(57)【要約】  疾患又は損傷の重篤度を、体液中において好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の独特の分子形態を測定することによって診断、監視又は判定する方法が提供され、例えば、ＮＧＡＬの遊離モノマー形態の濃度を測定することによってヒト又は哺乳動物の患者における急性腎不全に至る急性腎損傷を診断及び監視することを含む。
2011503587.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における器官、組織又は細胞型の疾患又は損傷の重篤度を診断、監視又は評価する方法であって、前記哺乳動物の体液試料中における好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の少なくとも１種の独特の分子形態の濃度を測定し、そして当該濃度を、前記疾患又は損傷に罹患していない個体で起こる前記独特の分子形態の濃度範囲と比較し、こうして、前記範囲からの前記濃度の偏差によって前記器官、組織又は細胞型の疾患又は損傷の有無を判定することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＮＧＡＬの独特の分子形態が遊離ＮＧＡＬモノマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＮＧＡＬの独特の分子形態がＮＧＡＬホモダイマー又は高級オリゴマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＮＧＡＬの独特の分子形態が、その起源細胞によって特定の方法でグリコシル化されたＮＧＡＬであり、前記特定の方法は異なる起源細胞による別の方法でグリコシル化されたＮＧＡＬと識別可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物における器官、組織又は細胞型の疾患又は損傷の重篤度を診断、監視又は評価する方法であって、前記疾患又は損傷が、哺乳動物から採取した体液中に存在するＮＧＡＬの独特の分子形態の濃度の特定のパターンによって特徴付けられ、前記体液の試料中におけるＮＧＡＬの２種以上の独特の分子形態の濃度を測定し、かつ、測定結果を前記疾患又は損傷において生じる前記濃度のパターンと比較し、これによって、特定の濃度パターンの存在が対応する種類の疾患又は損傷の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項６】
遊離ＮＧＡＬモノマーとＮＧＡＬホモダイマーとの濃度比を決定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
遊離ＮＧＡＬモノマーと、ＮＧＡＬホモダイマーとＮＧＡＬの高級オリゴマーの合計との濃度比を決定する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＮＧＡＬのマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）を含まない分子形態とＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体との濃度比を決定する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
急性腎不全に至ったか、又は急性腎不全発症の差し迫ったリスクを意味する哺乳動物における腎損傷、腎疾患又は腎障害の重篤度を診断、監視又は評価する請求項１に記載の方法であって、
ｉ）前記哺乳動物から採取した体液試料中の遊離ＮＧＡＬモノマーの濃度を測定する工程、及び
ｉｉ）前記濃度を、腎損傷、腎疾患又は腎障害の兆候を示さない前記哺乳動物の種の他の個体における遊離ＮＧＡＬモノマー濃度の範囲から決定したカットオフ値と比較する工程、
を含み、前記カットオフ値よりも大きな値が前記腎損傷、腎疾患又は腎障害の存在を示す方法。
【請求項１０】
哺乳動物における急性腎不全の発症リスクを診断、監視又は判定する請求項１に記載の方法であって、急性腎不全に罹患しておらず、急性腎不全を発症する差し迫ったリスクを有していない個体と、急性腎不全に罹患している可能性があるか、急性腎不全を発症するリスクを有している個体とを区別し、
ｉ）前記哺乳動物から採取した体液試料中の遊離ＮＧＡＬモノマーの濃度を測定する工程、及び
ｉｉ）前記濃度を、所定のカットオフ値と比較する工程、
を含み、前記カットオフ値未満の遊離ＮＧＡＬモノマーの濃度の場合には、急性腎不全に罹患しておらず、急性腎不全を発症する差し迫ったリスクを有していないとして前記哺乳動物を類別するように選択される方法。
【請求項１１】
前記工程ｉ）及びｉｉ）を１回以上繰り返すさらなる工程を含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の工程ｉ）及びｉｉ）を、２４時間以内、例えば１２時間以内、例えば６時間以内、例えば３時間以内、例えば１時間以内、例えば３０分以内又は１５分以内に繰り返すさらなる工程を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
急性腎不全の治療の開始又は終了後に、請求項９又は１０に記載の工程ｉ）及びｉｉ）を繰り返すさらなる工程を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記腎損傷又は急性腎不全の発症リスクが、虚血に起因する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記腎損傷又は急性腎不全の発症リスクが、炎症性、感染性又は腫瘍性疾患の合併症に起因する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記腎損傷又は急性腎不全の発症リスクが、集中治療を必要とするあらゆる原因の重症疾患に起因する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記腎損傷又は急性腎不全の発症リスクが、外科的治療介入に起因する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記腎損傷又は急性腎不全の発症リスクが、腎毒性物質の投与に起因する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記損傷が、外部からの物理的又は化学的原因に起因する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記損傷が、放射線照射への曝露に起因する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記体液が血漿である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記体液が血清である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記体液が尿である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
遊離ＮＧＡＬモノマーを、遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的に結合するが、この方法を適用する哺乳動物種のＮＧＡＬの複合化形態には結合しない分子を使用して測定する、請求項１、２及び５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ＮＧＡＬホモダイマー又はＮＧＡＬホモダイマーとＮＧＡＬの高級オリゴマーとの合計を、遊離ＮＧＡＬモノマーに一度に結合することができない結合分子の組み合わせによって測定する、請求項１、３、５〜８及び１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物がヒト個体である、請求項の１〜２５いずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット又は装置であって、固体担体と、請求項２４又は２５に記載の結合分子とを含むキット又は装置。
【請求項２８】
ＮＧＡＬモノマーに特異的に結合することができるモノクローナル抗体を含む結合分子を、ＮＧＡＬモノマーに結合する性質及びＮＧＡＬホモダイマーに結合しない性質に応じて一連の結合分子侯補から選択することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病態の診断及び監視（モニタリング）に関し、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の濃度及び分子形態の変化、特に、腎臓に影響を及ぼした又は現在影響を及ぼしており、さらに腎損傷又は急性腎不全（ＡＲＦ）になった又は腎損傷又は急性腎不全（ＡＲＦ）になる可能性がある哺乳動物における最近の又は進行中の損傷又は病理過程に特徴を有する。本発明は、それ自体として、内科医学に関し、特に、外傷学を含む救命医療又は集中治療医療及び腎損傷を引き起こし得る処置が行われる外科手術、腫瘍学及び画像診断に関する。また、本発明は、獣医学及び獣医外科並びに腎臓病態生理学及び実験動物の腎臓に対する有害影響又は治療的影響の研究に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、血液及び尿に現れる腎臓病理学の新規なタンパク質バイオマーカーの診断における使用に関し、ヒト又は哺乳動物における腎障害又は腎損傷のみならず前記タンパク質を放出するその他の器官、組織又は細胞型の疾患又は損傷の重篤度を検出、監視及び評価するための診断における使用に関する。前記タンパク質バイオマーカーは好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）であり、ヒトを含む動物における好中球リポカリン（ＮＬ；ヒト好中球リポカリンの場合はＨＮＬ）、リポカリン２（ＬＣＮ２）又はヒトを含む多様な動物におけるシデロカリン、ラットにおける２５−ｋＤａ  α２−ミクログロブリン関連タンパク質又はｎｅｕ関連リポカリン（ＮＲＬ）、マウスにおける２４Ｐ３、２４−ｋＤａ分泌誘導タンパク質（ＳＩＰ２４）又はウテロカリンとしても知られている。ヒトＮＧＡＬは、好中球多形核白血球（以下、「好中球」という）の顆粒から最初に分離された糖タンパク質である（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９８９；Ｖｅｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ.，１９９０，Ｔｒｉｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，１９９２；Ｋｊｅｌｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，１９９３）。成熟タンパク質は１７８個のアミノ酸残基の単一のタンパク質鎖によって構成され、その分子量はグリコシル化状態において２４ｋＤａ又は２５ｋＤａと種々推定されている。そのタンパク質は鎖内ジスルフィド架橋を含み、ヒト型は、それ自身と又は好中球ゼラチナーゼとの複合体の形成に関与すると思われるシステイニル残基をさらに含む。システイニル残基は、ｃＤＮＡ配列が今まで入手可能な非ヒト種（チンパンジー、アカゲザル、犬、ブタ、馬、ラット及びマウス）のＮＧＡＬには存在していない。好中球から分離されたＮＧＡＬは通常ホモダイマーを高い割合で含み、時たまホモトリマーと考えられるより高分子量の材料を含む。また、約１５０ｋＤａから２００ｋＤａを超える分子量を有するＮＧＡＬの高級ホモオリゴマーも微量ながら検出されている。インビトロでヒト好中球から分離又は分泌されたＮＧＡＬはホモダイマーを高い割合で含んでおり、その分子量は４０又は４５ｋＤａであると報告されている（Ｖｅｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ.，１９９０；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ.，１９９４）。
【０００３】
インビトロでヒト好中球から分離又は分泌される少量の可変比率の総ＮＧＡＬは、見掛け１１５ｋＤａの複合体を形成するＮＧＡＬモノマー（Ｍｏｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，２０００；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ.，２００１）又は見掛け１２５ｋＤａの複合体を形成するＮＧＡＬダイマー（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ.，２００１）として、９２ｋＤａヒト好中球ゼラチナーゼ（ゲラチナーゼＢ、タイプＩＶコラゲナーゼ又はマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）とも呼ばれる）に結合する。これらの複合体は、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌及び乳癌等の様々な癌に罹患した患者の尿中においても確認されている。
【０００４】
ＮＧＡＬホモダイマー、ホモトリマー、高級ホモオリゴマー及びＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体は還元によってそれらの構成モノマーに解離することができる。これは、複合体の少なくとも一部がジスルフィド架橋によって共有結合していることを示唆している。しかしながら、鎖内ジスルフィド架橋に関与しないシステイニル残基のヒトＮＧＡＬにおける存在は、ＮＧＡＬ単独又はＭＭＰ−９と複合体を形成するＮＧＡＬからなる場合であっても、ジスルフィド結合トリマー又は高級オリゴマーの形成について説明することができない。これらのホモトリマー、高級オリゴマー又はＭＭＰ−９とＮＧＡＬホモダイマーとの複合体を結合するメカニズムはいまだ解明されていない。カルシウムと亜鉛イオンを含む緩衝液の存在下で組替え型ヒトＮＧＡＬモノマーと組替え型ヒトＭＭＰ−９をともに培養することによってインビトロでＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体が生成されている（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ.，２００１）。これらの複合体は１１５ｋＤａの分子量を有し、一時的な存在であると報告されている。
一方、癌患者の尿中に見られる最も一般的な形態の複合体は１２５ｋＤａの分子量を有する。
【０００５】
Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ.（１９８９）は、ヒト好中球のＮＧＡＬの見かけの分子量がカルシウムイオンの存在下において２４ｋＤａから５０〜７０ｋＤａに増加することを観察しており、これは、本願発明者らの見解では、少なくとも当初は非共有的に結合したダイマー及びトリマーの形成を示唆している。
【０００６】
従って、ヒトＮＧＡＬはモノマー、ホモダイマー（主成分として）、ホモトリマー、高級ホモオリゴマー、ＭＭＰ−９と複合化したモノマー及びＭＭＰ−９と複合化したホモダイマーを含む複数の分子形態で好中球内において形成されることは明らかである。また、さらに高い見かけ分子量（２００ｋＤａ台）を有するＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体が観察されている。これらは、ＭＭＰ−９ホモダイマーと未知数のＮＧＡＬ分子を含む。これらの分子形態の個々のサブユニットは少なくとも一部が鎖間ジスルフィド架橋によって結合されているが、異なる複合体においてそれらに関与するシステイニル残基は確実には特定されていない。また、非共有結合力が複合体形成に関与していることもあり得る。
【０００７】
ラット及びマウス等の非ヒト哺乳動物におけるＮＧＡＬの複数の分子形態に関して得られている情報はさらに少ない。ただし、Ｂｕ  ｅｔ  ａｌ.（２００６）は、ＮＧＡＬとＭＭＰ−９とは血管形成性損傷又はインターロイキン−１βによる刺激に応じてラットの血管平滑筋細胞によって共合成されることを示している。ラットのＮＧＡＬは、モノマー、ダイマー、トリマー形態において、１５０ｋＤａの分子量を有する分子形態におけるのと同様にウェスタンブロットにより生じることが判明している。ＭＭＰ−９は、モノマー及びダイマー形態において生じた。
ラットＮＧＡＬとＭＭＰ−９の複合体は溶解したラット内膜平滑筋細胞における実証されていないが、約１１５及び１２５ｋＤａのＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体はこれらの細胞によって調整した培地において実証されており、ＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体が細胞内ではなく、細胞外で形成されることを証明している。ラットのＮＧＡＬのタンパク質鎖は、たった２つのシステイニル残基を含み、これは鎖内ジスルフィド架橋を形成すると推定される。しかしながら、タンパク質鎖にはその他のシステイニル残基がないため、ウェスタンブロットにおいて非還元及び還元状態で鎖間ジスルフィド結合の存在に依存するような挙動を示すラットにおけるＮＧＡＬの複数の分子形態の形成は妨げられないと思われる。ラットにおいて観察される複数の分子形態のサブユニットがどのように結合されているか明らかになっていない。１つの可能性としては、ジスルフィド交換が起こり、鎖内ジスルフィド架橋が壊れ、鎖内ジスルフィド結合が形成されることが考えられる。
【０００８】
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ.（２００６）も、野生型マウスと大動脈拡張傾向を有するＲＥＣＳ−１ノックアウトマウスの両方の血漿におけるＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体の存在を証明している。ラットのＮＧＡＬと同様に、マウスのＮＧＡＬタンパク質鎖はたった２つのみのシステイニル残基を含む。
【０００９】
従って、これまでに分析された非ヒト哺乳動物からのＮＧＡＬタンパク質鎖には３番目のシステイニル残基がないにもかかわらず、ラット及びマウスから得られた兆候は、非ヒト哺乳動物におけるＮＧＡＬはヒトにおいて観察されている分子形態と匹敵する複数の分子形態で生じることを示唆している。
【００１０】
診断バイオマーカーとしてヒトＮＧＡＬは、微生物（特に化膿菌）が侵入する好中球の脱顆粒及び顆粒タンパク質のエクソサイトーシスを引き起こす際に血液に放出される好中球活性化の特異的マーカーとしてＨＮＬの呼称のもとに最初に開示された（米国特許第６，１３６，５２６号；国際公開第ＷＯ９５／２９４０４号）。ヒト血漿又は血清試料におけるＮＧＡＬの上昇した濃度を測定することによって、個人が炎症過程、特に細菌感染によって引き起こされた炎症過程を患うことを確認することが提案されている。上記文献は、インビトロで好中球から放出された非還元物質の免疫ブロッティングは、＞２００ｋＤａ、４５ｋＤａ及び２４ｋＤａの見かけの分子量を有する３つのＨＮＬ−免疫反応バンドを含むことを開示している。放出された物質の還元後、２４ｋＤａの見かけの分子量で１つのバンドのみが観察されている。しかしながら、ＨＮＬの測定を行った体液試料における異なる分子形態のタンパク質の共存及び１つの分子形態に選択的な又は特異的な定量方法の使用については開示されていない。
【００１１】
マウスにおいては、ＮＧＡＬ（ＳＩＰ２４又は２４Ｐ３の呼称のもとで）は１型急性期タンパク質として特定されており、その発現は急性期反応中主に肝臓において生じるとされている（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｎｉｌｓｅｎ−Ｈａｍｉｌｔｏｎ，１９９５）。上記文献は、複数の分子形態を有するタンパク質の発生については開示していない。また、それは、ＮＧＡＬは好中球顆粒球に完全に特異的なタンパク質であるとしている米国特許第６，１３６，５２６号でなされている主張とも相反する。
【００１２】
米国特許出願公開第２００４／０２１９６０３号は、初期段階の尿細管細胞損傷を検出するための尿中バイオマーカーとしてのＮＧＡＬの使用を開示している。米国特許出願公開第２００５／０２７２１０１号は、同じ目的のための血清中のＮＧＡＬの使用を開示している。しかしながら、上記文献はいずれも、ＮＧＡＬ濃度の上昇の原因として、尿細管細胞損傷が全身性炎症、細菌感染又は癌とどのように区別することができるかについては開示していない。また、いずれの文献も、ＮＧＡＬの複数の分子形態の存在を開示せず、及びＮＧＡＬの特定の分子形態の選択的又は特異的測定の使用も開示していない。
【００１３】
本願発明者らは国際公開ＷＯ２００６／０６６５８７を出願しており、そこで、如何にして尿、血漿又は血清中のＮＧＡＬ濃度を、カットオフ値を使用してＡＲＦに至る腎損傷の兆候を示さない低濃度及びＡＲＦに至る腎損傷の兆候を示し高濃度に分離することができることを開示している。国際公開ＷＯ２００６／０６６５８７号（この開示内容はこの参照によって本願明細書に援用する）は、体液中のＮＧＡＬ濃度は、炎症、感染症及びある種の癌において上昇する場合があるが、通常はＡＲＦに至る腎損傷と関連するもの低濃度であるとの事実に配慮する。
【００１４】
また、本願発明者らは米国仮特許出願第６０／９１９，２７７号も出願した。それは、所与の体液中のＮＧＡＬ濃度のカットオフ値を使用せずに、体液中における腎損傷によるＮＧＡＬ濃度の上昇と腎臓に関連しないＮＧＡＬ濃度の上昇を識別する方法を開示している。上記方法は、血漿又は血清試料中に同時に存在するＮＧＡＬの濃度に対する尿試料中に存在するＮＧＡＬの濃度の比率を決定することを含む。約１を超える比率は、試料を採取した個人が、ＡＲＦに至った腎損傷に罹患しているか、あるいはＡＲＦを患う個人の差し迫ったリスクを有していることを示す。
【００１５】
本願発明者らによる上記文献はいずれも、ＮＧＡＬの特定の分子形態の検出又は測定によるものではなく、同時に、ＮＧＡＬ測定の診断における使用に関する上述した他の者による文献は全て、ＭＭＰ−９と複合化していない特定の独特な分子形態を有するＮＧＡＬの測定については開示していない。
【００１６】
定義
以下の用語は先行技術において様々な特殊又は限定的な意味で往々にして使用されるため、ここで用いられる意味の定義を要し、本明細書の開示においては以下に示す用語を使用する。
【００１７】
腎障害：腎臓の内あらゆる部で生じようと、外部において生じようと、腎臓の機能に影響を及ぼす異常な又は病理学的な症状。
【００１８】
腎疾患：分類可能な疾病単位を構成すると考えられるあらゆる腎障害。
【００１９】
腎損傷：腎臓へのあらゆる損傷、起源は物理的（例えば、外傷性）、化学的（腎毒性）又は病理学的（疾患関連）の腎損傷であって、特に、腎臓機能の検出可能な損傷を生じさせるに十分な数の腎臓細胞に影響を与える何らかの損傷。
【００２０】
急性腎損傷：迅速、通常は数時間以内に生じる腎損傷。
【００２１】
急性腎不全（ＡＲＦ）：迅速に生じる腎臓の主要な排出及び恒常性機能の可変的（必ずしも完全ではない）な損傷又は損失。通常は、代謝変化による変動に加えて血清クレアチニンの上昇及び／又は尿排出量の低下によって証明される。
【発明の概要】
【００２２】
急性腎損傷を含む腎障害の臨床的及び生化学的兆候を示す患者及び急性腎損傷を含む腎障害の臨床的及び生化学的兆候を示さない対照個体から採取した体液試料を分析することによって、本発明者らは、予期せぬことに、障害に冒された腎臓によって血液及び尿に放出されるＮＧＡＬは大部分が遊離モノマーの形態であることを見出した。この知見は、循環好中球及び特定の上皮細胞等の腎臓以外の供給源に由来すると考えられ、かつ、ＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体を含む高級ＮＧＡＬ複合体、ＮＧＡＬホモトリマー、ＮＧＡＬホモダイマー、ＮＧＡＬモノマーからなる健常者の血清中において低濃度で見られる免疫反応性ＮＧＡＬとは対照をなすものである。また、特定の腺癌等の他の病態の患者の体液において見られ、ＮＧＡＬモノマーに加え、ＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体、ＮＧＡＬオリゴマーの存在を特徴とするＮＧＡＬとも対照をなすものである。
【００２３】
これにより、抗凝固処理全血から測定前に分離した血漿、又は抗凝固処理全血から測定手順の一部として濾過した血漿、あるいは血清又は尿中のＮＧＡＬ測定の特異性を改良して腎損傷を含む腎障害を診断することができる。ＮＧＡＬの独特の分子形態を測定する同様な原理は、腎臓とは異なるパターンでこれらの分子形態を放出するその他の器官、組織及び細胞型の障害や損傷を診断するために適用することができることは明らかである。
【００２４】
従って、本発明は、哺乳動物における器官、組織又は細胞型の疾患や損傷の重篤度を、前記哺乳動物の体液試料中の独特の分子形態を有する好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の濃度を測定することによって診断、監視又は評価する方法に関する。特定の実施形態では、前記哺乳動物はヒトの個体である。特定の実施形態では、ＮＧＡＬの独特の分子形態は遊離ＮＧＡＬモノマーである。遊離ＮＧＡＬモノマーは、遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的に結合するが、前記方法を適用する哺乳動物種のＮＧＡＬ複合体には結合しない分子を使用して測定することができる。また、遊離ＮＧＡＬモノマーは、ＮＧＡＬ結合分子、又は遊離ＮＧＡＬモノマーとＮＧＡＬ複合体の両方に結合する分子の組み合わせによって測定することもでき、遊離ＮＧＡＬモノマーは、高速で自動化に適した物理的又は化学的方法によって複合化された形態から分離した場合にはゲル電気泳動は使用しない。また、遊離ＮＧＡＬモノマーは、試料中の総ＮＧＡＬと複合ＮＧＡＬとの差から間接的に測定することもでき、総ＮＧＡＬはＮＧＡＬ結合分子、又は遊離ＮＧＡＬモノマーと複合化形態のＮＧＡＬの両方に結合する分子の組み合わせを使用して測定され、そして複合ＮＧＡＬは遊離ＮＧＡＬモノマーに一度に結合することができないＮＧＡＬ結合分子の組み合わせを使用して測定される。
【００２５】
別の実施形態では、ＮＧＡＬの独特の分子形態はＮＧＡＬホモダイマーである。
【００２６】
別の実施形態では、遊離ＮＧＡＬモノマーを除く、ＮＧＡＬホモダイマー及び高級オリゴマーの組み合わせを測定する。このような分子形態のＮＧＡＬの組み合わせは、遊離ＮＧＡＬモノマーに一度に結合することができない結合分子の組み合わせを使用して測定することができる。本発明の別の態様は、哺乳動物における疾患あるいは細胞又は組織損傷の診断マーカー分子としてのＮＧＡＬの独特の分子形態の使用であって、係るＮＧＡＬの分子形態は、起源細胞によって特定の方法でグリコシル化されたＮＧＡＬであり、その特定の方法は異なる起源細胞によって別の方法でグリコシル化されたＮＧＡＬと識別可能である。
【００２７】
本発明の一態様は、ＮＧＡＬの遊離モノマーに特異的又は選択的な体液内のＮＧＡＬを測定する方法を使用することを含む。これらの方法は、健常者における、又は腎損傷又は腎障害以外の原因によってＮＧＡＬ濃度が上昇した患者における非選択的なＮＧＡＬ測定方法よりも低いＮＧＡＬ濃度を記録する。同時に、腎損傷又は腎障害によるＮＧＡＬモノマーの増加をモノマーに特異的な測定方法によって完全に読み取る。従って、モノマーに特異的な測定方法を使用することにより、異なる分子形態に選択性を少ししか示さないか、全く示さないＮＧＡＬ測定方法よりも、腎損傷又は腎障害をより選択的に検出することができる。
【００２８】
逆に、ホモダイマーのみを測定する方法又はＮＧＡＬのホモダイマー及び高級オリゴマーのみを測定する方法は、これらのＮＧＡＬの分子形態を合成する非腎臓組織によって分泌されたＮＧＡＬの高いレベルを特徴とする症状の診断に有用である。従って、本発明のさらなる態様は、哺乳動物における器官、組織又は細胞型の疾患又は損傷の重篤度を診断、監視又は評価する方法に関し、前記疾患又は損傷は前記哺乳動物から採取した体液中に存在するＮＧＡＬの独特の分子形態の特定のパターンによって特徴付けられ、前記体液の試料中においてＮＧＡＬの２種以上の独特の分子形態の濃度を測定することによって診断、監視又は評価する。
【００２９】
ＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体の測定は先行技術で公知であり、その測定結果を本発明によって得られた結果と比較するために測定を行う場合を除いて本発明の一部を構成するものではない。ＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体の測定は、例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−９／ＮＧＡＬ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＤＭ９Ｌ２０，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ.（米国ミネソタ州ミネアポリス）の製品カタログに記載されている。
【００３０】
遊離ＮＧＡＬモノマー又はホモダイマー及びＮＧＡＬの高級オリゴマーをそれぞれ特に測定する特異的リガンド結合法が考案されている。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】急性尿細管壊死に罹患した患者から採取した血漿の分子サイズ排除クロマトグラフィー（カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を示す。線は、左から右に、マクログロブリン（ピーク：約５４ｍＬ）、免疫グロブリン（ピーク：約６９ｍＬ）及びアルブミン（ピーク：約７９ｍＬ）に相当する２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収ピークを示す。棒部分は、ＮＧＡＬのモノマー及びオリゴマー形態の両方を検出するＥＬＩＳＡで分析した回収フラクションにおけるＮＧＡＬ免疫反応性を示す。次の４つのＮＧＡＬ免疫反応性ピークが観察された：約６０〜６５ｍＬに現れ、より高級なＮＧＡＬ複合体に帰属する小さなピーク（独特の分子形態に帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の１.０％）、約７４〜７９ｍＬに現れ、ＮＧＡＬホモトリマーに帰属する痕跡量のピーク（帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の０.８％）、約７９〜８７ｍＬに現れ、ＮＧＡＬホモダイマーに帰属する大きなピーク（帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の２２.３％）、及び約８８〜１０１ｍＬに現れ、遊離ＮＧＡＬモノマーに帰属する大きなピーク（帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の７５.９％）。
【図２】図１と同様にして実施した、急性尿細管壊死に罹患した別の患者から採取した尿の分子サイズ排除クロマトグラフィーを示す。２つのＮＧＡＬ免疫反応性ピークが観察された：約７８〜８６ｍＬに現れ、ＮＧＡＬホモダイマーに帰属する小さなピーク（帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の３.０％）、及び約８７〜９９ｍＬに現れ、遊離ＮＧＡＬモノマーに帰属する大きなピーク（帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の９７.０％））。
【図３】図１と同様にして実施した、正常なヒト血清の分子サイズ排除クロマトグラフィーを示す。次の４つのＮＧＡＬ免疫反応性ピークが観察された：約５６〜６５ｍＬに現れ、ＮＧＡＬのより高級な複合化形態に帰属するピーク（帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の２４.１％）、約７０〜７８ｍＬに現れ、ＮＧＡＬホモトリマーに帰属するピーク（帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の２４.５％）、約７８〜８６ｍＬに現れ、ＮＧＡＬホモダイマーに帰属する大きなピーク（帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の３３.１％）、及び約８８〜１００ｍＬに現れ、遊離ＮＧＡＬモノマーに帰属するピーク（帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の１８.３％）。
【図４】ＮＧＡＬモノマー（十字形）、ＮＧＡＬホモダイマー（菱形）及び総ＮＧＡＬ（三角形）の血漿中濃度の受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットを示す。“総”ＮＧＡＬは、高級オリゴマー形態から帰属可能なモノマー及びホモダイマー形態を含む。集中治療を行った３８人の患者（１９人は急性腎傷害と診断された）についてピーク血漿濃度を得た。ＮＧＡＬホモダイマーの血漿中濃度は急性腎傷害の診断には不適当であるようだ。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
集中治療を行う一連の重症患者では、腎障害又は腎損傷のためにＮＧＡＬの体液中濃度が上昇し、健常者又は腎障害又は腎損傷に罹患していない患者において通常観察されるパターンとは異なる血漿及び尿中におけるＮＧＡＬの分子形態パターンが観察された。健常者では、血漿又は血清中におけるＮＧＡＬ免疫反応性は、遊離ＮＧＡＬモノマー（１０〜５０％）、通常はより大量のＮＧＡＬホモダイマー（２５〜６０％）、及びより少量のＮＧＡＬホモトリマー（５〜３５％）及びＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体を含むＮＧＡＬの高級複合化形態（５〜３５％）に相当する分子形態（括弧内は推定濃度範囲）において生じる。健常者の尿における総ＮＧＡＬ免疫反応性の基底レベルは非常に低く、当分の間、上述の分子形態の相対的な含有量を分析することは不可能だった。
【００３３】
腎疾患に罹患していないため適度に上昇したＮＧＡＬレベルを有する患者では、血漿中のＮＧＡＬの分子形態パターンは正常な基礎的状態において観察されるパターンと実質的に同様である。これらの患者において尿中のＮＧＡＬの分子形態パターンは、モノマー形態が有意を占めるが、適度な量のＮＧＡＬホモダイマーも依然として存在する。尿中のＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体の存在は不規則である。
【００３４】
急性腎損傷によって上昇したＮＧＡＬレベルを有する患者では、血漿中のＮＧＡＬの分子形態パターンは正常な状態又は非腎疾患において観察されるパターンと非常に異なる。すなわち、血漿中において大勢を占める分子形態は遊離ＮＧＡＬモノマー（７０〜８０％）であり、比較的少量のＮＧＡＬホモダイマー（２０〜３０％）、痕跡量のＮＧＡＬホモトリマー（０〜２％）及びＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体を含む微量で不規則的に存在する高分子量形態（０〜２％）を含む。このことは、腎損傷に応答して腎臓から分泌されるＮＧＡＬの大勢を占める分子形態がＮＧＡＬの遊離モノマー形態であることを示唆している。比較的少量のホモダイマーが分泌され、ＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体を含む高分子量形態のＮＧＡＬの分泌は僅かであり、規則的には生じない。これまで、ＮＧＡＬは急性腎損傷を含む腎障害のマーカー分子として提案されているが、特別な分子形態を有するＮＧＡＬが関与することについては特定されていなかった。好中球及びＮＧＡＬをその周囲に放出するその他の細胞型は一般的には大量のＮＧＡＬホモダイマー及び一定ではない量のＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体を含むＮＧＡＬの高級オリゴマーをも通常は放出するため、腎損傷の分子マーカーはＮＧＡＬモノマーであることを提案する。
【００３５】
その結果、いずれの分子形態にも選択的ではない既存の方法によってＮＧＡＬの異なる分子形態の混合物を測定する代わりに、遊離ＮＧＡＬモノマーの濃度をその分子形態に特異的な方法によって測定することにより、腎損傷をより高い診断特異性をもって診断することができることを提案する。その方法の診断適用性に関しては、急性腎損傷の急速な進行を考慮すると、結果を短時間、例えば、４時間以内で利用できるように、測定方法は迅速な方法であることが望ましい。これは、先行技術においてＮＧＡＬの分子形態の遡及的分析のために使用されているゲル電気泳動によるＮＧＡＬの分子形態の分離を妨げる。
【００３６】
従って、本発明は、ＡＲＦに至ったか、又は哺乳動物におけるＡＲＦ発症の差し迫ったリスクを意味する腎損傷、腎疾患又は腎障害を診断又は監視する方法を含み、該方法は次のｉ）及びｉｉ）の工程を含む：
ｉ）前記哺乳動物から採取した体液試料中の遊離ＮＧＡＬモノマーの濃度を測定する工程、及び
ｉｉ）前記濃度の値と、腎損傷、腎疾患又は腎障害の兆候を示さない前記哺乳動物の種の他の個体における遊離ＮＧＡＬモノマー濃度の範囲から決定したカットオフ値とを比較する工程、
なお、前記カットオフ値よりも大きな値が前記腎損傷、腎疾患又は腎障害の存在を示す。
【００３７】
好適な実施形態では、前記方法の工程ｉ）はゲル電気泳動を使用することを含まない。
【００３８】
前記方法の特定の実施形態では、血漿又は血清試料のカットオフ値は、６０〜６００ｎｇ／ｍＬの間の数値であり、例えば６５ｎｇ／ｍＬ以上、例えば７０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば８０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば９０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば１００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば１２０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば１５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば２００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば２５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば３００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば３５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば４００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば４５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば５００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば５５０ｎｇ／ｍＬ以上であり、そして、尿試料のカットオフ値は、１０〜６００ｎｇ／ｍＬの間の数値であり、例えば１５ｎｇ／ｍＬ以上、例えば２０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば３０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば４０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば６０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば７０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば８０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば９０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば１００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば１２０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば１５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば２００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば２５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば３００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば３５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば４００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば４５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば５００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば５５０ｎｇ／ｍＬ以上である。
【００３９】
また、本発明は、哺乳動物における急性腎不全の発症リスクを診断、監視又は判定する方法であり、当該方法は、急性腎不全に罹患しておらず、急性腎不全を発症する差し迫ったリスクを有していない個体と、急性腎不全に罹患している可能性があるか、急性腎不全を発症するリスクを有している個体とを区別し、次のｉ）及びｉｉ）の工程を含む：
ｉ）前記哺乳動物から採取した体液試料中の遊離ＮＧＡＬモノマーの濃度を測定する工程、及び
ｉｉ）前記濃度を、前記カットオフ値は、遊離ＮＧＡＬモノマーの濃度が前記カットオフ値未満の場合には、急性腎不全に罹患しておらず、急性腎不全を発症する差し迫ったリスクを有していないとして前記哺乳動物を類別するように選択される所定のカットオフ値と比較する工程
【００４０】
好適な実施形態では、前記方法の工程ｉ）はゲル電気泳動を使用することを含まない。前記方法の特定の実施形態では、血漿又は血清試料のカットオフ値は、６０〜６００ｎｇ／ｍＬの間の数値であり、例えば５５０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば５００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば４５０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば４００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば３５０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば３００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば２５０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば２００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１５０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１２０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば９０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば８０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば７０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば６５ｎｇ／ｍＬ以下であり、尿試料のカットオフ値は、１０〜６００ｎｇ／ｍＬの間の数値であり、例えば５５０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば５００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば４５０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば４００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば３５０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば３００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば２５０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば２００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１５０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１２０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば９０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば８０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば７０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば６０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば５０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば４０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば３０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば２０ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１５ｎｇ／ｍＬ以下であってもよい。
【００４１】
本発明の特定の実施形態では、上記監視方法は、腎損傷のリスクを伴うことが知られている内科又は外科的処置後に、又は急性腎不全の治療の開始又は終了後に、特に重症疾患の過程において、前記工程ｉ）及びｉｉ）を１回以上繰り返す工程を更に含む。
【００４２】
特定の実施形態で、前記工程ｉ）及びｉｉ）は、２４時間以内に、例えば１２時間以内、例えば６時間以内、例えば３時間以内、例えば１時間以内、例えば３０分以内又は１５分以内に繰り返すことができる。その方法の実施には、遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的な測定方法が必要である。本発明の好適な実施形態では、その測定方法は、ＮＧＡＬの遊離モノマーに特異的に結合して該モノマーを測定するために、ＮＧＡＬの他の分子形態を測定せずに、遊離ＮＧＡＬモノマーのみを測定する特異的モノクローナル抗体又はその他の特異的な結合分子を使用した免疫化学分析等のリガンド結合法である。そのような方法の詳細は後記の実施例４に記載する。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、哺乳動物から採取した体液試料中のＮＧＡＬホモダイマーの濃度を測定することもできる。そのような方法の詳細は後記の実施例５に記載する。ＮＧＡＬホモダイマーの測定は、ＮＧＡＬホモダイマーを放出するその他の器官又は組織、例えば、好中球、及び例えば、気道の上皮組織、肝臓を含む胃腸管及び乳腺を含む尿生殖路を含む腎臓以外の上皮組織の疾患を診断に有用であることを証明する。ＮＧＡＬホモダイマーの測定は、全身性であろうと局所性であろうと、炎症の検出、及び前記管の細胞、組織又は器官、又はＮＧＡＬホモダイマーを分泌することが分かっているあらゆる細胞型、組織又は器官に影響を及ぼす病態の診断に関連する場合がある。
【００４４】
体液試料中で、一方では遊離ＮＧＡＬモノマーの、及びもう一方ではＮＧＡＬホモダイマーと高級オリゴマーとの和の両方の濃度を、上記２種類の分子形態の分離を必要とすることなく、迅速かつ簡便なやり方で両方の結果を得ることができる組み合わせ検定を使用して測定することができる。これは、後記の実施例６に記載する。試料中の遊離ＮＧＡＬモノマー、ＮＧＡＬホモダイマー及びＮＧＡＬの高分子量形態は、それらの分子形態をタンパク質分離法によって分離し、その後、各分子形態の量を先行技術で公知の非特異的なＮＧＡＬ測定方法の１つを使用して測定することによって分析することもできる。ＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体を測定する確立された方法と共に使用する非分離方法を用い、遊離ＮＧＡＬモノマーの及び、ＮＧＡＬホモダイマーと高級オリゴマーとの和の測定を組み合わせて、例えばクロマトグラフ分析によるタンパク質分離を必要とすることなく、試料中に存在するＮＧＡＬの分子形態のかなり完全なプロファイルを得ることができる。このＮＧＡＬの分子形態のプロファイルは、特定の器官の疾患又は異なる器官を侵す併発症を特定するために診断に使用することができる。
【００４５】
ＮＧＡＬの分子形態のプロファイルを分析する一態様は、上述したようにＮＧＡＬモノマー及びホモダイマーの絶対濃度を測定し、それらの間の比率を算出することを含む。所与の個体から採取した試料で得られた比率は、得られたＮＧＡＬモノマー／ホモダイマー比の値の決定した範囲によって特徴付けられる病理を識別するために使用することができる。例えば、急性腎損傷の血漿又は血清において観察されるＮＧＡＬホモダイマーに対するＮＧＡＬモノマーの比は、１を超え、例えば１.５以上、例えば２以上、例えば３以上、例えば４以上、例えば５以上であり、１０以下である。急性腎損傷の尿において観察されるＮＧＡＬホモダイマーに対するＮＧＡＬモノマーの比は１を超え、通常は血漿よりも大きく、２〜１００以上の間のあらゆる値を含み、例えば３以上、例えば４以上、例えば５以上、例えば７以上、例えば１０以上、例えば２０以上、例えば３０以上、例えば５０以上である。
【００４６】
ＮＧＡＬの分子形態のプロファイルを分析するさらなる方法では、ＭＭＰ−９と複合化していない１種以上のＮＧＡＬ形態の濃度を、本願明細書に開示する方法によって測定し、これを前記濃度を他の方法で測定したＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体の濃度と比較する方法によって決定することである。そして、ＭＭＰ−９と複合化していない分子形態のＮＧＡＬの濃度とＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体の濃度との比率を算出することができる。血漿、血清又は尿の場合には、それらの比率は、異なる病態に応じて１未満から１を超える範囲の値を取り得る。特定の腫瘍性症状では低い比率（例えば、１未満〜５）が予想され、非腫瘍性障害では高い比率（例えば、５を超える値）が予想される。多くの場合には、ＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体は検出されない。
【００４７】
本発明の一般的原理は、疾患又は有害な刺激に応答して異なる起源細胞によって産生されるＮＧＡＬの分子形態における特異的な差異を利用することにより、異なる器官及び組織の疾患に対して診断的に特異的なＮＧＡＬ測定を使用することである。本発明のさらなる態様では、異なる種類の細胞又は組織によるＮＧＡＬのグリコシル化における差異を診断的に利用して特定の組織又は器官に由来するＮＧＡＬを測定することもできる。
【００４８】
本発明の方法は、集中治療又は救命救急治療が必要であると認められる患者に特に有用であり、重症ではないが、腎臓の虚血性損傷につながり得る外科手術等の明確な損傷を受けたか、あるいは画像診断法のために静脈内投与された造影剤等の腎毒性物質に暴露されたか、腎毒性化学療法薬に暴露された患者にも有用である。また、本発明の方法は、虚血によって起こされる腎損傷、又は炎症性、感染性又は腫瘍性疾患の合併症、又は集中治療、又は腎臓の虚血性損傷を引き起こし得る外科的な治療介入を必要とするその他の要因によるＡＲＦの発症リスクを判断するために特に有用である。これらの場合、腎臓が疾患過程又は内科や外科的処置の影響を受け、その結果、ＡＲＦを発症するリスクを有する患者を早期に識別することにより、ＡＲＦの発症を予防するための早期かつ集中的な治療介入を行うことができる本発明の方法は、腎臓によって放出されるものとは異なるパターンで各分子形態のＮＧＡＬを放出するその他の器官、組織及び細胞型の障害又は損傷を診断及び監視するために有用である。また、この方法は、外部からの物理的又は化学的原因又は放射線照射曝露による損傷による器官及び組織の損傷を判定するために有用である。
【００４９】
また、本発明の方法は、獣医学、実験動物における腎臓の病態生理学の研究及び実験動物における腎毒性治療薬又は診断薬の侯補の試験にも有用である。
【００５０】
本発明のさらなる態様で、その方法は、病気の期間全体を通して又は病気を軽減するか、器官又は組織の損傷を引き起こすリスクを伴う内科又は外科的治療介入後の様々な時点において患者を監視するために使用することができる。監視のために体液試料を採取する間隔を短くし、器官障害の徴候を可能な限り早期に得、予防措置又は治療措置を早期に設定することができる。このために、例えば損傷が外科的又は内科的処置時に生じたことが判明している場合には、ＮＧＡＬの独特の分子形態の血漿中又は尿中濃度を、２４時間以下の間隔で、より好ましくはより短い間隔、例えば１６時間又は１２時間、より好ましくは９時間又は６時間で、３時間以下の示唆される期間で、又は１５分又は３０分又は１時間等のより短い間隔で、監視することが好ましい。
【００５１】
例えば、尿、血漿又は血清（しかし、これらに限定されない）等の体液の試料中の遊離ＮＧＡＬモノマー又はＮＧＡＬホモダイマーの測定は、満足できる分析特異性、感度及び精度が得られる任意の方法で行うことができる。好ましい方法は、遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的な結合分子、又はＮＧＡＬホモダイマーに特異的な結合分子又はＮＧＡＬホモダイマーに特異的な結合分子の組み合わせを使用する結合定量法であり、前記結合分子全ては試料を採取する哺乳動物種からのＮＧＡＬに結合することができる。そのような結合分子としては、それらに限定されるものではないが、ＮＧＡＬに対するモノクローナル抗体又はその他の手段で産生した特異的なＮＧＡＬ結合分子が挙げられる。
【００５２】
好ましい方法では、分析対象の哺乳動物種からの組換え型ＮＧＡＬに対して産生させたモノクローナル抗体を使用する。遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的な抗体は、様々な方法によって選択することができ、その非限定的試料は実施例３に一例が記載される。１つの抗体は固体担体に結合して尿試料、血漿又は血清試料等の試料からＮＧＡＬを捕捉し、一方、他方の抗体（例えば、遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的な抗体）は染料複合体、フルオロフォア、電気化学的検出部位、ビオチン又は酵素等の標識に結合し、当業者に公知の多くの方法のいずれかによって検出することができる。固体担体は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の場合にはポリスチレン又はポリ塩化ビニル表面、ラテックス（ポリスチレン）粒子、常磁性粒子、圧縮ポリエチレン粒子からなるフィルタフリット、多孔性ニトロセルロースマトリックス又は免疫化学分析に使用される任意の適当な担体であってもよい。検定の分子形態特異性に要求される方法でＮＧＡＬに特異的に結合する分子でコーティングされた粒子を使用して、手動で又は自動化装置を使用して遂行する粒子増強濁度検定又は比濁分析法によって試料中におけるＮＧＡＬの特定の分子形態の濃度を測定することもできる。
【００５３】
本発明に従って、尿又は血液試料中のＮＧＡＬを測定するための好ましい手段としては、試料の迅速かつ患者の近くにおける分析を可能とするディップスティック、ラテラルフロー（免疫クロマトグラフィー）試験又はミニカラム試験が挙げられる。ただし、当業者には明らかなように、この開示を読んだ上で、ＮＧＡＬの独特の分子形態を測定する、例えば、緊急分析のために試料にランダムにアクセスすることができる中央実験室における自動化方法を使用するその他の手段も使用することができる。
【００５４】
好適な実施形態では、本発明の方法は、人体に対して実施される外科、治療又は診断工程を含まない。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は、ＮＧＡＬモノマーに特異的に結合することができる、モノクローナル抗体を含む結合分子を、ＮＧＡＬモノマーに結合する性質及びＮＧＡＬホモダイマーに結合しない性質に応じて一連の結合分子侯補から前記分子を選択することによって、選択する方法を含む方法を範囲に含む。
【実施例】
【００５６】
本発明を限定するものでない以下の実施例によって本発明についてさらに説明する。
【００５７】
実施例１：正常試料及び患者試料に存在するＮＧＡＬの分子形態の判定
ＮＧＡＬのモノマー及びオリゴマー化形態の両方をＥＬＩＳＡを検出するＥＬＩＳＡによって測定するように、既知のヒトＮＧＡＬ免疫反応性の試料の公知量を含む試料（血漿、血清、尿又は組替え型ヒトＮＧＡＬ）に対して分子サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過）を行った。試料は、カラム緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７.４）で希釈し、上記緩衝液で平衡化したｐｒｅｐ−ｇｒａｄｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラム（１.６ｃｍ×６０ｃｍ）に添加した。カラムはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ａｋｔａクロマトグラフ装置によって充填及び操作し、フラクションを回収した。溶出液の紫外吸収を２８０ｎｍでモニターした。カラムは、取扱説明書に従って１回毎に洗浄及び消毒した。フラクションにおけるＮＧＡＬ免疫反応性を同じＥＬＩＳＡによって測定したＮＧＡＬ免疫反応性のピークをプロットし、免疫反応性の回復を判定した。
【００５８】
尿細管壊死によるＡＲＦに罹患した患者から採取した血漿の分子サイズ排除クロマトグラフィーを図１に示す。血漿マクログロブリン、免疫グロブリン及びアルブミンに対応するＵＶ吸収ピークを観察し、近似の分子サイズマーカーとして使用した。ＮＧＡＬ免疫反応性の第１のピークは、免疫グロブリンピークの立ち上がりに現れた非常に小さいピークだった。第１のピークは、ＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体を含むＮＧＡＬの高級複合化形態及び高級ＮＧＡＬオリゴマーを含んでいた。ＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体の含有量はＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって確認した。第１のピークは、クロマトグラフピークに帰属することができる総ＮＧＡＬ免疫反応性の１.０％を含んでいた。痕跡量のＮＧＡＬホモトリマーがアルブミンピークの前及び立ち上がりに現れ、帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の０.８％を占めていた。ＮＧＡＬ免疫反応性のより大きなピークがアルブミンピークの後に現れた。これはＮＧＡＬホモダイマーに対応するものであり、帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の２２.３％を含んでいた。このピークに続いて、遊離ＮＧＡＬモノマーに対応し、帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性の７５.９％を含む非常に大きなＮＧＡＬ免疫反応性ピークが現れた。これらの最後の２つのピークが分離していることにより、ＮＧＡＬのモノマー及びダイマーが互い迅速に平衡化されなかったことが確認された。
【００５９】
尿細管壊死によるＡＲＦに罹患した別の患者から採取した尿の分子サイズ排除クロマトグラフィーを図２に示す。図２では、３.０％の帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性を含むＮＧＡＬホモダイマーの非常に小さなピークと、それに続く、９７.０％の帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性を含む遊離ＮＧＡＬモノマーの非常に大きなピークを示す。ＮＧＡＬの高級複合化形態に相当するピークは観察されなかった。
【００６０】
正常なヒト血清の分子サイズ排除クロマトグラフィー（図３）では、ＮＧＡＬの高級複合化形態（２４.１％の帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性）、ＮＧＡＬホモトリマー（２４.５％の帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性）、ＮＧＡＬホモダイマー（３３.１％の帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性）及び遊離ＮＧＡＬモノマー（１８.３％の帰属可能な総ＮＧＡＬ免疫反応性）のピークが観察された。
【００６１】
実施例２：ヒト遊離ＮＧＡＬモノマー及びホモダイマーの調製
天然又は組替え型ヒトＮＧＡＬを好中球又はヒトＮＧＡＬのアミノ酸配列をコードするベクターで形質転換又はトランスフェクションを行った原核生物又は真核細胞の培養上清から、当業者に周知のタンパク質分離方法を使用して、それぞれ分離する。天然又は組替え型ヒトＮＧＡＬ両方について、それぞれの調合液は遊離ＮＧＡＬモノマーとＮＧＡＬホモダイマーの両方を含む。モノマーとホモダイマーをイオン交換クロマトグラフィーによって分離し、モノマー及びホモダイマーをそれぞれ含むピークを、還元及び非還元試料を分析することにより、硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のピークから確認する。ＮＧＡＬモノマーを含むフラクションをプールし、ダイマーの新たな形成が最小となるように１〜４日以内に使用する。あるいは、プールをヨードアセトアミド又はＮ−エチルマレイミドで処理して遊離スルフヒドリル基をブロックすると共にジスルフィド架橋形成の可能性を最小化する。溶液を塩酸でｐＨ６.５に調節したＰＢＳで３回透析し、そして４℃で保存する。ＮＧＡＬホモダイマーを含むフラクションもプールする。ホモダイマーはモノマーよりも安定しているが、上述したように透析・保存する前に、必要に応じて、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ.（２００１）に記載されているように、２０倍モル過剰のジチオ−ビス−（スルホサクシニミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ；Ｐｉｅｒｃｅ）で処理することによってさらに安定化することもできる。
【００６２】
実施例３：遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的なモノクローナル抗体の選別
組替え型ヒトＮＧＡＬ（主にモノマー形態）で免疫したＢａＩｂ−Ｃマウスに由来するハイブリドーマ上清を、コーティングされた組替え型ヒトＮＧＡＬに結合することができる抗体の選別のためにＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。次に、陽性ウェルからの抗体を、ｉ）ストレプトアビジンコーティングに結合した軽度にビオチン化されたヒトＮＧＡＬモノマー、及びｉｉ）ストレプトアビジンコーティングに結合した軽度にビオチン化されたヒトＮＧＡＬダイマーについて再びスクリーニングする。モノマーに結合するが、ダイマーには結合しない抗体を示す上清のみを選別する。これらの抗体は、ダイマー形成によってブロックされたエピトープにおいてヒトＮＧＡＬに結合すると考えられる。
【００６３】
あるいは、ヒトＮＧＡＬタンパク質鎖の一部と同一な又は密接に関連した配列を有する合成ペプチドに結合した担体を使用して免疫を行うこともでき、前記配列は、成熟タンパク質の８７位にＮＧＡＬホモダイマーの形成に関与すると思われるシステイニル残基を含む。その後、上述した手順と同様なスクリーニング手順を行う。
【００６４】
実施例４：遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡウェルをモノマー及びダイマーに結合することができるＮＧＡＬに対するモノクローナル抗体でコーティングする。試料を添加し、洗浄した後に、ＮＧＡＬモノマーに特異的であり、かつ高感度検出を可能とするように適切に標識された、実施例３に従って選別されたモノクローナル抗体を使用して結合したＮＧＡＬモノマーを検出する。あるいは、実施例３に従ってＮＧＡＬモノマーに特異的であるように選別されたモノクローナル抗体でＥＬＩＳＡウェルをコーティングし、モノマー特異的抗体に結合したＮＧＡＬモノマーに結合することができるＮＧＡＬに対する別の標識されたモノクローナル抗体を使用して結合したＮＧＡＬモノマーを検出する。
【００６５】
上述した方法は、遊離ＮＧＡＬモノマーを測定するためのキット又は装置に具体化することができ、前記キット又は装置は、固体担体と、上述した原理に従って選別されたモノクローナル抗体又はその他の結合分子とを含む。
【００６６】
実施例５：ＮＧＡＬホモダイマー及び高級オリゴマーに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡウェルを、モノマーとダイマーの両方に結合することができるＮＧＡＬに対するモノクローナル抗体でコーティングする。試料を添加し、洗浄した後に、高感度検出を可能とするように適切に標識された同一のモノクローナル抗体を使用して結合したＮＧＡＬモノマーを検出する。ＮＧＡＬの前記分子形態を捕捉手段及び検出手段に同一の抗体を使用するという事実のみが、互いに十分離れた位置に同一のエピトープの２以上のコピーを含み、同じ抗体の同時結合が可能となる場合にのみシグナルを与える。これにより、ＮＧＡＬのホモダイマー及び高級オリゴマーに特異的な検定とすることができる。
【００６７】
使用する２つのモノクローナル抗体が同一であることは必須条件ではない。また、第１の抗体のＮＧＡＬモノマーへの結合によって第２の抗体のＮＧＡＬモノマーへの結合がブロックされるように、そのエピトープが、全く同一でないけれども、ＮＧＡＬ分子に配置された異なる抗体の対を見出すことも可能である。上述した方法は、ＮＧＡＬホモダイマー及び高級オリゴマーを測定するためのキット又は装置において実施することができ、前記キット又は装置は、固体担体と、上述した原理に従って選別されたモノクローナル抗体又はその他の結合分子を含む。
【００６８】
実施例６：遊離ＮＧＡＬモノマー及びＮＧＡＬホモダイマーと高級オリゴマーとの和の両方の並行測定を可能とするサンドイッチＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡウェルを、モノマーとダイマーの両方に結合することができるＮＧＡＬに対するモノクローナル抗体でコーティングする。試料を添加し、洗浄した後に、結合したＮＧＡＬモノマーを、実施例３に従ってＮＧＡＬモノマーに特異的であるように選別され、かつ高感度検出を可能とするように適切に標識されたモノクローナル抗体を使用して検出する。同一の試料を添加したパラレルウェルにおいて、ウェルをコーティングするために使用したものと同じ抗体又はＮＧＡＬモノマーへの結合がコーティング抗体への事前の結合によってブロックされる別の抗体のいずれかの標識された形態を使用して、実施例５に記載したように結合したＮＧＡＬホモダイマー及び高級オリゴマーを検出する。
【００６９】
上述した方法は、遊離ＮＧＡＬモノマー及びＮＧＡＬホモダイマーと高級オリゴマーの和の両方の並行測定のためのキット又は装置において実施することができ、前記キット又は装置は、固体担体と、上述した原理に従って選別されたモノクローナル抗体又はその他の結合分子を含む。
【００７０】
実施例７：遊離ＮＧＡＬモノマーとＮＧＡＬホモダイマーの合計を測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
ＮＧＡＬのモノマー、ホモダイマー及び高級ホモオリゴマー形態に対する既存のＮＧＡＬ  ＥＬＩＳＡの反応性についてはこれまで開示されていない。ＮＧＡＬに対するポリクローナル抗体はＮＧＡＬのあらゆる分子形態と反応し、ＮＧＡＬに対するモノクローナル抗体の大部分もモノマー及びダイマー形態と反応する。実施例４及び５に記載した特異的ＥＬＩＳＡに適した抗体との組み合わせには特別な選別が必要となる。従って、既存のＮＧＡＬ  ＥＬＩＳＡのほとんどは各分子形態とある程度反応すると予想される。実施例２に記載した遊離ＮＧＡＬモノマーとＮＧＡＬホモダイマーの調合液を使用することにより、以下のａ）及びｂ）に記載するように、ＮＧＡＬのこれらの２種類の分子形態の定量化に関してＮＧＡＬに対するモノクローナル抗体の対を明らかにすることが可能である。
【００７１】
ａ）ＮＧＡＬモノマー及びホモダイマーの両方に結合することができるＮＧＡＬに対する第１のモノクローナル抗体でＥＬＩＳＡウェルをコーティングする。試料を添加し、洗浄した後に、ＮＧＡＬモノマー及びホモダイマーに結合することができ、高感度検出を可能とするように適切に標識された第２のモノクローナル抗体を使用して結合したＮＧＡＬモノマーを検出する。ＮＧＡＬモノマー及びＮＧＡＬホモダイマーの精製した調製品を既知の濃度でそれぞれ含む試料を使用して、第１及び第２の抗体の種々の対を試験する。モノマー形態又はダイマー形態であるか否かにかかわらず、ＮＧＡＬの所与の質量濃度に対して同一のシグナルを与える第１及び第２の抗体の対を選別する。これは、ＮＧＡＬモノマー又はダイマーが第１の抗体に結合する場合に第２の抗体が各ＮＧＡＬサブユニットに結合することができるように当該抗体対のエピトープがＮＧＡＬタンパク質鎖に配置されていることを意味する。そして、モノマー及びダイマーの相対含有量にかかわらず、所与のＮＧＡＬ質量濃度に対して同一の評価を得ることができる。評価における反応性が定量化されていないＮＧＡＬの高級オリゴマーの小さな貢献を無視すれば、この種のサンドイッチＥＬＩＳＡは総ＮＧＡＬ  ＥＬＩＳＡと大まかに呼ぶことができる。
【００７２】
ｂ）モノマー分子に対するものと同一のＮＧＡＬダイマー分子のシグナルを与える第１及び第２の抗体の対を選別することもできる。この場合、得られるシグナルは、ＮＧＡＬの質量濃度に比例していないが、ＮＧＡＬモノマー及びダイマーのモル濃度に比例する。これは、ＮＧＡＬブロックの二量体化がダイマーのサブユニットに対する第２の抗体の結合を妨げるように抗体対のエピトープがＮＧＡＬタンパク質鎖に配置されていることを意味する。この種のサンドイッチＥＬＩＳＡは、所与の質量のモノマーと同じシグナルを与えるために２倍の質量のダイマーが必要になるため、質量濃度に関してＮＧＡＬモノマーに対する選択性はあまり高くない。
【００７３】
実施例８：遊離ＮＧＡＬモノマーのＮＧＡＬディップスティック試験
ヒトＮＧＡＬのモノマー及びホモダイマーの両方に結合することができるモノクローナル捕捉抗体でポリスチレン表面からなるディップスティックの分析領域をコーティングする。遠心分離し、希釈した試料のアリコートを、第１のチューブ内で遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的な酵素標識した検出抗体の溶液に添加し、その中にディップスティックを浸す。酵素標識した検出抗体とＮＧＡＬの複合体がディップスティックに結合し、ディップスティックを水道水で洗浄し、第２のチューブ内の発色基質溶液に入れる。所与の時間内に基質溶液内で発色した色を肉眼で読み取り、尿試料中のＮＧＡＬ濃度を示す色強度のチャートと比較するか、例えばＮＧＡＬ濃度を直接示すようにプログラムされたシンプルな比色計によって読み取る。
【００７４】
実施例９：遊離ＮＧＡＬモノマーを測定するためのラテラルフロー装置
毛細管力によって液体のマイグレーションを促進することができる溝を有する多孔性ニトロセルロース又はその他の材料の細片からなるラテラルフロー装置を、遠位端近傍においてＮＧＡＬのモノマーとダイマー形態の両方と結合することができる、横帯として添加された捕捉抗体でコーティングする。前記検出抗体が由来する種の抗体に対する抗体のさらなる横帯を捕捉抗体帯に遠位に配置し、細片機能の対照としての役目をする。細片の近位端は、標識されたポリスチレン粒子又は染料複合体の粒子を吸着又は結合した遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的な検出抗体を含む。遠心分離又は濾過した尿試料のアリコートを細片の近位端に添加すると、検出抗体に結合した標識された粒子は毛細管引力によって細片に沿って移動する。捕捉抗体の帯に達すると、試料中のＮＧＡＬモノマーと結合した粒子のみが保持され、検出可能な帯が生じる。検出抗体に対する抗体の対照帯に達した粒子は、ＮＧＡＬが結合しているか否かを検出することができる帯を形成する。標識された帯の強度は着色された粒子の場合は肉眼で読み取ることができ、又は使用した標識を適当な検出装置を使用して読み取ることができる。陽性結果は両方の帯における発色又は標識の蓄積によって示され、陰性結果は対照帯のみにおける発色又は他の標識によって示される。対照帯における発色又は他の標識のない場合は、細片機能が不十分であることを示す。試験の感度は、使用する試料の希釈によって調節することができ、所定のカットオフ値を超えるＮＧＡＬモノマー濃度のみが陽性結果を生じるように調節する。また、試験の感度は標識粒子及び非標識粒子の混合物に検出抗体を結合させることによって調節することもできる。細片のバッチは、定量結果又は半定量結果が装置から読み取ることができるように予め較正され、検出装置で読み取ることができる較正コードを備えることができる。当業者には明らかなように、このようなラテラルフロー技法の個々の態様の様々な変形も可能である。
【００７５】
実施例１０：遊離ＮＧＡＬモノマーのミニカラム試験
ミニカラムは、体液及び細胞が通過することができる圧縮ポリエチレン粒子からなるフリットを含む。フリットは、ＮＧＡＬモノマー及びダイマーに結合することができるヒトＮＧＡＬに対する捕捉抗体によってコーティングする。ミニカラムは装置に組み込み、自動液体ハンドリングを用いて希釈された試料を一定の流速及び量で添加した後、遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的な染料複合化検出抗体を添加する。洗浄溶液を通した後、フリットの着色強度を光散乱測光法によって読み取る。標準を使用した事前の較正を必要とすることなく、定量結果を装置によって示すことができるように、フリットのバッチは予め較正し、ミニカラムは装置によって読み取ることができる較正コードを装備している。
【００７６】
実施例１１：血漿試料におけるＮＧＡＬモノマー、ＮＧＡＬホモダイマー及び総ＮＧＡＬを測定する急性腎損傷に関する診断性能の比較
集中治療室に入院した３８人の患者からＥＤＴＡ血漿試料を選択した。１９人は臨床的及び生化学的に急性腎損傷であると診断され、残りの患者は急性腎損傷の兆候は示さなかった。実施例７ｂ）に従って測定したように各患者において最も高いＮＧＡＬ濃度を示した試料について実施例５に従ってＮＧＡＬホモダイマー及び実施例７ａに従って総ＮＧＡＬ（））を再び測定し、ＮＧＡＬモノマー濃度も算出した。ＮＧＡＬモノマー、ダイマー及び総ＮＧＡＬのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線を図４に示す。
【００７７】
急性腎損傷の診断に関して最良の結果はＮＧＡＬモノマー値によって得られ、血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）は０.８５３であり、４５０ｎｇ／ｍＬのカットオフ値を使用した診断感度及び特異性は両方とも８４％だった。総ＮＧＡＬ値の診断結果は劣っていた（５８０ｎｇ／ｍＬのカットオフ値において、ＡＵＣ：０.８１２、感度：７４％及び特異性：８９％）。ＮＧＡＬダイマー値の診断結果は非常に劣っており（ＡＵＣ：０.６０９）、急性腎損傷の診断には貢献しないものだった。また、ＮＧＡＬホモダイマーの結果はＮＧＡＬモノマーの結果と有意な相関を示さなかった。これらの知見は、ＮＧＡＬホモダイマーではなく、ＮＧＡＬモノマーの血漿レベルがこれらの患者の急性腎損傷の有無に関連することを示している。
【００７８】
今回の少数の患者群において急性腎損傷の高い診断特異性を達成するために超えていることが必要なＮＧＡＬモノマーの血漿中濃度としての４５０ｎｇ／ｍＬのカットオフ値は、他の患者群に適切なカットオフ値を必ずしも表すわけではない。
今回の患者群は、ＮＧＡＬの腎臓以外における放出に関連することが知られている重篤な随伴症状（例えば、敗血症等の重症感染症、全身性炎症及び腺癌）のほとんど全ての患者において発生することによって特徴付けられる。そのため、急性腎損傷の診断のために適切なカットオフ値が高くなった（おそらくはあらゆる患者群において見られそうな最も高いレベル）。他の患者群は、ＮＧＡＬ濃度に影響を及ぼす随伴症状をほとんど又は全く有していない患者、例えば、心肺バイパス手術による外科治療介入による急性腎損傷のリスクがある患者でなってもよい。そのような群では、血漿中のＮＧＡＬモノマー濃度のカットオフ値（濃度がカットオフ値を超えると急性腎損傷の兆候を示す）は、ＮＧＡＬモノマーの正常範囲の上限（約６０ｎｇ／ｍＬ）に近付く場合がある。尿中濃度に関しては、急性腎損傷の兆候を示し得るＮＧＡＬモノマー濃度のカットオフ値は、同様の理由から正常範囲の上限（約１２ｎｇ／ｍＬ）に近付く場合がある。
【００７９】
参考文献
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【図１】
2011503587.tif 000003
【図２】
2011503587.tif 000004
【図３】
2011503587.tif 000005
【図４】
2011503587.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月21日(2010.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓の損傷、疾患又は障害の重篤度を診断、監視又は評価する方法であって、前記哺乳動物の体液試料中における好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）モノマーの濃度を測定し、そして当該濃度を、前記疾患又は損傷に罹患していない個体で起こる前記独特の分子形態の濃度範囲と比較し、こうして、前記範囲からの前記濃度の偏差によって前記器官、組織又は細胞型の疾患又は損傷の有無を判定することを特徴とする方法。
【請求項２】
急性腎不全に至ったか、又は急性腎不全発症の差し迫ったリスクを意味する哺乳動物における腎損傷、腎疾患又は腎障害の重篤度を診断、監視又は評価する請求項１に記載の方法であって、
ｉ）前記哺乳動物から採取した体液試料中の遊離ＮＧＡＬモノマーの濃度を測定する工程、及び
ｉｉ）前記濃度を、腎損傷、腎疾患又は腎障害の兆候を示さない前記哺乳動物の種の他の個体における遊離ＮＧＡＬモノマー濃度の範囲から決定したカットオフ値と比較する工程、
を含み、前記カットオフ値よりも大きな値が前記腎損傷、腎疾患又は腎障害の存在を示す方法。
【請求項３】
哺乳動物における急性腎不全の発症リスクを診断、監視又は判定する請求項１に記載の方法であって、急性腎不全に罹患しておらず、急性腎不全を発症する差し迫ったリスクを有していない個体と、急性腎不全に罹患している可能性があるか、急性腎不全を発症するリスクを有している個体とを区別し、
ｉ）前記哺乳動物から採取した体液試料中の遊離ＮＧＡＬモノマーの濃度を測定する工程、及び
ｉｉ）前記濃度を、所定のカットオフ値と比較する工程、
を含み、前記カットオフ値未満の遊離ＮＧＡＬモノマーの濃度の場合には、急性腎不全に罹患しておらず、急性腎不全を発症する差し迫ったリスクを有していないとして前記哺乳動物を類別するように選択される方法。
【請求項４】
前記工程ｉ）及びｉｉ）を１回以上繰り返すさらなる工程を含む、又は請求項２又は３に記載の工程ｉ）及びｉｉ）を、２４時間以内、例えば１２時間以内、例えば６時間以内、例えば３時間以内、例えば１時間以内、例えば３０分以内又は１５分以内に繰り返すさらなる工程を含む、又は急性腎不全の治療の開始又は終了後に、請求項２又は３に記載の工程ｉ）及びｉｉ）を繰り返すさらなる工程を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記腎損傷又は急性腎不全の発症リスクが、虚血に起因する、又は炎症性、感染性又は腫瘍性疾患の合併症に起因する、又は集中治療を必要とするあらゆる原因の重症疾患に起因する、又は外科的治療介入に起因する、又は腎毒性物質の投与に起因する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物における器官、組織又は細胞型の疾患又は損傷の重篤度を診断、監視又は評価する方法であって、前記疾患又は損傷が、哺乳動物から採取した体液中に存在するＮＧＡＬの独特の分子形態の濃度の特定のパターンによって特徴付けられ、前記体液の試料中におけるＮＧＡＬの２種以上の独特の分子形態の濃度を測定し、かつ、測定結果を前記疾患又は損傷において生じる前記濃度のパターンと比較し、これによって、特定の濃度パターンの存在が対応する種類の疾患又は損傷の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項７】
遊離ＮＧＡＬモノマーとＮＧＡＬホモダイマーとの濃度比を決定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
遊離ＮＧＡＬモノマーと、ＮＧＡＬホモダイマーとＮＧＡＬの高級オリゴマーの合計との濃度比を決定する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＮＧＡＬのマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）を含まない分子形態とＮＧＡＬ／ＭＭＰ−９複合体との濃度比を決定する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記損傷が、外部からの物理的又は化学的原因に起因する、又は放射線照射への曝露に起因する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記体液が血漿又は血清又は尿である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
遊離ＮＧＡＬモノマーを、遊離ＮＧＡＬモノマーに特異的に結合するが、この方法を適用する哺乳動物種のＮＧＡＬの複合化形態には結合しない分子を使用して測定する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物における器官、組織又は細胞型の全身性疾患、疾患又は損傷の重篤度を診断、監視又は評価する方法であって、哺乳動物から採取した体液の試料中におけるＮＧＡＬホモダイマーの濃度を測定し、かつ、その測定結果を前記疾患又は損傷に罹患していない個体で起こるＮＧＡＬホモダイマーの濃度範囲と比較し、これによって、特定の濃度パターンの存在が対応する種類の疾患又は損傷の存在を示すことを特徴とする方法。こうして、前記範囲からの前記濃度の偏差によって疾患又は損傷の有無を判定することを特徴とする方法。
【請求項１４】
ＮＧＡＬホモダイマーとＮＧＡＬの高級オリゴマーとの合計濃度を測定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＧＡＬホモダイマー又はＮＧＡＬホモダイマーとＮＧＡＬの高級オリゴマーとの合計を、遊離ＮＧＡＬモノマーに一度に結合することができない結合分子の組み合わせによって測定する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物がヒト個体である、請求項の１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット又は装置であって、固体担体と、請求項１５又は１６に記載の結合分子とを含むキット又は装置。
【請求項１８】
ＮＧＡＬモノマーに特異的に結合することができるモノクローナル抗体を含む結合分子を、ＮＧＡＬモノマーに結合する性質及びＮＧＡＬホモダイマーに結合しない性質に応じて一連の結合分子侯補から選択することを特徴とする方法。
【請求項１９】
ＮＧＡＬに特異的に結合し、かつＮＧＡＬの結合法で一緒に用いるとき、単量体のＮＧＡＬに一度に結合しない一対のモノクローナル抗体を含む一対の結合分子を選択し、使用する方法。
【国際調査報告】
2011503587.tif 000007
2011503587.tif 000008
2011503587.tif 000009