(57)【要約】  本発明では、薬剤を局所的に、長期間にわたり溶出する、インプラントが可能な医療器具を提供する。これには、数種類のデバイス、治療法、インプラントの実施の方法も含む。このデバイスは、例えば、マトリックスようなデバイス体としてのポリマー基体、薬剤、金属や別のポリマーで作成された骨補填剤、可視化や画像観察を強化するための材料から成る。薬剤を局所的に、長期間にわたり、炎症、変性、病的症状、平滑筋細胞損傷のような疾患部位の細胞外マトリックスに放出できるかという観点から薬剤が選択される。この薬剤の１つが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を基礎にした遺伝子サイレンシング薬剤であり、その例として、ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ/ＤＮＡ、リボザイム、ヌクレオシド類似物質がある（これらに限定されない）。インプラント法として、いくつかの実施形態では、既存のインプラントの方法を記載しており、それらの方法は、今日までに、別の治療用に開発されてすでに使用されているものもある。例えば、近接照射療法や針生検がある。そのような場合として、本発明の新型のインプラント寸法は、従前から存在したものと類似したものである。通常、これらのうちの数種のデバイスは、ある１つの治療が実施されている間に、これらのデバイスのインプラントも同時になされる場合もある。
2011526619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所部位からヌクレオチドベースの薬剤を投与するための組成物であり、上記局所部位からの実質的に有意な拡散を避けて、上記ヌクレオチドベースの薬剤を、長時間に亘り放出させるために、体内の部位に挿入する製剤から成る組成物。
【請求項２】
上記局所部位から一度放出させた上記薬剤が治療的に有効な濃度を保つ距離は、上記長期間の放出の間は、上記局所部位を取り巻く場所の５ｃｍまでに限定されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記の挿入にはインプラント（埋め込み）を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
上記ヌクレオチドベースの薬剤は、遺伝子発現干渉活性、遺伝子発現修飾活性、遺伝子発現停止活性、ノックダウン遺伝子発現活性、メッセンジャ遺伝子の分解活性、短鎖または多重鎖ＤＮＡヌクレオチドの変換活性、ＲＮＡ干渉活性、ＲＮＡサイレンシング活性から成る群から選択された１つ以上の活性を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１の請求項に記載の組成物。
【請求項５】
上記ヌクレオチドベースの薬剤は、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または翻訳の阻害により、メッセンジャＲＮＡの遺伝子ノックダウンを行なったり、ｔＲＮＡ機能およびｒＲＮＡ機能を抑止するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）薬剤や、短鎖（小鎖）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ)，ミクロＲＡＮ、非コードＲＮＡ、ＤＮＡに作用する短鎖ＲＮＡ、ダイサー基質ｓｉＤＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ)、ＵｓｉＲＮＡ、自己デリバリー型ＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ)、ｓｉＮＡ、ポリ（Ａ）尾部追加合成時のプレｍＲＮＡ成熟プロセスを阻止するヌクレオチド系薬剤、Ｕ１アダプター、ミクロＲＮＡ、アプトマー、３重らせん形成体、ＤＮＡザイム、アンチセンス鎖ＲＮＡ、モルフォリオン（ＰＭＯ，ホスホロジアミドモルフォリノオリゴ）、リボザイム、キメラプラスト、または、これらを組み合わせた物質の１つ以上を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１の請求項に記載の組成物。
【請求項６】
上記ヌクレオチドベース薬剤が１つ以上の修飾箇所を有することを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
上記修飾箇所が１つ以上の糖と塩基の箇所および/またはリン酸結合またはヌクレオチド結合のある箇所であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
上記修飾は他の分子または複数のヌクレオチドとの接合および/または複合であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
上記分子が１つ以上のポリマー、脂質、ペプチド、または、炭化水素であることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
上記脂質が１つ以上のリン脂質、カチオン性脂質、膜融合性脂質を含むことを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
上記分子はコレステロールおよび/またはその他のトランスフェクション薬剤および/またはトランスフェクション複合薬剤であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
上記薬剤がポリアミン、ポリマー、カチオン性ペプチド、非カチオン性ポリマー、または天然ポリマーであることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
上記ポリマーが、１つ以上のスペルミン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｌ−α−セファリン、ＤＯＰE、ＤＯＴＡＰ、および/または、ポリ(エチレングリコール）（ＰＥＧ）、および、ＰＥＧで修飾されたポリマー、ペグ化された粒子、ペグ化されたポリイオン複合体（ＰＩＧ)、および/または、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ[２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル）メタクリレート]（ＰＤＥＡＭＡ）、および/または、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ)であることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
上記薬剤を収容するためのポリマー基体のいずれかのタイプから成り、上記薬剤が上記構造体から、制御された放出速度で溶出することを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１の請求項に記載の組成物。
【請求項１５】
上記基体が１つ以上のマトリックス、ファイバ、ファイバ束または多層組成物から成ることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
上記長期間の放出が、少なくとも１週間を超える期間の放出であることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか１の請求項に記載の組成物。
【請求項１７】
上記放出が少なくとも３週間目に起こることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
上記放出は少なくとも６週間目に起こるあることを特徴とする請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ヌクレオチドベースの薬剤を、ヌクレオチドベースの薬剤による局所治療を必要としている疾病の患者に対して、局所治療または遠方部位での治療を可能にする１つの箇所に薬剤を遊離させることができる治療が必要な部位に、個体状組成物の状態で、局所に投与するプロセスから成る治療方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１８のいずれか１の請求項に記載された組成物から成る上記ヌクレオチドベースの薬剤を投与することを特徴とする請求項１９に記載の治療方法。
【請求項２１】
感染疾患、変性疾患、加齢関連疾患、癌、慢性炎症疾患、組織誤用疾患、行動障害疾患、疼痛 (抗痛み)疾患、自己免疫疾患のうちの１つ以上の疾患を治療する方法、および/または、請求項１乃至１８のいずれか１の請求項に記載された組成物を投与することで妊娠を予防する方法。
【請求項２２】
上記局所部位が腫瘍部位であることを特徴とする上記請求項に記載の方法又は組成物。
【請求項２３】
上記局所部位が、膵臓、乳房、肝臓、胆嚢、脾臓、腎臓、リンパ節、唾液腺、歯周組織、膣内部、内分泌腺、脳、関節、骨、口腔、胃腸系部位（胃腸管）、胆道系部位、呼吸器系部位、動脈、子宮頚部、血管、尿管、尿道、大脳基底核、白質と灰白質、脊椎、活動性慢性炎症関節、皮膚、交感神経感覚神経部位、骨内部位、急性慢性感染部位、耳、心臓内、心臓血管系部位、心外膜、膀胱、実質組織、眼球内、脳組織、脳室、体腔の１つ以上であることを特徴とする上記請求項に記載の方法又は組成物。
【請求項２４】
上記胃腸管が、口、咽頭、食道、胃、小腸、または、その１部、虫垂、直腸、肛門の組織の１つ以上であることを特徴とする請求項２３に記載の方法又は組成物。
【請求項２５】
上記耳が聴覚、内耳膜迷路、前庭系部位の１つ以上を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法又は組成物。
【請求項２６】
上記呼吸系部位が、鼻、下鼻甲介（鼻甲介とも呼ばれる部位）、咽頭、膜迷路、気管、気管支、肺、吸気筋（横隔膜筋と外肋間筋）であることを特徴とする請求項２３に記載の方法又は組成物。
【請求項２７】
上記体腔が頭蓋、脊椎管、胸郭腔，腹腔、骨盤腔の１つ以上であることを特徴とする請求項２３に記載の方法又は組成物。
【請求項２８】
上記組成物が挿入可能器具とも関連していることを特徴とする上記請求項に記載の方法又は組成物。
【請求項２９】
上記挿入可能器具が、子宮内装置（ＩＵＤ）、子宮内避妊リング（ＩＶＲ）、心臓血管用、末梢血管用、頸動脈用、子宮内用を含む血管システムの１つ以上のステントおよび/またはグラフとおよび/またはバイパスや、食道用、胆道用を含む胃腸系器具や、気管ステントやグラフトを含む呼吸器系器具や、尿ステント、心臓弁、心臓閉鎖術器具、人工ペースメーカ除細動器（埋め込み型除細動器「ＩＣＤ」)、左室補助循環装置（ＬＶＡＤ）、挿入型血圧モニター装置蝸牛インプラント、コンタクトレンズ、眼球内レンズ、前眼房または後眼房インプラント、気管支内リング、成形インプラント、股関節置換インプラント、
乳房インプラント、陰茎インプラント、頭蓋内インプラント、眼球内プラントの１つ以上を含むことを特徴とする方法又は組成物。
【請求項３０】
上記局所部位が膵臓であり、その疾患が腫瘍であることを特徴とする上記請求項に記載の方法又は組成物。
【請求項３１】
上記局所部位が前立腺であり、その疾患が腫瘍であることを特徴とする上記請求項に記載の方法又は組成物。
【請求項３２】
上記局所部位が乳房であり、その疾患が腫瘍であることを特徴とする上記請求項に記載の方法又は組成物。
【請求項３３】
上記組成物としてポリマーを含むことを特徴とする上記請求項の記載の方法又は組成物。
【請求項３４】
上記ポリマーが、ポリーエプシロンーカプロラクタン（ＰＣＬ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）(ＰＴＭＣ）、ポリ（ｐ−ダイオキシン）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、および、その共重合体、ポリグリコール酸（ＰＧA)、および、その共重合体、ポリアルキレンエステル、ポリオーソエステル、ポリエステルウレタン、ヒドロキシブタン酸、ポリエステル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリアミドエステル、ポリアンヒドライド、ポリ（アンヒドライド−コーイミド）、ポリ（アルキルシアノアクリレード）、ポリフォスファゼン、ポリサッカライドを含むポリビニルエステル、ポリ（オーガノホスファゼン）、ポリ（アミドアミン）、ポリ（Ｌ−グルタン酸）、ポリ（エチレンアミン）（ＰＥＩ）、ポリ（プロピレンアミン）および、その誘導体、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭA)、天然生分解性ポリマー、ポリエチレンテレフサレート（ＰＥＴ）、ポリサッカロイド、シリコン、および、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ＥＶＡ，ｐＨＥＭＡ，ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ（ダイオキシン）、ポリフォスファゼン、これらの混合物、共重合体、ブレンド、および、その誘導体を含む直線状脂肪酸ポリエステルや分岐型脂肪酸ポリエステルの群から選択されることを特徴とする請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
上記ポリマーが、ポリグリコール酸（ＰＧA)，ＰＬＧＡ（ポリグリコール酸とＰＬＡとの共重合体）、グリコリドーコートリメチレン  カーボネイト（ＰＧＡとトリメチレンカーボネートとの共重合体）、ポリ（グリコリドーコーカプロラクトン（ＰＧＡとエプシロンーカプロラクタンとの共重合体）、ＰＬＡとＰＣＬの共重合体、ポリエチレングリコールとその誘導体、ＰＶＯＨ，ＰＶＡ，ＰＶＡＬ，ＰＶＡｃ、ＰＣＬとＴＣＰ（トリカルシウムリン酸）との共重合体、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）、または、３−ヒドロキシ吉草酸から成ることを特徴とする請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
上記天然生分解性ポリマーが、フィブリン, コラーゲン、ゼラチン、ヒアルノナン, カゼイン, 絹、ウール、リグニン、シェラックの１つ以上であることを特徴とする請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
上記のポリサッカライドは、デンプン、セルロース、アルジネート、キトサンのうちの１つ以上であることを特徴とする請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
上記組成物の作製法は、鋳造法、フィルム成形法、溶融成形法を含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法又は組成物。
【請求項３９】
上記組成物の作製法は、ポリマーファイバ作製法を含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法又は組成物。
【請求項４０】
上記ポリマーファイバ作製法は、位相分離法、自己組立法、電子スピニング法のうちの１つ以上を含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法又は組成物。
【請求項４１】
上記電子スピニング法は、ポリマーに薬剤を埋め込むこと、単一のファイバを電子スピンニングすること、電子スピニングにより作成されたファイバを同軸多重ファイバとしてスピニングすることを含むことを特徴とする請求項４０に記載の方法又は組成物。
【請求項４２】
上記組成物の作成は、溶融スピニング法、ポリマースポンジ法、ファイバマット法を含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法又は組成物。
【請求項４３】
上記方法は、ポリマーと薬剤の混合されたデバイスを、室温、または、６５℃以下で準備すること、エラストマーポリマーを使うこと、室温加硫法により単一成分法と２成分法を選ぶことを特徴とする請求項３３に記載の方法又は組成物。
【請求項４４】
上記組成物には１つ以上の薬剤を含むことを特徴とする上記請求項に記載の方法又は組成物。
【請求項４５】
上記組成物には、抗炎症薬、抗凝固薬、抗癌剤、毒性代謝物の蓄積を予防する鎮痛薬、変性過程を抑制する薬剤、炎症を軽減する薬剤、アポプトーシスと細胞壊死を減少させる薬剤、感染を予防し軽減する薬剤、オートファージ、脱分化、分化を阻止する薬剤、悪性良性を問わず、細胞増殖を阻害する薬剤、免疫効果を強化したり、自己免疫応答を抑制する薬剤、アジュバント剤、幹細胞制御薬を含み、その薬剤は、オプションとして、好ましくは、抗癌薬、化学療法薬、鎮痛薬、抗変性薬、プロ変性薬、抗血小板薬、抗凝結薬、抗炎症薬、アンチレプリケート薬、プロ酸化薬、局所免疫抑制薬、免疫特権作成薬、抗代謝薬、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、抗寄生虫薬を含む抗感染薬、抗血管新生薬、避妊薬、抗痔薬、および、上記薬剤を組み合わせた薬剤から成る群から選択されることを特徴とする上記請求項４４に記載の方法又は組成物。
【請求項４６】
蛋白質、直線状または円形を問わず、ペプチド、ぺプチドミメティクス、レクチン、炭水化物、リピッド、小型薬剤、ホルモン、ステロイド、抗ウイルス薬、化学療法薬、放射線薬剤、デリバリー基体、造影薬、ポリコロールまたはモノクローナルを問わず、ヒト抗体、げつ歯動物由来の抗体、ペグ化薬を含むことを特徴とする請求項４５に記載の方法又は組成物。
【請求項４７】
局所部位から上記ヌクレオチドベースの薬剤を投与するための組成物であり、上記局所部位から、上記ヌクレオチドベースの薬剤を、挿入可能な器具と一緒に、体内の部位に挿入する製剤から成り、上記挿入可能器具が、子宮内装置（ＩＵＤ）、子宮内避妊リング（ＩＶＲ）、心臓血管用、末梢血管用、頸動脈用、子宮内用を含む血管システムの１つ以上のステント、グラフト、バイパス、食道用と胆道用を含む胃腸系器具、気管ステントやグラフトを含む呼吸器系器具や、尿ステント、心臓弁、心臓閉鎖術器具、人工ペースメーカ除細動器（埋め込み型除細動器「ＩＣＤ」)、左室補助循環装置（ＬＶＡＤ）、挿入型血圧モニター装置蝸牛インプラント、コンタクトレンズ、眼球内レンズ、前眼房または後眼房インプラント、気管支内リング、成形インプラント、股関節置換インプラント、乳房インプラント、陰茎インプラント、頭蓋内インプラント、眼球内プラントの１つ以上を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４８】
上記ヌクレオチドベースの薬剤は、上記薬剤の送達された局所から全身に、および/または、体の限局部位に対して拡散されることを特徴とする請求項４７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレトチドベースの治療薬のための局所または限局デリバリーの方法、そのシステム、その組成物に関し、特に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）治療薬の組成物、そのデリバリーシステム、そのデリバリー方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数の小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）薬剤に関する最近の研究と臨床試験進展の背景のなかで、このｓｉＲＮＡが、真の治療薬として使える可能性が高まってきている（１−４）。ＲＮＡｉには、遺伝子サイレンシングのための最適の作用機能があることが分かっている。つまり、ＲＮＡｉは、癌遺伝子または腫瘍増殖因子を標的にした投与によって、その腫瘍の増殖を抑止する効果があることが実験的に証明された。このｓｉＲＮＡｉが合成ｓｉＲＮＡであろうと、あるいは、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ)の発現ベクターによるものであろうと、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）のような標的物質の増殖を阻止することが可能である。上記ｓｉＲＮＡは、血管新生治療のような細胞再生目的の場合と、腫瘍および糖尿病性網膜症のような病理症例での治療の場合の両方において、その重要な担い手となっている。この効果は、ヒトにおいても有効であることが判明している。ｓｉＲＮＡ薬剤の改良進展にともない、そのデリバリー方法も多様である。つまり、次のようなディバリ方法が可能である。つまり、変性していない、または、修飾を施してあるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現しているＤＮＡを全身投与する方法（これは、主にインビボ試験において採用される）、ウイルスを使用しないで、ナノ粒子を使う方法や、ｓｉ/ｓｈＲＮＡをカプセルに封止してリボソームを全身投与する方法、ウイルスベクターをデリバリー手段として使う方法、レーザビーム遺伝子転移（ＬＢＧＴ）のような種々の物理的、化学的方法を使ったデリバリー方法（５）などがある。しかし、これらのデリバリー方法には、共通した欠点がある。つまり、これらのすべての投与方法において、全身投与であれ、直接の部位注入であれ、標的部位にうまく到達しない、免疫刺激や酵素分解や毒性反応が発生する、薬剤が組織や細胞障壁を貫通できない、コンスタントな放出量が確保できないために遺伝子サイレンシング効果で得られない、費用がかさむ、さらに、エレクトロポレーションや超音波血管内インフェクションのような場合には、その局部投与の効果が得られず、大きな副作用があることなどの欠点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
背景技術には、ヌクレオチドベースの治療薬を局所的（あるいは、限局的）にデリバリーするための方法、システム、その組成物については、なんらの教えも示唆もない。本発明の方法、システム、組成物を採用することで、薬剤の全身投与や直接注入での欠点を克服できる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、例えば、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡのようなヌクレチドベースの治療薬を局所的（あるいは、限局的）にデリバリーし、その薬剤の局所部位での長期放出（溶出）を可能にするデリバリーの方法、システム、組成物を提供する。ここで述べるヌクレチドベースの治療薬というのは、天然型か非天然型かを問わず、少なくとも１個のヌクレオチドを含む薬剤のことを指す。そのような薬剤としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮAｉ）薬剤に限定されるものでなく、単鎖であるか二本鎖であるかを問わず、遺伝子活性の停止作用や遺伝子ノックダウン作用を行うＲＮＡであり、例えば、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または翻訳阻止による遺伝子ノックダウンや、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡ機能や、それらのエピジェネティック作用を抑止するＲＮＡであり、短鎖（小鎖）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ)，ミクロＲＡＮ、非コードＲＮＡ、ＤＮＡに作用活性を有する短鎖ＲＮＡ、ダイサー基質ｓｉＤＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ)、ＵｓｉＲＮＡ、「ｒｘＲＮＡＴＭ」（「ＲＸｉ」治療薬）を含む自己デリバリー型ＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ)、あるいは、Ｕ１アダプター（ＩＤＴ社製）のような、ポリ（Ａ）尾部追加合成時のプレｍＲＮＡ成熟プロセスを阻止するＲＮＡも含む（これらに限定されない）。上記のＲＮＡのうち、ＤｓｉＲＮＡは、ＲＮアーゼＩＩＩエンドリボヌクレアーダイサによって、２−塩基ー３’オーバハングｓｉＲＮＡを有する２１−２３塩基の二本鎖に切断される。ここでのＵｓｉＲＮＡは、二本鎖のｓｉＲＮＡであり、非ヌクレオチドアクリルモノマーで修飾されており、「アンロックド・ヌクレオベース類似体（ＵＮＡ）」と呼ばれ、リボースの２つのアジュバント炭素原子間の結合を解く機能がある。上記のＵ１アダプターは２つの部分から成り、その１つは、標的遺伝子結合ドメインの部分であり、もう１つは、細胞スプライシング機器を受け入れたり抑止したりするＵ１ドメインの部分である。このＵ１アダプターは、同じ分子に、これらの両方の能力を結合させることで、ポリ（Ａ）尾部での合成追加時のプレｍＲＮＡ成熟プロセスを阻止することができる。さらに、オリゴヌクレオチドのドメイン作用は独立して作用するので、転移結合とスプライシング抑止を、それぞれ独立した状態で最適化させることができ、広い範囲の遺伝子作用の阻止に適用される。
【０００５】
いくつかの実施例で示したように、好ましくは、この薬剤が「ローダ」（局所薬剤溶出手段）と一緒に各部位に送達されることである。
【０００６】
いくつかの実施例で示したように、この薬剤は癌の治療に使われる。この薬剤が癌の特定タイプに合わせて特異的に選択され、腫瘍部位に局部投与がされることが好ましく、この時の投与量は、治療効果の低いほうの閾値を長期にわたり持続的に上回っている量であること、量のレベルを一定に保って、効果的サイレンシング期間を最適にすることが好ましい。
【０００７】
別の実施例で示されたように、この薬剤の使用により、慢性苦痛が軽減され、毒性代謝物の蓄積が予防され、変性症状の進行が止まり、炎症が軽減され、アポトーシスや壊死が減り、感染が予防、軽減され、細胞の自食作用、脱分化、分化が阻止される。オプションとして、ヌクレチドベース薬剤のほかに、あるいは、ヌクレチドに加えて、別の１つ以上のタンパク質系の薬剤を選んでもよい。それらの例として、成長因子、抗体、サイトカイン、その誘導体、ペプチド（線状、円形を問わない）、ペプチドミメティックス薬、レクチン、炭水化物、脂質があるが、これらに限定されるものではない。
【０００８】
オプションとして、さらに、これらのほかに、追加の薬剤を選択してもよく、その場合には、次の薬剤から成るグループから選択するのが好ましい。つまり、抗癌剤、化学療法剤、鎮痛剤、抗変性疾患剤、プロ変性疾患剤、抗血小板剤、抗凝固剤、抗炎症剤、アンチレプリケート剤、プロ酸化剤、局部免疫阻害剤、抗代謝剤、抗ウイルス剤、抗菌剤，抗カビ剤、抗寄生虫薬、避妊薬のような抗感染薬、免疫特権部位を作る薬剤、抗血管新生剤、認知機能障害薬、および、これらを組み合わせた薬剤である。
【０００９】
上記ヌクレオチドベースの薬剤は、上で述べたように、ヌクレオチドや、オリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドで構成されていることが好ましく、たとえば、修飾されたヌクレオチドを加えることにより、ＲＮアーゼによる分解を減少させるように調整することが好ましい。この修飾したヌクレオチドとして、２Ｆ−ＲＮＡ、および，部分修飾体の２’Ｆ−ＲＮＡの例としての、２’ＯＭｅ、フッ素−ＣＴＰ，および、フッ素−ＵＰＴが含まれる（これらに限定されない）。この薬剤を、オプションとして、ロックされた核酸（ＬＮA)や、ペプチド核酸（ＰＮＡ)バックボーンを使って作製してもよい。オプションとして、この薬剤の細胞内への侵入作用を高めるために、コレステロールのような脂質部分に接合させてもよい。さらに、上記薬剤を、オプションとして、細胞膜とエンドソーム破壊分子と混合してもよい。上記薬剤を、オプションとして、薬剤の安定性と細胞内への強力な侵入効果を実現させるために、スペルミンとセファリン（ホスホチジルエタノールアミン）のような天然ポリマー、あるいは、ポリエチレンイミン（ＰＥI)のような別のポリマーと混合または接合をさせてもよい。さらに、オプションとして、この薬剤の局所投与のために、「ローダ」（局所的に挿入できるので）を使用してもよい。この治療薬は、局所部位からは拡散させないで、その局所投与部位だけで効果が得られるようにしてもよいし、全身分布させて全身的効果を得られるような使い方をしてもよい（オプション）。ここで、「局所部位からは拡散させない」という意味は、当該治療薬が、ある限定的な量で、ある限定的な部位だけにおいて拡散し、投与効果が全身的でなく、治療的効果のある薬剤濃度が局所部位を囲む限定的部位だけに及ぶという意味である。この限定的な薬剤量と限定的部位は、「ローダ」の位置から５ｃｍの距離以内の部位であってよく、その薬剤濃度は治療効果の閾値以上に維持されていることが望ましい（オプション）。通常の場合、ここでの薬剤濃度は「ローダ」からの距離の関数であり、非線形的に変化する。
【００１０】
以下の説明において、「治療」という用語には、「予防」という意味も含まれるものとする。
【００１１】
以下の説明での「約（about）」という意味は、ある特定値の１０％前後という意味である。
【００１２】
本発明の種々の実施形態のその他の特徴と利点は、以下の詳細な説明とクレームにより明確となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ｓｉＲＮＡや、その他のヌクレオチドベースの治療薬に対する種々の化学修飾の例を示したものである。
【図２Ａ】「ローダ」からのメチレンブルーの放出の結果を示したものであり、薬剤が６２日間、安定的に適切にコンスタントな速度で放出されていることが示されている。
【図２Ｂ】「ローダ」からのメチレンブルーの放出の結果を示したものであり、薬剤が６２日間、安定的に適切にコンスタントな速度で放出されていることが示されている。
【図２Ｃ】「ローダ」からのメチレンブルーの放出の結果を示したものであり、薬剤が６２日間、安定的に適切にコンスタントな速度で放出されていることが示されている。
【図３Ａ】「ローダ」からのリゾチームの放出の結果を示したものであり、薬剤が６５日間、安定的に適切にコンスタントは速度で放出されていることが示されており、特に、ここでは、分子量がｓｉＲＮＡに類似している場合が示されている。
【図３Ｂ】「ローダ」からのリゾチームの放出の結果を示したものであり、薬剤が６５日間、安定的に適切にコンスタントは速度で放出されていることが示されており、特に、ここでは、分子量がｓｉＲＮＡに類似している場合が示されている。
【図３Ｃ】「ローダ」からのリゾチームの放出の結果を示したものであり、薬剤が６５日間、安定的に適切にコンスタントは速度で放出されていることが示されており、特に、ここでは、分子量がｓｉＲＮＡに類似している場合が示されている。
【図４】腫瘍増殖が、Ｈ１９のｓｉＲＮＡベース薬剤のサイレンシング作用により、インビボで、阻止されることが示されている。
【図５】ｓｉＧＦＴを内部に収容した「ローダ」が、特異的に有効に、ＧＦＰ発現をインビトロで阻害することが示されている。
【図６】ｓｉＲＮＡが、突然変異体であるｋＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）の発現をインビトロで特異的に強力に阻止することを示している。ここでは、突然変異体ｋＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）を発現する、膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ１）に対して、特定のｓｉＲＮＡ使って４０時間トランスフェクションを行い、突然変異体ｋＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）ｍＲＮＡの発現についての半定量ＰＣR（ポリメラーゼ鎖反応法）を実施した結果（ＧＡＰＤＨへの正規化後）が示されている。
【図７】突然変異体ｋＲＡＳの発現抑止により膵臓癌細胞（ＰａｎＣ１）の増殖が止まることを示している。このＰａｎｃ１細胞に対して、４８時間のトランスフェクションを行い、ＸＴＴ試験を実施した。
【図８】ｓｉＲＮＡによる突然変異体ｋＲＡＳの発現の抑止によりＰａｎｃ１細胞の増殖が用量応答的に阻止されることを示している。突然変異体ｋＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）を発現する、Ｐａｎｃ１細胞に対して、ｓｉＲＮＡを指定の用量投与して、７２時間のトランスフェクションを行い、その後にＸＴＴ試験を実施した。
【図９】上記の実験で使用された「ローダ」における、ｓｉＲＮＡの累積放出量の曲線を示している。
【図１０Ａ】ローダに充填されたｓｉＫＲＡＳＧ１２Ｄが、Ｐａｎｃ１細胞の生存性を阻害し、これを細胞死させることを示している。
【図１０Ｂ】ローダに充填されたｓｉＫＲＡＳＧ１２Ｄが、Ｐａｎｃ１細胞の生存性を阻害し、これを細胞死させることを示している。
【図１１Ａ】「ローダ」からの膵臓細胞に対するｓｉＲＮＡの放出効果を、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした場合と比較したものを示している。
【図１１Ｂ】「ローダ」からの膵臓細胞に対するｓｉＲＮＡの放出効果を、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした場合と比較したものを示している。
【図１２Ａ】図１０で示した試験の結果をウエスタンブロット法で検討した結果を示したものである。
【図１２Ｂ】図１０で示した試験の結果をウエスタンブロット法で検討した結果を示したものである。
【図１２Ｃ】図１０で示した試験の結果をウエスタンブロット法で検討した結果を示したものである。
【図１２Ｄ】図１０で示した試験の結果をウエスタンブロット法で検討した結果を示したものである。
【図１３Ａ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１３Ｂ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１３Ｃ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１４Ａ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１４Ｂ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１４Ｃ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１５Ａ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１５Ｂ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１６Ａ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１６Ｂ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１６Ｃ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１７Ａ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１７Ｂ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである。
【図１７Ｃ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＧＦＰの効果を示したものである
【図１８Ａ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図１８Ｂ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図１８Ｃ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図１９Ａ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図１９Ｂ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図１９Ｃ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図２０Ａ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図２０Ｂ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図２０Ｃ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図２１Ａ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図２１Ｂ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図２１Ｃ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図２２Ａ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図２２Ｂ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図２２Ｃ】ルシフェラーゼルミネセンスに対するｓｉＬＵＣの効果を示している。
【図２３】ＧＦＰ群（マウス１−５）とＬＵＣ群(マウス６−１０）の各群におけるマウスの平均発光強度を示している。ｓｉＵＣが、発光の有意な増加を防止して（腫瘍増殖そのものには影響がなかったが）、発光に対して、３日目頃に最も有意な効果を示した。
【図２４】ｙ軸に実際の強度を、ｘ軸には、各群における各マウスの治療開始からの日数を示したグラフである。本発明では、各マウス間には多少の差異はあるけれども、全体の傾向は明白である。つまり、インビボで腫瘍部位に、「ローダ」により、ｓｉＧＦＴとｓｉＬＵＣを投与した場合に、ｓｉＧＦＴよりもｓｉＬＵＣにおいて強度を減らす効果が認められた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施形態のいくつかについて、添付図面と画像を参照して説明をしてあるが、それらは、単なる例示である。図面と画像を詳しく参照する場合、そこに説明してある事柄は、あくまで、本発明の説明のための例示の目的であり、それらに限定されるものでない。以下の説明により、本発明の実施形態がどのように実施されるかについて、当業者には明白になるであろう。
【００１５】
本発明では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む（これらに限定されない）ヌクレオチドベースの治療薬の局所デリバリーのための方法、システム、組成物が提供される。少なくとも、いくつかの実施形態では、この薬剤は、「ローダ」（Local Drug Eluter、局部薬手段)により各部位に送達されることになる。薬剤、修飾体、薬剤設計、材料、製造、ターゲット、使用法、「ローダ」の挿入方法について以下に詳しく述べる。
【００１６】
１．薬品：薬剤、薬剤の選択、追加の薬剤、修飾体薬剤
本発明は、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡのようなヌクレオチドベースの治療薬の局所デリバリーおよび長期間デリバリーのシステム、方法、組成物を提供することで、従来技術の欠陥を克服する。ここで「ヌクレオチドベースの治療薬」というのは、天然型か非天然型に問わず、少なくとも、１個のヌクレオチドを含む場合を指す。そのような薬剤としては、ＲＮＡ干渉（ＲＮAｉ）剤に限定されるものでなく、また単鎖であるか二本鎖であるかを問わず、遺伝子作用の停止や遺伝子ノックダウン作用を行うＲＮＡであり、例えば、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または翻訳阻止による遺伝子ノックダウンや、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡ機能や、それらのエピジェネティック作用を抑止するＲＮＡであり、短鎖（小鎖）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ)，非コードＲＮＡなど、ＤＮＡに作用する短鎖ＲＮＡ、ダイサー基質ｓｉＤＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ)、ＵｓｉＲＮＡを含む。ここで、ＤｓｉＲＮＡは、ＲＮアーゼＩＩＩエンドリボヌクレアーダイサによって、２−塩基−３’オーバハングｓｉＲＮＡを有する２１−２３塩基の二本鎖に切断される。このＵｓｉＲＮＡは、二本鎖のｓｉＲＮＡであり、非ヌクレオチドアクリルモノマーで修飾されており、「アンロックド・ヌクレオベース類似体（ＵＮＡ）」と呼ばれ、リボースの２つのアジュバント炭素原子間の結合を解く機能がある。さらに、「ｒｘＲＮＡＴＭ」（「ＲＸｉ」治療薬）などの自己デリバリーＲＮＡ（ｓｄＲＮＡ)、ｓｉＮＡ（短鎖干渉核酸）、Ｕ１アダプター（ＩＤＴ社製）、ポリ（Ａ）尾部追加合成時のプレｍＲＮＡ成熟プロセスを阻止するＲＮＡも含む。上記Ｕ１アダプターは２つの部分から成り、その１つは、標的遺伝子結合ドメインの部分であり、もう１つは、細胞スプライシング機器を受け入れたり抑止したりするＵ１ドメインの部分である。このＵ１アダプターは、同じ分子に、これらの両方の能力を結合させることで、ポリ（Ａ）尾部での合成の追加時のプレｍＲＮＡ成熟プロセスを阻止することができる。さらに、オリゴヌクレオチドのドメイン作用は独立して作用するので、転移結合とスプライシング抑止を、それぞれ独立した状態で最適化させることができ、広い範囲の遺伝子作用の阻害剤とし使われる。上記治療薬の例として、さらに、ミクロＲＮＡを含み、これは、ＨＣＶ(Ｃ型肝炎ウイルス）複製でのミクロＲＮＡ１２２の効果の場合と同様に、細胞および非細胞メッセージ発現の増加を誘発する（ミクロＲＮＡ１２２はＨＩＶ複製を強化する）。さらに、上記治療薬は、アプトマー、三重らせん構造体、ＤＮＡザイム、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムも含む。
【００１７】
薬剤および追加薬剤の選択
いくつかの実施形態で示されているように、上記「ローダ」は、抗炎症剤でコーティングされている。これは、高い抗炎症反応を示す部位には、抗炎症剤をコーティングする場合と同様である。いくつかの実施形態では、この抗炎症効果は、ＣＯＸ−２阻害剤または抗Ｔ細胞免疫阻害剤を使うことで達成される。上記「ローダ」が血管内に侵入する可能性のある実施態様では、このコーティング剤を小分子ヘパリン（例えば、ヘパリン化ＰＥＧ)のような抗血液凝結剤で作成する。
【００１８】
別のいくつかの実施形態で示されているように、癌治療に上記薬剤が使用されている。この薬剤が癌の特定のタイプに合わせて特異的に選択され、腫瘍部位に局部投与がされ、この時の投与量が、治療効果の低いほうの閾値を長期に亘り持続的に上回っている量であること、投与量のレベルを一定に保って、効果的サイレンシング期間を最適にすることが好ましい。
【００１９】
別のいくつかの実施形態に示されているように、上記薬剤の使用目的は、慢性苦痛を軽減すること、毒性代謝物の蓄積を予防すること、変性症状の進行を抑制すること、炎症を軽減すること、アポトーシスや壊死を軽減させること、感染を予防し軽減させること、細胞の自食作用、脱分化、分化を阻止すること、悪性または良性細胞の増殖を阻止すること、癌や感染病の場合の薬物耐性を克服すること、免疫作用を強化すること、自己免疫反応を抑制すること、アジュバントとして作用すること、幹細胞を制御することである。
【００２０】
ヌクレオチドの使用とは別に、オプションとして、別のタイプの薬剤を１つ以上使用してもよい。その一つがタンパク質であるが、これに限定されるものではない。増殖因子を阻害するタンパク質に限定されるものではない。例として、抗体、サイトカイン、その他の誘導体、ペプチド（線状か円形かを問わない）、ペプチド模倣体、レクチン、炭水化物、脂質、低分子薬剤、ホルモン、ステロイド、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線薬剤、デリバリー剤、造影剤、ヒトポリクロナルあるいはヒトモノクローナル抗体、その他ヒト型誘導剤がある。
【００２１】
オプションとして、追加薬剤として、さらに、以下のものから成る群の中から選択してもよい。つまり、抗癌剤、化学療法剤、鎮痛剤、抗変性疾患剤、アンチレプリケート剤、抗小血板剤、抗炎症剤、アンチレプリケート剤、プロ酸化剤、局所免疫抑制剤、免疫特権部位を確保するため薬剤、抗代謝剤、抗ウイルス剤や抗細菌剤や抗真菌剤や抗寄生虫剤などの抗感染剤、抗血管新生剤、避妊薬、認知症薬、および上記薬剤を組み合わせたものがある。
【００２２】
ヌクレオチドベースの薬剤を基本にした修飾体と補助物質
上記薬剤は、あるタイプのヌクレオチド修飾体、オリゴヌクレオチド修飾体、ポリヌクレオチド修飾体、その他の修飾体、接合体、複合体であり、これらは、別々に投与してもよいし組み合わせて投与してもよい、ＲＮアーゼのような酵素による破壊や免疫刺激を軽減するものと調整して、細胞取り込みを増加させるものとするのが望ましい。オプションとして使用する修飾体は、ヌクレオチドベースの薬剤の近くの場所の１つ以上の部位に投与してもよい。
【００２３】
単なる１つの仮説に従うことは適切ではないが、オプションとして修飾体を使用してもよい。このとき、ヌクレオチドベースの薬剤に修飾を施すことで、薬剤の安定性を向上させ、免疫刺激を減らし、その他免疫関連の副作用を減らし、ｍｉＲＮＡパスウエイへの不本意な侵入を減らし、薬剤動態的作用や細胞取り込みを改善するという見方もある。これらの修飾体、接合体、複合体として、糖修飾体、リン酸連鎖修飾体、塩基修飾体、オーバハングと端末への修飾体、二本鎖構造の修飾体があり、これらについての、より詳しい記載は以下の通りである。
【００２４】
１．糖修飾について
ヌクレオチドの異なる糖に種々の修飾を施すことは可能であり、それらの修飾体の多くはすでに開示されて試験もされている。これらの修飾体のいくつかについては、本発明の実施例の中でのオプションの例として記載されている。
【００２５】
１つの仮説だけに従うことは不本意であるが、２’ＯＨは、一般的には、活性ｓｉＲＮＡには必要ないものと考えられている。したがって、リボース環の２’位は、広く修飾の対象となり、その目的は、エンドヌクレアーゼ酵素に対する安定性を与えることと免疫応答活性を減らすことである。例として、２’−Ｏ−メチルを修飾したものと、２’−Ｏ−メトオキシエチル（２’−Ｏ-MOE)を修飾したものがある。二重鎖の２’−ＯＨ基の７０％を任意に２，４−ジニトロフェニルエーテル（２’−Ｏ−ＤＮＰ）に変換したｓｉＲＮＡでは、多様な改良特性、例えば、高い結合親和性、ヌクレアーゼ耐性が示されている。ヒドロキシルの代わりに、アルコキシまたはアルコキシで置換した機能性ｓｉＲNAでは、２’位に窒素が含まれている。２Ｆ−ＲＮＡおよび２’Ｆ−ＲＮＡ修飾体は、センス鎖、アンチセンス鎖に耐性があり、完全に修飾した２’−ＲＮＡｓｉＲＮＡには活性がある。全体がＤＮＡプリンと２’−ＲＮAピリミジンから成るアンチセンス鎖は活性と有する。環状酸素も修飾されている。例えば、４’Ｓ−ＲＮＡは高い親和性のある修飾体であり有意なヌクレアーゼ安定性を示す。アンチセンス鎖の５’末端も少量の４’Ｓ−ＲＮＡで修飾が可能である。両鎖末端で、４’Ｓ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ＭＯＥを組み合わせて修飾させることも可能である。２’位と４’位で修飾させた４’−ＦＡＮＡは、ノーサン（northern）立体配座であり、ＲＮＡ様の立体配座となるが、この修飾をしたものも使える。上記薬剤をオプションでロックされた核酸（ＬＮA)またはペプチド核酸（ＰＮＡ)で設計してもよい．このＬＮＡは、リボースの２’−Ｏを４’−Ｏに接続するメチレン架橋を含む。メチレン架橋は、３’末端立体配座の糖を「ロック」して、Ｔｍを有意に増加させ、ヌクレアーゼ耐性を高める。
【００２６】
糖バックボーンへの修飾体として、２’ーフロオロＲＮＡ、ＬＡＮ（ロック核酸）、２’ＯＭe（２’−Ｏ−メチルＲＮＡ)、ＦＡＮＡ（２’−ジオキシー２’−フルオロベーターＤ−アラビノ核酸）、２’ＭＯＥ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、４’ＳＲＮＡがある（これらに限定されるものでない）。これらの修飾体は、図１に示されている。上記のような修飾を施す時には、特に、ＬＮＡの場合には、ヌクレオチドベースの薬剤として、毒性がなく、十分な機能が保持されるように注意を払う必要がある。
【００２７】
他のタイプの修飾体の例として以下のものがある（但し、これらに限定されない）。２’−メトキシエトキシヌクレアーゼ、２’−メチルーチオーエチルヌクレオチド、２’−ジオキシー２’−フルオロヌクレアーゼ、２’−ジオキシー２’−クロロヌクレオチチド、２’−アジドヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチルートリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシーエトキシヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、その他の異なる構造のヌクレオチドの末端キャップ部分などがある。
【００２８】
ｓｉＲＮＡに関する修飾については下記に詳しく述べる。但し、これらの修飾は、ヌクレオチドベース治療薬に対しての、別のタイプの薬剤にもオプションとして使用できる。
【００２９】
ホスホロチオアート（ＰＳ）結合について
ホスホロチオアート（ＰＳ）結合は、ＲＮＡのインターヌクレオチド結合内の２個の非結合酸素原子を硫酸原子で置換することで実現できる。ボラノリン酸ＯＤＮでは、非架橋ホスホジエステル酸素を、等電点ボロン（−ＢＨ３）部分で置換できる。末端レベルで修飾されたボラノリン酸ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチドによる分解に対して、非修飾のｓｉＲＮＡよりも高い安定性を示す。
【００３０】
フルオロ結合とメチル結合について
２’−ＯＭｅヌクレオチドおよび２’フルオロヌクレオチドから成るｓｉＲＮＡモチーフは、プラズマ安定性を示し、インビボでの機能を高める。２’−ＯＭｅ糖修飾体は、標準的右手Ａ型らせん形状を保持しており、これは、ｓｉＲＮＡの活性に必要なものである。この修飾をすることで、ＯＤＮおよびｓｉＲＮＡ二本鎖のヌクレオチド耐性を高めることも、すでに知られている。
【００３１】
ロック核酸について
ロック核酸（ＬＮＡ)（「接近不可能ＲＮＡ」とも呼ばれる）は、立体配座ロックヌクレオチドの系統のもであり、相補ＤＮＡ、相補ＲＮＡに対して従来にないハイブリッド形成親和性を示す。ＬＮＡは、リボソーム環の２’ー酸素を、４’ー炭素に結合させるメチレン架橋を含む。この架橋は、ＲＮＡの３’末端立体配座特性部のリボソーム環をロックする。ＬＮＡは、ｓｉＲＮＡ細胞内機構に適合する物質として知られており、分子一体性を保持しながら、ｓｉＲＮＡ技術の進展に関係する、いくつかの改良を提供している。
【００３２】
２．リン酸結合修飾について
ホスホジエステル結合には、いくつかの異なった形態があるが、それもＲＮＡｉ機構として受け入れ可能である。また、ボラノリン酸は、ヌクレアーゼ安定性を有意に増加させる。２’、５’−結合、２’、５’−ＤＮA，２’５’−ＲＮＡ、アミド結合２’５’は、本来の３’、５’結合で置換できる。ｓｉＲＮＡ二本鎖の３’−オーバハング内の非イオン性アミド結合もメチルリン酸結合である。
【００３３】
３．塩基修飾について
修飾された塩基は、Ａ−Ｕ塩基対（つまり、ウラシルの代わりに５−Ｂｒ−Ｕｒaおよび５−Ｉ−Ｕｒａ、アデニンの代わりにジアミノプリンの場合）を安定化させる。４ーチオウラシル、２−チオウラシル、Ｃ結合シュードウラシルも含まれる。ＤＮＡ，２Ｆ−ＡＮＡ、ＬＮＡのような糖修飾体と接合したピリミジンの５−メチル化（ＵおよびＣの代わりにＴ−および５−Ｍｅ−Ｃを使用）も塩基の修飾である。チミンと同じ形態を持つけれども、酸素ボンドを作らないジウルオロトシルは、ｓｉＲＮＡ二本鎖内の単一の位置でウラシルを置換する。非芳香族塩基であるジヒドロウラシルも使用できるが、これは塩基スタッキングに寄与しないので、二本鎖の結合親和性を低下させることになり、アンチセンス鎖により決定されるが、二本鎖の５’末端にあるときに最高の機能を発揮する。
【００３４】
修飾済塩基の例を以下に挙げるが、これらに限定されない。ジオキシインシン、５−メチルシトシン（５−ｍｅＣ），５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ハイポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、および、その他のアデニンのアルキル誘導体、グアニン、２−プロピル、および、その他のアデニンのアルキル誘導体、グアニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、シトシン、５−プロピルウラシル、６−アゾウラシル、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオアルキル、８−ヒドロキル、および、その他の８−置換アデニン、グアニン、５−ハロ、特に、５−ブロム、５−トリフルオロメチル、および、その他の５−置換ウラシル、シトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−ジアザグアニン、７ージアザアデニン、３−ジアザグアニン、３−アザアデニンがある。さらに、その他の塩基として、以下の特許、文献に記載のものがある。ＵＳ特許3,687,808。The  Concise  Encyclopedia  Of  Polymer  Science  and  Engineering,  878-859  pages,  Kroschwitz,  J.L,  ed.  John  Wiley  and  Sons,  1990,  Englisch  et.  al.  Angewandle  Chemie,  International  Edition,  1991,  30,  613。Sanghvi,  Y.S.  Chapter15,  Antisense  Research  and  Application.  Pages  289-301,  Crooke,  S.  T,  Leblue,  B.,  ed.,  CRC  Press,  1993。ここで引用された全部を参照として本願に取り込むものとする。
【００３５】
４．接合体および複合体について
本発明のいくつかの実施形態に示されているように、上記のヌクレオチドベースの薬剤は、オプションとして、修飾されたものでもよく、さらに、オプションとして、１つ以上の補助物質を含むことを特徴としてもよい。そのような補助物質が、共有結合により上記のヌクレオチドベースの薬剤の化学組成を変更するものである必要はない。オプションとして、上記薬剤は、その薬剤が細胞内に浸透していくように、補助物質であるコレステロールのような脂質部分に接合させてもよい。一般的には、ステロイドや脂質のような膜浸透性ぺプチドや親油性の物質群との接合が、薬剤のデリバリー性能を向上させる。オプションとして、上記薬剤は、ポリマーやカチオン性ペプチドや天然ポリマーと混合させてもよい。天然性ポリマーの例として、次のような物質がある。つまり、スペルミン、Ｌ−α−セファロン、ＤＯＰE，ポリエチレンイミン（ＰＥI)、および、その誘導体を含むホスファチジルエタノールアミン（ＰＥまたはセファロンと呼ばれている）がある。この誘導体薬剤として、jetPEL、Lipofectamine/RANiMAX、  RNotion、  Silencer、  Gene  Eraser、  SiPORT、  siEFECTOR、  TriEFCTIn、  BLOCK-it、  Oligofectamine、  TansITsiQUEST、  Dreamfactor （いずれも商品名）がある。これらの薬剤は、その薬剤の細胞内安定性や細胞内取り込み性能を改善する。
【００３６】
補助物質として、ほかに、添加剤、可塑剤、細胞色素がある。上記薬剤は、オプションとして、ウシ血清アルブミン（ＢＳA)、マンニトール、細胞破壊分子、エンドソーム破壊分子と混合させてもよい。
【００３７】
上記薬剤は、デリバリー運搬体としての補助物質をオプションとして含んでいてもよい。この運搬体は、非ウイルス性のもので、カチオン性脂質やカチオン性のポリマーがある（但し、これらに限定されない）。カチオン性脂質の例として、分岐ペプチドがあり、この例として、カルジオリピン類似体とリピオジオールがある。カチオン性ポリマーの例として、分岐ヒスチジンーリシン（ＨＫ)ペプチド，ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、プロテアーゼで処理したコラーゲン（アテロコラーゲン）、キトサン、オリゴフェクタミン、さらに、スペルミン、セファリン（ホスファチジルエタノールアミン）などの天然ポリマーがある。
【００３８】
ＵＳ特許申請番号２００８０２１３３７７（この内容はすべて参照として本願に取り込む）には、カチオン性ポリマーの例を挙げている。それらは、ポリエチレンイミン（ＰＥI)、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン（ＰＬＡ）、ポリビニルピロリデン（ＰＶＰ)，キトサン、プロタミン、ポリホスフェイト、ポリリン酸エステル（これについては、ＵＳ特許番号６、８５２、７０９を参照。この内容はすべて参照として本願に取り込む）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミン）などがある。このポリマーは、アミン基、イミン基、グアニン基、イミダゾール基から成る。ほかに、ポリ（ベータアミンエステル）（ＰＡＥ)ポリマー（これも、ＵＳ特許番号６，９９８，１１５、および、ＵＳ特許申請番号２００４/００７１６５４に開示されている。これらの内容はすべて参照として本願に取り込む）。カチオン性ポリマーは、直線的なものでも分岐型のものでもよい。ブレンドポリマー、共重合体、修飾済カチオンポリマーを使用してもよい。実施形態では、分子量が、少なくとも、約２５ｋＤのカチオン性ポリマーを使っている。実施形態では、脱アシルＰＥＩも使用されている。市販されているＰＥＩから残留Ｎ−アシル部分を取り除くことができ、このＰＥＩは、合成が可能であり、例えば、ポリ（ｓ−エチルー２−オキサゾリン）を、酸触媒下の加水分解により合成することにより純粋なポリマーを産生できる。
【００３９】
さらに、デリバリー運搬体の構成は、ある特定の細胞への標的送達能を増加させるものであり、標的細胞に付着する能力を増加させるものであれば、リガンド構成でもよいし、分子構成でもよい。つまり、病変部位への侵入の可能性を増加させ、侵入の前に標的細胞から離れてしまう可能性を減らすものであればよい。
【００４０】
ｓｉＲＮＡの接合体について以下に述べるが、これは、どの型のヌクレオチドベースの治療薬に適用できるものである（限定されず、オプションである。）
バイオ接合体について
熱力学的ヌクレアーゼ安定性を増加させる場合、ｓｉＲＮＡの生体内分布と薬物動態を改善する場合、特異的部位に薬剤をターゲット到達させる場合には、脂質とポリマーの接合した、１個以上のｓｉＲＮＡ鎖の接合体が望ましい。
【００４１】
脂質接合体について
脂質との接合体は、受容体介在のエンドサイトーシスにより、または、
接合による負電荷ＲＮＡの膜浸透性における増加のために、ｓｉＲＮＡの細胞内取り込みを強化させる。核酸にコレステロールが接合された場合、薬剤投与後の細胞培養液での取り込みと肝臓内での沈着を増加させることが知られている。
【００４２】
ペプチド接合について
タンパク質トランスダクションドメイン（ＰＴD)は、ｓｉＲＮＡデリバリーの従来方法に代わるものである。このＰＤＳは、短鎖アミノ酸配列であり、サイトプラズマへの効果的な取り込みを促進させるような方法でプラズマ膜との相互作用が可能となるものである。
【００４３】
接合体の例は以下の通りである（これらに限定されない）。コレステロール、パルテート接合体、αートコフェロル（ビタミンーＥ）接合体、コール酸、ヘキシルーＳ−トリチルチオールのようなチオエーテル、チオコレステロール、デカンジオール残基、または、ウラシル残基のような脂肪族酸、ジーヘキサデシルーラックーグリセロールまたはトリエチルアンモニア１，２−ジーＯ−ヘキサデシルーラックーグリセロー３−Ｈ−ホスフォネートのようなリン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミン、ヘキシルアミンーカルボニルーオキシコレステロール部分、ＵＳ特許番号６，３０３、３７４（全体を参照として本願に取り込む）で開示されたＭＥＡダイナミックポリ接合体粒子および多成分ポリマー接合体。多成分ポリマーは、オプションとして、上記のヌクレオチドベースの治療薬が、たとえば、電荷遮蔽用（例えば、ＰＥＧ)、または、ターゲティング用の別の１つ以上のポリマーとのジスフィルド結合のような共有結合をする膜活性ポリマーであっても構わない。これらの後者のポリマーは、不安定結合をしていて細胞内に入るべく切断された場合には、すぐに離れる接合が好ましい。ＭＥＡダイナミックポリ接合体粒子は、同じ、または、類似の材料で構成されるが、粒子の形状を有している。
【００４４】
５．オーバハング、および、末端への修飾について
一次構造のｓｉＲＮＡを、オプションとして、３’オーバハンドでの複数のヌクレオチドとして構成してもよい。オーバハング修飾体には、オプションとして、３’オーバハング、または、３’−エキソヌクレアーゼに耐性のある平滑末端二本鎖に使用されるデオキシユニットで構成してもよい。オプションとして、末端鎖をアンチセンス鎖の５’末端の化学リン酸化により、あるいは、センス鎖の５’位でのリン酸化により、修飾しても構わない。さらに、オプションとして、種々の基を、ｓｉＲＮＡ二本鎖末端、特に、センス鎖末端に接合してもよい。これらの基の例としては、逆方向エンドキャップがある。３’末端鎖の５−８ｄＡユニット、および、ｄＴユニットは、粘性末端を通して、逆のコンカテマー化につながり、従って、例えば、ＰＥＩを使って、二本鎖の効果的なデリバリーが可能となる。フルオロセインは、オプションとして、アンチセンス鎖の３’末端を除いては、どの末端部に接合してもよい。
【００４５】
６．二本鎖構造への修飾について
ｓｉＲＮＡを２本鎖だけで構成するのでなくて、三本鎖（二本のセンス鎖を有する無変性のアンチセンス鎖）で構成してもよい。三本鎖を使うことでオフターゲットを減らし、薬剤効果を増加させることができる。この結果により産生される二本鎖は、「微細内部セグメント干渉ＲＮＡ（ｓｉｓｉＲＮＡ)」と呼ばれている。機能ｓｉＲＮＡは、種々の作成方法があるが、ここでは、単鎖での作成が可能である。単鎖から作成されるヘアピン型の二本鎖を、細胞内に、外因性物質として導入させて、発現させることができる。ヘアピン鎖の他端を閉鎖すると、結果として、ＲＮＡは、ダンベル形状、または、ナノサークル形状になり、ＲＮＡｉ活性をそのまま保持したまま、同時にエキソヌクレアーゼから完全に保護された状態となる。単鎖のアンチセンスＲＮＡ（二本鎖に折りたたみがなされることは全くない）は、二本鎖のｓｉＲＮＡのパスウエイに近づく可能性がある場合があるとともに、ＲＮＡｉパスウエイに入ることが知られている。ｓｉＲＮＡ二本鎖の長さは変更できる。大抵の合成二本鎖の長さは、１９−２１ｂｐであり、ダイサー酵素の天然産生物を模倣している。しかし、ｓｉＲＮＡ二本鎖の長さを長くすると、ダイサーの基質が、その機能を増加させることが知られている。インタフェロン応答を誘発させないために、ｓｉＲＮＡの長さは３０ｎｔであることが好ましい（オプション）。
【００４６】
ＩＩ．設計
少なくとも、いくつかの本発明の実施形態によれば、埋め込み可能で挿入可能なドラッグデリバリーシステムが提供される。このシステムは腹腔のような穴部に適用可能で、それがつなぎとめられたり接着されることのないように適用され、生体安定性、生分解性、生体吸収性のあるポリマーから成る。オプションとして、マトリックスであってもよい。ここで、「挿入」という用語は、「埋め込み」という用語の意味も含む。上記ドラッグデリバリーシステムは、「ローダ」の形で埋め込みがなされることが好ましい。
【００４７】
好ましくは、運搬体となる、単一もしくは複数のポリマーそのものは生分解性であり、その中に単一または複数の薬剤が封入されていて、その薬剤を制御された速度で部位に放出することができるようになっている（オプション）。例えば、マトリックスのようなポリマー物質の全体量が、部位に到達すべき薬剤の治療レベルの最大量以下で放出されるようになっている。例えば、この薬剤と運搬体の容量は、０．１ｍｍ３乃至１０００ｍｍ３の範囲内であることが好ましいが、これに限定されるものではない。「ローダ」の大きさは、標的となるもの、例えば、膝関節、子宮内リング、子宮頚リングの大きさなどに適合して機能するように決定する（オプション）。
【００４８】
いくつかの実施形態に示されているように、このドラッグデリバリーシステム（組成物を放出させるために）は、以下のように設計される。つまり、この運搬体は、好ましくは、生分解性のポリマーであり、体内での主要な放出メカニズムは薬剤のバルク浸食作用である。このポリマーは、生分解性でゆっくりと体内で分解するポリマーが使用される。別の実施形態では、その主要な放出メカニズムは薬剤の拡散作用であり、デリバリーシステムの外側部分が膜として、内側の部分が薬剤の貯蔵部として機能し、長期にわたり（１週間から数カ月間）、これを囲んでいる周囲の物質には影響されないようになっている。この運搬体は、オプションとして、異なるポリマーを組み合わせたものでよいし、別の放出メカニズムにおいて薬剤を放出させる仕組みのものでもよい。表面の濃度勾配は、薬剤が放出されている重要な期間には、薬剤の効果が出るようにコンスタンな濃度に保たれており、さらに、拡散速度も薬剤が有効であるように、コンスタントになるようになっている（この状態を「ゼロモード拡散状態」と呼んでいる）。ここで、「コンスタント」という意味は、薬剤の拡散速度が、治療的有効性の閾値の下の値より上になる状態に保たれていることが好ましいということであり、ただ、オプションとして、最初に薬剤が一度に大量放出されるようにしたり、その薬剤の量を変動させるようにしてもよい。この拡散速度は、薬剤効果が長期間有効であるようなレベルに保つことが好ましく、治療効果を最大にする期間をコンスタントのレベルとし、例えば、効果的サイレンシング期間を通して拡散があるようにする。このドラッグデリバリーシステムは、薬剤の化学的分解や酵素からの分解の攻撃を受けたり、その他の体内要因により、ヌクレオチドベースの治療薬そのものが分解しないような設計することが好ましい。このドラッグデリバリーシステムでは、オプションとして、このシステムの埋め込みの後に、薬剤の感受性促進や活性化、作用促進、作用遅延などの効果を得るために、非浸襲であるか最小浸襲であるかを問わず、例えば、加熱、冷却、レーザビーム、焦点超音波、電波周波数などを使った手段を採用してもかまわない。
【００４９】
上記で述べたように、このシステムの構成組成物はポリマーであり、オプションとして、マトリックのような質体を使用してもよい。さらに、このシステムの組成は、オプションとして、薬剤をカプセル化して詰め込むことのできる型の微小ポリマーファイバであってよい。通常は、このファイバの直径は、ミクロまたはナノのレベルであり、１０ｎｍ乃至１０，０００ｎｍである。参考文献（７−１０）（これらの内容はすべて参照として本願に取り込む）に記載の電子スピニング法により製造するのが望ましい。
【００５０】
薬剤の濃度は、長期放出に必要な期間を通して、治療薬効果が得られるレベルであることが望ましく、濃度については、オプションである。有効な放出期間はオプションであり、１週間から４カ月であるが、別の実施形態では、数日という短い期間として設計されているものもあり、さらに、別の実施形態では、４カ月以上の長期に亘って有効であるように設計されている。
【００５１】
マトリックスのようなポリマー基体を、ポリマーフィルム、ポリマー鋳造で得たもの、ポリマーファイバ束、高温に耐える形状のもの、ポリマー成型物などで構成するようにする。ポリマーと薬剤が、別々または一緒に溶解するようにするが、薬剤を凍結乾燥、攪拌、混合するときは、薬剤を組み合わせてもよい。二重層ファイバ内では２つの相が同時に組み合わされる状態でもよい。これらの全製造プロセスが室温で実施されることが好ましいが、若干室温より高い温度でもかまわない。但し、６５℃以下であることが望ましく、薬剤が耐えられる場合であれば、どの温度でも構わない。
【００５２】
別の実施形態では、ポリマー基体はファイバ基体から成り、このファイバは、直径が１０乃至１０００ナノメートルのファイバを作成できるファイバ成形法、ファイバ電子スピニング法、溶融スピニング法、乾式スピニング法、湿式スピニング法を用いる。オプションとして、基体をマトリックスで形成してもよい。
【００５３】
別の実施形態によれば、ポリマー基体は多層型に設計しても構わない、例えば、バレル型（外部コート型）でもよい、これは、内部本体が、極めて高い高分子のポリマーで構成され、薬剤負荷率が〜２：１である。この負荷率の例として、ポリマーではＰＬＧＡ５０：５０である。外部薄層が純粋のＰＬＡから成る。
【００５４】
別の実施形態では、このポリマー基体をポリマーで構成していないものもあり、ポリマーの代わりに、金属を使ったもの、例えば、浸透膜ポンプデバイス（例えば、Ｖｉｄｕｒ）を使用しているものもある。
【００５５】
デリバリー運搬体とヌクレチドベース薬剤の両方を、オプションとして、サイズが約〜５０乃至１５０ｎｍの微小ナノ粒子に凝縮してもよい。こうすることで、上記薬剤の細胞へのエンドサイトーシス過程での取り込み効果が増える。運搬体をリポゾームやミセルで構成してもよい（これに限らない）。ナノ粒子の材料としては、上記の運搬体材料に加えて、あるいは、その代替として、シクロデキストリンまたはトランスフェリンーシクロデキストリンがある。運搬体を、上記材料により、多数のナノ粒子として構成する。
【００５６】
ＩＩＩ．ドラッグデリバリーシステム、特に、「ローダ」とその製造法について
３．１  材料
上記で述べたように、上記「ローダ」は１つ以上のポリマーから成り、好ましくは、持続的な放出が可能な材料である。オプションとして選択できるポリマーとして以下のものからなる群から選択してもよい。つまり、グリコライド、グリコール酸、ラクチド、ダイオキシン、カプロラクトン、トリメチルカーボネート、エチレングリコール、エチレンオキシドアミン、アルキルシアノアクリレート、３−ヒドロキブタン酸、オルガノフォスファゼン、Ｌ−グルタミン酸、エチレンアミン、プロピルイミン、リシンから成るモノマーなどがある。
【００５７】
このポリマーとして、以下のようなものがある（オプション）。直線状脂肪酸ポリエステルのような生体安定性、生分解性、生体吸収性のポリマー（直線状脂肪酸ポリエステルには、スターチやセルロースのような天然ポリマー多糖類を含む。）、デンプンやウールを含むタンパク質、ポリエステル（ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ））、リグニン、セラック、天然ゴムのようなポリエステル、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ)、および、それらの共重合体を含む合成生分解性ポリマー（この共重合体としては、ポリ（グリコリド−コー−ラクチド）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクタン（ＰＣＬ)，ポリ（アンヒドライドーコーイミド）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＯＨ、ＰＶＡ，ＰＶＡＬ）がある）、エステル、ポリアミドエステル、ポリアンヒドライドエステル、ポリアクキレンエステル、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（３−ヒドロオキシブタン酸）、ポリ（オルガノフォスファゼン）、ポリ（エチレングルコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アミドアミン）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリエチレン（ＰＥ），ポリエチレンイミン（ＰＥＩ),ポリ（プロピレンイミン）、これらの基、アルギニン、ポリサッカライド、これらの混合物、共重合体、誘導体がある。
【００５８】
別の実施形態では、上記ポリマーは、次のポリマーから成る群から選択される。つまり、フィブリン、コラーゲン、キトサン、デンプン、ヒアロロナン、ポリビニルアセテート（ＰＶＡまたはＰＶＡｃ）、シリコン、ＰＥＧ（ＰＥＯ),ポリオルソエステル、ポリ（ダイオキシン）、ポリ（アンヒドライド）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリファサゼン、および、これらの混合物または共重合体がある。
【００５９】
さらに、別の実施形態では、ステンレス、コバルトクロニウム金属、ニッケルチタニウム、マグネシウム金属、または、それらの合金または組成物からなる群から選択される生体適合性金属から成るデバイスに収容して送達されることになる。
【００６０】
３．２  製造
実施形態に示したように、溶解または凍結乾燥の状態の薬剤を、溶媒に溶かしたポリマーに混合させ、攪拌し、その後、乾燥させポリマー膜を形成（鋳造ポリマー）させるが、ここでの全体プロセスは室温で実行する。このプロセスは、実施例１．１と１．２に記載されている通りである。
【００６１】
別の実施形態によれば、上記の薬剤をポリマーと単一のファイバに閉じ込める。単一のファイバは電子スピニング法で作成する。さらに、別の実施形態では、この電子スピンイングファイバは、中空のファイバ（これは、特許申請文献１１で記載されていると同じ同軸ファイバ）で構成され、２本（２構成）のシリンジ電子スピニング法に従って、電子スピニングのプロセス中に、このファイバ内に薬剤を閉じ込めることが望ましい。
【００６２】
上記ファイバの別の製造法としては、溶融スピニング法（大きい直径である１０ｕｍ乃至５０ｕｍファイバ用の方法）と、溶融ブローイング(小さい直径である１乃至２０ｕｍファイバ用の方法である）がある（これに限定されない）。別の実施形態では、ポリマースポンジとファイバマットが示されている。放出期間が長く、しかも、コンスタントな放出を可能にする制御システムの製造法であれば、本発明のシステム用として、オプションとして採用してもよい。
【００６３】
他の実施例では、ここで使用するポリマーとして、シリコンおよびＰＶＡを含む生体適合性（通常は、同時に生体安定性がある）のあるエラストマーの群から選択したポリマーでもよいとする。この種のポリマーは、子宮内器具をサポートするデリバリーポリマーとして、例えば、感染症を予防する効果のある、抗ＨＩＶｓｉＲＮＡ薬剤（ホルモンなどが入っているかどうかを問わず）として作用するｓｉＲＮＡ制御放出用のものとして使用できる。通常、ポリマーとｓｉＲＮＡの混合デバイスの調整は、室温で行うが、その場合、例えば、室温加硫（ＲＴＶ）法を使用する。通常、ポリジメチルシクロキサン（ＲＴＶシリコン材料）を、凍結乾燥したｓｉＲＮＡと混合し、その混合液を、例えば、ポリプロピレンのモールド（型）に入れて、室温にて２４時間加硫する。
【００６４】
室温加硫（ＲＴV)シリコン材料には、加硫材料の材質強化のためにミネラルと組み合わせた反応性オイルベースのポリマーがある。２つの型の室温加硫シリコンがあり、１つは、単一成分のＲＴＶ−１システムであり、もう１つは、２成分のＲＴＶ-2システムである。
【００６５】
ＲＴＶ−１は、大気中の湿度のためにそれ自身で硬化するので、硬化を促すための別の物質を加える必要はない。この硬化は、表面部から開始され、中心部に向かって、硬化反応が進むことになる。これは、密閉したカートリッジに収容してもよいし、液体のままでもよく、ペースト状でもよい。
【００６６】
このＲＴＶ−２材料は、室温で硬化する２つの成分から成り、混合と同時に硬化が始まり、硬化の結果、固体状のエラストマーまたはゲルまたは柔軟な状態の泡に変化する。
【００６７】
オプションとして、マトリックスのような薬剤ポリマー基体を、薬剤の成分ではない追加のデバイス、金属骨補填剤、追加のポリマー骨補填剤、Ｘ線、超音波、造影などの可視性を強化する材料、ＩＵＤ，ＩＶＲ，ステントのようなデバイスに添付してもよい。
【００６８】
ＩＶ．標的、デリバリーシステムの使用法、その挿入方法
４．１  標的および使用法
本発明のいくつかの実施形態によれば、局所デリバリーの標的部位として、細胞の異常増殖、腫瘍のようなアプトーシス、活性で慢性な炎症、感染症、自己免疫疾患、筋肉や神経組織の変性疾患、慢性疼痛、骨折、その他の組織再生部位の負傷、損傷心臓、損傷筋肉、損傷黄紋筋が含まれる。局所デリバリーの標的部位として、妊娠に関連した疾患を予防をするような部位、感染症、加齢関連疾患を予防する部位も含まれる（オプション）。組成物のインプラントを行うターゲット部位としては、半径、容量などにおいて十分に小さい箇所であることが望ましい。例えば、標的部位の直径は、約０．１ｍｍ乃至５ｃｍの範囲である。
【００６９】
標的部位は、最大の治療効果が得られる部位を選択するのが望ましい。このドラッグデリバリーシステムの組成物が、オプションとして、腫瘍内および腫瘍の近くの部位や血液の供給される部位にインプラント（埋め込み）されることが好ましい。
【００７０】
組成物を（オプションとしてデバイスを使って）、例えば、膵臓、前立腺、乳房、肝臓、乳首、血管内などの臓器内あるいは臓器の近くにインプラントする。
【００７１】
標的として、以下の群に含まれる部位がある（但し、これらに限定されない。オプションとして、「ローダ」を埋め込むのに適していれば体内のどの部位でもよい）。
１．パーキンソン病やアルツハイマー病などによる大脳基底核、白質/灰白質などの脳内の変性部位。
２．筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などによる脊椎。
３．ＨＩＶ感染を予防する子宮頚部。
４．活動性および慢性炎症性関節。
５．乾癬疾患などによる皮膚。
６．鎮痛作用などによる交感神経および感覚神経。
７．インプラント対象の骨部。
８．急性および慢性の感染部位。
９．子宮内部。
１０．内耳、聴覚系、内耳膜迷路、内耳前庭。
１１．気管内部。
１２．心臓内部、冠状部位、心外膜。
１３．膀胱。
１４．胆道系部位。
１５．腎臓、肝臓、脾臓（これらに限定されない）を含む実質組織。
１６．リンパ節。
１７．唾液腺。
１８．歯ガム。
１９．関節内部。
２０．眼球内部。
２１．脳組織。
２２．脳室。
２３．腹腔を含む窩腔（卵巣癌を含む、これに限らない）
２４．食道内部。
２５．直腸内部。
【００７２】
オプションとして、システム（例えば、組成物を含むデバイス）の挿入が疾患部位でのＥＣＭ（細胞外マトリックス）と関連しており局所部のｐＨ、温度などの、標的部位のＥＣＭ（細胞外マトリックス）内での薬剤の拡散や薬物動態に影響する生化学的要因に作用する近くの部位において挿入されることになる。
【００７３】
さらに、いくつかの実施形態に示されているように、ここでの上記薬剤の放出では、オプションとして、このシステムの埋め込みの前または後に、薬剤の感受性促進や活性化、作用促進、作用遅延などの効果を得るために、非浸襲であるか最小浸襲であるかを問わず、例えば、加熱、冷却、レーザビーム、焦点超音波、電波周波数、化学活性剤などを併用してもよい。
【００７４】
別の実施例によれば、上記薬剤は、乳房、膵臓、脳、腎臓、膀胱、肺、前立腺の癌治療に有効な遺伝子サイレンシング作用のある生化学的ＲＮＡｉで構成されていることが好ましい。ｓｉＲＮＡ以外の多くの薬剤も、「ローダ」にカプセル封止して使用可能であり、マトリックスのような「ローダ」にカプセル封止できるかぎり、本発明と同様な使い方ができる。本発明以外の別の方法で、今日において認可されている薬剤も、本発明のデリバリーシステムで使える。例えば、真菌感染でのアンホテリシンＢ、骨髄炎での抗体、麻薬による痛みのための鎮痛剤、アルツハイマー病やパーキンソン病のような変性疾患薬をローダに入れて投与してもよく、背部痛であれば、脊椎の近くに、鎮痛薬を本発明の「ロード」に入れて、埋め込むことが可能もある。
【００７５】
例えば、平滑筋細胞（ステント手術で負傷した場合に起こり、結果として、これは拡散する傾向がある）の異常増殖を抑制する薬剤として、オプションで、平滑筋細胞に遺伝子サイレンシング作用を与えるＨ１９サイレンシングＲＮＡのようなｓｉＲＮＡ薬剤も、あるいは、その他の薬剤、例えば、タキソール、ラパマイシン、ラパマイシン類似薬を含む群から選択された薬剤も、本発明の投与の方法での使用が可能な薬剤である。本発明の特別な使用法として、本発明のデリバリーシステムと一緒に、コンスタントな量の薬剤を長期にわたって放出する「薬剤エルートシステム（溶出ステント）（ＤＥＳ）」を専用ステントデバイスとして個別に埋め込みをする方法もある。
【００７６】
本発明の特別な使用法として、異常な遺伝子の発現が原因となる神経筋肉変性疾患の例がある。サイレンシングＲＮＡの局所デリバリーには、異常遺伝子発現を抑える治療効果がある。抗アポトーシス剤、抗炎症剤、抗変性疾患剤などの微細薬剤、高分子薬剤の局所デリバリーでも治療効果がある。このデリバリーに「ローダ」を使うことで、専用デバイスで個別に埋め込みが可能となり、コンスタントな量で、長期にわたる薬剤投与が実現できる。
【００７７】
このデリバリーデバイスを使った治療法として、精神疾患および認知機能障害の薬剤として遺伝子修飾剤を使用することで治療が可能である。サイレンシングＲＮＡにより遺伝子ノックダウンを起こすことで治療が可能である。ヌクレオチドベースの薬剤を「ローダ」を使って投与することで、精神障害、認知機能障害、躁うつ病、行動障害の治療が可能である（これらに限定されない）。「ローダ」を埋め込むことで、脳内の部位に、微細薬剤でもマクロ分子薬剤でも投与が可能である。
【００７８】
さらに、このデリバリーデバイスを使った治療法として、天然型または適用型の免疫剤を、このデリバリーデバイスにより局所に投与することで、臓器移植拒絶反応も予防できる。サイレンシングＲＮＡや免疫調節剤を「ローダ」に入れて移植臓器部位に埋め込むことで、移植臓器に対して作用するＣＤ８のような免疫細胞の働きを抑えて局所免疫抑制を実現する。
【００７９】
さらに、このデリバリー用デバイスを使った治療法に関して、血管新生には、ＶＥＧＦやアンジオジェニンなどの血管成長因子が不可欠であるが、それらの成長因子、ペプチド剤、ペプチドミメティックス、これらのリプレッサ阻害剤を局所的に投与することで有意な治療効果が得られ、「ローダ」に、これらの成長因子、ペプチド剤、ペプチドミメティックス、これらのリプレッサ阻害薬を入れて、部位に投与することで、末梢心臓血管疾患、全身血管疾患を治療する効果がある。
【００８０】
挿入方法
インプラント（埋め込み）のような挿入方法は、別のタイプの組織インプラントや組織サンプリングにおいて、すでに使用されている（この場合、オプションとして、改良せずにそのまま使ってもよい。あるいは、これらを補助のインプラントとして、オプションで使用してもよい）。そのような方法が採用されているものとして、接近照射療法、生検、ＥＲＣＰのような超音波内視鏡、無超音波内視鏡、脳組織ステレオタクティック法、腹腔鏡、腹腔鏡下関節インプラント、腹腔鏡下腹部臓器インプラント、腹腔鏡下膀胱壁インプラント、腹腔鏡下体腔インプラントがある（これらに限定されない）。
【００８１】
ドラッグデリバリーシステムの寸法は、オプションとして、接近照射療法などに合わせて自由に設計されるが、長さが５ｍｍ、直径が１．１ｍｍの円筒体である。
【００８２】
「ローダ」（デバイスと組成物を含む）を挿入するための挿入（インプラント）装置は、インプランントの生検針に合わせて設計されるが、１例として、約１７乃至１９ゲージである。
【００８３】
いくつかの実施形態によれば、薬剤組成物をステント、グラフト、金属デバイス、ポリマーデバイスに付着ささせて部位に送るが、これらは、すべて管状に設計されており、哺乳動物体内の管状器官のようなものであり、例えば、動脈、血管、胃腸、呼吸器官がある。薬剤組成物は、このステントを使って埋め込まれる（オプション）。ステントには、バルーンステントや自己拡大型ステントなどがある。
【００８４】
組成物を収容しているデバイスは、その周りを抗炎症剤、ＣＯＸ−２抑止剤やＴ細胞免疫抑制剤や低分子へパリンのような抗血液凝固剤で覆われている状態でもよい（オプション）。
【００８５】
下記には、本発明のドラッグデリバリーシステムが特定の疾患の治療に使用される場合を中心に説明するが、これに限定されるものではない。本発明のデバイスで治療可能な癌の種類やその他の疾病について下記に記載する（これらに限定されない）。
【００８６】
乳房癌
この癌は、通常、その発症部位は、〜１０ｍｍ乃至５０ｍｍに集中しているので、局所治療に適応である。２００８年における米国の乳房癌の新規発症例は、女性が１８２，４６０例、男性が１、９９０例、死亡は、女性が４０，４８０例、男性が４５０例である。最も多い乳房癌の組織型は浸潤性または浸襲性管状癌であり、全体の７０％から８０％を占めている。ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２型）に陽性の腫瘍が乳房癌患者の２０％から２５％を占めている。トラスチズマブ（ハープチン）とラプチニブ（タイガー）の２つの抗癌剤が、ＨＥＲ２陽性乳房癌の治療薬としてＦＤＡ認可を受けている。
【００８７】
非浸潤性乳管癌（ＤＣＩS)は、非浸襲性の癌である。米国において、浸襲性または非浸襲性乳房腫瘍と新しく診断された患者の約１８％がＤＣＩＳであり、この％値は増えている。触知可能なＤＣＩＳ患者は極めて稀であり、８０％がマンモグラフィで発見されている。ＤＣＩＳ患者の治療オプションは以下のとおりである（１２）。
１．乳房保存外科手術と放射線治療、トマキシフェンを使用または不使用。
２．全乳法切除術。トマキシフェンを使用または不使用。
３．乳房保存外科手術、放射線療法を使用または不使用。
乳房癌のスクリーニング、診断、ステージングには、血清ＣＡ１５−３、ＣＡ２７．２９を推奨できるほどの十分なデータは今のところない。
【００８８】
膵臓癌
膵臓癌は、悪質な腫瘍であり、通常の場合、進行した段階で見つかる。米国における膵臓癌の２００８年における新規患者は、３７，６８０例であり、死亡は３４，２９０例である。膵臓癌は、米国では、ここ数十年で顕著に増加しており、癌死亡での４番目の原因となっている。膵臓癌の死亡率が高いけれども、その原因はほとんど解明されていない。外因分泌膵臓の癌は、まれにしか治癒しない癌で、全体生存率（ＯＳ）は、４％以下である。その癌が真に膵臓部位に発症している場合には、治癒率は高い。しかし、この高い治癒率の癌の割合は、２０％以下である。膵臓に癌があり、その大きさが２ｃｍ以下で、リンパ腺には転移しておらず、しかも、膵臓皮膜を越えて癌の拡大がない場合でも、完全外科切除手術後の５年生存率は１８％乃至２４％である。スパイラルコンピュタ断層スキャン（ＣＴスキャン）、磁気共鳴画像スキャン（ＭＲＩスキャン）、ポジトロン断層スキャン（ＰＥＴスキャン）、内視鏡超音波スキャン（ＥＵＳスキャン）、腹腔鏡ステージング画像スキャンにおける技術の進展により、診断が容易になり、切除をしないで、治癒不可能な疾患をもつ患者の同定が容易となっている。膵臓には腫瘍特異性マーカがなく、血清ＣＡ１９−９のようなマーカでも癌の同定能は低い。大抵の患者は、血清ＣＡ１９−９値が高い場合に、膵臓癌と診断される。根治療法に続いて、あるいは、根治療法中に、ＣＡ１９−９レベルが上昇して、その患者の腫瘍が進行性であることが判明する。ＣＡ１９−９レベルが正常であっても、再発を阻止するものではない。完全な外科摘出手術だけが唯一の膵臓癌の完治の可能性を提供する。診断の際に、すでに進行した癌、転移した癌があるとされた患者は、手術後に再発するかも知れない。全身化学療法だけが唯一の緩和療法である。ゲムシタビン投与療法が、局所的に進行した転移膵臓癌で、切除不能の例での受け入れ可能な療法であるが、平均生存期間はわずか６カ月である。
【００８９】
膵臓癌は、二番目に多い胃腸悪性腫瘍であり、予後が不良である。最近の標準的な治療は切除術であるが、可能であれば、全身化学療法を併用する。ＥＵＳスキャンが、膵臓腺癌の標準的な診断とステージングの方法である。微細針挿入によるインターベンショナルＥＳＵが、膵臓癌の治療方法として急速に広く行われ始めている。
【００９０】
膵臓癌に「ローダ」を使用するメリットは沢山あるが、腫瘍の大きさや微小環境物に合わせて「ローダ」を使えること、長期にわたり特異的な薬剤あるいは組み合わせ薬剤を投与できることである（これに限定されない）。
【００９１】
前立腺癌の背景
全米における２００８年の新規前立腺癌は１８６、３２０例であり、死亡は２８，６６０例である。１９８０代の早い時期から、局所前立腺癌の治療法は主に３つある。つまり、１．根治的前立腺切除術、２．根治的放射線療法、３．経過観察。プレＰＳＡ（前立腺特異抗原）スクリーニングでの（臨床ステージＴ１ｂ,Ｔ１ｃ，Ｔ２）早期ステージ症状のヒトにおいて、根治的前立腺切除群と経過観察群を比較したランダム化試験では、１０年全生存率（ＯＳ)において、統計的に有意な差異を示した。１０年後において、全生存率（ＯＳ)の差異は、約７３％対６８％であった。絶対差異は５．０％、相対死亡リスクは０．７４（９５％信頼区間、０．５６−０．９９）。このことのメリットは、手術時の６５歳以下の男性に限定される（年齢の治療効果への影響の計画されたサブセット分析においてＰ＝０．０１）。米国内では、ＰＩＶＯＴ試験（前立腺介入対観察試験）の結果、つまり、根治的前立腺切除群を経過観察群と比較したランダム化試験の結果は、まだ報告されていない。このＰＩＶＯＴでは、主要エンドポイント（評価項目）として、全生存率を使用する(１３、１４）。
【００９２】
前立腺近接照射療法
近接照射療法は、最小浸襲治療手法であり、小さい永久型放射線シード（多くの場合、５ｍｍ  ｘ１．１ｍｍ）を前立腺に埋め込み、埋め込まれたシードが腺内の癌を照射する（１５）。ここで埋め込まれるシードは、患者が異物を感じることのない程の小さいものである。使用する環境に応じて、放射性ヨード（Ｉ−１２５）または放射性パラジウム（Ｐｄ−１０３)を使う。近接照射療法は、組織内放射線治療法、または、シードインプラント療法とも呼ばれる。上記シードを埋め込む前に、患者には麻酔をする。その後、シードを入れてある針を会陰（陰嚢と肛門の間）の皮膚を通して超音波ガイド下で挿入する。上記シードは前立腺内に入り、そこで、放射線物質が前立腺癌が破壊されるまで数か月において放射線を照射することになる。同様に、オプションとして、ローダを近接照射療法と同様な手順で癌部位に埋め込んでもよい。ローダの外形は、円筒であり、長さが５ｍｍ、直径が１．１ｍｍである。
【００９３】
ＨＩＶの伝染と予防
ＡＩＤＳ流行が始まって以来２５年に亘って、コンドームが依然としてＨＩＶの性交感染を予防する主要な方法であり、この方法は、貧弱な方法であるが根強く使用されている。膣内殺菌薬が潜在的に女性に広く受け入れられる可能性を秘めているが、いままでのところ、大規模なＨＩＶ予防の臨床試験では失望する結果となっている。ノンオキシノール９、硫酸セルロース、Savvy（膣ゲル剤）は、ＨＩＶ伝染をかえって増加させてしまったし、Carraguard（ゲル剤）やBufferGel（ゲル剤）には効果がなかった。唯一、PRO 2000だけがＨＩＶ伝染の減少につながる傾向を示した。これらのゲル剤（殺精子薬などを含む）は、性交の前に一時的に使用するものであるが、経口避妊薬に比べて効果は低い。殺精子剤のような遺伝子組み換えタンパク質は、どれも臨床的な試験は実施されていない。包茎手術がＨＩＶ伝染を減らすという証拠があり、このために、大規模な外科手術を行っている国もある。
【００９４】
臨床が進められている殺菌剤はＨＩＶ予防だけのものであるが、３憶４千万人が４つで代表される性感染症（ＳＴI）に罹患し、数知れない者が慢性ウイルス感染、細菌感染にかかっている。しかし、非ＨＩＶ性のＳＴＩであっても、それがやがてＨＩＶ伝染の要因である。
【００９５】
インプラントデバイスの設計と婦人科への適用
いくつかの実施形態に示されているように、上記「ローダ」は数ミリ直径の小さなインプラントであり、形状も球状、チューブ状、リング状、薄いファイバ状、平坦なパッチ状などに限定されない。上記「ローダ」は、マトリックスのようなポリマー基体から成り、そのなかには、薬剤をカプセル封止で収容してあり、永久または半永久的に哺乳動物の組織内に埋め込んで、局所的に薬剤を放出し、標的とする疾患部位や細胞外マトリックスまたは疾患部位の近くの部位の組織に直接に薬剤を放出するように設計されている。
【００９６】
上記「ローダ」から薬剤が拡散される箇所の有効半径は、腫瘍の場合には、＜２ｃｍ乃至３ｃｍである。
【００９７】
別の実施例によれば、上記「ローダ」は、体内に挿入されるデバイスであり、ＩＵＤ、膣内リング、ステントなども含む。その「ローダ」から疾患部位に、制御された量で制御された期間において、薬剤を放出するようになっている。１つの実施形態によれば、この放出は、少なくとも４週間有効に持続するとしている。すべての適用において、どれくらいの薬剤を入れるか、どのくらいのペースで薬剤を放出するかは、それが適応となる疾患、薬剤タイプごとに、最大の効果が得られるようになっている。
【００９８】
実施例
この節では、本発明による多様な「ローダ」の調整や使用に関して、多数の図面説明や非限定例を示している。選択されたポリマーが生分解性の場合には、薬剤はバルク浸透（浸食）により、全体的または部分的に、放出される。拡散による放出も起こり、いくつかの実施形態では、拡散による放出が主流である。
【００９９】
その拡散は、「ローダ」の表面から、大抵の例では、ＥＣＭ（細胞外マトリックス）内に広がり、主に拡散による放出の場合には、この「ローダ」を調整して、その拡散速度が０．１−１０ｘ１０７ｃｍ２/ｓｅｃになるように調整する。上記「ローダ」の内部は、薬剤貯蔵部として機能し、１週間から数週間の長期に亘り周囲環境に影響されず、表面での濃度勾配が薬剤が有効になるようにコンスタントに維持され、その拡散速度がコンスタントに有効になる（このようにして、「ゼロモード」拡散が実際的に実現される）。
【０１００】
いくつかの実施形態によれば、上記「ローダ」は、マトリックスのようなポリマー基体をベースにしており、その中に薬剤をカプセル封止している。「ローダ」がマトリックスのようなポリマー基体で構成されている場合、薬剤放出の全期間、上記「ローダ」の寸法、標的の大きさ、ｐＨなどの周囲環境のパラメータなどの要求条件に適合するように設計がなされている。基体材料として、ポリマーが選択された場合、そのポリマーは、生体安定性、生分解性、生体吸収性、生体適合性があり、許可溶液の中での溶解性などの製造上の要件を満たしたものである。マトリックスのようなポリマー基体は、成形法やフィルム鋳造法などで制作する。「ローダ」はＰＣＬ（ポリカプロラクタン）のような単一ポロマーで構築するが、共重合体のような多様なポリマーを使ってもよい。
【０１０１】
高い可撓性を可能にすることのできる、１つの非限定の例としては、ＰＬＡとＰＧＡの異なった割合での共重合があり、これにより、生分解性ポリマーを産生することができる。この時の末端での割合が７５：２５（少なくとも２５：７５）より大きいと、少なくとも約１０週間以上の生分解性が得られ、一方、５０：５０では、通常、約８週間の安定性が確保できる。分子量が高い場合には、長期に亘って安定性を維持する。別の実施例は、トリブロック共重合体ＰＬＡ-ＰＣＬ−ＰＬＡである。ポリマーと薬剤を実施例１．１、１．２、２で述べた方法で混合する。「ローダ」や薬剤の製造と準備は、室温以上で実施することが好ましい（または、薬剤安定性と薬剤機能性を維持するのに必要な温度が望ましい）。
【０１０２】
いくつかの実施形態で示されているように、上記「ローダ」は、マトリックスのような薬剤ポリマーの基体ではない、金属骨格または追加ポリマー骨格などの骨格材を含み、これは、Ｘ線画像、超音波画像、画像などの可視光性を強化するためのものである。
【０１０３】
「ローダ」を、体調に合わせて、追加の薬剤や調整をしないで、ＥＣＭ内にインプラント（埋め込み）をすることが好ましい。別の実施形態では、局所的にｐＨを変化させたり、ＥＣＭ内での薬剤の拡散や、細胞取り込みを調整するために、このインプラントの実行中に、または、インプラントが完了した後、薬剤を「ローダ」の近くのＥＣＭに挿入する。
【０１０４】
実施例１
「ローダ」の作製
本節では、本発明の多様な実施形態に従って、「ローダ」作成のための２つの方法を例示的に示す（これに限定されない）。最初の例１．１では、本発明によるポリマーフィルムを有する「ローダ」の作成のための特定のプロトコルが示される。別の違った記載がないかぎり、本実施例に従って、インビトロ実験とインビボ実験で試験で得られた「ローダ」が準備される。実施例１．２は、ポリマーが鋳造法で生産された「ローダ」を作製するための別の方法を述べている。
【０１０５】
実施例１．１：ポリマーフィルムによる「ローダ」作成プロトコル
１．１０％マンニトールを透明溶液が得られるまで水に溶かした。
２．ｓｉＲＮＡを水溶液に溶かし、マンニトールに加えた。（次の実施例では、ｓｉＲＮＡは、以下の物質の１つ以上である）。
ーｓｉＧＦＰ、−緑色蛍光タンパク質に反応するｓｉＲＮＡ
ーｓｉＬＵＣ、−ルシフェラーゼに反応するｓｉＲＮＡ
ーｓｉＫ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓに反応するーｓｉＲＮＡ
ーｓｉーＫＲＡＳＧ１２Ｄ（ｓｉＫ−ＲasＴＲ）−突然変異Ｋ−Ｒａｓに反応するｓｉＲＮＡ）およびトランスフェクション薬剤（ＴＲ）との複合化で得たｓｉＲＮＡ（一般的には、カチオン性ポリマー）を攪拌することで、複合体が得られる。種々のカチオン性ポリマーが下記に記載されているが、特に別の記載がないかぎり、ここでは、ＰＥＩを使用した。実験において成功したトランスフェクション薬剤としては、リポフェクタミン２０００（インビトロのみ）、スペルミン、ジェットペル、Ｌ−α−セファリン、ＤＯＰＥがある。
３．ステージ１と２の産生物を攪拌して結合させた。
４．結果として産生された物質を液体窒素で凍結して２４時間凍結乾燥させた。
５．粒子サイズとゼータ電位を測定した（結果はここでは提供されていない）。
６．並行して、Ｘ％（この実施例では、１０％＜Ｘ＜３５％）ＰＬＧＡ（５０：５０、Ｍｗ：４０，０００−７５，０００）をクロロフォルムに溶かし、１時間攪拌した。
７．ＰＬＧＡ５０：５０溶液をｓｉＲＮＡ/ＴＲＭ/マンニトールに少しずつ注ぎ込み、均一になるまで攪拌した。
８．結果として得られた物質をテフロン（登録商標）で覆われたペトリ皿に注ぎ込んだ。  （Ｄ＝３０ｍｍ、２１ｍｍ、１５ｍｍ、ローダ番号、（Ｄ/ｄ）２ｄ＝ローダ直径）
９．当該物質をフード内で乾燥させて（１６８ｈ）フィルムを得た。
１０．フィルムを開いて「ローダ」を作成した。
【０１０６】
実施例１．２：ポリマー鋳造によるローダ作成
一般的な実施例では、上記「ローダ」は、主として、マトリックスのような鋳造基体で作製されるが、特定の「ローダ」の実施形態に従って、そのダイを設計することが好ましい。ＩＶＲのような、シリコンで作成したリングを有する非生分解性の「ローダ」の場合には、そのダイは、リング形状のものが好ましい。上記「ローダ」においては、薬剤拡散のための薬剤放出メカニズムとして、ポリマーの分解が重要であり、その中心となっている。共重合体やトリブロック共重合体とが組み合わされたポリマーから成る生分解ポリマーの選択では、表面分解か塊分解かなどの分解モードをベースにした適当な分子量も大切であり、特に、より安定な薬剤放出を達成するには、塊分解が望ましく、ポリマーの分解半減期は、要求される効果的治療期間より長いのが普通である。添付文献にも記載されているように、大容量のマトリックスで、その表面/体積比が「ローダ」よりも小さい場合には、通常、その半減期の測定を実施する。それゆえ、文献表示の分解時間が「ローダ」で要求されている数値よりも長いポリマーを選択することが好ましい。例えば、文献（１９）には、大きさが１０ｘ１０ｘ０．４ｍｍのトリブロック共重合体ＰＬＡ-ＰＣＬ−ＰＬＡフィルムでは、２０週間に亘り安定であり、その理由は、疎水性であるので、８週間連続で急速に分解するが、そのあとは、ゆっくり分解するからであるとする。この実施例では、上記のトリブロック共重合体は親水性の組成物であり、薬剤は、最初の段階で膨らみを起こすので、薬剤の放出を加速させる。達成された薬剤放出カーブは、急速（準急速）というよりは、より次第に早くなるという状態ものである。実施例１．１で述べたように、薬剤−ポリマー親水−疎水反応と膨張を軽減するために添加剤を追加してもよい（例えば、マニトール）。
【０１０７】
表面拡散とポリマー分解という点からＤＬ−ＰＬＧ７５/２５を選択する（これに限定されない）溶解パラメータは、半減期が４か月、薬剤放出期間が〜１０週間を選択した。ＤＬＰＬＧ７５/７２（エステル末端基、ＩＶ〜０．７ｄＬ/ｇ）(LakeShore Biomaterials 社 )１０ｇを、メチレンクロライドに、室温で完全に（〜６０＝１２０ｍｉｎ）溶解して、１０：９０ｗ/ｗ溶液を得た。そのあと、乾燥凍結したｓｉＲＮＡを１ｇ、連続攪拌（渦または弱い磁気により）しながら追加した。この作業は室温で約１１０分続け、均一溶液を得た。他の実施形態によれば、このｓｉＲＮＡを最初に水に溶かし縣濁液を得る。比率は１：１０で、これには、ＢＳＡを１：１０ｗ/ｗで加えてある。このｓｉＲＮＡ溶液をＤＬＰＬＧ溶液に加える。
【０１０８】
上記ｓｉＲＮＡ溶液は、円筒形（Ｄ＝１２ｃｍ、Ｈ＝４ｃｍ）のガラスダイ内に注ぎ（オプションとして渦動を含む）、溶媒蒸発させる。溶媒を、１００時間、室温で完全に乾燥するまで蒸発させ、その結果として産生される鋳造フィルムを真空チャンバに送り、さらに２０分、３０℃で蒸発させる（オプション）。このフィルムは、実施例１・１で作成されたフィルムより大きく、最初の大量の放出（「ローダ」の二重層デザイン）を避けるための薄いトップコートポリマーを噴霧するような追加プロセスを実行するのに適している。最終の鋳造は、専用の管状ダイやパンチで、または、専用のグリッド様のカッタで機械的に切断して作成する。その結果、長さ５ｍｍ、直径１．１ｍｍ、の筒状「ローダ」が完成し、近接照射療法で使用する放射線シードに匹敵するようなインプラント寸法となる。全体の重量は５．５ｍｇまでになるように最適化し、ｓｉＲＮＡ/ＤＬＰＬＧが０．５ｍｇ/５ｍｇ(この割合はオプションである）の比率になるように最適化する。
【０１０９】
実施例２
ファイバベースの「ローダ」の準備
遅い放出を実現するためのもうひとつの方法は、薬剤を非分解性ポリマーナノファイバ（または、半減期が４か月以上の分解性ポリマー）に閉じ込めることである。最初に同軸ナノファイバのマットから成るフィルムを、下記に述べるように、同軸電子スピニング法により作成する。実施例１で述べたように、フィルムを専用のダイまたはパンチで切断して「ローダ」を作成する。薬剤は、ポリマーの壁と上記ファイバ（通常Ｄ＞５０ｎｍ）の両方から拡散される。
【０１１０】
このマットは同軸ナノファイバから成り（２０）、電子スピニングで作成されてコレクタの上にランダムな方向で集められている。２つの同軸スピニングセットアップは、２つのニードル（内側と外側は、通常は、１８と２２ゲージ）上に固定され、そのニードルのサブ部分が直線的にコレクタの方向に移動するようになっている。この内側ニードルは、正確に同軸状に位置決めされ、シリンジを通してポンプに接続されている。外側ニードルは、周囲にある円錐のフィーダにつながっている。この実施例では、シェル層は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥT)から成る。このＰＥＴは、例えば、ｍ−クレゾール５％ｗ/wに溶解されて、その溶液は外側コーンから外部ニードルに流される。ＰＥＴの量は、５％乃至１０％の溶液を生成する量であれば、オプションであり、この溶液は、Sigma Aldrich社から入手可能である（Ｍｖ〜１８，０００、ＩＶ＝０．５９ｄＬ/ｇ、ｄ＝１．３７５ｇ/mL).上記溶液は、１：１０ｗ/w水溶液にｓｉＲＮＡを溶解させて得る。ｓｉＲＮＡ溶液は、内側のシリンジに注入され内側のニードルに注入され。このときのセットアップは、高い静電電位の下、コレクタを接地して高電圧ＤＣを内部シリンジに接続する。電圧、ニードル距離、溶液供給量を、特異的ポリマー、溶媒、粘度、導電率、薬剤投与量に適合するように微調整を行い、望み通りの直径のナノファイバを得るようにする。通常、溶液供給量は、０．１乃至０．４ｍＬ/h、溶液粘度に感受性を示す供給量、電圧は１乃至２ｋＶ/cm、ニードル距離が１０乃至３３cmであるが、これに限定されず、オプションである。例えば、供給量が、０．１５ｍＬ/h, 電圧が１６ｋＶ，距離が１４ｃｍであるが、これに限定されない。
【０１１１】
いくつかの実施態様によれば、上記「ローダ」は、薬剤を内部にカプセル封止してある微小ポリマーファイバを組み合わせて構成する。通常、このファイバの直径は、ミクロおよびナノのレベルであり、１０ｎｍ乃至１０，０００ｎｍであり、文献７−１０で記載されているような電子スピニング法で作成することが好ましい。実施態様では、薬剤をポリマーに詰め込み、単一のファイバは電子スピニング法で生産される。別の電子スピンイング法で作成されたファイバは、中空 (例えば、特許出願文献（１１）で記載されている同軸ファイバ）であり、薬剤は電子スピニング行程に、ツー（２つの構成物質）ニードル電子スピニング法（２０）により、薬剤が詰め込みが行われる。別の製造法として、溶融スピニング法（この場合は、通常、直径が大きく１０ｕｍ乃至５０ｕｍである）と溶融ブローイング法（この場合には、１ｕｍ乃至２０ｕｍ）がある。別の実施形態では、ポリマースポンジやファイバマットが使用されている。
【０１１２】
実施例３
ローダから溶出される薬剤
溶出される薬剤が、遺伝子サイレンシングｓｉＲＮＡであることが好ましく、これは、例えば、乳房、膵臓、前立腺部位での局所癌に投与される。別の適応は、抗ＨＩＶｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡ薬剤が変性なしで裸のままで投与できるので全身投与の場合の障壁がなくなる。この場合、カプセル化などの薬剤を保護する方法が開発され、例えば、上記「ローダ」のマトリックスのようなポリマー基体をカプセル化で保護することができる。薬剤の選択に際しては、ｓｉＲＮＡの細胞への取り込みとともに、その薬剤効果を最大限に引き出すようにする必要がある。上記ｓｉＲＮＡを薬剤として選択する際には、遺伝子配列、サイズ、構造、接合、化学修飾など、下記に記載したような点を考慮に入れる必要がある（しかし、これらに限定されないし、公開している。接合と化学修飾については、すでに述べたとおりである）。
【０１１３】
配列の決定
選択するｓｉＲＮＡが、以下の４つの遺伝子配列条件を同時に満たしていることが好ましい。
（１）７ｂｐという長いアンチセンス鎖の５’末端にＡＵ（アデニンとウラシル）を多く含むこと。
（２）センス鎖の５’末端にＧＣ（グアニンとシトシン）を多く含むこと。
（３）９ｂｐ以上の長いＧＣの広がりがないこと。
（４）Ｃに対するＧの含有割合が３６％乃至５２％であるｓｉＲＮＡが有効な薬剤であること。
【０１１４】
ｓｉＲＮＡのサイズの決定
長さが２５乃至３０ｎｔ（もっと具体的には２７ｎｔ）の合成ＲＮＡ二本鎖とはダイサー基質のことであり、従来の２１ｎｔのｓｉＲＮＡよりも１００倍の薬効がある。２塩基３’オーバハングが、ダイサー基質により切断されることになる。
【０１１５】
ｓｉＲＮＡ構造の決定
ガイド鎖ｍＲＮＡ二本鎖のＡ型ヘリックスは、ＲＮＡｉ構造に必須のものである。２５−３０ｎｔの長さの非対称ｄｓＲＮＡの一方の末端には、５’平滑末端があり、他端には長さ２ｎｔのオーバハングがある。３’末端にある平滑構造というのは、５’オーバハングの前にあり、ＰＫＲパスウエイと通しての、ｄｓＲＮＡシグナリングの活性化を促進する最も強い末端構造であり、この投与により、局所の抗癌効果を改善する。
【０１１６】
ｓｉＲＮＡ以外の多くの薬剤も「ローダ」にカプセル封止して使えるが、本発明においても、マトリックスのような、「ローダ」基体にカプセル封止が可能である限り使える。本発明以外の方法で送達できる薬剤として、真菌感染用のアンホテシリンＢ、骨髄炎での抗体薬、背部の脊椎の近くに埋め込みされた「ローダ」による痛みの鎮痛剤がある。
【０１１７】
別の適応として、ステント手術で損傷した平滑筋肉細胞（これは細胞が拡散する傾向がある）治療薬であるＨ１９サイレンシング薬のように平滑筋細胞にサイレンシング作用をする薬剤でもよいし、タキソール、ラパマイシン、ラパマイシン類似体薬でもよい。
【０１１８】
実施例４
乳房癌患者におけるローダ埋め込み法と使用法
乳房癌での「ローダ」の最適の適応は、乳房温存手術の場合と乳房切除手術の場合とである。その方法は以下の通りである（限定されない）。
（Ａ）術前補助治療として、外科手術に先立って「ローダ」を埋め込む。この治療法は、腫瘍塊を縮小にさせて術中での転移を避けるためである。他の腫瘍の例において、「ローダ」での術前治療を施すことで、腫瘍塊を縮小させ、術中の転移をさける効果があることが最近において証明されている。
（Ｂ）腫瘍の手術の後で、術後治療として「ローダ」をインプラントする。この方法は、マンモサイト近接照射治療法の場合において、その有効性が理解されている。乳腺腫瘤摘出術の後、２５ｍｍ以下の複数の「ローダ」を腫瘍切除の際に開けられた体腔に埋め込む。「ロード」数と、その正確な埋め込み位置は、特定「ローダ」の有効半径により決定するが、１ｍｍ乃至２０ｍｍが好ましい。「ローダ」の埋め込みが適応となる追加例として、腫瘍を排膿している局所リンパ節の部位がある。
【０１１９】
「ローダ」のインプラントの方法は以下の通りである（公開している）。
【０１２０】
「ローダ」の直接インプラントについて
これは、腫瘍塊部位、周辺の非腫瘍部位に対して、画像観察下または画像観察なしで、術前補助ｓｉＲＮＡ治療として「ローダ」を埋め込む方法である。この埋め込み手術では、超音波やＭＲＩを使用してもよい。この「ローダ」の埋め込みには、直接的な針を使っての注入をしてもよい。別の代替的方法として、「ローダ」の使用と同時に「ローダ銃」を同時にインプラントする方法もある。これは、上記の「ローダ」の寸法を、ワクチン接種などに使われている遺伝子銃の寸法に合わせて設計して作成して、２０個まで（これに限定されない）、上記「ローダ」を埋め込む方法である。
【０１２１】
乳管を通してローダを腫瘍に導入する方法について
乳管の腫瘍または腫瘍の周辺の非腫瘍部位に「ローダ」を導入する。超音波観察下で、疾患部位の乳管を通して腫瘍部位にローダを導入する。
【０１２２】
乳管腫瘍切除の後すぐに、「ローダ」を、オプションで、直接にインプラントを実施する。これは補助療法の一種である。「ローダ」を針や遺伝子銃と一緒にインプラントしてもよい。この時、限局リンパ節を造影してもよく、複数のローダを直接に、これらの部位にインプラントしてもよい。リンパ節には、ローダが直接に注入される。
【０１２３】
ｓｉＲＮＡ標的について
乳房癌細胞にかかわっているすべての遺伝子がｓｉＲＮＡ投与の標的である。標的となるものは、ｈＴＥＲT、エステロゲン受容体、プロゲステロン受容体、成長因子、ｃ−Ｍｙｃ、シクリンＤ１とシクリンＤ２，Ｈｅｒ２、Ｈ１９などである（１６）。「ローダｓｉＲＮＡ」の組成物は、短鎖ｓｉＲＮＡ型、または、ｓｉＲＮＡが２つ以上混合したものである。その含有率や濃度は等しい場合も異なった場合もある。さらに、本発明では、標的に対して効果があるように設計されたｓｉＲＮＡ（ローダ内にカプセル封止）であり、癌細胞に結合した乳房癌や腫瘍誘発因子などにも研究範囲が広がる予定である。このことは、乳房癌だけでなく、この発明の明細書で記載されていない別の癌にも当てはまることである。
【０１２４】
実施例５
膵臓癌患者におけるローダ埋め込み法と使用法
膵臓癌の適応となる「ローダ」を使っての適切な治療法の対象は、手術可能例および不可能例、術前補助治療の例、局所再発、反復処置、長期痛の例である（これらに限定されない）。膵臓癌におけるローダによる治療の適応は、手術可能な場合でも手術不可能な場合でもよい。
【０１２５】
Ａ：手術可能の患者への適用の場合
膵臓癌の主要原因は、血管の周りの局所浸襲性腫瘍の増殖である。術前の「ローダ」のインプラント、つまり、術前補助療法局所化学/ｓｉＲＮＡ療法には大きな利点（ローダが化学療法薬剤の局所投与を改善する）があるとの報告がある。例えば、臨床試験のあと１９９８年にＦＤＡ認可を得たゲミシタビンの「ローダ」による投与で、進行性の膵臓癌患者の「生活の質」(quality of life)が向上したとの報告がある（１４）。
【０１２６】
Ｂ：術中の治療法として使用する場合
腫瘍の術中に「ローダ」をインプラントするもので、手術中に発見された腫瘍浸襲部位に「ローダ」を通して薬剤を投与する。
【０１２７】
Ｃ：手術不可能な患者に使用する場合
腫瘍の手術不能患者の大きな群にローダを使用する。「ローダ」を腫瘍部位に直接にインプラントして、浸襲性腫瘍組織の増殖部、肝臓への転位組織に薬剤を投与する。
【０１２８】
Ｄ：膵臓外腫瘍が少し、あるいは、１か所だけに転移している場合には、「ローダ」を介して転移部位への薬剤投与が可能である。
【０１２９】
通常の治療手順は以下の通りである（これに限定されない）。
１．臨床データと関連画像を収集。
２．検査訪問と内視鏡検査
３．胃鏡検査と内視鏡検査
４．内視鏡下超音波検査
５．「ローダ」の経胃的インプラント
６．解剖評価
７．二回目のローダ」の経胃的インプラント（オプション）
８．ローダインプラントの評価
９．臨床試験、生化学検査、画像検査のフォローアップ
膵臓癌の治療のための「ローダ」のインプラントの方法
以下の方法で、「ローダ」を間接的、非間接的にインプラントする（これらに限定されないし、公開している）。
【０１３０】
直接インプラントの場合は、通常、ＣＴ観察下で、針でローダを腫瘍部位に挿入する。ＣＴだけではなく、超音波やＭＲＩ観察下で挿入してもよい。挿入するローダの数は、腫瘍の大きさで決定し、三次元構造は、画像システムで得る。通常の場合、腫瘍の中の〜１０ｍｍに位置決めをして、それぞれのローダ間の間隔は、１０ｍｍ乃至２０ｍｍとする。
【０１３１】
術中において、腫瘍を切除したあと、外科医が、ローダ針で「ローダ」を、再び、腫瘍壁内またはリンパ節内に埋め込む。この手順は、術中の超音波観察下で行ってもよいし、超音波を使わなくともよい。ローダの数は、腫瘍の大きさと形状により決定する。「ローダ」を針、または、ローダ銃と一緒に埋め込んでもよい。このインプラントでは、内視鏡的逆行性胆道造影法を採用してもよい。この造影法により、プローブを胆管または膵管を通し、そのあと腫瘍内に「ローダ」を挿入することになる。オプションとして、「ローダ」の挿入は、内視鏡的超音波下で行ってもよい。そうすることで、腫瘍の位置が画像で確認でき、「ローダ」を針またはローダ銃と共に腫瘍内に挿入できる。
【０１３２】
オプションとして、「ローダ」の挿入は、内視鏡的超音波を使って、経管腔的内視鏡下で行ってもよい。
【０１３３】
ｓｉＲＮＡの標的について
膵臓癌細胞にかかわるすべての遺伝子が、ｓｉＲＮＡの標的であり、以下のようなものがある。Ｋ−Ｒａｓ，ＢＲＡＦ，ＡＫＴ，Ｍｙｂ、シクリンＤ、Ｈ１９，テロメラーゼ、その他の癌タンパク質、ミクロＲＮＡ、その他の非コードＲＮＡである。（１８）。
組み合わせ療法について
「ローダ」から放出させる薬剤は、例えば、ゲムシタビンとエルロニチブや、ｓｉＲＮＡのようなヌクレオチドベースの薬剤などを１つ以上の別の薬剤を組み合わせたものであってもよい（これらに限定されないし、公開している）。
【０１３４】
「ローダ」を使った組み合わせ治療には以下のものがある。
（１）ゲムシタビンのような化学療法剤とサイレンシングＲＮＡを組み合わせた療法。
（２）同じまたは異なったメッセージＲＮＡまたは非コードＲＮＡを標的にする２つ以上のｓｉＲＮＡを同じ「ローダ」に詰め込む療法。
（３）造影分子を「ローダ」に詰め込む療法。
（４）免疫耐性薬または免疫刺激薬とサイレンシングＲＮＡを組み合わせた療法。
（５）ウイルス感染用のｓｉＲＮＡと抗ウイルス剤とを組み合わせた特異標的疾患のための組み合わせ療法。
（６）サイレンシングＲＮＡと局所放射線のための放射線物質との組み合わせ療法。
【０１３５】
実施例６
前立腺癌患者におけるローダ埋め込み法と使用法
オプションとして、上記「ローダ」を前立腺癌の単一治療法として使ってもよいし、他の治療法と組み合わせて使ってもよい。「ローダ」の円筒状の本体部の長さが５ｍｍ、直径が１．１ｍｍであることが好ましい。ローダを使っての治療法は多様であり、その例を以下に示す（これらに限らない）。
１．経過観察中の患者の場合、患者は通常６カ月乃至１２カ月ごとに生検を受ける。これらの患者は、ｓｉＲＮＡが入った「ローダ」または、その他の薬剤（例えば、化学アブレーション薬やホルモンアブレーション薬）の入った「ローダ」で治療する。生検を行う時、あるいは、別の治療手順として、「ローダ」が使用される。
２．別の例として、「ローダ」は前立腺術前の補助療法として、あるいは、前立腺切除術後の補助療法として使用される。
３．「ローダ」は、オプションとして、前立腺の近接照射療法と共に、あるいは、その近接照射療法の代替手段として使用される。この両方を使うことで、短期照射、長期照射が達成される。
【０１３６】
前立腺癌のためのローダのインプラント法について
上記ローダのインプラントは、下記に述べる方法により、画像観察下で行うことができる（公開している）。
【０１３７】
直接インプラントは、会陰（陰嚢と肛門の間の部位）の皮膚を通して、超音波観測下で、あるいは、その他の画像デバイスを使用して行われる。「ローダ」の数は、腫瘍と前立腺組織の状態により決定される。通常、１０ｍｍごとに１つのローダがインプラントされる。「ローダ」は、「ローダ」用の針やローダ銃と共に埋め込みがなされる。
【０１３８】
間接インプラントは、直腸用の超音波を使って行われる。超音波プローブを直腸から挿入し、前立腺生検用の器具を使ってローダ針を腫瘍部と前立腺組織に導入する。
【０１３９】
手術中に直接画像を見ながら、「ローダ」を腫瘍部位にインプラントする。また、疾患が疑われるリンパ節に「ローダ」を「ローダ針」か「ローダ銃」のいずれかと一緒にインプラントする。どちらにするかは、現在使っている遺伝子銃をベースにして決定する。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡの標的について
ｓｉＲＮＡの標的は前立腺癌に関わっているであろう、すべての遺伝子が標的となるが、その例としては、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、アンドロゲンＲｅｃ、ＡＫＴ，Ｈ１９，テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）、ｈＴＲなどがある（１４）。
【０１４１】
実施例７
「ローダ」の適応および使用法について
「ローダ」のインプラントの適応となるケースは以下の通りであるが、これらに限定されるわけではない。
【０１４２】
異なったスコープを使って腫瘍腔に「ローダ」をインプラントする場合がある。１つの治療法の例として、膀胱癌の場合には、「ローダ」を膀胱壁にインプラントする。このインプラントでは、膀胱鏡を使う。さらに、ローダを使っての治療として、食道癌用の内視鏡や上気道腫瘍用の咽頭鏡を使って「ローダ」を疾患部位にインプラントする治療がある。気管支鏡を使ってローダを肺組織にインプラントするケースもある。
【０１４３】
経皮インプラントについて
ローダが使用できる別のケースは、頭頚部癌のような皮膚を通して直接に発症する腫瘍である。この場合、「ロード」を挿入器具を使って直接に経皮的に腫瘍組織にインプラントする。ローダ寸法を、最近認可されている既存の注入器具に合わせて最適化する。
【０１４４】
術中のインプラントについて
「ローダ」を術中に腫瘍部位にインプラントする。そのようなケースとして、多形膠芽細胞腫の治療のための開頭手術の際にインプラントされる場合である。外科医は、手術の最後に腫瘍を囲んでいる脳組織内に「ローダ」をインプラントする。脳組織への「ローダ」のインプラントでは、開頭術で用いたものと同じ立体検査鏡を使う。
【０１４５】
ステント、グラフト、弁、ＣＡＢＧ（冠動脈バイパスグラフト）のようなバイパスグラフト、血管、心臓、冠動脈や末梢動脈のような血液系にインプラントされる多くのデバイスと関連するポリマー基体に詰め込まれる薬剤
このような場合に使われる薬剤としては、通常、平滑筋細胞の成長を阻害するｓｉＲＮＡがある。これは、タキソール、ラパマイシン（シロリマス）、ラパマイシン類似体のような最近の薬剤溶出ステントに使用されている毒性の薬剤とは異なる薬剤である。１つの実施形態によれば、Taxus (BSC社）、サイファ（Jandj社）、エンデバー（Medtronics社）、キーエンス（アボット社）のようなＤＥＳに似たデバイスが、ＲＮＡｉ薬剤を入れた状態で使用されており、そのデバイスのインプラントは、バルーン拡張型ステントや自己拡張型ステントで行う。ほかのケースでは、このＲＮＡｉ薬剤は、ポリマーステントを構成しているポリマー骨格やマトリックスのようなポリマー基体にカプセル封止されており、そのポリマーステントは生分解性のポリマーから成り、その生分解時間が、溶出される薬剤の有効期間より長くなるように設計されている。さらに別の実施例では、このデバイスが単独でインプラントされ、血管を広げるというステント機能のない、純粋な薬剤溶出デバイスとして使われている。
【０１４６】
内部にＲＮＡｉ薬剤をカプセル封止しているポリマー基体と非血管ステントの同時使用
非血管ステントには、食道、胆道、腸を含む胃腸系用として使うものと、気管支や気管用のステントとして使うものがあるが、このポリマー基体のインプラントは、内視鏡下で行うステント挿入手順と類似している。
【０１４７】
食道癌患者のローダの適用と使用法
食道癌において、「ローダ」が適応となるのは以下のケースであるが、これらに限定されるものではない。手術できない例（典型的な例は、食道の機械的な閉鎖、転移、びらん、出血、食道の痛み増大）、術前補助治療の場合（局所的浸襲のある大型腫瘍）、局所的再発（腫瘍の増殖の低下、長期生存性、苦痛制御）、長期間の痛み、反復処置の場合などである。
【０１４８】
治療手順は以下のとおりである（これらに限定されない）。
１．臨床データを収集。
２．検査訪問と内視鏡検査
３．食道鏡検査と胃鏡検査
４．粘膜フラップ（ＥＭR法）
５．「ローダ」の粘膜フラップ下のインプラント
６．粘膜閉鎖
７．内視鏡超音波
８．ローダインプラントの評価
実施例８
ローダからの主要物質の長期間放出の制御
長期間「ローダ」から放出される物質の放出能力を制御する方法により、２つの主要物質であるメチレンブルーとリゾソームを使って試験した。メチレンブルーの分子量は、ｓｉＲＮＡより小さく、わずかに、約３２０ダルトンであるが、一方、リゾチーム（１４，５００ダルトン）の分子量はｓｉＲＮＡの分子量に近い。ローダからの放出量は、両方とも類似しているが、両方とも最初に急激な速度で放出され、そのあとすぐに、低速度の量に落ち着き、長期間（６０日まで）に亘り、増大した量の放出が続く。
【０１４９】
材料と方法
メチレンブルーは、J.T.Basker社 から入手、リゾソームは、Sigma Aldrich社から入手した。「ローダ」の材料のうち、ＰＬＧＡは、Sigma Aldrich 社から、プラックとマンニトールは、J.T.Baker 社から入手した。「ローダ」は、実施例１．２で記載したプロセスにより準備した。メチレンブルーでは、各「ローダ」には、９ミクログラムを１．５グラムのＰＬＧＡ（５０：５０）Ｍｗ：４０乃至７５，０００）に溶解した。「ローダ」を、ＰＢＳバッファー中で、３７℃で、６０日間の培養を行った。この期間中に、１．５マイクロリットルのサンプルを定期的に培養緩衝役から取り除き、ナノドロップＮＤ１０００分光光度計を用いて、メーカの指示書に従って、試験を行ってＯＤを決定した。試験結果は図２Ａ乃至２Ｃに示されているが、以下にもう少し詳しく説明する。リゾソームでの実験では、各「ローダ」は、０．４５ｍｇリゾソームを含んでいる（４５０ｍｇＰＬＧＡ中に４５ｍｇのリゾソーム（ＰＬＧＡ（５０：５０）Ｍｗ：１５０，０００（プラック）。次に、「ローダ」をＰＢＳバッファ中で、３７℃で、６５日間の培養を実施した。この期間中に、１．５マイクロリットルのサンプルを、定期的に培養バッファーから取り除き、ナノドロップＮＤ１０００分光光度計でメーカの指示書に従って試験をしてＯＤを決定した。試験結果は、図３Ａ乃至３Ｃに示されているが、以下にもう少し詳しく説明する。
【０１５０】
結果
リゾソームまたはメチレンブルーを収容した「ローダ」では、量的に増大されて、しかも、その量が制御された状態での放出量を示し、この両物質で比較した放出量は、傾向として、全体的に類似しており、このことは、「ローダ」の特質は、搭載された物質よりも、その「ローダ」自身により決定されるということを示している。
【０１５１】
「ローダ」からのメチレンブルーの放出結果が、図２Ａ乃至２Ｃに示されている。図２Ａは、放出された物質の累積量を示している。ｘ軸は放出が始まってからの日数であり、ｙ軸は、放出されたメチレンブルーの量の割合を％で示している。各「ローダ」ごとに１つの曲線で示されている。図２Ｂは、１日当たりの放出量をミクログラムで示している。ｙ軸は、放出量をミクロ数で示し、ｘ軸は、放出が始まってからの日数を示す。各ローダ当たり１つの曲線で表している。図２Ｃは、全部の「ローダ」について、１日あたりの平均放出量をミクログラムで示している。ｙ軸は、放出量をミクログラムで示し、ｘ軸は、放出が始まってからの日数を示している。
【０１５２】
図２Ａに示しているように、６０日以上での累積放出速度は、最初は１５日目までは急激に上昇し、そのあとは、上昇も下降もせずに落ち着いている。しかし、メチレンブルーは放出を続き、累積放出量は６０日目でも増加し続けた。このことは、「ローダ」は、少なくとも、２ヵ月間は、放出量を増大させたことを示している。図２Ｂと図２Ｃは、両方とも、１０日目ないし１５日目に、放出速度のピークを示しており、その後、急速に低下して２５日目には、上昇も下降もせずに落ち着いている。上記の「ローダ」間に多少の差異があるが（この差異は、調整段階での影響や実際に収容した物質の量による影響である）、全体的な傾向は、全「ローダ」からの放射パターンデータに明確に表われている。一方、リゾチームを収容した実験で見てみると、その結果は、「ローダ」からのリゾチームの放出量は、図３Ａ乃至３Ｃの通りである。図３Ａは、累積の放出量を示したものである。ｘ軸は、放出が始まってからの日数を示しており、ｙ軸は放出されたリゾソームの全体量を％で表したものである。どちらも、各ローダごとに１つの曲線で表している。図３Ｂは、１日当たりの放出量をミクログラムで示し、ｙ軸は、放出された量をミクログラムで示し、ｘ軸は、放出が開始されてからの日数であり、各ローダごとに１つの曲線で表している。図３Ｃは、全ローダについて、一日当たりの平均放出量をミクログラムで示したもので、ｙ軸には、放出量をミクログラム数で、ｘ軸には、放出が始まってからの日数を示したものである。
【０１５３】
図３Ａに示したように、６５日間を通して累積放出速度が最も高いのは３日目であり、そのあとは、高くなることも低くなることもなく、落ち着いている。しかし、リゾチームは放出を続け、その累積放出量は６５日目でも増加し続けている。このことは、「ローダ」に収容して放出させた場合、１か月かそれ以上の期間に亘って増加した放出が続くということを示している。図２Ｂと２Ｃにある通り、大体３日目で放出速度の最初のピークを示し、そのあと、急速に下降し１５日目あたりで上昇も下降もせずに落ち着くことを示す。上記「ローダ」間に多少の差異はあるが（この差異は、調整段階での影響や実際に収容した物質の量による影響である）、全体的な傾向は、全「ローダ」からの放射パターンデータに明確に表れている。
【０１５４】
実施例９
特異的な腫瘍遺伝子へのインビボでのｓｉＲＮＡ投与による腫瘍増殖の阻害
この実験については、すでに出版がなされている（Ma'atuk et al, PLoS ONE, 2007 Sept. 5;2(9):e8345 文献２７として、この明細書にも引用）。図面は正確さを得るために書き直した。
【０１５５】
材料と方法
材料と方法については、Ma'atuk et al, PLoS ONE, 2007 Sept. 5;2(9):e8345 文献２７において、完全に記載されている。
【０１５６】
結果
膀胱癌に、インビボで、Ｈ１９ｓｉＲＮＡを発現させる効果を試験するために、１００万人のヒト膀胱癌細胞（ＵＭＵＣ３）を、胸腺欠損ヌードマウス（ＧＦＰｓｉＲＮＡの場合、ｎ＝３、Ｈ１９ｓｉＲＮＡの場合、ｎ＝５）に皮下注入し、４８時間後に、上記ｓｉＲＮＡを使って一過性のトランスフェクションを行った。６週間後に、３匹のマウスからなるＧＦＰｓｉＲＮＡ群のうちの２匹において、触知可能な腫瘍を発見したが、Ｈ１９ｓｉＲＮＡ群には発見できなかった。培養後８週間目にマウスを殺処分した。
【０１５７】
図４は、マウス群での平均腫瘍容量（右側パネル、Ｐ＜０．０５）と平均腫瘍重量（左側パネル、Ｐ＜０．０６）を示している。この図から明確に分かることは、Ｈ１９ｓｉＲＮＡ群での数値はゼロであるのに対して、ＧＦＰｓｉＲＮＡ群での平均重量は０から０．０６の間の数値で、平均容積は０から１の間の数値である。
【０１５８】
この結果は、特異的ｓｉＲＮＡは、特異的癌の治療に使えるということである。
【０１５９】
実施例１０
ｓｉＧＦＰ含有ＬＯＤEのＧＦＰ発現に対するインビトロでの特異的で有効な阻害
この実施例では、本発明のいくつかの実施形態で開示された、上記「ローダ」から放出されたｓｉＲＮＡに、インビトロで、細胞機能を阻害する能力、つまり、本実施例では、ＧＦＰ発現を阻害する能力があることが示されている。
【０１６０】
材料と方法
「ローダ」の材料については、上記で述べた。上記「ローダ」は、例１でのプロセスに従って作成した。実施例では、ｓｉＲＮＡ＝ｓｉＧＦＰ；ｓｉＬＵＣ（Damacon 社）、ＴＲ＝リポフェクタミン  ２０００（Invitrogen）・Ｘ＝１０％ＰＬＧＡ；Ｄ＝２．１ｍｍ。１つのローダに収容する薬剤量は４ｕｇ）。
【０１６１】
安定的にＥＧＦＰタンパク質（ＣＴ26-ＧＦＴ)を発現しているＣＴ−２６細胞を４８−ウエルプレートに播種する。２．５ｘ１０４細胞/ウエルを１０％のウシ胎仔血清を含み、ペニシリン（１８０ユニット/ml）とストレプトマイシン（１００ul/ml）を添加した合計２００ｕｌＲＰＭＩ培地に播種する。次の日に、その培地を取り換える、ローダを新しい培地に追加した。７２時間後に、細胞を収集して、ＦＡＣＳで分析した。
【０１６２】
結果
図５は、ｓｉＲＮＡを含む「ローダ」とともに７２時間培養して得たＣＴ２６−ＧＦＰ細胞内のＧＦＰの発現を示したものである。ｙ軸は、ＧＦＰの発現を中間蛍光強度として示してある。３例の平均中間ＧＦＰ強度を標準誤差で示した。棒グラフは、以下の条件下でのそれぞれの結果である。
１．「未処置」−対照試験、「ローダ」またはトランスフェクション薬剤（ＴＲ)であるリポフェクタミンの使用は無し。
２．「ローダのみ」−対照試験、ｓｉＲＮＡもＴＲも収容してない「ローダ」。
３．「ローダ＋ＴＲ」−対照試験、ＴＲを収容、ｓｉＲＮＡは含まない。
４．「ローダ＋ＴＲと複合させて得たｓｉＲＮＡ」−ＴＲは、「ローダ」へのカプセル封止を行う前にｓｉＧＦＰしＲＮＡと事前に複合化させて得た。
５．「ＴＲとの複合で得たローダ＋ｓｉＬＵＣ」−ＴＲはローダへのカプセル封止を行う前にｓｉＬＵＣ（ルシフェラーゼに反応するｓｉＲＮＡ）と事前に複合化させて得た。
【０１６３】
図５に示されているように、ローダから放出されたｓｉ−ＧＦＰ（ｓｉーＬＵＣではない）は、ＧＦＰレポータ遺伝子の発現を有意に阻害した（ケース５）。
【０１６４】
実施例１１
ＫＡＳＧ１２Ｄに反応するｓｉＲＮＡの突然変異体であるＫＲＡＳ発現に対するインビトロでの特異的阻害
この実施例では、腫瘍を軽減させるための、ローダから放出されたｓｉＲＮＡ、または、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡの薬効（これには、ｓｉＲＮＡの標的となったタンパク質の発現が必要）が示されている。Ｐａｎｃ１膵臓細胞株が使用された。その成長は、突然変異体ＫＲＡS（ＫＲＡＳＧ１２Ｄ）の発現に依存するとして知られる。その結果として、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡ（ｓｉーＫＲＡＳＧ１２Ｄ）またはローダから放出されたｓｉＲＮＡ（ｓｉーＫＲＡＳＧ１２Ｄ）のいずれかにより、Ｐａｎｃ１細胞のＫＲＡＳＧ１２Ｄの発現が阻害されて、やがて腫瘍を細胞死させることが示されている。
【０１６５】
材料と方法
半定量的ＰＣＲ
膵臓癌細胞Ｐａｎｃ１（突然変異体ＫＲＡタンパク質、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ）を発現）を、１０％ウシ胎仔血清を含む、ペニシリン（１８０ユニット/ml）とストレプトマイシン（１００ul/ml）を添加したＤＭＥＭ培地の６ウエルプレートに播種した。つぎの日に、その細胞を、１ナノモルのｓｉＧＦＰまたはｓｉーＫＲＡSＧ１２ＤｓｉＲＮＡにより、トランスフェクション薬剤であるリポフェクタミン２０００をメーカのプロコルに従って用いて、４８時間のトランスフェクションを実施した。
【０１６６】
４８時間のトランスフェクションに続いて、細胞を収集して、ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを、ランダムヘキサマプライマーを有するモロニーハウス白血病ウイルス逆転写酵素（プロメガ）を用いて調整した。その結果調整されたｃＤＮＡを以下のプライマーセットでＰＣＲ処理した。ＫＲＡＳＳＧ１２Ｄ  センス鎖  ５’ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡ  ３’；アンチセンス鎖  ５’ＣＧＴＴＴＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＡＡＴＣＡＣ  ３’；ＧＡＰＤＨ  センス鎖  ５’  ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ；アンチセンス鎖  ５’ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ  ３’。結合強度は、ＴＩＮＡＴＭソフトウエアを使って決定し、ＧＡＰＤＨに正規化させた。
【０１６７】
細胞生存性評価
Ｐａｎｃ１細胞を、すでに述べた方法で増殖させた。この細胞の生存性を評価するために、０．５ｘ１０４細胞/ウエルを９６ウエルプレートに播種した。次の日に培地を取り換えて、その細胞をｓｉＫＲＡＳまたはｓｉＫＲＡＳＧ１２Ｄ（２５モルまたは上記で記載の量）で、トランスフェクション薬剤であるリポフェクタミン２０００（１ul）を用いて、メーカの指示書に従って、疑似的にトランスフェクションを行った。細胞生存性を細胞増殖キット（ＸＴＴ評価キット）（Biological Industries, Bei Haemek, Isarel）をメーカのプロトコルに従って使用して評価した。細胞死を細胞毒性キット（ＬＤＨ評価キット）をメーカの指示に従って評価した。
【０１６８】
ローダの準備
実施例１．１記載の方法により、「ローダ」を準備した。
ローダを使っての細胞の処理について
上記のｓｉＲＮＡを含んだローダを、トランスフェクション薬剤（インビトロゲン）であるリポフェクトミン２０００と共に新鮮培地に添加して、細胞で培養した。
【０１６９】
ルシフェラーゼ発現評価について
ルシフェラーゼ発現を、デユアル型ルシフェラーゼ評価システム（Promega）をメーカの指示に従って使用して評価した。
【０１７０】
ウエスタンブロット法について
４８ウエルプレート上の細胞に４８時間と７２時間のトランスフェクションを行った後、その細胞を溶解バッファー（０．２５Ｍスクロース；２０ｍＭ  トリスｐＨ７．６、１．５ｍＭ  ＭｇＣ１２、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴA完全ミニタンパク質阻害剤が混合されたカクテル液(Roche Diagnostics社)、Ｃａｔ番号１１８３６１５３００１）中で均質化を行い、氷上で３０間培養させ、さらに、４０℃、１０分間、５０００ｒｍｐで遠心分離を行って、その上清を保管した。サンプルを１０％ＳＤＳ-PAGＥに入れて、ウエスタンブロット法分析を実施した。第一の抗体として、アンチＫＲＡS（Santa Cruz Biotechnology社、Ｃａｔ番号ｓｃ−３０）とアンチーベーターアクチン（MPL社、Ｃａｔ番号６９１００１）を使用した。第二の抗体として、ポリマーＨＲＰ抗マウス（Dako
EnVison System 社）（Ｃａｔ番号４００１）、または、ポリマーＨＲＰ抗うさぎ（Dako
EnVison System 社）（Ｃａｔ番号４００３）を使用した。タンパク質をＨＲＰ用のＥＺ−ＥＣＬ化学蛍光探知キット（biological Industries, Israel）を使用して可視化した。結合強度は、ＴＩＮＡＴＭソフトウエアを使って計算し、ベータアクチンタンパク質で正規化させた。
【０１７１】
統計的分析
結果は、平均値±標準誤差として表した。平均値間の誤差は対応のないスチューデントテスト（片側）で分析した。０．０５以下の確率は統計的に有意であると考えた。
【０１７２】
結果
専用のｓｉＲＮＡ（ｓｉＫＲＡＳＧ１２Ｄ）による、ＫＲＡＳＧ１２Ｄの特異な阻止を示すために、膵臓癌Ｐａｎｃ１細胞をｓｉＧＦＰまたはｓｉＫＲＡＳＧ１２Ｄでトランスフェクションを行い、４８時間後に、ＫＲＡＳＧ１２Ｄの水準を半定量ＰＣＲ法で評価した（図６）。図で分かるように、ｓｉＫＲＡＳＧ１２Ｄは、ＫＲＡＳＧ１２ＤｍＲＮＡのレベルを、ｍＲＮＡレベルｓｉによるトランスフェクションでのｍＲＮＡレベルに比べて、７０％低下させている。＊ｐ＜０．０５。
【０１７３】
別の実験により、ｓｉＫＲＡＳＧ１２Ｄの、Ｐａｎｃ１細胞に対する抗増殖効果が算定されている。ｓｉＫＲＡＳＧ１２Ｄの存在下での細胞生存性を評価するために、Ｐａｎｃ１細胞を、リポフェクタミンだけで、または、ＫＲＡＳ(ｗｔ）に反応するｓｉＲＮＡまたはＫＲＡＳＧ１２Ｄを使って疑似トランスフェクションを実施した。７２時間後に、ＸＴＴ評価キットを使って細胞生存性を評価した（この評価では、培地中の細胞の代謝率を測定した）。図７に示すように、ｓｉＫＲＡＳＧ１２Ｄ存在下では、擬似トランスフェクションを行った場合に比べて、細胞生存性が〜５０％低下している。ｓｉＫＲＡＳトランスフェクションでは、細胞生存性はそれほど大幅に減少するものではない。
【０１７４】
図８は、ｓｉＫＲＡＳＧ１２ＤのＰａｎｃ１細胞生存性に対する容量応答効果を示している（ｓｉＲＮＡの濃度を増加させて効果を見る）。図７での結果に対して、ｓｉＲＮＡ濃度を変化させて、実験がなされた。結果は、ｓｉＫＲＡＳＧ１２Ｄは、ｓｉ−ＧＦＰに比べて、より特異的で有意な効果があり、用量が多いか少ないかで、Ｐａｎc1細胞に対して、抗増殖効果が変動するということである。対応する濃度でのｓｉーＧＦＰに比較した時、＊＊-ｐ＜０．０１。
【０１７５】
「ローダ」から放出されたｓｉＲＮＡの効果を見るために、ナノドロップホトメータ（ＮＤ−１０００分光光度計）を用いて、細胞培地内に放出されたｓｉＲＮＡの定量化を行った。図９は、ｓｉＲＮＡ型のｓｉーＫＲａｓｍｔ（１３，０００Ｄａ；ＫＲａｓ突然変異体のｓｉＲＮＡ）の、６つの異なるｓｉーＫＲａｓｍｔを含む「ローダ」からの１週間の累積放出量（％）を示している。「ローダ」をＰＢＳバッファーを使って３７℃で培養した。ｓｉーＫＲａｓｍｔを、ナノドロップを使ってＯＤを測定することで算出した。
【０１７６】
図１０は、「ローダ」から放出されたｓｉＲＮＡの、膵臓癌細胞株であるＰａｎｃ１に対する効果を示している。簡単に言えば、ルシフェラーゼレポータ遺伝子を安定的に発現しているＰａｎｃ１細胞を、上記で述べた方法により、９６ウエルプレートに播種した。その次の日、培地を取り換えて、ｓｉＧＦＰまたはｓｉーＫＲＡＳＧ１２Ｄを含む「ローダ」を１ulのトランスフェクション薬剤であるリポフェクタミン２０００と共に、その取り替えた培地に添加した。細胞生存性を、ＸＴＴ評価キットを使って評価し（図１０Ａ)，細胞死をＬＤＨ試験により評価した（図１０Ｂ)。ｘ軸は、「ローダ」を添加した後の経過時間を示し、ｙ軸は測定されたＯＤ値を示している。この評価は、６回連続で実施した。＊-ｐ＜０．０５。
【０１７７】
ここで分ったことは、「ローダ」から放出されたｓｉーＫＲＡＳＧ１２Ｄが、Ｐａｎｃ１細胞生存を阻止して細胞死に至らしめることが出来るということである。
【０１７８】
図１１は、「ローダ」から放出されるｓｉＲＮＡの膵臓癌細胞株に対する効果をｓｉＲＮＡをトランスフェクションする場合と比較したものである。
簡単に言えば、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｐａｎｃ１−ＬＵＣ、クローン）を安定的に発現するＰａｎｃ１細胞を、「ローダ」で、２ul/ウエルのリポフェクタミン２０００(図１１Ａ)と一緒に培養させるか、あるいは、２ulのリポフェクタミン２０００(図１１Ｂ)と複合させて得た５０ピコモルのｓｉＲＮＡでトランスフェクションを行った。指定の時間に、標準的な手順により細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ発現レベルを専用のキットと光度計を使って測定した。この評価は４回連続して実施した。ｘ軸は「ローダ」や対照での処置後の経過時間を示し（図１１Ａ)、あるいは、種々のｓｉＲＮＡや対照を使いトランスフェクションを実施した後の経過時間である（図１１Ｂ)。ｙ軸は、測定ＯＤ値であり、この場合は、ルシフェラーゼレベルを測定することで算出されたものである。統計的な有意度は、ｔーテストを使って算出された。対応する点におけるｓｉＧＦＰに比べた時＊＊-Ｐ＜０.０１。ここで分かることは、「ローダ」から放出されたｓｉーＬＵＣ（ルシファラーゼに反応するｓｉＲＮＡ)は、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした場合に比べて、インビトロのＰａｎｃ１−ＬＵＣルシファラーゼ発現レベルを低下させる(図１１Ｂ)。ｓｉＲＮＡを含んだローダは、ｓｉＲＮＡで直接にトランスフェクションする場合と極めてうまく対応している。この実験は、間接的に、ローダに収容されたｓｉーＫＲＡＳＧ１２Ｄが細胞生存を阻止することを示している（つまり、ローダが収容するｓｉーＫＲＡＳＧ１２Ｄが原因となっている特異的な細胞死によるルシラーゼレベルの減少がみられる）。
【０１７９】
図１２は、図１１で記載した実験のウエスタンブロット結果であり、「ローダ」からインビトロで放出されたｓｉＲＮＡと違って、Ｐａｎｃ１細胞におけるｓｉＲＮＡ標的のタンパク質レベルに対してのｓｉＲＮＡトランスフェクションの効果を表している。簡単に言えば、Ｐａｎｃ１−ＬＵＣ細胞（クローン１５）を５０ピコモルのｓｉーＧＦPまたは２ulのリポフェクタミンと複合させることで得たｓｉーＫＲＡＳＧ１２Ｄでトランスフェクションさせるか、あるいは、ｓｉＲＮＡを含んだ「ローダ」で、２ul/ウエルのリポフェクタミンを追加して培養させた。４８時間後（図１２Ａ,１２Ｂ）、または、７２時間後（図１２Ｃ）に、細胞を溶解してウエスタンブロット法で分析を行った。この実験は４回連続で行われた。この実験は、未処理細胞についても４回連続で実施した。対応する時点のｓｉＧＦＰに比較した時、＊＊-ｐ＜０．０１。
【０１８０】
図１２Ａと図１２Ｂは、４８時間トランスフェクション後、または、ローダ追加後の４８時間時点での全体のＫＲＡSタンパク質レベルを示し、図１２Ｃは、ローダ追加後の７２時間時点での結果を示し、図１２Ｄは、結合強度（ベータアクチンに比べての強度）を定量化したものを示している。
【０１８１】
図１２は、ｓｉＲＮＡを「ローダ」により投与したか、あるいは、直接トランスフェクションにより投与したかには関係なく、ｓｉーＫＲＡＳＧ１２Ｄが、Ｐａｎｃ１−ＬＵC細胞内のＫＲＡＳタンパク質発現を阻害することを示している。さらに、この図は、「ローダ」から投与されたｓｉーＫＲＡＳＧ１２ＤによるＫＲＡＳタンパク質レベルの阻害が、トランスフェクションにより投与された阻害のレベルと類似していることも示している。
【０１８２】
実施例１２
ルシフェラーゼに反応する「ローダ」からの放出ｓｉＲＮＡのルシフェラーゼのインビボでの発現に対する特異的阻害
この実施例は、「ローダ」のｓｉＲＮＡの、マウスにおけるインビボ放出機能能力、つまり、放出されたｓｉＲＮＡの効果による、マウス細胞での機能効果能力に関する。下記に詳しく述べるように、「ローダ」から放出されたｓｉＲＮＡが、マウスに埋め込まれた腫瘍組織に対して機能的に作用したのである。
【０１８３】
材料と方法
１０匹のＢＡＬＢＣマウスに、安定的にルシフェラーゼレポータ遺伝子（ＣＴ−２６−ＬＵＣ）を発現する１＊１０＾６ＣＴ−２６癌細胞を注入した。注入から６日後に、マウスにおける腫瘍細胞の増殖を評価するために、ＣＣＣＤカメラを使った最初のルシフェラーゼ発現画像をすでに述べた方法（Honigman et al., 2001, Molecular Therapy 4:239-249）で得た。
【０１８４】
これらのマウスを、類似の画像から算出した平均ルシフェラーゼ光強度が似ている２つの治療群に分けた。
【０１８５】
細胞を注入してから１０日後に、第１群（＃１乃至＃５）のマウスにｓｉＧＦＰを含む二個のローダを腫瘍内にインプラント（対照として、＃４マウスに７日後にインプラント）を行った。第２群（＃６乃至＃１０）のマウスには、ｓｉＬＵＣを含む２個のローダを腫瘍内にインプラントした。これは、治療として実施したもので、目的は、ｓｉＲＮＡの投与による、ルシフェラーゼ発現の阻止の効果を見るためである。インプラントから３日と７日後に再度画像検査を行った。
【０１８６】
図１３は、「ローダ」−ｓｉーＬＵＣ（右パネル）と「ローダ」−ｓｉーＧＦＰ（左パネル）を、「ローダ」のインプラント（下側パネル）の４日後（上パネル）または３日後（下パネル）に、インプラントしたマウスの代表的な図である。表２は、上記の試験結果を記述的に表したもので、図１４は、その試験結果をグラフ（各マウス群における平均ルシフェラーゼ発現を標準誤差で）で示したものである。「ローダ」−ｓｉーＧＦＰ群に比較した時、＊-ｐ＜０．０５。
【０１８７】
2011526619.tif 000003
図２３は、各群における全マウスの平均強度（毎日、マウス＃１乃至＃５にはＧＦＰ，マウス＃６乃至＃１０にはＬＵＣを投与）を示す。ｓｉＬＵＣが、３日目あたりで、発光に対して最も有意な効果、つまり、発光の増加を有意に抑える効果を示した。
【０１８８】
図２４は、各群のマウスにおいて、治療の開始後の日数に対応する現実の発光のデータ（ｙ軸）を示したグラフである。マウス間に差異はあるけれども、全体の傾向は明白であり、本発明によれば、「ローダ」により腫瘍部位にインビボで投与したｓｉＬＵＣが、ｓｉＧＦＰに比べて、発光の阻止においてより有意な効果を示した。
【０１８９】
本発明の特徴が、明確さを得るために、別々の実施形態で説明されていても、それらを単一の実施形態の中で、組み合わせて説明してもよいことは理解されるべきである。逆に、特長が、簡略さを得るために、単一の実施形態で説明されていても、それらを別々の実施形態の中で組み合わせて説明してもよい。
【０１９０】
本発明は、特定の実施形態に関連して説明されているが、その代替、変更、変形についても、本発明に含まれることは当業者には明白である。従って、すべての代替、変更、変形が添付クレームの精神と範囲内にある。本明細書の中で記載されている、すべての出版物、特許、特許申請は、その全体について、それらを、具体的、個別的に、参照により、本明細書に取り込むものである。さらに、この明細書でのレフェレンスの引用と同定が、これらのレファレンスが本発明に対する先行技術として、その使用が許可されるものとして解釈してはならない。
【０１９１】
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【図１】
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【図２Ａ】
2011526619.tif 000005
【図２Ｂ】
2011526619.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2011526619.tif 000008
【図３Ｂ】
2011526619.tif 000009
【図３Ｃ】
2011526619.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2011526619.tif 000018
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
2011526619.tif 000051
【図２２Ｂ】
2011526619.tif 000052
【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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