(57)【要約】  本発明は、イオンチャネルタンパク質を過剰発現する組換え細胞株も検出標識も使用することなく、イオンチャネルの調節因子を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試薬のイオンチャネル調節特性を判定する方法であって、
（ａ）比色共鳴反射光バイオセンサーの表面に細胞を適用するステップ；
（ｂ）１つまたは複数の第一の型のイオンチャネルの機能的活性を実質的に遮断するステップであって、１つまたは複数の第二の型のイオンチャネルの活性は遮断されないステップ；
（ｃ）細胞について比色共鳴反射光の第一ピーク波長値（ＰＷＶ）を検出するステップ；
（ｄ）試験試薬を細胞に適用するステップ；
（ｅ）細胞について比色共鳴反射光の第二ＰＷＶを検出するステップ；および
（ｆ）第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとの比較に基づいて、試験試薬のイオンチャネル調節特性を判定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
１つまたは複数の型のイオンチャネルの機能的活性が、抗体、タンパク質または有機低分子によって実質的に遮断される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つまたは複数の第一の型のイオンチャネルが、電位開口型ナトリウムチャネル、電位開口型カルシウムチャネル、機械刺激型チャネル、カリウムチャネル、内向き整流性カリウムチャネル、カルシウム活性化カリウムチャネル、電位開口型カリウムチャネル、２ポアドメインカリウムチャネル、一過性受容体電位チャネル、精子のカチオンチャネル、環状ヌクレオチド作動性チャネル、過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル、２ポアチャネル、リガンド依存性チャネル、および光感受性チャネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つまたは複数の第二の型のイオンチャネルが、電位開口型ナトリウムチャネル、電位開口型カルシウムチャネル、機械刺激型チャネル、カリウムチャネル、内向き整流性カリウムチャネル、カルシウム活性化カリウムチャネル、電位開口型カリウムチャネル、２ポアドメインカリウムチャネル、一過性受容体電位チャネル、精子のカチオンチャネル、環状ヌクレオチド作動性チャネル、過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル、２ポアチャネル、リガンド依存性チャネルおよび光感受性チャネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞が、（ａ）表面への細胞の適用後；（ｂ）１つまたは複数の第一の型のイオンチャネルの機能的活性の遮断後；（ｃ）細胞についての第一ＰＷＶの検出後；（ｄ）細胞への試験試薬の適用後；（ｅ）細胞についての第二ＰＷＶの検出後；または（ｆ）それらの組合せ後に所定の期間にわたってインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
比色共鳴反射光バイオセンサーの表面が、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、マイクロ流体チャネルおよびマイクロアレイからなる群から選択される容器の内部表面である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第一ＰＷＶおよび第二ＰＷＶが、約２マイクロメートル〜約２００マイクロメートルの下限画素サイズを有するレンズを備えたスキャナーを使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞および試験試薬が検出標識を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
約２、１０、１５、２５、３０または３７℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ｇ）細胞を洗浄するステップ；
（ｈ）細胞を平衡化するステップ；
（ｉ）任意に、ステップ（ａ）〜（ｆ）を反復するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
イオンチャネルの調節因子を同定する方法であって、
（ａ）比色共鳴反射光バイオセンサーの表面に無血清培地中の細胞を適用するステップであって、１または複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リガンドがバイオセンサーの表面に固定化されているステップ；
（ｂ）細胞について比色共鳴反射光の第一ピーク波長値（ＰＷＶ）を検出するステップ；
（ｃ）１または複数の試験イオンチャネル調節因子をバイオセンサーの表面に適用するステップ；
（ｄ）細胞の１または複数のイオンチャネルの活性の変化を引き起こすステップ；
（ｅ）細胞について比色共鳴反射光の第二ＰＷＶを検出するステップ；および
（ｆ）１または複数の試験イオンチャネル調節因子が細胞の１または複数のイオンチャネルを調節したかどうかを判定するステップ
を含む方法。
【請求項１２】
（ｇ）細胞を洗浄するステップ；
（ｈ）細胞を平衡化するステップ；
（ｉ）任意に、ステップ（ａ）〜（ｆ）を反復するステップ
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
イオンチャネルの調節因子を同定する方法であって、
（ａ）比色共鳴反射光バイオセンサーの表面に無血清培地中の細胞を適用するステップであって、１または複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リガンドがバイオセンサーの表面に固定化されているステップ；
（ｂ）１または複数の試験イオンチャネル調節因子をバイオセンサーの表面に適用するステップ；
（ｃ）細胞の１または複数のイオンチャネルの変化を引き起こすステップ；
（ｄ）細胞について比色共鳴反射光の第一ＰＷＶを検出するステップ；
（ｅ）細胞の１または複数のイオンチャネルの変化を引き起こすステップ；
（ｆ）細胞について比色共鳴反射光の第二ＰＷＶを検出するステップ；および
（ｇ）１または複数の試験イオンチャネル調節因子が細胞の１または複数のイオンチャネルを調節したかどうかを判定するステップ
を含む方法。
【請求項１４】
（ｈ）細胞を洗浄するステップ；
（ｊ）細胞を平衡化するステップ；
（ｋ）任意に、ステップ（ａ）〜（ｇ）を反復するステップ
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２００７年７月１１日出願の米国特許出願番号６０／９４９，１４２に基づく優先権を主張する、２００８年７月１１日出願の米国特許出願番号１２／１７１，４７５の一部継続出願である。これらの出願は、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる。本出願は、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる、２００８年１２月１５日出願の表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈａｎｇｅｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ」の米国特許出願番号１２／３３５，３９３を相互参照する。
【背景技術】
【０００２】
イオンチャネルは、製薬およびバイオテクノロジー産業、特に心臓、肺および胃腸の健康の分野における、治療標的の最大のクラスの１つを構成する。細胞の内外へのイオンの流れを調節することに関与するタンパク質の治療的標的化は、患者の健康状態に対する劇的な影響を有する。イオンチャネル標的を調節するそれらの能力に関して化合物を試験することは、困難であり時間がかかり得る。パッチクランプアッセイは、イオンチャネル調節因子の生物学的作用に関する非常に高感度のアッセイである。しかし、パッチクランプ法は複雑であり、試験化合物の処理能力が低い。
【０００３】
イオンチャネル活性をアッセイする他の方法は、細胞におけるイオンチャネルもしくはイオンチャネルの一部の組換え体の発現、および／または蛍光もしくは放射性標識の使用を必要とする。これらのアプローチは有用ではあるが、チャネル機能のごく一部のみを標的化する薬物へのアクセスを制限する。さらに、組換えイオンチャネルは、それらがネイティブ細胞で機能するようには機能していない可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の方法は、薬物として有用であり得る試験化合物に対する特異的応答について、細胞の操作を伴わずに、親（非組換え）細胞株を、効率のよいハイスループットで、標識を用いずにスクリーニングすることを可能にする。
【０００５】
一実施形態において、本発明は、イオンチャネルのアンタゴニストまたはアゴニストを同定する方法を提供する。この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置および第二の位置に細胞を適用するステップ、および第一の位置に試験試薬を適用するステップを含む。細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが、第二の位置に適用される。第一の位置について比色共鳴反射光の第一ピーク波長値（ＰＷＶ）が検出され、第二ＰＷＶが第二の位置について検出される。第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが同じまたは類似の場合、その試験試薬は、イオンチャネルのアンタゴニストまたはアゴニストである。第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが異なる場合、その試験試薬はアンタゴニストでもアゴニストでもない。細胞は、第一の位置への細胞の適用後、第一の位置への試験試薬の適用後、第二の位置への細胞の適用後、第二の位置への既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストの適用後、またはそれらの組合せ後に、所定の期間にわたってインキュベートされ得る。ＰＷＶは、約２マイクロメートル〜約２００マイクロメートルの下限画素サイズを有するレンズを備えたスキャナーを使用して検出され得る。比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置および第二の位置は、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、マイクロ流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）チャネルおよびマイクロアレイからなる群から選択される容器の内部表面であり得る。細胞、試験試薬およびイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストは、検出標識を含んでいなくてもよい。この方法は、約２５、３０または３７℃の温度で実施できる。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、イオンチャネルの調節因子を同定する方法を提供する。この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置に細胞を適用するステップ、および試験試薬および細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストを第一の位置に適用するステップを含む。第一ＰＷＶが第一の位置について決定される。細胞が、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第二の位置に適用され、細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが、第二の位置に適用される。第二ＰＷＶが第二の位置について決定される。第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが異なる場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子である。第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが同じまたは類似の場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子ではない。細胞は、第一の位置への細胞の適用後、第一の位置への試験試薬の適用後、第二の位置への細胞の適用後、第二の位置への既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストの適用後、またはそれらの組合せ後に、所定の期間にわたってインキュベートされ得る。ＰＷＶは、約２マイクロメートル〜約２００マイクロメートルの下限画素サイズを有するレンズを備えたスキャナーを使用して検出され得る。比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置および第二の位置は、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、マイクロ流体チャネルおよびマイクロアレイからなる群から選択される容器の内部表面であり得る。細胞、試験試薬およびイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストは、検出標識を含んでいなくてもよい。この方法は、約２５、３０または３７℃の温度で実施できる。
【０００７】
本発明のさらに別の実施形態は、イオンチャネルの調節因子を同定する方法を提供する。この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置に細胞を適用するステップ、および第一の位置についてＰＷＶを検出するステップを含む。試験試薬が第一の位置に適用される。第二ＰＷＶが第一の位置について検出される。第一の値が決定され、この第一の値は、第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとの間の差異である。この第一の値はコントロール試験と比較され、このコントロール試験は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第二の位置に細胞を適用するステップ、および第二の位置について第三ＰＷＶを検出するステップを含む。細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが、第二の位置に適用される。第二の位置について第四ＰＷＶが決定される。第二の値が決定され、この第二の値は、第二の位置の第三ＰＷＶと第四ＰＷＶとの間の差異である。第一の値と第二の値とが同じまたは類似の場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子である。第一の値と第二の値とが異なる場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子ではない。
【０００８】
本発明のさらに別の実施形態は、イオンチャネルの調節因子を同定する方法を提供する。この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置に細胞を適用するステップ、および試験試薬を第一の位置に適用するステップを含む。第一の位置について第一ＰＷＶが決定される。細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが第一の位置に適用される。第一の位置について第二ＰＷＶが決定される。第一の値が決定され、この第一の値は、第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとの間の差異である。細胞が比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第二の位置に適用され、第二の位置について第三ＰＷＶが決定される。細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが第二の位置に適用される。第二の位置について第四ＰＷＶが決定される。第二の値が決定され、この第二の値は、第三ＰＷＶと第四ＰＷＶとの間の差異である。第一の値と第二の値とが異なる場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子である。第一の値と第二の値とが同じまたは類似の場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子ではない。
【０００９】
本発明のさらに別の実施形態は、試験試薬がイオンチャネルの調節因子であることを確認する方法を提供する。この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置に細胞を適用するステップ、および第一の位置について第一ＰＷＶを検出するステップを含む。細胞の既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストおよび試験試薬が、第一の位置に適用される。第一の位置について第二ＰＷＶが決定される。第一の値が決定され、この第一の値は、第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとの間の差異である。細胞が、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第二の位置に適用され、第三ＰＷＶが第二の位置について検出される。細胞の既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストが第二の位置に適用され、第二の位置について第四ＰＷＶが決定される。第二の値が決定され、この第二の値は、第三ＰＷＶと第四ＰＷＶとの間の差異である。第一の値と第二の値とが異なる場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子であると確認される。第一の値と第二の値とが同じまたは類似の場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子ではない。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態は、試験試薬がイオンチャネルの調節因子であることを確認する方法を提供する。この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置に細胞を適用するステップ、および細胞の既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストおよび試験試薬を第一の位置に適用するステップを含む。第一の位置について第一ＰＷＶが決定される。細胞が比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第二の位置に適用され、細胞の既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストが第二の位置に適用される。第二の位置について第二ＰＷＶが決定される。第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが異なる場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子であると確認される。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、試験試薬のイオンチャネル調節特性を判定する方法を提供する。この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面に細胞を適用するステップ；１つまたは複数の第一の型のイオンチャネルの機能的活性を実質的に遮断するステップであって、１または複数の第二の型のイオンチャネルの活性が遮断されないステップ；細胞について比色共鳴反射光の第一ピーク波長値（ＰＷＶ）を検出するステップ；試験試薬を細胞に適用するステップ；細胞について比色共鳴反射光の第二ＰＷＶを検出するステップ；および第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとの比較に基づいて、試験試薬のイオンチャネル調節特性を判定するステップを含む。１または複数の型のイオンチャネルの機能的活性は、抗体によって実質的に遮断され得る。１または複数の第一の型および第二の型のイオンチャネルは、電位開口型（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）ナトリウムチャネル、電位開口型カルシウムチャネル、カリウムチャネル、内向き整流性（ｉｎｗａｒｄ−ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ）カリウムチャネル、カルシウム活性化カリウムチャネル、電位開口型カリウムチャネル、２ポアドメイン（ｔｗｏ  ｐｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ）カリウムチャネル、一過性受容体電位（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャネル、精子のカチオンチャネル、環状ヌクレオチド作動性（ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｇａｔｅｄ）チャネル、過分極活性化型（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒａｉｚａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）環状ヌクレオチド作動性チャネル、２ポア（ｔｗｏ  ｐｏｒｅ）チャネル、リガンド依存性（ｌｉｇａｎｄ  ｇａｔｅｄ）チャネル、および光感受性（ｌｉｇｈｔ−ｇａｔｅｄ）チャネルであり得る。細胞は、この方法の各ステップの後に所定の期間にわたってインキュベートされ得る。比色共鳴反射光バイオセンサーの表面は、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、マイクロ流体チャネルおよびマイクロアレイからなる群から選択される容器の内部表面であり得る。第一ＰＷＶおよび第二ＰＷＶは、約２マイクロメートル〜約２００マイクロメートルの下限画素サイズを有するレンズを備えたスキャナーを使用して検出され得る。細胞および試験試薬は、検出標識を含まなくてもよい。この方法は、約２、１０、１５、２５、３０または３７℃の温度で実施できる。この方法は、細胞を洗浄するステップ；細胞を平衡化するステップを含み、任意に、このアッセイの上記ステップを反復するステップをさらに含んでいてもよい。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態は、イオンチャネルの調節因子を同定する方法を提供する。この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面に無血清培地中の細胞を適用するステップであって、１または複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リガンドがバイオセンサーの表面に固定化されているステップ；細胞について比色共鳴反射光の第一ピーク波長値（ＰＷＶ）を検出するステップ；１または複数の試験イオンチャネル調節因子をバイオセンサーの表面に適用するステップ；細胞の１または複数のイオンチャネルの活性の変化を引き起こすステップ；細胞について比色共鳴反射光の第二ＰＷＶを検出するステップ；および１または複数の試験イオンチャネル調節因子が細胞の１または複数のイオンチャネルを調節したかどうかを判定するステップを含む。この方法は、細胞を洗浄するステップ；細胞を平衡化するステップを含み、任意に、このアッセイの上記ステップを反復するステップをさらに含んでいてもよい。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態は、イオンチャネルの調節因子を同定する方法を提供する。この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面に無血清培地中の細胞を適用するステップであって、１または複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リガンドがバイオセンサーの表面に固定化されているステップ；１または複数の試験イオンチャネル調節因子をバイオセンサーの表面に適用するステップ；細胞の１または複数のイオンチャネルの変化を引き起こすステップ；細胞について比色共鳴反射光の第一ＰＷＶを検出するステップ；細胞の１または複数のイオンチャネルの変化を引き起こすステップ；細胞について比色共鳴反射光の第二ＰＷＶを検出するステップ；および１または複数の試験イオンチャネル調節因子が細胞の１または複数のイオンチャネルを調節したかどうかを判定するステップを含む。この方法は、細胞を洗浄するステップ；細胞を平衡化するステップを含み、任意に上記ステップを反復するステップをさらに含んでいてもよい。
【００１４】
従って、本発明は、イオンチャネルタンパク質を過剰発現する組換え細胞株の使用も検出標識の使用もなしに、イオンチャネルの調節因子を同定および確認する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ（ｈＥＲＧ）カリウムチャネルでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からのカリウム除去の影響および親ＣＨＯ細胞からのカリウム除去の影響を示す。
【図２】図２は、ｈＥＲＧでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するシサプリドおよびＥ４０３１の影響を示す。
【図３】図３は、親ＣＨＯ細胞に対するシサプリドおよびＥ４０３１の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないことを示さない限り、複数形の指示対象を含む。
【００１７】
いくつかの型のイオンチャネルが知られており、例えば、電位開口型ナトリウムチャネル（膜電位差を感知し、脱分極または過分極に応答して開口または閉口する）、電位開口型カルシウムチャネル、機械刺激型（ｍｅｃｈａｎｏ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）イオンチャネル、カリウムチャネル（例えば、内向き整流性カリウムチャネル、カルシウム活性化カリウムチャネル、電位開口型カリウムチャネルおよび２ポアドメインカリウムチャネル）、一過性受容体電位チャネル、精子のカチオンチャネル、環状ヌクレオチド作動性チャネル（例えば、過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル）（内部溶質に応答して開口し、セカンドメッセンジャーに対する細胞応答を媒介する）、伸展活性化（ｓｔｒｅｔｃｈ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）チャネル（機械力に応答して開口または閉口する）、２ポアチャネル、リガンド依存性チャネル（膜の外面上の特定のリガンド分子に応答して開口する）、Ｇタンパク質制御（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇａｔｅｄ）チャネル（そのレセプターを介したＧタンパク質の活性化に応答して開口する）、内向き整流性Ｋチャネル（内向きに整流するようにカリウムを細胞中に流す）および光感受性チャネルが含まれる。いくつかのチャネルは複数の影響に応答する。
【００１８】
リガンド依存性イオンチャネルは、レセプタータンパク質の細胞外ドメインへの特定のリガンド分子の結合に応答して開口する。リガンド結合は、チャネルゲートの開口およびそれに続く細胞膜を横切るイオンの流れを導く、チャネルタンパク質の構造におけるコンフォメーション変化を引き起こす。このようなチャネルの例には、Ｇタンパク質共役型イオンチャネル、アニオン透過性γ−アミノ酪酸開口型（ａｎｉｏｎ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ−ｇａｔｅｄ）ＧＡＢＡＡまたはＣレセプター、イオンチャネル型グルタミン酸レセプター（ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｇａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、セロトニン／５−ＨＴ３レセプター、ＡＴＰ依存性Ｐ２Ｘレセプター（ＡＴＰ−ｇａｔｅｄ  Ｐ２Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）およびカチオン透過性「ニコチン性」アセチルコリンレセプターが含まれる。
【００１９】
Ｇタンパク質共役型イオンチャネル（ＧＰＣ）は、神経伝達物質がＧタンパク質共役型レセプター（ＧＣＲ）に結合したときに刺激される。これがＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質が別のイオンチャネルに移動する。Ｇタンパク質はチャネルを開口させ、イオンは細胞膜を横切って流れることができる。レセプターからイオンまでの移動に起因して、チャネル開口の速度は遅くなるが、チャネルはより長い時間開口したままとなる。ＧＰＣチャネル（例えば、ＧＡＢＡ（サブタイプＡおよびＣ）およびＮＭＤＡ（アンタゴニスト））は、感覚機能の遮断のための麻酔機能、一時的な筋肉活動の低下および挙動の改変のための治療部位である可能性がある。
【００２０】
ＧＡＢＡＡレセプターおよびＧＡＢＡСレセプターの細胞外部分中の結合部位へのＧＡＢＡ分子（神経伝達物質、γ−アミノ酪酸）の結合は、塩化物イオン選択的ポアの開口を誘発する。塩化物イオンコンダクタンスの増大は、ニューロン中の膜電位をＣｌ−イオンの逆転電位の方向に向け、新たな活動電位または神経インパルスの発火を阻害する。
【００２１】
グルタミン酸はイオンチャネルを調節し、哺乳動物神経系において最も豊富な興奮性神経伝達物質である。神経インパルスは、シナプス前細胞からのグルタミン酸の放出を誘発する。反対のシナプス後細胞では、グルタミン酸レセプター（例えば、ＮＭＤＡ（リガンド依存性イオンチャネル）レセプター）がグルタミン酸と結合し、活性化される。
【００２２】
グルタミン酸トランスポーターは、ニューロンおよびグリアの膜中に見出される。グルタミン酸トランスポーターは、細胞外空間からグルタミン酸を迅速に除去する。脳の傷害または疾患において、グルタミン酸トランスポーターは逆に機能することができ、過剰なグルタミン酸が細胞の外側に蓄積し得る。このプロセスにより、カルシウムイオンがＮＭＤＡレセプターチャネルを介して細胞中に入り、ニューロンの損傷および最終的な細胞死を導く。
【００２３】
５−ＨＴ３レセプターへの神経伝達物質５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）の結合は、リガンド依存性イオンチャネルを開口させ、これが次にニューロンにおける興奮性の応答を引き起こす。アゴニストによってレセプターが活性化すると、イオンチャネルが開口する。５−ＨＴ３アンタゴニストには、オンダンセトロン、グラニセトロンおよびトロピセトロンが含まれる。
【００２４】
Ｐ２Ｘレセプターは、細胞外アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）の結合に応答して開口するカチオン透過性リガンド依存性イオンチャネルである。ＡＴＰがＰ２Ｘレセプターに結合すると、イオンチャネルの構造におけるコンフォメーション変化が引き起こされ、イオン透過性ポアの開口が生じる。これにより、カチオン（例えば、Ｎａ＋およびＣａ２＋）が細胞内に入り、細胞膜の脱分極および種々のＣａ２＋感受性細胞内プロセスの活性化が生じる。このチャネルの異なるタンパク質部分は、ＡＴＰ結合、イオン透過、ポアの拡張および脱感作の調節を担うことが見出されている。
【００２５】
アセチルコリンは、骨格筋線維上のアセチルコリンレセプターに結合すると、リガンド依存性ナトリウムチャネルを開口させることができる。
【００２６】
内向き整流性カリウム（Ｋｉｒ）チャネルは複数の細胞型上に見出される。心筋細胞では、Ｋｉｒチャネルは脱分極の際に閉口し、膜の再分極を遅延させ、より延長された活動電位の維持を助ける。この型の内向き整流性チャネルは、遅延整流性Ｋ＋チャネル（これは、活動電位後の神経細胞および筋細胞の再分極を助ける）およびカリウム漏出（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｌｅａｋ）チャネル（これは、静止膜電位の基盤の多くを提供する）とは別個である。内皮細胞では、Ｋｉｒチャネルは、一酸化窒素合成酵素の調節に関与する。腎臓細胞では、Ｋｉｒは、尿による除去のために余剰のカリウムを集合尿細管中に排出するか、あるいは、身体中へのカリウムの再取り込みに関与し得る。ニューロンおよび心臓の細胞では、Ｇタンパク質活性化型（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＩＲＫ（Ｋｉｒ３）は、重要なレギュレーターである。膵臓β細胞では、ＫＡＴＰチャネルはインスリンの放出を制御する。
【００２７】
カルシウム電位開口型イオンチャネル（ＶＤＣＣ）は、筋肉の興奮を収縮に関連付けること、ならびにニューロンの興奮を伝達物質の放出に関連付けることの両方において、重要な役割を果たす。ＶＤＣＣの活性化によりＣａ２＋が細胞中に入り、これは細胞型に依存して、筋肉の収縮、ニューロンの興奮、遺伝子発現の上方制御、またはホルモンもしくは神経伝達物質の放出を生じる。
【００２８】
電位開口型ナトリウムチャネルは、細胞膜を横切る活動電位を制御および設定する。電位開口型ナトリウムチャネルが開口すると、細胞の膜電位が変化し、少量ではあるが有意な数のＮａ＋イオンが細胞中に移動して、その電気化学勾配を低下させることにより、細胞を脱分極させる。細胞内および細胞外のブロッカーが、これらのイオンチャネルの薬理学的制御の既知の調節因子である。植物および動物（フグおよびヒョウモンダコ（ｂｌｕｅ−ｒｉｎｇｅｄ  ｏｃｔａｐｕｓ））のアルカロイドベースの毒素は、これらのチャネルに対して細胞外から作用し、神経活動の喪失を生じる。これらのチャネルの細胞内遮断は、麻酔薬、抗不整脈薬および抗痙攣薬を生じる。これらのチャネルのアゴニスト（例えば、ヤドクガエル（ｐｏｉｓｏｎ  ａｒｒｏｗ  ｆｒｏｇ）毒素）は、末梢神経系に直接影響を与え、持続性の活動（開口）チャネルを導き、心不整脈および呼吸麻痺を導く毒素として存在する。
【００２９】
いくつかの一過性受容体電位チャネル（ＴＲＰ）チャネルは、構成的に開口し得るが、他のチャネルは、電位、細胞内Ｃａ２＋、ｐＨ、酸化還元状態、モル浸透圧濃度および機械的伸展によってゲート開閉される。これらのチャネルは、これらのチャネルが通過させるイオン（複数可）に従って変動し、あるものはＣａ２＋に選択的であるが、他のものはあまり選択的ではなく、カチオンチャネルとして作用する。このファミリーは、相同性に基づいて、６つのサブファミリーに細分される：ＴＲＰＣ（カノニカル）；ＴＲＰＶ（バニロイド）；ＴＲＰＡ（アンキリン）；ＴＲＰＭ（メラスタチン）；ＴＲＰＰ（ポリシスチン）；ＴＲＰＭＬ（ムコリピン（ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ））；ＴＲＰＮ（ＮＯＭＰＣ）。
【００３０】
特定の化学物質および遺伝子障害は、正常なイオンチャネル機能を妨害し、疾患および病気を引き起こす。イオンチャネル機能を破壊し得る化学物質には、例えば、リドカイン、ノボカイン、デドロトキシン（ｄｅｄｒｏｔｏｘｉｎ）、コノトキシン、サキシトキシン、イベリオトキシン、ヘテロポダトキシン（ｈｅｔｅｒｏｐｏｄａｔｏｘｉｎ）、テトロドトキシンが含まれる。レセプターチロシンキナーゼ、ＧＰＣＲ、一過性受容体電位チャネル、ホスホリパーゼＣ、シグナル伝達経路（例えば、Ｐ１３キナーゼ）、サイトカイン、β−アレスチン経路応答、細胞骨格再編成、エピジェネティックシグナルは、イオンチャネル機能に影響を与え得る。
【００３１】
イオンチャネルを調節するイオンチャネルのサブユニットまたはタンパク質中の変異によって引き起こされる遺伝子疾患には、例えば、小児期の交代性片麻痺、バーター症候群、ブルガダ症候群、先天性高インスリン症、嚢胞性線維症、発作性運動失調症、肢端紅痛症、熱性痙攣を伴う全非症候性難聴般性てんかん、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、ＱＴ延長症候群、悪性高熱症、偏頭痛、重症筋無力症、先天性筋強直症、神経性筋強直症、家族性片麻痺性片頭痛、脊髄小脳失調症１３型、非症候性難聴、先天性パラミオトニア、カリウム惹起性ミオトニー（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｇｇｒａｖａｔｅｄ  ｍｙｏｔｏｎｉａ）、周期性四肢麻痺、網膜色素変性症、ムコリピドーシスＩＶ型、ロマノ・ワード症候群、ＱＴ短縮症候群およびチモシー症候群が含まれる。従って、イオンチャネルを調節し得る試薬の発見は、研究者にとって大いに興味のあるところである。
【００３２】
本発明の一実施形態は、イオンチャネル制御因子に応答した細胞の変化の直接的検出を可能にする。なぜなら、それらは、比色共鳴反射バイオセンサーを用いて、放射測定標識、比色標識または蛍光標識を組み込む必要なしに、リアルタイムで発生するからである。細胞を試験試薬、アゴニストおよびアンタゴニストを用いて探索すると、細胞の変化が検出できる。次いで、細胞の変化は、高速機器（例えば、ＢＩＮＤ  Ｓｃａｎｎｅｒ（商標））（即ち、比色共鳴反射バイオセンサーシステム）およびデータを定量するための対応するアルゴリズムを使用して、リアルタイムで検出され得る。例えば、米国特許第６，９５１，７１５号および米国特許公報第２００４／０１５１６２６号を参照のこと。この方法論、計測手段およびコンピューター分析を組み合わせることによって、細胞の変化を、リアルタイムで、標識なしの様式で、都合よくモニタリングすることができる。
【００３３】
バイオセンサー
本発明のバイオセンサーは、比色共鳴反射バイオセンサーであり得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、「Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｓａｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、第８１巻、３１６−３２８頁、２００２年１月５日；米国特許公報第２００４／００９１３９７号を参照のこと。比色共鳴バイオセンサーは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーではない。ＳＰＲバイオセンサーは、薄い金属層（例えば、銀、金、銅、アルミニウム、ナトリウムおよびインジウム）を有する。この金属は、適切な波長の光で共鳴することが可能な伝導帯電子を有さなければならない。光に曝されるＳＰＲバイオセンサー表面は、純粋な金属でなければならない。酸化物、硫化物および他の薄膜は、ＳＰＲを妨害する。比色共鳴バイオセンサーは金属層を有さず、高屈折率物質（例えばＴｉＯ２）の誘電性コーティングを有する。
【００３４】
格子ベース導波路バイオセンサー（ｇｒａｔｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）は、例えば、米国特許第５，７３８，８２５号に記載されている。格子ベース導波路バイオセンサーは、導波路フィルムと、入射光フィールドを導波路フィルム中にカップリングさせて回折光フィールドを生成する回折格子とを含む。導波路フィルムの有効屈折率の変化が検出される。デバイス内の有意な距離を波が運ばれなければならないデバイス（例えば、格子ベース導波路バイオセンサー）は、本発明の空間分解能を欠く。
【００３５】
比色共鳴反射バイオセンサーは、蛍光タグ、比色標識または任意の他の型の検出タグもしくは検出標識の使用なしに、バイオセンサー表面上の生化学的相互作用の測定を可能にする。バイオセンサー表面は、平行光および／または白色光が照射された場合に、狭い波長帯のみを反射する（「共鳴格子効果」）ように設計された光学構造を含む。狭い波長帯は、波長「ピーク」として記載される。この「ピーク波長値」（ＰＷＶ）は、物質（例えば、生物学的物質）がバイオセンサー表面に沈着またはバイオセンサー表面から除去されると、変化する。読み出し機器が、平行光および／または白色光でバイオセンサー表面上の個別の位置を照射するためおよび反射光を収集するために使用される。収集された光は、ＰＷＶの決定のための波長分光計中に集められる。
【００３６】
バイオセンサーは、構造（バイオセンサーを上にして）を接着して底なしマイクロタイタープレートカートリッジの底にすることによって、標準的な使い捨て実験室品目（例えば、マイクロタイタープレート）中に組み込むことができる。一般的な実験室形式のカートリッジ中へのバイオセンサーの組み込みは、既存のマイクロタイタープレート取り扱い装置（例えば、ミキサー、インキュベーターおよび液体分配装置）との適合性のために望ましい。比色共鳴反射バイオセンサーは、例えば、マイクロ流体、マクロ流体またはマイクロアレイデバイス中に組み込むこともできる（例えば、米国特許第７，０３３，８１９号、米国特許第７，０３３，８２１号を参照のこと）。比色共鳴反射バイオセンサーは、１または複数の細胞外試薬への曝露の際の、細胞の挙動の変化またはこれらの変化の欠如をモニタリングするために、当該技術分野でよく知られる方法論と共に使用され得る（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｕｎ−Ｌｉｎ  Ｇｕａｎ編、第２９４巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと）。
【００３７】
比色共鳴反射バイオセンサーは、サブ波長構造表面（ＳＷＳ）を含み、薄膜コーティングの効果を模倣し得る一般的でない型の回折光学素子である（ＰｅｎｇおよびＭｏｒｒｉｓ、「Ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｒａｔｉｎｇｓ」、Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ａ、第１３巻、第５号、９９３頁、１９９６年５月；ＭａｇｎｕｓｓｏｎおよびＷａｎｇ、「Ｎｅｗ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ」、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．、６１、第９号、１０２２頁、１９９２年８月；ＰｅｎｇおよびＭｏｒｒｉｓ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｏｎａｎｔ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｒａｔｉｎｇｓ」、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第２１巻、第８号、５４９頁、１９９６年４月）。ＳＷＳ構造は、反射および透過した０次以外の回折次数が伝達されないように、１次元、２次元または３次元の格子（格子周期が入射光の波長と比較して小さい）を含む。横方向での導波モードの伝播は支持されない。そうではなく、導波モード共鳴効果は、任意の光子がバイオセンサー構造に入る点から約３ミクロンの、非常に局部的な領域にわたって生じる。
【００３８】
比色共鳴反射バイオセンサーの反射または伝達された光は、分子（例えば、特異的結合物質もしくは結合パートナーまたはそれら両方）をバイオセンサーの上部表面に添加することによって、調節され得る。添加された分子は、この構造を通じた入射照射の光路長を増加させ、従って、最大の反射または透過が生じる波長を改変する。
【００３９】
一実施形態において、比色共鳴反射バイオセンサーは、白色光および／または平行光を照射した場合、単一波長または狭い波長帯を反射する（「共鳴格子効果」）ように設計される。光は、上部または底部のいずれかから、バイオセンサーを照射し得る。物体がバイオセンサーの表面上に沈着すると、反射波長は、バイオセンサー上で示される光の光路の変化に起因してシフトする。
【００４０】
検出システムは、例えば、光ファイバープローブなどを介して通常の入射でバイオセンサーの小さいスポットを照射する光源と、これもまた通常の入射で、第二の光ファイバープローブなどを介して反射光を収集する分光計とからなる。励起／検出システムとバイオセンサー表面との間で物理的接触が生じないので、特別なカップリングプリズムは必要なく、バイオセンサーは、例えばマイクロタイタープレートを含む任意の一般に使用されるアッセイプラットフォームに容易に適合させることができる。単一の分光計読み取りは数ミリ秒で実施でき、従って、バイオセンサー表面上で平行して生じる多数の分子相互作用を迅速に測定し、反応速度論をリアルタイムでモニタリングすることが可能である。
【００４１】
比色共鳴反射バイオセンサーは、例えば、高屈折率物質、格子を支持する基材層、および任意に基材層の反対側の格子の表面上に固定化された１または複数の特異的結合物質またはリンカーを含む、光学格子を含む。高屈折率物質は、基材層よりも高い屈折率を有する。例えば、米国特許第７，０９４，５９５号；米国特許第７，０７０，９８７号を参照のこと。任意にカバー層が格子表面を覆っていてもよい。一実施形態において、光学格子の屈折率は、任意選択のカバー層の屈折率よりも低くすることができる。光学格子は、例えば、硫化亜鉛、二酸化チタン、酸化タンタル、窒化ケイ素および二酸化ケイ素を含む物質を含み得る高屈折率の誘電性フィルムで被覆される。光学特徴を備えた格子の断面プロフィールは、任意の周期的に反復する関数（例えば、「矩形波」）を含み得る。光学格子は、直線（１次元）、方形、円形、楕円形、三角形、台形、正弦波、長円形、矩形および六角形からなる群から選択される形状の反復パターンを含むこともできる。本発明の比色共鳴反射バイオセンサーは、高屈折率物質で被覆された、例えば、プラスチックまたはエポキシを含む光学格子を含むこともできる。層の厚さ（即ち、カバー層、生物学的物質または光学格子）は、上部表面上のさらなる分子に対する共鳴波長感度を達成するために選択される。格子周期は、所望の波長での共鳴を達成するよう選択される。
【００４２】
直線格子（即ち、１次元格子）は、照射光の偏光が格子周期に対して垂直な方向であるという共鳴特徴を有する。比色共鳴反射バイオセンサーは、例えば２次元格子（例えば、孔または方形の六角形のアレイ）を含むこともできる。他の形状も同様に使用できる。直線格子は、六角形アレイ格子と同じピッチ（即ち、高屈折率の領域と低屈折率の領域との間の距離）、周期、層の厚さ、および物質特性を有する。しかし、光は、光学構造中に共鳴的にカップリングされるために、格子線に対して垂直に偏光される必要がある。従って、直線格子に対して垂直な偏光軸と同じ方向の偏光フィルターを、照射源とバイオセンサー表面との間に挿入することが必要である。照射光源のごく一部だけが正しく偏光するので、等量の共鳴的に反射した光を収集するために、六角形の格子と比較して、より長い積分時間が必要である。
【００４３】
光学格子は、例えば、単一の固定された高さの高屈折率領域がより低い屈折率のカバー層内に包埋される、「段階的（ｓｔｅｐｐｅｄ）」プロフィールを含むこともできる。高屈折率および低屈折率の交互の領域は、バイオセンサーの上部表面に対して平行な光導波路を提供する。
【００４４】
本発明の比色共鳴反射バイオセンサーは、基材層の反対側の光学格子の表面上にカバー層をさらに含み得る。カバー層が存在する場合、１または複数の特異的結合物質が、格子の反対側のカバー層の表面上に固定化される。好ましくは、カバー層は、格子を構成する物質よりも低い屈折率を有する物質を含む。カバー層は、例えば、ガラス（スピンオンガラス（ＳＯＧ）が含まれる）、エポキシまたはプラスチックを含み得る。
【００４５】
例えば、バイオセンサーの屈折率要件を満たす種々のポリマーがカバー層に使用できる。ＳＯＧは、その好ましい屈折率、取り扱いの容易さ、および多くのガラス表面活性化技術を使用して特異的結合物質で容易に活性化されることに起因して、使用され得る。バイオセンサー表面の平坦さが特定のシステム設定にとって問題にならない場合、ＳｉＮ／ガラスの格子構造が検知表面として直接使用してもよく、その活性化は、ガラス表面の場合と同じ手段を使用して実施され得る。
【００４６】
共鳴反射は、光学格子を覆う平坦化カバー層なしに得ることもできる。例えば、バイオセンサーは、高屈折率物質の構造化薄膜層で被覆された基材のみを含むことができる。平坦化カバー層を使用しない場合、周囲の媒体（例えば、空気または水）が格子を満たす。従って、特異的結合物質は、上部表面上だけでなく、特異的結合物質に曝露される光学格子の全表面上で、バイオセンサーに固定化される。
【００４７】
一般に、本発明の比色共鳴反射バイオセンサーは、全ての偏光角の光を含む白色光および／または平行光で照射する。バイオセンサー格子中の反復特徴に対する偏光角の方向は、共鳴波長を決定する。例えば、反復する線および空間のセットからなる「直線格子」（即ち、１次元格子）バイオセンサーは、別個の共鳴反射を生成し得る２つの可視偏光を有する。これらの線に対して垂直に偏光した光は「ｓ−偏光」と呼ばれ、直線に対して平行に偏光した光は「ｐ−偏光」と呼ばれる。入射光のｓ成分およびｐ成分の両方が、フィルターを通していない照射光線中に同時に存在し、各々が別個の共鳴シグナルを生成する。バイオセンサーは一般に、一方だけの偏光（ｓ−偏光）の特性を最適化するように設計され。最適化されていない偏光は、偏光フィルターによって容易に除去される。
【００４８】
各偏光角が同じ共鳴反射スペクトルを生じるように偏光依存性を除去するために、同心円のセットからなる代替のバイオセンサー構造が使用され得る。この構造において、各同心円の内径と外径との間の差異は、格子周期の約半分と等しい。各連続円は、その前の円の内径よりも約１格子周期分大きい内径を有する。同心円パターンは、単一のセンサー位置（例えば、アレイスポットまたはマイクロタイタープレートウェル）をカバーするように広がる。各個別のマイクロアレイスポットまたはマイクロタイタープレートウェルは、その中に中心がある別個の同心円パターンを有する。このような構造の全ての偏光方向は、同じ断面プロフィールを有する。この同心円構造には、偏光の独立性を維持するために、正確に中心に照射しなければならない。この同心円構造の格子周期は、共鳴的に反射された光の波長よりも短い。この格子周期は約０．０１ミクロン〜約１ミクロンである。格子深さは、約０．０１ミクロン〜約１ミクロンである。
【００４９】
別の実施形態において、孔またはポストのアレイが、照射光線がグリッドの任意の特定の位置を中心とする必要なしに、上記同心円構造に密に接近するように配置される。このようなアレイパターンは、等しい角度で３つの方向から表面上に入射する３つのレーザー光線の光学干渉によって自動的に生成される。このパターンにおいて、孔（またはポスト）は、密に圧縮された六角形のアレイの角を中心とする。孔またはポストは、各六角形の中心にあってもよい。孔またはポストのこのような六角形のグリッドは、同じ断面プロフィールを「見る（ｓｅｅ）」３つの偏光方向を有する。従って、この六角形のグリッド構造は、任意の偏光角の光を使用して、等価な共鳴反射スペクトルを提供する。従って、非偏光フィルターが、望ましくない反射シグナル成分を除去するために必要である。孔またはポストの周期は、約０．０１ミクロン〜約１ミクロンであることができ、その深さまたは高さは約０．０１ミクロン〜約１ミクロンであり得る。
【００５０】
検出システムは、比色共鳴反射バイオセンサー、比色共鳴反射バイオセンサーに光を向ける光源、およびバイオセンサーから反射した光を検出する検出器を含み得る。一実施形態において、所定の閾値を越えるポジティブな結果のみが検出を誘発するように、フィルターを適用することによって読み出し計測手段を単純化することが可能である。
【００５１】
本発明の比色共鳴反射バイオセンサーの各個別の位置における共鳴波長のシフトを測定することによって、どの個別の位置がバイオセンサー上に沈着した生物学的物質などを有するかを判定することが可能である。シフトの程度は、例えば、試験サンプル中の結合パートナーの量、および１または複数の特異的結合物質と試験サンプルの結合パートナーとの間の化学親和力を決定するために使用され得る。
【００５２】
比色共鳴反射バイオセンサーは、２回以上照射され得る。第一の測定により、例えばバイオセンサー上に生物学的物質が存在しない、または表面上に細胞が存在する、バイオセンサーの１または複数の個別の位置の反射スペクトルを決定できる。第二、第三、第四またはさらなる測定は、例えば、１または複数の細胞、試験試薬、イオンチャネルアゴニストまたはイオンチャネルアンタゴニストがバイオセンサーに適用された後、あるいはインキュベーション期間または洗浄ステップの後に、反射スペクトルを決定し得る。これら２つ以上の測定間のピーク波長の差異は、例えば、バイオセンサー上の細胞の存在もしくは量、または細胞に対する試験試薬、イオンチャネルアゴニストもしくはイオンチャネルアンタゴニストの活性を判定するために使用され得る。さらに、この照射方法は、ピーク共鳴波長中に僅かな変動を有する領域を生じ得る、バイオセンサーの表面における小さい欠点を考慮することができる。この方法は、バイオセンサー上の細胞物質の濃度または密度の変動を考慮することもできる。
【００５３】
バイオセンサーの表面
１または複数の細胞が、例えば、物理的吸着または化学結合によって、バイオセンサー上に固定化され得る。これらの細胞は、非接着細胞または接着細胞であり得る。これらの細胞は、１または複数のイオンチャネルあるいは１または複数のイオンチャネル成分を天然に発現し得る。あるいは、これらの細胞は、１または複数のイオンチャネルまたはイオンチャネル成分を、組換え的に発現し得る。これらの細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞であり得る。
【００５４】
細胞は、特異的結合物質（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質溶液、ペプチド溶液、コンビナトリアル化学ライブラリー由来の化合物を含む溶液、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、有機低分子、ウイルス、ポリマーまたは生物学的サンプル）を介してバイオセンサー表面に特異的に結合でき、この特異的結合物質は、バイオセンサーの表面に固定化され、結合パートナーは細胞の表面上に存在する。あるいは、細胞は、バイオセンサーの表面上で増殖し、任意に表面上に付着していてもよいが、細胞型が通常の接着型であれ非接着型であれ、バイオセンサーの表面に直接固定化されている必要はない。
【００５５】
細胞は、バイオセンサー表面上の１または複数の個別の位置のアレイに配置されることができ、この表面は、マルチウェルプレートの１または複数のウェル内に存在し、マルチウェルプレートまたはマイクロアレイの１または複数の表面を含む。細胞のアレイは、表面が１または複数の個別の位置（各々、異なる細胞を有するか、または異なる量の細胞を有する）を含むように、マイクロウェルプレート内のバイオセンサー表面上に１または複数の細胞を含む。例えば、アレイは、１、１０、１００、１，０００、１０，０００もしくは１００，０００またはそれ以上の個別の位置を含むことができる。従って、マルチウェルプレートまたはマイクロアレイの各ウェルは、その中に、マルチウェルプレートの他のウェルから離れた、１または複数の個別の位置のアレイを有することができ、これにより、１つのマルチウェルプレート上で複数の異なるサンプルを処理することが可能となる。任意の１つのウェル内のアレイ（単数または複数）は、同じマイクロタイタープレートの任意の他のマイクロタイターウェル中に見出されるアレイ（単数または複数）と同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００５６】
バイオセンサー表面への細胞の固定化は、例えば、以下の官能性リンカーへの結合を介しても行うことができる：ニッケル基、アミン基、アルデヒド基、酸基、アルカン基、アルケン基、アルキン基、芳香族基、アルコール基、エーテル基、ケトン基、エステル基、アミド基、アミノ酸基、ニトロ基、ニトリル基、炭水化物基、チオール基、有機リン酸基、脂質基、リン脂質基またはステロイド基。さらに、細胞は、物理的吸着、化学結合、電気化学結合、静電結合、受動的もしくは能動的接着分子、疎水性結合もしくは親性水結合、および免疫捕捉法を介して、バイオセンサーの表面上に固定化され得る。細胞の付着および／または増殖に適するように表面を被覆する方法は、細胞培養の分野の当業者によく知られており、物質またはその誘導体（ポリ−Ｄ−リジン、フィブロネクチン、アクチン、インテグリン、アドヘリン、カドヘリン、コラーゲン、ヒト血清、ウシ胎仔血清、ウシ血清、ラミニンまたは他の物質が含まれるがこれらに限定されない）でのバイオセンサーの被覆を含み得る。
【００５７】
本発明の一実施形態において、バイオセンサーは、リンカー（例えば、ニッケル基、アミン基、アルデヒド基、酸基、アルカン基、アルケン基、アルキン基、芳香族基、アルコール基、エーテル基、ケトン基、エステル基、アミド基、アミノ酸基、ニトロ基、ニトリル基、炭水化物基、チオール基、有機リン酸基、脂質基、リン脂質基またはステロイド基など）で被覆され得る。例えば、アミン表面は、いくつかの型のリンカー分子を付着させるために使用され得るが、アルデヒド表面は、さらなるリンカーなしにタンパク質を直接結合するために使用され得る。ニッケル表面は、ヒスチジン（「ヒス（ｈｉｓ）」）タグが組み込まれた分子を結合するために使用され得る。ニッケル活性化表面による「ヒスタグ化」分子の検出は、当該技術分野でよく知られている（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８、４９０、（１９９６））。
【００５８】
リンカーおよび特異的結合物質は、各ウェルに同じリンカーおよび／または特異的結合物質が固定化されるように、バイオセンサーの表面上に固定化され得る。あるいは、各ウェルは、リンカーおよび／または特異的結合物質の異なる組合せを含み得る。
【００５９】
細胞は、バイオセンサーの表面上に固定化されたリンカーまたは特異的結合物質に特異的または非特異的に結合し得る。あるいは、バイオセンサーの表面は、リンカーまたは特異的結合物質を有していなくてもよく、細胞は、バイオセンサー表面に非特異的に結合することができる。
【００６０】
バイオセンサー上への１または複数の特異的結合物質またはリンカーの固定化は、特異的結合物質またはリンカーがすすぎ手順によって洗い流されないように、かつ試験サンプル中の細胞へのその結合がバイオセンサー表面によって妨害されないように、実施される。いくつかの異なる型の表面化学戦略が、例えば、種々の型のマイクロアレイおよびバイオセンサーで使用するためのガラスまたはポリマーへの、特異的結合物質の共有結合のために実施されている。バイオセンサーが１または複数の特異的結合物質を結合するための正しい官能基を含むようにバイオセンサーの表面を調製することは、バイオセンサー製造プロセスの不可欠な部分である。
【００６１】
１または複数の特異的細胞は、物理的吸着（即ち、化学リンカーの使用を伴わない）または化学結合（即ち、化学リンカーの使用を伴う）ならびに電気化学結合、静電結合、疎水結合および親水結合によって、バイオセンサー表面に付着され得る。化学結合は、バイオセンサー表面上の特異的結合物質のより強い付着を生じ、表面に結合した分子の規定された配向およびコンフォメーションを提供する。
【００６２】
プラスチック、エポキシまたは高屈折率物質への特異的結合物質の固定化は、ガラスへの固定化について記載されたのと本質的に同様に、実施され得る。しかし、酸洗浄ステップは、そのような処理が特異的結合物質が固定化される物質に損傷を与える場合には、排除できる。
【００６３】
バイオセンサーを使用する方法
本発明の一実施形態は、イオンチャネルの調節因子を同定する方法を提供する。イオンチャネルの調節因子は、イオンチャネルの機能的活性に対する影響を有する。機能的活性に対する影響は、イオンチャネルの活性を遮断または阻害することを含む。調節因子は、イオンチャネルの機能的活性を遮断、阻害、増強または増大させ得る。遮断、阻害、増強または増大は、イオンチャネルを遮断する分子の存在下で、またはそのような分子に応答して、生じ得る。調節因子は、例えば、イオンチャネルに作用してゲート開閉／リガンドイオン選択性を変化させ、チャネル機能のための化学的シグナル（ｐＨ、モル浸透圧濃度）を改変し、ゲート開閉活性のための潜在的機能（変化した分極率または電位依存性）を変化させ、物理的遮断を引き起こし、物理的な拡張（チャネル制御タンパク質の折り畳み機能の変化）を引き起こし、不応期を改変し、チャネル機能に必要な機械力機能（機械的伸展）または温度を改変することができる。
【００６４】
本発明の方法は、特定のイオンチャネルを発現または過剰発現するように組換えにより変更されていない細胞または組換え細胞とともに使用され得るが、イオンチャネルタンパク質またはサブユニットを組換えにより発現または過剰発現する細胞は、本発明の方法では必要とされない。細胞は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置に適用され得る。細胞は、バイオセンサーに固定化してもよく、あるいは細胞は、単にバイオセンサーの表面上で増殖させてもよい。任意に、約１分、５分、１０分、３０分またはそれ以上、あるいは約１時間、２時間、５時間、２４時間、４８時間、３６時間またはそれ以上の時間にわたり、これらの細胞は、本発明の方法のいずれかのステップにおいて、バイオセンサーの表面上でインキュベートされ得る。これらのアッセイは、約２、５、１０、２５、３０または３７℃の温度（または約２℃と約３７℃との間の温度の任意の範囲）で実施され得る。
【００６５】
有利なことに、本発明のアッセイが一旦完了すると、これらの細胞は洗浄され、平衡化され、再度使用されて、同じアッセイまたは異なるアッセイを行うことができる。これは、細胞が高価な場合または取り扱い困難な場合に、特に有利である。
【００６６】
本発明の一実施形態において、イオンチャネルのアンタゴニストまたはアゴニストを同定する方法が提供される。この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置および第二の位置に細胞を適用するステップを含む。細胞は、第一セットの細胞が第一の位置に適用されるのと同時に、またはそれより早い時間もしくはそれより遅い時間に、第二の位置に適用され得る。これらの細胞は、第一の位置に適用される細胞のセットと同じ型の細胞でも異なる細胞であってもよい。試験試薬は、第一の位置に細胞が添加される前に、細胞が第一の位置に添加されるのと同時に、または細胞が第一の位置に添加された後に、第一の位置に添加される。細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが、第二の位置に添加される。既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストは、細胞が第二の位置に添加される前に、細胞が第二の位置に添加されるのと同時に、または細胞が第二の位置に添加された後に、第二の位置に添加される。既知のアゴニストまたはアンタゴニストを使用することにより、イオンチャネルの特異性を判定し得る。アンタゴニストおよびアゴニスト（例えば、既知の機能または既知の標的を有する特異的毒素および他の低分子が含まれる）を使用して、イオンチャネルに対する試験試薬／刺激／調節因子応答の特異性を判定できる。さらに、イオンチャネルの上流または下流の位置で作用する化合物の使用を用いて、特定のチャネルに対する応答の特異性も同様に判定できる。第一の位置についての比色共鳴反射光の第一ピーク波長値（ＰＷＶ）および第二の位置についての比色共鳴反射光の第二ＰＷＶを検出し、第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが同じまたは類似の場合、その試験試薬は、イオンチャネルのアンタゴニストまたはアゴニストである。第一の値と第二の値とが互いの約１ｎｍ以内に存在する場合、それらの値は同じまたは類似である。第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが実質的に異なる場合（即ち、第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍまたはそれ以上を超えて異なる場合）、その試験試薬はアンタゴニストでもアゴニストでもない。さらに、１または複数のさらなるＰＷＶが、この方法の任意のステップまたは添加の前または後に決定され、任意の他のＰＷＶと比較され得る。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、イオンチャネルのアンタゴニストまたはアゴニストを同定する方法が提供される。この方法は、第一の位置に細胞を適用するステップを含む。ＰＷＶが第一の位置について決定され得る。試験試薬が第一の位置に適用される。細胞および試験試薬が、所望に応じて、所定の期間にわたってインキュベートされ得る。第一の位置について第二ＰＷＶが決定され得る。第一の値が計算され、この第一の値は、第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとの間の差異である。第一の値がコントロール試験と比較され得る。このコントロール試験は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第二の位置に細胞を適用するステップを含み得る。これらの細胞は、所望に応じて、所定の期間にわたってインキュベートされ得る。これらの細胞は、細胞の第一セットが第一の位置に適用されるのと同時に、またはそれより早い時間もしくはそれより遅い時間に、第二の位置に適用され得る。これらの細胞は、第一の位置に適用される細胞のセットと同じ型の細胞でも異なる細胞であってもよい。第二の位置について第三ＰＷＶが検出され得る。細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが、第二の位置に適用される。これらの細胞は、所望に応じて、所定の期間にわたってインキュベートされ得る。第二の位置について第四ＰＷＶが検出され得る。第二の値が決定され、この第二の値は、第二の位置についての第三ＰＷＶと第四ＰＷＶとの間の差異であり得る。第一の値と第二の値とが同じまたは類似の場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子である。第一の値と第二の値とが互いの約１ｎｍ以内に存在する場合、それらの値は同じまたは類似である。第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが実質的に異なる場合（即ち、第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍまたはそれ以上を超えて異なる場合）、その試験試薬はアンタゴニストでもアゴニストでもない。細胞を調査する標識なしのバイオセンサー方法は、細胞に対して破壊的ではないので、これらの細胞は、何分間か、何時間か、または何日間かにわたって、差異を探索するために１回より多く処理され得る。
【００６８】
当該技術分野には、多数の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが存在する。一部の例としては、カルシウムチャネルブロッカー（例えば、ニソルジピン、ニフェジピン、ニカルジピン、ベプリジル、イスラジピン、ニモジピン、フェロジピン、アムロジピン、ジルチアゼムおよびベラパミル）、カリウムイオンチャネルの調節因子（例えば、米国特許公報第２００５０２６７０８９号を参照のこと）、Ｎａ＋イオンチャネル調節化合物（例えば、米国特許第６，５７６，７９１号を参照のこと）が含まれる。米国特許第７，１０１，８７７号；米国特許第７，０５７，０５３号、米国特許公報第２００７０００４７１８号；米国特許公報第２００６０１９９８４８号、米国特許公報第２００６０１３５５３６号、米国特許公報第２００５０１９２２０８号、米国特許公報第２００５００２６９９３号、米国特許公報第２００４００２９９３７号、米国特許公報第２００３０００８９０６号もまた参照のこと。
【００６９】
比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置および第二の位置は、マイクロタイターウェル、マイクロタイタープレート、試験管、ペトリ皿、マイクロ流体チャネルおよびマイクロアレイからなる群から選択される容器の内部表面であり得る。細胞、試験試薬およびイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストは、本発明のアッセイにおいて検出標識を含む必要がない。
【００７０】
本発明の別の実施形態は、イオンチャネルの調節因子を同定する方法を提供する。細胞が、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置に適用され得る。試験試薬および細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが、第一の位置に適用される。細胞、試験試薬および細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストは、任意の順序でまたは同時に、センサー表面に添加され得る。第一の位置について第一ＰＷＶが決定され得る。細胞が、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第二の位置に適用され得る。細胞は、細胞の第一セットが第一の位置に適用されるのと同時に、またはそれより早い時間もしくはそれより遅い時間に、第二の位置に適用され得る。これらの細胞は、第一の位置に適用される細胞のセットと同じ型の細胞でも異なる細胞であってもよい。細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが第二の位置に適用される。細胞および細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストは、任意の順序でまたは同時に、バイオセンサー表面に適用され得る。第二の位置について第二ＰＷＶが決定され得る。第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが異なる場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子である。第一の値と第二の値とが約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍまたはそれ以上を超えて離れている場合、それらは異なっている。第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが同じまたは類似の場合、その試験試薬は、イオンチャネルの調節因子ではない。第一の値と第二の値とが互いの約１ｎｍ以内に存在する場合、それらの値は同じまたは類似である。
【００７１】
本発明の別の実施形態において、イオンチャネルの調節因子を同定する方法が提供される。この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置に細胞を適用するステップ、試験試薬を第一の位置に適用するステップ、および第一の位置について第一ＰＷＶを検出するステップを含む。細胞および試験試薬は、任意の順序でまたは同時に、第一の位置に適用され得る。次いで、細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが第一の位置に適用され、第一の位置について第二ＰＷＶが検出され得る。第一の値が決定され、この第一の値は、第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとの間の差異である。
【００７２】
あるいは、この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置に細胞を適用するステップ、第一の位置に細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストを適用するステップ、および第一の位置について第一ＰＷＶを検出するステップを含み得る。細胞および細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストは、任意の順序でまたは同時に、第一の位置に適用され得る。次いで、試験試薬が第一の位置に適用され、第一の位置について第二ＰＷＶが検出され得る。第一の値が決定され、この第一の値は、第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとの間の差異である。
【００７３】
細胞が、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第二の位置に適用される。これらの細胞は、細胞の第一セットが第一の位置に適用されるのと同時に、またはそれより早い時間もしくはそれより遅い時間に、第二の位置に適用され得る。これらの細胞は、第一の位置に適用される細胞のセットと同じ型の細胞でも異なる細胞であってもよい。第二の位置について第三ＰＷＶが検出され得る。細胞の既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストが第二の位置に適用される。第二の位置について第四ＰＷＶが決定され得る。第二の値が決定され、この第二の値は、第二の位置の第三ＰＷＶと第四ＰＷＶとの間の差異である。第一の値と第二の値とが異なる場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子である。第一の値と第二の値とが約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍまたはそれ以上を超えて離れている場合、それらの値は異なっている。第一の値と第二の値とが同じまたは類似の場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子ではない。第一の値と第二の値とが互いの約１ｎｍ以内に存在する場合、それらの値は同じまたは類似である。
【００７４】
細胞は、第一の位置への細胞の適用後、第一の位置への試験試薬の適用後、第一の位置への既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストの適用後、第二の位置への細胞の適用後、第二の位置への既知のイオンチャネルアンタゴニストまたはアゴニストの適用後、またはアッセイ中の任意の他の時点、あるいはそれらの組合せ後に、所定の期間にわたってインキュベートされ得る。
【００７５】
任意に、細胞は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面への細胞の適用後；試験試薬の適用後；イオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストの適用後；またはアッセイ中の任意の他の時点、あるいはそれらの組合せ後に、所定の期間にわたってインキュベートされる。細胞を調査する標識なしのバイオセンサー方法は、細胞に対して破壊的ではないので、これらの細胞はまた、何分間か、何時間か、または何日間かにわたって、差異を探索するために１回より多く処理され得る。
【００７６】
本発明の別の実施形態は、試験試薬がイオンチャネルの調節因子であることを確認する方法を提供し、この方法は、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第一の位置に細胞を適用するステップ、および任意に第一の位置について第一ＰＷＶを検出するステップを含む。細胞の既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストが第一の位置に適用され、試験試薬が第一の位置に適用される。既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストおよび試験試薬が、第一の位置に同時に適用されてもよく、または一方が他方の前に第一の位置に適用されてもよい。第一の位置について第二ＰＷＶが検出され得る。第一の値が決定され、この第一の値は、第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとの間の差異である。細胞が、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上の第二の位置に適用される。これらの細胞は、細胞の第一セットが第一の位置に適用されるのと同時に、またはそれより早い時間もしくはそれより遅い時間に、第二の位置に適用され得る。これらの細胞は、第一の位置に適用される細胞のセットと同じ型の細胞でも異なる細胞であってもよい。第二の位置について第三ＰＷＶが決定され得る。細胞の既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストが第二の位置に適用され、第二の位置について第四ＰＷＶが決定され得る。既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストは、第一の位置で使用されるものと同じであってもよく、異なる既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。第二の値が決定され、この第二の値は、第三ＰＷＶと第四ＰＷＶとの間の差異である。第一の値と第二の値とが異なる場合、その試験試薬はイオンチャネルの調節因子であると確認される。第一の値と第二の値とが約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍまたはそれ以上を超えて離れている場合、それらの値は異なっている。
【００７７】
これらの細胞は、バイオセンサーへの細胞の適用後、試験試薬の適用後、既知のイオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニストの適用後、またはアッセイ中の任意の他の時点、あるいはそれらの組合せ後に、所定の期間にわたってインキュベートされ得る。
【００７８】
これは、化合物をスクリーニングして、いずれの様式でもそれらの化合物がイオンチャネルを調節しないことを確認するのにも有用である。イオンチャネルに対して、薬物の、多数の意図しない、望ましくない影響が存在する。いくつかの薬物が、これらの影響に起因して市場から除かれている（例えば、Ｒｅｚｕｌｉｎ、Ｌｏｒｏｎｅｘ、Ｐｒｏｐｕｌｓｉｄ、Ｒｅｄｕｘ、Ｐｏｎｄｉｍｉｎ、Ｈｉｓｍａｎａｌ、ＰｏｓｉｃｏｒおよびＳｅｌｄａｎｅ）。従って、本発明の方法は、イオンチャネルの非調節因子ならびにイオンチャネルの調節因子を同定するのに有用である。
【００７９】
アゴニスト、アンタゴニストおよび調節因子は、１より多いイオンチャネルに影響を与え得る。従って、１または複数の第二の型のイオンチャネルに対する添加された試験試薬の機能を判定するために、１つまたは複数の第一の型のイオンチャネルの機能を阻害することが好都合であり得る。第一の型のイオンチャネルと第二の型のイオンチャネルとは、同じでも異なってもよい。本発明の一実施形態において、１または複数の抗体、タンパク質、低分子、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたは他の因子が、１または複数の型のイオンチャネルの機能の一部または全てを阻害するために使用される。例えば、抗体は、ポアタンパク質に抗体が特異的に結合したときに、イオンチャネルの機能を部分的にまたは実質的に停止させるように、イオンチャネルの１または複数のポアサブユニットタンパク質に対して特異的であり得る。一旦そのイオンチャネルが阻害されると、試験試薬（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、イオンチャネル調節因子または任意の他の化合物）が、非遮断型のイオンチャネルに対する試験試薬の影響を判定するために、細胞に添加され得る。
【００８０】
本発明の一実施形態は、イオンチャネル活性の調節について試験試薬をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、１または複数のイオンチャネルを発現する細胞を、１または複数の型のイオンチャネルを部分的または実質的に遮断し得る因子に接触させるステップを含み得る。これらの細胞は試験試薬と接触させられる。１または複数の型のイオンチャネルのイオンチャネル活性は、細胞と試験試薬との間の接触の前および／もしくは後に、ならびに／または細胞と遮断因子との間の接触の前および／もしくは後に、判定され得る。ＰＷＶのシフトによって判定されるようなイオンチャネル活性の変化は、その試験試薬が、１または複数の型のイオンチャネルの活性を調節することが可能であることを示す。
【００８１】
試験試薬は、イオンチャネルの活性を潜在的に調節するかまたは細胞内でのイオンチャネルタンパク質の発現を変化させる、任意の分子であり得る。とりわけ、分子は、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、有機低分子、多糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジンまたは多価カチオンであり得る。有機低分子は、１００ダルトン（Ｄ）より大きく約２，５００Ｄ未満の分子量を有し得る。好ましい低分子は、２０００Ｄ未満、または１５００Ｄ未満、または１０００Ｄ未満、または５００Ｄ未満である。
【００８２】
本発明の一実施形態において、１または複数のＥＣＭリガンドが、バイオセンサーの１または複数の表面上に被覆される。無血清培地中の１または複数の型の細胞が、バイオセンサーの表面に添加される。無血清培地は、約５、４、３、２、１、０．５％またはそれ未満の血清を含む。無血清培地は、約０％の血清、または約０％〜約１％の血清を含み得る。ＰＷＶは、バイオセンサーへの細胞の添加後に決定され得る。イオンチャネルの１または複数の潜在的または既知の調節因子が、バイオセンサー表面に添加され得る。ＰＷＶは、１または複数の調節因子の添加後に決定され得る。細胞の１または複数のイオンチャネルの活性に、変化を引き起こすことができる。例えば、細胞は脱分極され得る。
【００８３】
１または複数のイオンチャネルの活性の変化は、細胞を脱分極させることによって引き起こすことができる。脱分極は、細胞の膜電位の絶対値の減少である。従って、膜電位があまりポジティブにならない変化およびあまりネガティブにならない変化は、共に脱分極である。脱分極は、カチオン（例えば、Ｎａ＋チャネルを通ったＮａ＋またはＣａ２＋チャネルを通ったＣａ２＋）の流入によって引き起こされ得る。脱分極は、Ｋ＋チャネルを通ったＫ＋の流出によって阻害され得る。従って、脱分極は、塩濃度、圧力および電流の操作によって引き起こされ得る。例えば、Ｂｏｕｌｔｏｎら（編）、Ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＮＹ（１９８８）；Ａｒｂｉｂ、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ、第２版、ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．（２００３）を参照のこと。
【００８４】
細胞培地は、イオンチャネルを「開口」させるために、除去されるか、カリウムなどのイオンの濃度が低下した培地で希釈または置換され得る。あるいは、細胞は、イオンチャネル開口剤（例えば、サソリ毒液毒素）に曝露され得る。
【００８５】
ＰＷＶは、１または複数のイオンチャネルにおける活性の変化をもたらした後（例えば、イオンチャネル開口剤の添加後）に決定され得る。任意に、予め定められた時間で、細胞の１または複数のイオンチャネルの活性における別の変化を引き起こすことができる。例えば、イオンチャネルの脱分極をもたらすために、イオン濃度を増大してもよく、あるいは電圧を印加してもよい。次いでＰＷＶが決定される。１または複数のＰＷＶを、コントロール細胞（例えば、細胞の１または複数のイオンチャネルにおいて活性の変化が引き起こされていない（例えば、イオンチャネル開口剤の添加なし）細胞、イオンチャネルを完全に欠く細胞、チャネル開口剤を受けているが調節因子を受けていない細胞）と比較することができる。これらの応答は、例えばマイクロプレートの異なるウェル中の、バイオセンサーの別個の位置上で測定され得る。
【００８６】
ＰＷＶは、試験イオンチャネル調節因子が細胞の１または複数のイオンチャネルを調節したかどうかを判定するために、比較され得る。例えば、イオンチャネルの試験調節因子がバイオセンサー表面上の細胞に添加されると、第一ＰＷＶが取得され、イオンチャネル開口剤が細胞に添加され、第二ＰＷＶが取得され、第一ＰＷＶと第二ＰＷＶとが比較され得る。ＰＷＶが実質的に異なる場合、その試験調節因子は、イオンチャネルを実際に調節している。一般に、５ｐｍほどの小ささの、ＰＷＶの差異の分解能が検出され得るが、約２０ｐｍ、１００ｐｍ、２００ｐｍまたはそれより大きい差異も、検出され得る。あるいは、これらのＰＷＶは、試験調節因子がイオンチャネルを調節したかどうかを判定するために、コントロールと比較され得る。
【００８７】
組換え細胞株が１つの型のイオンチャネルを過剰発現する場合、その１つの型のイオンチャネルに対する調節因子の影響が判定され得る。
【００８８】
本発明のアッセイにおいて、各ステップの前および／または後に、所定の期間にわたるインキュベーション、洗浄ステップ、ＰＷＶの決定またはそれらの組合せが存在し得る。任意に、ＰＷＶ読み取りは、アッセイの全工程または一部にわたって、絶えず取得してもよい。
【００８９】
本発明の実施形態では、イオンチャネルの調節またはその欠如は、発生すると検出できるので、評価のために放射測定標識、比色標識、蛍光標識または顕微鏡を組み込む必要性を回避できる。イオンチャネルの調節に起因して生じる細胞の変化は、リアルタイムで、標識なしの様式で、都合よくモニタリングされ得る。細胞の変化をリアルタイムで検出するために、ＢＩＮＤ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（商標）、ＢＩＮＤ  Ｒｅａｄｅｒ（商標）およびＢＩＮＤ  Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）（例えば、比色共鳴反射バイオセンサーシステム）が設計され、対応するアルゴリズムが、データを定量するために作製された。例えば、米国特許第６，９５１，７１５号、米国特許出願公開第２００４／０１５１６２６号を参照のこと。
【００９０】
本発明の方法は、細胞の標識化も、顕微鏡または比色／蛍光定量評価のための試薬も必要としない点、リアルタイムでの同じ細胞集団の連続的な複数の独立した読み取りを可能にする点、迅速である点、最小の試薬使用（体積および型の両方）しか必要としない点、組換え細胞株を必要としない点、細胞の機械的操作を必要としない点、および計数デバイスを通して細胞を流す必要がない点によって、有利である。
【００９１】
標識なしのバイオセンサー方法は、既知の化合物または試験化合物での処理ありまたはなしで、細胞または細胞のセットが長期間にわたって連続的または非連続的にモニタリングされ得るように、細胞に対して非破壊的である。本発明の方法は、何日間かにわたるリアルタイムでの、同じ細胞集団の連続的なモニタリングまたは複数の独立した読み取りを可能にする。細胞の変化は、通常の培養環境（適切な培地で静的）で、より長期間にわたって都合よくかつ客観的に定量され得る。本発明の方法は、各細胞または細胞集団からのさらなる細胞内データを得るために、蛍光標識と相乗的に使用することもできる。
【００９２】
細胞変化は、いくつかの期間にわたって、１つの位置についてＰＷＶを取得することによってモニタリングされ得る。あるいは、細胞を保持するレセプタクル（例えば、マイクロタイタープレートウェル）のスキャンが、いくつかの期間にわたって実施され得る。本発明の一実施形態において、試験試薬は、既知のイオンチャネル調節因子に対してそのＰＷＶパターンを経時的に比較することによって、潜在的なイオンチャネル調節因子として同定され得る。特定のイオンチャネル制御因子が特定の細胞集団に添加される場合、ＰＷＶは経時的に特定のパターンを示す。例えば、イオンチャネル調節因子が細胞に添加された後、ＰＷＶは、特定の期間にわたって増大し、次いで低下し得る。経時的に同じパターンのＰＷＶ値を示す試験試薬は、潜在的なイオンチャネルの制御因子または調節因子として同定され得る。
【００９３】
１または複数の細胞が、比色共鳴反射光バイオセンサーの表面上のマイクロタイターウェルなどの位置に、適用され得る。レセプタクルとは１つのコンテナをいい、コンテナの集合（例えば、マルチウェルプレート）ではない。この位置についての比色共鳴反射光ピーク波長値（ＰＷＶ）が検出される。１または複数の細胞は、所定の期間（例えば、１秒間、３０秒間、１分間、２分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、５時間、１０時間、またはそれ以上の時間）にわたってインキュベートされ得る。インキュベーション前、またはインキュベーション後、またはインキュベーション前およびインキュベート後に、１または複数の試験試薬、イオンチャネルアゴニストおよび／またはイオンチャネルアンタゴニストが、１または複数の細胞に適用され得る。この位置についての比色共鳴反射光ＰＷＶが、第二の期間にわたって検出され得る。細胞に変化が生じた場合、光の反射波長は、変化が生じない状況と比較して、シフトする。第一ＰＷＶが第二ＰＷＶと比較され得る。ＰＷＶの変化は、細胞における変化を示し得る。いくつかの期間にわたるＰＷＶが決定され比較され得る。
【００９４】
バイオセンサー位置での細胞変化は、バイオセンサー表面のＰＷＶを介して検出することができ、あるいはより一般には、レンズベースの光学素子または電子工学ベースの電荷結合素子（ＣＣＤ）技術を使用する、拡大または非拡大の、顕微鏡、デジタルカメラ、従来のカメラまたは他の可視化装置を使用してモニタリングされ得る。
【００９５】
ＰＷＶの変化は、ＢＩＮＤ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）、ＳｃａｎｎｅｒまたはＣａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｒｅａｄｅｒを使用して決定され得る。ＢＩＮＤ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）およびＣａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｒｅａｄｅｒの場合、アッセイは、約０．０００５〜８時間で完了し得る。
【００９６】
好ましくは、ＰＷＶを決定するスキャナーのレンズの分解能は、約２〜約２００、約２〜約５０または約２〜約１５マイクロメートルの画素サイズを有する。本発明のアッセイは、約０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７または８時間未満で完了し得る。即ち、例えば添加された試薬に応答した細胞変化は、時間効率の良い様式で判定され得る。
【００９７】
本明細書中のいずれかの箇所で参照した全ての特許、特許出願および他の科学的もしくは技術的著作物は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書中に例示的に記載された発明は、本明細書中に具体的に開示されていない全ての要素（単数または複数）、限定（単数または複数）の非存在下で、適切に実施できる。従って、例えば、本明細書中の各例において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」はいずれも、それらの元の意味を保持したまま、他の２つの用語のいずれかで置換され得る。これまで使用してきた用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、このような用語および表現の使用には、示されおよび記載された特徴またはそれらの一部の任意の等価物を排除する意図はなく、種々の改変が、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内に入る可能性があることが認識される。従って、実施形態によって本発明を具体的に開示してきたが、当業者は本明細書中に開示された概念の任意選択の特徴、改変および変形を用いることができ、このような改変および変形は、明細書および添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内であると解釈されることが、理解されるべきである。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群または他の代替手段の群の観点から記載される場合、当業者は、それにより、マーカッシュ群または他の群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位群の観点からも本発明が記載されることを認識するであろう。
【実施例】
【００９８】
ｈＥＲＧカリウムイオンチャネルのインヒビターのスクリーニング
このプロトコールは、細胞を脱分極させるために無カリウム飢餓バッファーを使用し、それによってイオンチャネルを開口させ、その結果、イオンチャネル調節因子のスクリーニングが可能となる。比色共鳴反射バイオセンサープレートを、水和ベースラインのために、１×ＰＢＳで、３〜５分間洗浄した。ＰＷＶを各ウェルについて決定した。このＰＷＶは、バイオセンサーが安定（ドリフトしない）であり、各ウェルにわたってシグナルが均一であることを確認するために、有用であり得る。これらのプレートを、室温で２時間、２５．０μｌ／ウェルのフィブロネクチンで被覆した。これらのプレートを、ＰＢＳ中２５．０μｌのオボアルブミンまたはＢＳＡを、フィブロネクチンで予め被覆したウェルに添加することによって、室温で１時間または４℃で一晩ブロッキングした。
【００９９】
カリウムありおよびなしの飢餓バッファーを調製した。５００．０ｍｌの無カリウム飢餓バッファーのために、以下の試薬を使用した：１５０ｍＭの最終ＮａＣｌのために２５ｍｌの３Ｍ  ＮａＣｌ；２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳのために１０．０ｍｌ；２ｍＭ塩化カルシウムのために１．０ｍｌ；２ｍＭ塩化マグネシウムのために０．５ｍｌ；５ｍＭ  Ｄ−（＋）−グルコースのために１．０ｍｌ；Ｈ２Ｏ  ＨＰＬＣで５００．０ｍｌにする。カリウム飢餓バッファーを、２ｍＭ  ＫＣｌを添加することを除き、上記と同様に調製する。
【０１００】
試験化合物の１０ｍＭストックを、連続１／３希釈で８ポイントの希釈系列で第一濃度として無カリウムバッファー中１０μＭに希釈して、試薬プレートを作製する：細胞内で０．１〜０．５の最終ＤＭＳＯ％のために、シサプリド一水和物−１０ｍＭ＝１０ｍｇ／２．０６ｍｌ  ＤＭＳＯ；Ｅ４０３１の用量設定は、３０μＭの高濃度で開始した。
【０１０１】
細胞（ヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ（ｈＥＲＧ）カリウムチャネルでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞またはＣＨＯ親細胞）を、３．０ｍＬのベルセン（ｖｅｒｓｅｎｅ）／フラスコで、５〜１０分間収穫した。ベルセンを、１フラスコ当たり８．０ｍＬの、ＦＢＳを含む完全培地（ｆｕｌｌ  ｍｅｄｉａ）で不活性化した。バイオセンサープレートを室温に平衡化し、予め添加したＰＢＳを除去した。細胞を、１Ｋ  ｒｐｍで、５分間穏やかにスピンダウンした。培地を吸引し、カリウム含有飢餓バッファーを細胞ペレットに添加した。次いで、細胞をそれらの初期濃度から、２０．０μｌ当たり２０，０００個の細胞になるように、１ｍｌ当たり１０６細胞の濃度まで希釈した。細胞が定着して付着するようになるのに充分な時間が経過した後に、バイオセンサープレートの各ウェルについてのベースラインＰＷＶを、品質制御ステップとして取得し、細胞接着の均一性についてチェックした。
【０１０２】
２０．０μｌのカリウム含有飢餓バッファーを各ウェルに添加した。各ウェルについてＰＷＶを取得した。細胞／ウェルの平均数を測定した。１ウェル当たり２０．０μｌ中に２０Ｋの細胞を播くために、細胞を１０６細胞／ｍｌで調製した。２０．０μｌの細胞を、２０．０μｌの培地／バッファーを既に含むウェルに添加した。
【０１０３】
播種したバイオセンサー試験プレートを、約１５分間室温に保持し、その後、定着、付着および細胞の健康状態の回復のために、１２０分間３７℃のインキュベーター中に置いた。トランスフェクトした細胞について、プレートを３０℃のインキュベーター中に置いて、タンパク質の再折り畳みを助けた。任意に、この時間の間に、新たに播種したバイオセンサープレートについてＰＷＶを得て、細胞接着をモニタリングしてもよい。
【０１０４】
ｈＥＲＧイオンチャネルの開口を防止する、ｈＥＲＧチャネルインヒビターの影響を観察するために、細胞をまず、カリウム含有培地中でインヒビターと予めインキュベートする。次いで、例えば細胞外カリウムを除去した、またはＫ＋チャネルを開口させるのに特異的な化合物（例えば、マロトキシン（ｍａｌｌｏｔｏｘｉｎ））の添加による、イオンチャネル開口条件下で、細胞を観察する。カリウムの存在下でインヒビターと予めインキュベートした細胞は、無カリウム条件下（ポアを開口させる静電ポテンシャルを通常は引き起こす）では、またはより少量のマロトキシンでは、開口しないはずである。顕著な比較において、インヒビターに曝されていない細胞は開口するはずであり、ＰＷＶの変化は、正常なチャネル機能を示す結果となるはずである。
【０１０５】
バイオセンサープレートについて、３〜５分間、または１〜２ｐｍ未満の変化／分の安定な読み取りが得られるまで、ＰＷＶを取得する。適切な体積のリガンドまたは試薬プレートからの試験試薬を、バイオセンサープレートに添加した。細胞を約１５〜３０分間インキュベートした。インヒビターを含有するカリウム含有飢餓バッファーの全体積を、ウェルへの同じ所望の最終濃度のリガンドまたは試験試薬を含む同じ体積の無カリウム飢餓バッファーで置換した。各ウェルについてＰＷＶを取得した。図１は、ｈＥＲＧでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞が、親ＣＨＯ細胞よりもより速くかつより大きく膨潤したことを示す。これは、それらの細胞が、親ＣＨＯ細胞より多くのイオンチャネルを有し、ナトリウムおよび水が、親ＣＨＯ細胞よりも迅速に細胞中に移動できるからである。図２Ａ〜Ｃは、２つのカリウムチャネルインヒビター（シサプリド一水和物およびＥ４０３１）の、細胞に対する影響を示す。インヒビター濃度が上昇するほど、カリウムの欠如に応答した細胞の膨潤は小さくなる。親ＣＨＯ細胞株は、ｈＥＲＧイオンチャネルの欠如に起因して、インヒビターの存在下で影響をほとんどまたは全く示さない。図３を参照のこと。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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