(57)【要約】  本発明は概して分子生物学及び増殖因子調節の分野に関するものである。具体的には、本発明は、癌などの病態を治療するための併用療法に関する。
2011513427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体に治療的有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストとＥＧＦＲアンタゴニストを投与することを含む、被検体の癌の治療方法。
【請求項２】
ＥＧＦＲアンタゴニストが、出典明記によって本明細書中に援用される米国特許第５７５７４９８号に記載の以下の一般式Ｉを有し、
2011513427.tif 000023
上式中、
ｍは、１、２又は３であり； 
各Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアミノ、カルボキシ、ニトロ、グアニジノ、ウレイド、シアノ、トリフロロメチル、及びＷが単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＨである−(Ｃ１−Ｃ４アルキレン)-Ｗ-(フェニル)からなる群からそれぞれ選択され；又は、
各Ｒ１は、Ｒ９及びシアノに置換したＣ１−Ｃ４アルキルからそれぞれ選択され、このＲ９は、Ｒ５、-ＯＲ６、-ＮＲ６Ｒ６、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、-ＮＨＯＲ５、-ＯＣ(Ｏ)Ｒ６、シアノ、Ａ及び-ＹＲ５からなる群から選択され；Ｒ５はＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒ６はそれぞれ水素又はＲ５であり；Ｒ７はＲ５、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６であり；Ａはピペリジノ、モルホリノ、ピロリジノ、４−Ｒ６−ピペラジン−１−イル、イミダゾール-１-イル、４-ピリドン−１−イル、−(Ｃ１−Ｃ４アルキレン)(ＣＯ２Ｈ)、フェノキシ、フェニル、フェニルスルファニル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、及び-(Ｃ１−Ｃ４アルキレン)Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ６から選択され；そして、ＹはＳ、ＳＯ又はＳＯ２であり；このとき、Ｒ５、-ＯＲ６及び、-ＮＲ６Ｒ６のアルキル部分は場合によって１〜３のハロ置換基に置換され、Ｒ５、-ＯＲ６、及び-ＮＲ６Ｒ６のアルキル部分は場合によって１又は２のＲ９基によって置換され、そして該任意の置換基のアルキル部分は場合によってハロ又はＲ９によって置換されているが、ただし２つの異種原子が同じ炭素原子に結合しておらず； 
各Ｒ１はそれぞれ、-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４)-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノから選択され、このＲ１０は、ハロ、-ＯＲ６、Ｃ２-Ｃ４アルカノイルオキシ、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、及び-ＮＲ６Ｒ６から選択され；前記-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノＲ１基は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルキル、シアノ、メタンスルホニル及びＣ１-Ｃ４アルコキシからそれぞれ選択される１又は２の置換基で置換されていてもよく；又は 
２のＲ１基は、それらが結合している炭素と共同して、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１又は２のヘテロ原子を含む、５-８員環を形成し； 
Ｒ２は、水素、又は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒ５からそれぞれ選択される１から３の置換基で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルであり； 
ｎは１又は２であり、各Ｒ３はそれぞれ、水素、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、-ＮＲ６Ｒ６、及びＣ１-Ｃ４アルコキシから選択され、該Ｒ３基中のアルキル部分は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒからそれぞれ選択される１から３の置換基で置換されていてもよく；Ｒ４はアジド又は-(エチニル)-Ｒ１１であり、このＲ１１は、水素、又は、ヒドロキシ、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＥＧＦＲアンタゴニストが、(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-[３-(３'-ヒドロキシプロピン-１-イル)フェニル]-アミン；[３-(２'-(アミノメチル)-エチニル)フェニル]-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-ニトロキナゾリン-４-イル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(４-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-２-メチルフェニル)-アミン；(６-アミノキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニルアミノキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６,７-メチレンジオキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-６-メチルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(７-ニトロキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(４'-トルエンスルホニルアミノ)キナゾリン-４-イル]-アミン；(３-エチニルフェニル)-{６-[２'-フタルイミド-ｅｔｈ-１'-イル-スルホニルアミノ]キナゾリン-４-イル}-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-グアニジノキナゾリン-４-イル)-アミン；(７-アミノキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(７-メトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(６-カルボメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(７-カルボメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；[６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)キナゾリン-４-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-アジドフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-アジド-５-クロロフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(４-アジドフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニル-キナゾリン-４-イル)-アミン；(６-エタンスルファニル-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシ-キナゾリン-４-イル)-[３-(プロピン-１'-イル)-フェニル]-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(５-エチニル-２-メチル- フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-４-フルオロ- フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-クロロ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；[６-(２-クロロ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３- エチニルフェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-アセトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニルフェニルアミノ)-７-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-６-イルオキシ]-エタノール；[６-(２-アセトキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３- エチニルフェニル)-アミン；[７-(２-クロロ-エトキシ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３- エチニルフェニル)-アミン；[７-(２-アセトキシ-エトキシ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニルフェニルアミノ)-６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノ���ル；２-[４-(３-エチニルフェニルアミノ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-６-イルオキシ]-エタノール；２-[４-(３-エチニルフェニルアミノ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノール；[６-(２-アセトキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-{６-(２-メトキシ-エトキシ)-７-[２-(４-メチル-ピペラジン- １-イル)-エトキシ]-キナゾリン-４-イル}-アミン；(３-エチニルフェニル)-[７-(２-メトキシ-エトキシ)-６-(２-モルホリン-４-イル)-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジブトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジイソプロポキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニル-２-メチル- フェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-アミン；[６,７-ビス-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニルフェニルアミノ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノール; (６,７-ジプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-５-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(５-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-メチル-フェニル)-アミン；(６-アミノメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-エトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-エトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-イソプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-プロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３- エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-イソプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３- エチニルフェニル)-アミン；及び、(６-アミノカルボニルエチル-７-プロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-アミン；[６,７-ビス-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニルアミノ-キナゾリン-１-イル)-アミン；及び、(６-アミノ-キナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミンからなる群から選択される式Ｉに記載の化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
式ＩのＥＧＦＲアンタゴニストが、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＥＧＦＲアンタゴニストであるＮ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンがＨＣｌ塩の形態である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＥＧＦＲアンタゴニストであるＮ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンが、およそ６．２６、１２．４８、１３．３９、１６．９６、２０．２０、２１．１０、２２．９８、２４．４６、２５．１４および２６．９１に２-θ度で表される特徴的なピークを有するＸ線粉体回折パターンを表す実質的に均質な結晶多形体形態である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗体が一価抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗体が一価性で、Ｆｃ領域を含み、このとき該Ｆｃ領域は第一および第二のポリペプチドを含み、該第一ポリペプチドは図７(配列番号：１７)に示されるＦｃ配列を含み、該第二ポリペプチドは図８(配列番号：１８)に示される配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
抗体が、(ａ) 配列：QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS(配列番号：１９)、図７(配列番号：１６)に示されるＣＨ１配列、及び図７(配列番号：１７)に示されるＦｃ配列を有する重鎖可変ドメインを含む第一ポリペプチドと、(ｂ) 配列：DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK(配列番号：２０)、及び図７(配列番号：８)に示されるＣＬ１配列を有する軽鎖可変ドメインを含む第二ポリペプチドと、(ｃ) 図８(配列番号：１８)に示されるＦｃ配列を含む第三ポリペプチドとを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
癌が、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、腎臓細胞癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイドカルチノーマ、頭頸部癌、胃癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
癌が非小細胞肺癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
癌がＥＧＦＲアンタゴニスト耐性癌でない、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
被検体に化学療法剤を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＥＧＦＲアンタゴニストが、４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)キナゾリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＥＧＦＲアンタゴニストが、Ｎ-[３-クロロ-４-[(３-フルオロフェニル)メトキシ]フェニル]-６-[５-[[[２-(メチルスルホニル)エチル]アミノ]メチル]-２-フラニル]-４-キナゾリンアミンである、請求項１に記載の方法。 
【請求項１７】
ＥＧＦＲアンタゴニストが、４-(４-ブロモ-２-フルオロアニリノ)-６-メトキシ-７-(Ｉ-メチルピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリンである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照について）
この出願は、米国特許法１１９(ｅ)に基づき、２００８年３月６日に出願の米国仮出願第６１／０３４４４６号及び２００８年４月１１日に出願の同第６１／０４４４３８号の優先権を主張し、出典明記によりここにその内容全体を援用するものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般に、分子生物学及び増殖因子調節の分野に関する。具体的には、本発明は、癌などの病態の治療を目的とした併用療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＧＦは、多くの異なる種類の細胞に対して分裂促進活性、細胞運動促進活性及び形態形成活性を有する肝葉由来の多能性因子である。ＨＧＦ作用は特定のチロシンキナーゼであるｃ-ｍｅｔに媒介されており、異常なＨＧＦ及びｃ-ｍｅｔの発現は様々な腫瘍において観察されることが多い。例としてMaulik ら, Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59、 Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7): 863-867を参照。ＨＧＦ／ｃ-Ｍｅｔシグナル伝達経路の調節機能は腫瘍発達及び転移に関係する。例としてTrusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300を参照。
【０００４】
ＨＧＦは、ｃ−ｍｅｔレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の細胞外ドメインを結合して、多様な生物学的プロセス、例えば細胞分散、増殖及び生存を制御する。ＨＧＦ-Ｍｅｔシグナル伝達は、正常な胚発生、特に筋肉始原細胞の移動と肝臓及び神経系の発達に必須である(Bladt 等, Nature (1995), 376, 768-771；Hamanoue 等, Faseb J (2000), 14, 399-406；Maina 等, Cell (1996), 87, 531-542；Schmidt 等, Nature (1995), 373, 699-702；Uehara 等, Nature (1995), 373, 702-705)。ＭｅｔノックアウトマウスとＨＧＦノックアウトマウスの発生上の表現型は非常に類似しており、ＨＧＦがＭｅｔレセプターの同種リガンドであることが示唆される(Schmidt 等, 1995, 上掲；Uehara 等, 1995, 上掲)。また、ＨＧＦ-Ｍｅｔは、肝再生、血管新生及び創傷治癒の役割も担っている(Bussolino 等, J Cell Biol (1992), 119, 629-641；Matsumoto及びNakamura, Exs (1993), 65, 225-249；Nusrat 等, J Clin Invest (1994) 93, 2056-2065)。Ｍｅｔレセプター前駆体は、タンパク質分解的切断により、ジスルフィド結合により結合する細胞外αサブユニットと膜架橋βサブユニットとなる(Tempest 等, Br J Cancer (1988), 58, 3-7)。βサブユニットは細胞質キナーゼドメインを含有しており、アダプタータンパク質が結合してシグナル伝達を開始する多基質ドッキング部位をＣ末端に有している(Bardelli 等, Oncogene (1997), 15, 3103-3111；Nguyen 等, J Biol Chem (1997), 272, 20811-20819；Pelicci 等, Oncogene (1995), 10, 1631-1638；Ponzetto 等, Cell (1994), 77, 261-271；Weidner 等, Nature (1996), 384, 173-176)。ＨＧＦが結合すると、Ｇａｂ１及びＧａｂ２/ＳｏｓがＰＩ３キナーゼ及びＲａｓ/ＭＡＰＫそれぞれの活性化を媒介することによって、Ｍｅｔが活性化され、チロシンリン酸化及び下流へのシグナル伝達が起こり、細胞運動及び細胞増殖が促進される(Furge 等, Oncogene (2000), 19, 5582-5589；Hartmann 等, J Biol Chem (1994), 269, 21936-21939；Ponzetto 等, J Biol Chem (1996), 271, 14119-14123；Royal 及び Park, J Biol Chem (1995), 270, 27780-27787)。
【０００５】
Ｍｅｔは、発癌物質処理した骨肉腫細胞株においてトランスフォーミングすることが示された(Cooper 等, Nature (1984), 311, 29-33；Park 等, Cell (1986), 45, 895-904)。Ｍｅｔの過剰発現又は遺伝子増幅は、様々なヒト癌において観察されている。例えば、Ｍｅｔタンパク質は、結腸直腸癌において少なくとも５倍過剰発現しており、肝転移巣における遺伝子増幅も報告されている(Di Renzo 等, Clin Cancer Res (1995), 1, 147-154；Liu 等, Oncogene (1992), 7, 181-185)。また、Ｍｅｔタンパク質は、経口扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、腎臓細胞上皮癌、胸部上皮癌及び肺上皮癌において過剰発現することが報告されている(Jin 等, Cancer (1997), 79, 749-760；Morello 等, J Cell Physiol (2001), 189, 285-290；Natali 等, Int J Cancer (1996), 69, 212-217；Olivero 等, Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868；Suzuki 等, Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868)。加えて、ｍＲＮＡの過剰発現は、肝細胞癌、胃上皮癌及び結腸直腸上皮癌において観察されている(Boix 等, Hepatology (1994), 19, 88-91；Kuniyasu 等, Int J Cancer (1993), 55, 72-75；Liu 等, Oncogene (1992), 7, 181-185)。
【０００６】
Ｍｅｔのキナーゼドメインの多くの突然変異は、腎臓乳頭上皮癌において観察され、恒常的なレセプター活性化を引き起こしている(Olivero 等, Int J Cancer (1999), 82, 640-643；Schmidt 等, Nat Genet (1997), 16, 68-73；Schmidt 等, Oncogene (1999), 18, 2343-2350)。これらの活性化突然変異により恒常的なＭｅｔチロシンリン酸化が起こり、その結果ＭＡＰＫ活性化、フォーカス形成及び腫瘍形成が生じる(Jeffers 等, Proc Natl Acad Sci U S A (1997), 94, 11445-11450)。加えて、これらの突然変異は細胞運動及び浸潤を亢進する(Giordano 等, Faseb J (2000), 14, 399-406；Lorenzato 等, Cancer Res (2002), 62, 7025-7030)。形質転換細胞のＨＧＦ依存性Ｍｅｔ活性化は、転移、拡散及び移動性の増加を媒介し、最終的に浸潤性腫瘍増殖及び転移を引き起こす(Jeffers 等, Mol Cell Biol (1996), 16, 1115-1125；Meiners 等, Oncogene (1998), 16, 9-20)。
【０００７】
Ｍｅｔは、レセプター活性化、形質転換及び浸潤を作動する他のタンパク質と相互作用することが示されている。新生細胞において、Ｍｅｔは、ラミニンなどの細胞外基質(ＥＣＭ)構成成分のレセプターであるα６β４インテグリンと相互作用して、ＨＧＦ依存性浸潤性増殖を促進することが報告されている(Trusolino 等, Cell (2001), 107, 643-654)。加えて、Ｍｅｔの細胞外ドメインは、セマフォリンファミリーのメンバーであるプレキシンＢ１と相互作用して、浸潤性増殖を増やすことが示されている(Giordano 等, Nat Cell Biol (2002), 4, 720-724)。さらに、腫瘍形成及び転移に関係しているＣＤ４４ｖ６は、Ｍｅｔ及びＨＧＦと複合体を形成して、Ｍｅｔレセプター活性化を引き起こすことも報告された(Orian-Rousseau 等, Genes Dev (2002), 16, 3074-3086)。
【０００８】
Ｍｅｔは、Ｒｏｎ及びＳｅａを含むレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)のサブファミリーのメンバーである(Maulik 等, Cytokine Growth Factor Rev (2002), 13, 41-59)。Ｍｅｔの細胞外ドメイン構造の予測から、セマフォリン及びプレキシンとの相同性の共有が示唆される。ＭｅｔのＮ末端は、すべてのセマフォリン及びプレキシンにおいて保存されるおよそ５００のアミノ酸のセマドメインを含有する。セマフォリン及びプレキシンは、神経発達における役割について最初に記載された、分泌型及び膜結合型のタンパク質の大きなファミリーに属する(Van Vactor and Lorenz, Curr Bio (1999),l 9, R201-204)。しかしながら、最近では、セマフォリン過剰発現は腫瘍浸潤及び転移と相関している。プレキシン、セマフォリン及びインテグリンにおいてみられるシステインリッチＰＳＩドメイン(Ｍｅｔ関連配列ドメインとも称される)は、プレキシン及び転写因子にみられるイムノグロブリン様領域である４つのＩＰＴリピートが続くセマドメインに近接して存在する。最近の研究では、Ｍｅｔセマドメインが十分にＨＧＦ及びヘパリンに結合することが示唆される(Gherardi 等, Proc Natl Acad Sci U S A (2003), 100(21):12039-44)。
【０００９】
上記のように、Ｍｅｔレセプターチロシンキナーゼはその同種リガンドであるＨＧＦによって活性化され、レセプターリン酸化はＭＡＰＫ、ＰＩ-３キナーゼ及びＰＬＣ-γの下流の経路を活性化する（L. Trusolino及びP. M. Comoglio, Nat Rev Cancer 2, 289 (2002); C. Birchmeiertら、Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003)）。下流のシグナル伝達経路の活性化を媒介するために、キナーゼドメイン内のＹ１２３４／Ｙ１２３５のリン酸化はＭｅｔキナーゼ活性化に重要であるのに対して、多基質ドッキング部位のＹ１３４９及びＹ１３５６はｓｒｃホモロジー-２(ＳＨ２)、ホスホチロシン結合(ＰＴＢ)及びＭｅｔ結合ドメイン(ＭＢＤ)タンパク質の結合に重要である（C. Ponzettoら、Cell 77, 261 (1994);  K. M. Weidnerら、Nature 384, 173 (1996)；G. Pelicciら、Oncogene 10, 1631 (1995)）。更なる膜近傍リン酸化部位であるＹ１００３は、Ｃｂｌ Ｅ３-リガーゼのチロシンキナーゼ結合(ＴＫＢ)ドメインに対するその結合にとても特徴があるとされている(P. Peschardら、Mol Cell 8, 995 (2001)；P. Peschard, N. Ishiyama, T. Lin, S. Lipkowitz, M. Park, J Biol Chem 279, 29565 (2004))。Ｃｂｌ結合は、エンドフィリン媒介性レセプターエンドサイトーシスであるユビキチン化と、その後のレセプター分解を起こすことが報告されている(A. Petrelliら、Nature 416, 187 (2002))。このレセプター下方制御のメカニズムは、類似のＣｂｌ結合部位も有するＥＧＦＲファミリーにおいて既に開示されている(K. Shtiegman, Y. Yarden, Semin Cancer Biol 13, 29 (2003)；M. D. Marmor, Y. Yarden, Oncogene 23, 2057 (2004)；P. Peschard, M. Park, Cancer Cell 3, 519 (2003))。Ｍｅｔ及びＨＧＦの調節不全は様々な腫瘍において報告されている。リガンド作動性Ｍｅｔ活性化はいくつかの癌において観察されている。血清及び腫瘍内ＨＧＦの上昇は、肺癌、乳癌及び多発性骨髄腫において観察される(J. M. Siegfriedら, Ann Thorac Surg 66, 1915 (1998)；P. C. Maら, Anticancer Res 23, 49 (2003)；B. E. Elliottら Can J Physiol Pharmacol 80, 91 (2002)；C. Seidel, et al, Med Oncol 15, 145 (1998))。Ｍｅｔ及び／又はＨＧＦの過剰発現、Ｍｅｔ遺伝子増幅又は突然変異は、結腸直腸癌、肺癌、胃癌及び腎臓癌などの様々な癌において報告されており、リガンド非依存性レセプター活性化を起こすと考えられる(C. Birchmeierら、Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003)；G. Maulikら、Cytokine Growth Factor Rev 13, 41 (2002))。加えて、肝臓マウスモデルにおけるＭｅｔの誘導性過剰発現が肝細胞癌を生じさせることから、レセプター過剰発現がリガンド非依存性の腫瘍形成を起こすことが示される(R. Wangら、J Cell Biol 153, 1023 (2001))。癌におけるＭｅｔの関連を最も強く表す所見は家族性の散発性腎臓乳頭上皮癌(ＲＰＣ)患者において報告される。レセプターの恒常的活性化を引き起こすＭｅｔのキナーゼドメインの突然変異は、ＲＰＣの生殖細胞系及び体細胞の突然変異として同定された(L. Schmidtら、Nat Genet 16, 68 (1997))。トランスジェニックマウスモデルにおけるこれらの突然変異の導入により腫瘍形成及び転移が引き起こされる。(M. Jeffersら、Proc Natl Acad Sci U S A 94, 11445 (1997))。 
【００１０】
ｃ−ｍｅｔ及びｃ−ｍｅｔのアンタゴニストに関する刊行物には、Martens, T,ら(2006) Clin Cancer Res 12(20 Pt 1) 6144；米国特許第６４６８５２９号；国際公開第２００６／０１５３７１号；国際公開第２００７／０６３８１６号；国際公開第２００６／１０４９１２号；国際公開第２００６／１０４９１１号；国際公開第２００６／１１３７６７号；米国特許出願公開第２００６−０２７０５９４号；ＵＳ２００６−米国特許第７４８１９９３号；国際公開第２００９／００７４２７号；国際公開第２００５／０１６３８２号；国際公開第２００９／００２５２１号；国際公開第２００７／１４３０９８号；国際公開第２００７／１１５０４９号；国際公開第２００７／１２６７９９が含まれる。
【００１１】
上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)ファミリは、分化及び増殖のような細胞性応答に関与する４つの非常に関連したレセプター(ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４)を含む。ＥＧＦＲキナーゼ又はそのリガンドＴＧＦ-αの過剰発現は、胸部、肺、結腸直腸、卵巣、腎臓細胞、膀胱、頭頸部癌、神経膠芽腫および星状細胞腫を含む多くの癌としばしば関係していて、これらの腫瘍の悪性増殖に関与すると考えられている。また、ＥＧＦＲ遺伝子(ＥＧＦＲｖＩＩＩ)の特定の欠失突然変異は、細胞性腫瘍原性を増やすことが明らかにされている。ＥＧＦＲ刺激を受けたシグナル伝達経路の活性化は、癌を促進しうる複数の工程、例えば増殖、脈管形成、細胞運動および浸潤、アポトーシスの減少、及び薬剤耐性の誘導を促す。ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ発現の増加はしばしば疾患の進行、転移および予後不良と関連がある。例えば、ＮＳＣＬＣおよび胃癌では、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ発現の増加が、速い転移速度、腫瘍分化不良および腫瘍増殖の増加と相関することが示されている。
【００１２】
レセプターの内因性タンパク質チロシンキナーゼ活性を活性化し、および／または下流のシグナル伝達を増やす突然変異は、ＮＳＣＬＣおよび神経膠芽腫に観察された。しかしながら、ＥＧＦレセプター阻害薬、例えばエルロチニブ(ＴＡＲＣＥＶＡ(登録商標))又はゲフィチニブに対する感度を与える際の原理メカニズムとしての突然変異の役割は、論争の的であった。完全長ＥＧＦレセプターの変異形は、ＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ阻害薬ゲフィチニブに反応を示すことが予測されることが報告された(Paez, J. G. et al. (2004) Science 304:1497-1500；Lynch, T. J. et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350: 2129-2139)。細胞培養試験から、ＥＧＦレセプターの前記のような変異形を発現する細胞株(すなわちＨ３２５５)がＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ阻害薬ゲフィチニブによる増殖阻害に対してより影響を受け、野生型ＥＧＦレセプターを発現している腫瘍細胞株を阻害するためには非常に高い濃度のゲフィチニブが必要であったことが示された。これらの観察から、ＥＧＦレセプターの特定の変異形はＥＧＦレセプター阻害薬に対するより大きな感度を反映しうるが、完全に反応しない表現型を識別するものではないことが示唆される。
【００１３】
ＥＧＦＲのキナーゼ活性を直接阻害する化合物、並びにＥＧＦＲ活性化のブロックによってＥＧＦＲキナーゼ活性を低減する抗体の抗腫瘍薬としての使用のための開発は、研究努力がなされている領域である(de Bono J.S. and Rowinsky, E.K. (2002) Trends in Mol. Medicine 8: S19-S26；Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313)。いくつかの研究は、いくつかのＥＧＦＲキナーゼ阻害薬が特定の他の抗癌又は化学療法剤又は治療と併用して使われると、腫瘍細胞又は腫瘍形成殺傷を向上しうることを示した、開示した又は示唆した(例としてHerbst, R.S. et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1:719-732；Solomon, B. et al (2003) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55:713-723；Krishnan, S. et al. (2003) Frontiers in Bioscience 8, e1-13；Grunwald, V. and Hidalgo, M. (2003) J. Nat. Cancer Inst. 95:851-867；Seymour L. (2003) Current Opin. Investig. Drugs 4(6): 658-666；Khalil, M.Y. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther.3: 367-380；Bulgaru, A.M. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther.3: 269-279；Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313；Ciardiello, F. et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6: 2053-2063；及び米国特許公開番号２００３／０１５７１０４)。
【００１４】
エルロチニブ(例としてエルロチニブＨＣｌ、別名ＴＡＲＣＥＶＡ(登録商標)又はＯＳＩ−７７４)は、ＥＧＦＲキナーゼの経口阻害薬である。インビトロで、エルロチニブは、結腸直腸および乳癌(Moyer J.D. et al. (1997) Cancer Res. 57: 4838)を含む多くのヒト腫瘍細胞株におけるＥＧＦＲキナーゼに対して実質的に阻害活性を示し、臨床前評価は多くのＥＧＦＲを発現するヒト腫瘍異種移植片に対する活性を示した(Pollack, V.A. et al (1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:739)。エルロチニブは、頭頸部癌(Soulieres, D., et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:77)、ＮＳＣＬＣ(Perez-Soler R, et al. (2001) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20:310a, abstract 1235)、ＣＲＣ (Oza, M., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:196a, abstract 785)およびＭＢＣ(Winer, E., et al. (2002) Breast Cancer Res. Treat. 76:5115a, abstract 445；Jones, R.J., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:45a, abstract 180)を含む多くの指標の臨床試験において活性を示した。第ＩＩＩ相試験において、エルロチニブ単一療法は、進行性治療抵抗性ＮＳＣＬＣ患者の肺癌関連症状において、悪化を遅延し、疾患進行を遅延し、そして有意に生存を延長した(Shepherd, F. et al. (2004) J. Clin. Oncology, 22:14S (July 15 Supplement), Abstract 7022)。２００４年１１月に、アメリカ食品医薬品局(ＦＤＡ)は、少なくとも一つの従来の化学療法投薬計画の失敗後の、局所的に進行したか又は転移性の非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)患者の治療のためのＴＡＲＣＥＶＡ(登録商標)を承認した。
癌の治療が大きく進歩したとはいえ、治療法の向上が依然として求められている。
【００１５】
特許出願及び刊行物を含む、本明細書中で引用したすべての文献は、出典明記によってそれらの全体を援用する。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、癌などの病態を治療するための併用療法であって、ｃ−ＭｅｔアンタゴニストをＥＧＦＲアンタゴニストと組み合わせることにより有意な抗腫瘍活性を生む療法を提供するものである。
【００１７】
一態様において、本発明は、対象の癌を治療する方法であって、対象に治療的に有効な量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストとＥＧＦＲアンタゴニストとを投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストの例には、限定しないが、可溶性ｃ−ｍｅｔレセプター、可溶性ＨＧＲ変異体、ｃ−ｍｅｔ又はＨＧＦに特異的なアプタマー又はペプチボディ（peptibodies）、ｃ−ｍｅｔ小分子、抗ｃ−ｍｅｔ抗体、及び抗ＨＧＦ抗体が含まれる。幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは抗ｃ−ｍｅｔ抗体である。
【００１９】
一実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、図７（配列番号１３−１５）に示すＣＤＲ１−ＨＣ、ＣＤＲ２−ＨＣ及びＣＤＲ３−ＨＣ配列のうちの一又は複数を含む重鎖可変ドメインを含む。幾つかの実施態様では、抗体は図７（配列番号５−７）に示すＣＤＲ１−ＬＣ、ＣＤＲ２−ＬＣ、及びＣＤＲ３−ＬＣのうちの一又は複数を含む軽鎖可変ドメインを含む。幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインは、図７（配列番号９−１２）に示すＦＲ１−ＨＣ、ＦＲ２−ＨＣ、ＦＲ３−ＨＣ、及びＦＲ４−ＨＣ配列を含む。幾つかの実施態様では、軽鎖可変ドメインは、図７（配列番号１−４）に示すＦＲ１−ＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、ＦＲ３−ＬＣ、及びＦＲ４−ＬＣ配列を含む。幾つかの実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、一価であってＦｃ領域を含む。幾つかの実施態様では、この抗体は、図７（配列番号１７）に示すＦｃ配列を含む。
【００２０】
幾つかの実施態様では、本抗体は、一価であってＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域は第１及び第２ポリペプチドを含んでおり、第１ポリペプチドは図７（配列番号１７）に示すＦｃ配列を含んでおり、且つ第２ポリペプチドは図８（配列番号１８）に示すＦｃ配列を含んでいる。
【００２１】
一実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、（ａ）配列：QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS（配列番号１９）と、図７（配列番号１６）に示すＣＨ１配列と、図７（配列番号１７）に示すＦｃ配列とを有する重鎖可変ドメインを含む第１ポリペプチド、（ｂ）配列：DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK（配列番号２０）と、図７（配列番号８）に示すＣＬ１配列とを有する軽鎖可変ドメインを含む第２ポリペプチド、及び（ｃ）図８（配列番号１８）に示すＦｃ配列を含む第３ポリペプチドを含む。
【００２２】
一態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、抗体断片内のＦｃ配列のヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を最小化する少なくとも一つの特徴を含んでいる。このような特徴は、免疫グロブリンの集合の、産生量及び／又は純度及び／又は均一性を向上させる。一実施態様では、抗体は、国際公開公報２００５／０６３８１６に記載されているような「ノブ(knob)」及び「ホール(hole)」を構成するＦｃ変異を含む。例えば、ホール変異には、ＦｃポリペプチドのＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ、及び／又はＹ４０７Ｖがあり、キャビティ(cavity)変異にはＴ３３６Ｗがある。
【００２３】
幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ＳＧＸ−５２３、ＰＦ−０２３４１０６６、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＢＭＳ−６９８７６９、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ５４１６、ＳＵ１２７４、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＡＭＧ１０２、抗体２２３Ｃ４又はヒト化抗体２２３Ｃ４（国際公開公報２００９／００７４２７）、Ｌ２Ｇ７、ＮＫ４、ＸＬ−１８４、ＭＰ−４７０、又はＣｏｍｐ−１である。
【００２４】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストを使用して、ＨＧＦ／ｃ−ｍｅｔに関連する作用の一又は複数の側面を低減又は阻害することができる。ＨＧＦ／ｃ−ｍｅｔに関連する作用には、限定しないが、ｃ−ｍｅｔの活性化、下流分子シグナル伝達（例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）リン酸化、ＡＫＴリン酸化、ｃ−ｍｅｔリン酸化、ＰＩ３キナーゼ媒介性シグナル伝達）、細胞増殖、細胞遊走、細胞生存、細胞形態形成、及び血管新生が含まれる。これらの作用は、ｃ−ｍｅｔに結合するリガンド（例えばＨＧＦ）の破壊、ｃ−ｍｅｔリン酸化、及び／又はｃ−ｍｅｔ多量体化を含む、生物学的に関連する任意の機序により調節することができる。
【００２５】
ＥＧＦＲアンタゴニストの例には、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子が含まれる。また、ＥＧＦＲアンタゴニストには、米国特許第５６１６５８２号、米国特許第５４５７１０５号、米国特許第５４７５００１号、米国特許第５６５４３０７号、米国特許第５６７９６８３号、米国特許第６０８４０９５号、米国特許第６２６５４１０号、米国特許第６４５５５３４号、米国特許第６５２１６２０号、米国特許第６５９６７２６号、米国特許第６７１３４８４号、米国特許第５７７０５９９号、米国特許第６１４０３３２号、米国特許第５８６６５７２号、米国特許第６３９９６０２号、米国特許第６３４４４５９号、米国特許第６６０２８６３号、米国特許第６３９１８７４号、国際公開９８１４４５１、国際公開９８５００３８、国際公開９９０９０１６、国際公開９９２４０３７、国際公開９９３５１４６、国際公開０１３２６５１、米国特許第６３４４４５５号、米国特許第５７６００４１号、米国特許第６００２００８号、米国特許第５７４７４９８号に記載される化合物のような小分子が含まれる。特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストには、ＯＳＩ−７７４(ＣＰ-３５８７７４、エルロチニブ、OSI Pharmaceuticals)；ＰＤ１８３８０５(ＣＩ１０３３、２-プロペンアミド、Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-７-[３-(４-モルホリニル)プロポキシ]-６-キナゾリニル]−、二塩化水素化物、Pfizer Inc.)；Ｉｒｅｓｓａ(登録商標)(ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ、AstraZeneca)；ＺＭ１０５１８０((６-アミノ-４-(３-メチル-フリル]アミノ)-キナゾリン、Zeneca)；ＢＩＢＸ-１３８２(Ｎ８-(３-クロロ-４-フルオロ-フェニル)-Ｎ２-(１-メチル-ピペリジン-４-イル)-ピリミド[５,４-ｄ]ピリミジン-２,８-ジアミン、Boehringer Ingelheim)；ＰＫＩ-１６６((Ｒ)４-[４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-１Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-イル]-フェノール)；(Ｒ)-６-(４-ヒドロキシフェニル)-４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン)；ＣＬ-３８７７８５(Ｎ-[４-[(３-ブロモフェニル)アミノ]-６-キナゾリニル]-２-ブチンアミド)；ＥＫＢ-５６９(Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-３-シアノ-７-エトキシ-６-キノリニル]-４-(ジメチルアミノ)-２-ブテンアミド)；ラパチニブ(Tykerb, GlaxoSmithKline)；ＺＤ６４７４(Zactima, AstraZeneca)；ＣＵＤＣ-１０１(Curis)；カネルチニブ(ＣＩ-１０３３)；ＡＥＥ７８８(６-[４-[(４-エチル-１-ピペラジニル)メチル]フェニル]-Ｎ-[(１Ｒ)-１-フェニルエチル]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-４-アミン、国際公開２００３０１３５４１、Novartis)、及び、ＰＫＩ１６６ ４-[４-[[(１Ｒ)-１-フェニルエチル]アミノ]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-イル]-フェノール、国際公開９７０２２６６ Novartis)が含まれる。
【００２６】
具体的な実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、出典明記によって本明細書中に援用される米国特許第５７５７４９８号に従って以下の一般式Ｉを有し、
2011513427.tif 000003
このとき
ｍは、１、２又は３であり； 
各Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアミノ、カルボキシ、ニトロ、グアニジノ、ウレイド、シアノ、トリフロロメチル、及びＷが単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＨである−(Ｃ１−Ｃ４アルキレン)-Ｗ-(フェニル)からなる群からそれぞれ選択され；又は、 
各Ｒ１は、Ｒ９及びシアノに置換したＣ１−Ｃ４アルキルからそれぞれ選択され、このＲ９は、Ｒ５、-ＯＲ６、-ＮＲ６Ｒ６、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、-ＮＨＯＲ５、-ＯＣ(Ｏ)Ｒ６、シアノ、Ａ及び-ＹＲ５からなる群から選択され；Ｒ５はＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒ６はそれぞれ水素又はＲ５であり；Ｒ７はＲ５、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６であり；Ａはピペリジノ、モルホリノ、ピロリジノ、４−Ｒ６−ピペラジン−１−イル、イミダゾール-１-イル、４-ピリドン−１−イル、−(Ｃ１−Ｃ４アルキレン)(ＣＯ２Ｈ)、フェノキシ、フェニル、フェニルスルファニル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、及び-(Ｃ１−Ｃ４アルキレン)Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ６から選択され；そして、ＹはＳ、ＳＯ又はＳＯ２であり；このとき、Ｒ５、-ＯＲ６及び、-ＮＲ６Ｒ６のアルキル部分は場合によって１〜３のハロ置換基に置換され、Ｒ５、-ＯＲ６、及び-ＮＲ６Ｒ６のアルキル部分は場合によって１又は２のＲ９基によって置換され、そして該任意の置換基のアルキル部分は場合によってハロ又はＲ９によって置換されていてよく、ただし２つの異種原子が同じ炭素原子に結合していない； 
各Ｒ１はそれぞれ、-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４)-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノから選択され、Ｒ１０は、ハロ、-ＯＲ６、Ｃ２-Ｃ４アルカノイルオキシ、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、及び-ＮＲ６Ｒ６から選択され；前記-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノのＲ１基は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルキル、シアノ、メタンスルホニル及びＣ１-Ｃ４アルコキシからそれぞれ選択される１又は２の置換基で置換されていてもよく；又は 
２のＲ１基は、それらが結合している炭素と共同して、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１又は２のヘテロ原子を含む、５-８員環を形成し； 
Ｒ２は、水素、又はハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒ５からそれぞれ選択される１から３の置換基で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルであり； 
ｎは１又は２であり、各Ｒ３はそれぞれ、水素、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、-ＮＲ６Ｒ６、及びＣ１-Ｃ４アルコキシから選択され、該Ｒ３基中のアルキル部分は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒからそれぞれ選択される１から３の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ４はアジド又は-(エチニル)-Ｒ１１であり、このＲ１１は、水素、又はヒドロキシ、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルである。
【００２７】
具体的な実施態様では、以下からなる群から選択される式Ｉに記載の化合物である。
(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-[３-(３'-ヒドロキシプロピン-１-イル)フェニル]-アミン；[３-(２'-(アミノメチル)-エチニル)フェニル]-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-ニトロキナゾリン-４-イル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(４-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-２-メチルフェニル)-アミン；(６-アミノキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニルアミノキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６,７-メチレンジオキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-６-メチルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(７-ニトロキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(４'-トルエンスルホニルアミノ)キナゾリン-４-イル]-アミン；(３-エチニルフェニル)-{６-[２'-フタルイミド-ｅｔｈ-１'-ｙｌ- スルホニルアミノ]キナゾリン-４-イル}-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-グアニジノキナゾリン-４-イル)-アミン；(７-アミノキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(７-メトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(６-カルボメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(７-カルボメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；[６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)キナゾリン-４-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-アジドフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-アジド-５-クロロフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(４-アジドフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニル-キナゾリン-４-イル)-アミン；(６-エタンスルファニル-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシ-キナゾリン-４-イル)-[３-(プロピン-１'-イル)-フェニル]-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(５-エチニル-２-メチル- フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-４-フルオロ- フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-クロロ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；[６-(２-クロロ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３- エチニル-フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-アセトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-７-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-６-イルオキシ]-エタノール；[６-(２-アセトキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３- エチニル-フェニル)-アミン；[７-(２-クロロ-エトキシ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３- エチニル-フェニル)-アミン；[７-(２-アセトキシ-エトキシ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３- エチニル-フェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノール；２-[４-(３-エチ���ル-フェニルアミノ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-６-イルオキシ]-エタノール；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノール；[６-(２-アセトキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３- エチニル-フェニル)-アミン；(３-エチニル-フェニル)-{６-(２-メトキシ-エトキシ)-７-[２-(４-メチル-ピペラジン- １-イル)-エトキシ]-キナゾリン-４-イル}-アミン；(３-エチニル-フェニル)-[７-(２-メトキシ-エトキシ)-６-(２-モルホリン-４-イル)-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジブトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジイソプロポキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニル-２-メチル- フェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)- キナゾリン-１-イル]-アミン；[６,７-ビス-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノール; (６,７-ジプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-５-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(５-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-メチル-フェニル)-アミン；(６-アミノメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-フェニル)-アミン；(６-アミノメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３- エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３- エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-エトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３- エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-エトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３- エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-イソプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３- エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-プロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３- エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３- エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-イソプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３- エチニルフェニル)-アミン；及び、(６-アミノカルボニルエチル-７-プロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３- エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)- キナゾリン-１-イル]-アミン；[６,７-ビス-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニルアミノ-キナゾリン-１-イル)-アミン；及び、(６-アミノ-キナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン。
【００２８】
特定の実施態様では、式ＩのＥＧＦＲアンタゴニストは、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンである。特定の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストであるＮ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンは、ＨＣｌ塩形態である。他の具体的な実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストであるＮ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンは、およそ６．２６、１２．４８、１３．３９、１６．９６、２０．２０、２１．１０、２２．９８、２４．４６、２５．１４および２６．９１で２-θ度で表される特徴的なピークを有するＸ線粉体回折パターンを表す実質的に均質な結晶多形体形態である(国際公開０１／３４５７４では多形Ｂと記載される)。Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンの前記多形型は、ＴａｒｃｅｖａＴＭ並びにＯＳＩ-７７４、ＣＰ-３５８７７４およびエルロチニブと称される。
【００２９】
また、ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲ活性化、下流の分子シグナル伝達、細胞増殖を含むがこれらに限らない、ＥＧＦＲ-ＥＧＦＲリガンド関連の効果の一又は複数の態様を低減又は阻害するために用いられうる。これらの効果は、ＥＧＦＲへのリガンド結合の破壊およびＥＧＦＲリン酸化の破壊を含む任意の生物学上関連するメカニズムによって調整されうる。
【００３０】
本発明の方法を使用して、何らかの適切な病的状態に働きかけることができる。例えば、本発明の方法を使用して、固形腫瘍及び軟組織腫瘍の両方を差別なく、種々の癌を治療することができる。本発明の治療を適用可能な癌の非限定的な例には、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド細胞腫、頭部及び頚部の癌、神経膠芽腫、メラノーマ、卵巣癌、胃癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫が含まれる。特定の態様では、癌は転移性である。他の態様では、癌は非転移性である。
一実施態様では、抗ｃ-ｍｅｔ抗体とエルロチニブが、非小細胞肺癌などの癌の併用治療に用いられる。
【００３１】
特定の実施態様では、癌はＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、エルロチニブ又はゲフィチニブ）耐性癌ではない。特定の実施態様では、癌はエルロチニブ又はゲフィチニブ耐性癌ではない。
特定の実施態様では、癌はチロシンキナーゼ阻害剤耐性癌ではない。特定の実施態様では、癌は小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤耐性癌ではない。
ある実施態様では、癌は、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの発現、増幅又は活性化を示す。ある実施態様では、癌は、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの発現、増幅又は活性化を示さない。ある実施態様では、癌はｃ-ｍｅｔ増幅を示す。ある実施態様では、癌はｃ-ｍｅｔ増幅およびＥＧＦＲ増幅を示す。
特定の実施態様では、癌は野生型ＥＧＦＲ遺伝子を示す。特定の実施態様では、癌は、野生型ＥＧＦＲ遺伝子とｃ−ｍｅｔ増殖及び／又はｃ−ｍｅｔ変異を示す。
【００３２】
特定の実施態様では、癌はＥＧＦＲ変異を示す。変異は、ＥＧＦＲ遺伝子のあらゆる部分、又はＥＧＦＲ遺伝子に関連する調節領域に位置しうる。例示的ＥＧＦＲ変異には、例えば、エクソン１８、１９、２０、又は２１における変異、キナーゼドメインにおける変異、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｓ７６８Ｉ、Ｌ８５８Ｐ、Ｅ７４６−Ｒ７４８ｄｅｌ、Ｒ７４８−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｍ７６６−Ａ７６７ＡＩ  ｉｎｓ、Ｓ７６８−Ｖ７６９  ＳＶＡ  ｉｎｓ、Ｐ７７２−７７３  ＮＳ  ｉｎｓ、２４０２ＯＣ、２４８２ＯＡ、２４８６Ｔ＞Ｃ、２４９１Ｇ＞Ｃ、２４９４ＯＣ、２５１  ０ＯＴ、２５３９ＯＡ、２５４９ＯＴ、２５６３ＯＴ、２８１９Ｔ＞Ｃ、２４８２−２４９０ｄｅｌ、２４８６−２５０３ｄｅｌ、２５４４−２５４５  ｉｎｓ  ＧＣＣＡＴＡ、２５５４−２５５５  ｉｎｓ  ＣＣＡＧＣＧＴＧＧ、又は２５６２−２５６３  ｉｎｓ  ＡＡＣＴＣＣが含まれる。ＥＧＦＲを活性化する変異体の他の例は従来技術に既知である（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７２０８３号参照）。特定の実施態様では、細胞又は細胞株は、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を含まない。
【００３３】
特定の実施態様では、癌はｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲ活性化を示す。特定の実施態様では、癌はｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲ活性化を示さない。
特定の実施態様では、癌は恒常的なｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの活性化を示す。幾つかの実施態様では、恒常的ＥＧＦＲは、チロシンキナーゼドメインに変異を含む。特定の実施態様では、癌は、恒常的なｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの活性化を示さない。
特定の実施態様では、癌は、リガンド依存性のｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの活性化を示す。特定の実施態様では、癌は、リガンド依存性のｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの活性化を示さない。
【００３４】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、同一の組成として、又は別個の組成として、ＥＧＦＲアンタゴニストと連続して又は組み合わせて投与することができる。ｃ−ｍｅｔアンタゴニストとＥＧＦＲアンタゴニストとは、同時に、例えば単一の組成として、又は二つ以上の別個の組成として、同じ又は異なる投与経路を使用して投与することができる。あるいは又はさらに、投与は順番に関係なく連続して行うことができる。あるいは又はさらに、順番に関係なく、連続的投与と同時投与の両方を組み合わせて、段階的投与を実行することができる。特定の実施態様では、二つ以上の組成を投与する間に、数分から数日、数週間から数か月に亘る間隔を空けることができる。例えば、ＥＧＦＲアンタゴニストを最初に投与し、続いてｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することができる。しかしながら、同時投与、又はｃ−ｍｅｔアンタゴニストを最初に投与することも考慮可能である。したがって、一態様では、本発明は、ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト（例えば抗ｃ−ｍｅｔ抗体）を投与し、次いでＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））を投与することを含むことができる。特定の実施態様では、二つ以上の組成を投与する間に、数分から数日、数週間から数ヶ月に亘る間隔を空けることができる。
【００３５】
一態様では、本発明は、癌の治療に使用される、有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストと製薬的に許容可能な担体とを含んでなる組成物を提供し、前記使用は、ＥＧＦＲアンタゴニストを連続して又は同時に投与することを含む。幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは抗ｃ−ｍｅｔ抗体である。幾つかの実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストはエルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））である。
【００３６】
一態様では、本発明は、癌の治療に使用される、有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストと製薬的に許容可能な担体とを含んでなる組成物を提供し、前記使用は、ＥＧＦＲアンタゴニストを連続して又は同時に投与することを含む。幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは抗ｃ−ｍｅｔ抗体である。幾つかの実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストはエルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））である。
【００３７】
治療対象である特定の癌の徴候に応じて、本発明の併用療法は、化学療法剤のような別の治療剤、或いは放射線療法又は外科的手術といった別の療法と組み合わせることができる。多くの既知の化学療法剤を、本発明の併用療法に使用することができる。好ましくは、特定の徴候の治療の標準であるこれら化学療法剤が使用されるであろう。併用に使用される各治療剤の用量又は投与頻度は、好ましくは、他の薬剤無しで使用されるときの対応する薬剤の用量又は投与頻度と同じか、又はそれより小さい。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ｑＲＴ-ＰＣＲによるＮＳＣＬＣ細胞株および原発性腫瘍におけるＥＧＦＲおよびＭＥＴのｍＲＮＡ同時発現の確認。ＥＧＦＲおよびＭＥＴのｍＲＮＡの発現は、ＮＳＣＬＣ細胞株(１Ａ)又は凍結原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍溶解物(１Ｂ)のパネルにおける定量的ＲＴ-ＰＣＲによって測定した。ＥＧＦＲおよびＭＥＴのｍＲＮＡレベルは、細胞株(ρ＝０．５９、ｐ＜０．０００１)および原発性ＮＳＣＬＣ試料(ρ＝０．４８、ｐ＝０．０００３)においてポジティブに相関した。
【図２】ｃ-ｍｅｔに対するテトラサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡを含むＥＢＣ１ ｓｈＭｅｔ４．１２細胞(ｓｈＭｅｔ４．１２)又はＧＦＰに対するコントロールｓｈＲＮＡを含むＥＢＣ１ ｓｈＭｅｔ４.１２細胞(ｓｈＧＦＰ２)を、コントロール培地(Ｃｏｎ)又は０．１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリンアナログドキシサイクリン(Ｄｏｘ)を含む培地中で４８時間生育させた。２時間の血清欠乏の後に、細胞を、ＴＧＦα(Ｔ、２０ｎＭ)又はヘレグリンｂ１(Ｈｒｇ、２ｎＭ)にて２０分間処置したものと処置しないものにした。示したように、全細胞溶解物は合計およびリン-タンパク質の発現について評価した。各レーンに同等に充填したことを示すためにベータアクチン（βアクチン）を検出した。
【図３】コントロール培地又は０．１ｕｇ／ｍｌのＤｏｘ（Ｄｏｘ）を有する培地中において、４８時間に亘り、ｃ−ｍｅｔに対する誘導性ｓｈＲＮＡ又はＧＦＰに対するコントロールｓｈＲＮＡを含むＮＳＣＬＣ  Ｈ４４１細胞を増殖させた。２時間に亘って血清を枯渇させた後、細胞を無処置にするか（−）、或いはＴＧＦα（Ｔ）又はヘレグリンｂ１（Ｈ）で２０分間処置した。各レーンに同等に充填したことを示すためにベータアクチン（βアクチン）（４つ目のパネル）を検出した。
【図４】ＥＢＣ−１  ＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおけるｃ−ＭｅｔのｓｈＲＮＡノックダウンとエルロチニブとの併用の有効性を示している。ヌード（ＣＲＬ  ｎｕ／ｎｕ）動物にＥＢＣ−１−ｓｈＭｅｔ−４．５腫瘍が生じており、これらを、メチルセルロースツイーン（ＭＣＴ）ベヒクル＋５％スクロース（Ｓｕｃ）を含む飲料水（矢印で示す位置のＰＯ、ＱＤ）、ＭＣＴ＋５％スクロースに調製した飲料水に１ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を加えたもの（１００ｍｇ／ｋｇ；矢印で示す位置のＰＯ、ＱＤ）、エルロチニブ＋５％スクロースに調製した飲料水に１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを加えたもの、エルロチニブ＋５％スクロースに調製した飲料水に１ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンを加えたもの（矢印で示す位置のＰＯ、ＱＤ）で処置した。矢印で示す日に経口投与を行った。２〜３日毎にボトルを取り替えて、スクロース又はＤｏｘを含む水を試験期間中に亘って維持した。腫瘍の体積及びＳＥＭは、実施例に記載のように算出された。
【図５】ＮＣＩ−Ｈ５９６  ｈｕ−ＨＧＦ−Ｔｇ−Ｃ３Ｈ−ＳＣＩＤ異種移植モデルにおけるＭｅｔＭＡｂとエルロチニブとの併用の有効性を示している。ｈｕ−ＨＧＦ−Ｔｇ−Ｃ３Ｈ−ＳＣＩＤ又はＣ３Ｈ−ＳＣＩＤ同腹仔のコントロール動物にＮＣＩ−Ｈ５９６腫瘍が生じており、これらを、Ｃａｐｔｉｓｏｌ溶媒（ＰＯ、ＱＤ、×２週）、エルロチニブ（黒丸、短破線；１５０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ、ＱＤ、×２週）、ＭｅｔＭＡｂ（３０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、一回）、又は同用量及びスケジュールにおけるＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブの併用で処置した。投薬は、グラフの下部に、ＭｅｔＭＡｂについては白矢印で、エルロチニブ又は溶媒については黒矢印で示した。約９週に亘り、又は試験群が群内の腫瘍が大きくなったことにより試験から除外されるまで、週に２〜３日回腫瘍測定値をキャリパーにより取得した。腫瘍の体積及びＳＥＭは、実施例に記載のように算出された。
【図６】腫瘍のサイズが２倍になるために要する時間として定められる、腫瘍倍加時間(ＴＴＤ)測定値を各グループについて算出し、これを用いてカプラン-マイアー生存曲線を作成した。ＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブの組合せは腫瘍進行の劇的な改善を示し、ＭｅｔＭＡｂ処置群１７．８(±２．２)日、エルロチニブ処置群９．５(±１．２)日、及びベヒクルコントロール群９．５(±１．２)日に対して、４９．５(±２．６)日の平均ＴＴＤであった。ベヒクルおよびエルロチニブ群の曲線は完全にオーバーラップしていた。
【図７】抗ｃ−ｍｅｔ抗体の一実施態様のフレームワーク領域（ＦＲ）、高頻度可変領域（ＨＶＲ）、第１の定常ドメイン（ＣＬ又はＣＨ１）及びＦｃ領域（Ｆｃ）のアミノ酸配列を示している。図示のＦｃ配列は、国際公開第２００５／０６３８１６号に記載の、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含んでいる。
【図８】国際公開第２００５／０６３８１６号に記載の、変異Ｔ３６６Ｗを含むＦｃポリペプチドの配列を示している。一実施態様では、この配列を含むＦｃポリペプチドは、図７のＦｃ配列を含むＦｃポリペプチドとの複合体を形成してＦｃ領域を生成する。
【図９Ａ】Ｃ−ｍｅｔ活性はＥＧＦＲリガンドの発現を制御する。図９Ａ) ＨＧＦ処置によってＨＧＦ反応性ＮＳＣＬＣ細胞株においてＥＧＦＲリガンドの上方制御が誘導された。Ｈｏｐ９２又はＮＣＩ-Ｈ５９６細胞を終夜血清欠乏状態に置き、その後無処置(ＨＧＦなし)かまたは６時間ＨＧＦ(５０ｎｇ／ｍｌ)にて処置した(ＨＧＦ)。-／＋ＨＧＦ処置の細胞からのＲＮＡを、実施例に記載のようにマイクロアレイ分析を行った。ＲＭＡ＝相対物マイクロアレイ。
【図９Ｂ】図９Ｂ) Ｃ-ｍｅｔノックダウンにより、リガンド非依存性のＮＳＣＬＣ細胞株ＥＢＣ-１においてＥＧＦＲリガンドの発現が低減された。ｃ-ｍｅｔに対するｓｈＲＮＡを安定して発現するクローン(クローン３-１５および４-１２)を無処置(Ｄｏｘなし)か又は２４ないし４８時間ドキシサイクリンにて処置した(Ｄｏｘ)。細胞からのＲＮＡを実施例に記載のようにマイクロアレイ分析を行った。
【図９Ｃ】図９Ｃ) ｃ-ｍｅｔに対するｓｈＲＮＡを安定して発現するＥＢＣ１ ｓｈＭｅｔ４-１２細胞を、無処置(Ｄｏｘなし)か又は、Ｄｏｘにて２４時間処置するもの(Ｄｏｘ)に分け、さらにＨＧＦなし(ＨＧＦなし)か又はさらにＨＧＦ(１００ｎｇ／ｍｌ)にて２時間処置した。細胞からのＲＮＡを実施例に記載のようにマイクロアレイ分析を行った。
【図９Ｄ】図９Ｄ) ｃ-ｍｅｔに対するｓｈＲＮＡを安定して発現するＥＢＣ ｓｈＭｅｔ４-１２細胞とｓｈＧＦＰ２を安定して発現するコントロール細胞を、無処置(Ｄｏｘなし)か又は、Ｄｏｘにて２４時間処置した(Ｄｏｘ)。細胞からのＲＮＡを実施例に記載のようにマイクロアレイ分析を行った。
【図９Ｅ】図９Ｅ) ＥＢＣ１ｓｈＭｅｔ-４．１２又はＥＢＣｓｈＭｅｔ-３．１５細胞からの腫瘍をヌード(ＣＲＬｎｕ-ｎｕ)動物において定着させ、マウスに１ｍｇ／ｍｌのＤｏｘ(Ｄｏｘ)を含む５％スクロース又は５％スクロースのみを含む飲料水を与えた。３日後に、腫瘍溶解物のＴＧＦαレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【図１０】(Ａ) ＥＢＣｓｈＭｅｔ４．１２又はＥＢＣｓｈＧＦＰ２細胞を、無処置(−)か又は２４、４８又は７２時間のＤｏｘ(＋)処置を行った。タンパク質溶解物を、ウェスタンブロッティングによってｃ-ｍｅｔ、ｐＥＧＦＲ又はＨｅｒ３について評価した。(Ｂ) ＥＢＣｓｈＭｅｔ４．１２細胞を４８時間Ｄｏｘ(１００ｎｇ／ｍｌ)にて処置し、細胞表面Ｈｅｒ３についてＦＡＣＳにて分析した。(Ｃ) ＥＢＣｓｈＭｅｔ４．１２腫瘍を有するマウスに、１ｍｇ／ｍｌのＤｏｘを含む５％スクロース(Ｄｏｘ)又は５％スクロースのみ(スクロース)を含む飲料水を与えた。腫瘍溶解物は、ウェスタンブロッティングによってＨｅｒ３タンパク質について評価した。
【図１１】ＥＢＣ-１ ｓｈＭｅｔ細胞(３．１５又は４．５又は４．１２)を、無処置(−)か、又は１００ｎｇ／ｍｌのＤｏｘ(＋)単独にて９６時間、又はＤｏｘ処置開始の４８時間後にＨＧＦ(５又は１００ｎｇ／ｍｌ)ないしはＴＧＦａ(１又は５０ｎＭ)を添加したものにて処置した。細胞数はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを使用して評価した。
【図１２】時間経過実験は、ＨＧＦの存在下(右パネル)又はＨＧＦ非存在下(左パネル)のＮＣＩ-Ｈ５９６細胞にて行った。細胞溶解物は、刺激の１０分後(１０')、２４時間後、４８時間後又は７２時間後(ｈｒ)に調製し、総ｃ-ｍｅｔ(上部パネル)、ホスホ-ＥＧＦＲ(第２パネル)および総ＥＧＦＲ(第３パネル)を検出するためにウェスタンブロットを行った。各レーンに同等に充填したことを示すためにベータアクチン（βアクチン）（４つ目のパネル）を検出した。
【図１３】ＮＣＩ-Ｈ５９６細胞は、リガンドなし、ＴＧＦ-α単独、ＴＧＦα＋ＨＧＦ又はＨＧＦ単独の存在下でプレートに播いた。細胞溶解物は、刺激の１０分後(１０分)および２４時間後(ｈｒ)に調製し、ｃ-ｍｅｔについての免疫沈降(ＩＰ)、その後ホスホチロシン(４Ｇ１０；上部パネル)、ｃ-ｍｅｔ(第２パネル)およびＥＧＦＲ(第３パネル)についてのウェスタンブロッティングを行った。ホスホチロシンブロットは、２４時間後に減弱する、リガンド依存性の様式のＥＧＦＲ(上部バンド)およびｃ-ｍｅｔ(下部バンド)の活性化を示す。Ｃ−ｍｅｔ免疫沈降は、ＥＧＦＲ又はｃ-ｍｅｔの活性化状態とは関係なく、すべての条件下でＥＧＦＲを沈降した。
【図１４】ＴＧＦαと図に示す様々な濃度のＨＧＦの存在下におけるエルロチニブへの細胞の応答を評価するためにＮＣＩ-Ｈ５９６細胞を用いて生存率アッセイを行った。ＨＧＦレベルが０．５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌに増加するにつれて、エルロチニブに対する相対的な感度の減少が検出された。
【図１５】ＴＧＨα及びＨＧＦ(５０ｎｇ／ｍｌ)の存在下であって、ＭｅｔＭＡｂ(１μＭ)を含む又は含まない、様々な濃度のエルロチニブの存在下のＮＣＩ-Ｈ５９６細胞を用いて生存率アッセイを行った。データは、未処置のコントロールの割合として表す。未処置のコントロール値は、図の左上に各々のポイントとして示す。
【図１６】ＭｅｔＭＡｂとエルロチニブによる併用処置により、ホスホ-Ａｋｔとホスホ-ＥＲＫ１／２がより有効に阻害された。ＮＣＩ-Ｈ５９６腫瘍を保持するヒトＨＧＦトランスジェニックＳＣＩＤ(ｈｕ-ＨＧＦ-Ｔｇ-ＳＣＩＤ)マウスを、ベヒクルバッファ(ＭｅｔＭＡｂバッファ(１００μＬ、ＩＰ)およびメチルセルローストゥイーン(ＭＣＴ、１００μＬ、ＰＯ)、ＭｅｔＭＡｂ((３０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１回)、及びＭＣＴ)、エルロチニブ((ＭＣＴ中の１００ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ、ＰＯ)、及びＭｅｔＭＡｂバッファ(１００μＬ、ＩＰ))又はＭｅｔＭＡｂとエルロチニブ(それぞれについて記載したのと同じ投与)にて処置した。ＭｅｔＭＡｂ(またはバッファ)をゼロ時間目(ｔ  ０時間)に投与し、エルロチニブ(またはＭＣＴ)を１８時間目(ｔ  １８時間)に投与し、マウスを安楽死させ、２４時間目(ｔ  ２４時間)に腫瘍を採取した。腫瘍溶解物は、総及びリン−タンパク質について、直接ウェスタンブロッティングと免疫沈降法、その後ウエスタンブロットによって分析した。省略記号：ｐＴｙｒ＝ホスホチロシン、ＥＧＦＲ＝上皮細胞増殖因子レセプター、ＥＲＫ＝細胞外シグナル制御キナーゼ-１および２。各レーンに同等に充填したことを示すためにベータアクチン（βアクチン）を検出した。
【図１７Ａ】本出願において記載するいくつかの結果を概略的に表す。
【図１７Ｂ】本出願において記載するいくつかの結果を概略的に表す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（詳細な説明）
Ｉ．定義
本明細書中で用いる「肝細胞増殖因子」又は「ＨＧＦ」なる用語は、特に別途示されない限り、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達過程を起こす条件下においてこの経路を活性化しうる任意の(天然に生じるもの又は合成のもののいずれにせよ)天然の又は変異形のＨＧＦポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦタンパク質のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦにおいてみられるアミノ酸配列を指す。ｃ-ｍｅｔは、そのレセプターによってＨＧＦ細胞内シグナル伝達が生物学的に達成されるＨＧＦの公知のレセプターである。
【００４０】
本明細書中で用いる「ＨＧＦ変異体」は、天然ＨＧＦ配列に一又は複数のアミノ酸突然変異を含むＨＧＦポリペプチドを指す。場合によっては、一又は複数のアミノ酸突然変異はアミノ酸置換を含む。
【００４１】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。よって、天然配列ポリペプチドは、任意の哺乳動物由来の天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、あるいは組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列」ポリペプチドという用語は特にポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型(例えば細胞外ドメイン配列)、ポリペプチドの天然に生じる変異体型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
【００４２】
ポリペプチド「変異体」は、天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、一又は複数のアミノ酸残基が、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加されているか、又は欠失しているポリペプチドが含まれる。通常、変異体は、天然配列ポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００４３】
「ＥＧＲＦ」（用語「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、及び「上皮増殖因子レセプター」と互換可能）とは、Ullrichら、Nature (1984) 309:418425に記載されているレセプターチロシンキナーゼポリペプチド上皮増殖因子レセプターを意味し、Ｈｅｒ−１及びｃ−ｅｒｂＢ遺伝子産物、並びにＥＧＦＲｖＩＩＩのようなそれらの変異体と呼ばれることもある。ＥＧＦＲの変異体は、欠失、置換及び挿入を有する変異体も含み、例えば、Lynchら(New England Journal of Medicine 2004, 350:2129), Paezら(Science 2004, 304:1497), Paoら(PNAS 2004, 101:13306)に記載のものが含まれる。
【００４４】
「生体試料」(「試料」又は「組織ないし細胞試料」と互換可能)は、個体から入手した様々なタイプの試料を包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに用いられうる。この定義には、血液及び生体起源の他の液体試料、生検標本や組織培養物やそれらに由来する細胞などの固形組織試料、及びこれらのプロジェニーが包含される。また、この定義には、入手後何らかの方法、例えば試薬で処理された試料、可溶化された試料、又はタンパク質やポリヌクレオチドなどの特定の成分について濃縮された試料、又は切片化のために半流動性基質ないしは固形基質に包埋することによって操作された試料が含まれる。「生体試料」なる用語は、臨床試料を包含し、培養物中の細胞、細胞上清物、細胞溶解物、血清、血漿、体液、及び組織試料も含む。生体試料の供給源は、新鮮な、凍結された及び／又は保存されていた臓器や組織試料、又は生検、又は吸引液から得られた固形組織；血液又は何らかの血液成分；大脳脊髄液、羊水、腹水又は間質液などの体液；被検体の妊娠期又は発生期の任意の時期の細胞であってよい。いくつかの実施態様では、生体試料は、原発性腫瘍又は転移性腫瘍から採取されたものである。生体試料は、防腐剤、抗凝血物質、バッファ、固定液、栄養分、抗生物質など天然の組織にはもともと混在していない化合物を含んでもよい。
【００４５】
「ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト」（「ｃ−ｍｅｔ阻害剤」と互換可能）は、ｃ−ｍｅｔの活性化又は機能を妨害する薬剤である。ｃ−ｍｅｔ阻害剤の例には、ｃ−ｍｅｔ抗体；ＨＧＦ抗体；小分子ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト；ｃ−ｍｅｔチロシンキナーゼ阻害剤；アンチセンス及び阻害性ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ）分子（例えば、国際公開第２００４／８７２０７号参照）が含まれる。好ましくは、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−ｍｅｔに結合する抗体又は小分子である。特定の一実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、約１０００ｎＭ以下のｃ−ｍｅｔに対して結合親和性（解離定数）を有する。別の実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、約１００ｎＭ以下のｃ−ｍｅｔに対して結合親和性を有する。別の実施態様では、ｃ−ｍｅｔは、約５０ｎＭ以下のｃ−ｍｅｔに対して結合親和性を有する。特定の一実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、ｃ−ｍｅｔに共有結合性に結合している。特定の一実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０でｃ−ｍｅｔシグナル伝達を阻害する。別の実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、５００ｎＭ以下のＩＣ５０でｃ−ｍｅｔシグナル伝達を阻害する。別の実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害剤は、５０ｎＭ以下のＩＣ５０でｃ−ｍｅｔシグナル伝達を阻害する。
【００４６】
ここで使用される「ｃ−ｍｅｔ標的薬」という用語は、ｃ−ｍｅｔに結合してｃ−ｍｅｔ活性化を阻害する治療薬を指す。ｃ−ｍｅｔ標的薬の一例は、ＭｅｔＭＡｂ（ＯＡ５Ｄ５．ｖ２）である。
【００４７】
「ｃ−ｍｅｔ活性化」は、ｃ−ｍｅｔレセプターの活性化又はリン酸化を指す。一般に、ｃ−ｍｅｔ活性化によりシグナルトランスダクションが起こる（例えば、ｃ−ｍｅｔ又は基質ポリペプチド内のｃ−ｍｅｔレセプターリン酸化チロシン残基の細胞内キナーゼドメインにより引き起こされるもの）。ｃ−ｍｅｔの活性化は、対象のｃ−ｍｅｔレセプターに結合するｃ−ｍｅｔリガンド（ＨＧＦ）により媒介されうる。ｃ−ｍｅｔに対するＨＧＦの結合は、ｃ−ｍｅｔのキナーゼドメインを活性化し、それによりｃ−ｍｅｔ内のチロシン残基のリン酸化及び／又は別の基質ポリペプチド内のチロシン残基のリン酸化を引き起こしうる。
【００４８】
「ＥＧＦＲアンタゴニスト」（「ＥＧＦＲ阻害剤」と互換可能）とは、ＥＧＦＲ活性化又は機能を妨害する薬剤である。ＥＧＦＲ阻害剤の例には、ＥＧＦＲ抗体；ＥＧＦＲリガンド抗体；小分子ＥＧＦＲアンタゴニスト、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤；アンチセンス及び阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）分子（例えば、国際公開第２００４／８７２０７号参照）が含まれる。好ましくは、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲに結合する抗体又は小分子である。幾つかの実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲ標的役である。特定の一実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、約１０００ｎＭ以下のＥＧＦＲに対する結合親和性（解離定数）を有する。別の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、約１００ｎＭ以下のＥＧＦＲに対する結合親和性を有する。別の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、約５０ｎＭ以下のＥＧＦＲに対して結合親和性を有する。特定の一実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲに対して共有結合性に結合している。特定の一実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０でＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。別の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、５００ｎＭ以下のＩＣ５０でＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。別の実施態様では、ＥＧＦＲ阻害剤は、５０ｎＭ以下のＩＣ５０でＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。
【００４９】
「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」なる表記は、ここで互換可能に使用され、例えばSemba等, PNAS(USA)82:6497-6501(1985)及びYamamoto等, Nature 319:230-234(1986)(Genebank受託番号X03363)に記載されているヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。「ｅｒｂＢ２」という用語は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を指し、「ｎｅｕ」はラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を指す。好ましくは、ＨＥＲ２は天然配列ヒトＨＥＲ２である。
【００５０】
「ＥｒｂＢ３」及び「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第５１８３８８４号及び第５４８０９６８号、並びにKraus等, PNAS(USA) 86:9193-9197(1989)に開示されたレセプターポリペプチドを指す。
【００５１】
本明細書中で用いる用語「ＥｒｂＢ４」及び「ＨＥＲ４」は、例えば、欧州特許出願第５９９２７４号；Plowman等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750(1993)；及びPlowman等, Nature 366: 473-475(1993)に開示されたレセプターポリペプチドを指し、例えば１９９９年４月２２日公開の国際公開公報９９／１９４８８に開示されているような、そのアイソフォームを含む。
【００５２】
本明細書で使用される「ＥｒｂＢ」とは、レセプターポリペプチドＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４を意味する。
【００５３】
「ＥＧＦＲ活性化」は、ＥＧＦＲの活性化又はリン酸化を指す。通常、ＥＧＦＲ活性化により、シグナル伝達が生じる(例えば、ＥＧＦＲ又は基質ポリペプチドのチロシン残基をリン酸化するＥＧＦＲレセプターの細胞内キナーゼドメインによって、生じる)。ＥＧＦＲ活性化は、ＥＧＦＲを含んでなるＥＧＦＲ二量体に、ＥＧＦＲリガンドが結合することにより媒介されうる。ＥＧＦＲ二量体へのＥＧＦＲリガンドの結合により、二量体のＥＧＦＲの一又は複数のキナーゼドメインが活性化され、このことにより一又は複数のＥＧＦＲのチロシン残基のリン酸化、及び／又は更なる基質ポリペプチド(一又は複数)のチロシン残基のリン酸化が生じる。
【００５４】
ここで使用される「ＥＧＦＲ標的薬」という用語は、ＥＧＦＲに結合してＥＧＦＲ活性化を阻害する治療薬を指す。このような薬剤の例は、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子を含む。ＥＧＦＲに結合する抗体の例は、ＭＡｂ５７９(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０６)、ＭＡｂ４５５(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７)、ＭＡｂ２２５(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０９)、ＭＡｂ５２８(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０９)(米国特許第４９４３５３３号、Mendelsohnら参照)及びその変異体、例えばキメラ２２５(Ｃ２２５又はセツキシマブ；ＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標）)及び再構成ヒト２２５(Ｈ２２５)(例えば、国際公開第９６／４０２１０号、Imclone Systems社参照)；ＩＭＣ−１１Ｆ８の、完全長ヒトＥＧＦＲ標的抗体（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；タイプII変異ＥＧＦＲに結合する抗体(米国特許第５２１２２９０号)；米国特許第５８９１９９６号に記載のＥＧＦＲに結合するヒト化及びキメラ抗体；及びＡＢＸ-ＥＧＦのようなＥＧＦＲに結合するヒト抗体(国際公開第９８／５０４３３号、Abgenix参照)；ＥＭＤ ５５９００ (Stragliotto 等. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996))；ＥＧＦＲ結合についてＥＧＦ及びＴＧＦ−αの両方と競合するＥＧＦＲを目標としたＥＭＤ７２００（マツズマブ）ヒト化ＥＧＦＲ抗体；及びｍＡｂ ８０６又はヒト化ｍＡｂ ８０６ (Johns等, J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004))を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞障害剤とコンジュゲートされ、よって免疫コンジュゲートを作る(例えば、欧州特許第６５９４３９Ａ２、Merck Patent GmbH)。ＥＧＦＲに結合する小分子の例は、ＺＤ１８３９又はゲフィチニブ(IRESSATM；Astra Zeneca)；ＣＰ-３５８７７４又はエルロチニブＨＣＬ(ＴＡＲＣＥＶＡＴＭ；Genentech/OSI)；ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１(ＳＵ５２７１；Sugen)；ＥＭＤ−７２００を含む。
【００５５】
「ＥＧＦＲ耐性」癌は、患者がＥＧＦＲアンタゴニスト療法を受ける間に進行する癌（即ち、患者は「ＥＧＦＲ抵抗性」である）、又はＥＧＦＲアンタゴニストに基づく治療計画の完了後１２か月以内（例えば、１、２、３、又は６か月後）に進行する癌を意味する。例えば、Ｔ７９０Ｍ変異ＥＧＦＲを取り込む癌は、エルロチニブ及びゲフィチニブ療法に対して耐性である。
【００５６】
「エルロチニブ又はゲフィチニブに耐性」の癌は、エルロチニブに基づく療法又はゲフィチニブに基づく療法を受ける間に進行する癌（即ち、患者は「エルロチニブ又はゲフィチニブ耐性」である）、又はエルロチニブに基づく治療計画又はゲフィチニブに基づく治療計画の完了後１２か月以内（例えば、１、２、３、又は６か月以内）に進行する癌を意味する。
【００５７】
本明細書において使用され、例えばレセプターシグナル伝達活性に適用される「リガンド非依存性」という用語は、リガンドの存在に依存しないシグナル伝達活性を指す。例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達はＨＥＲ２といったＨＥＲファミリの他のメンバーとの二量体化から生じうる。リガンド非依存性キナーゼ活性を有するレセプターは、リガンドがそのようなレセプターに結合してキナーゼ活性を更に活性化することを必ずしも妨げない。
【００５８】
本明細書において使用され、例えばリセプターキナーゼ活性に適用される「恒常的」という用語は、リガンド又はその他の活性化分子の存在に依存しないレセプターの継続的なシグナル伝達活性を指す。例えば、多形神経膠芽腫に広く見られるＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）では、その細胞外ドメインの大部分が削除されている。リガンドは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合できないが、活性であり続け、異常な増殖及び生存に関連する。レセプターの性質に応じて、活性の全てが継続するか、又は他の分子（例えばリガンド）の結合によってレセプターの活性は更に活性化される。レセプターの活性化に繋がる細胞事象は、当業者には周知である。例えば、活性化は、二量体形成、三量体形成といった、高次のレセプター複合体へのオリゴマー形成を含みうる。複合体は、単一種のタンパク質、即ちホモマー複合体を含みうる。或いは、複合体は、少なくとも二つの異なるタンパク質種、即ちヘテロマー複合体を含みうる。複合体形成は、例えば、細胞表面上におけるレセプターの正常な又は異常な形態の発現により引き起こされうる。複合体形成は、レセプターにおける一又は複数の特異的な変異によっても引き起こされることがある。
【００５９】
「遺伝子増幅」なる語句は、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞株において形成されるプロセスを意味する。複製された領域(増幅されたＤＮＡのストレッチ)は、しばしば「アンプリコン」と称される。通常は、生成されるメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の量、即ち遺伝子発現レベルも、発現された特定遺伝子の作成されたコピー数に比例して増加する。
【００６０】
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、ｃ−ｍｅｔレセプターなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を有る程度阻害する分子である。
【００６１】
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの発現、増幅、又は活性化を示す」癌又は生体試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲを発現（過剰発現を含む）する、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲ遺伝子を増幅している、及び／又はｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの活性化又はリン酸化を示すものである。
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの発現、増幅、又は活性化を示さない」癌又は生体試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲを発現（過剰発現を含む）しない、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲ遺伝子を増幅していない、及び／又はｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの活性化又はリン酸化を示さないものである。
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲ活性化を示す」癌又は生体試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は、直接的に（例えば、ＥＬＩＳＡによりｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲのリン酸化を測定することにより）、或いは間接的に、確認することができる。
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＧＦＲ活性化を示さない」癌又は生体試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＧＦＲの活性化又はリン酸化を示さないものである。このような活性化は、直接的に（例えば、ＥＬＩＳＡによりｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＧＦＲのリン酸化を測定することにより）、或いは間接的に、確認することができる。
【００６２】
「恒常的ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの活性化を示す」癌又は生物学的試料は、診断検査において、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの恒常的活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は直接的に(例えば、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲのリン酸化をＥＬＩＳＡで測定することによって)又は間接的に測定されうる。
「ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの増幅を示さない」癌又は生物学的試料は、診断検査において、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの遺伝子を増幅しないものである。
「ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの増幅を示す」癌又は生物学的試料は、診断検査において、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの遺伝子を増幅するものである。
「恒常的ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの活性化を示さない」癌又は生物学的試料は、診断検査において、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの恒常的活性化又はリン酸化を示さないものである。このような活性化は直接的に(例えば、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲのリン酸化をＥＬＩＳＡで測定することによって)又は間接的に測定されうる。
【００６３】
「リガンド非依存性のｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの活性化を示す」癌又は生物学的試料は、診断検査において、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲのリガンド非依存性の活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は直接的に(例えば、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲのリン酸化をＥＬＩＳＡで測定することによって)又は間接的に測定されうる。
「リガンド非依存性のｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲの活性化を示さない」癌又は生物学的試料は、診断検査において、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲのリガンド非依存性の活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は直接的に(例えば、ｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲのリン酸化をＥＬＩＳＡで測定することによって)又は間接的に測定されうる。
【００６４】
本願明細書において「ホスホ-ＥＬＩＳＡアッセイ」は、リン酸化されたｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲ、基質又は下流のシグナル伝達分子を検出するために、一又は複数のｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲのリン酸化が試薬、通常抗体を使用した酵素結合抗体免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)において評価されるアッセイである。好ましくは、リン酸化されたｃ-ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲを検出する抗体が使われる。このアッセイは、細胞溶解物、好ましくは新鮮又は凍結生物学的試料において実施されてよい。
【００６５】
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの過剰発現又は増幅」を有する癌細胞は、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲタンパク質又は遺伝子のレベルが、同じ組織種類の非癌細胞より有意に高いものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅、又は転写又は翻訳の増加により生じうる。ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの過剰発現又は増幅は、診断又は予後アッセイにおいて、細胞の表面上に存在するｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲタンパク質のレベルの上昇を評価することによって確認することができる（例えば、免疫組織化学アッセイ;ＩＨＣにより）。あるいは、又は付加的に、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月公開の国際公開９８／４５４７９参照）、サザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）により、細胞のｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲコード化核酸のレベルを測定してもよい。上記のアッセイとは別に、種々のインビボアッセイは、熟練技術者に入手可能である。例えば、患者の体内にある細胞を、例えば、放射活性アイソトープのような検出可能な標識で場合によって標識した抗体に曝してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば、放射活性の外部スキャンニングによって、又は以前に抗体へ曝した患者から取り出した生検を分析することによって、評価することができる。
【００６６】
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲを過剰発現しない」癌細胞は、同じ組織種類の非癌性細胞と比較したとき、正常レベルを上回るｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲタンパク質又は遺伝子を有さないものである。
【００６７】
本明細書で使用される「変異」とは、特定のタンパク質又は核酸（遺伝子、ＲＮＡ）のアミノ酸配列又は核酸配列が、それぞれ野生型のタンパク質又は核酸とは異なることを意味する。変異したタンパク質又は核酸は、遺伝子の、一方の対立遺伝子（ヘテロ接合性）又は両方の対立遺伝子（ホモ接合性）に発現されるか、又はそのような対立遺伝子に見られ、体細胞性又は生殖系列でありうる。本発明では、変異は通常体細胞性である。変異には、挿入、削除、及び点変異（単一のヌクレオチド／アミノ酸多形を含む）のような配列再構成が含まれる。
【００６８】
「阻害する」とは、基準より活性、機能、及び／又は量を減少させる又は低減させることである。
タンパク質の「発現」とは、遺伝子にコードされた情報のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転換と、それに続くタンパク質への転換とを指す。
本明細書では、対象のタンパク質（例えばＨＥＲレセプター又はＨＥＲリガンド）を「発現する」試料又は細胞は、そのようなタンパク質をコードするｍＲＮＡ、又はその断片を含むタンパク質が、試料又は細胞中に存在することが確認されているものである。
【００６９】
「イムノコンジュゲート」（「抗体−薬剤コンジュゲート」、又は「ＡＤＣ」と互換可能）は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物を起源とする、酵素的に活性の毒素又はその断片）、或いは放射性同位元素（例えばラジオコンジュゲート）といった一又は複数の細胞障害剤を意味する。
【００７０】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」なる用語は、概して、Ｃ末端ポリペプチド配列がインタクト抗体のパパイン消化によって取得されうる免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含んでなる二量体複合体を指す。Ｆｃ領域は、天然Ｆｃ配列又は変異形Ｆｃ配列を含むことができる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変化しうるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ配列はおよそＣｙｓ２２６の位置又はおよそＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からＦｃ配列のカルボキシル末端まで伸びると定義される。免疫グロブリンのＦｃ配列は、通常、二つの定常ドメイン、即ちＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の精製中に又は抗体をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって、取り除かれてもよい。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体を含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体、又はＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体との混合物を含みうる。
【００７１】
ここでの「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃ領域を形成するポリペプチドの一つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の好適な免疫グロブリンから得ることができる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、野生型のヒンジ配列の一部又はすべてを（一般的にはそのＮ末端に）含有してなる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、機能的ヒンジ配列又は野生型ヒンジ配列を含有していない。
【００７２】
ここで用いる「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」及びその変形例は、例えば、Janeway等, Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (第４版, 1999); Bloom等, Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys等, J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202に示される、当該分野に既知の意味を含む。
【００７３】
本明細書及び請求の範囲を通じて、免疫グロブリン重鎖内の残基の番号付けは、Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載のようなEU指標によるものであり、この文献は、ここで明示したことにより本明細書に包含される。「Ｋａｂａｔに記載のＥＵ指標」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基の番号付けを指す。
【００７４】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び一価の抗体、多価抗体、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を含む。
【００７５】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部のみを含有するものであり、この部分は、インタクト抗体中に存在する場合にその部分に通常伴う機能の少なくとも一、好ましくはほとんど又はすべてを保持する。一実施態様では、抗体断片は、インタクト抗体の抗原結合部位を含有するため、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含有するものは、完全抗体に存在するＦｃ領域が通常関連する生物学的機能の少なくとも一つ、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を保持する。一実施態様では、抗体断片は、インタクト抗体と実質的に同じインビボ半減期を有する一価の抗体である。例えばそのような抗体断片は、該断片にインビボ安定性を供与しうるＦｃ配列に結合した抗原結合アーム上に含みうる。一実施態様では、本発明の抗体は、国際公開公報２００５／０６３８１６に記載の一アーム形抗体である。一実施態様では、一アーム形抗体は、「ノブ(knob)」及び「孔(hole)」を構成するFc突然変異を含む。例えば、孔(hole)突然変異は、Ｆｃポリペプチド内のＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖの一又は複数でありえ、腔(cavity)突然変異はＴ３６６Ｗでありうる。
【００７６】
「ブロッキング」抗体及び抗体「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原の生物機能を抑制又は低減するものである。好ましいブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に又は完全に抑制する。
【００７７】
特に示さない限り、「多価抗体」なる表現は、本明細書全体を通して、３つ以上の抗原結合部位を含んでなる抗体を示すために用いられる。多価抗体は、３つ以上の抗原結合部位を持つように遺伝子操作するのが好ましく、一般に、天然配列のＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
【００７８】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識及び結合部位を含む抗体断片である。この領域は、堅く結合した重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つの二量体から成り、その結合は自然界では例えばｓｃＦｖにおけるように共有結合である。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を画定するのはこの構成である。この６つのＣＤＲ又はそのサブセットは、共同して抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含んでいないＦｖの半分)でさえ、通常は結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００７９】
本明細書で使われるように、「抗体可変ドメイン」は相補性決定領域(ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３)ならびにフレームワーク領域(ＦＲ)のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖及び重鎖の部分を指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。本発明で使用される方法によると、ＣＤＲとＦＲに割り当てられるアミノ酸位置はカバットに従って規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987及び1991))。抗体又は抗原結合断片のアミノ酸のナンバリングも、カバットのそれに準じる。
【００８０】
本明細書で使われるように、「相補性決定領域」(ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３)なる用語は、抗原結合のために存在している必要がある抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、一般的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と同定される３つのＣＤＲ領域を持つ。各相補性決定領域はカバットが記載しているような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２４〜３４(Ｌ１)、５０〜５６(Ｌ２)、及び８９〜９７(Ｌ３)ならびに重鎖可変ドメインの３１〜３５(Ｈ１)、５０〜６５(Ｈ２)及び９５〜１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))、及び／又は「超可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２６〜３２(Ｌ１)、５０〜５２(Ｌ２)及び９１〜９６(Ｌ３)ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２(Ｈ１)，５３〜５５(Ｈ２)及び９６〜１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk, J.Mol.Biol.196:901-917頁(1987))を含んでもよい。いくつかの場合には、相補性決定領域はカバットの記載により定義されているＣＤＲ領域及び超可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１は、アミノ酸２６〜３５を含む。
【００８１】
「フレームワーク領域」(以下ＦＲと称す)は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、一般的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と同定される４つのＦＲを持つ。ＣＤＲがカバットの定義に従うならば、軽鎖ＦＲ残基は残基約１〜２３(ＬＣＦＲ１)、３５〜４９(ＬＣＦＲ２)、５７〜８８(ＬＣＦＲ３)及び９８〜１０７(ＬＣＦＲ４)に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜３０(ＨＣＦＲ１)、３６〜４９(ＨＣＦＲ２)、６６〜９４(ＨＣＦＲ３)及び１０３〜１１３(ＨＣＦＲ４)に位置する。ＣＤＲが超可変ループからのアミノ酸残基を含むならば、軽鎖ＦＲ残基は軽鎖の残基約１〜２５(ＬＣＦＲ１)、３３〜４９(ＬＣＦＲ２)、５３〜９０(ＬＣＦＲ３)及び９７〜１０７(ＬＣＦＲ４)に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜２５(ＨＣＦＲ１)、３３〜５２(ＨＣＦＲ２)、５６〜９５(ＨＣＦＲ３)及び１０２〜１１３(ＨＣＦＲ４)に位置する。いくつかの場合には、ＣＤＲがカバットの定義によるＣＤＲと超可変ループのそれの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに応じて調節されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５を含むとき、重鎖ＦＲ１残基は位置１〜２５にあり、ＦＲ２残基は位置３６〜４９にある。
【００８２】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと重鎖の可変ドメイン及び第１の定常ドメイン(ＣＨ１)を含む。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は一対のＦａｂ断片を含み、通常これらはその間にあるヒンジシステインによってそのカルボキシ末端の近くで共有結合により連結される。抗体断片の他の化学的結合も当技術分野で公知である。
【００８３】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーはｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖのレビューに関しては、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁(1994)を参照。
【００８４】
「ダイアボディ(diabody)」なる用語は、抗原結合部位を２つ備える小さな抗体断片を指し、この抗体断片は同じポリペプチド鎖(ＶＨ及びＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に連結した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む。同じ鎖の上の２つのドメインの間で対合させるにはあまりに短いリンカーを用いて、このドメインを他の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位をつくる。ダイアボディについては、例えば欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger他, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448(1993)でさらに詳しく記載されている。
【００８５】
「線状抗体」なる表現はZapata等, Protein Eng., 8(10):1057-1062頁(1995)に記載されている抗体を指す。つまり、これらの抗体は相補性の軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント(ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１)を含む。線状抗体は二重特異性又は単一特異性でありうる。
【００８６】
「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1992)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、国際公開１９９８／２４８９３；国際公開１９９６／３４０９６；国際公開１９９６／３３７３５；国際公開１９９１／１０７４１；Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；及び同第５６６１０１６号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。
【００８７】
ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。キメラ抗体は、抗体の抗原結合領域が、例えば、対象の抗原を有するマカクザルを免疫化することにより生成される抗体に由来するＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体を含む。
【００８８】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種の高頻度可変領域からの残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部をまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００８９】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、当該分野で知られている様々な技術を使用することによって生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ここでファージライブラリーがヒト抗体を発現する(Vaughan等, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996):Sheets等, PNAS, (USA)95:6157-6162(1998)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウス中に導入することにより産生することができる。免疫刺激時に、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison等, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して抗体を生産するヒトＢリンパ球の不死化によって調製されてもよい(そのようなＢリンパ球は、個体から回収されてもよいし、インビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；及び米国特許第５７５０３７３号を参照のこと。
【００９０】
「ネイキッド抗体」は、細胞毒性部分又は放射性標識といった異種性分子にコンジュゲートしていない抗体である。
【００９１】
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の改変を有する抗体であって、そのような改変を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が向上している。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks等は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier等、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００９２】
設計された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、同じ抗原に結合する他の抗体からそれ自体を区別する抗体の生物学的特徴のうちの一又は複数を有するものである。
【００９３】
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane (1988)に記載されているような常套的クロスブロッキングアッセイを実行することができる。
【００９４】
本発明のアミノ酸配列を含む抗体又はポリペプチドの半減期を延ばすために、米国特許第５７３９２７７号等に記載されているように、抗体（特に抗体断片）に対してサルベージレセプター結合エピトープを付着させることができる。例えば、遺伝子操作された核酸分子により発現される融合タンパク質がサルベージレセプター結合エピトープと本発明のポリペプチド配列とを有するように、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸分子は、フレーム内で、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸にリンクすることができる。本明細書で使用される「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボでの血清半減期を延長するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す（例えば、Ghetie等、Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000), 表１）。Ｆｃ領域に置換を有する抗体と、血清半減期の延長は、国際公開第００／４２０７２号、同第０２／０６０９１９号、Shields等、J. Biool. Chem. 276:6591-6604 (2001)；Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)）にも記載されている。別の実施態様では、血清半減期は、例えば、他のポリペプチド配列を付着させることによっても延ばすことができる。例えば、血清アルブミンが抗体又はポリペプチドに結合するように、本発明の方法に有用な抗体又はその他のポリペプチドを、ＦｃＲｎレセプターに結合する血清アルブミン又は血清アルブミンの一部、或いは血清アルブミン結合エピトープに付着させることができる。そのようなポリペプチド配列は、国際公開第０１／４５７４６号に開示されている。好ましい一実施態様では、付着させる血清アルブミンペプチドは、ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号２１）のアミノ酸配列を含んでなる。別の実施態様では、Ｆａｂの半減期をこのような方法により延長する。血清アルブミン結合ペプチド配列については、例えばDennis等, J. Biol. Chem. (2002)を参照することができる。
【００９５】
「単離された」ポリペプチド又は「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定されて分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、ポリペプチド又は抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含む。好ましい実施態様では、ポリペプチド又は抗体は、(1)ローリー(Lowry)法により定量したポリペプチド又は抗体の９５重量％を上回るまで、好ましくは９９重量％を上回るまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(3)クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一性が得られるまで、精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチド又は単離された抗体には、組換え細胞内にインサイツのポリペプチド又は抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチド又は単離された抗体は、少なくとも一の精製工程により調製される。
【００９６】
「断片」とは、基準の核酸又はポリペプチドの全長の、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれを上回る長さを含むポリペプチド又は核酸分子の一部分を意味する。一つの断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、又はそれより多くのヌクレオチド、或いは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、１９０、２００、又はそれより多くのアミノ酸を含みうる。
【００９７】
「治療」は、治療的処置及び予防的又は防止的な処置を指す。治療を必要とするものには、既に良性、前癌性、又は非転移性の腫瘍を有するもの、並びに癌の発生又は再発を予防すべきものが含まれる。
【００９８】
「治療的有効量」という用語は、哺乳動物の疾患又は疾病を治療又は予防するための薬剤の量を指す。癌の場合、治療的に有効量の薬剤は、癌細胞の数を減じ；原発腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍増殖をある程度まで阻害し；及び／又は疾病に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。既存の癌細胞の増殖を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、薬剤は、細胞分裂停止及び／又は細胞障害性であり得る。癌治療の場合、インビボでの有効性は、生存期間、細胞増殖停止時間（ＴＴＰ）、奏功率（ＲＲ）、奏功期間、及び／又は生活の質を評価することにより測定することができる。
【００９９】
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に調節されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指す又は表わす。この定義には、良性及び悪性の癌が含まれる。「初期癌」又は「初期腫瘍」とは、侵襲性又は転移性でない癌を意味するか、或いはステージ０、Ｉ、又はＩＩの癌を意味する。癌の例には、限定するものではないが、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽腫及び網膜芽細胞腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫及び滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリン産生腫瘍、及び島細胞癌を含む）、中皮腫、シュワン腫（聴神経腫瘍を含む）、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌（例えば上皮の扁平細胞癌）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃(gastric、stomach)癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌（転移性乳癌を含む）、大腸癌、直腸癌、大腸直腸癌、子宮内膜ないし子宮細胞腫、唾液腺細胞腫、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞腫、食道細胞腫、肝細胞腫、肛門部の細胞腫、陰茎細胞腫、精巣癌、食道癌、胆道癌、並びに頭部及び頚部の癌が含まれる。
【０１００】
「前癌性」は、一般に、癌に先行又は進行する状態又は増殖を指す。「前癌性」の増殖は、異常な細胞周期制御、増殖、又は分化を特徴とする細胞を有し、異常な細胞周期制御、増殖、又は分化はそのマーカーにより確認することができる。
【０１０１】
「異形成」とは、組織、器官、又は細胞のあらゆる異常増殖又は発達を意味する。好ましくは、異形成は高悪性度又は前癌性である。
【０１０２】
「転移」とは、癌が原発部位から身体の他の場所へ広がることを意味する。癌細胞は、原発腫瘍を離れてリンパ管及び血管に侵入し、血流により循環し、身体の他の部分の正常組織中の遠隔病巣内で増殖（転移）しうる。転移は、局所性又は遠隔でありうる。転移は、連続的プロセスであり、原発腫瘍を離れた腫瘍細胞に随伴性であり、血流によって移動し、遠隔部位で停止する。新規部位において、細胞は血液供給を確立し、成長して致命的な腫瘤を形成しうる。
【０１０３】
腫瘍細胞内部の刺激性及び抑制性の分子経路は共にこのような挙動を制御し、遠隔部位における腫瘍細胞と宿主細胞との間の相互作用も著しい。
【０１０４】
「非転移性」とは、良性である癌又は原発部位に留まっており、リンパ管又は血管に、或いは原発部位以外の組織中に浸潤していない癌を意味する。一般に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ、又はＩＩのいずれかの癌であり、場合によってはステージＩＩＩの癌である。
【０１０５】
「原発腫瘍」又は「原発癌」とは、最初の癌を意味し、患者の身体の別の組織、器官、又は位置にある転移性の病変を意味しない。
【０１０６】
「良性腫瘍」又は「良性癌」とは、最初の部位に局在性に留まり、遠隔部位に湿潤、浸潤、又は転移する能力を持たない腫瘍を意味する。
【０１０７】
「腫瘍組織量」とは、身体における癌細胞の数、腫瘍の大きさ、又は癌の量を意味する。腫瘍組織量（tumor burden）は腫瘍量（tumor load）とも呼ばれる。
「腫瘍数」とは腫瘍の数を意味する。
【０１０８】
「被検体」とは、限定しないが、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコを含む哺乳動物を意味する。好ましくは、被検体はヒトである。
【０１０９】
「抗癌治療」は、癌の治療に有用な治療法を指す。抗癌治療剤の例には、限定しないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、放射線治療に使用される薬剤、血管新生抑制剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、及び癌を治療するための他の薬剤、抗ＣＤ２０抗体、血小板から得られた増殖因子阻害剤（例えば、グリベックＴＭ（イマチニブメシル酸塩））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、標的であるＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプター、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、及びその他の生理活性有機化学薬品などのうちの一又は複数に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）が含まれる。これらの組み合わせも本発明に含まれる。
【０１１０】
ここで用いられる「細胞障害性剤」は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び／又は細胞破壊を起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６)、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片を意味する。
【０１１１】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、癌の治療に有用な化学的化合物が含まれる。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む)； エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin)； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ−Ｃ」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標)ドキセタキセル、(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；ミトキサントン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(��録商標)ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン(カンプトサル(Camptosar)、ＣＰＴ-１１)(５−ＦＵ及びリューコボリンとのイリノテカンの治療処方を含む)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；コンブレタスタチン(combretastatin)；リューコボリン(leucovorin)(ＬＶ)；オキサリプラチン(oxaliplatin)、オキサリプラチン治療処方(FOLFOX)を含む；ＰＫＣ−αのインヒビター、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ(例として、エルロチニブ(erlotinib)(ＴａｒｃｅｖａＴＭ))及び細胞増殖を減少させるＶＥＧＦ−Ａ、並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【０１１２】
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ*トレミフェン(Fareston)；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ゾロゾール(vorozole)、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾール及びＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾール；；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ−ａｌｐｈａ、ラルフ及びＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ(登録商標)リボザイム)及びＨＥＲ２発現インヒビター；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン)などのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ(登録商標)ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)rmRH；ビノレルビン(Vinorelbine)及びエスペラミシン(Esperamicins)(米国特許第４６７５１８７号を参照)並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【０１１３】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【０１１４】
「放射線治療」とは、定方向γ線又はβ線を使用して細胞に十分な損傷を誘発することにより、細胞の正常に機能する能力を制限すること、又は細胞全体を破壊することを意味する。この治療の線量及び継続期間を決定する多数の方法が従来技術に既知である。一般的な治療は、一回の照射で行われ、典型的な線量範囲は一日当たり１０〜２００単位（Grays）である。
【０１１５】
治療薬
本発明は、併用療法においてｃ−ｍｅｔアンタゴニストとＥＧＦＲアンタゴニストとを使用することにより、腫瘍などの対象の病態を治療することを特徴とする。
【０１１６】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト
本発明の方法に有用なｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ−ｍｅｔに特異的に結合するポリペプチド、抗ｃ−ｍｅｔ抗体、ｃ−ｍｅｔ小分子、ｃ−ｍｅｔに特異的に結合するレセプター分子及び誘導体、並びに融合タンパク質を含む。ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ−ｍｅｔポリペプチドの拮抗性変異体、ＲＮＡアプタマー、並びにｃ−ｍｅｔ及びＨＧＦに対するペプチボディも含む。本発明の方法に有用なｃ−ｍｅｔアンタゴニストとして、更に、抗ＨＧＦ抗体、抗ＨＧＦポリペプチド、ｃ−ｍｅｔレセプター分子、及びＨＧＦに特異的に結合する誘導体が含まれる。これらの各々の例について後述する。
【０１１７】
本発明の方法において有用な抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、ｃ−ｍｅｔに対して十分に親和性且つ特異性に結合して、ｃ−ｍｅｔ活性を低減又は抑制するあらゆる抗体を含む。選択される抗体は、通常はｃ-ｍｅｔに対して十分に強力な結合親和性を有し、例えば、抗体は１００ｎＭ−１ｐＭのＫｄ値でヒトｃ−ｍｅｔに結合することができる。抗体の親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴法に基づくアッセイ（例えば、ＰＣＴ出願公開第２００５／０１２３５９号に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）；及び拮抗実験（例えばラジオイムノアッセイ）により決定することができる。好ましくは、本発明の抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、ｃ−ｍｅｔ／ＨＧＦ活性が関与する疾病又は状態を標的としてそれに干渉する治療薬として使用することができる。また、抗体に対して、例えば治療薬としての有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイを行うことができる。このようなアッセイは、従来技術に既知であり、標的抗原に依存しており、その使用目的は抗体である。
【０１１８】
抗ｃ−ｍｅｔ抗体は従来技術に既知である（例えば、Martens, Tら (2006) Clin Cancer Res 12(20 Pt 1):6144；米国特許第６４６８５２９号；国際公開第２００６／０１５３７１号；同第２００７／０６３８１６号；米国特許第７４０８０４３号；国際公開第２００９／００７４２７号；同第２００５／０１６３８２号；同第２００７／１２６７９９号を参照）。一実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、図７に示すＣＤＲ１−ＨＣ、ＣＤＲ２−ＨＣ、及びＣＤＲ３−ＨＣ配列の一又は複数を含む重鎖可変ドメインを含んでなる（配列番号１３−１５）。幾つかの実施態様では、抗体は、図７に示すＣＤＲ１−ＬＣ、ＣＤＲ２−ＬＣ、及びＣＤＲ３−ＬＣ配列の一又は複数を含む重鎖可変ドメインを含んでなる（配列番号５−７）。幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインは、図７に示すＦＲ１−ＨＣ、ＦＲ２−ＨＣ、及びＦＲ３−ＨＣ及びＦＲ４−ＨＣ配列の一又は複数を含む重鎖可変ドメインを含んでなる（配列番号９−１２）。幾つかの実施態様では、軽鎖可変ドメインは、図７に示すＦＲ１−ＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、及びＦＲ３−ＬＣ及びＦＲ４−ＬＣ配列の一又は複数を含む軽鎖可変ドメインを含んでなる（配列番号１−４）。幾つかの実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、一価であり、Ｆｃ領域を含んでなる。幾つかの実施態様では、抗体は、図７に示すＦｃ配列を含んでなる（配列番号１７）。
【０１１９】
幾つかの実施態様では、抗体は、一価であってＦｃ領域を含んでなり、このＦｃ領域は第１及び第２のポリペプチドを含み、この第１ポリペプチドは図７に示すＦｃ配列を含み（配列番号１７）、第２ポリペプチドは図８に示すＦｃ配列を含む（配列番号１８）。
【０１２０】
一実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、（ａ）配列：QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS（配列番号１９）、図７に示すＣＨ１配列（配列番号１６）、及び図７に示すＦｃ配列（配列番号１７）を有する重鎖可変ドメインを含む第１ポリペプチドと、（ｂ）配列：DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK（配列番号２０）、及び図７に示すＣＬ１配列（配列番号８）を有する軽鎖可変ドメインを含む第２のポリペプチドと、（ｃ）図８に示すＦｃ配列（配列番号１８）を含む第３ポリペプチドとを含んでなる。
【０１２１】
他の実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション受入番号ＡＴＣＣ  ＨＢ−１１８９４（ハイブリドーマ１Ａ３．３．１３）又はＨＢ−１１８９５（ハイブリドーマ５Ｄ５．１１．６）の下に寄託されたハイブリドーマ細胞株により生成されるモノクローナル抗体である。他の実施態様では、抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション受入番号ＡＴＣＣ  ＨＢ−１１８９４（ハイブリドーマ１Ａ３．３．１３）又はＨＢ−１１８９５（ハイブリドーマ５Ｄ５．１１．６）の下に寄託されたハイブリドーマ細胞株により生成されるモノクローナル抗体のＣＤＲ配列のうちの一又は複数を含んでなる。
【０１２２】
他の実施態様では、本発明のｃ−ｍｅｔ抗体は、ｃ−ｍｅｔ  Ｓｅｍａドメインの少なくとも一部、又はその変異体に特異的に結合する。一実施例では、本発明のアンタゴニスト抗体は、LDAQT（配列番号２２）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基２６９−２７３）、LTEKRKKRS（配列番号２３）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３００−３０８）、KPDSAEPM（配列番号２４）(例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３５０−３５７)、及びNVRCLQHF（配列番号２５）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３８１−３８８）からなる群より選択された配列の少なくとも一つに特異的に結合する。一実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は、LDAQT（配列番号２２）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基２６９−２７３）、LTEKRKKRS（配列番号２３）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３００−３０８）、KPDSAEPM（配列番号２４）(例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３５０−３５７)、及びNVRCLQHF（配列番号２５）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３８１−３８８）からなる群より選択された配列の少なくとも一つの一部又は全部により形成された立体構造エピトープに対して特異的に結合する。一実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は、LDAQT（配列番号２２）、LTEKRKKRS（配列番号２３）、KPDSAEPM（配列番号２４）、及び／又はNVRCLQHF（配列番号２５）と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列に対して特異的に結合する。
【０１２３】
抗ＨＧＦ抗体は、従来技術に周知である。例えば、Kim KJら Clin Cancer Res. (2006) 12(4):1292-8；国際公開第２００７／１１５０４９号、同第２００９／００２５２１号；同第２００７／１４３０９８号；同第２００７／０１７１０７号；同第２００５／０１７１０７号；Ｌ２Ｇ７；ＡＭＧ−１０２を参照されたい。
【０１２４】
ｃ−ｍｅｔレセプター分子又はＨＧＦに特異的に結合するその断片を本発明の方法において使用して、例えば、ＨＧＦに結合させて隔絶することにより、シグナル伝達を防止することができる。好ましくは、ｃ−ｍｅｔレセプター分子、又はそのＨＧＦ結合断片は、可溶形態である。幾つかの実施態様では、レセプターの可溶形態は、ＨＧＦに結合してｃ−ｍｅｔタンパク質の生物学的活性に対する阻害効果を発揮することにより、標的細胞の表面上に存在するその天然レセプターにＨＧＦが結合することを防止することができる。更にはｃ−ｍｅｔレセプター融合タンパク質が含まれる。その例について後述する。
【０１２５】
本発明の可溶性ｃ−ｍｅｔレセプタータンパク質又はキメラｃ−ｍｅｔタンパク質には、膜貫通ドメインを介して細胞の表面に固定されていないｃ−ｍｅｔレセプタータンパク質が含まれる。したがって、ｃ−ｍｅｔレセプターの可溶形態は、キメラレセプタータンパク質を含めて、ＨＧＦに結合してＨＧＦを不活性化できる一方で、膜貫通ドメインを含まず、したがって通常は分子が発現されている細胞の細胞膜に結合しない。例えば、Kong-Beltran, Mら Cancer Cell (2004) 6(1): 75-84を参照されたい。
【０１２６】
ｃ−ｍｅｔに特異的に結合してｃ−ｍｅｔの活性を遮断又は低減することにより、ｃ−ｍｅｔのシグナル伝達を防止するＨＧＦ分子又はその断片は、本発明の方法に使用可能である。
【０１２７】
アプタマーは、ＨＧＦポリペプチドのような標的分子に特異的に結合する三次構造を形成する核酸分子である。アプタマーの生成及び治療的使用は、従来技術において確立されている。例えば、米国特許第５４７５０９６号を参照されたい。ＨＧＦアプタマーは、ペグ化され且つ修飾されたオリゴヌクレオチドであり、細胞外ＨＧＦへの結合を可能にする三次元立体構造を取っている。アプタマーに関する更なる情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見ることができる。
【０１２８】
ペプチボディは、免疫グロブリン分子の断片又は一部をコードするアミノ酸配列にリンクするペプチド配列である。ポリペプチドは、ファージディスプレイ技術を含むがこれに限定されない特異的な結合のための任意の方法により選択された、無作為化配列から得ることができる。好ましい一実施態様では、選択されたポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ部分をコードするアミノ酸配列にリンクすることができる。ＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔに特異的に結合してこれをアンタゴナイズするペプチボディも、本発明の方法に有用である。
【０１２９】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、米国特許第５７９２７８３号；同第５８３４５０４号；同第５８８０１４１号；同第６２９７２３８号；同第６５９９９０２号；同第６７９０８５２号；米国特許出願公開２００３／０１２５３７０号；同第２００４／０２４２６０３号；同第２００４／０１９８７５０号；同第２００４／０１１０７５８号；同第２００５／０００９８４５号；同第２００５／０００９８４０号；同第２００５／０２４５５４７号；同第２００５／０１４８５７４号；同第２００５／０１０１６５０号；同第２００５／００７５３４０号；同第２００６／０００９４５３号；同第２００６／０００９４９３号；国際公開第９８／００７６９５号；同第２００３／０００６６０号；同第２００３／０８７０２６号；同第２００３／０９７６４１号；同第２００４／０７６４１２号；同第２００５／００４８０８号；同第２００５／１２１１２５号；同第２００５／０３０１４０号；同第２００５／０７０８９１号；同第２００５／０８０３９３号；同第２００６／０１４３２５号；同第２００６／０２１８８６号；同第２００６／０２１８８１号；同第２００７／１０３３０８）号に記載の化合物のような小分子を含む。ＰＨＡ−６６５７５２は、小分子であり、ｃ−Ｍｅｔの触媒活性と、様々な腫瘍細胞の細胞増殖、細胞運動性、侵襲、及び形態との、ＡＴＰ−競合性の活性部位阻害剤である（Maら (2005) Clin. Cancer Res. 11:2312-2319; Christensenら (2003) Cancer Res. 63:7345-7355)。
【０１３０】
ＥＧＦＲアンタゴニスト
ＥＧＦＲアンタゴニストには、ニモツズマブ(YM Biosciences)として知られるヒト化モノクローナル抗体、完全長ヒトＡＢＸ-ＥＧＦ(パニツムマブ、Abgenix Inc.)、並びにＥ１.１、Ｅ２.４、Ｅ２.５、Ｅ６.２、Ｅ６.４、Ｅ２.１１、Ｅ６. ３およびＥ７.６. ３として知られ、米国特許第６２３５８８３号に記載される完全長ヒト抗体；ＭＤＸ-４４７ (Medarex Inc)といった抗体が含まれる。パーツズマブ(２Ｃ４)は、ＨＥＲ２に直接結合するが、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ二量体化に干渉し、これによってＥＧＦＲシグナル伝達を阻害するヒト化抗体である。ＥＧＦＲに結合する抗体の他の例には、ＭＡｂ５７９(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０６)、ＭＡｂ４５５(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７)、ＭＡｂ２２５(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０８)、ＭＡｂ５２８(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ ８５０９)(米国特許第４９４３５３３号、Mendelsohn et al.を参照)およびこれらの変異体、例えばキメラ化２２５(Ｃ２２５又はセツキシマブ；ＥＲＢＵＴＩＸ(登録商標))及び再成形ヒト２２５(Ｈ２２５)(国際公開９６／４０２１０、Imclone Systems Inc.を参照)；ＩＭＣ-１１Ｆ８、完全長ヒト、ＥＧＦＲ標的抗体(Imclone)；ＩＩ型変異体ＥＧＦＲを結合する抗体(米国特許第５２１２２９０号)；米国特許第５８９１９９６号に記載される、ＥＧＦＲを結合するヒト化及びキメラ抗体；及び、ＡＢＸ-ＥＧＦ(国際公開９８／５０４３３、Abgenixを参照)などのＥＧＦＲを結合するヒト抗体；ＥＭＤ５５９００ (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A: 636-640 (1996))；ＥＧＦＲ結合についてＥＧＦおよびＴＧＦ-αと競合する、ＥＧＦＲに対するＥＭＤ７２００(マツズマブ)ヒト化ＥＧＦＲ抗体；及び、ｍＡｂ８０６又はヒト化ｍＡｂ８０６ (Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004))が含まれる。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞障害性剤とコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを生成しうる(例として欧州特許第６５９４３９号Ａ２、Merck Patent GmbHを参照)。
【０１３１】
本発明の方法において有用である抗ＥＧＦＲ抗体には、ＥＧＦＲに対して十分な親和性と特異性を持って結合し、ＥＧＦＲ活性を低減しうるか又は阻害しうる任意の抗体が含まれる。選択した抗体は通常ＥＧＦＲに対して十分に強い結合親和性を有するであろう。例えば、抗体はヒトｃ-ｍｅｔを１００ｎＭ〜１ｐＭのＫｄ値で結合しうる。抗体親和性は、例えば、表面プラスモン共鳴ベースのアッセイ(例えばＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載されるＢＩＡｃｏｒｅアッセイ)；酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)；及び競合アッセイ(例えばＲＩＡのもの)によって測定されてよい。好ましくは、本発明の抗ｃ-ｍｅｔ抗体は、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲリガンド活性が関与する疾患又は症状を標的とし、干渉する際の治療剤として用いられうる。また、抗体は、例えば、治療としての有効性を評価するために、他の生物活性アッセイに供されてよい。このようなアッセイは当分野において公知であり、標的抗原と抗体の使用目的によって決まる。
【０１３２】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びｃ-ｍｅｔに結合してよい。他の例では、例示的な二重特異性抗体は、同じタンパク質、例えばｃ-ｍｅｔタンパク質の２つの異なるエピトープに結合してよい。あるいは、ｃ-ｍｅｔ又はＥＧＦＲを発現する細胞に対する細胞性防衛機構を集中させるために、ｃ-ｍｅｔ又はＥＧＦＲアームは、Ｔ細胞レセプター分子などの白血球上のトリガー分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)、又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)などのＩｇＧに対するＦｃレセプター(ＦｃγＲ)に結合するアームと組み合わされてよい。また、二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ又はｃ-ｍｅｔを発現する細胞に細胞障害性剤を局所化するために用いられてよい。これらの抗体は、ＥＧＦＲ又はｃ-ｍｅｔ結合アームと、細胞障害性剤(例えばサポリン、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)を結合するアームを保持する。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製されてよい。
【０１３３】
また、ＥＧＦＲアンタゴニストには、米国特許第５６１６５８２号、米国特許第５４５７１０５号、米国特許第５４７５００１号、米国特許第５６５４３０７号、米国特許第５６７９６８３号、米国特許第６０８４０９５号、米国特許第６２６５４１０号、米国特許第６４５５５３４号、米国特許第６５２１６２０号、米国特許第６５９６７２６号、米国特許第６７１３４８４号、米国特許第５７７０５９９号、米国特許第６１４０３３２号、米国特許第５８６６５７２号、米国特許第６３９９６０２号、米国特許第６３４４４５９号、米国特許第６６０２８６３号、米国特許第６３９１８７４号、国際公開９８１４４５１、国際公開９８５００３８、国際公開９９０９０１６、国際公開９９２４０３７、国際公開９９３５１４６、国際公開０１３２６５１、米国特許第６３４４４５５号、米国特許第５７６００４１号、米国特許第６００２００８号、米国特許第５７４７４９８号に記載される化合物のような小分子が含まれる。具体的な小分子ＥＧＦＲアンタゴニストには、ＯＳＩ−７７４(ＣＰ-３５８７７４、エルロチニブ、OSI Pharmaceuticals)；ＰＤ１８３８０５(ＣＩ１０３３、２-プロペンアミド、Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-７-[３-(４-モルホリニル)プロポキシ]-６-キナゾリニル]−、二塩化水素化物、Pfizer Inc.)；Ｉｒｅｓｓａ(登録商標)(ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ、AstraZeneca)；ＺＭ１０５１８０((６-アミノ-４-(３-メチルフェニル-アミノ)-キナゾリン、Zeneca)；ＢＩＢＸ-１３８２(Ｎ８-(３-クロロ-４-フルオロ-フェニル)-Ｎ２-(１-メチル-ピペリジン-４-イル)-ピリミド[５,４-ｄ]ピリミジン-２,８-ジアミン、Boehringer Ingelheim)；ＰＫＩ-１６６((Ｒ)４-[４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-１Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-イル]-フェノール)；(Ｒ)-６-(４-ヒドロキシフェニル)-４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン)；ＣＬ-３８７７８５(Ｎ-[４-[(３-ブロモフェニル)アミノ]-６-キナゾリニル]-２-ブチンアミド)；ＥＫＢ-５６９(Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-３-シアノ-７-エトキシ-６-キノリニル]-４-(ジメチルアミノ)-２-ブテンアミド)；ラパチニブ(Tykerb, GlaxoSmithKline)；ＺＤ６４７４(Zactima, AstraZeneca)；ＣＵＤＣ-１０１(Curis)；カネルチニブ(ＣＩ-１０３３)；ＡＥＥ７８８(６-[４-[(４-エチル-１-ピペラジニル)メチル]フェニル]-Ｎ-[(１Ｒ)-１-フェニルエチル]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-４-アミン、国際公開２００３０１３５４１、Novartis)、及び、ＰＫＩ１６６ ４-[４-[[(１Ｒ)-１-フェニルエチル]アミノ]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-イル]-フェノール、国際公開９７０２２６６ Novartis)が含まれる。
【０１３４】
具体的な実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、出典明記によって本明細書中に援用される米国特許第５７５７４９８号に従って以下の一般式Ｉを有し、
2011513427.tif 000004
このとき
ｍは、１、２又は３であり； 
各Ｒ１は、水素、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアミノ、カルボキシ、ニトロ、グアニジノ、ウレイド、シアノ、トリフロロメチル、及びＷが単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＨである−(Ｃ１−Ｃ４アルキレン)-Ｗ-(フェニル)からなる群からそれぞれ選択され；又は、
各Ｒ１は、Ｒ９及びシアノに置換したＣ１−Ｃ４アルキルからそれぞれ選択され、このＲ９は、Ｒ５、-ＯＲ６、-ＮＲ６Ｒ６、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、-ＮＨＯＲ５、-ＯＣ(Ｏ)Ｒ６、シアノ、Ａ及び-ＹＲ５からなる群から選択され；Ｒ５はＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｒ６はそれぞれ水素又はＲ５であり；Ｒ７はＲ５、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６であり；Ａはピペリジノ、モルホリノ、ピロリジノ、４−Ｒ６−ピペラジン−１−イル、イミダゾール-１-イル、４-ピリドン−１−イル、−(Ｃ１−Ｃ４アルキレン)(ＣＯ２Ｈ)、フェノキシ、フェニル、フェニルスルファニル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、及び-(Ｃ１−Ｃ４アルキレン)Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ６から選択され；そして、ＹはＳ、ＳＯ又はＳＯ２であり；このとき、Ｒ５、-ＯＲ６及び、-ＮＲ６Ｒ６のアルキル部分は場合によって１〜３のハロ置換基に置換され、Ｒ５、-ＯＲ６、及び-ＮＲ６Ｒ６のアルキル部分は場合によって１又は２のＲ９基によって置換され、そして該任意の置換基のアルキル部分は場合によってハロ又はＲ９によって置換されていてよく、ただし２つの異種原子が同じ炭素原子に結合していない； 
各Ｒ１はそれぞれ、-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４)-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノから選択され、Ｒ１０は、ハロ、-ＯＲ６、Ｃ２-Ｃ４アルカノイルオキシ、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、及び-ＮＲ６Ｒ６から選択され；前記-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノのＲ１基は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルキル、シアノ、メタンスルホニル及びＣ１-Ｃ４アルコキシからそれぞれ選択される１又は２の置換基で置換されていてもよく；又は 
２のＲ１基は、それらが結合している炭素と共同して、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１又は２のヘテロ原子を含む、５-８員環を形成し； 
Ｒ２は、水素、又はハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒ５からそれぞれ選択される１から３の置換基で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルであり； 
ｎは１又は２であり、各Ｒ３はそれぞれ、水素、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、-ＮＲ６Ｒ６、及びＣ１-Ｃ４アルコキシから選択され、該Ｒ３基中のアルキル部分は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒからそれぞれ選択される１から３の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ４はアジド又は-(エチニル)-Ｒ１１であり、このＲ１１は、水素、又はヒドロキシ、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルである。
【０１３５】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、
(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-[３-(３'-ヒドロキシプロピン-１-イル)フェニル]-アミン；[３-(２'-(アミノメチル)-エチニル)フェニル]-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-ニトロキナゾリン-４-イル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(４-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-２-メチルフェニル)-アミン；(６-アミノキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニルアミノキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６,７-メチレンジオキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-６-メチルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(７-ニトロキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(４'-トルエンスルホニルアミノ)キナゾリン-４-イル]-アミン；(３-エチニルフェニル)-{６-[２'-フタルイミド-eth-１'-イル- スルホニルアミノ]キナゾリン-４-イル}-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-グアニジノキナゾリン-４-イル)-アミン； (７-アミノキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(７-メトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(６-カルボメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(７-カルボメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；[６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)キナゾリン-４-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン； (３-アジドフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-アジド-５-クロロフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(４-アジドフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニル-キナゾリン-４-イル)-アミン；(６-エタンスルファニル-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン； (６,７-ジメトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシ-キナゾリン-４-イル)-[３-(プロピン-１'-イル)-フェニル]-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(５-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-４-フルオロ-フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-クロロ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；[６-(２-クロロ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-アセトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-７-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-６-イルオキシ]-エタノール；[６-(２-アセトキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン； [７-(２-クロロ-エトキシ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；[７-(２-アセトキシ-エトキシ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノール；２-[４-(３-エチニル-��ェニルアミノ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-６-イルオキシ]-エタノール；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノール；[６-(２-アセトキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；(３-エチニル-フェニル)-{６-(２-メトキシ-エトキシ)-７-[２-(４-メチル-ピペラジン-１-イル)-エトキシ]-キナゾリン-４-イル}-アミン；(３-エチニル-フェニル)-[７-(２-メトキシ-エトキシ)-６-(２-モルホリン-４-イル)-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジブトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジイソプロポキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-アミン； [６,７-ビス-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノール；(６,７-ジプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-５-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(５-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-メチル-フェニル)-アミン；(６-アミノメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-フェニル)-アミン；(６-アミノメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-エトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-エトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-イソプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-プロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-イソプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；及び(６-アミノカルボニルエチル-７-プロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-アミン；[６,７-ビス-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフ��ニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニルアミノ-キナゾリン-１-イル)-アミン；及び(６-アミノ-キナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミンからなる群から選択される式Ｉの化合物である。
【０１３６】
特定の実施態様では、式ＩのＥＧＦＲアンタゴニストは、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンである。特定の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニスト、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンはＨＣｌ塩形態である。他の特定の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニスト、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンは、ほぼ６．２６、１２．４８、１３．３９、１６．９６、２０．２０、２１．１０、２２．９８、２４．４６、２５．１４及び２６．９１で、２θ度で表される特性ピークを有するＸ線粉末回折図形を示す実質的に均質な結晶多形形態(国際公開第０１／３４５７４号に多形体Ｂとして記載)である。このような多形形態のＮ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンは、タルセバTM、並びにＯＳＩ-７７４、ＣＰ-３５８７７４及びエルロチニブと呼ばれる。
【０１３７】
式Ｉの化合物、その製薬的に許容可能な塩及びプロドラッグ(以下、活性化合物)は、化学的に関連した化合物の調製に適用可能であることが知られている任意のプロセスにより調製することができる。一般的に、活性化合物は、米国特許第５７４７４９８号に開示されている一般スキームＩに示されているように、適切に置換されたアミンを使用し、適切に置換されたキナゾリンから調製することができる：
2011513427.tif 000005
【０１３８】
スキームＩに示されているように、Ｘが適切な置換可能な離脱基、例えばハロ、アリールオキシ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、例えばトリフルオロメタンスルホニルオキシ、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、シロキシ、シアノ、ピラゾロ、トリアゾロ、又はテトラゾロ、好ましくは４-クロロキナゾリンである適切な４-置換キナゾリン２を、Ｒ４が上述したもので、ＹがＢｒ、Ｉ、又はトリフルオロメタン-スルホニルオキシである適切なアミン又はアミンヒドロクロリド４又は５と、溶媒、例えば(Ｃ１-Ｃ６)アルコール、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、Ｎ-メチルピロリジン-２-オン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、１-４ジオキサン、ピリジン、又は他の非プロトン性溶媒中において反応させる。反応は、塩基、好ましくはアルカリ又はアルカリ土類金属の炭酸塩又は水酸化物、又は第３級アミン塩基、例えばピリジン、２,６-ルチジン、コリジン、Ｎ-メチル-モルホリン、トリエチルアミン、４-ジメチルアミノ-ピリジン又はＮ,Ｎ-ジメチルアニリンの存在下でなされうる。これらの塩基を、以後、適切な塩基と称する。反応混合物を、残存する４-ハロキナゾリンが実質的に検出されなくなるまで、典型的には約２〜約２４時間、ほぼ周囲温度から溶媒の還流温度まで、好ましくは約３５℃から還流温度までの温度に維持する。好ましくは、反応は、ドライ窒素等の不活性雰囲気下で実施される。
【０１３９】
一般的に、反応物は、化学量論的に混合される。アミン４又は５の塩(典型的にはＨＣｌ塩)が使用される化合物に対してアミン塩基が使用される場合、過剰のアミン塩基、一般的には更に一当量のアミン塩基を使用するのが好ましい。(あるいは、アミン塩基が使用されないならば、過剰のアミン４又は５が使用されうる)。
立体障害のアミン４(例えば、２-アルキル-３-エチニルアニリン)又は非常に反応性の４-ハロキナゾリンが使用される化合物に対しては、溶媒としてＤＭＦ又はＮ-メチルピロリジン-２-オン等の極性非プロトン性溶媒又はｔ-ブチルアルコールを使用することが好ましい。
【０１４０】
あるいは、Ｘがヒドロキシル又はオキソである(また、２-窒素が水素化されている)４-置換キナゾリン２を、例えば四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、又は他の非プロトン性溶媒、又はそれらの混合物等の溶媒中において、場合によっては不活性ポリマー(例えば、樹脂１グラム当たり３ｍｍｏｌのリンを含む２％のジビニルベンゼン架橋ポリスチレンであるAldrichカタログ番号36,645-5のトリフェニルホスフィンに支持)上に支持されていてもよい置換されていてもよいテトラアリールホスフィン及び四塩化炭素と反応させる。反応混合物を、ほぼ周囲温度から還流まで、好ましくは約３５℃から還流までの温度で、２〜２４時間維持する。この混合物を、直接か又は例えば真空蒸発による溶媒の除去、及び別の溶媒、例えば(Ｃ１-Ｃ６)アルコール、ＤＭＦ、Ｎ-メチルピロリジン-２-オン、ピリジン又は１-４ジオキサンの添加後に、適切なアミン又はアミンヒドロクロリド４又は５と反応させる。ついで、反応混合物を、周囲温度から溶媒の還流温度まで、好ましくは約３５℃からほぼ還流温度までの温度に、実質的に完全な生成物の形成が達成されるまで、典型的には約２〜約２４時間、維持する。好ましくは、反応は、ドライ窒素等の不活性雰囲気下で実施される。
【０１４１】
キナゾリン２との反応における出発物質として、ＹがＢｒ、Ｉ、又はトリフルオロメタンスルホニルオキシである化合物４が使用される場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＹが上述したものである式３の化合物が生成される。化合物３を、ジメチルアミン又はトリエチルアミン等の溶媒中において、適切なルイス酸、例えば塩化第一銅、及び適切なアルキン、例えばトリメチルシリルアセチレン、プロパルギルアルコール、又は３-(Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノ)-プロピンの存在下、適切なパラジウム試薬、例えばテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム又はビス(トリフェニルホスフィン)パラジウムジクロリドと反応させることにより、Ｒ４がＲ１１エチニルで、Ｒ１１が上述したものである式Ｉの化合物に転化される。ＹがＮＨ２である化合物３を、ジアゾ化剤、例えば酸及び亜硝酸塩(例えば酢酸及びＮａＮＯ２)で化合物３を処理し、続いてアジド、例えばＮａＮ３で得られた生成物を処理することにより、Ｒ４がアジドである化合物１に転化させることができる。
【０１４２】
Ｒ１がアミノ又はヒドロキシアミノ基である式Ｉの化合物の生成に対しては、Ｒ１がニトロである対応する式Ｉの化合物の還元が用いられる。
還元は、このような転換に対して知られている多くの手順の何れかにより、簡便に実施することができる。還元は、例えば適切な金属触媒、例えばパラジウム、白金又はニッケルの存在下、反応不活性な溶媒中におけるニトロ化合物の水素化によって、実施されうる。さらなる適切な還元剤は、例えば活性化鉄(塩酸等の酸の希釈液で鉄粉を洗浄することにより生成)等の活性化金属である。よって、例えば還元は、水とアルコール、例えばメタノール又はエタノールとの混合物のような溶媒中において、例えば５０℃〜１５０℃の範囲の温度、簡便には７０℃又はその近傍で、濃塩酸を用い、ニトロ化合物と活性化金属の混合物を加熱することにより、実施されうる。他の適切なクラスの還元剤は、アルカリ金属の亜ジチオン酸塩、例えばジチオン酸ナトリウムであり、これは、(Ｃ１-Ｃ４)アルカン酸、(Ｃ１-Ｃ６)アルカノール、水又はそれらの混合物中で使用されうる。
【０１４３】
Ｒ２又はＲ３が(キナゾリンと反応することを意図したアミノ基以外の)第１級又は第２級アミノ部分を含んでいる式Ｉの化合物の製造に対して、このような遊離のアミノ基は、好ましくは上述した反応の前に保護され、その後４-(置換)キナゾリン２との上述の反応の後に、脱保護する。
いくつかのよく知られている窒素保護基を使用することができる。このような基には、(Ｃ１-Ｃ６)アルコキシカルボニル、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、トリチル、ビニルオキシカルボニル、Ｏ-ニトロフェニルスルホニル、ジフェニルホスフィニル、ｐ-トルエンスルホニル、及びベンジルが含まれる。窒素保護基の添加は、第３級アミン塩基、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン又はピリジン、好ましくはトリエチルアミンの存在又は不在下で、約０℃〜約５０℃、好ましくはほぼ周囲温度で、塩化炭化水素溶媒、例えば塩化メチレン又は１,２-ジクロロエタン、又はエーテル溶媒、例えばグリム、ジグリム又はＴＨＦ中において実施することができる。あるいは、保護基は、ショッテン-バウマン(Schotten-Baumann)条件を使用して簡便に結合させる。
【０１４４】
化合物２及び５の上述したカップリング反応の後、保護基を、当業者に知られている脱保護方法、例えばtert-ブトキシカルボニル保護生成物に対しては塩化メチレン中でのトリフルオロ酢酸を用いた処理により、除去することができる。
保護基及びそれらの使用についての記載は、T. W. Greene及びP. G. M. Wuts, 「Protective Groups in Organic Synthesis」, 第2版, John Wiley & Sons, New York, 1991を参照のこと。
【０１４５】
Ｒ１又はＲ２がヒドロキシである式Ｉの化合物の製造に対しては、Ｒ１又はＲ２が(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシである式Ｉの化合物の開裂が好ましい。
開裂反応は、このような転換に対して知られている多くの手順の任意のものにより、簡便に実施することができる。１５０℃〜１７５℃での、溶融ピリジンヒドロクロリド(２０-３０当量)を用いての保護された式Ｉ誘導体の処理を、Ｏ-脱アルキル化に対して用いることができる。あるいは、開裂反応は、例えば、保護されたキナゾリン誘導体をアルカリ金属(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルフィド、例えばエタンチオラートナトリウムで処理するか、又はアルカリ金属ジアリールホスフィド、例えばジフェニルホスフィドリチウムで処理することにより、実施することができる。また開裂反応は、簡便には、三ハロゲン化ホウ素又はアルミニウム、例えば三臭化ホウ素を用いて、保護されたキナゾリン誘導体を処理することにより、実施することができる。このような反応は、好ましくは、反応不活性な溶媒の存在下で適切な温度で実施される。
【０１４６】
Ｒ１又はＲ２が(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルフィニル又は(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルホニル基である式Ｉの化合物は、好ましくは、Ｒ１又はＲ２が(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルファニル基である式Ｉの化合物の酸化により調製される。スルファニルのスルフィニル及び／又はスルホニルへの酸化に対して当該技術分野で、適切な酸化剤が知られており、例えば白金の存在下、過酸化水素、過酸(例えば３-クロロペルオキシ安息香酸又はペルオキシ酢酸)、ペルオキシ硫酸アルカリ金属(例えばペルオキシモノ硫酸カリウム)、三酸化クロム又は酸素ガスである。酸化は、一般的に、他の官能基にダメージを与えたり、過度に酸化される危険性を低減するために、化学量論的量の酸化剤を使用して、できるだけ穏やかな条件下で実施される。一般的に、反応は適切な溶媒、例えば塩化メチレン、クロロホルム、アセトン、テトラヒドロフラン又はtert-ブチルメチルエーテル中において、約−２５℃〜５０℃、好ましくは周囲温度又はその近傍、すなわち１５℃〜３５℃の範囲の温度で実施される。スルフィニル基を担持する化合物が所望されている場合、簡便には酢酸又はエタノール等の極性溶媒中において、メタ過ヨウ素酸ナトリウム又はカリウム等、より穏和な酸化剤を使用するべきである。(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルホニル基を含む式Ｉの化合物は、対応する(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルフィニル化合物並びに対応する(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルファニル化合物を酸化することにより得ることができる。
【０１４７】
Ｒ１が置換されていてもよい(Ｃ２-Ｃ４)アルカノイルアミノ、ウレイド、３-フェニルウレイド、ベンズアミド又はスルホンアミドである式Ｉの化合物は、Ｒ１がアミノである対応する化合物をアシル化又はスルホニル化することにより調製することができる。適切なアシル化剤は、アシルハロゲン化物等のアシルアミノにアミノをアシル化させるために当該技術分野で知られている任意の薬剤、例えば、(Ｃ２-Ｃ４)アルカノイルクロリド又はブロミド又はベンゾイルクロリド又はブロミド、無水アルカン酸又は混合無水物(例えば、適切な塩基の存在下、(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシカルボニルクロリド等の(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシカルボニルハライドとアルカン酸とを反応させることにより形成される無水酢酸又は混合無水物）である。Ｒ１がウレイド又は３-フェニルウレイドである式Ｉの化合物の製造に対しては、適切なアシル化剤は、例えばシアネート、特にシアン酸ナトリウム等のアルカリ金属のシアネート、又はイソシアネート、例えばイソシアン酸フェニルである。Ｎ-スルホニル化は、第３級アミン塩基の存在下、適切なスルホニルハロゲン化物又はスルホニル無水物を用いて実施されうる。一般的に、アシル化又はスルホニル化は、反応不活性な溶媒中において、約−３０℃〜１２０℃の範囲、簡便には周囲温度又はその近傍の温度で実施される。
【０１４８】
Ｒ１が(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシ又は置換(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシであるか、又はＲ１が(Ｃ１-Ｃ４)アルキルアミノ又は置換モノ-Ｎ-又はジ-Ｎ,Ｎ-(Ｃ１-Ｃ４)アルキルアミノである式Ｉの化合物は、好ましくは適切な塩基の存在下、それぞれＲ１がヒドロキシ又はアミノである対応する化合物をアルキル化することにより調製される。適切なアルキル化剤には、適切な塩基の存在下、反応不活性な溶媒中における、約１０℃〜１４０℃の範囲、簡便には周囲温度又はその近傍の温度での、アルキル又は置換アルキルハロゲン化物、例えば置換されていてもよい(Ｃ１-Ｃ４)アルキルの塩化物、臭化物又はヨウ化物が含まれる。
【０１４９】
Ｒ１がアミノ-、オキシ-又はシアノ-置換(Ｃ１-Ｃ４)アルキル置換基である式Ｉの化合物の製造に対しては、Ｒ１がアミノ-、アルコキシ-又はシアノ基で置き換え可能な基を担持する(Ｃ１-Ｃ４)アルキル置換基である対応する化合物が、適切なアミン、アルコール又はシアニドと、好ましくは適切な塩基の存在下で反応させられる。反応は、好ましくは、反応不活性な溶媒又は希釈剤中において、約１０℃〜１００℃、好ましくは周囲温度又はその近傍の温度で、実施される。
【０１５０】
Ｒ１がカルボキシ置換基又はカルボキシ基を含む置換基である式Ｉの化合物は、Ｒ１が(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシカルボニル置換基又は(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシカルボニル基を含む置換基である対応する化合物を、加水分解することにより調製される。加水分解は塩基性条件下、例えばアルカリ金属水酸化物の存在下で簡便に実施され得る。
【０１５１】
Ｒ１がアミノ、(Ｃ１-Ｃ４)アルキルアミノ、ジ-[(Ｃ１-Ｃ４)アルキル]アミノ、ピロリジン-１-イル、ピペリジノ、モルホリノ、ピペラジン-１-イル、４-(Ｃ１-Ｃ４)アルキルピペラジン-１-イル、又は(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルファニルである式Ｉの化合物は、適切な塩基の存在下、Ｒ１がアミン又はチオール置換可能な基である対応する化合物と、適切なアミン又はチオールを反応させることにより調製されうる。反応は、好ましくは、反応不活性な溶媒又は希釈剤中において、約１０℃〜１８０℃の範囲、簡便には１００℃〜１５０℃の範囲の温度で、実施される。
【０１５２】
Ｒ１が２-オキソピロリジン-１-イル又は２-オキソピペリジン-１-イルである式Ｉの化合物は、適切な塩基の存在下、Ｒ１がハロ-(Ｃ２-Ｃ４)アルカノイルアミノ基である対応する化合物を環化することにより調製される。反応は、好ましくは、反応不活性な溶媒又は希釈剤中において、約１０℃〜１００℃の範囲、簡便には周囲温度又はその近傍の温度で、実施される。
【０１５３】
Ｒ１がカルバモイル、置換カルバモイル、アルカノイルオキシ又は置換アルカノイルオキシである式Ｉの化合物の製造に対しては、Ｒ１がヒドロキシである対応する化合物をカルバモイル化又はアシル化するのが簡便である。
【０１５４】
ヒドロキシアリール部分をアルカノイルオキシアリール基にアシル化するための当該分野で知られている適切なアシル化剤には、例えば(Ｃ２-Ｃ４)アルカノイルハロゲン化物、(Ｃ２-Ｃ４)アルカノイル無水物、及び上述したような混合無水物が含まれ、典型的には適切な塩基の存在下で、適切なそれらの置換誘導体が使用されうる。あるいは、(Ｃ２-Ｃ４)アルカン酸又は適切に置換されたそれらの誘導体は、Ｒ１がヒドロキシである式Ｉの化合物と、縮合剤、例えばカルボジイミドの補助によりカップリングしていてもよい。Ｒ１がカルバモイル又は置換カルバモイルである式Ｉの化合物を製造するためには、適切なカルバモイル化剤は、例えば典型的には適切な塩基の存在下での、シアナート類又はアルキルもしくはアシルイソシアナート類である。あるいは、適切な中間体、例えばＲ１がヒドロキシである式Ｉの化合物のカルボニルイミダゾリル誘導体又はクロロホルマートは、例えばホスゲン(又はホスゲン等価物)又はカルボニルジイミダゾールを用いて、前記誘導体を処理することにより生じせしめてよい。ついで、得られた中間体は、適切なアミン又は置換アミンと反応させ、所望のカルバモイル誘導体を生成させることができる。
【０１５５】
Ｒ１がアミノカルボニル又は置換アミノカルボニルである式Ｉの化合物は、Ｒ１がカルボキシである適切な中間体のアミノ分解により生成することができる。
【０１５６】
Ｒ１がカルボキシである式Ｉの化合物の活性化及びカップリングは、当業者に知られている様々な方法により実施されうる。適切な方法には、カルボキシル、例えば酸ハロゲン化物、アジド、対称的又は混合無水物、又は活性エステルで、所望するアミンとのカップリングに対し適切な反応性を有するものの活性化が含まれる。このようなタイプの中間体の具体例、及びそれらの製造、及びアミンとのカップリングにおけるそれらの使用は、文献；例えばM. Bodansky及びA. Bodansky, 「The Practice of Peptide Synthesis」, Springer-Verlag, New York, 1984に、広く見出すことができる。得られた式Ｉの化合物は、標準的な方法、例えば溶媒除去及び再結晶化又はクロマトグラフィーにより、分離し精製することができる。
【０１５７】
記載した反応スキームＩの出発物質(例えば、アミン類、キナゾリン類、及びアミン保護基)は、容易に入手可能であるか、又は従来からの有機合成法を使用し、当業者が容易に合成することができる。例えば、２,３-ジヒドロ-１,４-ベンゾオキサジン誘導体の調製は、R. C. Elderfield, W. H. Todd, S. Gerber, Ch. 12 「Heterocyclic Compounds」,Vol. 6, R. C. Elderfield編, John Wiley and Sons, Inc., N.Y., 1957に記載されている。置換２,３-ジヒドロベンゾチアジニル化合物は、R. C. Elderfield及びE. E. Harrisにより、Elderfield 「Heterocyclic Compounds」の第６巻第１３章に記載されている。
【０１５８】
他の好ましい実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、出典明記によって本明細書中に援用される米国特許第５４５７１０５号に記載されているような、一般式ＩＩを有する：
2011513427.tif 000006
[上式中；
ｍは１、２又は３であり；
各Ｒ１は独立して、６-ヒドロキシ、７-ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、ウレイド、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル、Ｎ-(１-４Ｃ)アルキルカルバモイル、Ｎ,Ｎ-ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]カルバモイル、ヒドロキシアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシアミノ、(２-４Ｃ)アルカノイルオキシアミノ、トリフルオロメトキシ、(１-４Ｃ)アルキル、６-(１-４Ｃ)アルコキシ、７-(１-４Ｃ)アルコキシ、(１-３Ｃ)アルキレンジオキシ、(１-４Ｃ)アルキルアミノ、ジ-１[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ、ピロリジン-１-イル、ピペリジノ、モルホリノ、ピペラジン-１-イル、４-(１-４Ｃ)アルキルピペラジン-１-イル、(１-４Ｃ)アルキルチオ、(１-４Ｃ)アルキルスルフィニル、(１-４Ｃ)アルキルスルホニル、ブロモメチル、ジブロモメチル、ヒドロキシ-(１-４Ｃ)アルキル、(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシ-(１-４Ｃ)アルキル、カルボキシ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル-(１-４Ｃ)アルキル、カルバモイル-(１-４Ｃ)アルキル、Ｎ-(１-４Ｃ)アルキルカルバモイル-(１-４Ｃ)アルキル、Ｎ,Ｎ-ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]カルバモイル-(１-４Ｃ)アルキル、アミノ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルキルアミノ-(１-４Ｃ)アルキル、ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ-(１-４Ｃ)アルキル、ピペリジノ-(１-４Ｃ)アルキル、モルホリノ-(１-４Ｃ)アルキル、ピペラジン-１-イル-(１-４Ｃ) アルキル、４-(１-４Ｃ)アルキルピペラジン-１-イル-(１-４Ｃ) アルキル、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ-(１-４Ｃ)アルキル、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルキルチオ-(１-４Ｃ)アルキル、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルキルチオ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルキルチオ-(１-４Ｃ)アルキル、フェノキシ-(１-４Ｃ)アルキル、アニリノ-(１-４Ｃ)アルキル、フェニルチオ-(１-４Ｃ)アルキル、シアノ-(１-４Ｃ)アルキル、ハロゲノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ、(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ、カルボキシ-(１-４Ｃ)アルコキシ、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル-(１-４Ｃ)アルコキシ、カルバモイル-(１-４Ｃ)アルコキシ、Ｎ-(１-４Ｃ)アルキルカルバモイル-(１-４Ｃ)アルコキシ、Ｎ,Ｎ-ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]カルバモイル-(１-４Ｃ)アルコキシ、アミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、(１-４Ｃ)アルキルアミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ、フェニル-(１-４Ｃ)アルコキシ、フェノキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ、アニリノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、フェニルチオ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ピペリジノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、モルホリノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ピペラジン-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、４-(１-４Ｃ)アルキルピペラジン-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、ハロゲノ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、カルボキシ-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、カルバモイル-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、Ｎ-(１-４Ｃ)アルキルカルバモイル-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ-ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]カルバモイル-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、アミノ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、(１-４Ｃ)アルキルアミノ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、ジ-１(１-４Ｃ)アルキル]アミノ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、フェニル-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、フェノキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、アニリノ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、フェニルチオ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニルアミノ、(１-４Ｃ)アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホンアミド、３-フェニルウレイド ２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、ハロゲノ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、カルボキシ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、カルバモイル-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、Ｎ-(１-４Ｃ)アルキルカルバモイル-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、Ｎ,Ｎ-ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]カルバモイル-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、アミノ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、(１-４Ｃ)アルキルアミノ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ又はジ-[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノであり、ここで前記ベンズアミド又はベンゼンスルホンアミド置換基、又はＲ１基における任意のアニリノ、フェノキシ又はフェニル基は、一又は二のハロゲノ、(１-４Ｃ)アルキル又は(１-４Ｃ)アルコキシ置換基を担持していてもよく；
ｎは１又は２であり；
各Ｒ２は独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲノ、トリフルオロメチル、アミノ、ニトロ、シアノ、(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシ、(１-４Ｃ)アルキルアミノ、ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ、(１-４Ｃ)アルキルチオ、(１-４Ｃ)アルキルスルフィニル又は(１-４Ｃ)アルキルスルホニル；又はその製薬的に許容可能な塩である]
を有し、４-(４'-ヒドロキシアニリノ)-６-メトキシキナゾリン、４-(４,-ヒドロキシアニリノ)-６,７-メチレンジオキシキナゾリン、６-アミノ-４-(４'-アミノアニリノ)キナゾリン、４-アニリノ-６-メチルキナゾリン、又はその塩酸塩を除き、４-アニリノ-６,７-ジメトキシキナゾリン又はその塩酸塩を除く。
【０１５９】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、次の：
４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６,７-ジメトキシキナゾリン；４-(３',４'-ジクロロアニリノ)-６,７-ジメトキシキナゾリン；６,７-ジメトキシ-４-(３'-ニトロアニリノ)-キナゾリン；６,７-ジエトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；６-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；４-(３'-クロロアニリノ)-６-メトキシキナゾリン；６,７-エチレンジオキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；６-アミノ-７-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；４-(３'-メチルアニリノ)-６-ウレイドキナゾリン；６-(２-メトキシエトキシメチル)-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；６,７-ジ-(２-メトキシエトキシ)-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；６-ジメチルアミノ-４-(３'-メチルアニリノ)キナゾリン；６-ベンズアミド-４-(３'-メチルアニリノ)キナゾリン；６,７-ジメトキシ-４-(３'-トリフルオロメチルアニリノ)-キナゾリン；６-ヒドロキシ-７-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；７-ヒドロキシ-６-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；７-アミノ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；６-アミノ-４-(３'-メチルアニリノ)キナゾリン；６-アミノ-４-(３'-クロロアニリノ)-キナゾリン；６-アセトアミド-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；６-(２-メトキシエチルアミノ)-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；７-(２-メトキシアセトアミド)-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；７-(２-ヒドロキシエトキシ)-６-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；７-(２-メトキシエトキシ)-６-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン；６-アミノ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリンからなる群から選択される式ＩＩの化合物である。
【０１６０】
式ＩＩのキナゾリン誘導体又はその製薬的に許容可能な塩は、化学的に関連した化合物の調製に適用可能であることが知られている任意のプロセスにより調製することができる。適切なプロセスは、例えば米国特許第４３２２４２０号で使用されているものを例示することができる。必須の出発物質は商業的に入手可能であるか、又は有機化学の標準的手順により得ることができる。
【０１６１】
(ａ)簡便には適切な塩基の存在下での、Ｚが置換可能な基であるキナゾリン(ｉ)とアニリン(ｉｉ)との反応。
2011513427.tif 000007
適切な置換可能な基Ｚは、例えばハロゲノ、アルコキシ、アリールオキシ又はスルホニルオキシ基、例えばクロロ、ブロモ、メトキシ、フェノキシ、メタンスルホニルオキシ又はトルエン-ｐ-スルホニルオキシ基である。
【０１６２】
適切な塩基は、例えば有機アミン塩基、例えばピリジン、２,６-ルチジン、コリジン、４-ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、モルホリン、Ｎ-メチルモルホリン、又はジアザビシクロ[５.４.０]ウンデセ-７-エン、又は例えばアルカリもしくはアルカリ土類金属の炭酸塩又は水酸化物、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである。
【０１６３】
反応は、好ましくは適切で不活性な溶媒又は希釈剤、例えばアルカノール又はエステル、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール又は酢酸エチル、又はハロゲン化溶媒、例えば塩化メチレン、クロロホルム又は四塩化炭素、エーテル、例えばテトラヒドロフラン又は１,４-ジオキサン、芳香族溶媒、例えばトルエン、又は双極非プロトン性溶媒、例えばＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ-ジメチルアセトアミド、Ｎ-メチルピロリジン-２-オン又はジメチルスルホキシドの存在下で実施される。反応は、例えば１０℃〜１５０℃の範囲、好ましくは２０℃〜８０℃の範囲の温度で、簡便に実施される。
【０１６４】
式ＩＩのキナゾリン誘導体は、このプロセスから、遊離の塩基の形態で得られうるか、あるいはＺが上述した意味を有する式Ｈ-Ｚの酸との塩の形態で得られてもよい。塩から遊離の塩基を得ることが望まれる場合、塩は、一般的な手順を使用し、上述した適切な塩基で処理することができる。
【０１６５】
(ｂ)Ｒ１又はＲ２がヒドロキシである式ＩＩの化合物の製造に対しては、Ｒ１又はＲ２が(１-４Ｃ)アルコキシである式ＩＩのキナゾリン誘導体の切断。
切断反応は、このような変換に対して知られている多くの手順の何れかにより、簡便に実施されうる。反応は、例えばアルカリ金属の(１-４Ｃ)アルキル硫化物、例えばエタンチオラートナトリウムでキナゾリン誘導体を処理するか、又は例えばアルカリ金属のジアリールリン化物、例えばジフェニルホスフィドリチウムで処理することにより実施することができる。また切断反応は、例えばホウ素又はアルミニウムのトリハロゲン化物、例えば三臭化ホウ素でキナゾリン誘導体を処理することにより、簡便に実施することができる。このような反応は、好ましくは上述したような適切で不活性な溶媒又は希釈剤下、適切な温度で実施される。
【０１６６】
(ｃ)Ｒ１又はＲ２が(１-４Ｃ)アルキルスルフィニル又は(１-４Ｃ)アルキルスルホニル基である式ＩＩの化合物の製造に対しては、Ｒ１又はＲ２が(１-４Ｃ)アルキルチオ基である式ＩＩのキナゾリン誘導体の酸化。
適切な酸化剤は、チオのスルフィニル及び／又はスルホニルへの酸化に対して当該技術分野で知られている任意の薬剤、例えば、白金の存在下、過酸化水素、過酸(例えば３-クロロペルオキシ安息香酸又はペルオキシ酢酸)、アルカリ金属ペルオキシ硫酸塩(例えばペルオキシ一硫酸カリウム)、三酸化クロム又は酸素ガスである。酸化は、一般的に過剰な酸化及び他の官能基へダメージを与える危険性を低減するために、必要な化学量論的量の酸化剤を用い、できるかぎり穏やかな条件下で実施される。一般的に、反応は適切な溶媒又は希釈剤、例えば塩化メチレン、クロロホルム、アセトン、テトラヒドロフラン又はtert-ブチルメチルエーテル中において、例えば−２５℃〜５０℃、簡便には周囲温度又はその近傍、すなわち１５℃〜３５℃の範囲の温度で実施される。スルフィニル基を担持する化合物が必要とされる場合、簡便には、酢酸又はエタノール等の極性溶媒中において、メタ過ヨウ素酸ナトリウム又はカリウム等、より穏和な酸化剤を使用することができる。(１-Ｃ４)アルキルスルホニル基を含む式ＩＩの化合物が必要とされる場合、それは、対応する(１-４Ｃ)アルキルスルフィニル化合物、並びに対応する(１-４Ｃ)アルキルチオ化合物の酸化により得ることができることが理解される。
【０１６７】
(ｄ)Ｒ１がアミノである式ＩＩの化合物の製造に対しては、Ｒ１がニトロである式Ｉのキナゾリン誘導体の還元。
還元は、このような変換で公知の任意の多くの手順により、便宜的に実施されてよい。還元は、パラジウム又は白金等の適切な金属触媒の存在下、上述した不活性な溶媒又は希釈液において、ニトロ化合物溶液を水素化することにより実施されてよい。さらなる適切な還元剤は、例えば活性化金属、例えば活性化鉄(塩酸等の酸の希釈液で鉄粉を洗浄することにより生成)である。よって、例えば還元は、適切な溶媒又は希釈液、例えば水とアルコール、例えばメタノール又はエタノールとの混合物において、例えば５０℃〜１５０℃の範囲の温度、便宜的には７０℃又はその近傍で、ニトロ化合物と活性化金属の混合物を加熱することにより実施されてもよい。
【０１６８】
(ｅ)Ｒ１が(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ又は置換(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、ウレイド、３-フェニルウレイド又はベンズアミドであり、Ｒ２がアセトアミド又はベンズアミドである式ＩＩの化合物の製造に対しては、Ｒ１又はＲ２がアミノである式ＩＩのキナゾリン誘導体のアシル化。
適切なアシル化剤は、アシルアミノにアミノをアシル化させるための当該技術分野で知られている任意の薬剤、例えば、アシルハロゲン化物、例えば簡便には上述した適切な塩基の存在下での、(２-４Ｃ)アルカノイルクロリド又はブロミド又はベンゾイルクロリド又はブロミド、無水アルカン酸又は混合無水物、例えば(２-４Ｃ)アルカン酸無水物、例えばアルカン酸と例えば(１-４Ｃ)アルコキシカルボニルクロリド等の(１-４Ｃ)アルコキシカルボニルハライドとを、上述した適切な塩基の存在下で反応させることにより形成される無水酢酸又は混合無水物である。Ｒ１がウレイド又は３-フェニルウレイドである式ＩＩの化合物の製造に対しては、適切なアシル化剤は、例えばシアナート、特にシアン酸ナトリウム等のアルカリ金属シアナート、又はイソシアナート、例えばイソシアン酸フェニルである。一般的に、アシル化は、上述した適切で不活性な溶媒又は希釈剤中において、例えば−３０℃〜１２０℃の範囲、便宜的には周囲温度又はその近傍の温度で実施される。
【０１６９】
(ｆ)Ｒ１が(１-４Ｃ)アルコキシ又は置換(１-４Ｃ)アルコキシであり、又はＲ１が(１-４Ｃ)アルキルアミノ又は置換(１-４Ｃ)アルキルアミノである式ＩＩの化合物の製造に対しては、適切であるならばＲ１がヒドロキシ又はアミノである式ＩＩのキナゾリン誘導体の、好ましくは上述した適切な塩基の存在下でのアルキル化。
適切なアルキル化剤は、アルコキシ又は置換アルコキシへのヒドロキシのアルキル化に対して、又はアルキルアミノ又は置換アルキルアミノへのアミノのアルキル化に対して当該技術分野で知られている任意の薬剤、例えば上述した適切な塩基の存在下、上述した適切で不活性な溶媒又は希釈剤中において、例えば１０℃〜１４０℃の範囲、簡便には周囲温度又はその近傍の温度での、アルキル又は置換アルキルハロゲン化物、例えば(１-４Ｃ)アルキルの塩化物、臭化物又はヨウ化物、又は置換(１-４Ｃ)アルキルの塩化物、臭化物又はヨウ化物である。
【０１７０】
(ｇ)Ｒ１がカルボキシ置換基又はカルボキシ基を含む置換基である式ＩＩの化合物の製造に対しては、Ｒ１が(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル置換基又は(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル基を含む置換基である式ＩＩのキナゾリン誘導体の加水分解。
加水分解は、簡便には、例えば塩基性条件下で実施されうる。
【０１７１】
(ｈ)Ｒ１がアミノ-、オキシ-、チオ-又はシアノ-置換(１-４Ｃ)アルキル置換基である式ＩＩの化合物の製造に対しては、好ましくは上述した適切な塩基の存在下での、Ｒ１が上述の置換可能な基を担持する(１-４Ｃ)アルキル置換基である式ＩＩのキナゾリン誘導体と、適切なアミン、アルコール、チオール又はシアニドとの反応。
反応は、好ましくは上述した適切で不活性な溶媒又は希釈剤中において、例えば１０℃〜１００℃、簡便には周囲温度又はその近傍の温度で実施される。
式ＩＩのキナゾリン誘導体の製薬的に許容可能な塩が必要とされる場合、例えば前記化合物を、例えば一般的な手順を使用して適切な酸と反応させることにより、得ることができる。
【０１７２】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、出典明記によって本明細書中に援用される米国特許第５７７０５９９号に開示されている次の式ＩＩ'：
2011513427.tif 000008
[上式中、
ｎは１、２又は３であり；
各Ｒ２は独立して、ハロゲノ又はトリフルオロメチルであり；
Ｒ３は(１-４Ｃ)アルコキシであり；及び
Ｒ１は、ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ピロリジン-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、ピペリジノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、モルホリノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ピペラジン-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、４-(１-４Ｃ)アルキルピペラジン-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、イミダゾール-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、ジ-[(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルキル]アミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、チアモルホリノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、１-オキソチアモルホリノ-(２-４Ｃ)アルコキシ又は１,１-ジオキソチアモルホリノ-(２-４Ｃ)アルコキシであり、Ｎ又はＯ原子に結合していないＣＨ２(メチレン)基を有する上述したＲ１置換基の任意のものは、該ＣＨ２基上にヒドロキシ置換基を担持していてもよい]
の化合物、又はその製薬的に許容可能な塩である。
【０１７３】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、
４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(２-ピロリジン-１-イルエトキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(２-モルホリノエトキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(３-ジエチルアミノプロポキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-ピロリジン-１-イルプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(３-ジメチルアミノプロポキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(３',４'-ジフルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-ピペリジノプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(２-ジメチルアミノエトキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(２',４'-ジフルオロアニリノ)-６-(３-ジメチルアミノプロポキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(２',４'-ジフルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(２-イミダゾール-１-イルエトキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(３-イミダゾール-１-イルプロポキシ)-７-メトキシキナゾリン； ４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(２-ジメチルアミノエトキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(２',４'-ジフルオロアニリノ)-６-(３-ジメチルアミノプロポキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(２',４'-ジフルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(２-イミダゾール-１-イルエトキシ)-７-メトキシキナゾリン；及び４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(３-イミダゾール-１-イルプロポキシ)-７-メトキシキナゾリンからなる群から選択される式ＩＩ'の化合物である。
【０１７４】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)-キナゾリン、又はＺＤ１８３９、ゲフィチニブ及びＩｒｅｓｓａ(登録商標)と称される式ＩＩ'の化合物である。
式ＩＩ'のキナゾリン誘導体又はその製薬的に許容可能な塩は、化学的に関連した化合物の調製に適用可能なことが知られている任意のプロセスにより調製することができる。適切なプロセスには、例えば米国特許第５６１６５８２号、米国特許第５５８０８７０号、米国特許第５４７５００１号及び米国特許第５５６９６５８号に例証されているものが含まれる。特に記載しない限りは、ｎ、Ｒ２、Ｒ３及びＲ１は、式ＩＩ'のキナゾリン誘導体に対して上述した意味の何れかを有する。必須の出発物質は商業的に入手可能であるか、又は有機化学の標準的手順により得ることができる。
【０１７５】
(ａ)簡便には適切な塩基の存在下での、Ｚが置換可能な基であるキナゾリン(ｉｉｉ)とアニリン(ｉｖ)との反応。
2011513427.tif 000009
適切な置換可能な基Ｚは、例えばハロゲノ、アルコキシ、アリールオキシ又はスルホニルオキシ基、例えばクロロ、ブロモ、メトキシ、フェノキシ、メタンスルホニルオキシ又はトルエン-ｐ-スルホニルオキシ基である。
【０１７６】
適切な塩基は、例えば有機アミン塩基、例えばピリジン、２,６-ルチジン、コリジン、４-ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、モルホリン、Ｎ-メチルモルホリン、又はジアザビシクロ[５.４.０]ウンデセ-７-エン、又は例えばアルカリもしくはアルカリ土類金属の炭酸塩又は水酸化物、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである。また適切な塩基は、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属のアミド、例えばアミドナトリウム又はビス(トリメチルシリル)アミドナトリウムである。
【０１７７】
反応は、好ましくは適切で不活性な溶媒又は希釈剤、例えばアルカノール又はエステル、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール又は酢酸エチル、ハロゲン化溶媒、例えば塩化メチレン、クロロホルム又は四塩化炭素、エーテル、例えばテトラヒドロフラン又は１,４-ジオキサン、芳香族溶媒、例えばトルエン、又は双極非プロトン性溶媒、例えばＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ-ジメチルアセトアミド、Ｎ-メチルピロリジン-２-オン又はジメチルスルホキシドの存在下で実施される。反応は、例えば１０℃〜１５０℃の範囲、好ましくは２０℃〜８０℃の範囲の温度で、簡便に実施される。
【０１７８】
式ＩＩ'のキナゾリン誘導体は、このプロセスから、遊離の塩基の形態で得られうるし、又はＺが上述した意味を有する式Ｈ-Ｚの酸との塩の形態で得られうる。塩から遊離の塩基を得ることが所望されている場合、塩は、一般的な手順を使用し、上述した適切な塩基で処理されうる。
【０１７９】
(ｂ)Ｒ１がアミノ置換(２-４Ｃ)アルコキシ基である式ＩＩ'の化合物の製造に対しては、簡便には、Ｒ１がヒドロキシ基である式ＩＩ'のキナゾリン誘導体の、上述した適切な塩基の存在下でのアルキル化。
適切なアルキル化剤は、例えばアミノ置換アルコキシへのヒドロキシのアルキル化に対して当該分野で知られている任意の薬剤、例えばアミノ置換アルキルハロゲン化物、例えば上述した適切な塩基の存在下、上述した適切で不活性な溶媒又は希釈剤中において、例えば１０℃〜１４０℃の範囲、簡便には８０℃又はその近傍の温度での、アミノ置換(２-４Ｃ)アルキルの塩化物、臭化物又はヨウ化物である。
【０１８０】
(ｃ)Ｒ１がアミノ置換(２-４Ｃ)アルコキシ基である式ＩＩ'の化合物の製造に対しては、簡便には上述した適切な塩基の存在下での、Ｒ１がヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ基である式ＩＩ'の化合物、又はその反応性誘導体と、適切なアミンとの反応。
Ｒ１がヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ基である式ＩＩ'の化合物の適切な反応性誘導体は、例えばハロゲノ-又はスルホニルオキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ基、例えばブロモ-又はメタンスルホニルオキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ基である。
反応は、好ましくは、上述した適切で不活性な溶媒又は希釈剤の存在下、例えば１０℃〜１５０℃の範囲、簡便には５０℃又はその近傍の温度で実施される。
【０１８１】
(ｄ)Ｒ１がヒドロキシ-アミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ基である式ＩＩ'の化合物の製造に対しては、Ｒ１が２,３-エポキシプロポキシ又は３,４-エポキシブトキシ基である式ＩＩ'の化合物と、適切なアミンとの反応。
反応は、好ましくは、上述した適切で不活性な溶媒又は希釈液の存在下で、例えば１０℃〜１５０℃の範囲、簡便には７０℃又はその近傍の温度で実施される。
式ＩＩ'のキナゾリン誘導体の製薬的に許容可能な塩、例えば式ＩＩ'のキナゾリン誘導体の一酸又は二酸との付加塩が必要とされる場合、それは、例えば一般的な手順を使用して適切な酸と、前記化合物を反応させることにより、得ることができる。
【０１８２】
具体的な実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、出典明記によって本明細書中に援用される国際公開９９３５１４６に開示されているような、以下の式ＩＩＩの化合物又はその塩又は溶媒和化合物である：
2011513427.tif 000010
[上式中；
ＸはＮ又はＣＨであり；
ＹはＣＲ１であり、かつＶはＮであり；又は
ＹはＮであり、かつＶはＣＲ１であり；又は
ＹはＣＲ１であり、かつＶはＣＲ２であり；又は
ＹはＣＲ２であり、かつＶはＣＲ１であり；
Ｒ１は基ＣＨ３ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２-Ａｒ-を表し、このときＡｒはフェニル、フラン、チオフェン、ピロール及びチアゾールから選択され、この各々は場合によって１又は２のハロ、Ｃｌ-４アルキル又はＣｌ-４アルコキシ基によって置換されていてよく；
Ｒ２は、ヒドロゲン、ハロ、ヒドロキシ、Ｃｌ-４アルキル、Ｃ１-４アルコキシ、Ｃｌ-４アルキルアミノ及びジ[Ｃ１-４アルキル]アミノを含む基から選択され；
Ｕは、Ｒ３基によって置換され、場合によって少なくとも１のそれぞれ選択されたＲ４基によって置換された、フェニル、ピリジル、３Ｈ-イミダゾールイル、インドールイル、イソインドールイル、インドリンイル、イソインドリンイル、１Ｈ-インダゾールイル、２,３-ジヒドロ-１Ｈ-インダゾールイル、１Ｈ-ベンズイミダゾールイル、２,３-ジヒドロ-１Ｈ-ベンズイミダゾールイル又は１Ｈ-ベンゾトリアゾールイル基を表し；
Ｒ３は、ベンジル、ハロ-、ジハロ-及びトリハロベンジル、ベンゾイル、ピリジルメチル、ピリジルメトキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、ハロ-、ジハロ-及びトリハロベンジルオキシ、及びベンゼンスルホニルを含む基から選択され；又はＲ３はトリハロメチルベンジル又はトリハロメチルベンジルオキシを表し；又は
Ｒ３は以下の式の基を表し、
2011513427.tif 000011
上式中
各Ｒ５はそれぞれ、ハロゲン、Ｃｌ-４アルキル及びＣｌ-４アルコキシから選択され；ｎは０〜３であり；
各Ｒ４はそれぞれ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃｌ-４アルキル、Ｃ２-４アルケニル、Ｃ２-４アルキニル、Ｃ１-４アルコキシ、アミノ、Ｃｌ-４アルキルアミノ、ジ[Ｃ１-４アルキル]アミノ、Ｃｌ-４アルキルチオ、Ｃｌ-４アルキルスルフィンイル、Ｃ１-４アルキルスルホニル、Ｃ１-４アルキルカルボニル、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１-４アルコキシカルボニル、Ｃ１-４ アルカノイルアミノ、Ｎ-(Ｃ１-４アルキル)カルバモイル、Ｎ,Ｎ-ジ(Ｃ１-４アルキル)カルバモイル、シアノ、ニトロ及びトリフルオロメチルである。
【０１８３】
具体的な実施態様では、式ＩＩＩのＥＧＦＲアンタゴニストは、(１-ベンジル-１Ｈ-イミダゾール-５-イル)-(６-(５-((２-メタンスルホニル-エチルアミノ)-メチル)-フラン-２-イル)-ピリド[３,４-ｄ]ピリミジン-４-イル-アミン；(４-ベンジルオキシ-フェニル)-(６-(５-((２-メタンスルホニル-エチルアミノ)-メチル)-フラン-２-イル)-ピリド[３,４-ｄ]ピリミジン-４-イル-アミン；(１-ベンジル-１Ｈ-イミダゾール-５-イル)-(６-(５-((２-メタンスルホニル-エチルアミノ)-メチル)-フラン-２-イル)-キナゾリン-４-イル-アミン；(１-ベンジルＨ-イミダゾール-５-イル)-(７-(５-((２-メタンスルホニル-エチルアミノ)-メチル)-フラン-２-イル)-キナゾリン-４-イル-アミン；及び、(１-ベンジル-１Ｈ-イミダゾール-５-イル)-(６-(５-((２-メタンスルホニル-エチルアミノ)-メチル)-１-メチル-ピロール-２-イル)-キナゾリン-４-イル-アミンを除く。
【０１８４】
具体的な実施態様では、式ＩＩＩのＥＧＦＲアンタゴニストは、４-(４-フルオロベンジルオキシ)-フェニル)-(６-(５-((２-メタンスルホニル-エチルアミノ)メチル)-フラン-２-イル)-ピリド[３,４-ｄ]ピリミジン-４-イル)-アミン；(４-(３-フルオロベンジルオキシ)-フェニル)-(６-(５-((２-メタンスルホニル-エチルアミノ)メチル)フラン-２-イル)-ピリド[３,４-ｄ]ピリミジン-４-イル)-アミン；(４-ベンゼンスルホニル-フェニル)-(６-(５-((２-メタンスルホニル-エチルアミノ)-メチル)-フラン-２-イル)-ピリド[３,４-ｄ] ピリミジン-４-イル)-アミン；(４-ベンジルオキシ-フェニル)-(６-(３-((２-メタンスルホニル-エチルアミノ)-メチル)-フェニル)-ピリド[３,４-ｄ]ピリミジン-４-イル)-アミン；(４-ベンジルオキシ-フェニル)-(６-(５-((２-メタンスルホニル-エチルアミノ)-メチル)-フラン-２-イル)キナゾリン-４-イル)-アミン；(４-(３-フルオロベンジルオキシ-フェニル)-(６-(４-((２-メタンスルホニル-エチルアミノ)-メチル)-フラン-２-イル)-ピリド[３,４-ｄ]ピリミジン-４-イル)-アミン；(４-ベンジルオキシ-フェニル)-(６-(２-((２-メタンスルホニルエチルアミノ)-メチル)-チアゾール-４-イル)キナゾリン-４-イル)-アミン；Ｎ-{４-[(３-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-{４-[(３-フルオロベンジル)オキシ]-３-メトキシフェニル}-６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-[４-(ベンジルオキシ)フェニル]-７-メトキシ-６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-[４-(ベンジルオキシ)フェニル]-６-[４-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-{４-[(３-フルオロベンジル)オキシ]-３-メトキシフェニル}-６-[２-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-１,３-チアゾール-４-イル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-{４-[(３-ブロモベンジル)オキシ]フェニル}-６-[２-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-１,３-チアゾール-４-イル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-{４-[(３-フルオロベンジル)オキシ]フェニル)-６-[２-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)１,３-チアゾール-４-イル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-[４-(ベンジルオキシ)-３-フルオロフェニル-ｌ]-６-[２-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-１,３-チアゾール-４-イル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-(ｌ-ベンジル-ｌＨ-イミダゾール-５-イル)-７-メトキシ-６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-２-フリル]-Ｎ-(４-{[３-(トリフルオロメチル)ベンジル]オキシ)フェニル)-４-キナゾリンアミン；Ｎ-{３-フルオロ-４-[(３-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-{４-[(３-ブロモベンジル)オキシ]フェニル)-６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-[４-(ベンジルオキシ)フェニル]-６-[３-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-[ｌ-(３-フルオロベンジル)-ｌＨ-イミダゾール-５-イル]-６-[２-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-１,３-チアゾール-４-イル]-４-キナゾリンアミン；６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-２-フリル]-Ｎ-[４-(ベンゼンスルホニル)フェニル]-４-キナゾリンアミン；６-[２-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-１,３-チアゾール-４-イル]-Ｎ-[４-(ベンゼンスルホニル)フェニル]-４-キナゾリンアミン；６-[２-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-１,３-チアゾール-４-イル]-Ｎ-(４-{[３-(トリフルオロメチル)ベンジル]オキシ)フェニル)-４-キナゾリンアミン；Ｎ-{３-フルオロ-４-[(３-フルオロベンジル)オキシ]フェニル)-６-[２-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-１,３-チアゾール-４-イル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-(ｌ-ベンジル-ｌＨ-イミダゾール-５-イル)-６-[２-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-１,３-チアゾール-４-イル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-(３-フルオロ-４-ベンジルオキシフェニル)-６-[２-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-１,３-チアゾール-４-イル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-(３-クロロ-４-ベンジルオキシフェニル)-６-[２-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-１,３-チアゾール-４-イル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-{３-クロロ-４-[(３-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-２-フリル]-７-メトキシ-Ｎ-(４-ベンゼンスルホニル)フェニル-４-キナゾリンアミン；Ｎ-[４-(ベンジルオキシ)フェニル]-７-フルオロ-６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-(１-ベンジル-１Ｈ-イミダゾール-５-イル)-７-フルオロ-６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-[４-(ベンゼンスルホニル)フェニル]-７-フルオロ-６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ}メチル)-２-フリル]-４-キナゾリンアミン；Ｎ-(３-トリフルオロメチル-４-ベンジルオキシフェニル)-６-[５-({[２-(メタンスルホニル)エチル]アミノ)メチル)-４-フリル]-４-キナゾリンアミン；及びその塩及び溶媒和化合物からなる群から選択される。
【０１８５】
具体的な実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、Ｎ-[３-クロロ-４-[(３-フルオロフェニル)メトキシ]フェニル]-６-[５-[[[２-(メチルスルホニル)エチル]アミノ]メチル]-２-フランイル]-４-キナゾリンアミンジトシレート塩(ラパチニブ)である。
【０１８６】
具体的な実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、出典明記によって本明細書中に援用される国際公開０１３２６５１に開示される、以下の式ＩＶの化合物又はその塩である：
2011513427.tif 000012
上式中、
ｍは１から３の整数であり； 
Ｒ１はハロゲノ又はＣ１−３アルキルを表し；
Ｘ１は-０-を表し； 
Ｒ２は、以下の３つの基のうちの１から選択され： 
１) Ｃ１−５アルキルＲ３(このときＲ３は、ヒドロキシ、ハロゲノ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４ヒドロキシアルキルおよびＣ１−４アルコキシから選択される１又は２の置換基を持ってよいピペリジン-４-イルである)；
２) Ｃ２−５アルケニルＲ３(このときＲ３は本明細書中に定義する通りである)； 
３) Ｃ２−５アルキニルＲ３(このときＲ３は本明細書中に定義する通りである)、 
そして、何れかのアルキル、アルケニル又はアルキニル基は、ヒドロキシ、ハロゲノおよびアミノから選択される一又は複数の置換基を持っていてよい。
【０１８７】
具体的な実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、４-(４-クロロ-２-フルオロアニリノ)-６-メトキシ-７-(１-メチルピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリン；４-(２-フルオロ-４-メチルアニリノ)-６-メトキシ-７-(１-メチルピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリン；４-(４-ブロモ-２-フルオロアニリノ)-６-メトキシ-７-(１-メチルピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリン；４-(４-クロロ-２,６-ジフルオロアニリノ)-６-メトキシ-７-(１-メチルピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリン；４-(４-ブロモ-２,６-ジフルオロアニリノ)-６-メトキシ-７-(１-メチルピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリン；４-(４-クロロ-２-フルオロアニリノ)-６-メトキシ-７-(ピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリン；４-(２-フルオロ-４-メチルアニリノ)-６-メトキシ-７-(ピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリン；４-(４-ブロモ-２-フルオロアニリノ)-６-メトキシ-７-(ピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリン；４-(４-クロロ-２,６-ジフルオロアニリノ)-６-メトキシ-７-(ピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリン；４-(４-ブロモ-２,６-ジフルオロアニリノ)-６-メトキシ-７-(ピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリン；及び薬学的に許容可能なその塩類及び溶媒和化合物からなる群から選択される。
具体的な実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは、４-(４-ブロモ-２-フルオロアニリノ)-６-メトキシ-７-(Ｉ-メチルピペリジン-４-イルメトキシ)キナゾリン(ザクチマ)及びその塩類である。
【０１８８】
併用療法
本発明は、特定の治療計画の一部としてｃ−ｍｅｔアンタゴニストとＥＧＦＲアンタゴニストとを併用することにより、これらの治療薬の活性の組み合わせによる薬効を提供することを特徴とする。このような併用の薬効には、限定されないが、治療薬の併用による薬物動態学的又は薬力学的同時作用が含まれる。本発明は、様々な段階における様々な種類の癌の治療に特に有用である。
【０１８９】
癌という用語は、増殖異常の集合を包含し、限定しないが、前癌性の増殖、良性腫瘍、及び悪性腫瘍を含んでいる。良性腫瘍は、原発部位に局在したままであり、遠隔部位への浸潤能、侵入能、又は転移能を有していない。悪性腫瘍は周辺の他の組織に侵入してそれらの組織を損傷する。悪性腫瘍は、通常は血流を介して又はリンパ節が位置するリンパ系を介して、原発部位を離れて身体の他の部分へ広がる(転移する)能力を獲得することができる。原発腫瘍は、腫瘍が生じた組織の種類により分類され、転移性腫瘍は、癌細胞が由来する組織によって分類される。時間の経過に伴い、悪性腫瘍の細胞は異常性となって、正常細胞とは外観を異にする。このような癌細胞の外観の変化は腫瘍悪性度と呼ばれ、癌細胞は、高分化型（低悪性度）、中程度に分化型、低分化型、又は未分化型（高悪性度）と表わされる。高分化型細胞は、極めて正常な外観を有し、それらの細胞の起源である正常細胞に類似している。未分化細胞は、異常性が高いためにもはやそれら細胞の起源を決定することができない細胞である。
【０１９０】
癌ステージ分類システムは、解剖学的に癌がどの程度まで広がっているかを表わして、同じステージグループ内において、患者に対して同じような予後及び治療を付与しようとするものである。幾つかの試験を実行することにより、癌のステージ分類を補助することができ、そのような試験には、組織診と、胸部レントゲン検査、マンモグラフィ、骨スキャン、ＣＴスキャン、及びＭＲＩスキャンのような特定の画像化とが含まれる。患者の全体的な健康状態を評価し、癌が特定の器官に広がっているかどうかを検出するために、血液検査及び臨床評価も使用される。
【０１９１】
癌のステージ分類を行うために、アメリカ癌合同委員会（the American Joint Committee on Cancer）は、まず、癌、特に固形腫瘍を、ＴＮＭ分類システムを用いて文字により分類している。これは、癌を、文字Ｔ（腫瘍の大きさ）、Ｎ（触知可能なリンパ節）、及び／又はＭ（転移）で表わすものである。Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、及びＴ４は、原発病巣が大きくなっていることを表わし、Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３は、徐々にリンパ節の合併症が進行していることを表わし、Ｍ０及びＭ１は遠隔転移の有無を示している。
【０１９２】
第２のステージ分類法は、全病期分類（Overall Stage Grouping）又はローマ数字式分類（Roman Numeral Staging）として知られ、原発病巣の大きさとリンパ節への伝播と遠隔転移の存在を組み合わせて、癌を段階０〜ＩＶに分類するものである。このシステムでは、症例は、ローマ数字Ｉ〜ＩＶにより示される４つのステージにグループ分けされるか、又は「再発性」と分類される。乳癌の腺管上皮内癌又は非浸潤性小葉癌といった幾つかの症例の場合、ステージ０は「上皮内」又は「Tis」と呼ばれる。高悪性度の腺腫もステージ０に分類される。概して、ステージＩの癌は小さく局在化した癌であり、通常治癒可能であるが、ステージＩＶは、通常、手術不可能な癌又は転移性の癌を表わす。ステージＩＩ及びＩＩＩの癌は、通常、局所的に進行しており、及び／又は局所的リンパ節の関与を示している。一般に、ステージの番号が大きい程、腫瘍の大きさ、及び／又は近くのリンパ節及び／又は原発腫瘍に隣接する器官への伝播を含め、疾病が広範囲に亘ることを示す。このようなステージは正確に規定されているが、定義は、各種の癌によって異なっており、当業者に周知である。
【０１９３】
ＮＣＩの監視、疫学、及び遠隔成績プログラム（ＳＥＥＲ）のような多くの癌の記録では、略式のステージ分類を使用する。このシステムは、すべての種類の癌に使用されている。これは、癌の症例を以下の５つの主要なカテゴリにグループ分けするものである。
上皮内：  それが生じた細胞の層にのみ存在する早期癌
限局：  転移の証拠は無く、それが生じた器官に限定されている癌
隣接転移：  最初の（原発）部位を越えて近くのリンパ節又は器官及び組織に広がった癌
遠隔転移：  原発部位から遠隔器官又は遠隔リンパ節に広がった癌
不明：  ステージを示す十分な情報がない症例を表わすために使用される。
【０１９４】
加えて、原発腫瘍が除去されてから数か月又は数年後に、癌が再発することは珍しくない。可視の腫瘍が全て根絶された後に再発する癌は、再発性癌と呼ばれる。原発腫瘍の領域において再発する疾病は、局所的に再発性であり、転移として再発する癌は遠隔再発と呼ばれる。
【０１９５】
腫瘍は固形腫瘍であるか、或いは非固形腫瘍又は軟組織腫瘍でありうる。軟組織腫瘍の例には、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、又はヘアリーセル白血病）、或いはリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又はホジキン病）が含まれる。固形腫瘍には、血液、骨髄、又はリンパ系以外の身体組織のあらゆる癌が含まれる。固形腫瘍は更に、上皮細胞を起源とするものと、非上皮細胞を起源とするものとに分けられる。上皮細胞固形腫瘍の例には、胃腸管、大腸、乳房、前立腺、肺、腎、肝、膵臓、卵巣、頭頚部、口腔、胃の腫瘍、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、大陰唇、上咽頭、皮膚、子宮、雄性生殖器、尿路、膀胱、及び皮膚の腫瘍が含まれる。非上皮起源の固形腫瘍には、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が含まれる。
【０１９６】
幾つかの実施態様では、本発明の患者に対し、例えば治療前、及び／又は治療中、及び治療後に診断試験を行う。一般に、診断試験が実施される場合、治療を必要とする患者から試料を採取することができる。対象が癌に罹患している場合、試料は腫瘍試料、又はその他生物学的試料でありえ、例えば、限定しないが、血液、尿、唾液、腹水、又は血清及び血漿のような派生物などを含む生物学的流体である。
【０１９７】
本明細書において、生物学的試料は、固定された試料、例えばホルマリン固定されてパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）試料であるか、又は凍結された試料である。
【０１９８】
ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を決定する種々の方法は、限定しないが、遺伝子発現プロファイリング、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣ）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ法、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、大規模並行シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析、プロテオミクス、免疫組織化学（ＩＨＣ）などを含む。好ましくは、ｍＲＮＡは定量される。このようなｍＲＮＡ分析は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術を使用して、又はマイクロアレイ分析により実行される。ＰＣＲを使用する場合、ＰＣＲの好ましい形態は定量的リアルタイムＰｃＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。一実施態様では、上記遺伝子のうちの一又は複数の発現は、例えば同じ腫瘍種類の他の試料と比較して、中央値以上である場合に陽性発現とみなされる。中央値発現レベルは、基本的に、遺伝子発現の測定と同時に決定することができるか、又は事前に決定することができる。
【０１９９】
ＲＮＡ源として固定パラフィン包埋組織を用いる遺伝子発現プロファイリングの典型的なプロトコールのステップは、ｍＲＮＡの単離、精製、プライマーの伸張、及び増幅を含み、様々な出版物の記事に記載されている（例えば、Godfrey ら J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Spechtら、Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)）。簡単に説明すると、典型的なプロセスは、厚さ約１０マイクログラムのパラフィン包埋腫瘍組織の試料を切断することから開始される。次いでＲＮＡを抽出し、タンパク質及びＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の分析後に、必要に応じてＲＮＡ修復ステップ及び／又は増幅ステップを含み、遺伝子に特異的なプロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、その後ＰＣＲを行う。最後に、データを分析することにより、試験した腫瘍試料において特定された特徴的な遺伝子発現に基づいて、患者が受けることができる最善の治療オプションを特定する。
【０２００】
遺伝子又はタンパク質の発現の検出は、直接的に又は間接的に決定することができる。
（直接的に又は間接的に）癌におけるｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの発現又は増幅を決定することができる。様々な診断／予後判定アッセイが、このために利用可能である。一実施態様では、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲ過剰発現は、ＩＨＣによって分析することができる。腫瘍生検由来のパラフィン包埋組織切片に対してＩＨＣアッセイを行い、次のようなＥＧＦＲタンパク質染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０：染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋：わずかに／弱く認知できる程度の膜染色が１０％を上回る腫瘍細胞に検出される。細胞膜の一部のみが染色される。
スコア２＋：弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋：中程度から強い完全な膜染色が１０％を上回る腫瘍細胞に観察される。
【０２０１】
幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの過剰発現に関して０又は１＋スコアを呈する腫瘍は、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲを過剰発現しないことを特徴としうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアを呈する腫瘍は、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲの過剰発現を特徴としうる。
【０２０２】
幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍は、細胞１つ当たりに発現されるｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲ分子のコピーの数に対応する免疫組織化学的スコアにより評価することができ、生化学的に定量化することができる。すなわち：
０＝０〜１０，０００コピー／細胞
１＋＝少なくとも約２００，０００コピー／細胞
２＋＝少なくとも約５００，０００コピー／細胞
３＋＝少なくとも約２，０００，０００コピー／細胞
【０２０３】
或いは、又は加えて、ＦＩＳＨアッセイを、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織に実施して、腫瘍において(ある場合には)ｃ−ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲ増幅の範囲を決定することができる。
【０２０４】
ｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲ活性は、直接的に（例えば、ホスホ−ＥＬＩＳＡ試験、又はリン酸化したレセプターを定量化する他の方法により）、或いは間接的に（例えば、活性化した下流のシグナル伝達経路成分の検出、レセプター二量体（例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体）の検出、遺伝子発現プロファイルの検出などにより）、定量化することができる。
【０２０５】
同様に、ｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲの恒常的活性化、或いはリガンド独立性ＥＧＦＲ又はｃ−ｍｅｔの存在は、直接的又は間接的に（例えば、恒常的活性と相関するレセプター変異の検出、恒常的活性と相関するレセプター増幅の検出などにより）、定量化することができる。
【０２０６】
核酸突然変異の検出のための方法は当分野で公知である。しばしば、必ずしもそうではないが、突然変異が存在するかどうかの決定のために望ましい量の材料を得るために、試料中の標的核酸を増幅する。増幅技術は公知技術である。例えば、増幅された産物は、突然変異が予測される特定のアミノ酸配列位置／核酸配列位置を含む限り、対象とするタンパク質をコードするすべての核酸配列を包含してもよいし、しなくてもよい。
【０２０７】
一例では、変異の存在は、試料からの核酸を、突然変異した核酸をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させ、該ハイブリダイゼーションを検出することによって決定することができる。一実施態様では、プローブは例えば放射性同位元素(３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ等)、蛍光剤(ローダミン、フルオレセン等)又は発色剤で検出可能に標識される。いくつかの実施態様では、プローブはアンチセンスオリゴマー、例えばＰＮＡ、モルホリノ-ホスホロアミデート類、ＬＮＡ又は２'-アルコキシアルコキシである。プローブは約８ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、又は約１０から約７５、あるいは約１５から約５０、又は約２０から約３０でありうる。他の態様では、本発明の核酸プローブは試料中においてｃ-ｍｅｔ突然変異を同定するためのキットとして提供され、該キットは、ｃ-ｍｅｔをコードする核酸中の突然変異の部位に隣接して又は特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。該キットはキットを使用してハイブリダイゼーション試験の結果に基づいてｃ-ｍｅｔアンタゴニストでｃ-ｍｅｔ突然変異を含む腫瘍を有する患者を治療するための指示書を更に含みうる。
【０２０８】
また、突然変異は、野生型ｃ-ｍｅｔをコードする対応する核酸の電気泳動移動度と増幅された核酸の電気泳動移動度とを比較することによって検出することができる。移動度の相違は、増幅された核酸配列での突然変異の存在を示すものである。電気泳動移動度は、例えばポリアクリルアミドゲル上での、任意の適切な分子分離技術により測定されうる。
【０２０９】
また、核酸を、酵素突然変異検出法(Enzymatic Mutation Detection (EMD))(Del Tito等, Clinical Chemistry 44:731-739, 1998)を使用して突然変異の検出について分析することができる。ＥＭＤはバクテリオファージリゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼVIIを使用し、これは、点突然変異、挿入及び欠失などの核酸変異から生じる塩基対ミスマッチによって引き起こされる構造的歪みを検出し切断するまで二本鎖ＤＮＡに沿ってスキャンする。例えばゲル電気泳動によってリゾルベース切断により形成された２つの短い断片の検出は突然変異の存在を示している。ＥＭＤ法の利点は、増幅反応から直接アッセイされた点突然変異、欠失及び挿入を同定する単一のプロトコールであり、試料を精製する必要がなく、ハイブリダイゼーション時間を短縮し、信号対雑音比を増大させることである。２０倍までの過剰な正常核酸及び４ｋｂのサイズまでの断片を含む混合試料をアッセイすることができる。しかしながら、ＥＭＤスキャンは突然変異陽性試料中に生じる特定の塩基変化を同定せず、必要ならば特異的な突然変異を同定するために更なる配列決定手順を必要とする。ＣＥＬI酵素は米国特許第５８６９２４５号に実証されているようにリゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼVIIと同様にして使用することができる。
【０２１０】
突然変異を検出するための他の簡便なキットは、ヘモクロマトーシスを引き起こすＨＦＥ、ＴＦＲ２及びＦＰＮ１遺伝子における多重突然変異の検出のためのヘマクロマトーシスストリップアッセイ(Haemochromatosis  StripAssayTM)(Viennalabs http://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)に類似したリバースハイブリダイゼーションテストストリップである。そのようなアッセイは、ＰＣＲによる増幅に続く配列特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。単一突然変異アッセイに対しては、マイクロプレートベースの検出系を適用することができる一方、多重突然変異アッセイに対しては、ストリップは「マクロ-アレイ」として使用することができる。キットは試料調製、増幅及び突然変異検出のための直ぐに使用できる試薬を含みうる。多重増幅プロトコルは利便性を提供し、非常に限られた体積の試料の試験を可能にする。直接的なストリップアッセイ(StripAssay)態様を使用して、２０及びそれ以上の突然変異の試験を、高価な装置を用いないで５時間未満で完了させることができる。ＤＮＡが試料から単離され、標的核酸がインビトロで増幅され(例えばＰＣＲ)、一般的には単一(「多重(multiplex)」)増幅反応においてビオチン標識される。増幅産物は、プローブが平行線又はバンドとして固定されているストリップのような固体担体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブ(野生型及び変異型特異的)に選択的にハイブリダイズされたものである。結合したビオチン標識単位複製配列はストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ及び有色基質を使用して検出される。そのようなアッセイは本発明の突然変異の全て又は任意のサブセットを検出することができる。特定の突然変異プローブバンドに対しては３種のシグナル伝達パターンの一つが可能である：(i) 正常な核酸配列を示す野生型プローブに対してのみのバンド、(ii) ヘテロ接合遺伝子型を示す野生型及び突然変異双方のプローブに対するバンド、及び(iii) ホモ接合突然変異遺伝子型を示す突然変異プローブだけに対するバンド。従って、ある態様では、本発明は、本発明の突然変異を検出する方法であって、増幅産物がリガンドを含むように、試料から標的のｃ-ｍｅｔ核酸配列を単離及び／又は増幅し、増幅産物を、リガンドに対する検出可能な結合対を含むプローブであって本発明の突然変異体に特異的にハイブリダイズ可能なプローブに接触させ、ついで上記増幅産物に対する上記プローブのハイブリダイゼーションを検出する方法が更に提供される。一実施態様では、リガンドはビオチンであり、結合対はアビジン又はストレプトアビジンを含む。一実施態様では、結合対は、有色基質で検出可能なストレプトアビジン-アルカリ性である。一実施態様では、プローブは例えばストリップ上に固定されており、そこで、異なった突然変異に相補的であるプローブが互いに分離される。あるいは、増幅された核酸は、放射性同位元素で標識され、その場合、プローブは検出可能な標識を含む必要はない。
【０２１１】
野生型遺伝子の改変は、挿入、逆位、削除、及び／又は点変異といった突然変異の全ての形態を包含する。一実施態様では、突然変異は体細胞性である。体細胞性突然変異は、特定の組織、例えば腫瘍組織においてのみ発生し、生殖系列細胞に遺伝しないものである。生殖系列細胞突然変異は、あらゆる身体組織において見られる。
【０２１２】
標的核酸を含有する試料は、当分野で周知な、腫瘍の特定の種類や位置に適した方法によって入手できる。組織生検は、腫瘍組織の代表的な部分を得るために用いることが多い。これに対して、腫瘍細胞は、対象とする腫瘍細胞を含むことがわかっている又は含むと思われる組織／体液の形態で間接的に入手できる。例えば、肺癌病変の試料は、切除術、気管支鏡検査法、細針吸引、気管支のブラッシングによって、又は、痰、肋膜体液又は血液から入手してもよい。突然変異遺伝子又は遺伝子産物は、腫瘍から、又は、他の体試料、例えば尿、痰又は血清から検出できる。腫瘍試料中の突然変異標的遺伝子ないし遺伝子産物の検出のための上記に記載の同じ技術を他の体試料に応用できる。癌細胞は腫瘍からはがれて、このような体試料中に出現する。このような体試料のスクリーニングによって、癌などの疾患の診断を簡単かつ迅速に行うことができる。加えて、治療の経過は、突然変異標的遺伝子ないし遺伝子産物についてこのような体試料を試験することによって、より容易にモニタリングすることができる。
【０２１３】
腫瘍細胞の組織調製物を濃縮する方法は公知技術である。例えば、組織は、パラフィン切片又はクリオスタット切片から単離してもよい。また、癌細胞は、フローサイトメトリ又はレーザー捕獲顕微解剖によって正常細胞から切り離してもよい。正常細胞から腫瘍を分離するためのこれら並びに他の技術は公知技術である。腫瘍組織が正常細胞と非常に混濁している場合、突然変異の検出はより難しいが、混入及び／又は偽陽性／陰性の結果を最小化する技術が公知である。そのいくつかを以下に記述する。例えば、試料は、対象とする腫瘍細胞と結合するが対応する正常細胞とは結合しない、又はその逆も可であることがわかっているバイオマーカー(突然変異を含む)の存在について評価してもよい。
【０２１４】
標的核酸中の点突然変異の検出は、当該分野でよく知られている技術を使用して標的核酸を分子クローニングし、核酸を配列決定することによって達成することができうる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を使用して、腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製物から直接的に標的核酸配列を増幅させることができる。ついで、増幅された配列の核酸配列を決定し、それから突然変異を同定することができる。増幅技術は当該分野でよく知られており、Saiki等, Science 239:487, 1988；米国特許第４６８３２０３号；及び米国特許第４６８３１９５号に記載されている。
【０２１５】
適切なプライマーの設計及び選択は、従来技術において確立されていることに注意されたい。
【０２１６】
また、当該分野で知られているリガーゼ連鎖反応を、標的核酸配列を増幅させるために使用することができる。例としてWu等, Genomics, Vol. 4, pp.560-569 (1989)を参照。さらに、対立遺伝子特異的ＰＣＲとして知られている技術を使用することができる。例としてRuano及びKidd, Nucleic Acids Research, Vol. 17, p. 8392, 1989を参照。この技術によれば、特定の標的核酸突然変異にその３'末端でハイブリダイズするプライマーが使用される。特定の突然変異が存在していない場合は、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公開第０３３２４３５号及び Newton等, Nucleic Acids Research, Vol. 17, p.7, 1989に開示されたAmplification Refractory Mutation System (ARMS) もまた使用することができる。遺伝子の挿入及び欠失もまたクローニング、配列決定及び増幅によって検出することができる。また、遺伝子又は周りのマーカー遺伝子に対する制限酵素断片長多型(ＲＦＬＰ)プローブを、多型断片における対立遺伝子の改変又は挿入をスコア付けするために使用することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型(ＳＳＣＰ)解析もまた対立遺伝子の塩基変化変異体を検出するために使用することができる。例としてOrita等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989,及びGenomics, Vol. 5, pp. 874-879, 1989を参照。また、当該分野で知られているような挿入及び欠失を検出する他の方法を使用することができる。 
【０２１７】
野生型遺伝子の改変は野生型遺伝子発現産物の改変に基づいて検出することもできる。そのような発現産物にはｍＲＮＡ並びにタンパク質産物の双方が含まれる。点突然変異は、ｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの分子クローニングによって又はｍＲＮＡを増幅し配列決定することによって、検出することができる。クローン化ｃＤＮＡの配列は当該分野でよく知られたＤＮＡ配列決定法を使用して決定することができる。ｃＤＮＡはまたポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって配列決定することもできる。
【０２１８】
ミスマッチは、１００％相補的ではないハイブリダイズした核酸二本鎖である。完全な相補性の欠如は欠失、挿入、逆位、又は置換又はフレームシフト突然変異によりうる。ミスマッチの検出は標的の核酸中における点突然変異を検出するために使用することができる。これらの技術は配列決定よりも感受性が低いが、より簡便に多数の腫瘍試料に対して実施することができる。ミスマッチ切断技術の一例はリボヌクレアーゼ保護法であり、これは、Winter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p.7575, 1985及びMeyers等, Science, Vol. 230, p.1242, 1985に詳細に記載されている。例えば、本発明の方法は、ヒトの野生型標的核酸に相補的である標識されたリボプローブの使用を伴いうる。リボプローブと腫瘍試料由来の標的核酸は一緒にアニール(ハイブリダイズ)され、続いて二本鎖ＲＮＡ構造中の幾らかのミスマッチを検出することができる酵素リボヌクレアーゼＡで消化される。ミスマッチがリボヌクレアーゼＡによって検出される場合、それはミスマッチ部位で切断される。よって、アニールされたＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックスで分離されると、ミスマッチがリボヌクレアーゼＡによって検出され切断された場合、リボプローブとｍＲＮＡ又はＤＮＡに対する完全長二本鎖ＲＮＡよりも小さいＲＮＡ産物が見られる。リボプローブは標的核酸ｍＲＮＡ又は遺伝子の完全長である必要はないが、標的核酸の一部であり、変異していると思われる部位を含むものである。リボプローブが標的核酸ｍＲＮＡ又は遺伝子のセグメントのみを含む場合、多くのこれらプローブを使用してミスマッチに対する全標的核酸配列をスクリーニングすることが望ましい。
【０２１９】
同様な形で、ＤＮＡプローブを用いて、酵素的又は化学的切断などを介して、ミスマッチを検出することができる。例としてCotton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, 4397, 1988；及びShenk等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, p. 989, 1975を参照のこと。あるいは、ミスマッチは、マッチした二本鎖に対するミスマッチの二本鎖の電気泳動移動度における変化によって検出することができる。例としてCariello, Human Genetics, Vol. 42, p.726, 1988を参照のこと。リボプローブかＤＮＡプローブの何れかを用いて、突然変異を含みうる標的核酸ｍＲＮＡ又はＤＮＡはハイブリダイゼーション前に増幅させることができる。標的核酸のＤＮＡの変化は、例えば欠失及び挿入のように特に変化が全体的な再配列である場合は、サザンハイブリダイゼーションを使用して検出することもできる。
【０２２０】
また、増幅された標的核酸のＤＮＡ配列を、対立遺伝子特異的プローブを使用してスクリーニングすることもできる。これらのプローブは核酸オリゴマーであり、その各々が既知の突然変異を有する標的核酸遺伝子の領域を含む。例えば、一つのオリゴマーは、標的遺伝子配列の一部に対応する、約３０ヌクレオチド長でありうる。そのような一連の対立遺伝子特異的プローブの使用によって、標的核酸増幅産物をスクリーニングし、標的遺伝子中における過去に同定された突然変異の存在を同定することができる。増幅された標的核酸配列との対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションは例えばナイロンフィルターで実施することができる。ストリンジェントなハイブリダイズ条件下での特定のプローブのハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブにおけるものと同じ突然変異が腫瘍組織に存在していることを示している。
【０２２１】
野生型標的遺伝子の改変はまた対応する野生型タンパク質の改変についてスクリーニングすることによっても検出することができる。例えば、標的遺伝子産物と免疫反応性であるモノクローナル抗体、その例として遺伝子産物(タンパク質)の特定の変異した位置に結合することがわかっている抗体を用いて組織をスクリーニングすることができる。例えば、用いる抗体が、欠失したエキソン(例えば、エキソン１４)に結合する抗体又は、標的タンパク質の欠失した部位を含んでなる立体配位的なエピトープに結合する抗体でありうる。同種抗原の欠如が突然変異を示すであろう。また、突然変異対立遺伝子の産物に特異的な抗体を突然変異遺伝子産物の検出に使用することができる。抗体はファージディスプレイライブラリーから同定することができる。そのような免疫学的アッセイは当該分野で知られている任意の簡便な形態で行うことができる。これらには、ウェスタンブロット、免疫組織化学的アッセイ及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。改変されたタンパク質を検出するための任意の手段を、野生型標的遺伝子の改変を検出するために使用することができる。
【０２２２】
プライマー対はポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅技術を用いて標的核酸のヌクレオチド配列の決定のために有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーの対は標的配列を刺激増幅するために標的核酸配列内又は該標的核酸配列を囲む配列にアニーリングすることができる。対立遺伝子特異的プライマーもまた使用することができる。このようなプライマーは特定の突然変異標的配列にのみアニールし、よって鋳型としての突然変異標的配列の存在下でのみ産物を増幅する。引き続いての増幅された配列のクローニングを容易にするために、プライマーはその末端に付属した制限酵素部位配列を有しうる。そのような酵素及び部位は当該分野でよく知られている。そのプライマー自体は、当該分野でよく知られている技術を使用して合成することができる。一般に、プライマーは、商業的に入手できるオリゴヌクレオチド合成機を使用して作製することができる。特定のプライマーの設定は十分に当業者の技量の範囲内である。
【０２２３】
核酸プローブは多くの目的のために有用である。それらはゲノムＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーションにおいて、また上で既に検討した点突然変異を検出するためのリボヌクレアーゼ保護法において使用することができる。プローブは標的核酸増幅産物を検出するために使用することができる。それらはまた他の技術を使用して野生型遺伝子又はｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用することもできる。ミスマッチは酵素(例えばＳ１ヌクレアーゼ)か、化学物質(例えばヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム及びピペリジン)か、又は完全にマッチしたハイブリッドと比較した場合のミスマッチハイブリッドの電気泳動移動度の変化の何れかを使用して検出することができる。これらの技術は当該分野で知られている。Novack等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.83, p.586, 1986を参照。一般に、プローブはキナーゼドメイン外の配列に相補的である。一連の核酸プローブを用いて、標的核酸中の突然変異を検出するためのキットを構成することができる。そのキットにより、対象とする標的配列の広い領域へのハイブリダイゼーションが可能になる。プローブは互いにオーバーラップしていてもよいし又は近接していてもよい。
【０２２４】
リボプローブをｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用する場合、それは標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的である。よって、リボプローブは、センス鎖に相補的であるため、対応する遺伝子産物をコードしていない点でアンチセンスプローブである。リボプローブは一般に放射性、比色性、又は蛍光定量物質で標識され、これは当該分野で知られている任意の手段によって達成することができる。リボプローブがＤＮＡとのミスマッチを検出するために使用される場合、それは何れの極性でも、センス又はアンチセンスでもありうる。同様に、ＤＮＡプローブを、ミスマッチを検出するために使用することもできる。
【０２２５】
場合によっては、癌は、ｃ−ｍｅｔレセプター及び／又はＥＧＦＲを過剰発現するか、又はしない。レセプターの過剰発現は、細胞表面上に存在するレセプタータンパク質のレベルの上昇を（例えば免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣにより）評価することにより、診断又は予後判定アッセイにおいて決定することができる。或いは又は加えて、例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ、１９９８年１０月に公開の国際公開第９８／４５４７９号参照)、サザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)によって、細胞内のレセプターコード化核酸のレベルを測定してもよい。上記のアッセイを除き、技術者は様々なインビボアッセイを利用することができる。例えば、場合によって、検出可能な標識、例えば放射性同位体で標識した抗体に患者の体内の細胞を曝し、例えば放射能の外的スキャンによって、又は前もって抗体に曝される患者から採取した生検を分析することによって、患者の細胞に対する抗体の結合を評価してもよい。
【０２２６】
化学療法剤
本発明の併用療法は、更に、一又は複数の化学療法剤を含むことができる。併用投与は、別個の製剤又は単一の医薬的製剤を用いた同時投与又は同時発生的投与と、好ましくは両方（又は全て）の活性剤の生物学的活性が同時に発揮される期間を提供する、順序を問わない継続的投与とを含む。
【０２２７】
投与される場合、化学療法剤は普通、そのような薬剤に既知の用量で投与されるか、場合によっては薬剤の併用作用又は代謝拮抗性の化学療法剤の投与に起因する有害な副作用により用量が低減される。このような化学療法剤の調製及び投与計画は、製造者の指示に従って、又は当業者の経験的決定により、使用することができる。
【０２２８】
併用可能な様々な化学療法剤は上記に開示した。組み合わせる好ましい化学療法剤は、タキソイド（ドセタキセル及びパクリタキセルを含む）、ビンカ（例えばビノレルビン又はビンブラスチン）、白金化合物（例えばカルボプラチン又はシスプラチン）、アロマターゼ阻害剤（例えばレトロゾール、アナストロゾール、又はエキセメスタン）、抗エストロゲン（例えばフルベストラント又はタモキシフェン）、エトポシド、チオテパ、シクロホスファミド、メトトレキサート、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、カペシタビン、ゲムシタビン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、又はプロテアソーム阻害剤（例えばＰＳ３４２）からなる群より選択される。
【０２２９】
製剤、用量、及び投与
本発明に使用される治療薬の製剤、用量、及び投与は、良質な医療慣行（good medical practice）に則って決定される。この文脈で考慮すべき要素には、治療対象となる特定の障害、特定の治療対象、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、併用される薬剤同士の相互作用、及び医療従事者に既知のその他の要素が含まれる。
【０２３０】
治療的製剤は、従来技術に既知の標準的方法を用いて、所望の純度を有する有効成分と、任意の生理学的に許容可能な担体と、賦形剤又は安定剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences (第20版)、A. Gennaro編, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）とを混合することにより調製される。許容可能な担体には、生理食塩水又はリン酸塩のようなバッファと、クエン酸塩及びその他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミンなどのタンパク質と、ゼラチン又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコースを含むその他の炭水化物、マンノース、又はデキストリン；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、又はＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２３１】
随意で、しかし好ましくは、製剤は、製薬的に許容可能な塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくはほぼ生理的濃度で含んでいる。随意で、本発明の製剤は、製薬的に許容可能な保存料を含むことができる。幾つかの実施態様では、保存料の濃度は０．１〜２．０％（典型的にｖ／ｖで）である。適切な保存料には、薬剤的従来技術において既知のものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベンが好ましい保存料である。場合によっては、本発明の製剤は、製薬的に許容可能な界面活性剤を０．００５〜０．０２％の濃度で含むことができる。
【０２３２】
本明細書における製剤は、治療される特定の徴候に必要な二つ以上の活性化合物、好ましくは互いに逆に作用しない相補的活性を有する化合物を含むこともできる。このような分子は、適切には、意図された目的に有効な量で併用される。
【０２３３】
有効成分は、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合、例えばそれぞれコロイド性薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及び名のカプセル）又はマクロエマルシンの、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、マイクロカプセルに封入された形態に調製することもできる。このような技術は、上掲のRemington’s Pharmaceutical Sciencesに開示されている。
【０２３４】
徐放性製剤を調整してもよい。徐放性製剤の適切な例として、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透性基質を上げることができ、この基質は、有形物、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌグルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミンの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及びリュープロリド酢酸塩からなる注射可能な微粒子）のような、分解性の乳酸−グリコール酸の共重合体、並びにポリ−Ｄ−（−）３−ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレンビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日に亘る分子の放出を可能にし、一方、特定のハイドロゲルは、それよりも短期間に亘ってタンパク質を放出する。カプセル封入された抗体は、体内に長時間留まるとき、３７℃で水分に曝されることにより、変性又は凝集し、その結果生物学的活性を失い、場合によっては免疫原生が変化する。関与する機序に応じて、安定化のために合理的な戦略を講じることができる。例えば、凝集の機序が、チオ−ジスルフィド交換により分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液の凍結、水分含有率の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマー基質組成物の開発により、安定化させることができる。
【０２３５】
本発明の治療薬は、ヒト患者に対し、ボーラスとしての静脈内投与、或いは、一定の時間に亘る持続点滴、筋肉内投与、口腔内投与、脳脊髄内投与、皮下投与、関節内投与、髄膜内投与、くも膜下腔内投与、経口投与、局所投与、又は吸入といった既知の方法に従って、投与することができる。治療的適用のために、ex vivo戦略も使用することができる。ex vivo戦略では、対象から採取した細胞に、ｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを形質移入又は形質導入する。次いで、形質移入又は形質導入された細胞を対象に戻す。細胞は、限定しないが、造血性細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞）、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、又は筋細胞を含む、広範な種類のあらゆる細胞とすることができる。
【０２３６】
例えば、ｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲアンタゴニストが抗体である場合、この抗体は、非経口的投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、局所的免疫抑制治療に望ましい場合は病巣内投与を含む任意の適切な手段により投与される。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。加えて、抗体は、特に抗体の用量を減らしながら、パルス注入により適切に投与される。好ましくは、投薬は、投与期間の長短に応じて、注射により、最も好ましくは静脈内注入又は皮下注入により、行われる。
【０２３７】
別の実施例では、ｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲアンタゴニスト化合物は、障害又は腫瘍の位置が許す場合、局所的に、例えば直接的注入により投与され、注入は周期的に反復可能である。また、ｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲアンタゴニストは、局所的再発又は転移を防止又は低減するために、患者の全身に、又は腫瘍細胞に直接、例えば腫瘍の外科的切除後に、腫瘍又は腫瘍病床に対して送達することができる。
【０２３８】
併用療法における治療薬の投与は、所定の期間（通常は、選択される組み合わせに応じて、数分、数時間、数日、又は数週）に亘って行うことができる。併用療法は、このような治療薬を連続して、即ち各治療薬を異なる時間に投与する投与方法、並びに、このような治療薬、又は少なくとも二つの治療薬をほぼ同時に投与する投与方法を包含する。
【０２３９】
治療薬は、同じ経路又は異なる経路により投与することができる。例えば、組み合わせたＥＧＦＲ又はｃ−ｍｅｔアンタゴニストを静脈内注により投与し、組み合わせたプロテインキナーゼ阻害剤を経口投与することができる。別の方法では、例えば、特定の治療薬に応じて、両方の治療薬を経口投与するか、又は両方の治療薬を静脈内注入することができる。治療薬を投与する順番は、特定の薬剤に応じて変更することもできる。
【０２４０】
例えば、一又は複数の別個の投与を行うか、又は連続注入を行うかに関係なく、疾病の種類及び重症度に応じて、患者に投与される各治療薬の初回の候補用量は、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）である。典型的な一日当たりの用量は、上記要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上に亘りうる。数日間以上に亘って反復投与する場合、状態に応じて、上記方法によって測定した場合に癌が治療されるまで、治療を持続する。しかしながら、他の投与計画も有用でありうる。一実施例では、ｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲアンタゴニストが抗体である場合、本発明の抗体は、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で、２〜３週間毎に投与される。ｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲアンタゴニストが内服用小分子化合物である場合、薬剤は毎日、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。更に、本発明の内服用化合物は、伝統的な高用量間欠的投与計画で、又は中断を設けずに用量を減らし且つ頻度を上げて（「メトロノミック療法」と呼ぶ））投与することができる。間欠的投与計画を使用する場合、例えば、薬剤の投与は、１日当たりの用量及び特定の徴候に応じて、２〜３週間に亘って毎日行った後、１週間中断するか；又は、４週間に亘って毎日行った後、２週間中断する。本発明の療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０２４１】
本出願では、遺伝子療法によるｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲアンタゴニストの投与を考慮する。例えば、１９９６年３月１４日に公開された、細胞内抗体を生成するための遺伝子療法の使用に関する国際公開第９６／０７３２１号を参照されたい。
【０２４２】
核酸(場合によってはベクター内に含まれたもの)を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は患者の、抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する(米国特許第４８９２５３８号及び第５２８３１８７号参照)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって、異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【０２４３】
現在インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス)、及び脂質ベースのシステム(例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)での形質移入を含む。幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞、標的細胞上のレセプターのリガンドなどに特異的な抗体とともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を用いて、ターゲティング及び／又は取り込みを促す。そのタンパク質は、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて、内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)、及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開９３／２５６７３及びそこに引用された参考文献も参照。
【０２４４】
後述は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上述した概要に基づいて、他に様々な実施態様が実施可能であることを理解されたい。
【実施例】
【０２４５】
実施例１：ＮＳＣＬＣ細胞株および腫瘍試料におけるｃ−ｍｅｔおよびＥＧＦＲ発現の分析。
材料および方法
マイクロアレイ試験。  ＮＳＣＬＣ細胞株および原発性腫瘍の基礎遺伝子発現分析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ (Santa Clara, CA)マイクロアレイプラットフォーム(ＨＧＵ１３３Ｐｌｕｓ＿２．０チップ)上で、コンフルエント未満の細胞培養物又は凍結腫瘍溶解物から抽出したＲＮＡを使用して行った。基本的にHoffman EP et al., Nat Rev Genet 5:229-37 (2004)にて記載されるように、相補的ＲＮＡの調製、アレイハイブリダイゼーションおよびその後のデータ分析は、製造業者のプロトコールを使用して実施した。
ＮＳＣＬＣ試料において発現される他のレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の発現とｃ−ｍｅｔ発現との相関性を評価するために、変動フィルターを用いて、分析する試料全体にわたって変動が極小さい遺伝子を除外した。発現が極小さい遺伝子(試料全体の絶対的な変動(最大−最小)が１０００未満であったもの)は、更なる分析から除いた。さらに、１つの遺伝子を表すために単一プローブを選択した。スピアマン順位相関係数(ρ)は、ＭＥＴ ｍＲＮＡ(プローブＩＤ、２０３５１０＿ａｔ)又はｃ−ｍｅｔタンパク質(ＩＨＣ)に対する各々の遺伝子について決定した。
【０２４６】
定量的ＰＣＲ。  ＥＧＦＲおよびＭＥＴのｍＲＮＡ発現レベルは、標準的なＴａｑｍａｎ技術を使用した定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。転写レベルは、ハウスキーピング遺伝子リボソームタンパク質Ｌ１９(ＲＰＬ１９)に正規化し、結果は、正規化した発現値(＝２−ΔＣｔ)又はプールした組織源と比較したときの正規化した発現(＝２−ΔΔＣｔ)として表した。以下のプライマー／プローブ対を用いた。 
ＲＰＬ１９：フォワードプライマー、5'-ACCCCAATGAGACCAATGAAATC-3'(配列番号：２６)、リバースプライマー、5'-ATCTTTGATGAGCTTCCGGATCT-3'(配列番号：２７)、
プローブ、5'(VIC)- AATGCCAACTCCCGTCAG-(MGBNFQ)-3'(配列番号：２８)；
ＭＥＴ：フォワードプライマー、5'- CATTAAAGGAGACCTCACCATAGCTAAT-3'(配列番号：２９)、 
リバースプライマー、5'- CCTGATCGAGAAACCACAACCT-3'(配列番号：３０)、
プローブ、5'(FAM)- CATGAAGCGACCCTCTGATGTCCCA-(BHQ-1)-3'(配列番号：３１)。
ＥＧＦＲのためのプライマー／プローブ対は、Applied Biosystems (カタログ番号4331182、Hs00193306; Foster City, CA)から購入した。
【０２４７】
免疫組織化学(ＩＨＣ)。  ホルマリン固定しパラフィン包埋した試料は５ミクロン厚で切断しスライド上へ置いた。脱パラフィンおよび再水和の後、切片は、ｃ−ＭｅｔおよびＥＧＦＲのＩＨＣ分析のために処理した。ＥＧＦＲ ＩＨＣは、製造業者の指示に従って、ＥＧＦＲ ｐｈａｒｍＤｘＴＭキット(Dako, Glostrup, Denmark)を用いて実施した。ｃ-ｍｅｔ免疫組織化学(ＩＨＣ)のために、ｃ−ｍｅｔ ＩＨＣについて、予め熱した標的検索バッファ(Dako, Glostrup, Denmark)を用いて９９℃で４０分間かけて抗原検索を行った。内因性ペルオキシダーゼ活性は、ＫＰＬブロック溶液(KPL, Gaithersburg, MD)にて室温で４分間かけて反応を停止させた。内在性アビジン／ビオチンは、ベクターアビジンビオチンブロッキングキット(Vector Laboratories, Burlingame, CA)にてブロックした。その後、切片は、ブロック血清中の１０μｇ／ｍｌのマウス抗ｃ−ｍｅｔ(クローンＤＬ-２１)モノクローナル抗体(Upstate Biotechnology Inc. Lake Placid, NY)と共に室温で６０分間インキュベートし、その後、ビオチン化した二次ウマ抗マウス抗体と共に３０分間インキュベートした。金属増強ＤＡＢ(Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL)を含むベクタステインＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ試薬(Vector Laboratory, Burlingame, CA)を用いて、スライドを反応させた。発現のレベルは、陰性(−)、弱い(＋)、中程度(＋＋)又は強い(＋＋＋)と定義した。弱いか、中程度であるか、強い染色を示す腫瘍細胞を１０％より多く含む細胞株又は腫瘍試料は、陽性であると判断した。
【０２４８】
細胞培養物および腫瘍試料。  細胞株は、表１に示すように、American Type Culture Collection、NCI Division of Cancer Treatment and Diagnosis、及びJapanese Health Sciences Resources受託機関から入手した。すべての細胞株は、１０％ＦＢＳ(Sigma, St. Louis, MO)および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。腫瘍試料は、University of Michigan、Cybrdio、Cooperative Human Tissue NetworkおよびIntegrated Laboratoryサービスから入手した。
表１：実施例で使用される細胞株
2011513427.tif 000013
2011513427.tif 000014
* アメリカ培養細胞系統保存機関。
** Japanese Health Sciences Resources。
*** National Cancer Institute Division of Cancer Treatment and Diagnosis。
【０２４９】
結果
ＮＳＣＬＣ細胞株においてＭＥＴ ｍＲＮＡ発現はＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現と相関する
ＮＳＣＬＣ細胞株においてｃ−ｍｅｔの発現がＥＧＦＲおよび他のレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の発現と相関するか否かを評価するために、スピアマン順位相関係数を、表１に示す５０のＮＳＣＬＣ細胞株から生成されるマイクロアレイに基づく遺伝子発現データから決定した。ＥＧＦＲとＭＥＴのｍＲＮＡレベルは、細胞株においてポジティブに相関しており(ρ＝０．５４、ｐ＜０．０００１)、ＥＧＦＲ発現はＭＥＴ発現と非常に相関していた(表２)。
表２  ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＲＴＫ ｍＲＮＡ発現とＭＥＴ ｍＲＮＡ発現との相関性。
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【０２５０】
ＮＳＣＬＣ細胞株においてｃＭＥＴタンパク質発現はＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現と相関する
免疫組織化学(ＩＨＣ)によって決定されるｃ-ｍｅｔタンパク質発現が、ＮＳＣＬＣ細胞株においてＥＧＦＲおよび他のレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の発現と相関するか否かを評価するために、スピアマン順位相関係数を、表１に示される５０のＮＳＣＬＣ細胞株において生成されるマイクロアレイに基づく遺伝子発現データから決定した。この細胞株においてＥＧＦＲ ｍＲＮＡとｃ−ｍｅｔタンパク質レベルはポジティブに相関しており(ρ＝０．５０、ｐ＝０．００２)、ＥＧＦＲ発現はｃ−ｍｅｔタンパク質の発現と非常に相関していた(表３)。  
表３  ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＲＴＫ ｍＲＮＡ発現とｃ−ＭＥＴタンパク質発現(ＩＨＣ)との相関性。
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【０２５１】
ＮＳＣＬＣ腫瘍試料においてＭＥＴ ｍＲＮＡ発現はＥＧＦＲ ｍＲＮＡ発現と相関する
表１に示すＮＳＣＬＣ細胞株において、ｃ-ｍｅｔ ｍＲＮＡ発現が、ＥＧＦＲおよび他のレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の発現と相関するか否かを評価するために、スピアマン順位相関係数を、７８のＮＳＣＬＣ腫瘍から生成されるマイクロアレイに基づく遺伝子発現データから決定した。ＮＳＣＬＣ腫瘍においてＥＧＦＲ ｍＲＮＡとＭＥＴ ｍＲＮＡの発現はポジティブに相関した(ρ＝０．２６、ｐ＝０．０２)(表４)。
表４  ＮＳＣＬＣ腫瘍におけるＲＴＫ ｍＲＮＡ発現とＭＥＴ ｍＲＮＡ発現との相関性
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【０２５２】
ＮＳＣＬＣ細胞株及び原発性腫瘍におけるＥＧＦＲとＭＥＴの同時発現
ＮＳＣＬＣ細胞株及び原発性腫瘍試料においてｃ−ｍｅｔとＥＧＦＲが同時発現されるか否かを評価するために、ＥＧＦＲおよびＭＥＴのｍＲＮＡの発現を、ＮＳＣＬＣ細胞株(表１示す)又は凍結原発性ＮＳＣＬＣ腫瘍溶解物のパネルでの定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＥＧＦＲおよびＭＥＴのｍＲＮＡレベルは、細胞株(ρ＝０．５９、ｐ＜０．０００１)(図１、左パネル)および原発性ＮＳＣＬＣ試料(ρ＝０．４８、ｐ＝０．０００３)(図１、右パネル)においてポジティブに相関していた。これらのデータは、ＮＳＣＬＣ細胞株および原発性腫瘍試料においてＭＥＴとＥＧＦＲの発現にオーバーラップがあることを示す。
【０２５３】
ＮＳＣＬＣ細胞株および原発性腫瘍のＩＨＣによるＥＧＦＲおよびＭＥＴ同時発現の確認
４７の非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)細胞株(表１に示す)および１３８の原発性ＮＳＣＬＣ試料(ジェネンテック貯蔵)を、ＩＨＣによってｃ-ｍｅｔおよびＥＧＦＲのＩＨＣ発現について調べた。発現のレベルは、陰性(−)、弱い(＋)、中程度(＋＋)又は強い(＋＋＋)とスコア化し、弱いか、中程度であるか、又は強い染色を示す腫瘍細胞を１０％より多く含む細胞株又は腫瘍試料を陽性と判断した。
細胞株の７９％(３７／４７)およびＮＳＣＬＣ腫瘍の６８％(９４／１３８)はＥＧＦＲについてポジティブの染色を示した(表５)。さらに、ＥＧＦＲ陽性試料(７９％の細胞株および６８％の原発性腫瘍)を、それらのｃ-ｍｅｔ発現レベルに基づいて階層化した(表５)。ＥＧＦＲ陽性細胞株は、弱い(２２％)、中程度(５７％)、及び強い(１９％)ｃ−ｍｅｔ発現を表し、ＥＧＦＲ陽性原発性腫瘍試料は弱い又は中程度の陽性のみであった。腺癌サブタイプは、扁平細胞サブタイプよりｃ-ｍｅｔ染色について共通して陽性度が高く(７０％対４０％)、より多くの試料が中程度の染色であった(３０％対７％)。これらのデータは、ＮＳＣＬＣ細胞株および腫瘍試料、特に腺癌腫瘍サブタイプにおいて、ｃ-ｍｅｔとＥＧＦＲ間の発現に有意なオーバーラップがあることを示す。
【０２５４】
表５  ＮＳＣＬＣ細胞株および原発性腫瘍におけるＥＧＦＲとＭＥＴのタンパク質同時発現
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＊ＥＧＦＲについて陽性に染色された７９％(３７／４７)のＮＳＣＬＣ細胞株。
＊＊ＥＧＦＲについて陽性に染色された６８％(９４／１３８)のＮＳＣＬＣ細胞株。
【０２５５】
実施例２：ＮＳＣＬＣ細胞のｃ−ｍｅｔタンパク質発現の低減によりＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２およびＨｅｒ３のリガンド誘導活性化が増す
材料および方法
レトロウイルスｓｈＲＮＡコンストラクト。  ｃ−ｍｅｔに対するオリゴヌクレオチドコードｓｈＲＮＡ配列(5'-GATCCCCGAACAGAATCACTGACATATTCAAGAGATATGTCAGTGATTCTGTTCTTTTTTGGAAA-3'(配列番号：３２)(ｓｈＭｅｔ３)、及び、5'GATCCCCGAAACTGTATGCTGGATGATTCAAGAGATCATCCAGCATACAGTTTCTTTTTTGGAAA (配列番号：３３)(ｓｈＭｅｔ４))をＨ１プロモーター(David Davis, GNE)の下流のｐＳｈｕｔｔｌｅ-Ｈ１ベクターのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。下線部は標的のハイブリダイズ配列を示す。これらのコンストラクトは、クロナーゼＩＩ酵素(Invitrogen)を用いてレトロウイルスｐＨＵＳＨ-ＧＷベクター(Gray D et al BMC Biotechnology. 2007; 7:61)に再結合させ、ｓｈＲＮＡ発現が誘導性プロモーターの制御下にあるコンストラクトを生成した。テトラサイクリンアナログドキシサイクリンによる処置によりｓｈＲＮＡ発現が生じる。ＧＦＰに対するｓｈＲＮＡを含むｓｈＧＦＰ２コントロールレトロウイルスコンストラクト(Hoeflich et al. Cancer Res. (2006) 66(2): 999-1006)は、David Davis, Genentech, Incから提供を受けた。ｓｈＧＦＰ２は以下のオリゴヌクレオチドを含む：
(ＥＧＦＰ) ｓｈＲＮＡ 
(センス鎖) 5'-GATCCCCAGATCCGCCACAACATCGATTCAAGAGATCGATGTTGTGGCGGATCTTGTTTTTTGGAAA-3 (配列番号：３４)。
【０２５６】
細胞培養。  ＧＰ-２９３を内包する細胞(Clontech)は、１０％Ｔｅｔ-Ｆｒｅｅ ＦＢＳ(Clontech)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(GNE)、および１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン(Gibco)を添加したＨＧＤＭＥＭ(GNE)中で維持した。Ｈ４４１細胞(ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ-１７４)は、１０％Ｔｅｔ-Ｆｒｅｅ ＦＢＳ(Clontech)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(GNE)、および１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン(Gibco)を添加した５０：５０培地(ＤＭＥＭ：Ｆ１２、MediaTech)中で維持した。ＥＢＣ-１細胞(Japanese Health Sciences Resources；Cancer Res. (2005) 65(16): 7276-82を参照)は、１０％Ｔｅｔ-Ｆｒｅｅ ＦＢＳ(Clontech)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(GNE)、および１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン(Gibco)を添加したＲＰＭＩ１６４０(GNE)中で維持した。細胞は５％ＣＯ２にて３７℃に維持した。
【０２５７】
組み換えレトロウイルスおよび安定株の開発。  ＧＰ-２９３を内包する細胞は、ＦｕＧｅｎｅ６(Roche)およびＣａｌＰｈｏｓ哺乳動物形質移入キット(Clontech)を用いて、ｐＶＳＶ-Ｇ(Clontech)および上記の組み換えレトロウイルスコンストラクトと同時形質移入した。次いで、組み換えウイルスを含む培地をＥＢＣ-１細胞及びＨ４４１細胞に加え、細胞をピューロマイシン(Clontech)において選択した。次いで、レトロウイルスコンストラクトを安定して発現する細胞は９６ウェルプレートへのＦＡＣＳにより自動クローニングした。 
【０２５８】
ウエスタンブロット。  タンパク質を分析するために、２０ｕｇの全細胞溶解物を、ＭＯＰＳバッファ(Invitrogen)を有する４−１２％ビス-トリスＮｕＰＡＧＥゲルに流した。次いで、ゲルは、抗酸化剤バッファを有する２×ＮＵＰＡＧＥ転写バッファにおいて平衡化し、次いでｉＢｌｏｔによって０．２ｕｍのＰＶＤＦメンブランに転写した。メンブランを、５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ(１０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ツイーン２０)中で室温で１時間ブロックし、次いでブロッキングバッファにて希釈した一次抗体中で４℃で終夜インキュベートした。メンブランはＴＢＳＴにて洗浄し、次いで、５％の脱脂乳を有するＴＢＳＴ中のＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体(GE Healthcare)と共に室温で１時間インキュベートした。抗体は化学発光(GE Healthcare, ECL Plus)にて検出した。
【０２５９】
安定細胞株のスクリーニング。  レトロウイルスコンストラクトにて安定して形質導入されたクローンは、適切な培地＋／−１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン(Clontech)中で生育し、ｓｈＲＮＡの発現を誘導し、そして抗−ｃ−ｍｅｔ Ｃ−１２抗体(Santa Cruz Biotech)を用いてｃ−ｍｅｔノックダウンについてウェスタンブロットにてスクリーニングした。ホスホ−ｃ−ｍｅｔは、抗ホスホ-ｃ-ｍｅｔ Ｙ１００３(Biosource)および抗ホスホ−ｃ−ｍｅｔ Ｙ１２３４／１２３４(Cell Signaling)抗体を用いてブロットした。コントロールとして、アクチンは、抗アクチンＩ-１９抗体(Santa Cruz Biotech)を用いてブロットした。ＥＢＣクローン３．１５およびＥＢＣクローン４．１２はｍｅｔ発現及びホスホｃ-ｍｅｔレベルの強い低減を示し、Ｈ４４１クローン３．１１およびＨ４４１クローン３．１はｃ−ｍｅｔ発現およびホスホ-ｍｅｔ発現の中程度の低減を示し、ＥＢＣクローン４．５はｃ−ｍｅｔおよびホスホ−ｃ−ｍｅｔ発現の小さな低減を示した。 
細胞株ＥＢＣクローン４．５、ＥＢＣクローン４．１２はコンストラクトｓｈＭｅｔ４を含み、細胞株Ｈ４４１クローン３．１、Ｈ４４１クローン３．１１およびＥＢＣクローン３．１５はコンストラクトｓｈＭｅｔ３を含んだ。
【０２６０】
リガンド応答実験。  ４８時間(ＥＢＣ ｓｈＭｅｔ)又は６日間(Ｈ４４１ ｓｈＭｅｔ)の間にドキシサイクリンの有無の下で継代した細胞を、１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ中のＤｏｘ(０．１ｕｇ／ｍｌ)有無の６ウェルディッシュに１×１０６細胞／ウェルで播き、次いで３７℃で終夜インキュベートした。細胞をＰＢＳにて洗い流し、培地を(ドキシサイクリン有無の)０．５％ＢＳＡ−ＲＰＭＩに変え、３７℃で２時間かけて細胞を血清不足にした。リガンド(２０ｎＭ ＴＧＦａ又は２ｎＭ ＨＲＧ)を含む培地をウェルに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。ウェルを低温のＴＢＳにて洗い流し、次いでＴＢＳ、１％ＮＰ−４０、完全プロテアーゼインヒビター反応混液(Roche)およびホスファターゼ阻害剤反応混液１および２(Sigma)にて溶解した。単層および上清をウェルから削り取り、溶解物が氷上で１０〜３０分間インキュベートされる微量遠心管チューブへ移した。細胞片を微量遠心管にてペレット化し、上清を新鮮なチューブへ移した。タンパク質濃度はＢＣＡアッセイ(Pierce)にて定量化し、電気泳動のために解凍するまで溶解物を−２０℃に保存した。２０ｕｇ(ＥＢＣ１)又は１５ｕｇ(Ｈ４４１)の全細胞溶解物をゲルに流し、ホスホ−ｃ−ｍｅｔ(ＹＹ１２３４／３５、Cell Signaling Technologyの３１２６)、総ｃ−ｍｅｔ(Ｃ１２、San Cruz Biotechnologyのｓｃ−１０)、ｂ−アクチン(Ｉ−１９、Santa Cruz Biotechnologyのｓｃ−１６１６)、ホスホ-ＥＧＦＲ(Ｙ１１７３、Upstateの０４−３４１)、総ＥＧＦＲ(ＭＩ−１２−１、MBLから)、ホスホ-Ｈｅｒ２(ＹＹ１１２１／２２、Cell Signaling Technologyの２２４３)、総Ｈｅｒ３(Ｃ１８、ｓｃ−２８４、San Cruz Biotechnologyから)、ホスホ-Ｈｅｒ３(Ｙ１２８９、４７９１、Cell Signaling Technologyから)、又は総Ｈｅｒ３(Ｃ１７、ｓｃ−２８５、Santa Cruz Biotechnologyから)についてブロットした。
【０２６１】
結果
ｃ−ｍｅｔを標的とするテトラサイクリン誘導性短型ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)を保持するレトロウイルスを用いて、ｃ-ｍｅｔ発現をノックダウンするためにｓｈＲＮＡを発現するように誘導されうるＮＳＣＬＣ細胞安定株クローンを生成した。ＮＳＣＬＣ細胞株ＥＢＣ１におけるＥＧＦＲファミリメンバーの発現とリン酸化に対するｃ-ｍｅｔノックダウンの影響を調べるために、ｍｅｔに対する誘導性ｓｈＲＮＡ又はＧＦＰに対するコントロールｓｈＲＮＡを含むＥＢＣ１ ｓｈＭｅｔ４.１２細胞を、コントロール培地又は０．１ｕｇ／ｍｌのＤｏｘを含む培地中で４８時間生育させた。２時間の血清欠乏の後に、細胞を、ＴＧＦα又はヘレグリンｂ１にて２０分間処置したものと処置しないものにした。示したように、全細胞溶解物は合計およびリン-タンパク質の発現について評価した。
ｃ-ｍｅｔタンパク質発現がｓｈＲＮＡを用いてノックダウンされたＤｏｘ処置ＥＢＣ１細胞(図２；ＥＢＣｓｈＭｅｔ４．１２、Ｄｏｘ、左パネル)は、ＴＧＦａ処置に応答してｐＥＧＦＲ及びｐＨｅｒ２の増加とヘレグリン処置に応答してｐＨｅｒ３の増加、並びにＴＧＦａ又はヘレグリン処置によるｐＡＫＴの増加を示したが、Ｄｏｘ処置コントロールＥＢＣ１細胞(図２；ｓｈＧＦＰ２、右パネル)では示さなかった。Ｄｏｘ処置ＥＢＣ ｓｈＭｅｔ４．１２細胞(リガンド刺激なし)は、総Ｈｅｒ２及び総Ｈｅｒ３の増加と、ｐＥＧＦＲ及びｐＨｅｒ３の低減を示した。ＥＢＣ１細胞は、ｃ−ｍｅｔノックダウンの非存在下では、ＴＧＦａ又はヘレグリン処置に応答してｐＥＧＦＲ、ｐＨｅｒ２、ｐＨｅｒ３又はｐＡＫＴの強力な誘導を示さなかった。
【０２６２】
他のＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＧＦＲファミリメンバーの発現及びリン酸化に対するｃ-ｍｅｔノックダウンの影響を調べるために、ｍｅｔに対する誘導性ｓｈＲＮＡ又はＧＦＰに対するコントロールｓｈＲＮＡを含むＮＳＣＬＣ Ｈ４４１細胞を、コントロール培地又は０．１ｕｇ／ｍｌのＤｏｘを含む培地中で４８時間生育させた。２時間の血清欠乏の後に、細胞を、ＴＧＦα又はヘレグリンｂ１にて２０分間処置したものと処置しないものにした。示したように、全細胞溶解物は合計およびリン-タンパク質の発現について評価した。
ｃ-ｍｅｔがｓｈＲＮＡを用いてノックダウンされたＨ４４１細胞(図３；Ｄｏｘ処置ｓｈＭｅｔ３．１、左パネル、Ｄｏｘ処置ｓｈＭｅｔ３．１１、中パネル)はヘレグリン処置に応答してｐＨｅｒ２およびｐＨｅｒ３の亢進を示したが、Ｄｏｘ処置コントロールＨ４４１細胞(図３；ｓｈＧＦＰ１、右パネル)は示さなかった。Ｄｏｘ処置ｓｈＭｅｔ３．１及びｓｈＭｅｔ３．１１細胞もまた総Ｈｅｒ３の増加およびｐＥＧＦＲの低減を示す。ＥＢＣ１細胞とは異なり、Ｈ４４１細胞は、ｃ−ｍｅｔノックダウンのない場合、ＴＧＦα(ｐＥＧＦＲ)およびヘレグリン(ｐＨｅｒ２およびｐＨｅｒ３)にわずかに応答する。ＥＢＣ１細胞は、Ｈ４４１細胞より高いｃ−ｍｅｔレベルを有する。
これらの実験は、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるｃ−ｍｅｔ発現の低減により、ＥＧＦＲ(ｐＥＧＦＲ)の基礎活性化の低減とＨｅｒ２およびＨｅｒ３のリガンド誘導性活性化の増加が生じることを示したことから、Ｍｅｔ阻害がＥＧＦファミリのリガンドに対する感度を上げることが示唆される。
【０２６３】
実施例３：ｍｅｔノックダウンとＥＧＦＲ阻害薬エルロチニブによる処置の組合せにより、異種移植片モデルの腫瘍増殖が有意に阻害された
ｃ−ｍｅｔ機能が部分的に阻害されている細胞においてＥＧＦＲが腫瘍生存の維持に役割を有するか否かを試験するために、ＥＢＣ-１ ｓｈＭｅｔ-４．５腫瘍保持動物を、エルロチニブ(ＴａｒｃｅｖａＴＭ)とＤｏｘの組合せにて処置した。  
材料および方法
【０２６４】
試験材料。  エルロチニブ(ＴａｒｃｅｖａＴＭ)は、GenentechのOSI Pharmaceuticals to the Formulations部門から提供を受け、十分な量のベヒクル(メチルセルローストゥイーン(ＭＣＴ))と共に計量した。材料は、４℃〜８℃の温度範囲に維持するように設定された冷蔵庫に保存した。抗ｃ-ｍｅｔ一価性モノクローナル抗体ＭｅｔＭＡｂ(ｒｈｕＯＡ５Ｄ５ｖ２)(国際公開２００７／０６３８１６)は、Genentech, Inc.のAntibody Engineering部門によって、透明な液体状態で提供された。ＥＢＣ-１細胞株はJapanese Collection of Research Bioresources(ＪＣＲＢ)から入手した。
【０２６５】
動物種。  ４０匹のヌードマウス(ｎｕ／ｎｕ)は、Charles River Laboratories(CRL)から入手し、試験を行う前に少なくとも１週間慣れさせた。動物は、高性能微粒子を供給するフィルター(ＨＥＰＡ)を有する部屋の換気されたケージシステムに収容した。健康に見え、明らかな異常がない動物のみを、研究に用いた。
【０２６６】
試験設定。  ＥＢＣ-１細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１０％ウシ胎児血清からなる増殖培地中で培養した。マウスへの接種のための細胞を調製するために、細胞をトリプシン処置し、１０ミリリットルの滅菌１×リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)にて洗浄した。細胞のサブセットはトリパンブルー排除によって計数し、残りの細胞は１００μｌの滅菌１×ＰＢＳに再懸濁し、１ミリリットルにつき５×１０７細胞の濃度にした。マウスの右肩甲下領域に、５×１０６のＥＢＣ-１細胞を皮下注射した。３００ｍｍ３の平均体積に達するまで、腫瘍をモニターした。
腫瘍細胞を移植したマウスをランダムに１０匹のマウスの４つのグループに分け、各処置を開始した(表６にまとめる)。グループ１のマウス(コントロール群)は、１００μＬのベヒクルコントロール、メチルセルローストゥイーン(ＭＣＴ)にて、毎日(ＱＤ)、経口経管栄養(ＰＯ)により処置し、５％スクロースを含む飲料水に切り替えた。グループ２のマウス(ｃ-ｍｅｔノックダウン群)は、１００μＬのＭＣＴ、ＱＤ、ＰＯで処置し、５％スクロース中の０．５ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリン(Ｄｏｘ)を含む飲料水に切り替えた。グループ３のマウス(エルロチニブ処置群)は、ＭＣＴに調製した１００μＬ容量の１００ｍｇ／ｋｇのエルロチニブにて、ＱＤ、ＰＯで処置し、５％スクロースを含む飲料水に切り替えた。グループ４のマウス(ｃ-ｍｅｔノックダウンとエルロチニブ処置群)は、ＭＣＴに調製した１００μＬ容量の１００ｍｇ／ｋｇのエルロチニブにて、ＱＤ、ＰＯで処置し、５％スクロース中の１ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリン(Ｄｏｘ)を含む飲料水に切り替えた。Ｄｏｘおよびスクロース水は２〜３日ごとに交換した。エルロチニブおよびＭＣＴは１４日間投与し、６日間止めた後、残りの試験期間(２０日)再開した。腫瘍が１０００ｍｍ３超に達するか又は壊死病変の兆候を示す場合、動物を試験対象から外した。何れかのグループから４匹以上の動物が試験から外された場合、そのグループの処置を中断し、すべての動物を試験から外した。マウスのすべての研究および取扱いは、Institutional Animal Care and Use Committee(ＩＡＣＵＣ)ガイドラインに従った。
【０２６７】
表６  試験設定
2011513427.tif 000019
＊米国特許出願６１／０３４４４６では、Ｄｏｘ用量は１ｍｇ／ｍｌであると誤って記載された。上記のように、正しい用量は０．５ｍｇ／ｍｌである。 
【０２６８】
腫瘍および体重測定値。  腫瘍体積はＵｌｔｒａＣａｌ-ＩＶカリパス(モデル５４-１０-１１１、Fred V. Fowler Company, Inc.; Newton, MA)を用いて二次元(長さおよび幅)で計測した。腫瘍体積を算出するために、エクセルｖ１１.２(Microsoft Corporation; Redmond, WA)にて以下の式を用いた：
腫瘍体積(ｍｍ３)＝(長さ×幅２)×０．５
【０２６９】
有効性データ分析。  腫瘍阻害は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ３．６(Synergy Software; Reading, PA)を使用してプロットした。１７日目のパーセント増殖阻害(％Ｉｎｈ)は以下の通りに算出した： 
％Ｉｈｎ＝１００×[腫瘍サイズ(ベヒクル)−｛腫瘍サイズ(ＭｅｔＭＡｂ)／腫瘍サイズ(ベヒクル)｝]
腫瘍発生(ＴＩ)は、１７日目の各グループの測定可能な腫瘍の数によって決定した。部分的な退縮(ＰＲ)は、研究の間の何れかの日での開始腫瘍体積の５０％超かつ１００％未満の腫瘍退縮として定められる。完全な退縮(ＣＲ)は、研究の間の何れかの日での開始腫瘍体積からの１００％の腫瘍退縮として定められる。
平均腫瘍体積および平均値の標準誤差(ＳＥＭ)は、ＪＭＰソフトウェア、バージョン５.１.２(SAS Institute; Cary, NC)）を使用して算出した。データ分析およびスチューデントｔ検定又はダネットｔ検定用いたｐ値の生成もまた、ＪＭＰソフトウェア、バージョン５.１.２を使用して行った。
【０２７０】
結果
ｃ−ｍｅｔノックダウンとエルロチニブ処置の組合せは異種移植片モデルの腫瘍増殖を有意に阻害した
ＥＢＣ-１モデルにおける腫瘍増殖の制御時のｃ−ｍｅｔの役割を調査するために、ｃ−ｍｅｔ発現をノックダウンするためにｓｈＲＮＡを発現するように誘導されうるＥＢＣ-１安定クローンを、ｃ−ｍｅｔを標的とするテトラサイクリン誘導性短型ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)を保持するレトロウイルスを使用して生成した。ＥＢＣ-１非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)細胞株はｃ-ｍｅｔについて高度に増幅され、リガンド非依存性様式で細胞及び腫瘍の増殖を制御するように働くｃ-ｍｅｔレセプターを大量に発現する。ＥＧＦＲ遺伝子はＥＢＣ-１細胞株の野生型である。
テトラサイクリンアナログドキシサイクリンによるｓｈＲＮＡ発現の誘導の後に、クローンＥＢＣ-１ｓｈＭｅｔ-３．１５は、ｃ−ｍｅｔ発現の効率的な、ほぼ完全なノックダウンを示した。また、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ又はアラマーブルー細胞生存率アッセイにおいて分析されるように、ｓｈＲＮＡの誘導はこれらの細胞の増殖を妨げた。続いてアポトーシスが起こる増殖静止は、ｓｈＲＮＡ誘導の２４〜７２時間後のＥＢＣ１ ｓｈＭｅｔ３．１５細胞において観察された。同じ細胞株クローンは、(動物がエルロチニブにて処置されなかったことを除いて)基本的に上記の通りに動物モデルに移植され、腫瘍形成させた。これらの動物の腫瘍形成後にｓｈＲＮＡ発現を誘導すると、インビボで腫瘍退縮が生じた。これらの結果は、ｃ−ｍｅｔ発現がインビトロ及びインビボでのＥＢＣ-１細胞の増殖および生存に必須であることを示した。
ＥＢＣ-１ｓｈＭｅｔ-４．５クローンは、ＤｏｘによるｓｈＲＮＡ発現の誘導後にｃ−ｍｅｔ発現の部分的なノックダウンを示した。また、ｃ−ｍｅｔ発現の低減により、このクローンの細胞増殖および生存に対して以下のような効果が生じた。インビトロ細胞生存率アッセイにてアッセイした場合、ｓｈＲＮＡ発現の誘導により細胞数が減少し、異種移植片モデルの腫瘍形成の後にｓｈＲＮＡ発現を誘導すると腫瘍増殖が阻害されたが、腫瘍退縮は生じなかった。
【０２７１】
後述するように、クローンｓｈＭｅｔ-４．５を選択し、ｃ−ｍｅｔ発現のノックダウンとエルロチニブ処置とを組み合わせる効果を評価する実験に用いた。
ＥＢＣ-１ｓｈＭｅｔ-４．５ＮＳＣＬＣ細胞株をヌードマウスに接種し、次いで移植した細胞がおよそ３００ｍｍ３の腫瘍を形成するまで、動物の腫瘍増殖をモニターした。次いでマウスを以下の４つの処置アームに分けた；グループ１：ベヒクル、グループ２：ドキシサイクリン(Ｄｏｘ)、グループ３：エルロチニブ(１００ｍｇ／ｋｇ)、およびグループ４：エルロチニブ＋Ｄｏｘ(表６を参照)。
１９日目に、エルロチニブによるマウスの処置は腫瘍増殖に対して効果がなかった(−６％の腫瘍阻害；図４)のに対して、Ｄｏｘ(ｍｅｔ発現を阻害する)による処置はベヒクルコントロールと比較して腫瘍増殖が３８％低減し(図４；スチューデントｔ検定、ｐ＝０．０８４)、これは統計学的な有意差に僅かに足りない。しかしながら、腫瘍増殖の低減は、エルロチニブのみ群と比較して統計学的に有意であった(スチューデントｔ検定、ｐ＝０．００４；図４)。エルロチニブとＤｏｘの組合せにより有効性が劇的に改善され、１９日目にベヒクルコントロールと比較して腫瘍増殖の６８％が低減された(スチューデントｔ検定、ｐ＝０．００１；図４)。エルロチニブとＤｏｘの組合せによる処置により、Ｄｏｘのみによる処置(スチューデントｔ検定、ｐ＝０．０３)又はエルロチニブのみによる処置(スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０００１)と比較して、腫瘍増殖が統計学的に有意に低減された。
Ｄｏｘとエルロチニブによる処置により、部分的な応答(ＰＲ；研究の間の何れかの日での開始腫瘍体積の５０％超かつ１００％未満の腫瘍退縮として定められる)と、完全な応答(ＣＲ；研究の間の何れかの日での開始腫瘍体積からの１００％の腫瘍退縮として定められる)の値が高くなった。具体的には、エルロチニブとＤｏｘの組合せにより１ＰＲと３ＣＲが生じたのに対して、エルロチニブによる処置によりＰＲ又はＣＲは生じず、そしてＤｏｘによる処置(ｃ-Ｍｅｔノックダウン)により２ＰＲと１ＣＲが生じた。これらのデータは、たとえ個々の動物腫瘍データの分析によりすべての腫瘍がｃ−ｍｅｔ阻害とエルロチニブの組合せに強く応答するわけではないことが明らかにされている場合であっても、ｍｅｔ阻害(Ｄｏｘ処置)とＥＧＦＲ阻害(エルロチニブ処置)の組合せは、ｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲ単独の阻害より、完全な腫瘍退縮を誘導するようであることを示す。
【０２７２】
これらの結果は、ＥＢＣ-１ｓｈＭｅｔ-４．５異種移植片モデルにおけるｃ−ｍｅｔとＥＧＦＲの阻害は腫瘍増殖の有意な低減を起こしたことを示す。ゆえに、ｃ−ｍｅｔ発現および活性が部分的に阻害される腫瘍は、ＥＧＦＲ経路を利用して腫瘍増殖および生存を確認する。これは、ｃ−ｍｅｔが阻害される腫瘍の増殖及び腫瘍生存にＥＧＦＲが役割を果たすことを示す。
【０２７３】
実施例４：抗ｃ−ｍｅｔ抗体およびＥＧＦＲ阻害薬エルロチニブによる処置は、抗ｃ−ｍｅｔ抗体又はエルロチニブ単独による処置と比較して有効性の劇的な改善を示した
材料および方法
試験材料。  抗ｃ-ｍｅｔ一価性モノクローナル抗体ＭｅｔＭＡｂ(ｒｈｕＯＡ５Ｄ５ｖ２)は、Genentech, Inc.のAntibody Engineering部門によって、１０．６ｍｇ／ｍｌの透明な液体状態で提供された。ベヒクルは、１０ｍＭ ヒスチジン琥珀酸塩、４％トレハロース二水和物、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ５．７とした。エルロチニブ(ＴａｒｃｅｖａＴＭ)は、GenentechのOSI Pharmaceuticals to the Formulations部門から提供を受け、十分な量のベヒクル(メチルセルローストゥイーン(ＭＣＴ))と共に計量した。すべての材料は、Genentech, Inc.からVan Andel Research Institute (VARI; Grand Rapids, MI)へ出荷され、動物処置の前に調製された。材料は、４℃〜８℃の温度範囲に維持するように設定された冷蔵庫に保存した。ＮＣＩ−Ｈ５９６細胞株はAmerican Type Culture collection (Manassas, VA)から入手した。
【０２７４】
動物種。  ４０匹のヒトＨＧＦトランスジェニックＣ３Ｈ-ＳＣＩＤマウス(ｈｕ-ＨＧＦ-Ｔｇ-Ｃ３Ｈ-ＳＣＩＤ)はVan Andel Research Institute (VARI; Grand Rapids, MI)から入手した。５匹のＣ３Ｈ-ＳＣＩＤマウスはJackson Laboratoriesから入手した。動物は４〜６週齢であり、各々体重２１〜２２グラムであった。マウスは、腫瘍細胞接種の前に少なくとも３日間試験環境に慣れさせた。マウスはｓｈｏｗｅｒ−ｉｎバリア設備に収容した。動物は、高性能微粒子を供給するフィルター(ＨＥＰＡ)を有する部屋の換気されたケージシステムに収容した。健康に見え、明らかな異常がない動物のみを、研究に用いた。
【０２７５】
試験設定。  ほとんどのＨＧＦ応答腫瘍はパラ分泌様式で制御され、パラ分泌制御増殖をモデル化する異種移植片モデルを選択した。マウスＨＧＦはヒトｃ−ｍｅｔの弱いリガンドであり、マウスＨＧＦに対してヒトｃ−ｍｅｔ発現細胞株の低い生物学的応答を引き起こす(Bhargava, M., et al., 1992；Rong, S., et al.. 1992)。したがって、パラ分泌ＨＧＦ作動性ヒト腫瘍をモデル化するために、メタロチオネインプロモーターから遍在する様式にあるヒトＨＧＦを発現するトランスジェニックマウス(ｈｕ-ＨＧＦ-Ｔｇ-ＳＣＩＤ)を生成した(Zhang, Y., et al., 2005)であった。ｈｕ-ＨＧＦ-Ｔｇ-ＳＣＩＤマウスの血清ＨＧＦレベルは生理学的レベルのおよそ５〜１０倍であり(０．２〜０．５ｎｇ／ｍＬに対して１〜５ｎｇ／ｍＬ)、インビトロで増殖することによるＨＧＦに応答する細胞株は、ｈｕ-ＨＧＦ-Ｔｇ-ＳＣＩＤマウスにおいて異種移植片腫瘍として増殖する場合に腫瘍増殖の強力な亢進を示す。
【０２７６】
ＮＣＩ-Ｈ５９６非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)細胞株は高いＨＧＦ応答性であり、抗ｃ-ｍｅｔ抗体ＭｅｔＭＡｂはインビトロでのこの細胞株のＨＧＦ作動性増殖を妨げるので(Kong-Beltran, M., et al., 2006)、この細胞株をｈｕ-ＨＧＦ-Ｔｇ-ＳＣＩＤマウスにおけるインビボ有効性試験のために選択した。ＮＣＩ−Ｈ５９６細胞株は、Ｅ３ユビキチンリガーゼＣｂｌの結合部位をコードするエキソン１４欠失ｃ-ｍｅｔ遺伝子の変異した形態を有する(Kong-Beltran, M., 2006)。Ｃｂｌ-結合部位は、ＨＧＦ結合後にチロシン１００３(Ｙ１００３)でリン酸化され、これによりＣｂｌが結合しｃ-ｍｅｔをユビキチン化することが可能となり、ゆえにｃ-ｍｅｔはプロテアソーム分解の標的となる(Peschard, P., et al., 2001)。また、ＮＣＩ−Ｈ５９６細胞株はＨＧＦ-Ｔｇ-ＳＣＩＤマウス(上記したようにヒトＨＧＦを発現する)において容易に腫瘍を形成するが、ヒトＨＧＦを欠く免疫不全マウス(ｎｕ／ｎｕヌードマウス又はＳＣＩＤマウス)においては腫瘍を形成しないようであるので、ＮＣＩ−Ｈ５９６の反応性はインビボでも見られうる。ＮＣＩ-Ｈ５９６細胞は、ｃ−ｍｅｔ作動性腫瘍を形成すると思われる。ＮＣＩ-Ｈ５９６細胞は野生型ＥＧＦＲを持ち、ＴＧＦαの存在下で生育した場合にＥＧＦＲ阻害薬エルロチニブ(ＴＡＲＣＥＶＡＴＭ)に感受性がある。これは、エルロチニブおよびＴＧＦαの存在下で生育した場合の細胞生存率の低減により示される。
【０２７７】
ＮＣＩ-Ｈ５９６細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１０％ウシ胎児血清からなる増殖培地中で培養した。マウスへの接種のための細胞を調製するために、細胞をトリプシン処置し、１０ミリリットルの滅菌１×リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)にて洗浄した。細胞のサブセットはトリパンブルー排除によって計数し、残りの細胞は１００μｌの滅菌１×ＰＢＳに再懸濁し、１ミリリットルにつき５×１０６細胞の濃度にした。 
マウスは、クリッパーにて背面領域を剃り、接種のために準備した。次の日、各マウスの右肩甲下領域に、５×１０５のＮＣＩ-Ｈ５９６細胞を皮下注射した。１００ｍｍ３の平均体積に達するまで、腫瘍をモニターした。
【０２７８】
ＨＧＦ-Ｔｇ-Ｃ３Ｈ-ＳＣＩＤマウスは、各々１１匹のマウスの２つのグループにランダムに分け、４週間、週２回、試験材料を腹腔内注射した。グループ１の動物は１００μｌのベヒクルを投与し、グループ２の動物は３０ｍｇ／ｋｇの抗ｃ−ｍｅｔ一価性モノクローナル抗体ＭｅｔＭＡｂを投与した。試験設定を表７に示す。腫瘍は、処置の日から初め、５週間、週につき３回測定した。マウスは５週後に安楽死させたが、いくつかの動物は腫瘍体積が大きかったため(１５００のｍｍ３超)早く安楽死させた。また、コントロールＣ３Ｈ-ＳＣＩＤマウスにも接種し、腫瘍増殖のネガティブコントロールとし、５週間の腫瘍増殖をモニターした。 
マウスの取扱い及びすべての試験は、Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)ガイドラインに従った。 
【０２７９】
表７  試験設定
2011513427.tif 000020
【０２８０】
腫瘍および体重測定値。  腫瘍体積はＵｌｔｒａＣａｌ-ＩＶカリパス(モデル５４-１０-１１１、Fred V. Fowler Company, Inc.; Newton, MA)を用いて二次元(長さおよび幅)で計測した。腫瘍体積を算出するために、エクセルｖ１１.２(Microsoft Corporation; Redmond, WA)にて以下の式を用いた：
腫瘍体積(ｍｍ３)＝(長さ×幅２)×０．５
【０２８１】
有効性データ分析。腫瘍阻害は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ３．６(Synergy Software; Reading, PA)を使用してプロットした。１７日目のパーセント増殖阻害(％Ｉｎｈ)は以下の通りに算出した： 
％Ｉｈｎ＝１００×[腫瘍サイズ(ベヒクル)−｛腫瘍サイズ(ＭｅｔＭＡｂ)／腫瘍サイズ(ベヒクル)｝]
腫瘍発生(ＴＩ)は、１７日目の各グループの測定可能な腫瘍の数によって決定した。部分的な退縮(ＰＲ)は、研究の間の何れかの日での開始腫瘍体積の５０％超かつ１００％未満の腫瘍退縮として定められる。完全な退縮(ＣＲ)は、研究の間の何れかの日での開始腫瘍体積からの１００％の腫瘍退縮として定められる。
平均腫瘍体積および平均値の標準誤差(ＳＥＭ)は、ＪＭＰソフトウェア、バージョン５.１.２(SAS Institute; Cary, NC)）を使用して算出した。データ分析およびスチューデントｔ検定又はダネットｔ検定用いたｐ値の生成もまた、ＪＭＰソフトウェア、バージョン５.１.２を使用して行った。
カプラン-マイアー生存曲線は、各グループについて腫瘍倍加時間について描いた。グループ間のペアワイズ比較を行った。統計的な比較はログ-ランク検定にて行った。データ分析はＪＭＰソフトウェアを使用して実行した。
【０２８２】
結果
ＮＣＩ−Ｈ５９６ ＮＳＣＬＣ細胞株をｈｕ−ＨＧＦ−Ｔｇ−Ｃ３Ｈ−ＳＣＩＤ動物に接種し、移植した細胞がおよそ１００ｍｍ３の腫瘍を形成するまで、動物の腫瘍増殖をモニターした。次いでマウスを４つの処置アームに分類した；グループ１：ベヒクル、グループ２：エルロチニブ、グループ３：ＭｅｔＭＡｂ、およびグループ４：エルロチニブ＋ＭｅｔＭＡｂ(表７を参照)。ＭｅｔＭＡｂにて処置したグループは１回のみ投与したのに対して、エルロチニブにて処置したグループは２週間毎日投与し、その後処置を停止し、週に２〜３回腫瘍増殖をモニターした。また、Ｃ３Ｈ-ＳＣＩＤコントロールマウスも接種し、ヒトＨＧＦに曝されないＮＣＩ−Ｈ５９６腫瘍の増殖についてモニターした。
【０２８３】
ＮＣＩ-Ｈ５９６腫瘍の増殖は、Ｃ３Ｈ-ＳＣＩＤコントロールマウスと比較して、ｈｕ−ＨＧＦ−Ｔｇ−Ｃ３Ｈ−ＳＣＩＤマウスにおいて非常に改善された(図５；ベヒクルコントロール群をＣ３Ｈ-ＳＣＩＤと比較する)。２０日目に、抗ｃ−ｍｅｔ一価性モノクローナル抗体ＭｅｔＭＡｂによるマウスの処置により、ベヒクルコントロールと比較して、腫瘍増殖の６７％が減少し(図５；スチューデントｔ検定、ｐ＝０．００４４)、これは先のＮＣＩ−Ｈ５９６モデルにおけるＭｅｔＭＡｂの試験と一致していた。２０日目に、エルロチニブによるＮＣＩ−Ｈ５９６腫瘍保持マウスの処置により、ベヒクルコントロールと比較して、腫瘍増殖の統計学的に有意な減少が生じた(図５；スチューデントｔ検定、ｐ＝０．１６５)。２０日目に、ＭｅｔＭＡｂとエルロチニブの組合せによる処置により有効性の劇的な改善が示され、ベヒクルコントロールと比較して、腫瘍増殖の８９％が減少した(図５；スチューデントｔ検定、ｐ＝０．００３５)。
２０日目に、ＭｅｔＭＡｂによるマウスの処置により、ベヒクルコントロールと比較して、腫瘍増殖の６７％が減少し(図５；スチューデントｔ検定、ｐ＝０．００４４)、これは先のＮＣＩ−Ｈ５９６モデルにおけるＭｅｔＭＡｂの試験と一致していた。２０日目に、エルロチニブによるＮＣＩ−Ｈ５９６腫瘍保持マウスの処置により、ベヒクルコントロールと比較して、腫瘍増殖の統計学的に有意な減少が生じた(図５；スチューデントのｔ検定、ｐ＝０．１６５)。２０日目に、ＭｅｔＭＡｂとエルロチニブの組合せによる処置により何れかの薬剤単独よりも有効性の劇的な改善が示され、ベヒクルコントロールと比較して、腫瘍増殖の８９％が減少した(図５；スチューデントｔ検定；ＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブ対ベヒクル、２０日目−ｐ＝０．００３５；ＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブ対エルロチニブ単独、２６日目−ｐ＝０．０００９；ＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブ対ＭｅｔＭＡｂ単独、４８日目ｐ＝０．０１４９)。
【０２８４】
腫瘍体積データは投与終了後９週間採取し、ＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブの組合せにより腫瘍進行につれて改善されたか否かを調べた。この問題に対処するために、腫瘍のサイズが２倍になるために要する時間として定められる、腫瘍倍加時間(ＴＴＤ)測定値を各グループについて算出し、これを用いてカプラン-マイアー生存曲線を作成した。ＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブの組合せは腫瘍進行への時間の劇的な改善を示し、ＭｅｔＭＡｂ処置群１７．８(±２．２)日、エルロチニブ処置群９．５(±１．２)日、及びベヒクルコントロール群９．５(±１．２)日に対して、４９．５(±２．６)日の平均ＴＴＤであった(図６)。これらのデータは、ＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブの組合せが何れかの単一薬剤のみに対して腫瘍進行への時間を有意に改善することを示す(ログ-ランク検定；ベヒクル対ＭｅｔＭＡｂ−ｐ＜０．０００１；ベヒクル対ＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブ−ｐ＜０．０００１；エルロチニブ対ＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブ  ｐ＜０．０００１およびＭｅｔＭＡｂ対ＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブ−ｐ＝０．０００９)。
【０２８５】
これらのデータは、ＭｅｔＭＡｂとエルロチニブの組合せによる処置により、ＭｅｔＭＡｂ又はエルロチニブ単独による処置と比較して、腫瘍増殖阻害および腫瘍進行が非常に有意に改善されることを示す。 
【０２８６】
実施例５：Ｃ-ｍｅｔシグナル伝達はＥＧＦＲシグナル伝達を制御する
材料および方法
マイクロアレイ分析：  ３つのマイクロアレイ実験は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０アレイを使用して実施した。いずれの場合においても、相補的ＲＮＡの調製、アレイハイブリダイゼーションおよびその後のデータ分析は、基本的にHoffman EP et al., Nat Rev Genet 5:229-37 (2004)に記載されるように、製造業者のプロトコールを使用して実施した。Ｐａｒｔｅｋ ＧＳ６．３ｂソフトウェアパッケージ(Partek, Saint Louis, MO)において実行されるように、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＣＥＬファイルの形式の生の発現データを、一つのグループとして正規化(Irizarry, Biostatistics, 2003, PubMed ID 12925520)し、正規化ＲＭＡ方法を使用して個々の試料についてのデータ間の生物源でない変化を除いた。結果として生じた正規化したｌｏｇ２スケール発現値は以下の通りに分析し、プロットのために線状スケールに移した。
【０２８７】
第一の実験では、リガンド応答性ＮＳＣＬＣ ＨＯＰ９２及びＨ５９６細胞を、ｍＲＮＡ発現プロファイルの前６時間の間５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦにて刺激する場合としない場合に分けた。簡単に言うと、細胞をおよそ５×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートにプレーティングした。１日後、細胞を洗浄し、次いでＲＰＭＩ培地＋０．１％ＢＳＡに移した。３日目に、細胞を、ＲＰＭＩ培地＋０．１％ＢＳＡ中の５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦにて６時間刺激した。細胞を冷温のＰＢＳにて１回洗浄し、ＲＮＡｅａｓｙ溶解バッファにて溶解し、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡを調製した。ＨＯＰ９２およびＨ５９６試料はｔ検定を用いて別々に分析し、＋ＨＧＦ及び−ＨＧＦ条件下において各遺伝子の発現レベルの相違の有意性(Ｐ値)を測定した。これらのＰ値は、ベンジャミンとホッホバーグ法(Benjamini and Hochberg, 1995)を使用して複数の試験を補正することによってＱ値に変換した。次いで、遺伝子を、各細胞株の発現レベル差異の統計的有意差(Ｑ値)で分類した。
【０２８８】
第二の実験では、クローンＥＢＣｓｈＭｅｔ３−１５及びＥＢＣｓｈＭｅｔ４−１２のｍＲＮＡ発現レベルを、５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンの有無の下で２４及び４８時間インキュベートした後に分析した。各々のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ対(遺伝子)の発現パターンは線形統計モデル(ＡＮＯＶＡ)を使用して分析した。これにより、クローン(３−１５又は４−１２)の効果、処置(コントロール又はドキシサイクリン)、及び時間−時点(２４又は４８時間)、並びに時間−時点と処置効果の相互作用が評価された。ＡＮＯＶＡ手順により、各々のこれら４つの効果についての有意性(Ｐ値)が計測された。これらのＰ値は、ベンジャミンとホッホバーグ法を使用して複数の試験を補正することによってＱ値に変換した。次いで、遺伝子を、ドキシサイクリン試料とコントロール試料との間の発現レベル差異の統計的有意差(Ｑ値)で分類した。
【０２８９】
第三の実験では、ＥＢＣＭｅｔ ｓｈＲＮＡ４−１２細胞又はコントロールＥＢＣＧＦＰ ｓｈＲＮＡ細胞を、培地のみ又は５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンを含む培地中で２４時間インキュベートした。更なる処置(＋／−ＨＧＦ １００ｎｇ／ｍｌ、２時間)の後、ｍＲＮＡ発現をマイクロアレイによって分析した。各々のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ対(遺伝子)の発現パターンは線形統計モデル(ＡＮＯＶＡ)を使用して分析した。これにより、ｓｈＲＮＡ標的(Ｍｅｔ又はＧＦＰ)の効果、ｓｈＲＮＡ誘導(ドキシサイクリン又はコントロール)およびＨＧＦ処置並びにこれら３つの変数の相互作用が評価された。次いで、これらのＰ値は、ドキシサイクリン処置ＥＢＣＭｅｔｓｈＲＮＡ４−１２試料におけるプラス−ＨＧＦおよびマイナス−ＨＧＦ条件間の発現レベル差異のＱ値に変換した。０．０５のＱ値のカットオフ(５％Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ)と＋／−ＨＧＦ群の比較のための２倍発現変化を使用して、１８８のプローブ対を選択した。
【０２９０】
ＴＧＦα ＥＬＩＳＡ：  Ｄｏｘを５％スクロース中１ｍｇ／ｍｌで用い、腫瘍を処置の開始前に３００〜４００ｍｍ３まで成長させたことを除き、基本的に実施例３に記載したように、ＥＢＣ-１-ｓｈＭｅｔ異種移植片腫瘍を生成し、Ｄｏｘを投与した。動物に３日間投与し、その後屠殺した。新鮮凍結ＥＢＣ-１-ｓｈＭｅｔ-４．１２異種移植片腫瘍試料を、２ｍｌの冷温溶解バッファ(ＰＢＳ＋１％トリトンＸ-１００＋ホスファターゼ反応混液２(Sigmaカタログ番号Ｐ５７２６))及び完全ＭｉｎｉＥＤＴＡ-Ｆｒｅｅプロテアーゼインヒビター(Roche＃１１ ８３６ １７０ ００１)(１０ｍｌの溶液につき１錠)に置いた。腫瘍は携帯型ホモジナイザーにて均一にし、溶解物は時々かき混ぜながら１時間氷上でインキュベートした。溶解物を１００００×Ｇにて４℃で１０分間遠沈し、新しいチューブに移し、Ｈｅｒ３タンパク質をＢＣＡアッセイ(Pierceカタログ番号２３２２５)を用いて定量化した。
抗ＴＧＦ-αポリクローナル抗体(R&D Systems, Minneapolis, MN)をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)に１μｇ／ｍｌに希釈し、４℃で一昼夜インキュベートして、ＥＬＩＳＡプレート(２５μＬ／ウェル、ＭａｘｉＳｏｒｐ表面を有する３８４ウェルプレート、Nunc, Neptune, NJ)にコートした。洗浄バッファ(ＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０)にて６回洗浄した後、プレートをＰＢＳ／０．５％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)にて１〜２時間ブロックした。この及び今後すべてのインキュベートは軌道シェーカー上で室温で行った。試料は、試料バッファ(ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．５％ツイーン２０／０．２％ウシγグロブリン／０．２５％ＣＨＡＰＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１０ｐｐｍ プロクリン)を使用して希釈した。同じバッファを使用して、組換えヒトＴＧＦ-α(R&D Systems)の段階希釈液を調製し、標準曲線範囲を４００〜１２．５ｐｇ／ｍｌとした。標準曲線の高、中、低領域で定量化するために予め希釈した凍結コントロール試料を解凍した。プレートを６回洗浄し、試料、標準物質およびコントロールを加え(２５μＬ／ウェル)、２時間インキュベートした。プレートを１２回洗浄した後、試料バッファ中に１μｇ／ｍｌに希釈したビオチン化ヤギ抗ＴＧＦαポリクローナル抗体(R&D Systems)(２５μＬ／ウェル)を加えた。１時間のインキュベートの後、プレートを１２回洗浄した。次いで、試料バッファ中に１／４０００に希釈したストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を加えた(２５μＬ／ウェル)。最後に３０分間インキュベートした後、プレートを１２回洗浄し、テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ、Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を加えた。室温で、６〜８分間発色させ、１Ｍ リン酸の添加によって反応を止めた。マイクロプレート読み取り機(４５０ｎｍ、６２０対照)にて吸光度の値を求め、標準曲線の４-パラメーターフィットから試料濃度を算出した。
【０２９１】
結果
ＨＧＦ処置によってｃ−ｍｅｔを活性化すると、リガンド反応性ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈｏｐ-９２およびＮＣＩ−Ｈ５９６においてＥＧＦＲリガンド(ＨＢ-ＥＧＦ、エピレギュリン、アンフィレギュリン、ＴＧＦα)のｍＲＮＡ発現が増えた(図９Ａ)。これに対して、リガンド非依存性ＮＳＣＬＣ細胞株ＥＢＣ１細胞ではｓｈＲＮＡを用いてｃ−ｍｅｔ発現を阻害すると、それらＥＧＦＲリガンドのｍＲＮＡ発現が低減された(図９Ｂ)。ｄｏｘ処置したＥＢＣ１ｓｈＭｅｔ細胞株４−１２をＨＧＦ処置すると、ＥＧＦＲリガンドの発現が回復した(図９Ｃ)。ＥＧＦＲリガンドの低減は、ＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを発現したコントロールＥＢＣ-１細胞では起こらなかった(図９Ｄ)。ＥＢＣ-１-ｓｈＭｅｔ異種移植片腫瘍においてｃ−ｍｅｔ発現が減少すると、処置後３日目に腫瘍ＴＧＦαタンパク質レベルが減少した(図９Ｅ)。
これらのデータは、ｃ-ｍｅｔ活性は、ｃ-ｍｅｔ増幅ＨＧＦ非依存性細胞(ＥＢＣ１)並びにＨＧＦ依存性細胞株(Ｈｏｐ９２およびＮＣＩ-Ｈ５９６)においてＥＧＦＲシグナル伝達を制御しうることを示す。より具体的には、ｃ-ｍｅｔシグナル伝達はＥＧＦＲファミリのリガンドの発現を増やし、維持した。そして、これらのリガンドが自己分泌様式で自身のＥＧＦＲファミリのレセプターを刺激しうる。これに対して、ｃ−ｍｅｔシグナル伝達が阻害されると、ＥＧＦＲリガンドの発現が低減した。この自己分泌ループに対する干渉はおそらく、実施例２に記載の、ｃ−ｍｅｔノックダウン後のＥＢＣ１細胞において観察されるｐＥＧＦＲの低減(図１０)と、ｃ-ｍｅｔノックダウン後のＥＧＦＲのリガンド誘導性活性化への感度の増加の原因である。これらの結果から、ＥＧＦＲ活性は、ＨＧＦ依存性及びＨＧＦ非依存性の腫瘍においてｃ−ｍｅｔシグナル伝達活性の喪失を補いうることが示唆され、これは腫瘍がＥＧＦＲとｃ−ｍｅｔ阻害薬の組合せで処置される場合に観察される異種移植片腫瘍有効性の劇的な増加と一致している(実施例４)。
【０２９２】
実施例６：Ｃ-ｍｅｔ活性はＨＥＲ３発現を制御する
材料および方法
ｐＥＧＦＲおよびＨｅｒ３タンパク質のウエスタンブロット分析：  細胞は１×１０６の密度でプレーティングし、ＲＰＭＩ  １６４０中１０％Ｔｅｔ認可ＦＢＳ中で３７℃で１８時間インキュベートした。次の日に、培地を取り除き、０．１ｕｇ／ｍｌのＤｏｘ有無の新鮮通常培地と交換した。培地交換の２４、４８および７２時間後に、タンパク質は、冷温のＴＢＳにてすすいだ後に、１％ＮＰ−４０／ＴＢＳ／ロッシュの完全プロテアーゼインヒビター反応混液／シグマのホスファターゼ阻害剤反応混液１および２にて抽出した。１５ｕｇの総タンパクは、ＭＯＰＳバッファを有するインビトロゲンの４−１２％ビス-トリスＮＵＰＡＤＥゲルに流し、インビトロゲンのｉＢｌｏｔによってＰＶＤＦに転写した。メンブランは、リン酸化されたタンパク質(５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中１:１０００の希釈のｐＥＧＦＲ(Ｙ１１７３) Ｕｐｓｔａｔｅ０４−３４１)についてイムノブロットし、ピアスのリストアストリッピングバッファにて剥離し、次いで、総タンパク(５％脱脂粉ミルク及びＴＢＳＴ中、１：１００００希釈のｃ-ｍｅｔ：ＳＣＢＴ ｓｃ-１０；１：２０００希釈のＨｅｒ３：ＳＣＢＴ ｓｃ-２８５)について再プローブした。タンパク質は、製造業者の指示に従ってアマシャムのＥＣＬプラス化学発光キットを用いて、アマシャムのＨＲＰコンジュゲート二次抗体(Amersham 抗ウサギＨＲＰ、＃ＮＡ９３４Ｖ；Amersham抗マウスＨＲＰ)により検出した。
【０２９３】
Ｈｅｒ３ ＦＡＣＳ：  ＥＢＣ-１ｓｈＭｅｔ４−１２細胞はＲＰＭＩ１６４０中１０ｃｍプレートにつき１０６細胞で播き(上記)、プレートを終夜インキュベートした。Ｄｏｘをプレートに添加して１００ｎｇ／ｍｌの終濃度にした。プレートを４８時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をトリプシン処置し、遠心分離し、次いで、冷温の２００μＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ(ＦＡＣＳバッファ)に再懸濁し、９６ウェルプレートへ移した。細胞を遠沈し、ジェネンテックのＨｅｒ３：１６３８(３Ｅ９.２Ｇ６)抗体を１０μｇ／ｍｌ加えたＦＡＣＳバッファに再懸濁した。細胞は氷上で１時間インキュベートし、次いで、冷温のＦＡＣＳバッファにて洗浄し、そして、ＦＡＣＳバッファ＋１:２００のＲＰＥコンジュゲートＦ(ａｂ')２ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ(Ｈ＋Ｌ)(Jackson Immuno カタログ番号１１５-１１６-０６８)に再懸濁した。細胞は氷上で３０分間インキュベートし、次いで、冷温のＦＡＣＳバッファにて１回洗浄し、そして、ＦＡＣＳバッファ＋７ＡＡＤ(BD Pharmingen カタログ番号５５９９２５)に再懸濁した。ＦＡＣＳ分析は製造業者の指示に従って実施した。
【０２９４】
腫瘍溶解物：  Ｄｏｘを５％スクロース中１ｍｇ／ｍｌで用い、腫瘍を処置の開始前に３００〜４００ｍｍ３まで成長させたことを除き、基本的に実施例３に記載したように、ＥＢＣ-１-ｓｈＭｅｔ異種移植片腫瘍を生成し、Ｄｏｘを投与した。動物に３日間投与し、その後屠殺した。新鮮凍結ＥＢＣ-１-ｓｈＭｅｔ-４．１２異種移植片腫瘍試料を、２ｍｌの冷温溶解バッファ(ＰＢＳ＋１％トリトンＸ-１００＋(３×)ホスファターゼ反応混液２(Sigmaカタログ番号Ｐ5726))及び完全ＭｉｎｉＥＤＴＡ-フリープロテアーゼインヒビター(Roche＃１１ ８３６ １７０ ００１)に置いた。腫瘍は携帯型ホモジナイザーにて均一にし、溶解物は時々かき混ぜながら氷上で１時間インキュベートした。溶解物を１００００×Ｇにて４℃で１０分間遠沈し、新しいチューブに移し、Ｈｅｒ３タンパク質をＢＣＡアッセイ(Pierceカタログ番号２３２２５)を用いて定量化した。
【０２９５】
結果
ｓｈＲＮＡによるｃ−ｍｅｔ発現のノックダウンによりｐＥＧＦＲレベルが低減し、ＨＥＲ３タンパク質レベルが有意に増加した(図１０Ａ)。ＦＡＣＳ分析により、ｃ−ｍｅｔノックダウン後の表面ＨＥＲ３レベルの増加が明らかになった(図１０Ｂ)。ＥＢＣ-１ｓｈＭｅｔ-４.１２異種移植片腫瘍でのＣ-ｍｅｔノックダウンによりＨＥＲ３タンパク質レベルが増加した(図１０Ｃ)。
これらのデータは、ｃ−ｍｅｔ活性がＨＥＲ３発現レベルを制御しうることを示す。具体的には、ｃ-ｍｅｔが阻害されると、ＨＥＲ３タンパク質レベルの増加とｐＥＧＦＲレベルの減少が起こった。ｃ−ｍｅｔ阻害後のｐＥＧＦＲの減少はおそらくＥＧＦＲリガンドによる自己分泌シグナル伝達の減少によるためであり(図９参照)、ＨＥＲ３レベルの増加はエルロチニブ感度を増しうる。これは他者によっても示されている(例としてYauch et al. Clin Cancer Res (2005) 11:8686-98)。これらの結果からＨＥＲ３活性(例えばＨＥＲ２によるシグナル伝達)がｃ-ｍｅｔシグナル伝達のその後の阻害を増やしうることが示唆され、さらにｃ-ｍｅｔとＨＥＲ３阻害薬による併用療法の癌治療への使用を裏付けるものである。
【０２９６】
実施例７：ＥＧＦＲ経路活性化によりｃ−ｍｅｔ活性が阻害されている細胞の細胞増殖および生存度が回復しうる
材料および方法
ＥＢＣ-１ｓｈＭｅｔ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地(Clontechカタログ番号６３１１０７の１０％ＴｅｔフリーＦＢＳを含む)中に５０００／ウェルで、黒色壁の９６ウェルプレートに播き、プレートを終夜インキュベートした。培地を新鮮培地＋／−１００ｎｇ／ｍｌ ｄｏｘに置き換え、プレートを４８時間インキュベートした。次いで、ＥＧＦＲリガンドを下記の終濃度で添加し、プレートをさらに４８時間インキュベートし、その後、本明細書中に記載のようにＣｅｌｌ ＴｉｔｅｒＧｌｏ(Promega＃Ｇ7570)を用いて細胞数を決定した：Ｄｏｘ＋１００ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ；Ｄｏｘ＋５０ｎＭ ＴＧＦα；Ｄｏｘ＋５ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ；及びＤｏｘ＋１ｎＭ ＴＧＦα。
【０２９７】
結果
ｓｈＲＮＡによるｃ-ｍｅｔ発現のノックダウンにより細胞数が有意に減少したことから、細胞生存率と増殖の減少が示唆される。ＥＧＦＲリガンドＨＧＦおよびＴＧＦαは、用量依存的に細胞数を救出することができたが、ＨＧＦはＴＧＦαより多少多くの細胞数を救出したようであった。これらの結果は、ＥＧＦＲ経路活性化が、ｃ−ｍｅｔシグナル伝達活性が阻害されている細胞の細胞増殖および細胞生存率を回復させうることを示した。ゆえに、ＥＧＦＲ(および／または他のＨＥＲファミリメンバー)シグナル伝達は、ｃ−ｍｅｔシグナル伝達活性の喪失を補った。これらの結果は、ｃ−ｍｅｔとＥＧＦＲ阻害薬による併用療法の使用を裏付けるものであり、腫瘍がＥＧＦＲとｃ−ｍｅｔ阻害薬の組合せにより処置される場合に観察される、異種移植片腫瘍有効性の劇的な増加と一致している(実施例４)。
【０２９８】
実施例８：ｃ−ｍｅｔの活性化によりＥＧＦＲの活性化が生じ、ｃ−ｍｅｔはｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲ経路活性化とは無関係にＥＧＦＲと相互作用し、ｃ−ｍｅｔの活性化によりＥＧＦＲ阻害薬への応答が減弱した
材料および方法
細胞：  ＮＣＩ-Ｈ５９６細胞は、アメリカ培養細胞保存機関(ＡＴＣＣ)から入手し、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ；Sigma, St. Louis, MO)及び２ｍＭ Ｌ-グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。細胞アッセイ培地は、実験に応じて後述するように変えた。
【０２９９】
処置法および増殖因子：  上記の通りに、エルロチニブおよびＭｅｔＭＡｂはGenentech, Inc.から入手した。ＨＧＦおよびＴＧＦαはGenentechで生成した。
【０３００】
免疫沈降法およびイムノブロッティング：  文書中に記載のように、細胞は、リガンドによる刺激および／または化合物の投薬の前に０．１％ＢＳＡ／ＲＰＭＩ中で一昼夜飢餓状態にした。ＨＧＦおよびＴＧＦ−リガンドは社内で生成した。回収時に、細胞をすぐに冷温のＰＢＳにて１度洗浄し、その後、プロテアーゼ阻害剤(Sigma カタログ番号Ｐ３８４０)、ホスファターゼ阻害剤(Sigma カタログ番号Ｐ２８５０およびＰ３７２６)、ＮａＦ、Ｎａ３Ｖ０４およびＰＭＳＦをそれぞれ１ｍＭ添加した溶解バッファ(ＣＳＴ＃９８０３)中で溶解した。試料を４℃の１８０°ローターに置き、その後１４０００ｒｐｍにて、４℃で２０分間清澄化した。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイを使用して推定した。
細胞溶解物は、直接ゲルに流すか(図１２、４０μｇ／レーンの等価溶解物濃度)、又は免疫沈降した(図１３、１．６ｍｇ／試料の等価溶解物濃度)。免疫沈降は、アガロースコンジュゲートｃＭＥＴ：(Santa Cruz Biotechnology カタログ番号ＳＣ-１６１ＡＣ)、ＥＧＦＲ(Neomarkers ＭＳ−６０９−Ｐ)＋プロテインＡセファロースＦａｓｔＦｌｏｗビーズといった各々の抗体を用いて行った。試料を４℃の１８０°ローターに一昼夜置き、その後、溶解バッファにて３回洗浄し、続いて、β-メルカプトエタノールを含むＳＤＳ試料バッファ中で変性させた。試料を９５℃で５分間熱し、その後、４−１２％勾配ゲルに流し、標準的なウェスタンブロット手順を用いてニトロセルロースメンブランに転写した。文書中に示されるように、メンブランは５％ミルク／ＴＢＳＴ中で室温で１時間ブロックし、次いで、以下のホスホ-抗体にて４℃で一昼夜プローブした：ｐ−ｃ−ｍｅｔ：ｐＴｙｒ ４Ｇ１０(Upstate カタログ番号０５-７７７)；ｐＥＧＦＲ(Cell Signaling Technologies カタログ番号２２６４)。メンブランはリストアストリッピングバッファ(Pierce カタログ番号２１０５９)にて剥離し、総タンパク質に対する抗体：ｃＭＥＴ ＤＬ-２１(Upstate Biotech カタログ番号０５-２３８)；ＥＧＦＲ(MBL カタログ番号ＭＩ-１２-１)；βアクチン(Santa Cruz Biotechnologies カタログ番号ＳＣ-１６１６)にて再プローブした。二次抗体はJackson Laboratoriesから入手した。イムノブロットは製造業者の推奨に従って、ＥＣＬ法を用いて検出した。
【０３０１】
細胞生存率アッセイ：  細胞生存率アッセイのために、細胞は、３ｎＭ ＴＧＦ-ａ＋／−ＨＧＦを含むアッセイ培地による刺激の前に、０．５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ(アッセイ培地)中、３８４ウェルプレートのウェルにつき１×１０３細胞で４通り置いた。エルロチニブは複数の濃度で加え、７２時間後に、細胞生存率をＣｅｌｌｔｉｔｅｒ-Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ(Promega, Madison, WI)を使用して測定した。
【０３０２】
結果
ＨＧＦによるｃ-ｍｅｔの活性化によりＥＧＦＲの活性化が起こる
ｃ−ｍｅｔの活性化によりＮＣＩ−Ｈ５９６細胞の多数のＥＧＦＲリガンドの上方制御が起こったので、我々は、ｃ−ｍｅｔ活性化によりＥＧＦＲ経路のトランス活性化が生じることを仮定した。この仮説を試験するために、ＮＣＩ−Ｈ５９６ ＮＳＣＬＣ細胞をインビトロでＨＧＦのある場合とない場合で処置し、ＥＧＦＲ経路活性化を調べるために細胞溶解物を１０分、２４、４８および７２時間目に分析した。ｃ−ｍｅｔシグナル伝達が活性化されるとＥＧＦＲシグナル伝達の活性化が生じた(図１２)。ｐＥＧＦＲレベルの誘導はＨＧＦ刺激の１０分後という早い時期に観察されたことから、ｃ−ｍｅｔ活性化が直接ＥＧＦＲシグナル伝達をトランス活性化することが示唆される(図１２)。ｐＥＧＦＲレベルの増加は遅い時期に観察された(ＨＧＦ刺激の２４、４８および７２時間後)(図１２)。遅発型のｐＥＧＦＲ活性化動態は、ｃ−ｍｅｔ活性によりＥＧＦＲリガンドの発現が増加することを示すデータと一致しており、遅発型(２４時間超)のＥＧＦＲ経路活性化の原因となりうる。このモデルにおいて、ここで示されるデータと一致して、ＥＧＦＲの活性化は遅い時点で増加し、比較的高く維持することが予測される。
【０３０３】
ｃ−ｍｅｔはｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲ経路活性化状態とは無関係にＥＧＦＲと相互作用する 
共免疫沈降実験(ｃｏ−ＩＰ)は、ｃ−ｍｅｔおよび／またはＥＧＦＲ活性によりＥＧＦＲとｃ−ｍｅｔとが物理的に会合しうるか否かを決定するために実施した。ＮＣＩ-Ｈ５９６細胞を、リガンド無し、ＴＧＦα単独、ＨＧＦ単独、又はＴＧＦ-ａ＋ＨＧＦにて１０分間又は２４時間処置した。この処置の後、ｃ−ｍｅｔを免疫沈降し、その後、ホスホチロシン(４Ｇ１０)、ＥＧＦＲ又はｃ−ｍｅｔ何れかについてウェスタンブロッティングを行った。
何れのリガンドも存在しない場合、及びｐｃ−ｍｅｔおよびｐＥＧＦＲレベルが低下する遅い時点では、Ｃ-ｍｅｔ免疫沈降はＥＧＦＲを下げたことから、ｃ−ｍｅｔがｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲ経路活性化状態とは無関係にＥＧＦＲと相互作用したことを示す(図１３)。ホスホチロシンについてブロットしたｃ−ｍｅｔ ＩＰｓにより、ＥＧＦＲとｃ−ｍｅｔの活性化はリガンド依存性であり、２４時間後に減弱したことが明らかになった。ＨＧＦによるｃ−ｍｅｔの活性化によりｐＥＧＦＲの共免疫沈降が起こった。しかしながら、ｐＥＧＦＲレベルは、細胞がＴＧＦα単独により又はＨＧＦとの組合せにより刺激されたときに観察されるｐＥＧＦＲより非常に低かった。これらそれぞれのリガンドによるｃ−ｍｅｔ又はＥＧＦＲの活性化は、各々の経路が互いに独立して活性化されることを示した。
【０３０４】
ｃ−ｍｅｔの活性化によりＥＧＦＲ阻害薬に対するＮＣＩ−Ｈ５９６細胞の応答が減弱され、抗ｃ−ｍｅｔ抗体ＭｅｔＭＡｂによる処置によりＥＧＦＲ阻害薬に対する応答が救出された
ＴＧＦαの存在下にて生育されたＮＣＩ-Ｈ５９６細胞は、ＥＧＦＲ阻害薬エルロチニブ(ＴＡＲＣＥＶＡＴＭ)に感受性がある。これは、エルロチニブおよびＴＧＦαの存在下で生育した場合に細胞生存率が下がったことによって示された。ｃ−ｍｅｔ経路の活性化によりエルロチニブに対するＮＣＩ−Ｎ５９６細胞の応答が変化するか否かを決定するために、細胞をＴＧＦαにて刺激し、エルロチニブおよび／またはＨＧＦにて処置し、その後、細胞生存率を分析した。
低レベルのＨＧＦは、エルロチニブに対する細胞感度に対して適度な効果を示した。しかしながら、ＨＧＦ濃度の増加につれて、用量依存的にエルロチニブへの感度が劇的に低減した(図１４)。これは、これらの条件下において細胞生存率が増加することによって明らかになった。これらのデータは、Ｍｅｔ経路のＨＧＦ活性化がエルロチニブに対するＮＣＩ−Ｈ５９６細胞の応答を減弱するために十分であることを示す。
ｃ−ｍｅｔ阻害薬とＥＧＦＲ阻害薬の組合せにより、ＨＧＦおよびＴＧＦαによって同時活性化される細胞株の細胞生存率が低減したか否かを決定するために、ＮＣＩ−Ｈ５９６細胞生存率アッセイを、ＨＧＦ、ＴＧＦα、および様々な用量のエルロチニブおよび／またはｃ−ｍｅｔアンタゴニスト抗体ＭｅｔＭＡｂ(１ｕＭ)の存在下で実施した。
ＨＧＦの存在によりエルロチニブに対するＮＣＩ−Ｈ５９６細胞の応答が減弱された(図１５)。ＭｅｔＭＡｂによってｃ−ｍｅｔ経路が阻害されるとエルロチニブ感度が劇的に回復したので(図１５)、ｃ−ｍｅｔとＥＧＦＲ阻害薬による処置はＮＣＩ−Ｈ５９６細胞株における細胞生存率に影響を与える組合せ効果を有しうることが示唆される。
【０３０５】
まとめると、これらの試験は、ＥＧＦＲリガンド発現の誘導により並びにｃ-ｍｅｔとＥＧＦＲ間の直接の相互作用により、ｃ−ｍｅｔ経路の活性化がＥＧＦＲ経路を直接活性化するという仮説を裏付けるものである。これらの結果は、腫瘍がＥＧＦＲとｃ−ｍｅｔ阻害薬との組合せにより処置されたときに観察される異種移植片腫瘍有効性の劇的な増加(実施例４)と一致している。
【０３０６】
実施例９：ｃ−ｍｅｔアンタゴニストとＥＧＦＲアンタゴニストによる組合せ処置により、ＮＣＩ−Ｈ５９６異種移植片腫瘍の増殖及び生存シグナル伝達経路がより良好に阻害された
材料および方法
ＮＣＩ−Ｈ５９６ ｈｕ−ＨＧＦ−Ｔｇ−ＳＣＩＤ異種移植片腫瘍：  ＮＣＩ-Ｈ５９６異種移植片は、実施例４に記載したように、ｈｕ−ＨＧＦ−Ｔｇ−ＳＣＩＤマウスに定着させた。腫瘍は処置までに２００〜３００ｍｍ３にまで成長させた。投与は表８に記載のように行った。簡単に言うと、ＭｅｔＭＡｂ(３０ｍｇ／ｋｇ)又はＭｅｔＭＡｂバッファを０時間目(０ｈｒ)に投与し、メチルセルローストゥイーンベヒクル(ＭＣＴ)又はエルロチニブ(１５０ｍｇ／ｋｇ)を１８時間目(１８ｈｒ)に投与した。マウスを安楽死させ、腫瘍および血漿を２４時間目(２４ｈｒ)に採取した。腫瘍を液体窒素中でパリパリに凍結し、次いで、免疫沈降及びイムノブロッティングのための処理まで−７０℃に保存した。
【０３０７】
表８  試験設定
2011513427.tif 000021
【０３０８】
免疫沈降およびイムノブロッティング：  タンパク質分析のために腫瘍を処理するために、まず腫瘍を、ガラスｄｏｕｎｃｅを使用して、１ｍＭ ＰＭＳＦ、更なるプロテアーゼインヒビター反応混液およびホスファターゼインヒビター反応混液ＩおよびＩＩ(Sigma, Inc., St. Louis, MO)を添加した溶解バッファ(Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA)にて均一にした。溶解物を氷上で１時間インキュベートし、次いで、１４０００×ｇにて５分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質濃度をＢＣＡＴＭタンパク質アッセイキット(Pierce, Inc., Rockford, IL)を用いて決定し、試料をイムノブロットした。免疫沈降のために、１．５ｍｇの腫瘍溶解物を用い、Ｃ−２８抗ヒトｃ−Ｍｅｔポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)コンジュゲートアガロースビーズを用いてＭｅｔを、又は、ＭＩ−１２−１抗体(MBL, Inc., Woburn, MA)を用いてＥＧＦＲを、回転させながら４℃で終夜かけて沈降させた。ビーズは、４℃の溶解バッファにて３回洗浄した後、２．５％(ｗ／ｖ)β-メルカプトエタノールを含む１×Ｎｏｖｅｘトリス-グリシンＳＤＳランニングバッファ(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)に再懸濁した。直接ウエスタンブロットのために、１レーンにつき５０μｇの腫瘍溶解物を流した。次いで、試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによって分析した。使用する抗体には、マウス抗ヒトｃ-Ｍｅｔ ＤＬ-２１、マウス抗ホスホチロシンｍＡｂ ４Ｇ１０(共にUpstate Biotechnology/Millepore, Inc., Charlottesville, VA)、抗Ａｋｔ、抗ｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ(ＥＲＫ-１／２)、抗ホスホ−Ａｋｔ(Ｓｅｒ４７３)、抗ホスホｐ４４／４２ ＭＡＰキナーゼ(ＥＲＫ-１／２)(Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４)が含まれ、すべて製造業者の推奨に従って用いた(すべてCell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA))。ヤギ抗マウスＩＲｄｙｅ８００(Rockland Immunochemicals, Inc., Gilbertsville, PA)およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)を二次抗体として用いた。イムノブロットを撮像し、リン酸化タンパク質レベルを定量化し、オデュッセイア映像器(LI COR Biosciences, Lincoln, NE)を用いて総タンパク質レベル(例えば総ＥＧＦＲに対するｐＥＧＦＲ)に正規化した。
【０３０９】
結果
ｃ−ｍｅｔおよびＥＧＦＲ経路活性化は、ＮＣＩ−Ｈ５９６ ｈｕ−ＨＧＦ−Ｔｇ−ＳＣＩＤマウス異種移植片モデルにおいて生成され、ＥＧＦＲ阻害薬、ｃ−ｍｅｔ阻害薬およびＥＧＦＲとｃ−ｍｅｔ阻害薬の組合せにより処置した異種移植片腫瘍において調べた。前述したように、２０のｈｕ-ＨＧＦ-Ｔｇ-ＳＣＩＤマウスにＮＣＩ−Ｈ５９６細胞を接種し、腫瘍を定着させた。一旦腫瘍が２００〜３００ｍｍ３のサイズに達すると、マウスを、腫瘍体積に基づいて４つのグループに均等に分類し、投与を開始した(表８)。ＭｅｔＭＡｂは腫瘍採取の２４時間前に投与したのに対して、エルロチニブは採取の６時間前に投与した。投与時間は、各治療薬の相対的な半減期に基づいて選択した。２４時間目に、マウスを安楽死させ、腫瘍を採取して、腫瘍を、リン酸化及び総Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＡｋｔおよびＥＲＫ-１／２に対する免疫沈降(ＩＰ)および／またはイムノブロットのために処理した。
ＭｅｔＭＡｂ単独による処置により、ベヒクルコントロールの１２％(＋／−３．６％)までｃ−ｍｅｔリン酸化が阻害され(図１６)、ＭｅｔＭＡｂとエルロチニブによる併用処置によりベヒクルコントロールの６％(＋／−３．５％)までｃ−ｍｅｔリン酸化が阻害された(図１６)(ｐ＝０．０３９)。エルロチニブ単独による処置により(図１６)ｃ−ｍｅｔリン酸化は減少しなかった。エルロチニブ単独による処置により、ベヒクルコントロールの１６％(＋／−７．９％)までＥＧＦＲのリン酸化が阻害され、エルロチニブとＭｅｔＭＡｂによる併用処置によりベヒクルコントロールの１９％(＋／−１５％)までＥＧＦＲのリン酸化が阻害された(図１６)。また、ＭｅｔＭＡｂ単独による処置により、ベヒクルコントロールの６２％(＋／−２１．６％)までｐＥＧＦＲがやや阻害された(ｐ＝０．００６)。
これらの結果は、ＭｅｔＭＡｂおよびエルロチニブがそれぞれ各々の標的の活性化を効率よく阻害することそして、ｃ−ｍｅｔの遮断はＮＣＩ−Ｈ５９６ ｈｕ−ＨＧＦ−Ｔｇ−ＳＣＩＤモデルにおけるｐＥＧＦＲ応答を阻害しうることを示した。
【０３１０】
また、ＭｅｔＭＡｂとエルロチニブによる併用処置により、活性化されたＭｅｔおよびＥＧＦＲの下流で活性化されるＲａｓ-ＲＡＦ-ＭＥＫ-ＥＲＫ１／２経路及びＰＩ-３Ｋ／Ａｋｔがより有効に阻害された。これら経路は、それぞれ、腫瘍細胞生存および増殖を活性化し、腫瘍形成を作動するように働く。ホスホ-Ａｋｔおよびホスホ-ＥＲＫ-１／２は、ＭｅｔＭＡｂ、エルロチニブ又はＭｅｔＭＡｂ＋エルロチニブにて処置された動物の異種移植片腫瘍において調べた。
ＭｅｔＭＡｂ単独による処置により、ベヒクルコントロールの７２％(＋／−２７．９％)にまでｐＡｋｔが阻害され、そしてベヒクルコントロールの７２％(＋／−４０．３％)にまでｐＥＲＫ-１／２が阻害された(図１５、表９)。エルロチニブ処置により、ベヒクルコントロールの４５％(＋／−２５．７％)にまでｐＡｋｔが、３９％(＋／−８．９％)にまでＥＲＫ-１／２がそれぞれ強力に阻害された(図１６、表９)。ＭｅｔＭＡｂとエルロチニブの組合せによる処置により、ベヒクルコントロールの２４％(＋／−１３．８％)にまでｐＡｋｔが、ベヒクルコントロールの２９％(＋／−２．９％)にまでｐＥＲＫ-１／２がそれぞれ向上した阻害を示した(図１５、表９)。これらの結果は、ＭｅｔＭＡｂとエルロチニブによる併用処置は、ＭｅｔＭＡｂ単独又はエルロチニブ単独による処置よりも効果的に下流のシグナル伝達経路を阻害したことを示した。
【０３１１】
表９   ＭｅｔＭＡｂ、エルロチニブ又はＭｅｔＭＡｂとエルロチニブの組合せによるＮＣＩ−Ｈ５９６腫瘍保持マウスの処置後の、ベヒクルコントロールの割合としての、リン酸化タンパク質＊の定量化されたレベルの概要。リン酸化タンパク質レベルは、Ｌｉ-Ｃｏｒによってバンドのシグナル強度を定量化し、その後総タンパク質レベル(マイナスバックグラウンド)に正規化することによって決定した。データは、ベヒクルコントロールの割合として表される(値は、図１６に示すように５匹の処置されたそれぞれ異なる動物の腫瘍の平均を表す)。
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【０３１２】
図１７Ａおよび１７Ｂは、以下のような本明細書中に開示した所見のいくつかを概略的にまとめたものである。
(１) ｃ−ｍｅｔおよびＥＧＦＲは、ＮＳＣＬＣ細胞株および腫瘍において同時発現した。
(２) ｃ-ｍｅｔ活性はＥＧＦＲリガンドおよびｐＥＧＦＲの発現をポジティブに制御した。
(３) ｃ-ｍｅｔ活性はＨＥＲ３の発現をネガティブに制御した。
(４) ＴＧＦα処置は、ｃ−ｍｅｔ阻害によって引き起こされる生存率の喪失から、リガンドとは無関係にｃ−ｍｅｔが活性化された細胞を救出した。
(５) ｃ−ｍｅｔ活性化は、インビトロ及びインビボでのエルロチニブへの応答を低減した。
【０３１３】
文献一覧の一部
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【０３１４】
前述の発明は、明確に理解するために図と例とを挙げていくらか詳細に記載されているが、この記載や実施例は、本発明の範囲を制限するように解釈されてはならない。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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