(57)【要約】本発明により、異種配列の発現のための組成物および方法が提供される。これらの組成物および方法は、治療用途、診断用途、および産業用途の、大量の異種タンパク質および核酸を発現するのに特に有用である。一局面において、本発明は、宿主細胞中で異種配列を発現させる方法を提供し、この方法は、この異種配列が発現される培地中および条件下でこの宿主細胞を培養する工程を含み、この異種配列が、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結され、そしてこの異種配列の発現が、この培地にガラクトースを直接補充することなく誘導される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞中で異種配列を発現させる方法であって、該異種配列が発現される培地中および条件下で該宿主細胞を培養する工程を含み、該異種配列が、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結され、そして該異種配列の発現が、該培地にガラクトースを直接補充することなく誘導される、方法。
【請求項２】
前記異種配列の発現が、ガラクトースではない糖によって、ガラクトースが補充された培地中で前記宿主細胞を培養することによって得られるレベルと同等のレベルにまで誘導され、補充されたガラクトースの量とガラクトースではない糖の量は、モル数として測定すると同等である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主細胞中で異種配列を発現させる方法であって、該異種配列が発現される培地中および条件下で該宿主細胞を培養する工程を含み、該異種配列が、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結され、そして該異種配列の発現が、該培地にラクトースが添加されると誘導される、方法。
【請求項４】
前記異種配列の発現が、ラクトースが補充されると、ガラクトースが補充された培地中で前記宿主細胞を培養することによって得られるレベルと同等のレベルにまで誘導され、補充されたガラクトースの量とラクトースの量は、モル数として測定すると同等である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記異種配列がタンパク質性産物をコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記異種配列が、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アプタマー、およびリボザイムからなる群より選択される産物を生産する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞中でイソプレノイドを生産させる方法であって、メバロン酸非依存性デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路またはメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種類またはそれ以上の酵素をコードする１種類またはそれ以上の異種配列を発現する宿主細胞を培養する工程を含み、該１種類またはそれ以上の異種配列は、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結され、そして該１種類またはそれ以上の異種配列の発現が、該培地にガラクトースを直接補充することなく誘導される、方法。
【請求項８】
前記１種類またはそれ以上の異種配列の発現が、ラクトースの存在下で誘導される、請求項１または７に記載の方法。
【請求項９】
前記イソプレノイドが、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記イソプレノイドがＣ２０＋イソプレノイドである、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞に、プレニルトランスフェラーゼおよびイソプレノイドシンターゼをコードする外因性配列がさらに含まれる、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地にラクトースとラクターゼとが含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞に、ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞に、ＧＡＬ２ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞に、ラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞に、ＧＡＬ２であるガラクトーストランスポーターが含まれる、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項１７】
前記ガラクトース誘導性調節エレメントがエピソーム性である、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項１８】
前記ガラクトース誘導性調節エレメントが、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ガラクトース誘導性調節エレメントに、ＧＡＬ７プロモーター、ＧＡＬ２プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＬ３プロモーター、ＧＣＹ１プロモーター、ＧＡＬ８０プロモーターからなる群より選択されるガラクトース誘導性プロモーターが含まれる、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞に、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞に、ラクターゼ酵素をコードする外因性配列が含まれる、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞に、分泌可能なラクターゼをコードする外因性配列が含まれる、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞がガラクトースを異化する低減された能力を示す、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、機能性のＧＡＬ１タンパク質、ＧＡＬ７タンパク質、および／またはＧＡＬ１０タンパク質を欠いている、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞がＧＡＬ４タンパク質を発現する、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、構成的なプロモーターの制御下でＧＡＬ４タンパク質を発現する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１、３、または７に記載の方法。
【請求項３０】
培地中で培養すると、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された異種配列を発現するように修飾された宿主細胞であって、該異種配列の発現が、該培地にガラクトースを直接補充することなく誘導される、宿主細胞。
【請求項３１】
前記異種配列の発現が、ガラクトースではない糖によって、ガラクトースが補充された培地中で前記宿主細胞を培養することによって得られるレベルと同等のレベルにまで誘導され、補充されたガラクトースの量とガラクトースではない糖の量は、モル数として測定すると同等である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
培地中で培養すると、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された異種配列を発現するように修飾された宿主細胞であって、該異種配列の発現が、ラクトースの存在下で誘導される、宿主細胞。
【請求項３３】
前記異種配列の発現が、ラクトースが補充されると、ガラクトースが補充された培地中で前記宿主細胞を培養することによって得られるレベルと同等のレベルにまで誘導され、補充されたガラクトースの量とラクトースの量は、モル数として測定すると同等である、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
前記宿主細胞に、ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
前記宿主細胞に、ＧＡＬ２ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記宿主細胞に、ラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
前記ガラクトース誘導性調節エレメントが、１つまたは複数の染色体外プラスミドに含まれる、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
前記ガラクトース誘導性調節エレメントが前記宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
前記ガラクトース誘導性調節エレメントに、ＧＡＬ７プロモーター、ＧＡＬ２プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＬ３プロモーター、ＧＣＹ１プロモーター、およびＧＡＬ８０プロモーターからなる群より選択されるガラクトース誘導性プロモーターが含まれる、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
前記宿主細胞にラクターゼ酵素が含まれる、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
前記宿主細胞に、ラクターゼ酵素またはその生物学的に活性な断片をコードする外因性配列が含まれる、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
前記宿主細胞に、分泌可能なラクターゼをコードする外因性配列が含まれる、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
前記宿主細胞が、ガラクトースを異化する低減された能力を示す、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
前記宿主細胞が、機能的なＧＡＬ１タンパク質、ＧＡＬ７タンパク質、および／またはＧＡＬ１０タンパク質を欠いている、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
前記宿主細胞がＧＡＬ４タンパク質を発現する、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
前記宿主細胞が、構成的なプロモーターの制御下でＧＡＬ４タンパク質を発現する、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
前記宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
前記異種配列がタンパク質様産物をコードする、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
前記異種配列が、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、およびリボザイムからなる群より選択される産物を生産する、請求項３０または３２に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路を通じてイソプレノイドを生産する、請求項３０または３２に記載の宿主細胞であって、前記異種配列が、メバロン酸非依存性デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１種類またはそれ以上の酵素をコードする、宿主細胞。
【請求項５３】
メバロン酸（ＭＥＶ）経路を通じてイソプレノイドを生産する、請求項３０または３２に記載の宿主細胞であって、前記異種配列が、該ＭＥＶ経路の１種類またはそれ以上の酵素をコードする、宿主細胞。
【請求項５４】
前記イソプレノイドが、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、請求項５３または５４に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
前記イソプレノイドがＣ２０＋イソプレノイドである、請求項５２または５３に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
前記イソプレノイドがカロテノイドである、請求項５２または５３に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された第１の異種配列と、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする第２の異種配列とを含む発現ベクターであって、宿主細胞に導入されると、該宿主細胞が該第１の異種配列の発現を誘導するのに十分な量のラクトースが補充された培地中で培養されたときに、該発現ベクターが、該宿主細胞中で該第１の異種配列の発現を生じる、発現ベクター。
【請求項５８】
ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする前記第２の異種配列が発現され、ラクトースをグルコースとガラクトースとに加水分解する、請求項５７に記載の発現ベクター。
【請求項５９】
ＤＸＰ経路の酵素またはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、請求項５７に記載の発現ベクター。
【請求項６０】
ＭＥＶ経路の酵素またはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、請求項５７に記載の発現ベクター。
【請求項６１】
ラクトーストランスポーターをコードする異種配列をさらに含む、請求項５７に記載の発現ベクター。
【請求項６２】
ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、請求項５７に記載の発現ベクター。
【請求項６３】
少なくとも１つの第１の発現ベクターと少なくとも１つの第２の発現ベクターとを含む発現ベクターのセットであって、該第１の発現ベクターには、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された第１の異種配列が含まれ、そして第２の発現ベクターには、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする第２の異種配列が含まれ、宿主細胞に導入されると、該発現ベクターのカセットは、該宿主細胞を該第１の異種配列の発現を誘導するのに十分な量のラクトースが補充されている培地中で培養するとき、該宿主細胞中で該第１の異種配列の発現を生じる、発現ベクターのセット。
【請求項６４】
ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする前記第２の異種配列が発現され、ラクトースをグルコースとガラクトースとに加水分解する、請求項６３に記載の発現ベクターのセット。
【請求項６５】
ＤＸＰ経路の酵素またはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、請求項６３に記載の発現ベクターのセット。
【請求項６６】
ＭＥＶ経路の酵素またはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列がさらに含まれる、請求項６３に記載の発現ベクターのセット。
【請求項６７】
ラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、請求項６３に記載の発現ベクターのセット。
【請求項６８】
ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、請求項６３に記載の発現ベクターのセット。
【請求項６９】
請求項５７に記載の発現ベクターと、キットの使用説明書とを含む、キット。
【請求項７０】
請求項６３に記載の発現ベクターのカセットと、キットの使用説明書とを含む、キット。
【請求項７１】
請求項３０または３２に記載の宿主細胞を含む、細胞培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２００８年４月８日に出願された、米国仮出願第６１／１２３，５６２号（この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
多数のヒト用の治療薬、ワクチン、診断薬、ならびに多くの産業用物質、および商業的に有用な産物は、多様な発現系を利用して組み換えによって生産することができる。遺伝子発現系は、２つのクラス：誘導性発現系と非誘導性（恒常的）発現系に大きく分類される。誘導性の遺伝子発現系では、典型的には、最小限のタンパク質生産（例えば、無視できる程度のタンパク質の生産）しかないか、または誘導物質が提供されるまではタンパク質はほとんど生産されない。一方、非誘導性の（恒常的）遺伝子発現系には、典型的にはそのような誘導は必要なく、タンパク質の生産は、一般的には、恒常的な遺伝子発現系から連続して起こる。
【０００３】
特定の研究の設定のような一部の状況においては、誘導性の遺伝子発現系は、これにより生理学的に最適なタイミングとレベル（例えば、細胞の生理学的状態に対して毒性ではないレベル）でのタンパク質生産の制御が可能であるので、より望ましい。
【０００４】
頻繁に使用される誘導性の遺伝子発現系は、酵母におけるＧＡＬ調節をベースとする。酵母は炭素源としてガラクトースを利用することができ、ＧＡＬ遺伝子を使用して、ガラクトースを輸送し、細胞内でこれを代謝する。ＧＡＬ遺伝子としては、構造遺伝子であるＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０遺伝子（これらはそれぞれ、ガラクトキナーゼ、ガラクトースペルメアーゼ、α−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフエラーゼ、およびウリジンジホスホガラクトース−４−エピメラーゼをコードする）、ならびに調節遺伝子ＧＡＬ４、ＧＡＬ８０、およびＧＡＬ３が挙げられる。ＧＡＬ４とＧＡＬ８０の遺伝子産物およびタンパク質はそれぞれ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０遺伝子の発現のポジティブならびにネガティブな調節因子である。
【０００５】
ガラクトースが存在しなければ、これらの構造タンパク質（Ｇａｌ１ｐ、Ｇａｌ２ｐ、Ｇａｌ７ｐ、およびＧａｌ１０ｐ）の発現は通常はほとんど検出されない。Ｇａｌ４ｐは、上流の活性化配列（ＵＡＳ）（例えば、ＧＡＬ構造遺伝子の活性化配列）に結合することによって転写を活性化させる。しかし、Ｇａｌ４ｐの転写活性はＧａｌ８０ｐによって阻害される。ガラクトースが存在しなければ、Ｇａｌ８０ｐはＧａｌ４ｐと相互作用して、Ｇａｌ４ｐの転写活性を妨げる。しかし、ガラクトースが存在すれば、Ｇａｌ３ｐはＧａｌ８０ｐと相互作用して、Ｇａｌ８０ｐによるＧａｌ４ｐの発現を緩和する。これにより、Ｇａｌ４ｐ結合配列（例えば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０）の下流の遺伝子を発現させることができる。
【０００６】
従来のガラクトース誘導性の発現系には、多数の深刻な欠点があるが、それにも関らず、厳密な調節が提供され、そして異種タンパク質の高レベルの生産がサポートされる。最も厳しい制限は、異種タンパク質の発現を活性化させるためにはガラクトースの直接の補充が必要であることである。実際、宿主細胞が所望される密度に達した後に、所定の配列の発現を誘導するために培養培地に多量のガラクトースが直接添加される。しかし、ガラクトースは高価な商品である。多くの場合には、大規模生産（特に、利鞘の少ない製品の大規模生産）にガラクトースを利用することには桁外れの費用がかかる。したがって、同等の堅牢性があり、従来の系よりコスト効果の高い、代替発現系の設計が相当に求められている。本発明はこの要求を満たし、そしてさらに関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明により、ガラクトース誘導性発現系を使用する細胞培養物中での産物の異種生産のための方法が提供される。
【０００８】
１つの態様においては、本発明には、宿主細胞中で異種配列を発現させる方法が含まれる。この方法には、培地中で、そして異種配列が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程が含まれる。ここでは、異種配列は、ガラクトース誘導性の調節エレメントに作動可能であるように連結されており、異種配列の発現は、上記培地にガラクトースを直接補充しなくても誘導される。いくつかの実施形態においては、培地には、ガラクトースではない糖（例えば、ラクトース）が含まれ、上記異種配列の発現は、このガラクトースではない糖によって、ガラクトースが補充された培地中で上記宿主細胞を培養することによって得られるレベルと同等のレベルにまで誘導される。ここでは、補充されたガラクトースの量とガラクトースではない糖の量は、モルで測定した場合には同程度である。発現を誘導することができる異種配列としては、任意の核酸配列（例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アプタマー、およびリボザイム）が挙げられる。核酸配列はまた、タンパク質様産物をコードすることもできる。設計される場合には、異種配列は単一の発現ベクター上にまたは、複数の発現ベクター上に存在させることができる。
【０００９】
本発明によってはまた、宿主細胞中でイソプレノイドを生産させる方法も提供される。この方法には、メバロン酸非依存性デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路またはメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種類またはそれ以上の酵素をコードする１種類またはそれ以上の異種配列を発現する宿主細胞を培養する工程が含まれる。ここでは、上記１種類またはそれ以上の異種配列は、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結されており、そして、上記１種類またはそれ以上の異種配列の発現は、上記培地にガラクトースを直接補充しなくても誘導される。いくつかの実施形態においては、１種類またはそれ以上の異種配列の発現は、ラクトースの存在下で誘導される。異種配列は単一の発現ベクター上に、または、複数の発現ベクター上に存在させることができる。生産されるイソプレノイドは可燃性であり得る。いくつかの実施形態においては、宿主細胞にはさらに、プレニルトランスフェラーゼまたはイソプレノイドシンターゼをコードする外因性配列が含まれる。いくつかの実施形態においては、これらの方法には、ラクトースおよび／またはラクターゼを含む培地が含まれる。
【００１０】
本発明のなお別の態様においては、宿主細胞が本発明の方法において使用される。宿主細胞には、ガラクトーストランスポーター（例えば、ＧＡＬ２ガラクトーストランスポーター）が含まれ得る。他の実施形態においては、宿主細胞にラクトーストランスポーターが含まれ得る。宿主細胞にはまた、ラクターゼ酵素をコードする外因性配列も含まれ得る。いくつかの実施形態においては、この外因性配列は分泌可能なラクターゼをコードする。
【００１１】
いくつかの実施形態においては、宿主細胞は、デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路を介してイソプレノイドを生産することができる。ここでは、この異種配列は、メバロン酸非依存性デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路またはメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種類またはそれ以上の酵素をコードする。ここでは、上記異種配列は、これらの経路の１種類またはそれ以上の酵素をコードする。いくつかの実施形態においては、生産されるイソプレノイドは可燃性である。
【００１２】
いくつかの実施形態においては、ガラクトース誘導性調節エレメントはエピソーム性である。他の実施形態においては、ガラクトース誘導性調節エレメントは上記宿主細胞のゲノムに組み込まれる。ガラクトース誘導性調節エレメントには、ＧＡＬ７プロモーター、ＧＡＬ２プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＬ３プロモーター、ＧＣＹ１プロモーター、ＧＡＬ８０プロモーターからなる群より選択されるガラクトース誘導性プロモーターが含まれ得る。宿主細胞にはまた、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片も含まれ得る。宿主細胞は、ガラクトースを異化する低減された能力を示し得る。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は、機能性ＧＡＬ１タンパク質、ＧＡＬ７タンパク質、および／またはＧＡＬ１０タンパク質を欠いている。いくつかの実施形態においては、宿主細胞はＧａｌ４タンパク質を発現する。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は、ＧＡＬ４を構成的なプロモーターの制御下で発現する。
【００１３】
なお別の態様においては、宿主細胞は原核生物細胞である。他の実施形態においては、宿主細胞は真核生物細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。宿主細胞は、培地中で培養すると、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された異種配列を発現するように修飾することができる。ここでは、上記異種配列の発現は、上記培地にガラクトースを直接補充しなくても誘導される。培地には、ガラクトースではない化合物、例えば、ラクトースが含まれ得、そして異種配列の発現は、ガラクトースではない化合物と同等のガラクトースのモル量が補充された培地中で宿主細胞を培養することによって得られるレベルと同等のレベルにまで誘導される。さらに、目的の宿主細胞を含む細胞培養物が、本発明において提供される。
【００１４】
本発明によってはまた、発現ベクターも提供される。本発明の発現ベクターには、通常は、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された第１の異種配列と、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする第２の異種配列とが含まれる。この場合、宿主細胞に導入されると、上記発現ベクターは、上記細胞が上記第１の異種配列の発現の誘導に十分な量のラクトースが補充されている培地中で培養される場合には、上記宿主細胞中での上記第１の異種配列の発現を生じる。第２の異種配列は、ラクトースをグルコースとガラクトースとに加水分解するラクターゼまたは生物学的に活性な断片をコードし得る。発現ベクターにはさらに、ＤＸＰ経路またはＭＥＶ経路の酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をコードする異種配列が含まれ得る。ベクターにはまた、ラクトーストランスポーターまたはガラクトーストランスポーターをコードする異種配列も含まれ得る。
【００１５】
少なくとも１つの第１の発現ベクターと少なくとも１つの第２の発現ベクターとを含む発現ベクターのセットもまた、本明細書中で提供される。ここでは、第１の発現ベクターには、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された第１の異種配列が含まれ、そして第２の発現ベクターには、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする第２の異種配列が含まれる。この場合、宿主細胞に導入されると、この発現ベクターのセットは、上記細胞が培地中で培養される場合に上記宿主細胞中での上記第１の異種配列の発現を生じる。この場合、培地には、第１の異種配列の発現を誘導するために十分な量のラクトースが補充される。ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする第２の異種配列を発現し、ラクトースをグルコースとガラクトースとに加水分解することができる。この発現ベクターのセットにはさらに、ＤＸＰ経路またはＭＥＶ経路の酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をコードする異種配列が含まれ得る。このセットにはまた、さらに、ラクトーストランスポーターまたはガラクトーストランスポーターをコードする異種配列も含まれ得る。本発明の発現ベクターまたは発現ベクターのセットと、キットの使用説明書とを含むキットもまた提供される。
【００１６】
（参考文献による引用）
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が引用により組み入れられることが具体的かつ個別に示されているのと、同じ程度で、引用により本明細書中に組み入れられる。
【００１７】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において具体的に示される。本発明の特徴および利点についてのより良い理解は、例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明と添付の図面を参照することによって得られるであろう。以下の詳細な説明では、本発明の原理が利用される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ラクターゼによって触媒されるような、ラクトースのβ−Ｄ−ガラクトースとＤ−グルコースへの変換の模式図である。
【図２−１】図２は、ＤＮＡ断片ＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ａ）、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｂ）、ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｃ）、ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２（Ｄ）、およびＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９（Ｅ）のマップを示す。
【図２−２】図２は、ＤＮＡ断片ＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ａ）、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｂ）、ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（Ｃ）、ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２（Ｄ）、およびＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９（Ｅ）のマップを示す。
【図３】図３は、プラスミドｐＡＭ４０４のマップを示す。
【図４】図４は、ＤＮＡ断片ＧＡＬ７４〜１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７〜２５８７（Ａ）、ＧＡＬ７１２５〜５９８−ＨＰＨ−／ＧＡＬ４〜−５４９−ＧＡＬ４−ＧＡＬ１１５８５〜２０８８（Ｂ）、およびＧＡＬ７１２６〜５９８ＨＰＨ−ＱＧＡＬ４ＯＣ−ＧＡＬ４−ＧＡＬ１１５８５〜２０８８（Ｃ）のマップを示す。
【図５】図５は、ＤＮＡ断片５’遺伝子座−ＮａｔＲ−ＬＡＣ１２−ＰＴＤＨ１−ＰＰＧＫ１−ＬＡＣ４−３’遺伝子座のマップを示す。
【図６−１】図６は、ガラクトースまたはラクトースを含む培養培地中での宿主株Ｙ４３５およびＹ５９６によるβ−ファルネセンの生産を示す。
【図６−２】図６は、ガラクトースまたはラクトースを含む培養培地中での宿主株Ｙ４３５およびＹ５９６によるβ−ファルネセンの生産を示す。
【図６−３】図６は、ガラクトースまたはラクトースを含む培養培地中での宿主株Ｙ４３５およびＹ５９６によるβ−ファルネセンの生産を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明の好ましい実施形態が本明細書中に示され、記載されているが、そのような実施形態が例として提供されるにすぎないことは当業者に明らかであろう。ここでは、多数のバリエーション、変更、および代用が、本発明から逸脱することなく当業者によって行われるであろう。本明細書中に記載される本発明の実施形態についての様々な代替えが本発明の実施の際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、そしてこれらの特許請求の範囲内にある方法と構造、ならびにそれらの等価物がそれによって満たされることが意図される。
【００２０】
（一般的技術）
本発明の実施では、他に明記されない限りは、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、遺伝学、および組み換えＤＮＡの従来技術が使用される。これらは、当業者の知識の範囲内である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（ＭＪ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））を参照のこと。
【００２１】
（定義）
他に定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を持つ。以下の意味を持つと定義されるべきである多数の用語が言及される。
【００２２】
用語「構築物」または「ベクター」は、特定のヌクレオチド配列（単数または複数）の発現および／または増幅の目的のために作製されているか、あるいは、他の組み換え体ヌクレオチド配列の構築に使用される組み換え体核酸、一般的には、組み換え体ＤＮＡをいう。
【００２３】
用語「外因性」は、自然界においては通常は所定の細胞中では見られないおよび／または所定の細胞によっては生産されないことをいう。
【００２４】
用語「内因性」は、自然界においては通常は所定の細胞中で見られるおよび／または所定の細胞によって生産されることをいう。
【００２５】
用語「ガラクトース誘導性発現系」は、ガラクトース誘導機構とガラクトース誘導性調節エレメントとの組み合わせをいう。
【００２６】
用語「ガラクトース誘導機構」は、ガラクトースの存在下で、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された異種配列の転写を誘導するタンパク質の集まりをいう。ガラクトース誘導機構の一例は、酵母タンパク質Ｇａｌ３ｐ、Ｇａｌ４ｐ、およびＧａｌ８０ｐ、またはそれらの機能性ホモログの集まりである。
【００２７】
用語「ガラクトース誘導性発現カセット」は、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された異種配列を含むヌクレオチド配列をいう。ガラクトース誘導性発現カセットは、ガラクトースが存在する場合に誘導される（すなわち、その異種配列がｍＲＮＡに転写される）。
【００２８】
用語「ガラクトース誘導性プロモーター」は、ガラクトースによって調節される転写活性化因子が結合し、それによって調節されるプロモーター配列をいう。例えば、ガラクトース誘導性プロモーターは、Ｇａｌ４ｐまたはその機能性ホモログによって調節される。
【００２９】
用語「異種」は、自然界においては通常見られないことをいう。用語「タンパク質の異種生産」は、そのタンパク質を通常は生産しない細胞によるタンパク質の生産、または細胞によって通常生産されないレベルでのタンパク質の生産をいう。用語「異種配列」は、自然界においては、所定の細胞中では通常見られないヌクレオチド配列をいう。この用語には、以下の少なくとも１つが当てはまる核酸が含まれる：（ａ）所定の細胞に外部から導入される核酸（したがって、この配列がそのレシピエント細胞にとって外来のものであるかまたは自身のものであるかにはかかわらず、「外因性配列」）；（ｂ）核酸に、所定の細胞中で自然界において見られるヌクレオチド配列が含まれる（例えば、核酸に、その細胞にとって内因性であるヌクレオチド配列が含まれる）が、この核酸が、その細胞中で異常な（例えば、予想されるよりも多い、または自然界で見られるよりも多い）量で生産されるか、あるいはそのヌクレオチド配列が内因性ヌクレオチド配列とは異なり、その結果、内部で見られるその同じコードされるタンパク質（同じアミノ酸配列を持つかまたは実質的に同じアミノ酸配列を持つ）が、その細胞中で異常な（例えば、予想されるよりも多い、または自然界で見られるよりも多い）量で生産されるかのいずれかである；（ｃ）核酸に、自然界においては互いに同じ関係では見られない２種類またはそれ以上のヌクレオチド配列あるいはセグメントが含まれる（例えば、核酸が組み換え体である）。
【００３０】
用語「宿主細胞」は、ガラクトース誘導機構を含む任意の細胞をいい、そしてこれには、任意の適切な古細菌細胞、細菌細胞、または真核生物細胞が含まれる。
【００３１】
用語「誘導する」、「誘導」、および「誘導性」は、ヌクレオチド配列の転写の活性化、またはヌクレオチド配列の転写の抑制の緩和をいう。用語「ガラクトース誘導性」は、ガラクトースの存在下でのヌクレオチド配列の転写の活性化、またはガラクトースの存在下でのヌクレオチド配列の転写の抑制の緩和をいう。
【００３２】
用語「発現」は、それによってポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／またはそれによって転写されたｍＲＮＡ（「転写物」とも呼ばれる）が、続いてペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスをいう。転写物およびコードされるポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合は、発現には、真核生物細胞中のｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。
【００３３】
「作動可能であるように連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動可能であるように連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、そのように記載された要素が、それらについて意図される様式でそれらが機能できる関係にある並置をいう。例えば、プロモーター配列は、プロモーター配列がコード配列の転写を促進する場合には、コード配列に作動可能であるように連結される。
【００３４】
用語「イソプレノイド」は、イソペンテニル二リン酸（「ＩＰＰ」）によって誘導することができる分子をいい、そしてこれには１つまたは複数のＩＰＰ結合部（ｕｎｉｔｅｓ）が含まれ得る。
【００３５】
用語「ラクターゼ」は、ラクトース中のβ−グリコシド結合をガラクトース（例えば、β−Ｄ−ガラクトース）とグルコース（例えば、Ｄ−グルコース）を生じるように加水分解することができる酵素をいう。「ラクターゼ」に触媒されるラクトースの加水分解は図１に模式的に示される。
【００３６】
用語「ラクトース」は、分子式Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１で、βｌ−４グリコシド結合によって結合したβ−Ｄ−ガラクトース分子とＤ−グルコース分子からなる二糖をいう。「ラクトース」の構造と、β−Ｄ−ガラクトースとＤ−グルコースとへの加水分解を図１に示す。
【００３７】
用語「ＭＥＶ経路」は、アセチル−ＣｏＡのイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（「ＩＰＰ」）への変換のための生合成経路をいう。ＭＥＶ経路の酵素としては、アセチル−コエンザイムＡの２つの分子をアセトアセチル−ＣｏＡに変換することができる酵素、アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−コエンザイムＡとを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）に変換することができる酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸塩に変換することができる酵素、メバロン酸塩をメバロン酸５−リン酸に変換することができる酵素、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換することができる酵素、およびメバロン酸５−ピロリン酸をＩＰＰに変換することができる酵素が挙げられる。
【００３８】
用語「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖中の核酸塩基の順序をいう。
【００３９】
用語「作動可能であるように連結される」は、そのように記載された要素が、それらについて意図される様式でそれらが機能できる関係にある並置をいう。例えば、プロモーターは、プロモーターがタンパク質コード配列のｍＲＮＡへの転写に影響を与える場合には、そのタンパク質コード配列に作動可能であるように連結される。
【００４０】
用語「プレニル二リン酸シンターゼ」は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（「ＩＰＰ」）および／またはジメチルアリルピロリン酸（「ＤＭＡＰＰ」）をプレニル二リン酸に変換することができる酵素をいう。プレニル二リン酸の例は、ファルネシル二リン酸（「ＦＰＰ」）、ゲラニル二リン酸（「ＧＰＰ」）、およびゲラニルゲラニル二リン酸（「ＧＧＰＰ」）である。
【００４１】
用語「タンパク質コード配列」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列をいう。
【００４２】
用語「実質的に純粋」は、１種類またはそれ以上の化合物を実質的に含まないこと、すなわち、組成物に、その組成物の全容量に対して、８０容量％を上回る、９０容量％を上回る、９５容量％を上回る、９６容量％を上回る、９７容量％を上回る、９８容量％を上回る、９９容量％を上回る、９９．５容量％を上回る、９９．６容量％を上回る、９９．７容量％を上回る、９９．８容量％、または９９．９容量％を上回る化合物が含まれるか、あるいは、２０容量％未満、１０容量％未満、５容量％未満、３容量％未満、１容量％未満、０．５容量％未満、０．１容量％、または０．０１容量％未満の１種類またはそれ以上の他の化合物が含まれることをいう。
【００４３】
用語「組み換え体」は、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、天然の系において見られる内因性核酸とは区別することができる構造的コード配列または非コード配列を有している構築物を生じる、クローニング、制限酵素消化、および／または連結工程の様々な組み合わせの産物であることをいう。
【００４４】
用語「調節エレメント」は、転写制御配列および翻訳制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなど）をいう。これらは、転写物、コード配列の発現をもたらし、そして／またはその発現を調節する、ならびに／あるいは細胞中でのコードされるポリペプチドの生産をもたらす。
【００４５】
用語「シグナルペプチド」は、細胞からのタンパク質の分泌を媒介するタンパク質のアミノ酸配列のセグメントをいう。
【００４６】
用語「テルペンシンターゼ」は、１種類またはそれ以上のプレニルピロリン酸をイソプレノイドに変換することができる酵素をいう。
【００４７】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して特定の割合の「配列同一性」を有する。このことは、アラインメントされた際に、２つの配列を比較して、塩基またはアミノ酸のうちのその割合が同じであり、そして同じ相対位置にあることを意味している。配列同一性を決定するためには、配列は、公に広く利用することができる方法およびコンピュータープログラム（これには、ＢＬＡＳＴ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで利用することができる）、ＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ｐａｃｋａｇｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩで利用することができる）、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアラインメントが含まれる）、ならびに他の技術を使用してアラインメントされ得る。
【００４８】
用語「トランスポーター」は、細胞膜または細胞小器官の膜を横断する化合物の移動を媒介するタンパク質をいう。
【００４９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいうために、本明細書中では互換的に使用される。ポリマーは、直鎖である場合もまた分岐鎖でもある場合もあり、ポリマーには、修飾されたアミノ酸が含まれる場合があり、そしてポリマーには非アミノ酸が間に介在する場合がある。この用語にはまた、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作（例えば、標識成分との結合）によって修飾されているアミノ酸ポリマーも含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「アミノ酸」は、天然のアミノ酸または異常なアミノ酸または合成のアミノ酸のいずれかをいい、これには、グリシンと、Ｄ光学異性体またはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物が含まれるがこれらに限定されない。
【００５０】
（異種配列の誘導性発現）
本発明により異種配列を発現させるための組成物と方法が提供される。これにより、宿主細胞中での異種生産が生じる。１つの態様においては、異種配列はガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結されるが、その発現は、培養培地にガラクトースを直接補充しなくても誘導される。誘導は、１種類またはそれ以上の化合物、典型的には、ラクトース（ガラクトースに分解することができる）の添加によって起こり、それによって生じるガラクトースが、異種配列の発現を誘導する。他の実施形態においては、異種配列の発現は、ラクターゼが発現されると誘導される。ラクターゼは、培地中に存在するラクトースを加水分解してガラクトースを生じる。次いで、ガラクトースが目的の異種配列の発現を活性化させる。異種配列の発現は、適合量（モル量として測定した）のガラクトースが補充された培地中で宿主細胞を培養することによって得られるレベルと同等のレベルまで誘導され得る。特に、ラクトースが補充された培地中での宿主細胞の培養によって生産された異種産物の量は、同じモル量または同等のモル量のガラクトースが補充された培地中で生産される量と同等である。
【００５１】
別の実施形態では、培養培地には、ラクトースをガラクトースに加水分解する酵素（例えば、ラクターゼ）またはその生物学的に活性な断片がさらに含まれる。酵素は、発現される異種配列を持つ宿主細胞によって生産され得る。例えば、宿主細胞は、内因性ラクターゼを生産する場合があり、また、異種核酸配列からラクターゼを生産する場合もある。所望される場合には、生産されたラクターゼは、細胞培養培地に分泌される。なお別の実施形態においては、ラクターゼは、目的の異種配列を持たないが、ガラクトースを生成させるためのラクターゼまたはその生物学的に活性な断片を供給するために使用される別の細胞によって生産させることができ、これが次いで異種配列の発現を活性化させる。
【００５２】
なお他の実施形態においては、異種配列の発現は、宿主細胞とラクトースとを含む培地に外因性ラクターゼが添加されると誘導される。
【００５３】
ラクトースが異種配列を含む宿主細胞の外側（例えば、培地中）でガラクトースに変換される場合は、ラクトースによって生成されたガラクトースは、ガラクトーストランスポーターによって宿主細胞内に運ばれ得る。これは、内因性のガラクトーストランスポーターまたは異種ラクトーストランスポーターによって行われ得る。運ばれたガラクトースは、その後、細胞中で、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された１種類またはそれ以上の異種配列を誘導することができる。
【００５４】
さらに他の実施形態においては、培地に補充されたラクトースが宿主細胞内に運ばれ得る。この場合、ラクトースは、内因性のラクターゼまたは異種配列によって発現されたラクターゼにより、細胞内で加水分解される。細胞内でのラクトースの加水分解によっては、グルコースとガラクトースとが生じる。後者は、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された目的の異種配列の発現を活性化させるために利用される。適切なラクトーストランスポーターは、この場合もやはり、内因性でも、また外因性でもあり得、例えば、異種配列によって発現される外因性ラクターゼであり得る。
【００５５】
（ガラクトース誘導機構）
本発明の宿主細胞にはガラクトース−誘導機構が含まれる。ガラクトース誘導機構は、宿主細胞にとって内因性（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどで）である場合も、また異種である場合もある。ガラクトース誘導機構は、ガラクトースの存在下で、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された異種配列の転写を誘導するタンパク質の集まりをいう。ガラクトース誘導機構の一例は、酵母タンパク質Ｇａｌ３ｐ、Ｇａｌ４ｐ、およびＧａｌ８０ｐ、またはそれらの生物学的に活性な断片を含むそれらの機能性ホモログの集まりである。異種ガラクトース誘導機構を含む宿主細胞の作製において、本発明での使用に適しているヌクレオチド配列としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧａｌ４遺伝子のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＹＰＬ２４８Ｃ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧａｌ８０遺伝子のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＹＭＬ０５１Ｗ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧａｌ３遺伝子のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＹＤＲ００９Ｗ）、ならびにそれらの機能性ホモログ。
【００５６】
本発明の宿主細胞にはさらに、ガラクトース誘導性調節エレメントが含まれる。この調節エレメントは、転写制御配列または翻訳制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなど）であり得る。これらは、転写物、コード配列の発現をもたらし、そして／またはその発現を調節する、ならびに／あるいは細胞中でのコードされるポリペプチドの生産をもたらし、そして／またはその発現を調節する。ガラクトース誘導性調節エレメントは、内因性であっても、また異種であってもよい。例えば、宿主細胞には、１種類の異種ガラクトース誘導性発現カセットが含まれ得る。この場合、ガラクトース誘導性発現カセットにはガラクトース誘導性調節エレメントが含まれる。１種類の異種ガラクトース誘導性発現カセットは、同じまたは異なる配列同一性の１種類またはそれ以上の異種配列を発現することができる。いくつかの実施形態においては、発現カセットは、多コピーの同じ異種配列または異なる異種配列の発現を駆動し得る。いくつかの実施形態においては、１種類の異種ガラクトース誘導性発現カセットが、２個、３個、４個、５個、または複数のコピー数の同じ異種配列あるいは異なる異種配列を発現することができる。１つの実施形態においては、発現ベクターには、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された第１の異種配列と、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする第２の異種配列とが含まれ得る。所望される場合には、１種類の発現カセットが、生化学経路（例えば、ＭＥＶ経路またはＤＸＰ経路）の２種類、３種類、４種類、５種類、またはそれ以上の異なるタンパク質をコードする異種配列の発現を駆動することができる。例えば、１種類の発現カセットは、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼと別の酵素（例えば、ファルネシル二リン酸シンターゼ、イソポペンチルδイソメラーゼ（ｉｓｐｏｐｅｎｔｙｌ  δ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ））の両方をコードすることができる。他の実施形態においては、１種類の発現カセットが、メバロン酸キナーゼおよびアセトアセチルＣｏＡチオラーゼまたはジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｅｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）およびホスホメバロン酸キナーゼの発現を制御する。所定の経路の酵素のうちの任意の組み合わせの発現のための発現カセットは、日常的に行われている組み換え手順にしたがって構築することができる。
【００５７】
宿主細胞にはまた、複数の異種ガラクトース誘導性発現カセットも含まれ得る。例えば、宿主細胞は、同じ異種配列または異なる異種配列の発現を制御する複数の発現カセットを有し得る。所望される場合には、複数の発現カセットのそれぞれを、同じタンパク質、異なるタンパク質の発現を制御するように設計することができる。あるいは、複数の異種ガラクトース誘導性発現カセットのサブセットを、同じタンパク質の発現を駆動するために利用することができ、そして別のサブセットが異なるタンパク質を発現する。さらに、宿主細胞には、目的の異種配列の発現を調節する他の外因性配列が含まれ得る。生産されるように選択される異種産物に応じて、他の外因性配列には、ラクターゼ、特に、細胞培養培地に補充されたラクトースの加水分解を促進するための分泌可能なラクターゼを含めることができる。他の限定ではない例としては、ラクトーストランスポーター、ガラクトーストランスポーター、および機能性ホモログをコードする外因性配列が挙げられる。これらの外因性配列および他の適している外因性配列は恒常的に発現させることができ、また、ガラクトースではない誘導性調節エレメントの制御下に配置することもできる。
【００５８】
本発明のガラクトース誘導性調節エレメントにはガラクトース誘導性プロモーターが含まれる。誘導性プロモーターは、通常は、タンパク質の異種生産において構成的なプロモーターの代わりに使用される。なぜなら、この誘導性プロモーターによって生理学的に最適なタイミングおよび／またはレベル（例えば、細胞の生理学的状態に対して毒性ではないレベル）でのタンパク質の生産の制御ができるからである。ガラクトース誘導性プロモーターは、タンパク質の異種生産において頻繁に使用される。なぜなら、これらは標的とされる厳密な調節がしやすく、高レベルの発現をもたらすからである。本発明での使用に適しているガラクトース誘導性プロモーターとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｖｅｒｉｓｉａｅ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子ＧＡＬ７のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１１３４  ＲＥＧＩＯＮ：２７４４２７．．２７５５２７）、遺伝子ＧＡＬ２のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１１４４  ＲＥＧＩＯＮ：２９０２１３．．２９１９３７）、遺伝子ＧＡＬ１のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１１３４  ＲＥＧＩＯＮ：２７９０２１．．２８０６０７）、遺伝子ＧＡＬ１０のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１１３４  ＲＥＧＩＯＮ：２７６２５３．．２７８３５２）、遺伝子ＧＡＬ３のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１１３６  ＲＥＧＩＯＮ：４６３４３１．．４６４９９３）、遺伝子ＧＣＹ１のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１１４７  ＲＥＧＩＯＮ：５５１１１５．．５５２０５３）、および遺伝子ＧＡＬ８０のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１１４５  ＲＥＧＩＯＮ：１７１５９４．．１７２９０１）、またはそれらの機能性ホモログ。特定の実施形態においては、ガラクトース誘導性プロモーターに、ヌクレオチド配列ＣＧ（ＧまたはＣ）（Ｎ１１）（ＧまたはＣ）ＣＧが含まれる。式中、Ｎは任意のヌクレオチドである。ハイブリッドプロモーター（例えば、ＵＳ５７３９００７、ＵＳ５３１０６６０、またはＵＳ５０１３６５２に開示されているハイブリッドプロモーター）もまた使用され得る。特定の実施形態においては、ガラクトース誘導性プロモーターは合成のプロモーターである（すなわち、プロモーターが化学合成される）。
【００５９】
特定の実施形態においては、ガラクトース誘導性プロモーターにより、所定の異種配列の高レベルの転写が提供される。他の実施形態においては、ガラクトース誘導性プロモーターにより、異種配列の低レベルの転写が提供される。多数の遺伝子がガラクトースの存在下で誘導される（Ｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：２３０６−２３０９（２０００））。これらの遺伝子のプロモーター（例えば、ＵＡＳＧＡＬ）もまた、異なる活性化レベルを有し得る。例えば、理論には束縛されないが、
多数のＵＡＳＧＡＬが酵母において同定されており、これらはＧａｌ４ｐに対して様々な相対的親和性、ひいては異なる活性を有している（例えば、Ｌｏｈｒら、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅｓａｔ  ＧＡＬ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ：ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ９：７７７−７８７（１９９５）を参照のこと）。本発明の方法が実施される場合には、これらのプロモーターおよび任意の他の変異体プロモーターが、所望される発現レベルを細かく変化させるためのガラクトース誘導性調節エレメントとして含められる。
【００６０】
（培養培地）
異種配列の発現には、通常は、培養培地中で、そのような異種配列を含む宿主細胞を培養することが含まれる。適している培養培地には、宿主細胞培養物の増殖または維持を提供する任意の培地が含まれる。原核生物細胞および真核生物細胞の生存を支配する一般的なパラメーターは、当該分野で十分に確立されている。インビトロで制御することができる物理化学的パラメーターは、例えば、ｐＨ、ＣＯ２、温度、および浸透圧である。細胞の栄養要求は、通常は、最適環境を提供するように開発された標準的な培地処方物の中に提供される。栄養素は、いくつかのカテゴリーに分けることができる：アミノ酸およびそれらの誘導体、炭水化物、糖類、脂肪酸、複合脂質、核酸誘導体、ならびにビタミン。細胞の代謝を維持するための栄養素とは別に、一部の細胞には、生存または増殖のために、以下のグループの少なくとも１つから１種類またはそれ以上のホルモンが必要な場合がある：ステロイド、プロスタグランジン、増殖因子、下垂体ホルモン、およびペプチドホルモン（Ｓａｔｏ，Ｇ．Ｈ．ら、「Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｍｅｄｉａ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ｈａｍ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４，Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５、またはＭａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｐ．Ｅ．（１９９８）「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）。
【００６１】
適している培養培地には、通常は、容易に利用できるエネルギー源（例えば、単純な糖、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース、またはそれらの組み合わせ）、窒素源、およびリン酸供給源が含まれる。特定の実施形態においては、培養培地は液体培地である。適切な液体培地としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＹＰＤ（ＹＥＰＤ）培地、ＹＰＡＤ培地、Ｈａｒｔｗｅｌｌの完全（ＨＣ）培地、および合成完全（ＳＣ）培地。特定の実施形態においては、培養培地には、１種類またはそれ以上のさらなる物質（例えば、細胞内でのガラクトーストランスポーター、ラクトーストランスポーター、またはラクターゼの生産が誘導性プロモーターの制御下にある場合には、ガラクトース以外の誘導因子）が補充される。他の実施形態においては、培養培地には、所望される誘導レベルを得るために様々な割合でラクトースとガラクトースの両方が補充される。
【００６２】
所望される場合には、「規定培地（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）」を、宿主細胞を培養するために使用することができる。規定培地には、典型的には、培養物中の細胞の生存および／または増殖に不可欠な栄養素と他の必要なものが含まれており、その結果、培地の成分は公知である。従来から、規定培地は、増殖および／または生存に不可欠な栄養素および／または増殖因子の添加によって処方されている。典型的には、規定培地により、以下のカテゴリーの１つまたは複数による少なくとも１種類の成分が提供される：ａ）全ての必須アミノ酸、通常は２０種類のアミノ酸とシスチンとの基本的なセット；ｂ）エネルギー源（通常は、グルコースのような炭水化物の形態）；ｃ）低濃度で必要なビタミン類および／または他の有機化合物；ｄ）遊離の脂肪酸；ならびに、ｅ）微量元素（この場合、微量元素は、通常は極めて低濃度で（通常は、マイクロモル濃度で）必要とされる、無機化合物または自然界に存在している元素と定義される）。規定培地にはまた、状況に応じて、以下のカテゴリーのいずれかによる１種類またはそれ以上の成分が補充され得る：ａ）１種類またはそれ以上の分裂促進剤；ｂ）塩および緩衝液（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）；ｃ）ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、およびチミジン、ヒポキサンチン）；ならびに、ｄ）タンパク質および組織加水分解物。
【００６３】
培地中での宿主細胞の培養は、細胞の生存性および／または増殖を維持する任意の容器あるいは基体の中で行われ得る。適している容器としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：反応器もしくは発酵槽用のタンク、または遠心分離機の部品（これは、その後の処理工程においてより軽い物質からより重い物質を分離させることができる）。特定の実施形態においては、容器は、少なくとも１リットルの容量を有する。いくつかのそのような実施形態においては、容器は、少なくとも１０リットルの容量を有する。いくつかのそのような実施形態においては、容器は、少なくとも１００リットルの容量を有する。いくつかの実施形態においては、容器は、１００リットル〜３，０００，０００リットル、例えば、少なくとも１０００リットル、少なくとも５，０００リットル、少なくとも１０，０００リットルの容量を有し、容器は、少なくとも２５，０００リットル、少なくとも５０，０００リットル、少なくとも７５，０００リットル、少なくとも１００，０００リットル、少なくとも２５０，０００リットル、少なくとも５００，０００リットル、または少なくとも１，０００，０００リットルの容量を有する。
【００６４】
本発明の培養培地には、ガラクトースに分解することができる１種類またはそれ以上の化合物が含まれる。本発明の方法においては、培地には、通常は、ラクトースが含まれる。ラクトースは、ガラクトースとグルコースとに加水分解され得、ガラクトースは比較的安価な化合物であり、典型的にはガラクトースよりも有意にコストが低い。なぜなら、ラクトースは、多くの市販されている乳製品の製造プロセスの廃棄物である乳清の主要な構成成分であるからである。ラクトースの低いコストと、ラクトースを加水分解できる酸素の安定供給を考えると、酵素によるラクトースの加水分解が、タンパク質の大規模生産のためのガラクトース誘導性発現系の誘導のためのガラクトースを生成させる、コスト効果の高い手段であることを示す。
【００６５】
特定の実施形態においては、培養培地中でのラクトース濃度は、１０ｇ／Ｌ未満、５ｇ／Ｌ未満、または２ｇ／Ｌ未満である。特定の実施形態においては、ラクトースは、実質的に純粋な化合物として培地に添加される。他の実施形態においては、ラクトースは、複数の化合物の混合物の一成分として培地に添加される。いくつかの実施形態においては、ラクトースは、乳清の一成分として培地に添加される。他の実施形態においては、ラクトースは、乳汁または乳製品の一成分として培地に添加される。さらに他の実施形態においては、ラクトースは、宿主細胞によって培養培地に分泌される。他の実施形態においては、ラクトースは、宿主細胞以外の細胞によって培養培地に分泌される。特定の実施形態においては、ラクトースは、培養培地中に存在する特定の酵素の作用を通じて培養培地中で生成される。特定のそのような実施形態においては、酵素は、実質的に純粋な形態で培養培地に添加される。他のそのような実施形態においては、酵素は、酵素の混合物の成分として培養培地に添加される。他のそのような実施形態においては、酵素は、宿主細胞によって分泌される。なお他のそのような実施形態においては、酵素は、宿主細胞以外の細胞によって分泌される。上記方法の組み合わせによる複数の酵素が、培地中に存在する場合があり（例えば、実質的に純粋な形態で添加され得）、そしてまた、宿主細胞および／または宿主細胞ではない細胞によって分泌され得る。
【００６６】
いくつかの実施形態においては、本発明の培養培地にはまた、ラクトースをガラクトースとグルコースとに加水分解する酵素も含まれる。この酵素はラクターゼであり得る。本発明での使用に適しているラクターゼとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号；生物）：ＬＡＣ４（Ｍ８４４１０  ＲＥＧＩＯＮ：４３．．３１２０；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ｌａｃＺ（Ｘ９１１９７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ＬａｃＡ（Ｓ３７１５０；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、およびＥｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｌａｓｓ  ３．１．１．２３の他のメンバー。機能性変異体もまた使用され得る。特定の実施形態においては、ラクターゼは、実質的に純粋な酵素として培地に添加される。本発明で使用される実質的に純粋なラクターゼは、例えば、市販されているラクトースの錠剤を粉々に砕くことによって得ることができる（例えば、Ｌｏｎｇ’ｓ  Ｄｒｕｇｓｔｏｒｅから入手することができるＤａｉｒｙ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）。他の実施形態においては、ラクターゼは、複数の種類の酵素および／または複数の種類の化合物の混合物の一成分として培地に添加される。
【００６７】
特定の実施形態においては、ラクターゼは、宿主細胞によって、または宿主細胞以外の細胞によって培養培地に分泌される。特定の実施形態においては、ラクターゼは、酵素の細胞外輸送を媒介する天然のシグナルペプチドが含まれることにより、培養培地に放出される。天然のシグナルペプチドを含む適している分泌型ラクターゼとしては、ＬａｃＡ（Ｓ３７１５０；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が挙げられるが、これに限定されない。他の実施形態においては、ラクターゼは、酵素の細胞外輸送を媒介する異種シグナルペプチドに融合されることによって、培養培地に放出される。適切なシグナルペプチドとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα−接合因子のシグナルペプチドおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのキラー毒素のシグナルペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、ラクターゼは、細胞溶解の結果として培養培地に放出される。細胞溶解は、例えば、高密度細胞培養において、または本発明の細胞中での異種タンパク質の発現の結果としても起こり得る（Ｃｏｍｐａｇｎｏら（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３（５）：８２２−８２５）。
【００６８】
宿主細胞中または宿主細胞以外の細胞中で生産された分泌されるラクターゼは、内因的に生産される場合も、また異種生産される場合もある。宿主細胞中または宿主細胞以外の細胞中でのラクターゼの生産は、プロモーターによって制御され得る。プロモーターは恒常的である場合も、また誘導性である場合もある。適している誘導性プロモーターとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２５、ＭＥＴ３、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＴＰ１、およびＡＯＸ１のプロモーター。他の実施形態においては、プロモーターは恒常的である。適している構成的なプロモーターとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＰＧＫ１、ＴＤＨ１、ＴＤＨ３、ＦＢＡ１、ＡＤＨ１、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ１、およびＰＹＫ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
（ラクターゼ、ラクトーストランスポーター、およびガラクターゼトランスポーター）
特定の実施形態においては、本発明の宿主細胞には、ラクトースをガラクトースとグルコースとに加水分解することができる、ラクターゼまたはその生物学的活性断片が含まれる（図１）。ラクターゼは、宿主細胞にとって内因性である場合も、また異種である（例えば、異種核酸配列によって生産される）場合もある。いくつかの実施形態においては、ラクターゼは、宿主細胞から培地に分泌される。分泌可能なラクターゼには、典型的には、翻訳後に切断されるシグナルペプチドが含まれる。あるいは、内因性のラクターゼまたは異種ラクターゼが細胞内に存在し得、そして（例えば、ラクトーストランスポーター）を介して細胞内に運ばれたラクトースを加水分解し得る。
【００７０】
適しているラクターゼとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号；生物）：ＬＡＣ４（Ｍ８４４１０  ＲＥＧＩＯＮ：４３．．３１２０；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ｌａｃＺ（Ｘ９１１９７；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ＬａｃＡ（Ｓ３７１５０；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、およびＥｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ３．１．１．２３の他のメンバー。特定の実施形態においては、ラクターゼのアミノ酸配列には、配列番号３またはその変異体が含まれる。特定の実施形態においては、ラクターゼをコードするヌクレオチド配列には、配列番号４またはそのホモログが含まれる。
【００７１】
宿主細胞中でのラクターゼの生産は、プロモーターによって制御され得る。特定の実施形態においては、プロモーターは誘導性である。適している誘導性プロモーターとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２５、ＭＥＴ３、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＴＰｌ、およびＡＯＸ１のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態においては、プロモーターは恒常的である。適している構成的なプロモーターとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＰＧＫ１、ＴＤＨ１、ＴＤＨ３、ＦＢＡ１、ＡＤＨ１、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ１、およびＰＹＫ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
特定の実施形態においては、本発明の宿主細胞には、培養培地から細胞の細胞質ゾルにラクトースを運ぶことができるラクトーストランスポーターが含まれる。例えば、ラクトースが培地中に存在し、そしてラクターゼが宿主細胞中に存在する場合は、宿主細胞には、ラクトーストランスポーターが含まれる。ラクトーストランスポーターは、内因性である場合も、また異種である場合もある。いくつかの実施形態においては、宿主細胞には、内因性のラクトーストランスポーターと異種ラクトーストランスポーターの両方が含まれ得る。適しているラクトーストランスポーターとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＬＡＣ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０６９９７  ＲＥＧＩＯＮ：１６１６．．３３７９；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）およびＬａｃＹ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌｏｃｕｓ  Ｔａｇ  Ｂ０３４３；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）。特定の実施形態においては、ラクトーストランスポーターのアミノ酸配列には、配列番号１またはその変異体が含まれる。特定の実施形態においては、ラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列には、配列番号２またはそのホモログが含まれる。
【００７３】
特定の実施形態においては、本発明の宿主細胞には、培養培地から細胞の細胞質ゾルにガラクトースを運ぶことができるガラクトーストランスポーターが含まれる。例えば、ガラクトーストランスポーターを発現する宿主細胞が、ガラクトースが宿主細胞内に運ばれることを可能にするラクトースとラクターゼとを含む培地中で培養される。ガラクトーストランスポーターは、内因性である場合も、また異種である場合もあり、例えば、異種ヌクレオチド配列から発現され得る。宿主細胞には、内因性のガラクトーストランスポーターと異種ガラクトーストランスポーターの両方が含まれ得る。適しているガラクトーストランスポーターとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＡＬ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌｏｃｕｓ  Ｔａｇ  ＹＬＲ０８１Ｗ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ＭＳＴ４（ＡＹ３４２３２１；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｇｒｏｕｐ）、ＭＳＴ４（ＤＱ０８７１７７；Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、ＬＡＣｌ２（Ｘ０６９９７；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ＧＡＬ２（ＡＡＵ４３７５５；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｋａｔａｅ）、およびＨＧＴ１（ＫＬＵ２２５２５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）。
【００７４】
宿主細胞中でのラクトーストランスポーターまたはガラクトーストランスポーターの生産は、プロモーターによって制御され得る。特定の実施形態においては、プロモーターは誘導性である。適している誘導性プロモーターとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２５、ＭＥＴ３、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＴＰｌ、およびＡＯＸ１のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態においては、プロモーターは恒常的である。適している構成的なプロモーターとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＰＧＫ１、ＴＤＨ１、ＴＤＨ３、ＦＢＡ１、ＡＤＨ１、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ１、およびＰＹＫ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
（異種産物）
本発明の組成物（ベクター、宿主細胞、培養培地、およびガラクトース誘導性調節エレメントを含むがこれらに限定されない）は、誘導性の様式での任意の異種配列の発現に適している。任意の異種産物の生産を誘導するためには、誘導物質（通常は、ガラクトースではない糖）が使用される。ラクトースが補充された培地中で培養された宿主細胞によって生産された産物の量は、同等の量のガラクトースが補充された培養培地によって生産された産物の量と同等であり得る。いくつかの実施形態においては、生産される異種産物の量は、培地に直接同量のガラクトースが添加された場合に同じ宿主細胞によって生産される産物の量とほぼ同等であるか、またはそれより多い。いくつかの実施形態においては、生産される産物の量は、培地に同量のガラクトースを添加することによって生産される産物の量の少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上である。
【００７６】
発現した異種配列は、タンパク質またはペプチド（例えば、生体活性のあるタンパク質またはペプチド）をコードし得る。タンパク質の性質に応じて、これらは、脂質、炭水化物、およびそれらの組み合わせの合成または分解のために、宿主細胞によって利用され得る。異種配列の発現によって核酸産物が生じ得る。核酸産物には、オリゴヌクレオチド、例えば、リボヌクレオチド、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、外部ガイド配列（ｅｘｔｅｒｎａｌ−ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（ＥＧＳ）、アプタマー、およびｍｉＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
例えば、本発明の組成物によって、または本発明の方法によって発現した異種配列には、いくつかのクラスの触媒性ＲＮＡ（リボザイム）が含まれ、これには、イントロン由来リボザイム（ＷＯ８８／０４３００；Ｃｅｃｈ，Ｔ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９：５４３−５６８，（１９９０）もまた参照のこと）、ハンマーヘッド型リボザイム（ＷＯ８９／０５８５２およびＥＰ３２１０２１）、アックスヘッド型リボザイム（ＷＯ９１／０４３１９およびＷＯ９１／０４３２４）、ならびに本明細書中で例示される任意の他の異種配列が含まれる。ＥＧＳ分子は、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結される場合には、本発明の異種配列によってコードされる場合もある。ＥＧＳは、典型的には、標的基質に結合して、真核生物のＲＮＡｓｅ  Ｐの前駆体ｔＲＮＡの天然の切断部位と似ている二次構造および三次構造を形成する。ＥＧＳ分子を設計する方法は、例えば、米国特許第ＵＳ５６２４８２４号、同ＵＳ５６８３８７３号、同ＵＳ５７２８５２１号、同ＵＳ５８６９２４８号、同ＵＳ５８７７１６２号、および同ＵＳ６０５７１５３号（これらは全て、これらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。）に記載されている。
【００７８】
異種配列はまた、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアプタマーを生産し得る。ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ＥＧＳ、またはｍｉＲＮＡを生産する異種配列の設計には、通常は、細胞標的のｍＲＮＡ一次配列についての知見が必要である。全マウスゲノムおよび全ヒトゲノムの一次ｍＲＮＡ配列情報、ならびに、多数の他の生物（トリ、イヌ、ネコ、クマネズミ、および他の生物を含む）に由来する遺伝子配列は、ＮＣＢＩサーバー上で公に容易に入手することができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。ｓｉＲＮＡを設計する標準的な方法は当該分野で公知であり（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９−２１３（２００２））、そしてパブリックデザインツール（ｐｕｂｌｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏｏｌｓ）（例えば、ＭＩＴのＷｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより、ｈｔｔｐ：／／ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｕｂｉｎｔ／ｈｔｔｐ：／／ｉｏｎａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｉＲＮＡｅｘｔ／およびｗｗｗ．ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．ｏｒｇで、ならびにＰｒｏｍｅｇａ  ａｎｄ  Ａｍｂｉｏｎによって商用サイトから）もまた容易に利用することができる。ｍｉＲＮＡ配列のデータベースもまた、公に利用することができ、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇ／およびｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／で利用することができる。アプタマーは、当該分野で公知の方法によって作製することができ、また、ｈｔｔｐ：／／ａｐｔａｍｅｒ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ．のような公のデータベースから得ることができる配列でもあり得る。
【００７９】
異種配列は、タンパク質様産物（例えば、タンパク質またはペプチド）をコードする場合もある。タンパク質は、細胞にとって内因性である場合も、また外因性である場合もある。タンパク質は、細胞内タンパク質（例えば、細胞質ゾルタンパク質）、膜貫通タンパク質、また分泌型タンパク質であり得る。タンパク質の異種生産は、研究環境または産業の状況で、例えば、治療薬、ワクチン、診断薬、バイオ燃料の生産のために、および多くの他の目的の用途に、広く使用されている。本発明の組成物および方法を使用することによって生産することができる例示的な治療用タンパク質としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：特定の天然および組み換え体ヒトホルモン（例えば、インスリン、成長ホルモン、インスリン様成長因子１、卵胞刺激ホルモン、および絨毛性ゴナドトロピン）、造血性タンパク質（例えば、エリスロポエチン、Ｃ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１１）、血栓性およびうっ血性タンパク質（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子および活性化されたタンパク質Ｃ）、免疫学的タンパク質（例えば、インターロイキン）、ならびに他の酵素（例えば、デオキシリボヌクレアーゼＩ）。本発明の組成物および方法によって生産することができる例示的なワクチンとしては、様々なインフルエンザウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型）、およびそれぞれの型についての様々な血清型（例えば、Ａ型インフルエンザウイルスについてはＨ５Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、またはＤ型肝炎）、ライム病、ならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対するワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。異種生産されるタンパク質診断薬の例としては、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ＨＩＶ抗原、およびＣ型肝炎抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
異種配列によって生産されるタンパク質またはペプチドとしては、サイトカイン、ケモカイン、リンホカイン、リガンド、受容体、ホルモン、酵素、抗体および抗体断片、ならびに成長因子を挙げることができるが、これらに限定されない。受容体の限定ではない例としては、Ｉ型ＴＮＦ受容体、ＩＩ型ＩＬ−Ｉ受容体、ＩＬ−Ｉ受容体アンタゴニスト、ＩＬ−４受容体、および任意の化学修飾されたかまたは遺伝子修飾された可溶性受容体が挙げられる。酵素の例としては、以下が挙げられる：ラクターゼ、活性化されたタンパク質Ｃ、第ＶＩＩ因子、コラゲナーゼ（例えば、Ａｄｖａｎｃｅ  Ｂｉｏｆａｃｔｕｒｅｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからＳａｎｔｙｌの名称で販売されている）；アガルシダーゼ−β（例えば、ＧｅｎｚｙｍｅからＦａｂｒａｚｙｍｅの名称で販売されている）；ドルナーゼ−α（例えば、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈからＰｕｌｍｏｚｙｍｅの名称で販売されている）；アルテプラーゼ（例えば、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈからＡｃｔｉｖａｓｅの名称で販売されている）；ペグ化アスパラギナーゼ（例えば、ＥｎｚｏｎからＯｎｃａｓｐａｒの名称で販売されている）；アスパラギナーゼ（例えば、ＭｅｒｃｋからＥｌｓｐａｒの名称で販売されている）；およびイミグルセラーゼ（例えば、ＧｅｎｚｙｍｅからＣｅｒｅｄａｓｅの名称で販売されている）。特異的なポリペプチドまたはタンパク質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）、インターフェロガンマ（ＩＦＮγ）、インターフェロンガンマ誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化されると調節される、正常なＴ細胞によって発現され、そしておそらく分泌された）、マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、ＭＩＰ−１−αおよびＭＩＰ−１−β）、リーシュマニア伸長開始因子（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）（ＬＥＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、増殖因子、例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−２（ＮＴ−２）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＩＩ型ＴＮＦα受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、および可溶性糖タンパク質（例えば、ｇｐ１２０およびｇｐ１６０糖タンパク質。ｇｐ１２０糖タンパク質は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質であり、そしてｇｐ１６０糖タンパク質は、ｇｐ１２０糖タンパク質の公知の前駆体である。他の例としては、セクレチン、ネシリチド（ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ））、ＧＬＰ−１が挙げられる。
【００８１】
他の異種産物としては、ＧＰＣＲを挙げることができる。これには、以下が含まれるが、これらに限定されない：クラスＡロドプシン様受容体、例えば、ムスカリン性（Ｍｕｓｃａｔｉｎｉｃ）（Ｍｕｓｅ．）アセチルコリン脊椎動物１型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物２型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物３型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物４型；アドレナリン受容体（アルファアドレナリン受容体１型、アルファアドレナリン受容体２型、ベータアドレナリン受容体１型、ベータアドレナリン受容体２型、ベータアドレナリン受容体３型、ドーパミン脊椎動物１型、ドーパミン脊椎動物２型、ドーパミン脊椎動物３型、ドーパミン脊椎動物４型、ヒスタミン１型、ヒスタミン２型、ヒスタミン３型、ヒスタミン４型、セロトニン１型、セロトニン２型、セロトニン３型、セロトニン４型、セロトニン５型、セロトニン６型、セロトニン７型、セロトニン８型、セロトニンの他のタイプ、微量アミン、アンジオテンシン１型、アンジオテンシン２型、ボンベシン、ブラジキニン、Ｃ５ａアナフィラトキシン、Ｆｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、ＡＰＪ様、インターロイキン−８  Ａ型、インターロイキン−８  Ｂ型、インターロイキン−８の他のタイプ、Ｃ−Ｃケモカイン１型〜１１型および他の型のＣ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（２型〜６型および他の型）、Ｃ−Ｘ３−Ｃケモカイン、コレシストキニンＣＣＫ、ＣＣＫ  Ａ型、ＣＣＫ  Ｂ型、他のＣＣＫ、エンドセリン、メラノコルチン（メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノコルチンホルモン）、ダフィー抗原、プロラクチン放出ペプチド（ＧＰＲ１０）、ニューロペプチドＹ（１型〜７型）、ニューロペプチドＹ、他のニューロペプチドＹ、ニューロテンシン、オピオイド（Ｄ型、Ｋ型、Ｍ型、Ｘ型）、ソマトスタチン（１型〜５型）、タキキニン、（サブスタンスＰ（ＮＫｌ）、サブスタンスＫ（ＮＫ２）、ニューロメジンＫ（ＮＫ３）、タヒキニン様１およびタヒキニン様２）、バソプレシン／バソトシン（１型〜２型）、バソトシン、オキシトシン、メソトシン、コノプレシン）、ガラニン様、プロテイナーゼ活性化様、オレキシンおよび神経ペプチドＦＦ、ＱＲＦＰ、ケモカイン受容体様、ニューロメジンＵ様（ニューロメジンＵ、ＰＲＸアミド）、ホルモンタンパク質（卵胞刺激ホルモン、ルトロピン−絨毛膜性腺刺激性ホルモン、チロトロピン、ゴナドトロピンＩ型、ゴナドトロピンＩＩ型）、ロドプシン（（Ｒｈｏｄ）ｏｐｓｉｎ）、ロドプシン脊椎動物（１型〜５型）、ロドプシン脊椎動物５型、ロドプシン節足動物、ロドプシン節足動物１型、ロドプシン脊椎動物２型、ロドプシン脊椎動物３型、ロドプシン軟体動物、ロドプシン、嗅覚（嗅覚ＩＩ  ｆａｍ  １〜１３）、プロスタグランジン（プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ１受容体、プロスタグランジンＥ２／Ｄ２サブタイプＥＰ２受容体、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ３受容体、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ４受容体、プロスタグランジンＦ２−アルファ）、プロスタサイクリン、スロンボキサン、アデノシン１型〜３型、プリノセプター、プリノセプターＰ２ＲＹ１−４，６，１１  ＧＰＲ９１、プリノセプターＰ２���Ｙ５，８，９，１０  ＧＰＲ３５，９２，１７４、プリノセプターＰ２ＲＹ１２−１４  ＧＰＲ８７（ＵＤＰ−グルコース）、カンナビノイド、血小板活性化因子、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ型、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ型、脂質動員ホルモン様、コラゾニン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンおよび分泌促進物質、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質、成長ホルモン分泌促進物質様；脱皮誘因ホルモン（ＥＴＨＲ）、メラトニン、リゾスフィンゴ脂質およびＬＰＡ（ＥＤＧ）、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−１、リゾフォスファチジン酸Ｅｄｇ−２、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−３、リゾフォスファチジン酸Ｅｄｇ−４、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−５、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−６、リゾフォスファチジン酸Ｅｄｇ−７、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−８、他のロイコトリエンＢ４受容体、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴｌ、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ２、クラスＡオーファン／その他、推定される神経伝達物質、ＳＲＥＢ、ＭａｓプロトオンコジーンおよびＭａｓ関連のもの（ＭＲＧ）、ＧＰＲ４５様、システイニルロイコトリエン受容体、Ｇ−タンパク質共役胆汁酸受容体、遊離の脂肪酸受容体（ＧＰ４０、ＧＰ４１、ＧＰ４３）、クラスＢセクレチン様、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、胃抑制ペプチド、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、血管作動性腸管ポリペプチド、ラトロフィリン、ラトロフィリン１型、ラトロフィリン２型、ラトロフィリン３型、ＥＴＬ受容体、脳特異的血管新生阻害物質（ＢＡＩ）、メトセラ様タンパク質（ＭＴＨ）、カドヘリンＥＧＦ  ＬＡＧ（ＣＥＬＳＲ）、極めて大きなＧ−タンパク質共役受容体、クラスＣ代謝調節型グルタミン酸塩／フェロモン、代謝調節型グルタミン酸塩グループＩ〜グループＩＩＩ、カルシウム感知様、細胞外カルシウム感知性、フェロモン、カルシウム感知様の他のもの、推定されるフェロモン受容体、ＧＡＢＡ−Ｂ、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ１、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ２、ＧＡＢＡ−Ｂ様、オーファンＧＰＲＣ５、オーファンＧＰＣＲ６、セブンレスタンパク質（ＢＯＳＳ）のブライド（Ｂｒｉｄｅ）、Ｔａｓｔｅ受容体（ＴｌＲ）、クラスＤ真菌フェロモン、真菌フェロモンＡ因子様（ＳＴＥ２、ＳＴＥ３）、真菌フェロモンＢ様（ＢＡＲ、ＢＢＲ、ＲＣＢ、ＰＲＡ）、クラスＥ  ｃＡＭＰ受容体、眼白子症タンパク質、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄファミリー、ｆｒｉｚｚｌｅｄグループＡ（Ｆｚ  １および２および４および５および７〜９）、ｆｒｉｚｚｌｅｄグループＢ（Ｆｚ  ３および６）、ｆｒｉｚｚｌｅｄグループＣ（それ以外）、性フェロモン感知受容体、線虫の化学受容体、昆虫の嗅覚受容体、およびクラスＺ古細菌／細菌／真菌オプシン。
【００８２】
生体活性ペプチドは、本発明の異種配列によって生産させることもできる。例として以下が挙げられる：ＢＯＴＯＸ、Ｍｙｏｂｌｏｃ、Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ、Ｄｙｓｐｏｒｔ（またはボツリヌス菌の神経毒の他の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロイキン、デニロイキン・ディフティトックス、インターフェロンアルファ−ｎ３（注射剤）、インターフェロンアルファ−ｎ１、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、Ｓｕｎｔｏｒｙ（ガンマ−１ａ）、インターフェロンガンマ、サイモシンアルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、Ｒｅｂｉｆ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗鬆症）、カルシトニン注射剤（骨疾患）、カルシトニン（経鼻型、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組み換え体ヒト上皮成長因子（局所用ゲル、創傷治癒）、ＤＷＰ−４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、Ｍｏｎｏｎｉｎｅ、エプタコグアルファ（活性型）、組み換え体第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ、組み換え体第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組み換え体）、アルファネート、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、Ｉｎｄｉｋｉｎａｓｅ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エクセナチド、プラミンチド、イミグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ、モルグラモスチム、トリプロレリンアセテート、ヒストレリン（皮下埋め込み、Ｈｙｄｒｏｎ）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド徐放型デポー剤（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリド埋め混み型（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、ソマトロピン、Ｅｕｔｒｏｐｉｎ、ＫＰ−１０２プログラム、ソマトロピン、ソマトロピン、メセカルミン（成長不全）、エンフュービルタイド、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入薬）、インスリンリスプロ、インスリンデテミール、インスリン（口腔、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファバート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ｍＴｃ−アプシタイド注射剤、ミエロイド、ベタセロン、酢酸グラチラマー、Ｇｅｐｏｎ、サラグラモスティム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、Ｂｉｌｉｖｅ、インスリン（組み換え体）、組み換え体ヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン、Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ、インターフェロン−アルファ２、アルファフェロン、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファ、Ａｖｏｎｅｘの組み換え体ヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノタイド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、Ｚｅｍａｉｒａ、ＣＴＣ−１１１、Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ、ＨＰＶワクチン（四価）、ＮＯＶ−００２、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、プレザチッド銅酢酸（局所用ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、アクティミューン、ＰＥＧ−イントロン、トリコミン、組み換え体ハウスダストダニアレルギー脱感作注射剤、組み換え体ヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１〜８４（ｓｃ、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、グランジトロピン、ビトレース、組み換え体インスリン、インターフェロン−アルファ（経口用トローチ剤）、ＧＥＭ−２１Ｓ、バブレオチド、イズルスルファーゼ、オマパトリラト、組み換え体血清アルブミン、セルトリズマブペゴール、グルカルピダーゼ、ヒト組み換え体Ｃ１エステラーゼ阻害剤（血管浮腫）、ラノテプラーゼ、組み換え体ヒト成長ホルモン、エンフュービルタイド（針を用いない注射剤、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ  ２０００）、ＶＧＶ−Ｉ、インターフェロン（α）、ルシナクタント、アビプタディール（吸入薬、胚疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン、Ａｕｒｏｇｒａｂ、酢酸ペキシガナン、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデキンベスドトクス、ＦａｖＩｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、チファコギン、ＡＡ−４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ−４１３、ＡＲＴ−１２３、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ、デスモテプラ−ゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ−９５０７、テズグルチド、Ｄｉａｍｙｄ、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン（徐放型注射剤）、組み換え体Ｇ−ＣＳＦ、インスリン（吸入薬、ＡＩＲ）、インスリン（吸入薬、テクノスフィア）、インスリン（吸入薬、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ（Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ））、インターフェロンアルファ−ｎ３（経口薬）、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、Ｘｅｒｅｃｅｐｔ、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ−１００１、ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ、ランピルナーゼ、リポキサン、ラスプルチド、ＭＰ５２（ベータ型リン酸三カルシウムキャリア、骨再生）、メラノーマワクチン、シプリューセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、インセジア、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結型、手術による出血）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、プリカーゼ、テルリプレシン（静脈内、肝腎症候群）、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組み換え体ＦＧＦ−Ｉ（注入型、血管疾患）、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン（吸入型、嚢胞性線維症）、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＡＢＴ−５１０、ボーマン−バーク型阻害物質濃縮剤、ＸＭＰ−６２９、９９ｍＴｃ−Ｈｙｎｉｃ−アネキシンＶ、カ��ラリドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリクス（徐放型）、オザレリクス、ロミデプシン、ＢＡＹ−５０−４７９８、インターロイキン−４、ＰＲＸ−３２１、ペプスキャン、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンジタイド、アルブフェロン、Ｂｉｐｈａｓｉｘ、ＩＲＸ−２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭ１、卵巣がんの免疫治療用ワクチン、ＳＢ−２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ−ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ−Ｐ、ＢＬＰ−２５、ＣｅｒＶａｘ−１６、マルチエピトープペプチドメラノーマワクチン（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入型）、ｒＡＡＴ（皮膚科薬）、ＣＧＲＰ（吸入型、喘息）、ペグスネルセプト、サイモシンベータ−４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サケのカルシトイニン（経口薬、エリゲン）、カルシトニン（経口薬、骨粗鬆症）、エキサモレリン、カプロモレリン、カルデバ、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、ＴＰ−１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマタイド、クリサリン（局所用）、ｒＮＡＰｃ２、組み換え体第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組み換え体スタフィロキナーゼ変異体、Ｖ−１０１５３、ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ  Ｐｒｏｌｙｓｅ、ＮｅｕｒｏＶａｘ、ＣＺＥＮ−００２、膵島新生治療、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エクセナチド（徐放型、メディソルブ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン、ＡＯＤ−９６０４、酢酸リナクロチド、ＣＥＴｉ−１、ヘモスパン、ＶＡＬ（注射剤）、速効型インスリン（注射剤、ヴィアデル）、経鼻インルリン、インスリン（吸入型）、インスリン（経口薬、エリゲン）、組み換え体メチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ（皮下注射剤、湿疹）、ピトラキンラ（吸入型乾燥粉末、喘息）、マルチカイン、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１Ｏ（自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｉｓｅａｓｅｓ）／炎症）、ヒト型ラクトフェリン（ｔａｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）（局所型）、ｒＥＶ−１３１（眼科用）、ｒＥＶ−１３１（呼吸器疾患）、経口型組み換え体ヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン（経口薬）、ＣＹＴ−９９００７  ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ−ｎ３（局所型）、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、タウフェロン、胆汁酸塩刺激リパーゼ、メリスパーゼ、アルカリホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、メラノタン−ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ−１０４、組み換え体ヒトマイクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ  ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、マラリアワクチン（ビロソーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ−１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組み換え体ノイラミインダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、アンスラックスワクチン、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口薬）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔ  Ｔｏｘｏｉｄ、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、オスタボリン−Ｃ、ＰＴＨアナログ（局所型、乾癬）、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲ−４０４、ＢＡ−２１０、組み換え体疫病Ｆ１Ｖワクチン、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ−ｐ１／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７アレルギー誘発物質標的化ワクチン（イエダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、突然変異体ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６  Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリチンワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１ペプチドワクチン（ガン）、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、ペントライズ、ノレリン、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚科用、糖尿病性足部潰瘍）、ルピントリビル、レティキュロースｒＧＲＦ、Ｐ１Ａ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン治療用ワクチン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７（経口薬、結核）、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的免疫毒素（抗ガン剤）、ＤＴ３８８ＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスツズマブ−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２（組み換え体）、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７（局所型）、Ｌ−１９をベースとする放射線免疫治療薬（ガン）、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／Ｉ５４０／ＫＬＨワクチン（ガン）、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、メラノーマワクチン（パルス抗原治療薬）、前立腺ガンワクチン、ＣＢＰ−５０１、組み換え体ヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ２（注射剤）、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３６］（肥満
、経鼻型）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４（経鼻型、骨粗鬆症）、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１００１（シリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）リポソームクリーム（ノバゾーム）、デュラマイシン（眼科用、ドライアイ）、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、グリコペグ化（ＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｅｄ）エリスロポエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンディン、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリクス（即放型）、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ（徐放型、バイオスフィア）、ＯＧＰ−Ｉ、シフュービルタイド、ＴＶ−４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝臓選択性インスリン、スバリン、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、ｅｌａｆｉｎ、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少症）、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経成長因子アンタゴニスト（疼痛）、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、経口型テリパラチド（エリゲン）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合ワクチン（テラポア（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ））、ＥＰ−１０４３、肺炎連鎖球菌小児ワクチン、マラリアワクチン、Ｂ群髄膜炎菌ワクチン、新生児Ｂ群連鎖球菌ワクチン、炭疽病ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ−５９）、中耳炎治療薬、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１−３４）（経皮型、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン、ＢＩＭ−２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、ガンワクチン、エンカスチム、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（口腔徐放型）、オネルセプト、およびＴＰ−９２０１。
【００８３】
特定の実施形態においては、異種生産されるタンパク質は、酵素またはその生物学的に活性な断片である。適している酵素としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼ。特定の実施形態においては、異種生産されるタンパク質は、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＥＣ）のクラス１の酵素、例えば、ＥＣ１．１〜１．２１、または１．９７のいずれかによる酵素である。酵素はまた、ＥＣのクラス２、３、４、５、または６による酵素でもあり得る。例えば、酵素は、ＥＣ２．１〜２．９、ＥＣ３．１〜３．１３、ＥＣ４．１〜４．６、ＥＣ４．９９、ＥＣ５．１〜５．１１、ＥＣ５．９９、またはＥＣ６．１〜６．６のいずれかから選択することができる。
【００８４】
特定の実施形態においては、異種生産されるタンパク質は以下である：アセチラーゼ、アシラーゼ、アルドラーゼ、アミダーゼ、アミラーゼ、ＡＴＰａｓｅ、カルボキシラーゼ、シクラーゼ、シクロイソメラーゼ、デアセチラーゼ、デアシラーゼ、デカルボキシラーゼ、デシクラーゼ、デハロゲナーゼ、デヒドラターゼ、デヒドロゲナーゼ、デヒドロキシラーゼ、デメチラーゼ、デポリメラーゼ、デサチュラーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジスムターゼ、エンドヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エポキシダーゼ、エステラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、グリコシダーゼ、グリコシラーゼ、ハロゲナーゼ、ヒドラターゼ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ヒドロキシトランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、メチルエステラーゼ、モノオキシゲナーゼ、ムターゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレオシダーゼ、ヌクレオチダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、オキシゲナーゼ、ペプチダーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、ポリメラーゼ、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、ラセマーゼ、レダクターゼ、レダクトイソメラーゼ、リオヌクレアーゼ（ｒｉｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、リボヌクレアーゼ、シンターゼ、シンセターゼ、タウロメラーゼ、チオエステアーゼ、チオグルコシダーゼ、チオエステラーゼ、トポイソメラーゼ、またはトランスヒドロゲナーゼ。適しているキナーゼとしては、チロシンキナーゼ、セリンキナーゼ、スレオニンキナーゼ、アスパルチンキナーゼ、およびヒスチジンキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。適しているホスホリラーゼとしては、チロシンホスホリラーゼ、セリンホスホリラーゼ、およびスレオニンホスホリラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
特定の実施形態においては、異種生産されるタンパク質は、イソメラーゼまたはその生物学的に活性な断片である。適しているイソメラーゼとしては、イソペンテニル二リン酸（「ＩＰＰ」）イソメラーゼまたはその生物学的に活性な断片が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、異種生産されるタンパク質は、シンターゼまたはその生物学的に活性な断片である。適しているシンターゼとしては、プレニル二リン酸シンターゼおよびテルペンシンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。適しているプレニル二リン酸シンターゼまたはプレニルトランスフェラーゼ（例えば、プレニルトランスフェラーゼ）は、Ｅ−イソプレニル二リン酸シンターゼであり得、これには、以下が含まれるがこれらに限定されない：ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）シンターゼ、ファルネシルＩ二リン酸（ＦＰＰ）シンターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼ、ヘキサプレニル二リン酸（ＨｅｘＰＰ）シンターゼ、ヘプタプレニル二リン酸（ＨｅｐＰＰ）シンターゼ、オクタプレニル（ＯＰＰ）二リン酸シンターゼ、ソラネシル二リン酸（ＳＰＰ）シンターゼ、デカプレニル二リン酸（ＤＰＰ）シンターゼ、チクルシンターゼ、およびガッタパーチャシンターゼ；およびジソプレニル二リン酸シンターゼ（Ｚｉｓｏｐｒｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ノナプレニル二リン酸（ＮＰＰ）シンターゼ、ウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）シンターゼ、デヒドロドリチル二リン酸シンターゼ、エイコサプレニル二リン酸シンターゼ、天然ゴムシンターゼ、および他のジソプレニル二リン酸シンターゼが含まれるがこれらに限定されない）。いくつかの実施形態においては、プレニルトランスフェラーゼは、外因性配列によってコードされる。
【００８６】
様々な種に由来する多数のプレニルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列は公知であり、上記異種タンパク質を生産させるための異種配列の作製に使用するために使用され得るか、または修飾され得る。例えば、以下のものについての配列を公に利用することができる：ヒトファルネシルピロリン酸シンテターゼｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０５２６２；（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）；ファルネシル二リン酸シンテターゼ（ＦＰＰ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０５０９１；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；イソペンテニル二リン酸：ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼ遺伝子（Ｊ０５０９０；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｏｈｎｕｍａ（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５２９：３３−４８；米国特許第６，６４５，７４７号；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａファルネシルピロリン酸シンテターゼ２（ＦＰＳ２）／ＦＰＰシンテターゼ２／ファルネシル二リン酸シンターゼ２（Ａｔ４ｇｌ７１９０）ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿２０２８３６）；Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ｇｇｐｐｓ）ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ３７１３２１）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＳ１）／ＧＧＰＰシンテターゼ／ファルネシルトランストランスフェラーゼ（Ａｔ４ｇ３６８１０）ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿１１９８４５）；ファルネシル、ゲラニルゲラニル、ゲラニルファルネシル、ヘキサプレニル、ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＳｅｌＦ−ＨｅｐＰＳ）についてのＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０１６０９５）。
【００８７】
他の実施形態においては、生産されるタンパク質はテルペンシンターゼであり、これには以下が含まれるがこれらに限定されない：アモルファ−４，１１−ジエンシンターゼ、β−カリオフィレンシンターゼ、ゲルマクレンＡシンターゼ、８−エピセドロールシンターゼ、バレンセンシンターゼ、（＋）−δ−カジネンシンターゼ、ゲルマクレンＣシンターゼ、（Ｅ）−β−ファルネセンシンターゼ、カスベンシンターゼ、ベチスピラジエンシンターゼ、５−エピ−アリストロケンシンターゼ、アリストルケンシンターゼ、α−フムレンシンターゼ、（Ｅ，Ｅ）−α−ファルネセンシンターゼ、（−）−β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リモネンシクラーゼ、リナロールシンターゼ、１，８−シネオールシンターゼ、（＋）−サビネンシンターゼ、Ｅ−α−ビサボレンシンターゼ、（＋）−ボルニル二リン酸シンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、（Ｅ）−γ−ビサボレンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、コパリルピロリン酸シンターゼ、カウランシンターゼ、ロンギホレンシンターゼ、γ−フムレンシンターゼ、δ−セリネンシンターゼ、β−フェランドレンシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、（−）−カンフェンシンターゼ、（＋）−３−カレンシンターゼ、ｓｙｎ−コパリル二リン酸シンターゼ、α−テルピネオールシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダアラコピマラジエンシンターゼ（ｅｎｔ−ｓａｎｄａａｒａｃｏｐｉｍａｒａｄｉｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ステマル−１３−エンシンターゼ（ｓｔｅｍｅｒ−１３−ｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、Ｅ−β−オシメン、Ｓ−リナロールシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、リナロールシンターゼ１、Ｅ−β−オシメンシンターゼ、エピ−セドロールシンターゼ、α−ジンギベレンシンターゼ、グアイアジエンシンターゼ、カスカリラジエンシンターゼ、シス−ムウロラジエンシンターゼ、アフィジコラン−１６ｂ−オールシンターゼ（ａｐｈｉｄｉｃｏｌａｎ−１６ｂ−ｏｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、エリザベサトリエンシンターゼ（ｅｌｉｚａｂｅｔｈａｔｒｉｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、サンダロールシンターゼ（ｓａｎｄａｌｏｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、パチョロールシンターゼ、ジンザノールシンターゼ（ｚｉｎｚａｎｏｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、セドロールシンターゼ、スカレオールシンターゼ（ｓｃａｒｅｏｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、コパロールシンターゼ、およびマノールシンターゼ（ｍａｎｏｏｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）。
【００８８】
いくつかの実施形態においては、異種生産されるタンパク質は、代謝経路において機能する酵素またはその生物学的に活性な断片である。異種生産されるタンパク質は、異化経路において機能する酵素であり得る。適している異化経路の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：好気呼吸の経路（これには、解糖、ピルビン酸の酸化的脱炭酸、クエン酸回路、および酸化的リン酸化が含まれる）；および嫌気呼吸（発酵）の経路。他の実施形態においては、異種生産されるタンパク質は、同化経路において機能する酵素である。適している同化経路の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（「ＩＰＰ」）の生産のためのメバロン酸依存性（「ＭＥＶ」）経路およびメバロン酸非依存性（「ＤＸＰ」）経路。ＩＰＰはさらに、イソプレノイド（例えば、その経路の代謝流量を制御することにおいて役割を担っているＭＥＶ経路の酵素をコードする異種配列（例えば、律速工程に関与しているもの、または本発明において使用され得る代謝中間体の合成に関与しているもの））に変換され得る。このカテゴリーの例示的なＭＥＶ経路の酵素としては、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、およびメバロン酸キナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
ＤＸＰ経路に関与している酵素またはそれらの生物学的に活性な断片は同定されており、単離されており、そして使用することができる。これらの酵素としては、以下が挙げられる：１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（「ｄｘｓ」遺伝子によってコードされる）、１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（「ｉｓｐＣ」遺伝子としても知られている「ｄｘｒ」遺伝子によってコードされる）、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシチジルトランスフェラーゼ酵素（「ｙｇｂＰ」遺伝子としても知られている「ｉｓｐＤ」遺伝子によってコードされる）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリスリトールキナーゼ（「ｙｃｈＢ」遺伝子としても知られている「ｉｓｐＥ」遺伝子によってコードされる）、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（「ｙｇｂＢ」遺伝子としても知られている「ｉｓｐＦ」遺伝子によってコードされる）、ＣＴＰシンターゼ（「ｉｓｐＦ」遺伝子としても知られている「ｐｙｒＧ」遺伝子によってコードされる）、ジメチルアリル二リン酸の形成に関与している酵素（「ｉｓｐＨ」遺伝子としても知られている「ｌｙｔＢ」遺伝子によってコードされる）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼの合成に関与している酵素（「ｉｓｐＧ」遺伝子としても知られている「ｇｃｐＥ」遺伝子によってコードされる）。
【００９０】
ＤＸＰ経路の例示的なポリペプチド／ヌクレオチド配列としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸シンターゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＦ０３５４４０）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００２９４７  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＰＰ０５２７）、１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂ．ｓｐ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ  ｓｔｒ．ＡＴＣＣ９１５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＣＰ００００２６、Ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＳＰＡ２３０１）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００７４９３  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＲＳＰ＿０２５４）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＣＧＡ００９、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００５２９６  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＲＰＡ０９５２）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  Ｔｅｍｅｃｕｌａｌ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００４５５６  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＰＤ１２９３）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンターゼ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００３０７６  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＡＴ５Ｇ１１３８０）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＢ０１３３００）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＦ１４８８５２）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００２９４７  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＰＰ１５９７）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＬ９３９１２４  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＣＯ５６９４）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００７４９３  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＲＳＰ＿２７０９）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＰｆＯ−１、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００７４９２  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  Ｐｆ１＿１１０７）、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＦ２３０７３６）、４−ジホスホシチジル−２−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄ��ｓ  ２．４．１，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃，ＮＣ＿００７４９３  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ、ＲＳＰ＿２８３５）、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００３０７１  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＡＴ２Ｇ０２５００）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００２９４７  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＰＰ１６１４）、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ｉｓｐＥ）遺伝子（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＦ２１６３００）、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ｉｓｐＥ）（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００７４９３  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＲＳＰ＿１７７９）、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＦ２３０７３８）、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００７４９３  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＲＳＰ＿６０７１）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００２９４７  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＰＰ１６１８）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＹ０３３５１５）、４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン−１−イル二リン酸シンターゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００２９４７  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＰＰ０８５３）、４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン−１−イル二リン酸シンターゼ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００７４９３  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＲＳＰ＿２９８２）、ＩｓｐＨ（ＬｙｔＢ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＹ０６２２１２）、４−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エニル二リン酸レダクターゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＣ＿００２９４７  ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ  ＰＰ０６０６）、および米国特許出願番号２００６０１２１５５８（これは引用により本明細書中に組み入れられる。）に開示されている任意の他のＤＸＰ経路の遺伝子。
【００９１】
逆ＴＣＡ回路に関与している酵素をコードするヌクレオチド配列もまた当該分野で公知であり、これは、逆ＴＡＣ回路の酵素である異種産物を生産させるための異種配列として使用され得る。ＴＣＡ回路の例示的なポリペプチド／ヌクレオチド配列としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：２−オキソグルタレートフェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＢ０４６５６８、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  Ｙ１０５４０）、（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  Ｕ０９８６８）、フマル酸レダクターゼ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＤＱ６８０２７７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＹ６９２４７４）、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＢ０４２４１２）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＢ０７６０２１，Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＮＭ＿０３１５５１）、ＡＴＰ−クエン酸シンターゼ（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＢ０５４６７０，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  Ｘ００７８２）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  Ｘ５９３８１，Ｍ６９１１６）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＭ１６７９３８，Ｌｕｐｉｎｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＭ２３５２１１）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  Ｘ８０８３８，Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  Ｘ０７２９７，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  ＡＭ０５１１３７）、および／またはフマラーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  Ｘ７８５７６，Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ＃  Ｘ９１６１５）。これらの逆ＴＣＡ回路の核酸のうちの任意のものを、本発明の方法にしたがってイソプレノイドを生産する組み換え体宿主細胞を作製するために使用することができる。
【００９２】
ＭＥＶ経路の酵素をコードするヌクレオチド配列の幅広い選択肢が当該分野で利用され、そしてこれらの酵素またはそれらの生物学的に活性な断片を、本発明の異種配列の構築に容易に使用することができる。以下は、ＭＥＶ経路の遺伝子産物をコードする既知のヌクレオチド配列の限定ではない例であり、括弧内はそれぞれのＭＥＶ経路の酵素のＧｅｎＢａｎｋ登録番号と起源生物である：アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ：（ＮＣ＿０００９１３  ＲＥＧＩＯＮ：２３２４１３１．．２３２５３１５；Ｅ．ｃｏｌｉ）、（Ｄ４９３６２；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、および（Ｌ２０４２８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；ＨＭＧＳ：（ＮＣ＿００１１４５．ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  １９０６１．．２０５３６；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ９６６１７；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ８３８８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＢ０３７９０７；Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｇｒｉｓｅｏｌａ）、および（ＢＴ００７３０２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＳＡＶ２５４６，ＧｅｎｅＩＤ  １１２２５７１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）；ＨＭＧＲ：（ＮＭ＿２０６５４８；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＳＡＶ２５４５，ＧｅｎｅＩＤ  １１２２５７０；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、（ＮＭ＿２０４４８５；Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、（ＡＢ０１５６２７；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＫＯ−３９８８）、（ＡＦ５４２５４３；Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ａｔｔｅｎｕａｔａ）、（ＡＢ０３７９０７；Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｇｒｉｓｅｏｌａ）、（ＡＸ１２８２１３、短縮型ＨＭＧＲをコードする配列を提供する；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、および（ＮＣ＿００１１４５：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１１５７３４．．１１８８９８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））；ＭＫ：（Ｌ７７６８８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、および（Ｘ５５８７５；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；ＰＭＫ：（ＡＦ４２９３８５；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＮＭ＿００６５５６；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＮＣ＿００１１４５．ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ７１２３１５．．７１３６７０；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；ＭＰＤ：（Ｘ９７５５７；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＦ２９００９５；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、および（Ｕ４９２６０；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）；ならびにＩＤＩ：（ＮＣ＿０００９１３、３０３１０８７．．３０３１６３５；Ｅ．ｃｏｌｉ）、および（ＡＦ０８２３２６；Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）。
【００９３】
代謝経路の産物としては、炭化水素およびそれらの誘導体を挙げることができる。例えば、飽和炭化水素、不飽和炭化水素、シクロアルカン炭化水素、および芳香族炭化水素を、本発明の方法によって生産することができる。例えば、テルペンおよびテルペノイド（例えば、イソプレノイド）は、本発明の異種配列によってコードされるＭＥＶ経路の酵素のような異種タンパク質の生産の結果として生産され得る。
【００９４】
イソプレノイド（任意のＣ５〜Ｃ２０またはさらに大きな炭素数のイソプレノイドを含むがこれらに限定されない）は、本明細書中に記載される方法によって生産される異種産物であり得る。以下は、任意のＣ５〜Ｃ２０またはさらに大きな炭素数のイソプレノイドのような例示的なイソプレノイドを記載するが、これらに限定されない。本発明のＣ５化合物の例は、ＩＰＰまたはＤＭＡＰＰに由来し得る。これらの化合物はまた、ヘミテルペンとしても知られている。なぜなら、これらは、単一のイソプレン単位（ＩＰＰまたはＤＭＡＰＰ）に由来するからである。その構造が
【００９５】
【化１】
2011517410.tif 000002
【００９６】
であるイソプレンが、多くの植物において見られる。イソプレンは、通常は、イソプレンシンターゼによってＩＰＰから生成される。適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては、（ＡＢ１９８１９０；Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）および（ＡＪ２９４８１９；Ｐｏｌｕｌｕｓ  ａｌｂａ  ｘ  Ｐｏｌｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、本発明で使用される異種配列であり得る。
【００９７】
２つのイソプレン単位から導かれることからモノテルペンとしても知られている本発明のＣ１０化合物は、ＤＭＡＰＰとのＩＰＰの縮合によって生成されるゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）に由来し得る。特定の実施形態においては、本発明の宿主細胞には、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとをＧＰＰに変換する酵素をコードする異種配列が含まれる。この工程を触媒することが明らかになっている酵素は、例えば、ゲラニルピロリン酸シンターゼである。ゲラニルピロリン酸シンターゼのヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ＡＦ５１３１１１；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１３；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ５３４６８６；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ５３４６８７；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（Ｙ１７３７６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＥ０１６８７７、Ｌｏｃｕｓ  ＡＰ１１０９２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ；ＡＴＣＣ１４５７９）、（ＡＪ２４３７３９；Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、（ＡＹ５３４７４５；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ９５３５０８；Ｉｐｓ  ｐｉｎｉ）、（ＤＱ２８６９３０；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＡＦ１８２８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＡＦ１８２８２７；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＭＰＩ２４９４５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＰＺＥ４３１６９７、Ｌｏｃｕｓ  ＣＡＤ２４４２５；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、（ＡＹ８６６４９８；Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ  ｋｕｒｒｏｏａ）、（ＡＹ３５１８６２；Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、および（ＡＦ２０３８８１、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＦ１２８４３；Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）。次いで、その後、ＧＰＰは、様々なＣ１０化合物に変換することができる。Ｃ１０化合物の説明的な例としては、以下のモノテルペンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
例えば、モノテルペンは、その構造が
【００９９】
【化２】
2011517410.tif 000003
【０１００】
であるカレンであり得る。
【０１０１】
カレンは、通常は、ＧＰＰからカレンシンターゼによって生成される。カレンシンターゼをコードする異種配列として使用される、適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ＡＦ４６１４６０、ＲＥＧＩＯＮ  ４３．．１９２６；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）および（ＡＦ５２７４１６、ＲＥＧＩＯＮ：７８．．１８７１；Ｓａｌｖｉａ  ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）。
【０１０２】
別のモノテルペン（例えば、その構造が
【０１０３】
【化３】
2011517410.tif 000004
【０１０４】
であるゲラニオール（ロドノールとしても知られている））が、本発明によって生産される産物であり得る。ゲラニオールは、通常は、ＧＰＰからゲラニオールシンターゼによって生成される。本発明の異種配列として使用され得るゲラニオールシンターゼをコードする、適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ＡＪ４５７０７０；Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｐｉｌｕｍ）、（ＡＹ３６２５５３；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＤＱ２３４３００；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ株１８６４）、（ＤＱ２３４２９９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ株１８６１）、（ＤＱ２３４２９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ株４９３５）、および（ＤＱ０８８６６７；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）。
【０１０５】
その構造が
【０１０６】
【化４】
2011517410.tif 000005
【０１０７】
であるモノテルペン、リナロールは、通常は、ＧＰＰからリナロールシンターゼによって生成され、そして本発明によって生産され得る。適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ＡＦ４９７４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＣ００２２９４、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＢ７１４８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＹ０５９７５７；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１０４７９３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＦ  １５４１２４；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ０６７６０３；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＦ０６７６０２；Ｃｌａｒｋｉａ  ｃｏｎｃｉｎｎａ）、（ＡＦ０６７６０１；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（Ｕ５８３１４；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ８４００９１；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＤＱ２６３７４１；Ｌａｖａｎｄｕｌａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、（ＡＹ０８３６５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｃｉｔｒａｔｅ）、（ＡＹ６９３６４７；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＸＭ＿４６３９１８；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＰ００４０７８、Ｌｏｃｕｓ  ＢＡＤ０７６０５；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＸＭ＿４６３９１８、Ｌｏｃｕｓ  ＸＰ＿４６３９１８；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＹ９１７１９３；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）、（ＡＦ２７１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７３６２３；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、（ＤＱ１９５２７４；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、および（ＡＦ４４４７９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｎｏ．７９）。これらの配列は、本発明の異種配列として使用され得る。
【０１０８】
その構造が
【０１０９】
【化５】
2011517410.tif 000006
【０１１０】
である別のモノテルペン、リモネンは、通常は、ＧＰＰからリモネンシンターゼによって生成される。本発明の異種配列として使用され得る適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（＋）−リモネンシンターゼ（ＡＦ５１４２８７、ＲＥＧＩＯＮ：４７．．１８６７；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）および（ＡＹ０５５２１４、ＲＥＧＩＯＮ：４８．．１８８９；Ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｒｕｇｏｓａ）、ならびに（−）−リモネンシンターゼ（ＤＱ１９５２７５、ＲＥＧＩＯＮ：１．．１９０５；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、（ＡＦ００６１９３、ＲＥＧＩＯＮ：７３．．１９８６；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、および（ＭＨＣ４ＳＬＳＰ、ＲＥＧＩＯＮ：２９．．１８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）。
【０１１１】
その構造が
【０１１２】
【化６】
2011517410.tif 000007
【０１１３】
であるモノテルペン、ミルセンは、通常は、ＧＰＰからミルセンシンターゼによって生成され、そして、本発明によって生産され得る別の産物である。本発明の異種配列として使用され得る適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（Ｕ８７９０８；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＮＭ＿１２７９８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳ１０）、（ＮＭ＿１１３４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＡＦ２７１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７３６２６；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、（ＡＦ３６９９１９；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、および（ＡＪ３０４８３９；Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｉｌｅｘ）。
【０１１４】
その構造がそれぞれ、
【０１１５】
【化７】
2011517410.tif 000008
【０１１６】
である別のモノテルペン、オシメン（α−オシメンおよびβ−オシメン）は、通常は、ＧＰＰからオシメンシンターゼ（本発明の異種配列によってコードされ得るシンターゼ）によって生成される。異種配列として使用され得る適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ＡＹ１９５６０７；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＫ２２１０２４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１３４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１７７７５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿００１０３６５７４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿１２７９８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳｌＯ）、（ＡＢ１１０６４２；Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  ＣｉｔＭＴＳＬ４）、および（ＡＹ５７５９７０；Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ  ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）。
【０１１７】
その構造が
【０１１８】
【化８】
2011517410.tif 000009
【０１１９】
である別のモノテルペン、α−ピネンは、通常は、ＧＰＰからα−ピネンシンターゼ（本発明の異種配列によってコードされ得るシンターゼ）によって生成される。シンターゼをコードする異種配列として使用され得る適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（＋）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５３０、ＲＥＧＩＯＮ：１．．１８８７；Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５２７、ＲＥＧＩＯＮ：３２．．１９２１；Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、および（＋）／（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＧＵ８７９０９、ＲＥＧＩＯＮ：６１１１８９２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）。
【０１２０】
その構造が
【０１２１】
【化９】
2011517410.tif 000010
【０１２２】
である別のモノテルペン、β−ピネンは、通常は、ＧＰＰからβ−ピネンシンターゼ（本発明の異種配列によってコードされ得るシンターゼ）によって生成される。シンターゼをコードする異種配列として使用され得る適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（−）β−ピネンシンターゼ（ＡＦ２７６０７２、ＲＥＧＩＯＮ：１．．１７４９；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）および（ＡＦ５１４２８８、ＲＥＧＩＯＮ：２６．．１８３４；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）。
【０１２３】
その構造が
【０１２４】
【化１０】
2011517410.tif 000011
【０１２５】
である別のモノテルペン、サビネンは、通常は、ＧＰＰからサビネンシンターゼ（本発明の異種配列によってコードされ得るシンターゼ）によって生成される。異種配列として使用され得る適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては、Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  由来のＡＦ０５１９０１、ＲＥＧＩＯＮ：２６．．１７９８が挙げられるがこれに限定されない。
【０１２６】
その構造が
【０１２７】
【化１１】
2011517410.tif 000012
【０１２８】
である別のモノテルペン、γ−テルピネンは、通常は、ＧＰＰからγ−テルピネンシンターゼ（本発明の異種配列によってコードされ得るシンターゼ）によって生成される。異種配列として使用され得る適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ由来のＡＦ５１４２８６、ＲＥＧＩＯＮ：３０．．１８３２）および（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ由来のＡＢ１１０６４０、ＲＥＧＩＯＮ  １．．１８０３）。
【０１２９】
その構造が
【０１３０】
【化１２】
2011517410.tif 000013
【０１３１】
である別のモノテルペン、テルピノレンは、通常は、ＧＰＰからテルピノレンシンターゼ（本発明の異種配列によってコードされ得るシンターゼ）によって生成される。異種配列として使用され得る適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（Ｏｓｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ由来のＡＹ６９３６５０）および（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ由来のＡＹ９０６８６６、ＲＥＧＩＯＮ：１０．．１８８７）。
【０１３２】
本発明の異種産物はまた、Ｃ１５化合物でもあり得る。Ｃ１５化合物は、一般的には、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）（これは、２つのＩＰＰ分子の１つのＤＭＡＰＰ分子との縮合によって生成される）に由来する。この工程を触媒することが知られている酵素は、例えば、ファルネシルピロリン酸シンターゼである。これらのＣ１５化合物はまた、セスキテルペンとしても知られている。なぜなら、これらは、３個のイソプレン単位に由来するからである。特定の実施形態においては、本発明の宿主細胞には、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとをＦＰＰに変換する酵素をコードする異種配列が含まれる。
【０１３３】
本発明の異種配列であり得るファルネシルピロリン酸をコードするヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ＡＦ４６１０５０；Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、（ＡＢ００３１８７，Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、（ＡＥ００９９５１、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＬ９５５２３；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂ．ｓｐ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＡＢ０１６０９４，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、（ＣＰ０００００９、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＷ６００３４；Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ６２１Ｈ）、（ＡＦ０１９８９２；Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、（ＨＵＭＦＡＰＳ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、（ＬＡＵ１５７７７；Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＬＡＵ２０７７１；Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＡＦ３０９５０８；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＰＡＦＰＳ１；Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＰＡＦＰＳ２；Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＲＡＴＦＡＰＳ；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＹＳＣＦＰＰ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｄ８９１０４；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、（ＣＰ０００００３、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＴ８７３８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＣＰ００００１７、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＺ５１８４９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＮＣ＿００８０２２、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿５９８８５６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０２７０）、（ＮＣ＿００８０２３、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿６００８４５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ２０９６）、（ＮＣ＿００８０２４、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿６０２８３２；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０７５０）、および（ＭＺＥＦＰＳ；Ｚｅａ  ｍａｙｓ，（ＡＢ０２１７４７、ファルネシル二リン酸シンターゼのＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＦＰＰＳ１遺伝子）、（ＡＢ０２８０４４、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、（ＡＢ０２８０４６、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、（ＡＢ０２８０４７、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、（ＡＡＵ３６３７６；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ１１２８８１およびＡＦ１３６６０２，Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ３８４０４０，Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（Ｄ００６９４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）、（Ｄ１３２９３，Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（Ｄ８５３１７，Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＴＵ８０６０５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（Ｘ７５７８９，Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、（Ｙ１２０７２，Ｇ．ａｒｂｏｒｅｕｍ）、（Ｚ４９７８６，Ｈ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（Ｕ８０６０５、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａファルネシル二リン酸シンターゼ前駆体（ＦＰＳ１）ｍＲＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ）、（Ｘ７６０２６、ファルネシル二リン酸シンテターゼのＫ．ｌａｃｔｉｓ  ＦＰＳ遺伝子、ｂｃ１複合体、サブユニットＶＩＩＩのＱＣＲ８遺伝子）、（Ｘ８２５４２、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ１）のＰ．ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ  ｍＲＮＡ）、（Ｘ８２５４３、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ２）のＰ．ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ  ｍＲＮＡ）、（ＢＣ０１０００４、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ファルネシルピロリン酸シンテターゼ、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ、ゲラニルトランストランスフェラーゼ）、クローンＭＧＣ  １５３５２  ＩＭＡＧＥ、４１３２０７１、ｍＲＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ）、（ＡＦ２３４１６８，Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍファルネシル二リン酸シンターゼ（Ｄｆｐｓ））、（Ｌ４６３４９，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ２）ｍＲＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ）、（Ｌ４６３５０、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳ２）遺伝子、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ）、（Ｌ４６３６７、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＳｌ）遺伝子、別の産物、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ）、（Ｍ８９９４５、ラットファルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子、エキソン１〜８）、（ＮＭ＿００２００４、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓファルネシル二リン酸シンターゼ（ファルネシルピロリン酸シンテターゼ、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ、ゲラニルトランストランスフェラーゼ）（ＦＤＰＳ）、ｍＲＮＡ）、（Ｕ３６３７６、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａファルネシル二リン酸シンターゼ（ｆｐｓ１）ｍＲＮＡ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ）、（ＸＭ＿００１３５２、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓファルネシル二リン酸シンターゼ（ファルネシルピロリン酸シンテターゼ、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ、ゲラニルトランストランスフェラーゼ）（ＦＤＰＳ）、ｍＲＮＡ）、（ＸＭ＿０３４４９７、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓファルネシル二リン酸シンターゼ（ファルネシルピロリン酸シンテターゼ、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ、ゲラニルトランストランスフェラーゼ）（ＦＤＰＳ）、ｍＲＮＡ）、（ＸＭ＿０３４４９８、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓファルネシル二リン酸シンターゼ（ファルネシルピロリン酸シンテターゼ、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ、ゲラニルトランストランスフェラーゼ）（ＦＤＰＳ）、ｍＲＮＡ）、（ＸＭ＿０３４４９９、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓファルネシル二リン酸シンターゼ（ファルネシルピロリン酸シンテターゼ、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ、ゲラニルトランストランスフェラーゼ）（ＦＤＰＳ）、ｍＲＮＡ）、および（ＸＭ＿０３４５００２、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓファルネシル二リン酸シンターゼ（ファルネシルピロリン酸シンテターゼ、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ、ゲラニルトランストランスフェラーゼ）（ＦＤＰＳ）、ｍＲＮＡ）。
【０１３４】
あるいは、ＦＰＰは、ＩＰＰをＧＰＰに付加することによっても生成され得る。この反応を行うことができる酵素をコードするヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ＡＥ０００６５７、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＣ０６９１３；Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５）、（ＮＭ＿２０２８３６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（Ｄ８４４３２、Ｌｏｃｕｓ  ＢＡＡ１２５７５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、（Ｕ１２６７８、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＣ２８８９４；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＵＳＤＡ  １１０）、（ＢＡＣＦＤＰＳ；Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４０、Ｌｏｃｕｓ  ＮＰ＿８７３７５４；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ  ３５０００ＨＰ）、（Ｌ４２０２３、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＣ２３０８７；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ  ＫＷ２０）、（Ｊ０５２６２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＹＰ＿３９５２９４；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ｓｕｂ．ｓｐ  ｓａｋｅｉ  ２３Ｋ）、（ＮＣ＿００５８２３、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿０００２７３；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ  ｓｔｒ．Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０）、（ＡＢ００３１８７；Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４６、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿２０８７６８；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  ＦＡ  １０９０）、（Ｕ０００９０、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＢ９１７５２；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＮＧＲ２３４）、（Ｊ０５０９１；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、（ＣＰ００００３１、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＶ９３５６８；Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＤＳＳ−３）、（ＡＥ００８４８１、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＫ９９８９０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６）、および（ＮＣ＿００４５５６、Ｌｏｃｕｓ  ＮＰ  ７７９７０６；Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）。
【０１３５】
次いで、ＦＰＰは、様々なＣ１５化合物に変換させることができる。Ｃ１５化合物の１つの説明的な例としては、その構造が
【０１３６】
【化１３】
2011517410.tif 000014
【０１３７】
あるアモルファジエンが挙げられるがこれに限定されない。これは、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎａによって生成されるアルテミシニンの前駆体である。アモルファジエンは、通常は、ＦＰＰからアモルファジエンシンターゼ（本発明の異種配列によってコードされ得るシンターゼ）によって生成される。適しているヌクレオチド配列の説明的な例は、米国特許公開番号２００４／０００５６７８の配列番号３７である。
【０１３８】
その構造が
【０１３９】
【化１４】
2011517410.tif 000015
【０１４０】
であるα−ファルネセンは、通常は、ＦＰＰからα−ファルネセンシンターゼによって生成され、そして本明細書中に記載される方法によって生産され得る。異種配列によってコードされ得るシンターゼとしては、例えば、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  ｄ’Ａｎｊｏｕ由来のＤＱ３０９０３４（西洋ナシ；遺伝子名ＡＦＳ１）およびＭａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ由来のＡＹ１８２２４１（リンゴ；遺伝子ＡＦＳ１）。Ｐｅｃｈｏｕｕｓら、Ｐｌａｎｔａ  ２１９（１）：８４−９４（２００４）。
【０１４１】
その構造が
【０１４２】
【化１５】
2011517410.tif 000016
【０１４３】
であるβ−ファルネセンは、通常は、ＦＰＰからβ−ファルネセンシンターゼによって生成され、そして本明細書中に記載される方法によって生産され得る。シンターゼは、異種配列（例えば、Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ由来のＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０２４６１５（ペパーミント；遺伝子Ｔｓｐａｌ１）、およびＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ由来のＡＹ８３５３９８（Ｐｉｃａｕｄら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６（９）：９６１−９６７（２００５））であるがこれらに限定されない）によってコードされ得、そしてこれらは、本発明の異種配列として使用され得る。
【０１４４】
その構造が
【０１４５】
【化１６】
2011517410.tif 000017
【０１４６】
であるファルネソールは、通常は、ＦＰＰからヒドロキシラーゼ（例えば、ファルネソールシンターゼ）によって生成される。ファルネソールは、異種配列（Ｚｅａ  ｍａｙｓ由来のＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ５２９２６６、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＤＲ４８１Ｃ（遺伝子Ｐｈｏ８）を含むが、これらに限定されない異種配列の使用によって生産され得る（Ｓｏｎｇ，Ｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２８：１４９−１５８（２００６）））。
【０１４７】
その構造が
【０１４８】
【化１７】
2011517410.tif 000018
【０１４９】
であるネロリドールはペルビオールとしても知られており、通常は、ＦＰＰからヒドロキシラーゼ（例えば、ネロリドールシンターゼ、これは、本発明の異種配列によってコードされ得る）によって生成される。異種配列として使用され得る適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては、Ｚｅａ  ｍａｙｓ由来のＡＦ５２９２６６（トウモロコシ；遺伝子ｔｐｓ１）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１５０】
その構造が
【０１５１】
【化１８】
2011517410.tif 000019
【０１５２】
であるパチョロールは、通常は、ＦＰＰからパチョロールシンターゼ（ｐａｔｃｈｏｕｌｉｏｌ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）によって生成される。パチョロールは、異種配列（例えば、Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｃａｂｌｉｎ由来のＡＹ５０８７３０  ＲＥＧＩＯＮ：１．．１６５９であるが、これに限定されない）を使用して本発明において生産され得る。
【０１５３】
その構造が
【０１５４】
【化１９】
2011517410.tif 000020
【０１５５】
であるバレンセンは、通常は、ＦＰＰからヌートカトンシンターゼによって生成される。シンターゼをコードするために使用され得る適しているヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ由来のＡＦ４４１１２４  ＲＥＧＩＯＮ：１．．１６４７、およびＰｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ由来のＡＹ９１７１９５  ＲＥＧＩＯＮ：１．．１６５３。
【０１５６】
異種産物には、Ｃ２０化合物（例えば、３つのＩＰＰ分子の１つのＤＭＡＰＰ分子との縮合によって生成される、ゲラニルゲラニオールピロリン酸（ＧＧＰＰ）に由来するＣ２０化合物）も含まれ得る。これらのＣ２０化合物はジテルペンとしても知られている。なぜなら、これらは、４つのイソプレン単位に由来するからである。特定の実施形態においては、本発明の宿主細胞には、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとをＧＧＰＰに変換する酵素をコードする異種配列が含まれる。この工程を触媒することが知られている酵素は、例えば、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼである。
【０１５７】
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼのヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＢＴ００５３２８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１９８４５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、Ｌｏｃｕｓ  ＺＰ＿００７４３０５２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ、ＡＴＣＣ３５６４６  ｓｑｌ５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、Ｌｏｃｕｓ  ＺＰ＿００１４４５０９；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂ．ｓｐ  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、ＡＴＣＣ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＡＹ３７１３２１；Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、（ＡＢ０５５４９６；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＡＢ０１７９７１；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＭＣＩ２７６１２９；Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ）、（ＡＢ０１６０４４；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、Ｌｏｃｕｓ  ＮＣＵ０１４２７；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＮＣＵ２０９４０；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、Ｌｏｃｕｓ  ＺＰ＿００９４３５６６；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＳＣＵ３１６３２；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＢ０１６０９５；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）、（ＳＡＧＧＰＳ；Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、（ＳＳＯＧＤＳ；Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、（ＮＣ＿００７７５９、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿４６１８３２；Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ  ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＳＢ）、および（ＮＣ＿００６８４０、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿２０４０９５；Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ＥＳ１１４）。
【０１５８】
あるいは、ＧＧＰＰは、ＩＰＰをＦＰＰに付加することによっても生成され得る。この反応を行うことができる酵素をコードするヌクレオチド配列の説明的な例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ＮＭ＿１１２３１５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＥＲＷＣＲＴＥ；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、（Ｄ９００８７、Ｌｏｃｕｓ  ＢＡＡ１４１２４；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、（Ｘ５２２９１、Ｌｏｃｕｓ  ＣＡＡ３６５３８；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、（ＡＦ１９５１２２、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＦ２４２９４；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、および（ＮＣ＿００４３５０、Ｌｏｃｕｓ  ＮＰ＿７２１０１５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９）。次いでその後、ＧＧＰＰを、様々なＣ２０イソプレノイドに変換することができる。Ｃ２０化合物の説明的な例としては、例えば、ゲラニルゲラニオールが挙げられる。その構造が
【０１５９】
【化２０】
2011517410.tif 000021
【０１６０】
であるゲラニルゲラニオールは、例えば、発現構築物にホスファターゼ遺伝子を、ＧＧＰＰシンターゼの遺伝子の後ろに付加することによっても生成され得る。
【０１６１】
アビエタジエンは、本明細書中に記載される方法によって生産され得る別のジテルペンである。アビエタジエンには以下の異性体：
【０１６２】
【化２１】
2011517410.tif 000022
【０１６３】
が含まれ、そして通常は、アビエタジエンシンターゼによって生成される。アビエタジエンシンターゼは、以下を含むがこれらに限定されない適している異種ヌクレオチド配列によってコードされ得る：（Ｕ５０７６８；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）および（ＡＹ４７３６２１；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）。
【０１６４】
Ｃ２０＋化合物もまた本発明の範囲に含まれる。そのような化合物の説明的な例としては、セスターテルペン（５個のイソプレン単位から生成されるＣ２５化合物）、トリテルペン（６個のイソプレン単位から生成されるＣ３０化合物）、およびテトラテルペン（８個のイソプレン単位から生成されるＣ４０化合物）が挙げられる。これらの化合物は、本明細書中に記載される方法と同様の方法を使用し、そして適切なシンターゼ（単数または複数）のヌクレオチド配列に置き換えるまたは適切なシンターゼ（単数または複数）のヌクレオチド配列を付加することによって生成される。
【０１６５】
いくつかの実施形態においては、異種生産される産物の量は、１０ｍｇ／Ｌより多い。例えば、いくつかの実施形態においては、本発明の細胞によって生産される産物の量は、約１０ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、約１，０００ｍｇ／Ｌ〜約１，５００ｍｇ／Ｌ、約１，５００ｍｇ／Ｌ〜約２，０００ｍｇ／Ｌ、約２，０００ｍｇ／Ｌ〜約３，０００ｍｇ／Ｌ、約３，０００ｍｇ／Ｌ〜約４，０００ｍｇ／Ｌ、約４，０００ｍｇ／Ｌ〜約５，０００ｍｇ／Ｌ、約５，０００ｍｇ／Ｌ〜約６，０００ｍｇ／Ｌ、約６，０００ｍｇ／Ｌ〜約７，０００ｍｇ／Ｌ、約７，０００ｍｇ／Ｌ〜約８，０００ｍｇ／Ｌ、または約８，０００ｍｇ／Ｌ〜約１０，０００ｍｇ／Ｌである。特定の実施形態においては、異種生産される産物の量は１０，０００ｍｇ／Ｌより多い。特定のそのような実施形態においては、異種生産される産物の量は、約１０，０００ｍｇ／Ｌ〜約２０，０００ｍｇ／Ｌ、約２０，０００ｍｇ／Ｌ〜約３０，０００ｍｇ／Ｌ、約３０，０００ｍｇ／Ｌ〜約４０，０００ｍｇ／Ｌ、または約４０，０００ｍｇ／Ｌ〜約５０，０００ｍｇ／Ｌである。特定の実施形態においては、異種生産される産物の量は５０，０００ｍｇ／Ｌより多い。生産レベルは、細胞培養物を基準として単位容量あたり（例えば１リットルあたり）で表わされる。生産されるタンパク質または化合物のレベルは、以下のような周知の方法を使用して容易に決定される：例えば、ガスクロマトグラフィー−質量分析法、液体クロマトグラフィー−質量分析法、イオンクロマトグラフィー−質量分析法、薄層クロマトグラフィー、アンペロメトリック電気化学検出法、およびＵＶ−ｖｉｓ分光測定法。
【０１６６】
異種生産されるタンパク質、またはそのようなタンパク質によって生成される化合物は、宿主細胞から、または宿主細胞が増殖した培養培地から、当該分野で周知の標準的な精製方法（例えば、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、および他の標準的なクロマトグラフィー法を含む）を使用して回収することができる。いくつかの実施形態においては、精製されたタンパク質または化合物は純粋であり、例えば、少なくとも約４０％純粋、少なくとも約５０％純粋、少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、あるいは９８％を上回って純粋である。ここでは、用語「純粋」は、副産物、マクロ分子、混入物質などを含まないタンパク質または化合物をいう。
【０１６７】
本発明の異種産物は、商業的に有用である場合も、そして産業上有用である場合もある。例えば、生産されるイソプレノイドは、医薬品、化粧品、香料、色素および着色剤、抗生物質、殺菌剤、防腐剤、栄養補助食品（例えば、ビタミン類）、ファインケミカル中間体、ポリマー、フェロモン、工業用化合物、ならびに燃料として使用され得る。
【０１６８】
１つの実施形態においては、生産されるイソプレノイドは、ビタミン（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、またはビタミンＫ）および他のイソプレノイド系の栄養素である。血液凝固システムに関与している重要なビタミンであるビタミンＫは、止血剤として利用されている。ビタミンＫはまた骨の代謝にも関与しており、これは骨粗鬆症の処置に適用することができる。加えて、ユビキノンとビタミンＫとは、フジツボの目的物への付着を阻止することに有効であり、したがって、フジツボの付着を防ぐために塗料製品に適している添加剤である。
【０１６９】
本発明によってはまた、ユビキノン（これは、電子伝達系の必須の構成要素としての役割をインビボで担っている）のようなイソプレノイドの生産方法が提供される。ユビキノンは、心臓病に有効な医薬品として有用であるだけではなく、有用な食品添加物でもある。フィロキノンおよびメナキノンは、医薬品として承認されている。
【０１７０】
本発明にはまた、カロテノイド類（例えば、β−カロテン、アスタキサンチン、およびクリプトキサンチン）の生産にも関する。これらのカロテノイド類には、ガンを予防する効果と免疫増強効果とがあると期待される。これらの方法によって生産されるカロテノイド類はまた、顔料としても使用され得る。カロテノイド類は、天然の顔料のうちで最も広く分布しており、そして構造的に多様なクラスの１つを示し、明るい黄色〜オレンジ色〜深い赤色の色素色を生じる。カロテノイド生産性（ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ）組織の例としては、ニンジン、トマト、赤トウガラシ、ならびにラッパスイセンおよびマリーゴールドの花弁が挙げられる。カロテノイド類は、あらゆる光合成生物、ならびに一部の細菌および真菌によって合成される。これらの顔料は、光合成、栄養摂取、および光酸化傷害に対する防御において重要な機能を有している。例えば、動物は、カロテノイド類を合成する能力を持っていないが、その代わりに、それらの食事供給源を通じてこれらの栄養上重要な化合物を摂取しなければならない。１つの特異的なイソプレノイド（例えば、β−カロテン（黄色〜オレンジ色）またはアスタキサンチン（赤色〜オレンジ色）は、花の色を強くするまたは栄養補助食品の組成を強化するように作用し得る。例えば、修飾されたシアニジンおよびデルフィニジンアントシアニン（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ）顔料が生産され得、そして赤色〜青色のグループの色調を得るために使用され得る。ルテインおよびゼアキサンチンを生産させることができ、無色のフラボノイドと組み合わせて使用することができる（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｒ，Ｓｃｉｅｎｉａ  Ｈｏｒｔ．７１：２５７−２６６，１９９７）。
【０１７１】
本発明には、テルペノイド以外の脂質の異種産物も含まれる。例えば、脂質（例えば、脂肪アシル類（脂肪酸を含む）、糖脂質類、グリセロリン脂質類、スフィンゴ脂質類、ステロール脂質類、プレノール脂質類（ｐｒｅｎｏｌ  ｌｉｐｉｄｓ）、サッカロ脂質類（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、およびポリケタイド類（ｐｏｌｙｋｔｉｄｅｓ）である。炭水化物（例えば、単糖類、二糖類、および多糖類）の生産。
【０１７２】
（宿主細胞）
任意の宿主細胞が本発明の実施において使用され得る。宿主細胞にはガラクトース誘導機構が含まれる。適している宿主細胞の説明的な例としては、原核生物細胞および真核生物細胞、例えば、古細菌細胞、細菌細胞、および真菌細胞が挙げられる。多くの実施形態においては、宿主細胞は、液体の増殖培地中で増殖させることができる。
【０１７３】
古細菌細胞についてのいくつかの限定ではない例としては、以下の属に属している古細菌が挙げられる：Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、およびＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属。古細菌株についてのいくつかの限定ではない例としては以下が挙げられる：Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、およびＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ。
【０１７４】
細菌細胞についてのいくつかの限定ではない例としては、以下の属に属している細菌が挙げられる：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓ属、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓ属。
【０１７５】
細菌株についてのいくつかの限定ではない例としては、以下が挙げられる：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｇｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ。
【０１７６】
細菌宿主細胞が使用される場合は、例えば、限定ではないが以下のような非病原性株が使用され得る：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｔａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、およびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ。
【０１７７】
真核生物細胞についてのいくつかの限定ではない例としては真菌細胞が挙げられる。真菌細胞についてのいくつかの限定ではない例としては、以下の属に属している細菌細胞が挙げられる：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｒｙｏｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｎｅｏｔｙｐｈｏｄｉｕｍ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属。
【０１７８】
真核生物株についてのいくつかの限定ではない例としては、以下が挙げられる：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒａｍｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ。
【０１７９】
真核生物宿主細胞が使用される場合は、限定ではないが以下のような非病原性株が使用され得る：Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉ、およびＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【０１８０】
加えて、複数の特定の株が、ＧＲＡＳまたはＧｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  ＳａｆｅとしてＦｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって設計されており、そして本発明において使用され得る。これらの株についてのいくつかの限定ではない例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられる。
【０１８１】
特定の実施形態においては、宿主細胞は、不完全なガラクトース代謝経路を持つ場合がある。例えば、ガラクトースの代謝を媒介する１種類またはそれ以上の内因性の酵素が機能しない。理論には束縛されないが、ガラクトース代謝機能の不全により、さらに多くのガラクトースに、ガラクトース誘導性プロモーターの誘導を利用させることが可能となる。この機能不全は、１つの遺伝子全体またはその一部を欠失させること（その結果、遺伝子産物は生成されないかまたは短縮型となり、そして酵素的に非機能性である）；１つの遺伝子を突然変異させること（その結果、遺伝子産物は生成されないかまたは短縮型となり、そして酵素的に非機能性である）；１つの遺伝子の中に可動性の遺伝子エレメントを挿入すること（その結果、遺伝子産物は生成されないかまたは短縮型となり、そして酵素的に非機能性である）；ならびに、１つの遺伝子の発現を制御する１つまたは複数の調節エレメントを欠失させるかまたは突然変異させること（その結果、遺伝子産物は生成されない）を含む、当該分野で公知の任意の様々な方法で行うことができる。ガラクトースを異化するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の能力が機能しないかまたは低下している場合に適している酵素としては、ＧＡＬ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌｏｃｕｓ  ＹＢＲ０２０Ｗ）、ＧＡＬ７ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌｏｃｕｓ  ＹＢＲ０１８Ｃ）、およびＧＡＬ１０ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌｏｃｕｓ  ＹＢＲ０１９Ｃ）、ならびに他の機能的ホモログが挙げられる。
【０１８２】
（核酸）
多くの実施形態においては、宿主細胞は、その中に異種核酸分子が挿入されている、欠失させられている、または修飾されている（すなわち、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換、および／または反転によって突然変異させられている）、遺伝子修飾された細胞である。
【０１８３】
特定の実施形態においては、異種核酸が発現ベクターに挿入される。発現ベクターの選択は、選択される宿主細胞に応じて様々であろう。酵母細胞、トリ細胞、および哺乳動物細胞を含む真核生物細胞中での発現に適している多数の発現ベクターが当該分野で公知であり、これらの多くは商業的に入手することができる。一般的なベクターについてのいくつかの例としては、ＹＥｐ１３、およびＳｉｋｏｒｓｋｉシリーズｐＲＳ３０３〜３０６、３１３〜３１６、４２３〜４２６が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８４】
特定の実施形態においては、ガラクトース誘導性発現カセットを含むヌクレオチド配列と、ガラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列とが、１つの発現ベクター上に存在する。他の実施形態においては、ガラクトース誘導性発現カセットを含むヌクレオチド配列と、ガラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列とが、２つの発現ベクター上に存在する。特定の実施形態においては、ガラクトース誘導性発現カセットを含むヌクレオチド配列と、ラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列とが、１つの発現ベクター上に存在する。他の実施形態においては、ガラクトース誘導性発現カセットを含むヌクレオチド配列と、ラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列とが、２つの発現ベクター上に存在する。特定の実施形態においては、ガラクトース誘導性発現カセットを含むヌクレオチド配列と、ラクターゼをコードするヌクレオチド配列とが、１つの発現ベクター上に存在する。他の実施形態においては、ガラクトース誘導性発現カセットを含むヌクレオチド配列と、ラクターゼをコードするヌクレオチド配列とが、２つの発現ベクター上に存在する。
【０１８５】
特定の実施形態においては、ガラクトース誘導性発現カセットを含むヌクレオチド配列、ガラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列、およびラクターゼをコードするヌクレオチド配列が、１つの発現ベクター上に存在する。他の実施形態においては、ガラクトース誘導性発現カセットを含むヌクレオチド配列、ガラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列、およびラクターゼをコードするヌクレオチド配列が、２つまたはそれ以上の発現ベクター上に存在する。特定の実施形態においては、ガラクトース誘導性発現カセット、ラクターゼをコードするヌクレオチド配列、およびラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列が、１つの発現ベクター上に存在する。他の実施形態においては、ガラクトース誘導性発現カセットを含むヌクレオチド配列、ラクターゼをコードするヌクレオチド配列、およびラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列が、２つまたはそれ以上の発現ベクター上に存在する。
【０１８６】
特定の実施形態においては、宿主細胞には、１つの異種ガラクトース誘導性発現カセットが含まれる。他の実施形態においては、宿主細胞には、複数の異種ガラクトース誘導性発現カセットが含まれる。特定の実施形態においては、細胞には、ガラクトーストランスポーターをコードする１つのヌクレオチド配列が含まれる。他の実施形態においては、宿主細胞には、１つまたは複数のガラクトーストランスポーターをコードする複数のヌクレオチド配列が含まれる。特定の実施形態においては、宿主細胞には、ラクトーストランスポーターをコードする１つのヌクレオチド配列が含まれる。他の実施形態においては、宿主細胞には、１つまたは複数のラクトーストランスポーターをコードする複数のヌクレオチド配列が含まれる。特定の実施形態においては、宿主細胞には、ラクターゼをコードする１つのヌクレオチド配列が含まれる。他の実施形態においては、宿主細胞には、１つまたは複数のラクターゼをコードする複数のヌクレオチド配列が含まれる。１つまたは複数のタンパク質をコードする複数のヌクレオチド配列は、１つまたは複数の発現ベクター上に存在し得る。これらのタンパク質は同じである場合も、異なる場合もあり、そしてさらに、１つまたは複数の異種ガラクトース誘導性発現カセットとして同じ発現ベクター上に提供される場合も、また異なる発現ベクター上に提供される場合もある。
【０１８７】
いくつかの実施形態においては、発現ベクターは、染色体外発現ベクターである。いくつかの実施形態においては、発現ベクターはエピソーム性である。例えば、宿主細胞には、染色体外発現ベクター上にあるか、またはエピソームベクター上にある、１つまたは複数の異種ガラクトース誘導性発現カセットが含まれ得る。特定の実施形態においては、宿主細胞は、ガラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーまたは複数のコピーを、染色体外発現ベクターまたはエピソームベクター上に含む。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は、ラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーまたは複数のコピーを、染色体外発現ベクター上に含む。いくつかの実施形態においては、宿主細胞は、ラクターゼをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーまたは複数のコピーを、染色体外発現ベクターまたはエピソームベクター上に含む。いくつかの実施形態においては、染色体外発現ベクターは、単一の発現ベクターによってコードされる複数のタンパク質を有し得る。例えば、単一の染色体外発現ベクターまたはエピソームベクターに、ラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列とラクターゼをコードするヌクレオチド配列が含まれ得る。いくつかの実施形態においては、単一の染色体外発現ベクターに、同じタンパク質をコードするヌクレオチド配列の複数のコピーが含まれ得、例えば、単一の染色体外発現ベクターが、単一のラクターゼをコードする２つのヌクレオチド配列を有し得る。他の実施形態においては、単一の染色体外発現ベクターに、１つまたは複数のガラクトース誘導性発現カセットが、ラクターゼ、ラクトーストランスポーター、またはガラクトーストランスポーターをコードする１つまたは複数の他のヌクレオチド配列とともに、含まれ得る。
【０１８８】
他の実施形態においては、発現ベクターは、染色体組み込み型（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）ベクターである。この場合、染色体組み込み型ベクターの異種ヌクレオチド配列が、宿主細胞の染色体に、または宿主細胞のゲノムに導入される。いくつかの実施形態においては、宿主細胞には、染色体に組み込まれた１つまたは複数の異種ガラクトース誘導性発現カセットが含まれる。いくつかの実施形態においては、宿主細胞には、染色体に組み込まれたガラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーまたは複数のコピーが含まれる。いくつかの実施形態においては、宿主細胞には、染色体に組み込まれたラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーまたは複数のコピーが含まれる。いくつかの実施形態においては、宿主細胞には、染色体に組み込まれたラクターゼをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーまたは複数のコピーが含まれる。いくつかの実施形態においては、染色体組み込み型ベクターには、１つまたは複数の異種ガラクトース誘導性発現ベクターの配列と、染色体に組み込まれた１つまたは複数のラクターゼ、ラクトーストランスポーター、またはガラクトーストランスポーターをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列とが含まれる。
【０１８９】
特定の実施形態においては、ガラクトースまたはラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列と、ラクターゼをコードするヌクレオチド配列とが、同じ調節エレメントに作動可能であるように連結される。他の実施形態においては、ガラクトースまたはラクトーストランスポーターをコードするヌクレオチド配列は、第１の調節エレメントの制御下にあり、そしてラクターゼをコードするヌクレオチド配列は第２の調節エレメントの制御下にある。調節エレメントはプロモーターであり得る。例えば、プロモーターは誘導性でも、また恒常的でもあり得る。適している誘導性プロモーターとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２５、ＭＥＴ３、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＴＰ１、およびＡＯＸ１のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態においては、プロモーターは恒常的である。適している構成的なプロモーターとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＰＧＫ１、ＴＤＨ１、ＴＤＨ３、ＦＢＡ１、ＡＤＨ１、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ１、およびＰＹＫ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
遺伝子修飾された宿主細胞を作製するために、１つまたは複数の異種核酸が、以下を含むがこれらに限定されない確立されている技術を使用して、細胞に安定に、または一時的に導入される：エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−できストラン媒介性トランスフェクション、およびリポソーム媒介性トランスフェクション。安定な形質転換のために、核酸には一般的には、選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性マーカー、アンピシリン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性マーカー、またはカナマイシン耐性マーカー）がさらに含まれるであろう。安定な形質転換はまた、必須のアミノ酸についての原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）を付与する栄養マーカー遺伝子を使用するためにも選択され得る。（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの栄養マーカー遺伝子ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＭＥＴ２、およびＬＹＳ２、他のものとしては、ＨＩＳＭまたはＫＡＮＭＸを挙げることができる）。
【０１９１】
（変異体酵素およびヌクレオチド配列ホモログ）
本発明の任意の公知のタンパク質のコード配列は、アミノ酸配列中に標的化された変化を含むが、そのタンパク質の機能は実質的には変化していない変異体タンパク質を作製するために、当該分野で公知の様々な方法で変化させることができる。上記配列変化は、置換、挿入、または欠失であり得る。本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のヌクレオチド配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む核酸ホモログもまた、使用に適している。
【０１９２】
野生型ポリペプチドまたはタンパク質の等価物あるいは変異体もまた、本発明の範囲に含まれることが理解される。用語「等価物」、「機能的ホモログ」、および「その生物学的に活性な断片」は互換的に使用され、そして使用される状況に関係がある断片の少なくとも１つの機能的特性を保ちつつ、付加、欠失、または置換の任意の組み合わせによる、選択された配列からの変異体をいう。例えば、タンパク質様酵素の等価物（例えば、ラクターゼ）は、野生型のタンパク質様酵素と比較して、所定の化学反応を触媒する同じまたは同等の能力を有し得る。当業者に明らかであるように、等価物はまた、その機能を促進する、増強する、または調節する他の物質あるいは薬剤と組み合わせられる場合があり、またそれらと結合させられる場合もある。本発明には、ペプチドの酵素活性またはそれらの三次構造のようなそれらの特性に有意に影響を及ぼすことのない、保存的置換あるいは非保存的置換を含む修飾されたポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの修飾は、当該分野で日常的に行われている。別のアミノ酸残基で保存的に置換することができるアミノ酸残基としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン。これらのポリペプチドにはまた、グリコシル化ポリペプチドおよび非グリコシル化ポリペプチド、ならびに他の翻訳後修飾（例えば、様々な糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化）を持つポリペプチドもまた含まれる。
【０１９３】
（コドン使用法）
いくつかの実施形態においては、本発明の宿主細胞を作製するために使用されるヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列が細胞のコドン優先性を反映するように修飾される。特定の実施形態においては、ヌクレオチド配列は、酵母のコドン優先性のために修飾されるであろう（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ．１９８２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（６）：３０２６−３０３１を参照のこと）。
【０１９４】
（キット）
本発明にはまた、細胞培養培地にガラクトースを直接補充することなく、異種配列のガラクトース誘導性生産により異種産物を生産させるための試薬を提供するキットも含まれる。このキットにより、得られる産物の量が、同等のモル量のガラクトースが補充された培地中で宿主細胞を培養することによって得られる産物の量と同等となるように試薬が提供される。例えば、ラクトースが補充された培地によって生産される産物の量は、同等の量のガラクトースが補充された培地から生産される産物の量と同等である。いくつかの実施形態においては、生産される産物の量は、同等のモル量のガラクトースが直接補充された培地によって得られる産物の量とほぼ等しいかまたはそれより多い。いくつかの実施形態においては、生産される産物の量は、同等のモル量のガラクトースが補充された培地から得られる産物の量よりも、少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍（すなわち、倍）、２．５倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上である。
【０１９５】
それぞれのキットには、通常は、細胞培養培地にガラクトースを直接補充しなくても、ガラクトース誘導性調節カセットを通じて異種産物を生産させる試薬が含まれる。１つの実施形態においては、キットには、ガラクトース誘導性発現系の構成要素が含まれ得る。例えば、キットには、選択される異種配列に作動可能であるように連結させることができるガラクトース誘導性調節エレメントが含まれ得る。このキットにはさらに、選択される異種配列を調節エレメントに連結させるためのクローニング試薬のような複数の試薬が含まれ得る。他の実施形態においては、キットにはさらに、ガラクトース誘導性発現ベクターが含まれ得る。この場合、選択される異種配列を挿入することができる。ベクターは、エピソーム性ベクターであり得、染色体外ベクターであり得、また、染色体組み込み型ベクターでもあり得る。他の実施形態においては、キットには、ラクターゼ、ラクターゼトランスポーター、および／またはガラクトーストランスポーターの発現用のベクターが含まれ得る。他の実施形態においては、キット（ｋｉｄ）には、ガラクトース誘導機構の発現のための構成要素が含まれ得る。様々な宿主細胞のタイプのための様々なキットを設計することができる。例えば、いくつかのキットには、内因性のラクターゼを持つ宿主細胞用の試薬が含まれ得、したがってこのキットには、ラクターゼを発現するベクターは含まれない場合がある。
【０１９６】
いくつかの実施形態においては、キットには、少なくとも１つの第１の発現ベクターと少なくとも１つの第２の発現ベクターとを含む発現ベクターの１つのセットが含まれる。この場合、第１の発現ベクターには、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された第１の異種配列が含まれ、そして、第２の発現ベクターには、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする第２の異種配列が含まれる。
【０１９７】
他の実施形態においては、キットにはさらに、宿主細胞が含まれ得る。他の実施形態においては、キットにはさらに、培養培地、異種産物の生産を誘導するための化合物、および細胞培養物への他の補充物が含まれる。
【０１９８】
キットのそれぞれの試薬は、固体の形態で、または保存（ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ  ｓｔｏｒａｇｅ）に適している液体緩衝液に溶解／懸濁させられて供給され得、後で交換されるか、試験が行われる際に反応培地に添加される。適している個々のパッケージが、通常は提供される。キットによっては、状況に応じて、この手順において有用であるさらに別の成分が提供され得る。これらの随意成分としては、緩衝液、精製試薬、回収試薬、検出手段、対照試料、対照化合物（例えば、ガラクトース）、説明書、および説明的情報が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
本発明のキットには、通常は、本明細書中に含まれる試薬の使用のための説明書が含まれる。この説明書は、電子媒体を含む任意の読み取り可能媒体に記録された製品の挿入物、マニュアルの形態で提供され得る。
【実施例】
【０２００】
本発明の実施では、他に明記されない限りは、当業者の知識の範囲内である生合成の業界での従来技術などを使用することができる。そのような技術が本明細書中で完全には記載されていない範囲について、当業者は、化学文献においてそれらについての有り余る言及を見つけることができる。
【０２０１】
以下の実施例においては、使用される数値（例えば、量、温度など）の精度を確保する努力が行われているが、変動や偏差が許容され得、そして本明細書中で報告される数値の誤記が存在する場合には、本発明が属する分野の当業者は本明細書中に残されている開示を参照して正確な量を推定することができる。他に明記されない限りは、温度は、摂氏温度で報告され、そして圧力は海面での大気圧またはそれに近い。全ての試薬は、他に明記されない限りは商業的に入手した。以下の実施例は説明の目的ために意図されるものにすぎず、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【０２０２】
（実施例１）
本実施例では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの特異的な染色体位置にタンパク質をコードする配列が作動可能であるように連結されているガラクトース誘導性プロモーターを含む異種核酸の標的化された組み込みのためのプラスミドを作製する方法を記載する。
【０２０３】
ゲノムＤＮＡを、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｙ００２（ＣＥＮ．ＰＫ２  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ＭＡＴＡ  ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１−２８９  ｌｅｕ２−３，１１２  ｈｉｓ３Δ１  ＭＡＬ２−８Ｃ  ＳＵＣ２）、Ｙ００７（Ｓ２８８Ｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ＭＡＴ  Ａ  ｔｒｐ１Δ６３）、Ｙ０５１（Ｓ２８８Ｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ＭＡＴα  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ２Δ０  ｕｒａ３Δ０  ＰＧＡＬ１−ＨＭＧ１１５８６−３３２３ＰＧＡＬ１−ｕｐｃ２−１  ｅｒｇ９：：ＰＭＥＴ３−ＥＲＧ９：：ＨＩＳ３  ＰＧＡＬ１−ＥＲＧ２０  ＰＧＡＬ１−ＨＭＧ１１５８６−３３２３）、およびＥＧ１２３（ＭＡＴＡ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｌｅｕ２  ｈｉｓ４  ｃａｎ１）から単離した。これらの株を、１％の酵母抽出物、２％のＢａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ、および２％のデキストロースを含む液体培地（ＹＰＤ培地）中で一晩増殖させた。細胞を、１０ｍＬの液体培養物から、３，１００ｒｐｍで遠心分離し、細胞ペレットを１０ｍＬの超純水で洗浄し、そして再度遠心分離することによって単離した。ゲノムＤＮＡを、Ｙ−ＤＥＲ酵母ＤＮＡ抽出キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、製造業者によって示唆されているプロトコールにしたがって使用して抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを、１００ｕＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５に再懸濁し、そしてＯＤ２６０／２８０の読み取り値を、ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）で読み取って、ゲノムＤＮＡの濃度と純度を決定した。
【０２０４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ２７２０  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ＯＹ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を製造業者によって示唆されているプロトコールにしたがって使用して行った。ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入されたＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅が完了したら、ヌクレオチド突出を、１ｕＬのＱｉａｇｅｎ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を反応混合物に加え、さらに１０分間、７２℃でＰＣＲ伸長工程を行い、続いて４℃に冷却することによって作製した。ＰＣＲ増幅が完了したら、８ｕＬの５０％のグリセロール溶液を反応混合物に添加し、そして混合物全てを、０．５ｕｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドを含む１％のＴＢＥ（０．８９ＭのＴｒｉｓ、０．８９Ｍのホウ酸、０．０２ＭのＥＤＴＡナトリウム塩）アガロースゲル上にロードした。
【０２０５】
アガロースゲル電気泳動を、１２０Ｖ、４００ｍＡで３０分間行い、ＤＮＡのバンドを紫外線を使用して視覚化させた。ＤＮＡのバンドを、滅菌したカミソリの刃を用いてゲルから切り出し、切り出したＤＮＡを、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を製造業者によって示唆されているプロトコールにしたがって使用してゲル精製した。精製したＤＮＡを、１０ｕＬの超純水に溶出させ、ＯＤ２６０／２８０の読み取り値をＮＤ−１０００分光光度計で読み取って、ＤＮＡの濃度と純度を決定した。
【０２０６】
連結は、１００ｕｇ〜５００ｕｇの精製したＰＣＲ産物と、高濃度Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）とを、製造業者によって示唆されているプロトコールにしたがって使用して行った。プラスミドの増幅のために、連結させた構築物をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α化学的コンピテント細胞（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に、製造業者によって示唆されているプロトコールにしたがって形質転換した。ポジティブな形質転換体を、１．５％のＢａｃｔｏ  Ａｇａｒ、１％のＴｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％の酵母抽出物、１％のＮａＣｌ、および５０ｕｇ／ｍＬの適切な抗生物質を含む固体培地上で選択した。単離した形質転換体を、５０ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンまたはカナマイシン抗生物質を含む液体ＬＢ培地中で、３７℃で１６時間増殖させ、そしてプラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者によって示唆されているプロトコールにしたがって使用して、単離し、そして精製した。複数の構築物を、診断用の制限酵素消化、アガロースゲル上でのＤＮＡ断片の分解、および紫外線を使用したバンドの視覚化を行うことによって確認した。選択した構築物もまたＤＮＡ配列決定によって確認した。これはＥｌｉｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）によって行った。
【０２０７】
プラスミドｐＡＭ４８９を、ベクターｐＡＭ４７１のＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ挿入断片をベクターｐＡＭ４６６に挿入することによって作製した。ベクターｐＡＭ４７１は、ＤＮＡ断片ＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（これには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ２０遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＥＲＧ２０のヌクレオチド位置１〜１２０８が含まれる；ＡＴＧ開始コドンのＡがヌクレオチド１位である）（ＥＲＧ２０）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの異なるＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターを含むゲノム遺伝子座（ＧＡＬ１のヌクレオチド位置−１〜−６６８）（ＰＧＡＬ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＭＧ１遺伝子の短縮型ＯＲＦ（ＨＭＧ１のヌクレオチド位置１５８６〜３３２３）（ｔＨＭＧＲ）が含まれている）を、ＴＯＰＯ  ＺＥＲＯ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入することによって作製した。ベクターｐＡＭ４６６は、ＤＮＡ断片ＴＲＰ１−８５６〜＋５４８（これには、ヌクレオチド位置−８５６〜位置５４８に伸びるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生型ＴＲＰ１遺伝子座の１つのセグメントが含まれており、そして塩基−２２６と−２２５との間に天然のものではない内部ＸｍａＩ制限酵素部位を持つ）を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入することによって作製した。ＤＮＡ断片ＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲおよびＴＲＰ１−８５６〜＋５４８は、表１に概説したように、ＰＣＲ増幅によって作製した。図２Ａは、ＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ挿入断片のマップを示し、そして配列番号５は、このＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。ｐＡＭ４８９の構築のために、４００ｎｇのｐＡＭ４７１と１００ｎｇのｐＡＭ４６６とを、ＸｍａＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して完全に消化させ、ＥＲＧ２０−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ挿入断片に対応するＤＮＡ断片と、直鎖状にしたｐＡＭ４６６ベクターとをゲル精製し、そして４モル等量の精製した挿入断片を、１モル等量の精製した直鎖状のベクターと連結させて、ｐＡＭ４８９を得た。
【０２０８】
【表１】
2011517410.tif 000023
【０２０９】
プラスミドｐＡＭ４９１を、ベクターｐＡＭ４７２のＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ挿入断片をベクターｐＡＭ４６７に挿入することによって作製した。ベクターｐＡＭ４７２は、ＤＮＡ断片ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（これには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１３遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ１３のヌクレオチド位置１〜１６２６）（ＥＲＧ１３）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの異なるＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターを含むゲノム遺伝子座（ＧＡＬ１のヌクレオチド位置−１〜−６６８）（ＰＧＡＬ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＭＧ１遺伝子の短縮型ＯＲＦ（ＨＭＧ１のヌクレオチド位置１５８６〜３３２３）（ｔＨＭＧＲ）が含まれている）を、ＴＯＰＯ  ＺＥＲＯ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターに挿入することによって作製した。ベクターｐＡＭ４６７は、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−７２３〜７０１（これには、ヌクレオチド位置−７２３〜位置−２２４に伸び、そして塩基−２２４と塩基−２２３との間に天然のものではない内部ＸｍａＩ制限酵素部位を持つＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生型ＵＲＡ３遺伝子座の１つのセグメントが含まれる）を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって作製した。ＤＮＡ断片ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲおよびＵＲＡ３−７２３〜７０１を、表２に概説したように、ＰＣＲ増幅によって作製した。図２Ｂは、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ挿入断片のマップを示し、そして配列番号６は、このＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。ｐＡＭ４９１の構築のために、４００ｎｇのｐＡＭ４７２と１００ｎｇのｐＡＭ４６７を、ＸｍａＩ制限酵素を使用して完全に消化させ、そしてＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ挿入断片に対応するＤＮＡ断片と、直鎖状にしたｐＡＭ４６７ベクターとをゲル精製し、そして４モル等量の精製した挿入断片を、１モル等量の精製した直鎖状ベクターと連結させてｐＡＭ４９１を得た。
【０２１０】
【表２】
2011517410.tif 000024
【０２１１】
プラスミドｐＡＭ４９３を、ベクターｐＡＭ４７３のＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ挿入断片をベクターｐＡＭ４６８に挿入することによって作製した。ベクターｐＡＭ４７３は、ＤＮＡ断片ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ（これには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＩＤＩ１遺伝子のＯＲＦ（ＩＤＩ１のヌクレオチド位置１〜１０１７）（ＩＤＩ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの異なるＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターを含むゲノム遺伝子座（ＧＡＬ１のヌクレオチド位置−１〜−６６８）（ＰＧＡＬ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＭＧ１遺伝子の短縮型ＯＲＦ（ＨＭＧ１のヌクレオチド位置１５８６〜３３２３）（ｔＨＭＧＲ）が含まれる）を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターに挿入することによって作製した。ベクターｐＡＭ４６８は、ＤＮＡ断片ＡＤＥ−８２５〜６５３（これには、ヌクレオチド位置−２２５〜位置６５３に伸び、そして天然のものではない内部ＸｍａＩ制限酵素部位を塩基−２２６と塩基−２２５との間に持つ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの野生型ＡＤＥ１遺伝子座の１つのセグメントが含まれる）を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって作製した。ＤＮＡ断片ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲおよびＡＤＥ１−８２５〜６５３は、表３に概説したように、ＰＣＲ増幅によって作製した。図２Ｃは、ＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ挿入断片のマップを示し、そして配列番号７はＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。ｐＡＭ４９３の構築のために、４００ｎｇのｐＡＭ４７３と１００ｎｇのｐＡＭ４６８を、ＸｍａＩ制限酵素を使用して完全に消化させ、そしてＩＤＩ１−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲ挿入断片に対応するＤＮＡ断片と、直鎖状にしたｐＡＭ４６８ベクターとをゲル精製し、そして４モル等量の精製した挿入断片を１モル等量の精製した直鎖状ベクターと連結させて、ベクターｐＡＭ４９３を得た。
【０２１２】
【表３】
2011517410.tif 000025
【０２１３】
プラスミドｐＡＭ４９５は、ｐＡＭ４７４のＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２挿入断片をベクターｐＡＭ４６９に挿入することによって作製した。ベクターｐＡＭ４７４は、ＤＮＡ断片ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２（これには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１０遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ１０のヌクレオチド位置１〜１３４７）（ＥＲＧ１０）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの異なるＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーター（ＧＡＬ１のヌクレオチド位置−１〜−６６８）（ＰＧＡＬ）を含むゲノム遺伝子座、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１２遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ１２のヌクレオチド位置１〜１４８２）（ＥＲＧ１２）が含まれる）を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターに挿入することによって作製した。ベクターｐＡＭ４６９は、ＤＮＡ断片ＨＩＳ３−３２〜−１０００ＨＩＳＭＸ−ＨＩＳ３５０４〜−１１０３（これには、ヌクレオチド位置−３２〜位置−１０００、およびヌクレオチド位置５０４〜位置１１０３に伸びるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＩＳ遺伝子座の２つのセグメント、ＨＩＳＭＸマーカー、およびＨＩＳ３５０４〜−１１０３配列とＨＩＳＭＸマーカーとの間にある天然のものではないＸｍａＩ制限酵素部位が含まれる）を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって作製した。ＤＮＡ断片ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２とＨＩＳ３−３２〜−１０００−ＨＩＳＭＸ−ＨＩＳ３５０４〜−１１０３は、表４に概説するように、ＰＣＲ増幅によって作製した。図２Ｄは、ＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２挿入断片のマップを示し、そして配列番号８はこのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。ｐＡＭ４９５の構築のために、４００ｎｇのｐＡＭ４７４と１００ｎｇのｐＡＭ４６９とを、ＸｍａＩ制限酵素を使用して完全に消化させ、そしてＥＲＧ１０−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２挿入断片に対応するＤＮＡ断片と、直鎖状にしたｐＡＭ４６９ベクターとをゲル精製し、４モル等量の精製した挿入断片を１モル等量の精製した直鎖状ベクターと連結させて、ベクターｐＡＭ４９５を得た。
【０２１４】
【表４】
2011517410.tif 000026
【０２１５】
プラスミドｐＡＭ４９７は、ｐＡＭ４７５のＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９挿入断片をベクターｐＡＭ４７０に挿入することによって作製した。ベクターｐＡＭ４７５は、ＤＮＡ断片ＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９（これには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ８遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ８のヌクレオチド位置１〜１５１２）（ＥＲＧ８）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの異なるＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターを含むゲノム遺伝子座（ＧＡＬ１のヌクレオチド位置−１〜−６６８）（ＰＧＡＬ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１９遺伝子のＯＲＦ（ＥＲＧ１９のヌクレオチド位置１〜１３４１）（ＥＲＧ１９）が含まれる）を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターに挿入することによって作製した。ベクターｐＡＭ４７０は、ＤＮＡ断片ＬＥＵ２−１００〜４５０−ＨＩＳＭＸ−ＬＥＵ２１０９６〜１７７０（これには、ヌクレオチド位置−１００〜位置４５０、およびヌクレオチド位置１０９６〜位置１７７０に伸びるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＬＥＵ２遺伝子座の２つのセグメント、ＨＩＳＭＸマーカー、およびＬＥＵ２１０９６〜１７７０配列とＨＩＳＭＸマーカーとの間にある天然のものではないＸｍａＩ制限酵素部位が含まれる）を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することによって作製した。ＤＮＡ断片ＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９およびＬＥＵ２−１００〜４５０−ＨＩＳＭＸ−ＬＥＵ２１０９６〜１７７０は、表５に概説するように、ＰＣＲ増幅によって作製した。図２Ｅは、ＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９挿入断片のマップであり、配列番号９はこのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。ｐＡＭ４９７の構築のために、４００ｎｇのｐＡＭ４７５と１００ｎｇのｐＡＭ４７０とを、ＸｍａＩ制限酵素を使用して完全に消化させ、そしてＥＲＧ８−ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９挿入断片に対応するＤＮＡ断片と、直鎖状にしたｐＡＭ４７０ベクターとを精製し、そして４モル等量の精製した挿入断片を１モル等量の精製した直鎖状ベクターと連結させて、ベクターｐＡＭ４９７を得た。
【０２１６】
【表５】
2011517410.tif 000027
【０２１７】
（実施例２）
本実施例は、タンパク質コード配列に対して作動可能であるように連結されたガラクトース誘導性プロモーターを含む染色体外異種核酸の、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへの導入のための発現プラスミドを生成する方法を記載する。
【０２１８】
発現プラスミドｐＡＭ３５３は、β−ファルネセンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を、ｐＲＳ４２５−Ｇａｌ１ベクター（Ｍｕｍｂｅｒｇら（１９９４）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２（２５）：５７６７−５７６８）に挿入することによって作製した。このヌクレオチド配列挿入断片は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの中での発現のためにコドン最適化されたＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａのβ−ファルネセンシンターゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ８３５３９８）のコード配列（配列番号１０）を鋳型として使用して、合成によって作製した。合成によって作製したヌクレオチド配列には、５’ＢａｍＨＩ制限酵素部位を、そして３’ＸｈｏＩ制限酵素部位を隣接させ、そしてそれによって、これを、クローニングベクター（例えば、標準的なｐＵＣまたはｐＡＣＹＣを起源とするベクター）の適合する制限酵素部位にクローニングできるようにした。合成によって作製したヌクレオチド配列は、ＢａｍＨＩ制限酵素とＸｈｏＩ制限酵素とを使用して、ＤＮＡ合成構築物を完全に消化させることによって単離した。反応混合物をゲル電気泳動によって分解した。β−ファルネセンシンターゼコード配列を含むおよそ１．７ｋｂのＤＮＡ断片をゲル抽出し、そして単離したＤＮＡ断片を、ｐＲＳ４２５−Ｇａｌ１ベクターのＢａｍＨＩ  ＸｈｏＩ制限酵素部位中に連結させて、発現プラスミドｐＡＭ３５３を得た。
【０２１９】
発現プラスミドｐＡＭ４０４は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化されたＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａのβ−ファルネセンシンターゼをコードするヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ８３５３９８）を、ベクターｐＡＭ１７８（配列番号１１）に挿入することによって作製した。β−ファルネセンシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、プライマー５２−８４  ｐＡＭ３２６  ＢａｍＨＩ（配列番号１０８）と５２−８４  ｐＡＭ３２６  ＮｈｅＩ（配列番号１０９）とを使用して、ｐＡＭ３５３からＰＣＲ増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ制限酵素とＮｈｅＩ制限酵素とを使用して完全に消化させ、反応混合物をゲル電気泳動によって分解した。β−ファルネセンシンターゼのコード配列を含むおよそ１．７ｋｂのＤＮＡ断片をゲル抽出し、そして単離したＤＮＡ断片をベクターｐＡＭ１７８のＢａｍＨＩ  ＮｈｅＩ制限酵素部位に連結させて、発現プラスミドｐＡＭ４０４を得た（プラスミドマップについての図３を参照のこと）。
【０２２０】
（実施例３）
本実施例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｇａｌ７／１０／１染色体遺伝子座の標的化した破壊のためのベクターおよびＤＮＡ断片を生成するための方法を記載する。
【０２２１】
プラスミドｐＡＭ５８４を、ＤＮＡ断片ＧＡＬ７４〜１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７〜２５８７を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入することによって作製した。ＤＮＡ断片ＧＡＬ７４〜１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７〜２５８７には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ７遺伝子のＯＲＦの１つのセグメント（ＧＡＬ７のヌクレオチド位置４〜１０２１）（ＧＡＬ７４〜１０２１）、ハイグロマイシン耐性カセット（ＨＰＨ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のセグメント（ＧＡＬ１のヌクレオチド位置１６３７〜２５８７）が含まれる。ＤＮＡ断片を、表６に概説するように、ＰＣＲ増幅によって作製した。図４Ａは、ＤＮＡ断片ＧＡＬ７４〜１０２１−ＨＰＨ−ＧＡＬ１１６３７〜２５８７のマップを示し、そして配列番号１２は、このＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。
【０２２２】
【表６】
2011517410.tif 000028
【０２２３】
プラスミドｐＡＭ６１０は、ＤＮＡ断片ＧＡＬ７１２５〜５９８−ＨＰＨ−ＧＡＬ１４〜５４９−ＧＡＬ４−ＧＡＬ１１５８５〜２０８８を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入することによって作製した。ＤＮＡ断片ＧＡＬ７１２５〜５９８−ＨＰＨ−ＧＡＬ１４〜−５４９−ＧＡＬ４−ＧＡＬ１１５８５〜２０８８には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ７遺伝子のＯＲＦの１つのセグメント（ＧＡＬ７のヌクレオチド位置１２５〜５９８）（ＧＡＬ７１２５〜５９８）、ハイグロマイシン耐性カセット（ＨＰＨ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ１遺伝子の５’ＵＴＲの１つのセグメント（ＧＡＬ１のヌクレオチド位置４〜−５４９）（ＧＡＬ１４〜−５４９）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ４遺伝子のＯＲＦ（ＧＡＬ４）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  のＧＡＬ１遺伝子の３’ＵＴＲの１つのセグメント（ＧＡＬ１１５８５〜２０８８）が含まれる。このＤＮＡ断片は、表７に概説するように、ＰＣＲ増幅によって作製した。図４Ｂは、ＤＮＡ断片ＧＡＬ７１２５〜５９８−ＨＰＨ−ＧＡＬ１４〜−５４９−ＧＡＬ４−ＧＡＬ１１５８５〜２０８８のマップを示し、そして配列番号１３は、このＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。
【０２２４】
【表７】
2011517410.tif 000029
【０２２５】
ＤＮＡ断片ＧＡＬ７１２６〜５９８−ＨＰＨ−ＰＧＡＬ４ＯＣ−ＧＡＬ４−ＧＡＬ１１５８５〜２０８８（これには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  のＧＡＬ７遺伝子のＯＲＦの１つのセグメント（ＧＡＬ７のヌクレオチド位置１２６〜５９８）（ＧＡＬ７１２６〜５９８）、ハイグロマイシン耐性カセット（ＨＰＨ）、その天然のプロモーターの「作動可能な恒常性」のバージョンの制御下にあるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ４遺伝子のＯＲＦ（Ｇｒｉｇｇｓ  ＆  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８（１９）：８５９７−８６０１）（ＰＧａｌ４ＯＣ−ＧＡＬ４）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧａｌ１遺伝子の３’ＵＴＲの１つのセグメント（ＧＡＬ１のヌクレオチド位置１５８５〜２０８８）（ＧＡＬ１１５８５〜２０８８）が含まれる）は、表８に概説するように、ＰＣＲ増幅によって作製した。図４Ｃは、ＤＮＡ断片ＧＡＬ７１２６〜５９８−ＨＰＨ−ＰＧＡＬ４ＯＣ−ＧＡＬ４−ＧＡＬ１１５８５〜２０８８のマップを示し、そして配列番号１４は、このＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。
【０２２６】
【表８】
2011517410.tif 000030
【０２２７】
（実施例４）
本実施例は、ラクターゼおよびラクトーストランスポーターをコードする核酸の、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの特定の染色体位置への標的化された組み込みのためのＤＮＡ断片を作製する方法を記載する。
【０２２８】
ＤＮＡ断片５’遺伝子座−ＮａｔＲ−ＬＡＣ１２−ＰＴＤＨ１−ＰＰＧＫ１−ＬＡＣ４−３’遺伝子座（これには、ＥＲＧ９遺伝子の５’ＵＴＲの１つのセグメント（３’遺伝子座）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉのノーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性選択マーカー遺伝子（ＮａｔＲ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＤＨ１遺伝子のプロモーター（ＰＴＤＨ１）に作動可能であるように連結されたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのＬＡＣ１２遺伝子のＯＲＦ（Ｘ０６９９７  ＲＥＧＩＯＮ：１６１６．．３３７９）（ＬＡＣ１２）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＧＫ１プロモーターのプロモーター（ＰＰＧＫ１）に作動可能であるように連結されたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのＬＡＣ４遺伝子のＯＲＦ（Ｍ８４４１０  ＲＥＧＩＯＮ：４３．．３３８２）（ＬＡＣ４）、およびプラスミドｐＡＭ６２５のＭＥＴ３プロモーター領域（５’遺伝子座）が含まれる）を、表９に概説するようにＰＣＲ増幅によって作製した。図５は、ＤＮＡ断片５’遺伝子座−ＮａｔＲ−ＬＡＣ１２−ＰＴＤＨ１−ＰＰＧＫ１−ＬＡＣ４−３’遺伝子座のマップを示し、そして配列番号１５は、このＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。
【０２２９】
【表９】
2011517410.tif 000031
【０２３０】
（実施例５）
本実施例は、本発明に有用なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の作製を記載する。
【０２３１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ（Ｙ００２）（ＭＡＴＡ；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−２８９；ｌｅｕ２−３，１１２；ｈｉｓ３Δ１；ＭＡＬ２−８Ｃ；ＳＵＣ２）およびＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ（Ｙ００３）（ＭＡＴアルファ；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−２８９；Ｌｅｕ２−３，１１２；ｈｉｓ３Δ１；ＭＡＬ２−８Ｃ；ＳＵＣ２）（ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎら（２０００）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２６（９−１０）：７０６−７１４）は、ＥＲＧ９プロモーターをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＴ３プロモーターに置き換え、そしてＡＤＥ１  ＯＲＦをＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａのＬＥＵ２遺伝子（ＣｇＬＥＵＴ）に置き換えることによって、誘導性ＭＥＶ経路の遺伝子の導入のために調製した。これは、ベクターｐＡＭ３２８（配列番号１６）のＫａｎＭＸ−ＰＭＥＴ３領域を、プライマー５０−５６−ｐｗ１００−Ｇ（配列番号２８）と５０−５６−ｐｗ１０１−Ｇ（配列番号２９）（これには、天然のＥＲＧ９プロモーターと相同である４５塩基対が含まれる）とを使用してＰＣＲ増幅させること、１０ｕｇの得られるＰＣＲ産物を、指数増殖期にあるＹ００２細胞およびＹ００３細胞に、４０％ｗ／ｗのポリエチレングリコール３３５０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１００ｍＭの酢酸リチウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、および１０ｕｇのサケの精子ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して形質転換すること、そしてこれらの細胞を３０℃で３０分間インキュベートし、それに続いて、４２℃で３０分間これらに熱ショックをかけること（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ  ａｎｄ  Ｇｉｅｔｚ．（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６，３３９−３４６）によって行った。ポジティブな組み換え体を、０．５ｕｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む富化培地上で増殖するそれらの能力によって同定し、そして選択したコロニーを診断用ＰＣＲによって確認した。得られたクローンをＹ９３（ＭＡＴ  Ａ）およびＹ９４（ＭＡＴアルファ）と命名した。次いで、３．５ｋｂのＣｇＬＥＵ２ゲノム遺伝子座を、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から、プライマー６１−６７−ＣＰＫ０６６−Ｇ（配列番号７８）と６１−６７−ＣＰＫ０６７−Ｇ（配列番号７９）（これには、ＡＤＥ１  ＯＲＦと相同である隣接している５０塩基対が含まれる）とを使用して増幅させ、１０ｕｇの得られたＰＣＲ産物を、指数増殖期にあるＹ９３細胞およびＹ９４細胞に形質転換し、ポジティブな組み換え体を、ロイシンが補充されていない条件下での増殖について選択し、そして選択したクローンを診断用ＰＣＲによって確認した。得られたクローンをＹ１７６（ＭＡＴ  Ａ）およびＹ１７７（ＭＡＴアルファ）と命名した。
【０２３２】
次いで、株Ｙ１８８を、２ｕｇのｐＡＭ４９１プラスミドＤＮＡおよびｐＡＭ４９５プラスミドＤＮＡを、ＰｍｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して完全に消化させ、そして精製したＤＮＡ挿入断片を指数増殖期にあるＹ１７６細胞に導入することによって作製した。ポジティブな組み換え体を、ウラシルとヒスチジンを含まない培地上での増殖によって選択し、そして正確なゲノム遺伝子座への組み込みを診断用ＰＣＲによって確認した。
【０２３３】
株Ｙ１８９を、次に、２ｕｇのｐＡＭ４８９プラスミドＤＮＡおよびｐＡＭ４９７プラスミドＤＮＡを、ＰｍｅＩ制限酵素を使用して完全に消化させ、そして精製したＤＮＡ挿入断片を指数増殖期にあるＹ１７７細胞に導入することによって作製した。ポジティブな組み換え体を、トリプトファンとヒスチジンを含まない培地上での増殖について選択し、そして正確なゲノム遺伝子座への組み込みを診断用ＰＣＲによって確認した。
【０２３４】
株Ｙ１８８および株Ｙ１８９に由来するおよそ１×１０７個の細胞を、ＹＰＤ培地プレート上で室温で６時間混合して、接合させた。混合した細胞培養物を、ヒスチジン、ウラシル、およびトリプトファンを含まない培地にプレートして、二倍体細胞の増殖について選択した。株Ｙ２３８は、２ｕｇのｐＡＭ４９３プラスミドＤＮＡ（ＰｍｅＩ制限酵素を使用して完全に消化させた）を使用して二倍体細胞を形質転換し、そして精製したＤＮＡ挿入断片を指数増殖期にある二倍体細胞に導入することによって作製した。ポジティブな組み換え体を、アデニンを含まない培地上での増殖について選択し、そして正確なゲノム遺伝子座への組み込みを診断用ＰＣＲによって確認した。
【０２３５】
一倍体株Ｙ２１１（ＭＡＴアルファ）は、株Ｙ２３８を２％の酢酸カリウムおよび０．０２％のラフィノース液体培地中で胞子形成させること、Ｓｉｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＭＳＭ３００シリーズのマイクロマニピュレーター（Ｓｉｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＬＴＤ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＵＫ）を使用して、およそ２００の遺伝子のテトラッド（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｅｔｒａｄ）を単離すること、アデニン、ヒスチジン、ウラシル、およびトリプトファンを含まない条件下で増殖するそれらの能力によって導入された遺伝子材料の適切な相補鎖を含む個々の遺伝的単離物を同定すること、そして診断用ＰＣＲによって全ての導入されたＤＮＡの組み込みを確認することによって作製した。
【０２３６】
株Ｙ３８１は、株Ｙ２１１から、遺伝子操作されたＭＥＴ３プロモーターとＥＲＧ９コード配列の開始位置との間にある天然のＥＲＧ９遺伝子座の６９ヌクレオチドを除去し、それによってＥＲＧ９の発現をさらにメチオニンで抑制できるようにすること、そしてこの部位にあるＫａｎＭＸマーカーを別の選択マーカーに置き換えることによって作製した。この目的のために、指数増殖期にあるＹ２１１細胞を、１００ｕｇのＤＮＡ断片ＥＲＧ９−１〜−８００−ＤｓｄＡ−ＰＭＥＴ３−ＥＲＧ９１〜８１１で形質転換した。ＤＮＡ断片ＥＲＧ９−１〜−８００−ＤｓｄＡ−ＰＭＥＴ３−ＥＲＧ９１〜８１１（配列番号１７）には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ９遺伝子の５’ＵＴＲの１つのセグメント（ＥＲＧ９のヌクレオチド位置−１〜−８００）（ＥＲＧ９−１〜−８００）、ＤｓｄＡ選択マーカー（ＤｓｄＡ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＥＴ３遺伝子のプロモーター領域（ＭＥＴ３のヌクレオチド位置−２〜−６８７）（ＰＭＥＴ３）、およびＥＲＧ９遺伝子のＯＲＦの１つのセグメント（ＥＲＧ９のヌクレオチド位置１〜８１１）（ＥＲＧ９１〜８１１）が含まれる。ＤＮＡ断片は、表１０に概説するように、ＰＣＲ増幅によって作製した。宿主細胞の形質転換体を、２％のグルコースとＤ−セリンとを含む合成規定培地上で選択し、そして正確なゲノム遺伝子座への組み込みを診断用ＰＣＲによって確認した。
【０２３７】
【表１０】
2011517410.tif 000032
【０２３８】
株Ｙ４３５は、株Ｙ３８１から、この株をガラクトースを異化できないように、グルコースの存在下で高レベルのＧＡＬ４ｐを発現できるように（すなわち、グルコースの存在下でガラクトース誘導性プロモーターの発現オフをさらに効率よく駆動できるように、さらには、細胞中の全てのガラクトース誘導性プロモーターからの発現を駆動するために十分なＧａｌ４ｐ転写因子が確実に存在するように）、そしてガラクトースの存在下でβ−ファルネセンシンターゼを生産できるようにすることによって作製した。この目的のために、指数増殖期にあるＹ３８１細胞を、最初に、８５０ｎｇのゲル精製したＤＮＡ断片ＧＡＬ７１２６〜５９８−ＨＰＨ−ＰＧＡＬ４ＯＣ−ＧＡＬ４−ＧＡＬ１１５８５〜２０８８で形質転換した。宿主細胞の形質転換体を、２００ｕｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤ寒天上で選択し、単一コロニーを採取し、正確なゲノム遺伝子座への組み込みを診断用ＰＣＲによって確認した。ポジティブコロニーを、２００ｕｇ／ｕＬのハイグロマイシンＢを含むＹＰＤ寒天上に再び画線して、ストック調製物用の単一コロニーを得た。１つのそのようなポジティブな形質転換体株を、その後、発現プラスミドｐＡＭ４０４で形質転換して、株Ｙ４３５を得た。宿主細胞の形質転換体を、２％のグルコースと、ロイシンおよびメチオニンを除く全てのアミノ酸を含む合成規定培地（ＳＭ−ｌｅｕ−ｍｅｔ）上で選択した。単一コロニーを、５ｍＬの液体ＳＭ−ｌｅｕ−ｍｅｔを含む培養バイアルに移し、そして培養物を、増殖が静止期に達するまで３０℃で振盪させることによってインキュベートした。細胞を−８０℃で、凍結用バイアルの中で、４００ｕＬの５０％の滅菌グリセロールおよび６００ｕＬの液体培地で１ｍＬにした凍結アリコートで保存した。
【０２３９】
株Ｙ５９６は、株Ｙ４３５から、ラクターゼおよびラクトーストランスポーターを生産できる株にすることによって作製した。この目的のために、指数増殖期にあるＹ４３５細胞を、４ｕｇのゲル精製したＤＮＡ断片５’遺伝子座−ＮａｔＲ−ＬＡＣ１２−ＰＴＤＨ１−ＰＰＧＫ１−ＬＡＣ４−３’遺伝子座で形質転換した。ポジティブな組み換え体を、２００ｕｇのノーセオスリシンを含むＹＰＤ培地上での増殖について選択し、そして正確なゲノム遺伝子座への組み込みを診断用ＰＣＲによって確認した。単一コロニーを５ｍＬの液体ＹＰＤを含む培養バイアルに移し、そして培養物を、増殖が静止期に達するまで３０℃で振盪させることによってインキュベートした。細胞を、４００ｕＬの５０％の滅菌グリセロールと６００ｕＬの液体培養物で１ｍＬにした凍結アリコートで、凍結用バイアルの中で−８０℃で保存した。
【０２４０】
（実施例６）
本実施例は、ラクトースの存在下で増殖させたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主株におけるβ−ファルネセンの生産を記載する。
【０２４１】
宿主株Ｙ４３５およびＹ５９６の種培養物は、２５ｍＬのＢｉｒｄ’ｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ培地を含む１２５ｍＬのフラスコにストックアリコートを添加し、そして培養物を一晩増殖させることによって確立させた。それぞれの種培養物を使用して、２％のグルコースと、５．０ｇ／Ｌのガラクトース、または９．６ｇ／Ｌ、６．０ｇ／Ｌ、もしくは２．４ｇ／Ｌのラクトースのいずれかを含む４０ｍＬのＢｉｒｄ’ｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ培地を含む２つの２０ｍＬのバッフル付き三角フラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ  ｆｌａｓｋｓ）のそれぞれに、およそ０．０５の最初のＯＤ６００で接種した。これらの培養物に８ｍＬのオレイン酸メチルを重層し（ｏｖｅｒｌａｉｎ）、そして回転式振盪装置上で２００ｒｐｍ、３０℃でインキュベートした。２ｕＬ〜１０ｕＬの有機物の重層（ｏｒｇａｎｉｃ  ｏｖｅｒｌａｙ）を、内部標準物としてのベータ−カリオフィレンまたはトランス−カリオフィレンをスパイクした（ｓｐｉｋｅｄ）５００ｕＬの酢酸エチルを含む清潔な硝子製のバイアルに移すことによって、３連の試料を２４時間ごとに７２時間まで採取した。
【０２４２】
酢酸エチル試料を、水素炎イオン化型検出器が備えられているＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎガスクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上で分析した。それぞれの試料の１μＬのアリコート中の化合物を、ＤＢ−ＩＭＳカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ヘリウムキャリアガス、および以下の温度プログラムを使用して分離させた：２００℃で１分間保つ、１０℃／分で２３０℃の温度まで温度を上昇させる、４０℃／分で３００℃の温度まで温度を上昇させる、そして３００℃で１分間保つ。このプロトコールを使用して、β−ファルネセンが、およそ２分間の保持時間があることがこれまでに示されている。ファルネセンの力価を、トランス−カリオフィレンをスパイクした酢酸エチル中での精製されたβ−ファルネセン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の定量的検量線に対して、生じたピーク面積を比較することによって計算した。
【０２４３】
ラクトースを、屈折率検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用してＡｇｉｌｅｎｔ  １２００高速液体クロマトグラフィーで分析した。試料は、明澄化させた発酵培養液の５００μＬのアリコートを取り出し、そしてこれを等しい容量の３０ｍＭの硫酸で希釈することによって調製した。それぞれの試料中の１０μＬのアリコート中の化合物を、１５ｍＭの硫酸を０．６ｍＬ／分の流速で移動相として用いて、Ｗａｔｅｒｓ  ＩＣ−Ｐａｋを使用して分離させた。ラクトースのレベルは、真の化合物の定量的検量線に対して生じたピーク面積を比較することによって測定した。
【０２４４】
図６Ａに示すように、培養物の増殖は、培養培地にガラクトースが含まれているか、またはラクトースが含まれているかとは関係なく、２つの株のそれぞれについて類似していた。図６Ｂに示すように、株Ｙ５９６はガラクトースの存在下でも、またラクトースの存在下でも、０．６ｇ／Ｌより多くのβ−ファルネセンを生産し、一方、対照である株Ｙ４３５は誘導物質であるガラクトースの存在下でのみβ−ファルネセンを生産したが、ラクトースの存在下ではβ−ファルネセンを生産しなかった。図６Ｃに示すように、株Ｙ５９６によるβ−ファルネセンの生産を誘導するためには、２．４ｇ／Ｌより多くのラクトースは必要なかった。
【０２４５】
本発明は、限られた数の実施形態について記載されているが、１つの実施形態の特別な特徴は、本発明の他の実施形態に帰属させられるべきではない。１つの実施形態は、請求される本発明の事項の全ての態様の代表例ではない。いくつかの実施形態においては、複数の組成物または複数の方法には、本明細書中で言及される多数の化合物または工程が含まれ得る。他の実施形態においては、これらの組成物またはこれらの方法には、本明細書中には列挙されていない任意の化合物もしくは工程は含まれないか、または実質的に含まれない。記載される実施形態からの変更および改変も存在する。本明細書中に開示されるジェット燃料組成物の用途がジェットエンジンに限定されないことに留意されなければならず、これらは、ジェット燃料を必要とする任意の機器において使用され得る。大部分のジェット燃料についての詳細が記載されているが、本明細書中で開示された全てのジェット燃料の組成が、明細書中の全ての要件を満たすために必要であるというわけではない。本明細書中に開示されるジェット燃料組成物を生成し、そして使用するための方法が、多数の工程に関して記載されることに留意されたい。これらの工程は、任意の順序で行うことができる。１つまたは複数の工程は省略されるか、または組み合わせられる場合があるが、それでもなお、実質的に同じ結果に達する。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような変更や改変が本発明の範囲に含まれるように意図される。
【０２４６】
本明細書中に記載された全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、引用によって組み入れられることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度で、引用により本明細書中に組み入れられる。上記本発明は、理解の明確化のために説明および実施例によって幾分詳細に記載されいるが、特定の変更および改変を添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく本発明に対して行うことができることは、本発明の教示を参照すれば当業者に容易に明らかであろう。
【図１】
2011517410.tif 000033
【図２−１】
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【図２−２】
2011517410.tif 000035
【図３】
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【図４】
2011517410.tif 000037
【図５】
2011517410.tif 000038
【図６−１】
2011517410.tif 000039
【図６−２】
2011517410.tif 000040
【図６−３】
2011517410.tif 000041
【配列表】
2011517410000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月27日(2010.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011517410000001.app
【国際調査報告】
2011517410.tif 000071
2011517410.tif 000072
2011517410.tif 000073