(57)【要約】  本発明は、ＳＩＭＳ技術を用いて試料における多数の生体分子の有無を検出および定量化するための方法、ならびに上記方法に使用するアレイに関する。
2011513762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性表面と、少なくとも１つの微量な安定同位体もしくは不安定同位体、または外因性同位体によって標識されたプローブを含む複数の個別領域とを有する実質的に平面の基材を備えているアレイ。
【請求項２】
導電性表面を有する上記実質的に平面の基材がシリコンウエハである、請求項１記載のアレイ。
【請求項３】
上記プローブは、2Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、18Ｏ、33Ｓ、34Ｓおよび36Ｓの群から選択される少なくとも１つの安定重同位体、3Ｈおよび14Ｃの群から選択される少なくとも１つの不安定同位体、または79Ｂｒおよび81Ｂｒの群から選択される少なくとも１つの外因性同位体によって標識される、請求項１または２記載のアレイ。
【請求項４】
上記アレイはマイクロアレイであり、当該マイクロアレイの各個別領域の長さ、幅または直径のうち１つが１μｍ〜１０００μｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項５】
各個別領域が、少なくとも１つの微量な安定同位体もしくは不安定同位体、または外因性同位体によって標識されたプローブを含むマイクロウェルである、請求項４記載のアレイ。
【請求項６】
上記アレイはナノアレイであり、当該ナノアレイの各個別領域の長さ、幅または直径のうち１つが１ｎｍ〜１０００ｎｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項７】
各個別領域が、少なくとも１つの微量な安定同位体もしくは不安定同位体、または外因性同位体によって標識されたプローブを含むナノウェルであることを特徴とする請求項６記載のアレイ。
【請求項８】
各マイクロウェルは複数のナノウェルを有し、上記ナノウェルが、少なくとも１つの微量な安定同位体もしくは不安定同位体、または外因性同位体によって標識された上記プローブを含むことを特徴とする請求項５に記載のアレイ。
【請求項９】
少なくとも１つの試料において、少なくとも１つの生体分子の有無を検出および定量化するための方法であって、
（ａ）上記少なくとも１つの試料を請求項１〜８のいずれか一項に記載のアレイに接触させるステップと、
（ｂ）上記アレイを洗浄および乾燥させるステップと、
（ｃ）ＳＩＭＳによって、共通二次イオンおよび対応する微量な二次イオンを検出および計数するステップと、を含む方法。
【請求項１０】
検査対象の各試料を上記アレイにおける１つ以上の個別領域に接触させる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
検査対象の上記試料が単細胞である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
検査対象の上記試料の分子地図を決定するための方法であって、上記分子地図が、上記試料のトランスクリプトーム、プロテオーム、リピドーム、メタボローム、グリコーム、および／またはインタラクトームの決定要素となる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
疾病素因を予測するため、または診断を必要とする被験者に疾病の診断をするための、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
疾病を治療する被験者に投与される治療薬の有効性をモニタリングするための、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
治療薬をスクリーニングするための、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同位体標識法および二次イオン質量分析法を用いてＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質などの生体分子を検出および定量化するための方法、ならびに上記方法を実施するために設計されたアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
６０年代初め、CastaingおよびSlodzianは、二次イオンを用いたマスフィルタ放出イオン顕微鏡法（mass-filtered emission ion microscopy）を発展させた。この方法は、後に二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）と称される技術の一部である。この技術では、イオンビーム（一次イオンビーム）をプローブとして用いて、試料の表面原子層に原子または原子クラスタをスパッタする。原子または原子クラスタの小画分はイオン化されている。ＳＩＭＳ装置において、これらの二次イオンを質量に応じて分離し、その後、それらを用いて二次イオン電流を測定し、例えば分析された表面の定量的な原子質量画像を生成する。
【０００３】
ＳＩＭＳは、半導体および表面科学の研究、地球化学、有機材料の特性化、ならびに宇宙化学において主要な手段となっている。しかし長い間、イオン顕微鏡法は、方位分解能（１〜０．５μｍ）が乏しく、質量分離力が不十分であることから、生命科学分野における課題を解決する最低限の方法としてしか考えられてこなかった。
【０００４】
技術および概念の向上、特に均一に集束された一次イオンビームを用いることにより、方位分解能および質量分解能は著しく向上した。それゆえ、ＳＩＭＳ顕微鏡法は極めて効果的な画像処理手段になっている。例えば、Lecheneらは、ＳＩＭＳ技術を用いて、個々の不動毛、すなわち蝸牛の内部細胞の機械刺激細胞小器官を画像化することに成功した(Lechene at al. Journal of Biology, 2006, 5:20)。他の例では、15Ｎ環境下において培養された細菌における窒素固定の研究が可能になった。また、ＳＩＭＳ技術の使用により、Lecheneらは、単一細胞および細胞下構造において窒素固定の特定、定量化および比較が可能になった（Lechene et al. Science 2007, 317:1563)。このように、ＳＩＭＳ技術は、今や細胞または組織の画像化に広く用いられており、有力な診断手段である。
【０００５】
また、ＳＩＭＳ技術はペプチド核酸（ＰＮＡ）のマイクロアレイへの非標識ＤＮＡのハイブリダイゼーションを検出するためにも使用される(Brandt et al, 2003, Nucleic Acids Research, 31: 19)。これらの実験では、核酸の不可欠な要素であるがＰＮＡにおいて完全に欠損しているリン酸塩を検出するＳＩＭＳによって、ＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡの二本鎖が可視化された。
【０００６】
本発明の目的は、ＳＩＭＳ技術を用いて、試料における複数の生体分子の有無を検出および定量化するための方法を提供することにある。Brandtらに記載された方法は、（ｉ）リン酸塩を含まないＰＮＡプローブにしか適用できない、および（ｉｉ）プローブ／標的の相互作用を定量化できないという欠点がある。したがって、出願人は、ＳＩＭＳ技術を用いて、各試料におけるプローブ／標的の様々な相互作用を検出および定量化するための、多くの試料に適用可能な普遍的な方法を提供することを目的としている。上記相互作用の検出および定量化は、プローブ／標的の同位体比の計数によって決定される（図１参照）。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、導電性表面と、少なくとも１つの微量な安定同位体もしくは不安定同位体、または外因性同位体によって標識されたプローブを含む複数の個別領域とを有する実質的に平面な基材を備えたアレイに関する。一実施形態によると、上記導電性表面を有する実質的に平面な基材は、シリコンウエハである。
【０００８】
一実施形態によると、上記プローブは、2Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、18Ｏ、33Ｓ、34Ｓおよび36Ｓの群から選択される少なくとも１つの安定重同位体、3Ｈおよび14Ｃの群から選択される少なくとも１つの不安定同位体、または79Ｂｒおよび81Ｂｒの群から選択される少なくとも１つの外因性同位体によって標識される。
【０００９】
一実施形態によると、上記アレイはマイクロアレイであり、当該マイクロアレイの各個別領域の長さ、幅または直径のうち１つが１μｍ〜１０００μｍである。一実施形態において、各個別領域が、少なくとも１つの微量な安定同位体もしくは不安定同位体、または外因性同位体によって標識されたプローブを含むマイクロウェルである。
【００１０】
一実施形態において、上記アレイはナノアレイであり、当該ナノアレイの各個別領域の長さ、幅または直径のうち１つが１ｎｍ〜１０００ｎｍである。
【００１１】
一実施形態において、各個別領域が、少なくとも１つの微量な安定同位体もしくは不安定同位体、または外因性同位体によって標識されたプローブを含むナノウェルである。
【００１２】
一実施形態によると、各マイクロウェルは複数のナノウェルを有し、上記ナノウェルが、少なくとも１つの微量な安定同位体もしくは不安定同位体、または外因性同位体によって標識された上記プローブを含む。
【００１３】
本発明は、少なくとも１つの試料において、少なくとも１つの生体分子の有無を検出および定量化するための方法であって、
（ａ）上記少なくとも１つの試料を上述のようなアレイに接触させるステップと、
（ｂ）上記アレイを洗浄および乾燥させるステップと、
（ｃ）ＳＩＭＳによって、共通二次イオン、および対応する微量な二次イオンを検出および計数するステップと、を含む方法に関する。
【００１４】
一実施形態によると、検査する各試料をアレイの１つ以上の個別領域に接触させる。
【００１５】
一実施形態によると、検査する試料は単細胞である。
【００１６】
一実施形態によると、上記方法は、検査する試料の分子地図を作成するための方法であり、該分子地図は、上記試料のトランスクリプトーム、プロテオーム、リピドーム、メタボローム、グリコーム、および／またはインタラクトームに基づく。
【００１７】
一実施形態によると、上記方法は、疾病素因を予測するため、または診断を必要とする被験者の疾患を診断するための方法である。
【００１８】
一実施形態によると、上記方法は、疾病を治療する被験者に投与する治療薬の有効性をモニタリングするための方法である。
【００１９】
一実施形態によると、上記方法は、治療薬をスクリーニングするためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、標的タンパク質へのプローブの結合を検出するＳＩＭＳ検出の原理を示す。生体分子（プローブおよび標的）は、原子レベルまで細分化される（動的ＳＩＭＳ条件）。そのため、個々のプローブ／標的対は、数百の15Ｎおよび14Ｎ原子（実際の実験ではＣＮ-分子の二次イオンの形態において）を提供し、これらの原子はＳＩＭＳ分析器において容易に計測される（増幅）。14Ｎ／15Ｎ同位体比の増加を測定することにより、抗体に結合されたこれらの標的タンパク質の定量化が可能である。
【図２】図２は、プローブまたは標的が標識されているか否かに応じたＤＩＲの増加または減少を示す。
【図３】図３は、15Ｎの同位体画分を示す。
【図４】図４は、13Ｃの同位体画分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
〔発明の詳細な説明〕
（定義）
本明細書において使用する「核酸」という用語は、例えばデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドなどのヌクレオチド、またはＰＮＡなどの合成により生成された化合物からなるポリマーを指す。ＰＮＡは、２つの天然の核酸のハイブリダイズと同様の配列特定方法（例えば、ワトソン−クリック塩基対の相互作用に関与し得る）において天然の核酸とハイブリダイズし得る。
【００２２】
本明細書において使用する「リボ核酸」および「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチドからなるポリマーを指す。
【００２３】
本明細書において使用する「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドからなるポリマーを指す。
【００２４】
本明細書において使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、長さ約１０〜１００のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドマルチマー、および長さ２００以下のヌクレオチドを指す。
【００２５】
本明細書において使用する「試料」という用語は、１つ以上の対象の要素を含む材料、または材料の混合物であり、特に、限定されるものではないが、液体状の材料を指す。
【００２６】
「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、プリン塩基およびピリミジン塩基だけでなく、変性された他の複素環塩基も包含することを指す。このような変性は、メチル化されたプリンもしくはピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、アルキル化されたリボース、または他の複素環塩基を含む。さらに、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、従来のリボース糖およびデオキシリボース糖に限らず、他の糖を有する部分を含む。また、変性されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖部分における変性を含む。この変性では、例えば１つ以上のヒドロキシル基がハロゲン原子もしくは脂肪族基に置換されるか、または、エーテル、アミンなどとして官能基化される。
【００２７】
本明細書において使用する「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書において使用するこの用語は、任意の大きさ、構造または機能のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを指す。しかし、典型的に、タンパク質は少なくとも長さ６のアミノ酸である。好ましくは、タンパク質が短ペプチドである場合、少なくとも長さ約１０のアミノ酸残基である。タンパク質は、天然、組み換えもしくは合成であり得、またはこれらの任意の組合せであり得る。また、タンパク質は、天然のタンパク質またはペプチドの断片であってもよい。タンパク質は、単一分子または多分子錯体であってもよい。タンパク質という用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工化学類似体である、アミノ酸ポリマーを指してもよい。アミノ酸ポリマーは、１つ以上のアミノ酸残基が「非天然」アミノ酸であり、天然のアミノ酸のいずれにも対応しない場合でも、このアミノ酸ポリマーを本願において使用する「タンパク質」という用語に含める。
【００２８】
「固形支持体の表面に結合されたオリゴヌクレオチド」という語句は、ある箇所における固形基材の表面に固定されたオリゴヌクレオチド、またはその模倣物（例えば、ＰＮＡなど）を指す。ここで、基材は板、ビーズ、または他の構造などの様々な形態をとり得る。ある実施形態では、本願に適用されるオリゴヌクレオチドの集合特性は、同一の平面支持体の表面に認められる（例えばアレイの形態で）。
【００２９】
「アレイ」という用語は、「マイクロアレイ」および「ナノアレイ」という用語を包含する。以下に詳述するように、アレイは、一般的に、固体支持体の表面に結合された複数の相違する、または異なるプローブによって構成されており、基材固定化プローブとも呼ばれる。一実施形態において、本発明のアレイはホモアレイであり、本発明のアレイは、１つの化学タイプのプローブのみ、すなわち核酸プローブのみ、またはペプチドもしくはタンパク質プローブのみなどを含む。他の実施形態では、本発明のアレイはヘテロアレイであり、本発明に係るアレイは、核酸プローブとタンパク質プローブとの混合物などのプローブタイプの組合せを含む。
【００３０】
「ナノウェル」という用語は、プローブが結合されるナノメートル寸法の領域を指す。「マイクロウェル」という用語は、プローブが結合されるマイクロメートル寸法の領域を指す。
【００３１】
「ナノアレイ装置（Nano Array Device）」またはＮＡＤは、マイクロメートル寸法の（多くの同一の複製形態または異なる形態で単一チップ上に存在し得る）機構を指す。ＮＡＤは、１組のナノウェルまたは１組の個別領域（ウェルを含まずにプローブを含む）を含み、これらナノウェルまたは個別領域自体はマイクロウェルに包含されていてもよいし、包含されていなくてもよい。
【００３２】
「共通二次イオン」という用語は、ＳＩＭＳにおいて生成および分析されるとともに、それらの構成要素において微量な安定（または不安定）同位体を含まないイオンを指す。共通二次イオンの例は、12Ｃ14Ｎ-、12Ｃ-などである。
【００３３】
「微量な二次イオン」という用語は、ＳＩＭＳにおいて生成および分析されるとともに、それらの構成要素においてプローブおよび／または標的分子の標識に用いられる割合で微量な安定（または不安定）同位体を含むイオンを指す。微量な二次イオンの例は、13Ｃ-、13Ｃ14Ｎ-、12Ｃ15Ｎ-、および13Ｃ15Ｎ-である。
【００３４】
「バックグラウンド共通二次イオン」という用語は、ＳＩＭＳにおいて生成および分析されるとともに、それらの構成要素において微量な安定（または不安定）同位体を、自然発生的な割合（プローブおよび／または標的分子の標識に用いる割合とは反対に）で含むイオンを指す。それらの天然の割合における天然二次イオンの例としては、12Ｃ14Ｎ-、13Ｃ14Ｎ-、12Ｃ15Ｎ-、および13Ｃ15Ｎ-が０．９８５３８：０．０１０９６：０．００３６２：０．００００４である。
【００３５】
個別領域、マイクロウェル、またはナノウェルに使用するような「検出同位体比（Deletion Isotopic Ratio）」すなわちＤＩＲという用語は、共通二次イオンの数と、共通二次イオンの数にＳＩＭＳまたは関連する方法によって得られる微量な二次イオンの少なくとも１つを加えた数との比を指す(例えば、12Ｃ14Ｎ-／（12Ｃ14Ｎ-＋12Ｃ15Ｎ-）、12Ｃ14Ｎ-／（12Ｃ14Ｎ-＋13Ｃ14Ｎ-）、12Ｃ14Ｎ-／（12Ｃ14Ｎ-＋12Ｃ15Ｎ-＋13Ｃ14Ｎ-）、12Ｃ14Ｎ-／（12Ｃ14Ｎ-＋12Ｃ15Ｎ-＋13Ｃ14Ｎ-＋13Ｃ15Ｎ-）、または12Ｃ-／（12Ｃ＋13Ｃ-）など）。図２は、プローブまたは標的が標識されるか否かに基づく、ＤＩＲの増減を示す（例えば、異なる同位体によってプローブおよび標的の両方が標識された場合、ＤＩＲにおける方向の変化は特定の場合それぞれについて計数される）。
【００３６】
「外因性同位体」という用語は、生体分子（プローブおよび標的）に天然には含まれないが、使用者によってこれらの分子に加えられた同位体を表す。外因性同位体は、標準的な化学反応または生体化学反応によって生体分子に共有結合されていてもよい。別の態様では、外因性同位体は、プローブまたは標的のいずれかと強く相互作用し、プローブによって標的の認識が激減しない分子と共有結合されていてもよい。外因性同位体の例としては、79Ｂｒおよび81Ｂｒが挙げられる。
【００３７】
「対照個別領域」という用語は、プローブ（標識された、または標識されていない）が検査すべき試料と接触していない、またはプローブと標的との間に特定の相互作用が存在しない個別領域（すなわち、標的が分析すべき試料に存在しない）、マイクロウェルまたはナノウェルを指す。
【００３８】
〔本発明〕
（支持材料および表面の特性）
本発明の目的は、導電性表面および複数の個別領域を有する実質的に平面の基材を備えたアレイである。当該個別領域はウェル形状をとり、少なくとも１つの微量な同位体（例えば、安定重同位体もしくは安定軽同位体、または不安定同位体）、または少なくとも１つの外因性同位体（例えば79Ｂｒ、81Ｂｒ)によって標識されるプローブを含む。
【００３９】
本発明によると、導電性表面をもつ実質的に平面の基材は、シリコンウエハ、金、銀、アルミニウム、銅、白金、パラジウムもしくは他の金属、ＧａＡｓ、ＩｎＰなどの半導体、またはポリマー材料、ポリマー被覆材料、超電導体材料、セラミックス、酸化鉄、酸化ケイ素などの表面電導するように処理された他の材料からなる、任意の固体もしくは半固体表面である。
【００４０】
本発明に係る一実施形態では、導電性表面を有する上記実質的に平面の基材は、ＳＩＭＳに適している。
【００４１】
本発明に係る好ましい実施形態では、導電性表面を有する上記ＳＩＭＳに適合する実質的に平面の基材は、シリコンウエハである。
【００４２】
〔マイクロウェルの形態における個別領域〕
本発明の他の目的は、上述のようなマイクロアレイの構成をとるマイクロウェルアレイである。このアレイにおいて、個別領域は少なくとも１つの安定同位体または不安定同位体によって標識されたプローブを含むマイクロウェルである。マイクロウェルは、例えばドット、ライン、円、四角または三角などの任意の形状であり得、例えば横列および縦列、格子、グリッドなどの任意のより大きなパターンで配置されていてもよい。これらのマイクロウェルは、少なくとも１つの微量な安定同位体または不安定同位体によって標識されたプローブを含む。
【００４３】
本発明に係る一実施形態では、本発明のマイクロウェルアレイは、１０〜１０００００個のマイクロウェルを含み、他の実施形態では１０〜２５０００個のマイクロウェル、他の実施形態では１００〜１００００個のマイクロウェル、他の実施形態では１０００〜５０００個のマイクロウェルを含む。
【００４４】
本発明に係る一実施形態では、マイクロウェルの形状および大きさは、各マイクロウェルに単細胞を保存するのに適するように決定される。
【００４５】
一実施形態では、各マイクロウェルの長さ、幅または直径のうち１つは、１μｍ〜１０００μｍの範囲内であり、他の実施形態では１μｍ〜５００μｍ、他の実施形態では１μｍ〜２００μｍ、他の実施形態では１〜１００μｍの範囲内である。
【００４６】
一実施形態において、各マイクロウェルの深さは１μｍ〜１００μｍであり、他の実施形態では１μｍ〜５０μｍ、他の実施形態では５μｍ〜２０μｍである。
【００４７】
各マイクロウェル間の距離は２５〜５０００μｍ、他の実施形態では１００〜１０００μｍ、他の実施形態では５０〜１５０μｍであってもよい。
【００４８】
マイクロウェルは、任意の形状であり得る。例えば、円筒形の形状、複数の面をもつ多面体（平行六面体、六角柱、八角柱）、逆円錐形、逆ピラミッド形などの非円筒形の形状であり得、または、これらの形状を２つ以上組み合わせた形状であり得る。円錐形および平行六面体の場合、マイクロウェルの底部は通常は平らであるが、曲線状（凸型または凹型）の表面であってもよい。
【００４９】
本発明の実施形態において、一組のマイクロウェルを担持する実質的に平面の導電性表面は、長さ１ｃｍ、幅１ｃｍ、および厚さ約２５０μｍの、長方形の固体または円盤（他の形状も可能だが）として形成され得る。
【００５０】
（ナノウェル形状の個別領域）
本発明に係る他の目的は、上述したようなナノアレイの構造をとるナノウェルアレイである。このアレイにおいて、個別領域は少なくとも１つの微量な安定同位体または不安定同位体によって標識されたプローブを含むナノウェルである。ナノウェルは、例えばドット、ライン、円、四角または三角などの任意の形状であり得、例えば横列および縦列、格子、グリッドなどの任意のより大きなパターンで配置されていてもよい。これらのナノウェルは、少なくとも１つの微量な安定同位体または不安定同位体によって標識されたプローブを含む。
【００５１】
本発明に係る一実施形態において、本発明のナノウェルは１０〜１０００００個のナノウェルを含み、他の実施形態では１０〜２５０００個のナノウェル、他の実施形態では１００〜１００００個のナノウェル、他の実施形態では１０００〜５０００個のナノウェルを含む。
【００５２】
一実施形態では、各ナノウェルの長さ、幅または直径のうち１つは、１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内であり、他の実施形態では５ｎｍ〜５００ｎｍ、他の実施形態では１０ｎｍ〜２００ｎｍ、他の実施形態では５０〜１００ｎｍの範囲内である。
【００５３】
一実施形態では、各ナノウェルの深さは１ｎｍ〜１００ｎｍであり、他の実施形態では１ｎｍ〜５０ｎｍ、他の実施形態では５ｎｍ〜２０ｎｍである。
【００５４】
各ナノウェル間の距離は１０〜１０００ｎｍ、他の実施形態では５０〜５００ｎｍ、他の実施形態では１００〜２００ｎｍであってもよい。
【００５５】
ナノウェルは任意の形状であり得、例えば、円筒形の形状、複数の面をもつ多面体（平行六面体、六角柱、八角柱）、逆円錐形、逆ピラミッド形などの非円筒形の形状、またはこれらを２つ以上組み合わせた形状であってもよい。円錐形および平行六面体の場合、ナノウェルの底部は通常は平らであるが、曲線状（凸型または凹型）の表面であってもよい。
【００５６】
本発明に係る実施形態では、一組のナノウェルを担持する略平面の導電性表面は、長さ１ｃｍ、幅１ｃｍ、および厚さ約２５０μｍの、長方形の固体または円盤（他の形状も可能だが）として形成され得る。
【００５７】
（ウェルの形態ではない個別領域）
本発明の他の目的は、基材上により大きなパターンを形成する１組の個別領域、またはパターンユニットの構成をとるアレイである。個別領域またはパターンユニットは、例えばドット、ライン、円、四角または三角などの任意の形状であってもよく、例えば横列および縦列、格子、グリッドなどの任意のより大きなパターンに配置されていてもよい。これらの個別領域は、少なくとも１つの微量な安定（または不安定）同位体によって標識されたプローブを含む。
【００５８】
本発明の一実施形態において、本発明の個別領域は、１０〜１０００００個の個別領域を含み、他の実施形態では１０〜２５０００個の個別領域、他の実施形態では１００〜１００００個の個別領域、他の実施形態では１０００〜５０００個の個別領域を含む。
【００５９】
本発明に係る一実施形態では、本発明のアレイは、マイクロアレイである。本実施形態では、各個別領域の長さ、幅または直径のうち１つは、１μｍ〜１０００μｍの範囲内であり、他の実施形態では５μｍ〜５００μｍ、他の実施形態では１０μｍ〜２００μｍ、他の実施形態では５０〜１００μｍの範囲内である。各個別領域間の距離は、１０〜１０００μｍ、他の実施形態では５０〜５００μｍ、他の実施形態では１００〜２００μｍであってもよい。
【００６０】
本発明に係る一実施形態において、本発明のアレイは、ナノアレイである。本実施形態では、各個別領域の長さ、幅または直径のうち１つは、１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内であり、他の実施形態では５ｎｍ〜５００ｎｍ、他の実施形態では１０ｎｍ〜２００ｎｍ、他の実施形態では５０〜１００ｎｍの範囲内である。各個別領域間の距離は、１０〜１０００ｎｍ、他の実施形態では５０〜５００ｎｍ、他の実施形態では１００μｍ〜２００ｎｍであってもよい。
【００６１】
本発明に係る実施形態では、一組の個別領域を担持する膜組織またはシリコンウエハは、例えば長さ１ｃｍ、幅１ｃｍ、および厚さ約２５０μｍの、長方形の固体または円盤（他の形状も可能だが）として形成され得る。
【００６２】
〔プローブ〕
（プローブの化学特性および同位体組成）
本実施形態では、標的（通常は、細胞だけでなくウイルス、細胞小器官または細胞自体を構成する生体分子）に結合するプローブは、核酸（オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）、ペプチドもしくはタンパク質（抗体、酵素）、配位子（抗原、酵素基質、受容体または受容体の配位子）、グリカン、脂質、ポリアミン、ファージ、ウイルスなどの任意の分子（生体または非生体）、またはこれら分子の組合せから構成されていてもよい。
【００６３】
本発明によると、プローブは少なくとも１つの微量な安定同位体または不安定同位体を含む。一実施形態では、プローブは、2Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、18Ｏ、33Ｓ、34Ｓおよび36Ｓなどの少なくとも１つの安定重同位体を含む。他の実施形態では、プローブは、3Ｈおよび14Ｃなどの少なくとも１つの不安定同位体を含む。他の実施形態では、プローブは、79Ｂｒおよび81Ｂｒなどの少なくとも１つの外因性同位体を含む。
【００６４】
〔プローブの接着またはグラフティング〕
アレイへのプローブの接着または接合は、当業者に周知の技術によってなし得る。プローブは、アレイに吸着、物理吸着、化学吸着または共有結合され得る。プローブをパターン化して表面に直接または間接的に転写および吸着させるために、リソグラフィプリントを用いてもよい。
【００６５】
例えば、表面と接合させるプローブとの化学反応のために、プローブの接着は表面に官能基を導入することにより達成されてもよい。
【００６６】
カルボキシル基（ＣＯＯＨ）は、接合のための最も知られた官能基の１つである。化学結合は、タンパク質由来のアミノ基とカルボキシル官能基との間に生じる。また、アクリル酸、または共重合ビニルシランおよび無水マレイン酸は、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩によって表面にタンパク質を接合する場合にスペーサとして機能するシリコン−ＣＯＯＨ基質を生成するために使用され得る。
【００６７】
〔プローブの同定〕
多様な異なるプローブがアレイに接着されている実施形態では、プローブは、プローブを含む個別領域の位置または配位によって同定される。
【００６８】
〔試料の特性および原料〕
本発明の方法によると、検査対象の試料は、細胞、組織、器官、体液（血清、血漿、精液、滑液、脳脊髄液、血液または尿など）、細胞培養液、水（汚水、淡水、海水、地下水など）から分離され得る。
【００６９】
本発明の方法によると、検査対象の試料は、核酸（オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）、ペプチドもしくはタンパク質（抗体、酵素）、配位子（抗原、酵素基質、受容体または受容体の配位子）、グリカン、脂質、ポリアミン、ファージ、ウイルス、またはこれらの混合物を含んでいてもよい。このように、検出対象の生体分子は、核酸（オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）、ペプチドもしくはタンパク質（抗体、酵素、プリオン）、配位子（抗原、酵素基質、受容体または受容体の配位子）、グリカン、脂質、ポリアミン、ファージ、ウイルス、またはこれらの混合物であってもよい。
【００７０】
〔プローブの標識〕
本発明の方法によると、プローブまたは標的、すなわち検査対象の試料に存在する生体分子が、微量な安定同位体もしくは不安定同位体、または外因性同位体によって標識される。
【００７１】
一実施形態では、プローブまたは標的は、少なくとも１つの微量な安定同位体、例えば2Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、18Ｏ、33Ｓ、34Ｓおよび36Ｓなどによって標識されてもよい。
【００７２】
一実施形態では、プローブまたは標的は、少なくとも１つの不安定同位体、例えば3Ｈおよび14Ｃなどによって標識されてもよい。
【００７３】
他の実施形態では、プローブまたは標的は、少なくとも１つの外因性同位体、例えば79Ｂｒおよび81Ｂｒなどによって標識されてもよい。
【００７４】
インビボおよびインビトロという２つの技術を用いて標識プローブが得られる。インビトロ標識の場合、１）ポリメラーゼ連鎖反応を用いて標識オリゴヌクレオチドを生成する、２）ペプチド合成を用いて標識ペプチドを生成する、３）インビトロ転写／翻訳を用いて標識ＲＮＡおよび標識タンパク質を生成する、４）逆転写を用いて標識ｃＤＮＡを生成する、５）化学合成を用いて標識ＰＮＡを生成する。インビボ標識の場合、2Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、18Ｏ、33Ｓ、34Ｓおよび36Ｓの混合物、3Ｈ、14Ｃの混合物、または長い半減期をもつ他の不安定同位体によって標識された栄養素（例えばＮＨ4Ｃｌ、グルコースおよびアミノ酸）を含む培地上に、原核細胞または真核細胞を成長させる。その結果、これらの細胞が標識プローブ（例えば抗体、バクテリオファージ、核酸、タンパク質、糖、または他の細胞構成要素など）を生成する。
【００７５】
標的、すなわち検査対象の試料内に存在する生体分子を標識する場合、2Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、18Ｏ、33Ｓ、34Ｓおよび36Ｓの混合物、または3Ｈ、14Ｃの混合物によって標識された栄養素（例えばＮＨ4Ｃｌ、グルコースおよびアミノ酸）を含む培地上に、細胞を成長させる。その結果、これらの細胞が標識生体分子を生成する。
【００７６】
〔試料とアレイとの接触〕
本発明の方法に係る一実施形態では、検査対象の試料を複数の多様なプローブを含むアレイ（マイクロアレイまたはナノアレイ）と接触させる。
【００７７】
他の実施形態では、複数の試料が検査対象である場合、各試料をマイクロウェルアレイにおける１つ以上のマイクロウェルと接触させる。
【００７８】
他の実施形態では、検査対象の試料の数および種類が単細胞の数および種類に対応する場合、適切な方法によって得られる各単細胞の内容物をマイクロウェルアレイにおける１つのマイクロウェルと接触させる。
【００７９】
〔プローブと標的との相互作用の条件〕
そして、アレイ上に存在するプローブを標的生体分子と相互作用させる条件下において、試料をアレイに接触させる。
【００８０】
共通する12Ｃ同位体および14Ｎ同位体が存在しない（例えばリン酸緩衝生理食塩水など）様々な緩衝液中でプローブをその標的に結合させる。塩（乾燥ステップにおいて結晶を形成し得る）、非結合分子および大きな細胞残渣を除去するために、純水（好ましくは、標的からプローブが分離するのを制限するために低温にて）によって慎重に洗浄した後、真空下のオーブンまたは凍結乾燥によって無塵環境下にてアレイを乾燥させる。
【００８１】
〔ＳＩＭＳによる検出および他の関連技術〕
本発明に係る方法によると、検出同位体比を得るために微量な共通二次イオンの数を計測することにより、二本鎖のプローブ／標的を検出することができる。
【００８２】
一実施形態では、動的二次イオン質量分析（Ｄ−ＳＩＭＳ）によって二本鎖のプローブ／標的を検出する。他の実施形態では、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）によって二本鎖のプローブ／標的を検出する。
【００８３】
二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）では、一次イオンのエネルギービームの衝突により固体試料の表面（１ｎｍ〜１μｍの深さ）から抽出された二次イオンを質量分析し、無機材料および有機材料の表面組成を分析することができる。分子は、Ｄ−ＳＩＭＳにおける一次イオンによって、動的Ｄ−ＳＩＭＳにより分子の構成元素に完全に断片化されるか、またはＴｏＦ−ＳＩＭＳによりアミノ酸などの分子断片に部分的に断片化される。また、レーザーＳＮＭＳなどのＳＩＭＳ関連技術を用いてプローブ／標的の相互作用を検出してもよい。
【００８４】
本発明に係る方法の一実施形態において、アレイに接着されたプローブは、微量な安定同位体もしくは不安定同位体、または外因性同位体によって標識される。本実施形態では、検査対象の試料は、これらの微量な同位体を自然の比率（またはそれよりも低い比率）のみ含有する生体分子（標的）を含む。
【００８５】
プローブ／標的の相互作用の存在は、各個別領域、マイクロウェルまたはナノウェルから得られる検出同位体比と、対照個別領域、対照マイクロウェルもしくは対照ナノウェルから得られる、または以下の分離された領域から得られる基底検出同位体比とを比較することによって測定される。この個別領域においては、標識プローブと標的との間に特異的相互作用が存在せず（すなわち、標的が分析すべき試料に存在しない）、または、非標識プローブと非標識標的との間に特異的相互作用が存在しない。
【００８６】
したがって、プローブを標識し、かつ、標的を標識しない場合において、１つの個別領域、マイクロウェルまたはナノウェルから得られる検出同位体比が対照個別領域、対照マイクロウェルまたは対照ナノウェルから得られる検出同位体比よりも極めて高い場合、プローブ／標的の相互作用の存在が明らかとなる。例えば、同一の機器設定について、プローブを13Ｃによって標識する場合、個別領域、マイクロウェルまたはナノウェルから得られる検出同位体比12Ｃ／（12Ｃ＋13Ｃ）（または代替的に12Ｃ14Ｎ／（12Ｃ14Ｎ＋12Ｃ15Ｎ））が対照個別領域、対照マイクロウェルまたは対照ナノウェルから得られる検出同位体比よりも高い場合、プローブ／標的の相互作用の存在が明らかとなる。
【００８７】
したがって、プローブを標識せず、かつ、標的を標識する場合において、個別領域、マイクロウェルまたはナノウェルから得られる検出同位体比が対照個別領域、対照マイクロウェル、または対照ナノウェルから得られる検出同位体比よりも極めて低い場合、プローブ／標的の相互作用の存在が明らかとなる。例えば、同一の機器設定について、プローブを13Ｃによって標識する場合において、個別領域、マイクロウェルまたはナノウェルから得られる二次イオンの比12Ｃ／（12Ｃ＋13Ｃ）（または12Ｃ14Ｎ／（12Ｃ14Ｎ＋12Ｃ15Ｎ））が対照個別領域、対照マイクロウェルまたは対照ナノウェルから得られる二次イオン比よりも低い場合、プローブ／標的の相互作用の存在が明らかになる。
【００８８】
したがって、プローブおよび標的を同じ同位体によって標識する場合において、個別領域、マイクロウェルまたはナノウェルから得られる検出同位体が対照個別領域、対照マイクロウェル、または対照ナノウェルから得られる検出同位体比と大幅に異なる場合、プローブ／対象の相互作用の存在が明らかになる。
【００８９】
本発明によると、プローブまたは標的は、１つ以上の微量な安定同位体もしくは不安定同位体、またはそれらの構成要素の外因性同位体によって標識されてもよい。例えば、13Ｃおよび15Ｎによってプローブまたは標的を標識してもよい。プローブの13Ｃ15Ｎなどの多重標識は、バックグラウンドを最小化するのに特に有効である。
【００９０】
本発明によると、標的を微量な安定（または不安定）同位体によって標識する場合、各条件の特異的標識によって様々な実験条件（例えば、薬剤処理の有無など）が区別され得る。
【００９１】
〔検出および定量化の方法〕
本発明の目的は、少なくとも１つの試料において、少なくとも１つの生体分子の有無を検出および定量化するための方法である。当該方法は、
（ａ）アレイ上に存在するプローブを標的生体分子と相互作用させる条件下において、上記少なくとも１つの試料をアレイに接触させ、上記アレイに存在するプローブまたは上記試料に存在する生体分子が少なくとも１つの微量な安定（または不安定）同位体によって標識されるステップと、
（ｂ）アレイを洗浄および乾燥させるステップと、
（ｃ）ＳＩＭＳによって、共通二次イオン、および対応する微量な二次イオンを検出および計数するステップと、を有する。上記方法により、ＤＩＲを計測することができる。
【００９２】
そして、各個別領域、マイクロウェル、またはナノウェルから得られたＤＩＲを対照個別領域、対照マイクロウェル、または対照ナノウェルから得られたＤＩＲと比較し、ＤＩＲに大きな変化があった場合（図２参照）には、プローブ／対象の相互作用が存在するという証拠（検出）になる。さらに、ＤＩＲを正確に測定することにより、プローブと標的との間の相互作用の数を定量化することができる。共通二次イオンおよび微量な二次イオン両者の正確な計測統計を得るために材料の最大量をスパッタリングした後で、正確なＤＩＲ計測値が得られる。個別領域（マイクロウェルもしくはナノウェル、または実際に個別領域内の試料ユニット領域）毎のプローブと相互作用する標的の数を計数するために、ａ）個別領域表面上のプローブの密度、ｂ）個々のプローブおよび個々の標的における所望の各同位体の原子数、を知る必要がある。そして、この知識により、個別領域毎の標的の数に応じてＤＩＲをプロットすることができる。
【００９３】
〔発明の利用〕
他の実施形態によると、少なくとも１つの生体分子を含む、または含まない少なくとも１つの試料を検出および定量化するための方法による上記試料の分子地図を決定できるか、または、単細胞において生体分子および相互作用の検出が可能である。試料の分子地図の決定とは、上記試料のトランスクリプトーム、プロテオーム、リピドーム、メタボローム、グリコーム、またはインタラクトームの決定を意味する。
【００９４】
〔分子地図に対する適用〕
本発明の一実施形態によると、試料において少なくとも１つの生体分子の有無を検出および定量化するための方法は、上記試料の分子地図を提供することを目的とする。
【００９５】
一実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子はゲノム配列であり、試料におけるゲノム変異を決定することができる。
【００９６】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子はＲＮＡであり、試料におけるトランスクリプトームを決定することができる。
【００９７】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子はタンパク質であり、試料におけるプロテオームを決定することができる。
【００９８】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子は脂質であり、試料におけるリピドームを決定することができる。
【００９９】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子は代謝物であり、試料におけるメタボロームを決定することができる。
【０１００】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子は糖化タンパク質であり、試料におけるグリコームを決定することができる。
【０１０１】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子は少なくとも１つの特異的プローブと相互作用するタンパク質であり、試料におけるインタラクトームを決定することができる。
【０１０２】
〔単細胞に対する適用〕
本発明の他の実施形態によると、単細胞レベルにて少なくとも１つの生体分子の有無を検出および定量化するための方法は、単細胞レベルの分子地図を提供することにある。
【０１０３】
一実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子は、ゲノム配列であり、単細胞レベルでのゲノム変異を決定することができる。
【０１０４】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子はＲＮＡであり、単細胞レベルでのトランスクリプトームを決定することができる。
【０１０５】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子はタンパク質であり、単細胞レベルでのプロテオームを決定することができる。
【０１０６】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子は脂質であり、単細胞レベルでのリピドームを決定することができる。
【０１０７】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子は代謝物であり、単細胞レベルでのメタボロームを決定することができる。
【０１０８】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子は糖化タンパク質であり、単細胞レベルでのグリコームを決定することができる。
【０１０９】
他の実施形態では、検出および定量化対象である様々な生体分子は少なくとも１つの特異的プローブと相互作用するタンパク質であり、単細胞レベルでのインタラクトームを決定することができる。
【０１１０】
〔疾病に対する適用〕
本発明の他の目的は、
−疾病素因を予測するため、または被験者の疾病を診断するため、
−治療薬をスクリーニングするため、
−疾病の治療のために被験者に投与された治療薬の有効性をモニタリングするために、
単細胞レベルにて試料における少なくとも１つの生体分子を検出および定量化するための方法の利用である。
【０１１１】
本発明の他の目的は、疾病素因を予測するため、または被験者の疾病を診断するための方法である。この方法は、
（ａ）アレイ上に存在するプローブが、疾病に関連する、または特異的に発現することが知られる標的生体分子と相互作用することができる条件下において、上記被験者から単離した少なくとも１つの試料をアレイに接触させ、上記アレイ上に存在するプローブが少なくとも１つの微量な安定（または不安定）同位体によって標識されるステップと、
（ｂ）アレイを洗浄および乾燥させるステップと、
（ｃ）ＳＩＭＳによって共通二次イオンおよび対応する微量な二次イオンを検出および計数するステップであって、プローブと標的との相互作用の数は、各個別領域、マイクロウェルまたはナノウェルから得られるＤＩＲと、対照個別領域、対照マイクロウェルもしくは対照ナノウェルから得られる、または個別領域から得られるＤＩＲとを比較することによって定量化され、当該個別領域においては、プローブと標的との特異性相互作用が存在せず（すなわち、標的が分析対象である試料に存在しない）、または、非標識プローブと非標識標的との間に特異性相互作用が存在しない構成をとるステップと、
（ｄ）上記発現パターンと基準パターンとを比較するステップであって、上記疾病と関連する、または特異的に発現することが知られる少なくとも１つの生体分子の有無もしくは増減は、疾病が進行している可能性の指標または疾病の存在の指標である、ステップとを含む。
【０１１２】
一実施形態において、被験者は哺乳類である。好ましい実施形態において、被験者はヒトである。
【０１１３】
本発明に係る方法によると、検査すべき試料は、被験者の細胞、組織、器官または体液（血清、血漿、精液、滑液、脳脊髄液、血液もしくは尿など）から分離すればよい。
【０１１４】
病変細胞または組織から試料を抽出してもよい。例えば、細胞または組織は、ＨＩＶ、インフルエンザ、マラリア、肝炎、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスなどの病原体に感染していてもよい。一実施形態において、細胞または組織は、ウイルス性または細菌性の病原菌に感染していてもよい。他の実施形態では、疾病は癌である。他の実施形態では、疾病は、パーキンソン病、アルツハイマー症、または多発性硬化症などの神経変性疾患である。
【０１１５】
本発明の一実施形態では、上記方法は、癌の素因を予測すること、または被験者の癌を診断することを目的とする。
【０１１６】
本発明の他の実施形態では、上記方法は、細菌性疾患の素因を予測または診断することを目的とする。
【０１１７】
本発明の他の実施形態では、上記方法は、ウイルス性疾患の素因を予測または診断することを目的とする。
【０１１８】
本発明の他の目的は、治療薬をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）所望の少なくとも１つの治療薬とともに細胞を培養するステップと、
（ｂ）アレイ上に存在するプローブが標的生体分子と相互作用することができる条件下において、上記培養物から分離された少なくとも１つの試料をアレイに接触させ、上記アレイ上に存在するプローブが少なくとも１つの重同位体または不安定同位体によって標識されるステップと、
（ｃ）アレイを洗浄および乾燥させるステップと、
（ｄ）ＳＩＭＳによって共通二次イオンおよび対応する微量な二次イオンを検出および計数するステップであって、プローブと標的との相互作用の数は、各個別領域、マイクロウェルまたはナノウェルから得られるＤＩＲと、対照個別領域、対照マイクロウェルもしくは対照ナノウェルから得られる、または以下の個別領域から得られるＤＩＲとを比較することによって定量化され、当該個別領域においては、プローブと標的との特異的相互作用が存在せず（すなわち、標的が分析対象である試料に存在しない）、または、非標識プローブと非標識標的との特異的相互作用が存在しないステップと、
（ｅ）上記発現パターンと基準パターンとを比較するステップであって、特定の生体分子の増減が、上記治療薬の有効性の指標であるステップとを含む方法である。
【０１１９】
本発明の他の目的は、疾病の治療のために被験者に投与された治療薬の有効性をモニタリングするための方法である。方法は、
（ａ）アレイ上に存在するプローブが標的生体分子と相互作用することができる条件下において、上記被験者から分離された少なくとも１つの試料をアレイに接触させ、上記アレイ上に存在するプローブが少なくとも１つの重同位体または不安定同位体によって標識されるステップと、
（ｂ）アレイを洗浄および乾燥させるステップと、
（ｃ）ＳＩＭＳによって共通二次イオンおよび対応する微量な二次イオンを検出および計数するステップであって、プローブと標的との相互作用の数は、各個別領域、マイクロウェルまたはナノウェルから得られるＤＩＲと、対照個別領域、対照マイクロウェルまたは対照ナノウェルから得られる、あるいは以下の個別領域から得られるＤＩＲとを比較することによって定量化され、当該個別領域においては、プローブと標的との特異的相互作用が存在せず（すなわち、標的が分析すべき試料に存在しない）、または非標識プローブと非標識標的との間に特異的相互作用が存在しないステップと、
（ｄ）被験者の治療中に異なる回数、少なくとも１つの生体分子の試料から発現パターンを得るステップ、
（ｅ）上記発現パターンと基準パターンとを比較するステップであって、疾病に関連する、または特異的に発現することが知られる生体分子の増減が、上記治療薬の有効性の指標であるステップとを含む。
【０１２０】
〔実施例〕
以下の説明において、詳細な説明がなされていない全ての実験は、標準プロトコルにしたがって実施されている。
【０１２１】
以下の実施例は、本発明の好ましい形態を実証することを含む。当業者であれば、実施例は、本発明者が本発明の実施において好適に機能することを見出した技術に基づくものであり、その実施の好ましい形態を構成すると考えられることが理解できるであろう。しかしながら、当業者によれば、本開示を鑑みて、本発明の本質および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態を様々に変更することが可能であり、また、同じまたは同様の結果を得ることができる。
【０１２２】
＜実験１＞
この実験では、ＳＩＭＳ技術を用いて、同位体標識タンパク質、および異なる量の非標識分子を含む混合物における13Ｃ同位体の割合を定量検出することが可能であることを示す。
【０１２３】
〔同位体標識および希釈〕
同位体標識分子は、一般に、グリセロール（12Ｃの供給源である）およびアジ化ナトリウム（14Ｎの供給源である）などの保護剤ならびに防腐剤を含む緩衝液に供給される。これらの薬剤を用いて、透析膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅにより提供）を保護する。以下の実験の目的は、それらを除去するのに必要な透析の条件を決定することにある。
【０１２４】
利用可能な窒素が15Ｎである最小培地において培養したＥ．ｃｏｌｉから、タンパク質を抽出した。ＳＩＭＳにより、これらの同位体画分が９７．８％±０．０２％であることがわかった。これらの標識タンパク質２０μｇを水中にて６時間、未洗浄または洗浄済みのＭｉｌｌｉｐｏｒｅの透析膜において透析した。図３は、透析液中の15Ｎの同位体画分を示す。
【０１２５】
洗浄した膜の同位体画分レベルは、対照の同位体画分レベル（９７．９％±０．０２％）と類似していたが、未洗浄の膜（汚染窒素を含む）の同位体画分レベル（９２．１％±１．４％）は、それより低かった。したがって、透析膜を予め洗浄することにより、初期の同位体画分を復元することができた。
【０１２６】
また、利用可能な炭素が13Ｃのみである培地において培養した細菌からも、タンパク質を抽出した。これらのタンパク質の同位体画分は、ＳＩＭＳの測定によると、８６％±０．５％であった。そして、これらのタンパク質を水に溶解させ、最終濃度が１０％のグリセロールになるように二次溶液を生成した。図４は、これらの溶液における13Ｃの同位体画分を示す。
【０１２７】
グリセロールの添加により、同位体画分は７８％±２％まで減少したが、次段階のグリセロールを除去する透析により初期画分(８６％±２％)まで回復した。
【０１２８】
＜実験２＞
本実験によると、ＰＣＲ技術、および窒素化合物（汚染物質として、「定義」の項に記載されたＤＩＲ測定を混乱させる可能性がある）を含まない新規の緩衝液を用いて、同位体標識オリゴヌクレオチド（プローブ）を調製することができる。
【０１２９】
〔窒素汚染を低減するホウ砂緩衝液の使用〕
（はじめに）
生物学上の多くの方法においてトリスベースの緩衝液が用いられる。この有機分子は優れた緩衝液であり、さらにカルシウム塩またはマグネシウム塩の沈殿を引き起こさない。しかしながら、本方法にとって、トリスは14Ｎを含み、ＤＮＡ（および他の高分子）に対して強い親和性をもつという欠点をもつ。本方法が15Ｎプローブと14Ｎ標的との交雑により生じる15Ｎ／（14Ｎ＋15Ｎ）比を正確に測定することに基づくことから、上記14Ｎは本方法において重大な汚染となり、欠点となる。
【０１３０】
汚染窒素を含まないＤＮＡの生成方法は２つある。（ｉ）緩衝液にトリスを用いて、その後、ＤＮＡが生成されたらトリスを除去する方法、または（ｉｉ）トリスを含まない緩衝液を使用する方法である。一番目の方法は、時間およびコストがかかり、無駄が多い精製工程が必要になることから、本願においては二番目の解決策を採用し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に適したｐＨおよび濃度条件を設定する。我々が知る限りではＰＣＲにホウ砂緩衝液を用いることを説明した文献は存在しないが、本願においては、窒素を含まず、トリス緩衝液と同じｐＨ値を維持する無機緩衝液であるホウ砂緩衝液を使用した。
【０１３１】
〔材料および方法〕
（ＰＣＲ法）
【０１３２】
【表１】
2011513762.tif 000003
ＰＭＬ遺伝子由来のＤＮＡの２００ｂｐ配列を増幅させた。１周期の増幅のみによって（エラー生成を避けるため）テンプレート自体を生成した。ホウ砂緩衝液の効果を定量測定するように（そしてエラーの生成を制限するように）２０サイクルのＰＣＲを行なった。または、限定された基質を消費し、最大増幅を得るように６０サイクルのＰＣＲを行った。１％のアガロースゲルにおいて、電気泳動法によって単位複製配列を分析した。トリス緩衝液およびホウ砂緩衝液についての結果を示す。
【０１３３】
〔結果〕
２０サイクルの増幅の場合、ホウ砂緩衝液はトリス緩衝液の半分の収率であり、特筆すべきことに、ホウ砂緩衝液は異なる大きさの単位複製配列を生成しなかった。これはすなわち、ポリメラーゼがテンプレートの終端まで複製を継続したということである。６０サイクルの増幅では、トリス緩衝液およびホウ砂緩衝液は同様の結果を出した。
【０１３４】
〔結論〕
ホウ砂緩衝液はＰＣＲ増幅などの反応に最適であり、それゆえ、オリゴヌクレオチドプローブの合成にも最適である。したがって、本明細書に提示したＳＩＭＳに要求されるように、上記緩衝液を用いて汚染窒素を避けることができる。
【０１３５】
＜実験３＞
発明者らは、現在、ＳＩＭＳによる検出のためのＤＮＡおよびタンパク質配列を調製している。ＰＣＲを用いて、同位体標識および非標識ヌクレオチドプローブを調製し、ＰＭＬ遺伝子（前骨髄球性白血病タンパク質をコードする）の一部を含むＤＮＡとハイブリダイズした。プローブ配列（長さ２９８塩基）は、tgtctccaat acaacgacag cccagaagag gaagtgcagc cagacccagt gccccaggaa ggtcatcaag atggagtctg aggaggggaa ggaggcaagg ttggctcgga gctccccgga gcagcccagg cccagcacct ccaaggcagt ctcaccaccc cacctggatg gaccgcctag ccccaggagc cccgtcatag gaagtgaggt cttcctgccc aacagcaacc acgtggccag tggcgccggg gaggcagagg aacgcgttgt ggtgatcagc agctcggaag actcagat（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であった。
【０１３６】
プライマは、（順方向）５'−ＴＧＴＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＡＣＧＡＣＡＧＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、（逆方向）５'−ＡＴＣＴＧＡＧＴＣＴＴＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）であった。
【０１３７】
これらのヌクレオチドプローブは、適した化学技術によってシリコンウエハに共有結合される。これには、以下のステップが必要である。
【０１３８】
１）「ピラニア」混合物（Ｈ2Ｏ2：Ｈ2ＳＯ4  １：３）を用いてシリコンウエハを洗浄し、高濃度の表面ヒドロキシル基を含む酸化Ｓｉ表面を生じさせるステップ
２）官能基（例えばアルデヒド処理された）トリクロロオキシランまたはトリアルキルオキシランに表面ヒドロキシル基を結合させるステップ
３）ヌクレオチドプローブを上記官能基表面に接触させることによって、ヌクレオチドプローブを接着するステップ。
【０１３９】
同位体標識プローブおよび非標識抗体プローブを調製した。これらは、抗−ＣＤ３４、および抗クラスリンを含んでいた。適切な技術を用いてこれらの抗体プローブをシリコンウエハに接着させる。例えば、まずウエハ面をタンパク質Ａ（以下に示すように、同位体標識した）で覆い、その後抗体（タンパク質Ａが結合する）を加える。
【０１４０】
スタフィロコッカス  アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のタンパク質Ａのアミノ酸３２−３２７をコードする遺伝子をプラスミドにおいてクローン化し、ヒスチジン標識（以下の配列を参照）を有するＮ末端融合体を生成する。上記プラスミドを用いてエシェリキア  コリ（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、最小培地ＮＧ−５０５２（組成については下記を参照）において培養した。２５０ｍｌのフラスコ内にて２５ｍｌの細菌培養物を培養し、１８℃の温度下にて一晩、振盪させた（２２０ｒｐｍ）。培養物を遠心分離にかけ（６０００ｇ、４℃にて１０分間）、５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｎａ*ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で、ペレットを再び縣濁した。リゾチームを加え（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）、室温にて３０分間縣濁液を振盪させ、全出力の２０％の出力にて０．５秒のパルスで３０秒間ずつ２回超音波分解を行った（ＨＤ２２００／ｓｏｎｏｔｒｏｎｄｅ  ＭＳ７２）。遠心分離によって、溶解物の可溶性画分および不可溶性画分を分離した（２００００ｇ  ４℃の温度下にて２０分間）。イオン交換カラムに、（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＨＰ  １ｍｌをキレート化する）対イオンとしてニッケルととともに上清を加えた。この対イオンは１０倍量の緩衝液Ａによって予め平衡化されている。その後、２０倍量の緩衝液Ａを用いてカラムを洗浄し、１０倍量の緩衝液Ｂ（ｐＨ６．５である点を除いて緩衝液Ａと同一のもの）を用いて洗浄した。カラムに結合した融合タンパク質を１０倍量の緩衝液Ｃ（ｐＨ３である点を除いて緩衝液Ａと同一のもの）を用いて溶離させた。アクリルアミド勾配（７．５％〜１６％）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて溶出液を分析し、クマシーブルー、硝酸銀、および抗Ｈｉｓ抗体による免疫ブロット法を用いてタンパク質を可視化した。溶出液中の融合タンパク質の濃度は、０．３４４ｍｇ／ｍｌであると測定され（ブラットフォード法）、クマシーブルー染色ゲルの濃度測定により、タンパク質は９２％の純度であることがわかった。
【０１４１】
ここでは、Ｎ−５０５２における上記培養方法を用いて融合タンパク質を15Ｎに標識するが、非標識塩化アンモニウムの代わりに15Ｎ標識塩化アンモニウムを用いてもよい。
【０１４２】
〔培地ＮＧ−５０５２の組成〕
−Ｎａ2ＨＰＯ4   ５０ｍＭ
−ＫＨ2ＰＯ4     ５０ｍＭ
−ＮＨ4Ｃｌ      ５０ｍＭ
−Ｎａ2ＳＯ4     ５ｍＭ
−ＭｇＳＯ4      ２ｍＭ
−微量金属       １ｘ
−グリセロール   ０．５％（ｗ／ｖ）
−グルコース     ０．０５％（ｗ／ｖ）
−カナマイシン   ５０μｇ／ｍｌ
【０１４３】
〔培地Ｎ−５０５２の組成（Studier et al., 2005 Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein expression and purification 41: 207-234）〕
培地ＮＧ−５０５２
乳糖０．２％（ｗ／ｖ）
【０１４４】
〔「微量金属」溶液５０００ｘの組成〕
ＦｅＣｌ3  ５０ｍＭ
ＣａＣｌ2  ２０ｍＭ
ＭｎＣｌ2  １０ｍＭ
ＺｎＳＯ4  １０ｍＭ
【０１４５】
〔タンパク質Ａの融合タンパク質の配列〕
MGSSHHHHHHSSGPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
ＳＩＭＳを用いてプローブ−標的の連結を分析し、ＳＩＭＳ技術と標準の蛍光技術との比較を行なう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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