(57)【要約】細菌、植物、植物細胞、組織、および種子に殺虫活性を付与するための組成物および方法が提供される。デルタ−エンドトキシンポリペプチドのコード配列を含む組成物が提供される。コード配列を、植物および細菌における形質転換および発現のためにＤＮＡ構築物または発現カセットにおいて使用することができる。組成物はまた、形質転換された細菌、植物、植物細胞、組織、および種子を含む。特に、単離されたデルタ−エンドトキシン核酸分子が提供される。さらに、ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列、およびこのようなアミノ酸配列に特異的に結合する抗体も包含される。特に、本発明は、配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子、または配列番号１〜６０、１２４〜１３２、および１４２〜２８３に示されるヌクレオチド配列、並びにその変異体および断片を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１〜６０および１２４〜１３２のいずれかのヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１〜６０および１２４〜１３２のいずれかのヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、殺虫活性を有するポリペプチドをコードする；
ｃ）配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記ポリペプチドは殺虫活性を有する
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、植物における発現のために設計された合成配列である、請求項１の単離核酸分子。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１４２〜２８３のいずれかから選択される、請求項２の単離核酸分子。
【請求項４】
請求項１の核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項４のベクター。
【請求項６】
請求項４のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
細菌宿主細胞である、請求項６の宿主細胞。
【請求項８】
植物細胞である、請求項６の宿主細胞。
【請求項９】
請求項８の宿主細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１０】
前記植物が、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびナタネからなる群より選択される、請求項９のトランスジェニック植物。
【請求項１１】
ａ）配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ここで、前記ポリペプチドは殺虫活性を有する；
ｃ）配列番号１〜６０、１２４〜１３２、および１４２〜２８３のいずれかのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；および
ｄ）配列番号１〜６０、１２４〜１３２、および１４２〜２８３のいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、ここで、前記ポリペプチドは殺虫活性を有する
からなる群より選択される、殺虫活性を有する単離ポリペプチド。
【請求項１２】
異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項１１のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１１のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項１４】
請求項１１のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、粉剤、粉塵、ペレット、顆粒剤、スプレー、エマルション、コロイド、および液剤からなる群より選択される、請求項１４の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、Bacillus thuringiensis細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、ホモジナイゼーション、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、または濃縮によって調製される、請求項１４の組成物。
【請求項１７】
約１重量％から約９９重量％の前記ポリペプチドを含む、請求項１４の組成物。
【請求項１８】
チョウ目または甲虫目害虫個体群を、殺虫有効量の請求項１１のポリペプチドと接触させることを含む、前記個体群を防御するための方法。
【請求項１９】
チョウ目または甲虫目害虫を、殺虫有効量の請求項１１のポリペプチドと接触させるか、または前記害虫に殺虫有効量の請求項１１のポリペプチドを摂食させることを含む、前記害虫を殺滅するための方法。
【請求項２０】
請求項６の宿主細胞を、ポリペプチドをコードする核酸分子が発現される条件下で培養することを含む、殺虫活性を有する前記ポリペプチドを産生するための方法。
【請求項２１】
殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物がそのゲノムに安定に取り込まれた植物であって、前記ヌクレオチド配列が、以下：
ａ）配列番号１〜６０、１２４〜１３２、および１４２〜２８３のいずれかのヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１〜６０、１２４〜１３２、および１４２〜２８３のいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、殺虫活性を有するポリペプチドをコードする；
ｃ）配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記ポリペプチドは殺虫活性を有し；前記ヌクレオチド配列は、植物細胞においてコード配列の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されている
からなる群より選択される、植物。
【請求項２２】
前記植物が植物細胞である、請求項２１の植物。
【請求項２３】
請求項２２の植物のトランスジェニック種子。
【請求項２４】
植物またはその細胞に、殺虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの発現ベクターを導入することを含む、害虫から植物を保護するための方法であって、前記ヌクレオチド配列が、以下：
ａ）配列番号１〜６０、１２４〜１３２、および１４２〜２８３のいずれかのヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１〜６０、１２４〜１３２、および１４２〜２８３のいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、殺虫活性を有するポリペプチドをコードする；
ｃ）配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記ポリペプチドは殺虫活性を有する
からなる群より選択される、方法。
【請求項２５】
前記植物が、チョウ目または甲虫目害虫に対して殺虫活性を有する殺虫性ポリペプチドを産生する、請求項２４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野に関する。殺虫性タンパク質をコードする新規遺伝子が提供される。これらのタンパク質およびそれらをコードする核酸配列は、殺虫性製剤の調製およびトランスジェニック害虫抵抗性植物の作製に有用である。
【０００２】
発明の背景
Bacillus thuringiensisは、昆虫の特定の目および種に対して特異的毒性を有する結晶性封入体を産生する能力によって特徴づけられるグラム陽性胞子形成土壌細菌であるが、植物および他の標的としない生物には無害である。この理由のために、Bacillus thuringiensis株またはその殺昆虫タンパク質を含む組成物は、様々なヒトまたは動物の疾病において農業害虫または媒介昆虫を防御するための環境的に許容される殺昆虫剤として使用できる。
【０００３】
Bacillus thuringiensis由来の結晶（Ｃｒｙ）タンパク質（デルタ−エンドトキシン）は、主にチョウ目、ハエ目、および甲虫目幼虫に対して強力な殺昆虫活性を有する。これらのタンパク質はまた、Hymenoptera、Homoptera、Phthiraptera、Mallophaga、およびAcari害虫目、並びに他の無脊椎動物目、例えばNemathelminthes、Platyhelminthes、およびSarcomastigorphora(Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree.  In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.)に対して活性を示した。これらのタンパク質は当初、その殺昆虫活性に主に基づいてＣｒｙＩ〜ＣｒｙＶとして分類された。主要なクラスは、チョウ目特異的（Ｉ）、チョウ目およびハエ目特異的（ＩＩ)、甲虫目特異的（ＩＩＩ）、ハエ目特異的（ＩＶ）、および線虫特異的（Ｖ）および（ＶＩ）であった。タンパク質は亜科にさらに分類され；各科内のより高度に関連したタンパク質は、Cry1A、Cry1B、Cry1Cなどのような門の文字が割り当てられた。各門内のさらにより密接に関連したタンパク質は、Cry1C1、Cry1C2などの名称が与えられた。
【０００４】
新しい命名法が最近、昆虫標的特異性よりもむしろアミノ酸配列の相同性に基づいてＣｒｙ遺伝子について記載された(Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813)。新しい分類では、各毒素は、第一ランク（アラビア数字）、第二ランク（大文字）、第三ランク（小文字）、および第四ランク（別のアラビア数字）からなる独特な名称が割り当てられる。新しい分類では、ローマ数字が、第一ランクにおいてアラビア数字に置き換えられている。４５％未満の配列同一性を有するタンパク質は異なる第一ランクを有し、そして第二および第三ランクの基準はそれぞれ７８％および９５％である。
【０００５】
結晶タンパク質は、昆虫の中腸に摂取され可溶化されるまで殺昆虫活性を示さない。摂取されたプロトキシンは、昆虫の消化管でプロテアーゼによって活性な毒性分子へと加水分解される(Hofte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255)。この毒素は、標的幼虫の中腸の尖端の刷子縁レセプターに結合し、尖端膜に入りイオンチャンネルまたは孔を作り、その結果、幼虫は死滅する。
【０００６】
デルタ−エンドトキシンは、一般に、５つの保存された配列ドメイン、および３つの保存された構造ドメインを有する（例えば、de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199参照)。最初の保存された構造ドメインは、７つのαヘリックスからなり、そして膜挿入および孔形成に関与する。ドメインＩＩは、グリークキー（Greek key）立体配置に配置された３つのβシートからなり、そしてドメインＩＩＩは、「ゼリーロール」（jelly-roll）構造の２つの逆平行のβシートからなる(de Maagd et al., 2001、前記)。ドメインＩＩおよびＩＩＩは、レセプター認識および結合に関与し、そしてそれ故、毒素特異性の決定基と考えられる。
【０００７】
B. thuringiensisベースの殺昆虫剤の集中的な使用により、すでにダイヤモンドバックモス（Diamond-back moth）、Plutella xylostella (Ferre and Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533)の野外個体群に対して耐性が生じた。最も一般的な耐性の機序は、特異的中腸レセプター（群）への毒素の結合の減少である。これは、同じレセプターを共有する他の毒素に対しても交差耐性を付与し得る(Ferre and Van Rie (2002))。
【０００８】
発明の要約
細菌、植物、植物細胞、組織および種子に対して害虫抵抗性を付与するための組成物および方法が提供される。組成物は、デルタ−エンドトキシンポリペプチドの配列をコードする核酸分子、そのような核酸分子を含むベクター、および前記ベクターを含む宿主細胞を含む。組成物はまた、エンドトキシンのポリペプチド配列、およびそのようなポリペプチドに対する抗体を含む。ヌクレオチド配列は、生物（微生物および植物を含む）における形質転換および発現のためにＤＮＡ構築物または発現カセットにおいて使用することができる。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、生物（微生物または植物を含むがこれらに限定されるわけではない）における発現のために設計された合成配列であり得る。組成物はまた、形質転換された細菌、植物、植物細胞、組織および種子を含む。
【０００９】
特に、デルタ−エンドトキシン核酸配列に対応する単離核酸分子が提供される。さらに、ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列が包含される。特に、本発明は、配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１のいずれかに示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または配列番号１〜６０および１２４〜１３２のいずれかに示されるヌクレオチド配列、並びにその変異体および断片を含む、単離核酸分子を提供する。本発明のヌクレオチド配列に相補的であるか、または本発明の配列にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列も包含される。
【００１０】
本発明の組成物および方法は、殺虫剤に耐性を有する生物、特に細菌および植物の作製に有用である。これらの生物およびそれらから得られた組成物は、農業目的に望ましい。本発明の組成物は、また、殺虫活性を有するように改変または改良したデルタ−エンドトキシンタンパク質を作製するのに、または生産物もしくは生物中のデルタ−エンドトキシンタンパク質または核酸の存在を検出するのに有用である。
【００１１】
詳細な説明
本発明は、生物、特に植物または植物細胞において害虫抵抗性を調節するための組成物および方法に関する。前記方法は、本発明のデルタ−エンドトキシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列で生物を形質転換することを含む。特に、本発明のヌクレオチド配列は、殺虫活性を有する植物および微生物を調製するのに有用である。従って、形質転換された細菌、植物、植物細胞、植物組織および種子が提供される。
【００１２】
組成物は、Bacillus thuringiensisのデルタ−エンドトキシン核酸およびタンパク質である。前記配列は、対象の生物に後に形質転換するための発現ベクターの構築に、他のデルタ−エンドトキシン遺伝子の単離のためのプローブとして、および、ドメイン交換またはＤＮＡシャッフリングなどの当技術分野において公知の方法による改変した殺虫性タンパク質の作製に有用である。前記タンパク質は、チョウ目、甲虫目、および線虫の害虫個体群を防御または死滅させる上で、そして殺虫活性を有する組成物を作製をするのに有用である。
【００１３】
「デルタ−エンドトキシン」とは、１種以上の害虫（チョウ目、ハエ目、および甲虫目のメンバーまたは線形動物門のメンバーを含むがこれらに限定されるわけではない）に対して毒性活性を有するBacillus thuringiensis由来の毒素、またはこのようなタンパク質に対して相同性を有するタンパク質を意味する。いくつかの場合、デルタ−エンドトキシンタンパク質は、他の生物（Clostridium bifermentansおよびPaenibacillus popilliaeを含む）から単離されている。デルタ−エンドトキシンタンパク質は、本明細書に開示した完全長ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列、および、代替的な下流の開始部位の使用に起因するか、または殺虫活性を有するより短いタンパク質を産生するプロセシングに起因して、完全長よりも短い配列であるアミノ酸配列を含む。プロセシングは、タンパク質が発現される生物において、またはタンパク質の摂取後に害虫において起こり得る。
【００１４】
デルタ−エンドトキシンは、cry1からcry43、cyt1およびcyt2、およびCyt様毒素として同定されたタンパク質を含む。現在広範な特異性および毒性を有する２５０を超える公知のデルタエンドトキシン種が存在する。膨大なリストについてはCrickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813を参照し、最新情報についてはCrickmore et al. (2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature," at www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/indexを参照されたい。
【００１５】
本明細書において殺虫活性を付与する新規の単離ヌクレオチド配列が提供される。また、デルタ−エンドトキシンタンパク質のアミノ酸配列も提供される。この遺伝子の翻訳から生じたタンパク質は、細胞が、それを摂取した害虫を防御または殺滅することを可能とする。
【００１６】
単離核酸分子、並びにその変異体および断片
本発明の１つの態様は、デルタ−エンドトキシンタンパク質およびポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸分子、並びに、デルタ−エンドトキシンをコードする核酸を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子に関する。本明細書で使用した用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば組換えＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）並びにヌクレオチド類似体を使用して作製したＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むものとする。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００１７】
「単離」または「精製」核酸分子もしくはタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、組換え技術によって産生された場合には実質的に他の細胞材料または培養培地を含まないか、あるいは、化学的に合成された場合には実質的に化学的前駆体または他の化学物質を含まない。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて天然に核酸にフランキングしている配列（好ましくはタンパク質をコードする配列）（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。本発明の目的のため「単離」は、核酸分子を言及するために使用される場合、単離染色体を除外する。例えば、様々な実施態様において、単離されたデルタ−エンドトキシンをコードする核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて核酸分子に天然にフランキングする約５kb、４kb、３kb、２kb、１kb、０．５kb、または０．１kb未満のヌクレオチド配列を含み得る。細胞材料を実質的に含まないデルタ−エンドトキシンタンパク質は、約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量）未満の非デルタ−エンドトキシンタンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも称する）を有するタンパク質の調製物を含む。
【００１８】
本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜６０および１２４〜１３２で示される配列、並びにその変異体、断片および相補体を含む。「相補体」とは、特定のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションでき、これにより安定な二本鎖を形成できるような、特定のヌクレオチド配列に対して十分な相補性を有するヌクレオチド配列を意味する。このヌクレオチド配列によってコードされるデルタ−エンドトキシンタンパク質の対応するアミノ酸配列は、配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１に示されている。
【００１９】
これらのデルタ−エンドトキシンをコードするヌクレオチド配列の断片である核酸分子も本発明によって包含される。「断片」とは、デルタ−エンドトキシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分を意味する。ヌクレオチド配列の断片は、デルタ−エンドトキシンタンパク質の生物学的に活性な部分をコードし得るか、あるいは以下に開示された方法を使用してハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用できる断片であり得る。デルタ−エンドトキシンヌクレオチド配列の断片である核酸分子は、少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、２９５０、３０００、３０５０、３１００、３１５０、３２００、３２５０、３３００、３３５０の連続ヌクレオチド、または使用目的に応じて本明細書において開示される完全長デルタ−エンドトキシンをコードするヌクレオチド配列に存在する最大ヌクレオチド数までを含む。「連続」ヌクレオチドとは、互いに隣接しているヌクレオチド残基を意味する。本発明のヌクレオチド配列の断片は、デルタ−エンドトキシンタンパク質の生物活性を保持し、従って殺虫活性を保持したタンパク質断片をコードするだろう。「活性を保持」とは断片が、デルタ−エンドトキシンタンパク質の殺虫活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上を有することを意味する。殺虫活性を測定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293;および米国特許第5,743,477号を参照し、これらは全てその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２０】
本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分をコードするデルタ−エンドトキシンコードヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００の連続アミノ酸、または本発明の完全長デルタ−エンドトキシンタンパク質に存在する全アミノ酸数までをコードするだろう。
【００２１】
本発明の好ましいデルタ−エンドトキシンタンパク質は、配列番号１〜６０および１２４〜１３２のヌクレオチド配列に十分に同一であるヌクレオチド配列によってコードされる。「十分に同一」とは、標準的なパラメーターを使用し本明細書に記載のアラインメントプログラムの１つを使用して参照配列と比較して、少なくとも約６０％または６５％の配列同一性、約７０％または７５％の配列同一性、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、これらの数値を適切に調整できることを認識しているだろう。
【００２２】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一率を決定するために、配列を最適に比較する目的でアラインメントする。２つの配列間の同一率は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一率＝同一の位置の数／位置の全数（例えば重複位置）×１００）。１つの実施態様において、２つの配列は同じ長さである。別の実施態様において、比較は、参照配列の全体におよぶ（例えば配列番号１〜６０および１２４〜１３２の１つの全体におよぶか、または配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１の１つの全体におよぶ）。２つの配列間の同一率は、ギャップを許容する又は許容しないで、以下に記載のものと類似した技術を使用して決定することができる。同一率を計算する際に、典型的には正確なマッチを計測する。
【００２３】
２つの配列間の同一率の決定は数学的アルゴリズムを使用して達成できる。２つの配列の比較に使用した数学的アルゴリズムの非制限的な例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように改変された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長さ＝１２を用いて実施することにより、本発明のデルタ−エンドトキシン様の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３を用いて実施することにより、本発明のデルタ−エンドトキシンタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップの入ったアラインメントを得るために、ギャップの入ったＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０）を、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載のように利用できる。または、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用することにより、分子間の遠位の関係を検出する反復探索を実施することができる。Altschul et al. (1997)前記を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、ギャップの入ったＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用した場合、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。アラインメントはまた手動で調査することによって実施し得る。
【００２４】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの別の非制限的な例は、ClustalWアルゴリズムである(Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)。ClustalWは配列を比較し、アミノ酸またはＤＮＡ配列の全体をアラインメントし、そして従って全アミノ酸配列の配列保存についてのデータを提供することができる。ClustalWアルゴリズムは、いくつかの市販のＤＮＡ／アミノ酸解析ソフトウェアパッケージ、例えばベクターＮＴＩプログラムスイートのＡＬＩＧＮＸモジュール(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)に使用される。ClustalWを用いてアミノ酸配列をアラインした後、アミノ酸同一率を評価することができる。ClustalWアラインメントの解析に有用なソフトウェアプログラムの非制限的な例は、ＧＥＮＥＤＯＣ（登録商標）である。ＧＥＮＥＤＯＣ（登録商標）(Karl Nicholas)は、複数のタンパク質間のアミノ酸（またはＤＮＡ）類似性および同一性の評価を可能とする。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非制限的な例は、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ、バージョン１０(Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USAから入手可能)の一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、PAM120重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップ長ペナルティーを使用できる。
【００２５】
特記しない限り、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453のアルゴリズムを使用するＧＡＰバージョン１０を使用し、以下のパラメーターを用いて配列同一性または類似性を決定する：ＧＡＰウェイト（Weight）５０およびレングス・ウェイト（Length Weight）３、およびnwsgapdna.cmpスコアリング・マトリックスを使用してヌクレオチド配列の同一％および類似％；ＧＡＰウェイト８およびレングス・ウェイト２、およびBLOSUM62スコアリングプログラムを使用してアミノ酸配列の同一％または類似％。等価なプログラムも使用し得る。「等価なプログラム」とは、ＧＡＰバージョン１０によって作製された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチド残基マッチおよび同一の配列同一率を有するアラインメントを、問題のいずれかの２つの配列についてもたらす、任意の配列比較プログラムを意味する。本発明はまた、変異体核酸分子も包含する。デルタ−エンドトキシンコードヌクレオチド配列の「変異体」は、本明細書に開示したデルタ−エンドトキシンタンパク質をコードするが、遺伝子コードの縮重のために保存的に異なっている配列、並びに、前記に考察したように十分に同一であるものを含む。天然の対立遺伝子変異体は、周知の分子生物学技術、例えば以下に概略を示したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術を使用することにより同定することができる。変異体ヌクレオチド配列はまた、例えば部位特異的突然変異誘発によって作製されているが、以下に考察したような本発明に開示したデルタ−エンドトキシンタンパク質を依然としてコードする、合成により得られたヌクレオチド配列を含む。本発明によって包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち天然タンパク質の所望の生物活性を有し続けている、すなわち、殺虫活性を保持している。「活性を保持」とは、変異体が、天然タンパク質の殺虫活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％を有することを意味する。殺虫活性を測定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293;および米国特許第5,743,477号を参照し、その全てはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２６】
当業者は、本発明のヌクレオチド配列の突然変異によって変異を導入でき、これにより、タンパク質の生物活性を変化させることなく、コードされるデルタ−エンドトキシンタンパク質のアミノ酸配列を変化させることができることをさらに理解しているだろう。従って、変異体単離核酸分子は、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を本明細書に開示した対応するヌクレオチド配列に導入することによって作製され得、よって、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質に導入される。突然変異は、標準的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在突然変異誘発によって導入することができる。このような変異体ヌクレオチド配列も本発明によって包含される。
【００２７】
例えば、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基において行なわれ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変化させることなく、デルタ−エンドトキシンタンパク質の野生型配列から変化させることのできる残基であり、一方で「必須」アミノ酸残基は生物活性に必要とされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００２８】
デルタ−エンドトキシンは、一般に、５つの保存された配列ドメイン、および３つの保存された構造ドメインを有する(例えばde Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199参照)。最初の保存された構造ドメインは、７つのαヘリックスからなり、そして膜挿入および孔形成に関与する。ドメインＩＩは、グリークキー（Greek key）立体配置に配置された３つのβシートからなり、そしてドメインＩＩＩは、ゼリーロール（jelly-roll）構造の２つの逆平行のβシートからなる(de Maagd et al., 2001、前記)。ドメインＩＩおよびＩＩＩは、レセプター認識および結合に関与し、そしてそれ故、毒素特異性の決定基と考えられる。
【００２９】
アミノ酸置換は、機能を保持した非保存領域で行ない得る。一般に、このような置換は、保存アミノ酸残基、または保存モチーフ内に存在するアミノ酸残基（ここではこのような残基は、タンパク質の活性に必須である）に対しては行なわれない。保存され、そしてタンパク質活性に必須であり得る残基の例は、例えば、本発明のアミノ酸配列および公知のデルタ−エンドトキシン配列のアラインメントに含まれる全てのタンパク質の間で同一である残基を含む。保存されているが、保存的なアミノ酸置換が可能であり、そして依然として活性を保持する残基の例は、例えば、本発明のアミノ酸配列および公知のデルタ−エンドトキシン配列のアラインメントに含まれる全てのタンパク質の間で保存的な置換のみを有する残基を含む。しかしながら、当業者は、機能的変異体は、保存された残基において小さく保存されたまたは非保存の変化を有し得ることを理解しているだろう。
【００３０】
または、変異体ヌクレオチド配列は、飽和突然変異誘発などの、コード配列の全部または一部に沿って無作為に突然変異を導入することによって作製され得、そして得られた突然変異体をデルタ−エンドトキシン活性を付与する能力についてスクリーニングすることにより、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードされたタンパク質を組換え発現でき、そしてタンパク質の活性を標準的なアッセイ技術を使用して決定することができる。
【００３１】
ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの方法を使用して、対応するデルタ−エンドトキシン配列を同定でき、このような配列は、本発明の配列に実質的な同一性を有する。例えば、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)およびInnis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY)を参照されたい。
【００３２】
ハイブリダイゼーション法において、デルタ−エンドトキシンヌクレオチド配列の全部または一部を使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。このようなｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの作製法は、一般に当技術分野において公知であり、そしてSambrook and Russell, 2001、前記に開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、または他のオリゴヌクレオチドであり得、そして、３２Ｐなどの検出可能な基、または任意の他の検出可能なマーカー、例えば他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子で標識され得る。ハイブリダイゼーション用のプローブは、本明細書に開示した公知のデルタ−エンドトキシンコードヌクレオチド配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作製することができる。ヌクレオチド配列またはコードするアミノ酸配列における保存ヌクレオチドまたはアミノ酸残基に基づいて設計された変性プライマーをさらに使用することができる。プローブは、典型的には、本発明のデルタ−エンドトキシンコードヌクレオチド配列またはその断片もしくは変異体の少なくとも約１２、少なくとも約２５、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、または４００の連続ヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列の領域を含む。ハイブリダイゼーション用プローブを調製するための方法は、一般に当技術分野において公知であり、そして参照により本明細書に組み入れられるSambrook and Russell, 2001、前記に開示されている。
【００３３】
例えば、本明細書に開示した全デルタ−エンドトキシン配列、またはその１つ以上の部分は、対応するデルタ−エンドトキシン様配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイゼーションできるプローブとして使用し得る。様々な条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、このようなプローブは、独特でそして好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、または少なくとも約２０ヌクレオチド長である配列を含む。このようなプローブを使用して、ＰＣＲによって選択した生物から対応するデルタ−エンドトキシン配列を増幅し得る。この技術は、所望の生物からさらなるコード配列を単離するために、または生物中のコード配列の存在を決定するための診断アッセイとして使用し得る。ハイブリダイゼーション技術は、蒔いたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを含む(プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York参照)）。
【００３４】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行ない得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブがその標的配列に、他の配列よりも検出可能なより大きい程度で（例えば少なくともバックグラウンドの２倍）ハイブリダイゼーションする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして様々な状況により異なるだろう。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに１００％相補的な標的配列を同定することができる（相同性試験）。または、ストリンジェンシー条件を調整して配列中にいくらかのミスマッチを可能とすることにより、より低い程度の類似性が検出される（異種試験）。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００３５】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．５Ｍ Ｎａイオン未満、典型的には０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、そして温度は短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃そして長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより大きい）では少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成し得る。例示的な低いストリンジェンシーな条件は、３７℃で３０〜３５％のホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いてのハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）での洗浄を含む。例示的な中程度のストリンジェンシー条件は、３７℃での４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣでの洗浄を含む。例示的な高いストリンジェンシーな条件は、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣでの洗浄を含む。場合により、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％ＳＤＳを含み得る。ハイブリダイゼーションの期間は、一般に、約２４時間未満、通常約４〜約１２時間である。
【００３６】
特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、Ｔｍは、Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284:  Tm = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/Lの式から概算し得；式中、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの比率であり、％formは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの比率であり、そしてＬは、塩基対でのハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイゼーションする温度（規定のイオン強度およびｐＨ下で）である。Ｔｍは１％ミスマッチする毎に約１℃減少する；従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件を調整して、所望の同一性の配列にハイブリダイゼーションできる。例えば、９０％以上の同一性を有する配列を求めるならば、Ｔｍを１０℃減少させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて特異的配列およびその相補体の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、重度にストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用し得；中程度にストリンジェントな条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用し得；低いストリンジェンシーな条件は、熱融解温度（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用し得る。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成、および所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が固有に記載されていることを理解するだろう。所望の程度のミスマッチにより、Ｔｍが４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満になるならば、より高温を使用できるようにＳＳＣ濃度を増加することが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する詳細な指針は、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York);およびAusubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)に見られる。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning:  A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)を参照されたい。
【００３７】
単離タンパク質並びにその変異体および断片
デルタ−エンドトキシンタンパク質もまた本発明に包含される。「デルタ−エンドトキシンタンパク質」とは、配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。その断片、生物学的に活性な部分、および変異体も提供され、そして本発明の方法を実施するために使用され得る。
【００３８】
「断片」または「生物学的に活性な部分」は、配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１のいずれかで示されるアミノ酸配列と十分に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片を含み、そしてそれは殺虫活性を示す。デルタ−エンドトキシンタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。このような生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製でき、そして殺虫活性について評価できる。殺虫活性を測定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293;および米国特許第5,743,477号を参照し、その全てはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。ここで使用したように、断片は、配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１の少なくとも８つ連続したアミノ酸を含む。しかしながら、本発明は、他の断片、例えばタンパク質中の約１０、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、または１３００アミノ酸より大きい任意の断片を包含する。
【００３９】
「変異体」とは、配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを意味する。変異体はまた、ストリンジェントな条件下で、配列番号１〜６０および１２４〜１３２の核酸分子にハイブリダイゼーションする核酸分子またはその相補体によってコードされるポリペプチドを含む。変異体は、突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なるポリペプチドを含む。本発明によって包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち天然タンパク質の所望の生物活性を有し続けており、すなわち殺虫活性を保持している。殺虫活性を測定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293;および米国特許第5,743,477号を参照し、その全てはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４０】
細菌遺伝子、例えば本発明のaxmi遺伝子は、オープンリーディングフレームの開始の近くに複数のメチオニン開始コドンを有することが極めて多い。しばしば、これらの１つ以上の開始コドンにおける翻訳開始により、機能タンパク質の作製がなされる。これらの開始コドンは、ＡＴＧコドンを含み得る。しなしながら、Bacillus sp.などの細菌はまた、開始コドンとしてコドンＧＴＧも認識し、ＧＴＧコドンにおいて翻訳を開始するタンパク質は、最初のアミノ酸においてメチオニンを含む。さらに、事前にこれらのコドンのどれが細菌において天然に使用されるか決定されないことが多い。従って、代替的なメチオニンコドンの１つの使用によっても、殺虫活性をコードするデルタ−エンドトキシンの作製がもたらされ得ることが理解される。これらのデルタ−エンドトキシンタンパク質は本発明に包含され、そして本発明の方法において使用され得る。
【００４１】
本発明のポリペプチド、またはその変異体もしくは断片に対する抗体もまた包含される。抗体を作製するための方法は当技術分野において周知である（例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; 米国特許第4,196,265号参照）。
【００４２】
改変または改良された変異体
デルタ−エンドトキシンのＤＮＡ配列は、様々な方法によって改変され得、そして、これらの改変により、本発明のデルタ−エンドトキシンによってコードされるものとは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列がもたらされ得ることが認識される。このタンパク質は、配列番号６１〜１２１および１３３〜１４１の１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、切断短縮、および挿入（約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０またはそれ以上までのアミノ酸置換、欠失または挿入を含む）を含む様々な方法で改変され得る。
【００４３】
このような操作のための方法は一般に当技術分野において公知である。例えば、デルタ−エンドトキシンタンパク質のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡにおける突然変異によって調製することができる。これはまた、突然変異誘発のいくつかの形態の１つによっておよび／または指向進化で達成され得る。いくつかの態様において、アミノ酸配列にコードされる変化は、実質的にタンパク質の機能に影響を及ぼさないだろう。このような変異体は所望の殺虫活性を有するだろう。しかしながら、デルタ−エンドトキシンの殺虫活性を付与する能力は、本発明の組成物にこのような技術を使用することによって改良され得ることを理解されたい。例えば、ＤＮＡ複製中に高い割合の塩基の誤取り込みを示す宿主細胞、例えばＸＬ−１Ｒｅｄ（Stratagene）においてデルタ−エンドトキシンを発現し得る。このような株で増殖させた後、デルタ−エンドトキシンＤＮＡを単離し（例えば、プラスミドＤＮＡを調製することによって、またはＰＣＲによって増幅し得られたＰＣＲ断片をベクターにクローニングすることによって）、非突然変異誘発株においてデルタ−エンドトキシン突然変異体を培養し、そして、例えば殺虫活性について試験するためのアッセイを実施することによって、殺虫活性を有する突然変異したデルタ−エンドトキシン遺伝子を同定することができる。一般に、タンパク質は混合されそして摂食アッセイに使用される。例えば、Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293を参照されたい。このようなアッセイは、植物を１種以上の害虫と接触させ、そして植物が生存する能力および／または植物が害虫の死滅を引き起こす能力を決定することを含み得る。毒性の増加をもたらす突然変異の例は、Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806に見られる。
【００４４】
または、実質的に活性に影響を及ぼすことなく、アミノまたはカルボキシ末端において多くのタンパク質のタンパク質配列に改変を行ない得る。これは、ＰＣＲ増幅に使用したオリゴヌクレオチドにアミノ酸コード配列を包含させることによってタンパク質コード配列を改変または伸長するＰＣＲ増幅を含む、ＰＣＲなどの、現代の分子的方法によって導入された挿入、欠失または改変を含み得る。または、加えられたタンパク質配列は、タンパク質融合体の作製のために当技術分野において一般的に使用されるものなどの、全タンパク質コード配列を含み得る。このような融合タンパク質は、しばしば、（１）対象のタンパク質の発現を増加させるために、（２）タンパク質精製、タンパク質検出、または当技術分野で公知の他の実験的使用を容易にするために、結合ドメイン、酵素活性、またはエピトープを導入するために、（３）細胞内小器官、例えばグラム陰性細菌の細胞膜周辺腔、または真核細胞の小胞体（後者によりタンパク質はグリコシル化されることが多い）へのタンパク質の分泌または翻訳を標的とするために使用される。
【００４５】
本発明の変異体ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はまた、ＤＮＡシャッフリングなどの突然変異誘発および組換え誘導手順から得られた配列を包含する。このような手順を用いて、１つ以上の異なるデルタ−エンドトキシンタンパク質コード領域を使用することにより、所望の特性を有する新規なデルタ−エンドトキシンタンパク質を作製することができる。このように、組換えポリヌクレオチドのライブラリーは、実質的な配列同一性を有しそしてインビトロまたはインビボで相同的に組換えることができる配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの個体群から作製される。例えば、このアプローチを使用して、対象のドメインをコードする配列モチーフを、本発明のデルタ−エンドトキシン遺伝子と他の公知のデルタ−エンドトキシン遺伝子の間でシャッフルして、改良された対象の特性、例えば増加した殺昆虫活性を有するタンパク質をコードする新規遺伝子が得られる。このようなＤＮＡシャッフリングの戦略は当技術分野において公知である。例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291;および米国特許第5,605,793号および5,837,458号を参照されたい。
【００４６】
ドメイン交換またはシャッフリングは、改変したデルタ−エンドトキシンタンパク質を作製するための別の機序である。ドメインＩＩおよびＩＩＩは、デルタ−エンドトキシンタンパク質間で交換し得、これにより改良された殺虫活性または標的スペクトルを有するハイブリッドまたはキメラ毒素が得られる。組換えタンパク質を作製し、殺虫活性についてそれらを試験するための方法は当技術分野において周知である（例えば、Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925参照)。
【００４７】
ベクター
本発明のデルタ−エンドトキシン配列は、対象の植物において発現させるための発現カセットで提供され得る。「植物発現カセット」とは、植物細胞においてオープンリーディングフレームからタンパク質の発現を行なうことのできるＤＮＡ構築物を意味する。典型的にはこれらはプロモーターおよびコード配列を含む。しばしば、このような構築物はまた、３’非翻訳領域を含む。このような構築物は、特定の細胞内構造、例えば葉緑体（または他のプラスチド）、小胞体、またはゴルジ装置へのペプチドの同時翻訳または翻訳後輸送を容易にするための「シグナル配列」または「リーダー配列」を含み得る。
【００４８】
「シグナル配列」とは、細胞膜を通過し同時翻訳または翻訳後のペプチド輸送をもたらすことが知られるまたは考えられている配列を意味する。真核生物では、これは典型的にはゴルジ装置への分泌に関与し、いくつかはグリコシル化される。「リーダー配列」とは、翻訳された場合に、細胞内小器官へのペプチド鎖の同時翻訳輸送を引き起こすに十分なアミノ酸配列をもたらす任意の配列を意味する。従って、これは、小胞体への通過、液胞、プラスチド（葉緑体を含む）、ミトコンドリアなどへの通過によって、輸送および／またはグリコシル化を標的とするリーダー配列を含む。
【００４９】
「植物形質転換ベクター」とは、植物細胞の効率的な形質転換に必要とされるＤＮＡ分子を意味する。このような分子は、１つ以上の植物発現カセットからなり得、そして１つより多い「ベクター」ＤＮＡ分子に組織化され得る。例えば、バイナリーベクターは、植物細胞の形質転換のために全ての必要なシスおよびトランス作用機能をコードするために２つの非連続的なＤＮＡベクターを使用する植物形質転換ベクターである(Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451)。「ベクター」は、異なる宿主細胞間での移動のために設計された核酸構築物をいう。「発現ベクター」は、外来細胞において異種ＤＮＡ配列または断片を取り込み、組込み、および発現する能力を有するベクターをいう。カセットは、本発明の配列に作動可能に連結された５’および３’調節配列を含む。「作動可能に連結」とは、プロモーターと第二配列の間の機能的連結を意味し、プロモーター配列は、第二配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始および媒介する。一般に、作動可能に連結は、連結される核酸配列が連続的であり、そして２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合には連続的であり同じリーディングフレーム内にあることを意味する。カセットはさらに、生物に同時形質転換されるための少なくとも１つの追加の遺伝子を含み得る。または、追加の遺伝子（群）が複数の発現カセット上に提供され得る。
【００５０】
「プロモーター」は、下流コード配列の転写を指令するように機能する核酸配列をいう。他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と共にプロモーターは、対象のＤＮＡ配列の発現に必要である。
【００５１】
このような発現カセットは、調節領域の転写調節下にくるようにデルタ−エンドトキシン配列を挿入するための複数の制限酵素部位を備えている。
【００５２】
発現カセットは、転写の５’−３’方向に、植物において機能する、転写および翻訳開始領域（すなわちプロモーター）、本発明のＤＮＡ配列、並びに翻訳および転写終結領域（すなわち終結領域）を含む。プロモーターは、植物宿主および／または本発明のＤＮＡ配列に対して、天然または類似、あるいは外来または異種であり得る。さらに、プロモーターは天然配列または代替的には合成配列であり得る。プロモーターが植物宿主に対して「天然」または「相同」である場合、プロモーターは、プロモーターが導入された天然植物に見られることを意味する。プロモーターが本発明のＤＮＡ配列に対して「外来」または「異種」である場合、プロモーターは、本発明の作動可能に連結されたＤＮＡ配列に対して天然ではないまたは天然に存在するプロモーターではないことを意味する。
【００５３】
終結領域は、転写開始領域に対して天然であり得るか、対象の作動可能に連結されたＤＮＡ配列に対して天然であり得るか、植物宿主に対して天然であり得るか、または別の起源に由来し得る（すなわち、プロモーター、対象のＤＮＡ配列、植物宿主、またはその任意の組合せに対して外来または異種）。簡便な終結領域は、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域などの、A. tumefaciensのＴｉプラスミドから入手できる。Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; and Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639も参照されたい。
【００５４】
適宜、遺伝子（群）は、形質転換された宿主細胞において発現を増加させるために最適化され得る。すなわち、遺伝子は、発現向上のために宿主細胞に好ましいコドンを使用して合成されることができるか、または宿主に好ましいコドン使用頻度でコドンを使用して合成され得る。一般に、遺伝子のＧＣ含量は増加するだろう。例えば、宿主の好ましいコドン使用の考察については、例えば、Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11を参照されたい。植物に好ましい遺伝子を合成するための方法が当技術分野において入手可能である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,380,831号および5,436,391号およびMurray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498を参照されたい。
【００５５】
１つの実施態様において、デルタ−エンドトキシンは、発現のために葉緑体を標的とする。このように、デルタ−エンドトキシンが葉緑体に直接挿入されない場合、発現カセットは、デルタ−エンドトキシンを葉緑体に導く輸送ペプチドをコードする核酸をさらに含むだろう。このような輸送ペプチドは当技術分野において公知である。例えば、Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421;およびShah et al. (1986) Science 233:478-481を参照されたい。
【００５６】
葉緑体を標的とするデルタ−エンドトキシン遺伝子は、植物核とこの細胞小器官の間のコドン使用の差異を考慮して葉緑体において発現のために最適化され得る。このように、対象の核酸は、葉緑体で使用頻度がより高いコドンを使用して合成され得る。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,380,831号を参照されたい。
【００５７】
植物形質転換
本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物に導入することを含む。「導入」とは、構築物が植物の細胞内部に進入できるように、植物にヌクレオチド構築物を与えることを意味する。本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入するための特別な方法が使用されることを要求せず、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも１つの細胞の内部に進入できることのみを要求する。ヌクレオチド構築物を植物に導入するための方法は当技術分野において公知であり、安定な形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルス媒介法を含むがこれらに限定されるわけではない。
【００５８】
「植物」とは、全植物、植物器官（例えば葉、幹、根など）、種子、植物細胞、珠芽、胚、およびその子孫を意味する。植物細胞は、分化または非分化であり得る（例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師部細胞、花粉）。
【００５９】
「トランスジェニック植物」または「形質転換植物」または「安定に形質転換された」植物または細胞または組織は、植物細胞に外来性核酸配列またはＤＮＡ断片を取り込んだまたは組み込んだ植物をいう。これらの核酸配列は、外来性である、すなわち非形質転換植物細胞に存在しないもの、並びに、内因性であり得る、すなわち非形質転換植物細胞に存在するものを含む。「異種」は、一般に、細胞、またはそれらが存在する天然ゲノムの一部に対して内因性ではなく、そして、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔、マイクロプロジェクションなどによって細胞に加えられた核酸配列をいう。
【００６０】
植物細胞の形質転換は、当技術分野において公知のいくつかの技術の１つによって達成することができる。本発明のデルタ−エンドトキシン遺伝子は、植物細胞における発現を獲得または増強するために改変され得る。典型的には、このようなタンパク質を発現する構築物は、遺伝子の転写を駆動するためのプロモーター、並びに、転写終結およびポリアデニル化を可能とするための３’非翻訳領域を含む。このような構築物の構成は当技術分野において公知である。いくつかの場合において、得られるペプチドが分泌されるか、または植物細胞内に別様に標的化されるように遺伝子を操作することが有用であり得る。例えば、遺伝子を、小胞体へのペプチドの輸送を容易にするためのシグナルペプチドを含むように操作することができる。イントロンのｍＲＮＡプロセシングが発現のために必要とされるように、植物発現カセットにイントロンを含むように操作することがまた好ましくあり得る。
【００６１】
典型的には、この「植物発現カセット」は、「植物形質転換ベクター」に挿入されるだろう。この植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するために必要とされる１つ以上のＤＮＡベクターを含み得る。例えば、１つより多い連続ＤＮＡセグメントを含む植物形質転換ベクターを利用することが当技術分野において一般的な慣行である。これらのベクターは、しばしば当技術分野において「バイナリーベクター」といわれる。バイナリーベクター並びにヘルパープラスミドを有するベクターは、アグロバクテリウム媒介形質転換に最もよく使用され、効率的な形質転換を達成するのに必要なＤＮＡセグメントのサイズおよび複雑性が極めて大きく、そして別々のＤＮＡ分子上に機能を分離するのに有利である。バイナリーベクターは、典型的には、Ｔ−ＤＮＡ導入に必要とされるシス作用配列（例えば左境界および右境界）、植物細胞において発現できるように操作された選択マーカー、および「対象の遺伝子」（トランスジェニック植物の作製が望まれる植物細胞において発現できるように操作された遺伝子）を含むプラスミドベクターを含む。このプラスミドベクター上にはまた細菌複製に必要とされる配列も存在する。シス作用配列は、植物細胞への効率的な導入およびそこでの発現を可能とするように配置されている。例えば、選択マーカー遺伝子およびデルタ−エンドトキシンは、左境界と右境界の間に位置する。しばしば第二プラスミドベクターは、アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡの導入を媒介するトランス作用因子を含む。このプラスミドはしばしば、当技術分野において理解されているように(Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451)、アグロバクテリウムによる植物細胞の感染、および境界配列における切断によるＤＮＡの導入およびvir媒介ＤＮＡ導入を可能とする、病原性機能（Vir遺伝子）を含む。いくつかのタイプのアグロバクテリウム株（例えば、LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105など）を植物形質転換に使用することができる。第二プラスミドベクターは、マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔、ポリエチレングリコールなどの他の方法による植物の形質転換には必要ではない。
【００６２】
一般に、植物形質転換法は、異種ＤＮＡを標的植物細胞（例えば、非成熟または成熟胚、懸濁培養液、非分化カルス、プロトプラストなど）に導入し、次いで最大閾値レベルの適切な選択（選択マーカー遺伝子に依存して）をかけることによって一群の非形質転換細胞塊から形質転換植物細胞を回収することを含む。外植片は、典型的には新たに供給した同じ培地に移され、そして慣用的に培養される。その後、最大閾値レベルの選択剤を補充した再生培地に置いた後、形質転換された細胞は芽に分化する。その後、根づいた芽または小植物を回収するために芽を選択発根培地に移す。その後、トランスジェニック小植物は成熟植物へと成長し、そして繁殖性の種子を産生する(例えば、Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750)。外植片は、典型的には同じ培地の新しい供給物に移され、そして慣用的に培養される。トランスジェニック植物を作製するための技術および方法の一般的な記載は、Ayres and Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239およびBommineni and Jauhar (1997) Maydica 42:107-120に見られる。形質転換された材料は多くの細胞を含むので、形質転換細胞と非形質転換細胞の両方が、主題の標的カルスまたは組織または細胞群のあらゆる断片に存在する。非形質転換細胞を殺滅しそして形質転換細胞を増殖させる能力により、形質転換された植物培養物が得られる。しばしば、非形質転換細胞を除去する能力は、迅速な形質転換植物細胞の回収、および成功裏のトランスジェニック植物の作製に対する制約である。
【００６３】
形質転換プロトコル並びにヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコルは、形質転換の標的となる、植物または植物細胞のタイプ、すなわち単子葉または双子葉植物に依存して変化し得る。トランスジェニック植物の作製は、マイクロインジェクション、電気穿孔、直接的な遺伝子導入、アグロバクテリウムによる植物細胞への異種ＤＮＡの導入（アグロバクテリウム媒介形質転換）、粒子に付着させた異種外来ＤＮＡを用いての植物細胞への衝撃、弾道粒子加速、エアゾールビーム形質転換米国特出願許第20010026941号; 米国特許第4,945,050号; 国際出願第WO 91/00915号; 米国特許第2002015066号)、Ｌｅｃ１形質転換、およびＤＮＡを導入するための様々な他の非粒子直接媒介方法を含むがこれらに限定されるわけではない、いくつかの方法の１つによって実施され得る。
【００６４】
葉緑体の形質転換のための方法は当技術分野において公知である。例えば、Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606を参照されたい。前記方法は、選択マーカーを含むＤＮＡの粒子銃送達および相同組換えによるプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化に依拠する。さらに、プラスチド形質転換は、核のコードするプラスチド指向性ＲＮＡポリメラーゼの組織に好ましい発現によるサイレントプラスチド媒介導入遺伝子のトランス活性化によって達成することができる。このようなシステムは、McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305に報告されている。
【００６５】
植物細胞に異種外来ＤＮＡを組み込んだ後、次いで、培地中で最大閾値レベルの適切な選択を適用して、非形質転換細胞を殺滅分離し、そして定期的に新しい培地に移すことによって、この選択処理から生き延びた形質転換されたと推定される細胞を増殖させる。連続的に継代しそして適切な選択をかけることによって、プラスミドベクターで形質転換された細胞を同定し増殖させる。その後、分子および生化学的方法を使用して、トランスジェニック植物のゲノムに組み込まれた対象の異種遺伝子の存在を確認することができる。
【００６６】
形質転換された細胞は、従来の方法に従って植物へと成長させ得る。例えば、McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84を参照されたい。その後、これらの植物を成長させ得、そして同じ形質転換株または異なる株で受粉し、そして得られたハイブリッドが、所望の表現型特徴の構成的発現を有するかどうかを同定する。所望の表現型特徴の発現が安定に維持および遺伝されていることを確実にするために２世代以上を成長させ得、そして所望の表現型特徴の発現が達成されたことを確実にするために種子を収穫し得る。このように、本発明は、そのゲノムに安定に取り込まれた、本発明のヌクレオチド構築物、例えば本発明の発現カセットを有する、形質転換された種子（「トランスジェニック種子」ともいう）を提供する。
【００６７】
植物形質転換の評価
植物細胞に異種外来ＤＮＡを導入した後、植物ゲノムにおける異種遺伝子の形質転換または組込みは、組み込まれた遺伝子に関連した核酸、タンパク質および代謝物の分析などの様々な方法によって確認される。
【００６８】
ＰＣＲ解析は、土壌に移植する前のより早い段階で取り込まれた遺伝子の存在について形質転換された細胞、組織または芽をスクリーニングするための迅速な方法である(Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。ＰＣＲは、対象の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたはアグロバクテリウムベクターバックグラウンドなどを使用して行なわれる。
【００６９】
植物形質転換は、ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析によって確認され得る(Sambrook and Russell, 2001、前記)。一般に、全ＤＮＡを形質転換体から抽出し、適切な制限酵素で消化し、アガロースゲルで分画し、そしてニトロセルロースまたはナイロンメンブランに転写する。その後、メンブランまたは「ブロット」を、例えば放射標識した３２Ｐ標的ＤＮＡ断片でプローブし、標準的な技術に従って植物ゲノムへの導入遺伝子の組込みを確認する(Sambrook and Russell, 2001、前記)。
【００７０】
ノザンブロット解析では、当技術分野において慣用的に使用される標準的な手順に従ってＲＮＡが、形質転換体の特定の組織から単離され、ホルムアルデヒドアガロースゲルで分画され、そしてナイロンフィルターにブロッティングされる(Sambrook and Russell, 2001、前記)。その後、デルタ−エンドトキシンによってコードされるＲＮＡの発現を、当技術分野において公知の方法によって、デルタ−エンドトキシン由来の放射性プローブにフィルターをハイブリダイゼーションさせることによって試験する(Sambrook and Russell, 2001、前記)。
【００７１】
ウェスタンブロット、生化学アッセイなどをトランスジェニック植物に行なって、デルタ−エンドトキシンタンパク質上に存在する１つ以上のエピトープに結合する抗体を使用して、標準的な手順によってデルタ−エンドトキシン遺伝子によってコードされるタンパク質の存在を確認し得る(Sambrook and Russell, 2001、前記)。
【００７２】
植物における殺虫活性
本発明の別の態様において、殺虫活性を有するデルタ−エンドトキシンを発現しているトランスジェニック植物を作製し得る。例として前記した方法を使用してトランスジェニック植物を作製し得るが、トランスジェニック植物細胞を作製する様式は本発明にとって重要ではない。アグロバクテリウム媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、および非粒子媒介方法などの当技術分野において公知または記載された方法を、実験者の判断で使用し得る。デルタ−エンドトキシンを発現している植物は、例えば、カルスの形質転換、形質転換されたカルスの分泌、およびこのようなトランスジェニックカルスからの繁殖性植物の再生などの、当技術分野において記載される一般的な方法によって単離し得る。このようなプロセスにおいて、植物細胞におけるその発現が、形質転換細胞を同定または選択するための能力を付与する限りにおいて、任意の遺伝子を選択マーカーとして使用し得る。
【００７３】
植物細胞で使用するための多くのマーカー、例えばクロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、ヒグロマイシン耐性マーカーなどが開発されている。葉緑体代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子もまた選択マーカーとして使用され得る。例えば、グリホサート、ブロモキシニル、またはイミダゾリノンなどの植物除草剤に対する耐性を付与する遺伝子は、特定の用途を見出し得る。このような遺伝子が報告されている(Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314（ブロモキシニル耐性ニトリラーゼ遺伝子）；およびSathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:2188（ＡＨＡＳイミダゾリノン耐性遺伝子）。さらに、本明細書で開示された遺伝子は、細菌または植物細胞の形質転換を評価するためのマーカーとして有用である。植物、植物器官（例えば葉、幹、根など）、種子、植物細胞、珠芽、胚、またはその子孫における導入遺伝子の存在を検出するための方法は当技術分野において周知である。１つの実施態様において、導入遺伝子の存在は、殺虫活性を試験することによって検出される。
【００７４】
デルタ−エンドトキシンを発現している繁殖性植物を殺虫活性について試験し得、そして最適活性を示す植物をさらなる育種のために選択し得る。害虫活性についてアッセイするための方法が当技術分野において利用可能である。一般に、タンパク質を混合し、そして摂食アッセイにおいて使用される。例えば、Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293を参照されたい。
【００７５】
本発明は、単子葉および双子葉植物を含むがこれらに限定されるわけではない、任意の植物種の形質転換に使用され得る。対象の植物の例は、コーン（トウモロコシ）、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびナタネ、Brassica種、アルファルファ、ライムギ、アワ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類の木、ココア、お茶、バナナ、アボカド、イチジク、グァバ、マンゴー、オリーブ、パパイア、カシュー、マカダミヤ、アーモンド、オートムギ、野菜、観葉植物、および球果植物を含むがこれらに限定されるわけではない。
【００７６】
野菜は、トマト、レタス、グリーンビーンズ、ライマメ、エンドウおよびCurcumis属のメンバー（例えばキュウリ、カンタロープおよびマスクメロンなど）を含むがこれらに限定されるわけではない。観葉植物は、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、ラッパスイセン、ツクバネアサガオ、カーネーション、ポインセチア、およびキクを含むがこれらに限定されるわけではない。好ましくは、本発明の植物は、穀物植物である（例えば、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびナタネなど）。
【００７７】
害虫防御における使用
殺虫剤制御においてまたは殺虫剤として他の生物を操作する際に、本発明のヌクレオチド配列またはその変異体を含む株を使用するための一般的な方法は当技術分野において公知である。例えば、米国特許第5,039,523号および欧州特許第0480762A2号を参照されたい。
【００７８】
本発明のヌクレオチド配列またはその変異体を含むBacillus株、または殺虫性遺伝子およびタンパク質を含むように遺伝子的に改変された微生物を、農業穀物および生産物を害虫から保護するために使用し得る。本発明の１つの態様において、毒素（殺虫剤）産生生物の完全細胞、すなわち非溶解細胞を、細胞が標的害虫（群）の環境に適用されると細胞中において産生される毒素の活性を持続させる試薬で処理する。
【００７９】
または、殺虫剤は、デルタ−エンドトキシン遺伝子を細胞宿主に導入することによって産生される。デルタ−エンドトキシン遺伝子の発現によって、直接的にまたは間接的に、殺虫剤が細胞内に産生および維持される。本発明の１つの態様において、その後、これらの細胞を、細胞が標的害虫（群）の環境に適用されると細胞中において産生される毒素の活性を持続させる条件下で処理する。得られる産物は、毒素の毒性を保持する。その後、これらの天然に封入された殺虫剤は、標的害虫が住む環境、例えば土壌、水、および植物の枝葉への適用のための従来の技術に従って調合され得る。例えば、EPA 0192319およびそこに引用される文献を参照されたい。または、例えば得られる材料を殺虫剤として適用できるようにするために、本発明の遺伝子を発現している細胞を調合し得る。
【００８０】
殺虫性組成物
本発明の活性成分は、通常、組成物の形態で適用され、そして他の化合物と共に同時にまたは連続的に、処置しようとする穀物地帯または植物に適用することができる。これらの化合物は、肥料、雑草除去剤、抗凍結剤、界面活性剤、洗浄剤、殺虫性石鹸、ドルマントオイル（dormant oils）、ポリマー、および／または１回の製剤の適用後に標的領域の長期投与を可能とする徐放性もしくは生分解性担体製剤であり得る。それらはまた、所望であれば、さらに農学的に許容される担体、界面活性剤、または製剤の分野で慣用的に使用される適用を促進する補助剤を一緒に含む、選択的除草剤、化学的殺昆虫剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤、抗アメーバ剤、殺虫剤、抗真菌剤、抗細菌剤、抗線虫剤、軟体類駆除剤、またはこれらの調製物のいくつかの混合物であり得る。適切な担体および補助剤は、固体または液体であり得、そして製剤技術で通常使用される物質、例えば天然もしくは再生鉱物、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合剤または肥料に相当する。同様に、製剤は、標的害虫による殺虫性製剤の摂食または摂取を可能とするために、食用「餌」へと調製し得るか、または害虫「罠」へと形作られ得る。
【００８１】
本発明の細菌株によって産生される殺虫性タンパク質の少なくとも１つを含む、本発明の活性成分または本発明の農薬組成物を適用する方法は、葉への適用、種子コーティングおよび土壌適用を含む。適用回数および適用の割合は、対応する害虫による蔓延の強度に依存する。
【００８２】
前記組成物は、粉剤、粉塵、ペレット、顆粒剤、スプレー、エマルション、コロイド、液剤またはそのような類似物などとして製剤化され得、そして、前記ポリペプチドを含む細胞培養物の乾燥、凍結乾燥、ホモジネート、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、または濃縮などのこのような従来の手段によって調製され得る。少なくとも１つのこのような殺虫性ポリペプチドを含む全てのこのような組成物において、前記ポリペプチドは、約１重量％〜約９９重量％の濃度で存在し得る。
【００８３】
チョウ目、甲虫目、または線虫害虫は、多数、特定の領域において本発明の方法によって殺滅または減少され得るか、または感受性害虫による蔓延を防ぐために環境領域に予防的に適用され得る。好ましくは害虫は、殺虫有効量のポリペプチドを摂取するか、またはそれと接触する。「殺虫有効量」とは、少なくとも１つの害虫に死をもたらすか、または害虫の成長、摂食、または一般的な生理的発達を顕著に低減させることのできる殺虫剤の量を意味する。この量は、防御しようとする特定の標的害虫、処置しようとする特定の環境、場所、植物、穀物、または農業用地、環境条件、並びに殺虫に有効なポリペプチド組成物の適用の方法、割合、濃度、安定性および量などの因子に依存して変化するだろう。製剤はまた、気候条件、環境整備、および／または適用頻度および／または害虫蔓延の重度に対して変化し得る。
【００８４】
記載の殺虫性組成物は、細菌細胞、結晶および／または胞子懸濁液、または単離タンパク質成分のいずれかを、所望の農業的に許容される担体と共に製剤化することによって作製され得る。組成物は、投与前に、凍結乾燥（lyophilized）、凍結乾燥（freeze-dried）、乾燥などの適切な手段で、または水性担体、媒体または適切な希釈剤、例えば食塩水または他の緩衝液中で製剤化され得る。製剤化された組成物は、粉塵または顆粒材料、または油（植物油または鉱物油）もしくは水もしくは油／水エマルション中の懸濁液として、または湿潤可能な粉末として、または農業適用に適した任意の他の担体材料と組み合わせた態様であり得る。適切な農学的担体は固体または液体であり得、そして当技術分野において周知である。用語「農学的に許容される担体」は、殺虫性製剤技術に通常使用される全ての補助剤、不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着付与剤、結合剤などを網羅し；これらは殺虫性製剤の当業者には周知である。製剤は１つ以上の固体または液体補助剤と混合し得、そして、従来の製剤技術を使用して適切な補助剤と共に殺虫性組成物を例えば均一に混合、ブレンドおよび／または粉砕することなどの様々な手段によって調製され得る。適切な製剤および適用法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,468,523号に記載されている。
【００８５】
「害虫」は、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニなどを含むがこれらに限定されるわけではない。昆虫害虫は、甲虫目（Coleoptera）、ハエ目（Diptera）、ハチ目（Hymenoptera）、チョウ目（Lepidoptera）、ハジラミ目（Mallophaga）、ヨコバイ亜類（Homoptera）、カメムシ目（Hemiptera）、バッタ目（Orthroptera）、アザミウマ目（Thysanoptera）、ハサミムシ目（Dermaptera）、シロアリ目（Isoptera）、シラミ目（Anoplura）、ノミ目（Siphonaptera）、トビケラ目（Trichoptera）など、特に甲虫目、チョウ目およびハエ目から選択される昆虫を含む。
【００８６】
甲虫目は、オサムシ（Adephaga）およびカブトムシ（Polyphaga）亜目を含む。オサムシ亜目は、CaraboideaおよびGyrinoidea上科を含むが、カブトムシ亜目は、Hydrophiloidea、Staphylinoidea、Cantharoidea、Cleroidea、Elateroidea、Dascilloidea、Dryopoidea、Byrrhoidea、Cucujoidea、Meloidea、Mordelloidea、Tenebrionoidea、Bostrichoidea、Scarabaeoidea、Cerambycoidea、Chrysomeloidea、およびCurculionoidea上科を含む。Caraboidea上科は、Cicindelidae、Carabidae、およびDytiscidae科を含む。Gyrinoidea上科は、Gyrinidae科を含む。Hydrophiloidea上科は、Hydrophilidae科を含む。Staphylinoidea上科は、SilphidaeおよびStaphylinidae科を含む。Cantharoidea上科は、CantharidaeおよびLampyridae科を含む。Cleroidea上科は、CleridaeおよびDermestidae科を含む。Elateroidea上科は、ElateridaeおよびBuprestidae科を含む。Cucujoidea上科は、Coccinellidae科を含む。Meloidea上科は、Meloidae科を含む。Tenebrionoidea上科は、Tenebrionidae科を含む。Scarabaeoidea上科は、PassalidaeおよびScarabaeidae科を含む。Cerambycoidea上科は、Cerambycidae科を含む。Chrysomeloidea上科は、Chrysomelidae科を含む。Curculionoidea上科は、CurculionidaeおよびScolytidae科を含む。
【００８７】
ハエ目は、長角亜目（Nematocera）、短角亜目（Brachycera）および還縫亜目（Cyclorrhapha）を含む。長角亜目は、Tipulidae、Psychodidae、Culicidae、Ceratopogonidae、Chironomidae、Simuliidae、Bibionidae、およびCecidomyiidae科を含む。短角亜目は、Stratiomyidae、Tabanidae、Therevidae、Asilidae、Mydidae、Bombyliidae、およびDolichopodidae科を含む。還縫亜目は、AschizaおよびAschiza門を含む。Aschiza門は、Phoridae、Syrphidae、およびConopidae科を含む。Aschiza門は、AcalyptrataeおよびCalyptratae節を含む。Acalyptratae節は、Otitidae、Tephritidae、Agromyzidae、およびDrosophilidae科を含む。Calyptratae節は、Hippoboscidae、Oestridae、Tachinidae、Anthomyiidae、Muscidae、Calliphoridae、およびSarcophagidae科を含む。
【００８８】
チョウ目は、アゲハチョウ科（Papilionidae）、シロチョウ科（Pieridae）、シジミチョウ科（Lycaenidae）、タテハチョウ科（Nymphalidae）、マダラチョウ科（Danaidae）、ジャノメチョウ科（Satyridae）、セセリチョウ科（Hesperiidae）、スズメガ科（Sphingidae）、ヤママユガ科（Saturniidae）、シャクガ科（Geometridae）、ヒトリガ科（Arctiidae）、ヤガ科（Noctuidae）、ドクガ科（Lymantriidae）、スカシバガ科（Sesiidae）およびヒロズコガ科（Tineidae）を含む。
【００８９】
線虫は、寄生性線虫、例えばネコブ、シスト、およびネグサレ線虫（Heterodera spp. 、Meloidogyne spp.、およびGlobodera spp.を含む）、特にシスト線虫のメンバー（Heterodera glycines (ダイズシスト線虫); Heterodera schachtii (ビートシスト線虫); Heterodera avenae (穀類シスト線虫);およびGlobodera rostochiensisおよびGlobodera pailida (ジャガイモシスト線虫)を含むがこれらに限定されるわけではない）を含む。ネグサレ線虫は、Pratylenchus spp.を含む。
【００９０】
主要な作物についての本発明の昆虫害虫には以下が含まれる：
トウモロコシ：Ostrinia nubilalis、アワノメイガ（European corn borer）；Agrotis ipsilon、タマナヤガ（black cutworm）；アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、オオタバコガ（corn earworm）；Spodoptera frugiperda、ヨトウガ（fall armyworm）；Diatraea grandiosella、南西部アワノメイガ（southwestern corn borer）；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ（lesser cornstalk borer）；Diatraea saccharalis、サトウキビメイガ（surgarcane borer）；Diabrotica virgifera、ウエスタンコーンルートワーム（western corn rootworm）；Diabrotica longicornis barberi、ノーザンコーンルートワーム（northern corn rootworm）；Diabrotica undecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム（southern corn rootworm）；Melanotus spp.、ワイアワーム（wireworms）；Cyclocephala borealis、ノーザンマスクドコガネムシ（northern masked chafer）（ホワイトグラブ）；Cyclocephala immaculata、サザンマスクドコガネムシ（southern masked chafer）（ホワイトグラブ）；Popillia japonica、マメコガネ（Japanese beetle）；Chaetocnema pulicaria、ミノハムシ（corn flea beetle）；Sphenophorus maidis、メイズビルバグ（maize billbug）；Rhopalosiphum maidis、コーンリーフアフィド（corn leaf aphid）；Anuraphis maidiradicis、コーンルートアフィド（corn root aphid）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ（chinch bug）；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー（redlegged grasshopper）；Melanoplus sanguinipes、ミグラトリーグラスホッパー（migratory grasshopper）；タネバエ（Hylemya platura）、シードコーンマゴット（seedcorn maggot）；Agromyza parvicornis、コーンブロットリーフマイナー（corn blot leafminer）；Anaphothrips obscrurus、グラススリップス（grass thrips）；Solenopsis milesta、シーフアント（thief ant）；ナミハダニ（Tetranychus urticae）、ツースポテッドスパイダーマイト（twospotted spider mite）；
ソルガム：Chilo partellus、ソルガムボーラー（sorghum borer）；Spodoptera frugiperda、ヨウトガ；アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、オオタバコガ；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ；Feltia subterranea、グラニュレートカットワーム（granulate cutworm）；Phyllophaga crinita、ホワイトグラブ（white grub）；エレオデス（Eleodes）属、コノデルス（Conoderus）属、およびアエオルス（Aeolus）属、ワイアワーム；Oulema melanopus、シリアルリーフビートル（cereal leaf beetle）；Chaetocnema pulicaria、ミノハムシ；Sphenophorus maidis、メイズビルバグ；Rhopalosiphum maidis、コーンリーフアフィド；Sipha flava、イエローシュガーケーンアフィド（yellow sugarcane aphid）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ；ソルガムタマバエ（Contarinia sorghicola）、ソルガムミッジ（sorghum midge）；ニセナミハダニ（Tetranychus cinnabarinus）、カーマインスパイダーマイト（carmine spider mite）；ナミハダニ（Tetranychus urticae）、ツースポテッドスパイダーマイト；
コムギ：Pseudaletia unipunctata、アーミーワーム（army worm）；Spodoptera frugiperda、ヨウトガ；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ；Agrotis orthogonia、ウエスタンカットワーム（western cutworm）；Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ；Oulema melanopus、シリアルリーフビートル（cereal leaf beetle）；Hypera punctata、クローバーリーフウィービル（clover leaf weevil）；Diabrotica undecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム；ロシアンウィートアフィド（Russian wheat aphid）；ムギミドリアブラムシ（Schizaphis graminum）、グリーンバグ（greenbug）；ムギヒゲナガアブラムシ（Macrosiphum avenae）、イングリッシュグレインアフィド（English grain aphid）；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー（differential grasshopper）；Melanoplus sanguinipes、ミグラトリーグラスホッパー；Mayetiola destructor、ヘシアンフライ（Hessian fly）；ムギアカタマバエ（Sitodiplosis mosellana）、ウィートミッジ（wheat midge）；Meromyza americana、ウィートステムマゴット（wheat stem maggot）；Hylemya coarctata、ウィートバルブフライ（wheat bulb fly）；Frankliniella fusca、タバコスリップス（tobacco thrips）；Cephus cinctus、ウィートステムソーフライ（wheat stem sawfly）；チューリップサビダニ（Aceria tulipae）、ウィートカールマイト（wheat curl mite）；
ヒマワリ：Suleima helianthana、サンフラワーバッドモス（sunflower bud moth）；Homoeosoma electellum、サンフラワーモス（sunflower moth）；zygogramma exclamationis、サンフラワービートル（sunflower beetle）；Bothyrus gibbosus、キャロットビートル（carrot beetle）；Neolasioptera murtfeldtiana、サンフラワーシードミッジ（sunflower seed midge）；
ワタ：Heliothis virescens、コットンバッドワーム（cotton budworm）；アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、コットンボールワーム（cotton bollworm）；シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）、ビートアーミーワーム（beet armyworm）；ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、ピンクボールワーム（pink bollworm）；Anthonomus grandis、ボールウィービル（boll weevil）；ワタアブラムシ（Aphis gossypii）、コットンアフィド（cotton aphid）；Pseudatomoscelis seriatus、コットンフリーホッパー（cotton fleahopper）；Trialeurodes abutilonea、バンデッドウィングドホワイトフライ（bandedwinged whitefly）；サビイロカスミカメ（Lygus lineolaris）、ターニシュドプラントバグ（tarnished plant bug）；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー；ネギアザミウマ（Thrips tabaci）、オニオンスリップス（onion thrips）；Franklinkiella fusca、タバコスリップス；ニセナミハダニ（Tetranychus cinnabarinus）、カーマインスパイダーマイト（carmine spider mite）；ナミハダニ（Tetranychus urticae）、ツースポテッドスパイダーマイト；
コメ：Diatraea saccharalis、シュガーケーンボーラー；Spodoptera frugiperda、ヨトウガ；アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、コーンイアーワーム；Colaspis brunnea、グレープコラスピス（grape colaspis）；イネミズゾウリムシ（Lissorhoptrus oryzophilus）、ライスウォーターウィービル（rice water weevil）；ココクゾウムシ（Sitophilus oryzae）、ライスウィービル（rice weevil）；クロスジツマグロヨコバイ（Nephotettix nigropictus）、ライスリーフホッパー（rice leafhopper）；Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ；Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ（green stink bug）；
ダイズ：Pseudoplusia includens、ソイビーンルーパー（soybean looper）；Anticarsia gemmatalis、ベルベットビーンキャタピラー（velvetbean caterpillar）；Plathypena scabra、グリーンクローバーワーム（green cloverworm）；Ostrinia nubilalis、アワノメイガ； Agrotis ipsilon、タマナヤガ；シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）、ビートアーミーワーム；Heliothis virescens、コットンバッドワーム；アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、コットンボールワーム；インゲンテントウ（Epilachna varivestis）、メキシカンビーンビートル（Mexican bean beetle）；モモアカアブラムシ（Myzus persicae）、グリーンピーチアフィド（green peach aphid）；ジャガイモヒメヨコバイ（Empoasca fabae）、ポテトリーフホッパー（potato leafhopper）；Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ；Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー；Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー；タネバエ（Hylemya platura）、シードコーンマゴット；Sericothrips variabilis、ソイビーンスリップス（soybean thrips）；ネギアザミウマ（Thrips tabaci）、オニオンスリップス；Tetranychus turkestani、ストロベリースパイダーマイト（strawberry spider mite）；ナミハダニ（Tetranychus urticae）、ツースポテッドスパイダーマイト；
オオムギ：Ostrinia nubilalis、アワノメイガ； Agrotis ipsilon、タマナヤガ；ムギミドリアブラムシ（Schizaphis graminum）、グリーンバグ；Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ；Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ；Euschistus servus、ブラウンスティンクバグ（brown stink bug）；タネバエ（Delia platura）、シードコーンマゴット；ヘシアンバエ（Mayetiola destructor）、ヘシアンフライ；Petrobia latens、ブラウンウィートマイト（brown wheat mite）；
ナタネ：ダイコンアブラムシ（Brevicoryne brassicae）、キャベジアフィド（cabbage aphid）；Phyllotreta cruciferae、フリービートル（Flea beetle）；Mamestra configurata、バーサアーミーワーム（Bertha armyworm）；コナガ（Plutella xylostella）、ダイヤモンドバックモス；デリア（Delia）属、ルートマゴット（Root maggots）。
【００９１】
植物収穫を増加させるための方法
植物収穫を増加させるための方法が提供される。前記方法は、植物または植物細胞に、本明細書で開示した殺虫性配列を含むポリヌクレオチドを導入することを含む。本明細書で定義したような植物の「収穫」は、植物によって産生されるバイオマスの品質および／または量をいう。「バイオマス」とは、任意の測定される植物産物を意味する。バイオマス産生の増加は、測定される植物産物の収穫の任意の向上である。植物収穫の増加は、いくつかの商業的な応用を有する。例えば、植物の葉のバイオマスの増加は、ヒトまたは動物の消費のための葉野菜の収穫を増加させ得る。さらに、葉バイオマスの増加を使用して、植物に由来する医薬または工業製品の産生を増加させることができる。収穫の増加は、殺虫性配列を発現していない植物と比較して、収穫において少なくとも１％増加、少なくとも３％増加、少なくとも５％増加、少なくとも１０％増加、少なくとも２０％増加、少なくとも３０％増加、少なくとも５０％増加、少なくとも７０％増加、少なくとも１００％またはそれ以上の増加を含むがこれらに限定されるわけではない任意の統計学的に有意な増加を含み得る。
【００９２】
特別な方法において、植物収穫は、本明細書に開示した殺虫性タンパク質を発現している植物の害虫抵抗性を向上させることにより増加する。殺虫性タンパク質の発現により、害虫が植物に外寄生または植物を摂食する能力が低下し、従って植物の収穫が向上する。
【００９３】
以下の実施例は、説明のために提供され制限するためではない。
【００９４】
実験項
実施例１．Bacillus thuringiensis由来の新規殺虫性遺伝子の発見
新規な殺虫性遺伝子は、以下のステップを使用して表１に列挙された細菌株から同定された：
・典型的にデルタ−エンドトキシン遺伝子を有するプラスミドを含む、株からの染色体外ＤＮＡの調製
・サイズ分別断片を作製するための染色体外ＤＮＡの機械的剪断
・約２Ｋｂ〜約１０Ｋｂ断片の染色体外ＤＮＡのクローニング
・染色体外ＤＮＡの約１５００クローンの伸長
・クローニングベクターに特異的なプライマーを使用した１５００個のクローンの部分的シークエンス（末端解読）
・ＭｉＤＡＳアプローチを介した相同性解析による推定毒素遺伝子の同定（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第20040014091号に記載）
・対象の推定毒素遺伝子の断片を含むクローンの配列解読完了（ウォーキング）
【００９５】
【表１】
2011526150.tif 000002
１Axmi0014またはAxmi008などの別の毒素と共に発現または対になった場合の潜在的な共活性
２Axmi0014またはAxmi009などの別の毒素と共に発現または対になった場合の潜在的な共活性
３ホスホリパーゼＣ触媒ドメインに相同なＮ末端ドメイン
４Axmi052などの別の毒素と共に発現または対になった場合の潜在的な共活性
５Axmi051などの別の毒素と共に発現または対になった場合の潜在的な共活性
【００９６】
実施例２．Bacillus thuringiensis由来の新規殺虫性遺伝子の発見
新規殺虫性遺伝子を、以下のステップを使用して、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第20040014091号に記載のＭｉＤＡＳアプローチを使用して表２に列挙された株から同定した：
・株からの染色体外ＤＮＡの調製。染色体外ＤＮＡは、以下のいくつかまたは全ての混合物を含む：様々なサイズのプラスミド；ファージ染色体；精製プロトコルによって分離されないゲノムＤＮＡ断片；他の特徴づけられていない染色体外分子。
・サイズ分別断片を作製するための染色体外ＤＮＡの機械的または酵素的剪断。
・断片化ＤＮＡのシークエンス
・相同性および／または他のコンピューター分析を介した推定毒素遺伝子の同定。
・必要である場合、いくつかのＰＣＲまたはクローニング方法の１つによる対象の遺伝子の配列解読完了（例えばＴＡＩＬ−ＰＣＲ）。
【００９７】
【表２】
2011526150.tif 000003
2011526150.tif 000004
2011526150.tif 000005
１この遺伝子は、分断cry遺伝子のＮ末端部分であり、そして、分断cry対のＣ末端部分を示すAxmi126と天然状態において対になっている。これらの遺伝子は共毒素として作用し得、そして、共発現または融合された場合に増強された、新規の、または改変された活性を示し得る。Axmi125と下流Axmi126の間の介在領域は、配列番号１２２に示される。
２この遺伝子は、分断cry遺伝子のＣ末端部分であり、そして、分断cry対のＮ末端部分を示すAxmi125と天然状態において対になっている。これらの遺伝子は共毒素として作用し得、そして、共発現または融合された場合に増強された、新規の、または改変された活性を示し得る。
【００９８】
実施例３．Bacillus thuringiensis株ＡＴＸ１３０４６に由来する新規毒素遺伝子Axmi068の発見
axmi068をコードしている株は、以下のように同定された：
・公知のまたは推測される毒素遺伝子の配列情報を使用して、毒素群（ファミリー）内の保存されたおよび部分的に保存されたＤＮＡ配列を示すアラインメントを作製した。
・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを設計して、アラインメントした配列に基づいて１つ以上の毒素ファミリーメンバーを選択的に増幅した。
・細菌株から単離したＤＮＡを、ＰＣＲによってスクリーニングして、標的遺伝子ファミリーに対する推定相同体を含む株を同定した。
・ＰＣＲ産物をシークエンスして、対象の遺伝子を含む株を選択した。
【００９９】
完全な遺伝子配列を、ＭｉＤＡＳゲノムアプローチ(米国特許出願第20040014091号)により選択された株から以下のように同定した：
・株からの染色体外ＤＮＡの調製。染色体外ＤＮＡは、以下のいくつかまたは全ての混合物を含む：様々なサイズのプラスミド；ファージ染色体；精製プロトコルによって分離されないゲノムＤＮＡ断片；他の特徴づけられていない染色体外分子。
・サイズ分別断片を作製するための染色体外ＤＮＡの機械的または酵素的剪断。
・プラスミドベクターへの染色体外ＤＮＡ断片のクローニング。
・染色体外ＤＮＡのクローンの増殖および精製。
・クローンの部分的シークエンス。
・相同性および／または他のコンピューター分析による推定毒素遺伝子の同定。
・必要である場合、対象の推定毒素遺伝子の配列を含むクローンの配列解読完了（ウォーキング）。
・axmi068のヌクレオチド配列は配列番号１６に示され、そしてAXMI068に対するアミノ酸配列は配列番号７６に示される。
【０１００】
遺伝子およびタンパク質の特徴
遺伝子の長さ、ＤＮＡ塩基対：                  １，７９１
タンパク質の長さ、アミノ酸残基：              ５９７
推定されるタンパク質分子量、Ｄａ：            ６６，４９５
公知の相同体およびおよその同一率：            Cry1Id1、７１．４％
【０１０１】
実施例４．Bacillusにおける発現
本明細書で開示した殺昆虫性遺伝子はＰＣＲによって増幅され、そしてＰＣＲ産物は、当技術分野において周知の方法によって、Bacillus発現ベクターｐＡＸ９１６または別の適切なベクターにクローニングされる。axmi遺伝子を有するベクターを含む、得られるBacillus株を、胞子形成が顕微鏡検査によって明らかとなるまで、ＣＹＳ培地（１０g/lバクト・カシトン（Bacto-casitone）；３g/l酵母抽出液；６g/lＫＨ２ＰＯ４；１４g/lＫ２ＨＰＯ４；０．５mM ＭｇＳＯ４；０．０５mM ＭｎＣｌ２；０．０５mM ＦｅＳＯ４）などの慣用的な増殖培地で培養する。試料を調製し、そしてバイオアッセイで活性について試験する。
【０１０２】
実施例５．合成配列の構築
本発明の１つの態様において、合成axmi配列を作製した。これらの合成配列は、親axmi配列と比べて改変されたＤＮＡ配列を有し、そして、対応する親ＡＸＭＩタンパク質と同一線上にあるが、多くのデルタ−エンドトキシンタンパク質に存在するＣ末端「結晶ドメイン」を欠失しているタンパク質をコードする。合成遺伝子を表３に提示する。
【０１０３】
【表３】
2011526150.tif 000006
2011526150.tif 000007
2011526150.tif 000008
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【０１０４】
本発明の別の態様において、得られるペプチドが植物小器官、例えば小胞体またはアポプラストを標的とするように、改変型の合成遺伝子が設計される。融合タンパク質が植物小器官を標的とすることが知られるペプチド配列は当技術分野において公知である。例えば、シロバナルピナスLupinus albus(Genebank ID GI:14276838; Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606)由来の酸性ホスファターゼ遺伝子のＮ末端領域は、異種タンパク質が小胞体を標的とすることが当技術分野において知られている。得られる融合タンパク質がまた、Ｃ末端においてペプチドＮ末端−リシン−アスパラギン酸−グルタミン酸−ロイシン（すなわち「ＫＥＤＬ」モチーフ（配列番号１２３））を含む内質保持配列を含むならば、融合タンパク質は小胞体を標的とするだろう。融合タンパク質が、Ｃ末端において小胞体標的化配列を欠失しているならば、タンパク質は小胞体を標的とするが、最終的にはアポプラストに隔離されるだろう。
【０１０５】
実施例６．E. coliおよびBacillusにおけるaxmi100の発現
axmi100の完全ＯＲＦ（１１５６アミノ酸長タンパク質をコードする３．４５kb）を、ｐＲＳＦ１ｂ（ｐＡＸ５４４５を与える）をベースにしたE. coli発現ベクターおよびｐＡＸ９１６（ｐＡＸ５４４４を与える）をベースにしたBacillusベクターにクローニングした。得られたクローンを、制限酵素解析によって、および最終的にクローニングされた遺伝子の完全なシークエンスによって確認した。
【０１０６】
E. coliにおける発現のために、ＢＬ２１＊ＤＥ３をｐＡＸ５４４５で形質転換した。単一コロニーを、カナマイシンが補充されたＬＢにインキュベーションし、そして３７℃で一晩増殖させた。次の日、新しい培地に、一晩培養液の１％を用いて二連で接種し、そして３７℃で対数増殖期まで増殖させた。その後、培養液を、３７℃で３時間または２０℃で一晩、１mM ＩＰＴＧを用いて誘導した。各細胞ペレットを、１mM ＤＴＴが補充された５０mM炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）中に懸濁し、そして超音波処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、Axmi100に対応する１３０kDのタンパク質の発現を検出した。
【０１０７】
Bacillusにおける発現のために、Bacillus thuringiensisをｐＡＸ５４４４で形質転換し、そして単一コロニーを胞子が形成されるまで３日間ＣＹＳ−ｇｌｕ培地中で増殖させた。その後、細胞ペレットを１mM ＤＴＴが補充された５０mM炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）で抽出した。可溶性画分は、Axmi100のプロセシングに起因するいくつかのより小さな分子量のタンパク質バンドと共に、１３０kD Axmi100タンパク質の存在を示した。Axmi100のトリプシン処理は、約６５kDおよび５５kDの２つの別個のタンパク質バンドを与えた。
【０１０８】
実施例７．Axmi100のバイオアッセイ
試料の調製：
ＡＸＭＩ−１００を発現している細胞からの細胞遊離抽出物を、典型的には、還元剤として１mM ＤＴＴを含む、５０mM炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）に再度懸濁した。トリプシンを含むおよび含まない試料を、バイオアッセイ試験のために調製した。
【０１０９】
バイオアッセイ方法の概要：
２４ウェル組織培養プレート（Corning）に、１mlの多種食餌（Bio-Serv）を入れ、そして固形化させた。一旦固形化すると、４０μlのタンパク質試料を各ウェルの食餌表面に置き、そして室温で浸漬乾燥した。実験に応じて、ＥＣＢ卵塊、１０匹の新生仔幼虫または１匹の新生仔幼虫を各ウェルに入れた。プレートをガス透過性メンブラン(Research Products International)で封止し、そして２５℃および９０％ＲＨでインキュベーションした。５または７日後（実験に応じて）、試料を、緩衝液のみまたは非形質転換抽出液対照と比較して目視によりスコアリングした。
【０１１０】
ＡＸＭＩ−１００の強力な活性が、アワノメイガおよびタバコバッドワームにおいて観察された。タマナヤガに対する活性は高タンパク質濃度で観察された。いくらかの活性がまた、ベルベットビーンキャタピラーに対して高濃度で観察されたが、タマナヤガおよびベルベットビーンキャタピラーの両方の活性はあまり顕著ではなく、試験した他の昆虫よりも変動性があった。Axmi100のトリプシン処理は、約６５kDおよび５５kDの２つの別個のタンパク質バンドを与え、そしてＡＸＭＩ−１００の活性には必要とされないようであった。
【０１１１】
実施例８．殺虫活性についての追加アッセイ
害虫に対して殺虫剤として作用する殺虫性タンパク質の能力は、しばしば多くの方法で評価される。当技術分野において周知な１つの方法は、摂食アッセイを実施することである。このような摂食アッセイにおいて、害虫を、被験化合物を含む試料または対照試料のいずれかに曝す。しばしば、これは被験材料またはこのような材料の適切な希釈液を、害虫が摂取する材料、例えば人工食餌上に置くことによって行なわれる。被験材料は、液体、固体、またはスラリーからなり得る。被験材料を表面に置き、そしてその後、乾燥させ得る。または、被験材料を溶融した人工食餌と混合し、その後、アッセイチャンバーに分配し得る。アッセイチャンバーは、例えば、カップ、皿、またはマイクロタイタープレートのウェルであり得る。
【０１１２】
吸引害虫（例えばアブラムシ）のためのアッセイは、試験材料の摂取が可能となるように、仕切り、理想的には吸引昆虫の吸引口部分によって突き通すことのできる部分によって、昆虫から試験材料を分離することを含み得る。しばしば、試験材料は、試験化合物の摂取を促進するために、スクロースなどの摂食刺激剤と混合されている。
【０１１３】
他のタイプのアッセイは、害虫の口または腸への試験材料のマイクロインジェクション、並びに、トランスジェニック植物を開発し、その後、害虫によるトランスジェニック植物の摂取能力試験を含み得る。植物試験は、通常消費される植物部分、例えば葉に付着した小さなケージの単離、または、昆虫を含むケージにおける完全植物の単離を含み得る。
【０１１４】
害虫をアッセイするための他の方法およびアプローチは当技術分野において公知であり、そして、例えば、Robertson, J. L. & H. K. Preisler.  1992.  Pesticide bioassays with arthropods.  CRC, Boca Raton, FLに見出すことができる。または、アッセイは、ジャーナル「Arthropod Management Tests」および「Journal of Economic Entomology」において、またはEntomological Society of America (ESA)のメンバーとの議論によって一般的に記載されている。
【０１１５】
実施例９．Axmi079およびAxmi082のバイオアッセイ
遺伝子発現および精製
・Axmi079およびAxmi082の毒素ドメインをコードするＤＮＡ領域を、E. coli発現ベクターｐＭＡＬ−Ｃ４ｘに、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードするmalE遺伝子の後に別々にクローニングした。これらのインフレーム融合により、E. coliにおいてＭＢＰ−Ａｘｍｉ融合タンパク質の発現がなされた。
・E. coliにおける発現のために、ＢＬ２１＊ＤＥ３を個々のプラスミドで形質転換した。単一コロニーを、カルベニシリンおよびグルコースが補充されたＬＢにインキュベーションし、そして３７℃で一晩増殖させた。次の日、新しい培地に、一晩培養液の１％を接種し、そして３７℃で対数増殖期まで増殖させた。その後、培養液を、２０℃で一晩かけて０．３mM ＩＰＴＧを用いて誘導した。各細胞ペレットを、２０mMトリス−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．４＋２００mM ＮａＣｌ＋１mM ＤＴＴ＋プロテアーゼ阻害剤中に懸濁し、そして超音波処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、融合タンパク質の発現を確認した。
・全細胞遊離抽出液を、ＭＢＰ−axmi融合タンパク質のアフィニティ精製のためにＦＰＬＣに付着させたアミロースカラムに流した。結合した融合タンパク質を樹脂から１０mMのマルトース溶液を用いて溶出した。その後、精製融合タンパク質をＸａ因子またはトリプシンで切断して、Axmiタンパク質からアミノ末端ＭＢＰタグを除去した。タンパク質の切断および可溶性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。
【０１１６】
昆虫バイオアッセイ
・切断したタンパク質を、昆虫アッセイにおいて適切な対照を用いて試験した。５日目のプレートの解読により、以下にこれらのタンパク質活性を示す。
【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
追加の昆虫バイオアッセイ結果：
【０１１９】
【表５】
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ＶＢＣ＝ベルベットビーンキャタピラー
ＤＢＭ＝ダイヤモンドバックモス
ＳＷＣＢ＝南西部アワノメイガ
ＣＰＢ＝コロラドポテトビートル（Colorado potato beetle）
ＥＣＢ＝アワノメイガ
Ｈｚ＝アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）
Ｈｖ＝Heliothis virescens
*＝発育阻止率および死滅率として示し、発育阻止は以下の尺度に従ってスコアリングする。
【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
実施例１０．植物で発現させるための本発明の殺虫性遺伝子のベクター化
本発明の遺伝子の各コード領域を、植物における発現のために、独立して、適切なプロモーターおよび終結配列と結合する。このような配列は当技術分野において周知であり、そして単子葉植物における発現のためのコメアクチンプロモーターまたはメイズユビキチンプロモーター、双子葉植物における発現のためのArabidopsisＵＢＱ３プロモーターまたはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、およびｎｏｓまたはＰｉｎＩＩターミネーターを含み得る。プロモーター−遺伝子−ターミネーター構築物を作製および確認するための技術は当技術分野において周知である。
【０１２２】
実施例１１．アグロバクテリウム媒介形質転換による植物細胞への本発明の遺伝子の形質転換
穂を受粉の８〜１２日後に収集する。胚を穂から単離し、そしてその０．８〜１．５mmサイズの胚を形質転換のために使用する。胚を、適切なインキュベーション培地上に胚盤側を上にして蒔き、そして暗闇で２５℃で一晩インキュベーションする。しかしながら、胚を一晩インキュベーションすることそれ自体は必要ではない。胚を、５〜１０分間、Ｔｉプラスミド媒介導入のための適切なベクターを含むアグロバクテリウム株と接触させ、そしてその後、３日間（２５℃で暗闇中）共培養培地上に蒔く。共培養後、外植片を５日間（２５℃で暗闇中）回復期培地に移す。外植片を、使用する特定の選択の性質および特徴に応じて、８週間まで選択培地中でインキュベーションする。選択期間後、得られたカルスを、成熟体細胞胚の形成が観察されるまで、胚成熟培地に移す。その後、得られた成熟体細胞胚を微光の下に置き、そして再生プロセスを当技術分野において公知のように開始する。得られた芽を発根培地上で根づかせ、そして得られた植物を苗床ポットに移し、そしてトランスジェニック植物として成長させる。
【０１２３】
実施例１２．本発明の殺虫性遺伝子を用いたメイズ細胞の形質転換
トウモロコシの穂を受粉から８〜１２日後に収集する。胚を穂から単離し、そしてその０．８〜１．５mmサイズの胚を形質転換のために使用する。胚を、適切なインキュベーション培地、例えばＤＮ６２Ａ５Ｓ培地（３．９８g/L Ｎ６塩；１mL/L（１０００×ストック）Ｎ６ビタミン；８００mg/L Ｌ−アスパラギン；１００mg/L Myo−イノシトール；１．４g/L Ｌ−プロリン；１００mg/Lカザミノ酸；５０g/Lスクロース；１mL/L（１mg/mLストック）２，４−Ｄ）上に胚盤側を上にして蒔き、そして暗闇で２５℃で一晩インキュベーションする。
【０１２４】
得られた外植片を、メッシュスクエア（１プレートあたり３０〜４０）に移し、３０〜４５分間、浸透圧培地に移し、その後、ビーミング（beaming）プレートに移す(例えば、ＰＣＴ公開番号第WO/0138514号および米国特許第5,240,842号を参照)。
【０１２５】
植物細胞において本発明の遺伝子を発現するように設計されたＤＮＡ構築物は、本質的にPCT Publication No. WO/0138514に記載の条件を使用して、エアゾールビームアクセレーターを使用して植物組織へと急速に成長する。ビーム後、胚を浸透圧培地上で３０分間インキュベーションし、その後、一晩２５℃で暗闇中でインキュベーション培地上に置く。ビームを受けた外植片が過度の傷害を受けるのを避けるために、それらを、回復培地に移す前に少なくとも２４時間インキュベーションする。その後、胚を５日間２５℃で暗闇中で回復期培地にまき、その後、選択培地に移す。外植片を、使用する特定の選択の性質および特徴に応じて、８週間まで選択培地中でインキュベーションする。選択期間後、得られたカルスを、成熟体細胞胚の形成が観察されるまで、胚成熟培地に移す。その後、得られた成熟体細胞胚を微光の下に置き、そして再生プロセスが当技術分野において公知の方法によって開始される。得られた芽を発根培地上で根づかせ、そして得られた植物を苗床ポットに移し、そしてトランスジェニック植物として成長させる。
【０１２６】
材料
【０１２７】
【表７】
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【０１２８】
溶液のｐＨを、１Ｎ ＫＯＨ／１Ｎ ＫＣｌを用いて５．８に調整し、ゲルライト（Gelrite）（Sigma）を３g/Lまで加え、そしてオートクレーブにかける。５０℃まで冷却した後、２ml/Lの５mg/ml硝酸銀(Phytotechnology Labs)のストック溶液を加える。レシピにより約２０個のプレートができる。
【０１２９】
明細書に記載の全ての刊行物および特許出願は本発明が関係する当業者の熟練度を示すものである。全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み入れられているかのように、同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３０】
前記の本発明は、明確な理解のために幾分詳しく説明および実施例によって記載したが、特定の変更および改変を添付の特許請求の範囲内で実践し得ることは明らかであろう。
【配列表】
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【国際調査報告】
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