(57)【要約】  本発明は、対向電極を有するセンサおよびこのセンサを使用した試験ストリップを対象とする。本発明は、例えば抗凝固薬のポイントオブケア監視において、血液または血漿の凝固を、プロトロンビン時間（ＰＴ）、トロンビンポテンシャルのような検定で測定するのに使用することができる。
2011501181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用電極と、対電極と、電気化学基質とを備えた対向電極センサであって、前記電気化学基質の開裂を検出するセンサ。
【請求項２】
前記電気化学基質が、前記作用電極上に固定されていない、請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記電気化学基質が、トロンビンによって開裂すると電気的に活性化する脱離基に結合したペプチドを含むトロンビン用基質である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項４】
前記センサに接続された計器をさらに備え、前記計器が、試験中の試料の凝固時間を決定する、請求項１に記載のセンサ。
【請求項５】
前記計器が、前記凝固時間を含む結果、または前記凝固時間に依存した結果もしくは値を表示または出力する、請求項４に記載のセンサ。
【請求項６】
前記センサに接続された計器をさらに備え、前記計器が、試験試料中のトロンビン生成パラメータを含む結果を表示または出力する、請求項１に記載のセンサ。
【請求項７】
試料中の血液または血漿の凝固時間を測定するための試験ストリップであって、作用電極と、対電極と、電気化学基質とを備える対向電極センサを備え、前記センサが、前記電気化学基質の開裂を検出する試験ストリップ。
【請求項８】
前記センサ内の前記電気化学基質が、前記作用電極上に固定されていない、請求項７に記載の試験ストリップ。
【請求項９】
前記センサ内の前記基質が、トロンビンによって開裂すると電気的に活性化する脱離基に結合したペプチドを含むトロンビン用基質である、請求項７に記載の試験ストリップ。
【請求項１０】
前記センサに接続された計器をさらに備え、前記計器が、試験中の試料の凝固時間を決定する、請求項７に記載の試験ストリップ。
【請求項１１】
前記計器が、前記凝固時間を含む結果、または前記凝固時間に依存した結果もしくは値を表示または出力する、請求項１０に記載の試験ストリップ。
【請求項１２】
前記センサに接続された計器をさらに備え、前記計器が、前記試験試料中のトロンビン生成パラメータを含む結果を表示または出力する、請求項７に記載の試験ストリップ。
【請求項１３】
ストリップの完全性を確認する手段をさらに備える、請求項７に記載の試験ストリップ。
【請求項１４】
血液または血漿の凝固を測定する方法であって、
血液試料を得ること、
作用電極と、対電極と、電気化学基質とを備え、前記電気化学基質の開裂を検出する対向電極センサに、前記血液試料を加えること、および
前記センサを使用して前記試料を分析して、前記試料の少なくとも１つの血液または血漿凝固特性を決定すること
を含む方法。
【請求項１５】
ポイントオブケアにおいて実行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、前記センサに接続された計器をさらに備え、前記計器が、前記試験試料中のトロンビン生成パラメータを含む結果を表示または出力する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
患者が、抗凝固薬を服用している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗凝固薬がビタミンＫ拮抗薬である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料を、患者の指への突刺しによって前記患者から得る、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対向電極を有するセンサおよびこのセンサを使用した試験ストリップ（ｔｅｓｔ  ｓｔｒｉｐ）を対象とする。本発明は、例えば抗凝固薬のポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）監視において、血液または血漿の凝固を、プロトロンビン時間（ＰＴ）およびトロンビンポテンシャルのような検定で測定するのに使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
さまざまな特許が、電気化学基質を検出する装置および方法を論じている。例えば、Ｊｏｚｅｆｏｎｖｉｃｚ他（米国特許第４，３０４，８５３号）は、電気化学基質を使用して、凝固系中の酵素を含む、プロテアーゼを検出することを記載している。残念なことに、Ｊｏｚｅｆｏｎｖｉｃｚ他の方法は、ポイントオブケア装置に対しては実用的ではない。この教示は、本明細書で使用される場合、測定される電流が非常に小さいため、再現性を向上させるためには、電極（１つまたは複数）のプリコンディショニングが必要であることを知るのに役立つ。基質は、水溶液への溶解を助けるためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を必要とする。この特許はさらに、バイアブル（ｖｉａｂｌｅ）なポイントオブケア試験に必要な体積よりも数桁大きい試料および試薬体積が必要な３電極系を開示している。
【０００３】
Ｌｕｄｉｎ他（ＵＳ６，４９５，３３６）は、トロンビンの検出、一般に凝固検定におけるトロンビンの検出に使用することができる電気化学基質を開示している。この文献に記載された基質は、明らかに水溶性であるため、Ｊｏｚｅｆｏｎｖｉｃｚ他の基質に比べて改良されている。Ｌｕｄｉｎ他は、ポイントオブケア装置でその基質をどのように使用するかについては開示していない。
【０００４】
Ｆｒｅｎｋｅｌ他（ＵＳ６，３５２，６３０）は、ポイントオブケア試験に適していると思われる装置において、電気化学トロンビン基質、具体的にはＬｕｄｉｎ他（２００２）によって開示された電気化学トロンビン基質を使用することを開示している。この教示は、本明細書で使用される場合、開裂によって放出される電気活性基とは反対側の基質の末端を、作用電極上に固定することを提供している。この要件は、複雑さを増大させ、電極材料および製造工程を限定する。
【０００５】
Ｆｒｅｎｋｅｌ他が教示している共面電極を使用するときには、作用電極上に基質を固定することが重要かつ／または不可欠である。これは、作用電極と対電極との間の比較的に大きな距離が、一方の電極からもう一方の電極への分子の有意義な拡散を妨げるためである。
【０００６】
同様に、この教示は、対電極とすることもできるＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を提供する。Ａｇ／ＡｇＣｌは電子のシンクまたはソースの働きをすることができるため、この教示は、共面電極配置に対して望ましい。この装置の潜在的問題は、一実施形態では、例えば還元体として放出される比較的に少量の電気活性生成物が、それが酸化されたときにしか検出できないことである。これにより、電気化学電流が比較的に小さくなる可能性がある。さらに、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を用意することは、このようなセンサの製造費用を増大させる。
【０００７】
Ｕｎｋｒｉｇ他（ＵＳ２００３／０１４６１１３Ａ１）も、ポイントオブケア装置に適していると思われる電気化学トロンビン基質の使用を開示している。本明細書で使用される場合、この参照文献は、Ｐｄ作用電極と、Ａｇ／ＡｇＣｌ組合せ参照および対電極とを有する平面２電極系を記述している。この共面電極設計に固有の低信号を克服するため、ある種の実施形態では、この教示が、電気活性基の検出を、グルコースの酸化に結合することによって電気活性基を再生成する。本発明のある種の実施形態の利点は、別の酸化還元反応に結合する必要なしに、対向電極が、検出された種を自動的に再生成することができることである。
【０００８】
Ｏｐａｌｓｋｙ他（ＥＰ１，２３４，０５３Ｂ１）も、電気化学基質を使用する凝固センサを記載している。ある種の実施形態において、この教示は、複雑なカートリッジを開示しており、このカートリッジは、カートリッジ内で試料を移動させて、共面電極を通り過ぎる試料と試薬とを混合するために、ポンプを有することが好ましい。対照的に、本明細書のある種の実施形態では、試薬が、より小体積の試料全体に受動的に拡散することができるため、対向電極が、ポンプを利用しない単純なストリップを可能にする。
【０００９】
酸化還元種の濃度を測定するための対向電極バイオセンサが、Ｈｏｄｇｅｓ他（ＵＳ６，２８４，１２５Ｂ１）によって開示されている。具体的には、グルコースの酸化によって酸化還元種が生成され、これから、グルコース濃度が計算された。対向電極センサは、
（１）作用電極および対電極（ならびに任意選択で任意の配置の参照電極）を、所定の距離を置いて配置し、
（２）これらの電極を、ほぼ平行な異なる平面上に、互いに向い合せに配置し、
（３）作用電極と対電極との間の間隔を、反応生成物が対電極から作用電極へ拡散することができるように選択する
ことからなることができる。
【００１０】
凝固センサ用の対向電極が、ＮｅｗｍａｎおよびＣｈａｔｅｌｉｅｒ（ＰＣＴ／１Ｂ２００７／００１９９０）によって開示されているが、この開示は、磁性粒子の移動性（不動性）を使用して凝固を検出することに限定され、電気化学基質を教示していない。
【００１１】
Ｏｈａｒａ他（ＵＳ６，６２０，３１０Ｂ１）は、対向電極を流れる定常電流の減少を検出することによって、凝固する試料の粘度の変化を検出することを記載している。この場合も、開示は、電気化学基質に関するものではなく、その代わりに、凝固後の酸化還元対の拡散の変化が検出される。
【００１２】
対向電極を使用して電気化学基質を検出することを記載している先行技術はない。対向電極を使用するときには、作用電極上に電気化学基質を固定にしない方が好ましいという意外な発見について述べている先行技術もない。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の実施形態は、作用電極と、対電極と、電気化学基質とを備え、前記電気化学基質の開裂を検出する対向電極センサを対象とする。電気化学基質は、対電極上にコーティングすることができる。これらのセンサは、血液中での凝固時間を試験する試験ストリップの一部として使用することができる。
【００１４】
本発明の他の実施形態は、本発明のセンサおよびストリップを使用する方法を対象とする。これらの方法は、ポイントオブケアにおいて実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】下電極（１）と、絶縁セパレータ（２）と、上電極（３）と、充填チャネルのカバー（４）と、充填チャネル（５）と、反応室（６）とを含む、本発明の実施形態に基づく例示的な電気化学ストリップの分解図である。
【図２】下電極（１）と、絶縁セパレータ（２）と、上電極（３）と、充填チャネルのカバー（４）と、充填チャネル（５）と、反応室（６）とを含む、組み立てられた、本発明の実施形態に基づく例示的な電気化学ストリップを示す図である。
【図３】本発明の実施形態に基づく例示的なグラフを示す図である。この図は、対電極上にトロンビン基質をコーティングしたときの方が、凝血検出が向上することを証明している。横軸に時間（秒）、縦軸に電流（マイクロアンペア）が示されている。「ａ」のグラフは、対電極（この例ではカソード）上にコーティングされたトロンビン基質および作用電極（この例ではアノード）上にコーティングされたトロンボプラスチンを表す。「ｂ」のグラフは、作用電極（アノード）上にコーティングされたトロンビン基質および対電極（カソード）上にコーティングされたトロンボプラスチンを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明の例示的な実施形態を詳細に論じる。特定の例示的な実施形態について論じるが、これは、例示だけが目的であることを理解されたい。本発明の趣旨および範囲から離れることなく、他の構成要素および配置を使用することができることを当業者は理解するであろう。「一実施形態」、「実施形態」、「例示的な実施形態」、「さまざまな実施形態」等と言うとき、そのように記載された本発明の実施形態（１つまたは複数）は、特定の特徴、構造または特性を含むことがあるが、全ての実施形態が、それらの特定の特徴、構造または特性を必ずしも含むわけではない。さらに、「一実施形態では」または「例示的な実施形態では」という表現が繰り返し使用されたとき、それらは、同じ実施形態を指すこともあるが、必ず同じ実施形態を指すというわけではない。
【００１７】
本発明は、対向電極（例えば作用電極および対電極）と電気化学基質とを有するセンサを対象とする。いくつかの実施形態では、電気化学基質が対電極上にある。後述するとおり、これらのセンサは、センサ（任意選択で試験ストリップ上のセンサ）に試料を加えることによって、使用することができ、センサでは、プロテアーゼが基質を開裂させて、電気活性種を生成する。この電気活性種は、電極の酸化還元反応によって検出することができる。
【００１８】
本発明は、多種多様な技術において使用することができ、例えば、特に経口抗凝固薬（例えばワルファリン（ｗａｒｆａｒｉｎ）、フェンプロクーモン（ｐｈｅｎｐｒｏｃｏｕｍｏｎ）のようなクーマジン（ｃｏｕｍａｄｉｎ））のポイントオブケア監視において、プロトロンビン時間（ＰＴ）、トロンビンポテンシャルのような検定を使用して血液または血漿の凝固を測定する方法において使用することができる。
【００１９】
後により詳細に論じるとおり、本発明の１つの利点は、ある種の実施形態の対向電極が、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極などの真の参照電極の複雑さを必要としないことである。その代わりに、これらの実施形態では、電極が近接していることにより、電気活性種が循環することができる。すなわち、カソードで還元された分子を、アノードで再び酸化することができ、より高い電流を得ることができる。これにより、炭素、Ａｕ、Ｐｄ、Ｐｔ  Ｉｒ、酸化インジウム、酸化インジウム／酸化スズ混合物、および／または酸化スズなどの不活性導電材料から形成された電極など、同種の２つの電極を使用することができる。
【００２０】
本発明の装置および試験ストリップは電気化学基質を有し、いくつかの実施形態では、この電気化学基質を対電極上で乾燥させることができる。電気化学基質は、酵素、例えばプロテアーゼによって開裂されうる。プロテアーゼは、ペプチド結合を開裂する酵素群である。プロテアーゼは、多くの生物過程において不可欠な役割を有する。例えば、プロテアーゼは、食物の消化、ＨＩＶの複製、血液凝固カスケードおよび補体経路に関与する。
【００２１】
一部のプロテアーゼは、特定のペプチド配列に対して特異的であり、別のプロテアーゼはあまり選択的でない。いずれにせよ、プロテアーゼ活性は生物過程に対する洞察を提供するため、プロテアーゼ活性を検出し、かつ／または定量化することが非常に望ましいことがある。当業者なら分かるとおり、本発明では、その酵素が、使用されている電気化学基質中の１つまたは複数の所望の結合を認識し、開裂することができる限りにおいて、任意の天然または合成プロテアーゼまたは他の開裂酵素を検出し、または使用することができる。
【００２２】
ある範囲のプロテアーゼに対して有効ないくつかのペプチド基質が市販されている。一般に、プロテアーゼは、これらの基質を開裂させて、色素または蛍光基を放出させ、色または蛍光の変化を生じさせる。開裂後に電気化学的に検出することができる電気活性基を有する基質を生み出すことも可能である。ペプチド基質のアミノ酸配列は、プロテアーゼに対する特異性を決定する。したがって、いくつかの実施形態では、関心のプロテアーゼに対して特異的な基質を選択することによって、プロテアーゼ検出法の特異性を変更することができる。
【００２３】
本発明の実施形態が検出することができる例示的な１つのプロテアーゼ検出系は、血液凝固カスケードである。血液凝固カスケードは、一連のプロテアーゼ反応からなり、プロテアーゼの検出を調査するための、実用的用途を有するモデル系の役目を果たす。血液試料または血漿試料が凝固するまでにかかる時間は、さまざまな病態を表すことができ、抗凝固療法を監視するのに有用なことがある。このような凝血試験の特異性は通常、凝固をどのようにして検出するかではなく、凝固を開始させるために使用する試薬（１種または数種）の性質に依存する。したがって、本発明の実施形態は、広範囲にわたる凝血試験に適用可能である。
【００２４】
例えば、本発明の１つの使用分野は、ワルファリン、フェンプロクーモンなどの経口ビタミンＫ拮抗薬による抗凝固を、ポイントオブケアで監視する方法である。これらの薬物は一般に、プロトロンビン時間試験を使用して監視され、結果は、国際標準化比（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒａｔｉｏ：ＩＮＲ）として報告される。単純な指への突刺し（ｆｉｎｇｅｒ−ｐｒｉｃｋ）によって得た血液を使用して２、３分で結果を提供するポイントオブケア装置を使用してこれらの試験を実行することがトレンドとなっている。このアプローチは通常、伝統的な静脈穿刺および血漿製剤よりも便利だが、このような装置は、全血中の凝固を検出する方法を必要とする。本発明の実施形態は、この問題に取り組む技法を改良する。
【００２５】
血漿凝固はいくつかのやり方で検出することができる。例えば、試料のゲル化は、試料内での粒子（一般に磁性粒子）の移動に対する抵抗の増大、または試料の流動性の変化によって検出することができる。また、ゲル化点は、光学的に検出することができる血漿の濁度の増大に対応することがある。例えば米国特許第６，６７３，６２２号、第６，０６６，５０４号、第６，０６０，３２３号および第６，０４６，０５１号に記載されているように、インピーダンスの変化を測定することによって試料の粘度の変化を検出する電気化学的方法を使用することもできる。
【００２６】
凝固は、本発明の実施形態に基づくトロンビン用人工ペプチド基質を使用して間接的に検出することができる。例えば、色素形成基質は、トロンビン（または他の凝固酵素）によって開裂することができ、色素基が放出されることがある。これにより、溶液の色が検出可能に変化する。開裂した基が電気化学的に活性であり（電極で酸化および／または還元することができ）、電気化学センサで検出することができる場合、別の基質を提供することもできる。このタイプの基質は電気化学基質と呼ばれ、本明細書のある種の実施形態の主題である。
【００２７】
本発明の実施形態の目的上、電気化学基質は、酵素によって開裂されて電気活性脱離基を放出する化合物と定義される。開裂していない基質は、検出条件下で、開裂によって放出された遊離の脱離基に比べて電気化学活性をほとんど持たず、または開裂によって放出された遊離の脱離基とは異なる電気化学活性を有する。
【００２８】
本発明の実施形態では、例えば２または３電極系を使用することにより、アンペロメトリによって電気活性種を検出することができる。３電極系は、作用電極、対電極および参照電極を有することができる。参照電極は、作用電極の表面付近の溶液の電圧を測定する。作用電極と参照電極の間の電圧が所望の値にセットされるように、作用電極と対電極の間の電位を調整することができる。作用電極と対電極とを接続する回路を流れる電流の大きさは、作用電極の溶液界面における還元または酸化速度によって決まる。したがって、関心の反応が起こるのは作用電極である。この系は、対電極ではなく、作用電極における反応が電流を制限するように設計される。
【００２９】
一実施形態では、２電極系が別個の参照電極を持たない。その代わりに、残りの２つの電極の導体間の電圧を設定することができる。この場合も、作用電極を、関心の反応が起こる電極と定義することができる。これは、電流を制限する反応が起こる電極である。
【００３０】
本発明の発明者らは、意外にも、対向電極を有する電気化学センサは、共面電極を使用した電気化学センサに比べて、いくつかの利点を有することがあることを見出した。限定はされないが、それらの利点は以下のものを含む。
（１）小さな電気活性種は、一方の対向電極からもう一方の対向電極へ容易に拡散することができる。これにより、還元体および酸化体が再循環し、信号を効果的に増幅することができる。電気活性種が、使用可能な時間のうちに作用電極まで必要な距離だけ拡散するのには距離が大きすぎるため、共面電極ではこれは不可能である。
（２）当業者なら分かるとおり、酸化還元反応では、酸化成分と還元成分とがなければならない。対向電極センサでは、前述の再循環において、関心の電気活性種を、一方の電極で酸化し、もう一方の電極で還元することができる。共面電極センサでは、対電極で反応が起こることを保証するため、追加の措置が必要となる。例えば、対電極をＡｇ／ＡｇＣｌとし、または大きな電圧を印加することができ、あるいは相補的な電気活性種が必要となることがある。
（３）対向電極が互いに近接していることは、電圧が電極界面を横切り、溶液の大部分を横切らないことによって、電極間の電位差の大部分が寄与することを意味する。対照的に、共面電極は、試料を横切るかなりのＩ×Ｒ電圧降下を有することがあり、一実施形態において電極間の溶液のイオン強度が小さい場合には特にそうである。
（４）共面電極を形成するためには、金属（または他の導電材料）を付着させ、または除去して、互いから電気的に分離された異なる電極を形成する必要があることがあるため、共面電極の製造よりも、対向電極の製造の方が容易なことがある。対照的に、各対向電極を形成する材料全体を覆う導電性表面を有することが有利であることがある。このことは例えば、スパッタコーティングのような単純な工程を使用して、電極をコーティングすることができ、導体内に特定のパターンが必要ないことを意味する。試料と接触する対向電極の領域は、電極を分離する絶縁スペーサによって画定することができる。
（５）対向電極を使用すると、電気化学基質を特定の配向に固定する必要があるＦｒｅｎｋｅｌ他（ＵＳ６，３５２，６３０、２００２年）のある種の実施形態における要件を回避することができる。対向電極センサでは、電気化学基質は試料に自由に溶解することができ、その配向は無関係である。これにより製造工程が単純になる。
【００３１】
１つまたは複数の実施形態は、プロテアーゼ活性を測定する、ストリップ形の装置に関する。例えば、血液凝固を監視するため。ストリップは、所定の電圧または電流をストリップに印加し、その結果生じる電流または電圧を測定する計器に電気的に接続する。当業者なら分かるとおり、これらの方法はそれぞれ、例えばアンペロメトリまたは定電流電気化学法として知られている。この計器はさらに、ストリップを熱的に調節し、反応の結果を計算し、記録し、表示し、かつ／または送信することができる。
【００３２】
図１および２に示す例示的なストリップは、対向配置の２つの電極１および３を備えることができる。これらの電極は、プラスチックセパレータ２またはその等価物によって互いに電気的に絶縁することができる。いくつかの実施形態では、これらの電極を０．５ｍｍ未満の間隔を置いて配置することができ、ある種の実施形態では、０．０５ｍｍから０．１５ｍｍの間隔を置いて配置することができる。
【００３３】
セパレータ２は、電極間の空洞を形成し、反応室６を画定する空隙を有することができる。電極表面は導電性であり、計器と電気的に接触している。
【００３４】
ある種の実施形態では、表面が、プラスチック支持体上にスパッタコーティングされている。適当なコーティングは当業者に知られていることがあり、適当なコーティングには例えば、白金、イリジウム、炭素、酸化インジウム／酸化スズ混合物および酸化スズなどがあるが、パラジウムまたは金であることが好ましい。
【００３５】
各電極の表面は、同じでもまたは異なっていてもよい。電極の導電性の表面は、互いに向かい合っている。充填チャネル５は、反応室に試料を導入することを可能にすることができ、反応室は、計器内にセットされた温度に維持することができる。
【００３６】
反応室の表面に、プロテアーゼ活性を検出する目的に使用することができる乾燥試薬（１種または数種）をコーティングすることができる。ある種の実施形態では、作用電極上に、電気化学基質がコーティングされない。試料（例えば血液）を加えた後、基質が開裂して電気活性種を放出し、電気化学活性が検出可能に変化する。この試薬（１種または数種）はさらに、血液または血漿凝固酵素を活性化する成分、あるいは血液または血漿凝固酵素の活性化を促進する成分を含むことができる。
【００３７】
ある種の実施形態では、開示のストリップが、対向配置の２つの電極からなる。これらの電極は、プラスチック支持体上にスパッタコーティングされたパラジウムを含むことができる。厚さ０．１ｍｍの絶縁セパレータ層が、これらの電極の分離を画定することができる。セパレータ内の１つまたは複数の空隙は、反応室（１つまたは複数）を画定することができる。充填チャネルは、毛管作用によって、反応室（１つまたは複数）に試料を導入することを可能にすることができる。
【００３８】
凝固の開始または検出に役立ち、かつ／または必要となりうる乾燥試薬（１種または数種）を、反応室（１つまたは複数）の表面にコーティングすることができる。これらの試薬は例えば、接触活性化剤、組織因子、動物毒物、リン脂質、緩衝剤、防腐剤、安定剤、色素、界面活性剤およびこれらの組合せとすることができる。これらの乾燥試薬は、血液または血漿試料が反応室に導入されたときに反応しうる。活性化した凝固酵素は、試薬（１種または数種）中に存在する基質を開裂させて、電気活性基を生成する。
【００３９】
特定の一実施形態では、試薬が、トロンボプラスチンを含む、プロトロンビン時間試験に必要な化合物を含むことができる。
【００４０】
他の実施形態では、試薬が、トロンビン生成試験に必要な希トロンボプラスチン、組織因子などの化合物を含むことができる。トロンビン生成試験からは、遅れ時間、トロンビンピーク、内因性のトロンビンポテンシャルのようなパラメータを得ることができる。
【００４１】
他の実施形態では、試薬が、希ラッセルクサリヘビ毒時間試験、エカリン（ｅｃａｒｉｎ）凝血時間試験などの試験に必要な毒物由来の活性化剤を含む化合物を含むことができる。
【００４２】
他の実施形態では、試薬が、第Ｘａ因子および／またはトロンビン、ならびに／あるいは第Ｘａ因子またはトロンビン活性を阻害する抗凝固因子を測定するための抗トロンビンを含むことができる。
【００４３】
他の実施形態では、試薬がさらに、第Ｖ因子、フィブリノーゲンのような凝固因子の変動性を補償する血漿成分（例えばウシ血漿の成分）を含むことができる。これは、オーレン（Ｏｗｒｅｎ）のＰＴ試験に類似することがある。
【００４４】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の電極を、対電極が電流を制限しないことを保証する電気活性化合物でコーティングすると有利である。例えば、カソードが対電極である場合、カソードを鉄（ＩＩＩ）ＥＤＴＡでコーティングすると、関心の種の検出（この実施形態では酸化による検出）をサポートする還元可能な化合物が提供される。これは特に、関心の種が電気化学的に完全には可逆的でない場合に有利であることがある。
【００４５】
いくつかの実施形態では、対向する電極上のトロンボプラスチンと電気化学的トロンビン基質との間の有害反応を防ぐために、これらの２つの試薬を乾燥させると有利であることが分かった。例示的な一実施形態では、対電極上に、電気化学的トロンビン基質（トルオールスルホニル−グリシル−プロリニル−アルギニン−４−アミド−２−クロロフェノール）をコーティングすることができ、作用電極上に、トロンボプラスチンをコーティングすることができる。この例では、トロンビン基質の脱離基が、還元体として開裂される。ここでは、トロンビン基質が、検出され、電流を制限する種である。脱離基は還元体であるため、アノード上で酸化されて、電流を流すことができ、したがって、アノードが作用電極である。
【００４６】
一般的には、作用電極上にトロンビン基質をコーティングすると、脱離基が作用電極で放出され、作用電極で検出されるため、凝血検出がより速くなると予想されるであろう。しかしながら、いくつかの実施形態では、この逆が真である。例えば、図３は、トロンビン基質を対電極（カソード）上で乾燥したときの方が、作用電極（アノード）上で乾燥したときよりも、反応速度論が速かったことを示す。これらの実施形態のより速い反応速度は、凝血時間の決定をより一貫したものにする。
【００４７】
多くの生物学的検定（例えばトロンビン生成検定）は、反応速度を計算することを含む。ある種の実施形態では、化学的に生成された電気活性種が作用電極へ拡散しているときの方が、電気活性種が作用電極で生成されているときよりも、電気活性種の反応速度論を容易に測定することができることが観察される。例えば、米国特許第５，９４２，１０２号および第６，４４４，１１５号を参照されたい。このことは、ある種の実施形態において、作用電極から離れた位置に電気化学基質をコーティングすることが好ましいことがある別の理由である。
【００４８】
他の実施形態では、電気化学基質と他の試薬（例えばトロンボプラスチン）が、相互に有害に作用しないように製剤され、それにより、これらの試薬成分の全てを対電極上に一緒にコーティングすることを可能にすることができる。これには、作用電極を汚す可能性がある試薬が作用電極上にないという利点をある。対電極は電流を制限していないため、対電極上の汚れはあまり問題とならない。作用電極の汚れは直ぐには明らかにならないことがあり、しばしば、貯蔵後に初めて明らかになり、このことが、本発明を具体化する製品の保管寿命を縮める原因となることがある。したがって、対電極上のコーティングは、作用電極を汚す危険を回避することができる。
【００４９】
本発明の試験ストリップはさらに、ストリップおよび／または試料の完全性を確認する手段を含むことができる。一実施形態では、ストリップが、ストリップおよび／または試料の完全性を確認する働きをする試薬を含む反応室を有する。試薬は、試料中において欠乏している凝固因子を含むことができる。この反応室は、試料中における欠乏の程度とは無関係に、ほぼ通常の凝固時間を生成することができ、この反応室を使用して、凝固時間が所定の限度内にあるときにストリップの完全性を証明することができる。
【００５０】
他の実施形態では、試薬に電気活性化合物を含めることによって、ストリップの完全性を確認することができる。このような化合物は、おそらくは酵素開裂したときにだけ電気活性基を放出することができる、電気化学基質とは異なる化合物とするができる。ストリップの完全性を監視するこの化合物は、ストリップの他の成分に損傷を与える可能性がある貯蔵条件（例えば高温または高湿度）下で、電気化学活性を変化させる（増大または低下させる）ことができる。このような化合物の例は、４−アミノ−２−クロロフェノール、フェリシアン化物、フェロシアン化物、および米国特許出願第ＵＳ２００５／０１２３４４１号に開示されている有機Ｎ酸化物またはニトロソ化合物を含むことができる。このような化合物の電気化学活性を、ストリップのバッチに対する所定の限界と比較することができる。その値が限界の外側にある場合、計器は、結果の代わりにエラーメッセージを与えることができる。
【００５１】
ストリップの完全性を監視する試薬は、基質の開裂を検出する反応室と同じ反応室に配置することができ、または別の室に配置してもよい。反応室が別個である実施形態では、電極の不連続部によって反応室を電気的に分離することができ、または、代替実施形態では、反応室が、電気的に接続された電極を使用することができる。反応室が連続する電極を共有する場合には、計器が検出する信号を、それらの反応室の結合とすることができる。開裂反応の前または後に完全性反応を検出し、かつ／または交差反応する電極面積を低減させることによって、完全性信号と開裂反応信号との間の干渉を最小化することができる。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態は、限定はされないが、本明細書に開示された電気化学的バイオセンサストリップなどの電気化学バイオセンサストリップのバイアビリティ（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を監視するのに適したオンボード制御を対象とする。電極材料および電極材料上のコーティングは、電極間に電位差が確立されるように選択される。この電圧は直接に測定することでき、または、電圧が誘導する電流が測定される。いくつかの実施形態では、センサが、短時間、電池のように振る舞い、電荷を生成する。この電位差は、比較的に短い時間の後に消失し、後続の試験反応を妨害しない。
【００５３】
このような制御は例えば、使い捨てストリップ内での電気化学反応を測定する計器に基づく、ますます一般的になっている、例えばポイントオブケア試験において有用である。試験結果が正確であることを保証する必要性があり、そのため、ストリップの完全性を保証する制御が望ましい。最終利用者、例えば患者にとって最も都合がよい制御は、ストリップに「オンボード（on-board）」しており、試験している同じストリップの完全性を確認する制御である。オンボード制御の例は、既に市販されているポイントオブケア凝固装置の領域（例えばＣｏａｇｕｃｈｅｋ  ＸＳ、ＩＮＲａｔｉｏ）に見られる。また、ＵＳ２００５１２３４４１Ａ１は、オンボード制御の利点についての簡潔な序論を提供している。
【００５４】
一般に、制御反応が試験反応から分離されればされるほど、電気化学的バイオセンサはより複雑になる。例えば、複雑さが低い順に言うと以下のようになる。
ａ．制御反応と試験反応の両方を単一の反応室が含むストリップは、製造するのが比較的に容易である。
ｂ．制御室と試験室が離れているが電気的に接続されているストリップは、異なる領域に複数の試薬を付着させる必要があるため、より複雑である。
ｃ．制御室と試験室が離れているだけではなく、電気的にも分離されているストリップは、スケールで経済的に製造することが非常に困難なことがある。このストリップは通常、電極材料をあるパターンに蒸着または除去することを必要とする。
【００５５】
しかしながら、適当な制御反応ケミストリを見つける難しさは、上記の順序とは逆になる。
ａ．電気的に分離された別個の制御室と試験室とを有するストリップでは、一方の反応（例えば制御反応）がもう一方の反応（例えば試験反応）を妨害する問題が生じない。
ｂ．電気的に接続された別個の制御室と試験室とを有するストリップでは、一方の反応に由来する電子を、もう一方の反応に由来する電子から区別することができないため、制御室と試験室との間の電気的干渉が生じる可能性があるが、制御反応と試験反応は互いを化学的に妨害しない。
ｃ．単一の反応室を有するストリップは、互いを化学的に妨害しないか、または電気信号の干渉を引き起こさない成分を必要とする。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明が、電気化学センサ内の制御反応を評価する新規の方法、ならびに制御反応に由来する信号と試験反応に由来する電気信号とが互いに干渉することを防ぐ方法を対象とする。
【００５７】
ＵＳ２００５１２３４４１Ａ１は、ストリップの性能を低下させる可能性がある条件にさらされると還元されるＮ酸化物またはニトロソ化合物を利用するオンボード制御反応を開示している。このオンボード制御の変化は、光学的にまたは電気化学的に検出することができる。ＵＳ２００５１２３４４１Ａ１に開示されている電気化学的検出法は、Ａｇ／ＡｇＣｌを基準とした−７００ｍＶを、作用電極を横切って印加し、次いで−１００ｍＶを印加することを含む。
【００５８】
以前のいくつかの装置の４．５秒に対して、本発明の制御は１〜２秒しかかからないため、本発明の実施形態は有利であることができる。本発明の制御には、印加電圧が試験を妨害する危険がない。
【００５９】
特定の１つの実施形態は、血液凝固を検出する電気化学センサのバイアビリティを監視するオンボード制御を含む。この特定の実施形態では、ストリップのバイアビリティを測定する制御反応試薬が、凝血時間を測定する試験反応試薬と同じ室内に含まれる。制御反応に由来する信号は、生成される時刻によって、試験反応に由来する信号から区別される。具体的には、試料を追加してから最初の数秒のうちに制御反応が評価され、次いで試験反応が評価される。
【００６０】
この実施形態では、低濃度（例えば０．５ｍＭ）のフェリシアン化物を含む試薬を一方の電極にコーティングし、フェリシアン化物を含まない試薬をもう一方の電極にコーティングすることによって、制御反応を生み出すことができる。この電極ケミストリの差異が、試料が加えられたときに、電極を横切る電圧を生み出す。この電圧は、電圧計を用いて直接に測定することができ、または、好ましい一実施形態では、外部回路を流れる電流を電流計によって記録することができる。
【００６１】
この電気化学的な電圧は、少なくとも２つの方法によって消失することができる。すなわち、外部回路を流れる電流が、電気化学電池を効果的にフラットにし、一方の電極からもう一方の電極へのフェリシアン化物の拡散が、フェリシアン化物の濃度勾配を低減させ、したがって電圧を低下させる。制御反応に由来する信号が消失した後、試験反応の分析を始めることができる。これは例えば、電極を横切って０．３〜０．４Ｖを印加し、結果として生じるアンペロメトリ電流を測定することからなる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、フェリシアン化物が試験反応の検出を実質的に妨害しないように、フェリシアン化物の濃度が十分に低い。しかしながら、当業者なら分かるとおり、フェリシアン化物の代わりに別の物質を使用する別の実施形態を生成することもできる。例えば、ヨウ素、アスコルビン酸塩、フェロシアン化物、４−アミノ−２−クロロフェノールは電池効果を生み出すことができる。
【００６３】
一実施形態では、センサ電極を横切って外部電圧を印加せずに、電流を測定することによって、電池効果を測定する。しかしながら、その電圧が試験反応を大幅に妨害しない限り、小さな電圧を印加することによって電流を測定することも可能である。
【００６４】
本発明の実施形態は、２つの室を含むセンサを有する実施形態を含むことができる。一方の室は試験反応試薬を含むことができ、もう一方の室は制御反応試薬を含むことができる。このアプローチは、一方の反応（例えば制御反応）の成分が、もう一方の反応（例えば試験反応）を化学的に阻害する可能性がある場合に有利である。試験反応と制御反応が互いを電気的に妨害しない限り、これらの室を電気的に分離する必要はない。この実施形態は特に、（例えば対向電極上の）制御反応室に中和剤が含まれる場合に有利である。
【００６５】
他の実施形態では、普通なら試験反応を妨害すると考えられる濃度の制御反応試薬を使用することができる。この実施形態では、制御室が、別個の制御試薬領域と中和剤領域とを含む。試料が加えられると、制御試薬は、電池効果または別のある電気化学信号を生成するが、これは、中和剤によって直ぐに中和される。この中和効果は、化学反応（例えばヨウ素とアスコルビン酸塩は互いを中和する）、または沈殿などの物理的効果（例えばＣｏ２＋またはＭｎ２＋イオンはフェリシアン化物を沈殿させる）によることができる。電気活性化合物は、沈殿すると、電極と相互作用することができなくなることがある。
【００６６】
血液または血漿凝固を測定する実施形態では、計器が、センサを３７℃に維持することができる。計器が検出した電気信号を解釈して、凝血時間を計算することができる。凝血時間は例えば、信号または信号の変化率がしきい値に達した時点と定義することができる。凝血時間は、時間を単位にして報告し、表示し、または他の方法で出力することができ、あるいは、センサおよび／または計器に割り当てられた較正データを使用することによって、凝血時間を、ＩＮＲのような異なる単位に変換することもできる。
【００６７】
別の結果を計算し、報告することともできる。例えば、適正な試薬を使用すると、曲線の下の領域は、内因性のトロンビンポテンシャルを指示することができ、これを同様に報告することができる。検定結果は、計器のスクリーンに表示することによって報告することができるが、検定結果を、記憶装置に記憶し、かつ／または別の装置に送信することもできる。
【００６８】
本発明の実施形態はさらに、本明細書に記載したセンサまたは試験ストリップを有するキットを対象とする。このようなキットは滅菌包装することができる。試験ストリップまたはセンサは、個装およびマルチパックで供給することができる。任意選択で、キットは、試験ストリップまたはセンサと相互作用する計器、および／あるいは、キット、試験ストリップまたはセンサを使用するための説明書を含む。
【００６９】
ウェブサイト、雑誌論文または抄録、公開または対応する米国または外国特許出願、発行または外国特許、あるいは他の任意の文献を含む、本明細書に引用した全ての文献はそれぞれ、引用文献に記載された全てのデータ、表、図および本文を含むその全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、以下の文献は特に、それらに関係する同じ発明者による参照文献および／または同じ譲受人に譲渡された参照文献がある場合には、それらを含め、その全体が、参照によって組み込まれる：Ｊｏｚｅｆｏｎｖｉｃｚ他の米国特許第４，３０４，８５３号；Ｈｏｄｇｅｓ他の米国特許第５，９４２，１０２号；Ｊｉｎａの米国特許第６，０６０，３２３号；Ｊｉｎａの米国特許第６，０６６，５０４号；Ｊｉｎａの米国特許第６，０４６，０５１号；Ｈｏｄｇｅｓ他の米国特許第６，２４８，１２５号；Ｈｏｄｇｅｓ他の米国特許第６，４４４，１１５号；Ｆｒａｎｋｅｌ他の米国特許第６，３５２，６３０号；Ｌｕｄｉｎ他の米国特許第６，４９５，３３６号；Ｏｈａｒａ他の米国特許第６，６２０，３１０号；Ｊｉｎａの米国特許第６，６７３，６２２号；Ｕｎｋｒｉｇ他の米国特許出願第２００５／０１２３４４１号；Ｕｎｋｒｉｇ他の米国特許出願第２００３／０１４６１１３号；Ｏｐａｌｓｋｙ他の欧州特許第１，２３４，０５３号；Ｎｅｗｍａｎ他の国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０１９９０号；Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈ．ａｎｄ  Ｗａｌｓｈ，Ｋ．Ａ．（１９７６）、Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（レビュー）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７３：３８２５〜３８３２；Ｓｐｒｏｎｋ，Ｈ．Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）、Ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅ、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、２５:１２２０〜１２２８；およびＢａｔｅｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ｗｅｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．（２００５）、Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１１２：５３〜６０。
【００７０】
本発明を、そのいくつかの実施形態に関して具体的に示し、説明したが、それらの実施形態は単に例として提示したものであり、本発明を限定するものとして提示したものではないこと、ならびに、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、それらの形態および詳細にさまざまな変更を加えることができることを、当業者は理解するであろう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上記の例示的な実施形態によっては限定されず、以下の特許請求項およびそれらの等価物によってのみ定義される。本明細書中で使用されている見出しは単に、編成目的で提供したものであり、特に明示しない限り、本明細書を分割し、または本明細書に意味を付け加える意図はない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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