(57)【要約】  本発明は、生体内又は生体外でプロテアーゼの活性を評価するための診断薬又はアッセイ並びに癌性又は前癌性細胞の存在を検出する方法を提供する。  本発明のアッセイは、標的プロテアーゼに特異的な共通配列を含むオリゴペプチドリンケージを介して連結された二個の粒子からなる。標的プロテアーゼによる配列の開裂を、視覚的に又は種々のセンサーを用いて検出することができ、診断結果を癌の予後と相関させることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一粒子、第二粒子及び前記第一及び第二粒子間のリンケージを備え、
前記リンケージがプロテアーゼ共通配列を含むことを特徴とするプロテアーゼ活性の検出用ナノプラットフォーム組立体。
【請求項２】
前記第一及び第二粒子それぞれが、約１〜約１００ｎｍの直径を有する請求項１に記載の組立体。
【請求項３】
前記第一及び第二粒子が、それぞれ独立してナノ粒子、発色団／発光団、量子ドット、ビオロゲン並びにその組み合わせからなる群から選択される請求項１又は２に記載の組立体。
【請求項４】
前記第一及び第二粒子が同一でない請求項１〜３のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項５】
前記第一及び第二粒子が両者ともナノ粒子、発色団／発光団又は量子ドットである請求項１〜４のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項６】
前記粒子の少なくとも一つがナノ粒子である請求項１〜５のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、金属元素及び金属塩からなる群から選択された金属を備え、該金属塩が酸化物、硫化物、セレン化物及びテルル化物からなる群から選択される請求項６に記載の組立体。
【請求項８】
前記ナノ粒子が二以上の金属の合金からなる請求項６に記載の組立体。
【請求項９】
前記ナノ粒子が、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、ニッケル（Ｎｉ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、コバルト（Ｃｏ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、マンガン（Ｍｎ）、レニウム（Ｒｅ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、亜鉛 （Ｚｎ）、イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、カドミウム（Ｃｄ）、ランタン（Ｌａ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン(Ｗ)、アクチニウム(Ａｃ)、ローレンシウム（Ｌｗ）、ラザホージウム（Ｒｆ）、ドブニウム（Ｄｂ）、シーボーギウム（Ｓｇ）、ボーリウム（Ｂｈ）、ハッシウム（Ｈｓ）、マイトネリウム（Ｍｔ）、ダームスタチウム（Ｄｓ）、レントゲニウム（Ｒｇ）、ウンウンビウム（Ｕｕｂ）、セレン（Ｓｅ）からなる群から選択された金属、並びにその酸化物、水酸化物、硫化物、セレン化物及びテルル化物、又はその組み合わせを含む請求項６に記載の組立体。
【請求項１０】
前記酸化物が、ＦｅＯ、Ｆｅ3Ｏ4、Ｆｅ2Ｏ3、ＦｅxＯy、ＣｕＯ、ＮｉＯ、Ａｇ2Ｏ及びＭｎ2Ｏ3からなる群から選択される請求項９に記載の組立体。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が、金属又は金属合金コア及び金属シェルからなるコア／シェル型ナノ粒子である請求項６に記載の組立体。
【請求項１２】
前記コアが、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ及びＰｔからなる群から選択される請求項１１に記載の組立体。
【請求項１３】
前記シェルが、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｐｔ、その金属酸化物、並びにその組み合わせからなる群から選択される請求項１１又は１２に記載の組立体。
【請求項１４】
前記コア／シェル型ナノ粒子が、Ｆｅ／Ａｕ、Ｆｅ／Ｆｅ3Ｏ4及びＡｕ／Ｆｅ2Ｏ3からなる群から選択される請求項１１に記載の組立体。
【請求項１５】
前記コアが約１ｎｍ〜約２５ｎｍの直径を有する請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項１６】
前記シェルが約０．５ｎｍ〜約１０ｎｍの厚みを有する請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が、ナノ粒子を囲む有機単分子層を備える安定化ナノ粒子である請求項６〜１６のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項１８】
前記単分子層がリガンドからなる請求項１７に記載の組立体。
【請求項１９】
前記リガンドが、チオール、アルコール、ニトロ化合物、ホスフィン、ホスフィン酸化物、レソルシンアレーン、セレン化物、ホスフィン酸、ホスホン酸、スルホン酸、スルホン酸塩、カルボン酸、ジスルフィド、過酸化物、アミン、ニトリル、イソニトリル、チオニトリル、オキシニトリル、オキシシラン、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物及びセレン部分からなる群から選択された少なくとも一つの構成部分を含む請求項１８に記載の組立体。
【請求項２０】
前記単分子層が、アルカンチオレート単分子層、アミノアルキルチオレート単分子層、アルキルチオールサルフェート単分子層及び有機フェノールからなる群から選択される請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項２１】
前記ナノ粒子が、トリオクチルホスフィン酸化物安定化ナノ粒子、アミン安定化ナノ粒子、カルボン酸安定化ナノ粒子、ホスフィン安定化ナノ粒子、チオール安定化ナノ粒子、アミノアルキルチオール安定化ナノ粒子及び有機フェノール安定化ナノ粒子からなる群から選択される請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項２２】
前記粒子の少なくとも一つが発色団／発光団である請求項１〜５のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項２３】
前記発色団／発光団が、有機色素、無機色素、フルオロフォア、ホスホフォア、光吸収ナノ粒子、その組み合わせ、並びにその金属化錯体からなる群から選択される請求項２２に記載の組立体。
【請求項２４】
前記発色団／発光団が、クマリン、ピレン、シアニン、ベンゼン、Ｎ−メチルカルバゾール、エリスロシンＢ、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド、２、５-ジフェニルオキサゾール、ルブレン及びＮ−(３−スルホプロピル)アクリジニウムからなる群から選択された有機色素である請求項２３に記載の組立体。
【請求項２５】
前記発色団／発光団が、ポルフィリン、フタロシアニン、クロリン及び金属化発色団からなる群から選択された無機色素である請求項２３に記載の組立体。
【請求項２６】
前記ポルフィリンが、テトラカルボキシ−フェニル−ポルフィリン(ＴＣＰＰ)及びＺｎ−ＴＣＰＰからなる群から選択される請求項２５に記載の組立体。
【請求項２７】
前記発色団／発光団が、ルテニウムポリピリジル錯体、オスミウムポリピリジル錯体、ロジウムポリピリジル錯体、イリジウム（ＩＩＩ）の３−（１−メチルベンゾイミダゾール−２−イル)-７-(ジエチルアミノ)−クマリン錯体及びイリジウム（ＩＩＩ）の３-(ベンゾチアゾール−２−イル）−７−(ジエチルアミノ)−クマリン錯体からなる群から選択された金属化発色団である請求項２５に記載の組立体。
【請求項２８】
前記発色団／発光団が、りん光性色素、フルオレセイン、ローダミン及びアントラセンからなる群から選択されたフルオロフォア又はホスホフォアである請求項２３に記載の組立体。
【請求項２９】
前記粒子の少なくとも一つが量子ドットである請求項１〜５のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項３０】
前記量子ドットが、ＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル型量子ドット、ＣｄＴｅ／ＣｄＳｅコア／シェル型量子ドット、ＣｄＳｅ／ＺｎＴｅコア／シェル型量子ドット及び合金化半導体量子ドットからなる群から選択される請求項２９に記載の組立体。
【請求項３１】
前記量子ドットが、直径約１０ｎｍ未満である請求項２９又は３０に記載の組立体。
【請求項３２】
前記量子ドットが、量子ドットを囲むレソルシンアレーンリガンドを備える安定化量子ドットである請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項３３】
前記リンケージが、前記共通配列を含むオリゴペプチドからなる請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項３４】
前記オリゴペプチドが、前記プロテアーゼ開裂領域に対する少なくとも１０個のアミノ酸Ｎ末端の親水性領域と、前記プロテアーゼ開裂領域に対するＣ末端連結領域とを含む請求項３３に記載の組立体。
【請求項３５】
前記Ｃ末端連結領域が、その末端にチオール反応性基を備える請求項３４に記載の組立体。
【請求項３６】
前記Ｃ末端連結領域が、システイン残基、リシン又はアスパラギン酸塩を含む請求項３４に記載の組立体。
【請求項３７】
前記Ｃ末端連結領域が、ＧＧＧＣ(配列番号：１４)、ＡＡＡＣ(配列番号：１５)、ＳＳＳＣ(配列番号：１６)、ＴＴＴＣ(配列番号：１７)、ＧＧＣ(配列番号：３８)、ＧＧＫ(配列番号：３９)、ＧＣ(配列番号：４０)及びＧＧＤ(配列番号：４２)からなる群から選択された配列を含む請求項３４に記載の組立体。
【請求項３８】
前記Ｎ末端領域が、ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲ(配列番号：１)、ＫＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲ(配列番号：１９)、ＫＫＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲ(配列番号：２０)、ＣＧＧＧ(配列番号：２３)、ＫＧＧＧ(配列番号：２４)及びＫＧＧ(配列番号：３７)からなる群から選択された配列を含む請求項３４に記載の組立体。
【請求項３９】
前記Ｎ末端領域が、リシン、オルチニン、２、４ジアミノ酪酸及び２、３ジアミノプロピオン酸からなる群から選択された少なくとも一つの末端基を更に含む請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項４０】
前記共通配列が、セリンプロテアーゼ開裂配列、アスパラギン酸塩プロテアーゼ開裂配列、システインプロテアーゼ開裂配列及び金属プロテアーゼ開裂配列からなる群から選択される請求項１〜３９のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項４１】
前記共通配列が、ＳＧＲＳＡ(配列番号：２)、ＶＰＭＳＭＲＧＧ(配列番号：３)、ＩＰＶＳＬＲＳＧ(配列番号：４)、ＲＰＦＳＭＩＭＧ(配列番号：５)、ＶＰＬＳＬＴＭＧ(配列番号：６)、ＶＰＬＳＬＹＳＧ(配列番号：７)、ＩＰＥＳＬＲＡＧ(配列番号：８)、ＳＧＳＰＡＦＬＡＫＮＲ(配列番号：９)、ＤＡＦＫ(配列番号：１０)、ＳＧＫＰＩＬＦＦＲＬ(配列番号：１１)、ＳＧＫＰＩＩＦＦＲＬ(配列番号：１２)、ＧＰＬＧＭＬＳＱ(配列番号：１３)、ＨＧＰＥＧＬＲＶＧＦＹＥＳＤＶＭＧＲＧＨＡＲＬＶＨＶＥＥＰＨＴ(配列番号：２５)、ＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＦ(配列番号：２６)、ＳＬＬＫＳＲＭＶＰＮＦＮ(配列番号：２７)、ＳＬＬＩＦＲＳＷＡＮＦＮ(配列番号：２８)及びＳＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴ(配列番号：２９)からなる群から選択される請求項１〜４０のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項４２】
前記リンケージが、ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＧＲＳＡＧＧＧＣ(配列番号：１８)、ＫＧＧＶＰＭＳＭＲＧＧＧＣ(配列番号：３０)、ＫＧＧＩＰＶＳＬＲＳＧＧＣ(配列番号：３１)、ＫＧＧＶＰＬＳＬＴＭＧＧＣ(配列番号：３２)、ＫＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ(配列番号：３３)、ＣＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＣ(配列番号：３４)、ＣＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ(配列番号：３５)、ＤＧＧＳＧＲＳＡＧＧＫ(配列番号：３６)及びＫＧＧＳＧＲＳＡＧＧＤ(配列番号：４１)からなる群から選択される請求項１〜４０のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項４３】
前記第一及び第二粒子が共にナノ粒子である請求項１〜２１及び３３〜４２のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項４４】
前記第一及び第二粒子が異なるナノ粒子である請求項４３に記載の組立体。
【請求項４５】
前記第一及び第二粒子が共に発色団／発光団である請求項１〜５、２２〜２８及び３３〜４２のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項４６】
前記第一及び第二粒子が異なる発色団／発光団である請求項４５に記載の組立体。
【請求項４７】
前記リンケージが前記粒子の一つと結合するスペーサー部分を更に含む請求項４５又は４６に記載の組立体。
【請求項４８】
前記スペーサー部分がカルボキシル、チオール、その組み合わせからなる群から選択された反応性基を含む請求項４７に記載の組立体。
【請求項４９】
前記スペーサー部分が、アミド結合を通じて前記オリゴペプチドの前記Ｎ末端領域と共有結合する請求項４７又は４８に記載の組立体。
【請求項５０】
前記スペーサー部分が、ジスルフィド結合を通じて前記オリゴペプチドのＣ末端連結領域と共有結合する請求項４７又は４８に記載の組立体。
【請求項５１】
前記スペーサー部分が、二つの末端カルボキシル基又は一つの末端カルボキシル基及び一つの末端チオール基を各々有するエチレングリコール、アミド、アルキレン及びエステルからなる群から選択される請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項５２】
前記第一粒子がナノ粒子であり、前記第二粒子が発色団／発光団である請求項１〜４、６〜２８及び３３〜４２のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項５３】
前記第一粒子がナノ粒子であり、前記第二粒子が量子ドットである請求項１〜４、６〜２１及び２９〜４２のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項５４】
前記第一及び第二粒子を、該第一及び第二粒子間でフォルスター共鳴エネルギー転移又は表面プラズモン共鳴を可能にする距離だけ分離する請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項５５】
前記第一及び第二粒子を、該第一粒子が前記第二粒子の励起状態を消光できるようにする距離だけ分離する請求項５２又は５３に記載の組立体。
【請求項５６】
前記第一及び第二粒子を約１０ｎｍ未満の距離だけ分離する請求項５４又は５５に記載の組立体。
【請求項５７】
９個までの付加粒子を更に備え、該付加粒子のそれぞれが前記第一粒子にそれぞれのリンケージによって連結し、各リンケージがプロテアーゼ共通配列を備える請求項１〜５６のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項５８】
前記付加粒子それぞれと前記第一粒子の間のそれぞれのリンケージが異なるプロテアーゼ共通配列を備える請求項５７に記載の組立体。
【請求項５９】
前記付加粒子が、発色団／発光団及び量子ドットからなる群から選択される請求項５７又は５８に記載の組立体。
【請求項６０】
前記第一粒子がナノ粒子からなる群から選択される請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項６１】
請求項１〜６０のいずれか一項に記載の組立体と、薬学的に許容し得るキャリアーとを含む診断アッセイを備えることを特徴とする組成物。
【請求項６２】
前記薬学的に許容し得るキャリアーが、水性緩衝液及びリポゾームからなる群から選択される請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記リポゾームが約１００ｎｍ〜約５μｍである請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記リポゾームがホスホリン脂質二重層及びコレステロールを含む請求項６２又は６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記リポゾームが熱不安定性である請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
前記リポゾームがＮ−イソプロピル−アクリルアミドを含む請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記リポゾームが腫瘍に特異的な抗体又はアプタマーを更に含む請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
（ａ）哺乳類からの体液試料を、請求項１〜６０のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム組立体を含む診断アッセイと接触させ、
（ｂ）前記アッセイをエネルギー源に曝露し、
（ｃ）前記アッセイの吸収又は発光スペクトルにおける変化を検出し、前記変化がプロテアーゼ活性に対応することを特徴とする哺乳類における癌性又は前癌性細胞に関連するプロテアーゼの活性を検出する方法。
【請求項６９】
前記エネルギー源が、タングステンランプ、レーザーダイオード、レーザー、生物発光並びにその組み合わせからなる群から選択される請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記曝露が約４００ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長で生起する請求項６８又は６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記曝露が約５００ｎｍ〜約１０００ｎｍの波長で生起する請求項６８又は６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記体液試料が尿及び血液からなる群から選択される請求項６８〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記体液試料との接触前の前記アッセイの吸収又は発光スペクトルに対する体液試料との接触後の前記アッセイの最大吸収又は発光における青色シフトが、哺乳類における癌性又は前癌性細胞の存在を示す請求項６８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
最大吸収又は発光スペクトルにおける約５ｎｍ〜約２００ｎｍ間の青色シフトが、哺乳類における癌性又は前癌性細胞の存在を示す請求項６８〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記変化が、前記流体試料と接触する前の前記アッセイの吸収又は発光スペクトルに対する新たな可視光色又はルミネセンスバンドの出現を含み、該可視光色又はルミネセンスバンドが哺乳類における癌性又は前癌性細胞の存在を示す請求項６８〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記アッセイの前記吸収又は発光スペクトルにおける変化が、約１秒間〜約３０分間の時限にわたって観測される請求項６８〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記吸収又は発光スペクトルにおける変化が、ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７並びにその組み合わせからなる群から選択されたプロテアーゼの活性を示す請求項６８〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記プロテアーゼ活性を癌進行の予後と相関させることを更に備える請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
ｕＰＡ及びＭＭＰ−７両者の活性並びにＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２両者の活性の欠如の検出が、血管新生の予後と相関する請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７の全ての活性の検出が、細胞侵潤の予後と相関する請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
（ａ）請求項６１〜６７のいずれか一項に記載の組成物を哺乳類に投与し、
（ｂ）前記組成物中のアッセイを活性化し、
（ｃ）癌性又は前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の領域をエネルギー源に曝露し、
（ｄ）前記アッセイの吸収又は発光スペクトルにおける変化を検出することを備え、
前記変化がプロテアーゼ活性に対応することを特徴とする哺乳類における癌性又は前癌性細胞に関連するプロテアーゼの活性を検出する方法。
【請求項８２】
前記投与工程（ａ）が、前記組成物を前記癌性又は前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の領域内へ直接注入することを備える請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記投与工程（ａ）が、前記組成物を前記哺乳類の血流内へ注入することを備える請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記組成物が、注入後一時間以内に前記癌性又は前癌性細胞を有することが疑われる領域に到達する請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記活性化工程（ｂ）が、前記アッセイを前記薬学的に許容し得るキャリアーから放出するに十分な温度へ前記アッセイを加熱することを備える請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記加熱が、前記アッセイの光物理学的加熱からなる請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記加熱が、前記薬学的に許容し得るキャリアーの熱崩壊を引き起こす請求項８１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記エネルギー源が、タングステンランプ、レーザーダイオード、レーザー、生物発光及びその組み合わせからなる群から選択される請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記曝露工程が、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ又は約８００ｎｍ〜約９００ｎｍの波長で起こる請求項８１〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
最大吸収又は発光スペクトルにおける約５ｎｍ〜約２００ｎｍの青色シフトが、哺乳類における癌性又は前癌性細胞の存在を示す請求項８１〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記変化が、前記活性化（ｂ）の前の前記アッセイの吸収又は発光スペクトルに対する新たなルミネセンスバンドの出現を含み、該ルミネセンスバンドが哺乳類における癌性又は前癌性細胞の存在を示す請求項８１〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記プロテアーゼ活性を癌進行の予後と相関させることを更に備える請求項８１に記載の方法。
【請求項９３】
前記アッセイの活性化後１０分以内に検出したプロテアーゼ活性を、癌性又は前癌性細胞が高悪性度である高い確率と相関する請求項８１〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記アッセイの活性化後最初の３０分以内でのプロテアーゼ活性検出の欠如が、前記癌性又は前癌性細胞が高悪性度である極めて低い確率と相関する請求項８１〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
吸収又は発光スペクトルにおける変化が、ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、並びにその組み合わせからなる群から選択されたプロテアーゼの活性を示す請求項８１〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
ｕＰＡ及びＭＭＰ−７両方の活性、並びにＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２両方の活性の欠如の検出が、血管新生の予後と相関する請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７の全ての活性の検出が、細胞侵潤の予後と相関する請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記プロテアーゼ活性が、ＫＧＧＶＰＭＳ(配列番号：４３)、ＭＲＧＧＧＣ(配列番号：４４)、ＫＧＧＩＰＶＳ(配列番号：４５)、ＬＲＳＧＧＣ(配列番号：４６)、ＫＧＧＶＰＬＳ(配列番号：４７)、ＬＴＭＧＧＣ(配列番号：４８)、ＫＧＧＧＳＧＲ(配列番号：４９)、ＳＡＧＧＧＣ(配列番号：５０)、ＣＧＧＧＳＧＲ(配列番号：５１)、ＳＡＧＧＣ(配列番号：５２)、ＤＧＧＳＧＲ(配列番号：５３)、ＳＡＧＧＫ(配列番号：５４)、ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＧＲ(配列番号：５５)、ＫＧＧＳＧＲ(配列番号：５６)及びＳＡＧＧＤ(配列番号：５７)からなる群から選択された二つ以上のオリゴペプチド配列になる請求項８１に記載の方法。
【請求項９９】
前記癌性又は前癌性細胞が、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小児期小脳星細胞腫、小児期大脳星細胞腫、基底細胞癌腫、肝外胆管癌、小児期脳幹神経膠腫、成人脳腫瘍、小児期悪性神経膠腫、小児期脳室上衣腫、小児期髄芽腫、小児期テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児期視覚路及び視床下部神経膠腫、乳癌、妊娠関連乳癌、小児期乳癌、男性乳癌、小児期カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、小児期結腸直腸癌、食道癌、小児期食道癌、眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫、成人神経膠腫、成人(原発性)肝細胞癌、小児期(原発性)肝細胞癌、成人ホジキンリンパ腫、小児期ホジキンリンパ腫、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓(腎細胞)癌、小児期腎臓癌、成人(原発性)肝臓癌、小児期(原発性)肝臓癌、非小細胞型肝臓癌、小細胞型肝臓癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、成人非ホジキンリンパ腫、小児期非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、メラノーマ、成人悪性中皮腫、小児期中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌、小児期多重内分泌腫瘍形成症候群、多発性骨髄腫／プラズマ細胞腫瘍、菌状息肉腫、脊髄形成異常性症候群、脊髄形成異常／脊髄増殖性疾患、成人急性脊髄性白血病、小児期急性脊髄性白血病、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、小児期卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、全子宮頸部癌、小児期全子宮頸部癌、島細胞全子宮頸部癌、副甲状腺癌、陰茎癌、プラズマ細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、小児期腎細胞癌、腎盂及び尿管、移行細胞癌、成人柔組織肉腫、小児期柔組織肉腫、子宮肉腫、皮膚癌(非メラノーマ)、小児期皮膚癌、メラノーマ、メルケル細胞皮膚癌腫、小細胞肺癌、小腸癌、偏平上皮細胞癌、胃癌、小児期胃癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、甲状腺癌、小児期甲状腺癌及び膣癌からなる群から選択された癌に関連する請求項６８〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連特許出願の相互参照）
本出願は、「蛍光プロテアーゼアッセイ」の名称で２００８年３月３日に出願した米国仮出願第６１／０６７，８９１号に基づく優先権を主張し、その全体をここに参照して援用する。
【０００２】
（配列表）
本出願は、２００９年２月２５日に作製し、名称「４０１３２−ＰＣＴ」、９ＫＢで、ＡＳＣＩＩ形式でのテキストファイルとして提出されたコンピュータ読み取り可能な様式（ＣＲＦ）での配列表を備える。上記ＣＲＴの内容をここに参照して援用する。
【０００３】
本発明は、一般に、癌に関連したプロテアーゼ活性を検出するための診断アッセイ、診断結果の癌の予後との相関、並びに癌性又は前癌性細胞の存在の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
癌の予後は、その疾病の期に基づく。四つの主要な期として、初期の突然変異、細胞生存及び腫瘍進行、血管形成、最後に侵潤又は転移がある。最大の難題の一つは、癌が身体自身の細胞の疾病であることにある。このため、しばしば疾病が完全に進行するまで癌を診断することが極めて困難である。これはまた、治療効率に影響を及ぼす。その理由は、癌細胞が健常細胞と同じ酵素、複製機構、構造的特徴などを有し、健常細胞から癌細胞を線引きする治療を開発するのは困難だからである。このため、病期分類及び治療が、通常癌の源を特異的に標的化するよりも症状(すなわち、腫瘍のサイズ、リンパ節が癌を含むか否か、癌が最初の位置から身体の他の部位へ広がるか否か)に基づいている。
【０００５】
より最近、多数のプロテアーゼが癌における疾病の進行に関連づけられてきた。プロテアーゼは、他のタンパク質におけるペプチド結合の開裂を触媒する酵素の一分類である。これらは非常に特異的(一つのタンパク質における一つのペプチド結合だけしか分解できない)又は非常に広範(例えばリシンのように常にペプチド結合を開裂できる)とすることができる。数種のプロテアーゼが種々の癌細胞系統によって過剰発現されることが既知である。癌の発生及び進行に必要であることが既知のプロテアーゼとしては、マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰｓ)、組織セリンプロテアーゼ及びカテプシンが挙げられる。これらプロテアーゼの多くは、癌細胞内で発現上昇する(すなわち、健常組織よりも腫瘍においてずっと高い活性を有する)か、誤発現する(すなわち、見出されるべきでないコンパートメント内で見出される)かのいずれか、又は胚発生に含まれるが、成体細胞においてかなりの程度で見出されるべきでない。
【０００６】
ＭＭＰｓは、古典的な癌関連プロテアーゼである。ＭＭＰｓは、亜鉛と、共同因子として要求されるカルシウムイオンとに由来した一群の亜鉛プロテアーゼの系統である。２１種類の異なる既知のＭＭＰｓがあり、その基質に基づいた群、すなわちコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン、金属エラスタナーゼ、エナメリシン及び膜型ＭＭＰｓに分類される。かかる群の名前から分かるように、ＭＭＰｓは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び組織の基底膜（ＢＭ）を構成するタンパク質を分解する。通常、ＭＭＰｓは癌性細胞自身によってではなく、腫瘍を囲む間質細胞によって産生される。これは、癌性細胞が周囲の間質細胞にＭＭＰｓの産生を高度に発現上昇させる様々な細胞信号を発するからである。ＭＭＰｓはいくつかの理由で癌の生存及び進行に不可欠である。最初に、これらは間質及び上皮細胞から細胞表面結合増殖因子を開裂し、放出して癌細胞と相互作用して成長を刺激する。これらはまた、ＥＣＭを新しい血管発生に開くこと、並びに血管新生促進因子を放出し、血管新生促進プロテアーゼカスケードを開始することにより血管新生に役割を果たす。ＭＭＰｓは、ＥＣＭ及びＢＭを分解し、細胞が組織壁を通過できるようにすることにより腫瘍転移に主要な役割を果たす。これらはまた、ＥＣＭ及びＢＭ断片を放出し、細胞移動を刺激する。
【０００７】
数種類のセリンプロテアーゼ、特にウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）及びプラスミンは癌においても十分に裏づけられた役割を有する。プラスミノゲン活性化システムのウロキナーゼ及び数種類の他の成分の上昇した発現レベルが腫瘍の悪性度と相関することが見出された。ｕＰＡは、その受容体ｕＰＡＲと結合する極めて特異なプロテアーゼであり、不活性なプラスミノゲン(チモーゲン)を活性なプラスミンに開裂する。これは、血管新生を生起する周知のカスケードにおける第一段階である。プラスミノゲン活性化に続く組織の分解は、組織侵潤を促進し、転移に寄与すると考えられている。
【０００８】
カテプシンは、数個の例外はあるが、システインプロテアーゼである。カテプシンは通常低ｐＨ値で作動するが、いくつかは中性ｐＨでも活性であることがしばしばリソソーム／エンドソーム経路において見出された。三種類のカテプシンＢ、Ｄ及びＬは、中性ｐＨで活性であり、しばしば癌において誤発現し、細胞の外側で活性化を起こす。この細胞外活性化はＥＣＭ分解を生じうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
プラスミノゲン／プラスミン成分の予後効果を評価するための多数の研究が、大部分外科的に取り出した腫瘍からの組織摘出物における抗原レベル定量化に基づいて行われた。その後、これらの値が幾つかのタイプの癌における予後と相関づけられた。しかし、癌性細胞を健常細胞から識別する方法を決定するには癌治療において大きな研究領域が残っており、生体内外で適応し得る癌進行及びその疾病の病期を定量的に検出する方法に対する要望が当業界でいまだにある。また、種々の癌病期の多重マーカーを別個の試験を要することなく一度に検出するための要望がある。また、癌の生体内特徴づけの要望があり、それにより治療を最も悪性の癌組織に向けることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、第一粒子、第二粒子及び第一と第二粒子間のリンケージを備え、該リンケージがプロテアーゼ共通配列からなることを特徴とするプロテアーゼ活性を検出するためのナノプラットフォーム組立体を提供する。
【００１１】
本発明はまた、プロテアーゼの活性を評価するための診断アッセイ（試薬）と、薬学的に許容し得る担体とを備える組成物を提供する。当該診断アッセイは、第一粒子、第二粒子及び第一と第二粒子間のリンケージを備え、該リンケージがプロテアーゼに特異的な共通配列からなるナノプラットフォーム組立体を含む。
【００１２】
加えて、本発明は、哺乳類における癌性又は前癌性細胞に関連したプロテアーゼの活性の検出方法を提供する。当該方法は、哺乳類からの体液試料を診断アッセイ（試薬）と接触させることを備える。該診断アッセイ（試薬）はナノプラットフォーム組立体を含み、かかるナノプラットフォーム組立体が第一粒子、第二粒子及び第一と第二粒子間のリンケージを備え、ここでリンケージがプロテアーゼに特異な共通配列からなる。上記アッセイ（試薬）をエネルギー源に曝露して該アッセイ（試薬）を励起する。次いで、アッセイ（試薬）の吸収又は発光スペクトルにおける変化を検出する。かかる変化はプロテアーゼ活性に対応する。
【００１３】
本発明は、哺乳類における癌性又は前癌性細胞に関連したプロテアーゼの活性を検出する更なる方法を提供する。本発明の方法は、プロテアーゼの活性を評価するための本発明の診断アッセイと、薬学的に許容し得る担体とを含む組成物を哺乳類へ投与することを備える。その後、組成物中のアッセイを活性化する。癌性又は前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の領域を、上記アッセイを励起するエネルギー源に曝露し、該アッセイの吸収又は発光スペクトルにおける変化を検出する。これらの変化はプロテアーゼ活性に対応し、その後これを癌進行の予後と相関付けることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】癌進行の四つの主要な期と、これらの期に関連したプロテアーゼを図示する。
【図２】例３におけるオリゴペプチドのウロキナーゼによる開裂前、中、後での金ナノ粒子の結合対のプラズモン吸収におけるスペクトルシフトを示す。
【図３】例４におけるナノプラットフォーム組立体の発光スペクトルを示す。
【図４】例５からのナノプラットフォーム組立体及びＦＲＥＴ系センサーの発光スペクトルを示す。
【図５】例５におけるλ1＝６０７ｎｍ、λ2＝６５４ｎｍ及びλ3＝７１８ｎｍで示した蛍光バンドの積分値の放出されたＴＣＰＰのモル百分率に対してプロットした比率を示す。
【図６】例５において光スイッチ系センサーを用いてＭＡＴＢＩＩＩ型癌細胞を含浸したラットの尿中のアッセイからのデータを示す。
【図７】図６からのデータを用いてλ＝６５６ｎｍで生ずるＴＣＰＰのルミネッセンスの相対強度のプロットを示す。
【図８】例５において尿採取の１５日前にＭＡＴＢＩＩＩ型癌細胞を含浸したラットの尿を計測した際のλ＝６５６ｎｍで生ずるＴＣＰＰのルミネッセンスの相対強度のプロットを示す。
【図９】例５において尿採取の５日前にＭＡＴＢＩＩＩ型癌細胞を含浸したラットの尿を計測した際のλ＝６５６ｎｍで生ずるＴＣＰＰのルミネッセンスの相対強度のプロットを示す。
【図１０】例６からのルミネッセンスによって示されるような合成中のＣｄＳｅ量子ドットの成長を示す。挿入図はウルツ鉱型構造を有する高結晶質ＣｄＳｅ量子ドットの代表的像を示す。
【図１１】例７のマウスの左右肢からの蛍光顕微鏡により記録した単一光子数スペクトルを示す。
【図１２】例８の検量線結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
特定のプロテアーゼの存在が、成長し、やがて転移する多数の癌の能力に対するマーカーとして役立ち得ることを見出した。本発明は、プロテアーゼ活性を検出し、対応する疾病進行を診断する診断アッセイ並びに方法を提供する。本発明のアッセイを用いて、ＤＮＡ系、ＲＮＡ系、炭水化物系又はタンパク質系リンカーを開裂するあらゆるプロテアーゼ又は酵素を検出することができる。
【００１６】
本発明の診断アッセイは、ナノプラットフォーム組立体を含む。該ナノプラットフォーム組立体は、二個の粒子間のリンカーとして用いるプロテアーゼ共通配列(プロテアーゼによって開裂されるアミノ酸の配列)からなる。より好適には、上記リンカーは共通配列を含むオリゴペプチドからなる。
【００１７】
オリゴペプチドリンケージ及び共通配列
適切なオリゴペプチドは、末端カルボン酸基(Ｃ末端)及び末端アミノ基(Ｎ末端)を含む。オリゴペプチドはまた、Ｃ末端にチオール基を含むのが好ましいが、これをナノプラットフォーム組立体に用いる粒子に応じて修飾してもよい。より好適には、オリゴペプチドリンカーが、プロテアーゼ共通配列に対し少なくとも１０個のアミノ酸Ｎ末端の親水性領域と、開裂配列に対しＣ末端の連結領域とを含み、ここで該Ｃ末端の連結領域がその末端にチオール反応性基を含む。更により好適には、オリゴペプチドのＣ末端はシステイン残基、リシン又はアスパラギン酸塩を含む。オリゴペプチドのＮ末端親水性領域は、過剰正電荷又は負電荷を約１:１の割合で有するのが好ましい。Ｎ末端親水性領域はまた、互いに水素結合を形成し得るアミノ酸残基を備えるのが好ましい。
【００１８】
特に好適なＣ末端の連結領域は、ＧＧＧＣ(配列番号：１４)、ＡＡＡＣ(配列番号：１５)、ＳＳＳＣ(配列番号：１６)、ＴＴＴＣ(配列番号：１７)、ＧＧＣ(配列番号：３８)、ＧＧＫ(配列番号：３９)、ＧＣ(配列番号：４０)及びＧＧＤ(配列番号：４２)からなる群から選択した配列からなる。特に好適なオリゴペプチドのＮ末端領域は、ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲ(配列番号：１)、ＫＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲ(配列番号：１９)、ＫＫＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲ(配列番号：２０)、ＣＧＧＧ(配列番号：２３)、ＫＧＧＧ(配列番号：２４)及びＫＧＧ(配列番号：３７)からなる群から選択した配列からなる。Ｎ末端は、リシン、オルチニン、２、４ジアミノ酪酸及び２３ジアミノプロピオン酸からなる群から選択した少なくとも一つの末端基を更に含むのが好ましい。もうひとつの好適なオリゴペプチドは下記の一般構造を有する。
【化１】
2011517934.tif 000003
式中の「配列」はここに記載したあらゆるオリゴペプチド又は共通配列とすることができる。かかるオリゴペプチドは購入可能であるか、又は既知の方法(例えば、修飾メリフィールド合成法)を用いて合成可能である。
【００１９】
本発明の診断アッセイに用いる共通配列は、セリンプロテアーゼ開裂配列、アスパルチルプロテアーゼ開裂配列、システインプロテアーゼ開裂配列及び金属プロテアーゼ開裂配列からなる群から選択されるのが好ましい。更により好適には、上記共通配列は、ウロキナーゼ、マトリックス金属ペプチダーゼ、カテプシン及びゼラチナーゼからなる群から選択したプロテアーゼ用の開裂配列からなるのが好ましい。特に好適なプロテアーゼ及びその対応する共通配列を下記の表１に記載する。
【００２０】
【表１】
2011517934.tif 000004
【００２１】
図１を参照するに、上記プロテアーゼが癌進行における多くの特異的な事象に関連する。疾病進行の病期を、四つの事象、すなわち初期突然変異、細胞生存／腫瘍進行、血管新生(新しい血管の発生)及び侵潤／組織再構築に分ける。各期に関連したプロテアーゼの配列は、癌がどこまで進行し、予後がどうなるかをよく俯瞰できる図を与えうる。好適な診断薬又はアッセイは、ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−７からなる群から選択したプロテアーゼ用のプロテアーゼ共通配列を備える。ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−７をそれぞれ検出するのに最も好適なオリゴペプチド配列を、「−」で示した開裂点を用いて下記の表に記載する。
【００２２】
【表２】
2011517934.tif 000005
【００２３】
再び図１を参照するに、正確な癌の予後を本発明のアッセイを用いて決定できる。特に、本発明のアッセイによってＭＭＰ−１及びＭＭＰ−７が検出され、他の二つのプロテアーゼが検出されない場合、癌の予後は細胞生存／腫瘍進行である。上記アッセイによってｕＰＡ及びＭＭＰ−７(ＭＭＰ−１又はＭＭＰ−２ではなく)が検出される場合、予後は血管新生である。四つのプロテアーゼ全てが検出される場合、予後は浸潤及び最終的な転移である。それゆえ、これら四つのプロテアーゼの生体内での測定は、癌性組織の進行の空間分解測定を可能にし、体内の最も活発な腫瘍に対する治療を導くことができるより詳細な予後を可能にする。
【００２４】
プロテアーゼの存在下でナノプラットフォーム組立体の共通配列を開裂し、この開裂によって生じたスペクトル変化を本発明のアッセイにより検出する。それゆえ、次の配列、ＫＧＧＶＰＭＳ(配列番号：４３)、ＭＲＧＧＧＣ(配列番号：４４)、ＫＧＧＩＰＶＳ(配列番号：４５)、ＬＲＳＧＧＣ(配列番号：４６)、ＫＧＧＶＰＬＳ(配列番号：４７)、ＬＴＭＧＧＣ(配列番号：４８)、ＫＧＧＧＳＧＲ(配列番号：４９)、ＳＡＧＧＧＣ(配列番号：５０)、ＣＧＧＧＳＧＲ(配列番号：５１)、ＳＡＧＧＣ(配列番号：５２)、ＤＧＧＳＧＲ(配列番号：５３)、ＳＡＧＧＫ(配列番号：５４)、ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＧＲ(配列番号：５５)、ＫＧＧＳＧＲ(配列番号：５６)、ＳＡＧＧＤ(配列番号：５７)の二つ以上がナノプラットフォームによって標的にされたプロテアーゼに応じて得られる。
【００２５】
アッセイ用の粒子
下記により詳細に論述するように、多数の異なるタイプの粒子を用いて、プロテアーゼ活性を測定するのに用いるセンサーの種類に応じて本発明のアッセイ用のナノプラットフォーム組立体を形成することができる。粒子の最大励起及び発光スペクトルは６５０〜８００ｎｍであるのが好ましい。診断アッセイの使用に好適な粒子は、ナノ粒子(例えば、金属、金属合金又はコア／シェル型)、発色団／発光団、量子ドット、ビオロゲン、並びにその組み合わせからなる群から選択される。
【００２６】
１．ナノ粒子
ここで用いる「ナノ粒子」という用語は、金属又は非金属ナノ層シェルによって任意に囲み得る金属ナノ結晶質粒子を言う。適切なナノ粒子は、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好適には約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、更により好適には約５ｎｍ〜約２０ｎｍの直径を有するのが好ましい。ナノ粒子は、あらゆる種類の金属(金属元素を含む)又は金属合金を含んでもよい。金属又は金属合金ナノ粒子は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、ニッケル（Ｎｉ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、コバルト（Ｃｏ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、マンガン（Ｍｎ）、レニウム（Ｒｅ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、亜鉛 （Ｚｎ）、イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、カドミウム（Ｃｄ）、ランタン（Ｌａ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン(Ｗ)、アクチニウム(Ａｃ)、ローレンシウム（Ｌｒ）、ラザホージウム（Ｒｆ）、ドブニウム（Ｄｂ）、シーボーギウム（Ｓｇ）、ボーリウム（Ｂｈ）、ハッシウム（Ｈｓ）、マイトネリウム（Ｍｔ）、ダームスタチウム（Ｄｓ）、レントゲニウム（Ｒｇ）、ウンウンビウム（Ｕｕｂ）、セレン（Ｓｅ）からなる群から選択した金属、並びにその酸化物(例えば、ＦｅＯ、Ｆｅ3Ｏ4、Ｆｅ2Ｏ3、ＦｅxＯy(非化学量論的鉄酸化物)、ＣｕＯ、ＮｉＯ、Ａｇ2Ｏ、Ｍｎ2Ｏ3)、水酸化物、硫化物、セレン化物及びテルル化物、並びにこれらの組み合わせからなるのが好ましい。
【００２７】
コア／シェル型ナノ粒子は、金属又は金属合金コアと、金属シェルとを備えるのが好ましい。好適なコアは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ及びＰｔからなる群から選択される。好適なシェルは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｐｔ、その金属酸化物、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。特に好適な金属コア／シェル型の組み合わせは、Ｆｅ／Ａｕ、Ｆｅ／Ｆｅ3Ｏ4及びＡｕ／Ｆｅ2Ｏ3からなる群から選択される。該ナノ粒子のコアは、約１ｎｍ〜約２５ｎｍ、より好適には約３ｎｍ〜約５ｎｍの直径を有するのが好ましい。コア／シェル型ナノ粒子の金属シェルは、約０．５ｎｍ〜約１０ｎｍ、より好適には約０．５〜約２ｎｍの厚さを有するのが好ましい。
【００２８】
ナノ粒子を安定化又は非安定化とすることができる。安定化ナノ粒子は、ナノ粒子コアを囲む有機単分子層からなるのが好ましいここで用いる「安定化」という用語は、ナノ粒子を被覆し、保護し(例えば、生体腐食から)又は特性(例えば、水溶性)を付与するためのリガンドシェル又は単分子層の使用を意味する。単分子層はいくつかの同一リガンド(すなわち、ホモリガンド)又は混合リガンドから構成することができる。リガンドを多様なナノ粒子の表面に結合する種々の技術が当業界で既知である。例えば、ナノ粒子をリガンドを含む溶液中で混合してナノ粒子の被覆を促進することができる。或いはまた、被覆物がナノ粒子に付着又は結合するようにナノ粒子を被覆材料の気相に曝露することによって被覆物をナノ粒子に塗布してもよい。リガンドをナノ粒子に共有結合により結合するのが好ましい。単分子層を形成するのに必要なリガンドの数は、ナノ粒子の寸法に左右される。
【００２９】
リガンドは、ナノ粒子の金属表面に結合する官能基を含む。好適には、上記リガンドは、チオール、アルコール、ニトロ化合物、ホスフィン、ホスフィン酸化物、レソルシナレン、セレン化物、ホスフィン酸、ホスホン酸、スルホン酸、スルホン酸塩、カルボン酸、二硫化物、過酸化物、アミン、ニトリル、イソニトリル、チオニトリル、オキシニトリル、オキシシラン、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物及びセレノ部分からなる群から選択した少なくとも一つの基を含む。好適な有機単分子層は、アルカンチオレート単分子層、アミノアルキルチオレート単分子層、アルキルチオールサルフェート単分子層及び有機フェノール(例えば、ドーパミン及びその誘導体)からなる群から選択される。有機単分子層の厚さは、好ましくは約１０ｎｍ未満、より好ましくは約５ｎｍ未満である。特に好適な安定化ナノ粒子は、トリオクチルホスフィン酸化物安定化ナノ粒子、アミン安定化ナノ粒子、カルボン酸安定化ナノ粒子、ホスフィン安定化ナノ粒子、チオール安定化ナノ粒子、アミノアルキルチオール安定化ナノ粒子及び有機フェノール安定化ナノ粒子からなる群から選択される。
【００３０】
２．発色団／発光団
本発明のアッセイに使用するに適する発色団／発光団粒子としては、あらゆる有機又は無機の色素、フルオロフォア、燐光団、光吸収ナノ粒子(例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｐｄ)、それらの組み合わせ、もしくはそれらの金属化錯体が挙げられる。好適には、発色団／発光団粒子は約１００ｎｍ未満のサイズを有する。
【００３１】
適当な有機色素は、クマリン、ピレン、シアニン、ベンゼン、Ｎ−メチルカルバゾール、エリスロシンＢ、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド、２、５-ジフェニルオキサゾール、ルブレン及びＮ−(３−スルホプロピル)アクリジニウムからなる群から選択される。好適なクマリンの具体例としては、７−アミノクマリン、７−ジアルキルアミノクマリン及びクマリン１５３が挙げられる。好適なベンゼンの例としては、１、４−ビス(５−フェニルオキサゾール−２−イル)ベンゼン及び１、４-ジフェニルベンゼンが挙げられる。好適なシアニンの例としては、オキサシアニン、チアシアニン、インドシアニン、メロシアニン及びカルボシアニンが挙げられる。他のシアニンの例としては、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ、ＥＣＦ、Ｃ３−オキサシアニン、Ｃ３−チアシアニン色素(ＥｔＯＨ)、Ｃ３−チアシアニン色素(ＰｒＯＨ)、Ｃ５−インドシアニン、Ｃ５−オキサシアニン、Ｃ５−チアシアニン、Ｃ７−インドシアニン、Ｃ７−オキサシアニン、ＣｙｐＨｅｒ５、Ｄｙｅ−３３、Ｃｙ７、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３Ｃｙ５ ＥＴ、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ２、ＣＢＱＣＡ、ＮＩＲ１、ＮＩＲ２、ＮＩＲ３、ＮＩＲ４、ＮＩＲ８２０、ＳＮＩＲ１、ＳＮＩＲ２、ＳＮＩＲ４、メロシアニン５４０、ピナシアノールヨウ化物、１、１−ジエチル−４、４−カルボシアニンヨウ化物、Ｓｔａｉｎｓ Ａｌｌ、Ｄｙｅ−１０４１又はＤｙｅ−３０４が挙げられる。
【００３２】
適当な無機色素は、金属化及び非金属化ポルフィリン、フタロシアニン、クロリン(例えば、クロロフィルＡ及びＢ)、並びに金属化発色団からなる群から選択される。好適なポルフィリンは、テトラカルボキシ−フェニル−ポルフィリン(ＴＣＰＰ)及びＺｎ−ＴＣＰＰからなる群から選択される。好適な金属化発色団は、ルテニウムポリピリジル錯体、オスミウムポリピリジル錯体、ロジウムポリピリジル錯体、イリジウム（ＩＩＩ）の３−(１−メチルベンゾイミダゾール−２−イル)−７−(ジエチルアミノ)−クマリン錯体及び、イリジウム（ＩＩＩ）との３−(ベンゾチアゾール−２−イル）−７−(ジエチルアミノ)−クマリン錯体からなる群から選択される。
【００３３】
適当なフルオロフォア及び燐光団は、燐光性色素、フルオレセイン、ローダミン(例えば、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ)及びアントラセン(例えば、９−シアノアントラセン、９、１０−ジフェニルアントラセン、１−クロロ−９、１０−ビス(フェニルエチニル)アントラセン)からなる群から選択される。
【００３４】
３．量子ドット
量子ドットは、周期律表のＩＩ−ＶＩ族又はＩＩＩ−Ｖ族元素からの原子で構成された半導体(例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＰ)である。量子ドットの光学的特性は、(通常安定化している)シェルを合成することによって操ることができる。かかる量子ドットは、コア／シェル型量子ドット(例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＣｄＳｅ)として既知である。同一材料だが異なる寸法の量子ドットが、異なる色の光線を放射できる。その輝度は、三次元空間の全てにおける電子の閉じ込めによるエネルギー準位の量子化に起因する。バルク半導体において、電子−正孔対は各型の半導体に特有なボーア励起半径以内で結合される。量子ドットはボーア励起半径よりも小さく、離散エネルギー準位の出現をもたらす。半導体の価電子及び伝導帯間のバンドギャップΔＥは、ナノ結晶の寸法及び形状の関数である。量子ドットは、従来の有機発蛍光団よりも若干低いルミネセンス量子収量を特徴付けるが、ずっと大きな吸収断面及び非常に低い光退色速度を有する。量子ドットのモル吸光係数は、約１０5〜１０6Ｍ-1ｃｍ-1で、色素よりも１０〜１００倍大きい。
【００３５】
コア／シェル型量子ドットは、その低いバンドギャップコアの周りに高いバンドギャップシェルを有し、光をシェルによりあらゆる吸収なしに放射する。シェルは、コアから表面無放射発光を不動態化し、それにより光ルミネセンス量子収量を亢進し、自然分解を防止する。Ｉ型量子ドットのシェル(例えばＣｄＳｅ／ＺｎＳ)は、コアよりも高いエネルギーの伝導帯及び低いエネルギーの価電子帯を有し、コア内に電子と正孔を共に閉じ込める結果となる。ＩＩ型量子ドット(例えば、ＣｄＴｅ／ＣｄＳｅ、ＣｄＳｅ／ＺｎＴｅ)のシェルの伝導帯及び価電子帯は、コアよりも共に低いか共に高いかのいずれかである。そのため、電子及び正孔の運動が一次元に制限される。コア／シェル型界面における励起子の放射性再結合はＩＩ型発光を生ずる。ＩＩ型量子ドットは、バンド端近傍で間接遷移型半導体として挙動し、そのため赤色及び近赤外にまで及ぶ吸収裾部を有する。Ｉ及びＩＩ型が最も好適であるけれども、合金化半導体量子ドット(ＣｄＳｅＴｅ)も使用できる。変動可能な合金組成及び内部構造は、粒子のサイズを変えることなく光学特性を調整しうる。これら量子ドットは、８５０ｎｍまで発光できるため、生体内の生物学的アッセイ用の近赤外蛍光性プローブを開発するのに使用できる。
【００３６】
特に好適な量子ドットは、ＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル型量子ドット、ＣｄＴｅ／ＣｄＳｅコア／シェル型量子ドット、ＣｄＳｅ／ＺｎＴｅコア／シェル型量子ドット及び合金化半導体量子ドット(例えば、ＣｄＳｅＴｅ)からなる群から選択される。量子ドットは、生体内で使用する際に腎臓経路を介して排出されるほど十分小さいのが好ましい。より好適には、量子ドットは、直径が約１０ｎｍ未満、更により好適には直径が約２ｎｍ〜約５．５ｎｍ、最も好適には直径が約１．５ｎｍ〜約４．５ｎｍである。多重センサー(多重検出)を創出するために異なる色の発光が必要な場合、異なる発光波長をもたらす量子ドットコアの寸法を変えることにより達成することができる。量子ドットは、上記ナノ粒子に関して論述したように安定化又は非安定化とすることができる。量子ドットの安定化に好適なリガンドはレゾルシナレンである。
【００３７】
アッセイ用のナノプラットフォーム組立体
診断ナノプラットフォーム組立体は、上述のオリゴペプチド配列を介して相互に結合した少なくとも二個の粒子を備える。加えて、該組立体は、使用する粒子及びアッセイを検出するのに用いるスペクトルに応じて単一の中心粒子に連結した多重粒子を備えうる。検出中に全可視光及び近赤外スペクトルを用いる場合、十個までの粒子を中心粒子に連結できる(異なる開裂配列を用いて各粒子を連結する際に単一アッセイ内で１０個までの異なるプロテアーゼ検出するために)。可視光スペクトル又は赤外スペクトルのいずれかを単独で使用する場合、五個までの粒子を中心粒子に連結できる(異なる開裂配列を用いて各粒子を連結する際に、単一アッセイ内で５個までの異なるプロテアーゼ検出するため)。オリゴペプチド配列のほかに、上記粒子間の連結をいずれかの粒子に結合したリガンド又はスペーサー部分(後述する)から更に構成することができる。
【００３８】
当該組立体は、同型の粒子(すなわち、ナノ粒子に連結したナノ粒子)、又は異なる粒子(すなわち、発色団／発光団又は量子ドットのような異なる型の粒子に連結したナノ粒子)から構成することができる。組立体はまた、発色団／発光団に連結した発色団／発光団からなることもできる。二個のナノ粒子を同じ診断組立体に用いる場合、これらは同一(すなわち、同じ種類の金属、合金又はコア／シェル型からなり、また同じ形状(例えば、丸型、球状、棒状など)である)であるか、又は各粒子が異なる(すなわち、物理的及び／又は化学的に非同一)ことができる。好適には、粒子は異なる化学組成及び寸法を有し、組立体を異なるナノ粒子又は発色団／発光団を用いて創出するか、又は組立体をナノ粒子と発色団／発光団(すなわち、非同一粒子)の間で創出する。一形態において、当該組立体は、二つのフルオロフォア間で蛍光共鳴エネルギー転移又は表面プラズモン共鳴を可能にする距離によって分離した二つのフルオロフォアを備える。各フルオロフォアは蛍光性ナノ粒子又は蛍光性有機色素を含み、各々プロテアーゼ開裂配列を含むオリゴペプチドリンカーの各末端と結合する。
【００３９】
組立体における粒子間距離は、オリゴペプチドリンカーの長さ、並びにいずれかの粒子に結合したすべてのリガンド又はスペーサーに依存する。しかしながら、かかる距離は、好適には約１０ｎｍ未満、より好適には約５ｎｍ未満、更により好適には約１ｎｍ〜約３ｎｍである。
【００４０】
発色団／発光団の場合、かかる粒子を、発色団／発光団に結合したスペーサー部分を任意に介してオリゴペプチドリンカーと共有結合するのが好ましい。スペーサーが連結されるオリゴペプチドの端部に応じて、好適なスペーサー部分は、カルボキシル、チオール並びにその組み合わせからなる群から選択した反応性基を含む。一つの好適な実施形態において、スペーサー部分はアミド結合を介してオリゴペプチドリンカーのＮ末端に共有結合される。代替的な実施形態において、スペーサー部分はジスルフィド結合を介してオリゴペプチドリンカーのＣ末端に共有結合される。特に好適なスペーサー部分としては、二つの末端カルボキシル基又は末端カルボキシル基と末端チオール基とを有するエチレングリコール類(好適には、テトラエチレングリコールからドデカエチレングリコールのようなＣ3〜Ｃ20)、アミド類(好適にはＣ3〜Ｃ20)、アルキレン類(好適にはＣ3〜Ｃ20)又はエステル類(好適にはＣ3〜Ｃ20)が挙げられる。
【００４１】
診断アッセイは、そのまま用いるか、又は診断アッセイと、薬学的に許容し得るキャリアーを含む組成物の一部として用いることができる。生体内での診断に関しては、上記アッセイを薬学的に許容し得るキャリアーを用いて送達するのが好ましい。適当な例としては、詳細を後述する従来のリポソーム送達が挙げられる。
【００４２】
上記アッセイを用いて、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小児期小脳星細胞腫、小児期大脳星細胞腫、基底細胞癌腫、肝外胆管癌、小児期脳幹神経膠腫、成人脳腫瘍、小児期悪性神経膠腫、小児期脳室上衣腫、小児期髄芽腫、小児期テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児期視覚路及び視床下部神経膠腫、乳癌、妊娠関連乳癌、小児期乳癌、男性乳癌、小児期カルチノイド腫瘍、胃腸カルチノイド腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、小児期結腸直腸癌、食道癌、小児期食道癌、眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫、成人神経膠腫、成人(原発性)肝細胞癌、小児期(原発性)肝細胞癌、成人ホジキンリンパ腫、小児期ホジキンリンパ腫、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓(腎細胞)癌、小児期腎臓癌、成人(原発性)肝臓癌、小児期(原発性)肝臓癌、非小細胞型肝臓癌、小細胞型肝臓癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、成人非ホジキンリンパ腫、小児期非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、メラノーマ、成人悪性中皮腫、小児期中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌、小児期多重内分泌腫瘍形成症候群、多発性骨髄腫／プラズマ細胞腫瘍、菌状息肉腫、脊髄形成異常性症候群、脊髄形成異常／脊髄増殖性疾患、成人急性脊髄性白血病、小児期急性脊髄性白血病、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、小児期卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、全子宮頸部癌、小児期全子宮頸部癌、島細胞全子宮頸部癌、副甲状腺癌、陰茎癌、プラズマ細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、小児期腎細胞癌、腎盂及び尿管、移行細胞癌、成人柔組織肉腫、小児期柔組織肉腫、子宮肉腫、皮膚癌(非メラノーマ)、小児期皮膚癌、メラノーマ、メルケル細胞皮膚癌腫、小細胞肺癌、小腸癌、偏平上皮細胞癌、胃癌、小児期胃癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、甲状腺癌、小児期甲状腺癌及び膣癌からなる群から選択された癌に関連する癌性又は前癌性細胞を検出することができる。
【００４３】
本発明の方法
本発明のアッセイの一つの利点は、利用し得る粒子に応じて酵素活性を検出するための多種のセンサー技術を用いて粒子を利用し得るセンサー技術に適合するように修飾することによって該アッセイを適合させる柔軟性である。
【００４４】
１．ＦＲＥＴ系センサー
本発明の一形態において、アッセイは、開裂配列によって連結した異なる化学組成又は寸法を有する粒子のような非同一粒子間、若しくは異なる発色団／発光団間、又はナノ粒子と発色団／発光団間の表面プラズモン共鳴及びフォルスター共鳴エネルギー転移(ＦＲＥＴ)に基づいて作動する。ＦＲＥＴは二粒子間のエネルギー転移を描写する。表面プラズモン共鳴を用いて粒子を励起する。当初励起状態にあるドナー粒子は、エネルギーを近接にあるアクセプター粒子に無放射双極子−双極子結合を介して転移することができる。両粒子が蛍光性発色団／発光団である場合、エネルギーが実際には蛍光によって転移されないが、「蛍光共鳴エネルギー転移」という用語がしばしば代わりに使用される。本発明においては、ＦＲＥＴを用いてプロテアーゼ開裂を検出する。つまり、粒子をオリゴペプチドによって結合する一方、アクセプターからの発光をドナー粒子の励起により観測する。酵素が粒子間のリンケージを開裂すると、ＦＲＥＴの変化が観測され、発光スペクトルが変化する。ドナー発光のみが観測される。
【００４５】
より詳細には、両粒子がいわゆるフォルスター距離内にある場合、エネルギー転移が二粒子間で生じ、吸収及び発光における赤色シフトが観測される。この超高速処理中、第一粒子の電子的に励起された状態、すなわち表面プラズモンのエネルギーが少なくとも部分的に第二粒子へ転移される。これらの条件下、光線が第二粒子から放射される。しかしながら、二粒子間の結合が酵素によって開裂されると、光線が第一粒子のみから放射され、吸収及び発光における明瞭な青色シフトが観測される。これは両粒子間の距離が大幅に増加したためである(下記式参照)。
【００４６】
観測されたプラズモン共鳴の最大値を以下の式によって特徴付けることができる。
【数１】
2011517934.tif 000006
式中、Δλ／λ0はプラズモンシフトの分数、ｃ及びｄは定数、ｓは粒子間の端縁−端縁の距離及びＤは粒子径である。ナノプラットフォーム組立体において、粒子を分離する距離は、オリゴペプチド内に存在するアミノ酸当たり約０．３ｎｍと計算できる。ＦＲＥＴ効率(「Ｅ」)は下記式で特徴付けることができる。
【数２】
2011517934.tif 000007
式中、Ｒ0はフォルスター距離(すなわち、ドナーがそのエネルギーの５０％をＦＲＥＴを介してアクセプターに転移する距離)である。ＦＲＥＴアッセイに用いる両粒子は、各粒子の吸収及び発光波長が明瞭に異なり、それゆえ明瞭なルミネセンスバンドとして現れるように選択することができる。好適には、アッセイを生体外及び生体内で行うことができる。それゆえ、生体内使用に関しヒト組織による吸収及び散乱を最小化するために、第一粒子の励起を、好適には約４００ｎｍ〜約１０００ｎｍ間、より好適には約５００ｎｍ〜約８００ｎｍ間、更により好適には約６５０ｎｍ〜約８００ｎｍ間で行うことができる。また、発色団／発光団粒子を使用する場合、好適には適切なフォルスターエネルギー転移を可能にする第一発色団／発光団の励起スペクトルと第二発色団／発光団の蛍光又はりん光スペクトル間のオーバーラップが存在する。
【００４７】
ａ．生体外（イン  ビトロ）での方法
アッセイを用いて、哺乳類の尿又は血液試料のような生物学的液体を含む体液試料中のプロテアーゼ活性を検出することができる。一形態においては、尿試料を哺乳類から採取し、アッセイと物理的に混合する。尿中のアッセイの濃度は、好適には約１×１０-4Ｍ〜約１×１０-10Ｍ、より好適には約１×１０-5Ｍ〜約１×１０-8Ｍである。励起は、好適にはタングステンランプ、レーザーダイオード、レーザー及び生物発光(例えば、ルシフェラーゼ、レニラ属、緑色蛍光性タンパク質)からなる群から選択した適正な波長のエネルギー源で行われる。使用波長はナノプラットフォーム組立体に用いる粒子による。かかる波長は、好適には約４００ｎｍ〜約１０００ｎｍ間、より好適には約５００ｎｍ〜８００ｎｍ間である。高悪性腫瘍が存在する場合、尿試料中のプロテアーゼがオリゴペプチドリンカーを開裂するので、粒子の吸収及び発光における変化が約１秒間〜約３０分間、好適には約３０秒間〜約１０分間の時間にわたって観測される。プロテアーゼの存在下、約５〜約２００ｎｍ間の典型的な吸収及び発光の青色シフトが観測される。従って、本発明の方法において、最大吸収又は発光スペクトルにおける５〜２００ｎｍ間の青色シフトが好適には哺乳類における癌性又は前癌性細胞の存在を示す。
【００４８】
血液を哺乳類から採取し、上記尿のように分析することができる。血液試料中のアッセイの濃度は、好適には約１×１０-4Ｍ〜約１×１０-10Ｍ、より好適には約１×１０-5Ｍ〜約１×１０-8Ｍである。使用波長はナノプラットフォーム組立体に用いた粒子による。波長は、好適には約５００ｎｍ〜約１０００ｎｍ間、より好適には約６００ｎｍ〜８００ｎｍ間の範囲である。より好適には、血液の強い自己吸収のため、Ｔｉ−サファイアレーザーで波長約８００ｎｍでの多光子励起を用いて励起を行う。発光の変化が、高悪性腫瘍が存在する場合、約１秒間〜約３０分間、好適には約３０秒間〜約１０分間の時間にわたって観測される。尿と同じく、血液中にプロテアーゼが存在する場合、約５〜約２００ｎｍ間の典型的な発光青色シフトが観察される。これは好適には哺乳類における癌性又は前癌性細胞の存在を示す。
【００４９】
その後、これらのアッセイ結果(尿又は血液からの)を、上述したようにｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−７という好適なプロテアーゼに関して検出された特異的プロテアーゼ活性に基づくか、又は後述するアッセイ速度に基づいて癌進行の予後と相関させることができる。
【００５０】
ｂ．生体内（イン  ビボ）での方法
代替的な実施形態においては、上記アッセイを用いるプロテアーゼ活性の検出を哺乳類の生体内で行うことができる。上記診断アッセイ又は該アッセイを含む組成物を薬学的に許容し得るキャリアーを用いて投与するのが好ましい。かかるアッセイを血流内に注射により投与することができる。或いはまた、上記アッセイを腫瘍位置に直接又はその近くのような局所的な領域に注射により投与することができる。
【００５１】
生体内での分析のための腫瘍位置への送達は、リポゾーム(リポゾーム送達)を用いることにより達成することができる。リポゾームはホスホリン脂質二重層を有し、好適にはコレステロールの添加によって安定化される。調製方法に応じて、リポゾームの寸法は１００ｎｍ〜数マイクロメートル(好適には約１００ｎｍ〜約５μｍ)の範囲にある。リポゾームの調製方法は当業界で既知である。例えば、ホスホリン脂質及びアッセイを反応容器(例えば、フラスコ)中でクロロホルム(ＣＨＣｌ3)又はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）のような非水性溶媒に溶解することによりリポゾームを調製するのが好ましい。次いで、溶媒をロータリーエバポレーター又は他の蒸留装置を用いて蒸発させて、反応容器壁上にフィルム状の堆積物を得る。その後、ショ糖水溶液(又は任意の他の糖又は塩の組み合わせ)を容器に添加し、引き続き凍結融解サイクル又は超音波処理のいずれかを行った。次いで、生成したスラリーをナノ細孔フィルターを介して押出し、より好適な送達剤である単壁リポゾームを形成するのが好ましい。
【００５２】
その後、上記アッセイを含むリポゾームを血流中に注入するのが好ましい。有利なことに、血流中へ注入する場合、リポゾームは、急速な腫瘍成長のため血管が「漏出性」である腫瘍の近傍以外では血管から出ることができない。それゆえ、リポゾームは好適には腫瘍(すなわち、受動的標的化)の近傍に濃縮される。この処理は、既知の方法に従い腫瘍特異的抗体又はアプタマーをリポゾーム(すなわち、能動的標的化)に化学的に結合することで増強させることができる。その後、好適にはリポゾームを不安定化させ、その間に癌細胞間の間質内にアッセイを放出し、前記近傍におけるプロテアーゼ活性を検出する。
【００５３】
より好適には、熱不安定性リポゾームを使用する。熱不安定性リポゾームは、Ｎ−イソプロピル−アクリルアミド型の重合体(例えば、ポリ(ＮＩＰＡＭ／エチレングリコール)ブロック共重合体)を含み、化学的に結合した長鎖脂肪酸又はアルコールを介してリポゾームのホスホリン脂質二重層中に固着できる。次いで、リポゾームが標的位置に到達すると、少なくとも二本の交差するＴｉ：サファイアレーザーを用いる８００ｎｍでの光物理学的照射によってリポゾームを加熱することができる。リポゾームを、好適には少なくとも約３８℃、より好適には少なくとも約４５℃の温度に加熱する。これは、感熱性リポゾームの熱崩壊をもたらす。
【００５４】
光物理学的加熱(例えば、ナノ粒子が含まれる場合のプラズモン加熱)は、アッセイのナノ粒子を加熱し、その後熱をリポゾームへ放散させる。つまり、金属ナノ粒子を振動電場中に置いた場合、「自由」電子が周期的摂動に応答する。駆動電場を遮断すると、多様な散乱処理(すなわち、電子−電子、電子−フォノン、フォノン−表面など)による関与のため最終的に熱として発散される獲得エネルギーで自由電子の振動が数ピコ秒の時間尺度で急激に減衰する。急速な緩和は、熱を繰返し発生させ、大量のエネルギーをナノ粒子内に堆積させ得ることを確実にする。金属ナノ粒子を溶媒槽内に置く場合、この加熱方法がその周囲と熱的平衡にない熱源につながることができる。
【００５５】
既述の生体内での像化用の代替的な実施形態において、水性緩衝液(例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ))中に溶解したアッセイを腫瘍又は腫瘍領域内に直接注入できる。脳腫瘍の場合、これが唯一実行可能な選択とすることができる。
【００５６】
アッセイが癌性細胞の近傍にあると、一又は二本の交差するＴｉ：サファイアレーザーを用いてアッセイを励起するのが好ましい。他の適当な励起源としては、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー(１０６４ｎｍでの第一調和)、及びＮｄ：ＹＡＧレーザーの５３２ｎｍでの第二調波によって駆動するすべての種類の色素レーザーが挙げられる。次いで、アッセイからの光の放射を、カメラ、顕微鏡又は共焦点顕微鏡を用いて分析する。癌性領域から発した光は、癌性領域における標的プロテアーゼのより高い活性のため、健常組織領域から発した光と異なる色彩を有する。有利なことに、癌性組織は、例えば腫瘍遺伝学者や外科医に対して視覚的に識別可能である。好適には、Ｔｉ：サファイアレーザーを多重フォトン励起用の約８３０ｎｍの波長に調整するので、励起ではなく光の放射のみを観測することができる。その後、アッセイの結果を、下記に詳述するように検出されたプロテアーゼ活性に基づいて癌進行の予後と相間させることができる。
【００５７】
２．光スイッチ系センサー
もうひとつの形態において、アッセイは、オリゴペプチド開裂配列によって発色団／発光団又は量子ドットに連結されたナノ粒子を使用する。一以上の発色団／発光団又は量子ドットを単一中心ナノ粒子に連結することができる。しかしながら、多数の粒子を使用する場合、これらすべては、同じ種類の粒子からなるのが好ましい。好適な二つの組立体は、ナノ粒子と連結した少なくとも一つのポルフィリン又はナノ粒子と連結した少なくとも一つの量子ドットを備える。この方法において、コア／シェル型ナノ粒子の表面プラズモンは、連結したポルフィリンからの励起状態の発光スペクトルを消光できる。同様に、量子ドットは、コア／シェル型金属ナノ粒子の存在によって消光される場合以外、著しく発光性である。また、ビオロゲン(例えば、メチルビオロゲン又はプロピルビオロゲンスルホネート(ＰＶＳ))も消光剤として使用できる。
【００５８】
プロテアーゼが共通配列を開裂すると、量子ドット又はポルフィリンが放出され、発光し、ここでは「酵素トリガー光スイッチ」と言う。有利なことに、新たなルミネセンス／蛍光バンドの出現がずっとより敏感な検出を可能にする。量子ドットの発光波長はそのサイズに依存し、各標的酵素に割り当てられた量子ドットの一つの色(青色、緑色、黄色、赤色)を用いて組立体を構成することができる。４つまでの異なる共通配列を単一のナノ粒子(上記各色に対して一つ)に連結できる。この方法では、四つまでの酵素の活性を生体外又は生体内で同時に観察できる。励起を約４００ｎｍ〜約５００ｎｍ(単一光子)又は約８００ｎｍ〜約９００ｎｍ(多光子)の波長で行うのが好ましい。量子ドットの励起を、低強度可視光線光子源を使用するか、又は超高速赤外線レーザーパルスを使用する手段によって行うことができる。他の適当な励起源としては、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー(１０６４ｎｍでの第一調和)、及びＮｄ：ＹＡＧレーザーの５３２ｎｍでの第二調波によって駆動するすべての種類の色素レーザーが挙げられる。ポルフィリンの励起は、Ｔｉ：サファイアレーザーの８７０ｎｍでの三光子励起を用いて行うのが好ましい。次いで、アッセイからの発光をカメラ、顕微鏡又は共焦点顕微鏡を用いて分析する。光スイッチ系センサーを、上記ＦＲＥＴ系センサーに関して述べたのと厳密に同じ処置(生体外又は生体内)に利用することができる。
【００５９】
いずれかのセンサー方法(生体外又は生体内)を用いる場合、本発明のアッセイ時間は試料又は組織中に存在するプロテアーゼの濃度に依存する。開裂速度は、プロテアーゼ濃度の増加指標に対し３〜５倍だけ増大する。高悪性腫瘍の存在下、アッセイ時間はほんの一瞬の速さとすることができる。健常組織においては、検出すべき活性に対し約２４時間かけることができる。従って、アッセイがより高速なほど、腫瘍がより高悪性で、腫瘍の潜在的転移の可能性がより大きくなる。固形腫瘍の潜在的転移の決定用のナノ粒子系生体内ナノセンサーの構成のためにプロテアーゼ特異性オリゴペプチドを使用することは今までになかったものである。好適には、アッセイを腫瘍領域(又は腫瘍が疑われる領域)に直接注入する場合、注入後約３０分で結果を決定できる。アッセイを静脈内に投与した場合、静脈内投与後約１時間(アッセイが標的領域に到達しうる)以内で、また投与後２４時間までに結果を読み取ることができる。いずれの場合にも、アッセイが腫瘍の近傍にあると、１０分以内に検出したプロテアーゼ活性を、腫瘍が高悪性である高い確率で相関させることができる。好適には、活性が最初の３０分以内に検出されない場合、腫瘍が高悪性である確率は非常に低い。同様に、生体外での試験について、１０分以内に検出したプロテアーゼ活性は、腫瘍が高悪性である高い確率で相関させることができる一方、試料とアッセイとの接触後最初の３０分以内に活性が検出されないことは腫瘍が高悪性である確立が非常に低いことと相関させることができる。この反応速度は、アッセイ完了(及び結果)に数時間かかる既知の検出方法に対して明瞭な利点を提供する。
【実施例】
【００６０】
以下の例は本発明に係る好適な方法を示す。しかしながら、これらの例は説明の目的で提供されるもので、本発明の全範囲において限定されるべきものではないことが分かる。
【００６１】
例１
ナノ粒子組立体の合成
ここでは、ナノ粒子組立体の合成を記載する。ナノ粒子は既知の方法に従い合成することができる。これらはまた、例えばＮａｎｏｓｃａｌｅ社（カンザス州）及びＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社(ミズリー州)の多種の発売元から市販品が入手可能である。以下の方法での使用に適するナノ粒子としては、新たに調製した非安定化ナノ粒子又は安定化ナノ粒子が挙げられる。非安定化ナノ粒子は、下記のようにリガンド交換を用いて安定化させることができる。 
【００６２】
１．リガンド交換
第一組のナノ粒子を非極性又は双極性の非プロトン性溶媒に溶解し、次いで２−アミノエタンチオールで圧力下（１０００ｐｓｉ）室温で１時間処理した。或いはまた、水溶性ナノ粒子を２−アミノエタンチオールでＨ２Ｏ／アセトニトリル混合物中圧力下（１０００ｐｓｉ）室温で１時間処理することができる。
【化２】
2011517934.tif 000008
次いで、表面交換したナノ粒子を、分取型ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて単離した。
【００６３】
２．オリゴペプチドの調製及び第二ナノ粒子への結合
その後、標的プロテアーゼの共通配列(開裂配列)を選択し、ナノ粒子の結合用の共通配列を含むオリゴペプチドを古典的なペプチド合成(修飾メリフィールド合成)を使用することで調製する。これらオリゴペプチドはまた、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社(ニュージャージー州)のような多数の会社から市販品が入手可能である。かかる配列は、チオール基を介して第二組のナノ粒子(非交換)と反応するため、Ｃ末端に対しシステインで終了する。そのＮ末端を用いて上述した第一組の表面交換ナノ粒子と反応させる。また、Ｎ末端の第二ナノ粒子への結合を強化するため、２個までのリシン残基をオリゴペプチドの末端に付加することができる。ペプチド配列のＮ末端に結合した一個のリシン残基を有するオリゴペプチド構造の一例を下記に示す
【化３】
2011517934.tif 000009
【００６４】
その後、第二組の非交換ナノ粒子をオリゴペプチドと非極性又は双極性非プロトン性溶媒若しくは水性緩衝液中室温でＮ2又はアルゴン雰囲気下２４時間反応させる。反応溶液へＮａＢＨ4を添加してオリゴペプチドのシステイン単位がジスルフィド結合を形成しないことを確実にする。この反応を、希薄条件下(濃度＜１０-5Ｍ)で１：１付加体(ナノ粒子−オリゴペプチド)が高収率で形成できるように行わなければならない。
【００６５】
３．第一及び第二ナノ粒子の結合
二個のナノ粒子を連結するため、表面交換ナノ粒子を先ず高濃縮溶液中カルボニル−ビス−イミダゾール（ＣＤＩ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を用いて４０℃で １時間処理した。
【化４】
2011517934.tif 000010
【００６６】
次いで、処理した表面交換ナノ粒子を上述した非交換ナノ粒子−オリゴペプチド混合物に添加した。オリゴペプチドのＮ末端を表面交換ナノ粒子に結合する確率を、二個までのリシン残基をオリゴペプチドリンケージのＮ末端に結合することによって高めることができる。
【化５】
2011517934.tif 000011
【００６７】
４．非交換ナノ粒子の表面交換処理
最後に、第二ナノ粒子を２−アミノエタンチオールで高圧下（１０００ｐｓｉ)室温で１時間処理した。或いはまた、水溶性ナノ粒子を２−アミノエタンチオールのＨ２Ｏ／アセトニトリル混合物で加圧下（１０００ｐｓｉ）室温で１時間処理することができる。
【化６】
2011517934.tif 000012
【００６８】
アミノ基の一部がプロトンを結合し、水性環境中ｐＨ＝７で負に帯電する。これは、ナノ粒子が互いに反発し、最大距離を保持してアッセイ中にナノ粒子のクラスタリングを回避することを確実にする。
【００６９】
前述の処置に続いて、金属ナノ粒子(例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔなど)、ナノ粒子合金(例えば、ＡｕＣｕ、ＦｅＰｔ、ＣｏＦｅ／ＡｕＦｅなど)及びコア／シェル型ナノ粒子を用いてナノ粒子組立体を合成することができる。
【００７０】
例２
色素組立体の調製
ここでは、色素組立体の合成を記載する。標的プロテアーゼの共通配列(開裂配列)を選択する。その後、色素の結合用共通配列を含むオリゴペプチドを、古典的ペプチド合成(修飾メリフィールド合成)を用いて例１に示すような典型的なオリゴペプチドをもたらすことにより調製した。実際、あらゆる蛍光性又はりん光性色素がオリゴペプチドへの連結に適する。しかしながら、高い蛍光又はりん光量子収量を有する蛍光色素又はりん光性金属錯体がより適している。組立体において第一色素の励起スペクトルと第二色素の蛍光又はりん光スペクトルとの間にフォルスターエネルギー転移(下記参照)を可能にするためのオーバーラップがなければならない。適当な色素の例としては、全てがクマリン(特に単光子及び多重光子励起に適する)、ポルフィリン及び関連化合物、フルオレセイン及び関連化合物、ルテニウムポリピリジル錯体、並びにここに記載した他のフルオロフォア及び金属錯体が挙げられる。
【００７１】
フルオロフォア又はりん光性金属錯体を、アミノ基を介して一つのカルボキシル基及び一つのチオール基を特徴とするスペーサーに連結する。次いで、カルボキシル基を用いて色素と安定なアミド結合を形成する。チオール基を用いて色素をオリゴペプチドのＣ末端システイン基に連結する。先ず、下記に示すように、ジシクロヘキシル−カルボジイミド （ＤＣＣ）をＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）と共に用いて色素をスペーサーと反応させる。
【化７】
2011517934.tif 000013
【００７２】
その後、スペーサーが結合した色素をオリゴペプチドと非極性又は双極性非プロトン性溶媒又は水性緩衝液中室温でＮ2又はアルゴン雰囲気下２４時間反応させる。反応溶液へＮａＢＨ4を添加してシステイン単位がジスルフィド結合を形成しないことを確実にする。この反応を、希薄条件下(濃度＜１０-5Ｍ)で１：１付加体(色素−オリゴペプチド)が高収率で形成できるように行わなければならない。
【００７３】
或いはまた、色素をオリゴペプチドのＮ末端に連結できる。この場合、スペーサーは、下記に示すように、二基のカルボキシル基を特徴とする。
【化８】
2011517934.tif 000014
最終製品の分離を、逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーを用いて行う。
【００７４】
他のフルオロフォア及び金属錯体を、下記に例示するように、同じ方法に従って連結する。
【化９】
2011517934.tif 000015
式中、Ｒ＝−ＣＯＯＨ又はＮ(Ｒ1)3、ここで各Ｒ1をＨ、アルキル及びアリールからなる群から選択する。
【００７５】
例３
ナノ粒子−ナノ粒子：吸収分光法
ここでは、紫外線／可視光線吸収分光法を用いてｕＰＡの活性を測定した。全ての化学薬品及び溶媒を、特記しない限り、Ｆｉｓｈｅｒ／Ａｃｒｏｓ社(ペンシルベニア州)から購入した。ナノ粒子−ナノ粒子組立体を、直径１０ｎｍのクエン酸安定化金ナノ粒子(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズリー州)と、以下の配列ＣＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ(配列番号：３５)(ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、ニュージャージー州)を有するオリゴペプチドとを用いて調製した。先ず、ナノ粒子１ｍｇをグリセリン１．０×１０-3を含有するテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２５ｍｌ中に懸濁した。このミクロ不均一溶液を加圧(１００ｐｓｉ)下アルゴン雰囲気中２００℃に５時間加熱した。反応を高圧反応器 (Ｐａｒｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社から入手可能、イリノイ州)を用いて行った。消化熟成によりＡｕナノ粒子径を４〜５ｎｍに縮小させた。次いで、ナノ粒子を３０、０００ｒｐｍでの超遠心分離によって溶液から除去し、その後ＴＨＦに再懸濁させた。かかる処置を１０回繰返して非結合グリシンすべてを除去した。
【００７６】
次に、０．１ｍｇのオリゴペプチドを無水ＴＨＦ１．０ｍｌ中のＡｕナノ粒子に添加し、続いて２４時間撹拌する。オリゴペプチド及びナノ粒子を３０、０００ｒｐｍでの遠心分離によって沈降させ、その後ＴＨＦに再懸濁させた。この処置を１０回繰り返した。その後、連結したＡｕ−Ａｕナノ粒子組立体をリン酸塩緩衝液(ＰＢＳ、ｐＨ＝７．０２)に溶解し、２０、０００ｒｐｍでの遠心分離によって沈降させ、ＰＢＳに再度懸濁させた。
【００７７】
報告されたプラズモンの最大吸収で吸収係数はε＝７．６６×１０9Ｍ-1ｃｍ-1である。この吸収係数を用いて１×１０-4モルでのＡｕ−Ａｕナノ粒子の濃度を評価した。
【００７８】
その後、Ａｕ−Ａｕナノ粒子のＰＢＳ溶液を石英キュベット(約３．０ｍｌ)に添加した。該溶液を３７℃に１５分間加熱した。次に、ウロキナーゼ１×１０-8モルのＰＢＳ０．０５０ｍｌ溶液(Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ミズリー州)を上記キュベットへ添加した。
【００７９】
オリゴペプチドのウロキナーゼ開裂前、中、後における金ナノ粒子の結合対のプラズモン吸収におけるスペクトルシフトを図２に示す。恒温槽を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ８４５３紫外線−可視光線分光光度計を用いて発光スペクトルにおける変化を測定した。１８０秒以内で５２３ｎｍから５１７ｎｍへシフトする金のプラズモン吸収最大値が観測された。また、上記プラズモン吸収の強度が５１５ｎｍ（増大）及び５２５ｎｍ（減少）で大幅に変わることは明白である。両測定の指数はウロキナーゼ活性の信頼できる時間分解測定値を提供することができる。ウロキナーゼは、表１に示した全てのプロテアーゼに対するモデルとして機能できる。
【００８０】
例４
蛍光／りん光アッセイ
発色団−発色団組立体
本例において、蛍光／りん光アッセイを用いてｕＰＡの活性を測定した。ペプチド配列ＳＲＳＲＳＲＳＲＳＲＳＧＲＳＡＧＧＧＣ(配列番号：１８)(ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社)をピレンフルオロフォアとクマリンアクセプター間のスペーサーとして使用して発色団−発色団組立体を調製した。全ての化学薬品及び溶媒を、特記しない限り、Ｆｉｓｈｅｒ／Ａｃｒｏｓ社(ペンシルベニア州)から購入した。組立体を、クマリン０．０００１０モルをＴＨＦに室温で溶解することによって調製した。次に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）０．０００１２モルを固体としてアルゴン雰囲気下添加し、５時間反応させた。その後、二回蒸留した水(二回精製水)１ｍｌに溶解したオリゴペプチド０．０００１０モルを上記反応物に添加することによってオリゴペプチドリンケージをクマリンに結合し、続いて室温で２４時間アルゴン雰囲気下撹拌した。次に、メルカプトピレン０．００２０モルを固体として上記溶液に添加し、５分以内で完全に溶解させた。該溶液を大気条件下さらに２４時間連続的に撹拌した。
【００８１】
その後、溶媒を真空除去し、組立体を溶離液としてアセトニトリル及びＰＢＳを有する逆相（Ｃ１８）カラムクロマトグラフィーを用いるＨＰＬＣによって精製した。得られた発色団-発色団組立体を以下に示す。
【化１０】
2011517934.tif 000016
【００８２】
ＰＢＳ中のナノプラットフォーム組立体(１×１０-6モル)を石英キュベット(約３ｍＬ)に添加した。該溶液を３７℃に１５分間加熱した。その後、ウロキナーゼ約１×１０-8モルのＰＢＳ０．０５０ｍｌの溶液(Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社)を上記キュベットに添加した。
【００８３】
アッセイからのスペクトルシフトを図３に示した。発光スペクトルにおける変化を、分光蛍光光度計(ＩＳＡ−ＳＰＥＸ、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−２、ＩＳＡ社、ニュージャージー州)を用いて測定した。ピレンの２８０ｎｍでの光励起によりＦＲＥＴが生起し、結合したクマリンがりん光／ルミネセンスの大部分を放射した。ウロキナーゼが上記二つの発色団間のオリゴペプチドリンカーを開裂し、劇的に観測スペクトルを変えた。スペクトルは、０、２、４、６、８、１０及び１５ 分間にわたるアッセイ時間を示す。オリゴペプチドリンカーをウロキナーゼによって開裂する際にＦＥＲＴが減少するため、クマリンの発光が時間と共に減少し、クマリン及びピレン分子間の距離が増加する。
【００８４】
例５
ポルフィリン含有量及び組成物のステルス保護及び最適化
本例において、化学的に結合した金属化及び非金属化テトラカルボキシ−フェニル−ポルフィリン(ＴＣＰＰ)を特徴とするステルスリガンドを、オリゴペプチドリンカーを有するコア／シェル型Ｆｅ／Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子(ＮａｎｏＳｃａｌｅ社、カンサス州)に連結した。ポルフィリンを用いて、二種類の異なるウロキナーゼセンサーを作成できる。
【００８５】
１．ＦＲＥＴ系センサー
ＦＲＥＴ系センサーに関しては、五個のＺｎ−ＴＣＰＰポルフィリンを一個の中心ステルス保護Ｆｅ／Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子に結合し、その後非金属化ＴＣＰＰポルフィリンを後述する処理を用いて中心ナノ粒子に結合した。
【００８６】
ステルス保護Ｆｅ／Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子を調製するため、ドーパミン−テトラエチレングリコールリガンド３５mgをＴＨＦ５ｍｌに溶解した。次に、Ｆｅ／Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子１１．０ｍｇを添加し、室温で１時間超音波処理をした。ナノ粒子のコアは約３〜５ｎｍの直径を有した。Ｆｅ3Ｏ4シェルは、２ｎｍ未満の厚みを有した。その後、固体を磁石で集め、溶媒を注意深くデカントした。固体をＴＨＦ(３×３ｍｌ)で洗浄した。２時間の真空乾燥後、ステルス保護ナノ粒子生成物１０．０mgを得た。
【００８７】
その後、オリゴペプチドリンカーを金属化ポルフィリンに結合した。まず、ポルフィリン５．０ｍｇをＳＯＣｌ２５．０ｍｌ中にて１００℃で３０分間還流した。その後、過剰のＳＯＣｌ２を高真空下除去し、生成した固体を更に３時間真空乾燥した。次に、オリゴペプチド配列ＣＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ(配列番号：３５)４ｍｇ及びＴＨＦ５ｍｌをポルフィリン固体へ添加し、室温で５時間撹拌した。その後、ＴＨＦを真空下除去し、緑色がかった固体を得た。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法は、少なくとも２つの連結ポルフィリン種(ポルフィリンに連結したモノペプチド及びジペプチド)の混合物を示した。上記処置を繰返してオリゴペプチドリンカーを非金属化ポルフィリンへ結合した。
【化１１】
2011517934.tif 000017
【００８８】
ポルフィリンをナノ粒子に結合するため、金属化ポルフィリン−オリゴペプチド固体を１０ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解した。次に、この溶液５．０ｍｌをドーパミンテトラエチレングリコールで係留したＦｅ／Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子１０．０ｍｇに添加し、続いて４-ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）１．０ｍｇ及びＥＤＣ８．０ｍｇを添加した。生成した懸濁液を室温で１時間超音波処理した。固体沈殿を磁石で採取し、ＴＨＦ（８×２ｍｌ）で徹底的に洗浄した。その後、試料を５時間高真空下乾燥した。８．０ｍｇの生成物を得た。かかる処置を繰返して非金属化ポルフィリンをナノ粒子に結合した。
【００８９】
ウロキナーゼ約１×１０-8Ｍの存在下ＰＢＳ中のナノプラットフォーム組立体(１×１０-5Ｍ)の発光スペクトルを０分（Ａ）、２分（Ｂ）、４分（Ｃ）及び６分（Ｄ）で図４に示した。ウロキナーゼによるＦｅ／Ｆｅ3Ｏ4−ナノ粒子からのオリゴペプチド係留ＴＣＰＰの放出は、λ1＝６０７ｎｍでの蛍光バンドの明瞭な減少から明らかである。他の二つの蛍光バンド(λ2＝６５４ｎｍ、λ3＝７１８ｎｍでの)から生じる蛍光の濃度依存性は非線形であると観測された。観測された非線形挙動の理由は、非係留非金属化ＴＣＰＰの高い蛍光量子収量に見出されうる。本発明者らは、Ｆｅ／Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子周りの球における高いポルフィリン濃度がＦＲＥＴの増大に繋がり、その結果励起状態の無放射的失活に繋がる場合、係留状態よりもおよそ８倍大きいφ＝０．０８２と見積もった。
【００９０】
図５において、λ1＝６０７ｎｍ、λ2＝６５４ｎｍ及びλ3＝７１８ｎｍでの蛍光バンドの積分値の比率を、放出されたＴＣＰＰ(光学検出系を備えたＡｇｉｌｅｎｔ社ワークステーション(ＨＰ１０５０)を用いるＨＰＬＣにより測定した)のモル百分率に対してプロットした。Ｒ＝Ｉ（ｌ2）／Ｉ（ｌ1）及びＲ＝Ｉ（ｌ3）／Ｉ（ｌ1）のプロットは放出されたＴＣＰＰのモル百分率が増加するに従い増加する。これらプロットは、放出されたＴＣＰＰの０〜７モル％の濃度範囲で全く線形である。それゆえ、ウロキナーゼによって放出されたＴＣＰＰの濃度を、ナノプラットフォームの蛍光スペクトルを異なる時間隔で記録し、三種類の波長(λ1、λ2、λ3)での蛍光強度を比較することにより測定できる。特に単一光子計測技術(例えば、蛍光顕微鏡法)と結びついた場合、三種類の波長すべてが哺乳類の組織における生体内での測定を可能とすることに注目される。
【００９１】
本例においてはテトラカルボキシ−フェニル−ポルフィリン(ＴＣＰＰ)を用いたが、実際にはあらゆる有機発色団、金属化発色団又は量子ドット(例えば、ＺｎＳ安定化ＣｄＳｅ)を使用し、オリゴペプチドリンカーを介してナノ粒子へ結合することができる。
【００９２】
本組立体を用いて試験した他のオリゴペプチド配列はＫＧＧＳＧＲＳＡＧＧＤ(配列番号：４１)である。
【００９３】
２．プロテアーゼ活性検出用の「光スイッチ」
この種のウロキナーゼセンサーは、有機(例えば、ビオロゲン)又は無機消光剤(例えば金属、合金及びコア／シェル型ナノ粒子)を用いた発色団(例えば、ポルフィリン)の励起状態の消光に基づいている。ナノ粒子の発色団への近接(約２ｎｍ)のため、コア／シェル型ナノ粒子の表面プラズモンは、化学結合したポルフィリンからの発光スペクトルを消光することができる。ひとたびウロキナーゼ開裂によって放出されると、発色団の蛍光又はりん光が著しく増加する。この蛍光の増加は分光学的に検出することができる。識別可能な発光スペクトルを特徴とする数個の発色団を使用する場合、種々の酵素の活性を同時に検出可能である。組立体を、一種類のポルフィリンのみ（すなわち、非金属化のみ又は金属化のみ）を用いる以外は上記ＦＲＥＴ系センサーに述べたのと同じ処置を用いて調製する。かかる機構を、オリゴペプチド配列ＤＧＧＳＧＲＳＡＧＧＫ(配列番号：３６)を有する化学結合した非金属化ＴＣＣＰポルフィリンを特徴とするドーパミン−テトラエチレングリコールリガンドに連結した双磁性ナノ粒子を用いて下記に図示する
【化１２】
2011517934.tif 000018
【００９４】
光スイッチの機構を、ウロキナーゼが哺乳類の腎臓を通過でき、尿中で少なくともいくらかの活性を残存するため、ＭＡＴＢＩＩＩ型癌細胞を注入したラット(高悪性度乳癌のげっ歯類モデル)の３つの尿試料を用いて試験した。試料は、癌注入後それぞれ３６、１５及び５日後に採取し、−８０℃で急速凍結した。３６日の試料についての試験を二回行った。試験前に、尿試料を解凍し室温になるようにした。以下の処置を用いて各試料を試験した。
【００９５】
ＴＣＰＰ-ナノ粒子ナノプラットフォーム組立体を、３０分間の超音波処理を用いて、二回蒸留した水に溶解した。次に、尿１００μｌを上記ナノプラットフォーム０．１ｍｇを含む水溶液２．０ｍｌに添加した。温度を３４℃で一定に保った。蛍光スペクトルを、３６日及び５日の試料については２分間ごとに、１５日の試料については１分間ごとに記録した。
【００９６】
図６から分かるように、３６日尿ついてはＴＣＰＰからのルミネセンスが時間とともに着実に増加した。図７は、図６に示した測定を用いてλ＝６５６ｎｍで生じるＴＣＰＰのルミネセンスの相対強度のプロット図を示す。
【００９７】
図８は、１５日尿のλ＝６５６ｎｍで生じるＴＣＰＰのルミネセンスの相対強度のプロット図を示す。
【００９８】
ＭＡＴＢＩＩＩ型癌細胞のラットへの注入のわずか５日後に採取されたラットの尿は、図９に示すように、あらゆる識別可能なウロキナーゼ活性を示さなかった。上記尿のデータは、ラットで観測されたＭＡＴＢＩＩＩ型腫瘍の成長曲線とうまく相関し、ここで最大の腫瘍成長をＭＡＴＢＩＩＩ型細胞注入のおよそ２週間後に識別することができる。しかしながら、幹細胞治療後、腫瘍を３６日のものにより著しく減弱する。
【００９９】
例６
量子ドット組立体
本例において、金で被覆されたＦｅ2Ｏ3ナノ粒子に連結したＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル型量子ドットのナノプラットフォーム組立体の調製を記載する。ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットは、初めにナノ粒子の金表面に結合した際、ナノ粒子の消光効果のために、「切」状態にある。オリゴペプチドが酵素ウロキナーゼによって開裂されると、ＣｄＳｅ／ＺｎＳが放出され、蛍光性になる。この酵素トリガー光スイッチは、標的酵素の存在を示す。また、Ａｕ／Ｆｅ合金ナノ粒子をＦｅ2Ｏ3ナノ粒子の代わりに使用できる。
【０１００】
１．量子ドットの合成
ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットの合成は十分に確立している。合成はヘキサデシルアミン中１２０℃で起こり、単一の前駆体Ｌｉ4［Ｃｄ10Ｓｅ4（ＳＰｈ）16］を用いてＣｄＳｅコアを形成する。上記前駆体は長時間にわたり徐々に分解して高品質の結晶をもたらす。合成が完了すると、反応条件を極めて敏感に制御できる高温で現場光ルミネセンス技術によって示されるように、ＺｎＳシェルをＣｄＳｅコアを覆うように成長させる。量子ドットの成長は、図１０に示すように、光ルミネセンス（ＰＬ）最大発光のシフトによって表される。量子ドットを２５０℃に加熱する場合、未被覆の量子ドットの発光を強く消光する。上塗り工程で、量子ドットの発光が２５０℃であっても再び現れる。
【０１０１】
量子ドットは、非常に大きな吸収断面に沿って極めて高い光ルミネセンス収量を有し、生態系に対する熱負荷を低減する。多重センサー(多重検出)を作り出すために異なる色の発光が必要な場合、量子ドットコアの寸法を変えて異なる発光波長をもたらすことにより達成することができる。ＣｄＳｅは寸法変化と共に５００〜６５０ｎｍ間で容易に調整できる。これら量子ドットを実際あらゆる寸法に成長させることができる一方、生体内で使用する際にナノプラットフォームが身体(腎臓経路)のろ過系を効率的に離れることができるように量子ドットの成長を５．５ｎｍ未満に制限する。
【０１０２】
２．量子ドットの安定化
ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットは生体腐食に対し十分に安定であるが、両親媒性レソルシアレーン−リガンドの結合が水溶性を著しく増大させ、特に以下の配列、すなわちａ）ウロキナーゼに対するＫＧＧＧＳＧＲＳＡＧＧＧＣ、ｂ）ＭＭＰ１に対するＫＧＧＶＰＭＳ−ＭＲＧＧＧＣ、ｃ）ＭＭＰ２に対するＫＧＧＩＰＶＳ−ＬＲＳＧＧＣ及びｄ）ＭＭＰ−７に対するＫＧＧＶＰＬＳ−ＬＴＭＧＧＣ（ここで「−」はプロテアーゼ開裂点を示す）を用いる際にプロテアーゼ共通配列を含有するオリゴペプチド配列と結合可能にする。上記リガンドは量子ドットの周りに単分子層シェルを形成する。量子ドット安定化(並びにナノ粒子の安定化)に好適なレゾルシナレンリガンドを以下に示す。
【化１３】
2011517934.tif 000019
【０１０３】
上記単分子層を、選択した量子ドット(又はナノ粒子)の合成経路に応じて量子ドット表面上に非水性液体(例えば、ＴＨＦ、ＤＭＦ、アクリロニトリル)又は水性緩衝液(例えば、ＰＢＳ、水／ＴＨＦ混合液又は水アルコール混合液)中のいずれかで形成できる。直径５ｎｍのナノ粒子又は量子ドットは、単分子層の形成に５５個のレソルシンアレーンリガンドを要する。かかるリガンドは両親媒性(ｌｏｇＰ＝４．７)である。
【０１０４】
３．安定化量子ドットへのオリゴペプチドの結合
ナノプラットフォームの組立における次の工程は、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットを安定化するレソルシンアレーンリガンドの「脚部」におけるペンダントカルボン酸基へのオリゴペプチドリンカーの化学結合である。オリゴペプチドは市販品である。オリゴペプチドの末端リシン残基のレソルシンアレーンカルボキシレートへの結合は、タンパク質合成及び生物共役化での標準的処置である周知のＤＣＣ／ＮＨＳ／ＨＯＢＴ法を用いることにより達成される。各開裂配列を、明瞭な最大ルミネセンス(寸法に応じて青色、緑色、黄色又は赤色)を特徴とし、酵素活性の多重検出を可能にする一つの特定の量子ドットへ結合する。反応溶媒からの量子ドットの分離は、遠心分離によって達成される。連結後、量子ドットを再び水性緩衝液(ＰＢＳ)中へ段階的に移動する。
【０１０５】
エレクトロスプレー／飛行時間型質量分析法は組立体の全質量を計測するのに適しており、安定化量子ドットの表面にわたるオリゴペプチドの表面被覆の計測ができる。開裂位置に特徴ある結合したオリゴペプチドの層は、標的プロテアーゼ(例えば、ウロキナーゼ)の攻撃を許すにはいくぶん不完全(表面被覆率は最大約７５パーセント)であり、完全な被覆を達成する(ＤＣＣ／ＮＨＳ／ＨＯＢＴ法はかかる被覆を可能にするほど十分に効率的ではない場合があるが)場合立体因子によって妨げられることは重要である。余分なＨＰＬＣ工程を用いて高純度のオリゴペプチドを得る。量子ドットの表面にわたるオリゴペプチド被覆は表面被覆率２５％をはじめとして体系的に変化しうる。タンパク質合成及び水性溶媒中での生物共役化に適したＥＤＣ／ＮＨＳＳ法を使用することもできる。
【０１０６】
４．金被覆酸化鉄ナノ粒子への量子ドットの結合
次に、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットを、オリゴペプチドリンカーのＣ末端上のシステイン残基を介してＦｅ2Ｏ3／Ａｕナノ粒子に連結する。一つの酵素の活性を決定するため、一種類（寸法）の量子ドットをナノ粒子に連結する。しかしながら、癌進行の生体内測定のために、４個までの異なる量子ドット(異なるオリゴペプチド配列を特徴とする)を単一の金被覆ナノ粒子へ結合する。この反応は、開裂配列末端システイン残基を酸化鉄ナノ粒子周囲の金シェルへ結合することで行われる。分子モデリングを用いて、四種類のオリゴペプチド各々の長さが４．５ｎｍ未満であることを求める。それゆえ、Ｆｅ2Ｏ3／Ａｕナノ粒子及び安定化ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドット間の全長はおよそ５ｎｍ(すなわち、レソルシンアレーンリガンド＋オリゴペプチドリンカー)であり、係留した際のＡｕナノシェルによる量子ドットの最大ルミネセンス消光用の最適距離である。
【０１０７】
例７
蛍光顕微鏡を用いたウロキナーゼ用生体内センサーの試験
生体内ウロキナーゼアッセイを、測定の１０日前にＢ１６Ｆ１９マウスメラノーマ細胞を注入したチャールスリバー雌マウスで試験した。マウスを麻酔し、その後Ｆｅ／Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子−ＴＣＰＰ組立体溶液をマウスの静脈（ＩＶ）内に又は腫瘍（ＩＴ）に直接注入により投与した。ＩＶ溶液はナノ粒子組立体２００μｇのＰＢＳ２００ｍｌ溶液であった。ＩＴ溶液はナノ粒子組立体１００μｇのＰＢＳ２００ｍｌ溶液であった。アッセイの活性を測定するため、上記マウスを再度麻酔し、単一光子計数検出器を用いる蛍光顕微鏡下に静置した。本装置を社内で構築した。蛍光顕微鏡(解像度は１ｍ×１ｍ×１ｍ)により記録したマウスの左右肢からの単一光子計数スペクトルの結果を図１１に示す(赤色は左肢、青色は右肢)。区画Ａは、測定３０分前にＩＴ注入したマウス１の結果を示す。区画Ｂは、測定１２時間前にＩＶ注入したマウス２(腫瘍なし)の結果を示す。区画Ｃは、測定１２時間前にＩＶ注入したマウス３(両足に腫瘍を患う)の結果を示す。区画Ｄは、測定２４時間前にＩＶ注入したマウス４の結果を示す。区画Ｅは、ＩＴ又はＩＶ注入を行わない対照マウスの結果を示す。区画Ｆは、Ｃの繰り返しによるマウス７の結果である。
【０１０８】
マウスの後肢での腫瘍領域を赤外線領域のレーザー光線(Ｔｉ：サファイアレーザー、λ＝８７０ｎｍ、Ｐ＝６．５ｍＷ)を用いて励起した。ＴＣＰＰは、この励起波長で三光子励起を必要とする。腫瘍を患うマウスの右足で得た信号強度は腫瘍寸法と相関する一方、左肢での信号は明らかに相関しないことは注目に値する。仮説的説明としては、上記腫瘍によるナノ粒子組立体の摂取が極めて速やかで、静脈注入によって遭遇した第一の腫瘍がほとんどすべてを取り込む。ＩＴ注入がＩＶ注入よりも効果が低いことが見出された。なぜなら、ウロキナーゼが開裂配列の大部分を開裂する時間を有せず、ポルフィリンが発光しないためである。
【０１０９】
例８
ＰＢＳ中のウロキナーゼ活性の測定
本例において、検量曲線を記録してウロキナーゼ活性(ここで論述したプロテアーゼすべてのモデルとして)がウロキナーゼ濃度の増加によってどのように変化するかを示した。発光スペクトルの変化を、分光蛍光光度計(ＩＳＡ−ＳＰＥＸ、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−２、ＩＳＡ社、ニュージャージー州)を用いて測定した。全ての化学薬品及び溶媒を、特記しない限り、Ｆｉｓｈｅｒ／Ａｃｒｏｓ社から購入した。
【０１１０】
健常ラットの尿のｐＨは６．７±０．４である。それゆえ、ＰＢＳ(ｐＨ＝６．８)において四種類のウロキナーゼ濃度、１×１０-10Ｍ、１×１０-9Ｍ、５×１０-8Ｍ(２×)及び１×１０-8Ｍを用いて曲線を記録した。ウロキナーゼ開裂配列を特徴とするＦｅ／Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子−ＴＣＰＰ組立体をＰＢＳに溶解した。先ず、ナノ粒子組立体を水１ｍｌあたりナノ粒子０．５ｍｇの濃度で水に溶解し、続いて３０分間超音波処理してナノ粒子を水に可溶にした。次に、ナノプラットフォーム０．１ｍｇを含有する水２．０ｍｌをＰＢＳと混合した。温度を３４℃で一定に保った。連続的な励起を４１７ｎｍで行った。蛍光スペクトルを濃度に応じて一定の時間隔(１０分間、５分間、２分間又は１分間）で記録した。その後、ウロキナーゼをＰＢＳ混合液に添加した。６５６ｎｍでの発光バンドを監視した。
【０１１１】
結果を図１２に示す。ここで、ｋは(Ｉ：蛍光強度)／(Ｉ０：ウロキナーゼ添加前の蛍光強度)対時間(秒)のプロットによって得た速度定数である。図から分かるように、開裂速度はウロキナーゼ濃度の増加指標当たり３〜５倍だけ増大する。それゆえ、開裂速度を腫瘍の高悪性度と相関させることができる。
【図１】
2011517934.tif 000020
【図２】
2011517934.tif 000021
【図３】
2011517934.tif 000022
【図４】
2011517934.tif 000023
【図５】
2011517934.tif 000024
【図６】
2011517934.tif 000025
【図７】
2011517934.tif 000026
【図８】
2011517934.tif 000027
【図９】
2011517934.tif 000028
【図１０】
2011517934.tif 000029
【図１１】
2011517934.tif 000030
【図１２】
2011517934.tif 000031
【配列表】
2011517934000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月28日(2011.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一粒子，第二粒子及び該第一及び第二粒子間のリンケージを備え、
前記リンケージがプロテアーゼ共通配列を含むことを特徴とするプロテアーゼ活性の検出用ナノプラットフォーム組立体。
【請求項２】
前記第一及び第二粒子のそれぞれが，１〜１００ｎｍの直径を有する請求項１に記載の組立体。
【請求項３】
前記第一及び第二粒子が，互いに独立してナノ粒子，発色団／発光団，量子ドット，ビオロゲン並びにその組み合わせからなる群から選択される請求項１又は２に記載の組立体。
【請求項４】
前記粒子の少なくとも一つが，金属元素及び金属塩からなる群から選択された金属を含むナノ粒子であり、前記金属塩が酸化物，硫化物，セレン化物及びテルル化物からなる群から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項５】
前記ナノ粒子が，金（Ａｕ），銀（Ａｇ），銅（Ｃｕ），ニッケル（Ｎｉ），パラジウム（Ｐｄ），白金（Ｐｔ），コバルト（Ｃｏ），ロジウム（Ｒｈ），イリジウム（Ｉｒ），鉄（Ｆｅ），ルテニウム（Ｒｕ），オスミウム（Ｏｓ），マンガン（Ｍｎ），レニウム（Ｒｅ），スカンジウム（Ｓｃ），チタン（Ｔｉ），バナジウム（Ｖ），クロム（Ｃｒ），亜鉛 （Ｚｎ），イットリウム（Ｙ），ジルコニウム（Ｚｒ），ニオブ（Ｎｂ），モリブデン（Ｍｏ），テクネチウム（Ｔｃ），カドミウム（Ｃｄ），ランタン（Ｌａ），ルテチウム（Ｌｕ），ハフニウム（Ｈｆ），タンタル（Ｔａ），タングステン(Ｗ)，アクチニウム(Ａｃ)，ローレンシウム（Ｌｗ），ラザホージウム（Ｒｆ），ドブニウム（Ｄｂ），シーボーギウム（Ｓｇ），ボーリウム（Ｂｈ），ハッシウム（Ｈｓ），マイトネリウム（Ｍｔ），ダームスタチウム（Ｄｓ），レントゲニウム（Ｒｇ），ウンウンビウム（Ｕｕｂ），セレン（Ｓｅ）からなる群から選択された金属、その酸化物，水酸化物，硫化物，セレン化物及びテルル化物，又はその組み合わせを含む請求項４に記載の組立体。
【請求項６】
前記ナノ粒子が，金属又は金属合金コア及び金属シェルを含むコア／シェル型ナノ粒子であり，前記コアがＡｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｃｏ，Ｆｅ及びＰｔからなる群から選択され，前記シェルがＡｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｃｏ，Ｆｅ，Ｐｔ，その金属酸化物，並びにその組み合わせからなる群から選択される請求項４に記載の組立体。
【請求項７】
前記コア／シェル型ナノ粒子が，Ｆｅ／Ａｕ，Ｆｅ／Ｆｅ3Ｏ4，Ｆｅ／ＦｅxＯy及びＡｕ／Ｆｅ2Ｏ3からなる群から選択される請求項６に記載の組立体。
【請求項８】
前記ナノ粒子が，ナノ粒子を囲む有機単分子層を備える安定化ナノ粒子である請求項４〜７のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項９】
前記粒子の少なくとも一つが、発色団／発光団又は量子ドットである請求項１〜３のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項１０】
前記発色団／発光団が，有機色素，無機色素，フルオロフォア，ホスホフォア，光吸収ナノ粒子，その組み合わせ，並びにその金属化錯体からなる群から選択される請求項９に記載の組立体。
【請求項１１】
前記リンケージが、前記共通配列を含むオリゴペプチドからなる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項１２】
前記共通配列が，セリンプロテアーゼ開裂配列，アスパラギン酸塩プロテアーゼ開裂配列，システインプロテアーゼ開裂及び金属プロテアーゼ開裂配列からなる群から選択される請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項１３】
９個までの付加粒子を更に備え，該付加粒子それぞれを前記第一粒子に個々のリンケージによって連結し，該リンケージそれぞれがプロテアーゼ共通配列を備える請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組立体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組立体と、薬学的に許容し得るキャリアーとを含む診断剤を備えることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
（ａ）哺乳類からの体液試料を、ビトロで、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノプラットフォーム組立体を含む診断剤と接触させ，
（ｂ）前記診断剤をエネルギー源に曝露し，
（ｃ）前記診断剤の吸収又は発光スペクトルにおける変化を検出することを備え，
前記変化がプロテアーゼ活性に対応することを特徴とする哺乳類における癌性又は前癌性細胞に関連するプロテアーゼの活性を検出する方法。
【請求項１６】
前記診断剤の吸収又は発光スペクトルにおける変化が，約１秒間〜約３０分間の時間にわたって観測される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテアーゼ活性を癌進行の予後と相関させることを更に備える請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の組成物であって、
哺乳類に投与されて、前記組成物中の診断剤が活性化され、
癌性又は前癌性細胞を有することが疑われる哺乳類の領域をエネルギー源に曝露し、前記診断剤の吸収又は発光スペクトルにおけるプロテアーゼ活性に対応する変化が検出される、
哺乳類における癌性又は前癌性細胞に関連するプロテアーゼの活性を検出するための組成物。
【請求項１９】
前記診断剤の活性化後１０分以内で検出したプロテアーゼ活性が，癌性又は前癌性細胞が高悪性度である高い確率と相関し，前記診断剤の活性化後最初の３０分以内でのプロテアーゼ活性検出の欠如が，前記癌性又は前癌性細胞が高悪性度である極めて低い確率と相関する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記癌性又は前癌性細胞が，ＡＩＤＳ関連癌，ＡＩＤＳ関連リンパ腫，肛門癌，虫垂癌，小児期小脳星細胞腫，小児期大脳星細胞腫，基底細胞癌腫，肝外胆管癌，小児期脳幹神経膠腫，成人脳腫瘍，小児期悪性神経膠腫，小児期脳室上衣腫，小児期髄芽腫，小児期テント上原始神経外胚葉性腫瘍，小児期視覚路及び視床下部神経膠腫，乳癌，妊娠関連乳癌，小児期乳癌，男性乳癌，小児期カルチノイド腫瘍，胃腸カルチノイド腫瘍，原発性中枢神経系リンパ腫，子宮頸癌，結腸癌，小児期結腸直腸癌，食道癌，小児期食道癌，眼内メラノーマ，網膜芽細胞腫，成人神経膠腫，成人(原発性)肝細胞癌，小児期(原発性)肝細胞癌，成人ホジキンリンパ腫，小児期ホジキンリンパ腫，島細胞腫瘍，カポジ肉腫，腎臓(腎細胞)癌，小児期腎臓癌，成人(原発性)肝臓癌，小児期(原発性)肝臓癌，非小細胞型肝臓癌，小細胞型肝臓癌，ＡＩＤＳ関連リンパ腫，バーキットリンパ腫，成人非ホジキンリンパ腫，小児期非ホジキンリンパ腫，原発性中枢神経系リンパ腫，メラノーマ，成人悪性中皮腫，小児期中皮腫，原発不明転移性扁平上皮性頸部癌，口腔癌，小児期多重内分泌腫瘍形成症候群，多発性骨髄腫／プラズマ細胞腫瘍，菌状息肉腫，脊髄形成異常性症候群，脊髄形成異常／脊髄増殖性疾患，成人急性脊髄性白血病，小児期急性脊髄性白血病，多発性骨髄腫，神経芽細胞腫，非小細胞肺癌，小児期卵巣癌，卵巣上皮癌，卵巣胚細胞腫瘍，卵巣低悪性度腫瘍，全子宮頸部癌，小児期全子宮頸部癌，島細胞全子宮頸部癌，副甲状腺癌，陰茎癌，プラズマ細胞腫瘍／多発性骨髄腫，胸膜肺芽腫，前立腺癌，直腸癌，小児期腎細胞癌，腎盂及び尿管，移行細胞癌，成人柔組織肉腫，小児期柔組織肉腫，子宮肉腫，皮膚癌(非メラノーマ)，小児期皮膚癌，メラノーマ，メルケル細胞皮膚癌腫，小細胞肺癌，小腸癌，偏平上皮細胞癌，胃癌，小児期胃癌，皮膚Ｔ細胞リンパ腫，精巣癌，甲状腺癌，小児期甲状腺癌及び膣癌からなる群から選択された癌に関連する請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記癌性又は前癌性細胞が，ＡＩＤＳ関連癌，ＡＩＤＳ関連リンパ腫，肛門癌，虫垂癌，小児期小脳星細胞腫，小児期大脳星細胞腫，基底細胞癌腫，肝外胆管癌，小児期脳幹神経膠腫，成人脳腫瘍，小児期悪性神経膠腫，小児期脳室上衣腫，小児期髄芽腫，小児期テント上原始神経外胚葉性腫瘍，小児期視覚路及び視床下部神経膠腫，乳癌，妊娠関連乳癌，小児期乳癌，男性乳癌，小児期カルチノイド腫瘍，胃腸カルチノイド腫瘍，原発性中枢神経系リンパ腫，子宮頸癌，結腸癌，小児期結腸直腸癌，食道癌，小児期食道癌，眼内メラノーマ，網膜芽細胞腫，成人神経膠腫，成人(原発性)肝細胞癌，小児期(原発性)肝細胞癌，成人ホジキンリンパ腫，小児期ホジキンリンパ腫，島細胞腫瘍，カポジ肉腫，腎臓(腎細胞)癌，小児期腎臓癌，成人(原発性)肝臓癌，小児期(原発性)肝臓癌，非小細胞型肝臓癌，小細胞型肝臓癌，ＡＩＤＳ関連リンパ腫，バーキットリンパ腫，成人非ホジキンリンパ腫，小児期非ホジキンリンパ腫，原発性中枢神経系リンパ腫，メラノーマ，成人悪性中皮腫，小児期中皮腫，原発不明転移性扁平上皮性頸部癌，口腔癌，小児期多重内分泌腫瘍形成症候群，多発性骨髄腫／プラズマ細胞腫瘍，菌状息肉腫，脊髄形成異常性症候群，脊髄形成異常／脊髄増殖性疾患，成人急性脊髄性白血病，小児期急性脊髄性白血病，多発性骨髄腫，神経芽細胞腫，非小細胞肺癌，小児期卵巣癌，卵巣上皮癌，卵巣胚細胞腫瘍，卵巣低悪性度腫瘍，全子宮頸部癌，小児期全子宮頸部癌，島細胞全子宮頸部癌，副甲状腺癌，陰茎癌，プラズマ細胞腫瘍／多発性骨髄腫，胸膜肺芽腫，前立腺癌，直腸癌，小児期腎細胞癌，腎盂及び尿管，移行細胞癌，成人柔組織肉腫，小児期柔組織肉腫，子宮肉腫，皮膚癌(非メラノーマ)，小児期皮膚癌，メラノーマ，メルケル細胞皮膚癌腫，小細胞肺癌，小腸癌，偏平上皮細胞癌，胃癌，小児期胃癌，皮膚Ｔ細胞リンパ腫，精巣癌，甲状腺癌，小児期甲状腺癌及び膣癌からなる群から選択された癌に関連する請求項１８または１９に記載の組成物。
【国際調査報告】
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