(57)【要約】  本発明は、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−ティアゾル−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン、またはそれらの塩、およびアレンドロン酸またはその塩を含むする骨粗鬆症の予防および治療用薬学的組成物に関するものである。骨粗鬆症の予防または治療用薬学的組成物として、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン、またはそれらの塩、およびアレンドロン酸またはその塩の併用療法は、それらの物質を単独で処理したそれぞれの薬理学的効果に比べてはるかに強力でありながら有意的な破骨細胞阻害効果を示すことにより、骨粗鬆症の予防または治療に有用である。
2011529875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化合物（ａ）および（ｂ）を同時に、別に、または順次的に使用するために、有効成分として含む骨粗鬆症の予防または、治療用薬学的組成物：
（ａ）下記化学式１で表されるＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、下記化学式２で表される４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンおよびそれらの塩から選択される化合物；および
（ｂ）下記化学式３で表されるアレンドロン酸または、それらの塩。
【化１】
2011529875.tif 000006
【請求項２】
前記Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンの塩は、塩酸塩または、メタンスルホン酸塩である、請求項１に記載の骨粗鬆症の予防または、治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記アレンドロン酸の塩はナトリウム塩である、請求項１に記載の骨粗鬆症の予防または、治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記骨粗鬆症の予防または、治療用薬学的組成物は、前記（ａ）および（ｂ）を含む合剤(combination formulation)の形態で剤型化されたものであることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症の予防または、治療用薬学的組成物。
【請求項５】
前記骨粗鬆症の予防または、治療用薬学的組成物は、前記（ａ）および（ｂ）をそれぞれ含む独立した単剤(single formulation)の形態で剤型化されたものであることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症の予防または、治療用薬学的組成物。
【請求項６】
前記骨粗鬆症の予防または、治療用薬学的組成物は、前記（ａ）および（ｂ）をそれぞれ含む独立した単剤２つがキット形態で構成されたことを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症の予防または、治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたはその塩、およびアレンドロン酸またはその塩を含む骨粗鬆症の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨の組織は、身体の物理的支持体であって、必要な骨量と構造を保存する役割を果たし、カルシウム（Ｃａ２＋）などの保管庫として、カルシウムなどの血中濃度維持に重要な役割を果たしている。骨の組織は、非常に精巧で複雑な調節を介して、絶え間なく骨形成と骨吸収を繰り返す‘骨リモデリング（bone remodeling)’という動的な状態を維持する。骨リモデリングは、骨形成を主導する造骨細胞および骨の吸収と分解作用との機能を有した破骨細胞によって微細に調整され、生理学的および代謝的な観点から、常に平衡関係を維持している。しかし、様々な要因および病変によって骨形成と骨吸収との間の平衡関係が破壊されると、骨粗鬆症(osteoporosis)という骨疾患が引き起こされる。
【０００３】
骨粗鬆症は、骨組織のリモデリングに対する均衡が崩れて骨吸収が骨形成に比べて相対的に過多に行われて発生した骨疾患であって、特に中老年層の女性に多く発生している。骨粗鬆症の症状は、骨組織の石灰が減少して骨の緻密質が薄くなり、それにより骨髓腔が広くなり、骨密度または骨量の減少を引き起こして骨強度が維持され得ない状態を示す。その結果、症状が進展するにつれて骨が弱くなるため、小さい衝撃にも容易に骨折が発生する。
【０００４】
このような骨折誘発は、骨粗鬆症患者の病変率および致死率を増加させるだけでなく、生活の質を落とす非常に深刻な問題を引き起こす。従って、骨密度の増加および骨折誘発の可能性を低めるための目的として、様々な機作の多様な骨粗鬆症治療剤の開発がなされている。
【０００５】
現在、骨粗鬆症の治療剤として用いられている物質としては、ビスフォスフォネート製剤（アレンドロネート、エチドロネートなど）、ホルモン製剤（ラロキシフェン）、ビタミンＤ製剤、カルシトニン製剤、およびカルシウム製剤などがあり、最近、骨生成効能のある副甲状腺ホルモン製剤であるフォルテオ(Forteo)ＴＭなどが市販された。ホルモン製剤は一生服用しなければならず、長期投与の場合には、乳癌、子宮癌、胆石、および血栓症などの副作用が現れ、ビタミンＤ製剤は高価であり、効果が確実ではなく、カルシトニン製剤は高価であり、投与方法が難しく、カルシウム製剤は、副作用は少ないが、治療よりは予防効果に局限される短所がある。最近、商用化された副甲状腺ホルモン製剤であるフォルテオＴＭは、骨生成効能があるため、骨吸収抑制に限定された既存の薬物などの短所を補完できる長所があるが、長期間にわたって毎日注射で投与しなければならず、骨過多生成の副作用があり、非常に高価で幅広く使うのに制限的である。
【０００６】
骨粗鬆症治療剤の中で最も多く処方される治療剤は、ビスフォスフォネート系列の薬物であって、下記構造式のようなアレンドロネート(alendronate)は、強力な骨吸収阻害効果による骨密度上昇および骨折予防効果が証明され、経口服用可能およびコスト効果的な経済性などの長所があるため、現在、臨床において骨粗鬆症をはじめとするカルシウム代謝異常による疾患治療剤として広く使われている。
【０００７】
【化１】
2011529875.tif 000003
【０００８】
しかし、ビスフォスフォネート製剤は、吸収率が落ち、食道炎を引き起こすため、朝食前に十分な水と共に服用しなければならず、服用後３０分以内に他の飲み物、食べ物などを摂取できないだけでなく、一定時間以上横になっていることが禁止されるなどその服用方法が非常にやかましく、低カルシウム血症の危険性を増加させると報告されている。最近の研究で過度の骨吸収抑制による骨転換率(bone turnover rate)の低下、骨の生成速度に影響を与えて骨形成を抑制、胃腸障害および顎の骨壊死などの問題点が提起されている。最近の報告によると、長期間使用した際に、かえって骨折の危険性が高いと知られている(Andrew S Neviaserなど、Journal of Othopaedic Trauma,2008,22(5),346〜350)。
【０００９】
前述したように、現在の臨床で使われている骨粗鬆症の治療剤としては、骨吸収と骨形成とをバランスよく治療するのに限界がある。従って、骨粗鬆症の根本的な治療のためにバランスの骨量の増加と骨の質を改善させて実質的に骨折の危険を低くすることができる薬物および新しい治療法の開発が必要である。
【００１０】
前記のような短所を克服し、臨床的な治療効能を増進させるために様々な研究が進行されており、最近になって市販された骨形成を促進するものとして知られている副甲状腺ホルモン製剤と骨吸収阻害剤の併用投与に対する報告があった。これらの詳細な内容は次のとおりである。
【００１１】
アレンドロネートおよびその他の骨吸収阻害剤間の併用投与の例としては、アレンドロネートとエストロゲン(文献−Lindsayら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 84,3073-3081(1999))、アレンドロネートとラロキシフェン(文献−Johnellら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 87,985-992(2002))、アレンドロネートとＨＲＴ(hormone replacement therapy)(文献−Greenspanら、JAMA,289,2525-2533  (2003))およびアレンドロネートとカルシトリオール(calcitriol)(国際特許公開ＷＯ０１／２８５６４）などがある。これらの研究に対する一般的な見解は、単独投与に比べて骨密度がさらに増加したことが認められるか、骨折の危険率を低下させる効果は確認されなかった。また、機作は異なるが、より強化された骨吸収阻害効果によって急激な骨転換率および骨形成抑制のような根本的な問題点が依然として残っており、これらの治療法に細心の配慮と、研究が必要な実情である。
【００１２】
従って、アレンドロネートの骨形成阻害作用を低くし、副作用を緩和させる方案として骨形成促進剤との併用投与法が試みられた。代表的な例としては、副甲状腺ホルモン製剤との併用治療である。閉経後の女性(文献−Blackら、N. Eng. J. Med. 349,1207-1215,(2003))と高齢者の男性(文献−Finkelsteinら、N. Eng. J. Med. 349,1216-1226,(2003))を相手に、同時に２つの薬物を併用投与したが、単独投与と比較して併用投与による骨密度の上昇効果は観察されなかった。従って、何人かの研究者らは、同時に投与された強力な骨吸収阻害剤であるアレンドロネートが副甲状腺ホルモンの骨形成の促進効果を相殺させる可能性を提起している。この後、２つの薬物などの間の順次的な併用投与が試みられているが、正確な臨床的所見を決めるにはさらに多い研究が要求されている時点である。
【００１３】
一方、骨粗鬆症に対する効果的な治療剤として、本発明者らは、大韓民国特許登録第４５４７６７号を通じてベンズアミジン誘導体であるＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、それらの塩が骨粗鬆症の予防および治療剤として非常に有用であることを確認したことがある。
【００１４】
【化２】
2011529875.tif 000004
【００１５】
これに本発明者らは、骨粗鬆症予防剤または、治療剤として有効な前記化学式１と化学式２との成分を、単一の製剤として利用できるビスフォスフォネート系列のアレンドロネート、ホルモン製剤（ラロキシフェン）、ビタミンＤ製剤、カルシトニン製剤およびカルシウム製剤などの既存の様々な骨吸収抑制の骨粗鬆症治療剤などをはじめとして骨生成促進剤の骨粗鬆症治療剤と併用投与することにより、これらの長所を生かし短所を減らした新しい治療方法を研究してきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
その結果、本発明者などは単一の製剤として利用できる、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、それらの塩、およびアレンドロン酸または、その塩を併用することによって、顕著に効果の優れた骨粗鬆症予防または、治療用薬学的組成物を提供できることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の目的は、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、その塩、およびアレンドロン酸または、その塩を含む骨粗鬆症予防または、治療用薬学的組成物、およびそれを用いた骨粗鬆症の予防または、治療方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、０．１μＭのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩および０．２μＭのアレンドロン酸の単独処理あるいは同時処理が破骨細胞の分化に及ぼす影響を確認したグラフであって、骨髄細胞と骨芽細胞の共存培養を介して破骨細胞の分化を誘導し、各試料物質を単独あるいは同時に処理して７日間培養し、以後、ＴＲＡＰ染色で核を６個以上有した破骨細胞の数を数え、対照群との比較を介して百分率で示した。
【図２】図２は、０．３μＭのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩および０．２μＭのアレンドロン酸の単独処理あるいは同時処理が破骨細胞の分化に及ぼす影響を確認したグラフであって、骨髄細胞と骨芽細胞の共存培養を介して破骨細胞の分化を誘導し、各試料物質を単独あるいは同時に処理して７日間培養し、以後、ＴＲＡＰ染色で核を６個以上有した破骨細胞の数を数え、対照群との比較を介して百分率で示した。
【図３】図３は、０．５μＭのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩および０．２μＭのアレンドロン酸の単独処理あるいは同時処理が破骨細胞の分化に及ぼす影響を示したグラフであって、骨髄細胞と骨芽細胞の共存培養を介して破骨細胞の分化を誘導し、各試料物質を単独あるいは同時に処理して７日間培養し、以後、ＴＲＡＰ染色で核を６個以上有した破骨細胞の数を数え、対照群との比較を介して百分率で示した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
前記のような目的を達成するための一つの態様として、本発明は下記の化合物（ａ）および（ｂ）を同時に、別に、または順次的に使用するための有効成分として含む骨粗鬆症の予防または、治療用薬学的組成物に関するものである：
（ａ）下記化学式１で表されるＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、下記化学式２で表される４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンおよびそれらの塩から選択される化合物；および
（ｂ）下記化学式３で表されるアレンドロン酸または、塩。
【００２０】
【化３】
2011529875.tif 000005
【００２１】
本発明における用語‘骨粗鬆症(osteoporosis)’は、残っている骨には構造上に何の異常もないのに骨を形成する無機質と基質の量が過度に減少し、骨にスポンジのように小さい孔がたくさん出て脆く簡単に折れる状態をいい、骨減少症ともいう。
【００２２】
本発明において使用する、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンは、これに制限されるものではないか、例えば、公知の方法（イ・ソンウン、Synthesis and Biological Activity of Natural Products and Designed New Hybrid Compounds for the Treatment of LTB4 Related Disease,大韓民国釜山大学校大学院理学博士学位論文、1999.8)に記述された方法により製造され得る。
【００２３】
一方、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンの塩は、当業界において薬剤学的に許容される塩ならば制限なく使用することができ、これは制限されないが、当業界に良く知られている方法によって酸付加塩の形態になり得る。そのような薬剤学的に許容される塩としては、無機酸として塩酸、臭素酸、硫酸、リン酸などが、有機酸としてクエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、ギ酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、マレイン酸、安息香酸、グルコン酸、グリコール酸、コハク酸、４−トルエンスルホン酸、ガラクツロン酸、エンボン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸などが使用されることができ、好ましくは、無機酸として塩酸が、有機酸としてメタンスルホン酸が使用され得る。
【００２４】
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、それらの塩の投与量は、骨粗鬆症の予防または、治療に有効な量であり、患者の年齢、体重、併用療法の種類、治療の頻度、好ましい効果の種類あるいは投与法などによって決定しても良い。しかし、一般的に治療剤または、予防剤として使用される場合には、各種の投与経路を介して骨粗鬆症を治療するのに有効な量として投与することができ、その剤型、投与量などは投与目的、投与経路および投与対象の状態および体重などを考慮して当業者が容易に決定できる。具体的に、前記のＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、それらの塩は、約１〜５００ｍｇであり、好ましくは５〜２００ｍｇの量で投与できる。
【００２５】
また、本発明において使用されるアレンドロン酸も、公知の製造方法によって製造可能であり、その塩または、薬剤学的に許容可能な塩は制限なく使用することができ、好ましくは、ナトリウム塩である。アレンドロン酸または、その塩の投与量は、骨粗鬆症の予防または、治療に有効な量であり、患者の年齢、体重、併用療法の種類、治療の頻度、好ましい効果の種類、または、投与法などにより一律的に決定することはできないが、一般的に治療剤または、予防剤として使用される場合に、前記の化合物は通常の量で投与できる。具体的に、前記のアレンドロン酸または、その塩の一日投与量は、５〜４０ｍｇである。
【００２６】
本発明において、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、それらの塩、およびアレンドロン酸または、その塩は、任意の割合で併用され得る。
【００２７】
本発明において、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、それらの塩と、アレンドロン酸または、その塩は、混合して同時に投与することも可能であるが、それぞれを個別に同時または、順番に、あるいは時間を置いて個別に投与することも可能である。同時に投与することではない場合は、例えば、２つの有効成分を交互に投与するか、あるいは１つの有効成分を引き続き投与した後、他の１つの有効成分を投与することも可能である。
【００２８】
本発明において、薬剤は、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、それらの塩およびアレンドロン酸または、その塩を有効成分として含有する限り、どのような形態の薬剤も可能であり、例えば、２つの有効成分を含んだ合剤(combination formulation)を構成しても良く、それぞれ単剤(single formulation)として構成されても良い。ここで、合剤とは、１つの製剤に２つ以上の有効成分を配合したものをいい、単剤とは、１つの製剤に１つの有効成分を含有したものをいい、この時、前記の有効成分などは、それぞれの薬理、藥動学的特性に応じてそれぞれ異なる剤型（例えば、速放または、徐放型）で製造されて合されることもある。また、これらの合剤は、多層錠、コーティング錠などのように、各層または、コーティングおよびコアにそれぞれ異なる有効成分をそれぞれ含む形態で製剤化されることもできる。本発明において、２つの有効成分が単剤である場合の治療剤および予防剤は、それぞれ単一で利用できる単剤を組み合わせて利用する薬剤または、方法を意味する。従って、２つの有効成分を含有した薬剤がそれぞれ異なる剤刑でも構わない。２つの有効成分が単剤である場合は、２つの成分を一度に備えた形態であるキットの形態でも良い。
【００２９】
また、本発明の骨粗鬆症の予防剤または、治療剤は、毎日投与または、間けつ的に投与しても良く、１日あたりの投与回数は、１回または、２〜３回に分けて投与することが可能である。２つの有効成分がそれぞれ単剤である場合の投与回数は、同回数でも良く、他の回数にしても構わない。
【００３０】
本発明のＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、その塩およびアレンドロン酸または、その塩は、それぞれまたは、薬剤学的に許容される担体または、賦形剤と共に公知の方法によって製剤化することができる。このような剤型の具体的な例としては、軟質カプセル剤、硬質カプセル剤、錠剤、シロップ剤のような経口剤、注射剤または、局所剤が挙げられる。
【００３１】
薬剤学的に許容される担体には、滅菌溶液、錠剤、コーティング錠およびカプセルのような公知された剤型などに使用される標準の製薬学的担体のうちいずれも含まれる。典型的にこのような担体は、ポリビニルピロリドン、デキストリン、澱粉、牛乳、糖、特定種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸、タルク、植物性油（例えば、食用油、綿実油、ココナッツ油、アーモンド油、落花生油）、トリグリセリドなどの油状エステル、鉱物油、ワセリン、動物油脂、セルロース誘導体（例えば、結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）等の賦形剤、または、その他の公知の賦形剤を含む。このような担体には、また、酸化防止制、湿潤制、粘度安定剤、風味剤、色素添加剤および他の添加剤などが含まれ得る。このような担体を含有する組成物は、周知の方法によって剤型化され得る。
【００３２】
本発明の骨粗鬆症の予防剤および治療剤は、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンまたは、それらの塩とアレンドロン酸または、その塩という互いに異なる作用機転を有した２種類を有効成分として併用することであり、従来、単一薬物として使用される場合に比べて骨密度および骨強度の顕著な向上効果を提供する。
【００３３】
また他の一つの態様として、本発明は、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンまたは、それらの塩、およびアレンドロン酸または、その塩を投与する段階を含む骨粗鬆症の予防または、治療方法に関するものである。
【００３４】
前述したように、前記物質などの投与量は、様々な要素によって異なることもあり、その投与経路も患者の年齢、投与期間、体重、疾患の重症度、患者の意識の可否、併用薬物の種類などのような様々な要素によって経口または非経口の多様な投与経路を使用することができる。また、それぞれを個別に同時または順番に、あるいは時間をおいて個別に投与することも可能である。
【００３５】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３６】
骨粗鬆症治療効果を評価するために、本発明のＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンまたは、その塩およびアレンドロン酸または、塩を併用して投与したり、または、これらのそれぞれを単剤として使用した。
【００３７】
破骨細胞分化は、骨髄細胞(bone marrow cells)と頭蓋骨由来骨芽細胞(calvarial cells)との共存培養法(co-culture system)に誘導され、単剤あるいは合剤の処理によって破骨細胞の分化が阻害された程度を測定することにより、薬物の効果を評価した。
【実施例】
【００３８】
実施例１：骨髄細胞と骨芽細胞との用意
骨髄細胞は、６〜８週齢の雄のｄｄＹマウスから大腿骨および脛骨を摘出して注射器を利用した一般的な方法に応じて回収した。骨髄内の赤血球を除去した後、遠心分離を通じて回収した骨髄細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）が添加されたα−ＭＥＭ培地に入れて真核細胞の数を確認し、共存培養のために直に使用した。
【００３９】
マウス頭蓋骨を生後１〜２日齢のＩＣＲマウスから摘出し、頭蓋骨細胞(calvarial cell)、即ち、１次骨芽細胞(osteoblast)を０．２％コラゲナーゼ酵素溶液との連続的な反応を介して分離した。分離した頭蓋骨細胞は、遠心分離して１０％牛胎児血清が添加されたα−ＭＥＭ培地で一定期間の間に培養させた。次に、これらの細胞を所望の細胞数になるように希釈して実験に使用した。
【００４０】
実施例２：共存培養による破骨細胞分化実験
前記で用意した骨髄細胞（１×１０５細胞数／ウェル）と骨芽細胞（３，０００細胞数／ウェル）とを１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）が添加されたα−ＭＥＭ培地を用いた９６−ウェルプレートに分株した。この時、分化因子である１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１０−８Ｍ、以下、ビタミンＤ３という）とデキサメタゾン（１０−８Ｍ）とを破骨分化培地に共に添加した。前記の培地は、毎２〜３日ごとに分化因子が含まれた新鮮な培地に取り換えた。
【００４１】
７日後に、多核を有した破骨細胞が形成された際に、培地を除去して１０％ホルマリンが含まれたリン酸緩衝溶液で細胞を固定した。成熟した破骨細胞の形成程度は、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase：以下、ＴＲＡＰという)−陽性反応を有した多核破骨細胞(TRAP-positive multinucleated osteoclasts：以下、ＴＲＡＰ（＋）ＭＮＣｓという）の数を測定することによって決定した。ＴＲＡＰ染色液は、基質であるナフトールＡＳ−ＭＸホスフェート（ｐＨ  ５．０）、色素であるＦａｓｔ  Ｒｅｄ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢおよび５０ｍＭ酒石酸を入れて製造し、使用前まで冷蔵保管した。６〜７個以上の核を有したＴＲＡＰ（＋）ＭＮＣｓの数字を光学顕微鏡の観察下で測定した。
【００４２】
実施例３：実験物質が破骨細胞分化に及ぼす影響
イ．試料の用意
本発明のＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンおよび４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンは、公知の方法（イ・ソンウン、Synthesis and Biological Activity of Natural Products and Designed New Hybrid Compounds for the Treatment of LTB4 Related Disease，釜山大学校大学院理学博士学位論文、1999.8）により製造されることができ、また、アレンドロン酸ナトリウムは、公知の方法（米国特許４，４０７．７６１号、４，６２１，０７７号、４，７０５，６５１号、５，０３９，８１９、５号，１５９，１０８号）により製造され得る。
【００４３】
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩の単独処理、アレンドロン酸ナトリウムの単独処理、およびＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５  −イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩とアレンドロン酸ナトリウムとの同時処理時に破骨細胞分化に及ぼす影響を前記の実験を介して評価した。すべての実験は、ビタミンＤ３とデキサメタゾンとが存在する破骨分化培地を用いた。
【００４４】
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩は、ＤＭＳＯを用いて０．１ｍＭ，０．３ｍＭおよび０．５ｍＭの濃度で溶解させた後、破骨分化培地にて１，０００倍に希釈し、最終に０．１μＭ、０．３μＭおよび０．５μＭになるようにした。アレンドロン酸ナトリウム水和物は、精製水を使用して０．２ｍＭの濃度で溶解した後、破骨分化培地内に１，０００倍に希釈し、最終に０．２μＭの濃度になるようにした。この時、対照群は０．１％ＤＭＳＯが含まれた状態を維持した。各実験は、下記のような設定を通じてそれぞれ単独処理あるいは同時処理した。
【００４５】
実験例１：０．１μＭのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩および０．２μＭのアレンドロン酸ナトリウムの単独あるいは併用投与が破骨細胞分化に及ぼす影響
イ．対照群（０．１％ＤＭＳＯ溶媒）
ロ．Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩（０．１μＭ）単独処理群
ハ．アレンドロン酸ナトリウム（０．２μＭ）単独処理群
ニ．Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩（０．１μＭ）とアレンドロン酸ナトリウム（０．２μＭ）との同時処理群
前記の共存培養法で用意された細胞などを各ウェルに分株し、試料物質などあるいは溶媒を添加して培養した。培養３日目と５日目に、試料物質などが含まれた新鮮な分化培地に取り換えた。培養７日目に、細胞を固定し、ＴＲＡＰ染色を行った。６個以上の核を有したＴＲＡＰ（＋）破骨細胞を顕微鏡下で観察してその数を数えた。実験結果は、溶媒だけを使用した対照群の破骨細胞数を１００％とみなし、各実験群で観察された破骨細胞の数を対照群に比較して相対的百分率（％）で示した。各実験群当り４個ウェルの個体数（ｎ＝４）で実験を行い、結果は平均値±標準偏差として示した。また、前記の実施例は少なくとも２回以上の繰返し実験を行い、各実験群に対する相互有意性検証は、Student t-testを介して適用した。各実施例に対する結果は図１に示した。
【００４６】
その結果、０．１μＭ濃度のＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩を単独処理した際に、溶媒対照群に比べてＴＲＡＰ−陽性反応を見せる多核破骨細胞の相対的数が有意的に減少させた。また、単独処理したアレンドローン酸ナトリウム実験群（０．２μＭ）でも８０．６％の相対的数値を見せて破骨細胞分化が有意的に抑制されることを示した。Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩とアレンドロン酸ナトリウムとを前記と同様の濃度で同時に併用処理した場合、破骨細胞の相対的数値は、明らかに有意的に減少して３６．４％の数値に下がり、このような数値はそれぞれを単独処理した結果の和よりもはるかに低い数値であり、強力な破骨細胞分化の阻害現象を示している。前記の結果を介してＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩とアレンドロン酸ナトリウムとを同時処理、即ち、併用投与した場合には、単一物質個別効果の和から予想できる効果よりもはるかに高い薬効を誘導できることを立証した。
【００４７】
実験例２：０．３μＭのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩および０．２μＭのアレンドロン酸ナトリウムの単独処理あるいは同時処理が破骨細胞分化に及ぼす影響
イ．対照群（０．１％ＤＭＳＯ溶媒）
ロ．Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩（０．３μＭ）単独処理群
ハ．アレンドロン酸（０．２μＭ）ナトリウム単独処理群
ニ．Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩（０．３μＭ）とアレンドロン酸ナトリウム（０．２μＭ）との同時処理群
詳細実験は、実施例１と同様に適用した。
【００４８】
その結果、図２の破骨細胞分化に対する実験結果において示されたように、０．３μＭのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩は、０．１μＭの実験群に比べて低い数値の相対的破骨細胞比率（５２．４％）が観察されることによってより向上した破骨細胞分化の阻害効果を有意的に示した。
【００４９】
アレンドロン酸ナトリウム成分の単独処理は、前記の実施例１に記載されたように有意的に破骨細胞の相対的数を減少させた。２つの試料物質を同時に併用投与した際に、破骨細胞の形成が阻害され、２０．１％の非常に低い相対的破骨細胞の数値が観察された。このような結果は、２つの物質の同時処理が個別的な処理の和から期待されることよりもはるかに強力な阻害効果があることを示すものである。
【００５０】
実験例３：０．５μＭのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩および０．２μＭのアレンドロン酸ナトリウムの単独処理あるいは同時処理が破骨細胞分化に及ぼす影響
イ．対照群（０．１％ＤＭＳＯ溶媒）
ロ．Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩（０．５μＭ）単独処理群
ハ．アレンドロン酸ナトリウム（０．２μＭ）単独処理群
ニ．Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩（０．５μＭ）とアレンドロン酸ナトリウム（０．２μＭ）との同時処理群
詳細実験は実施例１と同様に適用した。
【００５１】
その結果、予想したように、０．５μＭのＮ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩は、強力に破骨細胞の分化を抑制して３４．５％の相対的破骨細胞数値が測定された。
【００５２】
これと共に、０．２μＭのアレンドロン酸ナトリウムを併用処理した際に、対照群に比べて９．７％という非常に低い数値の破骨細胞比率が観察された。これは、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンジメタンスルホン酸塩およびアレンドロン酸ナトリウムの単独処理結果の和よりも有意的に低い数値であって、破骨細胞分化に対する強力な併用処理効果を示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジンンジメタンスルホン酸塩とアレンドロン酸ナトリウムとを同時に併用処理した際に、単独処理したそれぞれの実験結果の和よりもはるかに強力ながら有意的な破骨細胞分化阻害効果が観察された。従って、Ｎ−ヒドロキシ−４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝ベンズアミジン、４−｛５−［４−（５−イソプロピル−２−メチル−１，３−チアゾール−４−イル）フェノキシ］ペントキシ｝−ベンズアミジンまたは、それらの塩、およびアレンドロン酸または、塩を併用して投与することがそれぞれを単独投与した結果に比べてはるかに優れた骨吸収抑制作用を示すことにより、より優秀な骨粗鬆症の予防効果および治療効果を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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