(57)【要約】  本発明は、対象の結合タンパク質のインビボ半減期を推定するために用いる方法を開示する。開示する方法は、（ａ）インビトロプロテアーゼ反応アッセイを用いて、対象の結合タンパク質についておよび少なくとも２つの異なる参照結合タンパク質についてインビトロ半減期を決定する段階（この場合、前記参照結合タンパク質は、既知の異なるインビボ半減期を有する。）、（ｂ）参照結合タンパク質のそれぞれについて既知インビボ半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の相関を決定する段階、および（ｃ）参照結合タンパク質についての既知インビボ半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の前記相関から、対象の結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期と相関する対象の結合タンパク質のインビボ半減期を推定する段階を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の結合タンパク質の被験者におけるインビボ半減期を推定するための方法であって、
（ａ）少なくとも２つの異なる参照結合タンパク質のそれぞれについておよび対象の結合タンパク質についてインビトロプロテアーゼ反応アッセイにおいてインビトロタンパク質分解半減期を決定する段階（この場合、前記参照結合タンパク質は、異なる既知インビボ被験者半減期を有する。）、
（ｂ）参照結合タンパク質の既知インビボ被験者半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の相関を決定する段階、
（ｃ）（ｂ）における参照結合タンパク質の既知インビボ被験者半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の相関から、対象の結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期と相関する対象の結合タンパク質のインビボ被験者半減期を推定する段階
を含む、方法。
【請求項２】
前記相関が、一次相関である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験者が、動物である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記動物が、無脊椎動物または脊椎動物のいずれかである、請求項３の方法。
【請求項５】
前記脊椎動物が、哺乳動物、魚類（ｐｉｃｅｓ）、鳥類、爬虫類、および両生類からなる群より選択される、請求項４の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物が、ラット、マウス、ヒツジ、ヤギ、サル、ウマおよびヒトからなる群より選択される、請求項５の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項６の方法。
【請求項８】
前記プロテアーゼが、サーモライシン、エラスターゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項９】
前記プロテアーゼが、サーモライシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記相関が、一次であり、式：
ｙ＝ｍｘ＋ｂ
（式中、「ｙ」は、インビボ半減期であり、「ｍ」は、インビボ半減期とインビトロプロテアーゼ媒介タンパク質分解半減期の間の一次相関の実測勾配であり、「ｘ」は、タンパク質分解反応アッセイにおいて決定されるようなインビトロ半減期であり、および定数「ｂ」は、一次相関に沿ったインビトロタンパク質分解半減期ゼロ（ｘ＝０）に対応するｙ切片である。）
によって表される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合タンパク質が、１つ以上のＩｇフォールドを有する、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも２つの異なる参照結合タンパク質が、リツキシマブ、ダクリズマブ、ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、４２５、ＥＭＤ５５９００、ＥＭＤ６２０００、ＥＭＤ７２０００、ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈＲ３、ｍＡｂ−８０６、ＭＲ１−１、ＳＣ１００、アレムツズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、イブリツモマブチウキセタン、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレファセプト、アブシキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、Ｄ２Ｅ７、Ｈｕｍｉｃａｄｅ（登録商標）、ゴリムマブ、エタネルセプト、レネルセプト、ＡＢＸ−ＣＢＬ、ＡＢＸ−ＩＬ８、ＡＢＸ−ＭＡ１、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、Ｔｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）、ＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ１４０５）、ＨｕＢＣ−ｌ、Ｔｈｉｏｐｌａｔｉｎ（ＡＳ  １４０７）、Ａｎｔｅｇｒｅｎ（登録商標）（ナタリズマブ）、ＶＬＡ−１  ｍＡｂ、ＬＴＢＲ  ｍＡｂ、ＣＡＴ−１５２、ＡＢＴ  ８７４（Ｊ６９５）、ＣＡＴ−１９２、ＣＡＴ−２１３、ＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−Ｂ（登録商標）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍＡｂ、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）ベバシズマブ、ｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦ、抗組織因子（Ａｎｔｉ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ：ＡＴＦ）、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ））、Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）（エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ））、ＭＬＮ−０２抗体、ＨｕＭａｘ  ＣＤ４、ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、ＨｕＭａｘ−Ｉｎｆｌａｍ、ＨｕＭａｘ−Ｃａｎｃｅｒ、ＨｕＭａｘ−Ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＨｕＭａｘ−ＴＡＣ、ＩＤＥＣ−１３１、ＩＤＥＣ−１５１、ＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ−１５２、ＢＥＣ２、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＤＣ１０１、抗ＶＥカドヘリン抗体、ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ（登録商標）（ラベツズマブ）、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ））、ＡＦＰ−Ｃｉｄｅ、ＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ、ＬｋｏＣｉｄｅ、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−０６０、ＭＤＸ−０７０、ＭＤＸ−０１８、Ｏｓｉｄｅｍ（登録商標）（ＩＤＭ−１）、ＨｕＭａｘ（登録商標）−ＣＤ４、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発中の抗ＣＤ４抗体、ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、ＣＮＴＯ  １４８、ＣＮＴＯ  １２７５、ＭＯＲ１０１、ＭＯＲ１０２、ＭＯＲ２０１、Ｎｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビシリズマブ）、ＨｕＺＡＦ（登録商標）、抗α５β１インテグリン、抗ＩＬ−１２、ＩＮＧ−１、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ））、およびＭＬＮ０１からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも２つの参照結合タンパク質が、インフリキシマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、パリビズマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、およびエタネルセプトからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対象の結合タンパク質のインビボヒト半減期を推定するための方法であって、
（ａ）少なくとも２つの異なる参照結合タンパク質のそれぞれについておよび対象の結合タンパク質についてインビトロプロテアーゼ反応アッセイにおいてインビトロタンパク質分解半減期を決定する段階（この場合、前記参照結合タンパク質は、異なる既知インビボヒト半減期を有する。）、
（ｂ）参照結合タンパク質の既知インビボヒト半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の相関を決定する段階、
（ｃ）（ｂ）における参照結合タンパク質の既知インビボヒト半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の相関から、対象の結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期と相関するこの対象の結合タンパク質のインビボヒト半減期を推定する段階
を含む、方法。
【請求項１５】
前記相関が、一次であり、式：
ｙ＝０．２７ｘ＋２．７９
（式中、「ｙ」は、日数でのインビボヒト半減期であり、「０．２７」は、インビボ半減期とインビトロ・サーモライシン・タンパク質分解半減期の間の一次相関の勾配であり、「ｘ」は、インビトロ・サーモライシン・タンパク質分解反応アッセイにおけるインビトロ半減期であり、および定数「２．７９」は、一次相関に沿ったインビトロタンパク質分解半減期ゼロ（０日）に対応するインビボ半減期である。）
によって表される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
対象の２つ以上の結合タンパク質の相対インビボヒト半減期を決定する方法であって、
（ａ）対象の２つ以上の結合タンパク質のそれぞれについてインビトロプロテアーゼ反応アッセイにおいてインビトロタンパク質分解半減期を決定する段階、および
（ｂ）段階（ａ）における対象の２つ以上の結合タンパク質のそれぞれについてのインビトロタンパク質分解半減期を比較する段階（この場合、段階（ａ）において決定された前記対象の２つ以上の結合タンパク質のそれぞれについての前記インビトロタンパク質分解半減期は、前記対象の２つ以上の結合タンパク質のそれぞれについてのインビボ半減期と相関する。）
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年４月１８日出願の米国特許仮出願第６１／０４６，０６２号の優先権を主張するものであり、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般には結合タンパク質に関する。詳細には、本発明は、治療用結合タンパク質のインビボ半減期を推定するためのインビトロ法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
被験者の循環内での治療薬の持続期間は、様々な要因に依存する。一般に、循環系における任意の薬剤の残存は、半減期（ｔ１／２）などの定量可能な薬物動態値として特性づけされる。個々の薬剤に依存して、この半減期に影響を及ぼし得るさらに明白な要因の一部には、様々な血漿または肝臓分解活性（例えば、タンパク質分解活性、糖分解活性）に対するこの薬剤の感受性、血液へのこの薬剤の溶解度、この薬剤の免疫原性、この薬剤を濾過する肝臓の能力、および１つ以上の血清結合タンパク質（例えば、血清アルブミン）に結合するこの能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００４】
多くの候補治療薬について、薬物動態学的半減期は、このような候補分子を効能のある治療薬へと開発できるかどうかの判定に極めて重要なものである。従って、候補分子が、ハイ・スループット・スクリーニング・プログラムにおいて所望のターゲットに対していくら活性に見えようとも、このような分子は、所望の治療的恩恵をもたらすための適切な定常状態濃度を達成するために十分に長く被験者の循環内にこの分子を残存させるインビボ半減期を欠く場合、実際にはあまり治療効果を有さないことがある。従って、候補治療薬についてのスクリーニングプロセスにおけるある時点で、それぞれの見込みのある候補分子の薬物動態学的インビボ半減期の指標を評価して、望ましくないインビボ半減期を有する分子をこのプロセスから除去しなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一般に、候補分子が許容されるインビボ半減期を有し得るかどうかの第一の指標は、ラットまたはマウスなどの小型哺乳動物を使用して得られる。しかし、価値のあるこのような小型哺乳動物インビボ半減期研究は、スクリーニングプロセスに相当な人力、時間および出費を加えるような手法であるだろう。明らかに、新規治療薬についてのスクリーニングプロセスは、候補分子が医薬品開発プロセスにこれらの分子を含め続けることを是認する薬物動態学的インビボ半減期を有するかどうかを判定するために利用できる信頼性のある単純なインビトロ手段があれば、より効率的に、およびより経済的になるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、結合タンパク質のインビボ半減期を推定するための単純で効率的で信頼性のあるインビトロ法を提供する。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、治療用結合タンパク質を含む。もう一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、参照結合タンパク質を含む。特定の態様において、本発明は、１つ以上の免疫グロブリンフォールド（Ｉｇ）を有する結合タンパク質についてのインビボ薬物動態学的半減期（ｔ１／２）を推定するためのインビトロ法を提供する。本方法は、効率的な時宜を得た様式で多数の結合タンパク質のインビボ半減期の推定を可能にする自動化されたロボット式のハイ・スループット・スクリーニング手順に容易に適応させられる。従って、本方法は、治療ターゲットに対する様々な抗体構築物などの新規治療用結合タンパク質のスクリーニングおよび開発のためのプログラムに特に有用である。
【０００７】
本発明の一つの実施形態は、対象の結合タンパク質のインビボ半減期の推定に関し、この推定は、以下の段階を含む：
（ａ）インビトロプロテアーゼ反応アッセイを用いて、対象の結合タンパク質についておよび少なくとも２つの異なる参照結合タンパク質のそれぞれについてインビトロ半減期を決定する段階（この場合、前記参照結合タンパク質は、既知の異なるインビボ半減期を有する。）；
（ｂ）参照結合タンパク質のそれぞれについての既知のインビボ半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の相関を決定する段階、
（ｃ）参照結合タンパク質についての既知のインビボ半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の前記相関から、対象の結合タンパク質についてのインビトロタンパク質分解半減期と相関する対象の結合タンパク質のインビボ半減期を推定する段階。
【０００８】
一つの態様において、結合タンパク質のインビボ半減期は、ヒトにおける半減期を指す。脊椎動物種と非脊椎動物種の両方を含む、他の動物種も本発明に適用される。例示的な種としては、哺乳類、鳥類、魚類（ｐｉｃｅｓ）、爬虫類および両生類が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００９】
一つの態様において、対象の結合タンパク質は、治療薬である。特定の態様において、対象の結合タンパク質は、１つ以上のＩｇフォールドを有する。
【００１０】
例えば、参照結合タンパク質のそれぞれについて決定されるようなインビトロタンパク質分解半減期に対する既知インビボ半減期のプロッティングにより、参照結合タンパク質のそれぞれについての既知のインビボ半減期とタンパク質分解反応アッセイによって決定されるようなこれらのそれぞれのインビトロタンパク質分解半減期との間の相関をプロットして、参照グラフ（標準曲線）を生成することができる。このような標準曲線は、データの実際のプロットを行わずにコンピュータ計算で生成することもできる。
【００１１】
本明細書に記載するような結合タンパク質（例えば、対象の結合タンパク質）のインビボ半減期を推定するために、インビトロ・プロテアーゼ・アッセイにおいて様々な適するプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせを使用することができる。適するプロテアーゼの例としては、サーモライシン、エラスターゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
本明細書において用いる場合の参照結合タンパク質は、既知コグネイトリガンドに概して結合し、既知の値のインビボ半減期、例えばヒトにおける半減期、を概して有する。一つの態様において、参照結合タンパク質は、１つ以上のＩｇフォールドを含む。このような参照結合タンパク質の例は、既知治療用抗体分子、ならびに例えば１つ以上のＩｇフォールドを有する、他の既知治療用結合タンパク質である。
【００１３】
一つの実施形態において、対象の結合タンパク質のインビボ半減期を推定するための本明細書において提供する方法は、タンパク質分解反応アッセイにおいてインビトロ半減期を決定すること、およびその後、一次式：
ｙ＝ｍｘ＋ｂ（方程式１）
（式中、「ｙ」は、インビボ半減期（例えば、日数でのもの）であり、「ｍ」は、インビボ半減期とインビトロプロテアーゼ媒介タンパク質分解半減期の間の一次相関の実測勾配であり、「ｘ」は、タンパク質分解反応アッセイにおいて決定されるようなインビトロ半減期であり、および定数「ｂ」は、ｙ切片、即ち、一次相関に沿ったインビトロタンパク質分解半減期ゼロ（ｘ＝０）に対応する理論上のインビボ半減期である。）
に従って推定インビボ半減期を計算することによる。
【００１４】
本発明の一つの実施形態は、対象の結合タンパク質のインビボ半減期を推定するための方法に関し、この方法は、タンパク質分解アッセイにおいてこのインビトロ半減期を決定すること、およびその後、少なくとも２つの参照結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期値に対してインビボ半減期値をプロットすることによって生成したグラフ、即ち標準曲線上のこのインビトロタンパク質分解半減期に対応するインビボ半減期を推定することを含む。このような標準曲線は、参照結合タンパク質のインビボ半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の相関のグラフ表示である。このような一次標準曲線の例を図１に示す。
【００１５】
一つの態様は、２つ以上の参照結合タンパク質の既知インビボヒト半減期およびこれらのそれぞれのインビトロタンパク質分解半減期から相関または標準曲線を（グラフによりまたはコンピュータ計算により）生成するものである、図１に示すような標準曲線の使用の代案を提供する。有利には、参照結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期を、対象の結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期の決定と並行してまたは同一の決定手順に従って決定することができる。このようにして、その後、対象の結合タンパク質のインビボ半減期を、新たに生成した標準曲線から推定する。
【００１６】
本発明のもう一つの態様では、対象の２つ以上の結合タンパク質の相対インビボ半減期を決定するための方法を提供し、この方法は、インビトロタンパク質分解反応アッセイにおいてインビトロタンパク質分解半減期をそれぞれの結合タンパク質について決定することを含み、この場合、対象の結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期間の相対差が、これらの対象の結合タンパク質のインビボ半減期間の相対差を示す。この方法は、対象の結合タンパク質のインビボ半減期のそれぞれについての値を提供しないが、これにもかかわらず、結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期とインビボ半減期の間の本明細書において最初に説明した強い相関のため、これらのインビボ半減期についての順序付けを可能にする。このような順序付けは、結合タンパク質の集団の特性づけにおいて、この集団のすべてのメンバーの実際のインビボ半減期が直ちに必要とされないまたは要求されないとき、特に有用である。さらに、これらの相対インビボ半減期に従って対象の結合タンパク質の大きな集団をこのように順序付けできることは、集団の中の一定の特性（例えば、より長い半減期）の結合タンパク質または結合タンパク質の亜集団をこの集団の残部と比較して特定する手段をもたらす。分子のこの相対的な順序付けまたは格付けによって、この集団のどのメンバーが、臨床開発の候補として残るために必要な薬物動態特性を有するかを知るために集団全体をインビボ試験に直接付す必要なく、候補分子の部分集合についての選択を行うことができる。
【発明の効果】
【００１７】
従って、本明細書に記載する方法は、治療薬として有望であることを示す結合タンパク質を特定するために必要な時間および（出費と人員の両方の点から）資源の消費を減らすことによって、治療薬の発見および開発の進歩をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】参照結合タンパク質の既知インビボヒト半減期と算出インビトロ・サーモライシン・タンパク質分解半減期の間の強い一次相関（Ｒ２＝０．８８５）を示すグラフ（標準曲線）である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な記述）
本発明は、インビトロタンパク質分解アッセイを用いて、対象の結合タンパク質についてのインビボ半減期を推定することができるという知見に、一部分、基づく。治療用結合タンパク質は、広範なインビボ半減期（ｔ１／２）を示す。有用な治療薬への可能性がある開発についての候補結合タンパク質のスクリーニングプロセスにおけるある時点で、候補結合タンパク質分子についてのインビボ半減期の前臨床予測を行って、被験者に所望の治療的恩恵を有効にもたらすために十分な期間にわたって動物（例えばヒト）の循環系内に残存できないまたはこの被験者の循環系内に望ましくなく長い期間にわたって残存し得る分子に関するさらなる資源の浪費を回避する。特定の候補結合タンパク質が医薬品開発プログラムにおいて対象であり続けるために何を許容されるインビボ半減期であると考えることができるのかは、この医薬品開発現場の人間の目的および判断に依存するが、資源を効能ある治療薬に開発するために最高のまたは最適な一連の特性を有する１つ以上の分子に絞るために、このような推定をある時点で行わなければならない。（例えば、人間用の医薬品候補についての）インビボ半減期の前臨床予測は、（例えばマウスまたはラットにおける）小型哺乳動物研究および高度な分析技術を一般に必要とし、これらの動物研究および分析技術は、これらの費用および労力のため、候補分子の比較的少数についての研究に最もよく指定される。従って、医薬品スクリーニングおよび開発プロセスにおける任意の時点でのインビボ半減期と同様に有用で同様に重要な薬物動態パラメータを予測するために常例的に用いることができる単純なインビトロアッセイの使用は、医薬品開発プログラムの総合効率、経済的側面および方向に非常に大きな影響を及ぼすだろう。
【００２０】
本発明は、驚くべき精度で被験者における結合タンパク質についてのインビボ半減期を意外にも予測するインビトロアッセイを提供する。このインビトロアッセイは、被験者への投与について認可されており現在市場で入手できる既知結合タンパク質（参照結合タンパク質）のプロテアーゼ切断アッセイにおけるインビトロ半減期とインビボ半減期の間の密接な相関の観察に基づく。一つの態様において、被験者は、脊椎動物または非脊椎動物のいずれかである動物である。このような脊椎動物としては、哺乳動物、魚類、鳥類、両生類、および爬虫類を挙げることができる。一つの特定の態様において、被験者はヒトである。
【００２１】
本発明をより明瞭に説明するために、以下の用語を定義する：
用語「結合タンパク質」は、リガンド（コグネイトリガンド、コグネイト結合パートナー）を結合する任意のタンパク質分子を指す。本明細書において用いる場合、結合タンパク質には２つのおおまかなカテゴリー：（１）参照結合タンパク質および（２）対象の結合タンパク質があり、両方を下で論じる。一つの態様において、結合タンパク質は、少なくとも１つのＩｇフォールドを有する。結合タンパク質が抗体であるとき、このリガンドは抗原である。Ｉｇフォールドは、完全長免疫グロブリン分子、即ち完全長抗体分子、の可変（Ｖ）および定常（Ｃ）領域において最初に特定された三次元球状構造ドメインである（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ  ａｎｄ  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐａｇｅｓ  ３．６−３．７参照）。Ｉｇフォールドは、ポリペプチド鎖のストランドの２つの逆並行層またはシートを含み、ポリペプチドのそれぞれのストランドが、βストランドとして既知の配座を有し、ストランドのそれぞれの層がβシートと呼ばれる。２つのβシートを互いに保持し、ほぼ円柱形（「グリーク・キー・バレル」とも呼ばれる。）を形成するように、それぞれのβシートの中央のβストランドがジスルフィド結合によって連結されている。免疫グロブリン分子のＣ領域のＩｇフォールドは、２つの逆並行βシートを有し、これらのβシートの一方が４つの逆並行βストランドを有し、他方のβシートが３つの逆並行βストランドを有する。免疫グロブリン分子のＶ領域のＩｇフォールドは、２つの逆並行βシートを有し、これらのβシートの一方が４つの逆並行βストランドを有し、他方のβシートが５つの逆並行βストランドを有する。
【００２２】
本明細書に記載する方法において使用することができる結合タンパク質は、４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖、からなる完全長抗体分子、ならびに抗原（リガンド）結合ドメインと少なくとも１つのＩｇフォールドとを有する様々な抗体構築物のいずれかを含む。上で述べたように、完全長抗体分子は、多数のＶおよびＣドメインを有し、従って、多数のＩｇフォールドを有する。抗体構築物としては、完全長抗体分子の機能的抗体フラグメント、融合体、突然変異体、変異体または誘導体が挙げられ、このような抗体構築物は、Ｉｇフォールを１つしか有さない場合がある。完全長免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ）の場合、それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常（ＣＨ）領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるさらに保存される領域が点在する、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に、さらに細分することができる。ＶＨおよびＶＬそれぞれは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配列された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。完全長免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスのものであってもよい。
【００２３】
さまざまな抗体構築物が、完全長免疫グロブリン分子のフラグメントまたは部分によって抗原結合機能を果たすことができることは証明されている。このような抗体構築物は、二特異性（２つの同一抗原分子を結合する。）、二重特異性（２つの異なる抗原分子を結合する。）、または２つ以上の異なる抗原の組み合わせを結合することができる多特異性フォーマットを有し得る。用語「結合タンパク質」に包含される抗体構築物の例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを含む一価（単一結合部位を含む）フラグメントであるＦａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価（２つの結合部位を含む）フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖフラグメント；単一可変ドメインを含む、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９）；Ｗｉｎｔｅｒら，ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１）；二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体；ならびに抗体分子のＶ領域の単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。Ｆａｂフラグメントがパパインでの完全長抗体分子の切断によって容易に生成されること、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントがペプシンでの完全長抗体分子の切断によって生成され得ることは、周知である。
【００２４】
Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換えＤＮＡ法を用いて、これらのドメインをコードする遺伝子を合成リンカー配列で連結させて、この組換え遺伝子が、ＶＬ領域とＶＨ領域がペプチドリンカーによって連結されて一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知の一価分子を形成する、単一タンパク質鎖をコードするようにすることができる（例えば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９９８）；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３（１９９８）参照）。このようなｓｃＦｖ抗体構築物は、リガンド（抗原）結合ドメインと少なくとも１つのＩｇフォールドとを有し、従って、用語「結合タンパク質」によって包含され、および本明細書に記載する方法において使用することができる。ダイアボディーも用語「結合タンパク質」によって包含される。ダイアボディーは、二価、二特異性抗体であり、この場合、ＶＨおよびＶＬドメインは、単一ポリペプチド鎖上で発現されるが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にすることができないリンカーを使用し、その結果、これらのドメインが別の鎖の相補ドメインとの対合を強制され、２つの抗原結合部位が作られる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）：Ｐｏｌｊａｋら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：１１２１−１１２３（１９９４）参照）。用語「結合タンパク質」は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０２４７１５に記載されているような二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体も包含する。上記分子のすべてが、本明細書に記載する方法において有用な結合タンパク質である。これらは、コグネイト結合パートナー、即ち抗原のための機能的結合ドメインを含み、および免疫グロブリンＶまたはＣ領域からの少なくとも１つのＩｇフォールドを含むからである。
【００２５】
本明細書に記載する方法において有用な結合タンパク質は、Ｉｇ  Ｆｃ領域に連結された細胞受容体分子またはこのリガンド結合部分を含む融合タンパク質である場合がある。このような融合タンパク質は、抗体Ｉｇ分子を模倣する構造を一般に有し、およびこのＦｃ領域のため、ＩｇＧまたはＩｇＭ分子に類似した様式で二量体または他の多量体形を形成し得る。このような細胞受容体／Ｆｃ融合タンパク質の例が治療薬エタネルセプトである。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＲＦ）の細胞外リガンド結合部分を含む二量体融合タンパク質である。エタネルセプトのＦｃ成分は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインと、ＣＨ１ドメインではなくヒンジ領域とを含む。
【００２６】
「対象の結合タンパク質」は、本明細書に記載するインビトロ法を用いてインビボ（例えば、ヒト）半減期を推定することとなるものである、任意の結合タンパク質である。状況によっては、対象の結合タンパク質を治療薬候補とみなす場合がある。
【００２７】
「参照結合タンパク質」は、既知インビボ（例えば、ヒト）半減期を有する結合タンパク質である。一般に、対象の結合タンパク質のインビボ半減期（例えば、ヒトにおけるもの）を推定するための本明細書に記載する方法は、少なくとも２つの参照結合タンパク質を利用する。本明細書に記載する方法において有用な参照結合タンパク質は、互いに異なる既知インビボ半減期（例えば、ヒトにおけるもの）を一般に有し、およびインビトロタンパク質分解アッセイにおいて異なるインビトロタンパク質分解半減期も一般に有する。このような相違は、インビボ半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の相関または標準曲線を生成するために必要とされる。従って、異なるインビボおよびインビトロ半減期を有する２つの異なる結合タンパク質の使用により、インビトロタンパク質分解半減期に対するインビボ半減期の相関を決定するまたは標準曲線を生成するために必要な最小限のデータが得られる。従って、結合タンパク質のインビボ半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の相関を決定するためのより多くのデータを提供するために本明細書に記載する方法において２つより多くの参照結合タンパク質を使用することは、本発明の範囲内である。
【００２８】
参照結合タンパク質としては、人間を治療することが認可されている治療用結合タンパク質を挙げることができるが、これらに限定されない。様々な治療用結合タンパク質が臨床試験での使用に認可されており、または臨床使用のために開発中であり、およびこれらとしては、例えば、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（米国特許第５，７３６，１３７号参照）、非ホジキンリンパ腫を治療するために認可されているキメラ抗ＣＤ２０抗体；ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、Ｇｅｎｍａｂによって現在開発中の抗ＣＤ２０、米国特許第５，５００，３６２号に記載されている抗ＣＤ２０抗体、ＡＭＥ−１３３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、ｈＡ２０（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ＨｕｍａＬＹＭ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）、およびＰＲＯ７０７６９（「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題する、ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０４２６）；トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（米国特許第５，６７７，１７１号参照）、乳癌の治療のために認可されているヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって現在開発中のペルツズマブ（ｒｈｕＭａｂ−２Ｃ４、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標））、米国特許第４，７５３，８９４号に記載されている抗Ｈｅｒ２抗体；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ）（米国特許第４，９４３，５３３号；ＰＣＴ  ＷＯ９６／４０２１０）、様々な癌についての臨床試験におけるキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；Ａｂｇｅｎｉｘ−Ｉｍｍｕｎｅｘ−Ａｍｇｅｎによって現在開発中のＡＢＸ−ＥＧＦ（米国特許第６，２３５，８８３号）；Ｇｅｎｍａｂによって現在開発中のＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ（米国特許出願第１０／１７２，３１７号）；４２５、ＥＭＤ５５９００、ＥＭＤ６２０００、およびＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）（米国特許第５，５５８，８６４号；Ｍｕｒｔｈｙら，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５２（２）：５４９−６０；Ｒｏｄｅｃｋら，１９８７，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５（４）：３１５−２０；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３）；ＩＣＲ６２（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＰＣＴ  ＷＯ９５／２００４５；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら，１９９３，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９３，２２（１−３）：１２９−４６；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら，１９９３，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９３，６７（２）：２４７−５３；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら，１９９６，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７３（２）：２２８−３５；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら，２００３，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０５（２）：２７３−８０）；ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈＲ３（ＹＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎａｄａ  ａｎｄ  Ｃｅｎｔｒｏ  ｄｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｕｂａ（米国特許第５，８９１，９９６号；米国特許第６，５０６，８８３号；Ｍａｔｅｏら，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ���ｎｏｌｏｇｙ，３（１）：７１−８１）；ｍＡｂ−８０６（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）（Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈら，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００（２）：６３９−４４）；ＫＳＢ−１０２（ＫＳ  Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）；ＭＲ１−１（ＩＶＡＸ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＰＣＴ  ＷＯ０１６２９３１Ａ２）；およびＳＣ１００（Ｓｃａｎｃｅｌｌ）（ＰＣＴ  ＷＯ０１／８８１３８）；アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病の治療に現在認可されているヒト化モノクローナル抗体；ムロモナブ−ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３（登録商標））、Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎによって開発された抗ＣＤ３抗体、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧによって開発された抗ＣＤ２０抗体、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈによって開発された抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体、アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標））、Ｂｉｏｇｅｎによって開発された抗ＬＦＡ−３  Ｆｃ融合体）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｌｉｌｌｙによって開発されたアブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、Ｎｏｖａｒｔｉｓによって開発されたバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅによって開発されたパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒによって開発された抗ＴＮＦα抗体、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、Ｄ２Ｅ７、Ａｂｂｏｔｔによって開発された抗ＴＮＦα抗体、Ｈｕｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｃｅｌｌｔｅｃｈによって開発された抗ＴＮＦα抗体、ゴリムマブ（ＣＮＴＯ−１４８）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒによって開発された完全ヒトＴＮＦ抗体、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、Ｉｍｍｕｎｅｘ／Ａｍｇｅｎによって開発されたｐ７５  ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合体；レネルセプト、Ｒｏｃｈｅによって以前に開発されたｐ５５  ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合体、ＡＢＸ−ＣＢＬ、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発中の抗ＣＤ  １４７抗体、ＡＢＸ−ＩＬ８、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発中の抗ＩＬ８抗体、ＡＢＸ−ＭＡ１、Ａｂｇｅｎｉｘによって開発中の抗ＭＵＣ１８抗体、Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ（Ｒ１５４９、９０Ｙ−ｍｕＨＭＦＧｌ）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中の抗ＭＵＣ１、Ｔｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中の抗ＭＵＣ１抗体、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中のＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ  １４０５）、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中のＨｕＢＣ−１、Ａｎｔｉｓｏｍａによって開発中のＴｈｉｏｐｌａｔｉｎ（ＡＳ  １４０７）、Ａｎｔｅｇｒｅｎ（登録商標）（ナタリズマブ）、Ｂｉｏｇｅｎによって開発中の抗−アルファ−４−ベータ−１（ＶＬＡ−４）およびアルファ−４−ベータ−７抗体、ＶＬＡ−１  ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎによっ��開発中の抗ＶＬＡ−１インテグリン抗体、ＬＴＢＲ  ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎによって開発中の抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）抗体、ＣＡＴ−１５２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発中の抗ＴＧＦ−β２抗体、ＡＢＴ  ８７４（Ｊ６９５）、Ａｂｂｏｔｔによって開発中の抗ＩＬ−１２  ｐ４０抗体、ＣＡＴ−１９２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよび  Ｇｅｎｚｙｍｅによって開発中の抗ＴＧＦβ１抗体、ＣＡＴ−２１３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発中の抗エオタクシン１（Ｅｏｔａｘｉｎ１）抗体、ＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−Ｂ（登録商標）Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．によって開発中の抗Ｂｌｙｓ抗体、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍＡｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．によって開発中の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）ベバシズマブ、ｒｈｕＭＡｂ−  ＶＥＧＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体、抗組織因子（Ａｎｔｉ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ：ＡＴＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗組織因子抗体、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ））、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発中の抗ＩｇＥ抗体、Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）（エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ））、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＸｏｍａによって開発中の抗ＣＤ１１ａ抗体、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＭｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中のＭＬＮ−０２抗体（以前は、ＬＤＰ−０２）、ＨｕＭａｘ  ＣＤ４、Ｇｅｎｍａｂによって開発中の抗ＣＤ４抗体、ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎによって開発中の抗ＩＬ１５抗体、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘによって開発中のＨｕＭａｘ−Ｉｎｆｌａｍ、ＨｕＭａｘ−Ｃａｎｃｅｒ、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘおよびＯｘｆｏｒｄ  ＧｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓによって開発中の抗ヘパラナーゼＩ抗体、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎによって開発中のＨｕＭａｘ−Ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｇｅｎｍａｂによって開発中のＨｕＭａｘ−ＴＡＣ、ＩＤＥＣ−１３１、およびＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ＩＤＥＣ−１５１（クレノリキシマブ（Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ））、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ４抗体、ＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ８０抗体、ＩＤＥＣ−１５２、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗ＣＤ２３、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発中の抗マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体、ＢＥＣ２、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発中の抗イディオタイプ抗体、ＩＭＣ−１Ｃ１１、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発中の抗ＫＤＲ抗体、ＤＣ  １０１、Ｉｍｃ��ｏｎｅによって開発中の抗ｆｌｋ−１抗体、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発中の抗ＶＥカドヘリン抗体、ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ（登録商標）（ラベツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中の抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ））、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中の抗ＣＤ２２抗体、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＡＦＰ−Ｃｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＬｋｏＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発中のＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ、ＭＤＸ−０１０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中の抗ＣＴＬＡ４抗体、ＭＤＸ−０６０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中の抗ＣＤ３０抗体、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中のＭＤＸ−０７０、Ｍｅｄａｒｅｘによって開発中のＭＤＸ−０１８、Ｏｓｉｄｅｍ（登録商標）（ＩＤＭ−１）、ならびにＭｅｄａｒｅｘおよびＩｍｍｕｎｏ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓによって開発中の抗Ｈｅｒ２抗体、ＨｕＭａｘ（登録商標）−ＣＤ４、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発中の抗ＣＤ４抗体、ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂによって開発中の抗ＩＬ１５抗体、ＣＮＴＯ  １４８、ＭｅｄａｒｅｘおよびＣｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊによって開発中の抗ＴＮＦα抗体、ＣＮＴＯ  １２７５、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊによって開発中の抗サイトカイン抗体、ＭＯＲ１０１およびＭＯＲ１０２、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発中の抗細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４）抗体、ＭＯＲ２０１、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによって開発中の抗線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）抗体、Ｎｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビシリズマブ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発中の抗ＣＤ３抗体、ＨｕＺＡＦ（登録商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発中の抗γインターフェロン抗体、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発中の抗α５β１インテグリン、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓによって開発中の抗ＩＬ−１２、ＩＮＧ−１、Ｘｏｍａによって開発中の抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍ
ａｂ））ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＮｏｖａｒｔｉｓによって開発されたヒト化抗ＩｇＥ抗体、ならびにＭＬＮ０１、Ｘｏｍａによって開発中の抗β２インテグリン抗体が挙げられる。この段落中で上に挙げた参照のすべては、参照により本明細書に明白に組み込まれる。
【００２９】
本明細書に記載する方法において有用な治療用結合タンパク質の特定の例としては、インフリキシマブ（抗ＴＮＦ−α、８日のインビボヒト半減期）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２、１２日のインビボヒト半減期）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０、関節リウマチ患者において２０日のインビボヒト半減期）、パリビズマブ（抗呼吸器性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）、１８日のインビボヒト半減期）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５、即ち抗ＩＬ−２受容体、２０日のインビボヒト半減期）、およびバシリキシマブ（抗−ＣＤ２５、即ち抗ＩＬ−２受容体、７．２日のインビボヒト半減期）、およびエタネルセプト（ＴＮＦαを結合、４．２５日のインビボヒト半減期）が挙げられる。組換え結合タンパク質エタネルセプトは、Ｉｇフォールドを含む免疫グロブリンＦｃ領域に融合したｐ７５  ＴＮＦ受容体のリガンド結合部分を有する。従って、実施例２において立証するように、エタネルセプトは、本明細書に記載する方法のための参照結合タンパク質として有用である。
【００３０】
本明細書に開示する任意の組成物または方法において、任意の指名必須要素または段階の既知のまたは開示する等価物を、この要素または段階の代わりに用いることができる。
【００３１】
特に指示がない限り、組成物または方法は、列挙する要素または段階のいずれの特定の順序によっても限定されない。
【００３２】
別の指示がない限り、他の用語の意味は、この文脈から明らかであろう、または当業者によって理解され用いられている意味と同じであると解釈されるであろう。
【００３３】
本発明は、インビトロプロテアーゼ切断反応における結合タンパク質の算出半減期（ｔ１／２）が、このインビボ半減期、例えばヒトにおけるこの半減期と高度に相関するという知見に一部分、基づく。従って、実際のインビボ小型哺乳動物またはヒト薬物動態研究を行うための労力、時間および出費を費やさずに対象の結合タンパク質のインビボ半減期を推定するために用いることができる方法を提供する。詳細には、対象の結合タンパク質のインビボ半減期を推定するための本明細書に記載する方法は、この対象の結合タンパク質についての、およびインビボ半減期が既知である少なくとも２つの参照結合タンパク質のそれぞれについての、インビトロタンパク質分解半減期の計算を含む。参照結合タンパク質のそれぞれの既知インビボ半減期と算出インビトロタンパク質分解半減期の間の相関を（例えば、グラフによりまたはコンピュータ計算により）決定する。その後、対象の結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期をこの相関関係にあてはめて、この対応するインビボ半減期を推定することができる。
【００３４】
本発明の一つの実施形態において、対象の結合タンパク質のインビボ半減期を推定するための方法は、
（ａ）少なくとも２つの参照結合タンパク質のそれぞれについておよび対象の結合タンパク質についてインビトロプロテアーゼ反応アッセイにおいてインビトロタンパク質分解半減期を決定する段階（この場合、前記参照結合タンパク質は、被験者における異なる既知インビボ半減期を有する。）と、
（ｂ）参照結合タンパク質の既知インビボ被験者半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の相関を決定する段階と、
（ｃ）参照結合タンパク質の既知インビボ被験者半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の相関から、対象の結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期と相関するこの対象の結合タンパク質のインビボ被験者半減期を推定する段階と
を含む。
【００３５】
一つの態様において、被験者は、動物であり得る。動物は、非脊椎動物と、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類および両生類を含む脊椎動物とを包含し得る。哺乳動物としては、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、サル、ヒツジ、ヤギ、ウマなどを挙げることができる。特定の態様において、被験者はヒトである。
【００３６】
様々なプロテアーゼが既知であり、本明細書に記載する方法での使用のために当分野において容易に入手することができる。このようなプロテアーゼとしては、サーモライシン、エラスターゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の市販されているプロテアーゼは、本発明の範囲に含められ、当業者に周知である。本明細書に記載する方法において有用なプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせを、２つ以上の参照結合タンパク質のそれぞれについての有意だが適度な切断、ならびに２つ以上の参照結合タンパク質のそれぞれについての有意に異なる切断速度をもたらすように、最適化することができる。一つの態様では、タンパク質分解処理した参照結合タンパク質および対象の１つ以上の結合タンパク質に関するインビトロタンパク質分解アッセイを１日以内に、３時間以内に、２時間以内に、または１時間以内に行う。
【００３７】
当分野において既知の様々な方法のいずれかを単独で用いて、または併用して、タンパク質のタンパク質分解的切断を追跡および測定することができる。このような方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、マイクロ流体チップでの電気泳動法（実施例２参照）、タンパク質またはこのフラグメントのクロマトグラフ分離および分析、タンパク質またはこのフラグメントを同定するための免疫検出技法、ならびに結合タンパク質またはこのフラグメントの質量分析法が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書に記載する方法において使用するためのプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせは、切断速度を正確に決定することができる、次いで、それぞれの結合タンパク質についてのインビトロタンパク質分解半減期を正確に計算することができる期間にわたって、参照結合タンパク質および対象の結合タンパク質を切断するであろう。
【００３８】
一つの態様において、本明細書に記載する方法において有用なプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせは、ハイ・スループット・スクリーニング・プログラムで常例的に使用できるような十分に迅速である期間に参照結合タンパク質および対象の結合タンパク質を切断するため、例えば、対象の１つ以上の結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期を妥当な期間、例えば１日以下で決定することができる。
【００３９】
本明細書に記載する方法での使用に適するプロテアーゼの一例は、本明細書（実施例２）に示すように、常例的インビトロアッセイにおいて使用して、算出インビトロサーモライシン媒介タンパク質分解半減期がこれらのそれぞれのインビトロ被験者、例えばヒト、半減期と高度に相関するような様式で、結合タンパク質を切断することができる、サーモライシンである。サーモライシンは、一つには、参照結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期とこれらのそれぞれの既知インビボ被験者半減期の間の一次相関を生じさせるようにタンパク質分解のための条件を最適化できるので適している。
【００４０】
インビボ被験者半減期とタンパク質分解インビトロ半減期の間の相関は、グラフにより、２つ以上の参照結合タンパク質の既知インビボ被験者半減期をこれらの算出インビトロプロテアーゼ半減期に対してプロットし、これらのデータ点により最も合う標準曲線（線または他の形）を描いて、インビボ被験者半減期とインビトロタンパク質分解半減期の相関を明らかにすることによって決定することができる。いずれの相関も、コンピュータ計算により、例えば、計算機、コンピュータプログラムなどを使用して決定することもでき、このコンピュータ計算により決定された相関を単に使用して対象の結合タンパク質のインビボ半減期を推定することができるので、このような標準曲線を実際に描く必要は勿論ない。
【００４１】
本明細書に記載する方法において有用な適する標準曲線は、結合タンパク質の被験者におけるインビボ半減期とインビトロタンパク質分解半減期の間の一次相関のグラフ表示である。このような歴史的標準曲線の例を図１に示す。参照結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期データを計算するために用いたタンパク質分解反応アッセイを繰り返して、対象の結合タンパク質についてのインビトロタンパク質分解半減期データを決定するのだから、前に生成し標準曲線を使用する対象の結合タンパク質についての被験者におけるインビボ半減期の推定の精度は、向上されるであろう。例えば、図１における一次標準曲線を実施例２において説明するように生成した；図１における標準曲線に対する対象の結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期の比較によって推定したインビボヒト半減期は、この標準曲線を生成するために用いたものと同一の条件下でインビトロタンパク質分解アッセイを行う限り、最も正確である。
【００４２】
図１の標準曲線に示すインビボヒト半減期とインビトロ・サーモライシン・タンパク質分解半減期の間の相関は、統計学的に有意であり、および相関係数の二乗（Ｒ２）＝０．８８５によって示されるようにインビボ半減期を予測する。Ｒ２の値が１．００に近いほど、インビトロ半減期値がインビボ半減期値に対する良好な予測となる。０．８８５のＲ２値は、データ点の値の８８．５％が線形回帰によって説明されることを示す。従って、図１に示すような一次標準曲線についての０．８８５のＲ２は、結合タンパク質のインビトロサーモライシン媒介切断が、結合タンパク質のインビボヒト半減期を予測するために妥当な方法であることを客観的に示している。従って、インビトロサーモライシン媒介タンパク質分解性切断反応（またはこの等価物）および既知インビボヒト半減期を有する参照結合タンパク質を用いる本明細書に記載する方法は、対象の結合タンパク質のインビボヒト半減期についての統計学的に有意な値をもたらす。しかし、本明細書に記載する方法において他のプロテアーゼも同様に使用することができる。
【００４３】
コンピュータ計算により、即ち新たな標準曲線を生成せずに、対象の結合タンパク質のインビボ半減期を推定するための本発明による方法は、例えばサーモライシンを使用するタンパク質分解反応アッセイにおいてインビトロ半減期を決定すること、およびその後、一次式：
ｙ＝０．２７ｘ＋２．７９
（式中、「ｙ」は、日数でのインビボヒト半減期であり、「０．２７」は、インビボ半減期とインビトロ・サーモライシン・タンパク質分解半減期の間の一次相関の勾配であり、「ｘ」は、サーモライシンタンパク質分解反応アッセイにおけるインビトロ半減期であり、および定数「２．７９」は、一次相関に沿ったインビトロタンパク質分解半減期ゼロに対応するインビボ半減期である。）
に従って推定インビボ半減期を計算することを含む。上の一次相関式中の「ｍ」および「ｂ」の値は、以下の参照結合タンパク質のインビトロ・サーモライシン・タンパク質分解半減期を決定した実施例２におけるデータから生成した図１の標準曲線から得た：インフリキシマブ（抗ＴＮＦ−α、８日のインビボヒト半減期）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２、１２日のインビボヒト半減期）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０、２０日のインビボヒト半減期）、パリビズマブ（抗呼吸器シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）、１８日のインビボヒト半減期）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５、即ち抗ＩＬ−２受容体、２０日のインビボヒト半減期）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５、即ち抗ＩＬ−２受容体、７．２日のインビボヒト半減期）、およびエタネルセプト（ＴＮＦ−αを結合、４．２５日のインビボヒト半減期）。従って、上の一次相関式を用いるために、実施例２において説明するようなアッセイのためのものと同じ反応条件を用いて対象の結合タンパク質のインビトロ・サーモライシン・タンパク質分解半減期を決定する必要がある。
【００４４】
代替手順において、参照結合タンパク質の在庫を利用できる場合には、参照結合タンパク質の既知インビボ被験者半減期と、対象の結合タンパク質についてのインビトロタンパク質分解半減期と並行しておよび同時に決定されるような、これらのそれぞれのインビトロタンパク質分解半減期（例えば、サーモライシンによって媒介されるもの）との新たな相関、即ち新たな標準曲線、を（グラフによりまたはコンピュータ計算により）生成することができることも理解される。このようにして、対象の結合タンパク質のインビボ被験者半減期を、新たに生成した標準曲線または対応するコンピュータ計算式から推定することができる。
【００４５】
一般に、プロテアーゼ反応混合物は、手作業によってまたはロボットによって、準備、実行および停止することが比較的簡単である。標準的なタンパク質分解性切断反応は、選択されたプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせ、適切な反応ｐＨを生じさせるための緩衝液、タンパク質分解活性に必要とされ得る任意のイオン種、および選択されたタンパク質基質（例えば、本明細書に記載するような結合タンパク質）を一般に含む。
【００４６】
選択されたプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせによって媒介される切断反応についての適切なｐＨおよび／または他の条件を維持するための様々な緩衝液は、当業者には既知でありおよび容易に入手することができ、または常例的な最適化によってこれらを容易に決定することができる。サーモライシン媒介タンパク質分解性切断反応の場合、有用な緩衝液としては、酢酸ナトリウム／塩化カルシウム緩衝液（ｐＨ約７．８）、１Ｘ  ＰＢＳ／塩化カルシウム（ｐＨ約７．５）、およびＨＥＰＥＳ／塩化カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
サーモライシンの場合、本明細書に記載する方法において有用な適するサーモライシンタンパク質分解アッセイは、結合タンパク質（約５０μｇ以下）；１Ｘ  ＰＢＳ／塩化カルシウム（約７．５のｐＨ）；およびサーモライシン（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（ミズーリ州、セントルイス、カタログ番号Ｔ７９０２）から入手できるようなサーモライシンについての約２から約４単位）を含む。一つの態様では、この反応をおよそ３７℃で実行し、サンプルを周期的に除去して結合タンパク質の切断を分析する。
【００４８】
タンパク質分解性切断反応は、様々な手段のいずれかによって停止させることができる。二価金属（例えば、カルシウム、マグネシウム）イオンがプロテアーゼ活性にとって重要である場合には、１つ以上の金属イオンキレート化剤、例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの添加によってタンパク質分解性切断反応を容易に停止させることができる。または、熱もしくは沸騰によるプロテアーゼの変性、化学的試薬（例えば、洗剤、有機溶媒、カオトロピック剤）による変性、および反応混合物からのプロテアーゼもしくは基質の選択的除去（例えば、反応混合物から離隔することができるもしくは別様に分離することができる回収可能な粒子または他の固体基質にプロテアーゼもしくはこの基質が連結されているとき）をはじめとする（しかし、これらに限定されない。）、より一般的な手段によってタンパク質分解性切断反応を停止させることができる。
【００４９】
上で述べたように、結合タンパク質の切断の量または、代替として、インビトロタンパク質分解性切断反応におけるある期間にわたっての未切断結合タンパク質の残存画分の量の決定は、当分野において利用できる方法（例えば、電気泳動法、免疫検出法、質量分析法）によって容易に得られる。例えば、結合タンパク質のインビトロタンパク質分解性切断反応から様々な時点で除去されるサンプルをポリアクリルアミドゲルによって電気泳動させ、このゲルを染色して、または免疫ブロッティングに付して、結合タンパク質分子および／またはこれらの切断フラグメントに対応する１つ以上のバンドを明らかにすることができる。このようにして、タンパク質分解性切断反応の過程を通して未切断結合タンパク質に対応するゲルバンドの消失を監視することができる。その後、例えば、各時点（即ち、ゲル内のレーン）で特定のゲルバンドをレーザーデンシトメータまたは等価の計器で走査することによって、未切断結合タンパク質の残存画分を各時点で定量することができる。タンパク質分解性切断生成物の標準的な電気泳動分析における最近の改良は、適切なコンピュータソフトウェアと連動するマイクロ流体チップの使用である。マイクロ流体チップの使用例を実施例２に提供する。このようなマイクロ流体チップは、サンプル中のタンパク質の分離および分析に非常に小さなサンプル体積（例えば、マイクロリットル、ナノリットル）を用いる。電気泳動移動において分離されたタンパク質を、レーザー励起蛍光を使用して検出および定量し、このチップに連結されたコンピュータにおいて適切なソフトウェアによりこのデータを蓄積および分析することができる。このデータを処理して、サンプル中のタンパク質の電気泳動分離および移動を図解する仮想ゲル画像を生成することができる。
【００５０】
例えば、（ゲルバンド中のまたは仮想ゲルバンド上の）未切断結合タンパク質に対応するタンパク質バンドの消失を、タンパク質分解性切断反応の過程を通して様々な方法によって監視および定量することができる。タンパク質バンドの量を反応時間に対してグラフによりまたはコンピュータ計算によりプロットして、インビトロタンパク質分解半減期を決定することができる。インビトロタンパク質分解性切断反応における結合タンパク質についての減衰の見掛けの擬一次速度定数（Ｋａｐｐ）および見掛けの半減期（ｔ１／２）は、当業者に周知の標準的な式によって容易に計算することができる。その後、結合タンパク質の残存未切断画分（ｒ）を、特定の時間（ｔ）での残存タンパク質の曲線下面積（ｙ）を測定し、これを時間ゼロでの未切断抗体の曲線下面積（ｙ０）で割ることよって定量することができる（ｒ＝ｙ／ｙ０）。時間に対して残存画分（ｒ）をプロットすることによって、プロテアーゼにより媒介される結合タンパク質の切断を表す指数減衰関数が得られる。従って、一次相関の場合、標準式ｒ＝ｅ−（Ｋａｐｐｘｔ）を解いて、見掛けの擬一次速度定数Ｋａｐｐを得ることができ、次いで、これを用いて、標準式ｔ１／２＝ｌｎ２／Ｋａｐｐから結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期を計算することができる。
【００５１】
その後、２つ以上の参照結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期をこれらのそれぞれの既知インビボヒト半減期に対して（グラフによりまたはコンピュータ計算により）プロットすることができる。上で述べたように、図１における歴史的参照線（標準曲線）は、実施例２において説明する反応条件を用いるサーモライシン媒介タンパク質分解反応においてインビトロタンパク質分解半減期を得られ、対象の結合タンパク質についてのインビボヒト半減期を推定するために用いることができる。参照結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期データを生成するために用いたサーモライシンタンパク質分解反応アッセイを繰り返して、対象の結合タンパク質についてのインビトロタンパク質分解半減期データを生成するのだから、図１を用いて推定されるインビボ半減期の精度は向上される。
【００５２】
結合タンパク質のインビトロタンパク質分解半減期が、この結合タンパク質のインビボヒト半減期と強く相関するという知見により、インビトロタンパク質分解半減期を用いて、対象の２つ以上の結合タンパク質を比較に基づいて、即ち、上で説明したインビボ半減期の推定を行うことなく、これらのインビボ半減期について得ることができる。対象の結合タンパク質のこのような順序付けは、治療に使用するための比較的多数の候補結合タンパク質のハイ・スループット・スクリーニングの際に特に価値がある。例えば、対象の様々な結合タンパク質の中のインビトロタンパク質分解半減期間の比較的広範な相違は、これらのそれぞれのインビボ半減期の広範な相違を示す。このような場合、他の結合タンパク質と比較して相対的に高いインビトロタンパク質分解半減期を有する結合タンパク質を含有するサブグループにさらなるスクリーニングまたは開発の的を絞る方が効率的であり、経済的であることを現場の人間は決めることができる。
【００５３】
対象の結合タンパク質の１つ以上の特性を調節または改善するための研究または手順において、インビトロタンパク質分解半減期は、改善が、対象の結合タンパク質のインビボ半減期に対して有害な影響を及ぼすのか、または望ましい様式の影響を及ぼすのかについての容易に得られる指標である。例えば、小さな変異、例えば親抗体分子のＣＤＲの１つ以上に関する小さな変異を有する抗体分子のファミリーを作る、アフィニティー・マチュレーションのプログラムの場合、このファミリーのすべてのメンバーは、特定の抗原に対して許容される結合親和性を有することができるが、変異の影響は、インビボ半減期などの他の望ましい特性に対して有害な影響を有することがある。このような状況において、本明細書に記載する方法は、抗体分子のファミリーのどのメンバーが相対的に長いインビボ半減期を有するか、およびどれが相対的に短いインビボ半減期を有するのかの決定に有用である。
【００５４】
２つ以上の参照結合タンパク質についてのインビトロタンパク質分解半減期を得るように、次いで、対象の結合タンパク質のインビボ半減期を予測するための相関または標準曲線を生成するように、本明細書に記載する方法において用いるインビトロタンパク質分解アッセイについての条件を計画することは理解される。相関または標準曲線を必要とする任意のアッセイと同じように、対象の結合タンパク質のインビボ半減期についての最も信頼性の高い値は、２つ以上の参照結合タンパク質のデータ点の間である相関または標準曲線の領域内で得られるもの、即ち値が参照データ間に内挿される場合、であろうし、対象の結合タンパク質のインビボ半減期についての信頼性の低い値は、相関または標準曲線のこの領域外で得られるもの、即ち値が参照結合タンパク質のデータを超えて外挿される場合である可能性が高い。
【００５５】
本発明の追加の実施形態および特徴は、以下の非限定的実施例から明らかになるだろう。
【００５６】
実施例
【実施例１】
【００５７】
治療用参照結合タンパク質のインビトロ部分的切断反応についてのプロテアーゼの初期スクリーニング
トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシンおよびサーモライシンを、既知インビボヒト半減期を有する結合タンパク質の様々な切断速度をもたらす能力について最初に試験した。標準的なプロテアーゼ切断反応条件を用い、およびポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて、これらのプロテアーゼのそれぞれによるそれぞれの結合タンパク質の切断の過程をある期間にわたって追跡した。
【００５８】
以下の結合タンパク質（即ち、参照結合タンパク質）の１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の保存調製物（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した：インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）インフリキシマブ；ペンシルバニア州、ヒューストンのＣｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）トラスツズマブ；カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）リツキシマブ；カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびマサチューセッツ州、ケンブリッジのＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ）、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）パリビズマブ；メリーランド州、ゲーサーズバーグのＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）ダクリズマブ；ニュージャージー州、ナトリーのＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．）、バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標）バシリキシマブ；スイス、バーゼルのＮｏｖａｒｔｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ）、およびエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）エタネルセプト；カリフォルニア州、サウザンドオークのＡＭＧＥＮおよびペンシルバニア州、フィラデルフィアのＷｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。
【００５９】
この初期分析は、結合タンパク質のすべてが、プロテアーゼのそれぞれによる切断をある程度受けやすいことを示した。例えば、サーモライシンは、ある期間にわたってそれぞれの参照結合タンパク質の観察可能な切断を生じさせる点で、ならびにそれぞれの参照結合タンパク質について異なるタンパク質分解性切断速度を生じさせる点で有効であった。上述の参照結合タンパク質のそれぞれのサーモライシン媒介タンパク質分解からのデータを表１に示す。
【００６０】
【表１】
2011517949.tif 000002
【実施例２】
【００６１】
対象の結合タンパク質のインビボ半減期（ｔ１／２）を推定するためのインビトロ・サーモライシン・タンパク質分解
【００６２】
この実施例は、結合タンパク質のインビボヒト半減期（ｔ１／２）とインビトロサーモライシン媒介タンパク質分解半減期の間の高度な一次相関を立証するものである。
【００６３】
材料および方法
バシラス・サーモプロテオリカス・ロッコ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｃｕｓ  ｒｏｋｋｏ）からのサーモライシンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（ミズーリ州、セントルイス；カタログ番号Ｔ７９０２）から入手した。
【００６４】
１０Ｘ反応緩衝液：５００ｍＭ  酢酸ナトリウム、１００ｍＭ  塩化カルシウム、ｐＨ＝７。
【００６５】
ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｈｉｐ  Ｋｉｔ（ロット番号Ｂ９１１Ａ；マサチューセッツ州、ホプキントンのＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【００６６】
９６ウェル・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）マイクロプレート（カタログ番号ＰＣＲ−９６−ＦＳ−Ｃ；カリフォルニア州、ユニオン・シティーのＡｘｙｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）。
【００６７】
停止溶液：０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５。
【００６８】
変性緩衝液：Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのＬＤＳを含有するＨＴタンパク質サンプル緩衝液（この有標緩衝液は、Ｌａｂｃｈｉｐ  ＬＣ９０の製造業者によって供給される。）。
【００６９】
結合タンパク質分子タンパク質分解および分析
１Ｘ  ＰＢＳ中の結合タンパク質溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を調製した。サーモライシンプロテアーゼ溶液を水に８ｍｇ／ｍＬで再懸濁させた後、タンパク質分解性切断反応を開始した。
【００７０】
サーモライシンプロテアーゼ切断反応：
１．５ｍＬエッペンドルフ反応菅には、
結合タンパク質４０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）、
１Ｘ反応緩衝液を作るための５μＬ  １０Ｘ反応緩衝液、
１：１（ｗ：ｗ）抗体：プロテアーゼ比にするための５μＬサーモライシン（８ｍｇ／ｍＬ）
が入っていた。この切断反応を３７℃で温置した。切断反応中の指定時間に、サンプル（４μＬ）を除去し、９６ウェルＰＣＲマイクロプレートのウェル内でＥＤＴＡ停止溶液（２μＬ）と混合した。それぞれのウェルに変性緩衝液（６μＬ）を添加し、このマイクロプレートを室温（ＲＴ）で２時間または一晩、温置した。その後、水１０μＬをそれぞれのウェルに添加し、その後、ＬａｂＣｈｉｐ  Ｃａｌｉｐｅｒ  ９０マイクロ流体チップ（製造業者の説示に従って準備して使用する。）で読み取った。時間＝０での対照サンプル（サーモライシンなし）の読み取りは、タンパク質分解性切断の定量にとって重要である。サーモライシンタンパク質分解性切断反応のサンプルを０、１０、２０、４５、６０、８０、１００、１２０および１５０分の時点で除去して停止させた。抗体分子の安定性に関するチェックとして１５０分の時点でも対照サンプル（サーモライシンなし）を採取した。
【００７１】
結果
既知インビボヒト半減期を有する参照結合タンパク質の市販調製物は、インビトロサーモライシン媒介タンパク質分解性切断反応における基質として役立った。サーモライシンは、それぞれの参照結合タンパク質の有意だが適度な切断、ならびにそれぞれの参照結合タンパク質の有意に異なる切断速度を生じさせた。それぞれのインビトロ切断速度（分あたり）をそれぞれの結合タンパク質について決定した。その後、このインビトロタンパク質分解性切断速度を用いて、対応する見掛けのサーモライシン媒介タンパク質分解（触媒）半減期（分）を計算した。
【００７２】
表２は、それぞれの治療用結合タンパク質についての見掛けのインビトロタンパク質分解性切断速度（分あたり）、見掛けのインビトロタンパク質分解半減期（分）および公表されている平均インビボヒト半減期（日）をまとめたものである。
【００７３】
【表２】
2011517949.tif 000003
【００７４】
インビトロサーモライシン媒介タンパク質分解半減期（分）に対する公表されている平均ヒト薬物動態学的インビボ半減期（日）のプロットにより、図１に示す標準曲線が得られる。注目すべきことに、この標準曲線についての相関係数の二乗（Ｒ２）は、０．８８５であり、この値は、結合タンパク質のインビトロサーモライシン媒介タンパク質分解半減期とこの対応するインビボヒト半減期の間の高い相関度を示している。Ｒ２のこの高い値は、結合タンパク質のインビトロサーモライシン媒介切断が、結合タンパク質のインビボヒト半減期を限定する主メカニズムの妥当なモデルであることを明示している。従って、この研究において説明するサーモライシン切断反応条件を用いて決定されるような任意の結合タンパク質についてのインビトロ・サーモライシン・タンパク質分解半減期を用いて、図１に示す標準曲線からそれぞれのインビボヒト半減期を推定することができる。
【００７５】
上の本文に引用したすべての特許、出願および出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
本発明の範囲を逸脱しない、本明細書に記載する本発明の他の変形形態および実施形態は、当業者には明らかであろう。
【図１】
2011517949.tif 000004
【国際調査報告】
2011517949.tif 000005