(57)【要約】  本発明は、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ及び該グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを使用する方法に関する。
2011501673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株及びグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを産生するヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株からなる群から選択される細胞株。
【請求項２】
哺乳動物のグリコシル化されたＮＧＡＬがイヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、非ヒト霊長類及びヒトからなる群から選択される、請求項１に記載のＣＨＯ細胞株又はＨＥＫ細胞株。
【請求項３】
前記グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬが野生型ヒトＮＧＡＬである、請求項１又は２に記載のＣＨＯ細胞株又はＨＥＫ細胞株。
【請求項４】
前記野生型ヒトＮＧＡＬが配列番号１又は１２のアミノ酸配列を含む、請求項１から３の何れかに記載のＣＨＯ細胞株又はＨＥＫ細胞株。
【請求項５】
前記ＣＨＯ細胞株がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２０である、請求項１に記載のＣＨＯ細胞株又はＨＥＫ細胞株。
【請求項６】
前記グリコシル化された野生型ヒトＮＧＡＬが約２５ｋＤａの分子量を含む、請求項３に記載のＣＨＯ細胞株又はＨＥＫ細胞株。
【請求項７】
野生型哺乳動物ＮＧＡＬのアミノ酸配列と比べたときに、前記グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬが、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＣＨＯ細胞株又はＨＥＫ細胞株。
【請求項８】
前記グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬがヒトＮＧＡＬであり、及び、さらに、前記ヒトＮＧＡＬが配列番号１又は１２に記載の野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸配列のアミノ酸８７に対応するアミノ酸にアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載のＣＨＯ細胞株又はＨＥＫ細胞株。
【請求項９】
前記アミノ酸置換がセリンによるシステインの置換を含む、請求項８に記載のＣＨＯ細胞株又はＨＥＫ細胞株。
【請求項１０】
前記グリコシル化されたヒトＮＧＡＬが配列番号２又は１０のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＣＨＯ細胞株又はＨＥＫ細胞株。
【請求項１１】
前記ＣＨＯ細胞株がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８１６８である、請求項９に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項１２】
（ａ）グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬが生産されるような条件下で、哺乳動物ＮＧＡＬをコードする遺伝子で細胞株を形質移入する段階；及び
（ｂ）前記細胞株によって生産された前記グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを回収する段階；
を含む、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを生産する方法。
【請求項１３】
グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬが、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、非ヒト霊長類及びヒトからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬがヒトＮＧＡＬである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞株がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む、請求項１２から１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
段階（ａ）において、増幅遺伝子で細胞株を形質移入すること、増幅された細胞に関して選択を実施すること、及び、次いで、段階（ｂ）を実施することをさらに含む、請求項１２から１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
増幅遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素又はグルタミン合成酵素をコードし、及び選択がメトトレキサート又はグルタミンを用いて行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記グリコシル化されたヒトＮＧＡＬが野生型ヒトＮＧＡＬを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記野生型ヒトＮＧＡＬが配列番号１又は１２のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記グリコシル化されたヒトＮＧＡＬが約２５ｋＤａの分子量を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
野生型哺乳動物ＮＧＡＬのアミノ酸配列と比べて、前記グリコシル化されたヒトＮＧＡＬが１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記グリコシル化されたヒトＮＧＡＬが野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸配列のアミノ酸８７に対応するアミノ酸にアミノ酸置換を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記アミノ酸置換がセリンによるシステインの置換を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記グリコシル化されたヒトＮＧＡＬが配列番号２又は１０のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヒトＮＧＡＬが配列番号１、配列番号１２、配列番号２及び配列番号１０からなる群から選択される配列を含む、請求項１２に記載の方法によって生産されたグリコシル化されたヒトＮＧＡＬ。
【請求項２６】
配列番号２又は１０の配列を含む単離された変異体グリコシル化されたヒトＮＧＡＬ。
【請求項２７】
検査試料中の哺乳動物ＮＧＡＬを検出するためのアッセイにおいて使用するための検量用物質又は対照であり、該検量用物質又は対照は、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを含む。
【請求項２８】
哺乳動物ＮＧＡＬがイヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、非ヒト霊長類及びヒトである、請求項２７に記載の検量用物質又は対照。
【請求項２９】
哺乳動物ＮＧＡＬが配列番号２、配列番号１０、配列番号１及び配列番号１２からなる群から選択される配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬである、請求項２７又は２８に記載の検量用物質又は対照。
【請求項３０】
方法が自動化されたシステム又は半自動化されたシステムにおける使用のために改変されている、請求項２７から２９の何れかに記載の検量用物質又は対照。
【請求項３１】
配列番号１又は１２に記載されている野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸配列のアミノ酸８７に対応するアミノ酸におけるセリンによるシステインの置換を含むアミノ酸置換をヒトＮＧＡＬ中に導入することを含む、検量用物質、対照又はその他の試料中におけるヒトＮＧＡＬの少なくとも１つの二量体の形成を抑制又は除去する方法。
【請求項３２】
二量体がホモ二量体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
二量体がヘテロ二量体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
配列番号４又は１１の配列を含む単離された及び精製されたヒトＮＧＡＬポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の情報
本願は、全て２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７０号、６０／９８１，４７１号及び６０／９８１，４７３号並びに全て２００８年４月１６日に出願された米国非仮特許出願１２／１０４，４０８号、１２／１０４，４１０号及び１２／１０４，４１３号の優先権を主張し、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ及びグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リポカリンは、細菌からヒトまで様々な生物中に見出される細胞外リガンド結合タンパク質のファミリーである。リポカリンは、小さな疎水性分子の結合及び輸送、栄養素の輸送、細胞増殖の制御並びに免疫応答の調節、炎症及びプロスタグランジン合成など、多くの異なる機能を有している。さらに、幾つかのリポカリンは、細胞制御プロセスにも関与しており、様々な病状における診断及び予後のマーカーとしての役割を果たす。例えば、α糖タンパク質の血漿レベルは、妊娠中に、並びに癌化学療法、腎機能不全、心筋梗塞、関節炎及び多発性硬化症などの症状の診断及び予後においてモニターされる。
【０００４】
１９９３年に、ヒト好中球由来の新規リポカリン好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（又はＮＧＡＬ、リポカリン−２若しくはＬＣＮ２としても知られる。）が同定された。ＮＧＡＬは、単量体並びにホモ及びヘテロ二量体形態で存在する２５ｋＤａのリポカリンであり、後者は、ヒト好中球ゼラチナーゼとの４６ｋＤａ二量体として存在する。ＮＧＡＬの三量体形態も同定されている。ＮＧＡＬは、活性化されたヒト好中球の特異的顆粒から分泌される。相同的なタンパク質が、マウス（２４ｐ３／ウテロカリン）及びラット（α（２）−ミクログロブリン関連タンパク質／ν関連リポカリン）中に同定されている。構造的データは、８本鎖のβバレルを有するＮＧＡＬの典型的なリポカイン折り畳みを確認したが、リポカリン中に通常見られるより極性が高く、正に帯電したアミノ酸残基とともに整列された異常に大きな空洞を有している。２５ｋＤａＮＧＡＬタンパク質は、細菌由来のリポ多糖及びホルミルペプチドなどの小さな親油性物質を結合すると考えられており、炎症の調節物質として機能し得る。
【０００５】
急性腎不全又は慢性腎不全などの腎臓の傷害又は病気は、（病気、傷害などの）様々な異なる原因に由来し得る。腎臓の傷害及び病気の早期同定及び治療は、疾病の進行を妨げる上で有用である。現在、腎機能のバイオマーカーとして、血清クレアチニンがしばしば使用されている。しかしながら、血清クレアチニンの測定は、筋肉質量、性別、人種及び服薬によって影響を受ける。残念なことに、これらの制約のために、しばしば、著しい損傷が既に生じた後でなければ、腎臓病の診断が得られない。
【０００６】
ＮＧＡＬは、急性腎臓傷害又は腎臓病に対する初期マーカーである。活性化されたヒト好中球の特異的な顆粒によって産生される他に、ＮＧＡＬは、尿細管上皮の損傷に応答して、ネフロンによっても産生され、尿細管間質性（ＴＩ）傷害のマーカーである。ＮＧＡＬレベルは、正常な血清クレアチニンレベルと比べて、穏やかな「無症候性」腎虚血の後でさえ、虚血又は腎毒性由来の急性尿細管壊死（ＡＴＮ）において上昇する。さらに、ＮＧＡＬは、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の場合に、腎臓によって発現されることが知られている。上昇した尿のＮＧＡＬレベルは、進行性の腎不全として示唆されている。ＮＧＡＬは動物及びヒトの両モデルにおいて、虚血性又は腎毒性傷害後の極めて早期に、腎臓尿細管によって顕著に発現されることが以前に示されている。ＮＧＡＬは、尿中に素早く分泌され（ＮＧＡＬは、尿中において、容易に検出及び測定できる。）、虚血性傷害の他のあらゆる公知の尿又は血清マーカーの出現に先行する。このタンパク質はプロテアーゼ耐性であり、ＮＧＡＬの尿細管発現の忠実なマーカーとして尿中に回収できることを示唆する。さらに、例えば、血液からろ過される腎臓の外側に由来するＮＧＡＬは、尿中に出現せず、むしろ、近位尿細管によって定量的に吸収される。
【０００７】
ＮＧＡＬを検出するための様々なイムノアッセイが本分野において公知である。本明細書に前述されているように、ＮＧＡＬは、単量体として、二量体（ホモ二量体又はヘテロ二量体）として、及び三量体としてさえ見出される。従って、検査試料中のＮＧＡＬ単量体、二量体又は三量体を特異的に検出及び識別することができる新規抗体及びイムノアッセイに対する要望が本分野において存在する。さらに、検査試料中に含有される二量体に対する単量体の相対的割合を定量することができるイムノアッセイに対する要望も本分野において存在する。このような新規抗体及びイムノアッセイは、とりわけ、患者中のあらゆる腎傷害又は腎臓病の程度を評価し、腎傷害又は腎臓病に罹患している患者の腎臓の状態をモニターし、又は患者中の何れかの腎傷害の程度を評価し、その後、患者の腎臓の状態をモニターするために使用することができる。もちろん、例えば、検量用物質／対照として及び／又は目的の抗体を作製するための免疫原として使用することができる適切なポリペプチドが、このようなイムノアッセイのために必要である。本発明のさらなる目的及び利点が、本明細書に提供されている記載から明らかとなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一実施形態において、本発明は、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に関する。具体的には、哺乳動物のグリコシル化されたＮＧＡＬは、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、非ヒト霊長類及びヒトからなる群から選択される。グリコシル化されたＮＧＡＬがヒトＮＧＡＬである場合、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは野生型ヒトＮＧＡＬである。さらに、グリコシル化された野生型ヒトＮＧＡＬは、約２５ｋＤａの分子量を有する。グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬが野生型ＮＧＡＬである場合、野生型ＮＧＡＬは、配列番号１又は１２のアミノ酸配列を含む。グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを産生するＣＨＯ細胞株の例は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２０を有するＣＨＯ細胞株である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載されているＣＨＯ細胞株において、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型哺乳動物ＮＧＡＬのアミノ酸配列と比べて、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むアミノ酸配列を含む。具体的には、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、ヒトＮＧＡＬであり、さらに、ヒトＮＧＡＬは、配列番号１又は１２に記載されている野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸配列のアミノ酸８７に対応するアミノ酸にアミノ酸置換を含む。具体的には、アミノ酸置換置換は、セリンによるシステインの置換を含む。より具体的には、グリコシル化されたヒトＮＧＡＬは、配列番号２又は１０のアミノ酸配列を含む。野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸配列のアミノ酸８７に対応するアミノ酸においてアミノ酸置換を含むＣＨＯ細胞株の一例は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８１６８を有するＣＨＯ細胞株である。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを産生するヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株に関する。具体的には、哺乳動物のグリコシル化されたＮＧＡＬは、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、非ヒト霊長類及びヒトからなる群から選択される。グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型ヒトＮＧＡＬである。グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬが野生型ＮＧＡＬである場合、野生型ＮＧＡＬは配列番号１又は１２のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
本明細書に記載されているＨＥＫ細胞株において、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型哺乳動物ＮＧＡＬのアミノ酸配列と比べて、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むアミノ酸配列を含み得る。具体的には、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、ヒトＮＧＡＬであり、さらに、ヒトＮＧＡＬは、配列番号１又は１２に記載されている野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸配列のアミノ酸８７に対応するアミノ酸にアミノ酸置換を含む。具体的には、アミノ酸置換置換は、セリンによるシステインの置換を含む。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを生産する方法に関する。該方法は、
（ａ）グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬが生産されるような条件下で、哺乳動物ＮＧＡＬをコードする遺伝子を細胞株に形質移入する段階；及び
（ｂ）細胞株によって生産されたグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを回収する段階；
を含むことができる。
【００１３】
上記方法において、哺乳動物のグリコシル化されたＮＧＡＬは、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、非ヒト霊長類及びヒトからなる群から選択される。具体的には、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬはヒトＮＧＡＬである。
【００１４】
上記方法において、細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。あるいは、細胞株は、ヒト胎児腎臓細胞を含む。
【００１５】
上記方法は、段階（ａ）において、増幅遺伝子で細胞株を形質移入すること、増幅された細胞に関して選択を実施すること、及び、次いで、段階（ｂ）を実施することもさらに含む。増幅遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素又はグルタミン合成酵素をコードし、選択はメトトレキサート又はグルタミンを用いて行われる。
【００１６】
上記方法において、グリコシル化されたヒトグリコシル化されたヒトＮＧＡＬは、野生型ヒトＮＧＡＬを含む。具体的には、野生型ヒトＮＧＡＬは、配列番号１又は１２のアミノ酸配列を含む。さらに、グリコシル化された野生型ヒトＮＧＡＬは、約２５ｋＤａの分子量を有し得る。
【００１７】
上記方法において、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型哺乳動物ＮＧＡＬのアミノ酸配列と比べて、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むアミノ酸配列を含む。具体的には、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、ヒトＮＧＡＬであり、さらに、ヒトＮＧＡＬは、配列番号１又は１２に記載されている野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸配列のアミノ酸８７に対応するアミノ酸にアミノ酸置換を含む。具体的には、アミノ酸置換置換は、セリンによるシステインの置換を含む。より具体的には、グリコシル化されたヒトＮＧＡＬは、配列番号２又は１０のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、上記方法によって生産されたグリコシル化されたヒトＮＧＡＬ（該ヒトＮＧＡＬは、配列番号１又は１２の配列を含む。）に関する。
【００１９】
さらに別の実施形態において、本発明は、上記方法によって生産されたグリコシル化されたヒトＮＧＡＬ（該ヒトＮＧＡＬは、配列番号２又は１０の配列を含む。）に関する。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号２又は１０の配列を含む単離された変異体グリコシル化ヒトＮＧＡＬに関する。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明は、検査試料中の哺乳動物ＮＧＡＬを検出するためのアッセイにおいて使用するための検量用試料又は対照（該検量用試料又は対照は、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを含む。）に関する。検出されるべき哺乳動物ＮＧＡＬは、イヌ、ネコ、マウス、ウマ、非ヒト霊長類及びヒトである。さらに、哺乳動物ＮＧＡＬは、配列番号２又は１０の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬである。あるいは、哺乳動物ＮＧＡＬは、配列番号１又は１２の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬである。
【００２２】
さらに別の実施形態において、本発明は、検量用物質、対照又はその他の試料中におけるヒトＮＧＡＬの少なくとも１つの二量体の形成を抑制又は除去する方法に関する。該方法は、配列番号１又は１２に記載されている野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸配列のアミノ酸８７に対応するアミノ酸におけるセリンによるシステインの置換を含むアミノ酸置換をヒトＮＧＡＬ中に導入することを含む。上記方法において、二量体はホモ二量体である。あるいは、二量体はヘテロ二量体である。
【００２３】
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号４又は１１の配列を含む単離された及び精製されたヒトＮＧＡＬポリヌクレオチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ヒトＮＧＡＬ野生型抗原配列（配列番号１）を示している。固有のヒトＮＧＡＬシグナルペプチド残基は斜字体で記載され、下線が付されている。ｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３プラスミド中の野生型ヒトＮＧＡＬ配列は、太字で記載されている。Ｃ末端の６×Ｈｉｓタグには、下線が付されている。
【図２】図２は、実施例１に記載されている野生型ヒトＮＧＡＬ配列を含有するプラスミドｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３（ｐＪＶ−ＮＧＡＬ−ｈｉｓＡとしても知られる。）を示す。
【図３】図３は、実施例１に記載されている様々な形質移入されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）クローン（横軸）を用いたヒトＮＧＡＬ野生型抗原産生収量（縦軸）を示す。クローンは、以下のとおりであった。（Ａ）ＣＨＯクローン＃２０４、３．８ｍｇ／Ｌの収量を示した。（Ｂ）ＣＨＯクローン＃４６５、２０ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）によって増幅され、約４ｍｇ／Ｌの収量を示した。（Ｃ）ＣＨＯクローン＃９５０、１００ｎＭＭＴＸによって増幅され、約３２ｍｇ／Ｌの収量を示した。（Ｄ）ＣＨＯクローン＃１１３、ＭＴＸの５００ｎＭによって増幅され、約８８ｍｇ／Ｌの収量を示した。（Ｅ）ＣＨＯクローン＃６６２、５μＭＭＴＸによって増幅され、約１２９ｍｇ／Ｌの収量を示した。
【図４】図４は、実施例２に従って行われ、ＣＨＯクローン＃６６２から得られたヒトＮＧＡＬ野生型抗原が還元条件下（レーン４）で二量体から単量体へ転化されたことを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。レーン：（１）マーカー；（２）ＣＨＯクローン＃６６２から得られる組換えＮＧＡＬ、非還元及び非沸騰条件；（３）ＣＨＯクローン＃６６２から得られる組換えＮＧＡＬ、非還元及び沸騰条件；並びに（４）ＣＨＯクローン＃６６２から得られる組換えＮＧＡＬ、還元及び沸騰条件。
【図５】図５は、蛍光（縦軸）によって測定された、ヒトＮＧＡＬ野生型が鉄（ＩＩＩ）ジヒドロキシ安息香酸（Ｆｅ（ＤＨＢＡ）３）を結合する能力（横軸）によってヒトＮＧＡＬ野生型活性を特定するために使用された鉄結合アッセイの結果を示している。結果は、実施例２に従って生産されたＨＥＫ２９３から発現されたヒトＮＧＡＬが１．５μＭを超えるＦｅ（ＤＨＢＡ）３を結合できることを示している。
【図６】図６は、本明細書に記載されているように、ＨＥＫ細胞から精製された組換えヒトＮＧＡＬ抗原が市販の抗ヒトモノクローナル抗体：（Ａ）ＨＹＢ２１１−０１；（Ｂ）ＨＹＢ２１１−０２；及び（Ｃ）ＨＹＢ２１１−０５に結合できることを確認するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。レーン：（１）還元された組換えＮＧＡＬ（実施例参照、２μｇ）；（２）還元された組換えＮＧＡＬ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、２μｇ）；（３）還元されたヒトＨＮＬ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ；固有のＮＧＡＬ、２μｇ）；（４）非還元組換えＮＧＡＬ（実施例参照、２μｇ）；（５）非還元組換えＮＧＡＬ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、２μｇ）；（６）非還元ヒトＨＮＬ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ；固有のＮＧＡＬ、２μｇ）；（７）タンパク質マーカー。
【図７】図７は、ＰＮＧａｓｅ処理の７２時間後に採取され、ＣＨＯ細胞がＮ結合型グリカンを示すヒト野生型ＮＧＡＬを発現することを確認するＭＡＬＤＩＭＳスペクトルである。
【図８】図８は、Ｃ８７Ｓ変異を有するヒトＮＧＡＬを含有するプラスミドｐＪ−ＮＧＡＬ（Ｃ８７Ｓ）−ｈｉｓＡ（ｐＪＶ−ＮＧＡＬ（ｓｅｒ８７）−Ｈｉｓ−Ｔ３としても知られる。）を示す。
【図９】図９は、ヒトＮＧＡＬＣ８７Ｓ変異体抗原配列（配列番号２）を示している。固有のヒトＮＧＡＬシグナルペプチドは斜字体で記載され、下線が付されている。ｐＪＶ−ＮＧＡＬ（Ｓｅｒ８７）−Ｈｉｓ−Ｔ３プラスミド中の野生型ＮＧＡＬ配列は、太字で記載されており、ＮＧＡＬＣ８７Ｓ変異体コドン配列は、太字で記載され、下線が付されている。Ｃ末端の６×Ｈｉｓタグにも、下線が付されている。
【図１０】図１０は、Ｃ８７Ｓ変異体ＮＧＡＬ抗原を発現するＣＨＯ細胞に関して、ＮＧＡＬの約９５％超が単量体形態であり（還元剤の添加あり又はなし）、二量体ヒトＮＧＡＬは検出されなかったことを確認するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン：（１）マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；（２）ＮＧＡＬＣ８７Ｓ変異体、非還元条件；（３）ＮＧＡＬＣ８７Ｓ変異体、還元条件；（４）野生型ＮＧＡＬ、非還元条件；及び（５）野生型ＮＧＡＬ、還元条件。
【図１１】図１１は、野生型ヒトＮＧＡＬポリヌクレオチド配列（配列番号３）を示している。
【図１２】図１２は、変異体ヒトＮＧＡＬポリヌクレオチド配列（配列番号４）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
ある種のグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬタンパク質が発見された。単独で又はＮＧＡＬタンパク質に対して誘導された抗体と組み合わせたこれらのＮＧＡＬタンパク質は、例えば、診断アッセイの成分として、又はイムノアッセイキット中に存在して、又は改良されたイムノアッセイ中で抗体を作製するための免疫原として、様々な用途を有する。
【００２６】
Ａ．定義
本明細書に使用されているように、文脈上明確に反対の記述がなければ、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、複数表記が含まれる。本明細書での数的範囲の引用に関して、その間に介在する各数字は、同じ正確度で明示的に想定される。例えば、範囲６から９の場合、６及び９に加えて、数字７及び８が想定され、範囲６．０から７．０の場合、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明示的に想定される。
【００２７】
ａ）抗体
本明細書において使用される、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全又は部分的にヒト化）、動物抗体（一態様において、鳥（例えば、アヒル又はガチョウ））、別の態様において、サメ又はクジラ、さらに別の態様において、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）及びヒト以外の霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）を含む哺乳動物）、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合されたＦｖ（ｓｄＦｖ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）及び上記の何れかの機能的に活性なエピトープ結合断片を表す。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含有する分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、あらゆる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。単純化のために、分析物に対する抗体は、「抗分析物抗体」又は単に「分析物抗体」（例えば、ＮＧＡＬ抗体）の何れかとしばしば称される。
【００２８】
本明細書に記載されているポリペプチドに対して誘導された抗体及び前記ポリペプチドを用いてこのような抗体を作製する方法は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（これらに関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。さらに、例えば、イムノアッセイにおける及び／又は検量用物質、対照及び免疫診断剤としてのこのような抗体及び本発明のポリペプチドの使用は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号（これらに関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００２９】
ｂ）尿細管細胞傷害
本明細書において使用される「尿細管細胞傷害」という表現は、多数の疾病又は疾患のプロセスによって引き起こされ得る、突然の（急性）又は時間をかけてゆっくり低下する（慢性）腎若しくは腎臓不全又は機能障害を意味する。尿細管細胞傷害の急性及び慢性形態は何れも、生命を脅かす代謝異常をもたらし得る。
【００３０】
ｃ）急性腎臓病
「急性尿細管細胞傷害」は、急性虚血性腎傷害（ＩＲＩ）又は急性腎毒性腎傷害（ＮＲＩ）を意味する。ＩＲＩには、虚血傷害及び慢性虚血傷害、急性腎不全、急性糸球体腎炎及び急性尿細管間質性腎障害が含まれるが、これらに限定されない。ＮＲＩ毒性には、敗血症（感染）、ショック、外傷、腎臓結石、腎感染症、薬物毒性、毒（ｐｏｉｓｏｎ）又は毒物（ｔｏｘｉｎ）又は放射線造影色の注射後が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
ｄ）慢性腎臓病
本明細書において互換的に使用される「慢性尿細管細胞傷害」、「進行性腎臓病」、「慢性腎臓病（ＣＲＤ）」、「慢性腎臓病（ＣＫＤ）」という用語には、突然の現象ではなく、ある期間にわたって発生して、尿細管細胞機能の漸進的低下又は尿細管細胞傷害の悪化を引き起こすあらゆる腎臓症状又は機能障害が含まれる。慢性腎臓病が継続した場合の１つの終末点は、「慢性腎不全（ＣＲＦ）」である。例えば、本明細書において互換的に使用される慢性腎臓病又は慢性腎傷害には、慢性的な感染によって引き起こされる症状又は機能障害、慢性的炎症、糸球体腎炎、血管疾患、間質性腎炎、薬物、毒物、外傷、腎臓結石、長期の高血圧、糖尿病、うっ血性心不全、鎌形赤血球貧血症及び他の造血機能障害に由来する腎障害、肝炎、ＨＩＶ、パルボウイルス及びＢＫウイルス（ヒトポリオーマウイルス）に関連する腎障害、嚢胞性腎臓病、先天性奇形、閉塞、悪性腫瘍、原因不明の腎臓病、ループス腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、局所的糸球体硬化症、微小変化型疾患、クリオグロブリン血症、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）陽性血管炎、ＡＮＣＡ陰性血管炎、アミロイドーシス、多発性骨髄腫、軽鎖沈着症、腎臓移植の合併症、腎臓移植の慢性的拒絶、慢性同種移植腎障害及び免疫抑制剤の慢性効果が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、慢性腎臓病又は慢性腎傷害は、慢性腎不全又は慢性糸球体腎炎を表す。
【００３２】
ｅ）免疫診断試薬
「免疫診断試薬」は、本明細書に記載されているＮＧＡＬタンパク質の領域に特異的に結合する１つ又はそれ以上の抗体を含む。免疫診断剤は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号（免疫診断剤に関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００３３】
ｆ）ＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列
ＮＧＡＬは、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号ＧｅｎｐｅｐｔＣＡＡ５８１２７（配列番号１）、ＡＡＢ２６５２９、ＸＰ ８６２３２２、ＸＰ ５４８４４１、Ｐ８０１０８、Ｐ１１６７２、Ｘ８３００６．１、Ｘ９９１３３．１、ＣＡＡ６７５７４．１、ＢＣ０３３０８９．１、ＡＡＨ３３０８９．１、Ｓ７５２５６．１、ＡＤ１４１６８．１、ＪＣ２３３９、１ＤＦＶＡ、１ＤＦＶＢ、１Ｌ６ＭＡ、１Ｌ６ＭＢ、１Ｌ６ＭＣ、１ＮＧＬＡ、１ＱＱＳＡ、１Ｘ７１Ａ、１Ｘ７１Ｂ、１Ｘ７１Ｃ、１Ｘ８９Ａ、１Ｘ８９Ｂ、１Ｘ８９Ｃ、１Ｘ８ＵＡ、１Ｘ８ＵＢ及び１Ｘ８ＵＣとして記載されているものなど、あらゆるＮＧＡＬ配列であり得る。ＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド（例えば、ポリアミノ酸）配列は、天然に見出される配列に基づいて、天然に見出されるとおりであり、単離され、合成的、半合成的、組換え又はその他である。一実施形態において、ＮＧＡＬは、ヒトＮＧＡＬ（「ｈＮＧＡＬ」としても知られる。）である。別段の記載がなければ、ＮＧＡＬポリペプチド配列は、天然に典型的に見出される２０残基のアミノ酸シグナルペプチドを差し引いた（及び他のあらゆるシグナルペプチド配列を差し引いた）成熟ヒトＮＧＡＬ配列に従って付番される。シグナルペプチドが存在する場合、例えば、残基−１から−２０のように負の数字が付番され、コードポリヌクレオチド配列に対しては同じ付番が適用される。
【００３４】
同様に、ＮＧＡＬのＮ末端の開始Ｍｅｔ残基は、原核生物（例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））中で産生されたＮＧＡＬ又は合成（半合成を含む。）若しくは誘導された配列中のみに存在し、真核生物（例えば、ヒトを含む哺乳動物細胞及び酵母細胞）中で産生されるＮＧＡＬ中には存在しない。従って、存在する場合には、開始Ｍｅｔ残基は本明細書において負の数として（例えば、残基−１として）カウントされ、原核及び真核両バックグラウンド中でポリヌクレオチド配列が同じように複製及び転写され、差異は翻訳のレベルで存在するので、真核生物と比較して原核生物のバックグラウンド又は発現系中のポリヌクレオチド配列に対して類似の調整を行わなかった。
【００３５】
従って、本明細書の開示は、原核生物及び／又は真核生物バックグラウンド中に存在し及び／又は産生される（例えば、その結果、コドン認識に対する最適化を有する）異なる多数のＮＧＡＬポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を包含する。要するに、配列は、（ａ）シグナルペプチド、（ｂ）成熟ＮＧＡＬ配列中のＮ末端に存在する開始Ｍｅｔ残基、（ｃ）成熟ＮＧＡＬタンパク質に先行するシグナルペプチドの先頭に存在する開始Ｍｅｔ残基及び（ｄ）当業者に自明なものなどの他の変動を保有若しくはコードしてもよく、又は保有若しくはコードしなくてもよい。
【００３６】
典型的な配列には、本明細書中に記載されているもの、すなわち、配列番号１（シグナルペプチドを含むＮＧＡＬ野生型ポリペプチド）、配列番号２（シグナルペプチドを含むＮＧＡＬ変異体ポリペプチド）、配列番号１０（シグナルペプチドを一切含まず、並びに原核生物中で産生され及びＭｅｔ開始コドンが存在するときには、Ｍｅｔ開始残基が先行し得るが、Ｍｅｔ開始コドンが存在するか否かに関わらず、真核生物中で産生されたときにはＭｅｔ開始残基が存在しないＮＧＡＬ変異体ポリペプチド）、配列番号１２（シグナルペプチドを一切含まず、並びに原核生物中で産生され及びＭｅｔ開始コドンが存在するときには、Ｍｅｔ開始残基が先行し得るが、Ｍｅｔ開始コドンが存在するか否かに関わらず、真核生物中で産生されたときにはＭｅｔ開始残基が存在しないＮＧＡＬ野生型ポリペプチド）；配列番号３（シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＮＧＡＬ野生型ポリヌクレオチド配列）；配列番号４（シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＮＧＡＬ変異体ポリヌクレオチド）；配列番号１１（何れかのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないが、Ｍｅｔ開始コドン、例えば、ＡＴＧあり又はなしに、場合によってＮ末端にさらに先行することができる、合成又は真核生物発現用のＮＧＡＬ変異体ポリヌクレオチド）、配列番号９（何れかのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないが、Ｍｅｔ開始コドン、例えば、ＡＴＧあり又はなしに、場合によってＮ末端にさらに先行することができる、合成又は真核生物発現用のＮＧＡＬ変異体ポリヌクレオチド）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
ｇ）グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ
本明細書において使用される場合、本明細書において互換的に使用される「オリゴ糖部分」又は「オリゴ糖分子」という用語は、インビボ又はインビトロでのグリコシル化によって、（例えば、哺乳動物のＮＧＡＬなどのグリコシル化されたポリペプチドを産生するために）ポリペプチドに付着させることができる１つ又はそれ以上の単糖残基を含む炭水化物含有分子を表す。ポリペプチドに付着されたオリゴ糖部分の数が明示的に表示されている場合を除き、本明細書において引用される「オリゴ糖部分」という表記は全て、ポリペプチドに付着された１つ又はそれ以上のこのような部分を表すものとする。好ましくは、前記炭水化物含有分子を付着させることができるポリペプチドは、すなわち、本明細書中にさらに記載されている「グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ」を提供するために野生型又は変異体哺乳動物ＮＧＡＬである。
【００３８】
「インビボグリコシル化」という用語は、インビボで、例えば、例えばＮ結合型及びＯ結合型グリコシル化によって、ポリペプチドの発現のために使用されるグリコシル化細胞中での翻訳後プロセッシングの間に起こるオリゴ糖部分のあらゆる付着を意味するものとする。通常、Ｎ−グリコシル化されたオリゴ糖部分は、５つの単糖残基（すなわち、２つのＮ−アセチルグルコサミン残基及び３つのマンノース残基）から構成される共通の基本的コア構造を有する。正確なオリゴ糖構造は、グリコシル化を行う問題の生物及び具体的なポリペプチドに大きく依存する。
【００３９】
「インビトログリコシル化」という用語は、場合によって架橋剤を用いて、オリゴ糖部分をポリペプチドの付着基へ共有結合させることを通常含む、インビトロで行われる合成的グリコシル化を表す。インビトログリコシル化は、様々な異なる化学を用いて、化学的に合成されたオリゴ糖構造をポリペプチド（例えば、哺乳動物ＮＧＡＬなど）に付着させることによって達成することができる。例えば、使用され得る化学は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質に付着させるために使用される化学であり、場合によって短いスペーサーを介して、オリゴ糖が官能基に連結される。インビトログリコシル化は、約０．０２から約２．０ｍＬの容量で、約０．５から約２．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、約４．０から約７．０のｐＨの適切な緩衝液中で実施することができる。他のインビトログリコシル化法は、例えば、Ａｐｌｉｎ他によるＷＯ８７／０５３３０、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ中のＬｕｎｄｂｌａｄ他によるＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９−３０６（１９８１）、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３：３７５９−３７６５（１９８２）及びＤｏｅｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２１９３−２１９９（１９８２）に記載されている。
【００４０】
ｈ）ヒトＮＧＡＬ断片
本明細書において使用される「ヒトＮＧＡＬ断片」は、本明細書において、成熟ヒトＮＧＡＬ又はシグナルペプチドを含むＮＧＡＬの全体より少ない部分を含むポリペプチドを表す。特に、ヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号１、２、１０又は１２の約５から約１７８まで又は約１７９の連続するアミノ酸を含む。特に、ヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号１、２、１０又は１２の約５から約１７０の連続するアミノ酸を含む。特に、ヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号１、２、１０又は１２の少なくとも約５個の連続するアミノ酸、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２のアミノ酸の少なくとも約１５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約２０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約２５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２のアミノ酸の少なくとも約３０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約３５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約４０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約４５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約５０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約５５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約６０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約６５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約７０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約７５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約８０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約８５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約９０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約９５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１００個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１０５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１１０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１１５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１２０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１２５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１３０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１３５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１４０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１４５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１５０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１６０個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１６５個の連続するアミノ酸残基、配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１７０個の連続するアミノ酸残基又は配列番号１、２、１０若しくは１２の少なくとも約１７５個の連続するアミノ酸残基を含む。
【００４１】
本発明によって想定されるヒトＮＧＡＬ断片の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
（ａ）配列番号１、２、１０又は１２のアミノ酸残基１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７及び１１８を含む少なくとも約７個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まり、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基は、本明細書に前述されているように、負の付番が為される。）；
（ｂ）配列番号１、２、１０又は１２のアミノ酸残基１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８及び１１９を含む少なくとも約８個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｃ）配列番号１、２、１０又は１２のアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７を含む少なくとも約３６個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｄ）配列番号１、２、１０又は１２のアミノ酸残基１５及び１０９を含む少なくとも約９５個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｅ）配列番号１、２、１０又は１２のアミノ酸残基１５、１０９及び１５８を含む少なくとも約１４４個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；
（ｆ）配列番号１、２、１０又は１２のアミノ酸残基１５、１０９、１５８及び１５９を含む少なくとも約１４５個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）；又は
（ｇ）配列番号１、２、１０又は１２のアミノ酸残基１５、１０９、１５８、１５９及び１６０を含む少なくとも約１４６個の連続するアミノ酸のヒトＮＧＡＬ断片（配列番号１及び２の付番は、シグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）。
【００４３】
場合によって、本明細書に記載されているこのようなヒトＮＧＡＬ断片は、配列番号３、４又は１１の対応する配列によって部分的に又は完全にコードされる。これらの線に沿って、一実施形態において、本発明は、配列番号４若しくは１１の配列を含む又は配列番号４若しくは１１の配列からなる単離され、精製され、又は単離及び精製されたヒトＮＧＡＬポリヌクレオチドを提供する。
【００４４】
ｉ）ＮＧＡＬハイブリッド
本明細書において使用される「ＮＧＡＬハイブリッド」又は「ＮＧＡＬハイブリドーマ」という用語は、目的の抗ＮＧＡＬ抗体を産生するハイブリドーマクローン又はサブクローン（明記されているとおりの）を表す。一般に、同じ種類のサブクローンから得られたものと比較すると、ハイブリドーマクローンによって産生された抗体の親和性には、幾らか小さな変動が存在し得る（例えば、クローンの純度を反映する。）。比較により、同じクローンを起源とし、さらに、目的の抗ＮＧＡＬ抗体を産生する全てのハイブリドーマサブクローンは、同じ配列及び／又は同じ構造の抗体を産生することが十分に確立されている。ＮＧＡＬハイブリッドは、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（ＮＧＡＬハイブリッドに関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００４５】
ｊ）エピトープ
本明細書において使用される「エピトープ」又は「目的のエピトープ」という用語は、認識され、その特異的結合パートナー上の相補的部位に結合することができる何れかの分子上の部位を表す。分子と特異的結合パートナーは、特異的結合ペアの一部である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、炭水化物抗原（糖脂質、糖タンパク質又はリポ多糖など（但し、これらに限定されない。））又は多糖であり得、その特異的結合パートナーは抗体であり得る（但し、これに限定されない。）。
【００４６】
特に、エピトープは、抗原（すなわち、抗体が結合するタンパク質）の特定領域（１つ又はそれ以上のアミノ酸から構成される。）を表す。より具体的には、抗原性エピトープは、抗体結合ドメインの表面上の相補的領域（パラトープ）と相互作用するタンパク質表面上の領域である。従って、エピトープは、抗体との静電的相互作用、疎水的相互作用及び水素結合に関与し、表面の正しい形状、その柔軟性及び構造的動力学に必要とされる残基も含有する。抗原性エピトープに対して強固な支持の役割を有する、埋め込まれた「第二球体」残基も存在する。
【００４７】
ｋ）対象
本明細書において使用される「対象」及び「患者」という用語は、当該対象が治療の何れかの形態を有し、又は現在行っているかどうかに関わらず、互換的に使用される。本明細書において使用される「対象」という用語は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウスなど）、ヒト以外の霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）及びヒトを含む哺乳動物を表す。好ましくは、対象は、ヒトである。
【００４８】
ｌ）検査試料
本明細書において使用される「検査試料」という用語は、血清、血漿、血液（全血を含むが、これに限定されない。）、リンパ、尿又は対象の他の体液に由来する生物学的試料を表す。検査試料は、当業者に公知の定型的な技術を用いて調製することが可能である。好ましくは、検査試料は、尿又は血液である。
【００４９】
ｍ）前処理試薬（例えば、溶解、沈殿及び／又は可溶化試薬）
本明細書に記載されている診断アッセイにおいて使用される前処理試薬とは、何れかの細胞を溶解し、及び／又は検査試料中に存在する何らかの分析物を可溶化する試薬である。本明細書中にさらに記載されているように、前処理は、全ての試料に対して必要とは限らない。とりわけ、分析物（すなわち、ＮＧＡＬ）の可溶化には、試料に存在する何れかの内在性結合タンパク質からの分析物の放出を引き起こす。前処理試薬は、同種（分離段階を必要としない）又は異種（分離段階を必要とする）であり得る。異種の前処理試薬を使用すると、アッセイの次の段階に進む前に、検査試料からのあらゆる沈殿した分析物結合タンパク質の除去が存在する。前処理試薬は、（ａ）１つ若しくはそれ以上の溶媒及び塩、（ｂ）１つ若しくはそれ以上の溶媒、塩及び界面活性剤、（ｃ）界面活性剤、（ｄ）界面活性剤及び塩又は（ｅ）細胞溶解及び／若しくは分析物の可溶化に適したあらゆる試薬若しくは試薬の組み合わせを場合によって含むことができる。また、単独の又は他の何れかの前処理剤（例えば、溶媒、界面活性剤、塩など）と組み合わせたプロテアーゼを使用することができる。
【００５０】
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態のみを記載することを目的とするものであって、その他、限定を意図するものではない。
【００５１】
Ｂ．グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ
本発明は、あらゆる種類の哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、単離された、組換え、変異体、野生型、合成、半合成など）、特に、場合によってグリコシル化されている哺乳動物ＮＧＡＬ、特にヒトＮＧＡＬに関する。
【００５２】
一実施形態において、本発明は、単離されたグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬに関する。より具体的には、本発明は、少なくとも１つのオリゴ糖分子又は部分及び最大１０のオリゴ糖分子又は部分を含有するグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬに関する。本発明のグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬには、グリコシル化されたイヌＮＧＡＬ、グリコシル化されたネコＮＧＡＬ、グリコシル化されたラットＮＧＡＬ、グリコシル化されたマウスＮＧＡＬ、グリコシル化されたウマＮＧＡＬ、グリコシル化された非ヒト霊長類ＮＧＡＬ及びグリコシル化されたヒトＮＧＡＬが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、ヒトＮＧＡＬである。さらに、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型ＮＧＡＬ（すなわち、野生型イヌＮＧＡＬ、野生型ネコＮＧＡＬ、野生型ラットＮＧＡＬ、野生型マウスＮＧＡＬ、野生型ウマＮＧＡＬ、野生型非ヒト霊長類ＮＧＡＬ又は野生型ヒトＮＧＡＬなどの（但し、これらに限定されない。）あらゆる野生型哺乳動物ＮＧＡＬ）であり得る。好ましくは、野生型哺乳動物ＮＧＡＬは、配列番号１（シグナルペプチドを含み、配列番号１の付番はシグナルペプチド及び何れかのＭｅｔ開始残基の直後の成熟配列のＧｌｎ残基から始まる。）又は配列番号１２（シグナルペプチドを含まない。）に示されているアミノ酸配列を有する野生型ヒトＮＧＡＬである。あるいは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型哺乳動物ＮＧＡＬの対応するアミノ酸配列と比べたときに、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むアミノ酸配列を含むグリコシル化された変異体哺乳動物ＮＧＡＬであり得る。例えば、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、野生型ヒトＮＧＡＬ（例えば、配列番号１又は１２参照）のアミノ酸配列は少なくとも１つのアミノ酸置換を含有するヒトＮＧＡＬであり得る。具体的には、少なくとも１つのアミノ酸置換を、配列番号１又は１２のアミノ酸残基８７に施すことができる。具体的には、配列番号１又は１２に示されているアミノ酸８７のシステインをセリンと置換することができる（例えば、配列番号２及び１０参照）。セリン又はシステイン以外のアミノ酸（例えば、グリシン又はアラニン）に対する他の置換を施すこともできる。さらに、定型的な実験操作を用いて、当業者により、配列番号１又は１２のアミノ酸残基８７における単一のアミノ酸置換以外の他のアミノ酸置換、欠失又は付加を施すことができる。
【００５３】
本明細書において使用される哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、場合によってグリコシル化された）は、組換えＤＮＡ技術を用いて、化学合成によって、又は化学合成と組換えＤＮＡ技術の組み合わせによって作製することができる。具体的には、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、目的の哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列を単離又は合成することによって構築され得る。上述のように、哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、場合によってグリコシル化された）は、野生型哺乳動物ＮＧＡＬであり得、又は１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含有する変異体哺乳動物ＮＧＡＬであり得る。このようなアミノ酸置換、欠失又は付加は、突然変異導入によるなど（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８０：１４７−１５１（１９８９）に記載されているような、周知の方法に従う部位指定突然変異導入、無作為突然変異導入又はシャッフリングを用いて）、本分野において公知の定型的技術を用いて施すことができる。
【００５４】
目的の哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用することによるなど、オリゴヌクレオチドが所望の哺乳動物ＮＧＡＬ（野生型又は変異体）のアミノ酸配列に基づいて設計される化学合成によって、好ましくは、組換え哺乳動物ＮＧＡＬがその中で産生される宿主細胞中で好まれるコドンを選択することによって調製され得る。例えば、所望の哺乳動物ＮＧＡＬの一部をコードする幾つかの小さなオリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結又は連結連鎖反応（ＬＣＲ）によって合成及び組み立てられ得る。各オリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的
組み立てのために５’又は３’突出を含有する。
【００５５】
（合成、部位指定突然変異導入又は別の方法によるなど）一旦組み立てられたら、目的の哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、組換えベクター中に挿入され、所望の形質転換された宿主細胞中でのその発現のために必要な何れかの調節配列へ作用可能に連結され得る。
【００５６】
全てのベクター及び発現調節配列が、目的のポリヌクレオチド配列を発現するために等しく良好に機能し得るわけではなく、全ての宿主が同じ発現系とともに等しく良好に機能するわけではないが、当業者は、過度の実験操作なしに、本発明において使用するためのこれらのベクター、発現調節配列、最適化されたコドン及び宿主から容易に選択を行い得ると考えられる。ベクターは、宿主中で複製可能でなければならず、又は染色体中に組み込まれなければならないので、例えば、ベクターを選択する際には、宿主を検討しなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力及びベクターによってコードされる何らかの他のタンパク質の発現（抗生物質マーカーなど）も検討すべきである。発現調節配列を選択する際には、様々な要因も検討され得る。これらには、配列の相対的な強さ、その調節可能性及び特に、潜在的な二次構造に関して、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列とのその適合性が含まれるが、これらに限定されない。宿主は、選択されたベクターとのその適合性、コドン使用、分泌特性、ポリペプチドを正しく折り畳む能力、発酵又は培養の必要性、タンパク質をグリコシル化する能力（又は能力の欠如）及びヌクレオチド配列によってコードされる産物の精製の容易さなどを検討することによって選択すべきである。
【００５７】
組換えベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外成分として存在し、その複製が染色体の複製から独立しているベクター（プラスミドなど）であり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、ベクターがその中に組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
【００５８】
ベクターは、好ましくは、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列はポリヌクレオチド配列の転写のために必要とされる追加セグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。ベクターは、典型的には、プラスミド又はウイルスＤＮＡに由来する。本明細書に挙げられている宿主細胞中での発現に適した多数の発現ベクターが市販されており、又は文献に記載されている。真核生物宿主に対する有用な発現ベクターには、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスから得られる発現調節配列を含むベクターが含まれるが、これらに限定されない。具体的なベクターには、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）／Ｈｙｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）が含まれる。酵母細胞中で使用するための発現ベクターの例には、２μプラスミド及びその誘導体、ＰＯＴ１ベクター（米国特許第４，９３１，３７３号参照）、ｐＪＳＯ３７ベクター（Ｏｋｋｅｌｓ，Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８２：２０２−２０７，（１９９６）に記載されている。）及びｐＰＩＣＺＡ、Ｂ又はＣ（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれるが、これらに限定されない。昆虫細胞中で使用するための発現ベクターの例には、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Ｃａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  ａｎｄＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒＭｕｌｌｅｒｉａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ”  Ｃｅｌｌ，４５：６８５−６９８（１９８６）、ｐＢｌｕｅｂａｃ４．５及びｐＭｅｌｂａｃ（何れも、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能である。）が含まれるが、これらに限定されない。本発明において使用するための好ましいベクターは、ｐＪＶ（Ａｂｂｏｔｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡから入手可能）である。
【００５９】
使用可能な他のベクターは、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列のコピー数を増幅することができる。このような増幅可能なベクターは、本分野において周知である。これらのベクターには、ＤＨＦＲ増幅（例えば、Ｋａｕｆｉｎａｎ、米国特許第４，４７０，４６１号、Ｋａｕｆｉｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃＤＮＡ  Ｇｅｎｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｓ  Ｕｔｉｌｉｚｅｄ  Ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１３０４−１３１９（１９８２））及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号及び欧州特許出願０３３８，８４１号参照）によって増幅され得るベクターが含まれるが、これに限定されない。
【００６０】
組換えベクターは、目的の宿主細胞中でのベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列をさらに含み得る。（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）このような配列の例は、ＳＶ４０の複製起点である。宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターの複製を可能にする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１から３及び複製起点である。
【００６１】
ベクターは、選択可能なマーカー、すなわち、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子をコードする遺伝子など（Ｐ．Ｒ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｇｅｎｅ，４０：１２５−１３０（１９８５）参照）、その産物が宿主細胞中の欠損を相補する遺伝子又はポリヌクレオチドをコードする遺伝子もしくはポリヌクレオチド又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものも含み得る。糸状真菌の場合、選択可能なマーカーには、ａｍｄＳ、ｐｒｙＧ、ａｒｃＢ、ｎｉａＤ及びｓＣが含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書において使用される「調節配列」という用語は、哺乳動物ＮＧＡＬの発現に必要な又は有利なあらゆる成分を表す。各調節配列は、哺乳動物ＮＧＡＬをコードする核酸配列にとって固有又は外来であり得る。このような調節配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサー又は上流活性化配列、シグナルペプチド配列及び転写終結因子が含まれるが、これらに限定されない。最小限、調節配列は、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列に作用可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。
【００６３】
本明細書において使用される「作用可能に連結された」という用語は、配列の正常な機能が発揮され得るような互いに対する配置での、酵素的連結又はその他の手段による２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列の共有結合を表す。例えば、プレ配列又は分泌リーダーをコードするポリヌクレオチド配列は、ポリペプチドの分泌に関与するプロタンパク質としてポリペプチドが発現された場合に、ポリペプチドに対するポリヌクレオチド配列に作用可能に連結されている。プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼした場合に、コード配列に作用可能に連結されている。リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合に、コード配列に作用可能に連結されている。一般に、「作用可能に連結された」とは、連結されているポリヌクレオチド配列が連続しており、分泌性リーダーの場合には、連続しており及び読み取り相にあることを意味する。連結は、都合のよい制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合には、標準的な組換えＤＮＡ法と組み合わせて、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【００６４】
本発明において、多様な発現調節配列が使用され得る。このような有用な発現調節配列には、前記発現ベクターの構造遺伝子に付随した発現調節配列及び原核若しくは真核細胞又はこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが知られているあらゆる配列並びにこれらの様々な組み合わせが含まれる。哺乳動物細胞中での転写を誘導するための適切な調節配列の例には、ＳＶ４０及びアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、例えば、アデノウイルス２主要後期プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト延長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ドロソフィラ最小熱ショックプロテイン７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモン終結因子、ＳＶ４０又はアデノウイルスＥ１ｂ領域ポリアデニル化シグナル及びＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １９６：９４７−５０（１９８７））が含まれる。
【００６５】
哺乳動物細胞中での発現を改善するために、合成イントロンが、哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列の５’非翻訳領域中に挿入され得る。合成イントロンの一例は、プラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから入手可能）から得られる合成イントロンである。
【００６６】
昆虫細胞中での転写を誘導するための適切な調節配列の例には、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、バキュロウイルス前初期遺伝子１プロモーター及びバキュロウイルス３９Ｋ後初期遺伝子プロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
酵母宿主細胞中で使用するための適切な調節配列の例には、酵母α接合系のプロモーター、酵母トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、酵母解糖系遺伝子又はアルコール脱水素酵素遺伝子由来のプロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーター及び誘導性ＧＡＬプロモーターが含まれる。
【００６８】
糸状真菌宿主細胞中で使用するための適切な調節配列の例には、ＡＤＨ３プロモーター及びターミネーター、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼトリオースリン酸イソメラーゼ又はアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、エー・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼ、エー・ニガー又はエー・ニジュラス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｓ）グルコアミラーゼ、エー・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ又はリパーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ＴＰＩ１ターミネーター及びＡＤＨ３ターミネーターが含まれる。
【００６９】
哺乳動物ＮＧＡＬをコードするポリヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよく、又は含まなくてもよい。哺乳動物ＮＧＡＬがその中で発現される細胞から分泌されるべき場合には、シグナルペプチドが存在する。このようなシグナルペプチドが存在する場合、このようなシグナルペプチドは、ポリペプチドの発現のために選択された細胞によって認識されるものであるべきである。シグナルペプチドは、目的の哺乳動物ＮＧＡＬに対して相同（例えば、目的の哺乳動物ＮＧＡＬとともに通常付随するシグナルペプチドであり得る。）若しくは異種（すなわち、目的の哺乳動物ＮＧＡＬとは別の源を起源とする。）であり得、又は宿主細胞に対して、相同又は異種であり得る（すなわち、宿主細胞から本来発現されるペプチドであり、又は宿主細胞から本来発現されないペプチド）。従って、シグナルペプチドは、原核生物性であり（例えば、細菌に由来する。）又は真核生物性（例えば、哺乳動物又は昆虫、糸状真菌又は酵母細胞に由来する。）であり得る。
【００７０】
シグナルペプチドの存在又は不存在は、例えば、哺乳動物ＮＧＡＬの産生のために使用される発現宿主細胞に依存する。糸状真菌において使用するために、シグナルペプチドは、アスペルギルス種のアミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ若しくはプロテアーゼ又はフミコラ・ラヌギノサリパーゼをコードする遺伝子に都合よく由来し得る。昆虫細胞中で使用する場合、シグナルペプチドは、鱗翅目のマンジュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）脂質動員ホルモン前駆体（米国特許第５，０２３，３２８号参照）、ミツバチのメリチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、エクジステロイドＵＤＰグルコシル転移酵素（ｅｇｔ）（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４：３４９−３５７（１９９３）などの昆虫遺伝子（ＷＯ９０／０５７８３参照）又はヒト膵臓リパーゼ（ｈｐｌ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ２８４：２６２−２７２（１９９７））に由来し得る。
【００７１】
哺乳動物細胞中で使用するためのシグナルペプチドの具体例には、マウスＩｇκ軽鎖シグナルペプチドが含まれる（Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５２：８９−１０４（１９９２））。酵母細胞中で使用する場合、適切なシグナルペプチドには、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα−因子シグナルペプチド（米国特許第４，８７０，００８号参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（Ｏ．Ｈａｇｅｎｂｕｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，２８９：６４３−６４６（１９８１））、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（Ｌ．Ａ．Ｖａｉｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４８：８８７−８９７（１９８７）参照）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０参照）及び酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（Ｍ．Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｓｔ，６：１２７−１３７（１９９０）参照）が含まれる。
【００７２】
本発明のグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを産生するために、細菌、真菌（酵母を含む。）、昆虫、哺乳動物又は他の適切な動物細胞若しくは細胞株及びトランスジェニック動物又は植物を含むあらゆる適切な宿主を使用し得る。イー・コリなどの非グリコシル化生物が使用される場合、本発明のグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを産生するために、イー・コリ中での発現の後に、好ましくは、適切なインビトログリコシル化が行われる。
【００７３】
細菌宿主細胞の例には、バシラス、例えば、ビー・ブレビス（（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）又はビー・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス又はストレプトミセスの系統などのグラム陽性細菌又はイー・コリの系統などのグラム陰性細菌が含まれるが、これらに限定されない。細菌宿主細胞中へのベクターの導入は、形質転換受容細胞（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ８１：８２３−８２９（１９６１））又はＤｕｂｎａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５６：２０９−２２１（１９７１））を用いた例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８：１１１−１１５（１９７９）参照）、電気穿孔（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：７４２−７５１（１９８８）参照）又は連結（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １６９：５７７１−５２７８（１９８７）参照）によって実施され得る。
【００７４】
適切な糸状真菌宿主細胞の例には、アスペルギルス、例えば、エー・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、エー・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の系統が含まれるが、これらに限定されない。真菌細胞は、当業者に公知の技術を用いて、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生を含む方法によって形質転換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための適切な手法は、欧州特許出願２３８０２３及び米国特許第５，６７９，５４３号に記載されている。フザリウム種を形質転換するための適切な方法は、「Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ，  ７８：１４７−１５６（１９８９）」及びＷＯ９６／００７８７によって記載されている。酵母は、「Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，  Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，  Ｍ．Ｉ．，  ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，  ｐｐ  １８２−１８７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １５３：１６３（１９８３）；及びＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，  ７５：１９２０（１９７８）」によって記載されている手法を用いて形質転換され得る。
【００７５】
好ましくは、本発明の哺乳動物ＮＧＡＬは、インビボでグリコシル化される。哺乳動物ＮＧＡＬがインビボでグリコシル化される場合、宿主細胞は、哺乳動物ＮＧＡＬの所望されるグリコシル化を作製することができる宿主細胞の群から選択される。従って、宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞から選択され得る。
【００７６】
適切な宿主細胞の例には、サッカロミセスの系統、例えば、エス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スキゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス、ピー・パストリス又はピー・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）などのピキア、エイチ・ポリモルファ又はヤロウィアなどのハンセニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の系統が含まれる。異種のポリヌクレオチドで酵母細胞を形質転換し、酵母細胞から異種のポリペプチドを産生する方法は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ  （ＹｅａｓｔｍａｋｅｒＴＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔの製品プロトコール中）によって、及びＲｅｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ９９：１９３−１９８（１９９２），  Ｍａｎｉｖａｓａｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２１：４４１４−４４１５（１９９３）及びＧａｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １２１：１５９−１６４（１９９４）によって開示されている。
【００７７】
適切な昆虫宿主細胞の例には、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９又はＳｆ２１）又はトリコプルシア・ニー細胞（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）などの鱗翅目細胞株が含まれるが、これらに限定されない（米国特許第５，０７７，２１４号参照）。昆虫細胞の形質転換及び異種のポリペプチドの産生は、当業者に周知である。
【００７８】
適切な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ミドリザル細胞株（ＣＯＳ）、マウス細胞（例えば、ＮＳ／Ｏ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株、ヒト細胞（ヒト胚性腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３）など）及び組織培養中の植物細胞が含まれる。好ましくは、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞株及びＨＥＫ２９３細胞株である。別の好ましい宿主細胞は、Ｂ３細胞株（例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，  ＭＡ）又は別のジヒドロ葉酸還元酵素欠損（ＤＨＦＲ−）ＣＨＯ細胞株（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）である。一態様において、本発明は、グリコシル化されたヒト野生型ＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１２のアミノ酸配列を有するもの）を産生し、２００６年１１月２１日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２０が付与されたＣＨＯ細胞株に関する。好ましくは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２０を有するＣＨＯ細胞株によって産生される野生型ヒトＮＧＡＬは、約２５キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する。別の態様において、本発明は、グリコシル化された変異体ヒトＮＧＡＬを産生するＣＨＯ細胞株に関する。好ましくは、グリコシル化された変異体ヒトＮＧＡＬは、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１２）のアミノ酸配列のアミノ酸８７に対応するアミノ酸においてアミノ酸置換を含む。より好ましくは、アミノ酸置換は、セリンによるシステインの置換である（配列番号２又は１０参照）。最も好ましくは、ＣＨＯ細胞株は、２００７年１月２３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８１６８が付与されたＣＨＯ細胞株である。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８１６８を有するＣＨＯ細胞株は、配列番号２又は１０のアミノ酸配列を含むグリコシル化された変異体ヒトＮＧＡＬを産生する。さらに別の態様において、本発明は、配列番号２又は１０のアミノ酸配列を含む単離された変異体グリコシル化されたヒトＮＧＡＬに関する。
【００７９】
哺乳動物の宿主細胞中に外来ポリヌクレオチドを導入する方法には、リン酸カルシウムによって媒介される形質移入、電気穿孔、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介される形質移入、リポソームによって媒介される形質移入、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００を用いる、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ，  Ｐａｉｓｌｅｙ，  ＵＫによって記載されているウイルスベクター及び形質移入方法が含まれる。これらの方法は、本分野において周知であり、例えば、Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ  （１９９６）によって記載されている。哺乳動物細胞の培養は、例えば、「Ｊｅｎｋｉｎｓ，  Ｅｄ．，  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（１９９９）」及び「Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）」に開示されている確立された方法に従って実施される。
【００８０】
製造方法において、細胞は、本分野で公知の方法を用いて、哺乳動物ＮＧＡＬの産生に適した栄養素培地中で培養される。例えば、細胞は、振盪フラスコ培養、適切な培地中並びにグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを発現及び／又は単離させる条件下で行われる研究室用又は産業用発酵装置中での小規模若しくは大規模発酵（連続、バッチ、フェドバッチ又は固体状態発酵を含む。）によって培養される。培養は、本分野において公知の手法を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養素培地中で行われる。適切な培地は、民間の業者から入手することができ、又は（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ中に）公開された組成に従って調製され得る。グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬが栄養素培地中に分泌される場合、哺乳動物ＮＧＡＬは、培地から直接回収され得る。哺乳動物ＮＧＡＬが分泌されない場合には、細胞可溶化液から回収することができる。
【００８１】
得られた哺乳動物ＮＧＡＬは、本分野において公知の方法によって回収され得る。例えば、哺乳動物ＮＧＡＬは、遠心、ろ過、抽出、スプレー乾燥、蒸発又は沈殿などの（但し、これらに限定されない。）慣用の手法によって、栄養素培地から回収され得る。
【００８２】
哺乳動物ＮＧＡＬは、クロマトグラフィー（イオン交換、アフィニティー、疎水性、等電点電気泳動及びサイズ排除など（但し、これらに限定されない。）、電気泳動手法（調製用等電点など（但し、これらに限定されない。））、溶解度の差（硫酸アンモニウム沈殿など（但し、これらに限定されない。））、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出（例えば、Ｊ−Ｃ  Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，  ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）参照）などの（但し、これらに限定されない。）本分野において公知の様々な手法によって精製され得る。
【００８３】
本明細書に記載されているグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ（野生型及び変異体）は、様々な異なる目的及び様々な異なる方法のために使用することができる。具体的には、本明細書に記載されているグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、１つ若しくはそれ以上の検量用試料、１つ若しくはそれ以上の対照又は検査試料中の哺乳動物ＮＧＡＬを検出するためのアッセイ（好ましくは、イムノアッセイ）における１つ若しくはそれ以上の検量用試料の組み合わせとして使用することができる。好ましくは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、配列番号１又は１２のアミノ酸配列を含む。あるいは、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬは、配列番号２又は１０のアミノ酸配列を含む。
【００８４】
具体的なアッセイにおける検量用物質及び対照としての本明細書に記載されているグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ（野生型及び変異体）の使用は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号（この点に関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。特に、(例えば、配列番号２又は１０に記載されているような)場合によってグリコシル化された変異体ＮＧＡＬの使用の利点は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号（この点に関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）の実施例に記載されている。すなわち、同出願に記載されているように、伝統的なＮＧＡＬアッセイは、二量体より単量体をよりよく検出し、これは、単量体の喪失として（不安定性として）感知され、検量曲線をシフトさせる。
【００８５】
さらに、本発明の哺乳動物ＮＧＡＬは、抗体産生のために動物を免疫化するための免疫原として使用することが可能であり、例えば、動物は、マウス、ウサギ、ニワトリ、ラット、ヒツジ、ヤギ、サメ、ラクダ、ウマ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒト又はその他の動物であり得る。一実施形態において、免疫原は、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ、特に配列番号１、２、１０又は１２の配列を含むグリコシル化されたヒトＮＧＡＬを含む。別の実施形態において、哺乳動物ＮＧＡＬは、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、非ヒト霊長類、ヒト又は他の哺乳動物のものである。
【００８６】
Ｃ．二量体形成を抑制する方法
別の態様において、本発明は、検量用物質、対照又は他の試料（例えば、好ましくは、検査試料）中の哺乳動物NGALの少なくとも１つの二量体の形成を抑制又は除去する方法に関する。抑制又は除去されるべき二量体の形成は、哺乳動物ＮＧＡＬホモ二量体又は哺乳動物ＮＧＡＬヘテロ二量体であり得る。
【００８７】
検量用物質、対照又は他の試料中における少なくとも１つの二量体の形成を抑制又は除去する方法は、哺乳動物ＮＧＡＬ、好ましくは、配列番号１又は１２のアミノ酸配列を有するヒトＮＧＡＬ中に少なくとも１つのアミノ酸置換を導入することを含む。最も好ましくは、アミノ酸置換は、ヒトＮＧＡＬの野生型配列（すなわち、配列番号１又は１２）のアミノ酸８７に対応するアミノ酸におけるセリンによるシステインの置換を含む。このアミノ酸置換の結果、得られたヒトＮＧＡＬは、配列番号２又は１０のアミノ酸配列を有する。この変異体ヒトＮＧＡＬは、検査試料などの試料に添加されたときに又は検量用物質若しくは対照として使用されたときに、二量体（すなわち、ホモ二量体又はヘテロ二量体）を一切形成せず、又はそれ自体とともに、試料中に存在する何れかの野生型ヒトＮＧＡＬ（配列番号１又は１２）とともに、又はＮＧＡＬと複合体を形成することができる何らかの部分（例えば、ゼラチナーゼ、ＭＭＰ−９、その他）とともに（野生型ＮＧＡＬと比べて）減少した二量体の量を形成する。従って、本発明は、場合によってグリコシル化された変異体哺乳動物ＮＧＡＬをさらに提供する。このような変異体哺乳動物ＮＧＡＬは、検量用物質又は対照として場合によって使用され得る。
【００８８】
Ｄ．ヒトＮＧＡＬ抗体を作製する上での使用
本発明のヒトＮＧＡＬ配列は、野生型ヒトＮＧＡＬ（すなわち、配列番号１又は１２）又はヒトＮＧＡＬ断片に特異的に結合し、及び変異体又は非固有配列（例えば、配列番号２又は１０）を含むように、アミノ酸配列が野生型配列（配列番号１又は１２）の少なくとも１つのアミノ酸置換を含有するヒトＮＧＡＬにも場合によって結合する抗体に対して使用され得る。
【００８９】
本明細書に記載されているポリペプチドに対して誘導された抗体及び前記ポリペプチドを用いてこのような抗体を作製する方法は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（これらに関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。さらに、例えば、イムノアッセイにおける及び／又は検量用物質、対照及び免疫診断剤としてのこのような抗体及び本発明のポリペプチドの使用は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（これらに関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００９０】
抗体は、本分野において公知の様々な異なる技術を用いて作製することができる。例えば、野生型ヒトＮＧＡＬに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体は、適切な免疫原を含有する免疫原性調製物で適切な対象（ウサギ、ヤギ、マウス又は他の哺乳動物など（但し、これらに限定されない。））を免疫化することによって産生され得る。免疫化のために使用することができる免疫原には、ヒトＮＧＡＬを発現することが知られている不死化された細胞株ＮＳＯから得られる細胞などの細胞が含まれ得る。
【００９１】
あるいは、免疫原は、精製された若しくは単離されたヒト野生型ＮＧＡＬタンパク質そのもの（すなわち、配列番号１又は１２）又はそのヒトＮＧＡＬ断片であり得る。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降又は本分野において周知である他の技術を用いて、タンパク質（ＮＳＯなど）を産生する細胞から単離された野生型ヒトＮＧＡＬ（配列番号１又は１２参照）を免疫原として使用することができる。あるいは、本分野において公知の定型的技術（合成装置など（但し、これに限定されない。））を使用する化学的合成を用いて、免疫原を調製することが可能である。
【００９２】
次いで、抗体が野生型ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片に結合するかどうかを測定するために、対象中で産生される抗体をスクリーニングすることができる。このような抗体は、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７１号（このような抗体に関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）に記載されている方法を用いてさらにスクリーニングすることができる（例えば、実施例１参照）。例えば、これらの抗体が野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸残基１１２、１１８及び１４７又は野生型ヒトＮＧＡＬのアミノ酸残基１５及び１０９（配列番号１又は１２参照）に結合するかどうかを測定するために、これらの抗体をアッセイすることができる。所望される特徴を有する抗体を同定するための適切な方法が、本明細書に記載されている（実施例１参照）。さらに、変異体ＮＧＡＬ（配列番号２又は１０参照）に結合する抗体を用いて得られた結果は、野生型ＮＧＡＬの結合へ完全に翻訳可能であること、及び抗体は野生型ヒトＮＧＡＬ（配列番号１又は１２参照）の同等の残基に結合することが完全に理解される。従って、便宜上、特定の事例において変異体ＮＧＡＬを使用しない合理的基礎が欠如しなければ、抗体の結合特性を評価するために、変異体ＮＧＡＬを使用することができる。
【００９３】
Ｅ．試料の収集及び前処理
尿、血液、血清及び血漿並びに他の体液を収集し、取り扱い及び処理するための本分野で周知の方法が本発明の実施に際して使用される。
【００９４】
検査試料は、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドなどの目的ＮＧＡＬ分析物の他に、さらなる部分を含み得る。例えば、試料は、対象から得られた全血試料であり得る。検査試料、特に、全血は、本明細書に記載されているようなイムノアッセイの前に、例えば、前処理試薬で処理することが必要であり得、又は所望され得る。前処理が不要である場合でさえ（例えば、多くの尿試料）、前処理は、場合によって、単に便宜のために実施され得る（例えば、市販のプラットフォーム上での計画の一環として）。前処理試薬は、異種の因子又は同質の因子であり得る。
【００９５】
本発明の異種の前処理試薬を用いると、前処理試薬は試料中に存在する分析物結合タンパク質（例えば、ＮＧＡＬを結合することができるタンパク質）を沈殿させる。このような前処理段階は、前処理剤の試料への添加によって形成された混合物の上清を沈殿した分析物結合タンパク質から分離することによって、あらゆる分析物結合タンパク質を除去することを含む。このようなアッセイでは、結合タンパク質が一切存在しない混合物の上清がアッセイにおいて使用され、抗体捕捉段階に直接進む。
【００９６】
同質の前処理試薬が使用される場合には、このような分離段階は存在しない。抗体捕捉段階において、検査試料と前処理試薬の混合物全体を捕捉抗体と接触させる。このようなアッセイのために使用される前処理試薬は、典型的には、抗体捕捉段階の前に又は抗体補足抗体で抗体と遭遇している間に、前処理された検査試料混合物中に希釈される。このような希釈に関わらず、抗体捕捉の間に、検査試料混合物中に前処理試薬のある量（例えば、５Ｍメタノール及び／又は０．６Ｍエチレングリコール）がなお存在する（又は残存する）。
【００９７】
前処理試薬は、本発明のイムノアッセイ及びキットとともに使用するのに適したあらゆる試薬であり得る。前処理は、（ａ）１つ若しくはそれ以上の溶媒（例えば、メタノール及びエチレングリコール）及び塩、（ｂ）１つ若しくはそれ以上の溶媒、塩及び界面活性剤、（ｃ）界面活性剤又は（ｄ）界面活性剤及び塩を場合によって含む。前処理試薬は本分野において公知であり、このような前処理は、文献に記載されているように（例えば、Ｙａｔｓｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓｓａｙ  Ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｉｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ，  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，  ３６：１９６９−１９７３  （１９９０）及びＷａｌｌｅｍａｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  ＡｘＳＹＭ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙｓ，  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：  ４３２−４３５  （１９９９）参照）に記載されているように、及び／又は市販されているように、ＡｂｂｏｔｔＴＤｘ、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）及びＡＴＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）分析装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）上でのアッセイのために使用されるように使用され得る。さらに、前処理は、Ａｂｂｏｔｔの米国特許第５，１３５，８７５号、ＥＰ０  ４７１  ２９３、２００６年１２月２９日に出願された米国特許出願６０／８７８，０１７号及び２００６年６月２１日に出願された米国特許出願１１／４９０６２４号（参照により、前処理に関するその教示に関して全体が組み込まれる。）に記載されているように行うことができる。また、単独で又は他の何れかの前処理剤（例えば、溶媒、界面活性剤、塩など）と組み合わせて、プロテアーゼを使用することができる。
【００９８】
Ｆ．ＮＧＡＬイムノアッセイ
前述されているように、ＮＧＡＬポリペプチド及びＮＧＡＬポリペプチドを用いて得られた抗体は、イムノアッセイにおいて使用することができる。具体的な改良されたイムノアッセイは、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号（これらに関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているように実施することができる。しかしながら、米国仮特許出願６０／９８１，４７３号にさらに記載されているように、ＮＧＡＬイムノアッセイは、サンドイッチフォーマットなどの（但し、これに限定されない。）本分野において公知のあらゆるフォーマットを用いて実施することができる。
【００９９】
具体的には、本発明の一態様において、検査試料中のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を分離及び定量するために、少なくとも２つの抗体が使用される。より具体的には、少なくとも２つの抗体は、「サンドイッチ」と称される免疫複合体を形成するヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片のあるエピトープに結合する。一般に、イムノアッセイにおいて、検査試料中のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を捕捉するために、１つ又はそれ以上の抗体を使用することが可能であり（これらの抗体は、「捕捉」抗体としばしば称される。）、サンドイッチに検出可能な（すなわち、定量可能な）標識を結合するために、１つ又はそれ以上の抗体を使用することができる（これらの抗体は、「検出抗体」、「連結物」としばしば称される。）。
【０１００】
捕捉抗体、検出抗体として、又は捕捉及び検出抗体として、本発明のＮＧＡＬポリペプチドに対して誘導された抗体を用いて、優れたイムノアッセイ、特に、サンドイッチアッセイを実施することができる。これらは、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号（これらに関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に詳しく記載されている。
【０１０１】
一般的に言えば、  ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片に関して検査されている（例えば、これらを含有することが疑われている）検査試料は、少なくとも１つの捕捉抗体（又は複数の抗体）及び少なくとも１つの検出抗体（第二の検出抗体又は第三の検出抗体である。）と同時に又は順次に、任意の順序で接触させることができる。例えば、検査試料は少なくとも１つの捕捉抗体とまず接触させ、次いで（順次）少なくとも１つの検出抗体と接触させることができる。あるいは、検査試料は、少なくとも１つの検出抗体とまず接触させ、次いで（順次）少なくとも１つの捕捉抗体と接触させることができる。さらに別の代替例において、検査試料は、捕捉抗体及び検出抗体と同時に接触させることができる。
【０１０２】
サンドイッチアッセイフォーマットにおいて、第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成を可能とする条件下で、ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を含有すると疑われる検査試料をまず少なくとも１つの第一の捕捉抗体と接触させる。２以上の捕捉抗体が使用される場合、第一の複数の捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、検査試料中に予測されるヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の最大量のモル濃度過剰量で使用される。例えば、抗体の約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬ／ｍＬ緩衝液（例えば、微小粒子コーティング緩衝液）を使用することができる。
【０１０３】
場合によって、検査試料を少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と接触させる前に、検査試料からの第一の抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の分離を促進するために、少なくとも１つの捕捉抗体を固体支持体に結合させることができる。ウェル、管又はビーズの形態のポリマー性材料から作製された固体支持体など（但し、これらに限定されない。）、本分野において公知のあらゆる固体支持体を使用することができる。１つの抗体（又は複数の抗体）は、吸着によって、化学的連結剤を用いた共有結合によって又は本分野によって公知の他の手段によって、固体支持体に結合させることができる（但し、このような結合は、ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片を結合する抗体の能力を妨害しない。）。あるいは、１つの抗体（又は複数の抗体）は、（例えば、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａから入手可能な、Ｐｏｗｅｒ−ＢｉｎｄＴＭ−ＳＡ−ＭＰストレプトアビジンによって被覆された微粒子を用いて）ストレプトアビジン又はビオチンで予め被覆された微粒子と結合させることができる。あるいは、１つの抗体（又は複数の抗体）は、抗種特異的モノクローナル抗体で予め被覆された微粒子を用いて結合させることができる。さらに、必要であれば、固体支持体は、抗体上の様々な官能基との反応性を許容するために誘導化することができる。このような誘導化には、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの（但し、これらに限定されない。）ある種のカップリング剤の使用が必要とされる。
【０１０４】
ヒトＮＧＡＬ若しくはヒトＮＧＡＬ断片に関して検査されている及び／又はヒトＮＧＡＬ若しくはヒトＮＧＡＬ断片を含有すると疑われている検査試料を少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と接触させた後、第一の抗体（又は複数の抗体）−ヒトＮＧＡＬ複合体の形成を可能とするために、混合物を温置する。温置は、約２℃から約４５℃の温度で、約４．５から約１０．０のｐＨで、少なくとも約１分から約１８時間、好ましくは、約１から約２０分、より好ましくは約１８分間の期間、実施し得る。本明細書に記載されているイムノアッセイは、１つの段階で（検査試料、少なくとも１つの捕捉抗体及び少なくとも１つの検出抗体が全て、順次に又は同時に反応容器へ添加されることを意味する。）、又は２つ段階、３つの段階など、２以上の段階で実施することができる。
【０１０５】
（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体の形成後、次いで、複合体を少なくとも１つの検出抗体（（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の抗体検出複合体の形成を可能とする条件下で）と接触させる。少なくとも１つの検出抗体は、イムノアッセイにおいて使用される第二、第三、第四などの抗体であり得る。捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体が２以上の検出抗体と接触される場合、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（複数の）検出抗体複合体が形成される。捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）と同様に、少なくとも第二の（及び後続の）検出抗体を捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ複合体と接触させる場合、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体の形成のために、上述の条件と類似の条件下での温置の期間が必要とされる。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は、検出可能な標識を含有する。検出可能な標識は、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体の形成前に、同時に又は後に、少なくとも１つの検出抗体（例えば、第二の検出抗体）に結合させることができる。本分野において公知のあらゆる検出可能な標識を使用することができる。例えば、検出可能な標識は、３Ｈ、１２５１、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなどの放射性標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース６−リン酸脱水素酵素などの酵素的標識、アクリジニウムエステル、ルミナール、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステルなどの化学発光標識、フルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナートなど）、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリンなどの蛍光標識、量子ドット（硫化亜鉛がキャッピングされたセレン化カドミニウム）、温度測定標識又は免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識への導入、標識の手法及び標識の検出は、「Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ，  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．（１９９７）」及び「（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎによって出版されたハンドブックとカタログの組み合わせである）Ｈａｕｇｌａｎｄ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）」に見出される。
【０１０６】
検出可能な標識は、直接又は連結剤を介して抗体に結合させることができる。使用可能な連結剤の例は、Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯから市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸塩）である。使用可能な他の連結剤は、本分野において公知である。検出可能な標識を抗体に結合するための方法は、本分野において公知である。さらに、Ｎ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド（ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステルとしても知られる。）又はＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド（ＳＰＳＰ−アクリジニウムエステルとしても知られる。）など、抗体への検出可能な標識の連結を容易にする末端基を既に含有する多くの検出可能な標識を購入又は合成することができる。
【０１０７】
（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体は、標識の定量前に、検査試料の残りから分離させることが可能であるが、分離させなければならないわけではない。例えば、少なくとも１つの捕捉抗体（例えば、第一の捕捉抗体）がウェル又はビーズなどの固体支持体に結合されている場合、分離は、固体支持体との接触から（検査試料の）液体を除去することによって達成することができる。あるいは、少なくとも第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されている場合、第一の捕捉抗体は、第一の（複数の）抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の（複数の）抗体複合体を形成するために、ヒトＮＧＡＬ含有試料及び少なくとも１つの第二の検出抗体と同時に接触させた後、固体支持体との接触から液体（検査試料）を除去することができる。少なくとも１つの第一の捕捉抗体が固体支持体に結合されていなければ、（第一の又は複数の）捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／（第二の又は複数の）検出抗体複合体は、標識の量の定量のために、検査試料から除去する必要はない。
【０１０８】
標識された捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／検出抗体複合体（例えば、第一の捕捉抗体／ヒトＮＧＡＬ／第二の検出抗体複合体）の形成後、本分野において公知の技術を用いて、複合体中の標識の量が定量される。例えば、酵素標識が使用されるのであれば、標識された複合体を、発色などの定量可能な反応を与える標識に対する基質と反応させる。標識が放射性標識であれば、標識はシンチレーションカウンターを用いて定量される。標識が蛍光標識であれば、１つの色（「励起波長」と知られる。）の光で標識を刺激し、刺激に応答して標識によって発光された別の色（「発光波長」として知られる。）を検出することによって、標識が定量される。標識が化学発光標識であれば、標識は、視覚的に又は光測定装置、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを使用することによって、発光された光を検出して定量される。複合体中の標識の量が定量されたら、既知濃度のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の系列希釈を用いて作製された標準曲線の使用によって、検査試料中のヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の濃度が測定される。ヒトＮＧＡＬ又はヒトＮＧＡＬ断片の系列希釈を使用する以外に、標準曲線は、重量分析、質量分析法によって及び本分野において公知の他の技術によって作製することができる。
【０１０９】
本明細書に記載されている方法（すなわち、イムノアッセイ及びキット）は、検査試料中に存在するＮＧＡＬのレベルの測定に基づいて、対象の尿細管細胞傷害状態を評価するために使用することができる。評価されるべき対象は、現在、尿細管細胞傷害を有し、又は尿細管細胞傷害を発症するリスクを有し得る。
【０１１０】
本明細書に記載されている方法は、尿細管細胞傷害に対して対象を治療した後に、又は対象が尿細管細胞傷害を現在経験しながら、対象に対して実施することができる。
【０１１１】
本明細書に記載されている方法は、対象中での薬物又は他の治療剤の腎毒性副作用をモニターするために使用することができる。
【０１１２】
本明細書に記載されている方法は、外科的処置の後など（心臓手術、冠動脈バイパス手術、心血管手術、血管手術又は腎臓移植後など）、対象によって経験される現象の後に、対象が腎臓への低下した血液供給を経験した後に、（対象が、損傷を受けた心機能、卒中、外傷、敗血症及び脱水からなる群から選択される医学症状を有し、又は経験している場合）集中治療室への患者の入室後に、１つ若しくはそれ以上の医薬の対象への投与後に、又は１つ若しくはそれ以上の造影剤を対象に投与した後に、実施し、又は実行することができる。
【０１１３】
本明細書中のある種の実施形態は、尿細管細胞傷害の状態を評価するために使用されたときに有利であることは言うまでもないが、イムノアッセイ及びキットは、他の疾病、例えば、癌、敗血症及びＮＧＡＬの評価を伴うあらゆる疾病、疾患又は症状においてＮＧＡＬを評価するためにも、場合によって使用することができる。
【０１１４】
より具体的には、腎疾患、疾病及び傷害の評価の他に（例えば、米国特許公開２００８／００９０３０４号、２００８／００１４６４４号、２００８／００１４６０４号、２００７／０２５４３７０号及び２００７／００３７２３２号参照）、本明細書に記載されているアッセイ及びアッセイ成分は、他のあらゆるＮＧＡＬアッセイにおいて、又はＮＧＡＬレベル若しくは濃度の評価が有用であると判明し得る他のあらゆる状況、例えば、癌関連アッセイ（例えば、全般的に又はより具体的に、膵臓癌、乳癌、卵巣／子宮癌、白血病、大腸癌及び脳癌が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許公開２００７／０１９８７６号参照；米国特許第５，６２７，０３４号及び５，８４６，７３９号も参照）、全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重篤な敗血症、敗血症ショック及び多発性臓器機能障害症候群（ＭＯＤＳ）の診断（例えば、米国特許公開２００８／００５０８３２号及び２００７／００９２９１１号参照；米国特許第６，１３６，５２６号も参照）；血液学用途（例えば、細胞の種類の推測）；とりわけ子癇前症、肥満（メタボリックシンドローム）、インシュリン抵抗性、高血糖、組織再構築（ＭＭＰ−９と複合される場合、例えば、米国特許公開２００７／０１０５１６６号及び米国特許第７，１５３，６６０号参照）、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症）、過敏性腸症候群（例えば、米国特許公開２００８／０１６６７１９及び２００８／００８５５２４参照）、神経変性疾患、呼吸器疾患、炎症、感染、歯周病（例えば、米国特許第５，８６６，４３２号参照）及び静脈血栓塞栓疾患を含む心血管疾患（例えば、米国特許公開２００７／０２６９８３６号）の評価においても場合によって使用することが可能である。
【０１１５】
Ｇ．ＮＧＡＬイムノアッセイキット
本発明は、検査試料中の哺乳動物のＮＧＡＬ抗原の存在を検出するためのキットも想定する。場合によって、キットは、本明細書に記載されている少なくとも１つの検量用物質又は対照も含有し得る。他のＮＧＡＬアッセイに対して（例えば、２００７年１０月１９日に出願された米国仮特許出願６０／９８１，４７３号（他のＮＧＡＬアッセイに関するその教示に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているもの）、他の検量用物質又は対照をＮＧＡＬイムノアッセイキット中に含めることができる可能性がある。しかしながら、好ましくは、本明細書に記載されているイムノアッセイキットに対して、検量用物質又は対照は、哺乳動物ＮＧＡＬ、特に、本明細書に記載されているグリコシル化されたヒトＮＧＡＬ（例えば、野生型又は変異体）である。
【０１１６】
従って、本発明のキットは、少なくとも１つの検量用物質、又は少なくとも１つの対照、又は少なくとも１つの検量用物質と少なくとも１つの対照の組み合わせを含むことができ、前記検量用物質又は対照は、本発明のグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬを含む。好ましくは、少なくとも１つの検量用物質又は少なくとも１つの対照は、配列番号１、配列番号２、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１、２、１０又は１２の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するグリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬである。キットがイムノアッセイを実施するためのキットである場合、キットは、（１）哺乳動物ＮＧＡＬに特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体、（２）少なくとも１つの連結物、（３）イムノアッセイを実施するための１つ若しくはそれ以上の指示書又は（４）項目（１）から（３）のあらゆる組み合わせを場合によってさらに含む。
【０１１７】
従って、本発明は、本発明の哺乳動物ＮＧＡＬを含む診断用及び品質管理キットをさらに提供する。場合によって、本発明のアッセイ、キット及びキット成分は、市販のプラットフォーム上での使用（例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬのＰｒｉｓｍ（Ｒ）、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）及びＥＩＡ  （ビーズ）プラットフォーム上でのイムノアッセイ並びに他の市販の及び／又はインビトロ診断用アッセイ）に対して最適化される。さらに、前記アッセイ、キット及びキット成分は、他の形式で、例えば、電気化学的な又はその他の携帯式又は治療場所でのアッセイ系に対して使用することができる。例えば、本発明は、ＴｎＩ、ＣＫＭＢ及びＢＮＰを含む幾つかの心臓マーカーに対するサンドイッチイムノアッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−  ＳＴＡＴ（Ｒ），  Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）電気化学的イムノアッセイ系に対して適用可能である。イムノセンサー及び使い捨て検査装置中でイムノセンサーを作動させる方法は、例えば、米国特許公開２００３０１７０８８１号、２００４００１８５７７号、２００５００５４０７８号及び２００６０１６０１６４号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。電気化学的なイムノセンサー及びイムノセンサーの他の種類の製造に関するさらなる背景は、米国特許第５，０６３，０８１号（同じく、これらに関するその記述に関して、参照により組み込まれる。）に見出される。
【０１１８】
場合によって、キットは、品質管理試薬（例えば、感度パネル、検量用試料及び陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は本分野において周知であり、例えば、様々な免疫診断用製品同封シート上に記載されている。ＮＧＡＬ感度パネルの一員は、例えば、適切なアッセイ緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）中に本発明のＮＧＡＬ抗原の既知量をスパイクすることによって、例えば、「低」から「高」にわたるＮＧＡＬ抗原の既知量を含有する可変量で場合によって調製することができる。これらの感度パネルの一員は、アッセイの性能特性を確立するために場合によって使用され、さらに、場合によって、イムノアッセイキット試薬の完全性及びアッセイの標準化の有用な指標である。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明は、アッセイの性能特性を評価し、並びに／又はアッセイ中に使用される抗原の完全性を定量及びモニターするための感度パネルとして使用するための１つ又はそれ以上の本発明の抗原を含む品質管理キットを提供する。
【０１２０】
さらに別の実施形態において、本発明の哺乳動物ＮＧＡＬ（例えば、グリコシル化された哺乳動物ＮＧＡＬ）は、検量用物質及び／又は対照として使用することができる。キットに提供される抗体は、蛍光色素、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能な標識を取り込むことができ、又はキットは、抗体を標識するための試薬若しくは抗体を検出するための試薬（例えば、検出抗体）及び／又は抗原を標識するための試薬若しくは抗原を検出するための試薬を含み得る。抗体、検量用試料及び／若しくは対照は別の容器中に与えることができ、又は、適切なアッセイフォーマット中に、例えばマイクロタイタープレート中に予め分配させることができる。
【０１２１】
キットは、診断アッセイを実施し、又は緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬などの品質管理評価を容易にするために必要とされる他の試薬を場合によって含み得る。検査試料を単離及び／又は治療するための緩衝液及び溶液などの他の成分（例えば、前処理試薬）も、キットに含め得る。キットは、１つ又はそれ以上の他の対照をさらに含み得る。キットの成分の１つ又はそれ以上は凍結乾燥させることができ、キットは、凍結乾燥された成分の再構成に適した試薬をさらに含み得る。
【０１２２】
キットの様々な成分は、場合によって、適切な容器中に与えられる。上述のように、容器の１つ又はそれ以上は、マイクロタイタープレートであり得る。さらに、キットは、試料を保持又は保存するための容器（例えば、血液又は尿試料用の容器又はカートリッジ）を含むことができる。適宜、キットは、反応容器、混合容器及び試薬又は検査試料の調製を容易にする他の成分も場合によって含有し得る。キットは、注射器、ピペット、鉗子、測定用スプーンなどの検査試料の取得を補助するための１つ又はそれ以上の機器も含み得る。
【０１２３】
キットは、紙形態又はディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどのコンピュータ読み取り可能な形態で提供され得る使用説明書を場合によってさらに含み得る。
【０１２４】
例として、限定することなく、ここで、本発明の実施例を記載する。
【０１２５】
Ｈ．アッセイキットの改良
キット（又はその成分）及び本明細書に記載されている成分を用いるアッセイによって、検査試料中のＮＧＡＬ抗原の濃度を測定する方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号に記載されているように、並びに、例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）としてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）によって市販されているように、様々な自動化又は半自動化されたシステム（固相が微粒子を含むシステムを含む。）で使用するために改良することができる。
【０１２６】
自動化されていないシステム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較した自動化又は半自動化されたシステムの差の幾つかには、第一の特異的結合パートナー（例えば、ＮＧＡＬ捕捉抗体）が付着されている基質（サンドイッチ形成及び分析物の反応性に影響を与えることができる。）並びに捕捉の長さとタイミング、検出及び／又は何らかの場合によって行われる洗浄段階が含まれる。ＥＬＩＳＡなどの自動化されていないフォーマットは、試料及び捕捉試薬との相対的により長い温置時間を必要とし得るのに対して（例えば、約２時間）、自動化又は半自動化されたフォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ），Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は相対的により短い温置時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）に関して約１８分間）を有し得る。同様に、ＥＬＩＳＡなどの自動化されていない形式は、相対的により長い温置時間（例えば、約２時間）、連結物試薬などの検出抗体を温置し得るのに対して、自動化又は半自動化されたフォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ））は、相対的により短い温置時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）に関して約４分）を有し得る。
【０１２７】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームには、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＩＭｘ（Ｒ）（例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれる米国特許第５，２９４，４０４号参照）、ＰＲＩＳＭ（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）及びＱｕａｎｔｕｍＴＭＩＩ並びに他のプラットフォームが含まれるが、これらに限定されない。さらに、アッセイ、キット及びキット成分は、他のフォーマット、例えば、電気化学的又は他の携帯式若しくは治療地点でのアッセイ系において使用することができる。本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイシステムに対して適用可能である。イムノセンサー並びに使い捨て検査装置におけるその製造及び操作方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許公開２００３／０１７０８８１号、米国特許公開２００４／００１８５７７号、米国特許公開２００５／００５４０７８号及び米国特許公開２００６／０１６０１６４号（これらに関する教示に関して、参照により、その全体が組み込まれる。）に記載されている。
【０１２８】
特に、Ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）システムへのＮＧＡＬアッセイの改造に関して、以下の構成が好ましい。微小加工されたシリコンチップは、金電流測定作用電極及び銀−塩化銀参照電極の一対を用いて製造される。作用電極の１つの上で、固定化された捕捉抗体を有するポリスチレンビーズ（直径０．２ｍｍ）が電極の上にパターン化されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに接着される。このチップは、イムノアッセイに適した流体装置フォーマットを有するＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジ中に組み立てられる。カートリッジの試料保持チャンバーの壁の一部上に、アルカリホスファターゼ（又は他の標識）で標識された第二の検出抗体を含む層が存在する。カートリッジの流体袋内には、ｐ−アミノフェノールリン酸を含む水性試薬である。
【０１２９】
作動時に、ＮＧＡＬ抗原を含有すると疑われる試料は、検査カートリッジの保持チャンバーに添加され、カートリッジはＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）読取装置中に挿入される。第二の抗体（検出抗体）が溶液中に溶解された後、カートリッジ内のポンプ要素がチップを含有する伝導路内に試料を押し出す。ここで、ポンプ要素は、ＮＧＡＬ抗原、ＮＧＡＬ捕捉抗体及び標識された検出抗体間でのサンドイッチの形成を促進するために、周期的に振動する。アッセイの最後から２番目の段階において、試料をチップから廃棄チャンバーの中に洗浄するために、液体は袋から伝導路の中に押し出される。アッセイの最後の段階において、アルカリホスファターゼ標識は、ｐ−アミノフェノールリン酸と反応してリン酸基を切断し、放出されたｐ−アミノフェノールを作用電極において電気化学的に酸化させる。測定された電流に基づいて、読取装置は、埋め込まれたアルゴリズム及び工場で測定された較正曲線を用いて、試料中のＮＧＡＬ抗原の量を計算することができる。
【０１３０】
さらに、本明細書に記載されている方法及びキットは、イムノアッセイを実施するための他の試薬及び方法を必ず包含することは言うまでもない。例えば、連結物希釈剤及び／又は検量用試料希釈剤として、例えば洗浄のために、本分野において公知の様々な緩衝液及び／又は使用するために容易に調製し、又は最適化され得る様々な緩衝液が包含される。典型的な連結物希釈剤は、ある種のキットにおいて使用され、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッキング剤、抗微生物剤及び界面活性剤を含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）連結物希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）である。典型的な検量用試料希釈剤は、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッキング剤及び抗微生物剤を含有する緩衝液を含む、ある種のキットにおいて使用されるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ヒト連結物希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  ＩＬ）である。
【実施例１】
【０１３１】
ヒトＮＧＡＬ野生型抗原
ヒトＮＧＡＬ野生型遺伝子のクローニング
ヒトＮＧＡＬ（ＬＣＮ２、ホモ・サピエンリポカリン−２、腫瘍遺伝子２４ｐ３）プラスミドクローンｐＣＭＶ６−ＸＬ４−ＮＧＡＬ（リポカリン−２、ＬＣＮ２）（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，カタログ番号ＴＣ１１６６５５，ＮＭ ００５５６４．２）をテンプレートとして使用した。ヒト（野生型）ＮＧＡＬ遺伝子をクローニングするために、ＰＣＲプライマーの一対を設計した。５’末端プライマーは部分的ＮＧＡＬシグナル配列及びＳｒｆＩ制限部位を含有し、３’末端プライマーは、ＮｏｔＩ制限部位、６×Ｈｉｓ及び部分的Ｃ末端ＮＧＡＬ配列を含有した。５’及び３末端プライマーが、以下に示されている。
【０１３２】
ＮＧＡＬ５’末端プライマー（Ｎ−ｆｏｒｓｒｆ）：
【０１３３】
【化１】
2011501673.tif 000003
【０１３４】
ＮＧＡＬ３’末端プライマー（Ｎ−ｒｅｖｈｉｓ）：
【０１３５】
【化２】
2011501673.tif 000004
【０１３６】
５’及び３’プライマー並びにＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）１．２５ユニットを用いて、２Ｘ反応緩衝液（ｄＮＴＰ）中でＰＣＲ反応を実施した。９４℃で１５秒の後、６８℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを実施した。合計３０サイクルを実施した。シグナルペプチドを含む野生型ヒトＮＧＡＬ抗原配列が図１（配列番号１）に示されており、シグナルペプチドを欠如する野生型ヒトＮＧＡＬ抗原配列が配列番号１２に示されている。
【０１３７】
６４３塩基対のＰＣＲ産物をゲル精製し、ＳｒｆＩ及びＮｏｔＩによって制限酵素加工し、次いで、ｐＪＶベクター中にクローニングし、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α中に形質転換した。ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）からｐＪＶベクターを取得し、アンピシリン耐性遺伝子、ｐＵＣ起点、ＳＶ４０起点、ＥＦ−１ａプロモーターを含む。得られたｐＪＶを基礎とするベクター、ｐＪＶ−ＮＧＡＬ−ＨｉｓＡ（ｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３としても知られる。図２参照）は、（図１に示されている）ヒトＮＧＡＬシグナルペプチド配列などの完全長野生型ヒトＮＧＡＬ抗原配列（図１１参照；配列番号３に記載されているコード配列も）をさらに含む。
【０１３８】
３７℃で振盪させながら、形質転換されたイー・コリクローンをＬＢブロス中で一晩増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて各個別のクローンからプラスミドＤＮＡを精製した後、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列を決定した。配列決定によって、プラスミドｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３（図２参照）を選択し、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＡｄｖａｎｃｅＴＭソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって分析した。ｐＪＶクローンが同定されたら、ｐＪＶクローンを保存するために、ｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３プラスミドを含有する別個のイー・コリＤＨ５α細胞バンクを作製した。
【０１３９】
ＨＥＫ２９３細胞中でのヒトＮＧＡＬ野生型抗原の一過性発現
標準的技術に従って、ＥｎｄｏｆｒｅｅプラスミドＭａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、ｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３プラスミドＤＮＡをＭａｘｉ調製した。次いで、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって、このようにして得られた高純度プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞中に一過性に形質移入した。３日間、８％ＣＯ２温置装置中にて、３７℃で、形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を温置し、次いで、４０００ｒｐｍで２０分間、遠心によって採集した。上清（ＮＧＡＬはその中に分泌された。）を集めた。緩衝液をリン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２に交換するために、Ｐｅｌｉｃｏｎ２ｍｉｎｉ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、上清を３回透析ろ過した。
【０１４０】
ヒトＮＧＡＬ野生型抗原の精製
ニッケル−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ、ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて、透析ろ過されたＮＧＡＬ溶液を精製した。ＮＩ−ＮＴＡｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂をＦＰＬＣカラム中に集め、蒸留水の３容量で洗浄し、洗浄緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び６ＮＮａＯＨで８．０になるようにｐＨを調整する。）で予め平衡化した。０．５ｍＬ／分の流速で、透析ろ過されたＮＧＡＬ試料をカラム上に搭載し、洗浄緩衝液の１０から２０容積で洗浄し、溶出緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び６ＮＮａＯＨで８．０になるようにｐＨを調整する。）を用いてカラムからＮＧＡＬタンパク質を溶出した。リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２の３から５リットルを用いて、精製されたＮＧＡＬタンパク質を３回透析した。
【０１４１】
安定なＣＨＯ細胞株の確立及びヒトＮＧＡＬの発現
以下に記載されているように、形質移入及び安定なヒトＮＧＡＬ発現のために、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｂ３．２，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）を使用した。ＣＨＯ細胞を培養し、リン酸カルシウムによって媒介された標準的な形質移入によって、ｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３プラスミドで形質移入した。９６ウェルプレート中、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを欠如し、５％の透析されたＦＢＳ（ｄＦＢＳ）を含有するαＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中において、ＮＧＡＬが形質移入されたＣＨＯ細胞を数週間選択した。５０％を上回る集密度になるまで、ＣＨＯクローンが増殖したら、ＣＨＯクローンの成績を順位付けするために、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）によって、上清を検査した。９６ウェルの形質移入されたＣＨＯ細胞から得られた上清を、室温で少なくとも１時間、９６ウェルＥＩＡプレート上に被覆し、次いで、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液で１時間ブロッキングした。被覆されたウェル中に、マウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を添加し、室温で少なくとも１時間、プレートを温置した。温置後、プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とともに約１時間温置した。Ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ（ＯＰＤ）を用いてプレートを発色させ、４９２ｎｍの光学密度で読み取った。ＥＩＡにおいて最高のシグナルを与えた１０個のＣＨＯクローンを増殖させ、再度アッセイした。ＥＩＡ９６ウェルプレート上に被覆された抗ＮＧＡＬマウスモノクローナル抗体を用いて、ＥＩＡの再アッセイを行い、洗浄し、次いで、培養されたＣＨＯ細胞クローンから得られた上清とともに温置し、次いで、再び洗浄し、抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とともに温置し、上述のようにＯＰＤを使用することによって、最後に発色させた。次いで、ＥＩＡ再アッセイにおいて得られた最高のシグナルに基づいて、「ＣＨＯクローン＃２０４」と称されるクローンを選択し、ＮＧＡＬ分泌を強化するために、メトトレキサート（ＭＴＸ）増幅を行った。
【０１４２】
ＣＨＯ細胞クローン＃２０４のメトトレキサート増幅
２０ｎＭＭＴＸ増幅：終末点希釈を用いて、αＭＥＭ培地＋５％ｄＦＢＳ＋２０ｎＭＭＴＸ中に、上記ＮＧＡＬ組換え抗原（ｒＡｇ）ＣＨＯ細胞クローン＃２０４をサブクローニングした。ＭＴＸ中での２、３週の増幅後、ＣＨＯクローン番号２０４から４６５（「ＣＨＯクローン＃４６５」とも称される。）を含む１０個のＣＨＯサブクローンを同定した。ＥＩＡプレート上に被覆された抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体を用いるＥＩＡを使用し、洗浄し、次いで、培養されたＣＨＯ細胞クローンから得た上清とともに温置し、次いで、再び洗浄し、抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とともに温置し、最後に、上述されているＯＰＤによって発色させて同定を行った。さらなるＭＴＸ増幅のために、アッセイ結果に基づいて、ヒトＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ細胞クローン番号２０４−４６５を選択した。
【０１４３】
１００ｎＭＭＴＸ増幅：９６ウェルプレート中、αＭＥＭ＋５％ｄＦＢＳ培地中に補充された１００ｎＭＭＴＸ中での終末点希釈によって、上述のように単離されたヒトＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ細胞クローン番号２０４−４６５をサブクローニングした。ＭＴＸ中での２、３週の増幅後に、上述のようにＥＩＡを用いて、ＣＨＯクローン番号２０４−４６５−９５０を含む３６のＣＨＯサブクローンがまず同定された。さらなるＭＴＸ増幅のために、アッセイ結果に基づいて、ヒトＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ細胞クローン番号２０４−４６５−９５０（「ＣＨＯクローン＃９５０」とも称される。）を選択した。
【０１４４】
５００ｎＭＭＴＸ増幅：９６ウェルプレート中、αＭＥＭ＋５％ｄＦＢＳ培地中に補充された５００ｎＭＭＴＸ中での終末点希釈によって、上述のように単離されたヒトＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ細胞クローン番号２０４−４６５−９５０をサブクローニングした。ＭＴＸ中での２、３週の増幅後に、上述のようにＥＩＡを用いて、ＣＨＯクローン番号２０４−４６５−９５０−１１３を含むＣＨＯサブクローンがまず同定された。さらなるＭＴＸ増幅のために、アッセイ結果に基づいて、ヒトＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ細胞クローン番号２０４−４６５−９５０−１１３（「ＣＨＯクローン＃１１３」とも称される。）を選択した。
【０１４５】
５μＭＭＴＸ増幅：５００ｎＭ増幅に加え、ヒトＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ細胞クローン番号２０４−４６５−９５０には、Ｔフラスコ中の２μＭ及び５μＭＭＴＸ中での一連のＭＴＸ増幅を行った。２、３週の増幅後に、９６ウェルプレート中、αＭＥＭ＋５％ｄＦＢＳ培地中に補充された５μＭＭＴＸ中での終末点希釈によって、ＭＴＸ増幅されたＣＨＯ細胞をサブクローニングした。上述のようにＥＩＡを用いて、ＣＨＯクローン番号２０４−４６５−９５０−６６２（「ＣＨＯクローン＃６６２」とも称される。）を含む２４個のＣＨＯサブクローンをまず同定した。ヒトＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ細胞クローン番号２０４−４６５−９５０−６６２を選択し、無血清ＤＨＦＲ−ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に移した。ＣＨＯサブクローン番号２０４−４６５−９５０−６６２の細胞バンクを調製し、ＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ６６２と名付けた。ＭＴＸによって増幅されたＣＨＯクローンを含むサブクローンに対するヒトＮＧＡＬ野生型抗原の作製の収量が図３に示されており、収量は３．８ｍｇ／Ｌから１２９ｍｇ／Ｌまで変動する。
【実施例２】
【０１４６】
組換えＮＧＡＬ抗原の性質決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動
還元条件又は非還元条件下でヒトＮＧＡＬ組換え抗原を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯクローン＃６６２）に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を実施した。組換えＮＧＡＬ抗原約４．５μｇを、還元剤（β−メルカプトエタノール）を加えた又は加えない搭載緩衝液と混合し、１０分間沸騰させ、次いで、４から２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に搭載し、８０ボルトで１．５時間走行させた。単量体ヒトＮＧＡＬは約２５ｋＤａに遊走するはずであり、二量体ヒトＮＧＡＬは約５０ｋＤａに遊走するはずである。ＮＧＡＬ抗原を発現するＣＨＯ細胞は、発現されたＮＧＡＬの約８０から９０％が単量体であり、約１０から２０％のＮＧＡＬが二量体であることを示した。β−メルカプトエタノールを含有する搭載緩衝液中の還元条件下で、二量体の形態のＮＧＡＬは単量体に転化された（図４参照）。
【０１４７】
鉄結合アッセイ
ＮＧＡＬ活性をさらに性質決定するために、ＮＧＡＬが鉄（ＩＩＩ）ジヒドロキシ安息香酸（Ｆｅ（ＤＨＢＡ）３）を結合する能力を測定した。（Ｆｅ（ＤＨＢＡ）３）の結合は、ＮＧＡＬ中のＴｒｐ蛍光の消光をもたらす。室温で１０分間、０．１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５中のＤＨＢＡ（０．５ｍＭ）の過剰量とともに、Ｆｅ３＋の異なる量（０から１６０μＭ）を温置することによって、（Ｆｅ（ＤＨＢＡ）３）を新たに調製する。ＴＣＮ（０．５ｍＭＴｒｉｓ、１０ｍＭＣａＣｌ２、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて、混合物を１０倍希釈し、室温で３０分間、２ｍＬの遠心管中でＮＧＡＬ（ＴＣＮ中５０μｇ／ｍＬ）とともに温置した（Ｇｏｅｔｓ，Ｄ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ１０：１０３３（２００２））。２８０ｎｍ（励起）及び３４０ｎｍ（発光）において、蛍光を測定する。結果は、上述のように作製されたＨＥＫ２９３から発現された（一過性発現）ヒトＮＧＡＬは、上記条件下で、（Ｆｅ（ＤＨＢＡ）３）の１．５μＭ超を結合できることを示した（図５参照）。
【０１４８】
ウェスタンブロット分析
９５℃で、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールによって、精製されたヒト組換えＮＧＡＬタンパク質約３μｇを処理し、１２％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル中で電気泳動した（Ｌａｅｍｍｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０−６８５（１９７０））。２５ｍＭＴｒｉｓ（（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、１９２ｍＭグリシン及び２．０％メタノール、ｐＨ８．３を含む標準的な転移緩衝液中で１から２時間、１００ボルトで電気泳動を行うことによって、タンパク質をゲルからニトロセルロース膜へ転移させた（Ｔｏｗｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３：４３５０−４３５４（１９７９））。タンパク質を転移させ、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡでニトロセルロースをブロッキングした後、ヒト組換え抗原の存在を測定するために、ニトロセルロースを使用した。ＰＢＳ／２％ＢＳＡ緩衝液、ｐＨ７．２の１０ｍＬ中で、抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体（ＨＹＢ２１１−０１、ＨＹＢ２１１−０２又はＨＹＢ２１１−０５の何れか、ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐＡ／Ｓ、ＧｅｎｔｏｆｔｅＤｅｎｍａｒｋから市販されている。）の適切な量とともに、ニトロセルロース膜を温置した。リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２でニトロセルロース膜を洗浄した後、ＨＲＰに連結されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加した。室温で１から２時間、ニトロセルロース膜を温置した後、ＰＢＳで洗浄した。最後に、安定な過酸化物緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ）中に、新たに調製された金属で補強されたＤＡＢを添加することによって、タンパク質に結合された抗体を可視化した。このアッセイは、抗ヒトＮＧＡＬモノクローナル抗体（ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）が組換えヒトＮＧＡＬ抗原に結合できることを示した（図６参照）。
【０１４９】
グリコシル化の分析
Ｎ結合型グリコシル化を測定するために、ＭＡＬＤＩＭＳによって、ヒトＮＧＡＬ抗原を発現するＣＨＯ細胞を分析した。ＭｉｎｉＤｉａｌｙｓｉｓ管を用いて、２５ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．０に対してＮＧＡＬ溶液（２０μＬ）を透析した。溶液１０μＬに、ＰＮＧａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）０．５μＬを添加し、３７℃で２０又は７２時間温置した。上記透析された試料の各々０．２μＬを、ＭＡＬＤＩ試料プレート上の試料スポットに添加した。マトリックス溶液（０．２５％ＴＦＡを含有する１／１（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水溶液中のシナピン酸溶液、新たに調製）０．２μＬをプレート上の試料と混合し、風乾し、ＭＡＬＤＩ装置上に搭載した。装置の較正のために、インシュリン溶液（０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中２ｍｇ／ｍＬ）を試料スポットに搭載した。２１６３９におけるピークの出現によって示されるように、処理の７２時間後、ＮＧＡＬの脱グリコシル化された形態の一部が出現した。これは、ヒトＮＧＡＬを発現したＣＨＯ細胞上にＮ結合型グリカンが存在することを示した（図７参照）。
【実施例３】
【０１５０】
ヒトＮＧＡＬ抗原変異体Ｃ８７Ｓ
ヒトＮＧＡＬ変異体Ｃ８７Ｓ遺伝子のクローニング
プラスミドｐＪＶ−ＮＧＡＬ−Ａ３をテンプレートとして使用した。野生型ヒトＮＧＡＬ遺伝子のアミノ酸８７のシステインの代わりにセリンを導入するために、４つのＰＣＲプライマー（プライマー対の２つの組、下記）を設計した。
【０１５１】
使用したプライマーの第一の対は、以下のとおりであった。
【０１５２】
ＮＧＡＬ５’末端プライマー（Ｎ−ｆｏｒｓｒｆ）：
【０１５３】
【化３】
2011501673.tif 000005
【０１５４】
ＮＧＡＬ３’末端プライマー（ＮＳｅｒ２）：
【０１５５】
【化４】
2011501673.tif 000006
【０１５６】
使用したプライマーの第二の対は、以下のとおりであった。
【０１５７】
ＮＧＡＬ５’末端プライマー（Ｎ−Ｓｅｒ１）：
【０１５８】
【化５】
2011501673.tif 000007
【０１５９】
ＮＧＡＬ３’末端プライマー（Ｎ−ｒｅｖｈｉｓ）：
【０１６０】
【化６】
2011501673.tif 000008
【０１６１】
部分的ＮＧＡＬシグナル配列及びＳｒｆＩ制限部位を含有する実施例１の５’末端プライマー（Ｎ−ｆｏｒｓｒｆ）並びにアミノ酸８７のシステインコドンの代わりにセリンコドンを含有する３’末端プライマーＮｓｅｒ２を用いて、第一のＰＣＲ反応（ＮＧＡＬ−Ａ）を行った。このプライマー対から得られたＰＣＲ産物は、３４１塩基対であった。アミノ酸８７のシステインコドンの代わりにセリンコドンを含有する上記５’末端プライマー（Ｎｓｅｒ１）及びＮｏｔＩ制限部位、６×Ｈｉｓ及び部分的Ｃ末端ＮＧＡＬ配列を含有する実施例１の３’末端プライマー（Ｎ−ｒｅｖｈｉｓ）を用いて、第二のＰＣＲ反応（ＮＧＡＬ−Ｂ）を行った。この対プライマーから得られたＰＣＲ産物は、３１９塩基対であった。それぞれの５’及び３’プライマー（すなわち、上記プライマー対の１つ）及びＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）１．２５ユニットを用いて、２Ｘ反応緩衝液（ｄＮＴＰ）中でＰＣＲ反応を行った。９４℃で１５秒後に続く６８℃で１分の３０サイクルにわたって、ＰＣＲを実施した。合計３０サイクルを実施した。プライマーＮｓｅｒ１及びＮｓｅｒ２中には、１６塩基対のヌクレオチドの重複が存在する。
【０１６２】
２つの観察されたＰＣＲ産物、すなわち、ＮＧＡＬ−Ａ（３４１塩基対）及びＮＧＡＬ−Ｂ（３１９塩基対）をゲル精製し、Ｎ−ｆｏｒｓｒｆ及びＮ−ｒｅｖｈｉｓのプライマー対（それぞれ、配列番号５及び６）を使用する別のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応は、上述のように実施された。完全長ヒトＮＧＡＬ遺伝子（６４３塩基対）を増幅し、ＳｒｆＩ及びＮｏｔＩによって制限酵素加工し、次いで、（実施例１に記載されているように）ｐＪＶベクター中にクローニングし、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α中に形質転換した。得られたｐＪＶを基礎とするベクターｐＪＶ−ＮＧＡＬ（ｓｅｒ８７）−Ｈｉｓ−Ｔ３（ｐＪＶ−ＮＧＡｌ（Ｃ８７Ｓ）−ｈｉｓＡとしても知られる。図８参照）は、アンピシリン耐性遺伝子、ｐＵＣ起点、ＳＶ４０起点、ＥＦ−１ａプロモーター、ヒトＮＧＡＬシグナルペプチド及び完全長ヒト変異体ＮＧＡＬＤＮＡ（配列番号４及び図１２（ヒト変異体ＮＧＡＬＤＮＡ及び図８））を含む。完全長Ｃ８７Ｓ変異体抗原配列は、図９に示されている（配列番号２にも）。
【０１６３】
３７℃で振盪させながら、形質転換されたイー・コリクローンをＬＢブロス中で一晩増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、各個別のクローンからプラスミドＤＮＡを精製した後、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列を決定した。配列決定によって、プラスミドｐＪＶ−ＮＧＡＬ（ｓｅｒ８７）−Ｈｉｓ−Ｔ３を選択し、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＡｄｖａｎｃｅＴＭソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって分析した。ｐＪＶクローンが同定されたら、ｐＪＶクローンを保存するために、ｐＪＶ−ＮＧＡＬ（ｓｅｒ８７）−Ｈｉｓ−Ｔ３プラスミドを含有する別個のイー・コリＤＨ５α細胞バンクを作製した。
【０１６４】
ＨＥＫ２９３細胞中でのヒトＮＧＡＬＣ８７Ｓ変異体抗原の一過性発現
標準的技術によって、ＥｎｄｏｆｒｅｅプラスミドＭａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、ｐＪＶ−ＮＧＡＬ（ｓｅｒ８７）−Ｈｉｓ−Ｔ３プラスミドＤＮＡをＭａｘｉ調製した。次いで、２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって、得られた高純度プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞中に一過性に形質移入した。実施例１に記載されているように、一過性に発現されたヒトＮＧＡＬ抗原Ｃ８７Ｓ変異体を採集し、透析ろ過した。
【０１６５】
ヒトＮＧＡＬＣ８７Ｓ変異体抗原の精製
実施例１に記載されているように、ニッケル−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ、ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて、透析ろ過されたＮＧＡＬＣ８７変異体溶液を精製した。
【０１６６】
安定なＮＧＡＬＣ８７Ｓ変異体発現ＣＨＯ細胞株の確立及びメトトレキサート増幅
実施例１におけるように、形質移入及び安定なヒトＮＧＡＬ発現のために、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ、Ｂ３．２）を使用した。ＣＨＯ細胞を培養し、リン酸カルシウムによって媒介された標準的な形質移入によって、ｐＪＶ−ＮＧＡＬ（ｓｅｒ８７）−Ｈｉｓ−Ｔ３プラスミドで形質移入した。１０ｃｍの組織培養プレート中、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを欠如し、５％の透析されたＦＢＳ（ｄＦＢＳ）を含有するαＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中において、形質移入されたＮＧＡＬＣＨＯ細胞を数週間選択した。形質移入されたＣＨＯ細胞が５０％を上回る集密度まで増殖した後、形質移入されたＣＨＯ細胞に対して、Ｔフラスコ中の２０ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、２μＭ及び５μＭＭＴＸ中での一連のＭＴＸ増幅を行った。２、３週の増幅後、９６ウェルプレート中の、５μＭＭＴＸが補充されたαＭＥＭ＋５％ｄＦＢＳ培地中への終末点希釈によって、ＭＴＸ増幅されたＣＨＯ細胞をサブクローニングした。細胞クローンに順位を付けるために、ＥＩＡ９６ウェルプレート上に被覆された抗ＮＧＡＬマウスモノクローナル抗体を使用し、続いて、洗浄し、次いで、培養されたＣＨＯ細胞クローンから得られた上清とともに温置し、次いで、再び洗浄し、ビオチン標識されたヤギ抗ＮＧＡＬ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）とともに温置し、次いで、再び洗浄し、さらに３０分から１時間、ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＨＲＰとともに温置し、次いで、最後に実施例１に記載されているようにＯＰＤによって発色させて、ＥＩＡアッセイを実施した。ヒトＮＧＡＬｒＡｇＣ８７Ｓ変異体ＣＨＯ細胞クローン＃７３４を同定し、無血清培地、すなわち、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に移した。ＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ細胞クローン＃７３４の細胞バンクを確立した。
【実施例４】
【０１６７】
組換えＣ８７Ｓ変異体ＮＧＡＬ抗原の性質決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動
還元条件又は非還元条件下で、ＣＨＯ発現されたヒトＣ８７Ｓ変異体ＮＧＡＬ組換え抗原に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った。Ｃ８７Ｓ変異体ＮＧＡＬ抗原の約３μｇを、還元剤（β−メルカプトエタノール）を加えた又は加えない搭載緩衝液と混合し、１０分間沸騰させ、次いで、４から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に搭載し、８０ボルトで１．５分間走行させた。単量体ヒトＮＧＡＬは約２５ｋＤａに遊走するはずであり、二量体ヒトＮＧＡＬは約５０ｋＤａに遊走するはずである。Ｃ８７Ｓ変異体ＮＧＡＬ抗原を発現するＣＨＯ細胞は、約９５％超のＮＧＡＬが単量体形態である（添加された還元剤あり又はなし）ことを示した。この変異体調製物中には、二量体ヒトＮＧＡＬは存在しないことが明らかとなった（図１０参照）。
【実施例５】
【０１６８】
ＡＴＣＣ寄託情報
野生型ＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ６６２細胞株は、２００６年１１月２１日に、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８０２０を与えられた。
【０１６９】
変異体ＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯＣ８７Ｓ細胞株（ＣＨＯ細胞クローン＃７３４（「変異体Ｃ８７ＳＮＧＡＬｒＡｇＣＨＯ７３４」としても知られる。））は、２００７年１月２３日に、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８１６８を与えられた。
【０１７０】
当業者は、目的を遂行し、記載されている目的及び利点並びに本発明に固有の目的及び利点を取得するように、本発明が上手く改変されることを容易に理解する。本明細書に記載されている分子複合体及び方法、手法、処置、分子、具体的化合物は好ましい実施形態の本明細書における代表例であり、典型的なものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示されている本発明に様々な置換及び改変を変更し得ることが当業者に自明である。
【０１７１】
本明細書に挙げられている全ての特許及び公報は、本発明が属する分野の当業者の水準を示唆するものである。全ての特許及び公報は、個別の各公報が参照により具体的且つ個別に取り込まれると記されているのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。特に、それぞれ２００７年１０月１９日に出願された以下の２つの米国仮特許出願６０／９８１，４７１号及び６０／９８１，４７３号の全体が、参照により組み込まれる。
【０１７２】
本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていないあらゆる１つの要素又は複数の要素、１つの限定又は複数の限定の不存在下において適切に実施され得る。従って、例えば、本明細書の各事例において、「含む」、「実質的に〜からなる」及び「からなる」という用語の何れも、他の２つの用語の何れかと置換され得る。使用されている用語及び表現は、限定の用語ではなく、説明の用語として使用されており、このような用語及び表現の使用において、示されている及び記載されている特徴又はその一部のあらゆる均等物を除外することを意図するものではなく、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲内で、様々な修飾が可能であることが認められる。従って、本発明は好ましい実施形態及び場合によって存在する特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修飾及び改変が当業者によって想到され得ること、並びにこのような修飾及び変更は、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲に属すると考えられることを理解すべきである。さらに、「定義」においてある種の用語が定義されており、「詳細な説明」の他の箇所で別段の定義、記載又は論述が為されている場合には、このような定義、記載及び論述は全て、このような用語に帰するものと理解しなければならない。また、このような用語及び表現の使用に際して、示されている及び記載されている特徴又はその一部のあらゆる均等物を除外することを意図するものではない。さらに、小見出し（例えば、「定義」）が「詳細な説明」において使用されているが、このような使用は、参照を容易にするためのものに過ぎず、ある見出し内に行われた何れかの開示をその見出しのみに限定することを意図するものではない。むしろ、１つの小見出しの下に為されたあらゆる開示は、それぞれのあらゆる他の小見出し下の開示を構成するものとする。
【図１】
2011501673.tif 000009
【図２】
2011501673.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011501673.tif 000015
【図８】
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【図９】
2011501673.tif 000017
【図１０】
2011501673.tif 000018
【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2011501673000001.app
【国際調査報告】
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