(57)【要約】  ワクチン、及びワクチンを生成及び使用するための方法。例示的なワクチンは腸毒性大腸菌に対するワクチンであってもよい。ワクチンは大腸菌の菌株を含んでもよい。大腸菌の菌株は：Ｋ８８線毛と；ＳＴｂエンテロトキシンと結合した変異体のＬＴエンテロトキシンを含む融合タンパク質と；を産生できる。ブタの離乳後下痢症用のワクチンを産生するための例示的な方法は、第１の大腸菌の菌株を提供するステップを具えることができる。菌株はｅｌｔＡＢ遺伝子とｅｓｔＢ遺伝子とを含むことができる。本方法は更に、ｅｌｔＡＢ遺伝子を増幅するステップと、ｅｌｔＡＢ遺伝子を変異するステップと、変異体のｅｌｔＡＢ遺伝子の、ｅｓｔＢ遺伝子との遺伝子融合物を産生するステップと、第２の大腸菌の菌株を遺伝子融合物で形質転換するステップと、を具えることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸毒性大腸菌に対するワクチンであって：
Ｋ８８線毛と；
ＳＴｂエンテロトキシンと結合した変異体のＬＴエンテロトキシンを含む融合タンパク質と；
を産生する大腸菌の菌株を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項２】
請求項１に記載のワクチンにおいて、当該ワクチンが大腸菌生ワクチンであることを特徴とするワクチン。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか１項に記載のワクチンにおいて、当該ワクチンがブタの離乳後下痢症に対するワクチンであることを特徴とするワクチン。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のワクチンにおいて、前記大腸菌の菌株がＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９２６１の下で、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託される菌株であることを特徴とするワクチン。
【請求項５】
ブタの離乳後下痢症用のワクチンを産生するための方法であって、当該方法が：
第１の大腸菌の菌株を提供するステップであって、前記菌株がｅｌｔＡＢ遺伝子とｅｓｔＢ遺伝子とを含むステップと；
前記ｅｌｔＡＢ遺伝子を増幅するステップと；
前記ｅｌｔＡＢ遺伝子を変異するステップと；
変異体の前記ｅｌｔＡＢ遺伝子の、前記ｅｓｔＢ遺伝子との遺伝子融合物を産生するステップと；
第２の大腸菌の菌株を前記遺伝子融合物で形質転換するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記第１の大腸菌の菌株がＫ８８線毛を発現することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５又は６のいずれか１項に記載の方法において、前記第１の大腸菌の菌株がＫ８８ａｃ線毛を発現することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５ないし７のいずれか１項に記載の方法において、前記第１の大腸菌の菌株がＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９２６２の下で、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託される菌株であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項５ないし８のいずれか１項に記載の方法において、前記変異体のｅｌｔＡＢ遺伝子の、前記ｅｓｔＢ遺伝子との遺伝子融合物を産生するステップが、前記ｅｌｔＡＢ遺伝子と前記ｅｓｔＢ遺伝子との間のリンカーを処分するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項５ないし９のいずれか１項に記載の方法において、前記第２の大腸菌の菌株が前記ｅｌｔＡＢ遺伝子を欠くことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項５ないし１０のいずれか１項に記載の方法において、前記第２の大腸菌の菌株が前記ｅｓｔＢ遺伝子を欠くことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項５ないし１１のいずれか１項に記載の方法において、前記第２の大腸菌の菌株がＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９２６０の下で、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託される菌株であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項５ないし１２のいずれか１項に記載の方法が：
前記遺伝子融合物で形質転換される前記第２の大腸菌の菌株を水、乳、代用乳又は食品に添加するステップと；
前記水、乳、代用乳又は食品を哺乳類に投与するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記哺乳類がブタであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
ブタの離乳後下痢症用の生ワクチンであって、
Ｋ８８線毛と；
ＳＴｂエンテロトキシンと結合した変異体のＬＴエンテロトキシンを含む融合タンパク質と；
を産生する大腸菌の菌株を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１６】
請求項１５に記載のワクチンにおいて、前記大腸菌の菌株がＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９２６１の下で、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託される菌株であることを特徴とするワクチン。
【請求項１７】
腸毒性大腸菌に対するワクチンであって、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９２６１の下で、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託される大腸菌の菌株を含むことを特徴とするワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００８年７月８日出願の先願である米国特許出願第１２／１６９，２５９号の利益を主張し、引用によって本明細書中に組み込まれている。
【０００２】
［発明の分野］
本発明はワクチンに関する。特に、本発明はブタにおいて、腸毒性大腸菌（ＥＴＥＣ）によって引き起こされる離乳後下痢症用のワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は特に下痢症を含む腸内の問題を引き起こすことで悪名高い通常の細菌種である。腸内疾患及び／又は下痢症と関連する、１の大腸菌の種類はいわゆる腸毒性大腸菌（ＥＴＥＣ）である。ＥＴＥＣは恐らくは、旅行者の下痢症を引き起こすことで最も良く知られている。食事及び／又は水の供給源の汚染が一般的にはＥＴＥＣの根源である。
【０００４】
ＥＴＥＣによって引き起こされる疾患は、腸内壁への細菌の接着と毒素（例えば、エンテロトキシン）の宿主系内への放出との双方による。腸内壁への接着は細菌の外部に配列し、接着を可能にする１以上の「線毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）」（すなわち、付属物）を通して実現される。特定のＥＴＥＣ菌株の線毛は宿主特異性である傾向にある。例えば、ブタに感染するＥＴＥＣはＫ−８８線毛を有するが、ヒトに感染する菌株はＣＦＡ  Ｉ及びＣＦＡ  ＩＩの線毛を有する。
【０００５】
ＥＴＥＣは２の毒素：易熱性（ＬＴ）毒素と；耐熱性（ＳＴ）毒素と；を産生する。ＬＴ毒素は活性又は「Ａ」サブユニットと、５の結合又は「Ｂ」サブユニットとを含む。ＬＴは腸内細胞においてｃＡＭＰを増加させる点でコレラ毒素と同様の方法で作用し、電解質及び水の排出の増加（下痢症）を引き起こす。ＳＴ毒素は「ａ型（ｔｙｐｅ  ａ）」（すなわち、ＳＴａ）又は「ｂ型（ｔｙｐｅ  ｂ）」（すなわち、ＳＴｂ）となりうる。ＳＴはｃＧＭＰの産生を刺激し、更に体液排出及び下痢症の増加を導く。腸毒性大腸菌の菌株は非侵襲性であるため、炎症、血性下痢症、あるいは発熱といった全身兆候を引き起こさない。
【０００６】
北アメリカ（及び世界中）の豚産業における、ＥＴＥＣによって引き起こされる新生仔及び離乳後の下痢症は、最も経済上重要なブタの疾患のうちの１つである。例えば、ＥＴＥＣ菌株は総ての離乳前のブタの１０．８％及び総ての離乳したブタの最大３％を超える死因と考えられている（Ｔｕｂｂら，１９９３，“Ｐｒｅｗｅａｎｉｎｇ  ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｓｗｉｎｅ  ｈｅｅｄ”，Ｓｗｉｎｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｄ．１：２１−２８；ＣＬ．Ｇｙｌｅ編，“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ”，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｏｘｏｎ，ＵＫのＨａｍｐｓｏｎ，１９９４，“Ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｉｎ  ｐｉｇｓ”，ｐｐ１７１−１９１；Ｄｅｗｅｙら，２０００，“Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｎ  ｎｕｒｓｅｒｙ  ｐｉｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｓｗｉｎｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｔｉｏｎｓｅｒｓ，Ｐ  ３−１１，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ。その開示全体は引用によって本明細書中に総て組み込まれる）。ブタにおける新生仔及び離乳後の下痢症を治療及び／又は予防する方法に対するニーズは進行中である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明はワクチン用の代替物の設計、材料、製造方法、及び使用を提供する。例示的なワクチンは腸毒性大腸菌に対するワクチンにできる。ワクチンは大腸菌の菌株を含みうる。大腸菌の菌株は、Ｋ８８線毛と、ＳＴｂエンテロトキシンと結合した変異体のＬＴエンテロトキシンを含む融合タンパク質とを産生できる。
【０００８】
ブタの離乳後下痢症用のワクチンを産生するための例示的な方法は、第１の大腸菌の菌株を提供するステップを具えることができる。菌株はｅｌｔＡＢ遺伝子とｅｓｔＢ遺伝子とを含みうる。この方法は更に、ｅｌｔＡＢ遺伝子を増幅するステップと、ｅｌｔＡＢ遺伝子を変異するステップと、変異体のｅｌｔＡＢ遺伝子の、ｅｓｔＢ遺伝子との遺伝子融合物を産生するステップと、第２の大腸菌の菌株を前記遺伝子融合物で形質転換するステップとを具えうる。
【０００９】
別の例示的なワクチンは、ブタの離乳後下痢症用の生ワクチンでありうる。ワクチンは大腸菌の菌株を含みうる。大腸菌の菌株は、Ｋ８８線毛と、ＳＴｂエンテロトキシンと結合した変異体のＬＴエンテロトキシンを含む融合タンパク質とを産生できる。
【００１０】
上のいくつかの実施形態の概要は、本発明の各々の開示した実施形態又は各々の実装について記載することを意図していない。図面及び詳細な説明が後に続き、これらの実施形態を更に詳しく例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に定義される用語については、異なる定義が特許請求の範囲において、あるいは他の場合に明細書において与えられない限り、これらの定義が適用される。
【００１２】
総ての数値は本明細書中では、明確に示されていようとなかろうと用語「約（ａｂｏｕｔ）」によって修飾されると推定される。用語「約」は一般的には、当該技術分野の当業者が列挙した数値と等価である（すなわち、同一の機能又は結果を有する）と見なす数値範囲のことである。多数の例において、用語「約」は最隣接する有効数字に四捨五入された数値を含むことができる。
【００１３】
端点によって列挙した数値範囲は、その範囲内の総ての数を含む（例えば、１ないし５は１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、及び５を含む）。
【００１４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「ある（ａ、ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、内容がそうではないと明確に示していない限り、複数の指示対象を含む。本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられるように、用語「又は（ｏｒ）」は一般的には、内容がそうではないと明確に示していない限り「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む意味で用いられる。
【００１５】
以下の詳細な説明は、異なる図面の同様の要素が同一の番号を付された図面を参照して解釈されるべきである。図面は縮尺通りである必要はなく、例示的な実施形態を示し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００１６】
実施例のワクチンは本明細書中に記載されており、腸毒性大腸菌（ＥＴＥＣ）によって引き起こされる下痢症の予防に有効であるように設計できる。ワクチンはブタにおいて、ＥＴＥＣによって引き起こされる離乳後下痢症の予防に有効になりうる。他のワクチンが考察されており、同一又は同様の設計の考えで設計でき、ヒトを含む他の哺乳類において、ＥＴＥＣによって引き起こされる下痢症の予防に有効になりうる。更に、ワクチンは：産生するのが容易で安全であるように；かつ実質的に、ブタを飼育し、処理し、輸送し、繁殖させ、あるいは別の方法でブタを扱う者が、ワクチンを用いて、ブタの離乳後下痢症から保護できるように；設計できる。
【００１７】
ワクチンは従来の方法でブタに送達できるように設計してもよい。例えば、ワクチンは給餌（例えば、食物、乳、若しくは代用乳、及び／又は水）を通して経口でブタに投与してもよい。この投与経路は、ブタが供される処理量を最小化しうるために所望されうる。代替的に、ワクチンは非経口的、静脈内、筋肉内、局所的、又は皮下を含む他の好適な方法で投与してもよい。当然ながら、投与経路は指示されてもよく、その他の場合においてはワクチンの形態によって判断してもよい。
【００１８】
ワクチンの設計はブタの下痢症における主要なＥＴＥＣの病原性因子を考慮でき：
１）細菌の宿主腸細胞の表面への接着を介在し、コロニー形成を惹起する細菌接着と；
２）体液分泌の原因となるエンテロトキシンと；を含みうる。
例えば、近年の研究は、離乳後下痢症に関連する５０ないし７０％を超える大腸菌の菌株が、Ｋ８８型の線毛を産生することが示している。Ｋ８８線毛のうち、Ｋ８８ａｃが北アメリカで発見された唯一のＫ８８の変異体であり、世界中で最も一般的である。Ｋ８８ａｃ線毛は更に、ブタのＥＴＥＣの大腸菌症において必須の病原性決定基として確立されてきた（例えば：Ｆｒａｎｃｉｓら，１９９８，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｎｃｉｎ−ｔｙｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋ８８  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｉｇｌｅｔ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  Ｋ８８＋  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，ｂｕｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｏ  ｂｒｕｓｈ  ｂｏｒｄｅｒｓ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ”，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６，４０５０−４０５５参照。その開示全体は引用によって本明細書中に組み込まれる）。従って、抗原としてＫ８８線毛及び／又はＫ８８ａｃ線毛を標的にするワクチンが所望されうる。
【００１９】
総てのＫ８８＋菌株はＬＴ及びＳＴｂを産生する（例えば：Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｄ．Ｈ．，２００２，“Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ”，Ｊ．Ｓｗｉｎｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｄ．１０，１７１−１７５；Ｆｒｙｄｅｎｄａｈｌ，Ｋ．，２００２，“Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ａｎｄ  ｅｄｅｍａ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ａｎｄ  ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ”，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８５，１６９−１８２；及び、Ｚｈａｎｇら，２００７，“Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｙｏｕｎｇ  ｐｉｇｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｕ．Ｓ．”，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２３，１４５−１５２；参照。その開示全体は総て、引用によって本明細書中に組み込まれる）。離乳後下痢症に関与する実質的に総ての大腸菌の菌株はＳＴｂを産生する。いくつかの研究は更に、ＬＴエンテロトキシン及びＳＴｂエンテロトキシンがＥＴＥＣ感染と関連する下痢症に関与することを実証している（例えば：Ｂｅｒｂｅｒｏｖら，２００４，“Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｕｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ｄｉａｒｒｈｅａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃ  ｐｉｇｌｅｔ  ｍｏｄｅｌ  ｂｙ  ａ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｅｎｔｅｒｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ”，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２，３９１４−３９２４；及び、Ｚｈａｎｇら，２００６，“Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｉｌｅ  ａｎｄ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｎ  ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４，３１０７−３１１４；参照。その開示全体は総て、引用によって本明細書中に組み込まれる）。従って、抗原としてＬＴ及び／又はＳＴｂを標的にするワクチンが所望される。更に、Ｋ８８ａｃ、ＬＴ、及びＳＴｂに対する抗原を含むワクチンは、ブタの主要な病原体の実質的に総ての病原性決定基をカバーするため所望されうる。この設計ストラテジーを用いるワクチンの独自性は、ワクチンが産生でき、ＥＴＥＣの総ての主要な病原性因子の抗原を発現することである。これらのワクチンの少なくとも一部は子ブタにおいて実質的に非病原性であるように見える。
【００２０】
本明細書中に記載のワクチンの更なる固有の態様は、ワクチンが競争的排除性の生菌ならびにワクチンとして機能しうることである（例えば、少なくともいくつかの実施形態においては、本明細書中に記載のワクチンは生菌の効果を有する）。微生物における競争的排除性の生菌は、疾患を引き起こすのに病原体によって要求される、宿主内の生物学的ニッチで、病原体と競合する。二重目的の生菌／ワクチンの菌株の大きな利点は、ブタが離乳時に所有権が変更し、ＥＴＥＣの疾患に対する脆弱性がその後すぐに生じる場合に、豚産業で重大となる、疾患からの保護が即時に起こしうることである。更に、有機体は生ワクチンであってもよいため、養豚場の水システムに送達でき、豚産業での懸案事項である、個々の動物処理を要求しない。
【００２１】
［ワクチン］
少なくとも一部の実施形態においては、本明細書中に記載のワクチンは、腸毒性大腸菌の菌株によって生じる下痢症の疾患から若齢の豚を保護するように設計される生ワクチンである。ワクチンはＫ８８ａｃ線毛由来の抗原と、遺伝子操作された融合タンパク質とを発現する、生存型の大腸菌の菌株を含むことができる。融合タンパク質は変異体及び／又は非毒性の易熱性（ＬＴ）エンテロトキシンと耐熱性Ｂ型（ＳＴｂ）エンテロトキシンとを含んでもよい。
【００２２】
別の実施形態においては、ワクチンはＫ８８ａｃ線毛由来の抗原と、変異体及び／又は非毒性の易熱性（ＬＴ）エンテロトキシンとを発現する生存型の大腸菌の菌株を含んでもよい。
【００２３】
更に別の実施形態においては、ワクチンはＫ８８ａｃ線毛由来の抗原と、変異体及び／又は非毒性の耐熱性Ｂ型（ＳＴｂ）エンテロトキシンとを発現する生存型の大腸菌の菌株を含んでもよい。
【００２４】
更に別の実施形態においては、ワクチンは変異体及び／又は非毒性の易熱性（ＬＴ）エンテロトキシン、非毒性の耐熱性Ｂ型（ＳＴｂ）エンテロトキシン、又は例えば融合タンパク質として結合した双方を産生する生存型の大腸菌の菌株を含んでもよい。
【００２５】
更に別の実施形態においては、ワクチンはＫ８８ａｃ以外の線毛、例えばＥＴＥＣと関連する他の線毛に対する抗原を発現する生存型の大腸菌の菌株を含んでもよい。これらのワクチンは更に、変異体及び／又は非毒性の易熱性（ＬＴ）エンテロトキシン、変異体及び／又は非毒性の耐熱性Ｂ型（ＳＴｂ）エンテロトキシン、又はその双方を発現してもよい。
【００２６】
本明細書中に記載のワクチンはブタ用の給餌に植菌することによってブタに送達してもよい。例えば、ワクチンはブタ用の食物、乳（若しくは代用乳）、水又は双方に添加してもよい。
【００２７】
本明細書中に記載のワクチンは：ｅｌｔＡＢ遺伝子とｅｓｔＢ遺伝子とを含む第１の大腸菌の菌株を提供すること；ｅｌｔＡＢ遺伝子を増幅すること；ｅｌｔＡＢ遺伝子を変異すること；変異体のｅｌｔＡＢ遺伝子の、ｅｓｔＢ遺伝子との遺伝子融合物を産生すること；及び、第２の大腸菌の菌株を遺伝子融合物で形質転換すること；によって生産及び／又は産生できる。
【実施例】
【００２８】
本発明は以下の実施例によって更に明確になり、好適な実施形態の一部を例示するのに用いられるが、決して本発明を限定するのに用いられない。
【００２９】
［実施例１］
〈ｅｌｔＡＢ遺伝子の分離及びクローン化〉
ｅｌｔＡＢ遺伝子（ＬＴエンテロトキシンをコード）及びｅｓｔＢ遺伝子（ＳＴｂエンテロトキシンをコード）のために用いられる原料は、「野生分離株（ｆｉｅｌｄ  ｉｓｏｌａｔｅ）３０３０−２」と称されるブタの腸毒性大腸菌（ＥＴＥＣ）の野生分離株由来のゲノムＤＮＡ全体であった。野生分離株３０３０−２は、米国ヴァージニア州マナッサス２０１１０−２２０９  ユニバーシティ大通り１０８０１にあるアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ（登録商標））で、ブダペスト条約の条件の下で２００８年６月６日に寄託され、既知のＡＴＣＣ特許寄託番号（ＡＴＣＣ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）ＰＴＡ−９２６２である。寄託された材料の公衆に対する利用可能性の総ての制限は、米国特許法施行規則§１．８０８（ｂ）に特定された要求を除き、特許の付与で変更不可能に除去され、寄託の条件は米国特許法施行規則§１．８０６に従う。
【００３０】
ゲノムＤＮＡはＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅキット（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社から商業上入手可能）を用いて野生分離株３０３０−２から単離された。得られた分離したゲノムＤＮＡは、０．１μｇ／μｌの保存液に保存／希釈された。この保存液はｅｌｔＡＢ遺伝子（ＬＴエンテロトキシンをコード）と、ｅｓｔＢ遺伝子（ＳＴｂエンテロトキシンをコード）とを増幅するためのＤＮＡの供給源及び／又は鋳型として用いられた。ｅｌｔＡＢ遺伝子は、配列番号２によって表わされるアミノ酸配列をコードする、配列番号１として表わされたヌクレオチド配列からなる。ｅｓｔＢ遺伝子は、配列番号４によって表わされるアミノ酸配列をコードする、配列番号３として表わされたヌクレオチド配列からなる。
【００３１】
ｅｌｔＡＢ遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅された。２のプライマー：
「ＬＴ−Ｆ」と称され、配列番号５によって表わされるヌクレオチド配列からなる合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドと；
「ＬＴ−Ｒ」と称され、配列番号６によって表わされるヌクレオチド配列からなる合成ＤＮＡプライマーと；
はこの反応で合成された。
ＰＣＲは、等倍のプラーク形成単位の（Ｍｇ＋＋を有する）ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と、０．２ｍＭのｄＮＴＰと、各０．５μＭのＬＴ−Ｆ及びＬＴ−Ｒと、１μｌの野生分離株３０３０−２由来のゲノムＤＮＡの保存液と、１ユニットのプラーク形成単位のＤＮＡポリメラーゼとを含む５０μｌの反応容量において、ＢＩＯＲＡＤ  ＰＴＣ−１００サーマルサイクラー（カリフォルニア州のＢＩＯＲＡＤ社）で行われた（カリフォルニア州のＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）。ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分の１サイクルと；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の３０サイクルと；その後の７２℃で６分の延長と；を含んだ。
【００３２】
増幅されたｅｌｔＡＢ遺伝子（すなわち、ＰＣＲによる反応産物）はアガロースゲル電気泳動を用いて適合する大きさであることを確認され、その後ゲルから切除され、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社から商業上入手可能）を用いて精製された。精製されたｅｌｔＡＢ遺伝子のＰＣＲ産物はその後、３５μｌのｄｄＨ２Ｏで溶出された。
【００３３】
ｅｌｔＡＢ遺伝子はｐＢＲ３２２プラスミドベクター（ウィスコンシン州Ｐｒｏｍｅｇａ社から商業上入手可能）にクローン化された。ｐＢＲ３２２ベクターは最初に、制限酵素ＥｃｏＲＶ（マサチューセッツ州のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社から商業上入手可能）で３７℃で１時間、等倍緩衝液（ＥｃｏＲＶ用の緩衝液３）と、等倍のＢＳＡと、２０ユニットの酵素とを有する２５μｌの反応容量において消化された。消化後、消化されたｐＢＲ３２２プラスミドは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社）を用いてアガロースゲル電気泳動によって精製された。消化されたｐＢＲ３２２プラスミドはその後、３５μｌのｄｄＨ２Ｏに溶出された。
【００３４】
ｅｌｔＡＢ遺伝子のベクターｐＢＲ３２２へのクローニングは、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（マサチューセッツ州のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社から商業上入手可能）で１６℃で一晩、２μｌの１０倍緩衝液と、１μｌのＴ４リガーゼと、７μｌの消化されたｐＢＲ３２２保存液と、１０μｌのｅｌｔＡＢ保存液とを含む２０μｌの反応容量において行われる連結反応を含んだ。
【００３５】
２マイクロリットルのＴ４連結された産物は、０．１ｃｍ間隙の電気穿孔キュベット（ミズーリ州のＳｉｇｍａ社）において２．５ｋＶ、２５ｕＦの静電容量、及び２００Ωの抵抗値に設定したＥＣＭ６３０（カリフォルニア州のＢＴＸ（登録商標）社）の電気穿孔器（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）を用いて、「野生分離株１８３６−２」と称されたブタの野生分離株由来の１００μｌの大腸菌のコンピテント細胞に導入された。野生分離株１８３６−２は、ｅｌｔＡＢ遺伝子とｅｓｔＢ遺伝子とを欠く非病原性のブタの大腸菌の野生分離株である。
【００３６】
野生分離株１８３６−２は、米国ヴァージニア州マナッサス２０１１０−２２０９  ユニバーシティ大通り１０８０１にあるアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））で、ブダペスト条約の条件の下で２００８年６月６日に寄託され、既知のＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９２６０である。寄託された材料の公衆に対する利用可能性の総ての制限は、米国特許法施行規則§１．８０８（ｂ）に特定された要求を除き、特許の付与で変更不可能に除去され、寄託の条件は米国特許法施行規則§１．８０６に従う。
【００３７】
菌株１８３６−２はＫ８８ａｃ線毛を発現し、Ｋ８８受容体陽性のブタの腸上皮をコロニー形成する。１８３６−２菌株のみが若齢のブタで病気を惹起しない（Ｚｈａｎｇら，２００６，“Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｎ  ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ”，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：３１０７−３１１４。その開示全体は引用によって本明細書中に組み込まれる）。
【００３８】
５０μｌの形質転換された１８３６−２細胞は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む寒天プレート上に延展された。プレートは３７℃で一晩インキュベートされた。
【００３９】
陽性コロニー（アンピシリン耐性で選択）はプレート上で観察された。プラスミドＤＮＡはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社）を用いて陽性コロニーから抽出され、最初にＰＣＲによってスクリーニングされ、その後ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社から商業上入手可能）で配列決定され、ｅｌｔＡＢ遺伝子がｐＢＲ３２２に挿入され、正しい読み枠にあることを確認した。
【００４０】
ｅｌｔＡＢ遺伝子を含む、得られたプラスミドベクターはｐＬＴと称され、精製され（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）、０．１μｇ／μｌの保存液に希釈された。
【００４１】
［実施例２］
〈ｅｌｔＡＢ遺伝子の変異体〉
ｐＬＴにおけるｅｌｔＡＢ遺伝子は、ｅｌｔＡＢ遺伝子のアミノ酸残基番号１９２に対応するヌクレオチドを「ＡＧＡ」から「ＧＧＡ」に変えるために部位特異的変異誘発を用いて変異された。プラスミドｐＬＴはこの変異のための配列を含むプラスミドを産生するための鋳型として用いられ、ｐＬＴ１９２と称した。ｐＬＴ１９２変異体を産生するために、２の内部のＰＣＲプライマー：
「ＬＴ１９２−Ｆ」と称され、配列番号７によって表わされるヌクレオチド配列からなる合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドと；
「ＬＴ１９２−Ｒ」と称され、配列番号８によって表わされるヌクレオチド配列からなる合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドと；
はＰＣＲ反応で用いられた。
ＰＣＲは、１μｌのｐＬＴの保存液と、等倍のプラーク形成単位の（Ｍｇ＋＋を有する）ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と、０．２ｍＭのｄＮＴＰと、各０．５μＭのＬＴ１９２−Ｆ及びＬＴ１９２−Ｒと、１ｕｌのｐＢＲ３２２保存液（１００ｎｇ／ｕｌ）と、１ユニットのプラーク形成単位のＤＮＡポリメラーゼとを含む５０μｌの反応容量において、ＢＩＯＲＡＤ  ＰＴＣ−１００サーマルサイクラー（カリフォルニア州のＢＩＯＲＡＤ社）で行われた（カリフォルニア州のＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）。ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分の１サイクルと；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の３０サイクルと；その後の７２℃で６分の延長と；を含んだ。
【００４２】
増幅された変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子（すなわち、ＰＣＲによる反応産物）はアガロースゲル電気泳動を用いて適合する大きさであることを確認され、その後ゲルから切除され、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社から商業上入手可能）を用いて精製された。精製された変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子のＰＣＲ産物はその後、３５μｌのｄｄＨ２Ｏで溶出された。
【００４３】
［実施例３］
〈変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子のクローン化〉
ＤＮＡ鋳型としてのｐＬＴプラスミドの場合、プラスミドｐＢＲ３２２の一部及びｅｌｔＡＢ遺伝子の５’末端は、ＰＣＲプライマーを用いて増幅され、ＳｆｃＩ制限部位を含む過剰重複する５’末端を追加した。この反応のプライマーは：
「ｐＢＲＥｃｏＲＩ−Ｆ」と称され、配列番号９によって表わされるヌクレオチド配列からなる合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドと；
ＬＴ１９２−Ｒと；
を含んだ。
ＰＣＲは、１μｌのｐＬＴの保存液と、等倍のプラーク形成単位の（Ｍｇ＋＋を有する）ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と、２００ｎＭのｄＮＴＰと、各０．５μＭのｐＢＲＥｃｏＲＩ−Ｆ及びＬＴ１９２−Ｒと、１ユニットのプラーク形成単位のＤＮＡポリメラーゼとを含む５０μｌの反応容量において、ＢＩＯＲＡＤ  ＰＴＣ−１００サーマルサイクラー（カリフォルニア州のＢＩＯＲＡＤ社）で行われた（カリフォルニア州のＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）。ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分の１サイクルと；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の３０サイクルと；その後の７２℃で６分の延長と；を含んだ。
【００４４】
ｅｌｔＡＢ遺伝子の３’末端及びプラスミドｐＢＲ３２２の一部は更に、ＰＣＲプライマーを用いて増幅され、ＥａｇＩ制限部位を有する過剰重複する３’末端を追加した。この反応のプライマーは：
「ｐＢＲＥａｇＩ−Ｒ」と称され、配列番号１０によって表わされるヌクレオチド配列からなる合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドと；
ＬＴ１９２−Ｆと；
を含んだ。
ＰＣＲは、１μｌのｐＬＴの保存液と、等倍のプラーク形成単位の（Ｍｇ＋＋を有する）ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と、０．２ｍＭのｄＮＴＰと、各０．５μＭのＬＴ１９２−Ｆ及びｐＢＲＥａｇＩ−Ｒと、１ユニットのプラーク形成単位のＤＮＡポリメラーゼとを含む５０μｌの反応容量において、ＢＩＯＲＡＤ  ＰＴＣ−１００サーマルサイクラー（カリフォルニア州のＢＩＯＲＡＤ社）で行われた（カリフォルニア州のＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）。ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分の１サイクルと；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の３０サイクルと；その後の７２℃で６分の延長と；を含んだ。
【００４５】
変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子の増幅した５’末端及び３’末端のフラグメントは生成され（ＱＩＡＧＥＮ社のキットＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎを用いて）、その後変異型のブタのｅｌｔＡＢ遺伝子（ＬＴ１９２タンパク質をコード化）用のＳＯＥ（スプライスオーバラップ伸長）ＰＣＲで連結された。ＳＯＥ  ＰＣＲは、等倍のプラーク形成単位の（Ｍｇ＋＋を有する）ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と、０．２ｍＭのｄＮＴＰと、各２０μｌの精製された５’末端及び３’末端のＰＣＲ産物と、１ユニットのプラーク形成単位のポリメラーゼと、０．５ユニットのｔａｑＤＮＡポリメラーゼとを含む５０μｌの反応容量において行われた（カリフォルニア州のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）。ＳＯＥ  ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分の１サイクルと；９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で３分の１０サイクルと；その後の７２℃で１０分の延長と；を含んだ。
【００４６】
この変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子（ＬＴ１９２）は、制限酵素ＳｆｃＩ及びＥａｇＩで消化され、ベクターｐＢＲ３２２となった。ＳｆｃＩ及びＥａｇＩ制限酵素（マサチューセッツ州のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）での制限酵素の消化は３７℃で１時間、等倍緩衝液（ＥａｇＩ用の緩衝液３及びＳｆｃＩ用の緩衝液４）と、等倍のＢＳＡと、２０ユニットの酵素とを有する２５μｌの反応容量において行われた。消化された産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社）を用いてアガロースゲル電気泳動によって精製され、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（マサチューセッツ州のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）で１６℃で一晩、２μｌの１０倍緩衝液と、１μｌのＴ４リガーゼと、７μｌのベクターと、１０μｌの挿入物とを含む２０μｌの反応容量において連結された。
【００４７】
２マイクロリットルのＴ４連結された産物は、２．５ｋＶ、２５ｕＦの静電容量、及び２００Ωの抵抗を用いた電気穿孔法で、１００μｌの大腸菌のコンピテント細胞１８３６−２に導入された。
【００４８】
５０μｌの形質転換された１８３６−２細胞は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む寒天プレート上に延展された。プレートは３７℃で一晩インキュベートされた。
【００４９】
陽性コロニー（アンピシリン耐性で選択）はプレート上で観察された。プラスミドＤＮＡはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社）を用いて陽性コロニーから抽出され、最初にＰＣＲによってスクリーニングされ、その後ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社から商業上入手可能）で配列決定された。変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子を含む、得られたプラスミドベクターはｐＬＴ１９２と称され、精製され（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）、０．１μｇ／μｌの保存液に希釈された。
【００５０】
［実施例４］
〈変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子のｅｓｔＢ遺伝子との遺伝子融合物の産生〉
変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子のｅｓｔＢ遺伝子との遺伝子融合物を産生するために、２のＰＣＲ反応が行われた。最初に、我々は２の更なるＰＣＲプライマー：
「ＳＴｂ：ＬＴ−Ｆ５」と称され、配列番号１１によって表わされるヌクレオチド配列からなる合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドと；
「ＬＴ：ＳＴｂ−Ｒ４」と称され、配列番号１２によって表わされるヌクレオチド配列からなる合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドと；
を設計した。
「ＳＴｂ：ＬＴ−Ｆ５」順方向プライマーは、変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子の３’末端のヌクレオチドと、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏリンカーと、ｅｓｔＢ遺伝子の５’末端のヌクレオチドとを含む。「ＬＴ：ＳＴｂ−Ｒ４」逆方向プライマーは、ｅｓｔＢ遺伝子の５’末端と、リンカーと、変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子の３’末端とを含む。プラスミドｐＬＴ１９２由来のＤＮＡ鋳型と、プライマーｐＢＲＥｃｏＲＩ−Ｆ及びＬＴ：ＳＴｂ−Ｒ４とを用いるＰＣＲは、ｐＢＲ３２２ベクターの一部と、変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子全体（停止コドンは欠失）と、Ｇｌｙ−Ｐｒｏリンカーと、ｅｓｔＢ遺伝子の５’末端の一部を増幅した。
【００５１】
第１のＰＣＲは、１μｌのｐＬＴ１９２の保存液と、等倍のプラーク形成単位の（Ｍｇ＋＋を有する）ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と、０．２ｍＭのｄＮＴＰと、各０．５μＭのＳＴｂ：ＬＴ−Ｆ５及びＬＴ：ＳＴｂ−Ｒ４と、１ユニットのプラーク形成単位のＤＮＡポリメラーゼとを含む５０μｌの反応容量において、ＢＩＯＲＡＤ  ＰＴＣ−１００サーマルサイクラー（カリフォルニア州のＢＩＯＲＡＤ社）で行われた（カリフォルニア州のＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）。ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分の１サイクルと；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の３０サイクルと；その後の７２℃で６分の延長と；を含んだ。
【００５２】
野生分離株３０３０−２及びＰＣＲプライマーＳＴｂ：ＬＴ−Ｆ５由来のゲノムＤＮＡと、「ＳＴｂＥａｇＩ−Ｒ」と称され、配列番号１３によって表わされるヌクレオチド配列からなる合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドとを用いた第２のＰＣＲは、変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子の３’末端の一部と、リンカーと、ｅｓｔＢ遺伝子とを増幅した。そのＰＣＲは、１μｌの野生分離株３０３０−２のＤＮＡ保存液と、等倍のプラーク形成単位の（Ｍｇ＋＋を有する）ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液と、０．２ｍＭのｄＮＴＰと、各０．５μＭのＳＴｂ：ＬＴ−Ｆ５及びＳＴｂＥａｇＩ−Ｒと、１ユニットのプラーク形成単位のＤＮＡポリメラーゼとを含む５０μｌの反応容量において、ＢＩＯＲＡＤ  ＰＴＣ−１００サーマルサイクラー（カリフォルニア州のＢＩＯＲＡＤ社）で行われた（カリフォルニア州のＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）。ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分の１サイクルと；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分の３０サイクルと；その後の７２℃で６分の延長と；を含んだ。
【００５３】
増幅した産物はＳＯＥ  ＰＣＲで連結され、ＬＴ１９２−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−リンカー−ｅｓｔＢの融合産物を得た。ＳＯＥ  ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分の１サイクルと；９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で３分の１０サイクルと；その後の７２℃で１０分の延長と；を含んだ。
【００５４】
増幅した産物は、制限酵素ＳｆｃＩ及びＥａｇＩで消化された。ＳｆｃＩ及びＥａｇＩ制限酵素（マサチューセッツ州のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）での制限酵素の消化は３７℃で１時間、等倍緩衝液（ＥａｇＩ用の緩衝液３及びＳｆｃＩ用の緩衝液４）と、等倍のＢＳＡと、２０ユニットの酵素とを有する２５μｌの反応容量において行われた。消化された産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社）を用いてアガロースゲル電気泳動によって精製され、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（マサチューセッツ州のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社から商業上入手可能）で１６℃で一晩、２μｌの１０倍緩衝液と、１μｌのＴ４リガーゼと、７μｌの消化されたベクター（ｐＢＲ３２２）と、１０μｌの消化された挿入物（増幅した産物）とを含む２０μｌの反応容量において連結された。
【００５５】
２マイクロリットルのＴ４連結された産物は、２．５ｋＶ、２５ｕＦの静電容量、及び２００Ωの抵抗を用いた電気穿孔法で、１００μｌの大腸菌のコンピテント細胞１８３６−２に導入された。
【００５６】
５０μｌの形質転換された１８３６−２細胞は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む寒天プレート上に延展された。プレートは３７℃で一晩インキュベートされた。
【００５７】
陽性コロニー（アンピシリン耐性で選択）はプレート上で観察された。プラスミドＤＮＡはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社）を用いて陽性コロニーから抽出され、最初にＰＣＲによってスクリーニングされ、その後ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社から商業上入手可能）で配列決定された。変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子を含む、得られたプラスミドベクターは「ｐＬＴ１９２：ＳＴｂ」と称され、精製され（カリフォルニア州のＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）、０．１μｇ／μｌの保存液に希釈された。
【００５８】
プラスミドＬＴ１９２ＳＴｂで形質転換された菌株１８３６−２（例えば、陽性コロニーの培養物）は３０％のグリセリン溶液中に保持された。この菌株１８３６−２は、ワクチン菌株「８４８８」と称された。ワクチン菌株８４８８は、米国ヴァージニア州マナッサス２０１１０−２２０９  ユニバーシティ大通り１０８０１にあるアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））で、ブダペスト条約の条件の下で２００８年６月６日に寄託され、既知のＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−９２６１である。寄託された材料の公衆に対する利用可能性の総ての制限は、米国特許法施行規則§１．８０８（ｂ）に特定された要求を除き、特許の付与で変更不可能に除去され、寄託の条件は米国特許法施行規則§１．８０６に従う。
【００５９】
［実施例５］
代替的に、第１のＰＣＲ反応は「Ｌ−リンカー（Ｌ−ｌｉｎｋｅｒ）」を変えるために、以下に示すものと置換された。この実施例においては、「Ｌ−リンカー」（５’−ｃｇａｇｅｔｃｇｇｔａｃｃｃｇｇｇｇａｔｃ−‘３，Ｃｌｅｍｅｎｔｓ及びＣａｒｄｅｎａｓ，１９９０，“Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｈｙｂｒｉｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ”，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１：９８１−９９３。その開示全体は引用によって本明細書中に組み込まれる）を含む２の更なるＰＣＲプライマー：
「ＬＴ：ＳＴｂ−Ｒ５」と称され、配列番号１４によって表わされるヌクレオチド配列からなる合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドと；
「ＳＴｂ：ＬＴＢ−Ｆ」と称され、配列番号１５によって表わされるヌクレオチド配列からなる合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドと；
は、２のタンパク質の間の可動性を増加させることを意図すべく設計された。
実施例４に記載のものと同様の反応においては、ｐＢＲＥｃｏＲＩ−Ｆ及びＬＴ：ＳＴｂ−Ｒ５と、ｐＬＴ１９２：ＳＴｂプラスミドＤＮＡとを用いたＰＣＲは、変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子と、Ｌ−リンカーと、ｅｓｔＢ遺伝子の５’末端とを増幅し、ＳＴｂ：ＬＴＢ−Ｆ及びＳＴｂＥａｇＩ−Ｒを用いた第２のＰＣＲ（実施例４における切片ＰＣＲと同様）は、変異型のｅｌｔＡＢ遺伝子の３’末端と、Ｌ−リンカーと、ｅｓｔＢ遺伝子とを増幅した。２のフラグメントはＳＯＥ  ＰＣＲで連結され、ＳｆｃＩ及びＥａｇＩ酵素で消化され、その後ベクターｐＢＲ３２２に連結された。
【００６０】
［実施例６］
〈ワクチンの産生及び投与〉
ワクチンは５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ａｍｐｉｌｉｃｉｌｉｎ）を含む１０ｍｌのＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地において、２５μｌの菌株８４８８の菌株を３７℃で一晩インキュベートすることによって産生された。
【００６１】
３ミリリットル（３×１０９のコロニー形成単位又はＣＦＵ）の一晩成長させた菌株８４８８の培養物は、ブタへの経口投与用に２１９ｍｌのＥｓｂｉｌａｃ代用乳（アイオワ州のＰｅｔ  Ａｇ社）に混合された。
【００６２】
ワクチンの研究に用いられる子ブタは帝王切開によって分娩され、３の群に無作為に分割され、純粋隔離群の設備（無菌環境）において成長させた。７日齢で、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａａｏｍｉｃｒｏｎ）、クロストリジウム・クロストリディオフォルメ（Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｆｏｒｍｅ）、ラクトバチルス・ブレビス、及び大腸菌の菌株Ｇ５８−１を含む標準の植物性細菌とともに経口接種されて、これらの純粋隔離群の子ブタの未処理の免疫系を活性化した。これらの非病原性の細菌は通常は、ブタの腸管及び標準的な植物の一部に存在する。１４日齢で、ブタは３群：ワクチン群と２の負のコントロールと；に配置された。第１の群の４のブタ（以降の本実施例及び他の実施例においては「ワクチン菌株」群として認知される）はワクチン菌株８４８８（代用乳中に）を摂取し、第２の群の４のブタ（以降の本実施例及び他の実施例においては「１８３６−２（−）」群として認知される）は菌株１８３６−２（２１９ミリリットルの代用乳中に３ミリリットル又は３×１０９のＣＦＵの菌株１８３６−２）を摂取し、第３の群の４のブタ（以降の本実施例及び他の実施例においては「負のコントロール」群として認知される）は代用乳のみを摂取した。
【００６３】
１週後、ワクチン菌株群におけるブタは、３８７ミリリットルの代用乳中の３ｍｌの一晩成長させた８４８８の培養物の経口消化で、更なる免疫化で追加免役された。
【００６４】
更に１週後に、総ての３群のブタが３８７ミリリットルの代用乳に混合された、３ｍｌの野生型のＥＴＥＣ菌株３０３０−２の一晩成長させた培養物で曝露された。ブタは下痢症及び脱水症を含む臨床症状の発生の緻密な観察下にあった。４８時間後に、総てのブタは組織学的検討のため検死に供された。血液サンプルは各々の免疫化前後、曝露の前後に各々のブタから収集されて、免疫応答をモニタリングした（結果の実施例１１参照）。総てのブタは接種材料を消費するのを観察され、嘔吐、下痢症、脱水症、及び嗜眠を含む、後の臨床上の兆候をモニタリングした。検死時に、小さな腸内サンプルが細菌のコロニー形成の研究のために各々のブタから検死時に収集された。
【００６５】
子ブタは安楽死後の接種後４８時間で検死に供され、回腸（Ｉ）（回盲弁の近傍の３ないし５ｃｍ）、空腸下部（ＬＪ）（幽門弁と回盲弁との間の３分の１ないし２分の１）、空腸上部（ＵＪ）（幽門弁と回盲弁との間の２分の１ないし３分の２）、及び十二指腸（Ｄ）（幽門弁の遠位の３ないし５ｃｍ）のサンプルが細菌学的及び組織学的研究のために収集された。
【００６６】
［実施例８］
〈子ブタの脱水症の評価〉
曝露に続く脱水症のレベルは、血液の血中血球容積（ＰＣＶ）及び血漿の総タンパク質量（ＴＰ）の変化を測定することによって決定された。血液サンプルは接種前及び接種後１８時間で各々のブタから引き出された、他に記載のように、血液の血中血球容積及び血漿の総タンパク質量について試験した。簡潔に言うと、血液サンプルは７５ｍｍの毛管に配置され、ＴＰ及びＰＣＶの分析のために遠心分離された。ＰＣＶは標準的なヘマトクリット値の全体の割合のカルテを用いて判断された。血漿ＴＰ成分は標準的な医療用屈折計を用いて判断された。接種前の収集サンプルから接種後の収集サンプルへのＰＣＶ及び血漿ＴＰの増加は、脱水症の指標の役割をした。
【００６７】
［実施例９］
〈細菌の腸内コロニー形成の評価〉
小腸の細菌のコロニー形成の大きさ及び位置の判定は、定量培養及び免疫組織化学的に染色された子ブタの小腸部分の画像分析によって実現された。回腸組織の１グラムに対するＣＦＵ単位での細菌の濃度が決定された。簡潔に言うと、回腸組織が秤量され、ＰＢＳ中で（９×ＮｍｌのＰＢＳにＮグラムの組織の比率で）洗浄及び粉砕され、連続的に溶出され、血液寒天培地（ブレインハートベース）又はＬＢ寒天プレートに播種され、細菌コロニーが計数された後に、３７℃で一晩インキュベートされた。
【００６８】
［実施例１０］
〈Ｋ８８受容体発現の評価のための子ブタの刷子縁の接着アッセイ〉
検死で各々の子ブタから収集された空腸のサンプルは以下の標準的な方法で刷子縁の小胞を調製するのに用いることができる。各々の子ブタからの小腸内の刷子縁の小胞は、Ｋ８８ａｂ、Ｋ８８ａｃ、及びＫ８８ａｄの線毛を発現する大腸菌の接着のために試験された。刷子縁と混合した細菌の懸濁液は細菌の刷子縁への接着について位相差顕微鏡の下で試験された。個々の刷子縁の小胞に接着した細菌の数は計数され、各々の刷子縁のサンプルからの１０の小胞は細菌の算出用に含まれた。個々の刷子縁は、２以上の細菌が刷子縁の小胞に接着する場合に接着性であると見なされた。接着性のないブタはデータ分析から除外された。
【００６９】
［実施例１１］
〈結果〉
ワクチン菌株８４８８（ワクチン菌株群）で免疫化された総てのブタが健常のままであり、ブタの下痢性のＥＴＥＣ菌株３０３０−２で曝露後にいかなる下痢症又は脱水症の発生しなかった。小腸における糞中の水分層は平均３５．５％（固形の糞便、標準、健常）であった。１００％の保護が観察された。
【００７０】
負のコントロール群におけるブタ（１８３２−３（−）群及び負のコントロール群の双方）はブタの下痢性のＥＴＥＣ菌株３０３０−２で曝露後に、下痢症を発生した。小腸における糞中の水分層は９０％を超えた（小腸に蓄積した水、下痢症）。
【００７１】
ワクチン群（ワクチン菌株群）におけるブタは抗Ｋ８８抗体及び抗ＬＴ抗体が多いことが観察される一方、コントロール群（１８３２−３（−）群及び負のコントロール群の双方）においては、検出された抗体は無いか有意に低かった（以下の表１ないし６参照）。
【００７２】
ワクチン群由来のブタの小腸はワクチン菌株（６．７×１０８ＣＦＵ／ｇ）で大きくコロニー形成され、３０３０−２によるコロニー形成を予防する（０ないし６×１０４ＣＦＵ／ｇ）一方、負のコントロール群（１８３２−３（−）群及び負のコントロール群の双方）由来のブタの小腸は菌株３０３０−２（１．０３×１０８ＣＦＵ／ｇの３０３０−２）の曝露で優位にコロニー形成され、下痢症の疾患を発生するのに必須条件となる。
【００７３】
抗Ｋ８８抗体及び抗ＬＴ抗体の存在はウエスタンブロット分析を用いて測定された。各々の群のブタについて血清中で検出された抗Ｋ８８抗体の滴定量は、表１ないし３に示される。
【００７４】
【表１】
2011527682.tif 000002
【００７５】
【表２】
2011527682.tif 000003
【００７６】
【表３】
2011527682.tif 000004
【００７７】
血清中で検出された抗ＬＴ抗体の滴定量は、表４ないし６に示されている。
【００７８】
【表４】
2011527682.tif 000005
【００７９】
【表５】
2011527682.tif 000006
【００８０】
【表６】
2011527682.tif 000007
【００８１】
この開示は多数の点において単なる例示であると理解すべきである。本発明の範囲を超えることなく、細部にわたって、特に形状、大きさ、及びステップの配列において変更がなされうる。本発明の範囲は当然ながら、添付の請求項が表現される言葉において規定される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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