(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌム毒素、ポリソルベート及びメチオニン；及び
糖、糖アルコール及びイオン化合物よりなる群から選択された１つ以上の成分を含む薬剤学的凍結乾燥製剤。
【請求項２】
ボツリヌム毒素は、ボツリヌム血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧよりなる群から選択されたものである、請求項１に記載の薬剤学的凍結乾燥製剤。
【請求項３】
ボツリヌム毒素は、複合体化タンパク質を含有しない形態または 複合体化タンパク質を含有する複合体形態である、請求項１に記載の薬剤学的凍結乾燥製剤。
【請求項４】
ポリソルベートは、ポリソルベート２０、４０、６０、８０または１００のうちいずれか１つである、請求項１に記載の薬剤学的凍結乾燥製剤。
【請求項５】
ポリソルベートは、ボツリヌム毒素１００ユニット当たり０．０１〜２ｍｇで含まれる、請求項１に記載の薬剤学的凍結乾燥製剤。
【請求項６】
メチオニンは、ボツリヌム毒素１００ユニット当たり０．０１〜１０ｍｇで含まれる、請求項１に記載の薬剤学的凍結乾燥製剤。
【請求項７】
糖は、トレハロース、スクロース、マルトース、フルクトース、ラフィノース、ラクトース及びグルコースよりなる群から選択された１つ以上である、請求項１に記載の薬剤学的凍結乾燥製剤。
【請求項８】
糖は、ボツリヌム毒素１００ユニット当たり０．１〜５０ｍｇで含まれる、請求項１に記載の薬剤学的凍結乾燥製剤。
【請求項９】
糖アルコールは、シクロデキストリン、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、キシリトール及びイノシトールよりなる群から選択された１つ以上である、請求項１に記載の薬剤学的凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
糖アルコールは、ボツリヌム毒素１００ユニット当たり０．１〜５０ｍｇで含まれる、請求項１に記載の薬剤学的凍結乾燥製剤。
【請求項１１】
イオン化合物は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム及びリン酸カリウムよりなる群から選択された１つ以上である、請求項１に記載の薬剤学的凍結乾燥製剤。
【請求項１２】
イオン化合物は、ボツリヌム毒素１００ユニット当たり０．１〜１０ｍｇで含まれる、請求項１に記載の薬剤学的凍結乾燥製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物来由のタンパク質安定化剤を含有しないボツリヌム毒素の凍結乾燥製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌム毒素は、嫌気性バクテリアクロストリジウムボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）のポリペプチド生成物であって、神経細胞に特異的に作用する毒性物質である。ボツリヌム毒素は、本来致死を起こす毒性物質であるが、最近、痙性斜頸（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｄｙｓｔｏｎｉａ）、眼瞼痙攣 （ｂｌｅｐｈａｒｏｓｐａｓｍ）、多汗症（ｈｙｐｅｒｈｉｄｒｏｓｉｓ）、斜眼（ｓｔｒａｂｉｓｍｕｓ）、弛緩不能（ａｃｈａｌａｓｉａ）、神経因性膀胱（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｂｌａｄｄｅｒ）、泌尿器疾患（ｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、偏頭痛（ｍｉｇｒａｉｎｅ）などの治療のために使用されている。このようなボツリヌム毒素を薬剤学的組成物として使用している例としては、現在、本発明者らによって販売されているメディトキシン注がある。
【０００３】
薬理効果を有する多くのタンパク質は、固体表面に接着する特性を有するので、容器に注入される場合、タンパク質の一部が容器の内壁に接着し、活性成分の損失をもたらす。また、タンパク質は、酸化しやすいか、または小さい断片に分解され得るので、これを防止することができる物質として安定化剤を添加する必要がある。
【０００４】
現在、ボツリヌムトキシンの安定化剤としてアルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）が使用されている。アルブミンは、容器に注入されるとき、タンパク質の吸着または希釈時に発生するタンパク質の変性を減少させることによって、タンパク質活性成分の損失を低減する。ゼラチンは、コラーゲンの加水分解により獲得される物質であって、アルブミンを代替して使用されたりする。しかし、アルブミンとゼラチンは、動物来由のタンパク質であるから、血液来由の病原体または潜在的な感染の危険性がある。したがって、動物から由来せず、ボツリヌム毒素の活性を損失させない安定化剤が要求される。
【０００５】
これと関連して、本発明者らは、韓国特開２００９−０００５９６３号（特許文献１）において常温で長期間安定性を示すボツリヌム毒素、メチオニン及びポリソルベート２０を含むボツリヌム毒素の薬剤学的液状組成物を開示したことがある。しかし、上記液状組成物は、常温以上の高温でボツリヌム毒素の安定性を維持させるには無理があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許第２００９−０００５９６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、常温以上の高温での保管安定性が長期間持続するボツリヌム毒素の凍結乾燥製剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従来のボツリヌム毒素製剤は、冷蔵または常温でのボツリヌム毒素の安定性を維持させることはできるが、高温でのボツリヌム毒素の活性を長期間維持させるには問題があった。これより、本発明者らは、ボツリヌム毒素が冷凍、冷蔵、常温及び高温を含む広い温度範囲でも活性を長期間維持し、貯蔵安定性に優れたボツリヌム毒素の凍結乾燥製剤を開発した。
【０００９】
したがって、本発明は、１）ボツリヌム毒素；２）ポリソルベート；３）メチオニン；及び４）糖、糖アルコール及びイオン化合物よりなる群から選択された１つ以上の成分を含む薬剤学的凍結乾燥製剤を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によるボツリヌム毒素の凍結乾燥製剤は、ボツリヌム毒素の保管、運搬、操作時に発生することができる高温条件でもボツリヌム毒素の活性が維持されると共に、長期安定性に非常に優れている。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明によるボツリヌム毒素の凍結乾燥製剤は、既存の液状製剤に含まれた１）ボツリヌム毒素；２）ポリソルベート；及び３）メチオニン以外に、追加的成分として、４）糖、糖アルコール及びイオン化合物よりなる群から選択された１つ以上を含むことを特徴とする。
【００１２】
上記追加的成分は、ボツリヌム毒素が凍結乾燥剤形に製剤化されるとき、ボツリヌム毒素の活性を維持しながら常温以上の高温でも安定化させる役目をする。１）ボツリヌム毒素；２）ポリソルベート；及び３）メチオニンを含む組成物は、凍結乾燥時に安定性が劣化し、液状製剤に製剤化されるときにも、常温以上の高温での安定性が劣化するが、本発明によるボツリヌム毒素凍結乾燥製剤は、常温以上の高温でもボツリヌム毒素の活性が維持されると共に、長期間の保管安定性に優れていた。
【００１３】
本発明による凍結乾燥製剤に含まれるボツリヌム毒素は、クロストリジウムボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）から由来したものであることができる。本発明による凍結乾燥製剤に含まれるボツリヌム毒素は、公知の方法によりこれら菌株から分離精製するか、または商業的に市販されている製品を使用することができる。
【００１４】
本発明による凍結乾燥製剤に含まれるボツリヌム毒素は、ボツリヌム血清型（Ｓｅｒｏｔｙｐｅ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧで構成された群から任意に選択されることができる。ボツリヌム毒素は、免疫学的区別法を用いて血清型（Ｓｅｒｏｔｙｐｅ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇに区別される。すべての血清型のボツリヌム毒素は、神経根接合部で信号伝達物質であるアセチルコリンの分泌を阻害することによって、神経麻痺効果を発生し、それぞれの血清型によって作用する動物種及び麻痺の程度、持続時間などが変わることができるものと知られている。
【００１５】
一方、クロストリジウムボツリヌムバクテリアにより毒素タンパク質が生産されるとき、ボツリヌム毒素タンパク質は、ボツリヌム毒素タンパク質の作用を補助及び保護するさまざまなヘマグルチニン（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タンパク質及び非ヘマグルチニンタンパク質と多様な複合体を形成して生産される。本発明による凍結乾燥製剤に含まれるボツリヌム毒素は、複合体化タンパク質を含有する形態と含有しない形態をすべて含むことができる。複合体化タンパク質の含有有無によってボツリヌム毒素の活性が影響を受けるものではない。
【００１６】
本発明によるボツリヌム毒素の凍結乾燥製剤は、ボツリヌム毒素の安定化剤の１つであって、ポリソルベート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）は、非イオン性界面活性剤であって、製薬または食品分野において乳化剤として主に使用される物質である。ポリソルベートの種類としては、オキシエチレングループの全体数を基準にしてポリソルベート２０、４０、６０、８０または１００がある。本発明によるボツリヌム毒素の凍結乾燥製剤には、これらのうちいずれのものを使用してもよい。上記ポリソルベートは、ボツリヌム毒素１００ユニット当たり０．０１〜２ｍｇで含まれることができる。上記範囲内の場合、常温以上の高温でもボツリヌム毒素の活性が維持されると共に、長期間の保管安定性を維持することができる。
【００１７】
一方、安定化剤の１つであるメチオニンは、ボツリヌム毒素の安定化剤であって、アルブミンやゼラチンのような動物性タンパク質の代わりに使用される。上記メチオニンは、ボツリヌム毒素１００ユニット当たり０．０１〜１０ｍｇで含まれることができる。上記範囲内の場合、常温以上の高温でもボツリヌム毒素の活性が維持されると共に、長期間の保管安定性を維持することができる。
【００１８】
本発明によるボツリヌム毒素の凍結乾燥製剤は、既存の液状製剤とは異なって、メチオニンとポリソルベート以外に、追加的成分として４）糖、糖アルコールまたはイオン化合物を少なくとも１つ含む。
【００１９】
糖（ｓｕｇａｒ）は、高分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｌｕｅ）の変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）を保護するものと知られている。本発明による凍結乾燥製剤に使用されることができる糖としては、これに制限されるものではないが、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、フルクトース（ｆrｕｃｔｏｓｅ）、ラフィノース（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、またはグルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）などがある。上記糖は、ボツリヌム毒素１００ユニット当たり０．１〜５０ｍｇで含まれることができる。上記範囲内の場合、常温以上の高温でもボツリヌム毒素の活性が維持されると共に、長期間の保管安定性を維持することができる。
【００２０】
糖アルコール（ｓｕｇａｒ  ａｌｃｏｈｏｌ）は、液状や凍結乾燥条件で高分子を安定化させ、変性を防止するのに有用なものと知られている。本発明による凍結乾燥製剤に使用されることができる糖アルコールとしては、これに制限されるものではないが、シクロデキストリン（ｃｙcｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、キシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）またはイノシトール（ｉｎｏｓｉｔｏｌ）などがある。上記糖アルコールは、ボツリヌム毒素１００ユニット当たり０．１〜５０ｍｇで含まれることができる。上記範囲内の場合、常温以上の高温でも、ボツリヌム毒素の活性が維持されると共に、長期間の保管安定性を維持することができる。
【００２１】
一方、イオン化合物（ｉｏｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、塩（ｓａｌｔ）または緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）などを意味する。イオン化合物は、特異的または非特異的結合を通じて高分子と作用する。塩は、熱安定性を増加させることができ、溶解度を増加させ、凝集の程度を低減する。しかし、高濃度の塩では、タンパク質の変性化傾向が現れるので、注意が必要である。イオン化合物は、これに制限されるものではないが、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、硫酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）、酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）、乳酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ）、コハク酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、プロピオン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）またはリン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などを含む。上記イオン化合物は、ボツリヌム毒素１００ユニット当たり０．１〜１０ｍｇで含まれることができる。上記範囲内の場合、常温以上の高温でもボツリヌム毒素の活性が維持されると共に、長期間の保管安定性を維持することができる。
【００２２】
本発明によるボツリヌム毒素の凍結乾燥製剤は、これに制限されるものではないが、特定培地で培養されたクロストリジウムボツリヌムの培養物から製造する。培養物溶液から一連の酸沈殿を通じてボツリヌム毒素複合体を活性高分子量毒素タンパク質及び関連赤血球凝集素タンパク質で構成される結晶形複合体に精製する。結晶形複合体を塩水及び安定化剤を含む溶液に溶解し、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅｄｒｙｉｎｇ）する過程を経てボツリヌム毒素の凍結乾燥製剤が製造される。
【実施例】
【００２３】
本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態に具現され、ただ、本実施例は、本発明の開示を完全にし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇により定義されるだけである。
【００２４】
＜実施例１＞ボツリヌム毒素凍結乾燥製剤の製造
本発明のボツリヌム毒素凍結乾燥製剤は、ボツリヌム毒素、メチオニン及びポリソルベートと、糖または糖アルコール及び／またはイオン化合物を含む滅菌された調剤液を凍結乾燥して準備した。
【００２５】
（ボツリヌム毒素安定性試験）
ボツリヌム毒素の安定性は、一定保管期間後に活性の持続として判断し、ボツリヌム毒素の活性の持続は、マウスＬＤ５０またはマウス致死率で測定した。上記凍結乾燥製剤の剤形を４０℃、相対湿度７０％で３０日間保管し、これを生理食塩水で溶解後、２．５  ＬＤ５０  ＩＵに該当するボツリヌム毒素をマウス３匹の腹腔に注射し、２匹以上が致死に至る場合、これを安定性が持続するものと判断し、これを下記の表では、死亡率で表現した。マウスの死亡率が５０％以上なら、ボツリヌム毒素の活性が維持されるものと評価されることができる。
【００２６】
（力価測定法）
力価測定法は、次のように実施する。検体２バイアルに生理食塩水２．８ｍＬをそれぞれ加えて溶かした。ここで、４．４ｍＬを取って生理食塩水１．４５ｍＬに入れた液を検液１とした。検液１の４．４ｍＬを生理食塩水１．４５ｍＬに入れた液を検液２とした。同一の方法で８回さらに希釈し、それぞれを検液とした。検液３から検液６までの検液を重さが１７〜２２ｇのマウス（ＣＤ１、雌）に検液ごとに１０匹の腹腔に匹当たり０．１ｍＬずつ注射した後、３日後に致死率を測定し、Ｐｒｏｂｉｔ法で統計処理し、マウスＬＤ５０を求め、力価を求めた。
【００２７】
＜実施例２＞ボツリヌム毒素の安定化剤の選別
（１）メチオニンとポリソルベート組合の選別
従来知られたボツリヌム毒素の安定化剤の構成成分であるヒト血清アルブミン、ポリソルベートの組合でヒト血清アルブミンを代替することができる安定化剤を選別した。
【００２８】
【表１】
0005826914.tif 000002
【００２９】
上記の結果からメチオニンとポリソルベート２０の組合は、ＨＳＡとポリソルベート２０の組合を代替することができる安定剤として評価された。
【００３０】
次に、ボツリヌム毒素の安定化剤として選別されたメチオニンとポリソルベート２０の組合でメチオニン及びポリソルベート２０の多様な濃度変化によるボツリヌム毒素の安定性実験を行った。
【００３１】
表２に３０日保管時にメチオニン及びポリソルベート２０の多様な濃度条件でのボツリヌム毒素の安定性実験結果（死亡率（％））を示し、表３に６０日保管時にメチオニン及びポリソルベート２０の多様な濃度条件でのボツリヌム毒素の安定性実験結果（死亡率（％））を示した。上記実験のボツリヌム毒素液状組成物でボツリヌム毒素の濃度は、１００ユニット／ｍＬであった。
【００３２】
【表２】
0005826914.tif 000003
【００３３】
【表３】
0005826914.tif 000004
【００３４】
表２及び表３の結果を利用して統計分析を行った結果、２５〜７５ｍＭのメチオニンと０．１〜２．５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０の組合がボツリヌム毒素を最も安定化させるものと推定された。
【００３５】
（２）追加成分の選別
表２及び表３を通じて選別されたメチオニンとポリソルベート２０を凍結乾燥製剤として使用する場合、メチオニン含量の範囲は、０．０１〜１０ｍｇ、ポリソルベート２０の含量の範囲は、０．０１〜１ｍｇに計算された。しかし、この組合の安定化剤を凍結乾燥製剤として使用する場合、３０日保管後に安定性が持続せず、したがって、安定性を維持することができる追加的な安定化剤を表４のように選別した。この際、ボツリヌム毒素１００ユニット、メチオニン３ｍｇ、ポリソルベート２０２ｍｇを使用した。
【００３６】
【表４】
0005826914.tif 000005
【００３７】
表４に示されたように、メチオニンとポリソルベートだけを安定化剤として含む凍結乾燥製剤では、ボツリヌム毒素の安定化効果が持続しないが、メチオニンとポリソルベートに追加に糖、糖アルコール及びイオン化合物のうち少なくとも１つを添加する場合、安定化効果が維持されることを確認することができた。
【００３８】
次に、メチオニンとポリソルベートの組合に追加に添加される糖または糖アルコール、イオン化合物の種類と適正含量について実験を行った。この際、ボツリヌム毒素１００ユニット、メチオニン２ｍｇ、ポリソルベート２０ ０．２ｍｇを使用した。
【００３９】
【表５】
0005826914.tif 000006
【００４０】
表５に示されたように、メチオニンとポリソルベートの組合に０．１〜５０ｍｇのスクロース、０．１〜１０ｍｇの塩化ナトリウムを添加した場合、安定化効果が維持されることを確認することができた。追加的な安定化剤の含量がこの範囲以下である場合、安定化効果がなく、この範囲以上である場合、凍結乾燥製剤として安定した形態を有しないようになる。
【００４１】
次に、凍結乾燥製剤の高温での長期安定性実験を力価測定法で実施した。この際、ボツリヌム毒素＋メチオニン＋ポリソルベート２０＋リン酸ナトリウム＋スクロース組合の凍結乾燥製剤の場合、ボツリヌム毒素１００ユニット、メチオニン０．８ｍｇ、ポリソルベート２０  ０．０２ｍｇ、リン酸ナトリウム（無水リン酸一水素ナトリウム０．０５ｍｇ＋リン酸二水素ナトリウム二水和物０．１０１ｍｇ）、スクロース４ｍｇを使用し、ボツリヌム毒素＋メチオニン＋ポリソルベート２０＋塩化ナトリウム＋スクロース組合の凍結乾燥製剤の場合には、ボツリヌム毒素１００ユニット、メチオニン０．２ｍｇ、ポリソルベート２０  ０．０２ｍｇ、塩化ナトリウム２ｍｇ、スクロース４ｍｇを使用した。対照群として使用された、ヒト血清アルブミン含有凍結乾燥製剤の場合には、ヒト血清アルブミン０．５ｍｇ、塩化ナトリウム０．９ｍｇを使用した。
【００４２】
【表６】
0005826914.tif 000007
【００４３】
表６に示されたように、ボツリヌム毒素、メチオニン、ポリソルベート、リン酸ナトリウムまたは塩化ナトリウム及びスクロース組合の凍結乾燥製剤で安定化効果が６ヶ月程度維持されることを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、痙性斜頸（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｄｙｓｔｏｎｉａ）、眼瞼痙攣 （ｂｌｅｐｈａｒｏｓｐａｓｍ）、多汗症（ｈｙｐｅｒｈｉｄｒｏｓｉｓ）、斜眼（ｓｔｒａｂｉｓｍｕｓ）、弛緩不能（ａｃｈａｌａｓｉａ）、神経因性膀胱（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｂｌａｄｄｅｒ）、泌尿器疾患（ｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、偏頭痛（ｍｉｇｒａｉｎｅ）などの治療剤として使用することができる。