eur J Immunol 25、64-68）。以下に、MCP-1〜4のcDNA、並びにアミノ酸配列の両方を示してある：
【０１４０】
ヒト、及び齧歯類MCP-1〜4の成熟形態は、グルタミニルシクラーゼによって翻訳後に修飾されてN末端ピログルタミル（pGlu）残基を有する。N末端pGlu修飾は、アミノペプチダーゼによってN末端の分解に対して耐性のタンパク質を生じ、MCP-1〜4の走化性能は、そのN末端によって媒介されるため、これは重要である。（Van Damme, J.らの文献、（1999）Chem Immunol 72, 42-56）。
【０１４１】
さらなる実施態様において、本発明は、MCP-1-4、好ましくはMCP-1によって媒介される疾患治療のために医薬の製造のための、本発明の動物モデルで選択される、Aβペプチド効果の阻害剤／プロモーターの使用を提供し、この疾患は、例えば慢性、及び急性の炎症、例えばリウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、又は膵炎である。
【０１４２】
別の実施態様において、本発明は、上記で選択される試験薬剤を使用することによりAβペプチドの効果を減少させ、又は阻害する一般的な方法を提供する。
また、導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、AβN3Q-42（配列番号：2）、AβN3E-40（配列番号：3）、及びAβN3Q-40（配列番号：4）から選択される少なくとも1つAβペプチドをコードする非ヒトトランスジェニック動物が提供される。
【０１４３】
また、Aβペプチド産生によって影響をうける標的化合物をスクリーニングするための方法であって、可能性ある標的化合物に対する、本発明のトランスジェニック非ヒト動物、又は本発明のトランスジェニックマウスを使用してインビボでのAβペプチド効果の評価を含む、前記方法が提供される。
【０１４４】
より好ましくは、Aβペプチド効果を阻害し、又は促進する治療薬をスクリーニングするための前記方法は、
（a）本発明に従ったトランスジェニックマウス系統に検査薬剤を投与すること、
（b）マウスの神経性表現型に対する試験薬剤の効果を評価すること、
（c）Aβペプチド効果を阻害し、又は促進する試験薬剤を選択すること、
を含む。
【０１４５】
更に本発明は、Aβペプチドに関連した疾患の治療、又は予防の方法であって、
（d）上述したスクリーニングにおいて選択された試験薬剤を投与すること；及び、
（e）Aβペプチドに関連した疾患についての臨床インデックスの減少について患者をモニターすること、
を含む、前記方法を提供する。
【０１４６】
本発明に従って、上述したスクリーニング、及び／又は治療方法におけるAβペプチド効果の阻害剤として同定された検査薬剤が好ましい。
Aβペプチドに関連した疾患は、好ましくはアルツハイマー病、又はダウン症候群における神経変性である。
【０１４７】
本状況における「Aβペプチドの効果」とは、Aβペプチドによって直接、若しくは間接的に媒介される、又はAβペプチドの存在の結果としての、全ての変化を意味する。これには、例示的に、非限定的な様式で、ニューロンの効果、及び神経学的効果、毒性、又はワクチン接効果を含む。
【０１４８】
本トランスジェニック非ヒト動物、特にマウスは、また特定の好ましい実施態様において、N末端のQで開始するAβペプチド、又はN末端のEで開始するAβペプチドの間の相違を決定するために使用することができる。AβN3Qは、AβN3Eよりも優れたQCのための基質である点を考えると、これは、Aβペプチドに関連した疾患におけるQCの役割に関して、有利な様式のものと結論できる。
【０１４９】
上記のスクリーニングによって選択された薬剤は、Aβペプチド（ネガティブエフェクター、阻害剤）の効果を減少させることによって、又はAβペプチドの効果を増加させることによって（ポジティブエフェクター、活性化因子）作動し得る。
本発明の一つの実施態様において、Aβペプチドの効果の阻害剤が好ましい。
本発明の化合物は、酸付加塩、特に医薬として許容し得る酸付加塩に変換することができる。
本発明の化合物の塩は、無機塩、又は有機塩の形態でもよい。
【０１５０】
本発明の化合物は、酸付加塩、特に医薬として許容し得る酸付加塩に変換すること、及び使用することができる。医薬として許容し得る塩は、一般に、塩基性側鎖が無機酸、又は有機酸でプロトン化された形態をとる。代表的な有機、又は無機酸には、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸の、マンデル酸、メタン硫酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸の、シュウ酸、パモ酸、2-ナフタレンスルホン酸、pトルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸、又はトリフルオロ酢酸を含む。本発明の化合物の全ての医薬として許容し得る酸付加塩形態が、本発明の範囲に包含されることが意図される。
【０１５１】
遊離化合物とこれらの塩の形態の化合物との間の緊密な関係からみて、化合物が、この状況において言及されるときはいつでも、対応する塩も意図されるが、ただし、このようなものが本状況下で可能であり、又は適切であることを条件とする。
【０１５２】
本発明に従った化合物が少なくとも1つキラル中心を有する場合、これらは、従ってエナンチオマーとして存在してもよい。該化合物が2つ以上のキラル中心を有する場合、これらは、加えてジアステレオマーとして存在してもよい。全てのこのような異性体、及びこれらの混合物が本発明の範囲内に包含されることを理解すべきである。更にまた、化合物の結晶形態のいくつかは、多形として存在してもよく、従って本発明に含まれることが意図される。加えて、化合物のいくつかは、水（すなわち、水和物）、又は共通の有機溶媒と溶媒和物を形成してもよく、このような溶媒和物も本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【０１５３】
また、それらの塩を含む化合物は、これらの水和物の形態で得ること、又はこれらの結晶化のために使用されるその他の溶媒を含むことができる。
さらなる実施態様において、本発明は、その必要のある対象において、Aβペプチドによって特徴づけられ、又は媒介される状態を予防し、又は治療する方法であって、本発明の化合物、又はその医薬組成物のいずれかを、状態を治療するために治療的に有効な量、及び投薬処方計画で投与することを含む、前記方法を提供する。加えて、本発明は、対象においてAβペプチドによって特徴づけられ、又は媒介される状態の予防、又は治療のための医薬の製造のための、本発明の化合物、及びこれらの対応する医薬として許容し得る酸付加塩形態の使用を含む。化合物は、経静脈、経口、皮下、皮内、筋肉内、非経口的、及びこれらの組み合わせを含むが、限定されない任意の従来の投与の経路によって患者に投与してもよい。
【０１５４】
更に好ましい実施の形態において、本発明は、少なくとも1つの本発明の化合物、又はその塩を、任意に1つ以上の医薬として許容し得る担体、及び／又は溶媒と組み合わせて含む医薬組成物に、すなわち医薬に関連する。
【０１５５】
該医薬組成物は、例えば、非経口的、又は経腸製剤の形態であってもよく、適切な担体を含んでいてもよく、又はこれらは、経口投与のために適した適切な担体を含んでいてもよい経口製剤の形態であってもよい。好ましくは、これらは、経口製剤の形態である。
【０１５６】
本発明に従って投与されるエフェクターは、薬学的に投与可能な製剤、若しくは製剤複合体において、哺乳類におけるQCタンパク質濃度を減少させる、阻害剤として、又は阻害剤、基質、偽基質、QC発現の阻害剤、結合タンパク質、若しくはこれらの酵素タンパク質の抗体と組み合わせて使用してもよい。本発明の化合物は、治療を患者、及び疾患に個々に合わせること、特に個々の不耐性、アレルギー、及び副作用を回避することができる。
【０１５７】
また、該化合物は、時間の関数として、異なる程度の活性を示す。これにより、治療を提供する医師は、個々の患者の状況とは異なって反応する機会が与えられ：彼は、正確に、一方では、作用開始の速度、及び一方では、作用の期間、及び特に作用の強度を調整することができる。
【０１５８】
本発明に従った好ましい治療方法は、哺乳類においてAβペプチドによって特徴づけられ、又は媒介される状態の予防、又は治療のための新たなアプローチになる。これは、都合よく簡便で、市販の適用の余地があり、かつ特に哺乳類における生理学的に活性なAβペプチドのアンバランスな濃度に基づく疾患治療における、及び特にヒト医薬における使用のために適する。
【０１５９】
該化合物は、例えば、従来技術から知られている希釈剤、賦形剤、及び／又は担体のような慣習的な添加物と組み合わせて活性成分を含む医薬品製剤の形態で、都合よく投与してもよい。例えば、これらは、非経口的に投与することができる（例えば、生理的食塩水中のi.v.）、又は経腸的に（例えば経口的に、慣習的な担体と共に製剤化される）。
【０１６０】
これらの内因的安定性、及びこれらの生物学的利用能に応じて、所望の血糖値の正常化を達成するために、化合物の1つ以上の用量を1日につき与えることができる。例えば、ヒトにおけるこのような用量範囲は、1日あたり約0.01mg〜250.0/mgの範囲、好ましくは、体重1kgあたり約0.01〜100mgの化合物の範囲であってもよい。
【０１６１】
哺乳類に対して該エフェクターを投与することにより、軽度認知障害、アルツハイマー病、ダウン症候群、家族性デンマーク人痴呆症、家族性英国人痴呆症、ハンチントン病、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）感染を伴う、又は伴わない潰瘍疾患、及び胃癌、病原性精神病状態、統合失調症、不妊症、新形成、炎症性宿主反応、癌、乾癬、リウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺線維症、肝臓線維症、腎臓の線維症、移植片拒絶、後天性免疫不全症候群、体液性、及び細胞を媒介した免疫応答の障害、内皮における白血球接着、及び遊走プロセス、摂食障害、睡眠-覚醒状態、エネルギー代謝の恒常性制御の障害、自律神経機能の障害、ホルモンバランスの障害、並びに体液の制御の障害から選択される状態を予防し、又は軽減し、又は治療することが可能性であり得る。
【０１６２】
更に、哺乳類に対してエフェクターを投与することにより、胃腸管細胞増殖、好ましくは胃粘膜細胞、上皮細胞の増殖、急性酸分泌、並びに酸を産生する壁細胞、及びヒスタミンを分泌する腸クロム親和性細胞様細胞の分化を刺激することが可能であり得る。
【０１６３】
加えて、哺乳類に対する阻害剤の投与は、従って、雄の受精能を抑制する精細胞機能の喪失を引き起こすであろう。従って、本発明は、雄の受精能の制御、及び制御のための方法、並びに雄のための避妊医薬の製造のための活性を低くするエフェクターの使用を提供する。
更に、哺乳類に対してエフェクターを投与することにより、骨髄球性前駆細胞の増殖を抑制することが可能であろう。
【０１６４】
本発明に従って使用される化合物は、公知の様式に従って、それ自体を、例えば錠剤、カプセル、糖衣錠、丸剤、坐薬、顆粒、エアロゾル、シロップ、液体、固体、及びクリーム様の乳剤、並びに懸濁液、及び溶液などの従来の製剤に、不活性な、無毒の、医薬としてに適切な担体、及び添加物、又は溶媒を使用して、変換することができる。これらの製剤のそれぞれにおいて、治療的に有効な化合物は、好ましくは総混合物のおよそ0.1〜80重量％、より好ましくは1〜50重量％濃度で、言及した投薬量の許容範囲が得られるほど十分な量で存在する。
【０１６５】
物質は、糖衣錠、カプセル、かむことができるカプセル、錠剤、ドロップ、シロップの形態で、又は坐薬として、若しくは鼻内噴霧としても、医薬として使用することができる。
製剤は、例えば溶媒、及び／又は担体と共に活性成分を伸ばすことによって、任意に乳化剤、及び／又は分散剤を用いて、都合よく調製してもよく、例えば、水が希釈剤として使用される場合、有機溶媒を任意に補助的な溶媒として使用することができる。
【０１６６】
本発明と関連して有用な賦形剤の例には、以下を含む：水、パラフィン（例えば、天然の油留分）、植物油（例えば、菜種油、落花生油、ゴマ油）、アルコール（例えば、エチルアルコール、グリセロール）、グリコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）などの無毒の有機溶媒；固体担体、例えば、天然の粉末状ミネラル（例えば、高度に分散されたシリカ、ケイ酸）、糖（例えば、粗糖、乳糖、及びデキストロース）；非イオン性、及び陰イオン性の乳化剤などの乳化剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、スルホン酸アルキル、及びアリールスルホナート）、分散剤（例えば、リグニン、亜硫酸蒸煮液、メチルセルロース、デンプン、及びポリビニルピロリドン）、及び潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ステアリン酸、及びラウリル硫酸ナトリウム）、及び任意に調味料。
【０１６７】
投与は、好ましくは経腸的、又は非経口的に、特に経口的に通常の様式で実施してもよい。経腸投与の場合、錠剤は、デンプン、好ましくはジャガイモデンプン、ゼラチン等などの、種々の添加物と共に、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、及びリン酸カルシウムなどのさらなる添加物を言及した担体に加えて含んでいてもよい。更にまた、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及び滑石などの潤滑剤を、錠剤化するために同時に使用することができる。経口投与が意図される水性懸濁液、及び／又はエリキシルの場合、種々の味調整剤、又は着色剤を、上述の賦形剤に加えて活性成分に添加することができる。
【０１６８】
非経口投与の場合、適切な液体担体を使用して、活性成分の溶液を使用することができる。一般に、静脈内投与の場合、有効な結果を得るために1日あたりおよそ0.01〜2.0mg/kg、好ましくはおよそ0.01〜1.0mg/kgの体重の量を投与することが有利であることが見いだされており、経腸投与の場合、投薬量は、1日あたりおよそ0.01〜2mg/kgに、好ましくはおよそ0.01〜1mg/kgの体重である。
【０１６９】
それにもかかわらず場合によっては、実験動物、若しくは患者の体重に応じて、又は投与経路のタイプにより、しかし、動物の種、及び医薬に対するその個々の反応、又は投与が実施される間隔に基づいて、明示された量から逸脱することが必要であってもよい。従って、一部の場合では、上述した最小量未満の使用で十分かもしれないが、他の場合には、言及した上限を上回られなければならないであろう。相対的に多くの量が投与される場合、これらの量を1日にわたって数回の単一用量に分けることが望ましいであろう。ヒト医薬における投与のためには、同じ投薬量の許容範囲が提供される。上記の所見は、その場合に類似して適用される。
【０１７０】
医薬品製剤の例については、具体的な参照が、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるWO 2004/098625、ページ50〜52の実施例に対してなされる。
上記の開示は、一般に本発明を記述する。より完全な理解は、以下の実施例を参照することによって得ることができる。これらの実施例は、単に例証のみのために記述してあり、本発明の範囲を限定することは意図されない。具体的用語を本明細書に使用したが、このような用語は、説明的な意味で、かつ限定のためではないことが意図される。
【実施例】
【０１７１】
（参照実施例1：ヒト、及びパパイアQCの調製）
（宿主株、及び培地）
ヒトQCの発現のために使用したピチア・パストリス（Pichia pastoris）株X33（AOX1、AOX2）は、製造業者の説明書（Invitrogen）に従って、培養し、形質転換し、及び解析した。P.パストリス（P. pastoris）のために必要とされる培地、すなわち緩衝したグリセロール（BMGY）複合培地、又はメタノール（BMMY）複合培地、及び発酵基礎塩培地は、製造業者の推奨に従って調製した。
【０１７２】
（ヒトQCをコードするプラスミドベクターの分子クローニング）
全てのクローニング手順は、標準的な分子生物学技術を適用して行った。酵母における発現のためには、ベクターpPICZαB（Invitrogen）を使用した。pQE-31ベクター（Qiagen）を使用して大腸菌（E. coli）においてヒトQCを発現した。コドン38で開始する成熟QCのcDNAを6×ヒスチジンタグをコードするプラスミドとインフレームで融合した。プライマーpQCyc-1、及びpQCyc-2（WO2004/098625）を利用する増幅、及びサブクローニングの後、断片をSphI、及びHindIIIの制限部位を使用して発現ベクターに挿入した。
【０１７３】
（P.パストリス（P. pastoris）の形質転換、及びミニスケール発現）
プラスミドDNAを大腸菌（E. coli）JM109において増幅して、製造業者（Qiagen）の推奨に従って精製した。使用した発現プラスミド（pPICZαB）では、3つの制限部位が直線化のために提供される。SacI、及びBstXIは、QC内のcDNAを切断したので、PmeIを直線化のために選択した。20〜30μgプラスミドDNAをPmeIで直線化して、エタノールによって沈殿して、無菌の脱イオン水に溶解した。次いで、10μgのDNAを、製造業者の説明書（Biorad）に従って、電気穿孔法によってコンピテントなP.パストリス（P. pastoris）細胞の形質転換のために適用した。選択は、150μg/mlゼオシン（Zeocin）を含むプレートを使用して行った。直線化プラスミドを使用する1回の形質転換により、数百の形質転換体を得た。
【０１７４】
組換え酵母クローンをQC発現について試験するために、組換え体を、2mlのBMGYを含む10mlの円錐チューブにおいて24時間培養した。その後、酵母を遠心分離して、0.5%のメタノールを含む2mlのBMMYに再懸濁した。この濃度を24時間毎にメタノールを添加することによって72時間まで維持した。その後、上清中のQC活性を決定した。融合タンパク質の存在は、6×ヒスチジンタグ（Qiagen）に向けられた抗体を使用して、ウエスタンブロット分析によって確認した。最高のQC活性を示したクローンを追実験、及び発酵のために選択した。
【０１７５】
（発酵槽における大規模発現）
本質的に「ピチア属（Pichia）発酵過程指針」（Invitrogen）に記載されているように、QCの発現は、5lの反応器（Biostat B, B. Braun biotech）において行った。簡潔には、細胞を微量塩と、及び唯一の炭素源（pH 5.5）としてのグリセロールとを補った発酵基礎塩培地において培養した。約24時間の初期バッチ相、及びその後の約5時間の供給バッチ相の間に、大量の細胞が蓄積した。一旦200g/lの細胞湿重量が達成されたら、メタノールを使用して、およそ60時間の全ての発酵時間の間に3工程フィードプロフィールを適用して、QC発現の誘導を行った。その後、細胞を6000×g、4℃にて15分間の遠心分離によってQCを含む上清から除去した。NaOHの添加によってpHを6.8に調整し、生じる濁った溶液を37000×g、4℃にて40分間、再び遠心分離した。濁りが続く場合には、セルロース膜（孔幅0.45 μm）を使用して、さらなる濾過工程を適用した。
【０１７６】
（P.パストリス（P. pastoris）に発現させた6×ヒスチジンタグを付けたQCの精製）
Hisタグを付けたQCは、最初に固定された金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）によって精製した。典型的な精製では、1000mlの培養上清を、750mM NaClを含む50mMリン酸緩衝液pH 6.8で平衡化したNi2+を充填したChelating Sepharose FFカラム（1.6×20cm、Pharmacia）に、5ml/分の流速で、適用した。10カラム容積の平衡緩衝液、及び5カラム容積の5mMヒスチジンを含む平衡緩衝液で洗浄後、結合したタンパク質を、150mM NaCl、及び100mMヒスチジンを含む50mMリン酸緩衝液、pH 6.8に交換することによって溶出させた。生じる溶出液を20mM Bi-Tris/HCl（pH 6.8）に対して4℃にて一晩透析した。その後、QCを、透析緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーMono Q6カラム（BioRad）によって更に精製した。QCを含む画分を、4ml/分の流速を使用してカラムに充填した。次いで、カラムを、100mM NaClを含む平衡緩衝液で洗浄した。溶出は、それぞれ30、又は5カラム容積の240mM、及び360mM NaClを含む平衡緩衝液を生じる2つの勾配によって行った。6mlの画分を収集して、純度をSDS-PAGEによって解析した。均質なQCを含む画分を限外濾過によってプールして、濃縮した。長期貯蔵（-20℃）のために、グリセロールを50%の終濃度に添加した。タンパク質は、Bradford、又はGill、及びvon Hippelの方法に従って定量化した（Bradford、M. M. 1976 Anal Biochem 72、248-254；Gill、S.C. 及びvon Hippel、P.H. 1989 Anal Biochem 182、319-326）。
【０１７７】
（大腸菌（E. coli）におけるQCの発現、及び精製）
QCをコードする構築物をM15細胞（Qiagen）に形質転換して、37℃にて選択的LB寒天プレートを培養した。タンパク質発現は、1%のグルコース、及び1%のエタノールを含むLB培地において室温にて実施した。培養がおよそ0.8のOD600に達したときに、発現を0,1 mMのIPTGで一晩誘導した。凍結解凍の1サイクル後、細胞を、300mM NaCl、及び2mMヒスチジンを含む50mMリン酸緩衝液、pH 8.0中の2.5mg/mlのリゾチームの添加によって、4℃にておよそ30分間溶解した。溶液を37000×g、4℃にて30分間遠心分離によって浄化し、続いてガラスフリット（DNA分離）を適用する濾過、並びに粗製、及び微細な沈殿物に対してセルロースフィルターを適用する2回のさらなる濾過工程を行った。上清（約500ml）を1ml/分の流速でNi2+-親和性カラム（1.6×20cm）に適用した。QCの溶出は、150mM NaCl、及び100mMヒスチジンを含む50mMリン酸緩衝液で実施した。QCを含む画分を、限外濾過によって濃縮した。
【０１７８】
（パパイアラテックスからのQCの精製）
パパイアラテックスからのQCは、BioCAD 700E（Perseptive Biosystems、Wiesbaden、Germany）を使用して、以前に報告された方法（Zerhouni, S.らの文献、1989 Biochim Biophys Acta 138, 275-290）の変更バージョンで調製した。50gのラテックスを、その中に記述されたように水に溶解して、遠心分離した。プロテアーゼの不活性化は、S-メチルメタンチオスルホナートで行い、生じる粗製抽出物を透析した。透析後、全上清を（21×2.5 cm i.d.）SP Sepharose Fast Flowカラム（100mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.0で平衡化した（流速3ml／分））に充填した。溶出は、2ml／分の流速で、酢酸ナトリウム緩衝液濃度を増加することによって、3工程で行った。最初の工程は、0.5のカラム床体積の0.1〜0.5M 酢酸緩衝液の直線勾配であった。第2の工程は、4カラム床体積の0.5〜0.68Mの緩衝液濃度で直線的に増大した。最後の溶出工程の間に、1カラム床体積の0.85M緩衝液を適用した。最も高い酵素活性を含む画分（6ml）をプールした。濃縮、及び0.02M Tris／HCl、pH 8.0への緩衝液交換を、限外濾過を介して行った（Amicon；膜10kDaの分子量分離）。
【０１７９】
硫酸アンモニウムを、2Mの終濃度に対するイオン交換クロマトグラフィー工程から得られた濃縮したパパイア酵素に添加した。この溶液を2M硫酸アンモニウム、0,02 M Tris／HCl、pH 8.0で平衡化した（21×2.5 cm i.d.）ブチルセファロース4 Fast Flowカラム（流速1.3ml／分）に適用した。溶出は、硫酸アンモニウムの濃度を減少させつつ、3工程で行った。最初の工程の間に、2〜0.6M 硫酸アンモニウム、0.02M Tris／HCl、pH 8.0の直線勾配を、1.3ml／分の流速で0.5カラム床体積に適用した。第2の工程は、1.5ml／分の流速で、5カラム床体積で、0.6〜0M 硫酸アンモニウム、0.02M Tris／HCl、pH 8.0の直線勾配であった。最後の溶出工程は、1.5ml／分の流速で、2カラム床体積に対して、pH 8.0にて0.02M Tris／HClを適用することによって実施した。QC活性を含む全ての画分をプールして、限外濾過によって濃縮した。生じる同質QCを-70℃に貯蔵した。最終的なタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンで得られた標準曲線と比較して、ブラッドフォードの方法を使用して決定した。
【０１８０】
（参照実施例2：グルタミニルシクラーゼ活性についてのアッセイ）
（蛍光定量的アッセイ）
全ての測定は、30℃にてマイクロプレート（BMG Labtechnologies）のためのNovoStarリーダーで行った。QC活性は、H-Gln-βNAを使用して蛍光定量的に評価した。試料は、250μlの最終的容積で、0.2mM蛍光発生基質、0.05M Tris/HCl、pH 8.0中の0.25Uピログルタミルアミノペプチダーゼ（Qiagen、Hilden、Germany）、及びQCの適切に希釈された一定分量からなった。励起波長／放出波長は、320/410nmであった。アッセイ反応は、グルタミニルシクラーゼの添加によって開始した。QC活性は、アッセイ条件下でのβ-ナフチルアミンの標準曲線から決定した。1単位は、記述された条件下で1分あたりにH-Gln-βNAから1μモルpGlu-βNAの形成を触媒するQCの量として定義される。
【０１８１】
第2の蛍光定量的アッセイでは、QC活性は、基質としてH-Gln-AMCを使用して決定した。反応は、マイクロプレート（BMG Labtechnologies）のためのNOVOStarリーダーを利用して30℃にて実施した。試料は、250μlの最終的容積で、蛍光発生基質の濃度を変化させ、0.05MのTris/HCl、pH 8.0中の0.1Uピログルタミルアミノペプチダーゼ（Qiagen）、及びQCの適切に希釈された一定分量からなった。励起波長／放出波長は、380/460nmであった。アッセイ反応は、グルタミニルシクラーゼの添加によって開始した。QC活性は、アッセイ条件下で7-アミノ-4-メチルクマリンの標準曲線から決定した。動力学的データは、GraFitソフトウェアを使用して評価した。
【０１８２】
（QCの分光光度アッセイ）
この新規アッセイを使用して、大部分のQC基質についての動力学的パラメーターを決定した。QC活性は、補助的酵素としてグルタミン酸脱水素酵素を利用して、以前の不連続アッセイ（Bateman, R. C. J.の文献、1989 J Neurosci Methods 30, 23-28）を使用して、分光光度的に解析した。試料は、250μlの最終的容積で、それぞれのQC基質、0.3mM NADH、14mM α-オキソグルタル酸、及び30U/mlグルタミン酸脱水素酵素からなった。反応をQCの添加によって開始して、340nmにて吸光度の低減のモニタリングによって8〜15分間追跡した。
【０１８３】
初速度を評価して、酵素活性をアッセイ条件下でのアンモニアの標準曲線から決定した。全ての試料は、マイクロプレートのためのSunrise（両方ともTECTAMから）リーダーを使用して30℃にて測定した。動力学的データは、GraFitソフトウェアを使用して評価した。
【０１８４】
（阻害剤アッセイ）
阻害剤試験については、試料組成は、推定上の阻害化合物を添加したこと以外、上記と同じであった。QC阻害の迅速試験については、試料には、4mMのそれぞれの阻害剤、及び1KMの基質濃度を含んだ。阻害の詳細な研究、及びKi値の決定については、補助的酵素に対する阻害剤の影響を最初に調査した。全ての場合において、検出した酵素のいずれに対しても影響はなく、従って、QC阻害の信頼できる決定が可能であった。阻害定数は、GraFitソフトウェアを使用して、競合阻害についての一般的な方程式に対してプログレス曲線のセットをフィットすることによって評価した。
【０１８５】
（参照実施例3：MALDI-TOF質量分析）
マトリックス支援レーザ脱離/イオン化質量分析は、リニアの飛行時間分析計を有するHewlett-Packard G2025 LD-TOFシステムを使用することにより実施した。機器には、337nm窒素レーザ、電位加速源（5kV）、及び1.0mの飛行管を備えた。検出器の操作は、陽イオンモードで行い、シグナルは、パーソナルコンピュータに連結したLeCroy 9350Mデジタルストレージオシロスコープを使用してを記録して、フィルターをかけた。試料（5μl）は、等量のマトリックス溶液と混合した。マトリックス溶液については、我々は、30mgの2',6'-ジヒドロキシアセトフェノン（Aldrich）、及び44mgのクエン酸水素二アンモニウム（Fluka）を1mlのアセトニトリル/0.1% TFA（1/1、v/v）水溶液に溶解することによって調製したDHAP/DAHCを使用した。少量のマトリックス-分析物-混合物（〜1μl）をプローブチップ（先端部）へ移して、直ちに真空チャンバ（Hewlett-Packard G2024A試料調製アクセサリ）において蒸発させ、迅速かつ均一な試料の結晶化を確実にした
【０１８６】
Glu1環化の長期の試験については、Aβ由来ペプチドを100μlの 0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.2、又は0.1Mビス‐Tris緩衝液、pH 6.5において30℃にてインキュベートした。ペプチドを0.5mM[Aβ3-11］、又は0.15mM[Aβ3-21a］濃度において適用し、0.2UのQCを全てに24時間添加した。Aβ3-21aの場合には、アッセイには、1% DMSOを含んだ。種々の時間にて、試料をアッセイチューブから取り出し、製造業者の推奨に従ってZipTips（Millipore）を使用してペプチドを抽出し、マトリックス溶液（1：1 v/v）と混合し、その後質量スペクトルを記録した。負の対照には、QCを含まないか、又は熱非活性化した酵素を含んだ。阻害剤研究については、試料組成は、阻害性化合物を添加したことを除き（5mMベンズイミダゾール、又は2mM 1,10-フェナントロリン）、上記と同じであった。。
【０１８７】
（参照実施例4：マウスQPCT）
（マウスQCのクローン化）
mQCのオープンリーディングフレームの単離のためのプライマーは、推定上のmQCをコードするPubMedヌクレオチドエントリーAK017598を用いてデザインした。プライマー配列は、以下の通りであった：センス
【化８】
2011501652.tif 000010
；アンチセンス、及び
【化９】
2011501652.tif 000011
。
総RNA は、RNeasy Miniキット（Qiagen）を使用してマウス膵島細胞腺腫株化細胞β-TC 3細胞から単離し、SuperScriptII（Invitrogen）によって逆転写した。その後、mQCのcDNAを、Herculase Enhanced DNAポリメラーゼ（Stratagene）での50μlの反応において、産生された産物の1：12.5の希釈で増幅し、PCR Script CAMクローニングベクター（Stratagene）に挿入して、シーケンシングによって検証した。成熟したmQCをコードするcDNA断片を、プライマー
【化１０】
2011501652.tif 000012
、及び
【化１１】
2011501652.tif 000013
を使用して増幅した。消化した断片を、ベクターpPICZαBに連結し、大腸菌（E. coli）において増殖させて、センス、及びアンチセンス鎖のシーケンシングによって検証した。最後に、発現プラスミドを、PmeIを使用して直線化し、沈殿して-20℃にて貯蔵した。
【０１８８】
（P.パストリス（P. pastoris）の形質転換、及びマウスQCのミニスケール発現）
1-2μgのプラスミドDNAは、製造者の説明書（BioRad）に従って、電気穿孔法によってコンピテントなP.パストリス細胞の形質転換のために適用した。選択は、100μg/ml Zeocinを含むプレートで行った。mQC発現により組換え酵母クローンを試験するために、2mlのBMGYを含む10mlのコニカルチューブにおいて組換え体を24時間増殖させた。その後、酵母を遠心分離して、0.5% メタノールを含む2mlのBMMYに再懸濁した。約72時間、24時間毎にメタノールを添加することによってこの濃度を維持した。その後、上清におけるQC活性を決定した。最高の活性を示したクローンをその後の実験、及び発酵のために選択した。
【０１８９】
（マウスQCのラージスケール発現、及び精製）
mQCの発現は、5Lの反応器（Biostad B, B. Braun biotech, Melsungen, Germany）において行った。発酵は、pH 5.5にて微量の塩を補った基礎塩培地において実施した。最初に、バイオマスをバッチ相、及び約28時間唯一の炭素源としてグリセロールを有する供給バッチ相に蓄積させた。mQCの発現は、およそ65時間の全発酵時間の間、Invitrogenによって推奨される3工程プロフィールに従って、メタノール供給によって開始した。その後、細胞、及び濁度を、、6000×g、及び38000×gで、それぞれ15分、及び4時間の2段階の遠心分離工程によってmQCを含む上清から除去した。精製については、発酵ブロスを、約5ms/cmの伝導率に水で希釈して、0.05M リン酸緩衝液、pH 6.4で平衡化したStreamline SP XLカラム（2.5x100cm）に逆の流れの向き（15mL/分）に加えた。2カラム体積に対して、逆の流れ方向の平衡緩衝液での洗浄工程の後、タンパク質を、1.5M NaClを含む0.15M Tris緩衝液、pH 7.6を使用して、8mL/分の流速で前進方向で溶出した。QCを含む画分をプールし、1Mの終濃度に硫酸アンモニウムを添加した。生じる溶液を、4mL/分の流速で、ブチルセファロースFFカラム（1.6x13cm）に加えた。結合したmQCを、0.75M 硫酸アンモニウムを含む0.05M リン酸緩衝液、pH 6.8で5カラム体積に対して洗浄し、0.05M リン酸緩衝液、pH 6.8で、逆の流れの向きに溶出した。mQCを含む画分をプールして、0.025M Tris、pH 7.5に対する透析によって一晩脱塩した。その後、NaOHの添加によってpHを8.0に調整し、0.02M Tris、pH 8.1で平衡化したUno Qカラム（Bio Rad）に加えた（4.0mL/分）。平衡緩衝液を使用する洗浄工程の後、mQCを、0.18M NaClを含む同じ緩衝液を使用して溶出した。QC活性を示す画分をプールし、1M ビス‐Tris緩衝液、pH 6.0の添加によって、pHを7.4に調整した。mQCは、4℃にて1箇月まで安定であった。−20℃での長期貯蔵のためには、50% グリセロールを添加した。
【０１９０】
（本発明を実施するための最良の実施態様）
（実施例1：トランスジェニックマウスの作成）
（トランスジェニックマウス）
マウス甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン-Aβ融合タンパク質mTRH-Aβ（N3E-42）、及びmTRH（N3Q-42）の産生は、本質的に他に記述されたとおりである（Cynis, H.,らの文献、グルタミニルシクラーゼの阻害が、哺乳動物細胞、におけるピログルタミン酸形成を変化させる（Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells）, Biochim Biophys Acta 1764、1618-1625（2006））。それぞれのcDNAを、標準的な分子生物学技術を適用して、マウスThy-1配列を含むベクターpUC18に挿入した。マウスQCは、膵島細胞腺腫株化細胞β-TC 3から単離した。mQC cDNAをベクターpTG-CAGにクローン化した。全ての構築物は、シーケンシングによって検証した。トランスジェニックマウスは、受精したC57Bl6卵母細胞（genOway、Lyon、Franceによって産生されたPNI）の雄の前核注射によって産生した。次いで、注射された卵母細胞を満期発生のために養母に移植した。生じる子孫（それぞれの系統の3つのファウンダー）を、PCR解析によって導入遺伝子組込みについて、およびC57Bl6野生型マウスに対する交雑の後に、RT-PCRによって導入遺伝子発現について更に特徴づけた（それぞれの系統n=3-5）。最高の導入遺伝子mRNAを発現する系統を、更に繁殖させるため、及び交雑実験のために選択した（tgN3E-42 X QCマウスと命名）。該tgN3E-42×QCトランスジェニックは、健康に見え、神経学的異常に関する証拠を示さなかった。tgN3Q-42 PNIの3つのファウンダーのうちの1つのみが、子孫を出産した（tgN3Q-42マウスモデル）。しかし、不妊性ファウンダーの1つは、海馬CA1層において、生後7月齢にてニューロン喪失、及びAβ（N3pGlu）に対するニューロン免疫反応性を示し、これは、その他のファウンダーの子孫でも観察された。このファウンダー、及び他のファウンダーの子供において同一の表現型が観察されたことは、観察された表現型が組込み効果のためではないことを明らかに示唆する。全ての動物は、動物保護のためのドイツ指針に従って取り扱った。
【０１９１】
（DNA構築物の調製）
cDNA構築物の品質は、アガロースゲル上に一定分量を泳動することによって検証、及び確認し、微量の分解物は、観察されなかった。最後に、診断用BglI、EcoRI、及びHindIII制限酵素を使用した切断解析により、予想される制限プロフィールを得た。TBA-tgプラスミドをEcoRIで消化し、導入遺伝子を含む7170-bp断片をベクターバックボーンから単離した。7.1kbのトランスジェニック構築物断片を更に精製して、希釈した後、受精した卵母細胞へ注射した。単離した導入遺伝子の純度、及び濃度は、アガロースゲル電気泳動によって検証した。
【０１９２】
（PCR遺伝子タイピングストラテジー）
導入遺伝子のランダムな組込みの検出についてのスクリーニングは、PCR増幅によって達成した。2種類のPCRをデザインした（図7を参照されたい）。
・PCR1は、導入遺伝子のランダムな組込みイベントを効率的に検出するようにデザインされる。選択されたプライマー対は、導入遺伝子配列内の短いDNA配列の増幅を可能にし、特異的な505-bpのPCR産物を産生する。
・PCR2は、導入遺伝子の組込みイベントの完全性を評価するようにデザインされる。選択されたプライマー対は、プロモーターの5'領域、及びThy1遺伝子の3'領域に延長しているDNA配列の増幅を可能にし、特異的な6279-bp PCR産物を産生する。Thy1プロモーターカセットは、マウスゲノム配列のに由来するため、導入遺伝子の完全性を調査するために使用したPCRスクリーンも、また内因性Thy1遺伝子からの7413-bp産物の増幅を生じる。
【０１９３】
【表２】
2011501652.tif 000014
【０１９４】
これらの試験は、プライマーの特異性、及びPCR反応の感度をモニターするために行った。一旦確立されると、これらのPCR条件を使用してFO世代（ファウンダー動物）をスクリーニングした。
【０１９５】
【表３】
2011501652.tif 000015
相対的な導入遺伝子コピー数の決定のためのプロトコル。
【０１９６】
【表４】
2011501652.tif 000016
【０１９７】
解析したトランスジェニック動物からの染色体DNAの等モル量を鋳型として使用し、次のプロトコルに従って蛍光色素SYBR-Green Iを使用してリアルタイムPCRを行った：
【０１９８】
【表５】
2011501652.tif 000017
【０１９９】
【表６】
2011501652.tif 000018
【０２００】
これらの試験は、プライマーの特異性、及びPCR反応の感度をモニターするために行われた。一旦確立されると、これらのPCRの条件を使用して、FO世代（ファウンダー動物）をスクリーニングした。
【０２０１】
【表７】
2011501652.tif 000019
【０２０２】
RT-PCRによるmRNA定量化のためのプロトコル。
【表８】
2011501652.tif 000020
【０２０３】
1μgの総RNAを逆転写し、次のプロトコルに従って蛍光色素SYBR-Green Iを使用してリアルタイムPCRを行った：
【０２０４】
【表９】
2011501652.tif 000021
【０２０５】
（免疫組織化学、及び組織学）
マウスを麻酔して、氷冷リン酸塩緩衝食塩水（PBS）、続いて4%パラホルムアルデヒドによって経心的に灌流した。脳試料を慎重に解剖し、4℃にて4%リン酸緩衝ホルマリンにおいて後固定した。免疫組織化学は、4μmパラフィン切片上で行った。以下の抗体を使用した：4G8（Aβ17-24, Signet）、GFAP（Chemicon）、Iba1（Waco）、ユビキチン（Dako）、及び位置3にピログルタミン酸をもつAβに対するもの（Saido, T.C., らの文献、老人斑における異なるβ-アミロイドペプチド種であるAβ N3（pE）の優勢、及び差動的沈着（Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Abeta N3(pE), in senile plaques, Neuron 14, 457-466 (1995)）。ビオチン化二次抗ウサギ、及び抗マウス抗体（1：200）は、DAKOから購入した。染色は、ベクタステインキット（Vector Laboratories）、及び色素原としてのジアミノベンジジンと共にABC法を使用して視覚化した。対比染色は、ヘマトキシリンで実施した。蛍光染色法については、AlexaFluor488-、及びAlexaFluor594抱合抗体（Molecular probes）を使用した。
tgN3E-42マウスの解析については、免疫組織化学的特性付けのために更に以下の抗体を使用した：Aβ/4G8（Acris）、Aβ/6E10（Calbiochem）、Aβ-N3pGlu-42（clone6）、GFAP（Dako）、NeuN（Chemicon）。ビオチン化二次抗ウサギ、及び抗マウスの抗体（1：250）は、Vector Laboratoriesから購入した。染色は、ベクタステインキット（Vector Laboratories）、及び色素原としてのジアミノベンジジンと共に、ABC法を使用して視覚化した。蛍光染色法については、Cy2、及びCy3抱合二次抗体（Dianova）を使用した。DAPI核酸染色（Molecular probes）は、蛍光免疫染色で行った。
【０２０６】
（ELISAによるAβ（x-42）、及びAβ（N3pGlu-42）の定量化）
脳を凍結した状態で重さを量り、完全プロテアーゼ阻害剤（Roche）を含む2.5mlの2% SDSにおいて、Dounceホモジェナイザで直接ホモジナイズした。ホモジネートを30秒間超音波処理（sonified）し、その後4℃にて1分間80.000gにて遠心した。上清を採取し、直接-80℃にて凍結した。生じるペレットを0.5mlの70%ギ酸（FA）に再懸濁して、30秒間超音波処理した。ギ酸は、9.5ml 1Mで中和し、一定分量を直接-80℃にて凍結した。Aβ（x-42）、及びAβ（N3pGlu）の両方のELISA測定のためには、SDS可溶化液を10倍希釈で使用した。Aβ（x-42）測定については、ギ酸可溶化液を10倍希釈で使用した。Aβ（N3pGlu-42）測定については、希釈されていないFA可溶化液を適用した。ELISA測定は、製造業者（IBL Co., Ltd. Japan）のプロトコルに従って行った。統計分析については、SDS-、及びFA-抽出から生じるAβ（x-42）、及びAβ（N3pGlu）濃度を集積した。
【０２０７】
（Aβ（x-42）、及びAβ（N3pGlu-42）のウエスタンブロット分析）
N末端が修飾されたAβペプチドの電気泳動分離は、他に記述されたように、15%尿素-PAGEゲルを適用して行った（Klafki, H. W., Wiltfang, J. 及びStaufenbiel, M.（1996）Anal. Biochem. 237, 24-29）。
タンパク質を、半乾燥条件下でニトロセルロース膜（Roth）へ移した。その後、膜をTBS-T（20mM Tris/HCl；pH 7.5；500mM NaCl, 0.05%（v/v）Tween20）中の3%（w/v）粉ミルクを使用してブロッキングした。Aβペプチドを、モノクローナル抗Aβ（1-16）抗体6E10を使用して検出した（Chemicon）。可視化については、ブロット膜を西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合した二次抗マウス抗体（Cell Signaling）と共に、5%（w/v）粉ミルクを含むTBS-Tにおいてインキュベートし、その後、製造業者のプロトコルに従って、SuperSignal West Pico System（Pierce）を使用して現像した。
【０２０８】
（統計分析）
グループ間の相違は、一元配置分散分析法（ANOVA）、続いて不対t検定で試験した。全てのデータは、平均±標準誤差として与えた。不対t検定の有意水準は、以下の通りに与えられた：***P＜0.001；**P＜0.01；*P＜0.05。生存率は、ログランク検定によって算出した。全ての算出は、Windows版のGraphPad Prism version 4.03（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を使用して行った。
【０２０９】
（実施例2：行動試験）
一次スクリーン：一次スクリーンは、標準的な方法を利用して、観察評価による行動的、及び機能的なプロフィールを提供する（Rogers D.C.らの文献、1997. マウス表現型の行動的および機能的な解析：SHIRPA、包括的な表現型評価のための提唱されたプロトコル。（Behavioral and functional analysis of mouse phenotype: SHIRPA, a proposed protocol for comprehensive phenotype assessment.）Mamm Genome, 8：711-713）。改変したSHIRPAプロトコルを使用して、さらなる行動試験を妨げ得る一般的な健康、及び特定機能（筋肉、及び低下した運動ニューロン機能、脊髄小脳、感覚、神経精神医学的、及び自律神経機能）を高スループットスクリーンにおいて調べた。
評価は、ホームケージにおける社会的行動（「ホームケージ観察」）、及び90秒間の透明なプレキシガラス活動領域における単一の動物の乱されていない行動（「個々の観察」）を観察することで開始した。マウス行動のこのモニタリングに続いて、さらなる特徴づけのための一連の短い試験を行った：聴覚驚愕反射、吊り下げ（hanging）行動、視覚置き直し（visual placing）、落下行動、正向反射、姿勢反射、ネガティブ重力走性、吊り下げワイヤー、耳単収縮（ear twitch）、頬髭単収縮（whiskers twitch）、及び眼の瞬き。最後に、動物の首をつかんで、異常形態学的な異常について調べた。評価を完了するために、動物の体重を計り、次いでそのホームケージに動物を戻した。
【０２１０】
（恐怖条件付け：）
マウスにおける状況的（contextual)、及びきっかけを与えられた恐怖反射を研究するために、市販のコンピュータ制御の「恐怖条件付けシステム（FCS）」（TSE System, Bad Homburg, Germany）を使用した。
実験設定は、Oliver Stiedlのプロトコルに従って選択した（Stiedl O.らの文献、2004マウスにおけるコンテクスチュアル恐怖条件付けの間の行動および自律神経動態（Behavioral and autonomic dynamics during contextual fear conditioning in mice.） Auton Neurosci. Basic and Clinical 115（1-2）：15-27）。FCSにおける調査は、2日連続で行い、3相に分けた。
第1相（トレーニング／条件付け試行）：トレーニングは、常に照射された（〜300lx）恐怖条件付け箱内の透明なアクリルコンパートメントにおいて行った。拡声器により、一定の、ホワイトバックグラウンドノイズ（68dB SPL）を提供した。270秒の休止の後、マウスに30秒間、聴覚キュー（10kHz、75dB SPL）を与えた（条件刺激）。2秒のフットショック（0,7mA、定電流；無条件刺激）を、音の最後の2秒間に施した。マウスは、ショック終了の30秒後に、これらのホームケージに返した。
【０２１１】
第2相（状況保持（contextual retention））：トレーニング（第１相）後の24時間、動物をオリジナルの状況に再暴露させて、行動を270秒間モニターした。
第3相（音依存的保持）：条件刺激（音）についての記憶は、新規状況（同じような大きさの黒いアクリル箱、黒色のため光強度が減少され、ショックグリッドの代わりに平らな底板）において、第2相の1時間後に試験した。新規状況において自由に探索した270秒後に、第１相と同じ音を180秒間適用し、行動をFCSによって自動的に記録した。
【０２１２】
（明暗箱：）
明＜-＞暗探索モデルにおける探索活動の自動評価（Crawley J. N.の文献（2007）私のマウスでどうかしましたか：不安症に関連した行動。（What's Wrong With My Mouse: Anxiety-Related Behaviors.） Wiley, 第2版、 240-241）は、PhenoMaste装置（TSE System, Bad Homburg, Germany）用の明暗箱インサートモジュールで行った。プレキシガラスチャンバーから成るインサートモジュールは、小さな通路を含む黒いプレキシガラスの箱によって、2つのコンパートメントに不均等に分けられた（チャンバの1/3〜2/3）。大きなコンパートメントは、開放的で、明るく照射され、一方で、小さなコンパートメントは、閉鎖的で、暗かった。動物を、明るく照らされたコンパートメントに個々に置き、2つのコンパートメントを10分間自由に探索させた。フォトセルのグリッドが自動的にマウスの活動（2つのコンパートメント間の移動数、それぞれのコンパートメント中で費やした時間、それぞれのコンパートメントにおいて移動する距離）を検出した。
【０２１３】
（学習、及び記憶の解析）
（Y-迷路：）自発的交替率（spontaneous alternation rates）は、30cm×8cmのアームサイズをもつ黒いプラスチック材料から構築される三角形のY形の迷路を使用して評価した。20分の試験セッションの間に、それぞれのマウスをランダムに一つのアームに置き、迷路を介して自由に移動させた（Frenois, F., Cador, M., Caille, S., Stinus, L.及びLe Moine, C.の文献（2002）ナロキソンで沈殿するモルヒネ禁断の動機づけ、および体細胞成分におけるで神経相関する（Neural correlates of the motivational and somatic components of naloxone-precipitated morphine withdrawal.） Eur J Neurosci., 16, 1377-1389）。交替（alternation）は、重複する3回のセットにおいて3つのアームへ連続して侵入するものとして定義した。侵入は、マウスが4つの足で全てアームに入るとすぐに連続するものと定義した。交替率は、可能な交替数に対するに実際の比率として算出した。匂いを嗅ぐきっかけを減少させるために、迷路は、30%エタノール、60%水、及び10%無臭の石鹸を含む溶液で清潔にした。
【０２１４】
（十字迷路：）
十字迷路は、黒いプラスチック材料からなる（アームサイズ：30.0cmの長さ、8.0cmの幅、15.0cmの壁の高さ）。隣接するアームは、90°の位置にある。4つのアームは、8.0cmの四方と測定される中心空間から伸張する。従って、動物は、中心空間を介してアームを訪問する。20.0分の試験セッションの間に、それぞれのマウスを、最初にランダムに一つのアームに置き、迷路をとおって自由に横断させた。個々のアームを1〜4と記した。交替は、重複する4回のセットでの連続侵入で4つの異なったアームに侵入することとして定義する（例えば、2,3,4,1、又は4,2,3,1であり、1,2,3,2ではない）。侵入は、マウスが4つの足で全てアームに入るとすぐに連続するものと定義した。交替率は、観察の期間の間に、全体で行われた交替に対する実際のものの比率として算出される。匂いを嗅ぐきっかけを減少させるために、迷路は、それぞれの試行の後、30%エタノール、60%水、及び10%無臭の石鹸を含む溶液で清潔にした。試験は、適度の白光条件下で行われる。より短い試験のための時間枠（すなわち、10分）ｍお可能である。
【０２１５】
（T迷路連続的交替課題（T-CAT）：）
T迷路は、Gerlaiによって提供される手段によって使用した（Gerlai, R.の文献（1998）T-迷路における新たな連続的交替課題は、マウスにおける海馬の機能障害を検出する。系統比較および病変研究。（A new continuous alternation task in T-maze detects hippocampal dysfunction in mice. A strain comparison and lesion study.） Behav Brain Res., 95, 91-101）。該装置は、黒い床、及びギロチンドアを有する黒いプラスチック材料でできていた。マウスの試験は、一回のセッションからなり、これは、1回の強制選択試行で始まり、14回の自由選択試行が続く。（i）強制選択試行：最初の試行において、2つの目標アームの1つは、ギロチンドアを降ろすことによって遮断される。マウスがスタートアームから開放された後、それは迷路を探索して、開放アームに入り、開始位置に戻るであろう。マウスがスタートアームに戻るとすぐにギロチンドアを降ろし、動物を5秒間閉じこめた。（ii）自由選択試行：スタートアームのドアを開いた後、動物は、全てのギロチンドアが開放されているので、両方の目標アームのどちらかを自由に選ぶことができる。一旦マウスが目標アームに入ると、別の目標アームは閉じられる。マウスがスタートアームに戻ったとき、次の自由選択試行は、スタートアームにおいて5秒拘束した後に開始した。試験セッションは、30分後、又は14回の自由選択試行が行われた後に終了した。動物は、課題の間に決して手で触られず、実験者は、試験動物の遺伝子型を知らされなかった。交替比率は、交替選択の数を全ての選択数で割ることによって、それぞれの動物について算出した。所与の時間枠おいて8回未満の選択を行った動物は、解析から除外した。
【０２１６】
（モリス水迷路：）典型的なパラダイムにおいて、マウスは、ストレスを回避するために最初に後ろから小さな水のプールに置き、バイアスを回避するためにプールサイドに向かわせ、水表面の数ミリメートル下には、隠した逃避プラットフォームを含む。着色した形状の視覚キューを、動物のわかりやすい視界のプール周辺に置く。プールは、通常直径4〜6フィート、及び深さ2フィートである。水の線より上の側壁は、研究室の活動によってマウスが乱されることを防止する。解放されると、マウスは、出口を捜してプール周辺を泳ぎ、一方でプールのそれぞれの四分円における所要時間、プラットフォームに到達するためにかかった時間（遅延時間（latency））、及び移動した合計距離を含む種々のパラメーターを記録する。水からのマウスの逃避は、それがすぐにプラットフォームを見つけようとする欲望を補強し、その後の試行（同じ位置にプラットフォームを有する）において、マウスは、より迅速にプラットフォームを探し当てることができる。この成績の改善は、マウスが、はっきりと見える視覚キューと関連させて、隠れたプラットフォームがどこに位置するかについて学んだために生じる。十分な経験の後、能力があるマウスは、任意の解放位置からプラットフォームまで直接泳ぐことができる。
【０２１７】
（運動能力の解析）
（クラスピング（clasping）試験：）クラスピング行動を試験するために、マウスを30秒間尾部によって吊り下げて、後肢を握っている時間を記録した。0秒のクラスピング期間には、0のスコアを、1〜10秒は、スコア1、10〜20秒はスコア2、20秒以上のクラスピングは、スコア3を与えた（Nguyen, T., Hamby, A 及びMassa, S. M.の文献 （2005） クリオキノールは、インビトロで突然変異体ハンチンチン発現をダウンレギュレートして、ハンチントン病マウスモデルにおける病態を緩和する。（Clioquinol down-regulates mutant huntingtin expression in vitro and mitigates pathology in Huntingtin's disease mouse model.） Proc Natl Acad Sci USA, 102 1184011845）。
【０２１８】
（フットプリント解析：）フットプリントを得るために、後ろ足を青い無毒のインクで標識した。動物を、封をした箱で終わる暗いトンネル（30cm×7 cm直径）の一端に置いた。トンネルの床には、白色紙を並べた。動物をトンネルの他端へ歩かせ、そこでこれらを回収して、これらのホームケージに置いた。最低でも2回のノンストップ歩行が必要であった。歩長は、それぞれのステップ間の距離を測定することによって決定し、平均歩長を算出した（Barlow, C., Hirotsune, S., Paylor, R., Liyanage, M., Eckhaus, M., Collins, F., Shiloh, Y., Crawley, J.N., Ried, T., Tagle, D.及びWynshaw-Boris, A.（1996）Atm欠損したマウス：血管拡張性失調症のパラダイム。（Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia.） Cell., 86, 159-171）。
【０２１９】
（平均台：）バランス、及び一般的な運動機能は、平均台課題を使用して評価した。1cmの細くて丸いさお（dowel beam）を、パッドを敷いた表面の44cm上の2つの支柱に取り付けた。長さ50cmのさおのいずれの末端にも、9×15 cmの逃避プラットフォームをを取り付ける。動物をさおの中心に置いて、解放する。それぞれの動物には、試験の一日の間に3回の試行を与える。動物がさおの上に残った時間を記録し、全ての3回の試行の落下までの生じる待ち時間を平均する。動物が全60秒の試行の間にさおに残るか、又は一方のプラットホームに逃げる場合、最高時間の60秒が記録される。（Arendash, G.W., Gordon, M.N., Diamond, D.M., Austin, L.A., Hatcher, J.M., Jantzen, P., DiCarlo, G., Wilcock, D.及びMorgan, D. （2001）長期のAβワクチン接種後のアルツハイマーのトランスジェニックマウスの行動の評価：Aβ沈着と空間記憶との間の課題特異性および相関。（Behavioral assessment of Alzheimer's transgenic mice following long-term Abeta vaccination: task sepecificity and correlations between Abeta deposition and spatial memory.） DNA Cell Biol., 20, 737-744）。
【０２２０】
（ひも吊り下げ（string suspension）課題：）敏捷性、及び握力の試験として、3mmのワタひもを、さお装置のパッドを敷き詰めた表面より35cm上に吊り下げる。動物は、これらの前肢によってひもを握らせ、かつ放させる。この課題においてそれぞれの動物の成績を評価するために、1回の60秒の試行の間に、0〜5の評点法を使用する：0=ひもの上に残ることができない；1=前、又は後ろ足だけでぶらさがる；2=1と同様だが、ひも上に登ることを試みる；3=ひもの上に座り、バランスを保持することができる；4=ひも周辺を4足、及び尾部で側方移動する；5 =逃避（Moran, P.M., Higgins, L.S., Cordell, B. 及びMoser, P.C.（1995）ヒトβアミロイド前駆体タンパク質の751アミノ酸アイソフォームを発現するトランスジェニックマウスにおける年齢に関連した学習欠損。（Age-related learning deficits in transgenic mice expressing the 751-amino acid isoform of human beta-amyroid precursor protein.） Proc Natl Acad sci U S A, 92, 5341-5345）。
【０２２１】
（垂直握力吊り下げ（Vertical Grip Hanging）課題：）動物は、ワイヤーバー（1cm間隔で1mmのワイヤーをもつ40×20cm領域）からこれらを吊り下げることによって、神経筋異常（バランス、及び筋力）について試験した。マウスが棒上に置かれて、ひっくりかえった後で、60秒以内に落ちるまでの時間を測定した（30cmの高さ）（Erbel-Sieler, C., Dudley, C. Zhou, Y., Wu, X., Estill, S.J., Han, T., Diaz-Arrastia, R., Brunskill, E.W., Potter, S.S. 及びMcKnight, S.L.（2004）NPAS1およびNPAS3転写因子の欠損したマウスにおける行動移動、及びおよび調節異常。（Behavioral and regulatory abnormalities in mice deficient in the NPAS1 and NPAS3 transcription factors.） Proc Natl Acad sci U S A., 101, 13648-13653）。
【０２２２】
（ロータロッド：）運動学習、及び協調は、加速ロータロッド（TSE-Systems, Germany）を使用することによって試験した。回転ロッドは、3.5cmの軸直径、及び黒いゴム表面を有した。それぞれのマウスは、連続2日間の間、1日あたり6回の試行を与えた。マウスは、実験者の視界と面しないように、さおの上に置いた。これらは、ドラム上を前進しなくてはならず（これは、垂直軸周辺で速度を増加して回転する）、連続的にこれらの移動のタイミングを調整するよう強いられる。それぞれの試行の始めに、マウスは、動いていないドラム上に置かれ、360秒の試行期間にわたって48rpmの速度に加速させた。動物が棒から落ちるまでの時間は、360秒後のカットオフで記録した（Dere, E., De Souza-Silva, M.A., Frisch, C., Teubner, B., Sohl, G., Willecke, K. 及びHuston, J.P.（2003）コネクチン30を欠損したマウスは、神経化学的変化と共にオープンフィールドにおける感情の増大および減少した立ち上がり活動の減少を示す。（Connexin30-deficient mice show increased emotionality and decreased rearing activity in the open-field along with neurochemical changes.） Eur J Neurosci., 18, 629-638）。解析は、二方ANOVA（遺伝子型×訓練日）、続いてボンフェローニポストホック試験を使用して実施した。
【０２２３】
（強制水泳試験：）強制水泳試験は、モリス水迷路におけるプローブ試験と同一で行われる（Spittaels, K., Van den Haute, C., Van Dorpe, J., Bruynseels, K., Vandezande, K., Laenen, I., Geerts, H., Mercken, M., Sciot, R., Van Lommel, A., Loos, R. 及びVan Leuven, F. （1999）4回リピートヒトタウタンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスの脳および脊髄における顕著な軸索障害。（Prominent axonopathy in the brain and spinal cord of transgenic mice overexpressing four-repeat human tau protein.） Am J Pathol.155, 2153-2165）。簡潔には、110cmの直径のプールを20cmの高さに不透明な水で満たし、22℃にて保持する。マウスを1回60秒の一回の試行の間にプールの中央に置き、総遊泳距離、及び遊泳速度を、コンピュータで自動化した追跡装置（VideoMot2, TSE-System）を使用して測定した。
【０２２４】
（オープンフィールド：）オープンフィールド試験は、探索行動、及び歩行活動の両方を評価するために使用した。マウスを50×50 cmの表面領域、及び38cmの高さの壁をもつ灰色のプラスチックでできたオープンフィールド箱を使用して試験した。モニタリングは、垂直活動を検出するための32台の赤外線センサからなる立ち上がりインジケーターを備えた自動追跡装置によってなされた（VideoMot2, TSE-System, Germany）。5分のセッションの間に登録される行動のパラメーターは、（i）速度、及び総移動距離、（ii）中心部分（20×20cm）において費やした時間対総時間の比、（iii）立ち上がりの症状：動物が、空気中、又は壁に対して前脚をついて、その後肢によって立つ回数（垂直活動の測定）（Dere, E., De Souza-Silva, M.A., Frisch, C., Teubner, B., Sohl, G., Willecke, K. 及びHuston, J.P.（2003）コネクチン30を欠損したマウスは、神経化学的変化と共にオープンフィールドにおける感情の増大および減少した立ち上がり活動の減少を示す。（Connexin30-deficient mice show increased emotionality and decreased rearing activity in the open-field along with neurochemical changes.） Eur J Neurosci., 18, 629-638）。
【０２２５】
（高架プラス迷路：）
装置：高架プラス迷路は、Lister（1987）の記述に従って敷設した。これは、5×5cmの中心の四角のプラットフォームをもつ黒いプレキシガラスの床を有し、そこから、透明なプレキシガラスでできた0.25cmの高さの縁をもつ2つの45×5cmの開放アーム、及び40cmの高さの壁をもつ2つの45×5cmの閉じたアームが放射状に広がる。移動を測定するために、4つのアームのそれぞれに沿って、白線を半分描いた。装置は、プラス形の合板基礎の上に、床の上に45cm上げた。装置は、60ワットの赤い電球で照射された2×5 mの研究室に置いた。
（手順：）マウスは、これらのホームケージ中で試験室に運んだ。マウスは、常にこれらの尾部の根本によって扱った。マウスは、一度に一匹ずつ、開放アームに面しているプラス迷路の中心の四角に置いた。次いで、マウスを、5分間装置を探索させた。装置から約1mにて静かに座っている観察者は、迷路上の動物の行動を記録した。迷路の中心より150cm上に置かれたビデオカメラも、行動を記録した。行動は、ライムライトを使用して記録した。5分後、マウスをこれらの尾部の根本によって迷路から取り出して、これらのホームケージに返した。次いで、迷路を70%エチルアルコールの溶液で清潔にし、検査の間に乾燥させた。
【０２２６】
（含まれるスコアした行動：）
1.  開放アームへの侵入：動物が開放アームに侵入した頻度。全てのマウスの4つの足がアーム内にあることが、侵入としてカウントされるために必要とされる。
2.  閉じたアームへの侵入：動物が閉じたアームに侵入した頻度。全てのマウスの4つの足がアーム内にあることが、侵入としてカウントされるために必要とされる。
3.  開放アーム期間：動物が開放アームにおいて費やした時間の長さ。
4.  閉じたアーム期間：動物が閉じたアームにおいて費やした時間の長さ。
5.  中心の四角への侵入：動物が全ての4つの足で中心の四角に侵入した頻度。
6.  中心の四角期間：動物が中心の四角において費やした時間の長さ。
7.  頭部を下げる：動物が開放アームの側面から床の方へ頭部を下げた頻度。
8.  伸ばす留まるの姿勢：動物が頭部、及び肩部を前に伸ばし、続いて元の位置に戻す頻度。
9.  立ち上がり：動物が後肢で立っているか、又は前足で迷路の壁にもたれる頻度。
10.  探索無し行動：グルーミング、又はマウスが移動していない任意の時間。
11.  排尿：尿のたまり、又は線の数。
12.  排便：生じた糞便（fecal boli）の数。
13.  移動：動物が開放、及び閉じたアームに描かれた線を横切った回数。
【０２２７】
これらの結果から、総アーム侵入に基づいた開放アーム、及び閉じたアームへの侵入の割合をそれぞれの動物について算出した。開放アーム、及び閉じたアームにおける所要時間の割合は、5分の試験にわたって算出した。開放アームの回避のインデックス（Trullas, R. 及びSkolnick, P. 1993 恐怖の相違は、近交系マウス株の間での行動を動機づけた（Differences in fear motivated behaviors among inbred mouse strains. Psychopharmacology）, 111、323-331）は、[100-（%開放アームにおける時間 + %開放アームへの侵入）/ 2］として算出した。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月9日(2010.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
AβペプチドをコードするDNA導入遺伝子を含む細胞を含む、Aβペプチドを過剰発現するためのトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
前記動物が前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項1記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
前記動物が前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項1記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
前記動物がマウスである、請求項1〜3のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
前記導入遺伝子がマウス起源である、請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
前記導入遺伝子がヒト起源である、請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
前記導入遺伝子が組換遺伝子である、請求項1〜6のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
前記組換え導入遺伝子がキメラ、又はヒト化されたポリペプチドをコードする、請求項7記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、AβN3Q-42（配列番号：2）、AβN3E-40（配列番号：3）、及びAβN3Q-40（配列番号：4）の少なくとも1つをコードする、請求項1〜8のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１０】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、及びAβN3Q-42、（配列番号：2）の少なくとも1つをコードする、請求項1〜8のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１１】
前記導入遺伝子が組織特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項1〜10記載のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１２】
加えて、グルタミニルシクラーゼ、又はグルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ様タンパク質をコードするDNA導入遺伝子を含む細胞を含む、請求項1〜11記載のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１３】
前記グルタミニルシクラーゼ、又はグルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ様タンパク質が、ヒトisoQC（配列番号：14、又は15）、マウス（配列番号：20）、カニクイザル（配列番号：16）、アカゲザル（配列番号：17）、ネコ（配列番号：18）、ラット（配列番号：19）、ウシ（配列番号：21）、又は少なくとも50%／75%の配列同一性／類似性を有するその類似体から選択される、請求項12記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１４】
前記グルタミニルシクラーゼ、又はグルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ様タンパク質が配列番号：13〜15、22、又は23に記載のヒトQC、若しくはイソQCのアイソフォーム、又はスプライスフォーム；ラットQC（配列番号：19）、又はマウス（配列番号：20）である、請求項12、又は13記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１５】
前記グルタミニルシクラーゼ、又はグルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ様タンパク質が配列番号：13、又は配列番号：20の1つである、請求項12〜14のいずれか1項記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１６】
インビボでAβペプチド効果を阻害し、又は促進する生物学的に活性な薬剤をスクリーニングする方法であって：
a）請求項1〜15のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に試験薬剤を投与すること、及び、
b）産生されたAβペプチドの効果に対する薬剤の効果を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記トランスジェニック非ヒト動物が前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記トランスジェニック非ヒト動物が前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項16の方法。
【請求項１９】
前記動物がマウスである、請求項16〜18のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記導入遺伝子がマウス起源である、請求項16〜19のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記導入遺伝子がヒト起源である、請求項16〜19のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記導入遺伝子が組換遺伝子である、請求項16〜21のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記組換え導入遺伝子がキメラ、又はヒト化されたポリペプチドをコードする、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、AβN3Q-42（配列番号：2）、AβN3E-40（配列番号：3）、及び／又はAβN3Q-40（配列番号：4）をコードする、請求項16〜23のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、及び／又はAβN3Q-42（配列番号：2）をコードする、請求項16〜24のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項1〜15のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に由来する細胞、又は株化細胞。
【請求項２７】
プロモーターに作動可能に連結されたAβペプチドをコードするトランスジェニックヌクレオチド配列を、マウスのゲノムに組み込んで含むトランスジェニックマウスであって、Aβペプチド効果のAβペプチド阻害剤で逆転させ、又は寛解させることができる表現型を示す、前記マウス。
【請求項２８】
前記マウスがAβペプチドを過剰発現する、請求項27記載のマウス。
【請求項２９】
前記マウスがAβペプチドに対してヘテロ接合性である、請求項27、又は28記載のマウス。
【請求項３０】
前記マウスがAβペプチドに対してホモ接合性である、請求項27、又は28のマウス。
【請求項３１】
前記トランスジェニック配列がマウスAβペプチドをコードする、請求項27、又は28記載のマウス。
【請求項３２】
前記トランスジェニック配列がヒトAβペプチドをコードする、請求項27、又は28記載のマウス。
【請求項３３】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、AβN3Q-42（配列番号：2）、AβN3E-40（配列番号：3）、及び／又はAβN3Q-40（配列番号：4）をコードする、請求項27〜32のいずれかに記載のマウス。
【請求項３４】
前記導入遺伝子がAβN3E-42（配列番号：1）、及び／又はAβN3Q-42（配列番号：2）をコードする、請求項27〜33のいずれかに記載のマウス。
【請求項３５】
Aβペプチド効果を阻害し、又は促進する治療薬をスクリーニングする方法であって、
a）請求項27〜34のいずれかに記載のトランスジェニックマウスに試験薬剤を投与すること、
b）マウスの神経性表現型に対する試験薬剤の効果を評価すること、及び、
c）Aβペプチド効果を阻害し、又は促進する試験薬剤を選択すること、
を含む、前記方法。
【請求項３６】
Aβペプチドに関連した疾患の治療、又は予防の方法であって、
a）請求項35記載の選択された試験薬剤を投与すること；及び、
b）Aβペプチドに関連した疾患についての臨床インデックスの減少について患者をモニターすること、
を含む、前記方法。
【請求項３７】
前記Aβペプチドに関連した疾患がアルツハイマー病である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
請求項36記載の選択された試験薬剤を含む、医薬組成物。
【請求項３９】
Aβペプチドに関連した疾患の治療、及び／又は予防のための医薬の製造のための請求項36に従って選択された試験薬剤の使用。
【請求項４０】
Aβペプチド産生によって影響を受ける標的化合物をスクリーニングする方法であって、可能性のある標的化合物に対する、請求項1〜15のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物、又は請求項27〜34のいずれかに記載のトランスジェニックマウスを使用したインビボにおけるAβペプチドの効果の評価を含む、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2011501652.tif 000075
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011501652000001.app
【国際調査報告】
2011501652.tif 000076
2011501652.tif 000077
2011501652.tif 000078
2011501652.tif 000079