(57)【要約】本発明は、腸疾患（ＢＤ）の検出、診断、および治療で用いる新規な配列に関する。本発明は、その発現がＢＤに関連するＢＤ関連ポリヌクレオチド配列を提供する。ＢＤの検出のための診断用組成物および診断方法を本明細書中に提供する。本発明は、ＢＤポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を提供する。本発明はまた、ＢＤの診断ツールおよび治療組成物ならびにスクリーニング、予防、および治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）タンパク質またはそのフラグメントを調整する化合物またはその塩をスクリーニングする方法であって、該ＰＸＲ受容体を１つまたは複数の候補化合物と接触させる工程、および該ＰＸＲ受容体を調整する化合物またはその塩を選択する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記候補化合物がリファマイシンアナログを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調整が、ＰＸＲタンパク質またはそのフラグメントのリファマイシンアナログへの結合によって誘導されるシグナル伝達の調整を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＸＲ受容体が、膜に結合し、トランスジェニックマウス中に存在し、アッセイプレート中に存在し、細胞中に存在し、そして／または人工膜中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＸＲタンパク質が、配列アクセッション番号Ｏ７５４６９、Ｑ８ＳＱ０１、Ｑ９Ｒ１Ａ７、Ｏ５４９１５、ＮＰ＿１４８９３４、ＮＰ＿００３８８０もしくはＮＰ＿０７１２８５、またはそのフラグメントもしくは改変体によって示されるアミノ酸配列、あるいは配列アクセッション番号ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３、またはそのフラグメントもしくは改変体によって示される核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＣＹＰ３Ａ１１、ＧＳＴＡ１、ＭＲＰ２、およびＯＡＴＰ２が全て上方制御された、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リファキシミンでの前処置をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
候補化合物での前記ＰＸＲ受容体タンパク質の前処置をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記候補化合物での前処理が、ＣＹＰ３Ａ基質ミダゾラムの薬物動態に影響を及ぼさない、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記候補化合物での前処理が、１’−ヒドロキシミダゾラムのＣｍａｘを増加させ、Ｔｍａｘを減少させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＹＰ３Ａ１１が、前記候補化合物での処理後、コントロールと比較して約１倍〜約４倍増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
候補化合物での処理後にＧＳＴＡ１  ｍＲＮＡが上方制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記上方制御が約６５％〜約２００％の範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
候補化合物処置後に腸内ＭＲＰ２  ｍＲＮＡが上方制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＸＲ受容体タンパク質またはその活性フラグメントおよびリファマイシンアナログを含む、ＰＸＲ受容体またはそのフラグメントを調整する化合物またはその塩をスクリーニングするためのキット。
【請求項１６】
プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）タンパク質またはそのフラグメントを調整する化合物またはその塩、もしくはＰＸＲタンパク質またはそのフラグメントのリファマイシンアナログへの結合によって誘導されるシグナル伝達を調整する化合物またはその塩を含む、ＰＸＲ関連障害を治療するための医薬。
【請求項１７】
プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）タンパク質またはそのフラグメントを調整する化合物またはその塩を投与する工程を含む、被験体のＰＸＲ関連障害を治療、予防、または緩和する方法。
【請求項１８】
前記調整が、ＰＸＲタンパク質またはそのフラグメントのリファマイシンアナログへの結合によって誘導されるシグナル伝達の調整を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＸＲ受容体が、膜に結合し、トランスジェニックマウス中に存在し、アッセイプレート中に存在し、細胞中に存在し、そして／または人工膜中に存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＸＲタンパク質が、配列アクセッション番号Ｏ７５４６９、Ｑ８ＳＱ０１、Ｑ９Ｒ１Ａ７、Ｏ５４９１５、ＮＰ＿１４８９３４、ＮＰ＿００３８８０もしくはＮＰ＿０７１２８５、またはそのフラグメントもしくは改変体によって示されるアミノ酸配列あるいは配列アクセッション番号ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３、またはそのフラグメントもしくは改変体によって示される核酸を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
治療効果を生成するのに有効な量でＰＸＲタンパク質アゴニストを含む、組成物。
【請求項２２】
内因性プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）遺伝子のホモ接合性破壊を含む、トランスジェニックマウス。
【請求項２３】
前記マウスがヒトＰＸＲ遺伝子を含む、請求項２２に記載のトランスジェニックマウス
【請求項２４】
請求項２２に記載のトランスジェニックマウスから単離した細胞または組織。
【請求項２５】
ＰＸＲ遺伝子またはＰＸＲ遺伝子発現産物の活性を調整することができる薬剤を同定する方法であって、
推定上の薬剤を請求項２３に記載のトランスジェニックマウスに投与する工程、
該薬剤を野生型コントロールマウスに投与する工程、および
該トランスジェニックマウスの生理学的応答をコントロールマウスの応答と比較する工程であって、該トランスジェニックマウスと該コントロールマウスとの間の生理学的応答の相違は、該薬剤が該遺伝子または遺伝子発現産物の活性を調整することができることの指標である、工程
を含む、方法。
【請求項２６】
腸疾患活性を有する薬物候補をスクリーニングする方法であって、
配列ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３からなる群から選択される核酸配列によってコードされるＰＸＲ遺伝子、またはＯ７５４６９、Ｑ８ＳＱ０１、Ｑ９Ｒ１Ａ７、Ｏ５４９１５、ＮＰ＿１４８９３４、ＮＰ＿００３８８０、ＮＰ＿０７１２８５、そのフラグメントもしくは改変体を発現する細胞を提供する工程、
該細胞を薬物候補と接触させる工程、および
組織サンプル中のＢＤポリヌクレオチドの発現に対する該薬物候補の影響をモニタリングする工程
を含む、方法。
【請求項２７】
ＰＸＲポリペプチドに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
前記抗体またはそのフラグメントが固体支持体に付着し、該抗体がモノクローナル抗体であり、該抗体がポリクローナル抗体であり、そして／または該抗体またはそのフラグメントが検出可能な標識をさらに含む、請求項２７に記載の単離抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００８年１０月１８日に出願された、米国仮出願第６０／９９９，２３４号の利益を主張する。上記出願の全体の内容は、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
キシファクサン（Ｘｉｆａｘａｎ）（登録商標）（リファキシミン（ｒｉｆａｘｉｍｉｎ）、ＲＩＦａｘ）は、旅行者下痢の治療薬として２００４年にＦＤＡに承認された（非特許文献１）。ＲＩＦａｘは、細菌ＲＮＡ合成を阻害するように作用する一般的抗生物質であることが示された。慢性胃腸障害におけるＲＩＦａｘの薬効に寄与する機構は十分に理解されていない。
【０００３】
したがって、腸疾患（ＢＤ）、特に過敏性腸症候群（ＩＢＳ）に関与するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を得ることが当該分野で必要である。診断および／または治療用の化合物および組成物（抗体を含む）の標的としての種々のＢＤに関連する抗原（ＢＤ関連ポリペプチド）を得ることも当該分野で必要である。これらの抗原はまた、創薬（例えば、小分子）ならびに細胞の調節、成長、および分化のさらなる特徴づけにも有用であろう。薬物または薬学的標的として有用であり得るか、機能障害または疾患の予防、改善、または矯正で役割を果たし得る遺伝子および関連タンパク質を同定および特徴づける必要もある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌａｕｓｔｓｅｎ  ＧおよびＷｉｍｍｅｔｔ  Ｌ、２００４  ｄｒｕｇ  ａｐｐｒｏｖａｌ  ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ：  ＦＤＡ  ｕｐｄａｔｅ．  Ｎｕｒｓｅ  Ｐｒａｃｔ（２００５）３０：１４−２９；ｑｕｉｚ  ２９−３１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
１つの態様では、ＰＸＲ受容体を１つまたは複数の候補化合物と接触させる工程を含む、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）タンパク質またはそのフラグメントを調整する化合物またはその塩をスクリーニングする方法を本明細書中に示す。
【０００６】
１つの実施形態では、候補化合物はリファマイシンアナログを含む。
【０００７】
関連する実施形態では、リファマイシンアナログはリファキシミンを含む。
【０００８】
１つの実施形態では、調整は、ＰＸＲタンパク質またはそのフラグメントのリファマイシンアナログへの結合によって誘導されるシグナル伝達の調整を含む。
【０００９】
１つの実施形態では、ＰＸＲ受容体は、膜に結合し、トランスジェニックマウス中に存在し、アッセイプレート中に存在し、細胞中に存在し、そして／または人工膜中に存在する。
【００１０】
１つの実施形態では、ＰＸＲタンパク質は、配列アクセッション番号Ｏ７５４６９、Ｑ８ＳＱ０１、Ｑ９Ｒ１Ａ７、Ｏ５４９１５、ＮＰ＿１４８９３４、ＮＰ＿００３８８０、ＮＰ＿０７１２８５、またはそのフラグメントもしくは改変体によって示されるアミノ酸配列あるいは配列アクセッション番号ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３、またはそのフラグメントもしくは改変体によって示される核酸を含む。
【００１１】
別の実施形態では、ＣＹＰ３Ａ１１、ＧＳＴＡ１、ＭＲＰ２、およびＯＡＴＰ２は上方制御された。
【００１２】
１つの実施形態では、本方法は、１つまたは複数のリファキシミン、リファマイシンアナログ、または候補化合物での前処理をさらに含むことができる。
【００１３】
１つの実施形態では、候補化合物での前処理は、ＣＹＰ３Ａ基質ミダゾラムの薬物動態に影響を及ぼさない。
【００１４】
別の実施形態では、候補化合物での前処理により、１’−ヒドロキシミダゾラムのＣｍａｘが増加し、Ｔｍａｘが減少する。
【００１５】
１つの実施形態では、ＣＹＰ３Ａ１１は、候補化合物での処理後、コントロールと比較して約１倍〜約４倍増加する。
【００１６】
別の実施形態では、候補化合物での処理後にＧＳＴＡ１  ｍＲＮＡが上方制御される。
【００１７】
別の実施形態では、上方制御は約６５％〜約２００％の範囲である。
【００１８】
１つの実施形態では、候補化合物処置後に腸内ＭＲＰ２  ｍＲＮＡが上方制御される。
【００１９】
１つの態様では、ＰＸＲ受容体タンパク質またはその活性フラグメントおよびリファマイシンアナログを含む、ＰＸＲ受容体またはそのフラグメントを調整する（Ｉ）化合物またはその塩をスクリーニングするためのキットを本明細書中に示す。
【００２０】
１つの態様では、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）タンパク質またはそのフラグメントを調整する化合物またはその塩、もしくはＰＸＲタンパク質またはそのフラグメントのリファマイシンアナログへの結合によって誘導されるシグナル伝達を調整する化合物またはその塩を含む、ＰＸＲ関連障害を治療するための医薬を本明細書中に示す。
【００２１】
１つの態様では、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）タンパク質またはそのフラグメントを調整する化合物またはその塩を投与する工程を含む、被験体のＰＸＲ関連障害を治療、予防、または緩和する方法を本明細書中に示す。
【００２２】
１つの実施形態では、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）タンパク質またはそのフラグメントを調整する化合物またはその塩は、リファキシミンではない。
【００２３】
１つの実施形態では、調整は、ＰＸＲタンパク質またはそのフラグメントのリファマイシンアナログへの結合によって誘導されるシグナル伝達の調整を含む。
【００２４】
別の実施形態では、ＰＸＲ受容体は、膜に結合し、トランスジェニックマウス中に存在し、アッセイプレート中に存在し、細胞中に存在し、そして／または人工膜中に存在する。
【００２５】
１つの実施形態では、ＰＸＲタンパク質は、配列アクセッション番号Ｏ７５４６９、Ｑ８ＳＱ０１、Ｑ９Ｒ１Ａ７、Ｏ５４９１５、ＮＰ＿１４８９３４、ＮＰ＿００３８８０、ＮＰ＿０７１２８５、またはそのフラグメントもしくは改変体によって示されるアミノ酸配列あるいは配列アクセッション番号ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３、またはそのフラグメントもしくは改変体によって示される核酸を含む。
【００２６】
１つの態様では、治療効果を得るのに有効な量でＰＸＲタンパク質アゴニストを含む組成物を本明細書中に示す。
【００２７】
１つの態様では、内因性プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）遺伝子のホモ接合性破壊を含むトランスジェニックマウスを本明細書中に示す。
【００２８】
別の実施形態では、マウスはヒトＰＸＲ遺伝子を含む。
【００２９】
１つの態様では、本明細書中に記載のトランスジェニックマウスから単離した細胞または組織を本明細書中に示す。
【００３０】
１つの態様では、ＰＸＲ遺伝子またはＰＸＲ遺伝子発現産物の活性を調整することができる薬剤を同定する方法であって、推定上の薬剤を本明細書中に記載のトランスジェニックマウスに投与する工程、薬剤を野生型コントロールマウスに投与する工程、およびトランスジェニックマウスの生理学的応答をコントロールマウスの応答と比較する工程であって、トランスジェニックマウスとコントロールマウスとの間の生理学的応答の相違は、薬剤が遺伝子または遺伝子発現産物の活性を調整することができることの指標である、比較する工程を含む、方法を本明細書中に示す。
【００３１】
１つの態様では、抗炎症性腸疾患活性を有する薬物候補をスクリーニングする方法であって、配列ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３からなる群から選択される核酸配列によってコードされるＰＸＲ遺伝子、またはＯ７５４６９、Ｑ８ＳＱ０１、Ｑ９Ｒ１Ａ７、Ｏ５４９１５、ＮＰ＿１４８９３４、ＮＰ＿００３８８０、ＮＰ＿０７１２８５、そのフラグメントもしくは改変体を発現する細胞を提供する工程、細胞を薬物候補と接触させる工程、および組織サンプル中のＢＤポリヌクレオチドの発現に対する薬物候補の影響をモニタリングする工程を含む、方法を本明細書中に示す。
【００３２】
１つの態様では、ＰＸＲポリペプチドに結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを本明細書中に示す。
【００３３】
１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントが固体支持体に付着し、抗体がモノクローナル抗体であり、抗体がポリクローナル抗体であり、そして／または抗体またはそのフラグメントが検出可能な標識をさらに含む。
【００３４】
本発明は、ＢＤに対する感受性がＰＸＲ遺伝子（核内受容体ファミリーのメンバー）の遺伝的変異に強く関連するという所見に一部基づく。ＰＸＲは、生体異物および一部の抗生物質の沈着および解毒に関与する遺伝子を調節する核内受容体である。本発明はまた、ヒトＰＸＲのＲＩＦａｘ特異的活性化に一部基づく。ＰＸＲは、内因性解毒および生物異物解毒に関与する生体防御機構の不可欠な構成要素である（Ｋｌｉｅｗｅｒら，２００２）。ＰＸＲは、広範な生体異物（処方薬、ハーブ系サプリメント、農薬、内分泌攪乱物質、および他の環境汚染物質が含まれる）によって活性化される（ＣａｒｎａｈａｎおよびＲｅｄｉｎｂｏ，２００５）。ＰＸＲ活性化により、生体異物（有毒化学物質が含まれる）の代謝および排出に関与する多数の遺伝子が調節される（Ｋｌｉｅｗｅｒ、２００３；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，２００３；Ｓｏｎｏｄａら，２００５）。新規な動物モデル（全ヒトＰＸＲ遺伝子がＰｘｒ−ヌルバックグラウンドに再導入されたＰＸＲヒト化マウス（ｈＰＸＲ））も本明細書中に開示する（Ｍａら，２００７）。
【００３５】
本発明は、炎症性腸疾患を調整する組成物のスクリーニング方法を提供する。本発明はまた、炎症性腸疾患を調整する組成物のスクリーニング方法を提供する。腸ならびに関連する組織および器官の炎症を阻害する方法も本明細書中に提供する。炎症性腸疾患の治療方法も本明細書中に提供する。
【００３６】
本開示は、一般に、トランスジェニック動物ならびに遺伝子機能の特徴づけに関する組成物および方法に関する。
【００３７】
１つの態様では、薬物候補のスクリーニング方法は、炎症性腸疾患関連（ＢＤ）遺伝子またはそのフラグメントを発現する細胞株を準備する工程を含む。ＢＤ遺伝子の一定の実施形態は、ＢＤで異なって発現される遺伝子である。本明細書中の方法で使用されるＢＤ遺伝子の一定の実施形態には、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３、またはそのフラグメント（これらから生成されたヒトｍＲＮＡに対応する）から選択される核酸が含まれるが、これらに限定されない。本方法は、さらに、薬物候補を細胞に添加する工程およびＢＤ遺伝子の発現、結合、挙動に及ぼす薬物候補の影響を決定する工程を含む。
【００３８】
１つの実施形態では、薬物候補のスクリーニング方法は、薬物候補の非存在下での発現レベルを薬物候補の存在下での発現レベルと比較する工程を含む。
【００３９】
ＢＤＰを候補生物活性剤と組み合わせる工程および候補剤のＢＤＰへの結合を決定する工程を含む、ＢＤタンパク質（ＢＤＰ）に結合することができる生物活性剤のスクリーニング方法も本明細書中に提供する。
【００４０】
ＢＤＰ活性を調整することができる生物活性剤のスクリーニング方法を本明細書中にさらに提供する。１つの実施形態では、該方法は、ＢＤＰを候補生物活性剤と組み合わせる工程およびＢＤＰの生物活性に及ぼす候補剤の影響を決定する工程を含む。
【００４１】
薬物を被験体に投与する工程および被験体から細胞サンプルを取り出す工程を含む、候補ＢＤ薬の影響を評価する方法も提供する。次いで、細胞の発現プロフィールを決定する。この方法は、さらに、被験体の発現プロフィールを健康な個体の発現プロフィールと比較する工程を含む。
【００４２】
ＢＤタンパク質は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｏ７５４６９、Ｑ８ＳＱ０１、Ｑ９Ｒ１Ａ７、Ｏ５４９１５、ＮＰ＿１４８９３４、ＮＰ＿００３８８０、ＮＰ＿０７１２８５で概説された配列からなる群から選択されるタンパク質を含む。本明細書中で使用する場合、ＢＤＰタンパク質には、例えば、リガンドによる活性化後のシグナル伝達経路中のタンパク質が含まれる。
【００４３】
ＢＤタンパク質は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３（これらから生成されたヒトｍＲＮＡに対応する）で概説された配列からなる群から選択される核酸によってコードされるタンパク質を含む。
【００４４】
さらに、ＢＤタンパク質をコードする核酸セグメント、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３（これらから生成されたヒトｍＲＮＡに対応する）で概説された配列からなる群から選択される核酸を含むバイオチップを本明細書中に提供する。
【００４５】
被験体の少なくとも１つのＢＤ遺伝子の配列決定によってＢＤの傾向を診断または決定する方法も本明細書中に提供する。本発明のさらに別の態様では、被験体における遺伝子コピー数を含むＢＤの決定方法を提供する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその相補物もしくはフラグメントは、検出可能な標識をさらに含むか、固体支持体に付着するか、化学合成によって少なくとも一部が調製されるか、アンチセンスフラグメントであるか、一本鎖であるか、二本鎖であるか、またはマイクロアレイを含む。
【００４７】
下記のポリヌクレオチド配列または相補物からなる群から選択されるＢＤ配列の読み取り枠内でコードされる単離ポリペプチドを本明細書中に提供する。下記配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを本明細書中に提供する。下記配列からなる群から選択されるポリペプチドによってコードされるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドを本明細書中に提供する。一定の実施形態では、ポリペプチドまたはそのフラグメントを、固体支持体に付着させることができる。１つの実施形態では、かかるポリペプチドに結合する単離抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）またはその抗原結合フラグメントを本明細書中に提供する。単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、固体支持体に付着させることができるか、検出可能な標識をさらに含む。
【００４８】
１つの実施形態では、（ａ）アクセッション番号：ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３のＢＤ配列からなる群から選択される核酸配列によってコードされるＢＤ関連遺伝子、またはアクセッション番号Ｏ７５４６９、Ｑ８ＳＱ０１、Ｑ９Ｒ１Ａ７、Ｏ５４９１５、ＮＰ＿１４８９３４、ＮＰ＿００３８８０、ＮＰ＿０７１２８５のＢＤ配列またはそのフラグメントを発現する細胞を提供する工程、（ｂ）ＢＤ細胞由来の組織サンプルを抗ＢＤ薬物候補（例えば、候補組成物）と接触させる工程、（ｃ）組織サンプル中でのＢＤポリヌクレオチドの発現に対する抗ＢＤ薬物候補の影響をモニタリングする工程、および任意選択的に、（ｄ）薬物候補の非存在下での発現レベルを薬物候補の存在下での発現レベルと比較する工程を含む、抗ＢＤ活性をスクリーニングする方法を本明細書中に提供する。薬物候補は、転写のインヒビター（Ｇタンパク質共役受容体アンタゴニスト、成長因子アンタゴニスト、セリン−トレオニンキナーゼアンタゴニスト、チロシンキナーゼアンタゴニスト）であり得る。
【００４９】
１つの実施形態では、化合物には、例えば、３，４部位で縮合した複素環を保有するリファマイシン誘導体が含まれる。例示的な組成物には、例えば、南アフリカ特許第６８／０９０３号に開示の化合物（ピロロ［５，４−ｃ］リファマイシンＳＶ誘導体）、独国特許出願公開第２，７３９，６７１号および同第２，７３９，６２３号に開示の化合物（１位および２位に置換を保有するイミダゾ［５，４−ｃ］リファマイシンＳＶ化合物）が含まれる。チアゾロ［５，４−ｃ］リファマイシンＳＶ（リファマイシンＰ）誘導体は、独国特許出願公開第２，７４１，０６６号で報告されている。他のリファマイシンアナログには、例えば、−Ｏおよび−Ｐが含まれる。これらは、当業者に周知であり、例えば、ＵＳＰＮ４，３４１，７８５号またはＵＳＰＮ４，２００，５７４号中に他の組成物およびその誘導体と共に見出すことができる。
【００５０】
ＢＤタンパク質（ＢＤＰ）の活性を調整することができる生物活性剤のスクリーニング方法であって、ＢＤＰは下記の核酸配列を含む核酸によってコードされ、ＢＤＰを候補生物活性剤と組み合わせる工程およびＢＤＰの生物活性に及ぼす候補剤の影響を決定する工程を含む、方法を本明細書中に提供する。該方法によれば、生物活性剤は、ＢＤタンパク質（ＢＤＰ）の発現に影響を及ぼすことができ、ＢＤタンパク質（ＢＤＰ）の活性に影響を及ぼすことができる。
【００５１】
本発明は、本明細書中に記載のものから選択されるＢＤタンパク質（ＢＤＰ）に優先的に結合するモノクローナル抗体を提供し、ここで、この抗体は、任意選択的に治療薬に結合するか、ヒト化されている。被験体中のＢＤ細胞の有無を検出し、かかる抗体を含むキットおよび薬学的組成物も提供する。
【００５２】
本開示は、ＰＸＲ遺伝子が破壊されたトランスジェニック細胞を提供する。本開示のトランスジェニック細胞は、相同組換えを起こすことができる任意の細胞から構成される。好ましくは、本開示の細胞は、幹細胞、より好ましくは胚性幹（ＥＳ）細胞、最も好ましくはマウスＥＳ細胞である。１つの実施形態によれば、トランスジェニック細胞を、ターゲティング構築物を幹細胞に導入して相同組換え体を産生し、それにより、ＰＸＲ遺伝子を変異させることによって産生する。別の実施形態では、トランスジェニック細胞は、下記のトランスジェニック動物に由来する。トランスジェニック動物由来の細胞には、組織または器官およびその任意の細胞株または任意の子孫から単離されたかこれらに存在する細胞が含まれる。
【００５３】
本開示はまた、幹細胞に導入した場合に相同組換え体を産生するターゲティング構築物およびターゲティング構築物の産生方法を提供する。１つの実施形態では、本開示のターゲティング構築物は、ＰＸＲ遺伝子に相同な第１および第２のポリヌクレオチド配列を含む。ターゲティング構築物はまた、好ましくは構築物中の２つの異なる相同なポリヌクレオチド配列の間に配置された選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ターゲティング構築物はまた、相同組換えを増強することができる他の調節エレメントを含むことができる。
【００５４】
本開示は、さらに、非ヒトトランスジェニック動物およびＰＸＲ遺伝子の破壊を含むかかる非ヒトトランスジェニック動物の産生方法を提供する。本開示のトランスジェニック動物には、ＰＸＲ遺伝子変異に関してヘテロ接合性およびホモ接合性のトランスジェニック動物が含まれる。１つの態様では、本開示のトランスジェニック動物は、ＰＸＲ遺伝子機能を欠く。別の態様では、本開示のトランスジェニック動物は、ＰＸＲ遺伝子変異の保有に関連する表現型を含む。
【００５５】
本開示はまた、トランスジェニック動物の表現型に影響を及ぼすことができる薬剤を同定する方法を提供する。例えば、推定上の薬剤をトランスジェニック動物に投与し、推定上の薬剤に対するトランスジェニック動物の応答を測定し、「正常な」マウスまたは野生型マウスの応答と比較するか、トランスジェニック動物コントロール（薬剤投与なし）と比較する。本開示は、さらに、かかる方法にしたがって同定した薬剤を提供する。本開示はまた、ＰＸＲ遺伝子の破壊に関連する容態の治療薬として有用な薬剤の同定方法を提供する。
【００５６】
本開示は、さらに、ＰＸＲの発現または機能に影響を及ぼす薬剤の同定方法を提供する。本方法は、有効量の薬剤をトランスジェニック動物（例えば、マウス）に投与する工程を含む。本方法は、例えば、薬剤に対するトランスジェニック動物の応答を測定する工程、およびトランスジェニック動物の応答をコントロール動物（例えば、野生型動物またはトランスジェニック動物コントロールであり得る）と比較する工程を含む。ＰＸＲの発現または機能に影響を及ぼし得る化合物を、細胞ベースのアッセイにおいて細胞に対してスクリーニングして、例えば、かかる化合物を同定することもできる。細胞は、本明細書中に記載のＰＸＲトランスジェニックマウスに由来する細胞であり得る。
【００５７】
本開示はまた、ＰＸＲ遺伝子の核酸配列を含む細胞株を提供する。かかる細胞株は、細胞株中で機能的なプロモーターへの作動可能な連結によってかかる配列を発現することができる可能性がある。１つの実施形態では、ＰＸＲ遺伝子配列の発現は、誘導性プロモーターの調節下にある。ＰＸＲ遺伝子を薬剤と接触させる工程および薬剤／ＰＸＲ遺伝子複合体を検出する工程を含む、ＰＸＲ遺伝子と相互作用する薬剤の同定方法も提供する。かかる複合体を、例えば、作動可能に連結された検出マーカーの発現の測定によって検出することができる。
【００５８】
本開示は、さらに、ＰＸＲ遺伝子の破壊、より詳細には、ＰＸＲ遺伝子の発現または機能の破壊に関連する疾患または容態の治療方法を提供する。１つの実施形態では、本開示の方法は、ＰＸＲ遺伝子の発現または機能の破壊に関連する疾患または容態を治療する工程（ＰＸＲの発現または機能に影響を及ぼす治療薬の、それを必要とする被験体への投与を含む）を含む。この実施形態によれば、本方法は、治療有効量の天然、合成、半合成、または組換えのＰＸＲ遺伝子、ＰＸＲ遺伝子産物、またはそのフラグメント、ならびに天然、合成、半合成、または組換えのアナログの投与を含む。
【００５９】
本開示は、さらに、遺伝子療法変異ＰＸＲ遺伝子による検出および置換を含む、破壊された標的遺伝子の発現または機能に関連する疾患または容態の治療方法を提供する。
【００６０】
別の実施形態では、ＰＸＲ遺伝子破壊に関連する表現型（または表現型の変化）を使用して、ＰＸＲ遺伝子産物を拮抗する薬物の作用および副作用の可能性を予想する。この実施形態では、マウスを使用して、「新薬開発可能な標的」として遺伝子を評価し、例えば、ＰＸＲ遺伝子産物をターゲティングする薬物の開発が薬学研究において注目に値するかどうかを決定する。
【００６１】
他の実施形態を以下に開示する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１Ａ】図１は、ＲＩＦおよびＲＩＦａｘのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。（Ａ）ＲＩＦの構造；（Ｂ）ＲＩＦａｘの構造；（Ｃ）ＲＩＦおよびＲＩＦａｘの典型的なクロマトグラム。ＲＩＦおよびＲＩＦａｘは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、ＲＩＦについてはｍ／ｚ  ８２３．５／７９１．５（１）、ＲＩＦａｘについてはｍ／ｚ  ７８６．３／７５４．５（２）と検出された。
【図１Ｂ】図１は、ＲＩＦおよびＲＩＦａｘのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。（Ａ）ＲＩＦの構造；（Ｂ）ＲＩＦａｘの構造；（Ｃ）ＲＩＦおよびＲＩＦａｘの典型的なクロマトグラム。ＲＩＦおよびＲＩＦａｘは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、ＲＩＦについてはｍ／ｚ  ８２３．５／７９１．５（１）、ＲＩＦａｘについてはｍ／ｚ  ７８６．３／７５４．５（２）と検出された。
【図１Ｃ】図１は、ＲＩＦおよびＲＩＦａｘのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。（Ａ）ＲＩＦの構造；（Ｂ）ＲＩＦａｘの構造；（Ｃ）ＲＩＦおよびＲＩＦａｘの典型的なクロマトグラム。ＲＩＦおよびＲＩＦａｘは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、ＲＩＦについてはｍ／ｚ  ８２３．５／７９１．５（１）、ＲＩＦａｘについてはｍ／ｚ  ７８６．３／７５４．５（２）と検出された。
【図２−１】図２は、１０ｍｇ／ｋｇ  ＲＩＦまたはＲＩＦａｘの単回投与による処置後のマウスにおけるＲＩＦおよびＲＩＦａｘの代謝プロフィールおよび腸管分布を示す。（Ａ）経口処置後の血清ＲＩＦおよびＲＩＦａｘの濃度−時間プロット。データを、各時点での平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）経口処置後の小腸（Ｓ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、盲腸、および結腸におけるＲＩＦおよびＲＩＦａｘの経時変化。小腸（Ｂ）、盲腸（Ｃ）、および結腸（Ｄ）中の内容物を、投与から１．５、３、６、９、１２、２４、および４８時間後に個別に収集した。ＲＩＦおよびＲＩＦａｘを腸管の内容物から抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。データを、各時点での平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。（Ｅ）経口処置後のＷＴ、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウス間のＲＩＦａｘ  Ｃｍａｘの比較。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｆ）ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、およびｐ．ｏ．処置による血清ＲＩＦａｘの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｇ）ｉ．ｐ．注射後の血清ＲＩＦａｘおよびＲＩＦの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｈ）ｉ．ｖ．注射後の血清ＲＩＦａｘおよびＲＩＦの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。
【図２−２】図２は、１０ｍｇ／ｋｇ  ＲＩＦまたはＲＩＦａｘの単回投与による処置後のマウスにおけるＲＩＦおよびＲＩＦａｘの代謝プロフィールおよび腸管分布を示す。（Ａ）経口処置後の血清ＲＩＦおよびＲＩＦａｘの濃度−時間プロット。データを、各時点での平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）経口処置後の小腸（Ｓ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、盲腸、および結腸におけるＲＩＦおよびＲＩＦａｘの経時変化。小腸（Ｂ）、盲腸（Ｃ）、および結腸（Ｄ）中の内容物を、投与から１．５、３、６、９、１２、２４、および４８時間後に個別に収集した。ＲＩＦおよびＲＩＦａｘを腸管の内容物から抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。データを、各時点での平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。（Ｅ）経口処置後のＷＴ、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウス間のＲＩＦａｘ  Ｃｍａｘの比較。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｆ）ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、およびｐ．ｏ．処置による血清ＲＩＦａｘの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｇ）ｉ．ｐ．注射後の血清ＲＩＦａｘおよびＲＩＦの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｈ）ｉ．ｖ．注射後の血清ＲＩＦａｘおよびＲＩＦの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。
【図２−３】図２は、１０ｍｇ／ｋｇ  ＲＩＦまたはＲＩＦａｘの単回投与による処置後のマウスにおけるＲＩＦおよびＲＩＦａｘの代謝プロフィールおよび腸管分布を示す。（Ａ）経口処置後の血清ＲＩＦおよびＲＩＦａｘの濃度−時間プロット。データを、各時点での平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）経口処置後の小腸（Ｓ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、盲腸、および結腸におけるＲＩＦおよびＲＩＦａｘの経時変化。小腸（Ｂ）、盲腸（Ｃ）、および結腸（Ｄ）中の内容物を、投与から１．５、３、６、９、１２、２４、および４８時間後に個別に収集した。ＲＩＦおよびＲＩＦａｘを腸管の内容物から抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。データを、各時点での平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。（Ｅ）経口処置後のＷＴ、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウス間のＲＩＦａｘ  Ｃｍａｘの比較。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｆ）ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、およびｐ．ｏ．処置による血清ＲＩＦａｘの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｇ）ｉ．ｐ．注射後の血清ＲＩＦａｘおよびＲＩＦの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｈ）ｉ．ｖ．注射後の血清ＲＩＦａｘおよびＲＩＦの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。
【図２−４】図２は、１０ｍｇ／ｋｇ  ＲＩＦまたはＲＩＦａｘの単回投与による処置後のマウスにおけるＲＩＦおよびＲＩＦａｘの代謝プロフィールおよび腸管分布を示す。（Ａ）経口処置後の血清ＲＩＦおよびＲＩＦａｘの濃度−時間プロット。データを、各時点での平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）経口処置後の小腸（Ｓ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、盲腸、および結腸におけるＲＩＦおよびＲＩＦａｘの経時変化。小腸（Ｂ）、盲腸（Ｃ）、および結腸（Ｄ）中の内容物を、投与から１．５、３、６、９、１２、２４、および４８時間後に個別に収集した。ＲＩＦおよびＲＩＦａｘを腸管の内容物から抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。データを、各時点での平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。（Ｅ）経口処置後のＷＴ、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウス間のＲＩＦａｘ  Ｃｍａｘの比較。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｆ）ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、およびｐ．ｏ．処置による血清ＲＩＦａｘの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｇ）ｉ．ｐ．注射後の血清ＲＩＦａｘおよびＲＩＦの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。（Ｈ）ｉ．ｖ．注射後の血清ＲＩＦａｘおよびＲＩＦの濃度−時間プロット。データを平均（ｎ＝３）として示す。
【図３−１】図３は、ＷＴ、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウスの小腸（Ｓ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）および肝臓におけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦおよびＲＩＦａｘの影響を示す。マウスを、２５ｍｇ／ｋｇのＲＩＦまたはＲＩＦａｘで３日間経口処置し、ＣＹＰ３Ａ１１、ＧＳＴＡ１、ＭＲＰ２、およびＯＡＴＰ２の発現をｑＰＣＲによって分析した。比較ＣＴ法を使用して値を定量し、サンプルをβアクチンに対して正規化した。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。（Ａ）ｈＰＸＲマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響；（Ｂ）ＷＴマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響；（Ｃ）Ｐｘｒ−ヌルマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響；（Ｄ）ｈＰＸＲマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦの影響；（Ｅ）ｈＰＸＲマウスの肝臓におけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦの影響；（Ｆ）ｈＰＸＲマウスの肝臓におけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響。
【図３−２】図３は、ＷＴ、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウスの小腸（Ｓ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）および肝臓におけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦおよびＲＩＦａｘの影響を示す。マウスを、２５ｍｇ／ｋｇのＲＩＦまたはＲＩＦａｘで３日間経口処置し、ＣＹＰ３Ａ１１、ＧＳＴＡ１、ＭＲＰ２、およびＯＡＴＰ２の発現をｑＰＣＲによって分析した。比較ＣＴ法を使用して値を定量し、サンプルをβアクチンに対して正規化した。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。（Ａ）ｈＰＸＲマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響；（Ｂ）ＷＴマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響；（Ｃ）Ｐｘｒ−ヌルマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響；（Ｄ）ｈＰＸＲマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦの影響；（Ｅ）ｈＰＸＲマウスの肝臓におけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦの影響；（Ｆ）ｈＰＸＲマウスの肝臓におけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響。
【図３−３】図３は、ＷＴ、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウスの小腸（Ｓ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）および肝臓におけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦおよびＲＩＦａｘの影響を示す。マウスを、２５ｍｇ／ｋｇのＲＩＦまたはＲＩＦａｘで３日間経口処置し、ＣＹＰ３Ａ１１、ＧＳＴＡ１、ＭＲＰ２、およびＯＡＴＰ２の発現をｑＰＣＲによって分析した。比較ＣＴ法を使用して値を定量し、サンプルをβアクチンに対して正規化した。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。（Ａ）ｈＰＸＲマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響；（Ｂ）ＷＴマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響；（Ｃ）Ｐｘｒ−ヌルマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響；（Ｄ）ｈＰＸＲマウスのＳ．ｉｎｔｅｓｔｉｎｅにおけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦの影響；（Ｅ）ｈＰＸＲマウスの肝臓におけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦの影響；（Ｆ）ｈＰＸＲマウスの肝臓におけるＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響。
【図４】図４は、種々の生体異物核内受容体のＲＩＦａｘ活性化を決定するための細胞ベースのレポーターアッセイを示す。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。（Ａ）ヒトＰＸＲ活性化についてのＲＩＦａｘの細胞ベースのレポーターアッセイ。１０μＭ  ＲＩＦ；１、１０、１００μＭ  ＲＩＦａｘを、培養培地に個別に添加した。ビヒクルとしてＤＭＳＯを使用した。ＰＸＲの活性化を、２４時間後のホタルルシフェラーゼ活性の測定およびその後のタンパク質濃度によるルシフェラーゼ活性の正規化によって決定した。（Ｂ）ヒトＰＸＲ、ＣＡＲ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、およびＦＸＲ活性化についてのＲＩＦａｘの細胞ベースのレポーターアッセイ。１０μＭ  ＲＩＦａｘを培養培地に添加し、２４時間インキュベートした。ＲＩＦ（１０μＭ）、ＴＣＰＯＢＯＰ（２５０ｎＭ）、Ｗｙ−１４，６４３（１０μＭ）、ロシグリタゾン（１０μＭ）、およびＧＷ４０６４（２５μＭ）を、それぞれヒトＰＸＲ、ＣＡＲ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、およびＦＸＲのポジティブコントロールとして使用した。ビヒクルとしてＤＭＳＯを使用した。標準的なデュアルルシフェラーゼアッセイを使用し、同時トランスフェクトしたコントロールレポーターに対して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
詳細な説明
リファキシミン（ＲＩＦａｘ）（旅行者下痢の治療薬として承認されたリファマイシンアナログ）は、胃腸障害またはＢＤの治療でも有益である。しかし、慢性胃腸障害に及ぼすリファキシミンの影響に寄与する機構は十分に理解されていない。本発明は、ヒトプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）（生体異物および一部の内生的な沈着および解毒に関与する遺伝子を調節する核内受容体）の特異的活性化におけるリファキシミンの役割に一部基づく。本発明はまた、ＰＸＲヒト化（ｈＰＸＲ）、Ｐｘｒ−ヌル、および野生型マウスの作製に一部基づく。
【００６４】
上記一般的説明および以下の詳細な説明は例示および説明のみを目的とし、特許請求の範囲に記載の本発明を制限しないものであると理解すべきである。本出願では、他で特記しない限り、単数形の使用には、複数形が含まれる。本出願では、他で示さない限り、「または」は「および／または」を意味する。さらに、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅｄ」などの他の形態の使用は本発明を制限しない。同様に、「エレメント」または「成分」などの用語は、他で特記しない限り、１単位を含む要素および成分ならびに１つを超えるサブユニットを含む要素および成分の両方を含む。同様に、用語「ｐｏｒｔｉｏｎ」の使用は、部分の一部または部分全体を含み得る。
【００６５】
本明細書中で使用される項目の表題は、系統立てのみを目的とし、記載の主題を制限するものであると解釈されるべきではない。本出願中に引用された全ての書類または書類の一部（特許、特許出願、論文、書籍、および学術論文が含まれるが、これらに限定されない）は、任意の目的のためにその全体が本明細書中に参考として明確に援用される。
【００６６】
用語「有効量」には、所望の結果を達成するのに必要な（例えば、患者または被験体のＢＤを治療または予防するのに十分な）投薬量および必要な期間で有効な量が含まれる。ＰＸＲ受容体修飾因子の有効量は、被験体の病状、年齢、および体重、ならびにＰＸＲ受容体修飾因子が被験体において所望の応答を誘発する能力などの要因に応じて変化し得る。最適な治療応答が得られるように投薬計画を調整することができる。有効量はまた、治療に有利な作用がＰＸＲ受容体修飾因子の任意の有毒作用または有害作用（例えば、副作用）を凌ぐ量である。
【００６７】
「回復する」、「回復」、または「改善」などは、例えば、被験体または少なくとも少数の被験体（例えば、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲）で起こる改善と一致する検出可能な改善または検出可能な変化をいう。かかる改善または変化は、リファキシミンで処置していない被験体と比較して、処置した被験体で認められる。ここで、未処置被験体は、同一または類似の疾患、容態、または症状などを有するか、発症している被験体である。疾患、容態、症状、またはアッセイパラメーターの回復を、例えば、被験体の自己評価、臨床家の評価、または適切なアッセイもしくは測定（例えば、被験体における生活の質の評価、疾患または容態の進行遅延、疾患または容態の重症度の軽減、または生体分子、細胞のレベルまたは活性のための適切なアッセイ、またはＢＤエピソードの検出が含まれる）の実施によって主観的または客観的に決定することができる。回復は、一過性、長期、または永久であり得るか、ＰＸＲ受容体修飾因子を被験体に投与するか、本明細書または引用文献に記載されているアッセイまたは他の方法で使用する間またはその後の関連時間（例えば、下記の時間枠内、またはＰＸＲ受容体修飾因子の投与または使用から約１時間後から被験体がかかる処置を受けてから約２８日後、１、３、６、または９ヶ月後またはそれを超えた期間）で変動し得る。
【００６８】
例えば、症状または分子のレベルまたは生物学的活性などの「調整」は、例えば、症状または活性などが増加または減少して検出されることをいう。かかる増加または減少を、ＰＸＲ受容体修飾因子で処置していない被験体と比較して、処置した被験体で認められる。ここで、未処置被験体は、同一または類似の疾患、容態、または症状などを有するか、発症している。かかる増加または減少は、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、１０００％、またはそれ以上、またはこれらの値のいずれか２つの間の任意の範囲内であり得る。調整を、例えば、被験体の自己評価、臨床家の評価、または適切なアッセイもしくは測定（例えば、生活の質の評価または分子、細胞のレベルもしくは活性または被験体内の細胞遊走に適切なアッセイが含まれる）の実施によって主観的または客観的に決定することができる。調整は、一過性、長期、または永久であり得るか、ＰＸＲ受容体修飾因子を被験体に投与するか、本明細書または引用文献に記載されているアッセイまたは他の方法で使用する間またはその後の関連時間（例えば、下記の時間枠内、またはＰＸＲ受容体修飾因子の投与または使用から約１時間後から被験体がＰＸＲ受容体修飾因子を受けてから約３、６、９ヶ月後またはそれを超えた期間）で変動し得る。
【００６９】
用語「調整する」はまた、ＰＸＲ受容体修飾因子への曝露に応答した細胞活性の増加または減少（例えば、所望の最終結果（例えば、治療のために使用したＰＸＲ受容体修飾因子の治療結果が一連の特定の治療で増加または減少し得る）が達成されるような動物細胞の少なくとも亜集団の増殖および／または分化誘導の阻害）をいうことができる。
【００７０】
「ＰＸＲ受容体修飾因子を得る」などの場合の用語「得る」は、ＰＸＲ受容体修飾因子の購入、合成、または獲得を含むことが意図される。
【００７１】
本明細書中で使用する場合、句「非経口投与」および「非経口で投与する」には、例えば、通常、注射による腸内投与および局所投与以外の投与様式が含まれ、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、および胸骨内への注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
化合物の用語「予防有効量」は、被験体への単回または複数回投与の際にＢＤの予防または治療に有用なＰＸＲ受容体修飾因子の量をいう。
【００７３】
本明細書中で使用する場合、用語「医薬品組成物」（または薬剤もしくは薬物）は、患者に適切に投与した場合に所望の治療効果を誘導することができる化合物、組成物、薬剤、または薬物をいう。これは、１つを超える成分型を必ずしも必要としない。
【００７４】
本明細書中で使用する場合、句「全身投与」、「全身に投与する」、「末梢投与」、および「末梢に投与する」は、被験体の系に入り、それにより、代謝および他の同様の過程（例えば、皮下投与）に供されるようなＰＸＲ受容体修飾因子、薬物、または他の材料の投与を意味する。
【００７５】
ＰＸＲ受容体修飾因子の用語「治療有効量」は、被験体への単回投与または複数回投与の際に、細菌の成長および／または侵入の阻害、または被験体における細菌成長に関連するＢＤエピソードなどの症状の軽減に有効なＰＸＲ受容体修飾因子の量をいう。「治療有効量」はまた、被験体におけるＢＤの重症度の減少に十分な療法（例えば、ＰＸＲ受容体修飾因子を含む組成物）の量をいう。
【００７６】
本明細書中で使用する場合、用語「予防する」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、ＢＤエピソードまたはＢＤのより多くの症状の再発、発病、または発症の予防をいう。予防には、ＢＤエピソードの出現および重症度の防御が含まれる。
【００７７】
本明細書中で使用する場合、用語「予防有効量」は、ＢＤエピソードの発症、再発、または発病の予防または別の療法の予防効果の増強または改善に十分な療法（例えば、ＰＸＲ受容体修飾因子を含む組成物）の量をいう。
【００７８】
本明細書中で使用する場合、「被験体」には、本明細書中に記載のＰＸＲ修飾因子によって治療可能な腸障害または他の障害を罹患し得る生物またはＰＸＲ修飾因子の投与から恩恵を受け得る生物（ヒトおよび非ヒト動物など）が含まれる。好ましいヒト動物には、ヒト被験体が含まれる。本発明の用語「非ヒト動物」には、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物（例えば、げっ歯類（例えば、マウス））および非哺乳動物（非ヒト霊長類（例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類など）））が含まれる。
【００７９】
本発明は、ＢＤに関連する多数の配列に関する。
【００８０】
被験体へのＰＸＲ修飾因子処方物の投与による胃腸障害または腸疾患を罹患しているか感受性を示す被験体の治療方法を本明細書中に記載する。本明細書中に記載のＰＸＲ修飾因子処方物の投与により、胃腸障害を有する被験体の治療効率が増加する。本発明の方法を使用して治療することができる例示的な胃腸障害および腸疾患（ＰＸＲ関連障害またはＰＸＲタンパク質関連障害）には、例えば、過敏性腸症候群、クローン病、旅行者下痢、潰瘍性大腸炎、腸炎、小腸細菌過剰増殖、慢性膵炎、膵機能不全、結腸炎、または肝性脳症が含まれるが、これらに限定されない。特にこの治療から恩恵を受けることができる被験体には、ＢＤであるか、ＢＤに感受性を示し得る被験体が含まれる。例えば、食物に起因する疾患を最近罹患した被験体。１つの実施形態では、腸疾患は肝性脳症を含む。１つの実施形態では、ＢＤは、１つまたは複数の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、肝性脳症、腸炎、結腸炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、線維筋痛（ＦＭ）、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）、鬱病、注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、旅行者下痢、小腸細菌過剰増殖、慢性膵炎、または膵機能不全を含む。
【００８１】
したがって、本発明は、本明細書中で「ＢＤ関連」または「ＢＤ」配列と呼ばれるＢＤに関連する核酸配列およびタンパク質配列を提供する。さらに、ＢＤ遺伝子は、他の疾患（加齢または神経変性に関連する疾患などであるが、これらに制限されない）に関与し得る。この文脈中の「関連」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が、正常組織と比較して、ＢＤ中で異なって発現するか、活性化するか、不活化するか、変化することを意味する。以下に概説するように、ＢＤ配列には、ＢＤ中で上方制御される（例えば、より高いレベルで発現する）配列および下方制御される（例えば、より低いレベルで発現する）配列が含まれる。ＢＤ配列には、変化し（例えば、短縮配列または置換、欠失、もしくは挿入（点変異が含まれる）された配列）、同一の発現プロフィールまたは変化したプロフィールのいずれかを示す配列も含まれる。１つの実施形態では、ＢＤ配列はヒトに由来するが、当業者に認識されるように、他の生物由来のＢＤ配列が疾患および薬物評価の動物モデルで有用であり得る。したがって、脊椎動物（哺乳動物（げっ歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど）、霊長類、および家畜（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどが含まれる）が含まれる）が含まれる）由来の他のＢＤ配列を提供する。いくつかの場合、原核生物ＢＤ配列が有用であり得る。他の生物由来のＢＤ配列を、以下に概説の技術を使用して得ることができる。
【００８２】
ＢＤ配列には、核酸配列およびアミノ酸配列の両方が含まれる。１つの実施形態では、ＢＤ配列は組換え核酸である。１つの実施形態では、ＢＤ配列は核酸である。当業者に認識され、且つ以下により完全に概説されるように、ＢＤ配列は、種々の適用（天然に存在する核酸を検出する診断的適用ならびにスクリーニング適用が含まれる）で有用であり、例えば、ＢＤ配列に対する核酸プローブを含むバイオチップを生成することができる。広義で、本明細書中での「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「オリゴヌクレオチド」、または等価物の使用は、相互に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、６、８、１０、１２、２０、３０、または１００個までのヌクレオチドのオリゴマーである。「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはホスホジエステルおよび／または任意の交互の結合によって連結したヌクレオチドのポリマーを含むことができる。
【００８３】
用語「標識」は、例えば、アッセイサンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す検出可能なシグナルを産生することができる組成物をいう。適切な標識には、放射性同位体、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、磁性粒子、および生物発光部分などが含まれる。そのようなものとして、標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、化学的手段、または任意の他の適切な手段によって検出可能な任意の組成物である。用語「標識」を、検出可能な物理的性質を有する任意の化学基もしくは化学的部分、または化学基もしくは化学的部分に検出可能な物理的性質を示させることができる任意の化合物（基質の検出可能な生成物への変換を触媒する酵素など）をいうために使用する。用語「標識」はまた、特定の物理的性質の発現を阻害する化合物を含む。標識はまた、結合対のメンバー、検出可能な物理的性質を保有する他のメンバーである化合物であり得る。
【００８４】
本明細書中で使用する場合、「生物サンプル」は、例えば、被験体から単離した組織または流動物（例えば、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸管および尿生殖路、涙、唾液、乳、細胞（血球が含まれるが、これらに限定されない）、ＢＤ、器官が含まれるが、これらに限定されない）のサンプルをいい、インビトロ細胞培養の構成要素のサンプルもいう。
【００８５】
本明細書中で使用する場合、用語「生物学的起源」は、例えば、標的ポリヌクレオチドが誘導される供給源をいう。供給源は、上記の任意の形態の「サンプル」（細胞、組織、または流動物が含まれるが、これらに限定されない）に由来し得る。「異なる生物学的起源」は、同一個体の異なる細胞／組織／器官、同一種の異なる個体由来細胞／組織／器官、または異なる種由来の細胞／組織／器官をいうことができる。
【００８６】
用語「遺伝子」は、例えば、（ａ）少なくとも１つの本明細書中に開示のＤＮＡ配列を含む遺伝子；（ｂ）本明細書中に開示のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする任意のＤＮＡ配列、および／または（ｃ）本明細書中に開示のコード配列の相補物とハイブリッド形成する任意のＤＮＡ配列をいう。好ましくは、この用語には、コード領域および非コード領域が含まれ、好ましくは、正常な遺伝子発現に必要な全ての配列（プロモーター、エンハンサー、および他の調節配列が含まれる）が含まれる。
【００８７】
「ＰＸＲ遺伝子」は、例えば、アクセッション番号：ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３またはアクセッション番号Ｏ７５４６９、Ｑ８ＳＱ０１、Ｑ９Ｒ１Ａ７、Ｏ５４９１５、ＮＰ＿１４８９３４、ＮＰ＿００３８８０、ＮＰ＿０７１２８５とＧｅｎｅｂａｎｋで同定された配列を含む遺伝子をいう。ＰＸＲ遺伝子の「破棄」は、ゲノムＤＮＡのフラグメントが存在し、内因性相同配列と組み合わせる場合に起こる。これらの配列の破壊または修飾には、ＤＮＡ配列の挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失、置換（すなわち、交換）、またはその任意の組み合わせが含まれ得る。挿入には、動物、植物、真菌、昆虫、原核生物、またはウイルス起源であり得る全遺伝子の挿入が含まれる。破壊により、例えば、ＰＸＲ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、またはスプライス部位を変化または置換することができ、その産生の部分的もしくは完全な阻害または正常な遺伝子産物の活性の増強によって正常な遺伝子産物を変化させることができる。
【００８８】
用語「トランスジェニック細胞」は、例えば、遺伝子ターゲティング法によって完全または部分的に破壊、修飾、変化、または置換されたＰＸＲ遺伝子をそのゲノム内に含む細胞をいう。
【００８９】
用語「トランスジェニック動物」は、例えば、遺伝子ターゲティング法によって破壊された特異的遺伝子をそのゲノム内に含む動物をいう。トランスジェニック動物には、ヘテロ接合体動物（例えば、１つの欠損対立遺伝子および１つの野生型対立遺伝子）およびホモ接合体動物（例えば、２つの欠損対立遺伝子）の両方が含まれる。
【００９０】
本明細書中で使用する場合、用語「選択マーカー」または「ポジティブ選択マーカー」は、例えば、遺伝子を保有する細胞のみが一定の条件下で生存および／または成長することができる産物をコードする遺伝子をいう。例えば、導入されたネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を発現する植物細胞および動物細胞は化合物Ｇ４１８に耐性を示す。Ｎｅｏｒ遺伝子マーカーを保有しない細胞は、Ｇ４１８によって死滅する。他のポジティブ選択マーカーが当業者に公知であろう。
【００９１】
「宿主細胞」には、ベクターまたは核酸分子および／またはタンパク質の組み込みのためのレシピエントであり得るか、レシピエントであった対象となる細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶然の、または故意の変異によって元の親と必ずしも完全に同一（形態または全ＤＮＡ相補性において）であるとは限らないであろう。宿主細胞には、本開示の構築物でトランスフェクトした細胞が含まれる。
【００９２】
本明細書中で使用する場合、用語「調整する」は、例えば、ＰＸＲ遺伝子破壊に関連するＰＸＲの機能、発現、活性、あるいは表現型の阻害、減少、増加、または増強をいう。ＰＸＲ受容体に関して、モジュールには、受容体または分子と受容体との相互作用の結合性の変化、結合、活性化、関連、および／または阻害も含まれる。
【００９３】
用語「回復する」は、例えば、容態、疾患、障害、または表現型（ＰＸＲ遺伝子破壊に関連する異常または症状が含まれる）の減少、軽減、または消失をいう。
【００９４】
用語「異常」は、例えば、ＰＸＲ遺伝子破壊が意図される任意の疾患、障害、容態、または表現型（病的状態が含まれる）をいう。
【００９５】
リファマイシンクラスの抗生物質は、例えば、式Ｉ：
【００９６】
【化１】
2011501672.tif 000002
（式中、Ａは、構造Ａ１：
【００９７】
【化２】
2011501672.tif 000003
または構造Ａ２：
【００９８】
【化３】
2011501672.tif 000004
であってよく、−ｘ−は共有結合性の化学結合であるか存在せず、Ｒは水素またはアセチルであり、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、（Ｃ１〜４）アルキル、ベンジルオキシ、モノ−およびジ−（Ｃ１〜３）アルキルアミノ−（Ｃ１〜４）アルキル、（Ｃ１〜３）アルコキシ−（Ｃ１〜４）アルキル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシ−（Ｃ２〜４）−アルキル、ニトロを示すか、Ｒ１およびＲ２は、ピリジン核の２つの連続した炭素原子と共に、１つまたは２つのメチル基またはエチル基で置換されていないか置換されたベンゼン環を形成し、Ｒ３は水素原子であるか存在せず、但し、ＡがＡ１である場合、−ｘ−は存在せず、Ｒ３は水素原子であり、さらに、但し、ＡがＡ２である場合、−ｘ−は共有結合性の化学結合であり、Ｒ３は存在しない）の構造を有する化合物である。
【００９９】
上記のようにＡはＡ１またはＡ２であり、−ｘ−は共有結合性の化学結合であるか存在せず、Ｒは水素またはアセチルであり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、（Ｃ１〜４）アルキル、ベンジルオキシ、ヒドロキシ−（Ｃ２〜４）アルキル、ジ−（Ｃ１〜３）アルキルアミノ−（Ｃ１〜４）アルキル、ニトロを示すか、Ｒ１およびＲ２は、ピリジン核の２つの連続した炭素原子と共に、ベンゼン環を形成し、Ｒ３は水素原子であるか存在せず、但し、ＡがＡ１である場合、−ｘ−は存在せず、Ｒ３は水素原子であり、さらに、但し、ＡがＡ２である場合、−ｘ−は共有結合性の化学結合であり、Ｒ３は存在しない、上記定義の化合物も本明細書中に記載する。
【０１００】
上記のようにＡはＡ１またはＡ２であり、−ｘ−は共有結合性の化学結合であるか存在せず、Ｒはアセチルであり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、（Ｃ１〜４）アルキルを示すか、Ｒ１およびＲ２は、ピリジン核の２つの連続した炭素原子と共に、ベンゼン環を形成し、Ｒ３は水素原子であるか存在せず、但し、ＡがＡ１である場合、−ｘ−は存在せず、Ｒ３は水素原子であり、さらに、但し、ＡがＡ２である場合、−ｘ−は共有結合性の化学結合であり、Ｒ３は存在しない、上記定義の化合物も本明細書中に記載する。
【０１０１】
４−デオキシ−４’−メチル−ピリド［１’，２’−１，２］イミダゾ［５，４−ｃ］リファマイシンＳＶである、上記定義の化合物も本明細書中に記載する。４−デオキシ−ピリド［１’，２’：１，２］イミダゾ［５，４−ｃ］リファマイシンＳＶである、上記定義の化合物も本明細書中に記載する。
【０１０２】
Ａは上記の通りであり、−ｘ−は共有結合性の化学結合であるか存在せず、Ｒは水素またはアセチルであり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、（Ｃ１〜４）アルキル、ベンジルオキシ、モノ−およびジ−（Ｃ１〜３）アルキルアミノ（Ｃ１〜４）アルキル、（Ｃ１〜３）アルコキシ−（Ｃ１〜４）アルキル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシ−（Ｃ２〜４）−アルキル、ニトロを示すか、Ｒ１およびＲ２は、ピリジン核の２つの連続した炭素原子と共に、１つまたは２つのメチル基またはエチル基で置換されていないか置換されたベンゼン環を形成し、Ｒ３は水素原子であるか存在せず、但し、ＡがＡ１である場合、−ｘ−は存在せず、Ｒ３は水素原子であり、さらに、但し、ＡがＡ２である場合、−ｘ−は共有結合性の化学結合であり、Ｒ３は存在しない、上記定義の化合物も本明細書中に記載する。
【０１０３】
リファキシミンは、式ＩＩ：
【０１０４】
【化４】
2011501672.tif 000005
の構造を有する化合物である。
【０１０５】
ＢＤ関連配列
ＢＤ配列を、本明細書中に概説のＢＤ配列に対する実質的な核酸および／またはアミノ酸の配列相同性によって最初に同定することができる。かかる相同性は、核酸配列またはアミノ酸配列全体に基づくことができ、一般に、相同性プログラムまたはハイブリッド形成条件のいずれかを使用して以下に概説のように決定する。１つの実施形態では、ＢＤ配列は、ＢＤ中で上方制御される配列である。すなわち、これらの遺伝子の発現は、正常組織と比較してＢＤ組織でより高い。本明細書中で使用する場合、「上方制御」は、約５０％、好ましくは約１００％、より好ましくは約１５０％〜約２００％の発現の増加（３００％〜１０００％の上方制御）を意味する。
【０１０６】
別の実施形態では、ＢＤ配列は、ＢＤ中で下方制御される配列である。すなわち、これらの遺伝子の発現は、同一の分化段階の正常組織と比較してＢＤ組織でより低い。本明細書中で使用する場合、「下方制御」は、約５０％、好ましくは約１００％、より好ましくは約１５０％〜約２００％の発現の減少（３００％〜１０００％から発現なしまでの下方制御）を意味する。
【０１０７】
さらに別の実施形態では、ＢＤ配列は、同一の分化段階の正常なリンパ組織と比較して配列が変化しているが、同一または変化した発現プロフィールのいずれかを示す配列である。本明細書中で使用する場合、「変化したＢＤ配列」はまた、例えば、短縮されているか、挿入を含むか、点変異を含む配列をいう。
【０１０８】
１つの実施形態では、ＢＤ配列は、膜貫通タンパク質である。膜貫通タンパク質は、細胞のリン脂質二重層に広がる分子である。膜貫通タンパク質は、細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、またはその両方を有し得る。かかるタンパク質の細胞内ドメインは、多数の機能（細胞内タンパク質について既に記載の機能が含まれる）を有し得る。タンパク質はまた、細胞内タンパク質、核内タンパク質、分泌タンパク質であり得る。
【０１０９】
一般に、本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、例えば、詳述のポリヌクレオチドによってコードされる全長ポリペプチドおよび列挙したポリヌクレオチドによって示される遺伝子によってコードされるポリペプチドの両方、ならびにその一部またはフラグメントをいう。本発明は、天然に存在するタンパク質の改変体を含み、かかる改変体は天然に存在するタンパク質と相同であるか実質的に類似し、天然に存在するタンパク質と同一または異なる種（例えば、ヒト、マウス、または列挙したポリペプチドを天然に発現するいくつかの他の種（通常、哺乳動物種））を起源とし得る。一般に、改変体ポリペプチドは、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、通常には少なくとも約９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、より通常には少なくとも約９９％の配列が異なって発現された本明細書中に記載のポリペプチドと同一である配列を有する。
【０１１０】
改変体も本発明の範囲内に含まれる。ポリペプチドの改変体には、変異体、フラグメント、および融合物が含まれる。変異体は、アミノ酸の置換、付加、または欠失を含むことができる。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非必須アミノ酸を排除するか（グリコシル化部位、リン酸化部位、またはアセチル化部位を変化させるなど）、機能に必要でない１つまたは複数のシステイン残基の置換または欠失による誤折り畳みを最小にするための置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、置換アミノ酸の全体的な電荷、疎水性／親水性、および／または立体容積が保存された置換である。タンパク質の特定の領域（例えば、機能ドメインおよび／または（ポリペプチドがタンパク質ファミリーのメンバーである場合）コンセンサス配列に関連する領域）の生物学的活性を保持するか増強されるように改変体をデザインすることができる。
【０１１１】
改変体はまた、本明細書中に開示のポリペプチドのフラグメント、特に、生物学的に活性なフラグメント、および／または機能ドメインに対応するフラグメントを含む。目的のフラグメントは、典型的には、少なくとも約８アミノ酸（ａａ）長、１０ａａ長、１５ａａ長、２０ａａ長、２５ａａ長、３０ａａ長、３５ａａ長、４０ａａ長から少なくとも約４５ａａ長、通常少なくとも約５０ａａ長、少なくとも約７５ａａ長、少なくとも約１００ａａ長、少なくとも約１２５ａａ長、少なくとも約１５０ａａ長、少なくとも約２００ａａ長、少なくとも約３００ａａ長、少なくとも約４００ａａ長であろう。任意の１つの本明細書中に提供するポリヌクレオチド配列またはそのホモログの配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同一であるアミノ酸をフラグメントが有する場合、５００ａａ長以上の長さであり得るが、通常は約１０００ａａ長を超えないであろう。本明細書中に記載のタンパク質改変体は、本発明の範囲内のポリヌクレオチドによってコードされる。遺伝暗号を使用して適切なコドンを選択して、対応する改変体を構築することができる。
【０１１２】
ＢＤに関連するポリヌクレオチド発現の変化が認められる一方で、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの発現レベルの変化がＢＤで役割を果たす可能性が高いかもしれない。
【０１１３】
以下で概説のようにクローン化および発現されるＢＤファミリーの他のＢＤタンパク質および他の生物由来のＢＤタンパク質も、１つの実施形態でＢＤタンパク質の定義内に含まれる。したがって、プローブまたは縮重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列を使用して、ヒトまたは他の生物から他の関連ＢＤタンパク質を見出すことができる。当業者に認識されるように、特に有用なプローブおよび／またはＰＣＲプライマー配列は、ＢＤ核酸配列の固有の領域を含む。当該分野で一般的に知られているように、一定のＰＣＲプライマーは約１５〜約３５ヌクレオチド長であり、約２０〜約３０が確かであり、必要に応じてイノシンを含むことができる。ＰＣＲの反応条件は当該分野で周知である。さらに、本明細書中で概説するように、例えば、さらなる配列の解明、エピトープまたは精製タグの付加、他の融合配列の付加などによって図の核酸によってコードされるものよりも長いＢＤタンパク質を作製することができる。ＢＤタンパク質を、ＢＤ核酸によってコードされると同定することもできる。したがって、ＢＤタンパク質は、本明細書中で概説するように、配列表の配列またはその相補物とハイブリッド形成する核酸によってコードされる。
【０１１４】
ＢＤ配列は、本明細書中に概説のＢＤ配列に対する実質的な核酸および／またはアミノ酸の配列相同性によって最初に同定される。かかる相同性は、核酸配列またはアミノ酸配列全体に基づくことができ、一般に、相同性プログラムまたはハイブリッド形成条件のいずれかを使用して以下に概説のように決定する。
【０１１５】
本明細書中で使用する場合、本明細書中に記載の１つの核酸に対する核酸配列の全相同性が好ましくは約７５％超、約８０％超、約８５％超、または９０％超である場合、核酸は「ＢＤ核酸」である。いくつかの実施形態では、相同性は、約９３〜９５％または９８％の高さであろう。１つの実施形態では、配列同一性または配列類似性を決定するために使用される配列は、本明細書中に記載の核酸配列から選択される。別の実施形態では、配列は、本明細書中に記載の核酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体である。別の実施形態では、配列は、本明細書中にさらに記載の配列改変体である。
【０１１６】
この文脈での相同性は、配列類似性または配列同一性を意味する。相同性を目的とした比較は、配列エラーを含む配列を正確な配列と比較することである。この相同性を、当該分野で公知の標準的技術（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．中のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実行、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）によって記載されたＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム（好ましくはデフォルト値を使用）、または目視が含まれるが、これらに限定されない）を使用して決定するであろう。有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメントを使用して、関連配列群から複数の配列アラインメントを作製する。これは、アラインメントを作製するために使用したクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、簡略化されたＦｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）のプログレッシブアラインメント法を使用する。本方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）によって記載された方法と類似する。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターには、デフォルトギャップウェイト３．００、デフォルトギャップレングスウェイト０．１０、および加重エンドギャップが含まれる。有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）およびＫａｒｌｉｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）に記載のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）アルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／から得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを使用し、そのほとんどがデフォルト値に設定される。調整可能なパラメーターを、以下の値の範囲内に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  ＳおよびＨＳＰ  Ｓ２パラメーターは動的な値であり、特定の配列の組成および目的の配列が検索される特定のデータベースの組成に応じてプログラム自体によって確立されるが、感度を増加させるために値を調整することができる。アミノ酸配列の同一率を、マッチングした同一残基数をアラインメントした領域中の「より長い」配列の総残基数で割ることによって決定する。「より長い」配列は、アラインメントした領域中の最多数の実際の残基を有する配列である（アラインメントスコアを最大にするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって導入されたギャップは無視する）。したがって、「核酸配列同一率（％）」を、アクセッション番号：ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、またはＣＳ６１８１３３の核酸のヌクレオチド残基と同一の候補配列中のヌクレオチド残基の比率と定義する。
【０１１７】
本発明の別の実施形態では、中〜高ストリンジェンシー条件下で本明細書中に提供したポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補配列とハイブリッド形成することができるポリヌクレオチド組成物を提供する。ハイブリッド形成技術は、分子生物学分野で周知である。例示のために、本発明のポリヌクレオチドの他のポリヌクレオチドとのハイブリッド形成試験に適切な中ストリンジェント条件は、５×ＳＳＣ（「クエン酸ナトリウム−生理食塩水液」；９ｍＭ  ＮａＣｌ、０．９ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液での予備洗浄、５×ＳＳＣにて５０〜６０℃で一晩のハイブリッド形成、その後の０．１％ＳＤＳを含む各２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ、および０．２ＳＳＣでの６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。当業者は、ハイブリッド形成のストリンジェンシーを、ハイブリッド形成溶液の塩含有量および／またはハイブリッド形成を行う温度の変化などによって容易に操作することができると理解するであろう。例えば、別の実施形態では、適切な高ストリンジェントハイブリッド形成条件は、ハイブリッド形成温度を、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃に上昇させることを除いて、上記の条件を含む。ストリンジェント条件を、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することもできる。
【０１１８】
さらに、本発明のＢＤ核酸配列は、より長い遺伝子のフラグメントである。例えば、ＢＤ核酸配列は核酸セグメントである。あるいは、ＢＤ核酸配列は、癌遺伝子位置の指標としての機能を果たすことができる。例えば、ＢＤ配列は、癌原遺伝子を活性化するエンハンサーであり得る。この文脈中の「遺伝子」は、コード領域、非コード領域、およびコード領域と非コード領域との混合物を含む。したがって、当業者に認識されるように、本明細書中に提供した配列を使用し、より長い配列または全長配列のいずれかのクローニングのための当該分野で周知の技術を使用して、さらなるＢＤ遺伝子配列を得ることができる。Ｍａｎｉａｔｉｓら、およびＡｕｓｕｂｅｌら，前出（本明細書中で参考として明確に援用される）を参照のこと。一般に、ＰＣＲ（例えば、動態学的ＰＣＲ）を使用してこれを行う。
【０１１９】
ＢＤ発現の検出
一旦ＢＤ核酸が同定されると、これをクローン化し、必要に応じて、その構成部分を組み換えて全ＢＤ核酸を形成することができる。一旦その天然供給源から単離される（例えば、プラスミドまたは他のベクター内に含まれるか、線状核酸セグメントとして切り出される）と、組換えＢＤ核酸を、他のＢＤ核酸（例えば、さらなるコード領域）を同定および単離するためのプローブとしてさらに使用することができる。これを、修飾ＢＤ核酸または改変体ＢＤ核酸およびタンパク質を作製するための「前駆体」核酸として使用することもできる。１つの実施形態では、一旦ＢＤ遺伝子が同定されると、そのヌクレオチド配列を使用して、ＢＤ遺伝子に特異的なプローブをデザインする。
【０１２０】
本発明のＢＤ核酸を、いくつかの方法で使用する。第１の実施形態では、ＢＤ核酸とハイブリッド形成可能な核酸プローブを作製し、スクリーニング法および診断法で使用されるか遺伝子療法および／またはアンチセンスへの適用のためにバイオチップに付着させる。あるいは、ＢＤタンパク質のコード領域を含むＢＤ核酸を、ＢＤタンパク質発現、さらに、スクリーニングまたは被験体への投与のいずれかのために発現ベクターに入れ込むことができる。
【０１２１】
最近のＤＮＡマイクロアレイテクノロジーの発展により、単一の固相支持体上での複数の標的ＢＤ核酸分子の大規模アッセイを行うことが可能となっている。米国特許第５，８３７，８３２号（Ｃｈｅｅら）および関連特許出願は、サンプル中の特異的核酸配列のハイブリッド形成および検出のためのオリゴヌクレオチドプローブアレイの固定を記載している。目的の組織から単離した目的の標的ポリヌクレオチドを、ＤＮＡチップおよび標的ポリヌクレオチドの優先度および個別のプローブ位置でのハイブリッド形成度に基づいて検出した特異的配列とハイブリッド形成する。異なる細胞（しばしば目的の細胞およびコントロール細胞）中の遺伝子の発現プロフィールを比較し、各細胞間の遺伝子発現の任意の差異を同定する場合、アレイの１つの使用例は、差次的遺伝子発現の分析における使用である。かかる情報は、特定の細胞または組織型で発現した遺伝子型の同定および発現プロフィールに基づいたＢＤ容態の診断に有用である。米国特許第６，４１０，２２９（Ｌｏｃｋｈａｒｔら）を参照のこと。例えば、ヒト癌における遺伝子発現パターンを分析するためのｃＤＮＡマイクロアレイの使用は、ＤｅＲｉｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５７−４６０（１９９６））によって記載されている。
【０１２２】
一定の実施形態では、プローブはキメラ分子であり得、例えば、１つを超える塩基または糖のサブユニット型を含むことができ、そして／または結合は同一プライマー内の１つを超える型に由来し得る。プローブは、当該分野で公知のように、その標的配列とのハイブリッド形成を容易にするための部分（例えば、介入物および／または副溝結合剤）を含むことができる。塩基、糖、およびヌクレオシド間骨格の変動、ならびにプローブ上の任意の懸垂基の存在は、配列特異的様式でその標的配列に結合するプローブの能力に適合するであろう。既知および開発中の多数の構造修飾は、これらの結合内で可能である。有利には、本発明のプローブは、シグナルが増幅されるような構造的特徴を有することができ、かかる構造的特徴は、Ｕｒｄｅａら（核酸  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２４：１９７−２００（１９９１））または欧州特許第ＥＰ−０２２５，８０７号に記載の分岐ＤＮＡプローブなどの分岐ＤＮＡプローブである。さらに、プローブを形成する種々の複素環の塩基、糖、ヌクレオシド、およびヌクレオチドの調製ならびに特定の所定の配列のオリゴヌクレオチドの調製のための合成方法は、十分に開発されており、当該分野で公知である。１つのオリゴヌクレオチド合成方法は、米国特許第５，４１９，９６６号の教示を組み込んでいる。
【０１２３】
１つの実施形態では、ＢＤタンパク質をコードするＢＤ核酸を使用してＢＤタンパク質を発現するための種々の発現ベクターを作製し、次いで、これを下記のようにスクリーニングアッセイで使用することができる。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。一般に、これらの発現ベクターには、ＢＤタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された転写および翻訳調節核酸が含まれる。用語「調節配列」は、例えば、特定の宿主生物中の作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な調節配列には、例えば、プロモーター、任意選択的なオペレーター配列、およびリボゾーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを使用することが公知である。
【０１２４】
核酸は、別の核酸配列と機能的に関係する場合、「作動可能に連結」される。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結される。プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。または、リボゾーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合、連続的且つ読み取り相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続的である必要はない。種々の宿主細胞のための多数の適切な発現ベクター型および適切な調節配列型は、当該分野で公知である。
【０１２５】
一般に、転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が含まれ得るが、これらに限定されない。１つの実施形態では、調節配列には、プロモーターならびに転写開始配列および転写終結配列が含まれる。プロモーター配列は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかをコードする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。１つを超えるプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターも当該分野で公知であり、本発明で有用である。
【０１２６】
さらに、発現ベクターは、さらなるエレメントを含むことができる。例えば、発現ベクターは２つの複製系を有することができ、したがって、２つの生物中（例えば、発現のための哺乳動物細胞中または昆虫細胞中およびクローニングおよび増幅のための原核生物宿主中）に維持することが可能となる。さらに、１つの実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択可能にするための選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当該分野で周知であり、使用される宿主細胞に応じて変化するであろう。
【０１２７】
本発明のＢＤタンパク質を、例えば、ＢＤタンパク質の発現を誘導するか引き起こすための適切な条件下で、ＢＤタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって産生することができる。ＢＤタンパク質発現に適切な条件は、選択する発現ベクターおよび宿主細胞に応じて変化し、日常的な実験により当業者によって容易に確認されるであろう。例えば、発現ベクター中の構成性プロモーターの使用は、宿主細胞の成長および増殖の至適化に必要である一方で、誘導性プロモーターの使用は、誘導に適切な成長条件に必要であろう。さらに、いくつかの実施形態では、回収のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現で使用されるバキュロウイルス系は、溶解性ウイルスであり、したがって、回収時期の選択は、産物の収量に非常に重要であり得る。
【０１２８】
ＢＤタンパク質を、当該分野で周知の技術を使用して、融合タンパク質として作製することもできる。
【０１２９】
１つの実施形態では、本発明のＢＤ核酸、タンパク質、および抗体を標識する。本明細書中の「標識された」は、化合物を直接または間接的に標識し、検出可能なシグナルが得られる少なくとも１つのエレメント（例えば、化合物を検出することができるように付着させた同位体または化合物）を有することができることを意味する。一般に、標識には、同位体標識（放射性同位体標識または重同位体であり得る）、磁気標識、酵素標識、免疫標識（抗体または抗原であり得る）、および有色色素または蛍光色素が含まれる。標識を、ＢＤ核酸、タンパク質、および抗体の任意の位置に組み込むことができる。例えば、標識は、検出可能なシグナルを直接または間接的に産生することができなければならない。検出可能な部分は、放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなど）、蛍光化合物または化学発光化合物（フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、またはルシフェリンなど）、または酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼなど）であり得る。抗体を標識に抱合するための当該分野で公知の任意の方法（Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．およびＣｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）に記載の方法が含まれる）を使用することができる。他の標識には、特異的結合分子が含まれ得る。特異的結合分子には、対（ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンなど）が含まれる。特異的結合メンバーについて、相補メンバーを、通常、上記で概説するように、公知の手順にしたがって検出される分子で標識するであろう。標識により、検出可能なシグナルを直接または間接的に得ることができる。
【０１３０】
１つの実施形態では、候補生物活性剤の結合を、競合結合アッセイの使用によって決定する。この実施形態では、競合物は、標的分子（例えば、ＢＤタンパク質）に結合することが公知の結合部分（抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなど）である。一定の環境下で、生物活性剤と結合部分との間で競合結合が起こり得、結合部分が生物活性剤に取って代わる。
【０１３１】
ＢＤ抗原およびＢＤ抗原に対する抗体
１つの実施形態では、本発明は、ＢＤ特異的抗体を提供する。１つの実施形態では、ＢＤタンパク質が、例えば、免疫療法のための抗体を生成するために使用される場合、ＢＤタンパク質は、少なくとも１つのエピトープまたは決定基を全長タンパク質と共有すべきである。本明細書中の「エピトープ」または「決定基」は、ＭＨＣの状況下で抗体またはＴ細胞受容体を生成し、そして／またはこれらと結合するタンパク質の一部を意味する。したがって、ほとんどの場合、より小さなＢＤタンパク質に対して作製された抗体は、全長タンパク質に結合することができるであろう。１つの実施形態では、エピトープは固有である。すなわち、固有のエピトープに対して生成された抗体は、交差反応性をほとんど示さないか、全く示さない。ＢＤポリヌクレオチド配列によってコードされる任意のポリペプチド配列を分析して、ポリペプチドの一定の領域を決定することができる。高抗原性領域を、例えば、免疫応答の開始過程で抗原認識が生じ得る環境下でポリペプチド表面上に露呈される可能性が高いポリペプチド領域を示す値の選択によるＤＮＡＳＴＡＲ分析によってデータから決定する。例えば、ＢＤポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を、ＤＮＡＳＴＡＲコンピュータアルゴリズム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．；ワールドワイドウェブのｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍで見出される）のデフォルトパラメーターを使用して分析することができる。
【０１３２】
１つの実施形態では、用語「抗体」には、全抗体または組換えＤＮＡテクノロジーを使用して再度合成された抗体の修飾によって産生された当該分野で公知の抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ２、単鎖抗体（例えば、Ｆｖ）、キメラ抗体などが含まれる）が含まれる。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に公知である。ポリクローナル抗体を、例えば、免疫剤および必要に応じたアジュバントの１回または複数回の注射によって哺乳動物中で惹起することができる。あるいは、抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載の方法などのハイブリドーマ法を使用して調製することができる。１つの実施形態では、ＢＤに対する抗体は、下記のように、ＢＤの生物機能を減少または消失させることができる。すなわち、ＢＤ（またはＢＤを含む細胞）への抗ＢＤ抗体（ポリクローナル抗体または好ましくはモノクローナル抗体のいずれか）の添加により、ＢＤ活性を減少または消失させることができる。１つの実施形態では、ＢＤタンパク質に対する抗体はヒト化抗体である。「ヒト化」抗体は、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有し、且つヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいた分子の免疫グロブリン構造を維持する分子をいう。ＢＤタンパク質に対する特異的抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれか）を、上記で考察の当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生することができる。例えば、マウスまたはヒトモノクローナル抗体を、ハイブリドーマテクノロジーによって産生することができるか、ＢＤタンパク質もしくはその免疫学的に活性なフラグメントまたは抗イディオタイプ抗体もしくはそのフラグメントを動物に投与して、ＢＤタンパク質を認識して結合することができる抗体の産生を誘発することができる。かかる抗体は、任意の抗体クラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、または、鳥類の場合、ＩｇＹが含まれるが、これらに限定されない）および任意の抗体サブクラスに由来し得る。
【０１３３】
別の一定の実施形態では、抗体が惹起されるＢＤタンパク質は膜貫通タンパク質である。理論に拘束されないが、治療のために使用される抗体は、ＢＤタンパク質の細胞外ドメインに結合し、細胞外ドメインの他のタンパク質（循環リガンドまたは細胞結合分子など）への結合を予防する。抗体により、膜貫通ＢＤタンパク質を下方制御することができる。当業者によって認識されるように、抗体は、ＢＤタンパク質の細胞外ドメインへのタンパク質結合の競合性インヒビター、非競合性インヒビター、または不競合性インヒビターであり得る。抗体はまた、ＢＤタンパク質のアンタゴニストである。さらに、抗体は、膜貫通ＢＤタンパク質の活性化を予防する。１つの態様では、抗体がＢＤタンパク質への他の分子の結合を予防する場合、抗体は細胞成長を予防する。抗体はまた、細胞毒性薬（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＮＦ−γ、およびＩＬ−２が含まれるが、これらに限定されない）または化学療法薬（５ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシン  Ｄ、シスプラチン、およびメトトレキサートなどが含まれる）に対して細胞を感作させることができる。いくつかの例では、抗体は、膜貫通タンパク質と複合体化した場合に血清補体を活性化し、それによって細胞傷害性を媒介するサブタイプに属する。したがって、ＢＤを、膜貫通ＢＤタンパク質に指向する本抗体への投与によって処置することができる。
【０１３４】
別の一定の実施形態では、抗体を治療部分に抱合する。１つの態様では、治療部分は、ＢＤタンパク質の活性を調整する小分子である。別の態様では、治療部分は、ＢＤタンパク質に会合するか、ごく接近した分子の活性を調整する。治療部分は、ＢＤに関連するプロテアーゼ活性またはタンパク質キナーゼなどの酵素活性を阻害することができる。
【０１３５】
別の一定の実施形態では、抗体が惹起されるＢＤタンパク質は細胞内タンパク質である。この場合、抗体を、細胞への侵入を容易にするタンパク質に抱合することができる。１つの場合、抗体はエンドサイトーシスによって細胞に侵入する。別の実施形態では、抗体をコードする核酸を、個体または細胞に投与する。さらに、ＢＤタンパク質を細胞内（例えば、核内）でターゲティングすることができる場合、その抗体は、局在化をターゲティングするシグナル（例えば、核局在化シグナル）を含む。
【０１３６】
本発明のＢＤ抗体は、ＢＤタンパク質に特異的に結合する。本明細書中の「特異的に結合する」は、抗体が１０４〜１０−６Ｍの範囲（ある範囲は１０−７〜１０−９Ｍである）の結合定数でタンパク質に結合することを意味する。１つの実施形態では、ＢＤタンパク質を、発現後に精製または単離する。ＢＤタンパク質を、どのようなタンパク質成分がサンプル中に存在するかに応じて、当業者に公知の種々の方法で単離または精製することができる。
【０１３７】
本明細書中に記載の抗体の産生には、例えば、１つまたは複数のエピトープを特異的に認識することができる抗体の産生方法が含まれる。かかる抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれ得るが、これらに限定されない。かかる抗体を、例えば、生物サンプル中のＰＸＲ遺伝子の検出で使用することができるか、異常なＰＸＲ遺伝子活性の阻害方法として使用することができる。したがって、かかる抗体を、異常なＰＸＲ遺伝子タンパク質レベル、またはかかるタンパク質の異常な形態の存在について被験体を試験することができる疾患治療方法の一部として使用することができ、そして／または診断技術の一部として使用することができる。
【０１３８】
抗体産生のために、種々の宿主動物を、ＰＸＲ遺伝子、その発現産物、またはその一部を使用した注射によって免疫化することができる。かかる宿主動物には、ほんの数例を挙げれば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、およびニワトリが含まれ得るが、これらに限定されない。宿主の種に応じて種々のアジュバント（フロインド（完全および不完全）、ミネラルゲル（水酸化アルミニウムなど）、界面活性物質（リゾレシチンなど）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホール−リンペット−ヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなど）が含まれ得るが、これらに限定されない）を使用して、免疫学的応答を増加させることができる。
【０１３９】
ポリクローナル抗体は、抗原（ＰＸＲ遺伝子産物など）またはその抗原機能性誘導体で免疫化した動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。ポリクローナル抗体産生のために、宿主動物（上記の宿主抗体など）を、上記にも記載のアジュバントを補足した遺伝子産物を使用した注射によって免疫化することができる。
【０１４０】
特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体を、連続細胞株の培養によって抗体分子が産生される任意の技術によって得ることができる。これらには、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−７（１９７５）および米国特許第４，３７６，１１０号のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２０２６−３０（１９８３））、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  ＢＤ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．７７−９６（１９８５））が含まれ得るが、これらに限定されない。かかる抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤが含まれる）および任意のそのサブクラスに由来し得る。この開示のｍＡｂを産生するハイブリドーマを、インビトロまたはインビボで培養することができる。インビボでの高力価のｍＡｂの産生により、現在、一定の産生方法が得られている。
【０１４１】
さらに、適切な生物学的活性を示すヒト抗体分子由来の遺伝子との適切な抗原特異性を示すマウス抗体由来の遺伝子のスプライシングによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−５４（１９８５））を使用することができる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子（マウスｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有する分子など）である。
【０１４２】
あるいは、単鎖抗体産生について記載の技術（米国特許第４，９４６，７７８；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５４４−４６（１９８９））を、遺伝子−単鎖抗体を産生するように適合させることができる。単鎖抗体を、典型的には、アミノ酸架橋を介したＦｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントを連結して単鎖ポリペプチドを得ることによって形成する。
【０１４３】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントを、公知の技術によって生成することができる。例えば、かかるフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって生成することができるＦａｂフラグメントが含まれ得るが、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速且つ容易に同定するためのＦａｂ発現ライブラリーを構築することができる（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−８１（１９８９））。
【０１４４】
ＢＤ表現型の検出
一旦発現および精製されると、必要に応じて、ＢＤタンパク質およびＢＤ核酸は、多数の適用で有用である。１つの態様では、ＢＤ表現型における異なる細胞状態についての遺伝子の発現レベルを決定する。すなわち、正常組織およびＢＤ組織中の遺伝子の発現レベルを評価して発現プロフィールを得る。特定の細胞状態または発生点の発現プロフィールは、本質的に、状態の「フィンガープリント」である一方で、２つの状態は、同様に発現する任意の特定の遺伝子を有することができ、多数の遺伝子の評価によって細胞の状態に固有の遺伝子発現プロフィールが同時に得られる。異なる状態の細胞の発現プロフィールの比較により、これらの各状態で遺伝子がどちらであるか（遺伝子の上方制御および下方制御の両方が含まれる）に関する情報が得られる。次いで、診断を行うか、例えば、特定の被験体由来の組織が正常組織またはＢＤ組織の遺伝子発現プロフィールを有するかを確認することができる。
【０１４５】
１つの実施形態では、本明細書中に記載の３つのタンパク質クラスのいずれか（分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内タンパク質）を、診断アッセイで使用する。ＢＤタンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質、およびＢＤ配列を含む細胞を、診断アッセイで使用する。本遺伝子レベルもしくは対応するポリペプチドレベルについてまたはアッセイ組としてこれを行うことができる。
【０１４６】
別の一定の方法では、ＢＤタンパク質に対する抗体をインサイチュ画像化技術で使用する。この方法では、細胞を、１つから多数までのＢＤタンパク質に対する抗体と接触させる。非特異的抗体結合を除去するための洗浄後、抗体の存在を検出する。１つの実施形態では、検出可能な標識を含む二次抗体とのインキュベーションによって抗体を検出する。別の方法では、ＢＤタンパク質に対する一次抗体は検出可能な標識を含む。別の一定の実施形態では、複数の一次抗体はそれぞれ異なる検出可能な標識を含む。この方法を、特に、複数のＢＤタンパク質の同時スクリーニングで使用する。当業者によって認識されるように、多数の他の組織学的画像化技術は、本発明で有用である。
【０１４７】
被験体と標準との間の発現フィンガープリントを比較した場合、当業者は診断および予後を得ることができると理解される。診断を示す遺伝子が予後を示す遺伝子と異なり得ることがさらに理解される。
【０１４８】
候補組成物のスクリーニング
１つの実施形態では、本明細書中に記載の任意のＢＤ配列を、薬物スクリーニングアッセイで使用する。ＢＤタンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質、およびＢＤ配列を含む細胞を、薬物スクリーニングアッセイで使用するか、「遺伝子発現プロフィール」またはポリペプチドの発現プロフィールに及ぼす薬物候補の影響の評価によって使用する。１つの実施形態では、発現プロフィールを、好ましくは、候補剤での処置後に発現プロフィール遺伝子をモニタリング可能な高処理スクリーニング技術と併せて使用する（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，８４−８（１９９８）、Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６：９８６−９９４（１９９６））。
【０１４９】
別の実施形態では、ＢＤタンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質、および未変性または修飾ＢＤタンパク質を含む細胞をスクリーニングアッセイで使用する。すなわち、本発明は、ＢＤ表現型を調整する組成物の新規なスクリーニング方法を提供する。上記のように、遺伝子発現の修飾因子またはタンパク質活性の修飾因子のスクリーニングによってこれを行うことができる。同様に、本遺伝子またはタンパク質レベルについて、または「遺伝子発現プロフィール」に及ぼす薬物候補の影響の評価によってこれを行うことができる。１つの実施形態では、発現プロフィールを、好ましくは、候補剤での処置後に発現プロフィール遺伝子をモニタリング可能な高処理スクリーニング技術と併せて使用する（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ、前出を参照のこと）。
【０１５０】
本明細書中のＢＤ遺伝子が同定されると、遺伝子発現に及ぼす薬剤の影響を評価するための種々のアッセイを実行することができる。１つの実施形態では、本遺伝子またはタンパク質レベルに対してアッセイを行うことができる。すなわち、特定の遺伝子がＢＤで異常に調節されると同定されると、遺伝子調節を調整するための候補生物活性剤をスクリーニングすることができる。したがって、「調整」には、遺伝子の発現または活性の増加および減少の両方が含まれる。一定の調整量は、正常組織対ＢＤ組織の遺伝子発現の元の変化（少なくとも１０％、好ましくは５０％、より好ましくは１００〜３００％、いくつかの実施形態では３００〜１０００％またはそれを超える変化）に依存するであろう。したがって、遺伝子が正常組織と比較してＢＤで４倍増加する場合、約１／４に減少させることが望ましい。正常組織と比較してＢＤで１／１０に減少する場合、候補剤で１０倍に増加させることなどが望ましい。あるいは、ＢＤ配列は変化したが、同一の発現プロフィールまたは変化した発現プロフィールを示す場合、タンパク質を本明細書中に概説のように検出するであろう。
【０１５１】
当業者に認識されるように、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルのいずれかでの評価によってこれを行うことができる。すなわち、遺伝子発現量を、核酸プローブを使用してモニタリングすることができるか、遺伝子発現レベルまたは遺伝子産物自体のレベルの定量を、例えば、ＢＤタンパク質に対する抗体および標準的な免疫アッセイの使用によってモニタリングすることができる。あるいは、タンパク質を使用した結合アッセイおよび生物活性アッセイを以下に概説のように行うことができる。
【０１５２】
１つの実施形態では、遺伝子発現のモニタリングを行い、多数の遺伝子（例えば、発現プロフィール）を同時にモニタリングするが、複数のタンパク質発現のモニタリングを同様に行うことができる。
【０１５３】
一般に、１つの実施形態では、分析前に候補生物活性剤を細胞に添加する。さらに、スクリーニングを行って、特定のＢＤ型を調整するか、ＢＤタンパク質を調整するか、ＢＤタンパク質に結合するか、ＢＤタンパク質と抗体との間の結合を干渉する候補生物活性剤を同定する。
【０１５４】
本明細書中で使用する場合、用語「候補生物活性剤」、「候補剤」、「候補組成物」、または「薬物候補」、または文法上の等価物は、ＢＤ表現型、ＢＤタンパク質への結合および／または生物活性の調整、またはＢＤ配列（核酸配列およびタンパク質配列の両方が含まれる）の発現のいずれかを直接または間接的に変化させることができる生物活性剤について試験すべき任意の分子、（例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機小分子または無機小分子、ポリサッカリド、ポリヌクレオチドなど）を説明する。特に一定の実施形態では、候補剤は、例えば、正常な組織フィンガープリントにＢＤ表現型を抑制する。同様に、候補剤は、好ましくは、重篤なＢＤ表現型を抑制する。一般に、複数のアッセイ混合物を、異なる薬剤濃度を使用して並行してアッセイして、種々の濃度に対する異なる応答を得る。典型的には、これらの濃度のうちの１つは、例えば、濃度０または検出レベル未満でのネガティブコントロールとして役立つ。
【０１５５】
１つの態様では、候補剤は、ＢＤタンパク質の影響を中和するであろう。「中和する」は、タンパク質活性を阻害するか反作用して、細胞に対する影響が実質的になくなることを意味する。
【０１５６】
候補剤は多数の化学クラスを含むが、典型的には、有機分子または無機分子、好ましくは、１００ダルトンを超え、且つ約２，５００ダルトン未満の分子量の有機小化合物である。小分子は、例えば、２０００Ｄ未満、１５００Ｄ未満、１０００Ｄ未満、または５００Ｄ未満であり得る。候補剤は、タンパク質との構造的相互作用（特に、水素結合）に必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含み、好ましくは少なくとも２つの化学反応性官能基を含む。候補剤は、しばしば、１つまたは複数の上記官能基と置換された環状炭素構造または複素環構造および／または芳香族構造または多環芳香族構造を含む。候補剤はまた、生体分子（ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、その構造アナログまたは組み合わせが含まれる）の間で見出される。
【０１５７】
候補剤は、広範な種々の供給源（合成化合物または天然化合物のライブラリーが含まれる）から得られる。例えば、多数の手段が広範な種々の有機化合物および生体分子の無作為および指向性の合成（無作為化オリゴヌクレオチドの発現が含まれる）に利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、容易に産生される。さらに、天然または合成的に産生されたライブラリーおよび化合物を、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に修飾する。公知の薬理学的作用物質を、指向性または無作為な化学修飾（アシル化、アルキル化、エステル化、またはアミド化など）に供して構造アナログを生成することができる。１つの実施形態では、候補生物活性剤はタンパク質である。１つの実施形態では、候補生物活性剤は、天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質のフラグメントである。したがって、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物またはタンパク質性細胞抽出物の無作為または指向性の消化物を使用することができる。このようにして、本発明の方法におけるスクリーニングのための原核生物または真核生物のタンパク質のライブラリーを作製することができる。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、例えば、細菌、真菌、ウイルス、および哺乳動物のタンパク質でできている。
【０１５８】
別の実施形態では、候補生物活性剤は、約５〜約３０アミノ酸、約５〜約２０アミノ酸、または約７〜約１５アミノ酸のペプチドである。ペプチドは、上記で概説の天然に存在するタンパク質、ランダムペプチド、または「偏った」ランダムペプチドの消化物であり得る。
【０１５９】
１つの実施形態では、候補生物活性剤は核酸である。タンパク質について一般に説明されるように、核酸候補生物活性剤は、天然に存在する核酸、ランダム核酸、または「偏った」ランダム核酸であり得る。別の実施形態では、候補生物活性剤は、有機化学部分であり、広範な種々の有機化学部分は文献に記載されている。
【０１６０】
アッセイの実施中または実施後に、データを分析して、各遺伝子の発現レベルおよび各遺伝子の状態の間の発現レベルの変化を決定し、遺伝子発現プロフィールを形成する。
【０１６１】
１つの実施形態では、診断および予後への適用に関して、任意の１つの状態で異なって発現された遺伝子または変異遺伝子が同定された場合、スクリーニングを行って、ＢＤ遺伝子の発現の変化を個別に試験することができる。すなわち、単一遺伝子の発現調節の調整についてのスクリーニングを行うことができる。したがって、例えば、その有無が２つの状態間で固有の標的遺伝子の場合、標的遺伝子発現の修飾因子についてスクリーニングを行う。１つの実施形態では、候補生物活性剤を標識する。候補生物活性剤、競合物、または両方のいずれかを、存在する場合、結合させるのに十分な期間タンパク質に最初に添加する。最適活性を促進する任意の温度（典型的には、４℃と４０℃との間）でインキュベーションを行うことができる。最適活性のためのインキュベーション期間を選択するが、迅速な高処理スクリーニングを容易にするために至適化することもできる。典型的には、０．１時間と１時間との間で十分であろう。過剰な試薬を、一般に、除去するか洗い流す。次いで、第２の化合物を添加し、結合を示すために標識された成分の有無を追跡する。
【０１６２】
１つの実施形態では、競合物を最初に添加し、その後に候補生物活性剤を添加する。競合物の置換は、候補生物活性剤がＢＤタンパク質に結合し、したがって、ＢＤタンパク質に結合して潜在的にＢＤタンパク質の活性を調整することができることを示す。この実施形態では、いずれかの成分を標識することができる。したがって、例えば、競合物を標識する場合、洗浄液中の標識の存在は薬剤との置換を示す。あるいは、候補生物活性剤を標識する場合、支持体上の標識の存在は置換を示す。
【０１６３】
別の実施形態では、候補生物活性剤を最初に添加してインキュベーションおよび洗浄を行い、その後に競合物を添加する。競合物による結合の非存在は、生物活性剤がＢＤタンパク質に高親和性で結合することを示し得る。したがって、候補生物活性剤を標識する場合、競合物結合の欠如を伴う支持体上の標識の存在は、候補剤がＢＤタンパク質に結合することができることを示し得る。
【０１６４】
１つの実施形態では、本方法は、ＢＤタンパク質の活性を調整することができる生物活性剤を同定するためのディファレンシャルスクリーニングを含む。この実施形態では、本方法は、第１のサンプル中でＢＤタンパク質を競合物と組み合わせる工程を含む。第２のサンプルは、候補生物活性剤、ＢＤタンパク質、および競合物を含む。両サンプルについての競合物の結合を決定し、２サンプル間の結合の変化（すなわち、差異）は、ＢＤタンパク質に結合し、潜在的にその活性を調整することができる薬剤の存在を示す。すなわち、競合物の結合は、第１のサンプルと比較して第２のサンプルで異なり、薬剤はＢＤタンパク質に結合することができる。
【０１６５】
ＢＤタンパク質活性を調整する薬剤のスクリーニングも行うことができる。１つの実施形態では、ＢＤタンパク質活性を調整することができる生物活性剤のスクリーニング方法は、上記のＢＤタンパク質サンプルに候補生物活性剤を添加する工程、およびＢＤタンパク質の生物学的活性の変化を決定する工程を含む。「ＢＤタンパク質活性の調整」には、活性の増加、活性の減少、または存在する活性の型もしくは種類の変化が含まれる。したがって、この実施形態では、候補剤は、ＢＤタンパク質に結合し（しかし、これは必ずしも必要ではない）、上記定義のその生物活性または生化学活性を変化させるべきである。本方法は、ＢＤタンパク質の存在、分布、活性、または量の変化についての細胞の上記で一般的に概説されたインビトロスクリーニング法およびインビボスクリーニングの両方を含む。
【０１６６】
したがって、この実施形態では、本方法は、ＢＤサンプルを候補生物活性剤と組み合わせる工程およびＢＤ活性に及ぼす影響を評価する工程を含む。本明細書中の「ＢＤ活性」またはその文法上の等価物は、ＢＤタンパク質の生物活性の１つ（ＢＤにおけるその役割が含まれるが、これに限定されない）を意味する。
【０１６７】
１つの実施形態では、ＢＤタンパク質活性は増加し、別の実施形態では、ＢＤタンパク質活性は減少する。したがって、いくつかの実施形態では生物活性剤はアンタゴニストであり、他の実施形態では生物活性剤はアゴニストである。
【０１６８】
適用
１つの実施形態では、ＢＤの阻害方法を提供する。別の実施形態では、ＢＤの回復方法を提供する。さらなる実施形態では、ＢＤを有する細胞または個体の治療方法を提供する。
【０１６９】
本方法は、ＢＤインヒビターの投与を含む。特定の実施形態では、ＢＤインヒビターは、アンチセンス分子、薬学的組成物、治療薬、小分子、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である。特定の実施形態では、治療薬は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体とカップリングされている。特定の実施形態では、ＢＤインヒビターはＰＸＲアクチベーターである。例えば、リファマイシンアナログ。リファマイシンアナログには、例えば、リファキシミンおよびリファマイシンが含まれる。
【０１７０】
他の実施形態では、被験体におけるＢＤ細胞の検出または診断方法を提供する。特定の実施形態では、診断薬／検出薬は、本発明のＢＤＰに優先的に結合する小分子である。１つの実施形態では、診断薬／検出薬は、任意選択的に検出可能な薬剤と連結した抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。
【０１７１】
本発明の他の実施形態では、ＢＤの動物モデルの生成で使用される動物モデルおよびトランスジェニック動物を提供する。
【０１７２】
アンチセンス、リボザイム、および抗体
治療薬として使用することができる他の薬剤には、ＰＸＲ遺伝子、その発現産物、およびその機能的フラグメントが含まれる。さらに、変異ＰＸＲ遺伝子活性を減少または阻害する薬剤を使用して、病徴を回復することができる。かかる薬剤には、アンチセンス、リボザイム、および三重らせん分子が含まれる。かかる分子を産生および使用する技術は、当業者に周知である。
【０１７３】
リボザイムは、ＲＮＡの特的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリッド形成およびその後の内ヌクレオチド結合分解性切断を含む。リボザイム分子の組成物は、１つまたは複数のＰＸＲ遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を含まなければならず、ｍＲＮＡ切断を担う周知の触媒配列を含まなければならない。この配列については、米国特許第５，０９３，２４６号（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。そのようなものとして、ＰＸＲ遺伝子のタンパク質をコードするＲＮＡ配列の内ヌクレオチド結合分解性切断を特異的且つ効率的に触媒する操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は本開示の範囲内である。
【０１７４】
任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位を、以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを含むリボザイム切断部位についての目的の分子のスキャニングによって最初に同定する。一旦同定されると、切断部位を含むＰＸＲ遺伝子領域に対応する１５リボヌクレオチドと２０リボヌクレオチドとの間の短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る予想された構造の特徴（二次構造など）について評価することができる。候補配列の適合性を、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用した相補オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成の容易性を試験することによって評価することもできる。
【０１７５】
転写阻害のための三重らせん形成で使用すべき核酸分子は、一本鎖であり、且つデオキシリボヌクレオチドから構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成を、フーグスティーン塩基対合則によって三重らせん形成が促進されるようにデザインしなければならない。これは、一般に、プリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きなストレッチが二重鎖の一方の鎖上に存在する必要がある。ヌクレオチド配列はピリミジンベースであり得る。それにより、得られた三重らせんの、３つの会合鎖を介してＴＡＴトリプレットおよびＣＧＣトリプレットが得られるであろう。ピリミジンリッチ分子により、二重鎖の単一鎖のプリンリッチ領域に対して相補的な塩基がその鎖に対して平行方向で得られる。さらに、プリンリッチである（例えば、Ｇ残基のストレッチを含む）核酸分子を選択することができる。これらの分子は、ＧＣ対が豊富なＤＮＡ二重鎖と三重らせんを形成するであろう。ここで、プリン残基の大部分がターゲティングされた二重鎖の単一鎖上に存在し、それにより、三重鎖中の３つの鎖にわたってＧＧＣトリプレットが得られる
あるいは、三重らせん形成をターゲティングすることができる潜在的配列を、いわゆる「スイッチバック」核酸分子の作製によって増加させることができる。スイッチバック分子が最初に二重鎖の一方の鎖と、次いで他方の鎖と塩基対合して、プリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きなストレッチが二重鎖の一方の鎖上に存在する必要性が排除されるように、交互する５’−３’、３’−５’様式でスイッチバック分子を合成する。  
【０１７６】
本明細書中に記載のアンチセンス、リボザイム、および／または三重らせん分子が正常および変異ＰＸＲ遺伝子の対立遺伝子の両方によって産生されたｍＲＮＡの転写（三重らせん）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）を軽減または阻害することができる可能性がある。実質的に正常なＰＸＲ遺伝子活性レベルを維持するために、正常な活性を示すＰＸＲ遺伝子のポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子を、どのようなアンチセンス、リボザイム、または三重らせん処理が利用されるかに感受性を示す配列も含まない細胞に導入することができる。あるいは、正常なＰＸＲ遺伝子のタンパク質を細胞または組織に同時投与して、細胞または組織の必要とされるＰＸＲ遺伝子活性レベルを維持することが好ましいかもしれない。
【０１７７】
本開示のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、および三重らせん分子を、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の当該分野で公知の任意の合成方法によって調製することができる。これらには、例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成などの当該分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドの化学的合成技術が含まれる。あるいは、ＲＮＡ分子を、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボでの転写によって生成することができる。かかるＤＮＡ配列を、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターに組み込む広範な種々のベクターに組み込むことができる。あるいは、使用されるプロモーターに応じてアンチセンスＲＮＡを構成性または誘導性に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞株に安定的に導入することができる。
【０１７８】
ＤＮＡ分子に対する種々の周知の修飾を、細胞内での安定性および半減期の増加手段として導入することができる。可能な修飾には、分子の５’末端および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加またはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ架橋よりもむしろホスホロチオアートまたは２’Ｏ−メチルの使用が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７９】
ＰＸＲ遺伝子のタンパク質、特に変異遺伝子のタンパク質に特異的であり、且つその活性を干渉する抗体を使用して、変異ＰＸＲ遺伝子機能を阻害することができる。かかる抗体を、当該分野で公知であり、且つ本明細書中にも記載されている標準的な技術を使用して、タンパク質自体またはタンパク質の一部に対応するペプチドに対して生成することができる。かかる抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、キメラ抗体などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
ＰＸＲ遺伝子のタンパク質が細胞内タンパク質であり、且つ全抗体を使用する場合、内在化抗体が確実であり得る。しかし、リポフェクチンリポソームを使用して、ＰＸＲ遺伝子のエピトープに結合する抗体またはＦａｂ領域のフラグメントを細胞に送達させることができる。抗体のフラグメントを使用する場合、標的または拡大された標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害フラグメントが確実である。例えば、ＰＸＲ遺伝子のタンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドを使用することができる。かかるペプチドを化学合成するか、当該分野で周知の方法を使用した組換えＤＮＡテクノロジーによって産生することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（１９８４）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３、前出およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出を参照のこと）。あるいは、細胞内ＰＸＲ遺伝子のエピトープに結合する単鎖中和抗体も投与することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−９３（１９９３）に記載の技術などの技術の使用による標的細胞集団内で一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列の発現によって、かかる単鎖抗体を投与することができる。
【０１８１】
ＰＸＲ遺伝子のタンパク質をコードするＲＮＡ配列を、病徴が回復するようなＰＸＲ遺伝子のタンパク質レベルを得るのに十分な濃度で病徴を示す被験体に直接投与することができる。被験体を、遺伝子置換療法によって治療することができる。正常なＰＸＲ遺伝子またはＰＸＲ遺伝子機能を有する正常なＰＸＲ遺伝子のタンパク質の産生を指示する遺伝子の一部の１つまたは複数のコピーを、細胞にＤＮＡを導入する他の粒子（リポソームなど）に加えて、ベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない）を使用して細胞に挿入することができる。さらに、上記の技術などの技術を、ヒト細胞への正常なＰＸＲ遺伝子配列の導入のために使用することができる。
【０１８２】
次いで、細胞、好ましくは、正常なＰＸＲ遺伝子を発現する遺伝子配列を含む自己細胞を、病徴回復が可能な被験体の位置に導入または再導入することができる。
【０１８３】
アンチセンスＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子は、ターゲティングされたｍＲＮＡとのハイブリッド形成およびタンパク質翻訳の予防によってｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用する。アンチセンスＤＮＡに関して、翻訳開始部位（例えば、目的のＰＸＲ遺伝子のヌクレオチド配列の−１０と＋１０との間の領域）由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが確実である。
【０１８４】
１つの実施形態では、ＢＤインヒビターまたはＢＤアクチベーターは、アンチセンス分子（例えば、ＰＸＲアクチベーター）である。本明細書中で使用する場合、アンチセンス分子には、ＢＤ分子の標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、一般に少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４〜３０ヌクレオチドのフラグメントを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，（１９８８）およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，（１９８８）に記載されている。
【０１８５】
アンチセンス分子は、修飾または未修飾のＲＮＡ，ＤＮＡ，または混合ポリマーオリゴヌクレオチドであり得る。これらの分子は、適合配列に特異的に結合してペプチド合成が阻害されることによるか（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ、１９９４年１１月、，ＢｉｏＰｈａｒｍ，２０−３３）、ＲＮアーゼＨ酵素の立体的遮断または活性化によって機能する。アンチセンス分子はまた、ＲＮＡプロセシングまたは核から細胞質への輸送の干渉によってタンパク質合成を変化させることができる（ＭｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙおよびＲｏｔｈ、１９９６、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ７，１５１−１９０）。さらに、一本鎖ＤＮＡのＲＮＡへの結合により、ヘテロ二重鎖のヌクレアーゼ媒介分解が起こり得る（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ、前出）。ＲＮアーゼＨの基質として作用することがこれまで示されてきた骨格修飾ＤＮＡ化学は、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ボロントリフルオリダート、ならびに２’−アラビノおよび２’−フルオロアラビノ含有オリゴヌクレオチドである。
【０１８６】
ＲＮＡ干渉は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング過程をいう（Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６（１９９８））。植物における対応する過程を、転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングといい、真菌においてはクエリングともいう。細胞中のｄｓＲＮＡの存在により、依然として完全に特徴づけられていない機構によってＲＮＡｉ応答が誘発される。この機構は、リボヌクレアーゼＬによってｍＲＮＡが非特異的に切断されるタンパク質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニル酸シンセターゼのｄｓＲＮＡ媒介活性化に起因するインターフェロン応答と異なるようである（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−−２００１、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５：４８５−４９０（２００１）に概説）。
【０１８７】
ＢＤ配列と特異的にハイブリッド形成することができる配列を含む単離核酸分子を含む発現系を本明細書中に提供する。１つの実施形態では、核酸分子は、ＢＤタンパク質発現を阻害することができる。短いＲＮＡ自体が折り畳まれてＢＤ  ｍＲＮＡ配列同一性を有する二本鎖ＲＮＡを作製することができ、且つ細胞内のＢＤ遺伝子の転写後遺伝子サイレンシング（すなわち、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ））を誘発することができる短いＲＮＡのベクター指示発現による細胞内のＢＤ発現の阻害方法。別の方法では、ＢＤ  ｍＲＮＡ配列同一性を有する短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に送達させて、ＢＤ遺伝子の転写後遺伝子サイレンシング（すなわち、ＲＮＡｉ）を誘発する。種々の実施形態では、核酸分子は、少なくとも７量体、少なくとも１０量体、または少なくとも２０量体である。さらなる実施形態では、配列は固有である。
【０１８８】
薬学的組成物
本明細書中に提供する薬学的組成物には、活性薬剤として、治療有効量の本明細書中に開示の小分子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または抗体が含まれる。「有効量」は、有利または所望の結果（臨床結果が含まれる）を得るのに十分な量である。有効量を、１回または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的のために、アデノウイルスベクターの有効量は、病状を緩和、回復、安定化、逆転、進行の遅延または遅くするのに十分な量である。
【０１８９】
組成物を使用してＢＤを治療することができる。用語「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ」、および「ｔｒｅａｔ」などを、一般に、所望の薬理学的影響および／または生理学的影響を得ることをいうために本明細書中で使用する。影響は、疾患または症状の完全または部分的な予防の観点から予防であり得、そして／または疾患および／または疾患に寄与する副作用の部分的または完全な安定化または治癒の観点から治療であり得る。本明細書中で使用する場合、「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は、哺乳動物（特に、ヒト）における疾患の任意の治療を対象として、治療には、（ａ）疾患または症状を患いやすいが、依然としてこれらを有すると診断されていない被験体の疾患または症状の発症の予防、（ｂ）病徴の阻害（例えば、その発症の停止）、または（ｃ）病徴の軽減（例えば、疾患または症状の後退）が含まれる。
【０１９０】
本発明の目的のための「被験体」には、ヒトおよび他の動物（特に、哺乳動物）ならびに生物の両方が含まれる。したがって、本方法を、ヒト療法および動物の両方に適用することができる。一定の実施形態では、被験体は哺乳動物であり、ほとんどの一定の実施形態では、被験体はヒトである。
【０１９１】
本明細書中で使用する場合、用語「治療有効量」は、例えば、所望の疾患または容態を治療する、回復する、または予防するか、検出可能な治療効果または予防効果を示すための治療薬の量をいう。例えば、化学マーカーまたは抗原レベルによって効果を検出することができる。治療効果には、理学的症状の軽減（体温の低下など）も含まれる。被験体の正確な有効量は、被験体のサイズおよび健康状態、容態の性質および範囲、ならびに投与のために選択された治療薬または治療薬の組み合わせに依存するであろう。所与の状況のための有効量を、日常的な実験によって決定し、これは臨床医の判断の範囲内に含まれる。本発明のために、有効用量は、一般に、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの本発明の組成物であろう。
【０１９２】
薬学的組成物はまた、薬学的に許容可能なキャリアを含むことができる。用語「薬学的に許容可能なキャリア」は、例えば、治療薬（抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬など）投与のためのキャリアをいう。本用語は、例えば、それ自体が組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導せず、且つ、過度の毒性を示さずに投与することができる任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは、巨大でゆっくり代謝する高分子（タンパク質、ポリサッカリド、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子など）であり得る。かかるキャリアは、当業者に周知である。治療組成物中の薬学的に許容可能なキャリアには、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれ得る。湿潤剤または乳化剤、およびｐＨ緩衝物質などの補助剤もかかるビヒクル中に存在することができる。典型的には、治療組成物を、注射剤として（溶液または懸濁液のいずれかとして）調製する。注射前に液体ビヒクルの溶液または懸濁液にするのに適切な固体形態として調製することもできる。リポソームは、薬学的に許容可能なキャリアの定義の範囲内に含まれる。薬学的に許容可能な塩も薬学的組成物中に存在することができる（例えば、鉱酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）および有機酸塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩，および安息香酸塩など））。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９９５）Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓに記載されている。
【０１９３】
薬学的組成物を、種々の形態（顆粒、錠剤、丸薬、座剤、カプセル、懸濁液、蝋膏、およびローションなど）で調製することができる。経口および局所での使用に適切な製薬等級の有機または無機のキャリアおよび／または希釈剤を使用して、治療活性化合物を含む組成物を作製することができる。当該分野で公知の希釈剤には、水媒体、植物性および動物性の油脂が含まれる。安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、または適切なｐＨを確保するための緩衝液、および皮膚浸透促進剤を助剤として使用することができる。
【０１９４】
本発明の薬学的組成物は、被験体への投与に適切な形態のＢＤタンパク質を含む。一定の実施形態では、薬学的組成物は、水溶性形態であり（薬学的に許容可能な塩として存在するなど）、酸付加塩および塩基付加塩の両方が含まれることを意味する。「薬学的に許容可能な酸付加塩」は、例えば、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、且つ生物学的またはその他の点で望ましくないわけではなく、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸などの無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、およびサリチル酸などの有機酸を使用して形成された塩をいう。「薬学的に許容可能な塩基付加塩」には、無機塩基由来の塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、およびアルミニウム塩など）が含まれる。アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩が特に確かである。薬学的に許容可能な無毒の有機塩基由来の塩には、第一級アミン、第二級アミン、および第三級アミン、置換アミン（天然に存在する置換アミンが含まれる）、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびエタノールアミンなど）の塩が含まれる。
【０１９５】
本発明の治療ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達させることができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルスまたは非ウイルス起源であり得る（一般に、Ｊｏｌｌｙ、ＢＤ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照のこと）。かかるコード配列の発現を、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導することができる。コード配列の発現は、構成性または調節性のいずれかであり得る。
【０１９６】
本発明のＢＤタンパク質および修飾因子を、上記で考察の種々の方法（経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣、直腸、または眼内が含まれるが、これらに限定されない）で投与することができる。いくつかの例では（例えば、創傷および炎症の治療では）、ＢＤタンパク質および修飾因子を、溶液またはスプレーとして直接適用することができる。
【０１９７】
１つの実施形態では、細胞または生物中でのＢＤ遺伝子活性の調整方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、内因性ＢＤタンパク質の生物学的活性を減少または消失させる抗ＢＤ抗体を細胞へ投与する工程を含む。あるいは、本方法は、ＢＤタンパク質をコードする組換え核酸を細胞または生物に投与する工程を含む。当業者に認識されるように、多数の方法でこれを行うことができる。１つの実施形態では、例えば、ＢＤにおいてＢＤ配列が下方制御する場合、ＢＤ遺伝子産物の活性を、公知の遺伝子療法技術を使用した細胞中のＢＤ発現量の増加（例えば、内因性ＢＤ遺伝子の過剰発現またはＢＤ配列をコードする遺伝子の投与）によって増加させる。１つの実施形態では、遺伝子療法技術には、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の増強された相同組換え（ＥＨＲ）を使用した外因性遺伝子の組み込みが含まれる。あるいは、例えば、ＢＤでＢＤ配列が上方制御される場合、例えば、ＢＤアンチセンス核酸の投与によって内因性ＢＤ遺伝子の活性を減少させる。
【０１９８】
キットの一部として検出方法を提供することができる。したがって、本発明は、さらに、ＢＤ細胞中で異なって発現されるポリヌクレオチド（例えば、目的の、異なって発現された遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの検出による）および／または生物サンプル中でこれらによってコードされるポリペプチドの存在および／またはレベルを検出するためのキットを提供する。これらのキットの使用手順を、臨床検査室、実験室、医師、または私人によって行うことができる。ＢＤ細胞中で異なって発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの検出のための本発明のキットは、ポリペプチドに特異的に結合する部分（ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する抗体であり得る）を含むことができる。ＢＤ細胞中で異なって発現されるポリヌクレオチドを検出するために使用される本発明のキットは、かかるポリヌクレオチドと特異的にハイブリッド形成する部分を含むことができる。キットは、任意選択的に、手順で有用なさらなる成分（緩衝液、発色試薬、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、標準、説明書、および解釈上の情報が含まれるが、これらに限定されない）を提供することができる。したがって、本発明は、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０３３０１３、ＮＭ＿００９８０３、ＮＭ＿０２２００２、ＮＭ＿００３８８９、ＣＳ６１８１３７、ＣＳ６１８１３５、ＣＳ６１８１３３、またはそのフラグメントに示す配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む前立腺ＢＤの検出用キットを提供する。
【０１９９】
標的変異遺伝子の発現、合成および／または活性を阻害する同定された化合物を、疾患を治療または回復するための治療有効用量で被験体に投与することができる。治療有効用量は、例えば、疾患の症状を回復させるのに十分な化合物の量をいう。
【０２００】
かかる化合物の毒性および治療有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を死滅させる用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療に有効な用量）を決定するための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒作用と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比と示すことができる。高い治療指数を示す化合物が確かである。有毒作用を示す化合物を使用することができるが、非感染細胞への潜在的な損害を最小にし、それにより副作用が軽減されるように、かかる化合物を罹患組織部位にターゲティングする送達系をデザインするように注意を払わなければならない。
【０２０１】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトで使用するための投薬量範囲の処方で使用することができる。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。投薬量は、使用した投薬形態および使用した投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。開示の方法で使用した任意の化合物について、治療有効用量を、細胞培養アッセイから最初に評価することができる。細胞培養物中で決定したところ、ＩＣ５０（例えば、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するための用量を動物モデル中で処方することができる。かかる処方物を使用して、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２０２】
本開示にしたがって使用するための薬学的組成物を、１つまたは複数の生理学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して従来の様式で処方することができる。したがって、化合物ならびにその生理学的に許容可能な塩および溶媒和物を、吸入またはガス注入（口腔または鼻腔のいずれかによる）または経口、口内、非経口、局所、皮下、腹腔内、静脈内、胸膜内、眼内、動脈内、または直腸への投与による投与のために処方することができる。化合物の活性を増強する他の生成物と共に薬学的組成物を投与することができ、任意選択的に、薬学的組成物は他の治療成分を含むことができることも意図される。
【０２０３】
経口投与のために、薬学的組成物は、例えば、薬学的に許容可能な賦形剤（結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）など）を使用して従来の手段によって調製した錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠剤を、当該分野で周知の方法によってコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態をとることができるか、使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として存在することができる。かかる液体調製物を、薬学的に許容可能な添加物（懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分留植物油）；および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）など）を使用して従来の手段によって調製することができる。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味料、着色料、および甘味剤を含むことができる。経口投与のための調製物を、活性化合物が徐放されるように適切に処方することができる。口内投与のために、組成物は、従来の様式で処方した錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。
【０２０４】
吸入による投与のために、本開示にしたがって使用するための化合物を、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）を使用した加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレーの形態で都合よく送達させる。加圧エアゾールの場合、投薬単位を、定量を送達するための弁を準備することによって決定することができる。例えば、化合物の粉末混合物および適切な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）を含む吸入器または空気吸入器で用いるゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
【０２０５】
化合物を、注射（例えば、ボーラス注射または連続注入）による非経口投与のために処方することができる。注射用処方物は、例えば、防腐剤が添加されたアンプルまたは分割投与容器中に単位投薬形態で存在することができる。組成物は、懸濁液、溶液、または油性ビヒクルもしくは水性ビヒクルの乳濁液などの形態をとることができ、処方剤（懸濁剤、安定剤、および／または分散剤など）を含むことができる。あるいは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌無発熱物質水）で構成するための粉末形態であり得る。
【０２０６】
化合物を、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の座剤の基剤を含む座剤または停留浣腸などの直腸組成物中に処方することもできる。経口摂取は、おそらく任意の薬物を摂取するための最も容易な方法である。かかる投与経路は、一般に簡潔且つ簡単であり、しばしば、被験体の観点から最も不便または不快でない投与経路である。しかし、これは、多数の物質（タンパク質および他の生物学的に活性な組成物が含まれる）にとって厳しい環境である胃を介した物質の通過を含む。胃の酸性、加水分解性、およびタンパク質分解性の環境がその後の同化のためにタンパク質性物質をアミノ酸およびオリゴペプチドに消化するのに有効に進化しているので、単純に経口で摂取した場合、広範な種々の生物学的に活性なタンパク質性物質のうちで胃を通過して小腸から体内に取り込まれるものはほんの少しまたは少しもないことは驚くに値しない。結果的に、非経口などの別の方法、しばしば、皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射によって多数のタンパク質性薬剤を摂取しなければならない。
【０２０７】
薬学的組成物は、薬学活性を安定化するための種々の緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、ポリソルベート）、ヒト血清アルブミンなどのキャリア、防腐剤（チメロゾール、ベンジルアルコール）、およびアスコルビン酸などの抗酸化剤も含むことができる。安定剤は、界面活性剤（ｔｗｅｅｎ−２０、ｔｗｅｅｎ−８０、ＮＰ−４０、またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００など）であり得る。ＥＢＰを、長期間にわたって被験体への制御送達のための高分子化合物の特定の調製物に組み込むこともできる。薬学的組成物中の成分のより広範囲な調査については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、編者：Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）に記載されている。
【０２０８】
前述の処方物に加えて、化合物を、デポー調製物として処方することもできる。かかる長時間作用性処方物を、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物を、適切な高分子または疎水性の材料（例えば、許容可能なオイルの乳濁液として）またはイオン交換樹脂、またはやや溶けにくい誘導体（例えば、やや溶けにくい塩として）を使用して処方することができる。
【０２０９】
組成物は、必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位投薬形態を含むことができるパックまたはディスペンサーデバイス中に存在することができる。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔（ブリスターパックなど）を含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスに、投与説明書を同封することができる。
【０２１０】
プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）
本発明で有用な細胞には、真核細胞または原核細胞（細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞、および動物細胞が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。適切な動物細胞には、ＢＤＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｕ２０Ｓ細胞、ＣＨＯ−ＫＩ細胞、および種々の初代哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１１】
本発明で有用な細胞には、ＰＸＲ、未知のＰＸＲ、修飾ＰＸＲ、およびその組み合わせを発現する細胞が含まれる。ＰＸＲを発現する細胞は、その細胞膜中に機能的受容体としてＰＸＲを含む細胞である。細胞は、ＰＸＲを天然に発現することができるか、種々の発現レベルでＰＸＲを発現するように遺伝子操作することができるか、ＰＸＲを誘導的に発現するように遺伝子操作することができる。当業者は、遺伝子操作分野で標準的な分子生物学技術によってＰＸＲを発現するように細胞を遺伝子操作することができると容易に理解するであろう。
【０２１２】
さらに、本発明で有用な細胞は、本明細書中に記載の方法で使用されるＰＸＲを安定的または一過性に発現することができる。米国特許第４，７４５，０５１号、同第４，８７９，２３６号、同第５，３４８，８８６号、同第５，７３１，１８２号、同第５，８７１，９８６号、同第６，２８１，００９号、および同第６，２３８，９１４号に記載の非哺乳動物ウイルス（例えば、バキュロウイルス）を使用した遺伝子発現方法を、本方法で使用することができる。米国特許第４，７４５，０５１号、同第４，８７９，２３６号、同第５，３４８，８８６号、同第５，７３１，１８２号、同第５，８７１，９８６号、同第６，２８１，００９号、および同第６，２３８，９１４号の全ての内容は、その全てが本明細書中で参考として援用される。本発明の方法と共に使用することができる検出方法は、米国特許出願第１０／０９５，６２０号、米国特許第５，８９１，６４６号、および米国特許第６，１１０，６９３号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）にも記載されている。
【０２１３】
動物モデルおよびトランスジェニック動物
別の実施形態では、ＢＤ遺伝子は、ＢＤの動物モデルの生成で使用される。当業者に認識されるように、同定されたＢＤ遺伝子がＢＤ組織で抑制されるか減少される場合、アンチセンスＲＮＡがＢＤ遺伝子に指向される遺伝子療法テクノロジーも遺伝子発現を減少または抑制するであろう。このようにして生成された動物は、生物活性薬物候補のスクリーニングで使用されるＢＤの動物モデルとして役立つ。同様に、例えば、適切な遺伝子ターゲティングベクターを使用した相同組換えの結果としての遺伝子ノックアウトテクノロジーにより、ＢＤタンパク質が存在しないであろう。必要に応じて、ＢＤタンパク質の組織特異的発現またはノックアウトが必要であり得る。
【０２１４】
ＢＤ中でＢＤタンパク質が過剰発現する可能性もある。そのようなものとして、ＢＤタンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物を生成することができる。所望の発現レベルに応じて、種々の強度のプロモーターを使用して、導入遺伝子を発現することができる。また、取り込まれた導入遺伝子のコピー数を決定し、決定した導入遺伝子の発現レベルを比較することができる。かかる方法によって生成された動物はＢＤの動物モデルとして使用され、ＢＤを治療するための生物活性分子のスクリーニングでさらに有用である。
【０２１５】
ターゲティング構築物の生成
本開示のターゲティング構築物を、当該分野で公知の標準的な方法を使用して産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；編者：Ｅ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ、１９８５、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻；編者：Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、１９８４、Ｏｌｙｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；編者：Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、１９８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；編者：Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、１９８４、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；編者：Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８６、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、１９８４、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。例えば、ターゲティング構築物を、配列を合成するか、天然供給源から単離するか、操作するか、クローン化するか、ライゲーションするか、インビトロ変異誘発、プライマー修復などに供することができる従来の方法にしたがって調製することができる。種々の段階で、連結した配列をクローン化し、制限分析または配列決定などによって分析することができる。
【０２１６】
当該分野で周知の技術を使用して、ターゲティングＤＮＡを構築することができる。例えば、ターゲティングＤＮＡを、オリゴヌクレオチドの化学合成、二本鎖ＤＮＡテンプレートのニック翻訳、配列のポリメラーゼ連鎖反応による増幅（またはリガーゼ連鎖反応による増幅）、目的の配列（例えば、クローン化ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または任意の上記の組み合わせ由来）を保有する原核生物または標的クローニングベクター（プラスミド、ファージミド、ＹＡＣ、コスミド、バクテリオファージＤＮＡ、他のウイルスＤＮＡまたは複製中間体、またはその精製された制限フラグメント、ならびに所望のヌクレオチド配列を有する一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの他の供給源など）の精製によって産生することができる。さらに、相同性の長さを、当該分野で公知の方法を使用して選択することができる。例えば、選択は、所定の内因性標的ＤＮＡ配列の配列組成および複雑さに基づき得る。
【０２１７】
本開示の１つの実施形態では、ターゲティング構築物を、２００４年１１月９日に発行された米国特許第６，８１５，１８５号（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の方法を使用してプラスミドゲノムライブラリーから直接調製する。前述の米国特許は、２００１年６月１９日出願の米国特許出願第０９／８８５，８１６号に基づき、これは１９９８年１１月１７日出願の米国特許出願第０９／１９３，８３４号（現在放棄）の継続であり、これは１９９８年５月１１日出願の米国特許仮出願第６０／０８４，９４９号および米国特許仮出願第６０／０８４，１９４号ならびに１９９７年１１月１７日出願の米国特許出願第０８／９７１，３１０号（米国特許仮出願第６０／０８４，１９４号に変更）の優先権を主張している。一般に、目的の配列を同定し、例えば、ロングレンジＰＣＲを使用して一工程でプラスミドライブラリーから単離する。この配列の単離後、標的配列を破壊する第２のポリヌクレオチドを、目的の配列をコードする２領域間に容易に挿入することができる。本態様によれば、（１）標的配列に相同な配列の増幅（例えば、ロングレンジＰＣＲを使用）および（２）別のポリヌクレオチド（例えば、選択マーカー）を相同配列に隣接するようにＰＣＲ産物に挿入することによる、２つの工程で構築物を生成する。典型的には、ベクターは、プラスミドゲノムライブラリー由来のプラスミドである。意図する構築物は、典型的には、環状プラスミドでもある。
【０２１８】
別の実施形態では、２００１年９月１７日に出願され、現在公開されている米国特許出願公開第２００３００３２１７５号である米国特許出願第０９／９５４，４８３号（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の調節されたポジティブ選択法にしたがってターゲティング構築物をデザインする。ＰＧＫプロモーター中に配置された２つのｌａｃＯ部位を有するＰＧＫ−ｎｅｏ融合遺伝子およびＳＶ４０  Ｔ抗原由来のＮＬＳをコードする配列に融合されたｌａｃリプレッサーを含むＮＬＳ−ｌａｃＩ遺伝子を含むようにターゲティング構築物をデザインする。別の実施形態では、ターゲティング構築物は、１つを超える選択マーカー遺伝子（単純ヘルペスウイルスｔｋ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子などのネガティブ選択マーカーが含まれる）を含むことができる。ネガティブ選択マーカーを、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結することができる（例えば、米国特許第５，４６４，７６４号、同第５，４８７，９９２号、同第５，６２７，０５９号、および同第米国特許第５，６３１，１５３号を参照のこと）。
【０２１９】
一旦適切なターゲティング構築物が調製されると、ターゲティング構築物を、当該分野で公知の任意の方法を使用して適切な宿主細胞に導入することができる。本開示において種々の技術（例えば、前核微量注入、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入、胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング、胚のエレクトロポレーション、精子媒介遺伝子移入、およびリン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈、核へのＤＮＡの微量注入、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、トランスフェクション、ポリカチオン（例えば、ポリブレンまたはポリオルニチンなど）が含まれる）を使用することができる（例えば、米国特許第４，８７３，１９１号；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９、Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１；Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４；Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、１９８９、Ｃｅｌｌ，５７：７１７−７２３を参照のこと）。哺乳動物細胞の種々の形質転換技術は当該分野で公知である（例えば、Ｇｏｒｄｏｎ、１９８９、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１１５：１７１−２２９；Ｋｅｏｗｎら、１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ｋｅｏｗｎら、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８５巻、ｐｐ．５２７−５３７；Ｍａｎｓｏｕｒら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２を参照のこと）。
【０２２０】
次いで、選択された細胞を、動物（例えば、マウス）の胚盤胞（または生存可能な動物の作製に適切な他の発生段階（例えば、桑実胚など））に注射して、キメラを形成させる（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、編者：Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．１１３−１５２（１９８７）を参照のこと）。あるいは、選択されたＥＳ細胞を分離マウス胚細胞と凝集させて凝集キメラを形成することができる。次いで、キメラ胚を、適切な偽妊娠雌養育動物に移植し、胚を予定日に出産させることができる。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを保有するキメラ子孫を使用して、動物の全細胞が相同組換えしたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。１つの実施形態では、キメラ子孫マウスを使用して、ＰＸＲ遺伝子がヘテロ接合性破壊されたマウスを生成する。次いで、ヘテロ接合性トランスジェニックマウスを交配させることができる。典型的には、かかる交配による子孫の１／４のＰＸＲ遺伝子がホモ接合性破壊を有することが当該分野で周知である。
【０２２１】
１つの実施形態では、ＰＸＲ遺伝子破壊に関連する表現型（または表現型の変化）を、データベースに格納するか、保存する。好ましくは、データベースには、（ｉ）遺伝子型データ（例えば、破壊された遺伝子の同定）および（ｉｉ）遺伝子型データに関連する表現型データ（例えば、遺伝子破壊に起因する表現型）が含まれる。データベースは、好ましくは電子データである。
【０２２２】
本開示は、さらに、条件的トランスジェニック動物またはノックアウト動物（組換え法を使用して産生された動物など）を意図する。バクテリオファージＰ１  Ｃｒｅリコンビナーゼおよび酵母プラスミド由来のｆｌｐリコンビナーゼは、特定の標的部位（ｃｒｅリコンビナーゼについてはｌｏｘＰ部位、ｆｌｐリコンビナーゼについてはｆｒｔ部位）でＤＮＡを切断し、このＤＮＡの第２の切断部位へのライゲーションを触媒する部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ酵素の２つの非限定的な例である。多数の適切な代替部位特異的リコンビナーゼが記載されており、その遺伝子を本開示の方法にしたがって使用することができる。かかるリコンビナーゼには、λバクテリオファージのＩｎｔリコンビナーゼ（Ｘｉｓを含むか含まない）（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ，Ｒ．ら、ｉｎ  Ｌａｍｂｄａ  ＩＩ，（編者：Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｒ．ら），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、ｐｐ．２１１−５０（１９８３）（本明細書中で参考として援用される））、ＴｐｎＩおよびβ−ラクタマーゼトランスポゾン（Ｍｅｒｃｉｅｒら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：３７４５−５７（１９９０））、Ｔｎ３リゾルバーゼ（ＦｌａｎａｇａｎおよびＦｅｎｎｅｗａｌｄ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２０６：２９５−３０４（１９８９）；Ｓｔａｒｋら、Ｃｅｌｌ，５８：７７９−９０（１９８９））、酵母リコンビナーゼ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：６１０−１８（１９９０））、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳｐｏＩＶＣリコンビナーゼ（Ｓａｔｏら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：１０９２−９８（１９９０））、Ｆｌｐリコンビナーゼ（ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＳａｄｏｗｓｋｉ、Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２０５：６４７−６５８（１９８９）；Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：４５２７−３３（１９９０）；ＧｏｌｉｃおよびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ、Ｃｅｌｌ，５９：４９９−５０９（１９８９）；Ａｍｉｎら、Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１４：５５−７２（１９９０））、Ｈｉｎリコンビナーゼ（Ｇｌａｓｇｏｗら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１００７２−８２（１９８９））、免疫グロブリンリコンビナーゼ（Ｍａｌｙｎｎら、Ｃｅｌｌ，５４：４５３−４６０（１９８８））、およびＣｉｎリコンビナーゼ（ＨａｆｆｔｅｒおよびＢｉｃｋｌｅ、ＥＭＢＯ  Ｊ，７：３９９１−３９９６（１９８８）；Ｈｕｂｎｅｒら、Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２０５：４９３−５００（１９８９））（全て本明細書中で参考として援用される）が含まれる。かかる系は、Ｅｃｈｏｌｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４６９７−１４７００（１９９０））、ｄｅ  Ｖｉｌｌａｒｔａｙ（Ｎａｔｕｒｅ，３３５：１７０−７４（１９８８））、Ｃｒａｉｇ、（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２２：７７−１０５（１９８８））、Ｐｏｙａｒｔ−Ｓａｌｍｅｒｏｎら、（ＥＭＢＯ  Ｊ  ８：２４２５−３３（１９８９））、Ｈｕｎｇｅｒ−Ｂｅｒｔｌｉｎｇら、（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９２：１０７−１６（１９９０））、およびＣｒｅｇｇおよびＭａｄｄｅｎ（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１９：３２０−２３（１９８９））（全て本明細書中で参考として援用される）によって考察されている。Ｃｒｅは均一に精製されており、ｌｏｘＰ部位とのその反応は広範に特徴づけられている（Ａｂｒｅｍｓｋｉ  ＆  Ｈｅｓｓ  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：１５０９−１４（１９８４）（本明細書中で参考として援用される））。Ｃｒｅタンパク質の分子量は３５，０００であり、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｄｕ  Ｐｏｎｔから購入することができる。ｃｒｅ遺伝子（Ｃｒｅタンパク質をコードする）はクローン化および発現されている（Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｃｅｌｌ  ３２：１３０１−１１（１９８３）（本明細書中で参考として援用される））。Ｃｒｅタンパク質は、同一または異なるＤＮＡ分子上に存在し得る２つのｌｏｘＰ配列の間の組換えを媒介する（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４５：２９７−３０９（１９８１））。ｌｏｘＰ部位の内部スペーサー配列が非対称であるので、２つのｌｏｘｐ部位は、相互に関連する方向性を示し得る（Ｈｏｅｓｓ  ＆  Ａｂｒｅｍｓｋｉ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：１０２６−２９（１９８４））。したがって、同一ＤＮＡ分子上の２つの部位が順方向に反復した方向である場合、Ｃｒｅは部位間のＤＮＡを切り出すであろう（Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｃｅｌｌ  ３２：１３０１−１１（１９８３））。しかし、部位が相互に逆である場合、部位間のＤＮＡは組換え後に切り出されないが、単純に反転する。したがって、順方向に２つのｌｏｘＰ部位を有する環状ＤＮＡ分子が組換えられて、２つの類似の環を産生するのに対して、逆方向に２つのｌｏｘＰ部位を有する環状分子は、ｌｏｘＰ部位に隣接するＤＮＡ配列が単純に反転する。さらに、リコンビナーゼ作用により、標的が個別のＤＮＡ分子上に存在する場合、標的部位に対して遠位の領域の相互交換が起こり得る。
【０２２３】
１つの実施形態では、精製リコンビナーゼ酵素を、直接微量注入によって細胞に供給する。別の実施形態では、リコンビナーゼを、リコンビナーゼ遺伝子が機能的プロモーターに作動可能に連結された同時トランスフェクションされた構築物またはベクターから発現させる。本実施形態のさらなる態様は、組換えの時期および場所が選択可能な組織特異的または誘導性のリコンビナーゼ構築物の使用である。
【０２２４】
本明細書中に記載の細胞および動物ベースの系を、疾患モデルとして使用することができる。任意の種の動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、および非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）が含まれるが、これらに限定されない）を使用して、疾患動物モデルを生成することができる。さらに、ヒト由来の細胞を使用することができる。これらの系を、種々の適用で使用することができる。かかるアッセイを、薬剤（病徴を回復させることができる化合物など）を同定するようにデザインされたスクリーニングストラテジーの一部として使用することができる。したがって、動物および細胞ベースのモデルを使用して、疾患の治療に有用であり得る薬物、医薬品、療法、および介入を同定することができる。細胞ベースの系を使用して、病徴を回復するように作用することができる化合物を同定することができる。例えば、かかる細胞系を、曝露した細胞におけるかかる病徴の回復を誘発するのに十分な濃度および十分な時間、病徴を回復する能力を示す疑いのある化合物に曝露することができる。曝露後、細胞を試験して、１つまたは複数の疾患細胞表現型がより正常またはより野生型の非疾患表現型に類似するように変化したかどうかを決定する。
【０２２５】
さらに、動物ベースの疾患系（本明細書中に記載の疾患系など）を使用して、病徴を回復することができる化合物を同定することができる。かかる動物モデルを、動物に特徴的な疾患または他の表現型の治療に有用であり得る薬物、医薬品、療法、および介入の同定のための試験基質として使用することができる。例えば、動物モデルを、曝露した動物におけるかかる病徴の回復を誘発するのに十分な濃度および十分な時間、病徴を回復する能力を示す疑いのある化合物または薬剤に曝露することができる。曝露に対する動物の応答を、疾患に関連する障害の逆転の評価によってモニタリングすることができる。曝露は、本明細書中に記載のモデル動物の妊娠期間中に母動物を治療し、それにより、疾患または表現型を予防または回復することができる化合物または薬剤に胚または胎児を曝露する工程を含むことができる。新生期、幼若期、および成体期の動物も曝露することができる。
【０２２６】
より詳細には、開示の動物モデル、詳細にはトランスジェニックマウスを使用して、好ましくはＰＸＲ遺伝子破壊に関連する少なくとも１つの表現型に影響を及ぼす能力に基づいて、薬剤（化合物が含まれる）を同定する方法を提供する。１つの実施形態では、本開示は、ＰＸＲの発現または機能に影響を及ぼす薬剤を同定する方法を提供する。本方法は、例えば、薬剤に対する動物の生理学的応答を測定する工程およびかかる動物の生理学的応答をコントロール動物と比較する工程を含み、ここで、コントロール動物と比較してＰＸＲが破壊された動物の生理学的応答は薬剤の特異性を示す。「生理学的応答」は、測定することができる動物の任意の生物学的または物理学的なパラメーターである。分子アッセイ（例えば、遺伝子転写、タンパク質産生、および分解率）、物理的パラメーター（例えば、運動生理学試験、種々の呼吸パラメーターの測定、心拍数または血圧の測定、出血時間の測定、ａＰＴＴ．Ｔ、またはＴＴ）、および細胞アッセイ（例えば、細胞表面マーカーの免疫組織化学アッセイ、または細胞の凝集または増殖能力）を使用して、生理学的応答を評価することができる。本開示のトランスジェニック動物および細胞を、ＰＸＲ破壊に関連する表現型に関連する疾患、障害、または容態のモデルとして使用することができる。
【０２２７】
本開示は、ＢＤに関する新規な治療の試験および開発のための固有の動物モデルを提供する。ＢＤ表現型の分析により、例えば、ＢＤのための提案された薬理学的療法の有効性の試験に有用な動物モデルが開発可能である。
【０２２８】
スクリーニング方法
本開示を、アゴニスト（例えば、ＰＸＲポリペプチドに結合して活性化する薬剤）またはアンタゴニスト（例えば、ＰＸＲポリペプチドの活性またはそのリガンドとの相互作用を阻害する）などの薬剤のスクリーニング過程で使用することができる。したがって、本開示のポリペプチドを使用して、例えば、当該分野で公知の細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、および天然生成物の混合物における小分子基質およびリガンドの結合を評価することもできる。受容体を調整することができる薬剤を同定およびスクリーニングするために日常的に使用される任意の方法を、本開示にしたがって使用することができる。
【０２２９】
１つの実施形態では、スクリーニング方法で同定された組成物は、リファキシミンと比較した以下の５つの特徴に少なくともしたがって分類されるであろう：溶解性、吸収、細菌侵入、ＲＮＡポリメラーゼ阻害、および／またはＰＸＲ特異性。これらの各特徴は、これらの特徴のうちの１つまたは複数でリファキシミンの性質と異なり得、特徴の任意の組み合わせでも異なり得る。
【０２３０】
・溶解性：スクリーニングアッセイで同定される例示的分子は、例えば、結腸送達の改善のための溶解性の増加を有し得る。より溶解する分子が望ましい場合、溶解性の増加および改善も全身吸収の増加に有用であろう。
【０２３１】
・吸収：全身抗菌活性の増加または改善が望ましいかも知れない。スクリーニングアッセイで同定される例示的分子は、例えば、吸収の改善を有し得る。
【０２３２】
・細菌侵入：抗菌活性が改善され得る細菌侵入の増加または改善が望ましいかも知れない。至適化された抗炎症性分子が細菌侵入の減少を望む場合、これも有用である。
【０２３３】
・ＲＮＡ  Ｐｏｌ．阻害：抗菌性の増加または改善が望ましいかも知れない。抗菌性を、スクリーニングで選択された化合物のＲＮＡ  ｐｏｌ活性の増加として測定することができる。至適化された抗炎症性分子のＲＮＡポリメラーゼ阻害活性が減少することが望ましい場合、これも有用であり得る。
【０２３４】
・ＰＸＲ特異性：結合、活性化、および／または下流シグナル伝達経路応答によって測定される特異性の増加または改善が望ましいかもしれない。おそらくＰＸＲ特異性がより高い化合物をより低いレベルで投与することができるか、より高いＰＸＲ効果を誘発するか、改善された抗炎症性を有することができる。
【０２３５】
本開示から恩恵を受ける当業者は、リファキシミンと比較したスクリーニングアッセイで同定された化合物の５つの特徴を試験するためのアッセイを理解するであろう。一旦スクリーニングアッセイによっていくつかの例示的化合物が同定されると、化合物を相互に比較することもできる。
【０２３６】
本開示は、ＰＸＲの発現または機能を調整する薬剤を同定およびスクリーニングする方法を提供する。より詳細には、ＰＸＲ遺伝子配列を含み、且つ発現する細胞を使用して、治療薬をスクリーニングすることができる。かかる細胞には、非組換え単球細胞株（Ｕ９３７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１  ５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−２０２）、およびＰ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６３）など）、ＤＰＸ２、内皮細胞（ＨＵＶＥＣおよびウシの大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）など）、ならびにＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５１））などの一般的な哺乳動物細胞株が含まれ得る。さらに、かかる細胞には、組換え細胞株、トランスジェニック細胞株が含まれ得る。例えば、開示のトランスジェニックマウスを使用して、障害の細胞培養モデルとして使用することができる疾患に関与する１つまたは複数の細胞型を含む細胞株を生成することができる。開示の疾患トランスジェニック動物由来の細胞、組織、および初代培養物を使用することができる一方で、連続細胞株の生成が確実である。トランスジェニック動物から連続細胞株を誘導するために使用することができる技術の例については、Ｓｍａｌｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：６４２−４８（１９８５）を参照のこと。
【０２３７】
ＰＸＲ遺伝子配列を、目的の細胞のゲノムに導入し、目的の細胞のゲノムで過剰発現させることができる。ＰＸＲ遺伝子配列を過剰発現させるために、ＰＸＲ遺伝子配列のコード部分を、目的の細胞型で遺伝子発現を駆動することができる調節配列にライゲーションすることができる。かかる調節領域は当業者に周知であり、過度に実験することなく使用することができる。ＰＸＲ遺伝子配列を、破壊するか過小発現させることもできる。ＰＸＲ遺伝子が破壊されているか、ＰＸＲ遺伝子配列を過小発現する細胞を使用して、例えば、破壊または過小発現に寄与する機能の任意の喪失を補う別経路に影響を及ぼすことができる薬剤をスクリーニングすることができる。
【０２３８】
ＰＸＲ遺伝子産物に結合することができる化合物を同定するためのインビトロ系をデザインすることができる。かかる化合物には、Ｄ型および／またはＬ型アミノ酸から作製されたペプチド（例えば、ランダムペプチドライブラリー形態（例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−４（１９９１）を参照のこと））、リンペプチド（例えば、ランダムまたは部分的に縮重した定方向リンペプチドライブラリー形態（例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ，７２：７６７−７８（１９９３）を参照のこと））、抗体、ならびに有機小分子および無機小分子が含まれ得るが、これらに限定されない。同定された化合物は、例えば、ＰＸＲ遺伝子のタンパク質活性、好ましくは変異ＰＸＲ遺伝子のタンパク質活性の調整、ＰＸＲ遺伝子のタンパク質の生物学的機能の同化、または正常なＰＸＲ遺伝子の相互作用を破壊するか、かかる相互作用を自ら破壊する化合物のスクリーニングで有用であり得る。
【０２３９】
例えば、ＰＸＲ遺伝子のタンパク質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイは、２つの成分が相互作用して結合するのに十分な条件および期間でＰＸＲ遺伝子のタンパク質および試験化合物の反応混合物を調製し、それにより、反応混合物中で除去および／または検出することができる複合体を形成する工程を含む。種々の方法でこれらのアッセイを行うことができる。例えば、かかるアッセイを行うための１つの方法は、ＰＸＲ遺伝子のタンパク質または試験物質を固相上に係留する工程、反応終了時に固相上に係留された標的タンパク質／試験物質複合体を検出する工程を含むであろう。かかる方法の１つの実施形態では、ＰＸＲ遺伝子のタンパク質を固体表面上に係留し、係留しない試験化合物を直接または間接的に標識することができる。
【０２４０】
マイクロタイタープレートを都合よく使用することができる。係留した成分を、非共有結合または共有結合によって固定することができる。タンパク質溶液での固体表面のコーティングおよび乾燥によって簡単に非共有結合させることができる。あるいは、固定した抗体、好ましくはタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を使用して、タンパク質を固体表面に係留することができる。予め表面を調製し、保存することができる。
【０２４１】
アッセイを行うために、非固定成分を、固定した成分を含むコーティング表面に添加する。反応完了後、未反応成分を、形成された任意の複合体が固体表面上に固定されたままであるような条件下で（例えば、洗浄によって）除去する。固体表面上に係留した複合体の検出を、多数の方法で行うことができる。事前に固定されなかった成分を予め標識する場合、表面上に固定された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。事前に固定されなかった成分を予め標識しない場合、間接的標識を使用して（例えば、事前に固定されなかった成分に特異的な標識された抗体を使用）、表面上に係留された複合体を検出することができる（次に、標識された抗Ｉｇ抗体を使用して抗体を直接標識するか間接的に標識することができる）。
【０２４２】
あるいは、例えば、溶液中で形成された任意の複合体を係留するためのＰＸＲ遺伝子産物または試験化合物に特異的な固定された抗体および係留された複合体を検出するための可能な複合体の他の成分に特異的な標識された抗体を使用して、液相、未反応成分から分離した反応生成物、および検出された複合体中で反応を行うことができる。
【０２４３】
上記の１つの方法によって特定のＰＸＲ遺伝子産物に結合することが示された化合物を、ＰＸＲ遺伝子のタンパク質由来の生化学的応答を誘発するその能力をさらに試験することができる。発現産物のアゴニスト、アンタゴニスト、および／またはインヒビターを、当該分野で周知のアッセイを使用して同定することができる。
【０２４４】
種々の方法を使用して、ＰＸＲ遺伝子に関連する病状を診断することができる。詳細には、試薬を、例えば、ＰＸＲ遺伝子変異の存在の検出またはＰＸＲ遺伝子ｍＲＮＡの過剰発現または過小発現のいずれかの検出のために使用することができる。
【０２４５】
以下の実施例は、本開示を例示することのみを意図し、本開示を制限すると決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２４６】
材料と方法
化学物質
リファンピシン（ＲＩＦ）、３−（４−メチルピペラジニルイミノメチル）リファマイシンＳＶ；リファキシミン（ＲＩＦａｘ）、４−デオキシ−４’−メチルピリド［１’，２’−１，２］イミダゾ［５，４−ｃ］リファマイシンＳＶ、およびミダゾラム（ＭＤＺ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。１’−ヒドロキシミダゾラム（１’−ＯＨ−ＭＤＺ）を、ＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から購入した。他の全ての化学物質は、市販の最高等級のものであった。
【０２４７】
動物および処置
ＰＸＲヒト化（ｈＰＸＲ）、Ｐｘｒ−ヌル、および野生型（ＷＴ）マウスを、標準的な１２時間／１２時間明暗サイクルで、水および固形飼料を自由に与えて維持した。Ｐｘｒ−ヌルおよびｈＰＸＲマウスは以前に記載されていた（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒら、２００１；Ｍａら、２００７）。ＰＸＲ活性化におけるＲＩＦａｘの潜在的役割を調査するために、２〜４月齢の雄ｈＰＸＲ、Ｐｘｒ−ヌル、およびＷＴマウスを、２５ｍｇ／ｋｇ／日のＲＩＦａｘで３日間経口にて処置した。ＲＩＦ（特異的ヒトＰＸＲリガンド）を、ポジティブコントロールとして２５ｍｇ／ｋｇ／日（ｐ．ｏ．）で３日間使用した。トウモロコシ油を、ＲＩＦおよびＲＩＦａｘ処置のためのビヒクルとして使用した。全マウスを、最後の投与から２４時間後にＣＯ２窒息によって屠殺した。肝臓および小腸を回収し、さらなる分析のために−８０℃で凍結した。
【０２４８】
ＲＩＦａｘの薬物動態および腸管中のその分布
薬物動態分析のために、ＷＴ、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウスを、経口経管栄養によって１０ｍｇ／ｋｇ  ＲＩＦまたはＲＩＦａｘで処置した。トウモロコシ油を、ＲＩＦおよびＲＩＦａｘ処置のためのビヒクルとして使用した。血液サンプルを、投与前、投与から０．２５、０．５、１．５、３、６、９、１２、２４、および４８時間後にヘパリン化管を使用して眼窩下静脈から収集した。ＲＩＦａｘおよびＲＩＦの代謝プロフィールを比較するために、１０ｍｇ／ｋｇ  ＲＩＦａｘおよびＲＩＦを、静脈内（ｉ．ｖ．）および腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。ｉ．ｐ．注射のために、トウモロコシ油をＲＩＦおよびＲＩＦａｘの両方のためのビヒクルとして使用し、血液サンプルを、投与前、投与から０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、および４８時間後に眼窩下静脈から収集した。ｉ．ｖ．注射のために、３０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量４００）をＲＩＦおよびＲＩＦａｘの両方のためのビヒクルとして使用し、血液サンプルを、投与前、投与から０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、および４８時間後に眼窩下静脈から収集した。血清を、８，０００ｇで１０分間の遠心分離によって分離した。５０μｌの血清を１５０μｌメタノールと混合し、２０秒間のボルテックスを２回行い、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離した。次いで、上部有機層を、ＡＰＩ２０００  ＳＣＩＥＸ三連四重極タンデム質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＲＩＦまたはＲＩＦａｘの検出のためのオートサンプラーバイアルに移した。ＲＩＦおよびＲＩＦａｘの薬物動態パラメーターを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用したノンコンパートメントアプローチによって血清濃度−時間データから評価した。最大血清濃度（Ｃｍａｘ）を、元のデータから得た。血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０〜４８時間）を、台形公式によって計算した。腸管中の分布を検出するために、マウスを、１０ｍｇ／ｋｇ  ＲＩＦａｘまたはＲＩＦ（ｐ．ｏ．）で処置した。投与から１．５、３、６、９、１２、２４、および４８時間後、マウスを屠殺し、腸管の異なる区画中の内容物を収集した。腸内容物を秤量し、メタノール（１００ｍｇ／ｍｌ）中でホモジナイズした。ホモジネートを、１４，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離した。次いで、上部有機層を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＲＩＦまたはＲＩＦａｘの検出のためのオートサンプラーバイアルに移した。
【０２４９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＲＩＦａｘおよびＲＩＦの分析
ＲＩＦａｘおよびＲＩＦを、高速液体クロマトグラフィーシステムを使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。このシステムは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２００クォータナリーポンプ、真空脱ガス装置、および上記のＬＣ−ＭＳ／ＭＳに接続された１００μｌループを備えたオートサンプラーからなる。ＲＩＦａｘおよびＲＩＦを、Ｌｕｎａ  Ｃ１８（内径５０ｍｍ×４．６ｍｍ）カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）によって分離した。周囲温度でのカラムの流速は０．２５ｍｌ／分であり、８５％メタノールおよび０．１％ギ酸を含む１５％Ｈ２Ｏを使用した。質量分析計をターボイオンスプレーモードで操作し、陽イオン検出を行った。ターボイオンスプレー温度を３００℃に維持し、電圧４．８ｋＶをスプレーニードルに印加した。ターボイオンスプレーおよび霧化ガスとしてＮ２を使用した。マルチ反応モニタリング（ＭＲＭ）モード（ＲＩＦａｘについてはｍ／ｚ  ７８６．３／７５４．５、ＲＩＦについてはｍ／ｚ  ８２３．５／７９１．５）を使用して、検出および定量を行った。
【０２５０】
ＲＩＦａｘで前処置したｈＰＸＲマウスにおけるＭＤＺの薬物動態分析
ｈＰＸＲマウスを、１０ｍｇ／ｋｇ  ＲＩＦａｘで１日１回、３日間にわたって前処置したか前処置しなかった。トウモロコシ油を、ＲＩＦａｘ処置のためのビヒクルとして使用した。最後のＲＩＦａｘ投与から２４時間後、マウスに経口経管栄養によって２．５ｍｇ／ｋｇ  ＭＤＺを投与した。血液サンプルを、ＭＤＺ投与前、５、１０、２０、３０、６０、および９０分後にヘパリン化管を使用して眼窩下静脈から収集した。血清を、８，０００ｇで１０分間の遠心分離によって分離した。ＭＤＺおよび１’−ＯＨ−ＭＤＺの抽出のために、５０μｌの血清を、１５０μｌのリン酸緩衝化生理食塩水、２００μｌの酢酸エチル、および２００μｌのメチルｔ−ブチルエーテルと混合した。混合物を、３，０００ｒｐｍにて４℃で５分間遠心分離した。次いで、有機層を、新規な管に移し、Ｎ２で乾燥させ、１００μｌの７０％メタノール水溶液および０．１％ギ酸を含む３０％Ｈ２Ｏ中で再構成した。ＭＤＺおよび１’−ＯＨ−ＭＤＺを、前述のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した（Ｍａら、２００７）。ＭＤＺおよび１’−ＯＨ−ＭＤＺの薬物動態パラメーターを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用したノンコンパートメントアプローチによって血漿濃度−時間データから評価した。血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０〜９０分）を、台形公式によって計算した。最大血清濃度（Ｃｍａｘ）およびその対応する時間（Ｔｍａｘ）を、元のデータから得た。
【０２５１】
ＰＸＲ標的遺伝子のｑＰＣＲ分析
以下のＰＸＲ標的遺伝子を、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって分析した：シトクロムＰ４５０  ３Ａ１１（ＣＹＰ３Ａ１１）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼα１（ＧＳＴＡ１）、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）、および有機アニオン輸送ポリペプチド２（ＯＡＴＰ２）（Ｇｕｏら、２００２；Ｋａｓｔら、２００２；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、２００３）。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、異なる組織からＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１μｇの総ＲＮＡから生成したｃＤＮＡを使用してｑＰＣＲを行った。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｑＰＣＲのためのプライマーをデザインした。プライマー配列を表１に列挙する。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）においてＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ）を使用して、ＰＣＲ反応を行った。比較ＣＴ法を使用して値を定量化し、サンプルをβアクチンに対して正規化した。
【０２５２】
【表１】
2011501672.tif 000006
細胞ベースのレポーターアッセイ
組換えヒトＰＸＲを安定的に発現するｈｅｐＧ２細胞株（ＤＰＸ２）およびルシフェラーゼベクター中でクローン化したＰＸＲ応答エレメントを、Ｐｕｒａｃｙｐ  Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。細胞株の構築および検証は以前に報告されていた（Ｙｕｅｈら、２００５）。業者の説明書にしたがって細胞を播種した。ＲＩＦａｘ（１、１０、１００μＭ）を培養培地に添加し、ポジティブコントロールとして１０μＭ  ＲＩＦを使用した。ＰＸＲの活性化を、２４時間後のホタルルシフェラーゼ活性の測定およびその後のタンパク質濃度によるルシフェラーゼ活性の正規化によって決定した。核内受容体ＣＡＲ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、およびＦＸＲの細胞ベースのレポーターアッセイのために、ＨＣＴ１１６細胞を２４ウェルプレート（５×１０４細胞／ウェル、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養）上にプレートし、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して種々の発現ベクターでトランスフェクトした。マウスＰＰＡＲおよびＣＡＲベクターは、以前の報告書に記載されていた（Ｋｌｉｅｗｅｒら、１９９２；Ｓｗａｌｅｓら、２００５）。マウスＦＸＲベクターは、Ｄｒ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｊ．Ｓｉｎａｌから提供を受けた。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、ビヒクル（ＤＭＳＯ）および１０μＭ  ＲＩＦａｘと２４時間インキュベートした。ＴＣＰＯＢＯＰ（２５０ｎＭ）、Ｗｙ−１４，６４３（１０μＭ）、ロシグリタゾン（１０μＭ）、およびＧＷ４０６４（２５μＭ）を、それぞれ、マウスＣＡＲ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、およびＦＸＲのポジティブコントロールとして使用した。標準的なデュアルルシフェラーゼアッセイを使用し、同時トランスフェクトしたコントロールレポーターに対して正規化した（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。各インビトロアッセイを、少なくとも３回繰り返した。
【０２５３】
統計分析
全値を平均±ＳＤで示し、両側スチューデントｔ検定によって分析した。Ｐ＜０．０５を、群間の有意差と見なした。
【０２５４】
ＰＸＲヒト化（ｈＰＸＲ）、Ｐｘｒ−ヌル、および野生型マウスを、リファキシミンおよびリファンピシン（十分に特徴づけられたヒトＰＸＲリガンド）で経口にて処置した。リファンピシンと比較した場合、リファキシミンは腸管中で高度に濃縮されていた。リファキシミン処置により、ｈＰＸＲマウスの腸でＰＸＲ標的遺伝子が有意に誘導されたが、野生型およびＰｘｒ−ヌルマウスでは誘導されなかった。しかし、リファキシミン処置により、野生型、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウスにおける肝臓ＰＸＲ標的遺伝子に有意な影響は及ぼさないことが証明された。インビボデータと一致して、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイにより、ヒトＰＸＲのリファキシミン媒介活性化が明らかとなったが、他の生体異物核内受容体であるＣＡＲ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、およびＦＸＲでは明らかとならなかった。リファキシミンでの前処置は、ＣＹＰ３Ａ基質ミダゾラムの薬物動態に影響を及ぼさなかったが、１’−ヒドロキシミダゾラムのＣｍａｘが増加し、Ｔｍａｘが減少した。まとめると、本研究により、腸特異的ヒトＰＸＲリガンドとしてリファキシミンが同定された。
【０２５５】
マウスにおける代謝プロフィールおよびＲＩＦａｘの腸管分布
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、ＲＩＦおよびＲＩＦａｘの薬物動態を研究した。保持時間は、ＲＩＦについては２．２１分（ｍ／ｚ  ８２３．５／７９１．５）（図１Ｃ中のピーク１）およびＲＩＦａｘについては３．０３分（ｍ／ｚ  ７８６．３／７５４．５）（図１Ｃ中のピーク２）であった。検出限界は、ＲＩＦについては０．０２３ｐｍｏｌであり、ＲＩＦａｘについては０．０１２ｐｍｏｌであった。ＲＩＦまたはＲＩＦａｘの単回経口投与後、マウス血液サンプルおよび腸内容物を、処置４８時間後までの異なる時点で収集した。薬物動態研究では、血清ＲＩＦａｘのＣｍａｘは０．０４μＭであり、これは、ＲＩＦ（２．７５μＭ）より低い、約１／７０であった。血清ＲＩＦａｘのＡＵＣ０〜４８時間は、ＲＩＦより低い、約１／３００であった（図２Ａ）。しかし、腸管分布について、ＲＩＦａｘ濃度は、ＲＩＦより有意に高かった。小腸では、ＲＩＦ濃度は、測定した全時点で２０μｇ／ｇ未満であった（図２Ｂ）。ＲＩＦａｘについて、濃度は約１６０μｇ／ｇであり、この濃度が投与後９時間持続した。盲腸（図２Ｃ）および結腸（図２Ｄ）中のＲＩＦａｘの腸管分布は、小腸と類似していた。経口処置後のＷＴ、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウス間で、ＲＩＦａｘ代謝の有意な相違は見出されなかった。ＷＴ、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウスにおけるＲＩＦａｘ（ｐ．ｏ．処置）のＣｍａｘを、図２Ｅに示す。ＲＩＦａｘは、経口処置による非吸収性リファマイシンとして周知である。ｉ．ｐ．注射により、ＲＩＦａｘは十分に吸収されず、生物学的利用能は、ＲＩＦより有意に低かった（図２Ｆ、２Ｇ）。ｉ．ｖ．処置後のＲＩＦａｘとＲＩＦとの間の代謝プロフィールの相違が、ＲＩＦと比較した場合のＲＩＦａｘについての超短時間Ｔ１／２および超低ＡＵＣとして認められた（図２Ｈ）。
【０２５６】
ＲＩＦａｘによるＰＸＲ活性化
ＰＸＲは、ＷＴおよびｈＰＸＲマウスの十二指腸、空腸、回腸、盲腸、および結腸中で検出されたが、胃内には検出されなかった（Ｍａら、２００７）。腸管中のＲＩＦａｘの高分布および腸内のＰＸＲ発現により、腸ＰＸＲ標的遺伝子に及ぼすＲＩＦａｘの影響をｑＰＣＲによって調査した。ＲＩＦａｘで処置したｈＰＸＲマウスの小腸では、ＣＹＰ３Ａ１１、ＧＳＴＡ１、ＭＲＰ２、およびＯＡＴＰ２は全て上方制御された（図３Ａ）。腸ＣＹＰ３Ａ１１は、ビヒクル処置ｈＰＸＲマウスと比較して約４倍に増加した一方で、ＷＴマウスで発現が阻害され、Ｐｘｒ−ヌルマウスで有意な変化は認められなかった（図３Ｂおよび３Ｃ）。腸ＧＳＴＡ１  ｍＲＮＡは、ＲＩＦａｘ処置後に３つ全てのマウス株で上方制御され（ＷＴ、Ｐｘｒ−ヌル、およびｈＰＸＲマウスで８７％、７４％、および１７２％増加が認められた）、それにより、Ｇｓｔａ１遺伝子は直接のＰＸＲ標的ではないかもしれないが、間接的機構によって上昇し得ることが示唆された。いかなる特定の科学的理論に拘束されることも望まないが、ＧＳＴＡ１に及ぼすＲＩＦａｘの影響についての１つの可能な説明は、ＲＩＦａｘの抗菌活性である。ＲＩＦａｘを、２５ｍｇ／ｋｇで経口にて３日間処置した。この量は、腸の細菌ホメオスタシスを変化させることができ、且つ間接的にＧＳＴＡ１発現をもたらし得る。腸内ＭＲＰ２  ｍＲＮＡの有意な上方制御がＲＩＦａｘ処置後のｈＰＸＲマウスで認められたのに対して、その発現はＷＴマウスで有意に抑制され、Ｐｘｒ−ヌルマウスでは変化は認められなかった（図３Ｂおよび３Ｃ）。ヒトおよびラットの肝細胞中のＲＩＦおよびＰＣＮによってそれぞれ活性化されると報告されているＭＲＰ２（Ｋａｓｔら、２００２）は、肝臓中でＲＩＦによって顕著に誘導されず、腸内でＲＩＦまたはＲＩＦａｘによってわずかに誘導された。他の者は、ＭＲＰ２がＰＣＮなどのマウスＰＸＲリガンドによって有意に誘導されないことを見出した（Ｍａｈｅｒら、２００５）。ＭＲＰ２がｈＰＸＲマウスにおいてＲＩＦによって誘導されないという所見により、ヒトとマウスとの間でのＭｒｐ２遺伝子を調節するシスエレメントの種差の可能性が示唆される。腸ＯＡＴＰ２  ｍＲＮＡは、ＲＩＦａｘ処置後のｈＰＸＲマウスで３．４倍増加したが、ＷＴおよびＰｘｒ−ヌルマウスの両方でこのｍＲＮＡの有意な誘導は認められなかった（図３Ｂおよび３Ｃ）。予想通り、ＲＩＦは腸内で４つのｍＲＮＡも誘導したが、誘導範囲は、ＲＩＦａｘで認めら得た誘導範囲より狭かった（図３Ｄ）。対照的に、ＲＩＦは、肝臓中でＣＹＰ３Ａ１１、ＧＳＴＡ１、およびＯＡＴＰ２を有意に誘導した一方で、ＧＳＴＡ１  ｍＲＮＡのみがＲＩＦａｘ処置ｈＰＸＲマウスの肝臓中で増加した（図３Ｅおよび３Ｆ）。これらのデータは、ＲＩＦａｘが腸特異的ヒトＰＸＲリガンドであることを示す。
【０２５７】
細胞ベースのレポーターアッセイにおけるＲＩＦａｘによるヒトＰＸＲ活性化
ルシフェラーゼ活性の用量依存性増加は、ＲＩＦａｘによるｈＰＸＲ活性化についての細胞ベースのレポーターアッセイで認められた。ｈＰＸＲレポーター系における１、１０、および１００μＭ  ＲＩＦａｘとのインキュベーションにより、ＤＭＳＯコントロールと比較して、それぞれ２．１倍、６．７倍、および２５．２倍増加した（図４Ａ）。１００ｎＭのＲＩＦａｘではｈＰＸＲに有意な影響を及ぼさなかった一方で、１０μＭ  ＲＩＦａｘによってＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＣＡＲ、およびＦＸＲの存在下でのルシフェラーゼ活性は有意に変化しなかった（図４Ｂ）。
【０２５８】
ＲＩＦａｘで前処置したｈＰＸＲマウスにおけるＭＤＺの薬物動態
ＭＤＺ（２．５ｍｇ／ｋｇ）の単回経口投与後、ｈＰＸＲマウスにおけるＭＤＺおよび１’−ＯＨ−ＭＤＺの血清濃度−時間曲線を決定した。薬物動態パラメーターを、ノンコンパートメント分析によって評価した。ＲＩＦａｘで前処置したか前処置しなかったｈＰＸＲマウスにおけるＭＤＺのＣｍａｘ、Ｔｍａｘ、およびＡＵＣ０〜９０分について有意な変化は認められなかった（ｐ＞０．０５）。ｈＰＸＲマウスにおけるＲＩＦａｘ前処置は、１’−ＯＨ−ＭＤＺ（ＭＤＺの主な代謝産物）のＡＵＣ０〜９０分に有意な影響を及ぼさなかった。しかし、１’−ＯＨ−ＭＤＺのＣｍａｘ値は、ＲＩＦａｘ前処置ｈＰＸＲマウスで５０％高く（ｐ＜０．０５）、対応するＴｍａｘは、コントロール群より有意に短かった（表２）。これらの結果により、ｈＰＸＲマウス腸におけるＲＩＦａｘ媒介ＣＹＰ３Ａ１１上方制御がＭＤＺの肝臓外初回通過代謝に寄与することが示唆された。
【０２５９】
表２  １０ｍｇ／ｋｇ／日のＲＩＦａｘで３日間前処置したか前処置しなかったｈＰＸＲマウスにおけるＭＤＺの薬物動態。血清ＭＤＺおよび１’−ＯＨ−ＭＤＺをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した。ＭＤＺおよび１’−ＯＨ−ＭＤＺについてのＡＵＣ０〜９０分を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用したノンコンパートメントアプローチによって血漿濃度−時間データから評価した。ＣｍａｘおよびＴｍａｘを、元のデータから得た。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。
【０２６０】
【表２】
2011501672.tif 000007
ＰＸＲに及ぼすＲＩＦａｘの影響を調査した。ｈＰＸＲ、Ｐｘｒ−ヌル、およびＷＴマウス、ならびに細胞ベースのヒトＰＸＲレポーター遺伝子アッセイの使用により、ＲＩＦａｘを腸特異的ヒトＰＸＲリガンドとして同定した。ＲＩＦａｘの医薬開発中、ＲＩＦａｘによるＣＹＰ３Ａ４誘導がヒト肝細胞モデルで認められた。ＲＩＦａｘは、ＰＸＲ標的遺伝子（ＣＹＰ３Ａが含まれる）を上方制御する腸特異的ヒトＰＸＲリガンドであるという新規な所見を本明細書中に報告する。組換えヒトＰＸＲを安定的に発現するＤＰＸ２細胞株では、ルシフェラーゼ活性はビヒクルと比較して２．１倍増加したので、ｈＰＸＲは１μＭを超えるＲＩＦａｘ濃度で有意に活性化された。ＤＰＸ２細胞株におけるＲＩＦａｘによるｈＰＸＲの活性化についてのＥＣ５０はおよそ２０μＭと評価された。腸内のＲＩＦａｘ濃度は、ＲＩＦａｘ処置後に２０μＭよりはるかに高い。本研究では、マウスを１０ｍｇ／ｋｇ  ＲＩＦａｘ（単回投与、ｐ．ｏ．）で処置した場合、腸管内ＲＩＦａｘ濃度は１５０ｕｇ／ｇ（約２００μＭ）腸内容物までであった。ヒトでは、ＲＩＦａｘ処置（８００ｍｇを毎日、ｐ．ｏ．）の３日後、ＲＩＦａｘ濃度は約８ｍｇ／ｇ（約１０，０００μＭ）糞便であった（Ｊｉａｎｇら、２０００）。これは、腸内のＲＩＦａｘ曝露濃度が非常に高いことを示していた。腸ＰＸＲ（しかし肝臓受容体ではない）に及ぼすＲＩＦａｘの影響は、おそらくその不十分な吸収に関連していた。腸管内でＲＩＦａｘ濃度が高く、血中に少しだけ分布するので、本研究におけるＲＩＦａｘの代謝プロフィールは、以前の研究と一致している（Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ、１９８３；Ｃｅｌｌａｉら、１９８４）。これは、腸内のＰＸＲ発現と無関係であり、吸収の欠如がＰＸＲ誘導性代謝に起因しないことを示した。ヒトでは、経口投与後のＲＩＦａｘ吸収も無視できる。ＲＩＦａｘ（４００ｍｇ）の単回経口投与後、血漿ＲＩＦａｘ濃度は、検出限界（２ｎｇ／ｍｌ）未満であった。尿中では、非常に少量の不変の分子が検出された。この分子は、投与用量の０．０１％未満であった（Ｄｅｓｃｏｍｂｅら、１９９４）。したがって、本研究は、臨床での使用中にＲＩＦａｘは抗生物質として機能し、腸内でＰＸＲアクチベーターとしても機能することを示す。
【０２６１】
ヒトＰＸＲリガンドとしてのＲＩＦａｘの同定により、薬理学および治療学におけるＲＩＦａｘの役割に関する新規な洞察が得られる。ＰＸＲ（リガンド活性化転写因子の核内受容体ファミリーのメンバー）は、生体異物の解毒に関与する生体防御機構の不可欠な要素である（Ｋｌｉｅｗｅｒら、２００２）。ＰＸＲ活性化は、生体異物酸化および抱合酵素ならびに身体由来の潜在的に有害な化学物質の代謝および排除に関与する輸送体の発現を調節する。前の研究により、ヒト肝細胞モデルにおけるＲＩＦａｘによるＣＹＰ３Ａ４誘導が明らかとなった。ＭＤＺならびにエチニルエストラジオールおよびノルゲスチメートを含む経口避妊薬を使用した２つの臨床研究（Ｔｒａｐｎｅｌｌら、２００７）により、ＲＩＦａｘはこれらの薬物の薬物動態を変化させず、したがって、ＲＩＦａｘが腸または肝臓のＣＹＰ３Ａ４に有意な影響を及ぼさないことを示すことが証明された。しかし、本明細書中では、腸ＣＹＰ３Ａ１１は、ＲＩＦａｘで処置されたｈＰＸＲマウスで有意に上方制御された。ＲＩＦａｘで前処置したｈＰＸＲにおけるＭＤＺの薬物動態研究では、Ｃｍａｘの２０％減少が認められ、これは、その主な中間体である１’−ＯＨＭＤＺのＣｍａｘ増加と一致した。いかなる特定の科学的理論に拘束されることも望まないが、腸ＣＹＰ３Ａ代謝を介した初回通過効果によってこれを説明することができる。しかし、ＲＩＦａｘで前処置したｈＰＸＲにおいてＭＤＺ  ＡＵＣの平行減少は認められなかった。ＡＵＣは、初回通過による排除に関連するだけでなく、吸収などの他の要因にも関連する。ＲＩＦａｘで前処置したｈＰＸＲマウスでは、いくつかの腸遺伝子（輸送体（流入輸送体ＯＡＴＰ２など）が含まれる）が上方制御され、これがＭＤＺ吸収の増加に寄与し得る。マウスにおけるその不十分な生物学的利用能および変動の大きさにより、ＭＤＺについての生物学的利用能研究を行わなかった（Ｇｒａｎｖｉｌら、２００３）。ＰＸＲ活性化の有利な態様は、生体異物の排除に関与する酵素および輸送体（Ｐ４５０ｓ、ＧＳＴ、ＯＡＴＰ、ＭＲＰなどが含まれる）の上方制御による解毒における役割である（Ｋｌｉｅｗｅｒ、２００３；Ｓａｉｎｉら、２００５；Ｗａｇｎｅｒら、２００５）。ＰＸＲ標的遺伝子は、生体異物および細菌に対する腸関門機能における成分である（Ｌａｎｇｍａｎｎら、２００４）。ＲＩＦａｘで処置したｈＰＸＲマウスの小腸では、いくつかのＰＸＲ標的遺伝子（ＣＹＰ３Ａ１１、ＧＳＴＡ１、ＭＲＰ２、およびＯＡＴＰ２など）が上方制御された。ＲＩＦａｘは、複数の慢性胃腸障害（肝性脳症、腸ガスおよびガス関連症候群、憩室性疾患、回腸嚢炎、およびＢＤなど）の治療で有利である（ＳｃａｒｐｉｇｎａｔｏおよびＰｅｌｏｓｉｎｉ、２００５）。慢性胃腸障害におけるＲＩＦａｘの有利な影響に寄与する機構は、完全に理解されていない。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性ＢＤマウスモデルでは、ＰＣＮ媒介性ＰＸＲ活性化がＤＳＳ誘導性結腸炎を有意に予防し（Ｓｈａｈら、２００７）、これは、ＢＤの治療薬としてのＰＸＲリガンドの潜在的価値を示す。慢性胃腸障害を治療するための医薬におけるＲＩＦａｘ媒介性腸ＰＸＲ活性化の役割を評価す���ためのさらなるヒト研究が提案される。
【０２６２】
前述の発明は理解を明確にするための例証および実施例によって幾らか詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の教示を考慮して、その一定の変更形態および修正形態が可能であることが当業者に容易に理解されるであろう。
【０２６３】
略語：ＲＩＦ、リファンピシン；ＲＩＦａｘ、リファキシミン；ＰＸＲ、プレグナンＸ受容体；ＣＡＲ、構成性アンドロスタン受容体；ＰＰＡＲα、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ；ＰＰＡＲγ、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ；ＦＸＲ、ファルネソイドＸ受容体；ＷＴ、野生型マウス；ｈＰＸＲ、ＰＸＲヒト化マウス；ＣＹＰ３Ａ、シトクロムＰ４５０  ３Ａ；ＧＳＴＡ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ；ＭＲＰ、多剤耐性タンパク質；ＯＡＴＰ、有機アニオン輸送ポリペプチド；ＭＤＺ、ミダゾラム。
【０２６４】
参考文献
【０２６５】
【化５】
2011501672.tif 000008
【０２６６】
【化６】
2011501672.tif 000009
【０２６７】
【化７】
2011501672.tif 000010
【０２６８】
【化８】
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【図１Ａ】
2011501672.tif 000012
【図１Ｂ】
2011501672.tif 000013
【図１Ｃ】
2011501672.tif 000014
【図２−１】
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【図２−２】
2011501672.tif 000016
【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
2011501672.tif 000021
【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2011501672.tif 000024
2011501672.tif 000025