(57)【要約】本発明は、抗体代替Κ軽鎖配列を含む、構築物及びライブラリーに関する。特に、本発明は、例えば抗体重鎖及び／又は軽鎖ドメイン配列などの別のポリペプチドと場合によっては組み合わされた抗体代替Κ軽鎖配列を含む構築物、並びにそれを含むライブラリーに関する。一態様においては、本発明は、Ｖκ様及び／又はＪＣκ配列を含む、κ様代替軽鎖（ＳＬＣ）構築物に関する。種々の実施形態においては、κ様ＳＬＣ構築物は、Ｖκ様配列、又はＪＣκ配列、又はＶκ様配列とＪＣκ配列の両方を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｖκ様及び／又はＪＣκ配列を含む、κ様代替軽鎖（ＳＬＣ）構築物。
【請求項２】
Ｖκ様配列を含む、請求項１に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項３】
ＪＣκ配列を含む、請求項１に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項４】
Ｖκ様配列とＪＣκ配列の両方を含む、請求項１に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項５】
標的に特異的に結合することができる、請求項１に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項６】
前記Ｖκ様配列が、シグナル配列を有する若しくは有さないかつＣ末端部を有する若しくは有さない配列番号２又はその断片を含む、請求項５に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項７】
前記Ｖκ様配列が、配列番号２のＮ末端シグナルペプチド（アミノ酸１〜２０）を含む、請求項６に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項８】
前記Ｖκ様配列が、配列番号２内からのＣ末端部の少なくとも一部を含む、請求項７に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項９】
前記Ｖκ様配列が、シグナル配列を有する若しくは有さないかつＣ末端部を有する若しくは有さない配列番号７〜１８又はその断片を含む群より選択される、請求項５に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項１０】
前記ＪＣκ配列が、Ｎ末端伸長部を有する若しくは有さない配列番号４又はその断片を含む、請求項５に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項１１】
前記ＪＣκ配列が、Ｎ末端伸長部を有する若しくは有さない配列番号１９〜２３又はその断片からなる群より選択される配列を含む、請求項５に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項１２】
抗体重鎖配列と結合した、請求項１から３及び５から１１のいずれか一項に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項１３】
抗体重鎖配列と結合した、請求項４に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項１４】
前記Ｖκ様配列がＣ末端部を含む、請求項１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項１５】
前記ＪＣκ配列がＮ末端伸長部を含む、請求項１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項１６】
前記Ｖκ様配列がＣ末端部を含み、前記ＪＣκ配列がＮ末端伸長部を含む、請求項１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項１７】
前記Ｖκ様配列がＣ末端部を欠き、前記ＪＣκ配列がＮ末端伸長部を欠く、請求項１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項１８】
前記抗体重鎖配列が完全長抗体重鎖又はその断片である、請求項１２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項１９】
前記抗体重鎖配列が完全長抗体重鎖又はその断片である、請求項１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項２０】
前記Ｖκ様配列及び前記ＪＣκ配列が互いに共有結合している、請求項１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項２１】
前記結合が直接融合である、請求項２０に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項２２】
前記結合が異種リンカーを介する、請求項２０に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項２３】
前記異種リンカーが未変性ポリペプチドの配列又はその断片を含む、請求項２２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項２４】
前記異種リンカーが治療用ポリペプチドの配列又はその断片を含む、請求項２２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項２５】
前記異種リンカーが抗体配列を含む、請求項２２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項２６】
前記抗体配列が抗体の軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を含む、請求項２５に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項２７】
前記抗体の軽鎖配列及び重鎖配列が抗原に結合することができる、請求項２６に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項２８】
前記抗原が、前記構築物が結合する前記標的とは異なる、請求項２７に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項２９】
前記Ｖκ様配列及び／又は前記ＪＣκ配列に共有結合した抗体の少なくとも１個の抗原結合領域を含む、請求項１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項３０】
二機能性である、請求項２９に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項３１】
三機能性である、請求項２９に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項３２】
前記Ｖκ様配列がＣ末端部を含み、前記ＪＣκ配列がＮ末端伸長部を含む、請求項１に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項３３】
前記Ｃ末端部及び／又は前記Ｎ末端伸長部が異種分子に結合した、請求項３２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項３４】
前記異種分子がペプチド又はポリペプチドである、請求項３３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項３５】
同じ結合特異性を有する抗体よりも改善された薬物動態プロファイルを有する、請求項１２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項３６】
同じ結合特異性を有する抗体よりも改善された効力を有する、請求項１２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項３７】
同じ標的に結合する抗体よりも改善された特異性を有する、請求項１２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
【請求項３８】
請求項１に記載のκ様ＳＬＣ構築物のコレクションを含む、ライブラリー。
【請求項３９】
ディスプレイの形の請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４０】
前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ、及びマイクロビーズディスプレイからなる群より選択される、請求項３９に記載のライブラリー。
【請求項４１】
前記ディスプレイがファージディスプレイである、請求項４０に記載のライブラリー。
【請求項４２】
抗体配列のコレクションを更に含む、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４３】
前記抗体配列が重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む、請求項４２に記載のライブラリー。
【請求項４４】
Ｖκ様配列のコレクションを含む、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４５】
前記Ｖκ様配列のコレクションが、そのＣＤＲ配列及び／又はＣ末端配列が異なるＶκ様配列変異体を含む、請求項４４に記載のライブラリー。
【請求項４６】
ＪＣκ配列のコレクションを含む、請求項３８に記載のライブラリー。
【請求項４７】
前記ＪＣκ配列のコレクションが、そのＮ末端伸長部が異なるＪＣκ配列変異体を含む、請求項４６に記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗体代替κ軽鎖配列を含む、構築物及びライブラリーに関する。特に、本発明は、例えば抗体重鎖及び／又は軽鎖ドメイン配列などの別のポリペプチドと場合によっては組み合わされた抗体代替（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）κ軽鎖配列を含む構築物、並びにそれを含むライブラリーに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂリンパ球によって産生される抗体（Ｉｇ）分子は、重（Ｈ）鎖と軽（Ｌ）鎖で構成される。Ｈ鎖及びＬ鎖のアミノ末端ドメインのアミノ酸配列は、特に抗原結合部位を形成する３つの超可変領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）において、可変である（ＶＨ及びＶＬ）。Ｈ鎖とＬ鎖の会合体は、Ｌ鎖の定常領域（ＣＬ）と重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）とのジスルフィド結合及びＶＨドメインとＶＬドメインの非共有結合性相互作用によって安定化される。
【０００３】
Ｂリンパ球発生の様々な段階は、Ｉｇ遺伝子座の再配列状態によって特徴づけられる（例えば、非特許文献１参照）。ヒト及びマウスなどの多数の動物においては、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、Ｖ領域の一部をコードする遺伝子断片の段階的な体細胞再配列によって明確な秩序のある様式で組み立てられ、μ重鎖がκ及びλ軽鎖に先行する（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
【０００４】
軽鎖（ＬＣ）再配列は、λ５及びＶｐｒｅＢ分子で構成される２本の共有結合した代替軽鎖（ＳＬＣ）と併せて２本のμ重鎖（μＨＣ）によって形成されるプレＢ細胞受容体（プレＢＣＲ）を介して駆動されるシグナルによって惹起されることが知られている。すなわち、Ｂ細胞の前駆体（プレＢ細胞）は、μ重鎖を産生するリンパ球として骨髄中で特定されたが、十分に発達した軽鎖の代わりに、それぞれＶｐｒｅＢ（１−３）及びλ５と呼ばれる１組のＢ系譜特異的遺伝子を発現する。
【０００５】
ヒトＶｐｒｅＢ１（ＣＡＧ３０４９５）の主アイソフォームは、１４５ａａ長鎖ポリペプチドである。１４５ａａ長鎖ポリペプチドは、ＩｇＶドメイン様構造を有するが、典型的なＶドメインの最後のβ鎖（β７）を欠き、他のいかなるタンパク質とも配列相同性を示さないカルボキシ末端を有する。ＶｐｒｅＢ２は、１４２アミノ酸マウスＶｐｒｅＢ２ポリペプチド（Ｐ１３３７３）及びマウスＶｐｒｅＢ２配列の１７１アミノ酸長スプライスバリアント（ＣＡＡ０１９６４ｌ）を含めて、幾つかのアイソフォームを有する。ＶｐｒｅＢ１及びＶｐｒｅＢ２配列は、特許文献１及び特許文献２、非特許文献５、及び非特許文献６に開示されている。ヒトＶｐｒｅＢ３の主アイソフォームは、非特許文献５に開示された１２３ａａ長鎖タンパク質（ＣＡＧ３０４９６）である。
【０００６】
ＶｐｒｅＢ（１−３）は、別のタンパク質λ５と非共有結合している。ヒトλ５は、抗体軽鎖と高い相同性を有するＩｇＣドメイン様構造と、そのアミノ末端方向に２つの機能的に異なる領域とを有する、２０９アミノ酸ポリペプチド（ＣＡＡ０１９６２）である。２つの機能的に異なる領域の一方は、Ｖλドメインのβ７鎖と高い相同性を示す。ヒトλ５様タンパク質は、２１３個のアミノ酸を有し（ＮＰ＿０６４４５５）、抗体λ軽鎖定常領域と約８４％の配列相同性を示す。
【０００７】
更なる詳細については、以下の総説を参照されたい。Ｋａｒａｓｕｙａｍａら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６３：１−４１（１９９６）、Ｍｅｌｃｈｅｒｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １４：６０−６８（１９９３）、及びＭｅｌｃｈｅｒｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：２５７１−２５７３（１９９９）。
【０００８】
ＶｐｒｅＢとλ５ポリペプチドは一緒に、代替軽鎖又は偽軽鎖と呼ばれる非共有結合されたＩｇ軽鎖様構造を形成する。初期のプレＢ細胞の表面では、代替軽鎖は、シグナル伝達物質ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂヘテロ二量体に付随して膜結合性Ｉｇμ重鎖とジスルフィド結合して、Ｂ細胞受容体様構造であるプレＢ細胞受容体（ｐｒｅ−ＢＣＲ）を形成する。
【０００９】
興味深いことに、Ｂ細胞前駆体の成熟、細胞表面発現及びμ重鎖のシグナル伝達（λＨＣ）は、λ５発現の非存在下でさえも認められた。すなわち、代替軽鎖欠失マウス及び代替軽鎖ノックアウトマウスは、依然として抗体を産生できることが報告され、Ｂ細胞発生の代替経路が示唆された（例えば、Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｃｅｌｌ  ６９：８２３−３１（１９９２）；Ｒｏｌｉｎｋら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：１２８４−８（１９９３）；Ｓｃｈｕｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：３３４３−７（２００３）；Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：４５３−６０（１９９９）；Ｍｕｎｄｔら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９３：４３５−４５（１９９１）；Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８：６２８６−９３（２００２）参照）。
【００１０】
κ様Ｂ細胞受容体（κ様ＢＣＲ）は、κ様代替軽鎖（κ様ＳＬＣ）を利用して、特定された（Ｆｒａｎｃｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５９３７−４３（１９９４）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８：３０５−１１（１９９８）；Ｒａｎｇｅｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：１７８０７−１４（２００５））。
【００１１】
Ｒａｎｇｅｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０（１８）：１７８０７−１７８１４（２００５）は、非再配列Ｖκ遺伝子の産物であるＶκ様タンパク質の特定及び分子特性解析を報告し、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８：３０５−３１１（１９９８）によって以前に報告されたｃＤＮＡ配列と同一であることが判明した。一方、Ｆｒａｎｃｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５９３７−４３（１９９４）は、Ｂ細胞前駆体表面でμ重鎖に結合する能力を有し、それによってＢ細胞発生のλ５経路の代替経路をもたらす、再配列生殖系列ＪＣｋの特定及び分子特性解析を報告した。
【００１２】
κ様ｐｒｅ−ＢＣＲとλ様ｐｒｅ−ＢＣＲは協調して働き、軽鎖再配列を促進し、Ｂ細胞前駆体を確実に成熟させることが提案された。総説については、ＭｃＫｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｖａｌｄｅｚ  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８：４０４３（２００６）を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０２６９１２７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，１８２，２０５号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｆ．＆Ｒｏｌｉｎｋ，Ａ．，Ｂ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，１９９９，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｐｈｉａ
【非特許文献２】Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＰＤ  ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒ  ＭＤ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）９：２３９〜４４
【非特許文献３】Ａｌｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ（１９９２）１３：３０６〜１４
【非特許文献４】Ｂａｓｓｉｎｇら、Ｃｅｌｌ（２００２）１０９  Ｓｕｐｐｌ．：Ｓ４５〜５５
【非特許文献５】Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．（２００４）５（１０）：Ｒ８４
【非特許文献６】Ｈｏｌｌｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６（１４）：５５５２〜５５５６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一態様においては、本発明は、Ｖκ様及び／又はＪＣκ配列を含む、κ様代替軽鎖（ＳＬＣ）構築物に関する。
【００１６】
種々の実施形態においては、κ様ＳＬＣ構築物は、Ｖκ様配列、又はＪＣκ配列、又はＶκ様配列とＪＣκ配列の両方を含む。
【００１７】
すべての実施形態においては、κ様ＳＬＣ構築物は、標的に特異的に結合する能力を有し得る。
【００１８】
種々の更なる実施形態においては、κ様ＳＬＣ構築物において、Ｖκ様配列は、シグナル配列を有する若しくは有さないかつＣ末端部（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔａｉｌ）を有する若しくは有さない配列番号２又はその断片を含み、又は配列番号２のＮ末端シグナルペプチド（アミノ酸１〜２０）を含み、配列番号２内からのＣ末端部の少なくとも一部を更に含み得る。
【００１９】
特定の一実施形態においては、Ｖκ様配列は、シグナル配列を有する若しくは有さないかつＣ末端部を有する若しくは有さない配列番号７〜１８又はその断片を含む群より選択される。
【００２０】
別の実施形態においては、本明細書に記載のκ様ＳＬＣ構築物において、ＪＣκ配列は、Ｎ末端伸長部を有する若しくは有さない配列番号４又はその断片を含み、又はＮ末端伸長部を有する若しくは有さない配列番号１９〜２３又はその断片からなる群より選択される配列を含む。
【００２１】
すべての実施形態において、κ様ＳＬＣ構築物は、抗体重鎖配列に結合し得る。
【００２２】
別の実施形態においては、κ様ＳＬＣ構築物において、Ｖκ様配列はＣ末端部を含む。
【００２３】
更なる実施形態においては、κ様ＳＬＣ構築物において、ＪＣκ配列はＮ末端伸長部を含む。
【００２４】
更に別の一実施形態においては、本明細書に記載のκ様ＳＬＣ構築物において、Ｖκ様配列はＣ末端部を含み、ＪＣκ配列はＮ末端伸長部を含む。
【００２５】
異なる一実施形態においては、Ｖκ様配列はＣ末端部を欠き、ＪＣκ配列はＮ末端伸長部を欠く。
【００２６】
すべての実施形態においては、構築物が抗体重鎖配列に結合又は連結される場合、抗体重鎖配列は完全長抗体重鎖又はその断片であり得る。
【００２７】
一実施形態においては、κ様ＳＬＣ構築物において、Ｖκ様配列とＪＣκ配列は、直接融合（）、及び異種リンカーを介した結合を含めて、ただしそれだけに限定されないが、互いに共有結合している。異種リンカーは、例えば、未変性（ｎａｔｉｖｅ）ポリペプチドの配列又はその断片、かかる治療用ポリペプチドの配列又はその断片を含み得る。
【００２８】
別の一実施形態においては、異種リンカーは、抗体重鎖及び／又は軽鎖の可変及び／又は定常領域配列を含み得る抗体配列を含む。
【００２９】
特定の一実施形態においては、抗体の軽鎖配列及び重鎖配列は、存在するときには、前記構築物が結合する標的と同じでも異なってもよい抗原に結合することができる。
【００３０】
したがって、例えば、本明細書に記載の構築物は、二機能性、三機能性又は一般に多機能性であり得る。
【００３１】
別の実施形態においては、Ｖκ様配列はＣ末端部を含み、ＪＣκ配列はＮ末端伸長部を含み、その一方又は両方は、例えばペプチド、ポリペプチドなどの異種分子に結合していてもよい。
【００３２】
すべての実施形態においては、κ様ＳＬＣ構築物は、同じ定性的結合特異性を有する抗体よりも改善された薬物動態プロファイル及び／又は効力、及び／又は他の改善された機能的諸性質を有し得る。
【００３３】
別の一態様においては、本発明は、本明細書に記載のκ様ＳＬＣ構築物のコレクションを含むライブラリーに関する。
【００３４】
ライブラリーは、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ、マイクロビーズディスプレイなどのディスプレイの形であり得る。
【００３５】
さらに、ライブラリーは、抗体重鎖及び／又は軽鎖配列などの抗体配列のコレクションを含み得る。
【００３６】
別の実施形態においては、ライブラリーはＶκ様配列のコレクションを含み、Ｖκ様配列コレクションは、そのＣＤＲ配列及び／又はＣ末端配列が異なるＶκ様配列変異体を含み得る。
【００３７】
更なる実施形態においては、ライブラリーはＪＣκ配列のコレクションを含むことができ、ＪＣκ配列コレクションは、そのＮ末端伸長部が異なるＪＣκ配列変異体を含み得る。
【００３８】
すべての実施形態においては、可変領域配列を含む抗体重鎖が存在するとき、本発明のポリペプチド、及び抗体重鎖可変領域配列は、同じ又は異なる標的に結合し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＶｐｒｅＢ１ドメインのＣＤＲ類似領域及びＣ末端部がかなりの距離に及ぶことを示す図である。薄灰色：ＣＤＲ残基；濃灰色：フレームワーク残基。
【図２】ヒトＶκ様核酸のヌクレオチド配列（配列番号１）及びコードされたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】ヒトＪＣκ核酸のヌクレオチド配列（配列番号３）及びコードされたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
【図４】κ様代替軽鎖（ＡＪ００４９５６Ｖκ様、配列番号２及びＡＡＢ３２９８７ヒトＪＣκ、配列番号４）とヒトＩｇ可変及び定常κ軽鎖（ＶκＩＶ＿Ｂ３、配列番号５；定常カッパ、配列番号６）とのアラインメントを示す図である。Ｖκ様は、非再配列ＶκＩＶ遺伝子ファミリーメンバーであるが、独特のＣ末端伸長部を有する。ＪＣκは、カッパＪ及び定常領域と同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を共有するが、独特のＮ末端を有する。ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は保存されているが、ＣＤＲ３は分断されている。
【図５】種々のヘテロ二量体代替κ軽鎖欠失変異体の略図である。「完全長」構築物においては、Ｖκ様とＪＣκ配列の両方は、それぞれＣ及びＮ末端伸長部（尾部）を保持する。ｄＪ変異体においては、ＪＣκのＮ末端伸長部は欠失している。ｄＶκ尾部変異体においては、Ｖκ様配列のＣ末端伸長部は除去されているが、ＪＣκのＮ末端伸長部は保持されている。「短鎖カッパ」変異体においては、Ｖκ様配列のＣ末端部とＪＣκ配列のＮ末端伸長部の両方が保持されている。
【図６】個々に、又は抗体重鎖若しくはその断片などの別のタンパク質と一緒に、使用することができるκ様軽鎖欠失及び単鎖構築物を示す図である。
【図７】コンビナトリアル機能的多様性をκ様代替軽鎖構築物に組み入れた図である。赤線は、ペプチドライブラリーなどの付加された多様性を示す。
【図８】軽鎖が遺伝子再配列及びＲＮＡプロセシングの産物であることを示す図である。
【図９】Ｖκ様タンパク質が非再配列ＶκＩＶ遺伝子転写及び翻訳に由来することを示す図である。ＶκＩＶは、７１種類のＶＬ生殖細胞遺伝子の一つである。Ｖκ様タンパク質を産生する能力を有するさらに７０種類のＶＬ生殖細胞遺伝子が存在するので、さらに３９種類のκＶ遺伝子及びさらに３１種類のλＶ遺伝子が存在する。
【図１０】ＡＪ００４９５６Ｖκ様原型配列（配列番号２）と整列された異なる長さの伸長部（配列番号７〜１８）を各々が有する、すべてのＶκファミリーから考えられるＶκ様タンパク質の予測アミノ酸配列を示す図である。
【図１１】ＪＣκが非再配列Ｊ及びＣ生殖系列由来のプロセシングされたＲＮＡの産物であることを示す図である。ＪＣκは、４５種類のＪＣ生殖系列組合せの一つである。ＪＣκ様タンパク質を産生する能力を有するさらに４４種類のＶＬ生殖細胞遺伝子が存在する（Ｃκと組み合わせられるさらに４種類のＪκ遺伝子、及び１０種類のＣλ遺伝子と組み合わせられる４種類のＪλ遺伝子（合計４０種類））。
【図１２】残留カッパＪ定常領域再配列由来の予測ＪＣκ様（Ｊ１−Ｊ５Ｃκ）（配列番号１９〜２３）を示す図である。
【図１３】κ様代替軽鎖成分に機能性を付加する模式図である。二機能性及び三機能性構造を示す。Ａ：ｓｃＦｖ束縛融合、Ｂ：Ｖκ様ｓｃＦｖ融合、Ｃ：ＪＣκｓｃＦｖ融合、Ｄ：ＳＬＣ二重融合。
【図１４】説明のための代替軽鎖機能的尾部伸長部タイプを示す図である。
【図１５】説明のための代替軽鎖ＧＬＰ−１融合体を示す図である。
【図１６】説明のためのκ様及びλ様代替軽鎖機能的キメラを示す図である。
【図１７】ヒトＶｐｒｅＢ１（配列番号３０）、マウスＶｐｒｅＢ２（配列番号３１）、ヒトＶｐｒｅＢ３（配列番号３３）、ヒトλ５配列（配列番号３４）及びヒトλ５様配列（配列番号３５）のアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
Ａ．定義
特に断らない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）は、本願で使用する用語の多くに対する一般的指針を当業者に提供する。
【００４１】
当業者は、本発明の実施において使用することができる、本明細書に記載の方法及び材料と類似した、又は等価である、多数の方法及び材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載の方法及び材料に決して限定されない。本発明では、下記の用語を以下で定義する。
【００４２】
「κ様代替軽鎖可変ドメイン」、「Ｖκ様ＳＬＣ」及び「Ｖκ様」という用語は、区別なく使用され、非再配列Ｖκ遺伝子の産物である任意の未変性配列ポリペプチド、及びその変異体を指す。未変性配列「Ｖκ様」ポリペプチドとしては、具体的に、図２に示すヒトκ様ポリペプチドＡＪ００４９５６（配列番号２）、及び図１０に示すヒトＶκ様ポリペプチド（配列番号７〜１８）、並びに非ヒト哺乳動物種における、特に、げっ歯類、例えばマウス及びラット、非ヒト高等霊長類など、ヒトのように、主に遺伝子再配列及び／又は超変異によって抗体多様性を生じる種における、ホモログが挙げられるが、それだけに限定されない。一実施形態においては、未変性配列Ｖκ様ポリペプチドの変異体は、抗体κ軽鎖配列に対するＣ末端伸長部（尾部）を含む。特定の一実施形態においては、未変性配列Ｖκ様ポリペプチドの変異体は、Ｖκ様ポリペプチドを対応する抗体κ軽鎖から識別する独特のＣ末端伸長部（尾部）の少なくとも一部、好ましくは全部を保持する。別の一実施形態においては、変異体Ｖκ様ポリペプチドのＣ末端部は、配列の残部に天然には付随しない配列である。後者の実施形態においては、未変性Ｖκ様配列中に天然に存在するＣ末端部と変異体配列との相違は、１個以上のアミノ酸変化（置換、挿入、欠失及び／又は付加）から生じ得、又はＣ末端部は、異なるＶκ様タンパク質中に天然に存在する尾部と同一であり得る。したがって、例えば、図１０に記載のＶκ様タンパク質（配列番号２及び７〜１８）のいずれかにおいては、（図１０において「翻訳伸長部」と称する）Ｃ末端伸長部は、別のＶκ様タンパク質のＣ末端伸長部で置換することができ、及び／又は任意の天然のＣ末端伸長部配列とは異なるように改変し得る。その代わりに、又はそれに加えて、未変性配列Ｖκ様ポリペプチドの変異体は、未変性抗体κ可変ドメイン配列と同一である配列の一部に、特にかかる配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／又はフレームワーク残基の１個以上に、１個以上のアミノ酸変化を含み得る。したがって、Ｖκ様ポリペプチドは、抗体κ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１個以上に対応する領域にアミノ酸変化を含み得る。すべての場合において、変異体は、未変性抗体κ軽鎖可変領域配列に対して少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７、又は少なくとも８、又は少なくとも９、又は少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは４〜１００、又は４〜９０、又は４〜８０、又は４〜７０、又は４〜６０、又は４〜５０、又は４〜４５、又は４〜４０、又は４〜３５、又は４〜３０、又は４〜２５、又は４〜２０、又は４〜１５、又は４〜１０個のアミノ酸残基のＣ末端伸長部を含むことができ、好ましくは含む。本明細書に定義するように、Ｖκ様ポリペプチド変異体は、未変性抗体κ若しくはλ軽鎖配列又はその断片とは異なり、好ましくは、未変性配列Ｖκポリペプチドと少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の配列相同性を保持する。別の好ましい一実施形態においては、Ｖκ様ポリペプチド変異体は、そのアミノ酸配列において、未変性抗体λ又はκ軽鎖配列と９５％未満、又は９０％未満、又は８５％未満、又は８０％未満、又は７５％未満、又は７０％未満、又は６５％未満、又は６０％未満、又は５５％未満、又は５０％未満、又は４５％未満、又は４０％未満同一である。別の実施形態においては、配列相同性は、約４０％から約９５％、又は約４５％から約９０％、又は約５０％から約８５％、又は約５５％から約８０％、又は約６０％から約７５％、又は約６０％から約８０％、又は約６５％から約８５％、又は約６５％から約９０％、又は約６５％から約９５％である。すべての実施形態においては、好ましくは、Ｖκ様ポリペプチドは標的に結合する能力を有する。
【００４３】
「ＪＣκ」と「ＪＣκ様」という用語は、区別なく使用され、未変性配列κＪ定常（Ｃ）領域セグメントと同一である部分と独特のＮ末端伸長部（尾部）とを含む未変性配列ポリペプチド、及びその変異体を指す。未変性配列ＪＣκ様ポリペプチドとしては、図３及び４に示すＡＡＢ３２９８７ヒトＪＣκポリペプチド（配列番号４）、及び図１２に示すＪＣκ様ポリペプチド（配列番号１９〜２３）、並びに非ヒト哺乳動物種における、特に、げっ歯類、例えばマウス及びラット、非ヒト高等霊長類など、ヒトのように、主に遺伝子再配列及び／又は超変異によって抗体多様性を生じる種における、ホモログが挙げられるが、それだけに限定されない。一実施形態においては、未変性配列ＪＣκ様ポリペプチドの変異体は、該変異体を抗体ＪＣセグメントから識別するＮ末端伸長部（尾部）を含む。特定の一実施形態においては、未変性配列ＪＣκ様ポリペプチドの変異体は、ＪＣκ様ポリペプチドを対応する抗体κ軽鎖ＪＣセグメントから識別する独特のＮ末端伸長部（尾部）の少なくとも一部、好ましくは全部を保持する。別の一実施形態においては、変異体ＪＣκ様ポリペプチドのＮ末端部は、配列の残部に天然には付随しない配列である。後者の実施形態においては、未変性ＪＣκ様配列中に天然に存在するＮ末端部と変異体配列との相違は、１個以上のアミノ酸変化（置換、挿入、欠失及び／又は付加）から生じ得、又はＮ末端部は、異なるＪＣκ様タンパク質中に天然に存在する末端部と同一であり得る。したがって、例えば、図１２に記載のＪＣκ様タンパク質のいずれかにおいては、Ｎ末端伸長部は、別のＪＣκ様タンパク質のＮ末端伸長部で置換することができ、及び／又は任意の天然のＮ末端伸長部配列とは異なるように改変し得る。その代わりに、又はそれに加えて、未変性配列ＪＣκ様ポリペプチドの変異体は、未変性抗体κ可変ドメインＪＣ配列と同一である配列の一部に、１個以上のアミノ酸変化を含み得る。すべての場合において、変異体は、未変性抗体κ軽鎖ＪＣ配列に対して少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７、又は少なくとも８、又は少なくとも９、又は少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは４〜１００、又は４〜９０、又は４〜８０、又は４〜７０、又は４〜６０、又は４〜５０、又は４〜４５、又は４〜４０、又は４〜３５、又は４〜３０、又は４〜２５、又は４〜２０、又は４〜１５、又は４〜１０個のアミノ酸残基のＮ末端伸長部（独特のＮ末端）を含むことができ、好ましくは含む。本明細書で定義するＪＣκ様ポリペプチド変異体は、未変性抗体λ若しくはκ軽鎖ＪＣ配列又はその断片とは異なり、好ましくは、未変性配列ＪＣポリペプチドと少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の配列相同性を保持する。別の好ましい一実施形態においては、ＪＣκ様ポリペプチド変異体は、そのアミノ酸配列において、未変性抗体λ又はκ軽鎖ＪＣ配列と９５％未満、又は９０％未満、又は８５％未満、又は８０％未満、又は７５％未満、又は７０％未満、又は６５％未満、又は６０％未満同一である。別の実施形態においては、配列相同性は、約４０％から約９５％、又は約４５％から約９０％、又は約５０％から約８５％、又は約５５％から約８０％、又は約６０％から約７５％、又は約６０％から約８０％、又は約６５％から約８５％、又は約６５％から約９０％、又は約６５％から約９５％である。
【００４４】
アミノ酸配列相同率は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いて決定することができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードすることができ、又はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから入手することができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、幾つかの検索パラメータを使用し、検索パラメータのすべては、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝ｙｅｓ、ｓｔｒａｎｄ＝ａｌｌ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓ＝１０、ｍｉｎｉｍｕｍ  ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｌｅｎｇｔｈ＝１５／５、ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ  ｅ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉ−ｐａｓｓ＝２５、ｄｒｏｐｏｆｆ  ｆｏｒ  ｆｉｎａｌ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝２５、及びｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含めて、デフォルト値に設定される。
【００４５】
「κ様」代替軽鎖配列は、場合によっては、異種アミノ酸配列又は任意の他の異種成分と複合化して、本明細書に記載の「κ様代替軽鎖構築物」を形成し得る。したがって、「κ様代替軽鎖構築物」という用語は、最も広い意味で使用され、κ様代替軽鎖配列と複合化される異種アミノ酸配列、核酸及び他の分子を含めて、任意のすべての追加の異種成分を含む。ここで、「複合化」は後で定義する。好ましい一実施形態においては、「κ様代替軽鎖配列」は、標的に結合する能力を有する。好ましい一実施形態においては、「κ様」代替軽鎖配列は、ＪＣκ様配列及び／又は抗体重鎖配列又はその断片と非共有結合又は共有結合する。共有結合は、直接融合だけでなく、リンカーを介した連結も含む。したがって、例えば、Ｖκ様及びＪＣκ様配列は、抗体軽鎖及び／又は重鎖可変領域配列を介して連結し得る。
【００４６】
「ＶｐｒｅＢ」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、任意の未変性配列又は変異体ＶｐｒｅＢポリペプチドを指し、具体的には、配列番号３０のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号３１及び３２のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号３３のヒトＶｐｒｅＢ３、スプライスバリアント及び翻訳後修飾によって形成される変異体を含めたアイソフォーム、その別の哺乳動物の相同体、特にヒトのように主に遺伝子再配列及び／又は超変異によって抗体多様性を生じる、げっ歯類、例えばマウス及びラットなどの哺乳動物における相同体、並びにかかる未変性配列ポリペプチドの変異体が挙げられるが、それだけに限定されない。
【００４７】
「λ５」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、任意の未変性配列又は変異体λ５ポリペプチドを指し、具体的には、配列番号３４のヒトλ５、配列番号３５のヒトλ５様タンパク質、スプライスバリアント及び翻訳後修飾によって形成される変異体を含めたそのアイソフォーム、その別の哺乳動物の相同体、特にヒトのように主に遺伝子再配列及び／又は超変異によって抗体多様性を生じる、げっ歯類、例えばマウス及びラットなどの哺乳動物における相同体、並びにかかる未変性配列ポリペプチドの変異体が挙げられるが、それだけに限定されない。
【００４８】
本発明のポリペプチドに関連して、第１のアミノ酸配列に対する「異種アミノ酸配列」という用語は、第１のアミノ酸配列に天然には付随しない、少なくとも本明細書に記載のκ様代替軽鎖構築物中に存在する形ではない、アミノ酸配列を指すのに使用される。したがって、Ｖκ様ポリペプチドに対する「異種アミノ酸配列」は、Ｖκ様配列と一緒にアミノ酸配列変異体、例えば短縮及び／又は誘導体化配列などのκ様代替軽鎖を形成するＪＣκ配列とは異なるＪＣκ配列を含めて、ただしそれだけに限定されない、その自然環境において未変性Ｖκ様ポリペプチドに付随しない任意のアミノ酸配列である。Ｖκ様ポリペプチドに対する「異種アミノ酸配列」は、その自然環境においては、ＶκＩＶとＪＣκ配列が互いに共有結合、例えば融合していないので、未変性配列ＪＣκを含むＶκ様ポリペプチドに共有結合した、例えば融合した、ＪＣκ配列も含む。さらに、ＪＣκ配列に対する「異種アミノ酸配列」は、ＪＣκ配列がその自然環境では結合しない任意のＶκ様ポリペプチド配列であり得る。Ｖκ様とＪＣκ配列の両方に対する更なる代表的な「異種アミノ酸配列」としては、未変性及び変異体のＶｐｒｅＢ及びλ５配列、並びに抗体軽鎖及び重鎖の可変及び定常領域配列が挙げられる。一般に、本発明は、古典的な軽鎖アミノ酸配列とは異なる異種アミノ酸配列を提供する。例えば、異種アミノ酸配列は、古典的な軽鎖のＶ−Ｊ結合を含まない。
【００４９】
「複合体」、「複合型」及び「複合化」という用語は、共有又は非共有結合の任意及びすべての形態を指し、直接の遺伝子又は化学融合、リンカー又は架橋剤を介したカップリング、及び例えばファンデルワールス力を介した、又はロイシンジッパーを用いた、非共有結合を含むが、それだけに限定されない。
【００５０】
「融合」という用語は、１本のポリペプチド鎖中の異なる起源のアミノ酸配列の、それらのコードヌクレオチド配列のインフレームの組合せによる、組合せを指すのに本明細書では使用される。「融合」という用語は、その末端の１つとの融合に加えて、内部の融合、すなわち、ポリペプチド鎖内の異なる起源の配列の挿入を明示的に包含する。
【００５１】
本明細書では「標的」という用語は、本明細書に記載のポリペプチドと相互作用する物質である。本明細書で定義する標的としては、本発明のＶκＩＶ又はＪＣκ含有構築物が相互作用する抗原が具体的に挙げられる。好ましくは、相互作用は直接結合によって生じる。
【００５２】
本明細書では「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語はすべて、共有結合性「ペプチド結合」によって連結されたアミノ酸の一次配列を指す。一般に、ペプチドは、少数のアミノ酸、典型的には約２から約５０個のアミノ酸からなり、タンパク質よりも短い。本明細書では「ポリペプチド」という用語は、ペプチド及びタンパク質を包含する。
【００５３】
「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」という用語は、典型的には、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択されるアミノ酸など、その分野で認められた定義を有するアミノ酸を指す。ただし、修飾、合成又は希少アミノ酸を所望のとおりに使用することができる。したがって、３７ＣＦＲ１．８２２（ｂ）（４）に記載の修飾及び異常アミノ酸は、この定義に具体的に含まれ、参照により本明細書に明確に援用される。アミノ酸は、種々の亜群に細分することができる。すなわち、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）、負に帯電した側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、正に帯電した側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、又は無電荷の極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）を有するとして分類することができる。アミノ酸は、低分子アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ）、求核性アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ）、疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、アミド（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）及び塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）として分類することもできる。
【００５４】
「ポリヌクレオチド（単数又は複数）」という用語は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、その類似体（例えば、ヌクレオチド類似体又は核酸化学反応を用いて作製される、ＤＮＡ又はＲＮＡ）などの核酸を指す。所望のとおりに、ポリヌクレオチドは、例えば当分野で認められた核酸化学反応を用いて、合成的に作製することができ、又は例えばポリメラーゼを用いて、酵素的に作製することができ、必要に応じて修飾することができる。典型的な修飾としては、メチル化、ビオチン化、及び当分野で公知の他の修飾が挙げられる。また、核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよく、所望であれば、検出可能な成分と連結することができる。
【００５５】
基準ポリペプチドに対する「変異体」という用語は、未変性ポリペプチドに比べて少なくとも１個のアミノ酸変異又は修飾（すなわち、改変）を有するポリペプチドを指す。「アミノ酸修飾」によって生成される変異体は、例えば、未変性アミノ酸配列中の少なくとも１個のアミノ酸を置換、欠失、挿入及び／又は化学修飾することによって作製することができる。
【００５６】
「アミノ酸修飾」とは、所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列変化を指す。例示的な修飾としては、アミノ酸置換、挿入及び／又は欠失が挙げられる。
【００５７】
「指定位置におけるアミノ酸修飾」とは、指定残基の置換若しくは欠失、又は指定残基に隣接した少なくとも１個のアミノ酸残基の挿入を指す。指定残基に「隣接した」挿入とは、その１から２個の残基内の挿入を意味する。挿入は、指定残基のＮ末端でもＣ末端でもよい。
【００５８】
「アミノ酸置換」とは、所定のアミノ酸配列における別の異なる「置換」アミノ酸残基による少なくとも１個の既存アミノ酸残基の置換を指す。置換残基（単数又は複数）は、「天然アミノ酸残基」（すなわち、遺伝コードによってコードされる）とすることができ、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択される。１個以上の非天然アミノ酸残基による置換は、本明細書に記載のアミノ酸置換の定義によっても包含される。
【００５９】
「非天然アミノ酸残基」とは、ポリペプチド鎖中の隣接アミノ酸残基（単数又は複数）に共有結合することができる、上記天然アミノ酸残基以外の残基を指す。非天然アミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及びＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１  ３３６（１９９１）に記載のものなどの他のアミノ酸残基類似体が挙げられる。かかる非天然アミノ酸残基を作製するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１８２（１９８９）及びＥｌｌｍａｎら、（上掲）の手順を使用することができる。手短に述べると、これらの手順は、非天然アミノ酸残基によってサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化し、続いてＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳することを含む。
【００６０】
「アミノ酸挿入」とは、所定のアミノ酸配列中への少なくとも１個のアミノ酸の組み込みを指す。挿入は、通常、１又は２個のアミノ酸残基の挿入からなるが、本願は、より大きい「ペプチド挿入」、例えば、約３から約５個、さらには最高約１０個のアミノ酸残基の挿入を企図する。挿入された残基（単数又は複数）は、上記天然又は非天然とすることができる。
【００６１】
「アミノ酸欠失」とは、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１個のアミノ酸残基の除去を指す。
【００６２】
「変異誘発」という用語は、別段の記載がない限り、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を変更する当分野で認められた任意の技術を指す。変異誘発の好ましいタイプとしては、誤りがちなＰＣＲ変異誘発、飽和変異誘発、又は他の部位特異的変異誘発が挙げられる。
【００６３】
「部位特異的変異誘発」は、当分野では標準的な技術であり、所望の変異に相当する限定されたミスマッチ以外は、変異誘発しようとする一本鎖ファージＤＮＡに相補的である合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施される。手短に述べると、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、一本鎖ファージＤＮＡに相補的である鎖の合成を誘導し、ファージを支持する宿主細菌に生成した二本鎖ＤＮＡを転換する。形質転換細菌の培養物を上層寒天に蒔き、ファージを宿す単細胞からプラークを形成させる。理論的には、新しいプラークの５０％は一本鎖として変異型を有するファージを含み、５０％は元の配列を有することになる。目的とするプラークは、完全一致のハイブリダイゼーションを可能にする温度であるが、元の鎖とのミスマッチがハイブリダイゼーションの阻止に十分である温度で、キナーゼ処理合成プライマーとハイブリッド形成することによって選択される。次いで、プローブとハイブリッド形成したプラークを選択し、配列を決定し、培養し、ＤＮＡを回収する。
【００６４】
本発明の状況において「抗体」（Ａｂ）という用語は、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子組換えに由来する古典的に組み換えられた重鎖とやはりＶＪ遺伝子組換えに由来する古典的に組み換えられた軽鎖とに由来する未変性抗体、又はその断片を指すのに使用される。
【００６５】
「未変性抗体」は、２本の同一軽（Ｌ）鎖と２本の同一重（Ｈ）鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、ジスルフィド結合数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖及び軽鎖は、規則的に間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く幾つかの定常ドメインを一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並び、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並ぶ。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの界面を形成すると考えられる（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）、Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５））。
【００６６】
抗体鎖に関連した「可変」という用語は、抗体間で配列が大きく異なり、その特定の抗原に対する特定の各抗体の結合及び特異性に関与する、抗体鎖の部分を指すのに使用される。かかる可変性は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方の超可変領域と称する３個のセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。未変性重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、４個のＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を各々含み、４個のＦＲは、主としてβシート形状をとり、３個の超可変領域によって連結される。３個の超可変領域は、βシート構造を連結するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって近位に共に保持され、他方の鎖の超可変領域と一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１），６４７−６６９頁参照）。定常ドメインは、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【００６７】
本明細書では「超可変領域」という用語は、抗原結合性を担う、抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」、すなわち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基３０〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）及び８６〜９６（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメイン中の３０〜３５（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）及び９３〜１０１（Ｈ３）（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−４５（１９９６））。
【００６８】
「フレームワーク領域」という用語は、より異なるＣＤＲ領域間に存在する、抗体可変領域の当分野で認められた部分を指す。かかるフレームワーク領域は、典型的には、フレームワーク１から４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）と称され、ＣＤＲが抗原結合性表面を形成できるように、重鎖又は軽鎖抗体可変領域中に存在する３個のＣＤＲを３次元空間に保持する足場を提供する。
【００６９】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を種々のクラスに帰属させることができる。５つの主要な抗体クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、その幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に更に分割することができる。
【００７０】
異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
【００７１】
任意の脊椎動物種に由来する抗体の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプの１つに帰属させることができる。本明細書に記載の抗体軽鎖という表記は常にκとλ軽鎖の両方を含む。
【００７２】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般に抗原結合又はその可変ドメインを含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、抗体断片から形成される線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、並びに一般に、ポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられるが、それだけに限定されない。
【００７３】
「単鎖Ｆｖ」、すなわち「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする、ＶＨドメインとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。単鎖抗体は、例えば、国際公開第８８／０６６３０号及び同９２／０１０４７号に開示されている。
【００７４】
二重特異性抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、短かすぎて同じ鎖上でこれら２個のドメインの対形成が不可能であるリンカーを用いることによって、これらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２個の抗原結合部位を生成させた、二価の二重特異的な抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４  ６４４８（１９９３）、及びＰｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１  １１２３（１９９４）参照）。
【００７５】
「ミニボディ」という用語は、８０ｋＤａの二価の二量体（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２に自己組織化するｓｃＦｖ−ＣＨ３融合タンパク質を指すのに使用される。
【００７６】
「アプタマー」という用語は、タンパク質標的に高い特異性及び親和性で結合する合成核酸リガンドを指すのに本明細書では使用する。アプタマーは、タンパク質機能の強力な阻害剤として知られる。
【００７７】
「Ａｆｆｉｂｏｄｙ」という用語は、ブドウ球菌性プロテインＡに由来するＺドメインの３ヘリックス足場に典型的には基づく、操作された標的特異的非免疫グロブリン結合タンパク質を指すのに使用される。５８アミノ酸Ｚドメインは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡ（ＳＰＡ）中の５個の相同ドメイン中の１個（Ｂドメイン）に由来する。ＳＰＡは、免疫グロブリンのＦｃ領域に強く結合する。Ｚは、ＩｇＧ含有樹脂を用いることによって組換えタンパク質の親和性精製のための安定化遺伝子融合相手として最初は開発された。ＳＰＡのＢドメインとＦｃ断片の複合物の構造によれば、結合性表面はヘリックス１及び２上に露出した残基からなるのに対して、ヘリックス３は結合に直接関与しない。Ａｆｆｉｂｏｄｙは、通常、典型的にはヘリックス１及び２のＦｃ結合性表面における１３個の残基が無作為化された、コンビナトリアルライブラリーから選択される。次いで、タンパク質を標的にした特異的結合剤は、所望の標的に対するファージディスプレイライブラリーのバイオパニングによって特定される。かかるＡｆｆｉｂｏｄｙは、種々の生化学アッセイ及び臨床応用において、免疫グロブリンの代替として使用することができる。
【００７８】
ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４  ５４６（１９８９））は、ＶＨドメイン又はＶＬドメインからなる。
【００７９】
本明細書では「抗体結合領域」という用語は、抗原（単数又は複数）に結合可能である、免疫グロブリン又は抗体可変領域の１個以上の部分を指す。典型的には、抗体結合領域は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体軽鎖（ＶＬ）（又はその可変領域）、抗体重鎖（ＶＨ）（又はその可変領域）、重鎖Ｆｄ領域、組合せ抗体軽鎖及び重鎖（又はその可変領域）、又は完全長抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ若しくはＩｇＭ抗体である。
【００８０】
本明細書では「エピトープ」という用語は、配列に応じて生成される抗体に単独で、又はより大きい配列の一部として、結合する配列を規定する、少なくとも約３から５、好ましくは少なくとも約５から１０、又は少なくとも約５から１５個のアミノ酸、典型的には約５００個以下、又は約１，０００個のアミノ酸の配列を指す。エピトープは、エピトープが由来する親タンパク質の部分と同一である配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは、常時変化した状態にあり、単離体間で比較的高度の可変性を示す。すなわち、「エピトープ」という用語は、未変性配列と同一である配列、並びに未変性配列における欠失、置換及び／又は挿入などの修飾を包含する。一般に、かかる修飾は、本質的に保存的であるが、非保存的修飾も企図される。この用語は、具体的には、「ミモトープ」、すなわち連続線状未変性配列を識別しないが、又は未変性タンパク質中に必ずしも存在しないが、未変性タンパク質上のエピトープを機能的に模倣する配列を含む。「エピトープ」という用語は、具体的には、線状及び配座エピトープを含む。
【００８１】
「ベクター」という用語は、細胞中で自己複製可能であり、ＤＮＡセグメント、例えば遺伝子又はポリヌクレオチドが、付着したセグメントが複製されるように作用可能に結合することができる、ｒＤＮＡ分子を指すのに使用される。１個以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導可能なベクターを本明細書では「発現ベクター」と称する。「制御配列」という用語は、特定の宿主生物において作動可能に結合したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に適切な制御配列としては、プロモーターが挙げられ、場合によってはオペレーター配列及びリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００８２】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれたときに、「作動可能に結合」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダー用のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合には、ポリペプチド用のＤＮＡに作動可能に結合している。また、プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列に作動可能に結合している。あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置する場合には、コード配列に作動可能に結合している。一般に、「作動可能に結合した」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接していること、また、分泌リーダーの場合、近接し、読み相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接していなくてもよい。結合は、好都合な制限酵素切断部位におけるライゲーションによって行われる。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを慣例的実務に従って使用する。
【００８３】
「ファージディスプレイライブラリー」は、クローン化タンパク質配列のコレクションをファージコートタンパク質との融合体として発現するタンパク質発現ライブラリーである。したがって、「ファージディスプレイライブラリー」という句は、本明細書では、ファージ（例えば、繊維状ファージ）のコレクションを指し、ファージは外部（典型的には異種）タンパク質を発現する。外部タンパク質は、ファージが接触する別の部分と自由に相互作用（結合）することができる。外部タンパク質をディスプレイする各ファージは、ファージディスプレイライブラリーの「メンバー」である。
【００８４】
「繊維状ファージ」という用語は、その表面の異種ポリペプチドをディスプレイする能力を有するウイルス粒子を指し、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１及びＭ１３を含むが、それだけに限定されない。繊維状ファージは、テトラサイクリンなどの選択マーカーを含むことができる（例えば、「ｆｄ−ｔｅｔ」）。種々の繊維状ファージディスプレイ系が当業者に周知である（例えば、Ｚａｃｈｅｒら、Ｇｅｎｅ９：１２７−１４０（１９８０），Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１３１５−１３１７（１９８５）及びＰａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ７３：３０５−３１８（１９８８）参照）。
【００８５】
「パニング」という用語は、抗体などの化合物を有するファージを、標的に対して高い親和性及び特異性で特定及び単離する、複数回のスクリーニングプロセスを指すのに使用される。
【００８６】
「ドミナントネガティブ」という用語は、本明細書では、親又は関連タンパク質の少なくとも幾つかの生物学的特性の拮抗物質として作用するポリペプチド変異体又はポリペプチド断片を指すのに使用される。
【００８７】
Ｂ．詳細な説明
本発明の方法を実施するための技術は当分野で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１、Ｏ’Ｂｒｉａｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｈｉｃｋｌｅ  ａｎｄ  Ｆｉｔｃｈ，ｅｄｓ．，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ：ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ，Ｔ．Ｒ．Ｇｌａｒｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，２０００、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００１、及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｇ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，ｅｄ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ，２００４を含めて、標準の実験室の教科書に記載されている。変異誘発は、例えば、部位特異的変異誘発によって実施することができる（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ８２：４８８−４９２（１９８５））。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９２号、同４，６８３，２０２号、同４，８００，１５９号及び同４，９６５，１８８号、並びに”ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら、ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を含めて、幾つかの教科書に記載されている。
【００８８】
本発明は、抗体代替軽鎖配列を含む、構築物及びライブラリーに関する。
【００８９】
Κ様代替軽鎖構築物
代替軽鎖（ＳＬＣ）は、発生途上のＢ細胞受容体の新生重鎖に自然に結合する発生的に制御されたポリペプチドである。重鎖及び代替軽鎖の研究は、時には、それらが自己抗原に結合し得ることを示すことがある。代替軽鎖を含むＢ細胞は耐容性が良好であり、通常条件下で循環しているのを見つけることができることは十分に証明されている。伸長によって、治療用ＶＨ代替軽鎖ヘテロメリックタンパク質は、より容易に自己抗原に結合することができ、治療薬として耐容性が良好であり得る。重要な特徴は、代替軽鎖が抗体軽鎖ではないことである。代替軽鎖は、２種類の分離したポリペプチドで明確に構成され、これらはその発現に対して古典的な軽鎖ＶＪ再配列を行わないが、それでも依然として古典的な抗体重鎖に結合する。
【００９０】
十分に記述されたラムダ様代替軽鎖が存在するが、更に別のＳＬＣ、具体的には代替カッパ様軽鎖の概念を支持する証拠も多数ある。これは、代替軽鎖ノックアウトマウスにおいて裏付けられている。代替軽鎖ノックアウトマウスは、依然として抗体産生能力を有し、それによってＢ細胞発生の代替経路が示唆される。一代替軽鎖候補はκ様軽鎖である。κ様軽鎖は、ＪＣκ融合遺伝子と組み合わされた生殖系列ＶκＩＶ遺伝子である。これらの遺伝子の各々においては、ペプチド性伸長部が、ＣＤＲ３に類似した部位の周囲に存在する。これら２種類のタンパク質は、ゲノムレベルでは再結合しないように見えるので、重鎖とそれらの結合は互いに相容れず、λ様代替軽鎖に対して記述される結合に類似している可能性がある。重要なことには、これらの遺伝子に見られるペプチド伸長部は、更なる多様性又は機能性を組み入れる機会を与える。
【００９１】
Ｖκ様遺伝子とＪＣκ様遺伝子は、互いに独立に代替軽鎖として機能することができるタンパク質をコードするので、本発明のκ様代替軽鎖構築物は、具体的に、ＪＣκ様配列なしにＶκ様配列、及びＶκ様配列なしにＪＣκ様配列を含む構築物を含む。
【００９２】
一態様においては、本発明は、Ｖκ様及び／又はＪＣκ配列を含み、標的に結合する能力を有する、構築物を提供する。標的は、例えば、Ｖκ様及び／又はＪＣκ配列の結合相手である任意のペプチド若しくはポリペプチド、又はかかる配列（単数又は複数）を含む構築物であり得る。標的は、具体的には、抗体結合に関連して「抗原」と一般に称されるすべてのタイプの標的を含む。
【００９３】
本発明のκ様代替軽鎖構築物がＶκ様とＪＣκ配列の両方を含むときには、２個の配列は、典型的には互いに融合しない独立したポリペプチドであるが、非共有結合することもでき、又はペプチドリンカー及び／又は抗体配列を含むリンカーなどの共有結合性リンカーによって互いに連結することもできる。
【００９４】
本発明の構築物は、ＶκＩＶ及び／又はＪＣκ配列と異種アミノ酸配列との複合体を含むが、それだけに限定されない。異種アミノ酸配列との結合は、共有結合でも非共有結合でもよく、直接的でも、ペプチドリンカーを含めたリンカーを介してでもよい。
【００９５】
その変異体及び断片を含めたＶκ様及び／又はＪＣκ配列の自由末端は、かかる配列のライブラリーに更なる多様性を組み入れるのに利用可能である。例えば、無作為ペプチドライブラリーを、これらの自由末端の１つに付加又は置換することができ、特定の標的との特異的結合に対してパニングすることができる。所望の結合特異性を有することが確認された代替軽鎖を同じ標的に対する重鎖又は重鎖断片と組み合わせることによって、２つの異なる場所の同起源の標的に結合する能力を有する分子を作製することができる。このタンデム結合又は「キレート」効果は、二量体免疫グロブリンで見られる結合活性効果と同様に、単一の標的への結合を強力に強化する。異なる標的に結合する成分を使用することも可能である。したがって、例えば、所望の結合特異性を有する代替軽鎖成分を、異なる標的に結合する抗体重鎖又は重鎖断片と組み合わせることができる。例えば、代替軽鎖成分を腫よう抗原に結合させ、抗体重鎖又は重鎖断片を効果細胞に結合させることができる。こうして、ターゲティング及び抗腫よう活性を有する単一体を作製することができる。特定の一実施形態においては、Ｖκ様及び／又はＪＣκ配列を連結する付加物（ａｐｐｅｎｄａｇｅ）又はポリペプチドは、抗体又はＦａｂ、ｓｃＦｖ断片などの抗体断片とすることができる。抗体配列の組み込みは、「キレート」効果を生じるだけでなく、二重特異性抗体で見られるものなどの第２の独立した腕を必要とせずに、単一の分子において二重特異性をもたらすこともできる。２つの特異性は、同じ標的の異なる部分、異なる標的、又は標的抗体複合物に対するものであり得る。
【００９６】
本明細書に記載のポリペプチド構築物の具体例としては、Ｖκ様及び／又はＪＣκ配列が抗体重鎖に結合したポリペプチド、又はその断片が挙げられる。Ｖκ様とＪＣκ配列の両方を含む具体的ヘテロ二量体構築物を図５に示す。図５に示すように、本発明のκ様代替軽鎖構築物においては、Ｖκ様ポリペプチド及び／又はＪＣκポリペプチドは、類似の抗体配列には存在しない、それぞれＣ及びＮ末端伸長部を含み得る。あるいは、伸長部（単数又は複数）の一部又は全体を本明細書に記載のκ様代替軽鎖構築物から除去することができる。
【００９７】
個々に使用することができる、又は更に誘導体化することができる、及び／又は完全長抗体重鎖若しくはその断片などの抗体重鎖配列などの追加の異種配列に結合することができる、他のκ様代替軽鎖構築物。
【００９８】
Ｖκ様ポリペプチド及び／又はＪＣκポリペプチドのＣ及びＮ末端伸長部は、本発明の構築物中に存在する必要はないが、かかる付加物の少なくとも１個の少なくとも一部を保持することが有利である。というのは、図７に示すように、スクリーニングループライブラリーの結果として、線状伸長部又は、例えば、束縛された多様性の形で、それらがコンビナトリアル機能的多様性をもたらす独特の機会を提供するからである。さらに、Ｖκ様ポリペプチド及び／又はＪＣκポリペプチドの「尾部」部分は、別のペプチド及び／又はポリペプチドと融合して、例えば、強化された結合、更なる結合特異性、増大されたｐＫ、改善された半減期、短縮された半減期、細胞表面係留（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）、細胞トランスロケーションの増大、ドミナントネガティブ活性など種々の所望の性質に備えることができる。具体的な機能的尾部伸長部を図１４に記載する。
【００９９】
必要に応じて、本発明の構築物は、例えば、公知の治療用抗体を含めた抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域由来の公知の配列又は配列モチーフをκ様代替軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３類似領域に組み入れる又は付加することによって、操作することができる。これによって、抗体ではないが、公知の抗体医薬と類似した又はそれよりも優れた結合特異性及び親和性を示すであろう分子を作製することができる。
【０１００】
ある実施形態においては、異種アミノ酸配列は、１つ以上の追加の機能性を本発明の構築物に追加することができる。所望の結合特異性を有する抗体可変領域配列を含む、追加の機能性を有するかかる構築物を図１３に示す。特に、図１３は、上記Ｖκ様及びＪＣκポリペプチド配列を含む種々の二機能性及び三機能性構築物を示す。
【０１０１】
本発明の構築物を特定の実施形態を参照して説明したが、当業者は、代替軽鎖及び抗体配列の様々な並べ換えによって得られる多数の更なる実施形態が可能であり、本発明の範囲内であることを理解するであろう。本発明は、代替軽鎖配列を含み所望の標的に結合する能力を有するすべての構築物を含む。ある実施形態においては、構築物は、抗体重鎖可変領域配列に結合する能力も有する。
【０１０２】
本発明の構築物を使用して、代替軽鎖配列のライブラリーを構築することができ、そのライブラリーは、抗体ライブラリーと同様に、所望の結合特異性及び親和性を有する構築物の選択を含めて、種々の目的で使用することができる。
【０１０３】
Ｖκ様及びＪＣκ遺伝子は、独立したタンパク質として機能することができ代替軽鎖として機能することができるポリペプチドをコードするので、代替様軽鎖を真の軽鎖から操作することができ、操作された真の代替軽鎖に対して提案された以前のあらゆる用途に使用することができる。これは、ＶｐｒｅＢ又はＶκ様遺伝子に類似したペプチド性伸長部を含むように可変軽鎖領域を発現させることによって果たすことができる。同様に、定常領域は、ラムダ５又はＪＣκ遺伝子及びそのペプチド性伸長部に類似するように操作することができる。さらに、任意のキメラ又はヘテロ二量体との組合せも本明細書の範囲内である。
【０１０４】
κ様代替軽鎖構築物の調製
本発明のκ様代替軽鎖構築物は、組換えＤＮＡ技術の周知技術を含めて、当分野で公知の方法によって調製することができる。
【０１０５】
κ様代替軽鎖ポリペプチドをコードする核酸は、自然源、例えば発生途上のＢ細胞から単離することができ、及び／又は合成若しくは半合成方法によって得ることができる。このＤＮＡが特定されて、単離されると、又は産生されると、更なるクローニングのために、又は発現のために、複製可能なベクター中にそれを連結することができる。
【０１０６】
本明細書に記載のポリペプチドのコード配列を発現するのに使用することができるクローニング及び発現ベクターは、当分野で周知であり、市販されている。ベクター成分としては、一般に、以下、すなわち、シグナル配列、複製開始点、１個以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列のうちの１個以上が挙げられるが、それだけに限定されない。本明細書に記載のベクターにおいて代替軽鎖構築物をコードするＤＮＡのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物（哺乳動物）細胞であり、哺乳動物細胞が好ましい。
【０１０７】
適切な哺乳動物宿主細胞系の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、懸濁培養増殖用にサブクローニングされたヒト胚性腎臓系２９３（２９３細胞）（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）、スイギュウラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳房腫よう（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、及びＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞が挙げられるが、それだけに限定されない。
【０１０８】
哺乳動物細胞用に、発現ベクターに対する制御機能がウイルス性材料によってもたらされることが多い。したがって、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、レトロウイルス、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムに由来し得る。βアクチンプロトマーなどの別のプロモーターは、異種の供給源から生ずる。適切なプロモーターの例としては、ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））、ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーター（Ｇｒｅｅｎａｗａｙら、Ｇｅｎｅ，１８：３５５−３６０（１９８２））、及び所望の遺伝子配列に通常は付随するプロモーター及び／又は制御配列が挙げられるが、それだけに限定されない。ただし、かかる制御配列は、宿主細胞系に適合したものである。
【０１０９】
高等真核細胞による所望の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写開始活性を増大させる、通常約１０から３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作用要素である。エンハンサーは、配向及び位置に比較的無関係であるが、好ましくは、発現ベクター中に存在するプロモーター配列の上流に位置する。エンハンサーは、例えば、真核細胞ウイルス由来など、プロモーターと同じ供給源に由来し得る（例えば、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサー）。
【０１１０】
哺乳動物宿主細胞に使用される発現ベクターは、例えばＳＶ４０（初期及び後期）、ＨＢＶなどのウイルスに由来するものなどのポリアデニル化部位も含む。
【０１１１】
複製開始点は、ＳＶ４０又は別のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）源に由来し得るなど、外来性開始点を含むようにベクターを構築することによって用意することができ、又は宿主細胞によって用意することができる。
【０１１２】
発現ベクターは、通常、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードする選択マーカーを含む。哺乳動物細胞用の適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）及びネオマイシンが挙げられる。
【０１１３】
形質転換された宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。市販培地としては、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などが挙げられる。また、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）及びＢａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）に記載の培地のいずれかを宿主細胞用培地として使用することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で以前に使用された条件であり、製造者の指示に含まれ、又は当業者に明らかである。
【０１１４】
ライブラリーは、κ様代替軽鎖配列を含む。
【０１１５】
本発明は、さらに、κ様代替軽鎖配列及びかかる配列を含む構築物の種々のライブラリーにも関する。すなわち、かかるライブラリーは、上で又は実施例で具体的に記述したものを含めて、ただしそれだけに限定されない、本発明のＶκ様及び／又はＪＣκ含有構築物などの、κ様代替軽鎖配列のディスプレイを含むことができ、該ディスプレイから本質的になることができ、又は該ディスプレイからなることができる。
【０１１６】
本発明のライブラリーは、好ましくはディスプレイの形である。抗体及び他のポリペプチドを含めて、異種タンパク質をディスプレイする系は、当分野で周知である。抗体断片は、抗体遺伝子をコードする繊維状ファージの表面にディスプレイされる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：３８１  ３８８（１９９２）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ３４８（６３０１）：５５２  ５５４（１９９０）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３（１４）：３２４５−３２６０（１９９４））。抗体ライブラリーを選択及びスクリーニングする技術の総説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（９）：１１０５−１１１６（２００５）を参照されたい。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ａｇｔｅｒｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ  ８８：３７−４５（１９９０）、Ｃｈａｒｂｉｔら、Ｇｅｎｅ  ７０：１８１−１８９（１９８８）、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：２７１３−２７１７（１９９２））、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７（１９９７）、Ｋｉｅｋｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：１３０３−１３１０（１９９７））の表面での異種タンパク質及びその断片のディスプレイのための当分野で公知の系がある。他の公知のディスプレイ技術としては、リボソーム又はｍＲＮＡディスプレイ（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９０２２−９０２６（１９９４）、Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４９３７−４９４２（１９９７））、ＤＮＡディスプレイ（Ｙｏｎｅｚａｗａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３１（１９）：ｅ１１８（２００３））、細菌ディスプレイなどの微生物細胞ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２９−３４（１９９７））、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ（Ｉｓｔｉｃａｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：６２９４−６３０１（２００１）、Ｃｈｅｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３３３７−３３４１（２００５）、レトロウイルスディスプレイなどのウイルスディスプレイ（Ｕｒｂａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ３５（２００５）、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：２８０６−２８１０（２００４）、Ｒｅｉｅｒｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１０（２００５））、ミクロビーズディスプレイ（Ｓｅｐｐら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５３２：４５５−４５８（２００２））などが挙げられる。
【０１１７】
本発明では、代替軽鎖含有ライブラリーは、有利には、ファージディスプレイ及び胞子ディスプレイを含めて、任意のディスプレイ技術を使用してディスプレイすることができる。
【０１１８】
ファージディスプレイにおいては、代替軽鎖ポリペプチドなどの異種タンパク質はファージ粒子のコートタンパク質に結合するが、それが発現されたＤＮＡ配列はファージ外被内に収められる。ファージディスプレイ法の詳細は、例えば、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからのヒト抗体及び抗体断片のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成を記述したＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ３４８，５５２−５５３（１９９０））に見いだすことができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３、ｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要な又は少数のコートタンパク質遺伝子中にインフレームでクローン化され、ファージ粒子表面で機能的抗体断片としてディスプレイされる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡ複製物を含むので、抗体を機能的性質に基づいて選択すると、その性質を示す抗体をコードする遺伝子も選択される。したがって、ファージは、Ｂ細胞の諸性質の一部を模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で実施することができる。その総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ３，５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。幾つかのＶ遺伝子セグメント源をファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３５２，６２４−６２８（１９９１）は、免疫マウスのひ臓に由来するＶ遺伝子の小規模無作為コンビナトリアルライブラリーから多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２，５８１−５９７（１９９１）又はＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，７２５−７３４（１９９３）に記載の技術に基本的に従って、非免疫ヒトドナー由来のＶ遺伝子レパートリーを構築することができ、（自己抗原を含めて）多様な抗原に対する抗体を単離することができる。自然な免疫応答においては、抗体遺伝子は、変異を高率で蓄積する（体細胞超変異）。導入された変化の一部はより高い親和性を与え、それに続く抗原曝露中に、高親和性表面免疫グロブリンを示すＢ細胞が優先的に複製され、分化する。この自然プロセスは、「鎖シャフリング」として知られる技術を使用することによって模倣することができる（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０，７７９−７８３（１９９２））。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖及び軽鎖のＶ領域遺伝子を、非免疫ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然変異体（レパートリー）のレパートリーで逐次置換することによって改善することができる。この技術によって、ｎＭ範囲の親和性を有する抗体及び抗体断片を作製することができる。極めて大きなファージ抗体レパートリーを作製する戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１，２２６５−２２６６（１９９３）によって記述された。これら及び当分野で公知の他の技術は、代替軽鎖配列を含むポリペプチド及び別の構築物を含めて、任意のポリペプチドのディスプレイに適合させることができる。
【０１１９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ胞子殻（ＣｏｔＢ）及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）胞子ディスプレイの成分を使用した表面ディスプレイ系を含めて、胞子ディスプレイは、その開示全体を参照により本明細書に明示的に援用する、Ｉｓｔｉｃａｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：６２９４−６３０１（２００１）、Ｃｈｅｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３３３７−３３４１（２００５）に記載されている。別の胞子ディスプレイ系は、米国特許出願公開第２００２０１５０５９４号、同２００３０１６５５３８号、同２００４０１８０３４８号、同２００４０１７１０６５号及び同２００４０２５４３６４号に開示されている。
【０１２０】
κ様代替軽鎖配列、それを含む構築物及びライブラリーの使用
本発明のライブラリーを使用して、κ様代替軽鎖配列を特定することができ、代替軽鎖配列を含む融合体など、所望の諸性質を有するκ様代替軽鎖構築物を特定することができる。例えば、本明細書に記載のライブラリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングによって、高い結合特異性及び親和性で所望の標的に結合するκ様代替軽鎖配列を含むポリペプチドを生成することができる。したがって、本明細書に記載のライブラリーを使用して、腫ようマーカー又は治療的介入の別の分子標的に結合する代替軽鎖配列を含むポリペプチドなどの、治療及び診断のための分子を特定することができる。さらに、上記技術によって、同じ標的に結合するポリペプチドのコレクションを含むライブラリー、異なる標的に結合するポリペプチドのライブラリー、複数の特異性を有するポリペプチドのライブラリーなどを含めて、代替軽鎖ポリペプチドの極めて多様なライブラリーを設計することができる。
【０１２１】
本発明の更なる詳細を以下の非限定的実施例に記載する。
【実施例】
【０１２２】
実施例１
結合ドメインタンパク質としてのκ様ＳＬＣ成分、Ｖκ様又はＪＣκ
Ｖκ様結合ドメインを作製するために、図２及び４（配列番号２）に示す単一タンパク質を組換え作製する。代替軽鎖（ＳＬＣ）結合ドメインタンパク質構築物は、予測される配列番号２の分泌Ｖκ様タンパク質に由来するアミノ酸２１から１８０（これは３〜６個のアミノ酸ほどの短さであり得る）で構成される。必要に応じて、新規の特異的結合能力を得るために、構造又は配列上の証拠に従って分子を再設計する。再設計は、例えば、無作為又は合理的に設計された変異誘発手段による、ＣＤＲ及び／又はＣ末端部内の多様化を含み得る。それに加えて、又はその代わりに、変異体のコレクションは、Ｖκ様タンパク質の全長に沿って、例えば誤りがちなＰＣＲによって、無作為に、又はアミノ酸のコレクションを用いた単一若しくは多部位特異的変異誘発によって直接的に、作製される。次いで、生成したクローン又はコレクションを、ファージ又はファージミドディスプレイ用のｐＩＩＩを用いてインフレームでクローン化することができる。次いで、このファージミド構築物をＴＧ１細胞に転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び２％グルコースを補充したＬｕｒｉａ培地（ＬＢ）中でＯＤ６００が約０．３になるまで増殖させ、振とうせずにＭＫ３０７ヘルパーファージに３７℃で３０分間感染させる。細胞をペレット化し、次いで５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び７５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢに再懸濁させ、激しく曝気しながら３０℃で終夜増殖させる。翌日、ファージミドによって発現されたＶκ様タンパク質を含む上清を、一般に容認されたパニング法に従ってヒトＴＮＦ−αに対してパニングする。ＴＮＦ−αに結合した特定のＶκ様クローンを、選択及び増幅を繰り返して濃縮し、次いでやはり一般に容認されたｍ１３ファージ評価法を利用して個々に結合を評価することができる。ｍ１３ファージ評価法は、典型的には、ファージＥＬＩＳＡ、又はＥ．ｃｏｌｉ中で産生された分泌タンパク質の粗製若しくは精製周辺質溶解物の試験を含む。
【０１２３】
上の記述は、Ｖκ様結合タンパク質の調製に関するが、Ｖκ様タンパク質は、共通標的を認識する別の異種配列と組換えによって再結合させ、ライブラリーとしてスクリーニングすることもできる。さらに、このＶκ様結合タンパク質を、以前に選択された抗体重鎖コレクションと組み合わせ、目的とする同じ標的又は目的とする第２の標的に対して直接スクリーニングして、二重特異性分子を作製することができる。あるいは、この強化された結合、すなわち二重特異的結合は、重鎖の非選択コレクションと組み合わせたスクリーニングによって発見することができる。
【０１２４】
この実施例は抗体重鎖に言及したが、完全な重鎖は不要であることを理解すべきである。重鎖定常領域の非存在下での重鎖可変領域配列を含む組合せ、又は完全な重鎖定常領域も同様に作製することができ、この実施例の範囲内である。
【０１２５】
最後に、Ｎ末端伸長部、非ＣＤＲループ中に、又はＪＣκタンパク質の全長にわたって、単独で又は上記組合せで多様化を組み入れることができる以外は、ＪＣκを同様に作製し、使用することができる。
【０１２６】
実施例２
カッパＳＬＣ構築
（「ＳＵＲＲＯＢＯＤＹ（商標）変異体」とも称する）図５に示すヘテロ二量体ＳＬＣ欠失変異体のカッパ代替軽鎖成分のコード配列を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）に、完全長ＩｇＧ１抗体重鎖と同時導入して、生化学分析用の代替軽鎖構築物を過渡的に作製することができる。
【０１２７】
例えば、完全長Ｖκ様（配列番号２）及びＪＣκ（配列番号４）を哺乳動物発現ベクターｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）に別々にクローン化する。これらのタンパク質の両方について、その予測される非構造的尾部の一部を削除する。Ｖκ様の場合、このＣ末端部は、Ｋａｂａｔ類似残基＃９５又は配列番号２の残基１２２〜１４６に続き、ＪＣκの場合、これは、配列番号４のＪ領域Ｎ末端アミノ酸１〜２８を含む。具体的には、ＪＣκの場合、残基１〜２８は、カッパＪ領域の予測される開始から終わりまでである。Ｖκ様構築物は、未変性の予測される分泌シグナルを含み、Ｖκ様の場合には、この予測されるシグナルペプチドは配列番号２のアミノ酸１〜２０である。しかし、ＪＣκは、正準のシグナル配列を有するようには見えない。Ｆｒａｎｃｅｓらは、ＪＣκが表面の露出した重鎖に結合することができることを示し、翻訳されたタンパク質が細胞外表面に輸送又は移行する能力を有することを示唆した。しかし、過剰発現目的では、ＳＵＲＲＯＢＯＤＹ（商標）タンパク質産生を改善するＪＣκタンパク質のアミノ末端又は任意の尾部欠失変異体に付加した正準の哺乳動物軽鎖シグナル配列を含む１セットの変異体も作製される。この短縮されたＪＣκ配列の配列は配列番号２４で示され、重鎖及び完全長Ｖκ様と組み合わせると図５で「ｄＪ」と命名されるＳＬＣ欠失変異体を形成する。短縮されたＶκ様配列の配列は配列番号２５で示され、重鎖及び完全長ＪＣκと組み合わせると図５で「ｄＶκ尾部」と命名されるＳＬＣ欠失変異体を形成する。短縮ＪＣκ配列と短縮Ｖκ様タンパク質の両方を重鎖と組み合わせたとき、ＳＬＣ欠失変異体は、図５で「短鎖カッパ」と命名される。
【０１２８】
実施例３
哺乳動物細胞におけるカッパ代替軽鎖構築物（ＳＵＲＲＯＢＯＤＹ（商標））の発現及び精製
図５の４種類のコンビナトリアルカッパ代替軽鎖候補の各々は、Ｃ末端ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ（配列番号２６）を含む公知のヒト抗インフルエンザウイルス重鎖を同時導入し、低血清培地中で製造者の提言（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）に従って発現させることができる。３日後、上清を収集し、ろ過し、ニッケルキレートクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製する。次いで、精製タンパク質を、抗ペプチドウサギ血清（Ｖκ様及びＪＣκ）又は抗ヒスチジン抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ  ＮＣ）を用いたウエスタンブロット分析によって検査する。タンパク質の検出は、抗ウサギＨＲＰ（Ｖκ様及びＪＣκ）又は抗マウスＨＲＰ（重鎖）及びＴＭＢ基質を用いた発色に従って可視化される。
【０１２９】
コンビナトリアルカッパ代替軽鎖変異体の各々を、抗インフルエンザ重鎖に関連した同種抗原に結合する能力について試験する。これは、精製タンパク質又は浄化された移入上清を用いて実施することができる。いずれの場合も、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを、Ｋａｓｈｙａｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：５９８６−５９９１（２００８）によって記述されたように、Ｈ５Ｎ１赤血球凝集素（Ｖｉｅｔｎａｍ  １２０３）で被覆し、ブロックする。次に、ＳＵＲＲＯＢＯＤＩＥＳ（商標）を添加し、室温で１時間抗原に結合させる。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いた洗浄段階後、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ抗体、及び４５０ｎｍにおける吸光度の読みを記録するＴＭＢ基質比色検出によって、結合を定量的に検出する。
【０１３０】
実施例４
カッパＳＬＣ成分への機能性付加
カッパＳＬＣは２種類の独立したポリペプチドで構成されるので、これは、第２の機能性を付加する、又は埋め込む、自然な機会を創出する。本実施例においては、まず、抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖを挿入して、Ｖκ様、又はｄＶκ尾部及びＪＣκ若しくはｄＪを連結する融合タンパク質を作製する（図１３Ａ）。生成した操作されたカッパＳＬＣ束縛ｓｃＦｖを抗ＴＮＦ−α抗体の重鎖と組み合わせる。所望のタンパク質は、個々の束縛融合体をＣ末端ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ（配列番号２７）を含む完全長重鎖と同時導入し、低血清培地中で製造者の提言（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）に従ってタンパク質を発現させることによって産生される。３日後、分泌されたＳＵＲＲＯＢＯＤＩＥＳ（商標）を培地から収集し、ろ過し、ニッケルキレートクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製する。
【０１３１】
生成したタンパク質をＥＬＩＳＡに使用して、標的結合を決定する。手短に述べると、ＥＬＩＳＡでは、ＥＬＩＳＡプレートをヒトＴＮＦ−α又はヒトＶＥＧＦで被覆、ブロッキングし、続いてカッパＳＬＣ  ＳＵＲＲＯＢＯＤＩＥＳ（商標）を４℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０（０．０５％）で洗浄し、抗ヒト重鎖−ＨＲＰ抗体を直接検出する。
【０１３２】
あるいは、抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖとＶκ様のＣ末端（図１３Ｂ）又はＪＣκのＮ末端（図１３Ｃ）を融合させ、生成したタンパク質複合構築物を上記ｓｕｒｒｏｂｏｄｙ  ＥＬＩＳＡと同様に評価することができる。
【０１３３】
最後に、抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖとＶκ様のＣ末端及び抗卵白アルブミンｓｃＦｖの融合体をＪＣκのアミノ末端に融合し、三連タンパク質複合物をＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α及び卵白アルブミンとの結合について試験する（図１３Ｄ）。
【０１３４】
記述ｓｃＦｖにおいては、異種標的に対して組み入れられるが、機能性結合剤を同じ標的に結合させて、タンデム「スーパー結合剤」を作製することができる。このタンデム結合剤は、強化された結合、さらに場合によっては架橋機能さえもたらすことができる。Ｆａｂ架橋は、抗体全体が望ましくない長期の架橋をもたらす場合に有益であろう。例えば、インスリン代用物として作用して血清クリアランスに３〜４週間を要するインスリン受容体抗体は、免疫グロブリン全体には望ましくない場合がある。インスリンは、通常、数分の半減期を有するので、Ｆａｂは、この規模の半減期とより同調し、タンデム機能性は、この適用に適切に対処することができる。
【０１３５】
上の記述は、抗体のみを第２の機能性グループとして記述したが、関連するペプチド（例えば、エリスロポイエチン模倣物）、受容体（例えば、ＴＮＦ−ＲＩ）、ドミナントネガティブ全タンパク質（例えば、ＤＮ−ＴＮＦ、Ｓｔｅｅｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０１：１８９５−１８９８（２００３））拮抗断片又はドメイン（例えば、ＨＧＦに基づくＮＫ１又はＮＫ４ドメイン）、及び結合タンパク質（例えば、ＩＬ−１ｒａ）も付加及び束縛された構築物に同様に組み入れて、類似機能の分子を作製することができる。さらに、２個の部位を利用して、第２のＦａｂ様分子を作製する重鎖と軽鎖などのヘテロ二量体タンパク質を組み入れることもできる。
【０１３６】
実施例５
カッパＳＬＣライブラリー
上述したように、Ｖκ様及びＪＣκドメインは、単一の結合体として使用することができるが、それらを重鎖と組み合わせて、抗原に対するパニングのためのコンビナトリアルライブラリーを作製することもできる。重鎖は、無処置又は過免疫のリンパ球由来のコレクション又は合成コレクションであり得る。カッパＳＬＣライブラリーと併用される前もって濃縮された抗体ライブラリー由来の重鎖コレクションを有することが有益な場合もある。いずれにしても、カッパＳＬＣ  ＳＵＲＲＯＢＯＤＩＥＳ（商標）の十分に多様なコレクションは、実施例１で上述した適切な選択及び設計のもとで、各カッパＳＬＣ成分中の独立した結合要素を介して複数の抗原選択性をもたらすことができ、又は標的に対してＶκ様及びＪＣκ尾部を介して、古典的な抗体には存在しない追加の結合を介した結合を増強することができる。
【０１３７】
具体的には、本発明者らは、Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザ生存物の骨髄から調製されたコンビナトリアル抗体ライブラリーを用いた反復手法を使用する。これらのライブラリーを２回の選択のためにＨ５Ｎ１ウイルス赤血球凝集素タンパク質に対してスクリーニングする。次に、ファージミドプラスミドを増幅し、精製し、このプラスミド調製物から制限消化によって重鎖可変領域を単離する。次いで、これらの重鎖を定常重鎖ドメイン１とインフレームでクローン化して、ファージミドディスプレイ用のｍ１３遺伝子ＩＩＩコートタンパク質との組換え融合体を形成する。
【０１３８】
パニング後、濃縮クローンをＨＢ２１５１  Ｅ．ｃｏｌｉ系統に移行させて、可溶性ＳＵＲＲＯＢＯＤＹ（商標）タンパク質を産生させることによって、すべての適切な回数の選択からのクローン抗原結合ファージ及びライブラリーに対して、ＥＬＩＳＡ試験を実施する。手短に述べると、ＨＢ２１５１クローンを増殖させ、可溶性ＳＵＲＲＯＢＯＤＩＥＳ（商標）を産生させる。具体的には、１００ｍｃｇ／ｍｌアンピシリン及び２００マイクロモルＩＰＴＧを補充した２−ＹＴ培地中でコロニーを終夜３０度で培養し、上述したように、周辺質溶解物を基本的に以前に概説したようにＥＬＩＳＡによって試験する。
【０１３９】
実施例６
既存の軽鎖Ｖ遺伝子及び軽鎖定常遺伝子由来のＳＬＣ様分子の操作
カッパＳＬＣの成分は、非再配列軽鎖Ｖ遺伝子及び再配列軽鎖ＪＣ遺伝子から代替機能をもたらすので、すべての残留カッパ及びラムダ軽鎖Ｖ遺伝子からの類似の翻訳されたタンパク質を操作して、Ｖκ様分子（図９及び１０）及び残留カッパＪＣ再配列物の全組合せ（４種類のＪＣκ様）（図１１及び１２）及びラムダＪＣ再配列物（４「Ｊ」×１０「定常」＝４０種類のＪＣλ様）（図１１）を作製することができる。これらの操作された分子の各々は、Ｖκ様及びＪＣκを用いたもの、並びに２００７年３月２８日に出願された同時係属中のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８２８３にＶｐｒｅＢ及びλ５と一緒に含まれるもの、並びにその組合せ及びキメラと類似の目的を果たすことができる（図１６）。
【０１４０】
実施例７
血清中半減期を延長するカッパ代替軽鎖融合
ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体断片の半減期は、抗体断片が、安定な抗原結合性断片を形成するのに必要なものだけでなくすべての重鎖定常ドメインを含む無処置の完全な重鎖との融合体の一部であるときに、かなり延長される。ＩｇＧの場合には、これは、ドメインＣＨ１、ＣＨ２及び場合によってはＣＨ３の含有を意味する。特に、ＣＨ２及びＣＨ３がｉｎ  ｖｉｖｏでこの効果の大部分を与えることは十分に証明されている。実際、これらのＣＨ２及びＣＨ３ドメインと異種タンパク質の融合は、典型的には、親分子と比較してこれらのキメラ分子の効力及びＰＫ／ＰＤを改善するのに十分である。同様に、Ｖκ様とＪＣκの一方又は両方との機能的融合体は、重鎖の定常ドメインとのこの結合によって利点を得る。
【０１４１】
ＩＩ型糖尿病の治療の場合、グルカゴン様ペプチド１（すなわちＧＬＰ−１）の投与は、すい臓におけるグルコース依存性インスリン分泌を誘発し、それによって患者のグルコース管理を改善して、個々を利するものである。しかし、持続性ＧＬＰ−１ペプチドが望ましい目標である。カッパ代替軽鎖の尾部は、独特で利用可能であるので、この目標は、活性ＧＬＰ−１部分をＶκ様尾部（配列番号２８）のＣ末端又はＪＣκ（配列番号２９）のＮ末端部に組換え融合することによって達成することができる。ＪＣκ融合体の場合には、発現は、図１５に示すように、Ｖκ様の存在下でも非存在下でも、さらには可変重鎖ドメインの存在下及び非存在下でさえも、実施することができる。同様に、Ｖκ様との融合体は、ＪＣκの存在下でも非存在下でも、恐らくは重鎖のＣＨ１ドメインを用いても用いなくても、実施することができる。同様に、他の有益な成長因子、サイトカイン、受容体及び酵素融合体を作製することができる。これらの場合のすべてにおいて、結合は、代替軽鎖又はＳＵＲＲＯＢＯＤＹ（商標）成分の必要条件ではなく、全体的に又は主に異種代替軽鎖融合要素によって与えられ得る。
【０１４２】
上記記述においては、本発明を特定の実施形態に関連して説明したが、本発明はそのようには限定されない。実際、本明細書に示し、記載するものに加えて、本発明の種々の改変が、上記記述から当業者に明らかになるはずであり、添付の特許請求の範囲に包含される。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年3月8日(2011.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
【図１】ＶｐｒｅＢ１ドメインのＣＤＲ類似領域及びＣ末端部がかなりの距離に及ぶことを示す図である。薄灰色：ＣＤＲ残基；濃灰色：フレームワーク残基。
【図２】ヒトＶκ様核酸のヌクレオチド配列（配列番号１）及びコードされたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】ヒトＪＣκ核酸のヌクレオチド配列（配列番号３）及びコードされたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
【図４】κ様代替軽鎖（ＡＪ００４９５６Ｖκ様、配列番号２及びＡＡＢ３２９８７ヒトＪＣκ、配列番号４）とヒトＩｇ可変及び定常κ軽鎖（ＶκＩＶ＿Ｂ３、配列番号５；定常カッパ、配列番号６）とのアラインメントを示す図である。Ｖκ様は、非再配列ＶκＩＶ遺伝子ファミリーメンバーであるが、独特のＣ末端伸長部を有する。ＪＣκは、カッパＪ及び定常領域と同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を共有するが、独特のＮ末端を有する。ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は保存されているが、ＣＤＲ３は分断されている。
【図５】種々のヘテロ二量体代替κ軽鎖欠失変異体の略図である。「完全長」構築物においては、Ｖκ様とＪＣκ配列の両方は、それぞれＣ及びＮ末端伸長部（尾部）を保持する。ｄＪ変異体においては、ＪＣκのＮ末端伸長部は欠失している。ｄＶκ尾部変異体においては、Ｖκ様配列のＣ末端伸長部は除去されているが、ＪＣκのＮ末端伸長部は保持されている。「短鎖カッパ」変異体においては、Ｖκ様配列のＣ末端部とＪＣκ配列のＮ末端伸長部の両方が保持されている。
【図６】個々に、又は抗体重鎖若しくはその断片などの別のタンパク質と一緒に、使用することができるκ様軽鎖欠失及び単鎖構築物を示す図である。
【図７】コンビナトリアル機能的多様性をκ様代替軽鎖構築物に組み入れた図である。赤線は、ペプチドライブラリーなどの付加された多様性を示す。
【図８】軽鎖が遺伝子再配列及びＲＮＡプロセシングの産物であることを示す図である。
【図９】Ｖκ様タンパク質が非再配列ＶκＩＶ遺伝子転写及び翻訳に由来することを示す図である。ＶκＩＶは、７１種類のＶＬ生殖細胞遺伝子の一つである。Ｖκ様タンパク質を産生する能力を有するさらに７０種類のＶＬ生殖細胞遺伝子が存在するので、さらに３９種類のκＶ遺伝子及びさらに３１種類のλＶ遺伝子が存在する。
【図１０】ＡＪ００４９５６Ｖκ様原型配列（配列番号２の残基２１〜１８０）と整列された異なる長さの伸長部（配列番号７〜１８）を各々が有する、すべてのＶκファミリーから考えられるＶκ様タンパク質の予測アミノ酸配列を示す図である。
【図１１】ＪＣκが非再配列Ｊ及びＣ生殖系列由来のプロセシングされたＲＮＡの産物であることを示す図である。ＪＣκは、４５種類のＪＣ生殖系列組合せの一つである。ＪＣκ様タンパク質を産生する能力を有するさらに４４種類のＶＬ生殖細胞遺伝子が存在する（Ｃκと組み合わせられるさらに４種類のＪκ遺伝子、及び１０種類のＣλ遺伝子と組み合わせられる４種類のＪλ遺伝子（合計４０種類））。
【図１２】残留カッパＪ定常領域再配列由来の予測ＪＣκ様（Ｊ１−Ｊ５Ｃκ）（配列番号１９〜２３）を示す図である。
【図１３】κ様代替軽鎖成分に機能性を付加する模式図である。二機能性及び三機能性構造を示す。Ａ：ｓｃＦｖ束縛融合、Ｂ：Ｖκ様ｓｃＦｖ融合、Ｃ：ＪＣκｓｃＦｖ融合、Ｄ：ＳＬＣ二重融合。
【図１４】説明のための代替軽鎖機能的尾部伸長部タイプを示す図である。
【図１５】説明のための代替軽鎖ＧＬＰ−１融合体を示す図である。
【図１６】説明のためのκ様及びλ様代替軽鎖機能的キメラを示す図である。
【図１７】ヒトＶｐｒｅＢ１（配列番号２８）、マウスＶｐｒｅＢ２（配列番号２９および３０）、ヒトＶｐｒｅＢ３（配列番号３１）、ヒトλ５配列（配列番号３２）及びヒトλ５様配列（配列番号３３）のアミノ酸配列を示す図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
「κ様代替軽鎖可変ドメイン」、「Ｖκ様ＳＬＣ」及び「Ｖκ様」という用語は、区別なく使用され、非再配列Ｖκ遺伝子の産物である任意の未変性配列ポリペプチド、及びその変異体を指す。未変性配列「Ｖκ様」ポリペプチドとしては、具体的に、図２に示すヒトκ様ポリペプチドＡＪ００４９５６（配列番号２）、及び図１０に示すヒトＶκ様ポリペプチド（配列番号７〜１８）、並びに非ヒト哺乳動物種における、特に、げっ歯類、例えばマウス及びラット、非ヒト高等霊長類など、ヒトのように、主に遺伝子再配列及び／又は超変異によって抗体多様性を生じる種における、ホモログが挙げられるが、それだけに限定されない。一実施形態においては、未変性配列Ｖκ様ポリペプチドの変異体は、抗体κ軽鎖配列に対するＣ末端伸長部（尾部）を含む。特定の一実施形態においては、未変性配列Ｖκ様ポリペプチドの変異体は、Ｖκ様ポリペプチドを対応する抗体κ軽鎖から識別する独特のＣ末端伸長部（尾部）の少なくとも一部、好ましくは全部を保持する。別の一実施形態においては、変異体Ｖκ様ポリペプチドのＣ末端部は、配列の残部に天然には付随しない配列である。後者の実施形態においては、未変性Ｖκ様配列中に天然に存在するＣ末端部と変異体配列との相違は、１個以上のアミノ酸変化（置換、挿入、欠失及び／又は付加）から生じ得、又はＣ末端部は、異なるＶκ様タンパク質中に天然に存在する尾部と同一であり得る。したがって、例えば、図１０に記載のＶκ様タンパク質（現れている順にそれぞれ配列番号２の残基２１〜１８０及び配列番号７〜１８）のいずれかにおいては、（図１０において「翻訳伸長部」と称する）Ｃ末端伸長部は、別のＶκ様タンパク質のＣ末端伸長部で置換することができ、及び／又は任意の天然のＣ末端伸長部配列とは異なるように改変し得る。その代わりに、又はそれに加えて、未変性配列Ｖκ様ポリペプチドの変異体は、未変性抗体κ可変ドメイン配列と同一である配列の一部に、特にかかる配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び／又はフレームワーク残基の１個以上に、１個以上のアミノ酸変化を含み得る。したがって、Ｖκ様ポリペプチドは、抗体κ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１個以上に対応する領域にアミノ酸変化を含み得る。すべての場合において、変異体は、未変性抗体κ軽鎖可変領域配列に対して少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７、又は少なくとも８、又は少なくとも９、又は少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは４〜１００、又は４〜９０、又は４〜８０、又は４〜７０、又は４〜６０、又は４〜５０、又は４〜４５、又は４〜４０、又は４〜３５、又は４〜３０、又は４〜２５、又は４〜２０、又は４〜１５、又は４〜１０個のアミノ酸残基のＣ末端伸長部を含むことができ、好ましくは含む。本明細書に定義するように、Ｖκ様ポリペプチド変異体は、未変性抗体κ若しくはλ軽鎖配列又はその断片とは異なり、好ましくは、未変性配列Ｖκポリペプチドと少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の配列相同性を保持する。別の好��しい一実施形態においては、Ｖκ様ポリペプチド変異体は、そのアミノ酸配列において、未変性抗体λ又はκ軽鎖配列と９５％未満、又は９０％未満、又は８５％未満、又は８０％未満、又は７５％未満、又は７０％未満、又は６５％未満、又は６０％未満、又は５５％未満、又は５０％未満、又は４５％未満、又は４０％未満同一である。別の実施形態においては、配列相同性は、約４０％から約９５％、又は約４５％から約９０％、又は約５０％から約８５％、又は約５５％から約８０％、又は約６０％から約７５％、又は約６０％から約８０％、又は約６５％から約８５％、又は約６５％から約９０％、又は約６５％から約９５％である。すべての実施形態においては、好ましくは、Ｖκ様ポリペプチドは標的に結合する能力を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
「ＶｐｒｅＢ」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、任意の未変性配列又は変異体ＶｐｒｅＢポリペプチドを指し、具体的には、配列番号２８のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２９及び３０のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号３１のヒトＶｐｒｅＢ３、スプライスバリアント及び翻訳後修飾によって形成される変異体を含めたアイソフォーム、その別の哺乳動物の相同体、特にヒトのように主に遺伝子再配列及び／又は超変異によって抗体多様性を生じる、げっ歯類、例えばマウス及びラットなどの哺乳動物における相同体、並びにかかる未変性配列ポリペプチドの変異体が挙げられるが、それだけに限定されない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
「λ５」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、任意の未変性配列又は変異体λ５ポリペプチドを指し、具体的には、配列番号３２のヒトλ５、配列番号３３のヒトλ５様タンパク質、スプライスバリアント及び翻訳後修飾によって形成される変異体を含めたそのアイソフォーム、その別の哺乳動物の相同体、特にヒトのように主に遺伝子再配列及び／又は超変異によって抗体多様性を生じる、げっ歯類、例えばマウス及びラットなどの哺乳動物における相同体、並びにかかる未変性配列ポリペプチドの変異体が挙げられるが、それだけに限定されない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
ＩＩ型糖尿病の治療の場合、グルカゴン様ペプチド１（すなわちＧＬＰ−１）の投与は、すい臓におけるグルコース依存性インスリン分泌を誘発し、それによって患者のグルコース管理を改善して、個々を利するものである。しかし、持続性ＧＬＰ−１ペプチドが望ましい目標である。カッパ代替軽鎖の尾部は、独特で利用可能であるので、この目標は、活性ＧＬＰ−１部分をＶκ様尾部のＣ末端又はＪＣκのＮ末端部に組換え融合することによって達成することができる。ＪＣκ融合体の場合には、発現は、図１５に示すように、Ｖκ様の存在下でも非存在下でも、さらには可変重鎖ドメインの存在下及び非存在下でさえも、実施することができる。同様に、Ｖκ様との融合体は、ＪＣκの存在下でも非存在下でも、恐らくは重鎖のＣＨ１ドメインを用いても用いなくても、実施することができる。同様に、他の有益な成長因子、サイトカイン、受容体及び酵素融合体を作製することができる。これらの場合のすべてにおいて、結合は、代替軽鎖又はＳＵＲＲＯＢＯＤＹ（商標）成分の必要条件ではなく、全体的に又は主に異種代替軽鎖融合要素によって与えられ得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
すべての実施形態においては、可変領域配列を含む抗体重鎖が存在するとき、本発明のポリペプチド、及び抗体重鎖可変領域配列は、同じ又は異なる標的に結合し得る。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
Ｖκ様及び／又はＪＣκ配列を含む、κ様代替軽鎖（ＳＬＣ）構築物。
（項目２）
Ｖκ様配列を含む、項目１に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目３）
ＪＣκ配列を含む、項目１に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目４）
Ｖκ様配列とＪＣκ配列の両方を含む、項目１に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目５）
標的に特異的に結合することができる、項目１に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目６）
上記Ｖκ様配列が、シグナル配列を有する若しくは有さないかつＣ末端部を有する若しくは有さない配列番号２又はその断片を含む、項目５に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目７）
上記Ｖκ様配列が、配列番号２のＮ末端シグナルペプチド（アミノ酸１〜２０）を含む、項目６に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目８）
上記Ｖκ様配列が、配列番号２内からのＣ末端部の少なくとも一部を含む、項目７に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目９）
上記Ｖκ様配列が、シグナル配列を有する若しくは有さないかつＣ末端部を有する若しくは有さない配列番号７〜１８又はその断片を含む群より選択される、項目５に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目１０）
上記ＪＣκ配列が、Ｎ末端伸長部を有する若しくは有さない配列番号４又はその断片を含む、項目５に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目１１）
上記ＪＣκ配列が、Ｎ末端伸長部を有する若しくは有さない配列番号１９〜２３又はその断片からなる群より選択される配列を含む、項目５に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目１２）
抗体重鎖配列と結合した、項目１から３及び５から１１のいずれか一項に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目１３）
抗体重鎖配列と結合した、項目４に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目１４）
上記Ｖκ様配列がＣ末端部を含む、項目１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目１５）
上記ＪＣκ配列がＮ末端伸長部を含む、項目１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目１６）
上記Ｖκ様配列がＣ末端部を含み、上記ＪＣκ配列がＮ末端伸長部を含む、項目１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目１７）
上記Ｖκ様配列がＣ末端部を欠き、上記ＪＣκ配列がＮ末端伸長部を欠く、項目１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目１８）
上記抗体重鎖配列が完全長抗体重鎖又はその断片である、項目１２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目１９）
上記抗体重鎖配列が完全長抗体重鎖又はその断片である、項目１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目２０）
上記Ｖκ様配列及び上記ＪＣκ配列が互いに共有結合している、項目１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目２１）
上記結合が直接融合である、項目２０に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目２２）
上記結合が異種リンカーを介する、項目２０に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目２３）
上記異種リンカーが未変性ポリペプチドの配列又はその断片を含む、項目２２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目２４）
上記異種リンカーが治療用ポリペプチドの配列又はその断片を含む、項目２２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目２５）
上記異種リンカーが抗体配列を含む、項目２２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目２６）
上記抗体配列が抗体の軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を含む、項目２５に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目２７）
上記抗体の軽鎖配列及び重鎖配列が抗原に結合することができる、項目２６に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目２８）
上記抗原が、上記構築物が結合する上記標的とは異なる、項目２７に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目２９）
上記Ｖκ様配列及び／又は上記ＪＣκ配列に共有結合した抗体の少なくとも１個の抗原結合領域を含む、項目１３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目３０）
二機能性である、項目２９に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目３１）
三機能性である、項目２９に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目３２）
上記Ｖκ様配列がＣ末端部を含み、上記ＪＣκ配列がＮ末端伸長部を含む、項目１に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目３３）
上記Ｃ末端部及び／又は上記Ｎ末端伸長部が異種分子に結合した、項目３２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目３４）
上記異種分子がペプチド又はポリペプチドである、項目３３に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目３５）
同じ結合特異性を有する抗体よりも改善された薬物動態プロファイルを有する、項目１２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目３６）
同じ結合特異性を有する抗体よりも改善された効力を有する、項目１２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目３７）
同じ標的に結合する抗体よりも改善された特異性を有する、項目１２に記載のκ様ＳＬＣ構築物。
（項目３８）
項目１に記載のκ様ＳＬＣ構築物のコレクションを含む、ライブラリー。
（項目３９）
ディスプレイの形の項目３８に記載のライブラリー。
（項目４０）
上記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ、及びマイクロビーズディスプレイからなる群より選択される、項目３９に記載のライブラリー。
（項目４１）
上記ディスプレイがファージディスプレイである、項目４０に記載のライブラリー。
（項目４２）
抗体配列のコレクションを更に含む、項目３８に記載のライブラリー。
（項目４３）
上記抗体配列が重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列を含む、項目４２に記載のライブラリー。
（項目４４）
Ｖκ様配列のコレクションを含む、項目３８に記載のライブラリー。
（項目４５）
上記Ｖκ様配列のコレクションが、そのＣＤＲ配列及び／又はＣ末端配列が異なるＶκ様配列変異体を含む、項目４４に記載のライブラリー。
（項目４６）
ＪＣκ配列のコレクションを含む、項目３８に記載のライブラリー。
（項目４７）
上記ＪＣκ配列のコレクションが、そのＮ末端伸長部が異なるＪＣκ配列変異体を含む、項目４６に記載のライブラリー。
【国際調査報告】
2011527707.tif 000019
2011527707.tif 000020
2011527707.tif 000021
2011527707.tif 000022
2011527707.tif 000023