(57)【要約】  本発明は、GLI2の発現低下を誘導する、細胞中のGLI2 mRNAを標的化するオリゴマー化合物(オリゴマー)に関する。GLI2発現の低下は、癌などの過増殖性障害などの特定の医学的障害の治療にとって有益である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
合計10〜30個のモノマーの連続する配列の第1領域を含む長さ10〜30個のモノマーのオリゴマーであって、該連続する配列が、哺乳動物GLI2遺伝子に対応する領域または哺乳動物GLI2遺伝子もしくはmRNAなど、例えば、配列番号1および／もしくは配列番号2および／もしくは配列番号134に記載の配列を有する核酸、もしくはその天然の変異体などの哺乳動物GLI2をコードする核酸の標的領域の逆相補体と少なくとも80％同一である、前記オリゴマー。
【請求項２】
前記連続する配列が配列番号19、3〜18および20〜90のいずれかに対応する領域と少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％相同である、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
前記連続する配列が、配列番号1、配列番号2もしくは配列番号134の対応する領域の逆相補体との不一致を含まないか、または1もしくは2個以下の不一致を含む、請求項１または２に記載のオリゴマー。
【請求項４】
前記連続する配列が長さ9〜18個のヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項５】
前記連続する配列がヌクレオシド類似体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項６】
前記ヌクレオシド類似体が、Locked Nucleic Acid (LNA)単位；2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、および2'-フルオロ-DNA単位からなる群より選択される糖修飾ヌクレオシドなどの糖修飾ヌクレオシドであり、好ましくは該ヌクレオシド類似体がLNAである、請求項５に記載のオリゴマー。
【請求項７】
ギャップマーである、請求項５または６に記載のオリゴマー。
【請求項８】
GLI2遺伝子またはmRNAを発現している細胞中でのGLI2遺伝子またはmRNAの発現を阻害し、好ましくは、前記オリゴマーが配列番号112、114、118、120、130および132からなる群より選択され、より好ましくは、前記オリゴマーが配列番号118または132である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴマーと、該オリゴマーに共有結合した少なくとも1個の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項９に記載のコンジュゲートと、製薬上許容し得る希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物。
【請求項１１】
癌などの過増殖性障害の治療のためなどの、医薬として使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
癌などの過増殖性障害の治療のための医薬の製造における、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項９に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１３】
癌などの過増殖性障害を治療する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項９に記載のコンジュゲートまたは請求項１０に記載の医薬組成物を、癌などの過増殖性障害に罹患しているか、または罹患する可能性が高い動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
GLI2を発現している細胞中でGLI2を阻害する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項９に記載のコンジュゲートを前記細胞に投与して、該細胞中でGLI2を阻害することを含む、前記方法。
【請求項１５】
GLI2を発現している細胞中でアポトーシスを誘導する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載のオリゴマーまたは請求項９に記載のコンジュゲートまたは請求項１０に記載の医薬組成物を、アポトーシスを誘発するのに十分な量で前記細胞に投与する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、GLI2の発現を調節するための化合物、組成物および方法を提供する。特に、本発明は、GLI2の発現低下を誘導する、細胞中のGLI2 mRNAを標的化するオリゴマー化合物(オリゴマー)に関する。GLI2発現の低下は、癌などの様々な医学的障害にとって有益である。
【０００２】
関連出願
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、2008年7月16日に出願された米国特許仮出願第61/081,135号(その開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)の利益を請求する。本出願はまた、2008年7月15日に出願されたEP 08104754に由来する優先権も主張する。
【背景技術】
【０００３】
グリオーマ関連癌遺伝子2(GLI2)は、多くの細胞型および多くの器官における細胞運命の決定、増殖およびパターン化に関与するGLIジンクフィンガー含有転写因子のメンバーである。ヒトGLI2 mRNAは選択的スプライシングを受けて、選択的スプライス変異体を作製することが知られている。皮膚ケラチノサイト中でGLI2を過剰発現するトランスジェニックマウスは、多発性基底細胞癌を生じ、これらの癌の発生におけるGLI2の役割を示している。
【０００４】
米国特許第6,440,739号およびWO03/008545は、GLI2を標的化する様々な2'-メトキシエチル修飾キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示しており、これらがGLI2発現に関連する疾患の治療において有用であり得ることを示している。Kimら、2007, Cancer Res. 67(8) 3583-3593は、GLI2を特異的に下方調節し、in vitroで肝細胞癌細胞の増殖を低下させるのに用いた2'-メトキシエチル修飾キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドに関して報告している。
【０００５】
GLI2を標的化する改良されたオリゴマーの必要性が存在する。さらに、GLI1およびGLI2の両方を標的化するオリゴマーが必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、10〜30個のモノマーなどの10〜50個のモノマーの連続的配列(連続する配列)(第1領域)であって、哺乳動物のGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3遺伝子もしくはmRNAに対応する領域または哺乳動物のGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3遺伝子もしくはmRNA、例えば、配列番号1および／もしくは配列番号2および／もしくは配列番号134に記載の配列を有する核酸、もしくはその天然の変異体などの哺乳動物のGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3をコードする核酸の標的領域の逆相補体と少なくとも80％(例えば、85％、90％、95％、98％もしくは99％)同一である前記連続的配列を含む、10〜30個のモノマーなどの10〜50個のモノマーのオリゴマーを提供する。かくして、例えば、前記オリゴマーは、配列番号1に示される配列を有する一本鎖核酸分子の領域にハイブリダイズする。
【０００７】
本発明は、10〜30個のモノマーなどの10〜50個のモノマーの連続的配列(第1領域)であって、哺乳動物のGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3遺伝子もしくはmRNAに対応する領域、または哺乳動物のGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3遺伝子もしくはmRNA、例えば、配列番号1および／もしくは配列番号2および／もしくは配列番号134に記載の配列を有する核酸、もしくはその天然の変異体などの哺乳動物のGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3をコードする核酸の標的領域の逆相補体と少なくとも80％(例えば、85％、90％、95％、98％もしくは99％)同一であり、第1領域中の少なくとも1個のモノマーが、Locked Nucleic Acid(ロックド核酸)(LNA)モノマーであるヌクレオシド類似体である前記連続的配列を含む、10〜30個のモノマーなどの10〜50個のモノマーのオリゴマーを提供する。かくして、例えば、前記オリゴマーは、配列番号1に示される配列を有する一本鎖核酸分子の領域にハイブリダイズする。
【０００８】
本発明は、本発明に従うオリゴマー、および該オリゴマーに共有結合された少なくとも1個の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲートを提供する。
【０００９】
本発明は、本発明に従うオリゴマーまたはコンジュゲートと、製薬上許容し得る希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、癌などの過増殖性障害または他の過増殖性障害などの本明細書に開示される疾患または医学的障害の治療のためなどの医薬としての使用のための、本発明に従うオリゴマーまたはコンジュゲートを提供する。
【００１１】
本発明は、癌などの過増殖性障害などの本明細書に開示される疾患または障害の治療のための医薬の製造における、本発明に従うオリゴマーまたはコンジュゲートの使用を提供する。
【００１２】
本発明は、癌などの過増殖性障害などの本明細書に開示される疾患または障害を治療する方法であって、例えば、有効量の本発明に従うオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を、該疾患または障害に罹患するか、またはそれに罹りやすい動物(該疾患または障害に罹患するか、またはそれに罹りやすい患者など)に投与することを含む前記方法を提供する。
【００１３】
本発明は、細胞中でアポトーシスを誘導する方法であって、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3遺伝子もしくはmRNAを発現している細胞と、アポトーシスを誘発するのに十分な量の本発明に従うオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物とを接触させることを含む前記方法を提供する。
【００１４】
一実施形態においては、前記疾患または障害または症状は、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3遺伝子もしくはmRNAの過剰発現と関連する。
【００１５】
本発明は、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3を発現している細胞中でのGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3の阻害のための方法であって、該細胞中でのGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3発現の阻害に影響する(例えば、GLI2発現に対する阻害効果を引き起こす)ように、該細胞と、本発明に従うオリゴマー、またはコンジュゲートとを接触させることを含む前記方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、GLI1とGLI2の両方を標的化するオリゴマーにも関し、従って、本発明はさらに、GLI1およびGLI2を発現している細胞中でのGLI1とGLI2の両方の阻害のための方法であって、該細胞中でのGLI1とGLI2発現の両方の阻害に影響する(例えば、GLI1とGLI2発現の両方に対する阻害効果を引き起こす)ように、該細胞と、本発明に従うオリゴマー、またはコンジュゲートとを接触させることを含む前記方法を提供する。
【００１７】
本発明は、10〜50個の連続モノマーの第1領域を含み、第1領域の配列が、哺乳動物GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3遺伝子に対応する領域または哺乳動物GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3をコードする核酸の標的領域の逆相補体と少なくとも80％同一である、10〜50個のモノマーのオリゴマーを提供する。
【００１８】
本発明はさらに、本発明のオリゴマーに共有結合された少なくとも1個の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分(「結合部分」)を含む、本発明に従うオリゴマーを含むコンジュゲートを提供する。
【００１９】
本発明は、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートと、製薬上許容し得る希釈剤、担体、塩もしくはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、医学における使用のための本発明に従うオリゴマーを提供する。
【００２１】
本発明はさらに、前立腺癌、グリオーマ、結腸直腸癌、メラノーマ、乳癌、肺癌もしくは肝細胞癌などの癌などの過増殖性障害からなる群より選択される疾患などの、本明細書に記載の1種以上の疾患の治療のための医薬の製造における本発明のオリゴマーの使用を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、前立腺癌、グリオーマ、結腸直腸癌、メラノーマ、乳癌、肺癌もしくは肝細胞癌などの癌などの過増殖性障害からなる群より選択される疾患などの、本明細書に記載の1種以上の疾患の治療のための使用のための、本発明に従うオリゴマーを提供する。
【００２３】
本発明のオリゴマーを含む医薬組成物および他の組成物も提供する。さらに、細胞もしくは組織を、in vitroもしくはin vivoで、有効量の本発明の1種以上のオリゴマー、コンジュゲートもしくは組成物と接触させることを含む、細胞もしくは組織中でのGLI1および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3の発現を下方調節する方法も提供する。さらに、細胞もしくは組織を、in vitroもしくはin vivoで、有効量の本発明の1種以上のオリゴマー、コンジュゲートもしくは組成物と接触させることを含む、細胞もしくは組織中でGLI1およびGLI2の発現を下方調節する方法も提供する。
【００２４】
また、動物(非ヒト動物もしくはヒト)に、治療上もしくは予防上有効量の本発明の1種以上のオリゴマー、コンジュゲートもしくは医薬組成物を投与することにより、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3の発現、または過剰発現と関連する疾患または症状を有することが疑われるか、またはそれに罹りやすい非ヒト動物もしくはヒトを治療する方法も開示する。さらに、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3の発現の阻害のため、ならびにGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3の活性と関連する疾患の治療のためのオリゴマーの使用方法も提供する。
【００２５】
本発明は、前立腺癌、グリオーマ、結腸直腸癌、メラノーマ、乳癌、肺癌もしくは肝細胞癌などの癌などの過増殖性障害からなる群より選択される疾患を治療する方法であって、有効量の1種以上のオリゴマー、コンジュゲートまたはその医薬組成物を、それを必要とする動物(それを必要とする患者など)に投与することを含む前記法法を提供する。
【００２６】
本発明は、細胞もしくは組織中のGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3の発現を阻害する(例えば、下方調節による)方法であって、該細胞もしくは組織を、in vitroもしくはin vivoで、有効量の1種以上のオリゴマー、コンジュゲート、またはその医薬組成物と接触させて、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3の発現の下方調節を行う工程を含む前記方法を提供する。
【００２７】
本発明は、細胞もしくは組織中のGLI1およびGLI2の発現を阻害する(例えば、下方調節による)方法であって、該細胞もしくは組織を、in vitroもしくはin vivoで、有効量の1種以上のオリゴマー、コンジュゲート、またはその医薬組成物と接触させて、GLI1およびGLI2の発現の下方調節を行う工程を含む前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１−１】ヒトGLI2 mRNA(cDNA)配列(配列番号1)を示す。GenBankアクセッション番号NM_005270である。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図２】ヒトGLI1 mRNA(cDNA)配列(配列番号2)を示す。GenBankアクセッション番号NM_005269である。
【図３−１】ヒトGLI3 mRNA(cDNA)配列(配列番号134)を示す。GenBankアクセッション番号NM_000168である。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図４】GLI2オリゴマーでトランスフェクトした後のDU-145細胞中でのGLI2 mRNAの発現を示す。データをGAPDH mRNA発現を用いて正規化し、モック(100％)中での標的発現と比較する。モックトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション剤のみでトランスフェクトされたものである(陰性対照)。
【図５】GLI2オリゴマーでトランスフェクトした24時間後のDU-145細胞中でのGLI2 mRNAの発現を示す。Gli2オリゴマー(オリゴと呼ぶ場合がある)でトランスフェクトした24時間後のDU-145細胞に由来するQ-PCR(定量的PCR)データである。このデータをGAPDH mRNA発現を用いて正規化し、モック(100％)中の標的発現と比較する。モックトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション剤のみでトランスフェクトされたものである(陰性対照)。
【図６】GLI2オリゴマーでトランスフェクトした24時間後の518A2細胞中でのGLI2 mRNAの発現を示す。Gli2オリゴマーでトランスフェクトした24時間後の518A2細胞に由来するQ-PCRデータである。このデータをGAPDH mRNA発現を用いて正規化し、モック(100％)中の標的発現と比較する。モックトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション剤のみでトランスフェクトされたものである(陰性対照)。
【図７】GLI2オリゴマーでトランスフェクトした24時間後のDU-145細胞中でのGLI1 mRNAの発現を示す。GLI2オリゴマーでトランスフェクトした24時間後のDU-145細胞に由来するQ-PCRデータである。このデータをGAPDH mRNA発現を用いて正規化し、モック(100％)中の標的発現と比較する。モックトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション剤のみでトランスフェクトされたものである(陰性対照)。
【図８】GLI2オリゴマーでトランスフェクトした24時間後の518A2細胞中でのGLI1 mRNAの発現を示す。GLI2オリゴマーでトランスフェクトした24時間後の518A2細胞に由来するQ-PCRデータである。このデータをGAPDH mRNA発現を用いて正規化し、モック(100％)中の標的発現と比較する。モックトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション剤のみでトランスフェクトされたものである(陰性対照)。
【図９】GLI2オリゴマーでトランスフェクトした24時間後の518A2細胞中でのGLI3 mRNAの発現を示す。Gli2オリゴマーでトランスフェクトした24時間後の518A2細胞に由来するQ-PCRデータである。このデータをGAPDH mRNA発現を用いて正規化し、モック(100％)中の標的発現と比較する。モックトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション剤のみでトランスフェクトされたものである(陰性対照)。
【図１０】マウス血漿中でのLNAオリゴマーの安定性の決定を示す。LNAオリゴマーをマウス血漿と共に37℃でインキュベートし、アリコートを0、24、48および120時間で取得した。その結果をSDS-PAGEゲルを用いるゲル電気泳動により可視化する。DNAホスホロチオエートを、オリゴマーの分解を示す陽性対照オリゴマーとして用いた。用いたオリゴマーの配列番号を各ゲルの下に示す。
【図１１】DU-145細胞中での増殖アッセイを示す。MTSアッセイを、4 nMおよび20 nMの最終オリゴマー濃度を用いてDU-145細胞中で実施した。配列番号133に記載の配列を有するオリゴマーは、陰性対照(-ve)として用いたスクランブル対照である。陽性対照(+ve)はin vitroおよびin vivoの両方で毒性的であるオリゴマーであり、従ってそれを毒性アッセイにおける陽性対照として用いる。用いたオリゴマーの配列番号を、各グラフのヘッダーに示す。
【図１２】図12Aおよび12Bは血清中のALT/AST活性を示す。GLI2を標的化する配列番号120に記載の配列を有するオリゴマーを投与した群中の1匹のマウスが6日目に死亡しているのが見つかり、この群中の残りの動物は貧弱な状態にあり、6日目に屠殺した。配列番号120に記載の配列を有するオリゴマーで処理した群におけるALT活性は、高すぎて測定できなかった。用いたオリゴマーの配列番号をグラフの各バーの下に示す。
【図１３】DU-145細胞中でのキャスパーゼ3/7アッセイを示す。キャスパーゼ3/7アッセイを、4 nMおよび20 nMの最終オリゴマー濃度を用いてDU-145細胞中で実施した。スクランブル対照を陰性対照として用いた。モックとはオリゴマーを用いない対照を指す、すなわち、モックトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション剤のみでトランスフェクトされたものである(陰性対照)。用いたオリゴマーの配列番号を、グラフのバーの下に示す。
【図１４】518A2細胞中でのキャスパーゼ3/7アッセイを示す。キャスパーゼ3/7アッセイを、4 nMおよび20 nMの最終オリゴマー濃度を用いて518A2細胞中で実施した。スクランブル対照を陰性対照として用いた。モックとはオリゴマーを用いない対照を指す。毒性オリゴマー(TC)は、in vitroおよびin vivoの両方で毒性的であることが示され、陽性対照として用いたオリゴマーである。用いたオリゴマーの配列番号を、グラフのバーの下に示す。
【図１５ａ】図15aおよび15bは、PC3前立腺癌モデルにおける配列番号3、19または75に記載の配列を有するオリゴマーの抗腫瘍効果を示す。用いたオリゴマーの配列番号をグラフのバーの上に示す。図面の凡例において、関連する配列番号はそれぞれの量に先行する(しかし、カンマにより分離される)。かくして、例えば、G2に関する「3,3 mg/kg」は配列番号3の3 mg/kgを表す。
【図１５ｂ】図15aの続きである。
【図１６】DU-145前立腺癌モデルにおける配列番号19、または配列番号75に記載の配列を有するオリゴマーの腫瘍増殖阻害(TGI)を示す。グラフへの鍵において、「スクランブル対照」とは、スルビビンのためのスクランブル対照オリゴマーを指し、「19」とは配列番号19を指す(例えば、「19 30 mg/kg」とは、30 mg/kgの配列番号19を指す)。
【図１７】PC3前立腺癌モデルにおける配列番号3、配列番号19、もしくは配列番号75に記載の配列を有するオリゴマーの効力試験(腫瘍増殖阻害)を示す。グラフへの鍵において、「3」とは配列番号3を指す(例えば、「3 30 mg/kg」とは30 mg/kgの配列番号3を指す。「スクランブル対照」とは、スルビビンのためのスクランブル対照オリゴマーを指し、「19」とは配列番号19を指す(例えば、「19 30 mg/kg」とは、30 mg/kgの配列番号19を指す)。「75」とは配列番号75を指す(例えば、「75 10 mg/kg」とは、10 mg/kgの配列番号75を指す)。
【図１８】PC3前立腺癌モデルにおける配列番号19に記載の配列を有するオリゴマーの効力試験(腫瘍増殖阻害)を示す。グラフへの鍵において、「19」とは配列番号19を指し、「mpk」とはmg/kgを指し、「IP」とは腹腔内投与を指す。「IV」とは静脈内投与を指し、「q1x10」とは、毎日10回投与を指し、「q2x10」とは2日目毎に10回投与を指し、「q3x10」とは3日目毎に10回投与を指す。例えば、「19 3mpk;IP;q1x10」とは、腹腔内投与による3 mg/kgの配列番号19の毎日の10回投与を指す。
【図１９】DLD-1結腸直腸癌モデルにおける配列番号19に記載の配列を有するオリゴマーの効力試験(腫瘍増殖阻害)を示す。グラフへの鍵において、「19」とは配列番号19を指し、「mpk」とはmg/kgを指し、「Q3x10」とは3日目毎の10回投与を指す。例えば、「19; 3mpk; Q3x4」とは、3 mg/kgの配列番号19の3日目毎の4回投与を指す。
【図２０ａ】図20a、bおよびcは、DU-145前立腺癌モデルにおける配列番号19に記載の配列を有するオリゴマーの効力試験(腫瘍増殖阻害)を示す。グラフへの鍵において、「3」とは配列番号3を指し、「19」とは配列番号19を指し、「75」とは配列番号75を指す。「IV」とは静脈内投与を指し、「q3x4」とは3日目毎の4回投与を指す。例えば、「3 3 mg/kg;IV;q3x4」とは、静脈内投与による3 mg/kgの配列番号3の3日目毎の4回投与を指す。
【図２０ｂ】図20aの続きである。
【図２０ｃ】図20bの続きである。
【図２１】PC3前立腺癌モデルにおける配列番号3、19、または75に記載の配列を有するオリゴマーの腫瘍増殖阻害(TGI)を示す。グラフへの鍵において、「3」とは配列番号3を指し、「19」とは配列番号19を指し、「75」とは配列番号75を指し、「iv」とは静脈内投与を指し、例えば、「3, 3 mg/kg, iv」とは、静脈内投与による3 mg/kgの配列番号3を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
オリゴマー
本発明は、哺乳動物GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3をコードする核酸分子(配列番号1に示されるGLI2核酸；もしくは配列番号2に示されるGLI2核酸；もしくは配列番号134に示されるGLI2核酸など)、ならびにそのような核酸分子の天然変異体の機能の調節における使用のために、オリゴマー化合物(本明細書ではオリゴマーと呼ぶ)を用いる。本発明の文脈における用語「オリゴマー」とは、2個以上のモノマーの共有結合により形成される分子(すなわち、オリゴヌクレオチド)を指す。いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、10〜50個の共有結合したモノマー、例えば、10〜30個の共有結合したモノマー、例えば、10〜24個の共有結合したモノマー、例えば、10〜18個の共有結合したモノマー、例えば、10〜16個の共有結合したモノマーを含むか、またはそれからなる。
【００３０】
いくつかの実施形態においては、用語「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「単位」および「モノマー」は互換的に用いられる。ヌクレオチドまたはモノマーの配列に言及する場合、言及されるものはA、T、G、CまたはUなどの塩基の配列であることが認識されるであろう。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「ヌクレオチド」とは、糖部分、塩基部分およびリン酸もしくはホスホロチオエートヌクレオチド間連結基などの共有結合した基(連結基)を含むグリコシドを指し、DNAもしくはRNAなどの天然ヌクレオチドと、本明細書では「ヌクレオチド類似体」とも呼ばれる、修飾糖および／もしくは塩基部分を含む非天然ヌクレオチドの両方を包含する。本明細書では、単一のヌクレオチド(単位)をモノマーまたは核酸単位と呼んでもよい。
【００３２】
生化学の分野では、用語「ヌクレオシド」は糖部分と塩基部分とを含むグリコシドを指すように一般的に用いられ、従って、オリゴマーのヌクレオチド間のヌクレオチド間結合により共有結合される「ヌクレオチド」単位に言及する場合に用いることができる。バイオテクノロジーの分野では、用語「ヌクレオチド」は核酸モノマーまたは単位を指すように用いられることが多く、そのようなものとして、オリゴヌクレオチドの文脈においては、「ヌクレオチド配列」などの塩基を指してもよく、典型的には、核酸塩基配列を指す(すなわち、糖主鎖とヌクレオシド間結合の存在は暗黙的である)。同様に、特に、1個以上のヌクレオシド間連結基が改変されたオリゴヌクレオチドの場合、用語「ヌクレオチド」は、「ヌクレオシド」を指してもよく、例えば、用語「ヌクレオチド」を、ヌクレオシド間の結合の存在または性質を特定する場合でも用いることができる。
【００３３】
当業者であれば、本発明の文脈において、オリゴヌクレオチド(オリゴマー)の5'末端ヌクレオチドが、5'ヌクレオチド間連結基を含まないが、それは5'末端基を含んでも、または含まなくてもよいことを理解できるであろう。
【００３４】
用語「モノマー」は、核酸中に天然に存在し、修飾された糖もしくは修飾された核酸塩基を含まないヌクレオシドとデオキシヌクレオシド(集合的に「ヌクレオシド」)、すなわち、リボース糖もしくはデオキシリボース糖が、天然の、非修飾核酸塩基(塩基)部分に共有結合している化合物(すなわち、プリンおよびピリミジンヘテロ環アデニン、グアニン、シトシン、チミンもしくはウラシル)と、糖部分がリボースもしくはデオキシリボース糖以外のものである(二環式糖もしくは2'置換糖などの2'修飾糖など)か、または塩基部分が修飾されている(例えば、5-メチルシトシン)か、またはその両方である、核酸中に天然に存在するか、もしくは核酸中に天然に存在しないヌクレオシドである「ヌクレオシド類似体」の両方を含む。
【００３５】
「RNAモノマー」は、リボース糖と非修飾核酸塩基を含有するヌクレオシドである。
【００３６】
「DNAモノマー」は、デオキシリボース糖と非修飾核酸塩基を含有するヌクレオシドである。
【００３７】
「Locked Nucleic Acidモノマー」、「ロックドモノマー」または「LNAモノマー」は、本明細書の以下にさらに記載されるような、二環式糖を有するヌクレオシド類似体である。
【００３８】
用語「に対応する(corresponding to)」および「に対応する(corresponds to)」とは、オリゴマーのヌクレオチド／ヌクレオシド配列(すなわち、核酸塩基もしくは塩基配列)または連続的ヌクレオチド／ヌクレオシド配列(第1領域)と、i)核酸標的の逆相補体のサブ配列、および／もしくはii)本明細書で提供されるヌクレオチド／ヌクレオシドの配列から選択されるさらなる配列の等価な連続的ヌクレオチド／ヌクレオシド配列との比較を指す。ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を、その等価な、または対応するヌクレオチド／ヌクレオシドと直接比較する。i)またはii)の下でさらなる配列に対応する第1領域は、典型的には、第1領域の長さにわたってその配列(連続的ヌクレオチド／ヌクレオシド配列など)と同一であるか、または本明細書に記載のように、いくつかの実施形態においては、対応する配列と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％相同である、少なくとも97％相同である、少なくとも98％相同である、少なくとも99％相同である、例えば、100％相同である(同一である)など、少なくとも80％相同であってよい。
【００３９】
用語「対応するヌクレオシド類似体」および「対応するヌクレオシド」は、ヌクレオシド類似体中の塩基部分と、ヌクレオシド中の塩基部分が同一であることを示す。例えば、「ヌクレオシド」がアデニンに連結された2'-デオキシリボース糖を含む場合、「対応するヌクレオシド類似体」は、例えば、アデニン塩基部分に連結された修飾糖を含む。
【００４０】
用語「オリゴマー」、「オリゴマー化合物」および「オリゴヌクレオチド」は、本発明の文脈において互換的に用いられ、例えば、リン酸基(ヌクレオシド間でホスホジエステル結合を形成する)またはホスホロチオエート基(ヌクレオシド間でホスホロチオエート結合を形成する)による2個以上のモノマーの共有連結により形成された分子を指す。前記オリゴマーは、10〜50個のモノマー、例えば、10〜30個のモノマー、例えば、10〜24個のモノマー、例えば、10〜18個のモノマー、例えば、10〜16個のモノマーからなるか、またはそれを含む。オリゴマーは、例えば、9〜30個の連続するモノマー、例えば、9〜24個のモノマー、例えば、9〜18個のモノマー、例えば、9〜16個のモノマーからなる第1領域(連続配列)からなるか、またはそれを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態においては、用語「連続配列」、「連続モノマー」および「領域」は互換的である。
【００４２】
いくつかの実施形態においては、オリゴマーは、本明細書に記載のヌクレオシド、またはヌクレオシド類似体、またはその混合物を含む。「LNAオリゴマー」または「LNAオリゴヌクレオチド」とは、1個以上のLNAモノマーを含むオリゴヌクレオチドを指す。
【００４３】
必要に応じてオリゴマー内に含まれるヌクレオシド類似体は、対応するヌクレオシドと同様に機能するか、または特定の改良された機能を有してもよい。いくつかの、または全てのモノマーがヌクレオシド類似体であるオリゴマーは、細胞膜を貫通する能力、細胞外および／もしくは細胞内ヌクレアーゼに対する良好な耐性ならびに核酸標的に対する高い親和性および特異性などの、そのようなオリゴマーのいくつかの望ましい特性のため、天然の形態よりも好ましいことが多い。LNAモノマーは、例えば、1つ以上の上記特性を付与するために特に好ましい。
【００４４】
様々な実施形態において、オリゴマー内に存在する1個以上のヌクレオシド類似体は、対応する天然のヌクレオシドに対する機能において「サイレント」または「等価」である、すなわち、オリゴマーが標的遺伝子発現を阻害するように機能する方法に対する機能的効果を有さない。にもかかわらず、そのような「等価な」ヌクレオシド類似体は、例えば、それらが製造するのがより容易であるか、もしくはより安価であるか、または保存もしくは製造条件下でより安定であるか、またはタグもしくは標識を含んでもよい場合、有用である。しかしながら、典型的には、前記類似体は、オリゴマーが、例えば、標的核酸の標的領域に対する結合親和性の増加および／または細胞内ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対する耐性の増加、および／または細胞中への輸送の容易性の増加をもたらすことにより、発現を阻害するように機能する方法に対する機能的効果を有するであろう。
【００４５】
かくして、様々な実施形態において、本発明に従うオリゴマーは、ヌクレオシドモノマーおよびLNAモノマーなどの少なくとも1個のヌクレオシド類似体モノマー、または他のヌクレオシド類似体モノマーを含む。
【００４６】
用語「少なくとも1」は、1以上の整数、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20などを含む。本発明のオリゴマーの核酸またはタンパク質標的に言及する場合などの様々な実施形態において、用語「少なくとも1」は、用語「少なくとも2」および「少なくとも3」および「少なくとも4」を含む。同様に、いくつかの実施形態においては、用語「少なくとも2」は、用語「少なくとも3」および「少なくとも4」を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態においては、オリゴマーは、第1領域中に9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個の連続モノマーを含むか、またはそれからなる。
【００４８】
いくつかの実施形態においては、オリゴマーは、10〜24個の連続モノマー、例えば、10〜22個の連続モノマー、例えば、10〜18個の連続モノマー、例えば、10〜16個の連続モノマー、例えば、12〜18個の連続モノマー、例えば、13〜17個もしくは12〜16個の連続モノマー、例えば、13、14、15、16もしくは24個の連続モノマーを含むか、またはそれからなる。オリゴマー、または連続するヌクレオチド配列長に関する範囲が与えられる場合、それはその範囲に提供される低い方と大きい方の長さを含み、例えば、10〜30は10と30の両方を含むことが理解されるべきである。
【００４９】
特定の実施形態においては、オリゴマーは、10、11、12、13、もしくは14個の連続モノマーを含むか、またはそれからなる。
【００５０】
様々な実施形態において、本発明に従うオリゴマーは、24個以下のモノマー、例えば、22個以下のモノマー、例えば、20個以下のモノマー、例えば、18個以下のモノマー、例えば、15、16もしくは17個のモノマーからなる。いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーは20個未満のモノマーを含む。
【００５１】
様々な実施形態において、本発明のオリゴマーはRNAモノマーを含まない。
【００５２】
様々な実施形態において、本発明に従うオリゴマーは、線状分子であるか、または合成された場合に線状である。そのような実施形態においては、前記オリゴマーは、一本鎖分子であり、典型的には、例えば、オリゴマーが内部二重らせんを形成するような同じオリゴマー内の別の領域と相補的である少なくとも3、4もしくは5個の連続モノマーの短い領域を含まない。いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは本質的に二本鎖ではない、すなわち、siRNAではない。
【００５３】
いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーは、モノマーの連続ストレッチ(第1領域)であって、その配列が本明細書に開示される配列番号により同定される前記ストレッチからなる(例えば、表1〜3を参照)。他の実施形態においては、オリゴマーは、標的をコードする核酸分子のモノマーの連続ストレッチからなる第1領域と、少なくとも1個のさらなるモノマーからなる1個以上のさらなる領域とを含む。いくつかの実施形態においては、第1領域の配列は、本明細書に開示される配列番号により同定される。
【００５４】
ギャップマー設計
典型的には、本発明のオリゴマーはギャップマーである。
【００５５】
「ギャップマー」は、本明細書では領域Bと呼ばれる少なくとも6個もしくは7個のDNAモノマーの領域などの、本明細書の以下にさらに記載されるRNAse(例えば、RNAseHなど)を動員することができるモノマーの連続ストレッチを含むオリゴマーである。領域Bは、その5'および3'末端の両方で、それぞれA領域およびC領域と呼ばれる領域に隣接し、領域Aと領域Cはそれぞれ、1〜6個のヌクレオシド類似体などの親和性を増強するヌクレオシド類似体などのヌクレオシド類似体を含むか、またはそれからなる。RNaseは、好ましくは、大腸菌またはヒトRNaseHなどのRNaseHである。オリゴマーが相補的RNA分子(mRNA標的など)との二重らせん中で形成される場合、RNaseHを動員するオリゴマーの能力を決定する。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、RNAseを動員することができるモノマーを、DNAモノマー、α-L-LNAモノマー、C4'アルキル化DNAモノマー(参照により本明細書に組み入れられるものとするPCT/EP2009/050349およびVesterら、Bioorg. Med. Chem. Lett. 18(2008), 2296-2300を参照)、およびUNA(ロックされていない核酸)ヌクレオチド(参照により本明細書に組み入れられるものとするFluiterら、Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照)からなる群より選択する。UNAは、典型的には糖のC2'-C3'結合(すなわち、C2'およびC3'炭素間の共有炭素間結合)が除去され、ロックされていない「糖」残基を形成するロックされていない核酸である。
【００５７】
典型的には、ギャップマーは、5'側から3'側に向かって、領域A-B-C、または必要に応じてA-B-C-DまたはD-A-B-Cを含む：領域A(A)は、少なくとも1個のヌクレオシド類似体、例えば、少なくとも1個のLNAモノマー、例えば、1〜6個のヌクレオシド類似体、例えば、LNAモノマーからなるか、もしくはそれを含み、領域B(B)は、DNAモノマーなどの、RNAseを動員することができる少なくとも5個の連続モノマー(mRNA標的などの標的RNA分子の相補的標的領域との二重らせん中で形成された場合)からなるか、もしくはそれを含み；領域C(C)は、少なくとも1個のヌクレオシド類似体、例えば、少なくとも1個のLNAモノマー、例えば、1〜6個のヌクレオシド類似体、例えば、LNAモノマーからなるか、もしくはそれを含み；ならびに領域D(D)は、存在する場合、1、2もしくは3個のモノマー、例えば、DNAモノマーからなるか、もしくはそれを含む。
【００５８】
様々な実施形態において、領域Aは、1、2、3、4、5もしくは6個のヌクレオシド類似体、例えば、LNAモノマー、例えば、2〜5個のヌクレオシド類似体、例えば、2〜5個のLNAモノマー、例えば、3もしくは4個のヌクレオシド類似体、例えば、3もしくは4個のLNAモノマーからなる；ならびに／または領域Cは、1、2、3、4、5もしくは6個のヌクレオシド類似体、例えば、LNAモノマー、例えば、2〜5個のヌクレオシド類似体、例えば、2〜5個のLNAモノマー、例えば、3もしくは4個のヌクレオシド類似体、例えば、3もしくは4個のLNAモノマーからなる。
【００５９】
特定の実施形態においては、領域Bは、RNaseHなどのRNAseを動員することができる5、6、7、8、9、10、11もしくは12個の連続モノマー(例えば、連続ヌクレオチド)、またはRNAseを動員することができる6〜10個、もしくは7〜9個の連続モノマー、例えば、10もしくは9もしくは8個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。特定の実施形態においては、領域Bは、少なくとも1個のDNAモノマー、例えば、1〜12個のDNAモノマー、好ましくは、4〜12個のDNAモノマー、より好ましくは6〜10個のDNAモノマー、例えば、7〜10個のDNAモノマー、最も好ましくは8、9もしくは10個のDNAモノマーからなるか、またはそれを含む。
【００６０】
様々な実施形態において、領域Aは、3もしくは4個のヌクレオシド類似体、例えば、LNAモノマーからなり、領域Bは、7、8、9もしくは10個のDNAモノマーからなり、領域Cは3もしくは4個のヌクレオシド類似体、例えば、LNAモノマーからなる。そのような設計は、(A-B-C)3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3を含み、DNAモノマーなどの1個もしくは2個のモノマーを有してもよい領域Dをさらに含んでもよい。
【００６１】
さらなるギャップマー設計は、参照により本明細書に組み入れられるものとするWO2004/046160に開示されている。
【００６２】
参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許仮出願第60/977,409号から優先権を主張するWO2008/113832号は、「ショートマー」ギャップマーオリゴマーに関する。いくつかの実施形態においては、本明細書で提供されるオリゴマーはそのようなショートマーギャップマーであってよい。
【００６３】
特定の実施形態においては、前記オリゴマーは、10、11、12、13、14、15もしくは16個のモノマーからなり、該オリゴマーの領域はパターン(5'-3')、A-B-C、または必要に応じて、A-B-C-DもしくはD-A-B-Cを有し、ここで領域Aは1、2もしくは3個のヌクレオシド類似体モノマー、例えば、LNAモノマーからなり、領域BはRNaseHなどのRNAseを動員することができる7、8、9もしくは10個の連続モノマーからなり、領域Cは1、2もしくは3個のヌクレオシド類似体モノマー、例えば、LNAモノマーからなる。存在する場合、領域Dは1個のDNAモノマーからなる。
【００６４】
特定の実施形態においては、領域Aは1個のLNAモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域Aは2個のLNAモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域Aは3個のLNAモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域Cは1個のLNAモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域Cは2個のLNAモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域Cは3個のLNAモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域Bは7個のヌクレオシドモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域Bは8個のヌクレオシドモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域Bは9個のヌクレオシドモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域Bは10個のヌクレオシドモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域Bは1〜10個のDNAモノマー、例えば、2、3、4、5、6、7、8もしくは9個のDNAモノマーを含む。特定の実施形態においては、領域Bは1〜9個のDNAモノマー、例えば、2、3、4、5、6、7もしくは8個のDNAモノマーを含む。特定の実施形態においては、領域BはDNAモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域Bはα-L-配置にある少なくとも1個のLNAモノマー、例えば、α-L-配置にある2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個のLNAモノマーを含む。特定の実施形態においては、領域Bは少なくとも1個のα-L-オキシLNAモノマーを含む。特定の実施形態においては、α-L-配置にある領域B中の全てのLNAモノマーはα-L-オキシLNA単位である。特定の実施形態においては、A-B-C領域中に存在するモノマーの数は、それぞれ、(ヌクレオシド類似体モノマー-領域B-ヌクレオシド類似体モノマー)：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4、または; 1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、3-9-3、4-9-1、1-9-4、または; 1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1、2-10-3、3-10-2、もしくは3-10-3からなる群より選択される。特定の実施形態においては、本発明のオリゴマーのA-B-C領域中に存在するモノマーの数は、それぞれ、2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4、および4-7-3からなる群より選択される。特定の実施形態においては、領域AおよびCのそれぞれは、3個のLNAモノマーからなり、領域Bは8もしくは9もしくは10個のヌクレオシドモノマー、好ましくはDNAモノマーからなる。特定の実施形態においては、領域AおよびCのそれぞれは2個のLNAモノマーからなり、領域Bは8もしくは9個のヌクレオシドモノマー、好ましくはDNAモノマーからなる。
【００６５】
様々な実施形態において、他のギャップマー設計としては、領域Aおよび／もしくはCが3、4、5もしくは6個のヌクレオシド類似体、例えば、2'-O-メトキシエチル-リボース糖(2'-MOE)を含むモノマーまたは2'-フルオロ-デオキシリボース糖を含むモノマーからなり、領域Bが8、9、10、11もしくは12個のヌクレオシド、例えば、DNAモノマーからなり、領域A-B-Cが3-9-3、3-10-3、5-10-5もしくは4-12-4モノマーを有するものが挙げられる。さらなるギャップマー設計は、参照により本明細書に組み入れられるものとするWO 2007/146511A2に開示されている。
【００６６】
ヌクレオシド間結合
本明細書に記載のオリゴマーのモノマーを、連結基を介して一緒に結合させる。好適には、各モノマーを、連結基を介して3'側の隣接するモノマーに連結する。
【００６７】
当業者であれば、本発明の文脈において、オリゴマーの末端の5'モノマーは5'連結基を含まないが、それは5'末端基を含んでも、または含まなくてもよいことを理解できるであろう。
【００６８】
用語「連結基」および「ヌクレオシド間結合」とは、2個の連続するモノマーを一緒に共有結合させることができる基を意味する。特定例および好ましい例としては、リン酸基(隣接するヌクレオシドモノマー間でホスホジエステルを形成する)およびホスホロチオエート基(隣接するヌクレオシドモノマー間でホスホロチオエート結合を形成する)が挙げられる。
【００６９】
好適な連結基としては、WO2007/031091に、例えば、WO2007/031091(参照により本明細書に組み入れられるものとする)の34頁の第1パラグラフに列挙されたものが挙げられる。
【００７０】
様々な実施形態においては、連結基を、その通常のホスホジエステルから、ホスホロチオエートもしくはボラノホスフェート(これらの2個の基はRNaseHにより切断可能であり、それにより、標的遺伝子の発現のRNaseを介するアンチセンス阻害を可能にする)などの、ヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性であるものに改変することが好ましい。
【００７１】
いくつかの実施形態においては、本明細書に提供される好適な硫黄(S)を含有する連結基が好ましい。様々な実施形態において、ホスホロチオエート連結基は、特に、ギャップマーのギャップ領域(B)にとって好ましい。特定の実施形態においては、ホスホロチオエート結合を用いて、フランキング領域(AおよびC)中のモノマーを一緒に連結する。様々な実施形態において、ホスホロチオエート結合を、領域AもしくはCを領域Dに連結するために、および領域D内のモノマーを一緒に連結するために用いる。
【００７２】
様々な実施形態において、領域A、BおよびCは、特に、例えば、ヌクレオシド類似体の使用がエンドヌクレアーゼ分解から領域AおよびC内の連結基を保護する場合、例えば、領域AおよびCがLNAモノマーを含む場合、ホスホジエステル結合などのホスホロチオエート以外の連結基を含む。
【００７３】
様々な実施形態において、オリゴマーの隣接モノマーを、ホスホロチオエート基を用いて互いに連結する。
【００７４】
特に、ヌクレオシド類似体モノマーの間の、もしくはそれに隣接するホスホロチオエート連結基(典型的には、領域Aおよび／もしくはC中)を用いる、1もしくは2個の結合などのホスホジエステル結合の、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴマー中への含有が、オリゴマーの生体利用能および／または生体分布を改変することができることが認識される(参照により本明細書に組み入れられるものとするWO2008/053314を参照)。
【００７５】
上記の実施形態などの、いくつかの実施形態においては、好適かつ具体的に指摘しない場合、全ての残りの連結基はホスホジエステルまたはホスホロチオエートのいずれか、またはその混合物である。
【００７６】
いくつかの実施形態においては、全てのヌクレオシド間連結基はホスホロチオエートである。
【００７７】
本明細書に提供されるものなどの、特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列に言及する場合、様々な実施形態において、結合がホスホロチオエート結合である場合、本明細書に開示されるものなどの代替的な結合を用いることができ、例えば、特にLNAモノマーなどのヌクレオシド類似体間の連結のためには、リン酸(ホスホジエステル)結合を用いることができることが理解されるであろう。同様に、様々な実施形態において、本明細書に提供されるものなどの、特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列に言及する場合、LNAモノマーなどの領域AもしくはC中の1個以上のモノマーは、5-メチルシトシン塩基を含み、その領域中の他のモノマーは非修飾シトシン塩基を含んでもよい。
【００７８】
標的核酸
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は本明細書では互換的に用いられ、上記のように2個以上のモノマーの共有連結により形成される分子と定義する。2個以上のモノマーを含む「核酸」は、任意の長さのものであってよく、この用語は本明細書に記載の長さを有する「オリゴマー」に対して包括的である。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、および環状の分子を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態においては、本明細書で用いられる用語「標的核酸」とは、哺乳動物GLI2ポリペプチド、例えば、ヒトGLI2、例えば、配列番号1に示される配列を有する核酸、およびそのような核酸の天然の対立遺伝子変異体をコードするDNAもしくはRNA(例えば、mRNAもしくはプレmRNA)を指す。特定の実施形態においては、哺乳動物GLI2はマウスGLI2である。
【００８０】
いくつかの実施形態においては、本明細書で用いられる用語「標的核酸」とは、哺乳動物GLI1ポリペプチド、例えば、ヒトGLI1、例えば、配列番号2に示される配列を有する核酸、およびそのような核酸の天然の対立遺伝子変異体をコードするDNAもしくはRNA(例えば、mRNAもしくはプレmRNA)を指す。特定の実施形態においては、哺乳動物GLI1はマウスGLI1である。
【００８１】
いくつかの実施形態においては、本明細書で用いられる用語「標的核酸」とは、哺乳動物GLI1ポリペプチド、例えば、ヒトGLI3、例えば、配列番号134に示される配列を有する核酸、およびそのような核酸の天然の対立遺伝子変異体をコードするDNAもしくはRNA(例えば、mRNAもしくはプレmRNA)を指す。特定の実施形態においては、哺乳動物GLI3はマウスGLI3である。
【００８２】
いくつかの実施形態においては、例えば、研究または診断において用いられる場合、「標的核酸」は上記のDNAまたはRNA核酸標的から誘導されたcDNAまたは合成オリゴヌクレオチドである。本発明に従うオリゴマーは、典型的には、標的核酸にハイブリダイズすることができる。
【００８３】
標的核酸の例としては、その対応するタンパク質配列と共に以下の表に示されるGenBankアクセッション番号を有する哺乳動物GLI2をコードする核酸が挙げられる。
【００８４】
2011527901.tif 000002
標的核酸の例としては、その対応するタンパク質配列と共に以下の表に示されるGenBankアクセッション番号を有する哺乳動物GLI1をコードする核酸が挙げられる。
【００８５】
2011527901.tif 000003
標的核酸の例としては、その対応するタンパク質配列と共に以下の表に示されるGenBankアクセッション番号を有する哺乳動物GLI3をコードする核酸が挙げられる。
【００８６】
2011527901.tif 000004
核酸に関する上記のGenBankアクセッション番号はcDNA配列を指すものであり、mRNA配列自体を指すものではないことが認識される。成熟mRNAの配列を、チミン塩基(T)をウラシル塩基(U)により置換した対応するcDNA配列から直接誘導することができる。
【００８７】
用語「その天然変異体」とは、マウス、サル、および好ましくはヒトの、好ましくはGLI2などの哺乳動物などの規定の分類群内に天然に存在するGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3ポリペプチドまたは核酸配列の変異体を指す。典型的には、GLI2ポリヌクレオチドの「天然変異体」に言及する場合、この用語は染色体転座もしくは複製によりヒト第2染色体；位置2q14に認められるGLI2をコードするゲノムDNAの任意の対立遺伝子変異体、およびそれから誘導されたmRNAなどのRNAも包含する。典型的には、GLI1ポリヌクレオチドの「天然変異体」に言及する場合、この用語は染色体転座もしくは複製によりヒト第12染色体；位置12q13.2-q13.3に認められるGLI1をコードするゲノムDNAの任意の対立遺伝子変異体、およびそれから誘導されたmRNAなどのRNAも包含する。典型的には、GLI3ポリヌクレオチドの「天然変異体」に言及する場合、この用語は染色体転座もしくは複製によりヒト第7染色体；位置7q13に認められるGLI3をコードするゲノムDNAの任意の対立遺伝子変異体、およびそれから誘導されたmRNAなどのRNAも包含する。「天然変異体」はまた、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3 mRNAの選択的スプライシングから誘導された変異体も含んでもよい。特定のポリペプチド配列に言及する場合、例えば、この用語は、天然形態のタンパク質も含み、従って、例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質溶解的切断、糖鎖付加などの翻訳同時または翻訳後修飾により加工することができる。
【００８８】
特定の実施形態においては、本明細書に記載のオリゴマーは、Watson-Crickの塩基対形成、Hoogsteenの水素結合、または逆転Hoogsteen水素結合により、オリゴマーのモノマーと標的核酸のモノマーとの間の標的核酸の領域(「標的領域」)に結合する。そのような結合は、「ハイブリダイゼーション」とも呼ばれる。別途指摘しない限り、結合は相補的塩基のWatson-Crick対形成によるものであり(すなわち、アデニンとチミン(DNA)もしくはウラシル(RNA)、およびグアニンとシトシン)、オリゴマーの配列は標的領域の逆相補体の配列と同一であるか、または部分的に同一であるため、オリゴマーは標的領域に結合する；本明細書の目的のために、前記オリゴマーを標的領域と「相補的」または「部分的に相補的」であると言い、標的領域の配列に対するオリゴマー配列の「相補性」の％は、標的領域の配列の逆相補体に対する「同一性」(相同性)％である。
【００８９】
本明細書で用いられる用語「逆相補体」、「逆相補的」および「逆相補性」は、用語「相補体」、「相補的」および「相補性」と互換性である。
【００９０】
本文により明確に為されない限り、本明細書での「標的領域」は、本明細書の以下に記載のアラインメントプログラムおよびパラメーターを用いる、特定のオリゴマー(またはその領域)の配列の逆相補体と最良に整列する配列を有する標的核酸の領域であろう。
【００９１】
本発明のオリゴマー(またはその領域)と本明細書に開示されるものなどの哺乳動物GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3をコードする核酸の標的領域との間の「相補性」の程度を決定する際、「相補性」の程度(「相同性」または「同一性」とも言う)を、オリゴマー(またはその領域)の配列と、それと共に最良に整列する標的領域(または標的領域の逆相補体)の配列との間の同一性％(または相同性％)として表す。この％を、2個の配列間で同一である整列した塩基の数を計数し、オリゴマー中の連続モノマーの総数で割って、100を掛けることにより算出する。そのような比較において、ギャップが存在する場合、そのようなギャップは、ギャップ内のモノマー数が本発明のオリゴマーと標的領域との間で異なる領域よりもむしろ、単に不一致であるのが好ましい。
【００９２】
本明細書で用いられる用語「相同な」および「相同性」は、用語「同一性」および「同一の」と互換性である。
【００９３】
アミノ酸およびポリヌクレオチドのアラインメント、配列同一性％、ならびに相補性の程度を、標準的な設定を用いるClustalWアルゴリズムを用いて本発明のために決定することができる：http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html, Method: EMBOSS::water (local): Gap Open = 10.0, Gap extend = 0.5を参照、Blosum 62(タンパク質)、またはヌクレオチド／核酸塩基配列にはDNAfullを用いる。
【００９４】
理解されるように、文脈に応じて、「不一致(ミスマッチ)」とは、配列中の非同一性(例えば、オリゴマーの核酸塩基配列とそれが結合する標的領域の逆相補体との間；例えば、2個の整列されたGLI2をコードする核酸の塩基配列の間)、または配列中の非相補性(例えば、オリゴマーとそれが結合する標的領域との間)を指す。
【００９５】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、GLI2標的遺伝子を発現している、または発現することができる細胞中での1個以上のGLI2標的遺伝子の発現を阻害(下方調節などによる)することができる(すなわち、細胞中のGLI2標的遺伝子のGLI2抑制を軽減することによる)。
【００９６】
GLI2 mRNAを標的化するオリゴマーは、5'非翻訳リーダー、エクソン、イントロンおよび3'非翻訳尾部などの標的mRNA核酸に沿った任意の部位にハイブリダイズすることができる。しかしながら、GLI2 mRNAを標的化するオリゴマーは標的核酸の成熟mRNA形態にハイブリダイズするのが好ましい。
【００９７】
GLI1 mRNAを標的化するオリゴマーは、5'非翻訳リーダー、エクソン、イントロンおよび3'非翻訳尾部などの標的mRNA核酸に沿った任意の部位にハイブリダイズすることができる。しかしながら、GLI1 mRNAを標的化するオリゴマーは標的核酸の成熟mRNA形態にハイブリダイズするのが好ましい。
【００９８】
GLI3 mRNAを標的化するオリゴマーは、5'非翻訳リーダー、エクソン、イントロンおよび3'非翻訳尾部などの標的mRNA核酸に沿った任意の部位にハイブリダイズすることができる。しかしながら、GLI3 mRNAを標的化するオリゴマーは標的核酸の成熟mRNA形態にハイブリダイズするのが好ましい。
【００９９】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーはGLI3 mRNAを標的化しない。
【０１００】
好適には、本発明のオリゴマーまたはそのコンジュゲートは、GLI2遺伝子の発現を下方調節(例えば、低下または除去)することができる。様々な実施形態において、本発明のオリゴマー(またはコンジュゲート)は、典型的には、ヒト細胞などの哺乳動物細胞中で、GLI2の阻害を行うことができる。特定の実施形態においては、本発明のオリゴマー、またはそのコンジュゲートは、標的核酸に結合し、オリゴマーまたはコンジュゲートの非存在下での発現レベルと比較して少なくとも10％または20％、より好ましくは、オリゴマーまたはコンジュゲートの非存在下でのGLI2発現レベルと比較して少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％のGLI2 mRNA発現の阻害を行う。
【０１０１】
好適には、本発明のオリゴマーまたはそのコンジュゲートは、GLI1遺伝子の発現を下方調節(例えば、低下または除去)することができる。様々な実施形態において、本発明のオリゴマー(またはコンジュゲート)は、典型的には、ヒト細胞などの哺乳動物細胞中で、GLI1の阻害を行うことができる。特定の実施形態においては、本発明のオリゴマー、またはそのコンジュゲートは、標的核酸に結合し、オリゴマーまたはコンジュゲートの非存在下での発現レベルと比較して少なくとも10％または20％、より好ましくは、オリゴマーまたはコンジュゲートの非存在下でのGLI1発現レベルと比較して少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％のGLI1 mRNA発現の阻害を行う。
【０１０２】
好適には、本発明のオリゴマーまたはそのコンジュゲートは、GLI3遺伝子の発現を下方調節(例えば、低下または除去)することができる。様々な実施形態において、本発明のオリゴマー(またはコンジュゲート)は、典型的には、ヒト細胞などの哺乳動物細胞中で、GLI3の阻害を行うことができる。特定の実施形態においては、本発明のオリゴマー、またはそのコンジュゲートは、標的核酸に結合し、オリゴマーまたはコンジュゲートの非存在下での発現レベルと比較して少なくとも10％または20％、より好ましくは、オリゴマーまたはコンジュゲートの非存在下でのGLI3発現レベルと比較して少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％のGLI3 mRNA発現の阻害を行う。
【０１０３】
いくつかの実施形態においては、そのような阻害は、約0.04 nM〜約25 nM、例えば、約0.8 nM〜約20 nMのオリゴマーまたはコンジュゲートを用いる場合に認められる。本明細書に例示されるように、細胞型は、いくつかの実施形態においては、ヒト細胞、例えば、癌細胞、例えば、ヒト結腸直腸癌細胞、ヒトグリオーマ細胞、ヒト肝細胞癌細胞、ヒトメラノーマ細胞、ヒト乳癌細胞、ヒト肺癌細胞またはヒト前立腺癌細胞(例えば、in vitroでトランスフェクトされた細胞)である。用いられるオリゴマー濃度は、いくつかの実施形態においては、5 nMである。用いられるオリゴマー濃度は、いくつかの実施形態においては、25 nMである。用いられるオリゴマー濃度は、いくつかの実施形態においては、1 nMである。細胞を処理するのに用いられるオリゴマーの濃度は、実施例に例示されるように、トランスフェクション(Lipofecton)を用いるin vitro細胞アッセイにおいて実施される様々な典型的な実施形態にあることに留意すべきである。トランスフェクション剤の非存在下では、標的の下方調節を得るのに必要なオリゴマー濃度は、典型的には1〜25μM、例えば、5μMである。
【０１０４】
様々な実施形態において、mRNA発現の阻害は、100％未満(すなわち、発現の完全未満の阻害)、たとえば、98％未満の阻害、95％未満の阻害、90％未満の阻害、80％未満の阻害、例えば、70％未満の阻害である。様々な実施形態において、遺伝子発現の調節を、例えば、SDS-PAGE、次いで、標的タンパク質に対する好適な抗体を用いるウェスタンブロッティングなどの方法により、タンパク質レベルを測定することにより決定することができる。あるいは、発現レベルの調節を、例えば、ノーザンブロッティングまたは定量的RT-PCRにより、mRNAのレベルを測定することにより決定することができる。mRNAレベルを介して測定する場合、約0.04 nM〜約25 nM、例えば、約0.8 nM〜約20 nMなどの好適な用量を用いる場合、下方調節のレベルは、様々な実施形態においては、典型的には、本発明のオリゴマー、コンジュゲートまたは組成物の非存在下での正常レベルの10〜20％のレベルまでである。
【０１０５】
従って、本発明は、GLI2タンパク質および／もしくはmRNAを発現している細胞中でGLI2タンパク質および／もしくはmRNAの発現を下方調節または阻害する方法であって、該細胞を、有効量の本発明に従うオリゴマーもしくはコンジュゲートと接触させて、該細胞中でのGLI2タンパク質および／もしくはmRNAの発現を下方調節または阻害することを含む前記方法を提供する。
【０１０６】
本発明は、GLI1タンパク質および／もしくはmRNAを発現している細胞中でGLI1タンパク質および／もしくはmRNAの発現を下方調節または阻害する方法であって、該細胞を、有効量の本発明に従うオリゴマーもしくはコンジュゲートと接触させて、該細胞中でのGLI1タンパク質および／もしくはmRNAの発現を下方調節または阻害することを含む前記方法を提供する。
【０１０７】
本発明は、GLI3タンパク質および／もしくはmRNAを発現している細胞中でGLI3タンパク質および／もしくはmRNAの発現を下方調節または阻害する方法であって、該細胞を、有効量の本発明に従うオリゴマーもしくはコンジュゲートと接触させて、該細胞中でのGLI3タンパク質および／もしくはmRNAの発現を下方調節または阻害することを含む前記方法を提供する。
【０１０８】
好適には、前記細胞は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。前記接触を、いくつかの実施形態においては、in vitroで行ってもよい。いくつかの実施形態においては、前記接触をin vivoで行ってもよい。
【０１０９】
配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、85、86(全配列モチーフ)ならびに配列番号91、92および93(設計)ならびに配列番号112、113および114(化合物)に示される核酸塩基を有するオリゴマーは、GLI1とGLI2の両方を標的化する。
【０１１０】
本発明は、癌などの過増殖性障害の治療のため、またはGLI1とGLI2の両方(および必要に応じてGLI3)を発現している細胞中でのGLI1およびGLI2(および必要に応じてGLI3)の下方調節のためのオリゴマーの調製のための方法であって、ヒトGLI1とGLI2 mRNA配列間の相同領域を選択し、該相同領域の逆相補体である核酸塩基配列を有するオリゴマーを提供し、オリゴマーの核酸塩基配列がGLI1またはGLI2 mRNA標的の対応する領域に対して1または2個以下の不一致を有する本発明に従うオリゴマーを調製することを含む前記方法を提供する。従って、相同領域は、GLI1および／もしくはGLI2 mRNA配列の対応する領域に対して1または2個の不一致、好ましくは1個の不一致を含むか、または不一致を含まなくてもよい。相同領域は、本発明のオリゴマーと同じぐらいの長さであってよい。いくつかの態様においては、前記方法はさらに、相同領域が、GLI3 mRNAの対応する領域と少なくとも2個、例えば、少なくとも3個または少なくとも4個の不一致を有する相同領域の選択を含んでもよい。あるいは、前記方法はさらに、相同領域がGLI3 mRNAの対応する領域と2個以下、例えば、1個の不一致を有するか、または不一致を有さない相同領域の選択を含んでもよい。
【０１１１】
特定の実施形態においては、配列番号1の標的領域としては、ヒトGLI1とヒトGLI2の間で完全な一致である配列、またはそのサブ配列を有する領域、例えば、配列番号1に記載の配列を有するヒトGLI2 mRNA転写物の以下の領域：1)ヌクレオチド909-926、2)ヌクレオチド933-948、3)ヌクレオチド1542-1555、4)ヌクレオチド1568-1586、5)ヌクレオチド1647-1663、6)ヌクレオチド1695-1708、7)ヌクレオチド1789-1809、および8)ヌクレオチド1839-1855からなる群より選択される標的領域が挙げられる。
【０１１２】
いくつかの実施形態においては、配列番号1の標的領域としては、ヒトGLI1とヒトGLI2の間で完全な一致である配列、またはそのサブ配列を有する領域が挙げられる。
【０１１３】
様々な実施形態においては、配列番号1の標的領域としては、ヒトGLI1、ヒトGLI2と、ヒトGLI3の間で完全な一致である配列、またはそのサブ配列を有する領域が挙げられる。
【０１１４】
本発明のオリゴマーは、最初の5個のエクソン中に存在するGLI2の選択的スプライス変異体に起因して、エクソン1〜5(すなわち、配列番号1のヌクレオチド1-831)を標的化しないのが好ましい。従って、いくつかの実施形態においては、標的領域は、配列番号1のヌクレオチド832から最も3'側のヌクレオチドの領域内に認められる。典型的には、オリゴマーはmRNA標的のポリA尾部を標的化しない。
【０１１５】
いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーは、GLI2 mRNAの対応する領域と100％相補的である核酸塩基配列を有し、GLI1 mRNA標的の対応する領域と2個以下、例えば、1個の不一致を含むか、または不一致を含まない。
【０１１６】
そのような実施形態においては、いくつかの態様において、前記オリゴマーの核酸塩基配列は、最良に整列されたGLI3 mRNAの標的領域の核酸塩基配列と比較した場合、0、1もしくは2個の不一致を含むか、または他の態様においては、最良に整列されたGLI3 mRNAの標的領域の核酸塩基配列と比較した場合、少なくとも2個、例えば、3、4もしくは5個の不一致を含んでもよい。
【０１１７】
好適には、オリゴマーは、最良に整列された配列番号1(ヒトGLI2)および配列番号2(ヒトGLI1)の標的領域の塩基配列と比較した場合、2個以下、例えば、1個以下の不一致を含むか、または不一致を含まない塩基配列を有すると考えられる。
【０１１８】
いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーは、最良に整列された配列番号1の標的領域の逆相補体の配列と比較した場合、0、1もしくは2個の不一致、例えば、1個の不一致を有するか、もしくは不一致を有さず、最良に整列された配列番号2の標的領域の逆相補体の配列と比較した場合、少なくとも1個もしくは少なくとも2個もしくは少なくとも3個の不一致を有する連続的核酸塩基配列を有する。
【０１１９】
いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーは、最良に整列された配列番号134の標的領域の逆相補体の配列と比較した場合、0、1もしくは2個の不一致、例えば、1個の不一致を有するか、もしくは不一致を有さず、最良に整列された配列番号2の標的領域の逆相補体の配列と比較した場合、少なくとも1個もしくは少なくとも2個もしくは少なくとも3個の不一致を有する連続的核酸塩基配列を有する。
【０１２０】
オリゴマー配列
いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーは、配列番号3〜90からなる群より選択される配列と同一である配列を有する。
【０１２１】
さらに、本発明の1種以上のオリゴマーと(全体に、もしくは完全に)相補的であるか、または部分的に相補的である標的領域を含む標的核酸(例えば、GLI2をコードするDNAもしくはmRNAも提供される。特定の実施形態においては、前記オリゴマーは、対立遺伝子変異体(ヒト第2染色体；位置2q14上に存在するGLI2遺伝子から誘導されるmRNAなど)などのGLI2標的領域の変異体に結合する。特定の実施形態においては、前記オリゴマーは、対立遺伝子変異体(ヒト第12染色体；位置12q13.3-q13.3上に存在するGLI1遺伝子から誘導されるmRNAなど)などのGLI1標的領域の変異体に結合する。特定の実施形態においては、前記オリゴマーは、対立遺伝子変異体(ヒト第17染色体；位置7p13上に存在するGLI3遺伝子から誘導されるmRNAなど)などのGLI3標的領域の変異体に結合する。いくつかの実施形態においては、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3標的領域の変異体は、配列番号1および／もしくは配列番号2および／もしくは配列番号134に記載の配列を有する標的領域に対して少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性を有する。かくして、他の実施形態においては、本発明のオリゴマーは、配列番号3〜90からなる群より選択される配列と比較した場合、1、2または3個の塩基において異なる配列を有する。典型的には、GLI2標的領域の変異体に結合する本発明のオリゴマーは、GLI2を阻害する(例えば、下方調節により)ことができる。典型的には、GLI1標的領域の変異体に結合する本発明のオリゴマーは、GLI1を阻害する(例えば、下方調節により)ことができる。典型的には、GLI3標的領域の変異体に結合する本発明のオリゴマーは、GLI3を阻害する(例えば、下方調節により)ことができる。
【０１２２】
他の実施形態においては、本発明のオリゴマーは、LNAオリゴマー、例えば、配列番号91〜132に示される配列を有するこれらのオリゴマーである。様々な実施形態において、本発明のオリゴマーは、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3 mRNAおよびタンパク質発現の強力な阻害剤である。いくつかの実施形態においては、語句「強力な阻害剤」とは、実施例5のリポフェクタミントランスフェクションアッセイにより決定される5 nM未満のIC50を有するオリゴマーを指す。いくつかの実施形態においては、IC50は4 nM未満、例えば、2 nM未満である。
【０１２３】
様々な実施形態において、本発明のオリゴマーは、配列番号118または配列番号132の配列を有するLNAオリゴマーである。
【０１２４】
様々な実施形態において、前記オリゴマーは、配列番号1および／もしくは配列番号2および／もしくは配列番号134中の標的領域の逆相補体の配列と同一であるか、または部分的に同一である塩基配列を有する第1領域を含むか、またはそれからなる。様々な実施形態において、前記オリゴマーは、配列番号3〜90からなる群より選択される配列を有する第1領域を含むか、またはそれからなる。
【０１２５】
特定の実施形態においては、前記オリゴマーは、哺乳動物GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3をコードする核酸の標的領域の配列と全体的に相補的(完全に相補的)である塩基配列を有する第1領域を含むか、またはそれからなる。
【０１２６】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、最良に整列されたGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3標的核酸の標的領域と比較して1、2、3、もしくは4個(以上)の不一致を含み、標的領域に依然として十分に結合してGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3 mRNAもしくはタンパク質発現の阻害を行う。Watson-Crick水素結合二本鎖に対する不一致の脱安定化効果を、例えば、オリゴマーの長さの増加および／またはオリゴマー内に存在するヌクレオシド類似体、例えば、LNAモノマーの数の増加により相殺することができる。
【０１２７】
様々な実施形態においては、オリゴマーの塩基配列は、例えば、哺乳動物GLI2もしくはGLI1もしくはGLI3をコードする標的核酸の最良に整列された標的領域の塩基配列と比較して3個以下、例えば、2個以下の不一致を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態においては、オリゴマーの塩基配列は、哺乳動物GLI2をコードする核酸の最良に整列された標的領域の塩基配列と比較した場合、1個以下の不一致を含む。
【０１２９】
様々な実施形態において、本発明のオリゴマー、またはその第1領域の塩基配列は、配列番号3〜90からなる群より選択される塩基配列を有するオリゴマーと少なくとも80％同一であり、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％同一であり、例えば、100％同一であるのが好ましい。
【０１３０】
特定の実施形態においては、本発明のオリゴマー、またはその第1領域の塩基配列は、配列番号1および／もしくは配列番号2および／もしくは配列番号134中に存在する標的領域の逆相補体の塩基配列と少なくとも80％同一であり、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％同一であり、例えば、100％同一である。
【０１３１】
様々な実施形態において、本発明のオリゴマー、またはその第1領域の塩基配列は、好ましくは配列番号1および／もしくは配列番号2および／もしくは配列番号134の標的領域と少なくとも80％相補的であり、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％相補的であり、例えば、100％相補的(完全に相補的)である。
【０１３２】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマー(またはその第1領域)は、配列番号3、10、19、35、59および75からなる群より選択される塩基配列を有するか、または配列番号3、10、19、35、59および75の少なくとも9もしくは10個の連続モノマーからなる群より選択される。他の実施形態においては、本発明のオリゴマーまたはその第1領域の配列は、配列番号3、10、19、35、59および75の配列、または必要に応じて選択された配列もしくはその領域と整列させた場合、少なくとも9もしくは10個の連続モノマーの配列を有するオリゴマー中のものとは異なる1、2、もしくは3個の塩基部分を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態においては、本明細書で用いられる用語「第1領域」とは、オリゴマーの一部(サブ配列)を指す。例えば、配列番号19に記載の16個のモノマーの配列は、配列番号87に記載の24個のモノマーの配列のサブ配列である、すなわち、配列番号87に記載の配列は配列番号19に記載の配列を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマー(またはその第1領域)は、配列番号85〜90からなる群より選択される塩基配列、またはその少なくとも9もしくは10個の連続モノマーの配列を有する。他の実施形態においては、前記オリゴマー(またはその第1領域)の配列は、配列番号85〜90の配列、または必要に応じて選択された配列もしくはその領域と整列させた場合、その少なくとも9もしくは10個の連続モノマーの配列を有するオリゴマー中のものと異なる1、2、または3個の塩基部分を含む。
【０１３５】
様々な実施形態においては、前記オリゴマーは、配列番号3、10、19、35、59および75からなる群より選択される配列中に同一に存在する塩基配列を有する、12〜16個などの9、10、11、12、13、14、15または16個の連続モノマーの領域を含む。他の実施形態においては、前記オリゴマーは、配列番号3、10、19、35、59および75の配列を有するオリゴマー中のものと異なる1、2もしくは3個の塩基部分を含む領域を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態においては、第1領域は、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28もしくは29個の連続モノマー、例えば、9〜22個、例えば、12〜24個、例えば、12〜22個、例えば、12〜18個、例えば、12〜16個のモノマーからなる。好適には、いくつかの実施形態においては、第1領域は、本発明のオリゴマーと同じ長さのものである。
【０１３７】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、標的領域と非相補的である、第1領域の5'および／もしくは3'末端にさらなるモノマー、例えば、オリゴマーの5'末端および／もしくは3'末端に、独立に1、2、3、4もしくは5個のさらなるモノマーを含む。様々な実施形態において、本発明のオリゴマーは、標的領域と相補的であるさらなるモノマーにより5'および／もしくは3'にフランキングする、標的と相補的である第1領域を含む。いくつかの実施形態においては、さらなる5'または3'モノマーは、DNAまたはRNAモノマーなどのヌクレオシドである。様々な実施形態において、5'または3'モノマーは、本明細書に記載のギャップマーオリゴマーの文脈において言及される領域Dである。
【０１３８】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号85に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または配列番号3、4、5、6、7または8などの、10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号86に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または配列番号10、11、12、13、14または15などの、10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号87に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または配列番号19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32または33などの、10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号88に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または配列番号36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48または49などの、10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号89に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または配列番号60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72または73などの、10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号90に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または配列番号76、77、78、79、80、81、82、83、または84などの、10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号9に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号16に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号17に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号18に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号34に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号35に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号50に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号51に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号52に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号53に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号54に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号55に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号56に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号57に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号58に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号59に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号74に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、配列番号75に記載の核酸塩基配列を有する連続モノマー(第1領域)、または10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどのその少なくとも9個の連続モノマーからなるか、またはそれを含む。
【０１６２】
ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体
いくつかの実施形態においては、用語「ヌクレオシド類似体」および「ヌクレオチド類似体」は互換的に用いられる。
【０１６３】
様々な実施形態において、前記オリゴマー中に存在する少なくとも1個のモノマーは、5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、2-クロロ-6-アミノプリン、キサンチンおよびヒポキサンチンから選択される塩基などの、修飾塩基を含むヌクレオシド類似体である。
【０１６４】
様々な実施形態において、前記オリゴマー中に存在する少なくとも1個のモノマーは、修飾糖を含むヌクレオシド類似体である。
【０１６５】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーの少なくとも2個の連続モノマー間の結合は、ホスホジエステル結合以外のものである。
【０１６６】
特定の実施形態においては、前記オリゴマーは、修飾塩基を有する少なくとも1個のモノマー、修飾糖を有する少なくとも1個のモノマー(同じモノマーであってよい)、および非天然である少なくとも1個のモノマー間結合を含む。
【０１６７】
ヌクレオシド類似体の特定例は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213により、ならびにスキーム1(いくつかのヌクレオシド類似体がヌクレオチドとして示されている)に記載されている。
【化１】
2011527901.tif 000005
【０１６８】
かくして、前記オリゴマーは、天然ヌクレオシド-好ましくはDNAモノマーだけでなく、RNAモノマーの単純な配列、またはヌクレオシドと1個以上のヌクレオシド類似体の組合せを含むか、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態においては、そのようなヌクレオシド類似体は、好適には、標的核酸の標的領域に対する前記オリゴマーの親和性を増強する。
【０１６９】
好適かつ好ましいヌクレオシド類似体の例は、WO2007/031091に記載されているか、またはそこで参照されている。
【０１７０】
いくつかの実施形態においては、ヌクレオシド類似体は、2'-置換基、例えば、2'-O-アルキル-リボース糖、2'-アミノ-デオキシリボース糖、および2'-フルオロ-デオキシリボース糖を提供するように改変された糖部分を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態においては、ヌクレオシド類似体は、結合親和性を増強し、またヌクレアーゼ耐性をいくらか増加させることができる二環式糖(LNA)を含む。様々な実施形態においては、LNAモノマーを、オキシ-LNA(β-D-オキシ-LNA、およびα-L-オキシ-LNAなど)、および／またはアミノ-LNA(β-D-アミノ-LNAおよびα-L-アミノ-LNA)および／またはチオ-LNA(β-D-チオ-LNAおよびα-L-チオ-LNA)および／またはENA(βD-ENAおよびα-L-ENA)から選択する。特定の実施形態においては、LNAモノマーはβ-D-オキシ-LNAである。LNAモノマーを以下でさらに説明する。
【０１７２】
様々な実施形態においては、LNAモノマーもしくは2'-置換糖を含むモノマーなどのオリゴマーへの親和性を増強するヌクレオシド類似体の組込み、または修飾連結基の組込みは、ヌクレアーゼ耐性の増加を提供する。様々な実施形態においては、親和性を増強するヌクレオシド類似体の組込みにより、オリゴマーのサイズを低下させることができ、また、標的配列の標的領域に特異的に結合するオリゴマーのサイズを低下させることができる。
【０１７３】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、少なくとも1個のヌクレオシド類似体を含む。いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは、少なくとも2個のヌクレオシド類似体を含む。いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーは3〜8個のヌクレオシド類似体、例えば、6もしくは7個のヌクレオシド類似体を含む。様々な実施形態においては、少なくとも1個のヌクレオシド類似体は、ロックされた核酸(LNA)モノマーである；例えば、少なくとも3個または少なくとも4個または少なくとも5個または少なくとも6個または少なくとも7個または8個のヌクレオシド類似体がLNAモノマーである。いくつかの実施形態においては、全てのヌクレオシド類似体がLNAモノマーである。
【０１７４】
好ましいオリゴマー塩基配列に言及する場合、特定の実施形態においては、前記オリゴマーは対応するヌクレオシド類似体、例えば、対応するLNAモノマーまたはオリゴマー／標的領域二本鎖の二本鎖安定性(Tm)を上昇させる他の対応するヌクレオシド類似体(すなわち、親和性を増強するヌクレオシド類似体)を含む。
【０１７５】
様々な実施形態においては、存在する場合、オリゴマーの塩基配列と標的領域の塩基配列との任意の不一致は、本明細書に記載の領域B内および／もしくは本明細書に記載の領域D内などの親和性を増強するヌクレオシド類似体を含むオリゴマーの領域(例えば、領域AもしくはC)、ならびに／またはDNAモノマーからなる領域、ならびに／または標的領域と相補的であるオリゴマーの領域に対して5'もしくは3'側にある領域以外に位置するのが好ましい。
【０１７６】
いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマー内に存在するヌクレオシド類似体(本明細書に記載の領域AおよびC中など)を、例えば、2'-O-アルキル-リボース糖を含むモノマー、2'-アミノ-デオキシリボース糖を含むモノマー、2'-フルオロ-デオキシリボース糖を含むモノマー、LNAモノマー、アラビノース糖を含むモノマー(「ANAモノマー」)、2'-フルオロ-アラビノース糖を含むモノマー、d-アラビノ-ヘキシトール糖を含むモノマー(「HNAモノマー」)、参照により本明細書に組み入れられるものとするChristensen(2002) Nucl. Acids. Res. 30: 4918-4925に定義された挿入モノマー、および2'-O-メトキシエチル-リボース(2'MOE)糖から独立に選択する。いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマー、またはその領域中に存在する上記の型のヌクレオシド類似体のうちの1種のみが存在する。
【０１７７】
特定の実施形態においては、ヌクレオシド類似体は、2'MOE糖、2'-フルオロ-デオキシリボース糖、もしくはLNA糖を含み、そのようなものとして、本発明のオリゴマーはこれらの3種の型から独立に選択されるヌクレオシド類似体を含んでもよい。ヌクレオシド類似体を含む特定のオリゴマーの実施形態においては、少なくとも1個の前記ヌクレオシド類似体は、2'-MOE-リボース糖を含み、例えば、2'-MOE-リボース糖を含む2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個のヌクレオシド類似体である。いくつかの実施形態においては、少なくとも1個のヌクレオシド類似体は、2'-フルオロ-デオキシリボース糖を含み、例えば、2'-フルオロ-DNAヌクレオチド糖を含む2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個のヌクレオシド類似体である。
【０１７８】
様々な実施形態においては、本発明に従うオリゴマーは、少なくとも1個のロックド核酸(LNA)モノマー、例えば、1、2、3、4、5、6、7もしくは8個のLNAモノマー、例えば、3〜7個もしくは4〜8個のLNAモノマー、または3、4、5、6もしくは7個のLNAモノマーを含む。様々な実施形態においては、全てのヌクレオシド類似体はLNAモノマーである。特定の実施形態においては、前記オリゴマーは、β-D-オキシ-LNAモノマーと、1個以上の以下のLNAモノマー：チオ-LNAモノマー、アミノ-LNAモノマー、オキシ-LNAモノマー、および／もしくはβ-Dもしくはα-L配置にあるENAモノマー、またはその組合せの両方を含む。特定の実施形態においては、オリゴマー中の全てのLNAモノマーのシトシン塩基部分は、5-メチルシトシンである。本発明の特定の実施形態においては、前記オリゴマーは、LNAモノマーとDNAモノマーの両方を含む。典型的には、LNAモノマーとDNAモノマーの総数は10〜25、好ましくは10〜24、好ましくは10〜20、好ましくは10〜18、さらにより好ましくは12〜16である。本発明のいくつかの実施形態においては、前記オリゴマーまたはその領域は少なくとも1個のLNAモノマーからなり、残りのモノマーはDNAモノマーである。特定の実施形態においては、前記オリゴマーは、必要に応じてホスホロチオエートなどの修飾連結基を有するLNAモノマーとヌクレオシド(RNAもしくはDNAモノマー、最も好ましくはDNAモノマー)のみを含む。
【０１７９】
様々な実施形態においては、オリゴマー中に存在する少なくとも1個のヌクレオシド類似体は、5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンからなる群より選択される修飾塩基を有する。
【０１８０】
LNA
用語「LNA」または「LNAモノマー」とは、「Locked Nucleic Acid」として知られる二環式ヌクレオシド類似体を指す。「LNAオリゴヌクレオチド」の文脈で用いられる場合、LNAとは1個以上のそのような二環式ヌクレオシド類似体を含むオリゴヌクレオチドを指す。LNAヌクレオシドは、二環系を形成するリボース糖環のC2'とC4'の間、例えば、以下に記載のR4*基とR2*基の間のリンカー基(架橋など)の存在を特徴とする。
【０１８１】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物(オリゴマー)中で用いられるLNAは、一般式I：
【化２】
2011527901.tif 000006
【０１８２】
(式中、全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められ；
式中、Xは-O-、-S-、-N(RN*)-および-C(R6R6*)-から選択され、より好ましくは-O-であり；
Bは水素、置換されていてもよいC1-4-アルコキシ、置換されていてもよいC1-4-アルキル、置換されていてもよいC1-4-アシルオキシ、天然の核酸塩基および核酸塩基類似体、DNA挿入剤、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化剤、リポーター基、ならびにリガンドから選択され、好ましくは、Bは核酸塩基もしくは核酸塩基類似体であり；
Pは隣接するモノマーとのヌクレオシド間連結、もしくは5'-末端基であり、該ヌクレオシド間連結もしくは5'-末端基は必要に応じて置換基R5もしくは同等に適用可能な置換基R5*を含み；
P*は隣接するモノマーとのヌクレオシド間連結、もしくは3'-末端基であり；
R4*およびR2*は一緒になって、例えば、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Z(式中、Zは-O-、-S-、および-N(Ra)-から選択され、RaおよびRbは水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいC1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA挿入剤、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化剤、リポーター基、およびリガンドから各々独立に選択され、式中、それぞれのアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個のゲミナル置換基RaおよびRbは一緒になって置換されていてもよいメチレン(=CH2)を形成してもよく、全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められる)から各々独立に選択される1〜4個の基／原子からなるビラジカルなどの二価リンカー基を形成し、ならびに；
それぞれの置換基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6およびR6*は、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA挿入剤、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化剤、リポーター基、およびリガンドから独立に選択され、式中、それぞれのアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個のゲミナル置換基は一緒になってオキソ、チオキソ、イミノ、もしくは置換されていてもよいメチレンであり；RNは水素およびC1-4-アルキルから選択され、2個の隣接する(非ゲミナル)置換基は二重結合をもたらすさらなる結合であってよい)；ならびにその塩基塩および酸付加塩の構造を有するのが好ましい。全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められる。
【０１８３】
本明細書で用いられる定義が置換されたC1-4-アルキル、置換されたC1-6-アルキル、置換されたC1-12-アルキル、置換されたC2-12-アルケニル、置換されたC2-6-アルケニル、置換されたC2-12-アルキニル、置換されたC2-6 アルキニル、置換されたC1-12-アルコキシ、置換されたC1-6-アルコキシ、置換されたC1-4-アルコキシ、置換されたC1-4-アシルオキシ、置換されたアリール、置換されたヘテロアリール、置換されたメチレン、置換されたアシル、置換されたC1-6-アミノアルキルまたは置換されたアミドを指す場合、好適な置換基は、好ましくは、1個以上のRg基(式中、それぞれのRgは、水素、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換されたC2-6アルキニル、CN、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、COOJ1、C(=X)J1、C(=X)NJ1J2、CN、O-C(=O)NJ1J2、O-C(=X)J1、NJ1C(=NH)NJ1J2およびNJ1C(=X)NJ1J2 (式中、XはOもしくはSであり; それぞれのJ1およびJ2は、H、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換されたC2-6アルキニル、C1-6アミノアルキル、置換されたC1-6アミノアルキルおよび保護基から独立に選択される)から独立に選択される)を含むのが好ましい。好ましくは、それぞれのRgは、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、CN、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、COOJ1、C(=X)J1、C(=X)NJ1J2、CN、O-C(=O)NJ1J2、O-C(=X)J1、NJ1C(=NH)NJ1J2およびNJ1C(=X)NJ1J2 (式中、XはOもしくはSであり；それぞれのJ1およびJ2はH、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アミノアルキルおよび保護基から独立に選択される)から独立に選択される。好適な保護基は、Theodora W GreeneおよびPeter G M Wutsによる「Protective Groups in Organic Synthesis」、第3版(John Wiley & Sons, 1999)に記載されている。
【０１８４】
いくつかの実施形態においては、R4*およびR2*は一緒になって、C(RaRb)-C(RaRb)-、C(RaRb)-O-、C(RaRb)-NRa-、C(RaRb)-S-、およびC(RaRb)-C(RaRb)-O-(式中、RaおよびRbは上記で定義された通りである)から選択されるリンカー基を形成する。いくつかの実施形態においては、RaおよびRbは水素およびC1-6アルキルから各々独立に選択され、より好ましくは、水素およびメチルから各々独立に選択される。
【０１８５】
いくつかの実施形態においては、R1*、R2、R3、R5、R5*は、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換されたC2-6アルキニル、C1-6アルコキシ、置換されたC1-6アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1-6アミノアルキルおよび置換されたC1-6アミノアルキルから各々独立に選択される。全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められる。
【０１８６】
いくつかの好ましい実施形態においては、R1*、R2、R3、R5、R5*は全ての水素である。
【０１８７】
いくつかの実施形態においては、R1*、R2、R3は水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換されたC2-6アルキニル、C1-6アルコキシ、置換されたC1-6アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1-6アミノアルキルおよび置換されたC1-6アミノアルキルから各々独立に選択される。全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められる。
【０１８８】
いくつかの好ましい実施形態においては、R1*、R2、R3は全て水素である。
【０１８９】
いくつかの実施形態においては、R5およびR5*は、H、-CH3、-CH2-CH3-、-CH2-O-CH3、および-CH=CH2から各々独立に選択される。好ましくは、いくつかの実施形態においては、R5またはR5*のいずれかは水素であり、他方の基(それぞれR5またはR5*)はC1-5アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換されたC1-6アルキル、置換されたC2-6アルケニル、置換されたC2-6アルキニルおよび置換されたアシル(-C(=O)-)から選択され；式中、各置換基は、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換されたC2-6アルキニル、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、COOJ1、CN、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2およびN(H)C(=X)N(H)J2(式中、XはOもしくはSであり; それぞれのJ1およびJ2はH、C1-6 アルキル、置換されたC1-6 アルキル、C2-6 アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6 アルキニル、置換されたC2-6 アルキニル、C1-6 アミノアルキル、置換されたC1-6アミノアルキルおよび保護基から独立に選択される)から独立に選択される置換基で一置換もしくは多置換される。いくつかの実施形態においては、R5またはR5*は、置換されたC1-6アルキルである。いくつかの実施形態においては、R5またはR5*は置換されたメチレンであり、ここで好ましい置換基としては、F, NJ1J2、N3、CN、OJ1、SJ1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2およびN(H)C(O)N(H)J2から独立に選択される1個以上の基が挙げられる。いくつかの実施形態においては、それぞれのJ1およびJ2は、独立にHまたはC1-6アルキルである。いくつかの実施形態においては、R5またはR5*は、メチル、エチル、またはメトキシメチルである。いくつかの実施形態においては、R5またはR5*はメチルである。いくつかの実施形態においては、R5またはR5*はエチレニルである。いくつかの実施形態においては、R5またはR5*は置換されたアシルである。いくつかの実施形態においては、R5またはR5*はC(=O)NJ1J2である。全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められる。そのような5'修飾二環式ヌクレオチドの例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとするWO 2007/134181に開示されている。
【０１９０】
いくつかの実施形態においては、Bは核酸塩基、例えば、核酸塩基類似体および天然核酸塩基、例えば、プリンもしくはピリミジン、または置換プリンもしくは置換ピリミジン、またはアデニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシル、および／または修飾核酸塩基もしくは置換された核酸塩基、例えば、5-チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、5-プロピニル-ウラシル、2'-チオ-チミン、5-メチルシトシン、5-チオゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシンおよび2,6-ジアミノプリンから選択される核酸塩基である。
【０１９１】
いくつかの実施形態においては、R4*およびR2*は一緒になって、-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Rc)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-O-、-C(RaRb)-S-および-C(RaRb)-C(RcRd)-S-(式中、Ra、Rb、Rc、Rd、Re、およびRfは、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA挿入剤、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化剤、リポーター基、およびリガンドから各々独立に選択され、式中、それぞれのアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個のゲミナル置換基RaおよびRbは一緒になって置換されていてもよいメチレン (=CH2)である)から選択されるリンカー基を形成する。全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められる。
【０１９２】
いくつかの実施形態においては、R4*およびR2*は一緒になって、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N(CH3)-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH(CH3)-、-CH=CH-CH2-、-CH2-O-CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N(CH3)-O-、-CH2-O-CH2-、-CH(CH3)-O-、-CH(CH2-O-CH3)-O-、-CH2-CH2-および-CH=CH-から選択されるリンカー基である。全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められる。
【０１９３】
いくつかの実施形態においては、R4*およびR2*は一緒になって、リンカー基C(RaRb)-N(Rc)-O-(式中、RaおよびRbは、水素、ハロゲン、C1-6 アルキル、置換されたC1-6 アルキル、C2-6 アルケニル、置換されたC2-6 アルケニル、C2-6 アルキニル、置換されたC2-6 アルキニル、C1-6 アルコキシ、置換されたC1-6アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1-6 アミノアルキルおよび置換されたC1-6 アミノアルキルから各々独立に選択され、より好ましくは、RaおよびRb は水素であり、; Rcは、水素、ハロゲン、C1-6 アルキル、置換されたC1-6 アルキル、C2-6 アルケニル、置換されたC2-6 アルケニル、C2-6 アルキニル、置換されたC2-6 アルキニル、C1-6 アルコキシ、置換されたC1-6 アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1-6 アミノアルキル、置換されたC1-6 アミノアルキルから選択され、より好ましくは、Rcは水素である)を形成する。
【０１９４】
いくつかの実施形態においては、R4*およびR2*は一緒になって、リンカー基C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-(式中、Ra、Rb、Rc、およびRdは、水素、ハロゲン、C1-6 アルキル、置換されたC1-6 アルキル、C2-6 アルケニル、置換されたC2-6 アルケニル、C2-6 アルキニル、置換されたC2-6 アルキニル、C1-6 アルコキシ、置換されたC1-6 アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1-6 アミノアルキル、置換されたC1-6 アミノアルキルから各々独立に選択され、より好ましくは、Ra、Rb、Rc、およびRdは水素である)を形成する。
【０１９５】
いくつかの実施形態においては、R4*およびR2*は一緒になって、リンカー基-CH(Z)-O-(式中、Zは、C1-6 アルキル、C2-6 アルケニル、C2-6 アルキニル、置換されたC1-6 アルキル、置換されたC2-6 アルケニル、置換されたC2-6 アルキニル、アシル、置換されたアシル、置換されたアミド、チオールおよび置換されたチオールから選択され; 置換された基の各々は、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2およびCN(式中、それぞれのJ1、J2およびJ3は、独立に、HもしくはC1-6 アルキルであり、XはO、SもしくはNJ1である)から独立に選択される必要に応じて保護された置換基で一置換もしくは多置換されていてもよい)を形成する。いくつかの実施形態においては、ZはC1-6 アルキルまたは置換されたC1-6 アルキルである。いくつかの実施形態においては、Zはメチルである。いくつかの実施形態においては、Zは置換されたC1-6 アルキルである。いくつかの実施形態においては、前記置換基はC1-6 アルコキシである。いくつかの実施形態においては、ZはCH3OCH2-である。全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められる。そのような二環式ヌクレオチドの例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第7,399,845号に開示されている。いくつかの実施形態においては、R1*、R2、R3、R5、R5*は全て水素である。いくつかの実施形態においては、R1*、R2、R3*は水素であり、R5、R5*の一方または両方は上記のように、およびWO 2007/134181に記載のように水素以外のものであってよい。
【０１９６】
いくつかの実施形態においては、R4*およびR2*は一緒になって、置換されたアミノ基を含むリンカー基を形成する、例えば、R4*およびR2*は一緒になって、基-CH2-N(Rc)-(式中、RcはC1-12 アルキルオキシである)からなるか、またはそれを含むリンカー基を形成する。いくつかの実施形態においては、R4*およびR2*は一緒になって、リンカー基-Cq3q4-NOR-(式中、q3およびq4は、水素、ハロゲン、C1-6 アルキル、置換されたC1-6 アルキル、C2-6 アルケニル、置換されたC2-6 アルケニル、C2-6 アルキニル、置換されたC2-6 アルキニル、C1-6 アルコキシ、置換されたC1-6 アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1-6 アミノアルキルおよび置換されたC1-6 アミノアルキルから各々独立に選択され; それぞれの置換された基は、独立に、ハロゲン、OJ1、SJ1、NJ1J2、COOJ1、CN、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)N J1J2およびN(H)C(=X=N(H)J2 (式中、XはOもしくはSであり; J1およびJ2のそれぞれは、H、C1-6 アルキル、C2-6 アルケニル、C2-6 アルキニル、C1-6 アミノアルキルおよび保護基から独立に選択される)から独立に選択される置換基で一置換もしくは多置換されている)を形成する。全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められる。そのような二環式ヌクレオチドの例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとするWO2008/150729に開示されている。いくつかの実施形態においては、R1*、R2、R3、R5、R5*は、水素、ハロゲン、C1-6 アルキル、置換されたC1-6 アルキル、C2-6 アルケニル、置換されたC2-6 アルケニル、C2-6 アルキニル、置換されたC2-6 アルキニル、C1-6 アルコキシ、置換されたC1-6 アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1-6 アミノアルキルおよび置換されたC1-6 アミノアルキルから各々独立に選択される。いくつかの実施形態においては、R1*、R2、R3、R5、R5*は全て水素である。いくつかの実施形態においては、R1*、R2、R3は全て水素であり、R5、R5*の一方または両方は上記のように、およびWO 2007/134181に記載のように水素以外のものであってよい。いくつかの実施形態においては、R4*およびR2*は一緒になって、リンカー基C(RaRb)-O-(式中、RaおよびRbは、ハロゲン、C1-C12アルキル、置換されたC1-C12アルキル、C2-C12アルケニル、置換されたC2-C12アルケニル、C2-C12アルキニル、置換されたC2-C12アルキニル、C1-C12アルコキシ、置換されたC1-C12アルコキシ、OJ1SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)NJ1J2、C(=O)J1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2およびN(H)C(=S)NJ1J2から各々独立に選択され; またはRaおよびRbは一緒になって=C(q3)(q4)(式中、q3およびq4は、各々独立に、H、ハロゲン、C1-C12アルキルもしくは置換されたC1-C12アルキルである)であり; それぞれの置換された基は、独立に、ハロゲン、C1-C6アルキル、置換されたC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換されたC2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換されたC2-C6アルキニル、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)NJ1J2、C(=O)J1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2およびN(H)C(=S)NJ1J2(式中、それぞれのJ1およびJ2はH、C1-C6アルキル、置換されたC1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換されたC2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換されたC2-C6アルキニル、C1-C6アミノアルキル、置換されたC1-C6アミノアルキルおよび保護基から独立に選択される)から独立に選択される置換基で一置換もしくは多置換されている)を形成する。そのような化合物は、その全体��参照により本明細書に組み入れられるものとするWO2009/006478に開示されている。
【０１９７】
いくつかの実施形態においては、R4*およびR2*は、リンカー基-Q-(式中、QはC(q1)(q2)C(q3)(q4)、C(q1)=C(q3)、C[=C(q1)(q2)]-C(q3)(q4)もしくはC(q1)(q2)-C[=C(q3)(q4)]であり; q1、q2、q3、q4は、H、ハロゲン、C1-12 アルキル、置換されたC1-12アルキル、C2-12アルケニル、置換されたC1-12 アルコキシ、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)-NJ1J2、C(=O) J1、-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2およびN(H)C(=S)NJ1J2(式中、それぞれのJ1およびJ2はH、C1-6 アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アミノアルキルおよび保護基から独立に選択される)から各々独立に選択され; 必要に応じて、式中、QがC(q1)(q2)(q3)(q4)であり、q3もしくはq4のうちの一方がCH3である場合、q3もしくはq4の他方のうちの少なくとも一方またはq1およびq2のうちの一方はH以外である)を形成する。いくつかの実施形態においては、R1*、R2、R3、R5、R5*は全て水素である。全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められる。そのような二環式ヌクレオチドの例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとするWO2008/154401に開示されている。いくつかの実施形態においては、R1*、R2、R3、R5、R5*は、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換されたC1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換されたC2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換されたC2-6アルキニル、C1-6アルコキシ、置換されたC1-6アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1-6アミノアルキルおよび置換されたC1-6 アミノアルキルから各々独立に選択される。いくつかの実施形態においては、R1*、R2、R3、R5、R5*は全て水素である。いくつかの実施形態においては、R1*、R2、R3は全て水素であり、R5、R5*の一方または両方は、上記のように、およびWO 2007/134181もしくはWO2009/067647に記載のように水素以外のものであってよい(α-L-二環式核酸類似体)。
【０１９８】
いくつかの好ましい実施形態においては、本発明のオリゴヌクレオチド化合物中に存在するLNAモノマーは、好ましくは、一般式II：
【化３】
2011527901.tif 000007
【０１９９】
(式中、Yは-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)および-CH2-から選択され；ZおよびZ*は、ヌクレオシド間結合、RH、末端基および保護基から各々独立に選択され；Bは天然もしくは非天然ヌクレオチド塩基部分(核酸塩基)であり、RHは水素およびC1-4アルキルから選択され；Ra、Rb、Rc、RdおよびReは、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNA挿入剤、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート化剤、リポーター基、およびリガンドから各々独立に選択され、それぞれのアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個のゲミナル置換基RaおよびRbは一緒になって、置換されていてもよいメチレン(=CH2)であってよく；ならびにRHは水素およびC1-4アルキルから選択される)
の構造を有する。いくつかの好ましい実施形態においては、Ra、Rb、Rc、RdおよびReは、水素およびC1-6アルキルから各々独立に選択され、より好ましくはメチルである。全てのキラル中心について、非対称の基はRもしくはS方向で認められ、例えば、2個の立体化学的異性体の例としては、以下に例示することができるβ-Dおよびα-L異性体が挙げられる：
【化４】
2011527901.tif 000008
【０２００】
特定のLNA単位の例を以下に示す(スキーム2)。
【化５】
2011527901.tif 000009
【０２０１】
用語「チオ-LNA」は、上記一般式中のYがSまたは-CH2-S-から選択されるロックされたヌクレオシドを含む。チオ-LNAは、β-Dおよびα-L配置の両方にあってよい。
【０２０２】
用語「アミノ-LNA」は、上記一般式中のYが-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-および-CH2-N(R)(式中、Rは水素およびC1-4アルキルから選択される)から選択されるロックされたヌクレオシドを含む。アミノ-LNAはβ-Dおよびα-L配置の両方にあってよい。
【０２０３】
用語「オキシ-LNA」は、上記一般式中のYが-O-であるロックされたヌクレオシドを含む。オキシ-LNAはβ-Dおよびα-L配置の両方にあってよい。
【０２０４】
用語「ENA」は、上記一般式中のYが-CH2-O-(式中、-CH2-O-の酸素原子は塩基Bに関して2'位置に結合している)であるロックされたヌクレオシドを含む。Reは水素またはメチルである。
【０２０５】
いくつかの例示的な実施形態においては、LNAはβ-D-オキシ-LNA、α-L-オキシ-LNA、β-D-アミノ-LNAおよびβ-D-チオ-LNAから選択され、特に、β-D-オキシ-LNAである。
【０２０６】
RNAse Hの動員
いくつかの実施形態においては、オリゴマーは、翻訳の立体障害などによる標的mRNAの非RNaseを介する分解、または他の機構を介して機能する；しかしながら、様々な実施形態において、本発明のオリゴマーは、RNase Hなどのエンドリボヌクレアーゼ(RNase)などの1種以上のRNAse酵素または複合体を動員することができる。
【０２０７】
典型的には、前記オリゴマーは、標的RNAの標的領域との二本鎖を形成する場合、RNaseを動員することができる、7、8、9、10、11、12、13、14、15もしくは16個の連続モノマーなどの、少なくとも8個もしくは少なくとも9個の連続モノマーなどの少なくとも7個の連続モノマーなどの少なくとも6個の領域を含む。RNAseを動員することができるオリゴマーの領域は、本明細書に記載のギャップマーの文脈において言及されるように、領域Bであってよい。いくつかの実施形態においては、領域BなどのRNAseを動員することができるオリゴマーの領域は、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のモノマーからなる。
【０２０８】
EP 1 222 309は、RNaseH活性を決定するためのin vitroでの方法を提供し、これを用いてRNaseHを動員する本発明のオリゴマーの能力を決定することができる。オリゴマーは、参照により本明細書に組み入れられるものとするEP 1 222 309の実施例91〜95により提供される方法を用いて、RNA標的の相補的領域と接触させた場合に、それが、同じ配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート連結基を有し、2'置換を含まないDNAモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを用いて決定された初期速度の少なくとも1％、例えば、少なくとも5％、例えば、少なくとも10％もしくは20％以上の、pmol/分で測定される初期速度を有する場合、RNaseHを動員することができると見なされる。
【０２０９】
いくつかの実施形態においては、オリゴマーは、EP 1 222 309の実施例91〜95により提供される方法を用いて、RNA標的の相補的標的領域およびRNaseHと接触させた場合に、pmol/分で測定されるRNaseH初期速度が、同じ配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート連結基を有し、2'置換を含まないDNAモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを用いて決定された初期速度の1％未満、例えば、5％未満、例えば、10％未満または20％未満である場合、RNaseHを本質的に動員することができないと見なされる。
【０２１０】
他の実施形態においては、オリゴマーは、EP 1 222 309の実施例91〜95により提供される方法を用いて、RNA標的の相補的標的領域およびRNaseHと接触させた場合に、pmol/分で測定されるRNaseH初期速度が、同じ配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート連結基を有し、2'置換を含まないDNAモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを用いて決定された初期速度の少なくとも20％、例えば、少なくとも40％、例えば、少なくとも60％、例えば、少なくとも80％である場合、RNaseHを動員することができると見なされる。
【０２１１】
典型的には、標的RNAの相補的標的領域との二本鎖を形成し、RNaseを動員することができるオリゴマーの領域は、DNAモノマーと、必要に応じてLNAモノマーを含み、標的領域とのDNA-RNA様の二本鎖を形成する。LNAモノマーは、好ましくはα-L配置にあり、特に好ましくはα-L-オキシLNAである。
【０２１２】
様々な実施形態においては、本発明のオリゴマーは、ヌクレオシドとヌクレオシド類似体の両方を含み、ギャップマー、ヘッドマーまたはミクスマーの形態にある。
【０２１３】
「ヘッドマー」は、領域Xと、それと連続的である領域Yを含み、領域Xの最も3'側のモノマーに連結された領域Yの最も5'側のモノマーを有するオリゴマーと定義される。領域Xは、非RNaseを動員するヌクレオシド類似体の連続的ストレッチを含み、領域YはRNaseにより認識かつ切断可能なDNAモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマーの連続的ストレッチ(少なくとも7個の連続モノマーなど)を含む。
【０２１４】
「テイルマー」は、領域Xとそれと連続的である領域Yを含み、領域Xの最も3'側のモノマーに連結された領域Yの最も5'側のモノマーを有するオリゴマーと定義される。領域Xは、RNaseにより認識かつ切断可能なDNAモノマーまたはヌクレオシド類似体の連続的ストレッチ(少なくとも7個の連続モノマーなど)を含み、領域Yは非RNaseを動員するヌクレオシド類似体の連続的ストレッチを含む。
【０２１５】
「ミクスマー」と呼ばれる他の「キメラ」オリゴマーは、(i)RNaseにより認識かつ切断可能なDNAモノマーまたはヌクレオシド類似体、および(ii)非RNaseを動員するヌクレオシド類似体モノマーの選択的組成物からなる。
【０２１６】
いくつかの実施形態においては、標的領域に関するオリゴマーの親和性の増強に加えて、いくつかのヌクレオシド類似体はまた、RNase(例えば、RNaseH)結合および切断を媒介する。α-L-LNAモノマーはある程度までRNaseH活性を動員するため、いくつかの実施形態においては、α-L-LNAモノマーを含むオリゴマーのギャップ領域(例えば、本明細書に記載の領域B)は、RNaseHにより認識かつ切断可能なより少ないモノマーからなり、ミクスマー構築物中により高い可撓性が導入される。
【０２１７】
コンジュゲート
本開示の文脈においては、用語「コンジュゲート」は、それ自体核酸でもモノマーでもない1個以上の部分(「結合部分」)への、本明細書に記載のオリゴマーの共有結合(「コンジュゲーション」)により形成される化合物を指す。そのような結合部分の例としては、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはその組合せなどの大分子化合物が挙げられる。典型的には、タンパク質は標的タンパク質に対する抗体であってよい。典型的なポリマーはポリエチレングリコールであってよい。
【０２１８】
従って、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のオリゴマーと、該オリゴマーに共有結合した核酸でもモノマーでもない少なくとも1個の結合部分とを含むコンジュゲートである。したがって、本発明のオリゴマーが本明細書に開示されるような特定の塩基配列を有する連続モノマーからなる特定の実施形態においては、前記コンジュゲートはまたオリゴマーに共有結合した少なくとも1個の結合部分を含んでもよい。
【０２１９】
本発明の様々な実施形態においては、前記オリゴマーを、オリゴマー化合物の細胞取込みを増加させる部分にコンジュゲートさせる。WO2007/031091は、好適なリガンドおよびコンジュゲート(部分)を提供し、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０２２０】
様々な実施形態においては、コンジュゲーション(結合部分への)は、本発明のオリゴマーの活性、細胞分布または細胞取込みを増強することができる。そのような部分としては、限定されるものではないが、抗体、ポリペプチド、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-s-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-h-ホスホナート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が挙げられる。
【０２２１】
特定の実施形態においては、本発明のオリゴマーを、活性薬剤物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗細菌剤または抗生物質に結合させる。
【０２２２】
特定の実施形態においては、結合部分はステロール、例えば、コレステロールである。
【０２２３】
様々な実施形態においては、結合部分は、正に荷電したポリマー、例えば、長さ1〜50個、例えば、2〜20個、例えば、3〜10個のアミノ酸残基の正に荷電したペプチド、および／またはポリアルキレンオキシド、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)もしくはポリプロピレングリコールを含むか、またはそれからなる(参照により本明細書に組み入れられるものとするWO 2008/034123を参照されたい)。好適には、ポリアルキレンオキシドなどの正に荷電したポリマーを、WO 2008/034123に記載の遊離性リンカーなどのリンカーを介して本発明のオリゴマーに結合させることができる。
【０２２４】
例えば、以下の部分を、本発明のコンジュゲート中で用いることができる。
【化６】
2011527901.tif 000010
【０２２５】
活性化オリゴマー
本明細書で用いられる用語「活性化オリゴマー」とは、1個以上の結合部分、すなわち、本明細書に記載のコンジュゲートを形成する、それ自体は核酸でもモノマーでもない部分へのオリゴマーの共有結合を可能にする少なくとも1個の機能的部分に共有結合(すなわち、官能化)した本発明のオリゴマーを指す。典型的には、機能的部分は、例えば、3'-ヒドロキシル基もしくはアデニン塩基の環外NH2基を介してオリゴマーに共有結合することができる化学基、好ましくは、結合部分(例えば、アミノ、スルフヒドリルもしくはヒドロキシル基)に結合することができる親水性基および末端基であるスペーサーを含むであろう。いくつかの実施形態においては、末端基は保護されておらず、例えば、NH2基である。他の実施形態においては、末端基を、例えば、Theodora W. GreeneおよびPeter G. M. Wutsによる「Protective Groups in Organic Synthesis」、第3版 (John Wiley & Sons, 1999)に記載のものなどの任意の好適な保護基により保護する。好適なヒドロキシル保護基の例としては、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチル、もしくはトリフェニルメチルなどのアラルキル基、およびテトラヒドロピラニルが挙げられる。好適なアミノ保護基の例としては、ベンジル、α-メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、およびトリクロロアセチルもしくはトリフルオロアセチルなどのアシル基が挙げられる。
【０２２６】
いくつかの実施形態においては、機能的部分は自己切断性である。他の実施形態においては、機能的部分は生分解性である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第7,087,229号を参照されたい。
【０２２７】
いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーを5'末端で活性化(すなわち、官能化)して、オリゴマーの5'末端への結合部分の共有結合を可能にする。他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを3'末端で官能化することができる。さらに他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを、主鎖に沿って、またはヘテロ環塩基部分上で官能化することができる。さらに他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを、5'末端、3'末端、主鎖および塩基から独立に選択される2個以上の位置で官能化することができる。
【０２２８】
いくつかの実施形態においては、本発明の活性化オリゴマーを、合成の間に、機能的部分に共有結合した1個以上のモノマーを組み入れることにより合成する。他の実施形態においては、本発明の活性化オリゴマーを、官能化されていないモノマーと共に合成し、該オリゴマーを合成の完了時に官能化する。
【０２２９】
いくつかの実施形態においては、前記オリゴマーを、アルキル部分が式(CH2)w(式中、wは1〜10の整数、好ましくは約6である)を有し、アルキルアミノ基のアルキル部分が直鎖もしくは分枝鎖であってよく、官能基をエステル基(-O-C(O)-(CH2)wNH)を介してオリゴマーに結合させた、アミノアルキルリンカーを含むヒンダードエステルを用いて官能化する。
【０２３０】
他の実施形態においては、前記オリゴマーを、(CH2)w-スルフヒドリル(SH)リンカー(式中、wは1〜10の整数、好ましくは約6であり、アルキルアミノ基のアルキル部分が直鎖もしくは分枝鎖であってよく、官能基をエステル基(-O-C(O)-(CH2)wSH)を介してオリゴマーに結合させる)を含むヒンダードエステルを用いて官能化する。いくつかの実施形態においては、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドを、ポリエチレングリコールもしくはペプチドなどのポリマー部分を用いてコンジュゲートさせる(ジスルフィド結合の形成を介する)。
【０２３１】
上記のヒンダードエステルを含む活性化オリゴマーを、当業界で公知の任意の方法により、特に、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとするPCT公開WO 2008/034122およびその中の実施例に開示された方法により合成することができる。
【０２３２】
少なくとも1個の機能的部分に共有結合した活性化オリゴマーを、当業界で公知の任意の方法により、特に、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許出願公開第2004/0235773号ならびにZhaoら(2007) J. Controlled Release 119:143-152; およびZhaoら(2005) Bioconjugate Chem. 16:758-766に開示された方法により合成することができる。
【０２３３】
さらに他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを、実質的には米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に記載の官能化試薬、すなわち、親水性スペーサー鎖を介して、保護されたもしくは保護されていないスルフヒドリル、アミノもしくはヒドロキシル基を含む反対側の末端に連結された一方の末端にホスホルアミダイトを有する実質的に線状の試薬を用いて、オリゴマー中にスルフヒドリル、アミノもしくはヒドロキシル基を導入することにより官能化する。そのような試薬は主に、オリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの実施形態においては、そのような活性化オリゴマーは、オリゴマーの5'ヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。他の実施形態においては、活性化オリゴマーは、3'ヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。さらに他の実施形態においては、本発明の活性化オリゴマーは、オリゴマーの主鎖上のヒドロキシル基に結合した官能化試薬を有する。さらなる実施形態においては、本発明のオリゴマーを、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に記載の2種以上の官能化試薬を用いて官能化する。そのような官能化試薬を合成し、モノマーまたはオリゴマー中にそれを組込む方法は、米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に開示されている。
【０２３４】
いくつかの実施形態においては、固相に結合したオリゴマーの5'末端を、ジエニルホスホルアミダイト誘導体を用いて官能化した後、Diels-Alder付加環化反応を介して、保護されたオリゴマーと、例えば、アミノ酸もしくはペプチドとをコンジュゲーションさせる。
【０２３５】
様々な実施形態においては、オリゴマーへの、2'-カルバメート置換糖もしくは2'-(O-ペンチル-N-フタルイミド)-デオキシリボース糖などの2'-糖修飾を含むモノマーの組込みにより、オリゴマーの糖への結合部分の共有結合が容易になる。他の実施形態においては、1個以上のモノマーの2'位置にアミノを含有するリンカーを含むオリゴマーを、例えば、5'-ジメトキシトリチル-2'-O-(e-フタルイミジルアミノペンチル)-2'-デオキシアデノシン-3'-N,N-ジイソプロピル-シアノエトキシホスホルアミダイトなどの試薬を用いて調製する。例えば、Manoharanら、Tetradedron Letters, 1991, 34, 7171を参照されたい。
【０２３６】
さらに他の実施形態においては、本発明のオリゴマーは、N6プリンアミノ基、グアニンの環外N2、またはシトシンのN4もしくは5位置上などの核酸塩基上にアミンを含有する機能的部分を有する。様々な実施形態において、そのような官能化を、オリゴマー合成中に既に官能化された市販の試薬を用いることにより達成することができる。
【０２３７】
いくつかの機能的部分が市販されており、例えば、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性連結部分がPierce Co. (Rockford, III)から入手可能である。他の商業的に入手可能な連結基は、両方ともGlen Research Corporation (Sterling, Va.)から入手可能な5'-アミノ-改変剤C6および3'-アミノ-改変剤試薬である。5'-アミノ-改変剤C6はAminolink-2としてABI(Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.)からも入手可能であり、3'-アミノ-改変剤はClontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.)からも入手可能である。
【０２３８】
組成物
様々な実施形態においては、本発明のオリゴマーを医薬製剤および組成物中で用いる。好適には、そのような組成物は、製薬上許容し得る希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。WO2007/031091は、好適かつ好ましい製薬上許容し得る希釈剤、担体およびアジュバントを提供しており、参照により本明細書に組み入れられるものとする。好適な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤もWO2007/031091に提供されており、これも参照により本明細書に組み入れられるものとする。また、製剤および投与のための技術に関する詳細を、「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES」(Maack Publishing Co, Easton Pa.)の最新版に見出すことができる。
【０２３９】
いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーを結合部分に共有結合させて、細胞膜を横断するオリゴマーの送達を助ける。細胞膜を横断するオリゴマーの送達を助ける結合部分の例は、コレステロールなどの脂肪族部分である。様々な実施形態においては、本発明のオリゴマーを、Lipofectamine 2000またはLipofectamine RNAiMAX(両方ともInvitrogenから市販されている)などのリポソームを形成する脂質製剤と共に製剤化する。いくつかの実施形態においては、本発明のオリゴマーを、1種以上の脂質様非天然小分子(「リピドイド」)の混合物と共に製剤化する。リピドイドのライブラリーを、従来の合成化学方法により合成し、様々な量および組合せのリピドイドをアッセイして、選択された投与経路により標的化された組織への特定のサイズのオリゴマーの効率的な送達のためのビヒクルを開発することができる。好適なリピドイドライブラリーおよび組成物を、例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとする、http://www.nature.com/nbt/journal/vaop/ncurrent/abs/nbt1402.htmlで利用可能なAkincら(2008) Nature Biotechnol.に見出すことができる。
【０２４０】
本明細書で用いられる用語「製薬上許容し得る塩」とは、本明細書で同定されたオリゴマーの所望の生物活性を保持し、許容し得るレベルの望ましくない毒性効果を示す塩を指す。そのような塩の非限定例を、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属陽イオンと共に形成された有機アミノ酸および塩基付加塩、またはアンモニア、N,N'-ジベンジルエチレン-ジアミン、D-グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、もしくはエチレンジアミンから形成された陽イオン；または(c)(a)と(b)の組合せ；例えば、タンニン酸亜鉛塩などと共に形成させることができる。
【０２４１】
特定の実施形態においては、本発明に従う医薬組成物は、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートに加えて、他の活性成分、例えば、前立腺癌、グリオーマ、結腸直腸癌、メラノーマ、乳癌、肺癌もしくは肝細胞癌などの癌などの過増殖性障害の治療にとって有用な活性薬剤を含む。
【０２４２】
いくつかの実施形態においては、さらなる活性薬剤はパクリタキセルである(Naritaら、Clin. Cancer. Res. 2008 Sept 15:14(18):5769)。
【０２４３】
一実施形態においては、本発明は、本発明に従う医薬組成物と、特定の実施形態においては本発明の医薬組成物の投与の前に、その間に、またはその後に投与するさらなる活性薬剤(例えば、パクリタキセル)とを投与することを含むことを特徴とする組合せ治療を提供する。
【０２４４】
本発明はまた、第1の部分が少なくとも1個の本発明に従うオリゴマー、コンジュゲートおよび／もしくは医薬組成物を含み、さらなる部分が前立腺癌、グリオーマ、結腸直腸癌、メラノーマ、乳癌、肺癌もしくは肝細胞癌などの癌などの過増殖性障害の治療にとって有用な1種以上の活性薬剤(例えば、パクリタキセル)を含むキットの部分を提供する。従って、前記キットの部分を、本明細書に記載の治療方法であって、第1の部分とさらなる部分の両方を、同時に、または一方の後に他方を投与することを含む前記方法において用いることができることが想定される。
【０２４５】
用途
本明細書で用いられる用語「治療」とは、存在する疾患(例えば、本明細書の以下に記載の疾患もしくは障害)の治療、または疾患の防止、すなわち、予防の両方を指す。従って、特定の実施形態においては、「治療」は予防を含むことが認識されるであろう。
【０２４６】
様々な実施形態においては、本発明のオリゴマーを、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として用いることができる。
【０２４７】
いくつかの実施形態においては、そのようなオリゴマーを、細胞および実験動物中でのGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3タンパク質の発現を特異的に阻害する(典型的には、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3 mRNAを分解もしくは阻害することにより、タンパク質形成を防止することによる)ための研究目的のために使用し、それによって標的の機能的分析または治療的介入のための標的としてのその無用性の評価を容易にすることができる。
【０２４８】
特定の実施形態においては、前記オリゴマーを診断において用いて、ノーザンブロッティング、in-situハイブリダイゼーションもしくは同様の技術により細胞および組織中でのGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3発現を検出および／または定量することができる。
【０２４９】
様々な治療的実施形態においては、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3の発現を調節することにより治療することができる疾患または障害を有することが疑われる非ヒト動物またはヒトを、本発明に従う有効量のオリゴマーを投与することにより治療する。さらに、治療上または予防上有効量の本発明の1種以上のオリゴマー、コンジュゲートまたは組成物を投与することにより、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3の発現と関連する疾患または症状を有することが疑われるか、もしくはそれに罹りやすいヒトなどの動物を治療する方法を提供する。
【０２５０】
特定の実施形態においては、本発明はまた、本明細書に記載の障害の治療のための医薬の製造における本明細書に記載の本発明のオリゴマーもしくはコンジュゲートの使用、または本明細書に記載の障害の治療方法も提供する。
【０２５１】
様々な実施形態においては、本発明はまた、本明細書に記載の障害を治療する方法であって、本明細書に記載の本発明に従うオリゴマー、および／もしくは本発明に従うコンジュゲート、および／もしくは本発明に従う医薬組成物を、それを必要とする動物(それを必要とする患者)に投与することを含む前記方法も提供する。
【０２５２】
実施例に例示されるように、本発明のオリゴマーを用いて、標的核酸を発現している哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞などの細胞中でアポトーシスを誘導することができる。これに関して、本発明はさらに、前記細胞中でアポトーシスを誘導する方法であって、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3を発現している細胞と、アポトーシスを誘導するのに十分な量の本発明のオリゴマーもしくはコンジュゲートもしくは医薬組成物とを接触させる工程を含む前記方法を提供する。アポトーシスをin vivoまたはin vitroで誘発することができる。好適には、前記オリゴマーを、前記細胞中でアポトーシスを誘発するのに有効な量で添加する。いくつかの実施形態においては、前記細胞は癌細胞である。
【０２５３】
医学的適応
特定の治療的実施形態においては、治療しようとする障害は、前立腺癌、グリオーマ、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、メラノーマもしくは肝細胞癌などの過増殖性障害(例えば、癌)である。様々な実施形態においては、本発明に従うそのような疾患または症状の治療を、放射線療法、化学療法または免疫療法などの1種以上の他の抗癌治療と組合わせることができる。
【０２５４】
様々な実施形態においては、前記疾患または障害は、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3遺伝子またはタンパク質産物がGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3と結合するか、もしくは相互作用する遺伝子の突然変異と関連する。従って、様々な実施形態において、標的mRNAは、突然変異形態のGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3配列であり、例えば、それは1個以上の単一の点突然変異またはトリプレット反復を含む。
【０２５５】
様々な実施形態においては、前記疾患または障害は異常なレベルのGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3と関連する。
【０２５６】
本明細書で用いられる用語「異常な」とは、本明細書に記載の疾患、障害または症状を有さない動物の細胞中での発現レベルと比較した、細胞中でのGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3遺伝子の過剰発現(例えば、上方調節)を指す。
【０２５７】
いくつかの実施形態においては、本発明に従うオリゴマー、コンジュゲートまたは組成物を、GLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3遺伝子の過剰発現(例えば、上方調節)と関連する症状の治療のために用いることができる。
【０２５８】
他の実施形態においては、前記疾患または障害は、異常なレベルの突然変異形態のGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3と関連する。
【０２５９】
本明細書で用いられる用語「突然変異」および「突然変異形態」とは、配列番号1に示されるGLI2核酸の変異体；および／または配列番号134に示されるGLI3核酸の変異体を指す。前記変異体は、本明細書に記載の疾患、障害または症状と関連してもよい。いくつかの実施形態においては、本明細書で用いられる用語「変異体」とは、1個以上のヌクレオチド付加および／または置換および／または欠失により配列番号1および／もしくは配列番号2および／もしくは配列番号134と異なる塩基配列を有するヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態においては、前記変異体は、配列番号1および／もしくは配列番号2および／もしくは配列番号134と少なくとも80％、85％、90％または95％の配列相同性(同一性)を有する。同じか、または異なる実施形態においては、変異体は配列番号1および／もしくは配列番号2および／もしくは配列番号134の全長にわたって、60個以下の追加のヌクレオチドおよび／または置換されたヌクレオチドおよび／または欠失したヌクレオチド；例えば、配列番号1および／もしくは配列番号2および／もしくは配列番号134の全長にわたって、30個以下の追加のヌクレオチドおよび／または置換されたヌクレオチドおよび／または欠失したヌクレオチド；例えば、15個以下の追加のヌクレオチドおよび／または置換されたヌクレオチドおよび／または欠失したヌクレオチドを有する。
【０２６０】
様々な実施形態において、本発明は、GLI2標的遺伝子、すなわち、GLI2により調節される遺伝子の遺伝子産物の発現を調節する方法に関する。GLI2標的遺伝子の例としては、GLI1およびPTCH1が挙げられる。いくつかの実施形態においては、GLI2標的遺伝子の調節は、標的遺伝子の発現または活性の増加をもたらす。他の実施形態においては、GLI2標的遺伝子の調節は、標的遺伝子の発現または活性の低下をもたらす。
【０２６１】
本発明はさらに、本明細書に開示される任意かつ全ての症状の治療のための薬剤の製造における本発明のオリゴマーの使用を提供する。
【０２６２】
様々な実施形態においては、本発明は、異常なレベルのGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3 mRNAまたはタンパク質と関連する症状に罹患するか、またはそれに罹りやすい哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物に、1個以上のLNAモノマーを含む、治療上有効量の本発明のオリゴマー、またはそのコンジュゲートを投与することを含む前記方法に関する。
【０２６３】
本発明の興味深い態様は、上記で開示された症状の治療のための医薬の調製における、本明細書に定義されるオリゴマー(化合物)または本明細書に定義されるコンジュゲートの使用に関する。
【０２６４】
様々な実施形態においては、本発明は、治療上有効量の本発明に従うオリゴマー、またはそのコンジュゲートを、そのような療法を必要とする非ヒト動物またはヒトに投与することを含む、疾患を予防または治療する方法を包含する。
【０２６５】
特定の実施形態においては、本発明のLNAオリゴマー、またはそのコンジュゲートを、連続的よりもむしろ短期間投与する。
【０２６６】
本発明の特定の実施形態においては、前記オリゴマー(化合物)を、結合部分に連結して、例えば、オリゴマーの細胞取込みを増加させる。一実施形態においては、結合部分は、コレステロールなどのステロールである。
【０２６７】
様々な実施形態においては、本発明は、異常なレベルのGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3を治療する方法であって、本発明のオリゴマー、またはそのコンジュゲートもしくは医薬組成物を、そのような治療を必要とする動物(患者など)に投与することを含み、必要に応じて、さらなる化学療法剤の投与をさらに含む前記方法に関する。いくつかの実施形態においては、化学療法剤を、オリゴマーにコンジュゲートし、医薬組成物中に存在させるか、または別の製剤中で投与する。
【０２６８】
本発明はまた、医薬としての使用のための本明細書に定義されるオリゴマー、組成物またはコンジュゲートに関する。
【０２６９】
本発明はさらに、異常なレベルのGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3または突然変異形態のGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3 (本明細書に記載の疾患の1つと関連するものなどの対立遺伝子変異体など)の発現の治療のための医薬の製造における、本明細書に定義されるオリゴマー、組成物、またはコンジュゲートの使用に関する。
【０２７０】
さらに、様々な実施形態において、本発明は、癌、例えば、前立腺癌、グリオーマ、結腸直腸癌、メラノーマ、乳癌、肺癌もしくは肝細胞癌などの過増殖性障害からなる群より選択される疾患または症状に罹患する動物(患者など)を治療する方法であって、本明細書に定義される医薬組成物を、それを必要とする動物(患者など)に投与する工程を含む前記方法に関する。
【０２７１】
特定の実施形態においては、本発明の方法を、異常なレベルのGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3により引き起こされる疾患に対する治療または予防に用いる。
【０２７２】
いくつかの実施形態においては、本発明は、異常なレベルのGLI2および／もしくはGLI1および／もしくはGLI3を治療する方法であって、本発明のオリゴマー、または本発明のコンジュゲートもしくは本発明の医薬組成物を、それを必要とする動物(患者など)に投与することを含む前記方法に関する。
【０２７３】
さらに、本発明は、本明細書に記載のものなどの疾患または症状に罹患する動物(ヒトなど)を治療する方法に関する。
【０２７４】
治療を必要とする動物(患者など)は、疾患または障害を罹患するか、または罹患する可能性がある動物(患者など)である。
【０２７５】
好適な動物としては、ヒトおよび非ヒト動物が挙げられる。
【０２７６】
いくつかの実施形態においては、動物は哺乳動物である。例としては、ヒト、げっ歯類(ラットおよびマウスなど)、ウサギ、霊長類、非ヒト霊長類(チンパンジーおよびサルなど)、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌおよびネコが挙げられる。
【０２７７】
好適な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組合せ、プロドラッグ製剤も、WO2007/031091(参照により本明細書に組み入れられるものとする)に提供されている。
【０２７８】
本発明はまた、本明細書に記載のオリゴマーまたはコンジュゲートと、製薬上許容し得る希釈剤、担体またはアジュバントとを含む医薬組成物も提供する。WO2007/031091(参照により本明細書に組み入れられるものとする)は、好適かつ好ましい製薬上許容し得る希釈剤、担体およびアジュバントを提供する。
【０２７９】
実施形態
本発明の以下の実施形態を、本明細書に記載の他の実施形態と組合わせて用いることができる。
【０２８０】
1. 合計10〜30個のヌクレオチドの連続的ヌクレオチド配列であって、哺乳動物GLI2遺伝子に対応する領域または配列番号1などの、そのmRNAの逆相補体もしくは天然の変異体と少なくとも80％相同である前記連続的ヌクレオチド配列を含む、長さ10〜30ヌクレオチドのオリゴマー。
【０２８１】
2. 連続的ヌクレオチド配列が、配列番号3〜90のいずれかに対応する領域と少なくとも80％相同である、実施形態1に記載のオリゴマー。
【０２８２】
3. 連続的ヌクレオチド配列が、配列番号1の対応する領域の逆相補体との不一致を含まないか、または2個以下の不一致を含む、実施形態1または2に記載のオリゴマー。
【０２８３】
4. 前記連続的ヌクレオチド配列が、ヒトGLI1(配列番号1)およびGLI2(配列番号2) mRNA配列の両方の逆相補体の対応する領域に対して不一致を含まないか、または1もしくは2個以下の不一致を含む、実施形態1〜3のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２８４】
5. オリゴマーのヌクレオチド配列が連続的ヌクレオチド配列からなる、実施形態1〜4のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２８５】
6. 連続的ヌクレオチド配列が、長さ10〜18ヌクレオチドである、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２８６】
7. 連続的ヌクレオチド配列がヌクレオチド類似体を含む、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２８７】
8. ヌクレオチド類似体が、Locked Nucleic Acid (LNA)単位；2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、および2'-フルオロ-DNA単位からなる群より選択される糖修飾ヌクレオチドなどの糖修飾ヌクレオチドである、実施形態7に記載のオリゴマー。
【０２８８】
9. ヌクレオチド類似体がLNAである、実施形態8に記載のオリゴマー。
【０２８９】
10. ギャップマーである実施形態7〜9のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２９０】
11. GLI2遺伝子またはmRNAを発現している細胞中でのGLI2遺伝子またはmRNAの発現を阻害する、実施形態1〜10のいずれか1つに記載のオリゴマー。
【０２９１】
12. 実施形態1〜11のいずれか1つに記載のオリゴマーと、該オリゴマーに共有結合した少なくとも1個の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
【０２９２】
13. 実施形態1〜11のいずれか1つに記載のオリゴマー、または実施形態12に記載のコンジュゲート、および製薬上許容し得る希釈剤、担体、塩もしくはアジュバントを含む医薬組成物。
【０２９３】
14. 癌などの過増殖性障害の治療のためなどの医薬としての使用のための、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のオリゴマー、または実施形態12に記載のコンジュゲート。
【０２９４】
15. 癌などの過増殖性障害の治療のための医薬の製造における、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のオリゴマー、または実施形態12に定義されたコンジュゲートの使用。
【０２９５】
16. 実施形態1〜11のいずれか1つに記載のオリゴマー、または実施形態12に記載のコンジュゲート、または実施形態13に記載の医薬組成物を、癌などの過増殖性障害を罹患しているか、または罹患する可能性がある患者に投与することを含む、癌などの過増殖性障害を治療する方法。
【０２９６】
17. GLI2を発現している細胞中でのGLI2の阻害のための方法であって、該細胞中でGLI2を阻害するように、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のオリゴマー、または実施形態12に記載のコンジュゲートを投与することを含む前記方法。
【０２９７】
18. GLI2を発現している細胞中でアポトーシスを誘導する方法であって、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のオリゴマー、または実施形態12に記載のコンジュゲート、または実施形態13に記載の医薬組成物を、アポトーシスを誘発するのに十分な量で該細胞に投与する工程を含む前記方法。
【０２９８】
(実施例)
【実施例１】
【０２９９】
モノマー合成
LNAモノマー構成要素および誘導体を、公開された手順およびそこに引用された参考文献に従って調製した(WO 07/031081およびそこに引用された参考文献を参照)。
【実施例２】
【０３００】
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド(オリゴマー)を、WO 07/031081に記載の方法に従って合成した。表1は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドモチーフの例を示す。
【実施例３】
【０３０１】
オリゴヌクレオチドの設計
本発明に従って、本明細書で配列番号1として提示される、公開された配列GenBankアクセッション番号NM_005270を用いて、ヒトGLI2 mRNAの異なる領域を標的化する一連のオリゴヌクレオチド(オリゴマー)を設計した。いくつかの実施形態においては、本明細書で配列番号2として提示される、公開された配列GenBankアクセッション番号NM_005269を用いて、GLI1 mRNAを標的化するオリゴヌクレオチドおよび／または本明細書で配列番号134として提示される、公開された配列GenBankアクセッション番号NM_000168を用いて、GLI3 mRNAを標的化するオリゴヌクレオチドも設計した。
【表１】
2011527901.tif 000011
【０３０２】
2011527901.tif 000012
【０３０３】
2011527901.tif 000013
【０３０４】
表2は、本発明のオリゴマーを設計することができる24マーの配列モチーフを示す。太字は表1に示されたオリゴマー配列モチーフを表す。
【表２】
2011527901.tif 000014
【表３】
2011527901.tif 000015
【実施例４】
【０３０５】
in vitroモデル：細胞培養
標的核酸発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を、標的核酸が測定可能なレベルで存在するという条件で、様々な細胞型のいずれかにおいて試験することができる。標的を内因的に発現させるか、または該標的核酸をコードする核酸の一過的もしくは安定的トランスフェクションにより発現させることができる。標的核酸の発現レベルを、例えば、ノーザンブロット分析、リアルタイムPCR、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて日常的に決定することができる。以下の細胞型を例示目的で提供するが、標的が選択された細胞型中で発現されるという条件で、他の細胞型も日常的に用いることができる。細胞を、以下に記載の好適な培地中で培養し、95〜98％湿度および5％CO2、37℃で維持した。細胞を週に2〜3回、日常的に継代した。
【０３０６】
DU-145：ヒト前立腺癌細胞系DU-145を、10％ウシ胎仔血清(Biochrom 19357-5010)および25μg/mlのゲンタマイシン(Sigma #G1397)を含有するglutamax I (Gibco # 61870-010)を含むRPMI 1640培地中で培養した。
【０３０７】
518A2：ヒトメラノーマ癌細胞系518A2を、10％ウシ胎仔血清(Biochrom 19357-5010)、2 mM Glutamax I(Gibco #35050-038)および25μg/mlゲンタマイシン(Sigma #G1397)を含有するDulbeccoのMEM(Sigma #D5671)中で培養した。
【実施例５】
【０３０８】
in vitroモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる処理
トランスフェクションビヒクルとして陽イオン性リポソーム製剤LipofectAMINE 2000 (Gibco)を用いて、細胞をオリゴマー(オリゴヌクレオチド)で処理した。細胞を6穴細胞培養プレート(NUNC)中に播種し、75〜90％集密になった時に処理した。用いたオリゴヌクレオチド濃度は0.8 nM〜20 nMの最終濃度であった。オリゴヌクレオチド-脂質複合体の製剤化を、無血清OptiMEM (Gibco)および5μg/mLの最終脂質濃度のLipofectAMINE 2000を用いて、本質的には製造業者により記載されたように実行した。細胞を37℃で4時間インキュベートし、オリゴヌクレオチドを含有する培養培地の除去により処理を停止した。細胞を洗浄し、血清を含有する培地を添加した。オリゴヌクレオチド処理の後、細胞を20時間回復させた後、それらをRNA分析のために回収した。
【実施例６】
【０３０９】
in vitroモデル：RNAの抽出およびcDNA合成
細胞系からのRNA単離のために、RNeasy miniキット(Qiagenカタログ番号74104)を製造業者により提供されたプロトコルに従って用いた。第1鎖合成を、製造業者の説明書に従って、Ambion社製の逆転写酵素試薬を用いて実施した。
【０３１０】
各サンプルにつき、0.5μgの全RNAを、RNaseを含まないH2Oを用いて10.8μlに調整し、2μlのランダムデカマー(50μM)および4μlのdNTPミックス(2.5 mMの各dNTP)と混合し、70℃で3分間加熱した後、サンプルを氷上で急速冷却した。氷上でサンプルを冷却した後、2μlの10xバッファーRT、1μlのMMLV逆転写酵素(100 U/μl)および0.25μlのRNase阻害剤(10 U/μl)を各サンプルに添加した後、42℃で60分間インキュベートし、95℃で10分間、酵素を熱不活化した後、サンプルを4℃に冷却した。
【実施例７】
【０３１１】
in vitroモデル：リアルタイムPCRによるGLI2発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
GLI2 mRNA発現のアンチセンス調節を、当業界で公知の様々な方法でアッセイすることができる。例えば、GLI2 mRNAレベルを、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、またはリアルタイムPCRにより定量することができる。リアルタイム定量的PCRが現在好ましい。RNA分析を、全細胞RNAまたはmRNA上で実施することができる。RNA単離およびノーザンブロット分析などのRNA分析の方法は当業界で日常的であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sonsに教示されている。リアルタイム定量的PCRを、Applied Biosystem社から入手可能な市販のMulti-Color Real Time PCR Detection Systemを用いて都合良く達成することができる。
【０３１２】
GLI2 mRNAレベルのリアルタイム定量的PCR分析
サンプル中のヒトGLI2 mRNAの含量を、製造業者の説明書に従って、ヒトGLI2 ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent (Applied Biosystemsカタログ番号Hs00257977_m1)を用いて定量した。
【０３１３】
サンプル中のヒトGLI1(本明細書ではGli1とも呼ばれる)の含量を、製造業者の説明書に従って、ヒトGli1 ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent (Applied Biosystemsカタログ番号Hs00171790_m1)を用いて定量した。
【０３１４】
グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) mRNA量を、サンプル調製における任意の偏差を正規化するための内部対照として用いた。
【０３１５】
ヒトGAPDH mRNAのサンプル含量を、製造業者の説明書に従って、ヒトGAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan Assay Reagent (Applied Biosystemsカタログ番号4310884E)を用いて定量した。
【０３１６】
リアルタイム定量的PCRは当業界でよく知られた技術であり、例えば、Heidら、Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994に教示されている。
【０３１７】
リアルタイムPCR
実施例6に記載のように実施した第1鎖合成に由来するcDNAを2〜20倍に希釈し、Applied Biosystems社製のTaqman 7500 FASTを用いるリアルタイム定量的PCRにより分析した。プライマーとプローブを、2 x Taqman Fast Universal PCRマスターミックス(2x)(Applied Biosystemsカタログ番号4364103)と混合し、10μlの最終容量となるように4μlのcDNAに添加した。各サンプルを3回分析した。目的のRNAを発現する細胞系から精製された材料上で調製されたcDNAの2倍希釈液をアッセイすることにより、標準曲線を作製した。鋳型なしの対照のために、滅菌H2OをcDNAの代わりに用いた。PCRプログラム：95℃で30秒、次いで95℃で3秒、60℃で30秒の40サイクル。標的mRNA配列の相対量を、Applied Biosystems Fast System SDS Software Version 1.3.1.21を用いて算出された閾値サイクルから決定した。
【実施例８】
【０３１８】
in vitro分析：オリゴヌクレオチドによるヒトGLI2発現のアンチセンス阻害
オリゴヌクレオチドを、DU-145細胞および518A2細胞中、0.8、4および20 nMの濃度でGLI2 mRNA発現をノックダウンする能力について評価した(図4、5および6を参照)。データを、4 nMでモックトランスフェクトされた細胞と比較したGLI2 mRNAの下方調節(％)として表4に提示する。モックトランスフェクトされた細胞は、スクランブル対照でトランスフェクトされたものである(陰性対照)。前記スクランブル対照は、標的配列に対する相補性を有さない、配列番号133として示される配列を有するオリゴマーなどのオリゴマーである。小文字はDNA単位を表し、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNA単位などのLNAを表す。LNAモノマー中の全てのシトシン塩基は5-メチルシトシンである。下付文字「s」はホスホロチオエート結合を表す。
【表４】
2011527901.tif 000016
【０３１９】
表4に示されるように、GLI2 mRNA発現を標的化する全ての試験したオリゴヌクレオチドは、4 nMの低用量で少なくとも30％の阻害を提供した。配列番号113、117、119、122、123、130および131は全て、4 nMの低用量で少なくとも50％の阻害を与え、配列番号112、114、115、116、118、120、121、126、128、129および132は全て、4 nM用量で少なくとも70％の阻害を与えた。
【０３２０】
配列番号117、119、122、123、130、131、112、114、115、116、118、120、121、126、128、129および132として示される配列を有するオリゴマー(本明細書ではオリゴとも呼ぶ)は全て、4 nMの用量で少なくとも60％の阻害を与え、従って、いくつかの実施形態においては好ましく、ならびに例えば、長さ(より短いか、もしくはより長い)および／または核酸塩基含量(例えば、類似体単位の型および／もしくは比率)を変化させる、例示されたアンチセンスオリゴマー配列に基づくオリゴヌクレオチドもGLI2 mRNA発現の良好な阻害を提供する。
【実施例９】
【０３２１】
in vitro分析：オリゴヌクレオチドによるヒトGLI1発現およびヒトGLI3発現のアンチセンス阻害
オリゴヌクレオチドを、DU-145細胞および518A2細胞中で0.8、4および20 nMの濃度でGLI1 mRNAをノックダウンするその能力について評価した(図7および8を参照)。
【０３２２】
オリゴヌクレオチドを、DU-145細胞および518A2細胞中で0.8、4および20 nMの濃度でGLI3 mRNAをノックダウンするその能力について評価した(図9を参照)。
【実施例１０】
【０３２３】
LNAオリゴヌクレオチドによるアポトーシス誘導
518A2細胞を、1.5 x 105細胞／ウェルの密度でトランスフェクションの前日に、DU-145細胞を2.8 x 105細胞／ウェルの密度で6穴培養プレート(NUNC)中に播種した。75〜90％集密になった時、トランスフェクションビヒクルとして陽イオン性リポソーム製剤LipofectAMINE 2000(Gibco)を用いてオリゴヌクレオチドで処理した。用いたオリゴマー濃度は4 nMおよび20 nMであった(ウェル中の最終濃度)。オリゴマー-脂質複合体の製剤化を、無血清OptiMEM(Gibco)および5μg/mLの最終脂質濃度のLipofectAMINE 2000を用いて本質的には製造業者により記載されたように実行した。細胞を37℃で4時間インキュベートし、オリゴマーを含有する培養培地の除去により処理を停止させた。Optimemで洗浄した後、300μlのトリプシンを、細胞が壁から剥離するまで各ウェルに添加した。ウェルに3 mlのHUH7培養培地を添加することによりトリプシンを不活化し、細胞懸濁液を上下に穏やかにピペッティングすることにより、単一細胞の懸濁液を作製した。スクランブルオリゴ(オリゴマー)配列番号133を対照として用いた。
【０３２４】
この後、Nunc社製白色96穴プレート(カタログ番号136101)の各ウェルに100μlの細胞懸濁液を添加した(様々な時点での測定のために、4個のプレートを調製した)。次いで、プレートを37℃、95％湿度および5％CO2で、アッセイを行うまでインキュベートした。
【０３２５】
キャスパーゼアッセイ
アポトーシス特異的キャスパーゼ3および7の活性を、発光性キャスパーゼ-Glo 3/7基質アッセイ(Promega社製カタログ番号G8091)を用いて測定した。分析しようとするプレートを、室温に15分間平衡化させた。キャスパーゼ-Glo(登録商標)3/7バッファーをキャスパーゼ-Glo(登録商標)3/7基質と混合してキャスパーゼ-Glo(登録商標)標準溶液を得て、これを室温に平衡化させた。次いで、100μlのキャスパーゼ-Glo(登録商標)標準溶液を、96穴プレートの各ウェル中の培地に注意深く添加した(気泡およびウェル間の夾雑を回避することが重要である)。プレートを1分間注意深く振とうした後、室温で1時間インキュベートし、光を遮断した。Luminoscan Ascent装置(Thermo Labsystems)中、1秒あたりの相対光単位(RLU/s)としてキャスパーゼ活性を測定した。データを補正し、1に設定されたモックサンプルの平均値と比較してプロットした。図13および14を参照されたい。
【実施例１１】
【０３２６】
LNAオリゴヌクレオチドを用いる増殖のin vitroでの阻害
518A2細胞をトランスフェクトし、実施例10に記載のように単一細胞懸濁液中に収穫した(アポトーシス誘導)。配列番号133をスクランブル対照として用いた。この後、MTSアッセイのための96穴プレート(「Orange Scientific」)の各ウェルに100μlの細胞懸濁液を添加した(様々な時点での測定のために、4個のプレートを調製した)。次いで、プレートを37℃、95％湿度および5％CO2で、アッセイを行うまでインキュベートした。
【０３２７】
生細胞の増殖の測定(MTSアッセイ)
増殖アッセイのために、10μlのCellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, G3582)を96穴プレートの各ウェルの培地に添加し、プレートを注意深く振とうし、測定前に1時間、37℃、95％湿度および5％CO2でインキュベートした。分光光度計中、490 nmで吸光度を測定し、アッセイのためのバックグラウンドを、培地のみを含むウェルから差し引いた。490 nmでの吸光度は、生細胞数に比例し、モックトランスフェクトされた細胞およびオリゴマーでトランスフェクトされた細胞について、時間に対してプロットした。図11を参照されたい。
【実施例１２】
【０３２８】
配列番号112、114、118、120、130および132と、ポリエチレングリコールとのコンジュゲートの調製
Fmocなどのブロッキング基でブロックされたヘキサン-1-アミンなどのアミノアルキル基を、日常的なホスホルアミダイト化学を用いてオリゴマーの5'リン酸基に結合させ、得られた化合物を酸化し、それを脱保護し、それを精製して、式(I)：
【化７】
2011527901.tif 000017
【０３２９】
を有する官能化オリゴマー(活性化オリゴマー)を達成することにより、オリゴマーを5'末端上で官能化する。
【０３３０】
式(I)または(III)中の用語「オリゴマー」とは、本発明のオリゴマー、例えば、配列番号112、114、118、120、130および132からなる群より選択されるオリゴマーを指す。
【０３３１】
PBSバッファー中の式(II)：
【化８】
2011527901.tif 000018
【０３３２】
(式中、PEG部分は12,000の平均分子量を有する)
に示されるものなどの活性化されたPEGと、式(I)の化合物の溶液を、室温で12時間攪拌する。反応溶液を塩化メチレンで3回抽出し、合わせた有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させる。残渣を二重蒸留水中に溶解し、陰イオン交換樹脂上に充填する。未反応のPEGリンカーを水で溶出させ、生成物をNH4HCO3溶液で溶出させる。純粋な生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、式(III)：
【化９】
2011527901.tif 000019
【０３３３】
(式中、オリゴマー(例えば、配列番号112、114、118、120、130および132)は遊離可能なリンカーを介して12,000の平均分子量を有するPEGポリマーに結合している)
のコンジュゲートを得る。
【実施例１３】
【０３３４】
Gli1、Gli2およびGli3 mRNA発現に関するDU-145および518A2細胞中でのIC50の決定
実験の詳細については実施例4〜9を参照されたい。
【０３３５】
GLI2 mRNA発現に関する様々なGLI2オリゴマーのIC50値を、DU-145細胞および518A2細胞中で決定した。細胞を、0.04 nM〜20 nMの最終濃度のオリゴマーでトランスフェクトした。GLI2(本明細書ではGli2とも呼ばれる) mRNA発現を、qPCR(定量的PCR)によりトランスフェクションの24時間後に決定した。その結果を図4、5および6に示す。全てのオリゴマーは、トランスフェクションの24時間後にGLI2 mRNAの強力な下方調節を示し、そのIC50は両方の細胞系において4 nM以下であった。
【０３３６】
GLI1 mRNA発現に関する様々なGLI2オリゴマーのIC50値を、DU-145細胞および518A2細胞中で決定した。細胞を、0.04 nM〜20 nMの最終濃度のオリゴマーでトランスフェクトした。GLI1 mRNA発現を、qPCRによりトランスフェクションの24時間後に決定した。その結果を図7および8に示す。二特異的Gli2オリゴマー、配列番号112および114は、トランスフェクションの24時間後に分析した場合、DU-145および518A2細胞の両方において4 nM以下のIC50でGLI1の強力な下方調節を示した。さらに、配列番号120は両方の細胞系においてGLI1のノックダウン(Gli1 mRNAの発現低下)を示し、最も強力なノックダウンはDU-145細胞中で認められた。配列番号120は、GLI1とただ1個の不一致を有し、これがこのオリゴマーによるGLI1の観察されたノックダウンの理由である可能性が高い。対照的に、配列番号130はDU-145細胞と518A2細胞の両方において10 nM〜20 nMの濃度でGLI1発現を誘導するようであった。
【０３３７】
GLI3(本明細書ではGli3とも呼ばれる)の発現を、GLI2オリゴマーでトランスフェクトした後、518A2細胞中で調査した。DU-145細胞は非常に低レベルのGLI3 mRNAを発現するため(qPCRの検出限界以下)、これらの細胞中では発現を分析しなかった。オリゴマーによるGLI3の標的化を避けることが望ましいため、全てのオリゴマーを、GLI3に対して少なくとも2個の不一致を有するように設計した。その結果を図9に示す。その結果は、配列番号114がGLI3 mRNA発現の強力なノックダウンを示し、そのIC50は4 nM以下であることを示していた。配列番号118および配列番号120は、20 nMを超える(118)か、または10〜20 nM(120)のIC50でGLI3の下方調節を示したが、残りのオリゴマーは最も高い濃度でもGLI3 mRNA発現に対して効果がないか、またはわずかな効果のみを有していた。
【実施例１４】
【０３３８】
GLI2オリゴマーの血漿安定性
マウス血漿(BomTac社製リチウムヘパリン血漿：NMRIマウス、2005年9月14日回収、Taconic Europe)を解凍し、45μl血漿／チューブでチューブに分注した。次いで、5μlのオリゴマー(200μM)を、20μMの最終濃度となるように45μlの血漿に添加した。完全に混合した後、サンプルを37℃で0〜120時間インキュベートした。様々な時点(0時間、24時間、48時間および120時間)で、サンプルを回収し、サンプルを液体窒素中で簡易凍結することにより反応をクエンチした。分析のために、サンプルをローディングバッファーに添加し、変性条件下、PAGE配列決定ゲル上での電気泳動により分析した。
【０３３９】
血漿安定性アッセイに由来する結果は、オリゴマーが非常に安定であることを示していた。全てのオリゴマーは、in vitroでの安定性を示し、90％を超える活性化合物が37℃でマウス血漿と共にインキュベートした場合、24時間後でも残存していた。3'末端にA残基を有する、配列番号120および配列番号132として示される配列を有するオリゴマーについては、24時間のインキュベーション後に開始して弱いN-1バンドを検出することができたが、他のオリゴマーについてはいずれも分解を検出することができなかった。本発明者らは以前に、3'末端にA残基を有するオリゴマーが血漿中でのインキュベーション後に弱いN-1バンドを示すことを観察したが、これはおそらく脱プリン反応に起因するものであろう。その結果を図10に示す。
【実施例１５】
【０３４０】
GLI2オリゴマーのTm決定
LNAを含有するオリゴマー／RNA二本鎖の融点を、対応するソフトウェア(Perkin Elmer, Fremont, USA)を含むUV分光系を用いて決定した。LNAオリゴマーおよびその相補的RNAを、1.5μMの最終濃度でTm-バッファー(200 nM NaCl、0.2 nM EDTA、20 mM NaP、pH 7.0)に添加した。サンプルを95℃に3分間加熱した後、室温で30分間冷却することにより、二本鎖形成を調製した。
【０３４１】
融点(Tm)の値をLambda 25 UV/VIS分光計(Perkin Elmer)中で測定し、データを回収し、TempLabソフトウェア(Perkin Elmer)を用いて分析した。器具を、20〜95℃にオリゴマー二本鎖サンプルを加熱した後、サンプルを25℃に冷却するようにプログラミングした。このプロセスの間、260 nmでの吸光度を記録した。融点曲線を用いてTm値を算出した(表5)。
【表５】
2011527901.tif 000020
【０３４２】
全てのGLI2オリゴマーは、その相補的RNAに対して60℃を超えるTmを有していた。
【実施例１６】
【０３４３】
DU-145および518A2細胞中での増殖アッセイ
MTSアッセイ：増殖アッセイのために、10μlのCellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, G3582)を96穴プレートの各ウェルの培地に添加し、プレートを注意深く振とうし、測定前に1時間、37℃、95％湿度および5％CO2でインキュベートした。分光光度計中、490 nmで吸光度を測定し、アッセイのためのバックグラウンドを、培地のみを含むウェルから差し引いた。
【０３４４】
GLI2オリゴマーを用いるトランスフェクション後の増殖を、MTSアッセイを用いてDU-145および518A2細胞中で調査した。増殖を、トランスフェクションの5時間後、24時間後、48時間後および72時間後に分析した。その結果は、配列番号130として示される配列を有するオリゴマー以外の全てのGLI2オリゴマーが、DU-145および518A2細胞の両方において増殖の強力かつ用量依存的な阻害を示すが、陰性対照は細胞増殖に対する効果を有さないことを示していた。増殖の阻害時に最も強力なオリゴマーは、配列番号114、118および120として示される配列を有するオリゴマーであった。4回の独立したスクリーニングを実施し、様々なオリゴマーの平均活性の最良の代表であるスクリーニングに由来するデータを提示する(図11)。
【実施例１７】
【０３４５】
in vivoでの分析：Gliオリゴヌクレオチドのin vivoでの静脈内投与後のマウス肝臓におけるALTおよびASTの決定
メスのNMRIマウスに、0、3、6および9日目に10 mg/kgの用量で配列番号112、114、118、120および132の配列を有するオリゴヌクレオチドを静脈内注射により投与した。動物を最後の投与の24時間後に屠殺した。ALTおよびASTレベルを、屠殺の時点でマウスから得られた、赤血球を含まない血清中で決定した。マウス血清中でのアラニン-アミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸-アミノトランスフェラーゼ(AST)の活性を、製造業者の説明書に従ったが、96穴形式に調整した酵素的ALTアッセイ(ABX Pentra A11A01627 (ALT)またはA11A01629 (AST), Horiba ABX Diagnostics, France)を用いて決定した。簡単に述べると、血清サンプルをH2Oで2.5倍に希釈し、2回アッセイした。50μlの希釈サンプルまたは標準物(ABX Pentra社製multical、A11A01652)を各ウェルに添加した後、200μlの37℃のALT試薬ミックスを各ウェルに添加した。動的測定を340 nmおよび37℃で5分間、30秒の間隔で実施した。データを2倍希釈された標準曲線に対して補正し、結果をALT活性としてU/Lで提示した。
【０３４６】
その結果を図12AおよびBに示す。
【実施例１８】
【０３４７】
動物モデルにおける抗GLIオリゴヌクレオチドの抗腫瘍効果
全ての異種移植片試験のために、マウスに腫瘍を皮下移植した。腫瘍が約100〜200 mm3(または示されたサイズ)に到達した時、指示された用量およびスケジュールでLNAオリゴヌクレオチドをマウスに注射した。
【０３４８】
PC3腫瘍を担持するマウス(前立腺癌モデル)を、配列番号3、配列番号19、または配列番号75に記載の配列を有する3、30および100 mg/kgのLNAオリゴマーで処理した(静脈内(IV)；3日目毎に4回投与(q3d x 4))。試験の終わりに、腫瘍を収穫し、ヒトまたはマウスmRNAに特異的なプローブを用いてヒトおよびマウスGLI mRNAおよびPTCH1 mRNAレベルをアッセイした。陽性対照(GLI2アンチセンスオリゴヌクレオチド-配列番号10でトランスフェクトした細胞に由来)を試験に含有させたところ、予想されたような下方調節の結果をもたらした。配列番号19、配列番号75または配列番号3に記載の配列を有するオリゴマーを用いる処理は、ヒトGLI1、GLI3またはPtch1 mRNAのノックダウンをもたらさなかった(データは示さない)。しかしながら、図15aに示されるように、腫瘍上皮細胞中でのGLI2 mRNAのある程度の下方調節が、配列番号19または配列番号75を有するオリゴマーを用いる処理の際に観察されたが、用量応答関係を確立することはできなかった。
【０３４９】
興味深いことに、GLI1、GLI2およびPtch1のマウスmRNAは、3種全部のオリゴマーによって有意に下方調節されたが、用量応答関係を確立することはできなかった(図15b-PC3腫瘍間質を参照)。GLI1(GLI2の制御下)はヘッジホッグ経路に直接関連する転写因子であるため、その結果は、間質細胞がGLI mRNAに対して標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの処理により影響される可能性があることを示唆している。GLI2はGLI1およびPtch1のレベルを制御する。従って、GLI2の阻害はGLI1およびPtch1の下方調節をもたらすであろう。
【０３５０】
図15において、G1とは塩水を指す；G2とは3 mg/kgの配列番号3を指す；G3とは30 mg/kgの配列番号3を指す；G4とは3 mg/kgの配列番号19を指す；G5とは30 mg/kgの配列番号19を指す；G6とは100 mg/kgの配列番号19を指す；G7とは3 mg/kgの配列番号75を指す；G8とは30 mg/kgの配列番号75を指す；G9とは100 mg/kgの配列番号75を指す；Cとはin vitroでの対照518A(メラノーマ細胞系)を指す；Tとはin vitroでの対照10 nMの4478(Gli2アンチセンス(配列番号10))を指す；用語RQ％とは相対量(％)を指す；用語KDとはノックダウンを指す；用語AN09017とは実験者により用いられた試験番号を指す；用語「mpk」とはmg/kgを指す。
【０３５１】
以前の小毒性学試験(minitox)により、腫瘍増殖阻害(TGI)の証拠が示された(図16)。この試験においては、配列番号3(データは示さない)、配列番号19(図16を参照)、または配列番号75(図16を参照)に記載の配列を有するオリゴマーの効力を、DU-145前立腺癌モデルにおいて複数の用量(0.3〜30 mg/kg；3日目毎に10回投与(q3d x 10))で試験した。小毒性学実験により示唆されたように、前記化合物は強固なTGIを示すことができなかった。少なくとも配列番号19および配列番号75に記載の配列を有するオリゴマーについて、3 mg/kgの用量が他の用量レベルよりも良好に作用する傾向があった。
【０３５２】
PC3異種移植片前立腺癌モデルにおける効力試験を行った。配列番号3、配列番号19、または配列番号75に示される配列を有するオリゴヌクレオチドを、3〜30 mg/kgでq3d x10(3日目毎に10回投与)で与えた。28日目(多くの群の間でほぼ100％が生存した最後の日)現在で、任意の処理の最大のTGIは、両方とも3 mg/kgの配列番号19(54％)に記載の配列を有するオリゴマーおよび配列番号3(34％)に記載の配列を有するオリゴマーによる処理について認められた(図17を参照)。応答における最大の変動は、任意の特定の群において観察された。興味深いことに、3 mg/kgの配列番号19に記載の配列を有するオリゴマーによる処理は、最良のTGIをもたらした。
【０３５３】
この試験においては、配列番号19に記載の配列を有するオリゴマーを、PC3異種移植片(前立腺癌モデル)に対する完全な効力試験において投与した(3 mg/kg, IV)。また、この試験はip(腹腔内)およびiv(静脈内)投与経路も比較した。q1d(毎日投与)スケジュールでの最良の応答と共に中程度のTGI(29％TGI)が観察された(図18を参照)。静脈内または腹腔内経路を介するオリゴマーの投与(q3dスケジュール上、3日目毎に投与)は、同様の効力をもたらした。この試験は、GLIアンチセンスオリゴマーが前立腺癌を治療するのに有効であり得ることを示唆している。図18上の用語「mpk」は「mg/kg」を意味する。
【０３５４】
DLD-1結腸直腸癌モデルは、シクロパミン耐性結腸癌モデルである(Yauchら、Nature 2008, 455: 406-410)。Smo遺伝子のエクソン11中の突然変異がこの癌細胞系に存在する。にもかかわらず、ヘッジホッグ経路は依然として活性化されている。このモデルはin vitroまたはin vivoでSmo阻害剤(例えば、シクロパミン)に対して応答しない。さらに、DLD-1はヘッジホッグリガンドを分泌しないことが示されている。リガンドおよび／またはSmo突然変異が存在しないため、このモデルはシクロパミンまたはその類似体に応答する可能性が低く、かくして、GLI2アンチセンス療法などの代替療法を試験するための良好なモデルである。増殖阻害はMOE糖を含有するオリゴヌクレオチドを用いて以前に証明されている(Kimら、2007 CANCER RES. 67(8) 3583-3593)。
【０３５５】
配列番号19に記載の配列を有するオリゴマーの効果を、DLD-1結腸直腸癌モデルにおいて2つの用量レベル(3および30 mg/kg、3日目毎に6回の静脈内投与(q3dx6(iv))))で試験した。結果(図19の上のパネル)は、週2回、3 mg/kgを注射された動物の治療は23％のTGIをもたらすことを示している。30 mg/kgの用量レベルでは効果は得られなかった。この試験を繰り返してTGIの結果を確認した。これらの予備結果により後押しされて、3 mg/kg、3日目毎に10回投与(q3dx10)、ivで投与した同じモデルにおいて効力試験を実施した。4回目の投与後、コホートを屠殺し、GLI1/GLI2 mRNAノックダウン分析のために腫瘍および肝臓サンプルを回収した。残りの動物をTGIについてモニターした。この試験においては、TGIは観察されなかった(図19の下のパネル)。さらなる効力試験が必要である。
【０３５６】
DU-145腫瘍異種移植片(前立腺癌モデル)を、示された様々な用量の配列番号19、配列番号75、または配列番号3に記載の配列を有するオリゴマーで処理した。3種全部の化合物について、良好な抗腫瘍増殖阻害(DU145モデル)が観察された(図20a-c)。しかしながら、用量応答は欠如していた。配列番号19および配列番号75の最も有効な用量は3 mg/kgであった(3日目毎に3回投与(q3dx3))。図20はq3dx4(3日目毎に4回投与)を指す。
【０３５７】
PC3前立腺癌モデルにおいて配列番号3、配列番号19および配列番号75を有するオリゴマーを用いて腫瘍増殖阻害試験を行った(3日目毎に10回投与(q3dx10))(n.b.n=3)。化合物の量が限定されているため、各群は3匹のマウスを含んでいた。3種全部の化合物について、良好から優れた抗腫瘍効果が観察されたが(図21を参照)、配列番号3および配列番号75に記載の配列を有する化合物については腫瘍ブレイクスルーが検出された。高用量のこれらの化合物のいくつかは、1回目の実験において腫瘍増殖に対する阻害効果を有さないようであったため、腫瘍を担持する動物を、配列番号19、配列番号3または配列番号75に記載の配列を有する30 mg/kgのアンチセンスオリゴマーを用いて41日目に再治療して、効果が再現可能であるかどうかを決定した。配列番号19および配列番号75は腫瘍静止状態を示した。
【０３５８】
上記明細書に記載の全ての刊行物は参照により本明細書に組み入れられるものとする。記載の方法および本発明の系の様々な改変および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかとなるであろう。本発明を特定の好ましい実施形態と関連して説明してきたが、特許請求された本発明はそのような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないことが理解されるべきである。実際、生化学および分子生物学または関連する分野における当業者には明らかである本発明を実施するための記載の様式の様々な改変が、以下の特許請求の範囲内にあると意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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