(57)【要約】本発明は、全身性紅斑性狼瘡および薬物誘発性全身性紅斑性狼瘡の診断および処置のための方法に関する。より具体的には、本明細書では、全身性紅斑性狼瘡および薬物誘発性全身性紅斑性狼瘡などの自己免疫障害の診断および処置の方法においてリソソームホスホリパーゼＡ２を用いる方法を述べる。本発明では、例えば、個体における可染体マクロファージの蓄積を減少させる方法であって、可染体マクロファージの蓄積を有する細胞を、可染体マクロファージの蓄積を減少させる量および時間で、ＬＰＬＡ２酵素活性を有する作用物質と接触させるステップを含む方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内可染体マクロファージの蓄積を減少させる方法であって、可染体マクロファージの蓄積を有する細胞を、可染体マクロファージの蓄積を減少させるのに有効な量のリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）酵素活性を有する作用物質と接触させるステップを含む方法。
【請求項２】
前記ＬＰＬＡ２酵素活性を有する作用物質が、配列番号１〜２８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記作用物質が哺乳類ＬＰＬＡ２酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記作用物質がヒトＬＰＬＡ２酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記作用物質が１つまたは複数のマンノース残基を含むＬＰＬＡ２酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒトＬＰＬＡ２酵素が、配列番号１に示されているアミノ酸配列、またはその断片、ＬＰＬＡ２酵素活性を有する配列番号１の誘導体もしくは変異体を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒトＬＰＬＡ２酵素が、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００（Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ）に対応する触媒部位を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒトＬＰＬＡ２酵素が、配列番号１の６５位におけるＣｙｓとＣｙｓ８９の間のシステイン結合に対応するシステイン結合をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒトＬＰＬＡ２酵素が、長さが少なくとも７５残基であり、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００を含む配列番号１の断片のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類ＬＰＬＡ２酵素が、配列番号１〜２８８ならびに配列番号１〜２８８の断片、誘導体および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＬＰＬＡ２酵素が触媒コンセンサス配列−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
可染体マクロファージの細胞内蓄積によって特徴付けられる障害を有すると診断された患者を処置する方法であって、該患者にＬＰＬＡ２酵素活性を有する有効量の作用物質を投与することを含む方法。
【請求項１３】
前記障害が全身性紅斑性狼瘡である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記障害が薬物誘発性狼瘡である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＬＰＬＡ２酵素活性を有する作用物質が、配列番号１〜２８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記作用物質が哺乳類ＬＰＬＡ２酵素である、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記作用物質がヒトＬＰＬＡ２酵素である、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記作用物質が１つまたは複数のマンノース残基を含むＬＰＬＡ２酵素である、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒトＬＰＬＡ２酵素が、配列番号１に示されているアミノ酸配列、またはその断片、ＬＰＬＡ２酵素活性を有する配列番号１の誘導体もしくは変異体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒトＬＰＬＡ２酵素が、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００（Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ）に対応する触媒部位を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒトＬＰＬＡ２酵素が、配列番号１の６５位におけるＣｙｓとＣｙｓ８９の間のシステイン結合に対応するシステイン結合をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒトＬＰＬＡ２酵素が、長さが少なくとも７５残基であり、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００を含む配列番号１の断片のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳類ＬＰＬＡ２酵素が、配列番号１〜２８８ならびに配列番号１〜２８８の断片、誘導体および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＬＰＬＡ２酵素が触媒コンセンサス配列−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
可染体マクロファージの細胞内レベルを低下させる治療薬候補をスクリーニングする方法であって、該方法は、試験化合物の存在下および非存在下での狼瘡マウスモデルにおける細胞内可染体マクロファージの数または食作用指数を測定するステップを含み、該試験化合物の存在下での細胞内可染体マクロファージレベルが、該試験化合物の非存在下での細胞内可染体マクロファージレベルと比較して低いことにより、該試験化合物が治療薬候補として特定され、該試験化合物が配列番号１〜２８８の断片、変異体または誘導体である方法。
【請求項２６】
可染体マクロファージの細胞内レベルを低下させる治療薬候補をスクリーニングする方法であって、該方法は、試験化合物の存在下および非存在下でのＬＰＬＡ２酵素活性を測定するステップを含み、該試験化合物の存在下でのＬＰＬＡ２酵素活性のレベルが、該試験化合物の非存在下と比較して高いことにより、該試験化合物が治療薬候補として特定される方法。
【請求項２７】
個体における全身性紅斑性狼瘡を診断する方法であって、該方法は、個体からの試料におけるリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）酵素活性を決定するステップ、または個体からの試料におけるＬＰＬＡ２発現を決定するステップを含み、該個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性またはＬＰＬＡ２発現レベルが、正常個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性またはＬＰＬＡ２発現レベルと比較して低いことが、全身性紅斑性狼瘡という診断を示唆し、該正常個体が全身性紅斑性狼瘡に罹患していないことが分かっている方法。
【請求項２８】
前記個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性またはＬＰＬＡ２発現レベルが、同じ個体における以前のＬＰＬＡ２酵素活性またはＬＰＬＡ２発現レベルと比較して低いことが、全身性紅斑性狼瘡という診断を示唆する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
個体における全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を決定するための方法であって、該方法は、個体からの試料におけるリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）酵素活性を決定するステップ、または個体からの試料におけるＬＰＬＡ２発現を決定するステップを含み、該個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性またはＬＰＬＡ２発現レベルが、正常個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性またはＬＰＬＡ２発現レベルと比較して低いことが、全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を示す方法。
【請求項３０】
ＬＰＬＡ２酵素活性またはＬＰＬＡ２発現レベルが、同じ個体における以前のＬＰＬＡ２酵素活性またはＬＰＬＡ２発現レベルと比較して低いことが、全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を示す、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
全身性紅斑性狼瘡を診断するための方法であって、該方法は、個体からの試料におけるリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）自己抗体を検出するステップを含み、該個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体のレベルが、正常個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体のレベルと比較して高いことを検出することが、全身性紅斑性狼瘡という診断を示唆し、該正常個体が全身性紅斑性狼瘡に罹患していないことが分かっている方法。
【請求項３２】
個体からの試料におけるＬＰＬＡ２自己抗体のレベルが、同じ個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体の以前のレベルと比較して高いことを検出することが、全身性紅斑性狼瘡という診断を示唆する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
個体における全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を決定するための方法であって、該方法は、個体からの試料におけるリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）自己抗体を検出するステップを含み、該個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体のレベルが、正常個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体のレベルと比較して高いことを検出することが、全身性紅斑性狼瘡感受性を示唆し、該正常個体が全身性紅斑性狼瘡に罹患していないことが分かっている方法。
【請求項３４】
個体からの試料におけるＬＰＬＡ２自己抗体のレベルが、同じ個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体の以前のレベルと比較して高いことを検出することが、全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を示唆する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
個体における全身性紅斑性狼瘡の進行を決定するための方法であって、該方法は、経時的に採取した該個体からの試料におけるリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）酵素活性を決定するステップを含み、該個体における経時的に採取した該試料におけるＬＰＬＡ２酵素活性の低下が全身性紅斑性狼瘡の進行を示唆する方法。
【請求項３６】
個体における全身性紅斑性狼瘡の進行を決定するための方法であって、該方法は、経時的に採取した該個体からの試料におけるリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）自己抗体を検出するステップを含み、該個体における経時的に採取した該試料におけるＬＰＬＡ２自己抗体の増加が全身性紅斑性狼瘡の進行を示唆する方法。
【請求項３７】
ＬＰＬＡ２の発現または活性を減少させる多型を有する患者を処置することをさらに含む、請求項１または請求項１２に記載の方法。
【請求項３８】
前記多型が配列番号１のアミノ酸１９６〜２００に対応する位置にある、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所により付与された助成金交付番号ＲＯ１ＤＫ０５５８２３のもとでの政府の支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）およびその症状を診断する方法および処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の背景
全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）は、多臓器に罹患する自己免疫疾患である。臨床徴候は、一定しないが、皮膚、腎臓、肝臓、肺、心臓およびリンパ器官が関与することが多い。ＬＰＬＡ２ノックアウトマウス（非特許文献１）は、ＳＬＥの表現型を模写する、高度に頑健な後期発現リンパ球増殖を示す。より具体的には、このマウス表現型は、脾腫、リンパ節腫脹、肺炎、肝炎、ならびに腎不全や、免疫グロブリン、Ｃ３およびＣｌｑの沈着を伴う糸球体腎炎によって特徴付けられる。これらのマウスは、高レベルの血中免疫グロブリンならびに高力価の抗核抗体（ＡＮＡ）および抗二本鎖ＤＮＡ抗体（抗ｄｓＤＮＡ）によっても特徴付けられる。このような顕著な表現型は、ＬＰＬＡ２が狼瘡において異常に制御される免疫学的過程を媒介するのかという疑問を提起するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈｉｒａｏｋａら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２６巻、６１３９〜６１４８頁、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、当技術分野では、ＳＬＥの原因に関するさらなる理解と、そのような自己免疫障害に対する新たな治療的介入の特定が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
リソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）は、リパーゼおよびトランスアシラーゼの活性、リソソーム局在化ならびに酸性至適ｐＨを含めたいくつかの独特な特徴を有する。これらの特徴に基づいて、二重条件付き遺伝子ターゲティング（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を用いて、ＬＰＬＡ２の機能を解明した。ＬＰＬＡ２活性に必須のリパーゼモチーフをコードするＬＰＬＡ２遺伝子のエキソン５の全身欠失によって、ＬＰＬＡ２欠損マウスを作製した。ＬＰＬＡ２欠損マウスは、後期発現リンパ球増殖表現型、リンパ組織の拡大、腎不全および糸球体腎炎、高い血中免疫グロブリンレベル、陽性の抗核抗体（ＡＮＡ）および抗二本鎖ＤＮＡ抗体、ならびにマクロファージにおける消化されないアポトーシス小体または可染体の蓄積を含む、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）の特徴を示した。
【０００７】
本発明は、驚くべきことに、ＬＰＬＡ２がＳＬＥにおいて異常に制御される免疫学的過程を媒介することを実証している。したがって、本発明は、活動性ＳＬＥのマーカーとしてのＬＰＬＡ２酵素活性の喪失の役割を実証している。本明細書で述べる研究は、ＬＰＬＡ２のレベルの低下が、ＳＬＥの症状を同定し、処置するための診断および治療標的として使用できることを実証している。
【０００８】
本明細書では、「ＬＰＬＡ２」は、由来する種に関係なく、ＸＶ群ホスホリパーゼＡ２とも呼ばれている全長リソソームホスホリパーゼＡ２酵素、ならびにその断片、誘導体および酵素活性を有する変異体を意味する。「変異体」という用語は、アミノ酸の付加、欠失または置換を指す。「誘導体」という用語は、アミノ酸の化学修飾もしくは修飾アミノ酸の組込み、親水性ポリマーとのコンジュゲーション、または他の化学部分とのコンジュゲーションなど、ＬＰＬＡ２の付加的な化学修飾を包含する。
【０００９】
「ＬＰＬＡ２酵素活性」は、細胞外リン脂質を分解して、遊離脂肪酸ならびにリゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）およびリゾホスファチジルエタノールアミンを生成するＬＰＬＡ２の能力を指す。
【００１０】
「ＬＰＬＡ２触媒コンセンサス配列」は、配列番号１の１９６〜２００位におけるアミノ酸−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−を指す。
【００１１】
「ＬＰＬＡ２自己抗体」は、個体の自己のＬＰＬＡ２タンパク質に対して免疫特異的である個体により産生される抗体を指す。
【００１２】
「可染体マクロファージ」は、脾細胞がアポトーシス細胞を除去できないことに起因する肥大化したマクロファージを指す。
【００１３】
本明細書では、「ＳＬＥ」は、全身性紅斑性狼瘡または可染体マクロファージの蓄積の症状を示す他のあらゆる自己免疫疾患を含む。「薬物誘発性狼瘡」は、特定の薬物による長期治療による可染体マクロファージの蓄積などの狼瘡の症状の発現を指す。
【００１４】
本発明は、個体における可染体マクロファージの蓄積を減少させる方法であって、可染体マクロファージの蓄積を有する細胞を、可染体マクロファージの蓄積を減少させる量および時間で、ＬＰＬＡ２酵素活性を有する作用物質（ａｇｅｎｔ）と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００１５】
一態様では、ＬＰＬＡ２活性を有する作用物質は、配列番号１〜２８８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００１６】
他の態様では、該作用物質は、哺乳類ＬＰＬＡ２酵素である。一実施形態では、該作用物質は、配列番号１〜２８８から選択されるアミノ酸配列を有する哺乳類ＬＰＬＡ２酵素またはその酵素活性を有する断片、誘導体もしくは変異体である。
【００１７】
さらに他の態様では、該作用物質は、ヒトＬＰＬＡ２酵素である。一実施形態では、該作用物質は、配列番号１におけるアミノ酸配列を有するヒトＬＰＬＡ２酵素またはその酵素活性を有する断片、誘導体もしくは変異体である。
【００１８】
一実施形態では、該作用物質は、１つもしくは複数のマンノース残基または１つもしくは複数のマンノース−６−リン酸残基を含むＬＰＬＡ２酵素である。
【００１９】
他の実施形態では、該作用物質は、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００（−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−）に対応する触媒部位を含むヒトＬＰＬＡ２酵素またはその変異体もしくは誘導体である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ヒトＬＰＬＡ２酵素、その変異体または誘導体は、配列番号１の６５位におけるＣｙｓとＣｙｓ８９の間のシステイン結合に対応するシステイン結合をさらに含む。
【００２１】
一態様では、該作用物質は、長さが少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００または２２５残基であり、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００（−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−）に対応する触媒部位を含む配列番号１の断片のアミノ酸配列との少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＬＰＬＡ２酵素またはその変異体もしくは誘導体である。
【００２２】
他の態様では、該作用物質は、触媒コンセンサス配列−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−を含むＬＰＬＡ２酵素である。さらに他の態様では、該作用物質は、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００（−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−）に対応する触媒コンセンサス配列を含むＬＰＬＡ２酵素である。関連する態様では、ＬＰＬＡ２酵素は、配列番号１の６５位におけるＣｙｓとＣｙｓ８９の間のシステイン結合に対応するシステイン結合を含む。
【００２３】
本発明は、個体における異常なＬＰＬＡ２活性に伴う状態を処置するための方法であって、前記個体に該状態を軽減するのに有効な量でＬＰＬＡ２酵素活性を有する作用物質を投与するステップを含む方法をさらに提供する。
【００２４】
一態様では、本発明は、可染体マクロファージの細胞内蓄積によって特徴付けられる障害を有すると診断された患者を処置するための方法であって、該患者に有効な量のＬＰＬＡ２酵素活性を有する作用物質を投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
他の態様では、該状態は、異常なＬＰＬＡ２酵素活性である。他の態様では、該状態は、異常なＬＰＬＡ２  ｍＲＮＡ転写である。さらに他の態様では、該状態は、可染体マクロファージの蓄積である。さらに他の態様では、該状態は、ＳＬＥまたは全身性紅斑性狼瘡である。他の態様では、該状態は、薬物誘発性狼瘡である。
【００２６】
一実施形態では、該個体は、ＬＰＬＡ２の発現または活性を低下させる、配列番号１に対応するＬＰＬＡ２遺伝子における多型を有する。ヒトＬＰＬＡ２酵素をコードするヒトゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２８９に示されている。該ヒトゲノムＤＮＡ配列は、１５７１５塩基である。ヒトｍＲＮＡ配列は、ヌクレオチド１．．２１０、３９４７．．４１０３、９５７６．．９６９４、９９３９．．１００３７、１０４２３．．１０６４７および１３８０３．．１５７１５に対応すると予測される。コーディング領域は、ヌクレオチド８４．．２１０、３９４７．．４１０３、９５７６．．９６９４、９９３９．．１００３７、１０４２３．．１０６４７および１３８０３．．１４３１４に対応すると予測される。ヒトＬＰＬＡ２酵素をコードするヒトｃＤＮＡ配列は、配列番号２９０に示されている。いくつかの実施形態では、該個体は、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００に対応する触媒部位をコードする遺伝子の位置における多型を有する。さらに他の実施形態では、該個体は、ＬＰＬＡ２酵素の切断または陽イオン性アミノ酸の損失をもたらす多型を有する。さらに他の実施形態では、該個体は、ＬＰＬＡ２酵素発現の喪失をもたらすＬＰＬＡ２遺伝子に関連する調節制御領域における多型を有する。
【００２７】
さらなる態様では、ＬＰＬＡ２活性を有する作用物質は、配列番号１〜２８８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００２８】
他の態様では、該作用物質は、哺乳類ＬＰＬＡ２酵素である。一実施形態では、該作用物質は、配列番号１〜２８８から選択されるアミノ酸配列を有する哺乳類ＬＰＬＡ２酵素またはその酵素活性を有する断片、誘導体もしくは変異体である。
【００２９】
さらに他の態様では、該作用物質は、ヒトＬＰＬＡ２酵素である。一実施形態では、該作用物質は、配列番号１におけるアミノ酸配列を有するヒトＬＰＬＡ２酵素またはその酵素活性を有する断片、誘導体もしくは変異体である。
【００３０】
一実施形態では、該作用物質は、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００（Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ）に対応する触媒部位を含む、ヒトＬＰＬＡ２酵素、その変異体または誘導体である。他の態様では、該作用物質は、触媒コンセンサス配列−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−を含む、ＬＰＬＡ２酵素、その変異体または誘導体である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＬＰＬＡ２酵素、変異体または誘導体は、配列番号１の６５位におけるＣｙｓとＣｙｓ８９の間のシステイン結合に対応するシステイン結合をさらに含む。
【００３２】
一態様では、該作用物質は、長さが少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００または２２５残基であり、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００（−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−）に対応する触媒部位を含む配列番号１の断片のアミノ酸配列との少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のまたはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＬＰＬＡ２酵素、その変異体または誘導体である。関連する態様では、ＬＰＬＡ２酵素は、配列番号１の６５位におけるＣｙｓとＣｙｓ８９の間のシステイン結合に対応するシステイン結合をさらに含む。
【００３３】
一実施形態では、該個体は、ＬＰＬＡ２の発現または活性を低下させる多型を有する。他の実施形態では、該個体は、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００に対応する位置における多型を有する。さらなる実施形態では、該個体は、ＬＰＬＡ２酵素の切断または陽イオン性アミノ酸の損失をもたらす多型を有する。さらに他の実施形態では、該個体は、ＬＰＬＡ２酵素発現の喪失をもたらすＬＰＬＡ２の調節制御領域における多型を有する。
【００３４】
さらに他の態様では、該作用物質は、１つまたは複数のマンノース残基を含むＬＰＬＡ２酵素である。
【００３５】
本発明はまた、可染体マクロファージの細胞内レベルを低下させる治療薬候補（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）をスクリーニングする方法であって、該方法は、試験化合物の存在下または非存在下でのＬＰＬＡ２欠損マウスモデルにおける細胞内可染体マクロファージのレベルを測定するステップを含み、試験化合物の存在下での細胞内可染体マクロファージのレベルが、試験化合物の非存在下での細胞内可染体マクロファージのレベルと比較して低いことにより、試験化合物が治療薬候補として特定される方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、個体におけるＳＬＥを診断する方法であって、該方法は、個体からの試料におけるＬＰＬＡ２酵素活性を決定するステップを含み、該個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性が、正常個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性と比較して低いことが、ＳＬＥを示唆し、前記正常個体がＳＬＥに罹患していないことが分かっている方法を提供する。ここで全体を通して、「正常個体」は、特定の疾患に罹患していていないことが分かっている個体を意味する。
【００３７】
本発明はさらに、個体におけるＳＬＥを診断する方法であって、該方法は、個体からの試料におけるＬＰＬＡ２自己抗体を検出するステップを含み、該個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体が、正常個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体の検出と比較して高いことを検出することがＳＬＥを示唆し、前記正常個体がＳＬＥに罹患していないことが分かっている方法を提供する。
【００３８】
本発明は、個体におけるＳＬＥを診断する方法であって、該方法は、個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性を検出するステップを含み、個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性が、同じ個体における以前のＬＰＬＡ２酵素活性と比較して低いことがＳＬＥを示唆する方法を提供する。
【００３９】
本発明はまた、個体におけるＳＬＥを診断する方法であって、該方法は、個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体を検出するステップを含み、個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体が、同じ個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体の以前の検出と比較して高いことを検出することがＳＬＥを示唆する方法を提供する。
【００４０】
本発明は、個体におけるＳＬＥに対する感受性を決定するための方法であって、該方法は、個体からの試料におけるＬＰＬＡ２酵素活性を決定するステップを含み、個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性が、正常個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性と比較して低いことが、ＳＬＥに対する感受性を示す方法を提供する。
【００４１】
本発明はさらに、個体におけるＳＬＥに対する感受性を決定するための方法であって、該方法は、個体からの試料におけるＬＰＬＡ２自己抗体を検出するステップを含み、該個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体が、正常個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体の検出と比較して高いことを検出することが、ＳＬＥに対する感受性を示す方法を提供する。
【００４２】
本発明はまた、個体におけるＳＬＥに対する感受性を決定するための方法であって、該方法は、個体からの試料におけるＬＰＬＡ２酵素活性を検出するステップを含み、個体における低いＬＰＬＡ２酵素活性が、同じ個体における以前のＬＰＬＡ２酵素活性と比較して低いことが、ＳＬＥに対する感受性を示唆する方法を提供する。
【００４３】
本発明はさらに、個体におけるＳＬＥに対する感受性を決定するための方法であって、該方法は、個体からの試料におけるＬＰＬＡ２自己抗体を検出するステップを含み、個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体が、同じ個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体の以前の検出と比較して低いことを検出することが、ＳＬＥに対する感受性を示唆する方法を提供する。
【００４４】
本発明によって、個体におけるＳＬＥの進行を決定するための方法であって、該方法は、経時的に採取した個体からの試料におけるＬＰＬＡ２酵素活性を決定するステップを含み、個体における経時的に採取した試料におけるＬＰＬＡ２酵素活性の低下がＳＬＥの進行を示唆する方法も提供される。
【００４５】
本発明はまた、個体におけるＳＬＥの進行を決定するための方法であって、該方法は、経時的に採取した個体からの試料におけるＬＰＬＡ２自己抗体を検出するステップを含み、個体における経時的に採取した試料におけるＬＰＬＡ２自己抗体の増加がＳＬＥの進行を示唆する方法を提供する。
【００４６】
本発明の方法の様々な実施形態では、ＬＰＬＡ２  ｍＲＮＡレベルおよび／またはＬＰＬＡ２タンパク質レベルを用いて、試料におけるＬＰＬＡ２酵素活性を測定する。
【００４７】
該方法の様々な態様では、試料は、前記個体の体液、組織および／または器官である。
【００４８】
該方法の他の態様では、組織は、脾臓標本である。
【００４９】
該方法の他の態様では、液体は、血清または血漿である。
【００５０】
前述の概要は、本発明のすべての態様を定義するものでなく、さらなる実施形態を詳細な説明などの他の項で述べる。本文書全体は、統一された開示として関連付けられるものであり、特徴の組合せが本文書の同じ文、段落または項に一緒に見出されないとしても、本明細書で述べる特徴のすべての可能な組合せを考慮することができると理解すべきである。
【００５１】
さらに、本発明は、本明細書における特定の段落により定義される変形形態より多少なりとも範囲が狭い本発明のいずれか１つまたはすべての実施形態を含む。例えば、本発明の特定の態様を属（genus）として記載する場合、属のすべてのメンバーが個々に本発明の実施形態であり、また、属の２つ以上の組合せが本発明の実施形態であることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】リソソームホスホリパーゼＡ２の経路。セラミド（Ｎ−アセチルスフィンゴシン（ＮＡＳ））などのアクセプターの存在下では、該酵素は、ＬＣＡＴと類似したトランスアシラーゼホスホリパーゼ（ｔｒａｎｓａｃｙｌａｓｅｌｐｈｏｓｐｈｌｉｐａｓｅ）Ａ２として挙動する。水のみをアクセプターとした場合、ＬＰＬＡ２は、通常のホスホリパーゼＡ２として挙動する。
【図１Ｂ】ＬＰＬＡ２およびＬＣＡＴに認められる触媒３残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｔｒｉａｄ）およびジスルフィド結合の比較。
【図１Ｃ】ヒト、マウスおよびウシＬＰＬＡ２の推定アミノ酸配列の比較。位置１は、ヒトおよびマウスにおける予測コーディング領域の最初のアミノ酸残基を意味する。点線の囲みは、Ｎ−グリコシル化部位コンセンサスモチーフを示し、実線の囲みは、リパーゼモチーフを示す。網掛けの囲みは、触媒３残基を構成するアミノ酸Ｓｅｒ、ＡｓｐおよびＨｉｓを示す。縦線は、推定シグナルペプチド切断部位を示す。アステリスクは、これらの３つの種の間で同一のアミノ酸を表す。
【図２】２０カ月齢のＬＰＬＡ２−／−ノックアウトおよびＬＰＬＡ２＋／＋野生型マウスにおける肉眼的解剖学的変化。
【図３】２０カ月齢のＬＰＬＡ２−／−ノックアウトおよびＬＰＬＡ２＋／＋野生型マウスにおける組織学的変化。組織切片を過ヨウ素酸シッフ試薬で染色した。ピンク色に染色した細胞は、脂質を有するマクロファージを表す。
【図４Ａ】ＬＰＬＡ２−／−ノックアウトおよびＬＰＬＡ２＋／＋野生型マウスの腎臓のＩｇ重鎖およびＣｌｑの免疫蛍光染色。
【図４Ｂ】３〜４カ月齢、１２〜１４カ月齢および２４カ月齢ＬＰＬＡ２＋／＋野生型およびＬＰＬＡ２欠損マウスの抗ｄｓＤＮＡ力価。
【図４Ｃ】１２カ月齢ＬＰＬＡ２＋／＋野生型およびＬＰＬＡ２−／−ノックアウトマウスからのＨｅＬａ細胞のＡＮＡ染色。ノックアウトマウス血清を用いたアッセイで均一および斑点状核染色の両方が認められる。
【図４Ｄ】ＬＰＬＡ２−／−ノックアウトマウスからの脾臓におけるマクロファージに関連する可染体の同定。凍結切片をＴＵＮＥＬ染色（緑）によりＣＤ６８（赤）およびアポトーシス小体について染色した。
【図５】図５Ａ〜５Ｃ。組換えＬＰＬＡ２で処置したＬＰＬＡ２欠損マウスからのマクロファージの免疫蛍光染色。ＬＰＬＡ２は、欠損細胞に２時間加えた。次いで、マクロファージを固定し、抗ＬＰＬＡ２モノクローナル抗体（緑）（図５Ａ）またはリソソームマーカーＬＡＭＰ−１に対する抗体（赤）（図５Ｂ）で染色した。Ａｌｅｘ−ｆｌｏｕｒ結合二次抗体を用いて取込みおよび共局在化を評価した（図５Ｃ）。
【図６】ノックアウト（ＫＯ）ＬＰＬＡ２−／−マウス対野生型（ＷＴ）ＬＰＬＡ２＋／＋マウスにおける２４時間タンパク質排出。
【図７】図７Ａ〜７Ｈ。野生型（ＷＴ）マウス（図７Ａ〜７Ｄ）およびノックアウト（ＫＯ）マウス（図７Ｅ〜７Ｈ）からの腹膜マクロファージによるアポトーシス胸腺細胞の結合、エンドサイトーシスおよびクリアランス。エンドサイトーシスによって取り込まれた胸腺細胞の時間依存的変化を抗ＣＤ６８（赤）およびＴＵＮＥＬアッセイ（緑）により検出した。
【図８】アポトーシス小体／マクロファージの数により測定したＷＴおよびＫＯマウスからのマクロファージの食作用指数。図示した値は、時点ごとの平均値＋／−ＳＤ（ｎ＝８）を表す。＊は、ｐ＜０．０５を表す。
【図９】図９Ａ〜９Ｄ。６または８カ月齢ＷＴおよびＫＯマウスにおけるＢおよびＴ細胞増殖試験。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂ。１−Ｏ−アシルセラミドシンターゼ活性（図１０Ａ）および細胞リン脂質含量（図１０Ｂ）に対する陽イオン性両親媒性薬物ＰＤＭＰおよびアミオダロンの影響。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂ。ＬＰＬＡ２活性に対する負に荷電した脂質の影響。ジオクタノイル−ＰＣ（ＤＯＰＣ）／Ｎ−アセチルスフィンゴシン（ＮＡＳ）またはＤＯＰＣ／スルファチド／ＮＡＳからなるリポソームをＬＰＬＡ２酵素とともにインキュベートし、反応生成物である１−Ｏ−オレオイル−ＮＡＳを時間に対してプロットした（図１１Ａ）。各種モル比のスルファチドを含むＤＯＰＣ／ガラクトシルセラミド／ＮＡＳまたはＤＯＰＣ／スルファチド／ＮＡＳからなるリポソームをＬＰＬＡ２酵素とともにインキュベートし、反応生成物である１−Ｏ−オレオイル−ＮＡＳをモル比に対してプロットした。
【図１２】図１２Ａ。ＬＰＬＡ２活性に対するイオン強度の影響。１−Ｏ−オレオイル−ＮＡＳをＮａＣｌ濃度（ｍＭ）に対してプロットした。図１２Ｂ。ＬＰＬＡ２活性に対するｐＨの影響。１−Ｏ−オレオイル−ＮＡＳをｐＨに対してプロットした。図１２Ｃ。ＬＰＬＡ２活性に対する陽イオン性両親媒性薬物の影響。ＤＯＰＣスルファチドおよびＮＡＳからなるリポソームを各種濃度の陽イオン性両親媒性薬物アミオダロンとともにプレインキュベートし、次いで、ＬＰＬＡ２酵素とともにインキュベートした。１−Ｏ−オレオイル−ＮＡＳを薬物の濃度（μＭ）に対してプロットした。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃ。ＬＰＬＡ２とリポソームとの共沈降。ＤＯＰＣまたはＤＯＰＣ／スルファチドからなるリポソームを種々の量のＬＰＬＡ２とともにインキュベートし、反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した（図１３Ａ）。ＤＯＰＣ、ＤＯＰＣ／スルファチドまたはガラクトシルセラミド（ｇｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）（ＧａｌＣｅｒ）からなるリポソームをＬＰＬＡ２とともにインキュベートし、反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１３Ｂ）。ＤＯＰＣまたはＤＯＰＣ／スルファチドからなるリポソームをＬＰＬＡ２とともにＮａＣｌまたはアミダロン（ＡＭＩＯＤ）の存在下または非存在下で種々のｐＨでインキュベートし、反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
発明の詳細な説明
全身性紅斑性狼瘡は、依然として理解が十分になされていない自己免疫障害である。この２０年間で、狼瘡表現型に類似した遺伝モデルの特定について多大な進歩が達成された。しかし、この以前の研究は、狼瘡患者をより良く定義するための新たな診断ツールに、またはこれらの不運な患者の処置のための新たな治療学に容易に移し変えられなかった。機能の喪失がＳＬＥにおいて重要な役割を果たす、分泌リソソームタンパク質の本明細書における同定は、いくつかの重要な意味がある。第１に、分泌タンパク質として、血清ＬＰＬＡ２の活性は、疾患活動性の有用なマーカーである。第２に、ＬＰＬＡ２に対する自己抗体の存在は、ＳＬＥ患者のサブセットにおいて機構的に重要である可能性がある。第３に、ＬＰＬＡ２の遺伝性または後天性の欠損が患者のサブセットにおけるＳＬＥの発現の基礎となっている場合、タンパク質自体が有用な治療薬であり得る。マンノース終端リソソームタンパク質は、増加しつつある一連のリソソーム貯蔵病に対する酵素補充戦略の基礎である。これらは、Ｉ型ゴシェ病、ファブリー病およびハンター症候群などである。マクロファージにおけるＬＰＬＡ２の強結合、組込みおよびトラフィッキングを示した以前の研究は、この戦略がＳＬＥにも適用され得ることを示唆している。
【００５４】
本発明は、その断片、変異体または誘導体を含めたＬＰＬＡ２を含む組成物、ＬＰＬＡ２の活性を増強、増大あるいは刺激する組成物、およびＬＰＬＡ２の発現を増加あるいは刺激する組成物を投与することにより、可染体マクロファージの細胞内蓄積によって特徴付けられる障害を処置する方法に関する。そのような組成物は、リン脂質を異化し、かつ／または哺乳類組織におけるアポトーシス小体の消化もしくはクリアランスを増加し、かつ／または哺乳類組織における可染体マクロファージの蓄積を減少させるために用いることができる。したがって、そのような組成物は、可染体マクロファージの蓄積が関与する障害の徴候および症状を改善するのに、または該障害に罹患している患者が経験する合併症を低減するのに有用であることが企図される。可染体マクロファージの細胞内蓄積によって特徴付けられる障害は、全身性紅斑性狼瘡、薬物誘発性狼瘡、新生児狼瘡、および皮膚狼瘡、関節リウマチなどである。
【００５５】
関連する態様では、本発明は、ＬＰＬＡ２の活性を増強、増大または刺激する、あるいはＬＰＬＡ２の発現を増加または刺激することにより、可染体マクロファージの細胞内レベルを低下させる、さらなる作用物質を特定する方法を提供する。
【００５６】
さらに他の関連する態様では、本発明は、ＬＰＬＡ２自己抗体の存在について、またはＬＰＬＡ２の発現もしくは活性の低下について、患者からの体液または組織試料をアッセイすることにより、ＳＬＥすなわち全身性紅斑性狼瘡を診断し、またはそれに対する感受性を決定するための方法を提供する。ＳＬＥすなわち全身性紅斑性狼瘡の進行をモニタリングする同様の方法を提供する。
【００５７】
本出願は、アポトーシス小体の消化およびクリアランスにおける特定のリソソームホスホリパーゼＡ２の関与を実証する。ＬＰＬＡ２を欠くマウスは、蛋白尿、腎不全を伴い、Ｃ３、Ｃ１ｑおよびＩｇを含む免疫複合体沈着に関連する糸球体腎炎を示す。ＬＰＬＡ２欠損マウスの脾臓におけるマクロファージは、エンドサイトーシスによって取り込まれるが分解されないアポトーシス小体となる、非常に高レベルのＴＵＮＥＬ陽性の可染体を示す。ＬＰＬＡ２−／−マウスからの分離腹膜マクロファージは、アポトーシス胸腺細胞を消化できないが、アポトーシス胸腺細胞に結合し、エンドサイトーシスによって取り込む正常な能力があることによって特徴付けられる。ＬＰＬＡ２欠損マウスからのマクロファージが飲み込まれたアポトーシス小体を消化しないという所見により、この機能障害がＬＰＬＡ２が存在しないことに起因することが分かる。外因性ＬＰＬＡ２による処置は、アポトーシス小体の消化およびクリアランスを増大させ、可染体マクロファージの蓄積を減少させると予想される。
【００５８】
データから、陽イオン性両親媒性薬物がＬＰＬＡ２活性を阻害し、細胞リン脂質症をもたらすことも分かる。この阻害の基礎をなすメカニズムは、ＬＰＬＡ２とアニオン脂質膜との静電相互作用を妨げると思われる。
【００５９】
最後に、データから、ＬＰＬＡ２のｍＲＮＡ発現が、正常対照の糸球体ならびに糖尿病、高血圧性腎硬化症、微小変化群およびＩｇＡ腎症に起因する他の糸球体疾患を有する患者の糸球体と比較して狼瘡を有する患者の顕微解剖糸球体において低下していることが実証されている。
【００６０】
可染体マクロファージ
可染体マクロファージは、リンパ組織の胚中心に認められる大きい単核食細胞である（Ｓｍｉｔｈら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６巻（３〜４号）、２８５〜２９４頁、１９９８年）。これらのマクロファージは、様々な分解の状態の多くの貪食されたアポトーシス細胞（可染体と呼ばれる）を含む（ＳｗａｒｔｚｅｎｄｒｕｂｅｒおよびＣｏｎｇｄｏｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９巻、６４１〜６４６頁、１９６３年；Ｔａｂｅら、Ａｃｔａ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、５２３巻、６４〜６７頁、１９９６年）。これらの細胞は、１型食細胞と呼ばれている（Ｋｏｔａｎｉら、Ａｃｔａ  Ａｎａｔｏｍｉｃａ（Ｂａｓｅｌ）、９９巻（４号）、３９１〜４０２頁、１９７７年）。
【００６１】
これらのマクロファージは、時としてサイズが２０〜３０μｍ以上の範囲にあり、様々な数の封入体を含む。封入体は、核だけでなく、溶解の様々な段階の細胞質デブリでもある。様々な細胞型が可染体を構成するデブリを形成する。例えば、形質細胞およびリンパ球デブリ、顆粒球ならびに貪食された赤血球が胚中心のマクロファージにおいて同定された（Ｓｗａｒｔｚｅｎｂｒｕｂｅｒら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９巻、６４１〜６４６頁、１９６３年）。
【００６２】
アポトーシスの最も早期の変化の１つは、原形質膜の外側リーフレット上のホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の曝露である。可染体マクロファージは、ＰＳを認識することによってアポトーシス細胞に結合し、アポトーシス細胞の飲込みを促進する乳脂肪小球表皮成長因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）を強力に発現する。ＭＦＧ−Ｅ８の発現を欠くノックアウトマウスは、脾臓の胚中心に多くの飲み込まれていないアポトーシス細胞を有し、狼瘡様自己免疫疾患を発現する（Ｈａｎａｙａｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４巻（５６７４）、１１４７〜１１５０、２００４年およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、９巻、１６２〜１７２頁、２００６年）。アポトーシス小体は、完全な原形質膜および原形質膜の外側リーフレット上のＰＳの発現によって特徴付けられる。
【００６３】
可染体マクロファージの蓄積の増大が関節リウマチ患者のリンパ節胚中心に認められる（Ｉｍａｉら、Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｊｐｎ．、１９８９年２月、３９巻（２号）、１２７〜３４頁）。
【００６４】
ＳＬＥおよびアポトーシス細胞のクリアランス
アポトーシス細胞のクリアランスの不能または減少は、自己免疫の発現の最も一般的な仮説の１つとして明らかにされた（Ｅｒｗｉｇら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１７１巻、２〜８頁、２００７年；Ｓａｖｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、４０７巻、７８４〜７８８頁、２０００年；Ｔａｎａｋａら、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、１４巻、２８９２〜２８９７頁、２００７年）。食作用によるアポトーシス細胞のクリアランスは、４つの明確なステップに分けることができる。これらのステップは、アポトーシス細胞が位置する部位への食細胞の動員、受容体および架橋分子によるアポトーシス細胞の認識、アポトーシス小体の食細胞内へのエンドサイトーシス、ならびにエンドサイトーシスによって取り込まれた細胞小体の消化を含む。認識およびエンドサイトーシスに関連するメカニズムの記述について多大な進歩が達成されたが、エンドサイトーシスによって取り込まれたアポトーシス小体の消化に関しては解明されたのは非常にわずかであった。
【００６５】
アポトーシス細胞クリアランスの機能障害を反映し得る狼瘡の３つの独特な特徴が存在する。これらの病徴的特徴（ｐａｔｈｏｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅ）は、紅斑性狼瘡（ＬＥ）細胞（Ｈａｒｇｒａｖｅｓら、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒｏｃ、２３巻、２５〜２８頁、１９４８年）、ヘマトキシリン体（Ｗｉｌｓｏｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２４１巻、３１〜４３頁、１９６１年）および可染体マクロファージ（Ｂａｕｍａｎｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、４６巻、１９１〜２０１頁、２００２年）を含む。これらの病理学的異常の超微細構造的特徴付けに関して公表された少しであるが、すべてが、それらは、それぞれ骨髄、腎臓および肺ならびにリンパ組織における食細胞によって摂取されたアポトーシス小体の持続的な存在を意味することを示唆している（Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｅｓら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｓｕｐｐｌ、２３５巻、３１〜３７頁、２００１年；Ｓｗａｒｔｚｅｎｄｒｕｂｅｒら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９巻、６４１〜６４６頁、１９６３年）。Ｂａｕｍａｎｎら（２００２年）は、アポトーシス細胞は、ＳＬＥ患者のサブグループにおける胚中心の可染体マクロファージにより適切に除去されないことを報告した（Ｂａｕｍａｎｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、４６巻（１号）、１９１〜２０１頁、２００２年）。
【００６６】
ＳＬＥは、全身性紅斑性狼瘡またはＳＬＥ症状もしくは可染体マクロファージの蓄積を示す他の自己免疫疾患を含む。自己抗体は、ＳＬＥにおける疾患の発現に役割を果たす（Ｒａｈｍａｎ、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、４３巻（１１号）、１３２６〜１３３６頁、２００４年；Ｅｈｒｅｎｓｔｅｉｎ、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、３８巻、６９１〜６９３頁、１９９９年）。全身性紅斑性狼瘡における自己抗体の標的は、核および細胞質巨大分子、脂質成分ならびに血漿タンパク質などである。自己抗体は、標的器官にとどまる免疫複合体を形成し、正常器官の機能を破壊することにより、または標的抗原と交差反応し、組織を損傷させることにより疾患の発現に関与する。全身性紅斑性狼瘡において最も頻繁に関連する自己抗体は、Ｓｍｉｔｈ（リボ核タンパク質）に対する抗体、ならびにヌクレオソーム、ヒストンおよび二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに対する抗体などである。抗ｄｓＤＮＡ抗体は、ＳＬＥにおいて最も頻繁に検出される抗体である。ｄｓＤＮＡ抗体の力価は、全身性狼瘡を診断し、疾患の活動性を評価するのに用いることができる。
【００６７】
全身性紅斑性狼瘡は、多臓器疾患である。疾患の最も一般的な初期の徴候は、疲労、発熱ならびに筋肉および関節疼痛である。筋肉痛（筋痛）、関節疼痛（関節痛）および関節炎は、狼瘡の新たな発症および後の突然の再発に一般的に伴う。筋肉自体は、時として炎症状態になり、非常に有痛性で、これが衰弱および疲労の一因となる。狼瘡関節炎に関係する最も多い関節は、手、膝および手首の関節である。関節への血流の減少によって引き起こされる合併症は、関節の骨の死（無血管性壊死）をもたらし得る。無血管性壊死は、股関節および膝で最も一般的に起こる。
【００６８】
皮膚症状は、狼瘡患者の９０％超において起こり、多くの異なるタイプの皮疹を含み得る。古典的な狼瘡の皮疹は、しばしば日光曝露によってもたらされる頬の発赤（頬部赤面）である。皮膚の赤色皮膚斑点および落屑を伴う円板状狼瘡は、瘢痕化につながり得る独特の皮疹である。これは、一般的に顔面および頭皮上に発生し、頭毛の喪失（脱毛症）をもたらし得る。
【００６９】
腎臓における免疫複合体の沈着に起因する腎臓合併症である糸球体腎炎は、狼瘡を有するすべての患者の半数超で認められる。重度腎疾患は、しばしば免疫抑制療法を必要とする。狼瘡を有する患者の５０％超は、肺合併症を有する。肺の内層の炎症（胸膜炎）が一般的である。胸水も発生し得る。心臓の周りの炎症（心膜炎）だけでなく、動脈の炎症（血管炎）も起こり得る。狼瘡を有する患者は、アテローム動脈硬化症を発現するより大きい素因もある。
【００７０】
神経系合併症は、狼瘡患者の約１５％で起こる。起こり得る症状は、発作、神経麻痺、重度うつ病、精神病および卒中などである。狼瘡における脊髄炎症は、まれであるが、麻痺を引き起こし得る。狼瘡患者の約半数は、貧血および／または血小板減少および／または白血球減少を有する。一部の狼瘡患者は、凝血塊を発生する素因がある。これは、抗リン脂質抗体を有する患者で起こる可能性が最も高い。腸における凝血塊または血管の炎症に起因する腸の炎症または感染が起こり得る。一部の患者は、指の蒼白、青色（ｂｌｕｅｎｅｓｓ）および疼痛として発現する、手への血液供給の間欠的中断（レーノー症候群）を経験する。
【００７１】
薬物誘発性狼瘡（ＤＩＬ）は、特定の薬物の慢性使用による誘発される、全身性紅斑性狼瘡と類似した症状を伴う障害である。薬物誘発性狼瘡は、４０種超の薬物による長期の治療の副作用として報告されたすべての狼瘡症候群の５〜１０％を占める周知の実体である（Ｒｕｂｉｎ、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、２０９巻（２号）、１３５〜４７頁、２００５年；Ｐｅｒｅｚ−Ｇａｒｃｉａら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、４５巻（１号）、１１４〜１１６頁、２００６年）その臨床的および実験室的特徴は、患者が原因薬物を中止した後に一般的に回復することを除いて、全身性紅斑性狼瘡と類似している。４０種超の薬物は薬物誘発性狼瘡に関連することが公知であるが、最高の数を報告している３つは、プロカインアミド（商品名プロネスチル、心臓不整脈を処置するために用いる）、ヒドララジン（商品名アプレゾリン、高血圧を処置するために用いる）およびキニジン（商品名キナグルート、心臓不整脈を処置するために用いる）である（Ｈｏｆｓｔｒａ、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｖ、２６巻（３号）、４８５〜５０５頁、１９９４年；Ｕｅｔｒｅｃｈｔら、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ、１巻（１号）、７４〜８頁、１９９８年）。薬物誘発性狼瘡を引き起こす薬物は、アセブトロール、アミオダロン、ブプロピオン、カプトプリル、カルバマゼピン、クロルプロマジン、ジルチアゼム、ドセタキセル、エトスクシミド、ゲムフィブロジル、グリブリド、金塩、グリセオフルビン、ヒダントイン、ヒドララジン、ヒドロキシクロロキン、インターフェロン、インターロイキン、イソニアジド、酢酸ロイプロリド、リチウム、ロバスタチン、メフェニトイン、メチルドパ、ミノサイクリン、ニトロフラントイン、オランザピン、眼用チモロール、経口避妊薬、ペニシラミン、フェニトイン、プラクトロール、プロカインアミド、プロピルチオ尿素、キニジン、レセルピン、リファンピン、シムバスタチン、スルファサラジン、テトラサイクリン、チクロピジン、臭化チオトロピウム吸入剤、トリメタジオン、腫瘍壊死因子、バルプロ酸塩またはボリコナゾールなどである。全身性紅斑性狼瘡の再燃を引き起こす薬物は、次の通りである：シメチジン、ヒドララジン、ヒドロクロロチアジド、メサントイン、Ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシリン、フェニルブタゾン、スルホンアミドまたはテルビナフィン。
【００７２】
リソソームホスホリパーゼＡ２およびホスホリパーゼスーパーファミリー
本項では、ホスホリパーゼおよびＬＰＬＡ２酵素のファミリーの一般的な説明を具体的に示す。
【００７３】
ホスホリパーゼＡ２スーパーファミリーは、リン脂質のｓｎ−２エステル結合を加水分解する能力を共有する広範囲の酵素からなっている。この反応の生成物である遊離脂肪酸およびリゾリン脂質は、重要な生物学的役割を有する。前者は、細胞エネルギーの重要な源であるだけでなく、アラキドン酸代謝物の形のさらなる細胞メッセンジャーの基質でもある。後者の生成物は、膜リモデリングおよび膜摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）に対する重要な作用を有することに加えて、シグナリングの役割を果たす。歴史的にはＰＬＡ２は、触媒ヒスチジン、カルシウム依存性を有し、ジスルフィドに富むことによって特徴付けられる小分泌酵素であると考えられていた。酵素のファミリーは、ジスルフィド結合を欠き、触媒性セリンの存在によって特徴付けられるタンパク質に帰すことができる細胞質ゾルＰＬＡ２活性の発見により著しく拡大した（Ｇｒｏｎｉｃｈら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６３巻、１６６４５〜１６６５１頁、１９８８年）。現在のところ、１５群のホスホリパーゼＡ２が存在する。群Ｉ、ＩＩ、ＩＩ、Ｖ、ＩＸ、ＸおよびＸＩは、触媒性ヒスチジンを利用し、小分子量（１３〜１５ｋＤａ）のものである。群ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩは、求核性セリンを利用し、触媒作用のためのＣａ２＋の要求をほとんどまたは全く有さない。分子量は、より大きい（２６〜１１４ｋＤａ）。これらの後者の群の多くのメンバーは、Ｃ２ドメインを有し、α／β折りたたみヒドロラーゼタンパク質のメンバーであり、活性のための必須Ｓｅｒ／Ｈｉｓ／Ａｓｐ３残基を含むことがある。
【００７４】
１−Ｏ−アシルセラミドシンターゼとしても公知であるリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２、ＬＬＰＬ、ＬＹＰＬＡ３）は、ＰＬＡ２の新たな群ＸＶの第１のメンバーとして最近認識された（Ｓｃｈａｌｏｓｋｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１７６１巻、１２４６〜１２５９頁、２００６年）。ＬＰＬＡ２は、約４０ｋＤａの分子量を有するマンノースに富む単鎖糖タンパク質である。ＬＰＬＡ２は、リパーゼおよびトランスアシラーゼ活性ならびに酸性至適ｐＨを有する。これは、リン脂質ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に対して特異的である。該タンパク質は、肺胞マクロファージにおいて選択的かつ高度に発現するが、腹膜マクロファージ、末梢血単球または他の組織にもより低い程度で存在する。他のマクロファージ関連ホスホリパーゼＡ２は、同等な分布を示さない。
【００７５】
ＬＰＬＡ２は、アゴニストに応答してマクロファージおよびマスト細胞から分泌される。ＬＰＬＡ２は、細胞マンノース受容体により認識され、外因的に投与された場合、リソソームに再取込みされ、トラフィックバックされる。ＬＰＬＡ２の分泌は、リンパ球の動員、増殖およびサイトカインの産生に対する公知の作用を有する生物活性脂質リガンドの生成をもたらす。
【００７６】
１９９６年にセラミド代謝の新規な経路の存在が報告された（Ａｂｅ，  Ａ．、Ｓｈａｙｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．およびＲａｄｉｎ，  Ｎ．  Ｓ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１巻、１４３８３〜１４３８９頁、１９９６年）。この経路は、セラミドの高度に親油性の代謝物である１−Ｏ−アシルセラミドの生成をもたらす（図１Ａ）。この反応のもとで、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンのｓｎ−２位の脂肪酸がセラミドのＣ−１ヒドロキシル基に転移する。該酵素の精製により、セラミドまたは水がｓｎ−２脂肪酸のアクセプターとしての役割を果たし得ると判断された（Ａｂｅ，  Ａ．  およびＳｈａｙｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３巻、８４６７〜８４７４頁、１９９８年）。セラミドの存在下では、ＬＰＬＡ２は、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンのｓｎ−２位の脂肪酸のトランスアシル化による１−Ｏ−アシルセラミドの生成を触媒する。セラミドまたは他のアルコールの非存在下で、水がアクセプターとしての役割を果たす場合、該酵素は、従来のホスホリパーゼＡ２として作用する。このホスホリパーゼＡ２の２つの特性が直ちに明らかになった。第１に、該酵素は酸性至適ｐＨ約４．５を有し、第２に、該酵素はリソソームに局在化する。
【００７７】
該酵素の精製に基づいて、ＬＰＬＡ２のいくつかの部分的アミノ酸配列が決定され、コーディングの全長および全長アミノ酸配列が決定された（Ｈｉｒａｏｋａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７巻、１００９０〜１００９９頁、２００２年）。発現タンパク質は、ホスホリパーゼＡ２およびトランスアシラーゼ活性の両方を有することが確認された。コード配列の分析により、ＬＰＬＡ２が、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）とアミノ酸レベルで４９％同一であることが明らかになった。同一性の大部分が触媒ドメインに局在化していた（図１Ｂ）。ＬＣＡＴおよびＬＰＬＡ２の両方が、重複事象により生ずる１つの遺伝子と一致する、それらが隣接して配置されている１６ｑ２２に共局在化していた。系統発生分析により、両遺伝子がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼに由来し、ＬＰＬＡ２がＬＣＡＴの先祖であることが明らかになった。
【００７８】
ヒトＬＰＬＡ２の配列を配列番号１に示す。触媒ドメインのより詳細な解析により、ＬＰＬＡ２が、他のホスホリパーゼＡ２およびアシルヒドロラーゼに存在するコンセンサス配列−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−（配列番号１のアミノ酸１９６〜２００）を含むことが明らかになった。セリンは、緊密に近接したアスパラギンおよびヒスチジン残基からなり、セリンを強求核体に変換する役割を果たす触媒３残基の一部である。３残基アミノ酸の部位特異的突然変異誘発は、ＬＰＬＡ２の内因性ホスホリパーゼおよびトランスアシラーゼ活性を除去する。さらなる解析により、Ｃｙｓ６５とＣｙｓ８５との間の単一ジスルフィド架橋の存在が明らかになった（Ｈｉｒａｏｋａ，  Ｍ．、Ａｂｅ，  Ａ．およびＳｈａｙｍａｎ，  Ｊ．Ａ．、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ、４６巻、２４４１〜２４４７頁、２００５年）。より最近、酵素のｓｎ−１特異性とｓｎ−２特異性が比較評価された。ＬＰＬＡ２は、ｓｎ−２位にアラキドン酸を含むリン脂質に対して高い特異性を有する。しかし、他の脂肪アシル置換が存在する場合、ｓｎ−１およびｓｎ−２ヒドロラーゼ活性が認められる（Ａｂｅ，  Ａ．、Ｈｉｒａｏｋａ，  Ｍ．およびＳｈａｙｍａｎ，  Ｊ．Ａ．、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ、４７巻、２２６８〜２２７９頁、２００６年）。セラミドの他の親油性アルコールは、トランスアシル化活性により脂肪酸のアクセプターとしての役割を果たすことができる（Ａｂｅ，  Ａ．、Ｈｉｒａｏｋａ，  Ｍ．およびＳｈａｙｍａｎ，  Ｊ．Ａ．、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ、４８巻、２２５５〜２２６３頁、２００７年）。
【００７９】
２価陽イオンＣａ２＋およびＭｇ２＋は、ＬＰＬＡ２トランスアシラーゼ活性を増大させるが、その活性に必要でない。ＬＰＬＡ２は、ＡＴＰまたはジチオトレイトールなどのチオール試薬およびＮＥＭの存在下で活性化もされず、阻害もされない。したがって、該酵素は、そのような試薬に対して高度に敏感である群Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩホスホリパーゼＡ２と異なっている。ホスホリパーゼＡ２阻害剤ブロモエノールアセトン（ＢＥＬ）およびノナデシルテトラエニルトリフルオロメチルケトン（ＡＡＣＯＦ３）は、酵素活性を阻害しない。
【００８０】
ＬＰＬＡ２は、放出された酵素がマンノースまたはマンノース−６−リン酸受容体を介してマクロファージに再組込みされることを示唆する、高マンノース型糖タンパク質である。ＨＥＫ２９３細胞により産生された組換えグリコシル化マウスＬＰＬＡ２をＬＰＬＡ２欠損（ＬＰＬＡ２−／−）マウス肺胞マクロファージに適用した。外因性ＬＰＬＡ２のＬＰＬＡ２−／−肺胞マクロファージ内への取込みは、濃度依存的に、かつリソソームマーカーＬａｍｐ−１と共局在化した状態で起こった（Ａｂｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８１巻（１１号）、７８７３〜８１頁、２００８年）。この取込みは、アルファ−メチルマンノシドの存在下では有意に抑制されたが、マンノース−６−リン酸の存在下では抑制されなかった。したがって、外因性ＬＰＬＡ２の取込みの支配的な経路は、マンノース受容体を介するものである（Ａｂｅら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８１巻（１１号）、７８７３〜８１頁、２００８年）。
【００８１】
ＬＰＬＡ２断片、変異体および誘導体
本発明の方法でより有用であるＬＰＬＡ２は、配列番号１〜２８８のいずれか１つのアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体もしくは誘導体を含んでいてよい。そのようなＬＰＬＡ２、断片、変異体または誘導体を含む組成物は、アポトーシス小体のクリアランスの機能障害および／または可染体マクロファージの蓄積を伴って生じる障害の処置に用いられる。ＬＰＬＡ２、その断片または変異体をコードするポリヌクレオチドも、本発明において例えば、遺伝子治療の目的またはタンパク質の組換え産生のために有用である。
【００８２】
ＬＰＬＡ２タンパク質は、配列番号１〜２８８のアミノ酸配列、または配列番号１〜２８８の断片、または配列番号１〜２８８のタンパク質の変異体もしくは保存的置換変異体、または所望の生物学的活性を保持しているその誘導体を含むいずれかの哺乳類タンパク質を含む。特定の態様では、ＬＰＬＡ２タンパク質は、あらゆる天然源、例えば、ヒト（配列番号１）、ウシ、マウス（例えば、これらの配列は図１ＣおよびＨｉｒａｏｋａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７巻、１００９０〜９頁、２００２年に示されている）などの哺乳類源に由来するものであるか、あるいは、当業者に公知である合成により、もしくは組換え法により製造される。可染体マクロファージの蓄積に伴う障害、例えば、ＳＬＥすなわち全身性紅斑性狼瘡を処置する目的のために、所望の保持された生物学的活性は、リン脂質に対する異化作用、および／またはアポトーシス小体のクリアランスの改善および／または可染体マクロファージの蓄積減少である。
【００８３】
Ａ．断片および変異体
配列番号１〜２８８のいずれかのＮ末端またはＣ末端におけるアミノ酸の切断は、所望の生物学的活性を保持している断片をもたらす可能性がある。少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０連続アミノ酸の断片が企図される。そのような断片は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸１９６〜２００に対応する触媒コンセンサス配列−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−を含む。そのような断片は、配列番号１の６５位におけるＣｙｓとＣｙｓ８９の間のシステイン結合に対応するシステイン結合も含んでいてよい。
【００８４】
「変異体」という用語は、天然タンパク質の１つもしくは複数の部位における１つもしくは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加および／または天然タンパク質の１つもしくは複数の部位における１つもしくは複数のアミノ酸の置換により天然タンパク質から得られたタンパク質を意味するものとする。変異体は、組換え産生によるものを含む、当技術分野で公知の様々な手段のいずれかにより容易に作製される。変異体をコードするポリヌクレオチドは、例えばＬＰＬＡ２をコードするポリヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により、またはコードするポリヌクレオチド配列の直接合成により作製することができる。
【００８５】
本発明の天然ＬＰＬＡ２タンパク質の生物学的に活性な変異体は、配列整列プログラムにより判定されるような天然タンパク質のアミノ酸配列との少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。本発明のタンパク質の生物学的に活性な変異体は、当タンパク質とわずか１〜１５アミノ酸残基、６〜１０などのわずか１〜１０、わずか５、わずか４、３、２または１アミノ酸残基異なっていてよい。生物学的に活性な変異体は、あるいは、配列番号１をコードするポリヌクレオチドの相補体と厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。高度に厳密な条件は、比較的低いイオン強度および高温のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を含む。具体例としての高度に厳密な洗浄条件は、６５〜６８℃における０．１×ＳＳＣでの洗浄を含む。具体例としての中程度に厳密な洗浄条件は、５５℃における１×ＳＳＣでの洗浄を含む。
【００８６】
他の例として、配列番号１〜２８８のいずれかのアミノ酸残基の保存的置換または非保存的置換、挿入もしくは欠失は、所望の生物学的活性を保持し、かつ／または配列番号１〜２８８のタンパク質の３次元立体配座構造を保持する変異体を生成し得る。そのような変異体は、好ましくは触媒コンセンサス配列−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−を含む。そのような変異体は、配列番号１の６５位におけるＣｙｓとＣｙｓ８９の間のシステイン結合に対応するシステイン結合も含んでいてよい。
【００８７】
「保存的置換」という用語は、本明細書では、アミノ酸残基を、疎水性、親水性、陽イオン電荷、陰イオン電荷、形状、極性などに関して生物学的に類似する別の残基に置き換えることを意味する。保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシンもしくはメチオニンなど、ある疎水性残基から別の疎水性残基への置換、またはリシンからアルギニンへの置換、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換、もしくはアスパラギンからグルタミンへの置換など、ある極性残基から別の極性残基への置換を含む。互いに置換される中性の親水性アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニンなどである。「保存的置換」という用語は、置換されていない親アミノ酸の代わりに置換または修飾されたアミノ酸を使用することも含み、ただし、置換ポリペプチドに対する抗体も非置換ポリペプチドと免疫反応性を有する。「置換された」または「修飾された」により、本発明は、天然に存在するアミノ酸から改変または修飾されたアミノ酸を含む。
【００８８】
したがって、本発明の状況において、保存的置換は、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸に置換されていると当技術分野で認識されていることを理解すべきである。例示的な保存的置換は、例えば、記載されている。あるいは、保存的アミノ酸は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．：Ｎ．Ｙ．（１９７５年）、７１〜７７頁）に記載の通り分類されている。当業者は、特定の保存的置換を示す多くの表を認識している。そのような表の１つの具体例を以下に示す。
【００８９】
【表１】
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配列番号１〜２８８のＬＰＬＡ２の触媒ドメインの大部分またはすべてを保持する配列番号１〜２８８のタンパク質の変異体は、本発明の方法において有用であると企図される。上述のように、ＬＰＬＡ２の触媒ドメインは、他のホスホリパーゼＡ２およびアシルヒドロラーゼに存在するコンセンサス配列−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｇ−を含む。セリンは、緊密に近接したアスパラギンおよびヒスチジン残基からなり、セリンを強求核体に変換する役割を果たす触媒３残基の一部である。変異体の作製への１つの手法は、コンセンサス触媒配列を保持しながら触媒ドメイン内または近傍の保存的置換から始めることと、その後の触媒ドメインの外部での保存的置換または非保存的置換、挿入もしくは欠失である。配列番号１のＬＰＬＡ２は、コレステロールレシチンアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）と５０％の相同性を有し、この相同性の大部分は触媒ドメイン内にある。したがって、そのような変異体がリン脂質の分解を触媒するその特性を保持する限り、当業者が配列番号１の触媒ドメインがＬＣＡＴの触媒ドメインにより置換されている（Ｈｉｒａｏｋａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７巻、１００９０〜９頁、２００２年）配列番号１の変異体を製造することを選択する可能性があることが企図される。そのような活動は、本明細書の下文で述べるように容易に評価される。
【００９０】
さらに、合理的な薬物設計を用いてＬＰＬＡ２タンパク質の構造的変異体を製造し、それにより、本明細書で検討する方法に用いるさらなる組成物を得る。そのような変異体を創出することにより、熟練研究者は、改変に対する異なる感受性を有する天然分子より活性もしくは安定である、または他の様々な分子の機能に影響を及ぼし得るＬＰＬＡ２由来のタンパク質を創出することができる。一手法において、例えば、Ｘ線結晶学、コンピュータモデリングまたは両手法の組合せによって対象のＬＰＬＡ２由来タンパク質またはその断片の３次元構造を得ることが望ましい。代替の手法「アラニンスキャン」は、アラニンによるタンパク質全体の残基の系統的な置換の後の機能に対する得られた効果を決定することを必要とする。
【００９１】
さらに、構造の安定化または生分解の軽減をもたらすＬＰＬＡ２由来タンパク質の非ペプチド変異体も企図される。ペプチド模倣変異体は、対象のタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸残基を非ペプチド部分により置換することによって、基礎をなすＬＰＬＡ２タンパク質構造に基づいて調製する。一態様では、非ペプチド部分は、ペプチドがその天然の立体配座（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を保持する、または生物活性立体配座を安定化することを可能にする。ペプチドから非ペプチド模倣変異体を調製する方法の一例は、Ｎａｃｈｍａｎら、Ｒｅｇｕｌ．  Ｐｅｐｔ．、５７巻、３５９〜３７０頁（１９９５年）に記載されている。「ペプチド」は、本明細書では前記のすべてを含む。
【００９２】
Ｂ．誘導体
タンパク質の基本的アミノ酸構造に加えて、ＬＰＬＡ２タンパク質は、それらの取込みを増加させ、毒性を減少させ、循環時間を延長させ、またはＬＰＬＡ２タンパク質の生体内分布を修正するために修飾することが企図される。例えば、マクロファージによるＬＰＬＡ２組成物のより大きい取込みを促進する修飾、例えば、マンノース残基を増加させる修飾が企図される。ＬＰＬＡ２のマンノース含量は、例えば、マンノースの化学的コンジュゲーションにより、マンノースをグリコシル化部位に曝露もしくは付加する酵素による処理により、または得られる糖タンパク質の高いマンノース含量に有利に働く組換え製造法の修正により増加させることができる。あるいは、高マンノース含量を有するＬＰＬＡ２の組成物は、例えば、マンノース受容体、マンノース結合レシチンなどのマンノース結合タンパク質に結合させたマトリックスを用いたアフィニティー精製により調製することができる。
【００９３】
本発明の化合物は、線状ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリリシン、デキストラン等）、分枝鎖ポリマー（例えば、米国特許第４，２８９，８７２号；米国特許第５，２２９，４９０号；国際公開第９３／２１２５９号を参照）、脂質、コレステロール基（ステロイドなど）または炭水化物もしくはオリゴ糖などの担体分子と共有結合または非共有結合により結合させることもできる。他の可能な担体は、抗体部分および特に、抗体から得られる定常領域などである。他の可能な担体は、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号および第４，１７９，３３７号に記載されているようなポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールなどの１つまたは複数の水溶性ポリマー結合を含む。当技術分野で公知の他の有用なポリマーは、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭化水素ベースのポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールならびにこれらのポリマーの混合物などである。
【００９４】
例えば、Ｆｃ領域をＬＰＬＡ２タンパク質、断片または変異体のＮ末端またはＣ末端（または両方）に融合させることができる。本明細書に例示するような複数の媒体、例えば、末端におけるＦｃおよび他の末端または側鎖におけるＰＥＧ基も用いることができる。
【００９５】
種々の実施形態において、Ｆｃ成分は、天然ＦｃまたはＦｃ変異体である。例として、また制限なく、Ｆｃ成分は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１重鎖のＦｃ領域またはその生物学的に活性な断片、誘導体もしくは二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ，  Ｊ．  Ｗ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１０巻、４０７１〜４０７９頁（１９８２年）を参照）。しかし、本発明に用いるＦｃ領域は、任意の種のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ由来であってよいことが理解される。天然Ｆｃドメインは、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）および／または非共有結合により二量体または多量体に連結させることができる単量体ポリペプチドで構成されている。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）によって１〜４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化に起因するジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１０巻、４０７１〜９頁を参照）。
【００９６】
様々な水溶性ポリマーが生体内分布を修正し、細胞取込みの様態を改善し、生理的バリアを通しての透過性を変化させ、身体からのクリアランスの速度を変更することが示された（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒａｐ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、２０００年、１７巻、１０１〜１６１頁；Ｋｏｐｅｃｅｋら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、７４巻、１４７〜１５８頁、２００１年）。ターゲティングもしくは持続放出効果を達成するために、薬物部分を末端基として、主鎖の一部として、またはポリマー鎖上のペンダント基として含む水溶性ポリマーが合成された。
【００９７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高度の生体適合性および修飾の容易さを考慮して、薬物担体として広く使用されている（Ｈａｒｒｉｓら、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．、２００１年、４０巻（７号）、５３９〜５１頁）。様々な薬物、タンパク質およびリポソームへの結合が滞在時間を改善し、毒性を減少させることが示された（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒａｐ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、２０００年、１７巻、１０１〜１６１頁；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．、１９９７年、８巻、１１１〜１１８頁）。一態様では、ＰＥＧを鎖の末端のヒドロキシル基を介しておよび他の化学的方法により活性物質に結合させるが、ＰＥＧ自体は、１分子当たり最大で２つの活性物質に制限する。異なる手法では、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーは、ＰＥＧの生体適合性を保持するが、１分子当たり多数の結合点がある（より大きい薬物負荷を可能にする）という付加的な利点を有し、様々な適用分野に適合するように合成的に設計することができる生体材料として探究された（Ｎａｔｈａｎら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９２年、２５巻、４４７６〜４４８４頁；Ｎａｔｈａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ．、１９９３年、４巻、５４〜６２頁）。
【００９８】
当業者は、薬物の有効な修飾のためのＰＥＧ化法を知っている。例えば、ＰＥＧおよびリシンなどの三官能性モノマーの交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーがＶｅｃｔｒａＭｅｄ（Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、ＮＪ）によって使用された。ＰＥＧ鎖（一般的に２０００ダルトン以下）を安定なウレタン結合を介してリシンのα−およびε−アミノ基に結合させる。そのようなコポリマーは、厳密に制御され、ポリマー鎖に沿った所定の間隔の反応性ペンダント基（リシンのカルボン酸基）を備えていると同時に、ＰＥＧの望ましい特性を保持している。一態様では、反応性ペンダント基は、誘導体化、架橋または他の分子とのコンジュゲーションのために用いる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量および薬物とポリマーとの間の開裂可能結合を変化させることによって安定な長時間循環プロドラッグを製造するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／結合基複合体の間隔およびコンジュゲートの分子量当たりの薬物の量に影響を及ぼす（より小さいＰＥＧセグメントはより大きい薬物負荷を可能にする）。一般的に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全分子量を増加させることより、コンジュゲートの循環半減期が長くなる。それにもかかわらず、コンジュゲートは、容易に分解できるものであるか、または閾値制限糸球体濾過値を下回る分子量（例えば、４５ｋＤａ未満）を有さなければならない。したがって、一態様では、ＰＥＧ化ＬＰＬＡ２タンパク質は、分子量が２０ｋＤａから３５ｋＤａまでの範囲にある。
【００９９】
他の組の有用な誘導体は、トレーサーまたは放射性同位体を含む他の治療薬または診断薬にコンジュゲートさせたＬＰＬＡ２タンパク質である。有用なコンジュゲーションパートナーは、９０イットリウム、１３１ヨウ素、２２５アクチニウムおよび２１３ビスマスなどの放射性同位体；リシンＡ毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシン（例えば、ＰＥ３８、ＰＥ４０）などの微生物由来毒素など；キャプチャーシステムにおけるパートナー分子（下を参照）；ビオチン、ストレプトアビジン（キャプチャーシステムにおけるパートナー分子として、または特に診断用のトレーサーとして有用）；ならびに化学療法薬などである。
【０１００】
ＬＰＬＡ２タンパク質を作製する方法
ＬＰＬＡ２タンパク質は、従来の自動ペプチド合成法または組換え発現により製造することができる。タンパク質を設計し、製造するための一般的原則は、当業者には周知である。
【０１０１】
Ａ．自動固相ペプチド合成
一態様では、本発明のタンパク質は、従来の技術により溶液中または固体支持体上で合成する。様々な自動合成装置が市販されており、公知のプロトコールに従って使用されている。例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（１９８４年）；Ｔａｍら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０５巻、６４４２頁（１９８３年）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻、３４１〜３４７頁（１９８６年）；ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１〜２８４頁（１９７９年）を参照されたい。したがって、ＬＰＬＡ２タンパク質、その断片および変異体は、容易に合成され、関連する活性について、例えば、アシルセラミド（ａｃｌｙｃｅｒａｍｉｄｅ）シンターゼ活性アッセイにより場合によってスクリーニングされる。
【０１０２】
例えば、ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．製のＭｏｄｅｌ４３３Ａなどの具体例としてのペプチド合成装置を用いた固相技術により合成する。そのような場合に、自動ペプチド合成または組換え法により生成させた所与のペプチド基質の純度は、一般的に逆相ＨＰＬＣ分析を用いて決定する。各ペプチドの化学的信ぴょう性は、当業者に周知の方法によって立証する。特定の実施形態では、信ぴょう性は、質量分析により立証する。さらに、ペプチドはまた、例えば、ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製ＭＤＳ２０００マイクロ波オーブンなどのマイクロ波オーブンを用いてマイクロ波加水分解を行うアミノ酸分析を用いて定量する。特定の態様では、試料を逆相ＨＰＬＣにより分析し、高度積分器を用いて定量化を達成する。当業者は、逆相ＨＰＬＣと質量分析の組合せを用いてＬＰＬＡ２のアミノ酸配列を決定する方法の詳細を記載しているＨｉｒａｏｋａらを参照する。そのような方法は、当業者には周知であり、タンパク質またはペプチドの配列分析に容易に適用される。
【０１０３】
Ｂ．組換えタンパク質産生
自動ペプチド合成の代替として、本明細書の下文で述べるように本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、発現に適する条件下で培養する、組換えＤＮＡ技術を用いる。一態様では、配列番号１〜２８８のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、その断片または変異体を提供する。組換え法は、本発明の方法で用いるより長いポリペプチドを産生させるのに特に有用である。
【０１０４】
様々な発現ベクター／宿主系が当技術分野で公知である。これらは、組換えバクテリオファージで形質転換した細菌などの微生物、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクター；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）をトランスフェクトした、または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系などである。組換えタンパク質産生に有用な哺乳類細胞は、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２および２９３細胞を含むが、これらに限定されない。細菌、酵母および他の無脊椎動物におけるＬＰＬＡ２ポリペプチドの組換え発現に関する具体例としてのプロトコールは、当業者に公知であり、下で簡単述べる。
【０１０５】
原核宿主に用いる発現ベクターは、一般的に１つまたは複数の表現型選択マーカー遺伝子を含む。そのような遺伝子は、一般的に例えば、抗生物質耐性を付与する、または栄養要求性要件を満たすタンパク質をコードする。様々なそのようなベクターは、商業的供給源から容易に入手できる。例としては、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）などがある。
【０１０６】
所与のタンパク質または融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅し、ベクター、例えば、ベクターによりコードされるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質、およびベクターのクローニング部位に挿入されたＤＮＡ断片によりコードされるタンパク質を産生するように設計されたｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にクローニングする。一般的に、ＰＣＲ用のプライマーは、例えば、適切な切断部位を含むように生成させる。個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、自動シークエンサーを用いて部分的に配列決定を行って、適切な配向の所望のコーディング核酸インサートの存在を確認する。ベクターを細胞中に形質転換し、対象のＬＰＬＡ２タンパク質を精製し、トロンビンまたはＸａ因子（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）による組換え融合タンパク質の切断により回収する。
【０１０７】
分泌組換えタンパク質は、従来のタンパク質精製法により細菌培地から精製する。酵母宿主細胞における組換えタンパク質産生のための類似のシステムは、製造業者の指示に従って容易に商業的に入手できる、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）である。他の代替組換え産生は、昆虫系を用いて達成される。タンパク質発現のための昆虫系は、当業者に周知である。１つのそのような系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫における外来遺伝子を発現するためにベクターとして用いる。基質コード配列を多角体遺伝子などのウイルスの非必須領域にクローニングし、多角体プロモーターの制御下におく。基質の挿入に成功を収めると、多角体遺伝子が不活性になり、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスが産生される。次に組換えウイルスを用いて、基質が発現するＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫を感染させる（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、４６巻、５８４頁、１９８３年；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  ＥＫら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、９１巻、３２２４〜７頁、１９９４年）。
【０１０８】
組換えタンパク質の発現のための哺乳類宿主系も当業者に周知である。宿主細胞株は、一般的にタンパク質の活性をもたらすのに有用である発現タンパク質をプロセシングする、または特定の翻訳後修飾を生じさせる特定の能力について選択される。ポリペプチドのそのような修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を含むが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」体を切断する翻訳後プロセシングも正しい挿入、折りたたみおよび／または機能のために重要である。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの各種宿主細胞は、そのような翻訳後活動のための固有の細胞機構および特有のメカニズムを有し、導入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証するために選択される。
【０１０９】
一態様では、形質転換細胞は、長期の高収率タンパク質産生のために用いられ、したがって、安定な発現が望ましい。そのような細胞を、選択マーカーならびに所望の発現カセットを含むベクターで形質転換すると、選択培地に切替える前に細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させる。選択マーカーは、選択に対する耐性を付与するように設計されており、その存在により、導入された配列を成功裏に発現する細胞の増殖および回収が可能になる。安定に形質転換した細胞の耐性集団を、細胞に適切な組織培養技術を用いて増殖させる。
【０１１０】
組換えタンパク質の産生のために形質転換した細胞を回収するのに多くの選択システムが有用である。そのような選択システムは、それぞれｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ細胞中のＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むが、これらに限定されない。他の態様では、抗代謝物耐性を、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ、クロルスルフロンに対する耐性を付与するａｌｓおよびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏの選択の基礎として用いる。有用であるさらなる選択遺伝子は、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢまたは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤなどである。形質転換体の同定のための可視指示を示すマーカーは、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質であるＧＵＳならびにルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンなどである。
【０１１１】
Ｃ．組換えタンパク質産生のための発現構築物
本発明のＬＰＬＡ２タンパク質の組換え産生には、ＬＰＬＡ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターを用いる。そのようなベクターを調製ならびにそのようなベクターで形質転換した宿主細胞を作製する方法は、当業者に周知である。一態様では、用いるポリヌクレオチド分子（例えば、配列番号１〜２８８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片もしくは変異体）を、宿主における増殖のための選択マーカーおよび複製起点を一般的に含むベクターに連結させる。発現構築物のこれらのエレメントは、当業者に周知である。一般的に、発現ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来するものなどの適切な転写または翻訳調節配列に作動可能に連結した所与のタンパク質をコードするＤＮＡを含む。調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位ならびに転写および翻訳を制御する適切な配列などである。
【０１１２】
「発現ベクター」、「発現構築物」または「発現カセット」という用語は、本明細書を通して同義で用い、配列をコードする核酸の一部またはすべてを転写することができ、調節配列に作動可能に連結した遺伝子産物をコードする核酸を含むあらゆるタイプの遺伝的構築物を含むことを意味する。
【０１１３】
本発明のペプチドまたはポリペプチドの発現のための適切な発現ベクターの選択は、もちろん用いられる特定の宿主細胞に依存し、通常の技術者の技術の範囲内にある。哺乳類発現ベクターの構築の方法は、例えば、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、３巻、２８０頁（１９８３年））、Ｃｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻、９３５頁（１９８６年））；Ｃｏｓｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻、７６８頁（１９８４年））；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ９１／１８９８２に開示されている。
【０１１４】
一態様では、発現構築物は、ペプチドまたはポリペプチドの発現の検出を可能にする選択マーカーを含む。通常、薬物選択マーカーの包含は、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ（例えば、ネオマイシン、ピュロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ゼオシンおよびヒスチジノール）。あるいは、態様は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）（真核生物）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）（原核生物）などの酵素をマーカーとして用いる。あるいは、免疫学的マーカーも用いられている。例えば、ＦＬＡＧシステム（ＩＢＩ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、ＨＡおよび６ｘＨｉｓシステム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）などのエピトープタグが用いられている。さらに、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）またはマルトース結合タンパク質システム（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）も用いられている。用いられる選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することができる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【０１１５】
発現には、宿主細胞における対象の核酸の発現を誘導するのに用いられるウイルスおよび哺乳類源の両方からのエンハンサー／プロモーターなどの適切なシグナルがベクターに与えられることが必要である。通常、発現する核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するために必要とする、細胞の合成機構または導入合成機構により認識されるＤＮＡ配列を意味する。調節配列がペプチド基質または融合ポリペプチドをコードするＤＮＡと機能的に関連している場合、ヌクレオチド配列が作動可能に連結している。したがって、プロモーターヌクレオチド配列が配列の転写を誘導する場合、プロモーターヌクレオチド配列は、所与のＤＮＡ配列に作動可能に連結する。同様に、「転写制御下」という語句は、プロモーターがＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するために核酸に対して正しい位置および配向状態にあることを意味する。
【０１１６】
核酸の発現を駆動する任意のプロモーターが用いられる。対象の核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、標的細胞における核酸の発現を誘導することができる限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞を標的とする場合、核酸コーディング領域を、ヒト細胞において発現することができるプロモーターに隣接して、その制御下に置くことが好ましい。一態様では、そのようなプロモーターは、ヒトまたはウイルスプロモーターを含む。一般的なプロモーターとしては、すべてが当業者に周知であり、容易に入手可能であり、対象のコード配列の高レベルの発現を得るために用いられるプロモーターである、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、β−アクチン、ラットインスリンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーターおよびグリセルアリデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターなどがある。対象のコード配列の発現を達成するための当技術分野で周知である他のウイルスまたは哺乳類細胞または細菌ファージプロモーターの使用も、発現のレベルが所与の目的のために十分である限り、企図される。周知の特性を有するプロモーターを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換後の対象のタンパク質の発現のレベルおよびパターンは最適化される。誘導プロモーターの使用も企図される。
【０１１７】
タンパク質発現に用いられる他の調節エレメントは、エンハンサーである。これらは、ＤＮＡの同じ分子上の遠い位置にあるプロモーターによる転写を増大させる遺伝子エレメントである。発現構築物がｃＤＮＡインサートを用いる場合、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を達成するためのポリアデニル化シグナル配列を含めることを一般的に望む。ヒトまたはウシ成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどの、選択されるトランスジェニック動物種の細胞によって認識されるポリアデニル化シグナル配列は、本発明の実施に適している。
【０１１８】
ターミネーターも発現カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増大させ、カセットから他の配列への読み過ごしを最小限にする役割を果たす。本発明により企図されるもののような適用分野における終結領域は比較的置換え可能であると思われるので、終結領域は、便宜上選択される。特定の態様では、終結領域は、転写開始に関して固有であり、他の実施形態では、終結領域は、対象のＤＮＡ配列に固有のものであり、あるいは終結領域は、他の供給源に由来するものである。
【０１１９】
遺伝子治療
発現ベクターは、タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を達成するための遺伝子治療にも用いることができる。一態様では、当業者に公知のいずれかの方法を用いて治療の標的とする細胞に発現構築物を導入する。例えば、発現構築物は、ウイルス送達ベクターの一部を構成する。他の実施形態では、ウイルスを用いない送達が企図される。受容体介した送達も企図される（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、Ｉｎ：  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｒ  Ｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ  Ｄ  Ｔ編、Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ：  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、４６７  ４９２、１９８８年；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、Ｉｎ：  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ（編）、Ｓｔｏｎｅｈａｍ：  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、４９３  ５１３、１９８８年；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、Ｉｎ：  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１１７  １４８、１９８６年；Ｔｅｍｉｎ、Ｉｎ：  ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（編）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１４９  １８８、１９８６年）。
【０１２０】
様々なウイルスベクターを用いてＤＮＡを細胞に導入することができることは、現在広く認識されている。様々な実施形態では、対象の遺伝子を含むウイルスベクターを含む発現構築物は、アデノウイルス（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，８２４，５４４号；米国特許第５，７０７，６１８号；米国特許第５，６９３，５０９号；米国特許第５，６７０，４８８号；米国特許第５，５８５，３６２号参照）；レトロウイルス（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，８８８，５０２号；米国特許第５，８３０，７２５号；米国特許第５，７７０，４１４号；米国特許第５，６８６，２７８号；米国特許第４，８６１，７１９号参照）；アデノ関連ウイルス（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，４７４，９３５号；米国特許第５，１３９，９４１号；米国特許第５，６２２，８５６号；米国特許第５，６５８，７７６号；米国特許第５，７７３，２８９号；米国特許第５，７８９，３９０号；米国特許第５，８３４，４４１号；米国特許第５，８６３，５４１号；米国特許第５，８５１，５２１号；米国特許第５，２５２，４７９号参照）；アデノウイルス−アデノ関連ウイルスハイブリッド（例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，８５６，１５２号参照）またはワクシニアウイルスもしくはヘルペスウイルス（例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，８７９，９３４号；米国特許第５，８４９，５７１号；米国特許第５，８３０，７２７号；米国特許第５，６６１，０３３号；米国特許第５，３２８，６８８号参照）ベクターである。
【０１２１】
ウイルスを用いない遺伝子導入は、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻、４５６〜４６７頁、１９７３年；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、７巻、２７４５〜２７５２頁、１９８７年；Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０巻、６８９〜６９５頁、１９９０年）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５巻、１１８８〜１１９０頁、１９８５年）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、６巻、７１６〜７１８頁、１９８６年；Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻、７１６１〜７１６５頁、１９８４年）、直接マイクロインジェクション（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０１巻、１０９４〜１０９９頁、１９８５年）、ＤＮＡ負荷リポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、７２１巻、１８５〜１９０頁、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７６巻、３３４８〜３３５２頁、１９７９年；Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｓｃｉ  Ａｍ．、２７６巻（６号）、１０２  ６、１９９７年；Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７巻（１５号）、１７９１  ３、１９９６年）、細胞音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８４巻、８４６３〜８４６７頁、１９８７年）、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻、９５６８〜９５７２頁、１９９０年）および受容体を介したトランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６２巻、４４２９〜４４３２頁、１９８７年；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７巻、８８７〜８９２頁、１９８８年；ＷｕおよびＷｕ、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．、１２巻、１５９〜１６７頁、１９９３年）などである。
【０１２２】
リポソーム送達も企図される（Ｒａｄｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５巻（５３０１号）、８１０  ４、１９９７年）。本発明において、「リポフェクション」技術が関与する様々な商業的手法も企図される。リポソームと血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）との複合体化は、細胞膜との融合を促進し、リポソーム封入ＤＮＡの細胞侵入を促進する（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３巻、３７５〜３７８頁、１９８９年）。他の例示的実施形態では、リポソームを、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体化するか、またはそれとのコンジュゲーションに用いる（Ｋａｔｏら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６６巻、３３６１〜３３６４頁、１９９１年）。さらなる実施形態では、リポソームを、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１と複合体化するか、またはそれらとのコンジュゲーションに用いる。そのような発現構築物をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで核酸の導入および発現に用いることに成功した場合、それらの発現構築物を本発明に適用できる。
【０１２３】
受容体媒介遺伝子ターゲッティングビヒクルも有用であり、一般的に細胞受容体特異的リガンドおよびＤＮＡ結合物質の２成分からなる。いくつかのリガンドが受容体媒介遺伝子導入に用いられた。最も広範に特徴付けがなされたリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（ＷｕおよびＷｕ、１９８７年、前出）およびトランスフェリン（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻（９号）、３４１０〜３４１４頁、１９９０年）である。最近、同じ受容体をＡＳＯＲと認識する、合成ネオ糖タンパク質が遺伝子送達ビヒクルとして用いられ（Ｆｅｒｋｏｌら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、７巻、１０８１〜１０９１頁、１９９３年；Ｐｅｒａｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１巻、４０８６〜４０９０頁、１９９４年）、表皮成長因子（ＥＧＦ）も扁平細胞癌細胞に遺伝子を送達するのに用いられた（Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ０２７３０８５）。
【０１２４】
本発明の他の実施形態では、発現構築物は、単に裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドからなっている。構築物の導入は、細胞膜を物理的または化学的に透過性にする上述の方法のいずれかによって行う。これは、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの導入に適用できるが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用にも適用される。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻、７５２９〜７５３３頁、１９８４年）；ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８３巻、９５５１〜９５５５頁、１９８６年）。裸ＤＮＡ発現構築物はまた、粒子ボンバードメントを用いて導入される（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻、７０〜７３頁、１９８７年；Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻、９５６８〜９５７２頁、１９９０年）。
【０１２５】
タンパク質の精製
本発明のＬＰＬＡ２タンパク質を、例えば、本発明の治療法に用いるために精製することが望ましい。タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、１つのレベルにおいて、細胞環境のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への粗分別を必要とする。本発明のＬＰＬＡ２タンパク質／ポリペプチドを他のタンパク質から分離したならば、本発明のＬＰＬＡ２ポリペプチドをクロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製して、部分的または完全な精製（または均一性になるまで精製）を達成する。純ペプチドの調製に特に適する分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率のよい方法は、迅速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。具体例としてのＨＰＬＣ条件は、Ｈｉｒａｏｋａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７７巻、１００９０〜９頁、２００２年に例示されているものを含む。
【０１２６】
本発明の特定の態様は、精製に、また特定の実施形態では、コードされるポリペプチド、タンパク質またはペプチドの実質的精製に関係する。「精製ポリペプチド、タンパク質またはペプチド」という用語は、本明細書では、他の成分から分離された組成物を意味し、ポリペプチド、タンパク質またはペプチドがその天然で得ることができる状態に対してある程度精製されている。精製ポリペプチド、タンパク質またはペプチドは、したがって、それが天然で存在している環境にないポリペプチド、タンパク質またはペプチドも意味する。
【０１２７】
一般的に、「精製」は、他の種々の成分を除去するための分別にかけられたポリペプチド、タンパク質またはペプチド組成物を意味し、組成物がその発現した生物学的活性を実質的に保持している。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この呼びかたは、ポリペプチド、タンパク質またはペプチドが組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上を構成するような組成物の主成分をなす組成物を意味する。
【０１２８】
タンパク質の精製に用いるのに適する様々な技術が当業者に周知である。これらは、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などによる、または熱変性の後の遠心分離による沈殿；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーステップ；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；そのようなおよび他の技術の組合せなどである。当技術分野で一般的に公知であるように、種々の精製ステップを実施する順序は置き替えできる、または特定のステップを省略し、結果として、実質的に精製されたポリペプチド、タンパク質またはペプチドの調製に適する方法となると考えられる。
【０１２９】
遺伝子治療
治療用タンパク質の適切な細胞への送達は、物理的ＤＮＡ導入法（例えば、リポソームもしくは化学的処理）の使用による、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスもしくはレトロウイルス）の使用によるなどの当技術分野で公知のいずれか適切なアプローチの使用によるｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子治療により達成することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療のために、ＬＰＬＡ２をコードする核酸を単独で、またはベクター、リポソームもしくは沈殿物と組み合わせて対象に直接注射することができ、またいくつかの実施形態では、ＬＰＬＡ２化合物の発現が望まれる部位に注射することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ治療のために、対象の細胞を除去し、核酸をこれらの細胞に導入し、改良細胞を直接、または例えば、患者に植え込まれる多孔質膜に封入して対象に戻す。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照のこと。核酸を生存細胞に導入するために利用可能な様々な技術が存在する。技術は、核酸を培養細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入するか、または意図される宿主の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで導入するかによって異なる。核酸を哺乳類細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入するのに適する技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストランおよびリン酸カルシウム沈殿の使用などである。核酸のｅｘ  ｖｉｖｏ送達のために一般的に用いられるベクターは、レトロウイルスである。
【０１３０】
他のｉｎ  ｖｉｖｏ核酸導入技術は、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純疱疹Ｉウイルスまたはアデノ関連ウイルス）によるトランスフェクションおよび脂質ベースのシステムなどである。核酸およびトランスフェクション物質は、場合によって微粒子に結合させる。具体例としてのトランスフェクション物質は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共同沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬによりＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎとして市販されている第四級アンモニウム両親媒性ＤＯＴＭＡ（（ジオレオイルオキシプロピル）臭化トリメチルアンモニウム）（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８４巻、７４１３〜７４１７頁；Ｍａｌｏｎｅら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、６０７７〜６０８１頁）；ペンダントトリメチルアンモニウムヘッドを有する親油性グルタミン酸ジエステル（Ｉｔｏら（１９９０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、１０２３巻、１２４〜１３２頁）；カチオン脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）などの代謝性親脂質（Ｊ．  Ｐ．  Ｂｅｈｒ（１９８６年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２７巻、５８６１〜５８６４頁；Ｊ．  Ｐ．  Ｂｅｈｒら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、６９８２〜６９８６頁）；代謝性第四級アンモニウム塩（ＤＯＴＢ、Ｎ−（１−［２，３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル硫酸（ＤＯＴＡＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジオレオイルエステル、ＣｈｏＴＢ、ＣｈｏＳＣ、ＤＯＳＣ（Ｌｅｖｅｎｔｉｓら（１９９０年）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｉｎｔｅｒ．、２２巻、２３５〜２４１頁）；３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／３ベータ［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールＤＣ−Ｃｈｏｌの１：１混合物（Ｇａｏら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、１０６５巻、８〜１４頁）、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン（Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ、１９９４年、５巻、３８２〜３８９頁）、親油性ポリリシン（ＬＰＬＬ）（Ｚｈｏｕら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、９３９巻、８〜１８頁）、［［（１，１，３，３−テトラメチルブチル）クレソキシ］エトキシ］エチル］ジメチルベンジルアンモニウムヒドロキシド（ＤＥＢＤＡヒドロキシド）と過剰のホスファチジルコリン／コレステロール（Ｂａｌｌａｓら（１９８８年）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、９３９巻、８〜１８頁）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）／ＤＯＰＥ混合物（Ｐｉｎｎａｄｕｗａｇｅら（１９８９年��、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、９８５巻、３３〜３７頁）、グルタミン酸とＤＯＰＥとの親油性ジエステル（ＴＭＡＧ）、ＣＴＡＢ、ＤＥＢＤＡ、臭化ジドデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）およびホスファチジルエタノールアミンとの混合物中のステアリルアミン（Ｒｏｓｅら（１９９１年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１０巻、５２０〜５２５頁）、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（ＴｒａｎｓｆｅｃｔＡＣＥ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）ならびにオリゴガラクトースを有する脂質などである。導入の効率を高める具体例としてのトランスフェクションエンハンサー物質は、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、リソソーム破壊ペプチド（Ｏｈｍｏｒｉ  Ｎ  Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、１９９７年６月２７日、２３５巻（３号）、７２６〜９頁）、コンドロイタンベースのプロテオグリカン、硫酸化プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリシン（Ｐｏｌｌａｒｄ  Ｈら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９８年、２７３巻（１３号）、７５０７〜１１頁）、インテグリン結合ペプチドＣＹＧＧＲＧＤＴＰ、線状デキストラン単糖、グリセロール、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシド間結合で結合させたコレステリル基（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  Ｒ．  Ｌ．、１９８９年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６巻（１７号）、６５５３〜６頁）、リゾホスファチド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミンおよび１−オレオイルリゾホスファチジルコリンなどである。
【０１３１】
いくつかの状況において、核酸含有ベクターを標的細胞に誘導する物質により核酸を送達することが望ましい。そのような「ターゲティング」分子は、標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドなどである。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、ターゲティングのためおよび／または取込みを促進するために用いることができる。そのようなタンパク質の例は、特定の細胞型に対してトロピックであるキャプシドタンパク質およびその断片、繰返しインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を向上させるタンパク質などである。他の実施形態では、受容体媒介エンドサイトーシスを用いることができる。そのような方法は、例えば、Ｗｕら、１９８７年またはＷａｇｎｅｒら、１９９０年に記載されている。現在公知の遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコールのレビューについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９９２年を参照のこと。ＷＯ９３／２５６７３およびその中で引用されている参考文献も参照のこと。遺伝子治療技術のさらなるレビューについては、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻、１２７５〜１２８１頁（１９８９年）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３９２巻６６７９号の増刊、２５〜３０頁（１９９８年）；Ｖｅｒｍａ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、６８〜８４頁（１９９０年）およびＭｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻、４５５４６０頁（１９９２年）を参照のこと。
【０１３２】
ＬＰＬＡ２の酵素活性を測定する方法
上で示したように、本明細書で用いたＬＰＬＡ２タンパク質は、トランスアシラーゼ活性を有する。そのような酵素活性は、当業者に公知のアッセイを用いて容易に測定される。ＬＰＬＡ２タンパク質は、一般的にＰＥおよびＰＣに対して特異的であるので、トランスアシラーゼ酵素アッセイにおける基質は、例えば、これらのリン脂質の１つまたは両方を含む。具体例としての一般的アッセイにおける一態様では、ジオレオイルホスファチジルコリン（６０．５ｍｏｌ％）、ＰＥ（２７．３ｍｏｌ％）およびリン酸ジセチル（１２．３ｍｏｌ％）を含むリポソームを供試酵素に対するアシル基ドナーとして用いる。具体例としてのアッセイにおいて、そのようなリポソームは、クロロホルム中で成分脂質を混合し、混合物を窒素気流中で乾燥することによって形成させる。５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を１ｍｌ／１２８ｎｍｏｌ脂質リンの容積で乾燥脂質に加える。プローブ音波処理装置を用いて、脂質を氷冷浴中で８分間緩衝液中に分散させる。この手順により、酵素アッセイ用のドナーリポソームが形成される。当業者は、同様なリポソームが市販されていることを理解している。
【０１３３】
例えば、６４ｎｍｏｌのリン脂質を含むドナーリポソームを、１０ｎｍｏｌのＮ−アセチルスフィンゴシン（ＮＡＳ）または５ｎｍｏｌの［３Ｈ］ＮＡＳ（１００００ｃｐｍ）、５μｇのウシ血清アルブミンおよびＬＰＬＡ２タンパク質含有調製物とともに５００μｌの総容積の４０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で３７℃でインキュベートする。３ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１）および０．３ｍｌの０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを加えることにより反応を終結させる。８００×ｇで５分間遠心分離した後、下層を他のガラス管に移し、窒素ガスの気流中で乾燥する。次に脂質抽出物を例えば、高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）を用いて分析して、１−Ｏ−アシル−Ｎ−アセチルスフィンゴシン（１−Ｏ−アシル−ＮＡＳ）の存在を確認する。具体例としての実施形態では、ＨＰＴＬＣプレートをクロロホルム／酢酸（９：１）からなる溶媒系で展開する。もちろん脂質異化もガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの他の技術を用いて容易に分析される。
【０１３４】
具体例としての実施形態では、ＨＰＴＬＣアッセイを非放射性ＮＡＳを用いて実施し、ＴＬＣプレートを乾燥し、水／メタノール／濃Ｈ３ＰＯ４（６０：３２：８）中８％（重量／容積）ＣｕＳＯ４五水和物を噴霧し、１５０℃で１５分間炭化する。コンピュータに接続したスキャナー（ＵＭＡＸ  Ａｓｔｒａ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ２２００）によりプレートの像を撮影し、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．６２）によりスキャンして、各バンドの密度を推定する。既知量のセラミドを用いて、標準曲線を得る。放射性ＮＡＳを用いた具体例としてのアッセイで、１−Ｏ−アシル−ＮＡＳをプリムリン噴霧によりＵＶ光下で検出し、こすり落として、計数する。酵素活性の他のアッセイは、当業者に公知であり、所与のＬＰＬＡ２変異体または断片が必要なトランスアシラーゼまたはホスホリパーゼ活性を有するかどうかを決定するために容易に適用される。
【０１３５】
上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイに加えて、当業者はまた、試料をＬＰＬＡ２タンパク質と接触させる前および後の試料中の可染体マクロファージの存在を測定することによって、本明細書で述べたＬＰＬＡ２タンパク質組成物のいずれかの酵素活性を試験する。上のアッセイのいずれかは、可染体マクロファージの細胞内レベルを低下させる治療薬候補をスクリーニングするためにも用いられる。
【０１３６】
ＬＰＬＡ２のモジュレーターをスクリーニングする方法
本発明はまた、ＬＰＬＡ２の活性を増強、増大または刺激する、あるいはＬＰＬＡ２の発現を増加または刺激することにより、可染体マクロファージの細胞内レベルを低下させるさらなる作用物質を特定する方法を予期する。
【０１３７】
本発明のスクリーニングアッセイにおいて、候補物質は、基本的な生化学的活性、例えば、ＬＰＬＡ２活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を最初にスクリーニングし、次に細胞内可染体マクロファージの蓄積を減少させるその能力について試験することができる。この効果を試験するために、可染体マクロファージの蓄積を示す動物モデルは、公知であり、例えば、ＬＰＬＡ２−／−ノックアウトマウスモデルである。
【０１３８】
当技術分野で公知であるマクロファージ欠損の他のマウスモデルも細胞内可染体マクロファージの蓄積を減少させるその能力について候補物質を試験するのに適している。これらのモデルは、Ｒｏマウスモデル（Ｘｕｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１００巻、７５０３〜７５０８頁、２００３年、Ｔｙｒｏ３マウスモデル（Ｌｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３巻、３０６〜３１１頁、２００１年）、ｃ−ｍｅｒマウスモデル（Ｃｏｈｅｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１９６巻、１３５〜１４０頁、２００２年）およびＭＦＧ−Ｅ８マウスモデル（Ｈａｎａｙａｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４巻、１１４７〜１１５０頁、２００４年）を含むが、これらに限定されない。
【０１３９】
ａ．結合アッセイ
予備的には、候補物質は、ＬＰＬＡ２に結合する分子についてスクリーニングすることによって特定することができる。分子の標的への結合は、立体、アロステリックまたは電荷−電荷相互作用のため、それ自体またはそれだけで、刺激性であり得る。いくつかの態様では、これは溶液中で行われ、他の態様では、それは固相で行われ、より高度のスクリーニングアッセイに移る前の特定の化合物を速やかに除去するための第１回のスクリーニングとして用いられる。この種の一実施形態では、配列番号１のＬＰＬＡ２またはその断片に結合する化合物のスクリーニングを提供する。
【０１４０】
ＬＰＬＡ２は、溶液中で遊離であり、支持体に固定され、または細胞内もしくは細胞表面上で発現していてよい。ＬＰＬＡ２またはスクリーニングする化合物を標識し、それにより、結合の測定が可能になる。結合を測定するために遊離の標識と固定された標識の量を測定することができる。
【０１４１】
化合物の高処理能力スクリーニングの手法は、ＷＯ９４／０３５６４に記載されている。多数の小ペプチド試験化合物をプラスチックピンまたは何らかの他の表面などの固体基材上で合成する。ペプチド試験化合物を例えば、ＬＰＬＡ２と反応させ、洗浄する。様々な方法により結合ポリペプチドを検出する。
【０１４２】
ＬＰＬＡ２は、プレート上に直接コーティングすることにより、またはポリペプチドを固相に固定化するための非中和抗体を用いることにより支持体に固定することができる。あるいは、反応性領域（例えば、末端領域など）を含むＬＰＬＡ２融合タンパク質を用いて、ＬＰＬＡ２活性領域を固相に結合させることができる。
【０１４３】
ｂ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
候補物質がＬＰＬＡ２の活性を増強、増大または刺激する能力を測定するアッセイは、ｉ）配列番号１〜２８８のＬＰＬＡ２を候補モジュレーターと接触させ、ｉｉ）前記ＬＰＬＡ２の活性をモニターし、ｉｉｉ）前記候補物質の存在下および非存在下でのＬＰＬＡ２の活性を比較するステップを一般的に含み、前記ＬＰＬＡ２の活性の増加が、候補物質がＬＰＬＡ２活性を増強、増大または刺激することを示す。ＬＰＬＡ２活性を測定するための具体例としてのアッセイは、上の「ＬＰＬＡ２の酵素活性を測定する方法」と題する項で述べている。
【０１４４】
活性および／または発現の有意な変化は、少なくとも約３０％〜４０％の活性の変化により、いくつかの態様では、少なくとも約５０％の変化（より高い値が当然可能である）により示されるものを含む。
【０１４５】
あるいは、候補物質を分離腹膜マクロファージ、例えば、狼瘡の動物モデルからのマクロファージに加え、可染体マクロファージの数または食作用指数を添加候補物質の存在下および非存在下で測定する。
【０１４６】
ｃ．ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
本発明は、様々な動物モデルの使用を特に予期する。上述のように、ＬＰＬＡ２−／−ノックアウトマウスモデルが存在する。狼瘡の他の動物モデルも当技術分野で公知であり、例えば、Ｒｏマウスモデル、Ｔｙｒｏ３マウスモデル、ｃ−ｍｅｒマウスモデルおよびＭＦＧ−Ｅ８マウスモデルである。
【０１４７】
これらの動物の試験化合物による治療は、動物への適切な形態の化合物の投与を必要とする。投与は、経口、鼻、頬または局所を含むが、これらに限定されない、臨床または非臨床目的のために用いることができる経路による。あるいは、投与は、気管内滴注、気管支滴注、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射による。特に予期されるのは、静脈内および候補物質のリンパ組織への局所的送達のための他のメカニズムである。
【０１４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物の有効性の判定は、様々な基準を必要とする。そのような基準は、アポトーシス小体のクリアランス、可染体マクロファージの蓄積の減少、生存、ＳＬＥ関連徴候、症状または合併症の低減および活動を含む一般的身体的状態の改善を含むが、これらに限定されない。これらのマウスの組織について組織学的試験を実施すること、または細胞サイズ、他の形態学的指標もしくはＳＬＥ障害に関与する遺伝子の発現の変化を含む、細胞の分子的および形態学的状態を検査することも可能である。
【０１４９】
本発明のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングアッセイにおいて、化合物をモデル動物にある期間にわたり種々の用量で投与し、可染体マクロファージの蓄積および関連狼瘡様症状の軽減をモニターする。これらの症状の１つまたは複数の改善は、候補物質が有用なモジュレーターであることを示す。
【０１５０】
ｄ．ＬＰＬＡ２の発現の増大のスクリーニング
候補物質を、当技術分野で公知の技術を用いてＬＰＬＡ２の発現を増大させるそれらの能力についてスクリーニングする。例えば、正常にＬＰＬＡ２を発現する細胞または正常にＬＰＬＡ２を発現しない細胞を候補物質とある期間にわたり接触させ、ＬＰＬＡ２  ｍＲＮＡのレベルを、例えば、定量的ＰＣＲ法を用いてモニターする。
【０１５１】
ｅ．候補物質
本明細書では、「候補物質」という用語は、本発明のＬＰＬＡ２のモジュレーターとして作用する可能性があるあらゆる分子を意味する。特定の態様では、候補物質は、タンパク質もしくはその断片、小分子阻害剤または核酸分子である。他の態様では、候補物質は、非特異的転写因子、ＬＰＬＡ２カスケードにおける上流アクチベーター、ＬＰＬＡ２阻害剤の阻害剤、サイレンサー（すなわち、転写を阻害するＤＮＡ結合タンパク質）の阻害剤または天然ＬＰＬＡ２プロモーターをより活性なプロモーターで置換する遺伝子治療である。合理的な薬物デザインは、ホスホリパーゼの公知のモジュレーターとの比較だけでなく、標的分子の構造に関する予測も含む。あるいは、非関連もしくは関連有機化合物の全ライブラリー、またはコンビナトリアル的に発生させたライブラリー（例えば、ペプチドライブラリー）の迅速かつ効率的なスクリーニングが可能である。コンビナトリアルアプローチも第１世代に関連する第２、第３および第４世代の化合物の創出による候補薬物の迅速な進化に適している。
【０１５２】
動物、細菌、真菌、葉および樹皮ならびに海産試料を含む植物源などの天然源から分離された化合物を、潜在的に有用な医薬品の存在について候補としてアッセイする。スクリーニングにかける医薬品は、化学組成物または人工化合物に由来するものでもあり得る、またはそれらから合成することもできることが理解されるであろう。したがって、本発明により特定される候補物質は、ホスホリパーゼＡ２活性の公知のアクチベーターから出発する合理的薬物デザインによりデザインされるポリペプチド、アポリヌクレオチド（ａｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、小分子阻害剤または他の化合物であることが理解される。
【０１５３】
本発明のいくつかの態様では、候補物質は、上述のように調製されるＬＰＬＡ２の変異体である。そのような変異体は、本明細書で述べたアッセイのいずれかを用いてＬＰＬＡ２活性の増加について容易に試験される。本発明の他の態様では、候補物質は、ＬＰＬＡ２の抗イディオタイプ抗体である。抗イディオタイプは、所与のタンパク質に特異的な抗体を産生させ、次いで、そのような抗体を抗原として用いて、抗イディオタイプ抗体を産生させることによって発生させる。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は、最初の抗原の類似体である。ＬＰＬＡ２のような抗原に対する抗体を調製する方法は、当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０００年）ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）に開示されている。抗イディオタイプ抗体は、例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、７巻、４３７頁（１９９３年）を含む、当技術分野で公知の方法により発生させることができる。
【０１５４】
診断方法
本発明はまた、全身性紅斑性狼瘡を診断し、全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を判定し、全身性紅斑性狼瘡の進行をモニターする方法を提供する。そのような方法は、ＬＰＬＡ２自己抗体の存在もしくは非存在について、または低下したもしくは正常なＬＰＬＡ２発現もしくは活性について、患者の体液、細胞または組織試料をアッセイすることを必要とし、ＬＰＬＡ２自己抗体の存在が疾患の診断または疾患に対する感受性を示唆し、低下したＬＰＬＡ２発現もしくは活性が疾患の診断または疾患に対する感受性を示唆する。
【０１５５】
体液試料の例は、血液、血清、血漿、胸水、肺または気管支洗浄液、滑液、腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、骨髄吸引物、リンパ、脳脊髄液、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）、羊水、痰、膀胱洗浄液、精液、尿、唾液および涙液などである。細胞の例は、白血球、ＢもしくはＴリンパ球、腹膜リンパ球、マクロファージまたは樹状細胞などである。組織の例は、脾臓、腎臓、肺、リンパ節または血管からの生検材料などである。適切なアッセイ方法は、当技術分野で周知であり、本明細書における実施例で例示する。
【０１５６】
一態様では、そのような方法は、個体からの試料中のリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）酵素活性の測定を含む。患者の酵素活性レベルは、正常個体と比較することができ、または代わりになるべきこととして、同じ個体の以前のＬＰＬＡ２酵素活性レベルと比較することができる。個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性が、正常個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性と比較して低いことを検出すること（前記正常個体はＳＬＥに罹患していないことが分かっている）は、ＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡の診断、および／またはＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を示唆する。個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性が、同じ個体におけるＬＰＬＡ２酵素活性の以前の測定と比較して低いことを検出することも、ＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡の診断、および／またはＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を示唆する。
【０１５７】
他の態様では、そのような方法は、個体からの細胞または組織におけるＬＰＬＡ２の発現の測定を含む。患者のＬＰＬＡ２発現レベルは、正常個体と比較することができ、または代わりになるべきこととして、同じ個体の以前のＬＰＬＡ２発現レベルと比較することができる。個体におけるＬＰＬＡ２発現レベルが、正常個体におけるＬＰＬＡ２発現レベルと比較して低いことを検出すること（前記正常個体はＳＬＥに罹患していないことが分かっている）は、ＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡の診断、および／またはＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を示唆する。個体におけるＬＰＬＡ２発現レベルが、同じ個体における以前のＬＰＬＡ２発現レベルと比較して低いことを検出することも、ＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡の診断、および／またはＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を示唆する。
【０１５８】
さらに他の態様では、そのような方法は、個体からの試料中のリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）自己抗体の検出を含む。個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体が、正常個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体と比較して高いことを検出すること（前記正常個体はＳＬＥに罹患していないことが分かっている）は、ＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡の診断、および／またはＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を示唆する。個体からの試料中のＬＰＬＡ２自己抗体が、同じ個体におけるＬＰＬＡ２自己抗体の以前のレベルと比較して高いことを検出することは、ＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡の診断、および／またはＳＬＥもしくは全身性紅斑性狼瘡に対する感受性を示唆する。
【０１５９】
さらなる態様では、本発明は、個体におけるＳＬＥまたは全身性紅斑性狼瘡または関節リウマチの進行をモニターする方法を提供する。そのような方法は、個体からある期間にわたり採取した試料中のＬＰＬＡ２酵素活性のレベル、またはＬＰＬＡ２発現のレベル、またはＬＰＬＡ２自己抗体のレベルの定期的な測定を含む。レベルは、１週間、２週間、３週間ごと、または月１回、または２、３、４、５、６もしくは１２カ月ごとに測定することができる。ある期間にわたるＬＰＬＡ２酵素活性のレベルの低下、またはある期間にわたるＬＰＬＡ２発現のレベルの低下、またはある期間にわたるＬＰＬＡ２自己抗体のレベルの増加は、全身性紅斑性狼瘡の進行を示唆する。
【０１６０】
関連する態様では、本発明は、ＳＬＥまたは全身性紅斑性狼瘡または関節リウマチの薬物療法の有効性をモニターする方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、体外から投与されたＬＰＬＡ２酵素、またはその断片、変異体もしくは誘導体のレベルをモニターすることを必要とする。他の実施形態では、そのような方法は、個体からある期間にわたり採取した試料中のＬＰＬＡ２酵素活性のレベル、またはＬＰＬＡ２発現のレベル、またはＬＰＬＡ２自己抗体のレベルの定期的な測定を含む。レベルは、１週間、２週間、３週間ごと、または月１回、または２、３、４、５、６もしくは１２カ月ごとに測定することができる。ある期間にわたるＬＰＬＡ２酵素活性のレベルの増加、またはある期間にわたるＬＰＬＡ２発現のレベルの増加、またはある期間にわたるＬＰＬＡ２自己抗体のレベルの低下は、療法の有効性を示唆する。
【０１６１】
あるいは、そのような方法は、発現または活性の低下をもたらすＬＰＬＡ２遺伝子の多形の存在または非存在を決定することを必要とし、そのような多形の存在が疾患の診断または疾患に対する感受性を示唆する。そのような方法は、試料のＤＮＡまたはＲＮＡを増幅することを場合によって必要とする。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡまたはＲＮＡをオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションを検出すること、（ｂ）電気泳動分析、（ｃ）制限断片長多形分析および（ｄ）ヌクレオチド配列分析を含む当技術分野で公知の手段によって実施することができる。ハイブリダイゼーションのために、プローブを、核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で試料からのＤＮＡと接触させる。「特異的ハイブリダイゼーション」は、本明細書では、正確なハイブリダイゼーション（例えば、ミスマッチのない）を示す。特異的ハイブリダイゼーションは、高緊縮条件または中緊縮条件、好ましくは高緊縮条件下で行うことができる。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．ら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓを参照のこと。あるいは、プローブを特異的ハイブリダイゼーション条件下で試料のＲＮＡと接触させて、多形または特定のスプライシング変異体の存在を確認する。核酸の突然変異または多形が制限部位の形成または除去をもたらす場合、制限消化による突然変異分析を用いて、多形を検出することができる。おそらくフランキング配列を含むＤＮＡを増幅し、多形により形成または除去された制限部位で切断する制限酵素で消化する。ＲＦＬＰ分析は、当技術分野で公知のように行う（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、前出を参照）。当該ＤＮＡ断片の消化パターンは、多形の存在または非存在を示す。当該ＤＮＡまたはＲＮＡの配列決定および正常遺伝子配列との比較を用いて多形を検出することもできる。増幅ＤＮＡまたはＲＮＡと対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブとのドットブロットハイブリダイゼーション（例えば、Ｓａｉｋｉ  Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４巻、１６３〜１６６頁（１９８６年）を参照）も当技術分野で公知である。「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」（本明細書で「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ」とも呼ぶ）は、疾患に関連する多形を含む遺伝子と特異的にハイブリダイズする、約１０〜５０塩基対、例えば、約１５〜３０塩基対のオリゴヌクレオチドである。
【０１６２】
自己免疫障害を処置する方法
本明細書を通して述べたように、ＬＰＬＡ２タンパク質を用いてアポトーシス小体のクリアランスを改善し、かつ／または細胞内可染体マクロファージの蓄積を減少させることが発見された。したがって、本発明は、可染体マクロファージの蓄積の症状を示す障害の処置に用いる所望の生物学的活性を保持している配列番号１〜２８８のＬＰＬＡ２または断片、変異体もしくは誘導体を提供する。関連する態様では、本発明は、ＬＰＬＡ２の活性を増強、増大または刺激する、あるいはＬＰＬＡ２の発現を増加または刺激することにより、可染体マクロファージの細胞内レベルを低下させる作用物質を用いる処置の方法を提供する。
【０１６３】
特定の態様では、本発明の方法は、全身性紅斑性狼瘡、薬物誘発性狼瘡、新生児狼瘡および皮膚狼瘡を含む、ＳＬＥの処置に有用である。しかし、一態様では、本発明の方法は、関節リウマチなどの他の自己免疫障害を含む、細胞内可染体マクロファージの蓄積において発現するあらゆる障害の処置に有用であることを理解すべきである。本発明はまた、上述の障害の処置用の薬剤の調製における本明細書で述べる治療薬のいずれかの使用を特に考慮する。
【０１６４】
ＬＰＬＡ２関連組成物の単独での、または他の治療法と組み合わせての投与によって適切な治療結果を達成するために、一般的に有効量の治療用タンパク質組成物を対象に投与する。「有効量」は、所望の治療結果、すなわち、疾患の徴候または症状または合併症の１つまたは複数の軽減を再現性よくもたらすのに有効な量である。
【０１６５】
本発明によるこれらの組成物の投与は、標的組織が当該経路により到達可能な限り、いずれかの経路によるものである。しかし、他の通常の投与経路、例えば、非経口、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、硬膜下腔内、眼内、眼球後、肺内、気管内滴注、気管支滴注、エアゾール、舌下、経口、鼻、肛門、膣、または経皮送達、または特定の部位における外科的埋め込み。特に予期されるのは、静脈内および候補物質の局所的にリンパ組織への送達の他のメカニズムである。
【０１６６】
処置は、単回投与またはある期間にわたる複数回の投与からなっていてよい。組成物の投与は、全身的または局所であってよく、治療上有効量のＬＰＬＡ２タンパク質組成物の単一部位注射または注入を含んでいてよい。あるいは、治療用組成物を複数の部位で患者に送達することが予期される。複数回の投与は、同時に行ってよく、またはある期間にわたって投与してよい。付加的治療は、定期的、例えば、毎日、週１回または月１回行ってよい。
【０１６７】
特定の実施形態では、治療用化合物の非経口投与は、薬品の治療循環レベルを維持するために、初回ボーラスに続く持続注入により行う。当業者は、適切な医療慣行（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）および個々の患者の臨床状態により決定される有効量および投与法を容易に最適化する。
【０１６８】
投与頻度は、作用物質の薬物動態パラメーターおよび投与経路に依存する。投与経路によって、適切な用量は、体重、体表面積または臓器サイズに従って計算する。動物モデルの利用可能性は、所与の治療薬の適切な用量の決定を促進するうえで特に有用である。一態様では、用量は、本明細書で述べたＬＰＬＡ２−／−ノックアウトマウスモデルなどの動物モデルを用いて決定し、修正し、高等哺乳動物における使用に適応させる。
【０１６９】
適切な治療用量を決定するために必要な計算のさらなる改善は、必要以上の実験なしに当業者によって常法により行われる。最終的な投与レジメンは、薬物の作用を変化させる因子、例えば、薬物の比活性、障害の重症度および患者の反応性、患者の年齢、状態、体重、性および食事、感染の重症度、投与の時間、もしあるならば、併用治療の種類、投与頻度および所望の効果の種類ならびに他の臨床的因子を考慮して担当医が決定する。試験を行うとき、特定の疾患および状態に対する適切な用量レベルおよび処置の期間に関するさらなる情報が明らかになる。
【０１７０】
特定の実施形態では、組成物を単独で投与し、他の実施形態では、組成物を、疾患を対象とする、またはその他の症状を対象とする他の治療薬とともに投与する。用量レベルは、１日当たり体重１キログラム当たり約０．０１ｍｇ〜３０ｍｇ、例えば、約０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ程度である。
【０１７１】
本発明の医薬組成物および処置方法はヒト医療および動物医療の分野で有用であることは、十分に理解されるであろう。したがって、処置を受ける対象は、ヒトまたは他の哺乳類の動物などの哺乳動物である。獣医学的目的のために、対象は、例えば、乳牛、羊、豚、馬および山羊を含む家畜動物、犬および猫などのペット動物、外来および／または動物園動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターを含む実験動物；ならびにニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウなどの家禽を含む。処置を受ける患者は、あらゆる年齢、例えば、１０〜５０歳、２０歳以下または１０歳以下である。
【０１７２】
さらに、本発明のペプチド／タンパク質ベースの組成物は、可染体マクロファージの異常な蓄積に関連する障害に対して現在の療法と併用されることが予期される。例えば、特定の実施形態では、本発明の方法は、公知のＳＬＥ療法との併用で有用であることが予期される。ＬＰＬＡ２またはその断片、変異体もしくは誘導体を含む組成物は、そのような療法の前、後または施行中に投与する。
【０１７３】
ＳＬＥを処置するための他の作用物質または薬物による併用療法は、アスピリン、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ）、ナプロキセン（Ｎａｐｒｏｓｙｎ）およびスリンダック（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ）などの抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）、バルデコキシブ（Ｂｅｘｔｒａ）およびメロキシカム（Ｍｏｂｉｃｏｘ）などのシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロンおよびデキサメタゾンなどのコルチコステロイド、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ）、ミコフェニレートモフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ）、クロロキン（Ａｒａｌｅｎ）、キナクリン、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、ダプソン、レチノイン酸（Ｒｅｔｉｎ−Ａ）、プラスマフェレシス、メトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｔｒｅｘａｌｌ）、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）およびシクロスポリン（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ）などの細胞障害性薬ならびに副刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）ブロッカーＣＴＬＡ４１Ｇを含むが、これらに限定されない。本明細書で予期される併用療法、すなわち、ＬＰＬＡ２ベースの組成物とＳＬＥ薬との組合せは、一態様では、可染体マクロファージの蓄積の減少をもたらすのに有効な総量で投与する。いくつかの態様でのそのような併用投与は、細胞内可染体マクロファージの蓄積に関連する１つまたは複数の徴候、症状または合併症を軽減する。
【０１７４】
医薬組成物
本発明による投与用の医薬組成物は、少なくとも１つのＬＰＬＡ２由来タンパク質（例えば、配列番号１〜２８８のタンパク質、その変異体もしくは誘導体または可染体マクロファージの異化を刺激する他のＬＰＬＡ２由来タンパク質）を含み得る。医薬組成物はまた、ＳＬＥの処置に用いられる他の作用物質、例えば、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイドまたは細胞障害性薬を含む。これらの製剤のそれぞれは、いくつかの態様では、薬学的に許容される担体と場合によって組み合わされた薬学的に許容される形態で提供される。これらの組成物は、好ましくは滅菌済みであり、それらの所期の目的を達成するいずれかの方法により投与することができる。
【０１７５】
当該組成物は、例えば、経口投与による、経粘膜投与（肺および鼻投与を含む）、非経口投与（皮下投与を含む）、経皮（局所）投与または直腸投与による様々な投与経路、ならびに硬膜下腔内、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻内、眼内または脳室内注射用に製剤化することができる。本発明の化合物または複数の化合物は、徐放性製剤としての注射のように、全身的でなく局所に投与することもできる。
【０１７６】
最適な製剤は、当業者により投与経路および所望の用量によって決定される。そのような処方は、投与薬の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの放出の速度およびｉｎ  ｖｉｖｏでのクリアランスに影響を及ぼす可能性がある。
【０１７７】
本明細書で述べた代表的な剤形のほかに、薬学的に許容される賦形剤および担体は、一般的に当業者に公知であり、したがって、本発明に含まれる。そのような賦形剤および担体は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙに記載されている。
【０１７８】
非経口投与用の注射剤形は、一般的に適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて調製することができる、水性懸濁剤または油懸濁剤を含む。一般的に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物に有害である可能性ある他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを必要とする。注射剤は、溶液相の形であるか、または溶液として再構成するのに適する凍結乾燥粉末として提供することができる。両方が溶媒または希釈剤を用いて調製される。許容される溶媒またはビヒクルは、滅菌水、リンゲル液または等張性食塩水溶液などである。あるいは、滅菌済み油を溶媒または懸濁化剤として用いることができる。一般的に、天然または合成油、脂肪酸、モノ、ジもしくはトリグリセリドを含む油または脂肪酸は、不揮発性である。注射については、製剤は、安定化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、生物学的利用能調節剤およびこれらの組合せを場合によって含んでいてよい。化合物は、ボーラス注射または持続注入によるような注射による非経口投与用に製剤化することができる。注射用単位剤形は、アンプルまたは多数回投与用容器入りであってよい。
【０１７９】
本発明の製剤は、下記のように短時間作用性、速放性、長時間作用性および徐放性であるようにデザインすることができる。したがって、医薬製剤は、放出制御または徐放性用に製剤化することができる。当該組成物は、例えば、ミセルもしくはリポソーム、またはある種の他の封入された形態を含んでいてよく、あるいは長時間貯蔵および／または送達効果をもたらすために長時間放出製剤として投与してよい。したがって、医薬製剤は、ペレットまたはシリンダーに圧縮し、デポ注射剤として、またはステントなどのインプラントとして筋肉内または皮下に埋め込むことができる。そのようなインプラントは、シリコーンおよび生分解性ポリマーなどの公知の不活性材料を用いてよい。
【０１８０】
有効量を含む上の剤形のいずれかは、常用の実験の範囲内にあり、したがって、本発明の範囲内にある。
【０１８１】
本発明の範囲内の組成物は、有効量の本発明による少なくとも１つのＬＰＬＡ２由来タンパク質を含むすべての組成物を含む。いくつかの態様では、そのような処置は、上述のＳＬＥの１つまたは複数の徴候または症状または合併症の軽減をもたらす。
【０１８２】
組成物を安定にし、標的部位における組成物の取込みを可能にするために適切な塩および緩衝剤を用いることを一般的に望む。一般的に、本発明のタンパク質組成物は、投与前に再構成すべき凍結乾燥された形態で提供する。治療薬の再構成用の緩衝液および溶液は、投与のための本発明の水性組成物を産生するために医薬製剤とともに提供することができる。そのような水性組成物は、有効量の用いられるそれぞれの治療薬を含み、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散される。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与したとき、有害、アレルギーまたは他の都合の悪い反応を引き起こさない分子実体および組成物を意味する。本明細書では、「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒体または作用物質が治療用組成物と不適合性である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が予期される。さらに、補助的な有効成分が組成物中に組み込まれる。
【０１８３】
治療のための投与のためにタンパク質およびペプチドを製剤化する方法もまた、当技術分野で公知である。特定の実施形態では、活性化合物は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された遊離塩基または薬理学的に許容される塩の水中溶液として投与用に調製する。分散体もグリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中ならびに油中のものを調製する。貯蔵および使用の通常の条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【０１８４】
注射に適する医薬製剤は、滅菌済み水性溶液または分散体および滅菌済み注射用溶液または分散体の即時調製用の滅菌済み粉末を含む。すべての場合に、製剤は、無菌性でなければならず、容易なシリンジ操作可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流体でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。いくつかの態様では、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物ならびに植物油を含む溶媒または分散媒である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散体の場合に要求される粒径を維持することにより、界面活性剤を使用することにより維持される。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされる。多くの場合に、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中で用いることによってもたらされる。
【０１８５】
滅菌注射液は、必要な量の活性化合物を必要に応じて上に挙げた他の様々な成分を含む適切な溶媒に組み込んだ後、濾過滅菌を行うことによって調製する。一般的に、分散体は、様々な滅菌済み有効成分を基本的分散媒および上に挙げたものからの必要な他の成分を含む滅菌済みビヒクルに組み込むことによって調製する。滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合、調製の方法は、有効成分および以前に滅菌濾過済みの溶液からの追加の所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１８６】
いくつかの態様では、本発明の組成物は、中性または塩形で製剤化されている。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により生成）であり、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により生成するものである。遊離カルボキシル基により生成する塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基由来である。
【０１８７】
製剤化後、溶液は、剤形と適合するように、治療上有効であるような量で投与する。製剤は、注射液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液は、必要ならば適切に緩衝し、液体希釈剤は、最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする。これらの個々の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。
【０１８８】
「単位用量」は、適切な担体中に分散した治療用組成物の個別的な量と定義される。
【０１８９】
本発明はまた、可染体マクロファージの細胞内蓄積、例えば、ＳＬＥまたは全身性紅斑性狼瘡の処置に用いるキットを予期する。そのようなキットは、薬学的に許容される担体中に上述のタンパク質／ペプチドを含む少なくとも第１の滅菌済み組成物を含む。他の成分は、場合によって障害の治療用の第２の治療薬ならびに治療用組成物の投与用の適切な容器およびビヒクルである。キットはさらに、懸濁化、希釈用、または第１および第２の組成物の送達を行うための溶液または緩衝液を含んでいてよい。キットはさらに、本発明の方法に用いられる１つまたは複数の組成物の送達のためのカテーテル、シリンジまたは他の送達機器を含んでいてよい。キットはさらに、治療レジメンに関する投与プロトコールを含む指示書を含んでいてよい。
【０１９０】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を示し、さらに例示するために示すものであり、その範囲を制限すると解釈すべきでない。
【実施例】
【０１９１】
（実施例１）
ＬＰＬＡ２−／−ノックアウトマウスの特徴付け
二重条件付き遺伝子ターゲティングを使用してＬＰＬＡ２の機能を解明した。ホスホリパーゼＡ２活性に必須のリパーゼモチーフをコードするＬＰＬＡ２遺伝子のエキソン５の全身欠失によってＬＰＬＡ２欠損マウス（ＬＰＬＡ２−／−）を作製した（Ｈｉｒａｏｋａ，  Ｍ．、Ａｂｅ，  Ａ．、Ｌｕ，  Ｙ．、Ｙａｎｇ，  Ｋ．、Ｈａｎ，  Ｘ．、Ｇｒｏｓｓ，  Ｒ．  Ｗ．、およびＳｈａｙｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６巻：６１３９〜６１４８頁、２００６年）。ＬＰＬＡ２−／−マウスの生存率は、正常であった。ＬＰＬＡ２−／−マウスの交配対が正常な産子数を生むことから、遺伝子欠損が出生力または妊孕力を損なわないことが示された。野生型の肺胞マクロファージは、放射性標識されたホスファチジルコリンを直ちに分解したが、ＬＰＬＡ２−／−マウスでは分解しなかった。月齢３カ月までに、ＬＰＬＡ２−／−マウスの肺胞マクロファージ、腹腔マクロファージおよび脾臓中に、リン脂質、特にホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンの著しい蓄積が認められた。ＬＰＬＡ２−／−マウスの肺胞および腹腔マクロファージの超微細構造検査により、細胞リン脂質症の特徴である層状封入体とともに泡沫細胞の出現が明らかになった。肺胞マクロファージでは、ＬＰＬＡ２ｍＲＮＡおよびタンパク質の非常に高い発現が認められていたため、この発見は意外ではなく、サーファクタント異化にＬＰＬＡ２が果たす役割と一致していた（Ａｂｅ，  Ａ．、Ｈｉｒａｏｋａ，  Ｍ．、Ｗｉｌｄ，  Ｓ．、Ｗｉｌｃｏｘｅｎ，  Ｓ．  Ｅ．、Ｐａｉｎｅ，  Ｒ．，  ３ｒｄ、およびＳｈａｙｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９巻：４２６０５〜４２６１１頁、２００４年）。
【０１９２】
月齢６カ月までに、ＬＰＬＡ２欠損マウスは、リンパ増殖の徴候を起こし始めた。脾臓腫大は、リンパ節腫張のように容易に見てとれた。月齢１８カ月までに、脾臓は野生型マウスから得られる脾臓重量の１０倍を超え、びまん性リンパ節症が容易に見てとれた。雌マウスは、雄マウスよりも臓器重量増加に関して極めて大きい傾向を示した。月齢２０カ月までには、皮下脂肪の減少からも明らかなようにノックアウトマウスに衰弱の徴候を伴う体重減少が現れた（図２）。リンパ器官の組織学的分析により、泡沫細胞表現型を伴うマクロファージの存在および間質構造の消失が明らかになった（図３）。脾臓リンパ細胞のフローサイトメトリー分析により、Ｂ細胞およびＴ細胞両方の多クローン性増殖が明らかになった。
【０１９３】
ＬＰＬＡ２−／−マウスの腎臓の組織学的分析から、「フルハウス」型の沈着を伴う免疫複合体性糸球体腎炎の存在が明らかになった。ＬＰＬＡ２−／−マウスは、増殖性の変化および毛細血管係蹄の開通性の消失を示し、これは増殖性糸球体腎炎と一致した。対応する透過型電子顕微鏡写真により、足突起消失、免疫複合体沈着および電子密度の高いアポトーシス小体の存在が示された。蛍光抗体法により、欠損マウス（ＬＰＬＡ２−／−）の糸球体においては、野生型マウス（ＬＰＬＡ２＋／＋）と比べてＩｇおよびＣ１ｑの沈着が増加していることが示された（図４Ａ）。透過型電子顕微鏡写真によって、メサンギウム、上皮下および内皮下領域を含めた様々な糸球体区画における免疫複合体の沈着が、明らかになった。血清免疫グロブリンレベルは高齢マウスにおいて著しく上昇し、ＡＮＡの存在と同時に（図４Ｃ）、抗ｄｓＤＮＡ力価も年齢に依存して有意に上昇した（図４Ｂ）。その脾臓は、多数の増大したマクロファージおよび大量の可染体マクロファージの存在によって特徴付けられ、アポトーシス細胞を除去することができないことと一致した（図４Ｄ）。ＫＯ  ＬＰＬＡ２−／−マウスの脾臓凍結切片にＣＤ６８（赤色）染色およびＴＵＮＥＬ染色法（緑色）を用いてアポトーシス小体染色を行った（図４Ｄ）。
【０１９４】
ＬＰＬＡ２の主要な作用機序は細胞外リン脂質を分解して、遊離脂肪酸、リゾホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジルエタノールアミン（ｌｙｓｏ−ｐｈｏｓｐｈａｒｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｍｉｎｅ）を形成することである。リガンドによって活性化された後にＬＰＬＡ２はマクロファージから分泌され、続いてマクロファージ上のマンノース受容体に結合し、リソソームに戻される。ＬＰＬＡ２の取込みおよびリソソームとの共局在化を評価するために、ＬＰＬＡ２−／−ＫＯマウス由来のマクロファージを組換えＬＰＬＡ２で処理し、固定して、抗ＬＰＬＡ２モノクローナル抗体（緑色）（図５Ａ）またはリソソームマーカーであるＬＡＭＰ−１に対する抗体（赤色）（図５Ｂ）を用いて染色した。図５Ｃは、図５Ａと図５Ｂの重ね合わせを示し、図で黄色はＬＰＬＡ２とリソソームの共局在化を示している。
【０１９５】
１８カ月およびさらに高齢のマウスにおけるさらなる変化として、腎不全およびタンパク尿の発症があった。図６は、ＬＰＬＡ２−／−マウスにおける２４時間のタンパク質排出量が、野生型マウスと比較して２倍超上昇していることを示している。クレアチニン濃度も、ＬＰＬＡ２＋／＋マウス（０．２５±０．０６）に対してＬＰＬＡ２−／−マウス（０．６３±０．２２）において上昇していた。
【０１９６】
（実施例２）
アポトーシス小体の消化障害は、ＬＰＬＡ２−／−マウス由来の腹膜マクロファージにおいても再現される可能性がある
ＬＰＬＡ２−／−ノックアウトマウスの脾臓および糸球体内のアポトーシス小体の出現が、取り込まれたアポトーシス細胞の消化の全身における欠損に起因するのかどうか決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＰＬＡ２欠損を繰り返した。
【０１９７】
１年齢の野生型および欠損型マウスに腹腔内チオグリコレート注射した後に、腹腔マクロファージを採取した。胸腺細胞を回収し、デキサメタゾンで２４時間処理することによりアポトーシスを誘導した。ＬＰＬＡ２＋／＋（ＷＴ）およびＬＰＬＡ２−／−（ＫＯ）のマクロファージを野生型アポトーシス胸腺細胞とともに０．５、１、２および４時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを洗浄し、抗ＣＤ６８およびＴＵＮＥＬを用いてマクロファージを共染色して残ったアポトーシス小体を測定した（図７Ａ〜７Ｈ）。野生型および欠損型のマクロファージ間で取り込まれたアポトーシス小体の摂取率あるいは最高数に差異は観察されなかった。しかし、４時間目にＬＰＬＡ２−／−マクロファージ中のアポトーシス小体の持続性に著しい差異が観察された（図７Ｈ）。食作用指数として表した場合、野生型および欠損型マクロファージの間に極めて有意な差が観察された（図８）。
【０１９８】
Ｂ細胞およびＴ細胞の刺激アッセイを利用して、ＬＰＬＡ２−／−マウスおよびＬＰＬＡ２＋／＋マウスの間の応答性に差異があるかどうか解明した。８カ月齢の雌マウスの脾臓からＢ細胞およびＴ細胞を単離し、ＣＤ４０（図９Ａ）、ＣＤ３（図９Ｂ）、およびＣＤ３とＣＤ２８（図９Ｃ）に対する抗体を用いて刺激して、Ｂ細胞刺激、Ｔ細胞刺激またはＴ細胞副刺激をそれぞれ測定した。単離および刺激の３日後に、トリチウム化チミジンの取込みによって細胞増殖を測定した。ＣＤ４０に対するＢ細胞の応答性に差異は観察されなかった。しかしＬＰＬＡ２−／−Ｔ細胞は、ＣＤ３による直接刺激およびＣＤ３とＣＤ２８による副刺激の両方に対して応答が小さかった（図９Ｂおよび図９Ｃ）。この後者の応答は、Ｇ２Ａノックアウトマウスにおいて報告された応答と対照的である。自家、同系および同種刺激を使用して混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイも実施した（図９Ｄ）。同種刺激に対するＬＰＬＡ２−／−応答は、野生型Ｔ細胞において観察された応答よりも有意に低かった。これは、狼瘡患者におけるＭＬＲ活性が低下することを実証するいくつもの研究が報告されてきたという点で重要になり得る（Ｋｕｎｔｚら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６３巻（１号）：１５１〜１５３頁、１９７９年）。
【０１９９】
（実施例３）
ＬＰＬＡ２は、活性化後にマクロファージから分泌され、マンノース受容体を介してマクロファージの中に再び取り込まれる
ＬＰＬＡ２は、リガンドによる活性化後にマクロファージから分泌されると報告されている（Ａｂｅら、Ｊ  ｌｍｍｕｎｏｌ  １８１巻：７８７３〜７８８１頁、２００８年）。例えば、ザイモサンの結合および食作用の結果、肺胞マクロファージからＬＰＬＡ２が時間依存的に放出される。
【０２００】
ＬＰＬＡ２−／−マウス由来のマクロファージが組換えＬＰＬＡ２を認識し、取り込み、輸送することができるかを以下の通り調べた。ＬＰＬＡ２欠損肺胞マクロファージを、Ｈｉｓタグ付きマウスＬＰＬＡ２に０．３〜１０μｇ／ｍＬの間の異なる濃度で１日間曝露した。細胞の取込みを、抗Ｈｉｓ抗体またはＬＰＬＡ２に対するモノクローナル抗体を使用したウェスタンブロット法および共焦点顕微鏡によって測定した。細胞内ＬＰＬＡ２の濃度依存的増加を、酵素活性測定により容易に検出し確認した。処理した細胞を抗ＬＰＬＡ２抗体およびＬａｍｐ−１抗体の両方で染色した場合には、組換え酵素とリソソームタンパク質の共局在化を容易に検出した。
【０２０１】
組換えＬＰＬＡ２のこの認識および取込みが、マンノース対マンノースリン酸受容体による認識を通しているかどうか解明するために、１０ｍＭα−メチル−マンノシドまたは１０ｍＭマンノース−６−リン酸の存在下で取込み実験を繰り返した。α−メチル−マンノシドは、細胞内１−Ｏ−アシル−セラミドシンターゼ活性、免疫ブロット、および共焦点顕微鏡によって測定した通りＬＰＬＡ２の取込みを遮断したが、マンノース−６−リン酸は遮断しなかった。最終的に組換え酵素が細胞内表現型を「救済」する能力は、細胞内リン脂質の含有量を測定することによって確認した。細胞中のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの濃度依存的減少が観察された。触媒能のない酵素は、リン脂質レベルを低下させなかった。
【０２０２】
総括するとこれらのデータは、ＬＰＬＡ２がザイモサンに応答したマクロファージによって分泌され、分泌された後にマンノース受容体依存的過程によって回収され得ることを裏付けている。これらのデータは、ＬＰＬＡ２の主要な作用機序が、細胞外リン脂質を分解して遊離脂肪酸類、リゾＰＣおよびリゾＰＥを生成することである可能性も提起している。
【０２０３】
（実施例４）
陽イオン性両親媒性薬物がＬＰＬＡ２活性を阻害し、細胞リン脂質症を引き起こす
セラミド類似体である１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）は、細胞のリソソーム分画に局在するセラミドの酸性アシル基転移を阻害することが認められている。ＰＤＭＰは、陽イオン性両親媒性薬物として化学的に特徴付けられた薬物と構造的に似ている。このような陽イオン性両親媒性薬物が、類似の機構を経て細胞リン脂質症の原因になり得る可能性を次の通りに試験した。
【０２０４】
ＭＤＣＫ細胞を、陽イオン性両親媒性薬物であるＰＤＭＰ、アミオダロンおよびテトラサイクリンで１日または７日間処理した。ＬＰＬＡ２活性を、Ｎ−アセチルスフィンゴシンのアシル基転移として測定した。アミオダロンは、リン脂質症（およびＳＬＥ）を引き起こす原型となる作用物質である。テトラサイクリンは、狼瘡ともリン脂質症とも関連性がないと分かっている。セラミドアシル基転移で測定した通り、アミオダロンおよびＰＤＭＰは両方ともＬＰＬＡ２活性の濃度依存的阻害に関連していた（図１０Ａ）。アミオダロンおよびＰＤＭＰは、酵素阻害に対して同程度のＩＣ５０を示したが、テトラサイクリンは示さなかった。テトラサイクリンには阻害効果はなかった。アミオダロン処理は時間依存的に細胞中のリン脂質、特にＰＣおよびＰＥの増加ももたらした。主要な細胞リン脂質を、１日または７日間ＣＡＤに曝露した後にアッセイした。処理７日目までに、ＬＰＬＡ２の基質であるＰＥとＰＣでは非常に大きな変化が観察されたが、スフィンゴミエリン（ＳＭ）では全く変化が観察されなかった（図１０Ｂ）。
【０２０５】
アミオダロンおよび他の陽イオン性両親媒性物質によるＬＰＬＡ２活性の阻害は、拮抗的または非拮抗的効果によってこれらの薬物が酵素に直接結合した結果である可能性があった。代替機構は、ＬＰＬＡ２と陰イオン性リソソーム膜との間の静電的相互作用の崩壊であると考えられた。リソソーム膜は、酸性細胞器官、特に後期エンドソームおよびリソソーム中にのみ見られる陰イオンリン脂質であるリゾビスホスファチジン酸の存在によって特徴付けられている。
【０２０６】
この可能性を解決するために、ＬＰＬＡ２の１−Ｏ−アシルセラミドシンターゼ活性をリポソームにおいて試験したが、そのリポソーム中の陰イオン性脂質含有量を、負の電荷をもち、ＬＰＬＡ２の基質にならない硫酸含有糖脂質であるスルファチドの添加によって変えた。リポソームの基材としてジオクタノイル−ＰＣ（ＤＯＰＣ）を使用した。反応混合物は、４８ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、リポソーム（１２７μＭリン脂質）、１４．５ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＬＰＬＡ２を全容量５００μＬに含んでいた。ＤＯＰＣ／ＮＡＳ（モル比３：１）またはＤＯＰ／スルファチド／ＮＡＳ（モル比３：０．３：１）からなるリポソームを、酵素と一緒に３７℃で５、１０、１５、３０、および４５分間インキュベートした。その反応生成物を抽出し、クロロホルム／酢酸（９：１、ｖ／ｖ）からなる溶媒系を使用したＨＰＴＬＣプレートによって分離した。プレートをスキャンして定量した反応生成物である１−Ｏ−オレオイル−ＮＡＳを、時間に対してプロットした（図１１Ａ）。異なるモル比のＤＯＰＣ／ガラクトシルセラミド／ＮＡＳまたはＤＯＰＣ／スルファチド／ＮＡＳからなるリポソームを、組換え酵素と一緒に３７℃でインキュベートした（図１１Ｂ）。スルファチドの存在下でのアシル基転移活性は時間依存的に増加し、その活性はスルファチドのモル比に応じて増加することが観察された（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。
【０２０７】
（実施例５）
陽イオン性両親媒性薬物は、ＬＰＬＡ２と陰イオン性脂質膜との間の静電的相互作用を妨げる
ＬＰＬＡ２酵素活性およびＬＰＬＡ２とリポソームの間の静電的相互作用に対するイオン強度、ｐＨおよびアミオダロンの効果を決定した。
【０２０８】
反応混合物は、０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ、４８ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、リポソーム（１２７μＭリン脂質）および１４．５ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＬＰＬＡ２（＋）、またはマウスＬＰＬＡ２（＋）をトランスフェクトしたＭＤＣＫ細胞から採取した可溶性画分のタンパク質７．８μｇ／ｍＬを全容量５００μＬ中に含んでいた。反応を始める前に、ＤＯＰＣ、スルファチドおよびＮＡＳ（モル比３：０．３：１）からなるリポソームを３７℃で５分間プレインキュベートした。反応は組換えＬＰＬＡ２を添加して開始し、３７℃で実行した。その反応性生物を抽出し、クロロホルム／酢酸（９：１、ｖ／ｖ）からなる溶媒系を使用したＨＰＴＬＣプレートによって分離した。プレートをスキャンして定量した反応生成物の１つである１−Ｏ−オレオイル−ＮＡＳを、ＮａＣｌ濃度に対してプロットした（図１２Ａ）。ＤＯＰＣ、スルファチドおよびＮＡＳからなるリソソームを、異なる濃度の陽イオン性両親媒性薬物であるアミオダロンとともに３７℃で５分間プレインキュベートし、次に組換えＬＰＬＡ２を加えてインキュベートした（図１２Ｃ）。様々なｐＨをもつクエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウムバッファー中で反応を実行した（図１２Ｂ）。
【０２０９】
静電的相互作用に依存する酵素とリポソームの相互作用を予測しようとしたが、反応混合物のＮａＣｌ濃度またはｐＨの増大は、酵素のアシル基転移活性を有意に阻害した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。重大なことに、リポソーム非存在下で水溶性基質であるｐ−ニトロ−フェニルブチレート（ρ−ＮＰＢ）を使用して、ＬＰＬＡ２活性をエステラーゼとして単純に測定した場合、ｐＨ依存性がほぼ失われた。標準的な陽イオン性両親媒性薬物であるアミオダロン濃度が増加すると、同様に酵素活性を阻害した（図１２Ｃ）。
【０２１０】
ＬＰＬＡ２とリポソームの間の静電的相互作用の崩壊を物理的相互作用として測定できるかどうか究明するために、高速超遠心分離およびイオン強度、ｐＨ、アミオダロンの存在量を変化させてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後に酵素とリポソームの共沈殿を検出した。ＤＯＰＣまたはＤＯＰＣ／スルファチド（モル比１０：１）からなるリポソームを、様々な量の組換えマウスＬＰＬＡ２とともに５００μＬの４８ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で氷上にて３０分間インキュベートした（図１３Ａ）。４μｇの組換えＬＰＬＡ２または１６μｇの組換えＬＰＬＡ２を加えたＤＯＰＣ、ＤＯＰＣ／スルファチド（モル比１０：１）またはＤＯＰＣ／ガラクトシルセラミド（モル比１０：１）からなるリポソームを、５００ｍＭのＮａＣｌまたは３３μＭのアミオダロンのありなしでインキュベートした（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。反応混合物を１５０，０００ｇで４℃で１時間遠心分離した。これらのアッセイにおけるＤＯＰＣの濃度は１２７μＭであった。これら得られた沈殿物を５０ｍＭの冷クエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で簡単に洗い、４０μＬのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動サンプルバッファーで溶解した。この試料を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用して分離した。電気泳動後、ＣＢＢ染色によりＬＰＬＡ２を検出した。
【０２１１】
ＬＰＬＡ２とリポソーム間の物理的結合は、スルファチドの存在で増加し（図１３Ｂ）、より高いｐＨ、ＮａＣｌ濃度またはアミオダロンの存在で阻害された（図１３Ｃ）。これらのデータから、陽イオン性両親媒性薬物が、ＬＰＬＡ２と陰イオン性脂質膜との間の静電的相互作用を妨げることよってＬＰＬＡ２活性を阻害していることが示される。
【０２１２】
（実施例６）
ＬＰＬＡ２遺伝子発現量は、他の糸球体疾患の患者と比較して狼瘡患者の糸球体において減少している
狼瘡患者と他の種類の糸球体疾患の患者との間でＬＰＬＡ２の発現が異なるかどうかを究明するために、患者由来の遺伝子発現プロファイルを解析した。ミシガン大学の腎臓病学部門（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ）に応用システム生物学中核研究所（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）がある。このグループは、ヨーロッパおよび合衆国のセンターから入手した様々な腎障害をもつ患者由来の腎生検の遺伝子発現プロファイルをバイオバンク化し、分析した。対照生検標本は、健康な腎臓提供者から移植時に入手している。生検時には、マイクロダイセクションによって糸球体および尿細管間質区画を分離し、そのｍＲＮＡプロファイルを入手している。マイクロアレイによる統計分析（ＳＡＭ）を使用する解析から、狼瘡糸球体における発現レベルは、対照または糖尿病、ＩｇＡ腎障害、微小変化型疾患、もしくは高血圧性腎硬化症の患者由来の生検と比較して著しく低いことが明らかになった（表２）。
【０２１３】
【表２】
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早期および進行性糖尿病性腎障害（ＤＭ）、ＩｇＡ腎障害、微小変化型疾患（ＭＣＤ）、および高血圧性腎硬化症（ＨＴＮ）を含めた５種類の異なる糸球体疾患からｍＲＮＡ発現プロファイルを入手した。様々な推算糸球体濾過量（ＧＦＲ）をもち光学および電子顕微鏡による病理学的検査によって診断が確定している患者から５ｍｍコア皮質試料を表す腎生検よりｍＲＮＡを採取した。生検を糸球体性（ｇ）および尿細管間質性（ｔｉ）部分に顕微解剖した。公開されている手順を使用してアレイ間の再現性が０．９８より大きいｍＲＮＡプロファイルを得た。ＲＮＡ増幅によって、単離した糸球体の数とは無関係にプローブセットの検出が確実になった。ＡＳＢＣに保存されたデータを、標準化されたオープンソースの解析パイプラインであるジーンパターン（Ｇｅｎｅｐａｔｔｅｒｎ）で処理して、遺伝子発現地図を作成した。ＬＰＬＡ２発現を異なる糸球体疾患の間で比較し、マイクロアレイの有意性解析（ＳＡＭ）を使用して解析した（Ｌｏｒｚら、  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １９巻（５号）：９０４〜９１４頁、２００８年）。複数試料の偽陽性発見率を説明するｑ値として有意性を表した。
【０２１４】
これらのデータは、狼瘡患者の顕微解剖糸球体におけるＬＰＬＡ２  ｍＲＮＡの発現は、正常対照の糸球体ならびに糖尿病、高血圧性腎硬化症、微小変化型疾患およびＩｇＡ腎障害に伴う糸球体疾患患者の糸球体と比較して減少していることを示す。
【０２１５】
（実施例７）
ヒト血清中のＬＰＬＡ２活性および自己抗体の測定
ＬＰＬＡ２欠損マウスおよびＧ２Ａ欠損マウスは、前者のノックアウトモデルにおける泡沫細胞の発達を除くと区別ができない。リンパ節または脾臓胚中心においてリゾホスファチジルコリンまたは遊離脂肪酸を局所的に産生できないことは、これら２つの狼瘡モデル間の機構的関連性を表している可能性がある。あるいは、ＬＰＬＡ２は、アポトーシス小体の消化に必要であるとして確認された最初の遺伝子産物を表している可能性がある。
【０２１６】
ＳＬＥは、複雑な臨床的症候群を意味する。狼瘡症候群は、機構的には異なるが表現型の上では似ているいくつもの疾患からなっている可能性がある。ＬＰＬＡ２は、長い間探求されている酸性の分泌型ホスホリパーゼＡ２である、新たに報告されたリソソームタンパク質を意味している。マウスにおいてこの活性が失われると、狼瘡の臨床的兆候の多くに類似した非常に強い表現型が生じる。さらに血漿リソソームタンパク質プロテオームの解析により、ＬＰＬＡ２がヒト血行路中を循環していることが明らかになっている。ＬＰＬＡ２活性の消失が活性狼瘡のマーカーになるかどうか試験するために、ＬＰＬＡ２活性用およびＬＰＬＡ２に対する自己抗体用の血清アッセイが初めて開発された。
【０２１７】
Ａ．血清リソソームホスホリパーゼＡ２アッセイ
ＬＰＬＡ２活性は、２つの主要な性質に基づいて他の公知のホスホリパーゼＡ２の活性とは異なっている。第１に、この酵素は４．５の酸性至適ｐＨを示し、ｐＨ７．４での活性はほとんど検出できない。第２に、この酵素はホスホリパーゼＡ２およびトランスアシラーゼの両方の働きがある。Ｎ−アセチル−スフィンゴシン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｎｅ）（ＮＡＳ、Ｃ２セラミド）は、この酵素に対する好ましい親油性受容体である。したがって、Ｃ２セラミドの脂肪酸アシルエステルである１−Ｏ−アシル−Ｎ−アセチル−スフィンゴシンの形成は、非常に特異的な活性測定の基準を提供し、利用しようとする提案されたアッセイのもとになる原理となる（Ｓｈａｙｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．、およびＡｂｅ，  Ａ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１１巻：１０５〜１１７頁、２０００年）。
【０２１８】
現在までに、ＬＰＬＡ２アッセイは、組換え酵素、培養細胞、細胞培養上清および組織ホモジネートに制限されてきた。いくつかの要素が、血漿や血清中のＬＰＬＡ２の回収および測定に影響している可能性があり、このアッセイを検証する過程において研究する必要がある。
【０２１９】
ＬＰＬＡ２が遊離タンパク質または結合タンパク質として循環しているのかどうか、血漿または血清中の補助因子がＬＰＬＡ２活性を調節しているのかどうか、血漿または血清中に発見されるＬＰＬＡ２活性の生成物を代謝する追加の酵素があるのかどうか、および血漿または血清中に測定基質と拮抗しその結果ＬＰＬＡ２活性を阻害する可能性のある内在性脂質があるのかどうかを決定するために、この酵素用に次のアッセイを考案した。
【０２２０】
リン脂質のＤＯＰＣおよびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）ならびにＮＡＳをアシル基の供与体および受容体としてそれぞれこの測定系に使用する。１−Ｏ−アシル−Ｎ−アセチルスフィンゴシンの形成速度の解析によりアシル基転移活性を決定する。反応混合物は、総容量５００μＬ中の４５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１０μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、リン脂質リポソーム（ＤＯＰＣ／ＰＥ／ジセチルホスフェート／ＮＡＳ（モル比５：２：１：２））に組み込まれた４０μＭ  ＮＡＳ、および可溶性画分（０．７〜１０μｇ）からなる。血清または血漿試料を加えることにより反応を開始し、３７℃で５〜６分間保ち、３ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１）さらに０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを０．３ｍＬ加えて終了させる。この混合物を室温で５分間遠心分離する。得られた下層を、別のガラス管に移し、窒素ガスの通風下で乾燥させる。乾燥した脂質を４０μＬのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解させ、高性能薄層クロマトグラフィープレートにアプライし、クロロホルム／酢酸（９：１）からなる溶媒系で展開する。このプレートを乾燥させ、８％（ｗ／ｖ）ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、６．８％（ｗ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４、および３２％（ｗ／ｖ）メタノールに浸漬した。均一に湿ったプレートをヘアドライヤーで短時間風乾し、１５０℃のオーブンで１５分間炭化させる。このプレートをスキャンし、反応生成物の化学質量をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅバージョン１．６２で推定する。
【０２２１】
補助因子、タンパク質結合、干渉脂質、または生成物の代謝作用の潜在的効果をいくつかの実験で評価した。これらの効果には、生成物形成を経時的に、また試料サイズに応じて決定することが含まれている。さらに、血清試料に標準となる既知量の組換えＬＰＬＡ２を「スパイク」して、妨害物質が存在するかどうか確かめることができる。組換えＬＰＬＡ２を、アルブミンまたはリポタンパク質の存在下で測定して、これらが測定を妨害するかどうか決定することもできる。この酵素活性を、血清１ｍＬ、１分間当たりに形成される１−Ｏ−アシル−ＮＡＳのモル数として表す。ヒト血清および血漿におけるこれらの活性および同一試料の反復測定による測定の再現性を経時的に比較する。貯蔵、ヘパリン、カルシウム、キレート化および凍結融解の効果は、評価すべき追加要因である。
【０２２２】
Ｂ．リソソームホスホリパーゼＡ２自己抗体の血清測定
次の手順を、ＬＰＬＡ２に対する自己抗体の測定に使用する。組換えＬＰＬＡ２（１ウェル当たり５０μＬ  ＰＢＳ中に０．１〜０．５μｇ）を、４℃で一晩インキュベートしてマイクロタイタープレートウェル上に吸着させる。このプレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。次にこのプレートを１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含む５０μＬのＰＢＳで１時間ブロッキングする。ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄し、次いで血清試料または対照を添加して室温で２時間、次に４℃で一晩置く。このウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで再び洗浄し、次いで２次抗ヒトＩｇＧ抗体を添加して室温で２時間置く。同じ洗浄ステップの後に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質としてＯ−フェニレンジアミンジヒドロクロリドを利用して検出する。４９２ｎｍでプレートウェルの吸光度を読み取る。
【０２２３】
確立するために重要な変数としては、血清試料に希釈が必要であるかどうか、プレートのコーティングに使用するＬＰＬＡ２を炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６、０．０５Ｍ）で変性させるべきかどうか、および血清試料を同様に炭酸塩緩衝液で変性させるべきかどうかが挙げられる。
【０２２４】
抗体検出の再現性は、このアッセイを検証するのに考慮するべき血清の凍結および貯蔵の効果、ならびに測定において物質を妨害する潜在的効果が一定ではないということを示している。
【０２２５】
（実施例８）
バイオバンク化されている血清試料中のＬＰＬＡ２活性および自己抗体の力価およびＳＬＥ疾患活動係数と臨床プロファイルの相関
ミシガン狼瘡コホート（ＭＬＣ）は、ミシガン大学で継続治療を受けているＳＬＥ患者の活動的、前向きなコホートである。ＭＬＣは、２０００年に開設され、現在６００人を超える患者（９０％が女性、７９％が白人、１７％が黒人、１％がヒスパニック系、２％がアジア太平洋島民、１％がその他）がいる。コホート参加者は、臨床的、社会的および人口統計データの系統的追跡を可能にするインフォームドコンセントに署名する。疾患活動性（ＳＬＥＤＡＩスコア）（Ｂｏｍｂａｒｄｉｅｒ，  Ｃ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３５巻：６３０〜６４０頁、１９９２年）の前向き評価を含めた詳細な検査および臨床のデータが、それぞれの来診で収集され、この来診は通常３カ月間隔である。血液試料（ほとんどの来診者の協力によって収集される）の保管場所も、ＭＬＣの立ち上げ時から将来を見越して作られた。ＭＬＣは、ＳＬＥ診療記録のスクリーニングおよび募集手段としても役立ち、多数の共同研究および補助的事業を促進してきた。
【０２２６】
ＭＬＣは、ＬＰＬＡ２活性および自己抗体の力価を測定するための患者の血清および臨床データの供給源である。臨床データが長期間にわたり豊富にあることから、このデータはこの研究のための特別に価値のある資源となっている。血清は、現在ＭＬＣに加入しているすべての患者から測定されている。これらの測定は盲検法で行い、試料は疾患活動性または臨床的表現型に対する関連なしに無作為に測定している。健康な患者および自己免疫疾患のない患者（例えば、骨関節症）由来の年齢および性別が釣り合う試料を対照として試験している。これらの測定に基づいて、ＬＰＬＡ２活性の正常範囲を決定している。対照と比較して著しく低いＬＰＬＡ２活性または抗ＬＰＬＡ２抗体の強い力価の存在を示すことが確認された患者に対しては、患者の臨床的表現型の総合評価を始める。低いＬＰＬＡ２活性または上昇した抗ＬＰＬＡ２を示しているかなりの数のＭＬＣ患者は、これらの調査結果と特定の臨床的表現型（例えば、リンパ節症）または実験結果（例えば、抗リン脂質抗体）の存在との間で統計的に有意な関連性を示している。陽性結果をもつと分かったこれらの患者については、疾患活動性との相関を調査するのに利用可能なすべての試料についてＬＰＬＡ２活性および抗体力価を過去にさかのぼって決定している。性別とＬＰＬＡ２活性および自己抗体力価との間の潜在的関連性も評価している。
【０２２７】
（実施例９）
動物モデルにおけるＬＰＬＡ２活性
ヒトまたは哺乳類のＬＰＬＡ２酵素、あるいはその変異体または派生体を可染体マクロファージの蓄積を示す動物モデルで試験することは公知である、例えばＬＰＬＡ２−／−ノックアウトマウスモデルである。これらの作用物質が、細胞内可染体マクロファージの蓄積、または自己免疫疾患の他の徴候と症状を低減できるかについて試験する、他のマウスモデルとしては、Ｒｏマウスモデル（Ｘｕｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００巻：７５０３〜７５０８頁、２００３年）、Ｔｙｒｏ３マウスモデル（Ｌｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３巻：３０６〜３１１頁、２００１年）、ｃ−ｍｅｒマウスモデル（Ｃｏｈｅｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９６巻：１３５〜１４０頁、２００２年）およびＭＦＧ−Ｅ８マウスモデル（Ｈａｎａｙａｍａ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４巻：１１４７〜１１５０頁、２００４年）がある。
【０２２８】
本明細書の全体にわたって引用された参考文献は、本明細書に記載の事項を補足する例示的手順または別の詳細を提供する限りにおいて、参照によりすべて具体的に本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2011526916.tif 000016
【図１２】
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【図１３】
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【図４Ａ】
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【図５】
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【図７】
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【配列表】
2011526916000001.app
【国際調査報告】
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