(57)【要約】  複数のピペットからなるピペットシステムと、前記ピペットシステムの近傍に配置されたマイクロ流体チップと、前記マイクロ流体チップの近傍に配置された画像光学検知システムと、前記画像光学検知システムと通信する画像処理システムと、を有するマイクロ流体システム。前記マイクロ流体チップは、前記マイクロ流体チップの本体によって規定される複数の細胞培養室を有し、細胞培養室のそれぞれは、前記マイクロ流体チップによって規定される入力チャンネルおよび出力チャンネルと流体接続されている。前記ピペットシステムは、マイクロ流体システムの動作中に、流体を前記複数のピペットを介して複数の前記入力チャンネルに注入する、または流体を前記複数のピペットを介して複数の前記出力チャンネルから抽出する、の少なくとも１つを行うように構成および配置されている。
2011512125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のピペットからなるピペットシステムと、
前記ピペットシステムの近傍に配置されたマイクロ流体チップと、
前記マイクロ流体チップの近傍に配置された画像光学検知システムと、
前記画像光学検知システムと通信する画像処理システムと、を有するとともに、
前記マイクロ流体チップは、前記マイクロ流体チップの本体によって規定される複数の細胞培養室を有し、細胞培養室のそれぞれは、前記マイクロ流体チップによって規定される入力チャンネルおよび出力チャンネルと流体接続され、
前記ピペットシステムは、マイクロ流体システムの動作中に、流体を前記複数のピペットを介して複数の前記入力チャンネルに注入する、または流体を前記複数のピペットを介して複数の前記出力チャンネルから抽出する、の少なくとも１つを行うように構成および配置されていることを特徴とするマイクロ流体システム。
【請求項２】
複数の前記細胞培養室のそれぞれは、２００ピコリットルないし２．４マイクロリットルの容量であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体システム。
【請求項３】
前記マイクロ流体チップは、少なくとも１０個の細胞培養室を含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体システム。
【請求項４】
前記画像光学検知システムは、前記細胞培養室で培養される個別の関心生体細胞の画像を解像するのに十分な解像度を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体システム。
【請求項５】
前記マイクロ流体チップの前記本体は、基板に取り付けられたＰＤＭＳ層を含むことを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体システム。
【請求項６】
前記基板は、関心生体細胞を固定化するための細胞外マトリックス成分を塗布した層を含むことを特徴とする請求項５に記載のマイクロ流体システム。
【請求項７】
さらに、前記マイクロ流体チップへの光路を有するように構成および配置された照射システムを含み、前記照射システムは、作動中は前記細胞培養室で培養される細胞の照射に適合していることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体システム。
【請求項８】
前記照射システムは、前記マイクロ流体チップに白色光を供することを特徴とする請求項７に記載のマイクロ流体システム。
【請求項９】
前記照射システムは、前記マイクロ流体チップの少なくとも一部を所望波長の実質的単色光により照射するレーザを含むことを特徴とする請求項７に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１０】
前記画像光学検知システムは、前記マイクロ流体チップの少なくとも一部を照射した後の前記照射システムの前記レーザからの弾性的な散乱光、蛍光、および非弾性的な散乱光の少なくとも一つを検知するように構成されていることを特徴とする請求項９に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１１】
前記画像処理システムは、複数の前記細胞培養室で培養された個別の生体細胞における生物活性物質の生物学的機能または効果の少なくとも一つを示す前記画像光学検知システムからのデータを解析するように適合されていることを特徴とする請求項７に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１２】
前記ピペットシステムは、自動化された全自動ピペットシステムであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１３】
i）細胞培養の固定化のための細胞外マトリックス物質を塗布した表面を有するマイクロ流体チップの複数の細胞培養室に、複数の細胞培養を装填する工程と、
ii）少なくとも一つの蛍光プローブを前記細胞培養に適用し、前記蛍光プローブの細胞内または細胞上の特定の標的への結合を促進する適切な条件下で前記細胞培養を培養する工程と、
iii）前記蛍光プローブの蛍光の発光を引き起こすように前記細胞培養を照射する工程と、
iv）前記細胞内または前記細胞上の特定の前記標的に関する情報をもたらすため、前記細胞培養が複数の前記細胞培養室に実質的に固定化されている間に、複数の前記細胞培養室それぞれの前記細胞から発せられる蛍光を画像化する工程と、を含むことを特徴とする複数の細胞培養の自動蛍光イメージング方法。
【請求項１４】
前記画像化する工程の前に、細胞外にある結合していない蛍光プローブを洗浄により除去することを特徴とする請求項１３に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項１５】
複数の蛍光プローブが前記細胞培養に適用されることを特徴とする請求項１３または請求項１４に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項１６】
前記細胞外マトリックス物質は、フィブロネクチン、ラミニン、マトリゲル、ＲＧＤペプチドからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１３ないし請求項１５のいずれか一項に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項１７】
フローサイトメトリ様のデータを得るため、v）前記画像化する工程で得られた画像を処理する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１３ないし請求項１６のいずれか一項に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項１８】
経路分化のヒートマップを得るため、vi）前記フローサイトメトリ様のデータを処理する工程を含むことを特徴とする請求項１７に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項１９】
前記フローサイトメトリ様のデータが２次元または３次元のドットプロットまたはヒストグラムであることを特徴とする請求項１７または請求項１８に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項２０】
少なくとも一つの細胞培養は癌細胞を含んでいることを特徴とする請求項１３ないし請求項１９のいずれか一項に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項２１】
前記癌細胞は哺乳類膠芽腫細胞または乳癌細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項２２】
前記哺乳類の膠芽腫細胞が、Ｕ８７系列の膠芽腫細胞および遺伝子組み換えされたＵ８７系列細胞（Ｕ８７−ＰＴＥＮ，Ｕ８７−ＥＧＦＲ，Ｕ８７ＥＧＦＲｖＩＩＩ，およびＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＰＴＥＮ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項２３】
前記乳癌細胞は、ＭＤＡ４５３（ＥｒｂＢ２＋），ＭＤＡ３６１（ＥｒｂＢ２＋），ＢＴ４７４（ＥｒｂＢ２＋＋），ＳＫＢｒ３（ＥｒｂＢ２＋＋），およびＪＩＭＴ１（ＥｒｂＢ２＋＋，ＰＴＥＮ−）からなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項２４】
各細胞培養室の容量が、２ピコリットルないし２．４マイクロリットルであることを特徴とする請求項１３ないし請求項２３のいずれか一項に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項２５】
前記容量が１５０ナノリットルであることを特徴とする請求項２４に記載の自動蛍光イメージング方法。
【請求項２６】
細胞タイプの少なくとも一つの標的特性を決定する方法であって、
i）前記細胞タイプの実質的に純粋培養を請求項１に記載のシステムの細胞培養室に装填する工程と、
ii）前記細胞タイプの少なくとも一つの標的特性を決定するために適切な条件下で前記培養を分析する工程と、を有することを特徴とする細胞タイプの少なくとも一つの標的特性を決定する方法。
【請求項２７】
複数の細胞培養が分析されることを特徴とする請求項２６に記載の細胞タイプの少なくとも一つの標的特性を決定する方法。
【請求項２８】
前記標的特性は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＴＥＮ、ｍＴＯＲ、グルコース摂取、およびＦＤＧ摂取からなる群から選択されることを特徴とする請求項２６または請求項２７に記載の細胞タイプの少なくとも一つの標的特性を決定する方法。
【請求項２９】
複数の特性が決定されることを特徴とする請求項２６ないし請求項２８のいずれか一項に記載の細胞タイプの少なくとも一つの標的特性を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施の形態は、マイクロ（微小）流体システムに関し、特に、大規模細胞培養および分析のためのマイクロ流体システム、およびその方法に関する。
【０００２】
本発明は、２００８年２月１日出願の米国特許仮出願61/006842号の優先権を主張するものであり、その全内容を参照により援用する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書中の引用文献のすべては、参照により援用する。
【０００４】
（脳腫瘍分類の問題）
星状脳腫瘍は、臨床的、病理組織学的、および遺伝的に明確な特徴をもつ広い範囲の新生物に及んでいる。１９９３年のＷＨＯによる分類前から集めた分子遺伝学的データは、組織学的に定義されるタイプの個別の星状腫瘍が、生物学的には、さらに多様化していることを示唆している１。例えば、大多数のグリア芽腫は、それほど悪性でなく前兆となる病変である臨床的または組織学的な兆候なしに発生しており、これらの病変は一次性膠芽細胞腫と呼ばれている。これらの病変は、大抵３か月未満の短期の病歴後に、より高齢の患者（平均年齢５５歳）に発現する。これらの一次性膠芽細胞腫は、ＥＧＦＲ増幅（症例の約４０％）および／または過剰発現（６０％）、ＰＴＥＮ変異（３０％）、ｐ１６ＩＮＫ４ａ欠失（３０〜４０％）、ＭＤＭ２増幅（＜１０％）および／または過剰発現（５０％）、ならびに症例の５０〜８０％において、第１０番染色体全体でのヘテロ接合性の欠失（LOH）によって特徴づけられる。これに対し二次性膠芽細胞腫は、びまん性星状腫瘍（WHOグレードII）または未分化星状腫瘍（WHOグレードIII）による悪性の進行により、より遅く成長し、より若齢の患者（平均年齢４０歳）に発現する。二次性膠芽細胞腫は、症例の約６０％においてＴＰ５３変異を含み、これらの変異の９０％以上が、びまん性星状腫瘍（WHOグレードII）または未分化星状腫瘍（グレードIII）の前に既に存在している。二次性膠芽細胞腫への経路は、１９ｑ番および１０ｑ番染色体の対立遺伝子の欠失によってさらに特徴づけられる１。病理組織学的には、これらの亜類型の一義的な特徴が分かりにくいままであるが、それらは明確に異なる遺伝的経路を経て進化している１−３。また、これらの亜類型が予後診断において顕著に異なるか否かは発表されてはいないが、これらが今後開発される新規の特定の療法に対し、異なる反応を示すように思われる４。結果として、進行中の臨床試験は、分子の細分類を組み込む必要があり、また将来の分類体系は、これらの差異に基づくものになると確信する５。
【０００５】
（脳癌のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号伝達経路）
ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ
成人の最も一般的な一次性悪性脳腫瘍である膠芽細胞腫の患者において、少数のサブグループは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤エルロチニブおよびゲフィチニブによる恩恵を受けるようである６。しかし、膠芽細胞腫のＥＧＦＲキナーゼ領域における変異の希有性７，８は、このようなＥＧＦＲの変異がＥＧＦＲキナーゼ阻害剤への反応性を説明できないことを示唆している９。ＥＧＦＲ遺伝子は一般的に膠芽細胞腫において増幅される１０が、この異常性はＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の反応性と相互に関連してもいない９。膠芽細胞腫は、ＥＧＦＲの構造的に活性なゲノム欠失変異体であるＥＧＦＲｖＩＩＩをしばしば発現する１１−１５。このＥＧＦＲの変異体は、強度に、かつ持続的に、細胞の生存、増殖、および運動性に対する重要な情報を提供するホスファチジルイノシトール３キナーゼ（PI3K）の信号伝達経路を活性化させる１６−２０。ＥＧＦＲｖＩＩＩによる持続的なＰＩ３Ｋ信号伝達経路の活性化は、経路依存を引き起こすと考えられ２１、チロシンキナーゼ阻害剤によって経路が途絶されると、経路依存の腫瘍細胞は死滅する。ＰＩ３Ｋ信号伝達による慢性的な依存を促進することにより、ＥＧＦＲｖＩＩＩが膠芽腫細胞をＥＧＦＲキナーゼ阻害材に対し感作することになり得る。
【０００６】
ＰＴＥＮ
ＰＩ３Ｋ信号伝達経路の阻害剤であるＰＴＥＮ（phosphatase and tensin homologue deleted in chromosome 10、第１０染色体上欠失ホスファターゼ・テンシン・ホモログ）腫瘍抑制タンパク質は、膠芽細胞腫において一般的に喪失している１０，１７，２２。この喪失は、ＰＩ３Ｋ経路阻害下流からＥＧＦＲ阻害を解離することによって、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤による治療に対する細胞の耐性を促進し得る２３。そこで、ＥＧＦＲｖＩＩＩが腫瘍をＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対し感作させ、ＰＴＥＮの喪失がその阻害剤への反応を損なうと仮定した２３。
【０００７】
この仮説を検証するために、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤での治療前の患者からの膠芽細胞腫におけるＥＧＦＲｖＩＩＩとＰＴＥＮを、遺伝子およびタンパク質レベルで分析した。さらに、ＥＧＦＲの変異と、そのヘテロ二量化の相方であり、膠芽細胞腫で変異すると報告され、またＥＧＦＲキナーゼ阻害剤への反応に影響２４するＨｅｒ２／ｎｅｕを調査した。それにより、膠芽腫細胞におけるＥＧＦＲｖＩＩＩとＰＴＥＮとの共発現とＥＧＦＲキナーゼ阻害剤への反応性との間の強い関連性を見出した。
【０００８】
ｍＴＯＲ
ｍＴＯＲ（mammalian target of rapamycin、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質、ＦＲＡＰ、ＲＡＦＴ１およびＲＡＰ１としても知られる）は、ＰＩ３Ｋの活性化の下流で作用する主要なキナーゼとして認識されている２５。ｍＴＯＲを特異的に阻止するラパマイシンおよびラパマイシン誘導体が、過去５年間において、見込みのある抗癌剤として開発されている。ｍＴＯＲは、重要な信号変換経路を調節し、増殖刺激の細胞周期の進行への結合に関わっている。静止細胞は、増殖誘導信号に応じてｍＲＮＡのサブセットの翻訳を増加させ、そこでのタンパク質産物は、細胞周期のＧ１期の進行に必要とされる。ＰＩ３ＫおよびＡＫＴは、成長因子受容体とリン酸化反応との連結反応とｍＴＯＲの活性化状態とを結び付ける上流経路の主要要素である２６，２７。癌細胞の発生と増殖におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の役割は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の要素が、表面受容体の赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ERB）ファミリ、インスリン様成長因子（IGFR）、および発癌性Ｒａｓタンパク質によって活性化されることが実証されている２８−３１。
【０００９】
（ポジトロン放出断層撮影用放射性トレーサ）
ＦＤＧ（18F-2-fluoro-2-deoxy-d-glucose）ポジトロン放出断層撮影法（PET）の臨床応用への広がりが、特に腫瘍学において、継続されている。結腸直腸癌（CRC）においては、多様なＰＥＴの使用には、初期診断、病期分類、病期再分類、および治療反応の評価が含まれる３２−３４。ＰＥＴは、機能的な画像や腫瘍動態の形跡を提供できることから、ＣＲＣの再発や転移性疾患の検知における従来の解剖学に基づいた形態学上のモダリティに対する利点があるとも報告されている３５，３６。これは、グルコース摂取の増強が、悪性腫瘍に特徴的な代謝性変化の主要なものの一つであるという知識に基づくものである。臨床的に、ＦＤＧはＰＥＴトレーサの最も一般的に使われているものである。これは、グルコースと同様に代謝され、細胞内に搬送されるが、一度、酵素でリン酸化されると、このリン酸化酵素（FDG-6-phosphate）は、腫瘍細胞内に代謝的に捕捉される。したがって、腫瘍は、ＦＤＧの転換の増大を明示し、ＰＥＴの走査画像でのトレーサの活動が増大した領域によって識別可能となる３７。標準化摂取値（SUV）として半定量化されたＦＤＧ摂取の変化は、臨床的に、ＣＲＣを含む同じ起源からの腫瘍のＰＥＴの走査画像において見られた。腫瘍におけるＦＤＧ摂取の差異とこの摂取のメカニズムについて、多くの研究を行った。明らかになった証拠では、グルコース代謝の度合いは腫瘍の特異な生物学的特性によって決定されるため、ＦＤＧ摂取に影響する因子が複雑であることを示している３８−４０。低酸素状態や細胞濃度などのＦＤＧ摂取に最も影響する因子は、解糖関連タンパク質の発現の変化に関連付けられると考える４１，４２。グルコース輸送タンパク質、特にＧＬＵＴ−１の発現は、ＦＤＧ摂取に直接関わり、癌細胞内のＦＤＧ摂取のレベルを決定すると考える４３−４５。
【００１０】
（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号伝達経路とＰＥＴプローブ摂取）
上述のように、ＦＤＧは、ＰＥＴトレーサとして最も一般的に使われ、グルコース輸送タンパク質（Glut）を介して細胞内に搬送される。この搬送されたＦＤＧは、ヘキソキナーゼによってリン酸化され、細胞内に捕捉される。したがって、ＦＤＧ摂取は、Ｇｌｕｔとヘキソキナーゼの両者によって調節される。しかしながら、興味深いことには、細胞膜へのＧｌｕｔの局在化は、Ａｋｔの活動により強化される。さらに、ヘキソキナーゼの発現も、Ａｋｔにより調節される。このことは、ＦＤＧ摂取のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路との強い関係を意味する。
【００１１】
ＲＡＤ００１とＡＰ２３５７３を使った限られた回数でのパイロット試験では、ＦＤＧ（18F-2-fluoro-2-deoxy-d-glucose）ポジトロン放出断層撮影法（PET）を使い、ｍＴＯＲ阻害剤を投与後の腫瘍のグルコース摂取の観察を行った。これらの予備調査では、腫瘍によっては、放射線法によって決まる客観的反応と一貫して関連付けられないグルコース摂取の減少を提示した４６。
【００１２】
（薬剤スクリーニングとＰＥＴプローブ発見（治療学対診断法））
上述したように、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲの信号伝達経路は、癌細胞におけるグルコースとＦＤＧの摂取に強い関連性がある。それが、ＦＤＧがＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号伝達経路を標的とする阻害剤および／または薬剤の治療効果の進化における重要な代理マーカであることの理由である。さらに、上述のように、脳腫瘍は、分子指紋で分類されるべきで、臨床試験もこの分類に従うべきである。癌診断におけるＰＥＴ画像も、この分類に協同すべきである。よって、分子治療学の開発は、分子診断法の開発と連携して疾病の分子指紋の分類に従って行われるべきであると提案することは不合理ではない。しかし、そのような開発基盤が無いのが現状である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の実施の形態に係るマイクロ流体システムは、複数のピペットからなるピペットシステムと、前記ピペットシステムの近傍に配置されたマイクロ流体チップと、前記マイクロ流体チップの近傍に配置された画像光学検知システムと、前記画像光学検知システムと通信する画像処理システムと、を有する。前記マイクロ流体チップは、前記マイクロ流体チップの本体によって規定される複数の細胞培養室を有し、細胞培養室のそれぞれは、前記マイクロ流体チップによって規定される入力チャンネルおよび出力チャンネルと流体接続されている。前記ピペットシステムは、マイクロ流体システムの動作中に、流体を前記複数のピペットを介して複数の前記入力チャンネルに注入する、または流体を前記複数のピペットを介して複数の前記出力チャンネルから抽出する、の少なくとも１つを行うように構成および配置されている。本発明の実施の形態に係る自動蛍光イメージング方法は、細胞培養の固定化のための細胞外マトリックス物質を塗布した表面を有するマイクロ流体チップの複数の細胞培養室に、複数の細胞培養を装填する工程と、少なくとも一つの蛍光プローブを前記細胞培養に適用し、前記蛍光プローブの細胞内または細胞上の特定の標的への結合を促進する適切な条件下で前記細胞培養を培養する工程と、前記蛍光プローブの蛍光の発光を引き起こすように前記細胞培養を照射する工程と、前記細胞内または前記細胞上の特定の前記標的に関する情報をもたらすため、前記細胞培養が複数の前記細胞培養室に実質的に固定化されている間に、複数の前記細胞培養室それぞれの前記細胞から発せられる蛍光を画像化する工程と、を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明のさらなる特徴は、以下に、添付図面を参照しながら本発明のさまざまな実施の形態の詳細を説明することにより明らかになる。また、本発明における上述およびその他の効果は、詳細な説明を以下の添付図面と共に参照することにより、より良く理解される。
【図１】図１は、本発明の実施の形態に係る大規模細胞培養および分析用のマイクロ流体チップを示す概略図である。
【図２】図２は、ＰＩ３Ｋ信号伝達経路とＰＥＴプローブ摂取との関係を示す概略図（左側がＰＩ３Ｋ信号伝達経路の阻害剤を、右側がＰＥＴプローブとその標的を示す）である。
【図３】図３は、Ｕ８７細胞のＰＴＥＮ免疫蛍光画像とＰＴＥＮのフローサイトメトリのデータを示し、図３ＡはＵ８７−ＰＴＥＮ細胞、図３ＢはＵ８７細胞、図３Ｃは図３Ａおよび図３Ｂのデータに基づくＵ８７−ＰＴＥＮとＵ−８７細胞に対応するフローサイトメトリ定量化データをそれぞれ示す。
【図４】図４は、Ｕ８７細胞のＥＧＦＲ免疫蛍光画像とＥＧＦＲのフローサイトメトリのデータを示し、図４ＡはＵ８７−ＰＴＥＮ細胞、図４ＢはＵ８７細胞、図４Ｃは図４Ａおよび図４Ｂのデータに基づくＵ８７−ＰＴＥＮとＵ−８７細胞に対応するフローサイトメトリ定量化データをそれぞれ示す。
【図５】図５は、Ｕ８７細胞のＥＧＦＲｖＩＩＩ免疫蛍光画像とＥＧＦＲｖＩＩＩのフローサイトメトリのデータを示し、図５ＡはＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞、図５ＢはＵ８７細胞、図５ＣはＵ−８７個別細胞のＥＧＦＲｖＩＩＩ免疫蛍光の平均強度、図５Ｄは図５Ａおよび図５Ｂのデータに基づくＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩとＵ−８７細胞のフローサイトメトリに対応するヒストグラム、図５Ｅは図５Ａおよび図５Ｂのデータに基づくＤＡＰＩ対ＥＧＦＲｖＩＩＩの２次元プロットをそれぞれ示す。
【図６】図６は、グルコース類似体（2-NBDG）のＵ８７細胞への摂取を示し、図６Ａおよび図６ＢはＵ８７細胞、図６Ｃおよび図６ＤはＵ８７−ＰＴＥＮ細胞、図６Ａおよび図６Ｃが明視野画像であり、図６Ｂおよび図６Ｄが蛍光画像であり、図６ＥはＵ８７細胞の２−ＮＢＤＧ摂取のヒストグラムをそれぞれ示す。
【図７】図７は、本発明の実施の形態に係るマイクロ流体システムの概略図である。
【図８】図８Ａは大規模細胞培養および分析用のマイクロ流体装置の実物、図８ＢはマイクロチップでのＵ８７細胞増殖の６日間の顕微鏡写真、図８Ｃはマイクロチップで培養したＵ８７細胞の増殖の定量化をそれぞれ示す。
【図９】２次元または３次元ドットプロットの収集データを示す。
【図１０】収集データをヒストグラムとして示す。
【図１１】マイクロ流体サイトメトリプラットフォームでのｐＳ６染色の抗体濃度の最適化を示す。
【図１２】大規模信号伝達プロファイリング用の自動化された全自動ピペットを示す。
【図１３】膠芽腫細胞におけるＰＩ３Ｋ経路の上流マーカ（ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＴＥＮ）のオンチップマルチパラメータ測定を示す。
【図１４】フロー法とオンチップ法とで並行して行った同一細胞懸濁液におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮの検知を比較して示す。
【図１５】分子的に複雑で不均一な膠芽腫試料からの単細胞におけるＰＩ３Ｋ信号伝達（ｐ−ＥＧＦＲ、ｐ−ａｋｔ、ｐ−Ｓ６）の定量測定を示す。
【図１６】マイクロチップ上の分子的に不均一な個体群の特徴を示す。
【図１７】オンチップでの個体群の中の「まれな細胞」の検知を示す。
【図１８】個体臨床膠芽腫試料におけるＰＩ３Ｋ信号伝達の検知を示す。
【図１９】低レベルの内因性のＰＴＥＮの検知を示す。
【図２０】ＧＢＭにおいて、ＳＦＫがダサチニブ敏感分子標的であることを示す。
【図２１】を示す。膠芽腫患者におけるｍＴＯＲ阻害の効果を測定する開発手法とフィードバックループ促進の耐性の実証を示す。
【図２２】マイクロ流体画像サイトメトリ（IMC）技術の概要を示す。
【図２３】定量化ＩＣＣのためのＦＩＴＣ標識化されたｐＳ６抗体の濃度の最適化を示す。
【図２４】最適ＩＣＣ条件でのＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ｐＳ６の単細胞プロファイリングにおけるＭＩＣ技術のダイナミックレンジを示す。
【図２５】ｐ８（+/-）およびＣａＰ８（-/-）ならびにＰＴＥＮｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ（+/+）およびＰＴＥＮΔｌｏｘｐ／Δｌｏｘｐ（-/-）を含む２組の同系マウス細胞株のＰＴＥＮ発現とｐＡＫＴのリン酸化の定量化を示す。
【図２６】ＭＩＣ技術を使った並列信号伝達プロファイリングを示す。
【図２７】異なる濃度のラパマイシンで処理した個別の細胞におけるｐＳ６発現レベルの定量化を示す。
【図２８】ＭＩＣ技術で分析した脳腫瘍試料の分子不均一性を２つの異なる視角の３次元散布図を使って示す。
【図２９】大規模信号伝達プロファイリング用の自動化された全自動ピペットを示す。
【図３０】ＭＩＣチップ１２で分析した１２の脳腫瘍試料の３次元散布図で、個別の腫瘍試料の劇的に異なる細胞不均一性を示す。
【図３１】患者試料の細胞不均一性の分析および定量化に採用した異端なクラスタリング手法を示す。
【図３２】個別細胞のヒートマップで、緑色が低発現、赤色が高発現レベルを表し、初代継代のＮＳとＳＣとの対比において異なる細胞個体群を示す。
【図３３】図３３Ａは個別細胞のヒートマップで、緑色が低発現、赤色が高発現レベルを表し、ｍＴＯＲの遮断によるｐＡｋｔフィードバックループの阻害の開放（ｎ＝１）を示し、図３３Ｂは個別細胞のヒートマップで、緑色が低発現、赤色が高発現レベルを表し、ＥＧＦＲの遮断によりＥＧＦＲの信号伝播がｐＡｋｔを介していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（微小化学物質分析システム）
近年、微小（マイクロ）化学物質分析システム（Micro Total Analysis System、μＴＡＳ）は、細胞レベル分析の生物学研究者にとって重要になっている。μＴＡＳの顕著な特徴は、マイクロチップ上での高度に集積され機能化されたシステムの構築能力である。したがって、従来の細胞分析では複雑であった多くの処理が、スタンドアロン型のマイクロチップに集積できることになる。この集積は、分析時間の短縮および処理操作の簡便さをもたらしている。さらに、これらのマイクロ流体システムは、細胞、試薬および試料の消費量の減少、リアルタイム分析、実験条件の不変性などといった利点がある４７。上述のように、集積されたマイクロチップ上での細胞分析は、さまざまな恩恵をもたらす。よって、マイクロチップ上での細胞分析は迅速に拡大し、例えば、細胞分別への適用４８、および細胞への遺伝子の導入などがある。
【００１６】
（集積マイクロ流体）
ポリジメチルシロキサン（PDMS）系の集積マイクロ流体は、同じ装置でデジタル制御の処理による物理的、化学的および生物学的な順次処理の実施と自動化が可能な流体チャンネルの大規模構造を意味する４９，５０。特に、ＰＤＭＳ材の弾性が、順次処理に必要な弁、ポンプ、カラム５１などのミクロン規模の機能性モジュールの並列作製を可能にしている。さらに、この技術を使った複雑な装置の製作には、比較的簡単な設備が必要とされ、流体および制御ネットワークは、標準的なＣＡＤソフトを使ってマッピングされ、透明なフォトマスクに転写される。フォトリソグラフィ技術を使って、ＰＤＭＳ樹脂を流し入れ焼結させる再使用可能な金型を作製してもよい。例えば、流体チャンネルへのアクセスは、バルク材にパンチングでの穴あけで達成でき、装置はガラスまたはシリコン基板に簡単に接合することができる。弁やポンプなどの能動部品の大規模配列は、個別に作製された層を複数重ねることで作製することができる。空気または不活性ガスで加圧されると、流通層のチャンネルに交差する制御層のチャンネルが屈折され、流路を塞いで流体の動きを停止させる。この方法による弁の動作は、マイクロ流体チップのバイナリースイッチ（例、オープンまたはクローズ）をも構成する。この簡単な製作技術を使って、我々の共同研究チームは優れた多様性のある装置を実現させた。それには、化学反応回路を有するマイクロ流体装置（2006年4月 WO2006071470、2007年 米国特許出願60/876,525号）、ネズミ用集積マイクロ流体血液サンプル器（UCLAケース番号2005-659-1）、高感度放射性同位体濃度定量化マイクロ流体プラットフォーム（米国特許仮出願、UCLAケース番号2006-388-1）、および細胞培養および分析用マイクロ流体プラットフォーム（2006年12月22日出願の米国特許仮出願60/876,525号）が含まれ、それらすべての内容は参照によって本願に援用される。
【００１７】
（顕微鏡型サイトメトリ）
単細胞の測定は、個体群の平均による不明瞭な情報を明らかにする。例えば、大腸菌および出芽酵母の個別細胞の遺伝子発現の変化についての研究５２，５３は、遺伝子発現機構の仕組みの確率的揺らぎによるレポータ遺伝子の発現における細胞間でのわずかな変化５４−５６を示し、その変化が他のプロセスや遺伝子の大半の原因となったり制御をしたりすることを特定している５４。
【００１８】
単細胞のデータを収集する手段の一つがフローサイトメトリであり、その開発は１９３０年代に始まっている。近年の機器は強力であるが、（i）各細胞を時系列で提示するための個別の細胞の調査を繰り返しできない、（ii）細胞が検知器を通過する時間が短い（一般にマイクロ秒台）ことと対物レンズの開口数（NA）により多量の光を集光できず、放射光の１０％以下しか集光できないのがほとんどである、（iii）一般に細胞の画像を撮ることができないため、細胞の形、大きさ、および蛍光の細胞内局在を分析することを困難にしている。最近の研究では、蛍光信号をより長い時間積分し、カスタムメードの電荷結合素子（CCD）で細胞の画像を撮ることにより、後者２つの制限への対処が試みられている５７。光学顕微鏡は、長期にわたり個別の細胞を再閲覧し、長時間放射光を収集し、高解像度で画像を撮る能力を提供することにより、フローサイトメトリにおけるいくつかの制限を補うことができる。コンピュータ支援の細胞追跡および画像分析の自動化は１９６０年代に始まり、それらのデータを高スループットで生成することを可能にしている５７−６３。しかしながら、このような単細胞追跡は、低スループットおよび／または細胞生存の悪さなど、実応用では制限がある。
【００１９】
本発明の実施の形態によれば、新規ＰＤＭＳ系マイクロ流体装置（図１参照）は、ＰＩ３Ｋ／Ａｔｋ／ｍＴＯＲ信号伝達経路の観察、および蛍光顕微鏡法と組み込みの電波探知機との併用によるプローブ摂取の画像化に基づき、それぞれ薬剤スクリーニングおよびＰＥＴプローブ発見の両者を行うことができる（2007年4月20日出願のPCT/US2007/009705参照）。Ｕ８７、Ｕ８７−ＰＴＥＮ、Ｕ８７−ＥＧＦＲ、およびＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩを含む膠芽腫細胞株および遺伝子操作膠芽腫細胞を、本発明の実施の形態に係るマイクロ流体装置において分析した。このようなマイクロ流体システムの本質的な利点には、試料および／または試薬の経済性、高スループットな運用、実験的忠実性、拡張性、柔軟性、ならびにデジタル化された制御性が含まれる。本発明の実施の形態に係るこのようなマイクロ流体プラットフォームは、薬剤の高スループットなスクリーニングおよびプローブ対象の画像化に利用できる。本発明の実施の形態によれば、自動化ピペットシステムを含むことにより、スタンドアロン型装置で、試料の経済性および単細胞レベルでの定量化／システム読み出しの利点を有しながら、１０００個から１００００個の細胞培養の並列スクリーニングを行うことが可能である。本発明の実施の形態によれば、１０室から１５９６室に適用可能である。
【００２０】
（高スループット薬剤スクリーニング）
本発明の実施の形態に係るマイクロ流体プラットフォームには、顕微鏡型サイトメトリでの細胞分析のスループットを顕著に向上させる可能性がある。本装置では、個別の癌細胞のＰＩ３Ｋ信号伝達経路における薬剤の効果の分析とＰＥＴプローブ摂取の評価とを同時に行うことができる（図２参照）。
【００２１】
（小型化と低価格化）
本発明の実施の形態に係るマイクロ流体装置での薬剤スクリーニングおよびＰＥＴプローブ発見の本質的な利点は、培地、抗体、およびＰＥＴトレーサなどの使用量を削減できることである。本発明の実施の形態によれば、１微小室当たり約２００ピコリットルが適量である。
【００２２】
（信号伝達経路の観察）
本発明の実施の形態においては、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号伝達経路の痕跡は、免疫蛍光法で着色される。その後、ＰＩ３Ｋ信号伝達経路における薬物効果を、本発明の実施の形態に係る顕微鏡サイトメトリで分析することができる。
【００２３】
（個別細胞の分子指紋による膠芽腫の分類）
本装置では、個別の細胞の分子指紋分析により、患者の膠芽腫を分類することができる。この分類によれば、個々の膠芽腫の患者に対し、効果的な薬剤の選択が可能となる。
【００２４】
（ＰＥＴプローブ発見での個別細胞の分子指紋の併用）
同時に、本発明の実施の形態に係るマイクロ流体装置では、それぞれの患者に効果的なＰＥＴトレーサの評価、選択が可能となる。本発明の実施の形態によれば、癌細胞における各分子事象に対して、さまざまなＰＥＴトレーサを開発することができる。
【００２５】
（マイクロチップでの高スループットな哺乳類細胞培養）
カリフォルニア大学バークレイ校（UC Berkeley）のLuke Lee博士のグループが、連続培地灌流型の配列微小室内での細胞培養用の高アスペクト比のマイクロ流体装置を発表した。この装置は、費用効率の高い、自動化された細胞培養用の有望なツールを提供するために考案された。配列の１ユニットは、高さ２マイクロメータの複数の細い灌流チャンネルで囲まれた円形で高さ４０マイクロメータの微小流体室からなる。微小室と灌流チャンネル間の高アスペクト比（約２０）が、微小室内の細胞の局在化とともに、細胞成長の均一な微小環境の作成の利点をもたらす。この装置のフローのプロファイリングと物質移動のシミュレーションのために有限要素法が用いられた。ヒト癌（HeLa）細胞を、装置内で摂氏３７度での培地の連続灌流で培養し、成長させて集合体とした。
【００２６】
（マイクロチップでの薬剤スクリーニング）
パッチクランプ法によるイオンチャンネル活動の高スループットな測定は、薬剤発見における治療用分子の特徴付けのツールとして相当な関心が寄せられている。少量の試薬量と高スループットとを組み合わせるマイクロシステムは、マイクロスケールの商用パッチクランプ装置に発展した。これらの装置では、イオンチャンネルの記録は、一般的に、２つの電極を分離する膜におけるマイクロメートルサイズの開口に細胞を配置して行う６４，６５。マイクロ流体路を使って細胞を開口に案内することにより、細胞を記録部位に配置し、それに続く細胞に刺激を提示させるのに必要な大きな労力を要するマイクロマニピュレーションを低減することができる６６。高品質なイオンチャンネルの記録に必要な高抵抗（約１０９Ω）なシール材を得ることは、マクロスケール、マイクロスケールの両者において技術的に困難であるが、スループットの困難性に対してはマイクロシステムにおける成功率が高い。
【００２７】
（単細胞分析）
従来の研究とマイクロシステムの両者において、単細胞の分析は、画像に基づいた技術と細胞内蛍光プローブを使って行われている（例えば、カルシウム流出を測定するようなもの６７）。しかしながら、集積マイクロチップの正確な操作、処理、ごく少量で分析する能力は、細胞内構成物の分析における新しい機会をもたらした。単細胞を分離し、化学溶解バッファを使ってそれらを溶解することが可能な集積空気圧弁を有するマイクロ流体装置は、１つの細胞からメッセンジャーＲＮＡを抽出し、回収することが可能であることを示している６８。電気泳動分離を集積した同様の装置は、１つの細胞の溶解内容物からアミノ酸の分析が可能である６９。動電学的フロー駆動による細胞の装填、結合、および溶解ではあるが、電気泳動分離による単細胞分析も実証されている７０。
【００２８】
（膠芽腫の分子指紋）
Mischel博士のグループが、ＰＩ３Ｋ経路の生体分析をするため、細胞組織のマイクロアレイに適用した免疫組織化学分析を使って、単変量および多変量分析とともに、階層的クラスタ分析および多次元尺度分析を行った１７。生体の膠芽腫のＰＩ３Ｋ経路の最初の分析の結果は、対象キナーゼ阻害剤治療の患者を階層化する方法を示唆している。さらに、臨床、画像、および組織学的データを統合する際には、ＤＮＡマイクロアレイ分析が最も有用である。年齢や性別などの患者の特性を含んだ主要な臨床情報を含む適切なデータベースの開発には多大な労力が必要とされる。脳の画像化は日常的に行われ、画像は中央データベースに収納される。正確で最新の情報を確保するため、組織学的顕微鏡写真は細胞の形態を記録し、臨床データはワイアレス入力装置を介してリアルタイムに入力される。生検材料は、臨床データに関連付けられ、マイクロアレイを使った大規模発現分析７１用のＲＮＡの抽出に使用され、今後の分析のために保存される。
【００２９】
（顕微鏡サイトメトリ）
過去２０年間、臨床および薬物応用以外での相当量の研究目的の自動化顕微鏡サイトメトリは、MetaMorph（Molecular Devices Corporation社）およびImagePro（Media Cybernetics, Inc.社）という顕微鏡の操作、データの取集および分析を行う２つの市販ソフトウェアパッケージに依存してきた。これらのパッケージは、頻繁に、Matlab（The Mathworks, Inc.社）やLabview（National Instruments Corporation社）などの、より汎用的な分析プログラムと共に使用され、これらの目的に使用される最先端の商用ソフトウェアを構成すると見られる。同様に、オープンソースプロジェクトも画像分析に有益なツールを提供している。例として、顕微鏡画像のファイルフォーマットとメタデータ標準を提供するOpen Microscopy Environment（OME）１４、顕微鏡画像分析ツールのJavaベースのパッケージであるImage J１５、およびCellProfiler１６がある。
【００３０】
（本発明の実施の形態に係るマイクロチップ）
ＰＤＭＳ系のマイクロ流体システムに基づく薬剤スクリーニングおよびＰＥＴプローブ発見用のマイクロチップのプロトタイプ（図１）を設計、製作した。チャンネルパラメータは、３００μｍ（幅）×２０００μｍ（長）×２００μｍ（高）である。ＰＤＭＳチップは、３０秒間の酸素プラズマ処理により、スライドガラスに堅固に取り付けられている。細胞外マトリックス成分（例、フィブロネクチン（FN）、ラミニン、マトリゲル、およびＲＧＤペプチド）を、細胞の固定化のため、すべてのチャンネルの表面に塗布してもよい。
【００３１】
実施の形態の一部において使われた最も小さなマイクロ流体チップの寸法は、室寸法：１００μｍ（長）×１００μｍ（幅）×２０μｍ（高）、容積２００ピコリットルである。今までにおいて一般的に使われたマイクロ流体チップの寸法は、室寸法：３０００μｍ（長）×５００μｍ（幅）×１００μｍ（高）、容積１５０ナノリットルである。本発明の実施の形態における他の例における大きな室の寸法は、室寸法：６０００μｍ（長）×２０００μｍ（幅）×２００μｍ（高）、容積２．４マイクロリットルである。
【００３２】
（膠芽腫細胞）
先ず、ＵＣＬＡで治療を受けた脳腫瘍（NS 107、NS 117、NS 146）患者の一次性膠芽腫からのＵ８７ヒト膠芽腫細胞株および安定して成長する細胞を、概念実証の検証用として選択した。Ｕ８７細胞は、膠芽腫患者のモデル細胞株を構築するために、ＣＭＶプロモータにより駆動されたＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲｖＩＩＩを有するレトロウイルスで改変された（Ｕ８７−ＰＴＥＮ、Ｕ８７−ＥＧＦＲ、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）。
【００３３】
（マイクロチップでの細胞の免疫蛍光着色）
細胞外マトリックスであるフィブロネクチン（FN）を、細胞の付着のために、すべてのチャンネルの表面に塗布した。濃度２５０μｇ／ｍｌのＦＮ８．０マイクロリットルを各チャンネルに導入し、３７℃で３０分培養した。通常の細胞培養設定から得たＵ８７細胞株の懸濁混合液をＦＮ塗布されたチャンネルに導入し、培養器に３０分保持した。その後、チャンネルを１００マイクロリットルの細胞培養培地（Dulbecco社 Modified Eagle Medium + 10%子牛血清 + 1%ペニシリン−ストレプトマイシン + 1%L-グルタミン）で洗浄した。一晩おいて、室温で１５分間、４％のパラホルムアルデヒドにて、チャンネル内の細胞を固定化させた。１５分後、各チャンネルをＰＢＳで洗浄した。各チャンネルの表面に非特異性の抗体の結合を防ぐため、各チャンネルにブロッキング溶液（ＰＢＳ液中に、１０％正常ヤギ血清、０．１％トリトンＸ−１００、および０．１％Ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド）を装填して３０分間培養した。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号伝達経路を可視化するため、マウス抗ヒトＰＴＥＮ抗体（Cascade Bioscience社）１００μｇ／ｍｌ、マウス抗ヒトＥＧＦＲ抗体（Zymed Laboratories社）１５μｇ／ｍｌ、抗ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（Dako社）８７μｇ／ｍｌの抗体を使った。すべての抗体は、マウスＩｇＧ標識化キット（Invitrogen社）で標識化された。これらの抗体を、各チャンネルに装填し、室温にて３０〜６０分間培養した。免疫染色後、各チャンネルに核染色のためのＤＡＰＩを装填した。すべての染色終了後、マイクロチップを、ニコンＴＥ−２００顕微鏡で観察し、画像をMetaMorph（登録商標、Molecular Devices社）画像ソフトウェアで分析した。
【００３４】
図３は、Ｕ８７−ＰＴＥＮ細胞（図３Ａ）およびＵ８７細胞（図３Ｂ）におけるＰＴＥＮ発現の免疫蛍光画像を示す。これらの画像に基づき、定量的データが、MetaMorphでフローサイトメトリのように分析された（図３Ｃ）。ＤＡＰＩ染色を細胞の標識として使って、どの細胞が免疫蛍光の陽性または陰性の信号を有するかを知り、個々の細胞の明度を観察することができる。Ｕ８７−ＰＴＥＮの場合、異なる明度のＰＴＥＮ免疫蛍光の２つのピークが観察された。高明度の細胞が免疫蛍光染色による陽性のＰＴＥＮ細胞を示し、低明度の細胞が陰性のＰＴＥＮ細胞を示している。
【００３５】
ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの場合においても、陽性／陰性のＥＧＦＲ細胞の集団と、個々の細胞のＥＧＦＲ免疫蛍光明度とを定量的に分析することができる（図４、図５）。本発明の方法が、膠芽腫の分析と分類に適用できることを確認する。図５においては、本発明の顕微鏡型サイトメトリの二重染色法による二次元分析の能力を示している。これらの免疫蛍光画像から、個々の細胞の識別、単細胞レベルでの信号伝達経路の観察など、より多くの情報を得ることを可能にしている。
【００３６】
（Ｕ８７細胞のグルコース摂取の観察）
Ｕ８７細胞におけるグルコース摂取を観察するには、蛍光デオキシグルコース（2-NBDG:2-[N-(7-nitrobenz-1-oxa-1,3-diaxol-4-yl) amino]-2-deoxyglucose）７２，７３を使って、Ｕ８７およびＵ８７−ＰＴＥＮ細胞による２−ＮＢＤＧの摂取を観察した（図６）。細胞をチップに装填後、培養基を塩化カルシウムとハンクス液（HBSS）で洗浄した。その後、ＨＢＳＳ中の２−ＮＢＤＧを細胞室に装填し、２０分間培養器で培養した。Ｕ８７細胞の場合は、図６Ｂに示すように、２−ＮＢＤＧの信号が観察された。Ｕ８７−ＰＴＥＮ細胞の場合は、２−ＮＢＤＧ摂取による蛍光信号を検知できなかった（図６Ｄ）。Ｕ８７細胞における２−ＮＢＤＧ摂取のヒストグラムを図６Ｅに示す。この結果は、細胞膜およびヘキソキナーゼ活動へのＧｌｕｔの局在化と共に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号伝達経路が下方制御されたＰＴＥＮの過剰発現を示している。この結果によれば、ＰＩ３Ｋ信号伝達経路およびグルコース摂取両者の観察は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号伝達経路薬剤スクリーニングおよび新規ＰＥＴプローブの発見において、重要な位置とすべきである。
【００３７】
本発明の実施の形態に係るこのタイプのマイクロ流体装置は、膠芽細胞腫および患者の試料を含む分析に利用できることを実証している。本発明の一部の実施の形態に係るマイクロ流体装置は、個々の細胞観察のプラットフォームを提供することが可能である。本発明の一部の実施の形態に係るマイクロ流体装置は、細胞分析に使用可能である。本発明の一部の実施の形態に係るマイクロ流体システムは、高スループットの薬剤スクリーニングにも使用可能である。本発明の実施の形態によれば、細胞分析におけるコスト削減が達成できる。さらに、本発明の一部の実施の形態に係るマイクロ流体システムは、ＰＥＴプローブ発見にも使用可能である。
【００３８】
図７は、本発明の実施の形態に係るマイクロ流体システム１００を概略的に示している。マイクロ流体システム１００は、ピペットシステム１０２と、ピペットシステム１０２近傍に配置されたマイクロ流体チップ１０４と、マイクロ流体チップ１０４近傍に配置された画像光学検知システム１０６と、画像光学検知システム１０６と通信する画像処理システム１０８とを有する。ピペットシステム１０２には、複数のピペットが含まれる。本発明の実施の形態によれば、マイクロ流体システム１００は、マイクロ流体チップ１０４への光学路を有するように構成、配置された照射システム１１０も含まれる。照射システム１１０は、動作中の細胞培養室内の培養された細胞の照射に適している。本発明の一部の実施の形態においては、照射システムは、白色光または広域スペクトル照射システム、複数のスペクトル線を有する多色照射システム、および／またはレーザのような単色照射システムでもよい。
【００３９】
マイクロ流体チップ１０４は、マイクロ流体チップ１０４本体で規定される複数の細胞培養室を有する。細胞培養室のそれぞれは、マイクロ流体チップ１０４本体で規定される入力チャンネルおよび出力チャンネルと流体接続されている。マイクロ流体チップ１０４は、図１を参照して上述したようなＰＤＭＳ系チップでもよい。
【００４０】
ピペットシステム１０２は、マイクロ流体システム１００の動作中に、複数のピペットを介して複数の入力チャンネルに流体を注入する、または複数のピペットを介して複数の出力チャンネルから流体を抽出する、の少なくとも１つを行うように構成、配置されている。例えば、本発明の実施の形態によれば、ピペットシステム１０２は、培養する細胞を含んだ流体の注入、培養基および／または開発中の薬剤の注入、ならびに他のバイオマーカの注入を行うことができる。また、ピペットシステム１０２は、同じ複数のピペットまたは別の複数のピペットのマイクロ流体チップ１０４の出力チャンネルから、例えば、細胞灌流などの抽出を行うことができる。
【００４１】
ピペットシステム１０２は、自動化ピペットであってもよい（図１２Ａ〜図１２Ｆ）。しかし、本発明の範囲は自動化ピペットシステムに限定されない。本発明の別の実施の形態によれば、ピペットシステム１０２は、手動式または半自動式ピペットシステムでもよい。しかし、最初の細胞培養／培地の交換から免疫染色までの自動化された作業は、高スループットな信号伝達経路のプロファイリングの大規模な細胞培養／分析を行うことを可能とする。
【００４２】
使い勝手の良いインタフェースには、チップホルダ（図１２Ａ〜図１２Ｆ参照）、およびピペットチップアレイ（図１２Ａ〜図１２Ｆ参照）が含まれることがある。自動化ピペットは、例えば、９６、３９６および／または１５３６ウェルのプレートを扱うように設計することができる。チップホルダを現行のウェルプレートプラットフォームの寸法に適合させて使ったりして、現行の標準機器を利用することもできる。よって、さらなる変更なしに、２個のプレートホルダを直接、自動化システムに使用するように搭載することができる。現行、１つのチップホルダには４個のマイクロ流体チップを収容でき、１つのマイクロ流体チップには４０の細胞培養／分析室がある。各細胞培養室の注入口穴と排出口穴のそれぞれの位置は、１５３６ウェルプレートの特定のウェルの位置に合わせることができる。
【００４３】
本発明の実施の形態に係るマイクロ流体システムは、手動式、半自動式、および／または自動式の以下の動作が含まれる。
１．細胞の装填、培養器での細胞培養、および細胞維持のための培地交換を含む細胞培養試料の調製。
２．細胞の固定化、透過化、および免疫染色を含む免疫サイトメトリ。
【００４４】
本発明の実施の形態に係るマイクロ流体システム１００は、（i）高スループットスクリーニングのための大規模細胞培養、（ii）単細胞精度の生体分子の定量化のためのマイクロ流体サイトメトリ、（iii）癌診断および治療上の階層化に伴う信号伝達経路ネットワークのプロファイリング化、（iv）ウエスタンブロット法の代替えとしての動的タンパク質定量化、および細胞の定量的プロテオーム分析用の他の広範囲の用途を提供することができる。
【００４５】
マイクロ流体システム１００の潜在用途には、限定するものではないが、次のようなものがある。
１．フローサイトメトリの代替え技術として、（i）低価格、（ii）患者試料／試薬の消費量の少なさ、（iii）懸濁液および付着細胞への適合性、（iv）実験の忠実性をもたらすマイクロ流体環境（半自動または全自動式動作）、（v）個別細胞の元データの蛍光画像上での追跡、（vi）培養システムでの微小変化の取り込みが可能な優れた測定ダイナミックレンジ、および（vii）単細胞精度による腫瘍の不均一性の課題への対処の利点が含まれる。
２．ウエスタンブロット法の代替え技術として、（i）低価格、（ii）患者試料／試薬の消費量の少なさ、（iii）実験の忠実性をもたらすマイクロ流体環境（半自動または全自動式動作）、（iv）単細胞精度による腫瘍試料のタンパク質の欠失／下方制御の検知の可能性、（v）並列大規模分析、（vi）個別細胞の元データの蛍光画像上での追跡、（vii）優れた測定ダイナミックレンジ、および（viii）培養システムでの微小変化の取り込みの可能性の利点が含まれる。
３．単細胞または細胞サブセットでのピンポイントな変更。例えば、転移前の細胞および形質転換の極めて初期の段階において、患者に再発する癌細胞のどの信号伝達機構が活動するのかの答を提供すること。
４．「経路」のみでなく、全体としてのネットワークの視野。例えば、薬剤の「的中した」効果と「的外れ」の効果が何かの答を得ること。
５．癌幹細胞の識別と追跡。例えば、治療により死滅しない、および再発を仲介する、表現型的に区別される細胞のサブセットがあるか否か。
６．薬剤発見のターゲットの識別。例えば、どの信号伝達機構が特定の化学療法に対する耐性を癌細胞に付与するか。
７．最適療法の選択。例えば、特定の癌治療に対し反応する患者が類似の信号伝達のプロファイリングを有するか否か。
８．抗癌治療の観察。例えば、信号伝達のプロファイリングが治療反応または副作用のバイオマーカとして使用可能か否か。
９．癌の早期検知。例えば、循環癌細胞、または免疫システム細胞の信号伝達のプロファイリングが初期段階での癌検知に使用できないか否か。
１０．細胞−細胞間および癌細胞−宿主間相互作用のメカニズムの理解。例えば、癌細胞が宿主微環境または免疫システムにどのように相互作用し、変更するか。
【００４６】
本発明の実施の形態によれば、信号伝達ネットワークのプロファイリングは、以下のことをもたらす。
１．血清バイオマーカ分析（癌診断の主要な手段の１つ）と異なり、信号伝達ネットワークを研究することは、疾患および分子病変を対象とした層別化治療をより理解しやすくする。
２．定量化された信号伝達ネットワークのプロファイリング（複数信号伝達ノード）は、従来の組織形態学に基づく病理学的方法、ウエスタンブロット法および免疫組織化学（IHC）より、精度の高い癌診断技術（病期および診断時）となる。
３．生検試料が診療所でごく普通に入手可能。もちろん、適切な組織処理技術が使用されるべきである。
４．定量化された信号伝達ネットワークのプロファイリングは、システムによって情報がどのように処理されるかという、より動的な理解をもたらし、多次元システム生物学の研究（摂動／測定の経時変化）を可能にする。
５．定量化された信号伝達ネットワークのプロファイリングは、新薬の治療効果の評価に利用でき、臨床試験（フェーズ２およびフェーズ３）を促進できる。
６．チップベースでの研究は、患者に処置される前に治療効果を予知できる体外治療（患者の腫瘍組織試料の装置内での治療およびチップ内でのそれらの治療反応の観察）を行うプラットフォームを与える可能性がある。この方法を使うことにより、多剤またはカクテル治療法の試験、評価が、危険を伴うことなく短期間（例、４８時間）でできることになる。
【００４７】
（実施例Ａ：分析例）
１）細胞の装填、培養器での細胞培養、および細胞維持のための培地交換を含む試料調製。
２）細胞の固定化、透過化、および免疫染色を含む免疫サイトメトリ。
ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ信号伝達ネットワークに関わるＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＴＥＮ、ｐＡｋｔ、ｐｍＴＯＲ、ｐＳ６、および増殖マーカＫｉ６７を含む複数の信号伝達ノードは、膠芽腫システムで測定できる。
ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ信号伝達ネットワークに関わるＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＰＴＥＮ、ｐＡｋｔ、ｐｍＴＯＲ、ｐＳ６、および増殖マーカＫｉ６７を含む複数の信号伝達ノードは、乳癌システムで測定できる。
【００４８】
（生体細胞の成長カーブの観察）
図８に示す細胞培養／分析チップは、（i）７２個の細胞培養と分析の並列実施と（ii）隣接する細胞培養室の保湿（培地の蒸発の防止）に関する２つのタイプのマイクロチャンネルで構成されている。一方、細胞の７日間を超える生存期間を確保するために、マイクロチャンネル表面の改良の研究に多大な努力を注いだ。１２チップの半自動式ピペットを、細胞の装填、培養基の交換、ならびに固定化、透過化、および免疫染色の試薬の導入に採用した。コンスタントな培地交換は、チップ上の細胞培養を６日間以上にすることができる。多数の遺伝子操作された膠芽腫の細胞株（例、Ｕ８７、Ｕ８７−ＰＴＥＮ、およびＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＰＴＥＮ）は、装置内において、巨視的設定において得られるものと同程度の再現可能な成長率で、成功裏に培養できた。
【００４９】
図８Ａは、大規模細胞培養および分析用のマイクロ流体装置の実物である。２つのタイプの流体チャンネルは、食用色素を装填して標識化し、マイクロ流体チップの異なる機能を見やすいようにした。赤色が保湿チャンネルであり、緑色が培養チャンネルである。図８Ｂは、マイクロチップにおけるＵ８７細胞の増殖の６日間の時間経過を示す顕微鏡写真である。図８Ｃは、時間経過に伴うチップ培養されたＵ８７細胞の増殖を、細胞培養室内のＵ８７細胞の数の観察により定量化したものである。
【００５０】
（実施例Ｂ：データ収集）
本発明の実施の形態に係る方法において得られるデータは、例えば、２次、または３次元のドットプロットの形態（図９）であり、Ｘ軸：信号伝達ノードの強度（この例では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、Ｙ軸：別の信号伝達ノードの強度（この例では、ＤＡＰＩ）で、３次元ドットプロットではＺ軸：第３の信号伝達ノードの強度である。別の実施の形態（図１０）では、データはヒストグラム（Ｘ軸：信号伝達ノードの強度（この例では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、Ｙ軸：細部の数）の形態である。
【００５１】
（膠芽腫のオンチップ細胞培養の手順）
材料：
２４チャンネルのポリ−Ｌ−リシン塗布された細胞培養チップ
細胞培養基：ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）５００ｍｌ
ウシ胎児血清（FBS）  ５０ｍｌ
ペニシリン−ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン  ５ｍｌ
【００５２】
細胞株と同系細胞：
Ｕ８７
Ｕ８７−ＰＴＥＮ
Ｕ８７−ＥＧＦＲ
Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ
Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＰＴＥＮ
【００５３】
自動式ピペット：
マルチチャンネル（Matrix Technologies Corporation社、アイテム番号２２３９および２１３９ピペット推奨）
シングルチャンネル（Matrix Technologies Corporation社、ピペットアイテム番号１０２９）
【００５４】
測定機器：
ニコン  ＴＥ２０００顕微鏡
【００５５】
手順：
細胞装填
１．バイオセーフティフード内で、紫外線を１５分間照射し、チップを消毒する。
２．各チャンネルを２回、細胞培養基（各回２μｌ）で洗浄する。ピペットの装填速度は、６μｌ／秒。廃液の除去にピペットチップ（真空装置に接続）を使用。
３．各チャンネルに、３０％のＦＢＳの細胞培養基２μｌを装填する。
４．チップをペトリ皿に入れ、ペトリ皿に０．５ｍｌの滅菌水を加える。
５．ペトリ皿を培養器内に２４時間保存する。
６．培養器からペトリ皿を取り出し、各チャンネルを細胞培養基２μｌで２回洗浄する。ピペットの装填速度は、６μｌ／秒。廃液の除去にピペットチップ（真空装置に接続）を使用。
７．各チャンネルに、８×１０５細胞個／ｍｌの細胞懸濁液２μｌを、装填速度０．５５μｌ／秒で装填する。
８．チップを培養器に入れる（３７℃、５％二酸化炭素）。
９．細胞付着性を確実にするため、チップを培養器内に一晩保存する。
１０．１２時間ごとに、新鮮培地２μｌを装填速度０．５５μｌ／秒で装填し、各細胞の培地を取り換える。
１１．細胞の観察するために、毎日、ニコン  ＴＥ２０００顕微鏡で、各チャンネルの写真を１０枚ずつ撮る。
１２．細胞をチップ内で６日間培養する。
助言：チップ内に泡が発生することがある。各注入口に培養基を１滴たらすことによりチップ内での泡の発生を低減できる。
【００５６】
（ＰＤＭＳマイクロ流体チップの製作手順）
材料：
Sylgard 184 PDMS（Dow Corning Corp.社  カタログ番号4019862）
フォトリソグラフィでデザインされたシリコンウエハ（Silicon Quest社）
ペトリ皿（VWR LABshop  カタログ番号25384-302）
ポリ−Ｌ−リシン顕微鏡スライド（Polysciences Inc.社  カタログ番号22247）
マイクロスライド（Micro Slide、清浄済み、７５×５０ｍｍ  Corning社）
トルエン（Sigma社  カタログ番号244511）
【００５７】
手順：
マイクロ流体鋳物製作
１．アルミホイルで覆ったペトリ皿にシリコンウエハ鋳型を置く。
２．３３グラムの１０：１（試薬比Ａ：Ｂ）のＳｙｌｇａｒｄ  ＰＤＭＳを、無菌の混合カップ内で撹拌棒を使って混合する。
３．混合したＰＤＭＳを、ペトリ皿内のシリコンウエハ上に注ぐ。
４．ＰＤＭＳ／ペトリ皿を、真空ポンプで４０分間吸引し、空気を抜く。
５．ペトリ皿をオーブンに入れ、８０℃で３０分間培養する。
６．ペトリ皿をオーブンから取出し、室温で３０分間放置冷却する。
７．ペトリ皿からアルミホイル／ウエハ／ＰＤＭＳ型をそっと持ち上げる。
８．カミソリを使ってウエハの下側のアルミホイル／ＰＤＭＳをＸ状に切り、それをそっと剥がしてシリコンウエハの下側を露出させる。
９．ＰＤＭＳの鋳物の端部をそっと押し、シリコンウエハから鋳物を外す。
１０．ＰＤＭＳの鋳物をチップに切断し、各チップにパンチングで穴を開ける（逆に、パンチング穴を先に開けてもよい）。
１１．マイクロチャンネルとチップ上面に粘着テープを貼って剥がして塵やＰＤＭＳ片を除去することを２回繰り返し、各鋳物を掃除する。
【００５８】
チップの製作
１．６グラムの５：１（試薬比Ａ：Ｂ）のＳｙｌｇａｒｄ  ＰＤＭＳを、無菌の混合カップ内でガラス撹拌棒を使って混合する。
２．２０ｍｌのトルエン入りのガラスビーカに、５グラムのＰＤＭＳ混合物を溶解し、ガラス撹拌棒でよく混合する。
３．Ｍｉｃｒｏ  Ｓｌｉｄｅ（７５×５０ｍｍ）上にＰＤＭＳ−トルエン混合液を、４０００回転／分で３０秒間、スピンコートする。
４．流体鋳物（上述）をマイクロスライド上に、ＰＤＭＳ接着剤の薄層がＰＤＭＳ流体鋳物のマイクロチャンネル側に塗布されるように配置する。
５．流体鋳物を、商品化されたポリ−Ｌ−リシンスライド上に置く。
６．マイクロ流体チップを真空オーブンに入れ、８０℃で２４時間培養する。
【００５９】
（MetaMorph顕微鏡手順）
材料：
MetaMorph（Premierバージョン）：Molecular Devices社
顕微鏡：ニコン  TE2000S（落射蛍光顕微鏡）
試料
【００６０】
操作：
１．次の動作順序で顕微鏡をオンにする。（i）明視野光源（ライト１）、（ii）蛍光光源−キセノンランプ（ライト２）、（iii）ＣＣＤモニタ、（iv）カメラ、そして（v）コンピュータ（まだオンしていなければ）
＊顕微鏡をオンする前にキセノンランプが完全に冷えていること、および毎回使用時にはキセノンランプが少なくとも３０分間点灯されることを確認すること。
２．スライドを試料台に置く。
３．MetaMorphプログラムを立ち上げ（デスクトップのアイコンをクリックして）、取得（Acquire）メニューから「取得（Acquire）」を選択する。
＊画像を見るには２つの選択肢がある。
１）接眼レンズで、ＰＯＲＴノブ（カメラの右側にある）を「ＥＹＥ」側に回す。
２）モニタ上で、ＰＯＲＴノブを「ＳＩＤＥ」側に回す。これはＣＣＤカメラ用の選択肢でもある。
４．「取得ダイアログウィンドウ（Acquire Dialog Window）」で、または選択パネルを使って、適切なフィルタを選択する。明視野、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ｃｙ５、およびＬｉ−ｃｏｒを含む異なる選択肢が決定される。デジタイザ、ゲイン、露光時間を含む動作パラメータがこの時点で決定される。
＊ａ）蛍光画像を撮るには、「デジタイザ（Digitizer）」には「１ＭＨｚ」、「ゲイン（Gain）」には「３（４倍）」の使用を推奨。
ｂ）蛍光強度を得る露光時間の調節範囲は、２０００（ピクセル）と６５５３５（０．１秒〜１０秒の間が一般的）の間である。
明視野用の露光時間は、およそ５０ミリ秒
ＤＡＰＩ用の露光時間は、およそ１０ミリ秒
ＦＩＴＣ用の露光時間は、およそ１００〜５００ミリ秒
ＴＲＩＴＣ用の露光時間は、およそ２００〜２０００ミリ秒
Ｃｙ５用の露光時間は、およそ５００〜２０００ミリ秒
Ｌｉ−ｃｏｒ用の露光時間は、およそ１〜０秒
５．「ライブ画像表示（Show Live）」をクリックして画像を見る。フォーカスつまみを使って画像の焦点を合わせ、「ＡＳＩ」制御ボックスの位置制御スティックを使ってスライドを移動させる。
６．「取得（Acquire）」をクリックして所望の画像を取得する。
＊蛍光画像を撮る前に、ニコン制御ボックスのボタンで明視野用ライトを消灯する。
７．「ファイル（File）」のドロップダウンメニューから「保存（Save as）」を選択して画像を保存する。
８．画像を撮った後、顕微鏡を次の操作順序で終了する。（i）MetaMorphソフトウェア、（ii）蛍光光源、明視野光源、（iv）ＣＣＤモニタおよびカメラ、そして（v）コンピュータ
【００６１】
MetaMorphでの複数細胞の評価：
１．上記で保存した１セットの画像（ＤＡＰＩとＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ｃｙ５またはＬｉ−ｃｏｒ）を開く
２．「アプリケーション（Apps）」メニューを使って、「複数細胞評価（Multiple Cell Scoring）」をクリックする。
３．「全核（All Nuclei）」をクリックし、「Ｗ１画像ソース（W1 source image）」を介して画像をアクティブにする。
４．「最小幅（Approximate min width）」と「最大幅（Approximate max width）」のパラメータを、各核の大きさ（ＤＡＰＩ画像での）にしたがって設定する。
５．「背景からの強度（Intensity above local background）」のパラメータを、信号と背景との最小画素差（ＤＡＰＩ画像での）にしたがって設定する。
６．「ＦＴＩＣ（またはＴＲＩＴＣ、ＣＹ５、Ｌｉ−ＣＯＲ）」をクリックし、「Ｗ２画像ソース（W2 source image）」を介して画像をアクティブにする。
７．「最小幅（Approximate min width）」と「最大幅（Approximate max width）」のパラメータを、各細胞質領域の大きさ（ＦＩＴＣ画像での）にしたがって設定する。
８．「背景からの強度（Intensity above local background）」のパラメータを、信号（各細胞質領域）と背景との最小画素差（ＦＩＴＣ画像での）にしたがって設定する。
９．「適用（Apply）」をクリックする。
１０．「ログを開く（Open log）」をクリックする。
１１．「ログデータ（Log data）」をクリックすると、データが自動的にエクセル（Excel）にエクスポートされる。
１２．「積分強度（Integrated intensity）」または「平均強度（Average intensity）」の値を分析（ヒストグラム、またはＦＡＣＳ分析のような散布図）に使ってもよい。
【００６２】
（チップ内の膠芽腫の免疫サイトメトリ）
材料：
２４チャンネルのポリ−Ｌ−リシン塗布された細胞培養チップ
細胞培養基：
ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）５００ｍｌ（Invitrogen社、カタログ番号11965-118）
ウシ胎児血清（FBS）  ５０ｍｌ（Omega Scientific社、カタログ番号FB-01）
ペニシリン−ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン  ５ｍｌ（Invitrogen-Gibco社）
４％パラホルムアルデヒド（Electron Microscope Sciences）
トリトンＸ−１００（Fluka社）
メタノール
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Mediatech, Inc.社、ロット番号21040136）
正常ヤギ血清（NGS）（Fisher社）
ウシ血清アルブミン（Sigma社）
Ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（NDBM）（Pierce社、カタログ番号89902、89903）
ゼノンマウスＩｇＧ標識化キット（Zenon Mouse IgG Labeling Kit）（Invitrogen/Molecular Probes社）
ＨｉＬｙｔｅ７５０標識化キット（HiLyte750 Labeling Kit-NH2）（Dojindo社、LK16-10）
ＤＡＰＩ核染色試薬（Molecular Probes社、ロット35033A）
抗体（＊受領時に抗体を等分すること）
【００６３】
細胞株と同系細胞：
Ｕ８７
Ｕ８７−ＰＴＥＮ
Ｕ８７−ＥＧＦＲ
Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ
Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＰＴＥＮ
【００６４】
自動式ピペット：
マルチチャンネル（Matrix Technologies Corporation社、アイテム番号２２３９および２１３９ピペット推奨）
シングルチャンネル（Matrix Technologies Corporation社、ピペットアイテム番号１０２９）
【００６５】
手順：
細胞装填
１．バイオセーフティフード内で、紫外線を１５分間照射し、チップを消毒する。
２．各チャンネルを２回、細胞培養基（各回４μｌ）で洗浄する。ピペットの装填速度は、６μｌ／秒。廃液の除去にピペットチップ（真空装置に接続）を使用。
３．各チャンネルに、３０％のＦＢＳの細胞培養基４μｌを装填する。
４．チップをペトリ皿に入れ、ペトリ皿に０．５ｍｌの滅菌水を保湿のために加える。
５．ペトリ皿を培養器内に２４時間保存する。
６．培養器からペトリ皿を取り出し、各チャンネルを細胞培養基４μｌで２回洗浄する。ピペットの装填速度は、６μｌ／秒。廃液の除去にピペットチップ（真空装置に接続）を使用。
７．各チャンネルに、細胞懸濁液４μｌ（細胞培養用には８×１０５細胞個／ｍｌ（細胞約３２００個）、免疫染色用には２×１０６細胞個／ｍｌ（細胞約８０００個））を、装填速度０．５５μｌ／秒で装填する。
８．チップを培養器に入れる（３７℃、５％二酸化炭素）。
９．細胞付着性を確実にするため、チップを培養器内に一晩保存する。
助言：チップ内に泡が発生することがある。各注入口に培養基を１滴たらすことによりチップ内での泡の発生を低減できる。
【００６６】
免疫染色：
免疫染色に使用するすべての溶液は、ピペットで装填速度０．５５μｌ／秒で装填される。同様に、排液の除去のために真空装置が使われる。
１．チップを氷の上に載せ、試料細胞を４℃（冷）で４μｌのＰＢＳを装填して洗浄する。
２．各チャンネルに４μｌの４％パラホルムアルデヒドを装填し、試料細胞をできる限り速やかに固定化する。
３．各チャンネルに４μｌの透過化溶液（ＰＢＳ中に０．３％のトリトンＸ−１００）を装填し、細胞を透過化する。室温にて１５分間培養する。その後、各チャンネルを４μｌのＰＢＳで洗浄する（３回）。
４．ＰＢＳ中に１０％のＮＧＳ、０．１％のＮＤＢＭ、および３％のウシ血清アルブミンを混ぜ、ブロッキング溶液を調合する。これを４μｌ装填し、１時間、室温で維持する。
５．各チャンネルに４μｌのゼノンフルオロフォア標識化抗体溶液を追加し、４℃で一晩、暗所で培養する。４μｌのＰＢＳで洗浄する（３回）。
抗体溶液の調合：
１）光を避け、１５μｌ（９：１）のゼノンＩｇＧ標識化試薬を、１μｇの抗体溶液に加える。
２）５分間待つ。
３）混合液に、１５μｌ（９：１）のゼノンＩｇＧブロッキング溶液を加える。
４）５分間待つ。
５）適正な希釈の抗体混合液を、ＰＢＳ中に１０％のＮＧＳ、０．１％のＮＤＢＭ、および３％のウシ血清アルブミンを混ぜたものと混合する。
６）チップに装填する。
６．各チャンネルに４μｌの４％パラホルムアルデヒドを装填し、細胞試料を再度固定化する。チップを室温で１５分間培養し、その後、４μｌのＰＢＳで洗浄する（３回）。
７．各チャンネルに４μｌのＤＡＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）染色試薬を注入して５分置き、各チャンネルを４μｌのＰＢＳで洗浄する（３回）。
８．ニコン  ＴＥ２０００顕微鏡を使って蛍光を検知する。
【００６７】
助言：
ＥＧＦＲ染色の場合は、抗ヒトＥＧＦＲはＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０と直接接合するので、「抗体溶液の調合」は必要ない。「HiLyte Fluor 750での抗体標識化」を参照。
【００６８】
（実施例Ｃ：キナーゼ阻害剤で処置したネズミおよびヒトでのＰＩ３Ｋキナーゼ経路バイオマーカの定量化ナノテクノロジ）
この実施例は、膠芽腫の診断ツールとしてのマイクロ流体集積ナノエレクトロニクスセンサの開発、最適化、実証における技術的および臨床的専門知識の相乗効果が期待できる。本実施例では次の目標を設定した。
１）癌細胞の混成集団を単細胞レベルでより良く特徴付けるための膠芽腫のマイクロ流体分析の拡充
２）臨床膠芽腫試料の信号伝達を単細胞レベルで特徴づける臨床膠芽腫試料のマイクロ流体に基づく分析を行う能力の最適化
３）新規のバイオマーカおよび細胞表面マーカの開発、ならびにこの新規マーカの実証をするための一連の補完方法の使用
【００６９】
１）膠芽腫のマルチパラメータ測定用チップ型マイクロ流体集積分析の開発および改良
１ａ）チップ開発と分析の進化：
最近、共同の研究チームが、単細胞の解像度でＰＩ３Ｋ信号経路に関わる信号伝達イベントをプロファイリングする半自動式ピペットと蛍光顕微鏡を併用したマイクロ流体細胞分析に基づくマイクロ流体サイトメトリのプラットフォームを披露した。初期の関心の中心は、ＥＧＦＲ／ＰＩ３Ｋ信号伝達を軸としていた。基礎的な機構的研究の作図とそれらの臨床への展開をすることで、１）膠芽腫患者のＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する臨床反応との強い関連性のある変異上皮成長因子受容体（EGFRvIII）およびＰＴＥＮ腫瘍抑制タンパク質のＰＩ３Ｋの信号伝達を調節する２つの主要なタンパク質の共発現の実証、ならびにＰＴＥＮの欠失に関連する耐性のメカニズムの識別（Mellinghoff 他、NEJM 2005）、２）ＰＴＥＮの欠失によってもたらされるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する耐性を克服する戦略の開発（Wang 他、Cancer Res. 2006）、ならびに３）ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する感度を付与し得るさらなるＥＧＦＲ変異の識別（Lee 他、PLoS Medicine 2006）を行った。また、獲得耐性の課題の認識、および膠芽腫細胞が耐性を持つようになる潜在的な手段の数を認識し始めた（Mellinghoff 他、Clinical Cancer Res. 2007）。
【００７０】
多数の遺伝子操作された膠芽腫細胞（例、U87、U87-PTEN、U87-EGFR、U87-EGFRvIII、およびU87-EGFRvIII/PTEN）および初代細胞を装置で成功裏に培養でき、また、細胞の受容体（EGFRおよびEGFRｖIII）、プロテアーゼ（PTEN）、およびリン酸化されたキナーゼ（p-Akt、pmTOR、p-S6）の発現の定量的な分析を行うことができた。この実施例では、（i）チップベースのサイトメトリ測定において最適なダイナミックレンジを達成できる免疫染色および画像取得／分析の堅固で再現性のある手順の開発、（ii）近似する環境での大規模な信号伝達プロファイリングを可能にするマイクロ流体細胞配列と自動化ピペット間の使い勝手の良いユーザインタフェースの作成に研究努力を注いだ。
【００７１】
（i）チップベースのサイトメトリ測定において最適なダイナミックレンジを達成できる免疫染色および画像取得／分析の堅固で再現性のある手順の開発
このマイクロ流体サイトメトリプラットフォームは、信号伝達経路プロファイリングのためのヒストグラムの作成に利用できるが、細胞の固定化、透過化、および抗体治療、ならびに半自動式ピペットおよび蛍光顕微鏡法の操作パラメータの当初の状態／技術を、測定の最適な忠実性およびダイナミックレンジを達成するためにさらに最適化する必要がある。結果として、このチップベースのサイトメトリ測定によって、細胞の信号伝達ネットワークの小さな摂動が識別できることになる。系統的な方法に基づき、最適な固定化および透過化の条件を得るために、ホルムアルデヒド、メタノール、アセトン、およびトリトンＸ−１００の異なる組み合わせをテストした。さらに、個別の細胞内での異なる信号伝達イベントの多色分析を同時に提供するために、ゼノンネズミＩｇＧ標識化キットとＨｉＬｙｔｅフルオロフォア試薬でリン特定の抗体を標識化した。フルオロフォアで標識化された抗体を異なる濃度で検査した。陽性および陰性対照システムに対して得られる２つのヒストグラム間の最大分離を示す能力を検査することにより最適条件を決定した。ここに、ｐ−Ｓ６免疫染色の最適抗体濃度の決定の例を示す。この場合、陽性対照がｐ−Ｓ６信号で増幅されたＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ膠芽腫細胞で、陰性対照が、ラパマイシンで処置され、ｐ−Ｓ６上流信号がブロックされたＵ８７細胞である。異なる濃度（０、０．０４５、０．４５、４．５μｇ／ｍｌ）のゼノン標識化抗ｐ−Ｓ６を使って２セットの試料を処理した。倒立蛍光顕微鏡を使って蛍光画像を取得し（図１１Ａ）、さらにMetaMorphプログラム（Molecular Devices社）で分析した。特に、操作／分析パラメータが、再度、系統的な最適化によって決定された。図１１Ｂに示すように、４．５μｇ／ｍｌの抗体濃度で、陽性および陰性対照の最も良い分離が得られた。画像分析において、個々の細胞の積分された蛍光強度とともに、細胞の表面領域の広がりという興味深い情報が得られた。細胞の表面領域に変動があることに気付いた。この変数は、積分された蛍光強度を個々の細胞の細胞表面領域で割ることによって除去することができ、劇的に鋭いヒストグラムを得ることができた（図１１Ｃ）。平均強度によるヒストグラムの結果は、フローサイトメトリシステムで得られる結果に比べて、小さな信号伝達イベントの取り込みの精度がより高く、ダイナミックレンジが広くなっている。今のところ、系統的な研究により、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＴＥＮ、およびｐ−Ｓ６の免疫染色についての４つの標準手順が確立されている。
【００７２】
図１１Ａ〜図１１Ｂは、マイクロ流体サイトメトリプラットフォームでのｐ−Ｓ６染色での抗体濃度の最適化を示す。図１１Ａは、抗ｐ−Ｓ６の異なる濃度（０、０．０４５、０．４５、４．５μｇ／ｍｌ）での陽性（Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）および陰性（ラパマイシン処理されたＵ８７）対照の顕微鏡画像である。図１１Ｂは、MetaMorphプログラムを使って得られた個別細胞の積分された蛍光強度とｐ−Ｓ６の発現レベルのヒストグラム。図１１Ｃは、積分された蛍光強度を個別の細胞の表面領域で割って得られた平均ｐ−Ｓ６発現レベルを示す。細胞表面領域に関する要因を除去することによって、ヒストグラムが劇的に鋭くなり、２つのヒストグラムの分離がより見やすくなった。
【００７３】
以下に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号伝達経路とそれに関連する信号伝達ネットワークの調査を含む免疫染色の手順の収集について述べる。このマイクロ流体サイトメトリプラットフォームを使って、分子的に不均一な固形膠芽腫瘍を特徴づけるためのこの方法の側面について述べる。
【００７４】
（ii）近似する環境での大規模な信号伝達プロファイリングを可能にするマイクロ流体細胞配列と自動化ピペット間の使い勝手の良いユーザインタフェースの作成
元々のマイクロ流体サイトメトリプラットフォームは、細胞の装填、培養基の交換、固定化、透過化、および抗体染色の順の操作を、半自動式ピペットを使って行っていた。フロー注入の他に、ほとんどの操作／処理は、実際には、手動で行われていた。その結果、多大なる労力と必然的な操作ミスが、この半自動方式の大規模な研究を必要とする用途への適用のさらなる調査を抑制している。同僚（Mike van DamとChris Behrenbruch教授）との協力で、マイクロ流体細胞配列と自動化ピペット（図１２Ａ）間の使い勝手の良いユーザインタフェースを開発した。高スループットな信号伝達経路のプロファイリングのための大規模な細胞培養／分析が行われるように、初期の細胞培養／培地の交換から免疫染色までの自動化運転することが目標である。使い勝手の良いユーザインタフェースは、チップホルダ（図１２Ｂ）とピペットチップ配列（図１２Ｃ〜図１２Ｅ）の２つのカスタムデザインされたユニットからなる。自動化ピペットは、９６、３９６、および／または１５３６ウェルのプレートを扱うように設計されている。既存の設定を利用するため、チップホルダはウェルプレートのプラットフォームの寸法に適合され、２個のプレートホルダを、更なる変更なしに直接、自動化システムに搭載できるようになっている。現行、１つのチップホルダには、４個のマイクロ流体チップを収容でき、１つのマイクロ流体チップには４０の細胞培養／分析室がある。各細胞培養室の注入口穴と排出口穴のそれぞれの位置は、１５３６ウェルプレートの特定のウェルの位置に合わせてあるということが重要である。したがって、１５３６ウェルプレート用に開発された元のプログラムを、本発明のマイクロ流体細胞培養と分析の自動化運転のプログラムに採用できる。自動化ピペットには、５ナノリットルの精度で試液の分注および抽出が可能な８つの個別制御されるピペットチップが付いている。このマイクロ流体チップを自動化ピペットと統合するため、８つのピペットチップを４対のグループに分け、４つの細胞培養室を並列に処理するように異なる配向で組み立て直した。ピペットチップ対のそれぞれは、相対的に長い方のピペットチップは試料の分注用に、短い方のピペットチップは試料の抽出用である。ＰＤＭＳ系のマイクロ流体チップの弾性特性は、ピペットチップとマイクロ流体チップ間の良好な密封性と製作上での小さな不完全性を許容している。図１２Ｃは、マイクロ流体細胞培養室で、ピペットチップ対がどのように試料／溶液を移動するかを示す。半自動方式では通常の細胞培養基の交換に２０分掛かるのに対し、この自動化システムにより、同じ処理が１０秒以下で終了することができる（図１２Ｄ、図１２Ｅ）。
【００７５】
図１２Ａ〜図１２Ｆは、自動化された大規模な信号伝達のプロファイリングを行う自動化ピペットを示す。図１２Ａは、ウェルプレートプラットフォーム用に設計された自動化ピペット。図１２Ｂは、自動化システムとマイクロ流体チップ間の便利なインタフェースを可能にするウェルプレートプラットフォームと同一寸法にカスタムデザインされたチップホルダ。図１２Ｃは、マイクロ流体細胞培養室で、ピペットチップ対がどのように試料／溶液を分注、抽出するかを示す略図。図１２Ｄは、試薬容器から固定化溶液を装填する４対のピペット。図１２Ｅは、自動化免疫染色の動作状態。図１２Ｆは、マイクロチップの高さが固定のマイクロ流体チップ作製用のカスタムデザインされた複製器。
【００７６】
本発明の実施の形態に係る自動化システムを使って、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号伝達経路のプロファイリング用の新規の免疫染色の手順を実施できる。画像取得および処理を自動化し、本マイクロ流体サイトメトリ技術用の試料作製、画像取得およびデータ分析を対象とする完全な解決法を提供することができる。
【００７７】
１ｂ）分子的に不均一な試料における場合を含む、ＰＩ３Ｋ信号伝達経路の主要なノードのマルチパラメータ測定を行う本技術のアプリケーション。本装置は、膠芽腫と明らかに密接な関係があるが、他の癌の分析についても非常に重要と思われる。上流信号伝達タンパク質−膠芽腫細胞のＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびＰＴＥＮの定量的単細胞検知：
膠芽腫細胞におけるＰＩ３Ｋ信号伝達のこれらの上流マーカを単細胞レベルで定量化する能力は、大きく進歩した。ここで、ＰＩ３Ｋ経路の複数の信号伝達タンパク質に対し同時に、高度に定量的な方法で、かつ単細胞レベルの解像度で、どのように定量的分析が行われるかを示す。さらに、このようなデータがフローサイトメトリと同様の方法で、分析でき、直接の比較を容易にし、そして分子標的治療の前後を含む複雑で不均一な混合物での信号伝達のプロファイリングの分析を可能にすることを示す。
【００７８】
図１３は、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＰＴＥＮの点で異なる６つの同系の膠芽腫細胞株のチップ上で行われた免疫蛍光染色を示す。図１４は、同じ試料に対して行ったフローサイトメトリと比較した定量分析を示す。図示のように、オンチップベースの本方法は、フローサイトメトリのように、単細胞におけるこれらの主要な上流マーカを特徴づけることができるが、必要とする細胞はかなり少ない。
【００７９】
図１３は、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびＰＴＥＮの膠芽腫細胞におけるＰＩ３Ｋ経路の上流マーカの、オンチップマルチパラメータ測定を示す。
【００８０】
図１４は、同一の細胞懸濁液をオンチップ法とフロー法とで並列に処理したＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ検知のフロー法とオンチップ法との比較を示す。オンチップ法の定量検知は、フロー法のものと一致し、しかも少ない細胞を必要とする。
【００８１】
図１５は、分子的に複雑で不均一な膠芽腫試料の単細胞におけるＰＩ３Ｋ信号伝達（ｐ−ＥＧＦＲ、ｐ−ａｋｔ、ｐ−Ｓ６）の定量測定を示す。６つの同系膠芽腫細胞株を複合混合物として一緒に培養し、その後、ＥＧＦＲ、ａｋ、およびＳ６リン酸化の発現をチップ上で分析した。データをフローサイトメトリの形式で描画した。表に見られるように、野生型受容体に比較し、ａｋｔおよびＳ６のリン酸化は、すべてのＰＴＥＮ欠乏細胞において比較的上昇しているが、構成的ＥＧＦＲのリン酸化は、発癌性変異ＥＧＦＲｖＩＩＩにより大きく強化されている。したがって、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現、ＰＴＥＮ欠乏細胞（青色点）、およびこの混合物の６分の１が、以前の結果（Mellinghoff 他、NEJM 2005）と一致してＰＩ３Ｋの信号伝達の最も活性化された細胞であること、ならびに分子的不均一な腫瘍試料を単細胞単位で測定可能であることが明確となった。
【００８２】
膠芽腫細胞のＰＩ３Ｋ経路の下流信号伝達エフェクタ  Ａｋｔ、Ｓ６の定量的単細胞検知：
構成的に活性化したＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現、およびＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子の欠乏が、ＰＩ３Ｋ信号伝達の構成的な活性化に関わることは知られている（Mellinghoff 他、NEJM 2005）。したがって、ＥＧＦＲｖＩＩＩが発現した、および／またはＰＴＥＮが欠乏した同一細胞内で、これらの信号伝達タンパク質が活性化されるべきことが期待される。よって、ＥＧＦＲｖＩＩＩが過剰発現し、ＰＴＥＮが欠乏した同一細胞内でのこれらの下流マーカをチップ上でさらに分析した。図１５に示すように、６つの同系膠芽腫細胞株を混合し（U87、U87-PTEN、U87-EGFR、U87-EGFR-PTEN、U87-EGFRvIII、およびU87-EGFRvIII-PTEN）、チップ上で分析し、そのデータをフローサイトメトリの形式で表した。ＥＧＦＲｖＩＩＩが発現し、ＰＴＥＮが欠乏した腫瘍細胞において見られるａｋｔおよびＳ６のリン酸化の測定により、ＰＩ３Ｋ信号伝達経路の構成的活性化が明確になっている。これらの結果は、複雑で不均一な腫瘍における固有で臨床的に関連する分子署名の識別が可能であることを実証している。
【００８３】
分子的不均一な膠芽腫試料におけるＰＩ３Ｋ信号伝達の測定：
膠芽腫がすべての腫瘍の中で最も分子的に不均一であることは長い間認識されており、よって多形性膠芽腫と呼ばれている。この不均一性は、単一腫瘍内における個別の細胞の顕著な表現型的および分子的変動性を称している。よって、本実施例の１つの目的は、これらの分子的に多様な個別細胞内での信号伝達経路を特徴付けるツールを開発することである。図１３〜図１６は、開発したマイクロ流体集積チップの細胞混合物におけるＰＩ３Ｋ信号伝達経路の主要タンパク質測定の能力を実証している。以下では、さらに、このオンチップ法が、膠芽腫内の個別の個体群の分別と、腫瘍内の「まれな」細胞内を含むそれらの信号伝達の特徴付けができるかを実証する。図１６では、２つの同系膠芽腫細胞型（U87-PTENおよびU87-EGFRvIII）を１：１の比で混合し、これらの個体群が識別できるか否かを、チップ上とフローサイトメトリで検査した。以下に見られるように、細胞の２つの明確な個体群が識別できる（図１６参照）。
【００８４】
図１６は、チップ上の分子的に不均一な個体群の特徴付けを示す。Ｕ８７−ＰＴＥＮおよびＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を、１：１の比で混合し、オンチップ（左表）とフローサイトメトリ（右表）とで検査した。図では、チップ上で分子的に不均一な試料を検知できることを明示している。
【００８５】
主要信号伝達マーカの発現に基づき、「まれな」細胞の個体群をチップベースで識別できるか否かを判断するため、Ｕ８７（９５％）とＵ８７−ＰＴＥＮ−ＥＧＦＲ（５％）を混合し、チップ上で個体群を検査した。図１６に示すように、まれな細胞の個体群を、個体群の７．４％（+/-２％）と測定し、検知することができた。これは、またフローサイトメトリの評価と一致していたが、必要な細胞の数はかなり少なかった（数千分の一ではなく、数十から数百分の一）。これにより、主要信号伝達または細胞表面マーカに基づいて、脳癌幹細胞のような、まれな細胞の下位個体群を識別できる可能性が出てくる。
【００８６】
図１７は、個体群内の「まれな細胞」のオンチップ検知を示す。Ｕ８７細胞（９５％）とＵ８７−ＰＴＥＮ−ＥＧＦＲ細胞（５％）の混合物をオンチップで分析した。図に示すように、まれな細胞の個体群を、７．４％（+/-２％）と測定し、検知することができた。
【００８７】
（個体臨床腫瘍試料からの主要信号伝達経路のマルチパラメータ測定）
単細胞分析の分野における進歩のほとんどは、白血病やリンパ腫のような非個体腫瘍によるもので、これらは特徴付けのための単細胞懸濁液に容易に解離することができる。個体癌に対する課題の１つは、個体腫瘍試料における信号伝達を特徴づけるのに、これらの技術に基づく方法を適合させることである。この領域において顕著な進歩を開始した。重要な中間ステップとして、C. David James氏（UCSF）およびJann Sarkaria氏（Mayo clinic）（Sarkaria 他、Mol. Cancer Ther. 2006）により、発現された頭蓋内異種移植継代ヒト膠芽腫の研究を始めた。これらのモデルは、通常の培養および異種移植では欠失する、ＥＧＦＲｖＩＩＩのような、膠芽腫の主要な特徴を保持する継代ヒト腫瘍からなる。このモデルは、手術室から直接持ち込まれたものと同じように、どの点から見ても個体の分子的に不均一な臨床腫瘍試料であり、このモデルを使用することにより、再生可能な臨床資源を使用する方法を最適化することができる。以下に、この領域における重要な進歩を明らかにする。これと並行して、組織培養（腫瘍の分子構成が著しく変化する）を必要とせずに、手術室からの個体腫瘍試料をチップに移行する調製技術の最適化を行った。この領域においても、腫瘍試料を直接チップに移行できる方法を開発し、著しい進化を遂げた。最大の障害は、個体チップ上に、細胞を「横たえる」ことであった。腫瘍細胞の信号伝達の特性を変えることなく、これを容易にする幾つかの方法を開発した。
【００８８】
（個体ＧＢＭ腫瘍試料におけるＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＰＩ３Ｋ信号伝達のマルチパラメータ測定）
個体臨床試料におけるＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＰＩ３Ｋ信号伝達の分析を開始するのに、James/SarkariaモデルシステムのＧＢＭ３９を使用した。腫瘍の個体片を入手後、コラゲナーゼおよび機械的手段で解離させ、チップ上に移行する連続する方法を最適化し、ＰＩ３Ｋ信号伝達の分析を行った。以下に、知る限りでは初めての、個体ＧＢＭ試料における単細胞でのＰＩ３Ｋ信号伝達経路の主要なノードの定量化を示す。データは、腫瘍ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現と顕著なＰＩ３Ｋ経路の活性化を示している（図１８参照）。
【００８９】
図１８は、個体臨床膠芽腫試料におけるＰＩ３Ｋ信号伝達の検知を示す。生体内継代ＧＢＭモデル（Sarkaria、およびJames、Mol. Cancer Ther. 2006）から抽出した臨床個体膠芽腫試料ＧＢＭ３９からの、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＴＥＮ、およびＳ６のリン酸化の発現（ＰＩ３Ｋ信号伝達の読みとして）を分析した。同時に、比較のために、Ｕ−８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＰＴＥＮおよびＵ８７−ＰＴＥＮも分析した。ＧＢＭ３９におけるＥＧＦＲｖＩＩＩの発現（左表）およびＰＩ３Ｋ信号伝達の活性化（右表）を示す。これは知りうる限り、固定ＧＢＭ試料におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびＰＩ３Ｋ信号伝達の単細胞の定量的測定の最初のものである。
【００９０】
主要信号伝達タンパク質の内在レベルの測定課題への対応−ＰＴＥＮ測定
抗体の一部においては、理想的な信号対ノイズ比をもたらさないという課題がある。ＰＴＥＮのような、比較的低い発現レベルの特定の内在タンパク質との組み合わせは、課題である。チラミドシグナル増幅戦略を適合させてＰＴＥＮ検知の信号対ノイズ比を増加させることにより、反応測定の多重化を継続しながらＰＴＥＮの内在レベルを検知することができた。図１９においては、この方法により、ＰＴＥＮヌルマウス胚性線維芽細胞（MEFS）におけるＰＴＥＮの発現を検知することなしに、ＰＴＥＮの過剰発現の状況のみでなく、内在ＰＴＥＮの発現においても、ＰＴＥＮ発現の検知と定量化をすることができたことを示す。これらのデータは、低レベルの内在タンパク質検知の測定における感度と特異度があるように見られることを示している。次の報告までの期間に、この方法をさらに改善する（図１９参照）。
【００９１】
図１９は、低レベルの内在タンパク質の検知を示す。チラミドシグナル増幅を使って、以下を測定することができた。ａ）ＰＴＥＮ過剰発現システムにおいて、Ｕ８７−ＥＧＦＲ−ＰＴＥＮ（左図）、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の低レベル内在ＰＴＥＮ（中図）、ＰＴＥＮヌルＭＥＦＳでのＰＴＥＮの欠如（右図）を示す。下図は、定量化されていないＰＴＥＮの発現を示す。
【００９２】
２．単細胞レベルでの癌の経路のさらなる評価技術の開発
ＤＮＡコード化抗体ライブラリ（DEAL）を、新規の細胞表面マーカの開発と共に使用して、単細胞集団の単離と強化の新規戦略を開発した。
【００９３】
２ａ）ＤＥＡＬ技術−ＥＧＦＲ発現に基づくＤＥＡＬベースの細胞分別の能力の実証
新規の細胞表面マーカのこの処理への組み込みを研究している。このＤＥＡＬ法への組み込みのため、フローサイトメトリ、およびウエスタンブロット法で立証された、新規の細胞表面マーカ群を開発した。
【００９４】
２ｂ）新規細胞表面タンパク質および分泌タンパク質の検知
２０の正常脳試料とＧＢＭ細胞内で高度に過剰発現しそうな見込みのある識別された細胞表面マーカに対し、臨床試料の広範囲な遺伝子発現データ（６３のＧＢＭ）を利用した。その後、ＧＢＭおよびグレードＩＩＩ神経膠腫患者の大規模集団での発現を分析し、ＧＢＭにおけるこれらのマーカのｍＲＮＡレベルの過剰発現（およびＧＢＭにおけるグレードＩＩＩ腫瘍に対するそれらの顕著な過剰発現）を確認した。その後、ＧＢＭ細胞株において、さらに検視が行われた患者からの一連の膠芽腫／正常細胞の整合対において、それらのタンパク質レベルの発現を検査した。その後、これらのマーカとＥＧＦＲ／ＰＩ３Ｋ信号伝達軸との関連の可能性を体外で分析した。今日まで、ＰＳＣＬＲ１、ＣＸＣＲ４、およびＰＴＲＰＺ１（分泌タンパク質とも識別される−以下方法２参照）を含む１０個の見込みある細胞表面マーカを確認した。
【００９５】
２ｃ）新規分泌タンパク質の特定と検証
非腫瘍患者に対する膠芽腫患者からの脳組織試料の識別的遺伝子発現の広範囲なＭＰＳＳデータ分析により、膠芽腫脳細胞において特異的に発現される約５０００の遺伝子が見つかった。脳内でその発現が比較的高められた３８の遺伝子を、膠芽腫の血液診断の生物指標化合物の候補として、膠芽腫患者からの血清試料のスクリーニングの標的に選択した。ＩＳＢで開発されている質量分析ベースの標的プロテオミクス法では、血清試料からのタンパク質を、まずペプチドに消化し、ｉＴＲＡＱ（Applied Biosystems社）という安定した同位体標識化試薬を使ってＮ末端ですべてのペプチドを標識化した。４つの異なる試料にわたる何百ものタンパク質の相対存在量の測定のために、４つまでの試料からのペプチドをｉＴＲＡＱ試薬で特異的に標識化することができる。試料の複雑さによる血清の質量分析におけるタンパク質の低相対存在量の定量化における困難さを克服するために、２つの技術が使われた。（１）いくつかの主だった血清タンパク質を免疫親和性に基づく減少法によって除去し、（２）３８の血液タンパク質マーカ候補から８４のペプチドを安価に合成し、それをｉＴＲＡＱ試薬の１つと混合し、さらに正常および腫瘍患者からの２つのペプチド試料を他の２つのｉＴＲＡＱ試薬で標識化することにより、ｉＴＲＡＱ標識化混合物内の選択されたペプチドの総量を増加することで、質量分析計における低存在性のペプチドの検知を高めることができる。この実験のデータは、現在分析中である。この補足として、２５組の腫瘍正常脳整合対の試料を単離し、特異的発現タンパク質の質量分析でのスクリーニングを開始している。
【００９６】
２ｄ）新技術の分子標的臨床試験への統合
現在、ＶＥＧＦ阻害剤アバスチン（Avastin）（ＣＰＴ−１１との組み合わせで）で治療中の患者での臨床試験中である。アバスチンが、再発性の悪性神経膠腫の患者に対する腫瘍進行時間を、その中央値の５６日（９５％ＣＩ＝４９−９７）から２０９日（９５％ＣＩ＝１２２−２７２）にと４倍に、全生存期間をその中央値の１８４日（９５％ＣＩ＝１７１−２２５）から３４０日（９５％ＣＩ＝２５１−４２４）にと２倍近くにすることを実証できる。アバスチンの明らかな臨床有効性が、悪性神経膠腫患者の治療の基準を変えるのは間違いなさそうである。さらに、多数の明確な臨床奏功者（非奏功者も）を有し、診断時に得た凍結組織（パラフィン組織も）、臨床反応があったがその後の治療が奏功しなかった患者の小集団の凍結組織、ならびに治療前、臨床反応中、および治療が奏功しなかったときに得た血清を共に有するので、この薬剤に対する反応への分子決定基の特定、および効果的な標的組み合わせの特定をするための優れた組織的な分子的／臨床的資源となる。多数の明確な臨床奏功者（非奏功者も）を有し、診断時に得た凍結組織（パラフィン組織も）、臨床反応があったがその後の治療が奏功しなかった患者の小集団の凍結組織、ならびに治療前、臨床反応中、および治療が奏功しなかったときに得た血清を共に有する。以下の課題に対処する。１）血管分布の増大がアバスチンに対し臨床反応しやすくするか（これは、UCLAの著名な血管形成の専門家であるLuisa Iruela-Arispe博士と協働で行う）、２）ＶＥＧＦで調節された下流信号伝達経路が反応中に再活性されるか、またどの機構によるものか。ＶＥＧＦの発現を促進する主要な経路（例、ＥＧＦＲ／ＰＩ３Ｋ信号伝達）により駆動された腫瘍は、アバスチンに対しより敏感か？これらの特定の仮説の考査に加えて、広範囲なスクリーニング戦略を適用する。これには、感度と耐性に関連した（Mellinghoff博士によりMSKCCにて行われる）、および広範囲の遺伝子発現データと統合（UCLAおよびMSKCCにて行われた）された関心染色体領域を検知するアレイＣＧＨが含まれる。さらに、NanoSystem Biology Cancer Centerを介し、Lee Hood博士との協働で、血清試料における何千のタンパク質の定量的検知を容易にする表面プラズモン共鳴の使用を開始した。これにより、感度および後天的耐性に関連するタンパク質署名を特定することができる。
【００９７】
３．新規ＧＢＭ標的特定へのシステム生物学方法
３ａ）Ｓｒｃファミリキナーゼの標的化：
ＥＧＦＲ／ＰＩ３Ｋ信号伝達の標的化は、膠腫芽に対する分子標的療法の有効性の可能性の原理の証明をもたらす。新規の薬物標的の特定は、次の重大なステップである。膠腫芽における新規分子標的を特定するシステム生物学方法を開発、適用した。ＧＢＭ試料からの広範囲な遺伝子発現データと分子間相互作用のデータベースとを統合して標的化できる可能性のある経路を特定することにより、膠芽腫の分子標的として、Ｓｒｃファミリキナーゼ（SFK）のＦｙｎ、Ｌｙｎ、およびＳｒｃを特定した。臨床膠芽腫試料からの広範囲なトランスクリプトームデータを利用することにより、Ｓｒｃファミリキナーゼ（SFK）のＳｒｃ、Ｆｙｎ、およびＬｙｎを主要な分子標的として特定、正当性を検証した。これらのキナーゼが、５０％までの膠芽腫患者において過剰発現され、永続的にリン酸化されることを、膠芽腫の湿潤にはＳＦＫが必要かつ十分な条件であること、また、小分子阻害剤ダサチニブ（抗イマチニブ（imatinib）CML患者に安全に投与される化合物）が膠芽腫の湿潤を阻害し、腫瘍の退行およびアポトーシスを促進し、さらにマウスモデル生体での生存を大いに改善することを立証したこと、というｓｉＲＮＡ、小分子阻害剤および過剰発現の両者の研究を使って実証した（図２０参照）。
【００９８】
図２０において、ＳＦＫは、ＧＢＭにおけるダサチニブ敏感分子標的である。図２０Ａ、Ｂ）５０％までのＧＢＭにおいて、ＳＦＫのリン酸化の高揚が見られる。図２０Ｃ、Ｄ）ダサチニブ療法による短期のウィンドウ（灰色部分）が腫瘍の退行（光学発光イメージング法による測定で、David James博士との協働）を引き起こし、生体での頭蓋内異種移植継代ヒトＧＢＭモデルでの顕著な改善している。図２０Ｅ、Ｆ）ダサチニブが、生体での、ＳＦＫのリン酸化を阻害し、アポトーシスを促進している。
【００９９】
３ｂ）生体でのｍＴＯＲ仲介の阻害の研究：
ＰＴＥＮ欠損膠芽腫再発の患者に対するｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの臨床試験を行い、感度と耐性の主要決定因子を特定した（Cloughesy 他、PLoS Medicine、近刊）。１）ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンが、生体での、腫瘍組織内に治療の可能性のあるレベルで存在すること、２）ラパマイシンが、阻害の程度は異なるものの（１０％〜８０％の経路阻害）すべての患者においてｍＴＯＲの信号伝達を顕著に阻害すること、３）経路阻害の程度が重大であること、を明らかにした。５０％を超えるｍＴＯＲ経路の阻害は、増殖を顕著に阻害した。低レベルのｍＴＯＲ阻害は、生物学的または臨床的反応には変わらなかった。さらに、それが細胞の内因性の耐性によるものではなく、生体での薬物のその標的への完全アクセスの失敗に関連することを明らかにした。さらに、成長阻害と臨床反応の持続との関係を研究し、Ａｋｔ仲介フィードバックループが患者を半分近くにする証拠を見出した。このＡｋｔ仲介フィードバックループは、後天的臨床耐性と強い関連性があった。これらの発見は重要な意味を持っている。第１に、将来的な臨床試験において、臨床活性を解釈するために、膠芽腫患者における標的阻害を十分に記録する方法の開発が重要であることを意味している。第２に、これらの発見は、ＥＧＦＲ／ｍＴＯＲの組み合わせによる阻止の有用性をさらに示している（上記Ｉ．２．項で提案するように）。第３に、Ａｋｔ仲介フィードバックループのデータが、この経路のより良い阻害、および上流フィードバックループの抑制のために、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの組み合わせによる阻害の重要性を示唆している。これらの見識は、一連の臨床試験において、間もなく実践される（ＥＧＦＲ／ｍＴＯＲ阻害剤に加えて）（図２１参照）。
【０１００】
図２１は、膠芽腫患者におけるｍＴＯＲ阻害剤の効果の測定方法の開発、およびフィードバックループを促進する耐性の実証を示している。図２１Ａ）ラパマイシン治療前後の患者におけるバイオマーカを比較する画像分析方法を開発した。図２１Ｂ）この免疫組織化学法は、従来の生物化学で実証される。図２１Ｃ）生体での、ラパマイシンによる膠芽腫患者のｍＴＯＲの顕著な阻害と、図２１Ｄ）Ｋｉ６７での測定により、腫瘍細胞の増殖の阻害を示している。図２１Ｅ）ラパマイシン療法が、小集団の患者において、Ａｋｔを介するフィードバックループを活性化しており（ＰＲＡＳ４０バイオマーカでの測定）、この活性化が顕著に短期間な進行につながっている。
【０１０１】
３ｃ）生体ＥＧＦＲｖＩＩＩの測定
変異ＥＧＦＲｖＩＩＩの高信頼性な検知をするための核酸ベースの新規の方法を開発した（Yoshimoto 他、Clinical Cancer Res. 2007、近刊）。前に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（無傷ＰＴＥＮの状態で）が、膠芽腫をＥＧＦＲ阻害剤に感作すること（Mellinghoff 他、NEJM 2005）を示した。また、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ性ワクチンに対し、独自の抗原性標的を示す。よって、臨床試料における検知が保証されうる。しかしながら、凍結組織、特に類似性の療法患者のものが、常にある訳ではない。したがって、ホルマリン固定のパラフィン包埋（FFPE）臨床試料からのＥＧＦＲｖＩＩＩの検知は大きな課題であった。感度９２％で特異性９８％の通常処理されたホルマリン固定、パラフィン包埋の膠芽腫生検試料からのＥＧＦＲｖＩＩＩのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を開発した。この分析は、膠芽腫患者におけるＥＧＦＲｖＩＩＩの変異検査の拡大を容易にするため、どこの病理学研究所でも簡単に入手できるようになる。
【０１０２】
Ｂ）さらなる実施の形態
Ｂ．１：マイクロ流体分析の拡張
本発明の実施の形態によれば、膠芽腫の主要な信号伝達経路のオンチップ分析の拡張を継続することができる。さらに、信号伝達タンパク質の数を現在の測定よりも増やし、オンチップでのＧＢＭ細胞の混合群を含む信号伝達変換経路阻害剤の効果の研究能力を評価し、上述の細胞表面分別方法を使ったこれらのチップを集積することができる。患者からの新鮮腫瘍試料により、分子不均一性の定量化、および試料のオンチップ培養の最適化する方法の最適化のさらなる研究を始められる。
【０１０３】
Ｂ２：通常処理された臨床試料（凍結臨床試料についても）での主要な信号伝達経路の検知の最適化
個体臨床試料のマルチパラメータ測定の最適化のために、これを個体臨床腫瘍試料に適用することができる。それが信号伝達状態とこれまでに行われた臨床試験での標的療法の反応とを相関させることができるので、以前に凍結された試料、特に分子に基づく臨床試験の患者からのものを検査する方法の開発を目標とすることもできる。
【０１０４】
Ｂ３．分子不均一性が全体的なものか局所的なものかの評価
膠芽腫細胞内の分子不均一性の範囲は認識されたが、厳密な研究は行われていない。実際、腫瘍内の局所の不均一性が腫瘍全体を表すものか、または腫瘍の分子の完全な特徴付けには空間的に分散された生検が必要なのかは不明である。この課題への答えには、耐性を抑制する患者への合理的な療法の組み合わせを設計するうえで、明らかな重要性がある。これらのツールの開発が、この課題解決を容易にする。
【０１０５】
Ｂ４．単細胞レベルでの癌の経路：
ＤＥＡＬ法を、上記の細胞表面タンパク質への抗体を使って拡張することができる。さらに、これらのＤＥＡＬ法をマイクロ流体ベースのチップにも頭語できる。
【０１０６】
Ｂ５．新規血清マーカの開発：
ＵＣＬＡ、ＩＳＢおよびＣＩＴのグループは、可能性のある血清マーカのリストを統合してもよい。ＵＣＬＡおよびＩＳＢの両者は、腫瘍の試料と共に、血清試料を入手でき、こちらはＩＳＢベースの方法を使って、可能性のある血清タンパク質の大規模な分析を行うことができる。
【０１０７】
Ｂ６．細胞表面マーカのさらなる特定と実証：
一覧にある可能性のある細胞表面マーカの発現の分析を継続し、これらのマーカによる分別（ＤＥＡＬおよびフローベース）が表現型および生化学的特性の異なる（および感度のパターンおよび標的試薬への耐性が異なる）ＧＢＭ細胞の個体群を特定するか否かの判断を開始することができる。
【０１０８】
（実施例Ｃ：）
（病理学の現行モデル）
癌の病理学分析の現行モデルは、癌細胞の推定起始細胞、またはその発育上の前駆細胞との微視的類似性に基づいている。いくらかのタンパク質マーカの存在または不在とともに、組織の形態学上の外見に基づき、病理学者は、腫瘍の型とグレードを伝える広範な病理学的診断を判断する。一般的に、患者は、ＤＮＡ損傷する薬剤や放射線療法などの比較的毒性があり、非特異療法の治療を受ける。この分類および関連するグレード付けのシステムは、患者群の全体的な生存の予測、および疾患分類２４−２９の広範な情報の伝達においては有用であると証明されているものの、内在する分子経路の病変３０については比較的限定された洞察しか得られない。また、臨床的に関連する小集団は時間的経過において顕著に異なるとともに、療法に対する反応を現行の分類システムでは観察することができない。癌診断における「究極の判断基準」と考えられている従来の病理学的検査は、形態学に基づく系統型の区別が内在する分子ネットワークについての情報を明らかにしないので、分子標的な方法にとっては適切ではないかもしれない。
【０１０９】
癌は、分子の不均一性の疾患である３１−３５。過去１０年で、組織学的に同一な型の腫瘍に内在する分子の病変が全く異なることが明確に実証されている。さらに重要なことは、組織学的に同一の型の癌患者が、患者の腫瘍の分子構成によって療法に対しまったく異なる反応をし得るということである。例えば、小個体群の腫瘍による癌再発の主要な推進力であろう幹細胞の再増殖という、個別の腫瘍内における顕著な分子不均一性の新たな証拠がある。腫瘍の個別細胞内の信号伝達ネットワークをマルチパラメータで測定するための堅牢な定量化ツールの開発に対するかなりの需要がある。すべての癌の型は、それぞれの疾患が独自の分子署名を有する１組の疾患に階層化されることがはっきりしている。これらの関連する腫瘍の小個体群は、通常微視的には同一なので、従来の病理学的検査では区別することができない。
【０１１０】
標的療法の出現は、種々の特定標的薬物（例、キナーゼ阻害剤３６）の開発につながり、さまざまな型の癌において広範囲な成果を実証６、３７−４２している。標的療法の実施には、癌の悪性形質転換の原因となる的確な信号伝達経路に関連する疾患標的の特定、および定量化の新規の分子診断方法を必要とする。分子分析の従来の技術（例、ウエスタンブロット法）においては大量の組織を必要とすることが、動的な単細胞での特徴付けの制約となっていた。分子分析における重大な課題の１つが、分子的に多様性のある細胞内の信号伝達経路の単細胞精度でのマルチパラメータ測定である。
【０１１１】
（癌病理学へのシステム手法）
（癌は複雑な病気）
全く同一な個別腫瘍は２つとしてない。分離した個別の遺伝子またはタンパク質の分析は、癌の診断および治療の重要な飛躍的な進歩を生むようではない。これとは対照的に、癌に対するシステム生物学的手法４３、４６は、癌の創発特性（例、増殖能、湿潤能、治療阻害剤への耐性）の原因となるタンパク質、ならびに遺伝子「モジュール」およびネットワークを明らかにすることを目的としている。システムの主要な要素間の関係についての情報を取り込むことにより、高度に個別な癌間の共通性を理解し、標的化することができる。
【０１１２】
（複雑な入力の統合）
システム手法は、入力として、現象学的情報と共に、できる限り多くの遺伝子およびタンパク質発現の分子署名を得ることと、図解モデルを使ってそれらをネットワークに統合することを伴う。より多くの入力が統合されると、ネットワークの構造が精緻化され、システムがどのように動作するか（または、癌の場合は、どのように失敗したか）の仮説を生み出すことを可能にする。その後、これらの仮説は、一連のシステマチックな摂動の実行とネットワークの効果の測定（および成長、湿潤、治療に対する反応などの表現型の特性）により、動的に検証することができる。これにより、仮説の修正が可能になり、さらなる検証と精緻化が行われる。システムのより完全で分子的な「スナップショット」が可能で、このハイコンテントな情報は、新規の診断および治療ツールに変換され、癌の病理学的診断を再定義することになる。
【０１１３】
（癌に対するシステム手法への新規技術の必要性）
現行の技術では、真にシステムレベルでの癌の評価はできない。しかしながら、これら一連の分子およびナノテクノロジは、最先端の新しいものであり、システム生物学研究所に統合されつつある。本書に記載のマイクロ流体画像サイトメトリ（MIC）技術の開発および検証、主に、診断にシステムレベル手法を取り入れたものは、癌細胞および癌組織の新しいタイプの病理学検査を容易にするであろう。
【０１１４】
（癌の重要標的なＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路）
ＰＩ３Ｋ４７は、細胞増殖、生存および運動性を含む多様な生物学的機能を促進する脂質キナーゼである４８−５１。ＰＩ３Ｋの信号伝達経路は、増殖、成長、アポトーシス、細胞骨格再構成などの、さまざまな細胞プロセスを調節している。ＰＩ３Ｋの信号伝達経路は、大多数のヒト癌タイプにおいて、大抵、ＥＲＫ経路と組み合わされて５４−５６、頻繁に脱制御される５２、５３。ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路５７−６１（およびＲＡＳ／ＥＲＫ経路６２、６３）は、膠芽腫に一般的にみられる癌遺伝子の活性化および腫瘍抑制遺伝子の欠失６４−６６に基づいて、脱制御されることができる。大部分の癌細胞タイプは、ＰＩ３Ｋの信号伝達の負の調節役であるＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子の変化物７−９を含み、それによってＰＩ３Ｋの経路の構成的活性化が起こる６７。ＰＩ３Ｋの上流の上皮成長因子受容体（EGFR）は、一般的に過剰発現し３９、６４、６８−７１、頻繁にその構成的に活性化されたＥＧＦＲｖＩＩＩの変異体（および他の変異体）と関連し７１−７５、大抵、ＰＩ３ＫおよびＲＡＳ／ＥＲＫの信号伝達の脱制御につながっている６２。ＰＩ３ＫおよびＲＡＳ／ＥＲＫの経路は、他の信号伝達カスケードと十分に接続しており、これにより、他の細胞表面イベント、ストレス活性化経路、および細胞外マトリックスタンパク質に関連する信号伝達を統合している。明らかに、ＰＩ３ＫおよびＥＲＫの信号伝達経路、および関連する信号伝達分子は、重要な治療標的である。
【０１１５】
（フローサイトメトリによる信号伝達プロファイリング）
フローサイトメトリ７６−７９は、個別癌細胞内の信号伝達イベントの追跡および分析が可能である。個別細胞の複数の特性を定量化するというフローサイトメトリ特有の能力は、不均一混合物におけるそれぞれの細胞の情報を提供することができる。細胞は、さまざまな試薬によるアクセスを可能にするために、通常、固定化されて透過化される。関心信号伝達分子を有する細胞は、タンパク質の識別に特化されたフルオロフォア接合抗体を使って検知される。フローサイトメトリデータの単細胞解像度とマルチパラメータ性は、癌細胞と非腫瘍細胞とを区別する署名を提示することができる。検知のために細胞を解離しなければならないため、フローサイトメトリは主に血液癌の研究に用いられている８０、８１。個体腫瘍からの「付着性の」腫瘍細胞は、フローサイトメトリ測定の前に、解離、または分離されなければならない。この方法では、細胞の信号伝達経路が乱される可能性があり、誤測定となり得る。フローサイトメトリにおける根本的な限界は、細胞試料の必要数が大きく（１０６台）、針生検や他の低侵襲な生体標本技術とのインタフェースができないということである。
【０１１６】
（集積マイクロ流体システムと「チップ上の研究室」の開発）
マイクロ流体システムは、試料の経済性、正確な流体搬送、拡張性、およびデジタルでの制御性を含む多くの本質的な利点８２−８７から、腫瘍試料を取り扱うのに理想的なプラットフォームである。マイクロ流体装置で細胞培養および細胞分析を行うことができる７２、８８−９７。複数の培養室を１つのチップに組み込むことができ、これにより、高忠実度なマルチパラメータでの分析ができることになる。マイクロプレートベースの細胞培養システムと違って、マイクロ流体チップは、生体の微環境をより良く模倣する３次元の細胞培養環境を提供する。制御された双方向の流量は、生物学的分析の忠実性を改善する。この分野における研究者としては、スタンフォード大学（Stanford）のSteven Quake博士、カリフォルニア大学バークレイ校（UC Berkeley、UCB）のLuke Lee博士、およびウィスコンシン大学（University of Wisconsin, Madison）のDavid Beebe博士が挙げられる。Quake博士は、哺乳類細胞の長期培養７２およびバクテリアの極小個体群の単細胞レベルでの観察９８のためのマイクロ流体生物反応器を実施した。哺乳類細胞および酵母のマイクロ流体細胞培養装置９８−１０２は、ＵＣＢにて開発され、現在は商品化されている。Beebe博士は、拡散律速混合およびマイクロスケールに特有な他の現象を利用し、チップ上に興味深い細胞微環境を実現９６、１０３、１０４した。研究分野は高度に開発され、「チップ上の研究室」装置が、経済的および解決策ベースの主導権による後押しがありさえすれば、進歩が切望される他の停滞した、または非常に複雑な研究分野への加速化に確実に利用される段階に近づいていると特徴付けられる。
【０１１７】
（マイクロ流体画像サイトメトリ：革新的技術プラットフォーム）
本発明の実施の形態に係るマイクロ流体画像サイトメトリ（MIC）技術は、定量的なマルチパラメータでの免疫細胞化学（ICC）を、優れた精度とデータ忠実性で行うことができる。応用における目的は、悪性の癌への形質転換の原因となる癌の信号伝達ネットワークと関連するバイオマーカの一群を検知することである。分子署名の結果は、より良い癌診断と標的治療の実施の手助けとなることができる。ＭＩＣプラットフォームは、（i）原発性癌細胞の培養の支持をする経済的なＰＤＭＳ系のマイクロ流体細胞配列チップ、（ii）細胞播種／培養およびＩＣＣを行う半自動式ピペット、または自動化ピペット、（iii）関連データの取得（蛍光顕微鏡法）システムに、臨床癌応用に適した拡張性のあるハイコンテント分析用の高機能ソフトウェアをプラスしたもの、の３つの機能モジュールを統合している。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲおよびＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＡＲＫの両信号伝達経路における６つのバイオマーカ（ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ｐＳ６、およびｐＥＲＫ）の発現／リン酸化レベルを同時に測定する一連の手順が確立されている。一次性腫瘍組織からの不均一性細胞個体群のマルチパラメータな信号伝達プロファイリングが可能になっている。外部刺激（例、薬物および成長因子）に曝された際の癌細胞における信号伝達イベントの動的な変化を追跡するＭＩＣ技術の能力を実証した。さらに、例えば、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲおよびＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＡＲＫ経路間のクロストーク、ならびにｍＴＯＲ、ＩＲＳ１およびｐＡＫＴに関わるフィードバック相互作用などの１つの経路を超える信号伝達イベントの検知ＭＩＣ技術を応用している。ＭＩＣ技術の特徴を以下に要約する。
【０１１８】
１．体外分子診断化
ＭＩＣ技術は、マイクロ流体の利点（すなわち、試料の経済性、速度、拡張性、自動化、および再現性）を、臨床病理学者による個別の癌の分子レベル、および最終的レベルでの特徴付けを容易にするソリューション型のパッケージとした。患者の癌細胞における単細胞の信号伝達プロファイリングのコンセプトの先駆者である。
【０１１９】
２．顕著な試料の経済性
ウエスタンブロット法やフローサイトメトリのような、生物学および臨床検査室でのタンパク質の定量化の一般的に使われる技術では、１つの測定に、少なくとも１０４個の細胞を必要とする。ＭＩＣ技術では、１．０マイクロリットル以下の培地での２００個のみの細胞を使って、４つの信号伝達分子を定量化することができる。ウエスタンブロット法やフローサイトメトリに比べ、ＭＩＣ技術における抗体の消費量が劇的に削減されている。ＭＩＣ技術における試料の経済性は、量が限られ、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリ、ＩＣＣ、および免疫組織化学では分析できない、病理学上および細胞学上貴重な試料の分析との完全な結合を可能にする。ＭＩＣデータの単細胞解像度およびマルチパラメータ性は、癌細胞の信号伝達署名を非癌細胞から明確に区別することにより、細胞および腫瘍不均一性の問題に対処し、競合技術の能力を遥かに上回ることになる。
【０１２０】
３．費用効率の高い運用と導入の容易さ
半自動式のＭＩＣ測定を行う費用は、かなり低い。この生産戦略は、高付加価値の市場において非常に優位性があり、ＭＩＣチップの低価格化につながる。中間の自動液体処理ソリューションは、高いスループットを達成するために、比較的低い投資コストで取得することができる。蛍光サイトメトリ画像は、ＣＣＤカメラと標準的なフィルタセットを搭載したほとんどの蛍光顕微鏡から取得される。
【０１２１】
４．細胞分別能力のアドオン
専用チップ生産戦略は、機能表面のＭＩＣチップ基板への好都合な組み込みを可能にする。例えば、オンチップの細胞捕捉機能を達成するために、癌細胞表面マーカに特化したビオニチル化およびＤＮＡ繋留された抗体の不動化を可能にするストレプトアビジン被覆またはＤＮＡ配列をＭＩＣチップ上に盛り込むことができる。癌細胞の小集団の複雑な信号伝達プロファイリングは、先ず、オンチップでの細胞分別を行い、それに続く一群のバイオマーカに対するＭＩＣの信号伝達プロファイリングを行うことにより可能である。
【０１２２】
５．大規模集積
ＭＩＣ技術は、高スループットで細胞培養および分析を達成できる。限定するものではないが、癌細胞株および胚性幹細胞を含む、種々の哺乳類細胞タイプを室内で培養することができ、細胞の処理および調製ステップを統合および自動化することにより、複数の孤立した実験、または並列な、または二重の実験を可能にする。ＭＩＣ技術は、再現可能なハイコンテントなデータおよび定量分析を出力することができ、それを大規模な薬物スクリーニングの適用に利用することができる。
【０１２３】
（実験研究と成果）
マイクロ流体画像サイトメトリ（MIC）は、自動化されたピペット（試料調製と免疫組織化学を行う）のマイクロ流体細胞配列８８、８９と、自動化された蛍光顕微鏡（画像取得と分析）とを統合している。ＭＩＣ技術は、少量のみの生物学的試料を使って信号伝達ネットワークにおける複数タンパク質の検知する定量的で再現可能な免疫組織化学（ICC）を行うのに使われている。多数の膠芽腫細胞株が、遺伝子操作されたおよび原発膠芽腫細胞と共に、ＭＩＣ技術の検証に使われた。受容体チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ホスファターゼ（ＰＴＥＮ）およびリン酸化タンパク質（ｐＡＫＴ、ｐＳ６およびｐＥＲＫ）を含む、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲおよびＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＡＲＫ経路の両者に関連する６つの信号伝達タンパク質の発現／リン酸化レベルは、単細胞精度で並列に定量化することができる。特に、外部刺激（例、成長因子およびキナーゼ阻害剤）に曝された際のこれらのタンパク質の動的な変化を動力学的に観察することができ、膠芽腫細胞が薬物治療の組み合わせにどのように反応するかをより良く理解する有効なツールを提供することになる。並行して、Wu博士の研究グループが、ＰＴＥＮ制御された腫瘍発生の分子機構を研究している。ＰＴＥＮは、２番目に最も頻繁に欠失するヒト腫瘍抑制遺伝子１１−１３、１９、２０である。ＰＴＥＮの変異は、３つの常染色体優性腫瘍素質症候群の原因とも見られている。Wu博士の研究室では、経路分析のための種々の同系の細胞株、およびマウスのＰＴＥＮ制御された腫瘍発生に内在する分子および遺伝子機構を理解するための生体腫瘍モデルを生成し２２、１０７−１０９、Mischel博士の臨床病理学的専門知識が、ＭＩＣ技術を臨床応用への橋渡しをする。
【０１２４】
（半自動式ＭＩＣ技術）
ＭＩＣ技術の実施の形態（図２２）は、ＰＤＭＳ系のマイクロ流体細胞配列チップ、細胞播種／培養および免疫組織化学（ICC）を行うための半自動式ピペット、自動化機構顕微鏡および画像取得と分析の関連ソフトウェアを有する。細胞配列チップは、ソフトリソグラフィ技術とそれに続く未硬化のＰＤＭＳ膜を使った酸素プラズマ接合または直接装着を使って製造されている。典型的な細胞配列には、２４の細胞培養室（寸法が７０００μｍ（長）×１０００μｍ（幅）×８０μｍ（高）で、総容積が５６０ナノリットル）がある。細胞のタイプにより、１つの細胞培養室には、およそ２００から２０００の細胞を収納することができる。室のいずれかの端に位置する１組の注入と抽出のチャンネルがあり、培養細胞への培地および試薬の搬送を可能にしている。半自動式ピペットは、注入口に直接挿入され、試料／溶液量および流量が精密にデジタル制御される。概念実証の検証においては、過剰発現した信号伝達タンパク質を有する親細胞および遺伝子操作された細胞（Ｕ８７、Ｕ８７−ＰＴＥＮ、Ｕ８７−ＥＧＦＲ、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＰＴＥＮ）を含む遺伝子的および生物化学的に定義された膠芽腫細胞を、原発腫瘍組織とともに検査し、本実施の形態のＭＩＣ技術の検証を行った。実験中、細胞配列は加湿した培養器（５％ＣＯ２、３７℃）に置かれた。ＰＤＭＳはガス透過可能であり、培養器環境と室内の細胞培養基との迅速なガス交換が可能である。
【０１２５】
図２２は、マイクロ流体画像サイトメトリ（MIC）の概要を表している。図２２（ａ）患者から得た解離された膠芽腫細胞を、ＭＩＣ技術によるマルチパラメータ分析用のマイクロ流体細胞配列チップに取り込む。図２２（ｂ）半自動式ピペットが細胞播種／培養とＩＣＣを実行する。図２２（ｃ）チップ内のＩＣＣ処理された試料を蛍光顕微鏡に装着して画像の取得、およびそれに続く画像サイトメトリプログラム（即ち、MetaMorph、Molecular Devices Inc.社）を使った分析をし、単細胞の解像度で信号伝達タンパク質の発現レベルの定量化を行う。
【０１２６】
（オンチップ細胞培養条件と細胞成長の定量化の最適化）
本発明の実施の形態に係る細胞配列チップを使って、チップ培養細胞を維持する最適な表面被覆、および細胞給餌スケジュールを決定した。ガラス／ＰＤＭＳ基板上へのポリ−Ｌ−リシン（PLL）被覆が、親細胞および遺伝子操作されたＵ８７細胞株に最適であった。膠芽腫患者組織から解離した初代膠芽腫細胞の維持には、ガラス／ＰＤＭＳ表面へのマトリゲル（Matrigel）の層ごとの被覆方法を開発した。さらに、１２時間から３６時間の範囲の給餌周期で、少なくとも１０日間の再現可能な膠芽腫細胞の増殖を確認した。生死判別試験（例、Calcein AMまたはMitoTracker Red、Invitron社）により、装置内の細胞の生死が示される。ＧＢＭの成長度は、細胞の数を異なる時点で数えて定量化した。他のマイクロ流体細胞培養の設定では細胞増殖の阻害が報告されている１０３が、細胞配列チップでの膠芽腫細胞の成長度は、従来の培養皿で見られるものと同程度であった１１０。また、新鮮解離／遊離細胞を細胞配列チップの基板上に固定化する種々の直接付着手法を開発した。組織接着タンパク質（Cell Tak（商標））の層を堆積させ、懸濁液からの細胞を固定化して新鮮解離細胞のＭＩＣ測定をすることができた（図２６、図２８参照）。また、ストレプトアビジンおよびＤＮＡ被覆を細胞配列チップの基板上に施し、ビオチニル化およびＤＮＡ繋留捕捉剤（例、抗体）が表面固定化されて細胞分別が容易になるようにした。
【０１２７】
図２６は、ＭＩＣ技術を使った並列信号伝達プロファイリングを示している。４つの個別の細胞株（左図、Ｕ８７（緑）、Ｕ８７−ＥＧＦＲ（青）、Ｕ８７−ＰＴＥＮ（黄）、Ｕ８７−ＥＧＦＲ／ＰＴＥＮ（ピンク））、およびそれらの混合物（右図）を使って、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、およびｐＳ６を含む４つの信号伝達分子を並列に検知し定量化することができた。２つの異なる条件（例、ＭＩＣチップ内での細胞拡散前（下図）と細胞拡散後（上図））でＭＩＣ測定を行った。個別細胞株および細胞混合物の５彩免疫染色（ＤＡＰＩ、抗ＥＧＦＲ（Cy7）、抗ＰＴＥＮ（TRITC）、抗ｐＡＫＴ（Cy5）、抗ｐＳ６（FITC））多重顕微鏡画像（中央）を得た。画像サイトメトリ分析後、３次元散布図を使い、４つの異なるタイプの細胞が空間上に４つの明確なグループとして実質的に分析されるという、このマルチパラメータ分析の力を示した。細胞の混合物の測定（右図）は、個別の測定（左図）で得られた結果を再現している。
【０１２８】
図２８は、２つの異なる視野の３次元散布図を使い、ＭＩＣチップで分析した脳腫瘍試料の細胞不均一性を表している。青円（正常神経細胞）、赤円（単一病変脳癌細胞）、緑円（二重病変脳癌細胞）の３つのタイプの細胞が識別できる。
【０１２９】
（過剰発現したヌル細胞を使ったチップベースの免疫サイトメトリ（ICC）の定量化分析）
一般に、ＩＣＣでは細胞内の特定のタンパク質分子を認識するために、種々のフルオロフォア標識化された抗体が使われる。抗体試薬が高価格であるため、従来の巨視的レベルでのパラメトリック分析の最適化（試薬濃度、手順など）は現実性がない。その結果、ＩＣＣ手法は、細胞内の標的タンパク質の存在／不在のみを検査し、ＩＣＣ処理された試料の蛍光信号は標的タンパク質の絶対的定量を反映するものではない。ＭＩＣ技術の基礎は、徹底的に最適化された手順で築かれており、高信頼度で再現可能なＩＣＣを保証する。広範囲にわたるタンパク質の発現／リン酸化レベルの測定精度を達成するために、それぞれの抗体に対するＩＣＣ手順の系統的最適化を行った。ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路に関連する５つの関心信号伝達タンパク質、即ち、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、およびｐＳ６を、Ｕ８７対Ｕ８７−ＥＧＦＲ、Ｕ８７対Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｕ８７対トリシリビン処理されたＵ８７−ＰＴＥＮ、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ対ＥＧＦＲｖＩＩＩ、およびラパマイシン処理されたＵ８７対Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩの、それぞれ対応する低／高発現細胞株系統を使って検査した１１０。細胞固定化、膜の透過化、および抗体染色の種々のＩＣＣ試薬および条件を、試薬／溶液の容量と流量を制御する半自動式ピペットの操作パラメータとともに、検証することができた。最適化条件は、細胞の固定化には４％のパラホルムアルデヒド、および細胞膜の透過化には０．３％のトリトンＸ−１００である。特異性の抗体、抗ＥＧＦＲ（BD Pharmigen）、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Dako）、ＰＴＥＮ（Cascade）、ｐＡＫＴ（Cell Signaling）、およびｐＳ６（Cell Signaling）は、異なるフルオロフォアと共有結合し、それぞれ７５０ｎｍ（Cy7）、６４７ｎｍ（Cy5）、５５５ｎｍ（TRITC）、６４７ｎｍ（Cy5）、４８８ｎｍ（FITC）で発光する。同様の手法に基づき、ｐＥＲＫ（ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＡＰＫ経路の信号伝達ノード、データは不図示）に対するＭＩＣ手順を、それぞれ対照細胞株を使って最適化することができた。
【０１３０】
ＩＣＣ処理された細胞を含むＭＩＣチップを、画像取得のため、蛍光顕微鏡（ニコン、TE2000S）に装着した。顕微鏡およびＣＣＤカメラ（Photomatrix、Cascade II）の操作パラメータ、即ち、画像露光時間、ＥＭゲインも、蛍光画像の優れた信号対ノイズ比を得るために最適化された。個別の細胞の特定の蛍光信号を定量化とサイトメトリヒストグラムを生成するために、MetaMorphプログラム（Molecular Devices社）が使われた。各組の測定において、画像分析の後、低発現および高発現両者の細胞試料のヒストグラム対を生成した。ＭＩＣ条件と画像パラメータの微調整の目的は、２つのヒストグラムの分離を最大にするためである。分離の良さは、多数の信号伝達タンパク質の定量化に重要である。図２３は、Ｕ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞（確実に高レベルなｐＳ６）、およびラパマイシン処理されたＵ８７細胞（低ｐＳ６レベル、ラパマイシンによるｍＴＯＲ阻害の結果）でのｐＳ６のリン酸化の定量化における最適なダイナミックレンジを得るために、ＦＩＴＣで標識化されたｐＳ６抗体濃度の微調整のプロセスを示す。抗ｐＳ６濃度の４．５μｇ／ｍｌ時に、ｐＳ６陽性とｐＳ６陰性細胞間の蛍光信号の最善のコントラストを呈することを見出した。それぞれのＩＣＣ実験では、７００ナノリットルのｐＳ６抗体溶液（約２．５ナノグラムの抗体）のみを使用し、顕微鏡スライドカバーでの従来のＩＣＣ手法と比べ、少なくとも２桁台の試料の経済性を実証している。また、信号伝達分子の定量化は、高度に再現可能である。ｐＳ６の定量化以外にも、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、およびｐＡＫＴを含む他の信号伝達タンパク質の最適なＩＣＣ手順も同様な最適化プロセスを介して得た。
【０１３１】
図２３は、定量化ＩＣＣのためのＦＩＴＣで標識化されたｐＳ６抗体の濃度の最適化を示す。図２３ａ）は、異なる濃度（即ち、０、０．０４５、０．４５、および４．５）の抗ｐＳ６存在下におけるＵ８７−ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｐＳ６陽性）とパラマイシン処理されたＵ−８７（ｐＳ６陰性）の顕微鏡画像。図２３ｂ）は、MetaMorphを使った画像サイトメトリ分析で、抗体濃度が４．５μg／ｍｌのものがｐＳ６陽性細胞とｐＳ６陰性との最善の分離を示している。図２３ｃ）は、細胞拡散表面積平均およびバックグラウンド除去法により、ピーク分離が改善され、ヒストグラムの帯域（拡散）が減少されている。
【０１３２】
図２４は、最適なＩＣＣ条件と操作パラメータを使った個別細胞内のＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、およびｐＳ６の検知におけるダイナミックレンジの要約である。これらの結果は、同一の細胞試料を使ったウエスタンブロット法で実証された。（i）細胞拡散表面積平均（細胞の大きさによる変化をなくすため）と、（ii）バックグラウンド除去を適用することにより、それぞれのヒストグラム対での分離が改善され、各ヒストグラムの帯域幅が鋭くなり、ＭＩＣ技術のダイナミックレンジと感度の大幅な改善を反映している。
【０１３３】
図２４は、最適化ＩＣＣ条件下でのＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、およびｐＳ６の単細胞プロファイリングにおけるＭＩＣ技術のダイナミックレンジを示す。図２４ａ）は、ウエスタンブロット法での対照細胞株における５つの信号伝達タンパク質の検知データを示す。図２４ｂ）は、ＩＣＣ処理された細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。図２４ｃ）は、個別細胞内での５つの信号伝達タンパク質の定量化におけるダイナミックレンジの改善を示す。細胞拡散表面積平均とバックグラウンド除去の両者で、定量化のダイナミックレンジの改善が見られる。
【０１３４】
遺伝子病変における主な課題の１つは、特定の腫瘍抑制遺伝子（例、ＰＴＥＮ）におけるヘテロ接合性の欠失（LOH）の測定で、これは（i）組織の内因性信号が比較的低く、（ii）周囲の正常組織が通常レベルの腫瘍抑制遺伝子を発現し、顕著なバックグラウンド信号を発生しているためである。ＰＴＥＮはヒト癌における二番目に最も頻繁に欠失する腫瘍抑制遺伝子で、ＰＴＥＮはＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路を陰性に規制する。ＭＩＣ技術を使った初代細胞（ＰＴＥＮの発現レベルが２、１、および０である）におけるＰＴＥＮ発現の定量化の実現可能性を検証するために、（i）ＰＴＥＮ  ＥＳ株（即ち、ｐ８（+/-）およびＣａＰ８（-/-））、および（ii）ＭＥＦ株（即ち、ＰＴＥＮｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ（+/+）およびＰＴＥＮΔｌｏｘｐ／Δｌｏｘｐ（-/-））を含む２組の同系のマウス細胞株を使った。図２５に示すように、ＭＩＣ技術では、２組のヒストグラムを生成し、両者のヘテロ接合性（それぞれの組の試料（即ち、ｐ８（+/-）対ＣａＰ８（-/-）、およびＰＴＥＮｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ（+/+）対ＰＴＥＮΔｌｏｘｐ／Δｌｏｘｐ（-/-））におけるＬＯＨ、およびＰＴＥＮの完全欠失）を区別することが可能であることを示している。同じバッチの細胞試料を使って、ＭＩＣ技術を使って得た結果が、ウエスタンブロット法で見られるものと一致することを確認した。ウエスタンブロット法では信頼できる信号を得るには１０６個の細胞が必要であるが、ＭＩＣ技術では、各組の測定において２０００個のみの細胞を消費した。ＰＴＥＮ下流信号伝達ノードのｐＡＫＴも、ＭＩＣ技術によって検知でき、その結果はＰＴＥＮがＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路を陰性に規制することを示していた。
【０１３５】
図２５は、（i）ＰＴＥＮ  ＥＳ株（即ち、ｐ８（+/-）およびＣａＰ８（-/-））、および（ii）ＭＥＦ株（即ち、ＰＴＥＮｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ（+/+）およびＰＴＥＮΔｌｏｘｐ／Δｌｏｘｐ（-/-））を含む２組の同系マウス細胞株のＰＴＥＮ発現とｐＡＫＴリン酸化の定量化を示す。ウエスタンブロット法およびＭＩＣによる測定が、それぞれ１０６個と２０００個の細胞を使って、並行して行われた。ＭＩＣ技術では、ヘテロ接合性の欠失（LOH、ｐ８（+/-）対ＣａＰ８（-/-））およびＰＴＥＮの完全欠失（ＰＴＥＮｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ（+/+）対ＰＴＥＮΔｌｏｘｐ／Δｌｏｘｐ（-/-））の両者を区別することができた。ＭＩＣ技術を使って得た結果は、ウエスタンブロット法で見られるものと一致していた。ＰＴＥＮ下流信号伝達ノードのｐＡＫＴも、ＭＩＣ技術によって検知され、その結果はＰＴＥＮがＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路を陰性に規制することを示している。
【０１３６】
（４細胞タイプの細胞混合物の４信号伝達分子の並列検知）
ＭＩＣ技術は、個別の細胞における複数の信号伝達分子の並列検知ができるので、組織試料の細胞の不均一性を捕らえることができる。これを実証するため、個別の細胞株（即ち、Ｕ８７、Ｕ８７−ＥＧＦＲ、Ｕ８７−ＰＴＥＮ、およびＵ８７−ＥＧＦＲ／ＰＴＥＮ）、および人工的な細胞混合物（４つの細胞株を１：１：１：１の割合で含む）を使って、４つの信号伝達分子（即ち、ＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、およびｐＳ６）の並列検知を行った（図２６）。細胞形態が信号伝達分子プロファイリングにどのように影響するかを比較するため、ＭＩＣ測定を２つの異なる条件（即ち、細胞拡散前と後）で行った。個別に開発したＩＣＣ条件を合成し、マイクロチップ内のパラホルムアルデヒドで固定化され洗剤（detergent）透過化された細胞混合物を、Ｃｙ７標識化された抗ＥＧＦＲ、Ｃｙ５標識化された抗ｐＡＫＴ、ＴＲＩＴＣ標識化された抗ＰＴＥＮ、およびＦＩＴＣ標識化された抗ｐＳ６を含む抗体カクテルで処理し、多彩染色（ＤＡＰＩ、抗ＥＧＦＲ（Cy7）、抗ＰＴＥＮ（TRITC）、抗ｐＡＫＴ（Cy5）、および抗ｐＳ６（FITC））を生じさせた。４つの信号伝達分子の共局在化を示すために、異なる蛍光チャンネルで得た画像を合成した。画像サイトメトリ分析を行うことによって、個別細胞内のＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、およびｐＳ６レベルを得た。３次元（３Ｄ）散布図（Ｘ、Ｙ、Ｚ軸に、それぞれＥＧＦＲ、ＰＴＥＮ、およびｐＳ６を表示）は、マルチパラメータ分析による異なる細胞タイプの区別を示している。図２６に示すように、４つの異なる細胞タイプが実質的に４つの明確なグループに分離されている。同時に、低刺激な細胞解離手法も試験した。３７℃で１５分間、TryPEL Express（Invitrogen社）で処理し、細胞信号伝達イベントに最小の衝撃で培養フラスコから細胞を採取した。この処理を使って、新鮮解離細胞を接着マトリックス（Cell-Tak（商標））で被覆したマイクロ流体チャンネルに固定化した。連続するＭＩＣ測定により、付着した「丸い細胞」が、良好な拡散形態の安定化細胞に見られるものに非常に類似した信号伝達プロファイリングを呈した。この低刺激な細胞解離手法は、初代細胞の信号伝達プロファイリングへの最小の衝撃で、外科的に切除した脳腫瘍組織の解離されたものに適用した。
【０１３７】
（ＭＩＣ技術を使ったラパマイシンの単細胞薬理学研究）
ＩＣＣ手法は細胞内の標的タンパク質の存在／不在の検査によく用いられるが、データ再現性の悪さのため、タンパク質の発現／リン酸化の定量化には適していない。上述の通り、定量化を行うＭＩＣ技術の能力により、ＭＩＣ技術をラパマイシンの薬理学的測定への適用を試みた。ラパマイシンは、ＰＩ３Ｋ信号伝達経路における重大な信号伝達分子であるｍＴＯＲを標的とする強力な阻害剤である。ｍＴＯＲへのラパマイシン阻害の効果は、下流信号伝達分子ｐＳ６の活性化を観察することにより、定量化することができる。ＭＩＣ技術を、個別の細胞内のｐＳ６のラパマイシン誘発された下方制御のレベルを定量化することに使用した（図２７）。このとき、Ｕ８７細胞は、異なる組の細胞培養室に異なる濃度（即ち、０、０．２、０．５、２．０、５．０、および２０ｎＭ）のラパマイシンを含んだ細胞培養基を取り込んだマイクロ流体細胞配列チップで培養した。数千の単細胞データからなるヒストグラムの結果は、用量依存的な阻害性をまさに反映している。用量依存性の曲線は、ｐＳ６レベルの平均と対応するラパマイシンの濃度を描画することにより得られ、ＩＣ５０は２．６９ｎＭが得られた。このＩＣ５０は、各データ点で１０６の細胞を必要とするウエスタンブロット法ベースの定量化（１．０ｎＭ）により立証された。
【０１３８】
図２７は、異なる濃度のラパマイシンで処理された個別の細胞におけるｐＳ６の発現レベルの定量化を示す。図２７ａ）は、Ｕ８７細胞を、０、０．２、０．５、２．０、５．０、および２０ｎＭのラパマイシンを含んだ細胞培養基のマイクロ流体細胞配列チップでの培養を示す。図２７ｂ）は、個別細胞におけるｐＳ６レベルのラパマイシン誘発の下方制御を、ＭＩＣ技術で定量化したもの。ラパマイシンの異なる濃度に対応する６つのヒストグラムは、ラパマイシン阻害の異なるレベルを反映している。図２７ｃ）は、ｐＳ６レベル対ラパマイシンの対応する濃度を描画することにより得られる用量依存性曲線。この用量依存性曲線から、２．６９ｎＭのＩＣ５０が推定された。ＭＩＣ技術により測定されたＩＣ５０は、各データ点で１０６の細胞を使ったウエスタンブロット法で立証された。この用量依存性曲線での結果は、ＩＣ５０は１．０ｎＭであった。
【０１３９】
（脳腫瘍組織を使ったＭＩＣ技術の臨床実証）
膠芽腫細胞株を使ったＭＩＣ技術の成功裏な検証は、ＭＩＣ技術の臨床状況における体外での分子診断技術の検証へと促した。当初の妥当性確認の検証と脳腫瘍標的治療に集中した既存の臨床試験とを結合させることができた。ＵＣＬＡメディカルスクールにて臨床的に良く特徴付けされた脳癌患者のグループを採用し、検査を行った。脳腫瘍は、大抵、効率で癌細胞を含んでいるので、ＭＩＣ技術の妥当性の確認には優れたモデルシステムとなる。今までのところ、７つの外科的に除去された脳腫瘍（即ち、異なるグレードの神経脳腫）で、分子署名（即ち、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、およびｐＳ６）を測定するＭＩＣチップでの定量化／マルチパラメータＩＣＣを行うことができた。細胞への最小レベルの摂動を保証するため、共同チームで開発した新鮮分離腫瘍組織を処理するための低刺激な急速解離の手順（TryPEL Express処理を３７℃で１５分間）を確立した。図２８に示すように、小児脳腫瘍組織から、異なる細胞タイプの特徴と共に、腫瘍の内在する組織の不均一性を反映する３つの細胞の小集団を識別した。標的薬物（例、ラパマイシン）の治療を受けている患者においては、治療により誘発された信号伝達の阻害を示す、腫瘍細胞におけるｐＳ６のリン酸化レベルの劇的な減少（データ不図示）が見られた。現在は、白血病細胞株や他の患者の試料とともに、ヒト前立腺癌および膀胱癌におけるＭＩＣチップでのさらなる妥当性の検証をしている。
【０１４０】
（試料調製／免疫染色の自動化−近似する微環境での大規模信号伝達プロファイリングのためのマイクロ流体細胞配列チップと自動化ピペットシステムとの使いやすいインタフェースの作成）
元々のＭＩＣプラットフォームは、人が操作して、試料調製とＩＣＣとを順次行う半自動式ピペットを使用していた。ピペットは流量と用量とをデジタルで制御しているが、それ以外の操作／処理は、実際、手作業で行われていた。一般に、人の関与は、操作する人によるバラツキや間違いを招くので、高スループットおよび／または多段階な研究を必要とするものに適用するには、半自動式のＭＩＣプラットフォームの拡大が必要となる。マイクロ流体細胞配列チップと自動化ピペット間の使いやすいインタフェース（図２９Ａ−図２９Ｆ）を開発した。最初の細胞装填および培養（培養基の交換を含む）から免疫染色までの操作を完全自動化し、高スループットな信号伝達ネットワークのプロファイリングのための複雑な大規模細胞培養／分析が行えるようにすることが目標である。
【０１４１】
（試料調製および免疫染色の自動化のための自動化ピペットの設計）
使いやすいインタフェースの機械的な態様は、２つのカスタム設計された部品、即ち、チップホルダ（図２９Ａ、図２９Ｂ）とピペットチップ配列（図２９Ａの写真および図２９Ｅの概略図）からなる。自動ピペットシステム（Nanodrop II、Innovadyne社）は、９６、３８３、および／または１５３６ウェルプレート処理用に設計されている。これらの標準的な構成と一致させ、自動化システム（および他のウェルプレートシステム）との直接のインタフェースを可能にするため、チップホルダをウェルプレートと同じ大きさとした。現状、１つのチップホルダには、それぞれの細胞配列チップに３０〜４０の培養室を有する４つの細胞培養チップを収容することができる。細胞培養室の注入口穴および抽出口穴のそれぞれの位置は、１５３６ウェルプレートのウェルの位置と合わせてある。したがって、１５３６ウェルプレート処理用に開発された元のプログラムを、ＭＩＣチップ上での試料調製とＩＣＣを行うために簡単に最適化することができる。
【０１４２】
図２９は、本発明の実施の形態に係る自動化された大規模信号伝達プロファイリングを行う自動化ピペットシステムを示す。図２９ａ）は、ウェルプレートフォーマット上での試料と試薬の処理用に設計された自動化ピペットシステム。図２９ｂ）は、自動化システムと細胞配列チップ間の都合よく正確なインタフェースを可能にするウェルプレートと同じ大きさのカスタム設計されたチップホルダ。図２９ｃ）は、標準チップ高に固定のマイクロチップ製造用のカスタム設計された金型。図２９ｄ）は、３０細胞培養室の細胞配列チップ。図２９ｅ）は、４対のピペットを搭載したチップの断面図。図２９ｆ）は、マイクロ流体細胞培養室での試料／溶液の分注と回収にピペット対がどのように使われるかを示すピペットチップの概要図。
【０１４３】
図３０は、ＭＩＣチップ１２で分析した１２の脳腫瘍試料の３次元散布図で、個別の腫瘍試料における劇的に異なる細胞不均一性を示す。
【０１４４】
図３１は、患者試料の細胞不均一性の分析および定量化に採用した異端なクラスタリング手法を示す。
【０１４５】
（チップホルダとアライメントシステムの設計）
チップホルダは、自動化ピペットシステムの座標系に対する正確な位置およびマイクロ流体チップの配向を保証する主要な部品である。ピペットチップは、細胞培養室の注入口および抽出口と正確に位置合わせされる。マイクロチップに対する機械的な下降と挟持機構との組み合わせが、組立時の僅かなバラツキの許容範囲でのマイクロチップの恰好な一貫した位置合わせを保証する。
【０１４６】
自動化ピペットシステムは、それぞれ５ナノリットル精度で液試料の分注と回収が可能で、個別に制御される８つのピペットチップを有する。ＭＩＣチップを自動化ピペットシステムと統合するために、８つのピペットチップを４つの細胞培養室を処理するために４対のグループにした（図２９Ｅ）。各ピペットチップ対は、片方は液の分注に割り当てられ、他方は「排」液の回収用となっている。ＰＤＭＳ系のマイクロ流体チップの弾性を利用して、マイクロ流体室での泡の問題を解消するよう、各ピペットチップとマイクロ流体チップの注入口との間の液密封を達成するように設計されている。ピペットチップの直径が約１．０ｍｍで、ＰＤＭＳの穴の直径が約４００μｍであり、適度の位置ずれは許容される。図２９Ｆは、ピペットチップ対が、マイクロ流体細胞培養室で試料／溶液の装填と除去をどのように同時に処理するかを示す。左のピペットチップが新しい培養基または試薬を試薬容器から吸引し、そして注入口上部のＰＤＭＳチップの天面を封印する。液は、チャンネル内に注入され、抽出口から押し出される。この排液は２番目のピペットチップにより回収される。半自動式のピペット手法ではチップ上での所定の細胞培養基の交換におよそ２０分掛かるのとは対照的に、この自動化システムでは同じ処理が１０秒以下で終了することができる。マイクロチップの厚みは液密封の形成には不可欠なので、マイクロチップの安定した寸法での大量生産のために、特殊な成型を設計、製作した（図２９Ｃ）。
【０１４７】
（使いやすい制御インタフェース）
インタフェースの機械的な態様に加えて、重要なソフトウェア構成要素がある。ＸＭＬファイルで構成され、標準的なステップからなる一般的な「プロトコル／レシピ」（細胞装填、培養基交換、ＩＣＣ、他）を実行する非常にフレキシブルなプログラムインタフェースを開発した。各プロトコルのステップは、試薬の位置、分注量、分注速度、その他を指定する。ユーザは、単に自動的に実行するレシピを選択するだけである。ソフトウェアは、異なる細胞タイプまたは異なる治療に関わるさらに複雑な研究のための新しい培養基／試薬を、どのマイクロチップ（およびチップ毎のどのカラム）に装填すべきかの仕様を決めることもできる。
【０１４８】
（２０脳腫瘍患者からの組織試料に基づく臨床実証）
ＵＣＬＡメディカルスクールにて、臨床的によく特徴付けられた脳癌患者のグループを採用し検査を行った。脳腫瘍は、大抵、効率で癌細胞を含んでいるので、ＭＩＣ技術の妥当性の確認には優れたモデルシステムとなる。今までのところ、２０の外科的に除去された脳腫瘍（即ち、異なるグレードの神経脳腫）で、分子署名（即ち、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、およびｐＳ６）を測定するＭＩＣチップでの定量化／マルチパラメータＩＣＣを行うことができた。細胞への最小レベルの摂動を保証するため、共同チームで開発した新鮮分離腫瘍組織を処理するための低刺激な急速解離の手順（TryPEL Express処理を３７℃で１５分間）を確立した。それぞれの単細胞でのタンパク質の発現とリン酸化のレベルを視覚化するために、３次元対数散布図を使った。それぞれの患者は、異なる細胞タイプの特徴と共に、腫瘍に内在する組織の不均一性を反映する異なる分布およびクラスタリングを有している。図３０は、１２の脳腫瘍患者から得た結果を示す。
【０１４９】
下流タンパク質であるｐＡＫＴおよびｐＳ６と上流タンパク質であるＰＴＥＮおよびＥＧＦＲとの関係を表すために、二重パラメータドットプロットを使った。ＰＴＥＮ、ＥＧＦＲ、ｐＡＫＴ、およびｐＳ６の高発現と低発現のそれぞれの閾値は、すべての患者データの統計から得た。各小集団に位置する細胞の百分率を得ることも可能である。階層的クラスタ分析は、４つのタンパク質の発現レベルを同時に示し、各小集団細胞の類似性を示す。
【０１５０】
実施例：脳腫瘍細胞および脳腫瘍幹細胞の分子分析用マイクロ流体ベースの画像サイトメトリ（MIC）の開発
上皮細胞成長因子および線維芽細胞成長因子で補充された無血清培養基からなる体外神経幹細胞（NSC）培養システムをヒト初代腫瘍分離株の培養に使うと、「脳腫瘍幹細胞（BTSC）」といわれる腫瘍開始／腫瘍形成性の細胞の集団を増やし、維持することを、データが示唆している。これらの細胞は、神経幹細胞を発現（Nakano 他）し、表面接着のない成長の特性を有し、特徴的な「ニューロスフィア（球状細胞塊）」と呼ばれるスフェロイド凝集体を形成する。もう一方の血清をベースとする培養基からなる体外培養システムで強化された接着に依存する「非幹」のものと違って、これら想定されるＢＴＳＣは、自己再生をし、多様な分化の能力があり、異種移植した場合にそれが由来する元の腫瘍の多くの性状を反復する腫瘍を形成するという癌幹細胞の生物学的な主要な教義を満足している。最近のデータは、成長および患者ＢＴＳＣ株の長期継代にわたる維持の能力が患者腫瘍の臨床的進行を模倣し、よって、この体外モデルが独立予後因子として機能することを示唆している（Laks 他）。
【０１５１】
ＢＴＳＣ理論の別の要素として、最も不活発な細胞が最も「幹的な」特性を保持し、急速に分裂する細胞がより限定された前駆能力を有するが、正常神経発生において見られるＡ、ＢおよびＣタイプ神経前駆細胞に由来するこれらのＢＴＳＣが、より不活発で、他の脳腫瘍子孫細胞ほど分裂的に活発ではないかもしれないことである。これは、これらの細胞が「化学療法耐性である」理由の１つとして推測される。それは単純に、細胞の信号伝達経路の減衰に特化した分子を標的とするとして知られる薬物の種類が出現するまでは、最も一般的に臨床的に使用された化学療法モダリティは高活性な分裂の細胞を標的としていたということである。
【０１５２】
関心信号伝達経路は、その異常調節が、脳腫瘍の形成ならびに脳癌幹細胞の進化および維持の両者に関与するので、マイクロ流体ベースの画像サイトメトリ（IMC）システムの概念実証（POC）として、ホスホイノシトール３キナーゼ（PI3K）経路とした。単細胞解像度での同時多ノード（ｐＳ６、ＰＴＥＮ、ｐＡＫＴ、ＥＧＦＲ）分析は、原発腫瘍、培養脳腫瘍幹細胞、および非幹子孫細胞のそれぞれの細胞におけるこれらの成分の調査を可能とする。ＭＩＣシステムは、幹（ＮＳ、「ニューロスフィア」）および非幹（ＳＣ、「血清細胞」）を区別する顕著な経路の類似性を明らかにすることになる、患者脳腫瘍試料とそれらの非ＢＴＳＣおよびＢＴＳＣ強化された子孫（体外初代継代）との比較を介して、重要なグループ内および相互の経路の差、ならびに個別のＢＴＳＣ分子「署名」の識別を獲得している。その重要性はまだ明確ではないが、最も顕著に見られた定量的変化は、単細胞レベルでのＳＣ試料に対するＮＳ試料におけるＥＧＦＲおよびｐＳ６の発現の低さである（図３２）。
【０１５３】
ＭＩＣによる化学療法感受および化学療法耐性現象の分析は、化学療法への経路反応に基づき、ＢＴＳＣのさらなる詳細な特徴付けを可能にするデータを産出している。例えば、患者ＢＴＳＣ株において少なくとも２つの新規の化学療法現象が現れており、これは原発腫瘍の世界保健機構（WHO）の臨床診断とは全く無関係である。１つは、単細胞レベルでの活性化したｐＡＫＴに対するｍＴＯＲのフィードバック阻害の開放によるパラマイシン誘発の化学療法活性化である（図３３Ａ）。ＵＣＬＡで最近完了したＧＢＭにおけるラパマイシンのフェーズＩ臨床試験では、臨床集団の半分においてこの現象が発生していることを明らかにしている。
【０１５４】
さらに、多数のＢＴＳＣ株の検査では、化学療法反応の新規の予測モデルが、ＥＧＦＲからの信号伝播はＡｋｔを介していることを明らかにしている。このモデルの予測力は、当初、ＥＧＦＲの発現が前処理されたｐＡｋｔと強い相関があるとき、ＥＧＦＲの遮断が処理後の相関関係を無効にし、単細胞レベルで、活性化したＡｋｔの発現を定量的に減少できるという観察結果からきている（図３３Ｂ）。これらの２つの現象に対するＡｋｔの活性化の関わりは、Ａｋｔの信号伝達が悪性幹細胞の表現型の維持に非常に重要であると考えられているので、ＢＴＳＣ生物群集では特に興味深いことである。
【０１５５】
以上、本発明のさまざまな実施の形態について詳細に述べてきたが、当業者においては、本発明の広範な範囲から逸脱することなく変更および修正をすることが上述の記載から明らかであり、よって、請求項に定義された本発明は、そのような変更や修正も本発明の範囲に含むことを意味する。
【０１５６】
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３．Thomas R.K.、Baker A.C.、DeBiasi R.M.、Winckler W.、LaFramboise T.、Lin W.M.、Wang M.、Feng W.、Zander T.、MacConnaill L.E.、Lee J.C.、Nicoletti R.、Hatton C.、Goyette M.、Girard L.、Majmudar K.、Ziaugra L.、Wong K.、Gabriel K.、Beroukhim R.、Peyton M.、Barretina J.、Dutt A.、Emery C.、Greulich H.、Shah K.、Sasaki H.、Gazdar A.、Minna J.、Armstrong S.A.、Mellinghoff I.K.、Hodi F.S.、Dranoff G.、Mischel P.S.、Cloughesy T.F.、Nelson S.F.、Liau L.M.、Mertz K.、Rubin M.S.、Moch H.、Loda M.、Catalona W., Fletcher J., Signoretti S., Kaye F., Anderson K.C., Demetri G.D., Dummer R.、Wagner S.、Herlyn M.、Sellers W.R.、Meyerson M.及びGarraway L.A. (2007).  High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer.  Nat Genet 39(3)、P347-51.
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５．Nakano I.、Masterman-Smith M.、Saigusa K.、Paucar A.A.、Horvath S.、Shoemaker L.、Watanabe M.、Negro A.、Bajpai R.、Howes A.、Lelievre V.、Waschek J.A.、Lazareff J.A.、Freije W.A.、Liau L.M.、Gilbertson R.J.、Cloughesy T.F.、Geschwind D.H.、Nelson S.F.、Mischel P.S.、Terskikh A.V.及びKornblum H.I. (2007)  Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells.  J Neurosci Res.
６．Beroukhim R.、Getz G.、Nghiemphu L.、Barretina J.、Hsueh T.、Linhart D.、Vivanco I.、Lee J.C.、Huang J.H.、Alexander S.、Du J.、Tweeny K.、Thomas R.K.、Shah K.、Soto H.、Perner S.、Prensner J.、Debiasi R.M.、Demichelis F.、Hatton C.、Rubin M.A.、Garraway L.A.、Nelson S.F.、Liau L.M.、Mischel P.S.、Cloughesy T.F.、Meyerson M.、Golub T.A.、Lander E.S.、Mellinghoff I.K.、Sellers W.R. (2007)  Assessing the Significance of Chromosomal Aberrations in Cancer.  Methodology and Application to Glioma, PNAS（近刊）.
７．Yoshimoto K.、Dang J.、Zhu S.、Nathanson D.、Huang T.、Dumont R.、Seligson D.B.、Yong W.H.、Xiong Z.、Rao N.、Winter H.、Chakravarti A.、Bigner D.D.、Mellinghoff I.K.、Horvath S.、Cavenee W.K.、Cloughesy T.F.及びMischel P.S. (2007)  Development of real-time RT-PCR assay for detecting EGFRvIII in formalin-fixed paraffin-embedded glioblastoma samples.  Clinical Cancer Research（近刊）
８．Cloughesy T.F.、Koji Yoshimoto K.、Nghiemphu P.、Brown K.、Dang J.、Zhu S.、Huseh T.、Chen Y.、Wang W.、Youngkin D.、Liau L.、Martin N.、Becker D.、Bergsneider M.、Lai A.、Green R.、Oglesby T.、Koleto M.、Trent J.、Horvath S.、Mischel P.S.*、Mellinghoff D.C.*及びSawyers C.L.*（*Co-Senior and corresponding authors). (2007)  Antitumor activity of rapamycin in patients with recurrent PTEN-deficient glioblastoma PLoS Medicine（近刊）
９．Lu K.V.、Zhu S.J.、Dang J.、Yoshimoto K.、Felciano R.M.、Richards D.R.、Laurance M.E.、Chen Z.、Caldwell J.S.、Shah N.P.、Horvath S.、Nelson S.F.、James C.D.、Bergers G.、Lee F.、Weinmann R.及びMischel P.S.  The Src Tyrosine Kinases Fyn and Lyn are Dasatinib-Sensitive Molecular Target in Glioblastoma Patients.  提出済み、Cancer Cellにて改訂原稿検討中。
【図１】
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【図７】
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【図１２Ａ−１２Ｆ】
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【図１３】
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【図２９Ａ−２９Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【国際調査報告】
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