(57)【要約】本発明は、被検体に、治療有効量の非タンパク質分解的活性化トロンビン受容体アゴニストを投与することを含む、被検体の急性心筋梗塞の処置方法を含む。本発明の方法において、ＮＰＡＲアゴニストは、本明細書において開示するトロンビンペプチド誘導体である。より具体的には、トロンビンペプチド誘導体の一例は、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：１）またはその少なくとも６個のアミノ酸残基を含むＣ末端切断断片を含むものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性心筋梗塞中、被検体に、非タンパク質分解的活性化トロンビン受容体のアゴニストの治療有効量を投与することを含む、被検体の急性心筋梗塞の処置方法。
【請求項２】
前記アゴニストが静脈内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アゴニストが単独投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アゴニストがアミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｒを含むトロンビンペプチド誘導体であり、式中、Ｒはセリンエステラーゼ保存配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記トロンビンペプチド誘導体が約１２〜約２３アミノ酸残基長である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記セリンエステラーゼ保存配列が、Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：１４）または少なくとも６個のアミノ酸残基を有するそのＣ末端切断断片を含む、ただし、該セリンエステラーゼ保存配列内の０、１、２または３個のアミノ酸残基は、配列番号：１４内の対応する位置と異なっているものとする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記セリンエステラーゼ保存配列が、Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：１４）または少なくとも９個のアミノ酸残基を有するそのＣ末端切断断片を含む、ただし、該セリンエステラーゼ保存領域内のアミノ酸残基の０、１または２個は、配列番号：１４の対応するアミノ酸の保存的置換であるものとする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記セリンエステラーゼ保存配列が、Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：１５）または少なくとも６個のアミノ酸残基を有する配列番号：１５のＣ末端切断断片を含み、式中、Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（配列番号：１６）を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：１７）または少なくとも６個のアミノ酸残基を有するそのＣ末端切断断片を含み、該ペプチド内の０、１、２または３個のアミノ酸残基が配列番号：１７内の対応する位置と異なっている、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記トロンビン誘導体がＣ末端アミドを含み、アシル化Ｎ末端を任意選択で含み、該Ｃ末端アミドが−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂで表わされ、式中、ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、１０個までの炭素原子を含む置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＲａとＲｂが、これらが結合している窒素と一緒になってＣ３〜Ｃ１０非芳香族複素環式基を形成しており、該Ｎ末端アシル基はＲｃＣ（Ｏ）−で表わされ、、式中、Ｒｃは水素、１０個までの炭素原子を含む置換もしくは非置換脂肪族基、またはＣ３〜Ｃ１０置換もしくは非置換芳香族基である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記トロンビンペプチド誘導体が、非置換であるＮ末端と、非置換であるＣ末端または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２で表わされるＣ末端アミドを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：１７）または少なくとも６個のアミノ酸残基を有するそのＣ末端切断断片を含み、該ペプチド内のアミノ酸残基の０、１または２個が配列番号：１７の対応するアミノ酸の保存的置換である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：１）を含み、式中、Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
Ｘ１がＧｌｕであり、Ｘ２がＰｈｅである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：６）、少なくとも１４個のアミノ酸残基を有する該トロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断断片、または少なくとも１８個のアミノ酸残基を有する該トロンビンペプチド誘導体のＣ末端切断断片を含む、ただし、該トロンビン誘導体内の１〜９および１４〜２３位の０、１、２または３個のアミノ酸残基は、配列番号：６内の対応する位置のアミノ酸残基と異なっているものとする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：６）、少なくとも１４個のアミノ酸残基を有する該トロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断断片、または少なくとも１８個のアミノ酸残基を有する該トロンビンペプチド誘導体のＣ末端切断断片を含む、ただし、該トロンビン誘導体内の１〜９および１４〜２３位のアミノ酸残基の０、１または２個は、配列番号：６内の対応する位置のアミノ酸の保存的置換であるものとする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：２）、少なくとも１４個のアミノ酸残基を有する該トロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断断片、または少なくとも１８個のアミノ酸残基を有する該トロンビンペプチド誘導体のＣ末端切断断片を含み、式中、Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
被検体に、非タンパク質分解的活性化トロンビン受容体のアゴニストの治療有効量を投与することを含み、該アゴニストが、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ２（配列番号：３）である、被検体の急性心筋梗塞の処置方法。
【請求項２０】
前記急性心筋梗塞が左心室（ｖｅｎｔｉｃｕｌａｒ）壁で起こっている、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：１１）または少なくとも６個のアミノ酸残基を有するそのＣ末端切断断片を含み、該ペプチド内の０、１、２または３個のアミノ酸が配列番号：１１内の対応する位置と異なっている、ただし、Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンまたはＳ保護システインであるものとする、請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
前記トロンビンペプチド誘導体がＣ末端アミドを含み、アシル化Ｎ末端を任意選択で含み、該Ｃ末端アミドが−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂで表わされ、式中、ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、１０個までの炭素原子を含む置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＲａとＲｂが、これらが結合している窒素と一緒になってＣ３〜Ｃ１０非芳香族複素環式基を形成しており、該Ｎ末端アシル基はＲｃＣ（Ｏ）−で表わされ、式中、Ｒｃは水素、１０個までの炭素原子を含む置換もしくは非置換脂肪族基、またはＣ３〜Ｃ１０置換もしくは非置換芳香族基である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記トロンビンペプチド誘導体が、非置換であるＮ末端と、非置換であるＣ末端または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２で表わされるＣ末端アミドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：１１）または少なくとも６個のアミノ酸残基を有するそのＣ末端切断断片を含み、該ポリペプチド内のアミノ酸残基の０、１または２個が配列番号：１１の対応するアミノ酸の保存的置換である、ただし、Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンまたはＳ保護システインであるものとする、請求項５に記載の方法。
【請求項２５】
Ｘａａがアラニンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：４）を含み、式中、Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンまたはＳ保護システインであり；Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり；Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項２７】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：２０）または配列番号：２０のアミノ酸残基１０〜１８を含むその断片を含む、ただし、該トロンビンペプチド誘導体内の０、１または２個のアミノ酸残基は、配列番号：２０内の対応する位置のアミノ酸残基と異なっているものとする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：２０）を含み、式中、Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンもしくはＳ保護システインまたは配列番号：２０のアミノ酸残基１０〜１８を含むその断片である、ただし、該トロンビンペプチド誘導体内の０、１または２個のアミノ酸残基が、配列番号：２０内の対応する位置のアミノ酸残基の保存的置換であるものとする、請求項５に記載の方法。
【請求項２９】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：５）または配列番号：５のアミノ酸残基１０〜１８を含むその断片を含み、式中、Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンまたはＳ保護システインであり；Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり；Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項３０】
Ｘａａがアラニンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：５）を含み、式中、Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンまたはＳ保護システインであり、Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項３２】
Ｘａａがアラニンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｘ１がＧｌｕであり、Ｘ２がＰｈｅである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ２（配列番号：２２）である、請求項５に記載の方法。
【請求項３５】
前記アゴニストが、１２〜２３アミノ酸残基長の２つのトロンビンペプチド誘導体を含むペプチド二量体であり、該トロンビンペプチド誘導体が、独立して、ポリペプチドＡｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：１０）を含み、式中、Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓもしくはＶａｌまたは少なくとも６個のアミノ酸残基を有するそのＣ末端切断断片である、ただし、該ポリペプチド内の０、１、２または３個のアミノ酸残基は、配列番号：１０内の対応する位置の残基と異なっているものとする；該トロンビンペプチド誘導体は任意選択でＣ末端アミドを含み；該トロンビンペプチド誘導体はアシル化Ｎ末端を任意選択で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記二量体が本質的に単量体を含まない、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記トロンビンペプチド誘導体が同じである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記トロンビンペプチド誘導体がジスルフィド結合によって共有結合されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記トロンビンペプチド誘導体が約１２〜約２３個のアミノ酸からなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記トロンビンペプチド誘導体がＣ末端アミドを含み、アシル化Ｎ末端を任意選択で含み、該Ｃ末端アミドが−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂで表わされ、ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、１０個までの炭素原子を含む置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＲａとＲｂが、これらが結合している窒素と一緒になってＣ３〜Ｃ１０非芳香族複素環式基を形成しており、該Ｎ末端アシル基はＲｃＣ（Ｏ）−で表わされ、式中、Ｒｃは水素、１０個までの炭素原子を含む置換もしくは非置換脂肪族基、またはＣ３〜Ｃ１０置換もしくは非置換芳香族基である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記トロンビンペプチド誘導体が各々、非置換であるＮ末端；および非置換であるＣ末端または−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２で表わされるＣ末端アミドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記トロンビンペプチド誘導体が、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：１７）または少なくとも６個のアミノ酸残基を有するそのＣ末端切断断片のアミノ酸配列を含む、ただし、該トロンビンペプチド誘導体内のアミノ酸残基の０、１または２個が、配列番号：１７内の対応するアミノ酸残基の保存的置換であるものとする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：１）を含み、式中、Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：６）または配列番号：６のアミノ酸残基１０〜１８を含むその断片を含む、ただし、該トロンビンペプチド誘導体内の０、１、２または３個のアミノ酸残基は、配列番号：６内の対応する位置のアミノ酸残基と異なっているものとする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：６）または配列番号：６のアミノ酸残基１０〜１８を含むその断片を含む、ただし、該トロンビンペプチド誘導体内の０、１または２個のアミノ酸残基は、配列番号：６内の対応する位置のアミノ酸残基の保存的置換であるものとする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：２）を含み、式中、Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓもしくはＶａｌまたは配列番号：２のアミノ酸残基１０〜１８を含むその断片である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：２）を含み、式中、Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
Ｘ１がＧｌｕであり、Ｘ２がＰｈｅである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記トロンビンペプチド誘導体が、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ−ＮＨ２（配列番号：１２）を含み、式中、Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
Ｘ１がＧｌｕであり、Ｘ２がＰｈｅである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記アゴニストが、各々がポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：６）を含む２つのトロンビン誘導体を含むペプチド二量体であり、該トロンビンペプチド誘導体がジスルフィド結合によって共有結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
急性心筋梗塞中、被検体に、非タンパク質分解的活性化トロンビン受容体のアゴニストの治療有効量を投与することを含む、急性心筋梗塞が起こっている被検体において心筋組織のアポトーシスを低減する方法。
【請求項５３】
前記アゴニストが、下記の構造式：
【化３】
2011515471.tif 000004
で表わされるペプチド二量体である、請求項１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記アゴニストが心筋梗塞発症の１２０分以内に投与される、請求項１または５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記アゴニストが心筋梗塞発症の６時間以内に投与される、請求項１または５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記アゴニストが心筋梗塞発症の７日以内に投与される、請求項１または５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記急性心筋梗塞が左心室壁で起こっている、請求項１または５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記急性心筋梗塞が右心室壁で起こっている、請求項１または５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記アゴニストが別の治療用薬剤と組み合わせて投与される、請求項１または５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記アゴニストが心臓組織に直接投与される、請求項１または５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記アゴニストが薬学的に許容され得る担体とともに投与される、請求項１または５２に記載の方法。
【請求項６２】
前記アゴニストが、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ２（配列番号：２８）である、請求項１または５２に記載の方法。
【請求項６３】
被検体における心筋組織のアポトーシスの前記低減が、アポトーシスと関連している１種類以上のタンパク質因子のレベルが未処置対照と比べて低いことにより判定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６４】
前記タンパク質因子が、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、ｂａｄおよび切断型カスパーゼ３からなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０７０，８３７号、および２００８年８月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１３７，９５３号の利益を主張する。上記出願の全体の教示は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
心筋梗塞（ＭＩ）は、米国を含む多くの先進国での主な死亡原因である。世界保健機関（ＷＨＯ）により、全世界の死亡例の１３パーセントは、無症候性虚血から急性ＭＩ（ＡＭＩ）の範囲に及ぶ心臓の虚血状態に関連していると推定された。一般的に、ＡＭＩは、典型的には、（血液供給が遮断された心臓領域の）急速な細胞損傷の原因となる重度の酸素不足（虚血）に至る（または死に至る可能性もある）アテローム性動脈硬化または塞栓症に起因する冠動脈の閉塞によって引き起こされる。また、ＡＭＩは、冠動脈攣縮、貧血、不整脈、高血圧症、低血圧症または心停止に起因する他の虚血事象によっても引き起こされる。場合によっては、経皮冠動脈介入（ＰＣＩ）、ステント内血栓症または冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術によってもＡＭＩが引き起こされることが知られている。
【０００３】
心臓疾患のいくつかの異なるリスクファクターでＡＭＩに至るものとしては、喫煙、高血圧（高血圧症）、肥満、糖尿病、高脂肪の食事、および高い血液コレステロールレベル、特に高い低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）値と低い高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルの組合せが挙げられる。他の因子としては、性別（男性の方がリスクが高い）、年齢ならびに遺伝的素因が挙げられる。
【０００４】
ＡＭＩの発症は、多くの場合、左腕、首または上胃部に放射状に広がることがあり得、場合によっては急性消化不良または胆嚢発作の感覚を刺激する狭心症（胸痛）を特徴とする。患者は、通常、息切れ、発汗、吐き気および／または失神を起こす。典型的な徴候は、頻脈、かろうじて認知できる脈、低血圧、体温の上昇、心律動異常、およびＳＴ部分とＱ波の上昇を示す心電図（ＥＫＧ／ＥＣＧ）の異常である。また、臨床検査により、赤血球沈降速度の増大、白血球増加、および血清酵素（生化学的マーカー）（クレアチンキナーゼ（ＣＫ−ＭＢ）、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸‐オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、ならびにトロポニンＩ、ＣおよびＴなど）のレベルの上昇が示されることがあり得る。３つの典型的な徴候（すなわち、虚血性胸痛、ＥＣＧ図の異常、および血清酵素レベルの上昇；「ＷＨＯ基準」としても知られている）のうち２つが観察された場合、患者はＡＭＩと診断される。（非特許文献１；非特許文献２）。とはいえ、現在では、ＡＭＩの判定において、心臓トロポニンなどの生化学的マーカーの上昇をより重視する傾向にある（非特許文献３）。トロポニンは、まず４〜１２時間の間に増加し、梗塞形成の１０〜４８時間後にピークとなることが示されている（非特許文献４）。
【０００５】
最近まで、壊死は、ＡＭＩにおける組織の損傷の唯一の原因とみなされていた。しかしながら、最近の研究により、アポトーシスも、ヒトＡＭＩの心筋組織の損傷の過程に重要な役割を果たしていることが示されている（非特許文献５）。
【０００６】
壊死もアポトーシスもどちらも細胞の死をもたらすが、これらは、形態学的特徴および細胞調節の特徴においていくつか異なる。ＡＭＩ後の心臓組織の壊死は、細胞恒常性の急速な低下、水分と余分な細胞外イオン（電解質）の流入の結果としての急速な腫脹、早期の原形質膜破断、および細胞小器官の破壊を特徴とする。該膜の破断、続いて広範な細胞物質の漏出のため、壊死により心筋の炎症応答および白血球増加が誘発される。
【０００７】
壊死とは異なり、ＡＭＩに関連するアポトーシスは、細胞収縮および核クロマチン凝縮を特徴とする調節型エネルギー要求性プロセスである。その後、細胞は、その膜から出芽してアポトーシス体を形成することにより周囲組織から離脱し、急速に貪食または分解される。心筋細胞のアポトーシスは、再灌流障害によって引き起こされることがわかっており、３時間という早期に起こり、最初のＡＭＩ事象から２２時間後まで持続することが示されている（非特許文献６）。壊死とは異なり、一般的に、心筋細胞のアポトーシスでは炎症応答は引き起こされない。
【０００８】
米国では、毎年、ほぼ１００万人の患者がＡＭＩのため病院を訪れる。さらに、ＡＭＩに苦しむ２００，０００〜３００，０００人が医療補助を受けようとする前に死亡している。ＳＴ上昇が起こった患者の３分の１は、突発的な虚血の発生２４時間以内に死亡しており、生存者の多くは死亡率が相当高い。
【０００９】
ＡＭＩの緊急処置の際には心肺蘇生術が施され、その後、患者は、集中心臓治療室に収容され、心臓モニタリング下に置かれる。また、酸素、強心剤、抗不整脈薬および抗凝固薬も投与され得る。しかしながら、ＡＭＩ罹患者の心臓組織に直接介入させ、それにより細胞損傷を低減するためのＦＤＡ承認薬はまだない。したがって、心筋梗塞に起因する心筋層の細胞損傷を低減させる新たな治療用薬剤の開発の必要性が存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｇｉｌｌｕｍら，Ａｍ．  Ｈｅａｒｔ．  Ｊ．（１９８４）１０８：１５０−８
【非特許文献２】Ｔｕｎｓｔａｌｌ−Ｐｅｄｏｅら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：５８３−６１２（１９９４）
【非特許文献３】Ａｌｐｅｒｔら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３６：９５９−９６９（２０００）
【非特許文献４】Ｇｏｌｄｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｔｒｉａｌｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｍｅｄ．  ２：７５−８４（２００１）
【非特許文献５】Ｓａｒａｓｔｅら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９５：３２０−３２３（１９９７）
【非特許文献６】Ｈｏｆｓｔｒａら，Ｌａｎｃｅｔ  ３５６：２０９−２１２  （２０００）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
ＴＰ５０８は、非タンパク質分解的活性化トロンビン受容体（以下、本明細書において「ＮＰＡＲ」）を刺激または活性化するポリペプチドであり、急性心筋梗塞を処置するために使用され得る。ＴＰ５０８により、急性心筋梗塞に伴って生じる心筋組織に対する損傷が限定的となり得る。本発明は、被検体に治療有効量のＮＰＡＲアゴニストを投与することを含む、急性心筋梗塞を有する被検体（例えば、ヒト患者）の心筋組織の処置方法を含む。
【００１２】
本発明の方法において、ＮＰＡＲアゴニストは、本明細書において開示するトロンビンペプチド誘導体である。より具体的には、トロンビンペプチド誘導体の一例は、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：１）またはその少なくとも６個のアミノ酸残基を含むＣ末端切断断片を含むものである。別の特定の一実施形態において、トロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：２）、少なくとも１４個のアミノ酸残基を有する該トロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断断片、または少なくとも１８個のアミノ酸残基を含むトロンビンペプチド誘導体のＣ末端切断断片を含むものである。Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。別の特定の一実施形態において、トロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ２（配列番号：３）である。
【００１３】
別の実施形態において、ＮＰＡＲアゴニストは、本明細書において開示する修飾型トロンビンペプチド誘導体である。特定の一実施形態において、修飾型トロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：４）または少なくとも６個のアミノ酸残基を有するそのＣ末端切断断片を含むものである。別の特定の一実施形態において、修飾型トロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：５）または配列番号：５のアミノ酸残基１０〜１８を含む断片を含むものである。
【００１４】
また、本発明のトロンビンペプチド誘導体または修飾型トロンビンペプチド誘導体を含む医薬組成物には、二量体化インヒビターが含まれ得る。二量体化インヒビターは、トロンビンペプチド誘導体または修飾型トロンビンペプチド誘導体の二量体化を抑止または低減させる化合物である。二量体化インヒビターとしては、キレート剤および／またはチオール含有化合物が挙げられる。
【００１５】
別の実施形態において、ＮＰＡＲアゴニストは、本明細書において開示する２つのトロンビンペプチド誘導体の二量体である。より具体的には、かかる二量体の一方は、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：１）または少なくとも６個のアミノ酸残基を有するそのＣ末端切断断片を含むものである。別の特定の一実施形態において、該二量体は、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：２）または配列番号：２のアミノ酸残基１０〜１８を含む断片を有するポリペプチドを含むものである。本発明の別の実施形態において、該二量体は、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ２（配列番号：３）を含むものである。別の特定の一実施形態において、該二量体は構造式（ＩＶ）で表わされる。
【００１６】
上記でいうトロンビンは哺乳動物のトロンビン、特にヒトトロンビンであり得る。トロンビン部分は、トロンビン受容体結合ドメインまたはその一部分であり得る。一実施形態において、トロンビン受容体結合ドメインまたはその一部分は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：６）を含むものである。トロンビン受容体結合ドメインの別の一部分は、ポリペプチドＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（配列番号：７）を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、雄ユカタンブタのＴＰ５０８（「ＴＰ」，ｎ＝７）処置群およびビヒクル対照（「ＣＴ」，ｎ＝７）処置群における、内皮依存性アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）（図１Ａ）および内皮非依存性ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）（図１Ｂ）物質に対する冠微細血管応答を示すグラフである。このグラフは、予備収縮直径に対する弛緩割合で規定される弛緩応答を示す。
【図２】図２は、リスク領域（ａｒｅａ−ａｔ−ｒｉｓｋ）（ＡＡＲ）に対する割合としての梗塞サイズを示すグラフである。ＯＶＣ：正常コレステロール血で未処置（ｎ＝７）；ＯＴＣ：正常コレステロール血で処置（ｎ＝７）；ＯＶＨ：高コレステロール血症で未処置（ｎ＝７）；ＯＴＨ：高コレステロール血症で処置（ｎ＝７）；およびＯＴＨＦ：高コレステロール血症で２倍用量（ｎ＝４）。
【図３】図３は、全左心室質量に対する割合としてのリスク領域（ＡＡＲ）を示すグラフである。ＯＶＣ：正常コレステロール血で未処置（ｎ＝７）；ＯＴＣ：正常コレステロール血で処置（ｎ＝７）；ＯＶＨ：高コレステロール血症で未処置（ｎ＝７）；ＯＴＨ：高コレステロール血症で処置（ｎ＝７）；およびＯＴＨＦ：高コレステロール血症で２倍用量（ｎ＝４）。
【図４】図４は、ＴＰ５０８（ＮＣ−ＴＰ５０８；ボーラス：０．５ｍｇ／ｋｇ；注入：１．２５ｍｇ／ｋｇ／時；ｎ＝７）で処置した正常コレステロール血の（ＮＣ）ブタの梗塞サイズを、正常コレステロール血で未処置のビヒクル対照群（ＮＣ−対照；生理食塩水；ｎ＝７）の梗塞サイズに対する割合として示すグラフである。ｐ値は０．０５未満（ｐ＜０．０５）であった。
【図５】図５は、ＴＰ５０８で処置した高コレステロール血症の（ＨＣ）ブタの梗塞サイズを、高コレステロール血症で未処置のビヒクル対照群（Ａ；ＨＣ−対照；ｎ＝７）の梗塞サイズに対する割合として示すグラフである。処置群には：（１）０．０５ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス用量および０．１２５ｍｇ／ｋｇ／時の注入用量のＴＰ５０８（Ｂ；ＨＣ−ＴＰ５０８用量０．１倍；ｎ＝７）；（２）０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス用量および１．２５ｍｇ／ｋｇ／時の注入用量のＴＰ５０８（Ｃ；ＨＣ−ＴＰ５０８用量１倍；ｎ＝７）；（３）１．０ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス用量および２．５０ｍｇ／ｋｇ／時の注入用量のＴＰ５０８（Ｄ；ＨＣ−ＴＰ５０８用量２倍；ｎ＝７）；あるいは（４）モルベースでＨＣ−ＴＰ５０８用量１倍に等価な用量のＴＰ５０８二量体（Ｅ；ＨＣ−ＴＰ５０８二量体；ｎ＝７）のいずれかを与えた。ｐ値は０．０５未満（ｐ＜０．０５）であった。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、被検体に、非タンパク質分解的活性化トロンビン受容体（ＮＰＡＲ）のアゴニストの治療有効量を急性心筋梗塞発症の７日以内に投与することを含む、被検体（例えば、ヒト患者）の急性心筋梗塞の処置方法を含む。一実施形態において、ＮＰＡＲアゴニストは、心筋組織のアポトーシスを抑止または低減することにより心筋組織の損傷を低減または限定する。
【００１９】
本明細書で用いる場合、「急性心筋梗塞」は、動脈への血流または酸素供給が不充分である結果としての急速な心筋組織の損傷を特徴とする突発的または即時的な（慢性でない）虚血事象をいう。急性心筋梗塞は、バイオマーカー（例えば、限定されないが、トロポニンＩおよびＴ、ならびにクレアチンキナーゼ（ＣＫ−ＭＢ））の血清濃度の上昇を特徴とする。急性心筋梗塞に関連するトロポニンＩおよびＴならびにＣＫ−ＭＢの血清レベルの上昇は、参照対照群（すなわち、正常集団）の９９パーセンタイルより高いと定義する。例えば、９９パーセンタイルの急性心筋梗塞と判定するためのカットオフポイントは、トロポニンＩおよびＴでは、市販のアッセイの感度および型によるが、０．０３〜１．０ｎｇ／ｍｌの範囲である（Ｔｈｙｇｅｓｅｎら  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１６：２６３４−２６５３（２００７）；Ｍｏｒｒｏｗら  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３：５５２−５７４（２００７）参照）。
【００２０】
本明細書で言及する場合、「急性心筋梗塞」は、突発的または即時的な虚血事象の発生により起こり、その後、７日間まで持続するものである。本明細書で用いる急性心筋梗塞は、突発的または即時的な虚血事象の発生後６時間までを、さらに「発展期（ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｓｔａｇｅ）」と分類する。さらに、急性心筋梗塞は、突発的または即時的な虚血事象の発生後６時間から７日間までを、「急性期」と分類する。
【００２１】
ＮＰＡＲアゴニストは、発展期および／または急性期中の任意の時点で投与される（数回の間隔で投与される複数回用量を含む）。ＮＰＡＲアゴニストは、突発的または即時的な虚血事象の発生後、１、２、３、４、５または６時間の時点および／または該時間以内に投与され得る。ＮＰＡＲアゴニストは、急性心筋梗塞発症後、７、８、９、１０、１５、２４、３６または４８時間の時点および／または該時間以内に投与され得る。ＮＰＡＲアゴニストは、急性心筋梗塞発症後、３、４、５、６または７日の時点および／または該日数以内に投与され得る。あるいはまた、ＮＰＡＲアゴニストは、本明細書で用いているように、急性心筋梗塞発症後０〜４８時間、１〜３日、２〜４日、２〜７日または３〜７日の間に投与され得る。ボーラス用量は静脈内投与され得るか、または連続注入により、ある期間にわたって投与され得る。また、ボーラス法と連続注入法の組合せを使用してもよい。ＮＰＡＲアゴニストは、このような期間中に１回投与してもよく、あるいはまた、このような期間内に２、３、４、５、６、７、８回またはさらにそれ以上投与してもよい。一実施形態において、ＮＰＡＲアゴニストでの処置は、このような期間後に終了する。あるいはまた、該期間終了後も処置を継続してもよい。
【００２２】
ＮＰＡＲを刺激する化合物はＮＰＡＲアゴニストと称される。かかるＮＰＡＲの一例は、ほとんどの細胞の表面上に存在する高親和性トロンビン受容体である。このＮＰＡＲ成分は、主に、細胞へのトロンビン、タンパク質分解的不活化トロンビンおよびトロンビン由来ペプチドの高親和性結合を担う。このＮＰＡＲは、トロンビンによって、そのタンパク質分解活性とは無関係に生成されるいくつかの細胞内シグナルを媒介していると思われる（Ｓｏｗｅｒら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４７：４２２（１９９９）参照）。したがって、このＮＰＡＲは、細胞表面でのトロンビンとの高親和性相互作用、およびトロンビンのタンパク質分解的不活性誘導体とトロンビン由来ペプチドアゴニストによる活性化を特徴とする（後述）。ＮＰＡＲの活性化は、米国特許第５，３５２，６６４号および同第５，５００，４１２号に開示されているように、分裂促進濃度未満濃度のトロンビンまたはプロテインキナーゼＣを活性化する分子の存在下で線維芽細胞に添加したとき、細胞増殖を刺激する分子の能力に基づいてアッセイされ得る。これらの特許の全教示は、引用により本明細書に組み込まれる。ＮＰＡＲアゴニストは、この活性化または細胞に対して１２５Ｉ−トロンビン結合と競合する能力によって認定され得る。
【００２３】
トロンビン受容体結合ドメインは、トロンビン受容体に直接結合する、および／または高親和性トロンビン受容体とα−トロンビン間の結合を競合的に阻害するポリペプチドまたはポリペプチド部分と定義する。
【００２４】
本発明のＮＰＡＲアゴニストとしては、本明細書に開示しているようなトロンビン誘導体ペプチド、修飾型トロンビン誘導体ペプチドおよびトロンビン誘導体ペプチド二量体が挙げられる。
【００２５】
トロンビンペプチド誘導体
ＮＰＡＲアゴニストのうち、トロンビンペプチド誘導体（また、「トロンビン誘導体ペプチド」）は、トロンビンの類似体であり、少なくとも一部がトロンビンのものに由来するアミノ酸配列を有し、非タンパク質分解的活性化トロンビン受容体において活性である。トロンビンペプチド誘導体としては、例えば、組換えＤＮＡ法によって作製されるペプチド、ペプチド二量体、トロンビンの酵素分解によって作製されるペプチド、および合成により作製されるペプチドが挙げられ、これらは、トロンビンに対するアミノ酸置換および／または修飾型アミノ酸残基を含むものであってもよい（特に、末端に）。
【００２６】
本明細書に記載のペプチドはすべて、イオン化性基（すなわち、Ｎ末端残基（ｒｅｓｉｄｅ）のアミノ基、Ｃ末端残基のカルボキシル基および／または該ペプチドの側鎖内のアミノ酸）を含むことは理解されよう。当業者であれば、このようなイオン化性基が、本明細書でいうトロンビンペプチド誘導体が存在している溶液のｐＨに加え、該ペプチドの正味電荷にも寄与することは理解されよう。イオン性物質は酸または塩基の形態で存在し得るため、本明細書でいうトロンビンペプチド誘導体は、そのイオン化状態に応じて種々の塩形態で存在し得る。したがって、本明細書において、トロンビンペプチド誘導体をアミノ酸配列またはなんらかの他の記述によって示している場合、対応するその薬学的に適した塩も包含されていることは理解されよう。
【００２７】
薬学的に許容され得る塩形態としては、薬学的に許容され得る酸性／アニオン性または塩基性／カチオン性の塩が挙げられる。薬学的に許容され得る酸性／アニオン性の塩としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩（ｅｓｔｏｌａｔｅ）、エシル酸塩（ｅｓｙｌａｔｅ）、フマル酸塩、グルセプト酸塩（ｇｌｙｃｅｐｔａｔｅ）、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、アルサニル酸グリコリル、レゾルシン酸ヘキシル、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、粘液酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩（ｄｉｐｈｏｓｐａｔｅ）、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸、トシル酸塩、およびトリエチオダイド（ｔｒｉｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）塩が挙げられる。薬学的に許容され得る塩基性／カチオン性の塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、ジエタノールアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、アンモニウム、エタノールアミン、ピペラジンおよびトリエタノールアミン塩が挙げられる。
【００２８】
本発明のＮＰＡＲアゴニストは、米国特許第５，３５２，６６４号および同第５，５００，４１２号に記載のトロンビン誘導体ペプチドを含む。一実施形態において、本発明のＮＰＡＲアゴニストは、トロンビンペプチド誘導体または生理学的機能性等価物、すなわち、約５０個以下のアミノ酸残基、好ましくは約３０個以下のアミノ酸残基を有し、トロンビンアミノ酸残基５０８〜５３０（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ；配列番号：６）に対応するヒトトロンビン断片に充分な相同性を有するポリペプチドであって、ＮＰＡＲを活性化するポリペプチドである。本明細書に記載のトロンビンペプチド誘導体または修飾型トロンビンペプチド誘導体は、好ましくは約１２〜約２３個のアミノ酸残基、より好ましくは約１９〜約２３個のアミノ酸残基を有する。
【００２９】
別の実施形態において、本発明のＮＰＡＲアゴニストは、構造式（Ｉ）：
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｒ（Ｉ）
で表わされる部分を含むトロンビンペプチド誘導体である。Ｒは、セリンエステラーゼ保存ドメインである。セリンエステラーゼ（例えば、トリプシン、トロンビン、キモトリプシンなど）は、高度に保存された領域を有する。「セリンエステラーゼ保存ドメイン」は、このような保存領域のうちの１つのアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはこのような保存領域のうちの１つに対して、該トロンビンペプチド誘導体がＮＰＡＲ活性化能を保持するように充分に相同であるポリペプチドをいう。
【００３０】
トロンビン誘導体の生理学的機能性等価物は、トロンビン誘導体と特定事項において異なるが、トロンビン受容体結合ドメインまたはセリンエステラーゼ保存アミノ酸配列の機能には影響しない分子を包含する。かかる特定事項としては、限定されないが、同類アミノ酸置換および修飾、例えば、カルボキシル末端のアミド化、アミノ末端のアセチル化、生理学的に不活性な担体分子への該ポリペプチドのコンジュゲーション、またはセリンエステラーゼ保存配列に従う配列改変が挙げられ得る。
【００３１】
セリンエステラーゼ保存配列を有するドメインは、セリンプロテアーゼ間で高度に保存されていることがこれまでに示されているドデカペプチド（Ａｓｐ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ３−Ｖａｌ；配列番号：１３）の４〜１２個のＮ末端アミノ酸残基を含むポリペプチド配列を含むものであり得る；式中、Ｘ１は、ＡｌａまたはＳｅｒのいずれかであり；Ｘ２は、ＧｌｕまたはＧｌｎのいずれかであり；Ｘ３は、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。
【００３２】
一実施形態において、セリンエステラーゼ保存配列は、アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：１４）または配列番号：１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端切断断片を含むものである。しかしながら、該セリンエステラーゼ保存配列内の０、１、２または３個のアミノ酸残基は、配列番号：１４の対応するアミノ酸と異なっていることがあり得ることは理解されよう。好ましくは、配列番号：１４の対応するアミノ酸と異なっているセリンエステラーゼ保存配列内のアミノ酸残基は保存的置換であり、より好ましくは高度保存的置換である。「Ｃ末端切断断片」は、アミノ酸残基またはアミノ酸残基ブロックをＣ末端から除去した後に残る断片をいい、前記断片は少なくとも６個、より好ましくは少なくとも９個のアミノ酸残基を有する。
【００３３】
別の実施形態において、セリンエステラーゼ保存配列は、配列番号：１５（Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ；Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである）またはその少なくとも６個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも９個のアミノ酸残基を有するＣ末端切断断片のアミノ酸配列を含むものである。
【００３４】
好ましい実施形態において、トロンビンペプチド誘導体は、セリンエステラーゼ保存配列と、より特異的なトロンビンアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（配列番号：１６）を有するポリペプチドを含む。この型のトロンビンペプチド誘導体の一例は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：１）を含むものである。Ｘ１およびＸ２は上記に規定のとおりである。トロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：６）またはそのＮ末端切断断片を含むものであってもよい、ただし、該トロンビンペプチド誘導体内の１〜９位の０、１、２または３個のアミノ酸残基は、配列番号：６内の対応する位置のアミノ酸残基と異なっているものとする。好ましくは、配列番号：６内の対応するアミノ酸残基と異なっている該トロンビンペプチド誘導体内のアミノ酸残基は保存的置換であり、より好ましくは高度保存的置換である。「Ｎ末端切断断片」は、アミノ酸残基またはアミノ酸残基ブロックを、好ましくは６個以下のアミノ酸残基ブロック、より好ましくは３個以下のアミノ酸残基ブロックをＮ末端から除去した後に残る断片をいう。
【００３５】
任意選択で、本明細書に記載のトロンビンペプチド誘導体は、Ｃ末端がアミド化および／またはＮ末端がアシル化されていてもよい。特定の一実施形態において、トロンビンペプチド誘導体はＣ末端アミドを含み、アシル化Ｎ末端を任意選択で含み、前記Ｃ末端アミドが−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂで表わされ、式中、ＲａおよびＲｂは、独立して、水素、１０個までの炭素原子を含む置換もしくは非置換脂肪族基であるか、またはＲａとＲｂが、これらが結合している窒素と一緒になってＣ３〜Ｃ１０非芳香族複素環式基を形成しており、前記Ｎ末端アシル基がＲｃＣ（Ｏ）−で表わされ、式中、Ｒｃは水素、１０個までの炭素原子を含む置換もしくは非置換脂肪族基、またはＣ３〜Ｃ１０置換もしくは非置換芳香族基であるものである。別の特定の一実施形態において、トロンビンペプチド誘導体のＮ末端は遊離状態（すなわち、非置換）であり、Ｃ末端は遊離状態（すなわち、非置換）であるか、または好ましくはカルボキサミド（すなわち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）としてアミド化されている。特定の一実施形態において、トロンビンペプチド誘導体は、下記のアミノ酸配列：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：６）を含むものである。別の特定の一実施形態において、トロンビンペプチド誘導体は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：１７）のアミノ配列を含むものである。あるいはまた、トロンビンペプチド誘導体は、配列番号：１８：Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅのアミノ酸配列を含むものである。配列番号：６、１７または１８のアミノ酸配列を含むトロンビンペプチド誘導体は、任意選択で、Ｃ末端がアミド化および／またはＮ末端がアシル化されていてもよい。好ましくは、Ｎ末端は遊離状態（すなわち、非置換）であり、Ｃ末端は遊離状態（すなわち、非置換）であるか、または好ましくはカルボキサミド（すなわち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）としてアミド化されている。しかしながら、トロンビンペプチド誘導体内の１〜９位および１４〜２３位の０、１、２または３個のアミノ酸残基は、配列番号：６内の対応するアミノ酸と異なっていることがあり得ることは理解されよう。また、トロンビンペプチド誘導体内の１〜１４位および１９〜３３位の０、１、２または３個のアミノ酸残基が、配列番号：１８内の対応するアミノ酸と異なっていることがあり得ることも理解されよう。好ましくは、配列番号：６または配列番号：１８内の対応するアミノ酸と異なっているトロンビンペプチド誘導体内のアミノ酸残基は保存的置換であり、より好ましくは高度保存的置換である。あるいはまた、少なくとも１４個のアミノ酸残基を有するトロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断断片、または少なくとも１８個のアミノ酸残基を有するトロンビンペプチド誘導体のＣ末端切断断片は、ＮＰＡＲアゴニストとして使用されるトロンビンペプチド誘導体である。
【００３６】
「Ｃ末端切断断片」は、アミノ酸残基またはアミノ酸残基ブロックをＣ末端から除去した後に残る断片をいう。「Ｎ末端切断断片」は、アミノ酸残基またはアミノ酸残基ブロックをＮ末端から除去した後に残る断片をいう。Ｃ末端切断断片およびＮ末端切断断片はともに、任意選択で、Ｃ末端がアミド化および／またはＮ末端がアシル化されていてもよいことは理解されよう。
【００３７】
開示した方法における使用に好ましいトロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：２）を含むものである。開示した方法における使用に好ましい別のトロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＡｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：１９）を含むものである。Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり；Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。配列番号：２および配列番号：１９のトロンビンペプチド誘導体は、上記に規定したようなＣ末端アミドおよび／またはアシル化Ｎ末端を任意選択で含んでいてもよい。好ましくは、Ｎ末端は遊離状態（すなわち、非置換）であり、Ｃ末端は遊離状態（すなわち、非置換）であるか、または好ましくはカルボキサミド（すなわち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）としてアミド化されている。あるいはまた、このような好ましいトロンビンペプチド誘導体のＮ末端切断断片（少なくとも１４個のアミノ酸残基を有するＮ末端切断断片）、またはこのような好ましいトロンビンペプチド誘導体のＣ末端切断断片（少なくとも１８個のアミノ酸残基を有するＣ末端切断断片）も、開示した方法において使用することができる。
【００３８】
ＴＰ５０８は、トロンビンペプチド誘導体の一例であり、２３アミノ酸残基長であり、そのＮ末端アミノ酸残基Ａｌａは非置換であり、Ｃ末端アミノ酸ＶａｌのＣＯＯＨは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２で表わされるアミドに修飾されている（配列番号：３）。トロンビンペプチド誘導体の別の例は、配列番号：６のアミノ酸配列を含むものであり、Ｎ末端とＣ末端の両方が非置換である（「デアミドＴＰ５０８」）。開示した方法に使用され得るトロンビンペプチド誘導体の他の例としては、ＴＰ５０８（またはデアミドＴＰ５０８）のＮ末端切断断片（少なくとも１４個のアミノ酸残基を有するＮ末端切断断片）、またはＴＰ５０８（またはデアミドＴＰ５０８）のＣ末端切断断片（少なくとも１８個のアミノ酸残基を有するＣ末端切断断片）が挙げられる。
【００３９】
本明細書で用いる場合、ポリペプチドにおける「保存的置換」は、あるアミノ酸を、同じ正味電荷およびほぼ同じ大きさと形状を有する別のアミノ酸で置き換えることである。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基は、側鎖内の炭素原子とヘテロ原子の総数が約４個より多く異ならない場合、ほぼ同じ大きさを有する。これらは、側鎖内の分枝の数が１つより多く異ならない場合、ほぼ同じ形状を有する。フェニルまたは置換フェニル基を側鎖内に有するアミノ酸残基は、ほぼ同じ大きさと形状を有するとみなされる。以下に、アミノ酸の５つの群を示す。ポリペプチド内のあるアミノ酸残基を同じ群の別のアミノ酸残基で置き換えると、保存的置換がもたらされる。
【００４０】
第Ｉ群：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、およびＣ１〜Ｃ４脂肪族またはＣ１〜Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖または１分枝）を有する非天然アミノ酸。
【００４１】
第ＩＩ群：グルタミン酸、アスパラギン酸およびカルボン酸置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または１分枝）を有する非天然アミノ酸。
【００４２】
第ＩＩＩ群：リジン、オルニチン、アルギニンおよびアミンまたはグアニジノ置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または１分枝）を有する非天然アミノ酸。
【００４３】
第ＩＶ群：グルタミン、アスパラギンおよびアミド置換Ｃ１〜Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または１分枝）を有する非天然アミノ酸。
【００４４】
第Ｖ群：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプトファン。
【００４５】
本明細書で用いる場合、ポリペプチドにおける「高度保存的置換」は、あるアミノ酸を、側鎖内に同じ官能基を有し、大きさと形状がほぼ同じである別のアミノ酸で置き換えることである。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、側鎖内の炭素原子とヘテロ原子の総数が２個より多く異ならない場合、ほぼ同じ大きさを有する。これらは、側鎖内に同じ数の分枝を有する場合、ほぼ同じ形状を有する。高度保存的置換の例としては、ロイシンの代わりにバリン、セリンの代わりにトレオニン、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸、およびフェニルアラニンの代わりにフェニルグリシンが挙げられる。高度同類でない置換の例としては、バリンの代わりにアラニン、セリンの代わりにアラニン、およびセリンの代わりにアスパラギン酸が挙げられる。
【００４６】
修飾型トロンビンペプチド誘導体
本発明の一実施形態において、ＮＰＡＲアゴニストは、上記のトロンビンペプチド誘導体に対して修飾されたものであって、前述のトロンビンペプチド誘導体のシステイン残基が、該ペプチドの二量体化が最小限となるように同様の大きさおよび電荷特性を有するアミノ酸で置き換えられたものである。好適なアミノ酸の例としては、アラニン、グリシン、セリン、およびＳ保護システインが挙げられる。好ましくは、システインは、アラニンまたはセリンで置き換えられる。修飾型トロンビンペプチド誘導体は、非修飾型トロンビンペプチド誘導体とほぼ同じ生物学的活性を有する。
【００４７】
本明細書において開示する修飾型トロンビンペプチド誘導体は、上記のようなＣ末端アミドおよび／またはＮ末端アシル基を任意選択で含んでいてもよいことは理解されよう。好ましくは、トロンビンペプチド誘導体のＮ末端は遊離状態（すなわち、非置換）であり、Ｃ末端は遊離状態（すなわち、非置換）であるか、または好ましくはカルボキサミド（すなわち、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）としてアミド化されている。
【００４８】
特定の一実施形態において、修飾型トロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：４）またはその少なくとも６個のアミノ酸を有するＣ末端切断断片を含むものである。より具体的には、該トロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：２０）または配列番号：２０のアミノ酸残基１０〜１８を含む断片を含むものである。さらにより具体的には、該トロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：５）または配列番号：５のアミノ酸残基１０〜１８を含む断片を含むものである。Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンまたはＳ保護システインである。Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。一実施形態において、Ｘ１はＧｌｕであり、Ｘ２はＰｈｅであり、ＸａａはＡｌａである。別の実施形態において、Ｘ１はＧｌｕであり、Ｘ２はＰｈｅであり、ＸａａはＳｅｒである。この型のトロンビンペプチド誘導体の一例は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：２１）である。この型のトロンビンペプチド誘導体のさらなる一例は、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ２（配列番号：２２）であり、式中、Ｈは、Ｎ末端での修飾がないことを示すアラニンの水素原子であり、ＮＨ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２としてのＣ末端のアミド化を示す。該トロンビンペプチド誘導体内の０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号：４、２０、５、２１または２２内の対応する位置のアミノ酸と異なっている、ただし、Ｘａａはアラニン、グリシン、セリンおよびＳ保護システインであるものとする。好ましくは、その違いは同類である。
【００４９】
別の特定の一実施形態において、トロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＡｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：２３）またはそのアミノ酸６〜２８個を含む断片を含むものである。より好ましくは、該トロンビンペプチド誘導体は、ポリペプチドＡｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｘｂｂ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：２４）またはそのアミノ酸６〜２８個を含む断片を含むものである。ＸａａおよびＸｂｂは独立して、アラニン、グリシン、セリンまたはＳ保護システインである。Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。好ましくは、Ｘ１はＧｌｕ、Ｘ２はＰｈｅであり、ＸａａとＸｂｂはアラニンである。この型のトロンビンペプチド誘導体の一例は、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：２５）を含むポリペプチドである。この型のトロンビンペプチド誘導体のさらなる一例は、ポリペプチドＨ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号：２６）であり、式中、Ｈは、Ｎ末端での修飾がないことを示すアスパラギン酸の水素原子であり、ＮＨ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２としてのＣ末端のアミド化を示す。該トロンビンペプチド誘導体内の０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号：２３、２４、２５または２６内の対応する位置のアミノ酸と異なっていることがあり得る。ＸａａおよびＸｂｂは独立して、アラニン、グリシン、セリンまたはＳ保護システインである。好ましくは、その違いは同類である。
【００５０】
「Ｓ保護システイン」は、チオール部分−ＳＨの反応性が保護基でブロックされているシステイン残基である。好適な保護基は当該技術分野で知られており、例えば、Ｔ．  Ｗ．  ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（１９９９），ｐｐ．４５４−４９３（その教示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。好適な保護基は、無毒性であり、医薬製剤中で安定であり、トロンビンペプチド誘導体の活性を維持するためのさらなる官能基が最小限であるものがよい。遊離状態のチオールは、チオエーテル、チオエステルとして保護してもよく、非対称ジスルフィドに酸化してもよい。好ましくは、チオールはチオエーテルとして保護する。好適なチオエーテルとしては、限定されないが、Ｓ−アルキルチオエーテル（例えば、Ｃ１〜Ｃ５アルキル）、およびＳ−ベンジルチオエーテル（例えば、システイン−Ｓ−Ｓ−ｔ−Ｂｕ）が挙げられる。好ましくは、保護基はアルキルチオエーテルである。より好ましくは、Ｓ保護システインはＳ−メチルシステインである。あるいはまた、保護基は：１）ジスルフィド結合によってトロンビンペプチド誘導体のシステインチオール基に結合させるシステインもしくはシステイン含有ペプチド（「保護性ペプチド」）；または２）トロンビンペプチド誘導体のシステインチオール基と保護性ペプチド内のカルボン酸（例えば、Ｃ末端あるいはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の側鎖）とをチオアミド結合によって結合させるアミノ酸またはペプチド（「保護性ペプチド」）であり得る。保護性ペプチドは、生理学的に不活性なもの（例えば、約５０個以下のアミノ酸のポリグリシンもしくはポリアラニン（任意選択でシステインが割り込んでいる））であり得るか、または所望の生物学的活性を有するものであり得る。
【００５１】
本発明のトロンビンペプチド誘導体または修飾型トロンビンペプチド誘導体は、本発明のトロンビンペプチド誘導体または修飾型トロンビンペプチド誘導体を含む医薬組成物の調製のために、二量体化インヒビターと混合してもよい。二量体化インヒビターとしては、キレート剤および／またはチオール含有化合物が挙げられ得る。また、抗酸化剤をキレート剤および／またはチオール含有化合物と組み合わせて使用してもよい。
【００５２】
「キレート剤」は、本明細書で用いる場合、例えば、鉛、コバルト、鉄または銅イオンなどの金属イオン（１種類または複数種）に同時に結合することができる多数の部位（２、３、４つまたはそれ以上）を有する化合物である。該結合部位は、典型的には、酸素、窒素、イオウまたはリンを含む。例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）の塩は、金属イオン（１種類または複数種）と、ＥＤＴＡの４つの酢酸部分（−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−）の酸素原子およびエチレンジアミン部分（＞Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＜）の窒素原子との少なくとも４〜６つの結合により形成され得る。キレート剤には、金属イオン（１種類または複数種）に対する多数の結合部位を有するポリマーも含まれることは理解されよう。好ましくは、本発明のキレート剤は、無毒性であり、本発明の方法において投与される医薬組成物の投薬量で、許容され得ない副作用を引き起こさないものである。本発明のキレート剤としては、銅キレート剤が好ましい。「銅キレート剤」は、銅イオン（１種類または複数種）に結合することができるキレート剤をいう。銅キレート剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ペニシラミン、トリエンチン、Ｎ，Ｎ’−ジエチルジチオカルバメート（ＤＤＣ）、２，３，２’−テトラアミン（２，３，２’−ｔｅｔ）、ネオクプロイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（２−ピリジルメチル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）、１，１０−フェナントロリン（ＰＨＥ）、テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）、トリエチレンテトラアミンおよびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が挙げられる。さらなるキレート剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびバソフェナントロリンジスルホン酸（ＢＰＡＤＡ）である。ＥＤＴＡは好ましいキレート剤である。本発明の医薬組成物中に存在させるキレート剤の典型的な量は、約０．００００１％〜約０．１％（重量基準）、好ましくは約０．０００１％〜約０．０５％（重量基準）の範囲である。
【００５３】
「薬学的に許容され得るチオール含有化合物」は、本明細書で用いる場合、少なくとも１つのチオール（−ＳＨ）基を含み、投与される投薬量で、許容され得ない副作用を引き起こさない化合物である。薬学的に許容され得るチオール含有化合物の例としては、チオグリセロール、メルカプトエタノール、チオグリコール、チオジグリコール、システイン、チオグルコース、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびジチオ−ビス−マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）が挙げられる。典型的には、約０．００１％〜約５％（重量基準）、好ましくは約０．０５％〜約１．０％（重量基準）の薬学的に許容され得るチオール含有化合物を本発明の医薬組成物中に存在させる。  
【００５４】
「抗酸化剤」は、本明細書で用いる場合、酸素などの酸化剤によって引き起こされる酸化反応を抑制または低減させるために使用される化合物である。抗酸化剤の例としては、トコフェロール、シスチン、メチオニン、グルタチオン、トコトリエノール、ジメチルグリシン、ベタイン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ビタミンＥ、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、チオグリコール酸および抗酸化剤ペプチド（例えば、ツルメリンなど）が挙げられる。典型的には、約０．００１％〜約１０％（重量基準）、好ましくは約０．０１％〜約５％、より好ましくは約０．０５％〜約２．０％（重量基準）の抗酸化剤を本発明の医薬組成物中に存在させる。
【００５５】
ある種のキレート剤またはチオール含有化合物は、抗酸化剤としての機能も果たすことがあり得ることは理解されよう（例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、システインまたはジチオトレイトール）。しかしながら、一般に使用されている他の型の抗酸化剤は、チオール基を含まない。また、ある種のチオール含有化合物が、キレート剤としても機能を果たすことがあり得ることも理解されよう（例えば、ジチオトレイトール）。しかしながら、一般に使用されている他の型のキレート剤は、チオール基を含まない。また、本発明の医薬組成物に、１種類より多くのキレート剤、チオール含有化合物または抗酸化剤を含めてもよいことも理解されよう。すなわち、例えば、キレート剤は、単独または１種類以上の他の適当なキレート剤との組合せのいずれかで使用され得る。
【００５６】
トロンビンペプチド誘導体二量体
本発明の一部の態様において、本方法のＮＰＡＲアゴニストはトロンビンペプチド誘導体二量体である。該二量体は、本質的に単量体には戻らないが、依然として上記のトロンビンペプチド誘導体単量体とほぼ同じ生物学的活性を有する。「トロンビンペプチド誘導体二量体」は、共有結合によって、好ましくはシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結された２つのトロンビンペプチド誘導体（ポリペプチド）を含む分子である。トロンビンペプチド誘導体二量体は、典型的には、対応する単量体を本質的に含まない（例えば、９５重量％超含まない、好ましくは９９重量％超含まない）。好ましくは、該ポリペプチドは同じであり、ジスルフィド結合によって共有結合されている。
【００５７】
本発明のトロンビンペプチド誘導体二量体は、上記のトロンビンペプチド誘導体を含むものである。具体的には、トロンビンペプチド誘導体は、約５０個より少ないアミノ酸、好ましくは約３３個またはより少ないアミノ酸を有する。本明細書に記載のトロンビンペプチド誘導体二量体は、典型的には少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは約１２〜約３３個のアミノ酸残基、より好ましくは約１２〜約２３個のアミノ酸残基を有するポリペプチドで形成されたものである。該二量体のトロンビンペプチド誘導体単量体サブユニットは、ＮＰＡＲが活性化されるようにトロンビンアミノ酸残基５０８〜５３０（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：６））に対応するヒトトロンビン断片に対して充分な相同性を有する。
【００５８】
特定の一実施形態において、二量体の２つのトロンビンペプチド誘導体（単量体）は各々、ポリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：１）またはその少なくとも６個のアミノ酸残基を含むＣ末端切断断片を含むものである。より具体的には、ポリペプチド単量体は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：６）または配列番号：５のアミノ酸残基１０〜１８を含む断片を含むものである。さらにより具体的には、ポリペプチド単量体は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ（配列番号：２）または配列番号：２のアミノ酸残基１０〜１８を含む断片を含むものである。Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。好ましくは、Ｘ１がＧｌｕであり、Ｘ２がＰｈｅである。この型のポリペプチドの一例は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：６）である。さらなる一例は、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ２（配列番号：３）であり、式中、Ｈは、Ｎ末端での修飾がないことを示すアラニンの水素原子であり、ＮＨ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２としてのＣ末端のアミド化を示す。ポリペプチド内の０、１、２または３個のアミノ酸残基は、配列番号：６、１、２または３内の対応する位置のアミノ酸残基と異なっている。好ましくは、その違いは同類である。
【００５９】
本発明のトロンビンペプチド誘導体二量体の一例は、式（ＩＶ）：
【００６０】
【化１】
2011515471.tif 000002
で表わされるものである。式（ＩＶ）の二量体およびその塩を「ＴＰ５０８二量体」と称する。
【００６１】
別の特定の一実施形態において、二量体の２つのトロンビンペプチド誘導体（単量体）は、各々、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号：２７）またはその少なくとも２３個のアミノ酸残基を有するＣ末端切断断片を含む。より好ましくは、ポリペプチドは、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号：８）またはその少なくとも２３個のアミノ酸残基を含むＣ末端切断断片を含む。Ｘ１はＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘ２はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである。好ましくは、Ｘ１がＧｌｕであり、Ｘ２がＰｈｅである。この型のポリペプチドの一例は、ポリペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（配列番号：２７）である。この型のポリペプチドのさらなる一例は、ポリペプチドＨ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号：９）であり、式中、Ｈは、Ｎ末端での修飾がないことを示すアラニンの水素原子であり、ＮＨ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２としてのＣ末端のアミド化を示す。ポリペプチド内の０、１、２または３個のアミノ酸残基は、配列番号：２７、配列番号：８または配列番号：９内の対応する位置のアミノ酸残基と異なっている。好ましくは、その違いは同類である。
【００６２】
ＮＰＡＲアゴニストでの処置方法
本発明は、被検体に、治療有効量のＮＰＡＲアゴニストを急性心筋虚血の発症後７日以内に投与することを含む、被検体の急性心筋梗塞の処置方法に関する。
【００６３】
開示した方法は、急性心筋梗塞発生時の一次処置法として使用され得る。開示した方法は、任意の特定の種類の心臓組織または心臓箇所に限定されない。開示した方法によって処置され得る急性心筋梗塞の例としては、限定されないが、中隔壁、前壁、前壁中隔壁、前外側壁、広範（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）前壁、下側壁、外側壁  後壁、左心室壁および右心室壁の心筋層に対する梗塞形成が挙げられる。開示した方法によって処置され得る急性心筋梗塞の一例としては、限定されないが、心内膜に対する梗塞形成が挙げられる。
【００６４】
「被検体」は、好ましくはヒトであるが、トロンビン受容体アゴニストでの処置を必要とする動物、例えば、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコなど）、飼育動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマなど）および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。本明細書で用いる場合、「被検体」は、急性心筋梗塞が起こっているヒト患者であり得る。一実施形態において、「被検体」は、コレステロールレベルが２００ｍｇ／デシリットル（ｍｇ／ｄＬ）より高い高コレステロール血症患者である。別の実施形態において、高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｒｏｌｅｍｉｃ）患者は、２４０ｍｇ／ｄＬ以上である総コレステロールレベルを有する。本明細書で用いる場合、「被検体」は、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルが７０ｍｇ／ｄＬ以上の高コレステロール血症患者であり得る。別の実施形態において、被検体は、ＬＤＬレベルが１００、１３０、１６０、１９０ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上の急性心筋梗塞が起こっているヒト患者であり得る。また別の実施形態において、「被検体」は、トリグリセリドレベルが２００ｍｇ／ｄＬ以上のヒト患者であり得る。
【００６５】
「高コレステロール血症」または「高コレステロール血症の」は、本明細書で用いる場合、被検体の総コレステロールの血中レベルが、急性心筋梗塞を発症する直前において１、２、３、４、５、６、７日間またはそれ以上長く２００ｍｇ／ｄＬより高かった状態をいう。一実施形態において、「高コレステロール血症」または「高コレステロール血症の」は、本明細書で用いる場合、被検体の総コレステロールの血中レベルが、急性心筋梗塞を発症する直前において少なくとも１、２、３または４週間２００ｍｇ／ｄＬより高かった状態をいう。別の実施形態において、「高コレステロール血症」または「高コレステロール血症」は、被検体の総コレステロールレベルが、急性心筋梗塞を発症する前において少なくとも１、２、３、４、６ヶ月またはそれ以上長く２００ｍｇ／ｄＬより高かった状態をいう。
【００６６】
「治療有効量」は、未処置対照またはシャム処置対照と比べて心筋層に対する損傷の量の低減がもたらされるＮＰＡＲアゴニストの量である。ＮＰＡＲアゴニストは、アポトーシスの程度を有効に抑制または低減するものであり得る。治療有効量は、未処置対照またはシャム処置対照と比べて、心筋層におけるアポトーシスの程度の低減がもたらされるＮＰＡＲアゴニストの量であり得る。これは、（１）梗塞サイズが小さくなっている；（２）心筋層内のアポトーシスと関連しているタンパク質因子（アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、ｂａｄおよび切断型カスパーゼ３など）が少なくなっている；および／または（３）未処置集団と比べてＴＵＮＥＬ陽性心筋細胞が少なくなっていることによって判定され得る。投与されるＮＰＡＲアゴニストの量は、急性心筋梗塞の重症性の程度、および医薬製剤の放出特性に依存する。また、被検体の健康、体格、体重、年齢、性別および薬物に対する耐容性にも依存する。１回より多く投与される場合、ＮＰＡＲアゴニストは、好ましくは等間隔で投与し、各用量は同じであっても異なっていてもよいが、好ましくは同じにする。虚血部位に送達されるＮＰＡＲアゴニストの用量は、例えば０．１〜５００μｇ、好ましくは１〜５０μｇであり得、一般的には３、５、１０、３０または５０μｇである。
【００６７】
開示したＮＰＡＲアゴニストは任意の適当な経路によって、例えば、虚血部位への局所導入（例えば、心臓カテーテル法により）などによって投与され得る。ＮＰＡＲアゴニストを静脈内投与してもよい。ＮＰＡＲアゴニストは、被検体に徐放製剤にて投与してもよく、ポンプもしくは埋入可能なデバイスによって、あるいは埋入可能な担体（後述するポリマーなど）によって送達してもよい。「心臓組織に投与される」とは、心臓の内表面または外表面に送達されることを意味する。あるいはまた、ＮＰＡＲアゴニストの送達点は、該アゴニストが拡散して虚血部位または心臓表面に接触し得るように虚血部位または心臓表面に充分近接している点、例えば、虚血部位または心臓表面の一方または両方の１ｃｍ以内の点であり得る。
【００６８】
ＮＰＡＲアゴニストは被検体に、医薬組成物の一部としての許容され得る医薬用担体とともに投与され得る。医薬組成物の製剤は、選択される投与様式に応じて異なる。好適な医薬用担体は、ＮＰＡＲアゴニストと相互作用しない不活性な成分を含むものであり得る。担体は、生体適合性である、すなわち、無毒性、非炎症性、非免疫原性であり、投与部位において他の望ましくない反応をしないものであるのがよい。薬学的に許容され得る担体の例としては、例えば、食塩水、市販の不活性なゲル、またはアルブミン、メチルセルロースもしくはコラーゲンマトリックスを補給した液体が挙げられる。さらなる例としては、滅菌水、生理食塩水、静菌食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含有する食塩水）、リン酸緩衝食塩水、ハンクス液、乳酸加リンゲル液などが挙げられる。標準的な医薬製剤化手法、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ＸＶＩＩＩ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０））に記載のものなどが使用され得る。
【００６９】
医薬組成物は、ゲルを含むものであってもよい。ゲルは、油性基剤、水または乳化−懸濁基剤から選択される基剤を含む組成物である。基剤には、基剤中でマトリックスを形成し、半固形の粘稠度まで粘性を増大させるゲル化剤が添加される。ゲル化剤の例は、ヒドロキシプロピルセルロース、アクリル酸ポリマーなどである。活性成分は製剤に、所望の濃度で、ゲル化剤の添加前の時点で添加されるか、またはゲル化プロセスの後に混合され得る。
【００７０】
一実施形態において、ＮＰＡＲアゴニストは徐放製剤にて投与される。徐放製剤の形成には、多くの場合、ポリマーが使用される。このようなポリマーの例としては、ポリα−ヒドロキシエステル、例えば、ポリ乳酸／ポリグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマー、ポリホスファゼン（ＰＰＨＯＳ）、ポリ無水物ならびにポリ（プロピレンフマレート）が挙げられる。
【００７１】
ポリ乳酸／ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）のホモポリマーおよびコポリマーは、徐放媒体として当該技術分野でよく知られている。放出速度は、当業者により、ポリグリコール酸に対するポリ乳酸の比率および該ポリマーの分子量を変えることによって調整され得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２８：５（１９９７）（その全教示は、引用により本明細書に組み込まれる）参照）。ポリエチレングリコールを該ポリマーにブレンドとして組み込むことによって微粒子担体を形成すると、活性成分の放出プロフィールのさらなる改変が可能になる（Ｃｌｅｅｋら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４８：２５９（１９９７）（その全教示は、引用により本明細書に組み込まれる）参照）。また、リン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイトなどのセラミックスを製剤に組み込むことにより、機械的特性が改善され得る。
【００７２】
ＰＰＨＯＳポリマーは、以下の構造式（ＩＩ）：
【００７３】
【化２】
2011515471.tif 000003
に示すように、ポリマー主鎖内に窒素とリンを交互に含み、炭素を含まないものである。該ポリマーの性質は、該ポリマーの主鎖に結合された側鎖基ＲおよびＲ’の適当な変更によって調整され得る。例えば、ＰＰＨＯＳによる分解および薬物放出は、加水分解に不安定な側鎖基の量を変えることにより制御され得る。例えば、イミダゾリルまたはエチルグリコールのいずれかで置換されたＰＰＨＯＳの組込みが多いほど、分解速度の増大が観察され（Ｌａｕｒｅｎｃｉｎら，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２７：９６３（１９９３）（その全教示は、引用により本明細書に組み込まれる）参照）、それにより薬物放出速度が増大する。
【００７４】
急性心筋梗塞には、多くの場合、損傷心臓組織内での壊死プロセスによる胸痛および炎症などの症状および徴候が随伴する。かかる問題に対処するため、場合によっては、１種類以上のさらなる薬理学的に活性な薬剤をＮＰＡＲアゴニストとともに共投与することが好都合であり得る。例えば、痛みや炎症のマネージメントには、鎮痛剤および／または抗炎症剤との共投与が必要であることがあり得る。また、血栓溶解剤（組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）など）、抗血液凝固剤（ヘパリンなど）、抗不整脈剤（例えば、ナトリウム、カルシウムまたはカリウムチャネル遮断薬（キニジン、リドカイン、プロパフェノン、ブレチリウム、ベラパミルなど））ならびにβ遮断薬（プロプラノロールおよびソタロール）を共投与してもよい。
【００７５】
トロンビンペプチド誘導体および修飾型トロンビンペプチド誘導体は、固相ペプチド合成（例えば、ＢＯＣもしくはＦＭＯＣ）法、液相合成、または他の適当な手法（例えば、前述の方法の組合せ）によって合成され得る。確立され、広く使用されているＢＯＣおよびＦＭＯＣ法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８８：２１４９（１９６３）；Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃ．Ｈ．Ｌｉ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８３，ｐｐ．４８−２６７；ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０，ｐｐ．３−２８５に記載されている。固相ペプチド合成法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１（１９８６）；Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．およびＨａｎ，Ｇ．Ｙ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３７：３４０４（１９７２）；ならびにＧａｕｓｐｏｈｌ，Ｈ．ら，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，５：３１５（１９９２））に記載されている。これらの６件の論文の教示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７６】
トロンビンペプチド誘導体二量体は、その単量体の酸化によって調製され得る。トロンビンペプチド誘導体二量体は、該トロンビンペプチド誘導体を過剰の酸化剤と反応させることにより調製することができる。よく知られた好適な酸化剤はヨウ素である。
【００７７】
「非芳香族複素環式基」は、本明細書で用いる場合、３〜１０個の原子を有し、少なくとも１個のヘテロ原子（窒素、酸素またはイオウなど）を含む非芳香族炭素環系である。非芳香族複素環式基の例としては、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニルが挙げられる。
【００７８】
用語「アリール基」は、炭素環系と複素環式芳香族環系の両方を含む。アリール基の例としては、フェニル、インドリル、フラニルおよびイミダゾリルが挙げられる。
【００７９】
「脂肪族基」は、直鎖、分枝鎖または環状の非芳香族炭化水素である。脂肪族基は完全に飽和であってもよく、１つ以上の不飽和単位（例えば、二重結合および／または三重結合）を含むものであってもよいが、好ましくは飽和、すなわちアルキル基である。典型的には、直鎖または分枝鎖の脂肪族基は１〜約１０個、好ましくは１〜約４個の炭素原子を有するものであり、環状脂肪族基は３〜約１０個、好ましくは３〜約８個の炭素原子を有するものである。脂肪族基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、オクチルおよびシクロオクチルが挙げられる。
【００８０】
脂肪族基、アリール基または非芳香族複素環式基に好適な置換基は、ＮＰＡＲアゴニストの治療活性を有意に低下させないもの、例えば天然アミノ酸に見られるものである。例としては、−ＯＨ、ハロゲン（−Ｂｒ、−Ｃｌ、−Ｉおよび−Ｆ）、−Ｏ（Ｒｅ）、−Ｏ−ＣＯ−（Ｒｅ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＨ、＝Ｏ、−ＮＨ２−ＮＨ（Ｒｅ）、−Ｎ（Ｒｅ）２、−ＣＯＯ（Ｒｅ）、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（Ｒｅ）、−ＣＯＮ（Ｒｅ）２、−ＳＨ、−Ｓ（Ｒｅ）、脂肪族基、アリール基ならびに非芳香族複素環式基が挙げられる。各Ｒｅは、独立して、アルキル基またはアリール基である。置換脂肪族基は、１つより多くの置換基を有するものであってもよい。
【００８１】
本発明を以下の実施例によって例示するが、実施例はなんら限定することを意図しない。
【実施例】
【００８２】
実施例１
Ｉ．  実験手順
高コレステロール血症のユカタン（Ｙｕｃａｔａｎ）ミニブタを無作為に３つの処置群に分けた。これらの群は：（１）プラセボ（ｎ＝５〜１０）（２）低用量ＴＰ５０８処置（ｎ＝６〜１０）および（３）高用量ＴＰ５０８処置（ｎ＝４）とした。動物はすべて、第二対角枝に対して遠位の左前下行（ＬＡＤ）動脈閉塞による局所左心室（ＬＶ）虚血（６０分間）に供した。処置群には、再灌流の開始前に、静脈内（ＩＶ）ボーラス用量のプラセボまたはＴＰ５０８のいずれかを１０分間与えた後、残りの実験期間、ＴＰ５０８またはビヒクルの持続的ＩＶ注入を与えた。虚血後、心筋層に再灌流を１２０分間行なった。動脈血液ガス（ＡＢＧ）、動脈血圧、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）、ＬＶ圧、心拍数（ＨＲ）、ＥＫＧ／ＥＣＧ、Ｏ２飽和、核心温度、および静脈内輸液の必要性を測定し、記録した。長軸（ＬＡＤに対して平行）および短軸（ＬＡＤに対して垂直）の心筋の筋短縮（ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）を、虚血発生の前のベースラインおよび１２０分間の再灌流後の回収前において記録した。プロトコルが終了したら心臓を摘出し、虚血再灌流を行なった遠位ＬＡＤ領域からの組織試料を、後述する分子解析のために採取した。また、適切な量の血液試料を採取し、後のさらなるバイオマーカーの解析に備えて凍結させた。
【００８３】
手術
ブタを塩酸ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）で鎮静させ、チオペンタールナトリウム（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ；５．０〜７．０ｍｇ／ｋｇ  静脈内）のボーラス注入で麻酔した後、気管内挿管を行なった。換気は、従量式換気装置（Ｎａｒｋｏｍｅｄ  ＩＩ−Ａ型；Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｒａｇｅｒ，Ｔｅｌｆｏｒｄ，ＰＡ；酸素，４０％；一回換気量，６００ｃｃ；換気速度，１２呼吸／分；呼気終末陽圧，３ｃｍ  Ｈ２Ｏ；呼気時間／吸気時間比、１：２）を用いて開始した。手術準備の開始時に３．０％セボフルラン（Ｕｌｔａｎｅ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で気管内全身麻酔を確立し、実験中は、１．０％で維持した。麻酔導入後、１リットルの乳酸加リンゲル静脈内（ＩＶ）液を投与し、その後、手術プロトコル中は１５０ｃｃ／時で継続した。右鼡径部の解離を行ない、大腿静脈および総大腿動脈を分離し、８Ｆシース（Ｃｏｒｄｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を用いてカニューレを挿入した。大腿静脈には、静脈内アクセス、ＴＰ５０８／プラセボ送達のためにカニューレを挿入し、右総大腿動脈には、動脈血試料採取および連続的動脈内血圧モニタリング（Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）のためにカニューレを挿入した。胸骨正中切開を行なって心膜を露出させ、次いで、これを切開して心膜クレイドル（ｃｒａｄｌｅ）を形成した。カテ先マノメーター（Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を左心室尖部から導入し、ＬＶ圧を記録した。Ｓｏｎｏｍｅｔｒｉｃｓ社製デジタル超音波水晶振動子測定システム（Ｓｏｎｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用し、心外膜下層内の虚血ＬＶ領域にほぼ１０ｍｍ離して埋め込んだ４つの２ｍｍのデジタル超音波プローブを用いて、リスク領域（ＡＡＲ）における筋短縮を評価した。データ記録（ＬＶ  ｄＰ／ｄｔ、筋短縮、動脈血圧、心拍数）および心筋機能を調べるための後のデータ解析には、Ｃａｒｄｉｏｓｏｆｔソフトウェア（Ｓｏｎｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｃｏｒｐ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用した。ベースラインの血流力学的測定および機能測定（全般：＋ＬＶ  ｄＰ／ｄｔ、局所：筋短縮）、動脈血ガス解析、およびヘマトクリットを取得した。ＡＢＧ解析は、プロトコル中１５分おきで継続し、ヘマトクリットは２０分ごとに測定した。すべての動物に、心室律動異常に対する予防として７５ｍｇのリドカインと２０ｍＥｑの塩化カリウム、ならびにＬＡＤ閉塞の前に６０単位／ｋｇの静脈内ヘパリンボーラスを与えた。ＬＡＤ冠動脈は、ルンメル止血帯を使用し、第二対角枝の起点から３ｍｍ遠位で閉塞させた。心筋の虚血は、心筋表面の局所チアノーゼによって目視により確認した。局所虚血開始の５０分後（再灌流の開始の１０分前）、対照ブタにプラセボ担体溶液の静脈内注入を行ない、処置動物にはＴＰ５０８を与えた。急性虚血発生の６０分後、ルンメル止血帯を解き、心筋層に再灌流を１２０分間行なった。再灌流��間の終了時、血流力学的測定値および機能測定値を上記のようにして記録した後、ＬＡＤを再結紮し、リスク領域（ＡＡＲ）との境界を画定するために冠動脈口に対して遠位に大動脈内クロスクランプを設置後、モナストリル（ｍｏｎａｓｔｒｙｌ）青色色素（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  Ｃｏｒｐ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）（ＰＢＳ中、１：１５０希釈）を、大動脈根に注射した。速やかに心臓を摘出し、隔壁を含む左心室全体を解離して遊離状態にした。ＬＶを、ＬＡＤの軸に対して垂直に１ｃｍ厚の切片に切断した。青色色素染色部がないことから、ＡＡＲが明白に確認された。ＬＶ尖部の近位１ｃｍの切片のＡＡＲからの組織を分離し、分子試験および微細血管試験における使用のために分けた。残りの切片の重量を計測し、後述する梗塞サイズの計算に使用した。心室律動異常（心室細動または無脈性心室頻脈）事象を記録し、即時に電気的除細動（５０  Ｊ、内部パドル）で処置した。
【００８４】
全般および局所心筋機能の測定
全般心筋機能は、経時的なＬＶ圧の最大の正の一次導関数を計算することにより評価した（＋ｄＰ／ｄｔ）。局所心筋機能は、心外膜下の２ｍｍの超音波プローブを使用し、筋短縮率（％ＳＳ）（ベースラインに対して正規化）を算出することにより測定した。測定値は、虚血発生の前のベースラインおよび再灌流終了時において取得した。データ取得中は、呼吸の影響を排除するため換気装置を停止させた。測定は、正常な洞調律での少なくとも３回の心臓周期のときに行ない、次いで平均した。拡張末期および収縮末期を正しく特定するためにデジタルデータを検査した。拡張末期筋長（ｓｅｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ）（ＥＤＬ）は、正のｄＰ／ｄｔの開始時に測定し、収縮末期筋長（ＥＳＬ）は、負のピークｄＰ／ｄｔ時に測定した。
【００８５】
冠微細血管試験
冠微細血管試験は、冠微小循環における虚血−再灌流後の内皮平滑筋および血管平滑筋の損傷に対するＴＰ５０８の効果を調べるために行なった。心臓を回収後、虚血ＬＡＤ領域からの心筋被検物を４℃のクレブズ溶液中に浸漬させ、冠細動脈（直径８０〜１３０μｍおよび長さ１〜２ｍｍ）を周囲組織から、倍率４０倍の解剖顕微鏡を用いて明確に解離した。微細血管をマウントし、加圧型分離臓器チャンバ内で上記のようにして調べた（１）。ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）（１ｎＭ〜１００ｍＭ）、内皮非依存性ｃＧＭＰ媒介性血管拡張薬、ならびにサブスタンスＰ（０．１ｐＭ〜１０ｎＭ）、内皮依存性受容体媒介性血管拡張薬（生物学的に利用可能な一酸化窒素を介して作用する）に対する応答を、トロンボキサンＡ２類似体Ｕ４６６１９（０．１〜１μＭ）によるベースライン直径の２０〜５０％までの予備収縮後に試験した。また、内皮依存性血管拡張薬であるアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）に対する冠微細血管応答も調べた。弛緩応答は、予備収縮直径に対する弛緩割合と定義する。
【００８６】
心筋梗塞サイズの定量
左心室を分離し、１ｃｍ切片に切断し、梗塞サイズを評価した。簡単には、切片を即座に、１％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）含有リン酸バッファー（ｐＨ７．４）中に、３８℃で３０分間浸漬させた。ＬＶの梗塞領域（無染色を特徴とする）、非梗塞形成リスク領域（赤色の組織染色を特徴とする）、および非虚血部分（紫色の組織染色を特徴とする）を互いに明確に解離し、重量計測した。リスク領域率は：（梗塞質量＋非梗塞リスク領域の質量）／全ＬＶ質量×１００と定義した。梗塞サイズは、リスク領域（ＡＡＲ）に対する割合として計算し、ＡＡＲサイズのばらつき（あれば）に対して、下記の等式：（梗塞質量／全ＡＡＲ質量）×１００を用いて正規化した。
【００８７】
抗アポトーシス因子に対するウエスタンブロッティング
全細胞溶解物を、放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファー（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）を用いて心筋ホモジナイズ試料から分離し、１２，０００ｇで、４℃にて１０分間遠心分離し、可溶性画分を不溶性画分から分離した。タンパク質濃度は、ＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、５９５ｎｍの波長で分光測光法により測定した。４０〜８０マイクログラムの総タンパク質を、４〜２０％勾配のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって分画し、ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移した。各膜を、以下のとおり：抗アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）（１：１０００希釈）、抗Ｂｃｌ−２（１：１０００希釈）、抗Ｂａｄ（１：１０００希釈）、抗ホスホＢａｄ（セリン１３６）（１：５００希釈）、抗ホスホＢａｄ（セリン１１２）（１：２０００希釈）、抗カスパーゼ−３（１：１０００希釈）、抗切断型カスパーゼ−３（１：１０００希釈）、抗ＰＡＲＰ（１：１０００希釈）、抗切断型ＰＡＲＰ（１：１０００希釈）および抗ＢＮＩＰ３の特異的抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）とともにインキュベートした。続いて、この膜を、希釈した適切な二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）中で１時間インキュベートした。免疫複合体を、高感度化学発光検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて可視化した。ラジオオートグラフィフィルムのデンシトメトリーによってバンドを定量した。タンパク質の負荷が等価であることを確認するため、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ染色を行なった。
【００８８】
血清クレアチンキナーゼ−ＭＢ、トロポニンＩ、および脂肪酸結合タンパク質の定量
致死させる前に採取した血清を、クレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、トロポニンＩ、および脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）の定量に使用した（タンパク質マイクロアレイ（Ａｌｌｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用）。マーカーの血清レベルを、製造業者によって提供された標準品を基準にして計算した。
【００８９】
組織炎症マーカーの定量
リスク領域（ＡＡＲ）からの心筋組織（約５０ｍｇ）を、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を添加したＲＩＰＡバッファー（Ｂｏｓｔｏｎ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）中でホモジナイズし、１０分間１２，０００ｇで遠心分離した。上清みをアリコートに分け、サイトカインアレイを用いて（Ａｌｌｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αの検出を３連で行なった。炎症メディエーターの組織内レベルを、製造業者によって提供された標準品を基準にして計算した。
【００９０】
免疫組織化学的染色
虚血領域からの心筋組織を１０％緩衝ホルマリン中に２４時間入れた後、パラフィン包埋し、４μｍ切片に切断した。
【００９１】
１．  ポリ（ＡＤＰ）リボシル化染色
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ活性の免疫組織化学的検出のため、マウスモノクローナル抗ポリ（ＡＤＰ−リボース）（ＰＡＲ）抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（１：１０００，一晩，４℃）を使用した。二次標識は、ビオチン化ウマ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用することにより行なった（３０分間、室温）。ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートアビジン（３０分間、室温）および褐色着色ジアミノベンジジン（約６分間、室温）を用いて、標識（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を可視化した。切片をヘマトキシリンで対比染色した（青色）。盲検式で実験者が個々の切片の特異的染色強度を判定した。半定量的ＰＡＲの陽性スコアを、以下のとおり：１：特異的染色なし、２：薄い細胞質染色、３：数個の陽性核、４：細胞のほぼ１０％に薄い核染色、５：細胞のほぼ２５％に薄い核染色、６：細胞のほぼ５０％に薄い核染色、７：細胞のほぼ５０％に強い核染色、８：核のほぼ７５％が陽性、９：核のほぼ９０％が陽性、１０：数個の陰性細胞とした。
【００９２】
２．  ＴＵＮＥＬ染色
アポトーシス細胞は、アポトーシス検出キットを製造業者のプロトコル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）に従って使用し、ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）によって認定した。各組織切片について５枚の写真（倍率２０倍）を撮影した。実験条件に対して知らされていない観測者が、核を見て手作業で計数した。アポトーシスを示すＴＵＮＥＬ陽性心筋細胞の数を、平均数／１００細胞／顕微鏡視野で示した。
【００９３】
統計学的方法
データは、平均±ＳＥＭで報告した。微細血管応答を、予備収縮直径に対する弛緩割合で示し、血管弛緩、ｌｏｇ対象血管作用剤濃度、および実験群間の関係を調べるために、二元反復測定分散分析を用いて解析した（ＳＡＳ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１，Ｃａｒｙ，ＮＣ）。ウエスタンブロットは、負荷バンド密度に対するタンパク質の比で示し、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３３（米国国立衛生研究所，ＵＳＡ）でのＸ線フィルムのデジタル処理および定量後に解析した。ブロットおよびＩＬＭデータを、分散分析を用いて解析した。多数回の検定にボンフェローニの補正を適用し、０．０５未満の確率値を統計学的に有意とみなした。
【００９４】
ＩＩ．  結果
１．  １４匹の雄ユカタンブタに対し、上記のセクションＩに記載の手順に従って、６０分間の中間左前下行動脈閉塞の後、１２０分間の再灌流を行なった。この１４匹の雄ユカタンブタのうち、７匹のブタにビヒクル対照溶液を与え（ＣＴ，ｎ＝７）、その他の７匹のブタにＴＰ５０８を与えた（ＴＰ，ｎ＝７）。全実験を通して、上記のようにして心筋機能をモニタリングした。内皮依存性（ＡＤＰ）物質および内皮非依存性（ＳＮＰ）物質に対する冠微細血管応答を調べた。リスク領域（ＡＡＲ）および壊死の測定には、モナストリルブルー／ＴＴＣ染色を使用した。ウエスタンブロッティングにより、アポトーシス関連タンパク質の発現を調べた。虚血領域および非虚血領域におけるアポトーシスの大きさの定量には、ＴＵＮＥＬ染色を使用した。ボーラス用量を５００μｇ／ｋｇとし、続いて、１．２５ｍｇ／ｋｇ／時の連続ＩＶ注入を行なった。
【００９５】
心臓機能は、群間で有意に異ならなかった。内皮依存性ＡＤＰおよび内皮非依存性ＳＮＰに対する冠微細血管応答は、対照（ＣＴ）群と比較すると、ＴＰ５０８（ＴＰ）群において改善された（図１）。値は、ＡＤＰに対する応答において−８（ｐ＜０．０１）、−６（Ｐ＝０．０１）および−５（ｐ＜０．０１）、ならびにＳＮＰに対する応答において−６（ｐ＝０．０４）で有意に異なっていた。
【００９６】
ＡＡＲに対する割合としての梗塞サイズは、対照群で４４±５％に対して、ＴＰ５０８群では２４±４％であった（ｐ＝０．０１）。
【００９７】
抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２の発現は、対照群と比べてＴＰ５０８群において２．２倍高かった（ｐ＝０．０４）。アポトーシス促進性タンパク質ＰＡＲＰ（１．６倍、ｐ＝０．０２）、切断型ＰＡＲＰ（６．３倍、ｐ＜０．０１）、およびＢＮＩＰ３（３．７倍、ｐ＜０．０１）の発現は、虚血領域では、対照群と比べてＴＰ５０８群において高かった。しかしながら、ＡＡＲにおけるＴＵＮＥＬ＋細胞計数は、ＴＰ５０８群と比べて対照群において１．８倍高かった（ｐ＝０．０２）。
【００９８】
この試験により、トロンビン断片での処置によって、梗塞サイズが減少し、急性心筋損傷の状況における内皮微細血管応答が改善されることが示された。Ｂｃｌ−２の発現は、ＴＰ５０８処置で有意に高く、これは、アポトーシス細胞の数の減少の説明となり得る。したがって、ＴＰ５０８により、心筋梗塞が著しく低減され、微細血管機能が改善され、心筋組織内でのアポトーシスが低減され得る。
【００９９】
２．  高コレステロール血症の（ＨＣ）ブタに、４％のコレステロール、１７．２％のココナッツ油、２．３％のコーン油、１．５％のコール酸ナトリウムおよび７５％の通常の飼料からなる高脂肪食を４週間摂取させた。この食事により、普通の食事を摂取させたブタと比べて、血清コレステロール、ＬＤＬおよびＨＤＬのレベルが３．５〜９倍増大した。このＨＣブタに対し、正常コレステロール血の（ＮＣ）ブタと同じ急性心筋梗塞（ＡＭＩ）外科処置を、上記およびセクションＩに記載のようにして行なった。７匹のブタ（ＯＶＣ）は正常コレステロール血で、ビヒクル対照溶液を受け（ｎ＝７）、７匹のブタ（ＯＴＣ）は正常コレステロール血で、上記のようにしてＴＰ５０８で処置した（ＴＰ，ｎ＝７）。７匹のブタ（ＯＶＨ）は高コレステロール血症で、ビヒクル対照溶液を受けた（ｎ＝７）。７匹のブタ（ＯＴＨ）は高コレステロール血症で、上記のようにしてＴＰ５０８で処置した（ＴＰ，ｎ＝７）。４匹のブタ（ＯＴＨＦ）は高コレステロール血症で、２倍用量のＴＰ５０８で処置した（ＴＰ，ｎ＝４）。
【０１００】
ＨＣ食事により、ＮＣブタと比べて梗塞が有意に大きくなった（ＨＣブタのリスク領域（ＡＡＲ）で６１％に対してＮＣブタでは４１％；ｐ＝０．０１）。セクションＩで上記のように、ＴＰ５０８処置ＨＣブタに対し、再灌流前に、０．５ｍｇ／ｋｇ（ＯＴＨ）または１．０ｍｇ／ｋｇ（ＯＴＨＦ）のボーラス用量を１０分間与えた。これに続いて、全２時間の再灌流期間中、１．２５ｍｇ／ｋｇ／時（ＯＴＨ）または２．５ｍｇ／ｋｇ／時（ＯＴＨＦ）の低速注入を行なった。図２に示されるように、ＯＴＨ群は、生理食塩水処置ＯＶＨ対照群と比べて有意に小さい梗塞サイズを有した（４０％対６１％；ｐ＝０．００３）。ＯＴＨＦ群においてＴＰ５０８の用量を２倍にすると、梗塞サイズは２７％までさらに縮小された（ＯＶＨに対してｐ＝０．００３；ＯＴＨに対してｐ＝０．０１）。要約すると、梗塞サイズは、ＯＶＨと比べると、ＯＴＣ（ｐ＝０．０３）およびＯＴＨＦ（ｐ＝０．０００３）において有意に減少した（すなわち、６１％から４０％および２７％に）。ＯＶＨでは、ＯＶＣと比べて、ほぼ１．５倍の梗塞サイズ増大が示された。ＯＴＣでは、ＯＶＣと比べて、ほぼ１．５倍の梗塞サイズ減少が示された。
【０１０１】
図３は、全左心室質量に対する割合としてのリスク領域（ＡＡＲ）を示すグラフである。図３は、リスク領域（ＡＡＲ）が、いずれの群においても有意に異ならなかったことを示す。７匹のブタ（ＯＶＣ）は正常コレステロール血で、ビヒクル対照溶液を受け（ｎ＝７）、７匹のブタ（ＯＴＣ）は正常コレステロール血で、上記のようにしてＴＰ５０８で処置した（ＴＰ，ｎ＝７）。７匹のブタ（ＯＶＨ）は高コレステロール血症で、ビヒクル対照溶液を受けた（ｎ＝７）。７匹のブタ（ＯＴＨ）は高コレステロール血症で、上記のようにしてＴＰ５０８で処置した（ＴＰ，ｎ＝７）。４匹のブタ（ＯＴＨＦ）は高コレステロール血症で、上記のようにして２倍用量のＴＰ５０８で処置した（ＴＰ，ｎ＝４）。ＬＶの梗塞領域（無染色を特徴とする）、非梗塞形成リスク領域（赤色の組織染色を特徴とする）、および非虚血部分（紫色の組織染色を特徴とする）を互いに明確に解離し、重量計測した。リスク領域率は：（梗塞質量＋非梗塞リスク領域の質量）／全ＬＶ質量×１００と定義した。
【０１０２】
これらのデータは、ＴＰ５０８が、高コレステロール血症のブタにおいて梗塞サイズを用量依存的に縮小させることを示す。
【０１０３】
実施例２
Ｉ．  実験手順
急性心筋梗塞の正常コレステロール血の（ＮＣ）ブタモデルの梗塞サイズに対するＴＰ５０８の効果を調べるため、体重がほぼ２５ｋｇで通常の飼料の普通の食事をしているＮＣユカタンミニブタを無作為に２つの群に分けた。これらの群は、（１）プラセボ（ｎ＝７）および（２）ＴＰ５０８処置（ｎ＝７）とした。１４匹の動物はすべて、第二対角枝に対して遠位の左前下行（ＬＡＤ）動脈閉塞による局所左心室（ＬＶ）虚血（６０分間）およびこの動脈閉塞の直後の再灌流（１２０分間）に供した。この２つの群には、再灌流の開始前に、プラセボ（ＮＣ−対照；生理食塩水）または０．５ｍｇ／ｋｇのＴＰ５０８（ＮＣ−ＴＰ５０８）いずれかの静脈内（ＩＶ）ボーラス用量を１０分間与えた。この２つの群を、全１２０分間の再灌流期間中、プラセボ（ＮＣ−対照；生理食塩水）または１．２５ｍｇ／ｋｇ／時のＴＰ５０８（ＮＣ−ＴＰ５０８）の持続的ＩＶ注入に供した。
【０１０４】
ブタモデルにおける梗塞サイズの取得および解析のための実施例１に記載の実験手順を、実施例２において使用した。
【０１０５】
ＩＩ．  結果
正常コレステロール血のＴＰ５０８（ＮＣ−ＴＰ５０８）で処置したユカタンミニブタでは、プラセボで処置した対照群（ＮＣ−対照）と比べて有意に小さい梗塞サイズが示された。図４に示されるように、急性虚血事象後のＴＰ５０８での処置により、梗塞サイズの有意な縮小がもたらされた（すなわち、対照群と比べて４５％縮小；図４）。この結果は、ＴＰ５０８が、急性心筋梗塞後の心筋層における梗塞サイズの縮小に対してプラスの効果を有することを示す。
【０１０６】
実施例３
Ｉ．  実験手順
急性心筋梗塞の高コレステロール血症の（ＨＣ）ブタモデルの梗塞サイズに対するＴＰ５０８およびＴＰ５０８二量体の効果を調べるため、ＨＣユカタンミニブタに対して、４％のコレステロール、１７．２％のココナッツ油、２．３％のコーン油、１．５％のコール酸ナトリウムおよび７５％通常の飼料の高コレステロール食事の摂取を、７週齢のときに開始させ、全試験期間を通して継続させた。体重がほぼ２５ｋｇのＨＣユカタンミニブタを無作為に、各々７匹のブタ（ｎ＝７）からなる５つの群に分けた。これらの群は：（１）プラセボ（ＨＣ−対照；ｎ＝７）；（２）０．０５ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス用量および０．１２５ｍｇ／ｋｇ／時の注入用量でのＴＰ５０８処置（ＨＣ−ＴＰ５０８用量０．１倍；ｎ＝７）；（３）０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス用量および１．２５ｍｇ／ｋｇ／時の注入用量でのＴＰ５０８処置（ＨＣ−ＴＰ５０８用量１倍；ｎ＝７）；（４）１．０ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス用量および２．５０ｍｇ／ｋｇ／時の注入用量でのＴＰ５０８処置（ＨＣ−ＴＰ５０８用量２倍；ｎ＝７）；ならびに（５）モルベースでＨＣ−ＴＰ５０８用量１倍に等価な用量でのＴＰ５０８二量体処置（ＨＣ−ＴＰ５０８二量体；ｎ＝７）とした。実施例１および２に記載のように、動物はすべて、第二対角枝に対して遠位の左前下行（ＬＡＤ）動脈閉塞による局所左心室（ＬＶ）虚血（６０分間）の後、再灌流（１２０分間）に供した。該用量の投与のタイミングは実施例１および２と同じにした。梗塞サイズの取得および解析には、実施例１に詳細に記載したものと同じ実験手順を使用した。
【０１０７】
ＩＩ．  結果
図５に示されるように、ＴＰ５０８（ＨＣ−ＴＰ５０８用量０．１倍；ＨＣ−ＴＰ５０８用量１倍；およびＨＣ−ＴＰ５０８用量２倍）またはＴＰ５０８二量体（ＨＣ−ＴＰ５０８二量体）で処置した高コレステロール血症の（ＨＣ）ユカタンミニブタでは、プラセボで処置した対照群（ＨＣ−対照）と比べて小さい梗塞サイズが示された。急性虚血事象後のＴＰ５０８での処置により、梗塞サイズの有意な縮小がもたらされた：対照群と比べて、ＨＣ−ＴＰ５０８用量１倍群において３２％縮小およびＨＣ−ＴＰ５０８用量２倍群において５４％縮小（図４）。さらに、ＴＰ５０８と同様、ＴＰ５０８二量体でも、梗塞サイズの縮小に対してプラスの効果が示された。ＨＣ−ＴＰ５０８用量１倍群で使用した用量とモル用量において等価なＴＰ５０８二量体で処置したＨＣユカタンミニブタでは、対照と比べて、梗塞サイズの３２％縮小が示された（ＨＣ−ＴＰ５０８用量１倍群で観測されたものと同様の縮小）。
【０１０８】
これらの結果は、ＴＰ５０８とＴＰ５０８二量体がともに、急性心筋梗塞後の心筋層における梗塞サイズの縮小に対してプラスの効果を有することを示す。
【０１０９】
本発明を、その一例の実施形態に関して具体的に図示および記載したが、当業者には、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書において形態および詳細において種々の変更がなされ得ることが理解されよう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2011515471.tif 000012
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