(57)【要約】  哺乳類の創傷の感染を診断又は予測する方法であって、サイトカインの存在を検出する工程を、備えており、サイトカインは、創傷から採取した体液中の、プロカルシトニン、アミノプロカルシトニン（N-ProCT）、エオタキシン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン１Ｂ単球走化性タンパク質（MCP-1）、マクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（MIP-a）、及び、血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質（RANTES）、を含むグループから、選択される。また、その方法を使用するための装置である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の創傷の感染を診断又は予測する方法であって、
サイトカインの存在を検出する工程を、備えており、
サイトカインは、創傷から採取した体液中の、プロカルシトニン、アミノプロカルシトニン（N-ProCT）、エオタキシン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン１Ｂ単球走化性タンパク質（MCP-1）、マクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（MIP-a）、及び、血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質（RANTES）、を含むグループから、選択される、
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
創傷体液のサンプル中の１つのマーカーの濃度を測定する工程を、備えている、
請求項１に記載の哺乳類の創傷の感染を診断又は予測する方法。
【請求項３】
創傷から採取された創傷体液のサンプルに対して実行される、体外方法である、
請求項１又は２に記載の哺乳類の創傷の感染を診断又は予測する方法。
【請求項４】
サイトカインの測定レベルを非感染創傷の特有の基準レベルと比較する工程を、備えている、
前記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
創傷から採取した体液を希釈する工程を、備えている、
前記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
創傷が、例えば、皮膚潰瘍、静脈潰瘍、褥瘡、又は、褥瘡性潰瘍等の、慢性潰瘍である、
前記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
サイトカインを、サイトカインの結合パートナーを備えている装置を使用することによって、創傷体液中で、検出する、
前記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
サイトカインが、プロカルシトニン、又は、アミノプロカルシトニンである、
前記請求項のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
プロカルシトニンのレベルが、０．５ｎｇ／ｍｌより大きい、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
創傷体液中のサイトカインの存在及びレベルを測定することによって、プロカルシトニン、アミノプロカルシトニン（N-ProCT）、エオタキシン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン１B単球走化性タンパク質（MCP-1）、マクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（MIP-a）、及び、血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質（RANTES）、を含むグループから選択されたサイトカインの、レベルを、測定することにより、哺乳類の創傷の感染の診断又は予測をするのに、使用するための、診断装置であって、  
サイトカインの結合パートナーを備えている、
ことを特徴とする、診断装置。
【請求項１１】
装置が、創傷包帯を備えている、
請求項１０に記載の診断装置。
【請求項１２】
装置が、ピペット、側方流動テストストリップ、及び、カラースケール、を備えている、
請求項１０に記載の診断装置。
【請求項１３】
装置が、ディップスティックの形態のテストストリップと、カラースケールと、を備えている、
請求項１０に記載の診断装置。
【請求項１４】
哺乳類の創傷の感染の、体外診断又は予測のための、診断装置の製造において、サイトカインの結合パートナーを使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷における不顕性感染又は臨床感染に関連した、マーカーの存在及び／又はレベルを検出することによって、創傷感染の発現又は進行について、患者をモニタリングすること、に関するものである。マーカーは、創傷、特に創傷体液における、不顕性感染又は臨床感染に関連した、ホルモンの前駆体であってもよく、又は、サイトカインであってもよい。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物において、皮膚の損傷は、細胞的及び生化学的事象である、組織化された複雑なカスケード（organized complex cascade）を引き起こし、それにより、結果的に創傷は治癒する。創傷治癒は、解剖学的な連続性及び機能の復元をもたらす、複雑でダイナミックなプロセスであり、完全に治癒した創傷とは、解剖学的に正常な、構造、機能、及び外観へ、回復したものである。
【０００３】
慢性創傷は、細菌叢に、自然に定着する。細菌による創傷の感染は、治癒プロセスを遅らせる。なぜなら、細菌は、酵素と毒素とを生成し、また、創傷治癒にとって不可欠な活性を有するマクロファージ及び線維芽細胞と、栄養素及び酸素を競合する。したがって、感染は、侵入する細菌に支配された、宿主と細菌との乱れた均衡の、発現である。これは、全身敗血症反応を引き出し、創傷治癒に含まれる多数のプロセスを抑制する。治癒の肉芽形成段階は、感染が低下した後に、始まるだけである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
例えば炎症や分泌等の多くの臨床指標は、創傷における感染に対し、低い予測値を有しているが、臨床診療では、感染の診断は、局部的な痛み、熱、腫れ、分泌、発赤、の存在に、基づいている。感染の診断は、揃えるのに数日かかる創傷のサンプルの、微生物学的分析によって、通常は、確認されている。感染の診断の遅れは、抗菌薬療法の投与を遅らせる可能性があり、また、敗血症を進行させる危険性を増加させる。逆に、無感染であるという迅速な診断は、抗生物質療法の不適切使用を、減少させる。
【０００５】
したがって、この技術分野においては、創傷感染の早期診断のための方法、及び、そのような方法を実行するのに使用するための装置及び創傷包帯を、必要としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
特定のサイトカインは、細菌炎症用のマーカーである。例えば、プロカルシトニンは、カルシトニンのペプチド前駆体である。組織からのプロカルシトニンの放出は、細菌の存在を介して、直接的に誘導される。
【０００７】
本発明者らは、特定のサイトカインが創傷感染を示すものであり、及び、サイトカインのレベルが、創傷における感染のレベルと相関関係がある、という驚くべき発見をした。更に、本発明者らは、特定のサイトカインが、不顕性感染創傷又は臨床感染創傷の創傷体液において見つかった、という発見をした。
【０００８】
本発明は、創傷感染のある患者を、予測し且つ確認するためのマーカー、に関するものである。マーカーは、好ましくはサイトカインであり、ホルモンの前駆体であってもよい。サイトカインは、アッセイの使用によって、検出できる。
【０００９】
したがって、本発明の第１の態様は、哺乳類の創傷の感染の診断又は予測の方法を、提供しており、上記方法は、サイトカインの存在を検出する工程を、備えており、サイトカインは、プロカルシトニン、アミノプロカルシトニン（N-ProCT）、エオタキシン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン１Ｂ単球走化性タンパク質（MCP-1）、マクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（MIP-a）、及び、血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質（RANTES）、を含むグループから、選択される。
【００１０】
プロカルシトニンを検出することの利点は、血液中でのレベル上昇が、細菌感染又は真菌感染に起因する炎症に反応するときのみに生じることが、見られることである。ウイルス感染は、プロカルシトニンのレベルを上昇させない。
【００１１】
従って、第２の態様において、本発明は、哺乳類の創傷の感染を診断又は予測する方法を、提供しており、上記方法は、少なくとも１つのマーカーの存在を検出する工程を、備えており、そのマーカーは、上記創傷から採取された創傷体液のサンプル中の、プロカルシトニン、アミノプロカルシトニン（N-ProCT）、エオタキシン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン１Ｂ単球走化性タンパク質（MCP-1）、マクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（MIP-a）、及び、血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質（RANTES）、を含むグループから、選択される。
【００１２】
少なくとも１つのマーカーが創傷中に存在するという発見は、局部的な感染が明らかであることを、示している。マーカーは、テストストリップにおいて色変化を発生させるアッセイを、使用することによって、通常は検出されている。発生した色の強度は、サンプル中のマーカー濃度に、正比例する。ブラームスＰＣＴ−Ｑ（BRAHMS PCT-Q）等の診断キットは、マーカーを検出するのに使用できる。例えば、プロカルシトニンでは、ベースラインレベルは、健常人において、０．０５ｎｇ／ｍｌより小さい。感染の発現後では、プロカルシトニンのレベルは、感染の発現から２〜３時間の間に、初期レベルの１０００倍以上に上昇し、その後、継続して２４時間以上増加し続ける。通常では、０．５ｎｇ／ｍｌ以上且つ２ｎｇ／ｍｌ以下の範囲のプロカルシトニンを含んでいる創傷体液のサンプルは、細菌感染が大いに起こりうることを、示している。好ましくは、テストストリップは、基準色のチャートを伴っており、そのチャートでは、テストストリップにおいて発生した色の強度が、存在するマーカーのレベルと相関関係を示している。好ましくは、プロカルシトニンを備えたアッセイは、０．５ｎｇ／ｍｌ以下、０．５ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ以上、１０ｎｇ／ｍｌ以上、における基準バンドを、有している。
【００１３】
通常は、２ｎｇ／ｍｌ以上の範囲のプロカルシトニンを含む創傷体液のサンプルは、感染創傷を示しており、また、１０ｎｇ／ｍｌ以上の範囲のプロカルシトニンを含む創傷体液のサンプルは、大いに感染した創傷を示している。テストストリップは、マーカーが１つも検出されないという懸念を回避するために、テストが完了していることを示す、陽性テストバンドを、好ましくは、有している。
【００１４】
代わりに、他の方法が、マーカー濃度を検出し又は測定するのに、使用できる。適した方法は、VIDAS BRAHMS PCT、KRYPTOR、BRAHMS PCT sensitive LIA等の診断装置の使用を含んでおり、それらの装置は、マーカーに特有の抗体を用いるものであり、その抗体は、存在するマーカーと結合して、存在するマーカーのレベルに比例した、蛍光シグナル又は発光シグナルを、生成する。これらのテストの結果は、診断ソフトウェアによって、通常は分析される。創傷からのサンプルの分析は、患者の創傷体液のサンプルを採取することにより、実行される。体液は、遠心分離され、その後、テストされ、また、簡易キット又は実験室ベースの装置を使用することにより、半定量的に又は定量的に、測定される。
【００１５】
アッセイの結果を用いることにより、感染の存在及び重症度を推測でき、また、これに基づいて、治療コースを決定することができる。また、治療の成功は、例えば１２時間おきにテストを繰り返すことにより、モニターすることができる。
【００１６】
「創傷体液」という用語は、あらゆる創傷滲出液又は他の体液（実質的には血液を含まない）に言及しており、それらは、創傷の表面に存在し、或いは、吸引、吸収、又は洗浄によって、創傷表面から取り除かれる。「創傷体液」という用語は、創傷部位から離れた血漿又は組織プラズマに、言及していない。
【００１７】
第２の実施形態では、本発明は、創傷体液中のサイトカインの存在及びレベルを測定することによって、プロカルシトニン、アミノプロカルシトニン（N-ProCT）、エオタキシン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン１B単球走化性タンパク質（MCP-1）、マクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（MIP-a）、及び、血小板やＴ細胞由来の好酸球走化性物質（RANTES）、を含むグループから選択されたサイトカインの、レベルを、測定することにより、哺乳類の創傷の感染の診断又は予測をするのに、使用するための、診断装置であって、サイトカインの結合パートナーを備えているものである。
【００１８】
本発明の装置は、サイトカインの結合パートナーを備えた創傷包帯の形態にすることができる。創傷包帯は、創傷からの体液の吸収時に、創傷体液中のサイトカインの存在及びレベルを示す色変化を与えるための、錯体を、形成する。代わりに、本発明の装置は、テストキットの形態にすることができ、それは、ピペット、テストストリップ、及びカラースケールを、備えており、又は、創傷中に浸すためのディップスティック及びカラースケールを、備えている。
【００１９】
装置は、創傷体液中におけるサイトカインの存在、及び、創傷体液中に存在するサイトカインのレベルを、求めるのに使用される。検出されたレベルに従って、適切な診断が行われ、且つ、適した治療を与えることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって、ここに記載されている。
【００２１】
［実施例１］
馬の後下肢にある創傷から、創傷体液のサンプルを採取した。創傷体液を、ブラームス ＰＣＴ−Ｑ（BRAHMS-PCT-Q）キットを用いて、テストした。そのキットは、ピペット、側方流動テストストリップ、及びカラースケールを、備えており、創傷体液中のプロカルシトニン（procalcitonin）の存在及びレベルを示すことができる。テストは、ストリップのテスト領域上へ、２００μｌの創傷体液を塗布することを、含んでいる。テストストリップ上の、抗体−プロカルシトニン錯体サンドイッチ(complex sandwich)の形成は、ストリップ上に、可視赤色バンドを生成し、その強度は、半定量的カラースケールを用いて、プロカルシトニンのレベルを求めるのに、使用した。バンドは、創傷体液が０．５ｎｇ／ｍｌ以上且つ２ｎｇ／ｍｌ以下の範囲のプロカルシトニンを含んでいることを、示した。テストキットガイドラインを使用することによって、プロカルシトニンのレベルは、細菌感染が大いに起こり得ることを、示したので、局所的及び全身的抗菌療法を施した。
【００２２】
［実施例２］
慢性創傷又は急性創傷の治療のために、Philip Leverhulme Large Animal Hospital at Leahurst, University of Liverpool, Wirralに入院した２８頭の所有馬を、評価した。馬は、１歳から１９歳であり、１１頭の雌馬と、１１頭の去勢馬と、４頭の雌子馬と、２頭の雄子馬と、であった。創傷滲出液サンプルは、外傷性創傷、手術創傷、及び火傷から、収集した。
【００２３】
（試薬調製）
無菌食塩水：食塩水を、蒸留水を用いて０．９％濃度に調製し、１２１℃で加圧滅菌処理した。
正常ウマ血清：無菌ウマ血清は、Sigma-Aldrich Ltd (Poole, Dorset)製のロット番号２６Ｈ４６１２（有効期限２０１３年７月）から得た。血清は、等分して、必要となるまで、−２０℃で無菌で冷凍した。
【００２４】
（方法）
創傷滲出液収集：創傷滲出液は、包帯交換の際に収集し、血球を除去するために、２０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離器にかけた。一組の創傷滲出液は、直ぐに評価した。他の組の創傷滲出液は、収集して直ぐに−２０℃で冷凍した。冷凍サンプルは、３７℃で１０分間で解凍し、ＰＣＴキットに塗布する前に３０秒間緩やかにボルテックスした。
【００２５】
ＰＣＴ分析：ＰＣＴ分析は、ブラームス ＰＣＴ−Ｑキットを用いて、実行した。これは、半定量的テストであり、結果を得るのに約３０分間を要する。その読取範囲は、０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの間であり、それは、実験室で又は病院で、実行できる。
【００２６】
６滴の創傷滲出液を、キットの凹部（〜２００μｌ）内に、ピペットで入れて、３０分間、室温で培養した。その後、テストバンドの色の強度を、キットに同梱されている基準カードのカラーブロックと、比較することによって、ＰＣＴ濃度を求めた。コントロールバンドがカードに現れない場合は、テストは無効とみなされる。
【００２７】
（結果）
正常ウマ血清（ｎ＝３）と０．９％無菌食塩水（ｎ＝３）とを、ＰＣＴ−Ｑテストを用いて、テストした。両者とも、否定的結果であった。両者とも、可視の陽性テストバンドのみを備えた否定的結果を、示した。
【００２８】
慢性創傷又は急性創傷を有する１１頭の馬の、新鮮な創傷滲出液ＰＣＴ濃度を、評価した（表１）。表１は、また、品種、年齢、性別、創傷のタイプ、及び感染の兆候、という情報を、示している。遠心分離器にかけられた滲出液は、創傷から取り除いた後に直ぐにテストした。
【００２９】
テストした１１の滲出液サンプルの内、５サンプル（その内の４サンプルは外傷性創傷であり、１サンプルは開放胸部創傷である）は、０．５ｎｇ／ｍｌより小さいという結果を示し、３サンプルは、否定的結果を示し、２サンプルは、遠心分離器にかけたにも拘わらず創傷滲出液があまりにも粘性であるためにテストしなかった。最後に、火傷からの創傷滲出液をテストした。これは、２．０ｎｇ／ｍｌより大きいというＰＣＴ結果を示した。
【００３０】
１７の創傷滲出液サンプルを、−２０℃で冷凍した後に、テストした（表２）。これらの内の（急性創傷からの）３サンプルは、０．５ｎｇ／ｍｌより小さいというＰＣＴ結果を示した。別の８の急性創傷サンプルは、否定的結果（すなわち、テストキットにバンドがない）を示した。更に、５つの事例は、数日から週齢３週の範囲にある創傷を、示し、これらの各々は、０．５ｎｇ／ｍｌの結果を示すが、これらには、臨床感染の目に見える兆候はなかった。最後に、最近の事例は、外傷性膝創傷からのものであり、その創傷は、明らかに感染しており、すなわち、多量の膿があり、強い刺激臭があった。これは、２．０ｎｇ／ｍｌより小さいＰＣＴを記録した。比較として、別の創傷滲出液を、収集し、−２０℃で冷凍した。そのテストは、上記と同様に実行した。
【００３１】
サンプルされた２８の創傷滲出液において、（急性創傷からの）４６％は、否定的であり、（初期の外傷性創傷からの）２９％は、０．５ｎｇ／ｍｌより小さい値を記録し、（長期継続の外傷性創傷からの）１８％は、０．５ｎｇ／ｍｌを記録し、７％（すなわち、２／２８、その両創傷は、臨床的感染の臨床的兆候、すなわち、悪臭、不快性、膿、を示した）は、２．０ｎｇ／ｍｌを記録した。慢性創傷又は急性創傷を有する馬のＰＣＴ濃度を、表２に見られるように、比較した。
【００３２】
【表１】
2011503631.tif 000002
【００３３】
表１は、事例情報と、収集した後に直ぐにテストした創傷滲出液からのＰＣＴ結果と、を示している。ＮＤは、「見られず」を意味している。
【００３４】
【表２】
2011503631.tif 000003
【００３５】
表２は、事例情報と、収集して−２０℃で貯蔵した後にテストした創傷滲出液からのＰＣＴ結果と、を示している。
【００３６】
これらの結果は、創傷滲出液中のプロカルシトニンが急性創傷及び慢性創傷の感染状態を求めることができる、ということを示している。これは、高い滲出液ＰＣＴレベルと、多種類の創傷の感染の兆候と、の相関関係によって、見ることができる。例えば、明らかな相関関係を、２より大きいＰＣＴレベルと、感染の臨床的兆候と、の間に、見ることができる。また、結果は、サンプルを凍らせることがテストの結果に影響しない、ということを示している。
【００３７】
［実施例３］
創傷体液サンプルを、人の慢性創傷から収集し、ＰＣＴ−Ｑキット（BRAHMS,ドイツ）を用いて、プロカルシトニンの証拠を評価した。殆どの事例では、創傷体液サンプルは、ＰＣＴ−Ｑ側方流動システムを用いて測定するには粘性すぎるので、（１：５又は１：１０に）希釈した。
【００３８】
第１の患者（０１６）では、３年継続の下肢潰瘍が、臨床的に感染しているとみなされた。バイオフィルムの痕跡もあり、滲出液レベルは、重かった。ＰＣＴ−Ｑキットを用いるプロカルシトニン検出は、０．５ｎｇ／ｍｌより大きいレベルを示した。
【００３９】
第２の患者（０１８）は、４年継続の下肢潰瘍を有し、重い滲出液レベルとバイオフィルムの痕跡とを備えていた。ＰＣＴ−Ｑキットを用いるプロカルシトニン検出は、０．５ｎｇ／ｍｌレベルを示した。
【００４０】
第３の患者（０１９）は、５年継続の褥瘡を有し、重い滲出液レベルとバイオフィルムの痕跡とを備えていた。ＰＣＴ−Ｑキットを用いるプロカルシトニン検出は、否定的（すなわち、０．５ｎｇ／ｍｌより小さい）であった。
【００４１】
ウマ血清を用いる否定的コントロールサンプルは、ＰＣＴ−Ｑキットにおいて否定的結果（すなわち、０．５ｎｈ／ｍｌより小さい）を生じさせた。
【００４２】
３つの臨床的事例から得られたデータは、創傷滲出液中のプロカルシトニンレベルと、慢性創傷における感染状態と、の間の潜在的な相関関係を、示す。
【国際調査報告】
2011503631.tif 000004
2011503631.tif 000005
2011503631.tif 000006
2011503631.tif 000007
2011503631.tif 000008
2011503631.tif 000009