(57)【要約】  本発明は、外科的切除後の肺癌の再発について良好な予後を有する早期非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者を同定する方法を提供する。本発明は、染色体５ｐ１５、７ｐ１２、８ｑ２４および６番セントロメアの２種以上における染色体コピー数異常の評価を予後分類に使用することができるという知見に基づく。本発明は、好ましくは、患者試料にハイブリッド形成させてこれらの遺伝子座の染色体コピー数を定量するための蛍光標識核酸プローブを用いる蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを使用する。４種の分類指標を使用するコピー数異常パターンの評価は、ＮＳＣＬＣについての統計的に有意な予後分類をもたらした：（ｉ）ＦＩＳＨシグナルの最大数を有する染色体遺伝子座におけるＦＩＳＨシグナルからＦＩＳＨシグナルの最小数を有する染色体遺伝子座におけるＦＩＳＨシグナルを引いた少なくとも３のＦＩＳＨプローブシグナルの差を細胞ベースで示す細胞のレンジ３パターン；（ｉｉ）ＥＧＦＲ  ＦＩＳＨプローブシグナルより小さいＭＹＣ  ＦＩＳＨプローブシグナルを示す細胞の百分率を評価するＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失パターン；（ｉｉｉ）レンジ３パターン、およびＣＥＰ６についてのＦＩＳＨプローブシグナルに対するＭＹＣ  ＦＩＳＨプローブシグナルの相対損失を示す細胞の百分率のＭＹＣ／ＣＥＰ６比パターンの組合せ；（ｉｖ）ＭＹＣ遺伝子座シグナルと５ｐ１５遺伝子座シグナルとの相対比＝０．８０を示すＭＹＣ／５ｐ１５比パターンおよび５ｐ１５ＦＩＳＨプローブシグナルとＣＥＰ６ＦＩＳＨプローブシグナルとの相対比＝１．１を有する細胞の百分率を評価する５ｐ１５／ＣＥＰ６比パターンの組合せと、＜０．８０のＭＹＣ／５ｐ１５比または５ｐ１５／ＣＥＰ６＜１．１；ならびに（ｖ）約２．５以上のプローブシグナル差の平均範囲と細胞の百分率のレンジ３パターンとの組合せ。本発明は、術前にネオアジュバント化学療法により、または術後にアジュバント化学療法により治療されるべき再発のリスクがより高いこれらの早期ＮＳＣＬＣ患者を同定するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）早期非小細胞肺癌を罹患していると分類されたヒト患者からの生物試料を得ること；
（ｂ）生物試料を、染色体５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、染色体８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、６番染色体列挙プローブおよび染色体７ｐ１２遺伝子座特異的プローブからなる群から選択される少なくとも２種のプローブを含む染色体プローブのセットと、存在する場合に試料中の染色体へのセット中のプローブのハイブリダイゼーションを可能にする十分な条件下で接触させること；
（ｃ）生物試料への染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを同定すること；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）において同定されたハイブリダイゼーションパターンに基づき、対象における肺癌の予後を決定することを含む、
ヒト患者における肺癌の予後を決定する方法。
【請求項２】
生物試料が、肺組織生検物および切除物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
染色体プローブのそれぞれが、別個に検出することができる蛍光標識物質により直接標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生物試料が、１ｂ期の非小細胞肺癌を罹患していると分類された患者からの生物試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生物試料が、２期の非小細胞肺癌を罹患していると分類された患者からの生物試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
接触工程（ｂ）を自動化装置により実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ハイブリダイゼーションパターンが、プローブシグナルの最大数を有する染色体遺伝子座におけるプローブシグナルからプローブシグナルの最小数を有する染色体遺伝子座におけるプローブシグナルを引いた少なくとも３のプローブシグナルの差を細胞ベースで示す生物試料中の細胞の数の同定である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞の数が、生物試料中の評価細胞の少なくとも約４２パーセントである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ハイブリダイゼーションパターンが、７ｐ１２シグナルと比較した８ｑ２４シグナルの損失を示す生物試料中の細胞の数の同定である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
細胞の数が、生物試料中の評価細胞の少なくとも約３１パーセントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ハイブリダイゼーションパターンが、（ｉ）プローブシグナルの最大数を有する染色体遺伝子座におけるプローブシグナルから、プローブシグナルの最小数を有する染色体遺伝子座におけるプローブシグナルを引いた、少なくとも３のプローブシグナルの差を細胞ベースで示す、生物試料中の細胞の数の同定および（ｉｉ）６番セントロメアシグナルと比較した８ｑ２４シグナルの損失を細胞ベースで示す、生物試料中の細胞の数の同定の組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも３のプローブシグナルの差を有する細胞の数が、生物試料中の評価細胞の約４５パーセント未満であり、および６番セントロメアシグナルと比較した８ｑ２４シグナルの損失を示す細胞の数が、生物試料中の評価細胞の約２４パーセント未満である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ハイブリダイゼーションパターンが、（ｉ）≧０．８０の８ｑ２４遺伝子座シグナルと５ｐ１５遺伝子座シグナルとの比を、細胞ベースで示す生物試料中の細胞の数の同定および（ｉｉ）少なくとも１．１の５ｐ１５プローブシグナルと６番セントロメアプローブシグナルとの比を細胞ベースで示す、生物試料中の細胞の数の同定の組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ハイブリダイゼーションパターンが、（ｉ）プローブシグナルの最大数を有する染色体遺伝子座におけるプローブシグナルから、プローブシグナルの最小数を有する染色体遺伝子座におけるプローブシグナルを引いた、少なくとも３のプローブシグナルの差を細胞ベースで示す、生物試料中の細胞の数の同定および（ｉｉ）プローブシグナルの最大数を有する染色体遺伝子座におけるプローブシグナルからプローブシグナルの最小数を有する染色体遺伝子座におけるプローブシグナルを引いた差の平均プローブシグナル差を、細胞ベースで示す、生物試料中の細胞の数の同定の組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
平均プローブシグナル差が約２．５以上である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも３のプローブシグナルの差を有する細胞の数が、生物試料中の評価細胞の約４２％パーセント未満であり、およびプローブシグナル差の平均を示す細胞の数が、生物試料中の評価細胞の少なくとも約２．５パーセントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
生物試料が細胞試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
染色体プローブがそれぞれ蛍光標識されている、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の予後を決定するための、肺癌患者からの組織試料のインビトロ診断アッセイに関し、特に、早期患者、例えばＩｂ期またはＩＩ期の非小細胞肺癌と診断された患者の予後を決定するためのインビトロアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、２００５年における米国の癌死亡のほぼ１／３を占め、２種のタイプ：非小細胞肺癌および小細胞肺癌に大まかに分類される。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、米国において肺癌症例の８０から８５％を構成する。ＮＳＣＬＣのタイプは、癌に見出される細胞の種類にちなみ、および顕微鏡下で細胞がどのように見えるかにちなんで命名される。ＮＳＣＬＣは、３種の主要なタイプを含む：（ｉ）魚の鱗のように見える薄く平らな細胞である扁平上皮細胞内で発生する扁平上皮癌。扁平上皮癌は、類上皮癌とも称される；（ｉｉ）大肺細胞の数タイプ内で発生する大細胞癌；（ｉｉｉ）肺の肺胞を裏打ちし、粘液などの物質を作出する細胞内で発生する腺癌。他の一般的でないＮＳＣＬＣのタイプは、多形癌、カルチノイド腫瘍および分類不明な癌腫を含む。
【０００３】
ＮＳＣＬＣの診断は、疑いのある組織、例えば生検試料の病理学者の試験により行われる。ＮＳＣＬＣの診断後、患者の全身健康状態および年齢、症候、例えば、咳および呼吸困難の重症度、ＮＳＣＬＣの特定のタイプ、ならびに癌の病期分類を使用して患者の疾患に予後（回復の見込み）が割り当てられる。病期分類は、腫瘍のサイズおよび腫瘍が肺のみに存在するかどうか、または体内の他の場所に転移しているかどうかが考慮される。次いで、ＮＳＣＬＣ患者のための特定の治療オプションがこれらの考慮に基づき選択され、癌の病期分類は治療選択にとって重要な要素である。早期ＮＳＣＬＣの患者は、腫瘍を除去する外科的切除により潜在的に治癒させることができるが、現在の診断様式では患者が術後に再発することを予期することができない。
【０００４】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋのインターネットウェブサイトは、ＮＳＣＬＣ病期分類を以下の通り記載している。「非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の増殖および転移を説明するために米国臨床診療において使用されることが最も多いシステムはＴＮＭ病期分類システムであり、これはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）システムとしても知られている。ＴＮＭ病期分類において、腫瘍（Ｔ）、近傍のリンパ節中への転移（Ｎ）および遠隔臓器転移（Ｍ）についての情報が組み合わせられ、病期が具体的なＴＮＭ分類に割り当てられる。分類された病期は、数字０およびローマ数字ＩからＩＶを使用して記載される。
【０００５】
「Ｔカテゴリーは、肺癌のサイズ、肺内部におけるこの転移および局在、ならびに近傍組織へのこの転移に基づく。Ｔｉｓカテゴリーにおいて、癌は、気道を裏打ちする細胞の層のみに見出される。癌は、他の肺組織内に転移していない。このカテゴリーは、上皮内癌としても知られている。
【０００６】
「Ｔ１カテゴリーにおいて、癌は、３ｃｍ以下（１から１と１／４インチをわずかに下回る。）であり、臓側胸膜（肺を覆う膜）に転移しておらず、主気管支に及ばない。
【０００７】
「Ｔ２カテゴリーにおいて、癌は、以下の特徴の１つ以上を有する：（ｉ）癌は、３ｃｍより大きく；（ｉｉ）癌は、肺の主気管支に併発するが、気管（風管）が左右の主気管支分岐部まで２ｃｍ（約３と１／４から４インチ）以上遠位；または（ｉｉｉ）癌は、臓側胸膜に転移している。癌は、気道を部分的に遮断し得るが、癌は、肺全体の虚脱を引き起こさず、または肺炎を発症させない。
【０００８】
「Ｔ３カテゴリーにおいて、癌は、以下の特徴の１つ以上を有する：（ｉ）癌は、胸壁、横隔膜（胸部を腹部から分ける呼吸筋）、縦隔胸膜（２個の肺の間の空間を覆う膜）または壁側心膜（心臓を覆う嚢の膜）に転移しており；（ｉｉ）癌は、肺の主気管支に併発し、気管（または風管）が左右の主気管支分岐部まで２ｃｍ（約３と１／４から４インチ）以内、この領域には併発せず；または（ｉｉｉ）癌は、片肺の完全な虚脱を引き起こし、もしくは肺全体の肺炎を引き起こすほど気道内に増殖している。
【０００９】
「Ｔ４カテゴリーにおいて、癌は、以下の特徴の１つ以上を有する：（ｉ）癌は、縦隔（胸骨後部および心臓前部の空間）、心臓、気管（風管）、食道（咽頭を胃に連結する管）、背骨、または気管が左右の主気管支に分岐する箇所に転移しており；（ｉｉ）２つ以上の別個の腫瘍結節が同一葉内に存在し；または（ｉｉｉ）肺を覆う空間内における癌細胞を含有する流体の存在である悪性胸膜滲出液が存在する。
【００１０】
「Ｎカテゴリーは、存在する場合、肺近傍のリンパ節のどのリンパ節が癌により冒されるかに依存する。Ｎ０カテゴリーにおいて、癌は、どのリンパ節にも転移していない。Ｎ１カテゴリーにおいて、癌は、肺内部のリンパ節に、または肺門リンパ節（気管支が肺に入る領域の周囲に局在するリンパ節）内に転移している。Ｎ１カテゴリーにおいて、冒されたリンパ節は、癌性肺と同側にのみに存在する。Ｎ２カテゴリーにおいて、癌は、気管分岐部リンパ節（気管が左右の気管支に分岐する箇所の周囲に存在するリンパ節）に、または縦隔（胸骨後部および心臓前部の空間）内のリンパ節に転移している。Ｎ２カテゴリーにおいて、冒されたリンパ節は、癌性肺と同側に存在する。Ｎ３カテゴリーにおいて、癌は、いずれかの側の鎖骨近傍のリンパ節に、および／または癌性肺と対側の肺門もしくは縦隔リンパ節に転移している。
【００１１】
「Ｍカテゴリーは、癌が遠隔組織および器官に転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｚｅ）および転移しているかどうかに依存する。Ｍ０カテゴリーにおいて、癌は遠隔転移していない。Ｍ１カテゴリーにおいて、癌は、１箇所以上の遠隔部位に転移している。遠隔とみなされる部位は、他の肺葉、癌のＮカテゴリーを決定するために使用されるリンパ節より遠いリンパ節、および他の器官または組織、例えば、肝臓、骨もしくは脳を含む。
【００１２】
Ｔ、ＮおよびＭカテゴリーが特定のＮＳＣＬＣに割り当てられると、０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの総合病期を割り当てるためにこの情報が組み合わせられる（病期分類）（表１を参照のこと）。ＴおよびＮカテゴリーの種々の組合せが病期に組み合わせられる。これらの病期は、同様の予後を有し、同様の手法において治療される腫瘍タイプを同定する。表１に記載の通り、遠隔転移を有する腫瘍（即ち、Ｍ１カテゴリーの癌）は、リンパ節併発の腫瘍サイズに関係なく、ＩＶ期とみなされる。」ＮＣＣＮインターネットウェブサイトからの以下の表は、ＮＳＣＬＣについての組み合わせられたカテゴリーおよび病期分類を示す。
【００１３】
【表１】
2011517573.tif 000002
【００１４】
より低い病期数を有するＮＳＣＬＣ患者は、一般に、より良好な予後および生存の見込みを有し、これらの患者は、一般に、腫瘍の外科的切除により治療される。しかしながら、早期患者、例えばＩＢ期、ＩＩＡまたはＩＩＢ期のＮＳＣＬＣの患者であっても、これらの患者のかなりの割合が、外科的切除後に、より侵攻性疾患を再発し、死亡する。現在の臨床診断方法は、早期ＮＳＣＬＣの予後を、より再発しやすいこれらの患者に対してより集中的な治療を進めるほど高精度に同定することができない。従って、ネオアジュバントもしくはアジュバント化学療法を受けるべき、またはさらには外科的切除を完全に省くべき、リスクがより高い早期ＮＳＣＬＣ患者を同定するための、より良好なインビトロ診断方法が必要とされている。
【００１５】
ＮＳＣＬＣ患者のための化学療法の選択において使用される、蛍光標識ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを使用する蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に基づく染色体異常を同定するための分子インビトロ診断アッセイが開示されている、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８８７９「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｔｏ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」，Ｍ．Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌを参照のこと。ＦＩＳＨアッセイは、ＮＳＣＬＣ用の最初の診断アッセイとしても使用されている、参照により全体として本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２００６００６３１９４、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６年３月２３日公開）（以下、「Ｍｏｒｒｉｓｏｎ‘１９４」と称する。）を参照のこと。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ‘１９４出願は、スクリーニングおよびＮＳＣＬＣの診断に有用な複数のＦＩＳＨプローブセットを記載しており、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ‘１９４に記載の１種のプローブセットは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から、臨床診断アッセイを製造するための臨床検査室により使用されるＡＳＲ（分析物特異試薬）標識下のＬＡＶｙｓｉｏｎ（商標）プローブセットとして市販されている。Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  ＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎのＡＳＲ標識の条件下で、ＡＳＲ標識はＡＳＲの医学的有用性に関するいかなる請求をも含んではならない。ＬＡＶｙｓｉｏｎ  ＡＳＲプローブセットは、４種のＦＩＳＨプローブを含む：ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ緑色フルオロフォアにより標識されている染色体５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ黄色フルオロフォアにより標識されている染色体８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ青色フルオロフォアにより標識されている６番染色体列挙プローブおよびＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ赤色フルオロフォアにより標識されている染色体７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ。
【００１６】
複数の研究刊行物は、ＬＡＶｙｓｉｏｎプローブセットを使用して実施された研究を記載している、例えば、Ｍ．Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ  ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｐｕｔｕｍ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２４，Ｉｓｓｕｅ４，２００４：２４４−２５１；Ｋ．Ｈａｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂｒｏｎｃｈｏｓｃｏｐｉｃ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」，Ｃｈｅｓｔ，２００６；１３０：６９４−７０１；およびＩ．Ｚｕｄａｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｉｎｅ  ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｅｓ」，Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐｈａｔｈｏｌ．（２００８）２３：３３−４０を参照のこと。さらに、総説記事Ｋ．Ｈａｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ」．Ｈｕｍ．Ｐａｔｈ．（２００７）３８：１１３７−１１４４を参照のこと。ＮＳＣＬＣ用ＦＩＳＨアッセイについてのこれらの先行特許出願または刊行物は、早期ＮＳＣＬＣ、特にＩＢ期またはＩＩ期と分類されたＮＳＣＬＣについての予後をより正確に同定するためにＦＩＳＨプローブの使用を開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８８７９
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／００６３１９４号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｍ．Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ  ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｐｕｔｕｍ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２４，Ｉｓｓｕｅ  ４，２００４：２４４−２５１
【非特許文献２】Ｋ．Ｈａｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｂｒｏｎｃｈｏｓｃｏｐｉｃ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」，Ｃｈｅｓｔ，２００６；１３０：６９４−７０１
【非特許文献３】Ｉ．Ｚｕｄａｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｉｎｅ  ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｅｓ」，Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐｈａｔｈｏｌ．（２００８）２３：３３−４０
【非特許文献４】Ｋ．Ｈａｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ」．Ｈｕｍ．Ｐａｔｈ．（２００７）３８：１１３７−１１４４
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、（ａ）ヒトからの生物試料を提供すること；（ｂ）生物試料を、染色体５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、染色体８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、６番染色体列挙プローブおよび染色体７ｐ１２遺伝子座特異的プローブからなる群から選択される少なくとも２種のプローブを含む染色体プローブのセットと、存在する場合に試料中の染色体へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする十分な条件下で接触させること；（ｃ）プローブにより標的とされる各染色体遺伝子座に存在する染色体コピー数異常を同定すること；ならびに（ｄ）工程（ｃ）において同定された染色体コピー数異常に基づき、対象における早期非小細胞肺癌の予後を決定することを含む、ヒトにおける早期非小細胞肺癌の予後を決定する方法を提供する。本発明は、これらの４種の特異的染色体遺伝子座の少なくとも２種からの異常染色体コピー数パターンの検出が、外科的切除後により再発しやすいこれらの早期ＮＳＣＬＣ患者をより正確に同定するために使用することができるという知見に基づく。本出願人は、患者を良好な（再発しなかった、または術後３年以内に再発しなかった。）、および不良な（術後１年以内、または１から３年の間に再発した。）予後に分ける、患者試料におけるコピー数異常パターンに基づく早期ＮＳＣＬＣの５種の異なる分類を同定した。好ましくは、生物試料は、肺腫瘍組織生検物または切除物であり、この試料は早期癌、例えば、ＴＮＭ病期分類システムを使用してＩＢ期、ＩＩＡ期またはＩＩＢ期のいずれかなどとして分類されている。本発明は、好ましくはインサイチューハイブリダイゼーション、より好ましくは、これらの遺伝子座のそれぞれにおけるコピー数を決定するための蛍光標識核酸プローブまたは核酸類縁体を含む蛍光標識プローブを用いる蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用する。本発明は特に、早期ＮＳＣＬＣ患者についての改善された予後情報の提供に有益であり、癌再発のリスクがより高いこれらの早期ＮＳＣＬＣ患者のための改善された治療選択を可能にする。
【００２０】
ＬＡＶｙｓｉｏｎ  ＡＳＲプローブセットを用いるＦＩＳＨアッセイは、６０人の患者のコホートにおける早期ＮＳＣＬＣ用の予後ツールとしてのパラフィン包埋ＮＳＣＬＣ腫瘍生検試料において染色体コピー数異常を評価するために使用し、これらの患者は全員、化学療法を用いず手術により治療されていた。このコホートにおいて、１６人の患者は術後１年以内に再発性肺癌を発症し；４人は術後１から３年の間に再発性肺癌を発症し；１６人は術後３年以上経って再発性肺癌を発症し；２４人は再発性肺癌を発症しなかった（術後の追跡は少なくとも３４．５ヵ月であった。）。種々の分類指標は、ＬＡＶｙｓｉｏｎ  ＦＩＳＨアッセイにより決定された染色体コピー数異常に由来した。各分類指標についてのカットオフ値の範囲は患者を２種の群に分類するために使用し、この２種の群における癌の再発までの時間を分割表（両側Ｆｉｓｃｈｅｒ正確検定ｐ値）およびＫａｐｌａｎ  Ｍｅｙｅｒ分析（ログランクｐ値）により比較した。術後３年以内に進行した患者（不良な予後）を、進行しなかった、もしくは術後３年以上経って進行した患者（良好な予後）と比較した場合、または進行までの時間（ＴＴＲ）の中央値の時間を分類指標により区別された患者群間で比較した場合、予後と強く関連する５種のＦＩＳＨ分類指標を見出した。これらの分類指標は：（ｉ）ＦＩＳＨシグナルの最大数を有する染色体遺伝子座におけるＦＩＳＨシグナルから、ＦＩＳＨシグナルの最小数を有する染色体遺伝子座におけるＦＩＳＨシグナルを引いた、少なくとも３のＦＩＳＨプローブシグナルの差を細胞ベースで示す、細胞のレンジ（Ｒａｎｇｅ）（以下、レンジ３（Ｒａｎｇｅ３）と称する。）；（ｉｉ）ＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失、即ち、ＥＧＦＲ  ＦＩＳＨプローブシグナルより小さいＭＹＣ  ＦＩＳＨプローブシグナルを示す細胞の百分率；（ｉｉｉ）レンジ３、およびＣＥＰ６についてのＦＩＳＨプローブシグナルに対するＭＹＣ  ＦＩＳＨプローブシグナルの相対損失を示す細胞の百分率（ＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失）（例えば、１３％未満）の組合せ；（ｉｖ）ＭＹＣ  ＦＩＳＨプローブシグナルと５ｐ１５ＦＩＳＨプローブシグナルとの全体比（ＭＹＣ／５ｐ１５比、列挙された細胞内の全てのＭＹＣプローブシグナルの合計を列挙された細胞内の全ての５ｐ１５シグナルの合計で割ったものに等しい。）および５ｐ１５ＦＩＳＨプローブシグナルとＣＥＰ６ＦＩＳＨプローブシグナルとの全体比（５ｐ１５／ＣＥＰ６比、列挙された細胞内の全ての５ｐ１５プローブシグナルの合計を列挙された細胞内の全てのＣＥＰ６シグナルの合計で割ったものに等しい。）の組合せ；ならびに（ｖ）評価細胞のプローブシグナル差の平均範囲およびレンジ３パターンの組合せである。これらの５種の分類指標のそれぞれは、良好および不良な予後への患者の統計的に有意な分類を提供し、ｐ値はｐ＝０．００３５（レンジ３）；ｐ＝０．０３４６（ＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失）；ｐ＝０．０００８（レンジ３およびＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失；ｐ＝０．００２６（ＭＹＣ／５ｐ１５および５ｐ１５／ＣＥＰ６比）；およびｐ＝０．０００１（プローブシグナル差の平均範囲およびレンジ３）（最適な閾値（カットオフとも称される。）が���明細書に記載の各パラメーターに適用された場合）である。レンジ３群における進行までの時間の中央値は、より大きい細胞百分率を有する群およびより小さい細胞百分率を有する群（カットオフ＝４２％の細胞）について、それぞれ１２１および１４．５ヵ月であり；ｐ＝０．００３５であった。ＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失群における進行までの時間の中央値は、より大きい細胞百分率を有する群およびより小さい細胞百分率を有する群（カットオフ＝４２％の細胞）について、それぞれ、１１３および５３．３ヵ月であり；ｐ＝０．０３４６であった。レンジ３およびＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失群における進行までの時間の中央値は、他の患者と比較してレンジ３（カットオフ＝４５％）およびＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失（カットオフ＝１３％）の両方のより低い百分率を有する患者について、それぞれ１０．１および７８．８ヵ月であり；ｐ＜０．０００１であった。ＭＹＣ／５ｐ１５および５ｐ１５／ＣＥＰ６比群における進行までの時間の中央値は、他の患者と比較してＭＹＣ／５ｐ１５（カットオフ＝０．８）および５ｐ１５／ＣＥＰ６（カットオフ＝１．１）の両方のより高い比を有する患者について、それぞれ２２．７および１２１ヵ月であり；ｐ＝０．００４６であった。プローブシグナル差の平均範囲およびレンジ３群における進行までの時間の中央値は、他の患者と比較して高い平均範囲（カットオフ＝２．５）および低いレンジ３（カットオフ＝４２％の細胞）を組み合わせて有する患者について、それぞれ９．８６および８３．１ヵ月であり；ｐ＜０．０００１であった。従って、本発明の方法は、早期ＮＳＣＬＣについての顕著に改善された予後情報を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】レンジ３パターンにより分類された早期ＮＳＣＬＣの６０人の患者コホートについての肺癌再発までの時間を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線である。
【図２】ＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失パターンにより分類された早期ＮＳＣＬＣの６０人の患者コホートについての肺癌再発までの時間を示す曲線である。
【図３】レンジ３パターンおよびＭＹＣ／ＣＥＰ６比パターンの組合せにより分類された早期ＮＳＣＬＣの６０人の患者コホートについての肺癌再発までの時間を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線である。
【図４】レンジ３パターンおよびＭＹＣ／ＣＥＰ６比パターンの組合せ（ただし、ＭＹＣ／ＣＥＰ６パターンを有するパーセント細胞のより高いカットオフを有する。）により分類された早期ＮＳＣＬＣの６０人の患者コホートについての肺癌再発までの時間を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線である。
【図５】ＭＹＣ／５ｐ１５比パターンおよび５ｐ１５／ＣＥＰ６比パターンの組合せにより分類された早期ＮＳＣＬＣの６０人の患者コホートについての肺癌再発までの時間を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線である。
【図６】プローブシグナル差の平均範囲およびレンジ３パターンの組合せにより分類された早期ＮＳＣＬＣの６０人の患者コホートについての肺癌再発までの時間を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ＮＳＣＬＣ予後。本発明は、早期癌と分類されたＮＳＣＬＣ患者、特に、広範に使用されるＴＮＭ病期分類システムを使用してＩＢ期、ＩＩＡ期またはＩＩＢ期（ＩＩＡおよびＩＩＢ期は、まとめてＩＩ期と呼ばれる。）と分類されたＮＳＣＬＣ患者の予後を決定する方法を含む。他の診断分類に基づく代替的なＮＳＣＬＣ病期分類システムは、組織試料を本発明の方法により評価分析することができる患者を同定するために使用することができる。本明細書に使用される早期ＮＳＣＬＣは、１つ超のリンパ節に転移しておらず、他のどの器官にも転移していないＮＳＣＬＣ腫瘍を指す。早期ＮＳＣＬＣ患者は、大部分が、完全な腫瘍除去を求める外科的切除により治療されるのが常であり、腫瘍が完全に切除されたとさえ考えられるこれらの早期患者について、再発の顕著なリスクが依然として存在する。現在の診断様式では、これらの早期癌のどの癌が再発のリスクが高いか、ひいては切除後にアジュバント化学療法により治療すべきか、または切除前にネオアジュバント化学療法を使用して治療すべきかを正確に予測することができない。本発明は、患者試料中の染色体コピー数をこれらの４種のコピー数の評価：３種の異なる染色体遺伝子座：５ｐ１５、７ｐ１２および８ｑ２４、ならびに６番染色体のコピー数の少なくとも２種測定することにより、リスクがより高いこれらの早期患者の予後同定を提供する。本明細書における目的のため、良好な予後を有する早期ＮＳＣＬＣ患者は、患者腫瘍の外科的切除後３年以内に癌の再発または進行がなかったと決定された患者であり、不良な予後を有する早期ＮＳＣＬＣ患者は、患者腫瘍の外科的切除後３年以内に癌の再発または進行があったと決定された患者である。
【００２３】
ＬＡＶｙｓｉｏｎ  ＡＳＲプローブセットを用いるＦＩＳＨアッセイは、６０人の患者のコホートにおける早期ＮＳＣＬＣ用の診断ツールとしてのパラフィン包埋ＮＳＣＬＣ腫瘍生検試料において染色体コピー数異常を評価するために使用し、これらの患者は全員、化学療法を用いず手術により治療されていた。このコホートにおいて、１６人の患者は術後１年以内に再発性肺癌を発症し；４人は術後１から３年の間に再発性肺癌を発症し；１６人は術後３年以上経って再発性肺癌を発症し；２４人は再発性肺癌を発症しなかった（術後の追跡は少なくとも３４．５ヵ月であった。）。術後３年以内に進行した患者（不良な予後）を、進行しなかった、もしくは術後３年以上経って進行した患者（良好な予後）と比較した場合、または進行までの時間（ＴＴＲ）の中央値の時間を分類指標により区別された患者群間で比較した場合、予後と強く関連する、４種のプローブＬＡＶｙｓｉｏｎセットを使用して同定された染色体コピー数異常パターンに基づく５種の別個の分類指標を見出した。
【００２４】
これらの５種の分類指標は、組織試料の４０から１２０個の細胞における４種のプローブからのハイブリダイゼーションパターンを分析するために使用した。分類指標は：（ｉ）ＦＩＳＨシグナルの最大数を有する染色体遺伝子座におけるＦＩＳＨシグナルからＦＩＳＨシグナルの最小数を有する染色体遺伝子座におけるＦＩＳＨシグナルを引いた少なくとも３のＦＩＳＨプローブシグナルの差を細胞ベースで示す細胞のレンジ３パターン；（ｉｉ）７ｐ１２（ＥＧＦＲ）ＦＩＳＨプローブシグナルより小さい８ｑ２４（ＭＹＣ）ＦＩＳＨプローブシグナルを示す細胞の百分率を評価する８ｑ２４／７ｐ１２％損失パターン（本明細書においてＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失パターンとも称される。）；（ｉｉｉ）レンジ３パターン、およびＣＥＰ６についてのＦＩＳＨプローブシグナルに対する８ｑ２４（ＭＹＣ）ＦＩＳＨプローブシグナルの相対損失を示す細胞の約１３％未満の８ｑ２４／６番セントロメア比パターン（本明細書においてＭＹＣ／ＣＥＰ６比パターンとも称される。）の組合せ；（ｉｖ）≧０．８０の８ｑ２４遺伝子座シグナルと５ｐ１５遺伝子座シグナルとの比を示す８ｑ２４／５ｐ１５比パターン（本明細書においてＭＹＣ／５ｐ１５比パターンとも称される。）、および≧１．１の５ｐ１５ＦＩＳＨプローブシグナルとＣＥＰ６ＦＩＳＨプローブシグナルとの相対比を有する細胞の百分率を評価する５ｐ１５／６番セントロメア比（本明細書において５ｐ１５／ＣＥＰ６比パターンとも称される。）と、＜０．８０のＭＹＣ／５ｐ１５比または５ｐ１５／ＣＥＰ６＜１．１；ならびに（ｖ）約２．５以上のプローブシグナル差の平均範囲（本明細書においてアベレージシグナルレンジ（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｒａｎｇｅ））と細胞の約４２％未満のレンジ３パターンとの組合せである。これらの５種の分類指標のそれぞれは、良好および不良な予後への患者の統計的に有意な分類を提供し、ｐ値はｐ＝０．００３５（レンジ３）；ｐ＝０．０３４６（ＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失）；ｐ＝０．０００８（レンジ３およびＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失；ｐ＝０．００２６（ＭＹＣ／５ｐ１５比および５ｐ１５／ＣＥＰ６比）；およびｐ＝０．０００１（アベレージシグナルレンジおよびレンジ３）である。レンジ３群における進行までの時間の中央値は、それぞれ１２１および１４．５ヵ月であった（ｐ＝０．００３５）。ＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失群における進行までの時間の中央値は、それぞれ１１３および５３．３ヵ月であった（ｐ＝０．０３４６）。レンジ３および相対ＭＹＣ／ＣＥＰ６比群における進行までの時間の中央値は、それぞれ１０．１および７８．８ヵ月であった（ｐ＜０．０００１）。ＭＹＣ／５ｐ１５および５ｐ１５／ＣＥＰ６比群における進行までの時間の中央値は、それぞれ２２．７および１２１ヵ月であった（ｐ＝０．００４６）。アベレージシグナルレンジおよびレンジ３群における進行までの時間の中央値は、それぞれ９．８６および８３．１ヵ月であった（ｐ＜０．０００１）。従って、本発明の方法は、早期ＮＳＣＬＣについての顕著に改善された予後情報を提供することができる。
【００２５】
本発明の早期ＮＳＣＬＣの予後同定は、患者から得られた適切な生物試料について、患者試料中の染色体異常の存在およびパターンを確定するためのインサイチューハイブリダイゼーションにより行われる。一般に、インサイチューハイブリダイゼーションは、生物試料を固定する工程、１種以上の染色体プローブを、固定試料中に含有される標的ＤＮＡにハイブリッド形成させる工程、洗浄して非特異的結合プローブを除去する工程およびハイブリッド形成されたプローブを検出する工程を含む。インサイチューハイブリダイゼーションは、液体懸濁液中の生物試料からの検体細胞を用いて実施し、次いでフローサイトメトリーにより検出することもできる。
【００２６】
本発明のＮＳＣＬＣ予後の同定は、他の予後インビトロ診断アッセイ、例えば、好適なタンパク質、例えば、ＥＧＦＲ、ｐＡＫｔおよびＰＴＥＮの患者試料における発現の評価を用いて使用することもできる。試料にこのようなタンパク質の発現と、不良なアウトカム（悪い予後）と関連する異常染色体コピー数パターンとが同時に見出される患者は、より集中的な術後治療、例えば化学療法を受ける資格があり得る。
【００２７】
染色体プローブ。異常コピー数パターン（異数染色体性（ａｎｅｕｓｏｍｙ）または多染色体性）を検出するための、本発明により利用されるインサイチューハイブリダイゼーション法において使用される好適なプローブは、６番染色体に対する染色体列挙プローブおよび３種の染色体遺伝子座特異的プローブの組合せであり、各プローブは他のプローブから区別可能にするために標識されている。染色体列挙プローブは、染色体領域、通常は繰り返し配列領域にハイブリッド形成し、標的の６番染色体の存在または不存在を示す。当分野において周知の通り、染色体列挙プローブは、セントロメア近傍もしくはセントロメアから離れて局在する反復配列にハイブリッド形成することができ、または染色体上の任意の位置に局在するユニーク配列にハイブリッド形成することができる。例えば、染色体列挙プローブは、染色体のセントロメアと会合している反復ＤＮＡとハイブリッド形成することができる。霊長類染色体のセントロメアは、αサテライトＤＮＡと称される約１７１の塩基対のモノマーリピート長からなるＤＮＡの長いタンデムリピートの複雑なファミリーを含有する。特異的染色体列挙プローブの非限定的な例は、６番染色体用のＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａＭＣＥＰ（登録商標）６プローブ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．）である。このプローブは、ＬＡＶｙｓｉｏｎプローブセットに含まれ、実施例に記載されている。
【００２８】
６番染色体のコピー数を列挙するためのプローブは、染色体５ｐ１５、７ｐ１２および８ｑ２４のそれぞれにおけるコピー数異常を検出するための遺伝子座特異的プローブとともに、例えばこれらの遺伝子座の増幅および／または多染色体性の状態を決定するために使用される。遺伝子座特異的プローブは、染色体上の特異的非反復遺伝子座にハイブリッド形成する。７ｐ１２プローブはＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも一部を含むこと、および８ｑ２４プローブはＣ−ＭＹＣ遺伝子の少なくとも一部を含むことが好ましい。好ましい遺伝子座特異的プローブは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃから市販されているＶｙｓｉｓ  ＬＳＩ  Ｄ５Ｓ７２１、Ｄ５Ｓ２３  ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎプローブ（５ｐ１５．２）、Ｖｙｓｉｓ  ＬＳＩ  ＥＧＦＲ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅプローブ（７ｐ１２）およびＬＳＩ  ＭＹＣ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎプローブ（８ｑ２４）である。
【００２９】
セントロメアＤＮＡとハイブリッド形成するプローブは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から市販されている。または、プローブは、周知の技術を使用して非市販物として作製することができる。ＤＮＡプローブの構築において使用されるＤＮＡの源は、ゲノムＤＮＡ、クローン化ＤＮＡ配列、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト染色体の１種または一部を宿主の正常染色体相補対とともに含有する体細胞ハイブリッド、ならびにフローサイトメトリーまたは顕微解剖により精製された染色体を含む。対象の領域は、クローン化を介して、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する部位特異的増幅より単離することができる。例えば、Ｎａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ，１９９８，７３（１）：６−２２；Ｗｈｅｅｌｅｓｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１９９４，１７：３１９−３２７；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４９１，２２４を参照のこと。有用な遺伝子座特異的プローブを製造するために使用される出発ヒトＤＮＡは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚにより維持されているＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅデータベースからの遺伝子座についての核酸配列を得、次いでこの配列を使用し、例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより維持されているＢＡＣヒトＤＮＡライブラリーをインシリコで選別して有用なＢＡＣクローンを同定することにより得ることができる。核酸類縁体、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブから作製された合成オリゴＤＮＡプローブも使用することができる。
【００３０】
本発明において使用されるプローブにより検出される染色体領域のサイズは、例えば、上記のαサテライト１７１塩基対プローブ配列から９００，０００個の塩基の大きいセグメントまでの間で変動し得る。直接標識されている遺伝子座特異的プローブは、好ましくは、少なくとも１００，０００個の複雑な塩基であり、参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７５６，６９６に開示の未標識ブロッキング核酸を使用してプローブの非特異的結合を回避する。未標識の合成オリゴ核酸または未標識の核酸類縁体、例えば、ペプチド核酸をブロッキング核酸として使用することも可能である。
【００３１】
染色体プローブは、染色体にハイブリッド形成したときにプローブの検出を容易にする任意の検出部分を含有することができる。効率的な検出部分は、本明細書に記載の直接および間接標識物質の両方を含む。検出可能な標識物質の例は、フルオロフォア（即ち、光を吸収した後に蛍光を発する有機分子）、放射性同位体（例えば、３２Ｐおよび３Ｈ）および発色団（例えば、視覚的に検出可能なマーカーを産生する酵素マーカー）を含む。フルオロフォアが好ましく、標準技術、例えば、ニックトランスレーション、ランダムプライミングおよびＰＣＲ標識により標識ヌクレオチドをプローブ中に導入することによりヌクレオチドに共有結合させた後に直接標識することができる。または、プローブ中のデオキシシチジンヌクレオチドをリンカーによりアミノ基転移させることができる。次いで、フルオロフォアをアミノ基転移されたデオキシシチジンヌクレオチドに共有結合させることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＢｉｔｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４９１，２２４を参照のこと。有用なプローブ標識技術は、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｙ．−Ｓ．Ｆａｎ，Ｅｄ．，Ｃｈａｐ．２，「Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ」．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｐ．２１−４０，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，（著作権）２００２に記載されている。
【００３２】
本明細書に記載の方法において使用することができるフルオロフォアの例は：７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン；フルオレセイン−５−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−（および−６）−イソチオシアナート；５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン；７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸；６−［フルオレセイン５−（および−６）−カルボキサミド］ヘキサン酸；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−３−インダセンプロピオン酸；エオシン−５−イソチオシアナート；エリスロシン−５−イソチオシアナート；５−（および−６）−カルボキシローダミン６Ｇ；ならびにＣａｓｃａｄｅ（商標）ブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）である。ＬＡＶｙｓｉｏｎプローブセットにおいては、セット中の各染色体プローブを区別して可視化することができるように異なる色のフルオロフォアが使用される。
【００３３】
ハイブリダイゼーション後、蛍光顕微鏡および各フルオロフォアに適切なフィルターにより、または複数のフルオロフォアを観察するためのダブルもしくはトリプルバンドパスフィルターセットを使用することによりプローブを見ることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＢｉｔｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７７６，６８８を参照のこと。自動化デジタルイメージングシステム、例えば、ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇから入手可能なシステムを含む任意の好適な顕微鏡イメージング法を、ハイブリッド形成されたプローブを可視化するために使用することができる。または、フローサイトメトリーなどの技術を、染色体プローブのハイブリダイゼーションパターンを試験するために使用することができる。
【００３４】
プローブは、例えば、当分野において周知の手段によりビオチンまたはジゴキシゲニンにより間接的に標識することもできる。しかしながら、この場合、標識されたプローブを可視化するために第２の検出分子またはさらなる処理が要求される。例えば、ビオチンにより標識されたプローブは、検出可能なマーカー、例えば、フルオロフォアに共役されたジエンにより検出することができる。さらに、アビジンは、酵素マーカー、例えば、アルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼに共役させることができる。このような酵素マーカーは、酵素の基質を使用する標準比色反応において検出することができる。アルカリホスファターゼの基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファートおよびニトロブルーテトラゾリウムを含む。セイヨウワサビペルオキシダーゼの基質としては、ジアミノベンジジンを使用することができる。
【００３５】
本発明の方法に有用なプローブおよびプローブセットは、他の試薬と包装し、本発明の方法の実施において使用されるべきキットとすることができる。
【００３６】
好ましいプローブセット。好ましいプローブ組成物は、ＬＡＶｙｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）である。ＬＡＶｙｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉ−ｃｏｌｏｒ  Ｐｒｏｂｅは、４種の直接標識ＤＮＡ  ＦＩＳＨプローブの混合物からなる。ＬＳＩ  ＥＧＦＲ  Ｐｒｏｂｅは、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄにおいて標識されており、全ＥＧＦＲ遺伝子（７ｐ１２）を含有する約３００ｋｂの領域を包含する。ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ標識ＬＳＩ  Ｃ−ＭＹＣ  Ｐｒｏｂｅは、全Ｃ−ＭＹＣ遺伝子（８ｑ２４．１２−ｑ２４．１３）を含有する約７５０ｋｂの領域を包含する。ＬＡＶｙｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉ−ｃｏｌｏｒ  Ｐｒｏｂｅは、５ｐ１５．２における約４５０ｋｂの領域を包含するＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ標識ＬＳＩ  Ｄ５Ｓ２３、Ｄ５Ｓ２７１も含有する。最後の成分は、６番染色体のセントロメア（６ｐ１１．１−ｑ１１）に局在するαサテライトＤＮＡ領域にハイブリッド形成するＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａにおいて標識されているＣＥＰ６プローブである。このプローブセットは、好適なハイブリダイゼーション緩衝液中で予備混合されて市販されている。ＬＡＶｙｓｉｏｎ  Ｓｅｔ中の個々のプローブは、単一のＡＳＲ標識プローブとしてＡｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃからそれぞれ市販されている。
【００３７】
試料の調製。生物試料は、患者試料からの細胞含有抽出物を含む、細胞または細胞材料を含有する試料である。例えば、肺試料は、典型的には、限定されるものではないが、肺実質、細気管支、気管支（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ）、気管支（ｂｒｏｎｃｈｉ）および気管を含む肺構造由来の細胞または細胞材料である。肺癌の検出に有用な生物試料の非限定的な例は、気管支検体、切除された肺組織、肺生検物および痰試料を含む。気管支検体の例は、気管支分泌物、洗液、洗浄物、吸引物およびブラシ掻き落とし物を含む。肺生検物は、手術、気管支鏡、穿刺吸引（ＦＮＡ）および経胸郭針生検を含む方法により得ることができる。一例において、捺印標本を肺生検物から作製することができる。本発明のアッセイは、早期ＮＳＣＬＣ患者からの血液試料に由来する循環腫瘍細胞試料について実施することもできる。循環腫瘍細胞試料は、Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎから入手可能な免疫磁気分離技術を使用して調製することができる。
【００３８】
組織は、固定剤、例えば、ホルムアルデヒドにより固定し、次いでパラフィン中に包埋することができる。次いで、切片をミクロトームを使用して切断し、顕微鏡スライドに適用する。細胞検体は、ＦＮＡ、気管支洗液、気管支洗浄物もしくは痰に由来する細胞懸濁液、または播種された組織細胞から調製することができる。細胞検体は、エタノールまたはメタノール：酢酸中での細胞の固定を、細胞遠心分離（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、薄層堆積法（例えば、ＴｈｉｎＰｒｅｐ、Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐ．）、塗抹または顕微鏡スライド上へのピペット滴下と組み合わせることにより調製することができる。さらに、生物試料は、滲出液、例えば、胸膜滲出液、心膜滲出液または腹膜滲出液を含むことができる。
【００３９】
ハイブリダイゼーション法。任意の好適なインサイチューハイブリダイゼーション法を使用することができる。インサイチューハイブリダイゼーション前に、染色体プローブおよび細胞内に含有される染色体ＤＮＡをそれぞれ変性させる。染色体プローブを一本鎖核酸として調製する場合、プローブの変性は要求されない。変性は、典型的には、高ｐＨ、加熱（例えば、約摂氏７０度から約摂氏９５度までの温度）、有機溶媒、例えば、ホルムアミドおよびハロゲン化テトラアルキルアンモニウムまたはこの組合せの存在下で温置することにより実施する。例えば、染色体ＤＮＡは、約摂氏７０度（例えば、約摂氏７３度）の温度、ならびに７０％のホルムアミドおよび２．×ＳＳＣ（０．３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）を含有する変性緩衝液の組合せにより変性させることができる。変性条件は、典型的には、細胞形態が保存されるように確定する。例えば、染色体プローブは、加熱により、例えば、プローブを約摂氏７３度に約５分間加熱することにより変性させることができる。
【００４０】
変性化学物質または条件を除去した後、プローブをハイブリッド形成条件下で染色体ＤＮＡにアニール化させる。「ハイブリッド形成条件」は、プローブおよび標的染色体ＤＮＡの間のアニーリングを容易にする条件である。ハイブリダイゼーション条件は、濃度、塩基組成、複雑度およびプローブの長さ、ならびに塩濃度、温度および温置の長さに応じて変動する。例えば、インサイチューハイブリダイゼーションは、典型的には、１−２．×．ＳＳＣ、５０から５５％のホルムアミド、ハイブリダイゼーション促進剤（例えば、１０％の硫酸デキストラン）および非特異的ハイブリダイゼーションを抑制するための未標識ブロッキングＤＮＡを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中で実施する。一般に、ハイブリダイゼーション条件は、上述の通り、約摂氏２５度から約摂氏５５度の温度および約０．５時間から約９６時間の温置の長さを含む。さらに特定すると、ハイブリダイゼーションは、約摂氏３２度から約摂氏４５度において、約２から約１６時間実施することができる。
【００４１】
標的領域外のＤＮＡへの染色体プローブの非特異的結合は、塩溶液による一連の洗浄により排除することができる。各洗浄における温度および塩濃度は、所望のストリンジェンシーに依存する。例えば、高ストリンジェンシー条件については、約摂氏６５度から約摂氏８０度において、０．２．×から約２．Ｘ．ＳＳＣおよび非イオン性界面活性剤、例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）約０．１％から約１％を使用して洗浄を実施することができる。ストリンジェンシーは、洗浄の温度を低下させることにより、または洗浄中の塩濃度を増加することにより低めることができる。
【００４２】
蛍光標識された４色プローブのプローブ組成物を使用する好ましい方法は、以下の実施例セクションに記載する。組織試料へのプローブのハイブリダイゼーションは、手作業で、または装置、例えば、ＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅハイブリダイゼーションオーブン、ＶＰ２０００ＰｒｏｃｅｓｓｏｒまたはＸＭａｔｒｉｘ（商標）処理装置（全て、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．から市販）を一助として実施することができる。
【００４３】
細胞の予備選択。細胞試料は、種々の方法により、種々の基準を使用して予め評価することができる。本明細書に記載のプローブおよび方法は、特定のスクリーニング法を用いる使用法に限定されるものではない。一例は、観察者が例えばＤＡＰＩフィルターにより見られるような細胞学的異常について細胞数百から数千を走査する「走査法」である。評価細胞の数は、患者毎に変動する検体の細胞充実性に依存する。形成異常および新生物性細胞と一般に関連しているが常に関連しているわけではない細胞学的異常は、核腫大、核不整および異常なＤＡＰＩ染色（まだらであり、色がより薄いことが多い。）を含む。走査工程において、観察者は、好ましくは、（ＦＩＳＨにより実証されるような）染色体異常についての細胞の評価を細胞学的異常も示す細胞に対して焦点を当てる。さらに、染色体異常は細胞学的異常の不存在下でも起きるので、明白な細胞学的異常を有さない細胞の割合を評価することができる。この走査法は、参照により本明細書に組み込まれるＨａｌｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，１７４，６８１にさらに詳細に記載されている。肺癌細胞は、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．によるＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂ．２００３／００８７２４８Ａ１に記載の方法を使用して評価用に選択することができる。
【００４４】
検体の領域は、慣用の染色剤、例えば、ヘマトキシリンおよびエオシンを含有する染色剤を使用して評価用に選択することもできる。例えば、病理学者はパラフィン包埋検体の切片をヘマトキシリン／エオシン染色剤により染色し、ある領域を組織形態および染色パターンにより癌性の可能性があると同定し、この領域をフェルト製の先端を有するインクペンまたはガラス筆記具により輪郭書きすることができる。次いで、マークされた領域をパラフィン包埋検体の連続切片上の対応する位置にガラス筆記具により転写し、ＦＩＳＨをこのスライド上で実施する。次いで、筆記された領域内の細胞をＦＩＳＨシグナルについて評価する。
【００４５】
染色体異常の分類パターンの検出。異常な細胞は、染色体コピー数異常の１種以上のパターンの存在を特徴とする。患者試料の細胞内のコピー数異常パターンの存在は、細胞内の染色体プローブのハイブリダイゼーションパターン（例えば、各プローブについてのシグナル数）を試験し、シグナル数を記録することにより評価する。異数染色体性は、典型的には、染色体全体の、または染色体上の遺伝子座のいずれかの異常なコピー数を意味するものとする。異常なコピー数は、欠失とも称される常染色体の一染色体性（１コピー）および零染色体性（０コピー）の両方を含み、２コピーより多く、特定の染色体遺伝子座については遺伝子増幅と称される場合がある（または、増幅は、遺伝子コピー数が、遺伝子が含有される染色体のコピー数を超過する状況のために保留される。）。しかしながら、パラフィン包埋検体の切片化（典型的には４から６μｍ）が細胞核のトランケーションをもたらし得るので、一部の細胞については細胞当たりのＦＩＳＨシグナル数がインタクトな核における実際のコピー数より幾分低い。本発明の５種の分類指標においては、各プローブについての特定のＦＩＳＨプローブハイブリダイゼーションシグナルの絶対数を決定し、次いで種々の比の比較において使用する。
【００４６】
試験試料は、臨床診断に十分な細胞の任意数を含むことができ、好ましいパラフィン包埋組織試料中で、ハイブリダイゼーションパターンを典型的には約２０から約２００個の細胞内で評価する。ハイブリダイゼーションパターンを試料当たり約４０から約１２０個の細胞において評価することが好ましい。
【００４７】
レンジ３分類指標は、ＦＩＳＨシグナル＞３の範囲（即ち、細胞ベースで、ＦＩＳＨシグナルの最大数を有する遺伝子座からＦＩＳＨシグナルの最小数の有する遺伝子座を引いたもの）の含有する細胞の百分率を決定した。レンジ３分類指標は、任意の特定のＦＩＳＨシグナルを信頼するのではなく、シグナルの最大数から最小数の各細胞における比較であった。ハイブリダイゼーションシグナルの最大数を有するプローブからハイブリダイゼーションシグナルの最小数を有するプローブの間で３超のシグナルの差を細胞ベースで示す４２％の細胞のカットオフを使用するレンジ３は、患者を３６人の群（≧４２％の細胞）（これらの患者の２９人（８０．６％）が良好な予後を有した。）および２４人の群（＜４２％の細胞）（１１人（４５．８％）のみが良好な予後を有した。）に分割することができた（ｐ＝０．０１１）。前者および後者の群における進行までの時間の中央値は、それぞれ１２１および１４．５ヵ月であった（ｐ＝０．００３５）。図１は、レンジ３分類指標により同定された良好および不良な患者予後群についての肺癌再発までの時間のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットである。
【００４８】
ＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失パターン分類指標は、ＥＧＦＲプローブからのシグナルに対するＭＹＣプローブシグナルの相対損失を示す細胞の数の比を当てにする。ＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失は、ＥＧＦＲシグナルより小さいＭＹＣシグナルを示す細胞の百分率であった。３１％の細胞のカットオフを使用するＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失分類指標は、患者を２５人の群（≧３１％の細胞）（２０人（８０．０％）が良好な予後を有した。）および３５人の群（２０人（５７．１％）が良好な予後を有した。）に分割することができた（ｐ＝０．０９６）。前者および後者の群における進行までの時間の中央値は、それぞれ１１３および５３．３ヵ月であった（ｐ＝０．０３４６）。図２は、ＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失分類指標により同定された良好および不良な患者予後群についての肺癌再発までの時間のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットである。
【００４９】
レンジ３パターンとＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失パターンとの組合せを評価した。ＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失は、ＣＥＰ６シグナルより小さいＭＹＣシグナルを示す細胞の百分率であった。レンジ３パターンが細胞の＜４５％に存在し、ＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失パターンが細胞の＜１３％に存在する場合、６人（コホートの１０％）の患者の群（６人全員が不良な予後を有した（全員１５ヵ月以内に進行））が同定される。残り５４人の患者（レンジ３パターンが≧４５％の細胞に存在し、またはＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失が≧１３％の細胞に存在する。）のうち、４０人（７４．１％）が良好な予後を有した（ｐ＝０．０００８）。前者および後者の群における疾患再発までの時間の中央値は、それぞれ１０．１および７８．８ヵ月であった（ｐ＜０．０００１）。図３は、レンジ３およびＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失分類指標の組合せにより同定された良好および不良な患者予後群についての肺癌再発までの時間のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットである。図４は、レンジ３およびＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失分類指標（ただし、ＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失パターンを有する細胞のより高いパーセントのカットオフを使用）の組合せにより同定された良好および不良な患者予後群についての肺癌再発までの時間のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットである。
【００５０】
ＭＹＣ／５ｐ１５全シグナル比＞０．８および５ｐ１５／ＣＥＰ６全体比＞１．１の組合せも、統計的に有意な予後分類を提供した。全体比は、検体中で列挙された全ての細胞にわたるＭＹＣプローブについてのシグナルを合計し、検体中で列挙された全ての細胞にわたる５ｐ１５プローブについてのシグナルの合計で割ることにより得る。この組合せの分類指標は、２８人の患者の群（１３人（４６．４％）が良好な予後を有した。）を同定した。残り３２人の患者（０．８０未満のＭＹＣ／５ｐ１５シグナル比を有する患者または５ｐ１５／ＣＥＰ６シグナル比＜１．１を有する患者）のうち、２７人（８４．４％）が良好な予後を有した（ｐ＝０．００２６）。前者および後者の群における進行までの時間の中央値は、それぞれ２２．７および１２１ヵ月であった（ｐ＝０．００４６）。図５は、ＭＹＣ／５ｐ１５および５ｐ１５／ＣＥＰ６の組合せの分類指標により同定された良好および不良な患者予後群についての肺癌再発までの時間のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットである。
【００５１】
アベレージシグナルレンジ≧２．５と評価細胞の４２％未満に存在するレンジ３パターンとの組合せも、統計的に有意な分類を提供する。この組合せの分類指標において、アベレージシグナルレンジは、評価組織試料中の細胞の総数を使用して、シグナルの最大数または最小数を有する特定のプローブ標的遺伝子座とは独立して、ハイブリダイゼーションシグナルの最大数を有するプローブからプローブシグナルの最小数を有するプローブの差を各細胞内で決定し、次いで、個々の細胞のシグナルレンジ数を合計し、評価細胞の数で割ってアベレージシグナルレンジ数を出すことにより計算する。２．５以上のアベレージシグナルレンジにおけるカットオフは、細胞の４２％未満のレンジ３シグナルパターンと組み合わせて最良の予後分類をもたらした。この組合せの分類指標は、１２人の患者の群（２人（１６．７％）が良好な予後を有した。）を同定した。残り４８人の患者（アベレージシグナルレンジ＜２．５および細胞の≧４２％のレンジ３パターンを有する患者）のうち、３８人（７９．２％）が良好な予後を有した（ｐ＝０．０００１）。前者および後者の群における進行までの時間の中央値は、それぞれ９．８６および８３．１ヵ月であった（ｐ＜０００１）。
【００５２】
本発明の詳細を以下の実施例においてさらに記載するが、これらの実施例は特許請求されている本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、本明細書の精査に基づき本発明の変更および改変が明らかになり得ることを認識する。従って、本明細書に記載の実施形態のこのような改変および変更を本発明の範囲または精神から逸脱することなく提供することが目的である。
【００５３】
実施例
実験方法
検体。６０人のＮＳＣＬＣ患者からの組織検体を、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｕｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）の保管所から入手した。全ての患者は、Ｉｂ期またはＩＩ期と診断されており、いかなる追跡またはネオアジュバント化学療法も用いず外科的切除により治療されていた。チャートレビューおよび研究分析は、ＲＵＭＣ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより許可された。保管材料中の早期ＮＳＣＬＣの診断は、病理報告から得た。肺癌の再発までの時間は、患者のチャートから得た。６０人の患者のうち、１６人が１年以内に再発性肺癌を罹患し、４人が１から３年の間に再発性肺癌を罹患し、１６人が３年後に再発性肺癌を罹患し、２４人が進行しなかった（３４．５ヵ月の最低限の追跡）。
【００５４】
インサイチューハイブリダイゼーション。ＦＩＳＨによるコピー数分析のため、ＬＡＶｙｓｉｏｎプローブセットを患者検体にハイブリッド形成させた。検体スライドは、Ｖｙｓｉｓ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ＩＩまたはＩＩＩキット（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．）を使用して調製した。調製された検体スライドを、ＨＹＢｒｉｔｅ（商標）自動化同時変性オーブン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．）中で４色プローブ溶液とハイブリッド形成させた。スライドをオーブン表面上に置き、１０μＬのプローブ溶液を組織切片上に積層した。カバーガラスをプローブ溶液上に適用し、スライドにゴムセメントにより密封した。７３℃において５分間変性させた後、プローブを３７℃において１６から１８時間ハイブリッド形成させた。ハイブリダイゼーションおよびゴムセメントシールの除去後、スライドを室温の２×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．３ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、０．３％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０（ＮＰ４０）の中に２から５分間入れてカバーガラスを剥離した。次いで、スライドを７３℃の２×ＳＳＣ、０．３％のＮＰ４０中で２分間浸漬して非特異的に結合したプローブを除去し、次いで暗所で乾燥させた。核の可視化のためにＤＡＰＩＩ退色防止剤溶液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．）を検体に適用した。検体の一部は、最適なＦＩＳＨ結果をもたらすために追加の処理が必要であった。
【００５５】
ＦＩＳＨスライドを、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ落射蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）下で評価した。シグナルを可視化し、核を可視化するためのＤＡＰＩシングルバンドパスフィルターセット、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ標識８ｑ２４プローブを可視化するための金色シングルバンドパスフィルターセット、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ標識ＣＥＰ６プローブを可視化するための青色シングルバンドパスフィルターセット、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ標識７ｐ１２プローブを可視化するための赤色シングルバンドパスフィルターセットおよびＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ標識５ｐ１５プローブを可視化するための緑色シングルバンドパスフィルターセットを用いて計数を実施した（全てのフィルターセットは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．製である。）。悪性腫瘍細胞の形態学的特徴を有する核のみを計数した。スライドを複数回計数した場合、計数を合わせ、ハイブリダイゼーションシグナル比およびシグナルパターンの再計算に使用した。ＦＩＳＨシグナルは、検体当たり４０から１２０個の細胞（平均＝８２個の細胞）において列挙して４種の遺伝子座のそれぞれについてコピー数を得た。
【００５６】
良好な予後を有する患者（再発しなかった、または３年後に再発した患者）の平均および標準偏差を使用して各パラメーター（比および％増加）について、０．１標準偏差増分で、平均マイナス２標準偏差から平均プラス２標準偏差までのカットオフを最初に生成することにより、カットオフ点の範囲を分析した。各カットオフにおける各比および％シグナル増加または損失を、分割表において疾患再発までの時間（再発まで３年超または３年未満）と比較した。最小のカイ二乗確率を有するカットオフをさらなる分析用に選択した。
【００５７】
統計法。選択された分類指標およびアウトカムの間の関連付けを、Ｆｉｓｈｅｒ正確検定を使用して実施した。有意水準は両側検定においてｐ＜０．０５であった。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法は再発までの時間の中央値を決定するために使用し、ログランク検定により評価された群間を比較した（ｐ＜０．０５の有意）。
【００５８】
結果
術後３年以内に進行した患者（不良な予後群）を、進行しなかった、または術後３年以上経って進行した患者（良好な予後群）と比較した場合、または進行までの時間（ＴＴＲ）の中央値の時間を分類指標により区別された患者群間で比較した場合に予後と強く関連する、幾つかの分類を見出した。
【００５９】
レンジ３分類指標。この分類指標は、ＦＩＳＨシグナル＞３の範囲（即ち、細胞ベースで、ＦＩＳＨシグナルの最大数を有する遺伝子座からＦＩＳＨシグナルの最小数を有する遺伝子座を引いたもの）を含有する細胞の百分率を決定した。４２％の細胞のカットオフを使用するレンジ３は、患者を３６人の群（シグナル差＞３を有する≧４２％の細胞、）（２９人（８０．６％）が良好な予後を有した。）および２４人の群（シグナル差＞３を有する＜４２％の細胞）（１１人（４５．８％）のみが良好な予後を有した。）に分割することができた（ｐ＝０．０１１）。前者および後者の群における進行までの時間の中央値は、それぞれ１２１および１４．５ヵ月であった（ｐ＝０．００３５）。表１は、この分類指標についてのデータを示す。図１は、２種の群における再発までの時間（ＴＴＲ）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットを示す。
【００６０】
【表２】
2011517573.tif 000003
【００６１】
ＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失分類指標。ＥＧＦＲシグナルより小さいＭＹＣシグナルを含有する細胞の百分率、即ちＭＹＣ／ＥＧＦＲ％損失は、ＭＹＣシグナルの相対損失を有する細胞の３１％のカットオフを使用して、患者を２５人の群（相対ＭＹＣ損失を有する≧３１％の細胞）（２０人（８０．０％）が良好な予後を有した。）および３５人の群（相対ＭＹＣ損失を有する＜３１％の細胞）（２０人（５７．１％）が良好な予後を有した。）に分割することができた（ｐ＝０．０９６）。前者および後者の群における進行までの時間の中央値は、それぞれ１１３および５３．３ヵ月であった（ｐ＝０．０３４６）。図２は、２種の群における再発までの時間（ＴＴＲ）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットを示す。表２は、この分類指標についてのデータを示す。
【００６２】
【表３】
2011517573.tif 000004
【００６３】
レンジ３およびＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失の組合せの分類指標。レンジ３パターンが＜４５％の細胞に存在し、ＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失が＜１３％の細胞に存在する場合、６人（１０％）の患者の群（６人全員が不良な予後を有した。）（全患者が１５ヵ月以内に再発した。）が同定された。残り５４人の患者（レンジ３が≧４５％の細胞に存在し、またはＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失が≧１３％の細胞に存在する。）のうち、４０人（７４．１％）が良好な予後を有した（ｐ＝０．０００８）。前者および後者の群における進行までの時間の中央値は、それぞれ１０．１および７８．８ヵ月であった（ｐ＜０．０００１）。表３は、細胞の１３％のＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失カットオフを使用した組合せの分類指標の結果についてのデータを示す。図３は、カットオフ１３％の２種の群における再発までの時間（ＴＴＲ）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットを示す。
【００６４】
【表４】
2011517573.tif 000005
【００６５】
比較目的のため、この組合せの分類指標を使用するが、ＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失を有する細胞の百分率についての２４％のより高いカットオフを用いた２種の群における再発までの時間（ＴＴＲ）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットも決定した。表４および図４は、カットオフがより高い組合せの分類指標についてのデータおよびＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットを示す。予後の劇的な分離は達成されなかったが、ＭＹＣ／ＣＥＰ６％損失についてより高いカットオフも、極めて小さいｐ値を提供した（予後についてｐ＝０．００１３、再発までの時間の中央値についてｐ＜０．０００１）。
【００６６】
【表５】
2011517573.tif 000006
【００６７】
ＭＹＣ／５ｐ１５および５ｐ１５／ＣＥＰ６の組合せの分類指標。細胞のＭＹＣ／５ｐ１５シグナル比≧０．８０および５ｐ１５／ＣＥＰ６比≧１．１の組合せを使用して、２８人の患者の群（１３人（４６．４％）が良好な予後を有した。）を同定する。残り３２人の患者（ＭＹＣ／５ｐ１５シグナル比＜０．８０を有する患者または５ｐ１５／ＣＥＰ６シグナル比＜１．１を有する患者）のうち、２７人（８４．４％）が良好な予後を有した（ｐ＝０．００２６）。前者および後者の群における進行までの時間の中央値は、それぞれ２２．７および１２１ヵ月であった（ｐ＝０．００４６）。表５はこの組合せの分類指標の結果についてのデータを示し、図５は２種の群における再発までの時間（ＴＴＲ）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットを示す。
【００６８】
【表６】
2011517573.tif 000007
【００６９】
アベレージシグナルレンジおよびレンジ３パターンの組合せ分類指標。この組合せの分類指標（２．５未満のアベレージシグナルレンジまたは細胞の少なくとも４２％のレンジ３パターン）は、４８人の患者の群（３８人（７９．２％）が良好な予後を有し、１０人（２０．８％）が不良な予後を有した。）を同定した。残り１２人の患者（２．５以上のアベレージシグナルレンジおよび細胞の４２％未満のレンジ３パターンを有する患者）のうち、２人のみ（１６．７％）が良好な予後を有した一方（ｐ＝０．０００１）、１０人（８３．３％）が不良な予後を有した。前者および後者の群における進行までの時間の中央値は、それぞれ８３．１および９．８６ヵ月であった（ｐ＜０．０００１）。表６は、細胞の４２％未満のレンジ３カットオフを使用したこの組合せの分類指標結果についてのデータを示す。図６は、２種の群における再発までの時間（ＴＴＲ）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットを示す。
【００７０】
【表７】
2011517573.tif 000008
【００７１】
結果の考察
これらのデータは、適切な分類指標の使用を伴うＦＩＳＨにより計測されたＥＧＦＲ、ＭＹＣ、５ｐ１５および６遺伝子座の少なくとも２種のゲノムコピー数評価の使用が早期ＮＳＣＬＣにおいて予後的に重要であることを示す。試験された分類指標の５種全てが、ネオアジュバントまたは追跡化学療法を用いない手術により治療された患者の良好および不良な再発カテゴリーへの統計的に有意な分類をもたらすことができた。現在の臨床インビトロ診断アッセイは、この可能性を提供しない。このデータは、遠隔転移を有しない、または１つ以下のリンパ節への転移を有する早期ＮＳＣＬＣ患者を、分子ハイブリダイゼーションアッセイを使用して統計的に有意なベースで良好および不良な予後群に分類する最初のデータである。早期ＮＳＣＬＣ生検検体または切除腫瘍について実施される染色体遺伝子座５ｐ１５、７ｐ１２、８ｑ２４および６番セントロメアの２種以上へのＦＩＳＨアッセイは、手術およびアジュバント療法に関する決定において有価であると考えられる。
【００７２】
分類指標のそれぞれにおける関連性は、一部のパラメーターについて１０％以上もの広範なカットオフ値の範囲にわたり統計的有意性を見出すことができたという点でもかなり強固であった。各分類指標についてのデータに示されるカットオフは、最小のｐ値を有したカットオフである。このことは、異常パターンを有する評価組織内の細胞の特定の百分率のカットオフまたは分類指標において使用される特定の比のカットオフがカットオフのこのｐ値から変動し得ることを意味する。
【００７３】
本発明をこの詳細な説明とともに記載してきたが、上記の記載は本発明を説明するものであり、本発明の範囲の限定するものではないと解されるべきである。本発明の他の態様、利点および改変は、以下に記載の特許請求の範囲の範囲内である。
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月14日(2010.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
2011517573.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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