(57)【要約】  本発明は特異的なモノクローナル抗体による膜レセプター結合の程度の決定に関する。本方法は、標的指向療法で用いられるモノクローナル抗体にとって標的有効用量（TED）を規定するためにとりわけ有益である。特に本発明は、注目する抗EGFR抗体によって達成されるレセプター結合の飽和度の決定に関する。
2011529172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々が別個の検出系を与えられている第一（Ab1A）および第二（Ab2）のモノクローナル抗体の手段によって、問題のモノクローナル抗体（Ab1）によって達成されるレセプター結合飽和の程度を決定する方法であって、Ab1が組織サンプル中のレセプタードメインのエピトープ（E1）と特異的に結合し、Ab1Aが前記レセプタードメインの同じエピトープE1を認識してこれと結合し、さらにAb2が同じレセプタードメインのE1とは異なるエピトープ（E2）と結合し、さらに前記Ab2の結合がAb1またはAb1AとE1との結合に関して相互作用しない、以下の工程（i）−（iii）を含む前記方法：
（i）抗体Ab2を、E2に対してレセプター結合飽和を達成するために十分な量で個体の組織サンプルに適用して、抗体Ab2に結合させた前記別個の検出系によって提供されるシグナル強度を決定する工程、
（ii）前記抗体Ab1で以前に処置した同じ個体の組織サンプルに抗体Ab1Aを、抗体Ab1がまだ結合していないレセプターエピトープE1に結合させるために十分な量で適用して、抗体Ab1Aに結合させた前記別個の検出系によって提供されるシグナル強度を決定する工程、および
（iii）工程（i）および（ii）により得られたシグナル強度の差から、抗体Ab1となおも結合し得るレセプタードメインの量を計算し、したがって抗体Ab1によって達成されるレセプター結合飽和の程度を決定する工程。
【請求項２】
抗体Ab2に結合させた別個の検出系によって提供されるシグナル強度を抗体Ab1aに結合させた別個の検出系によって提供されるシグナル強度に対して調整する工程を最初の工程として含み、Ab2およびAb1aは、同じ供給源に由来するが抗体Ab1で処置されていない任意の組織サンプルに適用されている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
抗体Ab1のエピトープE1に対する結合親和性が抗体Ab1AのE1に対する結合親和性と同一または類似する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗体Ab2のエピトープE2に対する結合親和性が抗体Ab1のエピトープE1に対する結合親和性と同一または類似する、請求項1−3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗体Ab2および抗体Ab1Aに結合させた別個の検出系の固有の検出マーカーが任意の検出マーカーであり、さらに発生するシグナル強度の利用が半定量的態様で行われる、請求項1−4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
検出マーカーが色素である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
抗体Ab1および抗体Ab1Aが同じ重鎖および軽鎖配列を有する、請求項1−6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
レセプタードメインが、EGFR（Her1、ErbB1）、Her2（ErbB2）およびHer3（ErbB3）から成る群から選択されるチロシンキナーゼ膜レセプターであり、抗体Ab1、Ab2およびAb1Aがこれらレセプターの少なくとも1つに対する抗体である、請求項1−7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
抗体Ab1が、マツズマブ（Mab h425）もしくはセツキシマブ（Mab c225、Erbitux（商標））または前記の結合活性フラグメント／誘導体またはそれぞれのマウス型、キメラ型もしくはヒト化型である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
個体の組織サンプルが皮膚組織由来である、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
皮膚組織のレセプターパターンおよびプロフィルが個体の腫瘍組織のレセプターパターンおよびプロフィルと関連する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
組織サンプルが、癌または対応する疾患もしくは異常に罹患する個体に由来する、請求項10または11に記載の方法。
【請求項１３】
抗体Ab1が治療用抗体である、請求項1−12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
抗体Ab1がヒト抗体もしくはヒト化抗体またはキメラ抗体であり、さらに抗体Ab2がマウス抗体またはラット抗体である、請求項1−13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
治療法、特に抗腫瘍療法での適用に適した抗体の有効用量をex vivoで発見および最適化するために請求項1−14のいずれかに記載の方法を使用すること。
【請求項１６】
請求項1−14のいずれかに記載の方法を含む、患者に投与される問題の治療用抗体の有効用量を発見および最適化するex vivoの方法であって、場合によって、抗体Ab1によるレセプターの飽和が測定され、患者に対して最適な個々の有効用量が見出され得るまで、異なる用量の抗体Ab1を患者に投与後に工程（i）から（iii）を少なくとも1回繰り返す工程がその後に続く、前記方法。
【請求項１７】
最適なレセプター飽和の発見が治療用抗体の用量不足または用量過剰を回避するために用いられる、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
（i）治療用モノクローナル抗体（Ab1）を含む第一のパッケージ、（ii）別個の検出系を結合させた第一の診断用モノクローナル抗体（Ab1A）を含む第二のパッケージ、および（iii）別個の検出系を結合させた第二の診断用モノクローナル抗体（Ab2）を含む第三のパッケージを含む診断キットであって、抗体Ab1が組織サンプル中のリガンド-レセプタードメインのエピトープ（E1）と特異的に結合し、Ab1Aが前記レセプタードメインの同じエピトープE1を認識してこれと結合し、さらにAb2が同じレセプタードメインのE1とは異なるエピトープ（E2）と結合し、さらに前記Ab2の結合がAb1またはAb1AとE1との結合に関して相互作用しない、前記診断キット。
【請求項１９】
患者において治療用抗体の有効で最適な個々の用量をex vivoで見つけるために請求項18に記載の診断キットを使用すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特異的モノクローナル抗体による膜レセプター結合度の測定に関する。本方法は、標的指向療法で用いられるモノクローナル抗体にとって標的有効用量（TED）を規定するためにとりわけ有益である。特に本発明は、問題の抗EGFR抗体によって達成されるレセプター結合の飽和度の決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤開発は膜レセプターに誘導される標的指向療法にますます集中しつつある。関係する膜レセプター標的に薬理学的に到達することによるシグナルトランスダクション経路の破壊は、例えば多様な腫瘍タイプの治療のための効果的な治療選択肢となった。
生物学的分子、例えばモノクローナル抗体（MAb）は、腫瘍表面の多様な膜レセプターおよび他の細胞タンパク質に誘導される小化合物と同様に、抗腫瘍療法のために適切であることが20年以上も前から知られていた。MAbは、腫瘍細胞およびほとんどの場合には正常組織にもまた存在するそれらMAbの標的構造物と特異的に結合し、それらのエピトープ特異性および／または個々の抗原の機能的特徴に左右される多様な作用を惹起することができる。膜レセプター（例えばキナーゼ活性を有する増殖因子レセプター）のリガンド結合部位の外側のエピトープと結合するMAbは、標的細胞に対する免疫エフェクター機能（抗体依存細胞媒介細胞傷害（ADCC）、補体依存細胞傷害（CDC））を主として誘導すると予測されよう。
リガンド結合部位内またはその直ぐ近傍に存在するエピトープと結合するMAbは、それらの天然のリガンドとの結合に競合し、したがってリガンド結合を低下または完全に阻害し、さらに既に結合したリガンドをそれらのレセプターから放逐することができる。このレセプター遮断はリガンド依存レセプター活性化および下流のシグナリングを阻害する。
【０００３】
腫瘍細胞の膜チロシンキナーゼレセプターは抗腫瘍療法における特に魅力的な標的である。あるレセプター型チロシンキナーゼサブファミリー（HERまたはErbBサブファミリーと称される）には、EGFR（ErbB1）、HER2（ErbB2またはp185neu）、HER3（ErbB3）およびHER4（ErbB4またはtyro2）が含まれる。このレセプターサブファミリーのリガンドには、上皮増殖因子（EGF）、TGF-a、アンフィレグリン、HB-EGF、ベータセルリン、ヘレグリンおよびニューレグリンが含まれる。このサブファミリーの中では、EGFRが抗腫瘍療法におけるもっとも有望な標的として浮上している。
EGFRは170kDの膜貫通糖タンパク質であり、（1）621アミノ酸残基を含むアミノ末端細胞外ドメイン（リガンド結合ドメインを含む）；（2）ただ1つの23アミノ酸の膜貫通アンカー領域（安定性に寄与し得る）；および（3）542アミノ酸のカルボキシル末端細胞内ドメイン（細胞質内標的を活性化するチロシンキナーゼ活性を保持する）を含む。EGFRを刺激するリガンドの例には、上皮増殖因子（EGF）、形質転換増殖因子cc（TGF-a）、へパリン結合増殖因子（HBGF）、3-セルリンおよびCripto-1が含まれる。特異的なリガンドの結合は、EGFRの自己リン酸化、レセプターの細胞質内チロシンキナーゼドメインの活性化、および腫瘍の増殖と生存を調節する多数のシグナルトランスダクション経路の開始をもたらす。
【０００４】
レセプタータンパク質チロシンキナーゼ（例えばEGFRキナーゼ）はホモダイマー化およびヘテロダイマー化の両方を経ることができるということは注目に値しよう。ホモダイマーレセプターの結合は、対応するヘテロダイマー結合よりも細胞分裂促進性および形質転換性が低い（シグナリングの開始がまったくないかまたは弱い）（Yarden and Sliwkowski, 2001, 2001, Nature Reviews, Molecular cell Biology, 2:127-137；Tzahar and Yarden, 1998, BBA 1377:M25-M37）。
異常なEGFRシグナリングによる発癌性形質転換は、いくつかの別個のメカニズム（レセプター過剰発現を含む）の結果であり得る。
上皮増殖因子レセプター（EGFR）は多様な上皮癌で異常に活性化され、抗腫瘍療法の治療標的として大きな関心が寄せられている。EGFRは重要な細胞プロセス、例えば増殖、分化およびアポトーシスに必要である(Hubbard and Miller, 2007)。過剰発現または変異によるEGFRの異常調節は構成的活性または障害レセプターのダウンレギュレーションをもたらし、細胞の悪性形質転換を引き起こし得る（Mendelsohn and Baselga, 2006）。
【０００５】
EGFRを薬理学的に狙い撃ちする最も重要な方法の１つは、細胞外レセプタードメイン内のリガンド結合部位との結合について活性化EGFRリガンドと競合するモノクローナル抗体（MAb）を含む。
悪性細胞における異常なEGFRシグナリングを標的とするために臨床的に用いられる第一の方法はMAbの使用であった。抗EGFR抗体は、レセプター／リガンド相互作用、異常なシグナリングの阻止（したがって腫瘍細胞分裂および増殖の阻止）を破壊するだけでなく、それら抗体は抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）により抗腫瘍エフェクターを調節することができる。ナチュラルキラー（NK）細胞は、IgGの低親和性レセプター、FcyRIIIA/CD16を介して抗体分子のカルボキシル末端を認識することによってADCCを仲介する。したがって、NK細胞は、抗体で覆われた腫瘍細胞と緊密に相互作用して壊死およびアポトーシスにより細胞を破壊することができる。最初に開発されたげっ歯類抗EGFR MAbは動物モデルで良好な抗腫瘍活性を示した。しかしながら、それらの臨床使用は、患者でのヒト抗げっ歯類抗体の高い発生率（有効性の低下をもたらす）のために限定的であった。この欠点に呼応して、研究者は抗EGFR MAbのキメラ型およびヒト化型を開発した。
セツキシマブ（IMC-C225, Erbitux（商標））（キメラ型抗EGFR抗体）はこのタイプの最初のMAbであり、成功裡に臨床試験が完了していくつかの癌の治療として2003年に使用が開始された。セツキシマブは例えばWO96/40210に記載されている。
その他の多数の抗EGFR抗体が癌治療のために活発に臨床開発されている。それらのうちの1つはマツズマブである。
【０００６】
マツズマブ（EMD-72000）は、高い特異性および親和性でEGFRと結合するヒト化IgG1 MAbである。マツズマブはWO1992/015683に記載されている。前記は、動物腫瘍異種移植モデルでヒトの癌（頭部および頸部癌、胃癌、膵臓癌並びに肺癌を含む）に対して強力な抑制活性を有することが示された。マツズマブは、EGFとEGFRとの結合を阻止し、それによって下流のシグナリング経路を阻害することが示された。前記はまた、免疫細胞でのFcR結合によるADCCを介して作用する可能性がある。マツズマブは癌治療として更なる開発のために選択された。マツズマブは、EGFRを発現しているヒトの肺腺癌（LXFA629）、胃腺癌（GXF251）、および膵腺上皮癌（ＰＡXF546）（これらは化学療法剤（ブレオマイシン、シスプラチン、ビンデシン、パクリタキセル、イフォスファミド）に対して非感受性である）の手術検体並びにヌードマウスの移植s.c.に対して抗腫瘍活性を示した。マツズマブによる処置（腫瘍が70−120mm3に達したときに開始、0.5または0.5 mg/マウスを腹腔内に1週間に1回2週間）は良好な耐性を示し、さらに3つの腫瘍タイプのいずれにも有効であった。完全な緩解は、より高用量で処置された胃癌および肺癌をもつ動物のそれぞれ83%および87%で観察される。コントロールと比較して31%の平均腫瘍体積が得られるという膵臓腫瘍の著名な縮小が観察された（27）。ヒトL3.6pl膵原発性腫瘍をもつマウスにおけるマツズマブの有効性（40mg/kg隔週）は、ゲムシタビン（100mg/kg隔週）の同時処置によって強化されることが示された。どちらか一方のみによる処置は腫瘍サイズ並びにリンパ節および肝臓転移の低下をもたらした。これらの効果は併用処置によって顕著に強化された。マツズマブ単独またはゲムシタビンとの併用処置はまた微小血管密度および分裂指数を有意に低下させた。in vitroおよびin vivo実験の結果はさらにマツズマブの抗腫瘍作用はADCCを含むことを示唆した。
【０００７】
セツキシマブとマツズマブとの組み合わせは腫瘍退行の相乗効果をもたらす（WO2004/032960）。
抗EGFR抗体と化学療法剤の組み合わせもまた抗腫瘍作用の強化を引き出す（例えばEP0667165）。
Mabの他に、膜レセプターの強力な阻害物質であることが判明している多数の小さな化学薬剤が存在する。ErbBレセプターに関しては、それらは天然のリガンドの結合部位を遮断するか、またはレセプターキナーゼの結合部位のチロシン残基を遮断し、したがってリン酸化および後続のカスケードシグナリングを妨害する。臨床試験で高い有効性を示す１つの代表例はイレッサ（IressaTM, ZD-1839）であり、NSCLC適応症（非小細胞肺癌）に適用することができる。
これらの従来の細胞障害性薬剤とは対照的に、標的指向療法は最大許容用量（MTD）では適用できない。なぜならば、標的指向療法は飽和用量を超えて投与された場合他のシグナル経路と相互作用するおそれがあるからである。腫瘍学または血液学分野では、標的指向療法は、これらの細胞障害性薬剤としばしば併用される。標的指向薬剤との併用療法は安全性プロフィルに影響する可能性がある。この問題はMAbの用量削減の必要性につながる。したがって、標的有効用量（TED）を規定し、十分なMAb投薬を担保しなければならない。レセプター結合飽和の判定は論理的用量（すなわちTED）の規定に大いに寄与し、排除経路によって変動する可能性がある下流シグナリングにおける有効性を調べるよりも優れている。
【発明の概要】
【０００８】
当技術分野の現況では、MAbは、疾患（例えば種々のタイプの癌）治療のために患者に投与されるか、または臨床試験に用いられる。これらの標的指向療法では、TEDの決定は治療用MAbによって達成される標的組織の飽和に主として左右される。免疫組織化学のような公知の検出方法の使用では飽和度を測定することは不可能である。
レセプター結合飽和の直接的決定を妨げる種々の事項が存在する：
（１）治療下の状態に類似する飽和を得るために、標識抗体を投与することはできない。治療用MAbに結合させた標識マーカー（例えば蛍光色素（すなわちFITC）または核医薬画像化異性体Tc-99mまたは分子（例えばビオチン））は、標的組織の生検という手段によってレセプター結合飽和の測定を可能にしよう。しかしながら、標識抗体の使用は治療下では適切ではない。
（２）標的組織の生検標本を得ることは医学的理由から極めて困難であるかまたは不可能ですらある。
これらの理由により、信頼に足る方法でTEDを決定することが必要であり、さらに緊急を要する。
【０００９】
本発明は免疫組織化学的アッセイの確立に関し、前記アッセイは、問題のMab（本明細書ではモノクローナルAb1と呼ぶ）が結合する、特異的エピトープE1によって区別される、膜レセプタードメインの程度を決定することを可能にする。特に、本発明は、モノクローナルAb1によって処置されたex vivo組織サンプルの手段によってレセプター結合飽和の検出を可能にする方法に関する。
本発明の他の特徴では、標的組織の生検標本を入手できない事例では、代用組織を使用することがレセプター結合飽和の決定に適切であることが示された。
免疫組織化学的アッセイは、（組織サンプルのレセプタードメインのエピトープ（E1）と特異的に結合する抗体Ab1の適用時または適用後に）以下を含む：
（i）組織サンプルのレセプタードメインの同じエピトープE1であるが飽和されていないE1を認識しこれと結合する第一の抗体Ab1Aの適用、および
（ii）（i）の組織サンプルの同じレセプタードメインのエピトープ（E2）と結合する第二の抗体Ab2の適用（レセプタードメインの全量を表す）。
これらの結果を比較することによって、問題の抗体Ab1のレセプタードメイン結合を半定量的態様で計算することができる。モノクローナル抗体はレセプタードメインに対する標的指向療法で用いられるので、この方法は標的有効用量（TED）の決定に有益である。
【００１０】
疾患（例えば癌）の治療に投与されるMabはますますヒト由来となっているかまたはヒト化されている。患者の組織サンプルにおけるレセプター結合飽和のex vivo決定には、非ヒト化または非ヒトモノクローナルAb1A（治療用ヒト化またはヒトAb1と正確に同じエピトープを検出する）が要求される。抗体Ab1Aは非ヒト起源であるために、未占拠標的エピトープ（すなわちレセプタードメイン内の）を検出することが可能である。そのような抗体の適用は、治療用抗体による治療時または治療後に採取された組織サンプルで未占拠標的エピトープをex vivoで検出することを可能にする。
Ab1AがヒトMabまたはヒト化Mab（例えば治療用抗体）であるとしたら、Ab1およびAb1Aに対して別個の検出系を提供することはできないであろう。Ab1およびAb1Aによる固有の染色を判定するために、別個の検出系は本発明の免疫組織化学的アッセイの前提条件である。
このタンパク質上のレセプタードメインであるが異なるエピトープに対して作製された別の非ヒト抗体Ab2を使用することによって、ある免疫組織化学的技術を用い当該タンパク質の全量を決定することが可能である。これらの測定をAb1Aの適用の結果と比較して、治療用抗体Ab1によって占拠された標的と当該レセプターの全量との比を決定することができる。
【００１１】
好ましい実施態様では、患者は抗腫瘍治療用モノクローナル抗体Ab1で処置される。治療期間中にまたは決定を行うべきある時点の治療後に、組織サンプル（例えば腫瘍または標的レセプタードメインを含む別の組織サンプル）を採取し、例えば即時瞬間冷凍によって保存する。この組織サンプルは、抗体Ab1およびAb1Aが結合するレセプターを発現している必要がある。これは、罹患組織、腫瘍組織、または可能な場合は単に皮膚組織であってもよい。治療用抗体と正確に同じエピトープを検出するAb1Aと組織サンプルの切片をインキュベートする。好ましくは、Ab1およびAb1Aは、エピトープE1に対し同じかまたは類似の結合親和性を有する。本発明にしたがえば、Ab1Aは、Ab1と同じ抗体またはそのげっ歯類、キメラもしくはヒト化型であり、同じエピトープE1を認識するが、固有の検出系と結合されている。好ましくは、Ab1AはAb1と同一である。
並行して、当該組織切片の同等切片を、前記レセプタードメインに対する抗体であるが当該ドメイン上の異なるエピトープE2に対して作製された非ヒト抗体Ab2（好ましくはマウスまたはラット）（前記抗体は固有の検出系と結合されてある）とインキュベートする。Ab2を使用することによって、当該タンパク質の全量を決定することができる。レセプター結合飽和は、競合Mab 1Aによって検出されるレセプタードメインとコントロールMab 2によって検出されるレセプタードメインとの比として決定される。本発明にしたがえば、同じレセプター上のエピトープE2またはその結合ポケットが、E1およびE2と結合する抗体間で相互作用が全く発生しないかまたは有意な相互作用が発生しないほど十分にエピトープE1（またはその結合ポケット）と離れて位置することが重要である。換言すれば、Ab2とE2との結合はAb1またはAb1AとE1との結合によって影響されてはならず、逆もまた同様である。
【００１２】
本発明の別の特徴では、Ab1AはAb1と同じ重鎖および軽鎖配列を有する。結果として、Ab1Aは治療用Ab1と同じレセプタードメインエピトープを検出する。さらにまた、Ab1Aは別個の固有検出系によって標識され、前記検出系はAb1A−レセプタードメイン結合の検出を可能にする。そのような抗体の適用によって、治療用抗体による治療中または治療後に採取された組織サンプルにおける未占拠標的タンパク質のex vivo検出を可能にする。
前記レセプタードメインに対する抗体であるがこのタンパク質上の異なるエピトープに対して作製された別の非ヒト抗体Ab2を使用することによって、ある免疫組織化学的技術を用い当該タンパク質の全量を決定することが可能である。これらの測定をAb1Aの適用から得られた結果と比較して、治療用抗体Ab1によって占拠された標的と当該レセプターの全量との比を決定することが可能である。Ab1と同じ重鎖および軽鎖配列を有するAb1Aを使用することによって、治療用A1と比較して同一の結合親和性が提供される。そのような条件の使用は、本発明の免疫組織化学的アッセイの信頼性を高める。
【００１３】
好ましい実施態様では、患者は抗腫瘍治療用モノクローナル抗体Ab1で処置される。治療期間中にまたは決定を行うべきある時点の治療後に、組織サンプル（腫瘍または標的レセプタードメインを含む別の組織サンプル）を採取し、即時瞬間冷凍を実施する。この組織サンプルの切片をAb1Aとインキュベートする（前記Ab1AはAb1と同じ重鎖および軽鎖配列を有し、さらにAb1A−レセプタードメイン結合の検出を可能にする別個の固有検出系によって標識される）。並行して、前記レセプタードメインに対する抗体であるがこのタンパク質上の異なるエピトープに対して作製されたAb2（この抗体は固有の検出系と結合される）と当該組織サンプルの切片をインキュベートする。Ab2を使用することによって、当該タンパク質の全量を決定することが可能である。レセプター結合飽和は、競合Mab 1Aによって検出されるレセプタードメインとコントロールMab 2によって検出されるレセプタードメインとの比として決定される。
本発明のある実施態様では、抗体Ab1はEGFレセプターの特定のエピトープE1に対する抗体である。好ましい実施態様では、Ab1は、抗体マツズマブ（EMD72000、hMab425）またはセツキシマブ（Erbitux, c225）（前記はEGFRの異なるエピトープ（E1A／E1b）と結合する）から選択される抗EGFR抗体である。この事例では、Ab1Aもまたマツズマブ（またはセツキシマブ）であることができ、前記には固有の検出マーカーが与えられるか、または固有の検出マーカーと結合した前記のげっ歯類型もしくはキメラ型である。
【００１４】
極めて好ましい実施態様では、患者は治療用Mab EMD72000で処置される。治療期間中にまたは決定を行うべきある時点の治療後に、腫瘍または標的EGFRを含む皮膚組織サンプルを採取し、例えば即時瞬間冷凍を実施する。組織サンプル（皮膚、腫瘍など）の切片をビオチニル化EMD72000（さらにビオチンで標識されてある）とインキュベートする。例えばマウスIgG1-抗体E62（EGFレセプタードメインのエピトープE2に対して作製）を使用することによって、ある免疫組織化学的技術により当該タンパク質の全量を決定することが可能である。レセプター結合飽和は、競合ビオチニル化EMD72000によって検出されるレセプタードメインとコントロールmAb E62によって検出されるレセプタードメインとの比として決定される。抗体は以下の文献から公知である（European Archives of Oto-Rhino-Laryngology 1995, 252:433-439）。EMD72000またはセツキシマブが結合するエピトープE1から十分に離れた距離にあるエピトープE2と結合することが判明している他の抗EGFR抗体が存在する。
【００１５】
さらに別の実施態様では、患者は治療用Mab EMD72000（マツズマブ）で処置される。治療期間中にまたは決定を行うべきある時点の治療後に、組織サンプル（例えば腫瘍またはEGFレセプターを発現する皮膚に由来する）を採取する。好ましくは瞬間凍結した組織サンプルの切片をモノクローナル抗体EMD59000とインキュベートする。EMD59000はIgG2aアイソタイプのマウスMabであり、前記はEMD72000と同じEGFR内エピトープを認識する。並行して、当該レセプタードメインの異なるエピトープE2に対するマウスIgG1-抗体E62（前記抗体は固有の検出系と結合されある）と当該組織サンプルの切片をインキュベートする。mAb E62を使用することによって、ある免疫組織化学的技術を用い当該タンパク質の全量を決定することが可能である。レセプター結合飽和は、競合EMD55900によって検出されるレセプタードメインとコントロールｍAb E62によって検出されるレセプタードメインとの比として決定される。
本発明の別の特徴では、問題のさらに別の診断用抗体（Ab1A）によって達成されるレセプター結合飽和の程度は、本発明の免疫組織化学的アッセイによって決定できよう。前記免疫組織化学的アッセイは（組織サンプル中のレセプタードメインのエピトープ（E1）と特異的に結合する抗体の適用中にまたは適用後に）以下を含む：
−組織サンプル中のレセプタードメインの同じエピトープE1であるが未飽和であるエピトープE1を認識しこれと結合するAb1Aの適用、および
−組織サンプル中の同じレセプタードメインのエピトープ（E2）と結合するAb2の適用（これによってレセプタードメインの全量が表わされる）。
これらの結果を用いて、半定量的態様でレセプタードメインの結合を計算することができる。
【００１６】
したがって本発明はより詳細には以下に関する：
各々が別個の検出系を与えられている第一（Ab1A）および第二（Ab2）のモノクローナル抗体という手段によって、注目のモノクローナル抗体（Ab1）によって達成されるレセプター結合飽和の程度を決定する方法であって、Ab1が組織サンプル中のレセプタードメインのエピトープ（E1）と特異的に結合し、Ab1Aがレセプタードメインの同じエピトープE1を認識してこれと結合し、さらにAb2が同じレセプタードメインのE1とは異なるエピトープ（E2）と結合し、前記Ab2の結合がE1とAb1またはAb1Aとの結合に対して相互作用しない、以下の工程（i）−（iii）を含む前記方法：（i）抗体Ab2を、E2に対してレセプター結合飽和を達成するために十分な量で個体の組織サンプルに適用し、抗体Ab2に結合させた前記別個の検出系によって提供されるシグナル強度を決定する工程、（ii）前記抗体Ab1で以前に処置した同じ個体の組織サンプルに抗体Ab1Aを、抗体Ab1がまだ結合していないレセプターエピトープE1に結合させるために十分な量で適用し、抗体Ab1Aに結合させた前記別個の検出系によって提供されるシグナル強度を決定する工程、および（iii）工程（i）および（ii）により得られたシグナル強度の差から、抗体Ab1となおも結合し得るレセプタードメインの量を計算し、したがって抗体Ab1によって達成されるレセプター結合飽和の程度を決定する工程。
【００１７】
抗体Ab2に結合させた別個の検出系によって提供されるシグナル強度を抗体Ab1aに結合させた別個の検出系によって提供されるシグナル強度に対して調節する工程を最初の工程として含む上記に規定の方法であって、Ab2およびAb1aは同じ供給源であるが抗体Ab1で処置されていない供給源に由来する任意の組織サンプルに適用されている、前記方法。
抗体Ab1のエピトープE1に対する結合親和性が抗体Ab1AのE1に対する結合親和性と同一または類似する、上記に規定の方法。
抗体Ab2のエピトープE2に対する結合親和性が抗体Ab1のエピトープE1に対する結合親和性と同一または類似する、上記に規定の方法。
抗体Ab2および抗体Ab1Aに結合させた前記別個の検出系の固有の検出マーカーが任意の検出マーカーであり、発生するシグナル強度の利用が半定量的態様で行われる、上記に規定の方法。
前記検出マーカーが色素である、上記に規定の方法。
抗体Ab1および抗体Ab1Aが同じ重鎖および軽鎖配列を有する、上記に規定の方法。
レセプタードメインが、EGFR（Her1、ErbB1）、Her2（ErbB2）およびHer3（ErbB3）から成る群から選択されるチロシンキナーゼ膜レセプターであり、抗体Ab1、Ab2およびAb1Aがこれらレセプターの少なくとも1つに対する抗体である、上記に規定の方法。
抗体Ab1が、マツズマブ（Mab h425）もしくはセツキシマブ（Mab c225、Erbitux（商標））または前記の結合活性フラグメント／誘導体またはそれぞれのげっ歯類型、キメラ型もしくはヒト化型である、上記に規定の方法。
前記個体に由来する組織サンプルが皮膚組織由来である、上記に規定の方法。
皮膚組織のレセプターパターンおよびプロフィルが前記個体の腫瘍組織のレセプターパターンおよびプロフィルと関連する、上記に規定の方法。
前記組織サンプルが、癌または対応する疾患もしくは異常に罹患している個体に由来する、上記に規定の方法。
抗体Ab1が治療用抗体である、上記に規定の方法。
抗体Ab1がヒトもしくはヒト化またはキメラ抗体であり、抗体Ab2がマウスまたはラット抗体である、上記に規定の方法。
【００１８】
治療法、特に抗腫瘍療法での適用に適した抗体の有効用量をex vivoで発見および最適化するために上記規定の方法を使用すること。
請求項1−14のいずれかに記載の方法を含む、問題の治療用抗体（患者に投与される）の有効用量を発見および最適化するex vivoでの方法であって、場合によって、抗体Ab1によるレセプターの飽和が測定され、前記患者に対して最適な個々の有効用量が見出され得るまで、異なる用量の抗体Ab1を患者に投与後に工程（i）から（iii）を少なくとも1回繰り返す工程がその後に続く、前記方法。
治療用抗体の用量不足または用量過剰を回避するために、最適なレセプター飽和の発見が用いられる、上記に規定の方法。
（i）治療用モノクローナル抗体（Ab1）を含む第一のパッケージ、（ii）別個の検出系を結合させた第一の診断用モノクローナル抗体（Ab1A）を含む第二のパッケージ、および（iii）別個の検出系を結合させた第二の診断用モノクローナル抗体（Ab2）を含む第三のパッケージを含む診断キットであって、抗体Ab1が組織サンプルのリガンド-レセプタードメインのエピトープ（E1）と特異的に結合し、Ab1Aが前記レセプタードメインの同じエピトープE1を認識してこれと結合し、Ab2が同じレセプタードメインであるがE1とは異なるエピトープ（E2）と結合し、さらに前記Ab2の結合がAb1またはAb1AとE1との結合に関して相互作用しない、前記診断キット。
治療用抗体の患者における有効で最適な個々の用量をex vivoで見つけるために上記に規定の診断キットを使用すること。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】対応する患者サンプルの比較。抗体E62（AおよびBの左の棒）およびビオチニル化抗体EMD72000（AおよびBの右の棒）で染色し、フェーズA試験後に採取した全皮膚組織（A）および腫瘍組織（B）の平均IRS値（ｙ軸）。
【図１ｂ】対応する患者サンプルの比較。抗体E62（AおよびBの左の棒）およびビオチニル化抗体EMD72000（AおよびBの右の棒）で染色し、フェーズB試験後に採取した全皮膚組織（A）および腫瘍組織（B）の平均IRS値（ｙ軸）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の免疫組織化学的アッセイを適用するための前提条件は、抗体Ab2に結合させた別個の検出系によって提供されるシグナル強度を抗体Ab1aに結合させた別個の検出系によって提供されるシグナル強度に対して調整することを含む最初の工程であり、この場合、Ab2およびAb1aは、抗体Ab1で処置されていない同じ供給源に由来する任意の組織サンプルに適用されている。
好ましい実施態様では、抗体Ab2（例えばmAb E62およびビオチニル化EMD72000）の濃度は、未処置のヒト皮膚のサンプルが当該組織サンプルで同じ染色強度および染色分布を示すように調節される。
本発明の免疫組織化学的アッセイは標的レセプター分子としてEGFRのみについて上記に記載したが、本発明者らが発見し上記および下記に記載する科学的原理は、EGFR以外の他の生物学的レセプターについても適用し得ることは指摘されるべきである。
【００２１】
本明細書および請求項16に規定した本発明の免疫組織化学的アッセイは、好ましくは抗腫瘍療法で用いられる治療薬の有効用量の発見および最適化のために用いることができる。個体に投与される化合物、組成物、薬剤および治療法の用量を緩和することの利益には、より高い用量に付随する副作用の発生の減少が含まれる。例えば、上記および下記に記載の薬剤の投与量を減少させることによって、より高用量において観察される吐き気および嘔吐と比較したとき、それらの頻度並び劇症度の緩和がもたらされるであろう。副作用の発生を低下させることによって、癌患者の生活の質の改善が予想される。副作用の発生低下のさらに別の利益には、患者のコンプライアンスの改善、副作用の治療のために必要とされる入院の回数の減少、および副作用に付随する痛みの治療に要求される鎮痛剤の投与の減少が含まれる。
本発明の免疫組織化学的アッセイは個々の患者の全てについて標的有効用量の決定を可能にする。本方法は、腫瘍組織サンプルまたは代用組織サンプルが利用可能であるならば、いずれの患者の事例にも適用することができる。治療薬剤の薬力学的および／または薬物動態学的特性は患者毎に固有であるので、患者毎に治療有効用量を最適化できることは重要である。
【００２２】
本発明にしたがえば、“別個の検出系”とは、固有であり、他の抗体によって達成される他の染色とは正確に区別することができる抗体の染色が検出系と密接に結びついていることを意味する。
別個の検出系はこの染色を検出できるようにするためにいくつかの工程を抗体の適用と組み合わせることができることも意味する。例えば、抗体Ab1AまたはAb2は分子（例えばビオチン、ビオチン-アビジン複合体またはビオチン-ストレプトアビジン複合体）を介して標識し、標識分子に対して作製された第二の抗体を適用することができる。第二の抗体は色素または酵素と結合されている。用いられる色素は好ましくは蛍光色素、発色色素またはルミネセンス色素であるが、ただしこれらに限定されない。用いられる酵素は基質を変換し、前記基質は、例えば発色シグナル、蛍光シグナルまたはルミネセンスシグナルを生じる。前記別個の検出系の抗体染色の検出を可能にさせる最後の工程は、“検出マーカー”と定義される。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様では、ビオチニル化Ab1a、例えばEMD72000に対して作製された抗ビオチン抗体はペルオキシダーゼで標識される。ペルオキシダーゼは、発色性基質ジアミノベンジヂン（＝DAB）を変換することによってシグナルを引き出す。
さらに、抗体1aまたは2のFc-領域を認識する二次抗体を適用することができる。さらに、Ab1AまたはAb2に対して作製された抗体を分子（例えばビオチン、ビオチン-アビジン複合体）を介して標識することができる。
さらに、標識複合体（例えばビオチン-アビジン）は、基質を変換することによってシグナルを引き出す酵素に直接結合させることができる。そのようなビオチン-アビジン複合体はABCと称される。
さらに、別個の検出系においてリンカーを標識と抗体との間で用いてもよい。
上記の別個の検出系は抗体について述べているが、抗体の結合活性フラグメント／誘導体またはそれぞれのげっ歯類型、キメラ型またはヒト化型もまた含まれる。
本発明の文脈で用いられる“シグナル強度”という用語は、特異的な染色反応において抗体Ab1AおよびAb2によって生じるシグナルの強度が、好ましくは未処置の組織サンプルで、最適に調整されるべきであることを意味する。前記調整は、例えばこのアッセイの抗体および／または試薬の種々に希釈することによって達成される。好ましくは、ビオチニル化抗体、例えばEMD72000およびE62によって達成される本発明の同等なシグナル強度は本アッセイの前提条件である。シグナル強度の利用は半定量的態様で行われる。本発明の好ましい実施態様では、シグナル強度はIRS-スコア（免疫反応スコア、実施例1を参照）により判定される。
【００２４】
“組織サンプル”とは、本発明の免疫組織化学的アッセイのために好ましくは切片としてこの材料を使用するために、個体から取り出された生検標本を意味する。好ましくは本発明のために皮膚および／または腫瘍サンプルが用いられる。
“レセプター”または“レセプター分子”は、リガンドが結合してレセプター-リガンド複合体を形成する１つ以上のドメインを含む、可溶性または膜結合性／膜付随性タンパク質もしくは糖タンパク質である。リガンド（前記はアゴニストでもアンタゴニストでもあり得る）と結合することによって、レセプターは活性化または不活化されて、シグナリング経路を開始または遮断することができる。
“リガンド”または“レセプターリガンド”は、天然もしくは合成化合物、または本発明の文脈ではモノクローナル抗体を意味し、前記はレセプター分子と結合してレセプター分子-リガンド複合体を形成する。リガンドという用語にはアゴニスト、アンタゴニストおよび部分的なアゴニスト／アンタゴニスト作用を有する化合物が含まれる。
【００２５】
“レセプタードメイン”はレセプター分子の一部分であって、分子内で特異的な三次元構造を形成する。“レセプタードメイン”は、本発明の文脈ではレセプター分子の局所的領域（結合配列／ループ／ポケット）であり、天然のリガンドまたは抗体または薬剤が前記と結合する。この領域は、それぞれ1つの特異的エピトープだけでなく2つ以上のエピトープを含むことができる。本発明にしたがえば、特異的抗体はレセプター分子のドメイン内の特異的エピトープと結合する。
“レセプター分子の結合飽和の程度または度合い”は、モノクローナル抗体1が結合するレセプター（精査される組織サンプルに含まれる細胞上に存在する）の百分率を意味する。
“組織のレセプターパターン”という用語は、当該組織を構築する1つの細胞タイプまたは他の複数の細胞タイプの表面のレセプターの密度、または前記に組み込まれたレセプターに関する。“組織のプロフィル”は、例えば細胞タイプの数および／またはそれらの分布および／またはそれらの形態学的形状および／またはそれらの状態に関する。本発明の好ましい実施態様では、腫瘍組織および皮膚組織のレセプターパターンおよびプロフィルは、皮膚組織が腫瘍生検のための信頼できる代用組織として処理されるので類似しているべきである。
【００２６】
本発明の抗体Ab1およびAb1Aとエピトープ１との間で“結合親和性が類似する”とは、前記抗体が、それらの結合親和性において30%、好ましくは20%、最も好ましくは10%を超える相違を示さないことを意味する。
抗体Ab1Aとエピトープ1およびAb2とエピトープ2との間で“結合親和性が類似する”とは、前記抗体が、それらの結合親和性において30%、好ましくは20%、最も好ましくは10%を超える相違を示さないことを意味する。
本明細書で用いられる“モノクローナル抗体”という用語は実質的に均一な抗体の集団から入手される抗体を指す。すなわち、前記集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在する可能性がある自然に発生し得る変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的で、ただ1つの抗原性部位に対する。さらにまた、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上のただ1つの決定基に対する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体を夾雑させることなく合成できるという点で有利である。モノクローナル抗体を作製する方法には、Kohler and Milsteinの論文（1975, Nature 256:495）および以下の文献（”Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas”, 1985, Burdon et al., Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam）に記載された ハイブリドーマ法が含まれるが、また周知の組換えDNA法によって作製することができる（例えばUS4,816,567を参照されたい）。モノクローナル抗体はまた、例えば以下の文献に記載された技術を用いファージ抗体ライブラリーから単離することができる（Clackson et al., Nature, 1991, 352:624-628；およびMarks et al., J Mol Biol, 1991, 222(58):1-597）。
【００２７】
“キメラ抗体”という用語は、当該重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、一方、当該鎖の残りの部分が別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体（同様にそのような抗体のフラグメント）の対応する配列と同一または相同である抗体を意味し、ただしそれらが所望の生物学的活性を示すものとする（例えば、US 4,816,567；Morrison et al., 1984, Proc Natl Acad Sci USA, 81:6851-6855）。当分野ではキメラおよびヒト化抗体の作製方法もまた周知である。例えば、キメラ抗体の作製方法にはBoss（US 4,816,397（Celltech））およびCabilly（US 4,816,567（Genentech））の特許に記載された方法が含まれる。
【００２８】
“ヒト化抗体”は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む非ヒト（例えばげっ歯類）キメラ抗体形である。大半の部分についてヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域（CDR）由来の残基は、所望の特異性、親和性および性能を有する非ヒト種（例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類）の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基によって置き換えられている。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（FR）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらにまた、ヒト化抗体はレシピエント抗体またはドナー抗体で見出されない残基を含むことができる。これらの改変は抗体の性能をさらに高めるために実施される。一般的には、ヒト化抗体は少なくとも１つおよび典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含み、超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものと一致し、さらにFRの全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた場合によって、免疫グロブリン定常領域（Fc）（典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部分を含むであろう。ヒト化抗体の作製方法は、例えばWinter（US 5,225,539）およびBoss（Celltech, US 4,816,397）が記載している。
“ヒト抗体”は完全にヒトの配列を含む抗体である。
“げっ歯類抗体”はもっぱらげっ歯類の配列を含む抗体である。
【００２９】
“結合活性フラグメント”は無傷の抗体の一部分、すなわち抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。
“誘導体”は抗体の誘導された形態を表す。
本発明の文脈における抗体のげっ歯類、キメラまたはヒト化型には、げっ歯類抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体の定義にしたがって抗体の部分が置換されている等価の抗体または誘導体が含まれる。
本発明の文脈における“治療用抗体”は、レセプタードメインの特異的エピトープに対する抗体であり、したがって疾患または異常を治療するために治療薬として用いることができる抗体に関する。本発明の好ましい実施態様では、治療用抗体は抗癌療法で用いられる。
本発明の文脈における“診断用抗体”は、レセプタードメインの特異的エピトープに対する抗体であり、したがって診断ツールとして用いることができる抗体に関する。
“癌”および“腫瘍”という用語は、典型的には制御不能の細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すかまたは前記をいう。本発明の医薬組成物の手段によって、腫瘍（例えば乳房、心臓、肺臓、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部および頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸部および肝臓の腫瘍）を治療することができる。
【００３０】
“細胞傷害性薬剤”という用語は“化学療法剤”、すなわち特に抗新形成作用を好ましくは腫瘍細胞に直接的におよび生物学的応答の改変のようなメカニズムを介してより直接的に示す化学物質を意味する。本発明の適切な化学療法剤は、好ましくは天然または合成された化合物である。商業的使用、臨床評価、および前臨床での開発で利用可能な多数の抗新形成化学薬剤が存在し、それらは、本発明で開示し特許請求の範囲に記載したレセプターアンタゴニストとの併用療法によって腫瘍／新形成の治療のために本発明に含まれ得る。化学療法剤は場合によってErbBレセプターアンタゴニストと一緒に投与することができることは指摘されるべきである。
化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネートおよびアルキル化作用をもつ他の化合物、例えばニトロソウレア、シスプラチンおよびダカルバジン；抗代謝薬、例えば葉酸、プリンまたはピリミジンアンタゴニスト；有糸分裂阻害剤、例えばビンカアルカロイドおよびポドフィロトキシンの誘導体；細胞傷害性抗生物質およびカンプトテシン誘導体が含まれる。
もっとも好ましい本発明の化学療法剤はシスプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、パクリタキセル（タキソール）およびブレオマイシンである。
【００３１】
“最大耐性用量＝MTD”は、許容不能の副作用を引き起こさない最大用量の薬剤または処置を意味する。最大耐性用量は、副作用が許容可能である最大用量が見出されるまで異なる対象者グループで上昇用量を調べることによって臨床試験で決定される。
“超飽和用量”はMTDをはるかに超えるものである。
“用量過剰”は、１回の用量が多すぎる投薬または多すぎる回数の投薬が患者に実施されることを意味する。用量過剰は副作用の発生を伴う。例えば、用量過剰は吐き気および嘔吐と連動している。
“用量不足”は、１回の用量が少なすぎる投薬または回数が少なすぎる投薬が実施されることを意味する。用量不足は用量過剰と同様に正味の治療利益を低下させるであろう。
“治療有効用量＝TED”は、哺乳動物で疾患または異常を治療するために有効な薬剤（例えば治療用抗体）の量を指す。癌の事例では、治療有効量の薬剤は癌細胞数を減少させ、腫瘍サイズを縮小させ、周辺器官への癌細胞浸潤を抑制し（すなわちある程度遅らせさらに好ましくは停止させる）、腫瘍の転移を抑制し（すなわちある程度遅らせさらに好ましくは停止させる）、ある程度腫瘍の増殖を抑制し、および／または癌に付随する１つ以上の徴候をある程度緩和し得る。薬剤が既存の癌細胞の増殖を妨げるかおよび／または死滅させ得る程度に、前記薬剤は細胞増殖抑制性または細胞傷害性である。抗腫瘍療法については、有効性は例えば疾患進行時間（TTP）の判定および／または応答率（RR）の決定によって測定することができる。
【００３２】
レセプター結合飽和決定用“診断キット”という用語は、診断用および治療用抗体並びに本発明の免疫組織化学的アッセイの適用に必要な試薬、並びに原則として前記試薬および抗体を使用するための指示で構成された種々のパッケージを含む。抗体は試薬と同様に液体、散剤、錠剤、懸濁物として提供することができる。抗体および試薬は、本発明の方法にしたがって別々に適用するために適した別個のパッケージで提供することができる。本発明のキットはまた、パッケージに収納されている材料を“使用するための指示”を含む。
要約すれば、本発明の診断キットは、好ましくは以下の組み合わせを含む：
（i）治療用抗体Ab1（例えばEMD72000またはセツキシマブ）、
（ii）第一の診断用Mab Ab1A、前記はAb1と同じ重鎖および軽鎖配列を有するがさらに別にビオチンで標識される、
（iii）当該レセプタードメインの別個のエピトープE2に対して作製された抗体Ab2（例えばマウスIgG1抗体E62）。
【実施例１】
【００３３】
フェーズI試験で、静脈内投与抗体EMD72000によって達成されるEGFRの飽和を調査した。
したがって、２つの別々の抗体による免疫組織化学的アッセイを用いた。マウス抗体E62（Merck KGaA（Darmstadt）製造および供給）はEGFRの細胞外ドメインのエピトープと結合する（前記エピトープは天然のリガンドおよび特異的抗体EMD72000の結合部位とは異なる）。E62による染色は細胞／組織サンプル当たりのEGFレセプターの全含有量を示す。ビオチニル化抗体EMD72000（Merck KGaA（Darmstadt）製造および供給）は、天然のリガンド（例えばEGFおよびTGFアルファ）とEGFレセプターの細胞外ドメインにおいて同じ結合部位を共有する治療用EMD72000の別形である。
EMD72000のin vivoまたはin vitro投与により達成されたEGFレセプターの遮断またはレセプター結合飽和は、E62の染色と比べてビオチニル化EMD72000によって達成される染色を低下または排除するはずである。染色は、2人の独立した病理検査技師によって半定量的免疫反応スコア（IRSスコア）を用いて判定した。これらの結果は統計的有意について精査された。
混合化学療法剤ECX（エピルビシン、シスプラチンおよびカペシタビンを含む）と併用して治療用抗体EMD72000で処置した胃食道癌患者由来の皮膚および腫瘍組織を本実験で精査した。いくつかの癌タイプに関して種々の臨床試験で調べたとき、腫瘍サイズの縮小、疾患の安定化または腫瘍退縮さえもたらす、EMD72000単独または放射線照射もしくは他の化学療法剤と併用したEMD72000の治療能力が明らかであった。
本アッセイは、EMD72000のヌードマウスの静脈内投与後の異種移植腫瘍モデルで立証された。したがって、未処置コントロール群と比べて、EMD72000の投与による3つの異なる癌タイプにおける部分的EGFレセプター遮断がそれぞれ示された。
目標は、治療用抗体EMD72000によるEGFR遮断または飽和を立証するために皮膚が信頼できる代用組織であるか否かを決定すること、および皮膚と腫瘍でEGFR遮断を比較することであった。
【００３４】
材料と方法
種々の患者の皮膚および腫瘍サンプルを精査した。患者の腫瘍組織を異なる時点で採取した（第一回目はEMD72000による治療の二周期目の終わり（６週間後）（＝フェーズA）および第二回目は四周期目の終わり（12週間後）（＝フェーズB））。
我々の精査の最初の工程で、全腫瘍サンプルの凍結切片をヘマトキシリン／エオシンで染色して腫瘍細胞の内容を分析した。500を超える生存腫瘍細胞を含む腫瘍サンプルを分析した。
凍結切片：
瞬間凍結腫瘍および皮膚サンプルを5μmの切片に切った。各組織サンプルから、5つの組織切片を有する2枚の顕微鏡スライドを作製した。1枚の顕微鏡スライドをmAb E62、2枚目のスライドをビオチニル化抗体EMD72000で、両方とも同じ染色工程で染色した。
免疫組織化学染色：
E62による染色によって組織切片のEGFレセプターの全量が示される。ビオチニル化抗体EMD72000は、天然のリガンド（例えばEGFおよびTGFアルファ）とEGFレセプターの細胞外マトリックスにおいて同じ結合部位を有する治療用モノクローナルヒト化抗体EMD72000の別形である。異なる染色条件（例えば室温）となることを回避するために、1人の患者の全組織サンプル（皮膚および腫瘍）を同じ工程で染色した。各染色工程で、未処置ヒト皮膚組織サンプルを有する陽性および陰性コントロールを一緒に用いた。
E62およびビオチニル化EMD72000の抗体濃度は、未処置ヒト皮膚のサンプルが両抗体について同じ染色強度および染色分布を示すように調節しなければならない。
評価方法および統計学：
各顕微鏡スライドで少なくとも3つの切片が評価された場合に、2つの別々の抗体染色の判定を実施した。抗体E62およびビオチニル化EMD72000による免疫組織化学的染色の分析は、2人の独立した病理検査技師によって光学顕微鏡を用いて実施した。
IRSスコアは、染色強度および陽性細胞の百分率を取り入れた半定量系である。IRSスコアの最大が12になるように、強さを表す因子（0−3）に百分率を表す因子（1−4）を掛ける（前記スコアは例えば80%を超える表皮細胞または生存腫瘍細胞を表す強い染色（スコア3）で表現される）。統計解析のもっとも良好な態様では、組織サンプル当たりおよび免疫組織化学染色当たり5つのIRS値が得られた。IRSスコアを組織切片全体で平均し、ウィルコクソンランクサム検査によって判定した。
結果：
皮膚および腫瘍の両組織種の平均IRS値は、EMD72000による治療後にmAb E62およびビオチニル化EMD72000による染色で類似の結果を示した。したがって、皮膚は治療用EMD72000の結合を確認するための代用組織として適切である。全皮膚および全腫瘍サンプルのmAb E62の着色と比較して、フェーズAおよびフェーズBの後のビオチニル化EMD72000による着色の有意な低下が示された。これらの結果は用いた免疫組織学的アッセイの機能を証明している。
【図１ａ】
2011529172.tif 000003
【図１ｂ】
2011529172.tif 000004
【国際調査報告】
2011529172.tif 000005
2011529172.tif 000006
2011529172.tif 000007