(57)【要約】  Ｃ３ｂエピトープに結合する組成物および組成物を使用する方法が本出願に記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ３ｂネオエピトープに結合する抗原結合部分を含む単離された結合分子。
【請求項２】
特異的にＣ３ｂエピトープに結合する抗原結合部分を含む単離されたＣ３ｂ結合分子であって、抗原結合部分が以下のうちの１つに含まれるか、または以下のうちの１つと重複しているヒトＣ３ｂのエピトープに結合するものであるＣ３ｂ結合分子：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸ＧＥＤＴＶＱＳＬＴＱＧ；
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸ＤＥＤＩＩＡＥＥＮＩＶＳＲＳＥＦ；
（ｃ）配列番号：３のアミノ酸ＩＲＭＮＫＴＶＡＶＲＴ；
（ｄ）配列番号：４のアミノ酸ＳＤＱＶＰＤＴＥＳＥＴ；
（ｅ）配列番号：５のアミノ酸ＶＡＱＭＴＥＤ；
（ｆ）配列番号：６のアミノ酸ＦＶＫＲＡＰ；
（ｇ）配列番号：７のアミノ酸ＫＤＫＮＲＷＥＤＰＧＫＱＬＹＮ；
（ｈ）配列番号：８のアミノ酸ＣＴＲＹＲＧＤＱＤＡＴＭＳ；または
（ｉ）配列番号：９のアミノ酸ＧＦＡＰＤＴＤＤＬＫＱＬＡＮＧＶ。
【請求項３】
抗原結合部分が非ヒト霊長類のＣ３ｂ抗原と交差反応する、請求項１または２に記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項４】
抗原結合部分が齧歯動物種のＣ３ｂ抗原と交差反応する、請求項１−３のいずれかに記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項５】
抗原結合部分が直鎖エピトープに結合する、請求項１−４のいずれかに記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項６】
抗原結合部分が非直鎖エピトープに結合する、請求項１−４のいずれかに記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項７】
抗原結合部分が１ｎＭ以下のＫＤにてヒトＣ３ｂ抗原に結合する、請求項１−６のいずれかに記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項８】
抗原結合部分が５ｎＭ以下のＫＤにて非ヒト霊長類のＣ３ｂ抗原に結合する、請求項１−６のいずれかに記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項９】
抗原結合部分がヒト抗体の抗原結合部分である、請求項１−８のいずれかに記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項１０】
抗体がヒトまたはヒト化抗体である、請求項１に記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項１１】
抗原結合部分がモノクローナル抗体の抗原結合部分である、請求項１−１０のいずれかに記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項１２】
抗原結合部分がポリクローナル抗体の抗原結合部分である、請求項１に記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項１３】
Ｃ３ｂ結合分子がキメラ抗体である、請求項１に記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項１４】
Ｃ３ｂ結合分子が抗体のＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメントを含む、請求項１に記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項１５】
Ｃ３ｂ結合分子が一本鎖Ｆｖを含む、請求項１に記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項１６】
Ｃ３ｂ結合分子がダイアボディを含む、請求項１または２に記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項１７】
抗原結合部分が下記アイソタイプのいずれか：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の抗体由来である、請求項１−１６のいずれかに記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項１８】
抗原結合部分が下記アイソタイプのいずれか：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の抗体由来であり、Ｆｃ配列が通常配列と比較してエフェクター機能を調節するか、またはＦｃ受容体への結合を改変するために改変された、請求項１−１７のいずれかに記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項１９】
Ｆｃ配列がアミノ酸残基２３４または２３５にて改変された、請求項１８に記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項２０】
Ｃ３ｂ結合分子が細胞におけるＭＡＣ生産を阻害する、上記いずれかの請求項に記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項２１】
Ｃ３ｂ結合分子が転換酵素へのＣ３ｂ結合を阻害する、上記いずれかの請求項に記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項２２】
Ｃ３ｂ結合分子がＣ３またはＣ５転換酵素へのＣ３結合を阻害する、請求項２１に記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項２３】
Ｃ３ｂ結合分子がＣ３またはＣ５転換酵素のタンパク質分解活性を阻害する、請求項１−２２のいずれかに記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項２４】
Ｃ３ｂ結合分子が、Ｃ３ｂ抗原が存在する条件下にて細胞またはプロパージンと接触させたとき、Ｃ３ｂ結合分子の非存在下における阻害と比較して、細胞または表面における：（ｉ）Ｃ３またはＣ５転換酵素；または（ｉｉ）Ｃ５ａまたはＭＡＣ；または（ｉｉｉ）Ｃ３ａまたはｉＣ３ｂまたはＣ３ｂの生成を減少させる、請求項１−２３のいずれかに記載のＣ３ｂ結合分子。
【請求項２５】
上記いずれかの請求項に記載のＣ３ｂ結合分子を含む医薬組成物。
【請求項２６】
（細胞）におけるＭＡＣ合成を阻害する方法であって、細胞またはプロパージンをＣ３ｂ結合分子と接触させることを含む方法。
【請求項２７】
表１から選択されるアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２８】
対象におけるＣ３ｂ活性を調節する方法であって、補体系が介在する細胞活性を調節するＣ３ｂ結合分子を対象に投与することを含む方法。
【請求項２９】
有効量の請求項２５の組成物を対象に投与することを含む、処置を必要とする対象における眼疾患を処置する方法。
【請求項３０】
対象のＭＡＣレベルを組成物の投与前の対象におけるＭＡＣレベルと比較して少なくとも５％減少させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
対象が第２の薬剤における治療も受けている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
対象がＡＭＤを有するか、または、ＡＭＤの危険性がある、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
対象が乾燥型ＡＭＤを示すか、または湿潤型ＡＭＤの危険性がある、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は抗原結合分子、これらの分子により結合されているネオエピトープおよび該分子を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
加齢関連黄斑変性症（ＡＭＤ）は６５歳以上のアメリカ人における進行性疾患および失明および盲目の主な原因である。ＡＭＤは主に黄斑；読書または運転に必要とされる高視力に関与する網膜の一部に影響する。大多数のＡＭＤ患者はドルーゼンと呼ばれる細胞外網膜沈着物の存在により特徴付けられる疾患の早期段階を患う。ドルーゼンは細胞残屑の細胞外網膜沈着物、炎症性メディエーターおよび細胞外マトリックス成分である。ＡＭＤの後期は乾燥型または湿潤型として現れ、それらは両方とも失明と関連している。地図状萎縮としても知られている乾燥型ＡＭＤは検眼鏡検査において網膜色素上皮（ＲＰＥ）喪失の局所地域に対応する明白に区別される領域として現れる。湿潤型ＡＭＤは脈絡膜の新血管新生と関連し、ブルッフ膜における完全性および網膜における血管成長の喪失を引き起こし、そのような場所ではしばしば出血が起こり得る。この漏出は網膜細胞において永久的損傷を引き起こし、次々に死に、中心視において盲点を創る。
【０００３】
本来のヒト系は補体経路から構成される。補体経路は化膿性細菌感染症に対して防御するために働き、先天および適応免疫を乗り越え；そして、免疫複合体および炎症性損傷の生成物を処分する。該補体は血漿および細胞表面におけるカスケード反応に関与する３０個以上のタンパク質系である。補体系およびその補体成分は種々の免疫過程に関与する。例えば、最終複合体または細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）としても呼ばれる補体Ｃ５ｂ−９複合体は膜透過性損傷を誘導することにより細胞死において重要な役割を果たす。
【０００４】
最近の研究により、補体成分Ｃ３およびＣ５がＡＭＤを有する患者におけるドルーゼンの主な構成成分であることが証明されている（Mulling, R.F. et al. (2000) FASEB J 14, 835-46）。これらの存在ならびにドルーゼンを覆うＲＰＥ細胞における細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）Ｃ５ｂ−９および他の急性期反応物質タンパク質の存在が、補体活性化およびＭＡＣの形成を引き起こすことができるプロセスに関与すると推測されている（Johnson, L et al. (2001) Exp Eye Res 73, 887-896）。したがって、補体成分が単なる先天免疫のメディエーター以上であるという証拠が増加している。
【０００５】
栄養学的介入は乾燥型ＡＭＤの湿潤型ＡＭＤへの進行を阻害するために指示されている。現在、湿潤型ＡＭＤに対してＦＤＡにて承認されている治療は光力学的治療（ＰＤＴ）、抗ＶＥＧＦアプタマー、例えば、ペガプタニブ、および抗ＶＥＧＦ抗体、ラニビズマブのみを含む。これらの薬物または治療は一般的にすでに実質的な失明を患った患者に投与される。
【０００６】
現在の処置に取って代わる、または現在の処置を補うためのＡＭＤに対する有効な処置を開発する必要性が残っている。特に、失明の早期検出、予防または回復を提供することができる処置の必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
要約
本発明は補体成分Ｃ３ｂのエピトープ、Ｃ３ｂ結合分子ならびに該分子を製造および使用する方法に関する。本発明はさらにＣ３ｂに結合する分子（すなわち、Ｃ３ｂ結合分子）、特にヒトＣ３ｂエピトープに結合する抗体およびその部分ならびに少なくとも１つの補体タンパク質または副および／または古典的補体経路が介在する細胞活性を調節するものを提供する。
【０００８】
本明細書中における“補体経路”または“補体”なる記載は副補体経路または古典的補体経路のいずれか、または両方を示す。
【０００９】
１つの局面において、レベルを調節される補体成分タンパク質はアナフィラトキシン、因子Ｈ、因子Ｐ、因子Ｂ、Ｃ３またはＣ５転換酵素；Ｃ３分解産物、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄ、Ｃ５分解産物、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ；ＭＡＣおよび補体副産物のＭＡＣ依存生産物である。
【００１０】
他の局面において、本発明の結合分子は補体タンパク質の酵素活性を調節する。いくつかの方法において、調節される酵素活性はＣ３および／またはＣ５転換酵素活性、Ｃ３のＣ３ａおよびＣ３ｂへの変換、Ｃ５のＣ５ａおよびＣ５ｂへの変換ならびにＣ５ｂ−９の形成である。
【００１１】
他の局面において、本発明は対象における補体タンパク質生産のレベルを調節する方法を特徴とする。該方法は以下の１つ以上の生物学的活性を調節するＣ３ｂ結合分子を対象に投与することを含む：（ａ）Ｃ３転換酵素への因子Ｐ結合の阻害；（ｂ）Ｃ３ｂへの因子Ｂ結合の阻害；（ｃ）Ｃ３またはＣ５転換酵素のタンパク質分解活性の競合または非競合阻害；（ｄ）Ｃ３ｂのＣ３転換酵素への結合の阻害、それによるＣ５転換酵素の形成の阻害；（ｅ）Ｃ３分解産物、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄの形成の阻害；（ｆ）Ｃ５分解産物、Ｃ５ａおよびＣ５ｂの形成の阻害；（ｇ）ＭＡＣ形成の阻害、および（ｈ）Ｃ６、クラスタリン、ハプトグロビン、Ｉｇカッパ鎖、Ｉｇラムダ鎖またはＩｇガンマ鎖を含む補体副産物のＭＡＣ依存生産の阻害。いくつかの方法はさらに対象からの尿、血漿、血清、すべての血液または眼の液体における補体タンパク質のレベルを検出することを含む。
【００１２】
したがって、１つの局面において、本発明はＣ３ｂネオエピトープ(neo-epitope)に結合する抗原結合部分を含むＣ３ｂ結合分子であって、ここで、抗原結合部分は以下の表１に挙げられているアミノ酸の群から選択されるネオエピトープに結合する結合分子を提供する。
【００１３】
他の局面において、Ｃ３ｂ結合分子はエフェクターリガンドに対する親和性において改変されている。本発明の抗Ｃ３ｂ抗体は、ＦｃＲγ結合を排除し、エフェクター機能を弱めるために、好ましくは２３４および２３５位置にてロイシンからアラニンへの変異を有する。
【００１４】
特に、本発明はＣ３ｂネオエピトープに結合する（例えば、特異的に結合する）抗体の抗原結合部分を含む単離されたＣ３ｂ結合分子であって、ここで、抗原結合部分は以下のＣ３ｂネオエピトープのうちいずれかに含まれるか、または以下のうちいずれかと重複しているヒトＣ３ｂのネオエピトープに結合する結合分子を提供する：（ａ）ＧＥＤＴＶＱＳＬＴＱＧ（アミノ酸３９３−４０３、配列番号：１）；（ｂ）ＤＥＤＩＩＡＥＥＮＩＶＳＲＳＥＦ（アミノ酸７５２−７６７、配列番号：２）；（ｃ）ＩＲＭＮＫＴＶＡＶＲＴ（アミノ酸９３６−９４６、配列番号：３）；（ｄ）ＳＤＱＶＰＤＴＥＳＥＴ（アミノ酸９６８−９７８、配列番号：４）；（ｅ）ＶＡＱＭＴＥＤ（アミノ酸９８７−９９３、配列番号：５）、（ｆ）ＦＶＫＲＡＰ（アミノ酸１０６９−１０７４、配列番号：６）；（ｇ）ＫＤＫＮＲＷＥＤＰＧＫＱＬＹＮ（アミノ酸１２１５−１２２９、配列番号：７）；（ｈ）ＣＴＲＹＲＧＤＱＤＡＴＭＳ（アミノ酸１３８９−１４０１、配列番号：８）；（ｉ）ＧＦＡＰＤＴＤＤＬＫＱＬＡＮＧＶ（アミノ酸１４１０−１４２５、配列番号：９）。
【００１５】
他の局面において、本発明は第２または第３の分子に関連するＣ３ｂネオエピトープに結合する（例えば、特異的に結合する）結合分子の抗原結合部分を含む単離されたＣ３ｂ結合分子を提供する。第２または第３の分子は遊離であるか、またはデュプレックスまたはトリプレックスのごとき複合体として結合していてもよい。このような第２または第３の分子は、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂＢｂ、Ｃ４ｂ、Ｃ４ｂ２ａ、因子Ｐ、因子Ｈ、因子Ｂまたはそれらの部分からなる群から選択され得る。
【００１６】
種々の局面において、抗原結合部分は以下の表１において挙げられている１つ以上のアミノ酸のうちいずれかに含まれるか、または以下の表１において挙げられている１つ以上のアミノ酸のうちいずれかと重複しているヒトＣ３ｂのネオエピトープに特異的に結合する。種々の局面において、結合分子は抗体または直鎖もしくは非直鎖エピトープに結合することができる抗体の様態において機能する分子である。１つの局面において、Ｃ３ｂ分子が本明細書における表１の１つ以上のネオエピトープを含む非直鎖エピトープに結合するとき、ネオエピトープは、望ましい生物学的機能を実質的に生じるようにネオエピトープの１つ以上の抗原部分と相互作用するために、結合分子に対して構造的に配置されているべきである。直鎖および非直鎖ネオエピトープは以下のいずれかの直鎖エピトープの少なくとも１つの部分を含む：（ａ）配列番号：４のアミノ酸９６８−９７８；および（ｂ）配列番号：２のアミノ酸７５２−７６２。他の例において、抗原結合部分は以下のいずれかの直鎖ネオエピトープの少なくとも１つの部分を含むまか、あるいは該１つの部分からなる非直鎖ネオエピトープに結合する：（ａ）配列番号：３のアミノ酸９３６−９４６；および（ｂ）配列番号：８のアミノ酸１３８９−１４０１。非直鎖ネオエピトープの任意の組合せは少なくとも１つの補体タンパク質または補体経路が介在する細胞活性を調節するようにこのような結合分子により結合されていてもよい。
【００１７】
他の局面において、Ｃ３ｂ結合分子は非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）のＣ３ｂと交差反応する。種々の局面において、抗原結合部分は齧歯動物種（例えば、ネズミＣ３ｂ、ラットＣ３ｂ、ウサギＣ３ｂ）のＣ３ｂと交差反応する。
【００１８】
１つの局面において、本方法の結合分子は解離定数（ＫＤ）１ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ）にてＣ３ｂに結合する。
【００１９】
他の局面において、Ｃ３ｂ結合分子はヒトＣ３ｂへの結合に対するＫＤの５−１０倍以内のＫＤにて非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）のＣ３ｂネオエピトープに結合する。
【００２０】
１つの態様において、本発明の結合分子はＫＤ５ｎＭ以下にて、またはヒトＣ３ｂへの結合に対するＫＤの１００倍以内にてマウスＣ３ｂネオエピトープに結合する。
【００２１】
１つの局面において、結合分子はキメラ（例えば、ヒト化）抗体またはヒト抗体である。
他の局面において、結合分子はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
【００２２】
Ｃ３ｂ結合分子は、例えば、抗体のＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメントを含む。
【００２３】
１つの局面において、Ｃ３ｂ結合分子はヒト抗体である。
１つの局面において、Ｃ３ｂ結合分子は一本鎖Ｆｖを含む。
【００２４】
１つの局面において、Ｃ３ｂ結合分子はダイアボディ（例えば、一本鎖ダイアボディまたは２つのポリペプチド鎖を有するダイアボディ）を含む。他の局面において、抗体の抗原結合部分は下記アイソタイプの１つの抗体由来である：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４。他の局面において、抗体の抗原結合部分はＩｇＡまたはＩｇＥアイソタイプの抗体由来である。
【００２５】
他の局面において、本発明は、動物に投与されたとき、Ｃ３ｂネオエピトープに特異的に結合する抗体を誘導するための組成物を提供する。該組成物は、例えば、本明細書の表１に挙げられている１つ以上のペプチド；５個以下のアミノ酸変化を有するそれらのペプチド；またはそれらのフラグメント（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸を含むフラグメント）を含む。該組成物は、例えば、Ｃ３ｂネオエピトープまたはそのフラグメントが担体タンパク質に結合することにより、抗原性を高めるように調節することができる。
【００２６】
他の局面において、本発明は細胞におけるＭＡＣ生産を減少させる方法を特徴とする。１つの例において、ＭＡＣ生産または阻害は、例えば、ニワトリ、ウサギまたはヒトからの赤血球の溶血の阻害のごとき標準ＣＨ５０およびＡＨ５０溶血アッセイを使用することにより測定され得る。該アッセイ方法は、本明細書においてさらに提供されるとおり、赤血球をＣ３ｂ結合分子と接触させ、それにより赤血球のＭＡＣ形成を阻害することを含む。
【００２７】
本発明のいくつかの方法において、結合分子は活性化補体系に応答するか、または介在する細胞活性を調節する。いくつかの方法において、調節される細胞活性は細胞溶解である。いくつかの方法はさらに、例えば、溶血アッセイにより細胞活性を検出することを含む。いくつかの方法において、細胞活性は対象からの尿、血漿、血清、すべての血液または眼の液体において検出される。
【００２８】
本発明は、また、本明細書に記載されている１つ以上のＣ３ｂ結合分子を含む医薬組成物を提供する。１つの態様において、本発明は、以下のＣ３ｂエピトープのうちいずれか１つに含まれるか、または以下のＣ３ｂネオエピトープのうちいずれか１つと重複しているヒトＣ３ｂエピトープに結合するＣ３ｂ結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。ここで、該Ｃ３ｂネオエピトープの群は以下のものからなる：（ａ）ＧＥＤＴＶＱＳＬＴＱＧ（アミノ酸３９３−４０３、配列番号：１）；（ｂ）ＤＥＤＩＩＡＥＥＮＩＶＳＲＳＥＦ（アミノ酸７５２−７６７、配列番号：２）；（ｃ）ＩＲＭＮＫＴＶＡＶＲＴ（アミノ酸９３６−９４６、配列番号：３）；（ｄ）ＳＤＱＶＰＤＴＥＳＥＴ（アミノ酸９６８−９７８、配列番号：４）；（ｅ）ＶＡＱＭＴＥＤ（アミノ酸９８７−９９３、配列番号：５）；（ｆ）ＦＶＫＲＡＰ（アミノ酸１０６９−１０７４、配列番号：６）；（ｇ）ＫＤＫＮＲＷＥＤＰＧＫＱＬＹＮ（アミノ酸１２１５−１２２９、配列番号：７）；（ｈ）ＣＴＲＹＲＧＤＱＤＡＴＭＳ（アミノ酸１３８９−１４０１、配列番号：８）；（ｉ）ＧＦＡＰＤＴＤＤＬＫＱＬＡＮＧＶ（アミノ酸１４１０−１４２５、配列番号：９）。
【００２９】
他の態様において、本発明は、以下の直鎖エピトープの各々の少なくとも１つの部分を含むヒトＣ３ｂネオエピトープに結合するＣ３ｂ結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。ここで、該直鎖エピトープは：（ａ）配列番号：４のアミノ酸９６８−９７８；および（ｂ）配列番号：２のアミノ酸７５２−７６２である。１つの態様において、Ｃ３ｂ結合分子は直鎖Ｃ３ｂネオエピトープに結合する。他の態様において、Ｃ３ｂ結合分子は非直鎖Ｃ３ｂネオエピトープに結合する。
【００３０】
他の態様において、本発明は、以下の直鎖エピトープの各々の少なくとも１つの部分を含むか、または該部分からなるヒトＣ３ｂ非直鎖ネオエピトープに結合するＣ３ｂ結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。ここで、該直鎖エピトープは：（ａ）配列番号：３のアミノ酸９３６−９４６；および（ｂ）配列番号：８のアミノ酸１３８９−１４０１である。
【００３１】
他の局面において、本発明は対象における失明を処置または予防する方法を特徴とする。本明細書において使用される“処置する”または“処置”なる用語は対象における障害または疾患のすべての処置を意味し、障害または疾患に罹患しやすいであろうが、まだ障害または疾患を有すると診断されていない対象における発症から障害または疾患を予防；障害または疾患を抑制、例えば、障害または疾患の発症を阻止；障害または疾患を軽減、例えば、障害または疾患の緩解を誘導；または、疾患または障害により引き起こされる状態を軽減、例えば、疾患または障害の症状を停止または改善することを含むが、これらに限定されない。対象における疾患または障害に関して、本明細書において使用される“予防する”または“予防”なる用語は、発症したことがないとき、疾患または障害を発症しないか、または、すでに障害または疾患の発症が起こっているとき、さらに障害または疾患発症しないことを意味する。該方法は少なくとも１つの補体タンパク質の活性またはレベルまたは補体経路が介在する細胞活性を調節するために有効な量における本明細書に記載されているＣ３ｂ結合分子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの方法において、対象は黄斑変性症と関連する状態または障害を有する。他の方法において、対象は黄斑変性症と関連する障害を発症する危険性がある。いくつかの方法において、対象は黄斑変性症関連障害以外の補体関連疾患を有さない。特に、調節される補体タンパク質は対象におけるＣ３転換酵素またはＣ５転換酵素活性である。
【００３２】
対象に投与することができる量はＭＡＣ、Ｃ５ａ生産またはＣ３分解産物（例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ）の形成を阻害するために有効な量である。特に、補体活性化産物（Ｃ３ａおよび／またはＣ５ａを含むが、これらに限定されない）の濃度を対象の血液において医薬組成物の投与前のベースラインレベルと比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７５％減少させることができる。
【００３３】
本発明の方法にて処置することができる他の疾患または障害は、加齢関連黄斑障害、ノースカロライナ(North Carolina)黄斑変性、ソースビー眼底変性症、スタルガルト病、パタンジストロフィ、ベスト病、家族性ドルーゼンおよびマラッティアレベンティネース（malattia leventinese）、網膜剥離、脈絡網膜変性、網膜変性、光受容体変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、錐体変性、糸球体腎炎、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、体外循環と関連する免疫および止血系の減少による機能障害、神経障害、多発性硬化症、卒中、ギラン・バレー症候群、外傷性脳損傷、パーキンソン病、不適当なまたは望ましくない補体活性化の障害、血液透析合併症、超急性同種移植片拒絶反応、異種移植片拒絶反応、ＩＬ−２治療中のインターロイキン２誘導毒性、炎症性障害、自己免疫性疾患の炎症、クローン病、成人呼吸窮迫症候群、熱傷または凍傷を含むやけど、虚血後再潅流状態、心筋梗塞、バルーン血管形成術、心肺バイパスまたは腎臓バイパスにおけるポストポンプシンドローム、血液透析、腎臓虚血、皮膚腺再構成後の腸間膜動脈再潅流、感染病または敗血症、免疫複合体障害および自己免疫性疾患、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＳＬＥ腎炎、増殖性腎炎、溶血性貧血および重症筋無力症を含むが、これらに限定されない。加えて、他の既知の補体関連疾患は肺疾患および障害、例えば、呼吸困難、喀血、ＡＲＤＳ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、肺塞栓および梗塞、肺炎、線維形成粉塵疾患、不活性粉塵および無機物（例えば、シリコン、炭塵、ベリリウムおよびアスベスト）、肺線維症、有機粉塵疾患、化学的損傷（刺激性ガスおよび化学物質、例えば、塩素、ホスゲン、二酸化硫黄、硫化水素、二酸化窒素、アンモニアおよび塩酸による）、煤煙傷害、やけど（例えば、熱傷、凍傷）、喘息、アレルギー、気管支収縮、過敏性肺炎、寄生虫症、グッドパスチャー症候群、肺血管炎、免疫複合体関連炎症、自己免疫性心臓疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患、虚血再灌流障害、バラクワ・サイモン(Barraquer-Simons)症候群、血液透析、全身性狼瘡、エリテマトーデス、乾癬、多発性硬化症、移植、中枢神経系の疾患、例えば、アルツハイマー病および他の神経変性状態、ａＨＵＳ、類天疱瘡またはＩＩ型ＭＰＧＮである。
【００３４】
本発明の医薬組成物は当分野において既知の経路により、例えば、皮下に、静脈内にまたは硝子体内を含む眼内に投与され得る。
【００３５】
本発明の１つ以上の特徴の詳細は添付の図面および以下の記載において説明する。本発明の他の特徴、対象および利点は記載および図面および特許請求の範囲から明らかである。
【００３６】
詳細な説明
古典的および副補体経路の両方において、本発明者はＣ３ｂネオエピトープを認識して結合し、Ｃ３および／またはＣ５転換酵素の生物学的活性およびＭＡＣの生成を調節する結合分子を見出した。このような結合分子は古典的および／または副補体経路の異常活性と関連する疾患、例えば、眼疾患、黄斑変性症と関連する状態および本明細書に記載されている非眼疾患の予防および／または処置において使用することができる。
【００３７】
したがって、本発明は補体タンパク質および／または補体経路が介在する細胞活性を調節するＣ３ｂネオエピトープ、例えば、ヒト抗体およびそれらのフラグメントに結合する分子を提供する。Ｃ３ｂのネオエピトープならびにこれらのネオエピトープを製造および使用する方法は、また、本明細書において提供される。
【００３８】
本明細書において使用される“ネオエピトープ”または“ネオ抗原”は互換的に使用され、Ｃ３のタンパク質分解開裂後のＣ３ｂ上に存在するタンパク質の抗原部分である。これらのネオエピトープは開裂されていないＣ３においては利用できない。
【００３９】
“黄斑変性症と関連する状態または障害”なる用語は、網膜黄斑が、例えば、黄斑の細胞の増殖減少、黄斑の細胞（例えば、ＲＰＥ細胞）の死または再配列の増加、正常生物学的機能の喪失またはこれらの事象の組合せの結果として、機能障害を悪化させる、または機能障害となる、多くのすべての状態を意味する。黄斑変性症は正常黄斑の細胞および／もしくは細胞外マトリックスの組織構造の完全性の喪失ならびに／または黄斑の細胞の機能喪失を引き起こす。黄斑変性症関連障害の例は、ＡＭＤ、ノースカロライナ黄斑変性、ソースビー眼底変性症、スタルガルト病、パタンジストロフィ、ベスト病、家族性ドルーゼンおよびマラッティアレベンティネース（ラジアル(radial)ドルーゼン）を含む。該用語は、また、黄斑の機能障害および／または変性前または後に起こる黄斑外変化を含む。したがって、“黄斑変性症関連障害”なる用語は、また、黄斑の完全性または機能を変えるか、または損傷する（例えば、ＲＰＥまたはブルッフ膜を損傷する）広くすべての状態を含む。例えば、該用語は網膜剥離、脈絡網膜変性、網膜変性、光受容体変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィーおよび錐体変性を含む。
【００４０】
“補体成分”、“補体タンパク質”または“補体成分タンパク質”なる用語は補体系の活性化に関連する分子を意味する。古典的経路構成成分は、例えば、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９およびＣ５ｂ−９複合体（細胞膜傷害複合体：ＭＡＣ）を含む。他の経路構成成分は、例えば、因子Ｂ、因子Ｄ、プロパージン、ＨおよびＩを含む。
【００４１】
“調節”または“調節する”なる用語は本明細書において互換的に使用され、活性または生物学的プロセス（例えば、補体プロセス）の上方調節（すなわち、活性化または刺激（例えば、作動または増強することによる））および下方調節（すなわち、阻害または抑制（例えば、アンタゴナイズ、減少または阻害することによる））両方を意味する。“調節する”はプロセスの上方調節または下方調節両方を表すことを意図する。ある刺激剤により上方調節されるプロセスは刺激剤に対するアンタゴニストにより阻害され得る。逆に、ある調節剤により下方調節されるプロセスは調節剤に対するアゴニストにより阻害され得る。
【００４２】
“補体経路関連分子”、“補体経路分子”および“補体経路関連タンパク質”なる用語は互換的に使用され、補体活性化および活性化補体系により介在されるか、活性化補体系に応答するか、または活性化補体系により引き起こされる下流細胞活性において役割を果たす種々の分子を意味する。それらは補体経路のイニシエーター（すなわち、直接または間接的に補体系の活性化を引き起こす分子）、補体活性化中に生産されるか、または役割を果たす分子（例えば、補体タンパク質／酵素、例えば、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ５ｂ−９、因子Ｂ、因子Ｄ、ＭＡＳＰ−１およびＭＡＳＰ−２）、補体受容体または阻害剤（例えば、クラスタリン、ビトロネクチン、ＣＲ１またはＣＤ５９）および活性化補体系により制御されるか、または引き起こされる分子（例えば、細胞膜傷害複合体−阻害因子、ＭＡＣＩＦ；例えば、Sugita et al., J Biochem, 106:589-92, 1989、参照）を含む。したがって、本明細書に記載されている補体タンパク質に加えて、補体経路関連分子は、また、例えば、Ｃ３／Ｃ５転換酵素レギュレーター（ＲＣＡ）、例えば、補体１型受容体（ＣＲ１またはＣＤ３５とも呼ばれる）、補体２型受容体（ＣＲ２またはＣＤ２１とも呼ばれる）、膜補因子タンパク質（ＭＣＰまたはＣＤ４６）およびＣ４ｂＢＰ；ＭＡＣレギュレーター、例えば、ビトロネクチン、クラスタリン（“ＳＰ４０、４０”とも呼ばれる）、ＣＲＰ、ＣＤ５９および相同制限因子（ＨＲＦ）；免疫グロブリン鎖（例えば、Ｉｇカッパ、ＩｇラムダまたはＩｇガンマ）；Ｃ１阻害剤；および他のタンパク質、例えば、ＣＲ３、ＣＲ４（ＣＤ１１  ｂ／１８）およびＤＡＦ（ＣＤ５５）を含む。
【００４３】
“補体経路により調節される細胞活性”なる用語はＣ５ｂ−９傷害複合体、血管透過性変化、平滑筋細胞の収縮および移動、Ｔ細胞増殖、免疫接着、樹状細胞、単核細胞、顆粒球および血小板の凝集、食作用、好中球（ＰＭＮ）およびマクロファージの移動および活性化による細胞損傷を含む。
【００４４】
さらに、補体経路の活性化は補体経路内の副産物により寄与される炎症性応答の増加を引き起こす。補体経路の活性化と関連する障害は腎炎、喘息、再かん流傷害、血液透析、リウマチ性関節炎、全身性狼瘡、乾癬、多発性硬化症、移植、アルツハイマー病、ａＨＵＳ、ＩＩ型ＭＰＧＮまたはすべての他の補体介在疾患を含む。黄斑変性症と関連する障害はＡＭＤ、ノースカロライナ黄斑変性、ソースビー眼底変性症、スタルガルト病、パタンジストロフィ、ベスト病、家族性ドルーゼンおよびマラッティアレベンティネース（ラジアルドルーゼン）、機能障害および／または黄斑の変性前または後に起こる黄斑外変化、網膜剥離、脈絡網膜変性、網膜変性、光受容体変性、ＲＰＥ変性、ムコ多糖症、桿体錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィーおよび錐体変性を含む。
【００４５】
本明細書において使用される“対象”なる用語はヒトまたは非ヒト動物のすべてを含む。
【００４６】
“非ヒト動物”なる用語はすべての非ヒト脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、齧歯動物、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、トリ、両生類、は虫類などを含む。
【００４７】
本明細書において使用される“抗体”なる用語はインタクトな抗体または抗原結合フラグメント（すなわち、“抗原−結合部分”）またはそれらの一本鎖（すなわち、軽鎖または重鎖）または模倣物に関する。インタクトな抗体はジスルフィドにより相互結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと省略する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域により分断されている相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分類できる。それぞれのＶＨおよびＶＬはアミノ−末端からカルボキシ−末端へ次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４にて配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への結合を介し得る。
【００４８】
本明細書において使用される抗体の“抗原結合部分”または“結合ドメイン”なる用語は、特異的に任意の抗原（例えば、Ｃ３ｂ）に結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つ以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能はインタクトな抗体のフラグメントにより実施できる。抗体の“抗原結合部分”なる用語内に包含される結合フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメント（一般的に重鎖および軽鎖から１つ）を含む二価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００４９】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する一本のタンパク質鎖として作製可能とする人工ペプチドリンカーにより連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても既知；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426;およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883、参照）。このような一本鎖抗体は抗体の１つ以上の“抗原結合部分”を含む。これらの抗体フラグメントは当業者に既知の慣用の技術を使用して得られ、これらのフラグメントはインタクトな抗体と同様の方法にて有用性に関してスクリーニングされる。
【００５０】
抗原結合部分は、また、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに組み込まれていてもよい（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136、参照）。抗体の抗原結合部分はポリペプチドに基づく骨組、例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）にグラフトすることができる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載している米国特許第６，７０３，１９９号、参照）。
【００５１】
抗原結合部分は相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に１対の抗原結合領域を形成する、１対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込まれていてもよい（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062;および米国特許第５，６４１，８７０号）。
【００５２】
本明細書において使用される“単離されたＣ３ｂ結合分子”は、Ｃ３ｂ以外の抗原に対する抗原特異性を有する分子を実質的に含まない結合分子を意味する（例えば、特異的にＣ３ｂに結合する単離された抗体は特異的にＣ３ｂ、例えば、Ｃ３以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、特異的にＣ３ｂに結合する単離された結合分子は他の種の他の抗原、例えば、Ｃ３ｂ分子に対して交差反応性を有し得る。細胞材料を実質的に含まないとき、単離された結合分子は“精製”されている。
【００５３】
本明細書において使用される“モノクローナル抗体組成物”なる用語は単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。
【００５４】
本明細書において使用される“ヒト抗体”なる用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来している可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含むとき、定常領域は、また、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列または突然変異型のヒト生殖細胞系列配列に由来する。本発明のヒト抗体はヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムまたは部位特異的突然変異またはインビボで体細胞変異により導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される“ヒト抗体”なる用語は、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことを意図しない。
【００５５】
“ヒトモノクローナル抗体”なる用語はフレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト配列に由来している可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を意味する。１つの局面において、ヒトモノクローナル抗体は不死化細胞に融合させた遺伝子導入非ヒト動物（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入マウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより製造される。
【００５６】
本明細書において使用される“組換えヒト抗体”なる用語は、組換え手段により製造、発現、作製または単離されたすべてのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入または染色体導入された動物（例えば、マウス）またはそれから製造されたハイブリドーマから単離された抗体；ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体；組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体；およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他の手段により製造、発現、作製または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体はフレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。しかしながら、特定の局面において、このような組換えヒト抗体をインビトロ突然変異（または、ヒトＩｇ配列に対して動物遺伝子導入が使用されるとき、インビボ体細胞突然変異）に付すことができ、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連するが、自然にヒトにおいてヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に存在しない配列である。
【００５７】
本明細書において使用される“アイソタイプ”は重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）を意味する。
【００５８】
“抗原を認識する抗体”および“抗原に対して特異的な抗体”なる用語は“抗原に特異的に結合する抗体”なる用語と互換的に使用される。
【００５９】
本明細書において使用される、“高い親和性”なる用語は、ＩｇＧ抗体に対する言及のとき、抗体が標的抗原に対して１０−９Ｍ以下のＫＤを有することを意味する。
【００６０】
本明細書において使用される“Ｃ３ｂに特異的に結合する”Ｃ３ｂ結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合部分）は１×１０−７Ｍ以下のＫＤにてＣ３ｂに結合するＣ３ｂ結合分子を意味することを意図する。好ましい本発明の結合分子は１ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ）のＫＤにてＣ３ｂネオエピトープに結合する。
【００６１】
抗原と交差反応するＣ３ｂ結合分子（例えば、抗体）は１×１０−６Ｍ以下のＫＤにて抗原に結合するＣ３ｂ結合分子を意味する。特定の態様において、Ｃ３ｂ結合分子はヒトに対するＫＤの５−１０倍以内のＫＤにて非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）のＣ３ｂネオエピトープに結合する。他の特定の態様において、Ｃ３ｂ結合分子はヒトに対して等しいか、または１００倍以内のＫＤにてマウスＣ３ｂネオエピトープに結合する。
【００６２】
特定の抗原と交差反応しないＣ３ｂ結合分子（例えば、抗体）は検出可能にその抗原に結合しないか、または１×１０−５Ｍ以上のＫＤにて結合する、Ｃ３ｂ結合分子を意味することを意図する。１つの局面において、抗原と交差反応しないこのような結合分子は標準結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して本質的に検出できない結合を示す。
【００６３】
Ｃ３ｂ結合分子
本発明の結合分子は以下の１つ以上のネオエピトープと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＣ３ｂのネオエピトープに結合する：
表１
【表１】
2011503024.tif 000002
【表２】
2011503024.tif 000003
表１のアミノ酸はＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）におけるＣＯ３＿ＨＵＭＡＮエントリーにおいて説明されているガイドラインにしたがって番号付けされている。
【００６４】
Ｃ３ｂ結合分子は表１から選択されるネオエピトープを含む直鎖または非直鎖エピトープに特異的に結合し得る。本発明において包含されるものはＣ３ｂ生物活性を調節する非直鎖エピトープに結合する結合分子である。
【００６５】
Ｃ３ｂ結合分子は、例えば、Ｃ３ｂネオエピトープに結合する抗体（遊離形態または複合体形態のいずれか）およびこのような抗体の抗原結合部分を含むポリペプチドを含む。Ｃ３ｂ結合分子は、また、結合部分が抗体由来ではない分子、例えば、免疫グロブリン様フォールドを有するポリペプチド由来Ｃ３ｂ結合分子、および抗原結合部分がランダム化、選択化および親和性成熟を介してＣ３ｂネオエピトープに結合するように加工されている分子を含む。好ましいＣ３ｂ結合分子は、抗体もしくはそれらのフラグメントまたは抗体もしくはそれらのフラグメントの結合を模倣するように構築された人工構築物を含む、抗体、それらのフラグメントまたは人工構築物を含む。
【００６６】
本発明は、また、抗体ではないＣ３ｂ結合分子を特徴とする。このようなＣ３ｂ結合分子は非抗体ポリペプチド、例えば、以下のいずれかのものなどの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）フォールド由来アミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７５％、８０％、８５％または９０％同一のアミノ酸配列を有するＣ３ｂ結合ドメインを含む：テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ−受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質、色素タンパク質、ミエリン膜接着分子、Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ−細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２およびＶＣＡＭ−１のＩ−ｓｅｔドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬまたはソーマチン。一般的に、Ｃ３ｂ結合ドメインのアミノ酸配列は、免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列と比較して、Ｃ３ｂ結合ドメインが特異的にＣ３ｂネオエピトープに結合するように改変される（すなわち、ここで、免疫グロブリン様フォールドは特異的にＣ３に結合しない）。
【００６７】
Ｃ３ｂ結合ドメインのアミノ酸配列はフィブロネクチン、サイトカイン受容体またはカドヘリンの免疫グロブリン様フォールドのアミノ酸配列と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも６５％、７５％、８０％、８５％または９０％同一）である。
【００６８】
Ｃ３ｂ結合分子は特異的に結合し、Ｃ３ｂの多くの生物活性の１つ以上を調節する。したがって、本発明はプロパージン、因子Ｈ、因子Ｂ、因子Ｉ、膜補因子および／またはそれらの複合体のＣ３ｂ結合を阻害するＣ３ｂ結合分子を特徴とする。Ｃ３ｂ結合分子は、また、ＭＡＣのＣ３ｂ形成をコントロールと比較して（例えば、Ｃ３ｂ結合分子の非存在下における結合と比較して）少なくとも５％、１０％、１５％、２５％または５０％阻害する。
【００６９】
本発明のＣ３ｂ結合分子は副経路におけるＣ３転換酵素（例えば、二分子複合体Ｃ３ｂＢｂ）へのＣ３ｂ結合を阻害し、Ｃ５転換酵素（例えば、Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂ、三分子複合体）の形成をブロックする。他の局面において、Ｃ３ｂ結合分子は古典的経路におけるＣ３転換酵素（例えば、二分子複合体Ｃ４ｂＣ２ａ）へのＣ３ｂ結合を阻害し、Ｃ５転換酵素（例えば、三分子複合体Ｃ３ｂＣ４ｂＣ２ａ）の形成をブロックする。これらの生物学的活性は、Ｃ３タンパク質開裂を含むフィードバックループ内の競合結合メカニズムにより生産される。したがって、Ｃ３ｂ結合分子はＣ３開裂をコントロールと比較して（例えば、Ｃ３ｂ結合分子の非存在下における活性と比較して）少なくとも５％、１０％、１５％、２５％または５０％阻害する。
【００７０】
当分野において既知であり、本明細書に記載されている方法論にしたがって決定される１つ以上のＣ３ｂ生物活性（例えば、補体経路活性化の結果として生化学的、細胞的、生理学的または他の生物学的活性）を阻害するか、または調節するＣ３ｂ結合分子は、Ｃ３ｂ結合分子の非存在下（例えば、無関連の特異性のコントロール分子が存在するとき）と比較して特定の機能特性において統計学的に有意な減少を引き起こすと理解される。Ｃ３ｂ生物活性を調節するＣ３ｂ結合分子は測定パラメーターの少なくとも５％の統計学的に有意な低下を引き起こす。１つの局面において、Ｃ３ｂ結合分子は選択された機能特性においてコントロールと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％または５０％の減少を引き起こし得る。
【００７１】
種々の種のＣ３ｂおよび特定のＣ３ｂのエピトープに結合する分子の能力を評価するための標準アッセイは、当分野で既知であり、例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを含む。Ｃ３ｂ結合分子がＣ３ｂの特定のエピトープに結合するかどうかの同定にペプチドエピトープ競合アッセイを使用することができる。例えば、Ｃ３ｂ結合分子をペプチドの飽和濃度にて興味あるＣ３ｂエピトープに対応するペプチドとインキュベートする。プレインキュベートしたＣ３ｂ結合分子を、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析により、固定化Ｃ３ｂへの結合に対して試験する。ペプチドとのプレインキュベーションによるＣ３ｂ結合の阻害は、Ｃ３ｂ結合分子がペプチドエピトープに結合することを示す（例えば、米国特許出願第２００７００７２７９７号、参照）。結合動態は、また、当分野で既知の標準アッセイ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析により評価することができる。Ｃ３ｂの機能特性に対するＣ３ｂ結合分子の作用を評価するためのアッセイは以下にさらに詳細に記載されている。
【００７２】
Ｃ３ｂ阻害は、例えば；（ａ）インビトロアッセイにおいて赤血球溶血をブロックする患者血清の能力；（ｂ）血清Ｃ３ａまたはＣ５ａレベル；（ｃ）血漿、組織および／または他の生物学的構成成分、例えば、眼の物質または構成成分における可溶性ＭＡＣレベルを測定することにより同定され得る。Ｃ３ｂ結合分子の存在下におけるＣ５ａ、Ｃ３ａまたはＣ５ｂ−９レベルの減少は、Ｃ３ｂ結合分子がＣ３ｂおよび／またはその生物活性を阻害することを示す。
【００７３】
対象からの種々の生物学的サンプル、例えば、任意の臓器、組織または細胞、ならびに血液、尿または他の体液（例えば、眼の液体）から得られるサンプルは検出のために使用することができる。いくつかの診断方法において、好ましいサンプルは眼の液体である。いくつかの他の方法において、好ましい組織サンプルはすべての血液およびそれ由来の生成物、例えば、血漿および血清である。血液サンプルは、例えば、ガスリーカード(Guthrie card)から得られる血斑から得られる。組織サンプルの他の源は皮膚、髪、尿、唾液、精液、糞便、汗、乳、羊水、肝臓、心臓、筋肉、腎臓および他の臓器である。組織の他の源は対象からの初代細胞から増殖された細胞系である。組織サンプルは、サンプル内の細胞のタンパク質および／または核酸内容物を放出させるために一般的に溶解される。次にこのような粗溶解物からのタンパク質画分を分析前の部分的または完全な精製に付すことができる。
【００７４】
本発明のＣ３ｂ結合分子における処置に適している他の対象は黄斑変性症関連障害以外の既知の補体関連疾患を有さない個体を含む。補体関連疾患または障害は当分野、例えば、米国特許第６，１６９，０６８号において公知である。既知の補体関連疾患の例は：神経障害、多発性硬化症、卒中、ギラン・バレー症候群、外傷性脳損傷、パーキンソン病、不適当なまたは望ましくない補体活性化の障害、血液透析合併症、超急性同種移植片拒絶反応、異種移植片拒絶反応、ＩＬ−２治療中のインターロイキン２誘導毒性、炎症性障害、自己免疫性疾患の炎症、クローン病、成人呼吸窮迫症候群、熱傷または凍傷を含むやけど、虚血後再潅流状態、心筋梗塞、バルーン血管形成術、心肺バイパスまたは腎臓バイパスにおけるポストポンプシンドローム、血液透析、腎臓虚血、皮膚腺再構成後の腸間膜動脈再潅流、感染病または敗血症、免疫複合体障害および自己免疫性疾患、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＳＬＥ腎炎、増殖性腎炎、溶血性貧血および重症筋無力症を含む。加えて、他の既知の補体関連疾患は肺疾患および障害、例えば、呼吸困難、喀血、ＡＲＤＳ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、肺塞栓および梗塞、肺炎、線維形成粉塵疾患、不活性粉塵および無機物（例えば、シリコン、炭塵、ベリリウムおよびアスベスト）、肺線維症、有機粉塵疾患、化学的損傷（刺激性ガスおよび化学物質、例えば、塩素、ホスゲン、二酸化硫黄、硫化水素、二酸化窒素、アンモニアおよび塩酸による）、煤煙傷害、やけど（例えば、熱傷、凍傷）、喘息、アレルギー、気管支収縮、過敏性肺炎、寄生虫症、グッドパスチャー症候群、肺血管炎および免疫複合体関連炎症である。
【００７５】
本発明の治療剤において処置される対象は、また、黄斑変性症と関連する状態を処置する既知の方法、例えば、米国特許第６，２１８，３６８号において記載されている抗生物質処置と共に他の治療剤を投与され得る。他の処置において、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンは免疫応答を抑制することができる薬物である。これらの薬物は細胞毒性薬物、コルチコステロイド、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、特定のＴ−リンパ球免疫抑制剤およびそれらの抗体またはフラグメントを含む（Physicians' Desk Reference, 53rd edition, Medical Economics Company Inc., Montvale, N.J. (1999)、参照）。免疫抑制性処置は一般的に１週、１月、３月、６月または１年の間隔において続ける。いくつかの患者において、処置は患者の障害にわたって投与される。
【００７６】
抗体
本明細書に記載されている抗Ｃ３ｂ抗体はヒトモノクローナル抗体を含む。いくつかの局面において、Ｃ３ｂに結合する抗体の抗原結合部分（例えば、ＶＨおよびＶＬ鎖）は他の抗Ｃ３ｂ結合分子を創造するように“混合および適合”される。このような“混合および適合”された抗体の結合は前記結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。特定のＶＬ配列と混合および適合するＶＨを選択するとき、典型的には、ＶＬとの対において置き換えられるＶＨと構造的に類似しているＶＨを選択する。同様に特定の全長重鎖／全長軽鎖対の全長重鎖配列は一般的に構造的に類似している全長重鎖配列と置換すべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対のＶＬ配列は構造的に類似しているＶＬ配列と置換すべきである。同様に特定の全長重鎖／全長軽鎖対の全長軽鎖配列は構造的に類似している全長軽鎖配列と置換すべきである。この文脈における構造類似の同定は当分野においてよく知られている方法である。
【００７７】
他の局面において、本発明は１つ以上のＣ３ｂ結合抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を種々の組合せにおいて含む抗体を提供する。これらの抗体のそれぞれがＣ３ｂに結合し、抗原−結合特異性が主としてＣＤＲ１、２および３領域により提供され得ることを考慮すると、ＶＨのＣＤＲ１、２および３配列とＶＬのＣＤＲ１、２および３配列は“混合および適合”され得る（すなわち、異なる抗体からのＣＤＲは混合および適合され得る）。このような“混合および適合”された抗体のＣ３ｂ結合は本明細書に記載されている結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨのＣＤＲ配列が混合および適合されているとき、特定のＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３は構造的に類似しているＣＤＲ配列と置換すべきである。同様に、ＶＬのＣＤＲ配列が混合および適合されているとき、特定のＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は構造的に類似しているＣＤＲ配列と置換すべきである。この文脈における構造類似の同定は当分野でよく知られている方法である。
【００７８】
本明細書において使用される、ヒト抗体は、抗体の可変領域または全長鎖が配列源としてヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られるとき、特定の生殖細胞系列配列の“生成物”である、またはそれに“由来”する重鎖または軽鎖可変領域または全長重鎖または軽鎖を含む。このような系の１つにおいて、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスにより製造される。遺伝子導入マウスは興味ある抗原（例えば、本明細書に記載されているＣ３ｂのネオエピトープ）により免疫化される。あるいは、ヒト抗体は、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを提供し、興味ある抗原（例えば、本明細書に記載されているＣ３ｂまたはＣ３ｂネオエピトープ）ライブラリーをスクリーニングすることにより同定される。
【００７９】
ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の“生成物”である、またはそれに“由来”するヒト抗体はヒト抗体のアミノ酸配列とヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列を比較して、ヒト抗体の配列と配列において非常に近い（すなわち、同一性％が非常に高い）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を選択することによりそれ自体同定することができる。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の“生成物”である、またはそれに“由来”するヒト抗体は生殖細胞系列にコードされた配列と比較して、例えば、自然に起こる体細胞変異または人工部位特異的変異によるアミノ酸の違いを含み得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は一般的にヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したとき、ヒト抗体をヒトとして同定するアミノ酸残基を含む。特定の場合において、ヒト抗体は生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
【００８０】
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップ数および各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の＃／位置の全＃×１００）。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定はＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (1988 Comput. Appl. Biosci., 4:11-17)のアルゴリズムを使用して、PAM120 weight residue table、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用して決定される。
【００８１】
一般的に、特定のヒト生殖細胞系列配列由来ヒト抗体のＶＨまたはＶＬはヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とわずか１０個のアミノ酸の違いを示す。特定の場合において、ヒト抗体のＶＨまたはＶＬは生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とわずか５つまたはわずか４、３、２または１つのアミノ酸の違いを示し得る。
【００８２】
ラクダ抗体
新世界(New World)メンバー、例えば、ラマ種（Lama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna）を含むラクダおよびヒトコブラクダ（Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius）科のメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性およびヒト対象に対する抗原性に対して特徴付けられている。この科の哺乳動物において自然に見られる特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠き、したがって他の動物の抗体において典型的な２つの重鎖および２つの軽鎖を有する４鎖の四次構造とは構造的に異なる。ＷＯ９４／０４６７８、参照。
【００８３】
ＶＨＨとして同定された小さい１本の可変ドメインであるラクダ抗体の領域は、標的に対して高い親和性を有する小タンパク質を得るための遺伝子工学により得ることができ、“ラクダナノボディ”として既知の低分子量抗体由来タンパク質が得られる。米国特許第５，７５９，８０８号、参照；Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62;およびLauwereys. et al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520も参照。ラクダ抗体および抗体フラグメントの加工されたライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト起源の他の抗体に関して、ラクダ抗体のアミノ酸配列はヒト配列をより密接に似ている配列を得るために組換え的に改変させることができる、すなわち、ナノボディはヒト化することができる。したがって、ヒトに対するラクダ抗体の本来の低い抗原性をさらに低減することができる。
【００８４】
ラクダナノボディはヒトＩｇＧ分子の分子量の約１／１０を有し、該タンパク質はわずか数ナノメーターの物理的直径を有する。小さいサイズの１つの結果は、より大きい抗体タンパク質によっては機能的に見えない抗原部位に結合するラクダナノボディの能力であり、すなわち、ラクダナノボディは従来の免疫技術を使用して他の方法では隠れている抗原を検出する試薬、および可能性としては治療剤として有用である。したがって、小さいサイズのさらなる結果は、ラクダナノボディが標的タンパク質の溝または狭い割れ目の特定の部位に結合する結果として阻害することができ、したがって従来の抗体よりも従来の低分子量薬物の機能とより密接に似ている能力で働き得ることである。
【００８５】
さらに、低分子量および緻密化サイズの結果、ラクダナノボディが極めて熱安定性であり、極端なｐＨおよびタンパク質分解消化に対して安定であり、抗原性が低い。さらなる結果は、ラクダナノボディが循環系から組織へ、血液脳関門を介する場合でも容易に移動し、神経組織に影響する障害を処置することができることである。さらにナノボディは血液脳関門を介する薬物輸送を促進することができる。２００４年８月１９日公開の米国特許出願第２００４０１６１７３８号、参照。これらの特徴は、ヒトにおける低い抗原性と結合して、大きな治療的可能性を示す。さらに、これらの分子は原核細胞、例えば、大腸菌において完全に発現することができる。
【００８６】
したがって、本発明の１の特徴はＣ３ｂに対して高い親和性を有するラクダ抗体またはラクダナノボディである。本明細書におけるある特定の局面において、ラクダ抗体またはナノボディはラクダ動物で自然に製造され、すなわち、Ｃ３ｂまたはそのペプチドフラグメントで免疫化した後、他の抗体に関して本明細書に記載されている技術を使用してラクダにより製造される。あるいは、抗Ｃ３ｂラクダナノボディは、すなわち、例えば、適当に突然変異させたラクダナノボディタンパク質を提示するファージのライブラリーから標的として本明細書に記載されているＣ３ｂまたはＣ３ｂネオエピトープを使用したパンニング法を使用して選択により加工、すなわち製造される。さらに、加工されたナノボディをレシピエント対象において４５分から２週間の半減期を有するように遺伝子工学によりカスタマイズすることができる。
【００８７】
ダイアボディ
ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖で発現され、あまりに短すぎるため同じ鎖の２つのドメイン間で対になることができないリンカーにより結合している、二価、二重特異性分子である。ＶＨおよびＶＬドメインは別の鎖の相補的ドメインと対を作り、それによって２つの抗原結合部位を創造する（例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123、参照）。ダイアボディは同じ細胞内で構造ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ構成）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ構成）のいずれかを有する２つのポリペプチド鎖を発現させることにより製造することができる。それらのほとんどは細菌において可溶性形態で発現させることができる。
【００８８】
一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を約１５アミノ酸残基のリンカーと結合させることにより、製造される（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36、参照）。ｓｃＤｂは細菌において可溶性かつ活性な単量体型で発現させることができる（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21、参照）。
【００８９】
ダイアボディはＦｃと融合させ、“ジ−ダイアボディ”を製造することができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65、参照）。
【００９０】
加工および修飾された抗体
本発明の抗体は、出発抗体から改変された特性を有し得る修飾された抗体を加工するように、出発物質として１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を使用して製造することができる。抗体を１つまたは両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域および／または１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することにより加工することができる。さらに、または、あるいは、抗体を、例えば、抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することにより加工することができる。
【００９１】
実施することができる可変領域加工の１つはＣＤＲグラフト法である。抗体は、主として６つの重鎖および軽鎖ＣＤＲに存在するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列はＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間でより異なっている。ＣＤＲ配列がほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク配列にグラフトされた特定の天然抗体のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen et al., 1989 Proc. Natl. Acad。U.S.A. 86:10029-10033、参照;米国特許第5,225,539号および米国特許第5,530,101; 5,585,089; 5,693,762および6,180,370号、参照）。
【００９２】
フレームワーク配列は生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは刊行されている参照文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖細胞系列配列データベース（インターネットwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用できる）、ならびにKabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992  J. Mol. Biol. 227:776-798;およびCox et al., 1994 Eur. J. Immunol. 24:827-836;（これらのそれぞれの内容を出典明示により本明細書に包含させる）において見出すことができる。
【００９３】
ＶＨのＣＤＲ１、２および３の配列およびＶＬのＣＤＲ１、２および３の配列をフレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子において見出されたものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトすることができ、またはＣＤＲ配列を生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域にグラフトすることができる。例えば、ある場合において、抗体の抗原結合力を維持または強化するためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出されている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号、参照）。
【００９４】
ＣＤＲは、また、免疫グロブリンドメイン以外のポリペプチドのフレームワーク領域にグラフトさせることができる。適当な骨組は、局在した表面を形成し、興味ある標的（例えば、Ｃ３ｂ抗原）に結合するようにグラフトされた残基を示す、構造的に安定なフレームワークを形成する。例えば、ＣＤＲは、フレームワーク領域がフィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノスタチン、シトクロムｂ、ＣＰ１亜鉛フィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメインまたはテンドラミスト(tendramisat)に基づく骨組上にグラフトすることができる（例えば、Nygren and Uhlen, 1997 Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469、参照）。
【００９５】
別種の可変領域修飾はＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域のアミノ酸残基の変異であり、それによって“親和性成熟”として既知の興味ある抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善する。部位特異的突然変異またはＰＣＲ介在突然変異を変異を導入するために実施することができ、抗体結合の作用または興味ある他の機能特性を本明細書に記載されているインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価することができる。保存的修飾を導入することができる。変異はアミノ酸の置換、付加または欠失であり得る。さらに、一般的にＣＤＲ領域内のわずか１、２、３、４または５つの残基が改変される。
【００９６】
加工された本発明の抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に行われたものを含む。一般的にこのようなフレームワーク修飾は抗体の免疫原性を軽減するために行われる。例えば、１つのアプローチは１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列へと“復帰変異(backmutate)”させることである。さらに特に、体細胞変異がおこった抗体は抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は抗体のフレームワーク配列と抗体が由来する生殖細胞系列配列を比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系列の構成へ戻すために、体細胞変異を、例えば、部位特異的突然変異またはＰＣＲ介在突然変異により生殖細胞系列配列へ“復帰変異”させることができる。このような“復帰変異”抗体は、また、本発明により包含されることを意図する。
【００９７】
別種のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞−エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を減少するために、フレームワーク領域内の、さらには１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基の変異を含む。このアプローチは、また、“脱免疫化”として称され、Carr et alによる米国特許公報第２００３０１５３０４３号においてさらに詳細に記載されている。
【００９８】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加え、またはあるいは、本発明の抗体は、一般的に１つ以上の抗体の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存細胞傷害性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように加工することができる。さらに、本発明の抗体は、再び１つ以上の抗体の機能特性を改変するために、化学的に修飾させるか（例えば、１つ以上の化学部分を抗体に結合させることができる）、またはそのグリコシル化を改変するために修飾させることができる。
【００９９】
１つの局面において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基の数が改変、例えば、増加または減少されるように修飾される。このアプローチはBodmer et al.による米国特許第５，６７７，４２５号においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の組み立てを促進するか、または抗体の安定性を増強または低下させるために改変される。
【０１００】
他の局面において、抗体のＦｃヒンジ領域を抗体の生体半減期を短縮するために変異させる。さらに特に、１つ以上のアミノ酸変異は、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して損なわれたブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に導入される。このアプローチはWard et al.による米国特許第６，１６５，７４５号においてさらに詳細に記載されている。
【０１０１】
他の局面において、抗体は生体半減期を延長するために修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号はインビボで半減期を延長するＩｇＧにおける下記変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆを記載している。あるいは、生体半減期を延長するため、抗体は、Presta et al.による米国特許第５，８６９，０４６および６，１２１，０２２号に記載されているとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で改変され得る。
【０１０２】
さらに他の局面において、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を改変するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることにより改変される。親和性を改変されたエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１因子であり得る。例えば、１つ以上のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。典型的なアミノ酸変異は２３４、２３５、２３６、２３７、２５２、２５４、２５６、２９７、３０９、３１１、３１５、３１８、３２０、３２２、４３３および／または４３４から選択される位置にて起こる。本発明のＣ３ｂ結合分子は本発明の教示にしたがって製造される、および使用されるコンセンサスＦｃ抗体ドメインを特異的に含む。好ましい抗Ｃ３ｂ抗体は２３４および／または２３５から選択される位置にてＦｃ変異を含む。このアプローチは両方Winter et al. による米国特許第５，６２４，８２１および５，６４８，２６０号において詳細に記載されている。
【０１０３】
他の局面において、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基により置き換えて、抗体がＣ１ｑ結合を改変され、そして／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を減少または排除されるようにすることができる。このアプローチはIdusogie et al.による米国特許第６，１９４，５５１号においてさらに詳細に記載されている。
【０１０４】
他の局面において、１つ以上のアミノ酸残基を改変し、それによって抗体が補体を固定する能力を改変する。このアプローチはBodmer et al.によるＷＯ９４／２９３５１においてさらに詳細に記載されている。
【０１０５】
さらに他の局面において、Ｆｃ領域は、抗体が抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介在する能力を増強するため、および／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性を増強するために、１つ以上のアミノ酸を修飾することにより修飾される。このアプローチはPrestaによるＷＯ００／４２０７２においてさらに詳細に記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位はマッピングされており、改良された結合を有する変異体は記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604、参照）。
【０１０６】
さらに別の局面において、抗体のグリコシル化は修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗体の抗原に対する親和性を増強するために改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内でグリコシル化の１つ以上の部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それによってその部位のグリコシル化を排除することを行うことができる。このようなグリコシル化は抗体の抗原に対する親和性を増強し得る。このようなアプローチはCo et al.による米国特許第５，７１４，３５０および６，３５０，８６１号においてさらに詳細に記載されている。
【０１０７】
さらに、またはあるいは、抗体は改変された型のグリコシル化を有する抗体、例えば、少ない量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を製造することができる。このような改変されたグリコシル化パターンは抗体のＡＤＣＣ能力を増強することが証明されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現することにより達成することができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は当分野で報告されており、本発明の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用し、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を製造することができる。例えば、Hang et al.によるＥＰ１，１７６，１９５は、発現された抗体が低フコシル化を示すような、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊されている細胞系を記載している。PrestaによるＰＣＴ出願ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースがＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合する能力を減少させ、また、宿主細胞において発現された抗体の低フコシル化を引き起こす、変異ＣＨＯ細胞系であるＬｅｃｌ３細胞を記載している（Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。Umana et al.によるＷＯ９９／５４３４２は、加工された細胞系において発現された抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増強を引き起こすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように加工された細胞系を記載している（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照）。
【０１０８】
本発明により考慮される本明細書の抗体のさらなる修飾はペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生体（例えば、血清）半減期を延長するためにペグ化することができる。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントは、一般的にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と１つ以上のＰＥＧ部分が抗体または抗体フラグメントに結合するようになる条件下で反応させる。ペグ化は反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）でのアシル化反応またはアルキル化反応により実施することができる。本明細書において使用される“ポリエチレングリコール”なる用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの全ての形態を包含することを意図する。特定の局面において、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当分野で既知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Nishimura et al.によるＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.によるＥＰ０４０１３８４、参照。
【０１０９】
加えて、ペグ化は非天然アミノ酸の導入により本発明のＣ３ｂ結合ポリペプチドの任意の部分で達成することができる。特定の非天然アミノ酸はDeiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004またはＵＳ特許第７，０８３，９７０号に記載されている技術により導入することができる。簡潔には、いくつかのこれらの発現系は部位特異的突然変異を含み、ナンセンスコドン、例えば、アンバーＴＡＧが本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに導入される。次にこのような発現ベクターを導入されたナンセンスコドンに対して特異的なｔＲＮＡを利用することができる宿主に導入し、一般的に好まれる非天然アミノ酸で満たす。部分が本発明のポリペプチドに結合するために有益である特定の非天然アミノ酸は、アセチレンおよびアジド側鎖を有するものを含む。次にこれらの新規アミノ酸を含むポリペプチドをタンパク質のこれらの選択された部位でペグ化することができる。
【０１１０】
抗体を加工する方法
上記のとおり、抗Ｃ３ｂ抗体は全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれに結合した定常領域を修飾することにより、新規抗Ｃ３ｂ抗体を創造するために使用することができる。例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲ領域は、新規組換え加工された抗Ｃ３ｂ抗体を創造するために、既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲで組換えにより組み合わせることができる。他の型の修飾は前のセクションにおいて記載されているものを含む。加工する方法のための出発物質は１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域である。加工された抗体を創造するため、１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に作製（すなわち、タンパク質として発現）する必要はない。それどころか、配列に含まれる情報を元の配列に由来する“第二世代”配列を創造するため出発物質として使用し、次に“第二世代”配列をタンパク質として製造および発現させる。
【０１１１】
標準分子生物学技術は改変された抗体配列を製造および発現させるために使用することができる。改変された抗体配列によってコードされる抗体は、機能特性が、特異的なＣ３ｂへの結合、Ｃ３ｂ複合体の形成阻害、Ｃ３転換酵素活性化の阻害、Ｃ５転換酵素活性化の阻害、ＭＡＣの形成阻害を含むが、これらに限定されない、抗Ｃ３ｂ抗体の機能特性の１つ、一部または全部を保持するものである。改変された抗体の機能特性は当分野で利用できる、および／または本明細書に記載されている標準アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して評価することができる。
【０１１２】
本発明の抗体を加工する方法の１つの局面において、変異は抗Ｃ３ｂ抗体コード配列の全体または一部にランダムまたは選択的に導入することができ、得られた修飾された抗Ｃ３ｂ抗体は本明細書に記載されている結合活性および／または他の機能特性（例えば、Ｃ３またはＣ５転換酵素活性の阻害、ＭＡＣの形成阻害、補体経路調節異常の調節）に関してスクリーニングすることができる。変異法は当分野で報告されている。例えば、ShortによるＰＣＴ出願ＷＯ０２／０９２７８０は飽和突然変異、合成連結アセンブリまたはその組合せを使用して抗体変異を創造およびスクリーニングする方法を記載している。あるいは、Lazar et al.によるＷＯ０３／０７４６７９は抗体の物理化学的特性を最適化するためにコンピューター利用スクリーニング方法を使用する方法を記載している。
【０１１３】
核酸配列は、生産細胞または生物、一般的に真核細胞、例えば、酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａの細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように改変されたとき、“最適化された”と呼ばれる。最適化核酸配列は、“親”配列としても知られている元の出発核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と同一またはほぼ同一のアミノ酸配列をコードするように加工される。
【０１１４】
非抗体Ｃ３ｂ結合分子
さらに、本発明は抗体の機能特性を示すが、他のポリペプチド（例えば、抗体遺伝子によってコードされるか、またはインビボで抗体遺伝子の組換えにより製造されるもの以外のポリペプチド）からフレームワークおよび抗原結合部分に由来するＣ３ｂ結合分子を提供する。これらの結合分子の抗原結合ドメイン（例えば、Ｃ３ｂ結合ドメイン）は指向進化過程を介して製造される。米国特許第７，１１５，３９６号、参照。抗体の可変ドメインのフォールド（“免疫グロブリン様”フォールド）と類似している全体的なフォールドを有する分子が適当な骨格タンパク質である。抗原結合分子を得るのに適した骨格タンパク質はフィブロネクチンまたはフィブロネクチンダイマー、テネイシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、タイチン、ＧＣＳＦ−受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質色素タンパク質、ミエリン膜接着分子、Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ  ＭＨＣ、Ｔ−細胞抗原受容体、ＣＤ１、Ｃ２およびＶＣＡＭ−１のＩ−ｓｅｔドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−ｓｅｔ免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ−細胞抗原受容体、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬおよびソーマチンを含む。
【０１１５】
非抗体結合分子の抗原結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン様フォールド）は１０ｋＤより小さいまたは７．５ｋＤより大きい分子量（例えば、分子量７．５−１０ｋＤ）を有することができる。抗原結合ドメインを得るために使用されるタンパク質は天然哺乳動物タンパク質（例えば、ヒトタンパク質）を含み、抗原結合ドメインは得られるタンパク質の免疫グロブリン様フォールドと比較して５０％以下（例えば、３４％、２５％、２０％または１５％以下）の変異アミノ酸を含む。一般的に免疫グロブリン様フォールドを有するドメインは５０−１５０アミノ酸（例えば、４０−６０アミノ酸）からなる。
【０１１６】
非抗体結合分子を製造するため、抗原結合表面を形成する骨格タンパク質の領域（例えば、位置および構造において抗体可変ドメイン免疫グロブリンフォールドのＣＤＲに類似している領域）における配列がランダム化された、クローンのライブラリーを創造する。ライブラリークローンを興味ある抗原（例えば、Ｃ３ｂ）への特異的結合および他の機能（例えば、Ｃ３ｂの生物学的活性の阻害）に対して試験する。選択されたクローンをさらなるランダム化および選択に基づき、抗原に対して高い親和性の誘導体を製造するために使用することができる。
【０１１７】
高い親和性結合分子は、例えば、骨組としてフィブロネクチンＩＩＩの１０番目のモジュール（１０Ｆｎ３）を使用して製造される。ライブラリーを残基２３−２９、５２−５５および７８−８７で１０ＦＮ３の３つのＣＤＲ様ループのそれぞれに対して構築する。それぞれのライブラリーを構築するため、それぞれのＣＤＲ様領域と重複する配列をコードするＤＮＡセグメントをオリゴヌクレオチド合成によりランダム化する。選択可能な１０Ｆｎ３ライブラリーを製造するための技術は、米国特許第６，８１８，４１８および７，１１５，３９６号；Roberts and Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297；米国特許第６，２６１，８０４号；米国特許第６，２５８，５５８号；およびSzostak et al.ＷＯ９８／３１７００に記載されている。
【０１１８】
非抗体結合分子は標的抗原に対する親和性を増加するためにダイマーまたはマルチマーとして製造することができる。例えば、抗原結合ドメインをＦｃ−Ｆｃダイマーを形成する抗体の定常領域（Ｆｃ）を有する融合体として発現させる。例えば、米国特許第７，１１５，３９６号、参照。
【０１１９】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の他の局面は本発明のＣ３ｂ結合分子をコードする核酸分子に関する。核酸は細胞溶解物において細胞全体に存在してもよく、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ結合、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他当分野で既知の技術を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞性核酸またはタンパク質から精製されたとき、“単離された”または“実質的に純粋にされた”である。F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York、参照。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでいても含まなくてもよい。１つの局面において、核酸はｃＤＮＡ分子である。核酸はベクター、例えば、ファージディスプレイベクターまたは組換えプラスミドベクター中に存在していてもよい。
【０１２０】
本発明の核酸は標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載しているとおりのヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスから製造されたハイブリドーマ）により発現された抗体に関して、ハイブリドーマにより製造された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）得られた抗体に関して、抗体をコードする核酸はライブラリーのメンバーである種々のファージクローンから回収することができる。
【０１２１】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたとき、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメントはさらなるタンパク質、例えば、抗体定常領域もしくはフレキシブルリンカーをコードするさらなるＤＮＡ分子またはフラグメントに作動可能に連結されている。この文脈において使用されるとき“作動可能に連結された”なる用語は、２つのＤＮＡフラグメントが、例えば、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に残るように、またはタンパク質が所望のプロモーターのコントロール下で発現されるように機能する方法で連結されることを意味することを意図する。
【０１２２】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡはＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードするさらなるＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で既知であり（例えば、Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、参照）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子に関して、ＶＨをコードするＤＮＡは重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードするさらなるＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【０１２３】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡはＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードするさらなるＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で既知であり（例えば、Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、参照）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【０１２４】
ｓｃＦｖ遺伝子を創造するため、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、フレキシブルリンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有するＶＨおよびＶＬ配列が連続する一本鎖タンパク質として発現することができるように、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードするフレキシブルリンカーをコードするさらなるフラグメントに作動可能に連結される（例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554、参照）。
【０１２５】
モノクローナル抗体生成
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は慣用のモノクローナル抗体方法論を含む種々の技術、例えば、Kohler and Milstein (1975 Nature, 256:495)の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術により、またはライブラリーディスプレイ法、例えば、ファージディスプレイ法を使用して製造することができる。
【０１２６】
ハイブリドーマを製造するための動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ製造はよく確立された方法である。免疫化プロトコールおよび免役された融合用脾細胞の単離のための技術は当分野で既知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合方法は、また、既知である。
【０１２７】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は上記のように製造されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて製造することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、標準分子生物学技術を使用して、興味あるマウスハイブリドーマから得ることができ、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように加工することができる。例えば、キメラ抗体を創造するために、マウス可変領域は、当分野で既知の方法を使用して、ヒト定常領域に連結することができる（例えば、Cabilly et al.による米国特許第４，８１６，５６７号、参照）。ヒト化抗体を創造するために、マウスＣＤＲ領域は、当分野で既知の方法を使用して、ヒトフレームワークに挿入することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号および米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号、参照。
【０１２８】
特定の局面において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。Ｃ３ｂエピトープに対するこのようなヒトモノクローナル抗体はマウス系よりむしろヒト免疫系部分を有する遺伝子導入されたまたは染色体導入されたマウスを使用して製造することができる。これらの遺伝子導入されたまたは染色体導入されたマウスは各々ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称される、および本明細書において“ヒトＩｇマウス”と総称されるマウスを含む。
【０１２９】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Medarex, Inc.）は、内因性μおよびκ鎖座を不活性化する標的変異とともに、非再配置ヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座(miniloci)を含む（例えば、Lonberg et al., 1994 Nature 368(6474): 856 859、参照）。したがって、マウスはマウスＩｇＭまたはκの発現低下を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラス切り換えと体細胞突然変異を受け、高い親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを製造する（Lonberg, N. et al., 1994 supra; reviewed in Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭＡｂマウスの製造およびその使用およびこのようなマウスが有するゲノム修飾は、さらにTaylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591;およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851に記載されている（これらの全ての内容を出典明示によりその全体を本明細書の一部とする）。さらに、米国特許第５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，７８９，６５０；５，８７７，３９７；５，６６１，０１６；５，８１４，３１８；５，８７４，２９９；および５，７７０，４２９号（全てLonberg and Kay）；Surani et al.による米国特許第５，５４５，８０７号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ９２１０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７１１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２（全てLonberg and Kay）；ならびにKorman et al.によるＰＣＴ出願番号ＷＯ０１／１４４２４、参照。
【０１３０】
他の局面において、本発明のヒト抗体は導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するマウスを使用して製造することができる。“ＫＭマウス”として本明細書で称されるこのようなマウスはＷＯ０２／４３４７８において詳細に記載されている。
【０１３１】
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の遺伝子導入動物系が当分野で利用可能であり、本発明の抗Ｃ３ｂ抗体を製造するために使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏマウス（登録商標）（Abgenix, Inc.）と称される別の遺伝子導入系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.による米国特許第５，９３９，５９８；６，０７５，１８１；６，１１４，５９８；６、１５０，５８４および６，１６２，９６３号に記載されている。
【０１３２】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の染色体を導入した動物系が当分野で利用可能であり、本発明の抗Ｃ３ｂ抗体を製造するために使用することができる。例えば、“ＴＣマウス”と称されるヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を含むマウスを使用することができる；このようなマウスはTomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を有するウシは当分野で報告されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明の抗Ｃ３ｂ抗体を製造するために使用することができる。
【０１３３】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、また、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用して製造することができる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ方法は当分野で確立されている。例えば：Ladner et al.による米国特許第５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；および５，５７１，６９８号；Dower et al.による米国特許第５，４２７，９０８および５，５８０，７１７号；McCafferty et al.による米国特許第５，９６９，１０８および６，１７２，１９７号；ならびにGriffiths et al.による米国特許第５，８８５，７９３；６，５２１，４０４；６，５４４，７３１；６，５５５，３１３；６，５８２，９１５および６，５９３，０８１号、参照。ライブラリーは全長Ｃ３ｂ抗原または特定のＣ３ｂネオエピトープへの結合についてスクリーニングされ得る。
【０１３４】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫で製造され得るようにヒト免疫細胞を再構成されたＳＣＩＤマウスを使用して製造することもできる。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.による米国特許第５，４７６，９９６および５，６９８，７６７号に記載されている。
【０１３５】
ヒトＩｇマウスにおけるヒトモノクローナル抗体の製造
原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞）において発現される精製された組換えヒトＣ３ｂは抗原として使用することができる。該タンパク質は担体、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合され得る。
【０１３６】
Ｃ３ｂネオエピトープに対する完全なヒトモノクローナル抗体はＨｕＭａｂ遺伝子導入マウスのＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＨＣｏ１７系ならびに遺伝子導入染色体導入マウスのＫＭ系（これらはそれぞれヒト抗体遺伝子を発現する）を使用して製造される。これらのマウス系のそれぞれにおいて、内因性マウスカッパ軽鎖遺伝子はChen et al., 1993 EMBO J.12:811-820に記載されているとおりホモ接合的に分断することができ、内因性マウス重鎖遺伝子はＷＯ０１１０９１８７の実施例１に記載されているとおりホモ接合的に分断することができる。これらのマウス系のそれぞれは、Fishwild et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851に記載されているとおりヒトカッパ軽鎖導入遺伝子、ＫＣｏ５を有する。ＨＣｏ７系は米国特許第５，５４５，８０６；５，６２５，８２５；および５，５４５，８０７号に記載されているとおりＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＨＣｏ１２系はＷＯ０１／０９１８７の実施例２に記載されているとおりＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＨＣｏ１７系はＨＣｏ１７ヒト重鎖導入遺伝子を有する。ＫＮＭ系はＷＯ０２／４３４７８に記載されているとおりＳＣ２０導入染色体を含む。
【０１３７】
Ｃ３ｂネオエピトープに対する完全なヒトモノクローナル抗体を製造するために、ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスを、精製された組換えＣ３ｂ、Ｃ３ｂフラグメントまたはそれらのコンジュゲート（例えば、Ｃ３ｂ−ＫＬＨ）を抗原として免疫化する。ＨｕＭａｂマウスの一般的な免疫スキームはLonberg, N. et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845-851およびＷＯ９８／２４８８４に記載されている。マウスは抗原の初回注入時に６−１６週齢である。抗原の精製された組換え製造物（５−５０μｇ）を腹腔内、皮下（Ｓｃ）または足蹠注射によりＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスを免疫化するために使用する。
【０１３８】
遺伝子導入マウスを完全フロイントアジュバントまたはＲｉｂｉアジュバント中の抗原を腹腔内（ＩＰ）、皮下（Ｓｃ）または足蹠（ＦＰ）のいずれかにより２回免疫化させ、３−２１日間後にフロイントの不完全またはＲｉｂｉアジュバント中の抗原をＩＰ、ＳｃまたはＦＰ免疫化させる（最大１１回の免疫化）。免疫応答を眼窩後方採血によりモニタリングする。血漿をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、十分な力価の抗Ｃ３ｂヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合のために使用する。マウスを屠殺する３日および２日前に抗原を静脈内に追加し、脾臓を取り出す。一般的に、それぞれの抗原に対して１０−３５回の融合を行う。数ダースのマウスをそれぞれの抗原に対して免疫化する。ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７およびＫＭマウス系の全８２匹のマウスをＣ３ｂ抗原で免疫化する。
【０１３９】
Ｃ３ｂネオエピトープと結合した抗体を製造するＨｕＭａｂまたはＫＭマウスを選択するため、免疫マウスの血清をFishwild, D. et al., 1996に記載されているＥＬＩＳＡにより試験することができる。手短に言えば、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中１−２μｇ／ｍｌで精製された組換えＣ３ｂでコーティングし、５０μｌ／ウェルを４℃で一晩インキュベートし、次にＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中の５％のニワトリ血清を２００μｌ／ウェルでブロッキングする。Ｃ３ｂ免疫マウスからの血漿の希釈物をそれぞれのウェルに加え、１−２時間周囲温度でインキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体と１時間室温でインキュベートする。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ、Ａ−１８８８、０．２２ｍｇ／ｍｌ）で現像し、分光光度計によりＯＤ  ４１５−４９５で分析する。抗Ｃ３ｂ抗体の最高力価を表した抗マウスの脾細胞を融合のために使用する。融合を行い、ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡにより抗Ｃ３ｂ活性に関して試験する。
【０１４０】
ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスから単離されたマウス脾細胞を標準プロトコールに基づいてＰＥＧでマウス骨髄腫細胞系に融合させる。次に得られたハイブリドーマを抗原−特異的抗体の生成に関してスクリーニングする。免疫マウスからの脾臓リンパ細胞の単細胞懸濁液を１／４の数のＳＰ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８１）に５０％のＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ）で融合させる。細胞を平底マイクロタイタープレート中で約１×１０５／ウェルで置き、次に約２週間、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ＣＲＬ  １００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含む）プラス５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、ＣＲＬ  Ｐ−７１８５）中で１０％のウシ胎児血清、１０％のＰ３８８Ｄ  １（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  ＴＩＢ−６３）馴化培地、３−５％のＯｒｉｇｅｎ（登録商標）（ＩＧＥＮ）を含む選択培地中でインキュベートする。１−２週間後、細胞をＨＡＴがＨＴと置き換えられている培地中で培養する。次に個々のウェルをヒト抗Ｃ３ｂモノクローナルＩｇＧ抗体に対してＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。広範なハイブリドーマ増殖が起こると、通常、培地を１０−１４日後にモニタリングする。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、まだヒトＩｇＧ陽性のとき、抗Ｃ３ｂモノクローナル抗体を制限希釈により少なくとも２回サブクローニングする。次に安定なサブクローンをインビトロで培養し、さらなる特徴付けのために組織培養培地中で少量の抗体を得る。
【０１４１】
ヒトモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマの製造
本発明のヒトモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマを製造するため、免疫マウスからの脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、適当な不死化細胞系、例えば、マウス骨髄腫細胞系に融合することができる。得られたハイブリドーマ抗原−特異的抗体の生成に関してスクリーニングすることができる。例えば、免疫マウスからの脾臓リンパ細胞の単細胞懸濁液を１／６の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８０）に５０％のＰＥＧで融合させることができる。細胞を平底マイクロタイタープレート中で約２×１４５で置き、次に２０％の胎児クローン血清、１８％の“６５３”馴化培地、５％のＯｒｉｇｅｎ（登録商標）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０：０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴを融合２４時間後に加える）を含む選択培地中で２週間インキュベートする。約２週後、細胞をＨＡＴがＨＴと置き換えられている培地中で培養する。次に個々のウェルをヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体に対してＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。広範なハイブリドーマ増殖が起こると、通常、培地を１０−１４日後に観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、まだヒトＩｇＧ陽性のとき、モノクローナル抗体を制限希釈により少なくとも２回サブクローニングすることができる。次に安定なサブクローンをインビトロで培養し、特性化のため組織培養培地中で少量の抗体を生成する。
【０１４２】
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させることができる。上清を濾過し、濃縮し、タンパク質Ａ−セファロース（Pharmacia, Piscataway, N.J.）でアフィニティクロマトグラフィーに付すことができる。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによりチェックし、純度を確認することができる。バッファー溶液をＰＢＳに交換し、濃度を吸光係数１．４３を使用してＯＤ２８０により測定することができる。モノクローナル抗体をアリコートし、−８０℃で保存することができる。
【０１４３】
モノクローナル抗体を製造するトランスフェクトーマの製造
本発明の抗体は、また、例えば、当分野で既知である組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマ中で製造することができる（例えば、Morrison, 1985 Science 229:1202）。
【０１４４】
例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるため、部分的または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または興味ある抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング）により得ることができ、ＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、発現ベクターに挿入することができる。これに関して、“作動可能に連結された”なる用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図された機能を果たすように、ベクターに連結されることを意味することを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入するか、または、さらに一般的に、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入することができる。抗体遺伝子は標準方法（例えば、抗体遺伝子フラグメント上の相補性制限部位およびベクターの連結または制限部位が存在しないとき、平滑末端連結）により発現ベクターに挿入される。本明細書に記載されている抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントと作動可能に連結され、そしてＶＬセグメントがベクター内のＣＨセグメントと作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクターに挿入することにより、いずれかの抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を製造するために使用することができる。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
【０１４５】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現をコントロールする調節配列を有する。“調節配列”なる用語は抗体鎖遺伝子の転写または翻訳をコントロールするプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Gene Expression Technology. 1990 Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA）に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターのデザインが形質転換された宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者に理解されよう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびパピローマに由来する、哺乳動物細胞における高レベルタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、例えば、ユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターのような非ウイルス調節配列を使用され得る。なおさらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒト１型Ｔ細胞白血病ウイルスの長い末端反復配列からの配列を含む、異なる源からの配列、例えば、ＳＲａプロモーター系を含む（Takebe et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。
【０１４６】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターはさらなる配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）および選択マーカー遺伝子を有し得る。選択マーカー遺伝子はベクターが挿入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、すべてAxel et al.による米国特許第４，３９９，２１６；４，６３４，６６５；および５，１７９，０１７号、参照）。例えば、一般的に、選択マーカー遺伝子はベクターが挿入されている宿主細胞上で薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８を選択するため）を含む。
【０１４７】
軽鎖および重鎖の発現のため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。“トランスフェクション”なる用語の種々の形態は、外来ＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞に導入するために一般的に使用されている広範な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを含むことを意図する。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれにおいても本発明の抗体を発現させることは理論上可能である。このような真核細胞、特に哺乳動物細胞が原核細胞よりも適当に折りたたまれた免疫学的に活性な抗体をアッセンブルおよび分泌しやすいため、真核細胞、特に哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が議論される。抗体遺伝子の原核生物発現は高収率の活性抗体の生成には無効であることが報告されている（Boss and Wood, 1985 Immunology Today 6:12-13）。
【０１４８】
本発明の組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（例えば、Kaufman and Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621に記載されているようなＤＨＦＲ選択可能マーカーと使用されるUrlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞の使用に関して、さらなる発現系はＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に示されているＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入するとき、宿主細胞中で抗体の発現または宿主細胞を増殖させる培養培地中へ抗体の分泌を可能にする十分な時間、宿主細胞を培養することにより抗体を製造する。抗体は標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収することができる。
【０１４９】
二重特異性分子
他の局面において、本発明は本発明のＣ３ｂ結合分子（例えば、抗Ｃ３ｂ抗体またはそのフラグメント）を含む二重特異性分子を特徴とする。本発明のＣ３ｂ結合分子は誘導体化されるか、または他の機能分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド）と結合し、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を製造することができる。実際に、本発明のＣ３ｂ結合分子は誘導体化されるか、または１つ以上の他の機能分子と結合し、２つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を製造することができる；このような多重特異性分子は、また、本明細書において使用される“二重特異性分子”なる用語により包含されることを意図する。本発明の二重特異性分子を創造するため、本発明の抗体を（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合またはその他のものにより）二重特異性分子となるように１つ以上の他の結合分子、例えば、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物に機能的に結合することができる。
【０１５０】
したがって、本発明はＣ３ｂネオエピトープに対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープ、例えば、因子Ｂ、因子Ｄ、プロパージン、因子Ｈ、因子ＩまたはＭＡＣ、例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９の生産に関する補体タンパク質／酵素に対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。
【０１５１】
１つの局面において、本発明の二重特異性分子は結合特異性のために少なくとも１つの抗体またはその抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖを含む。抗体は、また、軽鎖または重鎖ダイマーまたはそれらのいずれかの最小フラグメント、例えば、ＦｖまたはLadner et al. 米国特許第４，９４６，７７８号（この内容を明白に出典明示により包含させる）に記載されている一本鎖構築物であり得る。
【０１５２】
本発明の二重特異性分子は当分野で既知の方法を使用して成分結合特異性を結合させることによって製造することができる。例えば、二重特異性分子のそれぞれの結合特異性は、別々に製造され、次に互いに結合させることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、種々のカップリング剤または架橋剤を共有結合複合体のために使用することができる。架橋剤の例はタンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシニミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648、参照）。他の方法はPaulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375に記載されているものを含む。結合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両方ともPierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手できる。
【０１５３】
結合特異性が抗体であるとき、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合により結合させることができる。特定の局面において、ヒンジ領域は結合の前に奇数、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
【０１５４】
あるいは、両方の結合特異性は同じベクターにおいてコードされ、同じ宿主細胞において発現およびアセンブルされる。この方法は、特に、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき有用である。本発明の二重特異性分子は１つの一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子または２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を製造するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３；５，４５５，０３０；４，８８１，１７５；５，１３２，４０５；５，０９１，５１３；５，４７６，７８６；５，０１３，６５３；５，２５８，４９８；および５，４８２，８５８号に記載されている。
【０１５５】
二重特異性分子のこれらの特異性標的への結合は、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）またはウェスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは一般的に興味ある複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することにより特定の興味あるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０１５６】
スクリーニングおよびアッセイ
補体活性化アッセイ
Ｃ３ｂ結合分子の機能特性はインビトロおよびインビボにて試験することができる。例えば、結合分子はＣ３ｂおよび補体タンパク質、例えば、プロパージン、因子Ｈ、因子Ｂ、因子Ｉ、膜補因子および／またはそれらの複合体の相互作用を阻害する能力に対して試験することができる。さらに結合分子は、Wiesmann, C, et al.(2006). Nature 444, 217-220にしたがってＣ３および／またはＣ５転換酵素活性を阻害する能力に対して試験することができる。
【０１５７】
種々の方法は補体経路分子の活性および補体系の活性化を測定するために使用することができる（例えば、米国特許第６，０８７，１２０号;およびNewell et al., J Lab Clin Med, 100:437-44, 1982、参照）。例えば、補体活性は（ｉ）赤血球の補体介在溶解（溶血）の阻害の測定；（ｉｉ）Ｃ３またはＣ５の開裂を阻害する能力の測定；および（ｉｉｉ）古典的および／または副経路介在溶血の阻害によりモニタリングすることができる。
【０１５８】
２つの非常に一般的に使用される技術は溶血アッセイ（例えば、Baatrup et al., Ann Rheum Dis, 51:892-7, 1992、参照）および免疫学的アッセイ（例えば、Auda et al., Rheumatol Int, 10:185-9, 1990、参照）である。溶血技術はすべての一連の、またはいずれかの古典的または副経路の機能的能力を測定する。免疫学的技術は特定の補体成分または分解産物のタンパク質濃度を測定する。本発明の方法において補体活性化を検出するか、または補体成分の活性を測定するために使用することができる他のアッセイは、例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ（Chain et al., J Immunol Methods, 99:221-8, 1987）および遅延型過敏（ＤＴＨ）アッセイ（Forstrom et al., 1983, Nature 303:627-629; Hallidayet al., 1982, in Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York pp. 1-26; Koppi et al., 1982, Cell. Immunol. 66:394-406;および米国特許第５，８４３，４４９号）を含む。
【０１５９】
溶血技術において、すべての適当な補体成分は存在し、機能的でなければならない（測定される経路に依存して、必要とされる構成成分は変化し得る）。したがって、溶血技術は補体系の機能的な完全性および欠損の両方をスクリーニングすることができる（例えば、Dijk et al., J Immunol Methods 36: 29-39, 1980; Minh et al., Clin Lab Haematol. 5:23-34 1983;およびTanaka et al., J Immunol 86: 161-170, 1986、参照）。例えば、古典的経路の機能的能力を測定するために、ヘモリシン（ヒツジ赤血球に対するウサギＩｇＧ）にて被覆されたヒツジ赤血球（他の種からの赤血球を同様に使用することができる、例えば、ニワトリ赤血球を使用することができる）を標的細胞（感受性細胞）として使用する。これらのＡｇ−Ａｂ複合体は古典的経路を活性化し、構成成分が機能的であり、適当な濃度にて存在するとき、標的細胞の溶解をもたらす。副経路の機能的能力を測定するために、ウサギ赤血球を標的細胞として使用する（例えば、米国特許第６，０８７，１２０号、参照）。
【０１６０】
溶血補体測定は、全範囲の機能的補体タンパク質を必要とする細胞溶解を誘導する補体の機能に基づくため、例えば、対象の血液における補体タンパク質の欠損および機能的障害を検出するために適用することができる。古典的経路活性化を測定するいわゆるＣＨ５０方法および副経路のためのＡＰ５０方法は全血清の代わりに特定の単離された補体タンパク質を使用することにより拡張されているが、高希釈試験サンプルは未知の濃度の制限補体成分を含む。この方法により、補体系のより詳細な測定を実施することができ、どの構成成分が欠損しているかを示す。
【０１６１】
免疫学的技術は、例えば、補体成分の分解産物を検出するために、種々の補体成分（例えば、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５）の異なるエピトープに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する（例えば、Hugli et al., Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460, 1980; Gorski et al., J Immunol Meth 47: 61-73, 1981; Linder et al., J Immunol Meth 47: 49-59, 1981;およびBurger et al., J Immunol 141: 553-558, 1988、参照）。次に、既知の濃度の標識化分解産物と競合する分解産物と抗体の結合を測定することができる。種々のアッセイ、例えば、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡおよび放射拡散(radial diffusion)アッセイを補体分解産物を検出するために利用できる。
【０１６２】
免疫学的技術は、黄斑変性症関連障害を有するか、または有さない試験対象およびコントロール対象からの血液中における分解産物形成の測定を可能にするために、補体活性化を検出するような高い感度を提供する。したがって、本発明のいくつかの方法において、黄斑変性症と関連する障害の診断は試験対象からの血漿中の補体成分の可溶性分解産物（例えば、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９最終複合体）の定量を介する異常補体活性化の測定により得られる。測定は、例えば、Chenoweth et al., N Engl J Med 304: 497-502, 1981;およびBhakdi et al., Biochim Biophys Acta 737: 343-372, 1983において記載されているとおりに実施することができる。好ましくは、インビボにて形成された補体活性化のみを測定する。これは補体系の阻害剤を含む培地中にて対象からの生物学的サンプル（例えば、血清）を回収し、次にサンプル中の補体活性化（例えば、分解産物の定量）を測定することにより成し遂げることができる。
【０１６３】
黄斑変性症と関連する障害を有する患者の臨床診断またはモニタリングにおいて、正常対象からの対応する生物学的サンプルにおけるレベルと比較して補体タンパク質の検出は黄斑変性症と関連する障害を有する患者を示す。
【０１６４】
インビボ診断またはイメージングはＵＳ２００６／００６７９３５において記載されている。簡潔には、これらの方法は一般的に非侵襲的な方法により検出可能であるマーカーまたは標識に作動可能に結合した診断的に有効量のＣ３ｂ結合分子を患者に投与するか、または導入することを含む。抗体−マーカー複合体は眼内に局在し、補体タンパク質に結合するために十分な時間を許容される。次に、患者を検出可能マーカーを同定するために検出デバイスに暴露し、患者の眼内におけるＣ３ｂ結合分子の局在の像を形成する。Ｃ３ｂ結合分子またはそれらの複合体の存在は抗体−マーカーが眼の構成成分に結合するかどうかを同定することにより検出する。ＡＭＤ疾患を有さない正常な個体と比較して選択される補体タンパク質またはそれらの組合せにおける増加したレベルの検出は黄斑変性症と関連する障害に罹患しやすいこと、および／または障害の発症を示す。本発明のこれらの局面は、また、眼のイメージング方法ならびに合わせた血管新生診断および処置方法における使用に対して好ましい。
【０１６５】
動物モデル
Ｃ３ｂ結合分子によるＣ３ｂ調節を試験するために適当な動物モデルはＵＳ２００６／００６７９３５において記載されている。ＡＭＤの動物モデルをマウスにおいて発症させると、ヒト状態において見られる病理学的特徴を発症する。Ambati, J et al, (2003) Nat Med 9, 1390-1397。
【０１６６】
Ｃ３ｂ結合分子の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療有効な用量）を決定するために、これらの実験動物において標準的な医薬的手順により決定することができる。毒性と治療作用間の用量比は治療係数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。動物試験から得られたデータはヒト用の用量範囲を処方する際に使用することができる。用量は、細胞培養において決定されるとおりのＩＣ５０（すなわち、症状の最大半減阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて製剤化され得る。このような情報はヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０１６７】
医薬組成物およびその使用
医薬組成物
他の局面において、本発明は、本発明のＣ３ｂ結合分子（例えば、モノクローナル抗体またはその抗原−結合部分）の１つまたは組合せを含む、薬学的に許容される担体とともに製剤化された組成物、例えば、医薬組成物を提供する。このような組成物は（例えば、２種以上の異なる）結合分子の１つまたは組合せを含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する抗体または薬物の組合せを含むことができる。
【０１６８】
本発明の医薬組成物は、また、組合せ治療、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、組合せ治療は抗Ｃ３ｂ抗体を少なくとも１つの抗炎症剤と共に含むことができる。組合せ治療において使用することができる治療剤の例は、下記の本発明の薬剤の使用のセクションにおいてより詳細に記載されている。
【０１６９】
本明細書において使用される“薬学的に許容される担体”は生理学的に適合するあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。担体は（例えば、注射または注入による）非経口投与に適しているべきである。本明細書において使用される“非経口”投与は通常、注射による経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、眼内（硝子体内を含む）、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含むが、これらに限定されない。投与経路に依存して、Ｃ３ｂ結合分子は、本発明の結合分子を不活性にし得る酸および他の天然条件の作用からそれを保護するために送達物質でコーティングまたは送達物質中にて提供され得る。
【０１７０】
本発明の医薬化合物は１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。“薬学的に許容される塩”は所望の親化合物の生物学的活性を保持するが、望ましくない毒性作用を付与しない塩を意味する（例えば、Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19、参照）。このような塩の例は酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は無毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸など、ならびに無毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などに由来するものを含む。塩基付加塩はアルカリ土金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに無毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものを含む。
【０１７１】
本発明の医薬組成物は、また、薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は：水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、アルファ−トコフェロールなど；および金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などを含む。
【０１７２】
本発明の医薬組成物において使用され得る適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれの適当な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、および注入可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルを含む。適当な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１７３】
これらの組成物は、また、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含み得る。微生物存在の防止は上記殺菌手順ならびに種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含により確保され得る。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物に包含させることが望ましいこともある。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の延長は吸収を遅らせる薬物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの包含により実現され得る。
【０１７４】
薬学的に許容される担体は無菌注射可能溶液または分散液の即時製造調製のための無菌水溶液または分散液および無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬物の使用は当分野で既知である。慣用の媒体または薬物が活性な化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助的な活性化合物も組成物に包含することができる。
【０１７５】
一般的に、治療組成物は製造および保存の条件下にて無菌および安定でなければならない。本発明のＣ３ｂ結合分子は、溶液、ミクロエマルション、リポソームまたはその他の高濃度の薬物に適した調整構造物として調剤することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）および適当なそれらの混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことができる。注射可能な組成物の吸収の延長は組成物中に吸収を遅らせる薬物、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことにより実現することができる。
【０１７６】
無菌注射可能溶液は適当な溶媒中で必要な量の活性な化合物を上記に挙げられた成分の１つまたは組合せと混合し、必要なとき、次に無菌的精密濾過をすることにより製造することができる。一般的に、分散液は基本的な分散媒および上記に挙げられたものから必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に活性な化合物を配合することにより製造される。無菌注射可能溶液の製造のための無菌粉末の場合、製造方法は、事前に無菌濾過した溶液から活性成分プラス何らかのさらなる所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドドライ（凍結乾燥）である。
【０１７７】
単位投与形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は処置される対象および特定の投与経路に依存して変化する。単位投与形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は一般的に治療効果を引き起こす組成物の量である。一般的に、１００％のうち、この量は薬学的に許容される担体との組み合わせで活性成分が約０．０１％から約９９％、約０．１％から約７０％または約１％から約３０％の範囲である。
【０１７８】
投与レジメンは所望の最適応答（例えば、治療応答）を提供するために調節される。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、経時的に数回の分割投与で投与してもよく、または治療状況の緊急性により指示されるとき、比例的に用量を減少または増加してもよい。とりわけ、投与の容易性および投与量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で調剤することが有利である。本明細書において使用される投与単位形態は処置される対象に対する単位用量として適した物理的に別個の単位を意味し；それぞれの単位は必要な医薬担体と一緒に所望の治療効果を引き起こすように計算されたあらかじめ決められた量のＣ３ｂ結合分子を含む。本発明の投与単位形態の仕様は活性な化合物の独自の特徴と達成すべき特定の治療効果、および各個体における治療感受性に関して、このような結合分子を調剤する技術に固有の限界により規定され、かつ直接的に依存する。
【０１７９】
該抗体の投与に関して、用量は約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常０．０１から５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。典型的な処置レジメンは１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１月に１回、３月に１回または３から６月に１回の投与を必要とする。
【０１８０】
本発明のＣ３ｂ抗体に対する投与レジメンは１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重にて、以下の投与スケジュールのいずれかを使用して投与される抗体の静脈内投与を含む：４週間ごとに６回、次に３月ごとに投与；３週間ごとに投与；３ｍｇ／ｋｇ体重を１回投与し、次に１ｍｇ／ｋｇ体重を３週間ごとに投与。
【０１８１】
Ｃ３ｂ結合分子の好ましい投与形路は眼に対する局所適用である。眼の組成物は一般的に、１から４滴の滅菌溶液または懸濁液、または、同量の軟膏、ゲルまたは他の固体もしくは半固体組成物を１日に１から４回、罹患している眼の表面に適用することにより、罹患している眼に投与される。製剤は、また、外科手術中に罹患している眼に適用される潅流溶液として製剤化され得る。
【０１８２】
Ｃ３ｂ結合分子は静脈内、腹腔内または硝子体内注射のために適応された医薬組成物として慣用の手段にしたがって製剤化され得る。Ｃ３ｂ結合分子を静脈内注射により投与する。高量静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）ならびにＦ（ａｂ）２−ＩＶＩＧおよび不適切なヒトモノクローナル抗体でさえ全て、Ｃ３ａおよびＣ５ａに結合し、これらの機能を妨げることができる。Basta M. et al. F(ab)'2-mediated neutralization of C3a and C5a anaphylatoxins: a novel effector function of immunoglobulins. Nature Medicine 2003; 9:431-8。Ｃ３ｂ結合分子を含む組成物は眼への硝子体内注射のために適応され得る。一般的に、注射のための組成物は滅菌等張水性バッファー中の溶液である。必要なとき、Ｃ３ｂ結合分子は、また、可溶化剤および注射部位において痛みを軽減するための局所麻酔、例えば、リグノカインを含み得る。一般的に、複数の成分は別々に、または、例えば、密封されている容器、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサッシェ(sachette)中の凍結乾燥された粉末または水非含有濃縮物として、単位投与形態において一緒に混合されて提供される。組成物を注入により投与されるとき、滅菌医薬グレード水または塩水を含む注入ボトルにて解決することができる。組成物を注射により投与されるとき、注射用滅菌水または塩水のアンプルが、成分を投与前に混合することができるように提供され得る。
【０１８３】
１つの態様において、成人患者における新生血管（湿潤型）加齢黄斑変性症の処置のための適当な用量は０．５ミリグラム（０．０５ミリリットル）であり、月（約２８日）１回罹患している眼へ硝子体内に注射される。適当な麻酔および広範囲の殺菌剤を結合分子注射前に投与する。月１回の注射が実行可能でないとき、処置は、最初に４回注射後、３月に１回の注射に減らし得る。他の態様において、新生血管黄斑変性症の処置のための抗体の有効量は硝子体内に月１回０．３ミリグラムである。
【０１８４】
いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する２つ以上の結合分子（例えば、モノクローナル抗体）を同時に投与され、この場合、投与されるそれぞれの抗体の用量は指示される範囲内である。Ｃ３ｂ結合分子を通常、複数回投与する。各投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３月ごとまたは１年ごとであり得る。間隔は、また、患者のＣ３ｂネオエピトープに対する結合分子の血中レベルを測定することにより示されるように不定期であり得る。いくつかの方法において、用量は約１−１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法において、約２５−３００μｇ／ｍｌのＣ３ｂ結合分子の血漿濃度を達成するように調節される。
【０１８５】
あるいは、Ｃ３ｂ結合分子を持続放出製剤として投与することができ、この場合、投与頻度は少なくてよい。用量および頻度は患者におけるＣ３ｂ結合分子の半減期に依存して変化する。一般的に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。用量および投与頻度は処置が予防的または治療的であるかどうかに依存して変化し得る。予防的適用において、比較的低用量を比較的低頻度で長期間投与する。ある患者は残りの生涯、処置を受け続ける。治療的適用において、ときどき、比較的高用量を比較的短間隔で、疾患の進行を遅らせるかもしくは停止させるまで、または患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで必要である。その後、患者は予防レジメンで投与され得る。
【０１８６】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性がなく、特定の患者、組成物および投与経路に対して所望の治療応答を達成するために有効な量の活性成分に変化させることができる。選択された用量レベルは使用される本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排泄速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態および病歴ならびに医薬分野で既知の因子を含む種々の薬物動態因子に依存する。
【０１８７】
本発明のＣ３ｂ結合分子の“治療有効量”は疾患症状の重症度における減少（例えば、Ｃ３および／またはＣ５転換酵素活性における減少）、疾患無症状期間の頻度および持続時間の増加または疾患苦痛による消耗または無力感の予防をもたらすことができる。
【０１８８】
本発明の結合分子は、１つ以上の当分野で既知の種々の方法を使用して、１つ以上の投与経路により投与することができる。投与様式および／または投与経路は所望の結果に依存して変化することが、当業者に理解される。本発明のＣ３ｂ結合分子の投与形路は、例えば、注射または注入による、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口経路の投与を含む。
【０１８９】
あるいは、本発明のＣ３ｂ結合分子は、非経口経路、例えば、局所、上皮または粘膜経路の投与、例えば、鼻腔内、経口的、舌下的または局所的により投与することができる。
【０１９０】
活性な化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のように、化合物を迅速な放出に対して保護する担体とともに製造することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤の製造のための多数の方法は特許されているか、または一般的に当業者に既知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978、参照。
【０１９１】
治療組成物は当分野で既知の医療デバイスで投与することができる。例えば、１つの局面において、本発明の治療組成物は無針皮下注射デバイス、例えば、米国特許第５，３９９，１６３；５，３８３，８５１；５，３１２，３３５；５，０６４，４１３；４，９４１，８８０；４，７９０，８２４または４，５９６，５５６号に示されているデバイスで投与することができる。本発明において有用な既知のインプラントおよびモジュールの例は：コントロールされた速度で薬物を分配するためのインプラント可能な微小注入ポンプを示す米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介する薬物を投与するための治療デバイスを示す米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを示す米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための流量可変のインプラント可能な注入装置を示す米国特許第４，４４７，２２４号；複数チャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４７５，１９６号を含む。これらの特許は出典明示により本明細書に包含される。他のこのような多数のインプラント、送達系およびモジュールは当業者に既知である。
【０１９２】
特定の局面において、本発明のＣ３ｂ結合分子をインビボで適切な分布を確実にするため製剤化することができる。例えば、血液脳関門（“ＢＢＢ”）または血液網膜関門（“ＢＲＢ”）は多数の高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢまたはＢＲＢを（所望により）通過することを確実にするため、それらは、例えば、リポソーム中で製剤化することができる。リポソームを製造する方法に関して、例えば、米国特許第４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；および５，３９９，３３１号、参照。リポソームは特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１以上の部分を含み得、したがって標的薬物送達を強化する（例えば、V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685、参照）。典型的な標的とする部分は葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.による米国特許第５，４１６，０１６号、参照）；マンノシド（Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180）；界面活性剤タンパク質Ａ受容体（Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090）を含む；K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273も参照。
【０１９３】
使用および方法
本明細書に記載されているＣ３ｂ結合分子はインビトロおよびインビボにおける診断および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、例えば、インビトロまたはインビボにて培養下における細胞に、あるいは、例えば、インビボにて対象における細胞に投与して、種々の障害を処置、予防または診断することができる。Ｃ３ｂ結合分子は特に、約１０％の場合において新生血管形成と関連する状態であるＡＭＤ（湿潤型ＡＭＤ）、炎症および失明を有するか、または危険性があるヒト患者を処置するために適当である。Ｃ３ｂ結合分子は、また、腎炎、喘息、再かん流傷害、血液透析、リウマチ性関節炎、全身性狼瘡、乾癬、多発性硬化症、移植、アルツハイマー病、ａＨＵＳ、ＩＩ型ＭＰＧＮまたはすべての他の補体介在疾患のような疾患または障害を有するヒト患者を処置するために適当である。
【０１９４】
Ｃ３ｂ結合分子がさらなる薬剤と共に投与されるとき、２つは連続して順番にまたは同時に投与することができる。いくつかの局面において、Ｃ３ｂ結合分子は第２の薬剤（例えば、ベルテポルフィン）と共に治療を受けている対象にも投与される。他の局面において、結合分子は外科的処置と組み合わせて投与される。
【０１９５】
Ｃ３ｂ結合分子との組合せ処置のために適当な薬剤は補体成分の活性を調節することができる当分野において既知の薬剤を含む（例えば、米国特許第５，８０８，１０９号、参照）。他の薬剤は補体介在活性を減少させることが報告されている。このような薬剤はアミノ酸（Takada, Y. et al. Immunology 1978, 34, 509）；亜リン酸エステル（Becker, L. Biochem. Biophy. Acta 1967, 147, 289）；ポリアニオン物質（Conrow, R. B. et al. J. Med. Chem. 1980, 23, 242）；スルホニルフルオリド（Hansch, C.; Yoshimoto, M. J. Med. Chem. 1974, 17, 1160、これらの文献を本明細書に引用する）；ポリヌクレオチド（DeClercq, P. F. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975, 67, 255）；ピマル酸（Glovsky, M. M. et al. J. Immunol. 1969, 102, 1）；ポルフィン（Lapidus, M. and Tomasco, J. Immunopharmacol. 1981, 3, 137）；いくつかの抗炎症剤（Burge, J. J. et al. J. Immunol. 1978, 120, 1625）；フェノール（Muller-Eberhard, H. J. 1978, in Molecular Basis of Biological Degradative Processes, Berlin, R. D. et al., eds. Academic Press, New York, p. 65）；およびベンズアミジン（Vogt, W. et al Immunology 1979, 36, 138）を含む。これらのいくつかの薬剤はプロテアーゼおよびエステラーゼの一般的な阻害により機能する。他のものは補体経路におけるいずれかの特定の中間段階に特異的ではなく、むしろ、２つ以上の補体活性化を阻害する。後者の化合物の例はＣ１、Ｃ４およびＣ５利用をブロックするベンズアミジンを含む（例えば、Vogt et al. Immunol. 1979, 36, 138、参照）。
【０１９６】
補体成分の活性を阻害することができる当分野で既知のさらなる薬剤はスタキボトリスからの真菌代謝物であるＫ−７６を含む（Corey et al., J. Amer. Chem. Soc. 104: 5551, 1982)。Ｋ−７６およびＫ−７６  ＣＯＯＨは両方とも、主にＣ５段階における補体を阻害する（Hong et al., J. Immunol. 122: 2418, 1979; Miyazaki et al., Microbiol. Immunol. 24: 1091, 1980)、および、正常ヒト補体からの化学走化性因子の生成を防止する（Bumpers et al., Lab. Clinc. Med. 102: 421, 1983)ことが見出されている。高濃度のＫ−７６またはＫ−７６  ＣＯＯＨにおいて、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ７およびＣ９とそれぞれの前中間物質のいくつかの反応の阻害が示されている。Ｋ−７６またはＫ−７６  ＣＯＯＨは、また、補体のＣ３ｂインアクチベーター系を阻害することが報告されている（Hong et al., J. Immunol. 127: 104-108, 1981）。本発明の方法を実施するための他の適当な薬剤はグリセオフルビン（Weinberg, in Principles of Medicinal Chemistry, 2d Ed., Foye, W. O., ed., Lea & Febiger, Philadelphia, Pa., p. 813, 1981）、イソパナリン(isopannarin)（Djura et al., Aust. J. Chem.36: 1057, 1983）およびSiphonodictyon coralli-phagumの代謝物（Sullivan et al., Tetrahedron 37: 979, 1981）を含む。
【０１９７】
組合せ治療レジメンは相加的であるか、あるいは相乗的な結果（例えば、２つの薬剤の組合せ使用に対して予期される以上の補体経路活性における減少）を引き起こし得る。いくつかの局面において、Ｃ３ｂ結合分子および抗血管形成剤、例えば、抗ＶＥＧＦとの組合せ治療は相乗的結果（例えば、Ｃ３ｂ生物活性における相乗的減少）を引き起こす。
【０１９８】
また、本発明の組成物および使用するための指示書からなるキットは本発明の範囲内にある。該キットはさらに少なくとも１つのさらなる試薬または１つ以上のさらなる本発明の抗体（例えば、第一の抗体と異なるＣ３ｂネオエピトープに結合する相補的活性を有する抗体）を含み得る。一般的に、キットはキットの内容の意図した使用を示したラベルを含む。ラベルなる用語は、キット上またはキットとともに供給されるか、他の方法でキットに付随する書類、または記録材料を含む。
【０１９９】
本発明は完全に記載されており、以下の実施例および特許請求の範囲によりさらに説明されるが、これらは説明のためであり、さらなる限定を意図しない。当業者は慣用の実験、本明細書に記載されている特定の手順に対する多くの等価なもののみを使用して確認するか、または確かめることができる。このような等価なものは本発明の範囲および特許請求の範囲内である。本出願に引用されている発行特許および公開特許出願を含む全ての刊行物の内容は出典明示により本明細書に包含される。
【実施例】
【０２００】
実施例
実施例Ａ  ファージディスプレイによるヒト抗体の作製
Ｃ３ｂに対する抗体の作製のために、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージディスプレイライブラリーによる選択を実施する。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）は、全６個のＣＤＲが多様であるＨｕＣＡＬ（登録商標）概念に基づくＦａｂライブラリーであり、Ｆａｂフラグメントをファージ表面に結合させるためにＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ技術を使用する（Knappik et al., 2000 J.Mol. Biol. 296:57-86; Krebs et al., 2001 J Immunol. Methods 254:67-84; Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194-38205; WO 01/05950, Loehning, 2001）。
【０２０１】
ファージミドレスキュー、ファージ増幅および精製
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーを３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１％のグルコース（２×ＹＴ−ＣＧ）を含む２×ＹＴ培地中にて増幅させる。０．５のＯＤ６００ｎｍにてＶＣＳＭ１３ヘルパーファージの感染後（３７℃３０分、振とうなし；２５０ｒｐｍにて３７℃３０分、振とう）、細胞をスピンダウンし（４１２０ｇ；５分；４℃）、２×ＹＴ／３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌのカナマイシン／０．２５ｍＭのＩＰＴＧに再懸濁し、２２℃にて一晩増殖させる。ファージを上清から２回ＰＥＧ沈殿し、ＰＢＳ／２０％のグリセロールに再懸濁し、−８０℃にて保存する。
【０２０２】
２回のパニングラウンド間のファージ増幅を下記のとおりに実施する：対数期の大腸菌ＴＧ１細胞を溶出ファージに感染させ、ＬＢ−寒天を補った１％のグルコースおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＬＢ−ＣＧプレート）に置く。３０℃にて一晩インキュベーション後、ＴＧ１コロニーを寒天プレートから掻き取り、０．５のＯＤ６００ｎｍに達するまで２×ＹＴ−ＣＧを植菌するために使用し、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを上記のとおりに感染のために加える。
【０２０３】
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）によるパニング
Ｃ３ｂネオエピトープを認識する抗体の選択のために、２つの異なるパニング戦略を適用する。要約すると、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージ抗体を、ＶＨマスター遺伝子の異なる組合せを含む４つのプールに分類する（プール１：ＶＨ１／５λκ、プール２：ＶＨ３λκ、プール３：ＶＨ２／４／６λκ、プール４：ＶＨ１−６λκ）。これらのプールを、ｓｕｌｆｏｌｉｎｋアガロースビーズに直接結合したヒトＣ３ｂ上およびスルフヒドリル結合プレートに直接被覆したＣ３ｂ上の両方において、個々に３回、固相パニングに付し、さらに、ビオチン化Ｃ３ｂ抗原上において、３回溶液パニングに付す。
【０２０４】
１回目のパニング変形はＣ３ｂネオエピトープに対する固相パニングであり：スルフヒドリル−Ｂｉｎｄプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上の２つのウェルを３００μｌの５μｇ／ｍｌのＣ３ｂ−それぞれ４℃でｏ／ｎにて被覆する。被覆ウェルを３５０μｌのＰＢＳにて２回洗浄し、マイクロタイタープレート振とう機において室温にて２時間、３５０μｌの５％のＭＰＢＳでブロックする。それぞれのパニングのために、約１０１３のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージ抗体を室温にて２時間、等しい量のＰＢＳＴ／５％のＭＰにてブロックする。ブロッキング後、被覆ウェルを３５０μｌのＰＢＳにて２回洗浄する。３００μｌのあらかじめブロックしたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージ−抗体をそれぞれの被覆ウェルに加え、振とう機において室温にて２時間インキュベートする。洗浄は３５０μｌのＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎを５回加え、次にＰＢＳにてさらに４回洗浄することにより実施する。プレートからのファージの溶出をウェルあたり１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ  ｐＨ８中の３００μｌの２０ｍＭのＤＴＴにて１０分間実施する。ＤＴＴファージ溶出物を１４ｍｌの大腸菌ＴＧ１に加え、これを２×ＹＴ培地中で３７℃にて０．６−０．８のＯＤ６００に増殖させ、ファージ感染のための振とうなしに３７℃で４５分間、５０ｍｌプラスチックチューブにおいてインキュベートする。５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離後、細菌ペレットを５００μｌの２×ＹＴ培地にそれぞれ再懸濁し、２×ＹＴ−ＣＧ寒天プレートに置き、３０℃にて一晩インキュベートする。次にコロニーをプレートから掻き取り、上記のとおりファージをレスキューおよび増殖させた。直接被覆したＣ３ｂ抗原上における２回目および３回目の固相パニングを１回目のプロトコールにしたがって実施するが、洗浄工程のストリンジェンシーは高める。
【０２０５】
２回目のパニング変形はビオチン化ヒトＣ３ｂ抗原に対する溶液パニングであり：溶液パニングのために、Ｄｙｎａビーズ  Ｍ−２８０（Ｄｙｎａｌ）に結合したビオチン化Ｃ３ｂ抗原を使用して、下記のプロトコールを適用する：１．５ｍｌエッペンドルフチューブをＰＢＳにおいて１：１希釈した１．５ｍｌの２×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒにて４℃で一晩ブロックする。２００μｌのストレプトアビジン被覆磁気Ｄｙｎａビーズ  Ｍ−２８０（Ｄｙｎａｌ）を２００μｌのＰＢＳにて１回洗浄し、２００μｌの１×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（１×ＰＢＳにて希釈した）に再懸濁する。ビーズのブロッキングをあらかじめブロックしたチューブにて４℃で一晩実施する。それぞれのパニングに対して５００μｌのＰＢＳにおいて希釈したファージを５００μｌの２×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ／０．１％のＴｗｅｅｎと室温にて１時間で混合する（ローター）。ファージのプレ吸着を２回実施する：５０μｌのブロック化ストレプトアビジン磁気ビーズをブロック化ファージに加え、室温にて３０分間ローターでインキュベートする。磁気デバイス（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｅ）によるビーズの分離後、ファージ上清（〜１ｍｌ）を新しいブロック化チューブに移し、プレ吸着を５０μｌのブロックビーズにて３０分間繰り返した。次に、２００ｎＭのビオチン化Ｃ３ｂを新しいブロック化１．５ｍｌチューブ中のブロック化ファージに加え、室温にて１時間ローターでインキュベートする。１００μｌのブロック化ストレプトアビジン磁気ビーズをそれぞれのパニングファージプールに加え、室温にて１０分間ローターでインキュベートする。ビオチン化Ｃ３ｂに結合したファージを磁気ビーズに固定し、磁気粒子分離機（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｅ）にて回収する。次にビーズをローターを使用してＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎにて７回洗浄し、次にＰＢＳにてさらに３回洗浄する。Ｄｙｎａｂｅａｄからのファージの溶出は１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８中の３００μｌの２０ｍＭのＤＴＴをそれぞれのチューブに１０分加えることにより実施する。Ｄｙｎａｂｅａｄを磁気粒子分離機により除去し、上清を０．６−０．８のＯＤ６００ｎｍまで増殖させた１４ｍｌの大腸菌  ＴＧ−１培養物に加える。次にビーズを２００μｌのＰＢＳにて１回、さらに除去されたファージと共に洗浄し、ＰＢＳを１４ｍｌの大腸菌  ＴＧ−１培養物に加える。ファージ感染のために、培養物を３７℃にて４５分振とうなしに５０ｍｌプラスチックチューブにおいてインキュベートする。５０００ｒｐｍにて１０分遠心分離後、細菌ペレットを５００μｌの２×ＹＴ培地にそれぞれ再懸濁し、２×ＹＴ−ＣＧ寒天プレートに置き、３０℃にて一晩インキュベートする。次にコロニーをプレートから掻き取り、上記のとおりファージをレスキューおよび増幅させた。
【０２０６】
ビオチン化Ｃ３ｂ抗原上の２回目および３回目の溶液パニングを１回目のプロトコールにしたがって実施するが、洗浄工程のストリンジェンシーは高める。
【０２０７】
可溶性Ｆａｂフラグメントのサブクローニングおよび発現
選択されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージミドのＦａｂコード挿入物を発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨにサブクローニングし、迅速なおよび効率のよい可溶性Ｆａｂの発現を促進する。この目的のために、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡをＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩにて消化し、それによってＦａｂコード挿入物（ｏｍｐＡ−ＶＬＣＬおよびｐｈｏＡ−Ｆｄ）を取り出し、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ−消化発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨにクローニングする。このベクターから発現されるＦａｂは検出および精製両方のために２つのＣ−末端タグ（ＦＬＡＧＴＭおよび６×Ｈｉｓ、各々）を有する。
【０２０８】
大腸菌におけるＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体のマイクロ発現
ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨ発現ベクターへ選択されたＦａｂのサブクローニング後に得られたクロラムフェニコール耐性単一コロニーをウェルあたり１００μｌの２×ＹＴ−ＣＧ培地を含む滅菌９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに播種するために使用し、３７℃にて一晩増殖させる。５μｌのそれぞれの大腸菌ＴＧ−１培養物をウェルあたり３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび０．１％のグルコースを補った１００μｌの２×ＹＴ培地にてあらかじめ満たした新鮮な滅菌９６ウェルマイクロタイタープレートに移す。マイクロタイタープレートを培養物が〜０．５のＯＤ６００ｎｍを有し、わずかに混濁するまで（〜２−４時間）、マイクロプレート振とう機において４００ｒｐｍにて振とうして３０℃にてインキュベートする。
【０２０９】
これらの発現プレートに、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび３ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を補った２０μｌの２×ＹＴ培地をウェルごとに加え（最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧ）、マイクロタイタープレートをガス透過性テープにて密閉し、プレートを４００ｒｐｍにて振とうして３０℃にて一晩インキュベートする。
【０２１０】
全細胞溶解物（ＢＥＬ抽出物）の生産：発現プレートのそれぞれのウェルに、４０μｌのＢＥＬバッファー（２×ＢＢＳ／ＥＤＴＡ：２４．７ｇ／ｌのホウ酸、１８．７ｇのＮａＣｌ／ｌ、１．４９ｇのＥＤＴＡ／ｌ、ｐＨ８．０）を２．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含むように加え、マイクロタイタープレート振とう機（４００ｒｐｍ）において２２℃にて１時間インキュベートする。ＢＥＬ抽出物をＥＬＩＳＡまたはＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｍ−ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）３８４分析器による結合アッセイのために使用する。
【０２１１】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術
ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌのヒト組換えＣ３ｂ抗原を３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）上に４℃にて一晩で被覆する。被覆後、ウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）にて１回およびＰＢＳにて２回洗浄する。次にウェルを２％のＢＳＡを有するＰＢＳ−Ｔで室温にて２時間ブロックする。同時に、１５μｌのＢＥＬ抽出物および２％のＢＳＡを有する１５μｌのＰＢＳ−Ｔを室温にて２時間インキュベートする。ブロック化ＭａｘｉｓｏｒｐプレートをＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄し、１０μｌのブロック化ＢＥＬ抽出物をウェルに加え、室温にて１時間インキュベートする。一次Ｆａｂ抗体の検出のために、下記の二次抗体を適用する：アルカリホスファターゼ（ＡＰ）−結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヤギ抗ヒト、−抗マウスもしくは−抗ヒツジＩｇＧ（Jackson Immuno Research）。ＡＰ結合体の検出のために、ＡｔｔｏＰｈｏｓ（Roche）のような蛍光基質を製造者の指示にしたがって使用する。すべてのインキュベーション工程間、マイクロタイタープレートのウェルをＰＢＳ−Ｔにて３回、二次抗体との最終インキュベーション後に３回洗浄する。蛍光はＴＥＣＡＮ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダーにおいて測定することができる。
【０２１２】
大腸菌におけるＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体の発現および精製
ＴＧ−１細胞におけるｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨによってコードされるＦａｂフラグメントの発現を３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補った７５０ｍｌの２×ＹＴ培地を使用して振とう機フラスコ培養において実施する。培養物をＯＤ６００ｎｍが０．５に達するまで３０℃にて振とうする。発現を３０℃にて２０時間、０．７５ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導する。細胞をリゾチームを使用して破壊し、ＦａｂフラグメントをＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（Qiagen, Hilden, Germany）により単離する。タンパク質濃度をＵＶ−分光光度法（Krebs et al. J Immunol Methods 254, 67-84 (2001)）により測定することができる。
【０２１３】
実施例Ｂ  ＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ２カセットの平行交換により選択された抗Ｃ３ｂネオエピトープＦａｂの親和性成熟
親和性成熟のためのＦａｂライブラリーの生成
同定された抗Ｃ３ｂ抗体の親和性および阻害活性を増加するために、Ｆａｂクローンを親和性成熟に付す。この目的のために、ＣＤＲ領域をトリヌクレオチド特異的変異を使用してカセット変異により最適化する（Virnekas et al. Nucleic Acids Res 22, 5600-5607, 1994）。
【０２１４】
以下のパラグラフは成熟ライブラリーのクローニングおよびＦａｂ最適化のために使用することができるプロトコールを簡潔に記載している。発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨからのＦａｂフラグメントをファージミドベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５にクローニングする（米国特許第６，７５３，１３６号）。２つの異なる戦略を平行に適用して、親Ｆａｂの親和性および有効性の両方を最適化する。
【０２１５】
ファージ抗体Ｆａｂライブラリーは、６つの選択された成熟候補物（“親”クローン）のＬＣＤＲ３は個々の軽鎖ＣＤＲ３配列のレパートリーにより置き換えられて製造される。平行して、それぞれの親クローンのＨＣＤＲ２領域は個々の重鎖ＣＤＲ２配列のレパートリーにより置き換える。親和性成熟ライブラリーは標準クローニング方法および種々のクローンのエレクトロコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ細胞（Invitrogen）への形質転換により製造される。Ｆａｂ存在ファージは実施例１において記載されているとおりに製造される。それぞれのライブラリーに対応する成熟プールは次の選択プロセス中に構築し、別々に保持する。
【０２１６】
成熟パニング戦略
４つの抗体プールを使用するパニングをそれぞれ上記のとおりに溶液中のＣ３ｂについて３ラウンド行う。ビオチン化Ｃ３ｂに対して溶液パニングにおいて実施する。選択ストリンジェンシーは、パニングラウンドからパニングラウンドへのビオチン化抗原の減少、洗浄工程の延長およびオフ速度(off-rate)選択のための非ビオチン化抗原の添加により増加される。
【０２１７】
細菌溶解物におけるＣ３ｂ結合Ｆａｂの検出のための電気化学ルミネセンス（BioVeris）ベース結合分析
大腸菌溶解物（ＢＥＬ抽出物）における最適化されたＦａｂ抗体のＣ３ｂへの結合をＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｍ−ＳＥＲＩＥＳ（登録商標）３８４分析器（BioVeris, Europe, Witney, Oxforfshire, UK）にて分析する。ＢＥＬ抽出物をＢｉｏＶｅｒｉｓスクリーニングにおいて使用するためにアッセイバッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ）に希釈する。ビオチン化Ｃ３ｂをストレプトアビジン被覆常磁性ビーズに結合させ、抗ヒト（Ｆａｂ）’２（Dianova）をＢＶ−ｔａｇＴＭ（BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK）を使用してルテニウム標識した。この二次抗体を、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｍ−ＳＥＲＩＥＳ（登録商標）３８４分析器における測定前に、Ｃ３ｂ結合ビーズに加える。ＢｉｏＶｅｒｉｓスクリーニングからのヒット物の配列分析をＦａｂクローンを同定するために実施する。選択されたＦａｂ抗体をＩｇＧ１フォーマットにサブクローニングする。
【０２１８】
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）を使用するピコモル親和性の測定
ＫＤ測定のために、Ｆａｂのモノマー画分（分析ＳＥＣにより分析された少なくとも９０％モノマー含有；Superdex75, Amersham Pharmacia）を使用する。溶液における電気化学発光（ＥＣＬ）ベース親和性測定およびデータ評価は本質的にHaenel et al., 2005に記載されているとおりに実施することができる。一定量のＦａｂを溶液の異なる濃度（連続３回希釈）のＣ３ｂにて平衡にする。常磁性ビーズ（M-280 Streptavidin, Dynal）に結合したビオチン化Ｃ３ｂおよびＢＶ−ｔａｇＴＭ（BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK）標識抗ヒト（Ｆａｂ）’２（Dianova）を加え、混合物を３０分インキュベートする。次に、非結合Ｆａｂの濃度をＭ−ＳＥＲＩＥＳ（登録商標）３８４分析器（BioVeris Europe）を使用してＥＣＬ検出を介して定量する。
【０２１９】
溶液中の他の種（例えば、チンパンジーまたはカニクイザル）のＣ３ｂに対する親和性測定をヒトＣ３ｂをチンパンジーまたはカニクイザルＣ３ｂと置き換えて、上記の実質的にとおりに行う。遊離Ｆａｂの検出のために、常磁性ビーズに結合したビオチン化Ｃ３ｂを使用する。親和性をHaenel et al. (2005 Anal Biochem 339, 182-184)にしたがって計算する。
【０２２０】
実施例Ｃ  溶血アッセイによる補体タンパク質の検出
房水および硝子体の試料は加齢黄斑変性症を有する患者から得られる。患者は基礎疾患に対して外科手術を受け、試料は眼内外科手術の開始時に得られる。サンプル（１００−２００μｌの房水および２００から３００μｌの硝子体）を不希釈で得て、即座に使用するか、または−８０℃にて保存する。
【０２２１】
房水および硝子体サンプルは正常ヒト患者から得られ、正常ヒト血清と３７℃にて２時間インキュベートする。混合物を、標準ＣＨ５０およびＡＨ５０溶血アッセイを使用して、古典的および副補体経路の阻害に対してアッセイする。これらのアッセイにおいて、正常ヒト血清は正常健康対象から得られ、補体の源として使用し、−８０℃にてアリコートにおいて保存する。正常ヒト血清は、また、当分野において慣用に使用されるマイクロ遠心分離およびゲル濾過カラム後に得られる画分にて処理される。房水および硝子体における全補体活性も測定する。
【０２２２】
ＣＨ５０アッセイ
ＣＨ５０アッセイはKabat, EA. et al Experimental Immunochemistry 1961. pp. 133-239に記載されている。正常ヒト血清を補体の源として使用し、−８０℃にてアリコートにおいて保存する。また、房水および硝子体単独における全補体活性を、標的細胞としてヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）（他の種からの赤血球、例えば、ニワトリ赤血球を使用することができる）を利用して、決定した。懸濁液含有ＳＲＢＣ／ｍｌをＧＶＢ２＋バッファー（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を有するゼラチン／ベロナール緩衝塩水）、ｐＨ７．３５において製造する。溶血素（ウサギ抗ヒツジ抗血清）をＳＲＢＣを感受性にするために最適希釈を測定するために滴定する。希釈された溶血素を等量のＳＲＢＣと混合し、全体を３７℃にて１５分インキュベートする。これは抗体被覆赤血球（ＥＡ）となる。ＥＡを正常ヒト血清の連続２倍希釈物または正常ヒト血清および試験サンプルの混合物の同様の希釈物と３７℃にて１時間インキュベートする。試験サンプルは非分画房水／硝子体、濾液および保存物（マイクロ濃縮後に得られた、サイズ排除カラム後に得られた）として定義される。ＧＶＢ２＋バッファーとインキュベートした正常ヒト血清をコントロールとして使用する。バックグラウンドコントロールをＥＡをバッファー単独（血清を加えていない）とインキュベートすることにより得、全溶解物（１００％溶血）を蒸留水をＥＡに加えることにより測定する。反応を１．２ｍｌの氷冷０．１５ＭのＮａＣｌを使用して停止し、混合物を回転させ、非溶解細胞をペレットにし、上清の光学濃度を分光光度法にて測定する（４１２ｎｍ）。溶血のパーセントを１００％溶解コントロールと比較して決定する。
【０２２３】
補体活性をアッセイ混合物中の５０％の細胞を溶解するために必要な血清希釈物を測定ことにより定量する。この結果は、血清の希釈率の逆数として、ＣＨ５０単位／ｍｌで示される。
【０２２４】
ＡＨ５０アッセイ
ＡＨ５０アッセイを副経路の活性化によりヒト血清によって非感作ウサギ赤血球（Ｅｒａｂ）の溶解に依存するKabat, et alに記載されている標準方法を使用して実施する。カルシウム依存古典的経路の活性化をアッセイバッファーへのカルシウムキレート剤エチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）の添加により防止し、両方の経路のために必要であるマグネシウムをバッファーに加える。ウサギＲＢＣの細胞懸濁液をＧＶＢ−Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡバッファーにおいて製造する。正常ヒト血清の連続１．５倍希釈物または正常ヒト血清および試験サンプルの混合物の同様の希釈物をＧＶＢ−Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡバッファーにおいて製造し、１００μｌのそれぞれの血清希釈物を５０μｌの標準化Ｅｒａｂに加える。ＧＶＢ−Ｍｇ２＋−ＥＧＴＡバッファーにてインキュベートされた正常ヒト血清をコントロールとして使用する。次に混合物を、懸濁液中に細胞を維持するために、振とう水浴中において６０分３７℃にてインキュベートし、１．２ｍｌの氷冷ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）を使用して、反応を停止する。チューブを１２５０ｇで４℃にて１０分回転させ、細胞をペレットにし、上清の光学濃度を分光光度法にて測定する（４１２ｎｍ）。全溶解コントロールチューブにおいて、１００μｌの蒸留水を５０μｌのＥｒａｂ懸濁液に加え、溶血のパーセントを１００％溶解コントロールと比較して決定する。補体活性をアッセイ混合物中の５０％の細胞を溶解するために必要な血清希釈物を測定ことにより定量する。この結果は、血清の希釈率の逆数として、ＡＨ５０単位／ｍｌで示される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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