(57)【要約】  本発明は、昆虫細胞における組換えパルボウイルスビリオンの改良された産生に関する。特に、本発明は、充填／空パルボウイルスビリオン比が増加する、昆虫細胞における組換えパルボウイルスビリオンの産生のための改良法に関する。本発明は、遺伝子治療において使用できるパルボウイルスベクターの作製、及びパルボウイルスベクターの生産性を増加させるウイルスＲｅｐタンパク質の発現の改良にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えパルボウイルスビリオンを産生するための方法であって、
（ａ）（ｉ）少なくとも１つのパルボウイルス反転末端反復ヌクレオチド配列が隣接している導入遺伝子を含むヌクレオチド配列、
（ｉｉ）昆虫細胞においてＲｅｐタンパク質の発現を推進することができる第１のプロモーターに作動可能に連結されているパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセット、
（ｉｉｉ）昆虫細胞においてカプシドタンパク質の発現を推進することができる第２のプロモーターに作動可能に連結されているパルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセット
を含む１つ又は複数の核酸構築物を含む昆虫細胞を提供する段階と、
（ｂ）Ｒｅｐ及びカプシドタンパク質の発現を促す条件下で、（ａ）に定義される細胞を培養する段階と、
（ｃ）任意選択で組換えパルボウイルスビリオンを回収する段階と
を含み、第１及び第２の発現カセットが単一の核酸構築物上に存在し、第１及び第２の発現カセットが、昆虫細胞において等モル量存在する場合は、トランスフェクションの２４時間後と７２時間後の間の時点での定量的逆転写ＰＣＲにより決定される少なくとも０．５のレベル比のＲｅｐタンパク質コードｍＲＮＡ対カプシドタンパク質コードｍＲＮＡを産生する上記方法。
【請求項２】
Ｒｅｐ対カプシドタンパク質の発現比が、
（ａ）第１のプロモーターが第２のプロモーターと等しく強力又は第２のプロモーターより強力であること、
（ｂ）第２の発現カセットと比べて第１の発現カセットでより多くの且つ／若しくはより強力なエンハンサーエレメントの存在、
（ｃ）パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列と比べてより高いコドン適応インデックスを有すること、
（ｄ）パルボウイルスＲｅｐタンパク質の温度最適化、及び／又は
（ｅ）対応する野生型Ｒｅｐタンパク質と比べて、アミノ酸配列に、その結果、昆虫細胞におけるＡＡＶ産生の増加を検出することにより評価されるＲｅｐ機能の活性が増加する１つ若しくは複数の変化を有する変異Ｒｅｐタンパク質
のうちの１つ又は複数により調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ｉｉ）のヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを１つだけ含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオープンリーディングフレーム、又はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む少なくとも１つのオープンリーディングフレームが人工イントロンを含まない、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームのどれも、並びに／又はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームのどれも、人工イントロンを含まない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第１のプロモーター又は第２のプロモーターが、ＰｏｌＨプロモーター、ｐ１０プロモーター、塩基性プロモーター、誘導性プロモーター、Ｅ１プロモーター又はｄｅｌｔａＥ１プロモーターからなる群から選択される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第１のプロモーターが、ＰｏｌＨプロモーター、ｐ１０プロモーター又は塩基性プロモーターからなる群から選択され、第２のプロモーターがｄｅｌｔａＥ１プロモーター又はＥ１プロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第１の発現カセットが、少なくとも１つのバキュロウイルスエンハンサーエレメント及び／又は少なくとも１つのエクジソン応答性エレメントを含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
エンハンサーエレメントが、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４及びｈｒ５からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
パルボウイルスＩＴＲ配列、パルボウイルスＲｅｐタンパク質及び／又はパルボウイルスＣａｐタンパク質が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来である、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）第１のプロモーターがｐ１０プロモーターであり、第２のプロモーターがＰｏｌＨプロモーター若しくは４ｘＨｓｐ２７  ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーターである、
（ｂ）第１のプロモーターが４ｘＨｓｐ２７  ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーターであり、第２のプロモーターがＰｏｌＨプロモーターである、
（ｃ）第１のプロモーターがＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターがｐ１０、ｄｅｌｔａＥ１若しくはＥ１プロモーターである、
（ｄ）第１のプロモーターがＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターがｄｅｌｔａＥ１若しくはＥ１プロモーターである、
（ｅ）第１のプロモーターがｐ１０プロモーターであり、第２のプロモーターがｄｅｌｔａＥ１若しくはＥ１プロモーターである、又は
（ｆ）第１のプロモーターがＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターがＰｏｌＨプロモーターであり、
第１の発現カセットが任意選択でエンハンサーエレメントを含む、
請求項１から１２までのいずれか一項に定義される第１及び第２の発現カセットを含む核酸構築物。
【請求項１４】
請求項１から１２までのいずれか一項に定義される昆虫細胞。
【請求項１５】
（ａ）請求項１から１２までのいずれか一項に定義される第１及び第２の発現カセットを含む核酸構築物、並びに
（ｂ）少なくとも１つのパルボウイルス反転末端反復ヌクレオチド配列が隣接している導入遺伝子の複数のクローニング部位をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、前記導入遺伝子が、宿主細胞において前記導入遺伝子の発現を推進することができるプロモーターに作動可能に連結されている上記核酸構築物、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パルボウイルスベクターの作製、特に昆虫細胞における組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生、本発明の構築物を含むバキュロウイルス発現ベクター、及びそのようなバキュロウイルス発現ベクターを含む細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
バキュロウイルス発現システムは、真核生物クローニング及び発現ベクターとしてのその使用でよく知られている（Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，１９９２，“Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ”，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ．）。バキュロウイルス発現系の利点は、とりわけ、発現されたタンパク質がほぼ必ず可溶性であり、正しく折り畳まれており、生物学的に活性であることである。さらなる利点には、高タンパク質発現レベル、より迅速な産生、大きなタンパク質発現に対する適性及び大規模生産に対する適性が挙げられる。しかし、昆虫細胞バイオリアクターにおいてバキュロウイルス発現系を使用した異種タンパク質の大規模又は連続生産では、継代効果としても知られる産生レベルの不安定性が重大な障害となっている。この効果は、少なくとも部分的には、バキュロウイルスＤＮＡ中の反復相同配列間の組換えに起因する。
【０００３】
バキュロウイルス発現系は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの作製でも使用に成功していた（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：１９３５−１９４３；米国特許第６７２３５５１号及び米国特許出願公開第２００４０１９７８９５号）。ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療に対するもっとも有望なウイルスベクターの１つであると見なすことができる。ＡＡＶは、分裂ヒト細胞にも非分裂ヒト細胞にも効率的に感染する能力があり、ＡＡＶウイルスゲノムは宿主細胞ゲノム中の単一染色体部位に組み込まれ、もっとも重要なのは、ＡＡＶは多くのヒトに存在していても、決していかなる疾患とも関連したことがない。これらの利点を考慮して、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、血友病Ｂ、悪性黒色腫、嚢胞性線維症、高リポ蛋白血症Ｉ型及び他の疾患に対する遺伝子治療臨床試験において評価中である。
【０００４】
ＡＡＶの哺乳動物産生系についての問題を克服するために、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記参照）は、昆虫細胞におけるＡＡＶ産生系を開発した。昆虫細胞におけるＡＡＶ産生のためには、３種のＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）の正しい化学量論を達成するためにいくつかの改変が必要であり、これは、２つのスプライス受容部位の交互の使用と昆虫細胞により正確には複製されないＶＰ２のＡＣＧ開始コドンの準最適な利用の組合せに利用する。昆虫細胞においてカプシドタンパク質の正しい化学量論を再現するために、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記参照）は、スプライシングを必要とせずに３種のＶＰタンパク質をすべて発現することができる単一ポリシストロン性メッセンジャーに転写され、もっとも上流の開始コドンが準最適開始コドンＡＣＧで置き換えられている構築物を使用している。ＷＯ２００７／０４６７０３は、昆虫細胞内で産生されるＡＡＶカプシドタンパク質の化学量論の最適化によるバキュロウイルス産生ｒＡＡＶベクターベースの産生の感染性のさらなる改良を開示している。
【０００５】
Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記参照）により最初に開発されたＡＡＶ昆虫細胞発現系におけるＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質の発現のために、２つの独立したＲｅｐ発現ユニット（１つはＲｅｐ７８用及び１つはＲｅｐ５２用）を有し、各々がそれぞれ別々の昆虫細胞プロモーターであるΔＩＥ１及びＰｏ１Ｈプロモーターの制御下にある組換えバキュロウイルス構築物が使用されている。しかし、Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：１２１７−２５；ＷＯ２００５／０７２３６４）は、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．により使用された２種のＲｅｐタンパク質の発現のためのバキュロウイルス構築物は固有の不安定性を被ることを報告した。Ｕｒａｂｅの最初のベクター中の２つのＲｅｐ遺伝子の回文構造配向を分割し、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８を発現するための２つの別々のバキュロウイルスベクターを設計することにより、Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５、上記参照）は、ベクターの継代安定性を増加した。しかし、少なくとも５継代にわたり昆虫細胞において２つの独立したバキュロウイルスＲｅｐ構築物からＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２が一貫して発現されたが、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記参照）が設計した最初のバキュロウイルスＲｅｐ構築物と比べて、ｒＡＡＶベクターの産生量は５分の１から１０分の１である。
【０００６】
特許出願ＷＯ２００７／１４８９７１では、本発明者らは、翻訳の開始がさらに下流のＲｅｐ５２タンパク質の開始コドンでも起こるように、スキャニングリボソームにより部分的にスキップされる準最適開始コドンがＲｅｐ７８タンパク質に使用される、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の単一コード配列を使用することにより、昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクター産生の安定性を著しく改善した。
【０００７】
国際特許出願ＷＯ２００７／０８４７７３は、ＶＰ２及びＶＰ３に対してＶＰ１を補充することにより、感染性ウイルス粒子の産生が増加される、昆虫細胞におけるｒＡＡＶ産生の方法を開示している。昆虫細胞にＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を発現するヌクレオチド配列を含むカプシドベクターを導入し、同一カプシドベクター上にあっても異なるベクター上にあってもよいＶＰ１を発現するヌクレオチド配列を昆虫細胞にさらに導入することにより、補充を達成することができる。
【０００８】
しかし、それでも昆虫細胞におけるパルボウイルスベクターの大規模（商業的）生産にはさらに改良点が必要である。したがって、パルボウイルスベクターの安定した高収量（大規模）生産、及び充填対空粒子比を改善する（すなわち、より大きな割合の充填された粒子）生産を可能にする手段及び方法を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、組換えパルボウイルスビリオンの産生のための方法に関する。そのような方法の使用により、そのようなビリオンの増加した産生力価での産生が可能となり得る。その方法の使用により、その代わりに又はそれに加えて、より大きな割合の充填された粒子、すなわち、さらに有利な充填対空粒子比、又は全対充填比を有する産生が可能となり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、組換えパルボウイルスビリオンを産生するための方法であって、
（ａ）（ｉ）少なくとも１つのパルボウイルス反転末端反復ヌクレオチド配列に隣接している導入遺伝子を含むヌクレオチド配列、
（ｉｉ）昆虫細胞においてＲｅｐタンパク質の発現を推進することができる第１のプロモーターに作動可能に連結されているパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセット、
（ｉｉｉ）昆虫細胞においてカプシドタンパク質の発現を推進することができる第２のプロモーターに作動可能に連結されているパルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセット、
を含む１つ又は複数の核酸構築物を含む昆虫細胞を提供する段階と、
（ｂ）Ｒｅｐ及びカプシドタンパク質の発現を促す条件下で（ａ）に定義される細胞を培養する段階と、
（ｃ）任意選択で組換えパルボウイルスビリオンを回収する段階と
を含み、
第１及び第２の発現カセットが単一の核酸構築物上に存在し、第１及び第２の発現カセットが、昆虫細胞に等モル量存在する場合は、トランスフェクションの２４時間後と７２時間後の間の時点での定量的逆転写ＰＣＲにより決定される少なくとも０．５のレベル比のＲｅｐタンパク質コードｍＲＮＡ対カプシドタンパク質コードｍＲＮＡを産生する上記方法を提供する。
【００１１】
本発明は、上で定義される第１及び第２の発現カセットを含む核酸構築物であって、
（ａ）第１のプロモーターがｐ１０プロモーターであり、第２のプロモーターがＰｏｌＨプロモーター若しくは４ｘＨｓｐ２７  ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーターである、
（ｂ）第１のプロモーターが４ｘＨｓｐ２７  ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーターであり、第２のプロモーターがＰｏｌＨプロモーターである、
（ｃ）第１のプロモーターがＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターがｐ１０、ｄｅｌｔａＥ１若しくはＥ１プロモーターである、
（ｄ）第１のプロモーターがＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターがｄｅｌｔａＥ１若しくはＥ１プロモーターである、
（ｅ）第１のプロモーターがｐ１０プロモーターであり、第２のプロモーターがｄｅｌｔａＥ１若しくはＥ１プロモーターである、又は
（ｆ）第１のプロモーターがＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターがＰｏｌＨプロモーターであり、
第１の発現カセットが、任意選択でエンハンサーエレメントを含む上記核酸構築物、
上で定義される昆虫細胞、並びに
（ａ）上で定義される第１及び第２の発現カセットを含む核酸構築物、及び
（ｂ）少なくとも１つのパルボウイルス反転末端反復ヌクレオチド配列に隣接している導入遺伝子の複数のクローニング部位をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、その導入遺伝子が宿主細胞において前記導入遺伝子の発現を推進することができるプロモーターに作動可能に連結されている上記核酸構築物
を含むキット
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ｐＶＤ１１８（新）の構築の概略図である。
【図２】ｐＶＤ１１８（新）＋ＨＲ１の構築の概略図である。
【図３】ｐＶＤ１６５の構築の概略図である。
【図４】ｐＶＤ１６５＋ＨＲ１の構築の概略図である。
【図５】ｐＶＤ１６５＋４ｘＥｃＲＥ  ＣＡＰの構築の概略図である。
【図６】ｐＶＤ１６５＋４＊ＥｃＲＥ  Ｒｅｐ７８の構築の概略図である。
【図７】ｐＶＤ１６５＋ｄｅｌｔａＩＥ１  ＣＡＰの構築の概略図である。
【図８】ｄｅｌｔａＩＥ１  ＣＡＰ＋ｐＰｏｌｈ  Ｒｅｐ（ｐＶＤ１９０）の構築の概略図である。
【図９】ｐ１０  Ｃａｐ＋ｐＰｏｌｈ  Ｒｅｐの構築の概略図である。
【図１０】ｐＶＤ１９４の構築の概略図である。
【図１１Ａ】バキュロウイルス比１：１及び５：１での感染３日後のＢａｃ．ＶＤ１９４から発現されたＣａｐ及びＲｅｐタンパク質のウェスタンブロット解析を示す図である（Ｃ＝それぞれ５：１：１でのＢａｃ．ＶＤ８８：Ｂａｃ．ＶＤ８４：Ｂａｃ．ＶＤ４３）。
【図１１Ｂ】図１１Ａにおいて解析された同一産生のウイルス力価を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書で使用されるように、用語「作動可能に連結されている」とは、機能的関係でのポリヌクレオチド（又はポリペプチド）エレメントの連鎖のことである。核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれると、「作動可能に連結されている」。たとえば、転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、典型的に、連結されているＤＮＡ配列が近接しており、必要ならば、２つのタンパク質コード領域を近接してリーディングフレームに結合させることを意味する。
【００１４】
「発現制御配列」とは、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列のことである。
【００１５】
発現制御配列は、前記発現制御配列がヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御し調節するときには、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結されている」。したがって、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び終止コドンを含むことができる。用語「発現制御配列」は、最小でも、その存在が発現に影響を与えるように設計されている配列を含むように意図されており、追加の有利な成分も含むことができる。たとえば、リーダー配列及び融合パートナー配列は、発現制御配列である。前記用語は、フレームの内と外の望ましくない潜在的開始コドンが配列から取り除かれるような核酸配列の設計も含むことができる。前記用語は、望ましくない潜在的スプライス部位が取り除かれるような核酸配列の設計も含むことができる。前記用語は、ポリＡテール、すなわち、ｍＲＮＡの３’末端の一連のアデニン残基の付加を指示する配列又はポリアデニル化配列（ｐＡ）、すなわちポリＡ配列と呼ばれる配列を含む。前記配列は、ｍＲＮＡ安定性を増強するように設計されることもできる。転写及び翻訳安定性に影響を与える発現制御配列、たとえば、プロモーター、の他にも翻訳を達成する配列、たとえば、コザック配列は、昆虫細胞においては既知である。発現制御配列は、より低い発現レベル又はより高い発現レベルが実現されるように、前記配列が作動可能に連結されているヌクレオチド配列を調節するような性質をもつことができる。
【００１６】
本明細書で使用されるように、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」とは、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置しており、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、並びに、転写因子結合部位、リプレッサーとアクチベータータンパク質結合部位、及びプロモーターからの転写量を直接的に又は間接的に調節するよう作用することが当業者には既知のヌクレオチドの他の任意の配列を含むが、これらに限定されることはない他の任意のＤＮＡ配列の存在により構造的に同定される核酸フラグメントのことである。「構成的」プロモーターとは、大半の生理学的条件及び発生条件下で、大部分の組織において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、たとえば、化学誘導物質の適用により、生理学的に又は発生的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定種の組織又は細胞においてのみ活性である。
【００１７】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに依存して、グローバル又はローカルアライメントアルゴリズムを使用して２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアライメントによって決定することができる。類似の長さの配列は、好ましくは、配列をその全長にわたり最適に整列させるグローバルアライメントアルゴリズム（たとえば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して整列され、実質的に異なった長さの配列は、好ましくは、ローカルアライメントアルゴリズム（たとえば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して整列される。次に、配列は、それが（たとえば、デフォルトパラメータを使用したプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に配列されているとき）少なくとも一定最小割合の配列同一性（下で定義される）を共有している場合、「実質的に同一の」又は「基本的に類似の」と呼んでよい。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを使用して２つの配列をその全長（完全長）にわたって整列させ、マッチ数を最大化しギャップ数を最小化する。２つの配列が類似の長さを有する場合、グローバルアライメントを適切に使用して配列同一性を決定する。一般に、ＧＡＰデフォルトパラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドでは、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａ、タンパク質では、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ８９，９１５−９１９）。配列アライメント及びパーセント配列同一性のスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５Ｓｃｒａｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡより入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３などのコンピュータプログラムを使用して、又は、上のＧＡＰの場合と同じパラメータを使用した、プログラム“ｎｅｅｄｌｅ”（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して）若しくは“ｗａｔｅｒ”（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して）ｉｎ  ＥｍｂｏｓｓＷＩＮ  ｖｅｒｓｉｏｎ２．１０．０などのオープンソースソフトウェアを使用して、又はデフォルト設定（“ｎｅｅｄｌｅ”に対しても“ｗａｔｅｒ”に対しても、タンパク質に対してもＤＮＡアライメントに対しても、デフォルトＧａｐ開始ペナルティーは１０．０、デフォルトギャップ伸長ペナルティーは０．５；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質に対してはＢｌｏｓｕｍ６２、ＤＮＡに対してはＤＮＡＦｕｌｌである）を使用して決定してよい。配列が実質的に異なった全体長を有する場合、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用したアライメントなどのローカルアライメントが好ましい。或いは、パーセント類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等などのアルゴリズムを使用して、公開データベースを検索することにより決定してもよい。
【００１８】
本発明のパルボウイルスＣａｐ及び／又はＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、中程度のハイブリダイゼーション条件下で、又は好ましくは厳密なハイブリダイゼーション条件下で、それぞれ配列番号２０、２２、２４及び１〜４のヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力により定義してもよい。
【００１９】
厳密なハイブリダイゼーション条件とは、少なくとも約２５、好ましくは約５０ヌクレオチド、７５又は１００、もっとも好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列を、約１Ｍ塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液中で、又はこれに匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液中で、約６５℃の温度でハイブリダイズさせ、約０．１Ｍ以下の塩、好ましくは０．２×ＳＳＣを含む溶液で、又はこれに匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液で６５℃で洗浄するという条件として本明細書では定義される。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、一晩、すなわち、少なくとも１０時間は実施され、好ましくは、洗浄は、洗浄液を少なくとも２回変えて少なくとも１時間実施される。これらの条件ならば、通常、約９０％以上の配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることになる。
【００２０】
中程度の条件とは、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列を、約１Ｍ塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液中で、又はこれに匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液中で、約４５℃の温度でハイブリダイズさせ、約１Ｍの塩、好ましくは６×ＳＳＣを含む溶液で、又はこれに匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液で室温で洗浄するという条件として本明細書では定義される。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、一晩、すなわち、少なくとも１０時間は実施され、好ましくは、洗浄は、洗浄液を少なくとも２回変えて少なくとも１時間実施される。これらの条件ならば、通常、最大５０％の配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることになる。当業者であれば、同一性が５０％から９０％まで変化する配列を特異的に同定するために、これらのハイブリダイゼーション条件を変更することができるであろう。
【００２１】
「ベクター」とは、パッセンジャー核酸配列（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主細胞に移行させる働きをする核酸分子（典型的には、ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。３つの一般的種類のベクターには、プラスミド、ファージ及びウイルスが挙げられる。好ましくは、ベクターはウイルスである。プロモーターとポリヌクレオチドを作動可能に連結することができるクローニング部位の両方を含有するベクターは、当技術分野ではよく知られている。そのようなベクターは、ＲＮＡをインビトロ又はインビボで転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）及びＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの供給源から市販されている。発現及び／又はインビトロ転写を最適化するためには、クローンの５’及び／又は３’非翻訳部分を取り除く、付加する又は改変して、余分な潜在的に不適切な別の翻訳開始コドン、又は転写レベル若しくは翻訳レベルのいずれかで発現を妨げる又は減少する可能性がある他の配列を除去することが必要であることがある。或いは、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンの５’に直に接して挿入し発現を増強することができる。
【００２２】
「ウイルスベクター」とは、以下の、遺伝子産物をコードするウイルス遺伝子、制御配列及びウイルスパッケージング配列の一部又はすべてを含むベクターのことである。
【００２３】
「パルボウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボ又はインビトロのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換え的に産生されるパルボウイルス又はパルボウイルス粒子として定義される。パルボウイルスベクターの例には、たとえば、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。本明細書では、パルボウイルスベクター構築物とは、ウイルスゲノム又はその一部、及び導入遺伝子を含むポリヌクレオチドのことである。
【００２４】
宿主細胞のコドン使用に対する酵素をコードするヌクレオチド配列の適応性は、コドン適応インデックス（ＣＡＩ）として表してもよい。コドン適応インデックスは、特定の宿主細胞又は生物における高度に発現される遺伝子のコドン使用に対する遺伝子のコドン使用の相対的適応性の測定値として本明細書では定義される。各コドンの相対的適応性（ｗ）は、同一アミノ酸についてのもっとも豊富なコドンの使用に対する各コドンの使用比である。ＣＡＩインデックスは、これらの相対的適応値の幾何平均として定義される。非同義コドン及び終止コドン（遺伝コードに依存する）は排除される。ＣＡＩ値は０から１までの範囲であり、高い値ほどもっとも豊富なコドンの割合が高いことを示している（Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｌｉ，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１２８１−１２９５参照；Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（８）：２２４２−５１も参照）。
【００２５】
用語「リポーター」（又はリポーター遺伝子若しくはタンパク質）は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｅＧＦＰ、他の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ＧＵＳ及び同類のものなどの可視マーカータンパク質の他にも、ｎｐｔＩＩマーカー及び同類のものをコードするヌクレオチド配列に言及するのに主に使用される。
【００２６】
本発明は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において、核酸の導入及び／又は発現のためのベクターとしての使用のための、パルボウイルス、特に感染性ヒト又はサルＡＡＶなどのディペンドウイルス及びその成分（たとえば、パルボウイルスゲノム）の使用に関する。特に、本発明は、昆虫細胞において産生される場合の、そのようなパルボウイルスベクターの生産性の改善に関する。
【００２７】
この文脈での生産性は、産生力価の改良、及びこうして得られる産物、たとえば、全対充填比（核酸を含む粒子の数の尺度）を改良した産物の品質の改良を包含する。すなわち、最終産物は、充填された粒子の割合が増加している可能性があり、充填されたは、粒子が核酸を含むことを意味する。
【００２８】
パルボウイルス科のウイルスは、小型ＤＮＡウイルスである。パルボウイルス科は、２つの亜科、すなわち、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科と昆虫を含む無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科に分類されることもある。パルボウイルス亜科のメンバーは、本明細書ではパルボウイルスと呼ばれ、ディペンドウイルス属を含む。その属の名称から推定されるように、ディペンドウイルスのメンバーは、細胞培養における増殖性感染のためには、通常、アデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの同時感染が必要であるという点でユニークである。ディペンドウイルス属には、通常、ヒト（たとえば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（たとえば、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ、並びに他の温血動物に感染する関連ウイルス（たとえば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーに関する追加の情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｈａｐｔｅｒ  ６９  ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３ｄ  Ｅｄ．１９９６）に記載されている。便宜上、本発明は、ＡＡＶを参照することにより、本明細書ではさらに例証され、記述される。しかし、本発明は、ＡＡＶに限定されることはなく、他のパルボウイルスにも等しく適用されると理解されている。
【００２９】
既知のＡＡＶ血清型すべてのゲノム組織は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子である。反転末端反復（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質のためのユニークなコードヌクレオチド配列に隣接している。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、−２及び−３）がカプシドを形成する。末端１４５ｎｔは、自己相補的であり、Ｔ型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成されるように組織化される。これらのヘアピン構造体は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとしての働きをする。哺乳動物細胞におけるｗｔＡＡＶ感染に続いて、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）は、それぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現され、両Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製の際に機能を有している。Ｒｅｐ  ＯＲＦのスプライシング事象により、実際に４種のＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）が発現される。
【００３０】
しかし、哺乳動物細胞において、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングされていないｍＲＮＡは、ＡＡＶベクター産生のために十分であることが明らかにされている。昆虫細胞においても、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質はＡＡＶベクター産生のために十分である。
【００３１】
本明細書の「組換えパルボウイルス若しくはＡＡＶベクター」（又は「ｒＡＡＶベクター」）とは、少なくとも１つのパルボウイルス又はＡＡＶ反転末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している対象の１つ若しくは複数のポリヌクレオチド配列、対象の遺伝子、又は「導入遺伝子」を含むベクターのことである。好ましくは、導入遺伝子（単数又は複数）には、導入遺伝子（単数又は複数）のそれぞれの側に１つずつ、ＩＴＲが隣接している。そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ  Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現している昆虫宿主細胞に存在する場合、複製させ感染性ウイルス粒子にパッケージングすることができる。ｒＡＡＶベクターがもっと大きな核酸構築物に（たとえば、染色体に、又はクローニング若しくはトランスフェクションのために使用されるプラスミド若しくはバキュロウイルスなどの別のベクターに）組み込まれると、ｒＡＡＶベクターは、典型的に、ＡＡＶパッケージング機能及び不可欠なヘルパー機能の存在下で、複製及びキャプシド形成により「救済」することができる「プロベクター」と呼ばれる。
【００３２】
本発明は、昆虫細胞において、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを産生するための方法に関する。
【００３３】
第１の態様では、本発明は、組換えパルボウイルスビリオンを産生するための方法であって、（ａ）（ｉ）少なくとも１つのパルボウイルス反転末端反復ヌクレオチド配列が隣接している導入遺伝子を含むヌクレオチド配列、（ｉｉ）昆虫細胞においてＲｅｐタンパク質の発現を推進することができる第１のプロモーターに作動可能に連結されているパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現カセット、（ｉｉｉ）昆虫細胞においてカプシドタンパク質の発現を推進することができる第２のプロモーターに作動可能に連結されているパルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現カセットを含む１つ又は複数の核酸構築物を含む昆虫細胞を提供する段階と、（ｂ）Ｒｅｐ及びカプシドタンパク質の発現を促す条件下で（ａ）に定義される細胞を培養する段階と、（ｃ）任意選択で組換えパルボウイルスビリオンを回収する段階とを含む方法に関する。好ましくは、昆虫細胞において、第１及び第２の発現カセットは単一の核酸構築物上に存在している。
【００３４】
好ましくは、第１及び第２の発現カセットは、昆虫細胞中に等モル量存在する場合、少なくとも約０．５、少なくとも約０．７５、少なくとも約１．０、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約５．０、又は少なくとも約１０．０のレベル比のＲｅｐタンパク質コードｍＲＮＡ対カプシドタンパク質コードｍＲＮＡを産生する。Ｒｅｐ及びカプシドコードｍＲＮＡのレベルは、好ましくは、定量的逆転写ＰＣＲ、ノーザンブロット、又は当技術分野では既知のＲＮＡ定量化のための他の手段により決定される。
【００３５】
好ましくは、前記レベル比のＲｅｐ及びカプシドコードｍＲＮＡは、トランスフェクションの２４、３０、３６、４０、４４又は４６時間後からトランスフェクションの７２、６６、６０、５４、５２、又は５０時間後までの時点で昆虫細胞において産生される。さらに好ましくは、前記レベル比のＲｅｐ及びカプシドコードｍＲＮＡは、少なくとも、トランスフェクションの４８時間後を挟んで前後２又は１時間に昆虫細胞において産生される。
【００３６】
或いは、好ましくは、第１及び第２の発現カセットは、昆虫細胞に等モル量存在する場合、少なくとも約０．５、少なくとも約０．７５、少なくとも約１．０、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約５．０、又は少なくとも約１０．０のレベル比のＲｅｐタンパク質対カプシドタンパク質を産生する。Ｒｅｐ及びカプシドタンパク質レベルは、好ましくは、定量的免疫アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ又は定量的ウェスタンブロット）において、Ｒｅｐ及びカプシドタンパク質に対する参照抗体を使用して決定される。好ましくは、前記比のＲｅｐ及びカプシドタンパク質レベルは、トランスフェクションの２４、３０、３６、４０、４４又は４６時間後からトランスフェクションの７２、６６、６０、５４、５２、又は５０時間後までの時点で昆虫細胞において産生される。さらに好ましくは、前記比のＲｅｐ及びカプシドタンパク質レベルは、少なくとも、トランスフェクションの４８時間後を挟んで前後２又は１時間に昆虫細胞において産生される。ＡＡＶ  Ｒｅｐ及びカプシドタンパク質レベルの定量化に適切な参照抗体は、たとえば、ＰＲＯＧＥＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨから入手可能な抗ＡＡＶ−ｒｅｐマウスモノクローナル、クローン３０３．９又は抗ＡＡＶ  ＶＰ１／ＶＰ２／ＶＰ３、マウスモノクローナル、クローンＢ１である。
【００３７】
本発明の方法では、第１及び第２の発現カセットは単一核酸構築物上に存在する。両方の発現カセットが単一核酸構築物上に存在する利点の１つは、形質移入された昆虫細胞であれば、Ｒｅｐタンパク質とカプシドタンパク質の両方を発現することになる点である。昆虫細胞において、Ｒｅｐタンパク質とカプシドタンパク質の両方が発現された場合のみ、パルボウイルスビリオンが形成されることになる。もう１つの利点は、第１及び第２の発現カセットが１つの構築物上に存在する場合には、Ｒｅｐタンパク質対カプシドタンパク質の最小必要発現比を制御することができる点である。
【００３８】
Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むもう１つの核酸構築物も細胞内に存在してよいことは、本発明の実施形態である。
【００３９】
本発明の方法では、第１の発現カセット（ｉｉ）のヌクレオチド配列は、好ましくは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを１つだけ含んでいてよい。すなわち、Ｒｅｐタンパク質（単数又は複数）は、２つ以上のオープンリーディングフレームによってではなく、単一のオープンリーディングフレームにコードされることになる。別の言い方をすれば、第１の発現カセットは、典型的には、同一の又は異なるＲｅｐタンパク質をコードする２つ以上の別々のオープンリーディングフレームをもたないことになる。しかし、誤解を避けるために、単一オープンリーディングフレームは、１つより多いタンパク質、たとえば、２つ、３つ又は４つのタンパク質をコードすることが可能であってよい。
【００４０】
上記の内容はすべて、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質に等しく適用してよい、すなわち、これらのタンパク質のうちの２つ又はすべては、都合よくすべてが単一オープンリーディングフレームによりコードされていてよい。
【００４１】
典型的には、本発明の方法では、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのオープンリーディングフレーム、又はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、人工イントロン（又は人工イントロン由来の配列）を含まない。すなわち、少なくとも、Ｒｅｐ又はＶＰタンパク質をコードするのに使用されるオープンリーディングフレームは、人工イントロンを含まないことになる。人工イントロンとは、アデノ随伴ウイルスＲｅｐ又はＣａｐ配列には天然に存在しないと考えられるイントロン、たとえば、昆虫細胞内で機能的スプライシングを可能にするように操作されているイントロンのことである。したがって、この文脈での人工イントロンは、野生型昆虫細胞イントロンを包含する。本発明の発現カセットは、天然の切断型イントロン配列（天然のとは、アデノ随伴ウイルスに天然に存在する配列を意味する）を含んでいてよく、そのような配列は、本明細書において定義される人工イントロンの意味に含まれることを意図していない。
【００４２】
本発明では、１つの可能性は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームのどれも、並びに／又はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームのどれも、人工イントロンを含まないことである。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列も、第１及び第２の発現カセットと同じ核酸構築物上にある。その利点は、形質移入された細胞はすべて、パルボウイルスビリオン産生に必要な３種のヌクレオチド配列をそれぞれ含む点である。
【００４４】
さらに、本発明者らは、Ｒｅｐタンパク質対カプシドタンパク質比が高くなるに従って、充填ビリオン対空ビリオン比が高くなることを見出した。用語「充填ビリオン」とは、パルボウイルスベクターを含むビリオン粒子のことである。用語「空ビリオン」とは、パルボウイルスベクターを含まないビリオン粒子のことである。本発明の好ましい実施形態では、充填ビリオン対空ビリオン比は、少なくとも１対１００、さらに好ましくは少なくとも１対１０、さらに好ましくは少なくとも１対１である。さらに好ましくは、空ビリオンを検出することができない、もっとも好ましくは、空ビリオンが存在しないことである。当業者であれば、たとえば、ビリオンあたり１つのゲノムコピーしか存在しないために、遺伝子コピー数を（全カプシド−ゲノムコピー数）で割ることにより、充填ビリオン対空ビリオン比を決定する方法を承知しているであろう。逆に、Ｒｅｐタンパク質対カプシドタンパク質比が高くなるに従って、空ビリオン対全ビリオン（すなわち、充填＋空ビリオン）の比は低くなる。当業者であれば、そのような比を決定する方法を承知しているであろう。たとえば、空ビリオン対全カプシドの比は、ゲノムコピーの量（すなわち、ゲノムコピー数）を全パルボウイルス粒子の量（すなわち、パルボウイルス粒子の数）で割ることにより決定してもよく、ｍｌあたりのゲノムコピーの量は、定量的ＰＣＲにより測定され、ｍｌあたり全パルボウイルス粒子の量は、たとえば、Ｐｒｏｇｅｎ社製の酵素免疫アッセイを使用して測定される。本発明の好ましい実施形態では、空ビリオン対全ビリオンの比は、１００対１未満、さらに好ましくは１０対１未満、さらに好ましくは１対１未満である。さらに好ましくは、空ビリオンを検出することができない、もっとも好ましくは、空ビリオンが存在しないことである。
【００４５】
好ましい実施形態では、Ｒｅｐ対カプシドタンパク質の発現比は、（ａ）リポーター遺伝子発現（たとえば、ルシフェラーゼ若しくはＳＥＡＰ）、又はノーザンブロットにより決定されるように、第１のプロモーターが第２のプロモーターと等しく強力、若しくは第２のプロモーターより強力であること、（ｂ）第２の発現カセットと比べて、第１の発現カセットでより多くの且つ／又はより強力なエンハンサーエレメントの存在、（ｃ）パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列と比べてより高いコドン適応インデックスを有すること、（ｄ）パルボウイルスＲｅｐタンパク質の温度最適化、及び／又は（ｅ）対応する野生型Ｒｅｐタンパク質と比べて、アミノ酸配列に、その結果、昆虫細胞におけるＡＡＶ産生の増加を検出することにより評価されるＲｅｐ機能の活性が増加する１つ又は複数の変化を有する変異Ｒｅｐタンパク質のうちの１つ又は複数により調節される。昆虫細胞におけるＡＡＶ産生の増加を検出することにより評価されるＲｅｐ機能の活性が増加している変異Ｒｅｐタンパク質の作製、選択及び／又はスクリーニングのための方法は、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ産生に関して機能が増加した変異Ｒｅｐタンパク質を得るための米国特許出願公開第２００３０１３４３５１号に記載されている方法を昆虫細胞に適応させることにより得てもよい。対応する野生型Ｒｅｐタンパク質と比べて、アミノ酸配列中に１つ又は複数の変化を有する変異Ｒｅｐタンパク質は、本明細書では、対応する野生型Ｒｅｐタンパク質のアミノ酸配列と比べて、変異アミノ酸配列中に１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を有するＲｅｐタンパク質を含むと理解されている。
【００４６】
第１のプロモーターが第２のプロモーターと等しく強力、又は第２のプロモーターより強力であることは、カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列よりもＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の方が多い場合、Ｒｅｐタンパク質の発現はカプシドタンパク質の発現と比べて増加することになるために、等しく強力なプロモーターを使用してよいが、Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列とカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の量が類似する場合、カプシドタンパク質の発現に対するよりも、Ｒｅｐタンパク質の発現に対してより強力なプロモーターを使用してよいことを意味する。プロモーターの強さは、本発明の方法において使用される条件下で得られる発現により決定してよい。好ましい実施形態では、第１のプロモーター又は第２のプロモーターは、ＰｏｌＨプロモーター、ｐ１０プロモーター、塩基性タンパク質プロモーター、誘導性プロモーター、又はｄｅｌｔａＥ１プロモーター、又はＥ１プロモーター、又は他の任意の後期若しくは最晩期バキュロウイルス遺伝子プロモーターからなる群から選択される。さらに好ましくは、第１のプロモーターは、ＰｏｌＨプロモーター、ｐ１０プロモーター又は塩基性タンパク質プロモーターからなる群から選択され、第２のプロモーターは、ｄｅｌｔａＥ１プロモーター、又はＥ１プロモーター、又は他の任意の初期若しくは後期バキュロウイルス遺伝子プロモーターである。好ましくは、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターはｐ１０プロモーターであり、第２のプロモーターはＰｏｌＨプロモーター又は４ｘＨｓｐ２７  ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーターである。別の実施形態では、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターは４ｘＨｓｐ２７  ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーターであり、第２のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターはｐ１０、ｄｅｌｔａＥ１又はＥ１プロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターはｄｅｌｔａＥ１又はＥ１プロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターはｐ１０プロモーターであり、第２のプロモーターはｄｅｌｔａＥ１又はＥ１プロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターである。もっとも好ましくは、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターはｄｅｌｔａＥ１プロモーターである。
【００４７】
「エンハンサーエレメント」又は「エンハンサー」は、プロモーターの活性を増強し（すなわち、プロモーターの下流にある配列の転写速度を増加する）、プロモーターとは対照的に、プロモーター活性をもたず、通常、プロモーターに対するその位置に関係なく（すなわち、プロモーターの上流でも、又は下流でも）機能することができる配列を定義すると意図されている。エンハンサーエレメントは、当技術分野ではよく知られている。本発明において使用することができると考えられるエンハンサーエレメント（又はその一部）の非限定的例には、バキュロウイルスエンハンサー及び昆虫細胞中に存在するエンハンサーエレメントが挙げられる。エンハンサーエレメントは、エンハンサーエレメントがない遺伝子のｍＲＮＡ発現に比べて、プロモーターが作動可能に連結されている遺伝子のｍＲＮＡ発現を細胞内で、少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも１００％、もっとも好ましくは少なくとも２００％増加することが好ましい。ｍＲＮＡ発現は、たとえば、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定してよい。
【００４８】
本明細書では、パルボウイルスＲｅｐタンパク質の発現を増強するエンハンサーエレメントを使用することが好ましい。したがって、さらに好ましい実施形態では、第１の発現カセットは、少なくとも１つのバキュロウイルスエンハンサーエレメント及び／又は少なくとも１つのエクジソン応答エレメントを含む。好ましくは、エンハンサーエレメントは、ｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４及びｈｒ５からなる群から選択される。
【００４９】
パルボウイルスＲｅｐタンパク質のコドン最適化について、今後さらに詳細に論じる。
【００５０】
パルボウイルスＲｅｐタンパク質の温度最適化とは、昆虫細胞が増殖し、Ｒｅｐが機能している両方の温度に関する最適条件を使用することである。Ｒｅｐタンパク質は、たとえば、３７℃で最適に活性であってよく、昆虫細胞は２８℃で最適に増殖してよい。Ｒｅｐタンパク質が活性であるのみならず昆虫細胞も増殖する温度は３０℃でよい。好ましい実施形態では、最適化温度は、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４若しくは３５℃超であり、及び／又は３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０若しくは２９℃未満である。
【００５１】
当業者であれば理解することになるように、充填ビリオン対空ビリオン比は、中程度から高Ｒｅｐ発現と比べて、減衰されたＣａｐ発現により、たとえば、比較的弱いプロモーターを用いて改良してもよい。
【００５２】
好ましくは、本発明の核酸構築物は、昆虫細胞適合性ベクターである。「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、昆虫又は昆虫細胞の増殖性形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子であると理解されている。例示的な生物学的ベクターには、プラスミド、直鎖状核酸分子、及び組換えウイルスが挙げられる。いかなるベクターも、それが昆虫細胞適合性である限り用いることができる。ベクターは昆虫細胞ゲノムに組み込まれてもよいが、昆虫細胞中のベクターの存在は永久である必要はなく、一過性のエピソームベクターも含まれる。ベクターは、いかなる既知の手段によっても、たとえば、細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、又は感染により導入することができる。好ましい実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス、ウイルスベクター、又はプラスミドである。さらに好ましい実施形態では、ベクターはバキュロウイルスである、すなわち、核酸構築物はバキュロウイルス発現ベクターである。バキュロウイルス発現ベクター及びその使用のための方法は、たとえば、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ．１９８６．Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘ．；Ｌｕｃｋｏｗ．１９９１．Ｉｎ  Ｐｒｏｋｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ’Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，９７−１５２；Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，１９９２，Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ，１９９２，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．，１９９５，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ３９；米国特許第４７４５０５１号、米国特許出願第２００３１４８５０６号及びＷＯ０３／０７４７１４に記載されている。
【００５３】
組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの産生のために昆虫細胞において用いられる核酸構築物の数は、本発明においては限定的ではない。たとえば、１つ、２つ、３つ以上の別々の構築物を用いて、本発明の方法に従って、昆虫細胞においてｒＡＡＶを産生することができる。２つの構築物を用いる場合、１つの構築物は、少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲ配列が隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含んでいてよく、もう１つの構築物は、その場合、第１及び第２の発現カセットを含んでいてよい。３つの構築物が用いられる場合、１つの構築物は、少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲ配列が隣接する導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含んでいてよく、もう１つの構築物は、第１及び第２の発現カセットを含んでいてよく、さらにもう１つの構築物は、下文に記載されるように、組換えを最小限に抑える又は防ぐために、任意選択でコドン最適化されている、ＡＴ最適化されている、又はＧＣ最適化されている、Ｒｅｐタンパク質をコードする追加のヌクレオチド配列を含んでいてよい。
【００５４】
パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書では、昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター産生のために必要とされ且つ十分である、Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８及び／又はＲｅｐ５２若しくはＲｅｐ４０タンパク質などの非構造Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列として理解されている。パルボウイルスヌクレオチド配列は、好ましくは、ディペンドウイルス由来であり、さらに好ましくはヒト又はサルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来であり、もっとも好ましくは、通常、ヒト（たとえば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（たとえば、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ由来である。パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号５に与えられており、配列番号５はＲｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ血清型２配列ゲノムの一部を描いている。Ｒｅｐ７８コード配列はヌクレオチド１１〜１８７６を含み、Ｒｅｐ５２コード配列はヌクレオチド６８３〜１８７６を含み、配列番号５及び７にも別々に描かれている。Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２タンパク質の正確な分子量の他にも翻訳開始コドンの正確な位置は、異なるパルボウイルス間で異なる可能性があると理解されている。しかし、当業者であれば、ＡＡＶ−２以外のパルボウイルス由来のヌクレオチド配列における対応する位置を特定する方法を承知しているであろう。
【００５５】
好ましい実施形態では、第１の発現カセットは、パルボウイルスＲｅｐ５２又は４０タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、及び／又はパルボウイルスＲｅｐ７８又は６８タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、パルボウイルスＲｅｐタンパク質はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質である。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明は、パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする単一オープンリーディングフレームを含む一種類のみのヌクレオチド配列を含む昆虫細胞に関する。好ましくは、単一オープンリーディングフレームはパルボウイルスＲｅｐタンパク質のうちの１つ又は複数をコードしており、さらに好ましくは、オープンリーディングフレームはパルボウイルスＲｅｐタンパク質のすべてをコードしており、もっとも好ましくは、オープンリーディングフレームは、好ましくは少なくともＲｅｐ５２とＲｅｐ７８タンパク質の両方が昆虫細胞において発現される可能性がある元になる完全長Ｒｅｐ７８タンパク質をコードしている。昆虫細胞は、たとえば、マルチコピーエピソームベクター中に、単一種類のヌクレオチド配列の１を超えるコピーを含んでもよいが、これらは本質的に同一の核酸分子の複数コピーであり、又は少なくとも、同一のＲｅｐアミノ酸配列をコードする核酸分子、たとえば、遺伝コードの縮重により互いの間のみで異なる核酸分子であると本明細書では理解されている。パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする単一種類の核酸分子のみの存在は、Ｒｅｐ配列を含む異なる種類のベクター中に存在することがある相同配列間での組換えを回避するが、この組換えが起これば昆虫細胞におけるパルボウイルス産生レベル（の安定性）に影響を与える欠損Ｒｅｐ発現構築物を生じる可能性がある。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、第１の発現カセットは、パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする１を超えるヌクレオチド配列を含む。（ｉｉ）のヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８タンパク質のうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含むことが好ましい。好ましくは、前記ヌクレオチド配列は同一血清型である。さらに好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、組換えを最小限に抑える又は防ぐために、それがコドン最適化されている、ＡＴ最適化されている、又はＧＣ最適化されている、のうちのいずれかであればよい点で互いに異なっている。好ましくは、第１の発現カセットは、パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする２つのヌクレオチド配列、すなわち、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、パルボウイルスＲｅｐタンパク質の共通のアミノ酸配列をコードする第１と第２のヌクレオチド配列の違いは、ａ）パルボウイルスＲｅｐ共通アミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列のコドンバイアスを変化させる、ｂ）パルボウイルスＲｅｐ共通アミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列のコドンバイアスを変化させる、ｃ）共通アミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列のＧＣ含有量を変化させる、及びｄ）共通アミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列のＧＣ含有量を変化させる、のうちの１つ又は複数により最大化される（すなわち、ヌクレオチド同一性は最小化される）。コドン最適化は、コドン使用データベース（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／参照）に見出される可能性がある、本発明の方法において使用される昆虫細胞、好ましくはヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のコドン使用に基づいて実施してよい。コドン最適化のための適切なコンピュータプログラムは当業者ならば入手できる（たとえば、Ｊａｙａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３（９）：３０１１−３０１６；及びインターネット上を参照）。或いは、最適化は、同一のコドン使用データベースを使用して、手動で行うことができる。
【００５８】
パルボウイルスＲｅｐ５２タンパク質をコードする第１の発現カセットのヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも５０、６０、７０、８０、８８、８９、９０、９５、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、
ｂ）配列番号１〜５のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列に少なくとも５０、６０、７０、８０、８１、８２、８５、９０、９５、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する、
ｃ）その相補鎖が（ａ）又は（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズする、
ｄ）遺伝コードの縮重により、その配列が（ｃ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列として定義してよい。
【００５９】
パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質をコードする第１の発現カセットのヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも５０、６０、７０、８０、８８、８９、９０、９５、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、
ｂ）配列番号７の位置１１〜１８７６のヌクレオチド配列に少なくとも５０、６０、７０、８０、８１、８２、８５、９０、９５、９７、９８、又は９９％の配列同一性を有する、
ｃ）その相補鎖が（ａ）又は（ｂ）の核酸分子配列にハイブリダイズする、
ｄ）遺伝コードの縮重により、その配列が（ｃ）の核酸分子の配列とは異なるヌクレオチド配列として定義してよい。好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター産生のために必要とされ且つ十分であるパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする。
【００６０】
他のパルボウイルスのＲｅｐタンパク質コード配列中の、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２翻訳開始部位以外の、考えうる偽翻訳開始部位を除去することは、昆虫細胞において認識される可能性のある推定スプライス部位を除去することと同じように、当業者であれば十分理解されるであろう。
【００６１】
好ましい実施形態では、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質の翻訳のための開始コドンは、準最適開始コドンである。準最適開始コドンは、好ましくは、部分的エクソンスキッピングをもたらす開始コドンである。部分的エクソンスキッピングとは、リボソームの少なくとも一部が、Ｒｅｐ７８タンパク質の準最適開始コドンでではなく、さらに下流の開始コドンで翻訳を開始し、それにより好ましくは、さらに下流の開始コドンがＲｅｐ５２タンパク質の開始コドンであることを意味すると、本明細書では理解されている。準最適開始コドンは、好ましくは、昆虫細胞においてヌクレオチド配列の発現に部分的エクソンスキッピングをもたらす。好ましくは、バキュロウイルス発現を使用して、好ましくは感染の約２０〜４０時間後に、さらに好ましくは感染の約３０〜４０時間後に、１対１０から１０対１まで、１対５から５対１まで、又は１対３から３対１までの範囲のモル比のＲｅｐ７８対Ｒｅｐ５２を昆虫細胞において産生するように、準最適開始コドンは昆虫細胞において部分的エクソンスキッピングをもたらす。Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２のモル割合は、好ましくは、Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２の両方の共通のエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用して、又はたとえば、マウス抗Ｒｅｐ抗体（３０３．９、Ｐｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；希釈度１：５０）を使用して、ウェスタンブロット法により決定してよい。
【００６２】
用語「準最適開始コドン」とは、本明細書では、トリヌクレオチド開始コドンそれ自体のことだけではなく、その状況のことでもある。したがって、準最適開始コドンは、準最適な状況、たとえば、非コザックの状況における「最適」ＡＴＧコドンからなるものでもよい。しかし、さらに好ましいのは、トリヌクレオチド開始コドンそれ自体が最適に準ずる、すなわち、ＡＴＧではない準最適開始コドンである。準最適とは、コドンが他の点では同一の状況において翻訳を開始するのに正常なＡＴＧコドンと比べて、効率が低いことを意味すると、本明細書では理解されている。好ましくは、準最適コドンの効率は、他の点では同一の状況における正常なＡＴＧコドンの効率の９０、８０、６０、４０又は２０％未満である。翻訳開始の相対的効率を比較するための方法は、それ自体当業者には既知である。好ましい準最適開始コドンは、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ、及びＧＴＧから選択してよい。より好ましいのはＡＣＧである。パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞におけるパルボウイルスベクター産生のために必要とされ且つ十分である、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質などの非構造Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列として本明細書では理解されている。
【００６３】
配列中の他のＡＴＧを、そのようなＡＴＧからの翻訳を開始する可能性が少なくなるように、メチオニンをコードする異なるコドンで置き換えることも可能である。
【００６４】
昆虫細胞での適切な発現のために、たとえば、野生型パルボウイルス配列を含む、上で定義されるコードヌクレオチド配列の種々の改変は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．に記載されているようなよく知られている遺伝子工学技術を適用することにより実現される。コードタンパク質の収量を増加することができると考えられるコード領域の種々の追加の改変は、当業者には既知である。これらの改変は、本発明の範囲内である。
【００６５】
パルボウイルスカプシド（Ｃａｐ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、３種のパルボウイルスカプシドタンパク質、すなわちＶＰ１、−２及び−３のうちの１つ又は複数をコードするヌクレオチド配列を含むと、本明細書では理解されている。パルボウイルスヌクレオチド配列は、好ましくは、ディペンドウイルス由来であり、さらに好ましくは、ヒト若しくはサルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来であり、もっとも好ましくは、通常、ヒト（たとえば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（たとえば、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ由来である。パルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号２０、２２及び２４に与えられている。
【００６６】
好ましい実施形態では、（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む。カプシドタンパク質コード配列は、種々の形で存在していてよい。たとえば、各コード配列が昆虫細胞における発現のために発現制御配列に作動可能に連結されている、カプシドタンパク質ＶＰ１、−２及び−３のそれぞれに対する別々のコード配列を使用してよい。しかし、さらに好ましくは、第２の発現カセットは、パルボウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質の３種すべてをコードする単一オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を含み、ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンは、たとえば、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２、上記参照）により及びＷＯ２００７／０４６７０３に記載されている、ＡＴＧではない準最適開始コドンである。ＶＰ１カプシドタンパク質のための準最適開始コドンは、Ｒｅｐ７８タンパク質について上で定義されているとおりでよい。ＶＰ１カプシドタンパク質のためのさらに好ましい準最適開始コドンは、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ及びＧＴＧから選択してよく、このうちＣＴＧ及びＧＴＧがもっとも好ましい。カプシドタンパク質の発現のための第２に発現カセットに含まれるヌクレオチド配列は、ＷＯ２００７／０４６７０３に記載されている１つ又は複数の改変をさらに含んでいてよい。ＶＰ及びビリオンの収量を増加する、又は改変されたトロピズムなどの他の目的の効果を有する、又はビリオンの抗原性を低下させることができると考えられるＶＰコード領域の種々の追加の改変は、当業者には既知である。これらの改変は本発明の範囲内である。
【００６７】
好ましい実施形態では、ＶＰ２及びＶＰ３の発現と比べて、ＶＰ１の発現が増加される。ＷＯ２００７／０８４７７３にすでに記載されているＶＰ１のヌクレオチド配列を含む単一ベクターを昆虫細胞内に導入することにより、ＶＰ１を補充することによってＶＰ１発現を増加させてもよい。
【００６８】
本発明の文脈では、「少なくとも１つのパルボウイルス反転末端反復ヌクレオチド配列」は、「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｃ」領域とも呼ばれる大半が相補的で対称的に配置された配列を含む回文構造配列を意味すると理解されている。前記ＩＴＲは、複製起点、すなわち、複製における「シス」の役割を有する部位、つまり、たとえば、回文構造及び回文構造に対して内部の特異的配列を認識するＲｅｐ７８（又はＲｅｐ６８）などのトランス作用性複製タンパク質に対する認識部位である部位として作用する。ＩＴＲ配列の対称性に対する１つの例外は、ＩＴＲの「Ｄ」領域である。この領域はユニークである（１つのＩＴＲ内に相補体をもたない）。一本鎖ＤＮＡのニッキングは、ＡとＤ領域間の連結部で起こる。そこは、新たなＤＮＡ合成が開始される領域である。Ｄ領域は、通常、回文構造の一方の側の方にあり、核酸複製段階に方向性を与える。哺乳動物細胞で複製しているパルボウイルスは、典型的には、２つのＩＴＲ配列を有する。しかし、結合部位がＡ領域の両方の鎖上にあり、Ｄ領域は、回文構造のそれぞれの側に１つずつ、対称的に位置しているように、ＩＴＲを操作することが可能である。その場合、二本鎖環状ＤＮＡ鋳型（たとえば、プラスミド）上では、Ｒｅｐ７８−又はＲｅｐ６８−支援核酸複製は両方向に進行し、単一ＩＴＲで環状ベクターのパルボウイルス複製には十分である。したがって、１つのＩＴＲヌクレオチド配列を本発明の文脈において使用することができる。しかし、好ましくは、２つの又は別の偶数の規則的ＩＴＲが使用される。もっとも好ましくは、２つのＩＴＲ配列が使用される。好ましいパルボウイルスＩＴＲはＡＡＶ  ＩＴＲである。安全上の理由で、第２のＡＡＶの存在下で、細胞内への最初の導入後はさらに増殖することができない組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを構築することが望ましい。レシピエントにおける望ましくないベクター増殖を制限するためのそのような安全機構は、米国特許出願第２００３１４８５０６号に記載されているキメラＩＴＲと一緒にｒＡＡＶを使用することにより与えてもよい。
【００６９】
別のエレメント（単数又は複数）が隣接している配列に関して用語「隣接した」は、本明細書では、配列に対して上流及び／又は下流、すなわち、５’及び／又は３’における１つ又は複数の隣接エレメントの存在を示している。用語「隣接した」は、配列が必ず連続していることを示すことを意図してはいない。たとえば、導入遺伝子をコードしている核酸と隣接エレメントの間に介在する配列が存在していてもよい。他の２つのエレメント（たとえば、ＩＴＲ）が「隣接」している配列は、１つのエレメントは配列の５’方向に位置し、もう１つは配列の３’方向に位置していることを示すが、それらの間に介在する配列が存在していてもよい。好ましい実施形態では、（ｉ）のヌクレオチド配列には、パルボウイルス反転末端反復ヌクレオチド配列がどちらかの側で隣接している。
【００７０】
本発明の実施形態では、少なくとも１つのパルボウイルスＩＴＲ配列が隣接している導入遺伝子（対象の遺伝子産物をコードしている）を含むヌクレオチド配列は、好ましくは、昆虫細胞において産生される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのゲノムに組み込まれる。好ましくは、導入遺伝子は、哺乳動物細胞における発現のために対象の遺伝子産物をコードしている。好ましくは、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列には、２つのパルボウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲヌクレオチド配列が隣接しており、導入遺伝子は前記２つのパルボウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲヌクレオチド配列間に位置している。好ましくは、（哺乳動物細胞における発現のために）対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、それが２つの規則的ＩＴＲ間に位置している場合には、又は２つのＤ領域で操作されたＩＴＲのいずれかの側に位置している場合には、昆虫細胞において産生される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに組み込まれることになる。
【００７１】
昆虫細胞における組換えＡＡＶビリオンの産生のために本発明において使用してよいＡＡＶ配列は、どんなＡＡＶ血清型のゲノムに由来していてもよい。一般的に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで著しく相同なゲノム配列を有し、同一セットの遺伝機能を与え、基本的に物理的機能的に等価であるビリオンを産生し、実質的に同一の機構により複製し構築される。種々のＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似点の概要は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９７９０、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０１９０１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４３３０３、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｌｏｒｉｎｉ  ａｔ  ａｌ．（１９９７，Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３−３３）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３，Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５−６４）；Ｃｈｌｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９−１３１９）：Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９−３１９）；及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５−４７）を参照されたい。ＡＡＶ血清型１、２、３、４及び５は、本発明の文脈において使用するための、ＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源である。好ましくは、本発明の文脈において使用するためのＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４由来である。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８及びＲｅｐ５２／４０）コード配列は、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４由来である。しかし、本発明の文脈において使用するためのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、既知の４２血清型のうちのいずれからでも、さらに好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８若しくはＡＡＶ９から、又は、たとえば、カプシドシャッフリング技術及びＡＡＶカプシドライブラリーにより得られる新たに開発されたＡＡＶ様粒子から、又は、新たに設計され、開発され、若しくは発展したＩＴＲから取ってもよい。
【００７２】
ＡＡＶ  Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列は、大半の血清型の中で特に保存されている。種々のＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、たとえば、８９％を超えて同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、及びＡＡＶ６間のゲノムレベルでの全ヌクレオチド配列同一性は約８２％である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（２）：９３９−９４７）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳動物細胞におけるＡＡＶ粒子の産生の際に他の血清型由来の対応する配列を効率的に交差補完する（すなわち、機能的に置換する）ことで知られている。米国特許出願第２００３１４８５０６号では、ＡＡＶ  Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列も昆虫細胞において他のＡＡＶ  Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列を効率的に交差補完することが報告されている。
【００７３】
ＡＡＶ  ＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞向性を決定することが知られている。異なるＡＡＶ血清型間では、ＶＰタンパク質コード配列はＲｅｐタンパク質及び遺伝子ほど有意に保存されていない。他の血清型の対応する配列を交差補完するＲｅｐ及びＩＴＲ配列の能力は、ある血清型（たとえば、ＡＡＶ３）のカプシドタンパク質並びに別のＡＡＶ血清型（たとえば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ及び／又はＩＴＲ配列を含む偽型ｒＡＡＶ粒子の産生を可能にする。そのような偽型ｒＡＡＶ粒子は、本発明の一部である。
【００７４】
改変された「ＡＡＶ」配列も、本発明の文脈で、たとえば、昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクターの産生のために使用することができる。たとえば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８若しくはＡＡＶ９  ＩＴＲ、Ｒｅｐ又はＶＰに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％以上のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性（たとえば、約７５〜９９％ヌクレオチド配列同一性を有する配列）を有する配列を含む、そのような改変された配列は、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ、Ｒｅｐ又はＶＰ配列に代わって使用することができる。
【００７５】
多くの点で他のＡＡＶ血清型に類似してはいるが、ＡＡＶ５は、他の既知のヒト及びサル血清型よりも、他のヒト及びサルＡＡＶ血清型とは異なっている。これを考慮すると、ｒＡＡＶ５の産生は昆虫細胞における他の血清型の産生とは異なる可能性がある。本発明の方法を用いてｒＡＡＶ５を産生する場合、１つ又は複数の構築物が、合計で１つを超える構築物の場合、ＡＡＶ５  ＩＴＲを含むヌクレオチド配列を含んでいて、ヌクレオチド配列はＡＡＶ５  Ｒｅｐコード配列を含む（すなわち、ヌクレオチド配列がＡＡＶ５  Ｒｅｐ７８を含む）ことが好ましい。そのようなＩＴＲ及びＲｅｐ配列は、要望通りに改変して、昆虫細胞においてｒＡＡＶ５又は偽型ｒＡＡＶ５ベクターの効率的産生を獲得することができる。たとえば、昆虫細胞におけるｒＡＡＶ５ベクターの産生を改善するために、Ｒｅｐ配列の開始コドンを改変することができる、ＶＰスプライス部位を改変する若しくは除去することができる、並びに／又はＶＰ１開始コドン及び隣接するヌクレオチドを改変することができる。
【００７６】
したがって、本明細書において上で定義される導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞における発現のために少なくとも１つの「対象の遺伝子産物」をコードし、昆虫細胞において複製される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに組み込まれるように位置しているヌクレオチド配列を含んでいてよい。本発明の文脈では、「対象の遺伝子産物」が発現されることになる特に好ましい哺乳動物細胞はヒト細胞であると理解されている。どんなヌクレオチド配列でも、本発明に従って産生される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物における後の発現のために組み込むことができる。前記ヌクレオチド配列は、たとえば、タンパク質をコードしていてもよいし、ＲＮＡ干渉剤、すなわち、たとえば、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピンＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）などの、ＲＮＡ干渉が可能であるＲＮＡ分子を発現してもよい。「ｓｉＲＮＡ」とは、哺乳動物細胞において有毒ではない長さが短い二本鎖ＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡを意味する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−９８；Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４２−４７）。好ましい実施形態では、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、それぞれが哺乳動物における発現のために対象の１つの遺伝子産物をコードする２つのコードヌクレオチド配列を含んでいてよい。対象の産物をコードする２つのヌクレオチド配列はそれぞれ、昆虫細胞において複製される組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに組み込まれるように位置している。
【００７７】
哺乳動物における発現のための対象の産物は、治療遺伝子産物であってよい。治療遺伝子産物は、標的細胞において発現されると、たとえば、望ましくない活性の除去、たとえば、感染細胞の除去、又は、たとえば、酵素活性の欠失を引き起こす遺伝子欠損の補完などの目的の治療効果を与えるポリペプチド、又はＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）又は他の遺伝子産物であってよい。治療ポリペプチド遺伝子産物の例には、ＣＦＴＲ、第ＩＸ因子、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、好ましくはＬＰＬ  Ｓ４４７Ｘ；ＷＯ０１／００２２０参照）、アポリポタンパク質Ａ１、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＴＧ）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ制御因子相互作用タンパク質（ＲＰ−ＧＲＩＰ）、並びに、たとえば、ＩＬ−１０、ポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素（ＰＢＧＤ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）などの神経栄養因子及びアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）のようなサイトカイン又はインターロイキンが挙げられる。
【００７８】
その代わりに、又はそれに加えて、別の遺伝子産物として、本明細書において上で定義される導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、細胞形質転換及び発現を評価するためのマーカータンパク質として働くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。この目的のために適切なマーカータンパク質は、たとえば、蛍光タンパク質ＧＦＰ、並びに、選択可能マーカー遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地上での選択用）、細菌性ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢ上での選択用）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８上での選択用）、及びジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）（メトトレキサート上での選択用）、ＣＤ２０、低親和性神経成長因子遺伝子である。これらのマーカー遺伝子を入手するための供給源及びその使用のための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ、上記参照に提供されている。さらに、本明細書において上で定義される導入遺伝子を含むヌクレオチド配列は、必要と見なされた場合には、本発明の組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターで形質導入された細胞から被験者を治療することを可能にする安全装置として働く可能性のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。そのようなヌクレオチド配列は、自殺遺伝子と呼ばれることが多いが、プロドラッグをタンパク質が発現されている遺伝子導入細胞を死滅させることができる有毒物質に変換することができるタンパク質をコードしている。そのような自殺遺伝子の適切な例には、たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシン脱アミノ酵素遺伝子又は単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）及び水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）由来のチミジンキナーゼ遺伝子の１つが挙げられるが、その場合、ガンシクロビルを被験者の遺伝子導入細胞を死滅させるプロドラッグとして使用してもよい（たとえば、Ｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３１：８４４−８４９参照）。
【００７９】
別の実施形態では、対象の遺伝子産物の１つはＡＡＶタンパク質であることが可能である。特に、Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８などのＲｅｐタンパク質、又はその機能的フラグメントである。Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列は、本発明の組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのゲノム上に存在し、そのベクターで形質導入された哺乳動物細胞において発現される場合には、形質導入された哺乳動物細胞のゲノムへの組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組込みを可能にする。ｒＡＡＶ形質導入又は感染哺乳動物細胞においてＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８が発現すれば、ベクターにより細胞に導入された対象の他の任意の遺伝子産物の長期又は永久的発現を可能にすることにより、組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのある種の使用に利点を与えることができる。
【００８０】
本発明の組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターでは、哺乳動物細胞における発現のために対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列（単数又は複数）は、好ましくは、少なくとも１つの哺乳動物細胞適合性発現制御配列、たとえば、プロモーターに作動可能に連結されている。多くのそのようなプロモーターが当技術分野では既知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１、上記参照）。多くの細胞型で広く発現されている、ＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターを使用してよい。しかし、さらに好ましいのは、誘導性、組織特異的、細胞型特異的、又は細胞周期特異的であるプロモーターであろう。たとえば、肝臓特異的発現のためには、プロモーターは、α１−抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬＰＳ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＨＣＲ−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメントと組み合わせたＡＡＴプロモーター及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターから選択してよい。他の例には、腫瘍選択性、及び、特に神経細胞腫瘍選択性発現のためのＥ２Ｆプロモーター（Ｐａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１４５−９）又は単核血液細胞における使用のためのＩＬ−２プロモーター（Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；１８５：２１０１−１０）が挙げられる。
【００８１】
ＡＡＶはいくつかの哺乳動物細胞に感染することができる。たとえば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０）及びＧｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：２４４５−２４５０）を参照されたい。しかし、ヒト滑膜線維芽細胞のＡＡＶ形質導入は、類似のマウス細胞におけるよりも有意に効率的であり、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．３：１（２００１）、ＡＡＶの細胞トロピシティーは血清型間で異なる。たとえば、哺乳動物ＣＮＳ細胞トロピズム及び形質導入効率に関するＡＡＶ２、ＡＡＶ４及びＡＡＶ５間の相違点を議論している、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：３４２８−３４３２）を参照されたい。好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、パルボウイルスビリオンが感染する可能性がある任意の哺乳動物細胞、たとえば、筋細胞、肝細胞、神経細胞、グリア細胞及び上皮細胞であるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞はヒト細胞である。
【００８２】
好ましくは、構築物において、パルボウイルスＲｅｐタンパク質及び／又はパルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞における発現のために発現制御配列に作動可能に連結されている。これらの発現制御配列は、昆虫細胞において活性であるプロモーターを少なくとも含むことになる。昆虫宿主細胞において外来遺伝子を発現させるための当業者には既知の技術を使用して、本発明を実行することができる。昆虫細胞におけるポリペプチドの分子工学及び発現の方法は、たとえば、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ．１９８６．Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘ．；Ｌｕｃｋｏｗ．１９９１．Ｉｎ  Ｐｒｏｋｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ’Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，９７−１５２；Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，１９９２，Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ，１９９２，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．，１９９５，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  ３９；米国特許第４７４５０５１号、米国特許出願第２００３１４８５０６号、及びＷＯ０３／０７４７１４に記載されている。本発明の第１及び第２の構築物に含まれるヌクレオチド配列の転写に適切なプロモーターには、たとえば、ポリヘドロン（ＰｏｌＨ）、ｐ１０、ｐ３５、ＩＥ−１又はΔＩＥ−１プロモーター及び上の参考文献に記載された追加のプロモーターが挙げられる。
【００８３】
少なくとも第１及び／又は第２の発現カセットを含む核酸構築物は、パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドン、及び／又はパルボウイルスＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に、配列番号９の９ヌクレオチド配列、又は配列番号９に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列をさらに含んでいてよい。配列番号９のヌクレオチド配列に実質的な同一性を有し、パルボウイルスＲｅｐタンパク質の発現を増加するのに寄与することになる配列は、たとえば、配列番号９の９ヌクレオチド配列に少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％の同一性を有する配列である。
【００８４】
昆虫細胞は、異種タンパク質の産生に適切であるどんな細胞でもよい。好ましくは、昆虫細胞はバキュロウイルスベクターの複製を可能にし、培養下で維持することができる。さらに好ましくは、昆虫細胞は、ｒＡＡＶベクターを含む組換えパルボウイルスベクターの複製も可能にする。たとえば、使用される細胞系は、ヨトウガ、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ）細胞系、又は蚊細胞系、たとえば、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞系由来でよい。好ましい昆虫細胞又は細胞系は、たとえば、Ｓ２（ＣＲＬ−１９６３、ＡＴＣＣ）、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）（米国特許第６１０３５２６号；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ＣＴ、ＵＳＡ）を含む、バキュロウイルス感染に感受性である昆虫種由来の細胞である。本発明に従った好ましい昆虫細胞は、組換えパルボウイルスベクターの産生のための昆虫細胞である。
【００８５】
本発明の方法の１つ又は複数の核酸構築物は、昆虫細胞のゲノムに安定的に組み込まれてよい。当業者であれば、ヌクレオチド配列を昆虫ゲノムに安定的に導入する方法、及びゲノムにおいてそのようなヌクレオチド配列を有する細胞を特定する方法を承知している。ゲノムへの取込みは、たとえば、昆虫ゲノムの領域に高度に相同なヌクレオチド配列を含むベクターの使用により支援されてもよい。トランスポゾンなどの特定の配列の使用は、ヌクレオチド配列をゲノムに導入するもう１つの方法である。
【００８６】
培養中の昆虫細胞の増殖条件、及び培養中の昆虫細胞における異種産物の産生は、当技術分野ではよく知られており、たとえば、昆虫細胞の分子工学に関する上に引用した参考文献に記載されている（ＷＯ２００７／０４６７０３も参照）。
【００８７】
本発明の方法の好ましい実施形態では、組換えパルボウイルスビリオンは回収される。回収は、好ましくは、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは、固定化抗体を使用した組換えパルボウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター（を含むビリオン）の親和性精製の段階を含む。抗ＡＡＶ抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。特に適切な抗体は、たとえば、ラクダ又はラマから入手可能な一本鎖ラクダ科動物抗体又はそのフラグメントである（たとえば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２参照）。ｒＡＡＶの親和性精製のための抗体は、好ましくは、ＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープに特異的に結合する抗体であり、好ましくは、前記エピトープは１つを超えるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質上に存在するエピトープである。たとえば、抗体は、ＡＡＶ２カプシドへの特異的結合に基づいて産生する又は選択してよいが、同時に抗体はＡＡＶ１、ＡＡＶ３及びＡＡＶ５カプシドにも特異的に結合してもよい。
【００８８】
第２の態様では、本発明は、本明細書において上で定義される本発明の１つ又は複数の発現カセットを含む核酸構築物に関する。好ましい実施形態では、本発明の核酸構築物は、本発明の第１及び第２の発現カセット、並びに任意選択で（ｉ）の核酸配列を含む。好ましくは、本発明の核酸構築物の第１のプロモーターは、ｐ１０プロモーターであり、第２のプロモーターはＰｏｌＨプロモーター又は４ｘＨｓｐ２７  ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーターである。さらに好ましくは、第１のプロモーターは、エンハンサー、好ましくは、ＨＲ１エンハンサーと作動可能に連結されている。別の実施形態では、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターは４ｘＨｓｐ２７ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーターであり、第２のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターはｐ１０、ｄｅｌｔａＥ１又はＥ１プロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターは、ｄｅｌｔａＥ１又はＥ１プロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターはｐ１０プロモーターであり、第２のプロモーターはｄｅｌｔａＥ１又はＥ１プロモーターである。さらに別の実施形態では、本発明の核酸構築物中の第１のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターであり、第２のプロモーターはＰｏｌＨプロモーターである。追加の実施形態では、第１のプロモーターと第２にプロモーターの他のどんな組合せも本発明の一部である。第１のプロモーターは、ＰｏｌＨプロモーター、ｐ１０プロモーター、塩基性タンパク質プロモーター、誘導性プロモーター又はｄｅｌｔａＥ１プロモーター又はＥ１プロモーター、又は他の任意の後期若しくは最晩期バキュロウイルス遺伝子プロモーターからなる群から選択してよい。第２のプロモーターは、ＰｏｌＨプロモーター、ｐ１０プロモーター、塩基性タンパク質プロモーター、誘導性プロモーター又はｄｅｌｔａＥ１プロモーター又はＥ１プロモーター、又は他の任意の後期若しくは最晩期バキュロウイルス遺伝子プロモーターからなる群から選択してよい。さらに好ましくは、第１のプロモーターは、ＰｏｌＨプロモーター、ｐ１０プロモーター又は塩基性タンパク質プロモーターからなる群から選択され、第２のプロモーターは、ｄｅｌｔａＥ１プロモーター又はＥ１プロモーター、又は他の任意の初期若しくは後期バキュロウイルス遺伝子プロモーターである。
【００８９】
好ましい実施形態では、本発明の核酸構築物中に含まれる第１の発現カセットは、上で定義されるエンハンサーエレメントを含む。
【００９０】
第３の態様では、本発明は、上で定義される昆虫細胞に関する。
【００９１】
第４の態様では、本発明は、（ａ）上で定義される第１及び第２の発現カセットを含む核酸構築物、並びに（ｂ）少なくとも１つのパルボウイルス反転末端反復ヌクレオチド配列が隣接している導入遺伝子の複数のクローニング部位をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、宿主細胞において前記導入遺伝子の発現を推進することができるプロモーターに作動可能に連結されている上記核酸構築物を含むキットに関する。
【００９２】
好ましい実施形態では、核酸構築物（ｂ）は、少なくとも１つのパルボウイルス反転末端反復ヌクレオチド配列が隣接している導入遺伝子であって、宿主細胞において前記導入遺伝子の発現を推進することができるプロモーターに作動可能に連結されている上記導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９３】
キットは、昆虫細胞及び昆虫細胞における発現のためにバキュロウイルスヘルパー機能をコードする核酸配列をさらに含んでいてよい。
【００９４】
追加の態様では、本発明は、本発明の上記の方法において産生される１バッチのパルボウイルスビリオンに関する。「バッチのパルボウイルスビリオン」とは、任意選択で昆虫細胞の容器あたりの、同一回の産生で産生される全パルボウイルスビリオンとして本明細書では定義される。好ましい実施形態では、本発明のパルボウイルスビリオンのバッチは、上記の充填ビリオン対全ビリオン及び／又は上記の充填ビリオン対空ビリオンを含む。
【００９５】
本文書及びその特許請求の範囲では、動詞「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用は、その非限定的意味で使用されて、前記単語に続く品目は含まれるが、特に言及されない品目は排除されないことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、前記要素がただ１つ存在することを文脈が明確に要求しない限り、２つ以上の前記要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００９６】
以下の例は、本発明を例証する。
【実施例】
【００９７】
（例１）
１．１  材料と方法
１．１．１  組換えバキュロウイルスの作製
以下の構築物が作製された。
【００９８】
１．１．１．１  ｐＶＤ１１８（新）の構築
ｐＶＤ１１８（新）は、ｐ１０プロモーターの制御下のＲｅｐ７８のヌクレオチド配列を含む発現カセットとポリヘドロン（ＰｏｌＨ又はｐＰＨ）プロモーターの制御下のＣａｐ遺伝子のヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む制御ベクターである。ｐＶＤ１１８（新）は、図１に示されるとおりに構築された。最終プラスミドｐＶＤ１１８（新）を作製することができるようになる前に、その先行物であるｐＦａｓｔＢａｃ  Ｄｕａｌ  Ｒｅｐ７８／ＡＣＧ  ａｎｄ  ｐＶＤ１１８（ロット番号１）が構築された。手短に言えば、プラスミドのＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣ（特許出願ＷＯ２００７１４８９７１；本明細書ではｐＶＤ８８とも呼ばれる）ｐＶＤ８８はＳｐｅＩ＊ＸｂａＩで消化され、５’オーバーハングは平滑末端化された。２０５７ｂｐフラグメントが、アガロースゲルから単離され、精製され、Ｓｍａで直鎖化されたｐＦａｓｔＢａｃ  Ｄｕａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートされ、ｐＦａｓｔＢａｃ  Ｄｕａｌ  Ｒｅｐ７８／ＡＣＧが得られた。その後、このプラスミドはＢｓｔＺ１７ＩとＳｎａＢＩで消化され、２５３７ｂｐのｐ１０＿Ｒｅｐ７８／ＡＣＧフラグメントが単離され、ＢｓｔＺ１７Ｉで直鎖化されたｐＶＤ８４にライゲートされ、ｐＶＤ１１８（ロット番号１）が作製された。しかし、Ｒｅｐ７８／ＡＣＧ発現カセットの配向性は正しくなく、したがって、ＮｈｅＩ＊ＢｌｐＩによる消化を実施することにより削除された。５’オーバーハングを平滑末端化した後、１２４３１ｂｐベクターフラグメントがゲルから単離され、精製された。続いて、ＲＥＰ−ＡＣＧ／ＰＳＣ由来の２０５７ｂｐ精製フラグメントがベクターにライゲートされ、形質転換混合物が化学的に形質転換受容性のあるＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換され、アンピシリン含有プレート上に蒔かれた。ＮａｅＩ＊ＳａｃＩを使用した制限解析が、ミニプレップ培養物から単離されたＤＮＡで実施された。正確なクローンは、サイズが２２０４ｂｐ及び１２２９２ｂｐであるフラグメントを与える。
【００９９】
１．１．１．２  ｐＶＤ１１８（新）＋ＨＲ１の構築
ｐＶＤ１１８（新）＋ＨＲ１はｐＶＤ１１８と同じであり、ｐ１０とポリヘドロンプロモーターの間に位置しているｈｒ１エンハンサーが付加されていて、図２に示されるとおりに構築された。手短に言えば、プライマーＨＲ１−Ｆｗ  ５’−ｇｔａｔａｃｇｔａｔｇａｃａｃｔ  ａｔｃｇａｔｇｔｔｇａｃ−３’（配列番号１０）及びＨＲ１−Ｒｖ  ５’−ｇｔａｔａｃｇａｔｃｇａｔｔａｔｔｇｃｔｃｃａａｔａｃｔａｇ−３’（配列番号１１）を使用して、ＡｃＭＮＰＶウイルスＤＮＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＵＳＡ）にＰＣＲを実施し、９０４ｂｐの産物を得て、ｐＣＲＩＩ−平滑末端−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化する。ＢｓｔＺ１７Ｉでの消化後、８９８ｂｐフラグメントがゲルから単離され、精製され、ＢｓｔＺ１７Ｉで切り開かれ脱リン酸化されたｐＶＤ１１８（新）ベクターにライゲートされた。ＳｐｅＩ＊ＥｃｏＮＩを使用した正確なクローンの制限消化により、１２６９ｂｐ及び１４１２５ｂｐのフラグメントが得られた。
【０１００】
１．１．１．３  ｐＶＤ８４（＋ｐ１０  Ｒｅｐ）（＝ｐＶＤ１６５）の構築
ｐＶＤ１６５は、ｐ１０プロモーターの制御下にある、開始コドンがすでにＡＣＧに変異しているＲｅｐ７８のヌクレオチド配列を含む発現カセットと、ＰｏｌＨプロモーターの制御下にあるＣａｐ遺伝子のヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む制御ベクターである。この発現カセット同士は、プラスミド内で反対方向にある。ｐＶＤ１６５は、図３に示されるとおりに構築された。手短に言えば、プライマーポリＡ  Ｆｗ５’−ａｇａｔｃｔ  ｇｔａｇｔｇｇｃｔａｔｇｇｃａｇｇｇｃ−３’（配列番号１２）及びｐ１０  Ｒｖ５’−ａｇａｔｃｔ ｃｃｃｇｇｇａｃｇｇａｃｃｔｔｔａａｔｔｃａａｃｃｃａａｃ−３’（配列番号１３）を使用して、ｐＶＤ１１８（新）にＰＣＲを実施し、２５６６ｂｐの産物を得て、ｐＣＲＩＩ−平滑末端−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。ＢｇｌＩＩでの消化後、２５４１ｂｐフラグメントがゲルから単離され、精製され、ＢｇｌＩＩで切り開かれ脱リン酸化されたｐＶＤ８４ベクターにライゲートされた。ＳｐｅＩ＊ＸｂａＩを使用した正確なクローンの制限消化により、１２６９ｂｐ及び１１８１０ｂｐのフラグメントが得られた。
【０１０１】
１．１．１．４  ｐＶＤ１６５＋ＨＲ１の構築
ｐＶＤ１６５＋ＨＲ１はｐＶＤ１６５と同じであり、ｐ１０プロモーターの下流にｈｒ１エンハンサーが付加されており、図４で示されるとおりに構築された。手短に言えば、プライマーＨＲ１−Ｆｗ  ５’−ｇｔａｔａｃｇｔａｔｇａｃａｃｔ  ａｔｃｇａｔｇｔｔｇａｃ−３’（配列番号１０）及びＨＲ１−Ｒｖ  ５’−ｇｔａｔａｃｇａｔｃｇａｔｔａｔｔｇｃｔｃｃａａｔａｃｔａｇ−３’（配列番号１１）を使用して、ＡｃＭＮＰＶウイルスＤＮＡにＰＣＲを実施し、９０４ｂｐの産物を得て、ｐＣＲＩＩ−平滑末端−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化された。ＢｓｔＺ１７Ｉでの消化後、８９８ｂｐフラグメントがゲルから単離され、精製され、ＳａｍＩで切り開かれ脱リン酸化されたｐＶＤ１６５ベクターにライゲートされた。ＣｌａＩを使用した正確なクローンの制限消化により、８７５ｂｐ、１１８４ｂｐ、４１６０ｂｐ及び９１８０ｂｐのフラグメントが得られた。
【０１０２】
１．１．１．５  ＣＡＰの上流に誘導性プロモーターのあるｐＶＤ１６５（ｐＶＤ１６５＋４ｘＥｃＲＥ  ＣＡＰ）の構築
ｐＶＤ１６５＋４ｘＥｃＲＥ  ＣＡＰはｐＶＤ１６５と類似しているが、ポリヘドロン（ｐＰＨ）プロモーターの代わりに誘導性プロモーターを含む。ｐＶＤ１６５＋４ｘＥｃＲＥ  ＣＡＰは、図５に示されるとおりに構築された。手短に言えば、４連続ＥｃＲＥ、最小ｈｓｐ７０プロモーター（Ｐｏｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００４，３４（５）：４５１−４５８）及びＣＡＰコード配列の一部を含む誘導性プロモーターが合成され、ｐＣＲＩＩ−平滑末端−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートされた。ＢｓｔＺ１７ＩとＥｃｏＮＩでの消化後、３７５ｂｐフラグメントがゲルから単離され、精製され、ＢｓｔＺ１７ＩとＥｃｏＮＩを使用して切り開かれたｐＶＤ１６５ベクターにライゲートされた。ＰｍｅＩ＊ＥｃｏＲＶを使用した正確なクローンの制限消化により、２５５４ｂｐと１２１１６ｂｐのフラグメントが得られた。
【０１０３】
１．１．１．６  Ｒｅｐの上流に誘導性プロモーターのあるｐＶＤ１６５（ｐＶＤ１６５＋４＊ＥｃＲＥ  Ｒｅｐ７８−５２）の構築
ｐＶＤ１６５＋４＊ＥｃＲＥ  Ｒｅｐ７８はｐＶＤ１６５に類似しているが、ｐ１０プロモーターの代わりに誘導性プロモーターを含む。ｐＶＤ１６５＋４＊ＥｃＲＥ  Ｒｅｐ７８は図６に示されるとおりに構築された。手短に言えば、４連続ＥｃＲＥ及び最小ｈｓｐ７０プロモーターからなる誘導性プロモーターが合成され、ｐＣＲＩＩ−平滑末端−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートされた。ＢｓｔＺ１７ＩとＳｐｅＩでの消化後、２９０ｂｐフラグメントがゲルから単離され、精製され、ＳｍａＩとＳｐｅＩを使用して切り開かれたｐＶＤ１６５にライゲートされた。ＳｐｅＩ＊ＢｇｌＩＩを使用した正確なクローンの制限消化により、２９８ｂｐ、２３７６ｂｐ及び１１９５４ｂｐのフラグメントが得られた。
【０１０４】
１．１．１．７  ｐＶＤ１９０構築物（ｄｅｌｔａＩＥ１  Ｃａｐ＋ｐＰｏｌｈ  Ｒｅｐ）の構築
ｄｅｌｔａＩＥ１  Ｃａｐ＋ｐＰｏｌｈ  ＲｅｐはｐＶＤ１６５に類似しているが、ｐＰＨプロモーターの代わりにｄｅｌｔａＩＥ１プロモーターを、ｐ１０プロモーターの代わりにｐＰｏｌＨプロモーターを含む。ｄｅｌｔａＩＥ１  Ｃａｐ＋ｐＰｏｌｈ  Ｒｅｐは、図７及び８に示されるとおりに構築された。これに、前駆ベクターは以下の方法で構築された。プライマーＢｓｔＺ１７Ｉ−ｄｅｌｔａＩＥ１  Ｆｗ：５’−ｇｇｔｃｃ  ｇｔａｔａｃｇａｃｇａｔａａｃｇｃｃｇｔｔｇｇｔｇｇｃｇ−３’（配列番号１４）とＡｆｌＩＩ−ｄｅｌｔａＩＥ１  Ｒｖ：５’−ｃｇａｃｔｔａａｇａｃｇｇｃｇａａｔｔｃｔｇｃ  ａｇａｔｇｇｃ−３’（配列番号１５）を使用して、ｐＦＢＤＳＬＲ（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２００２；１３（１６）：１９３５−１９４３）にＰＣＲを実施し、１８１ｂｐの産物を得て、ｐＣＲＩＩ−平滑末端−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化された。ＢｓｔＺ１７Ｉ＊ＡｆｌＩＩでの消化後、１６５ｂｐフラグメントがゲルから単離され、精製され、ＢｓｔＺ１７ＩとＡｆｌＩＩを使用して切り開かれたｐＶＤ１６５＋４ｘＥｃＲＥ  ＣＡＰベクターにライゲートされた。こうして得られたプラスミドはｐＶＤ１６５＋ｄｅｌｔａＩＥ１  ＣＡＰであり、ＢｓｔＺ１７Ｉ＊ＡｆｌＩＩを使用した制限消化により、１６５ｂｐ及び１４３７４ｂｐフラグメントが得られるはずである。それに続いて、ポリへドリンプロモーターはｐＶＤ１６５＋ｄｅｌｔａＩＥ１  ＣＡＰ中のＲｅｐ発現カセットの前にクローン化された。これに、プライマーＳａｍＩ−ｐＰｏｌｈ  Ｆｗ：５’−ｔｃｔｃｃｃｇｇｇａｇａｔｃａｔｇｇａｇａｔａａｔｔａａａａｔｇａｔａａｃ−３’（配列番号１６）とＳｐｅＩ−ｐＰｏｌｈ  ＲＶ：５’−ｇｔｔａｃｔａｇｔｇａｇｃｔｃｇｔｃｇａｃ−３’（配列番号１７）を使用して、ＰＣＲをｐＶＤ８８に実施した。これにより１９８ｂｐのＰＣＲ産物が作製され、ｐＣＲＩＩ−平滑末端−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化された。ＳｐｅＩ＊ＳｍａＩでの消化後、１８８ｂｐフラグメントがゲルから単離され、精製され、ＳｐｅＩとＳｍａＩを使用して切り開かれたｐＶＤ１６５＋ｄｅｌｔａＩＥ１＿Ｃａｐベクターにライゲートされた。最後に、これにより、ｐＶＤ１６５＋ｄｅｌｔａＩＥ１  ＣＡＰ構築物が得られた。
【０１０５】
１．１．１．８  ｐ１０−Ｃａｐ−ｐＰｏｌｈ−Ｒｅｐ構築物の構築
ｐ１０＿Ｃａｐ＋ｐＰｏｌｈ＿Ｒｅｐ構築物は、ｄｅｌｔａ−ＩＥ１−Ｃａｐ−ｐＰｏｌｈ−Ｒｅｐ構築物に類似しているが、Ｃａｐ発現カセットの前でｄｅｌｔａ−ＩＥ１プロモーターの代わりにｐ１０プロモーターを含み、図９に示されるとおりに構築された。プライマーＢｓｔＺ１７Ｉ−ｐ１０  Ｆｗ：５’−ａｇｔａｔａｃｇｇａｃｃｔｔｔａａｔｔｃａａｃ−３’（配列番号１８）とＡｆｌＩＩ−ｐ１０  Ｒｖ：５’−ｃｇａｃｔｔａａｇａｇｃｇｇｇｃｃｇｃｔｔｔｃｇａａｔｃ−３’（配列番号１９）を使用して、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＤｕａｌにＰＣＲを実施し、１７１ｂｐの産物が得られ、ｐＣＲＩＩ−平滑末端−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化された。ＢｓｔＺ１７Ｉ＊ＡｆｌＩＩでの消化後、１６０ｂｐフラグメントがゲルから単離され、精製され、ＢｓｔＺ１７ＩとＡｆｌＩＩを使用して切り開かれたｄｅｌｔａ−ＩＥ１−Ｃａｐ−ｐＰｏｌｈ−Ｒｅｐ構築物にライゲートされた。
【０１０６】
１．１．１．９  ｐＶＤ１９４（Ｒｅｐ７８／ＣＴＧ（ｄｅｌｔａ  ＡＴＧ））の構築
配列番号３１に提示される配列に従って必要な遺伝子を合成することにより、ＣＴＧ開始コドンを有しどんな内部ＡＴＧ部位もないｒｅｐプラスミドが先ず構築された。次に、ｒｅｐ遺伝子は、制限酵素ＲｓｒＩＩとＸｂａＩを使用して、プラスミドｐＶＤ８８から削除された。次に、合成された遺伝子は、制限部位ＲｓｒＩＩとＸｂａＩを使用してプラスミドｐＶＤ８８にライゲートされてｐＶＤ１９５が得られた。次に、ｐＶＤ１９５はＢｇｌＩＩで消化され、９２９７ｂｐと２２３１ｂｐフラグメントが得られた。次に、５’オーバーハングはＫｌｅｎｏｗで充填され、その後、ＳｅｘＡＩで消化された。これにより、９２９７ｂｐ、１３７２及び８５９ｂｐフラグメントが得られる。次に、８５９ｂｐフラグメントが単離された。必要なベクターはｐＶＤ１６５をＳｐｅＩで消化することにより作製され、１４５０１ｂｐ直鎖フラグメントが得られた。５’オーバーハングはＫｌｅｎｏｗで充填され、その後、ＳｅｘＡＩで消化されて、１３６００ｂｐと９０１ｂｐフラグメントが得られた。１３６００ｂｐフラグメントは単離された。次に、８５９ｂｐ  ＢｇｌＩＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）＊ＳｅｘＡＩフラグメントはｐＶＤ１６５（ＳｐｅＩ（ｋｌｅｎｏｗ）＊ＳｅｘＡＩ）にライゲートされ、ｐＶＤ１９４を得た（図１０参照）。ＳｅｘＡＩ＊ＸｍａＩを使用した制限消化により、１３４３５ｂｐと１０２９ｂｐのフラグメントが得られるはずである。
【０１０７】
１．１．１．１０  ｐＶＤ８４の構築
バキュロウイルス発現ベクターｐＦＢＡＡＶ１ＶＰｍ１１（Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒ．１３：１９３５−１９４３）の開始点をＡＣＧからＧＴＧに変換するために、以下のプライマーを使用してＰＣＲが実施された。
順方向プライマー配列は、ＢａｍＨＩ部位（ＡＭＴプライマー番号１６９；配列番号２９）を含有する。
５’−ＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＡＡＧＧＴＧＧＣＴＧＣＣＧＡＣＧＧ−３’
逆方向プライマー配列は、ＳｔｕＩ部位（ＡＭＴプライマー番号１５８；配列番号３０）を含有する。
５’−ＧＴＣＧＴＡＧＧＣＣＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣ−３’
【表１】
2011512156.tif 000002
【０１０８】
プライマー番号１６９及び番号１５８を使用したＰＣＲが実施され、ＰＣＲ産物（２５０ｂｐ）はＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ロット番号１１８７９３７２）を使用して精製され、制限酵素ＢａｍＨＩとＳｔｕＩで切断された。バキュロウイルス発現ベクターもＢａｍＨＩとＳｔｕＩで消化された。ＳＡＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ロット番号１７５０１５０４）でのベクターの脱リン酸化に続いて、挿入断片（ＧＴＧ開始点を有するＣａｐ）もベクターもゲル上で精製された。ベクターと挿入断片のライゲーション後、化学的に形質転換受容性のあるＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号１２４１７５３）に形質転換され、アンピシリン含有ＬＢプレート上に画線された。ｐＶＤ６３（Ｃａｐ／ＧＴＧ開始点）のＤＮＡは精製され、ＢａｓｅＣｌｅａｒ及び制限による配列解析を使用して同一性を調べられた。
【０１０９】
バキュロウイルス発現ベクターｐＰＳＣ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中にＧＴＧ開始点を有するＣａｐ遺伝子をクローン化するために、前記ベクターはＳｍａＩとＡｖｒＩＩでｐＶＤ６３から切断され、ＥｃｏＲＶとＸｂａＩで切り開かれた脱リン酸化発現ベクターにライゲートされた。それに続いて、ライゲーション混合物は、化学的に形質転換受容性のあるＤＨ１０β細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号１２６８５２７）に形質転換され、ＬＢアンピシリンプレートに画線された。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、ロット番号１２１８０２１８）を使用したミニプレップＤＮＡ単離後、１つのミニプレップ（クローン番号１３）がＳｐｈＩでの制限解析により選択された。これを使用して、クローンＤＮＡ（ｐＶＤ８４）はＳＮＡＰミディプレップキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、溶液ロット番号１２５６９２１及びカラムロット番号１２５９３６７）を使用して精製された。ｐＶＤ８４の同一性は、ＢａｓｅＣｌｅａｒにより及びＢａｍＨＩとＳｐｈＩでの制限解析により実施される開始コドン周辺の配列解析により検証された（配列番号２８）。
【０１１０】
１．１．１．１１  組換えバキュロウイルス作製
組換えＢａｃ．ＶＤ１１８（新）、Ｂａｃ．ＶＤ１１８（新）＋ＨＲ１、Ｂａｃ．ＶＤ１６５、Ｂａｃ．ＶＤ１６５＋ＨＲ１、Ｂａｃ．ＶＤ１６５＋４ｘＥｃＲＥ  ＣＡＰ、Ｂａｃ．ＶＤ１６５＋４＊ＥｃＲＥ  Ｒｅｐ７８、Ｂａｃ．ＶＤ１９０及びＢａｃ．ＶＤ１９４（ｐ０）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＵＳＡ）を使用して作製された。組換えバキュロウイルスは、ｍｌあたり２×１０６  ＳＦ＋細胞に（１：１００）で希釈することにより増幅された。感染３日後、細胞は遠心沈殿され、ウイルスを含有する上清が回収された。次継代の増幅は同一方法で実施された。
【０１１１】
１．１．２  ｒＡＡＶ産生
ｒＡＡＶバッチはＵｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００２（上記参照）に従って産生されたが、例外として、３つではなく２つの組換えバキュロウイルスが使用された。１つのバキュロウイルスは、ＣＭＶプロモーターの制御下の発現構築物を有しており、ＡＡＶ  ＩＴＲが隣接している。もう１つのバキュロウイルスは、１つはＡＡＶ複製遺伝子用で１つはＡＡＶカプシド用の２つの発現カセットを有しているＲｅｐ−Ｃａｐバキュロウイルスである。誘導性プロモーターの制御下にある複製又はカプシド遺伝子の発現は、培養培地に０．００１〜１ｕＭポナステロンＡを添加することにより調節された。異なったｒＡＡＶ１産生実験は、ＣＭＶプロモーター制御下のＬＰＬ導入遺伝子を含有するバキュロウイルスストックＢａｃ．ＶＤ４３  ｐ５及びＲｅｐ／Ｃａｐバキュロウイルスの異なる継代（ｐ３、ｐ４又はｐ５）を使用して実施された。各実験では、標準ｒＡＡＶ１産生（Ｂａｃ．ＶＤ８８：Ｂａｃ．ＶＤ８４：Ｂａｃ．ＶＤ４３を比５：１：１で）を対照として取り上げた。
【０１１２】
１．１．３  充填／全ＡＡＶ粒子決定
充填対全カプシドの比を決定するために、ゲノムコピー（ｇｃ）の量を、全ＡＡＶ粒子の量で割る。ｇｃ／ｍｌの量は、Ｑ−ＰＣＲアッセイにより測定され、全ＡＡＶ粒子の量はＰｒｏｇｅｎの酵素免疫アッセイ（下を参照）を使用して決定された。Ｑ−ＰＣＲ反応は、以下のプライマーセットのうちの１つを使用して、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、番号４３０９１５５）を、製造元の使用説明書に従って使用した（２５μｌ全容積、ＰＣＲプログラム：１０分９５℃、１５秒９５℃及び１分６０℃を４０サイクル）。
ｐｒ５９  ＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡ  ＣＭＶ  配列番号２６
ｐｒ６０  ＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡ  ＣＭＶ  配列番号２７
比は、５：１：１容積比のＢａｃ．Ｒｅｐ、Ｂａｃ．Ｃａｐ及びＢａｃ．ＩＴＲを使用して、標準産生条件下で得られた比と比較される。
【０１１３】
１．１．４  ウェスタンブロット解析
ｒＡＡＶ作製３日後、細胞は、０．１Ｖ  １０×ＴＲＩＳ溶解緩衝液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＴＲＩＳ、０．０１Ｍ  ＭｇＣｌ、１％  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、ｐＨ８．５、フィルター滅菌）を添加することにより溶解され、氷上で３０分間インキュベートされた。遊離のＤＮＡ及びＲＮＡは、ベンゾナーゼを使用した３７℃、１５分間のインキュベーションにより分解された。細胞溶解物は遠心分離された（１９００×ｇ、１５分間、４℃）。ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液（４ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を上清液試料に添加し、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１２０Ｖ）上に負荷した。タンパク質は３０分間、１０Ｖ（Ｓｅｍｉｄｒｙ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）上にブロットした。膜をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ−ＰＢＳブロッキング緩衝液（ＰＩＥＲＣＥ）でブロックし、それに続くマウス抗Ｒｅｐ（３０３．９、Ｐｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；希釈率１：５０）及びウサギ抗マウス−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ、希釈率１：５００）を使用したインキュベーションにより、ウェスタン免疫化学反応を実施した。Ｒｅｐタンパク質は、ルミライトとウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ）を使用した化学発光染色により視覚化した。
【０１１４】
１．１．５  全ｒＡＡＶ１粒子ＥＬＩＳＡ
それぞれの産生において作製されたｒＡＡＶ１粒子（ｔｐ）の総量は、ＡＡＶ１  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡキット（Ｐｒｏｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定され、製造業者が供給するプロトコルに従って実施されたが、例外として、すべての試料及び対照は粗溶解物バルク（ＣＬＢ）中で事前希釈された。手短に言えば、ＣＬＢは、１０×溶解緩衝液を添加し、２８℃で１時間のインキュベーションにより３日後にｅｘｐｒｅｓｓＳＦ＋細胞を収穫することにより作製された。３７℃で１時間、ベンゾナーゼで処置した後、溶解物は１９００ｇで遠心分離され、上清は４℃で保存された。各産生の粗溶解物中の全ｒＡＡＶ１粒子を決定するために、試料はＣＬＢで５０倍に事前希釈され、これを開始希釈液とする。その後、２５０、１２５０及び６２５０倍の追加の希釈液はＣＬＢで作製された。標準系統もＣＬＢで希釈された。Ｂａｃ．ＶＤ１９０を使用した産生由来の試料は、カプシドタンパク質の発現レベルが低いために、５０及び１００倍希釈のみであった。
【０１１５】
１．１．６  ＨＰＬＣを使用した全粒子解析
未知のＡＡＶ−１ストックがＨＰＬＣ系に注入され、クロマトグラムでピークを得た。このピークはＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアにより積分することができ、注入された全粒子の量を表す。濃縮されたＡＡＶ−１ストックは、電子顕微鏡によりミリリットルあたりの全粒子の量について滴定され、方法に設定された。この標準をキャリブレーターとして使用して、未知物質の全粒子の量を計測することができる。さらに、特定量のゲノムコピー（ほぼ全粒子の量を表す）を標準範囲内で注入すると、充填粒子と空粒子の比を見積もることができる。
【０１１６】
１．２  結果
充填対空ＡＡＶ粒子比は、特に高Ｒｅｐタンパク質発現及び中程度Ｃａｐタンパク質発現の２つのバキュロウイルス系の使用を改良する
ｐＶＤ１６５、ｐＶＤ１９０及びｐＶＤ１９４の３種の構築物が詳細に調査された。
【０１１７】
Ｂａｃ．ＶＤ１６５を使用して作製されたｒＡＡＶ１粒子の全／充填比を決定するために、粗溶解物中の全粒子濃度が２つの独立した実験で決定された。これらのＥＬＩＳＡの結果及び対応する全／充填比は表１に示されている。
表１：バキュロウイルスストックＢａｃ．ＶＤ１６５を使用して作製されたｒＡＡＶ１の全／充填比
全粒子濃度は、全ＡＡＶ１粒子ＥＬＩＳＡを使用して決定された。充填粒子濃度は、Ｑ−ＰＣＲにより決定された。全／充填比は、同一実験で作製された対照とのみ比較することができる。
【表２】
2011512156.tif 000003
【０１１８】
１：１産生の全／充填比は、両方の実験で、対照と比べると１．６倍改良されている。５：１産生では、全／充填比は、対照と比べると２．１倍及び１．４倍改良されている。結論として、Ｂａｃ．ＶＤ１６５を使用して作製されたｒＡＡＶ１粒子では、全／充填比は改良される。
【０１１９】
Ｂａｃ．ＶＤ１９０では、Ｃａｐ発現カセットは、弱ΔＩＥ１プロモーターの制御下にある。これにより、他のＲｅｐ／Ｃａｐバキュロウイルスを使用して実施した産生又は対照状況におけるよりもカプシド発現が低くなる可能性がある。なぜならば、これらの条件ではすべて、Ｃａｐ発現は強力なポリヘドリンプロモーターに誘導されるからである。Ｂａｃ．ＶＤ１９０を使用して実施された２つの異なる実験からこの仮説を検証するために、全粒子濃度が決定された。結果は表２に示されている。
表２：バキュロウイルスストックＢａｃ．ＶＤ１９０を使用して作製されるｒＡＡＶ１の全／充填粒子比
全粒子濃度は、全ＡＡＶ１粒子ＥＬＩＳＡを使用して決定された。充填粒子濃度は、Ｑ−ＰＣＲにより決定された。全／充填比は、同一実験で作製された対照とのみ比較することができる。
【表３】
2011512156.tif 000004
【０１２０】
産生番号１の結果（表２）から、１：１及び５：１産生により得られる全／充填比は、それぞれ対照と比べて１１４倍及び８倍改良されていた。産生番号２では、全／充填比は、１：１又は５：１産生に対して１．４倍低い又は１．４倍高い。結論として、全／充填比は、Ｂａｃ．ＶＤ１９０を使用して作製されたｒＡＡＶ１粒子でも改良されているように思われる（Ｂａｃ．ＶＤ１６５で観察されたのと同じ）。
【０１２１】
Ｂａｃ．ＶＤ１９４では、Ｒｅｐ及びＣａｐ発現を決定するために、ウェスタンブロット解析が実施された。したがって、細胞が２つの異なるバキュロウイルス比（すなわち、１：１及び９：１、３成分対照で５：１：１）で感染された３日後、細胞溶解物は回収され、ウェスタンブロット解析にかけられた。図１１Ａに示されるように、Ｃａｐ発現は、１：１バキュロウイルス比での産生では低いが、９：１比の産生では３成分対照に匹敵する。しかし、１：１及び９：１比産生では、Ｒｅｐ発現は３成分対照と比べて劇的に減少している。しかし、図１１Ｂでは、ウイルスの産生はＢａｃ．ＶＤ１９４を使用した産生での方が大きかったことが示されている。産生は大きいが、Ｃａｐ発現は低いという事実は、より都合のよい全対充填比を示している。さらに、結論としては、等モル量のＲｅｐとＣａｐを使用した、特に高Ｒｅｐと中程度のＣａｐ発現を使用した２成分系により、より低い全対充填比（すなわち、充填した粒子のより大きな割合）が得られる。
【０１２２】
（例２）
材料と方法
３つの振盪フラスコ（すべて感染に先立って２８℃で培養される）は、接種材料ｐ５；４ｍＬ  Ｂａｃ．ＶＤ４３、４ｍＬ  Ｂａｃ．ＶＤ８４及び２０ｍＬ  Ｂａｃ．ＶＤ８８を接種された。振盪機は、３つの異なる温度（２６、２８及び３０℃）で７２時間ウイルス産生中、インキュベートされた。
【０１２３】
すべての振盪フラスコの溶解処理が、０．９％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して１振盪インキュベーター内で実施された。溶解緩衝液添加後、振盪機は、設定値２８℃で３０分間インキュベートされ、ベンゾナーゼが添加され（４００ｍＬあたり１６μＬ）、振盪機は設定値３７℃で１時間インキュベートされた。ベンゾナーゼ処理後、振盪フラスコはすべてウイルス排除のために２９℃で一晩置かれ、続いて最大３日間４℃で保存された。
【０１２４】
それぞれの振盪インキュベーターから、２００ｍｌの粗溶解バルクが、１ｍＬ／分の流速を使用して、１ｍＬアフィニティーカラム上で処理された。洗浄後、産物は、ＰＢＳ、ｐＨ３．５を使用して溶出された。
【０１２５】
結果
温度研究のために使用された振盪フラスコのインプロセスの細胞計数は、表１に示されている。温度の増加は、回収時の全細胞濃度と生存率の減少と相関する。２８℃で得られた生存率は、Ｗａｖｅバイオリアクターシステムを使用して得られた結果に匹敵した。
【表４】
2011512156.tif 000005
振盪フラスコの粗溶解バルクと溶出物の試験結果は表２に示されている。
【表５】
2011512156.tif 000006
【０１２６】
考察と結論
ＳＦ＋細胞におけるｒＡＡＶ産生中温度を上げると、産生されるｒＡＡＶ粒子の全量をわずかに増加するが、産生される充填粒子の量の方をより増加させ、全対充填比は減少する。
【図１】
2011512156.tif 000007
【図２】
2011512156.tif 000008
【図３】
2011512156.tif 000009
【図４】
2011512156.tif 000010
【図５】
2011512156.tif 000011
【図６】
2011512156.tif 000012
【図７】
2011512156.tif 000013
【図８】
2011512156.tif 000014
【図９】
2011512156.tif 000015
【図１０】
2011512156.tif 000016
【図１１Ａ】
2011512156.tif 000017
【図１１Ｂ】
2011512156.tif 000018
【配列表】
2011512156000001.app
【国際調査報告】
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2011512156.tif 000020
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