(57)【要約】ここに記載される発明は、藻類油を生成するための、藻類培養物を連続的に培養し、採取し、油を抽出するための系に関する。上記プロセスは、培養容器および培養培地を提供する工程、光合成微生物を上記培地に導入する工程、他の微生物よりも上記光合成微生物の増殖を助けるために、上記培地を至適化する工程、所望の密度への上記光合成微生物の増殖を促進する条件下で、上記培地中の上記光合成微生物を培養する工程、抽出技術を清澄にした培養培地に直接適用する工程、抽出後に、上記培地に直接分離技術を適用する工程、分離後に、上記培地を処理し、富化し、リサイクルするための方法を適用する工程、上記培養容器へ上記リサイクルされた増殖培地を連続的に戻す工程、および上記方法の工程を反復する工程、を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光合成微生物を連続的に培養し、採取し、抽出するための方法であって、該方法は、
ａ）増殖培地中の光合成微生物および該増殖培地中の該光合成微生物を、該光合成微生物の増殖を所望の密度へと促進する条件下で培養する工程；
ｂ）水相中の該培養培地の一部を、油抽出プロセスへ流すと同時に、該培養培地の一部を自己接種のために培養容器中に残しておく工程；
ｃ）細胞膜を破壊し油を遊離させることによって、該培養培地プロセスの連続水流中で、該光合成微生物中の該油を抽出する工程；
ｄ）該抽出培地の連続水流中で、該藻類油、リサイクル可能な培地、およびバイオマスを、該抽出培地から分離する工程；
ｅ）水相中の該リサイクル可能な培地を、処理プロセスおよび増強プロセスへと流す工程；
ｆ）新たな増殖培地として再使用するために、該リサイクル可能な培地の連続水流中で、該リサイクル可能な培地を処理および増強する工程；
ｇ）水相中の該新たな増殖培地を該培養容器へ流す工程；ならびに
ｈ）工程ａ）〜ｇ）を反復する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記培養容器が、外部環境に対して閉鎖されているかもしくは開放されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光合成微生物が、海洋性珪藻類である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記海洋性珪藻類が、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ種である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記培地が、
ａ．少なくとも３．０ｍｇ  Ｎ／リットルの窒素濃度を生成するための窒素；
ｂ．少なくとも２．７５ｍｇ  Ｐ／リットルのリン濃度を生成するためのリン；
ｃ．少なくとも５μｇ／リットルのビタミンＢ１２濃度を生成するためのビタミンＢ１２；
ｄ．少なくとも０．３ｍｇ／リットルの塩化鉄濃度を生成するための塩化鉄；
ｅ．少なくとも０．０１ｍｇ／リットルの硫酸銅濃度を生成するための硫酸銅；
ｆ．少なくとも１０ｍｇ  ＳｉＯ２／リットルのシリケート濃度を生成するためのシリケート；および
ｇ．５ｍｇ／リットルのＮａ２ＥＤＴＡ濃度を生成するためのＮａ２ＥＤＴＡ
からなる群より選択される成分のうちの１つ以上の添加によって至適化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培養容器が、日光に当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培養容器が、人工光源に当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地が、約２４時間の増加で抽出へと流される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地が、抽出へと流す前に、連続流において清澄にされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記微細藻類油が、流体力学的キャビテーションを使用して抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
流体力学的キャビテーションが、マルチステージキャビテーションチャンバを使用して達成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
流体力学的キャビテーションが、磁気インパルスキャビテーションを使用して達成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂質が、バイオディーゼルへのエステル交換反応のためにさらなるラウンドのキャビテーションに供される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記リサイクル可能な培地が、栄養素およびＣＯ２の添加によって処理および増強され、次いで、流体力学的キャビテーションを通して加工処理され、次いで、紫外線を通して加工処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記リサイクル可能な培地が、栄養素およびＣＯ２の添加によって処理および増強され、次いで、流体力学的キャビテーションを通して加工処理され、次いで、紫外線を通して加工処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
バイオ燃料を生成するための方法であって、該方法は、
ａ）請求項１に記載の方法に従う供給原料を採取する工程であって、該供給原料は、１種以上の脂肪酸である、工程；
ｂ）流体力学的キャビテーションを使用して該供給原料を分画し、脂質を生成する工程；および
ｃ）該脂質を該バイオ燃料に変換する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記脂質が、バイオディーゼルへのエステル交換反応のためにさらなるラウンドのキャビテーションに供される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、米国仮出願番号６１／０８６，１０６の優先権の利益を主張し、上記米国仮出願は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
開示される発明は、光合成微生物の連続的培養、採取および油抽出に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
化石燃料の代替が存在し、その必要性が高まっている。大きな関心および投資は、バイオ燃料の分野において行われてきた。バイオ燃料は、生物学的供給源に由来する、標準的な内燃機関中で燃焼させるために適した燃料である。バイオ燃料のために特に魅力的な生物学的供給源は、一部には、他の供給原料と（３００〜７００ガロン／エーカー／年）と比較した場合のその実質的に良好な収率（５０００〜１０，０００ガロン／エーカー／年）に起因して、藻類である。藻類の特定の株は、望ましい脂質プロフィール（例えば、脂質組成、マス（ｍａｓｓ）のパーセンテージとしての脂質濃度）から、燃料生成のために特に適している。
【０００４】
現在利用可能な藻類のバイオ燃料生成系は費用がかかり、バイオ燃料１ガロンあたり＄３０〜＄６０の生成コストを生じてしまい、大規模に実現可能ではない。これら現在の藻類生成系は、２つの大きな課題に直面している−（１）コストが非常に高い閉鎖培養系の使用、および（２）多量のエネルギーを必要とする非常に複雑な培養後プロセス。
【０００５】
培養系は、光合成プロセスが起こるように日光へのアクセスを提供しなければならず、かつ、優占微小藻類種が「侵入してくる」株の脅威無しに、妨げられずに増殖することを可能にしなければならない。今日、両方の目的を達成するために、多くの閉鎖系が、透明なプラスチックバッグもしくは透明なガラスチュービングを使用している。
【０００６】
これら閉鎖系は、代表的には、「侵入してくる」種からの脅威を防ぐ保護された環境を提供するように設計され、所望の形質を有する藻類種の単一培養（ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ）の培養を可能にする。しかし、閉鎖系は、それらの天然環境への曝露が原因で、長期間にわたって株の安定性を維持できない。侵入してくる野生型株を排除するように系が設計されているにも拘わらず、侵入点は存在する（例えば、バルブ、コネクタ、および他の機械部品）。所定の期間中、上記単一培養には、最終的に、バイオ燃料生成に好都合な形質を有さない、特定の環境に特有な１種以上の藻類の野生型株が侵入する。いったんこのことが起こると、上記閉鎖系は、所望の株の単一培養ではなくなり、このことは、本質的に、上記培養プロセスを「つぶす」。つぶされた系は、高価かつ時間浪費型の滅菌を要し、このことは、増大した生成コストおよび低下した収率を生じさせる。
【０００７】
さらに、単一培養のためのガラスチューブ系は、上記培養プロセスの間に生じるバイオフォルムの蓄積を除去するため、定期的にラインから外されなければならない。手入れされていないチューブは、徐々に不透明になり、太陽光線照射を制限し、光合成微生物の増殖に不適切になる。バッグ系は、代表的には、手入れされないが、代わりに使い捨てにされ、新たなバッグに換えられる。上記バッグ系は、チューブ系の手入れという要件を排除する一方で、費用がかかり、かつ、プラスチックが石油ベースであることから環境的にあまり有効でない。
【０００８】
閉鎖系において見いだされる別の問題は、至適増殖培地温度を維持するために費用のかかる冷却が必要なことである。上記培養サイクルの過程にわたって、実質的な熱が、光合成プロセスによって生成され、次いで、温室効果に起因して保持される。開放系（すなわち、熱が空気への曝露を介して自然に発散される）において生じる天然の排出がないので、閉鎖生成系は、熱を閉じ込めて保持し、このことは、その培養物に実質的に損害を与え、増殖率を低下させる。結果として、冷却系は、閉鎖系に必要であり、このことは、さらなるコストを要し、エネルギー効率に負の影響を及ぼす。
【０００９】
閉鎖培養系に伴うこれら課題の全体的影響は、高い資本コストおよび高い操業コストを生じさせる。結果として、バイオ燃料のための閉鎖系で培養される微小藻類は、経済的に現実味がない。
【００１０】
現在の培養後の系は、多量のエネルギーを必要とし、非常に複雑で、コストが非常に高い。さらに、上記プロセスは、バッチ指向型かつ非連続型であり、このことは、大規模産業化への障壁になっている。現在実施されているプロセスにおいて、上記プロセスのコストを上げている種々の付加的なもの、操業コスト、および資本コストが存在することに注意すべきである。さらに、加工処理の時間は、非常に長い（ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｖｅｌｙ  ｈｉｇｈ）。
【００１１】
現在の培養後の系における最初の工程は、採取プロセスである。採取は、代表的には、上記微小藻類を濃縮するために凝集を要し、その結果、上記微小藻類は、上記増殖培地から実質的に取り出され得る。誘導性凝集は最も一般的な方法であり、これは、界面活性剤（通常は、硫酸アルミニウムおよび塩化鉄（ＩＩＩ）もしくは市販製品のキトサン）の添加を要する。凝集は、培養物を０．０２〜０．０７％藻類（約１ｇ藻類／５０００ｇ水）程度の低い密度を有するようにし得、最大１％までの藻類の懸濁物と、９８％の藻類回収を達成し得る。第２の採取工程は、最大３〜４％までの藻類のスラリー濃度を達成するためにさらに必要とされる。溶存空気浮揚（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ａｉｒ  ｆｌｏａｔａｔｉｏｎ）が、しばしば使用され、このプロセスは、懸濁した微小藻類を除去することによって、上記増殖培地を清澄にするプロセスである。上記除去は、加圧下で上記増殖培地中に空気を溶解させ、次いで、浮揚タンクもしくは水盤（ｂａｓｉｎ）中で、上記空気を大気圧で放出することによって達成される。上記放出された空気は、微小藻類に接着する小さな気泡を形成し、この気泡は、上記懸濁された物体を水表面に浮遊させ、これらは、スキミングデバイス（ｓｋｉｍｍｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）によって除去され得る。
【００１２】
培養後における第２の主要な工程は、一次脱水および二次脱水である。大規模産業化への重大な妨げとなっている脱水は、抽出前に、ペースト様の粘稠度を達成するために必要とされる。一次脱水は、微小濾過と遠心分離とのいくつかの組み合わせを使用して起こり、微小藻類密度を、増殖培地容積のうちの少なくとも６〜８％へと上昇させる。さらなる増大（最大２０％までの藻類）が、さらなる遠心分離およびベルトフィルタープレスで達成され得るが、増大したエネルギー投入量およびコストで達成され得る。乾燥は、抽出のために必要とされる、より高度の乾燥マス濃度を達成するために必要とされる。乾燥は、一般に、熱を要するので、メタンドラムドライヤーおよび他のオーブンタイプのドライヤーが使用されてきた。しかし、そのコストは、増大する温度および／もしくは時間の増大とともに急激に上昇する。風乾は、低湿度気候においては可能であるが、余分の空間およびかなりの時間を要する。乾燥後、残っている脱水されたバイオマスは、抽出準備ができた状態である。
【００１３】
培養後加工処理における第３の工程は、抽出である。抽出は、細胞膜もしくは構造が破壊されるかもしくは粉々にされ、その結果、上記細胞内の油が放出され、その後分離および加工処理され得るプロセスである。最も一般的な抽出法は、上記バイオマスへのヘキサン溶媒の添加である。しかし、ヘキサンの使用は、実質的な課題を提示する。ヘキサンは、ＥＰＡがＨＡＰ（危険な空気汚染物質）として分類しかつＴＲＩ（有害化学物質排出目録（ｔｏｘｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ））プログラム下で管理する、揮発性で、可燃性かつ爆発性の物質である。固有の構造によって、最新の油加工処理施設ですら、ヘキサンを環境中へと放出してしまう。平均的な大きさのダイズの施設は、１日あたり６，０００ポンドのヘキサンを、大気への漏れを介して環境へ放出してしまっていると概算されている。高圧下で、機械的加圧を使用して、本質的に油を絞り出す油加圧／圧搾法は、ヘキサン溶媒としばしば組み合わされる。その後の、ヘキサンのコストの高い回収が必要とされる。
【００１４】
最終の培養後工程は、油、残っている増殖培地および有機物質が分離される、分離である。重力流機構および遠心分離の両方の組み合わせは、所望の油純度を得るために使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
全世界での化石燃料の需要は、圧倒的である。ＮＲＥＬ調査によれば、自動車燃料の米国消費は、１日に３億９０００万ガロンもしくは１年に約１４２０億ガロンである。よって、将来の産業的に現実味のあるバイオ燃料生成系は、劇的に低下したコスト構造および実質的な大規模生成量を達成することを必要とする。
【００１６】
現在の培養後プロセスの複雑さ、操作の非効率さおよびエネルギー強度は、藻類バイオ燃料１ガロンあたり＄３０〜＄６０の推定生成コストを生じ、現在の閉鎖系および複雑な培養後プロセスの使用が、化石燃料への産業的に現実味のある代替品を提供する可能性は低い。
【００１７】
さらに、多くの培養後プロセスは、あるプロセスから別のプロセスへ行くのに、多くのコストの高い、労働集約的な、時間のかかる移行工程を必要とする別個のバッチプロセスであるので、連続的かつ効率的な生成プロセスに適さない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
本明細書に記載される発明は、光合成微生物の連続的採取、培養、および油抽出のための方法、ならびに上記方法を実施するための装置に関する。好ましい実施形態において、上記方法は、培養容器および培養培地を提供する工程；上記光合成微生物を上記培地に導入する工程；他の微生物よりも上記光合成微生物の増殖を助けるために、上記培地を至適化する工程；所望の密度への上記光合成微生物の増殖を促進する条件下で、上記培地および上記培地中の上記光合成微生物を培養する工程；抽出技術を清澄にした培養培地に直接適用し、それによって、一次採取と二次採取、および一次脱水と二次脱水を排除する工程、抽出後に、上記培地に直接分離技術を適用する工程、分離後に、上記培地を処理し、富化し（ｅｎｒｉｃｈ）、リサイクルするための方法、および上記培養容器へ上記リサイクルされた増殖培地を連続的に戻すことを適用する工程；ならびに上記方法の工程を反復する工程、を包含する。
【００１９】
好ましい実施形態において、上記抽出法は、流体力学的キャビテーションを、増殖培地中の微小藻類の連続流に適用して、細胞壁を破壊し、上記微細藻類油を抽出する工程を包含する。
【００２０】
好ましい実施形態において、上記分離法は、重力流と静水浮揚バッフル（ｈｙｄｒｏ  ｓｔａｔｉｃ  ｆｌｏｔａｔｉｏｎ  ｂａｆｆｌｅ）と組み合わせて、上記油、増殖培地および有機物を分離する工程を包含する。
【００２１】
好ましい実施形態において、上記処理、富化およびリサイクル法は、流体力学的キャビテーションと組み合わせた紫外線を、分離後の培地の連続流に適用して、細菌、侵入光合成生物、および他の不要な有機物を排除し、それによって、再利用のために培地を滅菌する工程、および改善された培養増殖特徴のために上記培養培地を増強する工程、を包含する。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態は、分画を使用して上記培養された光合成微生物を採取することおよび流体力学的キャビテーションを使用して上記採取されたバイオマスを抽出することを包含する。
【００２３】
本発明はさらに、上記の記載される方法によって生成される、採取された物質からバイオ燃料を生成することに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載される発明は、藻類油の産業的生成のために、藻類培養物を連続的に培養し、採取し、油抽出するための系に関する。上記プロセスは、代表的には、培養工程、抽出工程、分離工程、およびリサイクル工程を包含し、これら工程の各々は、以下で議論される。好ましくは、本明細書に記載される方法は、上記生成物を効率的に生成するために添加剤の添加を必要としない。さらに、現在記載される方法は、よりコスト効率的であり、かつ短時間の加工処理時間しか要しないという利点を有する。
【００２５】
上記連続流体系は、コスト効率的な培養プロセスと、一次採取と二次採取および一次脱水と二次脱水のコストが高くエネルギー集約的なバッチ工程を排除する、実質的に合理化された培養後プロセスとを併せ持つ。これらバッチ工程の排除は、脂質取得モードへ切り替える前に、光合成生物が増殖モードにとどまり得る期間を延ばすというさらなる利点を有する。例えば、珪藻類であるＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．は、連続流体系において１日あたり４回の倍加を達成するのに対して、現在の複雑なバッチ系においては１日に３回の倍加を達成する。結果として、３５００ガロン／エーカー／年から５５００ガロン超／エーカー／年へ収率が改善する。
【００２６】
上記連続流体系は、以下の完全に一体化された連続貫流工程（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｆｌｏｗ  ｓｔｅｐ）から構成される。（１）光合成生物の好ましい株の優占を維持する培養プロセス、（２）連続移動流中の清澄にした増殖培地を直接加工処理して、細胞膜を破壊し、藻類油を放出させる抽出系、（３）上記工程２からの移動流を直接加工処理して、油、増殖培地および有機物を分離し、９９．９％の油純度を達成する分離系、ならびに（４）上記工程３からの増殖培地を直接加工処理して、細菌および不要の光合成生物を排除し、必要とされる栄養素を注入して残っている増殖培地を富化し、次いで、富化された増殖培地を上記培養系に戻してリサイクルする、処理、富化およびリサイクル系。
【００２７】
好ましい実施形態において、光合成生物のうちの１つ以上の株が、培養のために選択される。上記増殖株は、適切な培養系に入れられて、上記培養物を採取するのに適した密度へ増殖させられる。いったん所望の密度が達成されたら、上記培養培地は、清澄装置（ｃｌａｒｉｆｉｅｒ）へと流れ、ここでは、藻類増殖の８０％を有する培養培地のうちの２０％が、抽出へと連続して流れる。残りの培地は、自己接種のために上記培養系に残る。上記抽出工程は、流体力学的キャビテーションを使用して細胞膜を破壊するかまたは粉々にし、藻類油および他の構成成分の放出を可能にする。いったん油のうちの９５％が放出されたら、上記培地は、分離へと直接流れる。重力フロースルー静水浮揚バッフルを使用して、上記油、増殖培地および有機物は、分離される。上記残りの増殖培地は、処理、富化およびリサイクルプロセスへと直接流れる。流体力学的キャビテーションと組み合わされた紫外線を使用して、上記増殖培地を滅菌し、必要とされる栄養素を注入する。次いで、上記流れは、リサイクルされ、その後のラウンドの培養のために戻される。
【００２８】
（光合成微生物）
用語「光合成微生物」とは、本明細書で使用される場合、光合成増殖が可能な全ての藻類および微小藻類、ならびに光合成細菌を包含する。真核生物である藻類株が、開示される方法論での使用に好ましい。例としては、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｅｎｅ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ  ｓｐ．、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｓｐ．、Ｓｐｉｒｏｌｉｎａ  ｓｐ．、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．（例えば、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｕｍ  ｓｐ．、およびＰｌｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．（例えば、Ｐｌｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｃａｒｔｅｒａｅ）が挙げられる。珪藻類（例えば、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．）は、本明細書に記載される発明で使用するのに特に好ましい藻類株である。これら用語はまた、人工的に改変された生物もしくは遺伝子操作によって改変された生物を含み得る。例えば、米国特許出願第１２／２０８，３００号（名称「ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ  ＬＩＧＨＴ−ＨＡＲＶＥＳＴＩＮＧ  ＯＲＧＡＮＩＳＭＳ」（これはその全体が本明細書に参考として援用される））は、開示される方法で使用するのに適した生物の例を開示している。
【００２９】
Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．は、本明細書に記載される発明での使用に特によく適している。４００を超える種および亜種が全世界を通じて知られている。この生物の増殖速度は迅速で、１日あたり３〜４回倍加し、培養物が迅速に増殖することを可能にしている。これらの生物は、温度、塩分および太陽光照射を含む環境条件に対して広い許容性を有することが公知である。Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．はまた、都合のよい脂質割合（最大４０％まで）、魅力的な脂肪酸プロフィールを有することが公知であり、その高い増殖速度と組み合わせた場合に、天然で、高収率、高品質の藻類油を生じ得る。
【００３０】
複数の微生物が、種ストック（ｓｅｅｄ  ｓｔｏｃｋ）として使用され得、複数の光合成微生物が、種ストックとして使用される。あるいは、光合成微生物は、有益な非光合成微生物とともに共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）され得る。
【００３１】
（培養）
培養のために選択される微生物は、関連分野の技術者に公知の任意の従来の方法によって増殖させられ得る。各生物についての好ましい至適条件が、使用される。至適条件は、上記光合成微生物の種ストックが増殖し、生成効率を低下させ得る夾雑物および他の不要な生物との競合に勝つ（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅ）条件である。好ましくは、至適条件は、以下の構成成分のうちのいくつかもしくは全ての濃度を最初に調節することによって、水性培地中で達成される：窒素、リン、ビタミンＢ１２、塩化鉄、硫酸銅、シリケートおよびＥＤＴＡナトリウム。上記培養培地のｐＨは、調節しながら（例えば、二酸化炭素処理）連続してモニターされ、調節は、所望のレベルのｐＨを維持するために行われる。
【００３２】
上記生物の培養は、例えば、開放系もしくは閉鎖系、またはこれらの組み合わせで行われ得る。開放系は、閉鎖系と比較して、資本投資、エネルギー投入量、および操作維持コストにおいて顕著な低下があることから好ましく、開放系は、代表的には、閉鎖系より安定である。例えば、天然もしくは人口設計である浅い池を含む水路池（ｒａｃｅｗａｙ  ｐｏｎｄ）は、藻類の培養に有用である。開放系を使用して、培養物における優占株を維持するための好ましい培養法は、米国特許第６，６７３，５９２号（これは、本明細書に参考として援用される）に記載されている。チューブ、バッグ、タンクなどを含む閉鎖系はまた、本明細書で開示される方法とともに使用され得る。
【００３３】
簡潔にまとめると、上記培養系は、培養培地を保持するための容器を含む。上記培養培地は、最初の水溶液および１種以上の生物の種ストックを含み、代表的には、上記生物のうちの少なくとも１種が、光合成微生物である。上記最初の水溶液は、上記目的の光合成微生物を培養するための至適条件が確立されるように、調製される。いったん上記至適条件が確立されると、上記水溶液は、少なくとも１種の光合成微生物を含む種ストックが接種される。得られた培養培地は、設定範囲においてｐＨ制御される。上記ｐＨ範囲は、１種以上の光合成微生物の要求に応じて変動する。光源（好ましくは、日光）は、光および熱を上記培養培地に届け、上記光合成微生物培養物の増殖を促進する。周期的に、あるパーセンテージの上記光合成微生物培養培地が、清澄装置を通って抽出へと流れる。除去された培地は、リサイクルされた培地もしくは非滅菌培地（例えば、海水）で置換される。上記方法は、連続して反復され、それによって、連続した生成を提供する。
【００３４】
選択される光合成微生物を培養するための至適条件は、代表的には、水性培地中で確立される。至適条件は、光合成微生物の種ストックが増殖することを可能にし、捕食者、夾雑物および他の潜在的な清掃動物（ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）との競合に勝つ条件である。このような培地を作り出すことは、野外および非滅菌条件下での光合成微生物の大量生産を可能にする。好ましくは、至適条件は、以下の構成成分のうちのいくつかもしくは全ての濃度を最初に調節することによって、上記水性培地中で達成される：窒素、リン、ビタミンＢ１２、塩化鉄、硫酸銅、シリケートおよびＮａ２ＥＤＴＡ。上記培養培地のｐＨは、調節しながら（例えば、二酸化炭素処理）、モニターされ、調節は、上記ｐＨを所望のレベルに維持するために行われる。
【００３５】
好ましい実施形態において、本発明の系は、上記光合成微生物としてＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．を培養するために使用される。上記容器は、以下の出発特徴を有する水性培地を保持する：約８．２の二酸化炭素制御されたｐＨ、少なくとも３．０ｍｇ  Ｎ／リットルの出発窒素濃度、少なくとも２．７５ｍｇ  Ｐ／リットルの出発リン濃度、少なくとも５μｇ／リットルの出発ビタミンＢ１２濃度、少なくとも０．３ｍｇ／リットルの出発塩化鉄濃度、少なくとも０．０１ｍｇ／リットルの出発硫酸銅濃度、少なくとも１０ｍｇ  ＳｉＯ２／リットルの出発シリケート濃度、および５ｍｇ／リットルのＮａ２ＥＤＴＡ濃度。上記培地は、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．光合成微生物の種ストックが接種され、直射日光に曝される。上記光合成微生物は、開放環境において増殖し、周期的にかつ連続して、上記抽出プロセスへと流される。この容積は、リサイクルされた培地もしくは非滅菌培地（例えば、海水）で置換される。次いで、培養は、連続して反復される。その採取された容積は、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．光合成微生物の新たな種ストックで置換され、培養が反復される。
【００３６】
任意の光源が本発明の系において使用され得るが、完全な強度の日光の下で上記光合成微生物を培養することが、最も経済的な選択肢である。
【００３７】
あるパーセンテージの上記培養物は、周期的に採取される。好ましくは、上記培養物容積のうちの約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％が、各期間の終わりに採取される。好ましくは、上記藻類培養物のうちの約８０％を有する、上記培養物容積のうちの約２０％が、各期間の終わりに抽出へと流される。本発明の系および方法の好ましい実施形態において、上記培養物は、抽出へと流されるか、または、そうでなければ１日に１回、すなわち、２４時間毎に約１回採取される。滅菌条件は必要とされないので、上記採取された容積は、リサイクルされた増殖培地もしくは非滅菌の光合成微生物の種ストック（例えば、海水）で容易に置換される。上記容積は、好ましくは、手動で採取されるか、または任意の許容可能な採取機械もしくは装置を使用して採取される。
【００３８】
上記容器は、任意の受容可能な寸法であり得、かつ任意の受容可能な材料から構築され得、好ましくは、開放上部を有する。好ましくは、開放タンク（例えば、水路タイプの大きなタンクもしくは池）は、上記容器として使用される。上記容器もしくはタンクは、地面の上に配置されて、日光が上記容器の側面を介して通るようにされ得る。あるいは、上記容器もしくはタンクは、地面の中に配置され得る。透明な光を通すカバーが、開放上部の上に配置され得る。一実施形態において、上記カバーは、上記開放上部の上に取り外し可能に配置される。
【００３９】
上記至適条件で光合成微生物を培養することによって、光合成微生物の大量生産が、コスト効率的な様式で可能である。単一の容器は、野外環境に設置され、その結果、上記容器の内容物は、天然光に直接曝される。人工光源もさらなる移動タンクも必要とされない。夾雑物および捕食者は、上記確立された培地条件が、上記光合成微生物が競合に勝ち、不要なもしくは有害な種を圧倒することを可能にするので、回避される。
【００４０】
Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．光合成微生物のための上記至適培養条件を確立することによって、本発明の系は、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．光合成微生物が、上記培養物に由来する光合成微生物の他の種との競合に勝つ環境を提供する。このことは、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．光合成微生物が天然光を使用して、大きな野外の容器中で連続して培養されることを可能にする。上記培養物から他の種を排除するように設計された労働集約的かつコストが高い系に必要なことは、排除される。開放容器および天然光の使用は、閉鎖系と関連する冷却のコストおよび維持の問題を大いに減らす。
【００４１】
（採取）
種々の方法論が、本明細書に記載される方法に従って培養される上記光合成微生物を採取するために使用され得る。１つの好ましい実施形態において、上記光合成微生物は、泡分画（ｆｏａｍ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）を使用して、上記培養培地から採取される。この方法論は、上記生物を採取するために気泡（ｂｕｂｂｌｅ）を利用する。適切な泡分画は、上記培養培地内で微細な気泡の流れを生成する。上記気泡を提供する並流系もしくは逆流系が、利用され得る。好ましくは、上記培地は、上記培養容器から分画カラムへとポンプでくみ上げられ、上記分画カラムは、上記採取プロセスを最大にするように垂直に配置される。上記培地が上記チャンバを満たし、上記チャンバを通って流れていくにつれて、上記培地は、微細な気泡のカラムと接触した状態になる。上記気泡は、上記光合成微生物（バイオマス）、タンパク質、細菌夾雑物、および他の物質と相互作用し、これらを上記気泡が泡を形成する上記カラムの上部へと運ぶ。上記分画された培地は、さらなる分画のために上記カラム中で再循環され得るか、またはくみ上げられて、好ましくは、上記培養容器へ戻され得る。上記泡は集められ、次いで、さらなる加工処理のために、液体へと濃縮される。上記濃縮物は、上記採取されたバイオマスを含む。種々の凝集剤は、上記プロセスを増強するために使用され得る。例示的な凝集剤としては、キトサン、塩化鉄（ＩＩＩ）、および明礬が挙げられる。いくらかの生物は、それら自身の凝集剤を生成するように誘導され得る。
【００４２】
適切な分画装置は、上記光合成微生物および他の有機化合物を、上記培地から抽出し得る。この作用は、培養生成物を採取するように働き、ならびに有害な夾雑物を除去することによって上記培養培地の品質を改善するように働く。好ましい実施形態において、泡分画装置を使用すると、上記培地中の溶存酸素がまた、上昇し得る。
【００４３】
上記泡分画プロセスの構成要素は、界面活性剤を含む。代表的には、外因性の界面活性剤が、上記分画プロセスの前に（ｐｒｉｏｒ  ａｒｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）上記培養培地に添加され得る。あるいは、内因性の界面活性剤が、上記光合成微生物によって生成され得る。例えば、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．は、上記泡分画プロセスで活用され得る界面活性剤を生成し、排出する（特に、上記系がストレス下、特に、栄養素ストレスの下におかれている場合）ことが公知である。好ましくは、上記ストレスは、採取前に、代表的には、採取の約１時間前に、上記増殖している培地に適用される。外因性界面活性剤を使用することが、必要な場合に、界面活性剤を排出する光合成微生物を増殖させるために使用される培養培地に加えられ得ることが企図される。
【００４４】
好ましくは、上記泡分画プロセスは、上記培養培地から上記培養された光合成微生物を除去するにあたって、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の効率である。上記プロセスにとって重要な制御変数としては、気泡サイズ、空気流速、細胞密度、オーバーフロー高度、および実行時間（ｒｕｎ  ｔｉｍｅ）が挙げられる。好ましい実施形態において、上記培養培地の完全な除去もしくは滅菌は達成されない。その結果、上記培養容器に戻された上記分画された培地は、別のラウンドの生成のために培養物を再度播種するのに十分な量の上記光合成微生物を含む。必要であれば、外因性の一定量の上記光合成微生物が、上記分画された培地に添加され得る。必然的に、上記好ましい株を優先的に増殖させるためのさらなる栄養素および他の成分もまた、上記分画された培地が上記培養容器に戻される前もしくはその後に、添加され得る。上記分画された培地は、上記培養容器に戻る前に、キャビテーションに供され得る。
【００４５】
別の実施形態において、上記培養培地は、泡分画なしに、上記抽出工程へ直接流された。
【００４６】
（抽出）
上記分画物からの、望ましい成分の効率的な単離を可能にする任意の抽出プロトコルが、本明細書に記載される発明で使用され得る。好ましくは、連続生成プロセスを可能にするように移動する液体流に適用される抽出法が、静的なバッチプロセスより好ましい。なぜなら、連続生成法は、最終のバイオ燃料もしくは他の生成物を生成するコストを顕著に低下させるからである。
【００４７】
抽出技術の選択は、培養物中の上記光合成微生物の性質に大いに依存する。有機性の壁を持った微小藻類は、ヘキサン溶媒および酵素的抽出に適している。しかし、シリカの壁を持った微小藻類（珪藻類）は、それら自身の細胞壁を極めて不溶性にしている。さらに、シリカは、物理的に強くかつ化学的に不活性な保護的被覆を作り出す。なぜなら、上記細胞壁は、酵素的に攻撃され得ないからである。珪藻類（例えば、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．）の上記シリカ細胞構造は、上記分画プロセスの間に採取した上記培養生物から、上記油および脂質を遊離させ、高品質シリカ（珪藻土）の単離を可能にする種々の細胞破壊技術の使用を可能にする。好ましい細胞破壊技術は、流体力学的キャビテーションであり、これは、有機性の壁を持った光合成生物およびシリカの壁を持った光合成生物の両方に効率的に適用され得る。
【００４８】
キャビテーションは、速やかに動く頑丈なボディー（例えば、プロペラ）によるか、もしくは高強度の音波による、液体中の部分減圧の形成である。上記部分的減圧は、上記光合成微生物を破壊するために使用される。種々の異なる流体力学的キャビテーション技術が、当該分野で公知である。例えば、米国特許出願第１２／１４４，５３９号、発明の名称「ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＣＡＶＩＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＦＥＡＴＵＲＥＳ  ＩＮ  Ａ  ＦＬＵＩＤ  ＭＥＤＩＵＭ」；米国特許出願第号、発明の名称「ＥＬＥＣＴＲＯＨＹＤＲＡＵＬＩＣ  ＡＮＤ  ＳＨＥＡＲ  ＣＡＶＩＴＡＴＩＯＮ  ＲＡＤＩＡＬ  ＣＯＵＮＴＥＲＦＬＯＷ  ＬＩＱＵＩＤ  ＰＲＯＣＥＳＳＯＲ」；米国特許出願第１２／１６７，５１６号、発明の名称「ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＰＲＯＤＵＣＩＮＧ  ＢＩＯＤＩＥＳＥＬ  ＦＲＯＭ  ＦＡＴＴＹ  ＡＣＩＤ  ＦＥＥＤＳＴＯＣＫ」；ならびに米国特許第５，８１０，０５２号；同第５，９３１，７７１号；同第５，９３７，９０６号；同第５，９７１，６０１号；同第６，０１２，４９２号；同第６，５０２，９７９号；同第６，８０２，６３９号；同第６，８５７，７７４号、および同第７，２０７，７１２号（全て、種々の流体力学的キャビテーションデバイスを教示し、これらは全て、その全体が本明細書に参考として援用される）。
【００４９】
好ましい実施形態において、流体中に流体力学的キャビテーションを作り出すためのデバイスが、利用される。代表的には、上記デバイスはフロースルーチャンバを含み、これは、種々の部分および上記チャンバの下流部分の一つの中の複数のバッフルを有する。上記バッフルのうちの１つ以上は、上記チャンバの上流部分へ動けるように構成され、上記チャンバの上流部分へ動かされた各バッフルから下流で流体力学的キャビテーション領域を生成する。
【００５０】
別の好ましい実施形態において、流体中の流体力学的キャビテーションを作り出すための磁性式衝撃スデバイスが利用される。
【００５１】
キャビテーション（液体中のガスもしくは蒸気が充填された気泡の形成、成長、および内破的崩壊（ｉｍｐｌｏｓｉｖｅ  ｃｏｌｌａｐｓｅ））は、実質的に化学的かつ物理的な効果を有し得る。音波キャビテーション（すなわち、音響化学および音ルミネセンス）の化学的効果が、近年広範囲に調査されてきた一方で、液体の乱流中に作り出される流体力学的キャビテーションの化学的結果については、ほとんど何も知られていない。
【００５２】
流体力学的キャビテーションは、液体流内もしくは流線型のボディーの境でのキャビテーション気泡および空洞の形成であり、上記液体流中の局所的な圧力低下から生じる。上記液体の移動のプロセスの間に、いくつかの点での圧力が、上記液体が（この圧力についての）沸点に達する大きさより低下する場合（「沸点低下（ｃｏｌｄ  ｂｏｉｌｉｎｇ）」）、非常に多くの蒸気が充填された空洞および気泡が形成される。これら蒸気が充填された空洞および気泡は、キャビテーション空洞およびキャビテーション気泡といわれる。上記蒸気が充填された気泡および空洞が上記流れと一緒に移動する限りにおいて、上記気泡および空洞は、高圧ゾーンへと移動する。次いで、ほぼ即時に、蒸気濃縮（ｖａｐｏｒ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）が、上記空洞および気泡中で起こり、それらはつぶれ、非常に大きな圧力衝撃を作り出す。上記つぶれている最中のキャビテーション気泡内の圧力衝撃の大きさは、１５０，０００ｐｓｉに達し得る。これら高圧内破の結果は、各つぶれたキャビテーション気泡の点から発せられる衝撃波の形成である。このような高い衝撃負荷は、上記つぶれつつあるキャビテーション気泡付近で見いだされる任意の培地の崩壊を生じる。懸濁物中の液体−固体粒子の相分離の境界付近でのキャビテーション気泡のつぶれは、上記懸濁物粒子の崩壊を生じる：分散プロセスが生じる。液体−液体タイプの相分離の境界付近でのキャビテーション気泡のつぶれは、分散相の液滴の崩壊を生じる：キャビテーションプロセスが生じる。従って、つぶれつつあるキャビテーション気泡および空洞からの運動エネルギーの使用は、微小藻類から脂質を抽出するために、および上記増殖培地を再使用のために滅菌するために、本発明者らのキャビテーションプロセスにおいて使用される。
【００５３】
（キャビテーションミキサー−ホモジナイザー反応器の操作の原則）
その最も単純な形態において、基本的なキャビテーションは、上記フロースルーチャンバと、入り口に位置したキャビテーション発生器からなる。上記キャビテーション発生器の形状は、上記キャビテーション流の特徴、応じて、分散の質に顕著に影響を及ぼす。その至適なキャビテーション発生器の設計は、マルチステージキャビテータの中で選択される。一般に、上記キャビテーション発生器は、以下の様式で機能する。圧力Ｐ１下で加工処理されるべき成分の流れは、上記フロースルーチャンバの入り口にある補助ポンプの助けにより充填される。さらに、上記流れは、キャビテーション発生器の周りに流れていき、その後、局所の圧縮（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）の結果として、キャビテーション空洞が形成される。この空洞はその後部部分とともに、多くの気泡を含む。上記キャビテーション気泡は、上記フロースルーチャンバの出口への流れとともに、高圧ゾーンＰ２の中へと流れる。このゾーンにおいて、上記キャビテーション気泡はつぶれ、懸濁物中の乳化液滴、粒子、もしくは集合した粒子に対して動的な影響を生じる。
【００５４】
しかし、本発明者らのプロセスにおいて、正確に計算され設計されたデザインが、マルチステージ流体力学的キャビテーション操作の物理的原則を最大にするために使用される。
【００５５】
（マルチステージキャビテーションの利点）
その操作の物理的原則とは無関係に、達成される粒度は、上記分散のプロセスにおける１つの主要なパラメーターである、上記キャビテーション反応器およびキャビテーションポンプにおけるエネルギー消散のレベルに依存する。上記反応器のキャビテータチャンバにおけるエネルギー消散のレベルが高いほど、任意の所定の培地で達成され得る粒度は小さくなる。
【００５６】
上記好ましいマルチステージ流体力学的キャビテーション反応器は、最も小さい粒度を達成し得る。キャビテーション反応器におけるエネルギー消散のレベルは、キャビテーション気泡領域における３つの極めて重大なパラメーターに主に依存する：キャビテーション気泡の大きさ、上記分散媒中でのそれらの濃縮体積、およびつぶれるゾーンにおける圧力。これらパラメーターを考慮すると、上記反応器におけるキャビテーション型を制御し、必要とされる分散の質を達成することが可能である。
【００５７】
上記の例において、キャビテーション気泡の体積濃度は、約１０％であった。これは、キャビテーション反応器で通常達成される濃度レベルの下端である。上記反応器におけるキャビテーションのタイプを変更することによって、１０％から６０％へと上記領域における気泡の体積濃度を変化させること、および１０μｍから１０００μｍへとそれらの大きさを変化させることが可能である。多数のキャビテーション気泡がつぶれる間に生成されるエネルギー消散の非常に高いレベルは、上記キャビテーション混合ポンプおよびマルチステージ流体力学的反応器が非常に小さな粒度および非常に均一な粒度分布を生成することを可能にする。上記結果は、５００ｐｓｉ操作圧で生成され、このことは、上記装置を毎日の加工処理操作に関して安全にする。
【００５８】
バイオディーゼル変換適用について、流体力学的２ステージキャビテーションプロセスは、分子レベルでの上記反応器中の成分混合である。反応器の中の全ての成分は、高圧衝撃および高度な、制御された流体力学的キャビテーションに影響を受ける。流体力学的反応器において、必要な成分とともに植物性油を加工処理する間に、脂肪酸の分子は、微小破裂によって壊れてばらばらになる；それは、粘稠度低下、セタン価増加、および生成された燃料の改善された出力パラメーター（ｐｏｗｅｒ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を生じる。エステル化反応の速度および質はまた、顕著に増大する。
【００５９】
上記流体力学的キャビテーション技術は、種々の有機性油をバイオディーゼルへ変換するために使用され得る。代表的には、植物性油（例えば、ラッカセイ油、椰子油、大豆油など）は、エステル交換反応に供されて、バイオディーゼルが生じる。上記で議論したキャビテーション技術は、バイオディーゼルを生成するためにこれら植物性油とともに使用され得る。上記バイオディーゼルは、そのままで（Ｂ１００）使用され得るか、石油から生成されたディーゼルと混合され得るか（例えば、Ｂ９９）、そして／または上記バイオ燃料の品質を改善するために他の添加剤と混合され得る。
【００６０】
好ましくは、本明細書で記載されるキャビテーション技術は、上記培養された光合成微生物によって生成された油を抽出するため、ならびに上記油をバイオディーゼルおよび他の組成物（グリセリンのような）へ変換するために、使用される。この技術の利点は、他の抽出プロセスにおいて必要とされる採取工程および脱水工程の必要性を排除することである。一実施形態において、上記増殖培地のかなりの部分が、上記微小藻類細胞構造を破壊しかつ上記油および他の成分を上記微小藻類細胞から抽出するキャビテーションへと、直接供される。微細藻類油、微小藻類細胞バイオマス、および採取した培地からなる得られた培地は、分離のための分離プロセスへと流される。
【００６１】
流体力学的抽出は、経済的かつ連続的プロセスへと容易に組み込まれるので、微細藻類油からの低コストバイオ燃料の生成を可能にする。１０ガロン／分反応器を使用する流体力学的抽出のコストは、処理された液体１ガロンあたり約＄０．００２である。これは、採取、脱水、および既存の抽出技術の代替併用コスト（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｃｏｓｔ）より数桁小さい。新たなより高速の流速反応器の設計は、上記コストを顕著に下げる。さらに、流体力学的抽出は、コストの高い添加剤もしくは化学物質の添加およびその後の除去を必要としない。流体力学的抽出はまた、微細藻類油生成についての珪藻類の採用を高める。
【００６２】
（分離）
連続生成プロセスを可能にするために連続移動流に適用される分離法は、静的バッチプロセスより好ましい。なぜなら、連続生成法は、最終のバイオ燃料もしくは他の生成物を生成するコストを顕著に低下させるからである。
【００６３】
分離は、排出物の種々の成分（油、水、および懸濁された有機性の固体を含む）がさらなる加工処理もしくは処分のために別個の流れへと分離されるプロセスである。抽出後の光合成生物の加工処理において、得られた培地は、藻類油、水および栄養素を含む増殖培地、ならびに上記細胞および細胞膜に由来する有機物から構成される。分離は、以下の理由から、上記成分のうちの各々について必要とされる−さらなる加工処理およびバイオ燃料生成物への変換のための藻類油、滅菌およびリサイクルのための上記増殖培地、ならびに処分もしくは潜在的な再販売のための有機物（珪藻類シリカの場合において）。
【００６４】
上記分離プロセスは、油滴の密度および大きさに基づいて、油滴の上昇速度を規定するために、ストークスの法則を使用することによって設計される。上記分離装置の設計は、上記油と廃水との間の比重の差異に基づく。なぜなら、その差異は、上記懸濁された固体と水との間の比重の差異より遙かに小さいからである。設計基準に基づいて、上記懸濁された固体の大部分は、沈降層として上記分離装置の底に沈殿し、上記油は、上記分離装置の上部に浮かび上がり、上記排水は、上部にある上記油と底にある上記固体との間の中間層にある。
【００６５】
好ましい実施形態において、上記分離プロセスは、連続移動流に適用され、時間を浪費する沈殿の必要性を排除する。
【００６６】
別の好ましい実施形態において、上記分離ユニットは、静水加圧浮揚バッフル（ＨＰＦＢ）からなる。上記混合物は、ＨＰＦＢユニットに入り、上記ユニットにおいて、層状かつシヌソイド様（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ）の流れが確立され、上記油は、上記浮揚バッフル表面に衝突する。油が蓄積するにつれて、上記油は、より大きな液滴へと合体し、これらが上部に到達するまで、上記浮揚バッフルを介して上昇し、そこで上記液滴は離れ、水面に浮かび上がる。同時に、固体は上記浮揚バッフルに接触し、受け水盤（ｃａｔｃｈ  ｂａｓｉｎ）へと滑り落ちる。
【００６７】
（処理、富化およびリサイクル）
分離後、上記成分のうちの１つは、残りの増殖培地である。この増殖培地は、水、栄養素、細菌および不要の光合成生物からなる。代表的な生成系において、上記増殖培地は、非滅菌状態であり、添加された栄養素が原因で潜在的に有害であると考えられ、処理される。しかし、これは、コストが高くかつ潜在的に環境に都合が悪い。
【００６８】
本発明において、上記増殖培地は、連続移動流中で処理され、富化され、リサイクルされる。そしてこの第１ラウンドのキャビテーションから生成された上記脂質およびバイオマスは、バイオディーゼルおよびグリセリンの生成を生じるその後のラウンドのキャビテーションに供され得る。例えば、米国特許出願第１２／１６７，５１６号（これは、脂肪酸供給原料からバイオディーゼルを生成することを開示する）を参照のこと。上記分画された培地は、上記培養容器へ戻すように分路され得る。また、上記で議論されるように、上記培養培地は、泡分画工程を省略して、キャビテーションに直接供され得る。上記生成物成分（例えば、脂質）のキャビテーションおよび除去後に、上記培地は、上記培養系に戻される。上記培地は処理され、滅菌されて、細菌および不要な光合成生物が排除され、さらなる栄養素が、上記増殖培地へ添加および注入され、上記富化された増殖培地は、上記培養系へと戻すように流される。
【００６９】
好ましい実施形態において、流体力学的キャビテーションと組み合わされた紫外線は、上記増殖培地を処理、富化およびリサイクルするために使用される。流体力学的キャビテーションの特有の特性と組み合わせた紫外線は、上記キャビテーション気泡の大きさ、流速および内破力を調整することによって、細菌および他の不要な光合成生物を死滅させるために使用される。この同じ調整が、添加された栄養素をナノサイズ粒子へと分解するために行われ、その結果、上記粒子は、上記増殖培地へと注入され、より均一な分布を可能にする。この均一な分布は、培養収量の増大という潜在的な利点を有する。
【００７０】
上記処理、富化およびリサイクルプロセスは、代表的な系と関連する処分のかなりのコストを除去し、上記増殖培地に残っている水および使用されなかった栄養素をリサイクルすることによって、さらなるコスト節減を提供する。
【００７１】
（バイオ燃料調製）
バイオ燃料は、生物学的供給源に由来する任意の燃料である−−近年は、生きている生物もしくはそれらの代謝副生成物（例えば、光合成生物由来の脂肪酸）。バイオ燃料は、生きている生物の代謝生成物に由来する燃料としてさらに定義され得る。好ましいバイオ燃料としては、バイオディーゼル、バイオクルード、エタノール、ブタノール、およびプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
代表的な脂肪酸としては、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸が挙げられる。飽和脂肪酸は、いかなる二重結合も他の官能基も含まない。不飽和脂肪酸は、炭素−炭素二重結合を有する２つ以上の炭素原子を含む。飽和酸としては、ステアリン酸（Ｃ１８；１８：０）、パルミチン酸（Ｃ１６；１６：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４；１４：０）、およびラウリン酸（Ｃ１２；１２：０）が挙げられる。不飽和酸としては、リノレン酸（ｃｉｓ，ｃｉｓ，ｃｉｓ  Ｃ１８；１８：３）、リノール酸（ｃｉｓ，ｃｉｓ  Ｃ１８；１８：２）、オレイン酸（ｃｉｓ  Ｃ１８；１８：１）、ヘキサデカン酸（ｃｉｓ，ｃｉｓ  Ｃ１６；１６：２）、パルミトレイン酸（ｃｉｓ  Ｃ１６；１６：１）、およびミリストレイン酸（ｃｉｓ  Ｃ１４；１４：１）のようなものが挙げられる。
【００７３】
分離および精製技術と組み合わされた、中鎖（Ｃ１０〜Ｃ１４）および／もしくは長鎖（Ｃ１６より長い）脂肪（天然合成されたカルボン）酸の熱クラッキングおよび触媒クラッキングが、燃料もしくは燃料ブレンドストックとして（最も具体的には、ディーゼル、灯油、航空タービン燃料、および自動車ガソリン燃料中の成分として）使用するのに適した化学物質の混合物を生成し得ることは、公知である。バイオマスから燃料を得るための方法の例は、米国特許出願第１１／８２４，６４４号（ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＣＯＬＤ  ＳＴＡＢＬＥ  ＢＩＯＪＥＴ  ＦＵＥＬ）（これは、本明細書に参考として援用される）に記載されている。米国特許出願第１１／８２４，６４４号は、−１０℃より低い曇り点を有するバイオマス由来の燃料を生成するためのプロセスを記載する。本発明は、短鎖カルボン酸およびカルボン酸エステルを生成し得ると同時に、燃料もしくは燃料ブレンドストックとして使用するのに適した物質もまた生成するプロセスを記載する。短鎖カルボン酸および酸エステルと、燃料もしくは燃料生成物との生成を組み合わせることは、クラッキングパラメーターの１つのセットを使用して、１つではなく２つの有益な生成物を生成する能力を提供する。
【００７４】
上記クラッキングプロセスにおいて、エネルギーは、炭素−炭素結合を壊すために使用される。いったん壊されると、各炭素原子は、１個の電子およびフリーラジカルで終わる。上記フリーラジカルの反応は、種々の成分をもたらし得る。より大きな有機分子をより小さい、より有用な分子へ壊すことは、触媒（触媒クラッキング）とともにもしくはそれなしで（熱クラッキング）、高い圧力および／もしくは温度を使用することによって、達成され得る。以前の研究から、中鎖（Ｃ１０〜Ｃ１４）および長鎖（Ｃ１６より長い）脂肪酸（天然合成されたカルボン）酸が、熱クラッキングもしくは触媒クラッキングのいずれかを使用する、クラッキングプロセスに対して適合性であることが示された。これら技術は、バイオディーゼルの化学組成を改変するために、以前の発明および研究において使用されてきた。しかし、それらは、産業的品質の短鎖カルボン酸および／もしくはエステルを生成するためには使用されてこなかった。
【００７５】
バイオマス（脂質および脂肪酸供給原料を含む）は、上記開示された連続的培養法によって生成される。上記バイオマスは、種々の方法（好ましくは、キャビテーション）を使用して「クラック」され得る。上記クラッキングプロセスの生成物は、クラッキングの条件およびバイオマスの元の組成およびクラッキング反応器中に存在する気体環境に依存する。上記クラッキング条件は、短鎖カルボン酸および燃料成分の至適混合物を生成するために、詳細な化学分析に基づいて変化する。
【００７６】
触媒は、所望の生成物の収率を改善するか、不要な生成物の形成を低下させるか、または低い圧力、温度もしくは滞留時間の要件に起因して、上記クラッキング反応の効率を増大させるために使用され得る。触媒としては、ゼオライト、炭素および希少金属（例えば、パラジウム、ニオブ、モリブデン、白金、チタン、アルミニウム、コバルト、金およびこれらの混合物）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
上記クラッキング産出物は、生成される物質に依存して、種々の加工処理および精製工程に供される。上記クラッキング反応器からの産出物は、使用される特定の反応器の設計に依存する。
【００７８】
本発明の一実施形態において、光合成生物から生物学的に生成される脂質、もしくはそのエステル交換反応誘導体は、３００〜５００℃の範囲に及ぶ温度へと、クラッキング反応器において、真空条件から３０００ｐｓｉａまでの範囲に及ぶ圧力で、不活性ガス（例えば、窒素、水蒸気、水素、気相有機化学物質の混合物もしくは任意の他の気体物質）を含み得る気体環境の存在下で、上記クラッキング反応器の内容物の化学組成を変化させるクラッキング反応に影響を及ぼすために、１〜１８０分間の範囲に及ぶ滞留時間にわたって、加熱される。上記クラッキング反応器に残っている蒸気（クラッケート（ｃｒａｃｋａｔｅ））は、下流の加工処理に供される。上記の加工処理としては、受容可能な輸送燃料（例えば、航空タービン燃料もしくはディーゼル燃料）を生成するための、冷却および部分凝縮、蒸気／液体分離、溶媒抽出もしくは他の化学的／物理的特性の操作による副生成化学物質の抽出、インサイチュー反応、蒸留もしくはフラッシュ分離（ｆｌａｓｈ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）が挙げられ得る。上記反応器に残っている液体および固体（残留物）は、下流の加工処理に供される。上記加工処理としては、受容可能な燃料副生成物もしくは副生成物を生成するための、冷却もしくは加熱、液体／固体分離、蒸気／液体分離、蒸気／固体分離、溶媒抽出による副生成化学物質の抽出、または他の化学的／物理的特性の操作が挙げられ得る。上記クラッケートもしくは上記残留物のうちのいずれかから分離された未反応のおよび部分的に反応した物質は、上記クラッキング反応器へとリサイクルされ得るか、さらなるクラッキング反応器へ送られ得るか、または他のプロセスにおいて使用され得る。
【００７９】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるのであって、限定するために提供されるのではない。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）
（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓの培養および採取）
（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓの供給源）
以下に記載される成長補助物質ミックス（ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ  ｍｉｘ）を、ハワイにある海岸近くのラグーンもしくは潮だまり環境から集めた未濾過の海水に添加した。上記海水中に空気を入れた（ｂｕｂｂｌｅ）。２〜３日以内に、微小藻類の混合種のブルーム（ｂｌｏｏｍ）が、上記水の中に発生してくる。微小藻類のブルームが少なくとも１．０×１０５細胞／ｍｌを確立した後、以下に記載の管理法を開始した。３〜５日後に、得られた藻類培養物は、少なくとも９９％  Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．であった。
【００８１】
（培養管理法）
各日、上記培養容積のうちの約２０％を、日没１時間後に取り出し、生の海水と置換した。以下に記載される成長補助物質ミックスを、新たな海水を添加した後に、上記培養物に添加した。上記培養物に、水カラムの底から上記培養物中に未濾過空気を入れた。ｐＨコントローラは、ｐＨが８．２より上に上昇した場合にソレノイドバルブを開け、二酸化炭素を、二酸化炭素流が遮断された場合に、ｐＨが８．１より低くなるまで上記培養物中に入れた。上記培養物において使用される光路は、最低６インチおよび最大３フィートであった。上記培養物の温度を制御せず、温度は、毎日、３５℃以上に達した。
【００８２】
（任意の培養容器が使用され得る）
６”の深さの四角形のタンクから、５フィートの深さの１８”直径シリンダーまで、非常に種々の培養容器を使用した。上記Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ  微小藻類を、全てのタイプの培養容器において優占種として維持できた。光路が短くなるほど、達する細胞密度が高くなった。ハワイの熱帯地方の太陽下で温度制御せずに野外に配置した６”  の深さの１リットル水槽において、８〜９×１０６細胞／ｍｌの最高細胞密度に達した。これら培養物における温度は、３５℃超に達した。
【００８３】
上記培養技術は、いかなるタイプの培養容器にも縛られないので、上記技術は、より大きなサイズのタンクへと容易に拡大され得る。
【００８４】
（成長補助物質ミックス）
改変Ｇｕｉｌｌａｒｄのｆ／２ミックスを、上記培養物に添加した。これは、以下の改変を伴った、以下の表中の標準レシピからなる。少なくとも３．０ｍｇ  Ｎ／リットルの出発窒素濃度、少なくとも２．７５ｍｇ  Ｐ／リットルの出発リン濃度、少なくとも５μｇ／リットルの出発ビタミンＢ１２濃度、少なくとも０．３ｍｇ／リットルの出発塩化鉄濃度、少なくとも０．０１ｍｇ／リットルの出発硫酸銅濃度、少なくとも１０ｍｇ  ＳｉＯ２／リットルの出発シリケート濃度、および５ｍｇ／リットルのＮａ２ＥＤＴＡ濃度。
【００８５】
標準のＧｕｉｌｌａｒｄのｆ／２成分リスト。珪藻類を培養するには、さらなるＮａ２ＳｉＯ３が必要である。
【００８６】
【表１】
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（採取法）
除去された上記培養物の一部を、採取タンク中で貯蔵した。上記採取タンク中の培養物を、夜から朝まで泡分画装置カラム中で循環させた。上記カラムは、少なくとも５フィートの高さであり、上記水流は、上記カラムにおいて下に動いた。上記カラム中、底から上方に空気を入れ、水の表面において濃縮された光合成微生物を含んだ泡を作り出した。この泡を、上記水の表面から集めた。液体へと濃縮する際にこの泡は、約３％の乾燥物質含有量を含んでいた。
【００８７】
得られた泡を濃縮し、次いで、１０，０００ｒｐｍにおいて操作する２０”直径連続遠心分離を行った。上記濃縮された藻類ペーストは、約３０％の乾燥物質含有量を有した。
【００８８】
（収率）
上記に記載される培養技術は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈａｗａｉｉ研究プロジェクトへ連続生成の４年超にわたって、濃縮されたＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．微小藻類ペーストを供給した。最終的な系は、合計システム容積３２００リットル（光路１８インチ）について、１６本の１８”直径×５フィート深さのポリカーボネートチューブからなった。この系は、平均して３００ｇの３０％の乾燥物質（７０％の水）のＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓペーストを毎日供給した。これは、３４．７ｋｇ／エーカー／日  乾燥物質もしくは１２，６６９ｋｇ／エーカー／年  乾燥物質（１２インチの深さの池を想定）に等しい。
【００８９】
（抽出および分離）
上記培養プロセスからの培養培地を、市販の清澄装置へと流し、その結果、３％の乾燥物質含有量を有する合計培養培地容積のうちの１０％からなる水性培地を、次いで、流体力学的キャビテーション反応器へと直接流した（流体力学的抽出については５００ｐｓｉ操作圧において１０ガロン／分を処理した）。３２０リットルを９分未満で加工処理した。合計加工処理コストは、＄０．１７であった。
【００９０】
上記流体力学的抽出は、灰分なしの乾燥重量油含有量と推定される、上記Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｓｐ．のうちの９８％超を抽出し、ベンチトップ重力静水バッフル分離装置を使用した分離後に、＄０．０６／リットルの油のコストで２．９リットルを超える９９％の純粋微細藻類油を生成した（油１ガロンあたり＄０．２２）。これは、現在の技術を使用する抽出についての、＄２．９１／リットルと比較される（これは、必要とされる脱水工程のコストを含まない）。
【国際調査報告】
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