(57)【要約】本発明は、複層のＬＴＣＣを備えたマイクロチップであって、リアクションチャンバが複数のトップ層に形成されて試料が投入される前記マイクロチップについてである。リアクションチャンバ層の下の少なくとも一層内にヒータが埋設され、ヒータと試料を分析するためのリアクションチャンバとの間の少なくとも一層内に温度センサが埋設される。温度センサは、チップ温度を測定するためにチップ外部に置かれてもよい。【選択図】図１
2011501122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）でできた複層を含むマイクロチップであって、ここでリアクションチャンバが試料を装填するための複数のリアクションチャンバ層内に形成され、コンダクタが該リアクションチャンバの下に置かれた少なくとも一のコンダクタ層に埋設され、そして、ヒータが該コンダクタ層の下に置かれた少なくとも一のヒータ層内に埋設された、前記マイクロチップ。
【請求項２】
該リアクションチャンバは、透明シーリングキャップでカバーされる、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項３】
該チップは、温度センサを備える、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
該温度センサは、該チップの少なくとも一のセンサ層内に埋設されている、請求項３に記載のマイクロチップ。
【請求項５】
該温度センサは、サーミスタである、請求項４記載のマイクロチップ。
【請求項６】
該チップは、外部制御回路を該温度センサ及び該ヒータに連結するためのコンタクトパッドを備える、請求項１及び４に記載のマイクロチップ。
【請求項７】
該温度センサは、チップ温度を測定するために該チップの外部に置かれる、請求項３記載のマイクロチップ。
【請求項８】
該リアクションチャンバは、コンダクタリングによって囲まれている、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項９】
該コンダクタリングは、該コンダクタ層にポストで結合されている、請求項１及び８に記載のマイクロチップ。
【請求項１０】
該コンダクタは、金、銀、白金及びパラジウム又はこれらの合金を含む群から選択される材料でできている、請求項１、８及び９に記載のマイクロチップ。
【請求項１１】
該リアクションチャンバベースと該ヒータとの間に離隔が存在し、その離隔は、約０．２ｍｍ〜約０．７ｍｍの範囲にある、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項１２】
該試料は、食品、又は、血液、血清、血漿、組織、唾液、たん及び尿からなる群から選択される生物学的試料である、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項１３】
該リアクションチャンバは、約１μｌ〜約２５μｌの範囲にある容積を有する、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項１４】
マイクロチップの製作方法であって、以下の工程：
ａ）低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）で作られ、そしてウエルを有する複層を配置してリアクションチャンバを形成し、
ｂ）該チャンバの下に、ヒータを含む少なくとも一層のＬＴＣＣを置き、
ｃ）該ヒータと該リアクションチャンバとの間に一又は数個のコンダクタ層を置き、そして、
ｄ）これらの層を互いに連結してマイクロチップを形成する、
を含む前記方法。
【請求項１５】
該ヒータと該リアクションチャンバ層内との間、あるいは該ヒータの下に、温度センサを備えた少なくとも一層のＬＴＣＣが置かれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該チャンバは、コンダクタリングによって囲まれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
該コンダクタ層へ該コンダクタリングを結合するポストが設けられる、請求項１４及び１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）複層のＬＴＣＣを含むマイクロチップであって、ここでリアクションチャンバが試料を投入するための複数のリアクションチャンバ層内に形成され、コンダクタが該リアクションチャンバの下に置かれた少なくとも一層に埋設され、そして、ヒータが該コンダクタ層の下に置かれた少なくとも一のヒータ層内に埋設された前記マイクロチップ；
ｂ）前記マイクロチップ内に埋設され又はチップ外に置かれる、チップ温度を測定するための温度センサ；
ｃ）前記温度センサの入力値に基づいて前記ヒータを制御するための制御回路；及び
ｄ）試料からの蛍光シグナルを検出するための光学システム
を含むマイクロＰＣＲ装置。
【請求項１９】
該装置は、ハンドヘルド装置である、請求項１８に記載のマイクロＰＣＲ装置。
【請求項２０】
該装置は、ポータブル計算プラットフォームを用いて制御される、請求項１８に記載のマイクロＰＣＲ装置。
【請求項２１】
該装置は、多重ＰＣＲを実行するアレイ内に配置される、請求項１８に記載のマイクロＰＣＲ装置。
【請求項２２】
該マイクロチップは、該装置から脱着可能である、請求項１８に記載のマイクロＰＣＲ装置。
【請求項２３】
マイクロＰＣＲ装置を用いて試料内の分析物を検出し、又は病気の状態を診断する方法であって、以下の工程：
ａ）複数のＬＴＣＣ層を備えたマイクロチップ上に核酸を含む試料を装填する、
ｂ）前記マイクロＰＣＲ装置の運転により核酸を増幅する、そして
ｃ）増幅した核酸の蛍光の読み取りに基づいて分析物の存在又は非存在を測定し、又は、増幅した核酸の蛍光の読み取りに基づいて病原体の存在又は非存在を測定して病気の状態を診断する、
を含む前記方法。
【請求項２４】
該核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該方法は、増幅産物の定性及び定量分析のためにある、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
該試料は、食品又は生物学的試料である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
該生物学的試料は、血液、血清、血漿、組織、唾液、たん及び尿を含む群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
該病原体は、ウイルス、バクテリア、菌類、酵母及び原生動物を含む群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この開示は、低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）でできた複層を含むマイクロＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）チップに関する。この開示は、また、ディスポーザブルＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップを持ったポータブルリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。
【背景技術】
【０００２】
最近の分子及び細胞生物学の進歩は、迅速かつ効率的な分析技術の発展の結果として起きている。小型化及び多重化技術のおかげで、遺伝子チップやバイオチップのような技術は、単一実験構成で全ゲノムの特徴付けが可能である。ＰＣＲは、核酸分子のｉｎ−ｖｉｖｏ増幅のための分子生物学的方法である。ＰＣＲ技術は、法医学、環境、臨床及び工業試料中の生物学的種及び病原体の同定について、時間を要しそして感度の低い他の技術と迅速に置き換わっている。バイオ技術の中でも、ＰＣＲは、大多数の分子及び臨床診断の際にライフサイエンス研究室内の最も重要な分析ステップとなっている。リアルタイムＰＣＲのようなＰＣＲ技術でなされた重要な発展は、従来方法と比べて迅速な反応工程を導いてきた。ここ数年の間に、微細加工技術が、分析時間と試薬の消費のさらなる削減の意図をもってＰＣＲ分析のような反応及び分析システムの小型化を拡張している。いくつかの研究グループは、“ラボオンチップ”装置に取り組んでおり、小型化された分離及び反応システムの分野で数多くの進歩につながっている。
【０００３】
現在入手可能なほとんどのＰＣＲでは、試料、容器及びサイクラーの熱容量のために瞬時の温度変更ができず、その結果、２〜６時間という長期の増幅時間になる。試料温度が一の温度から別の温度へ移る間に、無関係で不所望な反応が生じ、貴重な試薬を消費し、かつ不所望な妨害化合物を生成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、より迅速なＰＣＲパフォーマンスが可能なマイクロチップを提供することである。
【０００５】
本発明の別の目的は、改良されたマイクロチップを提供することである。
【０００６】
本発明の主な目的の１つは、複層のＬＴＣＣを備えたマイクロチップを開発することである。
【０００７】
さらに、本発明の別の目的は、マイクロチップの製作方法を開発することである。
【０００８】
さらに、本発明の別の目的は、マイクロチップを供えたマイクロＰＣＲ装置を開発することである。
【０００９】
さらに、本発明の別の目的は、マイクロＰＣＲ装置を用いて病気の状態を診断する方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）でできた複層を含むマイクロチップであって、ここでリアクションチャンバが試料を装填するための複数のリアクションチャンバ層内に形成され、コンダクタが該リアクションチャンバの下に置かれた少なくとも一のコンダクタ層に埋設され、そして、ヒータが該コンダクタ層の下に置かれた少なくとも一のヒータ層内に埋設された、前記マイクロチップ；マイクロチップの製作方法であって、以下の工程：（ａ）低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）で作られ、そしてウエルを有する複層を配置してリアクションチャンバを形成し、（ｂ）該チャンバの下にヒータを含む少なくとも一層のＬＴＣＣを置き、（ｃ）該ヒータと該リアクションチャンバとの間に一又は数個のコンダクタ層を置き、そして、（ｄ）これらの層を互いに連結してマイクロチップを形成する、を含む前記方法；（ａ）複層のＬＴＣＣを含むマイクロチップであって、ここでリアクションチャンバが試料を投入するための複数のリアクションチャンバ層内に形成され、コンダクタが該リアクションチャンバの下に置かれた少なくとも一層に埋設され、そして、ヒータが該コンダクタ層の下に置かれた少なくとも一のヒータ層内に埋設された前記マイクロチップ；（ｂ）前記マイクロチップ内に埋設され又はチップ外に置かれる、チップ温度を測定するための温度センサ；（ｃ）前記温度センサの入力値に基づいて前記ヒータを制御するための制御回路；及び（ｄ）試料からの蛍光シグナルを検出するための光学システムを含むマイクロＰＣＲ装置；マイクロＰＣＲ装置を用いて試料内の分析物を検出し、又は病気の状態を診断する方法であって、以下の工程：（ａ）複数のＬＴＣＣ層を備えたマイクロチップ上に核酸を含む試料を装填する、（ｂ）前記マイクロＰＣＲ装置の運転により核酸を増幅する、そしてｃ）増幅した核酸の蛍光の読み取りに基づいて分析物の存在又は非存在を測定し、又は、増幅した核酸の蛍光の読み取りに基づいて病原体の存在又は非存在を測定して病気の状態を診断する、を含む前記方法を提供する。
【００１１】
以下、添付の図面を参照して、本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】一実施態様のＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップの正投影図を示す。
【図２】一実施態様のＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップの断面図を示す。
【図３】一実施態様のＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップの各層毎の設計を示す。
【図４】ヒータ及びサーミスタを制御する一実施態様の回路のブロック図を示す。
【図５】作製されたチップリアクションチャンバ設計のモデルを示す。
【図６】ハンドヘルドユニットにより制御された集積ヒータ／サーミスタを用いたチップ上のλ−６３６  ＤＮＡ断片の溶解を示す。
【図７】チップ上のλ−３１１ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅であって、（ａ）チップからのリアルタイム蛍光シグナル；（ｂ）増幅産物を識別するゲル写真を示す。
【図８】処理された血液及び血漿（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ）のサルモネラ菌の１６ＳリボソームユニットについてのＰＣＲ増幅のゲル写真を示す。
【図９】全血（ｄｉｒｅｃｔ  ｂｌｏｏｄ）のサルモネラ菌の１６ＳリボソームユニットについてのＰＣＲ増幅のゲル写真を示す。
【図１０】直接血漿（ｄｉｒｅｃｔ  ｐｌａｓｍａ）全血のサルモネラ菌の１６ＳリボソームユニットについてのＰＣＲ増幅のゲル写真を示す。
【図１１】マイクロチップを用いたサルモネラ菌遺伝子のＰＣＲ増幅であって；（ａ）チップからのリアルタイム蛍光シグナル、（ｂ）増幅産物を識別するゲル写真を示す。
【図１２】ＬＴＣＣチップを用いてＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを増幅するのにかかった時間を示す。
【図１３】λ−３１１ＤＮＡの溶解のための蛍光シグナルの微分（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）についてのＬＴＣＣチップの溶解曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）でできた複層を含むマイクロチップであって、ここでリアクションチャンバが試料を装填するための複数のリアクションチャンバ層内に形成され、コンダクタが該リアクションチャンバの下に置かれた少なくとも一のコンダクタ層に埋設され、そして、ヒータが該コンダクタ層の下に置かれた少なくとも一のヒータ層内に埋設された、前記マイクロチップに関する。
【００１４】
本発明の一実施態様では、該リアクションチャンバは、透明シーリングキャップでカバーされる。
【００１５】
本発明の一実施態様では、該チップは、温度センサを備える。
【００１６】
本発明の一実施態様では、該温度センサは、該チップの少なくとも一のセンサ層内に埋設されている。
【００１７】
本発明の一実施態様では、該温度センサは、サーミスタである。
【００１８】
本発明の一実施態様では、該チップは、外部制御回路を該温度センサ及び該ヒータに連結するためのコンタクトパッド（ｃｏｎｔａｃｔ  ｐａｄｓ）を備える。
【００１９】
本発明の一実施態様では、該温度センサは、チップ温度を測定するために該チップの外部に置かれる。
【００２０】
本発明の一実施態様では、該リアクションチャンバは、コンダクタリングによって囲まれている。
【００２１】
本発明の一実施態様では、該コンダクタリングは、該コンダクタ層にポスト（ｐｏｓｔｓ）で結合されている。
【００２２】
本発明の一実施態様では、該コンダクタは、金、銀、白金及びパラジウム又はこれらの合金を含む群から選択される材料でできている。
【００２３】
本発明の一実施態様では、該リアクションチャンバベースと該ヒータとの間に離隔が存在し、その離隔は、約０．２ｍｍ〜約０．７ｍｍの範囲にある。
【００２４】
本発明の一実施態様では、該試料は、食品、又は、血液、血清、血漿、組織、唾液、たん及び尿からなる群から選択される生物学的試料である。
【００２５】
本発明の一実施態様では、該リアクションチャンバは、約１μｌ〜約２５μｌの範囲にある容積を有する。
【００２６】
本発明は、また、マイクロチップの製作方法であって、以下の工程：
ａ）低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）で作られ、そしてウエルを有する複層を配置してリアクションチャンバを形成し、
ｂ）該チャンバの下にヒータを含む少なくとも一層のＬＴＣＣを置き、
ｃ）該ヒータと該リアクションチャンバとの間に一又は数個のコンダクタ層を置き、そして、
ｄ）これらの層を互いに連結してマイクロチップを形成する、
を含む前記方法に関する。
【００２７】
本発明の一実施態様では、該ヒータと該リアクションチャンバ層内との間、あるいは該ヒータの下に、温度センサを備えた少なくとも一層のＬＴＣＣが置かれている。
【００２８】
本発明の一実施態様では、該チャンバは、コンダクタリングによって囲まれている。
【００２９】
本発明の一実施態様は、該コンダクタ層へ該コンダクタリングを結合するポストが設けられる。
【００３０】
本発明は、また、
ａ）複層のＬＴＣＣを含むマイクロチップであって、ここでリアクションチャンバが試料を投入するための複数のリアクションチャンバ層内に形成され、コンダクタが該リアクションチャンバの下に置かれた少なくとも一層に埋設され、そして、ヒータが該コンダクタ層の下に置かれた少なくとも一のヒータ層内に埋設された前記マイクロチップ；
ｂ）前記マイクロチップ内に埋設され又はチップ外に置かれる、チップ温度を測定するための温度センサ；
ｃ）前記温度センサの入力値に基づいて前記ヒータを制御するための制御回路；及び
ｄ）試料からの蛍光シグナルを検出するための光学システム
を含むマイクロＰＣＲ装置に関する。
【００３１】
本発明の一実施態様では、該装置は、ハンドヘルド装置である。
【００３２】
本発明の一実施態様では、該装置は、ポータブル計算プラットフォームを用いて制御される。
【００３３】
本発明の一実施態様では、該装置は、多重ＰＣＲを実行するアレイ内に配置される。
【００３４】
本発明の一実施態様では、該マイクロチップは、該装置から脱着可能である。
【００３５】
本発明は、また、マイクロＰＣＲ装置を用いて試料内の分析物を検出し、又は病気の状態を診断する方法であって、以下の工程：
ａ）複数のＬＴＣＣ層を備えたマイクロチップ上に核酸を含む試料を装填する、
ｂ）前記マイクロＰＣＲ装置の運転により核酸を増幅する、そして
ｃ）増幅した核酸の蛍光の読み取りに基づいて分析物の存在又は非存在を測定し、又は、増幅した核酸の蛍光の読み取りに基づいて病原体の存在又は非存在を測定して病気の状態を診断する、
を含む前記方法に関する。
【００３６】
本発明の一実施態様では、該核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかである。
【００３７】
本発明の一実施態様では、該方法は、増幅産物の定性及び定量分析のためにある。
【００３８】
本発明の一実施態様では、該試料は、食品又は生物学的試料である。
【００３９】
本発明の一実施態様では、該生物学的試料は、血液、血清、血漿、組織、唾液、たん及び尿を含む群から選択される。
【００４０】
本発明の一実施態様では、該病原体は、ウイルス、バクテリア、菌類、酵母及び原生動物を含む群から選択される。
【００４１】
本開示内の用語“リアクションチャンバ層”は、試料と接触するようになり、リアクションチャンバの形成に関わるマイクロチップのすべての層を意味する。
【００４２】
本開示内の用語“コンダクタ層”は、埋設されたコンダクタを有するマイクロチップのすべての層を意味する。
【００４３】
本開示内の用語“ヒータ層”は、埋設されたヒータを有するマイクロチップのすべての層を意味する。
【００４４】
ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、テンプレートから特定のＤＮＡ断片の多重コピーを合成するために開発された技術である。初期のＰＣＲ法は、Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素（Ｔａｑ）に基づき、これは、４つのＤＮＡ塩基及びターゲット配列の側面に配置する二つのプライマ断片を含む混合物中で所定のＤＮＡストランドと相補なストランドを合成することができる。該混合物を加熱してターゲット配列を含有する二重鎖ＤＮＡストランドを分離し、次いで、冷却して、プライマが分離ストランド上でその相補配列を見つけて結合できるようにし、Ｔａｑポリメラーゼがプライマに新しい相補ストランドを伸長させる。繰り返される加熱及び冷却サイクルは、新しい二重ストランドのそれぞれが分離してさらなる合成のための二個のテンプレートになるため、ターゲットＤＮＡを指数関数的に増殖させる。
【００４５】
ポリメラーゼチェインリアクションの典型的な温度プロファイルは、以下のとおりである：
１．９３℃、１５〜３０秒間での変性
２．５５℃、１５〜３０秒間でのプライマのアニーリング
３．７２℃、３０〜６０秒間でのプライマの伸長
【００４６】
一例として、最初の工程において、溶液を９０〜９５℃に加熱して、二重ストランドのテンプレートを溶解（”変性”）して二個の単一ストランドを形成するようにする。次の工程では、それを５０〜５５℃へ冷却して、特別に合成した短いＤＮＡ断片（”プライマ”）がテンプレートの適切な相補部位と結合するようにする（”アニーリング”）。最後に、溶液を７２℃に加熱し、その時、特別な酵素（”ＤＮＡポリメラーゼ”）が、溶液からの相補塩基を結合させることでプライマを伸長させる。こうして、二個の同一の二重ストランドが、単一の二重ストランドから合成される。
【００４７】
数百塩基よりも長い産物を生成させるために、プライマ伸長工程を概ね６０秒／ｋｂａｓｅまで増大しなけければならない。上記は、典型的な装置時間であり、実際、変性及びアニーリング工程は、ほとんど瞬時に起きる。しかし、メタルブロック又は水が温度平衡に用いられ、試料がプラスチック製微量遠心チューブに入れられる時、市販装置の温度速度は、通常、１℃／秒以下である。
【００４８】
断熱低質量ＰＣＲチャンバをマイクロ加工することにより、もっと速く、エネルギー効率的で特効なＰＣＲ装置を量産することが可能である。さらに、一の温度から別の温度への迅速な遷移によれば、試料が不所望な中間温度に費やす時間が最小になり、その結果、増幅したＤＮＡは最良の忠実度及び純度を有するようになる。
【００４９】
低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）は、自動車、防衛、航空機及び通信業界の電気部品のパッケージングに使用される厚膜テクノロジーの最新版である。それは、アルミナをベースとするガラスセラミクス材料であり、化学的安定、生体適合性、熱安定性（＞６００℃）であり、低い熱伝導度（＜３Ｗ／ｍＫ）、良好な機械強度を有し、かつ良好なエルミート性（ｈｅｒｍｉｔｉｃｉｔｙ）を有する。それは、従来、チップレベルの電気素子のパッケージングに使用され、そこで、構造及び電気機能の両方を担う。本発明者らの認識では、ＬＴＣＣの適合性はマイクロＰＣＲチップ用途に使用されるべきであり、そして、本発明者らの最高の知識では、ＬＴＣＣはそのような目的には使用されていなかった。ＬＴＣＣ技術での基礎の基板（ｂａｓｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）は、好ましくは、ポリマー結合材の付いたガラスセラミクス材料の未焼成（グリーン）層である。これらの層をカッティング／パンチング／ドリリングし多層を積み重ねることにより、構造的特徴が形成される。各層毎の工程でＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）にとって重要な３次元構造を作製することができる。５０ミクロンを下回る特徴がＬＴＣＣ上に容易に作り上げられる。電気回路は、各層上に導電及び抵抗ペーストをスクリーン印刷することにより製作される。多層は、ビアの穴あけを行って（ｐｕｎｃｈｉｎｇ  ｖｉａｓ）、そこに導電ペーストを充填することにより相互に連結される。これらの層が積み重ねられ、加圧され、そして焼成される。最高８０層の積み重ね工程が、文献１で報告されている。焼成された材料は、緻密かつ、良好な機械強度を有する。
【００５０】
ＰＣＲ産物は、典型的には、ゲル電気泳動を用いて分析される。この技術では、ＰＣＲ後のＤＮＡ断片が電場内で分離され、蛍光染料で着色することにより観測される。より適したスキームは、二重ストランドＤＮＡに特異的に結合して反応を継続的にモニタする蛍光染料を使用することである（リアルタイムＰＣＲ）。そのような染料の例は、４９０ｎｍの青色光によって励起され、ＤＮＡと結合したときに５２０ｎｍの緑色光を放出するＳＹＢＲグリーンである。蛍光強度は、ＰＣＲ中に形成された二重ストランド産物の量に比例するので、サイクル数とともに増大する。
【００５１】
図１に、リアクションチャンバ（１１）又はウエルを示す一実施態様のマイクロＰＣＲチップの正投影図を示す。図は、ＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップ内部にあるヒータ（１２）及び温度センササーミスタ（１３）のアセンブリを示す。ヒータコンダクタライン（１５）及びサーミスタコンダクタライン（１４）もまた示す。これらのコンダクタラインは、ヒップ（ｈｉｐ）内に埋設されたヒータ及びサーミスタを外部回路構成と連結するのを助ける。
【００５２】
一実施態様のＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップの断面図を示す図２を参照すると、１６ａ及び１６ｂは、ヒータ（１２）のためのコンタクトパッドを示し、１７ａ及び１７ｂは、サーミスタ（１３）のためのコンタクトパッドを示す。
【００５３】
一実施態様のＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップの各層毎の設計を示す図３を参照すると、チップは１２層のＬＴＣＣテープからなる。２個のベース層（３１）、ヒータ層（３２）、コンダクタ層（３３）及びサーミスタ（３４）を有する層を有する３個のミッド層が存在し、３５がリアクションチャンバ（１１）へのインターフェース層を形成する。リアクションチャンバ層は、図示のとおり、６層の３６からなる。コンダクタ層（３３）が、また、ヒータ層とサーミスタ層との間に設けられる。ヒータコンダクタライン（３３）及びサーミスタコンダクタライン（３２）もまた示す。図では、コンダクタライン（３２）がサーミスタ層（３４）のいずれかの側に置かれる。ヒータデザインは、”梯子”、”蛇行（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）”、”線”、”板”などのようなあらゆる形状でよく、サイズは、０．２ｍｍ  ｘ  ３ｍｍ〜２ｍｍ  ｘ  ２ｍｍの間で変更される。ヒータのサイズ及び形状は、要求に基づいて選択され得る。その要求は、リアクションチャンバ、試験される試料やコンダクタ層として使用される材料の大きさに依存する。
【００５４】
図３に、一実施態様の製作されたチップパッケージの層状設計及びイメージを示す。ＬＴＣＣチップは、１〜２５μｌのウエル容積、及び約５０％の抵抗変動（ヒータ及びサーミスタ）を有する。ヒータの抵抗値（〜４０Ω）及びサーミスタの抵抗値（〜１０５０Ω）は、予測値と一貫性があった。該ヒータは、汎用のＬＴＣＣパッケージに採用される厚膜抵抗素子をベースとする。アルミナを用いた該サーミスタ系が、埋設された温度センサの製作のために使用される。チップのＴＣＲ測定値は、１〜２Ω／℃の間であった。チップは、デュポン９５１グリーンシステム上に作製された。サーミスタ層は、チップ内のどこに置いてもよく、温度センサは、チップ内部のサーミスタの代わりにチップ外部に置かれ得る。
【００５５】
図４は、ヒータ及びサーミスタを制御する一実施態様の回路のブロック図を示し、ここで、ＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップ（１０）内のサーミスタは、ブリッジ（４６）内のアームの一つとして作用する。ブリッジ増幅器（４１）からのブリッジの増幅出力は、ＰＩＤコントローラ（４３）への入力として与えられ、ここで、デジタル化され、そして、ＰＩＤアルゴリズムは、制御されたデジタル出力を与える。出力は、再び、アナログ電圧に再変換され、そして、これが、ヒータドライバ（４６）内に在るパワートランジスタを用いたヒータを駆動する。さらに、シリコン加工と比べてＬＴＣＣはより安価に加工される。
【００５６】
本発明は、また、従来のＰＣＲシステムを分析時間、可搬性、試料容積、及び分析及び定量化を行う能力を改善するためにある。これは、以下を有するＰＣＲ産物のリアルタイムｉｎ  ｓｉｔｕ  検出／定量化をもったポータブルマイクロＰＣＲ装置により達成される：
■透明シーリングキャップを有し、リアクションチャンバ、埋設されたヒータ及び温度センサからなるディスポーザブルＰＣＲチップ
■以下のユニットからなるハンドヘルド電子機器ユニット：
○ヒータ及び温度センサ用の制御回路
○蛍光光学検知システム
■該ハンドヘルドユニットを制御するためのプログラムを動かすスマートフォン又はＰＤＡ（携帯情報端末）
【００５７】
ディスポーザブルＰＣＲチップは、埋設されたヒータで加熱され、埋設されたサーミスタでモニタされるリアクションチャンバからなる。それは、低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）システムで製作され、ヒータ及び温度センサと連結するためのコネクタで適当にパッケージされる。
【００５８】
埋設されたヒータは、ＬＴＣＣと適合するデュポン製ＣＦシリーズのような抵抗ペースト（ｒｅｓｉｓｔｏｒ  ｐａｓｔｅ）でできている。デュポン９５、ＥＳＬ（４１ＸＸＸシリーズ）、Ｆｅｒｒｏ（Ａ６システム）やＨａｒａｅｕｓのようなあらゆるグリーンセラミクステープ系を使用可能である。前記埋設された温度センサは、アルミナ基板のたためのＰＴＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）抵抗サーミスタペースト（例えば５０９Ｘ  Ｄは、ＥＳＬエレクトロサイエンス製のＥＳＬ２６１２である）を用いて作製されたサーミスタである。ＮＴＣ４９９３（ＥＭＣＡ  Ｒｅｍｅｘ製）のような抵抗ペーストのＮＴＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）もまた使用可能である。
【００５９】
透明（波長３００〜１０００ｎｍ）なシーリングキャップは、試料のリアクションチャンバからの蒸発を防ぐためにあり、ポリマー材料でできている。
【００６０】
制御回路は、オン／オフ又はＰＩＤ（Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）制御回路からなり、これらは、埋設されたサーミスタが一部を形成するブリッジ回路からの出力に基づいてヒータを制御する。ここで開示したヒータを制御し、そしてサーミスタ値を読み取る方法は、ほんの一例である。これを制御や限定の唯一の方法と解釈するべきではない。ヒータを制御し、そしてサーミスタ値を読み取る他の手段は、本開示に十分に応用できる。
【００６１】
蛍光光学検知システムは、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）の励起源及び光ダイオードによって検知された蛍光を含む。このシステムは、光を試料上へ照射するのに使用する光ファイバを収容する。光ファイバは、また、光を光ダイオード上へ向ける（ｃｈａｎｎｅｌ）のに使用される。ＬＥＤ及び光ダイオードは、光ファイバへ適当なバンドパスフィルタを介して結合される。光学検知器からの出力シグナルの正確な測定には、極めて良好なシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を有する回路が必要である。ここで開示した蛍光検出システムは、ほんの一例である。これを唯一の検出や限定ととらえるべきではない。試料へ照射できない限りすべての蛍光検出器が動作する。
【００６２】
本発明は、特定の診断用途のために市場性のあるハンドヘルドＰＣＲシステムを提供する。ＰＤＡは、完全なハンドヘルドＰＣＲシステムをリアルタイム検出及びソフトウエア制御をもって提供する制御ソフトウエアを有する。
【００６３】
本装置を用いて熱容積を減少し、加熱／冷却速度を改善することにより、５〜２５μｌの適度な試料容積の場合でも３０〜４０サイクルの反応を終了するためにかかる２〜３時間の時間を、３０分以下に削減する。図１２は、本発明のＬＴＣＣチップを用いてＢ型肝炎ウイルス性ＤＮＡを増幅するのにかかる時間を示す。ＰＣＲを４５サイクル実行し、そして、４５分以内に増幅を達成できた。さらに、増幅は、ＰＣＲを２０分及び１５分で４５サイクル行った場合にも観測された。ＨＢＶ（４５サイクル）のための汎用のＰＣＲ期間は、約２時間要する。
【００６４】
ミニチュア化では、より小さい試料サイズでの正確な読み取りと、コスト高な試薬のより小容積の消費が可能になる。マイクロシステムの小さい熱容積及び小さい試料サイズによれば、迅速で低出力の熱サイクルが可能で、マイクロＰＣＲを介するＤＮＡ複製のような多くのプロセスのスピードをアップする。さらに、マイクロスケールでの利用可能な表面対容積比の増大により、表面化学に依存する化学プロセスを大いに高める。マイクロ流体の利点が、化学分析のための集積マイクロシステムの開発の要望を促している。
【００６５】
ハンドヘルド装置（１０９）内に移されたマイクロチップは、これにより、高度な研究室からＰＣＲ機械装置を除去し、こうしてこの極めて強力な技術の範囲を増大させ、臨床診断、食品検査、血液バンクでの血液スクリーニング、他の用途分野でのホスト（ｈｏｓｔ）のためなる。
【００６６】
多数のリアクションチャンバを有する既存のＰＣＲ装置は、すべてが同一の熱プロトコルを実行し、したがって時間的に能率的でない多数のＤＮＡ実験サイトを提供する。反応時間及び試料容積の摂取量を最小化する必要がでてくる。
【００６７】
本ＰＣＲは、将来設計されるが、極めて迅速な熱応答を持つ装置のアレイを有し得、そして、多重反応を異なる熱プロトコロルを最小の混信をもって効率的かつ独立に実行し得るように隣接するＰＣＲチップと高度に孤立している。
【００６８】
ＰＣＲ産物の分析又は定量化は、リアルタイム蛍光検出システムの実用的集積化によって実現する。このシステムは、また、Ｂ型肝炎（図１２）、ＡＩＤＳ、結核などのような疾患を検出するための定量化及びセンサシステムを用いて集積化される。他の市場には、食品モニタリング、ＤＮＡ分析、法科学及び環境モニタリングが含まれる。
【００６９】
チップ内部の温度プロファイルの均一性を測定した後、ＰＣＲ反応をこれらのチップ上で行った。λＤＮＡ断片及びサルモネラ菌ＤＮＡは、これらのチップを用いて上首尾に増幅された。図５に、ヒータ、コンダクタリング、サーミスタ、及び伝導リング（５２）との様々な結合を示す３次元表示のマイクロチップを示す。それは、また、コンダクタリング（５２）をコンダクタプレート（３３）へ結合するポスト（５１）を示す。
【００７０】
図６に、集積化ヒータ及びサーミスタを用いたチップ上のλ−６３６ＤＮＡ断片の溶解の比較プロットを示す。
【００７１】
図７は、λ−３１１ＤＮＡの増幅に伴う蛍光シグナルの増大を示す。熱プロファイルは、ハンドヘルドユニットにより制御され、反応は、チップ上（３μｌの反応混合物及び６μｌのオイル）で行われた。蛍光を汎用ロックインアンプを用いてモニタした。
【００７２】
本発明は、また、診断システムを提供する。診断システムを開発するために採用された手順は、初期には、二三の問題のためにサーマルプロトコルを規格化し、同一物をチップ上で機能化していた。１６Ｓリボソームのために設計されたプライマは、Ｅ．ｃｏｌｉ及びサルモネラ菌から〜３００−４００ｂｐ断片を増幅し、一方、サチライシン遺伝子（ｓｔｎ  ｇｅｎｅ）についてのプライマは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉから〜２００ｂｐ断片を増幅した。得られた産物を、ＳＹＢＲグリーン蛍光検出とアガロースゲル電気泳動で確認した。図７及び１１に、マイクロチップを用いて増幅したλ−３１１ＤＮＡ及びサルモネラ菌遺伝子のゲル写真を示す。
【００７３】
λ−３１１ＤＮＡ増幅のための熱プロファイル：
変性：９４℃（９０秒）  
９４℃（３０秒）  −  ５０℃（３０秒）  −  ７２℃（４５秒）
伸長：７２℃（１２０秒）
【００７４】
サルモネラ菌遺伝子増幅のための熱プロファイル：
変性：９４℃（９０秒）  
９４℃（３０秒）  −  ５５℃（３０秒）  −  ７２℃（３０秒）
伸長：７２℃（３００秒）
【００７５】
処理血液及び血漿を用いたＰＣＲ
血液又は血漿を、試料から主要なＰＣＲ阻害物質を沈殿させることのできる沈殿剤で処理した。透明な上清を、テンプレートとして用いた。このプロトコルを用いて、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉから〜２００ｂｐ断片について増幅を得た（図８）。図８に、ゲル電気泳動写真を示す。
１．コントロール反応、
２．ＰＣＲ産物−血液（未処理）、
３．ＰＣＲ産物−処理血液、
４．ＰＣＲ産物−処理血漿
【００７６】
血液直接ＰＣＲバッファ
血液又は血漿試料を用いた直接ＰＣＲのためにユニークバッファを配合した。このユニークバッファシステムを用いて、血液及び血漿を用いた直接ＰＣＲ増幅を達成した。本発明のＬＴＣＣチップを用いてこのバッファシステムを用いると、最高５０％の血液、及び４０％の血漿で増幅が達成された（図９及び１０参照）。
図９にゲル電気泳動写真を示す。
１．ＰＣＲ産物−２０％血液、
２．ＰＣＲ産物−３０％血液、
３．ＰＣＲ産物−４０％血液、  
４．ＰＣＲ産物−５０％血液、及び  
図１０にゲル電気泳動写真を示す。
１．ＰＣＲ産物−２０％血漿、
２．ＰＣＲ産物−３０％血漿、  
３．ＰＣＲ産物−４０％血漿、
４．ＰＣＲ産物−５０％血漿、
５．コントロール反応
【００７７】
ユニークバッファは、バッファの塩、二価イオンを含有する塩化物又は硫酸塩、非イオン性界面活性剤、安定剤及び糖アルコールを含む。
【００７８】
図１３に、λ−３１１ＤＮＡの溶解のための蛍光シグナルの微分のためのＬＴＣＣチップの溶解曲線を示す。図は、また、本発明（１３１）と汎用のＰＣＲ装置（１３２）との比較を提供する。
より鋭いピーク：ピーク値／幅（ｘ軸）＠ハーフピーク値＝１．２／４３
より浅いピーク：ピーク値／幅（ｘ軸）＠ハーフピーク値＝０．７／６３
【００７９】
高い比率はより鋭いピークを示す。また、グラフにおいて、ｙ軸は、微分（溶解曲線の傾き）であり、より高い傾きは、より急峻な溶解を示す。
【図１】
2011501122.tif 000003
【図２】
2011501122.tif 000004
【図３】
2011501122.tif 000005
【図４】
2011501122.tif 000006
【図５】
2011501122.tif 000007
【図６】
2011501122.tif 000008
【図７】
2011501122.tif 000009
【図８】
2011501122.tif 000010
【図９】
2011501122.tif 000011
【図１０】
2011501122.tif 000012
【図１１】
2011501122.tif 000013
【図１２】
2011501122.tif 000014
【図１３】
2011501122.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月3日(2009.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）の層でできたマイクロチップであって、
ａ）試料を装填するために形成される複層のリアクションチャンバ
ｂ）該リアクションチャンバを囲むコンダクタリング、及び
ｃ）該コンダクタリングへ熱を供給するために少なくとも一の層内に埋設されたヒータ
を含む、前記マイクロチップ。
【請求項２】
該ヒータは、該コンダクタリングへ熱を少なくとも一の層内に埋設された該コンダクタ、好ましくは該リアクションチャンバの下に位置する該コンダクタを介して供給する、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項３】
該コンダクタリングは、該コンダクタ層に結合している、請求項２に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
該チップは、該チップの外部に置かれ、又は該チップの少なくとも一の層内に埋設された温度センサを備える、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項５】
該温度センサは、サーミスタである、請求項４記載のマイクロチップ。
【請求項６】
該チップは、外部制御回路を該温度センサ及び該ヒータに連結するためのコンタクトパッドを備える、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項７】
該コンダクタは、金、銀、白金及びパラジウム又はこれらの合金を含む群から選択される材料でできている、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項８】
該リアクションチャンバのベースと該ヒータとの間に約０．２ｍｍ〜約０．７ｍｍの範囲にある離隔を有する、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項９】
該試料は、食品、又は、血液、血清、血漿、組織、唾液、たん及び尿からなる群から選択される生物学的試料である、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項１０】
該リアクションチャンバは、約１μｌ〜約２５μｌの範囲にある容積を有する、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項１１】
マイクロチップの製作方法であって、以下の工程：
ａ）ＬＴＣＣで作られ、そしてウエルを有する複層を配置してリアクションチャンバを形成し、ここで、該チャンバはコンダクタリングで囲まれ、
ｂ）該チャンバの下に、ヒータを含む少なくとも一層のＬＴＣＣを置き、
ｃ）該ヒータと該リアクションチャンバとの間に一又は数個のコンダクタ層を置き、そして、
ｄ）これらの層を互いに連結してマイクロチップを形成する、
を含む前記方法。
【請求項１２】
該ＬＴＣＣの少なくとも一層に温度センサを埋設することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該コンダクタリングを該コンダクタ層へ結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）ＬＴＣＣ層でできたマイクロチップであって、試料を装填するために形成される複層のリアクションチャンバ、該リアクションチャンバを囲むコンダクタリング、及び、該コンダクタリングへ熱を供給するために少なくとも一の層内に埋設されたヒータを含む、前記マイクロチップ；
ｂ）前記マイクロチップ内に埋設され又はチップ外に置かれる、チップ温度を測定するための温度センサ；
ｃ）前記温度センサの入力値に基づいて前記ヒータを制御するための制御回路；及び
ｄ）試料からの蛍光シグナルを検出するための光学システム
を含むマイクロＰＣＲ装置。
【請求項１５】
該装置は、ハンドヘルド装置である、請求項１４に記載のマイクロＰＣＲ装置。
【請求項１６】
該装置は、ポータブル計算プラットフォームを用いて制御される、請求項１４に記載のマイクロＰＣＲ装置。
【請求項１７】
該装置は、多重ＰＣＲを実行するアレイ内に配置される、請求項１４に記載のマイクロＰＣＲ装置。
【請求項１８】
該マイクロチップは、該装置から脱着可能である、請求項１４に記載のマイクロＰＣＲ装置。
【請求項１９】
マイクロＰＣＲ装置を用いて試料内の分析物を検出し、又は病気の状態を診断する方法であって、以下の工程：
ａ）コンダクタリングで囲まれたリアクションチャンバを含むマイクロチップ上に核酸を含む試料を装填し、前記マイクロＰＣＲ装置の運転により核酸を増幅し；そして、
ｂ）増幅した核酸の蛍光の読み取りに基づいて分析物の存在又は非存在を測定し、又は、増幅した核酸の蛍光の読み取りに基づいて病原体の存在又は非存在を測定して病気の状態を診断する、
を含む前記方法。
【請求項２０】
該核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該方法は、増幅産物の定性及び定量分析のためにある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
該試料は、食品又は生物学的試料である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
該生物学的試料は、血液、血清、血漿、組織、唾液、たん及び尿を含む群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該病原体は、ウイルス、バクテリア、菌類、酵母及び原生動物を含む群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月28日(2010.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）の層でできたマイクロチップであって、
ａ）試料を装填するために形成される複層のリアクションチャンバ
ｂ）該リアクションチャンバを囲むコンダクタリング、及び
ｃ）該コンダクタリングへ熱を供給するために少なくとも一の層内に埋設されたヒータ
を含む、前記マイクロチップ。
【請求項２】
該ヒータは、該コンダクタリングへ熱を少なくとも一の層内に埋設された該コンダクタ、好ましくは該リアクションチャンバの下に位置する該コンダクタを介して供給する、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項３】
該コンダクタリングは、該コンダクタ層に結合している、請求項２に記載のマイクロチップ。
【請求項４】
該チップは、該チップの外部に置かれ、又は該チップの少なくとも一の層内に埋設された温度センサを備える、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項５】
該チップは、外部制御回路を該温度センサ及び該ヒータに連結するためのコンタクトパッドを備える、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項６】
該リアクションチャンバのベースと該ヒータとの間に約０．２ｍｍ〜約０．７ｍｍの範囲にある離隔を有する、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項７】
該リアクションチャンバは、約１μｌ〜約２５μｌの範囲にある容積を有する、請求項１に記載のマイクロチップ。
【請求項８】
マイクロチップの製作方法であって、以下の工程：
ａ）ＬＴＣＣで作られ、そしてウエルを有する複層を配置してリアクションチャンバを形成し、ここで、該チャンバはコンダクタリングで囲まれ、
ｂ）該チャンバの下に、ヒータを含む少なくとも一層のＬＴＣＣを置き、
ｃ）該ヒータと該リアクションチャンバとの間に一又は数個のコンダクタ層を置き、そして、
ｄ）これらの層を互いに連結してマイクロチップを形成する、
を含む前記方法。
【請求項９】
ａ）ＬＴＣＣ層でできたマイクロチップであって、試料を装填するために形成される複層のリアクションチャンバ、該リアクションチャンバを囲むコンダクタリング、及び、該コンダクタリングへ熱を供給するために少なくとも一の層内に埋設されたヒータを含む、前記マイクロチップ；
ｂ）前記マイクロチップ内に埋設され又はチップ外に置かれる、チップ温度を測定するための温度センサ；
ｃ）前記温度センサの入力値に基づいて前記ヒータを制御するための制御回路；及び
ｄ）試料からの蛍光シグナルを検出するための光学システム
を含むマイクロＰＣＲ装置。
【請求項１０】
該装置は、ハンドヘルド装置であり、ポータブル計算プラットフォームを用いて制御される、請求項９に記載のマイクロＰＣＲ装置。
【請求項１１】
該装置は、多重ＰＣＲを実行するアレイ内に配置される、請求項９に記載のマイクロＰＣＲ装置。
【請求項１２】
該マイクロチップは、該装置から脱着可能である、請求項９に記載のマイクロＰＣＲ装置。
【請求項１３】
マイクロＰＣＲ装置を用いて試料内の分析物を検出し、又は病気の状態を診断する方法であって、以下の工程：
ａ）コンダクタリングで囲まれたリアクションチャンバを含むマイクロチップ上に核酸を含む試料を装填し、前記マイクロＰＣＲ装置の運転により核酸を増幅し；そして、
ｂ）増幅した核酸の蛍光の読み取りに基づいて分析物の存在又は非存在を測定し、又は、増幅した核酸の蛍光の読み取りに基づいて病原体の存在又は非存在を測定して病気の状態を診断する、
を含む前記方法。
【請求項１４】
該核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該方法は、増幅産物の定性及び定量分析のためにある、請求項１３に記載の方法。
【国際調査報告】
2011501122.tif 000016
2011501122.tif 000017
2011501122.tif 000018