(57)【要約】  PCR等の化学又は生化学反応を行うための使用が意図される凍結乾燥組成物のための、ガラス形成剤としてのラフィノースの使用。このため、例えば、化学又は生化学反応を行うための組成物であって、該組成物は凍結乾燥の形態であり、(i)該化学又は生化学反応を行うのに必要な少なくともいくつかの化学又は生化学試薬を含む試薬のセット、(ii)ラフィノースを含む組成物を提供する。これらの組成物を含むキット及びこれらを用いる方法は、本発明の更なる態様を形成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学又は生化学反応を行うための組成物であって、前記組成物は凍結乾燥の形態であり、(i)前記化学又は生化学反応を行うのに必要な少なくとも数個の化学又は生化学試薬を含む試薬のセット、及び(ii)ラフィノースを含み、前記組成物が単量体の糖アルコールを含まない組成物。
【請求項２】
前記ラフィノースがラフィノース五水和物である請求項２記載の組成物。
【請求項３】
前記ラフィノースが、化学又は生化学反応を行うために前記組成物から再構築された最終組成物中において、2.5〜10％(m/v)の量で存在するような量で存在する請求項２又は３記載の組成物。
【請求項４】
抗酸化剤又は抗メイラード剤をさらに含む請求項２〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗酸化剤又は抗メイラード剤がスレオニンである請求項５記載の組成物。
【請求項６】
ガラス形成剤のために安定剤を更に含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記安定剤がポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルピロリジン(PVP)又は多糖から選ばれる請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記試薬のセットが蛍光試薬又は生物発光試薬を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記試薬のセット(i)が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）又は逆転写ポリメラーゼ反応（RT-PCR）を行うのに特異的に適合している試薬のセットである請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記試薬のセットが、ポリメラーゼ連鎖反応中に鋳型核酸配列に結合した際にプライマーを伸長することができるポリメラーゼを含む請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼが、Tsec等のRNA/DNA依存性ポリメラーゼである請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
(i)の混合物が、DNA配列を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応を行うのに好適な緩衝剤、プライマー及びヌクレオチドを含む請求項１０又は請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記試薬のセットが、DNA配列を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応を行うのに好適であり、前記ポリメラーゼに相溶性のあるマグネシウム及び／又はマンガン塩を更に含む請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
蛍光染料又はDNA結合剤又はリアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応の経過をモニタリングするのに有用である蛍光標識オリゴヌクレオチドから選ばれる蛍光試薬を更に含む請求項９〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記蛍光試薬が、アッセイでプローブとして作用する標識オリゴヌクレオチドであり、２つの標識を担持しており、そのうちの１つがエネルギー供与体として作用することができ、もう一方がそのエネルギーの受容体として作用することができる請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記蛍光試薬が、分子ビーコンの形態の標識オリゴヌクレオチドである請求項１４又は請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
標識プローブの対を含み、そのうちの１つは蛍光エネルギー供与体である標識を担持しており、もう１つは前記エネルギー供与体から蛍光エネルギーを受容できることができる標識を担持しており、前記プローブがPCT生産物鎖に近接近してハイブリダイズする請求項１４記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとエネルギーを交換することができるDNA二重鎖結合剤を更に含む請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
PCR反応の開始を制御することができる１つ以上の試薬を更に含む請求項９〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記試薬が抗Taq抗体である請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
遮断化合物を更に含む請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法であって、水と一緒に前記組成物の成分を一緒に混合し、生じた混合物を凍結乾燥させることを含む方法。
【請求項２３】
前記生じた混合物の濃度が、前記凍結乾燥組成物から再構築された推奨される最終組成物のそれもより低い請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれか一項記載の組成物と再水和緩衝剤を含むキット。
【請求項２５】
前記組成物がPCRを行うのに必要な塩を含有せず、前記再水和緩衝剤が前記塩を含む請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
化学又は生化学反応を行うための方法であって、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物を水和し、これを化学又は生化学反応が起こるであろう条件にさらすことを含む方法。
【請求項２７】
化学又は生化学反応を行うのに使用するための目的の凍結乾燥組成物のためのガラス形成剤として、単量体の糖アルコール（多価アルコール）なしでのラフィノースの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応等の化学又は生化学反応に用いるための試験用試薬を含む組成物及びこれらを調製するための方法に関する。
【０００２】
凍結乾燥は、材料、特に細胞及びタンパク質等の生物材料を長期保存するのに一般的に用いられる方法である。しかし、タンパク質をはじめとする多くの材料は、このプロセスにおいて不安定である。この問題は、スクロース、マルトース、トレハロース及びラクトース等の二糖類を凍結乾燥用の製剤に加えることにより、ある程度取り組まれている。これらの糖類はガラス形成剤として作用し、また凍結乾燥プロセス中でタンパク質を保護するように思われる。これは安定化効果に必須である水素結合を通したタンパク質と二糖類の直接的な相互作用によるものであると示され、これにより凍結乾燥プロセス中のタンパク質の構造変化を防ぐ。
【０００３】
これは今日において、凍結乾燥が特に保存の目的において、酵素及び細胞等のタンパク質を含む複雑な反応系を安定化させるために用いることができることを意味する。しかし、一般的には、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルピロリドン（PVP）等の高分子化合物及び/又はフィコール又はデキストラン等の多糖類等のポリマー等の更なる安定剤が、酵素活性を維持するのに用いられている。これらのポリマーは通常、均一なケーキ構造の形成を助長するのに用いられるケーキ安定化賦形剤である。これは、昇華中に水が効率的に除去できるように均一なマトリックスが形成することにより、乾燥プロセスに役立つ。このため、これらは最終的なケーキ構造に影響する。
【０００４】
例えば化学又は生化学反応において、一緒に通常用いられる試薬の凍結乾燥混合物の調製において更なる問題が発生する。例えば、広く用いられているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を含む）において、塩化マグネシウム（MgCl2）及び塩化カリウム等の塩、Taqポリメラーゼ等のポリメラーゼ酵素、トリス塩酸等の緩衝剤、核酸の増幅に必要なヌクレオチド等の様々な標準的な試薬が利用される。これらの調製品は、例えばAmersham BioSciences (UK)/Pharmaciaの「ready-to-go PCR beads」として市販されている。
【０００５】
一般的にこれらは、形成される構造のためにガラス形成剤及び安定剤並びに随意に増量剤の存在中で行われる凍結乾燥法により調製される（例えば、米国特許第5,250,429号、米国特許第5,763,157号及びEP-0726310を参照）。特にトレハロースが安定化を助長するためにPCR混合物に用いられ、またPCRエンハンサーとして非凍結乾燥処方にも用いられている。しかし、これらの反応混合物中のガラス形成剤及び安定剤として用いられる試薬を選ぶにあたって、組成物が参加することを要する化学又は生化学反応を阻害又は過度に抑制しないことを確かめるために、注意する必要がある。
【０００６】
しかし、このようなビーズは、必要とされる時に、研究所に所望のPCR反応を行うのに便利ですぐに利用できる手段を提供する。一般的に、例えばリアルタイムPCRに関する使用に必要とされるプライマーや任意のプローブ等の、特定の標的にPCRを調整する特定の試薬は、コアビーズに加えて反応が調整される「その場で（on site）」添加される。
【０００７】
しかし、多くの場合、特に診断の領域において標的が同じである場合が多く、このためビーズがアッセイに特異的になるようにビーズにプローブとプライマーを含有することが各使用簡略化するのに望ましい。
【０００８】
このように更なる反応成分を添加することによって、安定した形で維持されることを要する成分が増えるので、安定性の問題が増加する。アッセイの本質がより複雑になるにつれ、ガラス形成剤及び安定剤等の反応中の他の成分が反応を阻害又は抑制するリスクが高くなる。
【０００９】
更に、更なる反応成分は、標識及び特に蛍光標識又は染料等の光標識等の比較的高感度である化学的部分を含み得る試薬を含んでいる場合がある。これらは特に、「リアルタイム」のアッセイを行うのに用いられる。高感度部分は、多くの場合、プローブ又は標識されたプライマーとして作用するように設計され得るオリゴヌクレオチドに付加される。これらは、PCRの間において増幅された核酸にハイブリダイズする。一連のPCRの間のプローブの運命及び前記標識からの関連したシグナルの変化は、PCRの進行をモニタリングするのに様々な用途で用いられる。
【００１０】
しかし、このような部分の存在は、組成物の安定化添加物が特に蛍光標識からのシグナル機能を軽減又は抑制し得ることから、組成物の形態に関連した問題を悪化し得る。
【００１１】
以前はラフィノースが細胞又はタンパク質並びに医薬調製品の凍結乾燥の際にガラス形成剤として用いられていたが(Kajuwara他 Pharmaceutical Research VoI 16, 9 1999）、今まで複雑な化学又は生化学反応混合物の凍結乾燥には用いられていなかった。このような混合物において、上記したように、ガラス形成剤を含む全ての成分は、安定で長持ちする乾燥組成物を生成し、いかなる有害な方法で続く化学反応を抑制又は参加しないように、慎重に選ばなくてはならない。WO2006/119280において、凍結保護物質を含む、PCR等の反応に用いるための凍結乾燥ペレットが記載されている。提供される例はマンニトール又はソルビトールであることから、任意のポリオールではなく糖アルコールに時々言及しているという意味で、この内容では用いられているように思われる1つ以上の多価アルコールとラフィノースの混合物を含む、様々な凍結保護物質がこの参照文献に列挙されている。
【００１２】
出願人は、蛍光標識を利用するものも含む化学又は生化学反応を行うための、改善した凍結乾燥組成物を提供する手段を見出した。
【００１３】
本発明によれば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）又逆転写（RT）PCR 等の化学又は生化学反応を行うための使用を目的とした凍結乾燥組成物のためのガラス形成剤として、ラフィノースの使用を提供する。本出願人は、ラフィノースがこれらの組成物のために効果的なガラス形成剤及び安定剤として作用すること、PCR等の化学又は生化学反応に適合することを見出した。ラフィノースは好適には、単量体多価アルコール又はマンニトール又はソルビトール等の糖アルコールと混合させず、両方とも本発明の組成物に必要とされるこれらの追加の化合物ではない。このようにして用いられる場合、ラフィノースは、複雑な「リアルタイム」PCR反応の場合でも、反応を抑制しない。この結果、更なる安定剤の使用を回避することができ、蛍光シグナル系の抑制が軽減される。
【００１４】
このため、本発明は化学又は生化学反応を行うための組成物を提供し、前記組成物は凍結乾燥した形であり、(i)少なくとも前記化学又は生化学反応を行うのに必要ないくつかの化学又は生化学試薬を含む試薬のセット及び(ii)ラフィノースを含む。
【００１５】
ラフィノース（ラフィノース五水和物の形態であり得る）は、化学又は生化学反応に適合する効果的なガラス形成剤として作用する。好適な凍結乾燥組成物は、シグナル又は表示手段として蛍光標識又は部分を利用する化学又は生化学反応に用いられるものを含む。
【００１６】
更に、ラフィノースはトレハロース等の従来の糖よりも、より安定しているケーキを生成することが見出された。これは、乾燥剤としても作用可能であるという事実によるものかもしれない。凍結乾燥ラフィノース組成物によって得られたケーキは、トレハロース含有組成物に比べ、より良い構造及び取扱特性を有し得る。いくつかの場合において、以下に説明するように、ラフィノースで得られる結果はトレハロース含有組成物で得られるものよりも優れている。
【００１７】
ラフィノースは、組成物中にガラス形成量存在してなければならない。しかし、化学又は生化学反応に使用するための「最終組成物」を生成するために水を加えることによって組成物の再形成をする際に、反応を抑制又は他の形で制限してしまう量が存在していることになるため、そのような顕著な量は存在すべきでない。組成物中に好適に存在する量として、化学又は生化学反応を行うのに作られる際、最終反応組成物中、約l〜10%m/v又l〜10%w/w、例えば2.5〜10%m/v又は2.5〜10%w/w及び好適には約5%m/v又は5%w/wを表す。以下により詳細に論じるように、乾燥するために調製された組成物（即ち、「ケーキ組成物」）は、好適にはより希薄でもよく、よって最初に調製された組成物中のラフィノースの重量パーセント（容量による）が対応して低くなってもよい。以下に提供される実施例において、処方はここの試薬の容量の列挙として示される（所与の濃度又は特異的活性）。容量が「ケーキ容量」として言及される場合、これは凍結乾燥プロセスにおいて用いられた試薬の容量を表す。容量が反応又は最終容量として言及される場合、これはPCR/RT-PCR反応における試薬の容量又は濃度である。
【００１８】
しかし、出願人は10%m/v又は10%w/wで存在している場合でも、ラフィノースがリアルタイムPCRアッセイを抑制しないことを見出した。
【００１９】
本発明により調製された組成物は、良好な安定性及びケーキ形成特性を有する。PCR及び特にリアルタイムPCR等の複雑な反応は、蛍光シグナルが発生しても顕著に抑制されない。
【００２０】
組成物は好適には、更に抗酸化剤及び／又は抗メイラード試薬を含む。出願人は、スレオニンが特に効果的な抗酸化剤及び／又は抗メイラード剤として作用し、凍結乾燥組成物の安定性を高めることを見出した。特に、L-スレオニンが用いられる。理論にとらわれることなく、スレオニンは生成されたいかなる酸素とも反応するように思われ、これにより混合物の安定化を助ける。
【００２１】
更に、特に高い温度で保存された場合、スレオニンの存在が組成物に含まれる蛍光標識から達することのできるシグナル形成を安定化できることが見出された。
【００２２】
組成物中のスレオニンの量は、組成物の正確な性質に依存して変化する。それはいくつかの化学又は生化学反応で重要になり得る組成物のpHに影響しないように、好適に選ばれる。しかし、典型的には、2〜10mMの量、例えば約2.5mMで組成物中に存在し得る。
【００２３】
ガラス形成試薬の存在下で組成物が凍結乾燥された場合、一般的に「ケーキ」型3次元構造を形成する。この構造は、ケーキ構造のための好適な安定剤を含むことにより随意に支持され、このためこれは混合物の更なる成分である。
【００２４】
組成物に含まれ得る好適な安定剤の例として、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルピロリジン（PVP）等の高分子化合物及び／又はフィコールもしくはデキストラン等の多糖類が挙げられる。しかし、特定の実施形態において、PEG等の化合物が蛍光シグナルの抑制に寄与し得ることが見出されたことから、安定剤が組成物から省略される。ラフィノースがガラス形成剤として使用された場合、出願人はこのような化合物の必要性が軽減されることを見出した。
【００２５】
いくつかの場合においても、ゼラチンがケーキに安定性を与えるために用いられてもよい。ゼラチンは牛科（乳牛等）、豚（ブタ等）、海藻（カラギーナン）又は魚ゼラチンを含む様々な源から得られ得る。（用いられる任意の牛物質は好適に保証されたBSEなしの源からである）。特に魚ゼラチンは、好ましいゼラチン成分であり得る。
【００２６】
生じる化学又は生化学反応の特定の本質に依存して、上記の試薬のセット(i)が選ばれる。これらは、診断検査、スクリーニング検査、核酸増幅反応、核酸配列決定反応等の複数回又は反復して行われる反応を含んでもよい。
【００２７】
組成物は、蛍光団又は蛍光部分あるいはルシフェラーゼ及びルシフェリン等の生物発光試薬が用いられるもの、特に方法を達成するのに酵素の使用に依存するものを含む任意のアッセイ又は反応の使用に好適であり得る。このようなアッセイの特定のグループは核酸配列決定反応及び核酸増幅反応である（ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR)、鎖置換増幅（SDA）、転写媒介性増幅（TMA）、ループ媒介性等温増幅（LAMP）、ローリングサークルDNA増幅、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（MLPA）及び多重置換増幅を含む）。
【００２８】
好適な蛍光試薬には、蛍光染料又はSYBR（登録商標）Green I、SYBR（登録商標）Gold、臭化エチジウム、YOPRO-I、SYTO 9等の緑染料及びSYTO（登録商標）17、SYTO（登録商標）59、SYTO（登録商標）60、SYTO（登録商標）61、SYTO（登録商標）62、SYTO（登録商標）63及びSYTO（登録商標）64等の赤SYTO染料を含むSYTO染料等の挿入剤が含まれる。
【００２９】
これらはプローブ又はプライマーとして作用するオリゴヌクレオチドを含んでもよく、蛍光標識によって標識される。好適な標識は、フルオレセイン又はフルオレセイン誘導体、例えば5-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセイン又はこれらのサクシニミジルエステル等のカルボキシフルオレセイン化合物、シアニン染料又はローダミン染料等を含む。このような染料の特定の例として、フルオレセイン、JOE、FAM、HEX、TET、TAMRA、ROX Cy5、Cy3、Cy5.5、BoDIPY FL、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、オレゴングリーン488、500又は514、テキサスレッド、ライトサイクラーレッド610、640、670又は705が挙げられる。ほかのこのような染料には、IDT染料 MAX550、TEX615、TYE563、TYE665及びTYE705が含まれる。 
【００３０】
ダーククエンチャーも存在していてもよい。これらは一般的にアッセイ系に用いられ、検出できるシグナルを自身で放出することなく蛍光シグナルを変化させる。これらは本質的に、特にアゾ染料（DABCYL又はDABSYL染料及びこれらの構造類似体等）、マラカイトグリーン又はフェノールレッド等のトリアリルメタン染料、4',5-ジエーテル置換フルオレセイン（例えば米国特許第4,318,846号に記載されているもの、非対称シアニン染料消光剤（例えばWO99/37717に記載されているもの、各内容は本願明細書に参照により引用されたものとする）及びメチルレッドを含む非蛍光染料である。
【００３１】
特に、消光部分は、オリゴヌクレオチドのアミノ酸に対する部分の結合を促進するハロゲン化物又はアミド誘導体等のDABCYL（4-（ジメチルアミノアゾ）ベンゼン-4-カルボン酸）又はその誘導体である。
【００３２】
他の態様において、消光部分は本質的に、芳香族又はヘテロ芳香族環系によって１つ以上のアミノ窒素原子のところで置換されている3-及び/又は6-アミノキサンテンの非蛍光誘導体である（例えば、米国特許第6,399,392号に記載されているもの、その内容は本願明細書に参照により引用されたものとする）。これらの消光染料は、典型的に、530nm超の最大吸収を有し、ほとんど又は全く観察できる蛍光を有せず、化学発光体（chemilumiphore）、リン光体または蛍光団等によって放出された発光放出の広域スペクトルを効率的に消光する。一の実施形態において、消光染料は置換ローダミンである。他の実施形態において、消光化合物は置換ロードル（rhodol）である。
【００３３】
特定の実施形態において、試薬のセットは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うのに特化した試薬のセットである。この場合、項目(i)は、ポリメラーゼ連鎖反応中に鋳型核酸配列に結合した際に、プライマーを伸長することのできるポリメラーゼを一般的に含む。鋳型核酸はDNA、RT-PCRの場合はRNA配列であってもよい。
【００３４】
プライマー伸長を行うことのできるポリメラーゼには、いくつかのタイプがある；
１．DNA依存性DNAポリメラーゼはDNAを鋳型として利用して、相補的DNAを生成する。
Taq (サーマス・アクアチクスより)は一例であり、これは熱安定性pol酵素である。これの通常の機能は、細胞（細菌）DNAの壊れた部分及びミスマッチを修復することにある。
２．RNA依存性DNAポリメラーゼはRNAを鋳型として利用して、逆転写（RT）という方法で相補的DNAを生成する。MMULV及びAMVはこれら酵素の例である。一般的に知られているRNA依存性DNAポリメラーゼは、一般的に非熱安定性である。Taq等のいくつかのDNA依存性DNAポリメラーゼは、ごく少量のRNA依存性DNAポリメラーゼを呈するが、極めて低く、このため任意の現在の知られている用途には少ししか用いられていない。
３．RNA/DNA依存性DNAポリメラーゼは、特定の条件下でDNA及び/又はRNAを鋳型としてプライマー伸長反応に用いてDNAを生成する酵素である。Tth（サーマス・サーモフィルス  Thermus thermophilusより）は熱安定性でもあるこのタイプの酵素の一般的な例であり、Genesys UK Limitedから入手できるTsec酵素等の他のものもある。これらRNAポリメラーゼの活性のほとんどの重要な必要条件は、二価金属イオンとしてマグネシウムではなくマンガンの存在である（他のほとんどの酵素に用いられているように）。
【００３５】
任意の上述したポリメラーゼのタイプ又はこれら組み合わせは、本発明の組成物に用いられてもよく、選択は組成物の意図する目的をもとにして行われる。
【００３６】
逆転写PCR（RT-PCR）は、PCRサイクルにおいて急激に増幅される前にRNAが最初にDNAに変換される方法である。これは３つの異なる反応の状況において行われる：
１．RNA依存性DNAポリメラーゼ又はRNA/DNA依存性DNAポリメラーゼが最初の反応に利用される二段階RT-PCR。この反応は、特異的なプライマー、ランダムプライマー又は更にポリdTを用いて、ポリアデニル化細胞情報を増幅することにより準備されてもよい。そして、アリコートが、指数的増幅のために別々のPCR反応に移される。
２．二段階「結合」RT-PCRは、RNA依存性DNAポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼと同じ反応槽で混ぜ合わさる。特異的なプライマーが用いられるが、方法は実際には２つの分離した方法である（RNA及びDNA増幅に対して）。RNAがDNAに変換される最初の反応完了後、温度循環のPCR段階での最初の高温段階中、非熱安定性RNA依存性DNAポリメラーゼが変性される。
３．一段階RT-PCTは、方法の両方の段階が同じ反応槽で付随して起こるようにDNA/RNA依存性DNAポリメラーゼを用いる。PCRを通して、RNA及びDNAはプライマー伸長の全ての段階において生成されてもよい。これにより、単一の熱安定性酵素が方法を通して用いられるという利点が加わる。このため、増幅段階全体の生産及び自動化のための処方の簡易化診断において、これは度々好ましいアプローチである。
【００３７】
しかし、マグネシウムをマンガンにより置換し十分なRT活性を刺激するため、一段階RT-PCRは技術的に通常のPCRよりも難しい。これには、最適な反応を見つけることをより難しくする以下の効果がある：
１．マグネシウムはDNA結合動力学に影響する。ワトソン・クリックB-DNA二重らせん構造中で電荷斥力を減少させることにより、DNA二重鎖形成を助長する。最適PCRのマンガンの濃度範囲は、DNA結合を優先するものよりかなり低い。
２．高濃度のマンガンはDNApol活性が間違えてヌクレオチドを組み込む原因となり、これにより、PCRの忠実度がプライマー及び鋳型結合を優先する濃度で減少する可能性がある。
３．マンガンは、トリス緩衝剤（他の全てのタイプのPCR緩衝剤に使用される）がビシン（bicine)緩衝剤に置換されることを要する。
【００３８】
上記要因の組み合わせは、所与の一段階RT-PCR法の複雑さと最適化方法を増加させる。化学は、処方と動力学の両方において、通常のPCR及び二段階RT-PCR法とはっきりと異なる。多くのグループが、化学を克服し統合するために、これらの難点を克服しようと試みた。例えば、米国特許第7179590号において、ポリメラーゼRT活性がマグネシウムイオンによって刺激されることを可能にするTthポリメラーゼにおける新規変異の適用が記載されている。
【００３９】
組成物がRT-PCRを目的とする特定の実施形態において、用いられるポリメラーゼはTsec（GeneSys Ltd, UK）RNA/DNA依存性DNAポリメラーゼである。以下の実施例７で説明するように、ラフィノースを用いて、本発明の組成物中に環境的に安定な形で凍結乾燥されてもよい。
【００４０】
上記項目(i)の試薬のセットは好適に、緩衝剤、塩（マグネシウム及び/又はマンガン塩、上記概略されたポリメラーゼの要件に依存する）、標的DNA配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応を発生するのに要するプライマーの伸長を構築するために必要な1つ以上のプライマー及びヌクレオチドを更に含む。典型的なPCRにおいて、用いられる緩衝剤は一般的に、pHが7〜9、例えば8.5〜8.8、例えば8.0〜8.8のものである。しかし、特にこれらの要素が後から周到に加えることができる場合、例えば使用の準備ができている乾燥組成物をもどすのに用いられる再水和緩衝剤において、1つ以上のこれらの要素が失われていてもよいことが可能である。特に、必要な塩はこのように添加されてもよく、このため(i)の試薬のセットは塩を省略してもよい。これが行われた場合、組成物は、必要な塩添加物を含む、再水和緩衝剤付きのキットの形で供給されてもよい。
【００４１】
また、マグネシウム等の塩は存在していてもよいが、反応で用いられるのに必要とされるものよりも低い濃度で、例えば500μM未満の濃度で組成物に含まれていてもよい。WO2006/003439で記載されているように、このような少量のマグネシウム塩は実際には組成物の安定性に有益である。
【００４２】
組成物は更に、リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応の経過をモニタリングするのに有用な蛍光標識オリゴヌクレオチド等の標識オリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。本願明細書に用いられるとき、表現「リアルタイム」とは、ポリメラーゼ連鎖反応を進行させながら、中止させず又は開けることなくポリメラーゼ連鎖反応をモニタリングできることを意味する。増幅がどのようにして起こるのかを、特に単位複製配列においてどのサイクルで指数関数的な増加が顕著になるのかをモニタリングすることがが重要になり、当該技術分野においてよく知られて及び理解されているように、PCRにかけられたサンプル中に存在する標的核酸の量を定量化することができる。
【００４３】
組成物に含まれる様々な成分の量は、特定の成分の正確な本質、実施されるべきPCRの性質等の要因に依存して変化する。しかし、当該技術分野で理解されているように確立されたプロトコル及び方法を用いて、各場合においてこれは決定できる。
【００４４】
好適な標識オリゴヌクレオチドは、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応をモニタリングするのに用いることのできる任意の標識プローブ又は標識プライマーである。これにより、特定の実施形態において、これらは増幅された核酸配列とハイブリダイズでき、標識、特にPCRの経過に従って変化するシグナルを提供する蛍光標識等の光標識を担持するプローブを含み得る。
【００４５】
このため、Taqman（登録商標）アッセイに利用が意図されるプローブは、例えば、2つの標識を担持するプローブを一般的に含み、そのうち１つはエネルギー、特に蛍光エネルギーの供与体として作用することができ、もう一方はそのエネルギーの受容体又は「消光剤」として作用することができる。プローブが未変化のまま、これらの標識はエネルギーの相互作用が発生するように互いに近接近して保持される。蛍光標識の場合、これは蛍光エネルギー移動（FET）又は蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）として知られている。
【００４６】
プローブは、鋳型核酸の一方の鎖上の特異的領域に結合するように設計されている。この鎖に対するPCRプライマーのアニーリングの次に、Taq酵素はDNAを5'から3’ポリメラーゼ活性により伸長する。Taw酵素は5'から3'エキソヌクレアーゼ活性をも呈する。Taqman（登録商標）プローブは3'末端でリン酸化により保護され、Taq伸長の開始を防止している。Taqman（登録商標）プローブが生成鎖とハイブリダイズした場合、伸長しているTaw分子がプローブを加水分解してしまい、受容体から供与体を遊離することになる。これは供与体と受容体の相互作用が壊れたことを意味し、これにより各シグナルが変化し、この変化を検出の基礎として用いることができる。この例でシグナルは累積的であり、増幅反応の各サイクルが重ねられるにつれて遊離状態の供与体と受容体分子の濃度が増加してゆく。
【００４７】
ハイブリダイゼーションプローブは様々な形態で入手可能であり、組成物に含まれていてもよい。分子ビーコンは、ヘアピンループを形成する相補的5'及び3'配列を有するオリゴヌクレオチドである。２つの末端蛍光標識は、ヘアピン構造が形成された際にFRETが発生するようにごく接近している。相補的配列に対する分子指標のハイブリダイゼーションの後、蛍光標識が分離し、FRETが解除され、これによりポリメラーゼ連鎖反応中の検出の基礎を形成する。
【００４８】
対となる標識オリゴヌクレオチドも、ポリメラーゼ連鎖反応の検出においてプローブとして用いてよい。これらはPCR生成鎖を持ってくる供与体と受容体分子と一緒にごく接近してハイブリダイズし、FRETが起こる。FRETの亢進が検出の基礎である。この種類の方法は、例えばヨーロッパ特許出願第0912760号に記載されており、この全内容は参照により本願明細書に引用したものとする。この種類の変形には、単一の隣接したプローブと共に標識した増幅プライマーを用いることが含まれる。
【００４９】
WO99/28500（この全内容は参照により本願明細書に引用したものとする）において、サンプル中の標的核酸配列の存在を検出する特に成功したアッセイが記載されている。この方法において、DNA二重結合剤及び該標的配列に特異的なプローブがサンプルに添加される。プローブは、該DNA二重結合剤から蛍光を吸収することができる又は蛍光エネルギーを供与することができる反応分子を含む。そして、この混合物は標的核酸が増幅される増幅反応に施され、続いてプローブが標的配列にハイブリダイズする増幅プロセス中又はその後に条件が誘導される。該サンプルからの蛍光がモニタリングされる。
【００５０】
「Resonsense(商標)」として知られている、このアッセイの使用に適した組成物も調製されてもよい。この例において、組成物は好適に挿入染料等のDNA二重結合剤を更に含む。
【００５１】
可視光を放出しないがプローブ上の蛍光標識から蛍光エネルギーを吸収するDNA二重結合剤を利用する、このアッセイの代替的形態がWO2004/033726に記載されており、その全内容を参照により本願明細書に引用したものとする。
【００５２】
一般的に、この種類のアッセイに用いられる全てのプローブは、3'末端の伸長で例えばリン酸化により又は標識を3'ヒドロキシル基に直接結合させることにより阻害される。これにより、プローブが第2のプライマーとして作用し、PCR中に伸長されることを防止し、干渉生産物を除外する。あるいは、1つの標識は、標識が立体的に伸長を化学的に阻害されるよりも酵素で阻害するように位置し、及び／又は3'塩基又はプローブは、伸長の効率性が当該技術分野でよく理解されているように劇的に低減するようにミスマッチを含んでいてもよい。
【００５３】
任意の特定の組成物に利用されるプローブの量は、PCR中に消費又は加水分解されるか否か、及びシグナル系の本質等の要因に依存して変化する。これらは、当業者に理解されよう。しかし、一般的に、組成物に添加されるプローブ又は各プローブの量は、最終組成物中のプローブの濃度が0.05μM〜1μM、例えば約0.2μMであることを確保するのに十分であるだろう。
【００５４】
他のリアルタイムアッセイは、モニタリングシステムを提供するために標識プライマーを利用する。いくつかのこれらのプライマーは、自己探索「尾部」を含んでもよく、「サソリ」プライマーとして知られている。標識プローブは、化学的リンカー又はヘキサエチレングリコール等の非増幅単量体であり、オリゴヌクレオチドのプローブ領域を増幅する伸長反応を防止する「阻害基」を介して、反応に対してプライマーとして機能するDNA配列に連結する。この一般的な種類のプローブ／プライマーの組み合わせは「サソリ（Scorpion）」としてよく知られており、これらは例えばWO99/66071に記載されている。サソリはその長さに沿って、上記のようにFRETシグナルが可能なように、供与体／消光剤対を含む。
【００５５】
LUX（商標）（light upon extension; 伸長の際に光る）蛍光プライマーと呼ばれるリアルタイムプローブの更なる種類も利用可能である。これらは「ヘアピン」様プローブであり、上述した分子ビーコンに似ている。しかし、LUXプライマーは溶液中でステムループ構造を採用し、サソリプローブと同様に、LUXプライマーはPCRプライマーとして使用する目的がある。配列内容に基づいて自己消光するように設計された蛍光オリゴヌクレオチドであるため、これらは消光部分を含有しない。LUXプライマーは溶液中で遊離状態である時に消光しており、変性した場合に弱く発光し、DNAに組み込まれた場合に強く光を放出する。これらも本発明の組成物に含まれていてもよい。
【００５６】
試薬のセット(i)に含まれているポリメラーゼは、所望の「リアルタイム」アッセイを行うのに有用なように、選ばれる。このため、検出できるシグナルを発するのにプローブの加水分解が必須であるTaqman（登録商標）等のアッセイにおいて、高レベルの5'‐3'エキソヌクレアーゼ活性が好適に用いられ、一方、プローブハイブリダイゼーションが用いられるResonsense（商標）等のアッセイでは、このような活性は低い又はない。ポリメラーゼは好適に、ポリメラーゼ連鎖反応を行うのに必要な高温度で作用し耐える熱安定性ポリメラーゼである。添加するポリメラーゼの量は、当該技術分野で理解されるように、PCR反応を生じるのに十分であるべきである。典型的に、添加するポリメラーゼの量は0.02〜1.0U/μl反応組成物、典型的には約0.025U/μlの最終濃度を提供するのに十分である。
【００５７】
好適には、反応組成物は、時期尚早にポリメラーゼ連鎖反応が始まらないことを確保するために用いられる試薬を更に含んでいてもよい。様々な方法により、「ホットスタート」と呼ばれるPCRを達成し得る。
【００５８】
成功するPCRは、非常な正確な順番で、そのステップの操作に必要とされる正確な温度で起きる変性、アニーリング及び伸長のステップの順番に依存することから、「ホットスタート」PCRが対象とする問題が生じる。例えば反応を始める前に、異なる温度で短い時間でさえも試薬が一緒に混合されるとき、問題が生じる。プライマーが核酸鋳型と相互作用し得るため、鋳型のプライマー伸長が生じる。これにより、所望する全収率が減少し、非特異的生成物の生産につながる。
【００５９】
問題を克服するための最初の試みにおいて、試験管において様々なPCR試薬を互いに分離するためのワックスバリアが用いられた（例えば、USP5,565,339を参照）。ワックスは、反応混合物が初期変性温度まで熱せられると共に融解することにより、ぎりぎり最後の一瞬で試薬が一緒に混合され、副反応の可能性が最低限に抑えられ、これが表現「ホットスタート」を生じさせた。
【００６０】
副反応の抑制を達成するための他の化学的方法の試みがなされている。例えば、米国特許第5,677,152において、DNAポリメラーゼが化学的に修飾され、高温においてのみ活性化するように確認された方法が記載されている。この方法を実施するには、適切に修飾されたDNAポリメラーゼを上記項目(i)に含むことだけが必要である。
【００６１】
他の実施形態において、Clontech, Sigma & Invitrogenより入手可能な抗Taq DNAポリメラーゼ抗体等の、サーマス・アクアチクス（Taq）DNAポリメラーゼに対するモノクローナル抗体が組成物に含まれる。抗体は酵素活性部位に結合して、周囲温度において不活性化する。しかし、増幅サイクルにおいて用いられる高温において、抗体が変性し、酵素から解離するため、酵素が活性化する。
【００６２】
組成物に含まれる任意の抗Taq抗体の相対量は、好適にはそれが必要な程度にTaq酵素を阻害する機能を達成できるようにするのに十分である。一般的に、このため、Taq酵素と比較して、過剰量の抗Taq抗体が用いられるであろう。このため、例えば、組成物中のTaq酵素の各単位につき、少なくとも1.5、好ましくは少なくとも2単位の抗Taq抗体が含まれるであろう。Taq抗体は、通常、μgで売られており、濃度は原料、抗体の質及びアッセイの本質に非常に依存する。過多の抗体は不利になり、いくつかのアッセイにおいて実際により多くのプライマー二量体の原因となり得る。しかし、Taq抗体の正確な量は通常の慣習に従って決定され、典型的に0.001〜0.004μg/μl最終反応混合物の範囲であろう。
【００６３】
WO02/088387において、生じるプライマー伸長を防止するためのピロリン酸塩の阻害量の組み合わせの使用に関与する更に他のホットスタート方法、及びPCRを進ませるために高温でピロリン酸塩を消化するピロホスファターゼ酵素が記載されており、その全内容は参照により本願明細書に引用したものとする。
【００６４】
この場合、ピロリン酸塩及びピロホスファターゼ酵素が本発明の組成物の更なる成分として含まれていてもよい。
【００６５】
随意の安定剤の使用及び的確な選択は、ある程度、最終組成物を用いて行われる目的の特定のアッセイに依存し、これは常法を用いて試験することができる。例えば、デキストランは、組成物がDNA二重結合剤及び目的の標識プローブを含み、上記のReasonSense（商標）アッセイを行うのに用いられる意図がある場合、あまり好ましくない。しかし、PEGは、これら組成物の多くに耐えうる安定剤である。安定剤が用いられる場合、最終組成物において約l〜3%m/v又はl〜3%w/wを表すような量で好適に添加される。
【００６６】
上述したように、項目(i)の試薬のセットは、PCR反応混合物の調整のために一般的に理解される量の緩衝剤、プライマー、ヌクレオチド及びに随意に塩等の成分を含んでもよい。プライマーは好適に過剰に存在し、これは典型的に、最終反応組成物の各プライマーの濃度が0.1μM〜1μMであることを確保するのに十分なプライマーを含むことによって達成される。しかし、より詳細に後述するように、乾燥するためのケーキ組成物として調製された組成物は、好適にはより薄く、これによりそれら組成物中のプライマーのモル濃度（及び確かに他の全ての試薬）は対応して低くなるであろう。
【００６７】
特定の実施形態において、PCR反応混合物において標準である遮断化合物を組成物に含んでもよい。遮断化合物は、槽壁との相互作用によりPCRの阻害を防ぐことにより、例えば金属の浸出を防ぐことにより又は反応中に壁から浸出し得る任意の金属を隔離することにより機能すると考えられている。これは、反応槽壁に対する酵素とヌクレオチドの除去を低減し得る。遮断化合物の本質は、反応が行われるべきことを目的とする槽の本質に依存するだろう。
【００６８】
遮断化合物の特定の例として、単独又はゼラチン等の他の遮断物質との組み合わせたウシ血清アルブミン（BSA）等のガラス被覆又はガラス遮断化合物が挙げられる。上述したように、ゼラチンはウシ、ブタ、海藻（カラゲナン）又は魚ゼラチンを含む様々な原料から得ることができる。
【００６９】
遮断薬は、特定の選ばれた化合物に依存した有効量で好適に含まれる。しかし、例えばBSAの場合、その量は、最終反応組成物において0.1〜1mg/ml、好ましくは約0.25mg/mlで提供するのに好適に十分である（即ち、組成物は化学又は生化学反応を行うようにできている）。ゼラチンは約0.0025%〜0.01%m/v又は約0.0025%-0.01%w/wの範囲の量で好適に存在するだろう。最終反応を著しく抑制するように、遮断薬の量が十分に高くならないように気をつけるべきである。
【００７０】
PCRの技術分野において理解されるように、更なる成分が組成物に含まれていてもよい。これらには、内部標準として用いられる配列、これらの配列を増幅するためのプライマー並びに内部標準配列の増幅を検出するための上記に概説されたシグナル系を含んでもよい。
【００７１】
本発明の組成物は、組成物を形成するために上述した必要とされる成分を混合して、続いて水、好ましくはピロ炭酸ジエチル（DEPC）で処理された滅菌水を組成物に加えて混合するために、例えば少なくとも等量、好ましくは最終組成物の1〜1.5倍の量を加えることにより、好適に調製される。特に、この段階で形成されたケーキ混合物の量は、化学又は生化学反応自体での使用のために形成される目的のものよりも希釈されている。特に、組成物又はPCR等の化学又は生化学反応を行うための十分な物質を含有する各アリコートの量が、PCRを行う目的で最終反応組成物の推奨される量の1.5〜5倍、好適には2倍であることを確保するために、十分な水が加えられる。これにより形成された混合物は、必要な場合に、各反応ポット中にPCRのための十分な物質を含有する好適なアリコートに分注され、そして凍結乾燥処理される。凍結乾燥がすぐに行われない場合、遅延が約0.5時間超になる場合、凍結乾燥が行われるまで、最終混合物は好適に低温で、例えば氷上で又は冷凍庫で保存される。
【００７２】
用いられる凍結乾燥プロトコルは、乾燥される特定の組成物にある程度依存し、慣用的な手順を用いて各場合において決定されるであろう。典型的に、組成物は、低温、例えば-20℃〜-60℃、一般的に-40℃で、300〜400torrの圧力で冷やされ、完全な凍結が起こるのを確保するのに十分な時間この温度で保持される凍結ステップにさらされる。
【００７３】
そして、用いられる特定の凍結乾燥機に依存して、圧力は適切なレベルまで減圧される。いくつかの場合、圧力は6Mtorrの低圧力で作用してもよいが、現在の目的のためには、水を昇華させるのに10〜100mTorrの圧力が好適であり得る。そして、好適には、組成物は室温及び圧力に戻される。これは、凝縮効果を最低限にとどめるため真空状態が開放される前に、減圧下において組成物を徐々に室温に戻すことにより行われてもよい。
【００７４】
随意に、生成物が不活性環境において維持されるように、窒素等の不活性雰囲気の存在中に真空状態が開放される。これは、寿命を支持し、湿気侵入をも防止する。
【００７５】
この方法により得られた凍結乾燥生成物は、好適にすぐに例えばホイル包装紙でパッケージされ、汚染リスクを最小限にする。組成物が試薬ポット等の容器に入れられた場合、真空状態が開放される前にこれらは好適に密閉される。ホイル包装紙には、アルミニウムホイル、アルミニウムポリマー積層ホイルから作られた包装又は押し出し品が含まれる。また、これには長期保存に理想的な包装を強力に作るマイラー（登録商標）等の材料が含まれる。包装紙はガス交換及び湿気侵入を低減する第2のバリアを提供する。
【００７６】
組成物に利用される全ての試薬が、見つけられるレベルにおいて凍結乾燥を抑制又は防止する物質又は不純物を含まないことを保証するべく、配慮しなければならない。このため、例えば、ポリメラーゼ、逆転写ポリメラーゼ及びRNアーゼ阻害剤等の市販の酵素に時々含まれるグリセロール等の物質を除去し、及び/又はDNA二重鎖結合剤として用いられることができる挿入染料中に含まれ得るジメチルスルホキシド（DMSO）等の物質のレベルを低減する必要がある場合がある。これは、標準的な方法、例えば、当該技術分野でよく理解されている透析、超分離及び排除クロマトグラフィーで達成することができる。
【００７７】
上述した組成物は、3ヶ月及び更に9ヶ月までを含む長期間に渡って、その期間の終わりに活性喪失が全く見られず、安定であることが見出された。
【００７８】
上述した組成物を形成するための方法は、本発明の更なる態様を形成する。特定の実施形態において、本発明は、少なくとも上記項目(i)から(ii)を混合し、生じた混合物を凍結乾燥することを含む、凍結乾燥組成物を調製する方法を提供する。
【００７９】
使用に際して、本発明の組成物は従来の方法、例えば再水和緩衝剤を用いて水和され、そして適切な化学又は生化学反応にさらされる。一般的に、組成物は、反応が行われる前に、化学又は生化学サンプルと混合されるだろう。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の場合、反応混合物は、標的核酸及び随意に再水和緩衝剤を含有又は含有していると思われるサンプルと結合し、最終混合物はPCR条件にさらされる。シグナル試薬が含まれる場合、シグナル、例えば蛍光試薬からの蛍光はプロセスの前、中、後に渡って必要に応じてモニタリングされる。特に、シグナルは要求に応じてリアルタイムでモニタリングされ、反応の経過のモニタリングが可能になり、当該技術分野において理解されるように、サンプル中の標的の量が定量化される。このような方法は、本発明の更なる態様を形成する。
【００８０】
本発明を今から添付する図を参照しながら、実施例で特に説明する：図１は21日間、室温と30℃で保存した凍結乾燥試薬の平均Ct値(+/- sd)のグラフ比較であり；及び
図２は9ヶ月間、30℃で保存した凍結乾燥試薬のCt値(+/- sd)及び蛍光値を示す一連のグラフである。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
（原文記載なし）
【００８２】
実施例１
トレハロース及びラフィノース存在中のBacillus subtilis var. globigii (BG)DNA及び胞子検出のためのPCR阻害アッセイの試験
PCRマスターミックスが、20μl又は25μl反応のための次の試薬の複数を混合することにより調製された。
【表１】
2011526492.tif 000002
【００８３】
このマスターミックスのサンプルに対して、添加物、50％（m/v）トレハロース（20μlについては2μl、25μl反応混合物については2.5μl）又は25％（m/v）ラフィノース（20μlについては4μl、25μl反応については5μl）が加えられ、5％（m/v）トレハロース又は5％（m/v）ラフィノース組成物が生成された。対照反応は、トレハロース又はラフィノースなしで行われた。負の対照は、鋳型DNAに代わり水を用いて調製された。
【００８４】
これら非凍結乾燥製剤をLightcyler(商標)キャピラリーに移し、キャピラリーの蓋をした。これらを手短に遠心分離し、LightCycler 1.0 (Roche)のための回転子に搭載し、次のプロトコルを用いたPCR反応にかけた：
【表２】
2011526492.tif 000003
Taqmanプローブのシグナルを、連続希釈の範囲において各サイクルを通して単一獲得によって読んだ。平均Ct、蛍光及びシグナル対ノイズ第１A表おいて比較する。
【表３】
2011526492.tif 000004
【表４】
2011526492.tif 000005
BGプライマーとプローブの異なるセットで実験を繰り返し、その結果のまとめを第２表に示す。
【表５】
2011526492.tif 000006
【表６】
2011526492.tif 000007
【００８５】
結果において、いずれのアッセイも5％（m/v）トレハロース又は5%(m/v)ラフィノースの添加による悪影響はなく、任意の濃度のBG DNAで観察されたCt値、平均蛍光又はシグナル／ノイズに違いはなかった。
【００８６】
実施例２
凍結乾燥後のトレハロース及びラフィノース存在中のBacillus subtilis var. globigii (BG)DNA及び胞子検出のためのPCR阻害アッセイの試験
ラフィノース又はトレハロースのいずれも非凍結乾燥製剤/反応混合物のアッセイを阻害しなかったことから、これらの賦形剤は凍結乾燥製剤として1％(m/v)PEG(最終)の存在があり又はなしで試験された。1％(m/v)PEGの添加があり又はなしの実施例１に記載された反応混合物が調製され、第3表にまとめているプログラムを行うようにセットされているVirTis Advantage凍結乾燥機を用いて凍結乾燥した。
【表７】
2011526492.tif 000008
【００８７】
生じた凍結乾燥混合物（ケーキ）はすぐに緩衝剤に再懸濁され、実施例１に概説されたPCRプロトコルにさらされた。全てのケーキは50μl溶液（2x）として調製され、25μlに再懸濁された。
【００８８】
平均Ct、Taqman（登録商標）BGアッセイのための蛍光、シグナル/ノイズ反応の比較をそれぞれ第４表及び第５表に示す。
【表８】
2011526492.tif 000009
【表９】
2011526492.tif 000010
【００８９】
４つ全ての処方を用いて、いかなる混合物のCt値に明らかな違いが見られずに、陽PCR曲線が両方のアッセイのために得られた。
【００９０】
最初のアッセイにおいて、PEGなしでのトレハロースを含有する処方と1％(m/v)PEGを含むラフィノースは、BG DNAの両方の濃度の非凍結乾燥（ウェット）処方対照と似たシグナル対ノイズ値を有した（上記表４）。第２のアッセイにおいて、ラフィノースを単独又は1％（m/v）PEGと共に含有する製剤は、非凍結乾燥製剤混合物で観察されたものに最も近いシグナル対ノイズ値を保持し、これらが好ましい混合物であることを示す。
【００９１】
実施例３
二重ハイブリダイゼーションアッセイにおいてBGを検出するための、組成物におけるガラス剤及び安定剤としてのラフィノースの評価
単一Taqman（登録商標）標識プローブの代わりに二重ハイブリダイゼーションプローブ対を用い、及び第６表に掲載された試薬を用いたことを除いて、実施例１の方法の大部分を行った。この場合において、プローブは、FAMとCy5標識が互いに近接近するように、増幅BG DNAとハイブリダイズするように設計された。
【表１０】
2011526492.tif 000011
【００９２】
前と同じように、これらの試薬を反応管で合わせると、それらを前もって+5℃に冷やされており、上記第３表にまとめられたプログラムを行うようセットされた凍結乾燥機（Virtis Advantage）内に置いた。
【００９３】
各混合物の5つの複製物が調製された。凍結乾燥されたケーキの見かけの分析が行われ、以下の第７表に結果のまとめを示す。
【００９４】
そして、これらを更に乾燥混合物の再構築とBG DNAの添加によって比較した。各混合物は、次のプロトコルを用いてLightCycler（商標）のPCRを行った。
【表１１】
2011526492.tif 000012
【００９５】
5つの複製物の平均Ct値及び平均シグナルの結果を第7表にまとめる。
【表１２】
2011526492.tif 000013
【００９６】
トレハロース又はラフィノースの濃度が２つの間に明確な差がなく増大するにつれて、凍結乾燥ケーキは乾燥するように見えた。Ct値はラフィノースとトレハロースの両方の間で、２つの薬剤の異なる濃度内で似ていた。一般的に、ラフィノースの結果はトレハロースのそれらと似ており、有害作用なく凍結乾燥製剤中で置換できることを示す。しかし、ラフィノースはin situ防湿剤の特性を加え、組成物の安定性を改善することが期待されるであろう。
【００９７】
実施例６
組成物に対するスレオニンの効果
Taqman（登録商標）混合物を第８表に列挙されている成分で製剤化した。
【表１３】
2011526492.tif 000014
【００９８】
L-スレオニンなしで同様の混合物が作製された。そして、両方の混合物は、実施例２で記載されているように凍結乾燥された。凍結乾燥試薬を含む二重ホイルポットが、室温及び30℃でプラスチックのペトリ皿に置かれた。室温ポットは、戸棚の非温度制御実験室に保存された。各凍結乾燥試薬製剤は、25μlの最終反応量の次のプロトコルを用いてPCRを行うことにより、0日、そして、１、６、９、１４、２１及び２８日に試験された。
【表１４】
2011526492.tif 000015
結果は新たに調製された組成物と比較された。
Ct、シグナル、シグナル対ノイズ値はLightCycler（登録商標）1.0データを用いて決定された。シグナル対ノイズ値は次の式を用いて生じさせた：
シグナル対ノイズ値＝（シグナル−ノイズ）／ノイズ
ここで、シグナル＝最後に記録された値（サイクル５０で）
ノイズ＝最初の１０サイクルに渡って記録された最高及び最低値の差
【００９９】
室温で保存された組成物の結果を第９表に示し、３０℃で保存されたものは第１０表に示す。
【表１５】
2011526492.tif 000016
【表１６】
2011526492.tif 000017
【０１００】
この結果は、試験期間中、両方の製剤が室温で安定だったことを示唆する。30℃で保存された場合、結果において、組成物が21日間安定であったことを示す。
【０１０１】
しかし、L-スレオニンを含有する製剤は、30℃で保存された場合に全ての時点においてより良いシグナルを有していた（図1を参照）。L-スレオニン含有組成物からのシグナルは、明らかにL-スレオニンが省略された同様の組成物のからのものより阻害が軽くなっていた。よって、L-スレオニンの使用は抗酸化／抗メイラード特性の結果として安定性を促進するだけでなく、蛍光シグナルの喪失が軽減するだろうと思われる。
【０１０２】
実施例７
RT-PCRアッセイのための組成物中のガラス剤及び安定剤としてのラフィノースとトレハロースの比較
第１１表に記載のされた組成物を調製した。
【表１７】
2011526492.tif 000018
【０１０３】
そして、これらを上記実施例２に記載されたようにして凍結乾燥した。トレハロースケーキ製剤は、凍結乾燥前に混合物A＆Bを一緒に混合することにより調製された。両方の場合において（トレハロース及びラフィノース）、この段階のケーキ製剤は実際の反応量（25μl）の2倍（50μl）であった。
【０１０４】
後凍結乾燥において、次の観察はトレハロース及びラフィノース生成物からなる。トレハロースケーキは、ケーキを形成しなかった明確な「タフィー」一貫性を有した。生じたケーキの本質により、溶解は難しかった。少し崩壊したようにも見えたが、ラフィノースケーキは形成した。しかし、再懸濁するのは簡単であったため、取り扱いに好ましかった。
【０１０５】
そして、第１１表の組成物は水と必要とされる濃度でのDNAを25μl水の合計量で再構築された。
【０１０６】
これらの組成物及び新たに調製され凍結乾燥されなかった組成物をRT-PCRに用いた。Roche LightCycler 1.0機器で、次の温度及び光プロトコルを用いてサンプルを増幅した。
【表１８】
2011526492.tif 000019
【０１０７】
結果を次の表にまとめた。
【表１９】
2011526492.tif 000020
【表２０】
2011526492.tif 000021
【０１０８】
これらの表において、「非凍結乾燥製剤」とは、凍結乾燥されなかった組成物を意味する。「賦形剤」とは、各欄の実験にしたがって、トレハロース又はラフィノースを含むことを意味する。
【０１０９】
ラフィノース組成物は、非凍結乾燥製剤のものとより一致した結果を一貫して生じ、これらにより好ましい製剤と考えられる。
【０１１０】
実施例８
本発明の組成物の長期安定性
最終アッセイのための内部対照としてプラスミドDNAを含む競合的二重鎖Taqman（登録商標）混合物を、第１２表に列挙された成分を用いて製剤化した。
【表２１】
2011526492.tif 000022
【０１１１】
混合物は、実施例２で記載されたように凍結乾燥された。
【０１１２】
凍結乾燥試薬製剤は30℃で保存され、最終反応量が２５μlの下記プロトコルを用いてPCRを行うことにより、安定性を９ヶ月間に渡って試験した。
【表２２】
2011526492.tif 000023
【０１１３】
結果を図２に示す。図２A及び２Bにおいて、30℃で9ヶ月保存して達成されたCt値を示す。データは、特異的鋳型DNA（加えられた）及び内部対照DNA（凍結乾燥ケーキに含まれる）を用いた増幅の結果をそれぞれ示す。図２C及び２Dは、鋳型DNAと内部対照DNAのそれぞれの9ヶ月に渡る蛍光値（安定期における最高値）を示す。
【０１１４】
DNAの２つの濃度並びに約２０００（破線、四角）及び２００コピー（実線、丸）が各時点で用いられ、PCRが3重に繰り返され、グラフは各時点における平均(+/-)1標準偏差を示す。
【０１１５】
Ctが変数であったが、鋳型DNA又はIC制御DNAの0日目及び9ヶ月の間に最低濃度のDNAにおけるCt値の明らかな差はなかった。時間が経過すると共に蛍光値は僅かに下がったが、鋳型又は内部対照増幅いずれについても負の結果を生じなかった。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【国際調査報告】
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