(57)【要約】  蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）等のシャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下又は排除し、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログを発現させる下等真核宿主細胞について記載する。特定態様において、宿主細胞は更に１個以上のＯ−蛋白質マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の欠損もしくは破壊、及び／又は内在性もしくは外来Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼの過剰発現を含む。これらの宿主細胞は組換え糖蛋白質の大量生産と、Ｏ−グリコシル化の低下した組換え糖蛋白質の生産に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能が破壊又は欠損させられ、ならびに内在性シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子が宿主細胞で発現させられる下等真核宿主細胞。
【請求項２】
シャペロン蛋白質が蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）である、請求項１の下等真核宿主細胞。
【請求項３】
哺乳動物ホモログがヒトＰＤＩである、請求項１の下等真核宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞が更に組換え蛋白質をコードする核酸分子を含む、請求項１の下等真核宿主細胞。
【請求項５】
蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させられた、請求項１の下等真核宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞が更に内在性又は異種Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む、請求項１の下等真核宿主細胞。
【請求項７】
宿主細胞が更にＥＲｐ５７蛋白質をコードする核酸分子と、カルレティキュリン蛋白質をコードする核酸分子を含む、請求項１の下等真核宿主細胞。
【請求項８】
（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子、及び（ｂ）蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能が低下、破壊又は欠損させられ、ならびにシャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子が宿主細胞で発現させられる下等真核宿主細胞。
【請求項９】
シャペロン蛋白質をコードする内在性遺伝子が蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）をコードする、請求項８の下等真核宿主細胞。
【請求項１０】
シャペロン蛋白質の哺乳動物ホモログがヒト蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）である、請求項８の下等真核宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞が更に組換え蛋白質をコードする核酸分子を含む、請求項８の下等真核宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞が更に内在性又は異種Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む、請求項８の下等真核宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が更にＥＲｐ５７蛋白質をコードする核酸分子及びカルレティキュリン蛋白質をコードする核酸分子を含む、請求項８の下等真核宿主細胞。
【請求項１４】
（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能が破壊又は欠損させられ、ならびに内在性シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子が宿主細胞で発現させられる下等真核宿主細胞を準備する段階；
（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階；及び
（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階
を含む組換え蛋白質の生産方法。
【請求項１５】
シャペロン蛋白質が蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
哺乳動物ホモログがヒトＰＤＩである、請求項１４の方法。
【請求項１７】
蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能が低下、破壊又は欠損させられた、請求項１４の方法。
【請求項１８】
宿主細胞が更に内在性又は異種Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む、請求項１４の方法。
【請求項１９】
宿主細胞が更にＥＲｐ５７蛋白質をコードする核酸分子及びカルレティキュリン蛋白質をコードする核酸分子を含む、請求項１４の方法。
【請求項２０】
（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能が破壊又は欠損させられ、ならびに内在性シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子が宿主細胞で発現させられる下等真核宿主細胞を準備する段階；
（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階；及び
（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階
を含むＯ−グリコシル化の低下した組換え蛋白質の生産方法。
【請求項２１】
シャペロン蛋白質が蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
哺乳動物ホモログがヒトＰＤＩである、請求項２０の方法。
【請求項２３】
蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能が低下、破壊又は欠損させられた、請求項２０の方法。
【請求項２４】
宿主細胞が更に内在性又は異種Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む、請求項２０の方法。
【請求項２５】
宿主細胞が更にＥＲｐ５７蛋白質をコードする核酸分子及びカルレティキュリン蛋白質をコードする核酸分子を含む、請求項２０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（１）発明の分野
本発明は組換え発現システムにおける蛋白質生産を改善するためのシャペロン遺伝子の使用に関する。一般に、組換え下等真核宿主細胞は異種シャペロン蛋白質をコードする核酸と、内在性シャペロン蛋白質をコードする遺伝子の欠損又は破壊を含む。これらの宿主細胞は組換え糖蛋白質の大量生産と、Ｏ−グリコシル化の低下した組換え糖蛋白質の生産に有用である。
【背景技術】
【０００２】
（２）関連技術の記述
分子シャペロンは蛋白質の折り畳みと分泌、特に抗体の折り畳みと分泌に重要な役割を果たす。下等真核生物、特に酵母において、蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は抗体重鎖及び軽鎖間のジスルフィド結合等の多量体蛋白質間のジスルフィド結合の形成を助けるように機能するシャペロン蛋白質である。ヒトＰＤＩシャペロン蛋白質を過剰発現及び／又は内在性ＰＤＩを過剰発現させることによりＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける抗体発現レベルを増加しようとする試みが過去に行われている。例えば、Ｗｉｔｔｒｕｐら，米国特許第５，７７２，２４５号；Ｔｏｙｏｓｈｉｍａら，米国特許第５，７００，６７８号及び５，８７４，２４７号；Ｎｇら，米国出願公開第２００２／００６８３２５号；Ｔｏｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３３０３−２３３０９（２０００）；Ｋｅｉｚｅｒ−Ｇｕｎｎｉｎｋら，Ｍａｒｔｉｘ  Ｂｉｏｌ．１９：２９−３６（２０００）；Ｖａｄら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１６：２５１−２６０（２００５）；Ｉｎａｎａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．９３：７７１−７７８（２００５）；Ｚｈａｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２：１０９０−１０９５（２００６）；Ｄａｍａｓｃｅｎｏら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：３８１−３８９（２００６）；並びにＨｕｏら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．５４：２３４−２３９（２００７）参照。
【０００３】
蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は非触媒反応に比較してジスルフィド含有蛋白質の回収率を実質的に増加又は実質的に低下させることができ、ジスルフィド含有蛋白質の発現には小胞体（ＥＲ）における高濃度のＰＤＩが不可欠である（Ｐｕｉｇ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：７７６４−７７７１（１９９４））。ＰＤＩ１とそのコシャペロンの作用を図２に示す。
【０００４】
Ｇｕｎｔｈｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：７７２８−７７３２（１９９３）では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴｒｇ１／Ｐｄｉ１遺伝子を蛋白質ジスルフィドイソメラーゼファミリーのマウス遺伝子で置換している。２種類の非グリコシル化哺乳動物蛋白質ＰＤＩ及びＥＲｐ７２はＴｒｇ１の重要な機能の少なくとも一部を代行できることが判明したが、これらの３種類の蛋白質はチオレドキシン関連ドメインの周囲の配列が著しく相違し、ＥＲｐ６１は不活性であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，７７２，２４５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７００，６７８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８７４，２４７号明細書
【特許文献４】米国出願公開第２００２／００６８３２５号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｏｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３３０３−２３３０９（２０００）
【非特許文献２】Ｋｅｉｚｅｒ−Ｇｕｎｎｉｎｋら，Ｍａｒｔｉｘ  Ｂｉｏｌ．１９：２９−３６（２０００）
【非特許文献３】Ｖａｄら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１６：２５１−２６０（２００５）
【非特許文献４】Ｉｎａｎａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．９３：７７１−７７８（２００５）
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２：１０９０−１０９５（２００６）
【非特許文献６】Ｄａｍａｓｃｅｎｏら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：３８１−３８９（２００６）
【非特許文献７】Ｈｕｏら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．５４：２３４−２３９（２００７）
【非特許文献８】Ｐｕｉｇ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：７７６４−７７７１（１９９４）
【非特許文献９】Ｇｕｎｔｈｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：７７２８−７７３２（１９９３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
有効なシャペロン蛋白質を使用する改良型ベクター及び宿主細胞株に基づき、酵母及び糸状菌（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の他の蛋白質発現システムが開発されるならば、蛋白質の組換え生産用、特に抗体の組換え生産用の遺伝子強化酵母株の開発に有益であろう。
【０００８】
本発明は補助遺伝子及びシャペロン蛋白質を使用して組換え蛋白質を生産するための改良方法及び材料を提供する。一実施形態では、シャペロン経路をヒト化する遺伝子操作の結果、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞で産生される組換え抗体の収率が改善された。
【０００９】
本明細書に記載するように、本発明の方法及び材料には、従来公知の発現方法に勝るこのような発現方法の非自明な利点を提供する多数の属性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の簡単な要旨）
本発明者らは、組換え宿主細胞の内在性シャペロン蛋白質の１種以上を１種以上の異種シャペロン蛋白質で置換することにより、組換え宿主細胞における組換え蛋白質の発現を改善できることを見出した。一般に、内在性シャペロン蛋白質をコードする遺伝子を、宿主細胞で産生させる組換え蛋白質と同一又は類似種に由来し、内在性シャペロン蛋白質のホモログをコードする異種遺伝子で置換すると、組換え蛋白質の発現を増加できることが判明した。例えば、哺乳動物シャペロン蛋白質をコードする異種遺伝子を宿主細胞に導入すると、シャペロン蛋白質をコードする内在性遺伝子の機能を下等真核宿主細胞で低下又は排除することができる。一般に、哺乳動物シャペロンは宿主細胞により産生させる組換え蛋白質と同一種に由来するように選択される。哺乳動物シャペロン蛋白質を発現するが、その内在性シャペロン蛋白質を発現しない下等真核宿主細胞は活性な正しく折り畳まれた組換え蛋白質を大量に産生することが可能である。これは内在性ＰＤＩ遺伝子を保持する下等真核宿主細胞における組換え蛋白質の産生に対する生産性の改善である。
【００１１】
本発明者らは更に、本明細書に記載するように蛋白質発現を改善することにより、その内在性蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）遺伝子の１個以上を欠損又は破壊した健康な生存可能な組換え宿主細胞を構築できるという別の利点が得られることを見出した。下等真核細胞でＰＭＴ遺伝子の１個以上を欠損又は破壊する結果、細胞で産生される組換え蛋白質のＯ−グリコシル化の量が低下する。しかし、マンノシルトランスフェラーゼをコードする１個以上の遺伝子の欠損を更に含み、内在性シャペロン蛋白質を発現する下等真核宿主細胞にＰＭＴ欠損を形成すると、得られる細胞は生存不能又は産生能の低い細胞となることが多く、商業用には不適切であることが判明した。
【００１２】
従って、所定態様において、本発明はシャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下又は排除し、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を提供する。他の態様において、下等真核宿主細胞は酵母又は糸状菌宿主細胞である。
【００１３】
更に他の態様では、内在性ＰＤＩ１が宿主細胞に存在しなくなるようにシャペロン蛋白質である蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）をコードする内在性遺伝子の機能を破壊又は欠損させ、哺乳動物ＰＤＩ蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させる。一実施形態において、哺乳動物ＰＤＩ蛋白質は宿主細胞で発現させる組換え蛋白質及び宿主細胞のゲノムに組込む哺乳動物ＰＤＩをコードする核酸分子と同一種である。例えば、宿主細胞に導入したヒト遺伝子から組換え蛋白質を発現させる場合には、ＰＤＩをコードする遺伝子もヒト由来であることが好ましい。他の実施形態において、ＰＤＩを発現させるための核酸分子は宿主細胞で機能的であり、哺乳動物ＰＤＩ蛋白質をコードするオープンリーディングフレームと機能的に連結されたプロモーター及び転写終結配列等の調節エレメントを含む。他の実施形態では、哺乳動物ＰＤＩ遺伝子をコードする核酸分子で内在性ＰＤＩ遺伝子を置換する。これは相同組換え又はオーバーラップする配列を両端に含む哺乳動物ＰＤＩ遺伝子により内在性ＰＤＩ１遺伝子のループを広げる一塩基置換イベントにより実施することができる。
【００１４】
他の態様では、下等真核宿主細胞に由来する調節ヌクレオチド配列と上記宿主細胞により産生させる選択された哺乳動物蛋白質をコードするコーディング配列を含む組換えベクターで本発明の下等真核宿主細胞を更に形質転換する。所定態様において、選択された哺乳動物蛋白質は治療用蛋白質であり、抗体等の糖蛋白質とすることができる。
【００１５】
本発明は更に上記のような内在性シャペロン蛋白質の１種以上をコードする遺伝子の置換に加え、蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させた酵母及び糸状菌宿主細胞等の下等真核宿主細胞を提供する。特定実施形態では、ＰＭＴ１及びＰＭＴ４遺伝子から構成される群から選択される少なくとも１個の内在性ＰＭＴ遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させる。
【００１６】
他の実施形態において、宿主細胞は内在性Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１を哺乳動物ＰＤＩで置換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞等の酵母又は糸状菌宿主細胞とすることができ、宿主細胞は更にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞に由来するか又は前記細胞で機能的であり、抗体等のヒト治療用糖蛋白質をコードするオープンリーディングフレームと機能的に連結された調節ヌクレオチド配列を含み、宿主細胞に導入されたベクターを発現する。その後、ＰＭＴ１及びＰＭＴ４から構成される群から選択される蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子の機能を低下又は排除するように宿主細胞を更に操作し、機能的ＰＭＴ遺伝子をもつ宿主細胞に比較してＯ−グリコシル化の低下した組換え蛋白質を産生することが可能な宿主細胞を提供する。他の態様では、宿主細胞を更にＰＭＴ遺伝子発現又はＰＭＴ蛋白質機能の１種以上の阻害剤と接触させる。
【００１７】
他の態様において、本発明はヒト蛋白質を含む哺乳動物由来の糖蛋白質である組換え糖蛋白質を生産するための改善された特徴をもつ非ヒト真核宿主細胞、下等真核宿主細胞、並びに酵母及び糸状菌宿主細胞等の組換え宿主細胞を含む。本発明の組換え宿主細胞はシャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能の低下又は排除により改変されている。内在性遺伝子の機能の低下又は排除は当分野で公知の任意方法により実施することができ、例えば内在性遺伝子の機能を低下又は排除するために十分な遺伝子配列の突然変異、挿入又は欠失により、内在性遺伝子の遺伝子座の改変により実施することができる。機能を低下又は排除することができるシャペロン蛋白質としては限定されないが、ＰＤＩが挙げられる。一実施形態では、その機能を低下又は排除するようにＰＤＩをコードする内在性遺伝子を欠失又は改変させる。
【００１８】
他の態様では、シャペロン蛋白質の機能を低下又は排除した後に、例えば破壊又は欠損させたシャペロン蛋白質のホモログをコードする少なくとも１個の非内在性遺伝子で宿主細胞を形質転換することにより置換する。他の態様では、破壊又は欠損させたシャペロン蛋白質のヒト又は哺乳動物ホモログをコードする少なくとも１個の外来遺伝子を発現させるように宿主細胞を形質転換する。他の態様において、外来遺伝子は宿主細胞を使用して産生させる組換え糖蛋白質の起源種と同一種又は近縁種に由来するホモログをコードする。
【００１９】
特定態様では、内在性シャペロン蛋白質ＰＤＩ１の機能を低下又は排除し、宿主細胞を使用して産生させる組換え糖蛋白質の起源種と同一種又は近縁種に由来するＰＤＩのホモログを発現させるように宿主細胞を形質転換する。例えば、哺乳動物蛋白質発現用Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現システムでは、内在性ＰＤＩ１遺伝子の機能を低下又は排除するようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を改変し、哺乳動物ＰＤＩ遺伝子をコードする核酸分子で宿主細胞を形質転換する。
【００２０】
本発明は更に非ヒト真核宿主細胞、下等真核宿主細胞、又は酵母もしくは糸状菌宿主細胞における組換えヒト又は哺乳動物糖蛋白質の生産性を増加させるための方法を提供する。本発明の方法はシャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下又は排除する段階を含む。一般に、前記方法は更に機能を低下又は排除したシャペロン蛋白質のホモログをコードする少なくとも１個の異種遺伝子で宿主細胞を形質転換する段階を含む。異種遺伝子は機能を低下又は排除したシャペロン蛋白質のヒト又は哺乳動物ホモログをコードする外来遺伝子を含む。他の態様において、外来遺伝子は宿主細胞を使用して産生させる組換え糖蛋白質の起源種と同一種又は近縁種に由来するホモログをコードする。多くの態様において、機能を低下又は排除することができるシャペロン蛋白質としてはＰＤＩが挙げられる。
【００２１】
従って、更に本明細書に開示する宿主細胞で組換え蛋白質を生産する方法も提供し、例えば、一実施形態において、前記方法は、シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を破壊又は低下させ、内在性シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含む。別の実施形態において、前記方法は、（ｉ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子と、（ｉｉ）蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含む。別の実施形態において、前記方法は、シャペロン蛋白質ＰＤＩをコードする内在性遺伝子と、蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ−１（ＰＭＴ１）又はＰＭＴ４蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質ＰＤＩの少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含む。
【００２２】
更に、本発明の上記宿主細胞でＣａ２＋ＡＴＰアーゼを過剰発現させると、Ｏ−グリカン含有量が低下することも判明した。上記宿主細胞でカルレティキュリンとＥＲｐ５７蛋白質を過剰発現させてもＯ−グリカン含有量が低下することも判明した。従って、上記宿主細胞の他の実施形態において、宿主細胞は更に異種プロモーターと機能的に連結された１種以上の外来又は内在性Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする１個以上の核酸分子を含む。他の実施形態において、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＭＲ１遺伝子又はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＣＡ１遺伝子によりコードされるＣａ２＋ＡＴＰアーゼである。他の実施形態において、宿主細胞は更にカルレティキュリン及び／又はＥＲｐ５７をコードする１個以上の核酸分子を含む。適切な他のＣａ２＋ＡＴＰアーゼとしては限定されないが、ヒトＳＥＲＣＡ２ｂ蛋白質（ＡＴＰ２Ａ２ＡＴＰアーゼ，Ｃａ＋＋輸送心筋，遅筋２）とＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＣＯＤ１蛋白質（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＰＦ１のホモログ）が挙げられる。適切な他の蛋白質としては限定されないが、ヒトＵＧＧＴ（ＵＤＰ−グルコース：糖蛋白質グルコシルトランスフェラーゼ）蛋白質とヒトＥＲｐ２７蛋白質が挙げられる。
【００２３】
従って、本発明はシャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を破壊又は欠損させ、内在性シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を提供する。
【００２４】
別の実施形態において、破壊するシャペロン蛋白質は蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）であり、別の実施形態において、哺乳動物ホモログはヒトＰＤＩである。
【００２５】
一般に、下等真核宿主細胞は更に組換え蛋白質をコードする核酸分子を含み、特定態様において、前記蛋白質は糖蛋白質であり、他の態様では抗体又はＦｃやＦａｂ等のそのフラグメントである。
【００２６】
他の実施形態では、蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させる。特定実施形態において、ＰＭＴ蛋白質はＰＭＴ１及びＰＭＴ４から構成される群から選択される。従って、宿主細胞は更にＰＭＴ１もしくはＰＭＴ４の一方の低下、破壊もしくは欠損又はＰＭＴ１及びＰＭＴ４の両方の低下、破壊もしくは欠損を含むことができる。従って、（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子と、（ｂ）蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞も提供する。
【００２７】
他の実施形態において、宿主細胞は更に内在性又は異種Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を含む。特定態様において、Ｃａ２＋ＡＴＰはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＭＲ１及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＣＡ１から構成される群から選択される。従って、（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログと少なくとも１種のＣａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞も提供する。更に、（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子と、（ｂ）蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログと少なくとも１種のＣａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞も提供する。
【００２８】
更に他の態様において、宿主細胞は更にヒトＥＲｐ５７シャペロン蛋白質をコードする核酸分子又はカルレティキュリン（ＣＲＴ）蛋白質をコードする核酸分子又は両者を含む。特定態様において、カルレティキュリン蛋白質はヒトＣＲＴであり、ＥＲｐ５７はヒトＥＲｐＳ７である。従って、（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログとＣＲＴ又はＥＲｐ５７の少なくとも１種をコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞も提供する。更に、（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログと、ＣＲＴ又はＥＲｐ５７の少なくとも１種と、少なくとも１種のＣａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞も提供する。更に、（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子と、（ｂ）蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログと、ＣＲＴ又はＥＲｐ５７の少なくとも１種と、少なくとも１種のＣａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞も提供する。
【００２９】
上記宿主細胞の他の態様において、宿主細胞はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｔａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｉｃｈｉａ種、任意Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、任意Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、任意Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、任意Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、任意Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓから構成される群から選択される。
【００３０】
他の実施形態としては、本明細書に開示するように改変していない宿主細胞で獲得可能な収率よりも高収率で組換え蛋白質を生産する方法と、本明細書に開示する遺伝子改変を含まない組換え糖蛋白質に比較してＯ−グリコシル化又はＯ−グリカン含有量の低下した組換え蛋白質を生産する方法が挙げられる。組換え蛋白質としては治療関連蛋白質及び糖蛋白質が挙げられ、抗体とそのフラグメントが挙げられる。
【００３１】
従って、（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を破壊又は欠損させ、内在性シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含む組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００３２】
更に、（ａ）（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子と、（ｂ）蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含む組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００３３】
更に、（ａ）（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子と、（ｂ）蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログと、少なくとも１種のＣａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含む組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００３４】
更に、（ａ）（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログとＣＲＴ又はＥＲｐ５７の少なくとも１種をコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含む組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００３５】
更に、（ａ）（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログと、ＣＲＴ又はＥＲｐ５７の少なくとも１種と、少なくとも１種のＣａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含む組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００３６】
更に、（ａ）（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子と、（ｂ）蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログと、ＣＲＴ又はＥＲｐ５７の少なくとも１種と、少なくとも１種のＣａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含む組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００３７】
更に、（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を破壊又は欠損させ、内在性シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含むＯ−グリコシル化又はＯ−グリカン含有量の低下した組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００３８】
更に、（ａ）（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子と、（ｂ）蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含むＯ−グリコシル化又はＯ−グリカン含有量の低下した組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００３９】
更に、（ａ）（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子と、（ｂ）蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログと少なくとも１種のＣａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と；（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と；（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含むＯ−グリコシル化又はＯ−グリカン含有量の低下した組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００４０】
更に、（ａ）（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログと、ＣＲＴ又はＥＲｐ５７の少なくとも１種をコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と、（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と、（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含むＯ−グリコシル化又はＯ−グリカン含有量の低下した組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００４１】
更に、（ａ）（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログと、ＣＲＴ又はＥＲｐ５７の少なくとも１種と、少なくとも１種のＣａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と、（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と、（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含むＯ−グリコシル化又はＯ−グリカン含有量の低下した組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００４２】
更に、（ａ）（ａ）シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子と、（ｂ）蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１個の内在性遺伝子の機能を低下、破壊又は欠損させ、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物ホモログと、ＣＲＴ又はＥＲｐ５７の少なくとも１種と、少なくとも１種のＣａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸分子を宿主細胞で発現させる下等真核宿主細胞を準備する段階と、（ｂ）組換え蛋白質をコードする核酸分子を宿主細胞に導入する段階と、（ｃ）組換え蛋白質を生産するのに適した条件下で宿主細胞を増殖させる段階を含むＯ−グリコシル化又はＯ−グリカン含有量の低下した組換え蛋白質の生産方法を提供する。
【００４３】
上記方法の他の態様において、宿主細胞はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｔａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｉｃｈｉａ種、任意Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、任意Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、任意Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、任意Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、任意Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａから構成される群から選択される。
【００４４】
更に本明細書に開示する宿主細胞により産生される組換え蛋白質も提供する。
【００４５】
特定実施形態において、上記宿主細胞の任意１種は更に宿主細胞が特定Ｎ−グリカン構造又はＮ−グリカン構造の特定混合物を主体とする糖蛋白質を産生できるようにする遺伝子改変を含むことができる。例えば、宿主細胞はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２又はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２コア構造をもつＮ−グリカンを産生するように遺伝子操作されており、特定態様では、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース又はシアル酸等の１個以上の付加糖鎖を非還元末端に含み、場合により還元末端のＧｌｃＮＡｃにフコースを含む。従って、Ｎ−グリカンとしては、２本側鎖及び複数側鎖のグリコフォームと分岐型グリコフォームの両者が挙げられる。Ｎ−グリカンの例としては限定されないが、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が挙げられる。
【００４６】
定義
本明細書で特に定義しない限り、本発明に関して使用する科学技術用語は当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。更に、状況からそうでないことが明白な場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。一般に、本明細書に記載する生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学及び蛋白質・核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関して使用する命名法とその技術は当分野で通常使用されている周知のものである。特に指定しない限り、本発明の方法及び技術は本明細書の随所に引用及び記載する種々の一般及び特定文献に記載されているような当分野で周知の従来方法に従って一般に実施される。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，及び２００２年補遺）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  Ｉ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  ＩＩ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）参照。
【００４７】
本明細書に引用する全刊行物、特許及び他の文献はその開示内容全体を本明細書に組込む。
【００４８】
特に指定しない限り、以下の用語は以下の意味をもつものとする。
【００４９】
本明細書で使用する「Ｎ−グリカン」及び「グリコフォーム」なる用語は同義に使用し、Ｎ−結合型オリゴ糖、例えばアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によりポリペプチドのアスパラギン残基と結合したものを意味する。Ｎ−結合型糖蛋白質は蛋白質中にアスパラギン残基のアミド窒素と結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含む。糖蛋白質上に存在する主要な糖はグルコース、ガラクトース、マンノース、フコース，Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びシアル酸（例えばＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。Ｎ−結合型糖蛋白質では糖基のプロセシングはＥＲの内腔で翻訳と同時に行われ、ゴルジ装置で続行する。
【００５０】
Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の共通５糖コアをもつ（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）。Ｎ−グリカンはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造（別称「トリマンノースコア」、「５糖コア」又は「パウチマンノースコア」）に付加された末端糖鎖（例えばＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース及びシアル酸）を含む分岐（側鎖）の数が相違する。Ｎ−グリカンはその分岐成分に従って分類される（例えば高マンノース型、複合型又はハイブリッド型）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５個以上のマンノース残基をもつ。「複合」型Ｎ−グリカンは一般に１，３マンノースアームに結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃと、「トリマンノース」コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃをもつ。複合型Ｎ−グリカンは更に場合によりシアル酸又は誘導体（例えば「ＮＡＮＡ」ないし「ＮｅｕＡｃ」、ここで「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されたガラクトース（「Ｇａｌ」）又はＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基をもつ場合がある。複合型Ｎ−グリカンは更に「分岐型」ＧｌｃＮＡｃとコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む分子鎖内置換をもつ場合がある。複合型Ｎ−グリカンは更に「トリマンノースコア」に複数の側鎖をもつ場合があり、多くの場合には「複数側鎖グリカン」と呼ぶ。「ハイブリッド」型Ｎ−グリカンはトリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端に少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃをもち、トリマンノースコアの１，６マンノースアームに０個以上のマンノースをもつ。各種Ｎ−グリカンを「グリコフォーム」とも言う。
【００５１】
本明細書で使用する略語は当分野で通常使用されている通りであり、例えば上記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語としては、「ＰＮＧアーゼ」ないし「グリカナーゼ」ないし「グルコシダーゼ」が挙げられ、いずれもペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を意味する。
【００５２】
本明細書で使用する「ベクター」なる用語はこれを連結した別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子を意味する。１種のベクターは「プラスミドベクター」であり、別のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状２本鎖ＤＮＡループを意味する。他のベクターとしては、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。別の型のベクターはウイルスベクターであり、別のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる（以下に詳述）。所定のベクターはこれらを導入した宿主細胞で自律複製することができる（例えば宿主細胞で機能する複製起点をもつベクター）。他のベクターは宿主細胞に導入すると、宿主細胞のゲノムに組込むことができ、従って、宿主ゲノムと共に複製される。更に、所定の好ましいベクターはこれらを機能的に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターを本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と言う。
【００５３】
本明細書で使用する「該当配列」又は「該当遺伝子」なる用語は通常では宿主細胞で産生されない蛋白質を一般にコードする核酸配列を意味する。本明細書に開示する方法は宿主細胞ゲノムに安定的に組込まれた１種以上の該当配列又は遺伝子の効率的な発現を可能にする。該当配列の非限定的な例としては、酵素活性をもつ１種以上のポリペプチドをコードする配列が挙げられ、例えば宿主におけるＮ−グリカン合成に作用する酵素（例えばマンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラーゼ）が挙げられる。
【００５４】
「マーカー配列」又は「マーカー遺伝子」なる用語は宿主細胞内で配列の有無のポジティブ又はネガティブ選択を可能にする活性を発現することができる核酸を意味する。例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子はこの遺伝子を含む細胞がウラシルの不在下で増殖する能力によりその存在を選択できるのでマーカー遺伝子である。この遺伝子を含む細胞が５−ＦＯＡの存在下で増殖できないことによりその存在をネガティブ選択することもできる。マーカー配列又は遺伝子は必ずしもポジティブ及びネガティブ選択性の両方を示す必要はない。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに由来するマーカー配列又は遺伝子の非限定的な例としてはＡＤＥ１、ＡＲＧ４、ＨＩＳ４及びＵＲＡ３が挙げられる。抗生物質耐性マーカー遺伝子としては、カナマイシン、ネオマイシン、ゲネチシン（ないしＧ４１８）、パロモマイシン及びハイグロマイシン耐性遺伝子がこれらの抗生物質の存在下で増殖できるようにするために一般に使用されている。
【００５５】
「機能的に連結された」発現制御配列とは、該当遺伝子を制御するために発現制御配列が該当遺伝子と隣接している結合と、該当遺伝子を制御するためにトランス又は距離を隔てて作用する発現制御配列を意味する。
【００５６】
「発現制御配列」又は「調節配列」なる用語は同義で使用し、本明細書で使用する場合にはこれらの配列を機能的に連結したコーディング配列の発現に作用するために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は核酸配列の転写、転写後イベント及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシングシグナルやポリアデニル化シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増加する配列（例えばリボソーム結合部位）；蛋白質安定性を増加する配列；更に必要に応じて蛋白質分泌を増加する配列が挙げられる。このような制御配列の種類は宿主生物により異なり、原核生物では、このような制御配列として一般にプロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が挙げられる。「制御配列」なる用語は最低限でその存在が発現に不可欠な全成分を含むものとし、更にその存在が有利な他の成分（例えばリーダー配列や融合パートナー配列）も含むことができる。
【００５７】
本明細書で使用する「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」又は単に「宿主細胞」）なる用語は組換えベクターを導入した細胞を意味するものとする。当然のことながら、このような用語は特定対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味するものとする。突然変異又は環境的影響により子孫世代には所定の変異が生じる場合があるので、このような子孫は実際には親細胞と同一でない場合もあるが、やはり本明細書で使用する「宿主細胞」なる用語の範囲に含まれる。組換え宿主細胞は単離細胞でも培養増殖させた細胞株でもよいし、生体細胞又は生体内に存在する細胞でもよい。
【００５８】
「真核」なる用語は有核細胞又は生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞及び下等真核細胞が挙げられる。
【００５９】
「下等真核細胞」なる用語は酵母及び糸状菌を包含する。酵母及び糸状菌としては限定されないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｔａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｉｃｈｉａ種、任意Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、任意Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、任意Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、任意Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、任意Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａが挙げられる。
【００６０】
標準アッセイで測定した場合に改変後の遺伝子がこのような改変を含まない対応する遺伝子によりコードされる蛋白質に比較して少なくとも２０％〜５０％低い活性、特定態様では少なくとも４０％低い活性又は少なくとも５０％低い活性をもつ蛋白質をコードするように例えば１個以上のヌクレオチドの欠失、挿入、突然変異又は置換により蛋白質をコードする遺伝子が改変されているとき、この遺伝子の機能は「低下」していると言う。標準アッセイで測定した場合に改変後の遺伝子がこのような改変を含まない対応する遺伝子によりコードされる蛋白質に比較して少なくとも９０％〜９９％低い活性、特定態様では少なくとも９５％低い活性又は少なくとも９９％低い活性をもつ蛋白質をコードするように例えば１個以上のヌクレオチドの欠失、挿入、突然変異又は置換により蛋白質をコードする遺伝子が改変されているとき、この遺伝子の機能は「排除」されていると言う。
【００６１】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。具体的な方法と材料を以下に記載するが、本発明の実施には本明細書に記載するものに類似又は等価の方法及び材料も使用することができ、このような方法及び材料は当業者に容易に認識されよう。本明細書に引用する全刊行物及び他の文献はその開示内容全体を本明細書に組込む。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書に従う。材料、方法及び実施例は単なる例証であり、如何なる点でも限定的ではない。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】内在性ＰＤＩ１遺伝子を発現させたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞（パネルＡ）、内在性ＰＤＩ１遺伝子とヒトＰＤＩ遺伝子の併存下（パネルＢ）、及びヒトＰＤＩ遺伝子を発現し、内在性ＰＤＩ１遺伝子機能をノックアウトさせた細胞株（パネルＣ）でヒト抗ＤＫＫ１抗体を産生させたディープウェルプレートスクリーニングからの代表的な結果を示す。
【図２】小胞体でのチオールレドックス反応におけるヒトＰＤＩとそのコシャペロンの作用を示す。
【図３Ａ】図３Ａ及び３Ｂは本発明を例証するための実施例に記載する酵母株の系図を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ及び３Ｂは本発明を例証するための実施例に記載する酵母株の系図を示す。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩ遺伝子（ｈＰＤＩ）で置換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株と、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ１遺伝子を破壊した株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔｌ）でヒト抗Ｈｅｒ２抗体を産生させた振盪フラスコ（Ａ）及び０．５Ｌバイオリアクター（Ｂ）発現試験からの代表的な結果を示す。抗体を回収し、非還元及び還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１〜２は抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で株ｙＧＬＹ２６９６を形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示し、レーン３〜６はＰＭＴ１遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９６を、抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で形質転換することにより作製した４個のクローンから産生された抗体を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩ遺伝子（ｈＰＤＩ）で置換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株と、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ１遺伝子を破壊した株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔｌ）でヒト抗Ｈｅｒ２抗体を産生させた振盪フラスコ（Ａ）及び０．５Ｌバイオリアクター（Ｂ）発現試験からの代表的な結果を示す。抗体を回収し、非還元及び還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１〜２は抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で株ｙＧＬＹ２６９６を形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示し、レーン３〜６はＰＭＴ１遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９６を、抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で形質転換することにより作製した４個のクローンから産生された抗体を示す。
【図５】内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩ遺伝子（ｈＰＤＩ）で置換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株と、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ１遺伝子を破壊した株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔｌ）でヒト抗ＤＫＫ１抗体を産生させた振盪フラスコ発現試験からの代表的な結果を示す。抗体を回収し、非還元及び還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１及び３は抗ＤＫＫ１抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０で株ｙＧＬＹ２６９６及びｙＧＬＹ２６９０を形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示し、レーン２及び４はＰＭＴ１遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９６及びｙＧＬＹ２６９０を、抗ＤＫＫ１抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０で形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示す。
【図６】内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩ遺伝子（ｈＰＤＩ）で置換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株と、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊した株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）と、内在性ＰＤＩ１のみを発現し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊した株（ＰｐＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）でヒト抗Ｈｅｒ２抗体を産生させた０．５Ｌバイオリアクター発現試験からの結果を示す。抗体を回収し、非還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１及び２は抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で株ｙＧＬＹ２４−１を形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示し、レーン３〜５はＰＭＴ４遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９０の形質転換により作製した３個のクローンから産生された抗Ｈｅｒ２抗体を示す。
【図７】内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）と、内在性ＰＤＩ１のみを発現し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊した株（ＰｐＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）でヒト抗ＣＤ２０抗体を産生させた振盪フラスコ発現試験からの結果を示す。抗体を回収し、非還元及び還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１は抗ＣＤ２０抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ３２００で形質転換した株ｙＧＬＹ２４−１から産生された抗体を示し、レーン２〜７はＰＭＴ４遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９０の形質転換により作製した６個のクローンから産生された抗ＣＤ２０抗体を示す。
【図８】ヒトＰＤＩ（ｈＰＤＩ）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を示す。
【図９】ヒトＥＲＯ１α（ｈＥＲＯ１α）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰｒＢ１遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２の構築を示す。
【図１０】ヒトＧＲＰ９４をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＥＰ４遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を示す。
【図１１】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  α−１，２マンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）とマウスα−１，２マンノシダーゼＩＡ（ＦＢ５３）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＲＯ遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔの構築を示す。
【図１２】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  α−１，２マンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＲＯ遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２の構築を示す。
【図１３】抗ＤＫＫ１抗体重鎖（ＧＦＩ７１０Ｈ）及び軽鎖（ＧＦＩ７１０Ｌ）又は２本の軽鎖（ＧＦＩ７１０Ｌ）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＲＰ２遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０及び２２６１の地図。
【図１４】抗ＡＤＤＬ抗体重鎖（Ｈｃ）及び軽鎖（Ｌｃ）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＲＰ２遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ２０１２の地図。
【図１５】抗ＨＥＲ２抗体（抗ＨＥＲ２）重鎖（Ｈｃ）及び軽鎖（Ｌｃ）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＲＰ２遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８の地図。
【図１６】抗ＣＤ２０抗体重鎖（Ｈｃ）及び軽鎖（Ｌｃ）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＲＰ２遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ３２００の地図。
【図１７】Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＭＲ１をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ６遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ３８２２の地図。
【図１８】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＣＡ１（ＡｔＥＣＡ１）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ６遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ３８２７の地図。
【図１９】ヒトＣＲＴ（ｈＣＲＴ）とヒトＥＲｐ５７（ｈＥＲｐ５７）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＨＩＳ３遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ１２３４の地図。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
（発明の詳細な記述）
分子シャペロンは抗体の折り畳みと分泌に重要な役割を果たす。特に、シャペロン蛋白質の１種である蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は抗体重鎖及び軽鎖を結合する分子鎖間及び分子鎖内ジスルフィド結合形成を触媒するように機能する。蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は非触媒反応に比較してジスルフィド含有蛋白質の回収率を実質的に増加又は実質的に低下させることができ、ジスルフィド含有蛋白質の発現には小胞体（ＥＲ）における高濃度のＰＤＩが不可欠である［Ｐｕｉｇ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：７７６４−７７７１（１９９４）］。ヒトＰＤＩシャペロン蛋白質を過剰発現及び／又は内在性ＰＤＩ１を過剰発現させることによりＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける抗体発現レベルを増加しようとする従来の試みは成功が限られている。本発明者らは直接遺伝子操作により抗体収率改善の可能性を探るためにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるシャペロン経路のヒト化に着手した。
【００６４】
本発明者らは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓモデルにおいて内在性ＰＤＩ１蛋白質をコードする酵母遺伝子を、異種ＰＤＩ蛋白質をコードする発現カセットで置換した結果、組換え酵母細胞により産生される組換えヒト抗体の収率は内在性ＰＤＩ１蛋白質のみを発現した組換え酵母細胞により産生される収率に比較して約５倍に改善され、異種ＰＤＩ蛋白質と内在性ＰＤＩ１蛋白質を同時発現した組換え酵母細胞により産生される収率に比較して約３倍に増加することを見出した。
【００６５】
本発明の機序を特定の科学理論に限定するものではないが、非相同組換え蛋白質は分泌経路におけるその折り畳みとアセンブリ中に宿主細胞シャペロン蛋白質よりも効率的に異種シャペロン蛋白質と相互作用すると考えられる。同時発現の場合には、異種シャペロン蛋白質はその基質、即ち非相同組換え蛋白質に関して内在性シャペロン蛋白質と競合すると思われる。更に、異種ＰＤＩ蛋白質と組換え蛋白質は同一種に由来すると考えられる。従って、内在性シャペロン蛋白質をコードする遺伝子を、異種シャペロンをコードする発現カセットで置換する方法は、単に異種シャペロン蛋白質を内在性シャペロン蛋白質と同時発現する組換え蛋白質を生産するための組換え宿主細胞を作製するための良好な手段であると思われる。
【００６６】
更に、組換え宿主細胞で異種ＰＤＩ蛋白質と別の異種コシャペロン蛋白質（例えばＥＲＯ１α及び／又はＧＲＰ９４蛋白質）を過剰発現させることにより、組換え蛋白質収率を更に改善することができる。他の態様において、組換え宿主細胞は更にＦＡＤ、ＦＬＣ１及びＥＲｐ４４蛋白質を過剰発現することができる。これらの遺伝子は機能的に近縁であるので、これらの遺伝子をコードする核酸分子を単一ベクターに導入し、宿主細胞に形質転換することが望ましいと思われる。蛋白質の発現は蛋白質をコードする核酸分子を異種又は同種プロモーターと機能的に連結することにより実施することができる。特定態様において、宿主細胞がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓであるとき、異種コシャペロン蛋白質の１種以上の発現はＫＡＲ２プロモーター等の同種プロモーター又は別のＥＲ特異的遺伝子に由来するプロモーターにより実施することができる。他の態様において、全ての異種シャペロン蛋白質及び組換え蛋白質は同一種に由来する。
【００６７】
モデルとしてＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを使用する実施例で実証するように、本明細書に開示する方法は酵母や糸状菌等の下等真核宿主細胞からの組換えヒト糖蛋白質（抗体を含む）の生産に特に有用である。例えば、該当蛋白質の折り畳みとアセンブリはヒトＰＤＩと場合により他の哺乳動物由来シャペロン蛋白質（例えばＥＲＯ１α及びＧＲＰ９４）により助長され、収率を改善するので、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓからの組換え蛋白質の分泌はより効率的に進行する。実施例で実証するように、本発明の方法は活性を達成するために重鎖と軽鎖をジスルフィド結合により正しく結合する必要がある抗体生産に特に有利であろう。
【００６８】
従って、本発明のこれらの方法は下等真核宿主細胞、特に酵母及び糸状菌（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からの組換え抗体の分泌における生産性が低いという問題の対処に関して大きな利点を提供する。過去に、酵母、ヒト又はマウスシャペロン蛋白質が過剰発現されているが、その成功が限られていたこととは対照的に、本発明は宿主細胞の内在性シャペロン蛋白質を異種シャペロン蛋白質で置換することにより、正しく折り畳まれ、分泌される異種蛋白質（例えば抗体）の生産性の改善が得られることを立証する。蛋白質ホモログをコードする内在性遺伝子の欠損と哺乳動物由来シャペロン蛋白質の過剰発現を組合せると、哺乳動物由来蛋白質の過剰発現のみに比較して糖蛋白質の生産性は予想外に改善される。
【００６９】
本発明者らは更に、上記のように１個以上のシャペロン遺伝子をコードする核酸分子で形質転換した宿主細胞を更に遺伝子操作し、これらの細胞から産生される組換え蛋白質の他の特徴を改善できることを見出した。これは特に酵母や糸状菌等の下等真核宿主細胞からの組換え哺乳動物糖蛋白質産生の場合に該当する。
【００７０】
例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等の下等真核細胞は分泌蛋白質のセリル及びスレオニル残基へのマンノース転移に関与する蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）と呼ばれる遺伝子ファミリーを含む。本発明者らは、１個以上のヒト化又はキメラシャペロン遺伝子を発現させるように遺伝子改変したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞株が１個以上のＰＭＴ遺伝子の欠失に良好に耐えることができ、細胞増殖又は蛋白質発現に殆ど又は全く影響を与えないことを発見した。欠失させることができるＰＭＴ遺伝子としては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５及びＰＭＴ６が挙げられる。一般に、ＯＣＨ１遺伝子とＰＭＴ遺伝子の両方を欠失させたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞は増殖が不良であるか又は全く増殖しない。ヒト様Ｎ−グリカンをもつヒト糖蛋白質を産生することができる組換えＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を構築するにはＯＣＨ１遺伝子の欠損又は機能的ノックアウトが必要である。Ｏ−グリコシル化を排除又は低下したヒト糖蛋白質を生産することが望ましいので、ヒト様Ｎ−グリカンをもつヒト糖蛋白質を産生することも可能な組換えＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞でＯ−グリコシル化を低下させるための手段を見出すことが必要であった。本発明者らは、本明細書に開示するような１個以上のシャペロン遺伝子を含むＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞を更に遺伝子改変し、ＯＣＨ１遺伝子の欠損又は機能的ノックアウトと１個以上のＰＭＴ遺伝子（例えばＰＭＴ１、ＰＭＴ４、ＰＭＴ５及び／又はＰＭＴ６）の欠損又は機能的ノックアウトを含むようにできることを見出した。これらの組換え細胞は生存可能であり、ヒト様Ｎ−グリカンの収率が高く、Ｏ−グリコシル化の低下したヒト糖蛋白質を産生する。更に、ＰＭＴ蛋白質阻害剤の存在下で細胞を増殖させることにより、Ｏ−グリコシル化を更に低下させることができた。
【００７１】
実施例に実証するように、本発明の宿主細胞は化学的ＰＭＴ蛋白質阻害剤及び／又はＰＭＴ遺伝子の欠失に対する耐性を示すので、本発明者らは本明細書に開示する方法が特性を改善した酵母や糸状菌等の下等真核宿主細胞から抗体を含む組換えヒト糖蛋白質を生産するのに特に有用であることを立証する。実施例に示すように、組換え蛋白質は従来の下等真核発現システムに比較してＯ−グリコシル化含有量とＯ−グリカン長が低下した。実施例に実証するように、本発明の方法は活性を達成するために重鎖と軽鎖をジスルフィド結合により正しく結合する必要があり、抗体のＯ−グリコシル化を低下するか又はなくすことが必要な抗体生産に特に有利であろう。
【００７２】
本発明者らは更に、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゴルジＣａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＰｐＰＭＲ１）又はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＲ  Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＡｔＥＣＡ１）の過剰発現の結果、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換したが、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼを発現しなかった上記株に比較してＯ−グリカン含有量が約２分の１に低下することを発見した。従って、他の実施形態において、本明細書に開示する宿主細胞の任意１種は更に内在性又は外来ゴルジ又はＥＲ  Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼをコードする１個以上の核酸分子を含むことができ、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼは異種プロモーターと機能的に連結されている。これらの宿主細胞はＯ−グリコシル化の低下した糖蛋白質を生産するために使用することができる。
【００７３】
カルレティキュリン（ＣＲＴ）は小胞体の内腔で主要なＣａ（２＋）結合（貯蔵）蛋白質として作用する多機能性蛋白質である。核では、転写調節に役割を果たすらしいことも分かっている。カルレティキュリンは核内受容体スーパーファミリーのＤＮＡ結合ドメインにおけるアミノ酸配列とほぼ同一の合成ペプチドＫＬＧＦＦＫＲ（配列番号７５）と結合する。カルレティキュリンは抗Ｒｏ／ＳＳＡ抗体を含む全身性エリテマトーデス及びシェーグレン症候群患者の所定の血清中の抗体と結合し、種間で高度に保存されており、小胞体と筋小胞体に位置し、カルシウムと結合することができる。カルレティキュリンは誤って折り畳まれた蛋白質と結合し、小胞体からゴルジ装置に輸送されないようにする。
【００７４】
ＥＲｐ５７は小胞体のシャペロン蛋白質であり、レクチンシャペロンカルレティキュリンとカルネキシンとに相互作用し、新規に合成された糖蛋白質の折り畳みを調節する。この蛋白質は曾てホスホリパーゼであると考えられていたが、この蛋白質は実際には蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ活性をもつことが立証された。従って、ＥＲｐ５７は小胞体（ＥＲ）の内腔蛋白質であり、蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）ファミリーのメンバーである。レクチンとこの蛋白質の複合体はその糖蛋白質基質におけるジスルフィド結合の形成を促進することにより蛋白質折り畳みを媒介すると考えられる。典型的なＰＤＩとは対照的に、ＥＲｐ５７は新規に合成された糖蛋白質と特異的に相互作用する。
【００７５】
本発明者らは更にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓでヒトＣＲＴとヒトＥＲｐ５７を過剰発現させると、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換したが、ｈＣＲＴとｈＥＲｐ５７を発現しなかった株に比較してＯ−グリカン含有量が約３分の１に低下することを見出した。従って、他の実施形態において、本発明の宿主細胞の任意１種は更に各々異種プロモーターと機能的に連結されたカルレティキュリンとＥＲｐ５７蛋白質をコードする１個以上の核酸分子を含むことができる。これらの宿主細胞はＯ−グリコシル化の低下した糖蛋白質を生産するために使用することができる。
【００７６】
従って、本発明の方法は下等真核宿主細胞、特に酵母及び糸状菌（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からの組換え抗体の分泌における生産性が低いという問題の対処に関して大きな利点を提供する。過去に、酵母、ヒト又はマウスシャペロン蛋白質が過剰発現されているが、その成功が限られていたこととは対照的に、本発明は宿主細胞の内在性シャペロン蛋白質を異種シャペロン蛋白質で置換することにより、正しく折り畳まれ、分泌される異種蛋白質（例えば抗体）の生産性の改善が得られることを立証する。蛋白質ホモログをコードする内在性遺伝子の欠失と哺乳動物由来シャペロン蛋白質の過剰発現を組合せると、哺乳動物由来蛋白質の過剰発現のみに比較して糖蛋白質の生産性は予想外に改善される。
【００７７】
従って、本発明は下等真核宿主細胞に存在する過剰発現遺伝子産物の産生を増加する方法として、内在性シャペロン蛋白質の代わりに異種シャペロン蛋白質を宿主細胞で発現させ、過剰発現遺伝子産物の産生を増加する方法を提供する。内在性シャペロン蛋白質をコードする遺伝子を破壊又は欠損させ、宿主細胞に存在するか又は提供される発現ベクターでコードされる異種シャペロン蛋白質をコードする核酸分子を発現させ、過剰発現遺伝子産物の産生を増加することにより、宿主細胞からの過剰発現遺伝子産物の産生を増加する方法も提供する。更に、宿主細胞からの過剰発現遺伝子産物の産生を増加する方法として、内在性シャペロン蛋白質の代わりに少なくとも１種の異種シャペロン蛋白質を宿主細胞で発現させる方法も提供する。本発明に関して、過剰発現遺伝子産物とはこの遺伝子産物の通常の内在性発現よりも高レベルで発現される産物である。
【００７８】
一実施形態において、前記方法は、内在性シャペロン蛋白質の発現を欠損又は破壊する段階と、１種以上の異種シャペロン蛋白質と過剰発現遺伝子産物の発現を宿主細胞で実施する段階と、過剰発現遺伝子産物の分泌に適した条件下で前記宿主細胞を培養する段階を含む。シャペロン蛋白質と過剰発現遺伝子産物の発現はシャペロン蛋白質をコードする核酸分子と過剰発現遺伝子産物をコードする核酸分子の発現を誘導することにより実施することができ、前記核酸分子は宿主細胞に存在する。
【００７９】
別の実施形態において、異種シャペロン蛋白質と過剰発現遺伝子産物の発現は第１及び第２の核酸分子の発現に適した条件下で内在性シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子の発現を破壊又は欠損させた宿主細胞に異種シャペロン蛋白質をコードする第１の核酸分子と過剰発現させる遺伝子産物をコードする第２の核酸分子を導入することにより実施される。他の態様では、前記第１及び第２の核酸分子の一方又は両方が発現ベクターに存在する。他の態様では、前記第１及び第２の核酸分子の一方又は両方が発現／組込みベクターに存在する。別の実施形態において、異種シャペロン蛋白質の発現はシャペロン蛋白質をコードする核酸分子の発現を誘導することにより実施され、内在性シャペロン蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は破壊した宿主細胞に核酸分子を導入する。第２の蛋白質の発現は前記第２の遺伝子産物をコードする核酸分子を宿主細胞に導入することにより、過剰発現させる遺伝子産物をコードする核酸分子の発現を誘導することにより実施される。
【００８０】
本発明は更に、下等真核宿主細胞に存在するＯ−グリコシル化の低下した過剰発現遺伝子産物の産生を増加する方法として、蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）ファミリーの１個以上の遺伝子を破壊又は欠失させた宿主細胞で内在性シャペロン蛋白質の代わりに異種シャペロン蛋白質を発現させ、Ｏ−グリコシル化の低下した過剰発現遺伝子産物の産生を増加する方法を提供する。内在性シャペロン蛋白質をコードする遺伝子と、ＰＭＴをコードする遺伝子を破壊又は欠損させ、宿主細胞に存在するか又は提供される発現ベクターでコードされる異種シャペロン蛋白質をコードする核酸分子を発現させ、過剰発現遺伝子産物の産生を増加することにより、宿主細胞からのＯ−グリコシル化の低下した過剰発現遺伝子産物の産生を増加する方法も提供する。更に、宿主細胞からのＯ−グリコシル化の低下した過剰発現遺伝子産物の産生を増加する方法として、少なくとも１個のＰＭＴ遺伝子を破壊又は欠損させた宿主細胞で内在性シャペロン蛋白質の代わりに少なくとも１種の異種シャペロン蛋白質を発現させる段階を含む方法も提供する。
【００８１】
一実施形態において、前記方法は、少なくとも１種の内在性シャペロン蛋白質と少なくとも１個のＰＭＴ遺伝子の発現を欠損又は破壊する段階と、１種以上の異種シャペロン蛋白質と過剰発現遺伝子産物の発現を宿主細胞で実施する段階と、Ｏ−グリコシル化の低下した過剰発現遺伝子産物の分泌に適した条件下で前記宿主細胞を培養する段階を含む。シャペロン蛋白質と過剰発現遺伝子産物の発現は、シャペロン蛋白質をコードする核酸分子と過剰発現遺伝子産物をコードする核酸分子の発現を誘導することにより実施することができ、前記核酸分子は宿主細胞に存在する。
【００８２】
別の実施形態において、異種シャペロン蛋白質と過剰発現遺伝子産物の発現は、第１及び第２の核酸分子の発現に適した条件下で、内在性シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の遺伝子と少なくとも１個のＰＭＴ遺伝子の発現を破壊又は欠損させた宿主細胞に、異種シャペロン蛋白質をコードする第１の核酸分子と、過剰発現させる遺伝子産物をコードする第２の核酸分子を導入することにより実施される。他の態様では、前記第１及び第２の核酸分子の一方又は両方が発現ベクターに存在する。他の態様では、前記第１及び第２の核酸分子の一方又は両方が発現／組込みベクターに存在する。別の実施形態において、異種シャペロン蛋白質の発現は、内在性シャペロン蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は破壊した宿主細胞でシャペロン蛋白質をコードする核酸分子の発現を誘導することにより実施される。第２の蛋白質の発現は、前記第２の遺伝子産物をコードする核酸分子を宿主細胞に導入することにより、過剰発現させる遺伝子産物をコードする核酸分子の発現を誘導することにより実施される。
【００８３】
上記実施形態の任意１種の別の態様において、異種シャペロン蛋白質は内在性シャペロン蛋白質の種又は分類に対応する。例えば、宿主細胞が酵母細胞であり、内在性シャペロン蛋白質が蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）である場合には、対応する異種ＰＤＩは哺乳動物ＰＤＩとすることができる。上記実施形態の任意１種の更に別の態様において、特定宿主細胞で発現される異種シャペロン蛋白質は過剰発現遺伝子産物の種と同一種に由来する。例えば、過剰発現遺伝子産物がヒト蛋白質である場合には、異種シャペロン蛋白質はヒトシャペロン蛋白質であり、過剰発現遺伝子産物がウシ蛋白質である場合には、異種シャペロン蛋白質はウシシャペロン蛋白質である。
【００８４】
シャペロン蛋白質としては、蛋白質の分泌を助長又は増加することが可能な任意シャペロン蛋白質が挙げられる。特に、蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ及び熱ショック７０（ｈｓｐ７０）蛋白質ファミリーのメンバーが考えられる。構造的及び機能的類似性をもち、一般にストレスにより発現を誘導される熱ショック蛋白質７０蛋白質ファミリーを表すために本明細書では小文字の「ｈｓｐ７０」を使用する。約７０，０００の分子量をもち、当分野で熱ショック蛋白質−７０として知られている種の単独の熱ショック蛋白質とｈｓｐ７０蛋白質ファミリーを区別するために、本明細書では大文字のＨＳＰ７０を使用する。従って、所定種に由来するｈｓｐ７０蛋白質ファミリーの各メンバーはこの種に由来するＨＳＰ７０蛋白質に対して構造類似性をもつ。
【００８５】
本発明は過剰発現遺伝子産物の分泌を刺激することが可能な任意シャペロン蛋白質に関する。ｈｓｐ７０蛋白質ファミリーのメンバーは構造的に相同であることが知られており、ＫＡＲ２、ＨＳＰ７０、ＢｉＰ、ＳＳＡ１−４、ＳＳＢ１、ＳＳＣ１及びＳＳＤ１遺伝子産物等の酵母ｈｓｐ７０蛋白質と、ＨＳＰ６８、ＨＳＰ７２、ＨＳＰ７３、ＨＳＣ７０、クラスリン非被覆ＡＴＰアーゼ、ＩｇＧ重鎖結合蛋白質（ＢｉＰ）、グルコース調節蛋白質７５、７８及び８０（ＧＲＰ７５、ＧＲＰ７８及びＧＲＰ８０）等の真核ｈｓｐ７０蛋白質が挙げられる。更に、本発明によると、酵母ＫＡＲ２又は哺乳動物ＢｉＰポリペプチド配列に対して十分な相同性をもつ任意ｈｓｐ７０シャペロン蛋白質を本発明の方法で使用し、過剰発現遺伝子産物の分泌を刺激することができる。ＰＤＩファミリーのメンバーも構造的に相同であり、本発明の方法に従って使用することができる任意ＰＤＩが考えられる。特に、哺乳動物（ヒトを含む）及び酵母ＰＤＩ、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβ−サブユニット、ＥＲｐ５７、ＥＲｐ２９、ＥＲｐ７２、ＧＳＢＰ、ＥＲＯ１α、ＧＲＰ９４、ＧＲＰ１７０、ＢｉＰ及びＴ３ＢＰと、酵母ＥＵＧ１が考えられる。多くの人体治療用蛋白質はヒト由来であるので、本発明の方法の１特定態様は異種シャペロン蛋白質がヒト由来であるという点にある。更に他の実施形態において、好ましい異種シャペロン蛋白質はＰＤＩ蛋白質、特にヒト由来ＰＤＩ蛋白質である。
【００８６】
ＧＡＰＤＨ等の構成的プロモーターを使用してヒトＢｉＰを過剰発現させることにより酵母細胞株における異種ヒト蛋白質の発現レベルを増加させようとする試みは殆ど成功していない。ヒトＢｉＰのホモログであるＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＡＲ２のノックアウトは細胞に有害であった。ヒトＡＴＰアーゼドメインをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＡＲ２のＡＴＰアーゼドメインで置換し、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに由来するＫＡＲ２又は他のＥＲ特異的プロモーターの制御下でヒトＢｉＰペプチド結合ドメインに融合したキメラＢｉＰ遺伝子を構築することにより、従来技術の欠点を解決することができる。上記のような内在性ＰＤＩ１遺伝子の置換をキメラＢｉＰとヒトＥＲｄｊ３の使用に組合せることにより収率を更に改善することができる。
【００８７】
他の態様では、過剰発現遺伝子産物は分泌遺伝子産物である。過剰発現遺伝子産物が分泌されるか否かを観測する方法は当業者に容易に入手可能である。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，（Ｅｄ．）１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、及びＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．は分泌遺伝子産物の検出方法を記載している。
【００８８】
過剰発現遺伝子産物を分泌させるためには、過剰発現遺伝子産物の分泌に十分な条件下で宿主細胞を培養する。このような条件としては、細胞による分泌を可能にする温度、栄養及び細胞密度条件が挙げられる。更に、このような条件は細胞が蛋白質の転写、翻訳及びある細胞区画から別の細胞区画への移動の基本的な細胞機能を実施できる条件である。
【００８９】
更に、当業者に公知の通り、分泌遺伝子産物は本発明の宿主細胞を維持又は増殖させるために使用される培地中で検出することができる。培地は公知手法（例えば遠心又は濾過）により宿主細胞から分離することができる。その後、過剰発現遺伝子産物の特徴的な既知特性を利用することにより無細胞培地で過剰発現遺伝子産物を検出することができる。このような特性としては、過剰発現遺伝子産物の顕著な免疫、酵素又は物理的特性が挙げられる。例えば、過剰発現遺伝子産物がユニークな酵素活性をもつ場合には、宿主細胞により使用される培地でこの活性のアッセイを実施することができる。更に、所定の過剰発現遺伝子産物に対して反応性の抗体が入手可能な場合には、任意の公知免疫アッセイで遺伝子産物を検出するためにこのような抗体を使用することができる（Ｈａｒｌｏｗｅら，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ参照）。
【００９０】
更に、分泌遺伝子産物は、遺伝子産物の分泌を容易にする異種シグナル又はリーダーペプチドを遺伝子産物に付加した融合蛋白質とすることができる。分泌シグナルペプチドは不連続なアミノ酸配列であるため、宿主細胞は遺伝子産物を細胞内膜及び外膜から細胞外環境に誘導する。分泌の対象となる新生ポリペプチド遺伝子産物のＮ末端には分泌シグナルペプチドが存在する。他の真核分泌シグナルも特定アミノ酸に結合した糖鎖形態、即ちグリコシル化分泌シグナルとして遺伝子産物のポリペプチド鎖に沿って存在することができる。
【００９１】
Ｎ末端シグナルペプチドは約１０〜約３０アミノ酸の疎水性ドメインを含み、その前に約２〜約１０アミノ酸の短い荷電ドメインが存在する場合もある。更に、シグナルペプチドは分泌の対象となる遺伝子産物のＮ末端に存在する。一般に、シグナル配列の特定配列は重要ではないが、シグナル配列はアラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、メチオニン（Ｍｅｔ）等の疎水性アミノ酸リッチである。
【００９２】
多数のシグナルペプチドが公知である（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：４２５（１９８２））。例えば、酵母酸ホスファターゼ、酵母インベルターゼ及び酵母α因子シグナルペプチドが異種ポリペプチドコーディング領域に結合され、異種ポリペプチドの分泌に使用するのに成功している（例えばＳａｔｏら，Ｇｅｎｅ  ８３：３５５−３６５（１９８９）；Ｃｈａｎｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１８１２−１８１９（１９８６）；及びＢｒａｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：４６４２−４６４６（１９８４）参照）。従って、当業者は更に５’末端にシグナルペプチドをもつ過剰発現遺伝子産物のコーディング領域をコードする核酸分子を容易に設計又は獲得することができる。
【００９３】
本発明の方法により分泌することが好ましい過剰発現遺伝子産物の例としては、酵素、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ワクチン、抗体等の哺乳動物遺伝子産物が挙げられる。より特定的には、過剰発現遺伝子産物としては限定されないが、エリスロポエチン、インスリン、ソマトトロピン、成長ホルモン放出因子、血小板由来増殖因子、表皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、表皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、神経成長因子、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子ＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、顆粒球コロニー刺激因子、多系列コロニー刺激活性、顆粒球−マクロファージ刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、Ｔ細胞増殖因子、リンホトキシン、免疫グロブリン、抗体等の遺伝子産物が挙げられる。更に融合蛋白質も挙げられ、限定されないが、免疫グロブリン又は抗体の定常領域に融合したペプチド及びポリペプチドが挙げられる。特に有用な過剰発現遺伝子産物はヒト遺伝子産物である。
【００９４】
「抗体」、「複数の抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は組換えＤＮＡ技術により作製される任意組換えモノクローナル抗体を包含し、更にヒト化抗体とキメラ抗体も包含する。
【００９５】
本発明の方法はワクチンとして使用することができる任意過剰発現遺伝子産物の分泌を増加するように容易に適応させることができる。ワクチンとして使用することができる過剰発現遺伝子産物としては、哺乳動物病原体の任意構造遺伝子産物、膜会合型遺伝子産物、膜結合型遺伝子産物又は分泌型遺伝子産物が挙げられる。哺乳動物病原体としては、哺乳動物に感染又は攻撃することが可能なウイルス、細菌、単細胞又は多細胞寄生虫が挙げられる。例えば、ウイルスワクチンとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、リケッチア（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、ワクシニア、赤痢菌、ポリオウイルス、アデノウイルス、インフルエンザ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、デング熱ウイルス、Ｂ型日本脳炎、水痘帯状疱疹（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ）、サイトメガロウイルス、Ａ型肝炎、ロタウイルス等のウイルスに対するワクチンと、ライム病、麻疹、黄熱病、流行性耳下腺炎、狂犬病、ヘルペス、インフルエンザ、パラインフルエンザ等のウイルス疾患に対するワクチンが挙げられる。細菌ワクチンとしては、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｎｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、リン菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス菌（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）等の細菌に対する細菌ワクチンが挙げられる。
【００９６】
一般に、本発明の過剰発現遺伝子産物と異種シャペロン蛋白質は組換え発現され、即ち遺伝子産物又はシャペロン蛋白質をコードする核酸分子を発現ベクターに配置することにより発現される。このような発現ベクターは配列が遺伝子産物又はシャペロン蛋白質をコードする核酸分子と機能的に連結されているときに遺伝子産物又は異種シャペロン蛋白質の発現を生じる配列を最低限含む。このような発現ベクターは更に複製起点、選択マーカー、転写又は終結シグナル、セントロメア、自律複製配列等の他のエレメントを含むことができる。
【００９７】
本発明によると、過剰発現遺伝子産物及び／又は異種シャペロン蛋白質の調節発現を可能にするように、夫々過剰発現遺伝子産物と異種シャペロン蛋白質をコードする第１及び第２の核酸分子を発現ベクター内に配置することができる。異種シャペロン蛋白質と過剰発現遺伝子産物を同一発現ベクターでコードさせてもよいが、過剰発現遺伝子産物をコードするベクターとは異なる発現ベクターで異種シャペロン蛋白質をコードすることが好ましい。異種シャペロン蛋白質と過剰発現遺伝子産物をコードする核酸分子を別々の発現ベクターに配置すると、過剰発現遺伝子産物の分泌量を増加することができる。
【００９８】
本明細書で使用する発現ベクターは複製可能又は複製不能な発現ベクターとすることができる。複製可能な発現ベクターは宿主細胞染色体ＤＮＡから独立して複製することもできるし、又はこのようなベクターは宿主細胞染色体ＤＮＡに組込まれているために複製することができる。宿主細胞染色体ＤＮＡに組込まれると、このような発現ベクターは多少の構造エレメントを失う可能性があるが、遺伝子産物又はシャペロン蛋白質をコードする核酸分子と、遺伝子産物又は異種シャペロン蛋白質の発現を誘導することが可能なセグメントを保持する。従って、本発明の発現ベクターは染色体組込み又は染色体非組込み発現ベクターとすることができる。
【００９９】
別の実施形態では、組込み又は非組込み発現ベクターを宿主細胞に導入することにより１種以上の異種シャペロン蛋白質を宿主細胞で過剰発現させる。少なくとも１種のシャペロン蛋白質をコードする少なくとも１個の発現ベクターの導入後、遺伝子産物をコードする内在性遺伝子の発現を誘導するか又は遺伝子産物をコードする発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、遺伝子産物を過剰発現させる。別の実施形態では、少なくとも１種の異種シャペロン蛋白質を構成的又は誘導的に発現する細胞株を樹立する。過剰発現させる遺伝子産物をコードする発現ベクターをこのような細胞株に導入し、過剰発現遺伝子産物の分泌増加を達成する。
【０１００】
発現ベクターが異種シャペロン蛋白質又は過剰発現遺伝子産物の発現を可能にし、従って、選択された宿主細胞種におけるこのような遺伝子産物の分泌を助長する限り、本発明の発現ベクターは一方の宿主細胞種（例えば大腸菌）で複製可能であり、別の宿主細胞種（例えば真核宿主細胞）では殆ど又は全く複製しない。
【０１０１】
本明細書に記載するような発現ベクターとしては、所望遺伝子、即ち本発明のシャペロン蛋白質又は過剰発現遺伝子産物をコードする遺伝子を制御下に発現させるように構築したＤＮＡ又はＲＮＡ分子が挙げられる。このようなベクターは更に本発明のシャペロンポリペプチド又は本発明の過剰発現遺伝子産物をコードする核酸分子と機能的に連結された核酸分子セグメントをコードする。この関連で機能的に連結されているとは、このようなセグメントがシャペロン蛋白質又は過剰発現遺伝子産物をコードする核酸分子の発現を実施できることを意味する。これらの核酸配列としては、プロモーター、エンハンサー、上流制御エレメント、転写因子又はリプレッサー結合部位、終結因子及び該当宿主細胞で対照遺伝子発現を制御することができる他のエレメントが挙げられる。ベクターはベクター、バクテリオファージ、コスミド又はウイルスが好ましい。
【０１０２】
本発明の発現ベクターは酵母又は哺乳動物細胞で機能する。酵母ベクターとしては、酵母２μサークルとその誘導体、酵母自律複製配列をコードする酵母ベクター、酵母ミニ染色体、任意酵母組込みベクター等が挙げられる。多種の酵母ベクターの一覧がＰａｒｅｎｔら（Ｙｅａｓｔ  １：８３−１３８（１９８５））に記載されている。
【０１０３】
遺伝子産物の発現を実施することが可能なエレメント又は核酸配列としては、プロモーター、エンハンサーエレメント、上流活性化配列、転写終結シグナル及びポリアデニル化部位が挙げられる。本発明の発現ベクターではこのようなプロモーター及び転写調節エレメントを単独又は組合せて使用することが想定される。更に、遺伝子操作及び突然変異させた調節配列も本発明に含まれる。
【０１０４】
プロモーターは遺伝子発現を制御するためのＤＮＡ配列エレメントである。特に、プロモーターは転写開始部位を指定し、ＴＡＴＡボックス及び上流プロモーターエレメントが挙げられる。選択されるプロモーターは選択される特定宿主系で機能的であると予想されるものである。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ又はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母宿主細胞を使用する場合には、酵母プロモーターを本発明の発現ベクターで使用し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ又はＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ等の宿主細胞では真菌プロモーターを使用する。酵母プロモーターの例としては限定されないが、ＧＡＰＤＨ、ＡＯＸ１、ＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＣＹＣ１、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＦα１、ＰＭＡ１、ＰＤＩ、ＴＥＦ及びＧＵＴ１プロモーターが挙げられる。Ｒｏｍａｎｏｓら（Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８（１９９２））は酵母プロモーターと発現ベクターについて概説している。
【０１０５】
本明細書に開示する核酸分子と機能的に連結されるプロモーターは構成的プロモーターでも誘導プロモーターでもよい。誘導プロモーターとは、転写因子と結合すると、速度を増加又は低下して転写を誘導するプロモーターである。本明細書で使用する転写因子としては、プロモーターの調節又は制御領域と結合することができ、従って、転写に作用することが可能な任意因子が挙げられる。転写因子の合成又は宿主細胞内におけるプロモーター結合能は宿主をインデューサーに暴露するか又はインデューサーを宿主細胞環境から除去することにより制御することができる。従って、誘導プロモーターの発現を調節するためには、インデューサーを付加するか、又は宿主細胞の増殖培地から除去する。このようなインデューサーとしては、糖類、リン酸塩、アルコール、金属イオン、ホルモン、熱、冷却等が挙げられる。例えば、酵母で一般に使用されるインデューサーはグルコース、ガラクトース等である。
【０１０６】
選択される転写終結配列は選択される特定宿主細胞で機能的なものである。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ又はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母宿主細胞を使用する場合には、酵母転写終結因子を本発明の発現ベクターで使用し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ又はＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ等の宿主細胞では真菌転写終結配列を使用する。転写終結配列としては限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＹＣ転写終結配列（ＳｃＣＹＣ  ＴＴ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＬＧ３転写終結配列（ＡＬＧ３  ＴＴ）、及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＭＡ１転写終結配列（ＰｐＰＭＡ１  ＴＴ）が挙げられる。
【０１０７】
本発明の発現ベクターは更に選択マーカーをコードすることができる。選択マーカーは選択マーカーをもつベクターで形質転換された細胞を非形質転換細胞から区別できるように識別可能な形質を宿主細胞に付与する遺伝子機能である。マーカーに関連する遺伝子機能を宿主細胞集団に維持するためにベクターへの選択マーカーの付加を使用することもできる。このような選択マーカーは任意の容易に同定されるドミナント形質（例えば薬剤耐性、細胞栄養を合成又は代謝する能力等）を付与することができる。
【０１０８】
酵母選択マーカーとしては、酵母宿主細胞に必須細胞栄養素（例えばアミノ酸）を合成させる薬剤耐性マーカー及び遺伝子機能が挙げられる。酵母で一般に使用される薬剤耐性マーカーとしては、クロラムフェノコール、カナマイシン、メトトレキセート、Ｇ４１８（ゲネチシン）、ゼオシン等が挙げられる。対応するゲノム機能に栄養要求性突然変異をもつ入手可能な酵母株で酵母宿主細胞に必須細胞栄養素を合成させる遺伝子機能を使用する。一般的な酵母選択マーカーはロイシン（ＬＥＵ２）、トリプトファン（ＴＲＰ１及びＴＲＰ２）、ウラシル（ＵＲＡ３，ＵＲＡ５  ＵＲＡ６）、ヒスチジン（ＨＩＳ３）、リジン（ＬＹＳ２）、アデニン（ＡＤＥ１又はＡＤＥ２）等を合成するための遺伝子機能を提供する。他の酵母選択マーカーとしては、亜ヒ酸塩の存在下で増殖させる酵母細胞に亜ヒ酸塩耐性を付与するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡＲＲ３遺伝子が挙げられる。（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−０６６（１９９７））。多数の適切な組込み部位としては米国出願公開第２００７００７２２６２号に記載されているものが挙げられ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び他の酵母又は真菌類に公知の遺伝子座のホモログが挙げられる。
【０１０９】
従って、本発明の発現ベクターは培養に存在する細胞集団内でベクターを保有する宿主細胞を同定及び維持するために有用な選択マーカーをコードすることができる。状況によっては、発現ベクターのコピー数を増幅するために選択マーカーを使用することもできる。過剰発現遺伝子産物又は異種シャペロン蛋白質をコードするＲＮＡを産生するように本発明の発現ベクターから転写誘導後、遺伝子産物又は異種シャペロン蛋白質を産生するように細胞内因子によりＲＮＡを翻訳する。
【０１１０】
酵母及び他の真核生物では、ｍＲＮＡの５’キャップとリボソームが結合し、ポリペプチド合成を開始できる最初のＡＵＧ開始コドンまでｍＲＮＡに沿ってリボソームが移動することにより、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳が開始する。原核発現系では必要な場合もあるが、酵母及び哺乳動物細胞における発現には一般にリボソーム結合部位と開始コドンの間に特定数のヌクレオチドが不要である。他方、酵母又は哺乳動物宿主細胞における発現では、ｍＲＮＡの最初のＡＵＧコドンが目的の翻訳開始コドンであることが好ましい。
【０１１１】
更に、酵母宿主細胞で発現を実施する場合には、長い非翻訳リーダー配列（例えば５０〜１００ヌクレオチドよりも長い配列）が存在すると、ｍＲＮＡの翻訳が低下する可能性がある。酵母ｍＲＮＡリーダー配列は平均約５０ヌクレオチド長であり、アデニンリッチであり、二次構造が殆どなく、大抵は最初のＡＵＧ開始コドンを使用する。これらの特徴をもたないリーダー配列は蛋白質翻訳効率を低下させる可能性があるので、酵母宿主細胞における過剰発現遺伝子産物又はシャペロン蛋白質の発現には酵母リーダー配列を使用することが好ましい。多数の酵母リーダー配列が知られており、例えばＣｉｇａｎら（Ｇｅｎｅ  ５９：１−１８（１９８７））を参照することにより当業者に入手可能である。
【０１１２】
プロモーター、リボソーム結合部位及び開始コドンの位置以外に、得られる発現レベルに影響を与える可能性のある因子としては、複製可能な発現ベクターのコピー数が挙げられる。ベクターのコピー数はベクターの複製起点と関連するシス作用性制御エレメントが存在する場合にはこのようなエレメントにより一般に決定される。例えば、セントロメアに近接するプロモーターから転写を誘導することにより、調節されるセントロメアをコードする酵母エピソームベクターのコピー数の増加を達成することができる。更に、酵母ベクターで酵母ＦＬＰ機能をコードさせてもベクターのコピー数を増加することができる。
【０１１３】
当業者は入手可能なベクターに由来するＤＮＡフラグメントを結合するか、このような調節エレメントをコードする核酸分子を合成するか、又は新規調節エレメントを本発明のベクターにクローン化することにより、上記配列を含む発現ベクターを容易に設計及び作製することもできる。発現ベクターの作製方法は周知である。過剰発現ＤＮＡ法は遺伝子工学に関する無数の標準実験室マニュアルのいずれかに記載されている。
【０１１４】
本発明の発現ベクターは異種シャペロン蛋白質コーディング領域をプロモーター及び遺伝子発現を制御するために使用される他の配列エレメントと正しい向きでライゲーションすることにより作製することができる。本発明の発現ベクターの構築後、過剰発現遺伝子産物と異種シャペロン蛋白質を発現させることが可能な宿主細胞にこのようなベクターを形質転換する。酵母及び他の下等真核細胞を発現ベクターで形質転換する方法は当業者に周知であり、容易に利用可能である。例えば、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法、エクトロポレーション及び同等手順等の数種の手順のいずれかにより発現ベクターを酵母細胞に形質転換することができる。
【０１１５】
酵母複製可能な発現ベクターと併用することができる酵母宿主細胞としては、分泌可能な任意野生型又は突然変異体酵母株が挙げられる。このような株はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及び近縁酵母種に由来することができる。一般に、有用な突然変異体酵母株としては、選択マーカーをコードする酵母ベクターと併用することができる遺伝子欠損をもつ株が挙げられる。多種の酵母株がＹｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｄｏｒｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．９４７２０）、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２，以下ＡＴＣＣ）、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｌｎｅｙ  Ｌａｎｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＮＲ４７ＵＡ，ＵＫ）及びｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｊｕｌｉａｎａｌａａｎ  ６７ａ，２６２８  ＢＣ  Ｄｅｌｆｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能である。
【０１１６】
一般に、酵母等の下等真核生物は経済的に培養することができ、収率が高く、適切に改変すると、適切なグリコシル化が可能であるため、糖蛋白質の発現に有用である。酵母は特に迅速形質転換、試験蛋白質局在ストラテジー及び平易な遺伝子ノックアウト技術を可能にする確立された遺伝子工学材料である。適切なベクターは必要に応じてプロモーター（３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の糖分解酵素を含む）、複製起点、終結配列等の発現制御配列をもつ。
【０１１７】
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ及びＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ等の各種酵母は高い細胞密度まで増殖し、大量の組換え蛋白質を分泌することができるので、細胞培養に有用である。同様に、本発明の糖蛋白質を工業的規模で生産するためにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ等の糸状菌も使用することができる。
【０１１８】
グリコシル化パターンがヒト様であるか又はヒト化された糖蛋白質を発現するように下等真核生物、特に酵母を遺伝子改変することができる。これは、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，ＵＳ２００４００１８５９０に記載されているように選択された内在性グリコシル化酵素を排除すること及び／又は外来酵素を供給することにより達成できる。例えば、欠損させないと糖蛋白質のＮ−グリカンにマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損させるように宿主細胞を選択又は構築することができる。
【０１１９】
一実施形態において、宿主細胞は更に、通常では触媒ドメインと結合しておらず、α１，２−マンノシダーゼ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置に標的指向化するように選択された細胞内標的指向化シグナルペプチドと融合したα１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質（例えばＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質組成物）が産生される。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号と米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び２００５／０１７０４５２号はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖蛋白質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示している。
【０１２０】
別の実施形態において、前記宿主細胞は更に、通常では触媒ドメインと結合しておらず、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置に標的指向化するように選択された細胞内標的指向化シグナルペプチドと融合したＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴ  Ｉ）触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質（例えばＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質組成物）が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号と米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び２００５／０１７０４５２号はＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖蛋白質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示している。上記細胞で産生された糖蛋白質をヘキソサミニダーゼでインビトロ処理し、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質を作製することができる。
【０１２１】
別の実施形態において、前記宿主細胞は更に、通常では触媒ドメインと結合しておらず、マンノシダーゼＩＩ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置に標的指向化するように選択された細胞内標的指向化シグナルペプチドと融合したマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質（例えばＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質組成物）が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号及び米国特許出願公開第２００４／０２３００４２号はマンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主体とする糖蛋白質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示している。上記細胞で産生された糖蛋白質をヘキソサミニダーゼでインビトロ処理し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質を作製することができる。
【０１２２】
別の実施形態において、前記宿主細胞は更に、通常では触媒ドメインと結合しておらず、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置に標的指向化するように選択された細胞内標的指向化シグナルペプチドと融合したＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴ  ＩＩ）触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質（例えばＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質組成物）が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号と米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び２００５／０１７０４５２号はＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖蛋白質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示している。上記細胞で産生された糖蛋白質をヘキソサミニダーゼでインビトロ処理し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質を作製することができる。
【０１２３】
別の実施形態において、前記宿主細胞は更に、通常では触媒ドメインと結合しておらず、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置に標的指向化するように選択された細胞内標的指向化シグナルペプチドと融合したガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２もしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム又はその混合物を含む組換え糖蛋白質（例えばＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム又はその混合物を主体とする組換え糖蛋白質組成物）が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号と米国特許出願公開第２００６／００４０３５３号はＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖蛋白質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示している。上記細胞で産生された糖蛋白質をガラクトシダーゼでインビトロ処理し、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質（例えばＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質組成物）を作製することができる。
【０１２４】
別の実施形態において、前記宿主細胞は更に、通常では触媒ドメインと結合しておらず、シアリルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置に標的指向化するように選択された細胞内標的指向化シグナルペプチドと融合したシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム又はその混合物を主体とする組換え糖蛋白質が産生される。酵母や糸状菌等の下等真核宿主細胞では、更にＮ−グリカンに転移するためにＣＭＰ−シアル酸を提供するための手段を宿主細胞に加えると有用である。米国特許出願公開第２００５／０２６０７２９号はＣＭＰ−シアル酸合成経路をもつように下等真核生物を遺伝子操作するための方法を開示しており、米国特許出願公開第２００６／０２８６６３７号はシアル酸を付加した糖蛋白質を産生するように下等真核生物を遺伝子操作するための方法を開示している。上記細胞で産生された糖蛋白質をノイラミニダーゼでインビトロ処理し、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォーム又はその混合物を主体とする組換え糖蛋白質を作製することができる。
【０１２５】
上記宿主細胞の任意１種は更に、米国特許出願公開第２００４／０７４４５８号及び２００７／００３７２４８号に開示されているような分岐型（ＧｎＴ  ＩＩＩ）及び／又は複数側鎖（ＧｎＴ  ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＩＸ）Ｎ−グリカン構造をもつ糖蛋白質を産生するようにＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ及びＧｎＴ  ＩＸから構成される群から選択される１種以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを含むことができる。
【０１２６】
他の実施形態において、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主体とする糖蛋白質を産生する宿主細胞は更に、通常では触媒ドメインと結合しておらず、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置に標的指向化するように選択された細胞内標的指向化シグナルペプチドと融合したガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質が産生される。
【０１２７】
別の実施形態において、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主体とする糖蛋白質を産生する前記宿主細胞は更に、通常では触媒ドメインと結合しておらず、シアリルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置に標的指向化するように選択された細胞内標的指向化シグナルペプチドと融合したシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質が産生される。
【０１２８】
上記各種宿主細胞は更に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター（例えばＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ及びＭａｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター）、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター（例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター）、及びＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（例えばヒトシアル酸トランスポーター）等の１種以上の糖トランスポーターを含む。酵母や糸状菌等の下等真核宿主細胞は上記トランスポーターをもたないので、上記トランスポーターを含むように酵母や糸状菌等の下等真核宿主細胞を遺伝子操作することが好ましい。
【０１２９】
上記宿主細胞の他の実施形態では、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＢＭＴ２）（米国特許出願公開第２００６／０２１１０８５号参照）を欠損又は破壊することによりα−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンをもつ糖蛋白質を排除し、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１及びＭＮＮ４Ｂ（例えば米国特許第７，１９８，９２１号及び７，２５９，００７号参照）の一方又は両方を欠損又は破壊することによりホスホマンノース残基をもつ糖蛋白質を排除するように宿主細胞を更に遺伝子操作する。上記宿主細胞の更に他の実施形態では、蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼの１個以上（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：蛋白質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）（米国特許第５，７１４，３７７号参照）を欠損又は破壊することにより糖蛋白質のＯ−グリコシル化を排除するように宿主細胞を更に遺伝子改変するか、又は国際出願公開第ＷＯ２００７０６１６３１号に開示されているようにＰｍｔ−１、Ｐｍｔｉ−２及びＰｍｔｉ−３等の阻害剤の存在下で増殖させるか、又はその両方を実施する。
【０１３０】
従って、糖蛋白質を産生するように遺伝子改変された宿主細胞も提供し、主体となるＮ−グリカンとしては限定されないが、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２が挙げられる。更に上記Ｎ−グリカンの特定混合物を含有する糖蛋白質を産生する宿主細胞も含まれる。
【０１３１】
以下の実施例では、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ種の宿主細胞で異種ヒト蛋白質を発現させる。これらの実施例は本発明の特定実施形態について本発明を実証するものであり、如何なる点でも限定的であると解釈すべきではない。本明細書の開示と実施例を通読した当業者は記載する方法及び材料に加え、本発明の実施の範囲内で可能な多数の変形、変更及び改良に想到しよう。
【実施例１】
【０１３２】
本実施例は、内在性ＰＤＩ１をコードする遺伝子を不活性化し、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換した宿主細胞を使用することによりＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける異種ヒト蛋白質の発現が増加したことを示す。本実施例は更にこれらの宿主細胞がＯ−グリコシル化の低下した組換え抗体を産生したことを示す。
【０１３３】
ヒトＰＤＩ蛋白質をコードする発現カセットと、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１をコードする遺伝子を、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子で置換するためにプラスミドベクターをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子座に標的指向化するための核酸分子を含む発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を以下のように実施し、図８に示す。プライマーとしてｈＰＤＩ／ＵＰ１：５’−ＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＣ−３’（配列番号１）及びｈＰＤＩ／ＬＰ−ＰａｃＩ：５’−ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＴＣＡＴ−３’（配列番号２）と、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）と、ヒト肝ｃＤＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してヒトＰＤＩをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、及び７２℃で１．５分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１にクローン化し、プラスミドベクターｐＧＬＹ６１８を作製した。ヒトＰＤＩのヌクレオチド配列とアミノ酸配列（夫々配列番号３９及び４０）を表１１に示す。
【０１３４】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１のヌクレオチド配列とアミノ酸配列（夫々配列番号４１及び４２）を表１１に示す。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡに由来する領域のＰＣＲ増幅によりＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１  ５’及び３’領域を含む核酸分子の単離を行った。プライマーとしてＰＢ２４８：５’−ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＡＴＡＴＣＧＧＣＣＡＴＴＧＴＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＡＧ−３’（配列番号３）；ＰＢ２４９：５’−ＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣ−３’（配列番号４）を使用して５’領域を増幅した。プライマーとしてＰＢ２５０：５’−ＡＧＡＣＴＡＧＴＣＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣ−３’（配列番号５）；ＰＢ２５１：５’−ＡＴＣＴＣＧＡＧＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧ−３’（配列番号６）を使用して３’領域を増幅した。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で２．５分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。得られたＰＣＲフラグメントＰｐＰＤＩ１（５’）及びＰｐＰＤＩ１（３’）をプラスミドベクターｐＣＲ２．１に別々にクローン化し、夫々プラスミドベクターｐＧＬＹ６２０及びｐＧＬＹ６１７を作製した。ｐＧＬＹ６７８を構築するために、プラスミドベクターをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＲＧ３遺伝子座に標的指向化する組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２４のＤＮＡフラグメントＰｐＡＲＧ３−５’及びＰｐＡＲＧ−３’を、プラスミドベクターｐＧＬＹ６７８をＰＤＩ１遺伝子座に標的指向化してＰＤＩ１遺伝子座の発現を破壊するＤＮＡフラグメントＰｐＰＤＩ（５’）及びＰｐＰＤＩ（３’）で夫々置換した。
【０１３５】
次にヒトＰＤＩをコードする核酸分子をプラスミドベクターｐＧＬＹ６７８にクローン化し、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰＤＨプロモーター（ＰｐＧＡＰＤＨ）の制御下においたプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を作製した。５’末端ＮｏｔＩ制限酵素部位と平滑３’末端をもつＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α接合因子プレシグナルペプチド（ＳｃαＭＦプレシグナルペプチド）（配列番号２８）をコードする核酸分子（配列番号２７）と、ＡｆｅＩとＰａｃＩでプラスミドベクターｐＧＬＹ６１８から遊離させたヒトＰＤＩをコードする核酸分子を含む発現カセットをライゲーションし、平滑５’末端と３’末端ＰａｃＩ部位をもつ核酸分子を作製し、ＮｏｔＩとＰａｃＩで消化したプラスミドベクターｐＧＬＹ６７８に挿入することにより、発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を構築した。得られた組込み／発現プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓプロモーターと機能的に連結されたヒトＰＤＩ／ＳｃαＭＦプレシグナルペプチド融合蛋白質をコードする発現カセットと、ＰＤＩ１遺伝子座の破壊とＰＤＩ１遺伝子座への発現カセットの組込みのためにプラスミドベクターをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子座に標的指向化するための核酸分子配列を含む。図８はプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を示す。ＳｃαＭＦプレシグナルペプチドのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号２７及び２８に示す。
【０１３６】
ヒトＥＲＯ１α蛋白質をコードする発現／組込みベクターｐＧＬＹ２２３２の構築を以下のように実施し、図９に示す。ヒトＥＲＯ１α蛋白質をコードする核酸分子をＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成し、これを使用してプラスミドベクターｐＧＬＹ２２２４を構築した。ヒトＥＲＯ１α蛋白質のヌクレオチド配列とアミノ酸配列（夫々配列番号４３及び４４）を表１１に示す。制限酵素ＡｆｅＩ及びＦｓｅＩを使用してヒトＥＲＯ１α蛋白質をコードする核酸分子をプラスミドベクターから遊離させた後、上記のように５’ＮｏｔＩ末端と３’平滑末端をもつＳｃαＭＰプレシグナルペプチドをコードする核酸分子とライゲーションし、ＮｏｔＩとＦｓｅＩで消化したプラスミドベクターｐＧＬＹ２２２８に挿入した。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２８はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＲＢ１遺伝子の５’及び３’領域（夫々ＰｐＰＲＢ１−５’及びＰｐＰＲＢ１−３’領域）を含む核酸分子も含んでいた。得られたプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３０をＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで消化後、ＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで消化したプラスミドベクターｐＧＬＹ２１８７から得られたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１プロモーター（ＰｐＰＤＩプロモーター）を含む核酸分子とライゲーションした。ＰｐＰＤＩプロモーターのヌクレオチド配列は５’−ＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＴＧＴＡＡＡＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＴＧＧＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＴＡＴＴＧＴＣＴＴＡＣＧＣＧＧＣＴＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＣＡＡＴＣＣＣＣＡＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＣＣＣＡＣＴＣＡＡＡＧＡＴＡＡＴＣＴＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＣＣＴＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＧＴＣＧＣＧＡＴＣＡＣＣＣＣＴＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＴＧＡＡＣＡＣＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＴＡＴＡＡＧＡ−３’（配列番号５９）である。得られたプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１プロモーターの制御下にヒトＥＲＯ１α融合蛋白質をコードする発現カセットを含み、ＰＲＢ１遺伝子座の破壊とＰＲＢ１遺伝子座への発現カセットの組込みのためにゲノムのＰＲＢ１遺伝子座にプラスミドベクターを標的指向化するためのＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＲＢ１遺伝子の５’及び３’領域を含む発現／組込みベクターである。図９はプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２の構築を示す。
【０１３７】
ヒトＧＲＰ９４蛋白質をコードする発現／組込みベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を以下のように実施し、図１０に示す。プライマーとしてｈＧＲＰ９４／ＵＰ１：５’−ＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＴＡＣＡＧＴＡＧ−３’（配列番号１５）；及びｈＧＲＰ９４／ＬＰ１：５’−ＧＧＣＣＧ  ＧＣＣＴＴ  ＡＣＡＡＴ  ＴＣＡＴＣ  ＡＴＧＴＴ  ＣＡＧＣＴ  ＧＴＡＧＡ  ＴＴＣ−３’（配列番号１６）を使用してヒトＧＲＰ９４をヒト肝ｃＤＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、及び７２℃て２．５分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。ＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１にクローン化し、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２１６を作製した。ヒトＧＲＰ９４のヌクレオチド配列とアミノ酸配列（夫々配列番号４５及び４６）を表１１に示す。
【０１３８】
プラスミドベクターｐＧＬＹ２２１６からヒトＧＲＰ９４をコードする核酸分子をＡｆｅＩとＦｓｅＩで遊離させた。上記のようにＮｏｔＩ末端と平滑末端をもつＳｃαＭＰプレシグナルペプチドをコードする核酸分子に前記核酸分子をライゲーションし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＥＰ４  ５’及び３’領域（夫々ＰｐＰＥＰ４−５’及びＰｐＰＥＰ４−３’領域）を含む核酸分子をもつプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３１をＮｏｔＩとＦｓｅＩで消化後に挿入し、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２９を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２９をＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで消化し、プラスミドベクターｐＧＬＹ２１８７からＰｐＰＤＩ１プロモーターを含むＤＮＡフラグメントをＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで切出し、このＤＮＡフラグメントをｐＧＬＹ２２２９にライゲーションし、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩプロモーターの制御下にヒトＧＲＰ９４融合蛋白質をコードし、ＰＥＰ４遺伝子座の破壊とＰＥＰ４遺伝子座への発現カセットの組込みのためにゲノムのＰＥＰ４遺伝子座にプラスミドベクターを標的指向化するためのＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＥＰ４遺伝子の５’及び３’領域を含む。図１０はプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を示す。
【０１３９】
プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２、ｐＧＬＹ１８９６及びｐＧＦＩ２０７ｔの構築を以下のように実施した。全Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  α−１，２−マンノシダーゼ発現プラスミドベクターはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  αＭＡＴプレシグナルペプチドに融合したＴ．ｒｅｅｓｅｉ  α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（国際出願公開第ＷＯ２００７０６１６３１号参照）をコードし、発現をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰプロモーターの制御下におき、プラスミドベクターの組込みをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＲＯ１遺伝子座に標的指向化し、選択にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子を使用するｐＧＦＩ１６５に由来するものとした。プラスミドベクターｐＧＦＩ１６５の地図を図１１に示す。
【０１４０】
ｐＧＦＩ１６５のＧＡＰプロモーターをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ１（ＰｐＡＯＸ１）プロモーターで置換することによりプラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２を作製した。これはｐＧＬＹ２０２８からＥｃｏＲＩ（平滑化）−ＢｇｌＩＩフラグメントとしてＰｐＡＯＸ１プロモーターを単離し、ＮｏｔＩ（平滑化）とＢｇｌＩＩで消化したｐＧＦＩ１６５に挿入することにより実施した。プラスミドベクターの組込みはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＲＯ１遺伝子座を標的とし、選択にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子を使用する。プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２の地図を図１２に示す。
【０１４１】
プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＮＮ２膜挿入リーダーペプチド融合蛋白質（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５０２２（２００３）参照）に融合したマウスα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインをコードする発現カセットをプラスミドベクターｐＧＦＩ１６５（図１２）に挿入したものである。これはＸｈｏＩ（末端平滑化）とＰｍｅＩで消化したｐＧＬＹ１４３３からＧＡＰｐ−ＳｃＭＮＮ２−マウスＭＮＳＩ発現カセットを単離し、ＰｍｅＩで消化したｐＧＦＩ１６５にフラグメントを挿入することにより実施した。プラスミドベクターの組込みはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＲＯ１遺伝子座を標的とし、選択にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５遺伝子を使用する。プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６の地図を図１１に示す。
【０１４２】
プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔは亜ヒ酸塩耐性を付与するようにＵＲＡ５選択マーカーをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＲＲ３（ＳｃＡＲＲ３）遺伝子で置換した以外はｐＧＬＹ１８９６と同様である。これはＡｓｃＩ（ＡｓｃＩ末端平滑化）とＢｇｌＩＩで消化したｐＧＦＩ１６６からＳｃＡＲＲ３遺伝子を単離し、ＳｐｅＩ（ＳｐｅＩ末端平滑）とＢｇｌＩＩで消化したｐＧＬＹ１８９６に挿入することにより実施した。プラスミドベクターの組込みはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＲＯ１遺伝子座を標的とし、選択にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＲＲ３遺伝子を使用する。プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔの地図を図１１に示す。
【０１４３】
抗ＤＫＫ１抗体発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０及びｐＧＬＹ２２６１の構築を以下のように実施した。抗ＤＫＫ１抗体はＷｎｔシグナル伝達経路に関与するリガンドであるＤｉｃｋｋｏｐｆ蛋白質１を認識する抗体である。抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０及びｐＧＬＹ２２６１を作製するために、各々α−アミラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来）シグナルペプチドをコードする核酸分子とインフレームで連結された重鎖（ＨＣ；ＶＨ＋ＩｇＧ２ｍ４を含む融合蛋白質）及び軽鎖（ＬＣ；ＶＬ＋Ｌλ定常領域を含む融合蛋白質）融合蛋白質をコードするコドン最適化核酸分子をＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧにより合成した。α−アミラーゼシグナルペプチドのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を配列番号３３及び３４に示す。ＨＣのヌクレオチド配列を配列番号５１に示し、アミノ酸配列を配列番号５２に示す。ＬＣのヌクレオチド配列を配列番号５３に示し、アミノ酸配列を配列番号５４に示す。ＩｇＧ２ｍ４アイソタイプは米国出願公開第２００７／０１４８１６７号及び米国出願公開第２００６／０２２８３４９号に開示されている。ユニークな５’−ＥｃｏＲＩ及び３’−ＦｓｅＩ部位を使用してＨＣ及びＬＣ融合蛋白質をコードする核酸分子を別々に発現プラスミドベクターｐＧＬＹ１５０８にクローン化し、夫々プラスミドベクターｐＧＬＹ１２７８及びｐＧＬＹ１２７４を形成した。これらのプラスミドベクターはゼオシン耐性マーカー及びＴＲＰ２組込み部位と、ＨＣ及びＬＣ融合蛋白質をコードする核酸分子と機能的に連結されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ１プロモーターを含んでいた。ＬＣ融合蛋白質発現カセットをＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩでｐＧＬＹ１２７４から切出し、ＢｇｌＩＩで消化したｐＧＬＹ１２７８にクローン化し、ＨＣ及びＬＣ融合蛋白質をコードし、ＴＲＰ２遺伝子座への発現カセットの組込みのために発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的指向化するプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２６１はプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０に付加的なＬＣを含む（図１３）。
【０１４４】
抗ＡＤＤＬ抗体発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０の構築を以下のように実施した。抗ＡＤＤＬ抗体はＡβ由来拡散性リガンドを認識する抗体である（例えば米国出願公開第２００７００８１９９８号参照）。発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２０１２を作製するために、各々Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼシグナルペプチドをコードする核酸分子とインフレームで連結された重鎖（ＨＣ；ＶＨ＋ＩｇＧ２ｍ４を含む）及び軽鎖（ＬＣ；ＶＬ＋Ｌλ定常領域を含む融合蛋白質）融合蛋白質をコードするコドン最適化核酸分子をＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧにより合成した。ユニークな５’−ＥｃｏＲＩ及び３’−ＦｓｅＩ部位を使用してＨＣ及びＬＣ融合蛋白質をコードする核酸分子を別々に発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ１５０８及びｐＧＬＹ１２６１にクローン化し、ゼオシン耐性マーカー及びＴＲＰ２組込み部位と、ＨＣ及びＬＣ融合蛋白質をコードする核酸分子と機能的に連結されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ１プロモーターを含むｐＧＬＹ２０１１及びｐＧＬＹ２０１０を夫々形成した。ＨＣ発現カセットをＢｇｌＩＩとＮｏｔＩでｐＧＬＹ２０１１から切出し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化したｐＧＬＹ２０１０にクローン化し、ＨＣ及びＬＣ融合蛋白質をコードし、ＴＲＰ２遺伝子座への発現カセットの組込みのために発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的指向化するｐＧＬＹ２０１２を作製した（図１４）。
【０１４５】
上記発現／組込みベクターによる酵母形質転換を以下のように実施した。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＹＰＤ培地（酵母エキス（１％），ペプトン（２％），デキストロース（２％））５０ｍＬ中でＯＤが約０．２〜６．０になるまで一晩増殖させた。氷上で３０分間温置後、２５００〜３０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞をペレット化した。培地を捨て、細胞を氷冷滅菌１Ｍソルビトールで３回洗浄後、氷冷滅菌１Ｍソルビトール０．５ｍｌに再懸濁した。直鎖化ＤＮＡ１０μＬ（５〜２０μｇ）と細胞懸濁液１００μＬをエレクトロポレーションキュベットに加え、氷上で５分間温置した。プリセットＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓプロトコール（２ｋＶ，２５μＦ，２００Ω）に従ってＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌでエレクトロポレーションを実施し、直後にＹＰＤＳ回収培地（ＹＰＤ培地＋１Ｍソルビトール）１ｍＬを加えた。形質転換細胞を室温（２４℃）で４時間〜一晩回収後、細胞を選択培地に撒いた。
【０１４６】
細胞株の作製を以下のように実施し、図３に示す。従来記載されている方法（例えばＮｅｔｔ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ  ２０  １２７９（２００３），Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５０２２（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４（２００３）参照）を使用して株ｙＧＬＹ２４−１（ｕｒａ５△：：ＭＥＴ１  ｏｃｈ１△：：ｌａｃＺ  ｂｍｔ２△：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２／ｍｎｎ４Ｌ１△：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３  ｐｎｏ１△ｍｎｎ４△：：ｌａｃＺ  ｍｅｔ１６△：：ｌａｃＺ）を構築した。ＢＭＴ２遺伝子はＭｉｌｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８）及び米国出願公開第２００６０２１１０８５号に開示されている。ＰＮＯ１遺伝子は米国特許第７，１９８，９２１号に開示されており、ｍｎｎ４Ｌ１遺伝子（別称ｍｎｎ４ｂ）は米国特許第７，２５９，００７号に開示されている。ｍｎｎ４とはｍｎｎ４Ｌ２又はｍｎｎ４を意味する。遺伝子型において、ＫｌＭＮＮ２−２はＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＧｌｃＮＡｃトランスポーターであり、ＭｍＳＬＣ３５Ａ３はＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＧｌｃＮＡｃトランスポーターである。ＵＲＡ５欠損によりｙＧＬＹ２４−１株をウラシル栄養要求性（米国出願公開第２００４／０２２９３０６号参照）にし、これを使用して以下のヒト化シャペロン株を構築した。本明細書の実施例では各種発現カセットをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムの特定遺伝子座に組込んだが、当然のことながら、本発明の操作は組込みに使用する遺伝子座から独立している。本明細書に開示する遺伝子座以外の遺伝子座も発現カセットの組込みに使用することができる。適切な組込み部位としては、米国出願公開第２００７００７２２６２号に列挙されている部位が挙げられ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び他の酵母又は真菌類に公知の遺伝子座のホモログを含む。
【０１４７】
対照株ｙＧＬＹ６４５（ＰｐＰＤＩ１）を構築した。株ｙＧＬＹ６４５は天然Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子座を無傷のままにしながら、各々ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で構成的に発現されるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼ１（ＴｒＭＮＳ１）とマウスマンノシダーゼＩＡ（ＭｕＭＮＳ１Ａ）の両者を発現する。プラスミドベクターをＰｉｃｈｉａゲノム内のプロリン１（ＰＲＯ１）遺伝子座に標的指向化するプラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６でｙＧＬＹ２４−１を形質転換することにより株ｙＧＬＹ２４−１から株ｙＧＬＹ６４５を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６は各々ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で構成的に発現されるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼ１（ＴｒＭＮＳ１）とマウスマンノシダーゼＩＡ（ＦＢ５３，ＭｕＭＮＳ１Ａ）をコードする発現カセットを含む。
【０１４８】
内在性Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子の不在下にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞で発現されるヒトＰＤＩ１の有効性を試験するために株ｙＧＬＹ７０２及びｙＧＬＹ７０４を作製した。株ｙＧＬＹ７０２及びｙＧＬＹ７０４（ｈＰＤＩ）を以下のように構築した。構成的ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でヒトＰＤＩをコードする発現カセットを含むプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２でｙＧＬＹ２４−１を形質転換することにより株ｙＧＬＹ７０２を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２は更にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ５をコードする発現カセットを含むため、株ｙＧＬＹ７０２はウラシル原栄養性であった。５−ＦＯＡプレートでｙＧＬＹ７０２を対抗選択することによりＵＲＡ５発現カセットを除去し、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子をヒトＰＤＩ遺伝子で安定的に置換し、株がウラシル栄養要求性である株ｙＧＬＹ７０４を作製した。
【０１４９】
ＰｐＰＤＩ１  ＯＲＦのみに特異的なプライマーとしてＰｐＰＤＩ／ＵＰｉ−１，５’−ＧＧＴＧＡＧＧＴＴＧＡＧＧＴＣＣＣＡＡＧＴＧＡＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＣ−３’（配列番号７）；ＰｐＰＤＩ／ＬＰｉ−１，５’−ＧＡＣＣＴＴＧＡＴＡＧＴＣＡＣＴＴＧＧＧＡＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＣ−３’（配列番号８）；ＰｐＰＤＩ／ＵＰｉ−２，５’ＣＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＧＴＴＧＴＧ−３’（配列番号９）；及びＰｐＰＤＩ／ＬＰｉ−２，５’−ＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＣＧ−３’（配列番号１０）を使用するコロニーＰＣＲにより、プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を使用したヒトＰＤＩによるＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１の置換を確認した。即ち、ＰＣＲ産物の不在はＰｐＰＤＩ１のノックアウトを意味する。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で２０秒間、５８℃で２０秒間、及び７２℃で１分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。
【０１５０】
ＰＣＲプライマーとしてＰｐＰＤＩ−５’／ＵＰ，５’−ＧＧＣＧＡＴＴＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＣＴＧＴＡＴＣ−３’（配列番号１１）；及びｈＰＤＩ−３’／ＬＰ，５’−ＣＣＴＡＧＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１２）を使用してＰｐＰＤＩ１遺伝子座におけるｐＧＬＹ６４２のダブルクロスオーバーを確認するために更にＰＣＲを使用した。ＰｐＰＤＩ−５’／ＵＰはｐＧＹ６４２のＰｐＰＤＩ１（５’）に不在のＰｐＰＤＩ１の上流領域を増幅し、ｈＰＤＩ−３’／ＬＰはｐＧＬＹ６４２におけるヒトＰＤＩ  ＯＲＦを増幅する。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間、及び７２℃で２．５分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。
【０１５１】
ノックアウト（即ちダブルクロスオーバーイベント）又は「ロールイン」（即ちゲノムへのプラスミドベクターの１カ所の組込み）としてのプラスミドベクターの組込み効率は宿主染色体ＤＮＡ上のベクターと対応する遺伝子の間の相同領域の個数と長さ、選択マーカー、該当遺伝子の役割、及びノックイン遺伝子が内在性機能を相補する能力等の多数の因子に依存し得る。本発明者らは、ｐＧＬＹ６４２がダブルクロスオーバーとして組込まれると内在性ＰｐＰＤＩ遺伝子がヒトＰｐＰＤＩで置換され、ｐＧＬＹ６４２プラスミドベクターが１カ所組込みとして組込まれると、内在性ＰｐＰＤＩ１遺伝子とヒトＰｐＰＤＩ遺伝子が併存することを見出した。これらのイベントを区別するために、本発明者らは本明細書に記載する配列番号１１〜１４のＰＣＲプライマーを利用した。ｐＧＬＹ６４２プラスミドベクターの組込み後にＰｐＰＤＩ遺伝子が維持されているならば、ＰｐＰＤＩ−５’／ＵＰ及びｈＰＤＩ−３’／ＬＰは内部ＰｐＰＤＩコーディング配列と反応し、増幅産物と対応するバンドが得られるであろう。ノックアウトないしダブルクロスオーバーの場合には、これらのプライマーは増幅産物を生じず、対応するバンドも見えないであろう。
【０１５２】
プライマーとしてＰｐＰＤＩ１をコードするＰｐＰＤＩ／ＵＰｉ（配列番号７）及びＰｐＰＤＩ／ＬＰｉ−１（配列番号８）と、ヒトＰＤＩをコードするｈＰＤＩ／ＵＰ，５’−ＧＴＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＴＧＧＡＡＣ−３’（配列番号１３）；及びｈＰＤＩ−３’／ＬＰ，５’−ＣＣＴＡＧＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１４）を使用してｐＧＬＹ６４２のロールインを確認した。ＰＣＲ条件は、ＰｐＰＤＩ１では９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で２０秒間、５８℃で２０秒間、及び７２℃で１分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとし，ヒトＰＤＩでは９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間、及び７２℃で２．５分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。
【０１５３】
株ｙＧＬＹ７１４はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子座を含むと同時にヒトＰＤＩを発現し、シングルクロスオーバーイベントによる組込みの結果として得られた株である。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰＤＨプロモーターの構成的調節制御下にヒトＰＤＩ遺伝子を含むプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２をｙＧＬＹ２４−１のＰｐＰＤＩ  ５’ＵＴＲ領域に組込むことにより株ｙＧＬＹ２４−１から株ｙＧＬＹ７１４を作製した。このベクターの組込みはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子座の発現を妨げない。従って、ｙＧＬＹ７１４において、ヒトＰＤＩはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  内在性ＰＤＩ１の存在下で構成的に発現される。
【０１５４】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ１プロモーター（ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１）と機能的に連結されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）をコードする発現カセットを含むプラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２をｙＧＬＹ７０４のＰＲＯ１遺伝子座に形質転換することにより株ｙＧＬＹ７３３を作製した。この株はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩをコードする遺伝子がヒトＰＤＩ１をコードする発現カセットで置換され、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ＵＲＡ５原栄養株である。メタノールの存在下で細胞を増殖させると、ＰｐＡＯＸ１プロモーターにより過剰発現が可能になる。
【０１５５】
各々プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔでＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰＤＨプロモーターと機能的に連結されたＴｒＭＮＳ１とマウスマンノシダーゼＩＡ（ＭｕＭＮＳ１Ａ）をコードする発現カセットを株ｙＧＬＹ７３３のＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムの５’ＰＲＯ１遺伝子座ＵＴＲに組込むことにより株ｙＧＬＹ７６２を構築した。この株はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１をコードする遺伝子がヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換され、ＰｐＧＡＰＤＨ−ＴｒＭＮＳ１及びＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ＵＲＡ５原栄養株である。
【０１５６】
株ｙＧＬＹ７３０は株ｙＧＬＹ７３３の対照株である。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ１プロモーター（ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１）と機能的に連結されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｒｅｅｓｅｉマンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）をコードする発現カセットを含むｐＧＬＹ１１６２をｙＧＬＹ２４−１のＰＲＯ１遺伝子座に形質転換することにより株ｙＧＬＹ７３０を作製した。この株はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１をもち、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ＵＲＡ５原栄養株である。
【０１５７】
各々プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔでＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰＤＨプロモーターと機能的に連結されたＴｒＭＮＳ１とマウスマンノシダーゼＩＡ（ＭｕＭＮＳ１Ａ）をコードする発現カセットを対照株ｙＧＬＹ７３０のＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムの５’ＰＲＯ１遺伝子座ＵＴＲに組込むことにより対照株ｙＧＬＹ７６０を構築した。この株はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１をコードする遺伝子をもち、ＰｐＧＡＰＤＨ−ＴｒＭＮＳ１及びＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ＵＲＡ５原栄養株である。
【０１５８】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的指向化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６０で株ｙＧＬＹ６４５を形質転換することにより株ｙＧＬＹ２２６３を作製した。
【０１５９】
５−ＦＯＡプレートでｙＧＬＹ７３３を対抗選択することにより株ｙＧＬＹ２６７４を作製した。この株はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１をコードする遺伝子がヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換され、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ＵＲＡ５栄養要求株である。
【０１６０】
５−ＦＯＡプレートでｙＧＬＹ７６２を対抗選択することにより株ｙＧＬＹ２６７７を作製した。この株はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１をコードする遺伝子がヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換され、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ＰｐＧＡＰＨ−ＴｒＭＮＳ１及びＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ＵＲＡ５栄養要求株である。
【０１６１】
ヒトＥＲＯ１α蛋白質をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２をＰＲＢ１遺伝子座に組込むことにより株ｙＧＬＹ２６９０を作製した。この株はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１をコードする遺伝子がヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換され、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ヒトＥＲＯ１α発現カセットがＰＲＢ１遺伝子座に組込まれ、ＵＲＡ５原栄養株である。
【０１６２】
ヒトＧＲＰ９４蛋白質をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３をＰＥＰ４遺伝子座に組込むことにより株ｙＧＬＹ２６９６を作製した。この株はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１をコードする遺伝子がヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換され、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ＰｐＧＡＰＤＨ−ＴｒＭＮＳ１及びＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ヒトＧＲＰ９４がＰＥＰ４遺伝子座に組込まれ、ＵＲＡ５原栄養株である。
【０１６３】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的指向化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６１で株ｙＧＬＹ２６９６を形質転換することにより株ｙＧＬＹ３６２８を作製した。
【０１６４】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的指向化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６１で株ｙＧＬＹ２６９０を形質転換することにより株ｙＧＬＹ３６４７を作製した。
【０１６５】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１蛋白質の代わりにヒトＰＤＩ蛋白質を発現する株で産生される蛋白質の収率を、ヒト及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ蛋白質を同時に発現する株と、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１蛋白質のみを発現する株で産生される同一蛋白質の収率と比較した。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１蛋白質の代わりにヒトＰＤＩ蛋白質を発現する株ｙＧＬＹ７３３と、ヒト及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１蛋白質を同時に発現する株ｙＧＬＹ７１４と、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１蛋白質のみを発現する株ｙＧＬＹ７３０を評価し、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１蛋白質をヒトＰＤＩ蛋白質で置換することが株により産生される抗体力価に及ぼす影響を調べた。抗ＤＫＫ１抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６１で全３種類の酵母株を形質転換した。
【０１６６】
Ｒａｓｂａｎｄ，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，１９９７−２００７；及びＡｂｒａｍｏｆｆら，Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１１：３６−４２（２００４）に記載されているように、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアプロトコールに従ってディープウェルプレートスクリーニングから培養増殖の力価改善を測定した。要約すると、原則的に以下のように９６穴ディープウェルプレートで抗体スクリーニングを実施した。形質転換株をＢＭＧＹ６００μＬに接種し、Ｍｉｃｒｏ−Ｐｌａｔｅ  Ｓｈａｋｅｒで２４℃にて８４０ｒｐｍで２日間増殖させた。新鮮なＢＭＧＹ６００μＬ／ウェルを加えた９６穴プレート２枚に得られた５０μＬシード培養液を移し、上記と同一培養条件で２日間温置した。増殖プレート２枚を一緒にしてから５分間１０００ｒｐｍで遠心し、細胞ペレットをＢＭＭＹ  ６００μＬ／ウェルで２日間誘導後、遠心した透明上清４００μＬをプロテインＡビーズで精製した。精製した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に付し、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して蛋白質バンドの密度を分析した。
【０１６７】
代表的な結果を図１に示す。図１（パネルＢ）から明らかなように、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１とヒトＰＤＩを同時に発現するｙＧＬＹ７１４は収率が対照（ｙＧＬＹ７３０）（パネルＡ）の２倍に改善されたが、ヒトＰＤＩのみを発現する株ｙＧＬＹ７３３（パネルＣ）では収率の５倍増加が達成された。結果を表１にも示す。
【０１６８】
【表１】
2011514157.tif 000003
【０１６９】
抗ＡＤＤＬ抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２０１２で株ｙＧＬＹ７３０及びｙＧＬＹ７３３を形質転換した。形質転換株を上記のように９６穴ディープウェルスクリーニングにより評価し、以下の手順を使用して５００ｍＬ  ＳｉｘＦｏｒｓと３Ｌ発酵槽で抗体を産生させた。初期使用容量３５０ｍＬ（ＢＭＧＹ培地３３０ｍＬ＋接種材料２０ｍＬ）とし、ｐＨ６．５、２４℃、０．３ＳＬＰＭ、及び初期撹拌機速度５５０ｒｐｍの条件下に０．５Ｌ容器（Ｓｉｘｆｏｒｓ多重発酵システム，ＡＴＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌａｕｒｅｌ，ＭＤ）でバイオリアクタースクリーニング（ＳＩＸＦＯＲＳ）を実施した。ＩＲＩＳ多重発酵槽ソフトウェア（ＡＴＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌａｕｒｅｌ，ＭＤ）を使用し、接種の１時間後から１０時間かけて撹拌機速度を５５０ｒｐｍから１２００ｒｐｍまで直線増加させた。シード培養液（１Ｌバッフル付きフラスコにＢＭＧＹ  ２００ｍＬ）を寒天プレートから直接接種した。シードフラスコを７２時間２４℃で温置し、光学密度（ＯＤ６００）を９５〜１００とした。発酵槽に固定相フラスコ培養液２００ｍＬを接種し、遠心により２０ｍＬまで濃縮した。初期添加グリセロール（１８〜２４時間）発酵が完了すると、バッチ相は終了し、続いてグリセロールフィード溶液（５０％［ｗ／ｗ］グリセロール，５ｍｇ／Ｌビオチン，１２．５ｍＬ／Ｌ  ＰＴＭ１塩類（６５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２０ｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２，９ｇ／Ｌ  Ｈ２ＳＯ４，６ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，５ｇ／Ｌ  Ｈ２ＳＯ４，３ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，５００ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，２００ｍｇ／Ｌ  ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，２００ｍｇ／Ｌビオチン，８０ｍｇ／Ｌ  ＮａＩ，２０ｍｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ４））１７ｍＬの添加により第２のバッチ相を開始した。溶存酸素中のスパイクにより第２のバッチ相が完了したと判断されたら、メタノールフィード溶液（１００％  ＭｅＯＨ  ５ｍｇ／Ｌビオチン，１２．５ｍＬ／Ｌ  ＰＴＭ１）を０．６ｇ／ｈで３２〜４０時間供給することにより誘導相を開始した。遠心により培養液を回収する。
【０１７０】
３Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及び１５Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ガラス製バイオリアクターと、４０Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ステンレス鋼製定置蒸気滅菌バイオリアクターでバイオリアクター培養（３Ｌ）を実施した。ＢＭＧＹ培地に凍結ストックバイアルを１％容量比で直接接種することによりシード培養液を調製した。シードフラスコを２４℃で４８時間温置し、光学密度（ＯＤ６００）２０±５を得、導入後に細胞が指数的に増殖するように確保した。培養培地は１リットル当たりグリセロール４０ｇ、ソルビトール１８．２ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２．３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １１．９ｇ、酵母エキス（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）１０ｇ、ペプトン（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）２０ｇ、ビオチン４×１０−３ｇ及び酵母窒素塩基（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）１３．４ｇとした。１０％のシード対初期培地容量比でバイオリアクターに接種した。温度を２４±０．５℃に設定し、ｐＨをＮＨ４ＯＨで６．５±０．１に制御し、Ｏ２の添加後、撹拌速度をカスケード制御することにより溶存酸素を１．７±０．１ｍｇ／Ｌに維持する条件下に流加方式で培養を実施した。気流速度は０．７ｖｖｍに維持した。初期添加グリセロール（４０ｇ／Ｌ）の消費後に、ＰＴＭ１塩類１２．５ｍＬ／Ｌを含有する５０％グリセロール溶液を湿潤細胞重量２５０ｇ／Ｌに達するまで最大増殖速度の５０％で８時間指数的に供給した。３０分間飢餓相後に０．０１ｈ−１の比増殖速度を維持するようにメタノールを指数的に供給し、誘導を開始した。１５０ｍＭ／Ｌ／ｈの酸素取込み速度に達したら、酸素限界を避けるようにメタノール供給速度を一定に維持した。結果を表２に示す通り、抗体力価は約３倍に増加した。
【０１７１】
ヒトＰＤＩをコードする発現カセットでＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子を置換すると、抗体のＯ−グリコシル化に影響があるか否かについても抗体を分析した。一般に、人体用抗体のＯ−グリコシル化は望ましくない。
【０１７２】
Ｄｉｏｎｅｘ−ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を使用して以下のようにＯ−グリカン測定を実施した。Ｏ−グリコシル化低下を測定するために、プロテインＡクロマトグラフィー（Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：２１０−５（２００６））を使用して増殖培地から蛋白質を精製し、アルカリ排除（β排除）（Ｈａｒｖｅｙ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １８：３４９−４５１（１９９９））によりＯ−グリカンを蛋白質から遊離させ、分離した。この方法は遊離したＯ−グリカン（オリゴマンノース又はマンノース）の新たに形成された還元末端を更にマンニトールに還元する。従って、マンニトール基は各Ｏ−グリカンのユニークな指標となる。β排除にはＰＢＳバッファー１００μＬ容量内に含まれる０．５ｎｍｏｌ以上の蛋白質が必要であった。サンプルをアルカリ水素化ホウ素試薬２５μＬで処理し、５０℃で１６時間温置した。アラビトール内部標準約２０ｕＬを加えた後、氷酢酸１０μＬを加えた。次にＳＥＰＡＢＥＡＤＳとＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８樹脂を充填したＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターでサンプルを遠心濾過し、水洗した。洗浄液を含むサンプルをプラスチックオートサンプラーバイアルに移し、遠心蒸発器で蒸発乾涸した。１％  ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨ  １５０μＬをサンプルに加え、サンプルを遠心蒸発器で蒸発乾涸した。この最終工程を更に５回繰返した。水２００μＬを加え、サンプル１００μＬを高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー−パルス式電気化学検出法−Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により分析した。マンニトール回収量に基づいて平均Ｏ−グリカン含有量を測定した。
【０１７３】
表２に示すように、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットでＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１を置換した株ではＯ−グリコシル化が低下した。株ｙＧＬＹ７３３では、Ｏ−グリカン含有量（Ｏ−グリコシル化したＯ−グリコシル化部位数）が低下し、含有部位では、マンノース１個のみから構成されるＯ−グリカンの百分率が増加した。これらの結果から、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットでＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１を置換すると、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓでＯ−グリコシル化の低下した抗体の産生が可能になると思われる。
【０１７４】
【表２】
2011514157.tif 000004
【０１７５】
上記３株（ｙＧＬＹ７３０，ｙＧＬＹ７１４及びｙＧＬＹ７３３）はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｎ−グリコシル化パターンをもつ糖蛋白質を産生する。ＧＳ２．０株はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主体とする糖蛋白質を産生するように遺伝子操作されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株である。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主体とする糖蛋白質を産生するＧＳ２．０株で以下の実験を実施し、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１蛋白質をヒトＰＤＩ蛋白質で置換することがこれらの株により産生される抗体力価に及ぼす影響を調べた。株ｙＧＬＹ２６９０及びｙＧＬＹ２６９６はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主体とし、ヒトＰＤＩ蛋白質をコードする発現カセットでＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子を置換したＧＦＩ２．０株である（図３参照）。抗ＤＫＫ１抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６１でこれらの２株を形質転換し、株ｙＧＬＹ３６４７及びｙＧＬＹ３６２８を作製し（図３参照）、上記のように９６穴ディープウェルスクリーニングにより株を評価した。上記パラメーターを使用して５００ｍｌ  ＳｉｘＦｏｒｓと３Ｌ発酵槽で抗体を産生させ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１蛋白質をヒトＰＤＩ蛋白質で置換することが株により産生される抗体力価に及ぼす影響を調べた。結果を表３に示す。株ｙＧＬＹ２２６３はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主体とする糖蛋白質を産生し、内在性ＰＤＩ１遺伝子のみを発現する株ｙＧＬＹ６４５にプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０を形質転換した対照である。
【０１７６】
表３から明らかなように、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主体とする糖蛋白質を産生するように遺伝子操作した酵母においてヒトＰＤＩをコードする発現カセットでＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１をコードする遺伝子を置換すると、酵母により産生される抗体力価は改善する。更に表３から明らかなように、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主体とする糖蛋白質を産生するように遺伝子操作したこれらの株でもＯ−グリコシル化含有量は低下した。更に、表３から明らかなように、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換した株ではＮ−グリコシル化量が増加している。
【０１７７】
【表３】
2011514157.tif 000005
【実施例２】
【０１７８】
表２及び３に示した株の１つの利点は、異種ＰＤＩをコードする発現カセットで内在性ＰＤＩ１遺伝子を置換した酵母株を作製すると、蛋白質収率の増加をもたらすだけでなく、結合したＯ−グリカン数（含有量）の減少と望ましくないＭａｎ２Ｏ−グリカン構造の減少ももたらすという点である。酵母で産生される組換え蛋白質は哺乳動物細胞培養から産生される同一糖蛋白質の組成に対して異常なＯ−グリコシル化構造を示すことが多く、哺乳動物細胞と酵母細胞のグリコシル化機構には大きな差があると予想される。これらの異常な構造はヒトにおいて免疫原性となる可能性がある。
【０１７９】
本発明者らは内在性Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子の代わりにヒトＰＤＩ遺伝子を導入したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞がＰＭＴ蛋白質阻害剤に対する高耐性株であることに着目し（国際出願公開第ＷＯ２００７０６１６３１号参照）、これらの株が各種ＰＭＴ遺伝子の欠損に耐えるのにより好適ではないかと予想した。これは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのΔＯＣＨ１／ΔＰＮＯ１／ΔＰＢＳ２株でΔＰＭＴノックアウトを作製しようとする従来の試みでは、恐らくこの遺伝子バックグラウンドで致死性であることからΔＰＭＴ１ノックアウトとΔＰＭＴ２ノックアウトが得られなかったためである（未発表結果）。ΔＰＭＴ４ノックアウトは得られたが、一般に親株に比較して増殖が弱く、蛋白質発現が不良であった（図６及び７参照）。ΔＰＭＴ５及びΔＰＭＴ６ノックアウトは得られたが、欠損は親株に比較して細胞増殖又は蛋白質発現に殆ど又は全く影響がなく、これらのＰＭＴ遺伝子はＯ−グリコシル化の低下に無効であると思われた。
【０１８０】
国際出願公開第ＷＯ２００７０６１６３１号に詳述したように、Ｇｅｎｔｚｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔａｎｎｅｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：２５７５２−５７５９（１９９６）にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについて概説されている手順に従って、適切なＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株でＰＭＴノックアウト酵母株を作製した。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＭＴ１及びＰＭＴ４をコードする核酸分子を配列番号４７及び４９に示す。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＭＴ１及びＰＭＴ４のアミノ酸配列を配列番号４８及び５０に示す。ＰＣＲオーバーラップ法を使用してＰＭＴ欠損を作製するために使用したプライマーとＤＮＡ鋳型を以下に挙げる。
【０１８１】
ＰＭＴ１ノックアウトを作製するために、以下の手順に従った。３種類のＰＣＲ反応を設定した。ＰＣＲ反応ＡはプライマーとしてＰＭＴ１−ＫＯ１：５’−ＴＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＧＴＡＡＡＴＡＧＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１７）及びＰＭＴ１−ＫＯ２：５’−ＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＣＧＴＡＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＴＡＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＣＣ−３’（配列番号１８）と、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。ＰＣＲ反応ＢはプライマーとしてＰＭＴ１−ＫＯ３：５’−ＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＴＧＧＴＡＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号１９）及びＰＭＴ１−ＫＯ４：５’−ＴＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣ−３’（配列番号２０）と、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。ＰＣＲ反応ＣはプライマーとしてＰＲ２９：５’−ＣＡＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣ−３’（配列番号２１）及びＰＲ３２：５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧ−３’（配列番号２２）と、プラスミドベクターｐＡＧ２５（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＭｃＣｕｓｋｅｒ，Ｙｅａｓｔ  １５：１５４１（１９９９））を鋳型として使用した。全３種類のＰＣＲ反応の条件は９８℃で２分間を１サイクル、９８℃で１０秒間、５４℃で３０秒間、及び７２℃で４分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。
【０１８２】
次に、第２のＰＣＲ反応で上記からのプライマーＰＭＴ１−ＫＯ１＋ＰＭＴ１−ＫＯ４を上記ＰＣＲ反応Ａ、Ｂ及びＣからのＰＣＲにより生成されたフラグメントと混合した。ＰＣＲ条件は９８℃で２分間を１サイクル、９８℃で１０秒間、５６℃で１０秒間、及び７２℃で４分間を３０サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。
【０１８３】
第２のＰＣＲ反応で生成されたフラグメントをゲル精製し、ヒトＰＤＩ１蛋白質をコードする発現カセットでＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子を置換した適切な株を形質転換するために使用した。ノーセオトリシン１００μｇ／ｍＬを添加したリッチ培地プレート（ＹＰＤ）で形質転換株の選択を行った。
【０１８４】
ＰＭＴ４ノックアウトを作製するために、以下の手順に従った。３種類のＰＣＲ反応を設定した。ＰＣＲ反応ＡはプライマーとしてＰＭＴ４−ＫＯ１：５’−ＴＧＣＴＣＴＣＣＧＣＧＴＧＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴ−３’（配列番号２３）及びＰＭＴ４−ＫＯ２：５’−ＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＣＡＣＡＧＴＧＴＡＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＣＣ−３’（配列番号２４）と、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。ＰＣＲ反応ＢはプライマーとしてＰＭＴ４−ＫＯ３：５’−ＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＣＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＴＡＡＣＴＣＴＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣ−３’（配列番号２５）及びＰＭＴ４−ＫＯ４：５’−ＡＣＴＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＴＣＣＣＡＡＧＧＴ−３’（配列番号２６）と、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。ＰＣＲ反応ＣはプライマーとしてＰＲ２９：５’−ＣＡＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣ−３’（配列番号２１）及びＰＲ３２：５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧ−３’（配列番号２２）と、プラスミドベクターｐＡＧ２５を鋳型として使用した。
【０１８５】
全３種類のＰＣＲ反応の条件は９８℃で２分間を１サイクル、９８℃で１０秒間、５４℃で３０秒間、及び７２℃で４分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。
【０１８６】
次に、第２のＰＣＲ反応で上記からのプライマーＰＭＴ４−ＫＯ１＋ＰＭＴ４−ＫＯ４を上記ＰＣＲ反応Ａ、Ｂ及びＣからのＰＣＲにより生成されたフラグメントと混合した。ＰＣＲ条件は９８℃で２分間を１サイクル、９８℃で１０秒間、５６℃で１０秒間、及び７２℃で４分間を３０サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。
【０１８７】
第２のＰＣＲ反応で生成されたフラグメントをゲル精製し、ヒトＰＤＩ蛋白質をコードする発現カセットでＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子を置換した適切な株を形質転換するために使用した。ノーセオトリシン１００μｇ／ｍＬを添加したリッチ培地プレート（ＹＰＤ）で形質転換株の選択を行った。
【０１８８】
株がＯ−グリコシル化の低下した抗体を産生する能力を試験するために、抗Ｈｅｒ２抗体と抗ＣＤ２０抗体をコードする発現ベクターを構築した。
【０１８９】
発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８は抗Ｈｅｒ２抗体の重鎖と軽鎖をコードする発現カセットを含む。α−ＭＡＴプレシグナルペプチドのＮ末端に融合した抗Ｈｅｒ２重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧにより合成した。各々ユニークな５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＦｓｅＩ部位をもつように合成した。抗Ｈｅｒ２  ＨＣのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号２９及び３０に示す。抗Ｈｅｒ２  ＬＣのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号３１及び３２に示す。ユニークな５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＦｓｅＩ部位を使用してＨＣ及びＬＣ融合蛋白質をコードする核酸分子フラグメントの両者を別々に発現プラスミドベクターｐＧＬＹ２１９８（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＲＰ２標的指向化核酸分子とゼオシン耐性マーカーを含む）にサブクローン化し、夫々プラスミドベクターｐＧＬＹ２９８７及びｐＧＬＹ２３３８を形成した。ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化することにより、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ１プロモーターとＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｃｙｃターミネーターの制御下にＬＣ融合蛋白質をコードするＬＣ発現カセットをプラスミドベクターｐＧＬＹ２３３８から切出した後、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化したプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８７にＤＮＡフラグメントをクローン化し、最終発現プラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８（図１５）を作製した。
【０１９０】
発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ３２００（地図はＬＣとＨＣがα−アミラーゼシグナル配列をもつ抗ＣＤ２０である以外はｐＧＬＹ２９８８と同一）。抗ＣＤ２０配列は軽鎖（ＬＣ）フレームワーク配列がＶκ３生殖系列に由来するものに一致する以外はＧｅｎＭａｂ配列２Ｃ６に由来するものとした。α−アミラーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来）シグナルペプチドのＮ末端に融合した重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）可変配列をＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧにより合成した。ＩｇＧ１及びＶκ定常領域を含む発現ベクターに可変領域を直接クローン化できるように、各々ユニークな５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＫｐｎＩ部位をもつように合成した。抗ＣＤ２０  ＨＣのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号３７及び３８に示す。抗ＣＤ２０  ＬＣのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号３５及び３６に示す。ＨＣ及びＬＣ融合蛋白質を夫々ＩｇＧ１プラスミドベクターｐＧＬＹ３１８４及びＶκプラスミドベクターｐＧＬＹ２６００（各プラスミドベクターはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＲＰ２標的指向化核酸分子とゼオシン耐性マーカーを含む）にサブクローン化し、夫々プラスミドベクターｐＧＬＹ３１９２及びｐＧＬＹ３１９６を形成した。ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化することにより、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ１プロモーターとＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｃｙｃターミネーターの制御下にＬＣ融合蛋白質をコードするＬＣ発現カセットをプラスミドベクターｐＧＬＹ３１９６から切出した後、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化したプラスミドベクターｐＧＬＹ３１９２にＤＮＡフラグメントをクローン化し、最終発現プラスミドベクターｐＧＬＹ３２００（図１６）を作製した。
【０１９１】
本明細書に開示する適切な株を原則的に以下のように上記抗Ｈｅｒ２又は抗ＣＤ２０抗体発現／組込みプラスミドベクターで形質転換した。ＯＤが約０．２〜６になるまで適切なＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株をＹＰＤ培地（酵母エキス（１％），ペプトン（２％），デキストロース（２％））５０ｍＬ中で一晩増殖させた。氷上で３０分間温置後、細胞を２５００〜３０００ｒｐｍで５分間遠心することによりペレット化した。培地を捨て、細胞を氷冷滅菌１Ｍソルビトールで３回洗浄後、氷冷滅菌１Ｍソルビトール０．５ｍｌに再懸濁した。直鎖化ＤＮＡ１０μＬ（５〜２０μｇ）と細胞懸濁液１００μＬをエレクトロポレーションキュベットに加え、氷上で５分間温置した。プリセットＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓプロトコール（２ｋＶ，２５μＦ，２００Ω）に従ってＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌでエレクトロポレーションを実施し、直後にＹＰＤＳ回収培地（ＹＰＤ培地＋１Ｍソルビトール）１ｍＬを加えた。形質転換細胞を室温（２４℃）で４時間〜一晩回収後、細胞を選択培地に撒いた。
【０１９２】
抗体産生用形質転換株の細胞増殖条件は一般に以下の通りとした。１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）、１．３４％酵母窒素塩基、４×１０−５％ビオチン、及び１％グリセロールから構成される緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）を充填した振盪フラスコで２４℃にて形質転換酵母株の蛋白質発現を実施した。蛋白質発現誘導培地はＢＭＧＹのグリセロールを１％メタノールに変えた緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）とした。誘導培地の添加時にＰｍｔ阻害剤（Ｐｍｔｉ−３）のメタノール溶液を増殖培地に終濃度０．２μＭ、２μＭ又は２０μＭまで添加した。細胞を回収し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。
【０１９３】
ＳｉｘＦｏｒｓ発酵槽スクリーニングプロトコールは表４に示すパラメーターに従った。
【０１９４】
【表４】
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【０１９５】
接種後約１８時間の時点で培地Ａ３５０ｍＬ（下表６参照）＋４％グリセロールを加えたＳｉｘＦｏｒｓ容器に該当株を接種した。低用量（１００％メタノール中０．２ｍｇ／ｍＬを０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３（５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸）（国際出願公開第ＷＯ２００７０６１６３１号参照）を接種材料と共に添加した。約２０時間の時点で容器当たり５０％グリセロール溶液（グリセロール流加，下表７参照）１７ｍＬ＋高用量（４ｍｇ／ｍＬを０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３のボーラスを添加した。約２６時間の時点で溶存酸素（ＤＯ）濃度の陽性スパイクによりグリセロールが消費されたと判断されたら、０．７ｍＬ／ｈｒで連続的にメタノール供給（下表８参照）を開始した。同時に、容器当たり付加用量（４ｍｇ／ｍＬストック０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３を添加した。約４８時間の時点で、容器当たり付加用量（４ｍｇ／ｍＬを０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３を添加した。接種後約６０時間の時点で培養液を回収し、処理した。
【０１９６】
【表５】
2011514157.tif 000007
【０１９７】
【表６】
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【０１９８】
【表７】
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【０１９９】
【表８】
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【０２００】
Ｄｉｏｎｅｘ−ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を使用して以下のようにＯ−グリカン測定を実施した。Ｏ−グリコシル化低下を測定するために、プロテインＡクロマトグラフィー（Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：２１０−５（２００６））を使用して増殖培地から蛋白質を精製し、アルカリ排除（β排除）（Ｈａｒｖｅｙ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １８：３４９−４５１（１９９９））によりＯ−グリカンを蛋白質から遊離させ、分離した。この方法は遊離したＯ−グリカン（オリゴマンノース又はマンノース）の新たに形成された還元末端を更にマンニトールに還元する。従って、マンニトール基は各Ｏ−グリカンのユニークな指標となる。β排除にはＰＢＳバッファー１００μＬ容量内に含まれる０．５ｎｍｏｌ以上の蛋白質が必要であった。サンプルをアルカリ水素化ホウ素試薬２５μＬで処理し、５０℃で１６時間温置した。アラビトール内部標準約２０ｕＬを加えた後、氷酢酸１０μＬを加えた。次にＳＥＰＡＢＥＡＤＳとＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８樹脂を充填したＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターでサンプルを遠心濾過し、水洗した。洗浄液を含むサンプルをプラスチックオートサンプラーバイアルに移し、遠心蒸発器で蒸発乾涸した。１％  ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨ  １５０μＬをサンプルに加え、サンプルを遠心蒸発器で蒸発乾涸した。この最終工程を更に５回繰返した。水２００μＬを加え、サンプル１００μＬを高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー−パルス式電気化学検出法−Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により分析した。マンニトール回収量に基づいて平均Ｏ−グリカン含有量を測定した。
【０２０１】
図４〜７から明らかなように、内在性ＰＤＩ１を株で産生させる組換え蛋白質と同一種に由来する異種ＰＤＩで置換し、天然ＰＭＴ１又はＰＭＴ４遺伝子を欠損させたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株は、内在性ＰＤＩ１を含み、ＰＭＴ１又はＰＭＴ４遺伝子を欠損させない株における抗体産生に比較して高力価でＯ−グリコシル化の低下した組換えヒト抗体を産生することが可能である。
【０２０２】
図４Ａ及び４Ｂは内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩ遺伝子（ｈＰＤＩ）で置換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株と、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ１遺伝子を破壊した株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔｌ）でヒト抗Ｈｅｒ２抗体を産生させた振盪フラスコ（Ａ）及び０．５Ｌバイオリアクター（Ｂ）発現試験からの代表的な結果を示す。抗体を回収し、非還元及び還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。非還元条件下では、抗体は無傷のままであり、還元条件下では、抗体はＨＣとＬＣに分離した。レーン１〜２は抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で株ｙＧＬＹ２６９６を形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示し、レーン３〜６はＰＭＴ１遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９６を、抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で形質転換することにより作製した４個のクローンから産生された抗体を示す。図から明らかなように、ＰＭＴ１欠損により抗体収率は改善された。
【０２０３】
図５は内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩ遺伝子（ｈＰＤＩ）で置換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株と、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ１遺伝子を破壊した株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔｌ）でヒト抗ＤＫＫ１抗体を産生させた振盪フラスコ発現試験からの代表的な結果を示す。抗体を回収し、非還元及び還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。非還元条件下では、抗体は無傷のままであり、還元条件下では、抗体はＨＣとＬＣに分離した。レーン１及び３は抗ＤＫＫ１抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０で株ｙＧＬＹ２６９６及びｙＧＬＹ２６９０を形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示し、レーン２及び４はＰＭＴ１遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９６及びｙＧＬＹ２６９０を、抗ＤＫＫ１抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０で形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示す。図から明らかなように、ＰＭＴ１欠損により抗体収率は改善された。
【０２０４】
図６は内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）と、内在性ＰＤＩ１のみを発現し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊した株（ＰｐＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）でヒト抗Ｈｅｒ２抗体を産生させた０．５Ｌバイオリアクター発現試験からの結果を示す。抗体を回収し、非還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１及び２は抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で株ｙＧＬＹ２４−１を形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示し、レーン３〜５はＰＭＴ４遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９０の形質転換により作製した３個のクローンから産生された抗Ｈｅｒ２抗体を示す。図から明らかなように、ＰＭＴ４欠損により抗体収率は改善されたが、この収率改善を得るためには、更に細胞の内在性ＰＤＩ１遺伝子を、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換する必要がある。
【０２０５】
図７は内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）と、内在性ＰＤＩ１のみを発現し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊した株（ＰｐＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）でヒト抗ＣＤ２０抗体を産生させた振盪フラスコ発現試験からの結果を示す。抗体を回収し、非還元及び還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１は抗ＣＤ２０抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ３２００で形質転換した株ｙＧＬＹ２４−１から産生された抗体を示し、レーン２〜７はＰＭＴ４遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９０の形質転換により作製した６個のクローンから産生された抗ＣＤ２０抗体を示す。図から明らかなように、ＰＭＴ４欠損により抗体収率は改善されたが、この収率改善を得るためには、更に細胞の内在性ＰＤＩ１遺伝子を、ヒトＰＤＩをコードする発現カセットで置換する必要がある。
【実施例３】
【０２０６】
本実施例はヒトＡＴＰアーゼドメインをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＡＲ２のＡＴＰアーゼドメインで置換し、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに由来するＫＡＲ２又は他のＥＲ特異的プロモーターの制御下にヒトＢｉＰペプチド結合ドメインと融合したキメラＢｉＰ遺伝子について記載する。ヒトＢｉＰのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を表１１に夫々配列番号５５及び５６として示す。キメラＢｉＰのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を表１１に夫々配列番号５７及び５８として示す。上記のような内在性ＰＤＩ１遺伝子の置換をキメラＢｉＰ及びＥＲｄｊ３（夫々配列番号７６及び７７）の使用と組合せることにより更に改善収率が得られる。
【実施例４】
【０２０７】
本実施例はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓコルジＣａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＰｐＰＭＲ１）又はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＲ  Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＡｔＥＣＡ１）を株で過剰発現させると、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１の代わりにヒトＰＤＩを発現する上記株で産生される蛋白質中のＯ−グリカン含有量を有意に低下できることを立証する。本実施例では、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンを主体とする抗体を産生する糖鎖改変Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を使用して効果を例証する。
【０２０８】
ＰｐＰＭＲ１遺伝子をコードする発現カセットを次のように構築した。プライマーとしてＰｐＰＭＲ１／ＵＰ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＡＧＣＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧＡＧ−３’（配列番号６４）及びＰｐＰＭＲ１／ＬＰ：５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧ−３’（配列番号６５）を使用してＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゴルジＣａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＰｐＰＭＲ１）のオープンリーディングフレームをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で１０秒間、５２℃で２０秒間、及び７２℃で３分間を５サイクル、９５℃で１０秒間、５５℃で２０秒間、及び７２℃で３分間を２０サイクル後に、７２℃で１０分間を１サイクルとした。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１にクローン化し、ｐＧＬＹ３８１１と命名した。プラスミドをＰｓｔＩとＦｓｅＩで消化することによりＰｐＰＭＲ１をｐＧＬＹ３８１１から切出し、ＦｓｅＩで消化する前にＰｓｔＩ末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化しておいた。ＥｃｏＲＩ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで末端平滑化）とＦｓｅＩで消化したｐＧＦＩ３０ｔにＰｐＰＭＲ１をコードするＤＮＡフラグメントをクローン化し、ＰｐＰＭＲ１がＡＯＸ１プロモーターと機能的に連結されたｐＧＬＹ３８２２を作製した。プラスミドｐＧＬＹ３８２２はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ６遺伝子座を標的とする。プラスミドｐＧＬＹ３８２２を図１７に示す。ＰｐＰＭＲ１のＤＮＡ配列を配列番号６０に示し、ＰｐＰＭＲ１のアミノ酸配列を配列番号６１に示す。
【０２０９】
Ａａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＲ  Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＡｔＥＣＡ１）をコードする発現カセットを次のように構築した。ＡｔＥＣＡ１をコードするＤＮＡをＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から合成し、クローン化し、ｐＧＬＹ３３０６を作製した。合成したＡｔＥＣＡ１をＭｌｙＩとＦｓｅＩで消化することによりｐＧＬＹ３３０６から切出し、ＥｃｏＲＩ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで末端平滑化）とＦｓｅＩで消化したｐＧＦＩ３０ｔにＡｔＥＣＡ１をコードするＤＮＡフラグメントをクローン化し、組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２７を作製した。プラスミドｐＧＬＹ３８２７はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ６遺伝子座を標的とする。プラスミドｐＧＬＹ３８２７を図１８に示す。ＡｔＥＣＡ１のＤＮＡ配列をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓでの発現にコドン最適化し、配列番号６２に示す。コードされるＡｔＥＣＡ１は配列番号６３に示すアミノ酸配列をもつ。
【０２１０】
組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２２（ＰｐＰＭＲ１をコードする発現カセットを含む）又はｐＧＬＹ３８２７（ＡｔＥＣＡ１をコードする発現カセットを含む）をＳｐｅＩで直鎖化し、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株ｙＧＬＹ３６４７又はｙＧＬＹ３６９３のＵＲＡ６遺伝子座に形質転換した。プライマーとして、ＵＲＡ６遺伝子座へのＰｐＰＭＲ１組込みの確認には５’ＡＯＸ１（５’−ＧＣＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴ−３’）（配列番号６６）及びＰｐＰＭＲ１／ｃＬＰ（５’−ＧＧＴＴＧＣＴＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧ−３’）（配列番号６７）を使用し、ＵＲＡ６遺伝子座へのＡｔＥＣＡ１の組込みの確認には５’ＡＯＸ１及びＡｔＥＣＡ１／ｃＬＰ（５’−ＧＴＣＧＧＣＴＧＧＡＡＣＣＴＴＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号６８）を使用し、ＵＲＡ６遺伝子座におけるｐＧＬＹ３８２２又はｐＧＬＹ３８２７のゲノム組込みをコロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）により確認した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で１０秒間、５５℃で２０秒間、及び７２℃で１分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。
【０２１１】
ＰｐＰＭＲ１をコードし、ＵＲＡ６遺伝子座を標的とする組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８３３で株ｙＧＬＹ３６４７を形質転換することにより株ｙＧＬＹ８２３８を作製した。株ｙＧＬＹ３６４７では、実施例１に記載し、図３Ａ及び３Ｂに示すようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１シャペロン遺伝子がヒトＰＤＩ遺伝子で置換されている。
【０２１２】
ＡｔＥＣＡ１をコードし、ＵＲＡ６遺伝子座を標的とするプラスミドｐＧＬＹ３８２７で株ｙＧＬＹ３６４７を形質転換することにより株ｙＧＬＹ８２４０を作製した。これらの株の系図を図３Ａ及び３Ｂに示す。
【０２１３】
ヒト化シャペロン株へのＰｐＰＭＲ１又はＡｔＥＣＡ１の付加が各株により産生される抗体のＯ−グリコシル化の低下に及ぼす影響について各株を評価した。表９に示すように、株ｙＧＬＹ３６４７へのＰｐＰＭＲ１又はＡｔＥＣＡ１の付加はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１ではなくヒトＰＤＩを発現する株ｙＧＬＹ３６４７又は内在性ＰＤＩ１しか発現しないが、株ｙＧＬＹ３６４７と同様にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームをもつ抗体を産生することが可能な株ｙＧＬＹ２２６３に比較してＯ−グリコシル化含有量の有意低下を生じた。以上の結果は更に、その内在性ＰＤＩ１を発現するが、ヒトＰＤＩを発現せず、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼを過剰発現する酵母株がＯ−グリカン含有量の低下した糖蛋白質を産生することも示唆している。
【０２１４】
【表９】
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【実施例５】
【０２１５】
プライマーとしてｈＣＲＴ−ＢｓｔＺ１７Ｉ−ＨＡ／ＵＰ：５’−ＧＴＡＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＣ−３’（配列番号７３）及びｈＣＲＴ−ＰａｃＩ／ＬＰ：５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号７４）を使用し、その天然シグナル配列の不在下でヒトカルレティキュリン（ｈＣＲＴ）をコードするＤＮＡフラグメントをヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は９８℃で２分間を１サイクル、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で２分間を３０サイクル後に７２℃で１０分間を１サイクルとした。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１  Ｔｏｐｏベクターにクローン化し、ｐＧＬＹ１２２４を作製した。コードされる短縮型ｈＣＲＴがそのＮ末端にＨＡタグをもち、そのＣ末端にＨＤＥＬをもつように、ｈＣＲＴをコードするＤＮＡを更に修飾した。ＢｓｔＺ１７ＩとＰａｃＩで消化することによりｈＣＲＴをコードするＤＮＡをｐＧＬＹ１２２４から遊離させ、ＮｏｔＩとＰａｃＩに適合可能な末端をもつＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α接合因子プレシグナル配列をコードするＤＮＡフラグメントと共に、ＮｏｔＩとＰａｃＩで消化しておいた発現ベクターｐＧＬＹ５７９にＤＮＡフラグメントをクローン化し、ｐＧＬＹ１２３０を作製した。このプラスミドはＮ末端にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α接合因子プレシグナル配列とＨＡタグをもち、そのＣ末端にＨＤＥＬ配列をもち、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰＤＨプロモーターと機能的に連結されたｈＣＲＴをコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＨＩＳ３遺伝子座を標的とする組込み／発現プラスミドである。
【０２１６】
ＮｏｔＩとＰａｃＩに適合可能な末端をもつヒトＥＲｐ５７（ｈＥＲｐ５７）をコードするＤＮＡフラグメントをＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧにより合成した。次にＮｏｔＩとＰａｃＩで消化したｐＧＬＹ１２９にＤＮＡフラグメントをクローン化し、ｐＧＬＹ１２３１を作製した。このプラスミドはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＭＡ１プロモーターと機能的に連結されたｈＥＲｐ５７をコードする。
【０２１７】
プラスミドｐＧＬＹ１２３１をＳｗａＩで消化し、ＰｍｅＩで消化したプラスミドｐＧＬＹ１２３０にｈＥＲｐ５７をコードするＤＮＡフラグメントをクローン化した。従って、組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ１２３４はｈＣＲＴとｈＥＲｐ５７を同時にコードする。プラスミドｐＧＬＹ１２３４を図１９に示す。
【０２１８】
５’ＦＯＡの存在下で株ｙＧＬＹ２６９０を対抗選択することによりＵＲＡ５栄養要求株である株ｙＧＬＹ３６４２を作製した。
【０２１９】
ｈＣＲＴとｈＥＲｐ５７をコードし、ＨＩＳ３遺伝子座を標的とする組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ１２３４でｙＧＬＹ３６４２を形質転換することにより株ｙＧＬＹ３６６８を作製した。
【０２２０】
抗ＤＫＫ１抗体をコードする発現カセットをＴＲＰ２遺伝子座に標的指向化する組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ２２６１で株ｙＧＬＹ３６６８を形質転換することにより株ｙＧＬＹ３６９３を作製した。
【０２２１】
ＰｐＰＭＲ１をコードし、ＵＲＡ６遺伝子座を標的とする組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８３３で株ｙＧＬＹ３６９３を形質転換することにより株ｙＧＬＹ８２３９を作製した。
【０２２２】
ＡｔＥＣＡ１をコードし、ＵＲＡ６遺伝子座を標的とする組込み／発現プラスミドｐＧＬＹ３８２７で株ｙＧＬＹ３６９３を形質転換することにより株ｙＧＬＹ８２４１を作製した。
【０２２３】
本実施例に記載した株の系図を図３Ａ及び３Ｂに示す。
【０２２４】
前の実施例のＰｐＰＭＲ１又はＡｔＥＣＡ１を発現するヒト化シャペロン株にｈＣＲＴとｈＥＲｐ５７を付加すると、産生される抗体のＯ−グリカン含有量を更に低下させることができるか否かを調べるために上記株を評価した。表１０に示すように、ｈＣＲＴとｈＥＲｐ５７のみを発現する株ｙＧＬＹ３６９３では、Ｏ−グリカン含有量は約２分の１に減少し、ＰｐＰＭＲ１又はＡｔＥＣＡ１も発現する株では更に４分の１まで減少した。以上の結果は更に、その内在性ＰＤＩ１を発現するが、ヒトＰＤＩを発現せず、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼを過剰発現する酵母株がＯ−グリカン含有量の低下した糖蛋白質を産生することも示唆している。
【０２２５】
【表１０】
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【０２２６】
【表１１】
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【０２２７】
本明細書では例証する実施形態に関して本発明を説明するが、当然のことながら、本発明はこれらの実施形態に限定されない。本明細書の教示に接した当業者は本発明の範囲に含まれる他の変形及び実施形態に想到しよう。従って、本発明は添付の特許請求の範囲のみに限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2011514157.tif 000069
【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年10月21日(2010.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
【図１】内在性ＰＤＩ１遺伝子を発現させたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞（パネルＡ）、内在性ＰＤＩ１遺伝子とヒトＰＤＩ遺伝子の併存下（パネルＢ）、及びヒトＰＤＩ遺伝子を発現し、内在性ＰＤＩ１遺伝子機能をノックアウトさせた細胞株（パネルＣ）でヒト抗ＤＫＫ１抗体を産生させたディープウェルプレートスクリーニングからの代表的な結果を示す。
【図２】小胞体でのチオールレドックス反応におけるヒトＰＤＩとそのコシャペロンの作用を示す。
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは本発明を例証するための実施例に記載する酵母株の系図を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは本発明を例証するための実施例に記載する酵母株の系図を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは本発明を例証するための実施例に記載する酵母株の系図を示す。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩ遺伝子（ｈＰＤＩ）で置換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株と、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ１遺伝子を破壊した株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔｌ）でヒト抗Ｈｅｒ２抗体を産生させた振盪フラスコ（Ａ）及び０．５Ｌバイオリアクター（Ｂ）発現試験からの代表的な結果を示す。抗体を回収し、非還元及び還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１〜２は抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で株ｙＧＬＹ２６９６を形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示し、レーン３〜６はＰＭＴ１遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９６を、抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で形質転換することにより作製した４個のクローンから産生された抗体を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩ遺伝子（ｈＰＤＩ）で置換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株と、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ１遺伝子を破壊した株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔｌ）でヒト抗Ｈｅｒ２抗体を産生させた振盪フラスコ（Ａ）及び０．５Ｌバイオリアクター（Ｂ）発現試験からの代表的な結果を示す。抗体を回収し、非還元及び還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１〜２は抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で株ｙＧＬＹ２６９６を形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示し、レーン３〜６はＰＭＴ１遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９６を、抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で形質転換することにより作製した４個のクローンから産生された抗体を示す。
【図５】内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩ遺伝子（ｈＰＤＩ）で置換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株と、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ１遺伝子を破壊した株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔｌ）でヒト抗ＤＫＫ１抗体を産生させた振盪フラスコ発現試験からの代表的な結果を示す。抗体を回収し、非還元及び還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１及び３は抗ＤＫＫ１抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０で株ｙＧＬＹ２６９６及びｙＧＬＹ２６９０を形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示し、レーン２及び４はＰＭＴ１遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９６及びｙＧＬＹ２６９０を、抗ＤＫＫ１抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０で形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示す。
【図６】内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩ遺伝子（ｈＰＤＩ）で置換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株と、内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊した株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）と、内在性ＰＤＩ１のみを発現し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊した株（ＰｐＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）でヒト抗Ｈｅｒ２抗体を産生させた０．５Ｌバイオリアクター発現試験からの結果を示す。抗体を回収し、非還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１及び２は抗Ｈｅｒ２抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８で株ｙＧＬＹ２４−１を形質転換することにより作製した２個のクローンから産生された抗体を示し、レーン３〜５はＰＭＴ４遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９０の形質転換により作製した３個のクローンから産生された抗Ｈｅｒ２抗体を示す。
【図７】内在性ＰＤＩ１をヒトＰＤＩで置換し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株（ｈＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）と、内在性ＰＤＩ１のみを発現し、ＰＭＴ４遺伝子を破壊した株（ＰｐＰＤＩ＋Δｐｍｔ４）でヒト抗ＣＤ２０抗体を産生させた振盪フラスコ発現試験からの結果を示す。抗体を回収し、非還元及び還元ポリアクリルアミドゲルでポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。レーン１は抗ＣＤ２０抗体をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ３２００で形質転換した株ｙＧＬＹ２４−１から産生された抗体を示し、レーン２〜７はＰＭＴ４遺伝子を欠失させた株ｙＧＬＹ２６９０の形質転換により作製した６個のクローンから産生された抗ＣＤ２０抗体を示す。
【図８】ヒトＰＤＩ（ｈＰＤＩ）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＤＩ１遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を示す。
【図９】ヒトＥＲＯ１α（ｈＥＲＯ１α）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰｒＢ１遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３２の構築を示す。
【図１０】ヒトＧＲＰ９４をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＥＰ４遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を示す。
【図１１】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  α−１，２マンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）とマウスα−１，２マンノシダーゼＩＡ（ＦＢ５３）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＲＯ遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔの構築を示す。
【図１２】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  α−１，２マンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＲＯ遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２の構築を示す。
【図１３】抗ＤＫＫ１抗体重鎖（ＧＦＩ７１０Ｈ）及び軽鎖（ＧＦＩ７１０Ｌ）又は２本の軽鎖（ＧＦＩ７１０Ｌ）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＲＰ２遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２６０及び２２６１の地図。
【図１４】抗ＡＤＤＬ抗体重鎖（Ｈｃ）及び軽鎖（Ｌｃ）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＲＰ２遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ２０１２の地図。
【図１５】抗ＨＥＲ２抗体（抗ＨＥＲ２）重鎖（Ｈｃ）及び軽鎖（Ｌｃ）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＲＰ２遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８の地図。
【図１６】抗ＣＤ２０抗体重鎖（Ｈｃ）及び軽鎖（Ｌｃ）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＲＰ２遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ３２００の地図。
【図１７】Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＭＲ１をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ６遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ３８２２の地図。
【図１８】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＥＣＡ１（ＡｔＥＣＡ１）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＵＲＡ６遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ３８２７の地図。
【図１９】ヒトＣＲＴ（ｈＣＲＴ）とヒトＥＲｐ５７（ｈＥＲｐ５７）をコードし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＨＩＳ３遺伝子座を標的とするプラスミドベクターｐＧＬＹ１２３４の地図。
【国際調査報告】
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2011514157.tif 000073
2011514157.tif 000074