(57)【要約】  メラノコルチン受容体結合ミメティボディポリペプチドが開示される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含む又はミメティボディを発現する細胞、並びにこれらの製造方法及び使用方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）に従ったポリペプチドであって、
（Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)
（Ｉ）
式中、Ｍｐは、配列番号８７、８９、９１、９３、９５、９７又は２８２の生物学的に活性なメラノコルチン受容体結合分子断片であり、Ｌｋはポリペプチド又は化学連鎖であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端部分であり、Ｈｇは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、ＣH２は免疫グロブリン重鎖のＣH２定常領域であり、ＣH３は免疫グロブリン重鎖のＣH３定常領域であり、ｙは０又は１であり、ｔは独立して１〜１０の整数である、ポリペプチド。
【請求項２】
Ｍｐが、配列番号８７、８９、９１、９３、９５、９７又は２８２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、少なくとも１つのメラノコルチン受容体に結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記メラノコルチン受容体がメラノコルチン４受容体である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１２１、１２３、１２７、１２９、１３２、１３４、１３７、１３９、１４２、１４４、１４７、１４９、１５２、１５４、１５７、１５９、１６２、１６４、１６７、１６９、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８７、１８９、１９２、１９４、１９７、１９９、２０２、２０４、２０７、２０９、２１２、２１４、２１７、２１９、２２２、２２４、２２７、２２９、２３２、２３４、２３７、２３９、２４２、２４４、２５１、２５３、２５６、２５８、２６１、２６３、２６６、又は２６８に示される配列を有するポリペプチドを含むポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２１２に示される配列を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１２０、１２２、１２６、１２８、１３１、１３３、１３６、１３８、１４１、１４３、１４６、１４８、１５１、１５３、１５６、１５８、１６１、１６３、１６６、１６８、１７１、１７３、１７６、１７８、１８１、１８３、１８６、１８８、１９１、１９３、１９６、１９８、２０１、２０３、２０６、２０８、２１１、２１３、２１６、２１８、２２１、２２３、２２６、２２８、２３１、２３３、２３６、２３８、２４１、２４３、２５０、２５２、２５５、２５７、２６０、２６２、２６５、若しくは２６７に示される配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号１２０、１２２、１２６、１２８、１３１、１３３、１３６、１３８、１４１、１４３、１４６、１４８、１５１、１５３、１５６、１５８、１６１、１６３、１６６、１６８、１７１、１７３、１７６、１７８、１８１、１８３、１８６、１８８、１９１、１９３、１９６、１９８、２０１、２０３、２０６、２０８、２１１、２１３、２１６、２１８、２２１、２２３、２２６、２２８、２３１、２３３、２３６、２３８、２４１、２４３、２５０、２５２、２５５、２５７、２６０、２６２、２６５、若しくは２６７に示される配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１２１、１２３、１２７、１２９、１３２、１３４、１３７、１３９、１４２、１４４、１４７、１４９、１５２、１５４、１５７、１５９、１６２、１６４、１６７、１６９、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８７、１８９、１９２、１９４、１９７、１９９、２０２、２０４、２０７、２０９、２１２、２１４、２１７、２１９、２２２、２２４、２２７、２２９、２３２、２３４、２３７、２３９、２４２、２４４、２５１、２５３、２５６、２５８、２６１、２６３、２６６、又は２６８に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
配列番号１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５４、２５９、２６４、又は２６９に示される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１３】
請求項１０に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）由来の細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１３に記載の細胞を培養する工程と、発現したポリペプチドを精製する工程とを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドの有効量と、製薬上許容できる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の医薬組成物を細胞、組織又は臓器と接触させることを含む、該細胞、該組織又は該臓器の中のメラノコルチン受容体の生物活性を修飾する方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、少なくとも１つのメラノコルチン受容体媒介疾患を調節する方法。
【請求項１９】
前記メラノコルチン受容体媒介疾患が、肥満、男性勃起不全、女性の性的機能不全、炎症状態、又は線維症である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記炎症状態が、アレルギー性炎、痛風性関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、虚血後の腎損傷、肝炎、虚血脳障害又は末梢神経障害である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国仮特許出願第６０／６２１，９６０号（２００４年１０月２５日出願）への優先権を主張する、米国特許出願第１１／２５７，８５１号（２００５年１０月２５日出願）の一部継続出願である。本願はまた、米国仮特許出願第６０／９７２，０１８号（２００７年９月１３日出願）の利益を主張する。上記出願のそれぞれの全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、メラノコルチン受容体結合ミメティボディ（mimetibodies）、ミメティボディをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む又はミメティボディを発現する細胞、並びにこれらの製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
肥満は、体のサイズに対する過度の脂肪量の割合により明らかになる慢性疾患である。今日、３人に１人のアメリカ人が過体重（肥満度指数（ＢＭＩ）＞２５ｋｇ／ｍ2）であると考えられており、米国疾病管理予防センター（the United States Centers for Disease Control and Prevention）（ＣＤＣ）が、肥満が流行病のレベルに達しつつあると宣言することとなった（カミングス（Cummings）及びシュウォーツ（Schwartz）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．、５４：４５３〜４７１頁（２００３年））。肥満の治療の重要性は、この疾患が、特に２型糖尿病、うっ血性心不全、変形性関節症、及び睡眠時無呼吸症といった疾患を発症させる根本原因、又は危険因子であるという事実によって強調されている。
【０００４】
加えて、肥満は、肥満、アテローム性脂質異常症、高血圧、及びインスリン耐性によって特徴づけられる病状である「メタボリックシンドローム」に関係している。米国において、メタボリックシンドロームはますます多くの人々に影響を与えている。重要なことに、体重の軽度の減少（初期体重の５〜１０％）であってもメタボリックシンドロームの疾患を有意に改善することができ、かつ肥満に関連する疾患を発症する危険因子を減少させることができることが示された（ウィング（Wing）ら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．、１４７：１７４９〜１７５３頁（１９８７年）；ツォミレフト（Tuomilehto）ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４４：１３４３〜１３５０頁（２００１年）；ノウラー（Knowler）ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４６：３９３〜４０３頁（２００２年）；フランツ（Franz）ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２５：１４８〜１９８頁（２００２年））。加えて、ある文化においては、しばしば肥満者に付随する社会的不名誉に起因して、肥満の治療はメンタルヘルスの観点から重要である場合がある。
【０００５】
メラノコルチン受容体は、ヒト及び齧歯類の両方において、全体的なエネルギーバランス及び肥満を調節する重要な役割を果たす。αメラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）は、メラノコルチン系の重要な構成成分である１３アミノ酸ペプチドホルモンである。α−ＭＳＨは、下垂体により放出されるプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）のタンパク質プロセシングによって作り出される。α−ＭＳＨはメラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）と高親和性で結合するが、メラノコルチン受容体３（ＭＣ３Ｒ）及びメラノコルチン受容体５（ＭＣ５Ｒ）とも低親和性で結合する。ＭＣ４Ｒは、α−ＭＳＨ結合によって刺激されると食糧摂取量を減らして脂肪の酸化を増加させる、脳に見られるＧ結合タンパク質受容体である。最終的には、ＭＣ４Ｒなどのメラノコルチン受容体の刺激によって重量喪失がもたらされる。
【０００６】
ヒト及び齧歯類において、メラノコルチン系の異なる構成成分の突然変異機能の喪失は、肥満及び関連する疾患と密接に相関している。マウスでは、ＰＯＭＣ、又はＭＣ４Ｒ及びＭＣ３Ｒ内の変異は、肥満、インスリン耐性、及び過食症を引き起こす（グッドフェロー（Goodfellow）及びサンダース（Saunders）、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：８５５〜８８３頁（２００３年）；フサール（Huszar）ら、Ｃｅｌｌ  ８８：１３１〜１４１頁（１９９７年）；ヤスウェン（Yaswen）ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１０６６〜１０７０頁（１９９９年））。男性において、ＰＯＭＣ又はＭＣ４Ｒ内の変異は、増加した食糧摂取量に伴う肥満の発症を引き起こす（クリューデ（Krude）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：１５５〜１５７頁（１９９８年）；イョオ（Yeo）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：１１１〜１１２頁（１９９８年）；ブランソン（Branson）ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１０９６〜１１０３頁（２００３）；ヴェス（Vaisse）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６）：２５３〜２６２頁（２０００）；ホー（Ho）及びマッケンジー（MacKenzie）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３５８１６〜３５８２２頁（１９９９年））。
【０００７】
重量喪失はメラノコルチン系活性の薬理学的刺激によって生じ得る。齧歯類において、ＭＣ４Ｒなどのメラノコルチン受容体の薬理学的刺激は、食糧摂取量の低下、エネルギー消費の増加、及び重量喪失を引き起こす（ピアーロズ（Pierroz）ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１：１３３７〜１３４５頁（２００２年））。男性において、非肥満男性のＭＣ４Ｒを刺激するためにα−ＭＳＨを鼻内に投与すると、体脂肪の喪失に起因して体重の減少を引き起こすが、除脂肪体重の減少ではない（フェーム（Fehm）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂｏｌ．８６：１１４４〜１１４８頁（２００１年））。
【０００８】
肥満は現在さまざまな異なる対策で治療されているが、ある程度の成功しか得られていない。これらの対策には、主に、「ライフスタイル」を変えること（例えば、ダイエット及びエクササイズ）、低分子系による薬物療法、又は胃の一部分の外科切除（胃バイパス手術）が含まれる。更に、α−ＭＳＨのような減量刺激メラノコルチン受容体結合ペプチドの血清半減期は極めて短いので、調剤としての使用は限られている。
【０００９】
α−ＭＳＨはまた、男性の勃起活性を向上させる役割を果たす。合成メラノコルチン受容体のアクチベーター分子であるメラノタンＩＩ（ＭＴＩＩ）でメラノコルチン受容体を標的にすると、勃起不全を増強するという予期せぬ副作用を引き起こした（２０）。ＭＴＩＩはまた、選択的ＭＣ４受容体アゴニストとは対照的に、性的刺激なしに齧歯類及びヒトの勃起を惹起することが示されている。したがって、ＭＣ３及びＭＣ４受容体は共に、完全な勃起促進性の勃起に必要である可能性がある。臨床上のデータは、ＭＴＩＩ誘導体であるＰＴ−１４１（ブレメラノチド（bremelanotide））を経鼻又は皮下投与した後に、健康な男性被験者の統計的に有意な勃起反応が見られたことを示した（２２、２３）。男性勃起不全（ＥＤ）は現在のところ、主に、バイアグラ（VIAGRA）（登録商標）、シアリス（CIALIS）（登録商標）、及びレビトラ（LEVITRA）（登録商標）などのＰＤＥ−５阻害剤で治療されている。しかしながら、これらの薬剤は、性的活動の約１時間前に経口摂取する必要がある。
【００１０】
ブレメラノチドは、女性の性的機能不全（ＦＳＤ）の治療に用いるためにも試験されている。米国泌尿器疾患財団（the American Foundation for Urologic Disease）は、ＦＳＤを「十分な性的興奮を得る又は維持することが持続的に又は反復的にできずに個人的なストレスを引き起こす。これは、主観的興奮の欠如、又は生殖器若しくはその他の身体反応の欠如と表現することができる。」と定義している。ＦＳＤは、次の４つの要素からなる：性的欲求低下障害、女性の性的興奮障害（ＦＳＡＤ）、無オルガスム症、及び性交疼痛症。ＦＳＤのいくつかの形態は、女性集団の約４３パーセントに蔓延していると思われる。ラウマン（Laumann）ら、ＪＡＭＡ２８１、５３７〜５４４頁（１９９９年）。
【００１１】
α−ＭＳＨは、局所炎症の最も顕著な媒介物のいくつかに起因する炎症を抑制するサイトカイン拮抗物質としても作用する（３１）。例えば、α−ＭＳＨは、炎症性サイトカイン及びケモカインの生成及び作用を抑制する（３２、３３）。α−ＭＳＨは、細胞傷害性一酸化窒素（ＮＯ）及びネオプテリン（３４、３５）、プロスタグランジンＥ合成（３７）のマクロファージ生成も抑制する。α−ＭＳＨはまた、末梢β２アドレナリン受容体に依存して下行抗炎症神経経路を活性化させ（３８）、かつインターロイキン−１０の生成を増加させる（３９）。
【００１２】
アレルギー性炎では、非特異的刺激物質及びサイトカインによって誘導される急性皮膚炎において、α−ＭＳＨペプチドの抗炎症効果が確認された（４２〜４６）。接触過敏症の誘導及び誘発の抑制効果に加え、α−ＭＳＨは、ＩＬ−１０放出を介してハプテン特異的寛容をマウスに誘導する（４７）。
【００１３】
痛風性（急性）関節炎において、ＡＣＴＨは、痛風性関節炎のラットモデルに抗炎症効果をもたらした。同じ著者は、ＭＣ３Ｒサブタイプを標的にすることは、ヒトの痛風性関節炎、及び場合によってはその他の急性関節炎の臨床管理に有用であり得ることも示した（４８）。関節リウマチにおいて、前臨床のアジュバント誘発関節炎を有していたラットをα−ＭＳＨで治療すると、関節変形を有意に軽減した。α−ＭＳＨの有効性は、プレドニゾロンの有効性と同様であると報告された。
【００１４】
炎症性腸疾患において、硫酸デキストラン誘導大腸炎を有するマウスに投与されたα−ＭＳＨは、便潜血を減少させ、かつプラシーボを受けたマウスと比較して重量喪失は少なかった（５１）。α−ＭＳＨ投与は、トリニトロベンゾスルホン酸によってラットに誘導された急性及び慢性大腸炎のいずれにおいても、大腸の肉眼的病変を減少させた（５２）。
【００１５】
両側性腎虚血のマウスモデルでは、α−ＭＳＨは、虚血によって引き起こされた腎障害を有意に軽減した（３２）。
【００１６】
肝炎及び線維症において、α−ＭＳＨ遺伝子治療は、ＣＣｌ4処理マウスの確立した肝線維症を食い止めた（６０）。別の研究では、α−ＭＳＨは、ＴＮＦ−α、並びに好中球及び単球ケモカインに関して、全身的なＮＯの生産、肝臓の好中球浸潤、及び増加した肝臓のｍＲＮＡの存在量を抑制した（３３）。
【００１７】
虚血脳障害（脳卒中）において、α−ＭＳＨ治療は、一過性脳虚血の後の脳内の炎症性サイトカイン遺伝子発現を消滅させ、全身投与されたメラノコルチンが脳虚血に神経保護的効果を発揮し得ることを示している。この研究は、α−ＭＳＨが、脳内のＴＮＦ−αの活性化、並びに動脈閉塞及び再かん流後のＩＬｌβ遺伝子発現を軽減させることを示した（４０）。別の研究では、メラノコルチンは、ＣＮＳメラノコルチン４（ＭＣ４）受容体を活性化させることにより、脳虚血によって起こる炎症、アポトーシス（ＤＮＡ損傷を含む）、並びに組織病理学的及び行動学的結果に対して、広い治療領域を有する強力な保護作用をもたらした（４１）。
【００１８】
末梢神経障害において、α−ＭＳＨ及びＡＣＴＨは、両方のペプチドが、生体外の胎児脊髄のスライスからの軸索成長を用量依存的やり方で刺激したことを証明した（５３）。更に、α−ＭＳＨは、分離されたラットの脊髄ニューロン及び感覚ニューロンからの萌芽及び神経突起の伸長を促進した（５５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上述の疾患の更なる治療の必要性、具体的には、潜在的に作用が速やかに発現し、α−ＭＳＨ等のメラノコルチン受容体結合ペプチドの短い血清半減期を克服するメラノコルチン受容体結合分子の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の一態様は、式（Ｉ）に従ったポリペプチドであって、
（Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)
（Ｉ）
式中、Ｍｐは、配列番号８７、８９、９１、９３、９５、９７又は２８２の生物学的に活性なメラノコルチン受容体結合分子断片であり、Ｌｋはポリペプチド又は化学連鎖であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端部分であり、Ｈｇは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、ＣH２は免疫グロブリン重鎖のＣH２定常領域であり、ＣH３は免疫グロブリン重鎖のＣH３定常領域であり、ｙは０又は１であり、ｔは独立して１〜１０の整数である。
【００２１】
本発明の別の態様は、配列番号１２１、１２３、１２７、１２９、１３２、１３４、１３７、１３９、１４２、１４４、１４７、１４９、１５２、１５４、１５７、１５９、１６２、１６４、１６７、１６９、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８７、１８９、１９２、１９４、１９７、１９９、２０２、２０４、２０７、２０９、２１２、２１４、２１７、２１９、２２２、２２４、２２７、２２９、２３２、２３４、２３７、２３９、２４２、２４４、２５１、２５３、２５６、２５８、２６１、２６３、２６６、又は２６８に示される配列を有するポリペプチドを含むポリペプチドである。
【００２２】
本発明の別の態様は、配列番号２１２に示される配列を有するポリペプチドである。
【００２３】
本発明の別の態様は、配列番号１２０、１２２、１２６、１２８、１３１、１３３、１３６、１３８、１４１、１４３、１４６、１４８、１５１、１５３、１５６、１５８、１６１、１６３、１６６、１６８、１７１、１７３、１７６、１７８、１８１、１８３、１８６、１８８、１９１、１９３、１９６、１９８、２０１、２０３、２０６、２０８、２１１、２１３、２１６、２１８、２２１、２２３、２２６、２２８、２３１、２３３、２３６、２３８、２４１、２４３、２５０、２５２、２５５、２５７、２６０、２６２、２６５、若しくは２６７に示される配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号１２０、１２２、１２６、１２８、１３１、１３３、１３６、１３８、１４１、１４３、１４６、１４８、１５１、１５３、１５６、１５８、１６１、１６３、１６６、１６８、１７１、１７３、１７６、１７８、１８１、１８３、１８６、１８８、１９１、１９３、１９６、１９８、２０１、２０３、２０６、２０８、２１１、２１３、２１６、２１８、２２１、２２３、２２６、２２８、２３１、２３３、２３６、２３８、２４１、２４３、２５０、２５２、２５５、２５７、２６０、２６２、２６５、若しくは２６７に示される配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。
【００２４】
本発明の別の態様は、配列番号１２１、１２３、１２７、１２９、１３２、１３４、１３７、１３９、１４２、１４４、１４７、１４９、１５２、１５４、１５７、１５９、１６２、１６４、１６７、１６９、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８７、１８９、１９２、１９４、１９７、１９９、２０２、２０４、２０７、２０９、２１２、２１４、２１７、２１９、２２２、２２４、２２７、２２９、２３２、２３４、２３７、２３９、２４２、２４４、２５１、２５３、２５６、２５８、２６１、２６３、２６６、又は２６８に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。
【００２５】
本発明の別の態様は、本発明のミメティボディ組成物を含む医薬組成物である。
【００２６】
本発明の別の態様は、本発明のミメティボディ組成物を細胞、組織又は臓器と接触させることを含む、細胞、組織又は臓器の中のメラノコルチン受容体の生物活性を修飾する方法である。
【００２７】
本発明の別の態様は、本発明のミメティボディ組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、少なくとも１つのメラノコルチン受容体媒介疾患を調節する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】メラノコルチン受容体結合ミメティボディポリペプチドの要素。
【図２】メラノコルチン受容体結合ミメティボディの略画。
【図３】メラノコルチン受容体結合α−ＭＳＨミメティボディのアミノ酸（配列番号６２）及びｃＤＮＡ（配列番号６１）の配列。個々のミメティボディ要素のアミノ末端部分には下線が引かれている。
【図４】競合結合アッセイにおいてＭＣ４Ｒに結合しているα−ＭＳＨミメティボディ。
【図５】高レベルのＭＣ４Ｒを発現する細胞中のＭＣ４Ｒのα−ＭＳＨミメティボディ活性化。
【図６】低レベルのＭＣ４Ｒを発現する細胞中のＭＣ４Ｒのα−ＭＳＨミメティボディ活性化。
【図７】α−ＭＳＨミメティボディの媒介による動物の食糧摂取量の減少。
【図８】α−ＭＳＨミメティボディの媒介による動物の体重の減少。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書に引用される特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない全ての刊行文献は、参照により、完全に説明されているごとくに本願に組み込まれる。
【００３０】
本発明は、メラノコルチン受容体に結合する性質、及び抗体免疫グロブリン分子の異なるイソタイプ、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ、及びそれらの任意のサブクラス、例えばＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3又はＩｇＧ4、あるいはそれらの組合せを模倣する性質を有する、本明細書において後に一般的に「ミメティボディ」と呼ばれるポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のミメティボディポリペプチドは、α−メラノサイト刺激ホルモンペプチド（α−ＭＳＨ）配列を含有し、メラノコルチン受容体結合α−ＭＳＨミメティボディと称される。このようなα−ＭＳＨミメティボディポリペプチドは、メラノコルチン受容体４（ＭＣ４Ｒ）に結合し、等しい及び低い親和性でＭＣ３Ｒ及びＭＣ５Ｒにそれぞれ結合することができる。このようなメラノコルチン受容体結合の１つの結果は、メラノコルチン受容体活性の刺激又は抑制であり得る。メラノコルチン受容体活性の刺激又は抑制は、メラノコルチン受容体媒介疾患の治療に有用であり得る。
【００３１】
一実施形態において、本発明のポリペプチドは一般式（Ｉ）を有し、
（Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)
（Ｉ）
式中、Ｍｐは、メラノコルチン受容体結合分子であり、Ｌｋはポリペプチド又は化学連鎖であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端部分であり、Ｈｇは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、ＣH２は免疫グロブリン重鎖のＣH２定常領域であり、ＣH３は免疫グロブリン重鎖のＣH３定常領域であり、ｙは０又は１であり、ｔは独立して１〜１０の整数である。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「メラノコルチン受容体結合分子」は、ホモサピエンスＭＣ４Ｒ（配列番号７７）などの少なくとも１つのメラノコルチン受容体と結合することができる分子を意味する。その他のホモサピエンスメラノコルチン受容体の例には、ＭＣＲ１（配列番号７１）、ＭＣＲ２（配列番号７３）、ＭＣＲ３（配列番号７５）、及びＭＣＲ５（配列番号７９）が挙げられる。所与のペプチド鎖は、それが既知のメラノコルチン受容体配列又は既知のメラノコルチン受容体の成熟体に対して、少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する場合は「メラノコルチン受容体」であり、Ｇタンパク質結合受容体として作用し得る。２つのペプチド鎖のパーセント同一性は、ベクター（Vector）ＮＴＩバージョン９．０．０（インビトロジェン社（Invitrogen Corp.）、カリフォルニア州カールスバッド（Carslbad, CA））のアラインＸ（AlignX）モジュールのデフォルト設定を使用して、ペアワイズアラインメントで決定することができる。例示のメラノコルチン受容体結合分子は、（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有する１３アミノ酸α−ＭＳＨペプチドである。その他のメラノコルチン受容体結合分子は、配列番号２の生物学的に活性な断片と、メラノコルチン受容体に結合することができるその他のアミノ酸配列とを含む。本明細書で使用するとき、用語「生物学的に活性な断片」は、ＭＣ４Ｒなどのメラノコルチン受容体に結合することができるα−ＭＳＨペプチドの部分を指す。ペプチド配列ＨＦＲＷ（配列番号８１）は、α−ＭＳＨペプチド配列ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号２）の代表的な「生物学的に活性な断片」である。ＨＦＲＷ断片は、合成メラノコルチン受容体アクチベーター分子メラノタンＩＩ（ＭＴＩＩ）の構造に組み込まれてきた（ファン（Fan）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１６５〜１６８頁（１９９７年））。
【００３３】
本発明のミメティボディポリペプチドにメラノコルチン受容体結合分子を組み込むことで、幅広い親和性でのメラノコルチン受容体への結合が提供される。本発明のミメティボディポリペプチドは、約１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11又は１０-12Ｍ以下のＫdでメラノコルチン受容体に結合することができる。ａＭＳＨペプチド、ＭＴＩＩペプチド、及びａＭＳＨミメティボディに関して得られるＩＣ50値の範囲は、それぞれ、２６０〜４００ｎＭ、５〜３０ｎＭ及び２００〜３００ｎＭであった。メラノコルチン受容体に対するミメティボディポリペプチドの親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる。そのような方法は、ビアコア（Biacore）若しくはキネクサ（KinExA）計測手段、ＥＬＩＳＡ又は競合結合アッセイを用いてもよい。所望の親和性で特定のメラノコルチン受容体に結合するミメティボディポリペプチドは、当業者に既知の技術によって、変異体又は断片のライブラリーから選択することができる。
【００３４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するα−ＭＳＨペプチドは、他のメラノコルチン受容体結合分子を得るために修飾することができる。そのような修飾は、ペプチドにＣ−［Ｘ］n−Ｃモチーフを組み込んで、ジスルフィド結合の形成を介してペプチドを配座的に制限することを含んでもよい。Ｃ−［Ｘ］n−Ｃモチーフにおいて、Ｃはシステイン残基であり、Ｘはアミノ酸残基であり、ｎは、必要な配座的制約を達成するのに必要な整数である。この場合、ｎは、少なくて１残基、多くて５０であり得る。代表的なＣ−［Ｘ］n−Ｃ修飾ペプチド配列は、配列番号４、６、８、１０、８９、９１、９３、９５、及び９７に示される。必要であれば、Ｃ−［Ｘ］n−Ｃ修飾ペプチド配列を更に修飾して、成熟ミメティボディのＮ末端切り取りを防ぐことができる。例えば、配列番号４又は配列番号９７は、Ｎ末端Ｓ−Ｙ−Ｓ配列を除去して、それぞれ配列番号２８２又は配列番号２７１に示されるようなＧ−Ｇでそこを置換するように修飾され得る。
【００３５】
修飾は、ペプチドにＷａ−［Ｘ］n−Ｗａモチーフを組み込んで、トリプトファンジッパーの形成を介してペプチドを配座的に制限することを更に含んでもよい。Ｗａ−［Ｘ］n−Ｗａモチーフにおいて、Ｗはトリプトファン残基であり、Ｘはアミノ酸であり、ａは、通常は２であるが、１〜１０であることができる整数であり、ｎは、必要な配座的制約を達成するのに必要な整数である。この場合、ｎは、少なくて１残基、多くて５０であり得る。代表的なＷａ−［Ｘ］n−Ｗａペプチドは、配列番号１２、１４、１６及び１８に示される。更に、α−ＭＳＨペプチドに存在する配列ＨＦＲＷ（配列番号８１）もまた、この配列の任意の残基を、Ｆ、Ｈ、Ｗ及びＭの任意の１つで置換することで修飾されてもよい。例えば、ＨＦＲＷ（配列番号８１）はＦＨＷＭ（配列番号８３）に置換することができる。
【００３６】
本発明のポリペプチドでは、リンカー部分（Ｌｋ）は、ミメティボディに別の配向性及び結合特性をもたせることにより、構造的柔軟性を提供する。代表的なリンカーは、非ペプチド化学結合、又はペプチド結合でリンクされた１〜２０個のアミノ酸を含み、アミノ酸は、２０個の自然発生アミノ酸、又はその他のアミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸、非自然発生アミノ酸又は自然発生希少アミノ酸）から選択される。リンカー部分は、グリシン、アラニン及びセリンなどの、立体障害のないアミノ酸の大部分を含むことができ、ＧＳ、ポリＧＳ（例えば、ＧＳＧＳ（配列番号２０））、ＧＧＳＧ（配列番号２２）、ＧＳＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号２６）、ＧＳＳＧ（配列番号２８）、ＧＧＧＳ（配列番号８５）、ＧＧＧＧＳ（配列番号９９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０５）、若しくは任意の組合せ、又はこれらのポリマーを含むことができる。本発明の範囲内のその他の代表的なリンカーは、２０残基よりも長くてもよく、グリシン、アラニン及びセリン以外の残基を含んでもよい。
【００３７】
本発明のポリペプチドにおいて、Ｖ２は、重鎖可変領域などの免疫グロブリン可変領域のカルボキシ末端ドメインの一部分である。代表的なＶ２アミノ酸配列は、ＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）、ＴＬＶＡＶＳＳ（配列番号３４）及びＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２４９）である。
【００３８】
本発明の（Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)ミメティボディポリペプチドは、「ｙ」Ｖ２ポリペプチドを含んでもよい（式中、ｙは０（ゼロ）又は１である）。配列番号１２７、１２９、１３２、１３４、１３７、１３９、１４２、１４４、２０２、２０４、２０７、２０９、２１２、２１４、２１７、２１９、２２２、２２４、２２７、２２９、２５６、２５９、２６１、２６４、２６６、又は２６９に示されるアミノ酸配列は、１個のＶ２ポリペプチドを含むミメティボディポリペプチドの例である。別の言い方をすれば、これらのミメティボディポリペプチドは、式、（Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)の例である（式中、ｙは１である）。配列番号６０、６２、１２１、１２３、１４７、１４９、１５２、１５４、１５７、１５９、１６２、１６４、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８７、１８９、１９２、１９４、１９７、１９９、２３２、２３４、２３７、２３９、２４２、２４４、２５１、又は２５３のアミノ酸配列は、Ｖ２ポリペプチドが欠如したミメティボディポリペプチドの例である。換言すれば、これらは、式、（Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)のミメティボディポリペプチドである。
【００３９】
本発明のポリペプチドにおいて、Ｈｇは、重鎖可変領域などの免疫グロブリン可変領域のヒンジドメインの一部分である。代表的なＨｇアミノ酸配列には、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３６）、ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３８）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４０）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４２）、ＣＰＰＣＰ（配列番号４４）及びＣＰＳＣ（配列番号４６）が挙げられる。
【００４０】
Ｈｇアミノ酸配列は修飾され得る。このような修飾は、Ｏ−結合グリコシル化の潜在部位を除去することができる。このような修飾はまた、本発明のポリペプチドの凝集又は多量体を形成させる場合があるシステイン残基を除去することができる。
【００４１】
本発明のミメティボディのＯ−結合グリコシル化を最小限にする１つの方法は、本発明のポリペプチドのＨｇ部分のＴｈｒ残基をＡｌａ残基に置換することである。Ｈｇアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＡＣＰＰＣＰ（配列番号１０７）は、このようなＴｈｒからＡｌａへの置換の例であり、このＨｇの特異的置換は、配列番号６２の位置５９のＴｈｒをＡｌａに置換することで得ることもできる。
【００４２】
本発明のミメティボディの凝集又は多量体化を最小限にする１つの方法は、本発明のポリペプチドのＨｇ部分のＣｙｓ残基をＡｌａ残基に置換することである。Ｈｇアミノ酸配列ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１０９）は、このようなＣｙｓをＡｌａに置換する例であり、このＨｇの特異的置換は、配列番号６２の位置５４のＣｙｓをＡｌａに置換することで得ることもできる。
【００４３】
本発明のミメティボディポリペプチドのＨｇアミノ酸配列の修飾は、単独で、又は組み合わせて行うことができる。Ｈｇアミノ酸配列ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＡＣＰＰＣＰ（配列番号１１１）は、上記の置換の両方を組み合わせており、配列番号６２の、位置５４のＣｙｓをＡｌａに置換すること、及び位置５９のＴｈｒをＡｌａに置換することで得ることができる。当業者は、本発明のミメティボディのＯ−グリコシル化部位、及び凝集又は多量体化に関連する部位を除去する置換を行うのに使用することができるその他のアミノ酸残基を、認識するであろう。このような部位は、アミノ酸残基の除去によっても欠失され得る。
【００４４】
本発明のポリペプチドにおいて、ＣH２は、免疫グロブリン重鎖のＣH２定常領域である。代表的なＣH２アミノ酸配列には、
ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号４８）、
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号５０）、
ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号５２）、
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号５４）、
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＳＳＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号１１７）、及び
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２４６）
が挙げられる。
【００４５】
本発明のポリペプチドにおいて、ＣH３は、免疫グロブリン重鎖のＣH３定常領域である。代表的なＣH３アミノ酸配列には、
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号５６）、
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号５８）、及び
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１１９）が挙げられる。本発明のポリペプチドのＣH３領域が、特定の組換えシステムで発現されるときにＣ末端アミノ酸が切り取られる場合があることは、当業者には認識されよう。
【００４６】
本発明のミメティボディポリペプチドにおいて、Ｈｇ、ＣH２又はＣH３は、ＩｇＧ1又はＩｇＧ4サブクラスのものであってもよい。配列は、もしもそれが、γ１又はγ４重鎖からそれぞれ形成される又は生じるものである場合は、ＩｇＧ1又はＩｇＧ4サブクラスのものであってもよい。所与の種の既知のγ１又はγ４重鎖配列と少なくとも８０％同一であるならば、所与のペプチド鎖は、γ１又はγ４重鎖である。２つのペプチド鎖のパーセント同一性は、ベクター（Vector）ＮＴＩバージョン９．０．０（インビトロジェン社（Invitrogen Corp.）、カリフォルニア州カールスバッド（Carslbad, CA））のアラインＸ（AlignX）モジュールのデフォルト設定を使用して、ペアワイズアラインメントで決定することができる。
【００４７】
本発明のミメティボディポリペプチドにおいて、Ｈｇ、ＣH２又はＣH３は、個々に、ＩｇＧ1又はＩｇＧ4サブクラスのものであってもよい。本発明のミメティボディは、各サブクラスからのＨｇ、ＣH２又はＣH３要素の組合せを更に含んでよい。例えば、ＨｇはＩｇＧ4サブクラスのものであってもよく、ＣH２及びＣH３はＩｇＧ1サブクラスのものであってもよい。あるいは、Ｈｇ、ＣH２及びＣH３は、全てＩｇＧ4又はＩｇＧ1サブクラスのものであってもよい。ポリペプチドＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６５）は、Ｈｇ（配列番号６５の残基１〜１５）、ＣH２（配列番号６５の残基１６〜１２５）、及びＣH３（配列番号６５の残基１２６〜２３２）が全てＩｇＧ1サブクラスのものであるポリペプチドの例である。
【００４８】
ＩｇＧ1及びＩｇＧ4サブクラスは、ヒンジ領域のシステインの数が異なる。ほとんどのＩｇＧ型抗体、例えばＩｇＧ1は、２つの同一重（Ｈ）鎖と２つの同一軽（Ｌ）鎖から形成されるホモ二量体分子であり、典型的にはＨ2Ｌ2と略記される。したがって、これらの分子は一般に、重鎖間ジスルフィド結合の形成により、抗原結合に関しては二価であり、ＩｇＧ分子の両抗原結合性（Ｆａｂ）アームは同一の結合特異性を有する。これに対し、ＩｇＧ4イソタイプ重鎖は、重鎖間又は重鎖内いずれかのジスルフィド結合をも形成することが可能なそれらのヒンジ領域にＣＰＳＣ（配列番号４６）モチーフを含有している、即ち、ＣＰＳＣモチーフ中の２つのＣｙｓ残基は、他のＨ鎖中の対応するＣｙｓ残基とジスルフィド結合し得るか（間）、又は所与のＣＰＳＣモチーフ内の２つのＣｙｓ残基が相互にジスルフィド結合し得る（内）。ヒンジ領域に重鎖内結合を有するそれらのＩｇＧ4分子におけるＨＬペアは、互いに共有的に会合されないので、それらはＨＬ単量体に解離することができ、次に、これが他のＩｇＧ4分子から誘導されるＨＬ単量体と再会合して、二重特異性の、ヘテロ二量体ＩｇＧ4分子を形成する。生体内のイソメラーゼ酵素は、このプロセスを容易にすることができる。二重特異性ＩｇＧ抗体では、抗体分子の２つのＦａｂ「アーム」は、それらが結合するエピトープにおいて異なる。ＩｇＧ4のヒンジ領域内のＳｅｒ残基をＰｒｏと置換することで、「ＩｇＧ1様挙動」がもたらされる、即ち、当該分子は重鎖間の安定したジスルフィド結合を形成し、したがって、他のＩｇＧ4分子でのＨＬ交換を起こしにくい。
【００４９】
本発明のミメティボディポリペプチドは、ジスルフィド結合形成に関与し、かつミメティボディポリペプチドのＨｇ−ＣH２−ＣH３部分に存在する部位の修飾により、よりＩｇＧ4様、又はＩｇＧ1様にすることができる。このような部位は、他のアミノ酸の除去、欠失、挿入、又は他のアミノ酸での置換によって修飾されてもよい。典型的には、ジスルフィド結合に関連するモチーフに存在するシステイン残基は、除去又は置換される。これらの部位を除去することで、ミメティボディＨｇ−ＣH２−ＣH３ドメインの非共有結合二量化を許しつつ、ミメティボディ産生宿主細胞の中に存在するその他のシステイン含有タンパク質との共有ジスルフィド結合、又はＩｇＧ4系構築体内の重鎖内ジスルフィド結合を回避することができる。このような部位の修飾は、２つの異なるＭ部分を有する二重特異性のミメティボディポリペプチドの形成を可能にすることができ、又はそのような二重特異性の種の形成を防ぐことができる。
【００５０】
ＩｇＧ1及びＩｇＧ4サブクラスはまた、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するそれらの能力において異なる。ＣＤＣは、補体存在下での標的細胞の溶解である。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１構成成分が同種抗原と複合した分子に結合することで開始する。ＩｇＧ1は、補体カスケード及び続くＣＤＣ活性の強力な誘導物質である一方、ＩｇＧ4は、ほとんど補体誘導活性を有さない。ＡＤＣＣは細胞性プロセスであり、ＡＤＣＣに関与するＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）を発現する非特異性の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）は、標的細胞上の結合型抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす。ＩｇＧ1サブクラスは、ＡＤＣＣに関与するＦｃ受容体に高親和性で結合しＡＤＣＣに寄与する一方、ＩｇＧ4は、そのような受容体に弱く結合するのみであり、ＡＤＣＣ誘導活性はほとんど有さない。ミメティボディポリペプチドを細胞殺滅なしに細胞に送達することが可能であるので、ＡＤＣＣなどのエフェクター機能を活性化させるＩｇＧ4の相対的不能が望ましい。
【００５１】
ミメティボディポリペプチドのＨｇ−ＣH２−ＣH３部分に存在するＣＤＣ及びＡＤＣＣに関与する部位を変化させることにより、本発明のミメティボディポリペプチドのＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性を修飾することができる。このような部位は、他のアミノ酸の除去、欠失、挿入、又は他のアミノ酸での置換によって修飾されてもよい。本発明のミメティボディにおいて、ＣＤＣに関与する部位、例えばＣ１ｑ結合部位は、典型的には除去ないしは別の方法で修飾されて、ＣＤＣ活性を最小限にする。更に、本発明のミメティボディでは、ＡＤＣＣに関与するＦｃ受容体結合部位もまた同様に修飾されてよい。広くは、このような修飾は、ＡＤＣＣ活性に関与するＦｃ受容体結合部位を本発明のミメティボディから除去する。Ｌｅｕ残基を本発明のポリペプチドのＣH２部分のＡｌａ残基で置換するのは、本発明のポリペプチドのＡＤＣＣ活性を最小限にすることが可能な修飾の一例である。ＣH２アミノ酸配列ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号５２）及びＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＳＳＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号５４）は、（これら配列の中の）残基４及び５におけるこのようなＬｅｕからＡｌａへの置換の例である。更に、Ｖ１ドメインは、シグナルペプチドの切断の後ペプチドのＮ末端が遊離し、Ｎ末端がアセチラーゼなどの酵素に到達可能でありかつ酵素によって修飾され得るように、除去することができる。
【００５２】
ＩｇＧ4及びＩｇＧ1イソタイプの抗体は共に、ＦｃＲｎサルベージ受容体結合部位を含有する。ＦｃＲｎサルベージ受容体は、体腔及び血管の内部を覆うもののような内皮細胞層全体にＩｇＧ型抗体を再循環又は運搬することにより、体内のＩｇＧ抗体値を維持するのを助ける。ＦｃＲｎサルベージ受容体は、内皮細胞に入ったＩｇＧｓを非特異性の飲作用によって結合し、細胞のリソソーム内でこれらＩｇＧ抗体分子が分解されるのを防止して、これを行う。このようなＦｃＲｎ受容体の活性の結果は、ＦｃＲｎ結合部位を有する分子の血清半減期が、このような部位が欠如していること以外は同一である分子と比較して長くなることである。
【００５３】
ヒンジ領域のＳｅｒからＰｒｏへの置換、及びＩｇＧ骨格でのＣH２ドメインのＬｅｕからＡｌａへの置換を含む、本発明の代表的な成熟ミメティボディポリペプチドは、配列番号２１１〜２１５及び２５０〜２５４に示される核酸配列及びアミノ酸配列を有する。具体的には、配列番号２１２及び２１４は、それぞれシグナル配列を有さない又は有する、配列番号４に示されるようなＭｐ配列、及び配列番号１０１に示されるようなＬｋ配列を有する、ミメティボディポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号２１１及び２１３は、これらのポリペプチドをコードする代表的な核酸配列を示す。更に、配列番号２５１及び２５３は、それぞれシグナル配列を有さない又は有する、配列番号２８２に示されるようなＭｐ配列、及び配列番号１０１に示されるようなＬｋ配列を有する、ミメティボディポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号２５０及び２５２は、これらのポリペプチドをコードする代表的な核酸配列を示す。
【００５４】
本発明のミメティボディのＨｇ−ＣH２−ＣH３部分は、ＣH２領域とＣH３領域との接合部にＦｃＲｎ結合部位を含有するのが望ましい。このようなＦｃＲｎ部位は、α−ＭＳＨだけのようなメラノコルチン受容体結合分子と比べて、本発明のミメティボディの血清半減期を長くし、並びにその他の薬物速度論的特性を改善することが予想される。本発明のミメティボディにおいて、ＦｃＲｎ部位は、アミノ酸の除去、欠失、挿入、又は置換によって修飾又は加えられてもよい。典型的には、このような修飾は、所与の部位のＦｃＲｎへの結合を改善するために用いられる。ヒトのＦｃＲｎ結合部位の一例は、ＩｇＧ1及びＩｇＧ4抗体の両方に見られる配列ＭＩＳＲＴＰＴＶＬＨＱＨＮＨＹ（配列番号６９）である。その他のＦｃＲｎ結合部位は当業者には周知である。
【００５５】
ＩｇＧ4及びＩｇＧ1のような異なるイソタイプを有する抗体は、グリコシル化部位を含有してもよい。これらの部位のグリコシル化は、抗体分子の特性及び活性を変化させることができる。抗体分子は、Ｎ−グリコシル化又はＯ−グリコシル化であってよい。窒素原子を含有する抗体アミノ酸残基の側鎖（例えば、Ａｓｎ）のＮ−グリコシル化は、Ｎ−グリコシル化抗体分子に細胞溶解活性を与えることによって、ＡＤＣＣなどの抗体のＦｃエフェクター機能を調節することができる。このＡＤＣＣに関連する細胞溶解活性は、このようなＮ−グリコシル化抗体によってもたらされる細胞溶解を引き起こす。あるいは、抗体分子は、酸素原子を含有するアミノ酸残基側鎖（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）の修飾によってＯ−グリコシル化されてもよい。Ｏ−グリコシル化は、血清からのＯ−グリコシル化抗体分子の、増加したレクチン媒介クリアランスを介して、抗体分子の血清半減期を短くすることができる。更に、Ｏ−グリコシル化は、様々な抗体分子間のＯ−グリコシル化の程度が異なることに起因して、抗体多様性を望ましくなく高める可能性がある。最後に、Ｏ−グリコシル化及びＮ−グリコシルは共に、結合親和性及び免疫原性などの抗体分子の構造依存特性を変化させることができる。
【００５６】
それらが模倣する抗体分子と同様に、本発明のミメティボディポリペプチドもまた、Ｎ−グリコシル化及びＯ−グリコシル化によって翻訳後修飾されてもよい。ほとんどの場合、細胞溶解活性を最小限にするするために、本発明のミメティボディのＮ−グリコシル化を制限するのが望ましい。Ｎ−グリコシル化は、典型的にはＮ−グリコシル化されているＡｓｎ等のアミノ酸残基の除去又は置換によって制限され得る。レクチン媒介クリアランス、ミメティボディの多様性、並びに結合親和性及び免疫原性のような構造依存性のミメティボディの特性の変化を最小限にするために、ミメティボディのＯ−グリコシル化を制限するのも望ましい。本発明のミメティボディにおけるＯ−結合グリコシル化を最小限にするための１つの方法は、本発明のポリペプチドのＶ２部分のＴｈｒ残基をＡｌａ残基に置換することである。Ｖ２アミノ酸配列ＴＬＶＡＶＳＳ（配列番号３４）は、このようなＴｈｒからＡｌａへの置換の例であり、このＶ２の特異的置換は、配列番号６２の位置４７のＴｈｒをＡｌａに置換することで得ることもできる。当業者はまた、グリコシラーゼ酵素活性の調節を含む、Ｎ−結合及びＯ−結合グリコシル化を制御するその他の方法を認識するであろう。
【００５７】
本発明のミメティボディポリペプチドの単量体構造、Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３は、「ｔ個の」その他の単量体（ｔは１〜１０の整数である）に結合されることができる。このような結合は、非共有結合性相互作用、又はＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合などの共有結合を介して発生し得る。このようにして、本発明のポリペプチドの二量体及び高次多量体などの多重体構造を形成することができる。本発明のポリペプチドの二量化は、ＭＣ４Ｒなどのメラノコルチン受容体に対するこれらポリペプチドの親和性を高めることが予想される。本明細書で使用するとき、用語「多量体」は、四次構造を有し、かつ２つ以上のサブユニットの結合によって形成される分子を意味する。
【００５８】
式ＩＩに示されるように、本発明のポリペプチドは、任意に、アミノ末端に、Ｖ１と称される免疫グロブリン可変領域のアミノ末端部分を含むことができる。
【００５９】
（Ｖ１−Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)
（ＩＩ）
代表的なＶ１アミノ酸配列は、ＱＩＱ、ＱＶＱ、ＱＩＱＧＧ（配列番号１１３）、及びＱＩＱＧＧＧＧ（配列番号１１５）を含む。
【００６０】
本発明のポリペプチドは、タンパク質分泌を容易にするのに必要な分泌シグナル、又は細胞中のタンパク質輸送に必要なその他のシグナルを更に含んでもよい。代表的な分泌シグナル配列は、ＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡ（配列番号６９）である。当業者はその他の分泌シグナルを認識するであろう。
【００６１】
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号６０、６２、１２１、１２３、１２７、１２９、１３２、１３４、１３７、１３９、１４２、１４４、１４７、１４９、１５２、１５４、１５７、１５９、１６２、１６４、１６７、１６９、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８７、１８９、１９２、１９４、１９７、１９９、２０２、２０４、２０７、２０９、２１２、２１４、２１７、２１９、２２２、２２４、２２７、２２９、２３２、２３４、２３７、２３９、２４２、又は２４４、２５１、２５３、２５６、２５８、２６１、２６３、２６６、又は２６８に示される配列を有するポリペプチドを含む。これらの配列は、アミノ末端分泌シグナル配列を有する、又は配列が欠如している、メラノコルチン受容体結合α−ＭＳＨポリペプチドを例示している。配列番号６２は、一般式（ＩＩ）の（Ｖ１−Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)メラノコルチン受容体結合α−ＭＳＨポリペプチドを示しており、これは、そのアミノ末端に融合される分泌シグナルＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡ（配列番号６９）を有する。配列番号６０は、一般式（Ｉ）の（Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)メラノコルチン受容体結合α−ＭＳＨポリペプチドを示す。配列番号６０には分泌シグナルは存在しない。
【００６２】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのメラノコルチン受容体結合ミメティボディをコードするポリヌクレオチドを含む、当該ポリヌクレオチドに相補的な、又は当該ポリヌクレオチドと有意な同一性を有するポリヌクレオチドである。本発明の他の態様は、メラノコルチン受容体結合ミメティボディをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド分子を含むベクターを含む。異なる態様において、本発明は、本発明のベクターを含む細胞、又は本発明のミメティボディポリペプチドを発現する細胞を提供する。ポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞を使用して、本発明のミメティボディポリペプチドを製造する。
【００６３】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５９、６１、１２０、１２２、１２６、１２８、１３１、１３３、１３６、１３８、１４１、１４３、１４６、１４８、１５１、１５３、１５６、１５８、１６１、１６３、１６６、１６８、１７１、１７３、１７６、１７８、１８１、１８３、１８６、１８８、１９１、１９３、１９６、１９８、２０１、２０３、２０６、２０８、２１１、２１３、２１６、２１８、２２１、２２３、２２６、２２８、２３１、２３３、２３６、２３８、２４１、２４３、２５０、２５２、２５５、２５７、２６０、２６２、２６５、若しくは２６７に示される配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号５９、６１、１２０、１２２、１２６、１２８、１３１、１３３、１３６、１３８、１４１、１４３、１４６、１４８、１５１、１５３、１５６、１５８、１６１、１６３、１６６、１６８、１７１、１７３、１７６、１７８、１８１、１８３、１８６、１８８、１９１、１９３、１９６、１９８、２０１、２０３、２０６、２０８、２１１、２１３、２１６、２１８、２２１、２２３、２２６、２２８、２３１、２３３、２３６、２３８、２４１、２４３、２５０、２５２、２５５、２５７、２６０、２６２、２６５、若しくは２６７に示される配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドを含む。配列番号５９は、一般式（Ｉ）の（Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)メラノコルチン受容体結合α−ＭＳＨポリペプチドをコードするｃＤＮＡであり、これはシグナル配列を欠如している。配列番号６１は、一般式（ＩＩ）の（Ｖ１−Ｍｐ−Ｌｋ−（Ｖ２）y−Ｈｇ−ＣH２−ＣH３）(t)メラノコルチン受容体結合α−ＭＳＨポリペプチドをコードするｃＤＮＡであり、これは、そのアミノ末端に融合される分泌シグナルを有する。
【００６４】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号配列番号６０、６２、１２１、１２３、１２７、１２９、１３２、１３４、１３７、１３９、１４２、１４４、１４７、１４９、１５２、１５４、１５７、１５９、１６２、１６４、１６７、１６９、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８７、１８９、１９２、１９４、１９７、１９９、２０２、２０４、２０７、２０９、２１２、２１４、２１７、２１９、２２２、２２４、２２７、２２９、２３２、２３４、２３７、２３９、２４２、２４４、２５１、２５３、２５６、２５８、２６１、２６３、２６６、又は２６８に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。配列番号６０、６２、１２１、１２３、１２７、１２９、１３２、１３４、１３７、１３９、１４２、１４４、１４７、１４９、１５２、１５４、１５７、１５９、１６２、１６４、１６７、１６９、１７２、１７４、１７７、１７９、１８２、１８４、１８７、１８９、１９２、１９４、１９７、１９９、２０２、２０４、２０７、２０９、２１２、２１４、２１７、２１９、２２２、２２４、２２７、２２９、２３２、２３４、２３７、２３９、２４２、２４４、２５１、２５３、２５６、２５８、２６１、２６３、２６６、又は２６８に示されるポリペプチド配列をコードする代表的な核酸配列は、それぞれ、配列番号５９、６１、１２０、１２２、１２６、１２８、１３１、１３３、１３６、１３８、１４１、１４３、１４６、１４８、１５１、１５３、１５６、１５８、１６１、１６３、１６６、１６８、１７１、１７３、１７６、１７８、１８１、１８３、１８６、１８８、１９１、１９３、１９６、１９８、２０１、２０３、２０６、２０８、２１１、２１３、２１６、２１８、２２１、２２３、２２６、２２８、２３１、２３３、２３６、２３８、２４１、２４３、２５０、２５２、２５５、２５７、２６０、２６２、２６５、又は２６７に示される。
【００６５】
本発明のポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが更に提供される。ポリペプチドとの関係において、用語「実質的に同一」とは、所与のポリペプチド配列が、本発明のポリペプチド配列、具体的にはＶｌ−Ｍｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ領域と、アミノ酸残基が少なくとも５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５〜９８％同一であることを意味する。２つのポリペプチド配列間のパーセント同一性は、ベクター（Vector）ＮＴＩバージョン９．０．０（インビトロジェン社（Invitrogen Corp）、カリフォルニア州カールスバッド（Carlsbad, CA））のアラインＸ（AlignX）モジュールのデフォルト設定を使用して、ペアワイズアラインメントで決定することができる。上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、当業者には認識されよう。
【００６６】
典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のミメティボディポリペプチドの調製のために発現ベクターの中で用いられる。本発明の範囲内のベクターには、真核生物発現に必要な要素を提供し、ＣＭＶプロモータ駆動ベクターなどのウイルス性プロモータ駆動ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＥＰ４、及びそれらの誘導体と、バキュロウイルス発現ベクターと、ドロソフィラ発現ベクターと、ヒトＩｇ遺伝子プロモータなどの哺乳類遺伝子プロモータによって駆動される発現ベクターと、が挙げられる。他の例としては、Ｔ７プロモータ駆動ベクターなどの原核生物発現ベクター、例えば、ｐＥＴ４１と、ラクトースプロモータ駆動ベクターと、アラビノース遺伝子プロモータ駆動ベクターと、が挙げられる。
【００６７】
本発明はまた、本発明のミメティボディを発現する、又は本発明のベクターを含む細胞に関する。本発明のミメティボディポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、配列番号６３、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５４、２５９、２６４、又は２６９のヌクレオチド残基１６０１で始まるプラス鎖リーディングフレームの翻訳によって識別される得る。本明細書において例示された、本発明のミメティボディポリペプチドの様々なシグナルペプチド、Ｖ１、Ｍｐ、Ｖ２、Ｈｇ、ＣH２、及びＣH３部分もまた、これらのオープンリーディングフレーム中に存在し、かつ多重配列アラインメント又は当該分野において周知のその他の方法などの標準的な配列分析方法を用いて識別することが可能である。このような細胞は原核生物又は真核生物であり得る。代表的な真核生物細胞は哺乳類細胞であり、例えば、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ヒーラ、骨髄腫、リンパ腫細胞、又はこれらの任意の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましくは、真核生物細胞は、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＳＰ２／０、又はＣＨＯ細胞である。大腸菌は代表的な原核生物細胞である。本発明による細胞は、トランスフェクション、細胞融合、不死化、又は当該技術分野において周知のその他の手順によって産生され得る。細胞の中にトランスフェクトされたポリヌクレオチドは、染色体外であってもよく、又は細胞の染色体の中に安定的に組み込まれてもよい。
【００６８】
本発明のミメティボディは、ポリペプチドのＨｇ−ＣH２−ＣH３部分の修飾によって、所与の宿主細胞に、より適合性とすることができる。例えば、本発明のミメティボディを大腸菌などのバクテリア細胞の中で組換え発現させる場合、Ｈｇ要素中のＰｒｏ−Ａｌａ配列は、大腸菌の酵素プロリンイミノペプチダーゼによる消化を防止するために除去されてもよい。同様に、Ｈｇ要素の一部分を、本発明のミメティボディ中で欠失若しくは他のアミノ酸で置換して、選択された宿主細胞中で発現される産物の多様性を防止することができる。
【００６９】
本発明は、ミメティボディポリペプチドの製造方法を更に提供し、本方法は、本発明の細胞を培養する工程と、本発明の発現したミメティボディポリペプチドを精製する工程とを含む。生体外転写及び翻訳に必要なもののような細胞構成成分を使用して、本発明のポリペプチドを発現させることもできる。本発明は、上記両方の方法により製造されるミメティボディを包含する。発現したミメティボディポリペプチドは、これらに限定されるものではないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト（hydroxylatpatite）クロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む、当該技術分野において周知の方法で、細胞又は細胞構成成分系システムより回収かつ精製され得る。高速液体クロマトグラフィー（High performance liquid chroatography）（ＨＰＬＣ）も精製に使用することができる。典型的には、精製はいくつかの異なる方法の組合せを必要とする。
【００７０】
本発明の別の態様は、少なくとも１つのミメティボディポリペプチドの有効量と、製薬上許容できる担体又は希釈剤とを含む、医薬組成物である。用語「有効量」は、概して、有効な治療、即ち、そのための処置が探求された症状又は障害の部分的又は完全な軽減に必要なミメティボディの量を指す。当該組成物は、肥満及び以下に記載のその他の疾患を治療するのに有用な少なくとももう１つの化合物、タンパク質、又は組成物を所望により含み得る。組成物中の製薬上許容できる担体又は希釈剤は、溶液、懸濁液、乳濁液、コロイド、又は粉末であり得る。当業者は、その他の製薬上許容できる担体又は希釈剤を認識するであろう。
【００７１】
本発明の別の態様は、本発明の医薬組成物を細胞、組織又は臓器と接触させることを含む、細胞、組織又は臓器の中のメラノコルチン受容体の生物活性を修飾する方法である。本方法を用いて、脳、脳組織、又は脳細胞の中のメラノコルチン受容体活性を修飾することができる。あるいは、本発明の方法を用いて、筋肉などのその他の体皮細胞若しくは組織、又は胃などのその他の臓器の中のメラノコルチン受容体活性を修飾することができる。当業者は、使用することができるその他の細胞、組織又は臓器を認識するであろう。
【００７２】
本発明の別の態様は、本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、少なくとも１つのメラノコルチン受容体媒介疾患を調節する方法である。本発明の医薬組成物は、任意の好適な経路で投与することができる。そのような経路は、くも膜下腔、鼻孔内、末梢（例えば、皮下、筋肉内、皮内、静脈内）、又は当該技術分野において既知の任意のその他の手段であってよい。上述のように、メラノコルチン受容体の異常活性は、肥満及び２型糖尿病などの多くの病態に関わってきた。ＭＣ４Ｒの刺激は重量喪失を引き起こすことができる一方で、抑制は体重増加をもたらし得る。本発明のミメティボディポリペプチドは、男性及び女性の勃起不全、炎症、うっ血性心不全、中枢神経系障害、神経損傷、感染病、肺疾患、皮膚疾患、発熱及び疼痛等の、その他のメラノコルチン受容体媒介疾患を調節するために使用することもできる。
【００７３】
以下の実施例を参照して本発明を更に説明する。これらの実施例は単に本発明の局面を具体的に説明するためのもであり、本発明の制限であることを意図するものではない。
【実施例】
【００７４】
（実施例１）
α−ＭＳＨミメティボディ及び発現ベクター構成体
分泌シグナル配列、α−ＭＳＨペプチド配列、リンカー配列、ＶH配列、ヒンジ配列、ヒトＩｇＧ1  ＣH２配列、及びヒトＩｇＧ1  ＣH３配列を含むα−ＭＳＨミメティボディタンパク質を設計した（図３及び配列番号６２）。解析データ、例えば、質量分析により、成熟ポリペプチドが生成されたことが確認された（Ｇ１／Ｇ１形状で６１、３４４．６）。このα−ＭＳＨミメティボディタンパク質をコードする核酸配列（図３；配列番号６１）を、標準的分子生物学技術を用いて生成した。α−ＭＳＨミメティボディ配列をコードする核酸配列をｐ２３８９発現ベクターにサブクローニングして、α−ＭＳＨミメティボディ発現ベクター（配列番号６３）を生成した。
【００７５】
（実施例２）
α−ＭＳＨミメティボディ発現
α−ＭＳＨミメティボディをＨＥＫ２９３Ｅ細胞中に一過性に発現させた。細胞を標準条件で培養し、かつリポフェクタミン（Lipofectamine）２０００（インビトロジェン（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド（Carlsbad, CA））を使用して、製造業者の指示通りに、α−ＭＳＨミメティボディ発現ベクターで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を無血清培地配合物に移して、５日間培養した。次に、培地を取り除き、遠心分離にかけてデブリスを除去した。製造業者の指示通りに、浄化した培地をプロテインＡ−セファロース（Protein A-Sepharose）（商標）（ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ、アマシャム・バイオサイエンシス（Amersham Biosciencies）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway, NJ））でインキュベートし、プロテインＡ−セファロース（商標）複合物からタンパク質を溶出した。次に、溶出したタンパク質溶液を、スーパーロース（Superose）（商標）１２サイズ排除クロマトグラフィー（スーパーロース（Superose）１２  １０／３００ＧＬ、アマシャム・バイオサイエンシス（Amersham Biosciencies）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway, NJ）））を介して、標準方法を用いて更に精製した。続いて、カラム溶離液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀及びコマジーブルー染色で可視化した。次に、ウエスタンブロットを調製し、ブロットをＦｃ特異的一次抗体又はα−ＭＳＨ特異的一次抗体のいずれかでプローブした。このウエスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ染色の結果は共に、一過性にトランスフェクしたＨＥＫ２９３細胞から、２つのポリペプチド鎖から構成される精製されたα−ＭＳＨミメティボディが得られたことを示した。
【００７６】
（実施例３）
α−ＭＳＨミメティボディはＭＣ４Ｒに結合する
α−ＭＳＨミメティボディはＭＣ４Ｒに結合し、ＭＣ４Ｒ結合の放射性標識［Ｎｌｅ（４）、Ｄ−Ｐｈｅ（７）］−α−ＭＳＨ（ＮＤＰ−α−ＭＳＨ）アゴニスト分子と競合することができる（図４）。ＭＣ４Ｒはα−ＭＳＨの受容体である。ＨＥＫ２９３細胞膜（パーキン・エルマー・ライフ・アンド・アナリティカル・サイエンシス（Perkin Elmer Life and Analytical Sciences）、マサチューセッツ州ボストン（Boston, MA））中の組み替えにより発現されたＭＣ４Ｒに結合するα−ＭＳＨを、増加する量の非標識ＭＣ４Ｒアゴニスト（陽性対照）及びヒト抗体のＦｃドメイン（陰性対照）が、図４に示されるような［125Ｉ］−ＮＤＰ−α−ＭＳＨを含有するアッセイ混合物に加えられた競合（competive）結合アッセイで検査した。非標識ＭＣ４Ｒアゴニストは、メラノタンＩＩ（ＭＴＩＩ；α−ＭＳＨ類似体）、α−ＭＳＨ、及びＮＤＰ−α−ＭＳＨであった。競合（competive）結合アッセイによって評価すると、ＭＣ４Ｒに結合するα−ＭＳＨミメティボディは、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で４oＣ、−２０oＣ、及び−８０oＣで２週間貯蔵した後も安定していた。
【００７７】
シンチレーション近接アッセイ（Scintillation Proximity Assays）（登録商標）（アマシャム・バイオサイエンシス（Amersham Biosciencies）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Piscataway, NJ））を使用して、アッセイ製造業者の指示通りに、競合結合アッセイを実施した。アッセイ混合物は、ＥＣ８０、即ち、〜０．５ｎＭの［125Ｉ］−ＮＤＰ−α−ＭＳＨ、０．１μｇのＭＣ４Ｒ膜、１ｍＭのＭｇＳ０4、１．５ｍＭのＣａＣｌ2、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．２％のＢＳＡ、１ｍＭの１，１０−フェントロリン（phenthroline）を含んでおり、蛋白質分解酵素抑制剤混合物（ローチェ・ダイアグノスティックス社（Roche Diagnostics Corp.）、インディアナ州インディアナポリス（Indianapolis, IN））及びＳＰＡビーズの量はアッセイ製造業者によって推奨されていた。シンチレーション近接アッセイ（Scintillation Proximity Assays）（登録商標）ビーズから出射された光を、パッカード・トップ・カウントＮＸＴ計器（Packard Top Count NXT Instrument）（パーキン・エルマー・ライフ・アンド・アナリティカル・サイエンシス（Perkin Elmer Life and Analytical Sciences）、マサチューセッツ州ボストン（Boston, MA））を使用して５分間測定した。
【００７８】
（実施例４）
α−ＭＳＨミメティボディはＭＣ４Ｒを活性化する
α−ＭＳＨミメティボディはＭＣ４Ｒシグナルを活性化して、ＭＣ４Ｒを発現するＣＨＯＫ１細胞内のｃＡＭＰ生成を増加させることができる（図５及び図６）。ＭＣ４Ｒは、７回膜貫通（７ＴＭ）Ｇタンパク質結合受容体である。配位子又はアゴニストによってＭＣ４Ｒを活性化すると、サイクリックＡＭＰレベル（ｃＡＭＰ）の上昇を引き起こす。
【００７９】
ＭＣ４Ｒ発現ベクターで安定的にトランスフェクトされ、ＭＣ４Ｒを発現する、２つの異なるクローナルＣＨＯＫ１細胞株を使用して、ＭＣ４Ｒ受容体活性化アッセイを実施した。クローン２（図６）と比べて、クローン１（図５）はＭＣ４Ｒを高レベル発現した。クローン１及びクローン２細胞を、標準培養条件を用いて単層として、約１００，０００細胞／ウェルの濃度まで成長させ、次に、図５及び図６に示されるように、増加した量（０〜１００μＭ）のα−ＭＳＨ、ＭＴＩＩ、又はα−ＭＳＨミメティボディで１５分間インキュベートした。続いて細胞を溶解して、ｃＡＭＰ−スクリーン・ダイレクト（cAMP-Screen Direct）（商標）化学発光イムノアッセイシステム（Chemiluminescent Immunoassay System）（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、カリフォルニア州フォスターシティ（Foster City, CA））を使用して、製造業者の指示通りに、ｃＡＭＰアッセイを実施した。クローン１（図５）及びクローン２（図６）を使用したｃＡＭＰアッセイのＥＣ50値を、下記の表１に示す。
【００８０】
【表１】
2011501963.tif 000002
【００８１】
（実施例５）
α−ＭＳＨミメティボディ投与により動物の食糧摂取量及び体重が減少する
ラット（Rattus norvegicus）の脳心室にα−ＭＳＨミメティボディを投与すると、動物の食糧摂取量（図７）及び体重（図８）が減少する。左側脳室の中に外科的に挿入されたカニューレを介して、脳室内注入（ＩＣＶ）によってα−ＭＳＨミメティボディを脳心室に供給した。
【００８２】
体重が２５０ｇ〜３５０ｇの雄のスプラーグ・ドーリー（Sprague-Dawley）又はウィスター（Wistar）ラットの中にカニューレを外科的に挿入した。カニューレ配置の座標は以下の通りであった：ブレグマから−０．８ｍｍ、腹側から−４．５ｍｍ、及び前後方向から−１．５。動物は術後７〜１０日で正常な状態に戻った。ストレスを最小限にするために、毎日の操作及び模擬注入の両方によって、動物を実験手順に慣れさせた。加えて、動物に明暗サイクルの逆転を受けさせた。
【００８３】
カニューレが適切に配置されたかをアンギオテンシンＩＩ試験で確認した。試験は、カニューレを介して１０ｎｇのアンギオテンシンＩＩをＩＣＶ投与して、ラットが３０分以内に水を５〜１０ｍＬ飲んだ場合に、カニューレが適切に配置されたと確認した。このアンギオテンシンＩＩ試験に合格した動物だけが食糧摂取量実験に使用された。
【００８４】
動物を１８〜２４時間絶食させ、その後、α−ＭＳＨミメティボディ、α−ＭＳＨ（陽性対照）、又はＰＢＳ（陰性対照）を、カニューレを介して脳心室に、注入速度９μＬ／分で投与した。各治療群は最低で７動物であった。処置及び投与量は図７及び図８に示される通りであった。
【００８５】
餌及び水は、注入後に動物に与えられた。摂取した餌及び水の量を、注入後０時間、４時間、２４時間、４８時間、及び７２時間毎に測定した（図７）。注入後７２時間の体重を図８に示されるように測定した。
【００８６】
本発明はここに完全に記述されているが、添付の請求項の趣旨及び範囲を逸脱せずに、本発明に対する多くの変更及び修正をなし得ることは、当業者にとって明白であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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