(57)【要約】  細胞サンプルまたは被験者中の増殖因子経路シグナル伝達のレギュレーション状態を評価するための方法、バイオマーカー及び発現サインが開示されている。より具体的には、本発明の幾つかの態様は、サンプル中の増殖因子経路デレギュレーション状態を評価するために；細胞サンプルをデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類するために；物質がサンプル中の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするかを調べるために；被験者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測するために；被験者に対して治療を割り当てるためにに；及び増殖因子経路シグナル伝達をレギュレートするように設計された癌治療の薬力学的効果を予測し、評価するためにバイオマーカー及び遺伝子サインとして使用され得る遺伝子の集合を提供する。
2011515088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）腫瘍細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の発現レベルからなる第１発現プロファイルと異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも１つ以上有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第１の複数の遺伝子の発現レベルからなるレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ａ及び５ｂにリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されており；
（ｉｉ）第１発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、また第１発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第１発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しており、またレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第１発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しており：
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことからなる単離した細胞サンプルをデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類するための方法。
【請求項２】
（ｉ）ａ）対照細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第２発現レベルに対する細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第１発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、ｂ）第１の複数の遺伝子及び第２の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、ｃ）第１の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第２の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることからなる方法によりサインスコアを計算し；
（ｉｉ）ａ）得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、ｂ）サインスコアが統計上有意であるならば、細胞サンプルはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことを含む単離した細胞サンプルをデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類するための方法。
【請求項３】
第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表９ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表９ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されている請求項２に記載の方法。
【請求項４】
差次的発現値はｌｏｇ（１０）比である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
差次的発現値は１ｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）である請求項２に記載の方法。
【請求項６】
閾値は０である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
０．０５未満のｐ値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項２に記載の方法。
【請求項８】
単離した細胞サンプルはヒト被験者由来である請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
第１の複数はそのバイオマーカーが表５ａ及び５ｂにリストされている少なくとも１０個の遺伝子から構成されている請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第１の複数はそのバイオマーカーが表５ａ及び５ｂにリストされている少なくとも２０個の遺伝子から構成されている請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第１の複数はそのバイオマーカーが表５ａ及び５ｂにリストされている少なくとも５０個の遺伝子から構成されている請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第１の複数はそのバイオマーカーが表５ａにリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されており、第２の複数はそのバイオマーカーが表５ｂにリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されている請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）（ｉ）被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の発現レベルからなる第１発現プロファイルと異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも１つ以上有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第１の複数の遺伝子の発現レベルからなるレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ａ及び５ｂにリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されており；
（ｉｉ）第１発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば細胞サンプルをレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、また第１発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第１発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しており、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第１発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しており；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類することを含み、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対して応答すると予測される被験者を示す前記物質に対する被験者の応答の予測方法。
【請求項１４】
（ｉ）ａ）対照細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第２発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第１発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、ｂ）第１の複数の遺伝子及び第２の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、ｃ）第１の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第２の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得：
（ｉｉ）ａ）得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、ｂ）サインスコアが統計上有意ならば、被験者をデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に応答すると予測される被験者を示す被験者の前記物質に対する応答の予測方法。
【請求項１５】
第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表９ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表９ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されている請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
差次的発現値はｌｏｇ（１０）比である請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
差次的発現値はｌｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）である請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
閾値は０である請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
０．０５未満のｐ値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）ａ）対照細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第２発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第１発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、ｂ）第１の複数の遺伝子及び第２の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、ｃ）第１の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第２の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し；
（ｉｉ）ａ）得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、ｂ）サインスコアが統計上有意であるならば、被験者をデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｂ）被験者がデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類されるならば、該被験者に増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質を割り当て、前記癌患者に有糸分裂抑制剤タイプの物質を割り当てない；
ことを含む被験者への治療の割り当て方法。
【請求項２１】
第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表９ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表９ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されている請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
差次的発現値はｌｏｇ（１０）比である請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
差次的発現値はｌｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）である請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
閾値は０である請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
０．０５未満のｐ値ならばサインスコアは統計上有意である請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）被験者を増殖因子シグナル伝達経路の１つ以上の成分をモジュレートする物質と接触させ；
（ｂ）被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類する；
ことを含む被験者中の増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的活性の測定方法であって、前記分類は
（ｉ）ａ）対照細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第２発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第１発現レベルの差次的発現値を計算し、前記第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのびバイオマーカーが表５ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、ｂ）第１の複数の遺伝子及び第２の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、ｃ）第１の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第２の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し；
（ｉｉ）ａ）得られたサインスコアが所定閾値を下回るならば、ｂ）サインスコアが統計上有意であるならば、被験者はレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことを含み、前記物質での治療を受け且つレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的活性を有する物質を示す前記方法。
【請求項２７】
第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表９ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表９ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されている請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
差次的発現値はｌｏｇ（１０）比である請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
差次的発現値はｌｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）である請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
閾値は０である請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
０．０５未満のｐ値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）被験者を物質と接触させ、
（ｂ）被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類することを含む前記物質が被験者中の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするかを調べる方法であって、前記分類は
（ｉ）ａ）物質と接触していない対照細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第２発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第１発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、ｂ）第１の複数の遺伝子及び第２の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、ｃ）第１の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第２の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減ずることによりサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し；
（ｉｉ）ａ）得られたサインスコアが所定閾値を下回るならば、ｂ）サインスコアが統計上有意ならば、被験者をレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことを含み、物質での治療を受け且つレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路に対する効果を有する物質を示す前記方法。
【請求項３３】
第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表９ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表９ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されている請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
差次的発現値はｌｏｇ（１０）比である請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
差次的発現値はｌｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）である請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
閾値は０である請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
０．０５未満のｐ値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
（ｉ）腫瘍細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の発現レベルからなる第１発現プロファイルと異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも１つ以上有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第１の複数の遺伝子の発現レベルからなるレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１１ａ及び１１ｂにリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されており；
（ｉｉ）第１発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、また第１発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第１発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しており、またレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第１発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しており；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことを含む単離した細胞サンプルをデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類するための方法。
【請求項３９】
（ｉ）ａ）対照細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第２発現レベルに対する細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第１発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１１ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１１ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、ｂ）第１の複数の遺伝子及び第２の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、ｃ）第１の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第２の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し；
（ｉｉ）ａ）得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、ｂ）サインスコアが統計上有意であるならば、細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことを含む単離した細胞サンプルをデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類するための方法。
【請求項４０】
差次的発現値はｌｏｇ（１０）比である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
差次的発現値は１ｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）である請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
閾値は０である請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
０．０５未満のｐ値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
単離した細胞サンプルはヒト被験者由来である請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４５】
第１の複数はそのバイオマーカーが表１１ａ及び１１ｂにリストされている少なくとも１０個の遺伝子から構成されている請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
第１の複数はそのバイオマーカーが表１１ａ及び１１ｂにリストされている少なくとも２０個の遺伝子から構成されている請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
第１の複数はそのバイオマーカーが表１１ａ及び１１ｂにリストされている少なくとも５０個の遺伝子から構成されている請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
第１の複数はそのバイオマーカーが表１１ａにリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されており、第２の複数はそのバイオマーカーが表１１ｂにリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されている請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）（ｉ）被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の発現レベルからなる第１発現プロファイルと異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも１つ以上有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第１の複数の遺伝子の発現レベルからなるレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１１ａ及び１１ｂにリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されており；
（ｉｉ）第１発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば細胞サンプルをレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、また第１発現プロファイルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第１発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有し、またレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第１発現プロファイルはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しており；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対して応答すると予測される被験者を示す被験者の前記物質に対する応答を予測するための方法。
【請求項５０】
（ａ）（ｉ）ａ）対照細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第２発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第１発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１１ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数はそのバイオマーカーが表１１ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、ｂ）第１の複数の遺伝子及び第２の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、ｃ）第１の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第２の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し；
（ｉｉ）ａ）得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、ｂ）サインスコアが統計上有意であるならば、被験者をデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類することを含み、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対して応答すると予測される被験者を示す被験者の前記物質に対する応答を予測するための方法。
【請求項５１】
差次的発現値はｌｏｇ（１０）比である請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
差次的発現値はｌｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）である請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
閾値は０である請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
０．０５未満のｐ値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
（ａ）（ｉ）ａ）対照細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第２発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第１発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１１ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１１ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、ｂ）第１の複数の遺伝子及び第２の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、ｃ）第１の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第２の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得る方法によりサインスコアを計算し；
（ｉｉ）ａ）得られたサインスコアが所定閾値を超えているならば、ｂ）サインスコアが統計上有意であるならば、被験者をデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことにより被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｂ）被験者がデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類されたならば、被験者に増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質を割り当て、前記癌患者に有糸分裂抑制剤タイプの物質を割り当てない；
ことを含む被験者に対する治療の割り当て方法。
【請求項５６】
差次的発現値はｌｏｇ（１０）比である請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
差次的発現値はｌｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）である請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
閾値は０である請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
０．０５未満のｐ値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
（ａ）被験者を増殖因子シグナル伝達経路の１つ以上の成分をモジュレートする物質と接触させ、
（ｂ）被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類することを含む被験者における前記物質の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的活性の測定方法であって、前記分類は
（ｉ）ａ）対照細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第２発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第１発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１１ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１１ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、ｂ）第１の複数の遺伝子及び第２の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、ｃ）第１の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第２の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し；
（ｉｉ）ａ）得られたサインスコアが所定閾値を下回るならば、ｂ）サインスコアが統計上有意であるならば、被験者をレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）で得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことを含み、前記物質の治療を受け且つレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的活性を有する物質を示す前記方法。
【請求項６１】
差次的発現値はｌｏｇ（１０）比である請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
差次的発現値はｌｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）である請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
閾値は０である請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
０．０５未満のｐ値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
（ａ）被験者を増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質と接触させ、
（ｂ）被験者をデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類することを含む前記物質が被験者中の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするかを調べる方法であって、前記分類は
（ｉ）ａ）前記物質と接触していない対照細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第２発現レベルに対する被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の各々及び第２の複数の遺伝子の各々の第１発現レベルの差次的発現値を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１１ａにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、第２の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１１ｂにリストされている少なくとも３個以上の遺伝子から構成されており、ｂ）第１の複数の遺伝子及び第２の複数の遺伝子の発現レベルの平均差次的発現値を計算し、ｃ）第１の複数の遺伝子の平均差次的発現値から第２の複数の遺伝子の平均差次的発現値を減じてサインスコアを得ることを含む方法によりサインスコアを計算し；
（ｉｉ）ａ）得られたサインスコアが所定閾値を下回るならば、ｂ）サインスコアが統計上有意であるならば、被験者をレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことを含み、前記物質の治療を受け且つレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類された被験者は増殖因子シグナル伝達経路に対する効果を有する物質を示す前記方法。
【請求項６６】
差次的発現値はｌｏｇ（１０）比である請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
差次的発現値はｌｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）である請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
閾値は０である請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
０．０５未満のｐ値を有しているならばサインスコアは統計上有意である請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
（ｉ）腫瘍細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の発現レベルからなる第１発現プロファイルと酸素の存在下で有意な解糖活性を有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第１の複数の遺伝子の発現レベルからなる非活性化解糖経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１３にリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されており；
（ｉｉ）第１発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルを非活性化解糖経路を有しているとして分類し、また第１発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルを活性化解糖経路を有しているとして分類し、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第１発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有し、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第１発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しており；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことを含む単離した細胞サンプルを活性化または非活性化解糖経路を有しているとして分類するための方法。
【請求項７１】
単離した細胞サンプルはヒト被験者由来である請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
第１の複数はそのバイオマーカーが表１３にリストされている少なくとも１０個の遺伝子から構成されている請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
第１の複数はそのバイオマーカーが表１３にリストされている少なくとも２０個の遺伝子から構成されている請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
（ａ）（ｉ）被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の発現レベルからなる第１発現プロファイルと酸素の存在下で有意な解糖活性を有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第１の複数の遺伝子の発現レベルからなる非活性化解糖経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１３にリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されており；
（ｉｉ）第１発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば細胞サンプルを非活性化解糖経路を有しているとして分類し、また第１発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば細胞サンプルを活性化解糖経路を有しているとして分類し、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第１発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有しており、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第１発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しており；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことを含むことにより被験者を活性化または非活性化解糖経路を有しているとして分類し、活性化解糖経路を有しているとして分類された被験者は解糖経路をモジュレートする物質に応答すると予測される被験者を示す被験者の前記物質に対する応答を予測するための方法。
【請求項７５】
単離した細胞サンプルはヒト被験者由来である請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
第１の複数はそのバイオマーカーが表１３にリストされている少なくとも１０個の遺伝子から構成されている請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
第１の複数はそのバイオマーカーは表１３にリストされている少なくとも２０個の遺伝子から構成されている請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
（ａ）被験者を解糖経路をモジュレートする物質と接触させ、
（ｂ）被験者を非活性化または活性化解糖経路を有しているとして分類することを含む前記物質が被験者中の解糖経路をモジュレートするかを調べる方法であって、前記分類は
（ｉ）被験者由来の単離した細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の発現レベルからなる第１発現プロファイルと酸素の存在下で有意な解糖活性を有していない複数の対照細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第１の複数の遺伝子の発現レベルからなる非活性化解糖経路テンプレート間の類似度を計算し、前記した第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表１３にリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されており；
（ｉｉ）第１発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有しているならば細胞サンプルを非活性化解糖経路を有しているとして分類し、また第１発現プロファイルが非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しているならば細胞サンプルを活性化解糖経路を有しているとして分類し、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば第１発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して高い類似性を有し、非活性化解糖経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば第１発現プロファイルは非活性化解糖経路テンプレートに対して低い類似性を有しており；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させる；
ことを含み、前記物質の治療を受け且つ非活性化解糖経路を有するとして分類された被験者は解糖経路に対する効果を有する物質を示す前記方法。
【請求項７９】
単離した細胞サンプルはヒト被験者由来である請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
第１の複数はそのバイオマーカーが表１３にリストされている少なくとも１０個の遺伝子から構成されている請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
第１の複数はそのバイオマーカーが表１３にリストされている少なくとも２０個の遺伝子から構成されている請求項７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、全文参照により本明細書に組み入れる配列表を含む。
【背景技術】
【０００２】
治療に最も応答しそうな患者部分集団を同定することは現代分子医学の主要な目的である。この概念は、承認されている及び実験的治療が多数あるために（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇら，２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，３：３０３−３０９）、多くの現在の治療に対する応答率が低いために、第１治療サイクルにおいて最適治療を使用することが臨床上重要であるために（Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，５：１０３−１１０）癌にとって特に重要である。加えて、現在市販されている細胞傷害剤は狭い治療指数及び重大な毒性プロファイルが伴っている結果、正確に応答を予測することが緊急に必要とされている。最近の研究により細胞傷害性化学療法に対する応答に関連する遺伝子発現サインが同定されたが（Ｆｏｌｇｕｅｒｉａら，２００５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１１：７４３４−７４４３；Ａｙｅｒｓら，２００４，２２：２２８４−２２９３；Ｃｈａｎｇら，２００３，Ｌａｎｃｅｔ，３６２：３６２−３６９；Ｒｏｕｚｉｅｒら，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：８３１５−８３２０）、これらの例（及び文献からの他の遺伝子発現サイン）は未確認のままであり、まだ臨床実地に対して大きな効果を有していない。標準の技術的プラットフォームがなく、臨床サンプルの採取を取り巻く困難のような技術的問題に加えて、細胞傷害性化学療法により影響される無数の細胞プロセスがこれらの物質に対する応答の実際的でロバストな遺伝子発現予測子の同定を妨害する恐れがある。１つの例外は、微小管結合タンパク質ＴａｕのｍＲＮＡ発現が低いとパクリタキセルに対する向上した応答が予測されるというマイクロアレイによる最近の所見である（上記のＲｏｕｚｉｅｒら）。
【０００３】
細胞傷害性化学療法に対する限界を改良するために、腫瘍学における薬物設計に対する現在のアプローチは腫瘍増殖及び生存のために重要な特殊な細胞シグナル伝達経路をモジュレートすることを目指している（Ｈａｈｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２：３３１−３４１；Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２０００，Ｃｅｌｌ，１００：５７−７０；Ｔｒｏｓｋｏら，２００４，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０２８：１９２−２０１）。癌細胞において、これらの経路はデレギュレートされるようになり、その結果異常なシグナル伝達、アポトーシスの抑制、より多い転移及びより多い細胞増殖が生ずる（Ａｄｊｅｉ  ａｎｄ  Ｈｉｌｄａｌｇｏ，２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２３：５３８６−５４０３において精査されている）。正常細胞は制御された成長及び増殖のために複数のシグナル伝達経路を統合しているが、腫瘍は１つまたは２つの経路の活性化に頼り切っているようである（“癌遺伝子活性化”）。慢性骨髄性白血病のＢＣＲ−ＡＢＬに対する公知の依存に加えて、上皮増殖因子受容体及びＭＹＣ経路の研究から１つの重要な癌遺伝子の不活化が細胞死または正常表現型を有する細胞への分化が誘導され得ることが判明した（Ｌｙｎｃｈら，２００４，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５０：２１２９−２１３９；Ｐａｅｚら，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０４：１４９７−１５００；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：６３−６４；Ｊａｉｎら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：１０２−１０４；Ｇｏｒｒｅら，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：８７６−８８０；Ｄｒｕｋｅｒら，２００１，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４４：１０３１−１０３７）。異常なシグナル伝達経路の成分は新しい抗癌治療に対する魅力的で選択的な標的に相当する。加えて、標的治療に対する応答者の同定は、特定の経路により“推進される”腫瘍を有している患者は前記経路の成分を標的とする治療に応答することが論理的と思われるので、細胞傷害剤についての同定よりもより達成され得るであろう。従って、我々はいずれの経路がいずれの腫瘍において活性であるかを同定するための方法を開発し、この情報を用いて治療決定を導くことが極めて重大である。これを可能にする１つの方法は経路活性化状態を示す遺伝子発現プロファイルを同定することである。
【０００４】
腫瘍中の経路活性化を評価するための現在の方法は薬物標的、公知の癌遺伝子または公知の腫瘍サプレッサーの測定を含む。しかしながら、１つの経路は複数のポイントで活性化され得、公知の癌関連遺伝子を評価することにより経路活性化を評価することは常に実行可能でない（Ｄｏｗｎａｒｄ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４３９：２７４−２７５）。この状況を説明するために、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ；図１）を介するシグナル伝達を考えたい。この経路は受容体チロシンキナーゼを介して複数の増殖因子により活性化され、細胞増殖及び生存、転移コンピテンス及び治療耐性を含めた複数のプロセスに影響を与える。ＰＩ３Ｋシグナル伝達はしばしばヒト癌において活性化され、多くの製薬会社が１つ以上の経路成分のインヒビターを開発している（Ｈｅｎｎｅｓｓｙら，２００５，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，４：９８８−１００４）。従って、ＰＩ３Ｋ経路活性化を正確に決定することはこうした開発中の新規治療薬に対する潜在的応答者を同定するために重要であろう。
【０００５】
しかしながら、ＰＩ３Ｋ経路は複数のポイントで異常により活性化され得、経路活性を評価することは簡単ではない恐れがある（Ｃｕｌｌｙら，２００６，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，６：１８４−１９２）。例えば、ＰＩ３Ｋそれ自体が癌においてしばしば変異を受けている。ＰＩ３Ｋ体細胞ミスセンス変異はＨＥＲ２増幅ホルモン受容体陽性乳癌で一般的であり、ＰＩ３Ｋ変異／増幅は卵巣癌、胃癌、肺癌、脳腫瘍等で見られる（Ｂａｃｈｍａｎら，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３：７７２−７７５；Ｓａｍｕｅｌｓら，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０４：５５４；Ｃａｍｐｂｅｌｌら，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６４：７６７８−７６８１；Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉら，２００４，Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，１４：３７２−３７７；Ｓｈａｙｅｓｔｅｈら，１９９９，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１：９９−１０２；Ｗｏｅｎｃｋｈａｕｓら，２００２，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９８：３３５−３４２）。加えて、ＲＡＳにおける活性化変異は膵臓癌及び肺癌で起こり（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｙｍａｃｈ，２００４，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０：４２５４−４２５７）、結腸直腸癌における最近の大規模な配列決定プロジェクトによりＰＤＫ１中の新規な珍しい変異が最近同定された（Ｐａｒｓｏｎｓら，２００５，Ｎａｔｕｒｅ，４３６：７９２）。最後に、ＡＫＴ（活性化、増幅）及びＰＴＥＮ（変異、欠失、後成的不活性化）も多くのヒト癌においてデレギュレートされている（Ａｌｔｏｍａｒｅら，２００３，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８８：４７０−４７６；Ｒｕｇｇｅｒｉら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，２１：８１−８６；Ｃｈｅｎｇら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３６３６−３６４１；Ｓｔａａｌら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：５０３４−５０３７；Ｌｉら，２００５，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１１：２８５−２８８；Ｌｉら，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１９４３−１９４７；Ｇｏｅｌら，２００４，６４：３０１４−３０２１）。ＰＩ３Ｋ経路活性化は臨床サンプル中のＰＴＥＮまたはリン酸化ＡＫＴレベルを免疫組織化学的に分析することにより評価され得るが（Ｓｌｉｐｉｃｅｖｉｃら，２００５，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２４：５２８−５３６）、これは経路活性化を調べるための最適方法ではない場合がある。これらのアッセイには免疫組織化学の技術的限界があり、定量的でない。加えて、発癌経路は複雑であり（例えば、ＲＡＳシグナル伝達はＰＩ３Ｋ活性化の一因となる）、よって重要な経路メディエータが少数の十分に特徴づけられている成分のみを試験するだけでは見逃される恐れがある。こうした手段によりＰＩ３Ｋ経路活性化を調べる難しさは、個々の経路成分をばらばらに分析したときに文献に報告されている整合していない結果により反映されている（Ｓａａｌら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６５：２５５４−２５５９；Ｐａｎｉｇｒａｈｉら，２００４，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０４：９３−１００）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇら，２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，３：３０３−３０９
【非特許文献２】Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ，２００５，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，５：１０３−１１０
【非特許文献３】Ｆｏｌｇｕｅｒｉａら，２００５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１１：７４３４−７４４３
【非特許文献４】Ａｙｅｒｓら，２００４，２２：２２８４−２２９３
【非特許文献５】Ｃｈａｎｇら，２００３，Ｌａｎｃｅｔ，３６２：３６２−３６９
【非特許文献６】Ｒｏｕｚｉｅｒら，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：８３１５−８３２０
【非特許文献７】Ｈａｈｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２：３３１−３４１
【非特許文献８】Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２０００，Ｃｅｌｌ，１００：５７−７０
【非特許文献９】Ｔｒｏｓｋｏら，２００４，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０２８：１９２−２０１
【非特許文献１０】Ａｄｊｅｉ  ａｎｄ  Ｈｉｌｄａｌｇｏ，２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２３：５３８６−５４０３
【非特許文献１１】Ｌｙｎｃｈら，２００４，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５０：２１２９−２１３９
【非特許文献１２】Ｐａｅｚら，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０４：１４９７−１５００
【非特許文献１３】Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：６３−６４
【非特許文献１４】Ｊａｉｎら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：１０２−１０４
【非特許文献１５】Ｇｏｒｒｅら，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：８７６−８８０
【非特許文献１６】Ｄｒｕｋｅｒら，２００１，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４４：１０３１−１０３７
【非特許文献１７】Ｄｏｗｎａｒｄ，２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４３９：２７４−２７５
【非特許文献１８】Ｈｅｎｎｅｓｓｙら，２００５，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，４：９８８−１００４
【非特許文献１９】Ｃｕｌｌｙら，２００６，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，６：１８４−１９２
【非特許文献２０】Ｂａｃｈｍａｎら，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３：７７２−７７５
【非特許文献２１】Ｓａｍｕｅｌｓら，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０４：５５４
【非特許文献２２】Ｃａｍｐｂｅｌｌら，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６４：７６７８−７６８１
【非特許文献２３】Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉら，２００４，Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，１４：３７２−３７７
【非特許文献２４】Ｓｈａｙｅｓｔｅｈら，１９９９，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１：９９−１０２
【非特許文献２５】Ｗｏｅｎｃｋｈａｕｓら，２００２，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９８：３３５−３４２
【非特許文献２６】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｙｍａｃｈ，２００４，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０：４２５４−４２５７
【非特許文献２７】Ｐａｒｓｏｎｓら，２００５，Ｎａｔｕｒｅ，４３６：７９２
【非特許文献２８】Ａｌｔｏｍａｒｅら，２００３，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８８：４７０−４７６
【非特許文献２９】Ｒｕｇｇｅｒｉら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，２１：８１−８６
【非特許文献３０】Ｃｈｅｎｇら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３６３６−３６４１
【非特許文献３１】Ｓｔａａｌら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：５０３４−５０３７
【非特許文献３２】Ｌｉら，２００５，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１１：２８５−２８８
【非特許文献３３】Ｌｉら，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１９４３−１９４７；Ｇｏｅｌら，２００４，６４：３０１４−３０２１
【非特許文献３４】Ｇｏｅｌら，２００４，６４：３０１４−３０２１
【非特許文献３５】Ｓｌｉｐｉｃｅｖｉｃら，２００５，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２４：５２８−５３６
【非特許文献３６】Ｓａａｌら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６５：２５５４−２５５９
【非特許文献３７】Ｐａｎｉｇｒａｈｉら，２００４，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０４：９３−１００
【発明の概要】
【０００７】
このような例から、遺伝子発現の同じサインが経路の複数の成分の活性化により引き出され得るので、経路活性化の遺伝子発現サインに基づく読出し情報は経路活性の１つの指標に頼るよりもより適正であり得ることが示唆される。加えて、複数の遺伝子からの発現データを統合することにより経路活性を定量的に評価することが可能であり得る。経路活性化状態を評価することにより腫瘍を分類するために遺伝子発現サインを使用することに加えて、経路活性化についての遺伝子発現サインは薬力学的バイオマーカーとして、すなわち治療後患者腫瘍または末梢組織において経路抑制をモニターする際に；応答予測バイオマーカーとして、すなわち特定経路を標的化するインヒビターで患者を治療する前にその経路活性レベルが高い腫瘍を有している患者を先を見越して同定する際に；及び早期有効性バイオマーカーとして、すなわち有効性を早期に読出す際にも使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＰＩ３Ｋ経路活性化及び遺伝子発現サイン。ＰＩ３Ｋは受容体チロシンキナーゼを介して増殖因子により活性化される。加えて、ＰＩ３ＫはＲＡＳにより活性化され得、これにより他のシグナル伝達カスケードとの混線が生じ得る（データ示さず）。活性化されると、ＰＩ３Ｋはホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）をホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェート（ＰＩＰ３）にリン酸化し、このプロセスはＰＴＥＮにより逆転される。ＰＩＰ３シグナルはキナーゼＰＤＫ１を活性化し、後者はキナーゼＡＫＴを活性化する。このシグナル伝達カスケードは複数の細胞プロセスに影響を及ぼし、経路活性の遺伝子発現“サイン”が生ずる。この経路の活性化は多くの癌に関与し、この活性化は複数の経路成分（ダークグレー）の異常により起こり得る。各種の経路成分の活性化により同一の遺伝子発現プロファイルが生じ得るので、経路活性化のサインは多分単一の公知の癌遺伝子または腫瘍サプレッサーの評価よりもより正確な情報を与えるであろう。
【図２】サイン遺伝子を発見するための出発ポイントとして使用される細胞株。１９個の大腸癌細胞株をＡＫＴ１／２インヒビターＬ−００１１５４５４７に対する感受性について表現型を分類した。３個のより感受性の細胞株（ＨＣＴ−８、ＬｏＶｏ、ＣＯＬＯ２０５；太いダークグレーで示す）及び３個のより耐性の細胞株（ＤＬＤ1、ＨＣＴ1１６、ＨＣＴ１５；太いライトグレーで示す）を処理後発現プロファイリングのために選択した。
【図３】ＡＫＴ1／２の抑制に対して感受性の遺伝子の最初の発見。図３Ａ：より感受性な細胞株とより耐性な細胞株間の処理後変化を比較するＡＮＯＶＡ計算で差次的に発現されるとして同定された遺伝子のＰ値が示されている。１，６００個の遺伝子がｐ＜０．０１で差次的に発現された。図３Ｂ：このデータセットでＩＲＳ２発現とも相関（ｒ＞０．７）していた図３Ａから同定された３９９個の遺伝子のレギュレーションを示す１次元ヒートマップ。発現データはビヒクル処理に対してｌｏｇ１０比で表されている。すべての細胞株が若干程度の細胞死滅を示したので、感受性及び耐性の分類は相対的である。
【図４】ＡＫＴインヒビター誘導プロファイルの分析中に観察されたフィードバック制御。（Ａ）ＥＲＢＢ３、ＩＲＳ1、ＥＲＢＢ２、ＩＮＳＲ、ＩＲＳ２、ＦＧＦＲ1及びＥＧＦＲはすべてＡＫＴ抑制に対して感受性であった細胞株においてＡＫＴ１／２のインヒビターに対する応答においてアップレギュレーション（ｐ＜０．０５）の証拠を示した。発現データはビヒクル治療に対してｌｏｇ１０比で表されている。これらの遺伝子の各々はＡＫＴの上流にあり、各々が増殖因子により活性化されるとＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を活性化することは公知である。（Ｂ）フィードバック制御を観察するための１つの仮説は、ＡＫＴを短期間急激に阻害すると通常ＡＫＴシグナルを中継する分子を大きく変化させることである。応答して、細胞はＡＫＴを介するシグナル伝達を活性化する上流遺伝子の発現をアップレギュレートする。（Ｃ）インビトロ及びインビボでＡＫＴシグナル伝達変化に対して同一方向で応答した遺伝子を同定するために、我々は大腸発現腫瘍アトラスからのデータを再び比率で示して、隣接する正常サンプルに対する各腫瘍毎の遺伝子発現の１つのプロファイルを作り出した。ここで、我々は、インビトロでＡＫＴインヒビターによりダウンレギュレートされたが、隣接正常組織に比して大腸腫瘍でのアップレギュレーションを示した（全データセットで平均で平均ｌｏｇ比＞０．２）遺伝子を示す。
【図５】乳房腫瘍におけるＡＫＴサインスコア。大腸癌細胞株及び大腸腫瘍において同定されたＡＫＴサイン遺伝子を用いて、我々はヒト乳癌データセットにおいてＡＫＴサインスコアを計算した。以下の式を使用した：平均ｌｏｇ比（インビトロでＡＫＴ抑制によりダウンレギュレートされた遺伝子）−平均ｌｏｇ比（インビトロでＡＫＴ抑制によりアップレギュレートされた遺伝子）。（Ａ）ＡＫＴサインスコアは乳房腫瘍アトラスにおいて乳房腫瘍を正常組織と区別し、乳房腫瘍は正常組織に比して平均でより高いＡＫＴ経路活性を示す。加えて、乳房腫瘍ではより大きな範囲のＡＫＴサインスコアが観察される。
【図６】ＡＫＴ及びＭＹＣサインの関係。ＡＫＴ及びＭＹＣサインスコアは（Ａ）大腸腫瘍（ｒ＝０．８１）及び（Ｂ）乳房腫瘍（ｒ＝０．８２）アトラスデータセットにおいて高度に相関している。ＡＫＴサインスコアは先に記載したように計算した。ＭＹＣサインスコアは以下の式を用いて計算した：平均ｌｏｇ比（Ｂｉｌｄら，２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４３９：３５３−３５７のＭＹＣ過剰発現によりアップレギュレートされた遺伝子）−平均ｌｏｇ比（ＢｉｌｄらのＭＹＣ過剰発現によりダウンレギュレートされた遺伝子）。（Ｃ）ＢｉｌｄらのＭＹＣサインはＡＫＴ、ｃＭＥＴ及びＦＧＦＲ２の小分子インヒビターにより抑制されるが、タキソールでもＫＳＰでも抑制されない。マゼンタ長方形はＢｉｌｄらのＭＹＣ過剰発現によりダウンレギュレートされた遺伝子を表し、シアン長方形はＢｉｌｄらのＭＹＣ過剰発現によりアップレギュレートされた遺伝子を表している。ＡＫＴ、ｃＭＥＴまたはＦＧＦＲ２が抑制されると、ＭＹＣ過剰発現により生ずるレギュレーションに比してＭＹＣサイン遺伝子は逆レギュレートされる。実験はヒートマップの左側にリストされている（ＨＣＴ１１６：大腸癌細胞、ＬｏＶｏ：大腸癌細胞、ＧＴＬ−１６：胃癌細胞、ＥＢＣ−Ｉ：肺癌細胞、ＫＡＴＯ  ＩＩＩ：胃癌細胞、ＳＵＭ５２：乳癌細胞）。各実験でプロファイルされた薬物（タキソール）または薬物標的（他のすべて）はヒートマップの右側に沿って示されている。
【図７】γ−セクレターゼを阻害するとＢｉｌｄら（２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４３９：３５３−３５７）のＭＹＣサインが抑制される。１００ｎＭまたは１μＭ濃度の４２１Ｂを用いて３または７日間処理した後Ｔ−ＡＬＬ細胞株をプロファイルした。マゼンタ色の長方形はＢｉｌｄらのＭＹＣ過剰発現によりダウンレギュレートされた遺伝子を表し、シアン色の長方形はＢｉｌｄらのＭＹＣ過剰発現によりアップレギュレートされた遺伝子を表している。γ−セクレターゼを阻害すると、Ｌｏｕｃｙ細胞を除いてＭＹＣ過剰発現により生ずるレギュレーションに比してＭＹＣサイン遺伝子の逆レギュレーションが生ずる。下図は、Ｌｏｕｃｙ細胞はＭＹＣを発現しないことを立証している細胞株アトラスからのデータを示す（ベースラインでのＭＹＣレベルは棒球で示す検出閾値以下である）。よって、この細胞株ではＭＹＣサインの抑制は予想されない。
【図８Ａ】新規ＭＹＣサインの同定。（Ａ）すべてのｃＭＥＴインヒビターＩＣ９０サンプルにおいて少なくとも２倍の変化を示す遺伝子をＩｎｇｅｎｕｉｔｙを用いて分析した。ＭＹＣはデータにより形成される最も有意な相互作用ネットワーク（ｐ＜1×１０−６４）の中央ハブであり、ＭＹＣそれ自体及び２１個の相互作用パートナーが同定された。星印を付けたノードはｃＭＥＴ抑制によりアップレギュレートされ（より低いＭＹＣ活性に関連していることが公知である）、星印のないノードはｃＭＥＴ抑制によりダウンレギュレートされた（より高いＭＹＣ活性に関連していることが公知である）。（Ｂ）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ分析に基づいて構築して、我々は新規なＭＹＣサインを同定するためにＭＹＣシグナル伝達を転写的に活性化または抑制することが公知の１８個の遺伝子に着目した。このヒートマップは、Ｂｉｌｄら（図５Ｃを参照されたい）のように新規ＭＹＣサインは増殖因子シグナル伝達のインヒビターにより抑制されるが、有糸分裂抑制剤により抑制されないことを示している。すべてのアレイに存在する遺伝子モデルのみを示している。実験はヒートマップの左側にリストされている。各実験においてプロファイルした薬物（タキソール）または薬物標的（他のすべて）はヒートマップの右側に沿って示されている。
【図８Ｂ】新規ＭＹＣサインの同定。（Ａ）すべてのｃＭＥＴインヒビターＩＣ９０サンプルにおいて少なくとも２倍の変化を示す遺伝子をＩｎｇｅｎｕｉｔｙを用いて分析した。ＭＹＣはデータにより形成される最も有意な相互作用ネットワーク（ｐ＜1×１０−６４）の中央ハブであり、ＭＹＣそれ自体及び２１個の相互作用パートナーが同定された。星印を付けたノードはｃＭＥＴ抑制によりアップレギュレートされ（より低いＭＹＣ活性に関連していることが公知である）、星印のないノードはｃＭＥＴ抑制によりダウンレギュレートされた（より高いＭＹＣ活性に関連していることが公知である）。（Ｂ）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ分析に基づいて構築して、我々は新規なＭＹＣサインを同定するためにＭＹＣシグナル伝達を転写的に活性化または抑制することが公知の１８個の遺伝子に着目した。このヒートマップは、Ｂｉｌｄら（図５Ｃを参照されたい）のように新規ＭＹＣサインは増殖因子シグナル伝達のインヒビターにより抑制されるが、有糸分裂抑制剤により抑制されないことを示している。すべてのアレイに存在する遺伝子モデルのみを示している。実験はヒートマップの左側にリストされている。各実験においてプロファイルした薬物（タキソール）または薬物標的（他のすべて）はヒートマップの右側に沿って示されている。
【図９】増殖因子経路インヒビターに対する増殖因子による増殖因子シグナル伝達経路サインの逆レギュレーション。表５にリストされている遺伝子はＹ軸に沿って示されており、各種処理はＸ軸に沿ってリストされている。薬物処理／薬物標的は左側に沿ってリストされており、機能分類は右側に沿ってリストされている。有糸分裂インヒビターは増殖因子シグナル伝達遺伝子の一定のレギュレーションを示さないのに対して、増殖因子経路インヒビターは実施例に記載されているようにロバストなレギュレーションを示す。増殖因子の概要から、我々はヘレグリン（Ｅｒｂｂファミリー受容体に結合し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を活性化する増殖因子）で処理した大腸（ＨＴ２９）及び乳房（ＭＣＦ７）細胞のデータを示す。細胞をヘレグリンで０．５、２、６、１８または２４時間処理した。増殖因子シグナル伝達のインヒビターによるレギュレーションと比較して両方の細胞株におけるヘレグリンによるサイン遺伝子の逆レギュレーションに注目されたい。
【図１０】複数の介入による同一サインの一定のレギュレーションの根底をなす考えられるメカニズム。細胞表面受容体（Ｍｅｔ、ＦＧＦＲ２、ＩＧＦ１Ｒ及びＮｏｔｃｈ）間のリンクを示し、裏付け文献も示されている。増殖因子受容体及びＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）はいずれもＰＩ３Ｋ／ＡＫＴを介するシグナル伝達を活性化する。こうすると、（他の考えられるリンクの中で）ＧＳＫ３Ｂの活性及びフォークヘッド転写因子のレギュレーションによりＭＹＣが活性化される。フォークヘッド転写因子ＭＬＬＴ７並びにフォークヘッド標的ＨＢＰｌ及びＢＣＬ６はすべてのＭＹＣサインの一部である（実施例３を参照されたい）（ＭＹＣシグナル伝達が抑制されるとアップレギュレートされる）。従って、増殖因子シグナル伝達カスケードに沿った複数のポイントでの介入が最高になり得、いったんシグナルが核に中継されると遺伝子発現の類似パターンが生ずる。
【図１１Ａ】ｏｎｃｏｔｅｓｔ腫瘍に対するＣＦＵアッセイ。１４個の腫瘍株をコロニー形成アッセイにおいてｃＭＥＴインヒビターＭＫ−２４６１に対する感受性について試験した。Ａ）ｃＭＥＴ  ｍＲＮＡ発現をＭＫ−２４６１に対する応答を予測する能力について試験した。ＭＫ−２４６１処理に対して最も感受性の腫瘍はｃＭＥＴの低い発現を有していた。Ｂ）増殖因子シグナル伝達経路サインをＭＫ−２４６１に対する応答を予測する能力についても試験した。最も感受性の腫瘍は最高のベースライン増殖因子シグナル伝達経路サインスコアを有していた。これらのデータから、増殖因子シグナル伝達経路サインがｃＭＥＴのｍＲＮＡ発現よりもＭＫ−２４６１感受性のより良い予測子であること及びサインはＭＫ−２４６１による治療に対する応答を予測するために使用され得ることが示唆される。
【図１１Ｂ】ｏｎｃｏｔｅｓｔ腫瘍に対するＣＦＵアッセイ。１４個の腫瘍株をコロニー形成アッセイにおいてｃＭＥＴインヒビターＭＫ−２４６１に対する感受性について試験した。Ａ）ｃＭＥＴ  ｍＲＮＡ発現をＭＫ−２４６１に対する応答を予測する能力について試験した。ＭＫ−２４６１処理に対して最も感受性の腫瘍はｃＭＥＴの低い発現を有していた。Ｂ）増殖因子シグナル伝達経路サインをＭＫ−２４６１に対する応答を予測する能力についても試験した。最も感受性の腫瘍は最高のベースライン増殖因子シグナル伝達経路サインスコアを有していた。これらのデータから、増殖因子シグナル伝達経路サインがｃＭＥＴのｍＲＮＡ発現よりもＭＫ−２４６１感受性のより良い予測子であること及びサインはＭＫ−２４６１による治療に対する応答を予測するために使用され得ることが示唆される。
【図１２】細胞株におけるｃＭＥＴインヒビターＭＫ−２４６１についての早期有効性実験。増殖因子シグナル伝達経路サインの抑制がＥＢＣ−Ｉ及びＧＴＬ−１６の２つの細胞株において観察された。これらの２つの細胞株がＭＫ−２４６１での抑制に対して感受性のアッセイにおいて唯一のものであり、このことから増殖因子シグナル伝達経路サインが有効性の早期読出し情報として使用され得ることが示唆される。
【図１３】異種移植片におけるｃＭＥＴインヒビターＭＫ−２４６１についての初期有効性実験。増殖因子シグナル伝達経路サインの抑制が１１２ｍｐｋでのみ観察された。アッセイした各種用量の中で、１１２ｍｐｋが有効な結果をもたらした唯一の用量であり、このことから増殖因子シグナル伝達経路サインが有効性の早期読出し情報として使用され得ることが示唆される。
【図１４Ａ】Ｍａｙｏ  Ｂｒｅａｓｔデータセットにおける増殖因子経路シグナル伝達サインのコヒーレンス及び細分についての試験。Ａ）このパネルはコヒーレンス試験の結果を示している。サインの“アップ”及び“ダウン”腕は１つの腕内で有意に相関し、腕間で反相関している。Ｂ）“アップ”（赤色）及び“ダウン”  （青色）腕はヒートマップにおいて離れてクラスター化している。Ｃ）サインの“アップ”及び“ダウン”腕の散布図。“アップ”及び“ダウン”腕の有意性スコアは有意に反相関している。
【図１４Ｂ】Ｍａｙｏ  Ｂｒｅａｓｔデータセットにおける増殖因子経路シグナル伝達サインのコヒーレンス及び細分についての試験。Ａ）このパネルはコヒーレンス試験の結果を示している。サインの“アップ”及び“ダウン”腕は１つの腕内で有意に相関し、腕間で反相関している。Ｂ）“アップ”（赤色）及び“ダウン”  （青色）腕はヒートマップにおいて離れてクラスター化している。Ｃ）サインの“アップ”及び“ダウン”腕の散布図。“アップ”及び“ダウン”腕の有意性スコアは有意に反相関している。
【図１４Ｃ】Ｍａｙｏ  Ｂｒｅａｓｔデータセットにおける増殖因子経路シグナル伝達サインのコヒーレンス及び細分についての試験。Ａ）このパネルはコヒーレンス試験の結果を示している。サインの“アップ”及び“ダウン”腕は１つの腕内で有意に相関し、腕間で反相関している。Ｂ）“アップ”（赤色）及び“ダウン”  （青色）腕はヒートマップにおいて離れてクラスター化している。Ｃ）サインの“アップ”及び“ダウン”腕の散布図。“アップ”及び“ダウン”腕の有意性スコアは有意に反相関している。
【図１５Ａ】Ｍａｙｏ  Ｂｒｅａｓｔデータセットにおける増殖因子経路シグナル伝達サインの細分。Ａ）このパネルはコヒーレンス試験の結果を示している。サインの“アップ”及び“ダウン”腕はサインを細分した（相関／反相関の正しくないサインを示した遺伝子を除去した）後、１つの腕内で有意に相関し、腕間で有意に反相関している。Ｂ）アップ及びダウン分枝の区別を示す細分したサインのヒートマップ。Ｃ）細分後のサインのアップ”及び“ダウン”腕の散布図。細分後、“アップ”及び“ダウン”腕はより有意に反相関している。
【図１５Ｂ】Ｍａｙｏ  Ｂｒｅａｓｔデータセットにおける増殖因子経路シグナル伝達サインの細分。Ａ）このパネルはコヒーレンス試験の結果を示している。サインの“アップ”及び“ダウン”腕はサインを細分した（相関／反相関の正しくないサインを示した遺伝子を除去した）後、１つの腕内で有意に相関し、腕間で有意に反相関している。Ｂ）アップ及びダウン分枝の区別を示す細分したサインのヒートマップ。Ｃ）細分後のサインのアップ”及び“ダウン”腕の散布図。細分後、“アップ”及び“ダウン”腕はより有意に反相関している。
【図１５Ｃ】Ｍａｙｏ  Ｂｒｅａｓｔデータセットにおける増殖因子経路シグナル伝達サインの細分。Ａ）このパネルはコヒーレンス試験の結果を示している。サインの“アップ”及び“ダウン”腕はサインを細分した（相関／反相関の正しくないサインを示した遺伝子を除去した）後、１つの腕内で有意に相関し、腕間で有意に反相関している。Ｂ）アップ及びダウン分枝の区別を示す細分したサインのヒートマップ。Ｃ）細分後のサインのアップ”及び“ダウン”腕の散布図。細分後、“アップ”及び“ダウン”腕はより有意に反相関している。
【図１６】コアＦＦＰＥ細分サインの“アップ”及び“ダウン”腕間の差の有意性をコルモゴルフ−スミルノフ検定を用いて試験した。点線はα＝０．０５有意性で引く。
【図１７】乳房腫瘍、肺腫瘍及び卵巣腫瘍からのＭａｙｏ  ＦＦＰＥデータセットで試験したサインのアップ−ダウン腕の差の有意性を検出するためのコルモゴルフ−スミルノフ、ステューデントのｔ検定及びウィルコクソン順位和検定の同値性。
【図１８】サイン翻訳のために開発された戦略の全体的記述。
【図１９】開発した各アッセイ毎のＰＣＲ有効性のヒストグラム。
【図２０】１２０個のＦＦＰＥサンプルで１０個のランダムに選択したアッセイについての発現データ。試験１＝増殖因子シグナル伝達経路サイン。ＤＯＷＮは遺伝子がサインのダウン腕に由来したことを示している。各アッセイ毎にダイナミック範囲及び要約統計量を示している。
【図２１】増殖因子シグナル伝達経路サイン遺伝子について作成した相関行列。この相関行列は、増殖因子シグナル伝達経路遺伝子の部分集合に対して１２０個のＦＦＰＥ腫瘍サンプルでアップ腕内及びダウン腕内の相関、並びにアップ及びダウン腕間の反相関を示している。Ｒｈｏ＝ピアソン相関係数。
【図２２】１２０個のＦＦＰＥ腫瘍サンプルでの５つの潜在的ノーマライザー遺伝子の発現変動。上図は各腫瘍サンプル毎に３回測定値の平均Ｃｔ値を示している。下図は各腫瘍型中の各遺伝子毎の変動係数を示している。腫瘍型で＜３％  Ｃｖを有する遺伝子が強調されている。発現の変動及びレベルが低いことから、ＮＵＰ２１４、ＳＡＦＢ及びＰＲＰＦ８を増殖因子シグナル伝達経路サインに対する我々のノーマライザーとして選択した。
【図２３】ＦＦＰＥ卵巣腫瘍サンプルにおいてマイクロアレイまたはｑＰＣＲにより作成したサインスコアの比較。
【図２４】増殖因子刺激によりレギュレートされた遺伝子。ＭＣＦ７またはＨＴ２９細胞株をＥＧＦ、ＩＧＦ、インスリン、ｂ−ＦＧＦまたはヘレグリンで０．５、２、６、１２または２４時間処理した。ヒートマップには増殖因子及びビヒクルで処理したサンプル間でｐ＜０．００１で差次的に発現した約４，５００個の遺伝子が示されている。マゼンタ色の遺伝子は増殖因子刺激によりアップレギュレートされ、シアン色の遺伝子は増殖因子刺激によりダウンレギュレートされた。カラーバーはビヒクルと比較した変化についてのｌｏｇ（１０）比を表している。
【図２５Ａ】ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、インスリンまたはヘレグリンは類似の遺伝子発現変化を誘導する。Ａ）ＭＣＦ７及びＨＴ２９ヒト癌細胞株において投与から０．５、２、６、１２または２４時間目の増殖因子の各々により誘導される変化はアップレギュレートされた傾斜パターンと相関していた。Ｙ軸は遺伝子の数を表し、Ｘ軸はビヒクルと比較した発現のｌｏｇ（１０）比を表している。第１列はＥＧＦにより、第２列はＦＧＦにより、第３列はＩＧＦ１により、第４列はインスリンにより、第５列はヘレグリンによりアップレギュレートされている遺伝子のみを示している。第１行はＥＧＦにより、第２行はＦＧＦにより、第３行はＩＧＦ1により、第４行はインスリンにより、第５行はヘレグリンにより刺激したとき、列に従ってフィルターにかけた遺伝子がどのように挙動するかを示している。１つの増殖因子によりアップレギュレートされる遺伝子は他の増殖因子によってもアップレギュレートされる。Ｂ）１つの増殖因子によりダウンレギュレートされる遺伝子は他の増殖因子によってもダウンレギュレートされる。
【図２５Ｂ】ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、インスリンまたはヘレグリンは類似の遺伝子発現変化を誘導する。Ａ）ＭＣＦ７及びＨＴ２９ヒト癌細胞株において投与から０．５、２、６、１２または２４時間目の増殖因子の各々により誘導される変化はアップレギュレートされた傾斜パターンと相関していた。Ｙ軸は遺伝子の数を表し、Ｘ軸はビヒクルと比較した発現のｌｏｇ（１０）比を表している。第１列はＥＧＦにより、第２列はＦＧＦにより、第３列はＩＧＦ１により、第４列はインスリンにより、第５列はヘレグリンによりアップレギュレートされている遺伝子のみを示している。第１行はＥＧＦにより、第２行はＦＧＦにより、第３行はＩＧＦ1により、第４行はインスリンにより、第５行はヘレグリンにより刺激したとき、列に従ってフィルターにかけた遺伝子がどのように挙動するかを示している。１つの増殖因子によりアップレギュレートされる遺伝子は他の増殖因子によってもアップレギュレートされる。Ｂ）１つの増殖因子によりダウンレギュレートされる遺伝子は他の増殖因子によってもダウンレギュレートされる。
【図２６】Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ分析を用いて評価した増殖因子サインが濃縮された標準的経路。この経路は増殖因子処理によりアップまたはダウンレギュレートされた遺伝子内で有意に（ｐ＜０．０５）濃縮された。Ｙ軸は濃縮に対する負のｌｏｇ（1０）ｐ値を示している。経路はＸ軸に沿って示されている。点線はｐ＝０．０５を表す。
【図２７】増殖因子サインはＨＴ−２９及びＭＣＦ−７細胞株の両方においてロバストにレギュレートされている。マゼンタ色の遺伝子は増殖因子刺激によりアップレギュレートされたのに対して、シアン色の遺伝子は増殖因子刺激によりダウンレギュレートされた。カラーバーはビヒクルと比較した変化のｌｏｇ（１０）比を表している。
【図２８】ｃ−ＭＹＣの活性化、増殖及び増殖因子サインの時間的パターン。細胞株及び増殖因子で各サインスコアを計算し、平均化した。Ｙ軸はサインスコアを表し、Ｘ軸は増殖因子添加後の時点を表す。エラーバーは標準偏差を表す。ｃ−ＭＹＣ及び増殖サインとは対照的に、増殖因子サインは２時間で誘導され、２４時間を通じて有意に誘導されたままである。
【図２９】増殖因子により誘導された負のフィードバック。示したデータは（Ａ）ＥＧＦＲ、（Ｂ）ＥＲＢＢ３、（Ｃ）ＩＮＳＲ、または（Ｄ）異常ＰＴＥＮ活性の最近公表されたサインのｍＲＮＡ発現に対する各増殖因子の影響を表している。Ｙ軸はビヒクルと比較した発現のｌｏｇ（1０）比を表す。各図の左半分はＭＣＦ７細胞についてのデータ、右半分はＨＴ２９細胞についてのデータを示している。Ｘ軸は増殖因子添加後の時点を表す。
【図３０】連結性マップデータセットにおけるサインレギュレーション。連結性マップデータセット中の化合物の増殖因子サイン、増殖サイン及びｃ−ＭＹＣサインに対する効果を評価した。各サイン毎に、各行は１つの化合物処理を表す。処理は各サインに対するその効果に従って順位付けされている。赤色の行はサインをアップレギュレートする処理、灰色の行は有意な効果を有していない処理を表し、緑色の行はサインをダウンレギュレートする処理を表す。興味深い３つの化合物が強調されている：黄色＝ＬＹ−２９４００２；青色＝シロリムス；黒色＝ワートマニン。
【図３１】ＡＫＴ1の小分子インヒビターは増殖因子サインのダウンレギュレーションを引き起こした。ＡＫＴ1の小分子インヒビターをＬｏＶｏ細胞株に４または２４時間添加した。データは時間照合ビヒクルに対するｌｏｇ（１０）比として表した。
【図３２】乳癌サブタイプでの（Ａ）増殖因子サイン、（Ｂ）ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ、（Ｃ）異常ＰＴＥＮサイン、及び（Ｄ）ＥＲＢＢ３  ｍＲＮＡ発現の分布。各図において、Ｙ軸は平均センタリングしたデータにおけるサインスコア（Ａ及びＣ）または１つの遺伝子のｌｏｇ（１０）発現（Ｂ及びＤ）を表す。Ｘ軸は平均センタリングしたデータにおけるＥＲＢＢ２のｌｏｇ（1０）遺伝子発現を表す。Ｘ及びＹ軸の点線はすべての乳房腫瘍サンプルの平均を表す。従って、ＥＲＢＢ２発現＞０を有するサンプルはＥＲＢＢ２高と見なされ得、ＥＲＢＢ２発現＜０を有するサンプルはＥＲＢＢ２低と見なされ得る。ＥＲ状態はＥＳＲ１遺伝子の発現に基づき、ＥＲ状態コールは既報のように実施した（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒら，２００２，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４７：１９９９−２００９）。白丸はＥＲ陽性腫瘍を表し、黒丸はＥＲ陰性腫瘍を表す。
【図３３】乳癌サブセットにおける増殖及び解糖サイン。Ｙ軸は増殖サインスコアを表し、Ｘ軸は解糖サインスコアを表す。ライトグレー色の丸はＨＥＲ２＋乳房腫瘍（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒら，２００２，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４７：１９９９−２００９における平均よりも高いＥＲＢＢ２  ｍＲＮＡ発現を有する乳房腫瘍と定義される）を表す。ダークグレー色の丸は“トリプルネガティブ”  乳房腫瘍（上掲したＶａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒらにおける平均を下回るＥＲＢＢ２  ｍＲＮＡ発現を有するＥＲ及びＰＲ陰性乳房腫瘍と定義される）を表す。
【図３４】解糖サインは増殖因子治療によりアップレギュレートされる。発現が解糖と明確に相関している遺伝子のみを示す。マゼンタ色の遺伝子は増殖因子刺激によりアップレギュレートされ、シアン色の遺伝子は増殖因子刺激によりダウンレギュレートされた。カラーバーはビヒクルと比較した変化についてのｌｏｇ（１０）比を表している。
【図３５】ＩＧＦ１Ｒ化合物ＭＫ−０６４６による増殖因子経路サイン変化の程度対腫瘍異種移植片増殖抑制の大きさ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本セクションは、本明細書中に開示されている本発明の代表的な多くの各種態様及び実施形態を詳細に記載する。この記載は詳細及び具体性を変えた幾つかの例示的説明にすぎない。これらの実施形態の他の特徴及び作用効果はいろいろな実施例を含めた本明細書中に与えられている追加の記載から明白である。提示されている例は本発明の各種実施形態を実施する際に有用な各種成分及び手法を説明している。これらの例は特許請求されている発明を限定すると、意図されない。本明細書の開示内容に基づいて、当業者は本発明を実施するために有用な他の成分及び手法を同定し、使用することができる。
【００１０】
３．１  序論
本発明の各種実施形態は、その発現パターンが癌細胞の重要な特徴、すなわち増殖因子（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達経路のデレギュレーションに相関している遺伝子バイオマーカーの集合に関する。幾つかの実施形態では、これらのバイオマーカーの集合は２つの対立する“腕”（表５ａ及び５ｂ、表９、表１１を参照されたい）、すなわち増殖因子（ＰＩ３Ｋ）経路を介するシグナル伝達が増加するにつれてアップレギュレートされる遺伝子である“アップ”腕及びダウンレギュレートされる遺伝子である“ダウン”腕に分けられ得る。より具体的には、本発明の幾つかの態様は、その発現が患者の腫瘍細胞サンプルの増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーション状態に相関し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍を、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍から分類するために使用され得る、遺伝子バイオマーカーの集合を提供する。増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態は、患者が増殖因子シグナル伝達経路のインヒビターのようなある治療薬に応答する可能性の有用な指標である。治療薬には、ＰＩ３ＫインヒビターのＬＹ２４９００２、ワートマニン及びＰＸ−８６６；ＡＫＴインヒビターの１７−ＡＡＧ、ＰＸ３１６、ミルテホシン及びペリホシン；ｍＴＯＲインヒビターのラパマイシン、ＣＣＩ１７７９、デフォロリムスＧａｕｄ  Ｒａｄ００1（Ｈｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，２００６，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，１８：２０８９−２０９７；Ｈｅｎｎｅｓｓｙら，２００５，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．，４：９８８−１００４において精査されている）、並びにＩＧＦ1Ｒモノクローナル抗体ＭＫ−０６４６（Ｕ．Ｓ．特許７，２４１，４４４）が含まれるが、これらに限定されない。また、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有している腫瘍は有糸分裂抑制剤タイプの治療薬（例えば、タキソール、ＫＳＰインヒビター、チューブリンインヒビター、キネシンインヒビター、キナーゼ阻害剤）に対して非常に低い応答を示す。本発明の１つの態様で、増殖因子シグナル伝達経路のインヒビターに応答するであろう患者群（予測される応答者）と増殖因子シグナル伝達経路のインヒビターに応答しないであろう患者群（予測される非応答者）を区別し、治療の一般的な方針を決定するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明の別の態様は、その発現が癌を有している被験者中の増殖因子シグナル伝達経路に対する治療薬の薬力学的効果に相関しているバイオマーカーに関する。本発明の更に他の態様では、癌を有している被験者中の増殖因子シグナル伝達経路に対する治療薬の薬力学的効果を調べるための上記バイオマーカーの使用方法及び増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするために治療薬の有効性を順位付けるための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。これらのバイオマーカーを含むマイクロアレイ及び前記マイクロアレイの構築方法も提供する。バイオマーカーの各々はヒトゲノム中の遺伝子に対応し、すなわち前記バイオマーカーは遺伝子の全部または一部として同定され得る。最後に、上記バイオマーカーの各々が癌関連状態に相関しているために、バイオマーカーまたは該バイオマーカーがコードするタンパク質は癌に対する薬物の標的になるであろう。
【００１１】
本発明の他の実施形態では、その発現パターンが癌細胞の別の重要な特徴、すなわちより多くの解糖に相関している遺伝子バイオマーカーの集合（表１３）に関する。より具体的には、本発明の幾つかの態様は、その発現が解糖経路活性に相関し且つ高い解糖経路活性を有する腫瘍を高い解糖経路活性を有していない腫瘍または正常細胞サンプルから分類するために使用され得る遺伝子バイオマーカーの集合に関する。高い解糖経路活性は原発性及び転移性癌のほぼ一般的な特性であり、腫瘍を正常細胞サンプルから分類するために使用され得、患者が解糖経路のインヒビターのようなある治療薬に対して応答するであろう可能性の有用な指標であり得る。治療薬にはヘキソキナーゼ阻害剤ロニダミン、３−ブロモピルベート；グルコースアナログ２−デオキシグルコース；イマチニブ；ホスホフルクトキナーゼ阻害剤；ピルベートキナーゼ阻害剤；ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ阻害剤；オキシチアミン；ゲニステイン；５−チオグルコース；マンノヘプツロース；α−クロロヒドリン；オルニダゾール；グルフォスファミド；ヒ素化合物；オキサメート；ヨードアセテート；ビスホスホネート；ツベルシジン；並びにＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼポンプインヒビター（Ｌｏｐｅｚ−Ｌａｚａｒｏ，２００８，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８：３０５−３１２において精査されている）が含まれるが、これらに限定されない。解糖経路バイオマーカーは、患者が増殖因子シグナル伝達経路のインヒビターに応答するであろう可能性の有用な指標でもあり得る。本発明の１つの態様で、解糖経路のインヒビターに応答するであろう患者群（予測される応答者）と解糖経路のインヒビターに応答しないであろう患者群（予測される非応答者）を区別し、治療の一般的方針を決定するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明の別の態様は、その発現が癌を有している被験者中の解糖経路に対する治療薬の薬力学的効果に相関しているバイオマーカーに関する。本発明の更に他の態様で、癌を有している被験者中の解糖経路に対する治療薬の薬力学的効果を調べるための上記バイオマーカーの使用方法及び解糖経路をモジュレートするために治療薬の有効性を順位付けるための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。これらのバイオマーカーを含むマイクロアレイ及び前記マイクロアレイの構築方法も提供する。バイオマーカーの各々はヒトゲノム中の遺伝子に対応し、すなわち前記バイオマーカーは遺伝子の全部または一部として同定され得る。最後に、上記バイオマーカーの各々が癌関連状態に相関しているために、バイオマーカーまたは該バイオマーカーがコードするタンパク質は癌に対する薬物の標的になるであろう。
【００１２】
３．２  定義
他の方法で定義されていない限り、本明細書中で使用されている技術用語及び科学用語のすべては本発明が属する業界の当業者が通常理解しているのと同じ意味を有している。
【００１３】
本明細書中で使用されている場合、本明細書中に記載されている１個以上の遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを指す。ハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドは典型的にはヌクレオチドレベルで遺伝子に対して少なくとも約７５％の配列同一性、好ましくは約８０％または８５％の配列同一性、より好ましくは約９０％または９５％、或いはそれ以上の配列同一性を示す。
【００１４】
「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、標的ポリヌクレオチド配列の所望する検出を達成するためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低下させることにより調節され得るマイナーミスマッチも包含する。
【００１５】
フレーズ「に対して特異的にハイブリダイズする」は、配列が複合混合物（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在するとき分子がストリンジェントな条件下で１つ以上の特定のヌクレオチド配列に対して実質的または部分的に結合、二重鎖形成またはハイブリダイズすることを指す。
【００１６】
「バイオマーカー」は、その発現または発現レベルがある条件下で変化する遺伝子、タンパク質、または前記遺伝子由来のＥＳＴを意味する。遺伝子の発現がある条件に相関している場合、その遺伝子は当該条件に対するバイオマーカーである。
【００１７】
「バイオマーカー誘導ポリヌクレオチド」は、バイオマーカー遺伝子から転写されたＲＮＡ、そこから産生されるｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ、並びにそこから誘導される核酸（例えば、バイオマーカー遺伝子に対応する遺伝子に由来する配列を有する合成核酸）を意味する。
【００１８】
遺伝子マーカーは、遺伝子マーカーの発現が偶然予想される以上に状態、表現型、遺伝子型または臨床的特徴に相関または反相関しているならば、前記した状態、表現型、遺伝子型または臨床的特徴についての「情報」を与える。
【００１９】
本明細書中で使用されている用語「遺伝子」は当業界で理解されている意味を有している。しかしながら、用語「遺伝子」が遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー等）及び／またはイントロン配列を含み得ることは当業者に自明であろう。更に、遺伝子の定義がタンパク質をコードせず、むしろｔＲＮＡのような機能性ＲＮＡ分子をコードする核酸への言及を含むことも明白である。明瞭とするために、用語「遺伝子」は一般的にはタンパク質をコードする核酸の一部を指す。この用語は場合により調節配列を包含し得る。この定義は、用語「遺伝子」の非タンパク質コード化発現単位への適用を排除することを意図せず、むしろ多くの場合本明細書中で使用されているこの用語はタンパク質コード化核酸を指すことを明瞭とすることを意図する。幾つかの場合には、遺伝子は転写、またはメッセージ作成または組成に関与する調節配列を含む。他の実施形態では、遺伝子はタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする転写配列を含む。本明細書中に記載されている学術用語と合わせると、「単離遺伝子」は、他の天然に存在する遺伝子、調節配列、ポリペプチドまたはペプチドコード配列等のような他の配列から実質的に単離された転写核酸、調節配列、コード配列等を含み得る。この点で、用語「遺伝子」はわかりやすくするために転写されたヌクレオチド配列からなる核酸及びその相補体を指すために使用されている。特定実施形態では、転写されたヌクレオチド配列は少なくとも１つの機能性タンパク質、ポリペプチド及び／またはペプチドコード単位を含む。当業者が理解しているように、この機能的用語「遺伝子」はゲノム配列、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列、或いは遺伝子の非転写部分の核酸セグメントを含めたより小さな工学処理した核酸セグメントを含む。前記した遺伝子の非転写部分には遺伝子の非転写プロモーターまたはエンハンサー領域を含むが、これらに限定されない。より小さな工学処理した遺伝子核酸セグメントは核酸操作技術、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、変異体及び／またはその他を用いて発現し得、または発現するように改変され得る。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は５’非翻訳配列（“５’ＵＴＲ”）と称される。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は３’非翻訳配列または（“３’ＵＴＲ”）と称される。
【００２０】
「有糸分裂インヒビター」は、有糸分裂を抑制する薬物または物質を指す。有糸分裂インヒビターは２つのクラスに分けられ得る。１つのクラスには微小管動態をモジュレートする物質が含まれる。これらの物質はチューブリンに可逆的に結合し、微小管組立及び分解を防止し得る。第２のクラスには、有糸分裂キネシン、キナーゼ、セパラーゼ等のような特定の細胞内標的と相互作用することにより有糸分裂事象を代理で調節する非チューブリン結合物質が含まれる。有糸分裂インヒビターの例は当業界で公知であり、その中にはチューブリンインヒビター（例えば、タキサン、エポチロン、ビンカアルカロイド、コンブレタスタチン、エレウテロビン）；キネシンインヒビター（例えば、モナストロール、エナストロン、エナストロール、ＶＳ−８３、スルホキノボシルアシルグリセロ−ル、イスピネシブ、アドシアスルファート−２）；有糸分裂キナーゼ阻害剤（例えば、ＰＬＫ1インヒビターのワートマニン、スキトネミン、スタウロスポリン、ＯＮ−０１９０１０、ＢＩ−２５３６）；オーロラキナーゼ阻害剤（ＶＸ−６８０、ＭＬＮ−８０５４、ＰＨＡ−６８０６３２、ＰＨＡ−７３９３５８、ＡＺＤ−１１５２、ＶＸ−５２８、ＭＰ−２３５、ヘスペラジン、ＺＭ−４４７４３９）；及びセパラーゼ阻害剤（Ｉｖａｃｈｔｃｈｅｎｋｏら，２００７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，７：７６６−７８４において精査されている）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
「サイン」は差次的発現パターンを指す。ｃＲＮＡ産物をマイクロアレイ分析において使用するときその発現が検出される個々のユニークなプローブの数として表示され得る。サインはバイオマーカーの特定集合により例示され得る。
【００２２】
「類似値」は比較する２つの事柄の類似度を表す値である。例えば、類似値は、特定の表現型関連バイオマーカーを用いる細胞サンプル発現プロファイルとそのテンプレートに特異的な対照間の全体的類似性（例えば、表現型がデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態のときには“デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート”に対する類似性）を示す数であり得る。類似値は相関係数のような類似性メトリックとして表示され得、或いは単に細胞サンプル発現プロファイルとベースラインテンプレート間の発現レベルの差または表現レベルの差の総計として表示され得る。
【００２３】
本明細書中で使用されている用語「発現レベルを測定する」、「発現レベルを得る」及び「発現レベルを検出する」等は、例えば遺伝子の転写物または遺伝子によりコードされるタンパク質の遺伝子発現レベルを定量する方法、並びに当該遺伝子が少しでも発現するかを判定する方法を含む。よって、必ずしも定量することなく発現の量の「イエス」または「ノー」の結果を与えるアッセイはその用語が本明細書中で使用されているとき「発現を判定する」アッセイである。或いは、測定または得られた発現レベルは、定量値、例えば対照遺伝子または別のサンプル中の同一遺伝子と比較したアップまたはダウン発現の数倍の変化、または発現のｌｏｇ比、或いはその視覚表示、例えばカラー強度が検出された遺伝子発現の量を表す「ヒートマップ」として表示され得る。増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションを有する腫瘍細胞中で差次的に発現されるとして同定された遺伝子は、所与のサンプル中の遺伝子または複数の遺伝子の発現レベルを検出または定量するための各種の核酸またはタンパク質検出アッセイにおいて使用され得る。遺伝子の発現レベルを検出するための方法の例にはノーザンブロッティング法、ドットまたはスロットドット法、レポーター遺伝子マトリックス（例えば、ＵＳ５，５６９，５８８号を参照されたい）ヌクレアーゼ保護、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイプロファイリング、ディファレンシャルディスプレイ、２Ｄゲル電気泳動、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ、ＩＣＡＴ、酵素アッセイ、抗体アッセイ等が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
「患者」はヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物を意味し得る。
【００２５】
本明細書中で使用されている「被験者」は生物；或いはそこに由来する細胞サンプル、組織サンプルまたは臓器サンプルを指し、その中には例えば培養細胞株、生検、血液サンプルまたは細胞を含有する流体サンプルが含まれる。多くの場合、被験者または被験者に由来するサンプルは複数の細胞型を含む。１つの実施形態では、サンプルは例えば腫瘍及び正常細胞の混合物を含む。１つの実施形態では、サンプルは少なくとも１０％、１５％、２０％、…、９０％または９５％の腫瘍細胞を含む。生物は動物であり得、その動物には非限定的にウシ、ブタ、マウス、ラット、家兎、ネコ、イヌ等の動物が含まれ、通常ヒトのような哺乳動物である。
【００２６】
本明細書中で使用されている用語「経路」は、産物または活性を生ずる２つ以上の連続的分子相互作用に関与するシステム成分の集合を意味すると意図される。経路は各種の産物または活性を生じ得、その中には例えば分子間相互作用、核酸またはポリペプチドの発現の変化、２つ以上の分子間の複合体の形成または解離、代謝性産物の蓄積または分解、酵素または結合活性の活性化または不活性化が含まれ得る。よって、用語「経路」は各種経路タイプ、例えば生化学的経路、遺伝子発現経路、調節経路を含む。また、経路はこれらの例示的経路タイプの組合せを含み得る。
【００２７】
「増殖因子シグナル伝達経路」は、増殖因子（非限定的に、ヘレグリン、インスリン、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦを含む）が受容体チロシンキナーゼ（非限定的に、受容体のＥＲＢＢファミリーを含む）に結合することにより開始する。増殖因子がその対応する受容体に結合すると、受容体のダイマー化、主要チロシン残基のリン酸化、及び受容体の細胞内部分での幾つかのタンパク質の補充が生ずる。その後、これらのタンパク質はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＲＡＳ／ＥＲＫやＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路のような幾つかの経路を介する細胞内シグナル伝達を開始し、それにより抗アポトーシスタンパク質の活性化及びプロアポトーシスタンパク質の不活化が生ずる（Ｈｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ、２００６、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１８：２０８９−２０９７において精査されている）。他の方法で特定されていない限り、本明細書中で「増殖因子シグナル伝達経路」は外部増殖因子が膜チロシンキナーゼ受容体に結合することにより開始するＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路を介するシグナル伝達を指すと理解される。
【００２８】
「ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路」または「ＡＫＴシグナル伝達経路」としても公知の「ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路」は、増殖因子が受容体チロシンキナーゼに結合することにより活性化される細胞内シグナル伝達経路の１つを指す。活性化すると、ＰＩ３Ｋはホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスホネート（ＰＩＰ２）をホスファチジルイノシトール−３，４、５−トリホスホネート（ＰＩＰ３）にリン酸化し、このプロセスはＰＴＥＮにより逆転する。ＰＩＰ３シグナルはキナーゼＰＤＫ１を活性化し、後者はキナーゼＡＫＴを活性化する。ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の説明のために図１も参照されたい（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達カスケードを精査するためにＨｅｎｎｅｓｓｙら，２００５，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，４：９８８−１００４も参照されたい）。加えて、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路はＲＡＳ経路のような他の細胞内シグナル伝達経路によってもモジュレートされ得、その結果増殖因子がその受容体に結合することにより活性化された細胞内シグナル伝達経路内で混線が生ずる。ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路には表１にリストされている遺伝子及びこれによりコードされるタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
【表１】
2011515088.tif 000003
2011515088.tif 000004
2011515088.tif 000005
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【００３０】
「増殖因子経路物質」はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達腕を介して増殖因子経路シグナル伝達をモジュレートする物質を指す。増殖因子経路インヒビターはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達腕を介して増殖因子経路シグナル伝達を抑制する。前記インヒビターの分子標的にはＰＤＫ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＰＤＫ１、ＭＹＣ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ２、増殖因子（ＥＧＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＩＧＦ１、インスリンまたはヘレグリン）及びその対応する受容体、並びに表１にリストされている遺伝子が含まれ得る。前記物質は当業界で公知であり、その中にはホスファチジルイノシトールエーテルリピドアナログ、アルキルホスホリピドアナログ、アロステリックＡＫＴインヒビター、ＨＳＰ９０インヒビター、アルキルホスホリピドペリホシン、ラパマイシン、ＲＡＤ００１、ＦＴＹ７２０、ＰＤＫ１インヒビター（ＢＸ−７９５、ＢＸ−９１２及びＢＸ−３２０（Ｆｅｌｄｍａｎら，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：１９８６７−１９８７４）；７−ヒドロキシスタウロスポリン（Ｓａｔｏら，２００２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：１７２７−１７３８））；ＰＩ３Ｋインヒビター（ワートマニン（Ｗｙｍａｎｎら，１９９６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６：１７２２−１７３３）；ＬＹ２９４００２（Ｖｌａｈｏｓら，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：５２４１−５２４８；Ｗｅｔｚｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｍｍｅｌ，２００４，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，１０：１９１５−１９２２）；ＩＣ８７１１４（Ｆｉｎａｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，３２：３７８−３８２；ＷＯ０１８１３４６、ＷＯ０１３７２５５７、ＵＳ６４０３５８８、ＷＯ０１４３２６６）；ＡＫＴ抗体（Ｓｈｉｎら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６５：２８１５−２８２４）（ＡＫＴ経路のインヒビターを精査するためにＣｈｅｎｇら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５，２４：７４８２−７４９２を参照されたい）、及びＩＧＦ１Ｒインヒビター（例えば、モノクローナル抗体ＭＫ−０６４６ｍ；Ｕ．Ｓ．特許７，２４１，４４４）が含まれるが、これらに限定されない。増殖因子シグナル伝達経路バイオマーカーを同定し、細分するために使用した実施例セクションにリストされているインヒビター及び物質も増殖因子経路物質の例（すなわち、ＡＫＴ１／２インヒビターＬ−００１１５４５４７（’５４７；３−フェニル−２−（４−｛［４−（５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾル−１−イル）ピペリジン−１−イル］メチル｝フェニル）−１，６−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン；ＷＯ２００６０６５６０１に開示されている）、Ｌ−０１１７３９３１（’９３１；６−メチル−３−フェニル−２−（４−｛［４−（５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾル−３−イル）ピペリジン−１−イル］−メチル｝フェニル）−１，６−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン；ＷＯ２００６０６５６０１に開示されている）；γ−セクレターゼ阻害剤４２１Ｂ（ＵＳ７，１３８，４００及びＷＯ０２／３６５５５）；ｃＭＥＴインヒビターＬ−００１５０１４０４（４−（６−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］［１，２，４］トリアジン−３−イルメチル）−フェノール；ＵＳ７，１２２，５４８も参照されたい）、ＭＫ−２４６１（Ｎ−［（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル］−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾル−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］スルファミド）、及びＬ−００１７９３２２５（１−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾル−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）メタンスルホンアミドである。
【００３１】
用語「デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路」は、本明細書中で増殖因子シグナル伝達経路が過剰活性化または過小活性化されていることを意味すべく使用されている。増殖因子シグナル伝達経路は、正常（レギュレートされている）サンプル中の増殖因子シグナル伝達経路よりも少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、１００％、２００％、５００％、１０００％高い活性／シグナル伝達を有しているならばサンプル（例えば、腫瘍サンプル）中で過剰活性化されている。増殖因子シグナル伝達経路は、サンプル（例えば、腫瘍サンプル）中の活性／シグナル伝達が正常（レギュレートされている）サンプル中の増殖因子シグナル伝達経路よりも少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、１００％低いならば過小活性化されている。レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する正常サンプルは隣接する正常組織由来であったり、またはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達を有していない他の腫瘍サンプルであり得る。或いは、サンプル増殖因子シグナル伝達経路状態の比較は薬物または物質対ビヒクルで治療した同一サンプルを用いてなされ得る。活性化状態の変化は増殖因子シグナル伝達経路中の１つ以上の遺伝子の変異（例えば、点変異、欠失または増幅）、転写調節の変化（例えば、メチル化、リン酸化またはアセチル化の変化）、またはタンパク質レギュレーションの変化（例えば、翻訳または翻訳後コントロールメカニズム）に起因し得る。
【００３２】
用語「解糖（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）経路」または「解糖（ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ）経路」は、１つのグルコース分子を２つのピルベート分子に分解して２つのＡＴＰを生成する酸素非依存性細胞エネルギー生成経路を指す。その後、ピルベートは解糖経路においてラクテートに還元される。酸素の存在下で、ピルベートはＨＣＯ３に酸化されると、１グルコースあたり３６個の追加ＡＴＰが生ずる（酸化的リン酸化経路）。酸素の存在下でのグルコースの乳酸への変換は所謂「好気的解糖」または「ワーブルグ効果」とも呼ばれている。酸素の存在下での高い解糖（好気的解糖）は原発性及び転移性癌の特徴である（Ｇａｔｅｎｂｙ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｉｅｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，４：８９１−８９９；Ｌｏｐｅｚ−Ｌａｚａｒｏ，２００８，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８：３０５−３１２；Ｋｏｎｄｏｈ，２００８，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，３１４：１９２３−１９２８において精査されている）。
【００３３】
「解糖経路物質」は解糖経路をモジュレートする物質を指す。解糖インヒビターは解糖経路を抑制する。前記インヒビターの分子標的にはヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ピルベートキナーゼ、グルコーストランスポーターが含まれる。そのような物質は当業界で公知であり、この中にはロニダミン、３−ブロモピルベート、２−デオキシグルコース、イマチニブ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ阻害剤ＳＢ−２０４９９０、オキシチアミン、ゲニステイン、５−チオグルコース、マンノヘプツロース、α−クロロヒドリン、オルニダゾール、グルホスファミド、ヒ素化合物、オキサメート、ヨードアセテート、ビスホスホネート、ツベルシジン、及びＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼポンプインヒビター、ＧＬＵＴインヒビター、３−（３−ピリジニル）−１−（４−ピリジニル）−２−プロペン−１−オン、ジクロロアセテート（Ｌｏｐｅｚ−Ｌａｚａｒｏ，２００８，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８：３０５−３１２；Ｃｌｅｍら，２００８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，７：１１０−１２０；Ｂｏｎｎｅｔら，２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１１：３７−５１において精査されている）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
用語「発癌経路」は、本明細書中で過剰活性化または過小活性化されたとき癌の発生または進行の原因となる経路を意味すべく使用されている。１つの実施形態では、発癌経路は癌遺伝子または癌サプレッサー遺伝子を含むものである。
【００３５】
本発明に関連していろいろな文法形の用語「治療する」は、病的状態、病気の進行、病気の原因物質（例えば、細菌またはウイルス）または他の異常な状態の有害な影響を予防する（すなわち、化学防御）、治癒させる、逆転させる、弱める、緩和する、最小限にする、抑制する、または停止させることを指す。例えば、治療は病気の症状（すなわち、必ずしもすべての症状でない）の緩和または病気の進行の減衰を含み得る。
【００３６】
本明細書中で使用されている「癌の治療」は、哺乳動物、例えばヒトにおける癌転移を含めた癌の進行を部分的にまたは完全に抑制、遅延または防止すること；癌転移を含めた癌の再発を抑制、遅延または防止すること；または癌の発生または発症を防止すること（化学防御）を指す。加えて、本発明の方法は癌を有しているヒト患者を治療するために実施され得る。しかしながら、本発明の方法は他の哺乳動物の癌の治療にも有効であろう。
【００３７】
本明細書中で使用されている用語「治療有効量」は、癌を治療するために必要な治療レジメンにおける治療薬の量を特定するために意図されている。これは、所望の生物学的応答を与える第１及び第２治療の合計量のような複数の治療薬の使用を含めた併用治療を含む。所望の生物学的応答は哺乳動物、例えばヒトにおける癌転移を含めた癌の進行を部分的にまたは完全に抑制、遅延または防止すること；癌転移を含めた癌の再発を抑制、遅延または防止すること；または癌の発生または発症を防止すること（化学防御）である。
【００３８】
「分類結果、予測結果または有効性結果を表示または出力させる」は、遺伝子発現に基づくサンプルの分類または予測の結果をメディア、例えば口頭で、文字で、画像表示等、コンピューター読み取り可能媒体またはコンピューターシステムを用いてユーザーに伝達することを意味する。結果を出力することがユーザーまたはリンクされているエクスターナル  コンポーネント（例えば、コンピューターシステムまたはコンピューターメモリー）に出力させることに限定されず、代替または追加的にインターナル  コンポーネント（例えば、コンピューター読み取り可能媒体）に出力させてもよいことは当業者に明白である。コンピューター読み取り可能媒体にはハードドライブ、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＤＡＴが含まれ得るが、これらに限定されない。コンピューター読み取り可能メディアはデータ搬送波または転送のための他の波の形態を含まない。本明細書中に開示、特許請求されている各種のサンプル分類方法はコンピューターにより実行され得るが、必須ではないこと及び例えば表示または出力ステップは例えばヒトに対して口頭または文字で（例えば、手書きで）行われることは当業者に明白である。
【００３９】
３．３  腫瘍を分類し、治療薬に対する応答を予測する際に有用なバイオマーカー
３．３．１バイオマーカー集合
本発明の１つの態様は、その発現がクラスタリング分析により増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションと相関している１０１個のバイオマーカーの集合を提供する。増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーション状態に従って腫瘍を分類するために、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする化合物に対する癌患者の応答を予測するために、または治療薬の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的効果を判定するために有用であるとして同定されたこれらのバイオマーカーは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、７２、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３及び１９５としてリストされている（表５ａ及び５ｂも参照されたい）。本発明の別の態様は、診断時に腫瘍型を区別するためまたは治療薬に対する応答を予測するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明の１つの実施形態では、１０１個のバイオマーカー集合は２つの対立する“腕”、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達が増加するにつれてアップレギュレートされる遺伝子である“アップ”腕（表５ａ及び５ｂを参照されたい）及びダウンレギュレートされる遺伝子である“ダウン”腕に分けられ得る。
【００４０】
１つの実施形態では、本発明は、増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態により腫瘍を分類し得る、すなわちレギュレート及びデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有している腫瘍を区別し得る１０１個のバイオマーカーの集合を提供する。これらのバイオマーカーは表５ａ及び５ｂにリストされている。本発明はまた、デレギュレート及びレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍を区別し得る１０１個の集合から選抜した少なくとも少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００個のバイオマーカーの部分集合を提供する。代替実施形態では、１０１個の集合から選抜した２０個のバイオマーカーの部分集合は表１０にリストされている。或いは、デレギュレート及びレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍を区別し得る“アップ”腕（表５ａを参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕（表５ｂを参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５個のバイオマーカーの部分集合を提供する。１つの実施形態では、“アップ”腕バイオマーカー及び“ダウン”腕バイオマーカーの部分集合は表１０にリストされている。本発明はまた、デレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍を区別するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、被験者の増殖因子シグナル伝達経路物質に対する応答を予測するために使用され得る１０１個の遺伝子バイオマーカーの集合を提供する。より具体的な実施形態では、本発明は、被験者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測するために使用され得る１０１個の集合から選抜した少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００個のバイオマーカーの部分集合を提供する。別の実施形態では、本発明は、癌を有している被験者を治療するための増殖因子経路物質を選択するために使用され得る１０１個のバイオマーカーの集合を提供する。より具体的な実施形態では、本発明は、癌を有している被験者を治療するための増殖因子経路物質を選択するために使用され得る１０１個の集合から選抜した少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００個のバイオマーカーの部分集合を提供する。或いは、“アップ”腕（表５ａを参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕（表５ｂを参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５個のバイオマーカーの部分集合は被験者の増殖因子シグナル伝達経路物質に対する応答を予測するために、または癌を有している被験者を治療するための増殖因子シグナル伝達経路物質を選択するために使用され得る。特定実施形態では、バイオマーカーの部分集合は表１０にリストされている。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、物質が増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的効果を有するかを判定するために使用され得る１０１個の遺伝子バイオマーカーの集合を提供する。提供されるバイオマーカーは、物質での治療からのいろいろな時点で増殖因子シグナル伝達経路の抑制をモニターするために使用され得る。より具体的な実施形態では、本発明は、物質の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的活性をモニターするために使用され得る１０１個の集合から選抜した少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００個のバイオマーカーの部分集合を提供する。或いは、“アップ”腕（表５ａを参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕（表５ｂを参照されたい）からの少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５個のバイオマーカーの部分集合は物質が増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的効果を有するかを判定するため、または物質の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的活性をモニターするために使用され得る。特定実施形態では、バイオマーカーの部分集合は表１０にリストされている。
【００４３】
本発明は、その発現がクラスタリング分析により増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションと相関している８６個の遺伝子バイオマーカーの代替集合をも提供する。増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーション状態に従って腫瘍を分類するために、被験者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする化合物に対する応答を予測するために、または治療薬の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的効果を判定するために有用であると同定されたこれらのバイオマーカーは配列番号２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９及び３７１としてリストされている（表１１も参照されたい）。本発明の別の態様は、診断する際に腫瘍型を区別するため、または治療薬に対する応答を予測するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明の１つの実施形態では、８６個のバイオマーカー集合は２つの対立する“腕”、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達が増加するにつれてアップレギュレートされる遺伝子である４４個の遺伝子を含む“アップ”腕（表１１を参照されたい）及びダウンレギュレートされる遺伝子である４２個の遺伝子を含む“ダウン”腕（表１１を参照されたい）に分けられ得る。本発明はまた、各種実施形態で使用され得る８６個の集合から選抜した少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０または７５個のバイオマーカーの部分集合を提供する。或いは、“アップ”腕（表１１を参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０または３５個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕（表１１を参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０または３５個のバイオマーカーの部分集合を提供する。
【００４４】
更には、本発明は、その発現がクラスタリング分析により解糖経路活性に相関している３９個のバイオマーカーの集合を提供する。解糖経路の活性に従って腫瘍を分類するために、癌患者の解糖経路をモジュレートする化合物に対する応答を予測するために、または治療薬の解糖経路に対する薬力学的効果を判定するために有用であると同定されたこれらのバイオマーカーは配列番号３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、２２１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、２５３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５としてリストされている（表１３も参照されたい）。本発明の別の態様は、診断する際に腫瘍型を区別するため、または治療薬に対する応答を予測するための上記バイオマーカーの使用方法を提供する。本発明はまた、各種実施形態で使用され得る３９個の集合から選抜した少なくとも５、１０、２０、３０または３５個のバイオマーカーの部分集合を提供する。
【００４５】
上で提供されたバイオマーカーの集合は、特に単独でまたは当該集合の範囲外のバイオマーカーと組み合わせて使用され得る。例えば、増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を区別するバイオマーカーは、ｐ５３機能状態を区別するバイオマーカー（Ａｎｄｒｅｙ  Ｌｏｂｏｄａらにより２００８年３月２２日に出願されたＵ．Ｓ．仮出願６１／０７０，２５９，“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｐ５３  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｕｓ”を参照されたい）と一緒に使用され得る。上で提供されたバイオマーカー集合は癌、或いは他の臨床または生理学的状態のための他のバイオマーカーと一緒に使用され得る。
【００４６】
３．３．２  バイオマーカーの同定
本発明は、癌に関連する状態または兆候を同定するためのバイオマーカーの集合を提供する。通常、バイオマーカー集合は〜４４，０００個のヒトバイオマーカーのいずれかが状態または兆候に相関する発現パターンを有しているかを調べることにより同定した。
【００４７】
１つの実施形態では、バイオマーカー集合を同定するための方法は以下の通りである。標的ポリヌクレオチドを抽出し、標識した後、サンプルＸ中のすべてのバイオマーカー（遺伝子）の発現を標準または対照中のすべてのバイオマーカーの発現と比較する。１つの実施形態では、標準または対照は正常個体（すなわち、増殖因子経路デレギュレーションを有していない個体）からのサンプルに由来する標的ポリヌクレオチドを含む。或いは、標準または対照は腫瘍に隣接する正常組織または増殖因子経路デレギュレーションを有していない腫瘍由来のポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、標準または対照は標的ポリヌクレオチド分子のプールである。前記プールは多数の正常個体からの採取サンプルに由来し得る。別の実施形態では、前記プールは増殖因子経路デレギュレーションを有していない腫瘍を有する多数の個体から採取したサンプルからなる。別の好ましい実施形態では、前記プールは腫瘍サンプルからのバイオマーカー由来核酸のプール中に存在する各バイオマーカーに由来する核酸のレベルに近づくように設計された核酸の人工的に作成した集団からなる。更に別の実施形態では、前記プールは正常または癌細胞株または細胞株サンプルに由来する。
【００４８】
比較は当業界で公知の手段により実施され得る。例えば、各種バイオマーカーの発現レベルは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルを用いてバイオマーカー由来の標的ポリヌクレオチド分子（例えば、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ）を分離した後、バイオマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることにより評価され得る。或いは、比較は標的ポリヌクレオチド分子を標識した後配列決定ゲルを用いて分離することにより実施され得る。患者及び対照または標準ポリヌクレオチドが隣接レーンにあるようにポリヌクレオチドサンプルをゲル上に配置する。発現レベルは肉眼でまたはデンシトメーターを用いて比較される。好ましい実施形態では、すべてのバイオマーカーの発現がマイクロアレイへのハイブリダイゼーションにより同時に評価される。各アプローチで、特定基準に適合するバイオマーカーを増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションを有する腫瘍に関連するとして同定する。
【００４９】
バイオマーカーは、標準または対照状態と比較したサンプル中の発現の有意な差に基づいて選択される。選択は、患者サンプル中のバイオマーカーが有意にアップまたはダウンレギュレーションされているかに基づいてなされ得る。選択は、バイオマーカーと状態または兆候の発現間の相関の統計上の有意差（すなわち、ｐ値）を計算することによってもなされ得る。好ましくは、両方の選択基準を使用する。よって、本発明の１つの実施形態では、標準と比較して発現の２倍以上の変化（上昇または低下）を示し、増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションの存在とバイオマーカー発現の変化の相関についてのｐ値が０．０１以下である（すなわち、統計上有意である）腫瘍中のデレギュレーション増殖因子シグナル伝達経路に関連するバイオマーカーを選抜する。
【００５０】
複数のＮ個の癌腫瘍サンプル中の複数の異なる遺伝子からなる発現プロファイルは、異なる臨床カテゴリーに相関し、従って異なる臨床カテゴリーを判別するために有用であるマーカーを同定するために使用され得る。具体的実施形態では、Ｎ個の腫瘍サンプル中の臨床カテゴリーまたは臨床パラメーター（例えば、レギュレートまたはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路）を表すベクトル
【数１】
2011515088.tif 000009
とＮ個の腫瘍サンプル中の遺伝子の測定した発現レベルを表すベクトル
【数２】
2011515088.tif 000010
の相関係数ρを遺伝子の発現レベルと増殖因子シグナル伝達経路状態間の相関度として使用する。発現レベルは遺伝子の転写物の測定したアバンタンスレベルまたは測定したアバンダンスの変換、例えば対数、すなわちｌｏｇ比であり得る。具体的には、相関係数は
【数３】
2011515088.tif 000011
として計算される。
【００５１】
相関係数がカットオフを超えるバイオマーカーは、所与の患者部分集合内の特定の臨床カテゴリー（例えば、デレギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達状態）に特異的な増殖因子経路シグナル伝達状態の情報を与えるバイオマーカーとして同定される。前記カットオフまたは閾値は得られた判別遺伝子の集合のある有意性に対応し得る。閾値は使用するサンプル数に基づいても選択され得る。例えば、閾値は
【数４】
2011515088.tif 000012
（式中、
【数５】
2011515088.tif 000013
は分布幅であり、ｎはサンプル数である）
として計算される。具体的実施形態では、相関係数が約０．３以上または約−０．３未満ならばマーカーを選択する。
【００５２】
次に、バイオマーカー遺伝子の集合の有意性が評価され得る。有意性は適当な統計方法により計算され得る。具体例では、複数の患者の発現プロファイルと臨床カテゴリー間の関係をランダム化して、ランダム化したデータセットを作成するためにモンテカルロ法を使用する。バイオマーカー集合を選択するために使用したのと同一のバイオマーカー選択手順をランダム化データに適用して、対照バイオマーカー集合を得る。複数の前記ランを実施して、対照バイオマーカー集合中の遺伝子の数の確率分布を作成する。好ましい実施形態では、前記ランを１０，０００回実施する。確率分布から、発現レベルと表現型間の相関（すなわち、ランダム化データに基づいて）が予想されないときには所与の数のバイオマーカーから構成されるバイオマーカー集合を見つける確率が決定され得る。実際のデータから得たバイオマーカー集合の有意性は、ランダム化データを用いて同一数のバイオマーカーから構成される対照バイオマーカー集合を得る確率を比較することによりバイオマーカー集合中のバイオマーカーの数に基づいて評価され得る。１つの実施形態では、ランダム化データを用いて同一数のバイオマーカーから構成される対照バイオマーカーを得る確率が所与の確率閾値を下回るならば、バイオマーカー集合は有意であると言える。
【００５３】
バイオマーカー集合が同定されたら、バイオマーカーは判別の相関または有意性の順に順位付けされ得る。１つの順位付け手段はバイオマーカーの遺伝子発現の変化と判別しようとする具体的状態の相関の大きさによる。別の好ましい手段は統計メトリックを使用することである。具体的実施形態では、メトリックはｔ検定様統計量である。
【数６】
2011515088.tif 000014
上記数式中、＜ｘ１＞は第１臨床群（例えば、デレギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達）内の転写物発現測定値のｌｏｇ比の誤差加重平均であり、＜ｘ２＞は第２の関連する臨床群（例えば、レギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達）内のｌｏｇ比の誤差加重平均であり、σ１は第１臨床群（例えば、デレギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達）内のｌｏｇ比の分散であり、ｎ１はｌｏｇ比の正当な測定値が有効なサンプル数であり、σ２は第２臨床群（例えば、レギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達）内のｌｏｇ比の分散であり、ｎ２はｌｏｇ比の正当な測定値が有効なサンプル数である。ｔ値は２つの平均間の分散補償差を表す。順位付けしたバイオマーカー集合は判別のために使用される集合中のバイオマーカーの数を最適とするために使用され得る。
【００５４】
増殖因子経路シグナル伝達状態に対する遺伝子の集合は反復アプローチを用いても同定され得る。これは、通常以下の“１個抜き（ｌｅａｖｅ  ｏｎｅ  ｏｕｔ）”方法を用いて実施される。第１ランで、順位付けしたリストのトップからのバイオマーカーの部分集合（例えば、５個）をテンプレートを作成するために使用する。ここでは、Ｎ個のサンプルからテンプレートを作成するためにＮ−１個を使用し、残りのサンプルの状態を予測する。このプロセスをＮ個のサンプルが１個ずつ１回予測されるまでサンプル毎に繰り返す。第２ランでは、テンプレートが１０個のバイオマーカーから作成されるように１つ以上の追加のバイオマーカー（例えば、５個の追加バイオマーカー）を添加し、残りのサンプルの出力を予測する。このプロセスを、バイオマーカーのすべての集合がテンプレートを作成するために使用されるまで繰り返す。各ラン毎に、タイプ１エラー（偽陰性）及びタイプ２エラー（偽陽性）をカウントする。最低のタイプ１エラー率またはタイプ２エラー率、好ましくはタイプ１エラー率及びタイプ２エラー率の合計に相当するトップに順位付けされたバイオマーカーの集合を選択する。
【００５５】
増殖因子経路シグナル伝達状態バイオマーカーについて、マーカー集合の確認は追加の統計量、生存モデルにより実施され得る。この統計量から最初の診断以降の時間の関数としての腫瘍の遠隔転移の確率が得られる。ワイブル、正規、対数正規、対数ロジスティック、対数指数またはｌｏｇ−Ｒａｙｌｅｉｇｈ（Ｃｈａｐｔｅｒ  １２“Ｌｉｆｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ”，Ｓ−ＰＬＵＳ  ２０００  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ，Ｖｏｌ．２，ｐ．３６８（２０００））を含めた多数のモデルが使用され得る。「正常」モデルの場合、時間ｔでの遠隔転移Ｐの確率は
【数７】
2011515088.tif 000015
（式中、αは一定で１に等しく、τは適合されるパラメーターであり、「予測寿命」を判定する）
として計算される。
【００５６】
バイオマーカー選択または順位付けから（すなわち、相関の計算から）１つ以上のサンプルを除外することにより上記バイオマーカー同定プロセスを２回以上反復することが好ましい。除外されるサンプルは以前の反復から正しく予想され得ないものである。好ましくは、この反復プロセスにおいてバイオマーカー選択から除外されたサンプルを性能を誇張して述べるのを避けるために分類子性能評価に含める。
【００５７】
増殖因子経路シグナル伝達状態についての遺伝子の集合が同定されたら、バイオマーカーを２つの対立する“腕”、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達が増加するにつれてアップレギュレートされる遺伝子である“アップ”腕（表５ａまたは表１１を参照されたい）及びダウンレギュレートされる遺伝子である“ダウン”腕（表５ｂまたは表１１を参照されたい）に分けられ得る。
【００５８】
先に記載した上記方法、特に統計的方法が増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態に関連するバイオマーカーの同定に限らず、表現型に関連するバイオマーカー遺伝子の集合を同定するために使用され得ることは当業者に自明である。表現型は癌のような疾患の存在または不在、或いは癌に関連する同定する臨床状態の存在または不在であり得る。例えば、先に記載した方法は解糖経路活性に関連するバイオマーカーを同定するために使用され得る。病気の関連で、表現型は生存期間、病的状態の遠隔転移の見込み、或いは治療または予防レジメンに対する具体的応答の可能性のような予後であり得る。表現型は癌または疾患である必要はない。表現型は健康な個人に関連する名目上の特徴であり得る。
【００５９】
３．３．３  サンプル採取
本発明において、標的ポリヌクレオチド分子を典型的にはそれぞれ癌または腫瘍細胞株に侵されている個体及び対応する正常／対照組織または細胞株から採取したサンプルから抽出する。サンプルは臨床的に許容され得る方法で採取され得るが、バイオマーカー由来ポリヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）が保存されるように採取されなければならない。ｍＲＮＡまたはこれに由来する核酸（すなわち、ｃＤＮＡまたは増幅ＤＮＡ）を標準または対照ポリヌクレオチド分子から区別できるように標識することが好ましく、両方をバイオマーカーの一部または全部、或いは上記したバイオマーカー集合または部分集合を含むマイクロアレイに同時にまたは独立してハイブリダイズする。或いは、ｍＲＮＡまたは底に由来する核酸を標準または対照ポリヌクレオチド分子と同一の標識で標識してもよく、この場合特定のプローブでの各々のハイブリダイゼーションの強度を比較する。サンプルは臨床的に関連する組織サンプル（例えば、腫瘍生検または細針吸引物）または体液（例えば、血液、血漿、血清、リンパ、腹水、嚢胞液、尿）のサンプルからなり得る。サンプルはヒトから、或いは獣医学的関係では非ヒト動物（例えば、反芻動物、ウマ、ブタまたはヒツジ）または家庭愛玩動物（例えば、ネコ及びイヌ）から採取され得る。加えて、サンプルは凍結または保管されているホルマリン固定またはパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルに由来してもよい。
【００６０】
全及びポリ（Ａ）＋ＲＮＡの作成方法は公知であり、一般的にＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ＮＤ  ＥＤ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））及びＡｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４））に記載されている。
【００６１】
ＲＮＡは真核細胞を溶解し、そこに含まれているタンパク質を変性することを含む手順により真核細胞から単離され得る。当該細胞には野生型細胞（すなわち、非癌性）、薬物暴露野生型細胞、腫瘍または腫瘍由来細胞、修飾細胞、正常または腫瘍細胞株細胞及び薬物暴露修飾細胞が含まれる。
【００６２】
ＤＮＡを除去するために追加ステップが使用され得る。非イオン性洗剤を用いて細胞溶解した後、微量遠心して、核、よって大量の細胞ＤＮＡも除去し得る。１つの実施形態では、ＲＮＡを問題の各種型の細胞からチオシアン酸グアニジン溶解を用いて抽出した後、ＣｓＣｌ遠心して、ＲＮＡをＤＮＡから分離する（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４−５２９９（１９７９））。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはオリゴ−ｄＴセルロースを用いる選択により選択される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ＮＤ  ＥＤ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）。或いは、ＲＮＡは有機抽出、例えば熱フェノールまたはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いる有機抽出によりＤＮＡから分離され得る。
【００６３】
所望により、ＲＮアーゼインヒビターを溶解バッファーに添加してもよい。また、特定の細胞型の場合、プロトコルにタンパク質変性／消化ステップを加えることが望ましいことがある。
【００６４】
多くの用途の場合、他の細胞ＲＮＡ（例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ））に対してｍＲＮＡを優先的に濃縮させることが望ましい。多くのｍＲＮＡはその３’末端にポリ（Ａ）テールを含んでいる。これにより、ｍＲＮＡは例えば固体支持体（例えば、セルロースまたはセファデックス（登録商標））にカップリングさせたオリゴ（ｄＴ）またはポリ（Ｕ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより濃縮され得る（Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照されたい）。結合させたら、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡをアフィニティーカラムから２ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．１％  ＳＤＳを用いて溶離させる。
【００６５】
ＲＮＡのサンプルは、各々の異なるｍＲＮＡ分子が異なるヌクレオチド配列を有している複数の異なるｍＲＮＡ分子を含み得る。具体的実施形態では、ＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡ分子は少なくとも１００個の異なるヌクレオチド配列を含む。より好ましくは、ＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡ分子はバイオマーカー遺伝子の各々に対応するｍＲＮＡ分子からなる。別の具体的実施形態では、ＲＮＡサンプルは哺乳動物ＲＮＡサンプルである。
【００６６】
具体的実施形態では、細胞由来の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを本発明の方法において使用する。ＲＮＡの起源は植物または動物、ヒト、哺乳動物、霊長類、非ヒト動物、イヌ、ネコ、マウス、ラット、鳥、酵母、真核、原核等の細胞であり得る。具体的実施形態では、本発明の方法は１×１０６個以下の細胞の全ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを含むサンプルを用いて使用される。別の実施形態では、タンパク質はタンパク質レベルでの発現分析において使用するために当業界で公知の方法を用いて前記源から単離され得る。
【００６７】
非ヒト核酸をアッセイする場合には本明細書に開示されているバイオマーカー配列のホモログに対するプローブが好ましく使用され得る。
【００６８】
３．４  増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションバイオマーカー集合の使用方法
３．４．１  診断／腫瘍分類方法
本発明は、腫瘍がデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているかを個体の腫瘍型を分子レベルで決定または分類すべく個体からのサンプルを分析するためのバイオマーカー集合の使用方法を提供する。個体が実際に癌に侵されている必要はない。本質的に、個体または個体から採取したサンプル中の特定のバイオマーカー遺伝子の発現を標準または対照と比較する。例えば、２つの癌関連状態Ｘ及びＹを仮定する。個体中の状態Ｘについて増殖因子シグナル伝達経路バイオマーカーの発現レベルを対照中のバイオマーカー由来ポリヌクレオチドのレベルと比較することができ、前記レベルは状態Ｘを有するサンプルが表す発現レベルに相当する。この場合、個体サンプル中のマーカーの発現が対照の発現とは実質的に（すなわち、統計上）異なるならば、個体は状態Ｘを有していない。選択がバイモデル（すなわち、サンプルはＸまたはＹのいずれかである）ならば、個体は追加的に状態Ｙを有していると言うことができる。勿論、状態Ｙに相当する対照と比較することもできる。好ましくは、各対照がポジティブ及びネガティブ対照の両方として働くように両方を同時に実施する。よって、鑑別結果は対照が表す発現レベル（すなわち、マーカー由来ＲＮＡまたはそこに由来するポリヌクレオチドの量）との明白な差であるか、または有意差なしであり得る。
【００６９】
従って、１つの実施形態では、個体の特定の腫瘍関連状態の確認方法は、（１）個体由来の標識標的ポリヌクレオチドを上記バイオマーカー集合またはバイオマーカーの部分集合を含むマイクロアレイにハイブリダイズするステップ；（２）標的分子由来の差次的に標識されている標準または対照ポリヌクレオチド分子をマイクロアレイにハイブリダイズするステップ；及び（３）標的及び標準または対照間の転写物レベルの差またはその差のないことを調べて、差の有無から個体の腫瘍関連状態を確認するステップを含む。より具体的実施形態では、標準または対照分子は正常個体からのサンプルのプール、正常隣接組織からのサンプルのプール、または癌を有している個体からの腫瘍サンプルのプールに由来するバイオマーカー由来ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、標準または対照は、特定の臨床兆候（すなわち癌性または非癌性；レギュレートされているまたはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路）を有している正常または癌腫瘍組織の臨床サンプルが表すバイオマーカー発現のレベルに似せるように設計されている人工的に作成したバイオマーカー由来ポリヌクレオチドのプールである。別の具体的実施形態では、対照分子は正常または癌細胞株由来のプールからなる。
【００７０】
本発明は、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍型をレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍型から区別するために有用なバイオマーカーの集合を提供する。よって、上記方法の１つの実施形態では、個体由来のサンプル中の、表５ａ及び５ｂ中に挙げられているバイオマーカーから発現されたポリヌクレオチド（すなわち、ｍＲＮＡまたはそこに由来するポリヌクレオチド）のレベルを対照由来の同一バイオマーカーの発現のレベルと比較し、前記対照はデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍サンプル及び／またはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍サンプル由来のバイオマーカー関連ポリヌクレオチドを含む。比較はデレギュレート及びレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍サンプルの両方に対してなされ得、比較はそれぞれ多数のデレギュレート及びレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路腫瘍サンプル由来のポリヌクレオチドプールに対してなされ得る。個体のバイオマーカー発現がデレギュレートされている対照に最も密接に類似または相関しており、レギュレートされている対照に類似または相関していないならば、個体はデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有していると分類される。プールが純粋なデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路型腫瘍サンプルでない場合、例えば散在性プールを使用した場合、公知の増殖因子シグナル伝達経路状態を有する個体を用いる実験の組をプールに対してハイブリダイズして、デレギュレート及びレギュレートされている群の発現テンプレートを規定する。未知の増殖因子シグナル伝達経路状態を有する各個体を同一プールに対してハイブリダイズし、発現プロファイルをテンプレートと比較して、個体の増殖因子シグナル伝達経路状態を確認する。
【００７１】
別の具体的実施形態では、上記方法は、
（ｉ）第１発現プロファイルとデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の類似度を計算し、或いは第１発現プロファイルとデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の第１の類似度及び第１発現プロファイルとレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート間の第２の類似度を計算し、前記した第１発現プロファイルは腫瘍細胞サンプル中の第１の複数の遺伝子の発現レベルからなり、前記したデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートは異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも１つ以上有する複数の腫瘍細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第１の複数の遺伝子の発現レベルからなり、前記したレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートは異常活性を有する増殖因子シグナル伝達経路の成分を少なくとも１つ以上有していない複数の腫瘍細胞サンプル中のそれぞれの遺伝子の平均発現レベルである第１の複数の遺伝子の発現レベルからなり、第１の複数の遺伝子はそのバイオマーカーが表５ａ及びｂにリストされている少なくとも５個の遺伝子から構成されており；
（ｉｉ）第１発現プロファイルがデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有しているかまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートよりもデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対してより高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、或いは第１発現プロファイルがデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しているかまたはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートよりもレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対してより高い類似性を有しているならば腫瘍細胞サンプルをレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有しているとして分類し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を超えているならば前記した第１発現プロファイルはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して高い類似性を有し、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対する類似性が所定閾値を下回るならば前記した第１発現プロファイルはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレートに対して低い類似性を有しており；
（ｉｉｉ）分類ステップ（ｉｉ）により得た分類をユーザーインターフェースデバイス、コンピューター読み取り可能記憶媒体、或いはローカルまたはリモートコンピューターシステムに表示または出力させることを含む。
【００７２】
上記した実施形態では、バイオマーカーの全体集合（すなわち、表５ａ及び５ｂのバイオマーカーの完全な集合）を使用し得る。他の実施形態では、１０１個のバイオマーカーの部分集合を使用し得、或いはバイオマーカーの“アップ”（表５ａ）及び“ダウン”腕（表５ｂ）の部分集合を使用し得る。或いは、表１１からのバイオマーカーの全体集合を使用し得、或いは８６個のバイオマーカーの部分集合を使用し得、またはバイオマーカーの“アップ”及び“ダウン”腕（表１１）の部分集合を使用し得る。
【００７３】
別の実施形態では、発現プロファイルは対照サンプル中の複数の遺伝子の測定値に対する患者由来のサンプル中の前記した複数の遺伝子の差次的測定値を含む差次的発現プロファイルである。差次的測定値はｘｄｅｖ、ｌｏｇ（比）、誤差加重ｌｏｇ（比）または平均減法したｌｏｇ（強度）（例えば、各々全文参照により本明細書に組み入れる２０００年７月６日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ００／３９３３９及び２００４年８月５日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０６５５４５を参照されたい）であり得る。
【００７４】
サンプルまたは個体のバイオマーカー発現プロファイルと対照のバイオマーカー発現プロファイル間の類似性は当業界で公知の任意の方法を用いていろいろな方法で評価され得る。例えば、Ｄａｉらは乳癌患者を分類する際に有用な遺伝子発現テンプレート及び対応するバイオマーカー遺伝子集合を計算する多数の各種方法を記載している（ＵＳ７，１７１，３１１、ＷＯ２００２／１０３３２０、ＷＯ２００５／０８６８９１、ＷＯ２００６０１５３１２、ＷＯ２００６／０８４２７２）。また、Ｌｉｎｓｌｅｙら（ＵＳ２００３／０１０４４２６）及びＲａｄｉｓｈら（ＵＳ２００７０１５４９３１）は慢性骨髄性白血病患者を分類する際に有用な遺伝子バイオマーカー遺伝子集合及び遺伝子発現テンプレートの計算方法を開示している。最も単純な場合、プロファイルを発現差データのプリントアウトを用いて肉眼で比較することができる。或いは、類似性は数学的に計算することができる。
【００７５】
１つの実施形態では、２人の患者（またはサンプル）ｘ及びｙ間、或いは患者（またはサンプル）ｘとテンプレートｙ間の類似度は以下の方程式を用いて計算することができる：
【数８】
2011515088.tif 000016
この方程式中、ｘ及びｙはｌｏｇ比ｘｉ及びｙｉ、ｉ＝１、２，…、Ｎ＝４，９８６のコンポーネントを有する２人の患者である。すべてのｘｉが誤差σｘｉを伴っている。値σｘｉが小さいほど、測定値ｘｉはより高い信頼性である。
【数９】
2011515088.tif 000017
は誤差加重算術平均である。
【００７６】
１つの実施形態では、類似性は患者またはサンプルプロファイルとテンプレート間の相関係数により表される。１つの実施形態では、相関閾値を超える相関係数は高い類似性を示し、閾値を下回る相関係数は低い類似性を示す。幾つかの実施形態では、相関閾値は０．３、０．４、０．５または０．６として設定されている。別の実施形態では、サンプルまたは患者プロファイルとテンプレート間の類似性はサンプルプロファイルとテンプレート間の距離で表される。１つの実施形態では、所与の値を下回る距離は高い類似性を示し、所与の値以上の距離は低い類似性を示す。
【００７７】
好ましい実施形態では、テンプレートをサンプル比較のために開発する。テンプレートは、バイオマーカー遺伝子の群が特定の増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を区別することができるように発現差の誤差加重ｌｏｇ比平均として定義され得る。例えば、テンプレートはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路サンプル及びレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路サンプルに対して定義される。次いで、分類子パラメーターを計算する。このパラメーターはサンプルとテンプレート間の発現レベル差を用いて、または相関係数を計算することにより計算され得る。前記係数Ｐｉは以下の方程式を用いて計算され得る：
【数１０】
2011515088.tif 000018
ここで、ｉ＝１及び２である。
【００７８】
説明として、１つの実施形態では、１つの表現型エンドポイント、例えば増殖因子シグナル伝達経路デレギュレート状態に基づいてサンプルを分類するためのテンプレートは
【数１１】
2011515088.tif 000019
（例として、例えば増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態に関連する相関値Ｃ１からなるプロファイル）として定義され、及び／または第２の表現型エンドポイント、すなわち増殖因子シグナル伝達経路レギュレート状態のためのテンプレートは
【数１２】
2011515088.tif 000020
（例として、例えば増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態に関連する相関値Ｃ２からなるプロファイル）として定義される。その後、２つの分類子パラメーター（Ｐ１及びＰ２）の１つまたは両方がサンプルのプロファイルとテンプレート間の類似度を調べるために使用され得る。Ｐ１はサンプルのプロファイル
【数１３】
2011515088.tif 000021
と第１発現テンプレート
【数１４】
2011515088.tif 000022
間の類似性を判定し、Ｐ２は
【数１５】
2011515088.tif 000023
と第２発現テンプレート
【数１６】
2011515088.tif 000024
間の類似性を判定する。
【００７９】
よって、１つの実施形態では、Ｐ１が選択した相関閾値よりも大きいかまたはＰ２が選択した相関閾値以下であるならば、
【数１７】
2011515088.tif 000025
は例えばデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類される。別の実施形態では、Ｐ１が選択した相関閾値未満であるかまたはＰ２が選択した相関閾値を上回るならば、
【数１８】
2011515088.tif 000026
は例えばレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類される。更に別の実施形態では、Ｐ１が第１の選択した相関閾値よりも大きいならば
【数１９】
2011515088.tif 000027
は例えばデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類され、Ｐ２が第２の選択した相関閾値よりも大きいならば
【数２０】
2011515088.tif 000028
は例えばレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類される。
【００８０】
よって、より具体的実施形態では、個体の特定の腫瘍関連状態を確認する上記方法は、（１）個体由来の標識標的ポリヌクレオチドを上記マーカー集合の１つを含むマイクロアレイにハイブリダイズするステップ；（２）標的分子由来の差次的に標識されている標準または対照ポリヌクレオチド分子をマイクロアレイにハイブリダイズするステップ；（３）２つのチャネル（個体及び対照）間の転写物レベルの比（または、差）、または単に個体の転写物レベルを測定するステップ；及び（４）（３）からの結果を予め定義したテンプレートと比較するステップを含み、この測定は当業界で公知の手段（セクション３．４，６の発現プロファイルの分類方法を参照されたい）により実施され、差の有無により個体の腫瘍関連状態を確認する。
【００８１】
方法は表５ａ及び５ｂにリストされているバイオマーカーの完全集合を使用し得る。しかしながら、１０１個のバイオマーカーの部分集合、またはバイオマーカーの“アップ”（表５ａ）または“ダウン”（表５ｂ）腕を使用してもよい。或いは、表１１からのバイオマーカーの全体集合を使用しても、８６個のバイオマーカーの部分集合を使用しても、またはバイオマーカーの“アップ”及び“ダウン”腕（表１１）の部分集合を使用し得る。
【００８２】
別の実施形態では、個体の増殖因子経路レギュレーション状態を確認する上記方法は１０１個のバイオマーカーの２つの“腕”を使用する。“アップ”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってアップする６３個の遺伝子（表５ａを参照されたい）を含み、“ダウン”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってダウンする３８個の遺伝子（表５ｂを参照されたい）を含む。或いは、増殖因子経路レギュレーション状態を確認する上記方法は表１１にリストされている８６個のバイオマーカーの２つの“腕”、すなわち４４個の遺伝子（表１１を参照されたい）を含む“アップ”腕及び４２個の遺伝子（表１１を参照されたい）を含む“ダウン”腕を使用する。個体サンプルを標準または対照と比較する場合、サンプル中の遺伝子Ｘの発現値を標準または対照中の遺伝子Ｘの発現値と比較する。バイオマーカーの集合中の各遺伝子毎に、標準または対照に対する個体サンプル中の発現値（差次的発現値）のｌｏｇ（１０）比を求める。サイン“スコア”は、“アップ”中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比を測定した後、“ダウン”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比を減ずることにより計算する。このサインスコアが有意であるかを確認するために、２つの対立する腕中の遺伝子の発現値を相互に比較するＡＮＯＶＡ計算（例えば、両側ｔ検定、ウィルコクソン順位和検定、コルモゴルフ−スミルノフ検定等）を実施する。例えば、“アップ”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比が“ダウン”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比と明らかに異なるかを確認するために両側ｔ検定を使用する場合、＜０．０５のｐ値は個体サンプル中のサインが標準または対照とは明らかに異なることを示している。サンプルのサインスコアが所定閾値を超えているならば、サンプルは増殖因子シグナル伝達経路のデレギュレーションを有していると見なされる。所定閾値は０であり得、またはサンプルの集合、または標準または対照として使用されるプールしたサンプルのサインスコアの平均、メジアンまたはパーセント点であり得る。代替実施形態では、表５ａからの６３個の“アップ”遺伝子の少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５及び６０個の部分集合及び表５ｂからの３８個の“ダウン”遺伝子の少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０及び３５個の部分集合をこのサインスコアを計算するために使用してもよい。或いは、表１１からの４４個の“アップ”遺伝子の部分集合及び４２個の“ダウン”遺伝子の部分集合をサインスコアを計算するために使用してもよい。更に別の実施形態では、表８ｂからの遺伝子をサインスコアを計算するために使用してもよい。値がバイオマーカーの遺伝子の転写物アバンダンスの客観的測定値を表す限り、ｌｏｇ（１０）比以外の他の差次的発現値をサインスコアを計算するために使用し得ることを当業者は認識しているであろう。その例にはｘｄｅｖ、誤差加重ｌｏｇ（比）及び平均減法ｌｏｇ（強度）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
バイオマーカー集合を使用する上記方法は、表１３にリストされているバイオマーカーの集合を用いてサンプルが活性化解糖経路を有しているかサンプルを分子レベルで決定または分類すべく個体由来のサンプルを分析するためにも使用され得る。表１３中の３９個のバイオマーカーの全体集合または部分集合を使用してもよい。解糖サインの場合、すべての遺伝子が同一方向でレギュレートされており、相関している。従って、このサインは１つの分枝のみから構成される。
【００８４】
バイオマーカー集合を使用する上記方法は、個体由来のサンプルを分析した後、その増殖因子経路デレギュレーション状態に従ってサンプルを順位付けするためにも使用され得る。サンプルを順位を決定するために基準サンプルと比較してもよい。順位を決めるために、サンプルを所定閾値、例えば基準サンプルに対するバイオマーカー集合または部分集合の平均発現値と比較する。基準サンプルは“デレギュレートされている”または“レギュレートされている”増殖因子シグナル伝達経路サンプルであり得る。サンプルをサンプルのプールと比較し、このサンプルのプールの所定閾値、例えばバイオマーカー集合または部分集合の平均、メジアンまたはパーセント点発現値と比較することにより順位付けてもよい。サンプルをそのサインスコアに従って順位付けてもよい。
【００８５】
３．４．２  治療に対する応答を予測し、治療を割り当てる方法
本発明は、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に応答すると予測される患者からのサンプルを増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に応答すると予測されない患者から区別するために有用なバイオマーカーの集合を提供する。よって、本発明は、更に癌を有している個人が増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に対して予測される応答者であるかを判定するために上記バイオマーカーを使用するための方法を提供する。１つの実施形態では、本発明は、癌患者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測する方法を提供し、その方法は、（１）個体から採取したサンプル中の表５ａ及び５ｂにリストされているバイオマーカーの発現のレベルをサンプル中でデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達を有することが分かっているレベルに相当する標準または対照中の同一バイオマーカーの発現のレベルと比較し；（２）個体からのサンプル中のバイオマーカー関連ポリヌクレオチドのレベルが対照のレベルと有意に異なっているかを調べることを含み、実質的な差が見られないならば患者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に対して応答すると予想され、実質的な差が見られたならば患者は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に応答しないと予想される。当業者は、標準または対照レベルがレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する腫瘍サンプルに由来し得ることが容易に分かるであろう。より具体的実施形態では、両方の対照を流す。プールが純粋な“レギュレートされている増殖因子”または“デレギュレートされている増殖因子”でない場合、公知の応答者状態を有する個体の実験の組を前記プールに対してハイブリダイズして、予測される応答者及び予測される非応答者群に対する発現テンプレートを規定しなければならない。未知の出力を有する各個体を同一のプールにハイブリダイズし、生じた発現プロファイルをテンプレートと比較してその出力を予測する。
【００８６】
腫瘍の増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーション状態は、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に応答するが、有糸分裂抑制剤に応答しない被験者を示し得る。従って、本発明は、表５ａ及び５ｂの１０１個のバイオマーカーまたはその部分集合の発現のレベルがデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態またはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態に相当するサンプル中の前記バイオマーカーのレベルと相関しているかを調べ；治療方針を決定または割り当てることを含む癌患者の治療方針を決定または割り当てる方法を提供し、発現がデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態パターンに相関しているならば腫瘍は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質で治療され、有糸分裂抑制剤タイプの癌物質で治療されない。
【００８７】
診断バイオマーカーの場合のように、上記方法は表５ａ及び５ｂにリストされているバイオマーカーの完全集合を使用し得る。しかしながら、１０１個のバイオマーカーの部分集合を使用してもよい。別の実施形態では、被験者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測したり、被験者に治療を割り当てるために１０１個の集合から選抜した少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００個のバイオマーカーの部分集合を使用してもよい。或いは、表１１からのバイオマーカーの全体集合を使用しても、８６個のバイオマーカーの少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０または７５個の部分集合を使用しても、またはバイオマーカーの“アップ”及び“ダウン”腕（表１１）の部分集合を使用してもよい。
【００８８】
サンプルを“予測される応答者”または“予測される非応答者”として分類することは上記した診断バイオマーカーと実質的に同様に実施し、テンプレートはサンプル中のいずれかのバイオマーカー発現レベルを比較するために作成する。
【００８９】
別の実施形態では、個体の治療応答を予測したり、治療を割り当てるために増殖因子経路レギュレーション状態を使用する上記方法は１０１個のバイオマーカーの２つの“腕”を使用する。“アップ”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってアップする遺伝子（表５ａを参照されたい）を含み、“ダウン”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってダウンする遺伝子（表５ｂを参照されたい）を含む。或いは、増殖因子経路レギュレーション状態を確認する上記方法は表１１にリストされている８６個のバイオマーカーの２つの“腕”、すなわち４４個の遺伝子（表１１を参照されたい）を含む“アップ”腕及び４２個の遺伝子（表１１を参照されたい）を含む“ダウン”腕を使用する。個体サンプルを標準または対照と比較する場合、サンプル中の遺伝子Ｘの発現値を標準または対照中の遺伝子Ｘの発現値と比較する。バイオマーカーの集合中の各遺伝子毎に、標準または対照と比較した個体サンプル中の発現値についてｌｏｇ（１０）比を得る。サイン“スコア”は、“アップ”中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比を求めた後、“ダウン”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比を減ずることにより計算する。サインスコアが所定閾値を超えているならば、サンプルは増殖因子シグナル伝達経路のデレギュレーションを有していると見なされる。所定閾値は０であり得、または標準または対照として使用したサンプルの集合またはプールしたサンプルのサインスコアの平均、メジアンまたはパーセント点であり得る。サインスコアが有意であるかを調べるために、２つの対立する腕中の遺伝子の発現値を相互に比較するＡＮＯＶＡ計算（例えば、両側ｔ検定、ウィルコクソン順位和検定、コルモゴルフ−スミルノフ検定等）を実施する。例えば、“アップ”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比が“ダウン”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比と有意に異なるかを調べるために両側ｔ検定を使用するならば、＜０．０５のｐ値は個体サンプル中のサインが標準または対照と有意に異なることを示す。代替実施形態では、表５ａからの６３個の“アップ”遺伝子の少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５及び６０個の部分集合及び表５ｂからの３８個の“ダウン”遺伝子の少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０及び３５個の部分集合をこのサインスコアを計算するために使用し得る。更に別の実施形態では、表１１からの４４個の“アップ”遺伝子の少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５及び４０個の部分集合及び表１１からの４２個の“ダウン”遺伝子の少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５及び４０個の部分集合をこのサインスコアを計算するために使用し得る。値がバイオマーカーの遺伝子の転写物アバンダンスの客観的測定値を表す限り、ｌｏｇ（１０）比以外の他の差次的発現値がサインスコアを計算するために使用され得ることを当業者は認識している。その例にはｘｄｅｖ、誤差加重ｌｏｇ（比）及び平均減法ｌｏｇ（強度）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
バイオマーカー集合を使用する上記方法は、表１３にリストされているバイオマーカーの集合を用いて解糖経路をモジュレートする物質に対する応答を予測すべく個体由来のサンプルを分析するためにも使用され得る。表１３中の３９個のバイオマーカーの全体集合または部分集合を使用してもよい。
【００９１】
バイオマーカーの使用は、癌関連状態についての増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答の予測に限定されず、遺伝子発現が役割を果たす各種の表現型、或いは臨床的または実験的状態において適用され得る。２つ以上の表現型に対応するバイオマーカーの集合が同定されたら、そのバイオマーカー集合を表現型を区別するために使用し得る。例えば、表現型は癌及び他の病的状態、または他の生理学的状態に関連する臨床状態の診断及び／または予後、増殖因子シグナル伝達経路以外の経路をモジュレートする物質に対する応答の予測であり得、発現レベルデータは特定の生理学的または病的状態に相関する遺伝子の集合から誘導される。
【００９２】
３．４．３  物質が増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするかを調べる方法
本発明は、被験者において増殖因子シグナル伝達経路を修飾またはモジュレートすると予測される物質を同定または評価するために有用なパイオマーカーの集合及び前記バイオマーカーの使用方法を提供する。「増殖因子シグナル伝達経路」はまず増殖因子（非限定的に、ヘレグリン、インスリン、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦが含まれる）が受容体チロシンキナーゼ（非限定的に、受容体のＥＲＢＢファミリーが含まれる）に結合することにより開始する。増殖因子がその対応する受容体に結合すると、受容体ダイマー化、主要チロシン残基のリン酸化、及び受容体の細胞内部分での幾つかのタンパク質の補充が生ずる。次いで、これらのタンパク質はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＲＡＳ／ＥＲＫやＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路のような幾つかの経路を介する細胞内シグナル伝達を開始し、これにより抗アポトーシスタンパク質の活性化及びプロアポトーシスタンパク質の不活性化が生ずる（Ｈｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，２００６，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１８：２０８９−２０９７において精査されている）。本明細書中、他の方法で特定されていない限り、「増殖因子シグナル伝達経路」は、外部増殖因子の膜チロシンキナーゼ受容体への結合により開始するＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路を介するシグナル伝達を指す。
【００９３】
「ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路」または「ＡＫＴシグナル伝達経路」としても公知の「ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路」は、増殖因子が受容体チロシンキナーゼに結合することにより活性化される細胞内シグナル伝達経路の１つを指す。活性化すると、ＰＩ３Ｋはホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスホネート（ＰＩＰ２）をホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェート（ＰＩＰ３）にリン酸化し、このプロセスはＰＴＥＮにより逆転する。ＰＩＰ３シグナルはキナーゼＰＤＫ１を活性化し、後者はキナーゼＡＫＴを活性化する。ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の説明のために図１も参照されたい（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達カスケードを精査するためにＨｅｎｎｅｓｓｙら，２００５，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，４：９８８−１００４も参照されたい）。加えて、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路はＲＡＳ経路のような他の細胞内シグナル伝達経路によってもモジュレートされ得、その結果増殖因子がその受容体に結合することにより活性化される細胞内シグナル伝達経路内で混線が生ずる。ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路には表１にリストされている遺伝子及びそれによりコードされるタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
増殖因子シグナル伝達経路に影響を及ぼす物質には小分子化合物；タンパク質またはペプチド（抗体を含む）；ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはミクロＲＮＡ分子；或いは増殖因子シグナル伝達経路または増殖因子シグナル伝達経路と相互作用する他のシグナル伝達経路（例えば、ＲＡＳ経路）内で機能する１つ以上の遺伝子またはタンパク質をモジュレートする他の物質が含まれる。
【００９５】
「増殖因子経路物質」は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達腕を介して増殖因子経路シグナル伝達をモジュレートする物質を指す。増殖因子経路インヒビターはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達腕を介する増殖因子経路シグナル伝達を抑制する。前記インヒビターの分子標的にはＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＰＤＫ１、ＭＹＣ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ２、及び表１にリストされている遺伝子が含まれ得る。前記物質は当業界で公知であり、その中にはホスファチジルイノシトールエーテルリピドアナログ、アルキルホスホリピドアナログ、アロステリックＡＫＴインヒビター、ＨＳＰ９０インヒビター、アルキルホスホリピドペリホシン、ラパマイシン、ＲＡＤ００１、ＦＴＹ７２０、ＰＤＫ１インヒビター（ＢＸ−７９５、ＢＸ−９１２及びＢＸ−３２０（Ｆｅｌｄｍａｎら，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：１９８６７−１９８７４）、７−ヒドロキシスタウロスポリン（Ｓａｔｏら，２００２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：１７２７−１７３８）、ＰＩ３Ｋインヒビター（ワートマニン（Ｗｙｍａｎｎら，１９９６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６：１７２２−１７３３）、ＬＹ２９４００２（Ｗｅｔｚｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｍｍｅｌ，２００４，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，１０：１９１５−１９２２）、ＩＣ８７１１４（Ｆｉｎａｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，３２：３７８−３８２；ＷＯ０１８１３４６、ＷＯ０１３７２５５７、ＵＳ６４０３５８８、ＷＯ０１４３２６６）、及びＡＫＴ抗体（Ｓｈｉｎら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６５：２８１５−２８２４を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない（ＡＫＴ経路のインヒビターを精査するためにＣｈｅｎｇら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５，２４：７４８２−７４９２も参照されたい）。増殖因子シグナル伝達経路バイオマーカーを同定し、細分するために使用した実施例セクションにリストされているインヒビター（すなわち、ＡＫＴ１／２インヒビターＬ−００１１５４５４７（’５４７；３−フェニル−２−（４−｛［４−（５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾル−３−イル）ピペリジン−１−イル］メチル｝フェニル）−１，６−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン；ＷＯ２００６０６５６０１に開示されている）、Ｌ−０１１７３９３１（’９３１；６−メチル−３−フェニル−２−（４−｛［４−（５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾル−３−イル）ピペリジン−１−イル］−メチル｝フェニル）−１，６−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン；ＷＯ２００６０６５６０１に開示されている）、γ−セクレターゼインヒビター４２１Ｂ（ＵＳ７，１３８，４００及びＷＯ０２／３６５５５）、ｃＭＥＴインヒビターＬ−００１５０１４（４−（６−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］［１，２，４］トリアジン−３−イルメチル）−フェノール；ＵＳ７，１２２，５４８も参照されたい）、ＭＫ−２４６１（Ｎ−［（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル］−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾル−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−６］ピリジン−７−イル］スルファミド）及びＬ−００１７９３２２５（１−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾル−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）メタンスルホンアミドも増殖因子経路物質の例である。
【００９６】
１つの実施形態では、効果を測定したり、物質が増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートするかを調べるための方法は、（１）物質で処理したサンプル中の表５ａ及び５ｂにリストされているバイオマーカーの発現のレベルをビヒクル処理サンプル中で観察される発現のレベルに相当する標準または対照中の同一バイオマーカーの発現のレベルと比較し；（２）処理したサンプル中のバイオマーカー関連ポリヌクレオチドのレベルがビヒクル処理した対照のレベルに比して有意な差があるかを確認することを含み、実質的な差がなければこの物質は増殖因子シグナル伝達経路のモジュレートしないと予測され、実質的な差があるならばこの物質は増殖因子シグナル伝達経路のモジュレートすると予測される。より具体的実施形態では、本発明は、物質の増殖因子シグナル伝達経路に対する効果を確認または調べるために使用され得る１０１個の集合から選抜した少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００個のバイオマーカーの部分集合を提供する。或いは、表１１からの８６個のバイオマーカーの全体集合を使用しても、８６個のバイオマーカーの少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０または７５個の部分集合を使用してもよい。
【００９７】
別の実施形態では、物質の増殖因子シグナル伝達経路に対する効果を判定する上記方法は１０１個のバイオマーカーの２つの“腕”を使用する。“アップ”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってアップする遺伝子（表５ａを参照されたい）を含み、“ダウン”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってダウンする遺伝子（表５ｂを参照されたい）を含む。或いは、“アップ”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってアップする表１１からの遺伝子を含み、“ダウン”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってダウンする表１１からの遺伝子を含む。個体サンプルを標準または対照と比較する場合、サンプル中の遺伝子Ｘの発現値を標準または対照中の遺伝子Ｘの発現値と比較する。バイオマーカーの集合中の各遺伝子毎に、標準または対照と比較した個体サンプル中の発現値のｌｏｇ（１０）比を求める。サイン“スコア”は“アップ”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比を求め、“ダウン”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比を減ずることにより計算する。サインスコアが所定閾値を超えているならば、サンプルは増殖因子シグナル伝達経路のデレギュレーションを有している（すなわち、物質は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする）と見なされる。所定閾値は０であり得、或いは標準または対照として使用されるサンプルの集合またはプールしたサンプルのサインスコアの平均、メジアンまたはパーセント点であり得る。サインスコアが有意であるかを判定するために、２つの対立する腕中の遺伝子の発現値を相互に比較するＡＮＯＶＡ計算（例えば、両側ｔ検定、ウィルコクソン順位和検定、コルモゴルフ−スミルノフ検定等）を実施する。例えば、“アップ”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比が“ダウン”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比に比して有意な差があるかを判定するために両側ｔ検定を使用するならば、＜０．０５のｐ値は個体サンプル中のサインが標準または対照とは有意に異なることを示す。或いは、“アップ”腕（表５ａを参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕（表５ｂを参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０または３５個のバイオマーカーの部分集合をこのサインスコアを計算するために使用してもよい。更に別の実施形態では、“アップ”腕から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のバイオマーカーの部分集合（表１１を参照されたい）及び“ダウン”腕から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のバイオマーカーの部分集合（表１１を参照されたい）をこのサインスコアを計算するために使用してもよい。値がバイオマーカーの遺伝子の転写物アバンダンスの客観的測定値を表す限り、ｌｏｇ（１０）比以外の他の差次的発現値がサインスコアを計算するために使用され得ることを当業者は認識している。その例にはｘｄｅｖ、誤差加重ｌｏｇ（比）及び平均減法ｌｏｇ（強度）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
バイオマーカー集合を使用する上記方法は、表１３にリストされているバイオマーカーの集合を用いて物質が解糖経路をモジュレートするかを確認するために個体からのサンプルを分析するためにも使用され得る。表１３中の３９個のバイオマーカーの全体集合または少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０または３５個の部分集合が使用され得る。
【００９９】
用語「解糖経路（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ）」または「解糖経路（ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）」は、１つのグルコース分子を２つのピルベート分子に分解して２つのＡＴＰを生成する酸素非依存性細胞エネルギー生成経路を指す。その後、ピルベートは解糖経路においてラクテートに還元される。酸素の存在下でピルベートはＨＣＯ３に酸化されると、グルコース１個あたり３６個の追加ＡＴＰが生ずる（酸化的リン酸化経路）。酸素の存在下でのグルコースの乳酸への変換は「好気的解糖」または「ワーブルグ効果」とも称されている。酸素の存在下での高い解糖は原発性及び転移性癌の特徴である（Ｇａｔｅｎｂｙ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｉｅｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，４：８９１−８９９；Ｌｏｐｅｚ−Ｌａｚａｒｏ，２００８，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８：３０５−３１２；Ｋｏｎｄｏｈ，２００８，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，３１４：１９２３−１９２８において精査されている）。
【０１００】
解糖経路に影響を及ぼす物質には小分子化合物；タンパク質またはペプチド（抗体を含む）；ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはミクロＲＮＡ分子；或いは解糖経路または解糖経路と相互作用する他の経路内で機能する１つ以上の遺伝子またはタンパク質をモジュレートする他の物質が含まれる。
【０１０１】
「解糖経路物質」は解糖経路をモジュレートする物質を指す。解糖インヒビターは解糖経路を抑制する。前記インヒビターの分子標的にはヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ピルベートキナーゼ、グルコーストランスポーターが含まれるが、これらに限定されない。前記物質は当業界で公知であり、この中にはロニダミン、３−ブロモピルベート、２−デオキシグルコース、イマチニブ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ阻害剤ＳＢ−２０４９９０、オキシチアミン、ゲニステイン、５−チオグルコース、マンノヘプツロース、α−クロロヒドリン、オルニダゾール、グルフォスファミド、ヒ素化合物、オキサマート、ヨードアセテート、ビスホスホネート、ツベルシジン、並びにＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼポンプインヒビター、ＧＬＵＴインヒビター、３−（３−ピリジニル）−１−（４−ピリジニル）−２−プロペン−１−オン、ジクロロアセテート（Ｌｏｐｅｚ−Ｌａｚａｒｏ，２００８，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８：３０５−３１２；Ｃｌｅｍら，２００８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，７：１１０−１２０；Ｂｏｎｎｅｔら，２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１１：３７−５１において精査されている）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
バイオマーカー集合を使用する上記方法は物質のバイオマーカー集合または部分集合に対する効果に従って前記物質を順位付けるためにも使用され得る。例えば、物質はバイオマーカー集合または部分集合中の差次的発現値（例えば、バイオマーカーの集合または部分集合の平均発現値、またはサインスコア）において誘導される変化に従って順位付けられ得る。候補物質は問題の特定経路を修飾することが公知の物質と比較することによっても順位付けられ得る。
【０１０３】
３．４．４  物質の薬力学的効果の測定方法
本発明は、増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的効果を判定するために有用なバイオマーカーの集合を提供する。提供されるバイオマーカーは患者またはサンプルにおいて物質で治療してからのいろいろな時点での増殖因子シグナル伝達経路のモジュレーションをモニターするために使用され得る。よって、本発明は、更に増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質の有効性の早期評価として上記バイオマーカーを使用する方法を提供する。１つの実施形態では、本発明は、（１）物質で処理したサンプル中の表５ａ及び５ｂにリストされているバイオマーカーの発現のレベルをビヒクル処理サンプルにおいて観察される発現のレベルに相当する標準または対照中の同一バイオマーカーの発現のレベルと比較し；（２）処理サンプル中のバイオマーカー関連ポリヌクレオチドのレベルがビヒクル処理対照中のレベルに比して有意な差があるかを調べることを含む患者またはサンプル中の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質の薬力学的効果を判定するための方法を提供し、実質的な差が見られないならば当該物質は増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的効果を有していないと予測され、実質的な差が見られたなら当該物質は増殖因子シグナル伝達経路に対して薬力学的効果を有していると予想される。より具体的実施形態では、本発明は、増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的活性をモニターするために使用され得る１０１個の集合から選抜した少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００個のバイオマーカーの部分集合を提供する。更に別の実施形態では、増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的活性をモニターするために表１１にリストされている８６個のバイオマーカーの集合を使用しても、また８６個の集合から選抜した少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０または８０個のバイオマーカーの部分集合を使用してもよい。
【０１０４】
別の実施形態では、増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的活性を測定する上記方法は１０１個のバイオマーカーの２つの“腕”を使用する。“アップ”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってアップする遺伝子（表５ａを参照されたい）を含み、“ダウン”腕はその発現が増殖因子経路活性化に伴ってダウンする遺伝子（表５ｂを参照されたい）を含む。或いは、薬力学的活性を測定する上記方法は表１１にリストされている８６個のバイオマーカーの２つの“腕”、すなわち４４個の遺伝子（表１１を参照されたい）を含む“アップ”腕及び４２個の遺伝子を含む“ダウン”腕（表１１を参照されたい）を使用する。個体サンプルを標準または対照と比較する場合、サンプル中の遺伝子Ｘの発現値を標準または対照中の遺伝子Ｘの発現値と比較する。バイオマーカーの集合中の各遺伝子毎に、標準または対照に対する個体サンプル中の発現値についてのｌｏｇ（１０）比を求める。サイン“スコア”は、“アップ”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比を求め、“ダウン”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比を減ずることにより計算する。サインスコアが所定閾値を超えているならば、サンプルは増殖因子シグナル伝達経路のデレギュレーションを有していると見なされる。所定閾値は０であり得、或いは標準または対照として使用したサンプルの集合またはプールしたサンプルのサインスコアの平均、メジアンまたはパーセント点であり得る。サインスコアが有意であるかを確認するために、２つの対立する腕中の遺伝子の発現値を相互に比較するＡＮＯＶＡ計算（例えば、両側ｔ検定、ウィルコクソン順位和検定、コルモゴルフ−スミルノフ検定等）を実施する。例えば、“アップ”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比が“ダウン”腕中の遺伝子の平均ｌｏｇ（１０）比と有意に異なるかを調べるために両側ｔ検定を使用するならば、＜０．０５のｐ値は個体サンプル中のサインが標準または対照と有意に異なることを示す。或いは、“アップ”腕（表５ａを参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕（表５ｂを参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０または３５個のバイオマーカーの部分集合をこのサインスコアを計算するために使用してもよい。更に別の実施形態では、“アップ”腕（表１１を参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のバイオマーカーの部分集合及び“ダウン”腕（表１１を参照されたい）から選抜した少なくとも３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のバイオマーカーの部分集合をこのサインスコアを計算するために使用してもよい。値がバイオマーカーの遺伝子の転写物アバンダンスの客観的測定値を表す限り、ｌｏｇ（１０）比以外の他の差次的発現値をサインスコアを計算するために使用し得ることを当業者は認識している。その例にはｘｄｅｖ、誤差加重ｌｏｇ（比）及び平均減法ｌｏｇ（強度）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
バイオマーカー集合を使用する上記方法は、表１３にリストされているバイオマーカーの集合を用いて解糖経路に対する物質の薬力学的効果を判定すべく個体からのサンプルを分析するために使用され得る。表１３中の３９個のバイオマーカーの全体集合または部分集合が使用され得る。
【０１０６】
バイオマーカーの使用は癌関連状態についての増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的効果を判定することに限定されず、遺伝子発現が役割を発揮する各種の表現型、或いは臨床的または実験的状態においても適用され得る。２つ以上の表現型に対応するバイオマーカーの集合が同定されたら、これらの表現型を区別するためにバイオマーカー集合が使用され得る。例えば、癌及び他の病的状態、或いは他の生理的状態に関連する臨床状態、または表現型の診断及び／または予後、増殖因子シグナル伝達経路以外の経路をモジュレートする物質に対する応答の予測であり得、発現レベルデータは特定の生理的状態または病的状態に相関している遺伝子の集合から誘導される。
【０１０７】
３．４．５  発現レベル差に対する感度の向上
本明細書中に開示されているバイオマーカーを使用すると、実際１つの表現型を有する個体または被験者を第２の表現型を有する別の個体または被験者と区別するためにバイオマーカーの集合を使用すると、サンプル中の各バイオマーカーの絶対発現を対照と比較することができる。例えば、対照はそれぞれ個体または被験者のプール中の各バイオマーカーの発現の平均レベルであり得る。しかしながら、比較の感度を向上させるために、発現レベル値を多数の方法で変換することが好ましい。
【０１０８】
例えば、バイオマーカーの各々の発現レベルはその発現レベルを測定するすべてのマーカーの平均発現レベルにより、または対照遺伝子の集合の平均発現レベルにより正規化され得る。よって、１つの実施形態では、バイオマーカーをマイクロアレイ上のプローブにより表され、バイオマーカーの各々の発現レベルは非バイオマーカー遺伝子を含めてマイクロアレイ上に表される遺伝子のすべてで平均またはメジアン発現レベルにより正規化される。具体的実施形態では、正規化はマイクロアレイ上のすべての遺伝子の発現のメジアンまたは平均レベルを分割することにより実施される。別の実施形態では、バイオマーカーの発現レベルは対照バイオマーカーの集合の発現の平均またはメジアンレベルにより正規化される。具体的実施形態では、対照バイオマーカーはハウスキーピング遺伝子の集合を含む。別の具体的実施形態では、正規化は対照遺伝子のメジアンまたは平均発現レベルにより分割することにより実施される。
【０１０９】
バイオマーカーをベースとするアッセイの感度は、個々のバイオマーカーの発現レベルをサンプルのプール中の同一バイオマーカーの発現と比較するならば向上させ得る。好ましくは、比較はサンプルのプール中の各バイオマーカー遺伝子の各々の平均またはメジアン発現レベルに対してなされる。前記比較は、例えばサンプル中の各バイオマーカーの発現レベルからバイオマーカーの各々についてのプールの平均またはメジアン発現レベルで割ることによりなされ得る。これは、サンプル中のバイオマーカーとプール中のマーカー間の発現の相対差を全体的に強調して、絶対発現レベルのみを使用するよりも比較をより高感度とし、有意義な結果を与える可能性が増える効果を有している。発現レベルデータは便利な方法で変換され得る。好ましくは、すべてについての発現レベルデータを平均またはメジアンをとる前にｌｏｇ変換する。
【０１１０】
プールに対する比較を実施する場合２つのアプローチを使用し得る。第１は、サンプル中のマーカーの発現レベルをプール中の前記マーカーの発現レベルと比較し得、１つの実験中にサンプル由来の核酸及びプール由来の核酸をハイブリダイズする。このアプローチは、各比較または限定数の比較のために新しいプール核酸を生成する必要があり、従って利用可能な核酸の量により制限される。或いは、正規化及び／または変換されているか否かにかかわらず、プール中の発現レベルをサンプルからの個々の発現レベルデータ（すなわち、単チャネルデータ）と比較する際に使用しようとするコンピューターまたはコンピューター読み取り可能媒体に記憶させる。これが好ましい。
【０１１１】
よって、本発明は、第１の細胞または生物を少なくとも２つの第１表現型及び第２表現型からなる異なる表現型の１つを有するとして分類する以下の方法を提供する。第１細胞または生物由来の第１サンプル中の複数の遺伝子の各々の発現レベルをそれぞれ複数の細胞または生物由来のプールしたサンプル中の前記遺伝子の各々の発現レベルと比較して第１の比較値を得る。前記した複数の細胞または生物は少なくとも２つの異なる表現型を示すいろいろな細胞または生物からなる。次いで第１の比較値を、第１表現型を有すると特徴づけられた細胞または生物由来のサンプル中の遺伝子の各々の発現レベルをそれぞれプールしたサンプル中の前記遺伝子の各々の発現レベルと比較することを含む方法の結果である第２の比較値と比較する。次いで、第１比較値を、第２表現型を有すると特徴づけられた細胞または生物由来のサンプル中の遺伝子の各々の発現レベルをそれぞれプールしたサンプル中の前記遺伝子の各々の発現レベルと比較することを含む方法の結果である第３比較値と比較する。場合により、第１比較値をそれぞれ、第１及び第２表現型と異なるが、少なくとも２つの異なる表現型の中に含まれる表現型を有すると特徴づけられた細胞または生物由来のサンプル中の遺伝子の各々の発現レベルをそれぞれプールしたサンプル中の前記遺伝子の各々の発現レベルと比較することを含む方法の結果である追加の比較値と比較してもよい。最後に、第２、第３及び存在するならば１つ以上の追加の比較値のいずれかが第１比較値に最も類似しているかを判定し、第１細胞または生物が第１比較値に最も類似している比較値を得るために使用される細胞または生物の表現型を有していると確認される。
【０１１２】
この方法の具体的実施形態では、比較値は前記遺伝子の各々の発現レベルの各比である。別の具体的実施形態では、比較ステップの前にプールしたサンプル中の各遺伝子の発現レベルの各々を正規化する。より具体的実施形態では、発現レベルの正規化は、遺伝子の各々の発現の平均またはメジアンレベルで割ることにより、または細胞または生物由来のプールしたサンプル中の１つ以上のハウスキーピング遺伝子の発現の平均またはメジアンレベルで割ることにより実施される。別の具体的実施形態では、発現の正規化レベルをｌｏｇ変換にかけ、比較ステップはサンプル中の各遺伝子の発現レベルのｌｏｇからｌｏｇ変換を減ずることを含む。別の具体的実施形態では、２つ以上の異なる表現型は増殖因子シグナル伝達経路の異なるレギュレーション状態である。更に別の具体的実施形態では、２つ以上の異なる表現型は増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質での治療に対する異なる予想される応答である。更に別の具体的実施形態では、それぞれプールしたサンプル中の各遺伝子の発現レベル、または第１表現型、第２表現型、或いは第１及び第２表現型とは異なる表現型を有するとして特徴づけられた細胞または生物由来のサンプル中の各遺伝子の発現レベルをコンピューターまたはコンピーター−読み取り可能媒体に記憶させる。
【０１１３】
別の具体的実施形態では、２つの表現型はデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態である。別の具体的実施形態では、２つの表現型は予想される増殖因子シグナル伝達経路物質応答者状態である。更に別の具体的実施形態では、２つの表現型は増殖因子シグナル伝達経路に対する物質の薬力学的効果の有無である。
【０１１４】
別の具体的実施形態では、２つの表現型は活性化または非活性化解糖経路状態である。別の具体的実施形態では、２つの表現型は予測される解糖経路物質応答者状態である。更に別の具体的実施形態では、２つの表現型は解糖経路に対する物質の薬力学的効果の有無である。
【０１１５】
別の具体的実施形態では、比較はサンプル中の各遺伝子の発現と２つ以上の表現型の１つのみを表すプール中の同一遺伝子の発現間でなされる。増殖因子シグナル伝達経路状態相関遺伝子の関係で、例えばサンプル中の増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態関連遺伝子の発現レベルをサンプルの“デレギュレートされている”プール（レギュレート及びデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有する患者からのサンプルを含むサンプルのプールとは対照的）中の同一遺伝子の発現の平均レベルと比較することができる。よって、この方法では、予後相関遺伝子の発現レベルが平均“デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路”発現プロファイル（すなわち、“デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態”を有する患者からのサンプルのプール中の増殖因子シグナル伝達経路状態相関遺伝子の発現レベル）に対する選択した相関係数を超えているならば、サンプルはデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有するとして分類される。その発現レベルが“デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路”発現プロファイルと余り相関していない（すなわち、その相関係数が選択した係数を超えていない）患者または被験者はレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有するとして分類される。
【０１１６】
勿論、１チャネルデータを算術サンプルプールと具体的に比較することなく使用してもよい。例えば、第１及び第２表現型が関連している場合、（ａ）サンプル由来の核酸を蛍光基で標識して蛍光基標識核酸のプールを得；（ｂ）蛍光基標識核酸をハイブリダイゼーションが起こり得る条件下でマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ上の複数の不連続位置の各々で前記条件下でマイクロアレイに結合している蛍光基標識核酸からの蛍光発光シグナルを検出し；（ｃ）個々のサンプル中のマーカー遺伝子発現の第１及び第２テンプレートに対する類似性を調べて、前記発現が第１テンプレートにより類似しているならばサンプルを第１表現型を有しているとして分類し、前記表現が第２テンプレートにより類似しているならばサンプルは第２表現型を有しているとして分類することにより、サンプル中の第１または第２表現型と相関している少なくとも５個のマーカーの発現と第１表現型テンプレート及び第２表現テンプレート中の同一マーカーの発現間の類似性を計算することにより、サンプルを第１または第２表現型を有するとして分類し得る。
【０１１７】
３．４．６  発現プロファイルの分類方法
好ましい実施形態では、本発明の方法は、サンプルの増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を予測するために、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答を予測するために、被験者に治療を割り当てるために及び／または前記物質の薬力学的効果を調べるために分類子を使用する。分類子はバイオマーカープロファイルを含む入力を受け取り、いずれの患者部分集合が患者に属するかを示すデータを含む出力を与える適切なパターン認識方法に基づき得る。分類子は被験者の訓練集団からの訓練データを用いて訓練され得る。典型的には、訓練データは訓練集団中の各被験者毎に患者から採取した適当なサンプル中の複数の遺伝子のそれぞれの遺伝子産物の測定値を含む訓練マーカープロファイル及び出力情報、すなわちデレギュレートまたはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を含む。
【０１１８】
好ましい実施形態では、分類子は下記する分類（パターン認識）方法、例えばプロファイル類似性、人工ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）、ロジック回帰、線形及び二次判別分析、決定木、クラスタリング、主成分分析、最近傍分類子分析（上記）に基づき得る。前記分類子は上の関連セクションに記載した方法を用いて訓練集団で訓練され得る。
【０１１９】
バイオマーカープロファイルは、上記した方法のような当業界で公知の方法を用いて被験者からの細胞サンプル中の複数の遺伝子産物を測定することにより得られ得る。
【０１２０】
各種公知の統計パターン認識方法が本発明と一緒に使用され得る。上記方法に基づく分類子はバイオマーカープロファイル及び訓練患者の増殖因子経路シグナル伝達状態データを用いて構築され得る。次いで、前記分類子は患者のバイオマーカープロファイルに基づいて患者の増殖因子経路シグナル伝達状態を評価するために使用され得る。前記方法は、バイオマーカープロファイル及び訓練患者の増殖因子シグナル伝達経路レギュレーションデータを用いて異なる増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を判別するバイオマーカーを同定するためにも使用され得る。
【０１２１】
Ａ．プロファイルマッチング
被験者は、被験者からの適当なサンプル中で得たバイオマーカープロファイルを特定の表現型状態を表すバイオマーカープロファイルと比較することにより分類され得る。前記マーカープロファイルは「テンプレートプロファイル」または「テンプレート」とも称される。テンプレートプロファイルに対する類似度により被験者の表現型が評価される。被験者マーカープロファイルとテンプレートプロファイルの類似度が所定閾値を超えているならば、被験者はテンプレートで表される分類に割り当てられる。例えば、被験者の出力予測を被験者のバイオマーカープロファイルを所与の表現型または出力に対応する所定テンプレートプロファイル（例えば、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態の腫瘍を有する複数の被験者中のバイオマーカーのレベルを代表する複数のバイオマーカーの測定値を含む増殖因子シグナル伝達経路テンプレート）と比較することにより評価され得る。
【０１２２】
１つの実施形態では、類似性は被験者のプロファイルとテンプレート間の相関係数により表される。１つの実施形態では、相関閾値を超える相関係数は高い類似性を示し、閾値を下回る相関係数は低い類似性を示す。
【０１２３】
具体的実施形態では、Ｐｉは被験者のプロファイル
【数２１】
2011515088.tif 000029
と特定の出力または表現型（例えば、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態
【数２２】
2011515088.tif 000030
またはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態
【数２３】
2011515088.tif 000031
）を有する被験者中のマーカー遺伝子産物の測定値を代表するマーカー遺伝子産物の測定値を含むテンプレートプロファイル間の類似性を調べる。前記係数Ｐ１は以下の方程式：
【数２４】
2011515088.tif 000032
（ここで、ｉは第ｉテンプレートを指す）
を用いて計算され得る。よって、１つの実施形態では、Ｐ１が選択した相関閾値を超えているならば
【数２５】
2011515088.tif 000033
はデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類される。別の実施形態では、Ｐ１が選択した相関閾値を超えているならば
【数２６】
2011515088.tif 000034
はレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルして分類される。好ましい実施形態では、相関閾値は０．３、０．４、０．５または０．６として設定される。別の実施形態では、Ｐ１がＰ２を超えているならば
【数２７】
2011515088.tif 000035
はデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類され、Ｐ１がＰ２未満ならば
【数２８】
2011515088.tif 000036
はレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路プロファイルとして分類される。
【０１２４】
別の実施形態では、相関係数は、各々の異なるマーカーの測定値に重みが割り当てられている患者のプロファイル
【数２９】
2011515088.tif 000037
とテンプレートプロファイルの重み付き内積である。
【０１２５】
別の実施形態では、患者のプロファイルとテンプレート間の類似性は患者のプロファイルとテンプレート間の距離により表される。１つの実施形態では、所与の値以下の距離は高い類似性を示し、所与の値以上の距離は低い類似性を示す。
【０１２６】
１つの実施形態では、式
【数３０】
2011515088.tif 000038
［ここで、Ｄｉは被験者のプロファイル
【数３１】
2011515088.tif 000039
と特定の増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態を有する被験者中のマーカー遺伝子産物の測定値を代表するマーカー遺伝子産物の測定値（例えば、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路
【数３２】
2011515088.tif 000040
またはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路テンプレート
【数３３】
2011515088.tif 000041
）を含むテンプレートプロファイル間の距離を測定する］
に従うユークリッド距離を使用する。他の実施形態では、ユークリッド距離は更に離れている細胞成分上に漸増する重みを置くために平方する。代替実施形態では、距離測定値Ｄｉは
【数３４】
2011515088.tif 000042
（ここで、ｙ（ｎ）及びｚｉ（ｎ）はそれぞれ被験者のプロファイル
【数３５】
2011515088.tif 000043
及びテンプレートプロファイル中の第ｎ遺伝子産物の測定値である）
により与えられるマンハッタン距離である。
【０１２７】
別の実施形態では、距離はＤｉ＝１−Ｐｉ（ここで、Ｐｉは上記した相関係数または正規化された内積である）として定義される。
【０１２８】
更に他の実施形態では、距離測定値は、いずれも当業界で公知のチェビシェフ距離、パワー距離及びパーセント不一致であり得る。
【０１２９】
Ｂ．人工ニユーラルネットワーク
幾つかの実施形態では、ニューラルネットワークを使用する。ニューラルネットワークは本発明の分子マーカーの選択した集合に対して構築される。ニューラルネットワークは２段階回帰または分類モデルである。ニューラルネットワークは出力ユニットの層に対して重みの層により結合させた入力ユニットの層（及びバイアス）を含む層状構造を有する。回帰のために、出力ユニットの層は典型的にはたった１つの出力ユニットを含む。しかしながら、ニューラルネットワークはシームレス様式で複数の定量応答を扱うことができる。
【０１３０】
多層ニューラルネットワークには、入力ユニット（入力層）、隠れユニット（隠れ層）及び出力ユニット（出力層）がある。更に、入力ユニット以外の各ユニットに結合されている１つのバイアスユニットがある。ニューラルネットワークはＤｕｄａら，２００１，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；及びＨａｓｔｉｅら，２００１，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１３１】
ニューラルネットワークを使用するための基本的アプローチは訓練されていないネットワークから始め、訓練パターン（例えば、訓練患者由来のバイオマーカープロファイル）を入力層に対して存在させ、ネットを介してシグナルを通し、出力（例えば、訓練患者における増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態）を出力層で確認することである。次いで、これらの出力を標的値と比較する。違いは誤差に相当する。この誤差または判定関数は重みの幾つかのスカラー関数であり、ネットワーク出力が所望出力に匹敵するときに最小化される。よって、重みは誤差を減らすように調節される。回帰の場合、この誤差は二乗和誤差であり得る。分類の場合、この誤差は二乗誤差またはクロスエントロピー（偏差）であり得る。例えば、Ｈａｓｔｉｅら，２００１，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０１３２】
３つの一般的に使用されている訓練プロトコルは確率的、バッチ及びオンラインである。確率的訓練では、パターンは訓練集合からランダムに選択され、ネットワーク重みを各パターンプレゼンテーション毎に更新する。確率的逆伝播法のような勾配降下方法により訓練された多層非線形ネットワークはネットワークトポロジーにより規定されるモデルにおいて重み値の最尤法を実施する。バッチ訓練では、学習を実施する前にすべてのパターンをネットワークに提示する。典型的には、バッチ訓練では、幾つかのパスを訓練データにより作成する。オンライン訓練では、各パターンを１度、たった１度ネットに提示する。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、重みに対する出発値を考慮する。重みがほぼゼロならば、ニューラルネットワークの隠れ層において通常使用されているシグモイドの操作部分（例えば，Ｈａｓｔｉｅら，２００１，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）は大体線形であり、よってニューラルネットワークはほぼ線形モデルに壊れる。幾つかの実施形態では、重みに対する出発値はゼロに近いランダム値であるように選択される。モデルはほぼ線形から出発し、重みが増えるにつれて非線形となる。必要ならば、個々のユニットを方向に局在させ、非線形性を導入する。正確にゼロの重みを使用すると、ゼロ微分及び完全対称となり、アルゴリズムは動かない。或いは、より大きな重みで出発すると、しばしば解は乏しい。
【０１３４】
入力のスケーリングは底層において重みの効果的スケーリングを決定するので、最終解の質に対して大きな影響を有し得る。よって、幾つかの実施形態では、手始めに、平均ゼロ及び標準偏差１を有するようにすべての発現値を標準化する。こうすると、すべての入力が正則化プロセスにおいて等しく処理され、ランダムな出発重みに対する有意義な範囲を選択することができる。標準化入力で、典型的には範囲［−０．７，＋０．７］でランダムな均一の重みを取る。
【０１３５】
隠れ層を有するネットワークの使用における再発する問題はネットワーク中に使用するための隠れユニットの最適数である。ネットワークの入力及び出力の数は解決すべき問題により決定される。本発明では、所与のニューラルネットワークに対する入力の数は本発明の分子マーカーの選択した集合中の分子マーカーの数であり得る。ニューラルネットワークに対する出力の数は典型的にはちょうど１である。しかしながら、幾つかの実施形態では、ちょうど２つ以上が状態がネットワークにより規定され得るように２つ以上の出力を使用する。ニューラルネットワークにおいてあまり多い隠れユニットを使用すると、ネットワークは多すぎる自由度を有し、余りに長く訓練され、ネットワークがデータを過剰適合する危険がある。隠れユニットが余りに少ないと、訓練集合は学習され得ない。しかしながら、概して、余りに少ないよりもかなり多い隠れユニットを有することがベターである。隠れユニットが余りに少ないと、モデルはデータ中の非線形を捕らえるのに十分な融通性を有していない。隠れユニットが余りに多いと、下記する適切な正則化または剪定を使用するならば過剰の重みはゼロに向かって収縮され得る。典型的な実施形態では、隠れユニットの数は５〜１００の範囲にあり、数は入力の数及び訓練ケースの数と共に増加する。
【０１３６】
使用しようとする隠れユニットの数を決定する１つの一般的アプローチは正則化アプローチを適用することである。正則化アプローチでは、古典的訓練誤差だけでなく、分類子の複雑さにも依存する新しい評価関数を構築する。具体的には、新しい評価関数が非常に複雑なモデルにペナルティーを課す。この評価における最小についての検索は訓練集合の誤差を訓練集合＋正則化期間の誤差のバランスを取り、解決の制約または所望特性を表すことである。
Ｊ＝Ｊｐａｔ＋λＪｒｅｇ
パラメーターλは正則化をより強くまたはより弱く付与するように調節される。換言すると、λの値が大きいと、重みはゼロに向かって収縮する傾向にある。典型的には、確認集合との交差検定がλを推定するために使用される。この検定は、訓練集団のランダム部分集合を除外して設定することにより得られ得る。ペナルティーの他の形、例えば重み除去ペナルティー（例えば、Ｈａｓｔｉｅら，２００１，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）も使用され得る。
【０１３７】
使用しようとする隠れユニットの数を決定するための別のアプローチは最小必要な重みを除外する、すなわち剪定することである。１つのアプローチで、最小のマグニチュードを有する重みを除外する（ゼロに設定する）。このマグニチュードに基づく剪定を実施し得るが、最適ではない。時には、小さいマグニチュードを有する重みが学習及び訓練データのために重要である。幾つかの実施形態では、マグニチュードに基づく剪定アプローチよりもむしろＷａｌｄ統計量を計算する。Ｗａｌｄ統計量における基本的考えは、モデル中の隠れユニット（重み）の重要性を推定するために使用され得ることである。次いで、最小の重要性しか有さない隠れユニットを（入力及び出力重みをゼロに設定することにより）排除する。これに関する２つのアルゴリズムは、どの程度の訓練誤差が重みに依存するかを予測し、訓練誤差において最小の増加をもたらす重みを排除するために二次近似を用いるＯｐｔｉｍａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｄａｍａｇｅ（ＯＢＤ）及びＯｐｔｉｍａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｓｕｒｇｅｏｎ（ＯＢＳ）アルゴリズムである。
【０１３８】
Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｄａｍａｇｅ及びＯｐｔｉｍａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｓｕｒｇｅｏｎは、重みｗでネットワークを局所最小誤差に訓練した後、訓練誤差において最小の増加しかもたらさない重みを剪定する同一の基本的アプローチを共有している。全重みベクターδｗにおける変化に対する誤差の予想される関数増加は
【数３６】
2011515088.tif 000044
（ここで、
【数３７】
2011515088.tif 000045
はヘッセ行列である）
である。我々は誤差が極小であるので第１項は存在しなくなり、第３項及びそれ以上の項は無視される。１つの重みを削除する制約を与えられたこの関数を最小限とするための一般的な解決は
【数３８】
2011515088.tif 000046
である。ここで、ｕｑは重み空間における第ｑ方向に沿ったユニットベクターであり、Ｌｑは重みｑの顕著性に対する近似であり、重みｑが剪定され、他の重みがδｗに更新されれば、訓練誤差は増加する。これらの方程式はＨの逆を必要とする。この逆行列を計算するための１つの方法は小さい値Ｈ０−１＝α−１Ｉ（ここで、αは小さいパラメーターである）から始め、効果的に重みを一定とする。次いで、行列を
【数３９】
2011515088.tif 000047
に従って各パータンで更新する。ここで、下付き文字は提示されるパターンに相当し、αｍはｍと共に減少する。全体訓練集合を提示したら、逆ヘッセ行列はＨ−１＝Ｈｎ−１により与えられる。アルゴニズムフォームでは、Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｓｕｒｇｅｏｎ方法は、
まずｎＨ、ｗ、θを初期化する、
かなり大きいネットワークを最小誤差まで訓練する；
Ｊ（ｗ）＞θまで、方程式１
【数４０】
2011515088.tif 000048
によりＨ−１を計算する；
ｗを戻す；
終了する。
【０１３９】
Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｄａｍａｇｅ方法は、行３における逆ヘッセ行列は対角行列の場合特に簡単であるのでコンピュータでより簡単であるる。誤差がθに初期化した基準を超えたときに上記アルゴリズムを中止する。別のアプローチは、重みの除外のためにＪ（ｗ）の変化が幾つかの基準値を超えたときには中止するために行６を変化させることである。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、ＥａｓｙＮＮ−Ｐｌｕｓバージョン４．０ｇソフトウェアパッケージ（Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｌａｎｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）中に見られる１０個のニューロン（１０個の隠れユニット）の１つの隠れ層を含む逆伝播ニューラルネットワーク（例えば、Ａｂｄｉ，１９９４，“Ａ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｐｒｉｍｅｒ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｙｓｔｅｍ．，２，２４７−２８３を参照されたい）を使用する。具体例では、ＥａｓｙＮＮ−Ｐｌｕｓプログラム内のパラメーター値は、学習速度０．０５、モメンタム０．２に設定する。ＥａｓｙＮＮ−Ｐｌｕｓバージョン４．０ｇソフトウェアパッケージを使用する幾つかの実施形態では、“外れ値”サンプルを各々２０，０００学習サイクルを含む２０回の独立してシードしたトライアルを実施することにより同定する。
【０１４１】
Ｃ．サポートベクターマシン
本発明の幾つかの実施形態では、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は本発明において記載されているマーカー遺伝子の発現プロファイルを用いて被験者を分類するために使用される。ＳＶＭの一般的記載は、例えばＣｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ  ａｎｄ  Ｓｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ，２０００，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｂｏｓｅｒら，１９９２，“Ａ  ｔｒａｉｎｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｍａｒｇｉｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒｓ”，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  ＡＣＭ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｈｅｏｒｙ，ＡＣＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ｐ．１４２−１５２；Ｖａｐｎｉｋ，１９９８，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｈｅｏｒｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｄｕｄａ，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；Ｈａｓｔｉｅ，２００１，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；及びＦｕｒｅｙら，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１６：９０６−９１４中に見つけることができる。生物学的用途におけるＳＶＭの適用はＪａａｋｋｏｌａら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＡＡＡＩ  Ｐｒｅｓｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ（１９９９）；Ｂｒｏｗｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７（ｌ）：２６２−６７（２０００）；Ｚｉｅｎら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１６（９）：７９９−８０７（２０００）；Ｆｕｒｅｙら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１６（１０）：９０６−９１４（２０００）に記載されている。
【０１４２】
１つのアプローチで、ＳＶＭを使用する場合、遺伝子発現データを平均ゼロ及び単位分散を有するように標準化し、訓練母集団のメンバーを訓練集合及び試験集合にランダムに分ける。例えば、１つの実施形態では、訓練母集団のメンバーの２／３を訓練集合に配置し、訓練母集団のメンバーの１／３を試験集合に配置する。本発明の遺伝子の選択した集合についての発現値をＳＶＭを訓練するために使用する。次いで、訓練したＳＶＭが試験集合中のメンバーを正しく分類することができるかを調べる。幾つかの実施形態では、この計算を分子マーカーの所与の選択した集合に対して数回実施する。前記計算の各反復で、訓練母集団のメンバーは訓練集合及び試験集合にランダムに割り当てられる。次いで、分子マーカーの組合せの質をＳＶＭ計算の各反復の平均として取る。
【０１４３】
サポートベクターマシンはバイナリー標識した訓練データの所与の集合を高次元特徴空間にマッピングし、最大境界超平面で２つのデータのクラスを分離する。一般的に、この超平面は入力空間中の非線形決定境界に相当する。Ｘ∈Ｒ０∈Ｒｎを入力ベクターとし、ｙ∈｛−１，＋１｝を標識とし、φ：Ｒ０→Ｆを入力空間から特徴空間へのマッピングとする。次いで、ＳＶＭ学習アルゴリズムは、量
【数４１】
2011515088.tif 000049
（ここで、ベクターｗはＦと同じ次元を有し、ｂは実数であり、γは境界と呼ばれる）
が最大であるような超平面（ｗ，ｂ）を見つける。この場合、対応する決定関数は
【数４２】
2011515088.tif 000050
である。
【０１４４】
この最小は、
【数４３】
2011515088.tif 000051
（ここで、｛αｉ｝は
【数４４】
2011515088.tif 000052
を最大とする正の実数である）
を
【数４５】
2011515088.tif 000053
にかけると生ずる。
【０１４５】
決定関数は、
【数４６】
2011515088.tif 000054
として等しく表示され得る。
【０１４６】
この方程式から、訓練ポイントＸｉに関連するαｉはそのポイントが最終決定関数に埋め込まれる強度を表すと考えられ得る。この代替表示の顕著な性質は、ポイントの部分集合のみが非ゼロαｉに関連していることである。これらのポイントはサポートベクターと呼ばれ、離れている超空間の最も近くにあるポイントである。αベクターのまばらさは幾つかの計算及び学習理論結果である。学習アルゴリズムも決定関数もイメージ＜φ（Ｘｉ），φ（Ｘｊ）＞間の内積のみを使用しているので、いずれもが特徴空間φ（Ｘｉ）中のポイントのイメージを明示するために必要でないことに注目することは重要である。関数Ｋ（Ｘ，Ｙ）＝＜φ（Ｘ），φ（Ｘ）＞を仮定したら、マッピングを明確に実施しなくとも特徴空間中の最大境界超空間を学習し、使用することができる。各々の連続する正の一定関数Ｋ（Ｘ，Ｙ）毎に、すべてのＸ，Ｙ∈Ｒ０についてＫ（Ｘ，Ｙ）＝＜φ（Ｘ），φ（Ｘ）＞であるようなマッピングφが存在する（マーセルの定理）。関数Ｋ（Ｘ，Ｙ）はカーネル関数と呼ばれる。カーネル関数を使用すると、空間の次元により悪影響を受けることなくサポートベンターマシンを非線形高次元特徴空間で効果的に操作することができる。事実、無限次元の特徴空間で作業することができる。更に、マーセルの定理により、φ及びＦを知らなくても特徴空間において学習することができる。行列Ｋｉｊ＝＜φ（Ｘｉ），φ（Ｘｊ）＞はカーネル行列と呼ばれる。最後に、学習アルゴリズムは大域最適のみを有する２次最適化問題であることに留意されたい。極小の不在がニューラルネットワークのような標準パターン認識技術との有意な違いである。中程度のサンプルサイズの場合、最適化問題は単純勾配降下技術で解決され得る。雑音が存在する場合、上記した標準最大境界アルゴリズムを過剰適合にかけることができ、より洗練された技術を使用しなければならない。最大境界アルゴリズムは常に完全に一致する仮定を見つけ、学習誤差を許容しないので、この問題は生ずる。しかしながら、時には、より良い予測パワーのために幾つかの訓練精度を交換しなければならない。訓練誤差を許容する必要から、ソフト境界及び境界分布分類子が開発された。決定フェーズにおいて標準カーネル関数をなお使用しながら、訓練フェーズにおいてこれらの技術の１つをカーネル行列で代える：
Ｋ←Ｋ＋λＩ
λに代えると、訓練誤差をコントロールすることができ、見られないポインの誤分類のリスクをλを適当に選択することにより減らすことができることを立証することができる。
【０１４７】
全訓練誤差をコントロールする代わりに偽陽性及び偽陰性間のトレードオフをコントロールしたいならば、Ｋをポジティブ及びネガティブ例に相当する位置で次のように修正することができる：
Ｋ←Ｋ＋λＤ
（ここで、Ｄはその入力がｄ＋またはｄ−のいずれかである対角行列である）
この技術はクラスのサイズに依存するようにαｉのサイズをコントロールして、より小さいｄを有するクラス中により大きいαｉに対するバイアスを導入することと均等であることを立証することができる。また、これは非対象境界に相当する。すなわち、より小さいｄを有するクラスは決定境界から更に離れて維持される。幾つかの場合、雑音の存在と共に２つのクラスの極端なアンバランスにより、少数クラスからのポイントが誤標識されたポイントと容易に間違えられ得る状況が作られる。少数クラス中の訓練誤差に対して強いバイアスを加えると、前記誤差から保護し、ＳＶＭによりポジティブ例をサポートベクターとすることができる。よって、
【数４７】
2011515088.tif 000055
及び
【数４８】
2011515088.tif 000056
を選択すると、それぞれの基数に基づいて２つのクラスの相対的重要性を自動的に調節するための発見的方法が提供される。この技術は感受性及び特異性間のトレードオフを効果的にコントロールする。
【０１４８】
本発明では、線形ケーネルを使用し得る。２つのマーカープロファイルＸ及びＹ間の類似性は内積Ｘ・Ｙであり得る。１つの実施形態では、ケーネルは
Ｋ（Ｘ，Ｙ）＝Ｘ・Ｙ＋１
である。
【０１４９】
別の実施形態では、次数ｄのカーネル
Ｋ（Ｘ，Ｙ）＝（Ｘ・Ｙ）ｄ
（ここで、ｄは２，３，…であり得る）
を使用する。
【０１５０】
なお別の実施形態では、ガウスカーネル
【数４９】
2011515088.tif 000057
（ここで、σはガウスの幅である）
を使用する。
【０１５１】
Ｄ．ロジスティック回帰
幾つかの実施形態では、分類子は回帰モデル、好ましくはロジスティック回帰モデルに基づいている。ロジスティックモデルは本発明の分子バイオマーカーの選択した集合中の各分子マーカー毎の係数を含む。前記実施形態では、回帰モデルに対する係数を例えば最尤アプローチを用いて計算する。特定実施形態では、２つの異なる分類または表現型群からの分子バイオマーカーデータ、例えばデレギュレートまたはレギュレートされた増殖因子シグナル伝達経路、増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする物質に対する応答または非応答を使用し、従属変数は分子マーカー特徴データを導き出す患者の表現型状態である。
【０１５２】
本発明の幾つかの実施形態は、マルチカテゴリー（多項）応答を扱うロジスティック回帰モデルの一般化を提供する。前記実施形態は生物を１または３つ以上の分類群に、例えば増殖因子シグナル伝達経路物質での治療に対する良好、適度及び悪い治療応答に判別するために使用され得る。前記回帰モデルはカテゴリーのすべての対を言及すると同時に別のカテゴリーの代わりに１つのカテゴリーにおける応答の見込みを記載するマルチカテゴリーロジットモデルを使用している。モデルがカテゴリーの特定（Ｊ−１）対に対するロジットを特定したら、残りは余分である。例えば、参照により明細書中に組み入れるＡｇｒｅｓｔｉ，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，１９９６，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８を参照されたい。
【０１５３】
Ｅ．判別分析
線形判別分析（ＬＤＡ）はあるオブジェクト特性に基づいて被験者を２つのカテゴリーの１つに分類しようと試みる。換言すると、ＬＤＡは実験において調べるオブジェクト属性がそのオブジェクトのカテゴリー分類を予測するかを試験する。ＬＤＡは典型的には連続する独立変数及び二分的カテゴリー従属変数を必要とする。本発明において、訓練母集団の部分集合で本発明の分子マーカーの選択した集合についての発現値は必要な連続独立変数として役立つ。訓練母集団の各メンバーの臨床群分類は二分的カテゴリー従属変数として役立つ。
【０１５４】
ＬＤＡは、グループ化情報を用いることにより群間分散と群内分散間の比を最大にする変数の線形組合せを探す。暗示的に、ＬＤＡにより使用される線形重みは、訓練集合で分子マーカーの発現がどのように２つの群（例えば、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路を有する群とレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有する群）に分けるか、この遺伝子発現がどのように他の遺伝子の発現と相関しているかに依存する。幾つかの実施形態では、ＬＤＡを、Ｋ個の遺伝子を本発明で記載されている遺伝子と組み合わせることにより訓練サンプル中のＮ個のメンバーのデータ行列に適用する。次いで、訓練母集団の各メンバーの線形判別をプロットする。理想的には、第１の部分群に相当する訓練母集団のメンバー（例えば、デレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有する被験者）を線形判別値（例えば、ネガティブ）の１つの範囲にクラスター化し、第２の部分群に相当する訓練母集団のメンバー（例えば、レギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態を有する被験者）を線形判別値（例えば、ポジティブ）の第２の範囲にクラスター化する。ＬＤＡは、判別値のクラスター間の分離がより大きいときにはより成功したと見なされる。線形判別分析に関するより多くの情報については、Ｄｕｄａ，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；及びＨａｓｔｉｅ，２００１，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｖｅｎａｂｌｅｓ  ＆  Ｒｉｐｌｅｙ，１９９７，Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ｓ−ｐｌｕｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０１５５】
二次判別分析（ＱＤＡ）は同じ入力パラメーターを利用し、ＬＤＡと同じ結果を得る。ＱＤＡは結果を得るために線形方程式ではなく二次方程式を使用する。ＬＤＡ及びＱＤＡは交換可能であり、いずれを使用するかは好みの問題及び／または分析をサポートするためのソフトウェアの利用可能性である。ロジスティック回帰はＬＤＡ及びＱＤＡと同じ入力パラメーターを使用し、同じ結果を得る。
【０１５６】
Ｆ．決定木
本発明の幾つかの実施形態では、本発明の分子バイオマーカーの選択した集合に関する発現データを用いて被験者を分類するために決定木を用いる。決定木アルゴリズムは教師あり学習アルゴリズムのクラスに属する。決定木の目的は現実世界の例のデータから分類子（木）を誘導することである。この木は決定木を誘導するために使用されたことのない未知の例を分類するために使用され得る。
【０１５７】
決定木は訓練データから誘導される。例は、異なる属性についての値及びその例が属するクラスを含む。１つの実施形態では、訓練データは訓練母集団で本発明で記載されている遺伝子の組合せについての発現データである。
【０１５８】
次のアルゴリズムは決定木誘導を記載する：
木（例、クラス、属性）；
ルートノードを作成する；
すべての例が同一のクラス値を有しているならば、このラベルにルートを与える；
或いは、属性が空ならば、最も一般的な値に従ってルートに標識をつける；
或いは、開始する；
各属性毎に情報利得を計算する；
最高の情報利得を有する属性Ａを選択し、これをルート属性とする。
この属性の各々の取り得る値ｖの場合、
ルートの下に、Ａ＝ｖに相当する新しい分枝を加える；
例（ｖ）をＡ＝ｖの例とする；
例（ｖ）が空ならば、新しい分枝を例の中で最も一般的な値で標識した葉ノードとする；
或いは、新しい分枝を
木（例（ｖ）、クラス、属性−｛Ａ｝｝
により作成した木とする；
終了する。
【０１５９】
情報利得の計算のより詳細な情報を以下に示す。例の可能なクラスｖｉが確率Ｐ（ｖｉ）を有しているならば、実際の回答の情報量Ｉは
【数５０】
2011515088.tif 000058
により与えられる。
Ｉ値は、使用する具体的データセットについての分類の出力を記載することを可能とするために我々が必要とする情報がどれだけか多いかを示す。データセットがｐ個のポジティブ及びｎ個のネガティブ（例として、例えば個体）を含んでいると仮定すると、正解中に含まれている情報は
【数５１】
2011515088.tif 000059
（ここで、Ｌｏｇ２は奇数２を用いた対数である）
である。１つの属性を試験することにより、正しく分類するために必要な情報の量を減らすことができる。具体的属性Ａ（例えば、遺伝子バイオマーカー）についての余りは必要とする多くの情報をどれだけ減らすことができるかを示している：
【数５２】
2011515088.tif 000060
（ここで、“ｖ”はあるデータセットにおける属性Ａについての独自の属性値の数であり、“ｉ”はある属性値であり、“ｐｉ”は分類がポジティブの場合の属性Ａに対する例の数であり、“ｎｉ”は分類がネガティブの場合の属性Ａに対する例の数である）。
【０１６０】
具体的属性Ａの情報利得はクラスについての情報利得と属性Ａの余りの間の差として計算される：
【数５３】
2011515088.tif 000061
情報利得は各種属性が分類のためにどれだけ重要であるか（どれだけうまく例を分けられるか）、最高の情報を有する属性を評価するために使用される。
【０１６１】
一般的に、多数のいろいろな決定木アルゴリズムがあり、そのうちの多くはＤｕｄａ，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。決定木はしばしば特徴処理、不純物測度、阻止基準及び剪定の考慮を必要とする。具体的な決定木アルゴリズムには分類及び回帰木（ＣＡＲＴ）、多変数決定木、ＩＤ３及びＣ４．５が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
１つのアプローチで、決定木の例示的実施形態を使用する場合、訓練母集団で本発明の分子マーカーの選択した集合についての遺伝子発現データを平均ゼロ及び単位分散を有するように標準化する。訓練母集団のメンバーを訓練集合及び試験集合にランダムに分ける。例えば、１つの実施形態では、訓練母集団のメンバーの２／３を訓練集合に配置し、訓練母集団のメンバーの１／３を試験集合に配置する。本発明に記載されている遺伝子の選択した組合せについての発現値を決定木を構築するために使用する。次いで、この決定木の試験集合中のメンバーを正しく分類する能力を判定する。幾つかの実施形態では、この計算を分子マーカーの所与の組合せに対して数回実施する。計算の各反復において、訓練母集団のメンバーを訓練集合及び試験集合にランダムに割り当てる。次いで、分子マーカーの組合せの質を決定木計算の各反復の平均として取る。
【０１６３】
Ｇ．クラスタリング
幾つかの実施形態では、本発明の分子マーカーの選択した集合の発現値を訓練集合をクラスター化するために使用する。例えば、本発明の遺伝子集合の１つに記載されている１０個の遺伝子バイオマーカーを使用する場合を考える。訓練母集団中の各メンバーｍは１０個のバイオマーカーの各々毎に発現値を有している。訓練母集団中のメンバーｍからの前記値がベクトルを規定する：
【０１６４】
【表２】
2011515088.tif 000062
ここで、Ｘｉｍが生物ｍ中の第ｉ遺伝子の発現レベルである。訓練集合中にｍ個の生物があるならば、ｉ遺伝子の選択はｍベクトルを規定する。本発明の方法ではベクトル中で使用される遺伝子毎の各発現値が１つのベクトルｍで表される必要がないことに留意されたい。換言すると、第ｉ遺伝子の１つが見つからない被験者からのデータがクラスタリングに使用される。このような場合、欠落発現値は“ゼロ”または幾つかの他の正規化値に割り当てられる。幾つかの実施形態では、クラスタリング前に、ゼロの平均値及び単位分散を有するように遺伝子発現値を正規化する。
【０１６５】
訓練群で類似の発現パターンを示す訓練母集団のメンバーは一緒にクラスター化する傾向にある。本発明の遺伝子の特定組合せは、ベクトルを訓練母集団中に見られる特徴群にクラスター化するとき本発明のこのアスペクト中の良好な分類子であると見なされる。例えば、訓練母集団が良好なまたは良くない予後を有している患者を含んでいるならば、クラスタリング分類子は母集団を２つの群にクラスター化し、各群は独自にデレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態またはレギュレートされている増殖因子シグナル伝達経路状態のいずれかに相当する。
【０１６６】
クラスタリングはＤｕｄａ  ａｎｄ  Ｈａｒｔ，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｅｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９７３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋのｐ．２１１−２５６に記載されている。Ｄｕｄａのセクション６．７に記載されているように、クラスタリング問題はデータセット中のファインディング自然グループ化の１つとして記載されている。自然グループ化を同定するためには２つの問題が検討される。第１は、２つのサンプル間の類似性（または、非類似性）を判定する方法を決定する。このメトリック（類似度）は、１つのクラスター中のサンプルが他のクラスター中のサンプルに対するよりも相互により似ていることを確認するために使用される。第２に、データを類似度を用いてクラスターに分割するためのメカニズムを決定する。
【０１６７】
類似度はＤｕｄａのセクション６．７において検討されており、クラスタリング研究を始める１つの方法が距離関数を規定し、データセット中のサンプルのすべての対間の距離の行列を計算するためであると言及されている。距離が類似性の良好な尺度であるならば、同一クラスター中のサンプル間の距離は異なるクラスター中のサンプル間の距離よりも有意に短い。しかしながら、Ｄｕｄａのｐ．２１５において言及されているように、クラスタリングは距離メトリックスの使用を必要としない。例えば、非メトリック類似性関数ｓ（ｘ，ｘ’）が２つのベクトルｘ及びｘ’を比較するために使用され得る。一般的に、ｓ（ｘ，ｘ’）は、ｘ及びｘ’がやや“類似”しているときにはその値が大きい対称関数である。非メトリック類似性関数ｓ（ｘ，ｘ’）の例はＤｕｄａのｐ．２１６に記載されている。
【０１６８】
データセットのポイント間の“類似性”または“非類似性”を判定する方法を選択したら、クラスタリングはデータの任意の分割のクラスタリング品質を調べる基準関数を必要とする。基準関数を極値にするデータセットの団且つがデータをクラスター化するために使用される。基準関数はＤｕｄａのセクション６．８で検討されている。
【０１６９】
より最近、Ｄｕｄａら，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋが発行された。ｐ．５３７−５６３はクラスタリングを詳細に記載している。クラスタリング技術に関するより多くの情報はＫａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｕｓｓｅｅｕｗ，１９９０，Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｄａｔａ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｅｖｅｒｉｔｔ，１９９３，Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（３ｄ  ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；及びＢａｃｋｅｒ，１９９５，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙに見られる。本発明において使用され得るクラスタリング技術の具体例には階層的クラスタリング（最短距離アルゴリズム、最長距離アルゴリズム、群平均アルゴリズム、重心アルゴリズムまたは平方和アルゴリズムを用いる凝集型クラスタリング）、ｋ−平均クラスタリング、ファジイーｋ−平均クラスタリングアルゴリズム及びＪａｒｖｉｓ−Ｐａｔｒｉｃｋクラスタリングが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
Ｈ．主成分分析
主成分分析（ＰＣＡ）が遺伝子発現データを分析するために提案されている。主成分分析は、データをそのデータの特徴を要約している変数（主成分）の新しい集合に変換することによりデータセットの次元を減らすための古典的技術である。例えば、Ｊｏｌｌｉｆｆｅ，１９８６，Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。主成分（ＰＣ）は未相関であり、ｋｔｈＰＣがＰＣの中で第ｋの最大分散を有するように順序付けられる。ｋｔｈＰＣは、第１のｋ−１  ＰＣに直交するようにデータポイントの射影の変動を最大にする方向として解釈され得る。第１の少数のＰＣはデータセット中の変動の多くを捕らえる。対照的に、最後の少数のＰＣはしばしばデータ中の残留“雑音”のみを捕らえると考えられる。
【０１７１】
ＰＣＡは、本発明に従って分類子を作成するためにも使用され得る。このアプローチでは、本発明の分子バイオマーカーの選択された集合のためのベクトルが上記クラスタリングについて記載したのと同一方法で構築され得る。実際、各ベクトルが訓練母集団の特定メンバー由来の選択した遺伝子についての発現値を表すベクターの集合が行列と見なされ得る。幾つかの実施形態では、この行列はモノマーの定性バイナリー記述のフリー−ウィルソン方法において表されており（Ｋｕｂｉｎｙｉ，１９９０，３Ｄ  ＱＳＡＲ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｈｅｏｒｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．５８９−６３８）、行列中のすべての分散情報が説明されるまで第１の主成分（ＰＣ）が分散情報の最大量をできるだけ捕らえる、第２の主成分（ＰＣ）がすべての分散情報の第２の最大量を捕らえる、等々ようにＰＣＡを用いて最大限に圧縮された空間に分布される。
【０１７２】
次いで、ベクトルの各々（各ベクトルは訓練母集団のメンバーを表す）をプロットする。多くのいろいろなタイプのプロットが可能である。幾つかの実施形態では、一次元プロットを作成する。この一次元プロットでは、訓練母集団のメンバーの各々に由来する第１主成分の値をプロットする。この形のプロットでは、第１群のメンバーが第１主成分値の１つの範囲でクラスター化し、第２群のメンバーは第１主成分値の第２範囲でクラスター化すると予想される。
【０１７３】
１つの例で、訓練母集団は２つの分類群を含む。第１主成分を、分類出力が公知である全訓練母集団データセットで本発明の選択した遺伝子についての分子バイオマーカー発現値を用いて計算する。次いで、訓練集合の各メンバーを第１主成分についての値の関数としてプロットする。この例では、第１主成分がポジティブである訓練母集団のメンバーは１つの分類出力に相当し、第１主成分がネガティブである訓練母集団のメンバーは他の分類出力に相当する。
【０１７４】
幾つかの実施形態では、訓練母集団のメンバーを１つ以上の主成分に対してプロットする。例えば、幾つかの実施形態では、訓練母集団のメンバーを、一次元が第１主成分であり、二次元が第２主成分である二次元プロット上にプロットする。この二次元プロットでは、訓練母集団中で表される各部分群のメンバーがばらばらの群にクラスター化されると予想される。例えば、二次元プロット中のメンバーの第１クラスターは第１分類群中の被験者に相当し、二次元プロット中のルンバーの第２クラスターは第２分類群中の被験者に相当する、等々。
【０１７５】
幾つかの実施形態では、訓練母集団のメンバーを２つ以上の主成分に対してプロットし、訓練母集団のメンバーが各々が訓練母集団中に見られる部分群に独自に相当する群にクラスター化されるかを調べる。幾つかの実施形態では、主成分分析はＲｍｖａパッケージ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９７３，Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７３；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，ＣＲＣ，１９９９）を用いることにより実施される。主成分分析は更にＤｕｄａ，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。
【０１７６】
Ｉ．最近傍分類子分析
最近傍分類子はメモリに基づき、モデルを適合させる必要がない。クエリーポイントｘ０、ｋ訓練ポイントｘ（ｒ），ｒ，…を仮定すると、ｘ０に最短距離のｋを同定した後、ポイントｘ０をｋ最近傍を用いて分類する。タイをランダムに壊す。幾つかの実施形態では、特徴空間におけるユークリッド距離が
【数５４】
2011515088.tif 000063
として距離を測定するために使用される。
【０１７７】
典型的には、最近傍アルゴリズムを使用する場合、線形判別を計算するために使用される発現データを平均ゼロ及び分散１を有するように標準化する。本発明では、訓練母集団のメンバーを訓練集合及び試験集合にランダムに分ける。例えば、１つの実施形態では、訓練母集団のメンバーの２／３を訓練集合に配置し、訓練母集団のメンバーの１／３を試験集合に配置する。本発明の分子バイオマーカーの選択した集合のプロフィールは試験集合のメンバーがプロットされている特徴空間を表す。次いで、訓練集合の試験集合のメンバーを正確に特徴付ける能力を計算する。幾つかの実施形態では、最近傍計算を本発明の遺伝子の所与の組合せに対して数回実施する。計算の各反復において、訓練母集団のメンバーを訓練集合及び試験集合にランダムに割り当てる。その後、遺伝子の組合せの質を最近傍計算の各々の前記反復の平均として取る。
【０１７８】
最近傍規則は不公平なクラス想定、差次的誤分類コスト及び属性選択の問題を取り扱うために細分され得る。これらの細分の多くは近傍に対する幾つかの形の重み付き投票を含む。最近傍分析についてのより多くの情報については、Ｄｕｄａ，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；及びＨａｓｔｉｅ，２００１，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０１７９】
Ｊ．進化的方法
生物学的進化のプロセスにより動機付けられて、分類子設計の進化的方法は最適分類子の確率検索を用いる。広い概説で、この方法により、本発明の遺伝子産物の測定値から幾つかの分類子、すなわち母集団が作成される。各分類子は他とやや異なる。次に、分類子を訓練母集団で発現データでスコアをつける。生物学的進化との類似を保って、得られた（スカラー）スコアは時々適合と呼ばれている。分類子はそのスコアに従って順位付けられ、最良の分類子（分類子の全母集団の一部）が保持される。再び、生物学的学術用語と合わせて、これは適者生存と呼ばれている。分類子は次世代、すなわち子供または子孫において確率的に変化する。幾つかの子孫分類子はその前の世代の親よりも高いスコアを有し、幾つかは低いスコアを有するであろう。次いで、全プロセスをその後の世代に対して繰り返す。分類子にスコアをつけ、最良のものを保持し、ランダムに変更して更に別の世代を得る、等々。一部、順位付けるために、各世代は平均して前の世代よりも僅かに高いスコアを有する。世代中で１つの最良の分類子が所望の基準値を超えるスコアを有しているときに上記プロセスを停止する。進化的方法に関するより多くの情報は、例えばＤｕｄａ，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に見られる。
【０１８０】
Ｋ．バギング、ブースティング及びランダム部分空間方法
バギング、ブースティング及びランダム部分空間方法は、弱い分類子を改良するために使用され得る連結技術である。これらの技術は決定木のために設計され、通常決定木に対して使用される。加えて、Ｓｋｕｒｉｃｈｉｎａ  ａｎｄ  Ｄｕｉｎは前記技術の線形判別分析においても有用であり得ることを示唆するための証拠を与えている。
【０１８１】
バギングでは、ランダム独立ブーツストラップ反復を生ずる訓練集合をサンプリングし、これらの各々で分類子を構築し、最終決定規則で単純多数決により集める。例えば、Ｂｒｅｉｍａｎ，１９９６，Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２４，１２３−１４０；及びＥｆｒｏｎ  ＆  Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３を参照されたい。
【０１８２】
ブースティングでは、分類子を従来の分類結果に依存する訓練集合の重み付きバージョンで構築する。最初に、すべてのオブジェクトは等しい重みを有し、第１分類子はこのデータセットで構築される。次いで、分類子の性能に従って重みを変化させる。誤って分類されたオブジェクト（データセット中の分子バイオマーカー）はより大きな重みを得、次の分類子は再重み付き訓練集合でブースティングされる。このようにして、一連の訓練集合及び分類子が得られ、次いで最終決断において単純多数決によりまたは重み付き多数決により合わされる。例えば、Ｆｒｅｕｎｄ  ＆  Ｓｃｈａｐｉｒｅ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｗ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ”，Ｐｒｏｅｅｄｉｎｇｓ  １３ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，１９９６，１４８−１５６を参照されたい。
【０１８３】
ブースティングを説明するために、研究中の母集団が示す２つの表現型群、すなわち表現型１及び表現型２がある場合を考慮する。分子マーカーＸのベクトルを前提として、分類子Ｇ（Ｘ）は２つの値集団｛表現型１、表現型２｝中のタイプ値の１つをとる予測を生ずる。訓練サンプルの誤差率は
【数５５】
2011515088.tif 000064
（ここで、Ｎは訓練集合中の被験者の数（表現型１または表現型２のいずれかを有する被験者の合計）である）
である。
【０１８４】
弱い分類子は誤差率が当て推量よりも僅かに良いものである。ブースティングアルゴリズムにおいて、弱い分類アルゴリズムをデータの修正バージョンに反復適用して、一連の弱い分類子Ｇｍ（ｘ），ｍ，＝１，２，…，Ｍを得る。次いで、この一連の分類子のすべてからの予測を重み付き多数決により組み合わせて、最終予測を得る。
【数５６】
2011515088.tif 000065
ここで、α１，α２，…，αＭはブースティングアルゴリズムにより計算され、その目的はそれぞれのＧｍ（ｘ）の寄与に重みを付けることである。この効果は、シーケンス中のより正確な分類子により大きな影響を与えることである。
【０１８５】
各ブースティングステップでのデータ修正は訓練観測（ｘｉ，ｙｉ），ｉ＝１，２，…，Ｎの各々に重みｗ１，ｗ２，…，ｗｎを加えることからなる。最初に、第１ステップは単に通常の方法でデータで分類子を訓練するようにすべての重みをｗｉ＝１／Ｎに設定する。各連続する反復ｍ＝２，３，…，Ｍ毎に、観測重みを個々に修正し、分類アルゴリズムを重み付き観測に対して再適用する。幹ｍで、前ステップで誘導された分類子Ｇｍ−１（ｘ）により誤分類された観測は増えた重みを有するのに対して、正しく分類された場合には重みが減少する。よって、反復を進めるにつれて、正しく分類し難い観測は増え続ける影響を受ける。これにより、各々の連続する分類子はシーケンス中の以前のものにより脱落する訓練観測に集中する。
【０１８６】
ブースティングアルゴリズムの例を以下に要約する：
１．観測重みｗｉ＝１／Ｎ，ｉ＝１，２，…，Ｎを初期化する；
２．ｍ＝ｌ〜Ｍの場合、
（ａ）分類子Ｇｍ（ｘ）を重みｗｉを用いて訓練集合に適合させる；
（ｂ）計算する；
【数５７】
2011515088.tif 000066
（ｃ）αｍ＝ｌｏｇ（１−ｅｒｒｍ）／ｅｒｒｍ）を計算する；
（ｄ）ｗｉ←ｗｉ・ｅｘｐ［αｍ・Ｉ（ｙｉ≠Ｃｍ（ｘｉ））］，ｉ＝１，２，…，Ｎを設定する；
３．
【数５８】
2011515088.tif 000067
【０１８７】
アルゴリズムにおいて、現在の分類子Ｇｍ（ｘ）が行２ａでの重み観測で誘導される。生じた重み付き誤差を行２ｂで計算する。行２ａは最終分類子Ｇ（ｘ）（行３）を得る際にＧｍ（ｘ）に与えた重みαｍを計算する。観測の各々の個々の重みは行２ｄでの次の反復のために更新される。Ｇｍ（ｘ）により誤分類された観測は因子ｅｘｐ（αｍ）により評価される重みを有し、シーケンス中の次の分類子Ｇｍ＋１（ｘ）を誘導するための相対影響が高められる。幾つかの実施形態では、Ｆｒｅｕｎｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｐｉｒｅ，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５，ｐ．１１９−１３９，ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄの修正を使用する。例えば、Ｈａｓｔｉら，Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２００１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０を参照されたい。幾つかの実施形態では、ブースティングまたは適応型ブースティング方法を使用する。
【０１８８】
幾つかの実施形態では、Ｆｒｅｕｎｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｐｉｒｅ，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５，ｐ．１１９−１３９の修正が使用される。例えば、幾つかの実施形態では、特徴予備選択をＰａｒｋら，２００２，Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．，６，５２−６３のノンパラメトリックスコアリング方法のような技術を用いて実施する。特徴予備選択は、分類間で最良を判別する遺伝子を分類子において使用するために選択する次元圧縮方法の形である。次いで、Ｆｒｅｕｎｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｐｉｒｅのブースティング手順よりもＦｒｉｅｄｍａｎら，２０００，Ａｎｎ．Ｓｔａｔ．，２８，３３７−４０７が導入したＬｏｇｉｔＢｏｏｓｔ手順を使用する。幾つかの実施形態では、Ｂｅｎ−Ｄｏｒら，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，５５９−５８３のブースティング及び他の分類方法を本発明において使用する。幾つかの実施形態では、Ｆｒｅｕｎｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｐｉｒｅ，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５，１１９−１３９のブースティング及び他の分類方法を使用する。
【０１８９】
ランダム部分空間方法では、分類子をデータ特徴空間のランダム部分空間において構築する。これらの分類子は通常最終決定規則において単純多数決により組み合わされる。例えば、Ｈｏ，“Ｔｈｅ  Ｒａｎｄｏｍ  ｓｕｂｓｐａｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｆｏｒｅｓｔｓ”，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ，１９９８；２０（８）：８３２−８４４を参照されたい。
【０１９０】
Ｌ．他のアルゴリズム
上記したパターン分類及び統計技術は分類のためのモデルを構築するために使用され得るモデルのタイプの単なる例である。更に、上記した技術の組合せが使用され得る。このような組合せ、例えば決定木とブースティングの組合せが記載されている。しかしながら、多くの他の組合せが可能である。加えて、射影追跡や重み付き投票のような当業界での他の技術を分類子を構築するために使用され得る。
【０１９１】
３．５  バイオマーカー遺伝子発現レベルの測定
３．５．１  方法
サンプル中のバイオマーカー遺伝子の発現レベルは当業界で公知の手段により測定され得る。発現レベルは各バイオマーカー遺伝子から転写された核酸を単離し、そのレベル（すなわち、量）を測定することにより調べられ得る。代替的または追加的に、バイオマーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳された特定のタンパク質のレベルを測定してもよい。
【０１９２】
特定のバイオマーカー遺伝子の発現のレベルはサンプル中に存在するｍＲＮＡまたはそこに由来するポリヌクレオチドの量を測定することにより調べられ得る。任意のＲＮＡレベルの測定方法が使用され得る。例えば、ＲＮＡをサンプルから単離し、アガロースゲルを用いて分離する。次いで、分離したＲＮＡを固体支持体（例えば、フィルター）に移す。次いで、１つ以上のバイオマーカーに相当する核酸プローブをノーザンハイブリダイゼーションによりフィルターにハイブリダイズし、バイオマーカー由来ＲＮＡの量を測定する。前記測定は肉眼で、または機器を用いて、例えばデンシトメーターを用いてなされ得る。ＲＮＡレベルを測定するための別の方法はドットプロットまたはスロットブロットの使用による。この方法では、サンプルからのＲＮＡまたはそこに由来する核酸を標識する。次いで、ＲＮＡまたはそこに由来する核酸を１つ以上のバイオマーカー遺伝子由来のオリゴヌクレオチドを含有しているフィルターにハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドはフィルター上に離れた容易に同定し得る位置に配置されている。標識ＲＮＡのフィルター結合オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションまたはその欠乏は目視でまたはデンシトメーターを用いて調べられ得る。ポリヌクレオチドは放射標識または蛍光（すなわち、目視可能な）標識を用いて標識され得る。
【０１９３】
上記した例は限定的と意図されない。ＲＮＡアバンダンスの測定方法は当業界で公知であり、この中には定量的ＰＣＲ方法（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））及びＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ’ｓ  ＮＣＯＵＮＴＥＲ（商標）Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ワシントン州シアトルに所在）（ＷＯ２００７０７６１２８、ＷＯ２００７０７６１２９も参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９４】
特定バイオマーカー遺伝子の発現レベルは、バイオマーカー遺伝子から発現させた特定のタンパク質のレベルを測定することによっても評価され得る。これは、例えばサンプルからタンパク質をポリアクリルアミドゲルを用いて分離した後、特定のバイオマーカー由来タンパク質をウェスタンブロットで抗体を用いて同定することによりなされ得る。或いは、タンパク質を二次元ゲル電気泳動システムにより分離してもよい。二次元ゲル電気泳動は当業界で公知であり、典型的には一次元に沿った等電点電気泳動の後二次元に沿ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を含む。例えば、Ｈａｍｅｓら，１９９０，ＧＥＬ  ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１４４０−１４４５（１９９６）；Ｓａｇｌｉｏｃｃｏら，Ｙｅａｓｔ，１２：１５１９−１５３３（１９９６）；Ｌａｎｄｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：５３６−５３９（１９９６）を参照されたい。得られた電気泳動図は質量分析技術、ウェスタンブロッティング、並びにポリクローナル及びモノクローナル抗体を用いる免疫ブロット分析を含めた複数の技術により分析され得る。
【０１９５】
或いは、バイオマーカー由来タンパク質レベルは、結合部位が細胞ゲノムによりコードされる複数のタンパク質種に特異的な固定化されている抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含む抗体マイクロアレイを構築することにより測定され得る。好ましくは、抗体は当該バイオマーカー由来タンパク質の大部分に対して存在している。モノクローナル抗体の作成方法は公知である（例えば、すべての目的のために全文参照により組み入れるＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。１つの実施形態では、モノクローナル抗体は細胞のゲノム配列に基づいて設計された合成ペプチド断片に対して作成する。前記抗体アレイを用いて、細胞由来のタンパク質をこのアレイに接触させ、その結合を当業界で公知のアッセイを用いてアッセイする。通常、診断または予防用タンパク質の発現及び発現のレベルは組織スライスまたは切片を免疫組織化学的に染色することにより検出され得る。
【０１９６】
最後に、多数の組織標本中のバイオマーカー遺伝子の発現は“組織アレイ”を用いて特性づけられ得る（Ｋｏｎｏｎｅｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４（７）：８４４−７（１９９８））。組織アレイにおいて、複数の組織サンプルを同一マイクロアレイを用いて評価する。このアレイにより、ＲＮＡ及びタンパク質レベルをその場で検出することができる。連続した切片により複数のサンプルを同時に分析することができる。
【０１９７】
３．５．２  マイクロアレイ
好ましい実施形態では、上記バイオマーカーの各々の発現状態が同時に評価されるようにポリヌクレオチドマイクロアレイを使用して発現を調べる。具体的実施形態では、本発明は、上記したバイオマーカー集合（すなわち、腫瘍の分子タイプまたはサブタイプを決定するためのバイオマーカー；腫瘍の増殖因子経路シグナル伝達状態を分類するためのバイオマーカー；被験者の増殖因子シグナル伝達経路をモジュレートする化合物に対する応答を予測するためのバイオマーカー；治療薬の増殖因子シグナル伝達経路に対する薬力学的効果を調べるためのバイオマーカー）の各々に対応する遺伝子にハイブリダイズし得るプローブを含むオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡアレイを提供する。
【０１９８】
本発明により提供されるマイクロアレイは、先に挙げた臨床状態の１つ、２つまたは３つすべての状態を区別することができるようにバイオマーカーに対応する遺伝子のハイブリダイズし得るプローブを含み得る。特に、本発明は、増殖因子シグナル伝達経路がデレギュレートおよびレギュレートされている患者または腫瘍を区別する表５ａ及び５ｂの１０１個のバイオマーカーの少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、１００個の遺伝子バイオマーカーの１つ以上の部分集合〜全体集合に対するプローブを含むポリヌクレオチドアレイを提供する。別の特定実施形態では、本発明は、増殖因子シグナル伝達経路がデレギュレート及びレギュレートされている患者または腫瘍を区別する表１１の８６個のバイオマーカーの少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０個の遺伝子バイオマーカーの１つ以上の部分集合〜全体集合に対するプローブを含むポリヌクレオチドアレイを提供する。更に別の実施形態では、本発明は、高い解糖経路活性を有する患者またはサンプルを区別する表１３の３９個のバイオマーカーの少なくとも５、１０、２０、３０個の遺伝子バイオマーカーの１つ以上の部分集合〜全体集合に対するプローブを含むアレイを提供する。
【０１９９】
更に別の具体的実施形態では、本明細書に開示されている方法において使用されるマイクロアレイは場合により表５にリストされているバイオマーカーの少なくとも一部に対して追加のバイオマーカーを含む。例えば、具体的実施形態では、マイクロアレイはＡｌｔｓｃｈｕｌｅｒらの２００２年３月７日に国際公開されたＷＯ０２／１８６４６及びＳｃｈｅｒｅｒらの２００２年２月２８日に国際公開されたＷＯ０２／１６６５０に記載されているスクリーニングまたはスキャンニングアレイである。スクリーニング及びスキャンニングアレイは発現及び発現されていないゲノム核酸配列由来の規則的に間隔をあけた位置的にアドレス可能なプローブを含む。前記アレイは表５にリストされているバイオマーカーの部分集合または全部、或いは上記したその部分集合に対応するプローブを含み得、表５にリストされているバイオマーカーのみを含有しているマイクロアレイと同様にしてバイオマーカー発現をモニターするために使用され得る。
【０２００】
更に別の具体的実施形態では、マイクロアレイは表５にリストされているバイオマーカーの少なくとも５個を含む市販のｃＤＮＡマイクロアレイである。市販されているｃＤＮＡマイクロアレイが表５にリストされているバイオマーカーの全部を含んでいることが好ましい。しかしながら、マイクロアレイは表５中の５、１０、１５、２５、５０、１００個またはそれ以上のバイオマーカー〜表５中のバイオマーカーの最大数を含み得、表５の１つの部分集合及び表５の別の部分集合、或いは上記した各々の部分集合中のバイオマーカーのすべてを含み得る。本明細書中に開示されている方法において使用されるマイクロアレイの具体的実施形態では、表５のすべてまたは一部であるバイオマーカーがマイクロアレイ上のプローブの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％を占めている。
【０２０１】
先のバイオマーカー集合及び／または部分集合を含むマイクロアレイの構築に関する一般的方法を以下のセクションにおいて記載する。
【０２０２】
３．５．２．１  マイクロアレイの構築
マイクロアレイは、ポリヌクレオチド配列を含むプローブを選択し、前記プローブを固体支持体または表面に固定化することにより作成される。例えば、プローブはＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはＤＮＡ及びＲＮＡのコポリマー配列を含み得る。プローブのポリヌクレオチド配列はＤＮＡ及び／またはＲＮＡアナログ、またはその組合せをも含み得る。例えば、プローブのポリヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡの完全または部分断片であり得る。プローブのポリヌクレオチド配列は合成したヌクレオチド配列、例えば合成オリゴヌクレオチド配列であってもよい。プローブ配列はインビボで酵素を用いて、インビトロで酵素を用いて（例えば、ＰＣＲにより）、またはインビトロで酵素を用いずに合成され得る。
【０２０３】
本発明の方法で使用されるプローブが多孔質または非多孔質であり得る固体支持体に固定化されていることが好ましい。例えば、本発明のプローブは、ポリヌクレオチドの３’または５’末端でニトロセルロースまたはナイロン膜またはフィルターに共有結合されているポリヌクレオチド配列であり得る。前記ハイブリダイゼーションプローブは当業界で公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮｌＮＧ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ＮＤ  ＥＤ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）。或いは、固体支持体または表面はガラスまたはプラスチック表面であり得る。特に好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションレベルは、その表面にポリヌクレオチドの集団（例えば、ＤＮＡまたはＤＮＡミミックの集団、或いはＲＮＡまたはＲＮＡミミックの集団）が固定されている固相から構成されているプローブのマイクロアレイに対して測定される。固相は非多孔質でも、場合によりゲルのような多孔質材料であり得る。
【０２０４】
好ましい実施形態では、マイクロアレイは、各々が本明細書中に記載されているバイオマーカーの１つに相当する結合（例えば、ハイブリダイゼーション）部位または“プローブ”の規則アレイを有する支持体または表面からなる。好ましくは、マイクロアレイはアドレス可能なアレイ、より好ましくは位置的にアドレス可能なアレイである。より具体的には、アレイの各プローブを各プローブの身元（すなわち、配列）がアレイ中のその位置から決定され得るように固体支持体上の公知の所定位置に配置することが好ましい。好ましい実施形態では、各プローブは固体支持体に単一サイトで共有結合している。
【０２０５】
マイクロアレイは多数の方法で作成され得、その方法の幾つかを以下に記載する。しかしながら、作成されたら、マイクロアレイはある特徴を共有している。アレイは再生可能であり、所与のアレイの複数コピーを作成することができ、相互に容易に比較することができる。マイクロアレイが結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件下で安定である材料から作成されることが好ましい。マイクロアレイは小さい、例えば１〜２５ｃｍ２、１２〜１３ｃｍ２、または３ｃｍ２であることが好ましい。しかしながら、大きなアレイも考えられ、例えばスクリーニングアレイで使用するためには好ましいことがある。マイクロアレイ中の所与の結合サイトまたは結合サイトの独自の組が細胞中の１つの遺伝子の産物に対して（例えば、特定のｍＲＮＡ、またはそこに由来する特定のｃＤＮＡに対して）特異的に結合させる（例えば、ハイブリダイズする）ことが好ましい。しかしながら、一般的には、他の関連するまたは類似の配列を所与の結合部位に対して交差ハイブリダイズさせる。
【０２０６】
本発明のマイクロアレイは１つ以上の試験プローブを含み、その各々は検出しようとするＲＮＡまたはＤＮＡのサブ配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有している。好ましくは、固体表面上の各プローブの位置は公知である。実際、マイクロアレイは好ましくは位置的にアドレス可能なアレイである。具体的には、アレイの各プローブを各プローブの身元（すなわち、配列）がアレイ上（すなわち、支持体または表面上）のその位置から決定され得るように固体支持体上の公知の所定位置に配置することが好ましい。
【０２０７】
本発明によれば、マイクロアレイは、各位置が本明細書中に記載されているバイオマーカーの１つに相当するアレイ（すなわち、行列）である。例えば、各位置は遺伝子バイオマーカーから転写された特定のＲＮＡまたはｃＤＮＡが特異的にハイブリダイズできるゲノムＤＮＡに基づいてＤＮＡまたはＤＮＡアナログを含み得る。ＤＮＡまたはＤＮＡアナログは、例えば合成オリゴマーまたは遺伝子断片であり得る。１つの実施形態では、バイオマーカーの各々に相当するプローブはアレイ上に存在している。
【０２０８】
３．５．２．２  マイクロアレイのためのプローブの作成
上述したように、特定のポリヌクレオチド分子が本発明に従って特異的にハイブリダイズする“プローブ”は相補的ゲノムポリヌクレオチド配列を含む。マイクロアレイのプローブは好ましくは１０００個以下のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列から構成されている。幾つかの実施形態では、アレイのプローブは１０〜１，０００個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列から構成されている。好ましい実施形態では、プローブのヌクレオチド配列は１０〜２００ヌクレオチド長の範囲であり、相補的配列を有し、よって生物の種のゲノムにハイブリダイズすることができ、前記ゲノムの全部または一部にわたって順次タイル張りされている複数の異なるプローブが存在するような生物の種のゲノム配列である。他の具体的実施形態では、プローブは１０〜３０ヌクレオチド長の範囲、１０〜４０ヌクレオチド長、２０〜５０ヌクレオチド長の範囲、４０〜８０ヌクレオチド長の範囲、５０〜１５０ヌクレオチド長の範囲、８０〜１２０ヌクレオチド長の範囲であり、最も好ましくは６０ヌクレオチド長である。
【０２０９】
プローブは生物のゲノムの一部に対応するＤＮＡまたはＤＮＡ“ミミック”（例えば、誘導体及びアナログ）からなり得る。別の実施形態では、マイクロアレイのプローブは相補的ＲＮＡまたはＲＮＡミミックからなり得る。ＤＮＡミミックはＤＮＡと特異的ワトソン・クリック様ハイブリダイゼーションし得る、またはＲＮＡと特異的ハイブリダイゼーションし得るサブユニットを含むポリマーである。核酸が塩基部分、糖部分またはホスホネート骨格で修飾されていてもよい。ＤＮＡミミックの例には、例えばホスホロチオエートが含まれる。
【０２１０】
ＤＮＡは、例えばゲノムＤＮＡまたはクローン化配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により得られ得る。ＰＣＲプライマーは、好ましくはゲノムＤＮＡの特定断片を増幅させるゲノムの公知の配列に基づいて選択される。当業界で公知のコンピュータープログラム、例えばＯｌｉｇｏバージョン５．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が所要の特異性及び最適の増幅特性を有するプライマーを設計する際に有用である。マイクロアレイ上の各プローブは典型的には１０〜５０，０００塩基長、通常３００〜１，０００塩基長の範囲である。ＰＣＲ方法は当業界で公知であり、例えばＩｎｎｉｓら編，ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。制御ロボットシステムが核酸を単離し、増幅するために有用であることは当業者に自明である。
【０２１１】
マイクロアレイのポリヌクレオチドプローブを作成するための代替の好ましい手段は、合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを例えばＮ−ホスホネートまたはホスホルアミデート化学を用いて合成することによる（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１４：５３９９−５４０７（１９８６）；ＭｃＢｒｉｄｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２４：２４６−２４８（１９８３））。合成配列は典型的には約１０〜約５００塩基長、より典型的には約２０〜約１００塩基長、最も好ましくは約４０〜約７０塩基長の範囲である。幾つかの実施形態では、合成核酸には非天然塩基が含まれ、その例はイノシンであるが、決してこれに限定されない。先に述べたように、核酸アナログはハイブリダイゼーションのための結合部位として使用され得る。適当な核酸アナログの例はペプチド核酸である（例えば、Ｅｇｈｏｌｍら，Ｎａｔｕｒｅ，３６３：５６６−５６８（１９９３）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５３９，０８３を参照されたい）。結合エネルギー、塩基組成、配列複雑さ、クロスハイブリダイゼーション結合エネルギー及び二次構造を考慮するアルゴリズムを用いてプローブを選択することが好ましい（Ｆｒｉｅｎｄらの２００１年１月２５日に公開された国際特許公開ＷＯ０１／０５９３５；Ｈｕｇｈｅｓら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９：３４２−７（２００１）を参照されたい）。
【０２１２】
当業者は、ポジティブ対照プローブ（例えば、標的ポリヌクレオチド分子中の配列に相補的であり且つハイブリダイズし得ることが公知のプローブ）及びネガティブ対照プローブ（例えば、標的ポリヌクレオチド分子中の配列に相補的でなく且つハイブリダイズし得ないことが公知のプローブ）をアレイ上に含めなければならないことも認識している。１つの実施形態では、ポジティブ対照はアレイの周囲に沿って合成される。別の実施形態では、ポジティブ対照はアレイを横切る対角縞中で合成される。更に別の実施形態では、各プローブの逆補体はネガティブ対照として役立つためにプローブの位置の隣で合成される。更に別の実施形態では、生物の他の種由来の配列はネガティブ対照または“スパイク−イン”対照として使用される。
【０２１３】
３．５．２．３  プローブの固体表面への結合
プローブは、例えばガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ナイロンセルロース、ゲル、或いは他の多孔質または非多孔質材料から作成され得る固体支持体または表面に結合される。核酸を表面に結合させるための好ましい方法は、Ｓｃｈｅｎａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４６７−４７０（１９９５）に概略的に記載されているようにガラスプレートに印刷することによる。この方法はｃＤＮＡのマイクロアレイを作成するために特に有用である（ＤｅＲｉｓｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４：４５７−４６０（１９９６）；Ｓｈａｌｏｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６：６３９−６４５（１９９６）；及びＳｃｈｅｎａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：１０５３９−１１２８６（１９９５）を参照されたい）。
【０２１４】
マイクロアレイを作成するための第２の好ましい方法は高密度オリゴヌクレオチドアレイを作成することによる。現場合成のためにフォトリソグラフィー技術を用いて表面上の規定の位置に規定の配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを数千含むアレイを作成するための技術（Ｆｏｄｏｒら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７３；Ｐｅａｓｅら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：５０２２−５０２６；Ｌｏｃｋｈａｒｔら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５７８，８３２、５、５５６，７５２及び５，５１０，２７０を参照されたい）、または規定のオリゴヌクレオチドの急速合成及び付着のための他の方法（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１１：６８７−６９０）は公知である。これらの方法を使用すると、公知の配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、６０マー）が表面（例えば、誘導体化したガラススライド）上で直接合成される。通常、作成されたアレイは余分であり、ＲＮＡあたり数個のオリゴヌクレオチド分子を含んでいる。
【０２１５】
マイクロアレイを例えばマスキング（Ｍａｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０：１６７９−１６８４）により作成する他の方法も使用され得る。原則として、上述したように、任意のタイプのアレイ、例えばナイロンハイブリダイゼーション膜上のドットブロット（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ＮＤ  ＥＤ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）を使用することができる。しかしながら、当業者は認識しているように、ハイブリダイゼーション容量がより少ないので非常に小さいアレイが多くの場合好ましい。
【０２１６】
１つの実施形態では、本発明のアレイは支持体上でポリヌクレオチドプローブを合成することにより製造される。このような実施形態では、ポリヌクレオチドプローブをポリヌクレオチドの３’または５’末端で支持体上に共有結合される。
【０２１７】
特に好ましい実施形態では、本発明のマイクロアレイはオリゴヌクレオチド合成のためのインクジェット印刷デバイスを用いて、例えばＢｌａｎｃｈａｒｄのＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０２８，１８９；Ｂｌａｎｃｈａｒｄら，１９９６，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１１：６８７−６９０；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，１９９８，ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＤＮＡ  ＡＲＲＡＹＳ  ＩＮ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，Ｖｏｌ．２０，Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．１１１−１２３に記載されている方法及びシステムを用いて製造される。具体的には、前記マイクロアレイ中のオリゴヌクレオチドプローブをアレイにおいて（好ましくは、ガラススライド上で）高表面張力の溶媒（例えば、プロピレンカーボネート）の“微小滴”中に個々のヌクレオチド塩基を連続的に沈着させることにより合成することが好ましい。微小滴は容量が小さく（例えば、１００ｐＬ以下、より好ましくは５０ｐＬ以下）、マイクロアレイ上に（例えば、疎水性ドメインにより）相互に分離されていて、アレイエレメント（すなわち、異なるプローブ）の位置を規定する円形表面張力壁を形成している。インクジェット法により製造したマイクロアレイは典型的には高密度を有しており、好ましくは少なくとも約２，５００個の異なるプローブ／１ｃｍ２の密度を有している。ポリヌクレオチドプローブはポリヌクレオチドの３’または５’末端で支持体に共有結合されている。
【０２１８】
３．５．２．４  標的ポリヌクレオチド分子
本発明により分析され得るポリヌクレオチド分子（“標的ポリヌクレオチド分子”）は任意の臨床的に関連する源由来であり得るが、天然に存在する核酸分子を含めた発現ＲＮＡまたはそこに由来する核酸（例えば、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡポレメラーゼプロモーターを含むｃＤＮＡに由来する増幅ＲＮＡ）、並びに合成核酸分子である。１つの実施形態では、標的ポリヌクレオチド分子はＲＮＡからなり、これには全細胞ＲＮＡ、ポリ（Ａ）＋メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはその画分、細胞質ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ（すなわち、ｃＲＮＡ；例えばＬｉｎｓｌｅｙ  ＆  Ｓｃｈｅｌｔｅｒの１９９９年１０月４日に出願されたＵ．Ｓ．特許出願番号０９／４１１，０７４；またはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，５４５，５２２、５，８９１，６３６または５，７１６，７８５）が含まれるが、これらに決した限定されない。全及びポリ（Ａ）＋ＲＮＡを製造する方法は当業界で公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ＮＤ  ＥＤ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に概略的に記載されている。１つの実施形態では、ＲＮＡを本発明において興味深い各種型の細胞からグアニジニウムチオシアナート溶解を用いて抽出した後、ＣｓＣｌ遠心にかける（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら，１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４−５２９９）。別の実施形態では、全ＲＮＡはシリカゲルカラムを用いて抽出される。前記シリカゲルの市販例にはＲＮｅａｓｙ（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ）及びＳｔｒａｔａＰｒｅｐ（カリフォルニア州ラ・ホイヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）が含まれる。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のために好ましい代替実施形態では、ＲＮＡは、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８９，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．１３．１２．１−１３．１２．５に記載されているように細胞からフェノール及びクロロホルムを用いて抽出される。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、例えばオリゴ−ｄＴセルロースを用いて選択することにより、或いは全細胞ＲＮＡのオリゴ−ｄＴプライマー逆転写により選択され得る。１つの実施形態では、ＲＮＡは当業界で公知の方法により、例えばＺｎＣｌ２とインキュベートすることによりＲＮＡ断片を生成することにより断片化され得る。別の実施形態では、本発明により分析されるポリヌクレオチド分子はｃＤＮＡ、或いは増幅ＲＮＡまたはｃＤＮＡのＰＣＲ産物からなる。
【０２１９】
１つの実施形態では、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはそれに由来する核酸を乳癌を患っているヒトから採取したサンプルから単離する。特定細胞において十分に発現しない標的ポリヌクレオチド分子は正規化技術（Ｂｏｎａｌｄｏら，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６：７９１−８０６）を用いて濃縮される。
【０２２０】
先に述べたように、標的ポリヌクレオチドは１つ以上のヌクレオチドで検出可能に標識される。標的ポリヌクレオチドを検出可能に標識するためには当業界で公知の任意の方法が使用され得る。標識化によりＲＮＡの長さに沿って均一に標識を取り込むことが好ましく、より好ましくは標識化を高い効率で実施する。この標識化のための１つの実施形態では、標識を取り込むためにオリゴ−ｄＴプライマー逆転写を利用する。しかしながら、この方法の慣用方法は３’末端断片の生成に偏っている。よって、好ましい実施形態では、標的ポリヌクレオチドの全長にわたって標識ヌクレオチドを均一に取り込むための逆転写においてランダムプライマー（例えば、９マー）を使用する。或いは、ランダムプライマーを標的ポリヌクレオチドを増幅するためにＰＣＲ方法またはＴ７プロモーターに基づくインビトロ転写方法と一緒に使用し得る。
【０２２１】
好ましい実施形態では、検出可能な標識はルミネセンス標識である。例えば蛍光標識、バイオルミネセンス標識、化学ルミネセンス標識及び比色標識が本発明において使用され得る。非常に好ましい実施形態では、標識は蛍光標識、例えばフルオレセイン、りん光体、ローダミンまたはポリメチン染料誘導体である。市販されている蛍光標識の例には、例えば蛍光ホスホルアミデート、例えばＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（ニュージャージー州ピスカタウェイに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＦＡＭ（カリフォルニア州フォスターシティーに所在のＡＢＩ）、及びＣｙ３またはＣｙ５（ニュージャージー州ピスカタウェイに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。別の実施形態では、検出可能な標識は放射標識ヌクレオチドである。
【０２２２】
更に好ましい実施形態では、患者サンプル由来の標的ポリヌクレオチド分子を標準の標的ポリヌクレオチド分子とは差次的に標識する。標準は正常個体（すなわち、癌に侵されていない個体）由来の標的ポリヌクレオチド分子を含み得る。非常に好ましい実施形態では、標準は正常個体由来のサンプルまたは癌を有している個体由来の腫瘍サンプルからプールした標的ポリヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、標的ポリヌクレオチド分子は同一個体から誘導されるが、異なる時点で採取され、よって治療（すなわち，増殖因子経路治療薬）中及びその後のバイオマーカーの発現の変化またはその欠乏により治療の有効性を示し、増殖因子経路デレギュレーションパターンから増殖因子経路レギュレーションパターンへのバイオマーカーの発現の変化は治療が有効であることを示す。この実施形態では、異なる時点が差次的に標識される。
【０２２３】
３．５．２．５  マイクロアレイへのハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、標的ポリヌクレオチド分子がアレイの相補的ポリヌクレオチド配列、好ましくは相補的ＤＮＡが存在している特定のアレイ部位に対して特異的に結合または特異的にハイブリダイズするように選択される。
【０２２４】
好ましくは、その上に配置されている二本鎖プローブＤＮＡを含むアレイは標的ポリヌクレオチド分子と接触させる前にＤＮＡを一本鎖とすべく変性条件にかけられる。一本鎖プローブＤＮＡ（例えば、合成オリゴデオキシリボ核酸）を含むアレイは、例えば自己相補性配列のために形成するヘアピンまたはダイマーを除去するために標的ポリヌクレオチド分子と接触させる前に変性させる必要があることがある。
【０２２５】
最適なハイブリダイゼーション条件はプローブの長さ（例えば、オリゴマー対２００塩基以上のポリヌクレオチド）及びタイプ（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、及び標的核酸に依存している。オリゴヌクレオチドが短くなると、満足なハイブリダイゼーション結果のために比較的均一な融点を得るべく長さを調節する必要が生ずることは当業者には自明である。核酸のための特異的（すなわち、ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件の一般的なパラメーターはＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（２ＮＤ  ＥＤ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）に記載されている。ＳｃｈｅｎａらのｃＤＮＡマイクロアレイに対する典型的なハイブリダイゼーション条件は５×ＳＳＣ＋０．２％  ＳＤＳ中、６５℃で４時間ハイブリダイゼーションし、次いで低ストリンジェントな洗浄バッファー（１×ＳＳＣ＋０．２％  ＳＤＳ）中２５℃で洗浄した後、高ストリンジェントな洗浄バッファー（０．１×ＳＳＣ＋０．２％  ＳＤＳ）中２５℃で１０分間洗浄する（Ｓｃｈｅｎａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：１０６１４（１９９３））。有用なハイブリダイゼーション条件は、例えばＴｉｊｅｓｓｅｎ，１９９３，ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＰＲＯＢＥＳ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．；及びＫｒｉｃｋａ，１９９２，ＮＯＮＩＳＯＴＯＰＩＣ  ＤＮＡ  ＰＲＯＢＥＳＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．にも記載されている。
【０２２６】
特に好ましいハイブリダイゼーション条件は、１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）、０．５％  ナトリウムサルコシン及び３０％  ホルムアミド中、プローブの平均融点またはそれに近い（例えば、５℃以内、より好ましくは２℃以内）温度でのハイブリダイゼーションを含む。
【０２２７】
３．５．２．６  シグナル検出及びデータ分析
蛍光標識したプローブを使用する場合、マイクロアレイの各部位での蛍光発光は好ましくは走査型共焦点レーザー顕微鏡により検出され得る。１つの実施形態では、適当な励起線を用いる別々のスキャンを使用した２つの蛍光体の各々に対して実施する。或いは、２つの蛍光体に対して特異的な波長で標本を同時照射できるレーザーを使用し得、２つの蛍光体からの発光を同時に分析し得る（すべての目的のために全文参照により組み入れるＳｈａｌｏｍら，１９９６，“Ａ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：６３９−６４５を参照されたい）。好ましい実施形態では、アレイをコンピューター制御Ｘ−Ｙステージ及び顕微鏡対物レンズを備えたレーザー蛍光スキャナーを用いて走査する。２つの蛍光体の連続励起はマルチライン混合ガスレーザーを用いてなされ、発光された光は波長により分割され、２つの光電子増幅管を用いて検出される。蛍光レーザースキャニングデバイスはＳｃｈｅｎａら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６：６３９−６４５（１９９６）及びここに引用されている他の文献中に記載されている。或いは、多数の部位でのｍＲＮＡアバンダンスレベルを同時にモニターするためにＦｅｒｇｕｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：１６８１−１６８４（１９９６）に記載されている光ファイバーバンドルを使用し得る。
【０２２８】
シグナルを記録し、好ましい実施形態では、例えば１２または１６ビットアナログ−デジタルボードを用いてコンピューターにより分析する。１つの実施形態では、スキャンした像をグラフィックプログラム（例えば、Ｈｉｊａａｋ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ）を用いてスペックル除去した後、各部位の各波長での平均ハイブリダイゼーションのスプレッドシートを作成するイメージグリッデイングプログラムを用いて分析する。必要ならば、２つの蛍光体のチャネル間の“混線”（または、オーバーラップ）に対して実験的に調べた補正を作成してもよい。転写アレイでの特定ハイブリダイゼーション部位毎に２つの蛍光体の発光の比を計算し得る。この比は同族遺伝子の絶対発現レベルに依存しないが、その発現がいろいろな乳癌関連状態に関連して有意にモジュレートされる遺伝子に対して有用である。
【０２２９】
３．６  コンピューター補助分析
本発明は更に、上記したバイオマーカー集合を含むキットを提供する。好ましい実施形態では、キットは標的ポリヌクレオチド分子へのハイブリダイゼーションの準備ができているマイクロアレイに加えて上記したデータ分析のためのソフトウェアを含んでいる。
【０２３０】
前セクションに記載されている分析方法は以下のコンピューターシステムを用いて、以下のプログラム及び方法に従って実行され得る。コンピューターシステムはエクスターナル  コンポーネントに接続するインターナル  コンポーネントを含む。典型的なコンピューターシステムのインターナル  コンポーネントはメインメモリーと相互接続させたプロセッサ素子を含む。例えば、コンピューターシステムはＩｎｔｅｌ  ８０８６−、８０３８６−、８０４８６−、Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）、または好ましくは３２ＭＢ以上のメインメモリーを有するＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）プロセッサであり得る。
【０２３１】
エクスターナル  コンポーネントは大容量記憶装置を含み得る。この大容量記憶装置は１つ以上のハードディスク（典型的には、プロセッサ及びメモリと一緒にパッケージされている）であり得る。ハードディスクは好ましくは１ＧＢ以上の記憶容量を有している。他のエクスターナル  コンポーネントは、入力デバイス（“マウス”または他のグラフィック入力デバイス及び／またはキーボードであり得る）と一緒にユーザーインターフェースデバイス（モニターであり得る）を含む。印刷デバイスもコンピューターに接続され得る。
【０２３２】
典型的には、コンピューターシステムは、他のローカルコンピューターシステム、リモートコンピューターシステムまたは広域通信ネットワーク（例えば、インターネット）へのＥｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）リンクの一部であり得るネットワークリンクにもリンクされている。このネットワークリンクにより、コンピューターシステムはデータ及びプロセッシングタスクを他のコンピューターシステムと共有し得る。
【０２３３】
このシステムのオペレーション中メモリに当業界で標準であり、本発明に特有の幾つかのソフトウェアコンポーネントをロードする。ソフトウェアコンポーネントは全体でコンピューターシステムを本発明の方法に従って機能させる。これらのソフトウェアコンポーネントは典型的には大容量記憶装置に保存されている。ソフトウェアコンポーネントはコンピューターシステム及びそのネットワーク相互接続を管理するのに関与するオペレーティングシステムを含む。このオペレーティングシステムは、例えばＷｉｎｄｏｗｓ３．１、Ｗｉｎｄｏｗｓ９５、Ｗｉｎｄｏｗｓ９８、Ｗｉｎｄｏｗｓ２０００またはＷｉｎｄｏｗｓＮＴのようなＭｉｃｒｏｓｏｆｔ・Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｆａｍｉｌｙのものであり得る。ソフトウェアコンポーネントは、本発明に特有の方法を実行するプログラムをアシストするためのこのシステム上に存在する共通の言語及び機能に相当する。多くの高または低レベルのコンピューター言語が本発明の分析方法をプログラムするために使用され得る。ランタイム中指示が解釈され、編集され得る。好ましい言語はＣ／Ｃ＋＋、ＦＯＲＴＲＡＮ及びＪＡＶＡ（登録商標）を含む。最も好ましくは、本発明の方法は、使用しようとするアルゴリズムの一部または全部を含めた方程式の記号エントリー及びプロセッシングの高レベル仕様を可能にする数学ソフトウェアパッケージでプログラム化され、これによりユーザーが個々の方程式またはアルゴリズムを手続き上プログラムする必要が免除される。前記パッケージにはＭａｔｈｗｏｒｋｓ（マサチューセッツ州ネーティックに所在）製Ｍａｔｈｌａｂ、Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（イリノイ州シャンペーンに所在）製Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ（登録商標）、またはＭａｔｈ  Ｓｏｆｔ（マサチューセッツ州ケンブリッジに所在）製Ｓ−Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｄが含まれる。具体的には、ソフトウェアコンポーネントには手続き型言語または記号パッケージにおいてプログラム化される本発明の分析方法が含まれる。
【０２３４】
キットに含まれるソフトウェアは本明細書中に開示されている本発明のデータ分析方法を含む。特に、ソフトウェアは、臨床カテゴリー（すなわち，増殖因子シグナル伝達経路レギュレーション状態）とバイオマーカー発現の相関係数の計算を含めたバイオマーカー発見のための数学的ルーチンを含み得る。ソフトウェアは、サンプルの臨床的分類を決定するためにアレイ生成蛍光データを用いてサンプルバイオマーカー発現と対照バイオマーカー発現間の相関を計算するための数学的ルーチンをも含み得る。
【０２３５】
例示的実行において、本発明の方法を実施するために、ユーザーはまずコンピューターシステムに実験データをロードする。これらのデータはユーザーによりモニター、キーボードから、ネットワーク通信によりリンクされている他のコンピューターシステムから、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピー（登録商標）ディスク（説明せず）、テープドライブ（説明せず）、ＺＩＰ（登録商標）ドライブ（説明せず）のようなリムーバル記憶媒体に、またはネットワークを介して直接入力され得る。次に、ユーザーは本発明の方法を実施する発現プロファイル分析ソフトウェアを実行する。
【０２３６】
別の例示的実行において、ユーザーはまず実験データ及び／またはデータベースをコンピューターシステムにロードする。このデータは記憶媒体またはリモートコンピューターから、好ましくは動的遺伝子集合データベースシステムからネットワークを介してメモリにロードする。次いで、ユーザーは本発明のステップを実施するソフトウェアを実行する。
【０２３７】
本発明の分析方法を実行するための別のコンピューターシステム及びソフトウェアは当業者に自明であり、添付されている特許請求の範囲内に包含されると意図される。特に、添付の特許請求の範囲は当業者が容易に認識する本発明の方法を実施するための代替プログラム構造を含むと意図される。
【実施例１】
【０２３８】
大腸癌細胞株においてＡＫＴ阻害によりレギュレートされる遺伝子の同定
ヒト腫瘍における増殖因子シグナル伝達経路デレギュレーションの遺伝子発現サインを同定するために、６つの大腸癌細胞株ＨＣＴ−８（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４４）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２９）、ＣＯＬＯ２０５（ＡＴＣＣ番号ＣＬＬ−２２２）、ＤＬＤ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２１）、ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４７）及びＨＣＴ−１５（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２５）をまずＡＫＴ１／２小分子阻害に応答する遺伝子を同定するためにマイクロアレイにより発現プロファイルさせた。６つの大腸癌細胞株を４μＭのＡＫＴ１／２阻害剤Ｌ−００１１５４５４７（’５４７；３−フェニル−２−（４−｛［４−（５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾル−３−イル）ピペリジン−１−イル］メチル｝フェニル）−１，６−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン；ＷＯ２００６０６５６０１に開示されている）または４μＭのＡＫＴ１／２阻害剤Ｌ−０１１７３９３１（’９３１；６−メチル−３−フェニル−２−（４−｛［４−（５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾル−３−イル）ピペリジン−１−イル］−メチル｝フェニル）−１，６−ナフチリジン−５（６Ｈ）−オン；ＷＯ２００６０６５６０１に開示されている）で６または２４時間処理した。１つの化合物のオフターゲット効果を相殺するための方法としてのプロファイリング実験のために２つのＡＫＴ１／２阻害剤を使用した。これらの６つの細胞株は、大腸癌細胞株の３つ（ＨＣＴ−８、ＬｏＶｏ、ＣＯＬＯ２０５）がインビトロで’５４７化合物によるＡＫＴ阻害に対して比較的感受性であり、他の３つの細胞株（ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６及びＨＣＴ−１５）が’５４７化合物によるＡＫＴ阻害に対して比較的耐性であったことを示した１９個の大腸癌細胞株に関する従来のデータに基づいて選択した（図２を参照されたい）。
【０２３９】
遺伝子発現プロファイリングのために、全ＲＮＡを細胞サンプルから抽出し、標準プロトコル（Ｈｕｇｈｅｓら，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：３４２−４７；Ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ，４１５：５３０−３６）を用いて増幅させた。約４４，０００個のヒト遺伝子の発現をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（カリフォルニア州ラ・ホヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて６０マーオリゴヌクレオチドアレイ（カリフォルニア州サンタクララに所在のＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）にハイブリダイズさせることにより確認した。遺伝子発現を先に記載した（上掲したＨｕｇｈｅｓら，２００１；上掲したＶａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら，２００２）標準方法を用いて調べ、正規化した。データをビヒクルのみで処理した細胞における平均発現に正規化させた。
【０２４０】
処理後変化のＡＮＯＶＡ分析から、ＡＫＴ化合物治療及びＡＫＴ化合物治療に対する処理応答に関連する有意な差次的発現が明らかとなった。３，５００個の遺伝子は処理後差次的にレギュレートされており（ｐ値＜０．０１）、１，６００個の遺伝子は比較的感受性な細胞株（ＨＣＴ−８、ＬｏＶｏ、ＣＯＬＯ２０５）と比較的耐性の細胞株（ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６及びＨＣＴ−１５）間で差次的にレギュレートされた（図３Ａ；ｐ値＜０．０１）。遺伝子発現の投与後変化を用いる応答者及び非応答者の判別分析は１つ抜き交差確認法で９０％正確であった（データ示さず）。これら１，６００個の遺伝子の中で、我々はこのデータセットでＩＲＳ２の発現の変化とぴったり相関（ｒ＞０．７）していた３９９個の遺伝子を増殖因子経路シグナル伝達の主要メディエータ（図３Ｂ）（Ｈｅｎｎｅｓｓｙら，２００５，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，４：９８８−１００４）として着目した。図１に示した感受性及び耐性表現型が絶対ではないが相対的であることに留意されたい。アッセイした１９個の細胞株の全部がＡＫＴ１／２の阻害に応答して若干程度の細胞死滅を示した。従って、予想されたように、すべての細胞株がこれら３９９個の遺伝子に対して処理後同様の方向のレギュレーションを示し、より感受性の細胞株はよりロバストなレギュレーションを示した。
【実施例２】
【０２４１】
ＡＫＴサイン遺伝子集合のフィルタリング
３９９個の遺伝子からのＡＫＴ遺伝子発現サインをより管理しやすいサイズに縮小するために、２つのアプローチを採用した。まず、我々は“フィードバックレギュレーション”に関与する遺伝子を除外した。我々は、フィードバックレギュレーション遺伝子をＡＫＴシグナル伝達を活性化することが公知であるが、インビトロでＡＫＴ阻害剤によりアップレギュレートされたものとして定義した。例えば、ＥＲＢＢ３、ＩＲＳ１、ＥＲＢＢ２、ＩＮＳＲ、ＩＲＳ２、ＦＧＦＲ１及びＥＧＦＲ（ＡＫＴを活性化することが公知の増殖因子経路成分）はより感受性の細胞株（ＣＯＬＯ２０５、ＨＣＴ−８、ＬｏＶｏ）においてＡＫＴ阻害によりアップレギュレートされた（少なくとも１つの実験でｐ＜０．５）（図４Ａ）。これらの遺伝子の各々はＡＫＴの上流にあり、各々は増殖因子により活性化されるとＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の活性化がもたらされることが公知である。ＡＫＴ活性化剤がＡＫＴ阻害によりアップレギュレートされるであろうことは反直観的と見られるが、このアップレギュレーションは阻害剤を添加した後ＡＫＴシグナル伝達活性を取り戻す細胞の試みに相当しているようである。
【０２４２】
このフィードバックレギュレーションはインビトロでのＡＫＴの短期間の急激な阻害の結果であり得（図４Ｂ）、インビボで正常組織に比してＡＫＴの長期間の慢性活性化を有しているヒト腫瘍では観察されそうもない。例えば、ＥＲＢＢ３、ＩＲＳ１、ＥＲＢＢ２、ＩＮＳＲ、ＩＲＳ２、ＦＧＦＲ１及びＥＧＦＲはインビトロでＡＫＴ阻害剤によりアップレギュレートされた（すなわち、ＡＫＴ阻害状態ではより高い）のに対して、多くの腫瘍ではアップレギュレートされる（すなわち、高いＡＫＴシグナル伝達を有する組織ではより高い）ことは公知である（Ｈｅｎｎｅｓｓｙら，２００５，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，４：９８８−１００４）。我々はヒト腫瘍中の増殖因子経路活性を評価するためにこのサインを使用したいので、我々は正確なインビトロ環境及びインビボ腫瘍環境でＡＫＴ経路モジュレーションに応答して同一方向のレギュレーションを示す遺伝子に着目した。我々のアプローチは、インビトロでＡＫＴ阻害剤によりダウンレギュレートされ、大腸腫瘍発現アトラスにおいて隣接する正常組織に比して大腸癌では平均してアップレギュレートされる（及びその逆）遺伝子を同定することであった。大腸腫瘍発現アトラスは大腸癌に関する遺伝子発現情報を含むデータベースである。大腸腫瘍発現アトラスの場合、同一患者からの照合させた大腸腫瘍及び正常（すなわち、隣接する非癌性）サンプルの最高７５対を正常サンプルの部分集合のプールに対してプロファイリングした。前記遺伝子を同定するために、我々は照合させた隣接正常組織に対して各腫瘍を再び比率で示すことにより大腸腫瘍発現アトラス中の各腫瘍サンプル毎に１つのプロファイルを作成した。上記した３９９個の遺伝子発現サインから始めて、我々は次のオペレーションを実施した。インビトロでＡＫＴ阻害剤によりアップレギュレートされた遺伝子の場合、正常組織に比して大腸腫瘍においてより低いもののみを保持する（腫瘍集合で平均ｌｏｇ比＜−０．２）；インビトロでＡＫＴ阻害剤によりダウンレギュレートされた遺伝子の場合、正常組織に比して大腸腫瘍においてより高いもののみを保持する（腫瘍集合で平均ｌｏｇ比＞０．２；図４Ｃ参照）。
【０２４３】
第２に、我々は上記したより感受性の大腸癌細胞株（ＨＣＴ−８、ＬｏＶｏ、ＣＯＬＯ２０５）において６つの時点プロファイルのすべてにおいてレギュレートされた遺伝子（ＦＣ＞１．２，ｐ＜０．０５）のみを維持した。これは、増殖のより非特異的な阻害を反映する可能性があるより遠隔変化よりもＡＫＴ阻害に対して近位の変化に着目すべく実施した。
【０２４４】
これらのフィルタリングアプローチを採用した後、我々はＡＫＴシグナル伝達活性に対する４８個の遺伝子発現サインを残した。このＡＫＴサインは大腸癌細胞及び大腸腫瘍において生じたので、我々は次に乳癌に対する適用可能性を評価した。我々は次の式；
平均ｌｏｇ比（インビトロでＡＫＴ阻害によりダウンレギュレートされた遺伝子）−平均ｌｏｇ比（インビトロでＡＫＴ阻害によりアップレギュレートされた遺伝子）
を用いて乳房腫瘍発現アトラス中の１つのサイン“スコア”を計算した。乳房腫瘍発現アトラスは乳癌に関する遺伝子発現情報を含むデータベースである。乳房腫瘍発現アトラスの場合、同一患者からの照合させた乳房腫瘍及び正常（すなわち、隣接する非癌性）サンプルの最高７５対を正常サンプルの部分集合のプールに対してプロファイリングした。ＡＫＴサインスコアは隣接正常組織に比して乳房腫瘍においてより高い（図５Ａ）。このことは、他の方法により固体腫瘍においてより高いＡＫＴシグナル伝達を示す証拠（Ａｌｔｏｍａｒｅら，２００３，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８８：４７０−４７６；Ｃｈｅｎｇら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３６３６−３６４１；Ｇｏｅｌら，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６４：３０１４−３０２１；Ｌｉら，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１９４３−１９４７；Ｌｉら，２００５，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１１：２８５−２８８；Ｒｕｇｇｅｒｉら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，２１：８１−８６；Ｓｔａａｌら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：５０３４−５０３７）、及びリン酸化したＡＫＴレベルは乳癌における負の予後指標であることを示すデータ（Ｖｅｓｔｅｙら，２００５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４１：１０１７−１０２５）と一致している。このことから、ＡＫＴシグナル伝達の我々のサインがヒト腫瘍におけるＡＫＴ経路活性化状態を正確に反映していることが示唆される。臨床的アッセイを開発するための遺伝子に着目するために、我々は生非得的機能を持たない非注釈遺伝子を排除し、３７個の遺伝子サイン、すなわち２４個のＡＫＴシグナル伝達活性の増加に伴いアップする遺伝子（“ＡＫＴ  ＵＰ”；表１を参照されたい）及び１３個のＡＫＴシグナル伝達活性の増加に伴いダウンする遺伝子（“ＡＫＴ  ＤＯＷＮ”；表２を参照されたい）を残した。
【０２４５】
【表３】
2011515088.tif 000068
2011515088.tif 000069
2011515088.tif 000070
【０２４６】
【表４】
2011515088.tif 000071
2011515088.tif 000072
【実施例３】
【０２４７】
ＭＹＣシグナル伝達サインの統合及び新規ＭＹＣサインの開発
Ｂｉｌｄらは、原発性ヒト乳房上皮細胞においてｃＭＹＣ（ＭＹＣとしても公知）過剰発現に応答してレギュレートされた遺伝子発現サインを発表した（２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４３９：３５３−３５７）。このＭＹＣサインを腫瘍発現アトラスデータの状況において分析した。腫瘍発現アトラスは乳房、大腸、胃、腎臓及び肺腫瘍を含めた幾つかの異なる型のヒト腫瘍において調べた遺伝子発現データのコレクションである。この腫瘍発現アトラスの場合、同一患者からの各型の腫瘍及び正常（すなわち、隣接する非癌性）サンプルの最高７５対を正常サンプルの部分集合のプールに対してプロファイルした。１個の遺伝子ＣＣＮＧ２（転写物ＩＤ  ＢＣ０３２５１８）のみがＡＫＴサインとＢｉｌｄのＭＹＣサイン間で共有された。我々は、ＭＹＣサインが大腸及び乳房腫瘍発現アトラスデータセットにおいてＡＫＴサインと高度に相関していたことも知見した（図６Ａ、Ｂ）。従って、我々は、ＡＫＴ及び他の腫瘍標的の抑制に応答したＭＹＣサインのレギュレーションを評価した。図６Ｃに示すように、Ｂｉｌｄらが開発したＭＹＣサインはＡＫＴ、ｃＭＥＴ及びＦＧＦＲ２を標的化する小分子インヒビターによりロバスト且つ常に抑制されたが、タキソールまたはＫＳＰ小分子インヒビターによっては抑制されなかった。ｃＭＥＴ、ＦＧＦＲ２及びＡＫＴ阻害により引き出されるサインは非常に似ており（データ示さず）、類似のメカニズムを反映している。従って、ＭＹＣサインは細胞死の一般的なサインでない。むしろ、増殖因子経路シグナル伝達（増殖因子受容体チロシンキナーゼまたはシグナル伝達中間体の標的化）が生じるとレギュレートされるが、有糸分裂抑制剤によりレギュレヘートされない。
【０２４８】
ｃＭＹＣがＴ−ＡＬＬ細胞におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の直接の標的であり、ｃＭＹＣの過剰発現がγ−セクレターゼ阻害剤誘導細胞死由来のＴ細胞急性リンパ球芽性白血病／リンパ腫（Ｔ−ＡＬＬ）細胞を保護し得ることは既に立証されている（Ｗｅｎｇら，２００６，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２０：２０９６−２１０９）。次には、我々はＴ−ＡＬＬ細胞株（ＤＮＤ−４１、ＭＯＬＴ−４（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８２）、ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＫＡＲＰＡＳ−４５、ＲＰＭＩ−８４０２、ＴＡＬＬ−１、ＬＯＵＣＹ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２６２９））におけるγ−セクレターゼ阻害に応答したＢｉｌｄらが開発したＭＹＣサインを評価した。Ｔ−ＡＬＬ細胞株を１００ｎＭまたは１μＭのγ−セクレターゼ阻害剤４２１Ｂで３または７日間処理した。４２１Ｂは（ＵＳ７，１３８，４００及びＷＯ０２／３６５５５の実施例７５に開示されている）スルファミド化合物である。図７に示すように、γ−セクレターゼが阻害されると、ＭＹＣを発現しないＬｏｕｃｙ細胞を除くＴ−ＡＬＬ細胞株においてＭＹＣサインは抑制された。従って、古典的な増殖因子経路インヒビターに加えて、ＭＹＣサインはγ−セクレターゼ阻害剤に対する標的阻害剤の読出し情報であり得る。
【０２４９】
複数の腫瘍学化合物によるＭＹＣサインの明らかに一定のレギュレーションのために、我々は新規ＭＹＣサインを開発するための代替アプローチを採用した。ＧＴＬ−１６胃癌（Ｇｉｏｒｄａｎｏ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３３９：１５５−１５６）及びＥＢＣ−１肺癌細胞株（ＲＩＫＥＮ  ＲＣＢ１９６５）をＩＣ１０、ＩＣ５０及びＩＣ９０用量（ｃＭＥＴリン酸化のインビトロ抑制のために）のｃＭＥＴインヒビターＬ−００１５０１４０４（４−（６−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ｂ］［１，２，４］トリアジン−３−イルメチル）−フェノール；ＵＳ７，１２２，５４８も参照されたい）、ＭＫ−２４６１（Ｎ−［（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル］−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾル−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］スルファミド；ＰＣＴ出願に開示されている）及びＬ−００１７９３２２５（１−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾル−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）メタンスルホンアミド；まだ出願されていないＰＣＴに開示されている）で１２または２４時間処理した。遺伝子発現プロファイルを得るために、全ＲＮＡを細胞サンプルから抽出し、標準プロトコル（Ｈｕｇｈｅｓら，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：３４２−４７；Ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ，４１５：５３０−３６）を用いて増幅させた。約４４，０００個のヒト遺伝子の発現は、６０マーオリゴヌクレオチドアレイ（カリフォルニア州サンタクララに所在のＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（カリフォルニア州ラ・ホイヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてハイブリダイズすることにより確認した。遺伝子発現を先に記載した（上掲のＨｕｇｈｅｓら，２００１；上掲のＶａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら，２００２）標準方法を用いて調べ、正規化した。データをビヒクルのみで処理した細胞における平均発現に対して正規化した。
【０２５０】
すべてのＩＣ９０サンプルにおいて少なくとも２倍の変化を示した遺伝子をＩｎｇｅｎｕｉｔｙソフトウェア（カリフォルニア州レッドウッドシティーに所在のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてパスウェイ分析したところ、ＭＹＣが最も有意な相互作用ネットワークの中心ハブであることが判明した（図８Ａ；ｐ＜１×１０−６４）。加えて、遺伝子集合アノテーターを用いる分析から、ＭＹＣプロモーターエレメントを含む遺伝子（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅプロモーターモチーフデータベース（Ｘｉｅら，２００５，Ｎａｔｕｒｅ，４３４：３３８−３４５も参照されたい）、Ｅ値＝２．２９×１０−１３）がすべてのＩＣ９０サンプルにおいて少なくとも２倍のダウンレギュレーションを示す遺伝子の中で最も有意に濃縮された群であったことが判明した（データ示さず）。作成し、図８Ａに示したＩｎｇｅｎｕｉｔｙ相互作用を用いて、我々は新規なＭＹＣサインを得るためにＭＹＣ及びＭＹＣと相互作用することが科学文献から公知の１８個の遺伝子に着目した。１８個の遺伝子は倍発現変化、及びタンパク質−タンパク質相互作用よりもＭＹＣとの相互作用がＩｎｇｅｎｕｉｔｙにより定義して転写レベルで公知であったという事実に基づいて選択された。ＭＹＣサイン遺伝子のうちの１３個はＭＹＣシグナル伝達の増加に伴ってアップし（“ＭＹＣ  ＵＰ”）、前記遺伝子のうちの６個はＭＹＣシグナル伝達の増加に伴ってダウンした（“ＭＹＣ  ＤＯＷＮ”；表３）。この新規なＭＹＣシグナル伝達サインは大腸腫瘍及び乳房腫瘍アトラスデータセットにおいてＡＫＴ経路サインとも相関し（データ示さず）、有糸分裂抑制剤（タキソール、ＫＳＰインヒビター）ではなく、増殖因子経路インヒビター及びγ−セクレターゼ阻害剤によりレギュレートされる（図８Ｂ）。
【０２５１】
【表５】
2011515088.tif 000073
2011515088.tif 000074
2011515088.tif 000075
【実施例４】
【０２５２】
“増殖因子シグナル伝達経路”サインの拡張
上記したように、ＡＫＴ及びＭＹＣシグナル伝達サインは有糸分裂抑制剤ではなく、複数の増殖因子経路インヒビターによりレギュレートされる。この結果から、ＡＫＴ及びＭＹＣシグナル伝達サインは多分増殖因子経路活性の大きな発現サインの一部であり、ＡＫＴ及びＭＹＣシグナル伝達サインにより表される遺伝子は増殖因子シグナル伝達軸に沿ったいろいろなポイントを表わし得ることが示唆される。増殖因子経路シグナル伝達の抑制に対して複数の可能性ある標的があるため、また〜１００個の遺伝子がバイオマーカーとしてのサイン遺伝子を測定するための臨床的アッセイを商業化及び作成するために選択され得る可能性があるために、我々は有糸分裂抑制剤ではなく増殖因子経路インヒビターによりロバストにレギュレートされる他の遺伝子を同定することにより我々の増殖因子シグナル伝達経路サインを拡張させた。
【０２５３】
増殖因子シグナル伝達経路サインに対する追加遺伝子を同定するために、以下の基準を使用した：１）ＧＴＬ−１６胃癌細胞においてＩＣ９０用量のＭＫ２４６１（ｃＭＥＴインヒビターＮ−［（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル］−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾル−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］スルファミド）により少なくとも２倍（ｐ＜０．０１）レギュレートされる；２）タキソールまたはＫＳＰの抑制によりレギュレートされない（ｐ＞０．０５）；３）上記したＡＫＴまたＭＹＣサインの一部でない。更に、増殖因子シグナル伝達活性の増加に伴ってアップする２６個の遺伝子（“ＧＦ  ＵＰ”；表４ａ）及び増殖因子シグナル伝達活性の増加に伴ってダウンする１９個の遺伝子（“ＧＦ  ＤＯＷＮ”；表４ｂ）を同定するために、これらの基準を用いて同定された遺伝子を倍発現変化並びにＡＫＴ及びＦＧＦＲ２の抑制に対する応答性に基づいて順位付けした。
【０２５４】
【表６】
2011515088.tif 000076
2011515088.tif 000077
2011515088.tif 000078
【０２５５】
【表７】
2011515088.tif 000079
2011515088.tif 000080
2011515088.tif 000081
【０２５６】
上記分析の最終結果は、腫瘍において増殖因子シグナル伝達経路の活性を反映している１０１個の遺伝子サインである（表５）。この遺伝子サインは２つの対立する腕、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達の増加に伴ってアップレギュレートされる遺伝子からなる“アップ”腕（表５ａ）及びダウンレギュレートされる遺伝子からなる“ダウン”腕（表５ｂ）に分けられる。
【０２５７】
【表８】
2011515088.tif 000082
2011515088.tif 000083
2011515088.tif 000084
2011515088.tif 000085
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【０２５８】
【表９】
2011515088.tif 000087
2011515088.tif 000088
2011515088.tif 000089
【実施例５】
【０２５９】
増殖因子シグナル伝達経路サインの小分子インヒビター及び増殖因子による逆レギュレーション
我々は増殖因子経路シグナル伝達のインヒビターによるレギュレーションに基づいて上記の新規な増殖因子シグナル伝達経路サインを開発したので、我々は、我々の新規サイン遺伝子が増殖因子シグナル伝達を活性化させる治療によりインビトロで逆レギュレートされるであろうと仮定した。複数の細胞株（ＳＫＭＣ（骨格筋）、ＭＣＦ７（乳癌）、ＨＴ２９（大腸癌）及びＨＭＥＣ（乳房上皮細胞）を５つの増殖因子（ヘレグリン、インスリン、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ）で０．５、２、６、１８または２４時間処理した後プロファイルした。図９に示すように、増殖因子経路サインは増殖因子経路シグナル伝達のインヒビターと比較して増殖因子により逆レギュレートされる。増殖因子インヒビターによりアップレギュレートされる遺伝子は増殖因子によりダウンレギュレートされ、またはその逆であり、レギュレーションは増殖因子で処理してから２時間くらいの早期に観察された。加えて、サイン遺伝子は有糸分裂抑制剤により一定のレギュレーションを示さなかった。これらの結果から、このサインが増殖または細胞死の一般的サインでなく、むしろサインは増殖因子経路シグナルの活性に対してより近似で特異的な事象を明らかに反映していることが立証される。
【実施例６】
【０２６０】
増殖因子シグナル伝達経路サインまたはｃＭＥＴ  ｍＲＮＡ発現によるｃＭＥＴインヒビターに対する応答の予測
１４個の腫瘍株のｃＭＥＴインヒビターＭＫ−２４６１に対する感受性について試験した。腫瘍を軟寒天に接種した腫瘍のコロニーを形成する能力を試験するコロニー形成アッセイで試験した。サンプルを異なる用量のＭＫ−２４６１で処理し、ＭＫ−２４６１のコロニー形成に対する抑制効果を評価した。コロニー形成をビヒクル処理に比して５０％低下させるＭＫ−２４６１のＩＣ５０用量を確認した。各腫瘍株で遺伝子発現プロファイリングも実施した。
【０２６１】
ＭＫ−２４６１応答を予測するためにｃＭＥＴのｍＲＮＡ発現の能力を評価した。図１１Ａに示すように、ＭＫ−２４６１処理に対して最も感受性であった腫瘍は低いｃＭＥＴ発現を有していた。しかしながら、図１１Ｂに示すように、最も感受性の腫瘍は最高のベースライン増殖因子シグナル伝達経路サインスコアを有していた。ビヒクル処理した腫瘍株及び化合物処理した腫瘍株からＲＮＡを採取したら、ＭＫ−２４６１処理細胞の遺伝子発現プロファイルをビヒクル処理細胞と比較することによりＭＫ−２４６１による増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーションを評価した。マイクロアレイ上の各プローブ毎に、照合させたビヒクル処理した細胞に対するＭＫ−２４６１処理した細胞における発現のｌｏｇ（１０）比を計算した。増殖因子シグナル伝達経路サインスコアは、サインの“アップ”腕中の遺伝子（表５ａを参照されたい）の平均ｌｏｇ（１０）比−サインの“ダウン”腕中の遺伝子（表５ｂを参照されたい）の平均ｌｏｇ（１０）比として計算した。これらのデータから、増殖因子シグナル伝達経路サインはｃＭＥＴのｍＲＮＡ発現よりも良好なＭＫ−２４６１感受性の予測子であること及びこのサインはＭＫ−２４６１での治療に対する応答を予測するために使用され得ることが示唆される。
【実施例７】
【０２６２】
細胞株における化合物有効性の早期読出し情報としての増殖因子シグナル伝達経路サイン
ｃＭＥＴが増殖している２つの細胞株（ＥＢＣ−１及びＧＴＬ−１６）を含めてＰＩ３Ｋ／ＭＡＰＫ経路成分が変化している１０個の細胞株を同定した（表６を参照されたい）。従来の研究で、表６にリストされている１０個の細胞株の中でＥＢＣ−１及びＧＴＬ−１６のみがｃＭＥＴインヒビターＭＫ−２４６１での処理に応答して細胞死に対して感受性であった（データ示さず）。これらの細胞における増殖因子シグナル伝達経路サインのレギュレーションを評価するために、これらの細胞株をビヒクルまたは１μＭのＭＫ−２４６１で処理した。処理してから６及び１２時間目に細胞株をプロファイルした。各処理群につき６つのウェルプレートに２つの培養物を接種した。細胞は採取した時点で〜７０％コンフルエンスであった。実験は２回実施した。
【０２６３】
【表１０】
2011515088.tif 000090
【０２６４】
ＲＮＡをビヒクル処理した細胞及び化合物処理した細胞から収集し、ビヒクル処理した細胞に対してＭＫ−２４６１処理した細胞の遺伝子発現プロファイルを比較することによりＭＫ−２４６１による増殖因子シグナル伝達経路のレギュレーションを評価した。マイクロアレイ上の各プローブ毎に、細胞株照合させたビヒクル処理したサンプルに対するＭＫ−２４６１処理したサンプルにおける発現のｌｏｇ（１０）比を計算した。増殖因子シグナル伝達経路サインスコアをサインの“アップ”腕中の遺伝子（表５ａを参照されたい）の平均ｌｏｇ（１０）比−サインの“ダウン”腕中の遺伝子（表５ｂを参照されたい）の平均ｌｏｇ（１０）比として計算した。図１２に示すように、ＥＢＣ−１及びＧＴＬ−１６の２個の細胞株でのみ増殖因子シグナル伝達経路の抑制が観察された。これらがＭＫ−２４６１に対して感受性のたった２つだけの細胞株であるので、これらのデータから増殖因子シグナル伝達経路サインが有効性の早期読出し情報として使用され得ることが示唆される。
【実施例８】
【０２６５】
異種移植片における化合物有効性の早期読出し情報としての増殖因子シグナル伝達経路サイン
ＨＲＬＮ雌ｎｕ／ｎｕマウスに５×１０６個のＥＢＣ−１腫瘍細胞を皮下移植した。治療薬を投与する前に腫瘍を４５０−５００ｍｇの平均サイズまで増殖させた。異種移植片をビヒクル、或いは１１、３４または１１２ｍｐｋのＭＫ−２４６１で処理した（各治療群につきｎ＝４）。従来のデータから、１１２ｍｐｋの用量のみが腫瘍増殖に対して効果を有していたことが立証された（データ示さず）。１１２ｍｐｋのＭＫ−２４６１で処理すると、ビヒクル処理に比べて腫瘍増殖が約３０％抑制された。１１ｍｐｋ及び３４ｍｐｋのＭＫ−２４６１での処理は腫瘍増殖に対して効果を有していなかった。治療薬は１日２回、７日間経口投与した。最後に投与してから２時間後がＣｍａｘに達する推定時間であったので、この時点で腫瘍を収集した。
【０２６６】
ビヒクル処理したサンプル及び化合物処理したサンプルからＲＮＡを収集した。４つのビヒクル処理したサンプルの平均遺伝子発現プロファイルに対してＭＫ−２４６１処理したサンプルの遺伝子発現プロファイルを比較することによりＭＫ−２４６１による増殖因子シグナル伝達経路サインのレギュレーションを評価した。マイクロアレイ上の各プローブ毎にビヒクル処理したサンプルの平均に対するＭＫ−２４６１処理したサンプルの発現のｌｏｇ（１０）比を計算した。増殖因子シグナル伝達経路サインスコアは、サインの“アップ”腕中の遺伝子（表５ａを参照されたい）の平均ｌｏｇ（１０）比−サインの“ダウン”腕中の遺伝子（表５ｂを参照されたい）の平均ｌｏｇ（１０）比として計算した。
【０２６７】
図１３に示すように、１１２ｍｐｋの用量でのみ増殖因子シグナル伝達経路サインの抑制が観察された。これは有効性が得られた唯一の用量であるので、これらのデータから増殖因子シグナル伝達経路サインが有効性の早期読出し情報として使用され得ることが示唆される。
【実施例９】
【０２６８】
増殖因子経路シグナル伝達遺伝子サインの確認及び細分
増殖因子シグナル伝達経路に対する遺伝子サインは２つの対立する腕、すなわち増殖因子経路を介するシグナル伝達の増加に伴ってアップレギュレートされる“アップ”腕（表５ａ）及びダウンレギュレートされる“ダウン”腕（表５ｂ）に分けられる。コヒーレンス分析の目的は、新しいデータセットにおけるサインの“アップ”及び“ダウン”腕間の統計的有意性を示すことである。表５ａ及び５ｂの“アップ”及び“ダウン”腕中のすべての遺伝子について２つの相関係数を計算した。まず、“アップ”腕中の各遺伝子と“アップ”腕中のすべての遺伝子の平均間の相関を計算する。第２に、“アップ”腕中の各遺伝子と“ダウン”腕中のすべての遺伝子の平均の反相関を計算する。このプロセスを“ダウン”腕中の遺伝子に対しても繰り返す。
【０２６９】
サインがコヒーレントならば、各腕からの遺伝子の多くは対応する腕平均と相関し、対立する腕中のすべての遺伝子の平均と反相関しなければならない。新しいデータセット中のサインのコヒーレンスの有意性を評価するためにフィッシャーの正確確率検定を遺伝子サインの腕内及び腕間の相関について計算した。
【０２７０】
サインを正確な関−反相関挙動を示さなかった遺伝子をフィルタリングにより除くことにより細分する。このフィルタリングプロセスにより、増殖因子経路シグナル伝達活性に関するコア情報を保持するサイン遺伝子の部分集合を同定し、新しいデータセットを分析するときに他の活性に関して報告する遺伝子を除外することができる。
【０２７１】
サインスコアは、“アップ”遺伝子（表５ａを参照されたい）の平均発現−“ダウン”遺伝子（表５ｂを参照されたい）の平均発現として計算した。
【０２７２】
初期サインコヒーレンスは３つのプラットフォーム、すなわち細胞株（細胞株アトラスのＣＭＴＩ部分）（乳房、大腸、肺））、新しい腫瘍（乳房、大腸、肺についての腫瘍アトラス）及びホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプル（乳房、大腸、肺のＭａｙｏ  ＦＦＰＥデータセット）で実施した。オランダ癌研究所（ＮＫＩ）大腸及び乳房データセットについて確認検定を実施した。
【０２７３】
ＦＦＰＥ乳房腫瘍サンプルのコヒーレンス分析は、１０１個の遺伝子サインの“アップ”及び“ダウン”腕はフィッシャーの正確確率検定により１０−９未満のｐ値でかなりコヒーレントであることを示している（図１４ａを参照されたい）。増殖因子経路サインの１０１個すべての遺伝子のヒートマップは、サインの“アップ”及び“ダウン”腕はこのデータセットにおいて離れてクラスター化していることを示している（図１４ｂを参照されたい）。１０１個の遺伝子サインの“アップ”及び“ダウン”腕の散布図は各分枝が相互に有意に反相関していることを示している（図１４ｃ）。“アップ”及び“ダウン”腕間の反相関のｐ値はピアソン、スピアマンまたはケンドール相関検定に基づいて有意である（それぞれ、Ｒ＝−０．７２、ｐ＝３ｅ−２４；Ｒ＝−０．７１、ｐ＝０ｅ＋０００；Ｒ＝−０．５３、ｐ＝２ｅ−２０）。
【０２７４】
次いで、同一の分析を、先に記載したように他の訓練データセットのアップ及びダウン腕に対して繰り返した。図１４ａに既に示したようにすべてのデータセットで実施したフィッシャー検定の結果を表７に要約する。この表は、殆どすべてのデータセットで増殖因子経路シグナル伝達について１０１個の遺伝子サインの常に非常に有意な挙動を示している。
【０２７５】
【表１１】
2011515088.tif 000091
【０２７６】
１０１個の遺伝子サインを更に、その腕中の他の遺伝子と相関せず、他の腕中の遺伝子と反相関しない遺伝子を選別することにより細分し得る。フィルタリング後の改善はフィルタリング前及びその後のヒートマップ及び散布図で見られ得る（図１４ａ、ｂ及びｃを図１５ａ、ｂ及びｃと比較されたい）。
【０２７７】
細分プロセスは、表８に示すように増殖因子経路遺伝子サインの両腕中の高％の遺伝子を保持した。元の１０１個の遺伝子サインの６０％以上が試験した３つの腫瘍型のすべてにおいてＦＦＰＥサンプルで正しいコレギュレーションパターンを示している。元の１０１個のバイオマーカー集合から始めて、元の遺伝子集合からの８１、７３及び６３個の遺伝子はそれぞれＭａｙｏ  ＦＦＰＥ乳房、肺及び卵巣データセットにおけるコヒーレンス検定に合格している。すべてのデータセットでコヒーレントであったコアＦＦＰＥ由来サイン（“アップ”腕からの４０個の遺伝子及び“ダウン”腕からの１７個の遺伝子）をＭａｙｏ  ＦＦＰＥサンプルから得た。コアＦＦＰＥサインを表８ｂに示す。腫瘍アトラスからの新鮮腫瘍サンプルでは、結果は乳房、大腸及び肺データセットで非常に類似しており（元の１０１個の遺伝子サインの＞７０％が正しいコギュレーションパターンを示す）、胃及び腎臓腫瘍データセットでは統計上余り有意でない（＞５０％）。元の１０１個の遺伝子サインの少なくとも７０％以上が乳房、大腸及び肺細胞株において正しいコレギュレーションパターンを示している。各種腫瘍型の中で調べた各種プラットフォームでコヒーレンスフィルターに合格したグルーバルなコアバイオマーカー遺伝子集合を表８ｃに示す。
【０２７８】
【表１２】
2011515088.tif 000092
【０２７９】
【表１３】
2011515088.tif 000093
2011515088.tif 000094
【０２８０】
【表１４】
2011515088.tif 000095
2011515088.tif 000096
2011515088.tif 000097
【０２８１】
サインスコアの振幅を評価することに加えて、サインの“アップ”及び“ダウン”腕間の差の有意性を評価した。試験した各プラットフォームでサンプル毎のｐ値をコルモゴルフ−スミルノフ検定を用いて計算した。図１６に示すように、複数のサンプルタイプ及びプラットフォームで、サンプルの大部分はα＝０．０５レベルで有意性を示し、このことからサンプルの大部分で各サンプルのサインスコアが標準／対照サンプルとは有意に異なることが分かる。コルモゴルフ−スミルノフ検定が“アップ”及び“ダウン”腕間の差を調べるために十分に保存的であったという確認検定も実施した。ｔ検定及びウィルコクソン順位和検定もＭａｙｏ  ＦＦＰＥデータセット中のサインスコアに対して実施した（図１７）。３つの検定の各々で得たｐ値はサンプルの殆どで非常にうまく一致しており、このことから我々はサインの“アップ”及び“ダウン”分枝間の真の差を捕らえることが示唆される。
【実施例１０】
【０２８２】
マイクロアレイに基づく遺伝子発現サインのｑＰＣＲアッセイへの変換
マイクロアレイの代替として、定量的ＰＣＲを用いる遺伝子発現分析を実施することが望ましいことがある。定量的ＰＣＲは短いターンアランドタイム、低いサンプル入力要件及びＦＦＰＥ組織におけるロバストな測定値を有している。しかしながら、定量的ＰＣＲプラットフォームに使用するための遺伝子発現サインの変換はサインダウン選択及びサインスコアリングのための代替方法を必要とする。更に、定量的ＰＣＲからのデータは腫瘍遺伝子発現プロファイルの既存のデータセットと直接比較することができない。
【０２８３】
ｑＰＣＲへのサイン翻訳のための戦略を設計するために、我々はまず最終産物の所望特性を同定した：１）アッセイはＦＦＰＥサンプル中で行わなければならない；２）ｑＰＣＲを用いて容易に測定できるようにアッセイは数百の遺伝子から数十の遺伝子にダウン選択されなければならない；３）アッセイが複数の腫瘍型を含む腫瘍学臨床トライアルに適用し得るように、ダウン選択した遺伝子は複数の腫瘍型においてシグナルを与えなければならない；４）ダウン選択した遺伝子はマイクロアレイを用いて測定される全サインと比較してできるだけ多くのシグナルを有していなければならない；５）マイクロアレイを用いて得られる結果と類似している結果を与えるスコアリングアルゴリズムを作成しなければならない；６）アッセイは１つの患者サンプル由来のスコアを与えることができなければならない。これらの所望の期待を満たすために、我々は図１８に示すような戦略を設計した。
【０２８４】
フェーズ１：遺伝子の優先順位付け
マイクロアレイに基づくサイン（１０１個の遺伝子）は合理的または費用効率良くｑＰＣＲアッセイに変換され得るより多くの遺伝子を含んでいる。我々はまずその後ｑＰＣＲアッセイ開発に持ち込まれるサイン遺伝子をダウン選択するための戦略を必要とした。遺伝子発現サインのパワーは大きな遺伝子集合を調べることにより与えられる感受性及び信頼性にある。ダウン選択する場合、我々は最小のパワーしか失われないことを確認しなければならない。臨床的実施はアッセイが複数の腫瘍型由来のＦＦＰＥ組織で適格であることを要求しているので、遺伝子のダウン選択に対する最も重要な優先は遺伝子をＦＦＰＥ腫瘍で測定するときのコヒーレンスの維持であった。複数の腫瘍データセットからの前臨床サンプル（細胞株、異種移植片）及び新鮮凍結腫瘍サンプルで研究したときマイクロアレイに基づくサイン中のすべての遺伝子が高度に相関している。しかしながら、遺伝子がシグナルを運ぶためには、ＦＦＰＥ材料でアッセイしたとき他のサイン遺伝子とのコレギュレーションのこのパターンを維持しなければならない。
【０２８５】
サイン遺伝子に優先順位付けるために、我々は実施例９に先に記載したコヒーレンス分析アプローチを使用した。増殖因子シグナル伝達経路サインは２つの対立する“腕”、すなわち経路を介するシグナル伝達が増加するとアップレギュレートされる遺伝子である“アップ”腕及びダウンレギュレートされる遺伝子である“ダウン”腕に分けられた。コヒーレンス分析の目的は、新しいデータセット中のサインの“アップ”と“ダウン”腕間の差の統計上有意差を示すことである。“アップ”及び“ダウン”腕中のすべての遺伝子について２つの相関係数を計算した。第１に、“アップ”腕中の各遺伝子と“アップ”腕中のすべての遺伝子の平均間の相関を計算する。第２に、“アップ”腕中の各遺伝子と“ダウン”腕中のすべての遺伝子の平均間の反相関を計算する。これを“ダウン”腕中の遺伝子に対して繰り返す。サインがコヒーレントならば、“アップ”腕からの遺伝子の多くはすべての“アップ”遺伝子の平均と相関し、“ダウン”腕中のすべての遺伝子の平均と反相関していなければならない。新しいデータセット中のサインコヒーレンスの有意性を評価するためにサインの腕内及びサインの腕間の相関についてフィッシャー正確確率検定を計算する。正確に相関−反相関挙動を示さない遺伝子をフィルタリングにより除くことによりサインを細分する。このフィルタリングプロセスにより、新しいデータセットを分析するときシグナル伝達活性に関するコア情報を保持するサイン遺伝子の部分集合を同定し、他の活性について報告する遺伝子を排除することができる。この手順を実施することにより、我々は増殖因子シグナル伝達経路サインについて４０個の遺伝子に優先順位を付けた。
【０２８６】
フェーズ２：各ダウン選択したサイン遺伝子に対するｑＰＣＲアッセイ開発
優先順位を付けた遺伝子の各々に対する分析で確認されたｑＰＣＲアッセイを得るために、複数の考えられるアッセイを設計し、試験して、１つの遺伝子あたり複数の設計及び幾つかの遺伝子におけるスプライスバリアントを可能とした。各遺伝子標的毎にプラスミＤＮＡまたは合成ＤＮＡ鎖、並びに対応するＩＶＴ作成ＲＮＡ標準を作成した。これらの標準をＤＮＡ中の線形性を評価するために３ｌｏｇｓで、線形性、感受性及び特異性を評価するために５ｌｏｇｓで滴定した（データ示さず）。アッセイをＦＦＰＥサンプル単離物からの早期性能データ及び分析特性に基づいて３つの“集合”の１つに分類した。各遺伝子毎に、アッセイをＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイプローブからの距離、ＰＣＲ有効性（ＩＶＴ  ＲＮＡ標準）、及び２ｎｇのＦＦＰＥＲＮＡ入力に対する平均Ｃｔ値のような基準を用いて選択した。図１９は開発した各アッセイについて得たＰＣＲ有効性の柱状グラフを示す。アッセイのかなりの大部分は１．０に非常に近いＰＣＲ有効性を示し、このことは計算を実施するときＰＣＲ有効性の補正は必要なかったことを示している。その結果、各ダウン選択した遺伝子毎に１つのｑＰＣＲアッセイをフェーズ３に前進させた。
【０２８７】
フェーズ３：コア遺伝子リストへのサインの更なるダウン選択
目的は、増殖因子シグナル伝達経路サインの最終サイズを約２０個のバイオマーカー遺伝子及び３〜５個のノーマライザー遺伝子に減らすことであった。好ましくは、ｑＰＣＲアッセイはサインの臨床的実施のために複数の腫瘍型由来のＦＦＰＥ組織で適格でなければならない。従って、更なるダウン選択は乳癌、大腸癌、肺癌及び胃癌の３０個のＦＦＰＥ腫瘍ブロックのパネルでの各ｑＰＣＲアッセイの発現特徴に基づいていた。ＦＦＰＥ腫瘍ブロックは＞５０％腫瘍及び３才未満であった。
【０２８８】
次いで、各々の分析で確認されたｑＰＣＲアッセイを各ＦＦＰＥ腫瘍サンプルにおいて実施した。図２０は、１２０個のＦＦＰＥ腫瘍サンプルでの１０個のランダムに選択したアッセイについての代表的データを示している。以下の戦略を用いて、サインを２０個のバイオマーカー遺伝子にダウン選択した。第１に、約１０個の“アップ”腕遺伝子及び１０個の“ダウン”腕遺伝子を最終サイン中に保持する。この“バランスのとれた”設計は、新しいデータセット中のサインの“アップ”及び“ダウン”腕間の違いの統計上有意性を示すためのコヒーレンス分析のために役立つ。この“バランスのとれた”設計はサインを定量する際にも有利であり得る（フェーズ４を参照されたい）。第２に、“アップ”腕中の遺伝子はすべての“アップ”遺伝子の平均発現レベルと相関し、“ダウン”腕中のすべての遺伝子の平均発現レベルと反相関していなければならず、“ダウン”腕中の遺伝子についてはその逆である。第３に、試験した４つのすべての腫瘍型でコヒーレンスを示す遺伝子に優先順位を付ける。最後に、入力ＲＮＡ量を少なくできるように、ｎ＝１２０腫瘍サンプルで平均Ｃｔ値＜３０を有する遺伝子に優先順位を付ける。これらの基準を用いて、増殖因子シグナル伝達経路について２０個の遺伝子サインを選択した（１０個の“アップ”腕遺伝子及び１０個の“ダウン”腕遺伝子）（表９を参照されたい）。ダウン選択したｑＰＣＲ増殖因子シグナル伝達サインに対して使用されるｑＰＣＲプライマー及びプローブ配列をそれぞれ表９及び１０に示す。図２１は、ＦＦＰＥ腫瘍で増殖因子シグナル伝達経路に対するダウン選択した２０個の遺伝子サインについての相関行列を示している。この相関行列は１２０個のＦＦＰＥ腫瘍サンプルでアップ”腕内及び“ダウン”腕内の相関及び“アップ”及び“ダウン”腕間の反相関を示している。
【０２８９】
【表１５】
2011515088.tif 000098
2011515088.tif 000099
【０２９０】
【表１６】
2011515088.tif 000100
2011515088.tif 000101
【０２９１】
【表１７】
2011515088.tif 000102
【０２９２】
【表１８】
2011515088.tif 000103
2011515088.tif 000104
【０２９３】
バイオマーカー遺伝子に加えて、更なるサイン定量化のためにノーマライザー遺伝子も選択され得る。ノーマライザー遺伝子は、当該サンプルで安定的に発現されなければならず、バイオマーカー遺伝子に対して類似の発現レベルを有していなければならず、ロバスト的に検出されなければならない。可能性あるノーマライザー遺伝子を同定するために、複数の候補を１２０個の腫瘍サンプルで調べた。ノーマライザー遺伝子の群を以前の経験及びＦＦＰＥプロファイルでのレギュレーションの欠乏に基づいて正規化した。図２２は試験した５個の候補ノーマライザー遺伝子の発現変動を示している。平均Ｃｔ値（技術的三重組の平均）を１２０個すべてのサンプルでプロットした。図２２に示すように、候補ノーマライザーの２つ（ＲＰＬＰ１及びＲＰＳ２９）は高い変動係数を有し、かなり低いＣｔ値を有していた。或いは、残りの３つの候補ノーマライザー遺伝子、すなわちＮＵＰ２１４、ＳＡＦＢ及びＰＲＰＦ８は低い変動係数（最大３．２２％）を有し、バイオマーカーの遺伝子の範囲のＣｔ値を有していた。よって、これら３つの遺伝子を我々の最終ノーマライザー遺伝子として選択した。
【０２９４】
ｑＰＣＲ条件
すべての容量及びプレートレイアウトは９６ウェルピペッティングフォーマットでの液体ハンドリングロボットを用いた組立てに基づいた。ＰＣＲ反応物は、３８４ウェルプレートにおいて５μｌのＲＮＡサンプルを１０μｌの合わせたプライマー及びＰＣＲマスター混合物に添加することにより組み立てる。
【０２９５】
ＰＣＲ試薬
１．ＣＲＡ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ７９００  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＣＲＡ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ７９００  ＰＭＭｘ）
各成分の密度を測定し、以下にリストする５つの成分の比率に基づいて重量基準でＣＲＡ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ７９００  ＰＭＭｘを組み立てる。
【０２９６】
【表１９】
2011515088.tif 000105
２．７５ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２、ｐＨ６．５（４℃で保存）、
３．１５μＭ  エンハンサー（Ｃｅｌｅｒａ、−２０℃で保存）、
４．２単位／μｌのウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，−２０℃で保存）、
５．２．５単位／μｌのｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，−２０℃で保存）、
６．プライマー（−２０℃で保存）−１００μＭの各プライマー、
７．ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１  ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）、
８．ＲＮＡ希釈剤（０．０６  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０、０．０３％  Ｎａアジド，２４μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ  ｒＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））（４℃で保存）。
【０２９７】
ＲＮＡサンプル
臨床標本由来のＲＮＡサンプルを−７０℃で保存した。ＦＦＰＥサンプルを１００ｐｇ／μｌに希釈した。ポジティブ対照のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ２×２００μｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡはＲＮＡ希釈剤で３ｎｇ／μｌに希釈した。希釈したＲＮＡサンプルは短期間保存のためには−２０℃で、長期間保存のためには−７０℃で保存した。
【０２９８】
プライマー組の作成
個々のプライマーは１００μＭストックで保存した。プライマーを室温で解凍し、１００μＭストックから２０μＭ作業濃度に希釈した。ＰＣＲ反応物を組み立てる前に順方向及び逆方向プライマーを各アッセイ毎に対とした。
【０２９９】
１５０μｌのＲＮアーゼフリーＴＥバッファーを各１．５ｍｌチューブに分取した。各チューブから９．０μｌのＴＥを除去した。４．５μｌの各２０μＭ  順方向及び逆方向プライマーをそれぞれの反応チューブに移した。各チューブを十分に混合し、遠心沈殿させた。
【０３００】
完全マスターミックス（完全ＭＭｘ）の作成
ＣＲＡ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ７９００  ＰＭＭｘを室温、暗所で完全に解凍し、十分に混合した。１５μＭ  エンハンサー（Ｃｅｌｅｒａ）、２単位／μｌのＵＮＧ（ウラシルＮ−グリコシレート，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び２．５単位／μｌのｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を室温で解凍し、十分に混合した。２８９６μｌのＣＲＡ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ７９００  ＰＭＭｘを５ｍｌチューブにピペットで移した。８００反応物（液体ハンドリングロボットが必要とする無用でむだな容積を含む）のための完全マスターミックスを調製した。エンハンサー、Ｍｎ（ＯＡｃ）２、ＵＮＧ及びｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼを下表に従って添加した。完全マスターミックスを優しく十分に混合し、回転し、フォイルを被せた。
【０３０１】
【表２０】
2011515088.tif 000106
【０３０２】
プライマー組及びマスターミックス（ＰＳ＋ＭＭｘ）ソースプレートの作成
１５０μｌの完全ＭＭｘをプライマー組の各々に添加した。成分を優しく混合し、回転させた。３０μｌの各ＰＳ＋ＭＭｘを９６ウェルプレートに分取し、非光学的シールを被せ、１分間遠心沈殿させた。
【０３０３】
ＲＮＡソースプレートの産生（ＦＦＰＥサンプル由来のＲＮＡのため）
臨床ＲＮＡサンプルを１００ｐｇ／μｌに希釈した。３０μｌの各臨床ＲＮＡサンプル（１００ｐｇ／μｌ）、対照及びＴＥを９６ウェルプレート中の１２ウェルの各々に分取した。プレートに非光学シールを被せ、１分間遠心沈殿させた。
【０３０４】
３８４ウェル増幅プレートの作成
液体ハンドリングロボットステーションを用いて、ＰＳ＋ＭＭｘ及びＲＮＡサンプルを９６ウェルプレートから１つの３８４ウェルプレートに分配した。プレＰＣＲロボット（ＤＮＡ／ＲＮＡに対して使用したことはない）を用いて、１０μｌを９６ウェル“ＰＳ＋ＭＭｘソースプレート”から３８４ウェル増幅プレートに分配した。別のロボットを用いて、５μｌを９６ウェル“ＲＮＡソースプレート”から３８４ウェル増幅プレートに分配した。プレートに光学シールを被せ、１分間遠心させた。
【０３０５】
プロファイリングラン
サンプルをＳＤＳソフトウェアを用いて以下のサイクル条件でＡＢ７９００ＨＴに流した：
ステージ１：５０℃  ２分間、
ステージ２：９５℃  １分間、
ステージ３：６０℃  ３０分間、
ステージ４：９５℃  １５秒間、
６０℃  ３０秒間−データ収集
４２サイクル、
ステージ５：９５℃  １分間、
ステージ６：６０℃  １分間、
ステージ７：９５℃  １分間−データ収集（２％  ランプ率）。
【０３０６】
フェーズ４：ｑＰＣＲプラットフォームを用いてサインスコアを得るためのスコアリングアルゴリズムの適応
マイクロアレイからのサインをｑＰＣＲプラットフォームに翻訳するときに経験する別の問題はデータ出力が異なることである。マイクロアレイデータを強度値またはｌｏｇ比によって表示し、ｑＰＣＲデータは閾値サイクル（Ｃｔ）によって表示する。従って、スコアリングアルゴリズムはｑＰＣＲプラットフォームで使用するために適応させなければならないマイクロアレイプラットフォームに対して作成した。加えて、マイクロアレイプラットフォームに由来する新しいサンプルのサインスコアを腫瘍サンプル発現プロファイリングデータの既存のデータベースと比較することができるが、各サンプルを基準に対して正規化するためには前記データセットはｑＰＣＲのために存在しない。従って、基準集合と比較する必要がなく１つのｑＰＣＲサンプルで実施し得るスコアリングアルゴリズムを作成した。
【０３０７】
基準データベースと比較する必要がないｑＰＣＲプラットフォームで経路活性を反映しているサインスコアを得るために、“アップ”及び“ダウン”腕の相対発現を比較する順位付けスキームを使用した。このスキームは以下のように要約され得る：１）Ｃｔ値をｌｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）に変換（この変換によりＣｔ値をアバンダンス測定値に変換する）；２）各遺伝子をｌｏｇ１０（２Λ−Ｃｔ）変換の値に基づいて順位付ける；３）サインの各腕毎に平均ランクスコア（ＭＲＳ）を作成する；４）“アップ”腕の平均ランク−“ダウン”腕の平均ランクに基づいてサインスコアを計算する。
【０３０８】
所与のサンプルのすべてのサイン遺伝子を同一ＰＣＲプレートに流し、所与サンプル内の値のみ用いてサイン遺伝子に対する計算した相対アバンダンスを用いて順位付けを実施した。サインスコアの閾値値をこの具体例ではゼロに設定した。ポジティブサインスコアは高いまたはデレギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達活性を示す。ネガティブサインスコアは低いまたはレギュレートされている増殖因子経路シグナル伝達活性を示している。このサインスコアの有意性は“アップ”及び“ダウン”腕中のサイン遺伝子の発現値または順位を比較することによっても評価され得る。実施例９で既に記載したように、個々のサンプル中の“アップ”及び“ダウン”腕における遺伝子発現の差の有意性を評価するためにコルモゴルフ−スミルノフ、ｔ検定またはウィルコクソン検定のような統計検定が使用され得る。サインスコアがポジティブであり、ｔ検定ｐ値が＜０．０５ならば、サインスコアは有意に高いと見なされる。ｐ値＞０．０５でポジティブなサインスコアは不確定と見なされる。このｑＰＣＲプラットフォームでサインスコアを計算する方法はハウスキーピング遺伝子に対して正規化する必要がないことに着目すべきである。このことは、サインが“アップ”及び“ダウン”腕のために内面的にバランスがとれており、よって各サイン遺伝子の発現をノーマライザー遺伝子に正規化させる必要がないためである。しかしながら、上記した同じ計算は、各サイン遺伝子のＣｔ値からノーマライザー遺伝子の平均Ｃｔ値を減ずることにより実施され得る。
【０３０９】
フェーズ５：盲検試験サンプルでのサインの評価
元の１０１個の遺伝子サインを２０個にダウン選択し、ｑＰＣＲプラットフォームに対してスコアリングアルゴリズムを作成したら、検定をｑＰＣＲサイン翻訳の“成功”を確認するために開発した。Ｍａｙｏクリニックからの約４０個のＦＦＰＥサンプルは既にマイクロアレイプロファイリングデータを用いて増殖因子経路シグナル伝達についてスコアリングされている。最極端なサイン分布を示した肺癌、卵巣癌、乳癌サンプルを選択した。マイクロアレイプロファイリングデータに基づいて、極めて低いサインスコアを有する２０個のサンプル及びかなり高いサインスコアを有する２０個のサンプルを盲検的にｑＰＣＲにより試験した。ｑＰＣＲデータから得たサインスコアをマイクロアレイデータから作成したスコアと比較した。図２３は、卵巣ＦＦＰＥサンプルについてのｑＰＣＲサインスコア（左側の棒グラフ）のマイクロアレイで作成したサインスコア（右側の棒グラフ）に対する比較を示している。ｑＰＣＲ及びマイクロアレイにより得たサインスコアのサインは各卵巣サンプル毎に一致していた。
【実施例１１】
【０３１０】
代替増殖因子シグナル伝達経路サインの同定
材料及び方法
細胞培養及び細胞株の増殖因子での処理
ＭＣＦ−７及びＨＴ−２９細胞株を６ウェルプレートに増殖因子添加時点で４０〜５０％コンフルエンスになるように接種した。細胞を０．２％  チャコール処理血清中で２４時間血清欠乏させ、増殖因子を１００ｎｇ／ｍｌ（ＥＧＦ、ＩＧＦ、インスリン、ｂ−ＦＧＦ）または３０ｎｇ／ｍｌ（ヘレグリン）で添加した。増殖因子の濃度は、受容体自己リン酸化により判断して増殖因子受容体が最大に活性化されるように選択した。増殖因子添加後の増殖因子受容体経路の活性化は細胞の別々のプレートにおいてリン酸化ＭＡＰＫ及びリン酸化ＡＫＴのウェスタン分析により確認した（データ示さず）。増殖因子を添加してから３０分、２時間、６時間、１８時間及び２４時間後に細胞を収集した。ＤＭＳＯ（ビヒクル）処理した細胞も各時点で収集した。ＲＬＴ溶解試薬Ｑｉａｇｅｎスピンカセムを製造業者の説明に従って使用してＲＮＡを作成した。
【０３１１】
細胞培養及びＡＫＴ阻害剤処理
ＬｏＶｏ結腸直腸癌細胞の２つの培養物を６０ｍｍプレートに１×１０６細胞／プレートの接種密度で接種した。細胞を一晩接着させた。ＡＫＴ１アイソザイムを優先的に抑制するＡＫＴの小分子インヒビターを細胞に対して５μＭの濃度で４または２４時間添加した。この濃度により、ウェスタンブロットによるとＡＫＴリン酸化が＞９０％抑制された（データ示さず）。このインヒビター（従来は“Ａｋｔｉ−１”と呼ばれていた）の構造及びＡＫＴアイソザイム活性は公開されている（ＤｅＦｅｏ−Ｊｏｎｅｓら，２００５，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，４：２７１−２７９）。ＤＭＳＯ（ビヒクル）処理した細胞も各時点で収集した。薬物とインキュベートした後、ＲＮＡをＲＬＴ溶解試薬及びＱｉａｇｅｎスピンカラムを製造業者の説明に従って用いて細胞から作成した。すべての処理を２回実施した。
【０３１２】
遺伝子発現プロファイリング
増殖因子及びＡＫＴ阻害剤処理した細胞の場合、全ＲＮＡを細胞株から単離し、先に記載したように（Ｈｕｇｈｅｓら，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，，１９：３４２−３４７；Ｍａｒｔｏｎら，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４：１２９３−１３０１）ＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイズした蛍光標識ｃＲＮＡに変換させた。簡単に説明すると、各処理サンプルからの４μｇの全ＲＮＡを使用して、逆転写によりｄｓＤＮＡを合成した。ｃＲＮＡをインビトロ転写により産生させ、合成後Ｃｙ３またはＣｙ５で標識した。増殖因子またはＡＫＴ阻害剤処理した細胞（実験サンプル）由来のｃＲＮＡをビヒクル処理したサンプル（基準サンプル）由来のｃＲＮＡに対してハイブリダイズした。２つのハイブリダイゼーションを蛍光染料逆戦略を用いて各ｃＲＮＡサンプル対で実施した。増殖因子処理した細胞の場合、マイクロアレイは遺伝子または発現配列タグに相当する２３，８８０個のプローブを含んでいた（ＧＥＯプラットフォームＧＰＬ２０２９）。ＡＫＴ阻害剤処理した細胞の場合、マイクロアレイは遺伝子または発現配列タグに相当するプローブを含んでいた（ＧＥＯプラットフォームＧＰＬ３９９１）。プローブ配列を遺伝子特異性を最大とし且つｍＲＮＡの逆転写に固有の３’−複製バイアスを最小とするように選択した。加えて、すべてのマイクロアレイに品質コントロールの目的で約２，０００個の対照を含んでいた。マイクロアレイ上のすべてのプローブを現場でインクジェット技術を用いて合成した（カリフォルニア州パロアルトに所在のＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｈｕｇｈｅｓら，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：３４２−３４７）。ハイブリダイゼーション後、アレイをスキャンし、各プローブの蛍光強度を記録した。アレイ強度データを正規化し、補正した後転写アバンダンスの比（実験対対照）を得た。遺伝子発現データをＲｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒ遺伝子発現分析ソフトウェア（バージョン７．０，ワシントン州シアトルに所在のＲｏｓｅｔｔａ  Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ）及びＭＡＴＬＡＢ（マサチューセッツ州ナティックに所在のＴｈｅ  Ｍａｔｈ  Ｗｏｒｋｓ）を用いて分析した。
【０３１３】
遺伝子機能及び経路分析
遺伝子機能及び経路分析はＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ分析（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）を用いて実施した。古典的経路分析で、データセットに対して最も有意であった古典的経路のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓライブラリーから経路を同定した。増殖因子サインの一部であると同定され、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅ中の古典的経路に関連していたデータセットからの遺伝子を分析のために考慮した。データセットと古典的経路間の関連の有意性を２つの方法で、すなわち１）経路にマッピングするデータセットからの遺伝子の数を古典的経路にマッピングされる遺伝子の総数で割った比を表示する；２）フィッシャー正確確率検定を使用して、データセット中の遺伝子と古典的経路間の関係が偶然のみで説明される確率を決定するｐ値を計算した。
【０３１４】
サインスコアの計算
細胞株研究のために、遺伝子発現を時間整合させたビヒクル処理細胞に対するｌｏｇ（１０）比として表示する。腫瘍サンプルの場合、遺伝子発現をすべてのサンプルの平均に対するｌｏｇ（１０）比として表示する。増殖因子及びｃ−ＭＹＣサインは、増殖因子またはＭＹＣ添加によりアップレギュレートされる遺伝子（“アップ”腕）及び増殖因子またはＭＹＣ添加によりダウンレギュレートされる遺伝子（“ダウン”腕）を含んでいる。これらの場合、サインスコアはアップ”腕中の遺伝子の平均発現−“ダウン”腕中の遺伝子の平均発現を計算することにより求めた。増殖及び解糖サインの場合、すべての遺伝子は同一方向にレギュレートされ、相関している。従って、これらのサインは１つの腕のみから構成され、スコアをすべてのサイン遺伝子の平均発現として計算した。異常ＰＴＥＮ活性の既に公表されているサイン（Ｓａａｌら，２００７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４：７５６４−７５６９）は２つの腕を含んでおり、サインスコアはＰＴＥＮを含んでいない腕の平均−ＰＴＥＮを含んでいる腕の平均として計算した。
【０３１５】
結果
ＨＴ−２０またはＭＣＦ−７細胞のＥＧＦ、ＩＧＦ、インスリン、ｂ−ＦＧＦまたはヘレグリン処理により誘導される遺伝発現変化のゲノムワイド解析をまず実施した。これらの増殖因子の各々は両細胞株でロバストな応答を引き出した。ＡＮＯＶＡ分析は、４，５００個以上の遺伝子が増殖因子処理したサンプル及びビヒクル処理したサンプル間でｐ＜０．００１で差次的に発現されることを示した（図２４を参照されたい）。図２４ヒートマップに示すように、いろいろな増殖因子により引き出される遺伝子発現サインは著しく類似している。この類似性を定量するために、我々は１つの増殖因子によりレギュレートされる遺伝子が別の増殖因子により刺激したときどのように挙動するかを評価した（図２５Ａ、Ｂ）。各増殖因子毎に、我々はそのサインと他の増殖因子により引き出されるサイン間の相関を計算した。相関係数の分布は圧倒的にポジティブであり、平均相関係数は０．６を超えている。
【０３１６】
最もロバストであり、潜在的に最も関連するサイン遺伝子に着目するために、我々はレギュレーションに関して有意なｐ値を有しているだけでなく、早い時点（２時間目）で数倍（＞２倍）の変化を有し、２４時間を通してレギュレートされ続けた遺伝子の“コア”集合を選択した。この時間的パターンは、増殖因子により誘導される事象の連続における早期ステップに相当し、増殖因子刺激に応答した一時的変化よりもむしろ構成的である遺伝子にとって必要である。この手順を実施することにより、我々は８６個の遺伝子コア“増殖因子”サインを同定した。４４個の遺伝子は増殖因子によりアップレギュレートされ（“アップ”腕）、４２個の遺伝子はダウンレギュレートされた（“ダウン”腕）（図２７、表１１Ａ、Ｂ）。
【０３１７】
【表２１】
2011515088.tif 000107
2011515088.tif 000108
2011515088.tif 000109
【０３１８】
【表２２】
2011515088.tif 000110
2011515088.tif 000111
2011515088.tif 000112
【０３１９】
増殖因子サインにおける遺伝子の生物学的分析
生物学的プロセス及び増殖因子に関与する公知のシグナル伝達経路の見識を得るために、我々は増殖因子サインにおける遺伝子中での関係性を明らかにするために生物学的経路分析を実施した。我々は、増殖因子サイン遺伝子の中で統計的に濃縮されている古典的シグナル伝達経路を同定するためにＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）ソフトウェアツールを使用した。他のグループは以前、炎症、グルココルチコイド受容体シグナル伝達及び癌を含めて複雑なプロセスに関与している生物学的経路を同定するためにＩＰＡツールを使用した（Ｃａｌｖａｎｏら，２００５，Ｎａｔｕｒｅ，４３７：１０３２−１０３７；Ｋａｓａｍａｔｓｕら，２００５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３７：１８６９−１８８０；Ｐｈｕｃら，２００５，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．，１：ｅ１６）。増殖因子によりアップレギュレートされる遺伝子の中には、濃縮経路はユビキチン化、ニューレグリンシグナル伝達、酸化窒素シグナル伝達及び解糖／糖新生を含んでいた（図２６）。増殖因子によりダウンレギュレートされる遺伝子の中には、ＰＴＥＮシグナル伝達が最も有意に濃縮されていた。ニューレグリンはＥｒｂＢファミリーの受容体チロシンキナーゼに対するリガンドであり（Ｆａｌｌｓ，２００３，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，２８４：１４−３０）、従来の研究でＡＫＴがグルコース輸送及び代謝を刺激することが立証されているので（Ｅｌｓｔｒｏｍら，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６４：３８９２−３８９９；Ｌｕｍら，２００７，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２１：１０３７−１０４９；Ｐｌａｓ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２００５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２４：７４３５−７４４２）、これらの経路のアップレギュレーションは増殖因子シグナル伝達の公知の生物学と一致している。ＰＴＥＮシグナル伝達に関与する遺伝子のダウンレギュレーションはＰＩ３Ｋ活性のネガティブレギュレーターとしてのＰＴＥＮの役割とも一致しており（Ｃａｎｔｌｅｙら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：４２４０−４２４５）、増殖因子及びＰＴＥＮが遺伝子の重複集合に対して逆の効果を有していることが示唆される。これらの結果は、増殖因子サインが増殖因子受容体を介するシグナル伝達の増加を反映する細胞生物学を読出すという仮説を裏付けている。
【０３２０】
増殖因子サインの他の経路サインに対する比較
ｃ−ＭＹＣの活性化及び高い増殖は増殖因子シグナル伝達の公知の下流効果であり（Ｂｏｕｃｈａｒｄら，２００４，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２３：２８３０−２８４０；Ｂｅｒｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｅｉｌｅｒｓ，２００６，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ．，４２：３２９−３４２）、最近の研究はｃ−ＭＹＣのレベル（Ｂｉｌｄら，２００６，Ｎａｔｕｒｅ，４３９：３５３−３５７）及び増殖（Ｄａｉら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６５：４０５９−４０６６）をモニターする遺伝子発現サインを作成した。従って、我々は既に公表されているｃ−ＭＹＣ及び増殖サインと比較した増殖因子の増殖因子誘導レギュレーションのタイミング及びカイネティックを評価した。細胞株及び増殖因子で平均化したｃ−ＭＹＣの活性化、増殖及び増殖因子サインの時間的パターンを図２８に示す。増殖因子サインは２時間目に誘導され、２４時間を通して有意に誘導されたままであるが、ｃ−ＭＹＣサインは少ないロバストで誘導され、一時的にレギュレートされ、６時間目に最大誘導された。加えて、増殖サインは後の時点でのみ誘導され、１２時間目から有意な誘導が観察された。これらのデータから、増殖因子サインは増殖因子受容体の刺激に対してより近位の事象を捕捉すること及びこれらの事象は増殖因子受容体が活性化されたままである限り維持されることが示唆される。
【０３２１】
増殖因子により誘導されるネガティブフィードバック
増殖因子受容体を通常異常シグナル伝達（Ｓｗｅｅｎｅｙ  ａｎｄ  Ｃａｒｒａｗａｙ，２００４，９０：２８９−２９３）を防止するように働くネガティブ調節メカニズムにかけ、タンパク質リン酸化及び遺伝子発現のプロファイリングを含む最近の研究で増殖因子シグナル伝達の早期事象を抑制するように働く遺伝子の動態的に規定される群の存在が立証された（Ａｍｉｔら，２００７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３９：５０３−５１２）。増殖因子により常にダウンレギュレートされた遺伝子を評価して、我々は上皮増殖因子受容体ファミリーメンバーＥＲＢＢ３が両方の細胞株においてすべての増殖因子により有意にダウンレギュレートされたことに注目した（表１１）。最近の研究でリガンド結合はユビキチン化後リゾソーム分解することによりＥＲＢＢ３をダウンレギュレートし得ることが立証されているので（Ｃａｏら，２００７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２７：２１８０−２１８８）、我々はＥＧＦ、ＩＧＦ、インスリン、ｂ−ＦＧＦまたはヘレグリンでどのように刺激すると増殖因子受容体のｍＲＮＡ発現に影響を与えるかを評価した（図２９）。細胞をＥＧＦまたは他の増殖因子で処理しても、ＥＧＦＲ発現のダウンレギュレーションは生じなかった（図２９Ａ）。対照的に、細胞をＥＧＦ、ＩＧＦ、インスリン、ｂ−ＦＧＦまたはヘレグリンで処理すると、ＥＲＢＢ３及びＩＮＳＲが有意にダウンレギュレートした（図２９Ｂ、２９Ｃ）。これらのデータから、ＥＲＢＢ３及びＩＮＳＲはフィードバック抑制に対してかなり感受性であり、これらのシグナルが他の増殖因子受容体を介して伝播されてもＥＲＢＢ３及びＩＮＳＲは増殖因子シグナル伝達に応答して迅速にダウンレギュレートされることが示唆される。よって、ＥＲＢＢ３またはＩＮＳＲのｍＲＮＡレベルを上記受容体を介するシグナル伝達の活性の代理として使用するときには注意を払わなければならない。
【０３２２】
ＰＴＥＮ経路シグナル伝達が増殖因子によりダウンレギュレートされる遺伝子内で有意に濃縮されるので（図２６）、我々は異常ＰＴＥＮ活性の最近公表されたサイン（Ｓａａｌら，２００７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４：７５６４−７５６９）の発現に対する増殖因子の影響を評価した。図２９Ｄに示すように、細胞を増殖因子で処理すると異常ＰＴＥＮサインは常にアップレギュレートした。この結果は、増殖因子はＰＴＥＮ損失によっても活性化される遺伝子を活性化することが立証し、増殖因子サインの重要な成分がＰＴＥＮ活性に関連するシグナルの拮抗を反映しているという見解を裏付ける。
【０３２３】
増殖因子サインのＰＩ３Ｋ経路インヒビターによる抑制
増殖因子サインを更に確認するために、我々は連結性マップデータセットからの薬物応答のサインにてこ入れした（Ｌａｍｂら，２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１９２９−１９３５）。このデータセットは、４５３個の個々の化合物処理実験に相当する１６４個の異なる小分子についてのｍＲＮＡ発現データを含む。これらの小分子インヒビターにはＰＩ３Ｋインヒビターのワートマニン及びＬＹ−２９４００２、並びにｍＴＯＲインヒビターのシロリムスが含まれる。我々は、増殖因子サインが本当にＰＩ３Ｋ経路の活性化を表しているならば、上記化合物はサインに対して抑制効果を有していなければならないと推量した。図３０に示すように、これらの化合物の各々は増殖因子サインの非常に重要なインヒビターである。表１２に示すように、シロリムス、ワートマニン及びＬＹ−２９４００２はこのデータセット中のすべての化合物のサイン抑制の有意性によって１、２及び３の順位が付けられる化合物であつた。対照的に、連結性マップデータセット中の他の摂動要因（ｐｅｒｔｕｒｂａｇｅｎｓ）は増殖因子シグナル伝達サインに対して効果もなく、余り重要な抑制効果もなく、更には活性化効果を有している。既に記載されている増殖及びＭＹＣサインもシロリムス、ワートマニン及びＬＹ−２９４００２により抑制されたが、分布の抑制目的においてこれら３つの化合物の順位は余り極端でなかった。例えば、ＬＹ−２９４００２は増殖サイン抑制の有意性によってトップに順位づけられた化合物であったが、シロリムスは５位に順位づけられ、ワートマニンは２３位に順位づけられた（表１２）。増殖サインのワートマニンによる抑制は統計上有意でなかった。この結果から、増殖因子シグナル伝達サインはＰＩ３Ｋ経路インヒビターにより最も有意に抑制されること及びこの抑制が１つのＰＤＫ経路成分に特異的でないことが示唆される。加えて、この結果から、抑制パターンが化合物の中で異なるので増殖因子サイン及び増殖サイン受容体が異なる生物学的態様で報告されることが示唆される。
【０３２４】
【表２３】
2011515088.tif 000113
【０３２５】
増殖因子サインのＡＫＴ１の抑制による抑制
ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲインヒビターに加えて、我々は増殖因子サインに対するＡＫＴ阻害の影響を評価しようとした。この目的で、我々はＡＫＴ１の内部開発したアロステリックでイソ型特異性のインヒビターにてこ入れした（ＤｅＦｅｏ−Ｊｏｎｅｓら，２００５，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，４：２７１−２７９）。我々は結腸直腸癌細胞株ＬｏＶｏをビヒクルまたは５μＭのＡＫＴ１インヒビターで４または２４時間処理し、生じた遺伝子発現プロファイルを評価した。図３１に示すように、ＡＫＴ１の抑制により、両方の時点でビヒクル処理に比して増殖因子シグナル伝達サインを抑制させた。増殖因子シグナル伝達サインの抑制が４時間目にｃ−ＭＹＣ及び増殖の抑制を超え、２４時間でｃＭＹＣサインにほぼ均等であった。これらのデータは、増殖因子サインがＰＩ３Ｋ経路シグナル伝達を抑制する治療に対して早期に応答することを示している。
【０３２６】
連結性データセットからの結果と合わせて考慮して、これらのデータは増殖因子サインのレギュレーションがＲＴＫ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲシグナル伝達軸の１つの成分に特異的でないことを立証している。むしろ、このサインはシグナル伝達軸に沿った複数のポイントでこの経路の活性化または抑制により常にレギュレートされる。これは増殖因子シグナル伝達がタンパク質リン酸化カスケードを引き出し、シグナルが核に達すると最終的に各種遺伝子の発現に影響を及ぼすので予測され得る。従って、この軸に沿った近位または遠位のポイントでリン酸化カスケードを抑制すると核中のｍＲＮＡ発現に対して類似の影響が生じることは論理的のようである。
【０３２７】
ヒト腫瘍における増殖因子サインの評価
増殖因子サインは増殖因子により活性化され、ＰＩ３Ｋ経路インヒビターにより抑制されるので、我々は腫瘍サンプルにおける増殖因子シグナル伝達サインのレベルがＰＩ３Ｋ経路活性の予測レベルに従って腫瘍を階層化するために使用され得ることを推論した。ＰＩ３Ｋシグナル伝達の予測レベルが高い腫瘍の部分集合を同定するために、我々はｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒら（２００２，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４７：１９９９−２００９）からの原発性乳癌遺伝子発現プロファイルにおける増殖因子サインを評価した。エストロゲン受容体状態を先に記載されているように（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒら，２００２，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４７：１９９９−２００９）測定した。図３２Ａに示すように、最高レベルの増殖因子サインを有する乳癌の部分集合はＥＲＢＢ２低でＥＲネガティブ部分集合である。前記腫瘍はプロゲステロン受容体（ＰＲ；データ示さず）の低発現も示し、よって乳癌の“トリプル・ネガティブ”部分集合に相当する。この部分集合はＥＲＢＢ２高、次いで増殖因子サインの基線レベルの低下順でＥＲポジティブ腫瘍である。このデータから、ＥＲＢＢ２は乳房腫瘍におけるＰＩ３Ｋ経路シグナル伝達の最大ドライバーでなく、むしろトリプル・ネガティブ腫瘍の幾つかのアスペクトが増殖因子シグナル伝達サインを最高レベルに動かすことが示唆される。驚くことに、トリプル・ネガティブ乳房腫瘍は最悪の出力に関連しており、これからＰＩ３Ｋシグナル伝達が乳癌の短い生存の原因となり得ることが示唆される（Ｈａｒｒｉｓら，２００６，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８：Ｒ６６）。
【０３２８】
先に立証したように、増殖因子及びＰＴＥＮは遺伝子の重複集合に対してアンタゴニスト効果を有している。従って、我々はＰＴＥＮの損失がトリプル・ネガティブ乳房腫瘍における増殖因子サインの中心ドライバーであり得ると仮定した。このことを調べるために、我々は乳房腫瘍でのＰＴＥＮのｍＲＮＡレベル及び異常ＰＴＥＮ活性の先に記載したサインのレベル（Ｓａａｌら，２００７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４：７５６４−７５６９）を評価した。我々の仮定と一致して、トリプル・ネガティブ乳房腫瘍は低レベルのＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ及び最高レベルの異常ＰＴＥＮサインを示した（図３２Ｂ、Ｃ）。このことはＰＴＥＮ損失は主にＥＲ／ＰＲネガティブ乳房腫瘍で生ずるという従来のレポート（Ｓａａｌら，２００５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６５：２５５４−２５５９）と一致している。これらのデータから、ＥＲＢＢ２増幅によりＥＲポジティブ部分集合に比してＰＩ３Ｋ経路シグナル伝達が高められるが、トリプル・ネガティブ腫瘍におけるＰＴＥＮの損失はこの部分集合が最高レベルの増殖因子シグナル伝達サインを示すという所見のもととなることが示唆される。
【０３２９】
我々はＥＲＢＢ３  ｍＲＮＡ発現がインビトロで増殖因子刺激により引き起こされるフィードバック抑制に対してかなり感受性であるという所見を既に得ているので、我々は乳房腫瘍でのＥＲＢＢ３発現も評価した。インビトロでの所見と一致して、ＥＲＢＢ３  ｍＲＮＡは増殖因子サインが最高である同じ部分集団のトリプル・ネガティブ乳房腫瘍において最低レベルで発現している（図３２Ｄ）。この結果から、インビトロで観察された高い増殖因子シグナル伝達サインと低いＥＲＢＢ３発現間の逆関係がインビボ環境でも持続されていることが立証される。インビトロで増殖因子を添加するとＥＲＢＢ３  ｍＲＮＡがダウンレギュレートされたが、このデータセットでのＰＴＥＮとＥＲＢＢ３  ｍＲＮＡ発現の相関からトリプル・ネガティブ乳癌においてＰＴＥＮ損失がＰＩ３Ｋ経路活性化及びその後のＥＲＢＢ３  ｍＲＮＡダウンレギュレーションに大きく寄与することが示唆される。従って、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の上流活性化剤（すなわち、ＥＲＢＢ３）はインビトロでのフィードバック抑制に対して感受性であり得、インビボでの経路活性化読出し情報と類似の関係を示すので、インビボでの全経路活性に対する代用としてｍＲＮＡレベルの単一経路活性化剤を使用するときには注意を払わなければならない。
【０３３０】
乳房腫瘍部分集合における解糖及び増殖
ＰＴＥＮ活性のダウンレギュレーションに加えて、我々は次にＥＲＢＢ２ポジティブ腫瘍と比較してトリプル・ネガティブ乳房腫瘍では増殖因子シグナル伝達が増加するという所見の基礎となり得る他の生物学的アスペクトを評価した。複数の乳癌プロファイリング研究は増殖が乳房腫瘍のＥＲネガティブ部分集合において高いことが示唆され（Ｓｏｔｉｒｉｏｕら，２００７，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，７：５４５−５５３において精査されている）、ＰＩ３Ｋ経路活性化の１つの出力は増えた増殖であるので（Ｖｉｖａｎｃｏ  ａｎｄ  Ｓａｗｙｅｒｓ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２：４８９−５０１）、１つの考えられる説明は増殖がトリプル・ネガティブ乳房腫瘍における高い増殖因子シグナル伝達サインレベルの主ドライバーであることである。しかしながら、多くの最近の研究で、ＡＫＴ活性化により細胞は酸化的リン酸化から好気性解糖への代謝変換を受けることが立証されており（Ｅｌｓｔｒｏｍら，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６４：３８９２−３８９９；Ｐｌａｓ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，２００５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２４：７４３５−７４４２）、解糖／糖新生経路遺伝子は細胞株の増殖因子処理によりアップレギュレートされる増殖因子シグナル伝達サイン遺伝子の中で有意に濃縮された（図２６）。よって、我々は高い解糖がＥＲＢＢ２ポジティブ集団に比してトリプル・ネガティブ乳房腫瘍で観察された増殖因子サインレベルの増加に対する寄与因子であったと仮定した。
【０３３１】
このことを調べるために、我々はまず解糖“サイン”を同定した（表１３）。解糖サインをＮＫＩ乳房腫瘍データセットにおいて相関分析を実施することにより同定した（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｉｊｖｅｒら，２００２，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４７：１９９９−２００９）。この分析は、増殖因子シグナル伝達サイン中の遺伝子を種子遺伝子として採用し、この種子と最も強く相関している（相関ｐ値＜０．０００１）遺伝子のクラスターを見つけることにより実施した。増殖因子シグナル伝達サイン由来の幾つかの遺伝子（例えば、ＰＦＫＰ、ＣＯＲＯ１Ｃ、ＴＵＢＢ３及びＴＵＢＢ４）を用いた相関分析により３９個の強く相関している遺伝子の集合を同定した。この相関から誘導されたコア遺伝子は解糖に関与する幾つかの他の公知遺伝子（例えば、ＬＤＨＡ）を含んでいた。解糖サインのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ分析は、この遺伝子集合が解糖関連遺伝子に関してかなり濃縮されていることを示した（データ示さず）。
【０３３２】
【表２４】
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【０３３３】
図３３に示すように、ＥＲＢＢ２ポジティブ及びトリプル・ネガティブ乳房腫瘍のいずれもが等しく高レベルの増殖サインを示したのに対して、トリプル・ネガティブ腫瘍はＥＲＢＢ２ポジティブ腫瘍に比して解糖サインの高い発現を有している。加えて、図３４はＨＴ−２９及びＭＣＦ−７細胞を増殖因子で処理すると解糖サインが全体的にアップレギュレートされたことを示している。これらのデータから、増殖因子によるＰＩ３Ｋ経路活性化により解糖が増加すること及びＥＲＢＢ２ポジティブ乳房腫瘍に比してトリプル・ネガティブ乳房腫瘍における増殖因子サインレベルの上昇が単に増加した増殖よりもむしろ高い解糖を反映していることが示唆された。ＡＫＴ活性化により解糖が増えるので、トリプル・ネガティブ腫瘍で観察されたＰＴＥＮシグナル伝達のデレギュレーションと合わせて、このデータからトリプル・ネガティブ乳房腫瘍は他の乳癌部分集合に比して高レベルのＰＩ３Ｋ経路シグナル伝達を有していることが示唆される。
【実施例１２】
【０３３４】
異種移植片におけるＩＧＦ１Ｒ化合物有効性の早期読出し情報としての増殖因子シグナル伝達経路サイン
ＮＭＲＩ雌ｎｕ／ｎｕマウスに患者由来腫瘍異種移植片を皮下移植した：肺腺癌ＬＸＦＡ  ５２６、ＬＸＦＡ  ６２９、ＬＸＦＡ  ６７７、ＬＸＦＡ  ７４９及びＬＸＦＡ  １０１２；扁平上皮細胞肺癌ＬＸＦＥ  ２１１、ＬＸＦＥ  ３９７、ＬＸＦＥ  ４０９及びＬＸＦＥ  １４２２；小細胞肺癌ＬＸＦＳ  ５３８、ＬＸＦＳ  ５７３及びＬＸＦＳ  ６１５；結腸直腸癌ＣＸＦ  ９４ＬＸ、ＣＸＦ  １５８、ＣＸＦ  ２８０、ＣＸＦ  ９７５、ＣＸＦ  １１０３及びＣＸＦ  １７２９；腎細胞癌ＲＸＦ  ３９３、ＲＸＦ  ４２３、ＲＸＦ  ６３１及びＲＸＦ  １２２０；胃癌ＧＸＦ  ９７、ＧＸＦ  ２５１及びＧＸＦ  ２８１；卵巣癌ＯＶＸＦ  ５５０、ＯＶＸＦ  ８９９、ＯＶＸＦ  １０２３、ＯＶＸＦ  １３５３及びＯＶＸＦ  １５４４（独国フライブルクに所在のＯｎｃｏｔｅｓｔ  ＧｍｂＨ）。腫瘍異種移植片はすべてヒト患者からの外科標本に由来し、増殖させるためにヌードマウスに直接移植した。腫瘍異種移植片を安定な増殖パターンが確立されるまでヌードマウスにおいて継代させた。早期継代異種移植片のマスターストックを液体窒素中で凍結させた。特定のマスターストックバッチは典型的に約２０の追加継代のためにのみ使用する。腫瘍断片をヌードマウスでの連続継代の異種移植片から得た。ドナーマウスから腫瘍を取り除いた後、断片（直径１〜２ｍｍ）に切断し、皮下移植するまでＲＰＭＩ  １６４０培地に置いた。イソフランの吸入によりレシピエントマウスに麻酔をかけた。腫瘍断片（１〜２個／マウス）をレシピエントマウスの背中に皮下移植した。少なくとも１つの適当なサイズ（平均腫瘍直径６〜８ｍｍ、最小の許容される腫瘍直径５ｍｍ）を有する腫瘍を有する動物が治療群及びビヒクル対照群にランダム化するために考慮された。
【０３３５】
ＭＫ−０６４６  ＩＧＦ１Ｒモノクローナル抗体（Ｕ．Ｓ．特許７，２４１，４４４）を２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＰＳ−８０ｗ／ｗ（ｐＨ６．５）を用いて１：５．６５の比で２ｍｇ／ｍＬの最終投与濃度に希釈した。希釈した治療溶液を５００μｇ／マウスの投与レベルに対して２５０μｌ／マウスの投与容量で投与した。対照ビヒクルは２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＰＳ−８０ｗ／ｗ（ｐＨ６．５）であった。ビヒクルは２５０μｌ／マウスで投与した。ＩＧＦ１Ｒモノクローナル抗体及び対照ビヒクルを腹腔内注射した。試験及び対照マウスに１週間に１回同じ日に注射した。注射回数は実験期間に応じて２〜７回の範囲であった。独国の動物規制が設定した限界の１つが満たされたとき実験を終了した。
【０３３６】
各実験は、２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ＰＳ−８０  ｗ／ｗ（ｐＨ６．５）を２５０μＬ／マウスで１週間に１回腹腔内で与えたビヒクル対照群（群１）、ＩＧＦ−１Ｒを用いて５００μｇ／マウスで１週間に１回腹腔内で治療した１つの群（群２）から構成した。サンプル採集の目的で、各実験には、ビヒクルまたはＩＧＦ−１Ｒを同じ用量レベルで１回与える２つの群（群３及び４）も含めた。研究プロトコルに従って、有効性群（１及び２群）の群サイズは７匹のマウスであり、サンプル採取群（３及び４群）には各々３匹のヌードマウスを含めた。ＣＸＦ  １１０３及びＲＸＦ  ６３１を持っているマウスを用いた実験では、有効性群に８匹のマウスを含め、ＬＸＦＥ  ２１１を持っているヌードマウスを用いた実験の有効性群の群サイズは９であった。ＲＸＦ  ３９３を持っているヌードマウスを用いた実験のビヒクル対照群は６匹のマウスから構成した。ＬＸＦＳ  ５３８を用いた実験のサンプル採取群はいずれも４匹のマウスを含め、ＣＸＦ  ９７５を持っているヌードマウスを用いたサンプル採取ビヒクル対照群には４匹のマウスも含めた。
【０３３７】
ｘ日目の個々の腫瘍の相対容積（ＲＴＶ）を、ｘ日目の個々の腫瘍容積（Ｔｘ）を０日目の同一腫瘍の個々の容積（Ｔ０）で割り、１００％を掛けることにより計算した。
【数５９】
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群腫瘍容積は、群中のすべての腫瘍のメジアンＲＴＶ（群メジアンＲＴＶ）として表示した。計算のためには、ｘ日目に生存しているマウス中の腫瘍の容積のみを考慮した。増殖曲線を描くため及び治療評価のために群メジアンＲＴＶ値を計算した。
【０３３８】
特定の日の腫瘍抑制（Ｔ／Ｃ；％）は、試験のメジアンＲＴＶ値対対照群の比に１００％を掛けて計算した。
【数６０】
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実験中特定の試験群で記録された最小Ｔ／Ｃ％値はそれぞれの治療に対する最大抗腫瘍活性を表した。
【０３３９】
１及び２群の動物は実験マウスを殺すためのガイドラインを満足した時に応じて１４日目〜４５日目までの終了期間の範囲を有していた。群３及び４の動物は、腫瘍が４００〜６００ｍｍ３の容積を有したとき及び対照ビヒクル（群３）またはＩＧＦ１Ｒ（群４）で１回治療してから２４時間後にサンプル採取のために殺した。腫瘍を２つの部分に切断し、液体窒素中でスナップ凍結し、−８０℃で保存した。ＲＮＡをＤＮＡオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションのために先に記載したようにビヒクル治療したサンプル及びＭＫ０６４６治療したサンプルの両方から収集した。
【０３４０】
ＭＫ−０６４６による増殖因子シグナル伝達経路サインのレギュレーションを、各異種移植片毎にＭＫ０６４６治療したサンプルの平均遺伝子発現プロファイルをビヒクル治療したサンプルの平均遺伝子発現プロファイルと比較することにより評価した。ビヒクル治療したサンプルに対するＭＫ−０６４６治療したサンプルにおける発現のｌｏｇ（１０）比をマイクロアレイ上のプローブ毎に計算した。増殖因子シグナル伝達経路サインスコアをサインの“アップ”腕中の遺伝子（表５ａを参照されたい）の平均ｌｏｇ（１０）比−サインの“ダウン”腕中の遺伝子（表５ｂを参照されたい）の平均ｌｏｇ（１０）比として計算した。次いで、各異種移植片毎に増殖因子シグナル伝達経路サインスコアの投与後／投与前比を計算し、腫瘍抑制Ｔ／Ｃ比と比較した（図３５を参照されたい）。ＧＦＳスコアの投与後／投与前比がより低いことはこの経路のシグナル伝達がＭＫ−０６４６治療によりより多く抑制されることを立証する。Ｔ／Ｃ比がより低いことはＭＫ−０６４６治療による増殖抑制がより大きいことを示している。図３５に示すように、ライトグレーで示した異種移植片（ＬＸＦＡ−６２９、ＭＡＸＦ−７１３、ＯＶＸＦ−８９９及びＣＳＦ−９４ＬＸ）はＭＫ−０６４６治療後強い腫瘍抑制を有していた。ミディアムグレーで示した異種移植片（ＳＸＦ−１１８６、ＣＳＦ−２８０、ＣＳＦ−１７２９）はＭＫ−０６４６治療後中程度の応答を有しており、ダークグレーで示した異種移植片はＭＫ−０６４６治療に対して最小または全く応答しなかった。図３５に示すように、最も高い腫瘍抑制（Ｔ／Ｃ比）を示した２つの異種移植片（ＭＡＸＦ−７１３及びＬＸＦＡ−６２９）は低い増殖因子シグナル伝達スコア投与後／投与前比をも有しており、ＭＫ−０６４６治療後のこの経路のシグナル伝達がより大きい抑制されたことを示している。これらのデータから、増殖因子シグナル伝達経路サインスコアは化合物有効性の早期読出し情報として使用され得ることが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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