(57)【要約】  本発明は、１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つであって、脂溶性物質に抱合されているオリゴヌクレオチドと、該抱合オリゴヌクレオチドが凝集、混合、または会合されているエマルションまたはリポソームのうちの少なくとも１つとを含む新しい製剤脂質粒子（ＦＬｉＰ）に関する。これらの粒子は、驚くことに、心臓、肺、および筋肉にオリゴヌクレオチドを有効に送達し、そこで遺伝子サイレンシングをもたらすことが示されている。
2011517676.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つであって、脂溶性物質に抱合されている前記オリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記脂溶性物質に抱合されたオリゴヌクレオチドが凝集、混合、または会合されているエマルションと、
を含む組成物であって、少なくとも１００ｎｍのサイズを有する組成物。
【請求項２】
前記脂溶性物質に抱合されたオリゴヌクレオチドが、２本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記２本鎖オリゴヌクレオチドが、相互に相補的である少なくとも２本鎖を含む２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であって、前記２本鎖のうちの各々が、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであって、センス鎖が、第１の配列を含み、アンチセンス鎖が、標的遺伝子のうちの少なくとも一部に実質的に相補的である相補性領域を含む第２の配列を含み、前記相補性領域が、３０ヌクレオチドの長さより短いものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合される末端ヌクレオチドから成る群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミド酸、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記相補性領域が、１９から２１ヌクレオチドの長さの間である、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｄｓＲＮＡが、前記ｄｓＲＮＡの片方または両方の末端に１本鎖オーバーハングを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
前記センス鎖およびアンチセンス鎖の各々が、１９個の塩基対相補性を有する２１ヌクレオチドの長さであり、前記ｄｓＲＮＡが、各鎖の３’末端に２ヌクレオチドの１本鎖オーバーハングを有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項１０】
前記脂溶性物質抱合体が、コレステロール部分である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記脂溶性物質が抱合されたオリゴヌクレオチドが、１本鎖オリゴヌクレオチドを含み、前記１本鎖オリゴヌクレオチドが、マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ標的化合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドを哺乳類の組織に選択的に標的化または送達するための方法であって、哺乳類を前記オリゴヌクレオチドに接触させ、前記オリゴヌクレオチドが、製剤脂質粒子（ＦＬｉＰ）エマルションで製剤化されており、前記エマルションが、少なくとも１００ｎｍのサイズである、方法。
【請求項１３】
前記哺乳類の組織が、心臓組織、肺組織、および／または筋肉組織である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、２本鎖を有する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含み、各鎖が、１９個の塩基対相補性を有する２１ヌクレオチドの長さであり、各鎖が、３’末端に２ヌクレオチドの１本鎖オーバーハングを有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、コレステロール部分で修飾される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが、ＡｐｏＢまたはＲｈｏＡを標的とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡ拮抗薬またはａｎｔａｇｏｍｉｒを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織を請求項１に記載の組成物に接触させることを含む、哺乳類の組織における遺伝子の発現を低減させる方法。
【請求項１９】
前記哺乳類の組織が、心臓組織、肺組織、および／または筋肉組織である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組織における遺伝子の発現が、哺乳類のインビボで低減され、前記接触させることが、前記哺乳類への全身送達を介するものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
トリアシルグリセロール、リン脂質、グリセロール、および脂溶性リンカー分子を介して１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドと凝集する１つまたは複数の脂質結合タンパク質を含むリポソームであって、心臓組織、肺組織、および／または筋肉組織に対して親和性を有する、リポソーム。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチド修飾によって安定化されるものである、請求項２１に記載のリポソーム。
【請求項２３】
約２０％のトリアシルグリセロール、約１．２％のリン脂質、ならびに約２．２５％のグリセロールおよび１つまたは複数の脂質結合タンパク質を含む、請求項２１または２２のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項２４】
２０〜５０ｎｍ、好ましくは、約３５ｎｍの粒子サイズを有する、請求項２１から２３のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉を媒介するオリゴヌクレオチド、ＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド、またはタンパク質を標的とするオリゴヌクレオチドである、請求項２１から２４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項２１から２５のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項２７】
脂質粒子のエマルションを分画し、次いで２０〜５０ｎｍ、好ましくは約３５ｎｍの粒子サイズについて選択することによって取得することができる、請求項２１から２６のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項２８】
請求項２１から２７のいずれかに記載のリポソーム凝集体を生成するための方法であって、
ａ．脂質エマルションを１つまたは複数の１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドと混合する工程と、
ｂ．工程ａ）の混合物を分画する工程と、
ｃ．２０〜５０ｎｍ、好ましくは約３５ｎｍの粒子サイズを有する分画を選択する工程と、
を含む、方法。
【請求項２９】
請求項２１から２７のいずれかに記載のリポソーム凝集体を生成するための方法であって、トリアシルグリセロール、リン脂質、グリセロール、および１つまたは複数の脂質結合タンパク質を含む前記脂質粒子が、第一に、脂質エマルションから単離され、次いで、２倍を超えるモル過剰の１つまたは複数の脂溶性物質に抱合された１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドと混合される、方法。
【請求項３０】
医薬として使用するための請求項２１から２７のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項３１】
心臓、肺、および／または筋肉の病気の治療のための請求項２１から２７のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項３２】
心臓、肺、および／または筋肉の病気の治療のための医薬の製造のための請求項２１から２７のいずれかに記載のリポソームの使用。
【請求項３３】
請求項２１から２７のいずれかに記載のリポソームを含む凍結乾燥物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００８年３月２７日に出願された欧州出願第０８００５８００．１号および２００８年３月２８日に出願された米国仮出願第６１／０４０，３８６号の利益を主張する。これらの優先出願の全体の内容は、出典明示により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、１本鎖および２本鎖の両方のオリゴヌクレオチドを含有する組成物と、ＲＮＡ干渉の媒介におけるその使用とに関する。より具体的には、本発明は、組織特異的送達と製剤されたオリゴヌクレオチドによる標的発現の低減とを可能にするオリゴヌクレオチドの特定の製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
２本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として既知である高度に保存された調節機構において遺伝子発現を阻止することが分かっている。特許文献１は、線虫における遺伝子の発現を抑制するために、長さが少なくとも２５のヌクレオチドのｄｓＲＮＡを使用することを開示している。ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、特許文献２および特許文献３参照）、ショウジョウバエ（例えば、非特許文献１参照）、および哺乳類（特許文献４および特許文献５）を含む他の生物において標的ＲＮＡを分解することが示されている。この自然のメカニズムは、現在、遺伝子の異常または不必要な調節により引き起こされる疾患を処置するための新しい種類の医薬剤の開発に着目されている。
【０００４】
ＲＮＡｉ分野における大幅な進歩および病理過程の処置の進歩にもかかわらず、薬剤を細胞に選択的かつ効率的に送達して、次いで細胞においてサイレンシングを発生させることが可能である製剤が現在も求められている。
【０００５】
インビボにおいて細胞膜を通過してオリゴヌクレオチドを送達することは、これまで、ベクターに基づく送達システム、オリゴヌクレオチドの高圧静脈注射、ならびにコレステロール抱合、脂質カプセル化、および抗体媒介オリゴヌクレオチドを含む種々の化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを用いて達成されてきたが、送達は依然としてインビボオリゴヌクレオチド治療における最大の障害である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９９／３２６１９号（Ｆｉｒｅら）
【特許文献２】国際公開第ＷＯ９９／５３０５０号（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら）
【特許文献３】国際公開第ＷＯ９９／６１６３１号（Ｈｅｉｆｅｔｚら）
【特許文献４】国際公開第ＷＯ００／４４８９５号（Ｌｉｍｍｅｒ）
【特許文献５】独特許第ＤＥ１０１００５８６．５号（Ｋｒｅｕｔｚｅｒら）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙａｎｇ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  （２０００）  １０：１１９１−１２００
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、１本鎖または２本鎖のオリゴヌクレオチドを含有する組成物と、脂質製剤と組み合わせてかかるオリゴヌクレオチドを使用して、細胞または哺乳類における遺伝子の発現を抑制するための方法とを提供する。また、本発明はまた、癌等の標的遺伝子の発現により引き起こされる病的状態および病気を処置するための組成物および方法を提供する。本明細書で特徴とされるオリゴヌクレオチドは、長さが３０ヌクレオチドより短く、概して長さが１９〜２４ヌクレオチドであり、かつ標的遺伝子のｍＲＮＡ転写の少なくとも一部に実質的に相補的である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を有する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。一実施形態では、標的遺伝子の発現を抑制するためのｄｓＲＮＡは、相互に相補的である少なくとも２つの配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は、標的遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、該相補性領域は、長さが３０ヌクレオチドより短く、および長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。一般に、ｄｓＲＮＡは、長さが１９から２４、例えば、１９から２１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ鎖は、長さが独立して約１０から約１５ヌクレオチドであり、別の実施形態では、長さが約２５から約３０ヌクレオチドである。
【０００９】
また、特徴とされる組成物における使用に適切な１本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的であるヌクレオチド配列も含み、該相補性領域は、長さが３０ヌクレオチドより短く、および長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。一般に、１本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが１９から２４、例えば、１９から２１ヌクレオチドである。一実施形態では、鎖は、約２５〜３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、１本鎖オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡに対して１００％より低い相補性を有する。
【００１０】
本明細書で特徴とされるオリゴヌクレオチドは、天然由来のヌクレオチドを含むことができるか、あるいは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはビタミンＥ基等のごとき抱合基に結合された末端ヌクレオチドのごとき、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。あるいは、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択されてもよい。
【００１１】
本明細書で特徴とされるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの分解を回避するために、１つもしくは複数の修飾によって安定化することが可能である。典型的な修飾には、ホスホロチオエートＤＮＡ単位、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メトキシ−エチルＲＮＡ単位、ペプチド核酸単位、Ｎ３’〜Ｐ５’ホスホロアミデートＤＮＡ単位、２’フルオロ−リボ核酸単位、ロックされた核酸単位、モルホリノホスホロアミデート核酸単位、シクロヘキサン核酸単位、トリシクロ核酸単位、２’−Ｏ−アルキル化ヌクレオチド修飾、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾、２，４−ジフルオロトルイル修飾、４’チオリボース修飾、またはボラノホスフェート修飾を含む。
【００１２】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、「製剤脂質粒子」（ＦＬｉＰ）に組み込まれる。驚くべきことに、１本鎖または２本鎖のいずれかのオリゴヌクレオチドがＦＬｉＰに製剤化される場合に、送達およびサイレンシングの両方が、インビボで組織において、特に、心臓組織、肺組織、および筋肉組織においてもたらされることが発見された。
【００１３】
ＦＬｉＰは、（ａ）１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つであって、脂溶性物質に抱合されているオリゴヌクレオチドと、（ｂ）該抱合されたオリゴヌクレオチドが凝集、混合、または会合されているエマルションまたはリポソームのうちの少なくとも１つとを含む。
【００１４】
一態様では、本発明は、生物、一般に、ヒト被験者における標的遺伝子の発現を抑制するための医薬組成物を提供する。本組成物は、典型的に、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチド、例えば、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、医薬上許容可能な担体または送達ビヒクルとを含む。一実施形態では、本組成物は、心臓、肺、または他の筋肉組織に影響を及ぼす病気または疾患を処置するために使用される。
【００１５】
別の態様では、本発明は、以下の工程を実施することにより、オリゴヌクレオチドを、心臓組織または肺組織のごとき特異的な組織に送達し、組織の細胞、例えば、筋肉細胞における標的遺伝子の発現を抑制するための方法を提供する：
（ａ）生物または生物の組織にＦＬｉＰを導入する工程であって、ＦＬｉＰのオリゴヌクレオチドが、標的遺伝子を発現する細胞との接触時に、標的遺伝子の発現を抑制する工程、次いで
（ｃ）工程（ａ）における細胞を、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それにより該細胞における標的遺伝子の発現を抑制する工程。
【００１６】
別の態様では、本発明は、このような処置、予防、または管理の必要のある患者に、１つもしくは複数の特徴とされるＦＬｉＰの治療または予防上有効な量を投与することによって、標的遺伝子により媒介される病理過程を処置、予防、または管理するための方法を提供する。
【００１７】
なお別の態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドをインビボで筋肉に送達するため、および筋疾患の処置のための方法を提供する。本明細書にて用いられるように、筋肉組織は、筋肉系統の特徴を呈する骨格、心臓、平滑、および任意の細胞の種類を指す。
【００１８】
一態様では、本発明は、トリアシルグリセロール、１つもしくは複数のリン脂質、グリセロール、および脂溶性リンカー分子を介して１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドと凝集される１つまたは複数の脂質結合タンパク質を有するリポソームに関し、該リポソームは、心臓組織および／または肺組織等の筋肉組織に親和性を有する。
【００１９】
以下の詳細な説明は、標的遺伝子および１つもしくは複数のさらなる遺伝子のうちのいずれかの発現をそれぞれ抑制するオリゴヌクレオチドを含有する組成物およびＦＬｉＰを生成および使用する方法、ならびにこれらの遺伝子の発現により引き起こされる病気および疾患を治療するための組成物および方法を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＦＰＬＣによるＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の分析である。コレステロール抱合ＲＮＡ（Ｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１−ｓｉＲＮＡおよびａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６）はＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）ピーク＃１に結合した。色の薄い四角形は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）分画を示す。
【図２】図２は、尾静脈注射後のＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）／ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６およびＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）／ｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１−ｓｉＲＮＡの血漿クリアランスを示すグラフである。
【図３】図３は、全身注射４時間後の「Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）１」により媒介される３２Ｐ標識ｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１−ｓｉＲＮＡの組織取り込みを示すグラフである。取り込みを、１ｍｇタンパク質毎に標準化した。レーン１は、肝臓を表し、レーン２は、胃を表し、レーン３は、十二指腸を表し、レーン４は、空腸を表し、レーン５は、腸骨を表し、レーン６は、結腸を表し、レーン７は、精巣を表し、レーン８は、腎臓を表し、レーン９は、副腎を表し、レーン１０は、脾臓を表し、レーン１１は、心臓を表し、レーン１２は、筋肉を表し、レーン１３は、肺を表し、レーン１４は、脂肪を表し、レーン１５は、脳を表す。
【図４】図４は、ｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１−ｓｉＲＮＡ／Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）１の注射後のｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１−ｓｉＲＮＡのＡｐｏＢサイレンシング活性を示すグラフである。レーン１は、野生型（ＰＢＳ対照）を表し、レーン２は、（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）１の非存在下で）抱合されていないｃｈｏｌ−ＡｐｏＢを表し、レーン３は、ｃｈｏｌ−ＡｐｏＢ  Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）１（注射前に、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）１と複合体化されるｓｉＲＮＡ）を表す。
【図５】ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１３３ａ／Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１の注射後の、マイクロＲＮＡ−１３３ａ（ｍｉＲ−１３３ａ）のサイレンシングを示すゲルである。発現レベルは、注射の２４時間後にノーザンブロット法によって測定した。ｔＲＮＡレベルは、負荷対照として示す。レーン１および４は、ＰＢＳ対照を表し、レーン２および５は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）ａｎｔ．１３３ａ（注射前にＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）１と複合体化されたａｎａｇｏｍｉｒ−１３３ａ）を表し、レーン３および６は、ａｎｔ．１３３ａ  Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）１を含まないａｎｔａｇｏｍｉｒの注射）を表し、レーン１〜３は、心臓組織を表し、レーン４〜６は、大腿四頭筋を表す。
【図６】脂質−ａｎｔａｇｏｍｉｒ複合体による筋特異的ｍｉＲ−２０６の標的化を示すゲルの対である。レーン１は、対照試料（３ｘ８０ｍｇ／体重ｋｇ、静脈注射）を表し、レーン２は、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−２０６（３ｘ  ８０ｍｇ／体重ｋｇ、静脈注射）を表し、レーン３は、対照（３ｘ５０ｍｇ／体重ｋｇ、静脈注射）試料を表し、レーン４は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）／ａｎｔａｇｏｍｉｒ−２０６（３ｘ５０ｍｇ／体重ｋｇ、静脈注射）を表す。
【図７】低分子量タンパク質が、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）ピーク＃１に結合することを示す銀染色ポリアクリルアミドゲルである。１０ｋＤから２０ｋＤの間の分子量（ＭＷ）における２つのタンパク質バンドは、分画３８〜５０（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１を含有する分画に対応する）において検出可能である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、１本鎖および／または２本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、細胞または哺乳類における標的遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法を提供する。これらのオリゴヌクレオチドは、１つもしくは複数の脂溶性物質に抱合され、パッケージ化されるか、または本明細書において「製剤脂質粒子」（ＦＬｉＰ）と呼ばれるものに製剤化される。驚くべきことに、１本鎖または２本鎖の脂溶性抱合オリゴヌクレオチドがＦＬｉＰとして製剤化されると、送達およびサイレンシングの両方がインビボにおける組織、特に、心臓組織、肺組織、および筋肉組織でもたらされることが知見された。
【００２２】
ＦＬｉＰは、（ａ）１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つであって、脂溶性物質に抱合されているオリゴヌクレオチドと、（ｂ）該抱合されたオリゴヌクレオチドが凝集、混合、または会合されているエマルションまたはリポソームのうちの少なくとも１つとを含む。
【００２３】
本発明はまた、標的遺伝子の過剰発現により引き起こされる哺乳類において、筋肉組織に関連する病気および疾患等の病的状態および病気を治療するための組成物および方法を提供する。該オリゴヌクレオチド成分は、１本鎖または２本鎖にかかわらず、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるアンチセンス機構を介してｍＲＮＡの配列特異的分解を生じる。
【００２４】
特徴とされる組成物のオリゴヌクレオチドは、長さが３０より短いヌクレオチド、概して長さが１９〜２４のヌクレオチド、具体的には長さが２１〜２３のヌクレオチドであり、かつ標的遺伝子のｍＲＮＡ転写の少なくとも一部に実質的に相補的である領域を有するｄｓＲＮＡを含む。一実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、具体的には、長さが２５〜３０のヌクレオチドであり、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のヌクレオチドのものを包含する。これらのｄｓＲＮＡの使用により、哺乳類において、病状、例えば、癌の複製および／または維持に関与する遺伝子のｍＲＮＡの標的とされる分解が可能となる。具体的には、極めて低用量のＦｌｉＰとしての製剤ｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを特異的かつ効率的に媒介し、標的遺伝子の発現の顕著な抑制を生じる。本明細書で特徴とされる方法および組成物は、肺組織、心臓組織、および他の筋肉組織の病理過程のごとき標的遺伝子発現により媒介される病理過程を治療するのに有用な製剤ｄｓＲＮＡを含む。
【００２５】
本発明で特徴とされるＦＬｉＰ医薬組成物は、長さが３０より短いヌクレオチド、概して長さが１９〜２４のヌクレオチドであり、標的遺伝子のＲＮＡ転写の少なくとも一部に実質的に相補的であり、任意選択により医薬的に許容可能な担体を含む相補性領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを含む。
【００２６】
Ｉ．定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語および語句の意味は、下記に提示される。本明細書の他の部分における用語の用法と、本項で提示されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本項の定義が優先されるものとする。
【００２７】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」の各々は、一般に、それぞれがグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを塩基として含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、用語の「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」が、さらに後述するように修飾ヌクレオチドを指すか、または代用置換部分を指しうることを理解されたい。当業者は、かかる置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に改変することなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを、他の部分により置換してもよいことを十分認識している。例えば、限定するものではないが、イノシンをその塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合してもよい。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドによって置換されてもよい。別の例では、オリゴヌクレオチドの任意の位置におけるアデニンおよびシトシンは、それぞれ、グアニンおよびウラシルのそれぞれと置換して標的ｍＲＮＡとのＧ−Ｕゆらぎ塩基対合を形成することができる。
【００２８】
本明細書において使用する「標的配列」は、１次転写産物のＲＮＡ処理の産物であるｍＲＮＡを含む、標的遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の接触する部分を指す。標的配列は、ＲＮＡ前駆体、プリもしくはプレ−マイクロＲＮＡ、またはｍＲＮＡをコードするＤＮＡをさらに含んでもよい。
【００２９】
本明細書において使用する「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を用いて言及される配列により記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【００３０】
本明細書にて用いられるように、特に示されていない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列に関して第１のヌクレオチド配列を記載するのに用いられる場合、当業者によって認識されるように、一定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、２本鎖構造を形成する第１のヌクレオチド配列を含むリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、この場合、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２〜１６時間５０℃または７０℃、その後の洗浄を含んでもよい。生物の内部で直面しうるような生理学的に関連する条件のごとき他の条件が適用できる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な適用により、２つの配列の相補性試験に最も適切な条件のセットを決定することができる。
【００３１】
これは、第１および第２のヌクレオチド配列の長さ全体において、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと塩基対合することを含む。かかる配列は、本明細書において、相互に「完全に相補的」と呼ばれうる。しかしながら、本明細書において第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」であると呼ばれる場合、該２つの配列は、完全に相補的でありうるか、または、２つの配列は、一般に、ハイブリダイゼーション時に４、３、または２つの不一致の塩基対を越えない１つもしくは複数の不一致の塩基対を形成し得る一方で、それらの最終的な適用に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持する。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション時に、１つもしくは複数の１本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、かかるオーバーハングは、相補性の決定について不一致であると見なされないものとする。例えば、長さが２１のヌクレオチドの一方のオリゴヌクレオチド鎖と、長さが２３のヌクレオチドの別のオリゴヌクレオチド鎖とを有するｄｓＲＮＡであって、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１のヌクレオチドの配列を含むものは、依然として「完全に相補的」と呼ばれてもよい。
【００３２】
「相補的」配列はまた、本明細書にて用いられるように、そのハイブリダイズ能力に関する上記要件が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対ならびに／もしくは非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含むか、またはそれから全体的に形成され得る。このような非ワトソン−クリック塩基対は、Ｇ：Ｕゆらぎまたはフーグスティーン塩基対合を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書の「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらの使用の内容から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の塩基一致、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基一致に関して使用され得る。
【００３４】
本明細書にて用いられるように、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部に実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、（例えば、標的遺伝子をコードする）目的のｍＲＮＡの接触部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が標的遺伝子をコードするｍＲＮＡの非干渉部分に実質的に相補的である場合、標的遺伝子ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
【００３５】
本明細書において使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、１本鎖および２本鎖ポリヌクレオチドの両方を包含する。
【００３６】
「２本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、本明細書にて用いられるように、２つの逆並行で、上述のように実質的に相補的な核酸鎖を含む２本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。該２本鎖構造を形成する２つの鎖は、１つの大きい方のＲＮＡ分子の異なる部分であり得るか、または別個のＲＮＡ分子であり得る。該２つの鎖が１つの大きい方の分子の部分であることから、一方の鎖の３’末端と、２本鎖構造を形成するそれぞれの他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続鎖によって連結される場合、該連結ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。該２つの鎖が、一方の鎖の３’末端と、２本鎖構造を形成するそれぞれの他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続鎖以外の手段により共有結合で連結される場合、該連結する構造は、「リンカー」と呼ばれる。該ＲＮＡ鎖は、同一数または異なる数のヌクレオチドを有してもよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチド数から２本鎖に存在する任意のオーバーハングを引いた数である。該２本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは１つもしくは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよい。
【００３７】
本明細書において使用する「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延出する場合にｄｓＲＮＡの２本鎖構造から突出する１つまたは複数の非対合ヌクレオチドを指し、その反対も同様である。「平滑」または「平滑末端」は、該ｄｓＲＮＡのその末端に非対合ヌクレオチドが存在しないこと、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端型」ｄｓＲＮＡは、その長さ全体において２本鎖であるｄｓＲＮＡであり、すなわち、分子の両端にヌクレオチドオーバーハングが存在しない。
【００３８】
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書において使用する「相補性領域」という用語は、本明細書で定義されるように、配列、例えば、標的配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が該標的配列に完全に相補的でない場合、不一致が該分子の内部または末端領域にあり得る。一般に、最大許容不一致は、末端領域、例えば、５’末端および／または３’末端の６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内である。
【００３９】
「センス鎖」という用語は、本明細書にて用いられるように、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
【００４０】
「細胞への導入」は、オリゴヌクレオチドを指す場合、当業者により理解されるように、細胞内への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。オリゴヌクレオチドの吸収または取り込みは、非支援型拡散（ｕｎａｉｄｅｄ  ｄｉｆｆｕｓｉｖｅ）もしくは活性な細胞プロセスを介して、または補助剤もしくはデバイスによって生じさせることができる。この用語の意味は、インビトロにおける細胞に限定されず、オリゴヌクレオチドが「細胞に導入」されてもよく、細胞が生きている生物の一部であってもよい。この場合、細胞への導入は、生物への送達を含む。例えば、インビボ送達では、オリゴヌクレオチドは、組織部位内に注入可能であるか、または全身に投与可能である。また、インビボ送達は、米国特許第５，０３２，４０１号および同第５，６０７，６７７号ならびに米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号に記述されるシステム等の、ベータグルカン送達システムによるものであることも可能である。米国特許第５，０３２，４０１号および同第５，６０７，６７７号ならびに米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。細胞へのインビトロ導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクション等の本技術分野において既知である方法を含む。
【００４１】
「サイレンス」、「〜の発現を抑制する」、「〜の発現を下方制御する」、「〜の発現を抑制する」という用語、およびその同等物は、それらの用語が標的遺伝子を指す限り、本明細書において、そのように処置されたまたは処置されなかった第１の細胞または細胞群に実質的に同一である第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較した、標的ｍＲＮＡの量の低減により明示されるように、標的遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。抑制の程度は、通常、
【表１】
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により表現される。
【００４２】
代替として、抑制の度合いは、標的遺伝子発現に機能的に関連するパラメータ、例えば、細胞から分泌される標的遺伝子によりコードされるタンパク質の量、または一定の表現型、例えば、アポトーシスを示す細胞の数の減少の観点から得られてもよい。原理的には、遺伝子サイレンシングは、構成的に、またはゲノム工学によって、および任意の適切なアッセイによって、標的物を発現する任意の細胞において決定され得る。しかしながら、所定のオリゴヌクレオチドが、一定の度合いだけ遺伝子の発現を抑制するか否かを決定するために基準が必要とされ、そのため、本発明により包含される場合、以下の実施例に提示されるアッセイがこのような基準としての役割を果たす。
【００４３】
例えば、一定の事例では、遺伝子の発現は、ＦＬｉＰとして製剤化された１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドを有する組成物の投与によって、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。いくつかの実施形態では、該標的遺伝子は、ＦＬｉＰとして製剤化されたオリゴヌクレオチドを有する組成物の投与によって、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。他の実施形態では、該標的遺伝子は、ＦＬｉＰとして製剤化されたオリゴヌクレオチドを有する組成の投与によって、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。
【００４４】
遺伝子発現に関連して本明細書において使用する「処置する」、「処置」という用語、およびその同等物は、標的遺伝子発現が媒介する病理過程からの緩和または軽減を指す。本明細書の以下に記述する他の状態（標的遺伝子発現が媒介する病理過程以外）のうちのいずれかに関連する限り、「処置する」、「処置」という用語、およびその同等物は、このような状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和または軽減することを意味するか、あるいは心筋炎または筋疾患等の、心臓組織または肺組織または筋肉組織の病気または疾患の進行を遅らせる等の、このような状態の進行を遅延または逆行させることを意味する。
【００４５】
本明細書において使用する「治療的に有効な量」および「予防的に有効な量」という語句は、標的遺伝子発現が媒介する病理過程または標的遺伝子発現が媒介する病理的方法の明白な症状の処置、予防、または管理における治療的有用性を提供する量を指す。治療的に有効な具体的な量は、通常の医師によって容易に決定することが可能であり、例えば、標的遺伝子発現が媒介する病理過程の種類、患者の病歴および年齢、標的遺伝子発現が媒介する病理過程の段階、ならびに標的遺伝子発現薬剤が媒介する他の抗病理過程の管理等の、当技術分野において既知である要因に応じて変動し得る。
【００４６】
本明細書において使用する「医薬組成物」は、ＦＬｉＰとして製剤化されたオリゴヌクレオチドの薬理学的に有効な量を含み、任意選択により、医薬的に許容可能な担体を含む。本明細書において使用する「薬理学的に有効な量」、「治療的に有効な量」、または単に「有効な量」は、オリゴヌクレオチドのその量を指すか、またはＦＬｉＰとして製剤化された場合に、対象の薬学的、治療的、または予防的結果をもたらすように有効である量を指す。例えば、病気または疾患に関連する測定可能なパラメータにおいて少なくとも２５％減少する場合に、提供された臨床処置が有効であると考える場合、その病気または疾患の治療のための薬物の治療的に有効な量は、そのパラメータにおける少なくとも２５％の減少をもたらすのに必要な量である。
【００４７】
「医薬的に許容可能な担体」という用語は、治療剤の投与のための担体を指す。このような担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本用語は、細胞培地を特異的に除外する。経口投与される薬物では、医薬的に許容可能な担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、平滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤、および防腐剤等の医薬的に許容可能な賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースが含まれる一方で、コーンスターチおよびアルギン酸は、適切な崩壊剤である。結合剤には、でんぷんおよびゼラチンが含まれる一方で、平滑剤は、存在する場合、概して、ステアリン酸マグネシウム，ステアリン酸、またはタルクである。必要に応じて、消化管における吸収を遅らせるために、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリル等の材料により錠剤をコーティングしてもよい。
【００４８】
本明細書において使用する「形質転換細胞」は、ベクターが導入される細胞であり、そこからｄｓＲＮＡ分子が発現され得る。
【００４９】
ＩＩ．オリゴヌクレオチド
ＩＩａ．２本鎖オリゴヌクレオチド
一実施形態では、本発明は、細胞または哺乳類の標的遺伝子の発現を抑制するための２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し（単独で、または第２の標的遺伝子の発現を抑制するための第２のｄｓＲＮＡと組み合わせて）、該ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性領域を含むアンチセンス鎖を含み、該相補性領域は、長さが３０ヌクレオチドより短く、概して長さが１９〜２４のヌクレオチドであり、該ｄｓＲＮＡは、該標的遺伝子を発現する細胞との接触時に、該標的遺伝子の発現を抑制する。該ｄｓＲＮＡは、２本鎖構造を形成するためにハイブリダイズするのに十分相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。概して、該２本鎖構造は、長さが１５から３０の間、より概して１８から２５の間、さらにより概して１９から２４の間、最も概して１９から２１の間の塩基対である。一定の実施形態では、長さが２５から３０の間の塩基対のより長いｄｓＲＮＡが典型的である。同様に、該標的配列への相補性領域は、長さが１５から３０の間、より概して１８から２５の間、さらにより概して１９から２４の間、最も概して１９から２１の間のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、長さが１０から１５のヌクレオチドであり、他の実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、長さが２５から３０のヌクレオチドである。本明細書で特徴とされるｄｓＲＮＡは、１つもしくは複数の１本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。該ｄｓＲＮＡは、さらに後述する当技術分野において既知の標準的な方法、例えば、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．より市販されるような自動ＤＮＡ合成装置を使用することによって合成可能である。一実施形態では、該標的遺伝子は、ヒトの標的遺伝子である。
【００５０】
具体的には２１である２０から２３の間の塩基対の２本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導する際に特に有効であるものとして称賛されていること（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  ２００１，  ２０：６８７７−６８８８）を当業者は十分認識している。しかしながら、より短いまたは長いｄｓＲＮＡも有効であり得ることも分かっている。上述の実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、最低限２１のヌクレオチドの長さの少なくとも１つの鎖を含むことが可能である。片方または両方の末端における数個のヌクレオチドを既知の配列から引いたより短いｄｓＲＮＡが、上述の長さのｄｓＲＮＡに比べて同様に有効であることを合理的に推測することができる。したがって、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の接触するヌクレオチドの部分配列を有し、かつ後述するＦＡＣＳアッセイにおいて標的遺伝子の発現の抑制能力が、完全配列を有するｄｓＲＮＡとは５、１０、１５、２０、２５、または３０％以下の抑制だけ異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって想定される。さらに、標的配列内で開裂するｄｓＲＮＡは、提供される標的遺伝子配列および標的配列を使用して容易に生成可能である。
【００５１】
第１のｄｓＲＮＡが標的とする配列内で標的とするｄｓＲＮＡは、特徴とされる組成物および方法における使用に適切である。本明細書にて用いられるように、第１のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的であるｍＲＮＡ内の任意の場所のメッセージを第２のｄｓＲＮＡが開裂する場合、第２のｄｓＲＮＡは、第１のｄｓＲＮＡの配列内で標的とする。このような第２のｄｓＲＮＡは、概して、標的遺伝子において選択された配列に接触する領域から取られる追加のヌクレオチド配列に結合する少なくとも１５の接触するヌクレオチドから成る。
【００５２】
本明細書で特徴とされるｄｓＲＮＡは、標的配列に対する１つもしくは複数の不一致を含有することができる。一実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、３つ以下の不一致を含有する。該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列に対して不一致を含有する場合、不一致の範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列に対して不一致を含有する場合、該不一致が、いずれかの末端からの５のヌクレオチドに制限されることが好ましく、例えば、相補性領域の５’または３’末端のいずれかからの５、４、３、２、または１のヌクレオチドであることが好ましい。例えば、標的遺伝子の領域に相補的である２３のヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖では、該ｄｓＲＮＡは、概して、中心の１３のヌクレオチド内にいかなる不一致も含有しない。本発明内に説明する方法は、標的配列に対して不一致を有するｄｓＲＮＡが標的遺伝子の発現の抑制に有効であるか否かを決定するために使用することが可能である。特に、標的遺伝子における特定の相補性領域が、集団内において多形配列変動を有するものとして知られている場合に、標的遺伝子の発現を抑制する際の不一致を有するｄｓＲＮＡの有効性を考慮することが重要である。
【００５３】
一実施形態では、該ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端は、１から４、概して１または２のヌクレオチドの１本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、平滑末端型の対応物よりも、予想外に優れた抑制特性を有する。さらに、本発明者は、ヌクレオチドオーバーハングが１つだけ存在することによって、全体の安定性に影響を及ぼさずに該ｄｓＲＮＡの干渉活性が強化されることを発見した。オーバーハングを１つだけ有するｄｓＲＮＡは、インビボ、ならびに多種多様の細胞、細胞培地、血液、および血清において特に安定かつ有効であることが判明した。概して、１本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端に位置し、代替として、センス鎖の３’末端に位置する。また、該ｄｓＲＮＡは、概してアンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端を有してもよい。このようなｄｓＲＮＡの安定性および抑制活性が改善されるため、低用量の投与、すなわち、１日当たり服用者の体重の５ｍｇ／ｋｇより少ない投与が可能になる。一実施形態では、該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端において、１から１０のヌクレオチドオーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端および／または５’末端において、１から１０のヌクレオチドオーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハングにおける１つもしくは複数のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオリン酸塩に置換される。
【００５４】
さらに別の実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、強度を強化するために化学的に修飾される。例えば、該核酸は、参照により本明細書に組み込まれる“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”  Ｂｅａｕｃａｇｅ，  Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｒｓ．），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ＵＳＡに記載される方法等の、当技術分野で十分確立された方法によって合成および／または修飾され得る。本明細書に説明する適用に有用なｄｓＲＮＡ化合物の具体的な例として、修飾骨格を含有する、または天然ヌクレオシド間結合を含まないｄｓＲＮＡが挙げられる。本明細書において規定するように、修飾骨格を有するｄｓＲＮＡには、骨格にリン原子を保持するｄｓＲＮＡと、骨格にリン原子を含まないｄｓＲＮＡとが含まれる。本明細書において、当技術分野において場合により参照されるように、ヌクレオシド間骨格にリン原子を含まない修飾ｄｓＲＮＡも、オリゴヌクレオシドであると考えることが可能である。
【００５５】
典型的な修飾ｄｓＲＮＡ骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホン酸塩およびキラルホスホン酸塩を含むメチルおよび他のアルキルホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、ならびに逆極性を有するものが含まれ、ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’−５’から５’−３’、または２’−５’から５’−２’に結合される。種々の塩、混合塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。
【００５６】
上記のリンを含有する結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９５号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３１６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、および同第５，６２５，０５０号が含まれるがこれらに限定されず、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
ｄｓＲＮＡ骨格内にリン原子を含まない典型的な修飾ｄｓＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する骨格が含まれる。
【００５８】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、および同第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されず、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
他のｄｓＲＮＡ模造物では、糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が新しい基に置換されている。該塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。このような１つのオリゴマー化合物、つまり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが分かっているｄｓＲＮＡ模造物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、ｄｓＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格、具体的にはアミノエチルグリシン骨格に置換されている。これらの核酸塩基は保持され、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号明細書が含まれ、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ＰＮＡ化合物の教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見られることができる。
【００６０】
本明細書で特徴とされる多くの実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するｄｓＲＮＡおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、具体的には、上記に参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２−−、−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチレンイミノ）またはＭＭＩ骨格として既知である］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−および−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［ここで、天然ホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−で表される］、および上記に参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格である。また上記に参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するＤｓＲＮＡも、本明細書に説明する用途に有用である。
【００６１】
また、修飾ｄｓＲＮＡは、１つもしくは複数の置換糖部分を含有し得る。典型的なｄｓＲＮＡは、例えば、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを２’位に含み、ここで該アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。特に、例示には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が含まれ、ここでｎおよびｍは１から約１０である。他の例示的ｄｓＲＮＡは、Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、ｄｓＲＮＡの薬物動態学的特性を改善する基、またはｄｓＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および類似の特性を有する他の置換基のうちの１つを２’位に含む。典型的な修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても既知である）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、すなわち、アルコキシ−アルコキシ基が含まれる。他の典型的な修飾には、以下の実施例において説明するような２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基であって、２’−ＤＭＡＯＥとしても既知であるもの、およびこれも以下の実施例において説明するような２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても既知である）、すなわち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２が含まれる。
【００６２】
他の例示的修飾には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。また、同様の修飾が、該ｄｓＲＮＡの他の位置で成されてもよく、特に、３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合ｄｓＲＮＡ上の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位が挙げられる。また、ｄｓＲＮＡは、ペンタフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模造物を有してもよい。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、および同第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されず、そのうちの一定の特許は、本出願と共同所有され、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６３】
また、ｄｓＲＮＡは、核酸塩基（当該技術分野において単に「塩基」と呼ぶことが多い）修飾または置換も含んでよい。本明細書において使用する「非修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等の、他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。
【００６４】
さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，  Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．  Ｌ，  ｅｄ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９１，  ３０，  ６１３に開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，  Ｙ  Ｓ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，  ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．，  Ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３に開示されているものが含まれる。これらの核酸塩基の一定のものは、本発明で特徴とされるオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃だけ核酸２重鎖安定性を増加させることが分かっており（Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．，  Ｅｄｓ．，  ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  １９９３，  ｐｐ．  ２７６−２７８）、特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせる場合に典型的な塩基置換である。
【００６５】
上述の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のうちの一定のものの調製を教示する代表的な米国特許には、上述の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、および第５，６８１，９４１号が含まれるが、これらに限定されず、その各々は、参照により本明細書に組み込まれ、また、米国特許第５，７５０，６９２号も、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
ｄｓＲＮＡの別の典型的な修飾は、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを強化する１つもしくは複数の部分または抱合物をｄｓＲＮＡに化学的に結合することを伴う。このような部分には、コレステロール部分等の脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸塩（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６４−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
このようなｄｓＲＮＡ抱合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、および同第５，６８８，９４１号が含まれるが、これらに限定されず、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
所定の化合物における全ての位置を均一に修飾する必要はなく、実際には、上述の修飾のうちの２つ以上は、単一の化合物に、またはｄｓＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込まれてもよい。また、本発明は、キメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も含む。本発明の内容では、「キメラ」ｄｓＲＮＡ化合物つまり「キメラ」は、各々が少なくとも１つの単量体単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合ではヌクレオチドから構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｄｓＲＮＡ化合物、特に、ｄｓＲＮＡである。これらのｄｓＲＮＡは、典型的には、少なくとも１つの領域を含み、この領域では、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞の取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加を該ｄｓＲＮＡに付与するように該ｄｓＲＮＡは修飾される。該ｄｓＲＮＡの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂することができる酵素の基質として役割を果たすことができる。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞性エンドヌクレアーゼである。ゆえに、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の開裂をもたらし、これにより遺伝子発現のｄｓＲＮＡ抑制の効率が大幅に強化される。その結果、キメラｄｓＲＮＡの使用時に、同じ標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、匹敵する結果をより短いｄｓＲＮＡでしばしば得ることができる。ＲＮＡ標的の開裂は、ゲル電気泳動、および必要に応じて当該技術分野で既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技法により日常的に検出することができる。
【００６９】
一定の例では、該ｄｓＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。いくつかの非リガンド分子は、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを強化するためにｄｓＲＮＡに抱合されており、このような抱合を実行するための手順は、科学文献において入手可能である。このような非リガンド部分には、コレステロール等の脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９４，  ４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １９９２，  ６６０：３０６；  Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．，  １９９３，  ３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９２，  ２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １９９１，  １０：１１１；  Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  １９９０，  ２５９：３２７；  Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  １９９３，  ７５：４９）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム  １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸塩（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９９５，  ３６：３６５１；  Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９０，  １８：３７７７）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １９９５，  ３６：３６５１）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９９５，  ３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １９９５，  １２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．，  １９９６，  ２７７：９２３）が含まれている。このようなｄｓＲＮＡ抱合物の調製を教示する代表的な米国特許は、上記に列挙されている。典型的な抱合プロトコルは、配列の１つもしくは複数の位置においてアミノリンカーを有するｄｓＲＮＡの合成を伴う。次いで、該アミノ基は、適切な結合試薬または活性化試薬を使用して抱合される分子と反応する。この抱合反応は、固体担体に依然として結合されたｄｓＲＮＡとともに、または溶液相におけるｄｓＲＮＡの開裂の後に実行され得る。ｄｓＲＮＡ抱合物のＨＰＬＣによる精製によって、典型的には、純抱合物が得られる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に説明するオリゴヌクレオチドは、脂溶性リガンドに共有結合される。例示的脂溶性リガンドには、コレステロール；胆汁酸；および脂肪酸（例えば、リトコール−オレイル酸、ラウロイル酸、デカノイル（ｄｏｃｏｓｎｙｌ）酸、ステアロイル酸、パルミトイル酸、リストイル酸、オレオイル酸、またはリノレオイル酸）が含まれる。該脂溶性リガンドは、例えば、開裂可能連結基を含むテザー等のテザーを介して、オリゴヌクレオリドに直接または間接的に結合することができる。いくつかの実施形態では、該脂溶性リガンドは、オリゴヌクレオチドにおけるある位置を介してオリゴヌクレオチドに連結され、そこにおいて、該オリゴヌクレオチドのリボースは、例えば、ピロリジン単量体等の単量体によって置換されている。
【００７１】
脂溶性部分に共有結合される例示的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に説明するオリゴヌクレオチド）に組み込まれる以下の化学式（Ｉ）の構造を含む。
【化１】
2011517676.tif 000004
（Ｉ）
式中、
Ｘは、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、
Ｒ３、Ｒ５、およびＲ９の各々は、Ｒ３、Ｒ５、またはＲ９のうちの１つのみがＯＨ、ＯＲａ、またはＯＲｂであるという条件で、独立してＨ、ＯＨ、ＯＲａ、ＯＲｂであり、
Ｒ７は、ＮＲｃＲｄまたはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されるＣ１〜Ｃ２０アルキルであり、
Ｒａは、
【化２】
2011517676.tif 000005
であり、
Ｒｂは、
【化３】
2011517676.tif 000006
であり、
ＡおよびＣの各々は、独立してＯまたはＳであり、
Ｂは、ＯＨ、Ｏ−、または
【化４】
2011517676.tif 000007
であり、
Ｒｃは、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり、および、
Ｒｄは、例えば、コレステロール；胆汁酸；または脂肪酸（例えば、リトコール−オレイル酸、ラウロイル酸、デカノイル（ｄｏｃｏｓｎｙｌ）酸、ステアロイル酸、パルミトイル酸、リストイル酸、オレオイル酸、またはリノレオイル酸）を含む脂溶性リガンドである。いくつかの実施形態では、該脂溶性リガンドは、炭水化物ラジカルにさらにテザーされることが可能である。本明細書に説明するオリゴヌクレオチドに組み込まれることが可能であり、かつ脂溶性部分に共有結合される他の例示的単量体が、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国２００５／０１０７３２５号に説明されている。
【００７２】
ＩＩｂ．１本鎖オリゴヌクレオチド
マイクロＲＮＡつまりｍｉｒとして説明および／または識別されるものを含む１本鎖オリゴヌクレオチドであって、標的物として使用され得るか、または本明細書で特徴とされるオリゴヌクレオチドの設計のテンプレートとしての役割を果たし得る１本鎖オリゴヌクレオチドについては、例えば、名称が「Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｓｍａｌｌ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ」であるＥｓａｕ  ｅｔ  ａｌ．への米国公開第２００５０２６１２１８号（ＵＳＳＮ：１０／９０９１２５）において教示されており、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。上述の２本鎖オリゴヌクレオチドに適用する任意の化学的な修正または変形が、１本鎖オリゴヌクレオチドにも適用することを、当業者は理解する。したがって、ここでは繰り返し説明しない。
【００７３】
ＩＩＩ．製剤脂質粒子（ＦＬｉＰ）
ＦＬｉＰは、（ａ）１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つであって、脂溶性物質に抱合されている該オリゴヌクレオチドと、（ｂ）該抱合されたオリゴヌクレオチドが凝集、混合、または会合されているエマルションまたはリポソームのうちの少なくとも１つとを含む。
【００７４】
高度に疎水性であるコレステロールのＲＮＡに対する共有結合抱合が、２本鎖ＲＮＡおよび１本鎖アンチセンスＲＮＡの細胞取り込みを媒介し、ＲＮＡ干渉およびマイクロＲＮＡサイレンシングのそれぞれを導くことが知られている。また、コレステロール抱合ＲＮＡが、そのそれぞれの受容体への結合時に、細胞取り込みを媒介するＨＤＬおよびＬＤＬリポタンパク質粒子に結合することも分かっている。高比重リポタンパク（ＨＤＬ）および低比重リポタンパク（ＬＤＬ）の両方は、コレステロール輸送において重要な役割を果たす。ＨＤＬは、肝臓、腸、腎臓、およびステロイド産生器官内へのｓｉＲＮＡの送達を導くが、ＬＤＬは、主に肝臓へのｓｉＲＨＡを標的とする（Ｗｏｌｆｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  ２５  （２００７））。しかしながら、現在まで、脂質抱合ＲＮＡの筋特異的送達のための方法は存在しない。解決すべき技術的問題は、具体的には心臓組織、肺組織、および筋肉組織にオリゴヌクレオチドを標的化するオリゴヌクレオチド用の非毒性担体を提供することにある。この問題は、製剤脂質粒子（ＦｌｉＰ）を使用することによって解決される。
【００７５】
リポソームは、その独特な特性により、薬物を輸送するために広く使用される別のツールである（Ｖ．  Ｐ．  Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２００５，  ４（２）：１４５−１６０）。リポソームは、１つまたは複数の同心脂質２重層により形成される球形の自己閉鎖型構造であり、脂質２重層の内部およびその間に水相を有する。リポソームのサイズ、形状、組成は異なってもよい。従来的には、リポソームは、リン脂質とコレステロールとの２重層から構成される膜を指す。リポソームは、卵黄ホスファチジルエタノールアミンのような混合脂質鎖を有する天然由来のリン脂質から構成可能であるか、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等の純粋界面活性剤成分から構成可能である。リポソームは、疎水性膜内部の水溶液上の領域を封入し、溶解親水性溶質は、脂質を容易に通過することができない。疎水性化学物質は、膜内に溶解可能であり、このように、リポソームは、疎水性分子および親水性分子の両方を担持することが可能である、これらの分子を作用部位に送達するためには、該脂質２重層は、細胞膜等の他の２重層と融合することができるため、リポソーム含有物が送達される。
【００７６】
免疫リポソームは、所望の組織および器官に蓄積するように設計されている。対象の細胞を認識しそれに結合することのできる表面付着リガンドを有する標的リポソームの使用が提案されている。葉酸およびトランスフェリンは、腫瘍細胞を標的とするリポソームを媒介する。葉酸およびトランスフェリンの受容体が腫瘍細胞において頻繁に過剰発現されることから、葉酸修飾またはトランスフェリンの修飾リポソームにより腫瘍を標的とすることが、有望な手法を表す。
【００７７】
別のリポソーム源は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）である。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）は、ヒト用の第１の安全な脂肪エマルションの商標名であり、１９６２年に認可され、Ａｒｖｉｄ  Ｗｒｅｔｌｉｎｄ教授，  Ｓｗｅｄｅｎにより発明された。これは、常食に脂肪をあまり摂ることのできない患者の静脈内に投与される。ゆえに、これは、完全に非毒性であり、ヒトにおいて十分認められている。
【００７８】
Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）２０％（２０％の静脈内脂肪エマルション）は、カロリー源および必須脂肪酸源として静脈内投与のために調製された無菌の非発熱性脂肪エマルションである。これは、２０％の大豆油、１．２％の卵黄リン脂質、２．２５％のグリセリン、および注入用の水から構成される。加えて、水酸化ナトリウムが、最終生成物のｐＨが６から８．９の範囲の約８になるようにｐＨを調整するように添加されている。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）２０％は、約３５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ  ｗａｔｅｒ（２６０ｍｏｓｍｏｌ／エマルションリットルを表す）のオスモル濃度を有し、約０．５ミクロンサイズの乳化脂肪粒子を含有する。該大豆油は、大部分が不飽和の脂肪酸の天然トリグリセリドの混合から成る精製天然産物である。
【００７９】
主成分の脂肪酸は、リノール酸、Ｃ１８Ｈ３２Ｏ２（４４〜６２％）；オレイン酸、Ｃ１８Ｈ３４Ｏ２（１９〜３０％）；パルミチン酸、Ｃ１６Ｈ３２Ｏ２（７〜１４％）；リノレン酸、Ｃ１８Ｈ３０Ｏ２（４〜１１％）、およびステアリン酸、Ｃ１８Ｈ３６Ｏ２（１．４〜５．５％）である。加えて、大豆油は、微量のラウリン酸、ミリスチン酸、アラキジン酸、およびパルミトレイン酸を含有する。
【００８０】
精製卵黄リン脂質は、卵黄から単離される天然由来のリン脂質の混合物である。これらのリン脂質は、飽和および不飽和脂肪酸と、リン酸のコリンエステルまたはエタノールアミンエステルのいずれかとを含有する。グリセロールは、化学的に指定されるＣ３Ｈ８Ｏ３であり、無色透明であり、吸湿性シロップ液である。
【００８１】
多くのリポソームは、１つには刺激的な炎症性サイトカインの放出により毒性であり、ゆえに、その用途は、薬剤送達システムとしての医療使用に限定される。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）は、非毒性であり、医療用途に認可されている。
【００８２】
いくつかの実施形態では、サフラワー油等の別の適切な油は、ＦＬｉＰのリポソームまたはエマルション成分を産生する役割を果たし得る。
【００８３】
ＦＰＬＣによるＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の分析により、このエマルションが、異なるサイズの種々の安定脂質粒子を含有することが明らかになった（図１）。１つの特定の分画が、心臓組織、肺組織、および筋肉組織に対して親和性を有することが本発明者によって示された。この特定の分画は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１と呼ばれる。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１の脂質組成物は、完全なＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）混合物に類似するが、分子量が１５ｋｄから３５ｋＤの間である１つまたは複数の特定の脂質結合タンパク質を含有する。
【００８４】
本事例は、リポソームを有するＦＬｉＰを教示するが、ＦＬｉＰ組成物は、エマルション成分も含んでもよく、またはリポソームの代わりにエマルションを含む。ＦＬｉＰのリポソームは、トリアシルグリセロール、リン脂質、グリセロール、および１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドを有する脂溶性リンカー分子を介して凝集、混合、または会合された１つまたは複数の脂質結合タンパク質を含み、この場合、該リポソームは、心臓組織、肺組織、および／または筋肉組織に対して親和性を有する。驚くことに、該１つまたは複数の脂質結合タンパク質を上述の脂質と組み合わせることにより、心臓組織、肺組織、および／または筋肉組織に対する親和性が、極めて特異的であることが発見された。ゆえに、これらのリポソームは、オリゴヌクレオチドの担体としての役割を果たすことができる。具体的には、リポソームは、心臓細胞、肺細胞、および筋肉細胞に対するその親和性により、オリゴヌクレオチドをこれらの組織に輸送することができる。ゆえに、リポソーム凝集体は、心筋炎、虚血性心疾患、ミオパシー、心筋ミオパチー、代謝性疾患、軟組織疾患および肉腫、筋ジストロフィー、筋捻挫および筋挫傷、間質性肺疾患（肺線維症）、ならびに紋筋肉腫等の多くの重い心臓、肺、および筋肉の病気に使用され得る。
【００８５】
一実施形態では、ＦＬｉＰは、約１５〜２５％のトリアシルグリセロール、約０．５〜２％のリン脂質、約１〜３％のグリセロール、および１つまたは複数の脂質結合タンパク質を含有するリポソームを含む。
【００８６】
別の実施形態では、ＦＬｉＰは、約１５〜２５％のトリアシルグリセロール、約１〜２％のリン脂質、約２〜３％のグリセロール、および１つまたは複数の脂質結合タンパク質を含有するリポソームを含む。
【００８７】
さらに別の実施形態では、ＦＬｉＰは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の全組成に対応する約２０％のトリアシルグリセロール、約１．２％のリン脂質、および約２．２５％のグリセロール、ならびに１つまたは複数の脂質結合タンパク質を含有するリポソームを含む。
【００８８】
別の実施形態では、リポソーム成分は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１として本明細書において既知である分画である。別の実施形態では、代替として、ＦＬｉＰのエマルション成分は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１である。
【００８９】
一実施形態では、ＦＬｉＰは、約２０〜５０ｎｍまたは約３０〜５０ｎｍ、例えば、約３５ｎｍまたは約４０ｎｍの粒子サイズを有する。
【００９０】
別の実施形態では、ＦＬｉＰは、少なくとも約１００ｎｍの粒子サイズを有する。代替として、ＦＬｉＰは、リポソームベースまたはエマルションベースとして特徴付けられるかにかかわらず、約１００〜１５０ｎｍの間、例えば、約１１０ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１３０ｎｍ、または約１４０ｎｍであってもよい。
【００９１】
別の実施形態では、複数のＦＬｉＰは、まとめて凝集される。本実施形態では、複数のＦＬｉＰが送達されるために、粒子サイズが１００ｎｍより大きくなり得ることが想定される。
【００９２】
オリゴヌクレオチド対エマルションまたはリポソームの化学量論は、１：１であってもよい。代替として、該化学量論は、１：多数、多数：１、または多数：多数であってもよく、この場合、多数は、２を上回る。
【００９３】
別の実施形態では、ＦＬｉＰのオリゴヌクレオチド成分は、脂溶性部分を介してリポソームまたはエマルション成分と凝集、会合、または混合される。この凝集、会合、または混合は、該リポソームまたはエマルションの表面に存在し得る。代替として、該脂溶性部分の一部分または全部のうちのいずれかのうちのいくつかの統合が、発生し、該リポソームまたはエマルションの中にまで及んでもよい。オリゴヌクレオチドを脂質に結合可能である任意の脂溶性リンカー分子を選択することができる。例として、コレステロール、ピロリジン、およびヒドロキシプロリノールが挙げられる。
【００９４】
ＦＬｉＰのオリゴヌクレオチド成分は、例えば、ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を媒介するオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡ）、ＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチド、またはタンパク質を標的とするオリゴヌクレオチドである。
【００９５】
さらに、本発明は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）エマルションから該リポソームまたはエマルション成分を選択する工程に関する。該脂質成分の源、特に大豆またはサフラワー油が、分画パターンならびに／あるいは送達またはサイレンシングの有効性を改変し得ることに留意されたい。本明細書に説明する方法の後に、商用成分源に基づいて最適化される分画を選択する際に比較研究を実行することは、当業者の技術の範囲内にある。一実施形態は、油または他の成分の商用源が比較されるＦＬｉＰの脂質成分を最適化する方法を提供する。
【００９６】
Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）エマルションを分画し、異なる脂質粒子を分離する任意の方法を選択することが可能である。サイズが２０〜５０ｎｍ、例えば、約３５ｎｍまたは約４０ｎｍ等の３０〜５０ｎｍのリポソーム粒子が選択され得る。サイズが１００〜１５０ｎｍ、例えば、約１００ｎｍのエマルション粒子が選択され得る。
例示的分画方法には、クロマトグラフィー、例えば、液体クロマトグラフィーおよび超遠心分離法が含まれる。
【００９７】
リポソームを生成するための方法は、
ａ）脂質エマルションを化学的に修飾され得る１つまたは複数の１本鎖または２本鎖脂溶性物質（例えば、コレステロール）抱合オリゴヌクレオチドと混合する工程と、
ｂ）この混合物を分画する工程と、
ｃ）サイズが約４０ｎｍ等の３０〜５０ｎｍの粒子を有する分画を選択する工程と、
を含む。
【００９８】
本例に示すように、コレステロール抱合ＲＮＡ（Ｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１およびＡｎｔａｇｏｍｉｒ−１６）は、ＦＰＬＣにより分画４０から５０の間で溶出し、かつサイズが３０ｎｍから５０ｎｍの間の粒子を含有するＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）ピーク＃１に結合する。
【００９９】
代替として、該リポソームは、初めに、トリアシルグリセロール、リン脂質、グリセロール、および１つまたは複数の脂質結合タンパク質を含み、かつＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１粒子に相当する脂質粒子を単離し、次いで、単離された粒子を、２倍を超えるモル過剰の１本鎖または２本鎖脂溶性物質（例えば、コレステロール）抱合オリゴヌクレオチドと混合することによって生成可能である。該粒子を分画および選択する工程は、該リポソームを生成するためのこの代替方法によって削除される。
【０１００】
一実施形態では、リポソームＦＬｉＰ凝集体は、心臓、肺、または筋肉の病気を治療する等の薬剤として使用される。このような薬剤は、典型的には、特定の遺伝子、ＲＮＡ、またはタンパク質の過剰発現により引き起こされる疾患を治療するために使用される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、リポソームまたはエマルション凝集体は、凍結乾燥物に含有される。
【０１０２】
一態様では、哺乳類をオリゴヌクレオチドに接触させることによって、哺乳類の心臓組織、肺組織、および／または筋肉組織に１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドを選択的に標的化するための方法が提供され、この場合、該オリゴヌクレオチドは、上記説明に従って、脂質エマルション分画方法を介して製剤化されている。心臓、肺、または筋肉等の特定の組織において選択的または排他的に発現する遺伝子を識別することは、当業者の技術の範囲内にある。これらの遺伝子のいずれもが、１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドを設計するための標的物としての役割を果たし、次いで、１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドは、脂溶性物質に抱合され、ＦＬｉＰにおいて製剤化され得る。
【０１０３】
さらに別の態様は、哺乳類の組織をＦＬｉＰ（リポソームもしくはエマルションを含有するＦＬｉＰ、またはその両方を含有するＦＬｉＰ等）に接触させることによって、哺乳類のインビボ組織における遺伝子の発現を低減するための方法に関する。
【０１０４】
ＩＶ．製剤オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物
一実施形態では、本発明は、本明細書に説明するようなオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物を提供する。このような組成物は、標的遺伝子発現が媒介する病理過程等の、標的遺伝子の発現または活性に関連する病気または疾患を治療するのに有用である。
【０１０５】
本明細書で特徴とされる医薬組成物は、標的遺伝子の発現を抑制するのに十分な用量で投与される。概して、全オリゴヌクレオチドの適切な投与量は、１日当たりの服用者の体重のキログラム当たり０．０１から２００．０ミリグラムの範囲であり、概して、１日当たりの体重のキログラム当たり０．０２から５０ｍｇの範囲である。例えば、ｄｓＲＮＡは、単回投与につき、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与可能である。該医薬組成物は、１日１回投与されてもよく、あるいは１日を通して適切な間隔で２回、３回、もしくはそれ以上のサブ投与量として、または制御放出製剤によって持続注入もしくは送達を使用して投与されてもよい。この場合、各サブ投与量に含有されるオリゴヌクレオチドは、１日の全用量を達成するために、対応するように少量でなくてはならない。また、用量単位は、例えば、数日間オリゴヌクレオチドの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を使用して、数日間の送達のために配合することが可能である。持続放出製剤は、当技術分野において周知であり、特に、本明細書で特徴とされる薬剤とともに使用され得る特定の部位における薬剤の送達に有用である。本実施形態では、該用量単位は、対応する複数の１日当たりの用量を含有する。
【０１０６】
当業者は、一定の要因が、被験者を効果的に治療するのに必要な投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解し、該要因には、病気または疾患の重度、前処置、全身の健康、および／または被験者の年齢が含まれるが、これらに限定されない。さらに、治療的に有効な量の組成物による被験者の治療には、単回治療または一連の治療が含まれることが可能である。本発明により包含される個々のオリゴヌクレオチドの有効な投与量およびインビボ半減期の推定は、本発明の他の場所で説明するように、従来の方法を使用して、または適切な動物モデルを使用するインビボ試験に基づいて行なうことが可能である。
【０１０７】
マウス遺伝子学における進歩によって、標的遺伝子発現が媒介する病理過程等の種々のヒトの病気の研究のためにいくつかのマウスモデルが作成されている。このようなモデルは、オリゴヌクレオチドのインビボ試験のため、ならびに治療的に有効な投与量を決定するために使用される。
【０１０８】
本明細書で特徴とされる医薬組成物は、局部的または全身的治療を所望するかに応じて、および治療範囲に応じて、多数の方式で投与され得る。投与は、局所的であるか（例えば、経皮貼布による）、経肺であるか（例えば、噴霧器による；気管内、鼻腔内、表皮、および経皮を含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹入による）、経口または非経口である。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射もしくは注入；皮下、例えば、埋め込みデバイスを介して；あるいは、頭蓋内、例えば、脳実質内、髄腔内、もしくは脳室内投与によるものが含まれる。
【０１０９】
局所的投与の医薬組成物および製剤には、経皮貼布、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点的薬、坐薬、噴霧、液体、および粉末が含まれ得る。従来の医薬担体、水溶液、粉末または油ベース、増粘剤、およびその同等物は、必要であってもまたは望ましくてもよい。また、コーティングされたコンドーム、グローブ、およびその同等物も、有用であり得る。適切な製剤には、その中で、ＦＬｉＰが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤等の局所的送達薬剤と混合する製剤が含まれる。
【０１１０】
適切な脂質およびリポソームには、天然（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれる。ＦＬｉＰは、それ自体、リポソーム内に封入されてもよく、またはそれと、具体的にはカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。代替として、ＦＬｉＰは、脂質、具体的にはカチオン性脂質と複合体を形成してもよい。適切な脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１−１０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、またはこれらの医薬的に許容可能な塩が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
経口投与のための組成物には、粉末または顆粒、ミクロ粒子、ナノ粒子、水または非水溶媒中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が、望ましくあり得る。典型的な経口製剤は、その中で、ＦＬｉＰが、１つもしくは複数の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート剤と併用して投与される経口製剤である。典型的な界面活性剤には、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が含まれる。適切な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。典型的な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、ジグリセリド、または医薬的に許容可能なそれらの塩（例えば、ナトリウム）が含まれる。また、浸透促進剤の組み合わせも適切であり、浸透促進剤の組み合わせには、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が含まれる。典型的な組み合わせの１つとして、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩が挙げられる。さらなる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本明細書で特徴とされるｄｓＲＮＡは、噴霧される乾燥粒子を含む顆粒形態またはミクロ粒子またはナノ粒子を形成するように複合体化された顆粒形態で、経口で送達され得る。ｄｓＲＮＡ複合体化剤には、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリル酸塩；ポリアクリル酸アルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、でんぷん、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびでんぷん；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロース、およびでんぷんが含まれる。典型的な複合体化剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラ��、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギナート、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびその調製は、米国特許出願第０８／８８６，８２９（１９９７年７月１日出願）、同第０９／１０８，６７３（１９９８年７月１日出願）、同第０９／２５６，５１５（１９９９年２月２３日出願）、同第０９／０８２，６２４（１９９８年５月２１日出願）、および同第０９／３１５，２９８（１９９９年５月２０日出願）に詳述されており、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
非経口投与、髄腔内投与、脳室内投与、または肝内投与に有用な追加の組成物には、滅菌水溶液が含まれ、この滅菌水溶液はまた、緩衝剤、希釈剤、ならびに例えば、浸透促進剤、担体化合物、および他の医薬的に許容可能な担体または賦形剤等であるがこれらに限定されない他の適切な添加物を含有してもよい。
本明細書で特徴とされる医薬組成物には、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、多種多様の成分から生成され、この成分には、事前形成液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体が含まれるが、これらに限定されない。肺、心臓、および他の筋肉を標的とする製剤が特に好適である。
【０１１３】
単位投薬形態で便宜的に提示され得る医薬的製剤は、製薬業界で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術には、活性成分を医薬担体または賦形剤と会合させる工程が含まれる。概して、この製剤は、活性成分を液体担体または細かく分割された固体担体またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて、この生成物を成形することによって調製される。
【０１１４】
該組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟性ゲル、坐薬、および浣腸を含むがこれらに限定されない多くの可能な投薬形態のいずれかに製剤化され得る。また、該組成物は、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁液として製剤化され得る。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘性を増加させる物質をさらに含有し得る。また、該懸濁液は、安定剤を含有し得る。
【０１１５】
エマルション
ＦＬｉＰ組成物は、エマルションとして調製および製剤化され得る。エマルションは、典型的には、液滴の形態で別の液体中に分散される、ある液体の不均一系である。（Ｉｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  １９９；  Ｒｏｓｏｆｆ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  ２４５；  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｐ．  ３３５；  Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １９８５，  ｐ．  ３０１）。エマルションは、しばしば、相互に密接に混合および分散された２つの不混和性の液体相を含む２相系である。概して、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）または水中油（ｏ／ｗ）種のいずれかであり得る。水相が、大量の油相に細かく分割されて、微細な液滴として分散される場合、生じた組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。代替として、油相が、大量の水相に細かく分割されて、微細な液滴として分散される場合、生じた組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、該分散された相の他に追加の成分を含有し得、および水相、油相、またはそれ自体を別の相とするいずれかの相に、溶液として存在し得る活性薬物を含有し得る。また、乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤等の医薬的賦形剤も、必要に応じて、エマルション中に存在し得る。また、医薬的エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）エマルションおよび水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合等の、２つより多くの相で構成される多重エマルションであり得る。このような複雑な製剤は、しばしば単純な２成分のエマルションが提供しない一定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油滴が、小さい水滴を囲む多重エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油の連続相中に安定化された水の小球中に囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
【０１１６】
エマルションは、熱力学的安定性がほとんどまたは全くないことによって特徴付けられる。しばしば、エマルションの分散された相または不連続相は、外側の相または連続相に十分分散されて、乳化剤の手段または製剤の粘性により、この形態で維持される。エマルション型の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルションの相のいずれかは、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する他の手段は、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、４つのカテゴリーに広く分類され得る：合成界面活性剤、天然由来の乳化剤、吸着基剤、および細かく分散された固体（Ｉｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  １９９）。
【０１１７】
界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）としても既知である合成の界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）は、エマルションの製剤において広い適用性が見出されており、文献中で概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  ２８５；  Ｉｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８８，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  １９９）。界面活性剤は、典型的には、両親媒性であり、親水性の部分および疎水性の部分を含む。界面活性剤の疎水性の性質に対する親水性の性質の割合は、親水／親油バランス（ＨＬＢ）と呼ばれ、製剤の調製において、界面活性剤を分類および選択する際に価値のあるツールである。界面活性剤は、親水基の性質：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両親媒性に基づいて異なる種類に分類され得る（Ｒｉｅｇｅｒ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  ２８５）。
【０１１８】
エマルション製剤において使用される天然由来の乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン、およびアカシアが含まれる。吸着基剤は、吸着基剤が水を吸い上げて、無水ラノリンおよび親水性ワセリン等の、吸着基剤の半固体の粘度を依然として維持するｗ／ｏエマルションを形成し得るように、親水性を有する。また、細かく分割された固体は、特に界面活性剤との併用において、および粘性の調製物において良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物等の無機固体、ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状のケイ酸アルミニウム、およびコロイド状のケイ酸マグネシウムアルミニウム等の非膨張性の粘土、顔料、ならびにカーボンまたはグリセリルトリステアレート等の非極性固体が含まれる。
【０１１９】
また、多種多様の非乳化物質も、エマルション製剤に含まれ、エマルションの特性に寄与する。これらには、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、保湿剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  ３３５；  Ｉｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  １９９）。
【０１２０】
親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギナン、グアールゴム、カラヤゴム、およびトラガカント）等の天然由来のゴムおよび合成ポリマー、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、ならびに合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が含まれる。これらは、水中で分散または膨潤し、コロイド状溶液を形成し、コロイド状溶液は、分散相の液滴の周りに強力な界面フィルムを形成することによって、および外部の相の粘性を増加させることによってエマルションを安定化させる。
【０１２１】
エマルションは、しばしば、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチド等の、微生物の増殖を容易に支援し得る多くの成分を含有するため、これらの製剤は、しばしば防腐剤を含む。エマルション製剤中に含まれる一般的に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が含まれる。また、抗酸化剤も、製剤の変質を防止するためにエマルション製剤に一般的に添加される。使用する抗酸化剤は、トコフェロール、アルキルギャレット、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム等の還元剤等のフリーラジカルスカベンジャーと、クエン酸、酒石酸、およびレシチン等の抗酸化共力剤とであり得る。
【０１２２】
皮膚科学的経路、経口経路、および非経口経路を介したエマルション製剤の適用およびそれらの製造方法は、文献に概説されている（Ｉｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  １９９）。経口送達のためのエマルション製剤は、製剤の容易さ、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティーの観点からの有効性により、非常に広く使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  ２４５；  Ｉｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  １９９）。ｏ／ｗエマルションとして一般的に経口投与されている物質中には、鉱油ベースの下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物が存在する。
【０１２３】
一実施形態では、ＦＬｉＰの組成物は、マイクロエマルションとして製剤化されている。マイクロエマルションは、単一で光学的に等方性であり、熱力学的に安定な液体溶液である、水、油および両親媒性物質の系として定義され得る（Ｒｏｓｏｆｆ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  ２４５）。典型的には、マイクロエマルションは、界面活性剤水溶液中の油をまず分散し、次いで十分な量の第４の成分、一般的には中間の鎖長のアルコールを透明な系を形成するように添加することによって調製される系である。ゆえに、マイクロエマルションは、熱力学的に安定で等方的に透明な、２つの混合できない液体の分散物としても説明され、これらの液体は、表面活性分子の界面フィルムによって安定化される（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ，  ｉｎ：  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｒｏｓｏｆｆ，  Ｍ．，  Ｅｄ．，  １９８９，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐａｇｅｓ  １８５−２１５）。マイクロエマルションは、３から５つの成分の組み合わせによって一般的に調製され、これらの成分には、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤、および電解質が挙げられる。該マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）型であるかまたは水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用する油および界面活性剤の特性ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的パッキングに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，  ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １９８５，  ｐ．  ２７１）。
【０１２４】
位相図を利用した現象論的手法は、広範に研究されており、当業者に、マイクロエマルションの製剤法について当業者に包括的な知識を与えてきた（Ｒｏｓｏｆｆ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  ２４５；  Ｂｌｏｃｋ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  ３３５）。従来のエマルションと比較すると、マイクロエマルションは、自発的に形成される、熱力学的に安定な小滴の製剤中に、水不溶性薬剤を溶解するという利点を提供する。
【０１２５】
マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤には、単独で、または補助界面活性剤との組み合わせる、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、脂肪酸ポリグリセロールエステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセスキオレアート（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が含まれるが、これらに限定されない。補助界面活性剤、つまり、通常は、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール等の短鎖アルコールは、界面活性剤分子間に生成された間隙空間に起因して、界面活性剤フィルムに浸透し、その結果として無秩序なフィルムを作成することによって界面の流動性を増加する役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を使用せずに調製されてもよく、無アルコールの自己乳化マイクロエマルション系は、当該分野で既知である。該水相は、典型的には、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。該油相には、Ｃａｐｔｅｘ（登録商標）３００、Ｃａｐｔｅｘ（登録商標）３５５、Ｃａｐｍｕｌ（登録商標）ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）のモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、ポリオキシエチレン化脂肪酸グリセリルエステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーンオイル等の物質が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１２６】
マイクロエマルションは、薬剤可溶化および薬剤の吸収強化の観点から特に重要である。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティーを強化するために提案されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９４，  １１，  １３８５−１３９０；  Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，  Ｍｅｔｈ．  Ｆｉｎｄ．  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  １９９３，  １３，  ２０５）。マイクロエマルションは、薬物可溶性の改善、酵素的加水分解からの薬剤の保護、膜の流動性および透過性における界面活性剤で誘導された改変に起因する可能な薬剤の吸収強化、調製の容易さ、固形投薬形態よりも容易な経口投与、臨床的効力の改善、および毒性減少の利点を与える（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９４，  １１，  １３８５；  Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  １９９６，  ８５，  １３８−１４３）。しばしば、マイクロエマルションは、それらの成分が周囲温度でまとめられる場合に、自発的に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチド、またはｄｓＲＮＡを製剤化する場合に特に有利であり得る。また、マイクロエマルションは、化粧品および医薬の適用の両方において活性成分の経皮送達にも有効である。該マイクロエマルション組成物および製剤が、消化管からのｄｓＲＮＡおよび核酸の増加した全身吸収を促進し、ならびにｄｓＲＮＡおよび核酸の局部細胞取り込みを改善することが考えられる。
【０１２７】
また、マイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）、および浸透促進剤等の添加成分および添加剤を含有して、製剤の特性を改善し、ｄｓＲＮＡおよび１本鎖核酸の吸収を強化し得る。マイクロエマルションで使用される浸透促進剤は、５つの広範なカテゴリー（界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤）のうちの１つに属するものとして分類され得る（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  １９９１，  ｐ．  ９２）。これら分類の各々については上述している。
【０１２８】
リポソーム
本発明において使用する「リポソーム」という用語は、球形の一つの２重層または複数の２重層に配置された両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。
【０１２９】
リポソームは、脂溶性材料および水性の内部から形成された膜を有する、単層または多層の小胞である。該水性部分は、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合可能であるという利点を所有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に融合することはできないが、インビボでマクロファージにより摂取される。
【０１３０】
無傷の哺乳類の皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、各々が５０ｎｍより小さい直径を有する、一連の微細な孔を通過しなければならない。ゆえに、高度に変形可能であり、かつこのような微細な孔を通過可能であるリポソームを用いることが望ましい。
【０１３１】
リポソームのさらなる利点は以下を含む；天然リン脂質から得られたリポソームは、生体適合性かつ生分解性である；リポソームは、多種多様の水および脂質可溶性薬物を取り込むことができる；リポソームは、それらの内部区画において、代謝および分解から封入された薬物を保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，  Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ  （Ｅｄｓ．），  １９８８，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐ．  ２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、脂質表面電荷、小胞サイズ、およびリポソームの水性容積である。
【０１３２】
リポソームは、作用部位への活性成分の輸送および送達に有用である。リポソームの膜は、生物学的膜に構造的に類似していることから、リポソームを組織に適用する際、該リポソームは、細胞膜の融合を開始し、リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、リポソームの含有物は、活性薬物が作用し得る細胞中に入って空になる。
【０１３３】
リポソーム製剤は、多くの薬物のための送達モードとして、広範な調査の焦点となっている。局所的投与では、リポソームが他の製剤に優るいくつかの利点を提示するという証拠が増加している。このような利点には、投与された薬物の高全身吸収に関連する副作用の低減、所望の標的における投与された薬物の蓄積の増加、ならびに皮膚への親水性および疎水性の両方の多種多様の薬剤を投与する能力が含まれる。
【０１３４】
いくつかの報告は、高分子量のＤＮＡを含む薬剤を皮膚に送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量のＤＮＡを含む化合物が皮膚に投与されている。大部分の適用は、上部表皮の標的化を生じた。
【０１３５】
リポソーム組成物の主要な種類の１つとして、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が挙げられる。天然リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成可能である。概して、アニオン性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方、アニオン性の融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣ、および卵ＰＣ等のホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の種類は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０１３６】
いくつかの研究は、リポソーム薬物製剤の皮膚への局所的送達を評価している。モルモット皮膚へのインターフェロンを含有するリポソームの適用により、皮膚ヘルペス痛が減少し、一方、他の手段によるインターフェロンの送達（例えば、溶液として、またはエマルションとして）は、有効でなかった（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  １９９２，  ２，  ４０５−４１０）。さらに、追加の研究により、水系を使用するインターフェロンの投与へのリポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性を試験し、このリポソーム組成物が、水投与より優れていたことが結論付けられた（ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９２，  １８，  ２５９−２６５）。
また、非イオンリポソーム系も、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む特定の系において、皮膚への薬物の送達におけるその有用性を判断するために試験された。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む、非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚の真皮中にシクロスポリンＡを送達した。その結果、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層中へのシクロスポリンＡの沈着の促進に有効であったことが示された（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．  Ｓｃｉ．，  １９９４，  ４，  ６，  ４６６）。
【０１３７】
また、ＦＬｉＰのリポソームは、「立体的に安定化した」リポソームも含み、この用語は、本明細書で使用する際、１つもしくは複数の特殊な脂質を含むリポソームを指し、リポソーム中に取り込まれる場合、このような特殊な脂質を欠くリポソームよりも循環寿命が増加する。立体的に安定化したリポソームの例は、リポソームの小胞形成性脂質部分の一部、（Ａ）が、モノシアロガングリオシドＧＭ１等の１つもしくは複数の糖脂質を含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分等の、１つもしくは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、当該分野では、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ−誘導体化脂質を含有する、立体的に安定化したリポソームでは、これらの立体的に安定化したリポソームの循環半減期の増加は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中への取り込みの低減に由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １９８７，  ２２３，  ４２；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９３，  ５３，  ３７６５）。
【０１３８】
１つもしくは複数の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびそれらの調製の方法は、当該分野において既知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｕｌｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｊｐｎ．，  １９８０，  ５３，  ２７７８）は、非イオン性洗剤、２Ｃ１２１５Ｇを含み、ＰＥＧ成分を含有するリポソームについて説明した。Ｉｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  １９８４，  １６７，  ７９）は、ポリマー性グリコールによるポリスチレン粒子の親水性コーティングが、大幅に増加した血液半減期をもたらすことを記述した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の結合によって修飾された合成リン脂質は、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）によって説明されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  １９９０，  ２６８，  ２３５）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームの血液循環半減期が大幅にに増加することを実証する実験について説明した。Ｂｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １９９０，  １０２９，  ９１）は、このような観察を、他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組み合せから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに拡張した。Ｆｉｓｈｅｒへの欧州特許第ＥＰ０４４５１３１Ｂ１号および国際公開第ＷＯ９０／０４３８４号では、リポソームの外面上に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームについて説明している。１〜２０モル％のＰＥＧで誘導体化されたＰＥを含有するリポソーム組成物、およびそれらの使用の方法は、Ｗｏｏｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号）およびＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第ＥＰ０４９６８１３Ｂ１号）によって説明されている。いくつかの他の脂質−ポリマー抱合物を含むリポソームが、国際公開第ＷＯ９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（両方ともＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．による）および国際公開第ＷＯ９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．）に開示されている。ＰＥＧ−修飾セラミド脂質を含むリポソームは、国際公開第ＷＯ９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．）に説明されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）は、リポソームの表面上で官能基によりさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームについて説明している。
【０１３９】
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソーム等の製剤において、広範な適用を見出している。天然および合成の両方の多くの種類の界面活性剤の特性を分類およびランク分けする最も一般的な方式は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基の性質（「頭部」としても既知である）は、製剤で使用する異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８８，  ｐ．  ２８５）。
【０１４０】
該界面活性剤分子がイオン化されていない場合、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品に広範な適用を見出し、広範なｐＨ値にわたって使用可能である。概して、これらのＨＬＢ値は、その構造に依存して、２から約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステル等の非イオン性エステルが含まれる。また、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマー等の、非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、この種類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤が、非イオン性界面活性剤の種類の最も一般的なメンバーである。
【０１４１】
該界面活性剤分子を水に溶解または分散する際に、それが負電荷を保持する場合、この界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド等のカルボキシレート、アルキル硫酸およびエトキシル化アルキルサルフェート等の硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート、およびスルホサクシネート等のスルホン酸、およびリン酸が含まれる。アニオン性界面活性剤の種類の最も重要なメンバーは、アルキルサルフェートおよび石鹸である。
【０１４２】
該界面活性剤分子を水に溶解または分散する際に、それが正電荷を保持する場合、この界面活性剤は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、第４級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第４級アンモニウム塩が、この種類で最も使用されるメンバーである。
【０１４３】
該界面活性剤分子が、正電荷または負電荷のいずれかを保持する能力を有する場合、この界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびホスファチドが含まれる。
【０１４４】
薬物品、製剤における、およびエマルションにおける界面活性剤の使用について概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８８，  ｐ．  ２８５）。
【０１４５】
浸透促進剤
いくつかの実施形態では、ＦＬｉＰは、浸透促進剤を用いて、動物の皮膚に、核酸、特にｄｓＲＮＡの効率的な送達を行う。大部分の薬物は、イオン化形態および非イオン化形態の両方で存在する。しかしながら、通常、脂質可溶性または脂溶性薬物のみが容易に細胞膜を通過する。通過される膜が浸透促進剤で処理される場合、非脂溶性薬物でも、細胞膜を通過することができることが発見された。細胞膜を通過する非脂溶性薬物の拡散を支援することに加え、浸透促進剤は、脂溶性薬剤の透過性も強化する。
【０１４６】
担体
ＦＬｉＰの一定の組成物は、製剤中に担体化合物も含む。本明細書において使用する「担体化合物」または「担体」は、核酸またはその類似体を指し、これは、不活性（すなわち、それ自体が生物活性を持たない）であるが、例えば、生物的に活性な核酸を分解すること、または血液循環から生物学的に活性な核酸の除去を促進することによって、生物活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを低減させるインビボプロセスにより、核酸として認識される。核酸と担体化合物との同時投与であって、典型的には、後者の物質を過剰に含む同時投与によって、恐らく、共通の受容体に対する担体化合物と核酸との間の競合に起因して、肝臓、腎臓、または他の外部循環の貯蔵部において回収される核酸の量が実質的に減少し得る。例えば、肝臓組織における部分的なホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸、または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与される場合に減少され得る（Ｍｉｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．，  １９９５，  ５，  １１５−１２１；  Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤｓＲＮＡ  ＆  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，  １９９６，  ６，  １７７−１８３）。
【０１４７】
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、医薬的に許容可能な溶媒、懸濁剤、または動物に１つもしくは複数の核酸を送達するための任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。該賦形剤は、液体でも固体でもよく、核酸および所定の医薬組成物の他の成分と組み合わせる場合、所望のバルク、稠度等を提供するように考慮して計画された投与様式によって選択される。典型的な医薬担体には、結合剤（例えば、予備糊化トウモロコシでんぷん、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸塩、またはリン酸水素カルシウム等）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状２酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、でんぷん、でんぷんグリコール酸ナトリウム等）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が含まれるが、これらに限定されない。
また、核酸と有害に反応しない、非経口外投与に適切な医薬的に許容可能な有機賦形剤または無機賦形剤も、組成物を製剤化するために使用可能である。適適切な医薬的に許容可能な担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、およびその同等物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
核酸の局所的投与のための製剤には、滅菌水溶液および非滅菌水溶液、アルコール等の一般的な溶媒中の非水溶液、または液体油ベースもしくは固体油ベース中の核酸溶液が含まれ得るが、これらに限定されない。また、これらの溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加剤を含有し得る。核酸と有害な反応をしない、非経口外投与に適切な医薬的に許容可能な有機賦形剤または無機賦形剤を使用することができる。
【０１４９】
適切な医薬的に許容可能な賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、およびその同等物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５０】
他の成分
ＦＬｉＰ組成物は、医薬組成物中に慣習的に見出される他の補助的な成分を、当技術分野で確立された使用レベルで付加的に含有してもよい。したがって、例えば、該組成物は、かゆみ止め薬、収れん薬、局部麻酔剤、または抗炎症剤等の、追加の適合する医薬的に活性な物質を含有し得るか、あるいは色素、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤等の、ＦＬｉＰ組成物の種々の投薬形態の物理的な製剤に有用な追加の物質を含有し得る。しかしながら、このような物質は、添加時に、該組成物の成分の生物活性を過度に干渉するべきではない。該製剤は、滅菌することが可能であり、所望に応じて、該製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色料、香味料、および／または芳香物質、およびその同等物と混合されることが可能である。
【０１５１】
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む懸濁液の粘性を増加させる物質を含有し得る。また、該懸濁液は、安定剤を含み得る
【０１５２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）１つもしくは複数のオリゴヌクレオチド化合物と、（ｂ）非アンチセンス機構によって機能する１つもしくは複数の他の化学療法剤とを含有する。このような化学療法剤の例として、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソウレア、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプレゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロへキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タクソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。概して、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １５ｔｈ  Ｅｄ．  １９８７，  ｐｐ．  １２０６−１２２８，  Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｒａｈｗａｙ，  Ｎ．Ｊを参照されたい。本明細書で特徴とされる化合物とともに使用する場合、このような化学療法剤は、個々に（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）か、連続して（例えば、一定時間の５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド、引き続いてＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）か、あるいは１つもしくは複数の他のこのような化学療法剤と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸ、およびオリゴヌクレオチド、または５−ＦＵ、放射線療法、およびオリゴヌクレオチド）使用され得る。また、非ステロイド抗炎症薬物およびコルチコステロイドを含むがこれらに限定されない抗炎症薬物、ならびにリビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルを含むがこれらに限定されない抗ウイルス薬物も、本明細書で特徴とされる組成物と組み合わされ得る。概して、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９８７，  Ｒａｈｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．，  ｐａｇｅｓ  ２４９９−２５０６および４６−４９をそれぞれ参照されたい。また、他の非アンチセンス化学療法剤も、特徴とされる本発明の範囲内にある。２つ以上の組み合わせた化合物は、まとめて、または連続して使用され得る。
【０１５３】
このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な医薬的手順によって決定可能である。毒性効果と治療効果との用量比は、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０と表すことが可能である。高い治療指数を呈する化合物が一般的である。
【０１５４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用するための広範な投与量の製剤化において使用可能である。適切な投与量は、概して、毒性をほとんどまたは全く含まないＥＤ５０を含む広範な血中濃度内にある。該投与量は、用いる投薬形態および利用する投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。本明細書で特徴とされる化合物では、該治療的に有効な投与は、初めに細胞培養アッセイから推定することができる。投与量は、化合物の、または適切な場合、細胞培養において決定されるように、ＩＣ５０（すなわち、症状の半最大抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む標的配列（例えば、ポリペプチドの濃度減少を達成する）のポリペプチド生成物の血中血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて製剤化され得る。このような情報を使用して、ヒトに有用な投与量をより正確に決定することが可能である。血漿レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１５５】
上述のように個々にまたはまとめて投与することに加え、本明細書で特徴とされるｄｓＲＮＡは、標的遺伝子発現が媒介する病理過程の治療に有効な他の既知の薬剤と組み合わせて投与可能である。いずれの場合も、投与する医師は、当技術分野において既知である有効性または本明細書に説明する有効性の標準的な測定を使用して観測された結果に基づいて、オリゴヌクレオチドの投与の量およびタイミングを調整することが可能である。
【０１５６】
Ｖ．製剤ＦＬｉＰ組成物を使用して、標的遺伝子の発現により引き起こされる病気を治療するための方法
本発明は、具体的には、（ａ）１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つであって、脂溶性物質に抱合されている該オリゴヌクレオチドと、（ｂ）該抱合されたオリゴヌクレオチドが、心臓、肺、または筋肉の病気または疾患または病状の治療のために凝集、混合、または会合するエマルションまたはリポソームのうちの少なくとも１つとを有するＦＬｉＰ組成物に関する。
【０１５７】
本発明は、さらに、例えば、他の医薬品および／または他の治療方法と組み合わせて、例えば、癌の治療および／または腫瘍転移の予防に現在用いられているもの等の、例えば、既知の医薬品および／または既知の治療方法と組み合わせて、例えば、癌を治療するため、または腫瘍転移、例えば、紋筋肉腫等の軟組織肉腫を予防するための、ＦＬｉＰまたはその医薬組成物の使用に関する。放射線治療と、およびシスプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェン等の化学療法剤との組み合わせが好ましい。
【０１５８】
また、本発明は、任意の従来の化学療法剤等の別の抗癌化学療法剤と組み合わせて、特定のオリゴヌクレオチドとともに含めることによって実用化可能である。このような他の薬剤との特定の結合剤の組み合わせは、化学療法プロトコルを増強することができる。当技術分野において既知である化学療法プロコルは、本明細書で特徴とされる方法とともに使用するのに適切である。アルキル化剤、代謝拮抗物質、ホルモンおよび拮抗薬、放射性物質、ならびに天然物を含む任意の化学療法剤を使用することができる。例えば、本明細書で特徴とされる化合物は、ドキソルビシンおよび他のアントラサイクリン類似体等の抗生物質、シクロホスファミド等のナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシル等のピリミジン類似体、シスプラチン、ヒドロキシウレア、タクソール、ならびにその天然および合成誘導体、およびその同等物とともに投与可能である。別の例として、乳腺腺癌等の混合腫瘍であって、該腫瘍がゴナドトロピン依存性細胞およびゴナドトロピン非依存性細胞を含む場合、該化合物は、ロイプロリドまたはゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチド類似体）と併用して投与可能である。他の抗腫瘍プロトコルは、本明細書において「補助的な抗腫瘍様式」とも呼ばれる別の治療様式、例えば、手術、放射線治療等によるテトラサイクリン化合物の使用を含む。したがって、本明細書で特徴とされる方法は、副作用を低減し、かつ有効性を強化する便益を有するこのような従来のレジメンとともに用いることが可能である。
【０１５９】
また、ＦＬｉＰを含有する組成物は、間質性肺疾患（ＩＬＤ）（肺線維症）等の肺の病気および疾患を標的にするのに有用である。また、心筋ミオパチーおよび心臓病等の心臓に影響を及ぼす病気および疾患も、ＦＬｉＰ組成物によって治療可能である。ＦＬｉＰを含んで製剤化された組成物による治療に適切な他の筋肉の病気および疾患には、例えば、筋ジストロフィー、捻挫、および筋違い、ならびに他のミオパシーが含まれる。
【０１６０】
ＶＩ．ＦＬｉＰ製剤オリゴヌクレオチドを使用して、標的遺伝子の発現を抑制するための方法
本発明は、標的遺伝子の発現がサイレンスされるようにＦＬｉＰ組成物を哺乳類に投与することによって、哺乳類の標的遺伝子の発現を抑制するための方法を提供する。
【０１６１】
一実施形態では、標的遺伝子発現を抑制するための方法は、標的遺伝子のＲＮＡ転写の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含有する組成物、および治療される哺乳類の遺伝子のＲＮＡ転写の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する組成物を投与することを含む。治療される生体がヒト等の哺乳類である場合、該組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経鼻、直腸、および局所的（口腔および舌下を含む）投与を含む経口経路または非経口経路を含むが、これらに限定されない当技術分野において既知である任意の手段によって投与され得る。いくつかの実施形態では、該組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。
【０１６２】
他に規定されない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する該当技術分野の当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に説明するものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することが可能であるが、適切な方法および材料について後述する。本明細に述べた全ての出版物、特許出願、特許、および他の文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。加えて、当該材料、方法、および実施例は、単に例証的であり、限定することを意図すものではない。
【実施例１】
【０１６３】
実施例１．オリゴヌクレオチドの合成
試薬の供給源
本明細書に試薬源が具体的に提示されない場合、このような試薬は、分子生物学での適用に標準的な品質／純度において分子生物学用の試薬の任意の供給業者から入手してもよい。
【０１６４】
ｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の合成
Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｐｐｌｅｒａ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）と、固相担体として制御多孔性ガラス（ＣＰＧ，  ５００Å，  Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，  Ｈａｍｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）とを使用して、１μモルの尺度で固相合成により１本鎖ＲＮＡを生成した。それぞれ対応するホスホルアミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトを用いて（Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，  Ｈａｍｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、固相合成によりＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するＲＮＡを生成した。Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｅａｕｃａｇｅ，  Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｒｓ．），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ＵＳＡに説明されているような標準ヌクレオチドホスホルアミダイト化学を使用して、これらの構成単位をオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に組み込んだ。ヨウ素酸化溶液をアセトニトリル（１％）中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ  Ｌｔｄ，  Ｇｌａｓｇｏｗ，  ＵＫ）に置き換えることにより、ホスホロチオエート結合を導入した。さらなる補助試薬をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【０１６５】
所定の手順に従って、アニオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製を行った。分光光度計（ＤＵ  ６４０Ｂ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧｍｂＨ，  Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉβｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２６０ｎｍの波長にてそれぞれのＲＮＡ溶液のＵＶ吸収により、収量および濃度を決定した。アニーリング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）中、相補鎖の等モル溶液を混合して２本鎖ＲＮＡを生成し、８５〜９０℃で３分、水槽中で加熱し、３〜４時間にわたり室温まで冷却した。使用するまで該精製ＲＮＡ溶液を−２０℃で保存した。
【０１６６】
３’−コレステロール抱合ｓｉＲＮＡ（本明細書において−Ｃｈｏｌ−３’と呼ばれる）の合成では、適切に修飾された固相担体をＲＮＡ合成のために使用した。該修飾固相担体を次のように調製した。
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレートＡＡ
【化５】
2011517676.tif 000008
【０１６７】
水（５０ｍＬ）中のエチルグリシナート塩酸（３２．１９ｇ、０．２３モル）の撹拌氷冷溶液に、水酸化ナトリウムの４．７Ｍ溶液（５０ｍＬ）を添加した。次いで、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、ＴＬＣにより反応の完了を確認するまで、この混合物を室温で撹拌した。１９時間後、この溶液をジクロロメタン（３ｘ１００ｍＬ）で分離した。無水硫酸ナトリウムで有機層を乾燥し、ろ過し、蒸発させた。残留物を蒸留し、ＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得た。
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル  ＡＢ
【化６】
2011517676.tif 000009
ＡＢ
【０１６８】
Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷した。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を０℃で該溶液に添加した。その後、ジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。該溶液を室温にし、さらに６時間撹拌した。ＴＬＣにより反応の完了を確認した。該反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加してジイソプロピル尿素を沈殿させた。該懸濁液をろ過した。ろ過物を５％塩酸水溶液、５％重炭酸ナトリウム、および水で洗浄した。硫酸ナトリウム上で合わせた有機層を乾燥して濃縮し、粗生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）により精製し、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを生成した。
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステル  ＡＣ
【化７】
2011517676.tif 000010
ＡＣ
【０１６９】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を、０℃でジメチルホルムアミド中、２０％ピペリジンに溶解した。この溶液を１時間、撹拌し続けた。該反応混合物を真空下で濃縮し、残留物に水を添加し、酢酸エチルで生成物を抽出した。塩酸塩に変換することにより該粗生成物を精製した。
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステル  ＡＤ
【化８】
2011517676.tif 000011
ＡＤ
【０１７０】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣの塩酸塩（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに取り込んだ。懸濁液を氷上で０℃まで冷却した。該懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ，５．２ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液にコレステリルクロロホルマート（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加した。該反応混合物を一晩撹拌した。該反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィーにより該生成物を精製した（１０．３ｇ、９２％）。
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステル  ＡＥ
【化９】
2011517676.tif 000012
ＡＥ
【０１７１】
カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの乾燥トルエンの中にスラリー化した。この混合液を、氷上で０℃まで冷却し、５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステルＡＤをゆっくり、撹拌しながら、２０分以内に添加した。添加中、温度は５℃より低く維持した。撹拌を０℃で３０分間続けてから１ｍＬの氷酢酸を添加し、その後すぐ４０ｍｌの水に溶解した４ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを添加した。得られた混合液をそれぞれ１００ｍＬのジクロロメタンを用いて２回抽出し、１つにまとめた有機抽出物をそれぞれ１０ｍＬのリン酸緩衝液を用いて２回洗浄、乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。残留物を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却してから３回に分けて、ｐＨ９．５の冷した５０ｍＬの炭酸緩衝液を用いて抽出した。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に調製し、５回に分けて４０ｍＬのクロロホルムで抽出し、一つにまとめてから乾燥、蒸発させて乾燥させた。残留物を２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用したカラムクロマトグラフィーにより精製し、１．９のｂ−ケトエステルを得た（３９％）。
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル  ＡＦ
【化１０】
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ＡＦ
【０１７２】
メタノール（２ｍＬ）を１時間かけて、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）および水素ホウ化ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）の還流中の混合液に滴下して添加した。還流温度で１時間撹拌を続けた。室温まで冷却した後、１ＮのＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、該混合液を酢酸エチル（３ｘ４０ｍＬ）で抽出した。一つにまとめた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮して生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製した（８９％）。
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル  ＡＧ
【化１１】
2011517676.tif 000014
ＡＧ
【０１７３】
ジオールＡＦ（１．２５ｇｍ、１．９９４ｍｍｏｌ）をピリジン（２ｘ５ｍＬ）とともに真空で蒸発させることによって乾燥した。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。該反応は室温で一晩行った。該反応はメタノールを添加して止めた。反応混合液を真空下で濃縮し、残留物にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加した。有機層を１Ｍの重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリムで乾燥し、ろ過して濃縮した。該残留ピリジンは、トルエンとともに蒸発させて除去した。粗生成物はクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、Ｒｆ＝５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中で０．５）（１．７５ｇ、９５％）で精製した。
スクシン酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステル  ＡＨ
【化１２】
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ＡＨ
【０１７４】
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、真空において、４０℃で一晩乾燥した。この混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を添加し、該溶液を室温、アルゴン雰囲気下で１６時間撹拌した。次いで、該溶液をジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷したクエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）および水（２Ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリムで乾燥し、濃縮して乾燥した。残留物をそのまま次の段階に使用した。
コレステロール誘導化ＣＰＧ  ＡＩ
【化１３】
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ＡＩ
【０１７５】
コハク酸ＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル（３：２，３ｍＬ）の混合液に溶解した。この溶液にＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．２５ｍＬ）溶液、２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）を連続して添加した。得られた溶液に、トリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（０．６ｍｌ）溶液を添加した。反応混合液は明るいオレンジ色に変わった。該溶液をリストアクション撹拌機を用いて短時間（５分間）撹拌した。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍｍ／ｇ）を添加した。該懸濁液を２時間撹拌した。該ＣＰＧを焼結漏斗を通してろ過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、およびエーテルを用いて連続的に洗浄した。未反応のアミノ基を、酸性の無水／ピリジンを用いてマスクした。該ＣＰＧの達成負荷を、ＵＶ測定を行って測定した（３７ｍＭ／ｇ）。
【０１７６】
５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書において「５’−Ｃ３２−」と呼ばれる）または５’−コレステリル誘導基（本明細書において、「５’−Ｃｈｏｌ−」と呼ばれる）を有するｓｉＲＮＡの合成を、国際公開第ＷＯ２００４／０６５６０１で説明されるように行ったが、コレステリル誘導体について、酸化工程を、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を用いて行うことにより核酸オリゴマーの５’末端にホスホロチオエート結合を導入したことを除く。
【０１７７】
核酸配列を、標準的な命名法を使用して、具体的には、表１の略語を使用して表す。
表１：核酸配列表現に使用されるヌクレオチド単量体の略語。これらの単量体が、オリゴヌクレオチドに存在する場合、５’−３’−ホスホジエステル結合によって相互に結合されることが理解される。
【表２】
2011517676.tif 000017
【実施例２】
【０１７８】
実施例２．コレステロール抱合ＲＮＡとのＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の複合体の形成
Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）（シグマ２０％）濃度は、２００ｍｇ／ｍｌ（約５７０μＭ）である。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）を１３３μＭに希釈し、室温で３０分間、Ｃｈｏｌ抱合ＲＮＡ（Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ）（定量化のために少量の３２Ｐ標識Ｃｈｏｌ−ＲＮＡを加えた４ｍｇ／ｍｌ、２６６μＭ）と１：２でインキュベートする。ＦＰＬＣ泳動緩衝剤（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）とともに２つのＳｕｐｒｏｓｅ６カラム（流出入体積：０．５ｍｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＨＲ１０／３０コード＃１７−０５３７−０１）を使用して、非結合Ｃｈｏｌ−ＲＮＡをゲルろ過により分離する。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）／ｃｈｏｌ−ＲＮＡ分画（３０ｎｍから５０ｎｍの粒子）を収集し、Ｃｈｏｌ−ＲＮＡ含有物をシンチレーション計測により定量化する。
【実施例３】
【０１７９】
実施例３．ＦＰＬＣによるＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）ピーク＃１を有するコレステロール抱合ＲＮＡの分画
Ｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１−ｓｉＲＮＡ、つまり、化学的に修飾された脂溶性物質抱合ｓｉＲＮＡ−ａｐｏＢ１を、対応するセンス鎖：５’−ＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵｓＨｙｐ−Ｌ−３’（配列番号：１）から構成し、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３２，  １７３−８に説明するように、アンチセンス鎖：５’−ＡＵＵＧＧＵＡＵＵＣＡＧＵＧＵＧＡＵＧＡＣｓＡｓＣ−３’（配列番号：２）を得た。該コレステロール抱合センス鎖を、ヒドロキシプロリノール脂溶性固体担体から合成した。６−アミノヘキサン酸結合を介して、コレステロールをトランス−４−ヒドロキシプロリノールにテザーして、ヒドロキシプロリノール脂溶性部分（Ｈｙｐ）を得て、その後、これを官能化制御多孔性ガラスに結合させて、固体担体を得た。文字の「Ｌ」は、脂溶性を表し、小文字は、２’−Ｏ−メチル糖修飾を表し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を表す。
【０１８０】
５’−ｃｓｇｓｃｃａａｕａｕｕｕａｃｇｕｇｃｕｇｓｃｓｕｓａｓ−Ｃｈｏｌ−３’（配列番号：３）で特定される修飾を含む２２ｎｔの長さから成る１本鎖オリゴヌクレオチドであるａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６。
【０１８１】
５’−ａｓｕｓｕｕｇｇｕｕｃｃａｕｕｕｕａｃｃｓａｓｇｓｃｓ−Ｃｈｏｌ−３’（配列番号：４）で特定される修飾を含む２１ｎｔの長さから成る１本鎖オリゴヌクレオチドであるａｎｔａｇｏｍｉｒ−１３３ａ。小文字は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを表し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を表す。
【０１８２】
Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）は、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ，  Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎにより製造された（１００ｍＬのＩｎｔａｒｌｉｐｉｄ（登録商標）２０％は、２０ｇの大豆油、１．２ｇのリン脂質、および２．２５ｇのグリセロール（ＵＳＰ）を含む）。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）のＦＰＬＣ分析により、エマルションは、異なるサイズの種々の安定脂質粒子を含有することが示された。コレステロール抱合ＲＮＡ（Ｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１−ｓｉＲＮＡおよびａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６）は、分画４０から５０の間で溶出するＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）ピーク＃１と結合した。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１は、本明細書で特徴とされるリポソームに対応する。図１のＲＮＡを３２Ｐで標識し、２３０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって脂質分画を調べた（図７も参照）。
【実施例４】
【０１８３】
実施例４．Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）／ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡの取り込みは、筋肉、心臓、および肺において強化される。
Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）／ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６およびＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）／ｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１−ｓｉＲＮＡの血漿クリアランスを、尾注射の後で調査した。ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１６の血液ｔ１／２を、約２０分であると決定し、ｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１−ｓｉＲＮＡの血液ｔ１／２を約４０分であると決定した（図２）。当該実験により、全身注射の後に、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）／ＲＮＡ複合体の血液からの迅速な除去が示された。
【０１８４】
「Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）１」により媒介された３２Ｐ標識ｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１−ｓｉＲＮＡの組織内取り込みを、全身注射の４時間後にマウスにおいて測定した。取り込みを、１ｍｇタンパク質あたりの取り込みに標準化した。実験により、筋肉、心臓、および肺において、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）／ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡの選択的（強化型）取り込みが示された（図３）。
【０１８５】
１０ｍｇ／体重ｋｇにおけるｃｈｏｌ−ａｐｏＢ１−ｓｉＲＮＡの単回注射により注射されたマウスの心臓のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ発現レベルを、注射２４時間後にリアルタイムＰＣＲで測定した。対照実験に比べてＡｐｏＢ  ｍＲＮＡが５倍減少したことが分かった（図４）。
【実施例５】
【０１８６】
実施例５．ａｎｔａｇｏｍｉｒ−１３３ａ／Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１の注射により、マウスにおいて、心臓および大腿四頭筋のｍｉＲ−１３３ａの発現が抑制される。
マウスにおけるＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）／ｍｉＲＮＡの注射
５０ｍｇ／体重ｋｇにおけるａｎｔａｇｏｍｉｒ−１３３ａ／Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１を単回注射によりマウスに注射した。心臓および大腿四頭筋におけるマイクロＲＮＡ−１３３ａ（ｍｉＲ−１３３ａ）のレベルを、注射の２４時間後にノーザンブロット法により測定した。治療毎に複製物を測定した。当該実験により、心臓および大腿四頭筋におけるｍｉＲ−１３３ａのインビボサイレンシングが明らかになった（図５）。
【実施例６】
【０１８７】
実施例６．ａｎｔａｇｏｍｉｒ−２０６／Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１の注射により、マウスにおいて、大腿四頭筋におけるｍｉＲ−２０６の発現が抑制される。
ＰＢＳ（対照）、ａｎｔａｇｏｍｉｒ−２０６、またはＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１で複合体化されたａｎｔａｇｏｍｉｒ−２０６を、それぞれ３ｘ８０ｍｇ／体重ｋｇ（ｂｗ）または３ｘ５０ｍｇ／ｋｇの投与量で、重複してマウスに注射した。マウスは、４日目（最終注射の２４時間後）に殺処分し、全てのＲＮＡを大腿四頭筋から単離し、ｍｉＲ−２０６レベルをノーザンブロット法により分析した。ｔＲＮＡは、負荷対照として示される。
【０１８８】
使用したａｎｔａｇｏｍｉｒ−２０６は、５’−ｃｓｃｓａｃａｃａｃｕｕｃｃｕｕａｃａｕｕｓｃｓｃｓａｓ−Ｃｈｏｌ−３’（配列番号：５）で特定される修飾を含む２２ｎｔの長さから成るものであった。小文字は、２’−Ｏ−メチル糖修飾ヌクレオチドを表し、下付き文字「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を表す。
当該実験により、大腿四頭筋におけるａｎｔａｇｏｍｉｒ−２０６／Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１の注射の後にｍｉＲ−２０６の完全なインビボサイレンシングが示される（図６）。
【実施例７】
【０１８９】
実施例７．ＨＰＬＣによるＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）１分画。
Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）をＨＰＬＣにより分画した。タンパク質を、標示される分画から抽出し、１２％のポリアクリルアミドゲルで分離した。タンパク質を銀染色により可視化した。１０ｋＤから２０ｋＤの分子量（ＭＷ）の２つのタンパク質バンドを、分画３８〜５０（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）＃１を含有する分画に対応する）において検出した（図７）（図１も参照）。
【０１９０】
他の実施形態は、請求項に記載される。
【図１】
2011517676.tif 000018
【図２】
2011517676.tif 000019
【図３】
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【図４】
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【図５】
2011517676.tif 000022
【図６】
2011517676.tif 000023
【図７】
2011517676.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月2日(2010.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011517676000001.app
【国際調査報告】
2011517676.tif 000025
2011517676.tif 000026
2011517676.tif 000027
2011517676.tif 000028
2011517676.tif 000029
2011517676.tif 000030
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