(57)【要約】  本発明は、向上されたナチュラルキラー細胞(Natural Killer cell, NK cell)の増殖方法に関し、具体的にはナチュラルキラー細胞を抗-CD3抗体及びインターロイキンタンパク質が含有された培地において、末梢血白血球細胞の存在下で培養する工程を含む、ナチュラルキラー細胞の増殖方法に関するものである。  本発明による方法は、既存のナチュラルキラー細胞の増殖方法に比べ、増殖率を顕著に増加させることにより、多量のナチュラルキラー細胞を得ることができる画期的なナチュラルキラー細胞の増殖方法を提供する。
2011529341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー細胞を抗-CD3抗体及びインターロイキンタンパク質が含有された培地において、末梢血白血球細胞の存在下で培養する工程を含む、ナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項２】
上記抗-CD3抗体は、OKT-3抗体、UCHT1抗体及びHIT3a抗体からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項1に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項３】
上記抗-CD3抗体は、OKT-3抗体であることを特徴とする、請求項2に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項４】
上記インターロイキンタンパク質は、IL-2、IL-15、IL-12、IL-18及びIL-21からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項1に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項５】
上記インターロイキンタンパク質は、インターロイキン-2(IL-2)であることを特徴とする、請求項4に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項６】
上記末梢血白血球細胞は、不活性化されたものであることを特徴とする、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項７】
上記不活性化された末梢血白血球細胞は、精製されたT細胞(purified T cell)であることを特徴とする、請求項6に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項８】
上記末梢血白血球細胞は、自己末梢血白血球細胞であることを特徴とする、請求項1に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項９】
ナチュラルキラー細胞を抗-CD3抗体及びインターロイキンタンパク質が含有された培地において、末梢血白血球細胞の存在下で培養する工程、
上記培養物から抗-CD3抗体を除去する工程、及び
上記抗-CD3抗体が除去された培養液をインターロイキンタンパク質が含有された培地に添加して追加培養する工程を含む、請求項1に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項１０】
上記抗-CD3抗体はOKT-3抗体であり、上記インターロイキンタンパク質はインターロイキン-2(IL-2)であることを特徴とする、請求項9に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項１１】
上記抗-CD3抗体が除去された培養液は、1×105乃至1×106細胞/ウェルの濃度で添加することを特徴とする、請求項9に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項１２】
上記抗-CD3抗体が除去された培養液は、1×105乃至3×106細胞/ウェルの濃度で添加することを特徴とする、請求項11に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高収率でナチュラルキラー細胞（Natural Killer cell, NK cell ）を増殖させる方法に関するもので、より具体的には、ナチュラルキラー細胞を抗-CD3抗体及びインターロイキンタンパク質が含有された培地で、末梢血白血球細胞の存在下で培養する工程を含むナチュラルキラー細胞の増殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー細胞(以下、「NK細胞」と略称する場合がある)は、免疫反応の一翼を担うリンパ球系の細胞である。この細胞には種々の機能があるが、特に腫瘍細胞を殺す強い活性があるので、体内では腫瘍化された又は腫瘍化に向かう異常がある細胞を除去する免疫監視機構の重要なメンバーと考えられている。これにより、この細胞を腫瘍の治療や腫瘍の発生源になるものとして想定されているウイルス感染細胞の除去において、有効利用しようとする研究が古くから行われている。
【０００３】
健常者の体内に存在するほとんどのNK細胞は不活性化状態で存在する。多くの研究者らが正常な血液から、又は不活性化された患者の血液からNK細胞を活性化させる研究を進めている。
【０００４】
体外で活性化されたNK細胞の高い細胞毒性は、免疫細胞治療剤としての可能性を開き、多様な癌腫に対して試験管内(in vitro)で、又は動物実験で可能性を確認した。通常は腫瘍細胞株(tumor cell line)を用いて試験管内のNK細胞の細胞毒性を確認し、血液癌、肝癌、肺癌、腎臓癌、小児神経癌及び皮膚癌などの種々の癌種に対して、NK細胞は相当な細胞毒性を示していた。特に、NK細胞は血液癌と小児神経癌腫に対して臨床及び非臨床において肯定的な治療効果を示した。
【０００５】
このような臨床可能性にも関わらず、体内に存在するNK細胞の数はそれほど多くなくて、治療的効果を示すために必要な有効NK細胞の数は非常に多いので、白血球搬出術(Leukapheresis)を行って多量の白血球を収集したとしても一度の採血で、1、2度の治療しかできない。
【０００６】
細胞治療療法において、十分な細胞の数と繰り返し投与は極めて重要な要素であるが、NK細胞の増殖が不完全で十分な数の細胞が投与されなかった場合は、臨床に適用する上で最も大きな問題点となり、このような点を克服するためNK細胞の増殖に対するたくさんの研究があったが、臨床に適用可能な水準に至らなかった。一般に、IL-2又はその他のサイトカイン(cytokine)及び化合物(chemical)を利用したNK細胞の増殖に対する研究は、初期分離されたNK細胞の数の3〜10倍程度の増加にしか至らなかった。
【０００７】
1990年代以後、ナチュラルキラー細胞の増殖に関する研究が種々の方面に進められた。既存のT細胞の増殖/活性のために用いていたIL-2だけでなくIL-15(Dunne J et al., Immunology, vol.167:3129. 2001, SA Perez, et al., Blood, vol. 106:158, 2005)、LPS(MR Goodier et al., Immunology 165:139,2000)、及びCD3を刺激するOKT-3抗体(Condiotti R, et al., Experimental Hematology 29:104, 2001)を用いて単独/複合の形態で用いることによってナチュラルキラー細胞を増殖させる研究があった。しかし、これらは古典的なIL-2の使用に対する変形及び発展の形態で、新しい増殖物質を見つけたにすぎず、画期的な増殖方法を提示することはできなかった。
【０００８】
一方、一部の研究者によって腫瘍細胞株を支持細胞(feeder cell)として用いてNK細胞を増幅させた事例も報告されたことがあるが、ほとんどが腫瘍細胞株を支持細胞として用いるなど、臨床適用において重要な安全性を保障するには適合してない方法であった。
【０００９】
そこで、本発明者らは、不活性化された自己末梢血細胞を支持細胞として用いて安全性を確保し、OKT-3抗体とIL-2を同時に処理することで、ナチュラルキラー細胞の殺傷能は維持しつつ、増殖率は懸隔に増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、ナチュラルキラー細胞を高い効率で増殖させる方法を提供することにある。
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明はナチュラルキラー細胞を抗-CD3抗体及びインターロイキンタンパク質が含有された培地で末梢血白血球細胞(peripheral blood lymphocyte, PBL)の存在下で培養する工程を含む、高純度のナチュラルキラー細胞を短期間で爆発的に増殖させる方法を提供する。
【００１２】
好ましい例として、本発明は、ナチュラルキラー細胞の培養において、自己PBL(peripheral blood lymphocyte)を支持細胞(feeder cell)として用いながらOKT-3抗体とIL-2を同時に処理する。
【００１３】
また、上記方法は、培養物から抗-CD3抗体を除去する工程及び上記の抗-CD3抗体が除去された培養液をインターロイキンタンパク質が含有された培地に添加して、追加培養する工程を含むが、この時、追加培養のために添加する抗-CD3抗体が除去された培養液には、1×105乃至3×106細胞/ウェル濃度のナチュラルキラー細胞が含有されていることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】健常者の末梢血液から分離した初期NK細胞の表面型を分析した結果である。
【図２】本発明の方法によって培養して得られたNK細胞の表面型を分析した結果である。
【図３】本発明の方法によって培養して得られたNK細胞の腫瘍殺傷能を確認した結果である。
【図４】本発明の方法によって培養して得られたNK細胞の増殖能を確認した結果である。
【図５】支持細胞PBMC、抗-CD3抗体OKT-3及びIL-2の有無による各々の培養条件で培養して得られたNK-細胞の増殖能を比較した結果である。
【図６】ナチュラルキラー細胞の播種(seeding)濃度を変えながら培養して得られたNK-細胞の増殖能を比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明に対して具体的に説明する。
【００１６】
本発明は、一観点から、ナチュラルキラー細胞(Natural killer cell, NK)を抗-CD3抗体及びインターロイキンタンパク質が含有された培地において、末梢血白血球細胞(PBL, peripheral blood lymphocyte)の存在下で培養する工程を含む、ナチュラルキラー細胞の増殖方法に関するものである。
【００１７】
本発明の上記ナチュラルキラー細胞の増殖方法は、特に制限されないが、例えば、以下のような工程を含み行え得る。
【００１８】
(1)ヒト末梢血液から末梢血白血球細胞及びナチュラルキラー細胞を分離する工程、
(2)ナチュラルキラー細胞を分離してない自己末梢血白血球細胞を不活性化させる工程(不活性化された支持細胞を準備する工程)、
(3)ナチュラルキラー細胞を抗-CD3抗体及びインターロイキンタンパク質が含有された培地において不活性化された末梢血白血球細胞の存在下で培養する工程、
(4)上記の培養物から抗-CD3抗体を除去する工程、及び
(5)上記抗-CD3抗体が除去された培養液をインターロイキンタンパク質が含有された培地に添加して追加培養する工程。
【００１９】
ナチュラルキラー細胞は、健常者の血液内に約10〜15％程度存在し、非自己抗原と反応する時に高い殺傷能を有する。各種ウイルスによって感染された細胞や細菌の浸透、又は非正常細胞の生成において、NK細胞は非特異的に即刻反応して異物を除去する。しかし、体内に存在するNK細胞の数はあまり多くなくて、治療的効果を示すために必要とされる有効NK細胞の数が相当多い必要があるため、効果的なNK細胞の増殖方法に対する必要性が求められているのが実情である。
【００２０】
ナチュラルキラー細胞を増殖させる方法は、大きく2つが考えられる。NK細胞のみを純粋に分離した後、支持細胞を用いながら適切な刺激を与えて増幅する方法と、全体末梢血白血球細胞(PBL)又は末梢血単核球細胞(PBMC, peripheral blood mononuclear cell)からNK細胞を選択的に増幅させて相対的に多くのNK細胞を得る方法とがある。
【００２１】
ナチュラルキラー細胞の分離を経ずにPBLからナチュラルキラー細胞を選択的に増幅させる方法で得られた細胞は、分離されたナチュラルキラー細胞群に対して細胞殺傷能が劣り、また、ナチュラルキラー細胞だけではなくT細胞も存在するため、自己MHC分子によって自己と非自己を認識するT細胞を除去しない限り、自己移植に限定するしかないという問題点がある。
【００２２】
本発明は、前者の分離されたナチュラルキラー細胞を増幅する方法に関するもので、本発明による増殖方法においても支持細胞を用いることを特徴とする。
【００２３】
末梢血液からナチュラルキラー細胞を分離する方法は、当業者に公知である通常の方法を用いることができ、市販されているものを購入して用いることもできる。本発明の一具体例ではRosettesep NK cell enrichment cocktail(ステムセル社(Stem cell technologies)、15065)を購入して用いた。
【００２４】
一方、「培養補助細胞(Feeder cell)」は、分裂増殖できないが、代謝活性があるため種々の代謝物質を生産して目的細胞の増殖を助ける細胞であり、最初に移植したこのような細胞を「支持細胞」とする。本発明では「feeder cell」を支持細胞という用語で用いることにする。
【００２５】
本発明で用いる支持細胞(feeder cell)としては、遺伝子が導入された動物細胞株や各種サイトカイン若しくは化合物が処理された末梢血白血球細胞(PBL)、自己又は他人の末梢血白血球細胞(PBL)、T-細胞、B-細胞、又は単核球などが挙げられる。最も好ましくは、自己末梢血白血球細胞(PBL)を用いることができる。
【００２６】
上記支持細胞に利用される自己末梢血白血球細胞は、不活性化させて用いることで安全性を確保する。不活性化させる方法としては、当業者に公知である通常の方法を使用しても良く、例えば、γ線を照射する方法が使用できる。このような不活性化させた支持細胞(feeder cell)は精製されたT-細胞(purified T cell)を含む。
【００２７】
本発明のように、支持細胞を用いる増殖方法は、ナチュラルキラー細胞を純粋分離した後に増殖させる方法で、以後も続けて分離されたナチュラルキラー細胞のみを増殖できる利点がある。
【００２８】
さらに、本発明の増殖方法は、ナチュラルキラー細胞を抗-CD3抗体及びインターロイキンタンパク質が含有された培地で培養することを特徴とする。
【００２９】
抗CD3抗体とは、T細胞受容体(TCR)と会合して抗原認識複合体を形成する分子群であるCD3抗原に特異的に反応するタンパク質であり、CD3分子はTCRと比較して細胞内の領域が長く、抗原認識信号を細胞内に伝達する役割を担っている。
【００３０】
本発明において用いることができる抗-CD3抗体の例としては、OKT-3抗体、UCHT1抗体及びHIT3a抗体などが挙げられ、好ましくはOKT-3抗体である。
【００３１】
インターロイキン(Interleukin, IL)タンパク質とは、リンパ球又は単球及びマクロファージなどの免疫担当細胞が生産するタンパク質性の生物活性物質の総称で、サイトカイン内の一群の分子種を指す。
【００３２】
本発明において使用できるインターロイキンタンパク質の例としては、IL-2、IL-15、IL-12、IL-18及びIL-21などが挙げられ、好ましくはIL-2タンパク質である。
【００３３】
本発明の培養方法は、AIM-V培地、RIMI1640、CellGro SCGM及びX-VIVO20のような通常の動物細胞培養用の培地にヒト末梢血から分離したNK細胞及びPBLを加え、この培養物に抗-CD3抗体及びインターロイキンタンパク質を添加して培養する。本発明の一具体例では、OKT-3抗体とIL-2を添加して培養した。添加するOKT-3抗体の濃度は0.1〜100ng/ml、好ましくは約10ng/mlであり、IL-2の濃度は10〜2000U/ml、好ましくは約500U/mlである。
【００３４】
また、ここに血清又は血漿とリンパ球の増殖を支持する追加の増殖因子を添加して培養することもできる。培地に添加する血清又は血漿の種類は特に限定されておらず、市販の各種動物由来のものを用いることができるが、ヒト由来として本人由来のものがより好ましい。例えば、PBMCからリンパ球を増殖させるサイトカインの組み合わせや、リンパ球の増殖を刺激するレクチン類などを添加するなど、当業者に知られている方法を用いることができる。
【００３５】
別の観点から、本発明はナチュラルキラー細胞を顕著に増殖させることができる最適なナチュラルキラー細胞の培養濃度を提供する。
【００３６】
前に説明したように、本発明の一つの態様をより具体的に記述すると、まず分離したナチュラルキラー細胞を抗-CD3抗体及びインターロイキンタンパク質が含有された培地において、末梢血白血球細胞の存在下で培養する工程、上記培養物から抗-CD3抗体を除去する工程、及び上記抗-CD3抗体が除去された培養液をインターロイキンタンパク質が含有された培地に添加して追加培養する工程を含む。
【００３７】
この時、抗-CD3抗体が除去された培養液をインターロイキンタンパク質が含有された培地に添加して追加培養することにおいて、培地に播種するナチュラルキラー細胞の濃度が増殖率に大きな影響を及ぼす。
【００３８】
好ましくは、ナチュラルキラー細胞が1×105乃至1×106細胞/ウェルの濃度で播種されていることが良く、より好ましくは1×105乃至3×106細胞/ウェルの濃度が良い。特に2×105細胞/ウェルの濃度で播種した場合、培養後14日で約900倍の増殖率を示していることを、実験を通じて確認した。
【００３９】
本発明では、ナチュラルキラー細胞を、適正濃度で、支持細胞を用いながらOKT-3抗体のような抗-CD3抗体とIL-2のようなインターロイキンタンパク質とを同時に処理することで、支持細胞のみを用いるか又はOKT-3抗体の刺激のみを用いた既存の研究に対して、高純度のナチュラルキラー細胞を短期間でより爆発的に増殖させることができる。
【００４０】
また、別の観点から、本発明は上記の方法で得られたナチュラルキラー細胞に関するものである。上記方法により増殖培養されたナチュラルキラー細胞の表面型特性を以下で説明する。
【００４１】
健常者の末梢血液を分離した初期NK細胞は、90%以上がCD3-/CD56+の表面型を有している。これを本発明の方法によって増殖培養させると、培養開始日から7日目頃にはCD3+T細胞が相対的に減っていき、CD3-/CD56+NK細胞がさらに多くなり、培養開始日から10日目頃にはほぼすべてのCD3+T細胞が消えてなくなり、95%以上の細胞全てがCD16を発現する活性化されたNK細胞である。つまり、CD16+の表面型を有する高純度のナチュラルキラー細胞を短期間で増殖させて得ることができる。
【００４２】
したがって、臨床適用が可能な、多量の活性化されたNK細胞を用いて腫瘍治療や腫瘍の発生源になるものと想定されているウイルス感染細胞の除去に有効な細胞治療剤が調製できる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものとして、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは当業者には明らかである。
【００４４】
実施例1：支持細胞の準備及びナチュラルキラー細胞の分離
(1)支持細胞の準備
健常者の末梢血液20mlを採血し、採取した血液5mlを15mlのコニカル(conical)チューブに入れた。生理食塩水5mlをその血液にさらに入れ、ピペットで十分に混合した。新しい15mlのコニカルチューブにフィコール(ficoll)(GEヘルスケア、アップサラ(Uppsala), 17-1440-03)を5ml入れ、フィコールが入っている15mlのチューブに上記で混合された(希釈された)血液を慎重に入れた後、2000rpmで常温で30分間遠心分離(ハンイル(Hanil)、韓国、Union32-R)した。
【００４５】
フィコールと血漿の間にできた免疫細胞層を新しい15mlのコニカルチューブに移し入れた後、HBSSを総量が10mlになるように入れて細胞をよく混ぜ1200rpmで10分間遠心分離した。上澄液は真空吸引して十分に除去した。さらに、HBSSを10ml添加して遠心分離する過程を繰り返した。
【００４６】
細胞培養液(hAB serum(シグマ(Sigma)、H4522)が5%含まれたAIM-V media(インビトロジェン(Invitrogen)、12055091)を1ml入れて細胞を分離した後、上記の細胞溶液中10μlをマイクロチューブに移し、トリパンブルー(trypan blue)(ギブコ(Gibco))90μlを入れてピペットでよく混ぜ、トリパンブルー(ギブコ、15250-061)試薬で染色して逆相顕微鏡(inverted microscope)(Olympus, CK2-TRC-2)を用いて細胞の数が5×106細胞/mlになるように細胞培養液を入れて希釈した。
【００４７】
FACS分析のために1mlの細胞懸濁液を5mlのチューブに移し入れて、残りの細胞は2000cGyのγ線を照射して不活性化させ(gamma-irradiatrior, MDS Nordion, gammacell 3000 Elan)支持細胞を用意した。
【００４８】
(2)NK細胞の分離
前に健常者から採血した血液のうち15mlを新しい50mlのコニカルチューブに移し入れ、Rosettesep NK cell enrichment cocktail(ステムセル社、15065)を750μl添加した後、常温で20分間ゆっくり回転させながら反応させた。上記反応が終わった血液に15mlの生理食塩水を追加してよく混ぜた。
【００４９】
新しい15mlのコニカルチューブ3個に各々フィコールを5mlずつ入れ、フィコールが入っている15mlのコニカルチューブに上記の生理食塩水を混ぜておいた血液10mlずつを慎重に入れた後、2000rpmで常温で30分間遠心分離した。遠心分離の後に、フィコールと自己血漿液の間のナチュラルキラー細胞層を全て新しい15mlのコニカルチューブに移し入れ、HBSSを総量が10mlになるように入れて、1500rpmで10分間さらに遠心分離した。上澄液を十分に除去し、さらにHBSSを総量が10mlになるように入れ、細胞を十分に分離した後、1200rpmで10分間遠心分離した。真空下で上澄液を除去した後に、細胞培養液を1ml入れ、細胞を十分に分離した。
【００５０】
細胞希釈液のうち10μlをマイクロチューブに移し40μlのトリパンブルーを入れピペットでよく混ぜてトリパンブルーで染色し、細胞数を測定しながら細胞数が1×106細胞/mlになるように細胞培養液で希釈した。
【００５１】
(3)分離された初期NK細胞の特性
上記分離されたNK細胞に抗-ヒトCD3-FITCと抗-ヒトCD56-APC抗体を染色(staining)して表面型を分析した。その結果、図1で分かるように、初期分離された細胞の90%以上がCD3-/CD56+のNK細胞であることを確認した。
【００５２】
実施例2：分離したナチュラルキラー細胞の培養
初期細胞は、12-ウェルプレート(ファルコン(Falcon))で培養した。実施例1-(1)で準備された支持細胞500μlをウェルに入れ、実施例1-(2)で分離したナチュラルキラー細胞500μlを支持細胞が入っているウェルに追加で入れた。
【００５３】
細胞が入っている各ウェルに500U/ml濃度のIL-2(ノバルティス(Norvatis)サイトカインとOKT-3抗体(ベイバイオサイエンス(ebioscience)、16-0037)10ng/mlを入れて、プレートを慎重に揺らして細胞とサイトカインをよく混ぜた。
【００５４】
プレートは5%の二酸化炭素が含まれた37℃の湿潤培養器に入れ、5日間培養し、この時、いかなる培養液やサイトカインも添加してない。
【００５５】
培養開始日から5日目になる日、細胞が入っている全てのウェルをパイペッティングして15mlのコニカルチューブに細胞を回収した。細胞が除去された各ウェルに細胞培養液を各1mlずつ入れて残った細胞を十分に回収して、回収した細胞は1200rpmで10分間遠心分離した。上澄液は十分に真空吸入してOKT-3抗体を除去した。
【００５６】
残った細胞は細胞培養液2mlを入れ希釈し、希釈された細胞10μlを取ってマイクロチューブに入れ、トリパンブルー溶液90μlとよく混ぜてトリパンブルーで染色して細胞の数を測定した。2×105細胞/ウェルになるように細胞培養液を入れて希釈した。
【００５７】
さらに、500U/mlになるようにIL-2を添加して、細胞とよく混ぜた後、12-ウェルプレートに2×105細胞/ml/ウェルで細胞を播種した。上記プレートを5%の二酸化炭素が含まれた37℃の湿潤培養器に入れ、12日間さらに培養した。
【００５８】
この時、OKT-3抗体を除去した次の日から、培養開始日から数えて10日目の日まで500U/mlのIL-2が添加されている細胞培養液を1mlずつ入れた。
【００５９】
培養開始日から10日目になる日に、細胞を回収し、数を測定して、回収された細胞は、T75フラスコに1×107個の細胞を再度植えて500U/mlのIL-2が入っている細胞培養液を5mlずつ入れた。細胞培養液は次のフラスコに移す時まで毎日5mlずつ入れた。
【００６０】
これ以上細胞が増殖されない程度になった後に新しいフラスコに移し、IL-2(500U/ml)が入っている細胞培養液を17日目になる日まで毎日5mlずつ入れた。
【００６１】
実施例3：得られたNK細胞の表面型分析
OKT-3の除去後、IL-2のみを単独処理して7日目と10日目になる日に、一部の細胞を回収して表面型を分析した。
【００６２】
培養前、培養中又は培養が終了した細胞を回収して12000rpmで5分間遠心分離して、培養溶液を真空吸入して除去した。1mlのFACS緩衝液(2.5% FBS+PBS)で希釈して細胞数を測定し、5×106細胞/mlになるようにFACS緩衝液で希釈した。FACSチューブ(ファルコン)に希釈した細胞溶液を100μlずつ入れ、次のように抗体を入れた。
【００６３】
チューブ1：染色なし
チューブ2：抗-ヒトCD3-FITC(BD Pharmingen, 5555339)+抗-ヒトCD56-APC(BD Pharmingen, 555518)+抗-ヒトCD16-PE(BD Pharmingen, 555407)
チューブ3：抗-CD16-FITC(Color control)(BD Pharmingen, 555406)
チューブ4：抗-CD56-PE(Color control)(BD Pharmingen, 555516)
チューブ5：抗-CD56-APC(Color control)
上記チューブを30分間冷蔵温度で放置して染色した後、染色が終わった細胞に2mlのFACS緩衝液を入れ、1500rpmで5分間遠心分離した。上澄液を除去し、さらに2mlの緩衝液を入れ1500rpmで5分間遠心分離した。さらに上澄液を除去して、300μl FACS緩衝液を入れボルテックス(vortexing)して細胞を分離した。FACSCalibur(Becton Dickinson)を用いて表面型を分析した。
【００６４】
その結果、図2に示すように、7日目においてOKT-3を処理した方が、処理せずに培養した方よりもCD3+T細胞が相対的に減り、CD3-CD56+NK細胞がより多かった。CD3+細胞は、未だ死なずに残存しているirradiated PBMCと推定される。培養開始日から10日目になる日において、OKT-3とfeeder PBMCとを用いて培養した場合、ほぼ全てのCD3+T細胞は消失し95%以上の細胞がNK細胞であることが確認される。すなわち、増殖されたNK細胞はいずれもCD16を発現する活性化されたNK細胞である。
【００６５】
実施例4：培養されたNK細胞の細胞殺傷能評価(Cr-release assay)
(1)作用細胞(Effector cell)の準備
ナチュラルキラー細胞の培養14日目に一部の細胞を回収して、1200rpmで5分間遠心分離して上澄液を除去した後、2mlの細胞培養液に入れ希釈した。細胞の数が3×106細胞/mlになるように細胞培養液を添加して希釈し、後に作用細胞：標的(target)細胞(E:T)比率=30:1に用いるように調整した。
【００６６】
上記のように準備された細胞懸濁液のうち1mlを取って新しいチューブに入れ、細胞培養液を2mlさらに添加してよく混ぜながら、後に作用細胞:標的細胞(E:T)比率=10:1に用いるように合わせた。また、その細胞懸濁液のうち500μlを取って新しいチューブに入れ、細胞培養液を4.5mlさらに添加してよく混ぜながら、後に作用細胞:標的細胞(E:T)比率=3:1に用いる調整した。
【００６７】
96-ウェルプレートに各条件について3ウェル/比率になるよう、上記特定比率で調整されたNK細胞を100μlずつ入れた。
【００６８】
(2)標的細胞の準備
80%コンフルエントにされている急性リンパ球性白血病(acute lymphoblastic leukemia)の細胞株であるCEMと慢性骨髄性白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)の細胞株であるK562を準備して、上記2つの細胞株を回収した後、15mlのコニカルチューブに入れ、1200rpmで5分間遠心分離した。上澄液は除去して、5mlの細胞培養液を入れて細胞を希釈した。細胞の数を測定して、1×106個の細胞を15mlのチューブに移し入れた。移された細胞に細胞培養液を総量が10mlになるように入れた後、1200rpmで5分間遠心分離した。上澄液は除去してFBS 25μlを入れ細胞を希釈した後、Cr-51(Perkin Elmer)を100μlずつ添加した。
【００６９】
チューブを5%の二酸化炭素が含まれた37℃の湿潤培養器に入れ1時間放置した後、細胞を取り出して細胞培養液を総量が10mlになるように入れて1200rpmで5分間遠心分離した。上澄液は除去して、同じ方法でさらに2回洗浄した。洗浄が終わった細胞に細胞培養液を10ml入れ、ピペットで均一に希釈した。
【００７０】
(3)殺傷能の測定
希釈された細胞株を、予め準備した作用細胞(effector cell)が入っている底が丸い96-ウェルプレート(ファルコン)に１ウェル当たり100μlずつをさらに入れた。各条件に対する陰性対照(spontaneous control)として、作用細胞が入っていない3個のウェルに標的細胞100μlを入れて、細胞培養液を100μl入れた。各条件に対する陽性対照(maximum control)として作用細胞が入っていない3個のウェルに標的細胞100μlを入れて、1%のトリトンX-100(triton X-100)が含まれたPBSを100μl加え、4時間培養した。
【００７１】
その後、2000rpmで3分間遠心分離して細胞を沈殿させて、5mlのテストチューブに上澄液を100μlずつ移し入れ、ガンマ計数機(gamma-counter:COBRA)を用いてガンマ線を測定した。次の式を用いて細胞毒性を計算した。
【００７２】
【数１】
2011529341.tif 000003
【００７３】
その結果、図3から分かるように、2つの細胞株間の細胞毒性は異なったが、2種類の標的細胞の全てにおいて最大70%以上の高い細胞毒性を示した。
【００７４】
実施例5:培養されたNK細胞の細胞増殖能評価(CFSE-proliferation assay)
実施例1のように、健常者の末梢血液15mlからRosetteSepを用いてNK細胞を分離して、自己末梢血液細胞を放射線照射して増殖を抑制してから支持細胞として用いた。PBL刺激に抗-CD3抗体(OKT-3)を低濃度で5日間刺激して、以後IL-2が添加された培地で17日間培養して最大600倍のNK細胞の増殖を確認した。
【００７５】
その結果、図4から確認できるように、OKT-3抗体の刺激がない場合、10日培養後に20倍の増殖で終わるのに対して、OKT-3の刺激で10日培養後には112倍、17日培養後には最大600倍の増殖を確認した。
【００７６】
比較例1:培養されたNK細胞の細胞増殖能比較
NK細胞の増殖能評価比較のために次のような条件で各々培養した。
【００７７】
a. NK細胞+IL-2(500U/ml)
b. NK細胞+IL-2(500U/ml)+OKT-3(10ng/ml)
c. NK細胞+IL-2(500U/ml)+放射線照射されたPBMC
d. NK細胞+IL-2(500U/ml)+放射線照射されたPBMC+OKT-3(10ng/ml)
全てのNK細胞は実施例1のように、Rosettesepを用いて分離し、放射線照射されたPBMCをNK細胞の5倍の数で播種した。培養開始日から5日目に、各細胞を回収して細胞の数を測定した。
【００７８】
上記、各条件別に1×106細胞を用意して5mlのチューブに移し入れ、細胞培養液が最終的に500μlになるように入れて、5μMのCFSE溶液を入れた後、細胞培養器で30分間放置した。PBSを用いて3回洗浄した後、FACS Calibureを用いて530nmの波長を分析した。
【００７９】
その結果、図5から分かるように、NK細胞のみを単独で培養するより支持細胞とともに培養する方が細胞増殖を促進し、支持細胞とともにOKT-3を処理した場合、より細胞増殖に効果的であることを確認した。そして、最も顕著な効果を発揮するのは、上記のd条件であるIL-2とOKT-3を同時に処理した場合で、14日間の培養で約200倍前後、17日間の培養で約600倍以上の増殖能力を示した。
【００８０】
実施例7:培養されたNK細胞の濃度別細胞増殖能の評価
実施例2のように、初期培養とOKT-3の除去を行った後、NK-細胞の数が次のように異なる濃度別に細胞を希釈した後、12-ウェルプレートに播種して、細胞培養器で9日間さらに培養し細胞の数を測定した。
【００８１】
a. 1×105細胞/ml/ウェル
b. 2×105細胞/ml/ウェル
c. 5×105細胞/ml/ウェル
d. 1×106細胞/ml/ウェル
各条件による細胞増殖を比較した結果、図6から分かるように、2×105細胞/mlで播種した場合、14日で約900倍と最大の増殖を示しており、1×106細胞/mlで播種した場合、14日で約100倍と最も増殖の程度が低かった。従って、OKT-3を除去した後、播種濃度がナチュラルキラー細胞の増殖に極めて大きな要素として作用していることを確認した。
【００８２】
以上、本発明の内容を詳細に記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は単に好適な実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とこれらの等価物によって定義されるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によるナチュラルキラー細胞の増殖方法は、既存の方法に比べてナチュラルキラー細胞の殺傷能を維持しながら、最大の増殖が可能な画期的な方法のため、少量の採血で多くのナチュラルキラー細胞を得ることができるようになることで、細胞治療剤としての常用化に有用である。
【００８４】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業者にとっては、このような具体的な記述は単に好適な実施態様に過ぎず、これによって、本発明の範囲が制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年3月14日(2011.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー細胞を、支持細胞として不活性化された末梢血白血球細胞の存在下において、上記支持細胞を刺激するための抗-CD3抗体及び成長因子としてインターロイキンタンパク質を含有する培地で培養する工程を含む、ナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項２】
上記抗-CD3抗体は、OKT-3抗体、UCHT1抗体及びHIT3a抗体からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項1に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項３】
上記抗-CD3抗体は、OKT-3抗体であることを特徴とする、請求項2に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項４】
上記インターロイキンタンパク質は、IL-2、IL-15、IL-12、IL-18及びIL-21からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項1に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項５】
上記インターロイキンタンパク質は、インターロイキン-2(IL-2)であることを特徴とする、請求項4に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項６】
上記不活性化された末梢血白血球細胞は、T細胞(purified T cell)を含むことを特徴とする、請求項1に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項７】
上記末梢血白血球細胞は、自己末梢血白血球細胞であることを特徴とする、請求項1に記載のナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【国際調査報告】
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