(57)【要約】  本発明は、生体サンプル中に存在する特定の上皮細胞の特定の特性を評価および使用するための手段および方法に関する。よって、本発明は、少なくとも一つのクローン培養物に上皮組織の生体サンプルから直接抽出された単一の上皮細胞が播種された、上皮細胞の培養のための系に関する。本発明はまた、特に、それぞれ上皮組織の生体サンプルから直接抽出された異なる独特の上皮細胞が播種されたクローン培養物の製造、それらのクローン培養における細胞増殖の評価、および有利には、それらの細胞培養物からの細胞材料の、天然組織に典型的な三次元上皮を再構築する能力の分析を含んでなる、上皮細胞の培養方法に関する。本発明は非常に多数のクローン培養の並行実行、特に大規模試験を形成するために適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養支持体が健常または罹患上皮組織の生体サンプルから直接抽出された単一の上皮細胞を播種した少なくとも一つのクローン培養物を含んでなり、単一細胞の特定の特性を評価および利用するために至適化された、上皮細胞のクローン培養のための系。
【請求項２】
前記培養支持体が少なくとも二つの並行クローン培養物を含んでなり、前記培養物がそれぞれ前記生体サンプルから直接抽出された異なる単一の上皮細胞が播種されていることを特徴とする、請求項１に記載の系。
【請求項３】
バイオチップであることを特徴とする、請求項１または２に記載の系。
【請求項４】
単一細胞に特定の特性を評価および利用するために至適化された上皮細胞のクローン培養のための方法であって、少なくとも
ａ）健常または罹患上皮組織の生体サンプルから直接１以上の上皮細胞を抽出する工程、
ｂ）所望により、工程ａ）で抽出された細胞から少なくとも一つの上皮細胞集団および／または部分集団を選択する工程、
ｃ）工程ａ）またはｂ）から直接生じた異なる単一の上皮細胞を播種したクローン培養物を製造する工程、および
ｄ）工程ｃ）のクローン培養物における細胞増殖を定性的および／または定量的に評価する工程
を含んでなる、方法。
【請求項５】
工程ｃ）のクローン培養の細胞集団またはその後代を、１回以上の連続的継代培養により増殖することからなる工程ｅ）をさらに含んでなることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
三次元組織を再構築してその組織の再構築能を評価するために、工程ｃ）のクローン培養物またはその後代の細胞集団を用いることからなる工程ｆ）をさらに含んでなることを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞集団の長期拡大能を評価するために、拡大能が消耗するまで細胞拡大を促進する条件下で、工程ｃ）のクローン培養物の細胞集団を継代培養することからなる工程ｇ）をさらに含んでなることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
厳密にクローン性の二次培養物および／または個別化されたコロニーの増殖を可能とする低密度培養物が形成されるクローン形成能の定量的試験により、工程ｃ）のクローン培養物の後代の細胞集団のクローン形成能を評価することからなる工程ｈ）をさらに含んでなることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ｃ）が少なくとも二つの並行クローン培養物の製造を含んでなり、その各培養物が工程ａ）またはｂ）から直接生じた異なる単一の上皮細胞が播種されていることを特徴とする、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
上皮組織の前記生体サンプルが、哺乳類、好ましくはヒトにおいて生検により得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の系または請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記上皮組織が上皮、例えば、成人または新生児皮膚の毛包間表皮、角膜、粘膜、毛包から選択されることを特徴とする、請求項１〜３および１０のいずれか一項に記載の系または請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体サンプルから直接抽出された上皮細胞が前駆細胞、幹細胞、ケラチノサイトから選択される単一の健常または罹患細胞であることを特徴とする、請求項１〜３、１０、および１１のいずれか一項に記載の系または請求項４〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項４に記載の方法の少なくとも工程ａ）〜ｃ）を適用することにより得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の系。
【請求項１４】
請求項５に記載の方法の工程ｅ）の終了時に得ることのできる、クローン細胞バンク。
【請求項１５】
請求項６に記載の方法の工程ｆ）の終了時に得ることのできる、クローン培養物から再構築された三次元組織。
【請求項１６】
上皮、皮膚、表皮から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の組織。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の少なくとも一つの組織を含んでなるバイオチップ。
【請求項１８】
目的の生物活性を有する薬剤を同定および選択するための、
請求項１〜３および１０〜１３のいずれか一項に記載の系、もしくは
請求項１４に記載の細胞バンク、もしくは
請求項１５または１６に記載の組織、もしくは
請求項１７に記載のバイオチップ
の使用、または
請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞および／または遺伝子療法分野、特に移植分野においてin vitro診断および／またはin vitro予後診断のための、
請求項１〜３および１０〜１３のいずれか一項に記載の系、
請求項１４に記載の細胞バンク、
請求項１５または１６に記載の組織、もしくは
請求項１７に記載のバイオチップ
の使用、または
請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
単一細胞、細胞サブタイプ、細胞部分集団または細胞集団に特異的な挙動および／または構造的および／または機能的個特性を試験するための、
請求項１〜３および１０〜１３のいずれか一項に記載の系、
請求項１４に記載の細胞バンク、
請求項１５または１６に記載の組織、もしくは
請求項１７に記載のバイオチップ
の使用、または
請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
機能ゲノム科学の１以上のツールを製造するための、
請求項１〜３および１０〜１３のいずれか一項に記載の系、
請求項１４に記載の細胞バンク、
請求項１５または１６に記載の組織、もしくは
請求項１７に記載のバイオチップ
の使用、または
請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
特に生物活性を有する薬剤、ストレス、毒物、遺伝毒性攻撃による治療の有効性または影響を評価するための、
請求項１〜３および１０〜１３のいずれか一項に記載の系、
請求項１４に記載の細胞バンク、
請求項１５または１６に記載の組織、もしくは
請求項１７に記載のバイオチップ
の使用、または
請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞生物学および組織工学の分野に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、生体サンプル中に存在する特定の上皮細胞の特定の特性を評価および使用し得る手段および方法を提供する。
【０００３】
よって、本発明の目的は、少なくとも一つのクローン培養物に上皮組織の生体サンプルから直接抽出された単一の上皮細胞を播種した、上皮細胞を培養するための系である。
【０００４】
さらに、少なくとも以下のを含んでなる、上皮細胞を培養するための方法に関する：
ａ）上皮組織の生体サンプルから直接１以上の上皮細胞を抽出する工程、
ｂ）所望により、工程ａ）で抽出された細胞から少なくとも一つの上皮細胞集団および／または部分集団を選択する工程、
ｃ）工程ａ）またはｂ）から直接生じた異なる単一の上皮細胞を播種したクローン培養物を製造する工程、および
ｄ）工程ｃ）のクローン培養物における細胞増殖を定性的および／または定量的に評価する工程。
【０００５】
さらに、本発明は、このような系または方法の適用に関する。
【０００６】
背景技術
表皮などの上皮組織を取り扱うin vitro系および方法は、医学的研究および臨床開発、組織工学、および毒性学などの多様な分野で適用が見出せる。
【０００７】
種々の多層上皮組織（特に、表皮、角膜、粘膜組織など）は、大規模in vitro試験構築物を設計するのに制約を課す一定数の共通した特徴を有する。これらの一般的特徴は表皮の場合には十分に実証されている。
【０００８】
表皮は皮膚の最も表層の構造であり、特に、そのバリア機能を確保する。ケラチノサイトからなる大部分は、平均２８日ごとに更新される。この組織は、ケラチノサイトが最も深い層である基底層から最も表層である角質層へ向かってのそれらの移動する間に受ける４段階の異なるプログラムに対応する４層を含んでなる。種々のケラチノサイト層の更新の連続的な生理学的工程はケラチン生成(keratinopoiesis)と呼ばれる。
【０００９】
単細胞層を１層だけ含む表皮の基底層は、発生部である。それはケラチノサイトの増殖が起こる薄い層にある。基底ケラチノサイトには、幹細胞と呼ばれる小集団の細胞が見られ、それに関しては、表皮の長期更新の起点であると認識されている。幹細胞のすぐ後に生じるものは前駆体集団と呼ばれる。後者は表皮の急速な短期更新を保証する。
【００１０】
従って、ヒト毛包間(interfollicular)表皮内の幹細胞の概念は、ケラチン生成の階層において最上流に位置する部分を定義する。これらの細胞は特に、顕著な自己更新能（前駆体細胞はそれを持たない）、さらには分化を約束されたケラチノサイトを特徴とする。さらに、幹細胞の重要な特性は、表皮組織を再生および再構築する能力を永続的に保存することである。
【００１１】
従って、表皮は、他の多層上皮組織と同様に種々の分化（または未成熟）程度を有するヘテロな細胞集合体からなる。一般に、基底ケラチノサイトは表皮全体のケラチノサイトの約１０％に相当し、表皮幹細胞の部分は０．１％程度に過ぎない。
【００１２】
機能評価およびスクリーニングするために本方法を適用するのに必要とされる定性の必要を考慮すれば、皮膚生検から慣例的に採取された細胞材料、すなわち、表皮サンプルの解離後に得られる全ケラチノサイトは、工業規模での使用に十分な大きさを有する細胞バンクの構築を可能とする。しかしながら、この種のバンクを構築するのに用いられる材料は、種々の増殖能を有する基底ケラチノサイトと分化過程の、もはや増殖能を持たない基底上層ケラチノサイトを含んでなるヘテロな細胞の集合体に相当する。
【００１３】
例えば、再構築された表皮の工業的キット製品を対象としたケラチノサイトバンクに関して、標準的な方法は、培養において１回の増殖工程の終了時に細胞を冷凍して複数の等価なアンプルのストックを形成することからなる（これらのアンプルは液体窒素中で維持される）。必要に応じて、細胞アンプルを解凍し、培養下に置いて２回目の増殖工程を行う。２回の連続する増殖工程の終了時に、ケラチノサイトは一般に１０倍程度の集団になっている。この種のアプローチはさらに、ヒトケラチノサイトの増殖能のヘテロ性を分析するために使用されていた(Barrandon and Green, 1987)。この筆者らはまず表皮に由来する一次培養物を形成し、それらを液体窒素中で冷凍した。半集密二次培養物を冷凍一次培養物から調製した。クローニング（３回目の培養または「第三代」）後に得られたクローンを、ホロクローン（増殖が速い）、パラクローン（増殖が制限）および眼メロクローン（中間的な集団）の三つのカテゴリーに分類した。２回の連続する増殖工程の後に慣例的に得られたケラチノサイトは、再構築組織のモデルを製造するために使用可能である。他方、膨大な試験戦略を行わなければならない工業規模では、これらの系をそのまま、幹細胞内の希少な細胞材料に適用することは不可能である。
【００１４】
概して言えば、大規模in vitro試験戦略の実施に匹敵する数種のモデルが現在利用可能である。これらの試験に用いられる生物材料は、１）不死化細胞系統、２）組織生検から抽出され、培養で増殖された正常細胞のバンク、３）再構築された三次元組織でってもよい。しかしながら、このようなモデルを大規模に適用するためには、大量の細胞材料が利用可能である必要がある。例えば、正常細胞に対して行われる試験の場合、in vitro増殖された細胞集団が用いられ、これにより適用される培養パラメーターに応じてその特定の特性が改変される。さらに、もし焦点が前駆細胞または表皮幹細胞などの希少細胞の部分集団にあれば、これらの細胞は組織生検からは十分な量が得られない。
【００１５】
Gangatirkarら(2007)は、ケラチノサイト全体から、または異なる表現型に基づいて選別された部分集団から表皮が再構築され得る方法を開示している。提供されている選択肢は双方とも、組織からの抽出後、他方、細胞選別後にそのまま細胞を用いること、および他方、培養拡大期の後に細胞材料を用いることからなる。しかしながら、記載されている方法を適用するための細胞材料の定量の必要性は、大規模試験戦略を並行して行うにはなお不適である。さらに、用いる細胞材料は異なる細胞の複雑な混合物に相当し、全体的には表皮を再構築するその能力が用いられる。
【００１６】
従って、多層上皮組織、特に、表皮のケラチノサイトからなる細胞のヘテロ性はin vitro試験戦略の精密化における制限因子である。
【００１７】
実際、細胞がそれらに特異的な特定の特徴を有する限り、それらは刺激またはストレスに違った応答を示し得る。病的上皮組織にも同じことが当てはまる。例えば、癌腫は極めてヘテロな腫瘍であり、腫瘍幹細胞の小集団が治療において重要な標的となる。
【００１８】
さらに、異なる特徴を有する細胞が培養において混合されている場合、それらのいくつかの特定の挙動が混合物内で改変されたり、または無視されたりする場合がある。従って、これらの培養細胞全体としては「平均化された」結果が見られる。よって、ヘテロな全細胞集団から再構築された表皮の構造的および機能的特性（例えば、Larderetら, 2006参照）は、互いの存在下に置かれた細胞の特性全体の結果である。従って、それにより再構築された表皮は単一細胞の特定の特性を決して反映しないであろう。
【００１９】
さらに、適用される培養条件は多少、細胞の固有の特徴を厳格に改変し得る。実際、上皮組織由来の細胞を人工的な培養環境に置いた場合には、それらの本来の特徴の改変がもたらされるということがよく知られている。結果、１以上の培養工程の後に用いられる上皮細胞は、組織細胞から直接生じた細胞にはもはや匹敵しない細胞材料を含む。特に、これらの改変は被験細胞の特定の表現型に関する。例えば、表皮から新しく単離されたヒトケラチノサイトの培養は、接着分子および幹細胞の表現型の定義に用いられるマーカーの発現に障害を及ぼし、これは用いる培養培地に応じた種々の様式に障害を及ぼすことが示されている(Lorenzら 2008)。
【００２０】
結局、ヘテロな複雑な細胞集団からの研究からなる標準的な解決策は、現在の医学、臨床および工業の必要性を満たすには十分ではない。
【００２１】
よって、これまでに用いられている一般集団よりも１００倍〜１０００倍まれである細胞材料の場合であっても、多層上皮組織由来の細胞の個々の特性に近づくことを可能とするとともに、大規模in vitro試験戦略の適用に好適な手段および方法についての必要性が存在する。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、（ｉ）それらのクローン的性質のために多層上皮組織から直接生じた細胞の個々の特定の特性を評価することを可能とし、（ｉｉ）該細胞の個々の能力を保存し、（ｉｉｉ）それらが大規模で適用される場合であっても大量の細胞材料を消費せず（これにより、それらは試験および少量の標本細胞（幹細胞および前駆細胞）の工業規模での利用に適する）、および（ｉｖ）既知の手段で得られるものに比べ、より高い細胞増殖レベルを達成可能とする培養手段および方法を提供することにより、初めてこの必要性を満たす。
【００２３】
よって、本発明の目的は、培養支持体が健常または罹患上皮組織の生体サンプルから直接抽出された単一の上皮細胞を播種した少なくとも一つのクローン培養物を含んでなり、単一細胞の特定の特性を評価および利用するために至適化された、上皮細胞のクローン培養のための系に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
次の図面は下記の実施例に関して、本発明の実施形態を説明するものである。
【図１】本発明のよる実施形態を示す図である。
【図２】それぞれ単一細胞の後代から生じた複数のケラチノサイトのバンクを製造するための長期拡大試験の結果をグラフで示したものである。
【図３】それぞれ単一細胞の後代から生じた複数の再構築表皮を製造するための試験結果である。
【図４】個々に培養下に置かれた基底ケラチノサイトＩｔｇαｓｔｒｏｎｇの短期クローン増殖の評価結果である。
【図５】個々に培養下に置かれた基底ケラチノサイトＩｔｇαｓｔｒｏｎｇから始めた長期培養物を定量する試験結果である。
【図６】異なる表現型の表皮ケラチノサイトに対する放射線の影響を単一の単離細胞の規模で定量した試験結果をグラフで示したものである。
【図７】単離細胞に対して行った照射の、その後代の増殖能に対する結果を評価するために並行クローン微小培養を用い、異なる表現型の表皮ケラチノサイトの挙動を比較した試験の結果である。
【図８Ａ】ＣＧＨチップによる第１０染色体における異常の検索結果：−二つの非照射ケラチノサイトの後代：Ｋ１およびＫ２−照射ケラチノサイトの後代：Ｋ３。
【図８Ｂ】ＣＧＨチップによる第１０染色体における異常の検索結果：−二つの非照射ケラチノサイトの後代：Ｋ１およびＫ２−照射ケラチノサイトの後代：Ｋ３。
【図８Ｃ】ＣＧＨチップによる第１０染色体における異常の検索結果：−二つの非照射ケラチノサイトの後代：Ｋ１およびＫ２−照射ケラチノサイトの後代：Ｋ３。
【発明の具体的説明】
【００２５】
有利には、該培養支持体は少なくとも二つの並行クローン培養物を含んでなり、該培養物はそれぞれ該生体サンプルから直接抽出された、異なる独特な上皮細胞が播種される。
【００２６】
好ましくは、このような系はバイオチップとして表現される。そして、並行播種されたクローン培養物は例えば微小培養物(microculture)である。実際に、バイオチップは、特に、異なる複数のウェル、例えば、６、２４、９６、またはそれを超えるウェルを含んでなる培養プレートからなってもよい。あるいは、バイオチップは、例えば細胞をその上において細胞の接着および増殖を可能とする表面処理により細胞の受容を意図した複数の微小表面が製造される、支持体、ガラスプレートまたは他のいずれかの好適な材料のプレートを持ち得る。プレート上に製造されたバイオチップは、例えば、グリッドの手段によるか、または例えばクローン化された細胞がそれらの個々の培養微小表面を離れないように、プレートの表面処理を施すなど化学的にコンパートメントへ物理的に分割されてもよい。
【００２７】
本発明のもう一つの目的は、単一細胞に特定の特性を評価および利用するために至適化された上皮細胞のクローン培養のための方法であって、少なくとも以下の工程をを含んでなる方法に関する：
ａ）上皮組織の生体サンプルから直接１以上の上皮細胞を抽出する工程、
ｂ）所望により、工程ａ）で抽出された細胞から少なくとも一つの上皮細胞集団および／または部分集団を選択する工程、
ｃ）工程ａ）またはｂ）から直接生じた異なる単一の上皮細胞を播種したクローン培養物を製造する工程、および
ｄ）工程ｃ）のクローン培養物における細胞増殖を定性的および／または定量的に評価する工程。
【００２８】
興味深いことに、本発明の目的である、本方法で用いる細胞は、これらの組織から直接抽出された全細胞集団、および／または特定の特徴に基づいて選別されたその部分集団であってもよい。よって、工程ｂ）から生じた細胞材料は、有利には、上皮前駆体および／または幹細胞が豊富な１以上の部分集団に相当し得る。
【００２９】
工程ｃ）（一次増殖工程とみなしてもよい）の間、それにより抽出された細胞調製物は並行クローン培養または微小培養を開始させるために用いられる。課題は、例えば個別の培養ウェル内でそれらの増殖を可能とする条件下で個々に目的の細胞を播種することである。実際には、クローンの播種は、特にフローサイトメトリーまたはマイクロフルイディクスなどの技術を用いた自動法で行うことができる。好ましくは、工程ｃ）は少なくとも二つの並行クローン培養物の製造を含んでなり、その各培養物は工程ａ）またはｂ）から直接生じた異なる単一の上皮細胞が播種されている。
【００３０】
特に、工程ｄ）においては、クローン化細胞の増殖が、以下のような１以上の定量的および／または定性的パラメーターに基づいて分析される：
−播種された培養物の数に対して得られたクローンの頻度、すなわち、クローン形成率［ＣＦＥ］、
−クローンの増殖能、すなわち、所定の培養時間における各クローンを構成している細胞の数、
−クローンの表現型、すなわち、クローンを構成している細胞の分化程度、分子マーカーの発現。
よって、本発明者らは、各予測に対して、本発明のクローン培養法に従って培養された細胞の増殖能が標準的な手法に従って培養された細胞の増殖能よりも高いことが観察できた（下記の実施例Ｂ参照）。
【００３１】
特定の実施形態においては、本発明のクローン培養法は、少なくとも以下を含んでなる：
ａ）上皮組織の生体サンプルから直接１以上の上皮細胞を単細胞懸濁液の形態で抽出する工程、
ｂ）工程ａ）で抽出された細胞から少なくとも一つの上皮細胞集団および／または部分集団を選択する工程、
ｃ）工程ｂ）から生じた異なる単一の上皮細胞を播種したクローン培養物を製造する工程、および
ｄ）工程ｃ）のクローン培養物における細胞増殖を定性的および／または定量的に評価する工程。
【００３２】
もう一つの実施形態によれば、本発明の目的である本方法は、工程ｃ）のクローン培養の細胞集団またはその後代を１回以上の連続的継代培養により増殖することからなる工程ｅ）をさらに含んでなる。
【００３３】
ここでの課題は、一次増殖工程ｃ）の終了時に得られた細胞クローンから、数週間増殖させた連続的継代培養により長期並行独立細胞培養物を作製することである。必要に応じ、増殖は例えば２〜約８週間の範囲、またはさらにはより長期間にわたって行ってもよい（下記の実施例１Ｃ．２参照）。これらの独立した培養物を用いれば、次に使用するために１以上の細胞バンクの形態で冷凍および保存可能な大量の細胞を得ることができる。
【００３４】
それにより得ることができるクローン細胞バンクはもまた本発明の目的に相当する。これらのバンクは、それらがそれらに極めて特異的な構造的および機能的特性を与えるクローン細胞培養物を組み込むことにより、既存のバンクから区別される。
【００３５】
もう一つの付加的または代替の実施形態では、本発明による方法は、工程ｃ）のクローン培養物またはその後代の細胞集団の組織の再構築能を評価することからなる工程ｆ）をさらに含んでなる。より具体的には、工程ｆ）は好ましくは、三次元組織を再構築してその組織の再構築能を評価するために、工程ｃ）のクローン培養物またはその後代の細胞集団を用いることからなる。
【００３６】
実際、この工程を行うために、一次クローン培養または微小培養由来の細胞をそれらの培養支持体から分離することができ、次にそれらを、三次元器官培養モデル（例えば、再構築された上皮、表皮、または皮膚）を生成するために、注目する各クローンに対して個々に使用してもよい。
【００３７】
本発明による方法の工程ｆ）の終了時に得ることのできるクローン培養物から再構築された三次元組織は本発明の目的の一部である。本発明の目的である組織の構造的および機能的特徴は、それらが単一細胞の特性に起因している限り、極めて特異的であることから、これらの組織は新規な三次元器官型モデルに従って作製される。このような組織は特に種々の上皮組織、皮膚、表皮から選択される。
【００３８】
さらに、上記のような少なくとも一つの組織を含んでなるバイオチップも本発明のもう一つの目的である。これらのバイオチップは例えば細胞増殖に適合した生体材料からなる三次元ゲル内に形成された微小培養物から形成されてもよい。複数の再構築三次元微小組織に基づく系もまた意図することができ、それぞれは前培養の工程が無く、バイオチップ内で直接、独立に生成される。
【００３９】
もう一つの付加的または代替の実施形態においては、本発明による方法は、工程ｃ）のクローン培養物の細胞集団の長期拡大能を評価することからなる工程ｇ）をさらに含んでなる。より具体的には、工程ｇ）は好ましくは、該細胞集団の長期拡大能を評価するために、拡大能が消耗するまで細胞拡大を促進する条件下において、工程ｃ）のクローン培養物の細胞集団を継代培養することからなる。
【００４０】
例えば、一次クローン培養または微小培養から生じた細胞をそれらの培養支持体から分離し、次に、それらの増殖能が消耗するまでそれらの増殖を促進する条件下で、継代培養してもよい。
【００４１】
もう一つの付加的または代替の実施形態では、本発明による方法は、工程ｃ）のクローン培養物の細胞集団の後代のクローン形成能を評価することからなる工程ｈ）をさらに含んでなる。より具体的には、工程ｈ）は好ましくは、厳密にクローン性の二次培養物および／または個別化されたコロニーの増殖を可能とする低密度培養物が形成されるクローン形成能(clonogenicity)の定量的試験により、工程ｃ）のクローン培養物の後代の細胞集団のクローン形成能を評価することからなる。
【００４２】
このため、例えば、各クローンを形成している細胞をそれらの培養支持体から分離することができ、それらのそれぞれについて定量的クローン形成能試験を行うことができる。よって、例えば厳密にクローン性の二次培養物および／または個別化されたコロニーの増殖を可能とする低密度培養を行うことができる。
【００４３】
本質的には、本発明の範囲内で、最初の生体サンプルは、例えば、哺乳類、好ましくはヒトにおいて生検により得られた健常または罹患上皮組織のサンプルである。特に、組織サンプルは上皮、例えば、成人または新生児皮膚の毛包間表皮、角膜、粘膜、毛包から選択され得る。罹患上皮組織のサンプルは例えば、遺伝病（色素性乾皮症、表皮水疱症(bullous epidermolyses)など）に罹患している患者の生検により、また、瘢痕性皮膚（特に、ひどい火傷の患者）の生検により得られる。罹患上皮組織はまた腫瘍組織（癌腫など）であってもよい。
【００４４】
生体サンプルは胚、胎児、および誘導型多能性幹細胞から選択される多能性幹細胞の上皮（特に、ケラチン生成）分化からの細胞を含んでいてもよい。例として、胎児幹細胞から生じた上皮能を有する細胞、すなわち、外胚葉性胚層由来の細胞、上皮組織、ケラチノサイト由来の細胞などが挙げられる。いわゆる「誘導型」多能性（ＩＰＳ）細胞から生じた上皮能を有する細胞は、分化細胞であり得る成人組織から生じた細胞を再プログラムすることにより生成される。
【００４５】
有利には、生体サンプルから直接抽出された上皮細胞は前駆細胞、幹細胞、ケラチノサイトから選択される単一の健常または罹患細胞である。
【００４６】
本発明のもう一つの目的は、本発明による方法の少なくとも工程ａ）〜ｃ）を適用することにより得られるクローン培養系（またはこのような系を含んでなるキット）に関する。これらの系は、それらがクローン培養に由来するということに内在する特定の特性を有する。これらのキットは例えば診断キット、生物活性を評価するための試験、毒性試験などであり得る。「試験」、「キット」、およびあるいは「系」という用語は、本発明では、それらが用いられる文脈に応じて同等であり得るということが当業者には自明である。
【００４７】
特定の実施形態では、単一細胞の特定の特性を評価および利用するために至適化された上皮細胞のクローン培養系は、本発明の範囲内で、培養支持体を含んでなり、そこには少なくとも一つのクローン培養物に先に記載されている方法の工程ａ）〜ｃ）に従って上皮組織の生体サンプル直接抽出された単一の上皮細胞が播種されている。
【００４８】
本発明はまた、本方法および上記の種々の手段（系、キット、細胞バンク、組織、バイオチップ）の使用に関する。
【００４９】
このような使用および適用の好ましい例は、次の通りである。
−目的の生物活性を有する薬剤を同定および選択するため。「薬剤」は、その生物活性に関して試験され、本適用に応じて選択される候補分子であってよく、該活性は陽性（例えば、医薬、治療薬、化粧品として着目されるエフェクターを選択するため）であっても、または陰性（例えば、毒性分子を選択するため）であってもよい。あるいは、「薬剤」は、非化学的性質のもの、例えば、紫外線、可視光、電磁放射線、磁気波などであってもよい。
−細胞および／または遺伝子療法分野、特に、移植分野における治療および／または診断（特に、in vitro）および／または予後診断（特に、in vitro）のため。
−単一細胞、細胞サブタイプ、細胞部分集団または細胞集団に特異的な挙動および／または構造的および／または機能的個特性を試験するため。
−機能ゲノム科学の１以上のツール、特に、生物活性の獲得または喪失の現象を誘導するため、医学的目的のため、および／またはいずれかの種類の機能的探求において有用なものを製造するため。例えば、干渉ＲＮＡ、過剰発現および／または抑制、ウイルス、または非ウイルスベクターなどが挙げられる。
−薬剤または化粧品として目的とされる分子などの生物活性を有する薬剤の有効性を評価するため、および／またはこのような薬剤（分子またはその他の種類の刺激、例えば、波、光、放射線、物理的パラメーターなど）による治療の有効性を評価するため。
【００５０】
結局、現在利用可能な手段および方法に比べて本発明の種々の目的は次の著しい利点を有する。
（ｉ）単一細胞から始まる並行微小培養系列を製造できること。これにより実際に、細胞材料を多く消費する標準的モデルでは考えることができないような、組織内で典型的であるとは言えない希少な部分集団を標的とする大規模試験戦略の適用を可能とする。
（ｉｉ）選択された表現型の個々の播種細胞から、例えば、マイクロウェル内で、組織から選択された直後にクローン培養を開始することができること。これにより、培養での増殖工程を受けていない細胞材料に対して試験戦略の設定を考える可能性が得られ、従って、特に処置または刺激が微小培養物の播種直後に適用される場合には、試験を行う前に人工的培養パラメーターにより改変されている可能性が低くなる。
（ｉｉｉ）個々に培養下に置かれた細胞の挙動に初めて取り組めるということ。これにより、生物特性および目的の集団を形成している種々の細胞の特異的な応答を表現および定量する可能性が得られ、細胞集団全体を用いる標準的なモデルでは不可能な細胞のヘテロ性の分析が可能となる。
【００５１】
よって、本発明の種々の目的は、極めて多くの分野で有用であることが見出された。上記にすでに記載した適用例に加え、特に、限定されるものではないが、次のものが挙げられる。
【００５２】
（ｉ）生物活性を有する薬剤の有効性の評価：機能獲得
・有益な生物活性を有する化合物（例えば、薬剤として着目される、化粧品として活性な分子）の有効性の評価：
−単一の単離細胞の規模で生物活性の影響、すなわち、実際の標的細胞に対する処置の作用、その後代に対する影響の定量を可能とするスクリーニング戦略を行う。
−正常または病的幹細胞などの典型的であるとは言えない集団を標的とする評価試験の戦略を開発することができる。
・例
−１）多層上皮組織の幹細胞または前駆細胞の増殖を誘導し、２）単離幹細胞の後代の培養において幹的性質の維持を増進することができるエフェクターの試験、
−癌腫から単離された幹細胞に対する新規な抗癌分子の試験。
【００５３】
（ｉｉ）毒性学の課題：機能喪失、癌への形質転換
・特定の基準に基づいて選択した後、単離状態の被処置細胞の規模でストレスおよび毒物の影響を評価する。これらの試験は上皮組織の長期更新（幹細胞）および短期更新（前駆体）を担う細胞に選択的に適用することができる。
・それらはまた、標的細胞の種類に応じて、予後診断または組織もしくは器官への急性もしくは遅発性有害作用の識別に適合した試験の設計を可能とする。
−治療の無害性の評価または他方でその毒性作用、すなわち、実際の単離細胞に対する短期作用、その後代への結果の定量を可能とする毒理学的試験を行う。
−遺伝毒性攻撃の影響、すなわち、単離状態で試験される細胞の規模で、ＤＮＡへの傷害の獲得、突然変異の伝達および／または後代に対する遺伝子異常、器官形成などに対する結果を評価する。
【００５４】
（ｉｉｉ）バイオチップ技術：生物学的応答の定量および定性の並行／大規模並行モデル
−二次元細胞培養物および／または三次元器官型モデルに対する機能ゲノム科学のスクリーニング
−生物活性を有する分子のハイスループットスクリーニング／有害特性の検出（「ハイスループットスクリーニング」［ＨＴＳ］）
【００５５】
（ｉｖ）細胞および遺伝子治療
・移植を意図した、および／または再構築組織の移植片を製造するために使用することを意図した細胞サンプルの定量：
−臨床使用を意図した細胞の再生能、すなわち、臨床条件下で細胞に対して個々に評価される増殖能の評価を可能とする培養における試験
−in vitroで再構築された組織の移植能の予後診断試験：移植片を製造するために用いる細胞の増殖能の維持または喪失の評価
・臨床的展望における遺伝子導入プロトコールのバリデーション：
−遺伝子修復プロトコールの有効性の評価：遺伝子導入法の終了時に実際に修復された細胞の頻度の評価
−遺伝子修復の安定性、すなわち、個別化された細胞の後代への伝達の評価
【００５６】
（ｖ）細胞および組織工学
単離状態の細胞およびそれらの後代に対する試験の適用と適合する細胞系および器官型モデル：
−それぞれ培養下および単離下に置かれた単一細胞の後代により形成される細胞バンクの並行製造
−クローン条件下で培養中の単一細胞の後代からなる、in vitroで再構築された正常または病的組織のモデル
【００５７】
本発明の特定の実施形態および利点は、成人毛包間表皮由来のケラチノサイトを用いた下記の実施例に記載される。
【００５８】
これらの実施例は単に例示として示すものであり、本発明の目的および範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００５９】
Ａ−試験手順
Ａ−１−細胞材料の調製
Ａ−１−１−クローン培養に用いることを目的とした上皮細胞
まず、組織生検（ここに記載される実施例では、成人皮膚生検）を、例えば、それらをベタジン含有溶液に浸漬することにより除菌した。次に、上皮組織と会合している結合組織（この場合、表皮と真皮）を分離させるために、これらのサンプルを酵素溶液中、４℃で１０〜１５時間インキュベートした（Ｇｉｂｃｏトリプシン）。酵素的消化工程の終了時に、組織サンプルを鋭いピンセットで切開して組織（ここでは、毛包間表皮）の上皮部分を単離した。ピペットで吸ったり出したりすることによる機械的解離工程によって完了されるこの酵素処理により、上皮の断片を構成するケラチノサイトの抽出が可能となる。最後に、細胞凝集物を除去するために細胞懸濁液を５０〜７０ミクロンメッシュの篩(BD Falcon)で濾過した。これらの工程の終了時に、細胞サンプルは単細胞懸濁液となり、クローン培養物を播種するために使用可能である。
【００６０】
Ａ−１−２−支持細胞として用いる繊維芽細胞
記載されている例において、上皮細胞（毛包間表皮から得られたケラチノサイト）を、線量６０グレイのγ線照射により複製不能とした繊維芽細胞の栄養層を支持体として用いた培養系のクローン条件下で研究した。よって、これらの細胞は静止状態に留まるが、生きており、それらは供試上皮細胞の増殖を支えた。これらの繊維芽細胞は特に皮膚生検の真皮部分から抽出することができる。これを行うために、真皮断片を、ディスパーゼ(Roche)とコラゲナーゼ(Roche)の混合物を含有する酵素溶液中、３７℃で２〜４時間インキュベートした。酵素による消化を機械的攪拌と組み合わせることで繊維芽細胞の抽出が可能となる。非消化組織断片を篩(BD Falcon)で濾過し、次に洗浄することにより除去した後、得られた繊維芽細胞を増殖させるために、９０％ＤＭＥＭ(Gibco)および１０％ウシ起源血清(Gibco)からなる媒体中での培養下に置いた。培養増殖後、繊維芽細胞を照射した後、使用するまで保存のために冷凍した。
【００６１】
Ａ−２−免疫表現型標識
本発明の特定の実施形態を示すために用いる上皮細胞は、α６インテグリン（Ｉｔｇα６またはＣＤ４９ｆ）の発現レベルが強く、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）の発現レベルが弱いケラチノサイトである：表現型Ｉｔｇα６strongＣＤ７１weak。この表現型を定義するために必要な蛍光抗体による標識を達成するため、細胞サンプルを２％ウシアルブミン血清（ＳＡＢ）(Sigma)を添加した生理食塩水バッファー（ＰＢＳ）中に懸濁した状態とし、その後、抗体の非特異的結合部位を飽和させるためにマウス免疫グロブリン(Jackson Immuno-Reasearch)とともに４℃で１０分間インキュベートした。次に、抗原ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７１の標識を、蛍光色素：抗ＣＤ４９ｆ−ＰＥ（フィコエリトリン）（クローンＧｏＨ３、BD Pharmingen）および抗ＣＤ７１−ＡＰＣ（アロフィコシアニン）（クローンＭ−Ａ７１２、BD Pharmingen）と結合させた特異的抗体を加えた後、４℃で３０分間インキュベートすることにより行った。余分な抗体を洗浄した後、これらのサンプルをそのままクローン培養物の播種に用いた。
【００６２】
Ａ−３−クローン培養微小培養の自動播種
Ａ−３−１−播種
記載されている例示的実施形態では、ケラチノサイトのクローン微小培養物を、クローニングモジュール（ＭｏＦｌｏ、Cytomation）を備えたフローサイトメーターを用いて自動的に播種した。標識抗体と結合させた蛍光色素の励起は、４８８ｎｍアルゴンレーザー(Coherent)および６３０ｎｍレーザーダイオードを用いることで行った。フィコエリトリン（ＰＥ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）により放出されたシグナルをそれぞれ検出し、５８０±３０ｎｍおよび６７０±３０ｎｍの波長枠で定量した。この場合に選択された選別基準は、表皮幹細胞が豊富であると記載されているケラチノサイトの部分集団(Liら, 1998)であるＩｔｇα６strongＣＤ７１weakを有するケラチノサイトに相当し、全ケラチノサイトの約１％を占めた。
【００６３】
Ａ−３−２−クローン播種の質の制御
試験および研究に使用することを目的としたクローン培養（培養条件は以下に記載）と並行して、細胞を定着させるための手順をバリデートする目的で一連のクローン播種を行った。これらの定着は、細胞の増殖に用いられるものよりも細胞の位置決定に好適な培地であること以外は、厳密に同じ技術条件下で行った。この観察培地は、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２(Sigma)を１０マイクログラム／ｍｌの濃度で加えた生理食塩水バッファー（ＰＢＳ）であってもよい。このＨｏｅｃｈｓｔは、ＵＶ励起下で蛍光性であるＤＮＡ着色剤である。これらの条件下で、多数の培養ウェルに個々に播種された細胞を位置決定することができ、これにより本方法の有効性のバリデーションが可能となる。各微小培養は単一の細胞を含まなければならず、２個のウェルや空のウェルの頻度は最小でなければならない。
【００６４】
Ａ−４−培養条件
Ａ−４−１−一次クローン増殖
記載されている例において、ケラチノサイトの微小培養は、Ｉ型コラーゲンが吸着された９６ウェルを含む培養プレート（Ｂｉｏｃｏａｔ、Becton Dickinson）で行った。クローン条件下、上皮細胞の播種前日に、照射繊維芽細胞の栄養層を培養ウェルに設置した。これらの支持細胞を６，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。
【００６５】
ケラチノサイトの増殖に用いた培養培地は、ウシ由来血清(Hyclone)を添加したＤＭＥＭ(Gibco)培地とＨａｍ  Ｆ１２(Gibco)培地の混合物に基づくものであった。この基本培地に特に、ＥＧＦ(Chemicon)、インスリン(Sigma)、ヒドロコルチゾン(Sigma)、アデニン(Sigma)、トリヨードチロニン(Sigma)、Ｌグルタミン(Gibco)、ならびに抗生物質および抗真菌物質(Gibco)の溶液を加えた。ウェル当たり１個の単一細胞の量でケラチノサイトを自動播種した後、これらの培養物を３７℃、湿度９０％を含む大気中、５％ＣＯ２の存在下、この場合には２週間培養維持した。選択された時点で、細胞クローンが発達したウェルの計数を行い、次に、各クローンを形成しているケラチノサイトの数を、トリプシン処理に(Gibco)により細胞を解離させた後に個々に求めた。
【００６６】
Ａ−４−２−組織の再構築能の研究
記載されている例において、最初に個々に培養下に置かれたケラチノサイトの後代の組織の再構築能を、表皮を剥離した死んだヒト真皮上の表皮再構築モデル(Regnier ら,  1986)で示した。真皮支持体を作製するために、ヒト皮膚サンプルをＰＢＳバッファー中、３７℃で１０日間インキュベートして、それらから表皮を剥離し、それを除去した。表皮を含まない真皮サンプルを約１ｃｍ２角に切った。次に、それらに数回連続して冷凍／解凍サイクルを行ったところ、真皮細胞を死滅させるに至った。得られた無細胞真皮を使用まで−２０℃で保存した。三次元表皮を再構築するためのプロセスは２連続の培養工程からなった。まず、クローン微小培養由来の細胞サンプルを真皮支持体上に播種し、一次クローン培養に用いたものと類似の匹敵する培養培地（上記の組成例）に浸漬して１週間培養した。表皮再構築法の第二の工程は、形成される表皮を液体培地とインキュベーターの周囲空気との間の界面に置くことからなった。次に、完全な分化に達するまで１〜２週間培養を続けた。固定し、ヘマラム−エロシン−サフラン（ＨＥＳ）で染色した後に再構築された三次元組織の組織学的特徴を観察した。
【００６７】
Ａ−４−３−長期拡大能の評価
クローン微小培養由来のケラチノサイトをトリプシン処理(Gibco)により分離した後、各供試クローンについて個別に大量培養下に置いた。これらの培養は、Ｉ型コラーゲンが吸着されたプラスチック表面（例えば、Ｐｅｔｒｉ、Ｂｉｏｃｏａｔ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎプレート）上で行った。培養条件は一次クローン増殖に用いたものと同等であった：照射繊維芽細胞の栄養層、同様の組成の培養培地。１週間後、培養物は５０％〜８０％の集密度に達した。次に、ケラチノサイトをトリプシン処理により分離し、計数した後に、同じ条件下、２，０００〜３，０００細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。その後、培養物を移植し、細胞の拡大能が消耗するまで１週間おきに継代培養した。一次クローンの増殖工程および連続的継代培養の終了時に、細胞増殖を拡大係数および達成された集団倍加数に関して評価し、最初に個別培養に置かれたケラチノサイトの全体的拡大能を定量した。
集団倍加数＝（Ｌｏｇ  Ｎ／Ｎ０）／Ｌｏｇ２
Ｎ０＝播種された細胞の数
Ｎ＝培養工程の終了時に得られた細胞の数
【００６８】
Ａ−４−４−二次クローン形成能の分析
課題は、クローン化されたケラチノサイトの後代を形成している細胞からのコロニー形成能の維持または喪失の評価についてである。これを行うために、一次クローンの細胞をトリプシン処理(Gibco)により分離した後、長期拡大能の評価に関して上記されたものと類似の条件下で、互いに分離したコロニーの増殖が得られるように低密度（例えば、５細胞／ｃｍ２）で播種した。１４日後、培養物を７０％エタノールで固定し、乾燥させた後、エオジン(RAL reagents)およびＲＡＬ  ５５５(RAL reagents)の二つの連続槽により染色した。供試細胞のクローン形成能を定量するために考慮に入れるパラメーターは、特に、得られるコロニーの数と大きさであった。
【００６９】
Ｂ−本発明の手段の性能
上皮細胞の増殖能を分析するのに用いられるパラメーターは、低密度培養物においてはコロニー（ＣＦＥは「コロニー形成率」を指す）、またはこれらが単一細胞が播種された培養物である場合にはクローン（ＣＦＥは「クローン形成率」を指す）を形成するそれらの能力である。本方法が高いＣＦＥ値を示すことができるほど、それらは上皮細胞の増殖能を有効に定量するのにより有用となる。
【００７０】
以下の表Ｉは、ケラチノサイトを選択および培養するための二つの既知の方法に従って得られた結果（それらは実験室で慣例的に用いられ、刊行物に記載されている）、ならびに本発明の方法によって得られた結果を示す。
【００７１】
【表１】
2011512146.tif 000002
【００７２】
Ｃ−例示的実施形態No.１
それぞれ単一細胞の後代から複数のケラチノサイトのバンクを製造するための並行クローン微小培養のモデルの使用（図２）。
【００７３】
Ｃ−１−材料および方法
−成人皮膚生検（乳房縮小術）から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−「幹」細胞の表現型を選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する（強い発現レベルのインテグリンα６（Ｉｔｇα６）および低い発現レベルのトランスフェリン受容体（ＣＤ７１）：表現型Ｉｔｇα６strong  ＣＤ７１weak、選択モデルLiら, 1998）。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールを用い、多ウェル培養プレートに１ウェル当たり単一「幹」表現型細胞１個の量で自動播種する。
−培養２週間後、クローン化されたケラチノサイトが細胞クローンを生じたウェルの位置決定を行う。
−細胞増殖を促進する条件下で各クローン微小培養物から大量培養の播種を行う。
−種々の増殖段階（例えば、「若い」または「古い」培養段階）で最初にクローン化された細胞の後代を得るために培養物を連続的に移植し、このクローン化細胞から生じた細胞材料の量は冷凍細胞のバンクの形成に適合している。
−単一のケラチノサイトから始まった各培養が達成可能であった連続的継代培養の最大数を試験し、長期培養の終了時に産生されたケラチノサイトの全累積数を評価する。
【００７４】
Ｃ−２−結果
ケラチノサイトのバンクを製造するそれらの能力に関して試験された五つの細胞クローンのコホートにおいて、それらは総て継代培養することができ、それらの後代は冷凍するのに十分に増殖させることができた。
【００７５】
培養の開始から２週間後、五つの選択クローンは８．６４×１０４〜１．１１×１０５個のケラチノサイトからなり、それは単一のクローニン化細胞の段階から１６．４０〜１６．８６連続細胞世代に達したことに相当する。
−一つのクローンは、培養増殖８週間以内にケラチノサイト８．４８×１０１２個の累積後代を生成し（Ｎｏ．１）、これは累積平均集団倍加数４２．９５に相当する。
−二つのクローンは、ケラチノサイト６．３６×１０１１および２．４×１０１１個の累積後代を生成し（Ｎｏ．２およびＮｏ．３）、これはそれぞれ平均集団倍加数３９．２１および３７．８０に相当する。
−一つのクローンは、培養増殖６週間以内にケラチノサイト２．０３×１０１０個の累積後代を生成し（Ｎｏ．４）、これは累積平均集団倍加数３４．２４に相当する。
−一つのクローンは、培養増殖６週間以内にケラチノサイト２．１５×１０９の累積後代を生成し（Ｎｏ．５）、これは累積平均集団倍加数３１．００に相当する。
【００７６】
Ｃ−３−結論
−本発明による並行クローン微小培養のモデルは、それぞれ組織サンプルから直接単離された単一細胞の後代からの複数のケラチノサイトバンクの標準的製造を可能とする技術に相当する。
−それはまた、異なる細胞種（例えば、前駆体、表皮幹細胞）の増殖能の、個々の細胞の規模での評価および比較を可能とする。
【００７７】
Ｄ−例示的実施形態Ｎｏ．２
それぞれ単一細胞の後代から複数の再構築表皮を製造するためのクローン微小培養の系の使用（図３）
【００７８】
Ｄ−１−材料および方法
−成人皮膚生検（乳房縮小術）から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−「幹」細胞の表現型をフローサイトメトリーで選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する（強い発現レベルのインテグリンα６（Ｉｔｇα６）および低い発現レベルのトランスフェリン受容体（ＣＤ７１）：表現型Ｉｔｇα６strong  ＣＤ７１weak、選択モデルLi ら, 1998）。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールの手段により、多ウェル培養プレートに１ウェル当たり単一「幹」表現型細胞１個の量で自動播種する。
−培養週間２週間後、クローン化されたケラチノサイトが細胞クローンを生じたウェルの位置決定を行う。
−それらのそれぞれについて個別に、細胞クローンを形成しているケラチノサイトを用い、再構築された表皮（例えば、表皮を剥離した死んだヒト真皮上の表皮の再構築：Regnierら,  1986）を製造する。
【００７９】
Ｄ−２−結果
５つの細胞クローンのコホートを各クローンの三次元再構築された表皮を製造する個々の能力に関して試験した。
【００８０】
実験を例示的実施形態Ｎｏ．１に記載されているものに相当するクローンの増殖段階で行った（増殖は〜１６〜１７の連続細胞世代に相当する）。
【００８１】
五つの供試クローンは、天然表皮のそれに典型的な構成を有する表皮を製造可能であることが分かった。
【００８２】
Ｄ−３−結論
−本発明による並行クローン微小培養の技術は一連の再構築表皮の製造を可能とし、その特殊性がそれぞれ単一細胞の後代に由来し、一方、大規模試験戦略のための慣用モデルは細胞の混合物に由来するバンクから製造される。
−本発明の目的である方法に従って製造された再構築表皮は組織から抽出された直後にクローン化細胞から製造され、その特徴を改変する可能性がある培養増殖工程の後ではない。
−この例示的実施形態においては、これらのクローンを〜１６〜１７の連続細胞世代に相当する増殖段階における表皮再構築に用いた。他の実施形態においては、表皮の再構築は、クローン化細胞のより早いまたはより遅い増殖段階から達成され得る。
【００８３】
従って、本発明による培養モデルは、組織から選択された直後に、最初に個々に培養下に置かれた細胞の器官形成能の定性を可能とする独創的な機能試験を提供する。それは、単離培養下に置いた細胞の種々の増殖段階で刺激およびストレスの影響を評価し、そして、治療後短期または中期で組織の再構築能に対するその結果を試験するという可能性を提供する。
【００８４】
Ｅ−例示的実施形態Ｎｏ．３
目的の組織の場所に存在するケラチノサイトのクローン形成能を特徴付けるための並行クローン微小培養のモデルの使用。特に、課題は、細胞クローンを生じるそれらの能力を評価することであり、その大きさはそれらの短期増殖能の指標を提供する（図４）。
Ｅ−１−材料および方法
−成人皮膚生検（乳房縮小術）から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−表皮の基底層に相当するケラチノサイトの集団を選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する（強い発現レベルのインテグリンα６（Ｉｔｇα６）：表現型Ｉｔｇα６strong）。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールの手段により、多ウェル培養プレートに１ウェル当たり単一基底ケラチノサイト１個の量で自動播種する。
−培養週間２週間後、クローン化されたケラチノサイトが細胞クローンを生じたウェルの位置決定を行い、次に、各クローンについて個々にそのケラチノサイトを分離および計数する。
−これらの異なるクローンをそれらの個々の大きさに応じて分類する。
【００８５】
Ｅ−２−結果
〜８００クローンの累積コホートに対して行った表皮の基底層由来のケラチノサイトにより生成されたクローンの大きさの分布の分析により、この細胞コンパートメントの機能的ヘテロ性が明らかになる（図４）。
−この階層の上位には、著しい短期増殖能を特徴とするクローンの少数画分が見られ、このサイズは２週間以内にケラチノサイト１５×１０４個を超え得る。
−これに対し、この階層の下位には、極めて限定された増殖能を特徴とするクローン画分が見られる。これらのこれらの発育不全クローンの大きさは培養２週間後にもケラチノサイト１０４個を超えない。
−これらの極値の間に、大多数のクローンが見られ、これらは大きさの勾配に従って分布しているようであり、多数が呈する大きさの値はケラチノサイト９×１０４個前後に位置している。
【００８６】
Ｅ−３−結論
−本発明による並行クローン微小培養の技術は、目的のサンプルに由来する細胞（この例示的実施形態では、表皮の基底ケラチノサイト）の個々のクローン形成能の特異的評価を可能とする。
−特に、この方法は組織に典型的な「機能的特徴」または組織内の部分的局在特性（この場合には、成人ヒト毛包間表皮の基底層）を提供するクローン増殖特性を定義するための解決法となることが分かる。
−さらに、この系を用いれば、目的の細胞サンプル内で、それらの短期クローン増殖能に応じた異なる能力を有する細胞を識別することができる。
【００８７】
従って、本発明による培養モデルは、個々に培養下に置かれた細胞のコホートのクローン形成能の評価を可能とする独創的な機能試験を提供する。可能性のある適用は、バリデートされた参照と比較することにより、目的の細胞サンプルの機能性（または非機能性）を評価することを目的として個々の細胞の規模で達成される品質管理の開発である。クローン微小培養の系はさらに、それぞれ個々に、具体的に定義された短期増殖能に相当する単一細胞から細胞サンプルを製造する可能性を提供する。もう一つの可能性のある適用は、個々の細胞の規模で適用された（有益または有毒な）治療の短期機能的結果を分析することを目的とする研究を行うためにこの系を用いることからなる。
【００８８】
Ｆ−例示的実施形態Ｎｏ．４
目的のサンプルからのケラチノサイトの長期増殖能を特徴付けるためのための並行クローン微小培養のモデルの使用。特に、課題は、表皮幹細胞に関連した機能的特性の一つ、すなわち、培養で少なくとも１００回集団倍加を行う能力を有するケラチノサイトの存在を検出することである（図５）。
【００８９】
Ｆ−１−材料および方法
−成人皮膚生検（乳房縮小術）から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−表皮の基底層に相当するケラチノサイトの集団を選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する（強い発現レベルのインテグリンα６（Ｉｔｇα６）：表現型Ｉｔｇα６strong）。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールの手段により、多ウェル培養プレートに１ウェル当たり単一基底ケラチノサイト１個の量で自動播種する。
−培養週間２週間後、クローン化されたケラチノサイトが細胞クローンを生じたウェルの位置決定を行う。
−細胞増殖を促進する条件下で、クローン微小培養物の典型的コホートから大量培養の播種を行う。
−異なる培養物を個別に、１週間おきに、それらの個々の増殖能の限界に達するまで連続的に移植する。
−クローン起源の各培養物が持続可能であった連続的継代培養の数を評価し、各移植時に、また、長期培養の終了時に、起こった集団倍加の全累積数を評価する。
【００９０】
Ｆ−２−結果
基底ケラチノサイトからの２３クローンのコホートの長期増殖能の分析により、このコンパートメントの著しい能力のヘテロ性が明らかになる（図５）。
−観察される能力階層の下層では、制限された増殖能を有するクローンが見られ、これらは６〜７週間培養維持できるに過ぎず、合計３０〜４０回集団倍加を行えるに過ぎない。
−能力階層の上位には、２４週間を超えても著しい増殖能の減退無く継代培養可能な、従って、集団倍加数１００の拡大レベルを超え得る極めて大きな増殖能を有するクローンが見られる。
−これらの極地の間に、広い能力勾配に応じて分布したクローンが見られ、それらは９〜１８週間継代培養可能であり、大多数は４０〜８０回集団倍加を行うことができる。
【００９１】
Ｆ−３−結論
−本発明による技術または並行クローン微小培養は、目的のサンプル（本例示的実施形態では、表皮の基底ケラチノサイトの調製物）由来の細胞の長期増殖能の特異的評価を可能にする。
−特に、本方法は、幹細胞から生じたクローンを、前駆細胞から生じたクローン（それらの長期増殖能はもっと限定され、一般に集団倍加数３０〜８０までの間である）から、累積で少なくとも１００回集団倍加を行うそれらの能力によって帰納的に識別するための解決法となることが分かる。
−この系を用いれば、幹細胞の後代および前駆細胞の抗体に相当する細胞サンプルを製造することができ、それらの特性を研究し、それらの長期増殖の種々の段階と比較することができる。
【００９２】
従って、本発明による培養モデルは、最初に個々に培養下に置かれた細胞の長期増殖能の定性を可能とする独創的な機能試験を提供する。例えば、それは、特に幹細胞の存在（または非存在）を評価することにより、サンプルの再生能を評価する可能性を提供する。可能性のある使用としては、個々の細胞の規模で適用された（有益または有毒な）処置の長期機能的結果を分析することを目的とする研究を行うことからなる。
【００９３】
Ｇ−例示的実施形態Ｎｏ．５
異なる表現型の表皮ケラチノサイトに対する照射の影響を単一の単離細胞の規模で定量するための並行クローン微小培養の機能試験の使用（図６）。
【００９４】
Ｇ−１−材料および方法
−成人皮膚生検（乳房縮小術）から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−「幹」細胞の表現型をフローサイトメトリーで選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する（強い発現レベルのインテグリンα６（強い発現レベルのインテグリンα６（Ｉｔｇα６）および低い発現レベルのトランスフェリン受容体（ＣＤ７１）：表現型Ｉｔｇα６strong  ＣＤ７１weak）および「前駆細胞」の表現型（強い発現レベルのインテグリンα６（Ｉｔｇα６）および強い発現レベルのトランスフェリン受容体（ＣＤ７１）：表現型Ｉｔｇα６strong  ＣＤ７１strong）（選択モデル：Liら, 1998）。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールの手段により、二つの供試細胞表現型のそれぞれについて、多ウェル培養プレートに１ウェル当たり単一細胞１個の量で自動播種する。
−播種２０時間後に、各単離細胞に線量２Ｇｙ（γ線）を１回照射する。
−培養２週間後に、細胞クローンが発達したウェルを計数し、次に、各クローンのついて個々にケラチノサイトの分離と計数を行う。
Ｇ−２−結果
Ｇ−２−１−単離ケラチノサイトのクローン形成能に対する照射の影響（図６Ａ）
【００９５】
対照条件下（照射無し）で、試験したケラチノサイトの両表現型とも、強い細胞クローン生成能を示した。それらは特にこの基準では識別されなかった。
−表現型Ｉｔｇα６strong  ＣＤ７１weakの、個々に播種されたケラチノサイト（幹細胞が豊富な部分集団）の７０．３％が細胞クローンを生じた。
−表現型Ｉｔｇα６strong  ＣＤ７１strongのケラチノサイト（前駆体が豊富な部分集団）の６１．７％がクローンを生じた。
【００９６】
他方、両表現型のケラチノサイトは照射により異なった影響を受けた。
−クローンを生じた表現型Ｉｔｇａ６strong  ＣＤ７１weakのケラチノサイトのパーセンテージは７０．３％（対照条件）から４７．３％（２Ｇｙの照射）に低下し、これらの細胞のクローン形成能の維持は６７．３％と推定可能であった。
−表現型Ｉｔｇａ６strong  ＣＤ７１strongのケラチノサイトのクローン形成能は照射により劇的に低下し、対照条件下では６１．７％の細胞がクローンを生じるのに対して、照射下では２３．０％であり、これらの細胞のクローン形成能は３７．３％でしかないと推定可能であった。
【００９７】
Ｇ−２−２−クローンの増殖能に対する照射の影響（図６Ｂ）
対照条件下で、生産されたクローンの大きさは、両種類の供試ケラチノサイトの明確な識別を可能とする基準となることは明らかにならなかった。
−両表現型のケラチノサイトは、少なくとも５×１０４個のケラチノサイトを含む大型のクローンの大集団を形成することが分かった。
【００９８】
得られたクローンの大きさの分布を分析したところ、異なる表現型のケラチノサイトの照射に対する特異的応答の明確な識別を可能とするパラメーターが得られた。
−照射後に大型のクローンを生じる、クローン化ケラチノサイトの能力の中程度の減退（対照条件下でのクローンサイズの中央値：１０．１×１０４細胞／クローン、照射群のサイズの中央値：６．８×１０４細胞／クローン）。
−照射後に大型のクローンを生じる、ケラチノサイトＩｔｇａ６strong  ＣＤ７１strongの能力の強い顕著な減退（対照群のクローンサイズの中央値：８．５×１０４細胞／クローン、照射群のサイズの中央値：１．２×１０４細胞／クローン）。
【００９９】
Ｇ−３−結論
−本発明による並行クローン微小培養のモデルは、特定の表現型のケラチノサイトの増殖能を個々の細胞の規模で分析するために行われることが分かる。実際、このモデルで得られたクローン形成率の値がクローン化細胞の６０〜７０％に達すると、それらは、組織生検から直接生じたケラチノサイトを考えれば、従来の培養系で一般に記載されているもの（その値は１０％程度である）よりも極めて優れていることが分かる。
−このモデルはまた、細胞増殖能に対する有害な作用を検出、定性、および定量するために行われることも分かる。本実施例は、in vitro放射能毒性試験の開発により有用となる系の能力を示す。
【０１００】
Ｈ−例示的実施形態Ｎｏ．６
その後代の増殖能に対する単一細胞の照射の結果を評価するための、並行クローン微小培養の機能試験の使用。表皮ケラチノサイトと異なる表現型との挙動の比較（図７）。
【０１０１】
Ｈ−１−材料および方法
例示的実施形態Ｎｏ．５の範囲に記載されている手順に従う。
−個別化されたコロニーを得るために、クローンから生じたケラチノサイトの一部を低密度播種する（本実施例では、ケラチノサイト５個／ｃｍ２の密度）。
−培養２週間後、顕微鏡観察および肉眼的観察を行うことができるように、コロニーの固定および染色を行う。
【０１０２】
Ｈ−２−結果
対照条件下（個々に培養下に置かれた最初の細胞の照射無し）、それらの二次コロニー形成能に関して調べたクローン群は、この基準に非常に類似した特徴を示した。
−それぞれケラチノサイトＩｔｇα６strong  ＣＤ７１weak［クローン（１）〜（５）］およびケラチノサイトＩｔｇα６strong  ＣＤ７１strong［クローン（１１）〜（１５）］から生じた２系統のクローンからの二次コロニー生産能は匹敵するものであることが分かった。
−これらの両群は、大型の二次コロニーを豊富に生じる細胞クローン［例えば、クローン（１）と（１１）］およびあまり豊富でないコロニーを生じ、小型である［例えば、クローン（５）と（１５）］の双方を含んでなった。
【０１０３】
照射（線量２Ｇｙ１回）を受けた細胞から生じたクローン群については、二次コロニー形成能は二つの表現型の供試ケラチノサイトで明らかに異なることが分かる。
−ケラチノサイトＩｔｇα６strong  ＣＤ７１weakから生じたクローン群［クローン（６）〜（１０）］は、非照射群と同等の二次コロニー形成能を示した。
−他方、照射を受けたケラチノサイトＩｔｇα６strong  ＣＤ７１strongから生じたクローン群は［クローン（１６）〜（２０）］は二次クローン形成能の低下（直径５ｍｍ以上のコロニーの消失）を示した。
【０１０４】
Ｈ−３−結論
本発明による並行クローン微小培養のモデルを、個々に検討されるケラチノサイトで行われる照射の非即時的な結果を実証、定性、および定量するために適合させる。この場合、示される有害作用はクローン培養下に置かれた細胞の後代において測定された増殖能の低下であった。
【０１０５】
Ｉ−例示的実施形態Ｎｏ．７
クローン条件下に置かれた細胞に適用された遺伝毒性ストレスの長期結果を分析するための、並行クローン微小培養モデルの使用。課題は、細胞を個別の培養ウェルに個々に播種した後、数時間ストレスをかけること、および次に、細胞が分裂した後に長期培養を開始することである。次に、ゲノムレベルでの異常の存在を、所定の集団倍加数を行った後にクローン化細胞の後代のレベルで探索した。この探索は例えばゲノム中のＤＮＡ配列の表現不平衡(representation disequilibria)（欠失、増幅）の検出を可能とする技術、すなわち、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を用いることにより行われる（図８）。
【０１０６】
１−１−材料および方法
−成人皮膚生検（乳房縮小術）から得られる表皮からケラチノサイトを抽出し、分離し、懸濁させる。
−表皮の基底層に相当するケラチノサイトの集団を選別する可能性を与える蛍光色素と結合された抗体で懸濁ケラチノサイトを標識する（強い発現レベルのインテグリンα６（Ｉｔｇα６）：表現型Ｉｔｇα６strong）。
−フローサイトメトリーによるクローニングモジュールの手段により、多ウェル培養プレートに１ウェル当たり基底ケラチノサイト１個の量で自動播種する。
−クローン微小培養物を、１）播種１９時間後に線量２グレイのγ線照射を１回受ける群と２）非照射対照群の２群に分ける。
−培養２週間後、これらの２群それぞれについて、クローン化ケラチノサイトが細胞クローンを生じたウェルを位置決定する。
−細胞増殖を促進する条件下、これら２群のそれぞれに典型的なクローン微小培養物のコホートから大量培養に播種を行う。
−異なる培養物を個別に、１週間おきに、それらの個々の増殖能の限界に達するまで連続的に移植する。
−クローン起源の各培養物が持続可能であった連続的継代培養の数を評価し、各移植時に、また、長期培養の終了時に、起こった集団倍加の全累積数を評価する。
−これらの対照群および照射群から、極めて有意な長期増殖能を示す、特に、少なくとも１５０回の集団倍加が起こり得る培養物を選択する。
−各選択候補について、後期長期増殖段階（この場合、クローン播種後約１５０回集団倍加を行った培養物）に相当するゲノムＤＮＡサンプルを調製する。
−対照群および照射群から生じた生成ＤＮＡサンプルに対して、参照ＤＮＡに対する比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（ＣＧＨチップＣｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌチップ（登録商標）４．０、PerkinElmer, Inc.、製造業者が推奨する方法に従う）により、欠失型および／または増幅の異常を有するゲノム領域を探索する。
【０１０７】
１−２−結果
クローン起源の長期培養物のＣＧＨチップによる細胞遺伝学的分析は、検討した線量２グレイのγ線が、獲得された染色体異常が後代に伝達されるという結果を持つことを示し、遺伝毒性ストレスを適用した後に多数の細胞分裂において検出可能であることが分かる（図８）。
−本実施例において、第１０染色体に位置する４４．３メガベースの大きさの遺伝子座（１０ｑ１１．２１〜１０ｑ２３．１の領域）の増幅が、照射後１５０回集団倍加した後のケラチノサイトの後代のＤＮＡレベルで検出される。
−他方、この同じ供試ゲノムセグメントは、照射を受けなかった二つの例示的ケラチノサイトの後代のＤＮＡレベルでは、この種のゲノム変化を示さなかった。
【０１０８】
１−３−結論
−クローン微小培養技術を用いれば、表皮の基底ケラチノサイトを個々に遺伝毒性ストレス（この場合、γ線照射）に曝し、次に、後代に対するその長期結果を評価することができる。
−特に、本方法は、基底ケラチノサイトのゲノムの完全性に対するストレスの影響をクローン規模で分析するのに有効であることが分かる。
−この例示的実施形態において、この系は、表皮の基底層から生じたケラチノサイトに対するγ線照射の遺伝毒性作用の検出を可能にする。
【０１０９】
従って、本発明による培養モデルは、毒性学的試験を個々の細胞の規模で行うことを可能とする独創的な系を提供する。例えば、それは、表皮の基底ケラチノサイトの遺伝毒性剤に対する個々の感受性を特徴付ける可能性を提供する。可能性のある使用としては、毒物への曝露に続く欠失および／または増幅型のゲノムにおける異常の発生を検出し、特に長期的な連続細胞分裂中に、それらの後代への伝達を分析することを目的とする試験の実施である。
【０１１０】
参考文献
【表２】
2011512146.tif 000003
【図１】
2011512146.tif 000004
【図２】
2011512146.tif 000005
【図３】
2011512146.tif 000006
【図４】
2011512146.tif 000007
【図５】
2011512146.tif 000008
【図６】
2011512146.tif 000009
【図７】
2011512146.tif 000010
【図８Ａ】
2011512146.tif 000011
【図８Ｂ】
2011512146.tif 000012
【図８Ｃ】
2011512146.tif 000013
【国際調査報告】
2011512146.tif 000014
2011512146.tif 000015
2011512146.tif 000016
2011512146.tif 000017
2011512146.tif 000018
2011512146.tif 000019