(57)【要約】  高速液体クロマトグラフィーに用いられるマイクロ流量及びナノ流量移動相のグラジエントを生成する装置であって、異なる比率の組成の少なくとも２つの移動相のマイクロ流量及びナノ流量の生成機（２，４，６，８，４０，４２，１０）と、多くのキャピラリのループ（２４i）に対する、入口ポート、出口ポート及び（ｎ−２）／２対のポートを備えるｎ−位置グラジエント分配装置（１６）を備え、前記ループのそれぞれは、一方の端部で前記入口ポートと選択的に接続可能であり、もう一方の端部で前記出口ポートと選択的に接続可能であり、前記装置はさらに、前記ｎ−位置グラジエント分配装置（１６）の出口に接続される入口、排出器（３０）に接続される１つの出口、及びマイクロ流量及びナノ流量計（３２）に接続されるもう一方の出口を有する流量偏向器（２８）を備え、分析回路（２６，３６）はそれぞれ接続され、前記装置はさらに、様々な移動相の混合組成を生成する前記マイクロ流量及びナノ流量の生成機（２，４，６，８，４０，４２，１０）を制御する手段、前記グラジエント分配装置（１６）の実行時間及び滞留時間に基づいて動作するグラジエントを生成する手段、前記マイクロ流量及びナノ流量計（３２）から受信したデータを基に、前記マイクロ流量及びナノ流量の生成機の処理能力を制御する手段、そして前記流量偏向器（２８）の位置を制御する手段が設けられた制御システム（３８）を備えることを特徴とする装置。【選択図】  図１
2011501143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高速液体クロマトグラフィーに用いられるマイクロ流量及びナノ流量移動相のグラジエントを生成する装置であって、
異なる比率の組成の少なくとも２つの移動相のマイクロ流量及びナノ流量の生成機（２，４，６，８，４０，４２，１０）と、
多くのキャピラリのループ（２４i）に対する、入口ポート、出口ポート及び（ｎ−２）／２対のポートを備えるｎ−位置グラジエント分配装置（１６）を備え、前記ループのそれぞれは、一方の端部で前記入口ポートと選択的に接続可能であり、もう一方の端部で前記出口ポートと選択的に接続可能であり、
前記装置はさらに、
前記ｎ−位置グラジエント分配装置（１６）の出口に接続される入口、排出器（３０）に接続される１つの出口、及びマイクロ流量及びナノ流量計（３２）に接続されるもう一方の出口を有する流量偏向器（２８）を備え、分析回路（２６，３６）はそれぞれ接続され、
前記装置はさらに、
様々な移動相の混合組成を生成する前記マイクロ流量及びナノ流量の生成機（２，４，６，８，４０，４２，１０）を制御する手段、前記グラジエント分配装置（１６）の実行時間及び滞留時間に基づいて動作するグラジエントを生成する手段、前記マイクロ流量及びナノ流量計（３２）から受信したデータを基に、前記マイクロ流量及びナノ流量の生成機の処理能力を制御する手段、そして前記流量偏向器（２８）の位置を制御する手段が設けられた制御システム（３８）を備えることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記マイクロ流量及びナノ流量の生成機は、異なる溶媒を有する少なくとも２つの容器(２，４)、各容器に連結された往復ポンプ（６，８）、該ポンプにより生成された流量のミキサ（１０）、そして分配回路（１８）を備えることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記分配回路（１８）は、制御ユニット（３８）により制御されるバルブ（１４）を備え、該制御ユニットは、前記分配回路（１８）との接続位置と、前記分配回路（１８）との回避位置を切り替えることを特徴とする、請求項２記載の装置。
【請求項４】
前記分配回路は、前記バルブ（１４）及び排出器（２２）を接続する少なくとも１つのキャピラリ（２０，２０’）を備えることを特徴とする、請求項３記載の装置。
【請求項５】
前記マイクロ流量及びナノ流量生成機は、様々な溶媒を備える少なくとも２つの容器（２，４）、各容器に連結されたシリンジポンプ（４０，４２）そして、前記シリンジポンプにより生成されたマイクロ流量及びナノ流量のミキサを備えることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項６】
フィルタ（１２）が、前記ミキサ（１０）と前記グラジエント分配装置（１６）との間に介在することを特徴とする、請求項２又は５記載の装置。
【請求項７】
前記フィルタ（１２）は０．５μm孔を有する焼結鋼からなることを特徴とする、請求項６記載の装置。
【請求項８】
前記グラジエント分配装置（１６）のｎ−１ループ（２４１−２４５）は同容積を有し、第ｎループ（２４６）は、より大きい容積を有することを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項９】
前記グラジエント分配装置（１６）のｎ−１ループ（２４１−２４５）は５０μLの容積を有し、第ｎループ（２４６）は、１５０μLの容積を有することを特徴とする、請求項８記載の装置。
【請求項１０】
前記グラジエント分配装置（１６）は、ｎ位置バルブから構成されることを特徴とする請求項１記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高速液体クロマトグラフィーに用いられるマイクロ流量及びナノ流量移動相のグラジエントを生成する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近数十年の間に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムの進歩的な小型化を目にする。特に、移動相流量に関して利用される。流量が減少することで、特に、高価な有害溶媒の消費を制限することが可能である。注入量の減少により、少量のサンプルで実行可能となる。さらに、高感度濃度センサーが用いられると、カラムにおけるより少ない希釈溶媒及びノイズに対する信号の比率がより高くなることで、感度が増大する。
【０００３】
最後に、上記技術と新しい液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）と組み合わせることで、１μL/分未満の流量で作動可能であり、より高い感度を獲得し、生じうる混入の危険性を制限する。
【０００４】
しかしながら、非常に低流量の作動で、信頼性のある移動相のグラジエントを生成可能な器具を欠く構成となっている場合、問題が生じる。その上、遅延が生じ、溶媒が均一混合されない。１μL/分未満の流量でグラジエントを生成するには、適切なポンプシステムが必要であり、注意深く均一に移動相を混合するだけでなく、最小の遅延と再現可能な方法によりカラムに移動相を移す必要がある。しかしながら、これらの状況下で、市販で入手可能な器具は、限界状態での作動を余儀なくされる。従って、動作の信頼性についてはしばしば疑義がある。さらに、本発明におけるセットと比較すると、実効性のあるグラジエントプロファイルが、不十分な型を示す。
【０００５】
マイクロ流量及びナノ流量移動相のグラジエントを生成するもっとも一般的な方法の１つは、ＨＰＬＣポンプと注入器の間に挿入される分配器を用いる分配技術である。この解決方法は、カラムに実際移されるグラジエントが不十分な制御となり、不十分な再現精度の制御となるため、限定された解決方法にしかならない。ナノスケールのグラジエントを実現する最初の試みの１つは、キャピラリ内に特定のグラジエントを保存すること、そして、シリンジポンプでカラムへとそのグラジエントを移すことである。このシステムの欠点は、実用性がかけていること、生成されるグラジエントの選択が制限されていること、及びグラジエントの制御が不十分であることである。
【０００６】
もう１つ別の従来のシステムは、エキポネンシャル希釈法（Exponential dilution method）として知られており、このシステムは、凹型のエキポネンシャルプロファイル（Concave exponential profile）のグラジエントを生成させるとともに、移動相の流量を混合チャンバ内における薄い溶離液から、濃い溶離液へと急速に合流させる。
【０００７】
このシステムの欠点は、生成されるグラジエントの種類数が限定されていることである。
【０００８】
この欠点を克服するために、混合チャンバを、薄い溶離液で満たし、プログラムされた方法で、濃い溶離液をダイナミックミキサ（dynamic mixer）に流入させることが提案されている。これにより、経時的にグラジエントの変動を制御することが可能である。
【０００９】
本システムの欠点は、達成可能なグラジエントのプロファイルの多用途性が不十分な点である。
【００１０】
もう１つ別のシステムは、第一に薄い溶離液と、第二に濃い溶離液の２つの連続的な混合チャンバを導入し、そして、１つのポンプを用いてカラムへとこれらを同時に移すことで、ナノ流量の急激なグラジエントを生成する。
【００１１】
この従来の解決方法の欠点は、制限されたグラジエント、プロファイル選択、それに加え、一貫してグラジエントの遅延が生じる点である。
【００１２】
米国特許第７１３５１１１号は、ナノ流量のグラジエント溶離装置について記載している。該装置は、異なる溶媒を混合し移動させる第１ポンプ、移動溶液を移動させる第２ポンプ、注入器、カラム及び検知システムを備える。２つのループを用いることで、異なる混合溶媒が一時的に保存されるようになる。これらは、第１のマイクロ流量ポンプで移動され、第２のポンプでナノ流量カラムへと輸送される。内部システムの接続の変更を行い、流方向を変更することにより、混合溶媒が保存可能となる。
【００１３】
公知の解決方法における問題点は、ナノリットル／分で作動する際、一定流量で移動相を輸送することが困難な点である。
【００１４】
米国特許第７１４１１６１号は、溶離液を継続的にクロマトグラフへと輸送可能なグラジエントポンプ（gradient pump）の配置を示している。該ポンプは、２もしくはそれ以上の溶離液の組成が変更される間、特定の時間間隔、かつナノリットル／分の一定流量で、溶離液を継続的にクロマトグラフへ輸送可能である。グラジエントポンプの配置として、１０ポート多位置バルブ、アイソクラティックポンプ（isocratic pump）及び第２ループに接続される第１ループを有し、これらを経て、溶離液は輸送される。
【００１５】
この解決方法の欠点は、ポンプ及びバルブシステムが相当複雑であり、器具の使用が特に自動化が困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第７１３５１１１号
【特許文献２】米国特許第７１４１１６１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、請求項１記載の高速液体クロマトグラフィーに用いられるマイクロ流量及びナノ流量移動相のグラジエントを生成する新しい配置を提供することで、前述した欠点を取り除くことにある。
【００１８】
２つの本発明の好適な実施例は、添付の図面を参照しつつ、以下にさらに明記する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の装置の第１実施例を示す概略図である、該装置は、分配装置に接続される２つの従来のＨＰＬＣポンプを有する。
【００２０】
【図２】所定濃度で４つの混合物質のクロマトグラフ分離を、５回繰り返していることを示す。
【００２１】
【図３】無段で整えられたグラジエントのプロファイルを示す。
【００２２】
【図４】特定のクロマトグラフ条件下での、Ｈ２Ｏ中の、０％から１００％までのＣＨ３ＣＮのグラジエントの３つの異なるプロファイルを示す。
【００２３】
【図５】図４の３つのプロファイルの予測される理論的なパターンを示す。
【００２４】
【図６】マイクロ流量及びナノ流量の２つのＨＰＬＣシリンジポンプを備える本発明の装置の第２の実施例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図１で提示する、本発明の装置の第１実施例は、マイクロ及びナノグラジエントを生成することを目的とする。
【００２６】
溶媒Ａ及びＢの２つの容器（２）及び（４）を備える。これらは、２つの従来のＨＰＬＣ往復ポンプ（６）（８）を介して、ミキサ（１０）に接続され、該ミキサ（１０）は、０．５μm孔を有する焼結フィルタ（１２）に接続される。このフィルタは、多位置バルブ（１６）の入口に、（１８）により全体が示される分配回路を介して接続される。
【００２７】
この分配回路は、バルブ（１４）と２つの同一のPEEKsilキャピラリ（２５もしくは５０μｍ  Ｉ．Ｄ．）を備え、該キャピラリは、小さなデッドボリュームである回路を介してバルブに接続されるとともに、排出器（２２）に接続される。分配回路（１８）は、ＨＰＬＣポンプ（６）（８）、２つのキャピラリ（２０）（２０’）により提供されるインピーダンス、及びクロマトグラフィーカラム（２６）により、生成される高流量から所望の流量を得ることを可能とする。これらは本発明により提供される
【００２８】
多位置バルブ（１６）は、従来の型であり、例えば、テキサス州のヒューストンにあるValco Instruments Co. Inc.,のEMTCST6UW型である。多位置バルブ（１６）は、１４のポートが提供され、そのうちの２つは、入口と出口である。一方、他の１２のポートは、６つのループ（２４i）の接続部を示す。該６つのループ（２４i）は、内径２５０μmのPEEKチューブで形成し、移動相を保存する。
【００２９】
第１の（２４１）から（２４５）までの５つのループは、５０μLと同量の容積であり、第６ループは１５０μLの容積である。第６ループは、最終のグラジエントの組成を備え、より多い容積であれば、クロマトグラフ分析の遂行及びカラム（２６）の洗浄に有益である。
【００３０】
多位置バルブ（１６）の出口ポートは、２位置バルブ（２８）の入口に接続される。該２位置バルブ（２８）は、排出器（３０）に接続される１つの出口を有し、もう一方の出口は、マイクロ流量及びナノ流量計（３２）に接続される。該流量計（３２）は、クロマトグラフィカラム（２６）に対する注入器（３４）に接続される。該カラムには、検出器（３６）に連結する。
【００３１】
各装置部品の動作、特に２位置バルブ（１４）と（２８）及び多位置バルブ（１６）は特に、制御システム（３８）に連動し、装置の組織立てられた自動動作を提供する。
【００３２】
動作において、第１の定期的な動作は、多位置バルブ（１６）に連結する６つのループ（２４i）に充填を行うことからなる。この充填を達成するために、２つの２位置バルブ（１４）及び（２８）がバルブ（１４）と調整され、分配装置（１６）及びを回避する。バルブ（２８）は、多位置バルブ（１６）と排出器（３０）を接続する。
【００３３】
この構成において、ポンプ（６）及び（８）は、0.8から1.0mL/分程度の高流量を提供し、手順を高速にする。制御システムは、ポンプ（６）及び（８）の制御プログラムを起動する。該ポンプ（６）（８）の制御プログラムは、多位置バルブ（１６）の実行時間のプログラムに関連付けられ、これにより、６つのループ（２４i）内に溶離力を増加する異なる移動相の組成を分配する。
【００３４】
例えば、容器（２）に含まれる溶媒Ａの１００％のグラジエントから、容器（４）に含まれる溶媒Bの１００％のグラジエントまで生成するために、第１ループ（２４１）が選択され、同時に、ポンプ（６）が溶媒Ａ１００％のみを、0.8-1.0mL/分でポンピングするようプログラムされている。理論上、ループを充填する時間は、ほんの数秒である。しかしながら、実際のところ、調節するのに数分待つのが好ましい。従って、数分後、ループ(２４１)には完全に対応する移動相の組成が充填される。そして、制御システムは、多位置バルブ（１６）を作動させ、第２ループ（２４２）をバルブ（１４）に接続する。同時に、ポンプ（６）と（８）の動作は変更され、ポンプ（６）が溶媒Ａの８０％をポンピングし、ポンプ（８）が溶媒Bの２０％をポンピングする。
【００３５】
さらに数分後、第３ループ（２４３）が選択され、ポンプは溶媒Ａの６０％をポンピングし、溶媒Ｂの４０％をポンピングするように、さらに変更される。
【００３６】
ポンプ（８）が単独で溶媒Ｂの１００％を送出するようプログラムされた状態で、第６ループ（２４６）が選択されるまで、この工程は繰り返される。
【００３７】
ループ（２４i）の充填が完成すると、溶媒Ａ１００％が通過する状態で、第１ループ（２４１）が選択される。そして、流量が減少し、２つの２位置バルブ（１４）と（２８）が切替えられ、分配回路に挿入され、多位置バルブ（１６）を分析回路に接続する。システムは、ナノ流量計（３２）からのデータを処理し、ポンプ（６）の流量を制御する。これにより、カラム(２６)に所望の流量を得ることができる。
【００３８】
この構成において、分配回路（１６）から生じたマイクロ流量もしくはナノ流量の溶媒Aは、より薄い溶離液（一般的に水）で、第１ループ（２４１）を継続的に再び充填し、カラム（２６）を調節する。
【００３９】
以下に示すサンプルの導入及びクロマトグラフ分析の開始で、多位置バルブ（１６）が作動し、より大きい溶離力を有する組成で装填されたすぐ隣のループ（２４２）の内容物をカラム（２６）へと移す。この工程は、あらゆるループで繰り返し行われる。生成されるグラジエントの型は、実行時間と滞留時間を変更させることで、獲得される。溶媒Ａは、一定の移動相の流量を送出することが可能である。該溶媒Aは、変化させずに、分析が終了するまで、各ループの内容物を押し出すために用いられる。
【００４０】
本発明の装置を実装するのに際し、従来のクロマトグラフに対して変更を行う必要はない。この点は特に重要である。従来の市販のＨＰＬクロマトグラフであればどれであっても、マイクロ流量及びナノ流量で効果的に作用する。
【００４１】
低流量であること、ループ（２４ｉ）が小径であること、及びキャピラリを接続させることにより、乱流の現象もしくは混合が生じることはない。一度、連続的に完全に満たされると、６つのループ（２４ｉ）により、流量に応じて、異なる分析に十分な溶離力を提供することが可能である。
【００４２】
制御システムは、グラジエントの種類及び使用される流量に応じて、各分析間の各ループ（２４ｉ）により使用される溶媒の量をメモリ内に保存する。これは、ループ（２４ｉ）が対応する移動相の組成が無くなる前、そして、正確なグラジエントを生成することが不可能である前に、新しい充填手順が自動的に開始されることを意味する。
【００４３】
本発明の装置の特性及び性能を評価するために、モニュロン、ジフェノキスロン、リニュロン及びアジンホスエチルの４つの組成を各々５mg/Lの濃度で混合させる分析を５回行うことで、１日における繰返精度が検証された。
【００４４】
１６分のＨ２Ｏ中、０%から１００％までのＣＨ３ＣＮの直線グラジエントを用いて、Ｃ18の粒子相3.5μmで充填されたAgilent Zorbax 150mm×75μmのカラムにより、分離が得られた。５０nLの容量を注入し、λ＝２３０nmのＵＶで検出した。
【００４５】
図２は、５つの分析における長保持時間の繰返精度を示す。相対標準偏差は、０．１９％未満である。
【００４６】
表１は、１日における繰返精度のより詳細な評価のために、図２のクロマトグラムに対する保持時間を示す。
【００４７】
【表１】
2011501143.tif 000003
【００４８】
また、１日における繰返精度を評価するために、５日の連続的作業日における日毎の１０のクロマトグラフ分離が実行された。分析された組成は、メトミル、モニュロン、ジフェノキスロン、リニュロンであり、それぞれ１９７mg/Lの濃度である。用いられたグラジエントは、１００％のＨ２Ｏから１００％のＣＨ３ＣＮまでの１６分におけるグラジエントである。３６０nL/分の流量のAgilent Zorbax C18 3.5μm, 150mm×75μmのカラムで、６０nLの容量を注入し、λ＝２３０nmのＵＶで検出した。
【００４９】
以下に示す表２は、各作業日の各組成の平均保持時間及び毎日の平均に対する標準偏差を示す。１日における優れた繰返精度が各組成において観察された。
【００５０】
【表２】
2011501143.tif 000004
【００５１】
移動相の組成における時定数変化を得るために、一般的に、無段のグラジエントを用いることが好ましい。この観点から、移動相の急変、段階が付された特有の型は、急激な極性変化に相当し、溶解性及び再現精度の両方の観点から、クロマトグラフ分離を突然に妨げる。
【００５２】
ナノ流量、連続的なループにおける異なる移動相は、太一バルブ（１６）及び接続部の空間内で交互に混合する。これにより、溶媒の組成の急速な変化を避ける。
【００５３】
図３は、無段で整えられたグラジエントのプロファイルを示す。
【００５４】
図４は、異なるバルブ動作プログラムで、４００nL/分の流量で獲得される１２分における３つのグラジエントのプロファイルを示す。
【００５５】
ループ（２４ｉ）は、以下の溶媒の組成で満たされる。ループ（２４１）は、１００％のＨ２Ｏと０％のＣＨ３ＣＮ、ループ（２４２）は、８０％のＨ２Ｏと２０％のＣＨ３ＣＮ、ループ（２４３）は、６０％のＨ２Ｏと４０％のＣＨ３ＣＮ、ループ（２４４）は、４０％のＨ２Ｏと６０％のＣＨ３ＣＮ、ループ（２４５）は、２０％のＨ２Ｏと８０％のＣＨ３ＣＮ、
ループ（２４６）は、０％のＨ２０と１００％のＣＨ３ＣＮである。
【００５６】
動作プログラムは、下記の通りである。ループ（２４２）は、０．３０分、ループ（２４３）は、１分、ループ（２４４）は、１．３０分、ループ（２４５）は、９分であり、凹型のグラジエントを意味する曲線ａを示す。ループ（２４２）は、３分、ループ（２４３）は、３分、ループ（２４４）は、３分、ループ（２４５）は、３分であり、直線グラジエントを意味する曲線ｂを示す。ループ（２４２）は、９．００分、ループ（２４３）は、１．３０分、ループ（２４４）は、１分、ループ（２４５）は、０．３０分であり、凸型のグラジエントを意味する曲線ｃを示す。
【００５７】
予期される理論上の型は、図５に示される。吸収に関連する線は、選択された実行時間により示されるが、非常によく差別化されている。非常に少ない作動流量を考慮すると、この点は特に重要である。
【００５８】
様々な状況下において、推定のグラジエントと実際のグラジエントの型との間は、多いに一致するため、実行時間の表、及びより直感的なグラフによる手法の両方で設定されるようなグラジエントの形成が可能である。この点で、制御システムは、実行時間に応じて、コンピュータスクリーン上にグラジエントのプロファイルを表示することが可能である。設定時間における各変化は、表示されたプロファイルにおいて、対応する変化として即座に反映される。
【００５９】
同様に、コンピュータポインタ（computer pointer）でドラッグされたグラフにより得られた、各グラジエントプロファイルが変更されると、表にされた実行時間における対応する変更を測定する。その結果、表にされた時間パラメータもしくはグラフのプロファイルを定めることで、各グラジエントの形は容易にプログラムされる。
【００６０】
直線グラジエントが必要な場合、「直線グラジエント」のコマンドが用いられる。これは、グラジエントの期間を選択することで、自動的に実行時間を計算し、グラジエントプロファイルを表示する。
【００６１】
図６の実施例に示すように、本発明の装置は、往復ポンプ（６）及び（８）を、マイクロ流量及びナノ流量のシリンジポンプ（４０）及び（４２）に取り替えている点で、図１に示すものとは異なる。これにより、分配回路（１８）を用いることなく、ナノ流量を得ることが可能である。
【００６２】
その他の点に関しては、同一の参照番号の付された同一の部品を有し、装置は類似する。
【００６３】
前述の記載から、マイクロ流量及びナノ流量が自動で生成され、分析要求に応じて、グラジエントの型を高度に柔軟な選択が可能であり、常に高い正確性と再現性を有することから、本発明の装置は特に有益であることは明らかである。
【図１】
2011501143.tif 000005
【図２】
2011501143.tif 000006
【図３】
2011501143.tif 000007
【図４】
2011501143.tif 000008
【図５】
2011501143.tif 000009
【図６】
2011501143.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月7日(2009.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高速液体クロマトグラフィーに用いられるマイクロ流量及びナノ流量移動相のグラジエントを生成する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近数十年の間に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムの進歩的な小型化を目にする。特に、移動相流量に関して利用される。流量が減少することで、特に、高価な有害溶媒の消費を制限することが可能である。注入量の減少により、少量のサンプルで実行可能となる。さらに、高感度濃度センサーが用いられると、カラムにおけるより少ない希釈溶媒及びノイズに対する信号の比率がより高くなることで、感度が増大する。
【０００３】
最後に、上記技術と新しい液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）と組み合わせることで、１μL/分未満の流量で作動可能であり、より高い感度を獲得し、生じうる混入の危険性を制限する。
【０００４】
しかしながら、非常に低流量の作動で、信頼性のある移動相のグラジエントを生成可能な器具を欠く構成となっている場合、問題が生じる。その上、遅延が生じ、溶媒が均一混合されない。１μL/分未満の流量でグラジエントを生成するには、適切なポンプシステムが必要であり、注意深く均一に移動相を混合するだけでなく、最小の遅延と再現可能な方法によりカラムに移動相を移す必要がある。しかしながら、これらの状況下で、市販で入手可能な器具は、限界状態での作動を余儀なくされる。従って、動作の信頼性についてはしばしば疑義がある。さらに、本発明におけるセットと比較すると、実効性のあるグラジエントプロファイルが、不十分な型を示す。
【０００５】
マイクロ流量及びナノ流量移動相のグラジエントを生成するもっとも一般的な方法の１つは、ＨＰＬＣポンプと注入器の間に挿入される分配器を用いる分配技術である。この解決方法は、カラムに実際移されるグラジエントが不十分な制御となり、不十分な再現精度の制御となるため、限定された解決方法にしかならない。ナノスケールのグラジエントを実現する最初の試みの１つは、キャピラリ内に特定のグラジエントを保存すること、そして、シリンジポンプでカラムへとそのグラジエントを移すことである。このシステムの欠点は、実用性がかけていること、生成されるグラジエントの選択が制限されていること、及びグラジエントの制御が不十分であることである。
【０００６】
もう１つ別の従来のシステムは、エキポネンシャル希釈法（Exponential dilution method）として知られており、このシステムは、凹型のエキポネンシャルプロファイル（Concave exponential profile）のグラジエントを生成させるとともに、移動相の流量を混合チャンバ内における薄い溶離液から、濃い溶離液へと急速に合流させる。
【０００７】
このシステムの欠点は、生成されるグラジエントの種類数が限定されていることである。
【０００８】
この欠点を克服するために、混合チャンバを、薄い溶離液で満たし、プログラムされた方法で、濃い溶離液をダイナミックミキサ（dynamic mixer）に流入させることが提案されている。これにより、経時的にグラジエントの変動を制御することが可能である。
【０００９】
本システムの欠点は、達成可能なグラジエントのプロファイルの多用途性が不十分な点である。
【００１０】
もう１つ別のシステムは、第一に薄い溶離液と、第二に濃い溶離液の２つの連続的な混合チャンバを導入し、そして、１つのポンプを用いてカラムへとこれらを同時に移すことで、ナノ流量の急激なグラジエントを生成する。
【００１１】
この従来の解決方法の欠点は、制限されたグラジエント、プロファイル選択、それに加え、一貫してグラジエントの遅延が生じる点である。
【００１２】
米国特許第７１３５１１１号は、ナノ流量のグラジエント溶離装置について記載している。該装置は、様々な溶媒を混合し移動させる第１ポンプ、移動溶液を移動させる第２ポンプ、注入器、カラム及び検知システムを備える。２つのループを用いることで、異なる混合溶媒が一時的に保存されるようになる。これらは、第１のマイクロ流量ポンプで移動され、第２のポンプでナノ流量カラムへと輸送される。内部システムの接続の変更を行い、流方向を変更することにより、混合溶媒が保存可能となる。
【００１３】
公知の解決方法における問題点は、ナノリットル／分で作動する際、一定流量で移動相を輸送することが困難な点である。
【００１４】
米国特許第７１４１１６１号は、溶離液を継続的にクロマトグラフへと輸送可能なグラジエントポンプ（gradient pump）の配置を示している。該ポンプは、２もしくはそれ以上の溶離液の組成が変更される間、特定の時間間隔、かつナノリットル／分の一定流量で、溶離液を継続的にクロマトグラフへ輸送可能である。グラジエントポンプの配置として、１０ポート多位置バルブ、アイソクラティックポンプ（isocratic pump）及び第２ループに接続される第１ループを有し、これらを経て、溶離液は輸送される。
【００１５】
この解決方法の欠点は、ポンプ及びバルブシステムが相当複雑であり、器具の使用が特に自動化が困難である。
【００１６】
Cappiello A. et Al 「Variable-Gradient Generators for Micro and NanoHPLC」, Anal. Chem. 2003,75, 1173-1179において、液体クロマトグラフィーでのマイクロ流量及びナノ流量の移動相のグラジエントを生成する装置については公知である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第７１３５１１１号
【特許文献２】米国特許第７１４１１６１号
【非特許文献１】Cappiello A. et Al 「Variable-Gradient Generators for Micro and NanoHPLC」, Anal. Chem. 2003,75, 1173-1179
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、この公知の装置を改良し、マイクロ流量及びナノ流量を自動的に、高速の動作速度で、生成し、提供することである。その上、分析的要求に応じて、グラジエントの傾きの選択し、非常に高い安定性を有し、高水準の精度と繰返精度を有するマイクロ流量及びナノ流量を提供することである。
【００１９】
本発明の目的は、請求項１記載の高速液体クロマトグラフィーに用いられるマイクロ流量及びナノ流量移動相のグラジエントを生成する装置を実現することである。
【００２０】
２つの本発明の好適な実施例は、添付の図面を参照しつつ、以下にさらに明記する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の装置の第１実施例を示す概略図である、該装置は、分配装置に接続される２つの従来のＨＰＬＣポンプを有する。
【００２２】
【図２】所定濃度で４つの混合物質のクロマトグラフ分離を、５回繰り返していることを示す。
【００２３】
【図３】無段で整えられたグラジエントのプロファイルを示す。
【００２４】
【図４】特定のクロマトグラフ条件下での、Ｈ２Ｏ中の、０％から１００％までのＣＨ３ＣＮのグラジエントの３つの異なるプロファイルを示す。
【００２５】
【図５】図４の３つのプロファイルの予測される理論的なパターンを示す。
【００２６】
【図６】マイクロ流量及びナノ流量の２つのＨＰＬＣシリンジポンプを備える本発明の装置の第２の実施例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
図１で提示する、本発明の装置の第１実施例は、マイクロ及びナノグラジエントを生成することを目的とする。
【００２８】
溶媒Ａ及びＢの２つの容器（２）及び（４）を備える。これらは、２つの従来のＨＰＬＣ往復ポンプ（６）（８）を介して、ミキサ（１０）に接続され、該ミキサ（１０）は、０．５μm孔を有する焼結フィルタ（１２）に接続される。このフィルタは、多位置バルブ（１６）の入口に、（１８）により全体が示される分配回路を介して接続される。
【００２９】
この分配回路は、バルブ（１４）と２つの同一のPEEKsilキャピラリ（２５もしくは５０μｍ  Ｉ．Ｄ．）を備え、該キャピラリは、小さなデッドボリュームである回路を介してバルブに接続されるとともに、排出器（２２）に接続される。分配回路（１８）は、ＨＰＬＣポンプ（６）（８）、２つのキャピラリ（２０）（２０’）により提供されるインピーダンス、及びクロマトグラフィーカラム（２６）により、生成される高流量から所望の流量を得ることを可能とする。これらは本発明により提供される
【００３０】
多位置バルブ（１６）は、従来の型であり、例えば、テキサス州のヒューストンにあるValco Instruments Co. Inc.,のEMTCST6UW型である。多位置バルブ（１６）は、１４のポートが提供され、そのうちの２つは、入口と出口である。一方、他の１２のポートは、６つのループ（２４i）の接続部を示す。該６つのループ（２４i）は、内径２５０μmのPEEKチューブで形成し、移動相を保存する。
【００３１】
第１の（２４１）から（２４５）までの５つのループは、５０μLと同量の容積であり、第６ループは１５０μLの容積である。第６ループは、最終のグラジエントの組成を備え、より多い容積であれば、クロマトグラフ分析の遂行及びカラム（２６）の洗浄に有益である。
【００３２】
多位置バルブ（１６）の出口ポートは、２位置バルブ（２８）の入口に接続される。該２位置バルブ（２８）は、排出器（３０）に接続される１つの出口を有し、もう一方の出口は、マイクロ流量及びナノ流量計（３２）に接続される。該流量計（３２）は、クロマトグラフィカラム（２６）に対する注入器（３４）に接続される。該カラムには、検出器（３６）に連結する。
【００３３】
各装置部品の動作、特に２位置バルブ（１４）と（２８）及び多位置バルブ（１６）は特に、制御システム（３８）に連動し、装置の組織立てられた自動動作を提供する。
【００３４】
動作において、第１の定期的な動作は、多位置バルブ（１６）に連結する６つのループ（２４i）に充填を行うことからなる。この充填を達成するために、２つの２位置バルブ（１４）及び（２８）がバルブ（１４）と調整され、分配装置（１６）及びを回避する。バルブ（２８）は、多位置バルブ（１６）と排出器（３０）を接続する。
【００３５】
この構成において、ポンプ（６）及び（８）は、0.8から1.0mL/分程度の高流量を提供し、手順を高速にする。制御システムは、ポンプ（６）及び（８）の制御プログラムを起動する。該ポンプ（６）（８）の制御プログラムは、多位置バルブ（１６）の実行時間のプログラムに関連付けられ、これにより、６つのループ（２４i）内に溶離力を増加する異なる移動相の組成を分配する。
【００３６】
例えば、容器（２）に含まれる溶媒Ａの１００％のグラジエントから、容器（４）に含まれる溶媒Bの１００％のグラジエントまで生成するために、第１ループ（２４１）が選択され、同時に、ポンプ（６）が溶媒Ａ１００％のみを、0.8-1.0mL/分でポンピングするようプログラムされている。理論上、ループを充填する時間は、ほんの数秒である。しかしながら、実際のところ、調節するのに数分待つのが好ましい。従って、数分後、ループ(２４１)には完全に対応する移動相の組成が充填される。そして、制御システムは、多位置バルブ（１６）を作動させ、第２ループ（２４２）をバルブ（１４）に接続する。同時に、ポンプ（６）と（８）の動作は変更され、ポンプ（６）が溶媒Ａの８０％をポンピングし、ポンプ（８）が溶媒Bの２０％をポンピングする。
【００３７】
さらに数分後、第３ループ（２４３）が選択され、ポンプは溶媒Ａの６０％をポンピングし、溶媒Ｂの４０％をポンピングするように、さらに変更される。
【００３８】
ポンプ（８）が単独で溶媒Ｂの１００％を送出するようプログラムされた状態で、第６ループ（２４６）が選択されるまで、この工程は繰り返される。
【００３９】
ループ（２４i）の充填が完成すると、溶媒Ａ１００％が通過する状態で、第１ループ（２４１）が選択される。そして、流量が減少し、２つの２位置バルブ（１４）と（２８）が切替えられ、分配回路に挿入され、多位置バルブ（１６）を分析回路に接続する。システムは、ナノ流量計（３２）からのデータを処理し、ポンプ（６）の流量を制御する。これにより、カラム(２６)に所望の流量を得ることができる。
【００４０】
この構成において、分配回路（１６）から生じたマイクロ流量もしくはナノ流量の溶媒Aは、より薄い溶離液（一般的に水）で、第１ループ（２４１）を継続的に再び充填し、カラム（２６）を調節する。
【００４１】
以下に示すサンプルの導入及びクロマトグラフ分析の開始で、多位置バルブ（１６）が作動し、より大きい溶離力を有する組成で装填されたすぐ隣のループ（２４２）の内容物をカラム（２６）へと移す。この工程は、あらゆるループで繰り返し行われる。生成されるグラジエントの型は、実行時間と滞留時間を変更させることで、獲得される。溶媒Ａは、一定の移動相の流量を送出することが可能である。該溶媒Aは、変化させずに、分析が終了するまで、各ループの内容物を押し出すために用いられる。
【００４２】
本発明の装置を実装するのに際し、従来のクロマトグラフに対して変更を行う必要はない。この点は特に重要である。従来の市販のＨＰＬクロマトグラフであればどれであっても、マイクロ流量及びナノ流量で効果的に作用する。
【００４３】
低流量であること、ループ（２４ｉ）が小径であること、及びキャピラリを接続させることにより、乱流の現象もしくは混合が生じることはない。一度、連続的に完全に満たされると、６つのループ（２４ｉ）により、流量に応じて、異なる分析に十分な溶離力を提供することが可能である。
【００４４】
制御システムは、グラジエントの種類及び使用される流量に応じて、各分析間の各ループ（２４ｉ）により使用される溶媒の量をメモリ内に保存する。これは、ループ（２４ｉ）が対応する移動相の組成が無くなる前、そして、正確なグラジエントを生成することが不可能である前に、新しい充填手順が自動的に開始されることを意味する。
【００４５】
本発明の装置の特性及び性能を評価するために、モニュロン、ジフェノキスロン、リニュロン及びアジンホスエチルの４つの組成を各々５mg/Lの濃度で混合させる分析を５回行うことで、１日における繰返精度が検証された。
【００４６】
１６分のＨ２Ｏ中、０%から１００％までのＣＨ３ＣＮの直線グラジエントを用いて、Ｃ18の粒子相3.5μmで充填されたAgilent Zorbax 150mm×75μmのカラムにより、分離が得られた。５０nLの容量を注入し、λ＝２３０nmのＵＶで検出した。
【００４７】
図２は、５つの分析における長保持時間の繰返精度を示す。相対標準偏差は、０．１９％未満である。
【００４８】
表１は、１日における繰返精度のより詳細な評価のために、図２のクロマトグラムに対する保持時間を示す。
【００４９】
【表１】
2011501143.tif 000011
【００５０】
また、１日における繰返精度を評価するために、５日の連続的作業日における日毎の１０のクロマトグラフ分離が実行された。分析された組成は、メトミル、モニュロン、ジフェノキスロン、リニュロンであり、それぞれ１９７mg/Lの濃度である。用いられたグラジエントは、１００％のＨ２Ｏから１００％のＣＨ３ＣＮまでの１６分におけるグラジエントである。３６０nL/分の流量のAgilent Zorbax C18 3.5μm, 150mm×75μmのカラムで、６０nLの容量を注入し、λ＝２３０nmのＵＶで検出した。
【００５１】
以下に示す表２は、各作業日の各組成の平均保持時間及び毎日の平均に対する標準偏差を示す。１日における優れた繰返精度が各組成において観察された。
【００５２】
【表２】
2011501143.tif 000012
【００５３】
移動相の組成における時定数変化を得るために、一般的に、無段のグラジエントを用いることが好ましい。この観点から、移動相の急変、段階が付された特有の型は、急激な極性変化に相当し、溶解性及び再現精度の両方の観点から、クロマトグラフ分離を突然に妨げる。
【００５４】
ナノ流量、連続的なループにおける異なる移動相は、多位置バルブ（１６）及び接続部の空間内で交互に混合する。これにより、溶媒の組成の急速な変化を避ける。
【００５５】
図３は、無段で整えられたグラジエントのプロファイルを示す。
【００５６】
図４は、異なるバルブ動作プログラムで、４００nL/分の流量で獲得される１２分における３つのグラジエントのプロファイルを示す。
【００５７】
ループ（２４ｉ）は、以下の溶媒の組成で満たされる。ループ（２４１）は、１００％のＨ２Ｏと０％のＣＨ３ＣＮ、ループ（２４２）は、８０％のＨ２Ｏと２０％のＣＨ３ＣＮ、ループ（２４３）は、６０％のＨ２Ｏと４０％のＣＨ３ＣＮ、ループ（２４４）は、４０％のＨ２Ｏと６０％のＣＨ３ＣＮ、ループ（２４５）は、２０％のＨ２Ｏと８０％のＣＨ３ＣＮ、
ループ（２４６）は、０％のＨ２０と１００％のＣＨ３ＣＮである。
【００５８】
動作プログラムは、下記の通りである。ループ（２４２）は、０．３０分、ループ（２４３）は、１分、ループ（２４４）は、１．３０分、ループ（２４５）は、９分であり、凹型のグラジエントを意味する曲線ａを示す。ループ（２４２）は、３分、ループ（２４３）は、３分、ループ（２４４）は、３分、ループ（２４５）は、３分であり、直線グラジエントを意味する曲線ｂを示す。ループ（２４２）は、９．００分、ループ（２４３）は、１．３０分、ループ（２４４）は、１分、ループ（２４５）は、０．３０分であり、凸型のグラジエントを意味する曲線ｃを示す。
【００５９】
予期される理論上の型は、図５に示される。吸収に関連する線は、選択された実行時間により示されるが、非常によく差別化されている。非常に少ない作動流量を考慮すると、この点は特に重要である。
【００６０】
様々な状況下において、推定のグラジエントと実際のグラジエントの型との間は、多いに一致するため、実行時間の表、及びより直感的なグラフによる手法の両方で設定されるようなグラジエントの形成が可能である。この点で、制御システムは、実行時間に応じて、コンピュータスクリーン上にグラジエントのプロファイルを表示することが可能である。設定時間における各変化は、表示されたプロファイルにおいて、対応する変化として即座に反映される。
【００６１】
同様に、コンピュータポインタ（computer pointer）でドラッグされたグラフにより得られた、各グラジエントプロファイルが変更されると、表にされた実行時間における対応する変更を測定する。その結果、表にされた時間パラメータもしくはグラフのプロファイルを定めることで、各グラジエントの形は容易にプログラムされる。
【００６２】
直線グラジエントが必要な場合、「直線グラジエント」のコマンドが用いられる。これは、グラジエントの期間を選択することで、自動的に実行時間を計算し、グラジエントプロファイルを表示する。
【００６３】
図６の実施例に示すように、本発明の装置は、往復ポンプ（６）及び（８）を、マイクロ流量及びナノ流量のシリンジポンプ（４０）及び（４２）に取り替えている点で、図１に示すものとは異なる。これにより、分配回路（１８）を用いることなく、ナノ流量を得ることが可能である。
【００６４】
その他の点に関しては、同一の参照番号の付された同一の部品を有し、装置は類似する。
【００６５】
前述の記載から、マイクロ流量及びナノ流量が自動で生成され、分析要求に応じて、グラジエントの型を高度に柔軟な選択が可能であり、常に高い正確性と再現性を有することから、本発明の装置は特に有益であることは明らかである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高速液体クロマトグラフィーに用いられるマイクロ流量及びナノ流量移動相のグラジエントを生成する装置であって、
異なる比率の組成の少なくとも２つの移動相のマイクロ流量及びナノ流量の生成機（２，４，６，８，４０，４２，１０）と、
多くのキャピラリのループ（２４i）に対する、入口ポート、出口ポート及びｎ対のポートを備えるｎ−位置グラジエント分配装置（１６）を備え、前記ループのそれぞれは、一方の端部で前記入口ポートと選択的に接続可能であり、もう一方の端部で前記出口ポートと選択的に接続可能であり、該出口ポートは、クロマトグラフカラム（２６）と検出器（３６）を備える分析回路に接続され、
前記装置はさらに、
異なる移動相の混合組成を生成する前記マイクロ流量及びナノ流量の生成機（２，４，６，８，４０，４２，１０）を制御する手段と、
前記グラジエント分配装置（１６）の実行時間及び滞留時間に基づいて動作する前記グラジエント分配装置（１６）を制御する手段と
前記分析回路（２６，３６）に接続されるマイクロ流量及びナノ流量計（３２）と、
前記分配装置（１６）の出口に接続される入口、排出器（３０）に接続される出口、及びマイクロ流量及びナノ流量計（３２）に接続されるもう一方の出口を有する流量偏向器（２８）と、
制御ユニットを備え、該制御ユニットは、異なる移動相の混合組成を生成する前記マイクロ流量及びナノ流量の生成機（２，４，６，８，４０，４２，１０）を制御する前記手段（３８）、前記グラジエント分配装置（１６）を制御する前記手段、前記流量偏向器（２８）の位置を制御する手段、前記マイクロ流量及びナノ流量計（３２）により供給される情報に従い、前記マイクロ流量及びナノ流量の前記生成機の処理量を制御する手段を備えることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記マイクロ流量及びナノ流量の生成機は、異なる溶媒を有する少なくとも２つの容器(２，４)、各容器に連結された往復ポンプ（６，８）、該ポンプにより生成された流量のミキサ（１０）、そして分配回路（１８）を備えることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記分配回路（１８）は、制御ユニット（３８）により制御されるバルブ（１４）を備え、該制御ユニットは、前記分配回路（１８）との接続位置と、前記分配回路（１８）との回避位置を切り替えることを特徴とする、請求項２記載の装置。
【請求項４】
前記分配回路は、前記バルブ（１４）及び排出器（２２）を接続する少なくとも１つのキャピラリ（２０，２０’）を備えることを特徴とする、請求項３記載の装置。
【請求項５】
前記マイクロ流量及びナノ流量生成機は、様々な溶媒を備える少なくとも２つの容器（２，４）、各容器に連結されたシリンジポンプ（４０，４２）そして、前記シリンジポンプにより生成されたマイクロ流量及びナノ流量のミキサを備えることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項６】
フィルタ（１２）が、前記ミキサ（１０）と前記グラジエント分配装置（１６）との間に介在することを特徴とする、請求項２又は５記載の装置。
【請求項７】
前記フィルタ（１２）は０．５μm孔を有する焼結鋼からなることを特徴とする、請求項６記載の装置。
【請求項８】
前記グラジエント分配装置（１６）のｎ−１ループ（２４１−２４５）は同容積を有し、第ｎループ（２４６）は、より大きい容積を有することを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項９】
前記グラジエント分配装置（１６）のｎ−１ループ（２４１−２４５）は５０μLの容積を有し、第ｎループ（２４６）は、１５０μLの容積を有することを特徴とする、請求項８記載の装置。
【請求項１０】
前記グラジエント分配装置（１６）は、ｎ位置バルブから構成されることを特徴とする請求項１記載の装置。
【国際調査報告】
2011501143.tif 000013
2011501143.tif 000014
2011501143.tif 000015