(57)【要約】  本発明は、単一段階でメチルグリオキサールを乳酸へと変換する酵素活性（グリオキサラーゼＩＩＩ活性として知られる）を有する新規ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドおよびその使用に関する。本発明は、そのようなポリペプチドについてコードするポリヌクレオチドの発現レベルを変更することによる微生物におけるグリオキサラーゼＩＩＩ活性の調整に関する。本発明はまた、グリオキサラーゼＩＩＩ活性を調整した微生物を発酵させることによる汎用化学物質、特に１，２−プロパンジオール、アセトール、および乳酸の生産にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列、その断片または相同配列を含んでなる、グリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性を有する、単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１の配列と少なくとも７０％同一性を有する配列を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１の配列の少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１の配列にある、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドについてコードする配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２の配列を含んでなる、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
宿主微生物内で機能を果たす調節エレメントの制御下で請求項５または請求項６に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現カセット。
【請求項８】
請求項７に記載のカセットまたは請求項５もしくは請求項６に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、形質転換ベクター。
【請求項９】
調整されたグリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性を有する改変微生物であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドの活性が減弱または増強された、改変微生物。
【請求項１０】
細菌、酵母および真菌からなる群の中から選択される、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
細菌が、腸内細菌科、バチルス科、ストレプトマイセス科およびコリネバクテリウム科からなる群の中から選択される、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
大腸菌、枯草菌、Clostridium acetobutylicumおよびCorynebacterium glutamicumからなる群の中から選択される、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１３】
減弱したグリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性を有する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の微生物であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドについてコードする天然遺伝子の発現が減弱している、微生物。
【請求項１４】
１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの産生を増強するようにさらに改変される、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
１，２−プロパンジオール産生を増強する次の改変の少なくとも１つおよびその組合せを含んでなる、請求項１４に記載の微生物：
・次の遺伝子の少なくとも１つの発現の減弱：ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ  ｐｔｓＩ、ｃｒｒ、ｅｄｄ、ｅｄａ、ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢ、ｌｄｈＡ、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ、ａｄｈＥ、ｔｐｉＡ、ｇａｐＡ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ａｒｃＡおよびｎｄｈ；
・次の遺伝子の少なくとも１つの発現の増強：ｇａｌＰ、ｇｌｋ、ｐｐｓＡ、ｍｇｓＡ、ｙｑｈＤ、ｙａｆＢ、ｙｄｈＦ、ｙｃｄＷ、ｙｑｈＥ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙａｊＯ、ｔａｓ、ｙｄｊＧ、ｙｄｂＣ、ｇｌｄＡ，ｆｕｃＯ；
・遺伝子ｌｐｄの改変、例えば、前記遺伝子は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質においてバリンによるアラニン５５の置換に至る点突然変異を有する。
【請求項１６】
アセトール産生を増強する次の改変の少なくとも１つおよびその組合せを含んでなる、請求項１４に記載の微生物：
・次の遺伝子の少なくとも１つの発現の減弱：ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ  ｐｔｓＩ、ｃｒｒ、ｅｄｄ、ｅｄａ、ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢ、ｌｄｈＡ、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ、ａｄｈＥ、ｔｐｉＡ、ｇａｐＡ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢおよびｇｌｄＡ；
・次の遺伝子の少なくとも１つの発現の増強：ｇａｌＰ、ｇｌｋ、ｐｐｓＡ、ｍｇｓＡ、ｙｑｈＤ、ｙａｆＢ、ｙｄｈＦ、ｙｃｄＷ、ｙｑｈＥ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙａｊＯ、ｔａｓ、ｙｄｊＧ、ｙｄｂＣ。
【請求項１７】
増強したグリオキサラーゼＩＩＩ活性を有する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の微生物であって、請求項５または請求項６に記載のポリヌクレオチドが過剰発現している、微生物。
【請求項１８】
請求項８に記載のベクターで形質転換する、請求項１７に記載の微生物。
【請求項１９】
請求項５もしくは請求項６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項７に記載のカセットがその染色体中に組み込まれる、請求項１７に記載の微生物。
【請求項２０】
増強したグリオキサラーゼＩＩＩ活性を有する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の微生物であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドについてコードする天然遺伝子の発現が増強している、微生物。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドについてコードする天然遺伝子のコード配列の上流に強力なプロモーターを含んでなる、請求項２０に記載の微生物。
【請求項２２】
ラクテートの産生を増強するようにさらに改変された、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２３】
ラクテート産生を増強する次の改変の少なくとも１つおよびその組合せを含んでなる、請求項２２に記載の微生物：
・次の遺伝子の少なくとも１つの発現の減弱：ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ  ｐｔｓＩ、ｃｒｒ、ｅｄｄ、ｅｄａ、ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢ、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ、ｆｒｄＡＢＣＤ、ａｄｈＥ、ｇａｐＡ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｙｑｈＤ、ｙａｆＢ、ｙｄｈＦ、ｙｃｄＷ、ｙｑｈＥ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙａｊＯ、ｔａｓ、ｙｄｊＧ、ｙｄｂＣ、ｇｌｄＡ、ｌｌｄＤ、ｄｌｄおよびｔｐｉＡ；
・次の遺伝子の少なくとも１つの発現の増強：ｇａｌＰ、ｇｌｋ、ｐｐｓＡおよびｍｇｓＡ。
【請求項２４】
微生物においてグリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性を調整するための方法であって、前記微生物において請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドの活性を増強または減弱させる、方法。
【請求項２５】
グリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性が、請求項５または請求項６に記載のポリヌクレオチドを過剰発現することにより増強される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
グリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性が、請求項５または請求項６に記載のポリヌクレオチドの発現を減弱することにより減弱される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの調製のための方法であって、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の微生物を、炭素の供給源を含んでなる適当な培養培地で増殖させ、１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールを回収する、方法。
【請求項２８】
回収された１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールが精製される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ラクテートを調製するための方法であって、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の微生物を、炭素の供給源を含んでなる適当な培養培地で増殖させ、ラクテートを回収する、方法。
【請求項３０】
回収されたラクテートが精製される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、単一段階でメチルグリオキサールを乳酸へと変換する酵素活性（グリオキサラーゼＩＩＩ活性として知られる）を有する新規ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドおよびその使用に関する。
【０００２】
さらに特に、本発明は、そのようなポリペプチドについてコードするポリヌクレオチドの発現レベルを変更することによる微生物におけるグリオキサラーゼＩＩＩ活性の調整(modulation)に関する。
【０００３】
本発明はまた、グリオキサラーゼＩＩＩ活性を調整した微生物を発酵させることによる汎用化学物質、特に１，２−プロパンジオール、アセトール、および乳酸の生産にも関する。
【０００４】
背景技術
いくつかの微生物では、一般的には発酵条件下でグルコースの異化によりラクテートが生成される。生物によってＤ−またはＬ−ラクテートが生成される：大腸菌(E. coli)では混酸発酵中にＤ−ラクテートが他の生成物とともに生成される一方、乳酸菌の発酵によりＤ−またはＬ−ラクテートが産生され得る。この産生経路は、グルコースからピルベートに至る解糖経路から派生する。ピルベートは、補因子としての還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）に依存する可溶性乳酸デヒドロゲナーゼによって単一反応によりラクテートへと還元される。大腸菌では、ｌｄｈＡ遺伝子によってコードされる乳酸デヒドロゲナーゼはＤ−ラクテートに対して特異的である(Clark, 1997)。乳酸菌では、Ｄ−またはＬ−ラクテートに対して特異的な乳酸デヒドロゲナーゼが見られる（Lactobacillus delbrueckiiではＤ−ラクテート、Lactobacillus helveticusではＬ−ラクテート、例えばGarvie, 1980参照）。
【０００５】
いくつかの生物では、ラクテート産生にもう１つの経路が関与する。この経路は、トリオースグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡ３Ｐ）をピルベートへと変換する解糖経路の下流部分に代わるものとなり得ることからメチルグリオキサールバイパスと呼ばれる(Cooper, 1984)。メチルグリオキサールバイパスは、フルクトース−１，６−二リン酸の開裂によって生成されるもう１つのトリオースリン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）から始まる。ＤＨＡＰは、メチルグリオキサールシンターゼによってメチルグリオキサール（ＭＧ）へと変換される。細胞に対して毒性のある化合物であるＭＧは、さらに、異なる系によってＤ−またはＬ−ラクテートへと変換され、生成されたラクテートはＤ−またはＬ−乳酸デヒドロゲナーゼによってピルベートへとさらに変換され得る。これらの酵素は、発酵乳酸デヒドロゲナーゼとは異なり、好気条件下でのみ活性化されるフラビン結合型膜結合タンパク質である(Garvie, 1980)。大腸菌においてＤ−およびＬ−乳酸デヒドロゲナーゼは、ｄｌｄおよびｌｌｄＤ（またはｌｃｔＤ）遺伝子によってそれぞれコードされる(Rule et al, 1985, Dong et al, 1993)。
【０００６】
メチルグリオキサールの異化経路は、この化合物の無毒化を理解するためだけでなく１，２−プロパンジオールの生産を目的としても、細菌において調査されてきた(Ferguson et al, 1998)。メチルグリオキサールからラクテートの産生を導き得る３つの経路は大腸菌において確認されている：
−第１の経路は、メチルグリオキサールを二段階でＤ−ラクテートへと変換するグルタチオン依存性グリオキサラーゼＩ−ＩＩ系（ｇｌｏＡおよびｇｌｏＢ遺伝子によってコードされる）である。
−第２の経路は、一段階でのメチルグリオキサールのＤ−ラクテートへの変換を触媒するグルタチオン非依存性グリオキサラーゼＩＩＩ酵素である。
−第３の系は、アセトールあるいはＤ−またはＬ−ラクトアルデヒドのいずれかを生じる、メチルグリオキサールレダクターゼによるメチルグリオキサールの分解である。Ｌ−ラクトアルデヒドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼの作用により、例えば、ａｌｄＡまたはａｌｄＢ遺伝子によりコードされる酵素によりＬ−ラクテートへとさらに変換され得る(Grabar et al, 2006)。
【０００７】
グリオキサラーゼＩＩＩ系は、グリオキサラーゼＩ−ＩＩ系ほど広く研究されていない。酵素グリオキサラーゼＩＩＩは１９９５年にMisra et alにより大腸菌において最初に記述され、精製された。この酵素は、異なる特性を有し、グルタチオン(gluthatione)と関係なく、単一段階でのメチルグリオキサールのＤ−ラクテートへの変換を触媒することができるため、グリオキサラーゼＩとは全く異なっている。この酵素は、大腸菌においてグリオキサラーゼＩまたはグリオキサラーゼＩＩよりも高い活性を有することがいくつかの報告書で後に記述されている(MacLean et al, 1998, Okado-Matsumoto and Fridovich, 2000, Benov et al 2004)。今日まで、グリオキサラーゼＩＩＩのアミノ酸配列は決定されておらず、この酵素についてコードする遺伝子は分かっていない。
【０００８】
Ｃ３ジアルコールである１，２−プロパンジオール、すなわちプロピレングリコールは、広く用いられている化学物質である。これは、不飽和ポリエステル樹脂、液体洗剤、冷却剤、不凍剤および航空機の解凍液の成分である。プロピレングリコールは、プロピレン誘導体より毒性が高いと認識されているエチレン誘導体の代わりとして１９９３−１９９４年以降使用されることが多くなってきている。
【０００９】
１，２−プロパンジオールは、大量の水を消費するプロピレンオキシド水和工程を用いて化学的手段により現在生産されている。プロピレンオキシドは、２つの工程のいずれかにより生産され得、一方の工程はエピクロルヒドリンを用い、もう一方の工程はヒドロペルオキシドを用いる。両経路は毒性の強い物質を用いる。加えて、ヒドロペルオキシド経路は、ｔｅｒｔ−ブタノールおよび１−フェニルエタノールのような副生成物を発生させる。プロピレンの産生を有利にするために、これらの副生成物の用途を見出さなくてはならない。化学的経路は、一般的にラセミ体１，２−プロパンジオールを生成するが、２つの立体異性体（Ｒ）１，２−プロパンジオールおよび（Ｓ）１，２−プロパンジオールの各々はある特定の用途には興味深いものである（例えば、特殊化学物質および医薬製剤のキラル出発材料）。
【００１０】
アセトール、すなわちヒドロキシアセトン（１−ヒドロキシ−２−プロパノン）はＣ３ケトアルコールである。この生成物は、繊維工業における建染め工程に還元剤として用いられている。この生成物は、有利には、環境に有害な、廃水の硫黄含量を減らすために伝統的な硫黄含有還元剤の代わるものとなり得る。アセトールはまた、化学工業の出発材料でもあり、例えば、ポリオールまたは複素環分子を製造するために用いられる。アセトールは、興味深いキレート特性および溶媒特性も有する。
【００１１】
アセトールは、現在、主として１，２−プロパンジオールの触媒による酸化または脱水により生産されている。グリセロールのような再生可能原料から出発する新規工程が現在提案されている（ＤＥ４１２８６９２およびＷＯ  ２００５／０９５５３６参照）。現在、化学的工程によるアセトールの生産コストがその産業上の利用や市場を減少させている。
【００１２】
１，２−プロパンジオールおよびアセトールの生産のための化学的工程の不利点が生物学的合成を魅力的な代替手段としている。唯一の経済的に実現可能な生物学的経路は、いくつかの微生物において見られる一般的な糖（例えば、グルコースまたはキシロース）からの１，２−プロパンジオールの自然産生経路を利用する。グルコースは、解糖経路、続いてメチルグリオキサールバイパスによって代謝され、ＭＧはラクトアルデヒドまたはアセトールのいずれかへ還元され得る。これらの２つの化合物は、その後第２の還元反応を受け１，２−プロパンジオールを生じ得る。この経路は、Clostridium sphenoidesおよびThermoanaerobacter thermosaccharolyticumなどの（Ｒ）−１，２−プロパンジオールの自然の生産者により用いられている。Clostridium sphenoidesを用いて、リン酸塩制限条件下で１，２−プロパンジオールが１，５８ｇ／ｌの力価で産生されている(Tran Din and Gottschalk, 1985)。Thermoanaerobacter thermosaccharolyticumも１，２−プロパンジオールの産生について調査されている(Cameron and Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al, 1987)。得られた最良の能力は力価９ｇ／ｌおよびグルコースからの収量０，２ｇ／ｇであった。しかしながら、これらの生物で得られる能力の向上は、利用可能な遺伝的手段の不足により制限される可能性が高い。同じ合成経路が大腸菌において機能を果たし、この生物における１，２−プロパンジオールの産生についてCameronのグループ(Cameron et al, 1998, Altaras and Cameron, 1999, Altaras and Cameron, 2000)やBennettのグループ(Huang et al, 1999, Berrios-Rivera et al, 2003)によりいくつかの調査が行われた。Cameronのグループによって得られた最良の結果は、嫌気フラスコ培養で１，２−プロパンジオール１．４ｇ／ｌの産生、消費したグルコースの１グラムあたり０．２ｇの収量である。嫌気フェドバッチ発酵槽の場合を推定すると
、産生は１，２−プロパンジオール４．５ｇ／ｌ、グルコースからの収量０．１９ｇ／ｇであり、Cameron et alの理論的評価からは程遠かった。また、同じアプローチを用いて得られた力価および収量が低い結果も特許ＵＳ  ６，０８７，１４０、ＵＳ  ６，３０３，３５２およびＷＯ  ９８／３７２０４に記載されている。Bennettのグループは嫌気条件下でのフラスコ培養により同じような結果を得、力価１．３ｇ／ｌおよび収量０．１２ｇ／ｇであり、微好気培養では力価１．４ｇ／ｌで収量０．１３ｇ／ｇを得た。
【００１３】
１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールを産生する菌株を得るための代替法は、より良い特性を有する所望の化合物を「進化した菌株」が産生する状態に向けて「最初の菌株」の進化を指向することである。１，２−プロパンジオールの産生のために微生物の「進化した菌株」を得るこのような手法は、特許出願ＷＯ  ２００５／０７３３６４に記載されている。この進化工程および次の発酵ステップは嫌気条件下で優先的に行われる。この技術は先行技術に比べて明らかな進歩である。１，２−プロパンジオール力価１．８ｇ／ｌを得、消費したグルコースの１グラムあたり０．３５ｇの収量であった。この方法の改良は、特許出願ＷＯ  ２００８／１１６８５２およびＷＯ  ２００８／１１６８４９に記載されており、その改良では上記の手法に従って得られた進化した菌株がそれぞれより優れた１，２−プロパンジオール生産者またはより優れたアセトール生産者を得るためにさらに改変される。そのような方法により、消費したグルコースの１ｍｏｌあたり１ｍｏｌより多い１，２−プロパンジオールの収量（０．４２ｇ／ｇ）を得ることができる。１，２−プロパンジオールの産生に関するＷＯ  ２００８／１１６８４８またはアセトールの産生に関するＷＯ  ２００８／１１６８５１に記載されている合理的な代謝工学のみで戦略を立て、菌株により同じ能力を得ることができる。
【００１４】
Ｄ−またはＬ−ラクテートは１，２−プロパンジオール産生プロセスによく見られる汚染物質であるようであった。競合経路は、発酵乳酸デヒドロゲナーゼ経路およびグリオキサラーゼＩ−グリオキサラーゼＩＩ経路であると分かっている。大腸菌におけるｌｄｈＡ遺伝子の欠失(Berrios-Rivera et al, 2003)または大腸菌におけるｌｄｈＡ遺伝子およびｇｌｏＡ遺伝子の両方の欠失(Altaras and Cameron, 2000)によってこれらの経路を標的にし、それによってグルコースからの１，２−プロパンジオールの収量が増加することが分かっている。Ｌ−ラクトアルデヒドの酸化によりＬ−ラクテートを産生するためのもう１つの経路は、ＷＯ  ２００５／０７３３６４ではｌｄｈＡおよびｇｌｏＡ遺伝子に加えてａｌｄＡおよびａｌｄＢ遺伝子の欠失により断ち切られた。しかしながら、これらの４つの欠失を用いても、ある特定の条件下でラクテートはなお産生された。この産生にグリオキサラーゼＩＩＩが関与しているようであり、１，２−プロパンジオール産生プロセスの収量と選択性の両方に影響を及ぼした。
【００１５】
乳酸またはラクテートおよびその誘導体は、食品工業、製薬工業、皮革工業および繊維工業において用途が幅広い。最近、再生可能な、生分解性の、環境に優しいプラスチックとしてポリ乳酸（ＰＬＡ）が開発されたため、ラクテートの需要は拡大すると見込まれる。ラクテートは、化学合成によるかまたは生物学的プロセスによるいずれかで生産することができる。しかしながら、生物学的プロセスだけが高光学純度の所望の立体異性体、Ｄ−またはＬ−ラクテートを生産することができ、この高光学純度はその最終用途の多くで重要な特性である。ＰＬＡの物理特性および生分解速度は、キラル基質、Ｄ−およびＬ−ラクテートの比率を操作することによって制御することができる。そのため、光学的に純粋なＤ−およびＬ−ラクテートの産生のための生物学的プロセスの利用可能性は高品質ポリマー合成の前提条件である。
【００１６】
乳酸菌はラクテートの自然の生産者であり、Ｄ−またはＬ−型に特異的であることが分かっているものもある。これらの細菌は、（例えば、ＵＳ  ２００４／０００５６７７では）特殊化学物質としてのラクテートの産生に伝統的に用いられている。しかしながら、ラクテートがＰＬＡ合成のための汎用化学物質として知られるようになったことから、より効率的でコスト効率の高い方法が必要である。無機塩培地で増殖することができ様々な異なる糖基質を用いることができる代替生体触媒が調査されている。酵母および大腸菌は、これらの特性と、代謝工学のための幅広い遺伝的手段の利用可能性とを兼ね備えている。乳酸産生のためのこれらの触媒の使用は、酵母菌株に関するＷＯ  ０３１０２２０１、ＷＯ  ０３１０２１５２およびＵＳ  ２００５／０１１２７３７ならびに大腸菌菌株に関するＥＰ  １７６０１５６およびＷＯ  ２００５／０３３３２４に記載されている。
【００１７】
微生物におけるＤ−またはＬ−ラクテートの合成は、ＮＡＤＨ依存性乳酸デヒドロゲナーゼによる糖の異化によってもたらされるピルベートの還元による。効率的な変換のための条件は、一般的に、ＮＡＤＨ補因子の大型プールが利用可能である嫌気生活下で達成される。唯一の発酵産物としてラクテートを生ずるホモ発酵代謝には乳酸菌を選択することができる。これは酵母または大腸菌には当てはまらず、エタノール、アセテート、ホルメートまたはスクシネートのような他の発酵産物は除去する必要がある。これは、対応する遺伝子の欠失を用いた遺伝子工学により達成することができる。
【００１８】
近年、光学的に純粋なＤ−ラクテートの産生に関する大腸菌の代謝工学が調査されている。Chang et al.(1999)は、アセテート産生経路が欠損しているｐｔａ変異株を用い、炭素フラックスを、天然乳酸デヒドロゲナーゼを用いてＤ−ラクテート産生へと向け直すことができることを示した。しかしながら、炭素フラックスの一部はそれでもやはり副生成物、特に、スクシネートの合成へと向かう。Zhou et al (2003 a)によって、アセテート、スクシネート、エタノールおよびホルメートそれぞれの合成を妨げるために酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、フマル酸レダクターゼ（ｆｒｄＡＢＣＤ）、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ(alcool/aldehyde dehydrogenase)（ａｄｈＥ）およびピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＡＢ）をコードする遺伝子の不活性化させることにより、改善された生体触媒が開発された。これらの改変は、Ｄ−ラクテートを９８％化学純度および９９％を超える光学純度で産生可能な菌株をもたらした。同じ著者ら(Chang et al, 1999, Zhou et al, 2003b)およびDien et al (2001)は同じアプローチを用いて、Ｌ−ラクテートの産生のためにｌｄｈＡ遺伝子を他の生物（Lactobacillus casei、Streptococcus bovisまたはPediococccus acidilactici）由来の、Ｌ−ラクテートの産生に特異的な乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子にさらに置換することにより大腸菌を操作した。ａｃｋＡ、ｆｒｄＡＢＣＤ、ａｄｈＥおよびｐｆｌＡＢ遺伝子を欠失している菌株については、Zhou et al (2003b)がＬ−ラクテートの９８％化学純度および９９％を超える光学純度での産生を報告した。そのような戦略もＥＰ  １７６０１５６に記載されている。
【００１９】
Ingramのチームによって開発されたＤ−およびＬ−ラクテート生産者(Zhou et al, 2003a and b)では、より優れたラクテート産生のための菌株の開発中に弱いキラル汚染が観察された。この汚染は、上述の通り、メチルグリオキサールバイパスによるＤ−またはＬ−ラクテートいずれかの産生が原因で起こることが分かった(Grabar et al, 2006)。この汚染は、ｍｇｓＡ遺伝子の欠失によって菌株を操作することによって阻むことができる。この研究は、メチルグリオキサールバイパスをラクテートの産生の代替非発酵経路として強調した。この代替産生経路は、ラクテート産生方法を構築するためにまだ用いられていない。
【発明の開示】
【００２０】
発明の説明
本発明は、配列番号１の配列、その断片または相同配列を含んでなる、グリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性を有する単離ポリペプチドに関する。
【００２１】
本発明はまた、前記ポリペプチドについてコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドも提供する。発明者らは、グリオキサラーゼＩＩＩ活性を有するタンパク質をコードする大腸菌由来の遺伝子の同定を報告する。この遺伝子はこれまで、ホモ二量体タンパク質であるＨｓｐ３１についてコードするｙｅｄＵ遺伝子として知られていた（ｈｃｈＡとしても知られている）(Sastry et al, 2002)。このタンパク質は後に、様々なグループによって精製され、結晶化され、その構造が解析された(Lee et al, 2003, Quigley ey al, 2003およびZhao et al, 2003)。いくつかの機能はＨｓｐ３１と関係していた：タンパク質のミスフォールディングの管理に関わる分子シャペロン(Malki et al, 2003)、広い特異性のアミノペプチダーゼ(Malki et al, 2005)、ならびに金属イオンを配位結合させることができる、いくつかのジオキシゲナーゼおよびヒドロキシラーゼ中に存在する２−Ｈｉｓ−１−カルボン酸モチーフと関連があるもう１つの潜在的な機能(Zhao et al, 2003)。Ｈｓｐ３１とグリオキサラーゼＩＩＩ活性との関連は文献に報告されていない。
【００２２】
本発明はさらに、宿主細胞内で機能を果たす調節エレメントの制御下で前記ポリヌクレオチドを含んでなる発現カセットおよび前記カセットまたは前記ポリヌクレオチドを含んでなる形質転換ベクターに関する。
【００２３】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドの活性が減弱または増強している、調整されたグリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性を有する改変微生物も提供する。
【００２４】
本発明の１つの目的は、減弱したグリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性を有する微生物を設計するために大腸菌由来のグリオキサラーゼＩＩＩタンパク質についてコードする遺伝子の新しい知識を活用することである。この微生物は、すでに知られている方法と比べて、向上した収量とより優れた選択性（すなわち副生成物がより少ない）でグルコースを１，２−プロパンジオールまたはアセトールへと変換することができる。
【００２５】
本発明のある特定の実施形態において、減弱したグリオキサラーゼＩＩＩ活性を有する本発明による微生物は、１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの産生を増強するようにさらに改変される。加えて、１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールを調製するための方法であって、前記微生物を適当な増殖培地で増殖させ、１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールを回収する方法を提供する。
【００２６】
また、ラクテートの産生に有用な微生物を設計するために大腸菌由来のグリオキサラーゼＩＩＩタンパク質についてコードする遺伝子の新しい知識を活用することも本発明の目的である。グリオキサラーゼＩＩＩについてコードする前記遺伝子の過剰発現によって、完全好気条件下でラクテートを産生することができ、それゆえ前記方法の生産性を高める菌株がもたらされる。ラクテートを調製するための方法であって、前記微生物を適当な増殖培地で増殖させ、ラクテートを回収する方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、微生物においてグリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性を調整するための方法であって、前記微生物において本発明のポリペプチドの活性を増強または減弱させる方法にも関する。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、配列番号１の配列、その断片または相同配列を含んでなる、グリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性を有する単離ポリペプチドに関する。
【００２９】
本明細書において、次の用語は特許請求の範囲および本明細書の解釈のために用いられる。
【００３０】
本発明によれば、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合により連結された２個以上のアミノ酸の配列を含んでなるペプチドまたはタンパク質を意味する。
【００３１】
「単離（された）」という用語は、自然に伴っている少なくとも１つの成分から取り出されているタンパク質またはＤＮＡ配列を意味する。
【００３２】
「グリオキサラーゼＩＩＩ」という用語は、単一段階でのメチルグリオキサールのＤ−ラクテートへの変換を触媒する酵素活性に関与するポリペプチドを意味する。そのような酵素活性は、Misra et al (1995)によって大腸菌において記載され、この酵素活性を測定する方法が提供されている。
【００３３】
「酵素活性(enzyme activity)」および「酵素活性(enzymatic activity)」という用語は同義的に用いられ、特定の化学反応、例えば、グリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性に関するメチルグリオキサールのＤ−ラクテートへの変換を触媒する酵素の能力を意味する。
【００３４】
本発明の単離ポリペプチドは、グリオキサラーゼＩＩＩ活性を有する微生物から、例えば、以下の実施例に記載の精製手法を用いることによって得ることができる。前記ポリペプチドを単離するために用いることができる微生物としては、限定されるものではないが、大腸菌が挙げられる。
【００３５】
「配列番号１の配列を含んでなる」という用語は、そのポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１に厳密に限定されず追加のアミノ酸も含み得るということを意味する。「配列番号１の断片」という用語は、そのポリペプチドの配列は配列番号１よりアミノ酸が少ないがグリオキサラーゼＩＩＩ活性を与えるのになお十分なアミノ酸を含むということを意味する。ポリペプチドは、その酵素活性を保持しながら１以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失および／または付加によって改変することができることは当技術分野で周知である。例えば、所定の位置における、タンパク質の機能特性に影響を及ぼさない化学的に等価なアミノ酸による１個のアミノ酸の置換は一般的である。本発明の目的において、置換は次のグループのうちの１グループ内での交換と定義される：
小型脂肪族非極性または弱極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
極性負荷電残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
極性正荷電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
大型脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
大型芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００３６】
よって、負荷電残基同士での（例えば、アスパラギン酸の場合にはグルタミン酸での）置換または正荷電残基同士での（例えば、アルギニンの場合にはリジンでの）置換をもたらす変化は機能的に等価な産物を生ずると思われる。
【００３７】
アミノ酸が改変される位置とアミノ酸配列において改変を受けるアミノ酸の数は特に限定されない。当業者ならば、タンパク質の活性に影響を及ぼさずに導入することができる改変を明確に理解することができる。例えば、タンパク質のＮ−またはＣ末端部分の改変は、タンパク質の活性を変更することはないと思われる。
【００３８】
「相同（の）」という用語は、上記に定義したような改変を受け、それでもなお最初の酵素活性を保持しているポリペプチドを意味する。
【００３９】
本発明の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の配列と少なくとも７０％同一性、優先的には少なくとも８０％同一性、より優先的には少なくとも９０％同一性を有する。
【００４０】
２つのタンパク質配列間の同一性百分率を決定するための方法は当業者から知られている。例えば、それらの配列のアラインメント後に、ウェブサイトhttp://www.ebi.ac.uk/clustalw/上で利用可能なソフトウェアＣＬＵＳＴＡＬＷを、そのウェブサイト上に示されたデフォルトパラメーターを使って用いることにより、それを行うことができる。同一性百分率の計算は、アラインメントから、残基の総数に対し、同じ位置において同一の残基の数を記録することにより簡単に行うことができる。あるいは、例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/上で利用可能なＢＬＡＳＴプログラムを、そのウェブサイト上に示されたデフォルトパラメーターを使って用いることにより、自動計算を行うことができる。
【００４１】
本発明の特定の実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号１の配列の少なくとも１００個の連続するアミノ酸、優先的には、配列番号１に示される配列の、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個またはより優先的には少なくとも２８０個の連続するアミノ酸を含んでなる。本発明のもう１つの実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号１の配列と厳密に同一のポリペプチド配列を有する。
【００４２】
本発明はまた、本発明のポリペプチドについてコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドにも関する。
【００４３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、所望により合成、非天然、または改変ヌクレオチド塩基を含有する、一本または二本鎖である、リボヌクレオチドのポリマー（すなわち、ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチドのポリマー（すなわち、ＤＮＡ）を意味する。ＤＮＡとしての単離ポリヌクレオチドは、合成ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの１以上のセグメントを含み得る。
【００４４】
前記ポリヌクレオチドの起源は必ずしも、前記酵素活性が最初に測定された生物でない。当業者は、遺伝子ライブラリーをそのようなポリヌクレオチドについてスクリーニングするために、配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなるプローブとのストリンジェンシーの異なる条件下でのハイブリダイゼーションを用いることができる。ハイブリダイゼーションについての詳細なプロトコールは、Sambrook et al (1989)に開示されている。
【００４５】
そのようなポリヌクレオチドの配列は、例えば、上記に定義したＢＬＡＳＴプログラムを用い配列番号２のヌクレオチド配列との相同性を検索して、データベースから抽出することができる。
【００４６】
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一のポリヌクレオチドである。本発明のより好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のポリヌクレオチドである。本発明のさらに好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドである。
【００４７】
特に、本発明には、配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドが含まれる。
【００４８】
「コードする(encoding)」または「コードする(coding)」という用語は、ポリヌクレオチドが、転写および翻訳の機構を通じて、アミノ酸配列を作り出すプロセスを意味する。このプロセスは遺伝子コードにより可能であり、遺伝子コードはＤＮＡの塩基配列とタンパク質のアミノ酸配列との関係である。遺伝子コードの１つの主な特徴は縮重していることであり、２以上の塩基トリプレット（「コドン」）によって１つのアミノ酸がコードされ得るということを意味する。直接の結果は、異なるポリヌクレオチドによって同じアミノ酸配列がコードされ得るということである。例として、遺伝子コードの縮重により配列番号２から誘導されたポリヌクレオチド配列も配列番号１のポリペプチド配列についてコードし得るため、本発明により意図される。コドンの使用は生物によって異なる可能性があることは当業者から周知である。ある微生物によれば、同じアミノ酸についてコードするコドンのうち、一部が優先的に使用され得る。よって、この生物における対応するタンパク質の発現を最適化するために、特定の微生物のコドン使用頻度に適応したポリヌクレオチドを設計することは興味深いであろう。
【００４９】
本発明はまた、宿主微生物内で機能を果たす調節エレメントの制御下で本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現カセットにも関する。
【００５０】
「発現」という用語は、遺伝子の産物である対応するタンパク質の生成を導く遺伝子配列の転写および翻訳を意味する。
【００５１】
「発現カセット」という用語は、調節エレメント、例えば、好適な宿主生物内で前記ポリヌクレオチドに含まれる遺伝子の発現を可能にするプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位またはターミネーターと好ましくは連結されたポリヌクレオチドを意味する。そのような調節エレメントは前記遺伝子の特有の調節エレメントであり得るが、前記遺伝子のより強い発現を可能にする改変または合成エレメントでもあり得る。例えば、前記遺伝子の天然プロモーターをより強力なプロモーターに置き換えることによってより強い発現を得ることができる。大腸菌の場合、これらのプロモーターは、例えば：ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターおよびラムダｃＩプロモーターである。他の生物の場合、当業者はより適したプロモーターを選択することができるかもしれない。
【００５２】
「宿主微生物」という用語は、外来もしくは異種遺伝子またはその特有の遺伝子の余分なコピーを受け入れることができ、それらの遺伝子を発現して活性タンパク質産物を産生することができる微生物を意味する。
【００５３】
本発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたはカセットを含んでなる形質転換ベクターを提供する。
【００５４】
「形質転換」という用語は、新たな遺伝子または既存遺伝子の余分なコピーの宿主生物への導入を意味する。獲得遺伝子は染色体ＤＮＡに組み込まれ得るか、または染色体外エレメントとして導入され得る。例として、大腸菌では、ＤＮＡを宿主生物へ移入するための方法はエレクトロポレーションである。
【００５５】
「形質転換ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを宿主生物に導入するために用いられる任意の輸送手段を意味する。そのような輸送手段は、用いる生物によって、例えば、プラスミド、ファージまたは当業者から公知の他のエレメントであり得る。形質転換ベクターは、通常、前記ポリヌクレオチドまたは前記発現カセットに加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする他のエレメントを含む。発現ベクターは、カセットに含まれている遺伝子の好適な発現を可能にする発現カセットと、形質転換ベクターの宿主生物への複製を可能にする追加エレメントを含んでなる。発現ベクターは宿主生物において単一コピーで存在し得るしまたは複数のコピーでも存在し得る。
【００５６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの活性が減弱または増強している、調整されたグリオキサラーゼＩＩＩ活性を有する改変微生物も提供する。
【００５７】
「酵素の活性の減弱」という用語は、改変前に同じ微生物において観察された活性と比べた、対象となる酵素の活性の低下を意味する。当業者はこの結果を得るための数多くの手段を知っており、例えば：
−遺伝子の発現レベルまたはコードされるタンパク質の活性レベルを低下させる、遺伝子への突然変異の導入。
−より低い発現をもたらす、低強度プロモーターによる遺伝子の天然プロモーターの置換。
−対応するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質を不安定にするエレメントの使用。
−全く発現の必要がない場合には遺伝子の欠失。
【００５８】
「増大した酵素活性」または「増強した酵素活性」は、活性が改変前に同じ微生物において測定された最初の活性よりも優れていることを意味する。対応する非改変微生物は、対象としている酵素活性を除き改変微生物の同じ特性を有する微生物である。有利には、前記酵素活性は、対応する非改変微生物の本来の活性と比べて、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも１００％増大している。グリオキサラーゼＩＩＩ活性を測定するための方法は以下に実施例１に示している。
【００５９】
本発明による微生物は、細菌、酵母および真菌からなる群の中から選択される。優先的には、前記細菌は、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、ストレプトマイセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)からなる群の中から選択される。より優先的には、前記細菌は、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、Clostridium acetobutylicumおよびCorynebacterium glutamicumからなる群の中から選択される。
【００６０】
本発明の目的は、本発明のポリペプチドについてコードする天然遺伝子の発現が減弱している、減弱したグリオキサラーゼＩＩＩ活性を有する微生物を提供することである。
【００６１】
本発明による「遺伝子の発現の減弱」という用語は、その遺伝子の発現の部分的または完全な抑制を示し、そしてその遺伝子はそれによって「減弱された」といわれる。この発現抑制は、遺伝子の発現の阻害、遺伝子発現に必要なプロモーター領域の総てまたは一部の欠失、あるいは遺伝子のコード領域の欠失のいずれかであり得る。優先的には、遺伝子の減弱は本質的にその遺伝子の完全欠失であり、その遺伝子は本発明による菌株の同定、単離および精製を容易にする選択マーカー遺伝子により置換することができる。遺伝子は相同組換え技術により優先的に不活性化される(Datsenko, K. A. & Wanner, B. L., 2000)。
【００６２】
本発明の一実施形態において、減弱したグリオキサラーゼＩＩＩ活性を有する微生物は、炭素の供給源からの１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの産生を増強するようにさらに改変される。
【００６３】
本発明の特定の実施形態において、本発明による微生物では、炭素の供給源からの１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトール産生収量を増加するために、バイパス経路または副生成物生成経路のいずれかに関与するいくつかの酵素活性は減弱される：
・遺伝子ｅｄｄおよびｅｄａによりコードされる、エントナー・ドウドロフ経路に関与する酵素活性の減弱。エントナー・ドウドロフ経路は、解糖に加え、グルコースをグリセルアルデヒド−３−リン酸とピルベートに分解する別の方法を与える。エントナー・ドウドロフ経路の減弱により、大部分のまたはよく見積もって総てのグルコースが解糖によって分解され１，２−プロパンジオールの産生に利用されることが保証される。
・メチルグリオキサールのラクテートへの変換に関与する酵素の減弱：メチルグリオキサールからのラクトイルグルタチオンの合成を触媒する、ｇｌｏＡ遺伝子によってコードされるグリオキサラーゼIおよび（Ｓ）ラクトアルデヒドからの（Ｓ）ラクテートの合成を触媒する、ａｌｄＡおよびａｌｄＢ遺伝子によってコードされるラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ。これらの酵素の減弱は、目的生成物の合成のために前駆体メチルグリオキサールを節約することを目的とする。
・ラクテート、エタノールおよびホルメートなどの副生成物の合成に関与する酵素の減弱：ピルベートからのラクテートの合成を触媒する、遺伝子ｌｄｈＡによってコードされる乳酸デヒドロゲナーゼ、アセチル−ＣｏＡからのエタノールの合成を触媒する、遺伝子ａｄｈＥによってコードされるアルコール−アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびピルベートからのアセチル−ＣｏＡおよびホルメートの合成を触媒する、遺伝子ｐｆｌＡおよびｐｆｌＢによってコードされるピルビン酸ギ酸リアーゼ。
【００６４】
優先的には、これらの遺伝子のうちの少なくとも１つは減弱される。
【００６５】
本発明のもう１つの特定の実施形態において、トリオースリン酸イソメラーゼ活性が減弱される。優先的には、この結果はｔｐｉＡ遺伝子の発現を減弱することによって達成される。より優先的には、ｔｐｉＡ遺伝子は欠失される。ｔｐｉＡ遺伝子は、ＤＨＡＰのグリセルアルデヒド３−リン酸への変換を触媒する酵素「トリオースリン酸イソメラーゼ」をコードする。この遺伝子の発現の減弱により、代謝されるグルコースの半分が１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールへと変換されることが保証される。
【００６６】
本発明のもう１つの特定の実施形態において、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ活性が減弱される。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼは、ＧＡＰＤＨとも呼ばれ、グルコースのピルビン酸への解糖変換に関与する重要な酵素の１つである。この酵素の減弱は、結果としてＧＡ３Ｐの一部を１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの合成へと向け直した。そのうえ、グルコースに対する１，２−プロパンジオールの収量は１モル／モルより高い場合もある。有利には、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性は、野生型ＧＡＤＰＨの通常の活性のおよそ３０％未満、より好ましくは１０％未満である。優先的には、ＧＡＰＤＨについてコードするｇａｐＡ遺伝子の発現は減弱される。
【００６７】
本発明のもう１つの実施形態において、本発明による微生物では、糖取り込み効率は増大される。ＧＡＰＤＨ反応において炭素フラックスを５０％より多く減少させる、ｇａｐＡ遺伝子の発現の強い減弱は、結果として取り込まれたグルコース１モル当たり１モル未満のＰＥＰの合成を生じる。取り込みは、グルコース−６−リン酸を生ずるＰＥＰからグルコースへのリン酸転移反応と連動するため、単純糖質の細胞への取り込みに通常利用される糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）にＰＥＰは必要である。よって、ＰＥＰの量の減少は糖取り込みに悪影響を及ぼすであろう。
【００６８】
本発明の特定の実施形態において、糖はホスホエノールピルベートに依存しない糖取り込み系により微生物に取り込まれる場合がある。リン酸化を伴わない、遺伝子ｇａｌＰによってコードされるガラクターゼプロトンシンポーター(The galactase-proton symporter)が利用され得る。この場合、取り込まれたグルコースは、ｇｌｋ遺伝子によってコードされるグルコースキナーゼ活性によりリン酸化される必要がある。この経路を促進するために、ｇａｌＰおよびｇｌｋの中から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増大させる。結果としてＰＴＳは不要となり、ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩまたはｃｒｒの中から選択される少なくとも１つの遺伝子を減弱することによりＰＴＳは排除することができる。これらの４つの遺伝子は、ＰＴＳ複合体の異なる機能ドメインについてコードしている：ｐｔｓＧは前記酵素ＩＩの２つのサブユニットＢおよびＣについてコードし、ｐｔｓＨはＨＰｒタンパク質についてコードし、ｐｔｓＩは前記酵素Ｉについてコードし、ｃｒｒは前記酵素ＩＩのサブユニットＡについてコードする。
【００６９】
本発明のもう１つの特定の実施形態において、糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の効率は、代謝産物であるホスホエノピルベート (phosphoenopyruvate)の利用可能性を高めることにより増大される。ｇａｐＡ活性の減弱およびピルベートへのより低い炭素フラックスから、本発明の改変菌株におけるＰＥＰの量は制限される可能性があり、細胞へのグルコース輸送量は低くなる。
【００７０】
微生物の菌株におけるＰＥＰの利用可能性を高めるのに用い得るさまざまな手段が存在する。特に、手段はＰＥＰ→ピルベートの反応を減弱することである。優先的には、この結果を得るために、前記菌株において、ピルビン酸キナーゼ酵素についてコードするｐｙｋＡおよびｐｙｋＦの中から選択される少なくとも１つの遺伝子を減弱する。ＰＥＰの利用可能性を高めるもう１つの方法は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼにより触媒されるピルベート→ＰＥＰの反応を、この酵素の活性を増大することによって有利にすることである。この酵素はｐｐｓＡ遺伝子によってコードされる。そのため、優先的には、微生物において、ｐｐｓＡ遺伝子の発現を優先的に増大させる。両方の改変は微生物において同時に存在し得る。
【００７１】
本発明のもう１つの特定の実施形態において、副生成物であるアセテートの合成は、その合成に関与する少なくとも１つの酵素を減弱することにより妨げられる。１，２−プロパンジオールの産生を最大限に高めるためにはそのようなアセテート合成を回避することが好ましい。
【００７２】
アセテートの産生を妨げるために、有利には、ａｃｋＡ、ｐｔａおよびｐｏｘＢの中から選択される少なくとも１つの遺伝子を減弱する。これらの遺伝子は総て、異なるアセテート生合成経路に関与する酵素をコードする。
【００７３】
具体的には、１，２−プロパンジオールの産生のためには、この化合物の生成をもたらす特異的な酵素活性を増大させることが有利であり得る：メチルグリオキサールシンターゼ、メチルグリオキサールレダクターゼおよび１，２−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ。有利には、前記酵素活性を、対応する非改変微生物の本来の活性と比べて、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも１００％増大させる。
【００７４】
特異的な酵素活性の増大を得るためには、これらの活性についてコードする遺伝子を優先的に過剰発現させる：ｍｇｓＡ遺伝子（メチルグリオキサールシンターゼについてコードする）、ｙｑｈＤ、ｙａｆＢ、ｙｄｈＦ、ｙｃｄＷ、ｙｑｈＥ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙａｊＯ、ｔａｓ、ｙｄｊＧ、およびｙｄｂＣ（総てはメチルグリオキサールレダクターゼについてコードする）、ｇｌｄＡまたはｆｕｃＯ（１，２−プロパンジオールデヒドロゲナーゼについてコードする）。
【００７５】
ｍｇｓＡ、ｙｑｈＤおよびｇｌｄＡ遺伝子の過剰発現の組合せは優先的に用いられる。
【００７６】
対象となる遺伝子の過剰発現を得るために、当業者は種々の方法を知っており、例えば：
１−対象遺伝子のより強い発現レベルを誘導するプロモーターによる遺伝子の天然プロモーターの置換。
２−前記対象遺伝子を運び発現する発現ベクターの微生物への導入。
３−対象遺伝子の追加コピーの微生物染色体への導入。
【００７７】
増大した酵素活性を得るためのもう１つの方法は、天然タンパク質より高い活性を示す遺伝子産物の翻訳を可能にする特定の突然変異を対象遺伝子に導入することである。
【００７８】
嫌気または微好気条件下では、前駆体を１，２−プロパンジオールへと還元するためのＮＡＤＨの利用可能性は有利に高められる。これは、（ａｒｃＡ遺伝子によってコードされる）グローバルレギュレーターＡｒｃＡにより媒介されるトリカルボン酸サイクルの抑制を軽減することによって達成される。細胞のＮＡＤＨ濃度は、遺伝子ｎｄｈによってコードされるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩＩを不活性化することによっても高めることができる。そのため、好ましくは、ａｒｃＡおよびｎｄｈの中から選択される少なくとも１つの遺伝子を減弱する。
【００７９】
特に嫌気または微好気条件下では、ピルベートをアセチル−ｃｏＡへと変換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）がＮＡＤＨによる阻害に対して低感受性であることが有利である。野生型酵素の感受性を基準として低い感受性が定義される。そのような特性は、（ＰＤＣのサブユニットリポアミドデヒドロゲナーゼについてコードする）ｌｐｄ遺伝子における特定の突然変異（その酵素のタンパク質配列のアラニン５５の、残基バリンによる置換をもたらす）によって得ることができる。
【００８０】
優先的には、主として１，２−プロパンジオールを産生するように設計される微生物は、細菌、酵母または真菌の中から選択される。より優先的には、前記微生物は、腸内細菌科、バチルス科、クロストリジウム科、ストレプトマイセス科およびコリネバクテリウム科の中から選択される。さらに優先的には、前記微生物は大腸菌またはClostridium acetobutylicumのいずれかである。
【００８１】
具体的には、アセトールの産生のためには、この化合物の生成をもたらす特異的な酵素活性を増大させることが有利であり得る：メチルグリオキサールシンターゼおよびメチルグリオキサールレダクターゼ。有利には、前記酵素活性を対応する非改変微生物の本来の活性と比べて、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも１００％増大させる。
【００８２】
特異的な酵素活性の増大を得るためには、これらの活性についてコードする遺伝子を優先的に過剰発現させる：ｍｇｓＡ遺伝子（メチルグリオキサールシンターゼについてコードする）、ｙｑｈＤ、ｙａｆＢ、ｙｄｈＦ、ｙｃｄＷ、ｙｑｈＥ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙａｊＯ、ｔａｓ、ｙｄｊＧ、およびｙｄｂＣ（総ては、メチルグリオキサールレダクターゼについてコードする）。
【００８３】
ｍｇｓＡおよびｙｑｈＤ遺伝子の過剰発現の組合せは優先的に用いられる。
【００８４】
加えて、アセトールの産生のためには、アセトールからの１，２−プロパンジオールの生成を妨げることが有利である。この結果は、アセトールの１，２−プロパンジオールへの変換に関与する少なくとも１つの酵素の活性を減弱することによって達成され得る。優先的には、ｇｌｄＡ遺伝子の発現は減弱され、より優先的には、ｇｌｄＡ遺伝子は欠失される。
【００８５】
発現を減弱することが有利である他の遺伝子は以下である：ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒ、ｅｄｄ、ｅｄａ、ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢ、ｌｄｈＡ、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ、ａｄｈＥ、ｔｐｉＡ、ｇａｐＡ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ。
【００８６】
発現を増強することが有利である他の遺伝子は以下である：ｇａｌＰ、ｇｌｋ、ｐｐｓＡ。
【００８７】
優先的には、主としてアセトールを産生するように設計される微生物は、細菌、酵母または真菌の中から選択される。より優先的には、前記微生物は、腸内細菌科、バチルス科、ストレプトマイセス科およびコリネバクテリウム科の中から選択される。さらに優先的には、前記微生物は大腸菌またはKlebsiella pneumoniaeのいずれかである。
【００８８】
また、本発明のポリヌクレオチドが過剰発現している、増強したグリオキサラーゼＩＩＩ活性を有する微生物を提供することも本発明の目的である。
【００８９】
優先的には、前記過剰発現は、本発明のベクターで生物を形質転換することにより、あるいは本発明のポリヌクレオチドまたはカセットを生物の染色体へ組み込むことにより達成される。
【００９０】
過剰発現を調整するために、発現ベクターに含まれているまたは染色体に組み込まれている遺伝子の単一コピーまたは複数のコピーを導入することができる。加えて、前記遺伝子の異なる発現レベルを誘導する異なる種類のプロモーターも用いることができる。
【００９１】
当業者ならば、新たな遺伝子の挿入に適当な染色体上位置を選択することができる。この位置（すなわち、遺伝子座）は宿主生物の本質的な機能に影響を及すものであってはならない。遺伝子を宿主生物の染色体に組み込むための方法は、例えば、Sambrook et al (1989)に開示されている。
【００９２】
本発明の目的は、本発明のポリペプチドについてコードする天然遺伝子の発現が増強している、増強したグリオキサラーゼＩＩＩ活性を有する微生物を提供することである。これは、天然遺伝子のコード配列の上流に強力なプロモーターを導入することによって優先的には達成される。
【００９３】
加えて、前記遺伝子の他の調節エレメントを改変することもできる。例えば、前記遺伝子の上流領域（開始コドン、リボソーム結合部位）の、当業者ならば選択することができる好適な突然変異は、発現の増大をもたらし得る。加えて、所望により前記遺伝子の発現をオン／オフするために、誘導プロモーターを導入することもできる。
【００９４】
本発明の好ましい実施形態において、強力なプロモーターは、本発明によるポリペプチドについてコードする天然遺伝子のコード配列の上流に存在する。
【００９５】
本発明はまた、ラクテートの産生を増強するようにさらに改変された、増強したグリオキサラーゼＩＩＩ活性を有する微生物にも関する。
【００９６】
本明細書における「ラクテート（lactate）」という用語は、Ｄ−ラクテートおよびＬ−ラクテートおよびそれらの混合物を示し、５０／５０（ラセミ混合物）、７５／２５、９０／１０および１００／０などの異なる比率の混合物を含む。
【００９７】
本発明の特定の実施形態において、ラクテートの産生を特異的に増強するために、従前に記載されたような微生物に改変を導入する。
【００９８】
優先的には、メチルグリオキサールシンターゼ活性を増大させる。好ましい方法はｍｇｓＡ遺伝子の過剰発現である。加えて、用いた培養条件下でメチルグリオキサールシンターゼ活性を増大するために、ｍｇｓＡ遺伝子に１つまたはいくつかの突然変異を導入することもできる。
【００９９】
発現を増強することが有利である他の遺伝子は以下である：ｇａｌＰ、ｇｌｋ、ｐｐｓＡ。
【０１００】
本発明のもう１つの実施形態において、遺伝子ｅｄｄおよびｅｄａによってコードされるエントナー・ドウドロフ経路の酵素活性の少なくとも１つは減弱される。優先的には、遺伝子ｅｄｄまたはｅｄａの少なくとも１つは減弱される。すでに記述したように、エントナー・ドウドロフ経路は解糖経路の望ましくないバイパスとして機能し得る。
【０１０１】
１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの産生に関しては、炭素フラックスをメチルグリオキサールバイパスへと向け直すことが有利である。そのため、ＧＡＰＤＨおよび関連する機構の減弱（糖取り込みの操作またはＰＥＰ再循環の操作）が優先的に導入される。
【０１０２】
優先的には、本発明による微生物では、ラクテート収量を増加するために、副生成物生成経路に関与するいくつかの酵素活性は減弱される：
・ピルベートからのアセチル−ＣｏＡおよびホルメートの合成に関与する、遺伝子ｐｆｌＡおよびｐｆｌＢによってコードされるピルビン酸ギ酸リアーゼ活性。
・フマレートからのスクシネートの合成に関与する、オペロンｆｒｄＡＢＣＤによってコードされるフマル酸レダクターゼ活性。
・アセチル−ＣｏＡからのエタノールの合成に関与する、遺伝子ａｄｈＥによってコードされるアルコール−アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性。
・アセチル−ＣｏＡからの二段階でのアセテートの合成に関与する、遺伝子ｐｔａおよびａｃｋＡそれぞれによってコードされるホスホトランスアセチラーゼおよび酢酸キナーゼ活性。
・ピルベートからの一段階でのアセテートの合成に関与する、遺伝子ｐｏｘＢによってコードされるピルビン酸オキシダーゼ活性。
【０１０３】
優先的には、活性の減弱は、これらの遺伝子のうちの少なくとも１つの減弱によって得る。
【０１０４】
メチルグリオキサールバイパスから生じる他の潜在的副生成物は、アセトール、ラクトアルデヒドおよび１，２−プロパンジオールである。これらの副生成物の生成を妨げるために、少なくとも１つのメチルグリオキサールレダクターゼ活性を減弱する。これは、ｙｑｈＤ、ｙａｆＢ、ｙｑｈＥ、ｙｄｈＦ、ｙｃｄＷ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙａｊＯ、ｔａｓ、ｙｄｊＧ、ｙｄｂＣおよびｇｌｄＡ：の中から選択される、メチルグリオキサールレダクターゼ活性についてコードする少なくとも１つの遺伝子を減弱することによって優先的に実現される。
【０１０５】
産生されたＤ−ラクテートはこれ以上代謝されないことが有利である。よって、本発明のもう１つの実施形態において、Ｄ−ラクテートを利用する少なくとも１つの酵素活性は減弱される。優先的には、ｄｌｄ遺伝子は減弱される。
【０１０６】
また、Ｌ−ラクテートのさらなる代謝を妨げることも有利である。優先的には、Ｌ−ラクテートを利用する少なくとも１つの酵素の発現または活性は減弱される。より優先的には、ｌｌｄＤ遺伝子は減弱される。
【０１０７】
ラクテートの産生を有利にするために発現を減弱することが有利である他の遺伝子は以下である：ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒ、ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢ、ｇａｐＡ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｔｐｉＡ。
【０１０８】
優先的には、ラクテートを産生するように設計される微生物は、細菌、酵母または真菌の中から選択される。より優先的には、前記微生物は、腸内細菌科、バチルス科、ストレプトマイセス科およびコリネバクテリウム科の中から選択される。さらに優先的には、前記微生物は、大腸菌、枯草菌またはCorynebacterium glutamicumの種のいずれかのものである。
【０１０９】
本発明は、微生物においてグリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性を調整するための方法であって、前記微生物において本発明のポリペプチドの活性を増強または減弱させる方法を提供する。
【０１１０】
優先的には、前記方法において、グリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性は本発明のポリヌクレオチドを過剰発現することにより増強される。
【０１１１】
優先的には、前記方法において、グリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性は本発明のポリヌクレオチドの発現を減弱することにより減弱される。
【０１１２】
本発明はまた、１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの調製のための方法であって、本発明による微生物を、炭素の供給源を含んでなる適当な培養培地で増殖させ、産生された１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールを回収する方法にも関する。１，２−プロパンジオールの産生は好気、微好気または嫌気条件下で行われる。アセトールの産生は好気または微好気条件下で、優先的には好気条件下で行われる。
【０１１３】
「炭素基質」または「炭素供給源」という用語は、その基質が少なくとも１つの炭素原子を含有する、微生物によって代謝され得る任意の炭素源を意味する。著者らは、特に、再生可能で安価な発酵性炭素源、例えば、単糖、オリゴ糖、多糖、単一炭素基質、およびグリセロールなどのポリオールを指す。式（ＣＨ２Ｏ）ｎの糖はオース(oses)または「単純糖質」とも呼ばれる；単糖としては、フルクトース、グルコース、ガラクトースおよびマンノースが挙げられる。他の炭素源は二糖、三糖、オリゴ糖および多糖である。二糖としては、サッカロース（スクロース）、ラクトースおよびマルトースが挙げられる。デンプンおよびヘミセルロースは多糖類であり、「複合糖質」としても知られている。
【０１１４】
有利には、回収された１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールはさらに精製される。
【０１１５】
本発明はまた、ラクテートを調製するための方法であって、本発明による微生物を、炭素の供給源を含有する適当な培養培地で増殖させ、ラクテートを回収する方法にも関する。ラクテートの産生は好気、微好気または嫌気条件下で、優先的には好気条件下で行われる。
【０１１６】
有利には、回収されたラクテートはさらに精製される。
【０１１７】
発酵工程の培養条件は、当業者ならば容易に定義することができる。特に、細菌は２０℃〜５５℃間、好ましくは２５℃〜４０℃間の温度で、好ましくは、C. acetobutylicumの場合には約３５℃で、大腸菌およびK. pneumoniaeの場合には約３７℃で発酵させる。
【０１１８】
この工程は、バッチ法、フェドバッチ法または連続法のいずれかで行うことができる。
【０１１９】
「好気条件下で」とは、酸素ガスを液相中に溶解することによって培養物に酸素が供給されることを意味する。これは、（１）酸素含有ガス（例えば、空気）を液相中に分散させることまたは（２）培養培地が入っている容器を振盪して液相のヘッドスペースに含まれる酸素を運ぶことによって達成された。嫌気条件の代わりに好気条件下で発酵させることの利点は、電子受容体として酸素が存在することにより、細胞プロセスのためにＡＴＰとしてより多くのエネルギーを生産する菌株の能力が向上することである。その結果、菌株の一般代謝は高まる。
【０１２０】
微好気条件は、液相中に低率の酸素（例えば、０．１〜１０％間の酸素を含有し、窒素により１００％となるガス混合物を用いること）が溶解している培養条件と定義される。
【０１２１】
嫌気条件は、培養培地に酸素が供給されない培養条件と定義される。偏性嫌気条件は、窒素のような不活性ガスを培養培地中に分散させて微量の他のガスを除去することにより達成される。菌株によるＡＴＰ生産を向上させその代謝を高めるために、ニトレートを電子受容体として用いることもできる。
【０１２２】
本発明による「適当な増殖培地」という用語は、微生物の増殖に適した既知分子組成の培地を示す。例えば、少なくとも１つの炭素源を含有する、用いる細菌に適した既知規定組成の無機培養培地である。従って、特に、大腸菌またはK. pneumoniae用の無機増殖培地は、Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)またはSchaefer et al.により規定されたような培地(1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)と同一または類似の組成のものであり得る。
【０１２３】
大腸菌またはK. pneumoniaeの培養に用いる炭素源は、優先的には単純炭素源であり、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース スクロースまたはキシロースであり得る。特に好ましい単純炭素源はグルコースである。
【０１２４】
本発明は、以上、以下および実施例において大腸菌に関して説明している。よって、本発明による最初の菌株および進化した菌株に関して減弱、欠失または過剰発現させることができる遺伝子は、主として大腸菌由来の遺伝子の名称を用いて定義される。しかしながら、この名称は本発明によるより一般的な意味を有し、他の微生物における対応する遺伝子を包含する。大腸菌由来の遺伝子についてのGenBankの参照を用いて、当業者ならば大腸菌以外の生物における等価な遺伝子を決定することができる。
【０１２５】
相同配列およびそれらの相同性百分率を同定する手段は、当業者には周知であり、特に、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/上で、そのウェブサイト上に示されたデフォルトパラメーターを使って用いることができるＢＬＡＳＴプログラムが挙げられる。得られた配列は、例えば、プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)を、これらのウェブサイト上に示されたデフォルトパラメーターを使って用い、活用する（アラインする）ことができる。
【０１２６】
ＰＦＡＭデータベース(protein families database of alignments and hidden Markov models http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列のアラインメントの膨大なコレクションである。各ＰＦＡＭは、多重アラインメントを視覚化し、タンパク質ドメインを調べ、生物での分布を評価し、他のデータベースにアクセスし、既知タンパク質構造を視覚化することを可能にする。
【０１２７】
ＣＯＧ(clusters of orthologous groups of proteins http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)は、１４の主要な系統発生系列を表す６６の完全に配列決定された単細胞ゲノム由来のタンパク質配列を比較することにより得られる。各ＣＯＧは少なくとも３系列から定義され、古くからの保存されたドメインを同定することを可能にする。
【参照文献】
【０１２８】
2011515083.tif 000002
2011515083.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】ＳＤＳ４〜１５％勾配ポリアクリルアミドゲル。レーン１：グリオキサラーゼ活性を有するゲル濾過カラム画分、レーン２：分子量マーカー
【実施例】
【０１３０】
実施例１：大腸菌ＰＧ００１６におけるグリオキサラーゼＩＩＩ活性の精製およびそのコード遺伝子の同定
１．ＰＧ００１６菌株の構築
１．１．改変菌株大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊、ΔｔｐｉＡ、ΔｐｆｌＡＢ、ΔａｄｈＥ、ｌｄｈＡ：：ｋｍ、ΔｇｌｏＡ、ΔａｌｄＡ、ΔａｌｄＢ、Δｅｄｄの構築。
プロトコール１に従い、菌株大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊、ΔｔｐｉＡ、ΔｐｆｌＡＢ、ΔａｄｈＥ、ｌｄｈＡ：：Ｋｍ、ΔｇｌｏＡ、ΔａｌｄＡ、ΔａｌｄＢ、Δｅｄｄ：：Ｃｍにおいてクロラムフェニコール耐性カセットを除去した（ＷＯ２００５０７３３６４参照）。
プロトコール１：耐性カセットの除去（ＦＲＴシステム）
次の技術に従い、クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットを除去した。クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位で作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０を、エレクトロポレーションにより前記菌株に導入した。４２℃での連続培養後に、表１に示したオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により抗生物質耐性カセットの喪失を確認した。
【０１３１】
前記菌株においてすでに構築された改変の存在を、表１に示したオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１３２】
得られた菌株を大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊、ΔｔｐｉＡ、ΔｐｆｌＡＢ、ΔａｄｈＥ、ｌｄｈＡ：：Ｋｍ、ΔｇｌｏＡ、ΔａｌｄＡ、ΔａｌｄＢ、Δｅｄｄと名付けた。
表１：耐性カセットの挿入または耐性カセットの喪失を確認するために用いられるオリゴヌクレオチド
【０１３３】
【表１】
2011515083.tif 000004
【０１３４】
１．２．改変菌株大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊、ΔｔｐｉＡ、ΔｐｆｌＡＢ、ΔａｄｈＥ、ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ、ΔｇｌｏＡ、ΔａｌｄＡ、ΔａｌｄＢ、Δｅｄｄの構築。
カナマイシン耐性カセットを除去しｌｄｈＡ遺伝子を不活性化するために、プロトコール２に従い、クロラムフェニコール耐性カセットをｌｄｈＡ遺伝子に挿入し、関連遺伝子の大部分の欠失を引き起こした。
【０１３５】
プロトコール２：組換えのためのＰＣＲ産物の導入および組換え体の選択（ＦＲＴシステム）。
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択し表２に示したオリゴヌクレオチドを用いてプラスミドｐＫＤ３のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドｐＫＤ４のカナマイシン耐性カセットのいずれかを増幅した(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))。次いで、得られたＰＣＲ産物を、プラスミドｐＫＤ４６（発現されるシステムλ  Ｒｅｄ（γ、β、ｅｘｏ）が相同組換えに非常に有利である）を有する受容菌株にエレクトロポレーションにより導入した。その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、表１に示した適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により耐性カセットの挿入を確認した。
【０１３６】
前記菌株の他の改変を、表１に示したオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１３７】
得られた菌株を大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊、ΔｌｄｈＡ：：Ｃｍ、ΔｔｐｉＡ、ΔｐｆｌＡＢ、ΔａｄｈＥ、ΔｇｌｏＡ、ΔａｌｄＡ、ΔａｌｄＢ、ΔｅｄｄまたはＰＧ００１６と名付けた。
【０１３８】
表２：ＰＣＲ産物を用いた組換えにより染色体領域を置換するために用いられるオリゴヌクレオチド
【表２】
2011515083.tif 000005
【０１３９】
２−グリオキサラーゼＩＩＩ活性アッセイ
大腸菌無細胞抽出液においてin vitroでグリオキサラーゼＩＩＩ酵素活性を決定した。遠心分離により回収したバイオマスを１００ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．６、１０％スクロース、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＰＬＰ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)中に再懸濁し、氷上で、３０秒間隔で３０秒を４サイクル超音波処理した(Branson sonifier、７０Ｗ)。遠心分離後、粗抽出液に相当する上清をＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０  ＤＧカラム(BioRad)用いて脱塩した。脱塩処理した上清のタンパク質濃度をBradfordの比色分析(Bradford, 1976)により測定した。
【０１４０】
１００μＬの脱塩処理した抽出液を、総量２５０μＬの、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８および５ｍＭメチルグリオキサールを含有する反応混合物中３７℃で５分間または３０分間インキュベートした。インキュベーション時間の経過後、次いで、−２０℃のアセトン１ｍｌを、総量１．５ｍＬ中１．５Ｍの濃度の内部標準Ｌ−セリン［１−１３Ｃ］１００μＬとともに加えた。この反応混合物を−２０℃で３０分間インキュベートし、１００００ｇで５分間遠心分離した。この上清を−８０℃で冷凍し、一晩凍結乾燥した。翌日、乾燥したサンプルを０．５ｍｌヒドロキシルアミン２０％（ピリジンで希釈）の添加によりシリル化し、３０℃で１時間３０インキュベートし、続いて、０．５ｍｌ  ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＴＢＤＭＳＴＦＡ）および０．５ｍｌのピリジンの添加を行い、６０℃で１時間のインキュベーションを行った。これらのサンプルをＧＣ−ＭＳ(Agilent GC6890-MS5973, カラム Varian DB5MS)により分析し、５分後および３０分後にグリオキサラーゼＩＩＩ酵素によって産生されたラクテートの量を、ラクテートの標準曲線（０〜３３μＭ）を利用することにより測定した。粗抽出液の全活性（ナノモル／分）を、５〜３０分の間に産生されたラクテートの量を使って計算した。タンパク質濃度を用いて比活性をナノモル／分／ｍｇ（ｍＵＩ／ｍｇ）で決定した。
【０１４１】
３−ＰＧ００１６菌株におけるグリオキサラーゼＩＩＩ活性の精製
１．４ｌ作業容積の２１バッチ発酵槽で菌株ＰＧ００１６を培養した。培養培地は、酵母抽出液を補給した１０ｇ／ｌグルコースを含む最少培地に基づいた。培養温度を３７℃で一定に維持し、ＮＨ４ＯＨ溶液を用いてｐＨを常に６．８に調整した。酸素要求量に応じて攪拌速度を調整した。ガス制御装置を使用することにより溶存酸素濃度を３０〜４０％間の値の飽和に維持する。光学濃度が値２に達したら、培養を停止し、バイオマスを遠心分離により回収した。
総てのクロマトグラフィーカラムを室温で実施した。精製ステップの間画分を−８０℃で保存した。
【０１４２】
ステップ１：無細胞抽出液の調製
３２０ｍｇのＰＧ００１６大腸菌バイオマスを４８ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．６、１０％スクロース、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＰＬＰ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル中に再懸濁した。細胞を氷上で、３０秒間隔で３０秒を４サイクル超音波処理した(Branson sonifier、７０Ｗ)。この懸濁液をＤＮアーゼＩ（１００Ｕ／ｍｌ）および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２で、攪拌下室温で３０分間処理した。細胞残屑を１２０００ｇで３０分間の遠心分離により除去した。この粗抽出液をＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０  ＤＧカラム(BioRad)用いて脱塩した。
この脱塩処理した抽出液のグリオキサラーゼＩＩＩ比活性は３３ｍＵＩ／ｍｇであった。
【０１４３】
ステップ２：硫酸アンモニウム沈殿
粗抽出液を４０％硫酸アンモニウムの濃度で沈殿させた：粗抽出液に攪拌しながら固体硫酸アンモニウム（２２６ｇ／ｌ）を加えた。室温での１５分のインキュベーション後に、このサンプルを４℃で１２０００ｇで３０分遠心分離し、このペレットを廃棄した。この上清のグリオキサラーゼＩＩＩ比活性は１０２ｍＵＩ／ｍｇであった。
【０１４４】
ステップ３：疎水性クロマトグラフィー
Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ(GE Healthcare)を使用し、４０％硫酸アンモニウム上清を、２０ｍＭ  ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．５、１０％スクロース、１ｍＭ  ＤＴＴ、１．２Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化した５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＰｈｅｎｙｌＨＰカラム(GE Healthcare)に流した。次いで、このカラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄した。２０カラム容量の１，２Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニウムの直線減少勾配を用いてタンパク質を溶出した。溶出後、このカラムを１０カラム容量の２０ｍＭ  ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．５、１０％スクロースで洗浄した。カラムの流速は２．５ｍｌ／分であり、２．５ｍｌの画分を集めた。
ＨｉＴｒａｐ  ＰｈｅｎｙｌＨＰカラムの画分をグリオキサラーゼＩＩＩ活性についてアッセイした。０．４〜０．２Ｍ間の硫酸アンモニウムでタンパク質を溶出した。最も活性の高い画分のグリオキサラーゼＩＩＩ比活性は１５０〜５４０ｍＵＩ／ｍｇ間であった。最も活性の高い画分をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％スクロースに対して透析した。
【０１４５】
ステップ４：陰イオンクロマトグラフィーｐＨ８
透析処理したプールを、２０ｍＭ  ＴｒｉｓバッファーｐＨ８、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％スクロースで平衡化した１ｍｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム(GE Healthcare)に用いた。次いで、このカラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄した。２０カラム容量の０Ｍ〜０．５ＮａＣｌの直線勾配を用いてタンパク質を溶出した。このカラムを１０カラム容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％スクロース  １Ｍ  ＮａＣｌで洗浄した。カラムの流速は１ｍｌ／分であり、０．５ｍｌの画分を集めた。Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムの画分をグリオキサラーゼＩＩＩ活性についてアッセイした。１９０ｍＭ  ＮａＣｌでタンパク質を溶出した。ゲル濾過のために最も活性の高い画分を濃縮した。この画分のグリオキサラーゼＩＩＩ比活性は１５９４ｍＵＩ／ｍｇであった。
【０１４６】
ステップ５：ゲル濾過
Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムの濃縮処理画分を、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ  カラム(GE Healthcare)に流した。カラムの流速は０．５ｍｌ／分であり、０．５ｍｌの画分を集めた。画分をグリオキサラーゼ活性についてアッセイした。１４，５ｍｌのバッファーでタンパク質を溶出した。カラムの較正によれば、この溶出量はタンパク質約６０ｋＤａに相当する。
ＳＤＳ４〜１５％勾配ポリアクリルアミドゲルに、グリオキサラーゼＩＩＩ比活性４７１８ｍＵＩ／ｍｇの最も活性の高い画分を用い流した。このゲル（図）では約３０ｋＤａに主要なバンドが見られた。
【０１４７】
表３：グリオキサラーゼＩＩＩ活性の精製の概要
【表３】
2011515083.tif 000006
【０１４８】
４−グリオキサラーゼＩＩＩ活性についてコードする遺伝子の同定
滅菌ピペットチップを使用し、３０ｋＤａのタンパク質に相当するゲルの領域を切り出した。このゲルプラグをその後質量分析によるタンパク質の同定に用いた。
サンプルをトリプシン消化に付し、ＣａｐＬＣ−Ｑ−ＴＯＦ２(Waters)でのｎａｎｏ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、そしてＭＡＬＤＩ  ＭＸ(Waters)でのＭＡＬＤＩにより分析した。大腸菌のタンパク質データバンクを利用し、ソフトウェアＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ(Waters)およびＭａｓｃｏｔ(Matrix Science)を用いて候補タンパク質を同定した。両分析では、有意なスコアを有するただ１つのタンパク質が同定された。このタンパク質は、Ｈｓｐ３１とも呼ばれる３１ｋＤａのタンパク質ＨｃｈＡであった（登録Ｐ３１６５８）。対応する遺伝子はｈｃｈＡまたはｙｅｄＵと呼ばれた。
【０１４９】
実施例２：大腸菌におけるグリオキサラーゼＩＩＩ活性の調整
１−大腸菌におけるｙｅｄＵ遺伝子の破壊およびグリオキサラーゼＩＩＩ活性喪失の確認
１．１．抗生物質耐性カセットのない菌株ＰＧ００１６の構築
プロトコール１に従い、菌株大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊、ΔｔｐｉＡ、ΔｐｆｌＡＢ、ΔａｄｈＥ、ΔｌｄｈＡ：：Ｃｍ、ΔｇｌｏＡ、ΔａｌｄＡ、ΔａｌｄＢ、Δｅｄｄ（ＰＧ００１６）においてクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。
得られた菌株大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊、ΔｔｐｉＡ、ΔｐｆｌＡＢ、ΔａｄｈＥ、ΔｌｄｈＡ、ΔｇｌｏＡ、ΔａｌｄＡ、ΔａｌｄＢ、ΔｅｄｄをＰＧ００２１と名付けた。
【０１５０】
１．２．改変菌株大腸菌ＭＧ１６５５ΔｙｅｄＵ：：Ｃｍの構築
プロトコール２に記載した技術を用い、表２に示したオリゴヌクレオチドを用いてクロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し関連遺伝子の大部分の欠失を引き起こすことにより、菌株大腸菌ＭＧ１６５５において遺伝子ｙｅｄＵを不活性化した。得られた菌株を大腸菌ＭＧ１６５５ΔｙｅｄＵ：：Ｃｍと名付けた。
【０１５１】
１．３．改変菌株ＰＧ００２１ΔｙｅｄＵ：：ｃｍの構築
菌株大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊、ΔｔｐｉＡ、ΔｐｆｌＡＢ、ΔａｄｈＥ、ΔｌｄｈＡ、ΔｇｌｏＡ、ΔａｌｄＡ、ΔａｌｄＢ、Δｅｄｄ（ＰＧ００２１）におけるクロラムフェニコール耐性カセットによる遺伝子置換による遺伝子ｙｅｄＵの欠失を、ファージＰｌを用いた形質導入技術により行った。
【０１５２】
プロトコール３：遺伝子の欠失のための、ファージＰｌを用いた形質導入
受容大腸菌菌株における耐性カセット（カナマイシンまたはクロラムフェニコール）による遺伝子置換による選択遺伝子の欠失を、ファージＰｌを用いた形質導入技術により行った。プロトコールは二段階であり、（ｉ）単一遺伝子を欠失した菌株ＭＧ１６５５でのファージ溶解液の調製および（ｉｉ）このファージ溶解液による受容菌株の形質導入。
【０１５３】
ファージ溶解液の調製
−単一遺伝子を欠失した菌株ＭＧ１６５５を１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭで一晩培養したもの１００μｌの接種。
−３７℃で３０分間振盪しながらインキュベーション。
−野生型菌株ＭＧ１６５５で調製したファージ溶解液Ｐｌの１００μｌの添加（約１ｘｌ０９ファージ／ｍｌ）。
−総ての細胞が溶解するまで３７℃で３時間振盪。
−２００μｌのクロロホルムの添加、およびボルテックス。
−細胞残屑を除くために４５００ｇで１０分間遠心分離。
−上清を滅菌した試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを添加。
−溶解液を４℃で保存。
【０１５４】
形質導入
−大腸菌受容菌株をＬＢ培地で一晩培養したもの５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離。
−細胞ペレットを２．５ｍｌのＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭに懸濁。
−対照試験管：１００μｌの細胞
１００μｌの、単一遺伝子を欠失した菌株ＭＧ１６５５のファージＰｌ。
−試験用試験管：１００μｌの細胞＋１００μｌの、単一遺伝子を欠失した菌株ＭＧ１６５５のファージＰｌ。
−３０℃で３０分間振盪せずにインキュベーション。
−各試験管に１００μｌクエン酸ナトリウム１Ｍの添加、およびボルテックス。
−１ｍｌのＬＢを添加。
−３７℃で１時間振盪しながらインキュベーション
−試験管を７０００ｒｐｍで３分間の遠心分離した後にＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌをディッシュにプレーティング。
−３７℃で一晩インキュベーション。
【０１５５】
その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、表１に示した適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により欠失の挿入を確認した。
【０１５６】
前記菌株の他の改変を、表１に示したオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１５７】
得られた菌株を大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊、ΔｌｄｈＡ、ΔｔｐｉＡ、ΔｐｆｌＡＢ、ΔａｄｈＥ、ΔｇｌｏＡ、ΔａｌｄＡ、ΔａｌｄＢ、Δｅｄｄ、ΔｙｅｄＵ：：ｃｍ（ＰＧ００２１  ΔｙｅｄＵ：：ｃｍ）と名付けた。
【０１５８】
１．４．菌株ＰＧ００２１  ΔｙｅｄＵ：：Ｃｍのバイオマス産生および活性アッセイ
菌株ＰＧ００２１  ΔｙｅｄＵ：：Ｃｍおよび対照菌株ＰＧ００２１を、５００ｍｌバッフル付エルレンマイヤーフラスコにおいて１０ｇ／ｌグルコースを含む、ＭＯＰＳで緩衝化した最少培地で好気条件下で３７℃で培養した。培養開始時にｐＨを６．８に調整した。フラスコをオービタルシェーカーにおいて２００ｒｐｍで攪拌した。５５０ｎｍで測定した培養物の光学濃度が５単位を上回った時にバイオマスを遠心分離により回収した。これまでに記載したように、無細胞抽出液を調製し、グリオキサラーゼＩＩＩ活性アッセイを実施した。
【０１５９】
親菌株ＰＧ００２１のグリオキサラーゼＩＩＩ活性は２４ｍＵＩ／ｍｇであり、一方、菌株ＰＧ００２１  ΔｙｅｄＵのグリオキサラーゼＩＩＩ活性は４ｍＵＩ／ｍｇであった。ｙｅｄＵ遺伝子の欠失は菌株ＰＧ００２１のグリオキサラーゼＩＩＩ活性をほとんど消失させた。
【０１６０】
２−大腸菌におけるｙｅｄＵ遺伝子の過剰発現およびグリオキサラーゼＩＩＩ活性増大の確認
２．１．プラスミドｐＭＥ１０１の構築
低コピーベクターのｔｒｃプロモーターの制御下でのｙｅｄＵ遺伝子の発現のためにプラスミドｐＭＥ１０１を次のように構築した。オリゴヌクレオチドＰＭＥ１０１ＦおよびＰＭＥ１０１Ｒを用いてプラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631-GenBank AX085428)をＰＣＲ増幅し、ｌａｃＩ遺伝子およびｔｒｃプロモーターを有するベクターｐＴｒｃ９９Ａ(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J)のＢｓｔＺ１７Ｉ−ＸｍｎＩ断片を、増幅したベクターに挿入した。
ＰＭＥ１０１Ｆ（配列番号２９）：
【化１】
2011515083.tif 000007
ＰＭＥ１０１Ｒ（配列番号３０）：
【化２】
2011515083.tif 000008
【０１６１】
２．２．プラスミドｐＭＥ１０１−ｙｅｄＵの構築
次のオリゴヌクレオチドを用いて大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡから遺伝子ｙｅｄＵをＰＣＲ増幅した：
ｙｅｄＵＦ２（３４塩基からなる）（配列番号３１）：
【化３】
2011515083.tif 000009
これは以下を含む:
−遺伝子ｙｅｄＵの配列（２０３３８５７−２０３３８８４）に相同な領域（下線を施した文字）、および
−制限部位ＢｓｐＨＩ（ボールド体の文字）
ｙｅｄＵＲ２（２８塩基からなる）（配列番号３２）：
【化４】
2011515083.tif 000010
これは以下を含む:
−遺伝子ｙｅｄＵの配列（２０３４８１５−２０３４７９７）に相同な領域（下線を施した文字）、および
−制限部位ＳｍａＩ（ボールド体の文字）。
【０１６２】
ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＳｍａＩで切断し、ベクターｐＭＥ１０１のＮｃｏＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＥ１０１−ｙｅｄＵと名付けた。
【０１６３】
プラスミドｐＭＥ１０１−ｙｅｄＵを菌株大腸菌ＭＧ１６５５にエレクトロポレーションにより導入した。得られた菌株を大腸菌ＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１−ｙｅｄＵ）と名付けた。
【０１６４】
２．３．菌株大腸菌ＭＧ１６５５  ｐＭＥ１０１−ｙｅｄＵのバイオマス産生および活性アッセイ
大腸菌菌株ＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１−ｙｅｄＵ）および対照菌株大腸菌ＭＧ１６５５を、５００ｍｌバッフル付エルレンマイヤーフラスコにおいて１０ｇ／ｌグルコースを含む、ＭＯＰＳで緩衝化した最少培地で好気条件下で３７℃で培養した。培養開始時にｐＨを６．８に調整し、１００μＭ  ＩＰＴＧを加えた。フラスコをオービタルシェーカーにおいて２００ｒｐｍで攪拌した。５５０ｎｍで測定した培養物の光学濃度が７単位を上回った時にバイオマスを遠心分離により回収した。これまでに記載したように、無細胞抽出液を調製し、グリオキサラーゼＩＩＩ活性アッセイを実施した。
【０１６５】
ＭＧ１６５５菌株のグリオキサラーゼＩＩＩ活性は８ｍＵＩ／ｍｇであり、一方、ｙｅｄＵを過剰発現しているＭＧ１６５５菌株のグリオキサラーゼＩＩＩ活性は１４２ｍＵＩ／ｍｇであった。グリオキサラーゼＩＩＩ活性はｙｅｄＵ遺伝子の過剰発現により１８倍増大した。
【０１６６】
３−ＹｅｄＵにより産生されたラクテートの異性体の測定
３．１．ＹｅｄＵタンパク質の精製
次のオリゴヌクレオチドを用いて大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡから遺伝子ｙｅｄＵを増幅することによりプラスミドｐＥＴＴＯＰＯ−ｙｅｄＵを構築した：
ｙｅｄＵ  ｐＥＴ  Ｆ（２９塩基からなる）（配列番号３３）
【化５】
2011515083.tif 000011
これは以下を含む:
−遺伝子ｙｅｄＵの配列（２０３３８５９−２０３３８８３）に相同な領域（イタリックボールド体の文字）、および
−ｐＥＴＴＯＰＯにおける、指向性クローニングのための領域（下線を施した文字）
ｙｅｄＵ  ｐＥＴ  Ｒ（２１塩基からなる）（配列番号３４）
【化６】
2011515083.tif 000012
これは以下を含む:
−遺伝子ｙｅｄＵの配列（２０３４６９０−２０３４６９２）に相同な、停止コドンに相当する領域（イタリックボールド体の文字）、
−遺伝子ｙｅｄＵの下流領域の配列（２０３４６９３−２０３４７１０）に相同な領域（下線を施した文字）
【０１６７】
ＰＣＲ増幅した断片を市販のベクターｐＥＴＴＯＰＯ(Invitrogen)にクローニングした。得られたプラスミドをｐＥＴＴＯＰＯ−ｙｅｄＵと名付けた。プラスミドｐＥＴＴＯＰＯ−ｙｅｄＵを市販の菌株大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ(Invitrogen)にエレクトロポレーションにより導入し、タンパク質過剰発現を最大限に高めた。得られた菌株を大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒ  ｐＥＴＴＯＰＯ−ｙｅｄＵと名付けた。
【０１６８】
大腸菌菌株ＢＬ２１  ｓｔａｒ  ＰＥＴＴＯＰＯ−ｙｅｄＵおよび対照菌株大腸菌ＢＬ２１  ｓｔａｒを、５００ｍｌバッフル付エルレンマイヤーフラスコにおいて２．５ｇ／ｌグルコースを含むＬＢ培地５０ｍｌを用いて好気条件下で３７℃で培養した。フラスコをオービタルシェーカーにおいて２００ｒｐｍで攪拌した。培養物の光学濃度（ＯＤ、５５０ｎｍで測定）が０．８ＯＤ単位に達した時に温度を２５℃に下げた。ＯＤが２．４単位に達した時に５００μＭ  ＩＰＴＧを用いて培養物を誘導した。培養物のＯＤが３．５単位を上回った時にバイオマスを遠心分離により回収した。これまでに記載したように、無細胞抽出液を調製し、グリオキサラーゼＩＩＩ活性アッセイを実施した。ＢＬ２１  ｓｔａｒ対照菌株のグリオキサラーゼＩＩＩ活性は測定できないが（定量レベルに満たない）、一方、菌株ＢＬ２１  ｓｔａｒ  ＰＥＴＴＯＰＯ−ｙｅｄＵのグリオキサラーゼＩＩＩ活性は１９２ｍＵＩ／ｍｇであった。この粗抽出液から、これまでに記載したプロトコール（実施例１参照）に従ってＹｅｄＵを精製した。１８０μｇのＹｅｄＵタンパク質を得た。これまでに記載したように、３５μｇの精製ＹｅｄＵタンパク質を用いてグリオキサラーゼＩＩＩ活性アッセイを行った。基質メチルグリオキサールと酵素ＹｅｄＵとの反応後に生成するラクテートの異性体を同定し、定量した。２つの分析法、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ＬＤＨ）またはＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ−ＬＤＨ）の存在下でのＮＡＤ＋によるＤ−ラクテートのピルベートへの酸化に基づく酵素−分光測光キット(Enzytec（商標）fluid D and L-lactic acid)、またはＤおよびＬ−ラクテートの分離を可能にするキラルカラム（Chirex(D)-Penicillamine 150x4.6mm、ガードカラムChirex(D)-Penicillamine 30x4.6mm）を用いたＨＰＬＣ法のいずれかを用いた。これらの結果を表４に示している。
【０１６９】
表４：メチルグリオキサールと精製ＹｅｄＵとの反応生成物の測定。
【表４】
2011515083.tif 000013
【０１７０】
ＧＣ  ＭＳまたは酵素キットを用いたラクテートの定量は同様であった。キラルカラムを用いてのラクテートの測定量は他の２つの技術を用いた場合よりも高かった。この相違は、様々な濃度のＤおよびＬ−ラクテートを用いずにただ１つの濃度のＤおよびＬラクテートを用いて行われた定量であることにより説明することができる。
【０１７１】
用いた方法に関係なく、ＹｅｄＵはメチグリオキサールをラセミ混合物に近いＤおよびＬ−ラクテートの混合物へと変換することができたと思われる。
【０１７２】
実施例３：ｙｅｄＵ遺伝子の欠失を有する大腸菌菌株による１，２−プロパンジオールとアセトールの産生の向上
１−改変菌株大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊  ΔｔｐｉＡ  ΔｐｆｌＡＢ  ΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｇｌｏＡ  ΔａｌｄＡ  ΔａｌｄＢ  Δｅｄｄ  ΔｙｅｄＵ：：Ｃｍの構築
この菌株の構築は実施例２にすでに記載した。
２−ｙｅｄＵ遺伝子の欠失を有する菌株および欠失のない同菌株による１，２−プロパンジオールおよびアセトールの産生
ｙｅｄＵ遺伝子の欠失を有するこれまでに構築した菌株（ΔｙｅｄＵ菌株）および欠失のない同菌株（対照菌株）を微好気条件下（２１ｍｌの培地を入れた７０ｍｌ密閉エルレンマイヤーフラスコ）で炭素源としてグルコースを含む以下に示す培地で２５時間培養した。フラスコをオービタルシェーカーにおいて２００ｒｐｍで攪拌した。
【０１７３】
表５：培地ＰＧ０１＿ＭＣ＿Ｖ０１の組成（ｐＨは６．５に調整）
【表５】
2011515083.tif 000014
【０１７４】
培養を３７℃で実施し、培養培地をＭＯＰＳで緩衝化することによりｐＨを維持した。培養終了時に、発酵培養液中の１，２−プロパンジオール、アセトール、ラクテートおよび残留グルコースをＨＰＬＣにより分析し、グルコースに対する１，２−プロパンジオール＋アセトールとラクテートの収量を計算した。これらの結果を以下の表に示す。
【０１７５】
表６：ｙｅｄＵ遺伝子を欠失した菌株および欠失のない同菌株による１，２−プロパンジオールおよびアセトール産生の比較
【表６】
2011515083.tif 000015
【０１７６】
実施例４：ｙｅｄＵ遺伝子を過剰発現している大腸菌菌株における微好気条件下でのラクテートの産生。
１−改変菌株大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊  ΔｔｐｉＡ  ΔｐｆｌＡＢ  ΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｇｌｏＡ  ΔａｌｄＡ  ΔａｌｄＢ  Δｅｄｄ  ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍ  ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｅｄＵまたはｐＭＥ１０１−ｙｅｄＵの構築
菌株大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊  ΔｔｐｉＡ  ΔｐｆｌＡＢ  ΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｇｌｏＡ  ΔａｌｄＡ  ΔａｌｄＢ  Δｅｄｄ  ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍの構築は特許出願ＷＯ  ２００８／１１６８５３においてすでに記載されている。
特許出願ＷＯ  ２００８／１１６８４８に示されている説明に従ってプラスミドｐＭＥ１０１−ＶＢ０１を構築した。
次のオリゴヌクレオチドを用いて大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡから遺伝子ｙｅｄＵをＰＣＲ増幅した：
ｙｅｄＵＦ３（３４塩基からなる）（配列番号３５）：
【化７】
2011515083.tif 000016
これは以下を含む：
−遺伝子ｙｅｄＵの配列（２０３３８５７−２０３３８８４）に相同な領域（下線を施した文字）、および
−制限部位ＢｓｐＨＩ（ボールド体の文字）
ｙｅｄＵＲ３（２４塩基からなる）（配列番号３６）：
【化８】
2011515083.tif 000017
これは以下を含む：
−遺伝子ｙｅｄＵの配列（２０３４７２７−２０３４７１５および２０３４７０８−２０３４７０４）に相同な領域（下線を施した文字）、および
−制限部位ＳｎａＢＩ（ボールド体の文字）
ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＳｎａＢＩで切断し、ベクターｐＭＥ１０１−ＶＢ０１のＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｅｄＵと名付けた。
プラスミドｐＭＥ１０１−ｙｅｄＵの構築は実施例２にすでに記載した。
プラスミドｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｅｄＵまたはｐＭＥ１０１−ｙｅｄＵを改変菌株大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊  ΔｔｐｉＡ  ΔｐｆｌＡＢ  ΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｇｌｏＡ  ΔａｌｄＡ  ΔａｌｄＢ  Δｅｄｄ  ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍに導入した。
得られた菌株をそれぞれ、大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊  ΔｔｐｉＡ  ΔｐｆｌＡＢ  ΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｇｌｏＡ  ΔａｌｄＡ  ΔａｌｄＢ  Δｅｄｄ  ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍ  ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｅｄＵ（菌株１）または大腸菌ＭＧ１６５５ｌｐｄ＊  ΔｔｐｉＡ  ΔｐｆｌＡＢ  ΔａｄｈＥ  ΔｌｄｈＡ  ΔｇｌｏＡ  ΔａｌｄＡ  ΔａｌｄＢ  Δｅｄｄ  ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍ  ｐＭＥ１０１−ｙｅｄＵ（菌株２）と名付けた。
２−ｙｅｄＵ遺伝子を過剰発現する菌株および過剰発現しない同菌株によるラクテートの産生
【０１７７】
ｙｅｄＵ遺伝子を過剰発現するこれまでに構築した菌株（菌株１および菌株２）および過剰発現しない同菌株（対照菌株）を微好気条件下（２１ｍｌの培地を入れた７０ｍｌ密閉エルレンマイヤーフラスコ）で炭素源としてグルコースを含む培地ＰＧ０１＿ＭＣ＿Ｖ０１（実施例３参照）で４６時間培養した。フラスコをオービタルシェーカーにおいて２００ｒｐｍで攪拌した。培養を３７℃で実施し、培養培地をＭＯＰＳで緩衝化することによりｐＨを維持した。ｙｅｄＵ遺伝子の発現を誘導するために、培養開始時に１００μＭ  ＩＰＴＧを用いて菌株１および菌株２の培養物を誘導した。培養終了時に、発酵培養液中のラクテートおよび残留グルコースをＨＰＬＣにより分析し、グルコースに対するラクテートの収量を計算した。これらの結果を以下の表に示す。
【０１７８】
表７：ｙｅｄＵ遺伝子を過剰発現する菌株および過剰発現しない同菌株によるラクテート産生の比較
【表７】
2011515083.tif 000018
【図１】
2011515083.tif 000019
【配列表】
2011515083000001.app
【国際調査報告】
2011515083.tif 000020
2011515083.tif 000021
2011515083.tif 000022
2011515083.tif 000023
2011515083.tif 000024