(57)【要約】  本発明は、動物における炎症性腸疾患および異常な腸機能の関連疾患の処置または予防に使用するための酵母由来のグルカンであって、１個またはそれ以上のベータ−（１，３）−側鎖が結合したベータ−（１，３）−バックボーンを有する、酵母由来のグルカンに関し、特に、経口投与される場合に好ましい、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の可溶性グルカンを用いた使用に関する。本発明は、キク科植物（Asteraceae）由来のミールまたはタンパク質を利用した炎症性腸疾患および異常な腸機能の関連疾患の、代替となる処置法にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における炎症性腸疾患および異常な腸機能の関連疾患の処置または予防に使用するための酵母由来のグルカンであって、１個またはそれ以上のベータ−（１，３）−側鎖が結合したベータ−（１，３）−バックボーンを有する、酵母由来のグルカン。
【請求項２】
酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項１記載のグルカン。
【請求項３】
他の細胞壁成分から少なくとも部分的に分離された、請求項１または２記載のグルカン。
【請求項４】
その天然の構造と比較して改変されている化学構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載のグルカン。
【請求項５】
化学基により誘導体化されていない、請求項１〜４のいずれか一項記載のグルカン。
【請求項６】
繰り返しのベータ−（１，６）−結合型グルコシル・ユニットを本質的に含まない、請求項１〜５いずれか一項記載のグルカン。
【請求項７】
微粒子の形状である、請求項１〜６のいずれか一項記載のグルカン。
【請求項８】
可溶性である、請求項１〜６のいずれか一項記載のグルカン。
【請求項９】
分子量が１５０ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲内にある、請求項７記載のグルカン。
【請求項１０】
分子量が約６ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲内にある、請求項８記載のグルカン。
【請求項１１】
経口投与される、請求項１〜１０のいずれか一項記載のグルカン。
【請求項１２】
１日に体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜５００ｍｇの範囲の用量で投与される、請求項１１記載のグルカン。
【請求項１３】
動物における炎症性腸疾患および異常な腸機能の関連疾患の処置または予防に使用するための、キク科植物由来のミール。
【請求項１４】
動物における炎症性腸疾患および異常な腸機能の関連疾患の処置または予防に使用するための、キク科植物由来のタンパク質。
【請求項１５】
キク科植物がヒマワリ属からのものである、請求項１３記載のミールまたは請求項１４記載のタンパク質。
【請求項１６】
キク科植物がヘリアンツス・アンヌースである、請求項１５記載のミールまたはタンパク質。
【請求項１７】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、請求項１〜１２のいずれか一項記載のグルカン、請求項１３、１５および１６のいずれか一項記載のミール、あるいは請求項１４〜１６のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１８】
異常な腸機能の関連疾患が、便秘、下痢、便失禁ならびに手術のため結果として生じる状態および疾患からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項記載のグルカン、請求項１３、１５および１６のいずれか一項記載のミール、あるいは請求項１４〜１６のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１９】
動物における炎症性腸疾患および異常な腸機能の関連疾患を処置する方法であって、該動物に、上記請求項のいずれか一項で規定されるグルカン、ミールまたはタンパク質の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
上記請求項のいずれか一項で規定されるグルカン、ミールまたはタンパク質と、ヒトまたは他の動物に該グルカン、該ミールまたは該タンパク質を投与することを記載した資料とを含む、キットまたは投与装置。
【請求項２１】
炎症性腸疾患および異常な腸機能の関連疾患の処置における同時使用、個別の使用もしくは連続使用のための組み合わせ調剤としての、（ａ）上記請求項のいずれか一項で規定されるグルカン、ミールまたはタンパク質と（ｂ）炎症性腸疾患および異常な腸機能の関連疾患の処置のための第二の活性物質とを含む、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管の炎症性疾患を処置または予防するためのグルカンの使用に関する。本発明はまた、腸管の炎症性疾患を処置または予防するためのキク科植物（Asteraceae）由来のミール、特にタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカンは、植物、細菌および菌類の細胞壁に見られる不均質な一群のグルコースポリマーである。本明細書中で記載されるようにベータ−グルカンの基本的な構成ユニットは、β（１→３）−結合型グルコシル・ユニットを含むもしくはそれらから成るバックボーン鎖および側鎖である。その供給源および分離方法に応じて、ベータ−グルカンは、側鎖にさまざまな程度の分岐および結合を有する。側鎖における結合の頻度および結合様式が、その分子の生物学的活性を決定する。菌類および酵母生物由来のベータ−グルカンは、通常水に溶けないが、酸加水分解によってかまたは外来の基、例えば、−ホスフェート、−スルフェート、−アミン、−カルボキシメチルなどの基を該分子に導入する誘導体化のいずれかによって、可溶化させることができる。
【０００３】
ヨーロッパ、アジアおよびアメリカでは、特にパン酵母由来のベータ−グルカンが、動物用の飼料添加物として、ヒトでは栄養補助食として、傷の処置に、そしてスキンクリーム薬品の活性成分として長い間用いられてきた。さらに、グルカンは、国際公開第ＷＯ  ０２０５８７１１号で示されるようにそれらの癌処置への応用によって例示される、機能的医薬成分として用いられた。この内容において、ベータ−グルカンは、うまく制御された局所的な炎症反応を誘導することによって部分的に白血球の活性を増大させる免疫刺激物質と考えることができる。
【０００４】
潰瘍性大腸炎およびクローン病は、腸管の不治の慢性疾患である。この２つの疾患は、その共通する症状から、炎症性腸疾患（以下、ＩＢＤと称する）をもたらす２つの主要な状態であるとして、しばしば一まとめにされる。世界中で４００万もの人々が、ＩＢＤの状態に苦しんでいると推定される。ノルウェーでは、毎年、６００人および３００人の人々が、それぞれ潰瘍性大腸炎およびクローン病であると診断される。ＩＢＤの病因は現在のところ不明である。当該分野の現状は、これらの疾患の原因となる可能のある環境要素、栄養要素および遺伝的要素、さらに喫煙や細菌／菌類感染を明らかにするところである。これらの疾患は、白色人種の人達、女性および若い人達には最も一般的なものである。
【０００５】
現在でもＩＢＤは治療できないため、ＩＢＤは、患者の環境の注意深い調節、腸機能の連続的な調節および医薬を通じて管理される。通常の医薬品は、抗炎症薬および免疫抑制剤を含む。多くの場合、外科手術、例えば腸の一部を取り除くこともまた、この疾患と対峙するために用いられる。
【０００６】
最近の知見により、ＩＢＤは、寄生虫や蠕虫などの典型的な標的の欠乏により発症することが示唆されている。その結果、免疫系は腸内で別の標的に向かうようになる。この仮説は、喘息やアレルギーなどの状態に広く適用される衛生仮説と密接に関連する。
【０００７】
プレバイオティクスおよびプロバイオティクスは、ＩＢＤの処置においても関心が高まりつつある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の他の態様は、サカナおよび哺乳動物などの動物における消化管に関連する疾患、特に異常な腸機能または消化管の変調に関連する疾患の処置である。現在の主な問題は、サカナや他の動物、例えば哺乳動物の飼料中の栄養成分として、植物性タンパク質、例えば大豆ミールおよびヒマワリ・ミールの増大しつつある使用である。大豆製品は、それらの価格の低さ、高含有量の非常にバラスのよいアミノ酸特性を有する利用可能なタンパク質、一定した組成および安定した供給ゆえに、肉食性、雑食性および草食性のサカナおよび他の動物の飼料において価値の高い原料である。
【０００９】
近年、動物の飼料中の植物性タンパク質の濃度が増加したことで、劇的に、望ましくない副作用、例えば炎症および他の状態を導き、その結果として、体重増加の低下、飼料転換効率の低下および飼育動物の業績低迷をもたらしている。植物性タンパク質は、広範囲の抗栄養因子（antinutritive factor、ＡＮＦ）などの物質を含み、それらは、サカナの生理機能を圧迫し、また動物の消化系で拒否反応を誘発する。
【００１０】
植物性タンパク質ミールは、サカナに大豆を与えた場合に見られるように、動物の腸に形態学的な変化もまた引き起こしうる。サカナに関し、この発病は、非感染性の亜急性炎症として分類され、増進した増殖、代謝回転、例えば消化系の粘液中での増大した数の未成熟細胞によって特徴付けられる。これは、結果的に内因性の化合物、例えば消化酵素の粘膜での低下した再吸収をもたらし、腸管表面領域が低減されることとなる。腸内の細菌構成もまた変化してゆく。この状態は、サカナの疾患に対する抵抗を弱めるであろうし、過敏反応に類似した機構のような免疫機構を伴うようである。これらの植物性タンパク質の大部分、例えば大豆ミールおよびヒマワリ・ミールについて、飼料への植物性タンパク質添加の通常の濃度は、実際の商品限度として約１０％である。
【００１１】
動物飼料中の高濃度の植物性タンパク質に加えて、動物飼料中には別の原料が、動物の消化系に有害な影響を導くこともある。これらは、環境毒素によりまたは一般に高濃度の既存の別の飼料成分、例えば糖質により例示される。
【００１２】
グルカン技術は前世紀の中頃にその起源があるにも関わらず、様々な環境での種々のグルカンの特定の作用機構および効果ならびにそれらの機能と多種多様な疾患および状態との関係は、いまだ完全には調べられていない。この分野で唯一確実なことは、グルカンは様々な分子構造およびオリジンを有し、多種多様な疾患および状態に関連して非常に多くの効果を示すので、グルカンを独立した一群の分子とみなすことはできない。
【００１３】
正確な作用機構はまだ分かっていない。幾つかの理論では、免疫系により有毒な病原体と把握されるためにグルカンのオリジンに着目するが、他の理論では、その分子のレベル、例えば数、側鎖の形式またはその立体配置に着目する。また、別の理論では、グルカンユニットの三重らせん構造に着目し、一方で他の理論では、他の要素、とりわけ分子量および受容体結合親和力などの特徴にさらに言及する。以前の研究で、そのオリジンおよび種々のグルカンに共通する分子構造が、様々な疾患に対するその機能に関する共通の特徴となりうることが示された。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
活性におけるこの不確実性と変動性の中で、本発明者らは、ＩＢＤが、特定の分子構造を有する特定の種類のグルカンを用いることにより治療されうることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、＜１％の繰り返しのベータ−１，６−結合型グリコシルユニットを含む分岐型のベータ−１，３−グルカンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【表１】
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【図２】図２は、以下の実施例１で規定されるように処置された動物の体重変化の比較を示す。
【図３】図３は、以下の実施例１で規定されるように処置された動物の生存率を示す。
【図４】図４は、以下の実施例１で規定される実験計画に従った急性大腸炎における大腸炎および組織損傷の代表的な大腸の切片（Ａ）および等級比較（Ｂ）を示す。
【図５】図５は、以下の実施例１で規定されるモデルに従って処置されたマウスの代表的な大腸の長さを表す図（Ａ）および大腸の長さの分布（Ｂ）を示す。
【図６】図６は、以下の実施例１で規定されるモデルに従って処置されたマウスの脾臓重量の分布（Ａ）および胸腺重量の分布（Ｂ）を示す。
【図７】図７は、下痢における優れた指標であるタイセイヨウ・サケの糞尿中の乾燥物質のパーセンテージを示すグラフである。
【図８】図８は、以下の実施例１で規定されるように処置された動物における急性大腸炎における全身性炎症に付随する選択されたメディエーターのレベルを示す一連のグラフである。
【図９】図９は、以下の実施例４に規定されるように処置されたマウスの体重（Ａ）および平均の液体の消費（Ｂ）を示す。
【図１０】図１０は、以下の実施例４に規定されるように処置されたマウスのホルマリン固定された腸間膜リンパ節での顕微鏡で観察できるパイエル板の数（Ａ）および横断面の面積（Ｂ）を示す。
【図１１】図１１は、以下の実施例４で規定されるように処置されたマウスの主要なリンパ球サブセットの組成（Ａ）および腸間膜リンパ節（Ｂ）を示す。
【図１２】図１２は、以下の実施例４で規定されるように処置されたマウスの遠位結腸における増殖型の腸上皮細胞であるＫｉ６７陽性細胞の数（Ａ）およびの分布（Ｂ）、代表的な染色画像（Ｃ）を示す。
【図１３】図１３は、以下の実施例４で規定されるように処置されたマウスのＡＢ／ＰＡＳ陽性の杯細胞の数と分布（Ａ）および代表的な染色画像（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のグルカンは、ベータ−１，３バックボーンを有する、すなわち、そのバックボーンはベータ−１，３結合型グルコピラノース・ユニットで構成される。本グルカンは、１個またはそれ以上のベータ−１，３側鎖、すなわちベータ−１，６結合を介してそのバックボーンに連結された側鎖を有し、該側鎖はベータ−１，３結合型グルコピラノース・ユニットで構成される。側鎖は、２個またはそれ以上、典型的には３個、４個、５個、１０個またはそれ以上のベータ−１，３結合型グルコピラノース・ユニットを含む。
【００１７】
本発明は、ＩＢＤまたは異常な腸機能の関連疾患の処置に使用するためのグルカンであって、１個またはそれ以上のベータ−１，３側鎖が結合したベータ−１，３バックボーンを有するグルカンを提供する。好ましくは、ＩＢＤは、ヒトおよびヒト以外の動物において処置され、ヒトＩＢＤと共通する成分を用いて腸疾患または異常な腸機能が処置される。ＩＢＤそれ自体は診断され、それゆえに、イヌおよびネコなどのペットを含むいくつかの動物では処置されうる。
【００１８】
本発明において、グルカンは、いずれかの可能な投与様式によって、好ましくは経口で対象に投与される。
【００１９】
医薬は、食事療法の部分として投与されうる。医薬は、栄養補助食品、動物用飼料、食事、あるいは栄養補助食品、動物用飼料、食事および／またはアジュバントの部分として、製剤化されうる。グルカンを含有する医薬は、ヒト、ヒト以外の霊長類および他の哺乳動物、家畜動物、家禽やオウムなどのコンパニオンバードおよび養殖魚やペット用のサカナを含む、トリおよびサカナなどの動物のいずれかに投与しうる。具体例として、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ラット、マウスおよびヒツジが挙げられる。本発明は、これらの種類のグルカンが、これ以降の本明細書中でさらに例示されるように、動物およびサカナにおいてＩＢＤおよび関連疾患を予防および／または処置するために用いることができることを明確に示す。哺乳動物、特にヒトが、処置の好ましい対象である。
【００２０】
本発明に用いられる酵母グルカンは、それらの天然の状態、すなわち酵母丸ごとであってもよいし、あるいは、それらはグルカンが他の細胞成分から分離されるという意味で、グルカンが誘導体化されるとういう意味で、および／またはその化学構造が天然型の構造と比較して改変されるという意味のいずれかで処理されていてもよい。誘導体化されたグルカンは、好ましくは以下の基、スルフェート、アミン、アセテート、ホスフェート、ホスホネートまたはカルボキシメチルを含みうる。さらにグルカンの化学構造の改変は、典型的には、バックボーンの長さの短縮および／または分岐鎖および／または側鎖の長さもしくは複雑度の低下を含みうる。
【００２１】
好ましくは、グルカンは、その天然状態にはない、すなわち細胞丸ごととしてではなくまたは細胞壁画分全体としてでもなく、天然で一緒に見出される他の細胞壁成分、例えばタンパク質およびキチンから部分的に分離されるように処理される。酸処理もしくはアルカリ処理または酵素による処理により、結果として本発明に関する使用に好ましいグルカンが得られる。そのようなグルカンの分子量は以下で示される。
【００２２】
グルカンは、多種多様な供給源由来のものであってよく、好ましくは酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（saccharomyces cerevisiae）由来のものである。
【００２３】
本発明のグルカンは、可溶性グルカンおよび微粒子グルカンを含み、その両方が有効である。
【００２４】
理論に拘泥されることなく、可溶性グルカンおよび微粒子グルカンは、腸管の炎症性疾患の処置におけるその作用に関し、同じ機構が用いられると考えられる。
【００２５】
本発明に関する使用のための好ましいベータ−グルカンを含有する製品は、細胞成分全体の割合として少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％の炭水化物を含む。この炭水化物の大部分が、グルカンである。
【００２６】
本発明に有用なベータ−グルカン製品の例としては、限定するものではないが、バイオセラ（Biothera）により製造されるグルカン製品のイムセル（Imucell）およびケアファーマ（CarePharma）社によって流通されるイミフレックス（Immiflex）（以前は、フルフレックス；Fluflex）がある。
【００２７】
有用なベータ−グルカンの例としては、限定するものではないが、ＰＣＴ／ＩＢ９５／００２６５およびＥＰ０７５９０８９に記載されるような微粒子性および可溶性の酵母細胞壁グルカンがある。酵母株および種類に応じて、グルカンは酵母細胞壁の乾燥重量の最大２５％までを構成する。ベータ−グルカンを酵母から分離する処理の間に、マンノプロテインの外層が取り出され、ならびに「ゴースト」粒子を残す細胞内側の内容物の大部分またはベータ−グルカン層を構成するグルカン粒子全体が取り出される。そのようなベータ−グルカンの例としては、限定されるものではないが、Biothera社によりＡＰＧ−３−６として市販されるベータ−１，３／１，６グルカン製品が挙げられる。ベータ−グルカンが自己消化酵母から分離された場合には、細胞壁はより破壊されており、より壊れたゴースト粒子が与えられることとなる。
【００２８】
グルカンの供給源として提供される他の酵母は、ビール酵母（Brewers yeast）、カンジダ種（Candida sp）、例えばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・クロアカエ（Candida cloacae）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・ユティリス（Candida utilis）、ハンゼヌラ種（Hansenula sp）、例えばハンゼヌラ・ウィングエイ（Hansenula wingei）、ハンゼヌラ・アーニ（Hansenula arni）、ハンゼヌラ・ヘンリシイ（Hansenula henricii）およびハンゼヌラ・アメリカーナ（Hansenula americana）、ヒストプラズマ種（Histoplasma sp）、クロエケラ種（Kloeckera sp）、クルイベロマイセス種（Kluyveromyces sp）、例えばクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロマイセス・ポリスポラス（Kluyveromyces polysporus）、ピキア種（Pichia sp）、ロドトルラ種（Rhodotorula sp）、サッカロマイセス種（Saccharomyces sp）、例えばサッカロマイセス・デルブルエキイ（Saccharomyces delbruekii）、サッカロマイセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、サッカロマイセス・マイクロエリプソデス（Saccharomyces microellipsodes）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）または別のサッカロマイセス株、例えばサッカロマイセス・セレビシエＲ４（Saccharomyces cerevisiae R4）（ＮＲＲＬ  Ｙ−１５９０３）およびＲ４  Ａｄ（受入番号７４１８１）、シゾフィラム種（Schizophyllum sp）、シゾサッカロマイセス種（Schizosaccharomyces sp）、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、およびトルラ種（Torula sp）やトルロプシス種（Torulopsis sp）が挙げられる。
【００２９】
本発明により規定されるようにベータ−１，３結合型グルカン・バックボーンであって、そこにベータ−１，６連結を介して結合した１個またはそれ以上のベータ−１，３側鎖を含む分子構造を有するグルカンの他の供給源には、キノコまたは他の菌類、藻類、草または細菌がある。
【００３０】
動物用飼料および農業において、生体の細胞が用いられ、多くの場合で酵母細胞が用いられ、動物に直接与えられる。これらの製品は、様々な形態および形状で、例えばコンプレス細胞、液状の細胞、砕かれた細胞、乾燥細胞、活性細胞、不活性細胞で、そして組み合わせで、例えば活性乾燥細胞、瞬間活性乾燥細胞および不活性乾燥細胞で提供される。これらの製品は、多くの場合、醸造またはベーキングのような他の生産過程に用いられる細胞の残り物であり、貴重なグルカン供給源と考えられる。本発明のグルカンは、細胞丸ごと、製品の中間物質、他の成分と一緒に部分的に処理された中間物質を意味する、あるいは他の細胞成分から完全にもしくは部分的に分離された抽出グルカン産物を意味する、精製されていない状態でも用いうる。特にヒト以外での使用に関しては、さらに処理されたグルカンが好ましい。
【００３１】
本発明の効果を達成するためには、処理された生産物または細胞抽出物を用いることが便利である。これらの生産物は、加水分解された細胞または自己消化細胞、部分的にもしくは完全に精製された細胞壁であってよい。これらの生産物はすべて、様々な種類の使用に適した種々の形態、ほんの一例に言及すれば、液状、半ペースト、ペースト、微粉、油コート粉末、微顆粒粉末の形態で利用できる。
【００３２】
分離された炭水化物成分を含む生産物は、２個またはそれ以上の成分（例えば、酵母細胞壁由来の成分）の併用品、例えば、グルカンとマンナンの組み合わせであってよい。
【００３３】
マンナンは、マンノース・サブユニットを高比率で含む多糖である。好ましくは、それは、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコースおよびＤ−ガラクトースから、約３：１：１の割合で構成される。
【００３４】
グルカンは、他の成分、例えばマンナンなどの細胞壁の他の部分またはビタミンもしくはミネラルなどの細胞壁の部分ではない成分と、医薬品業界、栄養補助食品業界、食の業界、動物用飼料の業界および獣医業界で頻繁に用いられる他の物質と一緒に混合されてよい。この一群の製品例は、ミネラルおよびビタミンと組み合わされたグルカン製品ならびにグルカンと他の抗ＩＢＤ剤とを組み合わせた栄養補助食品をすぐに用いることができる。
【００３５】
１，３結合型側鎖に加えて、グルカンはまた、１個またはそれ以上の１，６結合型側鎖を有していてもよい。しかしながら、好ましいグルカンは、グルカン内の（１，６）−結合型グルコース分子の繰り返しの数を著しく低下させるもしくは無くすために酸もしくは酵素によりまたは他の好ましい方法により処理されたもの、あるいは低頻度の１，６結合で自然に生じたものがある。これらの（１，６）−結合型グルコース分子は、大部分がベータ構造であり、通常はベータ−グルカン分子の側鎖に見出されうる。ベータ−１，６結合型グルコース部分の数は、グルカンの供給源に依存して１個から顕著な比率のグルカン部分まで変わりうる。結果として得られる好ましいグルカンは、ベータ−１，３−主鎖と、脱離反応では切り離されない単独のベータ−１，６−結合によりベータ−１，３−主鎖に連結されたベータ−１，３−側鎖とを有する。これらの製品は、微粒子、半可溶性または可溶性であってよい。これらのモディファイされたグルカン分子は、好ましくはＳ．セレビシエ（S.cerevisiae）から誘導される。
【００３６】
好ましいグルカンは、繰り返しのベータ−１，６−結合型グリコシル・ユニットを実質的に含まない。かくして、分岐部分の１，６−結合は、「繰り返し」のベータ−１，６−結合型グルコース・ユニットを与えないが、隣接する残基と一緒になって「繰り返し」のベータ−１，６−結合型グルコシル・ユニットを与えることができるであろう。「実質的に含まない」は、全グルコシル・ユニットの２％未満、好ましくは１％未満を意味する。そのような生産物の例は、１％未満の繰り返しのベータ−１，６−結合型グルコシル・ユニットを含む分岐ベータ−１，３−グルカンを用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムである図１において見出される。
【００３７】
このように、グルカン分子中のグリコシド結合の好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは３％未満または２％未満が、（１，６）結合であってよい。
【００３８】
幾つかの処理、例えば酵素処理により、側鎖中で切断されていない最大４個までのベータ−１，６−結合型グルコシル・ユニットとすることができる。また、そのような分子は、繰り返しのベータ−１，６−結合型グリコシル・ユニットを「実質的に含まない」。
【００３９】
本発明に関連して用いられうるグルカンは、単一の抽出された画分または２個もしくはそれ以上の異なる分子量を有する種々の画分中にあってよい。
【００４０】
本発明への適用に最も好ましいグルカン供給源は、サッカロマイセス・セレビシエの細胞壁である。これらのうち、本発明の使用に好ましい供給源は、ノルウェーを拠点とする企業であるバイオテック・ファーマコン（Biotec Pharmacon）ＡＳＡにより生産されるような可溶性の酵母製品のＳＢＧ（可溶性ベータ−グルカン）である。
【００４１】
この製品は、ＮＭＲおよび化学分析によりベータ−１，３およびベータ−１，６−連結型Ｄ−グルコース側鎖を含むベータ−１，３−結合型Ｄ−グルコースポリマーから成ることが特徴付けられた非誘導型（化学的な修飾基の観点から）の水溶性のベータ−１，３／１，６−グルカンであり、その側鎖中のベータ−１，６部分（バックボーン／側鎖の分岐点では含めない）の数は酵母細胞壁中の該グルカンの構造と比較して大幅に減少している。その成分の例は以下がある。
【表２】
2011503161.tif 000004
【００４２】
ＳＢＧの分子構造は、以下のとおりである。
【化１】
2011503161.tif 000005
ｎ≧０、Ｒ＝Ｈまたは（Ｃ６Ｈ８−１０Ｏ５）ｍ；ｍ（Ｒ１＋Ｒ２）＝３５〜２０００グリコシル・ユニット
【００４３】
本発明の以上の好ましいグルカンを産生するためのベータ−（１，６）−結合型グリコシル残基の還元は、以下の方法のいずれかにより達成することができる。
ｉ）例えばノルウェー特許第３００６９２号に記載されるような、酵素処理：
米国特許第５，４０１，７２７号のように調製された微粒子産物中のベータ−１，６−結合型グルコース側鎖は、ポリ−グルコース鎖中のベータ−１，６−結合に特異的に作用する酵素を用いた酵素処理により選択的に除かれる。その微粒子産物（０．２グラム）を、４０ｍｌの５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）中に懸濁し、２０ユニットのベータ−１，６−グルカナーゼ酵素と混合する。その混合液を連続して摂氏３７℃で６時間攪拌し、酵素作用は５分間煮沸することにより停止させた。酵素処理した残りの粒子を遠心分離と再懸濁により滅菌蒸留水中で繰り返し洗浄した。残る産物は、分岐点でベータ−１，６−結合により連結されたベータ−１，３−グルカン側鎖を有する分岐型ベータ−１，３−グルカンであり、その分岐点から伸びた側鎖中にベータ−１，６−結合型グルコースは本質的にはない。重要な工程は、微粒子グルカンをベータ−１，６−グルカナーゼ酵素と共に３２℃〜４０℃で３時間〜９時間のインキュベーションすることである。
【００４４】
ｉｉ）ギ酸処理：
例えば、米国特許第５，４０１，７２７号のように調製された微粒子産物を、ギ酸中に懸濁し加熱してよい。その懸濁液を冷却し、遊離しているギ酸を取り除く。
【００４５】
本発明の使用に好ましいグルカンを含有する製剤は、相互作用して高次構造を与える分子量（ＭＷ）＞６０００ダルトンの可溶性ベータ−グルカン分子の混合物である。例えば、数値にしてＭＷ＞６ｋＤａの、好ましくはＭＷの範囲が６ｋＤａ〜３０ｋＤａの直鎖型ベータ−１，３−グルカン鎖と、上記のように主鎖内から伸びたベータ−１，３−結合型側鎖（群）を有する分岐型の高分子量ベータ−１，３−グルカン（例えば、ＭＷ＞１５ｋＤａ）との混合物である。
【００４６】
好ましくは、グルカンは、平均分子量約２０ｋＤａの、約６ｋＤａ〜約３０ｋＤａの、好ましくは約１５ｋＤａ〜約２５ｋＤａの範囲の一本鎖である。一本鎖の形式では、グルカンは、ランダムコイル、ゲルマトリクスまたは凝集体、三重らせんおよび一重らせんなどの構造物の混合体として存在しうる。水溶液中で分子が相互作用に加わる場合、相互作用したものを高性能のゲル・クロマトグラフィーで分析すると、最大５０００ｋＤａの見かけの分子量を与える。好ましい組成は、複雑な分子間相互作用を示すために、水溶液中でゲルのような様相を呈するものである。
【００４７】
本発明に関連して使用するのにさらに好ましい製品は、バイオテック・ファーマコンＡＳＡにより生産される微粒子酵母製品のＮＢＧ（ノルウェー・ベータ・グルカン、Norwegian Beta Glucan）である。ＮＢＧは、パン酵母（サッカロマイセス・セレビシエ、Saccharomyces cerevisiae）から得られた製品である。この製品は、ＮＭＲおよび化学分析によりベータ−１，３−連結型Ｄ−グルコースとベータ−１，６−連結型Ｄ−グルコースの側鎖を含むベータ−１，３−結合型Ｄ−グルコースのポリマーから成ることが特徴付けられた天然の非誘導型（化学的な修飾基の観点から）の微粒子ベータ−１，３／１，６−グルカンである。
【００４８】
ＮＢＧの化学組成に関する典型的な値は以下のとおりである。
【表３】
2011503161.tif 000006
【００４９】
本発明の使用に好ましいベータ−グルカンであるＳＢＧおよびＮＢＧの基本的な共通する分子構造は、以下のとおりである。
【化２】
2011503161.tif 000007
Ｒ＝Ｈまたは（Ｃ６Ｈ８−１０Ｏ５）１−５０；ｎ＝３５〜２０００；
ＳＢＧおよびＮＢＧは、ヒトへの投与に特に好ましい。
【００５０】
本発明の使用に、特にヒト以外の受容者に投与するのにさらに好ましいグルカンの供給源は、ノルウェーを拠点とする企業であるイムノコープ（Immunocorp）により販売される酵母製品のＰａｔｏＧａｒｄ（登録商標）である。この製品の組成は、以下のとおりである。
【表４】
2011503161.tif 000008
【００５１】
炭水化物成分に関する典型的な値は以下のとおりである。
【表５】
2011503161.tif 000009
典型的には、ＰａｔｏＧａｒｄ（登録商標）は、重量あたり約２０％〜３０％のタンパク質、２０％〜３５％のベータ−グルカン、および２０％〜３５％のマンノースを含む。
【００５２】
特にヒト以外の受容者に対してさらに好ましい供給源は、ノルウェーを拠点とする企業であるイムノコープにより販売される加水分解した酵母製品のＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）フィード・イングレディエント（Feed Ingredient）である。この製品の組成は、以下のとおりである。
【表６】
2011503161.tif 000010
【００５３】
あるいは、以下の成分を有するＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）ペット（Pet）がある。
【表７】
2011503161.tif 000011
【００５４】
さらに好ましいグルカンの供給源は、ＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）アクアソル（AquaSol）であり、以下の組成を有する。
【表８】
2011503161.tif 000012
【００５５】
他のＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）製品としては、ＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）エマージョン・グレード（Immersion Grade）、ＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）アジュバント（Adjuvant）、およびＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）Ｆ１サスペンション（Suspension）がある。ＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）フィード・イングレディエント（Feed Ingredient）が特に好ましい。
【００５６】
ＰａｔｏＧａｒｄ（登録商標）およびＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）は、本明細書に記載される方法および使用のすべてに関して両方とも好ましい。
【００５７】
幾つかの例において、グルカンが実質的に精製されている酵母グルカン製品が、例えばイムノコープにより販売されるＭａｃｒｏＧａｒｄ（商標）および類似の製品が好ましい。そのような製品は、その酵母細胞壁由来の全てのグルカン内容物とマンナン内容物との比、すなわち本質的な炭水化物内容物全体に対する酵母細胞壁由来のグルカン内容物全体という観点で特定することができる。典型的には、そのような製品は、酵母細胞壁由来の炭水化物内容物全体の酵母細胞壁由来の全タンパク質内容物に対する比が、少なくとも７：１、好ましくは少なくとも１０：１もしくは１２：１、例えば約１５：１である。
【００５８】
別の適用例に関しては、グルカンが十分でなくても精製されている酵母グルカン製品が、例えばイムノコープにより販売されるＰａｔｏＧａｒｄ（登録商標）および類似の製品が好ましい。典型的には、そのような製品は、酵母細胞壁由来の炭水化物内容物全体の酵母細胞壁由来の全タンパク質内容物に対する比は、約１：１〜７：１、好ましくは１：１〜５：１である。
【００５９】
本発明の好ましい微粒子ベータ−グルカンは、以下の方法で調製することができる。
例えば、米国特許第５，４０１，７２７号（出典明示により本明細書の一部とされる）に記載の手順に従って、乾燥サッカロマイセス・セレビシエをアルカリ中および酸中で繰り返し抽出することによる。記載される抽出手順は、酵母細胞内の細胞質成分ならびに細胞表面上に存在するマンノースを含有する多糖類およびプロテオグリカンを取り除く。この手順に従って調製される製品は、粒径２μｍ〜５μｍのベータ−１，３ベータ−１，６グルカンを含む。この微小粒子ベータ−１，３  ベータ−１，６−グルカンの化学構造は、８３％のベータ−１，３結合型グルコース、６％のベータ−１，６結合型グルコースおよび５％のベータ−１，３，６結合型グルコースで特徴付けられ、それは、分岐点としてベータ−１，３，６結合型グルコースを有するベータ−１，３−グルカン鎖である。
【００６０】
本発明の微粒子グルカンは、５００Ｄａ〜１，０００，０００Ｄａの範囲の、好ましくは２５ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲の、より好ましくは１５０ｋＤａ〜３００ｋＤａの範囲の、最も好ましくは約２５０ｋＤａの分子量を有する。
【００６１】
上記の微粒子グルカンは、国際公開第ＷＯ／２００１／０６２２８３号（出典明示により本明細書の一部とされる）に記載されるように可溶化させることができる。従って、ギ酸を用いて、グルカン中のベータ−（１，６）−結合型グルコース残基の数を減少させることも、グルカンを可溶化させることもできる。
【００６２】
ベータ−１，３−グルカン・ファミリー中の別の構造および／または立体配置は、本発明の教示に従えば当業者により容易に特定もしくは分離することができる。従って、これまでの記載は、より高い効力のある製品を達成するための指針基準であり、さらにより効力のある製品に対する限定とはならない。この複雑な混合物からの単離された構造エレメントが投与された場合に、本明細書で例示される製剤に勝る改善された効果を有することがあってもよい。
【００６３】
本発明での使用のためのグルカンを含む組成物を製剤化する際に使用するのに好ましい担体または助剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよびその他の糖類、タルク、ミルクタンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物脂および植物油、ポリエチレングリコールおよび溶剤、例えば滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールが挙げられる。本組成物の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、通常の技術に従って調整される。
【００６４】
医薬および獣医での使用のための組成物は、用量単位で調製されて、投与されることが好ましい。本明細書中で用いられる用語「用量単位」およびその文法的な同義語は、ヒトおよびヒト以外の対象に対して単位あたりの適用量に好ましい物理的に分離した構成単位を意味し、各構成単位は必要な生理的に許容される担体、例えば希釈剤またはビヒクルと関連して、所望の治療効果を発揮するよう計算された所定の有効量のグルカンを含む。
【００６５】
組成物は、対象に投与するのに適した形状で活性成分を単独で含んでいてもよいし、または組成物は典型的にはグルカンおよび１つまたは複数の医薬的に許容される担体を、１つまたは複数の付加的な活性成分をまたはこれらの組み合わせを含みうる。
【００６６】
本明細書に記載される製剤は、既知の方法のいずれかにより調製されうるし、または今後、医薬、獣医学、動物およびヒトの栄養補助食品などの分野で開発されてもよい。一般に、そのような予備的な方法は、活性成分を担体または１つまたは複数の他の付属の構成要素と組み合わせる工程、次いで要すれば、その製品を所望の単回用量単位または複数回の用量単位に成型または包装する工程を含む。本発明組成物の制御放出製剤または持続放出製剤は、従来技術を用いて作製することができる。
【００６７】
本発明で使用するための組成物に含まれる活性化合物の投薬量は変更されてもよい。グルカンの基本的な用量範囲は、当業者であれば容易に決定できる。例えば、経口投与される場合、ヒトのための製剤の投薬範囲および有効量は、１日に体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１日に体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１００ｍｇ、最も好ましくは１日に体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜３０ｍｇの範囲であろう。非経口投与される場合、好ましい基本的な用量範囲は、１日に体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１０ｍｇであろう。
【００６８】
本発明に関する組成物は、物品（article）または担体の形状で、例えば、錠剤、コート錠剤、ロゼンジ、トローチ、シロップまたはエリキシル、リポソーム、粉剤／タルクもしくは他の固形製剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤、液剤、スプレー、ゲル、ドロップ、エアロゾル、灌注、軟膏、発泡、クリーム、ゲル、ペースト、マイクロカプセル、制御放出製剤、持続放出製剤、あるいは所定の時間や意図での好ましい投与様式に照らして可能もしくは有用でありうる他のいずれかのアーティクルまたは担体で存在してよい。
【００６９】
投与経路は、当業者であれば容易に理解されるであろうし、また処置される疾患の種類および重症度、処置される対象のタイプおよび年齢を含む多くの要素に依存するであろう。最も好ましい投与経路は、経口であり、場合によっては胃管である。
【００７０】
グルカン（好ましくは可溶性グルカン）の経口投与に適した製剤は、限定するものではないが、水性懸濁液もしくは油性懸濁液、水溶液もしくは油性溶液または乳液が挙げられる。そのような製剤は、限定するものではないが、軟質ゲルカプセルを含むいずれかの方法により投与されてよい。経口投与に適した本発明の医薬組成物の液剤は、液剤または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルを用いて再形成することが意図される乾燥製剤のいずれかで製造され、箱詰めされ、そして販売されてよい。微粒子製品に関して、限定するものではないが、カプセル剤、錠剤、粉剤、顆粒、ロゼンジ、ドロップ、坐剤を含む他の投与方法あるいは微粒子製品に適した他の投与方法を用いることが可能である。
【００７１】
治療は、症状が存在する間または症状が存在しない時でさえ、断続的に繰り返されてもよい。要求される接種の２週間前におよび／または接種後数週の間に、化合物を投与することが適当な場合がある。連続使用もまた慢性状態の処置に関しては可能である。
【００７２】
グルカンは、単独で、または適切に作用する組み合わせを提供するよう他の医薬と組み合わせて提供されうる。このように、さらなる態様において、（ａ）上記のグルカン、および（ｂ）ＩＢＤまたは異常な腸機能の関連疾患を処置するための第二の活性薬剤を含む製品が、ＩＢＤまたは異常な腸機能の関連疾患の処置に、同時に、別個にもしくは連続して使用するための組み合わせ製剤として提供される。第二の活性薬剤は、キク科植物から得られるものが好ましく、そこからタンパク質を含む画分、すなわちミール、例えばヒマワリ・ミール、油の大部分が取り除かれた製品が好ましい。
【００７３】
このように、単一のグルカンを、２個またはそれ以上のグルカンの組み合わせを、または該当する場合にはグルカン（群）と他の医薬物質との組み合わせを用いることが可能である。２種またはそれ以上のグルカンを含む組成物に関して、同一種もしくは異種からのまたは同一種由来であるが異なる方法により調製された様々なグルカンを使用することが可能である。
【００７４】
当業者であれば、その関連する状態の処置にグルカンと一緒に適用することができる医薬物質を選択することが可能であろう。適当な添加医薬物質の例には、限定するものではないが、アザチオプリン（Imuran）、メトトレキサート（Folex、Rheumatrex）または６−メルカプトプリン（Purinethol、６−ＭＰ）およびシクロスポリンＡ（Sandimmune、Neoral）などの免疫抑制剤；スルファサラジン（Azulfadine）、メサラミン（Asacol, Pentasa）およびオルサジン（Olsazine）（Dipentum）；プレドニゾン、メチルプレドニゾロンまたはブデソニド（Entocort EC）で例示されるコルチコステロイドなどのステロイド、メトロニダゾールまたはタイロシンなどの抗生物質；静脈内投与されるインフリキシマブ（infliximab）（Remicade）などの生物学的物質；ならびに魚油および限定するものではないが、アロエ・ベラ、ブチラート、ボスヴェリア（boswellia）、プロバイオティクスおよびニコチンなどの他の物質のような代替医薬に用いられる他の薬物および異なる薬物が挙げられる。
【００７５】
一般に、ベータ−グルカンは、１日に複数回の頻度で動物に投与することができ、または１日に１回のように低頻度で投与することもできる。処置は、例えば、ＩＢＤまたは関連疾患の種類、その状態の重症度および各患者の状態に依存するであろう。グルカン処置は、他の処置計画と密接に関連するであろうし、他のいずれかの医薬の投与前、投与と同時もしくは投与後であってよい。
【００７６】
本発明に記載されるようなグルカンまたは２個もしくはそれ以上のグルカンの組成物は、ＩＢＤの発生前にＩＢＤ状態を抑えるための予防法として、またはＩＢＤが診断された後の処置として適用することができる。従って、本明細書中で用いられる「処置」または「処置する」は、限定するものではないが、予防的処置、すなわち抑えること、さらに安定化させること、例えば処置せずに放っておけば悪化するか結果的にその疾患が治癒することはない疾患の処置が挙げられる。「処置」は、ＩＢＤまたは異常な腸機能の関連疾患の１つまたは複数の、好ましくは１つ以上の症状または危険因子における重要なおよび有益な改善を含む。好ましくは１つまたは複数の症状において、疾患経過を提示する点でまたは予見される点（例えば、予防的処置の場合）のいずれかで、患者および／または処置する医師によりＩＢＤまたは関連疾患が改善されるとの結論が、より好ましい。
【００７７】
用語「ＩＢＤ」は、主として腸管の炎症を引き起こす２つの慢性疾患である炎症性腸疾患（以下、ＩＢＤと称する）、すなわち潰瘍性大腸炎およびクローン病を示す。この疾患は幾つかの共通した特徴を有するが、主として炎症性変化の性質および場所に関して幾つかの重要な違いがある。潰瘍性大腸炎は、主として大腸、別名コロンに限定される炎症性の疾患である。潰瘍性大腸炎においては、腸の内部の層、すなわち粘膜に炎症が生じ、潰瘍が進行する。クローン病は、腸管の領域において潰瘍性大腸炎と異なっており、クローン病は共通して小腸の最後の部分である回腸末端および大腸部分に影響を及ぼすことを伴う。しかしながら、クローン病は胃腸管のいずれの部位もまた冒す場合がある。クローン病は一般的に腸壁全体を巻き込む傾向にあるのに対し、潰瘍性大腸炎は、腸の内部の層にのみ影響を及ぼす。かなり稀な症例に言及すれば、ＩＢＤの他の形態には、例えばコラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎（Diversion colitis）、ベーチェット症候群（Behcet's syndrome）、感染性大腸炎および分類不能の大腸炎がある。
【００７８】
「異常な腸機能の関連疾患」は、患者が、変化した腸の運動性および／または腸炎症に一般に付随する連続的もしくは弧発性の十分に機能しない腸機能を示す疾患および状態を含む。そのような関連疾患および状態は、便秘、下痢および便失禁ならびに外科的な腸切除もしくは類似の施術の結果生じる状態および疾患を含む。
【００７９】
本発明はまた、本明細書に記載されるグルカンと、ＩＢＤまたは異常な腸機能の関連疾患の処置のためにヒトまたは他の動物にグルカンを投与することを記載する資料とを含む、キットまたは投与装置を提供する。キットまたは投与装置はグルカンを含む部分を有しうる。本明細書で用いられる「資料」は、限定するものではないが、その指定された使用に関する本発明の組成物の有用性を伝えるために用いられうる文献、記録、図表またはいずれかの別の表現媒体を含む。
【００８０】
本明細書に記載されるキク科植物のタンパク質は、それ自体で（グルカンの存在とは無関係に）下痢の処置に有効である。そのような処置には、本発明に合致しない同程度の飼料を用いて見られる処理と比べると、下痢における相対的な軽減を含む。下痢は、糞便中の乾燥物質の量に基づいて評価しうる。飼料が別の期待される水準の下痢を予防するため、処置には予防もまた含まれる。
【００８１】
本明細書に記載されるキク科植物のタンパク質はまた、腸疾患の処置および腸の健康を改善するのに有効である。関連する腸疾患は、典型的には炎症であってよいし、炎症性腸疾患もしくは炎症性腸症候群を含みうる。
【００８２】
キク科植物は、好ましくはヒマワリ属（genus Helianthus）のものであり、最も好ましくはヘリアンツス・アンヌース（Helianthus annus）（ヒマワリ）である。
【００８３】
キク科植物のタンパク質は、動物飼料処方の部分として投与される場合に、キク科植物ミールは、典型的には飼料処方全体の２％〜５０％を、好ましくは５％〜４０％を、より好ましくは８％〜３０％を含むであろう。
【００８４】
このように、さらなる態様において、本発明は、動物における腸疾患を処置もしくは予防する際に使用するための、キク科植物のタンパク質を提供する。
【００８５】
本明細書中でキク科植物のタンパク質または他の植物性タンパク質に対する言及がなされる場合、特にその内容を明示しない限り、キク科植物ミールまたは他の植物ミールが用いられてもよいことは理解されよう。さらなる態様において、タンパク質部分以外のキク科植物ミールの他の成分が、本明細書に記載される様々な製剤／処方および方法において、キク科植物のタンパク質に代えて用いられてもよい。
【００８６】
用語「ミール」は、植物、タネまたはマメなどからその油の一部または大部分を、例えば粉砕し溶媒抽出する方法で取り出した後に残った残留物に言及して用いられる当分野で周知の用語である。このように、油糧種子タンパク質とも一般に定義されるこれらの植物性タンパク質供給源は、そのままで与えられてもよいが、それらはより一般的には油を抜き取った後の副産物として与えられる。
【００８７】
ヒマワリ・ミールは、タンパク質、繊維、灰分および脂肪そして油性残留物を含む。ヒマワリ・ミールの成分は、種子の油含有量、外皮除去の程度、油抽出の効率および油を取り出す温度、特に変化しやすいものに依存する。
【００８８】
このように、さらなる態様において、本発明は、ＩＢＤまたは異常な腸機能の関連疾患に使用するための、キク科植物ミールまたはそこから得られるいずれかの要素、例えばタンパク質を提供する。治療のためのグルカンおよび標的種の製剤に関する議論は、変更すべきところは変更してキク科植物由来の製品の使用に当てはめられる。ヒト、サカナおよび家畜の哺乳動物が好ましい。
【００８９】
「有効量」により、疾患症状を改善するのに、あるいは疾患を改善、処置、予防、疾患の発症を遅延または疾患の進行を阻害するのに、有効な化合物量が意味される。最終的には、主治医もしくは獣医師が適当な量および投薬計画を決定するものである。単回投薬を作り出すために担体物質と組み合わされうる活性物質の「有効量」は、処置される対象および具体的な投与様式に応じて変化しうる。
【００９０】
例えば、刊行物および特許を含む様々な文献が、この開示内容を通じて引用される。そのような文献はすべて、関連部分において出典明示により本明細書の一部とされる。いずれかの所定の文献の引用は、本発明に関する先行技術であるという承認と解されるべきものではない。本明細書中の用語の意味または定義はいずれも出典明示により一部とされる文献中の用語の意味または定義のいずれとも不一致とならない範囲で、本明細書中の用語に割り当てられた意味または定義が、優先されるべきであろう。
【００９１】
本明細書中で参照されるものに、本発明で利用される様々な原料を含む成分に関する商標名がある。本発明者らは、この点に関し、特定の商標名の材料に限定されることを意図しない。商標名により示されるものと同等の材料（例えば、別の名前または引用番号のもとで別の供給源から得られるもの）が、本明細書の記載に代えて用いられてもよいし、利用されてもよい。
【００９２】
本明細書に記載される組成物は、本明細書中で記載されるいずれかの要素を包含してもよく、本質的に含んでいてもよく、またはそれらから構成されていてもよい。
【００９３】
本明細書の目的に対して、用語「含む」は、「限定するものではないが含む」ことを意味し、用語「包含する」は類似の意味を有する。従って、用語「含む」および「包含する」は、排他的というよりは包括的に解釈されるべきである。
【００９４】
本明細書中および添付する特許請求の範囲で用いられる、単数形「ある（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈において特に断らない限り、複数形の言及を含む。
【００９５】
別に定義しない限り、本明細書中で用いられるすべての技術用語および科学用語および頭文字はいずれも、当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００９６】
以下の実施例は、本発明の例示であることが意図され、当業者が本発明を作ることができ、かつ使用することができるよう教示するものと意図される。これらの実施例は、いかようにも本発明を限定することを意図しない。ここで、本発明は、以下の実施例および図によりさらに記載される。
【００９７】
（実施例）
実施例１．実験大腸炎における可溶性のベータ−グルカンの効果。
１．１  実験計画：
炎症性腸疾患（ここでは潰瘍性大腸炎により例示される）の処置における可溶性グルカン（ここでは、バイオテック・ファーマコンＡＳＡのＳＢＧ製品）の効果を評価するためのモデルを確立した。
【００９８】
実験大腸炎は、飲用水に溶解させたデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）に７日間曝すことにより誘導した。動物は、大腸炎誘導前に７日間、下記で示されるように前処置した。マウスを、４日の急性期／回復期後に犠牲にした。
【００９９】
動物を、４つの実験群に分けた：
１．対照動物（ｎ＝１２）は、実験を通じて通常の飲用水が与えられた。
２．ＳＢＧ処置動物（ｎ＝１２）は、実験を通じて飲用水中ＳＢＧ（１００ｍｇ／Ｌ）が与えられた。
３．ＤＳＳ処置動物（ｎ＝１６）は、誘導期間の間（７日）、ＤＳＳ（１．５％ｗ／ｖ）が与えられた。通常の飲用水が、前処置期（７日）および急性期／回復期（４日）の間与えられた。
４．ＳＢＧ＋ＤＳＳ処置動物（ｎ＝１５）は、誘導期間の間（７日）、ＳＢＧ（１００ｍｇ／Ｌ）を含む水に溶解されたＤＳＳ（１．５％）が与えられた。飲用水中のＳＢＧ（１００ｍｇ／Ｌ）が、前処置期（７日）および急性期／回復期（７日）の間、与えられた。
【０１００】
１．２  実験の詳細：
動物を、病的状態の全身徴候について毎日観察し、体重および液体の消費を記録した。人道的エンドポイントの主な基準は、基準体重から＞２０％の体重減少であった。明らかに瀕死と判断されるマウスもまた、体重の基準に合っていなくても、動物の幸福を理由に安楽死させた。
【０１０１】
動物は、心穿刺前にＨｙｐｎｏｒｍ（登録商標）およびＭｉｄａｚｏｌａｍ（体重１０ｇあたり５０μＬ〜７５μＬ）の皮下注射により安楽死させた。死後に、大腸、脾臓および胸腺を採取した。大腸を、冷ＰＢＳを用いて洗い、近位結腸、中部結腸、遠位結腸部分に切り分け、固定した。組織試料はすべて、氷上で維持され、後の調製および分析のためにホルマリン中で固定した。
【０１０２】
結果は、体重変化、生存率、大腸炎および組織損傷、疾患に付随する大腸の短縮化および脾臓重量や胸腺重量の変化、そして血液循環中の炎症性メディエーターレベルの変化を研究することにより評価した。
【０１０３】
大腸炎および組織損傷は、試料の内容や試験群であることを隠された熟練した病理学者が評価した。病理組織学的スコアは、炎症細胞の浸潤（スコア  ０〜３）、組織損傷（スコア  ０〜３）、リンパ球凝集物の有無（スコア  ０または１）および上皮の再生の有無（スコア  ０または１）の組み合わせで表される。組織損傷のスコアは、スコアに潰瘍化した面積の割合を掛けることにより調整した（０％〜２５％＝×１、２５％〜５０％＝×２、５０％〜７５％＝×３および７５％〜１００％＝×４）（表２）。合計スコアは、近位回腸、中部回腸および遠位回腸部分から得られたスコアを足し合わせることにより計算した。
【０１０４】
【表９】
2011503161.tif 000013
【０１０５】
表２の注釈：
大腸炎および損傷の程度を定量化する病理組織学的スコアは、大腸の近位回腸、中部回腸および遠位回腸部分をもとにした生検により確立され、組み合わせて合計スコアとする。≧２の組織損傷スコアが記録された場合、そのスコアは病気の領域に対応する係数が掛けられる。
【０１０６】
１．３  結果：
ＳＢＧ経口投与は、大腸炎に付随する体重減少を低下させる。
重大な臨床症状である体重減少をモニタし、実験ＩＢＤにおけるＳＢＧの保護効果を評価した。オスＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＳＢＧまたは通常の飲用水を用いて７日間前処置し、７日間ＤＳＳを与えることにより急性大腸炎を誘導した。対照（Ｃｔｒ）動物［基準体重２２．７ｇ（２１．４ｇ〜２４．０ｇ）；平均値（範囲）、ｎ＝１２］は、実験を通じて通常の飲用水が与えられた。
【０１０７】
ＳＢＧ処置動物［基準体重２２．２ｇ（２０．３ｇ〜２４．９ｇ）；平均値（範囲）、ｎ＝１２］は、実験を通じて飲用水中のＳＢＧ（１００ｍｇ／Ｌ）が与えられた。ＤＳＳ処置動物［基準体重２２．３ｇ（２０．６ｇ〜２３．４ｇ）；平均値（範囲）、ｎ＝１６］は、誘導期間の間ＤＳＳ（１．５％ｗ／ｖ）が与えられた。通常の飲用水が、前処置期および急性期／回復期の間与えられた。
【０１０８】
ＤＳＳ＋ＳＢＧ処置動物［基準体重２２．１ｇ（１９．４ｇ〜２４．０ｇ）；平均値（範囲）、ｎ＝１５］は、誘導期の間ＳＢＧ（１００ｍｇ／Ｌ）を含む水に溶解されたＤＳＳ（１．５％ｗ／ｖ）が与えられた。飲用水中のＳＢＧ（１００ｍｇ／Ｌ）が、前処理期および急性期／回復期の間与えられた。体重および液体の消費を、前処置の間、大腸炎誘導の間およびＤＳＳ処置後４日間、毎日記録した。
【０１０９】
我々は、ＤＳＳ処置動物において１４日から１７日の間に劇的な体重減少約１５％を確認した。大腸炎誘導の前、その間およびその後にＳＢＧを用いて処置された動物は穏やかな体重減少を経験したが、ＤＳＳ＋ＳＢＧ群は、ＤＳＳ単独の群と比べて、大腸炎に付随する体重減少から比較的保護された（１６日目および１７日目にＰ＜０．０５、１８日目にＰ＜０．０１および１９日目にＰ＜０．００１、ＤＳＳ＋ＳＢＧ  対  ＤＳＳ）（図２）。
【０１１０】
さらに、体重低下の始まりが、ＤＳＳ群と比較して、ＳＢＧ＋ＤＳＳ群ではわずかに遅延した。大腸炎のない対照動物は、実験を通じて安定して体重が増加した。我々は、ＳＢＧ動物と通常の飲用水を与えられたマウスとの間に体重の動的変化にいかなる差異も見つけなかった（図２）。
【０１１１】
毎日のＳＢＧ投与量およびＤＳＳ暴露を評価するために、液体の消費をモニタした。１ｋｇあたり２０ｍｇ〜３０ｍｇのＳＢＧ投与量に相当する１日にマウス１匹あたり平均約５ｍＬ〜約７ｍＬが記録された（データは示さない）。
【０１１２】
ＳＢＧ経口投与は、大腸炎に付随する死亡を低下させる。
ＤＳＳ暴露は、血便、下痢、直腸出血、不活動性、不足した毛づくろいおよび幾つかの重症な場合では円背の姿勢および身震いなどの臨床症状を誘導した。明らかに瀕死の動物は、動物の幸福を理由に安楽死させた。重大な大腸炎に付随する体重減少は、死亡と関係しており、かくして基準体重から２０％を超えて体重減少を経験したマウスは、人道的理由により犠牲にした。
【０１１３】
経口ＳＢＧ処置は、計画的エンドポイントであるＤＳＳ処置後４日まで生存するマウスの比率を高めた（ｐ＝０．０４１、ＤＳＳ＋ＳＢＧ対ＤＳＳ）（図３）。ＤＳＳ群では１６匹のマウスのうち６匹が計画的エンドポイント前に犠牲にされたのに対して、ＤＳＳ＋ＳＢＧ群は１５匹の動物のうちただ１匹だけが計画的エンドポイント前に犠牲にされた。また、動物を犠牲にする必要性は、ＤＳＳ＋ＳＢＧ群と比べて、ＤＳＳ群ではより早くに生じた（図３）。
【０１１４】
ＳＢＧ経口投与は、ＤＳＳ誘導した大腸炎および組織損傷を軽減する。
ＳＢＧ投与がＤＳＳ誘導性の炎症および潰瘍に対する保護を与えうるかどうかを調べるために、近位回腸、中部回腸および遠位回腸の組織切片を試験した。炎症性細胞の浸潤および組織損傷の存在および程度ならびにリンパ球凝集物の有無および上皮の再生のサインに注意して、組織病理学スコアを確立した（表２を参照のこと）。
【０１１５】
明らかな病理は、対照群またはＳＢＧ群には観察されなかった。一方、ＤＳＳ群においては、粘膜下層に及ぶ多数の炎症細胞浸潤が観察され、幾つかの場合には貫壁性を伴っていた。粘膜微細構造の甚大な破壊、中程度から重篤な潰瘍、幾つかの場合には上皮組織の完全な欠乏を含め、明瞭な陰窩および杯細胞の欠損が見られた。粘膜の浮腫および腸壁肥厚のサインもまた認められた（図４Ａ）。
【０１１６】
ＤＳＳ＋ＳＢＧ処置マウス切片には、大腸炎の明瞭な組織学的サインが外見上明らかにあったが、この群では非常に低い病理組織学的スコアが得られた（Ｐ＝０．０２７、ＤＳＳ＋ＳＢＧ  対  ＤＳＳ）（図４Ｂおよび表３）。この炎症および組織損傷は、遠位回腸部分でより顕著なようだ（データは示さない）。
【０１１７】
ＳＢＧ経口投与は、大腸炎に付随する大腸の短縮化を軽減する。
大腸の短縮化は、ＤＳＳ誘導性大腸炎の十分に確立された疾患に付随する特徴である。実験的な大腸におけるＳＢＧの保護能力をさらに評価するために、大腸を切除し、その長さを測定した。
【０１１８】
ＳＢＧ経口投与は、炎症のない状態では大腸の長さに影響を及ぼさないようだ。ＤＳＳ群では大腸が、対照動物の大腸よりも約３０％短くなった。ＤＳＳ＋ＳＢＧ群の大腸の長さはＤＳＳへの暴露により明らかに影響を受けたが、大腸はＤＳＳ群よりも有意に長かった（Ｐ＝０．００５、ＤＳＳ＋ＳＢＧ  対  ＤＳＳ）（図５Ａ、Ｂおよび表３）。
【０１１９】
ＤＳＳ群において最も短縮化した６つの大腸はすべて疾患の進行により早期に安楽死させた動物から得られたことから、大腸の短縮化は疾患の重症度と良く相関している。我々はまた、ＤＳＳ群からの大腸が十分に形を成していない便を含んでいたのに対して、ＤＳＳ＋ＳＢＧ群および対照群では便の塊を成していたことも観察した。微視的な遠位での壁肥厚および大腸の透明性の消失がＤＳＳ群およびＤＳＳ＋ＳＢＧ群の両方で外見上明らかであり、ＤＳＳ群では、より強く表れるようであった。
【０１２０】
ＳＢＧ経口投与は、急性大腸炎において脾臓重量および胸腺重量をモジュレートする。
ＳＢＧ経口投与が急性大腸炎におけるリンパ組織に影響を及ぼしうるかどうかを調べるため、脾臓および胸腺を死後に採取した。早期に安楽死させたマウスは、対照動物と比較して、大腸炎の重症度のために減少した脾臓量および胸腺量を有しており、このことは、減少した体重が大腸炎に付随する病的変化と相関することを示すものである（図６、白抜きの記号）。
【０１２１】
対照群とＤＳＳ群との間に脾臓重量における全体的な差異は認められなかった。しかしながら、ＤＳＳ＋ＳＢＧ群において、脾臓重量はＤＳＳ群で観察されたものよりも有意に大きかった（Ｐ＝０．０４６、ＤＳＳ＋ＳＢＧ  対  ＤＳＳ）（図６Ａおよび表３）。統計学的に有意ではなかったが、ＳＢＧ群は対照マウスと比較して脾臓重量が僅かに大きいようであった。
【０１２２】
さらに、ＳＢＧ経口投与は、大腸炎に付随する胸腺の退縮を制限するようであった（Ｐ＝０．０４２、ＤＳＳ＋ＳＢＧ  対  ＤＳＳ）（図６Ｂおよび表３）。
【表１０】
2011503161.tif 000014
【０１２３】
ＳＢＧ経口投与は、急性大腸炎の全身性炎症を制限する。
ＳＢＧ経口投与が全身性炎症に影響を及ぼしうるかどうかを調べるために、様々な炎症メディエーターのレベルを、犠牲にした後の４つの実験群のマウスにおいて決定した。
【０１２４】
図８で見ることができるように、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１βのレベルはすべて、対照群と比較して、ＤＳＳマウスで増大した。しかしながら、これらの炎症メディエーターレベルは、ＤＳＳ群と比較してＤＳＳ＋ＳＢＧ群では減少しており、このことは、ＳＢＧが疾患に付随して増加するこられの炎症メディエーターのレベルを減少させることにより急性大腸炎における全身性炎症を低下させうることを示すものである。
【０１２５】
ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、エオタキシン、ランテス（Rantes）、ＫＣ、ＭＩＰ−１αおよびＧ−ＣＳＦのレベルにおける全体的な差異は、ＤＳＳ群とＤＳＳ＋ＳＢＧ群との間には認められなかった。
【０１２６】
１．４  結論：
実施例１は、ＤＳＳ誘導型の実験的ＩＢＤにおけるＳＢＧ経口投与の有益な効果を明らかに実証する。
１）経口ＳＢＧ処置は、実験動物における大腸炎に付随する体重減少を軽減する。
２）経口ＳＢＧ処置は、実験的ＩＢＤにおける大腸炎に付随する死亡を低下させる。
３）経口ＳＢＧ処置は、実験的大腸炎における大腸の炎症および組織損傷を軽減する。
４）経口ＳＢＧ処置は、実験的大腸炎における大腸炎に付随する大腸の短縮化を低減する。
５）経口ＳＢＧ処置は、大腸炎に付随する胸腺の退縮を制限する。
６）経口ＳＢＧ処置は、急性大腸炎における全身性の炎症を制限する。
【０１２７】
１．５  追加的な実験の詳細：
ＳＢＧ経口投与の急性大腸炎における体重減少に対する効果。
マウスは、ＳＢＧまたは通常の飲用水を７日間与えられ、７日間のＤＳＳ経口暴露により急性大腸炎を誘導した。体重は、大腸炎誘導の間に、前処置に、それに続く急性期および初期の回復期（Ａｃｕ／ｒｅｃ）の間の４日間（この後に、動物は犠牲にされた）、毎日記録した。対照動物（Ｃｔｒ、ｎ＝１２）は、実験を通じて通常の飲用水が与えられた。ＳＢＧ処置動物（ＳＢＧ、ｎ＝１２）は、実験を通じてＳＢＧが補充された飲用水（１００ｍｇ／ｍＬ）が与えられた。ＤＳＳ処置動物（ＤＳＳ、ｎ＝１６）は、前処置期には通常の飲用水が与えられ、誘導期にはＤＳＳが補充された飲用水（１．５％ｗ／ｖ）が、そして急性期／回復期には通常の飲用水が与えられた。ＤＳＳとＳＢＧとを組み合わせて処置された動物（ＤＳＳ＋ＳＢＧ、ｎ＝１５）は、前処置期にはＳＢＧが補充された飲用水が与えられ、誘導期には組み合わせたＤＳＳ／ＳＢＧが補充された飲用水が、そして急性期／回復期にはＳＢＧが補充された飲用水が与えられた。体重は、基準（ＢＬ）値からのパーセンテージ（平均値±ＳＥＭ）で表される。Ｅは、安楽死させたマウスであり、体重減少が＞２０％または瀕死の状態による。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、ボンフェローニ・ポストテスト（Bonferroni posttest）による分散の２ウェイ（two-way）分析により決定されたＤＳＳ  対  ＤＳＳ＋ＳＢＧ。表記のデータは、２つの独立実験から集められたものである。
【０１２８】
ＳＢＧ経口投与の急性大腸炎における生存に対する影響。
マウスは、記載のように、ＳＢＧまたは通常の飲用水を用いて前処置した後に、ＤＳＳの経口暴露により急性大腸炎を誘導した。死亡数／強制的な安楽死は、ＤＳＳ除去後の４日の急性期／回復期に記録され、当初の群サイズのパーセントで表した。人道的エンドポイントの基準は、基準体重から＞２０％の体重減少であった。間違いではなく、体重減少の基準を満たしていない瀕死の動物もまた安楽死させた。表記のデータは、２つの独立実験から集めたものである。
【０１２９】
ＳＢＧ経口投与の急性大腸炎における大腸炎および組織損傷に対する効果。
マウスは、記載のように、ＳＢＧまたは通常の飲用水を用いて前処置した後に、ＤＳＳの経口暴露による急性大腸炎を誘導した。死後に、大腸を採取し、ＰＢＳを用いて洗い、組織学的分析のために調製した。ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、Ｈ＆Ｅ染色した切片を、炎症細胞浸潤、組織損傷、リンパ球凝集物および上皮の再生に関して試験した（表２）。Ａ）対照動物（Ｃｔｒ、上段左）、ＳＢＧ処置動物（ＳＢＧ、上段右）、ＤＳＳ処置動物（ＤＳＳ、下段左）およびＤＳＳとＳＢＧとの組み合わせで処置した動物（ＤＳＳ＋ＳＢＧ、下段、右）の代表的な遠位回腸のＨ＆Ｅ切片で、元の倍率は１００×である。Ｂ）近位回腸、中部回腸および遠位回腸部分が評価され、全体的な病理組織学的スコアは、マウスごとに計算した。白抜きの記号は、計画的エンドポイント前に、動物の幸福を理由に安楽死させた動物を示す。棒（バー）は、中央値を表す。表記のデータは、２つの独立実験から集めたものである。
【０１３０】
ＳＢＧ経口投与の大腸炎に付随する大腸の短縮化に対する影響。
マウスは、記載のように、ＳＢＧまたは通常の飲用水を用いて前処置した後に、ＤＳＳの経口暴露による急性大腸炎を誘導した。死後に、大腸を採取し、大腸の長さを測定した。Ａ）対照動物（Ｃｔｒ）、ＳＢＧ処置動物（ＳＢＧ）、ＤＳＳ処置動物（ＤＳＳ）およびＤＳＳとＳＢＧとの組み合わせで処置した動物（ＤＳＳ＋ＳＢＧ）から採取された大腸の写真である。画像は、デジタル増強した（Adobe PhotoshopCS 8.0、Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA）。Ｂ）ｍｍ表示の大腸の長さ。白抜きの記号は、計画的エンドポイント前に、動物の幸福を理由に安楽死させた動物を示す。棒は、中央値を表す。表記のデータは、２つの独立実験から集めたものである。
【０１３１】
ＳＢＧ経口投与の急性大腸炎における脾臓重量および胸腺重量に対する効果。
マウスは、記載のように、ＳＢＧまたは通常の飲用水を用いて前処置した後に、ＤＳＳの経口暴露による急性大腸炎を誘導した。死後に、脾臓（Ａ）および胸腺（Ｂ）を採取した。ホルマリン固定後に、組織重量（ｍｇ）を記録した。白抜きの記号は、計画的エンドポイント前に、動物の幸福を理由に安楽死させた動物を示す。棒は、中央値を表す。表記のデータは、２つの独立実験から集めたものである。
【０１３２】
実施例２
２．１  実験計画：
飼料ベータ−１，３／１，６−グルカン製品であるＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）および加水分解された酵母細胞／完全な酵母細胞製品であるＰａｔｏＧａｒｄ（登録商標）の効果を、一般的とは言えない高濃度の植物性タンパク質を含む動物飼料製品を用いて試験した。高タンパク飼料の目的は、その腸内に状態を作り出し、ＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）およびＰａｔｏＧａｒｄ（登録商標）のその状態の予防および処置における効果を評価することである。この試行に用いられたサカナは、タイセイヨウ・サケ（Salmo salar）であった。
【０１３３】
１５％を超える高含有量の植物性タンパク質は、サカナがこの種の高タンパク質の餌に慣れていないため、通常、サカナの大腸の低下した健康をもたらす。この試行では総タンパク含有量が３２％まで増大されており、このため、サカナの大腸に有害な影響がもたらされる。種々の植物性タンパク質の効果を調べる目的で、大豆タンパク質およびヒマワリタンパク質の両方が用いられ、フィッシュ・ミール製品を消化することが容易な判断基準を比較した。
【０１３４】
この試行は、合計で９つの別個の群を含む。この別個の群は、ＰａｔｏＧａｒｄ（登録商標）およびＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）（６５％、β−１，３／１，６−グルカン）が与えられた。対照群は、製造された植物性タンパク質を多く含有する動物飼料だけが与えられた。その分布は以下の表４で確認できる。
飼料１ＦＭ：フィッシュ・ミールのみを用いた飼料
飼料２：ＦＭＳ：フィッシュ・ミールと３２％の大豆を用いた飼料
飼料３：ＦＭＳＰＧ：２０００ｍｇのＰａｔｏＧａｒｄ（商標）を用いた２群の飼料
飼料４：ＦＭＳＭＧ：１０００ｍｇのＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）を用いた２群の飼料
飼料５：ＦＭＳＳ：フィッシュ・ミール、１５％大豆ミールおよび１５％ヒマワリ・ミールを用いた飼料
飼料６：ＦＭＳＳＰＧ：２０００ｍｇのＰａｔｏＧａｒｄ（商標）を用いた５群の飼料
飼料７：ＦＭＳＳＭＧ：１０００ｍｇのＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）を用いた５群の飼料
【０１３５】
７つの群は、海中の５×５×５メーターの生簀（trail basin）で飼育された１５０匹のサカナから構成された。これらの群は、７１日間それぞれの飼料が与えられた。その期間の後に、サカナを寸法し、重量測定し、組織試料を無作為に選び出した２７匹のサカナの腸から切り出した。組織の変化は、標準方法を用いて記録し、ウラン・スコア（Uran-score）後に分類した。そのスコアは、（１）核上空胞の存在および大きさ、（２）固有層の単層ヒダ（simple fold）の広がりの程度、（３）基底ヒダ（base fold）と緻密層（stratus compactum）の粘膜ヒダとの間の結合組織の量および（４）粘膜ヒダの肥厚化の程度に着目する。各チェックポイントは、１が損傷を受けていないことを意味し、５が致命的な損傷である、１〜５の段階に分類される。
【０１３６】
２．２  結果および議論：
【表１１】
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表４：ウラン・スコア（Uran score）を用いて測定した１群〜７群の飼料による腸の健康
【０１３７】
２群および５群のサカナ飼料における腸健康への悪影響は、ＰａｔｏＧａｒｄ（商標）およびＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）を飼料に加えることにより大きく軽減した（３群、４群、６群および７群）。ＰａｔｏＧａｒｄ（商標）の添加は、大豆単独をまたは大豆とヒマワリとの組み合わせを含む飼料に比べて顕著な軽減をもたらした。これらの結果は、ＰａｔｏＧａｒｄ（商標）とＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）の両方が飼料中の植物性タンパク質の有害な効果を打ち消し、かくして改善した腸の健康をもたらすことを明らかに示す。
【０１３８】
実施例３
３．１  原料および食餌：
食餌の形状および組成は、表５および表６にそれぞれ示される。標準的なフィッシュ・ミールを元にした対照食餌（ＦＭ）、１３．２％の抽出後に炙られた大豆ミール［ＳＢＭ］と１３．５％の抽出後のヒマワリ・ミール［ＳＦＭ］とを含む野菜の多い食餌（ＦＭ＋ＳＳ）、および２９．９％の大豆ミールを含む野菜の多い食餌（ＦＭ＋Ｓ）が、Skretting（Averoy, Norway）による高圧の湿潤型押し出し成形により製造された。その粒子の大きさは６ｍｍであり、食餌はすべて乾燥させた後に、魚油でコーティングした。
【０１３９】
油でコーティングする前に、基礎材料となるＦＭ＋ＳＳ食餌の一部を最初に、食餌１ｋｇあたり１０００ｍｇのＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）（ＦＭ＋ＳＳ＋１０００ＭＧ）または２０００ｍｇのＰａｔｏＧａｒｄ（登録商標）（ＦＭ＋ＳＳ＋２０００ＰＧ）でコートした。同様に、基礎材料となるＦＭ＋Ｓ食餌の一部、食餌１ｋｇあたり５００ｍｇのＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）（ＦＭ＋Ｓ＋５００ＭＧ）もしくは１０００ｍｇのＭａｃｒｏＧａｒｄ（登録商標）（ＦＭ＋Ｓ＋１０００ＭＧ）または１０００ｍｇのＰａｔｏＧａｒｄ（登録商標）（ＦＭ＋Ｓ＋１０００ＰＧ）もしくは２０００ｍｇのＰａｔｏＧａｒｄ（ＦＭ＋Ｓ＋２０００ＰＧ）を、あらかじめコートした。これにより、一組の９つの実験食餌が得られた。
【０１４０】
【表１２】
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＊第一リン酸カルシウム
【０１４１】
【表１３】
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＊ＣＰ；Ｎ×６．２５
【０１４２】
３．２  サカナ、飼育条件およびサンプリング：
タイセイヨウ・サケ（Salmo salar）は、実験食餌が計６９日〜７１日の食餌日に与えられた。実験前には、サカナは商品の食餌（Skretting AS, Stavanger, Norway）が与えられた。実験は、２００６年の２５週に開始され、３６週で終了した。水温は、実験期間中に１２．３℃から１７．４℃の間で変動し、平均は１５．３℃であった。
【０１４３】
実験開始時に、２７群のサケ（６７９ｇ、一群あたり１５０匹のサカナ）を無作為に５×５×５ｍ３の生簀に分けた。次いで、３重で行う無作為試験計画において、各食餌を３群のサカナに割り当てた。サカナは、電気駆動式の給餌器により絶えず飼料が与えられ、食べられなかった飼料は、Einen（１９９９）により記載されたように生簀の底から集められ、ポンプを使ってワイヤーメッシュの濾し器に入れられた。その食餌の割合は、１５％過剰となるように計画され、Hellandら（１９９６）により記載されたように３日おきに過剰摂取の記録に従って調整された。
【０１４４】
サカナは、実験開始時と給餌開始７０日目にバルクで重量測定された。最後の重量測定の際に、十分な数のサカナを、Austreng（１９７８）により記載されたように、トリカイン・メタンスルフォネート（MS 222, Argent Chemical Laboratories Inc., Redmont, Wa, USA）を用いて麻酔をかけ、外皮を剥がし、さらに消化率評価のために糞便を集めることもした。糞便飼料を生簀ごとに集め、すぐに−２０℃で凍結した。
【０１４５】
３．３  化学分析および組織学的検査：
糞便は凍結乾燥後に分析した。食餌および凍結乾燥した糞便を、乾燥物質、灰分、窒素、脂肪、デンプン（α−アミラーゼおよびアミロ−グルコシダーゼにより加水分解した後にグルコースとして決定し、続いて「GODPOD方法」（Megazyme, Bray, Ireland）によりグルコース決定した）、総エネルギー（Parr 1271 ボンベ熱量計（Bomb calorimeter）, Parr, Moline, IL, USA）およびイットリウム（Jordforsk, Ås, Norway、Refstie et al.により既に記載されたように（1997）誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）質量分析で）について分析した。
【０１４６】
３．４  統計分析：
結果は、ＳＡＳコンピュータ・ソフトウェア（SAS、1985）の一般線形モデルの手順により分析した。生簀あたりの平均の結果を、独立変数として食餌を用いた一元配置分散分析（ANOVA）にかけた。有意な差は、Duncanの多重範囲検定により示された。有意の程度はＰ≦０．０５であり、その結果は平均値±標準誤差（平均の平均誤差）として表される。
【０１４７】
３．５  結果および議論：
ＦＭ＋ＳおよびＦＭ＋ＳＳ食餌を与えることで、概して、ＦＭ食餌を与えた場合と比べて糞便中に乾燥物質の量が少ない（すなわち、より水が多い）という結果が得られ、これは、下痢であることを示す（表７下段）。
【０１４８】
【表１４】
2011503161.tif 000018
列（カラム）内の種々の上付き文字ａｂｃｄは、Duncaの多重範囲検定により示されるように有意差を表す（Ｐ＜０．０５）。
【０１４９】
ＦＭ＋ＳＳ食餌を比較すると、２０００ｍｇ／ｋｇのＰＧを添加した場合にこれは有意に改善されており、１０００ｍｇ／ｋｇのＭＧを添加した場合にも下痢状態は回復傾向を示した。ＭＧおよびＰＧのそのような効果は、それらを基本材料のＦＭ＋Ｓに添加した場合でも見られなかった。
【０１５０】
実施例４．マウスの腸管および腸管関連リンパ系組織における可溶性のベータ−グルカンの効果。
４．１  実験計画：
健康なマウスの腸管および腸管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴ）および腸上皮における可溶性グルカン（ここでは、バイオテック・ファーマコンＡＳＡの製品ＳＢＧ）の効果を評価するためのモデルを確立した。結果は、体重変化、液体の消費、パイエル板（ＰＰ）の数およびリンパ球凝集物、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）の横断面の面積およびリンパ球凝集物、ならびにＫｉ６７陽性細胞および杯細胞の数および分布を調べることにより、評価した。肉眼で確認できるＰＰの数を、切除した腸の目視による検査で決定した。ホルマリン固定されたＭＬＮの横断面の面積は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した断面の分析により決定した。ＰＰおよびＭＬＮにおける主要なリンパ球サブセットの組成は、フローサイトメトリーを用いて試験した。増殖型のＫｉ６７陽性細胞、腸上皮細胞は、免疫組織化学により確認した。
【０１５１】
オスのＢＡＬＢ／ｃマウスは、実験に入る少なくとも１週間前に、ノルウェー、オスロにあるRikshospitalet大学病院の比較医学センター（Centre for Comparative Medicine at Rikshospitalet University Hospital, Oslo, Norway）内の微小疾患ユニット（minimal disease unit）で飼育した。動物は、１ケージあたりマウス２匹で飼育され、水が与えられ、餌は通常自由に得ることができた。ケージは、２１℃±１℃で比較的湿気のある５５％±１０％で維持された。光の条件は、徐々になる暗くする夕暮れの１時間を含む１２時間交代の明／暗の周期であった。
【０１５２】
マウスを、無作為に２つの実験群に分けた：２０日間（０日〜１９日）自由にＳＢＧが補充された水（１００ｍｇ／Ｌ）または通常の飲用水がそれぞれ与えられたＳＢＧ処置マウスおよび対照（Ｃｔｒ）マウス。体重および液体の消費を記録し、実験を通じて病的状態の臨床症状について、マウスをモニタした。
【０１５３】
３つの同じであるが別々に進行する実験を行った。続く組織学的研究のために保存される組織試料を、２つの最初の実験で集めたが、フローサイトメトリーによる分析のための新鮮な材料は、第三の実験で集めた。
【０１５４】
心穿刺前に、動物をＨｙｐｎｏｒｍ（登録商標）およびミダゾラム（体重１０ｇあたり５０μＬ〜７５μＬ）の皮下注射により麻酔にかけた。死後に、マウスを７０％エタノールに浸し、切開用のボードに固定した。腹部を切開し、ＭＬＮ、鼠径リンパ節（ＩＬＭ）、脾臓および腸を切り出した。小腸は、肉眼で確認できるＰＰについて調べて確認したＰＰを切り出した。結腸は、冷ＰＢＳを用いて洗い、糞便の内容物を取り出し、固定化した。続く組織学的分析のために集めた組織試料を、氷上で維持し、４℃で２４時間１０％ホルマリン中で固定化した。固定化された組織試料を、０．１％ホルマリンを含むＰＢＳに移し、次の調製および分析のために４℃で保存した。続くフローサイトメトリー分析のために分離したＰＰ、ＭＬＮ、ＩＬＮおよび脾臓を、氷冷ＦＭに移した。心穿刺によりリチウムヘパリン真空管中に採取した血液を、次の分析までの間氷上で維持した。
【０１５５】
組織化学および免疫組織化学
ホルマリン固定した生検は、自動組織処理装置を用いて処理し、続いてパラフィンに包埋した。切片は４μｍに切り、ポリジンコートしたスライド上にのせた。顕微鏡および画像解析は、試料の種類が伏せられた実験者により行われた。
【０１５６】
ＭＬＮ横断面の面積
ＭＬＮ断面は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて手作業で染色し、デジタルカメラとイメージングソフトウェアを備えた光学顕微鏡にて試験した。ＭＬＮ横断面の面積は、顕微鏡のイメージングソフトウェア中の組み込み機能を用いて顕微鏡写真を分析することにより計算した。簡単には、ＭＬＮ断面の周囲を、差し挟み可能な描画ツールを用いて印をつけて、その領域に含まれるピクセルの数に基づいて計算した。
【０１５７】
杯細胞の計数
遠位結腸の切片は、キシレンおよびエタノール中で脱パラフィン化し、蒸留水中で再度水和させた後に、ヘマトキシリン、アルシアンブルーおよび過ヨウ素酸シッフ試薬を用いて自動組織染色装置で染色した。結腸洗浄部分は光学顕微鏡において試験した。杯細胞の数は、２０の正しい場所に位置する陰窩中のＡＢ／ＰＡＳ陽性細胞を計数し、無傷の陰窩の高さを示すことにより決定し、陰窩あたりの陽性細胞の平均数で表した。杯細胞の陰窩内での分布は、陰窩の１／３の基底部、中央部、上部中の陽性細胞の数として示した。図の顕微鏡写真は、カメラを備えた光学顕微鏡を用いて取得した。
【０１５８】
免疫組織化学
遠位結腸生検のホルマリン固定した切片は、キシレンおよびエタノール中で脱パラホルム化し、ＰＢＳ中で再度水和させ、ＣＡ抗原を回復させる緩衝液中で２０分間煮沸した。切片を、一次抗体または濃度対応対照抗体もしくはアイソタイプ対応対照抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄した後、切片を蛍光色素結合二次抗体と共に室温で３時間インキュベートした。核は、ヘキスト染色により染めた。切片は、デジタルカメラおよびイメージングソフトウェアを備えた蛍光顕微鏡で調べた。
【０１５９】
増殖型のＫｉ６７陽性上皮細胞の数および増殖性の領域の大きさは、デジタル画像の分析により決定した。無傷の陰窩の高さを示す切片の領域を分析のために選んだ。細胞計数は、≧８つの陰窩を計数して、陰窩あたりの陽性細胞数の平均値として表し、増殖性の領域は陰窩の高さの合計に対するパーセンテージとして表した。
【０１６０】
ＩＥＬの数は、上皮内に位置することが明らかなＣＤ３陽性細胞を計数することにより決定した。結腸部分の完全な境界線は、蛍光顕微鏡で直接区切った。
【０１６１】
フローサイトメトリー
脾臓、ＭＬＮ、ＩＬＮおよびＰＰは、平型のスパチュラチップ・ピンセット（flat spatula-tip tweezer）を用いたＦＭ緩衝液中、２枚のナイロンメッシュ・シートの間で、バラバラにし、激しく擦り合わせた。そのホモジネートを、新しいナイロンメッシュにより濾過して、遠心（１４００ｒｐｍ／４１０ｇ、４℃で４分間）し、ＦＭ中で洗浄し、単独の細胞の懸濁溶液を得た。１００万個のＭＬＮ細胞、ＩＬＮ細胞およびＰＰ細胞ならびに３００μＬの全血を、ＦＭ緩衝液中に１００μＬあたり抗体と０．１ｍｇのラットＩｇＧからなる１００μＬの染色カクテルと共に暗所の氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＦＭ中で洗浄し、上記のように遠心分離し、ＡＰＣ−Ｃｙ７結合ストレプトアビジンと共に暗所の氷上で２０分間インキュベートし、用いたビオチン化抗体を標識した。ＦＭ中での洗浄後、組織由来の単独の細胞を、パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中１％）に再懸濁し、固定化のために暗所の氷上で５分間インキュベートした。固定剤を取り除き、細胞をＦＭ中に再懸濁し、次のフローサイトメトリー分析のために４℃の暗所中で保存した。白血球を、製造業者の使用説明書に従って、ＯｐｔｉＬｙｓｅＢ中で赤血球を溶解することにより、全血染色反応から分析のために調製した。溶解溶液を遠心分離により取り除き、細胞を固定化し、ＦＭ中で再懸濁し、そして上記のように分析のために保存した。染色していない脾臓、ＭＬＮ、ＩＬＮ、ＰＰおよびＯｐｔｉＬｙｓｅＢ処理した全血細胞は、対照として提供される。細胞懸濁液を、フローサイトメトリーにて分析した。
【０１６２】
統計分析
体重および液体の消費のデータは、平均値と平均値からの標準偏差（ＳＤ）とで表され、ボンフェローニ・ポストテスト（bonferroni post test）を用いた二元配置分散分析（ANOVA）により分析した。ＰＰの数、ＭＬＮ横断面の面積、杯細胞の数、上皮の増殖およびＩＥＬの数は、平均値で表され、マン・ホイットニー（Mann-Whitney）検定を用いて分析した。白血球組成物のフローサイトメトリー・データは、平均値と標準偏差（ＳＤ）として表され、マン・ホイットニー検定を用いて分析した。ガウス集団からの代表的な無作為標本抽出ではなく、非常に疑わしい異常値は、グラブス異常値検出検定（Grubb's outlier detection test）により見分けられ、さらなる分析から除いた。統計分析はすべて、グラフパッド・プリズム  バージョン４（GraphPad Prism, version 4）（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いて行った。Ｐ＜０．０５の差は、統計学的に有意とみなした。
【０１６３】
４．２  結果：
体重および液体の消費におけるＳＢＧ補充の効果
オスのＢＡＬＢ／ｃマウスを、無作為に２つの実験群に分けた：Ａ群は、ＳＢＧが補充された飲用水（ＳＢＧ）が与えられ、対照群は、単なる飲用水（Ｃｔｒ）が与えられた。ＳＢＧ経口投与に対する実験動物の全体的な健康状態をモニタするために、体重を記録した。マウスは、徐々に体重が増加し、Ｃｔｒ動物とＳＢＧ処置動物との間に大きな体重の差は観察されなかった（図９）。ＳＢＧは、非常によく寛容されるようで、病的変化の臨床徴候には気が付かなかった。
【０１６４】
食欲および全体的な活動におけるＳＢＧ補充の効果をさらに調べるために、また、重要なことには、摂取された日々のおよび合計のＳＢＧ量を評価するために、マウス１匹あたりの液体の平均消費量を計算した。液体の消費は、１日にマウス１匹あたり約４ｍｌ〜７ｍｌであり、これは、ＳＧＢ群において１日に体重１ｋｇあたり１５ｍｇ〜３０ｍｇのβ−グルカン量に相当する。実験群との間で液体の消費量には差が記録されなかった（図９）。
【０１６５】
ＳＢＧ経口投与は、粘膜誘導部位に影響を及ぼす。
ＳＢＧ経口投与のＧＡＬＴ、ＰＰおよびＭＬＮにおける効果を調べるために、不可欠な粘膜誘導部位および調節部位を試験した。ＳＢＧ群において、小腸中の肉眼により目視可能なＰＰの中央値は、我々がＣｔｒ群で観察したものより約４０％大きかった（Ｐ＜０．０１）（図１０Ａ）。さらに、我々は、ＳＢＧ処置マウスにおいてＭＬＮの大きさに有意な増加を認めた。ＳＢＧ群において、取り出されたＭＬＮの中央の横断面の面積は、我々がＣｔｒ群で観察したものより約３５％大きかった（Ｐ＜０．０５）（図１０Ｂ）。楕円体のＬＮを仮定すると、これは、推定容積で５０％〜６０％の増分に相当する。
【０１６６】
ＳＢＧ経口投与後のＧＡＬＴにおける明確な変化にもかかわらず、主要なリンパ球集団の特徴（ＣＤ４ｐｏｓ、ＣＤ８ｐｏｓ、ＣＤ１９ｐｏｓ細胞）は、ＰＰに対してだけでなく、ＭＬＮについても実験群間で差がないことが明らかとなった（図１１）。同様に、全身の一部を示す、血液白血球、脾臓の単独の細胞懸濁液およびＩＬＮの単独の細胞懸濁液におけるリンパ球の組成は、ＳＢＧ経口投与により変わらなかった（データは示さない）。フローサイトメトリー分析は、試験した全ての細胞調製物において、デクチン（Dectin）−１ｐｏｓ細胞、第一のＭＨＣクラスＩＩｐｏｓ、ＣＤ１１ｂｐｏｓまたはＣＤ１１ｃｐｏｓ細胞の存在、すなわちマクロファージおよび樹状細胞の存在を明らかにした。しかしながら、ＳＢＧ経口投与は、このβ−グルカン受容体の発現プロファイルを変化させることはないようだ。ＳＢＧ処置したマウスから分離したＭＬＮの単独の細胞のデクチン−１陽性は、３．３％±１．２％であったのに対し、対照動物では３．３％±１．２％であった（平均値±ＳＤ）。ＰＰに関して対応する数値は、０．２２％±０．０４％  対  ０．２３％±０．０５％、ＩＬＮについては３．２％±１．２％  対  ３．４％±０．７％、脾臓については６．５％±１．６％  対  ７．１％±１．２％、そして血液白血球については７．９％±１．６％  対  ８．０％±１．９％であった。
【０１６７】
ＳＢＧ経口投与は、上皮の増殖を増大させる
さまざまな腸管上皮細胞型により媒介される自然防御機能を調べるために、我々はまず、粘液を産生する杯細胞の数および分布を調べた。ＳＢＧ経口投与は、遠位結腸における杯細胞の数または陰窩内での分布に影響を及ぼさなかった。ＳＢＧ処置されたマウスにおける陰窩あたりのＡＢ／ＰＡＳ陽性杯細胞の数は、対照群の７．６［５．４〜１０．３］と比べて、６．６［３．１〜８．８］であった（平均値［範囲］）（図１３）。我々はまた、ＩＥＬの切片を染色し、ＩＥＬが遠位結腸切片中にはほとんど認められず、ＳＢＧ処置マウスと対照との間でＩＥＬの数に差がないことを明らかにした。ＳＢＧ処置マウスの切片あたりのＣＤ３ｐｏｓＩＥＬの数は、対照群の１２．３［６．５〜２１．５］に対して、１２．４［５．０〜２１．０］であった（平均値［範囲］）。
【０１６８】
次に、我々は、ＳＢＧ経口投与の腸管上皮、粘膜の作用部位における効果を調べた。ＳＢＧで処置されたマウスにおいて、遠位結腸における増殖型の上皮細胞の数は、我々が対照動物において観察した数よりも有意に多かった（図１２）。ＳＢＧ群における陰窩あたりのＫｉ６７ｐｏｓ細胞の中央値は、Ｃｔｒ群でのものよりも３７％多かった（Ｐ＜０．０１）。さらに、増殖性の領域の中央値のサイズは、対照と比べて、ＳＢＧ群での値よりも２５％大きかった（Ｐ＜０．００１）。
【０１６９】
４．３  結論：
本実施例は、ＳＢＧの投与が、ＰＰおよびＭＬＮ、生命維持に必要な粘膜の誘導部位に効果があることを明確に示す。ＰＰおよびＭＬＮは、経口免疫寛容および腸内での微生物叢に対する体系的な未反応性の誘導および維持に中心的な役割を果たす。
【０１７０】
本明細書中で、はじめて、経口投与されたＳＢＧが、ＧＡＬＴおよび上皮、生命維持に必要な粘膜免疫系の誘導部位および作用部位をそれぞれ刺激することを実証した。可溶性β−グルカンの経口投与は、ＧＡＬＴ（ＰＰおよびＭＬＮ）のサイズに効果があることを実証した。推論ではあるが、このことは、腸管上皮からＧＡＬＴに遊走するβ−グルカンを運搬する細胞が、観察されたＭＬＮおよびＰＰの拡張に貢献する可能性がもっともらしいと考えられる。
【０１７１】
フローサイトメトリーによるＭＬＮおよびＰＰでのＣＤ４ｐｏｓＴ細胞およびＣＤ８ｐｏｓＴ細胞、およびＣＤ１９ｐｏｓＢ細胞、主要なリンパ球集団の相対含量が特徴付けられ、ＳＢＧ処置マウスと対照との間に有意な差がないことを見出した。我々は、ＳＢＧの経口投与に応じたデクチン−１の発現における変化がないことを観察した。ＳＢＧ経口投与は、結腸中の杯細胞の数および分布を変化させなかった。
【０１７２】
本明細書中で、我々は、経口投与した場合に、ＳＢＧが結腸において増殖型の上皮細胞の数を増加させたこと、および増殖性の領域サイズを増大させたことを報告する。本明細書中で示したデータは、実験大腸炎におけるＳＢＧの保護効果は、部分的に、上皮の増殖における刺激効果によるものであり、従って場合によっては、上皮バリアの回復および機能における刺激効果によるものであることを示唆する。このように、我々はβ−グルカンの経口投与が腸管上皮の増殖を刺激することを報告する。
【０１７３】
我々は、サッカロマイセス・セレビシエから誘導された水溶性のβ−グルカンであるＳＢＧの経口投与が、ＰＰおよびＭＬＮの形成および／または拡張を刺激することを実証する。さらに、ＳＢＧ刺激された粘膜上皮細胞の増殖は、ＳＢＧが腸管バリアの機能にも影響を及ぼしうることを示唆する。このデータは、β−グルカンが部分的に粘膜免疫系における影響によって宿主保護を増強することを示唆する。この刺激効果は、免疫応答の粘液誘導部位と免疫防御の作用部位の両方をメディエートしうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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