(57)【要約】本発明は一般的に、標識されたおよび標識されていない切断可能な終結基ならびにDNA配列決定および他のタイプのDNA分析のための方法に関する。より詳細には、本発明は、一つには、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、酵素的に切断可能な基、または光切断不能な基を有するヌクレオチドおよびヌクレオシド、ならびにDNA配列決定におけるその使用および生物医学研究におけるその適用の方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式の化合物、またはそれらの塩、エステル、水和物、溶媒和物、互変異性体、プロドラッグもしくは光学異性体:
2011529449.tif 000214
式中
Zは-O-、-S-、-NH-、-OC(O)O-、-NHC(O)O-、-OC(O)NH-または-NHC(O)NH-であり;
R1はヒドロキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェートまたはポリホスフェートであり;
R2は水素またはヒドロキシであり;
R3およびR4はそれぞれ独立して以下であり:
水素、ヒドロキシ、ハロもしくはアミノ;または
アルキル(C≦12)、アルケニル(C≦12)、アルキニル(C≦12)、アリール(C≦12)、アラルキル(C≦12)、ヘテロアリール(C≦12)、ヘテロアラルキル(C≦12)、アルコキシ(C≦12)、アリールオキシ(C≦12)、アラルコキシ(C≦12)、ヘテロアリールオキシ(C≦12)、ヘテロアラルコキシ(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、アリールアミノ(C≦12)、アラルキルアミノ(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型;あるいは
R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立して以下である:
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノもしくはメルカプト;
アルキル(C≦12)、アルケニル(C≦12)、アルキニル(C≦12)、アリール(C≦12)、アラルキル(C≦12)、ヘテロアリール(C≦12)、ヘテロアラルキル(C≦12)、アシル(C≦12)、アルコキシ(C≦12)、アルケニルオキシ(C≦12)、アルキニルオキシ(C≦12)、アリールオキシ(C≦12)、アラルコキシ(C≦12)、ヘテロアリールオキシ(C≦12)、ヘテロアラルコキシ(C≦12)、アシルオキシ(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、アルコキシアミノ(C≦12)、アルケニルアミノ(C≦12)、アルキニルアミノ(C≦12)、アリールアミノ(C≦12)、アラルキルアミノ(C≦12)、ヘテロアリールアミノ(C≦12)、ヘテロアラルキルアミノ(C≦12)、アルキルスルホニルアミノ(C≦12)、アミド(C≦12)、アルキルチオ(C≦12)、アルケニルチオ(C≦12)、アルキニルチオ(C≦12)、アリールチオ(C≦12)、アラルキルチオ(C≦12)、ヘテロアリールチオ(C≦12)、ヘテロアラルキルチオ(C≦12)、アシルチオ(C≦12)、チオアシル(C≦12)、アルキルスルホニル(C≦12)、アリールスルホニル(C≦12)、アルキルアンモニウム(C≦12)、アルキルスルホニウム(C≦12)、アルキルシリル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型;
下記式の基:
2011529449.tif 000215
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である;あるいは
-リンカー-レポーター。
【請求項２】
式Aの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
式Bの化合物としてさらに定義される、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
Zが-O-である、請求項1〜3のいずれか一項記載の化合物。
【請求項５】
R1がヒドロキシである、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６】
R1がモノホスフェートである、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７】
R1がジホスフェートである、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８】
R1がトリホスフェートである、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９】
R1がポリホスフェートである、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１０】
R2が水素である、請求項1〜9のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１】
R2がヒドロキシである、請求項1〜9のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２】
R3が水素である、請求項1〜11のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１３】
R3がアルキル(C≦12)またはその置換型である、請求項1〜11のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１４】
R3がアルキル(C≦8)である、請求項13記載の化合物。
【請求項１５】
R3がアルキル(C≦6)である、請求項14記載の化合物。
【請求項１６】
R3が、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルおよびtert-ブチルからなる群より選択される、請求項15記載の化合物。
【請求項１７】
R3がメチルである、請求項16記載の化合物。
【請求項１８】
R3がアルキル(C2-6)である、請求項15記載の化合物。
【請求項１９】
R3がアルキル(C3-5)である、請求項18記載の化合物。
【請求項２０】
R3がイソプロピルである、請求項19記載の化合物。
【請求項２１】
R3がtert-ブチルである、請求項19記載の化合物。
【請求項２２】
R4が水素である、請求項1〜21のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２３】
R4がアルキル(C≦12)またはその置換型である、請求項1〜21のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２４】
R4がアルキル(C≦8)である、請求項23記載の化合物。
【請求項２５】
R4がアルキル(C≦6)である、請求項24記載の化合物。
【請求項２６】
R4が、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルおよびtert-ブチルからなる群より選択される、請求項25記載の化合物。
【請求項２７】
R4がメチルである、請求項26記載の化合物。
【請求項２８】
R4がアルキル(C2-6)である、請求項25記載の化合物。
【請求項２９】
R4がアルキル(C3-5)である、請求項28記載の化合物。
【請求項３０】
R4がイソプロピルである、請求項29記載の化合物。
【請求項３１】
R4がtert-ブチルである、請求項29記載の化合物。
【請求項３２】
R5が水素である、請求項1〜31のいずれか一項記載の化合物。
【請求項３３】
R5がシアノである、請求項1〜31のいずれか一項記載の化合物。
【請求項３４】
R5がアルコキシ(C≦12)またはその置換型である、請求項1〜31のいずれか一項記載の化合物。
【請求項３５】
R5がアルコキシ(C≦8)である、請求項34記載の化合物。
【請求項３６】
R5がアルコキシ(C≦6)である、請求項35記載の化合物。
【請求項３７】
R5がアルコキシ(C≦3)である、請求項36記載の化合物。
【請求項３８】
R5がメトキシである、請求項37記載の化合物。
【請求項３９】
R5が下記式の基である、請求項1〜31のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000216
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;かつ
nが0〜12の整数である。
【請求項４０】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項39記載の化合物。
【請求項４１】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項40記載の化合物。
【請求項４２】
Xが-C≡C-である、請求項41記載の化合物。
【請求項４３】
nがゼロである、請求項39〜42のいずれか一項記載の化合物。
【請求項４４】
R5が下記式の基である、請求項1〜31のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000217
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項４５】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項44記載の化合物。
【請求項４６】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項45記載の化合物。
【請求項４７】
Xが-C≡C-である、請求項46記載の化合物。
【請求項４８】
Yが-CH2-である、請求項44〜47のいずれか一項記載の化合物。 
【請求項４９】
nがゼロである、請求項44〜48のいずれか一項記載の化合物。
【請求項５０】
mがゼロである、請求項44〜49のいずれか一項記載の化合物。
【請求項５１】
R6が-リンカー-レポーターである、請求項1〜32のいずれか一項記載の化合物。
【請求項５２】
リンカーが以下である、請求項51記載の化合物:
2011529449.tif 000218
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;かつ
nが0〜12の整数である。
【請求項５３】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項52記載の化合物。
【請求項５４】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項53記載の化合物。
【請求項５５】
Xが-C≡C-である、請求項54記載の化合物。
【請求項５６】
nがゼロである、請求項52〜55のいずれか一項記載の化合物。
【請求項５７】
リンカーが以下である、請求項51記載の化合物:
2011529449.tif 000219
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項５８】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項57記載の化合物。
【請求項５９】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項58記載の化合物。
【請求項６０】
Xが-C≡C-である、請求項59記載の化合物。
【請求項６１】
Yが-CH2-である、請求項57〜60のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６２】
nがゼロである、請求項57〜61のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６３】
mがゼロである、請求項57〜62のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６４】
リンカーが以下である、請求項51記載の化合物:
2011529449.tif 000220
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項６５】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項64記載の化合物。
【請求項６６】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項65記載の化合物。
【請求項６７】
Xが-C≡C-である、請求項66記載の化合物。
【請求項６８】
Yが-CH2-である、請求項64〜67のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６９】
nがゼロである、請求項64〜68のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７０】
mがゼロである、請求項64〜69のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７１】
レポーターは色素に基づき、色素がザンテン(zanthene)、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、ALEXA FLUOR (登録商標) 350、ALEXA FLUOR (登録商標) 405、ALEXA FLUOR (登録商標) 430、ALEXA FLUOR (登録商標) 488、ALEXA FLUOR (登録商標) 514、ALEXA FLUOR (登録商標) 532、ALEXA FLUOR (登録商標) 546、ALEXA FLUOR (登録商標) 555、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 594、ALEXA FLUOR (登録商標) 610、ALEXA FLUOR (登録商標) 633、ALEXA FLUOR (登録商標) 647、ALEXA FLUOR (登録商標) 660、ALEXA FLUOR (登録商標) 680、ALEXA FLUOR (登録商標) 700、ALEXA FLUOR (登録商標) 750、またはスクアライン色素である、請求項51〜70のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７２】
レポーターが以下である、請求項51〜70のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000221
。
【請求項７３】
R6が水素である、請求項1〜72のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７４】
R6がアルコキシ(C≦12)またはその置換型である、請求項1〜72のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７５】
R6がアルコキシ(C≦8)である、請求項74記載の化合物。
【請求項７６】
R6がアルコキシ(C≦6)である、請求項75記載の化合物。
【請求項７７】
R6がアルコキシ(C≦3)である、請求項76記載の化合物。
【請求項７８】
R6がメトキシである、請求項77記載の化合物。
【請求項７９】
R6が下記式の基である、請求項1〜72のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000222
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;かつ
nが0〜12の整数である。
【請求項８０】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項79記載の化合物。
【請求項８１】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項80記載の化合物。
【請求項８２】
Xが-C≡C-である、請求項81記載の化合物。
【請求項８３】
nがゼロである、請求項79〜82のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８４】
R6が下記式の基である、請求項1〜72のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000223
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項８５】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項84記載の化合物。
【請求項８６】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項85記載の化合物。
【請求項８７】
Xが-C≡C-である、請求項86記載の化合物。
【請求項８８】
Yが-CH2-である、請求項84〜87のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８９】
nがゼロである、請求項84〜88のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９０】
mがゼロである、請求項84〜89のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９１】
R6が-リンカー-レポーターである、請求項1〜72のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９２】
リンカーが以下である、請求項91記載の化合物:
2011529449.tif 000224
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;かつ
nが0〜12の整数である。
【請求項９３】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項92記載の化合物。
【請求項９４】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項93記載の化合物。
【請求項９５】
Xが-C≡C-である、請求項94記載の化合物。
【請求項９６】
nがゼロである、請求項92〜95のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９７】
リンカーが以下である、請求項91記載の化合物:
2011529449.tif 000225
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項９８】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項97記載の化合物。
【請求項９９】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項98記載の化合物。
【請求項１００】
Xが-C≡C-である、請求項99記載の化合物。
【請求項１０１】
Yが-CH2-である、請求項97〜100のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１０２】
nがゼロである、請求項97〜101のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１０３】
mがゼロである、請求項97〜102のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１０４】
リンカーが以下である、請求項91記載の化合物:
2011529449.tif 000226
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項１０５】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項104記載の化合物。
【請求項１０６】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項105記載の化合物。
【請求項１０７】
Xが-C≡C-である、請求項106記載の化合物。
【請求項１０８】
Yが-CH2-である、請求項104〜107のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１０９】
nがゼロである、請求項104〜108のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１０】
mがゼロである、請求項104〜109のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１１】
レポーターは色素に基づき、色素がザンテン、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、ALEXA FLUOR (登録商標) 350、ALEXA FLUOR (登録商標) 405、ALEXA FLUOR (登録商標) 430、ALEXA FLUOR (登録商標) 488、ALEXA FLUOR (登録商標) 514、ALEXA FLUOR (登録商標) 532、ALEXA FLUOR (登録商標) 546、ALEXA FLUOR (登録商標) 555、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 594、ALEXA FLUOR (登録商標) 610、ALEXA FLUOR (登録商標) 633、ALEXA FLUOR (登録商標) 647、ALEXA FLUOR (登録商標) 660、ALEXA FLUOR (登録商標) 680、ALEXA FLUOR (登録商標) 700、ALEXA FLUOR (登録商標) 750、またはスクアライン色素である、請求項91〜110のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１２】
レポーターが以下である、請求項91〜110のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000227
。
【請求項１１３】
R7が水素である、請求項1〜112のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１４】
R8が水素である、請求項1〜113のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１５】
R8がニトロである、請求項1〜113のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１６】
R8がアルキル(C≦12)またはその置換型である、請求項1〜113のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１７】
R8がアルキル(C≦8)である、請求項116記載の化合物。
【請求項１１８】
R8がアルキル(C≦6)である、請求項117記載の化合物。
【請求項１１９】
R8がアルキル(C≦3)である、請求項118記載の化合物。
【請求項１２０】
R8がメチルである、請求項119記載の化合物。
【請求項１２１】
R9が水素である、請求項1〜120のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２２】
R9がニトロである、請求項1〜120のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２３】
R9がアルキル(C≦12)またはその置換型である、請求項1〜120のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２４】
R9がアルキル(C≦8)である、請求項123記載の化合物。
【請求項１２５】
R9がアルキル(C≦6)である、請求項124記載の化合物。
【請求項１２６】
R9が、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルおよびtert-ブチルからなる群より選択される、請求項125記載の化合物。
【請求項１２７】
R9がメチルである、請求項126記載の化合物。
【請求項１２８】
R9がアルキル(C2-6)である、請求項125記載の化合物。
【請求項１２９】
R9がアルキル(C3-5)である、請求項128記載の化合物。
【請求項１３０】
R9がイソプロピルである、請求項129記載の化合物。
【請求項１３１】
R9がtert-ブチルである、請求項129記載の化合物。
【請求項１３２】
R9がアリール(C≦12)またはその置換型である、請求項1〜120のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１３３】
R9がアリール(C≦8)である、請求項132記載の化合物。
【請求項１３４】
R9がフェニルである、請求項133記載の化合物。
【請求項１３５】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項2記載の化合物:
2011529449.tif 000228
。
【請求項１３６】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項2記載の化合物:
2011529449.tif 000229
。
【請求項１３７】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項136記載の化合物:
2011529449.tif 000230
。
【請求項１３８】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項136記載の化合物:
2011529449.tif 000231
。
【請求項１３９】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項2記載の化合物:
2011529449.tif 000232
。
【請求項１４０】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項139記載の化合物:
2011529449.tif 000233
。
【請求項１４１】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項139記載の化合物:
2011529449.tif 000234
。
【請求項１４２】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項2記載の化合物:
2011529449.tif 000235
。
【請求項１４３】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項142記載の化合物:
2011529449.tif 000236
。
【請求項１４４】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項142記載の化合物:
2011529449.tif 000237
。
【請求項１４５】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項2記載の化合物:
2011529449.tif 000238
。
【請求項１４６】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項145記載の化合物:
2011529449.tif 000239
。
【請求項１４７】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項145記載の化合物:
2011529449.tif 000240
。
【請求項１４８】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項2記載の化合物:
2011529449.tif 000241
。
【請求項１４９】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項148記載の化合物:
2011529449.tif 000242
。
【請求項１５０】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項148記載の化合物:
2011529449.tif 000243
。
【請求項１５１】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項3記載の化合物:
2011529449.tif 000244
。
【請求項１５２】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項3記載の化合物:
2011529449.tif 000245
。
【請求項１５３】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項152記載の化合物:
2011529449.tif 000246
。
【請求項１５４】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項152記載の化合物:
2011529449.tif 000247
。
【請求項１５５】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項3記載の化合物:
2011529449.tif 000248
。
【請求項１５６】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項155記載の化合物:
2011529449.tif 000249
。
【請求項１５７】
以下またはその塩としてさらに定義され、かつその他の光学異性体を実質的に含まない、請求項155記載の化合物:
2011529449.tif 000250
。
【請求項１５８】
下記式の化合物またはそれらの塩、エステル、水和物、溶媒和物、互変異性体、プロドラッグもしくは光学異性体:
2011529449.tif 000251
式中
Zは-O-、-S-、-NH-、-OC(O)O-、-NHC(O)O-、-OC(O)NH-または-NHC(O)NH-であり;
R1はヒドロキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェートまたはポリホスフェートであり;
R2は水素またはヒドロキシであり;
R3およびR4はそれぞれ独立して以下であり:
水素、ヒドロキシ、ハロもしくはアミノ;または
アルキル(C≦12)、アルケニル(C≦12)、アルキニル(C≦12)、アリール(C≦12)、アラルキル(C≦12)、ヘテロアリール(C≦12)、ヘテロアラルキル(C≦12)、アルコキシ(C≦12)、アリールオキシ(C≦12)、アラルコキシ(C≦12)、ヘテロアリールオキシ(C≦12)、ヘテロアラルコキシ(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、アリールアミノ(C≦12)、アラルキルアミノ(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型;
R5、R6、R7およびR8はそれぞれ独立して以下であり:
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノもしくはメルカプト;または
アルキル(C≦12)、アルケニル(C≦12)、アルキニル(C≦12)、アリール(C≦12)、アラルキル(C≦12)、ヘテロアリール(C≦12)、ヘテロアラルキル(C≦12)、アシル(C≦12)、アルコキシ(C≦12)、アルケニルオキシ(C≦12)、アルキニルオキシ(C≦12)、アリールオキシ(C≦12)、アラルコキシ(C≦12)、ヘテロアリールオキシ(C≦12)、ヘテロアラルコキシ(C≦12)、アシルオキシ(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、アルコキシアミノ(C≦12)、アルケニルアミノ(C≦12)、アルキニルアミノ(C≦12)、アリールアミノ(C≦12)、アラルキルアミノ(C≦12)、ヘテロアリールアミノ(C≦12)、ヘテロアラルキルアミノ(C≦12)、アルキルスルホニルアミノ(C≦12)、アミド(C≦12)、アルキルチオ(C≦12)、アルケニルチオ(C≦12)、アルキニルチオ(C≦12)、アリールチオ(C≦12)、アラルキルチオ(C≦12)、ヘテロアリールチオ(C≦12)、ヘテロアラルキルチオ(C≦12)、アシルチオ(C≦12)、チオアシル(C≦12)、アルキルスルホニル(C≦12)、アリールスルホニル(C≦12)、アルキルアンモニウム(C≦12)、アルキルスルホニウム(C≦12)、アルキルシリル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型;または
下記式の基:
2011529449.tif 000252
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である;あるいは
-リンカー-レポーター;かつ
R9はアルキル(C≦12)、アリール(C≦12)またはこれらの基のいずれかの置換型である。
【請求項１５９】
式Cの化合物としてさらに定義される、請求項158記載の化合物。
【請求項１６０】
式Dの化合物としてさらに定義される、請求項158記載の化合物。
【請求項１６１】
Zが-O-である、請求項158〜160のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１６２】
R1がヒドロキシである、請求項158〜161のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１６３】
R1がモノホスフェートである、請求項158〜161のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１６４】
R1がジホスフェートである、請求項158〜161のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１６５】
R1がトリホスフェートである、請求項158〜161のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１６６】
R1がポリホスフェートである、請求項158〜161のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１６７】
R2が水素である、請求項158〜166のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１６８】
R2がヒドロキシである、請求項158〜166のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１６９】
R3が水素である、請求項158〜168のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１７０】
R3がアルキル(C≦12)またはその置換型である、請求項158〜168のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１７１】
R3がアルキル(C≦8)である、請求項170記載の化合物。
【請求項１７２】
R3がアルキル(C≦6)である、請求項171記載の化合物。
【請求項１７３】
R3が、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルおよびtert-ブチルからなる群より選択される、請求項172記載の化合物。
【請求項１７４】
R3がメチルである、請求項173記載の化合物。
【請求項１７５】
R3がアルキル(C2-6)である、請求項172記載の化合物。
【請求項１７６】
R3がアルキル(C3-5)である、請求項175記載の化合物。
【請求項１７７】
R3がイソプロピルである、請求項176記載の化合物。
【請求項１７８】
R3がtert-ブチルである、請求項176記載の化合物。
【請求項１７９】
R4が水素である、請求項158〜178のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１８０】
R4がアルキル(C≦12)またはその置換型である、請求項158〜178のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１８１】
R4がアルキル(C≦8)である、請求項180記載の化合物。
【請求項１８２】
R4がアルキル(C≦6)である、請求項181記載の化合物。
【請求項１８３】
R4が、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルおよびtert-ブチルからなる群より選択される、請求項182記載の化合物。
【請求項１８４】
R4がメチルである、請求項183記載の化合物。
【請求項１８５】
R4がアルキル(C2-6)である、請求項182記載の化合物。
【請求項１８６】
R4がアルキル(C3-5)である、請求項185記載の化合物。
【請求項１８７】
R4がイソプロピルである、請求項186記載の化合物。
【請求項１８８】
R4がtert-ブチルである、請求項186記載の化合物。
【請求項１８９】
R5が水素である、請求項158〜188のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１９０】
R5がシアノである、請求項158〜188のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１９１】
R5がアルコキシ(C≦12)またはその置換型である、請求項158〜188のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１９２】
R5がアルコキシ(C≦8)である、請求項191記載の化合物。
【請求項１９３】
R5がアルコキシ(C≦6)である、請求項192記載の化合物。
【請求項１９４】
R5がアルコキシ(C≦3)である、請求項193記載の化合物。
【請求項１９５】
R5がメトキシである、請求項194記載の化合物。
【請求項１９６】
R5が下記式の基である、請求項158〜188のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000253
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;かつ
nが0〜12の整数である。
【請求項１９７】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項196記載の化合物。
【請求項１９８】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項197記載の化合物。
【請求項１９９】
Xが-C≡C-である、請求項198記載の化合物。
【請求項２００】
nがゼロである、請求項196〜199のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２０１】
R5が下記式の基である、請求項158〜188のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000254
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項２０２】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項201記載の化合物。
【請求項２０３】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項202記載の化合物。
【請求項２０４】
Xが-C≡C-である、請求項203記載の化合物。
【請求項２０５】
Yが-CH2-である、請求項201〜204のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２０６】
nがゼロである、請求項201〜205のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２０７】
mがゼロである、請求項201〜206のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２０８】
R6が-リンカー-レポーターである、請求項158〜189のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２０９】
リンカーが以下である、請求項208記載の化合物:
2011529449.tif 000255
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;かつ
nが0〜12の整数である。
【請求項２１０】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項209記載の化合物。
【請求項２１１】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項210記載の化合物。
【請求項２１２】
Xが-C≡C-である、請求項211記載の化合物。
【請求項２１３】
nがゼロである、請求項209〜212のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２１４】
リンカーが以下である、請求項208記載の化合物:
2011529449.tif 000256
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項２１５】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項214記載の化合物。
【請求項２１６】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項215記載の化合物。
【請求項２１７】
Xが-C≡C-である、請求項216記載の化合物。
【請求項２１８】
Yが-CH2-である、請求項214〜217のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２１９】
nがゼロである、請求項214〜218のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２２０】
mがゼロである、請求項214〜219のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２２１】
リンカーが以下である、請求項208記載の化合物:
2011529449.tif 000257
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項２２２】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項221記載の化合物。
【請求項２２３】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項222記載の化合物。
【請求項２２４】
Xが-C≡C-である、請求項223記載の化合物。
【請求項２２５】
Yが-CH2-である、請求項221〜224のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２２６】
nがゼロである、請求項221〜225のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２２７】
mがゼロである、請求項221〜226のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２２８】
レポーターは色素に基づき、色素がザンテン、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、ALEXA FLUOR (登録商標) 350、ALEXA FLUOR (登録商標) 405、ALEXA FLUOR (登録商標) 430、ALEXA FLUOR (登録商標) 488、ALEXA FLUOR (登録商標) 514、ALEXA FLUOR (登録商標) 532、ALEXA FLUOR (登録商標) 546、ALEXA FLUOR (登録商標) 555、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 594、ALEXA FLUOR (登録商標) 610、ALEXA FLUOR (登録商標) 633、ALEXA FLUOR (登録商標) 647、ALEXA FLUOR (登録商標) 660、ALEXA FLUOR (登録商標) 680、ALEXA FLUOR (登録商標) 700、ALEXA FLUOR (登録商標) 750、またはスクアライン色素である、請求項208〜227のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２２９】
レポーターが以下である、請求項208〜227のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000258
。
【請求項２３０】
R6が水素である、請求項158〜229のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２３１】
R6がアルコキシ(C≦12)またはその置換型である、請求項158〜229のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２３２】
R6がアルコキシ(C≦8)である、請求項231記載の化合物。
【請求項２３３】
R6がアルコキシ(C≦6)である、請求項232記載の化合物。
【請求項２３４】
R6がアルコキシ(C≦3)である、請求項233記載の化合物。
【請求項２３５】
R6がメトキシである、請求項234記載の化合物。
【請求項２３６】
R6が下記式の基である、請求項158〜229のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000259
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;かつ
nが0〜12の整数である。
【請求項２３７】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項236記載の化合物。
【請求項２３８】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項237記載の化合物。
【請求項２３９】
Xが-C≡C-である、請求項238記載の化合物。
【請求項２４０】
nがゼロである、請求項236〜239のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２４１】
R6が下記式の基である、請求項158〜229のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000260
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項２４２】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項241記載の化合物。
【請求項２４３】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項242記載の化合物。
【請求項２４４】
Xが-C≡C-である、請求項243記載の化合物。
【請求項２４５】
Yが-CH2-である、請求項241〜244のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２４６】
nがゼロである、請求項241〜245のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２４７】
mがゼロである、請求項241〜246のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２４８】
R6が-リンカー-レポーターである、請求項158〜229のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２４９】
リンカーが以下である、請求項248記載の化合物:
2011529449.tif 000261
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;かつ
nが0〜12の整数である。
【請求項２５０】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項249記載の化合物。
【請求項２５１】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項250記載の化合物。
【請求項２５２】
Xが-C≡C-である、請求項251記載の化合物。
【請求項２５３】
nがゼロである、請求項249〜252のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２５４】
リンカーが以下である、請求項248記載の化合物:
2011529449.tif 000262
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項２５５】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項254記載の化合物。
【請求項２５６】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項255記載の化合物。
【請求項２５７】
Xが-C≡C-である、請求項256記載の化合物。
【請求項２５８】
Yが-CH2-である、請求項254〜257のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２５９】
nがゼロである、請求項254〜258のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２６０】
mがゼロである、請求項254〜259のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２６１】
リンカーが以下である、請求項248記載の化合物:
2011529449.tif 000263
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;かつ
mが0〜12の整数である。
【請求項２６２】
Xがアルキンジイル(C≦12)である、請求項261記載の化合物。
【請求項２６３】
Xがアルキンジイル(C2-8)である、請求項262記載の化合物。
【請求項２６４】
Xが-C≡C-である、請求項263記載の化合物。
【請求項２６５】
Yが-CH2-である、請求項261〜264のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２６６】
nがゼロである、請求項261〜265のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２６７】
mがゼロである、請求項261〜266のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２６８】
レポーターは色素に基づき、色素がザンテン、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、ALEXA FLUOR (登録商標) 350、ALEXA FLUOR (登録商標) 405、ALEXA FLUOR (登録商標) 430、ALEXA FLUOR (登録商標) 488、ALEXA FLUOR (登録商標) 514、ALEXA FLUOR (登録商標) 532、ALEXA FLUOR (登録商標) 546、ALEXA FLUOR (登録商標) 555、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 594、ALEXA FLUOR (登録商標) 610、ALEXA FLUOR (登録商標) 633、ALEXA FLUOR (登録商標) 647、ALEXA FLUOR (登録商標) 660、ALEXA FLUOR (登録商標) 680、ALEXA FLUOR (登録商標) 700、ALEXA FLUOR (登録商標) 750、またはスクアライン色素である、請求項248〜267のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２６９】
レポーターが以下である、請求項248〜267のいずれか一項記載の化合物:
2011529449.tif 000264
。
【請求項２７０】
R7が水素である、請求項158〜269のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２７１】
R8が水素である、請求項158〜270のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２７２】
R8がニトロである、請求項158〜270のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２７３】
R8がアルキル(C≦12)またはその置換型である、請求項158〜270のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２７４】
R8がアルキル(C≦8)である、請求項273記載の化合物。
【請求項２７５】
R8がアルキル(C≦6)である、請求項274記載の化合物。
【請求項２７６】
R8がアルキル(C≦3)である、請求項275記載の化合物。
【請求項２７７】
R8がメチルである、請求項276記載の化合物。
【請求項２７８】
R9が水素ではない、請求項158〜277のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２７９】
R9がニトロである、請求項158〜277のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２８０】
R9がアルキル(C≦12)またはその置換型である、請求項158〜277のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２８１】
R9がアルキル(C≦8)である、請求項280記載の化合物。
【請求項２８２】
R9がアルキル(C≦6)である、請求項281記載の化合物。
【請求項２８３】
R9が、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルおよびtert-ブチルからなる群より選択される、請求項282記載の化合物。
【請求項２８４】
R9がメチルである、請求項283記載の化合物。
【請求項２８５】
R9がアルキル(C2-6)である、請求項282記載の化合物。
【請求項２８６】
R9がアルキル(C3-5)である、請求項285記載の化合物。
【請求項２８７】
R9がイソプロピルである、請求項286記載の化合物。
【請求項２８８】
R9がtert-ブチルである、請求項286記載の化合物。
【請求項２８９】
R9がアリール(C≦12)またはその置換型である、請求項158〜277のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２９０】
R9がアリール(C≦8)である、請求項289記載の化合物。
【請求項２９１】
R9がフェニルである、請求項290記載の化合物。
【請求項２９２】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項158記載の化合物:
2011529449.tif 000265
。
【請求項２９３】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項158記載の化合物:
2011529449.tif 000266
。
【請求項２９４】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項158記載の化合物:
2011529449.tif 000267
。
【請求項２９５】
以下またはその塩としてさらに定義される、請求項158記載の化合物:
2011529449.tif 000268
。
【請求項２９６】
以下またはそれらの塩からなる群より選択される式の化合物:
2011529449.tif 000269
。
【請求項２９７】
以下からなる群より選択されるジアステレオマーまたはこれらのジアステレオマーのいずれかの塩としてさらに定義され、その他の光学異性体を実質的に含まない、請求項296記載の化合物:
2011529449.tif 000270
。
【請求項２９８】
以下またはその塩からなる群より選択される式の化合物:
2011529449.tif 000271
および
2011529449.tif 000272
。
【請求項２９９】
以下からなる群より選択されるジアステレオマーまたはこれらのジアステレオマーのいずれかの塩としてさらに定義され、その他の光学異性体を実質的に含まない、請求項298記載の化合物:
2011529449.tif 000273
2011529449.tif 000274
2011529449.tif 000275
および
2011529449.tif 000276
。
【請求項３００】
塩である、請求項1〜299のいずれか一項記載の化合物。
【請求項３０１】
塩が一価の陽イオンを含む、請求項300記載の化合物。
【請求項３０２】
一価の陽イオンがリチウムである、請求項301記載の化合物。
【請求項３０３】
一価の陽イオンがナトリウムである、請求項301記載の化合物。
【請求項３０４】
一価の陽イオンがカリウムである、請求項301記載の化合物。
【請求項３０５】
塩が二価の陽イオンを含む、請求項300記載の化合物。
【請求項３０６】
二価の陽イオンがカルシウム、マグネシウムまたはマンガン(II)である、請求項305記載の化合物。
【請求項３０７】
塩が、アンモニウム、トリ-n-ブチルアンモニウムおよび(HOCH2)3CNH3+からなる群より選択される陽イオンを含む、請求項300記載の化合物。
【請求項３０８】
以下の段階を含む標的核酸を配列決定する方法:
(i) 固体表面にプライマーの5'末端を結合させる段階;
(ii) 固体表面に結合されたプライマーと標的核酸をハイブリダイズさせる段階;
(iii) 二種以上の塩基が存在する場合、各塩基が異なるレポーター基に結合されるという条件で、請求項1〜307のいずれか一項記載の化合物を添加する段階;
(iv) ハイブリダイズされたプライマー/標的核酸複合体に核酸複製酵素を添加して成長中のプライマー鎖へ段階(iii)の組成物を取り込み、取り込まれた段階(iii)の組成物が約70%〜約100%の効率でポリメラーゼ反応を終結させる段階;
(v) 固体表面を洗浄して非取り込み成分を除去する段階;
(vi) 取り込まれたレポーター基を検出して取り込まれた段階(iii)の組成物を特定する段階;
(vii) 終結部分を除去するための切断段階により天然塩基で伸長されたプライマーが生ずる段階;
(viii) 固体表面を洗浄して切断された終結基を除去する段階;および
(ix) 段階(iii)〜(viii)を一回または複数回繰り返して標的核酸における複数の塩基を特定する段階。
【請求項３０９】
以下の段階を含む標的核酸を配列決定する方法:
(i) 固体表面に標的核酸の5'末端を結合させる段階;
(ii) 固体表面に結合された標的核酸とプライマーをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 二種以上の塩基が存在する場合、各塩基が異なるレポーター基に結合されるという条件で、請求項1〜307のいずれか一項記載の化合物を添加する段階;
(iv) ハイブリダイズされたプライマー/標的核酸複合体に核酸複製酵素を添加して成長中のプライマー鎖へ段階(iii)の組成物を取り込み、取り込まれた段階(iii)の組成物が約70%〜約100%の効率でポリメラーゼ反応を終結させる段階;
(v) 固体表面を洗浄して非取り込み成分を除去する段階;
(vi) 取り込まれたレポーター基を検出して取り込まれた段階(iii)の組成物を特定する段階;
(vii) 任意で1種または複数種の化合物を添加して非伸長プライマーを永続的にキャップする段階;
(viii) 終結部分を除去するための切断段階により天然塩基で伸長されたプライマーが生ずる段階;
(ix) 固体表面を洗浄して切断された終結基を除去する段階;および
(x) 段階(iii)〜(ix)を一回または複数回繰り返して標的核酸における複数の塩基を特定する段階。
【請求項３１０】
化合物が、DNAポリメラーゼである核酸複製酵素により取り込まれる、請求項308または309記載の方法。
【請求項３１１】
DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Klenow (エキソ-) DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、VENT (登録商標) (エキソ-) DNAポリメラーゼ(サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)からクローニングされ、かつD141AおよびE143A突然変異を含有するDNAポリメラーゼA)、Pfu (エキソ-) DNAポリメラーゼ、およびDEEPVENT (商標) (エキソ-) DNAポリメラーゼ(パイロコッカス(Pyrococcus)種GB-Dからクローニングされ、かつD141AおよびE143A突然変異を含有するDNAポリメラーゼA)からなる群より選択される、請求項310記載の方法。
【請求項３１２】
DNAポリメラーゼが、AMPLITAQ (登録商標) DNAポリメラーゼ、FS (G46DおよびF667Y突然変異を含んだTaq DNAポリメラーゼ)、THERMOSEQUENASE (商標) DNAポリメラーゼ(F667Y突然変異を含んだTaq DNAポリメラーゼ)、THERMOSEQUENASE (商標) II DNAポリメラーゼ(THERMOSEQUENASE (商標) DNAポリメラーゼおよびT.アシッドフィラム(T. acidophilum)ピロホスファターゼの混合物)、THERMINATOR(商標) DNAポリメラーゼ(サーモコッカス(Thermococcus)種9°N-7からクローニングされ、かつD141A、E143AおよびA485L突然変異を含有するDNAポリメラーゼA)、THERMINATOR (商標) II DNAポリメラーゼ(さらにY409V突然変異を含んだTHERMINATOR (商標) DNAポリメラーゼ)およびVENT (登録商標) (エキソ-) A488L DNAポリメラーゼ(A488L突然変異を含んだVENT (登録商標) (エキソ-) DNAポリメラーゼ)からなる群より選択される、請求項310記載の方法。
【請求項３１３】
終結部分の切断が化学的切断、光切断、電気化学的切断または酵素的切断である、請求項308〜312のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１４】
化学的切断が触媒または化学量論的試薬を用いて行われる、請求項313記載の方法。
【請求項３１５】
触媒が均一または不均一である、請求項314記載の方法。
【請求項３１６】
不均一触媒がパラジウムを含む、請求項315記載の方法。
【請求項３１７】
均一触媒がパラジウムを含む、請求項315記載の方法。
【請求項３１８】
光切断可能な終結部分の85%〜100%が光切断によって除去される、請求項315〜317のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１９】
光切断が、300 nm〜400 nmの範囲の光の波長を用いて行われる、請求項314記載の方法。
【請求項３２０】
光切断可能な終結部分の85%〜100%が光切断によって除去される、請求項319記載の方法。
【請求項３２１】
請求項1〜307のいずれか一項記載の化合物を用いてSanger配列決定またはSanger型の配列決定を行う方法。
【請求項３２２】
請求項1〜307のいずれか一項記載の化合物を用いてピロ配列決定またはピロ配列決定型の配列決定を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2008年6月11日および2009年6月5日付でそれぞれ出願された、米国仮特許出願第61/060,795号および同第61/184,779号に対する優先権の恩典を主張するものであり、それらの内容の全体が参照により本明細書にそれぞれ組み入れられる。
【０００２】
I. 発明の分野
本発明は広くは、DNA配列決定および他のタイプのDNA分析のための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、一つには、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、酵素的に切断可能な基、または光切断不能な基を有するヌクレオチドおよびヌクレオシド、ならびにいくつかのDNA配列決定法におけるその使用および生物医学研究におけるその適用の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
II. 関連技術の説明
DNAを迅速に配列決定するための方法が集団内での疾患および突然変異の分析に、ならびに治療法の開発に必要とされるようになっている。よく見られる形態のヒト配列変異は、ゲノム配列のおよそ300中1塩基対〜1000中1塩基対に生じる単一ヌクレオチド多型(SNP)、ならびにブロック置換、挿入/欠失、転置、分節重複およびコピー数変種を含む構造的変種(SV)である。構造的変種は、全可変事象の22%を占め、SNPが一因となるものよりも多くの変種塩基を占めうる(参照により本明細書に組み入れられるLevy et al., 2007(非特許文献1))。この所見は、マイクロアレイに基づく方法を用いて270個体を分析したScherer、Hurlesおよび同僚らのものと一致している(参照により本明細書に組み入れられるRedon et al. 2006(非特許文献2))。完全なヒトゲノム配列を基にして、SNPマッピングまたは直接的な関連付けによりよく見られる疾患との根本的な遺伝的連関を特定する取り組みが進行中である。迅速、高速大量処理、かつ低価格DNA配列決定に焦点を合わせた技術開発は応用医学における、SNPなどの、遺伝情報の理解および使用を容易にするであろう。
【０００４】
概して、SNPの10%〜15%が、特定のアミノ酸残基を変化させることによりタンパク質機能に影響を与え、スプライシング機構を変化させることにより遺伝子の適切なプロセッシングに影響を与え、または調節機構を変化させることにより遺伝子もしくはタンパク質の通常の発現レベルに影響を与えている。SVもヒト生物学および疾患において重要な役割を果たしうる(参照により本明細書に組み入れられるIafrate et al., 2004(非特許文献3); Sebat et al., 2004(非特許文献4); Tuzun et al., 2005(非特許文献5); Stranger et al., 2007(非特許文献6))。情報価値のあるSNPおよびSVの特定は、遺伝性疾患に関するより正確な診断、リスク感受性に関するより良好な予後診断、または組織における散発的な突然変異に関する同一性につながるものと想定される。個体のSNPおよびSVプロファイルに関する一つの応用は、予防薬治療で疾患の発症または進行を大幅に遅延させることであろう。さらに、薬物代謝遺伝子に関するSNPおよびSVプロファイルを用いて特定の投薬計画を指示し、より安全かつ効果的な結果をもたらすこともできよう。これらの意欲的な目標を達成するため、ゲノム配列決定は、大多数の集団の部分的配列決定の可能性によって再配列決定段階に入りつつあり、これには、所与の複雑な疾患に対するSNPおよびSVプロファイルを得るようにヒトゲノム全体に分布している、特定領域を並行して配列決定する段階が含まれよう。
【０００５】
最もよく見られる疾患の基礎となる配列変異は、複数のSNP、SVおよびそれらのいくつかの組み合わせを含む可能性が高く、それらは、関連遺伝子全体に分散し、低い頻度で存在している。したがって、デノボ配列決定の戦略を利用するDNA配列決定技術は、公知のSNPだけを標的とする技術よりもこれらの稀有な、広く分散した変種を検出および/または発見する可能性が高い。
【０００６】
伝統的に、DNA配列決定は「Sanger」または「ジデオキシ」法によって達成されており、これらはDNAポリメラーゼを用いた2',3'-ジデオキシヌクレオチド(ddNTP)の取り込みによるDNA合成の鎖終結を伴う(参照により本明細書に組み入れられるSanger et al., 1997(非特許文献7))。この反応には、DNA合成によりDNA鎖を伸長する天然の2'-デオキシヌクレオチド(dNTP)も含まれる。適切に均衡を保ちながらも、鎖伸長と鎖終結との競合により、数千塩基にもわたって均一に分布し、塩基対が増えるにつれてサイズが異なった、入れ子DNA断片のセットの作出が起こる。電気泳動を用いて、その各サイズにより入れ子DNA断片を分離する。配列決定反応におけるdNTP/ddNTPの比率が鎖終結の頻度、ゆえに終結鎖の長さの分布を決定する。次に、適当なレーザー光源で照射されると各色の蛍光を出す、4種の異なるフルオロフォアの4種のDNA塩基(すなわち、A、C、GおよびT)への事前の結合によって断片を検出する。現在、Sanger配列決定が直接的PCR配列決定(参照により本明細書に組み入れられるGibbs et al., 1989(非特許文献8))またはゲノム配列決定(参照により本明細書に組み入れられるHunkapiller et al., 1991(非特許文献9); International Human Genome Sequencing Consortium., 2001(非特許文献10))によるSNPの発見に最も広く用いられている方法となっている。
【０００７】
次世代配列決定(NGS)技術の利点には、大量のデータを安価に、場合によっては機器の操作1回につき短い配列の読み出しを1億回よりも過度に、生成する能力が含まれる。これらの手法の多くは合成による配列決定(SBS)といわれることが多いが、これは、異なるDNA配列決定機構をはっきりと線引きするものではない(参照により本明細書に組み入れられるMetzker, 2005(非特許文献11))。ここで、DNAポリメラーゼ依存的な戦略はサイクル可逆的終結(CRT)、単一ヌクレオチド付加(SNA、例えば、ピロ配列決定)およびリアルタイム配列決定に分類されている。DNAポリメラーゼがDNAリガーゼに置き換えられる手法は、核酸連結による配列決定(SBL)といわれる。
【０００８】
比較ゲノミクスおよび進化、科学捜査、疫学、ならびに診断および治療に向けた応用医学を含めて多様な研究部門に及ぶ潜在用途により、新しい配列決定技術の開発に対する要求は大きい。現在の配列決定技術は、ヒト配列変異研究での広範な用途にはあまりにも高価であり、労働集約的であり、かつ時間のかかることが多い。ゲノムセンターの費用はQ20塩基1,000あたりに使われるドルに基づいて計算され、器具の使用、人員、試薬および材料、ならびに間接費の部類に一般に分類することができる。現在、これらのセンターはQ20塩基1,000あたり一ドル未満で運営されており、費用のうち少なくとも50%がDNA配列決定装置の使用のみに由来している。新規の検出方法の開発、装置使用の縮小化、マイクロ流体分離技術、および作動1回あたりのアッセイ数の増大は、費用の削減に最も大きく影響する可能性が最も高いであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Levy et al., 2007
【非特許文献２】Redon et al. 2006
【非特許文献３】Iafrate et al., 2004
【非特許文献４】Sebat et al., 2004
【非特許文献５】Tuzun et al., 2005
【非特許文献６】Stranger et al., 2007
【非特許文献７】Sanger et al., 1997
【非特許文献８】Gibbs et al., 1989
【非特許文献９】Hunkapiller et al., 1991
【非特許文献１０】International Human Genome Sequencing Consortium., 2001
【非特許文献１１】Metzker, 2005
【発明の概要】
【００１０】
いくつかの局面において、本開示は、高速大量処理の配列決定反応におけるゲノム情報の効率的な配列決定において有用な新規の化合物および組成物を提供する。別の局面において、ゲノム情報を効率的かつ入手可能に提供できる試薬および試薬の組み合わせが提供される。さらなる局面において、本発明は、診断方法のためのおよび個体を標的にした治療用物質の開発のためのライブラリおよび試薬のアレイを提供する。
【００１１】
いくつかの局面において、本開示は、DNA配列決定において使用できる新たな化合物を提供する。例えば、いくつかの態様において、本発明は、下記式の化合物:
2011529449.tif 000002
式中
Zは-O-、-S-、-NH-、-OC(O)O-、-NHC(O)O-、-OC(O)NH-または-NHC(O)NH-であり;
R1はヒドロキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェートまたはポリホスフェートであり;
R2は水素またはヒドロキシであり;
R3およびR4はそれぞれ独立して以下であり:
水素、ヒドロキシ、ハロもしくはアミノ;または
アルキル(C≦12)、アルケニル(C≦12)、アルキニル(C≦12)、アリール(C≦12)、アラルキル(C≦12)、ヘテロアリール(C≦12)、ヘテロアラルキル(C≦12)、アルコキシ(C≦12)、アリールオキシ(C≦12)、アラルコキシ(C≦12)、ヘテロアリールオキシ(C≦12)、ヘテロアラルコキシ(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、アリールアミノ(C≦12)、アラルキルアミノ(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型;あるいは
R5、R6、R7、R8およびR9はそれぞれ独立して以下である:
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノもしくはメルカプト;
アルキル(C≦12)、アルケニル(C≦12)、アルキニル(C≦12)、アリール(C≦12)、アラルキル(C≦12)、ヘテロアリール(C≦12)、ヘテロアラルキル(C≦12)、アシル(C≦12)、アルコキシ(C≦12)、アルケニルオキシ(C≦12)、アルキニルオキシ(C≦12)、アリールオキシ(C≦12)、アラルコキシ(C≦12)、ヘテロアリールオキシ(C≦12)、ヘテロアラルコキシ(C≦12)、アシルオキシ(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、アルコキシアミノ(C≦12)、アルケニルアミノ(C≦12)、アルキニルアミノ(C≦12)、アリールアミノ(C≦12)、アラルキルアミノ(C≦12)、ヘテロアリールアミノ(C≦12)、ヘテロアラルキルアミノ(C≦12)、アルキルスルホニルアミノ(C≦12)、アミド(C≦12)、アルキルチオ(C≦12)、アルケニルチオ(C≦12)、アルキニルチオ(C≦12)、アリールチオ(C≦12)、アラルキルチオ(C≦12)、ヘテロアリールチオ(C≦12)、ヘテロアラルキルチオ(C≦12)、アシルチオ(C≦12)、チオアシル(C≦12)、アルキルスルホニル(C≦12)、アリールスルホニル(C≦12)、アルキルアンモニウム(C≦12)、アルキルスルホニウム(C≦12)、アルキルシリル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型;
下記式の基:
2011529449.tif 000003
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;および
mが0〜12の整数である;あるいは
-リンカー-レポーター;
またはそれらの塩、エステル、水和物、溶媒和物、互変異性体、プロドラッグもしくは光学異性体を提供する。
【００１２】
いくつかの局面において、本発明は、下記式の化合物:
2011529449.tif 000004
式中
Zは-O-、-S-、-NH-、-OC(O)O-、-NHC(O)O-、-OC(O)NH-または-NHC(O)NH-であり;
R1はヒドロキシ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェートまたはポリホスフェートであり;
R2は水素またはヒドロキシであり;
R3およびR4はそれぞれ独立して以下であり:
水素、ヒドロキシ、ハロもしくはアミノ;または
アルキル(C≦12)、アルケニル(C≦12)、アルキニル(C≦12)、アリール(C≦12)、アラルキル(C≦12)、ヘテロアリール(C≦12)、ヘテロアラルキル(C≦12)、アルコキシ(C≦12)、アリールオキシ(C≦12)、アラルコキシ(C≦12)、ヘテロアリールオキシ(C≦12)、ヘテロアラルコキシ(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、アリールアミノ(C≦12)、アラルキルアミノ(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型;
R5、R6、R7およびR8はそれぞれ独立して以下であり:
水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノもしくはメルカプト;または
アルキル(C≦12)、アルケニル(C≦12)、アルキニル(C≦12)、アリール(C≦12)、アラルキル(C≦12)、ヘテロアリール(C≦12)、ヘテロアラルキル(C≦12)、アシル(C≦12)、アルコキシ(C≦12)、アルケニルオキシ(C≦12)、アルキニルオキシ(C≦12)、アリールオキシ(C≦12)、アラルコキシ(C≦12)、ヘテロアリールオキシ(C≦12)、ヘテロアラルコキシ(C≦12)、アシルオキシ(C≦12)、アルキルアミノ(C≦12)、ジアルキルアミノ(C≦12)、アルコキシアミノ(C≦12)、アルケニルアミノ(C≦12)、アルキニルアミノ(C≦12)、アリールアミノ(C≦12)、アラルキルアミノ(C≦12)、ヘテロアリールアミノ(C≦12)、ヘテロアラルキルアミノ(C≦12)、アルキルスルホニルアミノ(C≦12)、アミド(C≦12)、アルキルチオ(C≦12)、アルケニルチオ(C≦12)、アルキニルチオ(C≦12)、アリールチオ(C≦12)、アラルキルチオ(C≦12)、ヘテロアリールチオ(C≦12)、ヘテロアラルキルチオ(C≦12)、アシルチオ(C≦12)、チオアシル(C≦12)、アルキルスルホニル(C≦12)、アリールスルホニル(C≦12)、アルキルアンモニウム(C≦12)、アルキルスルホニウム(C≦12)、アルキルシリル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型;または
下記式の基:
2011529449.tif 000005
式中
Xが
-O-、-S-もしくは-NH-;または
アルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;
Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり;
nが0〜12の整数であり;および
mが0〜12の整数である;あるいは
-リンカー-レポーター;ならびに
R9はアルキル(C≦12)、アリール(C≦12)またはこれらの基のいずれかの置換型である;
またはそれらの塩、エステル、水和物、溶媒和物、互変異性体、プロドラッグもしくは光学異性体を提供する。
【００１３】
いくつかの態様において、化合物は式Aの化合物としてさらに定義される。いくつかの態様において、化合物は式Bのものである。いくつかの態様において、化合物は式Cの化合物としてさらに定義される。いくつかの態様において、化合物は式Dのものである。いくつかの態様において、Zは-O-である。いくつかの態様において、R1はヒドロキシである。いくつかの態様において、R1はモノホスフェートである。いくつかの態様において、R1はジホスフェートである。いくつかの態様において、R1はトリホスフェートである。いくつかの態様において、R1はポリホスフェートである。いくつかの態様において、R2は水素である。いくつかの態様において、R2はヒドロキシである。いくつかの態様において、R3は水素である。いくつかの態様において、R3はアルキル(C≦12)またはその置換型である。いくつかの態様において、R3はアルキル(C≦8)である。いくつかの態様において、R3はアルキル(C≦6)である。いくつかの態様において、R3は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルおよびtert-ブチルからなる群より選択される。いくつかの態様において、R3はメチルである。いくつかの態様において、R3はアルキル(C2-6)である。いくつかの態様において、R3はアルキル(C3-5)である。いくつかの態様において、R3はイソプロピルである。いくつかの態様において、R3はtert-ブチルである。いくつかの態様において、R4は水素である。いくつかの態様において、R4はアルキル(C≦12)またはその置換型である。いくつかの態様において、R4はアルキル(C≦8)である。いくつかの態様において、R4はアルキル(C≦6)である。いくつかの態様において、R4は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルおよびtert-ブチルからなる群より選択される。いくつかの態様において、R4はメチルである。いくつかの態様において、R4はアルキル(C2-6)である。いくつかの態様において、R4はアルキル(C3-5)である。いくつかの態様において、R4はイソプロピルである。いくつかの態様において、R4はtert-ブチルである。いくつかの態様において、R5は水素である。いくつかの態様において、R5はシアノである。いくつかの態様において、R5はアルコキシ(C≦12)またはその置換型である。いくつかの態様において、R5はアルコキシ(C≦8)である。いくつかの態様において、R5はアルコキシ(C≦6)である。いくつかの態様において、R5はアルコキシ(C≦3)である。いくつかの態様において、R5はメトキシである。いくつかの態様において、R5は下記式の基であり:
2011529449.tif 000006
式中Xが-O-、-S-もしくは-NH-;またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;およびnが0〜12の整数である。
【００１４】
いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C2-8)である。いくつかの態様において、Xは-C≡C-である。いくつかの態様において、nはゼロである。いくつかの態様において、R5は下記式の基であり:
2011529449.tif 000007
式中Xが-O-、-S-もしくは-NH-;またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり; nが0〜12の整数であり;およびmが0〜12の整数である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C2-8)である。いくつかの態様において、Xは-C≡C-である。いくつかの態様において、Yは-CH2-である。いくつかの態様において、nはゼロである。いくつかの態様において、mはゼロである。いくつかの態様において、R6は-リンカー-レポーターである。いくつかの態様において、リンカーは以下であり:
2011529449.tif 000008
式中Xが-O-、-S-もしくは-NH-;またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;およびnが0〜12の整数である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C2-8)である。いくつかの態様において、Xは-C≡C-である。いくつかの態様において、nはゼロである。いくつかの態様において、リンカーは以下であり:
2011529449.tif 000009
式中Xが-O-、-S-もしくは-NH-;またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり; nが0〜12の整数であり;およびmが0〜12の整数である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C2-8)である。いくつかの態様において、Xは-C≡C-である。いくつかの態様において、Yは-CH2-である。いくつかの態様において、nはゼロである。いくつかの態様において、mはゼロである。いくつかの態様において、リンカーは以下であり:
2011529449.tif 000010
式中Xが-O-、-S-もしくは-NH-;またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり; nが0〜12の整数であり;およびmが0〜12の整数である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C2-8)である。いくつかの態様において、Xは-C≡C-である。いくつかの態様において、Yは-CH2-である。いくつかの態様において、nはゼロである。いくつかの態様において、mはゼロである。いくつかの態様において、レポーターは色素に基づき、色素がザンテン(zanthene)、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、ALEXA FLUOR (登録商標) 350、ALEXA FLUOR (登録商標) 405、ALEXA FLUOR (登録商標) 430、ALEXA FLUOR (登録商標) 488、ALEXA FLUOR (登録商標) 514、ALEXA FLUOR (登録商標) 532、ALEXA FLUOR (登録商標) 546、ALEXA FLUOR (登録商標) 555、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 594、ALEXA FLUOR (登録商標) 610、ALEXA FLUOR (登録商標) 633、ALEXA FLUOR (登録商標) 647、ALEXA FLUOR (登録商標) 660、ALEXA FLUOR (登録商標) 680、ALEXA FLUOR (登録商標) 700、ALEXA FLUOR (登録商標) 750、またはスクアライン色素である。いくつかの態様において、レポーターは以下である:
2011529449.tif 000011
いくつかの態様において、R6は水素である。いくつかの態様において、R6はアルコキシ(C≦12)またはその置換型である。いくつかの態様において、R6はアルコキシ(C≦8)である。いくつかの態様において、R6はアルコキシ(C≦6)である。いくつかの態様において、R6はアルコキシ(C≦3)である。いくつかの態様において、R6はメトキシである。いくつかの態様において、R6は下記式の基である:
2011529449.tif 000012
式中Xが-O-、-S-もしくは-NH-;またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;およびnが0〜12の整数である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C2-8)である。いくつかの態様において、Xは-C≡C-である。いくつかの態様において、nはゼロである。いくつかの態様において、R6は下記式の基である:
2011529449.tif 000013
式中Xが-O-、-S-もしくは-NH-;またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり; nが0〜12の整数であり;およびmが0〜12の整数である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C2-8)である。いくつかの態様において、Xは-C≡C-である。いくつかの態様において、Yは-CH2-である。いくつかの態様において、nはゼロである。いくつかの態様において、mはゼロである。いくつかの態様において、R6は-リンカー-レポーターである。いくつかの態様において、リンカーは以下であり:
2011529449.tif 000014
式中Xが-O-、-S-もしくは-NH-;またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり;およびnが0〜12の整数である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C2-8)である。いくつかの態様において、Xは-C≡C-である。いくつかの態様において、nはゼロである。いくつかの態様において、リンカーは以下であり:
2011529449.tif 000015
式中Xが-O-、-S-もしくは-NH-;またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり; nが0〜12の整数であり;およびmが0〜12の整数である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C2-8)である。いくつかの態様において、Xは-C≡C-である。いくつかの態様において、Yは-CH2-である。いくつかの態様において、nはゼロである。いくつかの態様において、mはゼロである。いくつかの態様において、リンカーは以下であり:
2011529449.tif 000016
式中Xが-O-、-S-もしくは-NH-;またはアルカンジイル(C≦12)、アルケンジイル(C≦12)、アルキンジイル(C≦12)、アレーンジイル(C≦12)、ヘテロアレーンジイル(C≦12)、もしくはこれらの基のいずれかの置換型であり; Yが-O-、-NH-、アルカンジイル(C≦12)または置換アルカンジイル(C≦12)であり; nが0〜12の整数であり;およびmが0〜12の整数である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C≦12)である。いくつかの態様において、Xはアルキンジイル(C2-8)である。いくつかの態様において、Xは-C≡C-である。いくつかの態様において、Yは-CH2-である。いくつかの態様において、nはゼロである。いくつかの態様において、mはゼロである。いくつかの態様において、レポーターは色素に基づき、色素がザンテン、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン、クマリン、ピレン、フタロシアニン、フィコビリタンパク質、ALEXA FLUOR (登録商標) 350、ALEXA FLUOR (登録商標) 405、ALEXA FLUOR (登録商標) 430、ALEXA FLUOR (登録商標) 488、ALEXA FLUOR (登録商標) 514、ALEXA FLUOR (登録商標) 532、ALEXA FLUOR (登録商標) 546、ALEXA FLUOR (登録商標) 555、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 568、ALEXA FLUOR (登録商標) 594、ALEXA FLUOR (登録商標) 610、ALEXA FLUOR (登録商標) 633、ALEXA FLUOR (登録商標) 647、ALEXA FLUOR (登録商標) 660、ALEXA FLUOR (登録商標) 680、ALEXA FLUOR (登録商標) 700、ALEXA FLUOR (登録商標) 750、またはスクアライン色素である。いくつかの態様において、レポーターは以下である:
2011529449.tif 000017
。
【００１５】
いくつかの態様において、R7は水素である。いくつかの態様において、R8は水素である。いくつかの態様において、R8はニトロである。いくつかの態様において、R8はアルキル(C≦12)またはその置換型である。いくつかの態様において、R8はアルキル(C≦8)である。いくつかの態様において、R8はアルキル(C≦6)である。いくつかの態様において、R8はアルキル(C≦3)である。いくつかの態様において、R8はメチルである。いくつかの態様において、R9は水素である。いくつかの態様において、R9はニトロである。いくつかの態様において、R9はアルキル(C≦12)またはその置換型である。いくつかの態様において、R9はアルキル(C≦8)である。いくつかの態様において、R9はアルキル(C≦6)である。いくつかの態様において、R9は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピルおよびtert-ブチルからなる群より選択される。いくつかの態様において、R9はメチルである。いくつかの態様において、R9はアルキル(C2-6)である。いくつかの態様において、R9はアルキル(C3-5)である。いくつかの態様において、R9はイソプロピルである。いくつかの態様において、R9はtert-ブチルである。いくつかの態様において、R9はアリール(C≦12)またはその置換型である。いくつかの態様において、R9はアリール(C≦8)である。いくつかの態様において、R9はフェニルである。
【００１６】
いくつかの態様において、本発明は、下記式の化合物を提供する:
2011529449.tif 000018
2011529449.tif 000019
2011529449.tif 000020
2011529449.tif 000021
2011529449.tif 000022
2011529449.tif 000023
。
【００１７】
いくつかの態様において、化合物は上記式の塩である。いくつかの態様において、化合物は、α-炭素に立体中心を持つ、上記式のいずれかのジアステレオマー、またはそれらの塩のR:S 50:50のα-炭素混合物である。いくつかの態様において、化合物は、その他の光学異性体を実質的に含まない主に1つのジアステレオマーである。例えば、いくつかの態様において、本開示は、その他の光学異性体を実質的に含まない、以下のジアステレオマー、またはそれらの塩のいずれかを提供する:
2011529449.tif 000024
2011529449.tif 000025
2011529449.tif 000026
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2011529449.tif 000030
2011529449.tif 000031
2011529449.tif 000032
。
【００１８】
いくつかの態様において、上記の式またはジアステレオマーのいずれかの塩は一価の陽イオンを含む。いくつかの態様において、一価の陽イオンはリチウムである。いくつかの態様において、一価の陽イオンはナトリウムである。いくつかの態様において、一価の陽イオンはカリウムである。いくつかの態様において、塩は二価の陽イオンを含む。いくつかの態様において、二価の陽イオンはカルシウム、マグネシウムまたはマンガン(II)である。いくつかの態様において、塩は、アンモニウム、トリ-n-ブチルアンモニウムおよび(HOCH2)3CNH3+からなる群より選択される陽イオンを含む。
【００１９】
別の局面において、本発明は、以下の段階を含む標的核酸を配列決定する方法を提供する:
(i) 固体表面にプライマーの5'末端を結合させる段階;
(ii) 固体表面に結合されたプライマーと標的核酸をハイブリダイズさせる段階;
(iii) 二種以上の塩基が存在する場合、各塩基が異なるレポーター基に結合されるという条件で、請求項1〜293のいずれか一項記載の化合物を添加する段階;
(iv) ハイブリダイズされたプライマー/標的核酸複合体に核酸複製酵素を添加して成長中のプライマー鎖へ段階(iii)の組成物を取り込み、取り込まれた段階(iii)の組成物が約70%〜約100%の効率でポリメラーゼ反応を終結させる段階;
(v) 固体表面を洗浄して非取り込み成分を除去する段階;
(vi) 取り込まれたレポーター基を検出して取り込まれた段階(iii)の組成物を特定する段階;
(vii) 終結部分を除去するための切断段階により天然塩基で伸長されたプライマーが生ずる段階;
(viii) 固体表面を洗浄して切断された終結基を除去する段階;および
(ix) 段階(iii)〜(viii)を一回または複数回繰り返して標的核酸における複数の塩基を特定する段階。
【００２０】
別の局面において、本発明は、以下の段階を含む標的核酸を配列決定する方法を提供する:
(i) 固体表面に標的核酸の5'末端を結合させる段階;
(ii) 固体表面に結合された標的核酸とプライマーをハイブリダイズさせる段階;
(iii) 二種以上の塩基が存在する場合、各塩基が異なるレポーター基に結合されるという条件で、請求項1〜293のいずれか一項記載の化合物を添加する段階;
(iv) ハイブリダイズされたプライマー/標的核酸複合体に核酸複製酵素を添加して成長中のプライマー鎖へ段階(iii)の組成物を取り込み、取り込まれた段階(iii)の組成物が約70%〜約100%の効率でポリメラーゼ反応を終結させる段階;
(v) 固体表面を洗浄して非取り込み成分を除去する段階;
(vi) 取り込まれたレポーター基を検出して取り込まれた段階(iii)の組成物を特定する段階;
(vii) 任意で1つまたは複数の化合物を添加して非伸長プライマーを持続的にキャップする段階;
(viii) 終結部分を除去するための切断段階が天然塩基で伸長されたプライマーを生ずる段階;
(ix) 固体表面を洗浄して切断された終結基を除去する段階;および
(x) 段階(iii)〜(ix)を一回または複数回繰り返して標的核酸における複数の塩基を特定する段階。
【００２１】
いくつかの態様において、化合物は、DNAポリメラーゼである核酸複製酵素により取り込まれる。いくつかの態様において、DNAポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼ、Klenow (エキソ-) DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、VENT (登録商標) (エキソ-) DNAポリメラーゼ(サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)からクローニングされ、かつD141AおよびE143A突然変異を含有したDNAポリメラーゼA)、Pfu (エキソ-) DNAポリメラーゼ、およびDEEPVENT (商標) (エキソ-) DNAポリメラーゼ(パイロコッカス(Pyrococcus)種GB-Dからクローニングされ、かつD141AおよびE143A突然変異を含有したDNAポリメラーゼA)からなる群より選択される。いくつかの態様において、DNAポリメラーゼは、AMPLITAQ (登録商標) DNAポリメラーゼ、FS (G46DおよびF667Y突然変異を含んだTaq DNAポリメラーゼ)、THERMOSEQUENASE (商標) DNAポリメラーゼ(F667Y突然変異を含んだTaq DNAポリメラーゼ)、THERMOSEQUENASE (商標) II DNAポリメラーゼ(THERMOSEQUENASE (商標) DNAポリメラーゼおよびT.アシッドフィラム(T. acidophilum)ピロホスファターゼの混合物)、THERMINATOR(商標) DNAポリメラーゼ(サーモコッカス(Thermococcus)種9°N-7からクローニングされ、かつD141A、E143AおよびA485L突然変異を含有したDNAポリメラーゼA)、THERMINATOR (商標) II DNAポリメラーゼ(さらなるY409V突然変異を含んだTHERMINATOR (商標) DNAポリメラーゼ)およびVENT (登録商標) (エキソ-) A488L DNAポリメラーゼ(A488L突然変異を含んだVENT (登録商標) (エキソ-) DNAポリメラーゼ)からなる群より選択される。いくつかの態様において、終結部分の切断は化学的切断、光切断、電気化学的切断または酵素的切断である。いくつかの態様において、化学的切断は触媒または化学量論的試薬を用いて行われる。いくつかの態様において、触媒は均一または不均一である。いくつかの態様において、不均一触媒はパラジウムを含む。いくつかの態様において、均一触媒はパラジウムを含む。いくつかの態様において、光切断可能な終結部分の85%〜100%が光切断によって除去される。いくつかの態様において、光切断は、300 nm〜400 nmに及ぶ光の波長を用いて行われる。いくつかの態様において、光切断可能な終結部分の85%〜100%が光切断によって除去される。いくつかの態様において、本発明は、本明細書において開示する化合物を用いてSanger配列決定またはSanger型の配列決定を行う方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、本明細書において開示する化合物を用いてピロ配列決定またはピロ配列決定型の配列決定を行う方法を提供する。
【００２２】
本発明によって提供される化合物の非限定的な例としては、以下に示される式による化合物が挙げられる。ある種の態様において、これらの化合物は、その他の光学異性体を実質的に含まない。
2011529449.tif 000033
2011529449.tif 000034
2011529449.tif 000035
【００２３】
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、これらの詳細な説明および具体的な例は、本発明の具体的な態様を示してはいるものの、本発明の趣旨および範囲内にあるさまざまな変化および修正がこの詳細な説明から当業者には明らかになると考えられるため、例示に過ぎないものとして与えられることが理解されるべきである。特定の化合物が1つの特定の一般式に帰するというだけの理由で、それがまた、別の一般式には属しえないことを意味するものではないと留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本開示のある種の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において提示する特定の態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つを参照することでよりよく理解することができる。
【図１】取り込みアッセイ法を示す。: 天然dCTPおよび修飾dCTP類似体を相補的塩基「G」による鋳型上での取り込みについてアッセイした。
【図２】(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロピル(1S)-カンファネートのX-線結晶学データを示す。: C20H25NO6、M = 375.41、無色板状、0.26×0.24×0.10 mm3、斜方晶系、空間群P212121 (No. 19)、a = 11.9268(15)、b = 11.9812(14)、c = 13.5488(16) Å、V = 1936.1(4) Å3、Z = 4、Dc = 1.288 g/cm3、F000 = 800、MWPC面積検出器、CuKα照射、λ = 1.54178 Å、T = 110(2)K、2θmax = 120.0°、収集反射数22896、独立反射数2665 (Rint = 0.0462)。Final GooF = 1.009、R1 = 0.0219、wR2 = 0.0554、I >2σ(I) (F2上の精密化)での反射数2629に基づくR指数、245パラメータ、拘束0。Lpおよび吸収補正の適用、μ = 0.787 mm-1。絶対構造パラメータ = 0.09(5)。
【図３】(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロピル(1S)-カンファネートのX-線結晶学データ: lg01aの結晶データを示す。: C20H24INO6、M = 501.30、無色板状、0.30×0.20×0.20 mm3、単斜晶系、空間群P21 (No. 4)、a = 7.5810(15)、b = 12.446(3)、c = 11.722(3) Å、β = 107.613(10)°、V = 1054.2(4) Å3、Z = 2、Dc = 1.579 g/cm3、F000 = 504、CCD面積検出器、MoKα照射、λ = 0.71073 Å、T = 110(2)K、2θmax = 50.0°、収集反射数24239、独立反射数3558 (Rint = 0.0302)。Final GooF = 1.010、R1 = 0.0123、wR2 = 0.0316、I >2σ(I) (F2上の精密化)での反射数3520に基づくR指数、253パラメータ、拘束3。Lpおよび吸収補正の適用、μ = 1.554 mm-1。絶対構造パラメータ = 0.020(9)。
【図４】5-ベンジルオキシメチル-2'-デオキシウリジンの水素化分解のHPLCスタックトレースを示す。
【図５】5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの水素化分解のHPLCスタックトレースを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
例示的な態様の説明
I. 定義
化学基との関連で使用する場合、「水素」は-Hを意味し; 「ヒドロキシ」は-OHを意味し; 「オキソ」は=Oを意味し; 「ハロ」は-F、-Cl、-Brまたは-Iを独立して意味し; 「アミノ」は-NH2を意味し(アミノという用語を含んだ基の定義については以下、例えば、アルキルアミノを参照のこと); 「ヒドロキシアミノ」は-NHOHを意味し; 「ニトロ」は-NO2を意味し; イミノは=NHを意味し(イミノという用語を含んだ基の定義については以下、例えば、アルキルイミノを参照のこと); 「シアノ」は-CNを意味し; 「アジド」は-N3を意味し; 一価では「ホスフェート」は-OP(O)(OH)2またはその脱プロトン化体を意味し; 二価では「ホスフェート」は-OP(O)(OH)O-またはその脱プロトン化体を意味し; 「メルカプト」は-SHを意味し; 「チオ」は=Sを意味し; 「チオエーテル」は-S-を意味し; 「スルホンアミド」は-NHS(O)2-を意味し(スルホンアミドという用語を含んだ基の定義については以下、例えば、アルキルスルホンアミドを参照のこと); 「スルホニル」は-S(O)2-を意味し(スルホニルという用語を含んだ基の定義については以下、例えば、アルキルスルホニルを参照のこと); 「スルフィニル」は-S(O)-を意味し(スルフィニルという用語を含んだ基の定義については以下、例えば、アルキルスルフィニルを参照のこと);および「シリル」は-SiH3を意味する(シリルという用語を含んだ基の定義については以下、例えば、アルキルシリルを参照のこと)。
【００２６】
「-」という記号は単結合を意味し、「=」は二重結合を意味し、および「≡」は三重結合を意味する。
2011529449.tif 000036
という記号は単結合または二重結合を表す。結合を横切るようにして垂直に描く場合の
2011529449.tif 000037
という記号は基の結合点を示す。結合点は、典型的には、結合点を即座にかつ明確に特定するうえで読み手を補助するために、より大きな基に対してこのように特定されるにすぎないことに留意されたい。
2011529449.tif 000038
という記号は、くさびの太いほうの端に結合されている基が「頁外のほうに」ある場合の単結合を意味する。
2011529449.tif 000039
という記号は、くさびの太いほうの端に結合されている基が「頁内のほうに」ある場合の単結合を意味する。
2011529449.tif 000040
という記号は、立体配座が不明である(例えば、RもしくはSのどちらか)、幾何配置が不明である(例えば、EもしくはZのどちらか)または化合物が立体配座もしくは幾何配置の混合物(例えば、50%/50%の混合物)として存在する場合の単結合を意味する。
【００２７】
「R」という基が、例えば下記式中で環系上に「浮遊している基(floating group)」として描かれるなら:
2011529449.tif 000041
Rは、安定な構造が形成される限り、描かれている、暗示されている、または明示的に定義されている水素を含め、環原子のいずれかに結合されているどの水素原子にも取って代わることができる。
【００２８】
「R」という基が、例えば下記式中にあるように縮合環系上に「浮遊している基」として描かれるなら:
2011529449.tif 000042
Rは、特別の定めのない限りどちらかの縮合環のいずれかの環原子に結合されているどの水素にも取って代わることができる。置換可能な水素は、安定な構造が形成される限り、描かれている水素(例えば、上記式中の窒素に結合されている水素)、暗示されている水素(例えば、示されていないが存在するものと理解される上記式の水素)、明示的に定義されている水素、および存在が環原子の固有性に依る任意の水素(例えば、Xが-CH-に等しい場合の、X基に結合されている水素)を含む。描かれている例において、Rは、縮合環系の5員環または6員環のどちらにあってもよい。上記式において、括弧で囲まれた「R」基のすぐ後ろの下付き文字「y」は、数値変数を表す。特別の定めのない限り、この変数は0、1、2、または環もしくは環系の置換可能な水素原子の最大数によって制限されるだけの、2よりも大きな任意の整数であることができる。
【００２９】
yが2であり、かつ「(R)y」が2つの置換可能な水素を有する1つまたは複数の環原子、例えば下記式中にあるように飽和環炭素を有する環系上に浮遊している基として描かれるなら:
2011529449.tif 000043
2つのR基のそれぞれが同じまたは異なる環原子にあってもよい。例えば、Rがメチルであり、かつ両方のR基が同じ環原子に結合されている場合、1つの原子に同種基が2つ結合したジメチル基が生じる。具体的に規定されている場合、2つのR基は一緒になって、以下でさらに定義される二価の基の1つのような、二価の基を形成することができる。そのような二価の基が同じ環原子に結合される場合、スピロ環構造が生じるであろう。
【００３０】
結合点が、例えば下記式中で「浮遊している」として描かれるなら:
2011529449.tif 000044
結合点は、特別の定めのない限りどちらかの縮合環のいずれかの環原子上のどの置換可能な水素原子にも取って代わることができる。
【００３１】
二重結合R基(例えば、オキソ、イミノ、チオ、アルキリデンなど)の場合、1つの環原子に結合されている黙示的または明示的な水素原子のいずれかの対をR基によって置き換えることができる。この概念を以下に例示する:
2011529449.tif 000045
は
2011529449.tif 000046
を表す。
【００３２】
下記の基の場合、以下の括弧内下付き文字は、次のようにそれらの基をさらに定義する: 「(Cn)」は基の中の炭素原子の正確な数(n)を定義する。「(C≦n)」は、基の中にありうる炭素原子の最大数(n)を定義し、当該における炭素原子の最小数は、問題になっている基に対して少なくとも1つであるが、それ以外には可能な限り小さい。例えば、「アルケニル(C≦8)」という基の中の炭素原子の最小数は2であると理解される。例えば、「アルコキシ(C≦10)」は、1〜10個の炭素原子(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個、またはその中で導き出せる任意の範囲(例えば、3〜10個の炭素原子))を有するアルコキシ基を指定する。(Cn-n')は基の中の炭素原子の最小数(n)と最大数(n')の両方を定義する。同様に、「アルキル(C2-10)」は、2〜10個の炭素原子(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個、またはその中で導き出せる任意の範囲(例えば、3〜10個の炭素原子))を有するアルキル基を指定する。
【００３３】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキル」という用語は、結合点としての飽和炭素原子を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、炭素-炭素二重結合または三重結合を有さず、炭素および水素以外の原子を有さない、一価の非芳香族基をいう。-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr)、-CH(CH3)2(iso-Pr)、-CH(CH2)2(シクロプロピル)、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(sec-ブチル)、-CH2CH(CH3)2(イソブチル)、-C(CH3)3(tert-ブチル)、-CH2C(CH3)3(ネオペンチル)、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘキシルメチルといった基がアルキル基の非限定的な例である。「置換アルキル」という用語は、結合点としての飽和炭素原子を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、炭素-炭素二重結合または三重結合を有さず、N、O、F、Cl、Br、I、Si、PおよびSからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子を有する、一価の非芳香族基をいう。以下の基が置換アルキル基の非限定的な例である: -CH2OH、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2SH、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)H、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)NHCH3、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OCH2CF3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CH2CH2Cl、-CH2CH2OH、-CH2CF3、-CH2CH2OC(O)CH3、-CH2CH2NHCO2C(CH3)3およびCH2Si(CH3)3。
【００３４】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルカンジイル」という用語は、結合点としての1個または2個の飽和炭素原子を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、炭素-炭素二重結合または三重結合を有さず、炭素および水素以外の原子を有さない、二価の非芳香族基であって、アルカンジイル基が2個のσ結合により結合している二価の非芳香族基をいう。-CH2-(メチレン)、-CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-、-CH2CH2CH2-および
2011529449.tif 000047
といった基がアルカンジイル基の非限定的な例である。「置換アルカンジイル」という用語は、結合点としての1個または2個の飽和炭素原子を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、炭素-炭素二重結合または三重結合を有さず、N、O、F、Cl、Br、I、Si、PおよびSからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子を有する、一価の非芳香族基であって、アルキンジイル基が2個のσ結合により結合している一価の非芳香族基をいう。以下の基が置換アルカンジイル基の非限定的な例である: -CH(F)-、-CF2-、-CH(Cl)-、-CH(OH)-、-CH(OCH3)-および-CH2CH(Cl)-。
【００３５】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルケニル」という用語は、結合点としての非芳香族炭素原子を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも1個の非芳香族炭素-炭素二重結合を有し、炭素-炭素三重結合を有さず、炭素および水素以外の原子を有さない、一価の基をいう。アルケニル基の非限定的な例としては-CH=CH2(ビニル)、-CH=CHCH3、-CH=CHCH2CH3、-CH2CH=CH2(アリル)、-CH2CH=CHCH3および-CH=CH-C6H5が挙げられる。「置換アルケニル」という用語は、結合点としての非芳香族炭素原子を有し、少なくとも1個の非芳香族炭素-炭素二重結合を有し、炭素-炭素三重結合を有さず、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、N、O、F、Cl、Br、I、Si、PおよびSからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子を有する、一価の基をいう。-CH=CHF、-CH=CHClおよび-CH=CHBrといった基が置換アルケニル基の非限定的な例である。
【００３６】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルケンジイル」という用語は、結合点としての2個の炭素原子を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも1個の非芳香族炭素-炭素二重結合を有し、炭素-炭素三重結合を有さず、炭素および水素以外の原子を有さない、二価の非芳香族基であって、アルケンジイル基が2個のσ結合により結合している二価の非芳香族基をいう。-CH=CH-、-CH=C(CH3)CH2-、-CH=CHCH2-および
2011529449.tif 000048
といった基がアルケンジイル基の非限定的な例である。「置換アルケンジイル」という用語は、結合点としての2個の炭素原子を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも1個の非芳香族炭素-炭素二重結合を有し、炭素-炭素三重結合を有さず、N、O、F、Cl、Br、I、Si、PおよびSからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子を有する、二価の非芳香族基であって、アルケンジイル基が2個のσ結合により結合している二価の非芳香族基をいう。以下の基が置換アルケンジイル基の非限定的な例である: -CF=CH-、-C(OH)=CH-および-CH2CH=C(Cl)-。
【００３７】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキニル」という用語は、結合点としての非芳香族炭素原子を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を有し、炭素および水素以外の原子を有さない、一価の基をいう。-C≡CH、-C≡CCH3、-C≡CC6H5および-CH2C≡CCH3といった基がアルキニル基の非限定的な例である。「置換アルキニル」という用語は、結合点としての非芳香族炭素原子および少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、N、O、F、Cl、Br、I、Si、PおよびSからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子を有する、一価の基をいう。-C≡CSi(CH3)3といった基が置換アルキニル基の非限定的な例である。
【００３８】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキンジイル」という用語は、結合点としての2個の炭素原子を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を有し、炭素および水素以外の原子を有さない、二価の非芳香族基であって、アルキンジイル基が2個のσ結合により結合している二価の非芳香族基をいう。-C≡C-、-C≡CCH2-および-C≡CCH(CH3)-といった基がアルキンジイル基の非限定的な例である。「置換アルキンジイル」という用語は、結合点としての2個の炭素原子を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を有し、N、O、F、Cl、Br、I、Si、PおよびSからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子を有する、二価の非芳香族基であって、アルキンジイル基が2個のσ結合により結合している二価の非芳香族基をいう。-C≡CCFH-および-C≡CHCH(Cl)-といった基が置換アルキンジイル基の非限定的な例である。
【００３９】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アリール」という用語は、環原子がすべて炭素である1つまたは複数の6員の芳香環構造の一部を形成する芳香族炭素原子を結合点として有し、一価の基が炭素および水素以外の原子からなるわけではない、一価の基をいう。アリール基の非限定的な例としてはフェニル(Ph)、メチルフェニル、(ジメチル)フェニル、-C6H4CH2CH3(エチルフェニル)、-C6H4CH2CH2CH3(プロピルフェニル)、-C6H4CH(CH3)2、-C6H4CH(CH2)2、-C6H3(CH3)CH2CH3(メチルエチルフェニル)、-C6H4CH=CH2(ビニルフェニル)、-C6H4CH=CHCH3、-C6H4C≡CH、-C6H4C≡CCH3、ナフチル、およびビフェニルから誘導される一価の基が挙げられる。「置換アリール」という用語は、環原子がすべて炭素である1つまたは複数の6員の芳香環構造の一部を形成する芳香族炭素原子を結合点として有し、一価の基がN、O、F、Cl、Br、I、Si、PおよびSからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子をさらに有する、一価の基をいう。置換アリール基の非限定的な例としては-C6H4F、-C6H4Cl、-C6H4Br、-C6H4I、-C6H4OH、-C6H4OCH3、-C6H4OCH2CH3、-C6H4OC(O)CH3、-C6H4NH2、-C6H4NHCH3、-C6H4N(CH3)2、-C6H4CH2OH、-C6H4CH2OC(O)CH3、-C6H4CH2NH2、-C6H4CF3、-C6H4CN、-C6H4CHO、-C6H4CHO、-C6H4C(O)CH3、-C6H4C(O)C6H5、-C6H4CO2H、-C6H4CO2CH3、-C6H4CONH2、-C6H4CONHCH3および-C6H4CON(CH3)2といった基が挙げられる。
【００４０】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アレーンジイル」という用語は、環原子がすべて炭素である1つまたは複数の6員の芳香環構造の一部を形成する2つの芳香族炭素原子を結合点として有し、一価の基が炭素および水素以外の原子からなるわけではない、二価の基であって、アレーンジイル基が2個のσ結合により結合している二価の基をいう。アレーンジイル基の非限定的な例としては以下が挙げられる:
2011529449.tif 000049
。
「置換アレーンジイル」という用語は、環原子が炭素である1つまたは複数の6員の芳香環構造の一部を形成する2個の芳香族炭素原子を結合点として有し、二価の基がN、O、F、Cl、Br、I、Si、PおよびSからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子をさらに有する、二価の基であって、アレーンジイル基が2個のσ結合により結合している二価の基をいう。
【００４１】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アラルキル」という用語は一価の基-アルカンジイル-アリールをいい、ここでアルカンジイルおよびアリールという用語は、上記で示した定義と一致した様式でそれぞれ使用される。アラルキルの非限定的な例としてはフェニルメチル(ベンジル、Bn)、1-フェニル-エチル、2-フェニル-エチル、インデニルおよび2,3-ジヒドロ-インデニルがあり、但し、各場合の結合点が飽和炭素原子の1つである限り、インデニルおよび2,3-ジヒドロ-インデニルはアラルキルの例でしかない。「アラルキル」という用語を「置換」という修飾語と共に使用する場合、アルカンジイルおよびアリールのいずれか一方または両方が修飾される。置換アラルキルの非限定的な例としては(3-クロロフェニル)-メチル、2-オキソ-2-フェニル-エチル(フェニルカルボニルメチル)、2-クロロ-2-フェニル-エチル、結合点が飽和炭素原子のうち1つであるクロマニル、および結合点が飽和原子のうち1つであるテトラヒドロキノリニルがある。
【００４２】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「ヘテロアリール」という用語は、環原子のうち少なくとも1個が窒素、酸素または硫黄である芳香環構造の一部を形成する芳香族炭素原子または窒素原子を結合点として有し、一価の基が炭素、水素、芳香族窒素、芳香族酸素および芳香族硫黄以外の原子からなるわけではない、一価の基をいう。アリール基の非限定的な例としてはアクリジニル、フラニル、イミダゾイミダゾリル、イミダゾピラゾリル、イミダゾピリジニル、イミダゾピリミジニル、インドリル、インダゾリニル、メチルピリジル、オキサゾリル、フェニルイミダゾリル、ピリジル、ピロリル、ピリミジル、ピラジニル、キノリル、キナゾリル、キノキサリニル、テトラヒドロキノリニル、チエニル、トリアジニル、ピロロピリジニル、ピロロピリミジニル、ピロロピラジニル、ピロロトリアジニル、ピロロイミダゾリル、クロメニル(結合点が芳香族原子のうち1つである)およびクロマニル(結合点が芳香族原子のうち1つである)が挙げられる。「置換ヘテロアリール」という用語は、環原子のうち少なくとも1個が窒素、酸素または硫黄である芳香環構造の一部を形成する芳香族炭素原子または窒素原子を結合点として有し、一価の基が非芳香族窒素、非芳香族酸素、非芳香族硫黄、F、Cl、Br、I、SiおよびPからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子をさらに有する、一価の基をいう。
【００４３】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「ヘテロアレーンジイル」という用語は、環原子の少なくとも1つが窒素、酸素または硫黄である1つまたは複数の芳香環構造の一部を形成する芳香族炭素原子または窒素原子を結合点として有し、ヘテロアレーンジイル基が2個のσ結合により結合している二価の基であって、炭素、水素、芳香族窒素、芳香族酸素、および芳香族硫黄以外の原子からなるわけではない、二価の基をいう。ヘテロアレーンジイル基の非限定的な例としては以下が挙げられる:
2011529449.tif 000050
。
「置換ヘテロアレーンジイル」という用語は、環原子の少なくとも1つが窒素、酸素または硫黄である1つまたは複数の6員の芳香環構造の一部を形成する芳香族炭素原子または窒素原子を結合点として有し、ヘテロアレーンジイル基が2個のσ結合により結合している二価の基であって、非芳香族窒素、非芳香族酸素、非芳香族硫黄、F、Cl、Br、I、SiおよびPからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子をさらに有する、二価の基をいう。
【００４４】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「ヘテロアラルキル」という用語は一価の基-アルカンジイル-ヘテロアリールをいい、ここでアルカンジイルおよびヘテロアリールという用語は、上記で示した定義と一致した様式でそれぞれ使用される。アラルキルの非限定的な例としてはピリジルメチルおよびチエニルメチルがある。「ヘテロアラルキル」という用語を「置換」という修飾語と共に使用する場合、アルカンジイルおよびヘテロアリールのいずれか一方または両方が修飾される。
【００４５】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アシル」という用語は、カルボニル基の炭素原子を結合点として有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造をさらに有し、カルボニル基の酸素原子以外の炭素または水素ではないさらなる原子をさらに有さない、一価の基ををいう。-CHO、-C(O)CH3(アセチル、Ac)、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5、-C(O)C6H4CH3、-C(O)C6H4CH2CH3、-COC6H3(CH3)2および-C(O)CH2C6H5といった基がアシル基の非限定的な例である。したがって、「アシル」という用語は、「アルキルカルボニル」基および「アリールカルボニル」基と時々呼ばれる基を包含するがそれに限定されない。「置換アシル」という用語は、カルボニル基の炭素原子を結合点として有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造をさらに有し、カルボニル基の酸素に加えてN、O、F、Cl、Br、I、Si、PおよびSからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子をさらに有する、一価の基ををいう。-C(O)CH2CF3、-CO2H(カルボキシル)、-CO2CH3(メチルカルボキシル)、-CO2CH2CH3、-CO2CH2CH2CH3、-CO2C6H5、-CO2CH(CH3)2、-CO2CH(CH2)2、-C(O)NH2(カルバモイル)、-C(O)NHCH3、-C(O)NHCH2CH3、-CONHCH(CH3)2、-CONHCH(CH2)2、-CON(CH3)2、-CONHCH2CF3、-CO-ピリジル、-CO-イミダゾイルおよび-C(O)N3といった基が置換アシル基の非限定的な例である。「置換アシル」という用語は「ヘテロアリールカルボニル」基を包含するがそれに限定されない。
【００４６】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキリデン」という用語は、アルキリデン基が1個のσ結合および1個のπ結合により結合している二価の基=CRR'をいい、ここでRおよびR'は独立して水素、アルキルであるか、またはRおよびR'は一緒になってアルカンジイルを表す。アルキリデン基の非限定的な例としては=CH2、=CH(CH2CH3)および=C(CH3)2が挙げられる。「置換アルキリデン」という用語は、アルキリデン基が1個のσ結合および1個のπ結合により結合している=CRR'基をいい、ここでRおよびR'は独立して水素、アルキル、置換アルキルであるか、またはRおよびR'は一緒になって置換アルカンジイルを表し、但し、RおよびR'のいずれか一方は置換アルキルであるか、またはRおよびR'は一緒になって置換アルカンジイルを表す。
【００４７】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルコキシ」という用語は-OR基をいい、ここでRはアルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。アルコキシ基の非限定的な例としては-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCH(CH2)2、-O-シクロペンチルおよび-O-シクロヘキシルが挙げられる。「置換アルコキシ」という用語は-OR基をいい、ここでRは置換アルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。例えば、-OCH2CF3が置換アルコキシ基である。
【００４８】
同様に、「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルケニルオキシ」、「アルキニルオキシ」、「アリールオキシ」、「アラルコキシ」、「ヘテロアリールオキシ」、「ヘテロアラルコキシ」および「アシルオキシ」という用語は、-ORとして定義される基をいい、ここでRはそれぞれアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびアシルであり、それらの用語は上記に定義の通りである。アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシおよびアシルオキシという用語のいずれかが「置換」によって修飾される場合、-OR基をいい、ここでRはそれぞれ置換アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびアシルである。
【００４９】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキルアミノ」という用語は-NHR基をいい、ここでRはアルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。アルキルアミノ基の非限定的な例としては-NHCH3、-NHCH2CH3、-NHCH2CH2CH3、-NHCH(CH3)2、-NHCH(CH2)2、-NHCH2CH2CH2CH3、-NHCH(CH3)CH2CH3、-NHCH2CH(CH3)2、-NHC(CH3)3、-NH-シクロペンチルおよび-NH-シクロヘキシルが挙げられる。「置換アルキルアミノ」という用語は-NHR基をいい、ここでRは置換アルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。例えば、-NHCH2CF3が置換アルキルアミノ基である。
【００５０】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「ジアルキルアミノ」という用語は-NRR'基をいい、ここでRおよびR'は同一のまたは異なるアルキル基でありうるか、またはRおよびR'は一緒になって2個またはそれ以上の飽和炭素原子を有するアルカンジイルを表すことができ、飽和炭素原子のうち少なくとも2個は窒素原子に結合している。ジアルキルアミノ基の非限定的な例としては-NHC(CH3)3、-N(CH3)CH2CH3、-N(CH2CH3)2、N-ピロリジニルおよびN-ピペリジニルが挙げられる。「置換ジアルキルアミノ」という用語は-NRR'基をいい、ここでRおよびR'は同一のまたは異なる置換アルキル基でありうるか、RまたはR'のうち一方はアルキルでありかつ他方は置換アルキルであるか、あるいはRおよびR'は一緒になって2個またはそれ以上の飽和炭素原子を有する置換アルカンジイルを表すことができ、飽和炭素原子のうち少なくとも2個は窒素原子に結合している。
【００５１】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルコキシアミノ」、「アルケニルアミノ」、「アルキニルアミノ」、「アリールアミノ」、「アラルキルアミノ」、「ヘテロアリールアミノ」、「ヘテロアラルキルアミノ」および「アルキルスルホニルアミノ」という用語は、-NHRで定義される基をいい、ここでRはそれぞれアルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびアルキルスルホニルであり、それらの用語は上記に定義の通りである。アリールアミノ基の非限定的な例は-NHC6H5である。アルコキシアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアラルキルアミノおよびアルキルスルホニルアミノという用語のいずれかが「置換」によって修飾される場合、-NHR基をいい、ここでRはそれぞれ置換アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびアルキルスルホニルである。
【００５２】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アミド」(アシルアミノ)という用語は-NHR基をいい、ここでRはアシルであり、その用語は上記に定義の通りである。アシルアミノ基の非限定的な例は-NHC(O)CH3である。アミドという用語を「置換」という修飾語と共に使用する場合、-NHRとして定義される基をいい、ここでRは置換アシルであり、その用語は上記に定義の通りである。-NHC(O)OCH3および-NHC(O)NHCH3という基が置換アミド基の非限定的な例である。
【００５３】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキルイミノ」という用語は、アルキルイミノ基が1個のσ結合および1個のπ結合により結合している=NR基をいい、ここでRはアルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。アルキルイミノ基の非限定的な例としては=NCH3、=NCH2CH3および=N-シクロヘキシルが挙げられる。「置換アルキルイミノ」という用語は、アルキルイミノ基が1個のσ結合および1個のπ結合により結合している=NR基をいい、ここでRは置換アルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。例えば、=NCH2CF3が置換アルキルイミノ基である。
【００５４】
同様に、「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルケニルイミノ」、「アルキニルイミノ」、「アリールイミノ」、「アラルキルイミノ」、「ヘテロアリールイミノ」、「ヘテロアラルキルイミノ」および「アシルイミノ」という用語は、アルキルイミノ基が1個のσ結合および1個のπ結合により結合している、=NRとして定義される基をいい、ここでRはそれぞれアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびアシルであり、それらの用語は上記に定義の通りである。アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アリールイミノ、アラルキルイミノおよびアシルイミノという用語のいずれかが「置換」によって修飾される場合、アルキルイミノ基が1個のσ結合および1個のπ結合により結合している=NR基をいい、ここでRはそれぞれ置換アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびアシルである。
【００５５】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「フルオロアルキル」という用語は、水素が1個または複数のフッ素で置換されているアルキルをいい、その用語は上記に定義の通りである。-CH2F、-CF2H 、-CF3および-CH2CF3といった基がフルオロアルキル基の非限定的な例である。「置換フルオロアルキル」という用語は、結合点としての飽和炭素原子を有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造を有し、少なくとも1個のフッ素原子を有し、炭素-炭素二重結合または三重結合を有さず、N、O、Cl、Br、I、Si、PおよびSからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子を有する、一価の非芳香族基ををいう。以下の基が置換フルオロアルキルの非限定的な例である: -CFHOH。
【００５６】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキルホスフェート」という用語は、-OP(O)(OH)(OR)基をいい、ここでRはアルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。アルキルホスフェート基の非限定的な例としては-OP(O)(OH)(OMe)および-OP(O)(OH)(OEt)が挙げられる。「置換アルキルホスフェート」という用語は、-OP(O)(OH)(OR)基をいい、ここでRは置換アルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。
【００５７】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「ジアルキルホスフェート」という用語は、-OP(O)(OR)(OR')基をいい、ここでRおよびR'は同一のまたは異なるアルキル基でありうるか、またはRおよびR'は一緒になって2個またはそれ以上の飽和炭素原子を有するアルカンジイルを表すことができ、飽和炭素原子のうち少なくとも2個は酸素原子を介してリン原子に結合している。ジアルキルホスフェート基の非限定的な例としては-OP(O)(OMe)2、-OP(O)(OEt)(OMe)および-OP(O)(OEt)2が挙げられる。「置換ジアルキルホスフェート」という用語は、-OP(O)(OR)(OR')基をいい、ここでRおよびR'は同一のまたは異なる置換アルキル基でありうるか、RまたはR'のうち一方はアルキルでありかつ他方は置換アルキルであるか、あるいはRおよびR'は一緒になって2個またはそれ以上の飽和炭素原子を有する置換アルカンジイルを表すことができ、飽和炭素原子のうち少なくとも2個は酸素原子を介してリンに結合している。
【００５８】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキルチオ」という用語は-SR基をいい、ここでRはアルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。アルキルチオ基の非限定的な例としては-SCH3、-SCH2CH3、-SCH2CH2CH3、-SCH(CH3)2、-SCH(CH2)2、-S-シクロペンチルおよび-S-シクロヘキシルが挙げられる。「置換アルキルチオ」という用語は-SR基をいい、ここでRは置換アルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。例えば、-SCH2CF3が置換アルキルチオ基である。
【００５９】
同様に、「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルケニルチオ」、「アルキニルチオ」、「アリールチオ」、「アラルキルチオ」、「ヘテロアリールチオ」、「ヘテロアラルキルチオ」および「アシルチオ」という用語は、-SRとして定義される基をいい、ここでRはそれぞれアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびアシルであり、それらの用語は上記に定義の通りである。アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、アラルキルチオ、ヘテロアリールチオ、ヘテロアラルキルチオおよびアシルチオという用語のいずれかが「置換」によって修飾される場合、-SR基をいい、ここでRはそれぞれ置換アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびアシルである。
【００６０】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「チオアシル」という用語は、チオカルボニル基の炭素原子を結合点として有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造をさらに有し、カルボニル基の硫黄原子以外の炭素または水素ではないさらなる原子をさらに有さない、一価の基を意味する。-CHS、-C(S)CH3、-C(S)CH2CH3、-C(S)CH2CH2CH3、-C(S)CH(CH3)2、-C(S)CH(CH2)2、-C(S)C6H5、-C(S)C6H4CH3、-C(S)C6H4CH2CH3、-C(S)C6H3(CH3)2および-C(S)CH2C6H5といった基がチオアシル基の非限定的な例である。したがって、「チオアシル」という用語は、「アルキルチオカルボニル」基および「アリールチオカルボニル」基と時々呼ばれる基を包含するがそれに限定されない。「置換チオアシル」という用語は、チオカルボニル基の一部である炭素原子を結合点として有し、直鎖もしくは分岐、シクロ、環式または非環式構造をさらに有し、カルボニル基の硫黄原子に加えてN、O、F、Cl、Br、I、Si、PおよびSからなる群より独立して選択される少なくとも1個の原子をさらに有する、基を意味する。-C(S)CH2CF3、-C(S)O2H、-C(S)OCH3、-C(S)OCH2CH3、-C(S)OCH2CH2CH3、-C(S)OC6H5、-C(S)OCH(CH3)2、-C(S)OCH(CH2)2、-C(S)NH2および-C(S)NHCH3といった基が置換チオアシル基の非限定的な例である。「置換チオアシル」という用語は「ヘテロアリールチオカルボニル」基を包含するがそれに限定されない。
【００６１】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキルスルホニル」という用語は-S(O)2R基をいい、ここでRはアルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。アルキルスルホニル基の非限定的な例としては-S(O)2CH3、-S(O)2CH2CH3、-S(O)2CH2CH2CH3、-S(O)2CH(CH3)2、-S(O)2CH(CH2)2、-S(O)2-シクロペンチルおよび-S(O)2-シクロヘキシルが挙げられる。「置換アルキルスルホニル」という用語は-S(O)2R基をいい、ここでRは置換アルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。例えば、-S(O)2CH2CF3が置換アルキルスルホニル基である。
【００６２】
同様に、「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルケニルスルホニル」、「アルキニルスルホニル」、「アリールスルホニル」、「アラルキルスルホニル」、「ヘテロアリールスルホニル」および「ヘテロアラルキルスルホニル」という用語は、-S(O)2Rとして定義される基をいい、ここでRはそれぞれアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルであり、それらの用語は上記に定義の通りである。アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、アラルキルスルホニル、ヘテロアリールスルホニルおよびヘテロアラルキルスルホニルという用語のいずれかが「置換」によって修飾される場合、-S(O)2R基をいい、ここでRはそれぞれ置換アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである。
【００６３】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキルスルフィニル」という用語は-S(O)R基をいい、ここでRはアルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。アルキルスルフィニル基の非限定的な例としては-S(O)CH3、-S(O)CH2CH3、-S(O)CH2CH2CH3、-S(O)CH(CH3)2、-S(O)CH(CH2)2、-S(O)-シクロペンチルおよび-S(O)-シクロヘキシルが挙げられる。「置換アルキルスルフィニル」という用語は-S(O)R基をいい、ここでRは置換アルキルであり、その用語は上記に定義の通りである。例えば、-S(O)CH2CF3は置換アルキルスルフィニル基である。
【００６４】
同様に、「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルケニルスルフィニル」、「アルキニルスルフィニル」、「アリールスルフィニル」、「アラルキルスルフィニル」、「ヘテロアリールスルフィニル」、および「ヘテロアラルキルスルフィニル」という用語は、-S(O)Rとして定義される基をいい、ここでRはそれぞれアルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルであり、それらの用語は上記に定義の通りである。アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、アリールスルフィニル、アラルキルスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニルおよびヘテロアラルキルスルフィニルという用語のいずれかが「置換」によって修飾される場合、-S(O)R基をいい、ここでRはそれぞれ置換アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである。
【００６５】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキルアンモニウム」という用語は、-NH2R+、-NHRR'+または-NRR'R''+として定義される基をいい、ここでR、R'およびR''は同一のまたは異なるアルキル基であるか、あるいはR、R'およびR''のうち2つの任意の組み合わせが一緒になってアルカンジイルを表すことができる。アルキルアンモニウムカチオン基の非限定的な例としては-NH2(CH3)+、-NH2(CH2CH3)+、-NH2(CH2CH2CH3)+、-NH(CH3)2+、-NH(CH2CH3)2+、-NH(CH2CH2CH3)2+、-N(CH3)3+、-N(CH3)(CH2CH3)2+、-N(CH3)2(CH2CH3)+、-NH2C(CH3)3+、-NH(シクロペンチル)2+および-NH2(シクロヘキシル)+が挙げられる。「置換アルキルアンモニウム」という用語は、-NH2R+、-NHRR'+または-NRR'R''+をいい、ここでR、R'およびR''のうち少なくとも1つは置換アルキル基であるか、またはR、R'およびR''のうち2つは一緒になって置換アルカンジイルを表すことができる。R、R'およびR''のうち2つ以上が置換アルキルである場合、同一でも異なっていてもよい。置換アルキルまたは置換アルカンジイルのいずれでもないR、R'およびR''のいずれかは、同一であるかまたは異なるアルキルでありうるか、または一緒になって2個またはそれ以上の炭素原子を有するアルカンジイルを表すことができ、この炭素原子のうち少なくとも2個は式に示す窒素原子に結合している。
【００６６】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキルスルホニウム」という用語は-SRR'+基をいい、ここでRおよびR'は同一のまたは異なるアルキル基でありうるか、あるいはRおよびR'は一緒になってアルカンジイルを表すことができる。アルキルスルホニウム基の非限定的な例としては-SH(CH3)+、-SH(CH2CH3)+、-SH(CH2CH2CH3)+、-S(CH3)2+、-S(CH2CH3)2+、-S(CH2CH2CH3)2+、-SH(シクロペンチル)+および-SH(シクロヘキシル)+が挙げられる。「置換アルキルスルホニウム」という用語は-SRR'+基をいい、ここでRおよびR'は同一のまたは異なる置換アルキル基でありうるか、RまたはR'のうち一方はアルキルでありかつ他方は置換アルキルであるか、あるいはRおよびR'は一緒になって置換アルカンジイルを表すことができる。例えば、-SH(CH2CF3)+が置換アルキルスルホニウム基である。
【００６７】
「置換」という修飾語なしで使用する場合の「アルキルシリル」という用語は、-SiH2R、-SiHRR'または-SiRR'R''として定義される一価の基をいい、ここでR、R'およびR''は同一のまたは異なるアルキル基でありうるか、あるいはR、R'およびR''のうち2つの任意の組み合わせが一緒になってアルカンジイルを表すことができる。-SiH2CH3、-SiH(CH3)2、-Si(CH3)3および-Si(CH3)2C(CH3)3といった基が非置換アルキルシリル基の非限定的な例である。「置換アルキルシリル」という用語は、-SiH2R、-SiHRR'または-SiRR'R''をいい、ここでR、R'およびR''のうち少なくとも1つは置換アルキル基であるか、またはR、R'およびR''のうち2つは一緒になって置換アルカンジイルを表すことができる。R、R'およびR''のうち2つ以上が置換アルキルである場合、同一でも異なっていてもよい。置換アルキルまたは置換アルカンジイルのいずれでもないR、R'およびR''のいずれかは、同一であるかまたは異なるアルキルでありうるか、または一緒になって2個またはそれ以上の飽和炭素原子を有するアルカンジイルを表すことができ、この飽和炭素原子のうち少なくとも2個はケイ素原子に結合している。
【００６８】
さらに、本開示の化合物を構成する原子は、そのような原子のすべての同位体形態を含むよう意図されている。本明細書において使用する同位体は、同一の原子番号を有するが異なる質量数を有する原子を含む。一般例でありかつ非限定的なものとして、水素の同位体としてはトリチウムおよび重水素が挙げられ、炭素の同位体としては13Cおよび14Cが挙げられる。同様に、本開示の化合物の1個または複数の炭素原子をケイ素原子で置き換えることができるということが企図される。さらに、本開示の化合物の1個または複数の酸素原子を硫黄またはセレン原子で置き換えることができるということが企図される。
【００６９】
破線の結合を伴って表される式を有する化合物は、0個、1個または複数の二重結合を任意で有してもよい式を含むよう意図される。したがって、例えば
2011529449.tif 000051
という構造は
2011529449.tif 000052
という構造を含む。当業者が理解するように、そのような環原子のどの1個も、複数の二重結合の一部を形成しない。
【００７０】
本出願において示す構造の原子上の任意の未定義の原子価は、その原子に結合している水素原子を暗に表す。
【００７１】
本明細書において使用する「キラル補助基」とは、反応の立体選択性に影響を与えることが可能である除去可能なキラル基を意味する。当業者はそのような化合物に精通しており、多くは市販されている。
【００７２】
本明細書において使用する「ヌクレオチド塩基」、「核酸塩基」または単純に「塩基」という用語は、核酸中で一般的に見られる種類の置換または非置換窒素含有親芳香族複素環、およびそれらの天然の、置換された、修飾された、または遺伝子操作された変種または類似体をいう。典型的な態様において、核酸塩基は、適切に相補的な核酸塩基と共にワトソン−クリックおよび/またはフーグスティーン水素結合を形成することができる。例示的な核酸塩基としては、
2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、アデニン(A)、エテノアデニン、N6-Δ2-イソペンテニルアデニン(6iA)、N6-Δ2-イソペンテニル-2-メチルチオアデニン(2ms6iA)、N6-メチルアデニン、グアニン(G)、イソグアニン、N2-ジメチルグアニン(dmG)、7-メチルグアニン(7mG)、2-チオピリミジン、6-チオグアニン(6sG)、ヒポキサンチンおよびO6-メチルグアニンのようなプリン;
7-デアザアデニン(7-デアザ-A)、7-デアザグアニン(7-デアザ-G)、7-デアザ-7-ヒドロキシメチルアデニン、7-デアザ-7-アミノメチルアデニンおよび7-デアザ-7-ヒドロキシメチルグアニンのような7-デアザ-プリン;
シトシン(C)、5-プロピニルシトシン、イソシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン(HOMeC)、5-アミノメチル-シトシン、チミン(T)、4-チオチミン(4sT)、5,6-ジヒドロチミン、O4-メチルチミン、ウラシル(U)、4-チオウラシル(4sU)、5-ヒドロキシメチルウラシル(HOMeU)、5-アミノメチル-ウラシルおよび5,6-ジヒドロウラシル(ジヒドロウラシル; D)のようなピリミジン;
ニトロインドールおよび4-メチルインドールのようなインドール; ニトロピロールのようなピロール; ネブラリン; 塩基(Y); など
が挙げられるが、それに限定されない。さらなる例示的な核酸塩基は、参照により組み入れられるLehninger, 2005、およびその中で引用されている参考文献のなかで見出すことができる。
【００７３】
本明細書において使用する「ヌクレオシド」という用語は、五炭糖、典型的にはリボースまたはデオキシリボースに結合した核酸塩基からなるグリコシルアミンをいう。これらの例としてはシチジン、2'-デオキシシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシメチルシチジン、5-アミノメチルシチジン、2'-デオキシ-5-アミノメチルシチジン、ウリジン、2'-デオキシウリジン、5-ヒドロキシメチルウリジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシメチルウリジン、5-アミノメチルウリジン、2'-デオキシ-5-アミノメチルウリジン、アデノシン、2'-デオキシアデノシン、7-デアザ-7-ヒドロキシメチルアデノシン、2'-デオキシ-7-デアザ-7-ヒドロキシメチルアデノシン、7-デアザ-7-アミノメチルアデノシン、2'-デオキシ-7-デアザ-7-アミノ-メチルアデノシン、グアノシン、2'-デオキシグアノシン、7-デアザ-7-ヒドロキシメチルグアノシン、2'-デオキシ-7-デアザ-7-ヒドロキシメチル、7-デアザ-7-アミノメチルグアノシン、2'-デオキシ-7-デアザ-7-アミノメチルグアノシン、チミジンおよび2'-デオキシチミジンが挙げられるが、それに限定されない。
【００７４】
「ヌクレオチド」は、1個、2個、3個またはそれ以上のリン酸基がヌクレオシドの五炭糖に連鎖的に結合しているヌクレオシドで構成される。
【００７５】
特別の定めのない限り、「リンカー」は、2つの他基間の共有結合分子架橋として機能する1つまたは複数の二価の基(連結性の成員)をいう。リンカーは1つもしくは複数の連結性の成員および1つもしくは複数の種類の連結性の成員を含むことができる。例示的な連結性の成員としては-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、nが0、1もしくは2である-S(O)n-、-O-、-OP(O)(OH)O-、-OP(O)(O-)O-、アルカンジイル、アルケンジイル、アルキンジイル、アレーンジイル、ヘテロアレーンジイル、またはそれらの組み合わせが挙げられる。リンカーのなかにはペンダント側鎖もしくはペンダント官能基(またはその両方)を有するものもある。そのようなペンダント部分の例は親水性修飾因子、例えば、-SO3Hまたは-SO3-のような可溶化基である。いくつかの態様において、リンカーは、レポーターを化学的に、光化学的にまたは酵素的に反応性の基のような別の部分(例えば、切断可能または切断不能な終結部分)につなげることができる。他の態様において、リンカーは、レポーターを生物学的および非生物学的成分、例えば、核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドにつなげる。さらなる態様において、リンカーは、化学的に反応性の基を核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドにつなげる。レポーターに結合しているリンカーによって形成される部分は、-L-レポーターと指定することができる。連結される分子および鎖合成の方法が行われる条件のような要因に応じて、リンカーは、長さが異なってもよく、安定性、長さ、FRET効率、ある種の化学物質に対する耐性および/または温度パラメータのような特性を最適化するため組成が異なってもよく、得られる結合体が重合反応を最適化するうえで有用であるように標識をヌクレオチドに機能的に連結するのに十分な立体選択性またはサイズのものであってもよい。リンカーは標準的な化学技術を用いて利用することができ、以下に限定されるものではないが、標識をヌクレオチドに結合させるためのアミンリンカー(例えば、Hobbs and Trainor、米国特許第5,151,507号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる); 標識をヌクレオチドに機能的に連結するための第一級または第二級アミンを典型的には含むリンカー;およびヌクレオチド塩基に付加された強固な炭化水素腕(例えば、Service, 1998を参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる)を含むことができる。塩基分子へのレポーターの結合のためのいくつかの例示的な連結方法が米国特許第4,439,356号および同第5,188,934号; 欧州特許出願第87310256.0号; 国際出願PCT/US90/05565ならびにBarone et al., 2001のなかで提供されており、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００７６】
「切断可能なリンカー」は、反応または条件の結果によって壊されうる1つまたは複数の切断可能な基を有するリンカーである。「切断可能な基」という用語は、一部分の放出を可能にする部分、例えば、蛍光発生性または蛍光性の部分をいう。そのような切断は、典型的には化学的に、光化学的にまたは酵素的に媒介される。例示的な酵素的に切断可能な基としてはホスフェートまたはペプチド配列が挙げられる。
【００７７】
特許請求の範囲および/または明細書において「含む(comprising)」という用語と共に使用する場合の「a」または「an」という単語の使用は、「1つ」を意味しうるが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」および「1つまたは2つ以上」の意味とも一致している。
【００７８】
本明細書を通じて、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために使用されるデバイス、方法に固有の誤差の変動、または試験対象の間で存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００７９】
「含む(comprise)」、「有する(have)」および「含む(include)」という用語はオープンエンドの連結動詞である。「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(includes)」および「含む(including)」などのこれらの動詞のうち1つまたは複数の任意の形態または時制もオープンエンドである。例えば、1つまたは複数の段階を「含む(comprises)」か、「有する(has)」かまたは「含む(includes)」任意の方法は、それらの1つまたは複数の段階のみを有することに限定されず、他の列挙されていない段階も網羅する。
【００８０】
「有効な」という用語は、その用語が明細書および/または特許請求の範囲において使用される通り、所望の、予期されるまたは意図される結果を実現するために十分であることを意味する。
【００８１】
化合物に対する修飾語として使用する場合の「水和物」という用語は、化合物が、化合物の固体形態などでの各化合物分子に会合する1個未満(例えば半水和物)、1個(例えば一水和物)または2個以上(例えば二水和物)の水分子を有することを意味する。
【００８２】
本明細書において使用する「IC50」という用語はヌクレオチド類似体の濃度であって、プライマー-鋳型複合体に対するその取り込みが等モル数の基質および生成物を生ずるその濃度をいうが、それに限定されることはなく、かつ/または、以下に限定されるものではないが、該化合物がプライマー-鋳型複合体の半分に取り込まれる濃度を決定することにより測定される取り込み効率と定義することができよう。
【００８３】
本明細書において使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、2〜200個の共有結合的に連結されたヌクレオチドのDNA断片をいう。
【００８４】
本明細書において使用する「鋳型」という用語は、DNA合成(取り込み)のための相補鎖として働くオリゴヌクレオチドをいう。
【００８５】
本明細書において使用する「プライマー」という用語は、DNA合成(取り込み)を開始するために用いられる鋳型鎖上の相補配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをいう。
【００８６】
本明細書において科学的または技術的意味で使用する場合、「取り込み」という用語は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、鋳型鎖と相補的な塩基対およびプライマー鎖との共有結合をポリメラーゼにより形成することをいう。プライマー-鋳型複合体は最初のプライマー鎖から1つまたは複数の塩基伸長される。
【００８７】
本明細書において使用する「切断」という用語は、光切断、化学的切断、酵素的切断などによる終結基の除去をいう。
【００８８】
本明細書において使用する「取り込みサイクル」という用語は、ポリメラーゼによるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の取り込み、該ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の検出および特定、ならびにヌクレオチド類似体なら、該類似体からの終結基の切断をいう。
【００８９】
本明細書において使用する「誤取り込み」という用語は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、鋳型鎖と非相補的な塩基対およびプライマーとの共有結合をポリメラーゼにより形成することをいう。プライマー-鋳型複合体は最初のプライマー鎖から1つまたは複数の塩基伸長される。
【００９０】
本明細書において使用する「識別」という用語は、ポリメラーゼによるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の誤取り込み対取り込みに対するIC50濃度の相違をいう。
【００９１】
本明細書において使用する「終結」という用語は、鋳型鎖と相補的または非相補的な塩基対およびプライマーとの共有結合をポリメラーゼにより形成するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の取り込みをいう。プライマー-鋳型複合体はどのような所与の取り込みサイクルであっても最初のプライマー鎖から1塩基だけ伸長される。
【００９２】
本明細書において使用する「DT50」という用語は、プライマー-鋳型複合体に取り込まれた塩基類似体の50%を切断するのに必要とされる時間の量をいう。
【００９３】
本明細書において使用する「類似体」という用語は、その構造の中に「所与の化合物」と同じ塩基性炭素骨格および炭素官能性を含まないが、例えばヘテロ原子の代わりに炭素を用いることのような、1つまたは複数の適切な置換を組み入れることによって所与の化合物を模倣しうる物質であると理解される。
【００９４】
第1の化合物の「異性体」は、各分子が第1の化合物と同一の構成分子を含有しているが三次元でのそれらの原子の配置が異なる、別個の化合物である。
【００９５】
本明細書において使用する「患者」または「被験体」という用語は、ヒト、サル、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、またはそのトランスジェニック種などの生きている哺乳類生物を意味する。いくつかの態様では、患者または被験体は霊長類である。ヒト被験体の非限定的な例としては成人、若年、乳幼児および胎児がある。
【００９６】
化合物、組成物、方法またはデバイスに関連して使用する場合、「薬学的に許容される」とは、概して、安全で、無毒性であり、かつ生物学的にもその他の点でも望ましくないことのなきことを意味し、獣医用途およびヒト薬学的用途に許容されるものを含む。
【００９７】
本明細書において使用する「主として1種類の鏡像異性体」とは、化合物が少なくとも約85%の1種類の鏡像異性体、またはより好ましくは少なくとも約90%の1種類の鏡像異性体、またはさらに好ましくは少なくとも約95%の1種類の鏡像異性体、または最も好ましくは少なくとも約99%の1種類の鏡像異性体を含有していることを意味する。同様に、「他の光学異性体を実質的に含まない」という語句は、組成物が多くとも約15%の別の鏡像異性体またはジアステレオマー、より好ましくは多くとも約10%の別の鏡像異性体またはジアステレオマー、さらに好ましくは多くとも約5%の別の鏡像異性体またはジアステレオマー、最も好ましくは多くとも約1%の別の鏡像異性体またはジアステレオマーを含有することを意味する。
【００９８】
「予防」または「予防する」は、(1) 疾患の危険性がありかつ/または疾患に罹患しやすいが、疾患の病態または総体症状のいずれかまたは全部を未だ経験していないかまたは示していない被験体または患者において、疾患の発症を阻害すること、および/あるいは(2) 疾患の危険性がありかつ/または疾患に罹患しやすいが、疾患の病態または総体症状のいずれかまたは全部を未だ経験していないかまたは示していない被験体または患者において、疾患の病態または総体症状の発症を遅くすることを含む。
【００９９】
ある原子に言及する場合の「飽和した」という用語は、その原子が単一の結合のみによって他の原子に接続していることを意味する。
【０１００】
「立体異性体」または「光学異性体」は、同一の原子が同一の他の原子に結合しているが三次元でのそれらの原子の配置が異なる、所与の化合物の異性体である。「鏡像異性体」は、左手および右手のように互いの鏡像である所与の化合物の立体異性体である。「ジアステレオマー」は、鏡像異性体ではない所与の化合物の立体異性体である。
【０１０１】
本発明は、立体化学が定義されていない任意の立体中心または対掌性の軸について、立体中心または対掌性がそのR型、S型、または、ラセミ混合物および非ラセミ混合物を含むR型とS型との混合物として存在しうることを企図する。
【０１０２】
「治療有効量」または「薬学的有効量」とは、疾患を処置するために被験体または患者に投与する際に疾患についてそのような処置を実行するために十分な量を意味する。
【０１０３】
「処置」または「処置する」は、(1) 疾患の病態または総体症状を経験しているかまたは示す被験体または患者において疾患を阻害すること(例えば、病態および/または総体症状のさらなる発生を停止させること)、(2) 疾患の病態または総体症状を経験していかまたは示す被験体または患者において疾患を寛解させること(例えば、病態および/または総体症状を逆転させること)、ならびに/あるいは(3) 疾患の病態または総体症状を経験しているかまたは示す被験体または患者において疾患の任意の測定可能な減少を実行することを含む。
【０１０４】
本明細書において使用する「水溶性」という用語は、化合物が少なくとも0.010モル/リットルの程度まで水に溶解するか、または先行文献にしたがって溶解性であると分類されることを意味する。
【０１０５】
上記の定義は、参照により本明細書に組み入れられる参考文献のいずれかにおける任意の矛盾する定義に取って代わる。しかし、特定の用語が定義されているという事実を、未定義の任意の用語が不確定であることを示すものと考えるべきではない。むしろ、すべての使用される用語は、当業者が本発明の範囲を認識しかつ本発明を実践することができるように、用語により本発明を説明するものと考えられる。
【０１０６】
II. 合成方法
本開示の化合物は、実施例の項で概説されている方法を用いて作出することができる。これらの方法は、当業者によって適用されるように有機化学の原理および技術を用いてさらに改変され最適化されうる。そのような原理および技術は、例えば、March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007)に教示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０７】
III. 生物学的機能および切断速度
本開示のいくつかの局面において示されるように、2-ニトロベンジル基のα-炭素の置換およびその立体化学は、3'-非遮断の、塩基修飾dNTPの反応の生物学的機能および切断速度に影響を与える。
【０１０８】
一つの態様において、サンプル成分はSNPの判定を可能にする。この方法は情報価値のあるSNPの高速大量処理による特定のためであることができる。SNPはゲノムDNA材料から、PCR増幅された材料から、またはクローニングされたDNA材料から直接的に得ることができ、単一ヌクレオチドプライマー伸長法を用いてアッセイすることができる。単一ヌクレオチドプライマー伸長法は、単一の非標識dNTP、単一の標識dNTP、単一の3'-修飾dNTP、単一の塩基修飾3'-dNTP、単一のα-チオ-dNTPまたは単一の標識2',3'-ジデオキシヌクレオチドの使用を含むことができる。ミニ配列決定法は、単一の非標識dNTP、単一の標識dNTP、単一の3'-修飾dNTP、単一の塩基修飾2'-dNTP、単一のα-チオ-dNTPまたは単一の標識2',3'-ジデオキシヌクレオチドの使用を含むことができる。SNPはゲノムDNA材料から、PCR増幅された材料から、またはクローニングされたDNA材料から直接的に得ることができる。
【０１０９】
本開示は、迅速なDNA配列決定技術において使用できるヌクレオチドおよびヌクレオシド化合物ならびにそれらの塩、エステルおよびホスフェートをさらに提供する。これらの化合物は、任意で、リボヌクレオシド三リン酸(NTPs)およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)の形態である。ヌクレオチドおよびヌクレオシド化合物は、ある場合には、蛍光色素のようなレポーター基で標識された光切断可能な基を含む。ヌクレオチドおよびヌクレオシド化合物は、DNA合成を終結するようにも迅速に切断するようにもデザインされている光除去可能な保護基を含み、したがって並行形式での迅速な配列決定のためにこれらの単量体を使用することができる。ヌクレオチドおよびヌクレオシド化合物上の蛍光色素で標識されたそのような迅速に切断可能な基の存在は、大きなDNAオリゴマーの配列決定の速度および精度を同時並行的に増強し、例えば、迅速な全ゲノム配列決定、ならびに多型および他の有益な遺伝情報の特定を可能にしうる。
【０１１０】
ある種の局面において、本開示は、ヌクレオシドの塩基が2-ニトロベンジル基で共有結合され、かつ2-ニトロベンジル基のα炭素の位置が本明細書において記述の1つのアルキルまたはアリール基で置換されてもよい化合物に関する。ある種の例では、ヌクレオシドの塩基は2-ニトロベンジル基で共有結合され、かつ2-ニトロベンジル基は本明細書において記述の電子供与基および電子求引基の1つまたは複数で置換されてもよい。2-ニトロベンジル基を官能化して、終結特性および光触媒脱保護速度を増強することができる。核酸塩基に結合された2-ニトロベンジル基およびα炭素置換2-ニトロベンジル基の終結特性は、リボース糖上の3'-OH基が未遮断である場合でさえも生ずる。これらの3'-OH未遮断の終結剤はいくつかの市販のDNAポリメラーゼにより耐容性良好とされ、3'-O-遮断終結剤に比べて重要な利点となる。α炭素置換2-ニトロベンジル基を、選択した蛍光色素または他のレポーター基を含むように誘導体化することもできる。
【０１１１】
A. ヌクレオチドおよびヌクレオシド化合物ならびにDNA配列決定におけるその使用
DNA配列決定技術において有用であるヌクレオチドおよびヌクレオシド化合物が提供される。本発明の一つの局面は有望な配列決定手法のサイクル可逆的終結(CRT)の使用に関する。CRTは、複数の鋳型の共時的な単一塩基付加を検出するサイクル方法である。この手法は、この分野を進歩させるうえで主な障壁となる、ゲル電気泳動の必要性なしに実施できるという点でその手法自体とSanger法(参照により本明細書に組み入れられるMetzker, 2005)とを差別化するものである。しかしながら、Sanger配列決定のように、読み出し長が長くなると、全ゲノムを網羅するために必要とされる配列決定アッセイはそれだけ少なくて済むようになる。CRTサイクルは、典型的には三段階、つまり取り込み、撮像および脱保護を含む。この手順の場合、サイクル効率、サイクル時間および感度が重要な要因である。サイクル効率は脱保護および取り込み効率の帰結であり、CRT読み出し長を決める。CRTサイクル時間は、取り込み、撮像および脱保護の時間の合計である。全ゲノム配列決定のための迅速なCRTの場合、素早くて効率的な脱保護特性を示しうる、本明細書において開示のヌクレオチドおよびヌクレオシド化合物を使用することができる。これらの化合物を、2-ニトロベンジルに直接結合された、蛍光色素のようなレポーター基で標識し、例えば、類似の脱保護特性を有する蛍光性の、可逆的終結剤を提供することができる。CRTによる長い読み出しの目標を達成することは、可逆的終結剤が典型的には、市販のDNAポリメラーゼによっては不良な基質として作用するので、困難なままである。本発明の修飾ヌクレオチド類似体を使用して、市販のDNAポリメラーゼによって同様にまたは天然のヌクレオチドよりも良好に取り込まれる基質を提供することによりこの技術を改善することができる。
【０１１２】
ゲノムDNAに適用する場合、これらの化合物をCRTにおいて使用し、ゲノムDNAから直接的に読み出しを行うことができる。断片化されたゲノムDNAを、選択した染色体に及ぶプライミング部位を含んだ高密度オリゴヌクレオチドチップとハイブリダイズさせることができる。各プライミング配列をCRT法の推定読み出し長によって分離する。塩基付加の間に、蛍光撮像装置は高密度チップ全体をいっせいに撮像し、速度および感度の顕著な改善をマークすることができる。具体的な態様において、2-ニトロベンジル基または本明細書において記述するその誘導体に結合されている、フルオロフォアをUV照射によって除去し、次ラウンドの塩基付加のための2-ニトロベンジル基を放出させる。およそ500回のCRTサイクルの後、完全かつ連続的なゲノム配列情報を次に、参照ヒトゲノムと比較して、個体のサンプルにおける配列変異の程度および種類を判定することができる。より高い取り込みおよび脱保護効率を示す可逆的終結剤は、典型的には、より高いサイクル効率、かくしてより長い読み出し長を達成するであろう。
【０１１３】
CRT効率は式: (RL)Ceff = 0.5によって定義され、ここでRLは塩基の読み出し長であり、Ceffは全サイクル効率である。言い換えれば、7塩基の読み出し長を90%の全サイクル効率で達成することが可能で、70塩基では99%のサイクル効率で達成することが可能で、700塩基では99.9%のサイクル効率で達成することが可能であろう。本発明による化合物の取り込みの効率は、類似した天然ヌクレオシドの取り込みの約70%〜約100%に及ぶことができる。好ましくは、取り込みの効率は、約85%〜約100%に及ぶであろう。光切断効率は、好ましくは約85%〜約100%に及ぶであろう。さらに、核酸伸長の終結は、本発明による化合物の取り込みによって約90%〜約100%に及ぶであろう。ヌクレオチドおよびヌクレオシド化合物は一つの態様において、少なくとも80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%または99.9%のサイクル効率を有する。
【０１１４】
本発明の別の局面は、一連の酵素反応によって無機ピロリン酸(PPi)を可視光に比例的に変換することによりその放出を測定する、電気泳動によらない生物発光法であるピロ配列決定(参照により本明細書に組み入れられるRonaghi et al., 1998)の使用に関する。修飾ヌクレオチドを使用してDNA合成を終結する他の配列決定手法と異なり、ピロ配列決定アッセイでは限られた量でのdNTPの単一付加によってDNAポリメラーゼを操作する。DNAポリメラーゼは次いで、相補的dNTPの取り込みによってプライマーを伸長し、休止する。DNA合成は分注サイクルにおける次の相補的dNTPの添加後に再開される。光ピークの順序および強度をフローグラムとして記録し、根底にあるDNA配列を明らかにする。ホモ重合体が6ヌクレオチドまで反復する場合、付加されたdNTPの数は光シグナルに正比例する。6ヌクレオチドを超えるホモ重合体の反復は、ピロ配列決定に最もよく見られる誤りのタイプである挿入の誤りを生じうる。本発明の修飾ヌクレオチド類似体は、ホモ重合体の反復、特に長さが6ヌクレオチドを超えるものを通じての正確な配列決定によってこの技術を改善することができる。
【０１１５】
本発明の別の局面は、特にヘテロ接合体の検出における、Sanger配列決定の使用に関する。多くの進歩にもかかわらず、正確なヘテロ接合体の検出のためにはジデオキシ-BigDye終結剤による配列決定化学の改善が必要である。一次データにおける均一なピーク高さの分布は、塩基の呼び出しおよびヘテロ接合体の検出の信頼度および精度を高くするものと一般に考えられている。Sanger配列決定における終結パターンは主として、修飾ヌクレオチドよりも天然ヌクレオチドを選択的に取り込みうるDNAポリメラーゼによる配列依存的なバイアスの取り込みによるものである(参照により本明細書に組み入れられるMetzker et al., 1998)。これらのバイアスの取り込みの影響は、色素-プライマー化学でよりも色素-終結剤化学で顕著である。これは、終結ヌクレオチドに結合された大きな蛍光色素構造の影響によるものであり、酵素活性を天然の基質のものに対して少なくとも10倍低減しうる。したがって、色素で標識された終結剤に向けてDNAポリメラーゼによるバイアスの取り込みの影響を低減することは、ヘテロ接合体の検出の改善をもたらしうる。本発明の修飾ヌクレオチド類似体は、同様にまたは天然のヌクレオチドよりも良好に取り込まれ、かくしてSanger配列決定における取り込みのバイアスを取り除くことによりこの技術を改善することができる。
【０１１６】
本発明の別の局面は、クローン的に増幅された鋳型および単一のDNA分子鋳型の使用に関する。NGS技術のフロントエンドは二つの陣営(camp): 単一のDNA分子からクローン的に増幅された鋳型および単一のDNA分子鋳型に分けることができる。DNAは固体表面に、プライマーを該表面に結合させ、標的核酸を該プライマーとハイブリダイズさせることにより(参照により本明細書に組み入れられるSouthern and Cummins, 1998, 米国特許第5,770,367号; Harris et al., 2008)、またはクローン的に増幅することで標的核酸を該表面に結合させ、プライマーを該標的核酸とハイブリダイズさせることにより(参照により本明細書に組み入れられるDressman et al., 2003; Margulies et al., 2005)固定化できるものと当技術分野において十分に認識されている。次いでDNAポリメラーゼを結合するために本発明においてどちらかの固定化の構成を使用して、CRT法またはピロ配列決定法のどちらかを開始することができる。
【０１１７】
CRT終結剤が適切に機能するためには、保護基は温和な条件の下で効率的に切断されなければならない。保護基の除去では一般に、強力な酸もしくは塩基による処理、触媒反応もしくは化学反応、またはこれらの方法の組み合わせのいずれかを伴う。これらの条件は、DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドをプライマーとする鋳型または固体支持体に対して反応性を示し、望ましくない結果をもたらしうる。光化学的な保護基の使用は、厳密な化学的処理に代わる魅力的な手段であり、非侵襲的な方法において採用することができる。
【０１１８】
2-ニトロベンジル、ベンジルオキシカルボニル、3-ニトロフェニル、フェナシル、3,5-ジメトキシベンゾイニル、2,4-ジニトロベンゼンスルフェニルおよびそれらの各誘導体を含むが、それに限定されない、いくつかの光除去可能な保護基がペプチド、多糖類およびヌクレオチドの合成に使用されている(参照により本明細書に組み入れられるPillai, 1980)。これらのうち、光感受性の2-ニトロベンジル保護基は成功裏に、ジリボヌクレオシド合成の場合リボヌクレオシドの2'-OHに適用されており(参照により本明細書に組み入れられるOhtsuka et al., 1974)、自動リボザイム合成ではリボホスホラミダイトの2'-OHに適用されており(参照により本明細書に組み入れられるChaulk and MacMillan, 1998)、Affymetrix化学ではオリゴヌクレオチド合成の場合ホスホラミダイトの3'-OHに適用されており(参照により本明細書に組み入れられるPease et al., 1994)、およびDNA配列決定用途の場合3'-OH基に適用されている(参照により本明細書に組み入れられるMetzker et al., 1994)。脱保護条件(紫外線>300 nm)の下で、2-ニトロベンジル基は、ピリミジンまたはプリン塩基のどちらにも影響を与えずに効率的に除去することができる(参照により組み入れられるPease et al., 1994およびBartholomew and Broom, 1975)。
【０１１９】
一つの局面において、本発明は、化学的に切断可能な可逆的終結剤の使用に関する。例えば、ベンジル保護基はその安定性ならびに接触水素化分解による温和かつ選択的な脱保護の簡便性の結果として有機合成に広く使用されている(参照により本明細書に組み入れられるGreen and Wuts, 1999)。中性条件の下で行うことができる水素化分解は、ヌクレオシド二リン酸、およびとりわけヌクレオシド三リン酸が酸性条件の下で分解するため、リン酸無水結合を含んだヌクレオシドと共に働く場合には好都合である(参照により本明細書に組み入れられるWu et al., 2004; Johnson et al., 2004)。パラジウムナノ粒子を用いた水素化分解による固相担持化合物からのベンジル保護基の除去(参照により本明細書に組み入れられるKanie et al., 2000)および固定化パラジウム触媒を有する微小流体素子にて行われる水素化(参照により本明細書に組み入れられるKobayashi et al. 2004)も従来のパラジウム触媒を用いた水素化分解に加えて報告されている。
【０１２０】
B. ポリメラーゼアッセイ法
「ポリメラーゼ終点アッセイ法」を用い取り込み効率について天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドが試験されている(参照により本明細書に組み入れられるWu et al., 2007)。このアッセイ法では、取り込み効率をマッチおよびミスマッチ鋳型塩基に関して調べる。取り込み効率は、化合物がプライマー-鋳型複合体の半分に取り込まれる濃度(IC50)を決定することにより測定される。化合物濃度の漸増による滴定を行って曲線を作出し、この曲線からIC50を決定することができる。
【０１２１】
鋳型DNAの配列は、どの化合物を試験するかに依って選択される。例えば、鋳型配列におけるプライマーの後の最初の照合塩基は、取り込み効率の測定時には化合物の相補体塩基であり、ミスマッチ識別特性の測定時には3種のミスマッチ塩基のうちの1つである。
【０１２２】
アニールされた反応液に対し、DNAポリメラーゼ(例えば、THERMINATOR(商標) DNAポリメラーゼ、0.25単位/反応、New England Biolabs)、1×Thermopol緩衝液および既知濃度の天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのどちらかを各10 μLの反応液に加え、75℃で10分間インキュベートし、氷上で冷却し、停止溶液(98%ホルムアミド: 10 mM Na2EDTA, pH = 8.0, 25 mg/ml Blue Dextran) 10 μLで反応停止する。停止した溶液を75℃にまで30秒間加熱してDNAを変性し、その後、氷上に置く。ABIモデル377 DNA配列決定装置を用い10% Long Ranger (Lonza)ポリアクリルアミドゲル上にて伸長産物を分析する。以下、実施例1にさらなる詳細を示す。
【０１２３】
図1では、THERMINATOR(商標) DNAポリメラーゼによる本明細書において開示のヌクレオチドの取り込みを天然のヌクレオチドと比較している。例えば、化合物3p065 (5-(α-イソプロピル-2-ニトロベンジルオキシメチル-2'-dCTP)は、その天然の類似体よりも低い濃度で50%の取り込みに達する(IC50 = 1.1±0.1 nM対3.0±0.6 nM)。色素で標識された化合物もTHERMINATOR(商標) DNAポリメラーゼで効率的に取り込まれ、例えば化合物6p038/6p017 5-(α-イソプロピル-2-ニトロベンジルオキシ)メチル-2'-dCTP-Cy5はIC50 = 5.1±1.4 nMを有する。表Aは、本明細書において記述する修飾ヌクレオチド類似体の多くに対するIC50濃度を示す。
【０１２４】
（表Ａ）ミスマッチ識別に及ぼすα-炭素の位置での置換の影響
2011529449.tif 000053
2011529449.tif 000054
2011529449.tif 000055
【０１２５】
C. ミスマッチ識別
2-ニトロベンジル基のα-炭素の位置での置換は切断反応の速度を増大しうることが報告されている(参照により本明細書に組み入れられるReichmanis et al., 1985; Cameron and Frechet, 1991; Hasan et al., 1997)。理論によって束縛されるわけではないが、本明細書において提示する結果は、2-ニトロベンジル基のα-炭素の位置での置換がまた、3'-非遮断ヌクレオチド三リン酸に対するDNA合成の終結に影響を与え、ミスマッチの取り込みに対する識別を改善しうることを示唆する。さらに、および以下でより詳細に論じる結果に基づき、2-ニトロベンジル基のα-炭素の置換の立体化学がミスマッチ識別の程度および切断反応の速度に大きな影響を与えうることが分かった。
【０１２６】
表1は、α-置換炭素の2つのジアステレオマー「ds1」および「ds2」とそれらの前駆体との間の比較を示す。ミスマッチ/マッチ比は、マッチした鋳型塩基およびミスマッチ鋳型塩基に対して正しい取り込みを識別するポリメラーゼの能力を表す。識別は、ミスマッチ/マッチ比が100 (2桁)以上である場合に十分であると考えられる。表1は、天然dGTPならびにC7-ヒドロキシメチル-dGTP類似体5p107、5p143-ds1および5p143-ds2の識別を示す。天然dGTPもC7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-2'-dGTP (5p107)もともに、それぞれ、10〜360および10〜250に及ぶミスマッチ/マッチ比を示し、これらの2つとも閾値の100倍未満である。しかしながら、イソプロピル基でのα-メチレン炭素の置換は、すべてのミスマッチ鋳型塩基に対して顕著にいっそう高い識別比をもたらす。5p143-ds1は5p143-ds2と比べて高いミスマッチ識別比を示す。これらのデータは、α-イソプロピル基の立体化学がミスマッチの取り込みに対する識別の度合いに影響を与えうるという証拠を提供する。類似の傾向がC7-ヒドロキシメチル-dATP類似体でも認められる。表1に示した化合物の場合、2-ニトロベンジル基のα-炭素の位置での置換は立体特異的にミスマッチの識別を増大する。
【０１２７】
（表１）ミスマッチ識別に及ぼすα-炭素の位置での置換の影響
2011529449.tif 000056
dGTP = 天然dGTP
5p107 = C7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-2'-dGTP
5p143 = C7-(α-イソプロピル-2-ニトロベンジルオキシ)メチル-2'-dGTP
【０１２８】
D. 終結
理論によって束縛されるわけではないが、少なくとも2つの要因、つまりa) 2-ニトロベンジル基のα-炭素の位置での置換、およびb) ベンジル環の2位での置換が単一の取り込み後のDNA合成の終結に通例影響を及ぼすことが分かった。表2は、自動ゲル電気泳動を用いてプライマー伸長産物を定量化することにより判定される「加重和」分析によるさまざまな置換の影響を示す。1.0の加重和は単一の取り込み後の完全な終結を表し、一方で1.0を超える値は+1位を越えた取り込み(例えばヌクレオチドの通読(read through))を示す。終結アッセイ法を標準化するため、所与の化合物の25×IC50値の濃度を使用する。このアッセイ法は、使用する鋳型がホモ重合体の反復であり、それによって所与のヌクレオチド化合物の多重取り込みを可能にすることを除き、ポリメラーゼ終点アッセイ法について上述したように行う。この例では、修飾dUTP類似体を天然dTTPと比較する。天然dTTPは25×そのIC50値でホモ重合体の反復鋳型の全長を伸長し、11個目の塩基を誤取り込みする(加重和 = 11)。化合物3p085 (2-ニトロベンジルオキシメチル-2'-dUTP)は、加重和3.7±0.1の終結度を示す。メチル基でのα-炭素の置換(2p043)は、終結をさらに改善し、加重和値を1.7±0.1まで低減する。完全な終結はα-イソプロピル置換(2p148)で達成され、加重和値1.0を示す。しかしながら、相補体塩基に対するIC50値は増大せず、より大きなイソプロピル置換は終結に有益な効果があるが、取り込み効率を損なわないことを示唆している。
【０１２９】
（表２）2-ニトロベンジル環のα-炭素の位置での置換も、ベンジル環の2位での置換もともに化合物の終結特性に影響を及ぼす
2011529449.tif 000057
【０１３０】
ベンジル環上の2位の置換もこれらの修飾ヌクレオチドの終結特性に影響を及ぼしうる。例えば、この位置からニトロ基を除去することで(化合物5p111)、α-イソプロピル置換類似体の場合の1.1にまで加重和値が増大する。2位のさまざまな置換を用いていくつかのdUTP類似体を合成し、α-炭素の位置にイソプロピル基がない場合の終結について特徴付けした。表2は、置換基のサイズおよび形状ならびに終結特性の改善が次第に増していくという一般的傾向を示し、25×IC50濃度で5p145 (WS=2.9)と6p010 (WS=1.7)とを比較している。
【０１３１】
E. UV-切断速度
類似体がプライマー鎖に取り込まれる際の終結性の置換2-ニトロベンジル基の、365 nmのUV光による切断は、次サイクルの取り込みの再開を可能にする。理論によって束縛されるわけではないが、少なくとも2つの要因、つまりa) 2-ニトロベンジル基のα-炭素置換の立体化学、およびb) ベンジル環上での置換が、取り込まれたヌクレオチド類似体のUV切断速度に通例影響を及ぼすことが分かった。マッチした鋳型上での取り込みを、1 μM濃度を用い上記のように行って、プライマー鎖を伸長する。各取り込み実験のために10個の同一の試験管を用い、その後、NaN3を終濃度50 mMまで加える。伸長されたプライマー反応物を、Wuら(2007, これは参照により本明細書に組み入れられる)により記述されているUV脱保護装置を用いて各種の時点の間365 nmの光に曝露し、ABモデル377 DNA配列決定装置を用いて分析する。定量的データを産物形成対曝露時間として直線的にプロットし、ヌクレオチド類似体の半分が切断される時点を、DT50値として算出する。表3に示されるように、立体化学はC7-ヒドロキシメチル-dATP類似体5p098-ds1および-ds2、6p057-ds1および-ds2、ならびに6p087-ds1および-ds2に対するUV切断の速度に影響を与える。例えば、これらの例に基づき、ds2類似体はds1類似体と比べて、速い切断速度(例えば、低いDT50値)を示す。さらに、ベンジル環上の4位でのメトキシ基の置換は、ds2類似体の場合だけではあるが、UV切断の速度をさらに増大する(例えば、5p098-ds2のDT50値は6p087-ds2の場合の1.9秒のそれと対比して3.3秒である)。表3に要約されている例に基づき、2-ニトロベンジル環のα-炭素の位置での置換は立体特異的にUV切断を増大する。
【０１３２】
（表３）2-ニトロベンジル環誘導体のUV切断速度
2011529449.tif 000058
【０１３３】
F. 化学的切断
一つの局面において、本発明は、化学的に切断可能な可逆的終結剤の使用に関する。例えば、ベンジル保護基はその安定性ならびに接触水素化分解による温和かつ選択的な脱保護の簡便性の結果として有機合成に広く使用されている(参照により本明細書に組み入れられるGreen and Wuts, 1999)。中性条件の下で行うことができる水素化分解は、ヌクレオシド二リン酸、およびとりわけヌクレオシド三リン酸が酸性条件の下で分解するため、リン酸無水結合を含んだヌクレオシドと共に働く場合には好都合である(参照により本明細書に組み入れられるWu et al., 2004; Johnson et al., 2004)。パラジウムナノ粒子を用いた水素化分解による固相担持化合物からのベンジル保護基の除去(参照により本明細書に組み入れられるKanie et al., 2000)および固定化パラジウム触媒を有する微小流体素子にて行われる水素化(参照により本明細書に組み入れられるKobayashi et al. 2004)も従来のパラジウム触媒を用いた水素化分解に加えて報告されている。接触水素化分解を用いた5-ベンジルオキシメチル-dU類似体の切断を含む、化学的に可逆な切断結果の例は、以下の実施例10に提供されている。
【実施例】
【０１３４】
IV. 実施例
以下の例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の例に開示された技術は、本発明者により本発明の実践において十分に機能することが発見された技術に相当し、かくしてその実践のために好ましい様式を構成するものと考えられうることを当業者は理解するはずである。しかしながら、当業者は本開示に照らして、開示された特定の態様において多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることができるものと理解するはずである。
【０１３５】
実施例1 - 方法および材料
ポリメラーゼアッセイ法
「ポリメラーゼ終点アッセイ法」を用い取り込み効率について天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドが試験されている(参照により本明細書に組み入れられるWu et al., 2007)。このアッセイ法では、取り込み効率をマッチおよびミスマッチ鋳型塩基に関して調べる。取り込み効率は、化合物がプライマー-鋳型複合体の半分に取り込まれる濃度(IC50)を決定することにより測定される。化合物濃度の漸増による滴定を行って曲線を作出し、この曲線からIC50を決定することができる。
【０１３６】
このアッセイ法は、初めに1×Thermopol緩衝液(20 mM Tris-HCl, pH 8.8; 10 mM (NH4)2SO4; 10 mM KCl; 2 mM MgSO4; 0.1% Triton X-100, New England BioLabs)中で5 nMのBODIPY-FL標識プライマーを40 nMの鋳型DNAとアニーリングさせることによって行われる。プライマーアニーリングを完了するための温度サイクルは、30秒間80℃、30秒間57℃、その後、4℃に冷却である。鋳型DNAの配列は、どの化合物を試験するかに依って選択される。例えば、鋳型配列におけるプライマーの後の最初の照合塩基は、取り込み効率の測定時には化合物の相補体塩基であり、ミスマッチ識別特性の測定時には3種のミスマッチ塩基のうちの1つである。
【０１３７】
アニールされた反応液に対し、DNAポリメラーゼ(例えば、THERMINATOR(商標) DNAポリメラーゼ、0.25単位/反応、New England Biolabs)、1×Thermopol緩衝液および既知濃度の天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのどちらかを各10 μLの反応液に加え、75℃で10分間インキュベートし、氷上で冷却し、停止溶液(98%ホルムアミド: 10 mM Na2EDTA, pH = 8.0, 25 mg/ml Blue Dextran) 10 μLで反応停止する。停止した溶液を75℃にまで30秒間加熱してDNAを変性し、その後、氷上に置く。ABIモデル377 DNA配列決定装置を用い10% Long Ranger (Lonza)ポリアクリルアミドゲル上にて伸長産物を分析する。定量的データを産物形成対化合物濃度の片対数プロットとして表示し、KaleidaGraphソフトウェア(Synergy Software)を用いてIC50を算出する。
【０１３８】
実施例2
α-置換2-ニトロベンジルアルコールの合成
(RS)-1-(2-ニトロフェニル)エタノールの合成
2011529449.tif 000059
スキーム1  (i) NaBH4、MeOH、1,4-ジオキサン、室温、100%。
(RS)-1-(2-ニトロフェニル)エタノール: 2-ニトロアセトフェノン(1.0g、6.06mmol)のメタノール(9mL)および1,4-ジオキサン(6mL)溶液に水素化ホウ素ナトリウム(0.69g、18.16mmol)を少しずつ加えた(Dong et al., 2005、参照により本明細書に組み入れられる)。混合物を室温で30分間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を酢酸アセチル(50mL)で希釈し、水(10mL)およびブライン(10mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、減圧濃縮してラセミ(RS)-1-(2-ニトロフェニル)エタノール(1.02g、100%)を得た。
2011529449.tif 000060
【０１３９】
(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)エタノールの合成
2011529449.tif 000061
スキーム2  (RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)エタノールの合成: (i) NaNO2、H2SO4、-2℃; 次にNaI、100℃、82%; (ii) NBS、過酸化ベンゾイル、CCl4、還流、45%; (iii) DMSO、NaHCO3、86℃、61%; (iv) Me2Zn、Ti(Oi-Pr)4、CH2Cl2、トルエン、0℃、48%。
4-ヨード-2-ニトロトルエン: 氷水浴中で冷却した4-メチル-3-ニトロアニリン(4.30g、28.26mmol)の水(40mL)懸濁液に98%硫酸(1.89mL)を慎重に加えた(Herm et al., 2002、参照により本明細書に組み入れられる)。塩化ナトリウムを氷水浴に加えて温度を-2℃に低下させ、NaNO2 (2.15g、31.10mmol)の水(10mL)溶液を、反応温度が0℃を超えない速度で加えた。添加の完了時点で混合物を-2℃で45分間攪拌した。次にジアゾ化合物のこの溶液をNaI (12.89g、86mmol)の沸騰溶液に(少しずつ)慎重に加えた(注意: 激しいガス放出)。添加の完了時点で反応混合物を室温に冷却し、塩化メチレン(50mL)で4回抽出した。一緒にした有機相を飽和NaHCO3 (40mL)および水(40mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して4-ヨード-2-ニトロトルエン(6.07g、82%)を得た。
2011529449.tif 000062
【０１４０】
1-ブロモメチル-4-ヨード-2-ニトロベンゼン: 4-ヨード-2-ニトロトルエン(4.63g、17.60mmol)のCCl4 (60mL)溶液にNBS (5.45g、30.62mmol)および過酸化ベンゾイル(75%水溶液、200mg、0.85mmol)を加えた。混合物を終夜加熱還流させた後、室温に冷却し、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して1-ブロモメチル-4-ヨード-2-ニトロベンゼン(2.71g、45%)を得た。
2011529449.tif 000063
【０１４１】
4-ヨード-2-ニトロベンズアルデヒド: 1-ブロモメチル-4-ヨード-2-ニトロベンゼン(2.25g、6.58mmol)の無水DMSO (150mL)溶液にNaHCO3 (3.32g、39.48mmol)を加えた。混合物を窒素雰囲気下86℃で19時間攪拌した後、室温に冷却し、水(300mL)で希釈し、塩化メチレンで4回(250mL)抽出した。一緒にした有機相をNa2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して4-ヨード-2-ニトロベンズアルデヒド(1.11g、61%)を得た。
2011529449.tif 000064
【０１４２】
(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)エタノール: チタン(IV)イソプロポキシド(1.2mL、4.04mmol)を無水ジクロロメタン(8mL)に窒素雰囲気下で溶解させた。溶液を0℃に冷却し、ジメチル亜鉛(トルエン中2M、8.67mL、17.34mmol)を滴下した。混合物を0℃で45分間攪拌した後、4-ヨード-2-ニトロベンズアルデヒド(800mg、2.89mmol)を加えた。混合物を0℃で36時間攪拌した後、1M HClで反応停止させ(注意: 激しいガス放出!)、エチルエーテル(50mL)で3回抽出した。一緒にした有機相を水(50mL)、飽和NaHCO3溶液(50mL)およびブライン(50mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製してラセミ(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)エタノール(408mg、48%)を得た。
2011529449.tif 000065
【０１４３】
(RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールおよび(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成
2011529449.tif 000066
スキーム3  (RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールおよび(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成。(i) PhMgCl、i-PrCHO、THF(無水)、-40℃〜室温、99%; (ii) (1S)-カンファン酸クロリド、ピリジン(無水)、室温; (iii) メタノールからの再結晶; (iv) K2CO3/MeOH、還流、97%。
(RS)-1-(2ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール: 窒素雰囲気下-40℃に冷却した、1-ヨード-2-ニトロベンゼン(1.12g、4.5mmol)の無水THF (15mL)溶液に、塩化フェニルマグネシウム溶液(THF中2M、2.4mL、4.8mmol)を、温度が-35℃を超えない速度で滴下した。添加の完了時点で混合物を-40℃で5分間攪拌した後、イソブチルアルデヒド(0.545mL、6.0mmol)を加えた。混合物を徐々に室温に昇温し、飽和塩化アンモニウム(6mL)で反応停止させ、水(80mL)に注ぎ、酢酸エチルで3回(100mL)抽出した。一緒にした有機相をブライン(80mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してラセミ(RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(0.876g、99%)を明黄色油状物として得た。
2011529449.tif 000067
【０１４４】
(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピル (1S)-カンファネート: (RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(2.18g、11.2mmol)の無水ピリジン(10mL)溶液に(1S)-カンファン酸クロリド(2.63g、12.2mmol)を加えた。混合物を窒素雰囲気下室温で18時間攪拌した後、減圧濃縮して粗製の(RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピル (1S)-カンファネート(ジアステレオマーの1:1混合物)を得た。カンファネートを沸騰メタノール(100mL)に溶解させ、溶液を室温に冷却し、終夜放置した。形成された結晶を濾取し、沸騰メタノール(80mL)に再溶解させ、溶液を室温に冷却し、終夜放置した。形成された結晶を濾取して純粋な(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピル (1S)-カンファネート(0.76g、36%)を得た。
2011529449.tif 000068
【０１４５】
(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピル (1S)-カンファネートのX線結晶構造解析データ: C20H25NO6、M=375.41、無色プレート、0.26x0.24x0.10mm3、斜方晶、空間群P212121(No. 19)、a=11.9268(15)、b=11.9812(14)、c=13.5488(16)Å、V=1936.1(4)Å3、Z=4、Dc=1.288g/cm3、F000=800、MWPC面積検出器、CuKα線、λ=1.54178Å、T=110(2)K、2θmax=120.0°、収集反射数22896、ユニーク反射数2665(Rint=0.0462)。最終GooF=1.009、R1=0.0219、wR2=0.0554、R指数は反射数2629とI>2σ(I)(F2に対する精密化)に基づく、パラメータ数245、制限数0。適用されるLpおよび吸収補正μ=0.787mm-1。絶対構造パラメータ=0.09(5) (Flack, 1983、参照により本明細書に組み入れられる)。図2を参照。
【０１４６】
(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール: (S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピル (1S)-カンファネート(0.717g、1.90mmol)を熱メタノール(40mL)に溶解させ、K2CO3 (0.380g、2.74mmol)を加えた。混合物を1時間加熱還流させた後、冷却し、減圧濃縮し、ジエチルエーテル(100mL)で希釈した。有機相を水(20mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(0.360g、97%)を明黄色油状物として得た。1H NMRはラセミアルコールのそれと同一であった。
【０１４７】
(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール、(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールおよび(S)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成
2011529449.tif 000069
スキーム4  (RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール、(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールおよび(S)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成。(i) NaNO2、AcOH、H2SO4、-5〜0℃; NaI、100℃、99%; (ii) PhMgCl、i-PrCHO、THF(無水)、-40℃〜室温、80%; (iii) (1S)-カンファン酸クロリド、DMAP、CH2Cl2(無水)、室温、84%; (iv) メタノールまたはイソプロパノールからの再結晶; (v) K2CO3、MeOH、還流、100%。
1,4-ジヨード-2-ニトロベンゼン: 4-ヨード-2-ニトロアニリン(6.60g、0.025mol)を水(19mL)および氷酢酸(17.5mL)に懸濁させた(Sapountzis et al., 2005、参照により本明細書に組み入れられる)。混合物を0℃に冷却した。硫酸(17.5mL、0.328mol)を慎重に加えた。混合物を-5℃に冷却し、NaNO2 (1.90g、0.028mol)の水(7.5mL)溶液を、温度が0℃を超えない速度で滴下した。添加の完了時点で混合物を30分間攪拌し、ヨウ化ナトリウム(22.33g、0.149mol)の水(7.5mL)中沸騰溶液に少しずつ加えた(注意: 激しい窒素放出!)。得られた混合物を60℃に1時間維持した後、室温に冷却し、続いてジエチルエーテル(500mL)を加えた。エーテル溶液を分離し、水(150mL)で2回、飽和NaHCO3 (150mL)で1回洗浄した。溶液をNa2SO4で乾燥させ、減圧濃縮して固体を得て、これをエタノールから再結晶させて1,4-ジヨード-2-ニトロベンゼン(9.30g、99%)を得た。
2011529449.tif 000070
【０１４８】
(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール: 1,4-ジヨード-2-ニトロベンゼン(2.24g、6.0mmol)の無水THF (20mL)溶液に、窒素雰囲気下-40℃で、臭化フェニルマグネシウム(THF中2M、3.2mL、6.4mmol)を、温度が-35℃を超えない速度で滴下した。添加の完了時点で混合物を5分間攪拌した後、イソブチルアルデヒド(0.726mL、8.0mmol)を加えた。混合物を徐々に室温に昇温し、飽和NH4Cl (8mL)で反応停止させた後、水(100mL)に注いだ。混合物を酢酸エチル(150mL)で3回抽出し、一緒にした有機相をブライン(100mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してラセミ(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール(1.54g、80%)を明黄色油状物として得た。
2011529449.tif 000071
【０１４９】
(R)-および(S)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピル (1S)-カンファネート: 窒素雰囲気下、(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール(1.10g、3.41mmol)およびDMAP (0.50g、4.09mmol)の無水ジクロロメタン(30mL)溶液に(1S)-カンファン酸クロリド(0.89g、4.09mmol)を加えた。混合物を室温で1.5時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(1.44g、84%、ジアステレオマーの1:1混合物)を固体として得て、これを沸騰メタノール(70mL)に溶解させ、室温で終夜放置した。形成された結晶を濾過して純粋な(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(0.465g、65%)を得た。母液を蒸発させ、残渣を沸騰イソプロパノール(40mL)に溶解させ、室温で終夜放置した。形成された結晶を濾過し、沸騰イソプロパノール(20mL)から再結晶して純粋な(S)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(0.288g、40%)を得た。
2011529449.tif 000072
2011529449.tif 000073
【０１５０】
(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロピル (1S)-カンファネートのX線結晶構造解析データ: lg01aの結晶データ: C20H24INO6、M=501.30、無色プレート、0.30x0.20x0.20mm3、単斜晶、空間群P21 (No. 4)、a=7.5810(15)、b=12.446(3)、c=11.722(3)Å、β=107.613(10)°、V=1054.2(4)Å3、Z=2、Dc=1.579g/cm3、F000=504、CCD面積検出器、MoKα線、λ=0.71073Å、T=110(2)K、2θmax=50.0°、収集反射数24239、ユニーク反射数3558(Rint=0.0302)。最終GooF=1.010、R1=0.0123、wR2=0.0316、R指数は反射数3520とI>2σ(I)(F2に対する精密化)に基づく、パラメータ数253、制限数3。適用されるLpおよび吸収補正μ=1.554mm-1。絶対構造パラメータ=0.020(9) (Flack, 1983、参照により本明細書に組み入れられる)。図3を参照されたい。
【０１５１】
(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール: (R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(0.41g、0.82mmol)を熱メタノール(60mL)に溶解させ、K2CO3 (0.22g、1.58mmol)を加えた。混合物を1時間加熱還流させ、室温に冷却し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール(0.262g、100%)を明黄色油状物として得た。1H NMRはラセミアルコールのそれと同一であった。
【０１５２】
(S)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール: (S)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(0.288g、0.57mmol)を熱メタノール(40mL)に溶解させ、K2CO3 (0.15g、1.1mmol)を加えた。混合物を1時間加熱還流させ、室温に冷却し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して(S)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール(0.184g、100%)を明黄色油状物として得た。1H NMRはラセミアルコールのそれと同一であった。
【０１５３】
(RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールおよび(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成
2011529449.tif 000074
スキーム5  (RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールおよび(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成。(i) PhMgCl、t-BuCHO、THF(無水)、-40℃〜室温、72%; (ii) (1S)-カンファン酸クロリド、ピリジン(無水)、室温、81%; (iii) メタノールからの再結晶; (iv) K2CO3、MeOH、還流、92%。
(RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール: 窒素雰囲気下、1-ヨード-2-ニトロベンゼン(3.0g、12mmol)の無水THF (30mL)溶液を-40℃に冷却した後、塩化フェニルマグネシウム(THF中2M、7.2mL、14.5mmol)を、温度が-35℃を超えない速度で滴下した。混合物を-40℃で20分間攪拌した後、トリメチルアセトアルデヒド(1.85mL、16.8mmol)を滴下し、混合物を-40℃でさらに30分間攪拌した。混合物を徐々に室温に昇温し、飽和塩化アンモニウム(60mL)で反応停止させ、水(60mL)に注ぎ、酢酸エチルで3回(各60mL)抽出した。一緒にした有機相をNa2SO4で乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して(RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール(1.82g、72%)を黄色固体として得た。
2011529449.tif 000075
【０１５４】
(RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピル (1S)-カンファネート: 窒素雰囲気下、(RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール(2.71g、13mmol)およびDMAP (80mg、0.65mmol)の無水ピリジン(50mL)溶液に(1S)-カンファン酸クロリド(3.37g、15.6mmol)を加えた。混合物を室温で24時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を酢酸エチル(50mL)に溶解させ、0.5M HCl (20mL)で2回、続いて飽和NaHCO3溶液(20mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して(RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(4.11g、81%、ジアステレオマーの1:1混合物)を黄色固体として得た。
2011529449.tif 000076
【０１５５】
(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピル (1S)-カンファネート: メタノールからの(RS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(4.57g)の繰り返しの再結晶の後に純粋な単一ジアステレオマー(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(0.79g、35%)を得た。単一ジアステレオマーカンファネートの絶対配置は未決定である。
2011529449.tif 000077
【０１５６】
(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール: 単一ジアステレオマー(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(658mg、1.68mmol)およびK2CO3 (241mg、1.74mmol)のメタノール(23mL)中混合物を30分間加熱還流させた。水(5mL)を加え、溶液を1M HClでpH 7に中和した。溶媒を減圧除去し、残渣を酢酸エチル(20mL)および水(10mL)の混合物中に取り込んだ。有機相を分離し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して単一鏡像異性体(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール(325mg、92%)を明黄色油状物として得た。1H NMRはラセミアルコールのそれと同一であった。単一鏡像異性体アルコールの絶対配置は未決定である。
【０１５７】
(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールおよび(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成
2011529449.tif 000078
スキーム6  (RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールおよび(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノールの合成。(i) PhMgCl、t-BuCHO、THF(無水)、-40℃〜室温、81%; (ii) (1S)-カンファン酸クロリド、DMAP、CH2Cl2(無水)、室温、88%; (iii) メタノールからの再結晶; (iv) K2CO3、MeOH、還流、98%。
(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール: 窒素雰囲気下、1,4-ジヨード-2-ニトロベンゼン(3.0g、8.0mmol)の無水THF (20mL)溶液を-40℃に冷却した後、塩化フェニルマグネシウム溶液(THF中2M、4.8mL、9.6mmol)を、温度が-35℃を超えない速度で滴下した。添加の完了時点で混合物を10分間攪拌した後、トリメチルアセトアルデヒド(1.2mL、11.2mmol)を加え、混合物を-40℃で30分間攪拌した。混合物を徐々に室温に昇温し、飽和塩化アンモニウム(60mL)で反応停止させ、水(120mL)に注ぎ、酢酸エチルで2回(各60mL)抽出した。一緒にした有機相を水(60mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してラセミ(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール(2.17g、81%)を褐色油状物として得た。
2011529449.tif 000079
【０１５８】
(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピル (1S)-カンファネート: 窒素雰囲気下、(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール(2.17g、6.47mmol)およびDMAP (1.18g、9.7mmol)の無水ジクロロメタン(50mL)溶液に(1S)-カンファン酸クロリド(1.68g、7.77mmol)を加えた。混合物を室温で終夜攪拌した後、飽和NaHCO3溶液(60mL)および水(60mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して(RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(2.94g、88%、ジアステレオマーの1:1混合物)を白色固体として得た。
2011529449.tif 000080
【０１５９】
(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピル (1S)-カンファネート: (RS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(2.07g)を沸騰メタノール(100mL)に溶解させ、室温で2日間放置した。形成された結晶を濾過して純粋な単一ジアステレオマー(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(0.409g、39%)を得た。単一ジアステレオマーカンファネートの絶対配置は未決定である。
2011529449.tif 000081
【０１６０】
(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール: 単一ジアステレオマー(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピル (1S)-カンファネート(409mg、0.79mmol)およびK2CO3 (110mg、0.8mmol)のメタノール(15mL)中混合物を30分間加熱還流させた。水(5mL)を加え、溶液を1M HClでpH 7に中和した。溶媒を減圧除去し、残渣を酢酸エチル(30mL)および水(10mL)の混合物中に取り込んだ。有機相を分離し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して単一鏡像異性体(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール(260mg、98%)を明黄色油状物として得た。1H NMRはラセミアルコールのそれと同一であった。単一鏡像異性体アルコールの絶対配置は未決定である。
【０１６１】
(±)-1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成
2011529449.tif 000082
スキーム7  ラセミ1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成。(i) 亜硝酸イソアミル、ジヨードメタン、105℃、52%; (ii) PhMgBr、無水THF、-45℃; 次にi-PrCHO、ワークアップ、30%。
1-ヨード-2,2-ジニトロベンゼン: 2,6-ジニトロアニリン(4.00g、0.021mol)のジヨードメタン(24mL、0.297mol)懸濁液に亜硝酸イソアミル(15mL、0.112mol)を加えた(Smith et al., 1990、参照により本明細書に組み入れられる)。混合物を室温で1時間攪拌した後、105℃で8時間加熱した。過剰のジヨードメタンを高真空除去した。残渣を酢酸アセチル(10mL)で希釈した。シリカ(約30mL、メッシュ230〜400Å)を加え、混合物を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して1-ヨード-2,6-ジニトロベンゼン(3.21g、52%)を得た。
2011529449.tif 000083
【０１６２】
(±)-1-(2,2-ジニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール: 窒素雰囲気下-53℃で冷却した(ドライアイス-イソプロパノール浴)、1-ヨード-2,6-ジニトロベンゼン(1.55g、5.27mmol)の無水テトラヒドロフラン(18mL)溶液に、臭化フェニルマグネシウム(THF中2M、3.16mL、6.32mmol)を、温度を-45℃以下に維持する速度で加えた。添加の完了時点で混合物を5分間攪拌した後、イソブチルアルデヒド(0.957mL、10.54mmol)を加えた。混合物を徐々に室温に昇温した後、飽和NH4Cl (5mL)で反応停止させ、水(50mL)/ジクロロメタン(100mL)に注いだ。有機層を分離し、水層をジクロロメタン(各50mL)で3回抽出した。一緒にした有機抽出物を水(20mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してラセミ(RS)-1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール(0.375g、30%)を明黄色油状物として得た。
2011529449.tif 000084
【０１６３】
(±)-1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成
2011529449.tif 000085
スキーム8  1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成。(i) PhMgCl、無水THF、-40℃; 次にi-PrCHO、ワークアップ、67%。
(±)-1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール: 窒素雰囲気下-45℃で冷却した(ドライアイス-イソプロパノール浴)、4-ヨード-2-ニトロアニソール(2.79g、10.00mmol)の無水テトラヒドロフラン(20mL)溶液に、塩化フェニルマグネシウム(THF中2M、6mL、6.32mmol)を、温度を-40℃以下に維持する速度で加えた。添加の完了時点で混合物を5分間攪拌した後、イソブチルアルデヒド(1.816mL、20.00mmol)を加えた。混合物を徐々に室温に昇温した後、飽和NH4Cl (5mL)で反応停止させ、水(30mL)/ジクロロメタン(100mL)に注いだ。有機層を分離し、水層をジクロロメタン(各50mL)で3回抽出した。一緒にした有機抽出物を無水Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してラセミ(RS)-1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール(1.502g、30%)を黄色油状物として得た。
2011529449.tif 000086
【０１６４】
(±)-1-(5-シアノ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成
2011529449.tif 000087
スキーム9  ラセミ1-(5-シアノ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノールの合成。(i) NaNO2/H2SO4、0℃、1時間、次にNaNO2/CuSO4、100℃、35%; (ii) PhMgCl、無水THF、-40℃; 次にi-PrCHO、ワークアップ、30%。
3-ヨード-4-ニトロベンゾニトリル: 0℃に冷却した(氷水-NaCl浴)、4-アミノ-3-ヨードベンゼン(2.44g、10.00mmol)の硫酸水溶液(2M、50mL)中懸濁液に、亜硝酸ナトリウム(1.656g、24.00mol)の水(6mL)溶液を、反応混合物の温度が0℃を超えない速度で加えた。添加の完了時点で混合物を1時間(または透明になるまで)攪拌した後、亜硝酸ナトリウム(13.8g、200mmol)およびCuSO4・5H2O (0.12g、0.05mmol)の熱溶液にそれを数回に分けて移した(注意: 激しいガス放出!)。移動の完了時点で混合物を30分間攪拌還流させた後、室温に冷却し、ジクロロメタン(各100mL)で3回抽出した。一緒にした抽出物をNa2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカ(約30mL、メッシュ230〜400Å)と混合し、カラムクロマトグラフィーで精製して3-ヨード-4-ニトロベンゾニトリル(0.95g、35%)を得た。
2011529449.tif 000088
【０１６５】
(±)-1-(5-シアノ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール: 窒素雰囲気下-45℃で冷却した(ドライアイス-イソプロパノール浴)、3-ヨード-4-ニトロベンゾニトリル(314mg、1.14mmol)の無水テトラヒドロフラン(5.5mL)溶液に、臭化フェニルマグネシウム(THF中2M、3.16mL、6.32mmol)を、温度を-40℃以下に維持する速度で加えた。添加の完了時点で混合物を5分間攪拌した後、イソブチルアルデヒド(0.957mL、10.54mmol)を加えた。混合物を徐々に室温に昇温した後、飽和NH4Cl (2mL)で反応停止させ、水(50mL)/ジクロロメタン(50mL)に注いだ。有機層を分離し、水層をジクロロメタン(各25mL)で3回抽出した。一緒にした有機抽出物を無水Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してラセミ(RS)-1-(5-シアノ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール(57mg、23%)を明黄色油状物として得た。
2011529449.tif 000089
【０１６６】
実施例3
α-イソプロピル基を有するデオキシウリジンおよびデオキシシチジン類似体の合成
5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000090
スキーム10  5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) (S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール、未希釈、108〜112℃、4%; (ii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(dU.x1): 化合物dU.x0 (250mg、0.385mmol)および(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(300mg、1.54mmol)を窒素雰囲気下105〜110℃で30分間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量の酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジンdU.x1 (6mg、4%)を得た。(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(39mg、18%)および3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(36mg、14%)も反応により得られた。
2011529449.tif 000091
【０１６７】
5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(WW3p063): 化合物dU.x1 (14mg、0.03mmol)およびプロトンスポンジ(13mg、0.06mmol)のリン酸トリメチル(0.3mL)溶液にPOCl3 (4μL、0.045mmol)を0℃で加え、1時間攪拌した。追加のPOCl3 (4μL、0.045mmol)を加え、混合物をさらに3時間攪拌した。トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(72mg、0.15mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(30μL)の無水DMF (0.3mL)溶液を加えた。5分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 5mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、凍結乾燥により乾固させた。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、流速4.5mL/分のNH4HCO3の直線勾配(240分で50mM〜500mM)を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x20cm)上でのアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートWW3p063 (10mg、46%)を白色綿毛状固体として得た。
2011529449.tif 000092
【０１６８】
5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000093
スキーム11  5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) (S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール、未希釈、108〜112℃、14%; (ii) 2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、DAMP、Et3N、CH2Cl2(無水)、室温、42%; (iii) NH3 (1,4-ジオキサン中0.5M)、85〜90℃、61%; (iv) n-Bu4NF、THF、室温、96%; (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(dU.x2): 化合物dU.x0 (250mg、0.385mmol)および(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(300mg、1.54mmol)を窒素雰囲気下105〜110℃で30分間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量の酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジンdU.x2 (36mg、14%)を得た。(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(39mg、18%)および5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(6mg、4%)も反応により得られた。
2011529449.tif 000094
【０１６９】
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-O4-(2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニル)-2'-デオキシウリジン(dU.x3): 化合物dU.x2 (90mg、0.136mmol)、DMAP (17mg、0.140mmol)およびトリエチルアミン(0.172mL、1.224mmol)の無水ジクロロメタン(6mL)溶液に2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド(1.57g、5.19mmol)を加えた。混合物を窒素雰囲気下室温で17時間攪拌した後、減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-4-O-(2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニル)-2'-デオキシウリジンdU.x3 (54mg、42%)を得た。
2011529449.tif 000095
【０１７０】
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロポキシ]メチル-2'-デオキシシチジン(dC.x4): 化合物dU.x3 (47mg、0.051mmol)の無水1,4-ジオキサン(3mL)溶液にアンモニア溶液(3mL、ジオキサン中0.5M、1.50mmol)を加えた。混合物を封管に移し、85〜90℃で1.5時間加熱した。混合物を室温に冷却し、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロポキシ]メチル-2'-デオキシシチジンdC.x4 (20mg、61%)をワックス状固体として得た。
2011529449.tif 000096
【０１７１】
5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン(dC.x5): 化合物dC.x4 (16mg、0.024mmol)のTHF (1mL)溶液にフッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム三水和物(31mg、0.096mmol)のTHF (2mL)溶液を加えた。混合物を室温で30分間攪拌し、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジンdC.x5 (10mg、96%)をワックス状固体として得た。
2011529449.tif 000097
【０１７２】
5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-ホスフェート(WW3p065): 化合物dU.x5 (10mg、0.023mmol)およびプロトンスポンジ(10mg、0.046mmol)のリン酸トリメチル(0.3mL)溶液にPOCl3 (3μL、0.034mmol)を0℃で加え、2時間攪拌した。追加のPOCl3 (3μL、0.034mmol)を加え、混合物をさらに1時間攪拌した。トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(55mg、0.115mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(30μL)の無水DMF (0.25mL)溶液を加えた。5分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 5mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、凍結乾燥により乾固させた。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、流速4.5mL/分のNH4HCO3の直線勾配(240分で50mM〜500mM)を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x20cm)上でのアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-[(S)-1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートWW3p065 (16mg、96%)を白色綿毛状固体として得た。
2011529449.tif 000098
【０１７３】
実施例4
α-tert-ブチル基を有するデオキシウリジンおよびデオキシシチジン類似体の合成
5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000099
スキーム12  5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) (RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、未希釈、108〜115℃、4%; (ii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(dU.x4): 化合物dU.x0 (520mg、0.802mmol)およびエナンチオピュアな(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール(580mg、2.77mmol)を窒素雰囲気下108〜115℃で1時間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量の酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(dU.x4)(16mg、4%)を得た。(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(78mg、17%)および3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(115mg、21%)も反応により得られた。
2011529449.tif 000100
【０１７４】
5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(WW3p075): 化合物dU.x4 (16mg、0.035mmol)およびプロトンスポンジ(15mg、0.07mmol)のリン酸トリメチル(0.3mL)溶液にPOCl3 (5μL、0.053mmol)を0℃で加え、2時間攪拌した。追加のPOCl3 (3μL、0.032mmol)を加え、混合物をさらに1時間攪拌した。トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(83mg、0.175mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(35μL)の無水DMF (0.35mL)溶液を加えた。5分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 5mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、凍結乾燥により乾固させた。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、流速4.5mL/分のNH4HCO3の直線勾配(240分で50mM〜500mM)を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x20cm)上でのアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートWW3p075 (14mg、53%)を白色綿毛状固体として得た。
2011529449.tif 000101
【０１７５】
5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000102
スキーム13  5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) (S)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、未希釈、108〜115℃、21%; (ii) 2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド(TPSCl)、DMAP、Et3N、CH2Cl2(無水)、室温、31%; (iii) NH3 (1,4-ジオキサン中0.5M)、85〜90℃、61%; (iv) n-Bu4NF、THF、室温、96%; (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(dU.x5): 化合物dU.x0 (520mg、0.802mmol)およびエナンチオピュアな(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール(580mg、2.77mmol)を窒素雰囲気下108〜115℃で1時間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量の酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジンdU.x5 (115mg、21%)を得た。(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(78mg、17%)および5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(16mg、4%)も反応により得られた。
2011529449.tif 000103
【０１７６】
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-O4-(2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニル)-2'-デオキシウリジン(dU.x6): dU.x5 (110mg、0.16mmol)、DMAP (20mg、0.17mmol)およびトリエチルアミン(63μL、0.45mmol)の無水ジクロロメタン(3mL)溶液に2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド(61mg、0.20mmol)を加えた。混合物を窒素雰囲気下室温で36時間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-O4-(2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニル)-2'-デオキシウリジンdU.x6 (47mg、31%)を得た。
2011529449.tif 000104
【０１７７】
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン(dC.x6): 化合物dU.x6 (47mg、0.050mmol)の無水1,4-ジオキサン(2mL)溶液にアンモニア溶液(2mL、ジオキサン中0.5M)を加えた。混合物を封管に移し、92℃で10時間加熱した。混合物を室温に冷却し、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジンdC.x6 (31mg、91%)を得た。
2011529449.tif 000105
【０１７８】
5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン(dC.x7): 化合物dC.x6 (20mg、0.03mmol)のTHF (2mL)溶液にフッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム三水和物(28mg、0.09mmol)のTHF (1mL)溶液を加えた。混合物を室温で30分間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジンdC.x7 (11mg、82%)を得た。
2011529449.tif 000106
【０１７９】
5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'トリホスフェート(WW3p085): 化合物dU.x7 (11mg、0.025mmol)およびプロトンスポンジ(10.5mg、0.049mmol)のリン酸トリメチル(0.3mL)溶液にPOCl3 (3.5μL、0.038mmol)を0℃で加え、2時間攪拌した。追加のPOCl3 (3.5μL、0.038mmol)を加え、混合物をさらに1時間攪拌した。トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(59mg、0.125mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(30μL)の無水DMF (0.25mL)溶液を加えた。5分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 5mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、凍結乾燥により乾固させた。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、流速4.5mL/分のNH4HCO3の直線勾配(240分で50mM〜500mM)を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x20cm)上でのアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-[(RまたはS)-1-(2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートWW3p085 (12mg、65%)を白色綿毛状固体として得た。
2011529449.tif 000107
【０１８０】
実施例5
α-イソプロピル基を有する色素結合デオキシウリジンおよびデオキシシチジン類似体の合成
6-JOE標識5-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000108
スキーム14  6-JOE標識5-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) (R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール、未希釈、108〜112℃、9%; (ii) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4 (0)、CuI、Et3N、DMF(無水)、86%; (iii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; NH4OH; (iv) 6-JOE-SE、0.1M Na2CO3/NaHCO3緩衝液(pH 9.2)。
5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチルプロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(dU.y1): 化合物dU.x0 (775mg、1.19mmol)およびエナンチオピュアな(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール(1.22g、3.80mmol)を窒素雰囲気下108〜112℃で45分間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量の酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(dU.y1)(60mg、9%)を得た。(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(90mg、11%)および3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(194mg、21%)も反応により得られた。
2011529449.tif 000109
【０１８１】
5-{(R)-1-[4-(3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシウリジン(dU.y2): 化合物dU.y1 (60mg、0.11mmol)、N-プロパルギルトリフルオロアセチルアミド(48mg、0.32mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)-パラジウム(0)(12mg、0.01mmol)、CuI (4mg、0.02mmol)およびEt3N (30μL、0.21mmol)の無水DMF (5mL)溶液を室温で4.5時間攪拌した。メタノール(4mL)および塩化メチレン(4mL)を加えた後、炭酸水素ナトリウム(49mg、0.58mmol)を加えた。混合物をさらに1時間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-{(R)-1-[4-(3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシウリジンdU.y2 (54mg、86%)を得た。
2011529449.tif 000110
【０１８２】
5-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(dU.y3): 化合物dU.y2 (18mg、0.03mmol)およびプロトンスポンジ(13mg、0.06mmol)のリン酸トリメチル(0.3mL)溶液にPOCl3 (6μL、0.06mmol)を0℃で加え、2時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(73mg、0.15mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(30μL)の無水DMF (0.3mL)溶液を加えた。5分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 5mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、凍結乾燥により乾固させた。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、溶液の一部をPerkin Elmer OD-300 C18カラム(4.6x250mm)を使用する逆相HPLCにより精製して5-{(R)-1-[4-(3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシ-ウリジン-5'-トリホスフェートを得た。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)(pH 7.0); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。次に精製トリホスフェートを室温で濃水酸化アンモニウム(27%)により2時間処理して5-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートdU.y3を得た。
2011529449.tif 000111
【０１８３】
6-JOE標識5-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(WW3p024): トリホスフェートdU.y3 (0.31μmol)のNa2CO3/NaHCO3緩衝液(0.1M、pH 9.2; 180μL)中溶液に6-JOE-SE (0.625mg、1μmol)の無水DMSO (25μL)溶液を加え、室温で1時間インキュベートした。Perkin Elmer OD-300 C18カラム(4.6x250mm)を使用する逆相HPLCで反応液を精製して6-JOE標識トリホスフェートWW3p024を得た。移動相: A、水中100mM TEAA (pH 7.0); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。WW3p024をDNAポリメラーゼによるその取り込み、およびその光脱保護により特徴づけた。
【０１８４】
Cy5標識5-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000112
スキーム15  Cy5標識5-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) (R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール、未希釈、108〜112℃、21%; (ii) TPSCl、DMAP、Et3N、CH2Cl2(無水)、室温; (iii) NH3、1,4-ジオキサン、92〜94℃、2工程で76%; (iv) n-Bu4NF、THF、室温、80%; (v) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4 (0)、CuI、Et3N、DMF(無水)、99%; (vi) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; NH4OH;
2011529449.tif 000113
スキーム16  (vii) Cy5モノNHS、0.1M Na2CO3/NaHCO3緩衝液、pH 9.2。
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-エチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(dU.y4): 化合物dU.x0 (775mg、1.19mmol)およびエナンチオピュアな(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-1-プロパノール(1.22g、3.80mmol)を窒素雰囲気下108〜112℃で45分間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量の酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジンdU.y4 (194mg、21%)を得た。(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(90mg、11%)および5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(60mg、9%)も反応により得られた。
2011529449.tif 000114
【０１８５】
3',5-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン(dC.y5): 化合物dU.y4 (0.256g、0.32mmol)、DMAP (23mg、0.21mmol)およびトリエチルアミン(1.138mL、8.10mmol)の無水ジクロロメタン(14mL)溶液に2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド(1.57g、5.19mmol)を加えた。混合物を窒素雰囲気下室温で16時間攪拌した後、減圧濃縮した。アンモニア(ジオキサン中0.5M、24mL、12.0mmol)を加え、混合物を封管に移し、92〜94℃で4時間加熱した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して3',5-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジンdC.y5 (192mg、76%)を得た。
2011529449.tif 000115
【０１８６】
5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジンdC.y6: 化合物dC.y5 (192mg、0.24mmol)のTHF (8mL)溶液にフッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム三水和物(112mg、0.36mmol)のTHF (2mL)溶液を加えた。混合物を室温で45分間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジンdC.y6 (110mg、80%)を得た。
2011529449.tif 000116
【０１８７】
5-{(R)-1-[4-(3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシシチジン(dC.y7): 化合物dC.y6 (110mg、0.20mmol)、N-プロパルギルトリフルオロアセチルアミド(88mg、0.59mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)-パラジウム(0)(23mg、0.02mmol)、CuI (7mg、0.04mmol)およびEt3N (0.11mL、0.78mmol)の無水DMF (4mL)溶液を室温で4.5時間攪拌した。メタノール(4mL)および塩化メチレン(4mL)を加えた後、炭酸水素ナトリウム(90mg、1.07mmol)を加えた。混合物をさらに1時間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-{(R)-1-[4-(3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシシチジンdC.y7 (112mg、99%)を得た。
2011529449.tif 000117
【０１８８】
5-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェート(dC.y8): 化合物dC.y7 (19mg、0.03mmol)およびプロトンスポンジ(14mg、0.06mmol)のリン酸トリメチル(0.3mL)溶液にPOCl3 (6μL、0.06mmol)を0℃で加え、2時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(76mg、0.16mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(32μL)の無水DMF (0.32mL)溶液を加えた。5分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 5mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、25℃で減圧濃縮した。残渣を水(2mL)に溶解させ、濾過し、Perkin Elmer OD-300 C18カラム(4.6x250mm)を使用する逆相HPLCにより精製して5-{(R)-1-[4-(3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートを得た。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)(pH 7.0); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。次に精製トリホスフェートを室温で濃水酸化アンモニウム(27%)により2時間処理して5-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートdC.y8を得た。
【０１８９】
Cy5標識5-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェート(WW3p117): トリホスフェートdC.y8 (0.31μmol)のNa2CO3/NaHCO3緩衝液(0.1M、pH 9.2; 100μL)中溶液にCy5モノNHS (1mg、1.26μmol)の無水DMSO (40μL)溶液を加え、室温で1時間放置した。Perkin Elmer OD-300 C18カラム(4.6x250mm)を使用する逆相HPLCで反応液を精製してCy5標識トリホスフェートWW3p117を得た。移動相: A、水中100mM TEAA (pH 7.0); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０１９０】
実施例6
α-tert-ブチル基を有する色素結合デオキシウリジンおよびデオキシシチジン類似体の合成
6-TAMRA標識5-{(RまたはS)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2,2-ジメチル-プロポキシ}メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000118
スキーム17  6-TAMRA標識5-{(RまたはS)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2,2-ジメチル-プロポキシ}メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) エナンチオピュアな(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール、未希釈、108〜115℃、28%; (ii) TPSCl、DMAP、CH2Cl2(無水)、室温、54%; (iii) NH3、1,4-ジオキサン、96℃、65%; (iv) n-Bu4NF、THF、室温、73%; (v) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4 (0)、CuI、Et3N、DMF(無水)、85%;
2011529449.tif 000119
スキーム18  (vi) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; NH4OH; (vii) 6-TAMRA-SE、0.1M Na2CO3/NaHCO3緩衝液、pH 9.2。
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(dU.z1): 化合物dU.x0 (688mg、1.06mmol)およびエナンチオピュアな(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-1-プロパノール(889mg、2.65mmol)を窒素雰囲気下108〜115℃で1時間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量の酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]-メチル-2'-デオキシウリジンdU.z1 (236mg、28%)を得た。(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(20mg、3%)および5-[(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシウリジン(49mg、8%)も反応により得られた。
2011529449.tif 000120
【０１９１】
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-O4-(2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニル)-2'-デオキシウリジン(dU.z2): 化合物dU.z1 (0.236g、0.29mmol)、DMAP (38mg、0.32mmol)およびトリエチルアミン(0.465mL、3.31mmol)の無水ジクロロメタン(10mL)溶液に2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド(1.57g、5.19mmol)を加えた。混合物を窒素雰囲気下室温で24時間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピル-オキシ]メチル-O4-(2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニル)-2'-デオキシウリジンdU.z2 (169mg、54%)を得た。
2011529449.tif 000121
【０１９２】
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン(dC.z3): アンモニア(ジオキサン中0.5M、4mL、2.0mmol)を化合物dU.z2 (169mg、0.158mmol)に加え、混合物を封管に移し、96℃で16時間加熱した。室温に冷却後、混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-[(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジンdC.z3 (83mg、65%)を得た。
2011529449.tif 000122
【０１９３】
5-[(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン(dC.z4): 化合物dC.z3 (82mg、0.10mmol)のTHF (3mL)溶液にフッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム三水和物(81mg、0.26mmol)のTHF (2mL)溶液を加えた。混合物を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-[(RまたはS)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジンdC.z4 (43mg、73%)を得た。
2011529449.tif 000123
【０１９４】
5-[(RまたはS)-1-(4-{3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル}-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン(dC.z5): 化合物dC.z4 (40mg、0.069mmol)、N-プロパルギルトリフルオロアセチルアミド(32mg、0.208mmol)、CuI (3mg、0.014mmol)、Et3N (0.01mL、0.138mmol)およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0) (8mg、0.007mmol)の無水DMF (3mL)中混合物を室温で4.5時間攪拌した。メタノール(3mL)および塩化メチレン(3mL)を加えた後、炭酸水素ナトリウム(32mg、0.380mmol)を加えた。混合物を15分間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-[(RまたはS)-1-(4-{3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル}-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピル-オキシ]メチル-2'-デオキシシチジンdC.z5 (35mg、85%)を得た。
2011529449.tif 000124
【０１９５】
5-[(RまたはS)-1-(4-{3-アミノ-1-プロピニル}-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピル-オキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェート(dC.z6): 化合物dC.z5 (11mg、0.018mmol)およびプロトンスポンジ(8mg、0.036mmol)のリン酸トリメチル(0.3mL)溶液にPOCl3 (2.5μL、0.027mmol)を0℃で加え、2時間攪拌した。追加のPOCl3 (2.5μL、0.027mmol)を1時間の間隔で2回加えた。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(43mg、0.09mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(20μL)の無水DMF (0.2mL)溶液を加えた。5分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 5mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、25℃で減圧濃縮した。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、混合物の一部をPerkin Elmer OD-300 C18カラム(4.6x250mm)を使用する逆相HPLCにより精製して5-{(RまたはS)-1-[4-(3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2,2-ジメチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシ-シチジン-5'-トリホスフェートを得た。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)(pH 7.0); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。次に精製トリホスフェートを室温で濃水酸化アンモニウム(27%)により2時間処理して5-{(RまたはS)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2,2-ジメチル-プロピルオキシ}メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェートdC.z6を得た。
2011529449.tif 000125
【０１９６】
6-TAMRA標識5-[(RまたはS)-1-(4-{3-アミノ-1-プロピニル}-2-ニトロフェニル)-2,2-ジメチル-プロピルオキシ]メチル-2'-デオキシシチジン-5'-トリホスフェート(WW3p091): トリホスフェートdC.z6 (0.386μmol)のNa2CO3/NaHCO3緩衝液(0.1M、pH 9.2; 200μL)中溶液にCy5モノNHS (0.65mg、1.23μmol)の無水DMSO (26μL)溶液を加え、室温で1時間放置した。Perkin Elmer OD-300 C18カラム(4.6x250mm)を使用する逆相HPLCで反応液を精製して6-TAMRA標識トリホスフェートWW3p091を得た。移動相: A、水中100mM TEAA (pH 7.0); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０１９７】
実施例7
7-デアザグアノシン類似体の合成
7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000126
スキーム19  7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェートの合成。(i) TFAA、ピリジン(無水)、室温、91%; (ii) NIS、CH2Cl2(無水)、室温; (iii) NH3、MeOH、室温、59%; (iv) 2-デオキシ-3,5-O-ジ-(p-トルオイル)-α-D-リボフラノシルクロリド、TDA-1、KOH、MeCN(無水)、室温、80%; (v) NH3、MeOH、室温、80%; (vi) TBSCl、イミダゾール、DMF(無水)、室温、56%; (vii) CO、PdCl2[PhCN]2、MeOH/1,4-ジオキサン、50℃、90%; (viii) LiBH4、MeOH、THF、還流、68%; (ix) 臭化2-ニトロベンジル、n-Bu4NBr、CH2Cl2/NaOH水溶液、室温、48%; (x) n-Bu4NF、THF、95%;
2011529449.tif 000127
スキーム20  (xi) DABCO、H3O、還流、30%; (xii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
6-クロロ-2-(トリフルオロアセチル)アミノ-7-デアザプリン(dG.22): Seela and Peng (2006、参照により本明細書に組み入れられる)に記載の手順に従って化合物dG.22を合成した。2-アミノ-6-クロロ-7-デアザプリン(2.00g、11.86mmol)の無水ピリジン(15mL)溶液に無水トリフルオロ酢酸(2.18mL、15.54mmol)を15分間かけて加えた。溶液を室温で3時間攪拌し、減圧濃縮し、水(2mL)で2回共蒸発させた。次に材料を濾過し、冷水で洗浄し、KOHで減圧乾燥させて6-クロロ-2-(トリフルオロアセチル)アミノ-7-デアザプリンdG.22 (2.86g、91%)を琥珀色固体として得た。
【０１９８】
2-アミノ-6-クロロ-7-ヨード-7-デアザプリン(dG.23): Seela and Peng (2006、参照により本明細書に組み入れられる)に記載の手順に従って化合物dG.23を合成した。化合物dG.22 (2.86g、10.81mmol)の無水CH2Cl2 (51mL)懸濁液にN-ヨードスクシンイミド(2.68g、11.89mmol)を加えた。混合物を光から保護しながら室温で2時間攪拌した。次に反応液をCH2Cl2 322mLで希釈し、濾過した後、析出物をメタノール中7N NH3溶液(41mL)に溶解させ、室温で3時間攪拌した。得られた固体を濾過し、減圧乾燥させて2-アミノ-6-クロロ-7-ヨード-7-デアザプリンdG.23 (1.86g、59%)を琥珀色固体として得た。
【０１９９】
2-アミノ-6-クロロ-9-[β-D-3',5'-O-ジ-(p-トルオイル)-2'-デオキシリボフラノシル]-7-ヨード-7-デアザプリン(dG.24): KOH (1.38g、22.16mmol)およびトリス(3,6-ジオキサヘプチル)アミン(0.26mL、0.80mmol)の無水アセトニトリル(76mL)懸濁液に化合物dG.23 (1.86g、6.33mmol)を加えた。混合物を5分間攪拌後、2-デオキシ-3,5-ジ-O-(p-トルオイル)-α-D-リボフラノシルクロリド(3.20g、8.23mmol)を15分間かけて加えた。反応液を室温で30分間攪拌した後、濾過し、析出物をアセトニトリル(75mL)で洗浄した。一緒にした濾液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して2-アミノ-6-クロロ-9-[β-D-3',5'-O-ジ-(p-トルオイル)-2'-デオキシリボフラノシル]-7-ヨード-7-デアザプリンdG.24 (3.29g、80%)を白色泡状物として得た。
2011529449.tif 000128
【０２００】
2-アミノ-6-クロロ-9-(β-D-2'-デオキシリボフラノシル)-7-ヨード-7-デアザプリン(dG.25): 化合物dG.24 (3.29g、5.09mmol)をメタノール中7N NH3溶液(153mL)に溶解させ、室温で32時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して2-アミノ-6-クロロ-9-(β-D-2'-デオキシリボフラノシル)-7-ヨード-7-デアザプリンdG.25 (1.66g、収率80%)を白色泡状物として得た。
2011529449.tif 000129
【０２０１】
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-2-(tert-ブチルジメチルシリル)アミノ-6-クロロ-7-ヨード-7-デアザプリン(dG.26): 化合物dG.25 (0.29g、0.70mmol)を無水ピリジンから3回(各3mL)蒸発させた後、無水DMF (5mL)に溶解させた。tert-ブチルジメチルシリルクロリド(1.27g、8.43mmol)およびイミダゾール(1.15g、16.86mmol)を加え、混合物を40℃で42時間攪拌した(追加のtert-ブチルジメチルシリルクロリド(0.64g、4.22mmol)およびイミダゾール(0.57g、8.43mmol)を6時間ごとに加えた)。反応液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-2-(tert-ブチルジメチルシリル)アミノ-6-クロロ-7-ヨード-7-デアザプリンdG.26 (0.30g、収率56%)を白色泡状物として得た。
2011529449.tif 000130
【０２０２】
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-2-(tert-ブチル-ジメチルシリル)アミノ-6-クロロ-7-メトキシカルボニル-7-デアザプリン(dG.27): dG.26 (105mg、0.139mmol)の溶液を無水1,4-ジオキサン(6mL)に溶解させた。無水メタノール(6mL)およびトリエチルアミン(0.04mL)を加え、混合物を一酸化炭素雰囲気下10分間攪拌した後、ビス(ベンゾニトリル)ジクロロパラジウム(II)を加えた。反応液をCO雰囲気下50℃で48時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-2-(tert-ブチルジメチルシリル)アミノ-6-クロロ-7-メトキシカルボニル-7-デアザプリンdG.27 (112mg、90%)を粘稠油状物として得た。
2011529449.tif 000131
【０２０３】
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-2-(tert-ブチルジメチルシリル)アミノ-6-クロロ-7-ヒドロキシメチル-7-デアザプリン(dG.28): dG.27 (52mg、0.076mmol)の無水THF (3mL)溶液に水素化ホウ素リチウム(0.007g、0.305mmol)を加えた後、メタノール(0.05mL)を加えた。反応混合物を1時間加熱還流させた。冷却した時点で反応混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈し、水(10mL)で反応停止させ、有機層を分離し、ブライン(各10mL)で2回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボ-フラノシル]-2-(tert-ブチルジメチルシリル)アミノ-6-クロロ-7-ヒドロキシメチル-7-デアザプリンdG.28 (0.12g、45%)を粘稠油状物として得た。
2011529449.tif 000132
【０２０４】
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-2-(tert-ブチルジメチルシリル)アミノ-6-クロロ-7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザプリン(dG.29): 化合物dG.28 (150mg、0.23mmol)のCH2Cl2 (3mL)溶液にn-Bu4NBr (37mg、0.12mmol)、臭化2-ニトロベンジル(148mg、0.68mmol)および1M NaOH溶液(3mL)を加えた。反応混合物を暗所中室温で2日間激しく攪拌した。有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-2-(tert-ブチルジメチルシリル)アミノ-6-クロロ-7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザプリンdG.29 (87mg、48%)を粘稠油状物として得た。
2011529449.tif 000133
【０２０５】
2-アミノ-6-クロロ-9-[β-D-2'-デオキシリボフラノシル]-7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザプリン(dG.30): 化合物dG.29 (105mg、0.13mmol)のTHF (3mL)溶液にn-Bu4NF (123mg、0.39mmol)のTHF (2mL)溶液を0℃で滴下した。反応混合物を0℃で1時間、次に室温で2時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して2-アミノ-6-クロロ-9-[β-D-2'-デオキシリボフラノシル]-7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザプリンdG.30 (57mg、95%)を黄色泡状物として得た。
2011529449.tif 000134
【０２０６】
7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン(dG.31): dG.29 (38mg、0.084mmol)および1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン(11mg、0.1mmol)の水(4mL)中混合物を窒素雰囲気下4時間加熱還流させた。水を減圧除去し、残渣をメタノールから3回(各3mL)蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシンdG.31 (11mg、30%)を得た。
2011529449.tif 000135
【０２０７】
7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェート(WW5p107): 化合物dG.31 (11mg、0.025mmol)のリン酸トリメチル(0.3mL)溶液にPOCl3 (5μL、0.05mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で2時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(118mg、0.25mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(50μL)の無水DMF (0.5mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 5mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(10mL)に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)〜25%アセトニトリル/75% TEAB (1.5M)の直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェートWW5p107を得て、これをPerkin Elmer Aquapore OD-300カラム(7μm、250x4.6mm)上での逆相HPLCでさらに精製した。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０２０８】
7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000136
スキーム21  7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェートの合成。(i) PPh3/CH2Cl2(無水)、K2CO3、還流、46%; (ii) 1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(ラセミ)、未希釈、減圧、124℃; (iii) n-Bu4NF、THF、2工程で7%; (iv) DABCO、H2O、還流、29%; (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-2-(tert-ブチルジメチルシリル)アミノ-6-クロロ-7-クロロメチル-7-デアザプリン(dG.32): dG.27 (1.22g、1.84mmol)の四塩化炭素(24mL、CaH2から新たに蒸留)溶液に炭酸カリウム(1.00g、7.36mmol)およびトリフェニルホスフィン(1.20g、4.60mmol)を加えた。反応液を24時間攪拌還流させた。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-2-(tert-ブチルジメチルシリル)アミノ-6-クロロ-7-クロロメチル-7-デアザプリンdG.32 (0.54g、43%)を泡状物として得た。
2011529449.tif 000137
【０２０９】
2-アミノ-6-クロロ-9-[β-D-2'-デオキシリボフラノシル]-7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピル-オキシ]メチル-7-デアザプリン(dG.33): 化合物dG.32 (0.82g、1.21mmol)および1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(2.36g、12.10mmol)を無水ジクロロメタン(10mL)に溶解させた。溶媒を減圧除去し、残渣を124℃で22時間減圧加熱した後、酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して粗製の9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-2-アミノ-6-クロロ-7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリンを得た。次にこの中間体をテトラヒドロフラン(14mL)に溶解させ、フッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム三水和物(0.954g、3.03mmol)で処理した。30分後、混合物を蒸発させ、カラムクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-2'-デオキシリボフラノシル]-2-アミノ-6-クロロ-7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリンdG.33 (41mg、7%、ジアステレオマーの1:1混合物)を得た。
2011529449.tif 000138
【０２１０】
7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン(dG.34): dG.33 (54mg、0.11mmol)および1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン(25mg、0.22mmol)の水(5mL)中混合物を窒素雰囲気下3時間加熱還流させた。水を減圧除去し、残渣をメタノールから3回(各5mL)蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシンdG.34 (15mg、29%、ジアステレオマーの1:1混合物)を得た。
2011529449.tif 000139
【０２１１】
7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェート(WW5p143 ds1およびds2): 化合物dG.34 (15mg、0.032mmol)のリン酸トリメチル(0.4mL)溶液にPOCl3 (6μL、0.064mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で5時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(285mg、0.6mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(120μL)の無水DMF (1.2mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)〜25%アセトニトリル/75% TEAB (1.5M)の直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェートWW5p143を2つのジアステレオマーの混合物として得て、これをPerkin Elmer Aquapore OD-300カラム(7μm、250x4.6mm)上での逆相HPLCで分離して単一ジアステレオマーWW5p143_ds1(急速溶出)およびWW5p143_ds2(緩徐溶出)を得た。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０２１２】
6-ROX標識7-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000140
スキーム22  6-ROX標識7-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェートの合成。(i) (R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール、未希釈、減圧、124℃; (ii) n-Bu4NF、THF、2工程で13%; (iii) DABCO、H2O、還流、4時間、23%; (iv) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4 (0)、CuI、Et3N、無水DMF(無水)、4時間、50%;
2011529449.tif 000141
スキーム23  (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3; (vi) 6-ROX-SE、0.1M Na2CO3/NaHCO3緩衝液(pH 9.2)、1時間。
2-アミノ-6-クロロ-9-[β-D-2'-デオキシリボフラノシル]-7-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリン(dG.35): 化合物dG.32 (0.62g、0.914mmol)および(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(3.52g、10.97mmol)を無水ジクロロメタン(10mL)に溶解させた。溶媒を減圧除去し、残渣を122℃で16時間減圧加熱した後、酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して粗製の2-アミノ-6-クロロ-9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-7-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリンを得て、これをテトラヒドロフラン(15mL)に溶解させた。中間体をフッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム三水和物(0.72g、2.28mmol)で処理した。30分後に、混合物を蒸発させ、カラムクロマトグラフィーで精製して2-アミノ-6-クロロ-9-[β-D-2'-デオキシリボフラノシル]-7-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリンdG.35 (74mg、13%)を得た。
2011529449.tif 000142
【０２１３】
7-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン(dG.36): 水(5mL)中の化合物dG.35 (72mg、0.12mmol)および1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン(52mg、0.46mmol)を窒素雰囲気下4時間加熱還流させた。水を減圧除去し、残渣をメタノールから3回(各5mL)蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して7-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシンdG.36 (16mg、23%)を得た。
2011529449.tif 000143
【０２１４】
7-{(R)-1-[4-(3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン(dG.37): 化合物dG.36 (15mg、0.025mmol)、N-プロパルギルトリフルオロアセチルアミド(11mg、0.075mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)-パラジウム(0)(3mg、0.0025mmol)、CuI (1mg、0.005mmol)およびEt3N (7μL、0.050mmol)の無水DMF (1.5mL)溶液を室温で4時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して7-{(R)-1-[4-(3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシンdG.37 (15mg、99%)をワックス状固体として得た。
2011529449.tif 000144
【０２１５】
7-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェート(dG.38): 化合物dG.37 (12mg、0.019mmol)およびプロトンスポンジ(8mg、0.038mmol)のリン酸トリメチル(0.3mL)溶液にPOCl3 (7μL、0.076mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で4時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(237mg、0.5mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(100μL)の無水DMF (1mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)〜25%アセトニトリル/75% TEAB (1.5M)の直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥により乾固させた。残渣を水(5mL)に溶解させ、室温で濃水酸化アンモニウム(2mL、27%)により1時間処理して7-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェートdG.38を得て、これをPerkin Elmer Aquapore OD-300カラム(7μm、250x4.6mm)上での逆相HPLCで精製した。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０２１６】
6-ROX標識7-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシグアノシン-5'-トリホスフェート(WW6p034): トリホスフェートdG.38 (0.85μmol)のNa2CO3/NaHCO3緩衝液(0.1M、pH 9.2、800μL)中溶液に6-ROX-SE (3.5mg、5.54μmol)の無水DMSO (280μL)溶液を加えた。混合物を室温で1時間放置した。Perkin Elmer AX-300カラム(7μm、250x4.6mm)を使用するアニオン交換HPLCにより、色素標識トリホスフェートを最初に精製した。移動相: A、25% CH3CN/75% 0.1M TEAB; B、25% CH3CN/75% 1.5M TEAB。Perkin Elmer OD-300カラム(7μm、4.6x250mm)を使用する逆相HPLCで生成物をさらに精製して6-ROX標識トリホスフェートWW6p034を得た。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)(pH 7.0); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０２１７】
実施例8
7-デアザアデノシン類似体の合成
7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000145
スキーム24  7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートの合成。(i) NIS、CH2Cl2(無水)、室温、52%; (ii) 2-デオキシ-3,5-ジ-O-(p-トルオイル)-α-D-リボフラノシルクロリド、TDA-1、KOH、MeCN(無水)、室温; (iii) NH3、MeOH、室温、47%; (iv) TBSCl、イミダゾール、DMF(無水)、室温、51%; (v) CO、PdCl2[PhCN]2、MeOH/1,4-ジオキサン、50℃、99%; (vi) LiBH4、MeOH、THF、45%; (vii) 臭化2-ニトロベンジル、n-Bu4NBr、CH2Cl2/NaOH水溶液、室温、50%; (viii) n-Bu4NF、THF; NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、90〜100℃、91%; (ix) POCl3、(MeO)3PO、-40℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
6-クロロ-7-ヨード-7-デアザプリン(dA.23): Ju et al. (2006、参照により本明細書に組み入れられる)に記載の手順に従って化合物dA.23を合成した。6-クロロ-7-デアザプリン(1.00g、6.51mmol)の無水CH2Cl2 (55mL)懸濁液にN-ヨードスクシンイミド(1.70g、7.56mmol)を加えた。反応液を光から保護しながら室温で2時間攪拌した。次に反応液を減圧濃縮した。材料を熱メタノールから再結晶して6-クロロ-7-ヨード-7-デアザプリンdA.23 (0.94g、52%)を得た。
【０２１８】
9-(β-D-2'-デオキシリボフラノシル)-6-クロロ-7-ヨード-7-デアザプリン(dA.24): Ju et al. (2006、参照により本明細書に組み入れられる)に記載の手順に従って化合物dA.24を合成した。KOH (0.52g、8.29mmol)およびトリス(3,6-ジオキサヘプチル)アミン(0.07mL、0.22mmol)の無水アセトニトリル56mL懸濁液に化合物dA.23 (0.93g、3.32mmol)を加えた。反応液を室温で5分間攪拌した後、2-デオキシ-3,5-ジ-O-(p-トルオイル)-α-D-リボフラノシルクロリド(1.38g、3.55mmol)を15分間かけて加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、濾過し、熱アセトン(50mL)で洗浄した。濾液を減圧濃縮し、材料の半分をメタノール中7N NH3溶液(40mL)に溶解させ、室温で16時間攪拌した。次に反応液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-(β-D-2'-デオキシリボフラノシル)-6-クロロ-7-ヨード-7-デアザプリンdA.24 (0.31g、47%)を白色泡状物として得た。
【０２１９】
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-ヨード-7-デアザプリン(dA.25): 化合物dA.24 (0.30g、0.76mmol)を無水ピリジン(2mL)から3回蒸発させ、無水DMF (5mL)に溶解させた。tert-ブチルジメチルシリルクロリド(0.34g、2.28mmol)およびイミダゾール(0.31g、4.55mmol)を加え、混合物を室温で16時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-ヨード-7-デアザプリンdA.25 (0.24g、51%)を白色泡状物として得た。
2011529449.tif 000146
【０２２０】
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-メトキシカルボニル-7-デアザプリン(dA.26): dA.25 (1.3g、2.1mmol)の無水1,4-ジオキサン(30mL)および無水メタノール(25mL)溶液にトリエチルアミン(0.58mL)を加えた。CO雰囲気下で10分間攪拌後、ビス(ベンゾニトリル)ジクロロパラジウム(II)を加えた。反応液をCO雰囲気下50℃で48時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-メトキシカルボニル-7-デアザプリンdA.26 (1.15g、99%)を粘稠油状物として得た。
2011529449.tif 000147
【０２２１】
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-ヒドロキシメチル-7-デアザプリン(dA.27): dA.26 (0.28g、0.50mmol)の無水THF (4mL)溶液に水素化ホウ素リチウム(0.044g、2.01mmol)を加えた後、メタノール(0.1mL)を加えた。反応混合物を室温で10分間攪拌した後、45分間加熱還流させた。冷却時点で反応混合物をジクロロメタン(20ml)で希釈し、水(2mL)で反応停止させた。有機層を分離し、ブラインで2回(各5mL)洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-ヒドロキシメチル-7-デアザプリンdA.27 (0.12g、45%)を白色泡状物として得た。
2011529449.tif 000148
【０２２２】
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザプリン(dA.28): dA.27 (30mg、0.057mmol)のCH2Cl2 (2mL)溶液にn-Bu4NBr (9mg、0.029mmol)、臭化2-ニトロベンジル(37mg、0.17mmol)および1M NaOH溶液(2mL)を加えた。反応混合物を暗所中室温で48時間激しく攪拌した。有機層を分離し、Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザプリンdA.28 (19mg、50%)を粘稠油状物として得た。
2011529449.tif 000149
【０２２３】
7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン(dA.29): dA.28 (18mg、0.027mmol)のTHF (1mL)溶液にn-Bu4NF (17mg、0.054mmol)のTHF (1mL)溶液を0℃で加えた。反応混合物を室温に徐々に昇温し、2時間攪拌した。混合物を減圧濃縮した後、残渣を1,4-ジオキサン(2mL)に溶解させ、続いてメタノール中7N NH3 (4mL)を加えた。混合物を封管に移し、90〜100℃で16時間攪拌した後、冷却し、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシンdA.29 (10mg、91%)を白色泡状物として得た。
2011529449.tif 000150
【０２２４】
7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェート(WW5p085): dA.29 (6mg、0.014mmol)およびプロトンスポンジ(6mg、0.028mmol)のリン酸トリメチル(0.25mL)溶液にPOCl3 (2.6μL、0.028mmol)を-40℃で加え、4時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(66mg、0.14mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(28μL)の無水DMF (0.28mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 1mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(2mL)に溶解させ、濾過し、Perkin Elmer OD-300 C18カラム(7μm、4.6x250mm)を使用する逆相HPLCにより精製して7-(2-ニトロベンジルオキシ)メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートWW5p085を得た。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)(pH 7.0); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０２２５】
7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000151
スキーム25  7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートの合成。(i) TsCl、DMAP、CH2Cl2(無水)、室温、39%; (ii) 1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(ラセミ)、未希釈、減圧、105℃、54%; (iii) n-Bu4NF、THF; NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、90〜100℃、76%; (iv) POCl3、(MeO)3PO、-40℃〜0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-クロロメチル-7-デアザプリン(dA.30): dA.27 (0.257g、0.485mmol)のジクロロメタン(12mL、CaH2から新たに蒸留)溶液に4-N,N-ジメチルアミノピリジン(0.148g、1.213mmol)および塩化トシル(0.111g、0.583mmol)を加えた。反応混合物を室温で18時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-クロロメチル-7-デアザプリンdA.30 (0.103g、26%)を粘稠油状物として得た。
2011529449.tif 000152
【０２２６】
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリン(dA.31): 化合物dA.30 (54mg、0.1mmol)および1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(191mg、0.978mmol)を無水ジクロロメタン(10mL)に溶解させた。溶媒を減圧除去し、残渣を1時間減圧加熱した後、酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリンdA.31 (38mg、54%、ジアステレオマーの1:1混合物)を得た。
2011529449.tif 000153
【０２２７】
7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン(dA.32): dA.31 (38mg、0.053mmol)のTHF (2mL)溶液にn-Bu4NF (44mg、0.140mmol)のTHF (2mL)溶液を0℃で加えた。反応液を室温に徐々に昇温し、2時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、1,4-ジオキサン(4mL)に溶解させた後、メタノール中7N NH3溶液(8mL)を加えた。混合物を封管に移し、90〜100℃で24時間攪拌した後、冷却し、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシンdA.32 (19mg、76%、ジアステレオマーの1:1混合物)を粘稠油状物として得た。
2011529449.tif 000154
【０２２８】
7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェート(WW5p098 ds1およびds2): 化合物dA.32 (19mg、0.041mmol)のリン酸トリメチル(0.4mL)溶液にPOCl3 (8μL、0.083mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下-40℃で2時間攪拌した。追加のPOCl3 (8μL、0.083mmol)を加え、反応液を0℃でさらに3時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(97mg、0.2mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(40μL)の無水DMF (0.4mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75% 0.1M炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB)〜25%アセトニトリル/75% 1.5M TEABの直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて7-[1-(2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートWW5p098を2つのジアステレオマーの混合物として得て、これをPerkin Elmer Aquapore OD-300カラム(7μm、250x4.6mm)上での逆相HPLCで分離して単一ジアステレオマーWW5p098 ds1(急速溶出)およびWW5p098 ds2(緩徐溶出)を得た。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０２２９】
6-FAM標識7-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000155
スキーム26  6-FAM標識7-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートの合成。(i) (R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール、未希釈、真空、108℃、47%; (ii) n-Bu4NF、THF; NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、90〜100℃、82%; (iii) N-プロパルギルトリフルオロアセトアミド、Pd(PPh3)4 (0)、CuI、Et3N、無水DMF、99%; (iv) POCl3、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3;
2011529449.tif 000156
スキーム27  (v) 6-FAM-SE、0.1M Na2CO3/NaHCO3緩衝液(pH 9.2)。
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリン(dA.33)。化合物dA.30 (80mg、0.147mmol)およびエナンチオピュアな(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(518mg、1.163mmol)を無水ジクロロメタン(10mL)に溶解させた。溶媒を減圧除去し、残渣を1時間減圧加熱した後、酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリンdA.33 (57mg、47%)を得た。
2011529449.tif 000157
【０２３０】
7-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン(dA.34): dA.33 (57mg、0.069mmol)のTHF (2mL)溶液にn-Bu4NF (58mg、0.182mmol)のTHF (2mL)溶液を0℃で加えた。反応液を室温に徐々に昇温し、2時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、1,4-ジオキサン(5mL)に溶解させた後、メタノール中7N NH3溶液(16mL)を加えた。混合物を封管に移し、90〜100℃で24時間攪拌した後、冷却し、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して7-[(R)-1-(4-ヨード-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシンdA.34 (33mg、82%)を得た。
2011529449.tif 000158
【０２３１】
7-{(R)-1-[4-(3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン(dA.35): 化合物dA.34 (33mg、0.056mmol)、N-プロパルギルトリフルオロアセチルアミド(25mg、0.168mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)-パラジウム(0)(7mg、0.0065mmol)、CuI (2mg、0.0112mmol)およびEt3N (16μL、0.050mmol)の無水DMF (3mL)溶液を室温で4時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して7-{(R)-1-[4-(3-トリフルオロアセトアミド-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシンdA.35 (34mg、99%)をワックス状固体として得た。
2011529449.tif 000159
【０２３２】
7-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェート(dA.36): 化合物dA.35 (27mg、0.045mmol)およびプロトンスポンジ(19mg、0.089mmol)のリン酸トリメチル(0.4mL)溶液にPOCl3 (8μL、0.089mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で2時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(285mg、0.6mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(120μL)の無水DMF (1.2mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(10mL)に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75% 0.1M炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB)〜25%アセトニトリル/75% 1.5M TEABの直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥により乾固させた。残渣を水(5mL)に溶解させ、室温で濃水酸化アンモニウム(2mL、27%)により1時間処理して7-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートdA.36を得て、これをPerkin Elmer Aquapore OD-300カラム(7μm、250x4.6mm)上での逆相HPLCで精製した。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０２３３】
6-FAM標識7-{(R)-1-[4-(3-アミノ-1-プロピニル)-2-ニトロフェニル]-2-メチル-プロピルオキシ}メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェート(WW6p028): トリホスフェートdA.36 (2.6μmol)のNa2CO3/NaHCO3緩衝液(0.1M、pH 9.2、1.6mL)中溶液に6-FAM-SE (4mg、8.4μmol)の無水DMSO (80μL)溶液を加えた。混合物を室温で1時間放置した。PerkinElmer AX-300カラム(7μm、250x4.6mm)を使用するアニオン交換HPLCにより、色素標識トリホスフェートを最初に精製した。移動相: A、25% CH3CN/75% 0.1M TEAB; B、25% CH3CN/75% 1.5M TEAB。Perkin Elmer OD-300カラム(7μm、4.6x250mm)を使用する逆相HPLCで生成物をさらに精製して6-FAM標識トリホスフェートWW6p028を得た。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)(pH 7.0); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０２３４】
7-[1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000160
スキーム28  7-[1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートの合成。(i) 1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(ラセミ)、未希釈、減圧、108℃、33% (dA.37a)および11% (da.37b); (ii) n-Bu4NF、THF; NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、90〜100℃、86%; (iv) POCl3、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
9-[β-D-3'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリン(dA.37a)および9-[β-D-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリン(dA.37b): 化合物dA.30 (109mg、0.201mmol)および1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(448mg、1.863mmol)を無水ジクロロメタン(10mL)に溶解させた。溶媒を減圧除去し、残渣を108℃で30分間減圧加熱した後、酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリンdA.37a (42mg、33%、ジアステレオマーの1:1混合物)および9-[β-D-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリンdA.37b (13mg、11%、ジアステレオマーの1:1混合物)を得た。
2011529449.tif 000161
【０２３５】
7-[1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン(dA.38): dA.37a (42mg、0.066mmol)のTHF (5mL)溶液にn-Bu4NF (44mg、0.140mmol)のTHF (2mL)溶液を0℃で加えた。反応液を室温に徐々に昇温し、2時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、dA.37b (12mg、0.022mmol)の1,4-ジオキサン(4mL)溶液を加えた後、メタノール中7N NH3溶液(18mL)を加えた。混合物を封管に移し、90〜100℃で36時間攪拌した後、冷却し、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して7-[1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシンdA.38 (38mg、86%、ジアステレオマーの1:1混合物)を粘稠油状物として得た。
2011529449.tif 000162
ToF-MS (ESI): 分子イオンC22H27N6O8 [M+H]+について、計算質量は503.1890、実測質量は503.2029であった。
【０２３６】
7-[1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェート(WW6p057 ds1およびds2): 化合物dA.38 (30mg、0.06mmol)のリン酸トリメチル(0.4mL)溶液にPOCl3 (11μL、0.12mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で4時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(285mg、0.6mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(120μL)の無水DMF (1.2mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(10mL)に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75% 0.1M炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB)〜25%アセトニトリル/75% 1.5M TEABの直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x20cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて7-[1-(2,6-ジニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートWW6p057を2つのジアステレオマーの混合物として得て、これをPerkinElmer Aquapore OD-300カラム(7μm、250x4.6mm)上での逆相HPLCで分離して単一ジアステレオマーWW6p057 ds1(急速溶出)およびWW6p057 ds2(緩徐溶出)を得た。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０２３７】
7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000163
スキーム29  7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートの合成。(i) 1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(ラセミ)、未希釈、減圧、108℃、33% (dA.39a)および21% (da.39b); (ii) n-Bu4NF、THF; NH3、1,4-ジオキサン/MeOH、90〜100℃、61%; (iv) POCl3、(MeO)3PO、0oC; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリン(dA.39a)および9-[β-D-3'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリン(dA.39b): 化合物dA.30 (103mg、0.19mmol)および1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロパノール(428mg、1.90mmol)を無水ジクロロメタン(3mL)に溶解させた。溶媒を減圧除去し、残渣を108℃で30分間減圧加熱した後、酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して9-[β-D-3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリンdA.39a (46mg、33%、ジアステレオマーの1:1混合物)および9-[β-D-3'-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-2'-デオキシリボフラノシル]-6-クロロ-7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザプリンdA.39b (25mg、21%、ジアステレオマーの1:1混合物)を得た。
2011529449.tif 000164
【０２３８】
7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン(dA.40): dA.39a (46mg、0.063mmol)およびdA.39b (25mg、0.040mmol)のTHF (8mL)溶液にn-Bu4NF (68mg、0.217mmol)のTHF (2mL)溶液を0℃で加えた。反応液を室温に徐々に昇温し、30分間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、1,4-ジオキサン(8mL)に溶解させた後、メタノール中7N NH3 (24mL)を加えた。混合物を封管に移し、90〜100℃で16時間攪拌した後、冷却し、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシンdA.40 (38mg、61%、ジアステレオマーの1:1混合物)を粘稠油状物として得た。
2011529449.tif 000165
ToF-MS (ESI): 分子イオンC23H30N5O7 [M+H]+について、計算質量は488.2145、実測質量は488.2466であった。
【０２３９】
7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェート(WW6p087 ds1およびds2): 化合物dA.40 (28mg、0.06mmol)のリン酸トリメチル(0.35mL)溶液にPOCl3 (11μL、0.12mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で2時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(237mg、0.5mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(100μL)の無水DMF (1.0mL)溶液を加えた。10分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(10mL)に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75% 0.1M炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB)〜25%アセトニトリル/75% 1.5M TEABの直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x20cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて7-[1-(4-メトキシ-2-ニトロフェニル)-2-メチル-プロピルオキシ]メチル-7-デアザ-2'-デオキシアデノシン-5'-トリホスフェートWW6p087を2つのジアステレオマーの混合物として得て、これをPerkin Elmer Aquapore OD-300カラム(7μm、250x4.6mm)上での逆相HPLCで分離して単一ジアステレオマーWW6p087 ds1(急速溶出)およびWW6p087 ds2(緩徐溶出)を得た。移動相: A、水中100mM酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA); B、水/CH3CN (30:70)中100mM TEAA。
【０２４０】
実施例9
化学的に開裂可能な類似体の合成
5-(ベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000166
スキーム30  5-(ベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) ベンジルアルコール、未希釈、112℃、44%; (ii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
5-(ベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n1): 化合物dU.x0 (381mg、0.586mmol)およびベンジルアルコール(634mg、5.864mmol)を窒素雰囲気下112℃で30分間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量のジクロロメタンに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して5-(ベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n1 (89mg、44%)を得た。dU.n1は公知である(例えば参照により本明細書に組み入れられるMel'nik et al., 1991を参照)がここで報告した方法とは異なる方法でそれを得たということに留意する)。
2011529449.tif 000167
【０２４１】
5-(ベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(WW5p145): 化合物dU.n1 (15mg、0.043mmol)およびプロトンスポンジ(18mg、0.086mmol)のリン酸トリメチル(0.35mL)溶液にPOCl3 (8μL、0.086mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で2時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(237mg、0.5mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(100μL)の無水DMF (1mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)〜25%アセトニトリル/75% TEAB (1.5M)の直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-(ベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートWW5p145を得た。
2011529449.tif 000168
【０２４２】
5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000169
スキーム31  5-(1-フェニル-2-メチル-プロポキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) 2-メチル-1-フェニル-1-プロパノール、未希釈、108〜114℃、12%; (ii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n2): 化合物dU.x0 (0.331g、0.51mmol)および2-メチル-1-フェニル-1-プロパノール(1.238g、8.24mmol)を窒素雰囲気下108〜114℃で1時間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量の酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n2 (26mg、12%、ジアステレオマーの1:1混合物)を得た。3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシ-ウリジン(77mg、24%、ジアステレオマーの1:1混合物)および(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(46mg、18%、ジアステレオマーの1:1混合物)も反応により得られた。
2011529449.tif 000170
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(ジアステレオマーの1:1混合物)の1H NMR (400MHz, CDCl3):
2011529449.tif 000171
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(ジアステレオマーの1:1混合物)の13C NMR (100MHz, CDCl3):
2011529449.tif 000172
(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(ジアステレオマーの1:1混合物)の1H NMR (400MHz, CDCl3):
2011529449.tif 000173
【０２４３】
5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(WW5p143): 化合物dU.n2 (15mg、0.032mmol)およびプロトンスポンジ(14mg、0.063mmol)のリン酸トリメチル(0.4mL)溶液にPOCl3 (6μL、0.063mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で2時間攪拌した。追加のPOCl3 (6μL、0.063mmol)を1時間の間隔で2回加えた。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(285mg、0.6mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(120μL)の無水DMF (1.2mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)〜25%アセトニトリル/75% TEAB (1.5M)の直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートWW5p143 (ジアステレオマーの1:1混合物)を得た。
2011529449.tif 000174
【０２４４】
5-(2-メチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000175
スキーム32  5-(2-メチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) 2-メチルベンジルアルコール、未希釈、110℃; (ii) n-Bu4NF、THF、室温、38%; (iii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-メチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n3)および(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-メチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n4): 化合物dU.x0 (0.438g、0.67mmol)および2-メチルベンジルアルコール(0.823g、6.74mmol)を窒素雰囲気下110℃で45分間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-メチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n3 (20mg、5%)および(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-メチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n4 (43mg、14%)を得た。
2011529449.tif 000176
【０２４５】
5-(2-メチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n5): 化合物dU.n3 (20mg、0.034mmol)のTHF (2mL)溶液を室温でn-Bu4NF (32mg、0.1mmol)により3時間処理した。別途、化合物dU.n4 (43mg、0.09mmol)のTHF (4mL)溶液も室温でn-Bu4NF (64mg、0.2mmol)により3時間処理した。2つの反応混合物を一緒にし、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-(2-メチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n5 (17mg、38%)を得た。
2011529449.tif 000177
【０２４６】
5-(2-メチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(WW147): 化合物dU.n5 (15mg、0.041mmol)およびプロトンスポンジ(18mg、0.083mmol)のリン酸トリメチル(0.35mL)溶液にPOCl3 (8μL、0.083mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で2時間攪拌した。追加のPOCl3 (4μL、0.041mmol)を加え、混合物を0℃でさらに2時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(237mg、0.5mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(100μL)の無水DMF (1mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(5mL)に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)〜25%アセトニトリル/75% TEAB (1.5M)の直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-(2-メチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートWW5p147を得た。
2011529449.tif 000178
【０２４７】
5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000179
スキーム33  5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) n-BuLi、ホルムアルデヒド、-78℃、59%; (ii) 2-イソプロピルベンジルアルコール、未希釈、110〜112℃、12%; (iii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
2-イソプロピルベンジルアルコール: 1-ブロモ-2-イソプロピルベンゼン(2.50g、12.56mmol)の無水THF (40mL)溶液に2,2'-ジピリジル(約2mg)を窒素雰囲気下で加えた(Zhi et al., 2003、参照により本明細書に組み入れられる)。混合物を-78℃に冷却し、n-ブチルリチウム溶液(5.52mL、ヘキサン中2.5M、13.82mmol)をシリンジ経由で10分間以内に滴下した。添加時点で混合物を30分間攪拌した後、-30℃に昇温し、濃赤色が完全に消失するまでホルムアルデヒド流(160℃で加熱することでパラホルムアルデヒド1.77gから生成)を溶液に通した。混合物を飽和塩化アンモニウム(5mL)で反応停止させた後、ブライン(15mL)に注いだ。有機層を分離し、水層をジクロロメタン(各20mL)で2回抽出し、一緒にした抽出物を無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して2-イソプロピルベンジルアルコール(1.11g、59%)を油状物として得た。
2011529449.tif 000180
【０２４８】
5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n6): 化合物dU.x0 (0.331g、0.51mmol)および2-イソプロピルベンジルアルコール(1.238g、8.24mmol)を窒素雰囲気下110〜112℃で1.5時間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n6 (33mg、12%)を得た。3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(134mg、29%)および(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(98mg、26%)も反応により得られた。
2011529449.tif 000181
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの1H NMR (400MHz, CDCl3):
2011529449.tif 000182
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの13C NMR (100MHz, CDCl3):
2011529449.tif 000183
(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの1H NMR (400MHz, DMSO-d6):
2011529449.tif 000184
(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシ-ウリジンの13C NMR (100MHz, CDCl3):
2011529449.tif 000185
【０２４９】
化合物3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-イソプロピルベンジル-オキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(134mg、0.22mmol)および(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(98mg、0.19mmol)をTHF (5mL)に溶解させ、フッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム三水和物(323mg、1.05mmol)のTHF (2mL)溶液を加えた。混合物を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n6 (108mg、67%)を得た。
【０２５０】
5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'トリホスフェート(WW5p149): 化合物dU.n6 (32mg、0.082mmol)およびプロトンスポンジ(35mg、0.164mmol)のリン酸トリメチル(0.5mL)溶液にPOCl3 (15μL、0.164mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で2時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(356mg、0.75mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(150μL)の無水DMF (1.5mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(5mL)およびアセトニトリル(5mL)の混合物に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)〜25%アセトニトリル/75% TEAB (1.5M)の直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートWW5p149を得た。
2011529449.tif 000186
【０２５１】
5-(2-tert-ブチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000187
スキーム34  5-(2-tert-ブチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) NaNO2、HBr、5〜10℃、次にCu(0)、50℃、27%; (ii) n-BuLi、ホルムアルデヒド、-78℃、75%; (iii) 2-tert-ブチルベンジルアルコール、未希釈、115〜118℃; (iv) n-Bu4NF、THF、室温、70%; (v) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
1-ブロモ-2-tert-ブチルベンゼン: 5℃未満に冷却した(氷/塩浴)、2-tert-ブチルアニリン(7.46g、50mmol、15.6mL)の臭化水素酸(40% w/w、15mL)溶液に、亜硝酸ナトリウム7.55g (0.11mol)の水10mL溶液を、温度が10℃を超えない速度(約2時間の添加時間)で加えた。ジアゾ化が完了した時点で銅粉末0.20gを加えた(注意: 激しいガス放出を理由として溶液を非常に慎重に還流させた!)。激しい窒素放出が鎮静した時点で系を50℃に30分間維持した後、水80mLで希釈し、ジエチルエーテル(各100mL)で3回抽出した。有機層を10% KOH溶液で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲル上でのクロマトグラフィーで精製した。得られた生成物を85℃ (3mmHg)でさらに蒸留して1-ブロモ-2-tert-ブチルベンゼン(2.88g、27%)を得た。
2011529449.tif 000188
【０２５２】
2-tert-ブチルベンジルアルコール: 1-ブロモ-2-tert-ブチルベンゼン(2.88g、13.51mmol)の無水THF (45mL)溶液に2,2'-ジピリジル(約10mg)を窒素雰囲気下で加えた。混合物を-78℃に冷却し、n-ブチルリチウム溶液(ヘキサン中2.5M、5.94mL、14.86mmol)をシリンジ経由で10分間以内に滴下した。添加時点で混合物を30分間攪拌した後、-30℃に昇温し、濃赤色が完全に消失するまでホルムアルデヒド流(160℃超で加熱することでパラホルムアルデヒド1.91gから生成)を溶液に通した。混合物を飽和塩化アンモニウム溶液(5mL)で反応停止させた後、ジクロロメタン(100mL)および水(50mL)の混合物に注いだ。有機相を分離し、水相をジクロロメタン(20mL)で2回抽出した。一緒にした有機相を無水Na2SO4で乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して2-tert-ブチルベンジルアルコール(1.67g、75%)を油状物として得た。
2011529449.tif 000189
【０２５３】
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-tert-ブチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n7)および(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-tert-ブチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n8): 化合物dU.x0 (230mg、0.36mmol)および2-tert-ブチルベンジルアルコール(0.49g、3.60mmol)を窒素雰囲気下118〜122℃で1時間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量の酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-tert-ブチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n7 (32mg、17%)および(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-tert-ブチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n8 (28mg、19%)を得た。
2011529449.tif 000190
【０２５４】
5-(2-tert-ブチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n9): 化合物dU.n7 (32mg、0.050mmol)およびdU.n8 (27mg、0.052mmol)をTHF (4mL)に溶解させ、フッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム三水和物(65mg、0.204mmol)のTHF (2mL)溶液を加えた。混合物を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-(2-tert-ブチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n9 (108mg、67%)を得た。
2011529449.tif 000191
【０２５５】
5-(2-tert-ブチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(WW6p024): 化合物dU.n9 (30mg、0.074mmol)およびプロトンスポンジ(32mg、0.15mmol)のリン酸トリメチル(0.4mL)溶液にPOCl3 (10μL、0.11mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で2時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(285mg、0.6mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(120μL)の無水DMF (1.2mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(5mL)およびアセトニトリル(5mL)の混合物に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)〜25%アセトニトリル/75% TEAB (1.5M)の直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-(2-tert-ブチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートWW6p024を得た。
2011529449.tif 000192
【０２５６】
5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000193
スキーム35  5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成(i) 2-ビフェニルメタノール、未希釈、118〜122℃、15%; (ii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n10): 化合物dU.x0 (0.916g、1.41mmol)および2-ビフェニルメタノール(2.596g、14.10mmol)を窒素雰囲気下118〜122℃で1.5時間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n10 (87mg、15%)を得た。3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(134mg、19%)および(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(263mg、36%)も反応により得られた。
2011529449.tif 000194
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの1H NMR (400MHz, CDCl3):
2011529449.tif 000195
(3'または5')-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの1H NMR (400MHz, DMSO-d6):
2011529449.tif 000196
【０２５７】
5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(WW6p010): 化合物dU.n10 (28mg、0.066mmol)およびプロトンスポンジ(28mg、0.13mmol)のリン酸トリメチル(0.4mL)溶液にPOCl3 (9μL、0.1mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で2時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(285mg、0.6mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(120μL)の無水DMF (1.2mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(6mL)およびアセトニトリル(4mL)の混合物に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)〜25%アセトニトリル/75% TEAB (1.5M)の直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートWW6p010を得た。
2011529449.tif 000197
【０２５８】
5-(2,6-ジメチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成
2011529449.tif 000198
スキーム36  5-(2,6-ジメチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成: (i) BH3(SMe2)、THF、還流、51%; (ii) 2,6-ジメチルベンジルアルコール、未希釈、118〜120℃、80%; (iii) n-Bu4NF、THF、室温、67%; (iv) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
2,6-ジメチルベンジルアルコール: Beaulieu et al. (2000、参照により本明細書に組み入れられる)に従って2,6-ジメチルベンジルアルコールを調製したが、成功しなかったため、異なる還元剤を使用した。2,6-ジメチル安息香酸(1.00g、6.65mmol)の無水THF (10mL)懸濁液にBH3(SMe2)のTHF溶液を窒素雰囲気下で慎重に加えた。混合物を16時間加熱還流させた後、飽和塩化アンモニウム(5mL)および2M HCl (10mL)で反応停止させた(注意: 激しいガス放出!)。有機層を分離し、水層を酢酸エチル(各45mL)で3回抽出し、一緒にした抽出物を飽和炭酸水素ナトリウム(各20mL)で2回洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して2,6-ジメチルベンジルアルコール(0.50g、51%)を白色固体として得た。
2011529449.tif 000199
【０２５９】
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2,6-ジメチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n11): 化合物dU.x0 (230mg、0.36mmol)および2,6-ジメチルベンジルアルコール(0.49g、3.60mmol)を窒素雰囲気下118〜122℃で1時間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量の酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(2,6-ジメチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n11 (170mg、80%)を得た。
2011529449.tif 000200
【０２６０】
5-(2,6-ジメチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n12): 化合物dU.n11 (131mg、0.22mmol)のTHF (4mL)溶液にフッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム三水和物(171mg、0.54mmol)のTHF (2mL)溶液を加えた。混合物を室温で30分間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-(2,6-ジメチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n12 (108mg、67%)を得た。
2011529449.tif 000201
【０２６１】
5-(2,6-ジメチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート(WW6p015): 化合物dU.n12 (30mg、0.08mmol)およびプロトンスポンジ(34mg、0.16mmol)のリン酸トリメチル(0.4mL)溶液にPOCl3 (11μL、0.12mmol)を加え、反応液を窒素雰囲気下0℃で2時間攪拌した。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(285mg、0.5mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(120μL)の無水DMF (1.2mL)溶液を加えた。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加えた。反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮した。残渣を水(5mL)およびアセトニトリル(5mL)の混合物に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)〜25%アセトニトリル/75% TEAB (1.5M)の直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。トリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-(2,6-ジメチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートWW6p015を得た。
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【０２６２】
5-(3-フェニル-2-プロペニルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの合成およびその5'-トリホスフェートへの反応
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スキーム37  5-(3-フェニル-2-プロペニルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートの合成。(i) シンナモイルアルコール、未希釈、104℃、36%; (ii) n-Bu4NF、THF、室温、76%; (iii) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、0℃; (n-Bu3NH)2H2P2O7、n-Bu3N、DMF; 1M HNEt3HCO3。
3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(3-フェニル-2-プロペニルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n13): 化合物dU.x0 (500mg、0.77mmol)およびシンナミルアルコール(331mg、2.17mmol)を窒素雰囲気下104℃で1時間そのまま加熱した。混合物を室温に冷却し、最小量の酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して3',5'-O-ビス-(tert-ブチルジメチルシリル)-5-(3-フェニル-2-プロペニルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n13 (169mg、36%)を得た。
2011529449.tif 000204
【０２６３】
5-(3-フェニル-2-プロペニルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(dU.n14): 化合物dU.n13 (138mg、0.23mmol)のTHF (2mL)溶液にフッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム三水和物(321mg、0.73mmol)のTHF (2mL)溶液を加えた。混合物を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して5-(3-フェニル-2-プロペニルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンdU.n14 (65mg、76%)を得た。
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【０２６４】
5-(3-フェニル-2-プロペニルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェート: この化合物は作製しなかったが、以下の方法またはその修正版に従って合成することができる。化合物dU.n14 (28mg、0.066mmol)およびプロトンスポンジ(28mg、0.13mmol)のリン酸トリメチル(0.4mL)溶液にPOCl3 (9μL、0.1mmol)を加える可能性があり、次に反応液を窒素雰囲気下0℃で2時間攪拌する可能性がある。ビス-トリ-n-ブチルアンモニウムピロホスフェート(285mg、0.6mmol)およびトリ-n-ブチルアミン(120μL)の無水DMF (1.2mL)溶液を加える可能性がある。30分間攪拌後、炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液(1M、pH 7.5; 10mL)を加える可能性がある。次に反応液を室温で1時間攪拌した後、減圧濃縮する可能性がある。次に残渣を水(6mL)およびアセトニトリル(4mL)の混合物に溶解させ、濾過し、4.5ml/分の240分にわたる25%アセトニトリル/75%炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB、0.1M)〜25%アセトニトリル/75% TEAB (1.5M)の直線勾配を用いたQ Sepharose FFカラム(2.5x10cm)を使用するアニオン交換クロマトグラフィーで精製する可能性がある。次にトリホスフェートを含有する画分を一緒にし、凍結乾燥させて5-(3-フェニル-2-プロペニルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートWW6p014を得る可能性がある。
【０２６５】
実施例10
dU類似体の化学的開裂の結果
5-(ベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの化学的開裂
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スキーム38  5-(ベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの化学的開裂。(i) H2、Pd/C、エタノール、30分、88%; (ii) H2、Na2PdCl4、無水エタノール、20分。
不均一パラジウム触媒を使用する化学的開裂: 5-(ベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(29mg、0.082mmol)の無水エタノール(2mL)溶液に窒素雰囲気下でパラジウム担持活性炭10mg (10重量%、10mg)を加えた(注意: 可燃性固体!  確実に無酸素雰囲気で取り扱うこと)。混合物を水素ガスでフラッシングし、5分ごとにTLCでモニタリングしながら室温で30分間攪拌した。混合物を濾過し、減圧濃縮し、減圧乾燥させてチミジン(18mg、88%)を得て、これを標準品との比較(TLCおよび1H NMR)により同定した。
【０２６６】
均一パラジウム触媒を使用する化学的開裂: 5-(ベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(3.48mg、0.01mmol)の無水エタノール(0.1mL)溶液に窒素雰囲気下でテトラクロロパラジウム(II)酸ナトリウム(0.6mg、0.002mmol)の無水エタノール(0.9mL)溶液を加えた。混合物を水素ガスでフラッシングし、5分ごとにTLCでモニタリングしながら室温で攪拌した。20分後、TLCは出発原料の完全な消失を示した。TLCでの標準品との比較により、唯一の開裂生成物をチミジンであると同定した。
【０２６７】
5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの化学的開裂
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スキーム39  5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの化学的開裂。(i) H2、Pd/C、エタノール、5分。
不均一パラジウム触媒を使用する化学的開裂: 5-(2-イソプロピルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの無水エタノール(10mM、1mL)溶液に窒素雰囲気下でパラジウム担持活性炭(10重量%、2mg)を加えた(注意: 可燃性固体!  確実に無酸素雰囲気で取り扱うこと)。混合物を水素ガスでフラッシングし、1分ごとにTLCでモニタリングしながら室温で5分間攪拌した。5分後、TLCは出発原料の完全な消失を示した。TLCでの標準品との比較により、唯一の開裂生成物をチミジンであると同定した。
【０２６８】
5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの化学的開裂
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スキーム40  5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの化学的開裂。(i) H2、Pd/C、エタノール、5分。
不均一パラジウム触媒を使用する化学的開裂: 5-(2-フェニルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの無水エタノール(10mM、1mL)溶液に窒素雰囲気下でパラジウム担持活性炭(10重量%、2mg)を加えた(注意: 可燃性固体!  確実に無酸素雰囲気で取り扱うこと)。混合物を水素ガスでフラッシングし、1分ごとにTLCでモニタリングしながら室温で5分間攪拌した。5分後、TLCは出発原料の完全な消失を示した。TLCでの標準品との比較により、唯一の開裂生成物をチミジンであると同定した。
【０２６９】
5-(2,6-ジメチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの化学的開裂
2011529449.tif 000209
スキーム41  5-(2,6-ジメチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの化学的開裂。(i) H2、Pd/C、エタノール、5分。
不均一パラジウム触媒を使用する化学的開裂: 5-(2,6-ジメチルベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの無水エタノール(10mM、1mL)溶液に窒素雰囲気下でパラジウム担持活性炭(10重量%、2mg)を加えた(注意: 可燃性固体!  確実に無酸素雰囲気で取り扱うこと)。混合物を水素ガスでフラッシングし、1分ごとにTLCでモニタリングしながら室温で5分間攪拌した。5分後、TLCは出発原料の完全な消失を示した。TLCでの標準品との比較により、唯一の開裂生成物をチミジンであると同定した。
【０２７０】
5-(ベンジルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの化学的開裂
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スキーム42  5-ベンジルオキシメチル-2'-デオキシウリジンの接触水素化分解
5-ベンジルオキシ-2'-デオキシウリジン(10mg)のエタノール(1mL)溶液にPd/C (10%、10mg)を加え、混合物を5分間攪拌した。水素をバルーン経由で系に導入し、反応混合物を室温で攪拌した。アリコート(5μL)を様々な時点の間隔で反応混合物から取り出し、薄層クロマトグラフィーおよびHPLCで分析した。室温で10分後にチミジンへの完全な開裂が観察された(スキーム42および図4)。開裂の中間体をベンジル基の最初の除去により生成される5-ヒドロキシメチル-dUであると同定し、HOMedUをチミジンにさらに還元した。
【０２７１】
接触水素化分解を使用する5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの開裂: 5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジン(13mg)のエタノール(3mL)溶液にPd/C (10%、15mg)を加え、混合物を5分間攪拌した。水素をバルーン経由で系に導入し、反応混合物を室温で攪拌した。アリコート(5μL)を様々な時点の間隔で反応混合物から取り出し、薄層クロマトグラフィーおよびHPLCで分析した。室温で240分後にチミジンへの完全な開裂が観察された(スキーム43および図5)。α-イソプロピル置換5-ベンジルオキシメチル-dUの緩徐な開裂が、この化合物が触媒表面に結合する際に置換が呈する立体障害により引き起こされることがある。したがって、化学的開裂の速度は、α-炭素が置換されている場合の5-ベンジルオキシメチルウリジン類似体において実質的に減少し、このことはこれらの化合物の終結特性および識別特性においても重要である。理論には拘束されないが、α-炭素位ではなくベンジル環の2位の置換も終結特性に影響を与えることがあり(表2を参照)、これはより速やかなヌクレオチドの開裂を与える。
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スキーム43  5-(1-フェニル-2-メチル-プロピルオキシ)メチル-2'-デオキシウリジンの接触水素化分解
【０２７２】
本明細書において開示および請求したすべての方法を、本開示に照らして、過度の実験なしに実施および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様に関して説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲より逸脱することなく、この方法、および本明細書に記載の方法の段階または段階の順序に変動を適用することができることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にかつ生理学的に関連するある種の薬剤で、同一のまたは同様の結果を実現しながら、本明細書に記載の薬剤を代用することができることは明らかであろう。当業者には明らかなすべてのそのような同様の代用物および修正は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。
【０２７３】
参考文献
以下の参考文献、および付録に列挙されている参考文献は、それらが本明細書に開示の参考文献を補足する例示的な手順上のまたは他の詳細を与える限りにおいて、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
米国特許第4,439,356号
米国特許第5,151,507号
米国特許第5,188,934号
米国特許第5,770,367号
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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