(57)【要約】薬物の眼への眼内送達は、眼のユニークな解剖学的および生理学的な特性のために、進行中の挑戦である。ｐＨ６．０〜８．５を有する免疫抑制の抗炎症性化合物であるミコフェノール酸の溶液は、眼に局所適用された場合、改善された生物学的利用能を示すことが証明された。具体的には、そのような溶液の眼への局所適用は、前部および後部の眼構造に浸透する際に有効である。前記溶液は、いろいろな炎症性障害を処置するのに効果的であり、それは、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎および乾性角結膜炎を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミコフェノール酸ナトリウム（ＮａＭＰＡ）から本質的になる眼用溶液であって、該溶液のｐＨが、約６．０〜約８．５である、眼用溶液。
【請求項２】
ミコフェノール酸ナトリウム（ＮａＭＰＡ）と；保存剤、粘性強化剤、湿潤剤、抗酸化剤、緩衝剤、滑沢剤、および張度作用物質から選択される１つ以上の添加剤とから本質的になる眼用溶液であって、該溶液のｐＨが、約６．０〜約８．５である、眼用溶液。
【請求項３】
前記ミコフェノール酸ナトリウムが、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約４．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の眼用溶液。
【請求項４】
前記ミコフェノール酸ナトリウムが、約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約３．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の眼用溶液。
【請求項５】
前記ミコフェノール酸ナトリウムが、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約２．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の眼用溶液。
【請求項６】
前記ミコフェノール酸ナトリウムが、約１．０％（ｗ／ｖ）〜約４．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の眼用溶液。
【請求項７】
ｐＨが約７．０〜約８．０である、請求項１または２に記載の眼用溶液。
【請求項８】
ｐＨが約７．０〜約７．５である、請求項１または２に記載の眼用溶液。
【請求項９】
前記溶液中の全ナトリウムが、約０．４〜約２．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の眼用溶液。
【請求項１０】
前記溶液中の全ナトリウムが、約０．９％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の眼用溶液。
【請求項１１】
前記添加剤が、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化ベンゾドデシニウム、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、チメロサール、硝酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀、メチル／プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、および過ホウ酸ナトリウムから選択される保存剤である、請求項２に記載の眼用溶液。
【請求項１２】
前記添加剤が、カルボポールゲル、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポロキサマー４０７、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｏｄｉｎｅ）（ポビドン）から選択される粘性強化剤である、請求項２に記載の眼用溶液。
【請求項１３】
前記添加剤が、酢酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、４ホウ酸塩、二リン酸塩、トロメタミン、ヒドロキシエチルモルホリン、およびトリスヒドロキシメチルアミノ−メタン（ＴＨＡＭ）から選択される緩衝剤である、請求項２に記載の眼用溶液。
【請求項１４】
前記添加剤が、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、および塩化ナトリウムから選択される張度作用物質である、請求項２に記載の眼用溶液。
【請求項１５】
前記添加剤が、ポリソルベート２０および８０、ポロキサマー２８２、チロキサポール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルプロピルセルロース、ポビドン、およびポリビニルアルコールから選択される湿潤剤である、請求項２に記載の眼用溶液。
【請求項１６】
前記添加剤が、プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、ペトロラタム、鉱油、およびカルボマーから選択される滑沢剤である、請求項２に記載の眼用溶液。
【請求項１７】
前記添加剤が、リン脂質ベースの滑沢剤である、請求項２に記載の眼用溶液。
【請求項１８】
ナトリウム対イオンが、塩素イオンである、請求項１または２に記載の眼用溶液。
【請求項１９】
前記塩素イオンが、ＨＣｌ由来である、請求項１８に記載の眼用溶液。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の溶液を罹患した眼に局所的に投与することを含む、炎症または自己免疫状態と関係する眼障害を処置する、方法。
【請求項２１】
前記眼障害が、眼の前部に影響を及ぼす、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記眼の前部に影響を及ぼす眼障害が、眼瞼炎、角膜炎；虹彩ルベオーシス；Ｆｕｃｈｓ虹彩異色性虹彩毛様体炎；慢性ブドウ膜炎または前部ブドウ膜炎；結膜炎；アレルギー性結膜炎；乾性角結膜炎；虹彩毛様体炎；虹彩炎；強膜炎；上強膜炎；角膜浮腫；強膜疾患；眼瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）；毛様体扁平部炎；Ｐｏｓｎｅｒ  Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ症候群；ベーチェット病；Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ症候群；結膜浮腫；結膜静脈性うっ血；眼窩周囲蜂巣炎；急性涙嚢炎；非特異性脈管炎；および類肉腫症から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記眼障害が、眼の後部に影響を及ぼす、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記眼の後部に影響を及ぼす眼の障害が、黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫；網膜虚血；および脈絡膜新血管形成；黄斑変性；糖尿病性網膜症；糖尿病性網膜浮腫；網膜剥離；ブドウ膜炎；汎ブドウ膜炎；脈絡膜炎；上強膜炎；強膜炎；散弾網脈絡膜症；網膜脈管炎；脈絡膜脈管不全；脈絡膜血栓症；視神経新血管形成；および視神経炎から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記眼障害が、ブドウ膜炎である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記眼障害がアレルギー性結膜炎である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記眼障害が、乾性角結膜炎である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記溶液が毎日１〜４回投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記溶液が２日ごとに１回投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶液が４日ごとに１回投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記溶液が毎週１回投与される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００８年７月９日に出願された出願第６１／０７９，４１３号（この内容は、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
眼の多くの炎症性疾患は、いろいろな全身性疾患（例えば、自己免疫疾患または感染症）に対して、新規に、または２次合併症として起こる。局所適用ステロイドの使用などの標準的な処置法は、眼の炎症性徴候をコントロールすることに向けられる。しかし、ステロイド処置による合併症は、かなりの割合の処置対象が眼内圧上昇に苦しみ、それは緑内障や白内障などの眼障害を悪化させる場合がある。ある場合には、眼障害は、局所的に適用されたステロイドの効果が無効である。
【０００３】
ある場合には、抗炎症ステロイドまたは他の免疫抑制剤での全身的な処置は、眼の炎症を処置するのに用いられる。しかし、全身的な処置からの副作用は、それらの使用を制限することになる。副作用は、高血圧、高血糖、消化性潰瘍、骨粗鬆症、成長制限、筋障害、および腎臓機能不全を含むことができる。全身的ステロイド療法さえも、また、潜在的に視力を脅す副作用（例えば、緑内障、白内障、および眼感染症に対する罹病性）を有する。いくつかの代替療法（例えば、シクロスポリンＡ（ＲｅｓｔａｓｉｓＴＭ、Ａｌｌｅｒｇａｎ  Ｉｎｃ．）の局所投与（非特許文献１）が、特定の眼障害の処置に使用することが承認されている。しかし、局所適用のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、忍容性が低く、低い生物学的利用能を有することが指摘されている（非特許文献２）。したがって、炎症状態と自己免疫疾患を伴う眼障害を処置するのに使用できる他の療法を見つけることは望ましい。
【０００４】
上記文献の引用は、前述のいずれもが当該従来技術であることを認めることを本出願では意図するものではない。これらの文献の日付に関する全ての記載または内容に関する記述は、出願人らに入手可能であった情報に基づくものであり、これらの文献の日付または内容の正確性に関して何ら是認するものではない。さらに、本出願を通して引用されるすべての文献は、引用によってそれらの全体が本明細書に取り込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔａｕｂｅｒ．Ｊ．、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．（１９９８）４３８：９６９〜７２
【非特許文献２】Ｌａｌｌｅｍａｎｄら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．（２００３）５６（３）：３０７−１８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
３．概要
本開示は、炎症および自己免疫状態を伴ういろいろな眼疾患を処置するための眼用溶液に関するものである。１態様において、眼用溶液は、ミコフェノール酸ナトリウム（ＮａＭＰＡ）から本質的になる組成物を有し、そこでは、溶液のｐＨは約６．０〜８．５である。ＮａＭＰＡは、水溶液に非常に溶けるが、眼用溶液中のＭＰＡは、眼に浸透して治療効果を有するのに十分なレベルを達成することが分かる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡならびに保存剤、粘性強化剤（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、湿潤剤、緩衝剤、滑沢剤、抗酸化剤、および張度作用物質（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）から選択される１つ以上の添加剤から本質的になる組成物を有する。ＮａＭＰＡのレベルは、示されたｐＨ範囲で水溶液中の薬物の溶解限度までとすることができる。いくつかの実施形態では、溶液中のＮａＭＰＡの量は、最大４．５％（ｗ／ｖ）とすることができる。種々のの実施形態では、眼用溶液中のナトリウム濃度は、０．４〜２．０％（ｗ／ｖ）とすることができる。いくつかの実施形態では、等張状態（例えば、０．９％のＮａＣｌに等しい）より上のナトリウムレベルを使うことができる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡと保存剤を含む。特に、保存剤はＥＤＴＡであり、それは、約０．００５〜約０．０５０％（ｗ／ｖ）、０．００５〜約０．０４０％（ｗ／ｖ）、０．０１０〜約０．０３０％（ｗ／ｖ）、０．０１０〜約０．０２０％（ｗ／ｖ）、または約０．０１０〜約０．０１５％（ｗ／ｖ）で存在し得る。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡは、０．００５、０．０１、０．０１２、０．０１４、０．０１６、０．０１８、０．０２０、０．０３０、０．０４０、または０．０５０％（ｗ／ｖ）で存在し得る。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡ（２ナトリウム塩の脱水物として）は、約０．０１２％（ｗ／ｖ）で存在する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡ、保存剤および緩衝剤を含む。このタイプの典型的な製剤は、上記した量で保存剤ＥＤＴＡ；ホウ酸塩またはトロメタミンの緩衝剤を含むことができ、緩衝剤の量は、０．０１〜約０．１の緩衝能と約７．０〜８．０の溶液ｐＨを提供する量である。
【０００９】
眼用溶液は、いろいろな新規な炎症性眼障害または眼に影響を及ぼす自己免疫疾患または感染症と関連した障害を処置するのに用いることができる。いくつかの実施形態では、これらの眼の状態は、「眼の前部」障害を含み、例えば、眼瞼炎、角膜炎；虹彩ルベオーシス（ｒｕｂｅｏｓｉｓ  ｉｒｉｔｉｓ）；Ｆｕｃｈｓ虹彩異色性虹彩毛様体炎；慢性ブドウ膜炎または前部ブドウ膜炎；結膜炎；アレルギー性結膜炎（季節性または四季を通じての結膜炎、春に起こる結膜炎、アトピー性結膜炎、および巨大乳頭結膜炎）；乾性角結膜炎（ドライアイ症候群）；虹彩毛様体炎；虹彩炎；強膜炎；上強膜炎；角膜浮腫；強膜疾患；眼瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）；毛様体扁平部炎；Ｐｏｓｎｅｒ  Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ症候群；Ｂｅｈｃｅｔ病；Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ症候群；過敏性反応；結膜浮腫；結膜静脈性うっ血（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  ｖｅｎｏｕｓ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）；眼窩周囲蜂巣炎；急性涙嚢炎；非特異性脈管炎；および類肉腫症が挙げられる。いくつかの実施形態では、眼の状態は、「眼の後部」障害を含み、例えば、黄斑浮腫；嚢胞様黄斑浮腫；網膜虚血および脈絡膜新血管形成；黄斑変性；網膜疾患（例えば、糖尿病性網膜症；糖尿病性網膜浮腫；網膜剥離）；炎症性疾患（例えば、原因不明（突発性疾患）の、または全身性（例えば、自己免疫）疾患に関係したブドウ膜炎（汎ブドウ膜炎を含む）または脈絡膜炎（多巣性脈絡膜炎を含む））；上強膜炎または強膜炎；散弾網脈絡膜症（Ｂｉｒｄｓｈｏｔ  ｒｅｔｉｎｏｃｈｏｒｏｉｄｏｐａｔｈｙ）；脈管疾患（例えば、網膜虚血、網膜脈管炎、脈絡膜脈管不全（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、脈絡膜血栓症（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ））；視神経新血管形成；および視神経炎が挙げられる。
【００１０】
眼用溶液は、治療効果を提供するのに十分な用量で局所的に適用することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、１日につき１〜８回、罹患した眼に適用することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、１日につき１回または２回投与することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、眼障害を処置するために、必要に応じて、２日ごとに１回、４日ごとに１回、または１週間につき１回適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、眼に毎日８回１４日間、局所投与した後のウサギで達成されたＮａＭＰＡとシクロスポリンの眼組織浸透の試験を示す。これらの試験では、動物はＮａＭＰＡまたはシクロスポリンのどちらかを両眼に適用される局所溶液として受けた。組織は、薬物の服用の最後である１４日目に、分析のために採取された。データは、眼組織のグラム当たりηｇ（ηｇ／ｇ）薬物として表記される。これらの試験は、ＮａＭＰＡ製剤が、前部組織（例えば、結膜，涙嚢、房水）および後部組織（例えば、網膜／脈絡膜）、特に房水；虹彩／毛様体；涙嚢；強膜；および網膜／脈絡膜を含む試験されたすべての眼組織に浸透することを証明した。
【図２】図２は、図１で記述された結果に由来し、比率として表記され、眼組織で測定されたＮａＭＰＡまたはシクロスポリンのレベルを示す。
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、組み合わされた１日試験のためのＭＰＡ塩（１％、２％、４％、ｗ／ｖ）に関する眼組織浸透データを示す：ＮａＭＰＡ；ＮａＭＰＡ＋ホウ酸塩；トロメタミンＭＰＡ；およびモルホリンＭＰＡ。濃度は、μｇ／ｍＬで記述されていることに注意する。処置群につき１匹の動物を無作為に選択し、安楽死させ、両眼がＭＰＡレベル（取られた両眼の平均）を測定するために採取された。シクロスポリンのデータは、この表に示されていない。
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、組み合わされた１日試験のためのＭＰＡ塩（１％、２％、４％、ｗ／ｖ）に関する眼組織浸透データを示す：ＮａＭＰＡ；ＮａＭＰＡ＋ホウ酸塩；トロメタミンＭＰＡ；およびモルホリンＭＰＡ。濃度は、μｇ／ｍＬで記述されていることに注意する。処置群につき１匹の動物を無作為に選択し、安楽死させ、両眼がＭＰＡレベル（取られた両眼の平均）を測定するために採取された。シクロスポリンのデータは、この表に示されていない。
【図３Ｃ】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、組み合わされた１日試験のためのＭＰＡ塩（１％、２％、４％、ｗ／ｖ）に関する眼組織浸透データを示す：ＮａＭＰＡ；ＮａＭＰＡ＋ホウ酸塩；トロメタミンＭＰＡ；およびモルホリンＭＰＡ。濃度は、μｇ／ｍＬで記述されていることに注意する。処置群につき１匹の動物を無作為に選択し、安楽死させ、両眼がＭＰＡレベル（取られた両眼の平均）を測定するために採取された。シクロスポリンのデータは、この表に示されていない。
【図４】図４は、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）の両側涙腺注射によりドライアイが誘発されるウサギでの涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）値を示す。結果は、ＮａＭＰＡまたはビヒクルで処置された０日目から１７日目までのウサギに関するものである。Ｃｏｎ  Ａは、８日目に注射された。ドライアイの誘発は、９〜１２日目にわたる涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）値の減少により測定して観察された。ＴＢＵＴ値（例えば、１４〜１７日目）の統計的に有意な増加は、ＮａＭＰＡ群対ビヒクルに対して星印で示される。
【図５】図５は、図４で記述したと同じ試験からのＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）、デキサメタゾンおよびビヒクル群に対するＴＢＵＴ値を示す。ＴＢＵＴ値（例えば、１４〜１７日目）の統計的に有意な増加は、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）またはデキサメタゾン群対ビヒクルに対して星印で示される。
【図６】図６は、ブタクサアレルゲン（ＳＲＷ）で第０日目に全身的に感作され、それから２７日目にＳＲＷで局所的な眼内チャレンジされた動物での結膜充血、結膜浮腫、排出物および眼瞼浮腫に対する０〜４スケール（参照：Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓで等級付された臨床スコアを示す。スコアリングは、ＳＲＷチャレンジの１５分後になされた。各群は、ＮａＭＰＡ、Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）（酢酸プレドニゾロン）またはビヒクルで２１日目〜２７日目に処置されたか、あるいは未処置のままにされた。結膜充血の統計的に有意な減少が、陰性対照群に対して、２％、１％および０．５％のＮａＭＰＡ群とＰｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群について見られた。また、Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群対陰性対照群の結膜浮腫において、統計的に有意な減少があった。
【図７】図７は、図６で示された同じ動物に対するＳＲＷチャレンジの３、５、７および１０分後における痒み感／洗顔行動に対する臨床スコアを示す。統計的に有意な減少が、２％と１％のＮａＭＰＡ群対陰性対照群に関して１０分間隔で見られた。
【図８】図８は、図６および７で記述されたと同じ動物（臨床スコアリングがなされた後、２７日目に犠牲にされた）の結膜組織における、光学顕微鏡で見られた浸潤性ＣＤ４＋細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）の数を示す。ＣＤ４＋細胞に対する免疫染色は、Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｒａｇｗｅｅｄ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓに記載された標準的な手順によってなされた。統計的に有意な減少が、２％ＮａＭＰＡとＰｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群対陰性対照群について見られた。
【図９】図９は、図８で記述されたと同じ組織サンプルに関する結膜組織における、光学顕微鏡で見られた浸潤性マクロファージの数を示す。マクロファージに対する免疫染色は、Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｒａｇｗｅｅｄ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓに記載された通りになされた。統計的に有意な減少が、２％ＮａＭＰＡとＰｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群対陰性対照群について見られた。
【図１０】図１０は、化合物４８／８０で局所的な眼内チャレンジをした５、１０、１５、２０および３０分後の動物での結膜充血に対する臨床スコアを示す。動物は、ＮａＭＰＡ、Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）またはビヒクルで処置されたか、あるいは１〜７日目は未処置のままにされ、それから化合物４８／８０で７日目にチャレンジされた。統計的に有意な減少が、１５と２０分の間隔で１％のＮａＭＰＡ群対未処置群について見られた。
【図１１】図１１は、図１０で記述された動物の同じ群に対して化合物４８／８０でチャレンジした５、１０、１５、２０および３０分後に、動物での排出物に関する臨床スコアを示す。統計的に有意な減少は、２０または３０分の時間間隔で、２％と１％のＮａＭＰＡ群とＰｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群対対照群において見られた。
【図１２】図１２は、図１０および１１で記述された動物の同じ群に対して化合物４８／８０でチャレンジした５、１０、１５、２０および３０分後に、結膜浮腫に対する臨床スコアを示す。統計的に有意な減少は、２０および／または３０分の時間間隔で、２％ＮａＭＰＡとＰｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群対ビヒクル対照において見られた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
５．詳細な説明
眼への薬物の送達は、眼への薬物化合物の眼内アクセスを制限する解剖学的および生理的障壁（例えば、低角膜透過性など）があるので、挑戦的である。生物学的利用能を強化するために、薬物は角膜と親油性内皮を通過する浸透性を高めるために脂質可溶性であるべきであることが示唆された（Ａｈｍｅｄら、１９８７，”Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａ，ｓｃｌｅｒａ，ａｎｄ  ｃｏｒｎｅａ，”Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．７６：５８３−５８６；  Ｗａｎｇら、１９９１，”Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  ｄｒｕｇ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｒａｂｂｉｔ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ，”Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  １０：５７１−５７９）。水溶液に低い溶解度を有する親油性分子（例えば、ステロイド）については、担体分子から親油性膜に分配することができるシクロデキストリンなどの薬物担体への複合体が、薬物を溶解して膜表面に送達するのに使用されてきた（Ｌｏｆｔｓｓｏｎ  Ｔ  ａｎｄ  Ｍａｓｓｏｎ  Ｍ，２００１，”Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ  ｉｎ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，”Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２１２：２９−４０）。
【００１３】
免疫抑制化合物ミコフェノール酸（ＭＰＡ）およびそのエステルプロドラッグの形態ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）は、同種間の臓器移植の拒絶反応を予防するために、そして、全身性エリテマトーデスおよび重症筋無力症などの特定の自己免疫疾患の処置に対して主に使用されてきた。ＭＰＡは、酵素イノシンモノリン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）を特異的に阻害することは知られており、これは、細胞複製のために要求される新規のグアノシンヌクレオチドを生成するために優先してＴ細胞とＢ細胞によって利用される。ＭＭＦ（ＣｅｌｌＣｅｐｔ（登録商標））の承認された処方薬バージョンとＭＰＡ（Ｍｙｆｏｒｔｉｃ（登録商標））の腸溶性ナトリウム塩は、固形臓器移植の拒絶反応の防止のために市販されている。両方とも、全身性免疫抑制を達成するために、経口で与えられる。さらに、ＭＭＦとＭＰＡは、抗炎症性の効果を含む他の生物学的効果を有することが知られている。その免疫抑制効果と抗炎症性効果のために、経口で投与されたＭＭＦは、ブドウ膜炎や難治性の炎症性眼病などの特定の眼疾患の処置として試験されてきた（Ｚｉｅｒｈｕｔら、２００５，”ＭＭＦ  ａｎｄ  ｅｙｅ  ｄｉｓｅａｓｅ，”  Ｌｕｐｕｓ  １４  Ｓｕｐｐｌ  １：ｓ５０−４；Ｃｈｏｕｄｈａｒｙら、２００６，Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２２（３）：１６８−７５）。眼への局所投与のためのＭＭＦ製剤は、最近、報告されている（Ｋｎａｐｐら、２００３，Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９（２）：１８１  −９２）。少なくとも１つのマクロライドおよび／またはミコフェノール酸を含む眼用溶液は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００５／０３０３０５Ａ１に記述されている。ＭＭＦは、ＭＰＡよりも親油性であり、アルコールに可溶性であり、水にわずかに溶けるだけであるが（ＣｅｌｌＣｅｐｔ（登録商標）製品）、ＭＰＡのナトリウム塩は、生理的ｐＨで水溶液に非常に良く溶けると指摘されている（Ｍｙｆｏｒｔｉｃ（登録商標）製品）。眼でのＭＭＦの生物学的利用能を増加させるためにシクロデキストリンを用いて処方された（Ｋｎａｐｐ、上記）。
【００１４】
生理的ｐＨで処方されたＭＰＡのナトリウム塩は、眼に局所的に適用したとき、前部および後部の眼の構造に浸透する際に有効であることが本発明者らによって、今回、知見された。この製剤で眼の構造内で達成されるＭＰＡレベルは、治療効果を有するのに十分なレベルにあることができる。たとえＭＰＡのナトリウム塩が、生理的ｐＨで水溶液に非常に溶けて、ＭＭＦよりかなり親油性でないとしても、眼への浸透は起こる。したがって、本開示は、ミコフェノール酸を含む眼用溶液と、いろいろな眼障害を処置するための製剤を使用する方法を提供する。好ましくは、本開示は、いろいろな眼障害を処置するためのＭＰＡのナトリウム塩を含む製剤を提供する。
【００１５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で提供される記述に関して、単数形の「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「それ（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば、「１つの薬剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」への言及は、複数の薬剤への言及を含み、「１つの化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、複数の化合物を意味する。
【００１６】
いろいろな実施形態の説明が「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語を使用する場合、いくつかの特定の場合には、１つの実施形態は、言語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を用いて代わりに記述しうることを当業者はさらに理解すべきである。
【００１７】
前述の一般的な説明（図面を含む）と以下の詳細な説明の両方は、代表的で説明的なだけであって、本開示について制限的でないことを理解すべきである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ミコフェノール酸ナトリウム（ＮａＭＰＡ）から本質的になる組成物であり、そこでは、溶液のｐＨは、約６．０〜約８．５とすることができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ミコフェノール酸ナトリウムと、保存剤、粘性強化剤、湿潤剤、緩衝剤、滑沢剤、抗酸化剤、および張度作用物質から選択される１つ以上の添加剤とから本質的になる組成物であり、そこでは、溶液のｐＨは約６．０〜約８．５とすることができる。
【００１９】
眼用溶液のＮａＭＰＡの量は、示されたｐＨ範囲での薬物の水溶液中の溶解限度までとすることができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液のＮａＭＰＡの量は、最大４．５％（ｗ／ｖ）とすることができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約４．５％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約０．１％（ｗ／ｖ）〜約４．５％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約０．５％（ｗ／ｖ）〜約４．５％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約４．０％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約０．１％（ｗ／ｖ）〜約４．０％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約０．５％（ｗ／ｖ）〜約４．０％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約３．０％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約０．１％（ｗ／ｖ）〜約３．０％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約０．５％（ｗ／ｖ）〜約３．０％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約０．１％（ｗ／ｖ）〜約２．０％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約０．２％（ｗ／ｖ）〜約１．０％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡの約２％〜約４％（ｗ／ｖ）のＮａＭＰＡレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、ＮａＭＰＡの眼用溶液は、０．０５、０．０６、０．０８、０．１、０．２、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、または４．０％（ｗ／ｖ）から選択される薬物のレベルを有することができる。いくつかの実施形態では、ＮａＭＰＡレベルは、２．０、２．５、３．０、３．５、または４．０％（ｗ／ｖ）から選択される。選択されるＮａＭＰＡのレベルは、眼での治療的に有益なレベルを達成するのに必要な量に基づくことができる。ＭＰＡのナトリウム塩は、特にＷＯ９７／３８６８９に記載されている。
【００２０】
いくつかの実施形態では、眼用溶液のｐＨは、生理的ｐＨ（特に眼の外部環境の生理的ｐＨ）から、１．０〜１．５ｐＨ単位内とすることができる。ヒトの涙のｐＨは、約ｐＨ  ７．４である。したがって、眼用溶液のｐＨは、ｐＨ７．４の上下の約１．０〜１．５ｐＨ単位とすることができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液のｐＨは、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．５である。いくつかの実施形態では、眼用溶液のｐＨは、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０である。いくつかの実施形態では、眼用溶液のｐＨは、約６．５〜約８．０である。いくつかの実施形態では、眼用溶液のｐＨは、約７．０〜約８．０である。いくつかの実施形態では、眼用溶液のｐＨは、約７．０〜約７．５である。当業者は、指示されたｐＨでのＮａＭＰＡ製剤の安定性と効能および自然の状態と異なるｐＨに対する眼の忍容性のバランスを取るｐＨを選択することができる。
【００２１】
眼用溶液のいくつかの実施形態では、溶液中の総ナトリウムレベルは、約０．４〜約２．０％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、溶液中の総ナトリウムは、約０．４〜約１．０％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、溶液中の総ナトリウムは、約０．６〜約０．９％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、眼用溶液中のナトリウムの全レベルは、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８および２．０％（ｗ／ｖ）から選択される。一般に、ナトリウムのレベルは、ＮａＭＰＡと、他のソース（例えば、保存剤として使用されるＥＤＴＡおよび／または眼用溶液のｐＨを調節するのに使用されるＮａＯＨ）から溶液に加えられる任意の付加的なＮａ＋イオンとにより寄与されたレベルである。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌは、ナトリウムレベルを調節するために加えることができる。いくつかの実施形態では、溶液中の全ナトリウムは、眼の自然環境と等張的な量とすることができる。一般に、涙液の等張性は、０．９％の塩化ナトリウム溶液のそれと対応する。しかし、眼は、著しい不快感なしで、０．６％の塩化ナトリウム溶液のものと同じくらい低い値、そして、２．０％の塩化ナトリウム溶液のものと同じくらい高い値を許容できる。通常の眼の涙の総モル浸透圧濃度は、３１１〜３５０ｍＯｓＭ／Ｌ（Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｅｄ．Ａ  Ｍｉｔｒａ，Ｄｅｋｋｅｒ，１９９３）および２８４〜３１１ｍＯｓＭ／Ｌ（Ｆａｒｒｉｓ  Ｒ．，１９８６；Ｔｒ．Ａｍ．Ｏｐｈｔｈ．Ｓｏｃ．ＶｏＩ  ＬＸＸＸＩＶ）の間であると報告されている。いくつかの実施形態では、モル浸透圧濃度は、約２５０〜約４５０ｍＯｓＭ／Ｌまたは約２５０〜約３５０ｍＯｓＭ／Ｌとすることができる。いくつかの実施形態では、ナトリウムのより高い濃度、例えば、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、または２．０％（ｗ／ｖ）などの０．９％（ｗ／ｖ）を超えるレベルは、眼用溶液中でイオン化していないＭＰＡ（例えば、ＮａＭＰＡ）のレベルを上昇させるのに用いることができる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、溶液のナトリウムに対する対イオンは、塩素イオン（ｃｈｌｏｒｉｄｅ）である。いくつかの実施形態では、眼用製剤中の塩素イオンは、ＨＣｌ（それは、眼用溶液のｐＨを調節するのに用いることができる）または塩化ナトリウム（それは、製剤の浸透圧を調節するのに用いられる）由来とすることができる。塩素イオン源の他の例としては、塩化カリウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、いろいろな緩衝剤は、また、さらに以下に記すように、他のタイプの対イオン源ともなり得る。
【００２３】
いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡと、保存剤、粘性強化剤、湿潤剤、緩衝剤、滑沢剤、抗酸化剤、および張度作用物質などの１つ以上の添加剤とから本質的になることができる。一部の薬剤は複数のカテゴリーに分類されることができるように、薬剤のカテゴリーは、互いに排他的であることを意味しないことを理解すべきである。例えば、湿潤剤は、また、粘性強化特性も有することができ、したがって、湿潤剤ならびに粘性強化剤でありえる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、添加剤は、眼用溶液のｐＨを特定されたｐＨ範囲に調節および／または維持するための１つ以上の緩衝剤でありうる。緩衝剤は、通常、弱酸または弱塩基とそのコンジュゲート塩からなり、そこでは、「緩衝能」βは、
【００２５】
【数１】
2011527339.tif 000002
として定義され、式中、ΔＢは、緩衝液１ＬのｐＨを変える強酸／塩基のグラム当量であり、ΔｐＨは、強酸／塩基の添加により生じたｐＨ変化である。緩衝能と緩衝濃度の関係は、以下の式によって定義することができる：
【００２６】
【数２】
2011527339.tif 000003
式中、Ｃは、総緩衝剤濃度（すなわち、酸と塩のモル濃度の合計）である。通常、緩衝能は、かなり長い貯蔵寿命で製品ｐΗを維持するために十分に大きくなければならないし、また、投与した際に生理的ｐΗに製品を迅速に再調整することを可能とする十分に低いものでなければならない。一般的に、約０．０１〜０．１の緩衝能は、特に十分な緩衝能を提供し、副作用（例えば、眼の刺激）を最小にする濃度で眼科用溶液のために使用することができる。典型的な緩衝剤は、例示として、制限するものとしてではなく、以下のもののいろいろな塩類（例えば、ナトリウム、カリウム、その他）、酸または塩基を、必要に応じて含む：酢酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、４ホウ酸塩、二リン酸塩（ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、トロメタミン、ヒドロキシエチルモルホリン、およびＴＨＡＭ（トリスヒドロキシメチルアミノ−メタン）。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約０．５ｍＭから約１００ｍＭ、約１ｍＭから約５０ｍＭ、約１ｍＭから約４０ｍＭ、約１ｍＭから約３０ｍＭ、約１ｍＭから約２０ｍＭ、または、約１ｍＭから約１０ｍＭまで存在しうる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＮａＭＰＡの眼用溶液は、眼に治療的に投与する際と同様に、保存の過程で、例えば、貯蔵寿命を延ばすか、溶液での細菌増殖を制限するために、１つ以上の保存剤を含むことができる。使用することができる保存剤は、特に、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化ベンゾドデシニウム、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、チメロサール、硝酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀、メチル／プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、および過ホウ酸ナトリウムを含む。溶液中の保存剤の量は、貯蔵寿命を高めるか、細菌増殖を制限するか、さもなければ眼組織への最小毒性でもって眼用溶液を保存するレベルとすることができる（参照：例えば、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，２２ｎｄ  ｒｅｖ．，ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，  １７ｔｈ  ｅｄ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ：Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ；ｐａｇｅｓ  １６９２−３（１９８９））。眼用製剤の使用に適している保存剤の濃度は、当業者により決定することができる。いくつかの実施形態では、保存剤は、約０．００１〜約１．０％（ｗ／ｖ）の量で使うことができる。例えば、保存剤は、ＥＤＴＡなどの２価金属イオンキレート化剤であることができ、約０．００５〜約０．０５０（ｗ／ｖ）、約０．００５〜約０．０４０％（ｗ／ｖ）、約０．０１０〜約０．０３０％（ｗ／ｖ）、約０．０１０〜約０．０２０％（ｗ／ｖ）、または約０．０１０〜約０．０１５％（ｗ／ｖ）とすることができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液中の保存剤（例えば、ＥＤＴＡ）の量は、約０．００５、０．０１、０．０１２、０．０１４、０．０１６、０．０１８、０．０２０、０．０３０、０．０４０、または０．０５０％（ｗ／ｖ）とすることができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＮａＭＰＡの眼用溶液は、１つ以上の粘性強化剤を含むことができる。粘性強化剤は、一般的に、眼用溶液の粘性を高めて眼での溶液の保持時間を増加させ、ある場合には、眼の表面に保護層を提供する。いろいろな分子量でのいろいろな相容性の組み合わせで、粘性強化剤は、特に、カーボポールゲル、デキストラン４０（４０，０００ダルトンの分子量）、デキストラン７０（７０，０００ダルトンの分子量）、ゼラチン、グリセリン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、（ＨＰＭＣ）メチルセルロース、エチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポロキサマー４０７、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｏｄｉｎｅ）（ポビドン）を含む。溶液の粘性は、ポアズ単位で与えられ、約２５〜５０ｃｐｓの粘度が、眼科用溶液に適している。眼用製剤に用いられる薬剤の量は、当業者によって決定することができ、処置される状態および眼での溶液の所望の保持時間に適した１５分以上、３０分以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１２時間以上の眼における滞留時間を提供することができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＮａＭＰＡの眼用溶液は、１つ以上の抗酸化剤を含むことができる。適切な抗酸化剤は、例示として限定されるものではないが、ＥＤＴＡ（例えば、ＥＤＴＡ２ナトリウム）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、チオ尿素、およびアルファトコフェロールを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、添加剤は、１つ以上の湿潤剤である。通常、湿潤剤は、眼の水分補給をし、眼の乾燥を制限することができる。湿潤剤は、一般に、親水性ポリマーであり、例示として限定されるものではないが、ポリソルベート２０および８０、ポロキサマー２８２、ならびにチロキサポールを含む。いくつかの実施形態では、湿潤剤は、また、特に、セルロース系ポリマー（例えば、ＨＰＭＣとＣＭＣ）；ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｏｄｉｎｅ）；およびポリビニルアルコールを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、添加剤は、１つ以上の滑沢剤である。眼用滑沢剤は、内因性の涙の稠度に近似させ、自然な涙の増強を助成することができる。滑沢剤は、非リン脂質系およびリン脂質系（ｐｈｏｓｐｈｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ）の薬剤を含むことができる。非リン脂質系である眼用滑沢剤は、限定されるものではないが、プロピレングリコール；エチレングリコール；ポリエチレングリコール；ヒドロキシプロピルメチルセルロース；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；デキストラン（例えば、デキストラン７０）；水溶性タンパク質（例えば、ゼラチン）；ビニル重合体（例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン）；ペトロラタム；鉱油；およびカルボマー（例えば、カルボマー９３４Ｐ、カルボマー９４１、カルボマー９４０、およびカルボマー９７４Ｐ）を含む。非リン脂質滑沢剤は、また、前述の薬剤のいずれかの相容性混合物を含むこともできる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、眼用滑沢剤は、リン脂質系滑沢剤である。本明細書で使用する場合、「リン脂質滑沢剤」は、１つ以上のリン脂質を含む水性組成物を指す。涙液膜は脂質層を含むことが示され、それは涙腺によって分泌されて、さまざまなタイプのリン脂質からなる（参照：例えば、ＭｃＣｕｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｅ，２００３，Ｔｈｅ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  １：９７−１０６）。リン脂質滑沢剤の製剤の例は、米国特許第４，８０４，５３９号；同第４，８８３，６５８号；同第４，９１４，０８８号；同第５，０７５，１０４号；同第５，２７８，１５１号；同第５，２９４，６０７号；同第５，３７１，１０８号；および同第５，５７８，５８６号に開示されたものを含む；それらの全ては、引用により本明細書に取り込まれる。リポソームに基づく滑沢剤の組成物は、米国特許第４，８１８，５３７号および米国特許第５，８００，８０７号に記述されており、それらの開示は、引用により本明細書に取り込まれる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、添加剤は、１つ以上の張度作用物質であり、組成物の浸透圧を例えば、自然の涙の浸透圧に調節するために使用できる。適切な張度作用物質は、例示として制限するものではないが、デキストラン（例えば、デキストラン４０または７０）、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、および塩化ナトリウムを含む。１つ以上の塩類の等価量は、陽イオン（例えば、カリウム、アンモニウムなど）と陰イオン（例えば、塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、重硫酸塩など）からなり；塩の硫化水素ナトリウムおよび硫酸アンモニウムも、また、使うことができる。張度作用物質の量は、添加される特定の薬剤に依存して異なる。しかし、一般に、組成物は、上で示したように、最終組成物が眼科学的に許容できるモル浸透圧濃度、例えば、約２５０〜約４５０ｍＯｓＭ／Ｌ、または約２５０〜約３５０ｍＯｓＭ／Ｌを有するようにするのに十分な量での張度作用物質を含むであろう。
【００３４】
いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡと保存剤の組成物である。特に、保存剤はＥＤＴＡであり、それは、約０．００５〜約０．０５０％（ｗ／ｖ）、約０．００５〜約０．０４０％（ｗ／ｖ）、約０．０１０〜約０．０３０％（ｗ／ｖ）、約０．０１０〜約０．０２０％（ｗ／ｖ）、または約０．０１０〜約０．０１５％（ｗ／ｖ）で存在することができる。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡは、約０．００５、０．０１、０．０１２、０．０１４、０．０１６、０．０１８、０．０２０、０．０３０、０．０４０、または０．０５０％（ｗ／ｖ）で存在する。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡ（２ナトリウム塩脱水物として）は、約０．０１２％（ｗ／ｖ）で存在する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、眼用溶液は、ＮａＭＰＡ、保存剤、および緩衝剤を含む。このタイプの典型的な製剤は、上記した量での保存剤ＥＤＴＡ；０．０１〜約０．１の緩衝能を提供する量での緩衝剤（例えば、ホウ酸塩またはトロメタミン）；および約７．０〜８．０の溶液ｐＨを含むことができる。
【００３６】
本明細書における実施形態では、眼用溶液は、当該技術分野で知られている方法に従って製剤化することができる。ガイダンスは、Ｄｕｖａｌｌ  ａｎｄ  Ｋｅｒｓｈｎｅｒ，  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  Ｅｄ，Ｓｌａｃｋ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（２００６）；Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｆａｃｔｓ（登録商標）  １８ｔｈ  Ｅｄ，Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ（２００７）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ，ｅｄ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  １５８１−１９５９（１９９０）；およびＲｅｙｎｏｌｄｓ  ＬＡ．，１９９１，”Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，”Ａｍ  Ｊ  Ｈｏｓｐ  Ｐｈａｒｍ．４８：２４３８−９に見ることができる；その開示は、引用により本明細書に取り込まれる。
【００３７】
製剤中のＮａＭＰＡは、眼に浸透する能力を与えられるので、本明細書に記述される眼用溶液は、免疫抑制および抗炎症性化合物による処置に従っていろいろな眼性障害を処置するのに使用することができる。用語「眼科障害」、「眼障害」、「眼疾患」、および「眼の障害」は、本明細書では互換的に使用されて、特に、網膜、斑、窩などの眼の後部領域に関わる「眼の後部」疾患；および角膜、虹彩、毛様体、結膜、涙腺、その他などの組織に関わる疾患などの「眼の前部」疾患を含む。これらの状態および疾患は、痛み、不快感、組織損傷および罹患対象の眼の損なわれた視覚動作として現れる場合がある。
【００３８】
「眼の後部」疾患の例は、特に、血管造影嚢胞様黄斑浮腫などの黄斑浮腫；網膜虚血および脈絡膜新血管形成；黄斑変性；網膜疾患（例えば、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜浮腫、網膜剥離）；炎症性疾患（例えば、原因不明（突発性疾患）の、または全身性（例えば、自己免疫）疾患に関係したブドウ膜炎（汎ブドウ膜炎を含む）または脈絡膜炎（多巣性脈絡膜炎を含む））；上強膜炎または強膜炎；散弾網脈絡膜症；脈管疾患（例えば、網膜虚血、網膜脈管炎、脈絡膜脈管不全、脈絡膜血栓症）；視神経新血管形成；および視神経炎が挙げられる。
【００３９】
「眼の前部」疾患の例は、特に、眼瞼炎、角膜炎；虹彩ルベオーシス；Ｆｕｃｈｓ虹彩異色性虹彩毛様体炎；慢性ブドウ膜炎または前部ブドウ膜炎；結膜炎；アレルギー性結膜炎（季節性または四季を通じての結膜炎、春に起こる結膜炎、アトピー性結膜炎、および巨大乳頭結膜炎）；乾性角結膜炎（ドライアイ症候群）；虹彩毛様体炎；虹彩炎；強膜炎；上強膜炎；角膜浮腫；強膜疾患；眼瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）；毛様体扁平部炎；Ｐｏｓｎｅｒ  Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ症候群；ベーチェット病；Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ症候群；過敏性反応；結膜浮腫；結膜静脈性うっ血；眼窩周囲蜂巣炎；急性涙嚢炎；非特異性脈管炎；および類肉腫症が挙げられる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、眼疾患は、眼の炎症状態と関係している。これらの状態は、眼の前部と眼の後部に関する上記したいろいろな障害を含むが、これらに限定されず、例えば、黄斑浮腫を伴う炎症；網膜虚血；脈絡膜新血管形成、黄斑変性；糖尿病性網膜症；糖尿病性網膜浮腫；網膜剥離；炎症性疾患（例えば、原因不明（突発性疾患）の、または全身性（例えば、自己免疫）疾患に関係したブドウ膜炎（汎ブドウ膜炎を含む）または脈絡膜炎（多巣性脈絡膜炎を含む））；上強膜炎または強膜炎；散弾網脈絡膜症；脈管疾患（網膜虚血、網膜脈管炎、脈絡膜脈管不全、脈絡膜血栓症）；視神経新血管形成および視神経炎；眼瞼炎；角膜炎；虹彩ルベオーシス；Ｆｕｃｈｓ虹彩異色性虹彩毛様体炎；慢性ブドウ膜炎または前部ブドウ膜炎；結膜炎；アレルギー性結膜炎（季節性または四季を通じての結膜炎、春に起こる結膜炎、アトピー性結膜炎、および巨大乳頭結膜炎を含む）；乾性角結膜炎（ドライアイ症候群）；虹彩毛様体炎；虹彩炎；強膜炎；上強膜炎；角膜浮腫；強膜疾患；眼瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）；毛様体扁平部炎；Ｐｏｓｎｅｒ  Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ症候群；ベーチェット病；Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ症候群；過敏性反応；結膜浮腫；結膜静脈性うっ血；眼窩周囲蜂巣炎；急性涙嚢炎；非特異性脈管炎；および類肉腫症が挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、眼用製剤で処置できる眼疾患は、乾性角結膜炎であり、これは、ドライアイ、乾性角膜炎、乾燥症候群、眼乾症、およびドライアイ症候群（ＤＥＳ）としても知られる状態であり、それは、異常な涙の組成のために、減少した涙液の産生および／または増加した涙液層の蒸発に起因しうる。障害は、環境化学薬品や感染症に起因する場合があるが、障害はまた、自己免疫疾患の関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、真性糖尿病およびＳｊｏｅｇｒｅｎ症候群を伴う。
【００４２】
いくつかの実施形態では、製剤で処置することができる眼疾患は、自己免疫障害に伴う疾患である。これらの状態は、眼の後部と眼の前部に対する上記された様々な障害を含むことができ、これに限定されるものではないが、例えば、脈絡膜新血管形成；黄斑変性；糖尿病性網膜症；糖尿病性網膜浮腫；原因不明（突発性疾患）の、または全身性（例えば、自己免疫）疾患に関係したブドウ膜炎（汎ブドウ膜炎を含む）または脈絡膜炎（多巣性脈絡膜炎を含む）；上強膜炎または強膜炎；散弾網脈絡膜症；視神経新血管形成、および視神経炎；眼瞼炎；角膜炎；虹彩ルベオーシス；Ｆｕｃｈｓ虹彩異色性虹彩毛様体炎；慢性ブドウ膜炎または前部ブドウ膜炎；結膜炎；アレルギー性結膜炎（季節性または四季を通じての結膜炎、春に起こる結膜炎、アトピー性結膜炎、および巨大乳頭結膜炎を含む）；虹彩毛様体炎；虹彩炎；強膜炎；上強膜炎；角膜浮腫；強膜疾患；眼瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）；毛様体扁平部炎；Ｐｏｓｎｅｒ  Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ症候群；ベーチェット病；Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ症候群；過敏性反応；結膜浮腫；結膜静脈性うっ血；眼窩周囲蜂巣炎；急性涙嚢炎；非特異性脈管炎；および類肉腫症が挙げられる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、眼用製剤で処置することができる自己免疫状態と関連した眼疾患は、ブドウ膜炎であり、これは、ブドウ膜の任意成分の炎症を記述するのに用いられる一般用語である。眼のブドウ膜は、虹彩、毛様体および脈絡膜からなる。下にある網膜の炎症（網膜炎と呼ばれている）、または視神経の炎症（視神経炎と呼ばれる）、または上にある強膜の炎症（強膜炎もしくは上強膜炎と呼ばれる）は、ブドウ膜炎を併って、あるいは伴うことなく起こる場合がある。ブドウ膜炎は、前部、中間、後部、または拡散などの罹患した眼のセグメントに基づいて分類されるか、あるいは虹彩炎、虹彩毛様体炎または脈絡膜炎などの関与した特定の解剖学的な部分に基づいて分類され得る。後部ブドウ膜炎は、以下でさらに説明されるように、網膜炎、脈絡膜炎、または視神経炎の多くの型のどれをも意味する。び慢性ブドウ膜炎は、一般的に、前部、中間、および後部の構造を含む眼の全ての部分に関与する炎症と関係する。ブドウ膜炎は、関節リウマチ；全身エリテマトーデス；Ｓｊｏｅｇｒｅｎ症候群；真性糖尿病；類肉腫症；強直性脊椎炎；乾癬；多発性硬化症；Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ疾患；ベーチェット病；結節性多発動脈炎；巨細胞性動脈炎；および炎症性腸疾患を含む自己免疫疾患を伴う最も一般的な眼性障害のうちの１つである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、結膜炎、眼瞼炎；角膜炎；硝子体炎（ｖｉｔｉｒｉｔｓ）；脈絡網膜炎；およびブドウ膜炎などの炎症性の眼の状態は、全身性または局所性の感染症を伴い、そこでは、ＮａＭＰＡなどの免疫抑制薬が、眼の炎症を抑制するのに局所的に使用され得る。感染症は、細菌（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、その他）、ウイルス（例えば、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ，Ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ、サイトメガロウイルス、その他）、カビ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、その他）または寄生虫薬（例えば、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｓｅｐｔａｔａ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ、その他）によるものでありえる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、眼用溶液は、一般に、処置を必要とする対象の特定の眼障害または眼疾患を処置するのに有効な量で使用されるであろう。眼用溶液は、治療利益を達成するために治療的に、あるいは予防利益を達成するために治療的に投与することが可能である。本明細書で使用する場合、「対象」は、通常、本明細書に記述される治療剤の投与から利益を得る可能性のある任意の動物である。治療剤は、哺乳類の対象（例えば、ヒトの対象）に投与されうる。いくつかの実施形態では、治療剤は、獣医学動物の対象、例えば、特に、マウス、ラット、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、その他に投与されてもよい。
【００４６】
「処置すること」または「処置」は、徴候の予防、治癒、安定化、または寛解が起こるという意図でもって対象（例えば、患者）を医学的に管理することを意味する。処置は、積極的処置、すなわち、特に病気の改善に向けられた処置；対症処置（つまり、病気を治療することよりもむしろ徴候の軽減のために設計された処置）；予防処置（つまり、病気の予防に向けられた処置）；および支持的処置（つまり、病気の改善に向けられた別の特定療法を補うために使用される処置）を含む。このように、「処置」は、病気または障害の発症を遅らせるか、病気または障害を抑制するかして、予防的利益を提供することを指す。
【００４７】
本明細書における実施形態では、治療有効量は、処置を必要とする対象の眼に局所的に適用される。「治療有効量」は、処置される病気または状態に対する治療効果または予防利益を誘導するのに十分である個々の化合物としての、または、他の化合物との組み合わせでの治療剤の量を意味する。この語句は、用量が病気を完全に根絶しなければならないことを意味すると理解してはならない。治療有効量は、とりわけ、本方法で使われる化合物の薬理学的特性、処置される状態、投与頻度、送達方法、処置すべき個体の特徴、病気の重症度、および患者の応答に依存して変動するであろう。当業者は、本明細書に記述する処置のための組成物を処方する際には、そのような要因を考慮することができ、その方法は、十分に当業者の技術範囲内である。
【００４８】
眼疾患を処置するために、眼科用組成物は、罹患した１つまたは複数の眼に局所的に適用することができる。いくつかの実施形態では、眼用製剤は、定められた容量で、例えば、約１０、２０、５０、７５、１００、１５０、もしくは２００μｌ、またはそれ以上で適用することができる。適用頻度は、特に、処置されている眼疾患の種類、状態の重症度、患者の年齢と性別、製剤中のＮａＭＰＡの量、および処置すべき眼組織の薬物動態学的プロファイルに依存するであろう。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、１日につき複数回、投与できる。組成物が１日につき複数回、投与されるとき、投与頻度は、１日につき２回、３回、４回、最高８回とすることができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、毎日１〜４回、投与されることができる。いくつかの実施形態では、眼用溶液は、２日ごとに１回適用されることができる。いくつかの実施形態では、眼用製剤は、４日ごとに１回適用されることができる。いくつかの実施形態では、眼用製剤は、毎週１回、投与されることができる。特定の眼障害のために投与される頻度と量を決定することは、主治医の技術と判断の十分に範囲内である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、眼用製剤は、キットの形態で提供されることができる。そのように、キットは、単回用量単位として、または、単一の溶液貯槽として、容器中に眼用製剤を含むことができる。キットは、また、正確な用量を分配するためのディスペンサー、ならびに製剤の服用と使用のための指示書を含むことができる。
【００５０】
今や本発明を一般的に説明したので、同じことが、以下の実施例（これは、説明のために提供され、特に指定されない限り、本発明を制限することを意図するものではない）を参照してより容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００５１】
６．実施例
実施例１：ＮａＭＰＡの眼用溶液の調製
眼科用溶液１。４％ＭＰＡ眼科用溶液、ナトリウム塩
【００５２】
【数３】
2011527339.tif 000004
調製手順。精製水（最終容積の約８０％）を約８０℃まで加熱した。グリセリンとミコフェノール酸をその水に加え、混合して分散させた。加熱を止めて、ＮａＯＨ１０％をすぐにそのバッチに加えて、ＭＰＡが溶けるまで混合した。あるいはまた、精製水（最終容積の約８０％）、ＮａＯＨ１０％およびグリセリンを混合し、約８０℃まで加熱した。加熱を止めて、それから、ミコフェノール酸を加え、混合して溶解した。精製水をバッチ容積の約９５％に加え、室温に冷却しながら、組成物を混合した。ｐＨを較正されたｐＨメーターで測定し、そして、ｐＨは必要に応じてＮａＯＨ／ＨＣｌで調整された。精製水をバッチ容積の１００％に加え、そして、モル浸透圧濃度を測定した。適切なフィルターが、清澄化と殺菌のために使われた。
【００５３】
眼科用溶液２：４％のＭＰＡ眼科用溶液、トロメタミン塩
【００５４】
【数４】
2011527339.tif 000005
調製手順。精製水（最終容積の約８０％）を約８０℃まで加熱した。グリセリンとミコフェノール酸をその水に加え、混合して分散させた。加熱を止めて、トロメタミンをすぐにそのバッチに加えて、ＭＰＡが溶けるまで混合した。あるいはまた、精製水（最終容積の約８０％）、トロメタミンおよびグリセリンを混合し、約８０℃まで加熱した。加熱を止めて、それから、ミコフェノール酸を加え、溶液を混合してＭＰＡを溶解した。精製水をバッチ容積の約９５％に加え、室温に冷却しながら、溶液を混合した。ｐＨを較正されたｐＨメーターで測定し、必要に応じて、ｐＨは、ＮａＯＨ／ＨＣｌで調整された。精製水をバッチ容積の１００％に加え、そして、モル浸透圧濃度が測定された。フィルターが、必要に応じて、清澄化と殺菌のために使われた。
【００５５】
眼科用溶液３：３％のＭＰＡ眼科用溶液、（ヒドロキシエチルモルホリン塩）。
【００５６】
【数５】
2011527339.tif 000006
調製手順。精製水（最終容積の約８０％）を約８０℃まで加熱した。グリセリンとミコフェノール酸を水に加えて、混合して分散させた。加熱を止めて、ヒドロキシエチルモルホリンをそのバッチにすぐに加えて、ＭＰＡが溶けるまで混合した。あるいはまた、精製水（最終容積の約８０％）、ヒドロキシエチルモルホリンおよびグリセリンを混合し、約８０℃まで加熱した。加熱を止めて、ミコフェノール酸を加え、溶液を混合してＭＰＡを溶解した。精製水をバッチ容積の約９５％に加え、室温に冷却しながら、溶液を混合した。ｐＨを較正されたｐＨメーターで測定し、必要に応じて、ｐＨはＮａＯＨ／ＨＣｌで調整された。精製水をバッチ容積の１００％に加え、そして、モル浸透圧濃度が測定された。適切なフィルターが、清澄化と殺菌のために使われた。
【００５７】
実施例２：ＥＤＴＡを含む眼科用製剤
以下の表は、添加剤ＥＤＴＡと様々なレベルのＮａＣｌを有するＮａＭＰＡの様々な眼科用製剤を提供する。
【００５８】
【表１】
2011527339.tif 000007
上記の表は、以下で説明される効力試験を含む動物実験で使用された眼科用ＮａＭＰＡ製剤を示す。最初の３つの成分（ＮａＭＰＡ、ＮａＣｌ、およびエデト酸（ＥＤＴＡ）２ナトリウムは、１容積当たりの重さ（ｗ／ｖ）における最終的な％濃度として示されている。製剤は、ＮａＯＨまたはＨＣｌを使用して、示される望ましいｐＨに調整され、精製水によって１００ｍｌの最終的な容積とされる。眼科用ＮａＭＰＡ製剤の他の容積は、  表１に概説された処方を使用することで作ることができる。「ＮａＭＰＡ」の下では、ＭＰＡの最終的な濃度は、括弧内に示されている。  例えば、製剤３は、１％のＮａＭＰＡ製剤を指す。１％のＮａＭＰＡ製剤は、有効成分として１％のＭＰＡの最終濃度を含む。
【００５９】
上記溶液は、説明した方法で作られて、さらに以下に記すように、忍容性、組織浸透性、および効力について試験された。
【００６０】
実施例３：シクロスポリンと比較した、ＭＰＡ含有製剤の忍容性と眼組織浸透性に関する試験
この試験の目的は、１日間１日につき８回、ニュージーランド白ウサギの眼への局所的な滴下に続いて、８つのＭＰＡ製剤の眼の忍容性と眼組織浸透性を評価することであった。８つの試験品目の製剤、陰性対照品目（２．４％グリセリン）および陽性対照品目（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）、Ａｌｌｅｒｇａｎ  Ｉｎｃ．製、（Ａｌｌｅｒｇａｎ）  ｏｆ  Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳ）は、表２に提供される。各フェーズで使われる４つの試験品目と両方の対照品目を用いて、試験は２つのフェーズで実施された。ナイーブな動物が、両方のフェーズで使われた。表２、３および４で注記されるように、動物は処置群に入れられた。
【００６１】
【表２】
2011527339.tif 000008
【００６２】
【表３】
2011527339.tif 000009
【００６３】
【表４】
2011527339.tif 000010
フェーズ１およびフェーズ２試験
２４匹の雌のニュージーランド白ウサギは、Ｔｈｅ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，ＵＳ）から入手した。動物は１５〜１９週令であり、第１日目は、体重が２．１６〜３．２３ｋｇであった。プロトコルによれば、試験動物は、第１日目は１．５〜２．５ｋｇの重さであるという条件であったが、８匹のフェーズ１の動物とフェーズ２のすべての動物は、指定された最大値より０．０６〜０．７３ｋｇ重かった。この偏差は、試験の結果に影響を及ぼすとは思われなかった。動物は、耳標とケージカードで特定された。
【００６４】
動物の検疫と世話は、実験室のための標準作業手順書（ＳＯＰ）の下で実行された。到着と同時に、動物は８〜１０日間検疫されて、彼らが健康であったことを保証するために調べられた。収容、衛生、および環境モニタリングは、ＳＯＰの下で実行された。動物は、個々の懸架式ステンレス鋼のケージに収容された。試験室温度は、３０〜４８％の相対湿度で７２〜７４°Ｆであった。動物は、Ｔｅｋｌａｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｈｉ  Ｆｉｂｅｒ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｄｉｅｔと自由に水道水を毎日摂取した。
【００６５】
試験に配置する前に、各々の動物の両眼は、刺激または不快の徴候に対して全体的に評価され、観察はＳＯＰに従って採点され、標準化データ収集シートを使って記録された。眼の刺激のはなはだしい徴候のウサギは、本試験において使用されなかった。
【００６６】
試験に配置する前に、各動物は、プレ処置眼科検査（フルオレセインを用いる細隙灯）を受けた。眼所見は、ＳＯＰに従って採点され、標準化データ収集シートを使用して記録された。試験での配置の受理基準は以下の通りであった：結膜充血と腫脹に対しては、≦１のスコア；および他のすべての観測変数に対しては、０のスコア。眼は、第１日目の投薬の直前に、フルオレセインを用いた細隙灯検眼鏡検査によって再評価された。投薬の直前に、いかなる眼の異常を有する動物も置き換えられた。
【００６７】
各フェーズの投薬前に、１２匹の動物は、体重が測定され、ランダムに６つの試験群に配属された。各ランダム化は、修正ラテン方格法に基づいた。投薬は、以下の通りに各フェーズの第１日目に実行された：試験品目および対照品目は、投薬前に室温とした。処置群の表で特定された適切な間隔で、４０μＬの試験品目または対照品目は、各々の動物の両眼に較正されたピペットを使って投与された。動物は、１時間±５分離れた目標間隔で投与された用量で８回投薬された。各々の投薬後に、眼瞼は１０秒間、閉じたままにされた。各用量の投与時間が記録された。
【００６８】
各動物の両眼は、第１日目の最初の服用の前に、そして各々の連続した服用の後の１５〜３０分の目標間隔で、刺激または不快感の徴候について全体的に評価された。総括的観察が、標準化データ収集シートを使って採点され、記録された。各々の服用の直後に観察された不快感の徴候は、試験記録に書き留められた。
【００６９】
眼科検査（フルオレセインを用いる細隙灯）は、第１日目（最初の服用の前に、そして、最後の服用の後で）に、各動物の両眼に対して行われた。眼所見は、ＳＯＰに従って採点され、標準化データ収集シートを使って記録された。
【００７０】
動物は、１日２回、死亡率／罹病率に関して観察された。動物は、ランダム化の際と第１日目（最初の服用の前に）に重さが量られた。
【００７１】
各群からの１匹の動物は、眼組織採取のためにランダムに選択された。選ばれた動物は、最終的な眼科検査の後で、市販されている安楽死溶液の静脈注射により安楽死させた。安楽死は、ＳＯＰに従って実行された。残りの動物は、可能なさらなるフェーズの試験のために動物施設に戻された。
【００７２】
眼組織は、各々の安楽死した動物から以下のように採取された：房水は、各々の眼から採取され、房水量が測定された。眼球と周囲組織（涙腺と眼瞼を含む）が採取された。涙腺と眼瞼は、１つの複合体として秤量された。結膜は、各眼球から採取され、秤量された。すべての採取した組織は、液体窒素で急速凍結された。凍結後に、以下の組織は、試験動物の眼から採取された：角膜、虹彩−毛様体複合体（ｉｒｉｓ−ｃｉｌｌｉａｒｙ  ｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、水晶体、硝子体液、脈絡膜−網膜複合体、および強膜。組織は、ＳＯＰに従って採取された。群Ｂ〜ＥとＨ〜Ｋの眼球から解剖された眼組織は、秤量され、標識化され、凍結保存（−７０℃）された。群Ｂ〜ＥとＨ  Ｋ動物のすべての眼組織は、それから、ＭＰＡ濃度の分析のためにドライアイス上でＩＡＳに送られた。群ＦとＬの動物（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）投薬群）の眼組織は、ＢＴＣで凍結保存（−７０℃）された。
【００７３】
フェーズ３試験
方法は、フェーズ１とフェーズ２に対して上で提示されたものと類似していた。Ｂ〜Ｆ群からの各１匹の動物が、眼組織採取のためにランダムに選択された。選ばれた動物は、最終的な眼の検査の後で市販されている安楽死溶液の静脈注射により安楽死させた。安楽死は、ＳＯＰに従って実行された。残りの動物は、さらなるフェーズの試験のために動物施設に戻された。
【００７４】
眼組織は、各々の安楽死した動物から以下のように採取された：房水は、各々の眼から採取され、房水量が測定された。眼球と周囲組織（涙腺と眼瞼を含む）が採取された。涙腺と眼瞼は、別々に秤量された。結膜は、各眼球から採取され、秤量された。すべての採取した組織は、液体窒素で急速凍結された。凍結後に、以下の組織は、Ｂ〜Ｅ群の動物の眼から採取された：角膜、虹彩−毛様体複合体（ｉｒｉｓ−ｃｉｌｌｉａｒｙ  ｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、水晶体、硝子体液、脈絡膜−網膜複合体、および強膜。組織は、ＳＯＰに従って採取された。採取された眼組織は、秤量され、標識化され、そして、ＭＰＡ濃度の分析のためにドライアイス上で輸送されるまで凍結保存（−７０℃）された。
【００７５】
フェーズ１とフェーズ２試験の結果
１％のＭＰＡヒドロキシエチルモルホリン塩製剤を投薬された（フェーズ１）眼は、全般的な眼科検査で見られた充血と結膜浮腫を有した。これらの眼の充血と結膜浮腫は、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）を投薬された眼で見られる刺激に類似していた。２％のＭＰＡヒドロキシエチルモルホリン塩製剤を投薬された（フェーズ２）眼は、用量投与後ただちに激しい急性の不快感を示した。しかし、これらの眼は、全般的な眼科検査では、充血またはうっ血なしで正常に見えた。
【００７６】
フェーズ３試験の結果
すべての製剤は、適用後になされた全体的観察によれば、３％のＭＰＡヒドロキシエチルモルホリン塩溶液（Ｅ群）を除いては、忍容性が良好であった。両方のＥ群の動物は、試験品目の滴下直後に、中程度の眼の不快感（瞬き、眼を閉じ続けること、および眼の足掻き）の徴候を示した。Ｅ群のウサギ１６５０番の左眼は、最後の３つの試験品目の滴下後に、全体的観察において眼の刺激（充血、結膜浮腫、および排出物）の徴候を示した。同じ眼は、試験の終りまでに地図状表在性角膜潰瘍を発症した。障害は、薬剤投与と関連している上皮毒性と一致した。
【００７７】
眼組織のＭＰＡレベル
上記したように、ＭＰＡまたはシクロスポリンを服用する群からの１匹の動物が、眼組織採取のためにランダムに選択された。採取された眼組織は、房水、結膜、角膜、眼瞼、虹彩−毛様体、涙腺、水晶体、網膜／脈絡膜、強膜、および硝子体液であった。涙腺は、フェーズ１とフェーズ２のシクロスポリン処置動物だけから採取され、そして、水晶体は、ＭＰＡ処置動物だけから採取された。選択された動物は、最終的な眼科試験（それは８用量の後の約１時間）の後、市販の安楽死溶液の静脈注射により安楽死させた。
【００７８】
一般に、以下の観察がなされた：（１）ＭＰＡ濃度は、前部、外部の眼組織でより高く、後部、眼内組織でより低い；（２）製剤間では、眼の生物学的利用能に大きな違いがなかった；そして（３）適用溶液中のＭＰＡ濃度の増加により、いくつかの組織ではＭＰＡ濃度の増加が見られたが、他の組織では見られなかった。
【００７９】
１つの外部の眼組織（角膜）と１つの眼内組織（虹彩−毛様体）でのＭＰＡの平均組織濃度は、表５で示される。平均ＭＰＡ濃度は、角膜で約２０〜７０ｍｃｇ／ｇ（６．４〜２２．４μＭ）、虹彩／毛様体で０．５０  ５．０ｍｃｇ／ｇ（０．１６  １．６μＭ）であった。
【００８０】
【表５−１】
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【００８１】
【表５−２】
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【００８２】
【表５−３】
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実施例４：シクロスポリンと比較したＮａＭＰＡ含有製剤の浸透性に関する試験
この試験の目的は、１日につき２回、４回または８回の頻度で１４日間、ニュージーランド白ウサギの眼への局所的な滴下の後で、３つの試験品目製剤の薬物動態学と眼への毒性を評価することであった。３つの異なる試験品目製剤、陰性対照品目（２．４％グリセリン）、および陽性対照品目（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）、Ａｌｌｅｒｇａｎ  Ｉｎｃ．製、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳ）は、表６に提供される。
【００８３】
【表６】
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動物は表７にみられるように処置群に割り当てられた。
【００８４】
【表７】
2011527339.tif 000015
試験品目と陰性対照は、室温に４日間保存し、それから冷凍保存（２〜８℃）に移した。陽性対照は、試験の間中、室温で保存した。
【００８５】
４４匹の雌のニュージーランド白ウサギは、Ｔｈｅ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，ＵＳ）から入手した。動物は１３〜２１週令であり、第１日目は、体重が１．８１〜２．９０ｋｇであった。動物の検疫と世話は、生物学的防除操作手順（ＢＣＯＰ）に従って実行された。到着と同時に、動物は１０日間検疫されて、彼らが健康であったことを保障するために調べられた。収容、衛生、および環境モニタリングは、ＢＣＯＰの下で実行された。動物は、個々の懸架式ステンレス鋼のケージに収容された。試験室温は、４０〜７０％の相対湿度で６３〜７６°Ｆであった。動物は、Ｔｅｋｌａｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｈｉ  Ｆｉｂｅｒ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｄｉｅｔと自由に水道水を毎日摂取した。
【００８６】
試験に配属される前に、各々の動物の両眼は、刺激または不快感の徴候について全体的に評価された。観察は、実験室標準作業手順書（ＳＯＰ）に従って採点され、標準化データ収集シートを使って記録された。試験に配属される前に、各動物は、前処置の眼科検査（フルオレセインによる細隙灯）を受けた。眼所見は、標準化データ収集シートを使用するＳＯＰに従って採点されて記録された。試験への配属の受理基準は以下の通りであった：結膜充血と腫脹に対しては、≦１のスコア；および他のすべての観察変数に対しては、０のスコア。眼は、第１日目に投薬直前にフルオレセインを用いた細隙灯検眼鏡検査によって再評価された。
【００８７】
投薬前に、４４匹の動物は、重さが量られ、ランダムに１１の試験群に割り当てされた。ランダム化は、修正ラテン方格法に基づいた。処置群は、表７で示される。
【００８８】
試験は、フェーズ１で処置された群Ｂ〜Ｇとフェーズ２で処置された群ＡおよびＨ〜Ｋを用いて、２つのフェーズで実施された。１５匹の最初の試験動物（フェーズ１群の５匹とフェーズ２群の１０匹）は、ランダム化の後、発現した結膜充血により置き換えられた。フェーズ２で使われるすべての動物は、重さが量られて、フェーズ２投薬の直前に群に再ランダム化された。
【００８９】
投薬は、以下の通りに各フェーズの１〜１４日目まで実施された：処置群の表で規定した適切な間隔で、試験品目または対照品目の４０μＬを、各々の動物の両眼に較正ピペットを使って投与した。各々の投薬後に、眼瞼は１０秒間、閉じられたまま保持された。各々の用量の投与時間が記録された。
【００９０】
用量は、毎日２回（７または８時間間隔で）、１日４回（２時間間隔で）、または毎日８回（１時間間隔で）投与された。プロトコルは、用量が、毎日２回（８時間±５分間隔で）、１日４回（２時間±５分間隔で）、または毎日８回（１時間±５分間隔で）投与されることを規定した。フェーズ１では、すべての用量は、指定された時間間隔内で投与された。フェーズ２では、用量は以下の通りに指定された間隔外で投与された：１〜１４日目に、２回目の用量は、すべての群Ｈの眼に最初の投薬の７時間±５分後に与えられた。６日目に、６回目の用量が、１〜３分遅れて、１７の眼（群Ａ、ＪまたはＫ）に与えられた。８日目に、第２の用量が、１分遅れて２つの眼に与えられ、４回目の用量が、３分遅れて８つの眼（群Ｉ）に与えられ、６回目の用量が、１〜２分遅れて１６の眼（群ＪまたはＫ）に与えられ、７回目の用量が、１〜４分遅れて１８の眼（群Ａ、ＪまたはＫ）に与えられ、そして、８回目の用量が、１７分遅れて２０の眼（群Ａ、ＪまたはＫ）に与えられた。第９日目に、４回目の用量が、１４分遅れて８つの眼（群Ｉ）に与えられ、６回目の用量が、１〜２分遅れて６つの眼（群Ｋ）に与えられ、７回目の用量が、１〜３分遅れて１０の眼（群ＪまたはＫ）に与えられ、そして、８回目の用量が、１〜２分遅れて１４の眼（群ＪまたはＫ）に与えられた。１４日目に、２回目の用量が、１分早く８つの眼（群Ｉ）に与えられ、そして、３回目の用量が、１分早く１４の眼（群ＡまたはＫ）に与えられた。投薬間隔のこれらの偏差は、試験の結果に最小の影響を及ぼすと思われる。
【００９１】
１〜１４日間、各々の動物の両眼は、その日の最初の服用の前とその日の最後の服用の１５〜３０分後に、痒みまたは不快の徴候に関して全体的に評価された。各用量の投与直後に眼の不快感の徴候と持続時間が記録された。全体的な観察は、ＳＯＰに従って採点され、標準化データ収集シートを使って記録された。
【００９２】
眼科検査（フルオレセインを用いる細隙灯）が、１日目の最初の服用の前と、７日目および１４日目の全体的眼観察の直後に、すべての眼に関して行われた。眼所見は、ＳＯＰに従って採点されて、標準化データ収集シートを使って記録された。
【００９３】
動物は、１日２回、死亡率／罹病率に関して観察された。動物は、１日目（最初の服用の前に）と１４日目（安楽死の前に）のランダム化の際に重さが量られた。
【００９４】
血液サンプルは、１４日目に安楽死の前に、すべての動物から採取された。動物は、０．１ｍＬ／ｋｇでケタミン／キシラジン・カクテル（７７ｍｇ／ｍＬのケタミン、２３ｍｇ／ｍＬのキシラジン）の静脈注射で麻酔され、そして、７ｍＬの血液が心臓穿刺により採取された。血液採取の時間が記録された。各サンプルは、最終的な服用の１時間±１５分後に採取された。血液は、ラベンダー色のキャップのチューブに採取し、１０秒間、ゆり動かして血液とエチレンジアミン４酢酸の十分な混合を促進し、次いで、凍結保存されるまで氷の上に置かれた。サンプルは、それから薬物動態学的分析のために輸送された。血液採取の後で、動物をＳＯＰに従って、市販されている安楽死溶液の静脈注射により安楽死させた。
【００９５】
１試験群につき２匹の動物は、眼組織の組織病理学的評価のために、ランダムに選択された。組織は、組織病理学的評価のために以下の通りに採取された：眼球除去の前に、両眼は、３〜５ｍＬの平衡塩類溶液（ＢＳＳ）で洗浄された。両方の眼球は、それから摘出された。涙腺および眼瞼を含む周囲組織が、１つの複合体として採取され、１０％の中性緩衝ホルマリン中に入れられた。眼球は、Ｄａｖｉｄｓｏｎ溶液に約２４時間、保存されて、それから７０％のエタノールへ移された。眼球がＤａｖｉｄｓｏｎ溶液とエタノールに置かれた時間を記録した。眼球と涙腺／眼瞼が組織病理学的評価のために提出された。
【００９６】
試験群につき残りの２匹の動物が、眼組織の薬物動態学分析のために使われた。薬物動態学分析のための組織は、以下の通りに採取された：眼球除去の前に、両眼は、３〜５ｍＬのＢＳＳで洗浄された。房水が各眼から採取され、房水の容積が測定された。両方の眼球と、涙腺および眼瞼を含む周囲組織が採取された。涙腺と眼瞼は、別々に秤量された。結膜は、各眼球から採取されて、秤量された。採取された組織は、すべて、液体窒素中で急速凍結された。凍結後に、以下の組織が、各眼球から採取された：角膜、虹彩／毛様体（ｃｉｌｌｉａｒｙ）複合体、硝子体液、網膜／脈絡膜複合体、および強膜。組織は、ＳＯＰに従って採取された。眼球から解剖された組織は、重さが量られ、標識化され、そして凍結保存（−７０℃）された。すべての眼組織は、ＭＰＡ濃度の分析のために、ドライアイス上で輸送された。
【００９７】
１４日間にわたる４％のＮａＭＰＡまたは０．０５％のシクロスポリンの局所投与（１日につき８回）の後で、ＭＰＡとシクロスポリンのレベルは、図１で示すように、異なる眼組織で測定された。スケールが対数であることに注意すべきである。高い薬物濃度は、前部または「眼の前部」構造（例えば、房水、結膜、眼瞼）に存在した。さらに、ＭＰＡの有意なレベルが、より後部または「眼の後部」組織（例えば、硝子体、網膜／脈絡膜）でも見られた。さらに、ＭＰＡが親水性および疎油性であり、そのために、角膜に浸透することが期待されないので、ＮａＭＰＡ製剤による局所投与の後の前部および後部眼組織へのＭＰＡの浸透のこうした高いレベルは、予想外のことである。前部または後部であるにせよ、ＭＰＡのこうした組織でのレベルは、眼の炎症性疾患に対して薬理活性を有することが期待される。
【００９８】
ＮａＭＰＡ製剤とシクロスポリンの間での相対的な眼組織浸透を比較し、活性薬物（すなわち、４％のＮａＭＰＡ対０．０５％のシクロスポリン）の濃度の違いを考慮して、達成された組織濃度の比率が図２に示される。一般に、これらのデータは、多くの眼組織（涙嚢、強膜、房水、虹彩／毛様体、および網膜／脈絡膜）では、局所投与後の眼内浸透が、シクロスポリンによるよりもＮａＭＰＡ製剤で大きいことを示す。１日の急性試験では、ＭＰＡの組織浸透は、図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃで示すように、眼科用製剤（１％、２％、４％のＮａＭＰＡ）においてＮａＭＰＡの濃度に依存することが観察された。
【００９９】
実施例５：Ｃ５７ＢＬ／６マウスのスコポラミン誘発ドライアイに関する試験
このドライアイモデルは、引用により本明細書に取り込まれるＤｅ  Ｐａｉｖａら、２００６，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４７（７）：２８４７−２８５６に記述されたモデルに基づいている。実験設計は、表８に要約される。試験は、各々１０匹の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの７つの群からなるものであった。０日目から初めて、群１〜６のマウスは、対象品目または試験品目の局所的な両側の眼内（ＯＵ）投与により、少なくとも２時間の間隔で、１日４回（ＱＩＤ）処置された。具体的には、群１〜６は、（それぞれ）ビヒクル；０．５％、１．０％、または２．０％でのＮａＭＰＡ；デキサメタゾン（０．１％）；またはＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）（０．０５％のシクロスポリン）で投薬された。群７のマウスは、未処置の対照として用いられた。３日目に、スコポラミンパッチが、マウスの尾に配置されて、その後一日ごとに（Ｑ２Ｄ）置き換えられた。３日目から１２日目までは、マウスは、高容量気流（参照：下記の環境ストレスの章）の環境に維持された。剖検は、１３日目に実行された。
【０１００】
【表８】
2011527339.tif 000016
ＮａＭＰＡ眼科用製剤。０．５％、１％および２％のＮａＭＰＡ（ｗ／ｖ）を含む眼科用製剤が使用された（表１に従って調製）。すべてのＮａＭＰＡ製剤は、２〜８℃で冷凍保存されて、光から保護された。
【０１０１】
陰性対照。陰性対照溶液は、ＮａＭＰＡ溶液を製剤化するのに使用されたビヒクルと同じあったが、ＮａＭＰＡを欠いている。この溶液は、「ビヒクル」と呼ばれる。ビヒクルは、２〜８℃で冷凍保存され、光から保護された。
【０１０２】
陽性対照。最初の陽性対照は、０．１％デキサメタゾン（デキサメタゾン眼科用懸濁液ＵＳＰ、Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）カタログ番号１０３３５４２）の眼科用懸濁液であった。デキサメタゾンは、メーカーの指示通りに制御された室温（２０〜２５℃）に保存された。
【０１０３】
第２の陽性対照は、０．０５％のシクロスポリン（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）；Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）の眼科用エマルジョンであった。Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）は、メーカーの指示通りに制御された室温（２０〜２５℃）に保存された。
【０１０４】
動物。到着時それぞれ１６〜２５ｇの合計７８匹の雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）は、試験で使用するためにＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入された。
【０１０５】
用量投与。投薬のそれぞれの日に（０〜１２日目）、ＮａＭＰＡ製剤または対照製剤は、１日につき４回、処置（５μＬ／眼／用量、ＯＵ、ＱＩＤ）の間隔が最低２時間で、各々の動物の両眼に局所的に投与された。具体的には、群１〜６は、（それぞれ）ビヒクル；０．５％、１．０％または２．０％のＮａＭＰＡ；デキサメタゾン（０．１％）；またはＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）を服用した。群７のマウスは、未処置対照として用いられた。
【０１０６】
ドライアイの誘発。両側の、短期の、可逆的なドライアイが、スコポラミンの皮膚パッチ投与によって、３日目から１２日目にかけて高容量気流の環境でマウスを維持することと組み合わせて、マウスで誘発された。
【０１０７】
脱毛。最初のスコポラミン服用（３日目）の前に、尾の付け根のあたりの毛が脱毛剤で除去された。
【０１０８】
スコポラミンの服用。スコポラミンパッチは、経皮性のスコポラミンパッチ（Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎのカタログ番号２４８２５９２）として入手した。フルサイズのパッチは、各々１．５ｍｇのスコポラミンを含む；したがって、各々の服用のために、個々のパッチは２つに切られ、そして、半分のパッチ（〜０．７５ｍｇ）が、各々の動物に適用された。
【０１０９】
投与のそれぞれの日に、マウスを簡単に拘束した。３日目から開始し（すなわち、ＮａＭＰＡまたは対照製剤での眼の処置の４日目）、その後１日ごとに繰り返し（Ｑ２Ｄ）、半分の経皮性のスコポラミンパッチは、尾に配置された。各々の適用後に、パッチは動物によって取り除かれるのを防ぐためにＶｅｔｗｒａｐ（登録商標）で巻かれ、最高４８時間そのままにした。パッチの適用後、動物は、尾とＶｅｔｗｒａｐ（登録商標）の状態を含むどんな副作用に対してもモニタリングされた。
【０１１０】
環境ストレス。スコポラミン服用に続いて、マウスは、高容量気流（すなわち、層流フードで送風機が１の設定の気流）の環境下に、第３日目から１２日目にかけて最大８時間／日置かれた。
【０１１１】
臨床観察。臨床観察（毒性効果または１つもしくは複数の薬理的効果の明白な徴候を含む）は、順化と処置期間の間に各々の動物について１日１回少なくとも実行された。すべての異常な臨床徴候は記録された。
【０１１２】
体重。すべての動物は、最初の試験／対照品目の服用前に量られ、その後、週２回量られ、そして剖検の際に量られた。
【０１１３】
眼科学。試験に含ませる前に、各々の動物の両眼は、検査された。予備投薬評価は、全体的な眼の観察；細隙灯角膜試験；そして、フェノールレッド綿糸涙液検査法を含んでいた。眼性刺激または異常の徴候を有するマウスは、試験に入れられなかった。試験／対照品目の服用の開始後、角膜試験が、８日目を除いて６日目から１２日目にかけて１日に１回（ＱＤ、ＯＵ）実施された；涙液検査は、１日目から毎日実施された（ＱＤ、ＯＵ）。
【０１１４】
全体的な眼の観察。各々の動物の両眼は、刺激または不快の徴候に関して評価された。何らかの異常が観察されたら、そのような徴候は、標準化データ収集シートに記録された。
【０１１５】
細隙灯角膜試験。各々の動物の両眼は、局所適用されたフルオレセインを使って、細隙灯眼科検査により評価した。フルオレセイン染料は、角膜の表面を調べるのに用いられ、そして採点された。
【０１１６】
剖検。動物は、剖検の直前に安楽死させた。剖検で、各々の動物からの両眼は、眼球、眼瞼、涙腺、および結膜を含んで切除された。これらの組織は、１０％の中性緩衝ホルマリンで固定された。
【０１１７】
病理学。固定の後で、顕微鏡評価は、各々の動物から両眼に対して行われた。少なくとも２つの切片レベルが、組織病理学的に各々の眼に対して調べられた。組織を脱水し、パラフィンに包埋し、連続切片（３〜５μｍの厚さで）とし、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。委員会認定の獣医病理学者は、光学顕微鏡検査によりスライドを評価した。眼の全ての部分の詳細で完全な組織病理学的評価は、角膜、結膜と角膜の上皮（杯細胞を含む）、および涙腺への特別な注意をはらって実行されて、ドライアイ、角膜炎または角膜の他の変化（もし存在するならば）と一致する組織病理を確認した。
【０１１８】
眼は、連続的に切片化されて、調べられた。代表的な角膜は、０は正常、１は最小、２は軽度、３は中程度、そして、４は重度の０〜４のスケールに基づいて採点された。各々の角膜について、以下のパラメーターの各々にスコアが割り当てられた：（ａ）角膜浮腫（角膜実質の浮腫の存在）；（ｂ）表皮の厚み（基底細胞から表層細胞まで数えられた表皮層の上皮細胞の数）；および（ｃ）表皮細胞浮腫（上皮内細胞浮腫の存在）。表皮細胞の厚みに対するスコアは、所定の動物の集団のために存在する細胞層の平均数を表し、それは、この分析において２〜６の範囲であった。したがって、このパラメーターに対する最大のスコアは、４を超える場合がある。
【０１１９】
統計分析。計算と記述統計学（平均、標準偏差）は、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）を使って実行された（Ｏｆｆｉｃｅ  ２００７；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）。必要に応じて、推測統計学分析は、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）またはＰｒｉｓｍ（登録商標）を使って実行された（バージョン５．０１；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。０．０５未満（Ｐ＜０．０５）のｐ値は、統計的に有意であると考えられた。
【０１２０】
連続的正常データ。２群より多い群では、等分散に関するＢａｒｔｌｅｔｔ検定が、複数回投与群からのデータの均一性を決定するのに用いられた。分散が均一である場合は、、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）が使われ、そして、ＡＮＯＶＡが有意であるならば、Ｔｕｋｅｙの多重比較事後検定が続いた。非均一な分散に対しては、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ（ノンパラメトリック）検定が使われ、そして、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定が有意であるならば、Ｄｕｎｎのポスト検定が続いた。
【０１２１】
カテゴリーデータ。組織病理学障害データは、研究病理学者によって分析された。必要に応じて、組織病理学重症度のスコアは、ノンパラメトリック検定を使って、統計学的に分析された。
【０１２２】
結果。眼科用ＮａＭＰＡ製剤は、この試験において使われる最大濃度においてでさえ、１３日間１日４回局所的に投与されるとき、何らの顕著な眼性刺激または副作用の臨床徴候を生じなかった。したがって、これらの眼科用ＮａＭＰＡ製剤は、ドライアイの臨床徴候が存在した時と同様に、ドライアイ誘発の前に（すなわち、通常の条件下で）、マウスで十分に忍容性であった。
【０１２３】
組織病理学分析（参照：表９）では、２％のＮａＭＰＡ群での角膜損傷の減少があった。この効果は、角膜浮腫対ビヒクル対照、そして、未処置群に対する上皮細胞の厚さに関して、統計的有意差（ｐ＜０．０５）に到達した。上皮細胞浮腫に関しては、２％のＮａＭＰＡ群における平均スコアは、ビヒクル対照群におけるそれらの約６３％まで低下したが、この減少は統計的有意差に到達しなかった。全体的に見て、２％のＮａＭＰＡ群における組織病理学的所見の減少は、生物学的に有意であると考えられた。
【０１２４】
陽性対照のデキサメタゾンは、また、角膜に対する損傷を減少させた。この効果は、ビヒクル対照に対する角膜浮腫と上皮細胞の厚み、そして、未処置群に対する角膜浮腫、上皮細胞の厚みおよび上皮細胞浮腫に関して、統計的有意差（ｐ＜０．０５）に達した。しかし、副作用に関して、デキサメタゾン処置動物は、試験の終り（１３日目）までに、他の群と比較して、約２０％の体重減少を経験した。第２の陽性対照（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標））は、測定パラメーターのどれによっても、本試験で予防効果を有しなかった。
【０１２５】
２％のＮａＭＰＡ眼科用製剤は、ドライアイのスコポラミン誘発モデルで有効であることが証明された。この有効性は、組織病理学分析に基づき、そこでは、陰性対照に対する角膜浮腫と上皮細胞の厚みの統計的に有意な減少が観察された。また、１％のＮａＭＰＡ群について、組織病理学的スコアの減少に向かう傾向は、用量応答効果を示唆した。したがって、このデータは、眼科用ＮａＭＰＡ製剤は、ドライアイのラットモデルで眼組織病理を減少させることに有効であり、ドライアイの徴候が存在するときでも十分に忍容性であることを示す。このデータは、眼科用ＮａＭＰＡ製剤は、ヒトでのドライアイの処置に対する可能性があることを証明する。
【０１２６】
【表９】
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実施例６：Ｃｏｎ−Ａ誘発ドライアイを用いた試験
ＮａＭＰＡ含有眼用溶液の活性を評価するために、ドライアイは、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ−Ａ）の涙腺への両側注入によってウサギで誘発された。眼用溶液による処置は、以下に記載されるとおりである。眼検査、臨床試験、および組織病理学は、ドライアイの処置効果を評価するために実施された。
【０１２７】
実験設計は、表１０に要約される。試験は、各々６匹の雄のＮＺＷウサギの７群からなるものであった。群割当ての前に、動物は、獣医学的および眼科学的な検査により調べられた；どんな異常な徴候のウサギも除外された。群１〜５の動物は、（それぞれ）ビヒクル；０．５％、１．０％、または２．０％（ｗ／ｖ）でのＮａＭＰＡ；または０．０５％のシクロスポリン（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標））で投薬された。これらの動物は、０〜１４日目にかけて、それぞれのＮａＭＰＡ／対照溶液の最後の２用量だけが投与された第８日目を除き、両側の眼への局所適用（ＯＵ点眼）により１日４回（ＱＩＤ；各服用の間隔は少なくとも２時間）服用された。群６の動物は、９〜１４日目に、ＯＵ  ＱＩＤ  ０．１％のデキサメタゾン目薬で投薬された。群７のウサギは目薬投与を受けないで、未処置の対照として用いた。８日目に、すべての動物（群１〜７）は、副涙腺への注射により投与されたＣｏｎ  Ａの眼につき、３００μｇ（５０μＬで）が両側の眼に投薬された（参照：下記のＣｏｎ  Ａ注射手順）。
【０１２８】
臨床観察は、局所的な眼への投薬の開始前（０日目前）に、１日１回記録された；ＮａＭＰＡまたは対照溶液（０〜１６日目）の第１および第４の毎日の服用の前後に直ちに記録された；そして、犠牲（１７日目）の前に記録された。異常（特に眼性炎症または刺激）のどんな徴候でも記録された。涙液層破壊時間試験（ＴＢＵＴ）は、以下の通りに実施された：ＮａＭＰＡまたは対照溶液での服用の開始前の連続した３日間（−２日目から０日目）の間；Ｃｏｎ  Ａ注射の前の最初の週（１〜７日目）の間の３回；そして、Ｃｏｎ  Ａ注射の後の間隔（９〜１７日目）で１日１回。ＴＢＵＴは、Ｃｏｎ  Ａ注射の日（８日目）には、行われなかった。体重は、局所的な眼への投薬前に記録された；処置期間中は毎週２回記録された（０〜１６日目）；そして、犠牲（１７日目）の前に記録された。１７日目に、ウサギを安楽死させた。
【０１２９】
【表１０】
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コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，カタログ番号Ｃ５２７５）が、この試験で使用された。Ｃｏｎ  Ａは、−２０℃で保存された。
【０１３０】
０．５％、１％、および２％のＮａＭＰＡ（ｗ／ｖ）を含む眼科用製剤、（表１に従って調製される）が、この試験で使用された。すべてのＮａＭＰＡ溶液は、２〜８℃で冷凍保存し、光を遮断した。
【０１３１】
陰性対照。最初の陰性対照は、ＮａＭＰＡ溶液を製剤化するのに使用されるビヒクルと同じであったが、ＮａＭＰＡを欠いている。この対照溶液は、「ビヒクル」（またはいくつかの例では「Ｖ−ＮＥ」）と呼ばれた。ビヒクルは、２〜８℃で冷凍保存し、光を遮断した。
【０１３２】
第２の陰性対照は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、カタログ番号１８６０４５４；マグネシウムとカルシウムのないＤｕｌｂｅｃｃｏ処方）であった。ＰＢＳは、２〜８℃で冷凍保存された。
【０１３３】
陽性対照。最初の陽性対照は、０．１％デキサメタゾン（ＵＳＰ、Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ、カタログ番号１０３３５４２）の眼科用懸濁液であった。デキサメタゾンは、メーカーの指示通りに制御された室温（２０〜２５℃）に保存された。第２の陽性対照は、０．０５％のシクロスポリン（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標），Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）の眼科用エマルジョンであった。Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）は、メーカーの指示通りに制御された室温（２０〜２５℃）に保存された。
【０１３４】
用量の調合。製剤化と服用で使用する前に、無菌のＰＢＳのｐＨは、〜６．８に調整されて、２−μｍフィルターを通してフィルター滅菌された。ｐＨが調整されたＰＢＳを、使用前に実験台上で室温（最大１時間）に加温した。Ｃｏｎ  Ａは、処方され、６ｍｇ／ｍＬの最終濃度に無菌のＰＢＳ（ｐＨ６．８）で希釈された。Ｃｏｎ  Ａの服用溶液は、使用の前に物理的な状態（濁っている、透明である、その他）について検査されたが、ろ過はされなかった。各用量の投与直前に、Ｃｏｎ  Ａ溶液は、溶液／懸濁液がよく混合されることを確実とするために穏やかにひっくり返された。
【０１３５】
動物。合計４６匹の雄のＮＺＷウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）（到着時それぞれ２．４〜２．６ｋｇ）は、試験で使用するためにＭｙｒｔｌｅ’ｓ  Ｒａｂｂｉｔｒｙ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＮ）から購入された。
【０１３６】
最終的な選択と群の割当て。順化後に、そして、用量の投与開始前に、体重は記録され、そして、動物は、全体的な眼の観察、細隙灯角膜試験、およびＴＢＵＴを含む前処置の獣医学的および眼科的な評価に付された。評価後に、動物は、試験で使用するために解放された。望ましい重さの範囲にいた動物のうちの４２匹が選択されて、各々６匹のウサギの７つの試験群に任意に割り当てられた。動物は、体重と通常の臨床的および眼の症状に基づいて選択された。また、動物は、３つのベースライン試験期間の間に「正常範囲内」および「より少ない変数」のベースラインＴＢＵＴ値に基づく試験に含まれるように選択された。
【０１３７】
用量の投与。群１〜５の動物は、（それぞれ）ビヒクル；０．５％、１．０％、または２．０％（ｗ／ｖ）でのＮａＭＰＡ；または０．０５％のシクロスポリン（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標））で投薬された。これらの動物は、両側の眼への局所適用（ＯＵ点眼）により、１日４回（ＱＩＤ；各服用の間隔は少なくとも２時間）、０〜１６日目にかけて、それぞれのＮａＭＰＡ／対照溶液の最後の２用量だけが投与された第８日目を除き、服用された。群６の動物は、９〜１４日目に、ＯＵ  ＱＩＤ  ０．１％のデキサメタゾン目薬で投薬された。群７のウサギは目薬投与を受けないで、未処置の対照として用いた。
【０１３８】
前処置眼科検診。動物は、既存の眼の病態を有する動物を除外するために、最初の用量を投与する前に、スクリーニングされた。すべての動物が、眼科的に正常範囲内にあることが分かり、試験に編入させるために開放された。
【０１３９】
ドライアイの誘発。両側の、短期の、可逆的なドライアイは、涙腺にＣｏｎ  Ａを注射（８日目に）することによって、ＮＺＷウサギで誘発された。
【０１４０】
Ｃｏｎ  Ａ注射手順。ウサギは、ケタミン：キシラジン（４５：５のｍｇ／ｋｇ）で短時間、麻酔した。Ｃｏｎ  Ａは、１つの眼当たり３００μｇ（６ｍｇ／ｍＬで５０μＬ）の用量で、各々の動物の両眼に注射された。Ｃｏｎ  Ａは、３０ゲージ（１．５インチ針）を有する１ｍｌのツベルクリン注射器を用いて、結膜嚢を通して涙腺の両方に注射された。針はわずかに引っ込められた下眼瞼に沿った鼻眼角から１ｃｍで約１５ｍｍの深さに、眼窩下のスペースに導入された。眼窩の内側の下方に、それから眼の後の周囲に注射した。投与方法は、試験の間中、首尾一貫していた。
【０１４１】
臨床観察。臨床観察（毒性効果または１つもしくは複数の薬理的効果の明白な徴候を含む）は、局所的な眼への投薬開始の前に１日１回記録された；試験品目または対照品目の第１および第４の毎日の服用の直前または直後に記録された（０〜１４日目）；そして、犠牲（１５日目）となる前に記録された。異常のどんな徴候（特に眼の炎症または刺激）も記録された。
【０１４２】
体重。すべての動物は、最初の局所的な眼への用量の投与前に量られ、その後、週２回量られ、そして犠牲の際に量られた。デキサメタゾンを投薬したウサギの重さを必要に応じてより頻繁に量り、可能な減量を評価した。
【０１４３】
眼科学。試験に含ませる前に、各々の動物の両眼を検査して眼が正常な範囲内にあることを確かめた。予備投薬評価（１日目）は、全体的な眼の観察；細隙灯角膜試験；そして、ＴＢＵＴを含んでいた。異常な前区を有するウサギは、試験に含まれなかった。
【０１４４】
０〜１６日目の間、全体的な眼の観察は、臨床観察（すなわち、１日に最高４回）の一部として実行された。０〜１７日目の間、ＴＢＵＴ試験は、以下の通りに実施された：ＮａＭＰＡまたは対照品目での服用の開始前の連続した３日間（−２日目から０日目まで）の間；Ｃｏｎ  Ａ注射の前の週（１〜７日目）の間の３回；そして、Ｃｏｎ  Ａ注射の後（９〜１７日目）で１日１回。ＴＢＵＴ試験は、Ｃｏｎ  Ａ注射の日（８日目）には、行われなかった。ＴＢＵＴ試験は、局所的投薬の前に行われた。
【０１４５】
全体的な眼の観察。各々の動物の両眼は、刺激または不快の徴候について評価された。何らかの異常が観察されたら、そのような徴候は、標準化データ収集シートに記録された。
【０１４６】
涙液層破壊時間試験（ＴＢＵＴ）。ＴＢＵＴ値は、眼球表面中に均一に２％の無菌フルオレセインナトリウムの５μＬをしみ込ませた後に測定された。眼瞼はそれから一度手を使って瞬きさせ（涙液層で均等にフルオレセインを分配するために）、そして、眼瞼を開いたままに保った（さらに瞬くことを防ぐために）。各々の眼は、コバルト色の明るい照明の下で照らされ、そして、細隙灯は、１つ以上の暗い穴または線が眼を覆うフルオレセイン涙液層に現れるのに必要な時間（秒で）を測定するのに使用された。
【０１４７】
統計分析。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの「Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅ（スコポラミンによって誘発されたドライアイの試験）」で記述されるように、すべての統計分析が行われた。
【０１４８】
結果：この実施例では、Ｃｏｎ−Ａ誘発ドライアイモデルは、ウサギで実行された（Ｎａｇｅｌｈｏｕｔら、２００５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２１（２）：１３９−１４８）。ドライアイの臨床測定は、涙液層破壊時間（ＴＢＵＴ）アッセイを用いて行われた。ビヒクル、ＮａＭＰＡ、およびＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）による局所処置は、０日目から１７日目まで行われ、一方、デキサメタゾンが９日目から１７日目まで与えられた。１日に２回投薬される１日（８日目）を除いては、処置は１日４回実施された。ドライアイ誘導は、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）の両側涙腺注射によって、８日目に開始された。
【０１４９】
眼科用ＮａＭＰＡ製剤は、１７日間局所投与されるとき、この試験で使われる最大濃度においてでさえ、何らの顕著な眼性刺激や不利な臨床徴候を生じなかった。
【０１５０】
Ｃｏｎ  Ａ注射の後で、ドライアイは、１１日目に始まり、試験の終わり（１７日目）まで続くビヒクル群でのＴＢＵＴ値の減少で示されるように、誘発された。１４日目から１７日目まで、ＴＢＵＴ値は、ビヒクル群と比較して、２％のＮａＭＰＡと１％のＮａＭＰＡ群で有意に増加した（Ｐ＜０．０５からＰ＜０．００１）。１５日目には、ＴＢＵＴ値は、ビヒクル群と比較して、０．５％のＮａＭＰＡ群で有意に増加した（Ｐ＜０．０５）（表１１と図４）。
【０１５１】
同様に、１４日目から１７日目においては、ＴＢＵＴ値は、ビヒクル群と比較して、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）とデキサメタゾン群では、有意に増加した（Ｐ＜０．０１からＰ＜０．００１）（表１２と図５）。このデータは、ＮａＭＰＡ眼科用溶液のすべての３つの濃度の局所投与が、ドライアイの誘発の間、ＴＢＵＴ値の有意な改善をもたらしたことを示す。１４日目〜１７日目の期間で注目されるＴＢＵＴ値の増加は、ＮａＭＰＡ群では用量応答性であり、１７日目までにＣｏｎ  Ａ注射の前に観察されるベースライン値に戻るか、あるいは近づいた。そのうえ、２％と１％のＮａＭＰＡ群に対して１４日目〜１７日目にわたって観察されたＴＢＵＴ値の改善は、２つの陽性対照、デキサメタゾンおよびＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）について見られるそれと類似していた。
【０１５２】
これらの結果は、眼科用ＮａＭＰＡ製剤が、このモデルでのドライアイのＴＢＵＴパラメーターを修正する際に非常に活性であり、眼科用ステロイド、デキサメタゾンと同様にヒトのドライアイ処置のために承認された処方薬（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標））に対する有効性と等しいことを示す。ＴＢＵＴの測定は、ヒトのドライアイの診断のために認められた臨床基準である（Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ（ＤＥＷＳ）．Ｔｈｅ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ．Ａｐｒｉｌ  ２００７，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．２  ｐｇ．６５−１５２）。ＴＢＵＴは、涙液層の安定性の標準的な測定値であり、そして、それは今度はムチンと脂質を含む涙液層の組成に関連がある。涙液層の時期尚早な離散（それは減少したＴＢＵＴ値によって反映される）は、ドライアイの任意の形態の特徴でもある（Ｋａｌｌａｒａｃｋａｌら、Ｅｙｅ（２００２）１６：５９４−６００）。涙液層の質の異常は、水性涙の産生量が標準的であるときにさえ、徴候的なドライアイをもたらす（Ｌｅｍｐら、１９７１，Ｔｒａｎｓ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  ７５：１２２３−１２２７）。したがって、ＴＢＵＴの変化は、分離の際でさえ、ドライアイで臨床的に重要である。ＮａＭＰＡ処置によるＴＢＵＴ値の改善は、したがって、ヒトのドライアイでの有効性を予測するものである。このドライアイモデルに効果的であることに加えて、眼科用ＮａＭＰＡ製剤は、通常の条件下およびドライアイの徴候が存在した期間（すなわち、ＴＢＵＴの減少）、動物は十分に忍容性であった。このことは、眼科用処置に対する重要な考察であり、そこでは、局所的薬物の忍容性は、ヒトのドライアイの症例がそうであるように、眼性炎症疾患で減少する場合がある。まとめると、このデータは、ヒトでのドライアイの処置における眼科用ＮａＭＰＡ製剤の可能性を示す。
【０１５３】
【表１１】
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【０１５４】
【表１２】
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実施例７：Ｌｅｗｉｓラットでのウシ眼性メラニン誘発ブドウ膜炎を用いる試験
この試験は、ブドウ膜炎の処置の眼用溶液を含むＮａＭＰＡの活性を評価した。ブドウ膜炎は、動物にウシの眼のメラニンを注射することによって、Ｌｅｗｉｓラットで誘発された。処置は、下記のようにされた。眼の検査と組織病理学は、ブドウ膜炎に関しての処置効果を評価するために実施された。
【０１５５】
実験設計は、表１３に要約される。試験は、雄のＬｅｗｉｓラットの８群（すなわち、各々１６匹のラットの７つの群（群１〜７）と８匹のラットの１つの群（群８）からなるものであった。０日目に、ブドウ膜炎は、ウシの眼のメラニン、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）および百日咳毒素のエマルジョンで、皮内（ＩＤ）注射によって、各々の動物で誘発させた。同日（０日目）にスタートして、以下の通りにＮａＭＰＡまたは対照溶液による処置を開始した。群１〜５と８のラットは、（それぞれ）ビヒクル；０．５％、１．０％、または２．０％でのＮａＭＰＡ；デキサメタゾン（０．１％）；またはＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）（０．０５％のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ））を用いて、少なくとも２時間の間隔で、１日４回（ＱＩＤ）の局所的両眼投与を受けた。群６のラットは、ＣｓＡ（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標））の筋肉内（ＩＭ）注射を１日に１回受けた。群５、６および８のラットは、陽性対照（シクロスポリンＡおよびデキサメタゾン）として、群７のラットは、未処置対照として使用された。
【０１５６】
【表１３】
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ＮａＭＰＡ製剤。０．５％、１％および２％のＮａＭＰＡ（ｗ／ｖ）の眼用製剤（表１に従って調製される）が、この試験で使用された。ＮａＭＰＡ溶液は、２〜８℃で冷凍保存され、光を遮断した。
【０１５７】
陰性対照。陰性対照は、ＮａＭＰＡ溶液を製剤化するのに使用されるビヒクルと同じであったが、ＮａＭＰＡを欠いている。この対照は、「ビヒクル」（またはいくつかの例では「Ｖ−ＮＥ」）と呼ばれる。ビヒクルは、２〜８℃で冷凍保存し、光を遮断した。
【０１５８】
陽性対照。最初の陽性対照は、０．１％のデキサメタゾン（ＵＳＰ、Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）、カタログ番号１０３３５４２）の眼用懸濁液であった。デキサメタゾンは、メーカーの指示通りに制御された室温（２０〜２５℃）に保存された。
【０１５９】
第２の陽性対照は、５０ｍｇ／ｍｌのシクロスポリンＡ（シクロスポリン注射（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標））、ＵＳＰ、Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ  （Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，  ＮＹ）、カタログ番号１１００６６７）の注射用エマルジョンであった。注射用シクロスポリンは、メーカーの指示通りに制御された室温（２０−２５℃）に保存された。
【０１６０】
第３の陽性対照は、０．０５％のシクロスポリン（Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）、Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）の眼用エマルジョンであった。Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）は、メーカーの指示通りに制御された室温（２０−２５℃）で保存された。
【０１６１】
動物。合計１２４匹の雄のＬｅｗｉｓラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；株ＬＥＷ／ＳｓＮＨｓｄ）、到着時それぞれ１６０〜１８０ｇは、試験で使用するためにＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入された。
【０１６２】
眼への局所投与。群１〜５と８の動物は、（それぞれ）ビヒクル；０．５％、１．０％、または２．０％でのＮａＭＰＡ；デキサメタゾン（０．１％）；またはＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）（０．０５％のＣｓＡ）を投薬された。投薬のそれぞれの日に、ＮａＭＰＡまたは対照溶液は、処置の間の間隔が最低２時間であって１日につき４回、各々の動物の両眼に局所的に投与された（１０μＬ／眼／用量、ＯＵ、ＱＩＤ）。１５／１６日目には、群５に対する投薬計画は、試験の残存期間の間はＢＩＤに減少させた。これは、この群における有意な体重減少に対応するものであった。
【０１６３】
非経口投与。群６のラットは、１５ｍｇ／ｋｇでのＣｓＡの１日１回の筋内注射を受けた。注射は、ごく最近の体重に基づいて定期的に再計算され、左右の後肢に交互の日に投与される服用量を用いて、０．３ｍＬ／ｋｇで送達された。
【０１６４】
ブドウ膜炎の誘発。両側の実験的な自己免疫前部ブドウ膜炎は、ウシの眼の抽出物（Ｂｒｏｅｋｈｕｙｓｅら、１９９１、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ５２：４６５−４７４）を含むエマルジョンの全身的な投与によって、ラットで誘発された。ここに、この製剤は、「メラニン関連抗原」（ＭＡＡ）とも呼ばれる。ＭＡＡは、ウシの眼から単離されて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により１．４６８ｍｇ／ｍＬの濃度で希釈され、−２０℃で保存された。
【０１６５】
エマルジョン。免疫の日（０日目）に、ＭＡＡ、ＣＦＡおよび百日咳毒素からなる免疫原性エマルジョンは、以下の通りに調製された。ＣＦＡ（４ｍｇ／ｍｌの加熱殺菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＴＢ））を含む）は、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ（Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）からカタログ番号７００１として購入された。ＣＦＡは、免疫化の使用まで４℃に保存された。百日咳毒素は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からカタログ番号Ｐ７２０８（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの百日咳毒素）として購入された。毒素は、免疫化の使用まで２〜８℃に冷凍保存された。使用の直前に、各バイアルの内容物は、滅菌水の０．５ｍＬ（すなわち、１００μｇ／ｍＬ）で再構成された。エマルジョンの調製のために、ＭＡＡ、ＣＦＡおよび毒素は、７：７：１の比率（それぞれ２．３４ｍＬ：２．３４ｍＬ：０．３３ｍＬ）で配合し、そして、少なくとも３０分間、Ｈａｍｉｌｔｏｎの乳化針装置を複数回通過させて乳化した。
【０１６６】
注射。ラットを簡単に拘束し、エマルジョンを尾根に皮内（ＩＤ）注射した（〜１５０μＬ／ラット）。上で処方されるように、この注射剤は、１００μｇのＭＡＡ、２９２μｇのＭＴＢおよび１μｇの毒素の１ラット当たりの用量に対応した。
【０１６７】
眼科学。試験に含ませる前に、各々の動物の両眼を検査して眼が正常な範囲内にあることを確かめた。眼の刺激または異常の徴候を有するラットは、試験に入れなかった。処置期間の７日目から、そして、生前の間中、細隙灯試験が週につき３回実行された。
【０１６８】
眼の観察。各々の動物の両眼は、刺激または不快の徴候について評価された。観察は、標準化データ収集シートを使って採点された。
【０１６９】
細隙灯眼検査。各々の動物の両眼は、細隙灯眼検査により評価された。各々の眼の前区は、調べられ、そして、どんな変化でも記録されて、標準化データ収集シートを使って充血と混濁に関して記録された。
【０１７０】
統計分析。すべての統計分析は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのスコポラミン誘発ドライアイの研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅ）に記載されているように行われた。
【０１７１】
結果：この実施例では、実験的なメラニン誘発ブドウ膜炎（ＥＭＩＵ）のモデルは、Ｌｅｗｉｓラットで実行された（Ｓｍｉｔｈら、２００８，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０：１３６−１４０）。このモデルでは、前部ブドウ膜炎が、ウシの眼のメラニン関連抗原（ＭＡＡ）を用いる全身的な免疫化によって誘発される。
【０１７２】
眼科検査により決定されるように、前区炎症の出現は、一般的に１４〜１５日目頃に始まって、１６〜１８日目頃に最大のスコア値に達し、１９〜２０日目に一定に達し、そして、その後２８／２９日目（観察の最後の日）まで低下した。
【０１７３】
眼用ＮａＭＰＡ製剤は、本試験において使われる最大濃度においてでさえ、最大３０日間１日４回局所的に投与されるとき、何らの顕著な眼性刺激または副作用の臨床徴候を生じなかった。したがって、これらの眼用ＮａＭＰＡ製剤は、ブドウ膜炎の臨床徴候の出現前（すなわち、正常な状態で）、ならびに前区の均一で活発な炎症が、眼科検査により決定されるように存在するとき、ブドウ膜炎の間中、ラットで十分に忍容性であった。
【０１７４】
陽性対照デキサメタゾンとシクロスポリンの投与（筋肉内注射）ならびに２％のＮａＭＰＡの投与は、ビヒクル対照に対する充血と角膜混濁の両方（Ｐ＜０．０５）についての眼のスコアの統計的に有意な減少をもたらす（表１４と１５）。２％のＮａＭＰＡの場合、この減少は、ブドウ膜炎観察期間（２８／２９日目）後半に起き、このことは、前部炎症のわずかにより急速な回復を示した。デキサメタゾンと非経口シクロスポリンの場合、減少が、観察期間の初期（１４／１５日目および１７／１８日目）、ならびに後期（２８／２９日目）の両方で観察され、このことは、ブドウ膜炎のピークスコアの低減ならびに前部炎症の急速な回復を示した。しかし、デキサメタゾン処置ラットは、試験の間、有意な薬物関連の体重減少を経験し、この眼科用ステロイドで処置されたマウスでも観察が認められた（参照：Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅ  ｉｎ  Ｃ５７ＢＬ／６  Ｍｉｃｅ）。さらに、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）（局所的な０．０５％シクロスポリン）群（１８日後に犠牲にされた）において、何らの前区炎症の眼科用スコアパラメーターに関する有意な効果も存在しなかった。
【０１７５】
前区炎症の充血と角膜混濁パラメーターに関する眼用２％ＮａＭＰＡ製剤の統計的に有意な効果に基づき、前部ブドウ膜炎のラットでの良好な忍容性プロファイルと組み合わされて、これらの結果は、局所的ＮａＭＰＡ製剤はヒトのブドウ膜炎に対する治療剤として可能性があることを証明する。
【０１７６】
【表１４】
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【０１７７】
【表１５】
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実施例８：モルモットのオバルブミン誘発ブドウ膜炎を用いる試験
この試験は、モルモットのブドウ膜炎のモデルにおける眼用溶液の活性を評価する。ブドウ膜炎は、０日目にオバルブミンを足蹠に注射することによって動物で誘発される。処置は、下記のように行われる。眼の検査と組織病理学は、炎症への試験品目効果を評価するために、以下でさらに詳細に説明されるように行われる。
【０１７８】
動物（６匹の雄のモルモット／群）は、試験の開始時には約５〜７週令であり、そして、単独で、または、一対ずつＨＥＰＡフィルター装備の靴箱型ケージに寝具、飼料および自由に水が与えられて収容され、１２時間の明サイクルに曝される。
【０１７９】
試験は、以下の動物群が関係する：群１−ビヒクル対照；群２−低用量ＮａＭＰＡ；群３−中用量ＮａＭＰＡ；群４−高用量ＮａＭＰＡ；群５−デキサメタゾン陽性対照；群６−未処置対照。１つのタイプの処置計画では、動物の群は、０日目頃から始めて、それから実験の終わり（３０日目頃）まで毎日続けて、眼用溶液で適宜、処置することができる。陽性対照群（群５）に対する服用計画は、ビヒクル対照（群１）およびＮａＭＰＡ群（群２、３、４）のそれとは異なり、７〜１５日目頃から始めて、３０日目頃まで続く服用のより短い期間を含む。第２のタイプの処置計画では、動物は、眼用溶液で、適宜、約７〜１５日目から始めて、それから実験の終わり（約３０日目）まで毎日続けて処置することができる。陽性対照に対する服用計画は、ビヒクル対照およびＮａＭＰＡ群のそれとは異なり、約７〜２１日目から始めて、それから約３０日目まで続く服用のより短い期間を含む。すべてのタイプの処置計画では、投薬頻度は、１日１回から１日８回までとすることができる。
【０１８０】
ブドウ膜炎は、Ｉｍｊｅｃｔ  ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍａｌ）とコンジュゲートされたオバルブミン（Ｏｖａ  ｇｒａｄｅ  Ｖ、Ｓｉｇｍａ）を０日目と７日目に足蹠に皮下注射することによって動物で誘発される（１００μｌ容積中１ｍｇ）。動物は、オバルブミン目薬（ＰＢＳ中５０μｇ）を１４日目に（場合により、２１日目まで延ばしてもよい）投与することによりオバルブミンでチャレンジされてもよい。臨床観察は、少なくとも１日１回行われ、体重は、試験の前、週２回、および剖検のときに、評価される。前区の検査と眼底検査は、７日目から始めて剖検まで毎日行われる。
【０１８１】
剖検は、３０日目に行われるか、あるいは、試験に対して必要に応じて実行される。剖検は、改変Ｄａｖｉｄｓｏｎ溶液での両眼の固定により、または１つの眼を固定して他方の眼のＯＣＴでの凍結による両眼の摘出を含む。血液は、分析のための剖検（ＥＤＴＡの全血１ｍｌ、血漿、凍結）の後で採取される。
【０１８２】
眼の全ての部分の詳細で完全な組織病理学的評価は、いろいろな炎症性細胞浸潤の重症度と発生率を採点することを含む。特別な注意は、結膜と前区の細胞浸潤に払われる。細胞浸潤は、標準的なヘマトキシリンとエオシン染色を使用して評価されるか、あるいは、他の公知の染色技術（例えば、Ｍａｙ  Ｇｒｕｎｗａｌｄ染色、Ｇｉｅｍｓａ染色、  ＰＡＳ染色）を用いて評価される。いろいろな炎症性細胞の計数は、４００倍率での正方形格子の接眼レンズを使用して、病理学者によって盲検で実行され、そして、細胞数データは、それぞれの試験群の平均と標準偏差のために分析される。
【０１８３】
実施例９：ブタクサ誘発アレルギー性結膜炎に基づく試験
この試験では、能動アナフィラキシーのラットモデルは、アレルギー性結膜炎に関して眼用ＮａＭＰＡ溶液の有効性を評価するのに使用された（Ｍａｇｎｏｎｅら、１９９８，  ”Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ，”  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．８７：７５−８４；Ｍｉｙａｚａｋｉら、２０００，”Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｐｈａｓｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４１：３８５０−３８５５）。実験的な手順のスケジュールは、表１６で示される。
【０１８４】
【表１６】
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感作。ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の麻酔下、動物は、短いブタクサアレルゲン（ＳＲＷ，Ｇｒｅｅｒ，Ｌｅｎｏｉｒ，ＮＣ，ＵＳＡ）  の５０μｇと１ｍｇの水酸化アルミニウム２５μＬのＰＢＳ中の懸濁液を含む足蹠注射を両後肢に受けた。
【０１８５】
チャレンジ。２７日目に、処置の最後の用量を受けた後に、動物は各々の眼で、５μｌのＰＢＳ中の１０００μｇのＳＲＷ懸濁液の局所用量でチャレンジされた。ＳＲＷは、毎日、新鮮に調製され、均一性を確実にするために投与前によく混合し、混合後３時間以内に使用された。
【０１８６】
【表１７】
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ＮａＭＰＡ製剤。この試験で使用される眼科用ＮａＭＰＡ製剤は、表１に従って調製される２％、１％および０．５％のＮａＭＰＡ（ｗ／ｖ）溶液からなるものであった。ＮａＭＰＡ溶液は、暗がりに５℃±３℃で保存された。
【０１８７】
陽性対照。この試験で使用される陽性対照は、１％の酢酸プレドニゾロン（Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）、Ａｌｌｅｒｇａｎ、ロット番号５７２８４）からなるものであった。Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）は、メーカーの指示に従って２５℃±３℃に保存された。
【０１８８】
陰性対照。この試験で使用される陰性対照は、ＮａＭＰＡ溶液を調製するのに用いられる製剤と同じであるが、ＮａＭＰＡを欠いている。この陰性対照は、「ビヒクル」と呼ばれる。ビヒクルは、５℃±３℃で保存された。
【０１８９】
動物。５６匹の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスが、この試験（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において使われた。マウスは、到着時、約６〜８週令であった。
【０１９０】
投薬。２１〜２７日目に、マウスは、表１７に特定されるように、ＮａＭＰＡ、陽性対照、またはビヒクルで１日４回、両眼に投薬された。マウスは、較正されたマイクロピペットを使って、各々の眼の処置に５μＬ滴で中心角膜に局所的に投薬された。２７日目に、マウスは、４用量を受けて、最後の服用の１５分後に、ＳＲＷでチャレンジされた。
【０１９１】
臨床観察。動物は、充血、膨張、および排出物などの眼の所見に特別な注意を払って、毎日観察された。
【０１９２】
動物は、また、痒みを示す洗顔行動の割合に関して、２７日目のチャレンジの３、５、７、および１０分後に観察された。これらの時点の各々で、マウスは、完全に１分間観察されて、Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅに記述されたスケールに従って等級付けされた。
【０１９３】
眼科学。眼科検査は、眼が眼性刺激の少しの徴候も示さなかったことを確かめるために、ベースラインで実行された。眼科検査は、初回用量の投与前の投薬初日と最後の用量の後の２７日目に再び繰り返された、眼科検査は、アレルゲン誘発の１５分後、２７日目にも実行された。
【０１９４】
組織採取と維持。ペントバルビタールナトリウムの致死量を用いて安楽死させた直後に、すべての眼は、いくつかの周囲組織を含む各々の眼の区画を切除することによって採取された。
【０１９５】
組織学と組織病理学。組織学的評価は、以下の細胞タイプの密度等級づけを含んでいた：好酸球、好中球、ＣＤ４＋細胞（すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、およびマクロファージ。評点者は、処置群に対してマスクされた。凍結組織ブロックは、クリオスタットを使って１０μｍの切片に切断し、以下の通りに各々の細胞タイプに特異的な１次抗体で染色した：抗マウス主要塩基性タンパク質（好酸球）；抗マウスＮＩＭＰ−Ｒ１４（好中球）；抗マウスＦ４／８０（単球／マクロファージ系統）；抗マウスＣＤ４（ＣＤ４＋細胞）。１次抗体によるインキュベーションの後で、切片は洗浄されて、そして、適切な蛍光で標識された２次抗体でインキュベーションした。さらに洗浄ステップの後で、切片は免疫蛍光顕微鏡検査によって観るための準備が完了した。免疫蛍光は、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使って２００倍の倍率で調べられた。細胞は、表面の上皮の基底膜と平行に３００μｍの間質の深さまで、円蓋部結膜の３つの別々の視野で各々の動物の１つの眼において手動で数えた。３つの視野の平均は、各々の眼に対して算出された。
【０１９６】
統計分析。各々の動物の両眼は、平均化され、そして、１群内のすべての動物は、各測定パラメーターについて、処置群ごとの平均スコアを得るために平均化された。群間の統計的な有意差は、両側２標本ｔ−検定を用いて決定した。
【０１９７】
結果：２７日目のプレチャレンジ試験で、ＮａＭＰＡの全３つの濃度は、マウスで十分に忍容性であったことを明らかにした。
【０１９８】
図６は、結膜充血、結膜浮腫、排出物および眼瞼浮腫に対するポストチャレンジ結果を表す。データは処置群につきすべての動物の両眼のための平均的臨床スコア（平均の標準誤差（ＳＥＭ）で）として示され、そして、各々の眼でプレチャレンジのベースラインスコアのために修正された：Ｖ＋Ｓ＝処置されたビヒクル、ＳＲＷ感作；ＮＴ＋Ｓ＝未処理、ＳＲＷ感作；Ｖ＋ＮＳ＝処置されたビヒクル、未感作。
【０１９９】
臨床スコアは、ＳＲＷでチャレンジする直前に、あるいはＳＲＷでチャレンジされた１５分後に、０〜４のスケールで等級付けされた（参照：Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）。
【０２００】
図６で示すように、ポストチャレンジ試験は、他の全てのビヒクル群または未処置対照群（群５〜７）と比べて、すべてのＮａＭＰＡ処置群とＰｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）処置群（群１〜４）では、結膜充血がより少なかったことを明らかにした。この減少は、群６および７に対する２．０％のＮａＭＰＡ群の場合、統計的に有意（ｐ＜０．０５）であったし、群７に対する１．０％と０．５％のＮａＭＰＡ群とＰｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群の場合、統計的に有意（ｐ＜０．０２）であった。ビヒクルと未処置の対照群よりわずかに少ない結膜浮腫がＮａＭＰＡ処置群に見られたが、これらの減少は、統計的に有意ではなかった。Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群は、最低の結膜浮腫を示したが、これは、群６（ｐ＜０．００１）と群７（ｐ＜０．０２）に対して統計的に有意であった。群間では涙を流すこと／排出物における一貫した違いはなかった。
【０２０１】
２％のＮａＭＰＡ群は、Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）を含む他の全ての群よりも、最低の眼瞼浮腫を示した。この減少は、未処置／感作群（群６）に対して、統計的に有意（ｐ＜０．０１）であった。
【０２０２】
図７は、痒みと洗顔行動の試験結果を示す。データは、両眼におけるＳＲＷでのチャレンジの３、５、７および１０分後に観察された平均の痒みと洗顔行動のスコア（平均の標準誤差、ＳＥＭ）として示される。ビヒクル群（Ｖ＋Ｓ  ｐ＜０．０２）、未処置群（ＮＴ＋Ｓ  ｐ＜０．００１）および未感作群（Ｖ＋ＮＳ  ｐ＜０．０５）に対する２％のＮａＭＰＡ群では、そしてビヒクル群（ｐ＜０．０５）、および未処置群（ｐ＜０．０１）に対する１％のＮａＭＰＡ群では、１０分でのスコアに統計的に有意な減少があった：図７で示すように、ＮａＭＰＡの全３つの濃度による処置は、Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）を含むすべての非ＮａＭＰＡ群で、痒み／洗顔行動が劇的に増加したとき、他の全ての群よりも、特に、１０分の時点で、痒み／洗顔行動のより低い発生率をもたらした。Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群での痒み／洗顔行動は、他の対照群よりわずかに低かったが、しかし、この差は統計的に有意ではなかった。
【０２０３】
図８は、ＳＲＷチャレンジ後の結膜での浸潤性ＣＤ４＋細胞の数を表す。データは、３つの別々の視野のＣＤ４＋細胞の平均数である。群平均は、左の図に示される；各々の動物からの個々のデータ（３つの視野の平均）は、右側に示される。
【０２０４】
図８で示すように、浸潤性ＣＤ４＋細胞（すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞）の数は、２％のＮａＭＰＡ群およびＰｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群で最も少なかった。これらの減少は、２％のＮａＭＰＡ群対群７（Ｖ＋ＮＳ；ｐ＜０．０１）の場合に、そして、Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群と群６（ＮＴ＋Ｓ；ｐ＜０．０５）と群７（ｐ＜０．０１）の間では、統計的に有意差があった。
【０２０５】
図９は、ＳＲＷチャレンジ後の結膜の浸潤性マクロファージの数を表す。データは３つの別々の視野のマクロファージの平均数である。群平均は、左の図に示される；各々の動物からの個々のデータ（３つの視野の平均）は、右側に示される。群１（２％のＮａＭＰＡ）対群６（ＮＴ＋Ｓ；ｐ＜０．０５）と群７（Ｖ＋ＮＳ；ｐ＜０．０１）では、そして群４（Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標））と群７（ｐ＜０．０５）の間では、浸潤性マクロファージの数は、統計的に有意に減少した。
【０２０６】
ＮａＭＰＡは、この試験において使われる最大濃度においてでさえ、何らの顕著な眼性刺激または副作用の臨床徴候をもたらさないでマウスで十分に忍容性であった。痒み／洗顔行動、臨床応答の複数のパラメーター、および浸潤性炎症性細胞の数の統計的に有意な減少は、局所的なＳＲＷチャレンジに応じてＮａＭＰＡ処置群で観察された。このモデルとその改変は、アレルギー性結膜炎を証明する際に効果的であることを複数の研究所で示されており、眼性アレルギーの基礎をなしている免疫学的メカニズムを解明するのを助けるのに役立っている（Ｍａｇｏｎｅら、１９９８，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ  ８７：７５−８４；Ｇｒｏｎｅｂｅｒｇら、２００３，Ａｌｌｅｒｇｙ  ５８：１１０１−１１１３；Ｍｉｙａｚａｋｉら、２０００，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４１：３８５０−３８５５；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、２００６，ＭｏＩ  Ｖｉｓｉｏｎ  １２：３１０−３１７；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、２００５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５：４８９７−４９０３；Ｓｔｅｒｎら、２００５，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４６：３２３９−３２４６）。マウスのＢａｌｂ／Ｃ株は、複数の研究において、このモデルで適切であることが示された（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、２００６；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、２００５；Ｓｔｅｒｎら、２００５）。まとめると、このデータは、眼科用ＮａＭＰＡ製剤には、アレルギー性結膜炎のモデルで臨床徴候と組織病理学的所見を減らすのに効果的であり、したがって、ヒトでのアレルギー性結膜炎の予防と処置へのかなりの可能性があることを示す。
【０２０７】
実施例１０：アレルギー性結膜炎の化合物４８／８０誘発徴候のウサギモデルを用いる試験
この試験は、ニュージーランド白（ＮＺＷ）ウサギで化合物４８／８０によって誘発されるアレルギー性結膜炎のモデルを使用して、アレルギー反応の眼性徴候の発症を予防する際の眼用ＮａＭＰＡ溶液の効果を評価した。
【０２０８】
眼性アレルギーは、肥満細胞によって主に媒介され、それは、炎症誘発性メディエーターを含む免疫細胞である。ＩｇＥの架橋結合による脱顆粒の際に、肥満細胞は、ヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、走化因子、インターロイキン、ならびに他のサイトカインや血管作用性アミンを放出する。これらの物質（例えば、ヒスタミンおよびプロスタグランジン）の一部は、直接血管と神経に直接的に影響を及ぼすが、他のものは好中球、好酸球およびマクロファージなどの炎症性細胞の遊走をもたらす。同時に、これらのメディエーターは、眼性アレルギーの徴候と症候を引き起こす。
【０２０９】
化合物４８／８０は、Ｎメチル−ｐ−メトキシフェネチルアミンとホルムアルデヒドの縮合生成物であり、抗原抗体結合なしで肥満細胞の脱顆粒を起こす。それは、潜在的抗アレルギー性化合物のための予備スクリーニングとして広く使われている（Ａｂｅｌｓｏｎ  ら、１９８３，”Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ  ｉｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ，”Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１０１：６３１−６３３；Ｋｈｏｓｒａｖｉら、１９９５，”Ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｕｖｅｉｔｉｓ  ｍｏｄｅｌｓ：Ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ  ｗｉｔｈ  ｓｏｍｅ  ｍａｒｋｅｔｅｄ  ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｒｅｓ．４４：４７−５４；Ｕｄｅｌｌら、１９８１，”Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  ｏｃｕｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ  ｍａｓｔ−ｃｅｌｌ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０），”Ａｍｅｒ  Ｊｏｕｒ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．９１：２２６−２３０）。さらに、化合物４８／８０は、特にヒトの鼻粘膜、皮膚および他の組織に位置する肥満細胞と対照的に結膜肥満細胞の脱顆粒を誘発する際に効果的であることが示された（参照：Ａｂｅｌｓｏｎら、上記；Ｃｈｕｒｃｈら、１９９１，”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ，”Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２１：Ｓｕｐｐｌ  ３：１−９）。
【０２１０】
ＮａＭＰＡ。この試験において使われる眼科用ＮａＭＰＡ製剤は、表１に従って調製される２％、１％および０．５％のＮａＭＰＡ（ｗ／ｖ）溶液からなるものであった。ＮａＭＰＡ溶液は、暗所に５℃±３℃で保存された。
【０２１１】
陽性対照。この試験において使われる陽性対照は、１％の酢酸プレドニゾロン（Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）、Ａｌｌｅｒｇａｎ、ロット番号５７２８４）からなるものであった。Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）は、メーカーの指示に従って２５℃±３℃に保存された。
【０２１２】
陰性対照。この試験において使われる陰性対照は、ＮａＭＰＡを欠くこと以外は、ＮａＭＰＡ溶液を調製するのに用いられる製剤と同じであった。この陰性対照は、「ビヒクル」と呼ばれる。ビヒクルは、５℃±３℃で保存された。
【０２１３】
動物。３６匹のニュージーランド白色（ＮＺＷ）成熟雄ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）が、この試験において使われた。ウサギは、重量約１．５〜２．５ｋｇであったし、到着時には、少なくとも１１週令であった。ウサギは、登録された商業畜産家から得た。
【０２１４】
【表１８】
2011527339.tif 000026
化合物４８／８０のチャレンジ。７日目に、処置の最後の用量を受けた１５分後に、較正されたマイクロピペットを使って、動物は、両眼で化合物４８／８０の３０ｍｇ／ｍＬの２５μｌ局所的用量でチャレンジされた。化合物４８／８０は、チャレンジの日に新しく調製され、混合の３時間以内に使われて、均一性を確実にするために投与前によく混合された。
【０２１５】
【表１９】
2011527339.tif 000027
投薬。１〜７日目に、ウサギは、ＮａＭＰＡ、陽性対照またはビヒクルを用いて、１日に４回、表１９に特定されるように、局所的に両眼に投薬された。ウサギは、較正されたマイクロピペットを使って、各々の眼の処置に４０μＬの目薬で投薬された。７日目に、動物は、４用量を受けて最後の用量の１５分後にチャレンジされた。すべての用量は、用量間隔が少なくとも２時間はある状態で送達された。
【０２１６】
眼科学。眼科検査は、眼が眼性刺激の少しの徴候も示さなかったことを確かめるために、ベースライン（試験参加）で実行された。４回目の服用が動物の忍容性を試験するために投与された後、それらは１日目に再検査された。
【０２１７】
７日目に、試験は、チャレンジ直前に、そしてチャレンジの５、１０、１５、２０および３０分後に、繰り返された。スコアリングは、Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（アレルギー反応の等級付けシステム）に従って行われた。臨床徴候（３つの血管床の結膜注射、結膜浮腫、および排出物）が等級付けされた。
【０２１８】
組織採取と保存。眼球は犠牲の後ですぐに摘出し、少なくとも１０時間、しかし、２４時間を超えることなく、Ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｂｏｕｉｎ’ｓ／Ｄｕｂｏｓｃｑ−Ｂｒａｚｉｌ  Ｆｌｕｉｄ固定液で固定され、それから７０％エタノールへ移した。組織は包埋されて、中央垂直平面で切断（厚さ５μｍ）されて、評価のために染色された。
【０２１９】
統計分析。各々の動物の両眼に対するスコアのデータは、平均化されて、そして、群内のすべての動物のためのデータは、各測定パラメーターごとに各処置群の平均スコアを得るために平均化された。群間の統計的な有意差は、両側２−標本ｔ検定を使って決定された。
【０２２０】
結果：ＮａＭＰＡは、この試験において使われる最大濃度においてでさえ、１日４回、局所的に７日間投与されるとき、何らの眼性刺激または副作用の臨床徴候をもたらさず、ウサギで十分に忍容性であった。
【０２２１】
図１０は、結膜充血の分析を示す。データは、両眼での化合物４８／８０による局所的チャレンジの５、１０、１５、２０、および３０分後の平均の結膜充血スコア（スケール＝０〜４）である。
【０２２２】
図１０で示すように、他の全ての処置群（図２）と比較すると、わずかに少ない結膜充血がほとんどの時点の１．０％のＮａＭＰＡ群で存在していた。その減少は、チャレンジ後の２０分および３０分では、未処置群に対して統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。チャレンジ後の１０分、２０分および３０分では、Ｐｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群は、ビヒクルと比較して、下方の上強膜充血が統計的に有意に減少した。
【０２２３】
図１１は、排出物スコアを示す。データは、両眼での化合物４８／８０による局所的チャレンジの５、１０、１５、２０、および３０分後の平均の排出物スコア（スケール＝０〜４）である。統計的に有意な減少が、２０分の１．０％ＮａＭＰＡ群対未処置群（Ｐ＜０．０５）で、３０分の２％ＮａＭＰＡ群対ビヒクル群（ｐ＜０．０５）で、そして、３０分のＰｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群対ビヒクル群（ｐ＜０．０２）にあった。
【０２２４】
図１２は、結膜浮腫分析を示す。データは、両眼での化合物４８／８０による局所的チャレンジの５、１０、１５、２０、および３０分後の平均の結膜浮腫スコア（スケール＝０〜４）である。統計的に有意な減少が、２０分（ｐ＜０．００１）および３０分（ｐ＜  ０．０５）の２．０％ＮａＭＰＡ群対ビヒクル群、ならびに２０分（ｐ＜０．０５）のＰｒｅｄ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）群対ビヒクル群にあった。
【０２２５】
ＮａＭＰＡは、この試験において使われる最大濃度においてでさえ、１日４回、局所的に７日間投与されるとき、何らの顕著な眼性刺激または副作用の臨床徴候をもたらさず、ウサギで十分に忍容性であった。
【０２２６】
これらの結果は、眼科用ＮａＭＰＡ製剤がウサギで化合物４８／８０によって誘発される結膜充血、結膜浮腫および排出物の臨床徴候を減らすことに効果的だったことを示す。これは、ＮａＭＰＡの抗炎症性効果の徴候でありえて、さらにＮａＭＰＡがアレルギー反応の後期段階と関連した炎症を減らすことに効果的である可能性を示唆し、そこでは、リンパ球（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）が突出した役割を果たしうる。ＮａＭＰＡの２つの最大濃度によるこれらのパラメーターの減少は、おそらく、より決定的な抗炎症性効果が、ＮａＭＰＡのより高濃度、拡大服用計画および／または異なる製剤とともに見られるかもしれないことを示す。
【０２２７】
要約すると、結果は、眼性炎症性疾患の複数のモデルで、眼科用ＮａＭＰＡ製剤の効果を証明している。データの標準的な統計分析を使って、有効性が臨床観察（例えば、結膜充血、眼瞼浮腫）、痒み／洗顔行動、結膜浮腫、排出）、機能的な評価（例えば、ＴＢＵＴ）または組織学的評価（組織病理学、細胞浸潤）によって証明された。ＮａＭＰＡは、ドライアイとアレルギー性結膜炎のモデルにおいて、多くの場合、陽性対照のデキサメタゾンとＲｅｓｔａｓｉｓ（登録商標）の効力に匹敵あるいは凌駕して、非常に有効であった。そのうえ、ＮａＭＰＡ活性は、組織病理学的所見に基づき、前部ブドウ膜炎のモデルで証明された。試験されるあらゆるモデルと種において、眼科用ＮａＭＰＡ製剤の局所投与は、通常の状況の下で、そして、眼性炎症疾患の臨床徴候の間、十分に忍容性であった。合わせて考えると、眼科用ＮａＭＰＡ製剤の局所投与が、眼性炎症疾患のこれらのモデルの複数の眼組織の臨床徴候、眼の機能および組織病理学に有益な効果を有することをデータは示す。これらの知見は、局所投与の後で眼科用ＮａＭＰＡ製剤によって複数の眼組織の浸透を示す、図１、２、３および表４に示されるデータと一致している。
【０２２８】
実施例１１：アレルギー応答に対する等級付けシステム
以下の等級付けシステムが、前述の実施例でのアレルギー応答を評価するために使用された。
【０２２９】
結膜充血（結膜、毛様体、上強膜血管床の等級付け）
０．０  正常な血管の結膜が角膜輪部への注射なしで見える。
１．０−少量の限局性注射
２．０−結膜の白色領域の半分未満をカバーする血管の深紅色の注射
３．０−結膜の大部分をカバーする注射であるが、白色可視領域がまだある。血管を多少まだ区別できる。
４．０−ほとんど全ての結膜をカバーしている拡散性の牛肉様赤色の注射。ほとんど別の血管を識別することは不可能。
【０２３０】
結膜浮腫
０．０−結膜の非腫脹
１．０−結膜のわずかな拡散または領域的腫脹。血管はまだ非常によく見える。
２．０−結膜の明らかな一般的腫脹。血管はまだ識別可能である。
３．０−結膜の非常に著しい腫脹。深い血管を見ることは困難
４．０−混濁結膜。血管の間の完全分離。表在性血管は見ることができない。瞬膜と瞼板の膨れと腫脹。
【０２３１】
涙を流すこと／排出
１．０−涙三角のわずかな突出
２．０−涙三角または涙を流すことの中程度の突出
３．０−涙三角または涙を流すことの顕著な突出
４．０−涙三角および眼から涙が著しくあふれ出る顕著な突出
眼瞼浮腫。
１．０−眼瞼縁のわずかな腫れ
２．０−眼瞼裂のわずかな減少
３．０−眼瞼裂（閉じてはいない）の著しい減少
４．０−腫れて閉じた眼瞼
顔面洗浄行動／痒み感
０−痒み感／顔面洗浄行動がない
２−５秒間につき、頭を＞１０回拭う、１分間につき＞３回
１−５秒間につき、頭を＞１０回拭う、１分間につき＜３回
＊注−０．５単位が任意の眼のスコアに考慮される。
【０２３２】
本出願で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書がすべての目的のために引用によって取り込まれると同程度に、すべての目的のためにその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０２３３】
いろいろな特定の実施形態が例示されて記述されたが、１つまたは複数の本発明の精神と範囲から逸脱することなく、いろいろな変化がなされうることが理解されるであろう。
【図１】
2011527339.tif 000028
【図２】
2011527339.tif 000029
【図３Ａ】
2011527339.tif 000030
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2011527339.tif 000032
【図４】
2011527339.tif 000033
【図５】
2011527339.tif 000034
【図６】
2011527339.tif 000035
【図７】
2011527339.tif 000036
【図８】
2011527339.tif 000037
【図９】
2011527339.tif 000038
【図１０】
2011527339.tif 000039
【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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2011527339.tif 000043
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