(57)【要約】  本発明は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子およびｐＬＳＥＣｔｉｎの両方の全長ｃＤＮＡおよび遺伝子の新規のヌクレオチド配列を含む新たなブタＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬＳＥＣｔｉｎタンパク質をコードする独特なおよび全体的なゲノム配列のクローニング、同定および特徴付けに関する。また、ブタ単球由来樹状細胞から新たに発見したブタＩＣＡＭ−３アイソフォームをコードする核酸分子およびそれらの使用を提供する。具体的には、本発明は、ブタＤＣ−ＳＩＧＮ、ブタＩＣＡＭ−３、ブタＬＳＥＣｔｉｎをコードするヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列の相補体もしくはヌクレオチド配列の機能的な定義された部分のうち１つ以上を含む単離された核酸分子またはブタもしくはヒト起源であり得るタンパク質に連結したタンパク質融合産物に関する。新たなブタ遺伝子を単離およびクローニングするため、ならびにウイルス、特に、エンベロープウイルスを繁殖させるための改良された方法において、新たなヌクレオチド配列を使用するための方法についても、本明細書においてさらに説明する。本発明は、ブタタンパク質、新たな抗体などを安定に発現することができる新たなトランスフェクト細胞または細胞系統をさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３およびｐＬＳＥＣｔｉｎからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つの相補体、ならびに前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つの機能的な定義された部分を含む単離された核酸分子。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列は融合タンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記融合タンパク質は少なくとも２つのタンパク質を含み、ｐＬＳＥＣｔｉｎが、ｐＤＣ−ＳＩＧＮか、または２つのタンパク質のうちの少なくとも１つの機能的な定義された部分に連結されている、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記融合タンパク質は、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質、またはその機能的な定義された部分をさらに含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記融合タンパク質は、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質、またはその機能的な定義された部分をさらに含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記融合タンパク質は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮまたはｐＬＳＥＣｔｉｎの炭水化物認識ドメインと、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎの細胞質尾部、膜貫通ドメインもしくは反復ネック領域またはそれらの組み合わせとを含有する、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項７】
ｐＤＣ−ＳＩＧＮをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１またはその相補鎖を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
ｐＩＣＡＭ−３をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号４、配列番号３９またはその相補鎖を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
ｐＬＳＥＣｔｉｎをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号３６またはその相補鎖を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか一項に記載の核酸分子を含有する生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスベクター。
【請求項１１】
前記ベクターはｐＴｒｉＥｘ−１．１Ｎｅｏである、請求項１０に記載の生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスベクター。
【請求項１２】
ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３およびｐＬＳＥＣｔｉｎからなる群から選択される少なくとも１つ以上のタンパク質、ヌクレオチド配列の少なくとも１つの相補体ならびにそれらの機能的な定義された部分を発現する単離されたトランスフェクト細胞または細胞系統。
【請求項１３】
前記細胞または細胞系統は融合タンパク質を発現する、請求項１２に記載の細胞または細胞系統。
【請求項１４】
前記融合タンパク質は少なくとも２つのタンパク質を含み、ｐＬＳＥＣｔｉｎが、ｐＤＣ−ＳＩＧＮか、または２つのタンパク質のうちの少なくとも１つの機能的な定義された部分に連結されている、請求項１３に記載の細胞または細胞系統。
【請求項１５】
前記融合タンパク質は、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質、またはその機能的な定義された部分をさらに含む、請求項１３に記載の細胞または細胞系統。
【請求項１６】
前記融合タンパク質は、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質、またはその機能的な定義された部分をさらに含む、請求項１４に記載の細胞または細胞系統。
【請求項１７】
前記融合タンパク質は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮまたはｐＬＳＥＣｔｉｎの炭水化物認識ドメインと、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎの細胞質尾部、膜貫通ドメインもしくは反復ネック領域またはそれらの組み合わせとを含有する、請求項１５に記載の細胞または細胞系統。
【請求項１８】
前記細胞または細胞系統は、樹状細胞、マクロファージ細胞、単球系細胞、リンパ系細胞および絨毛細胞からなる群から選択される、請求項１２、１３、１４または１５のいずれか一項に記載の細胞または細胞系統。
【請求項１９】
前記細胞または細胞系統は、ＢＨＫ−２１、ＭＡＲＣ−１４５、ＰＫ−１５、ＣＯＳ−７、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、Ｒａｊｉ  Ｂ、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｄ４／３１、ＳＪＰＬ、ＩＰＥＣ−Ｊ２、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７、ＭＡ−１０４、２９３ＴおよびＳＴ細胞からなる群から選択される、請求項１２、１３、１４または１５のいずれか一項に記載の細胞または細胞系統。
【請求項２０】
タンパク質産物の産生のための方法であって、適切な栄養条件下で、請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のいずれか一項に記載の核酸分子でトランスフェクトされた原核または真核細胞を、前記タンパク質産物の発現を可能にする様式で増殖させる工程と、前記核酸分子の発現の所望されるタンパク質産物を単離する工程とを含む方法。
【請求項２１】
配列番号２、配列番号５または配列番号３７を含む単離されたタンパク質。
【請求項２２】
配列番号２、配列番号５または配列番号３７のアミノ酸配列に特異的に結合する単離されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
【請求項２３】
前記抗体はポリクローナルであり、そして前記ポリクローナル抗体は、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１３および配列番号１４の組み合わせを含むペプチド領域に特異的に結合する、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統。
【請求項２５】
配列番号２、配列番号５または配列番号３７のアミノ酸配列に特異的に結合する天然のまたは人工的に合成されたオリゴ糖リガンド。
【請求項２６】
（ａ）ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３およびｐＬＳＥＣｔｉｎからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つの相補体、ならびに前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つの機能的な定義された部分を含有するトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する工程と；
（ｂ）前記トランスフェクト細胞または細胞系統を増殖培地において増殖させて、培養物を形成する工程と；
（ｃ）前記培養物にウイルスを播種する工程と；
（ｄ）前記播種された培養物を、培養物中でウイルスを繁殖させるのに有効な条件下でインキュベートする工程と
を含む、ウイルスを繁殖させるための方法。
【請求項２７】
細胞変性効果が観察されるか、または高い力価が達成されるまで、前記播種された培養物をインキュベートする工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞を溶解して、細胞内のビリオンを放出させ、そしてウイルス抗原を採取する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ａ）は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項２６、２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ａ）における融合タンパク質は少なくとも２つのタンパク質を含み、ｐＬＳＥＣｔｉｎが、ｐＤＣ−ＳＩＧＮか、または２つのタンパク質のうちの少なくとも１つの機能的な定義された部分に連結されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ａ）における融合タンパク質は、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質、またはその機能的な定義された部分をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ａ）における融合タンパク質は、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質、またはその機能的な定義された部分をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ａ）における融合タンパク質は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮまたはｐＬＳＥＣｔｉｎの炭水化物認識ドメインと、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎの細胞質尾部、膜貫通ドメインもしくは反復ネック領域またはそれらの組み合わせとを含有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ａ）は、配列番号１またはその相補鎖を含むヌクレオチド配列を含有するトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項２６、２７または２８に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ａ）は、配列番号４、配列番号３９またはその相補鎖を含むヌクレオチド配列を含有するトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項２６、２７または２８に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）は、配列番号３６またはその相補鎖を含むヌクレオチド配列を含有するトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項２６、２７または２８に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）は、樹状細胞、マクロファージ細胞、単球系細胞、リンパ系細胞および絨毛細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項２６、２７または２８に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ａ）は、ＢＨＫ−２１、ＭＡＲＣ−１４５、ＰＫ−１５、ＣＯＳ−７、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、Ｒａｊｉ  Ｂ、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｄ４／３１、ＳＪＰＬ、ＩＰＥＣ−Ｊ２、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７、ＭＡ−１０４、２９３ＴおよびＳＴ細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項２６、２７または２８に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ａ）は、樹状細胞、マクロファージ細胞、単球系細胞、リンパ系細胞および絨毛細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
工程（ａ）は、ＢＨＫ−２１、ＭＡＲＣ−１４５、ＰＫ−１５、ＣＯＳ−７、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、Ｒａｊｉ  Ｂ、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｄ４／３１、ＳＪＰＬ、ＩＰＥＣ−Ｊ２、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７、ＭＡ−１０４、２９３ＴおよびＳＴ細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ａ）は、樹状細胞、マクロファージ細胞、単球系細胞、リンパ系細胞および絨毛細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
工程（ａ）は、ＢＨＫ−２１、ＭＡＲＣ−１４５、ＰＫ−１５、ＣＯＳ−７、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、Ｒａｊｉ  Ｂ、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｄ４／３１、ＳＪＰＬ、ＩＰＥＣ−Ｊ２、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７、ＭＡ−１０４、２９３ＴおよびＳＴ細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
工程（ａ）は、樹状細胞、マクロファージ細胞、単球系細胞、リンパ系細胞および絨毛細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
工程（ａ）は、ＢＨＫ−２１、ＭＡＲＣ−１４５、ＰＫ−１５、ＣＯＳ−７、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、Ｒａｊｉ  Ｂ、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｄ４／３１、ＳＪＰＬ、ＩＰＥＣ−Ｊ２、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７、ＭＡ−１０４、２９３ＴおよびＳＴ細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
工程（ａ）は、樹状細胞、マクロファージ細胞、単球系細胞、リンパ系細胞および絨毛細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
工程（ａ）は、ＢＨＫ−２１、ＭＡＲＣ−１４５、ＰＫ−１５、ＣＯＳ−７、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、Ｒａｊｉ  Ｂ、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｄ４／３１、ＳＪＰＬ、ＩＰＥＣ−Ｊ２、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７、ＭＡ−１０４、２９３ＴおよびＳＴ細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
工程（ａ）は、樹状細胞、マクロファージ細胞、単球系細胞、リンパ系細胞および絨毛細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
工程（ａ）は、ＢＨＫ−２１、ＭＡＲＣ−１４５、ＰＫ−１５、ＣＯＳ−７、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、Ｒａｊｉ  Ｂ、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｄ４／３１、ＳＪＰＬ、ＩＰＥＣ−Ｊ２、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７、ＭＡ−１０４、２９３ＴおよびＳＴ細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
工程（ａ）は、樹状細胞、マクロファージ細胞、単球系細胞、リンパ系細胞および絨毛細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３４に記載の方法。
【請求項５０】
工程（ａ）は、ＢＨＫ−２１、ＭＡＲＣ−１４５、ＰＫ−１５、ＣＯＳ−７、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、Ｒａｊｉ  Ｂ、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｄ４／３１、ＳＪＰＬ、ＩＰＥＣ−Ｊ２、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７、ＭＡ−１０４、２９３ＴおよびＳＴ細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３４に記載の方法。
【請求項５１】
工程（ａ）は、樹状細胞、マクロファージ細胞、単球系細胞、リンパ系細胞および絨毛細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５２】
工程（ａ）は、ＢＨＫ−２１、ＭＡＲＣ−１４５、ＰＫ−１５、ＣＯＳ−７、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、Ｒａｊｉ  Ｂ、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｄ４／３１、ＳＪＰＬ、ＩＰＥＣ−Ｊ２、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７、ＭＡ−１０４、２９３ＴおよびＳＴ細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
工程（ａ）は、樹状細胞、マクロファージ細胞、単球系細胞、リンパ系細胞および絨毛細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５４】
工程（ａ）は、ＢＨＫ−２１、ＭＡＲＣ−１４５、ＰＫ−１５、ＣＯＳ−７、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、Ｒａｊｉ  Ｂ、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｄ４／３１、ＳＪＰＬ、ＩＰＥＣ−Ｊ２、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７、ＭＡ−１０４、２９３ＴおよびＳＴ細胞からなる群から選択されるトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する、請求項３６に記載の方法。
【請求項５５】
前記ウイルスはエンベロープまたは非エンベロープウイルスである、請求項２６、２７または２８に記載の方法。
【請求項５６】
前記ウイルスは、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス、ブタ呼吸器型コロナウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ内在性レトロウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、感染性胃腸炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ブタサイトメガロウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、シンドビスウイルス、単純ヘルペスウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスおよびウマ動脈炎ウイルスからなる群から選択されるエンベロープウイルスである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ウイルスはエンベロープまたは非エンベロープウイルスである、請求項２９に記載の方法。
【請求項５８】
前記ウイルスは、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス、ブタ呼吸器型コロナウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ内在性レトロウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、感染性胃腸炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ブタサイトメガロウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、シンドビスウイルス、単純ヘルペスウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスおよびウマ動脈炎ウイルスからなる群から選択されるエンベロープウイルスである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ウイルスは、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス、ブタ呼吸器型コロナウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ内在性レトロウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、感染性胃腸炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ブタサイトメガロウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、シンドビスウイルス、単純ヘルペスウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスおよびウマ動脈炎ウイルスからなる群から選択されるエンベロープウイルスである、請求項３７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ウイルスは、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス、ブタ呼吸器型コロナウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ内在性レトロウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、感染性胃腸炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ブタサイトメガロウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、シンドビスウイルス、単純ヘルペスウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスおよびウマ動脈炎ウイルスからなる群から選択されるエンベロープウイルスである、請求項３８に記載の方法。
【請求項６１】
前記ウイルスは、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス、ブタ呼吸器型コロナウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ内在性レトロウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、感染性胃腸炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ブタサイトメガロウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、シンドビスウイルス、単純ヘルペスウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスおよびウマ動脈炎ウイルスからなる群から選択されるエンベロープウイルスである、請求項３９に記載の方法。
【請求項６２】
前記ウイルスは、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス、ブタ呼吸器型コロナウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ内在性レトロウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、感染性胃腸炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ブタサイトメガロウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、シンドビスウイルス、単純ヘルペスウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスおよびウマ動脈炎ウイルスからなる群から選択されるエンベロープウイルスである、請求項４０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ウイルスは非エンベロープウイルスである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
前記非エンベロープウイルスは、Ｅ型肝炎ウイルスまたはブタサーコウイルス２型である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ウイルスは非エンベロープウイルスである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
前記非エンベロープウイルスは、Ｅ型肝炎ウイルスまたはブタサーコウイルス２型である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
非霊長類大型動物種から未知のＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡ相同体をクローニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）動物の静脈血から、適切な宿主細胞において、前記樹状細胞の増殖を可能にする適切な栄養条件下で、単球由来樹状細胞を単離し、そしてインビトロで培養する工程と；
（ｂ）ＲＮＡを抽出する工程と；
（ｃ）ｃＤＮＡの第１鎖を合成し、そしてＲＴ−ＰＣＲによって、ｈＤＣ−ＳＩＧＮに相同な配列を有する短いフラグメントを増幅するために、ヒトおよびマウスＤＣ−ＳＩＧＮをコードする核酸分子の複数の配列アラインメントに基づいて、ヒトおよびマウスＤＣ−ＳＩＧＮヌクレオチド配列の保存配列に相補的であるように設計された縮重プライマーを使用して、逆転写酵素（ＲＴ）およびＰＣＲを実施する工程と；
（ｄ）それぞれ、５’−ＲＡＣＥまたは３’−ＲＡＣＥについて設計した、配列番号９を含む遺伝子特異的プライマーＰＤＲ−１および配列番号１０を含む遺伝子特異的プライマーＰＤＦ−１を使用して、縮重ＰＣＲ産物由来の配列情報に基づき、短いフラグメントに対して逆転写酵素およびＲＡＣＥ−ＰＣＲを実施する工程と；
（ｅ）ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）−ＰＣＲ反応産物によって、動物における未知のＤＣ−ＳＩＧＮ相同体の完全なｃＤＮＡの２つの重複フラグメントをクローニングする工程と；
（ｆ）動物のＤＣ−ＳＩＧＮ相同体を単離、精製または配列決定する工程と
を含む、方法。
【請求項６８】
前記宿主細胞は、ＣＤ１４陽性末梢血単球細胞、脾臓由来リンパ球または骨髄由来リンパ球の培養物である、請求項６７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１０月２９日に出願されたU.S. Provisional Application No. 60/000,800の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく利益を主張する。先の出願は、本明細書においてその全体が参照により援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
該当なし
【０００３】
共同研究契約の当事者の氏名または名称
該当なし
【０００４】
「配列表」の参照
本出願において提供された配列表のファイルを含有する単一のコンパクトディスク上の資料が、参照により援用される。
【０００５】
本発明は、新規のブタＤＣ−ＳＩＧＮおよびブタＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子（それぞれブタ単球由来樹状細胞および肝臓細胞から誘導されるｃＤＮＡ）、ブタＤＣ−ＳＩＧＮおよびブタＬＳＥＣｔｉｎタンパク質、新たなタンパク質、融合産物、抗体を安定に発現するトランスフェクト細胞または細胞系統、ブタ遺伝子を単離およびクローニングするための方法、ならびにウイルスを繁殖させるためのブタタンパク質の使用に関する。また、ブタ単球由来樹状細胞から新たに発見したブタＩＣＡＭ−３アイソフォームをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【背景技術】
【０００６】
本明細書において引用したすべての特許および文献は、それらの全体が本明細書において参照により援用される。
【０００７】
樹状細胞（ＤＣ）は、末梢免疫系全体に局在するプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。外来抗原が侵入すると、未熟なＤＣの血液から組織への移動が誘発され、ここで、これらのＤＣは、抗原を検出および捕捉する（非特許文献１）。活性化されたＤＣは、ＭＨＣ分子（ＭＨＣ分子または主要組織適合性複合体と呼ばれる１組の膜糖タンパク質）を介して捕捉したタンパク質を免疫原性ペプチドに処理し、そしてＴ細胞に提示する。ＤＣによる病原体の侵入の認識は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびレクチンを含むパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって仲介される（非特許文献２；非特許文献３）。ＤＣの表面上に発現されるレクチンは、カルシウム依存的Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）ファミリーのメンバーであり、そしてＤＣの抗原捕捉および内在化において重要な役割を果たす（非特許文献３）。ＣＬＲもまた、マクロファージを含む他のＡＰＣ上で発現される。
【０００８】
ＣＬＲファミリーは、カルシウム依存的様式で糖タンパク質リガンド上の多糖に結合することによって、タンパク質−炭水化物相互作用を実施する多くのタンパク質を含む。多数のＣＬＲが、外来性病原体を認識するＡＰＣの表面上に発現されるＰＲＲに属し、宿主免疫応答において重要な役割を果たす。ＩＩ型ＣＬＲは、それらのＮＨ２末端ドメイン、細胞の細胞質に局在する細胞質尾部（ＣＴ）によって分類される。他のＩＩ型ＣＬＲドメインは、ＣＴの後に膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、カルボキシル末端に細胞外に暴露された単一の炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）、およびＴＭＤとＣＲＤとの間にネックドメインを含む。
【０００９】
ヒト染色体１９ｐ１３．３に局在するＩＩ型ＣＬＲ、ＣＤ２３／ＬＳＥＣｔｉｎ／ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮのヒトレクチン遺伝子クラスターが、益々注目されている。類似のゲノム構造を有するヒトＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮおよびｈＬＳＥＣｔｉｎ（非特許文献４）は、病原体認識を仲介することが可能な重要なＣ型レクチンである。ヒトＣＤ２３（ＦＣＥＲ２）は、細胞間接着、Ｂ細胞生存および抗原提示に重要な役割を果たす低い親和性のＩｇＥ受容体である。樹状細胞特異的細胞内接着分子−３（「ＩＣＡＭ−３」）−グラビング非インテグリン（また、「ＤＣ−ＳＩＧＮ」としても公知であるヒトＣＤ２０９、４４ｋＤａ  ＩＩ型膜貫通タンパク質）、ＣＬＲが、ＤＣおよびＴ細胞相互作用を仲介するＩＣＡＭ−３結合タンパク質として同定され（非特許文献５）、そしてＨＩＶ−１の感受性細胞へのトランスでの伝播を仲介するＨＩＶ−１  ｇｐ１２０受容体として同定された（非特許文献６）。さらに、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＩＣＡＭ−２結合タンパク質と相互作用し、休止内皮および活性化内皮の両方を介するＤＣのケモカイン誘導性輸送を調節することが見出された（非特許文献７）。第２のヒトＤＣ−ＳＩＧＮ（ｈＤＣ−ＳＩＧＮ）相同体、ｈＬ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９Ｌ）またはＤＣ−ＳＩＧＮＲが続いて同定され、そして類似の機能であるが、ｈＤＣ−ＳＩＧＮとは若干異なる病原体認識の特性を有することを示した（非特許文献８）。
【００１０】
ヒトＤＣ−ＳＩＧＮは、単球由来ヒトＤＣにおいてインビトロで、正常なヒトリンパ節、真皮、粘膜および脾臓の未熟および成熟ＤＣにおいて、ならびに肺の肺胞のマクロファージにおいてインビボで主に発現される（非特許文献５；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）が、Ｌ−ＳＩＧＮは、肝臓およびリンパ節の類洞内皮細胞において高度に発現される（非特許文献８）。Ｌ−ＳＩＧＮ相同体は、ヒトおよび非ヒト霊長類のみにおいて存在し、他の非霊長類の哺乳動物種には存在しないことが観察されている。
【００１１】
最近、肝臓およびリンパ節類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）においてｈＬ−ＳＩＧＮと共に同時発現される第３のヒトＤＣ−ＳＩＧＮ関連Ｃ型レクチン（「ＣＬＥＣ４Ｇ」として同定され、そして「ＬＳＥＣｔｉｎ」と命名された）は、病原体認識および抗原捕捉の類似の特性を有するとみなされた（非特許文献１２）。ｈＬＳＥＣｔｉｎ以外では、他の哺乳動物種におけるＬＳＥＣｔｉｎ相同体は、実験的に同定されていないが、限定的な遺伝子情報を、ゲノムのデータベースから検索することができる。
【００１２】
器官のサイズおよび生理学がヒトに類似するため、ブタは、異種移植に好適な供給源動物であると考えられている（非特許文献１３）。分子相互作用のヒト−ブタ種の間の障壁の適合性を理解することは、ブタからヒトへの異種移植の臨床適用に極めて重要である。ブタ造血細胞上の受容体とヒト内皮細胞のリガンドとの相互作用は、ブタ造血細胞を使用して、ヒトレシピエントにおける忍容性を誘導する事象において極めて重要な役割を果たす（非特許文献１４）。Ｔ細胞仲介異種移植片拒絶（同種抗原よりブタ抗原に対してより強力なヒトＴ細胞応答の誘導によっておそらく引き起こされる現象）もまた、ＤＣのようなブタＡＰＣとヒトＴ細胞との間の接着分子の潜在的な相互作用を要した（非特許文献１５）。ＤＣ−ＳＩＧＮは、さらに、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３の内因性接着因子受容体として認められている（非特許文献５；非特許文献１６；非特許文献１７）。
【００１３】
ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、世界中で経済的に重要なブタ病原体は、ニドウイルス（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のアルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーである。これまで世界中で同定されたＰＲＲＳＶ単離体は、同じ疾患症状を引き起こすが、抗原的に異なる２つの異なる遺伝子型、欧州型（１型）および北米型（２型）遺伝子型に分けられる。ＨＩＶおよびＨＣＶのような他のエンベロープウイルスと同様に、ＰＲＲＳＶの宿主細胞、即ち、ブタ肺胞マクロファージへの進入は、シアロアドヘシン、ＣＤ１６３およびヘパラン硫酸を含むいくつかの進入因子の存在が関与する複雑な多段階プロセスである（非特許文献１８）。しかし、ＰＲＲＳＶとＡＰＣ上のブタＰＲＲとの間の潜在的な相互作用については、未だ報告されていない。ヒトＬ−ＳＩＧＮが肺におけるＳＡＲＳ−コロナウイルスの進入に関連することが明らかにされたため、ＰＲＲＳＶおよびコロナウイルスは両方ともニドウイルス（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目に属することから、ブタＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮ相同体がブタ肺におけるＰＲＲＳＶ感染中に類似の役割を果たす可能性はあるが、結論を導き出す前に有意な実験が保証されなければならない。
【００１４】
（特許文献１およびその他に記載の）サル腎細胞系統ならびに初代ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）は、増殖性ＰＲＲＳＶ複製を支持することが公知のただ２つの細胞であるが、ＢＨＫ−２１細胞系統のような他の細胞は、複製コンピテントである、即ち、ＰＲＲＳＶ複製を支持するのに必要な能力を有することが示されている（非特許文献１９；非特許文献２０）。例えば、ＢＨＫ細胞を、ウイルスＲＮＡ、または欧州型株ＬＶもしくは北米型株ＶＲ−２３３２の全長ゲノムｃＤＮＡからインビトロで合成したＲＮＡ転写物でトランスフェクトした場合、ＰＲＲＳＶ複製のエビデンスが、ＢＨＫ細胞において検出された。ＰＲＲＳＶビリオンが培地に産生および抽出された；そしてトランスフェクトＢＨＫ−２１細胞由来の上清をＰＲＲＳＶ許容細胞に移した場合、細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された。不運にも、トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞において複製中のウイルスは、細胞から細胞に拡大せず、ＢＨＫ−２１細胞上に受容体が存在しないことが示されている。推定ＰＲＲＳＶ結合受容体が、肺胞マクロファージ由来の２１０ｋＤａの膜タンパク質であることが同定された報告がある（非特許文献２１）が、ウイルス進入のレベルでのこの受容体候補の機能的確認は、なお認められていない。最近、ブタシアロアドヘシン（ｐＳｎ）が、ＰＡＭにおけるＰＲＲＳＶの内在化を仲介すること（非特許文献２２）、およびｐＳｎがシアル酸結合レクチンであり、そしてＰＲＲＳビリオン上のシアル酸とｐＳｎとの間の相互作用がＰＡＭのＰＲＲＳＶ感染に必須であること（非特許文献２３）が示されている。ヒト、マウスおよびブタでは、シアロアドヘシンは、組織マクロファージの個別のサブセットにおいてのみ発現される。ＰＲＲＳＶは、インビボでブタの呼吸器およびリンパ系のマクロファージに感染することが公知である。ＰＲＲＳＶが樹状細胞のような他の単球由来リンパ球にインビボでも感染するため、およびＰＲＲＳＶビリオンの構造が極めて複雑であるため、複数の別の受容体および／または共受容体がこれらの細胞上に存在する可能性がある。加えて、感受性サル腎細胞上のＰＰＲＳＶ受容体は、未だ同定されていない。
【００１５】
マクロファージおよび樹状細胞は、病原体の認識に重要であり、そして侵入する病原体に対する免疫において重要な役割を果たす。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮおよび関連する肝臓内皮細胞レクチンＬ−ＳＩＧＮは、特徴付けられており、そして樹状細胞様細胞の表面で多量に発現することが見出されている（非特許文献２４）。さらに加えて、Ｃ型マンノース結合レクチンｈＤＣ−ＳＩＧＮおよびｈＬ−ＳＩＧＮ（またはＤＣ−ＳＩＧＮＲ）では、ＨＩＶのようなエンベロープウイルス、細菌（マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、インビトロでの真菌および寄生体（非特許文献２５）、デングウイルス（非特許文献２６）、エボラウイルス（非特許文献２７）、マールブルグウイルス（非特許文献２８）、ＳＡＲＳ−コロナウイルス（非特許文献２８）、サイトメガロウイルス（非特許文献２９）、およびＣ型肝炎ウイルス（非特許文献３０；非特許文献３１）を含む病原体に結合し、そして取り込んで、細胞への侵入および感染を容易にするそれらの能力が、かなり注目されている。ｈＤＣ−ＳＩＧＮおよびｈＬ−ＳＩＧＮの両方とも、エンベロープウイルスの広範なスペクトルにおいて、ウイルスエンベロープ糖タンパク質のアスパラギン連結高マンノースグリカンに、カルシウム（Ｃａ２＋）依存的様式で緊密に結合するＣ型レクチン特異的炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含有する（非特許文献３２）。従って、Ｃ型レクチンは、ＤＣ−ＳＩＧＮまたはＬ−ＳＩＧＮを発現する細胞上でウイルスを濃縮し、そしてウイルスの細胞への結合および進入を容易にする。
【００１６】
ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＨＩＶ  ｇｐ１２０に結合し、そしてＴ細胞へのＨＩＶ伝播を容易にすることが報告されている（非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３６。ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮは、Ｃ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｅ２の高親和性結合受容体であり（非特許文献３７）、そしてＣ型肝炎ウイルスによる肝臓細胞のトランス感染を仲介する（非特許文献３０；非特許文献３１）ことが示されている。ＤＣ−ＳＩＧＮはまた、ヒト樹状細胞のデングウイルス感染を仲介することが見出されている（非特許文献２６）。ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮは、エボラウイルスによるシスおよびトランスでの細胞進入を仲介することが示されている（非特許文献２７；非特許文献３８）。他の報告では、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（デングウイルス、ウエストナイルウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ））、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（エボラおよびマールブルグウイルス）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ））、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（シンドビスウイルス）ならびにヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（ヒトサイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ））を含むエンベロープウイルスの広範なスペクトルが、インビトロで増強された感染の認識および接着分子受容体としてＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮを使用することが報告されている（非特許文献３９）。
【００１７】
ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮは、ホモ四量体ＩＩ型膜タンパク質であり、そしてＣ末端炭水化物認識ドメインを介して、ウイルスエンベロープ糖タンパク質上のマンノース含有複合糖質およびフコース含有ルイス血液型抗原のような比較的多数のＮ結合型炭水化物を認識することができる（非特許文献４０；非特許文献４１）。ＰＲＲＳＶビリオンエンベロープ上の４つの糖タンパク質のうち、ＧＰ２ａ、ＧＰ３、ＧＰ４およびＧＰ５は、コンピュータの予想に基づくと、それぞれ２〜７個のＮグリコシル化部位を含有する。エンドグリコシダーゼ処理により、すべての推定部位が複合型Ｎ−グリカンによって占有されることが示唆された（非特許文献２０）。これらの観察は、ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮは、ＰＲＲＳＶビリオン上の１つ以上の糖タンパク質と相互作用し得、それ故、ＰＲＲＳＶ進入およびエンドサイトーシスを仲介することを示唆する。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣおよびいくつかのタイプのマクロファージ（両方ともＰＲＲＳＶ複製の重要な標的である）上で発現される。Ｌ−ＳＩＧＮは、類洞内皮細胞および胎盤マクロファージ上で発現されることが見出された。ＤＣ−ＳＩＧＮの胎盤発現は、ＨＩＶの子宮内での垂直伝播を仲介することが見出された（非特許文献３６）。偶然にも、ＰＲＲＳＶは、妊娠雌性ブタにおいて生殖疾患を引き起こすことが公知である。
【００１８】
ＰＲＲＳＶがメンバーであるアルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）科と共にニドウイルス（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）科に属するＳＡＲＳ−コロナウイルスもまた、ウイルス感染および発病中にＳ糖タンパク質を使用して、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮに結合することが示された（非特許文献２８；非特許文献４２）。ＰＲＲＳＶおよびコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）は同じスーパーファミリーに属するが、感染および発病のためにＰＲＲＳＶも同様にＤＣ−ＳＩＧＮまたはＬ−ＳＩＧＮを使用するかどうかについて決定するためには、さらなる試験が必要である。
【００１９】
最近の研究により、ニパウイルス表面糖タンパク質（ＮｉＶ−Ｇ）は、ｈＬＳＥＣｔｉｎに結合することが可能であり、そしてｈＬＳＥＣｔｉｎは、ニパウイルス表面糖タンパク質（ＮｉＶ−Ｇ）の推定受容体であることが報告された（非特許文献４３）。相互作用は、ＮｉＶ−ＧのＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎ末端構造によって仲介された。エボラウイルスのエンベロープ表面糖タンパク質（短縮型グリカン）ならびに重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）のスパイクタンパク質は、これらの炭水化物モチーフを有し、そしてｈＬＳＥＣｔｉｎによって特異的に認識される（非特許文献４４）。ｈＤＣ−ＳＩＧＮおよびｈＬ−ＳＩＧＮとは異なり、ｈＬＳＥＣｔｉｎは、末端に二糖ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎが存在する糖タンパク質に選択的に結合した。
【００２０】
さらに加えて、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮは、ヒトのゲノムレベルにおいて、独立した２つの遺伝子であると考えられる。先のＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮヒト研究において示されたように、保存配列により、それらは、類似するが、異なる機能を有し得る。しかし、Ｌ−ＳＩＧＮの生物学的または生理的役割は肝臓に限定される（Ｌ−ＳＩＧＮのｍＲＮＡは肝臓においてのみ発現される）が、ＤＣ−ＳＩＧＮは、身体全体の樹状細胞において機能する。
【００２１】
他の関連技術が、ヒトＣ型レクチンおよびヒトＤＣ−ＳＩＧＮについて公開されている。例えば、特許文献２（Hoppe et al.）は、組み換えタンパク質を発現するように誘導された細菌培養物の溶解物から精製されたヒトＳＰ−ＤのコレクチンＣ型レクチンドメインおよびネック領域−レクチンドメインを含むポリペプチドについて説明しており、ポリペプチドは、コレクチンネック領域において三量体化することが可能である。三量体化ポリペプチドについて示唆される用途は、特に低い親和性で結合する受容体のペプチド−リガンド（例えば、神経ペプチド、インターロイキン）、抗原、活性化時に反応性である化学化合物、例えば、光活性化可能な化学架橋剤、カフェインおよびモルヒネのような有機化合物、薬学的研究において潜在的インヒビターのスクリーニングのための低親和性結合ドメインなどのように、コラーゲン形成を刺激することである。
【００２２】
特許文献３（Yang et al.）は、ヒトＣ型レクチン、および「ＣＬＡＸ」（Ｃ型レクチン活性化発現）タンパク質と称される３つの相同体をコードする単離されたｃＤＮＡ配列について説明している。この特許は、ヒトＣＬＡＸタンパク質のすべてまたは一部（例えば、細胞外領域）を有する核酸配列、ポリペプチド、融合タンパク質、ＣＬＡＸに特異的な抗体、ヒトＣＬＡＸのリガンドおよびインヒビターを使用する方法について開示している。タンパク質を含有する医薬組成物は、感染性、炎症性およびアレルギー疾患の予防ならびに治療に使用されることが示唆される。
【００２３】
特許文献４（Messier et al.）は、ヒトおよび／または非ヒト霊長類において、ＡＩＤＳの発達に対する感受性（ヒト）または耐性（チンパンジー）を含む疾患のような生理学的条件に関連し得るポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を提供する。生理学的特色には、ＡＩＤＳの進行に対する耐性が含まれ；ポリヌクレオチドは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子であってもよく；次いで、調節された機能は、ＡＩＤＳの進行に対して増加した耐性である。配列は、宿主の治療標的としておよび／またはスクリーニングアッセイにおいて有用であることが示唆される。
【００２４】
特許文献５（Lee）は、粘膜に対し投与しようとするウイルス特異的リガンドの半減期を増加する方法に関し、ここで、前記膜には、粘膜上でコロニー化した細菌に結合するように細菌特異的リガンドを改変することによって、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）のような細菌がコロニーを形成する。この特許はまた、ＣＤ４、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＩＣＡＭ−１、ＨｖｅＡ、ＨｖｅＣ、ポリオウイルス受容体、ビトロネクチン受容体、ＣＤ２１、またはＩｇＡ受容体配列のようなウイルス特異的リガンドおよび抗体、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または炭水化物のような細菌特異的リガンドを含むキメラ分子を開示している。
【００２５】
特許文献６（Littman et al.）は、樹状細胞上で特異的に発現され、そしてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によるＴリンパ球の感染を容易にする受容体としてのヒトＤＣ−ＳＩＧＮに関する。この特許は、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＨＩＶならびに／あるいはＴ細胞およびマクロファージの相互作用を調節する化合物を同定するためのアッセイを提供し、ここで、化合物は、細胞へのＨＩＶ進入のトランス増強を阻害する。
【００２６】
特許文献７（Figdor et al.）は、樹状細胞の表面上のＣ型レクチン受容体のＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ受容体への接着を調節することによって、免疫応答を調節するための組成物の調製におけるマンノース、フコース、植物レクチン、抗生物質、タンパク質、または樹状細胞の表面上のＣ型レクチンに結合するＣ型レクチンに対する抗体の使用に関する。この特許は、樹状細胞とＴ細胞との間、即ち、樹状細胞の表面上のＤＣ−ＳＩＧＮとＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ−３受容体との間の結合を阻害する抗体を開示している。特異的抗原に対する免疫応答を予防／阻害するため、忍容性を誘導するため、免疫療法のため、免疫抑制のため、自己免疫疾患の治療、アレルギーの治療および／またはＨＩＶ感染を阻害するための組成物が提示される。
【００２７】
上記のように、免疫学的スーパーファミリーの一部として、ＤＣ−ＳＩＧＮとＩＣＡＭ−３との間に生物学的関係が認められる。細胞接着分子（ＩＣＡＭ）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのサブファミリーに属するＩ型膜貫通糖タンパク質である。これまで、ＩＣＡＭファミリーのうちの５つのメンバー（ＩＣＡＭ１〜５）が、哺乳動物において同定されている（非特許文献４５）。それらは、機能的および構造的Ｉｇ様ドメインを共有し、そして免疫系の機能に関連の細胞間接着相互作用を仲介する（非特許文献４６）。ＩＣＡＭ−５を除いて、他のすべてのＩＣＡＭメンバーはインテグリンＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）に結合するが、組織の分布に大きなばらつきが認められる（非特許文献４５）。これらの接着相互作用は、炎症および非炎症組織を介して白血球輸送を仲介するのに重要な役割を果たし、そして抗原特異的Ｔ細胞応答に寄与する。ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２は、両方とも、休止中の白血球および抗原提示細胞（ＡＰＣ）において、発現されないか、または極めて低いレベルでしか発現されないため、ＩＣＡＭメンバーのうち、ＩＣＡＭ−３は、免疫応答の開始中、ＬＦＡ−１の優勢なリガンドであると考えられる（非特許文献４７）。ＩＣＡＭ−３とＤＣ−ＳＩＧＮとの間の相互作用が、抗原提示中の樹状細胞と休止Ｔ細胞との間の初期の接触を確立することについて、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３のＣ型レクチン、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮへの結合が報告されているが、ＩＣＡＭ−２のヒトＤＣ−ＳＩＧＮへの結合により、樹状細胞の遊出および内皮を介する移動が調節される（非特許文献５；非特許文献７）。
【００２８】
全長ＩＣＡＭ分子は、シグナルペプチド配列、２つの（ＩＣＡＭ２およびＩＣＡＭ４）、５つの（ＩＣＡＭ１およびＩＣＡＭ３）または９つの（ＩＣＡＭ−５）細胞外Ｉｇ様ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、および細胞質尾部（ＣＴ）を含有する。各Ｉｇ様ドメインは、異なるエキソンによってコードされる（非特許文献４８；非特許文献４９）。選択的スプライシングによって作製されたマウスＩＣＡＭ−１のアイソフォームは、ＩＣＡＭ−１欠損マウスにおいて同定されている（非特許文献５０；非特許文献５１）。各マウスＩＣＡＭ−１アイソフォームは、Ｉｇ様ドメイン２、３、および／または４をコードするエキソンの完全なスキッピングから作製される。加えて、エキソン６における別の５’スプライス部位の存在によってもまた、エキソン６の３’末端から６９−ｎｔの欠失を伴うマウスＩＣＡＭ−１アイソフォームが生じる（非特許文献５２）。マウスＩＣＡＭ−４では、イントロン保持により生じる貫通膜ドメインを欠くアイソフォームもまた同定された（非特許文献５３）。これまでに同定されているすべてのＩＣＡＭアイソフォームは十分に機能的であり、別のｍＲＮＡスプライシングは、異なる免疫応答経路において異なる役割を果たすことが示される。
【００２９】
ヒト−ブタ−マウス−ラットまたはヒト−イヌ−マウス−ラットゲノム領域に基づく２つの比較配列解析は、ＩＣＡＭ３遺伝子が、げっ歯類のゲノムにおいて消失していることを示した（非特許文献５４；非特許文献５５）。ヒト、非ヒト霊長類およびウシにおけるＩＣＡＭ３遺伝子の構成は類似し、７つの推定エキソンを含有しており、そしてエキソン３〜７は、遺伝子の３’−近位領域においてクラスター化される（非特許文献５６；非特許文献５７）。ブタＩＣＡＭ−３については、エキソン１〜部分的なエキソン５の領域のみが同定および配列決定されているため、遺伝子配列はなお完全には知られていない（非特許文献５５）。加えて、ブタＩＣＡＭ−３のｃＤＮＡは、これまで同定されていない。
【００３０】
エキソン内で生じるナンセンス変異は、ナンセンス変異に伴う選択的スプライシング（ＮＡＳ）として標示されるプレｍＲＮＡスプライシングプロセス中のエキソンスキッピングを誘導することができる（非特許文献５８；非特許文献５９；非特許文献６０）。翻訳の中途終止により、機能的タンパク質を産生することができなくなるため、少数の疾患を引き起こす遺伝子において認められているように、ＮＡＳは、通常、疾患に関連する（非特許文献５８）。ＮＡＳの機構は、スライシング、間接的ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）またはエキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）破壊前に翻訳様核スキャニングが生じることによると考えられる（非特許文献５８）。
【００３１】
ヒトＤＣ−ＳＩＧＮは、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デングウイルスおよびＳＡＲＳ−コロナウイルスのような様々なエンベロープウイルスのそれらのそれぞれの標的細胞への伝播に関与する一方、他の種から得られるＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の特徴および特性が、原則としてｈＤＣ−ＳＩＧＮを模倣することは認められていない。従って、所定の任意のＤＣ−ＳＩＧＮの機能を割り当てるために、さらなる試験が必要である。現時点の発見の前は、ブタ種由来のＤＣ−ＳＩＧＮおよび他のＬＳＥＣｔｉｎ関連相同体は、単離も、同定も、特徴付けも、されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】U.S. Patent No. 6,146,873
【特許文献２】U.S. Patent No. 6,190,886
【特許文献３】U.S. Patent No. 6,455,683
【特許文献４】U.S. Patent No. 6,280,953
【特許文献５】U.S. Patent No. 6,365,156
【特許文献６】U.S. Patent No. 6,391,567
【特許文献７】U.S. Patent No. 7,148,329
【非特許文献】
【００３３】
【非特許文献１】K. Palucka and J. Banchereau, “Dendritic cells: a link between innate and adaptive immunity,” J. Clin. Immunol. 19:12-25 (1999)
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【非特許文献５】T. B. Geijtenbeek et al., “Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses,” Cell 100:575-585 (2000)
【非特許文献６】T. B. Geijtenbeek et al, “DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells,” Cell 100:587-597 (2000)
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【非特許文献９】T. B. Geijtenbeek et al., “DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells,” Cell 100:587-597 (2000)
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
従って、本発明の重要な目的は、ブタゲノムデータベースにこれまで記載されていなかった新たなブタＤＣ−ＳＩＧＮおよびブタＬＳＥＣｔｉｎタンパク質をコードする完全核酸分子のクローニングおよび特徴付けを得ることである。
【００３５】
本発明のもう１つの重要な目的は、インビトロで培養されたブタ単球由来樹状細胞から、新たなブタＩＣＡＭ−３アイソフォームをコードする完全な核酸分子を同定および特徴付けすることである。
【００３６】
本発明のさらに重要な目的は、ウイルス、特に、ブタエンベロープウイルスに重点を置いたエンベロープウイルスを繁殖させ、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＬＳＥＣｔｉｎおよび／またはｐＩＣＡＭ−３を安定に発現する新たなトランスフェクト細胞または細胞系統を利用する新たな方法において、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＬＳＥＣｔｉｎ、ｐＩＣＡＭ−３を、単独でもしくはｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮまたはｈＬＳＥＣｔｉｎとの融合されたタンパク質として所定の組み合わせで、使用することである。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質のアミノ酸配列に特異的に結合し、そして抗原性の乏しい物質の免疫原性活性を増強するのに利用可能である抗体を作成することである。ｐＬＳＥＣｔｉｎおよびｐＩＣＡＭ−３タンパク質のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を作成することもまた、強く所望される。
【００３８】
本発明のさらなる意図および目的については、以下、本明細書において説明する。
【００３９】
上記の目的は、抗体などを作成するエンベロープウイルスを繁殖させるために特別に設計したベクターにおいて、下記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を利用して、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３およびｐＬＳＥＣｔｉｎをコードする新たなおよび完全な核酸配列を提供および単離することによって、達成される。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
本発明は、ブタ単球由来樹状細胞から得られるブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子全体、およびｃＤＮＡクローン、ならびに新たな遺伝子によってコードされる新規のブタＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質に関する。本発明はまた、ブタの肝臓組織から得られる完全な遺伝子およびｃＤＮＡ、ならびに新規のコードされたｐＬＳＥＣｔｉｎタンパク質に関する。加えて、本発明は、インビトロで培養されたブタ単球由来樹状細胞から単離されたブタＩＣＡＭ−３の新たな２つのｃＤＮＡアイソフォームを包含する。具体的には、本発明は、ブタＤＣ−ＳＩＧＮ、ブタＩＣＡＭ−３、ブタＬＳＥＣｔｉｎをコードするヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列の相補体もしくはヌクレオチド配列の機能的な定義された部分のうち１つ以上を含む単離された核酸分子またはブタもしくはヒト起源であり得るもう１つのタンパク質と連結し得る所定のタンパク質融合産物に関する。また、本発明の範囲内には、本明細書に記載の新たな核酸分子を含有する生物学的に機能的なプラスミド、ウイルスベクターなど、本発明のプラスミドまたはベクターによって一過的にトランスフェクトされた安定な細胞または細胞系統、およびポリペプチド発現産物が含まれる。本発明の重要な実施形態は、ウイルス、特にエンベロープウイルスを繁殖させるための方法におけるブタ相同体の新たな使用をさらに包含する。
【００４１】
本発明の背景および本発明の当該技術分野との相違について、添付の図面を参考にして、以下、本明細書においてさらに説明する：
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲまたはＲＡＣＥ−ＰＣＲによるインビトロで培養されたブタ単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）からのｐＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡの増幅およびゲノムＰＣＲによるブタゲノムＤＮＡからのｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の増幅を示す。図１（ａ）は、ｒｐＧＭ−ＣＳＦおよびｒｐＩＬ−４の存在下におけるＣＤ１４単球の７日間のインビトロ培養後のブタＭＤＤＣの形態学的発達を、倍率＝４００倍で示す。図１（ｂ）は、縮重プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって予想された約２１０ｂｐの産物の検出を示す。図１（ｃ）は、５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲの結果を示す。
【図２ａ】ｐＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列（配列番号１に対応する）およびその推定アミノ酸配列（配列番号２に対応する）を表す。１，０６９ヌクレオチド配列は、ｎｔ２６位から開始する２４０−ａａタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する。推定膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を破線枠内に示し、そして炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）に下線を付す。ポリアデニル化シグナルを枠内に示す。矢印はエキソンの境界を示す。
【図２ｂ】ｐＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列（配列番号１に対応する）およびその推定アミノ酸配列（配列番号２に対応する）を表す。１，０６９ヌクレオチド配列は、ｎｔ２６位から開始する２４０−ａａタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する。推定膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を破線枠内に示し、そして炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）に下線を付す。ポリアデニル化シグナルを枠内に示す。矢印はエキソンの境界を示す。
【図３】トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮ（構築物ｐＣＩ−ＰＤＣＳ）の発現を実証する。図３（ａ）は、トランスフェクションの４８時間後における、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗ペプチドポリクローナル抗体による免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）の結果（倍率＝２００倍）を示す。ほとんどの細胞において、細胞質および膜の染色が散見された。図３（ｂ）は、少数の細胞においてのみ細胞膜の染色が認められたことを示す。内側のパネルは、染色された細胞の拡大図（４００倍）を示す。図３（ｃ）は、陰性コントロールとしてのベクターｐＣＩ−ｎｅｏによる細胞のトランスフェクション（２００倍）を表す。図３（ｄ）は、プラスミドｐＣＩ−ＰＤＣＳまたはｐＣＩ−ｎｅｏでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の細胞溶解物を使用したウエスタンブロット分析を示す。
【図４ａ】ブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子のクローニングを例示し、図４ａは、ワンステップゲノムＰＣＲによるブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子ブタゲノムＤＮＡの増幅結果を示す。
【図４ｂ】は、シークエンシングプライマーＭ１３Ｆ、２Ｆ、３Ｆ、４ＦおよびＭ１３Ｒをそれぞれ使用した個々の５つの配列からのブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の３つのクローンのうちの１つ（ＧＤＣＳ−６）の集成を示す。
【図５ａ】染色体ＤＮＡ上に局在するブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の完全なヌクレオチド配列（エキソンおよびイントロンを含む）（配列番号３に対応する）を表す。エキソン１〜８、ゲノムＰＣＲプライマー１Ｆおよび４Ｒならびにシークエンシングプライマー２Ｆ、３Ｆおよび４Ｆの位置を示す。
【図５ｂ】染色体ＤＮＡ上に局在するブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の完全なヌクレオチド配列（エキソンおよびイントロンを含む）（配列番号３に対応する）を表す。エキソン１〜８、ゲノムＰＣＲプライマー１Ｆおよび４Ｒならびにシークエンシングプライマー２Ｆ、３Ｆおよび４Ｆの位置を示す。
【図５ｃ】染色体ＤＮＡ上に局在するブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の完全なヌクレオチド配列（エキソンおよびイントロンを含む）（配列番号３に対応する）を表す。エキソン１〜８、ゲノムＰＣＲプライマー１Ｆおよび４Ｒならびにシークエンシングプライマー２Ｆ、３Ｆおよび４Ｆの位置を示す。
【図５ｄ】染色体ＤＮＡ上に局在するブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の完全なヌクレオチド配列（エキソンおよびイントロンを含む）（配列番号３に対応する）を表す。エキソン１〜８、ゲノムＰＣＲプライマー１Ｆおよび４Ｒならびにシークエンシングプライマー２Ｆ、３Ｆおよび４Ｆの位置を示す。
【図６ａ】図６ａ〜６ｄはそれぞれ、ＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによる選択されたブタ組織および細胞集団におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現の検出を示す。図６ａは、ｐＤＣ−ＳＩＧＮのｍＲＮＡ発現を示すＲＴ−ＰＣＲ発現プロファイルを表す。ブタ組織ｃＤＮＡを、プライマーＰＤＣＳ−Ｅ５６Ｆ／ＰＤＣＳ−Ｅ７８ＲまたはブタＧＡＰＤＨ特異的プライマーによるＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。
【図６ｂ】図６ｂ〜６ｄは、定義されたブタ細胞集団および細胞系統におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現の検出を実証する。ブタＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ上での遠心分離によって単離し、そして前方および側方散乱光特性について評価した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ、ＣＤ１４−細胞）および単球（ＣＤ１４＋細胞）を、抗ＣＤ１４モノクローナル抗体を使用する免疫磁気標識ＭＡＣＳシステムによって分離した。他のパネルでは、ＰＢＬ、単球、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）、単球由来マクロファージ（ＭＤＭΦ）、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）、ブタ単球系統３Ｄ４／３１およびブタ腎臓上皮細胞系統ＰＫ１５におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮの発現を、抗ｐＤＣ−ＳＩＧＮ抗体による染色（灰色ヒストグラム）によって評価した。破線で囲んだ白抜きのヒストグラムは、バックグランドのコントロールを示す。データは、３つの独立した実験の代表値である。
【図６ｃ】図６ｂ〜６ｄは、定義されたブタ細胞集団および細胞系統におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現の検出を実証する。ブタＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ上での遠心分離によって単離し、そして前方および側方散乱光特性について評価した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ、ＣＤ１４−細胞）および単球（ＣＤ１４＋細胞）を、抗ＣＤ１４モノクローナル抗体を使用する免疫磁気標識ＭＡＣＳシステムによって分離した。他のパネルでは、ＰＢＬ、単球、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）、単球由来マクロファージ（ＭＤＭΦ）、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）、ブタ単球系統３Ｄ４／３１およびブタ腎臓上皮細胞系統ＰＫ１５におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮの発現を、抗ｐＤＣ−ＳＩＧＮ抗体による染色（灰色ヒストグラム）によって評価した。破線で囲んだ白抜きのヒストグラムは、バックグランドのコントロールを示す。データは、３つの独立した実験の代表値である。
【図６ｄ】図６ｂ〜６ｄは、定義されたブタ細胞集団および細胞系統におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現の検出を実証する。ブタＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ上での遠心分離によって単離し、そして前方および側方散乱光特性について評価した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ、ＣＤ１４−細胞）および単球（ＣＤ１４＋細胞）を、抗ＣＤ１４モノクローナル抗体を使用する免疫磁気標識ＭＡＣＳシステムによって分離した。他のパネルでは、ＰＢＬ、単球、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）、単球由来マクロファージ（ＭＤＭΦ）、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）、ブタ単球系統３Ｄ４／３１およびブタ腎臓上皮細胞系統ＰＫ１５におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮの発現を、抗ｐＤＣ−ＳＩＧＮ抗体による染色（灰色ヒストグラム）によって評価した。破線で囲んだ白抜きのヒストグラムは、バックグランドのコントロールを示す。データは、３つの独立した実験の代表値である。
【図７】ブタリンパ節組織（但し、ブタ肝臓組織ではない）における免疫組織化学（ＩＨＣ）によるｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質発現の検出を例示する。ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質発現の局在を、ブタリンパ節（ａ、ｃ、ｄ）およびブタ肝臓（ｂ）のパラフィン切片に対するＡＢＣ法を使用するＩＨＣによって調べた。図７（ａ）は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質が、リンパ節洞（被膜下洞）において好適に発現されたことを示し、図７（ｂ）は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質がブタ肝臓において発現されなかったことを示す。図７（ｃ）は、類洞におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗ペプチド抗体によって免疫染色された細胞のほとんどが、形態学的に、マクロファージ様細胞（矢印）および樹状細胞様細胞（矢尻部）であったことを示す。図７（ｄ）は、実質組織中のリンパ管内皮細胞もまた、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗体で免疫染色されたことを示す。
【図８ａ】図８ａ〜８ｅはｐＤＣ−ＳＩＧＮを安定に発現するＢＨＫ細胞へのヒトＩＣＡＭ−３およびＩＣＡＭ−２免疫接着因子の結合を示す。図８ａは、安定なＢＨＫ細胞系統上のｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の表面発現の検出を示す。ＢＨＫ−２１、および分取されていないまたは分取されたＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞系統を、それぞれ、抗ｐＤＣ−ＳＩＧＮ抗体およびＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧで染色し、そしてフローサイトメトリーで解析した。破線で囲んだ白抜きのヒストグラムは、バックグランドの染色を表した。ｐＤＣ−ＳＩＧＮの発現を、中実の灰色ヒストグラムで示した。３Ｔ３−ＨＤＣＳ細胞系統の表面上のｈＤＣ−ＳＩＧＮの発現もまた、ｈＤＣ−ＳＩＧＮモノクローナル抗体による染色によって確認した（最も下のパネル）。
【図８ｂ】図８ｂ〜８ｅは、ヒトＩＣＡＭ−３およびＩＣＡＭ−２免疫接着因子のＢＨＫ−ＰＤＣＳおよび３Ｔ３−ＨＤＣＳ細胞へのカルシウム依存的結合を例示する。破線で囲んだ白抜きのヒストグラムは、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体のみによる細胞染色を表す。結果は、３つの独立した実験の代表値である。データを、１０，０００個の細胞のヒストグラム解析として表す。
【図８ｃ】図８ｂ〜８ｅは、ヒトＩＣＡＭ−３およびＩＣＡＭ−２免疫接着因子のＢＨＫ−ＰＤＣＳおよび３Ｔ３−ＨＤＣＳ細胞へのカルシウム依存的結合を例示する。破線で囲んだ白抜きのヒストグラムは、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体のみによる細胞染色を表す。結果は、３つの独立した実験の代表値である。データを、１０，０００個の細胞のヒストグラム解析として表す。
【図８ｄ】図８ｂ〜８ｅは、ヒトＩＣＡＭ−３およびＩＣＡＭ−２免疫接着因子のＢＨＫ−ＰＤＣＳおよび３Ｔ３−ＨＤＣＳ細胞へのカルシウム依存的結合を例示する。破線で囲んだ白抜きのヒストグラムは、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体のみによる細胞染色を表す。結果は、３つの独立した実験の代表値である。データを、１０，０００個の細胞のヒストグラム解析として表す。
【図８ｅ】図８ｂ〜８ｅは、ヒトＩＣＡＭ−３およびＩＣＡＭ−２免疫接着因子のＢＨＫ−ＰＤＣＳおよび３Ｔ３−ＨＤＣＳ細胞へのカルシウム依存的結合を例示する。破線で囲んだ白抜きのヒストグラムは、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体のみによる細胞染色を表す。結果は、３つの独立した実験の代表値である。データを、１０，０００個の細胞のヒストグラム解析として表す。
【図９ａ】図９ａ〜９ｂは、ＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞におけるブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の感染結果を示す。図９ａは、ＰＲＲＳＶが、ＧＦＰを発現する改変されたＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンでのトランスフェクションによってＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞において複製コンピテントであり（左側のパネル）、そして放出されたウイルスは、標的ＭＡＲＣ−１４５細胞に感染することが可能である（右側のパネル）ことを示す。ＧＦＰシグナルを、ＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞においてトランスフェクションの４８時間後、またはＭＡＲＣ−１４５細胞において感染の７２時間後に直接モニターした（倍率＝１００倍）。
【図９ｂ】ＢＨＫ−ＰＤＣＳおよびＢＨＫ−２１細胞系統におけるＰＲＲＳＶ結合性の比較を示す。点線で囲んだ白抜きのヒストグラムは、ＰＲＲＳＶ播種を伴わずにインキュベートしたが、但し、抗ＰＲＲＳＶ  ｍＡｂ  ＳＤＯＷ１７−ＡおよびＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで染色したコントロール細胞を表す。ウイルスを播種し、そして２つの抗体と共にインキュベートした細胞を、中実の灰色ヒストグラムで示す。
【図９ｃ】ＰＲＲＳＶの株ＰＧＸＧおよび株ＶＲ２３８５の両方とも、ＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞系統へのｈＩＣＡＭ−３結合を阻止することを示す。ＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞を、ｈＩＣＡＭ−３−Ｆｃの添加の前に、ＰＧＸＧまたはＶＲ２３８５（１個の細胞あたりＭ．Ｏ．Ｉ．＝１０ＦＦＵ）のいずれかと共に、６０分間、４℃で、インキュベートした。染色した細胞を、本明細書に記載のようにＦＡＣＳを使用して解析した。データを、非処理コントロール（ｈＩＣＡＭ−３−ＦｃおよびＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体のみの添加）に対して正規化した平均蛍光強度±ＳＤとして表す。アスタリスクは、非処理コントロールと比較した統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示した。
【図９ｄ】ＢＨＫ細胞によって仲介されるＰＲＲＳＶ伝播がｐＤＣ−ＳＩＧＮによって増強されたことを示す。ドナー細胞としてＢＨＫ−ＰＤＣＳ、ＢＨＫ−２１およびＭＡＲＣ−１４５細胞を使用し、そして標的細胞としてＭＡＲＣ−１４５細胞を使用した、ＰＲＲＳＶ  ＰＧＸＧまたはＰＲＲＳＶ  ＶＲ２３８５のいずれかの伝播、およびＰＲＲＳＶの滴定を、実施例に記載のように実施した。ＰＲＲＳＶに暴露しなかったＭＡＲＣ−１４５標的細胞と共に共培養したドナー細胞を、疑似伝播コントロールとして使用し、そして結果は、図に示さなかった（ウイルスは検出されなかった）。アスタリスクは、ＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞とＢＨＫ−２１細胞との間のＰＲＲＳＶ  ＶＲ２３８５株の統計的有意差（ｐ＜０．０５）を示した。
【図１０】インビトロで培養したブタ単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）由来のブタＩＣＡＭ−３  ｃＤＮＡのＲＡＣＥ−ＰＣＲによる増幅を例示する。図１０（ａ）は、５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる２つのアイソフォーム（それぞれ約８００ｂｐ）の同定を実証する。図１０（ｂ）から、３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる約７００ｂｐの産物の検出が確認される。
【図１１ａ】図１１ａ〜１１ｂは、ブタＩＣＡＭ−３  ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列（配列番号４に対応する）および推定タンパク質配列（配列番号５に対応する）を示す。ヌクレオチドの位置を右側に表示し、そしてアミノ酸（ａａ）の位置を各残基の下側に表示する。大きな５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物の推定ＩＣＡＭ−３コード領域の上流にある６３ａａペプチドをコードすることが推定される小さなオープンリーディングフレーム（配列番号３８に対応する）を括弧内に示す。小さな５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物に見出される欠失ヌクレオチド領域の配列（配列番号３９に対応する）を破線枠内に示す。推定シグナルペプチドを二重破線で示し、そして潜在的ポリアデニル化シグナルを破線で示した。太い下線を付した配列は、推定膜貫通領域を表す。潜在的Ｎ−グリコシル化部位を−−Ｎ−−で示す。Ｉｇ様ドメイン１〜３および膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）＋細胞質尾部（ＣＴ）の提示される開始点を、対応するヌクレオチド配列の上に矢印で示す。
【図１１ｂ】図１１ａ〜１１ｂは、ブタＩＣＡＭ−３  ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列（配列番号４に対応する）および推定タンパク質配列（配列番号５に対応する）を示す。ヌクレオチドの位置を右側に表示し、そしてアミノ酸（ａａ）の位置を各残基の下側に表示する。大きな５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物の推定ＩＣＡＭ−３コード領域の上流にある６３ａａペプチドをコードすることが推定される小さなオープンリーディングフレーム（配列番号３８に対応する）を括弧内に示す。小さな５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物に見出される欠失ヌクレオチド領域の配列（配列番号３９に対応する）を破線枠内に示す。推定シグナルペプチドを二重破線で示し、そして潜在的ポリアデニル化シグナルを破線で示した。太い下線を付した配列は、推定膜貫通領域を表す。潜在的Ｎ−グリコシル化部位を−−Ｎ−−で示す。Ｉｇ様ドメイン１〜３および膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）＋細胞質尾部（ＣＴ）の提示される開始点を、対応するヌクレオチド配列の上に矢印で示す。
【図１２ａ】図１２ａ〜１２ｂは、ブタＩＣＡＭ−３遺伝子の提示されるナンセンス変異に伴う選択的スプライシング（ＮＡＳ）の略図を示す。図１２ａは、ブタＩＣＡＭ−３と霊長類／ウシＩＣＡＭ−３との間のプレｍＲＮＡスプライシングおよびタンパク質発現の比較を示す。すべてのＩＣＡＭ−３は、７つの推定エキソン（Ｅ１〜Ｅ７）を含有する類似のゲノム構造を共有し、そしてエキソン３〜７は、ゲノムの３’−近位領域においてクラスター化される。霊長類およびウシ種では、日常的なプレｍＲＮＡスプライシングが生じ、７つのすべてのエキソンの封入（太線および矢印で例示する）がもたらされる。エキソン１はシグナルペプチドをコードし、エキソン２〜６は、それぞれＤ１〜Ｄ５をコードし、そしてエキソン７は膜貫通ドメイン＋細胞質尾部をコードする。本研究のブタ種では、推定ＩＣＡＭ−３タンパク質においてＤ４およびＤ５が存在しないのは、プレｍＲＮＡスプライシングプロセス中のエキソン５および６（ｅ５およびｅ６）の連続スキッピング（細い線および矢印で例示する）から生じることが提示される。ブタＩＣＡＭ−３の既知のゲノムＤＮＡ配列の一部は、ＡＪ６３２３０３（クローンＲＰ４４−３７９Ｍ９）から参照されるが、ブタＩＣＡＭ−３の残りの未知の配列は、本発明の実験で決定される。
【図１２ｂ】図１２ｂは、プライマーＰＩＣ５３およびＰＩＣ５８を使用するゲノムＤＮＡフラグメントのゲノムＰＣＲ増幅によるブタＩＣＡＭ−３遺伝子のｅ５〜Ｅ７の間の未知の領域の配列の決定を示す（左側から右側の枠内の一連の配列は、それぞれ配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２に対応する）。霊長類／ウシＩＣＡＭ−３と比較して、ブタＩＣＡＭ−３エキソン５は、３−ｎｔのインフレームのナンセンス変異（ＣＴＴからＴＧＡへ、下線部）を含有するが、エキソン６は、上流の４−ｎｔ欠失（ＡＡＡＧ）による４つのインフレームナンセンス変異（下線部）を含有する。イントロン６（Ｉ６）における推定スプライスドナー部位の第１のヌクレオチドの点変異（ｇからａ）をアスタリスクで示す。
【図１３】ＲＴ−ＰＣＲによるブタ肝臓からのスプライシング中のｐＬＳＥＣｔｉｎプレｍＲＮＡの中間および最終産物（アイソフォーム）の増幅ならびにゲノムＰＣＲによるブタゲノムＤＮＡからのｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子の増幅を示す。破線の矢印は、スプライシングされた中間産物を示す；中実の線の矢印は、アイソフォームおよびｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子を示す。
【図１４ａ】図１４ａ〜１４ｃは、ｐＬＳＥＣｔｉｎのｃＤＮＡの遺伝子構造およびヌクレオチド配列を示す。図１４ａは、ｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子の遺伝子構造を示す。上の列は、ドメインのエキソン割り当てを示した。下の列は、推定ｐＬＳＥＣｔｉｎコード領域のドメイン構造を表した。ＣＴ：細胞質尾部；ＴＭＤ：膜貫通ドメイン；ＣＲＤ：炭水化物認識ドメインである。エキソン１および９の非翻訳領域を、白抜きの枠で示した。
【図１４ｂ】ｐＬＳＥＣｔｉｎ  ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列（配列番号３６に対応する）およびその推定アミノ酸配列（配列番号３７に対応する）を示す。本研究において決定されなかったｐＬＳＥＣｔｉｎ  ｃＤＮＡの非コード領域の両末端における余分なヌクレオチド配列に、破線の下線を付した。２つのインフレームの開始コドンおよび終止コドンを枠内に示した。２つの潜在的な内在化モチーフ、ＣＴにおけるＹＳＫＷおよびＥＥを、破線枠内に示した。推定ＴＭＤを二重枠で示したが、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）に下線を付している。ネック領域における２つの推定グリコシル化部位を、点線の下線で示した。ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を大文字で示した。矢印はエキソンの境界を示す。
【図１４ｃ】ｐＬＳＥＣｔｉｎ  ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列（配列番号３６に対応する）およびその推定アミノ酸配列（配列番号３７に対応する）を示す。本研究において決定されなかったｐＬＳＥＣｔｉｎ  ｃＤＮＡの非コード領域の両末端における余分なヌクレオチド配列に、破線の下線を付した。２つのインフレームの開始コドンおよび終止コドンを枠内に示した。２つの潜在的な内在化モチーフ、ＣＴにおけるＹＳＫＷおよびＥＥを、破線枠内に示した。推定ＴＭＤを二重枠で示したが、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）に下線を付している。ネック領域における２つの推定グリコシル化部位を、点線の下線で示した。ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を大文字で示した。矢印はエキソンの境界を示す。
【図１５ａ】ｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子と、他のＬＳＥＣｔｉｎ相同体ならびにｍＶＩＳＴＡプログラムによって作製したｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子との間の遺伝子配列およびエキソンの数の比較を例示する。配列の対の間の保存領域を、ｐＬＳＥＣｔｉｎの遺伝子配列の位置（Ｘ軸）に対する類似性のピーク（Ｙ軸）として示す。プロットの上の濃灰色の枠は、ｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子の９つのエキソンを表す。同じ灰色の陰線部におけるピークは、エキソン内の保存領域を示す一方、より薄い灰色の陰線のピーク（また、枠の上に陰線のないピーク）は、イントロン内の保存領域を示す。同一性パーセントのカットオフ値は、７０％に設定されている。ヒトおよびチンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子は、提示された開始コドンにおける点変異（ＧからＡ）のため、それらのタンパク質をコードする能力を消失した。２つのアカゲザルＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子は、フレームシフトをもたらす１−ｎｔ挿入または１−ｎｔ欠失のため、機能的なＬＳＥＣｔｉｎタンパク質をコードすることができない。チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子のエキソン４配列は、これまでのところ利用可能ではない。略称：ブタＬＳＥＣｔｉｎ（ｐＬＳＥＣｔｉｎ）、ウシＬＳＥＣｔｉｎ（ｂＬＳＥＣｔｉｎ）、イヌＬＳＥＣｔｉｎ（ｃａＬＳＥＣｔｉｎ）、ウマＬＳＥＣｔｉｎ（ｅＬＳＥＣｔｉｎ）、ヒトＬＳＥＣｔｉｎ（ｈＬＳＥＣｔｉｎ）、ヒトＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子（ｈｐＬＳＥＣｔｉｎ）、チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ（ｃｈＬＳＥＣｔｉｎ）、チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子（ｃｈｐＬＳＥＣｔｉｎ）、アカゲザルＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子（ｒｈｐＬＳＥＣｔｉｎ）、マウスＬＳＥＣｔｉｎ（ｍＬＳＥＣｔｉｎ）、ラットＬＳＥＣｔｉｎ（ｒＬＳＥＣｔｉｎ）、オポッサムＬＳＥＣｔｉｎ（ｏｐＬＳＥＣｔｉｎ）、カモノハシＬＳＥＣｔｉｎ（ｐｌＬＳＥＣｔｉｎ）、およびブタＤＣ−ＳＩＧＮ（ｐＤＣ−ＳＩＧＮ）。
【図１５ｂ】ｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子と、他のＬＳＥＣｔｉｎ相同体ならびにｍＶＩＳＴＡプログラムによって作製したｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子との間の遺伝子配列およびエキソンの数の比較を例示する。配列の対の間の保存領域を、ｐＬＳＥＣｔｉｎの遺伝子配列の位置（Ｘ軸）に対する類似性のピーク（Ｙ軸）として示す。プロットの上の濃灰色の枠は、ｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子の９つのエキソンを表す。同じ灰色の陰線部におけるピークは、エキソン内の保存領域を示す一方、より薄い灰色の陰線のピーク（また、枠の上に陰線のないピーク）は、イントロン内の保存領域を示す。同一性パーセントのカットオフ値は、７０％に設定されている。ヒトおよびチンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子は、提示された開始コドンにおける点変異（ＧからＡ）のため、それらのタンパク質をコードする能力を消失した。２つのアカゲザルＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子は、フレームシフトをもたらす１−ｎｔ挿入または１−ｎｔ欠失のため、機能的なＬＳＥＣｔｉｎタンパク質をコードすることができない。チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子のエキソン４配列は、これまでのところ利用可能ではない。略称：ブタＬＳＥＣｔｉｎ（ｐＬＳＥＣｔｉｎ）、ウシＬＳＥＣｔｉｎ（ｂＬＳＥＣｔｉｎ）、イヌＬＳＥＣｔｉｎ（ｃａＬＳＥＣｔｉｎ）、ウマＬＳＥＣｔｉｎ（ｅＬＳＥＣｔｉｎ）、ヒトＬＳＥＣｔｉｎ（ｈＬＳＥＣｔｉｎ）、ヒトＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子（ｈｐＬＳＥＣｔｉｎ）、チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ（ｃｈＬＳＥＣｔｉｎ）、チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子（ｃｈｐＬＳＥＣｔｉｎ）、アカゲザルＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子（ｒｈｐＬＳＥＣｔｉｎ）、マウスＬＳＥＣｔｉｎ（ｍＬＳＥＣｔｉｎ）、ラットＬＳＥＣｔｉｎ（ｒＬＳＥＣｔｉｎ）、オポッサムＬＳＥＣｔｉｎ（ｏｐＬＳＥＣｔｉｎ）、カモノハシＬＳＥＣｔｉｎ（ｐｌＬＳＥＣｔｉｎ）、およびブタＤＣ−ＳＩＧＮ（ｐＤＣ−ＳＩＧＮ）。
【図１５ｃ】ｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子と、他のＬＳＥＣｔｉｎ相同体ならびにｍＶＩＳＴＡプログラムによって作製したｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子との間の遺伝子配列およびエキソンの数の比較を例示する。配列の対の間の保存領域を、ｐＬＳＥＣｔｉｎの遺伝子配列の位置（Ｘ軸）に対する類似性のピーク（Ｙ軸）として示す。プロットの上の濃灰色の枠は、ｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子の９つのエキソンを表す。同じ灰色の陰線部におけるピークは、エキソン内の保存領域を示す一方、より薄い灰色の陰線のピーク（また、枠の上に陰線のないピーク）は、イントロン内の保存領域を示す。同一性パーセントのカットオフ値は、７０％に設定されている。ヒトおよびチンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子は、提示された開始コドンにおける点変異（ＧからＡ）のため、それらのタンパク質をコードする能力を消失した。２つのアカゲザルＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子は、フレームシフトをもたらす１−ｎｔ挿入または１−ｎｔ欠失のため、機能的なＬＳＥＣｔｉｎタンパク質をコードすることができない。チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子のエキソン４配列は、これまでのところ利用可能ではない。略称：ブタＬＳＥＣｔｉｎ（ｐＬＳＥＣｔｉｎ）、ウシＬＳＥＣｔｉｎ（ｂＬＳＥＣｔｉｎ）、イヌＬＳＥＣｔｉｎ（ｃａＬＳＥＣｔｉｎ）、ウマＬＳＥＣｔｉｎ（ｅＬＳＥＣｔｉｎ）、ヒトＬＳＥＣｔｉｎ（ｈＬＳＥＣｔｉｎ）、ヒトＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子（ｈｐＬＳＥＣｔｉｎ）、チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ（ｃｈＬＳＥＣｔｉｎ）、チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子（ｃｈｐＬＳＥＣｔｉｎ）、アカゲザルＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子（ｒｈｐＬＳＥＣｔｉｎ）、マウスＬＳＥＣｔｉｎ（ｍＬＳＥＣｔｉｎ）、ラットＬＳＥＣｔｉｎ（ｒＬＳＥＣｔｉｎ）、オポッサムＬＳＥＣｔｉｎ（ｏｐＬＳＥＣｔｉｎ）、カモノハシＬＳＥＣｔｉｎ（ｐｌＬＳＥＣｔｉｎ）、およびブタＤＣ−ＳＩＧＮ（ｐＤＣ−ＳＩＧＮ）。
【図１６】ブタＬＳＥＣｔｉｎプレｍＲＮＡからのイントロンの取り出しの提示された順序を示す。番号１〜９を有する枠は、９つのｐＬＳＥＣｔｉｎエキソン配列を表す。８つのイントロン配列（文字Ａ〜Ｈ）を、エキソン間の黒色線で示す。矢印は、スプライシング経路を示す。ＲＴ−ＰＣＲによって検出される遺伝子、スプライシング中間産物およびアイソフォームを、左側にそれらのそれぞれのサイズを表示すると共に示す。
【図１７】選択されたブタ組織におけるｐＬＳＥＣｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲによる検出を実証する。ブタ組織ｃＤＮＡを、プライマーＰＬＳＴ−Ｅ６７Ｆ／ＰＬＳＴ−Ｅ８９ＲまたはブタＧＡＰＤＨ特異的プライマーによるＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明に従えば、ブタＤＣ−ＳＩＧＮ（ｐＤＣ−ＳＩＧＮ）、ブタＩＣＡＭ−３（ｐＩＣＡＭ−３）、ブタＬＳＥＣｔｉｎ（ｐＬＳＥＣｔｉｎ）からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列の少なくとも１つの相補体、およびヌクレオチド配列の少なくとも１つの機能的な定義された部分を含む機能的フラグメントを含むこれまでに知られていない単離された核酸分子が提供される。
【００４４】
ゲノムＰＣＲ技術を使用して、本発明は、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）（イノシシ、ブタ科のメンバー）のインビトロで培養したブタ単球由来樹状細胞から単離された独特なｐＤＣ−ＳＩＧＮをコードする遺伝子全体およびｃＤＮＡ配列の分子クローニングおよび特徴付けを示す。マウスおよび文献において先に記載された他の種のゲノムデータベースにおけるＤＣ−ＳＩＧＮ相同体のコンピュータに基づくスクリーニングとは異なり、ＤＣ−ＳＩＧＮ関連ブタ遺伝子配列は、ブタゲノムデータベースにおいて利用することができず、それ故、完全な核酸配列をクローニングすることが課題であった。
【００４５】
また、本発明の範囲には、ブタ肝臓組織から単離された新たなｐＬＳＥＣｔｉｎタンパク質をコードする完全な遺伝子およびｃＤＮＡ配列も含まれる。本発明の開示物は、関連のブタタンパク質の組織および細胞部分布を示し、ｐＤＣ−ＳＩＧＮとｈＩＣＡＭ−３との間の交差相互作用を例示し、ｐＤＣ−ＳＩＧＮとｈＩＣＡＭ−２との間の交差相互作用を示し、そして特に重要なことに、ｐＤＣ−ＳＩＧＮによるトランスでの標的細胞へのＰＲＲＳＶ伝播の増大を実証する。
【００４６】
本発明の根拠は、ｈＤＣ−ＳＩＧＮおよびｈＬ−ＳＩＧＮが、多くのエンベロープウイルス、特に、ＰＲＲＳＶのようなマクロファージおよび樹状細胞において複製するそれらのウイルスの結合受容体であり得るという報告による。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮはまた、生殖系におけるＰＲＲＳＶ発病を仲介し、そして生殖不能に関与し得る。ブタ特異的ＤＣ−ＳＩＧＮおよびｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子を本明細書において同定し、そしてｈＤＣ−ＳＩＧＮおよびｈＬ−ＳＩＧＮと比較したところ、タンパク質構造において予想されていなかった類似性が今回観察されたことから、本明細書において、ＰＲＲＳＶは、ｐＤＣ−ＳＩＧＮを利用して、マクロファージおよび樹状細胞への進入を容易にし得、そしてＢＨＫ−２１のような複製コンピテント細胞におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮの発現が増殖性ＰＲＲＳＶ複製を生じることができることが決定される。従って、本発明は、さらに、増殖性ＰＲＲＳＶ複製を効率的に支持する遺伝子操作された安定なトランスフェクト細胞または細胞系統に関する。
【００４７】
意外なことに、本発明では、ブタＬＳＥＣｔｉｎは、アミノ酸レベルでヒトＬＳＥＣｔｉｎと高度に同一であることが観察されており、ｐＬＳＥＣｔｉｎは、ｈＬＳＥＣｔｉｎと同じ炭水化物−タンパク質相互作用パターンを共有することが示されている。先の研究では、ニパウイルス表面糖タンパク質（ＮｉＶ−Ｇ）がヒトＬＳＥＣｔｉｎに結合する能力、およびＮｉＶ−Ｇの推定受容体としてｈＬＳＥＣｔｉｎの可能な機能が報告された（T. A. Bowden et al., 2008、印刷中、上掲）。他の研究では、エボラウイルスのエンベロープタンパク質ならびにＳＡＲＳ−ＣｏＶのスパイクタンパク質は、同じ炭水化物モチーフを有し、そしてまた、ｈＬＳＥＣｔｉｎによって認識されることが報告された（T. Gramberg et al., 2005、上掲）。本発明の新たに発見されたｐＬＳＥＣｔｉｎとｈＬＳＥＣｔｉｎとの間に今回認められた類似性のため、新たなｐＬＳＥＣｔｉｎは、病原体認識受容体（ＰＲＲ）としての役割を果たして、宿主の生来の免疫応答を誘発し、そしてブタでの感染中のニパウイルスまたは他の病原性ブタエンベロープウイルスの伝播および拡大を容易にし得る。従って、ｐＬＳＥＣｔｉｎの有用性には、ウイルス−ｐＬＳＥＣｔｉｎ相互作用を阻止するための特異的抗ウイルス薬（例えば、炭水化物リガンド、ｓｉＲＮＡなど）の設計、ｐＬＳＥＣｔｉｎ依存的抗原認識を刺激し、そして宿主の生来の免疫応答を改善して、ワクチンの効力を増強する因子などを含有するウイルスワクチンの開発が含まれる。
【００４８】
また、本発明には、融合されたまたは融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮに連結されたｐＬＳＥＣｔｉｎを含み得る一方、融合されたタンパク質もまた、他のタンパク質の機能的な定義された部分に連結されたｐＬＳＥＣｔｉｎまたはｐＤＣ−ＳＩＧＮを含み得る。単独のもしくは融合されたｐＬＳＥＣｔｉｎ、ｐＤＣ−ＳＩＧＮまたはその機能的な定義された部分のいずれも、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎおよびそれらの組み合わせ、またはそれらの機能的な定義された部分からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質にさらに融合させてもよい。タンパク質の機能的な定義された部分は、ブタもしくはヒト相同体における免疫原性機能、受容体活性もしくは結合能を有することが同定されるそれらのドメインまたは領域、例えば、ｐＤＣ−ＳＩＧＮもしくはｐＬＳＥＣｔｉｎの炭水化物認識ドメイン、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎの細胞質尾部、膜貫通ドメインもしくは反復ネック領域、あるいはそれらの組み合わせに関する。
【００４９】
好適な実施形態では、融合されたまたは融合タンパク質は、抗原を捕捉することを担うｐＤＣ−ＳＩＧＮまたはｐＬＳＥＣｔｉｎの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）、ならびにエンドサイトーシスによって捕捉された抗原を細胞に吸収または貪食することを担うｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎまたはｈＬ−ＳＩＧＮの細胞質尾部（ＣＴ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）および反復ネック領域を含有してもよい。
【００５０】
ＰＲＲＳＶのような所定のエンベロープウイルスは、ＭＡＲＣ−１４５細胞系統のような限定された細胞系統のみにおいて、限定された程度で増殖することができ、そして十分な力価で培養することは困難である。ＢＨＫ−２１細胞の培養物のような他の細胞系統は、ＰＲＲＳＶが細胞の内部で複製することを可能にするが、ＰＲＲＳＶを細胞から細胞へ拡大させないことから、これは、ウイルスが、他の非感染ＢＨＫ−２１細胞に進入することができないことを意味し、抗原の産生、従って、実用的なワクチン製品の製造には課題が残る。有利なことに、ＰＲＲＳＶ受容体、即ち、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３、ｐＬＳＥＣｔｉｎなど、但し、望ましくは、ｐＬＳＥＣｔｉｎ、ｐＤＣ−ＳＩＧＮまたはその融合されたタンパク質構築物は、ウイルスが他の非感染細胞に進入し、十分な力価で繁殖することを可能にするＢＨＫ−２１細胞（即ち、生体工学的ＢＨＫ−２１細胞系統）の表面上で安定に発現させることができる。
【００５１】
従って、本発明に重要な態様は、ウイルス、好ましくは、エンベロープウイルス（主に、ＲＮＡウイルスである）、特に、細胞培養で全くまたは限定された程度でしか繁殖させることができないそれらのウイルスを、適切な細胞系統において繁殖させる新たなかつ高度に有益な方法を包含する。例えば、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタ呼吸器型コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ内在性レトロウイルス、ブタサイトメガロウイルス、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、アフリカブタコレラウイルス、ブタコレラウイルス、ブタポックスウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ＰＨＥＶ）などのようなエンベロープブタウイルス、ならびに感染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、ネココロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、シンドビスウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）などを培養するのに使用するための本発明のタンパク質もしくは融合されたタンパク質構築物を安定に発現するプラスミドまたはベクターが特に有利である。好ましくは、ブタワクチンを製造する目的でＰＲＲＳＶの繁殖を有意に改善するための新たな方法が用いられる。様Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ブタサーコウイルス２型などの非エンベロープウイルスもまた、新たな方法に使用することができる。
【００５２】
本発明のこの新規の方法に従えば、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３、ｐＬＳＥＣｔｉｎ、ヌクレオチド配列の少なくとも１つの相補体、それらの機能的な定義された部分または関連する融合されたタンパク質産物を安定に発現する新たな生体工学的細胞または細胞系統が、ウイルスを繁殖させるために使用される。発現されたタンパク質は、ウイルス受容体としての役割を果たして、ビリオンを捕捉して、細胞に取り込む。この方法においてブタタンパク質が存在すると、ウイルスの細胞間移行を援助し、それによって、ウイルスの繁殖を増強することによって、意外な利点が提供される。
【００５３】
１つの点に関して、改善された方法は、次の工程を用いる：（ａ）ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３およびｐＬＳＥＣｔｉｎからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列の少なくとも１つの相補体、ならびにヌクレオチド配列の少なくとも１つの機能的な定義された部分を含有するトランスフェクト細胞または細胞系統を提供する工程；（ｂ）細胞増殖培地においてトランスフェクトされた宿主細胞または細胞系統を増殖させて、培養物を形成する工程；（ｃ）前記培養物にウイルスを播種する工程；ならびに（ｄ）播種された培養物を、適切なウイルス培地において、培養物中でウイルスを増殖させるのに有効な条件下でインキュベートする工程。方法は、細胞変性効果が観察されるか、または高い力価が達成されるまで、播種された培養物をインキュベートする工程；あるいは細胞を溶解して、細胞内のビリオンを放出させる工程；および（ｇ）ウイルス抗原を回収する工程を、場合により、さらに含み得る。
【００５４】
プロセス展開のためのウイルスを繁殖させるための独特な方法はまた、次の基本工程を含み得る：（ａ）ポリペプチド産物の発現を可能にする様式で、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３およびｐＬＳＥＣｔｉｎからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列の少なくとも１つの相補体、ならびにヌクレオチド配列の少なくとも１つの機能的な定義された部分を含むベクターまたは本明細書に記載の融合されたタンパク質で適切な細胞をトランスフェクトする工程；（ｂ）タンパク質または融合ポリペプチド産物を安定に発現する細胞を、適切な細胞増殖培地により単層で増殖させる工程；（ｃ）増殖培地を取り出し、ウイルスストックを細胞に播種し、続いて、３７℃で通常１時間の初期の短期間のインキュベーションを行う工程；（ｄ）ウイルス培地を添加し、そしてウイルスの量が、ウイルスに依存してＣＰＥ（細胞変性効果）または高い力価によって示されるような十分なレベルに到達するまで、ウイルスを２〜３日間培養する工程；ならびに（ｅ）細胞を溶解して、細胞内のビリオンを放出させ、ウイルス滴定を実施し、そしてウイルスストックを凍結する工程。
【００５５】
独特なブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮおよびマウスＳＩＧＮＲファミリーに相同であるが、本明細書に記載のような所定のばらつきがあることが見出されている。新たなブタＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質は、２４０アミノ酸を有し、そしてＩＩ型膜貫通タンパク質であることが見出されている。そのＣ末端では、細胞外領域は、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含有する。意外なことに、ブタＤＣ−ＳＩＧＮの推定アミノ酸配列は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ、非ヒト霊長類ＤＣ−ＳＩＧＮまたは他のマウスＳＩＧＮＲ相同体よりも、系統的に、マウスＳＩＧＮＲ７およびＳＩＧＮＲ８により緊密に関連し、ブタＤＣ−ＳＩＧＮの異なる進化経路を示す。遺伝子を含有する真核細胞発現プラスミドでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の表面上のブタＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の一過性発現を、特異的抗ペプチドブタＤＣ−ＳＩＧＮ抗体による免疫蛍光アッセイによって確認した。
【００５６】
ヒト、非ヒト霊長類およびマウスＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子に基づく縮重ＲＴ−ＰＣＲプライマーを使用することによって、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ（ｈＤＣ−ＳＩＧＮ）に相同な配列を伴う短いフラグメントを、インビトロで培養したブタ単球由来樹状細胞から増幅した。続いて、最初に得られる配列に基づいて、完全なｃＤＮＡおよびブタＤＣ−ＳＩＧＮ相同体の遺伝子の両方を、ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）−ＰＣＲによって決定した。さらに、ブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の発現は、細胞表面に局在することを見出し、タンパク質の膜貫通特性が確認された。続いて、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗体を作製し、そしてｐＤＣ−ＳＩＧＮを発現する安定な細胞系統を開発した。遺伝子構造、組織および細胞分布ならびにｐＤＣ−ＳＩＧＮのヒトＩＣＡＭ−３およびＩＣＡＭ−２免疫接着因子へのインビトロ結合特性、ならびにｐＤＣ−ＳＩＧＮとＰＲＲＳＶとの間の潜在的な相互作用を特徴付けた。
【００５７】
従って、本発明の重要な実施形態は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮをコードする単離されたもしくは精製された核酸分子またはそのｃＤＮＡクローンあるいはｐＤＣ−ＳＩＧＮ単独かまたはｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎに連結されたｐＤＣ−ＳＩＧＮから構築されたタンパク質融合産物、あるいはそれらの任意の組み合わせに関する。望ましくは、ｐＤＣ−ＳＩＧＮをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１またはその相補鎖を含む。当該技術分野において周知である従来の方法を使用して、例えば、当該分野において認識された標準的なまたは高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション技術によって、配列番号１に高い相同性を有する相補鎖またはヌクレオチド配列を作製することができる。
【００５８】
本発明のもう１つの重要な実施形態は、ｐＬＳＥＣｔｉｎをコードするｃＤＮＡおよび完全な遺伝子の同定および特徴付けに関する。全長ｐＬＳＥＣｔｉｎのｃＤＮＡは、２９０個のアミノ酸のＩＩ型膜貫通タンパク質をコードする。今回、ブタＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子が、ヒトＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子、ならびに９つのエキソンを伴う推定ウシ、イヌ、マウスおよびラットＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子と同じ遺伝子構造を有することが見出されている。ＬＳＥＣｔｉｎのｍＲＮＡの端側３’−非翻訳領域における複数種保存性部位は、それぞれ、家畜におけるマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−３５０および霊長類におけるｍｉＲ−１４５の標的になることが予想された。ヒトＬＳＥＣｔｉｎと同様に、ｐＬＳＥＣｔｉｎのｍＲＮＡ発現は、肝臓、リンパ節および脾臓に分布した。ｐＬＳＥＣｔｉｎプレｍＲＮＡの一連の連続中間産物もまた、ブタ肝臓からのスプライシング中に同定した。
【００５９】
また、本発明の範囲内には、本明細書に記載の新たな核酸分子または融合産物を含有する生物学的に機能的なプラスミド、ウイルスベクターなど、本発明のプラスミドまたはベクターによって一過的にトランスフェクトされた適切な細胞、およびポリペプチド発現産物が含まれる。本発明の目的のために、ベクターは、広い意味で、任意の市販の標準的なウイルスベクターであってもよく、または当業者に公知の同種の生物学的に機能的なプラスミドであってもよいが、好ましくは、本発明の例示された組み換え２シストロン性ベクターｐＴｒｉＥｘ−ＰＤＣＳから最適かつ有利な結果を達成するためのｐＴｒｉＥｘ−１．１  Ｎｅｏである。
【００６０】
例示および比較により、組み換え２シストロン性ベクターｐＴｒｉＥｘ−ＰＤＣＳの構築および本明細書に記載のブタＤＣ−ＳＩＧＮを安定に発現するＢＨＫ−２１細胞系統の作製のためのｐＴｒｉＥｘ−１．１  Ｎｅｏは、他のベクターより有意な利点を提供する。ｐＤＣ−ＳＩＧＮを安定に発現するＢＨＫ−２１細胞系統を作製するためのｐＴｒｉＥｘ−ＰＤＣＳおよびｐＣＩ−ＰＤＣＳ構築物をそれぞれ設計し、次いで、フローサイトメトリー解析によって試験して、一過的にトランスフェクトされた細胞の百分率を調べた。ｐＣＩ−ＰＤＣＳ構築物の結果は、ｐＣＩ−ＰＤＣＳプラスミドの一過性トランスフェクションにより、ｐＤＣ−ＳＩＧＮの約１０％〜３０％の発現（図３）を示した。極めて対照的に、図８ａの上の第２のパネルに示すフローサイトメトリー分取は、ベクターをトランスフェクトしたコントロールと比較して、構築された新たな細胞系統の９５％を超える細胞がｐＴｒｉＥｘ−ＰＤＣＳの使用によりｐＤＣ−ＳＩＧＮを発現したことを実証する。両方の実験の詳細を以下に記載する。
【００６１】
最適なトランスフェクション結果のため、および本発明のタンパク質を安定に発現する細胞または細胞系統の構築のために、プロセスでは、Ｇ４１８耐性スクリーニングまたは当業者に公知の類似のスクリーニング技術を利用することが強く所望される。ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３および／またはｐＬＳＥＣｔｉｎを安定に発現するようにトランスフェクトすることができ、ウイルス繁殖に特に有用であり、ウイルス収量を増加し、そして免疫応答を誘導し、特に、ブタ抗原に対する免疫応答を増加する適切な細胞または細胞系統として、限定されないが、ＢＨＫ−２１、ＭＡＲＣ−１４５、ＰＫ−１５、ＣＯＳ−７、ＶＥＲＯ、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、Ｒａｊｉ  Ｂ、ＣＨＯ−Ｋ１、３Ｄ４／３１、ＳＪＰＬ、ＩＰＥＣ−Ｊ２、ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２６４．７、ＳＴ細胞、ＭＡ−１０４、２９３Ｔなどの培養物が挙げられ、但し、好ましくは、宿主細胞は、ＢＨＫ−２１細胞、ＭＡＲＣ−１４５細胞または他の樹状細胞系統、マクロファージ細胞系統、単球系細胞系統、絨毛細胞系統、リンパ系細胞細胞系統など、望ましくは、単球由来樹状細胞、間質樹状細胞などの培養物を含む。本明細書に記載の新規の発現、繁殖および関連する方法は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、または宿主細胞へのウイルス進入を可能にするウイルス受容体として作製されるその誘導された融合構築物を安定に発現するそのような適切な細胞または細胞系統を利用する。用語は、本発明の目的のために本明細書において同義的に使用されるが、用語「宿主細胞」は、動物またはヒトから直接および外部で培養される初代細胞を指し、即ち、本発明の宿主細胞は、顕微鏡または微生物レベルにおいてであり、動物またはヒト全体の感染に基づくものではないことが意図される。用語「細胞」は、宿主（例えば、ブタ）細胞系統に属さない初期のタイプの単離された細胞を指す。用語「細胞系統」は、特定の細胞タイプに代表的な樹立された細胞系統を指す。
【００６２】
特に好適なタンパク質またはポリペプチドは、共通の用語として、同義的に使用され、配列番号２および図２に記載のアミノ酸配列を有する単離されたｐＤＣ−ＳＩＧＮポリペプチドを包含し、単離されたｐＩＣＡＭ−３ポリペプチドは、配列番号５および図１１ａ〜１１ｂに記載のアミノ酸配列を有し、そして単離されたｐＬＳＥＣｔｉｎポリペプチドは、配列番号３７および図１４ｂ〜１４ｃに記載のアミノ酸配列を有する。ブタタンパク質の生物学的に活性な変異体も本発明にさらに包含される。当業者であれば、ポリペプチド配列由来のアミノ酸を改変、置換、欠失などし、そして過度の努力を伴わずに、親配列と同じか、または実質的に同じ活性を保持する生物学的に活性な変異体を産生させる仕方を知っている。
【００６３】
本発明のポリペプチド産物、特に、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＬＳＥＣｔｉｎまたはその融合タンパク質構築物を産生または発現させるために、プロセスは、次の工程を含んでもよい：適切な栄養条件下で、選択された核酸分子でトランスフェクトされた原核細胞または真核細胞宿主細胞を、ポリペプチド産物またはポリペプチド融合産物の発現を可能にする様式で増殖させ、そして当該技術分野において公知の標準的な方法によって、前記核酸分子の発現の所望されるポリペプチド産物を単離する工程。トランスフェクションのための核酸分子は、例えば、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３およびｐＬＳＥＣｔｉｎからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列の少なくとも１つの相補体、ならびにヌクレオチド配列の少なくとも１つの機能的な定義された部分、または本明細書に記載の融合タンパク質を含む。本発明のブタタンパク質、融合されたタンパク質などは、例えば、生化学合成などのような他の技術によって調製してもよいことが考慮される。
【００６４】
本発明のもう１つの重要な実施形態は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、特に、配列番号２のアミノ酸配列に対して惹起され、そしてそれに特異的に結合する単離されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体、さらにまた、配列番号５および配列番号３７のそれぞれのアミノ酸配列に特異的に結合するｐＩＣＡＭ−３およびｐＬＳＥＣｔｉｎに対して惹起された抗体に関する。好ましくは、抗体はポリクローナルであり、そしてポリクローナル抗体は、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１３および配列番号１４の組み合わせを含むペプチド領域に特異的に結合する。また、本発明の範囲内には、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、特に、配列番号２またはｐＩＣＡＭ−３もしくはｐＬＳＥＣｔｉｎのアミノ酸配列に特異的に結合する例えば、マンノース−、フコース−またはガラクトース−含有オリゴ糖などのような天然または人工的に合成されたオリゴ糖リガンド、ならびにｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３およびｐＬＳＥＣｔｉｎ、望ましくは、ｐＬＳＥＣｔｉｎまたはｐＤＣ−ＳＩＧＮを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統が含まれる。抗体、オリゴ糖リガンドおよびハイブリドーマ細胞系統は、本明細書に記載の方法によって、ならびに当業者に公知の標準的な方法によって調製してもよい。
【００６５】
オリゴ糖リガンドのｐＤＣ−ＳＩＧＮのような１つ以上のブタタンパク質への結合は、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン系を介するポリペプチド抗原−オリゴ糖複合体の作製によって仲介され得る。第１に、ポリペプチド抗原は、ストレプトアビジンに化学的に結合される。続いて、ストレプトアビジン−抗原コンジュゲートは、ストレプトアビジン−ビオチン結合を介して、オリゴ糖−ＰＡＡ−ビオチンに連結される。インビトロでの研究では、例えば、ｐＤＣ−ＳＩＧＮのようなブタタンパク質を安定に発現する細胞系統を、抗原−オリゴ糖コンジュゲートと共にインキュベートして、リガンド内在化について調べ、その活性を確認し、そして抗原特異的エフェクターＴ細胞の活性化と、ポリペプチドのみによって誘導される活性化とを比較する。オリゴ糖リガンドに加えて、抗ｐＤＣ−ＳＩＧＮ抗体、抗ｐＩＣＡＭ−３抗体または抗ｐＬＳＥＣＴｉｎ抗体を使用して、ポリペプチド抗原に架橋し、それぞれｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３またはｐＬＳＥＣｔｉｎ受容体を標的にすることができる。ｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的オリゴ糖または抗ｐＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を添加すると、抗原が免疫応答を開始する未熟樹状細胞に集中する。
【００６６】
基本的に、本発明のハイブリドーマ細胞系統は、次のものによって調製され得る：本発明のブタタンパク質抗原によるマウスの免疫化およびハイブリドーマ細胞の作製のためのマウスドナーの選択；抗体産生のためのマウスのスクリーニング；骨髄腫細胞の調製；骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合；限界希釈によるハイブリドーマ細胞系統のクローニング；ならびに腹水産生によるクローンの拡大および安定化。当業者であれば、他の日常的工程または文献において公開された方法を介して、ハイブリドーマ細胞系統を産生させる仕方を理解していることが考慮される。
【００６７】
本発明は、新たな免疫原性組成物、ならびにｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３および／またはｐＬＳＥＣｔｉｎを標的にすることによって、抗原特異的免疫応答を増強することができるブタタンパク質抗体を使用する方法をさらに含む。本発明の文脈内で使用するように、ｐＤＣ−ＳＩＧＮまたはｐＩＣＡＭ−３を「標的にする」とは、身体全体を通して、未熟樹状細胞が、リガンド（例えば、オリゴ糖もしくは抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体）と樹状細胞上の受容体（例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮ）との間の相互作用によって、免疫化された抗原−オリゴ糖コンジュゲートまたは抗原−抗タンパク質抗体複合体を認識する（そのままの抗原（ｎａｋｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）で免疫するより効率的である）ことを意味する。ｐＬＳＥＣｔｉｎ受容体を標的にするための適切な抗体複合体の同種の使用には、肝臓細胞が関与する。
【００６８】
本発明はまた、非毒性の生理学的に許容できるキャリアおよび抗原と混合されたかまたは共有結合した免疫原性量の本明細書に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体、あるいは、本明細書に記載のブタタンパク質を伴うキャリアを含む新規の獣医学的組成物を包含する。好ましくは、コンジュゲートワクチンが使用され、そしてこれは、標準的なプロセスによって作製して、貧弱な抗原をキャリアタンパク質として作用する抗体に共有結合させ、それによって、付着した抗原に免疫学的属性を付与することができる。
【００６９】
ブタに投与する場合、本発明の獣医学的組成物は、例えば、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィラス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、豚連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、エリシペロスリクス・ルシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、レプトスピラ属細菌、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、ブタパルボウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ブタ呼吸器型コロナウイルス、ロタウイルス、オーエスキー病、ブタ伝染性胃腸炎などの原因病原体のような１つ以上のブタ抗原を含有してもよい。本発明の組成物は、場合により、多様な典型的に非毒性の薬学的に許容できるキャリア、添加物、希釈剤およびアジュバントを含有する。例示として、獣医学的組成物を、例えば、ＰＣＶ−２およびＰＲＲＳＶのような１つ以上の抗原との混合またはそれにコンジュゲートされたｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３またはｐＬＳＥＣｔｉｎに特異的な抗ペプチドポリクローナル抗体を、適切なキャリア、保存剤およびアジュバントシステムとの組み合わせで含有するように調製してもよい。
【００７０】
本発明において所望される遺伝子操作されたワクチンは、当該技術分野において公知の技術によって生成される。そのような技術は、組み換えＤＮＡのさらなる操作、ＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質のアミノ酸配列の修飾または置換などに関与するが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明の融合されたタンパク質産物は、例えば、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮの細胞質尾部（ＣＴ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）および反復ネック領域とブタＤＣ−ＳＩＧＮの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）とを融合することによって、作製してもよい。例示として、２ラウンドのＰＣＲを含む融合ＰＣＲ技術を実施して、所望される融合フラグメントを作製してもよい。第１ラウンドのＰＣＲでは、全長ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡから得られたヒトＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮのＣＴ、ＴＭＤおよびネック領域を含有する上流のフラグメントを、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡクローンを使用して、プライマーＰ１およびＰ２によって増幅する一方、全長ブタＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡから誘導されるブタＤＣ−ＳＩＧＮのＣＲＤを含有する下流のフラグメントを、プライマーＰ３およびＰ４によって増幅する。プライマーＰ２およびＰ３は、相互に逆相補的である。それらの３’または５’末端で短いストレッチ（約２５ｂｐ）を共有する２つのフラグメントを精製し、そして第２のラウンドのＰＣＲのテンプレートとして使用して、プライマーＰ１およびＰ４で融合フラグメントを増幅する。第２のラウンドのＰＣＲ産物を、所望される制限酵素で二重消化し、そして同じ制限酵素で消化した発現ベクターにクローニングする。この融合ＰＣＲ技術については、S.U. Emerson et al., “In vitro replication of hepatitis E virus (HEV) genomes and of an HEV replicon expressing green fluorescent protein,” J. Virol. 78(9):4838-4846 (2004)にさらに説明されている。
【００７２】
フラグメントが活性であり、そして本発明において有用であることを決定するために、標準的なリガンド結合およびエンドサイトーシス活性アッセイを実施して、融合されたタンパク質のいずれかの部分の潜在的役割を確認してもよい。典型的に、ｐＤＣ−ＳＩＧＮまたはｐＬＳＥＣｔｉｎのｃＤＮＡから単離された融合タンパク質のＣＲＤ（炭水化物認識ドメイン）部分は、リガンド−結合アッセイによって確認可能なブタ病原体の認識および捕捉を担う一方、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬＳＥＣｔｉｎまたはｈＬ−ＳＩＧＮから誘導される融合タンパク質のＣＴ（細胞質尾部）、ＴＭＤ（膜貫通ドメイン）および反復ネック領域は、捕捉された病原体の細胞へのエンドサイトーシスによる取り込みを担い、これは、エンドサイトーシス活性アッセイによって実証することができる。
【００７３】
本発明は、本明細書に記載の免疫学的に有効量の獣医学的組成物を動物に投与することを含む未処置のおよびリコールＴ細胞応答を効率的に誘導することによって、動物における抗原（即ち、免疫原として作用する病原体）に対する受動免疫を付与する新たな方法を含む。抗原または病原体に対する抗原特異的免疫応答を提供する方法は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３またはｐＬＳＥＣｔｉｎを標的にすることによって、弱い抗原または病原体の免疫原性活性を増強するように優先的に設計される。これに関して、共有結合型ワクチン産物が特に有用である。抗体組成物由来の増強された免疫学的有効性を必要とする貧弱な抗原または免疫原性物質は、ウイルス、細菌、真菌または寄生体を含む。本発明の抗体は、細胞受容体部位における病原体の増強された進入を提供し、免疫応答の誘導、最終的に疾患伝播の予防を援助する。好ましくは、免疫原性増強組成物を必要とする動物は、ブタであるが、ウシまたはイヌのような他の動物もまた有益であることが予想される。
【００７４】
方法では、本発明の免疫学的有効量の組成物は、動物において防御免疫応答を誘導するために、疾患または感染に対する保護が必要な動物、特に、幼期のブタに投与される。ｐＤＣ−ＳＩＧＮ、ｐＩＣＡＭ−３またはｐＬＳＥＣｔｉｎを標的にすると、動物の免疫応答が増強される。有効な免疫量とは、病原体の有害効果から動物を保護するために、十分な免疫学的応答が達成される量である。獣医学的組成物が、少なくとも、ワクチン分野における標準値により必要とされるかなりの数の播種された動物を保護することが可能である場合、防御免疫応答が得られると考えられる。動物に播種され、そして満足のいくワクチン接種効果を発揮する免疫学的に有効な用量または有効な免疫量は、標準的な滴定研究のような日常的な試験によって、容易に決定または滴定することができる。
【００７５】
本発明の新規の免疫原性組成物は、健常な動物、好ましくは、約３箇月齢の幼期ブタのワクチン接種に用いられる。ワクチンはまた、繁殖期前の雌性ブタ（即ち、３箇月齢を超える）のような成熟または成獣動物に投与してもよい。ワクチンは、抗体価が低下し、そして追加注入が必要と思われる場合、単回用量または反復用量で、投与することができる。望ましくは、ワクチンは、健常な動物に単回播種で投与され、疾患に対する長期の保護を提供し、少なくとも１〜３年間以上、動物を保護する。適切な用量は、標準的な滴定研究によって決定される。
【００７６】
本発明はまた、非霊長類大型動物種から未知のＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡ相同体をクローニングする独特な方法を含み、次の工程を含む：（ａ）動物の静脈血から、適切な宿主細胞において、単球由来樹状細胞を単離し、そして前記樹状細胞の増殖を可能にする適切な栄養条件下で、インビトロで培養する工程；（ｂ）ＲＮＡを抽出する工程；（ｃ）ｃＤＮＡの第１鎖を合成し、そしてＲＴ−ＰＣＲによって、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに相同な配列を有する短いフラグメントを増幅するために、ヒトおよびマウスＤＣ−ＳＩＧＮをコードする核酸分子の複数の配列アラインメントに基づいて、ヒトおよびマウスＤＣ−ＳＩＧＮヌクレオチド配列の保存配列に相補的であるように設計された縮重プライマーを使用して、逆転写酵素（ＲＴ）およびＰＣＲを実施する工程；（ｄ）それぞれ、５’−ＲＡＣＥまたは３’−ＲＡＣＥについて設計した、配列番号９を含む遺伝子特異的プライマーＰＤＲ−１および配列番号１０を含む遺伝子特異的プライマーＰＤＦ−１を使用して、縮重ＰＣＲ産物由来の配列情報に基づき、短いフラグメントに対して逆転写酵素およびＲＡＣＥ−ＰＣＲを実施する工程；（ｅ）ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）−ＰＣＲ反応産物によって、動物における未知のＤＣ−ＳＩＧＮ相同体の完全なｃＤＮＡの２つの重複フラグメントをクローニングする工程；（ｆ）動物のＤＣ−ＳＩＧＮ相同体を単離、精製または配列決定する工程。
【００７７】
上記のクローニング方法では、適切な宿主細胞として、ＣＤ１４陽性末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）、脾臓由来リンパ球、骨髄由来リンパ球などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、新たなクローニング方法における宿主細胞は、ＣＤ１４陽性ＰＢＭＣの培養物を使用する。
【００７８】
細胞の継代期の１つの例として、ＤＣ−ＳＩＧＮを安定に発現する細胞を、光学顕微鏡で観察されるように、単層で培養する。ウイルス播種に必要であれば、細胞を、３〜４日間ごとに継代する。細胞増殖培地、例えば、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１×抗生物質（１０，０００単位／ｍＬペニシリンＧ、１０，０００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）を追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を、各フラスコから取り出し、そして細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ（ＴＥ）のような１ｍＬのタンパク質分解酵素と共にインキュベートする。細胞剥離が最初に認められた時点で、ＴＥを取り出す。５ミリリットルの細胞増殖培地を、懸濁された細胞に添加する；懸濁液を吸引し、そして５つのフラスコに分ける。７ミリリットルの細胞増殖培地を、各フラスコに添加し、続いて、吸引する。フラスコを加湿インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）に移し、そして細胞増殖のために水平位置でインキュベートする。フラスコに、ウイルス（例えば、ＰＲＲＳＶ）を播種するか、または９０％コンフルエンスが観察される場合、さらなる細胞継代に使用する。
【００７９】
ウイルス培養の例として、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ／ＰＳ細胞増殖培地を取り出す；そして細胞に、適切な滴定値を有する１ｍＬウイルスストックを播種する。フラスコを、１時間、水平にインキュベートする（３７℃、５％ＣＯ２）。次いで、９ミリリットルのウイルス培地（抗生物質を含まない２％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）を、各フラスコに添加し、そしてフラスコを、加湿インキュベータに２〜３日間、戻す。細胞のほとんどにおいて、光学顕微鏡下で細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められるまで、ウイルス培養を継続する。ＣＰＥが観察される場合、−８０℃に凍結することによって、細胞培養を終結させる。−８０℃〜室温の連続凍結／融解サイクルをさらに２回実施して、細胞を溶解し、そして細胞内ビリオンを放出させる。ウイルスワクチンを製造するためにさらに処理するために、プロセス展開またはウイルス播種に使用するまで、得られるウイルスストック溶液を滴定し、そして−８０℃で凍結する。
【００８０】
ＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子に関して、本発明は、初めて、ｐＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡのクローニングについて説明し、そして事実上、非霊長類大型動物種由来の（ｈＤＣ−ＳＩＧＮの）ＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡ相同体のクローニングに関する最初の報告について説明する。ブタゲノム配列決定プロジェクト（ＳＧＳＰ）データベースにおいて利用可能な関連配列は認められなかったため、本発明は、ブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子をクローニングするために、マウスＳＩＧＮＲ分子に先に使用されたストラテジーと比較して、全く異なるかつ新規のストラテジーを使用した。ブタＭＤＤＣをインビトロで作製し、そしてＭＤＤＣ細胞から抽出された全ＲＮＡを使用して、ブタＤＣ−ＳＩＧＮ相同体をクローニングした。ヒトおよびマウスＤＣ−ＳＩＧＮ配列に基づく縮重プライマーを使用することによって、ｈＤＣ−ＳＩＧＮおよびマウスＤＣ−ＳＩＧＮＲに配列相同性を有する２１０ｂｐフラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲによって最初に増幅した。この初期配列に基づいて、続いて、２つの重複フラグメントにおいて、それぞれ、５’−および３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲによって、ブタＤＣ−ＳＩＧＮの完全なｃＤＮＡ配列を得た。加えて、完全なｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子を、ｃＤＮＡ配列に基づき、ワンステップゲノムＰＣＲによって独自にクローニングした。ここで用いたクローニングストラテジーは、配列情報が入手できない他の動物種のＤＣ−ＳＩＧＮ相同体の同定に極めて有用である。
【００８１】
ブタＤＣ−ＳＩＧＮはブタＭＤＤＣからクローニングされたが、ｐＤＣ−ＳＩＧＮは、本来の精製されたＣＤ１４陽性ＰＢＭＣから増幅することができなかったことから、ｐＤＣ−ＳＩＧＮの発現は、ＭＤＤＣの発達中に活性化されたことが示唆される。
【００８２】
マウスＳＩＧＮＲメンバーでは、ＳＩＧＮＲ３のみが、高マンノースおよびフコース含有グリカンの両方に結合する能力をｈＤＣ−ＳＩＧＮと共有する（Ｐｏｗｌｅｓｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６、上掲）。ＳＩＧＮＲ２は、ＧｌｃＮＡｃ−末端グリカンにほとんど排他的に結合し、そして選択的にシアル酸を認識するシアル酸結合受容体のシグレックファミリーのいくつかのメンバーと同様に、ＳＩＧＮＲ７は、６−スルホ−シアリルルイスｘグリカンに優先的に結合する（同上）。本明細書において同定されたｐＤＣ−ＳＩＧＮは、ＣＲＤにおけるカルシウム依存的炭水化物結合性に関与する９つのすべての保存残基を有する。
【００８３】
しかし、配列アラインメントの結果は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮが、おそらく、ｈＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮとは異なる炭水化物結合特異性を有することを示唆しているが、他のＤＣ−ＳＩＧＮ関連タンパク質と比較して、配列相同性が低いため、それらは、類似のリガンド結合能をｈＤＣ−ＳＩＧＮと共有する。これは主に、ブタおよびウシＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の両方が、ＣＲＤの適切なフォールディングを容易にし、そしてカルシウム依存的炭水化物結合性に関与するすべての構造的保存残基を有することによる。これに対し、これらの相互作用は、タンパク質−炭水化物相互作用に加えて、ｈＩＣＡＭ−２およびｈＩＣＡＭ−３に結合するｈＤＣ−ＳＩＧＮの系統的変異導入解析によって示唆されているようにタンパク質−タンパク質相互作用に関与し得る（S. V. Su et al., “DC-SIGN binds to HIV-1 glycoprotein 120 in a distinct but overlapping fashion compared with ICAM-2 and ICAM-3,” J. Biol. Chem. 279:19122-32 (2004))。さらに加えて、ｈＤＣ−ＳＩＧＮは、ｇｐ１２０およびＩＣＡＭ−３について、異なるが重複する結合様式を有することが、先に示された(T. B. Geijtenbeek et al., “Identification of different binding sites in the dendritic cell-specific receptor DC-SIGN for intercellular adhesion molecule 3 and HIV-1,” J. Biol. Chem. 277:11314-11320 (2002)；Su et al., 2004、上掲）。ｈＤＣ−ＳＩＧＮのａａ３５１位におけるバリンからグリシンへの単一の変異は、ＩＣＡＭ−３結合性を無効にしたが、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０相互作用は無効にしなかった（Geijtenbeek et al., 2002、上掲）。しかし、バリンがアラニンに変異した場合、ＩＣＡＭ−３またはＩＣＡＭ−２への結合は、いずれも影響を受けなかった（Su et al., 2004、上掲）。ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質は、ウシ、イヌおよびウマＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質が特異的に共有する２０４位のヒスチジン残基を有する。バリンからヒスチジンへの変化は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ−ｈＩＣＡＭ−３／ｈＩＣＡＭ−２相互作用に対する影響が最小であるようである。
【００８４】
個々のＣＲＤ単独による小さな炭水化物化合物の認識は、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮとＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のような病原体との高い親和性相互作用を達成するのに不十分であることが示されている。ネック領域の反復ドメイン欠失変異に関する生化学的研究によってもまた、四量体を形成するのに最小で３つの反復が必要であること、およびさらなる反復が四量体を安定化することが示された（G. A. Snyder et al., “The structure of DC-SIGNR with a portion of its repeat domain lends insights to modeling of the receptor tetramer,” J. Mol. Biol. 347:979-989 (2005)）。本発明において新たに同定されたｐＤＣ−ＳＩＧＮは、既知のウシ、イヌおよびウマＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質と共に、ネック領域において反復配列を有さなかったことから、ブタＤＣ−ＳＩＧＮを含むこれらのタンパク質は、四量体を形成することができず、それ故、ブタＤＣ−ＳＩＧＮが、異なる炭水化物結合特異性を有するという意見を支持することが示唆された。
【００８５】
ｐＤＣ−ＳＩＧＮは、ｈＩＣＡＭ−３およびｈＩＣＡＭ−２のような潜在的リガンドと効果的に相互作用し、そしてＰＲＲＳＶを捕捉して、標的細胞に伝達することが可能であると示されないため、これは、これらのタンパク質の結合能に直接関連しない。同様に、ネック領域に反復配列を伴わないウシＤＣ−ＳＩＧＮはまた、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ならびにマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧに結合し、そしてそれらを内在化する能力を有する（Y. Yamakawa et al., “Identification and functional characterization of bovine orthologue to DC-SIGN,” J. Leukoc. Biol. 83:1396-403 (2008)）。もう１つの例は、ネック領域に反復領域がないｈＤＣ−ＳＩＧＮ関連レクチンＬＳＥＣｔｉｎであり、そしてなおそれは、ヒト骨髄細胞による抗原捕捉および病原体結合性を仲介することが可能である（A. Dominguez-Soto et al., “The DC-SIGN-related lectin LSECtin mediates antigen capture and pathogen binding by human myeloid cells,” Blood 109:5337-45 (2007)）。ｐＤＣ−ＳＩＧＮはＰＲＲＳＶ進入に関与しないが、本明細書では、ｐＤＣ−ＳＩＧＮは、操作されたＢＨＫドナー細胞から標的ＭＡＲＣ−１４５細胞へのトランスでのウイルス伝播を、これらの２つの細胞系統が両方ともブタ起源ではないという事実にもかかわらず、増強することができることが示されている。
【００８６】
細胞表面上で発現されたｐＤＣ−ＳＩＧＮの可溶性ｈＩＣＡＭリガンドへの結合もまた、本明細書において実証される。ｈＩＣＡＭ−２のｐＤＣ−ＳＩＧＮへの結合を改善すること、またはｈＩＣＡＭ−３のｐＤＣ−ＳＩＧＮへの結合を阻止することは、治療価値を有し得る。レシピエントＴ細胞が異種移植片拒絶を仲介するため、特に、インビボでの細胞細胞接着相互作用は、ブタ−ヒト間異種移植の臨床応用に重要な意味を有し得る。さらに加えて、組織および細胞の局在ならびにｐＤＣ−ＳＩＧＮの特性およびヒトの天然のリガンドに対するその交差結合は、細胞接着におけるこのレクチンの類似の生理学的役割を強く示唆する。ｐＬＳＥＣｔｉｎおよびｐＩＣＡＭ−３について同様の役割もまた、考慮される。
【００８７】
この研究から得られる意外な所見は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮが、他のマウスＳＩＧＮＲメンバーよりも、マウスＳＩＧＮＲ７およびＳＩＧＮＲ８により緊密に関連することであった。マウス種における８つのＤＣ−ＳＩＧＮ相同体の発見により、それらが大きく相違する生化学的および生理学的特性を有することが示された（Powlesland et al., 2006、上掲）。しかし、それらのうち、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに対する機能的相同分子種であることが実験的に確かめられたものはない。マウスＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質は、ヒトタンパク質と機能を共有しないことが見出されている一方、最近、ウシＤＣ−ＳＩＧＮが、ウシＭＤＤＣ上で発現し、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０ならびにマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）カルメット−ゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）に結合し、そしてそれらを内在化することが示され、たとえそれらが異なる２つの進化経路に分類されても、ウシＤＣ−ＳＩＧＮが、ｈＤＣ−ＳＩＧＮに機能的に関連する（Y. Yamakawa et al., “Identification and functional characterization of bovine orthologue to DC-SIGN,” J. Leukoc. Biol. 83:1396-403 (2008)）ことが示唆された。この結論はまた、以下の実験において、組織および細胞分布ならびにｐＤＣ−ＳＩＧＮのｈＩＣＡＭリガンドとの結合特徴のエビデンスによっても支持される。
【００８８】
本発明の詳細な説明では、ｐＤＣ−ＳＩＧＮのｍＲＮＡ発現が、様々なリンパ器官において主として分布し、そしてタンパク質発現が、ＣＤ１４＋単球またはＰＢＬの表面上に検出されないことが示されている。ブタＤＣ−ＳＩＧＮは、ＭＤＤＣ上で発現されるだけではなく、ＭＤＭΦおよびＰＡＭ上において発現されることから、それは、ブタＤＣおよびマクロファージの発達中に活性化されることが示唆される。ＩＨＣ解析を使用することによって、ｐＤＣ−ＳＩＧＮが、マクロファージ様および樹状細胞様細胞を含むリンパ節類洞ＡＰＣで発現されたが、ＢまたはＴリンパ球上では発現されなかったことがさらに確認される（図７）。ブタＤＣ−ＳＩＧＮ発現もまた、リンパ節内皮細胞上で検出されたが、これは、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ発現のパターンと類似のパターンを共有する（J. H. Martens et al., “Differential expression of a gene signature for scavenger/lectin receptors by endothelial cells and macrophages in human lymph node sinuses, the primary sites of regional metastasis,” J. Pathol. 208:574-89 (2006)）。しかし、ｐＤＣ−ＳＩＧＮのｍＲＮＡまたはタンパク質のいずれも、それぞれ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＩＨＣ解析を使用して、ブタ肝臓組織では検出されなかった。
【００８９】
これらの結果に基づいて、クローニングされたブタ遺伝子は（Ｌ−ＳＩＧＮ相同体ではなく）ＤＣ−ＳＩＧＮ相同体であるが、ｐＤＣ−ＳＩＧＮのアミノ酸配列は、ｈＤＣ−ＳＩＧＮともｈＬ−ＳＩＧＮとも有意な配列同一性を示さないと結論付けられる。Ｌ−ＳＩＧＮ遺伝子は、類人猿の共通のＤＣ−ＳＩＧＮ先祖における重複事象から出現したが、ウシ、イヌおよびウマゲノム領域において示されているように、おそらく非霊長類哺乳動物種には存在せず、ここで、Ｃ型レクチンは、４つの遺伝子クラスターＣＤ２３／ＬＳＥＣｔｉｎ／ＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮの代わりに、３つの遺伝子クラスターＣＤ２３／ＬＳＥＣｔｉｎ／ＤＣ−ＳＩＧＮとして、ヒト染色体１９ｐ１３．３上に配列する。これらの非霊長類哺乳動物種におけるＤＣ−ＳＩＧＮ相同体の進化経路は、霊長類の進化経路とは異なり、その結果、ＤＣ−ＳＩＧＮは単一の遺伝子として存在する。系統解析および遺伝子構成の比較により、ブタＤＣ−ＳＩＧＮは、これらの非霊長類  哺乳動物種に高度に関連し、それ故、同じ特徴を共有すべきであることが示された。さらに加えて、クローニングされたｐＤＣ−ＳＩＧＮがブタＬ−ＳＩＧＮ相同体であった場合、そのＲＮＡおよびタンパク質発現は、それぞれ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＩＨＣによって、肝臓組織において検出されていたはずであり、ＩＨＣおよびＲＴ−ＰＣＲにより、ブタ肝臓においてｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現が認められなかったことからもまた、この結論が裏付けられる。
【００９０】
ブタＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の膜貫通特性は、本発明に関する実験的エビデンスによって確認され、そしてブタＤＣ上で接着分子受容体として機能することが決定されている。
【００９１】
ブタＤＣ−ＳＩＧＮの発現をより良好に特徴付けるためには、ゲノムＤＮＡレベルでの遺伝子の決定が必要である。決定されたブタＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡの末端配列に基づいて、ＧｅｎＢａｎｋおよび他のブタゲノム配列供給源にこれまで公開されていないブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子もまた、ゲノムＰＣＲを使用することによって、増幅し、そしてクローニングした（図４）。ブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子のコンセンサス配列は３４３８ｂｐ長であり、遺伝子の完全なコード領域にわたって８つのエキソンをコードし、ここで、エキソン１および８は未知のサイズを有した（図５−１〜５−２）。イントロンのサイズは１１３〜６８９ｂｐで変動し、そしてイントロン上のすべてのアクセプターおよびドナー配列は、ＧＴ−ＡＧ規則に従った。さらなる代替的にスプライシングされたｍＲＮＡアイソフォームが、コンピュータプログラムによって推定されなかったことから、ブタ単球由来樹状細胞由来の同定されたｃＤＮＡは、ブタＤＣ−ＳＩＧＮ発現の唯一存在するアイソフォームであるようであることが示唆され、これは、上記のＲＡＣＥ−ＰＣＲ結果（図１（ｃ））に一致する。
【００９２】
ｐＤＣ−ＳＩＧＮの組織および細胞分布を調べて、ｐＤＣ−ＳＩＧＮのｍＲＮＡの発現が、ＲＴ−ＰＣＲによって、ブタの一次（胸腺および骨髄）ならびに二次リンパ器官（リンパ節および脾臓）の両方、ならびに肺および骨格筋において検出されたが、十二指腸、腎臓、心臓または肝臓では検出されなかったことが見出された（図６ａ）。リンパ節および骨髄の発現レベルが最も高かった。筋肉で発現されたＤＣ−ＳＩＧＮの検出が興味深かった。
【００９３】
様々なリンパ器官におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現を考慮すると、ｐＤＣ−ＳＩＧＮは、ＭＤＤＣに加えて、特定の造血細胞集団によっても発現されることが推測された。従って、フローサイトメトリー解析を実施して、ＰＢＬ、単球、ＭＤＤＣ、ＭＤＭΦおよびＰＡＭ上のｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の表面発現を検出した（図６ｂ〜６ｄ）。ブタＰＢＭＣの散乱光プロファイルから、明らかに、それらの形態学に従って、２つの細胞集団、ＰＢＬおよび単球が示された。ＣＤ１４分子はブタ単球の表面マーカーであるため（H.W. Ziegler-Heitbrock et al., “The antibody MY4 recognizes CD14 on porcine monocytes and macrophages,” Scand. J. Immunol. 40:509-14 (1994)）、これらの２つの細胞集団は、抗ブタＣＤ１４モノクローナル抗体を使用して、免疫磁気標識ＭＡＣＳシステムによって、分離され得る。ＣＤ１４＋単球をさらに使用して、サイトカインの非存在下、それぞれｒｐＧＭ−ＣＳＦおよびｒｐＩＬ−４またはＭＤＭΦの添加を伴って、ＭＤＤＣを発達させた。ＰＢＬおよび単球は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現を示さなかったが、ｈＤＣ−ＳＩＧＮもＬ−ＳＩＧＮも、リンパ球または単球において発現されないため、このことは予想されていた。従って、ブタ単球細胞系統３Ｄ４／３１上では、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現は検出されなかった（図６ｂ〜６ｄ）。培養物における単球からＭＤＤＣへの分化時に、３日目〜７日目に、中央値蛍光強度を約８倍増加させ、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現をアップレギュレートさせた。ブタＤＣ−ＳＩＧＮ発現はまた、ＭＤＭΦ上でも見出された。ＭＤＤＣと比較して、大多数のＭＤＭΦは、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ表現型を示した。ＰＡＭもまた、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ表現型が優勢であったが、発現レベルは、ＭＤＭΦ上での発現レベルより低かった。ブタ腎臓においてｐＤＣ−ＳＩＧＮのｍＲＮＡの発現が検出できなかったことと一致して、タンパク質は、ブタ腎臓由来の上皮細胞系統ＰＫ１５において発現されなかった（図６ｂ〜６ｄ）。
【００９４】
ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質が、特に、リンパ組織の細胞集団において実際に発現されたかどうかをさらに確認するために、ブタリンパ節および肝臓組織のパラフィン切片に対するＩＨＣ解析を実施した。ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質は、リンパ節における発現の優勢な類洞パターンを示したことが見出された（図７（ａ））。しかし、ブタ肝臓では、検出可能な発現は認められず（図７（ｂ））、このことは、ＲＴ−ＰＣＲの結果と一致した（図６ａ）。リンパ節の類洞におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗ペプチド抗体によって免疫染色された細胞のほとんどが、マクロファージ様細胞および樹状細胞様細胞であった（図７（ｃ））。実質組織のリンパ管における内皮細胞もまた、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗ペプチド抗体で免疫染色した（図７（ｄ））。ブタリンパ節におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の発現パターンは、ヒトリンパ節におけるｈＤＣ−ＳＩＧＮの発現パターンに類似し、ここで、ｈＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質は、ＩＨＣによって、類洞マクロファージ上だけではなく、内皮細胞においても同定された（J. H. Martens et al., “Differential expression of a gene signature for scavenger/lectin receptors by endothelial cells and macrophages in human lymph node sinuses, the primary sites of regional metastasis,” J. Pathol. 208:574-89 (2006)）。推定されたブタＬ−ＳＩＧＮは、存在する場合、ＬＳＥＣ上で強力に発現されるはずであるため、ブタ肝臓においてｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現が認められなかったことは、クローニングされたｐＤＣ−ＳＩＧＮがＬ−ＳＩＧＮ相同体ではないことをさらに支持する。
【００９５】
本発明の個別の実施形態では、ブタＩＣＡＭ−３の新たな２つのｃＤＮＡアイソフォームを、今回、インビトロで培養したブタ単球由来樹状細胞から同定した（より大きい方のｐＩＣＡＭ−３アイソフォームをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４に対応する一方、小さい方のｐＩＣＡＭ−３アイソフォームをコードする小さい方のヌクレオチド配列は、配列番号３９に対応する）。２つのアイソフォームのうち小さい方は、非コード領域中１１４−ｎｔの欠失を含有する。細胞接着分子−３（ヒトＩＣＡＭ−３、ＣＤ５０）は、白血球インテグリンＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）および樹状細胞特異的細胞内接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）−グラビング非インテグリン（ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＤ２０９）の両方に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。ＩＣＡＭ−３は、Ｔリンパ球および樹状細胞の両方の活性化において重要な役割を果たす。
【００９６】
意外なことに、新たに発見されたアイソフォームは、両方とも、３つのＩｇ様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ３）のみをコードし、そしてＩｇ様ドメイン４および５（Ｄ４〜Ｄ５）を欠き、５つのＩｇ様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ５）を有するヒトＩＣＡＭ−３とは異なる。ブタＩＣＡＭ−３においてＤ４およびＤ５が認められなかったのは、プレｍＲＮＡスプライシングプロセス中のブタＩＣＡＭ−３遺伝子のエキソン５および６の連続スキッピングによるようである。ブタＩＣＡＭ−３ゲノムＤＮＡ配列の残りの未知の３’−近位領域を決定した後、エキソン５において１つのインフレーム３−ｎｔナンセンス変異およびエキソン６において４つのインフレームナンセンス変異が存在する（ブタ種において独特である）ことを見出した。イントロン６の推定スプライスドナー部位における点変異（ＧからＡ）もまた、同定した。それ故、Ｄ４およびＤ５を欠くブタＩＣＡＭ−３アイソフォームの作製は、種に関連し、そしてプレｍＲＮＡスプライシングプロセス中にエキソン５および６を排除するナンセンス変異に伴う選択的スプライシング（ＮＡＳ）によって生じるようである。
【００９７】
以下の実施例は、本発明の所定の態様を実証する。しかし、これらの実施例は例示のみを目的としており、そして本発明の条件および範囲に関して完全に限定的であるとは意図していないことを理解すべきである。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間など）が与えられている場合、特定の範囲を超えるおよびそれ未満の条件もまた、一般的にそれほど妥当ではないが、使用することができることを理解すべきである。実施例は、室温（約２３℃〜約２８℃）および大気圧下で行われる。他で特定しない限り、本明細書において言及したすべての部およびパーセントは、重量に基づき、そしてすべての温度は、摂氏で表現される。
【００９８】
以下の非限定的例から、本発明がさらに理解され得る。
【実施例】
【００９９】
実施例１
ブタＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡおよび遺伝子のクローニングおよび特徴付け
材料および方法
ブタ：３〜７週齢の健常な雑種の従来のブタから、静脈血サンプルおよびブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を回収した。ブタを、実験条件下、隔離された部屋で維持した。
【０１００】
ブタ肺胞マクロファージ、ブタ末梢血リンパ球、単球、単球由来樹状細胞および単球由来マクロファージの単離および培養：ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を、冷ＰＢＳを使用する肺洗浄によって回収し、そして１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭに再懸濁した。新鮮培養物または３日間インビトロで培養したＰＡＭ培養物を、染色およびその後の解析に使用した。
【０１０１】
ブタのヘパリン処理血液を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１：２に希釈し、そしてＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）上、１０００ｇで４０分間、室温で遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含有するバフィーコート層を単離し、そして２５０ｇのＰＢＳで３回、１０分間４℃で洗浄した。ＰＢＭＣの表面上のＣＤ１４陽性単球を、抗ＣＤ１４ｍＡｂ（Ｍ−Ｍ９，ＶＭＲＤ  Ｉｎｃ．，Ｐｕｌｌｍａｎ，ＷＡ，ＵＳＡ）およびヤギ抗マウスＩｇＧ１−磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、細胞の免疫磁気標識ＭＡＣＳシステムによって分取した。ＣＤ１４陰性細胞を、フローサイトメトリー解析によって決定された細胞形態学に基づいて、ブタ末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と認識した。精製された単球を、１×１０５個の細胞／ｍＬで、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５５μｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエタノールおよび抗生物質を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に再懸濁した。次いで、単球を、６ウェルプレートまたは６０ｍｍペトリ皿において、３７℃で、２５ｎｇ／ｍＬの組み換えブタ顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｒｐＧＭ−ＣＳＦ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および２５ｎｇ／ｍＬ組み換えブタインターロイキン−４（ｒｐＩＬ−４，Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の存在下で培養した。３日ごとに、培養培地の半分を、新鮮培地で置き換えた。ＤＣの特徴的形態学について、細胞を観察した。細胞を、３日目または７日目に回収し、そして単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）として使用した。単球由来マクロファージ（ＭＤＭΦ）を、類似の手順で発達させたが、２つのサイトカインの非存在下で培養した。５日目に細胞を回収し、そしてＭＤＭΦとして使用した。
【０１０２】
連続細胞系統の培養：ベビーハムスター腎臓線維芽細胞系統ＢＨＫ−２１、サル腎細胞系統ＭＡＲＣ−１４５およびブタ腎臓上皮細胞系統ＰＫ１５を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＭＥＭにおいて、３７℃で、インキュベータにおいて増殖させた一方、ブタ単球系統３Ｄ４／３１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２８４４）を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中、３７℃インキュベータにおいて増殖させた。ｈＤＣ−ＳＩＧＮを安定に発現するマウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞系統を、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を介して入手し、そして本研究では３Ｔ３−ＨＤＣＳと改名した。この細胞系統を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【０１０３】
ＲＮＡ抽出、逆転写（ＲＴ）ならびに縮重ＰＣＲおよびｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）−ＰＣＲ：ｒｐＧＭ−ＣＳＦおよびｒｐＩＬ−４の存在下でブタ単球から誘導したインビトロで培養したブタ単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）を、７日目〜１０日目の間に回収した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用し、続いて、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ  Ｉの処理により、ＭＤＤＣから全ＲＮＡを単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、オリゴ−ｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を逆方向プライマーとして使用するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって、全ＲＮＡから合成した。ヒトおよびマウスＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子において保存配列に相補的な縮重プライマーのいくらかの対を、利用可能なヒトおよびマウスＤＣ−ＳＩＧＮ関連遺伝子の複数の配列アラインメントに基づいて、設計した。縮重プライマーによるＰＣＲを、５０μＬ反応液中、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により、次のＰＣＲパラメータを使用して実施した：９４℃で２分間、９４℃で１５秒間、５７．５℃で３０秒間および７２℃で１分間の３０サイクル、および７２℃で３分間の最終インキュベーション。１組のプライマー（ＮＦ−０５およびＮＲ−０５、以下の表１）を増幅に使用した場合にのみ、ＰＣＲフラグメントを増幅させた。得られたＰＣＲ産物を直接配列決定し、そしてヒトおよびマウスＤＣ−ＳＩＧＮ関連遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ配列と比較した。ＲＴおよびＲＡＣＥ−ＰＣＲを、製造者の取扱説明書に従って、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって実施した。５’−ＲＡＣＥまたは３’−ＲＡＣＥに使用した遺伝子特異的プライマーは、それぞれ、ＰＤＲ−１およびＰＤＦ−１（表１）であり、縮重ＰＣＲ産物から得られた配列情報に基づいて設計した。ＲＡＣＥ反応産物を、ＴＡクローニングストラテジーによってｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、そして配列決定した。
【０１０４】
表１．ｐＤＣ−ＳＩＧＮのブタ組織において縮重ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ、ゲノムＰＣＲ、遺伝子配列決定、サブクローニングおよびＰＣＲ検出に使用したオリゴヌクレオチドプライマー
【表１】
2011501958.tif 000002
１縮重プライマー（ＮＦ−０５およびＮＲ−０５）のために設計した混合した塩基（Ｓ＝Ｃ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、およびＲ＝Ａ＋Ｇ）を太字で示し、そして下線を付す。プライマーＮＦ−０５、ＮＦ−０６およびＮＲ−０５の配列は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮの最終的ｃＤＮＡ配列と完全には同一ではないことが留意される。プライマーＰＣＩ−ＸＨＯ、ＤＣＳ３、Ｎｃｏ−ＤＣＳ−５およびＸｈｏ−ＤＣＳ−３では、小文字は非ブタ−ＤＣ−ＳＩＧＮ配列を示し；下線を付したヌクレオチドは、サブクローニングに使用した制限部位（Ｘｈｏ  Ｉ、Ｘｂａ  ＩまたはＮｃｏ  Ｉ）を表し、そして斜体のヌクレオチドは、開始コドンＡＴＧより前方の最適なＫｏｚａｋ配列を示す。
２位置は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮの全長ｃＤＮＡに対応している（図２）。
【０１０５】
ゲノムＰＣＲおよび遺伝子配列決定：ワンステップゲノムＰＣＲに使用したプライマーは、本明細書において決定したブタＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡの配列に基づいた。順方向プライマー１Ｆ（５’−ＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＧＴＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡ−３’（配列番号１５に対応する））は、開始コドンＡＴＧ（下線部）を含有する一方、逆方向プライマー４Ｒ（５’−ＣＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＣＣＡＴＣ−３’（配列番号１６に対応する））は、ｃＤＮＡの３’−非コード領域内の配列に相補的である。ゲノムＰＣＲを、（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから購入した）１５０ｎｇのブタゲノムＤＮＡを使用するＰｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  ＨｉＦｉ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって、５０μＬの全容積で実施した。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒間、６８℃で５分間の３５サイクルであり、テンプレートＤＮＡの初期変性は、９４℃で２分間であった。得られたフラグメントを、ＴＡクローニングストラテジーによってｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。Ｍ１３順方向および逆方向プライマーならびに３つの遺伝子特異的プライマー２Ｆ（５’−ＴＣＧＴＣＴＣＡＴＴＧＧＧＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣ−３’（配列番号１７に対応する））、３Ｆ（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡ−３’（配列番号１８に対応する））および４Ｆ（５’−ＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴ−３’（配列番号１９に対応する））を、配列決定に使用した。全長遺伝子の集成を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）由来のＳｅｑＭａｎプログラムで行った。
【０１０６】
配列および系統解析：ＤＮＡおよびアミノ酸配列の解析ならびにアラインメントを、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して実施した。ｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子のｍＲＮＡスプライシングの配列解析および推定を、オンラインプログラムＡＳＰｉｃ（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ｈｔｔｐ：／／ｔ．ｃａｓｐｕｒ．ｉｔ／ＡＳＰＩＣ／ｈｏｍｅ．ｐｈｐ）によって実施した。
【０１０７】
ブタＤＣ−ＳＩＧＮに特異的な抗ペプチドポリクローナル抗体の作製：ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の発現を検出するためのｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗ペプチドポリクローナル抗体を作製するために、ブタＤＣ−ＳＩＧＮのＣＲＤ内に暴露されることが推定される領域に対応する２つのペプチド（アセチル−ＶＤＮＳＰＬＱＬＳＦＷＫＥＧＥＰＮＮＨＧＣ−アミド（配列番号１３に対応する）、およびアセチル−ＡＥＱＫＦＬＫＳＷＹＲＹＮＫＡＣ−アミド（配列番号１４に対応する））を、本発明の目的のために、２１ｓｔＣｅｎｔｕｒｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｒｌｂｏｒｏ，ＭＡ）によって商業的に合成した。続いて、ペプチドを精製し、そして共に使用して、２１ｓｔＣｅｎｔｕｒｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの抗体産生受託サービスとして、２匹のニュージーランドホワイト（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｗｈｉｔｅ）系ウサギに免疫した。ブタＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗ペプチドポリクローナル抗体を、免疫したウサギの血清から、アフィニティー精製により０．７３ｍｇ／ｍＬの濃度で製造した。
【０１０８】
ブタＤＣ−ＳＩＧＮを発現する組み換えベクターの構築およびインビトロ発現：ｐＤＣ−ＳＩＧＮの完全なコード領域を、プライマーＰＣＩ−ＸＨＯおよびＤＣＳ３（表１）を使用するＰＣＲによって増幅し、続いて、Ｘｈｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉ制限部位を使用して、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーターの下流にクローニングした。構築物の配列を決定して、同一性を確認し、そしてｐＣＩ−ＰＤＣＳと標示した。トランスフェクションでは、ＢＨＫ−２１細胞を、１ウェルあたり４×１０４個の細胞で、８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋチャンバスライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に播種し、そして抗生物質を伴わずに２４時間、増殖させた。プラスミドｐＣＩ−ＰＤＣＳおよびｐＣＩ−ｎｅｏを、若干の変更を加えた製造者のプロトコルに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ＢＨＫ−２１細胞に一過的にトランスフェクトした。簡単に説明すると、０．４μｇのプラスミドＤＮＡを、１．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００および１５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と、室温で、２０分間、混合し、続いて、細胞に添加した。６時間後、新鮮増殖培地を置き換えた。細胞を、２４〜４８時間培養し、次いで、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）またはウエスタンブロットに適用して、ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の発現を検出した。
【０１０９】
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）およびウエスタンブロット：トランスフェクト細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで２０分間、固定し、次いで、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸの登録商標でポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテルとして一般的に公知であり、そしてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている非イオン性界面活性剤）で１０分間、透過処理した。ＰＢＳ中１：１００希釈のｐＤＣ−ＳＩＧＮに特異的な１００マイクロリットルの抗ペプチド抗体を、細胞上に添加し、そして１時間、３７℃でインキュベートした。細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１：１００希釈の１００μＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、そして蛍光顕微鏡下で可視化した。抗体のＰＢＳでの２つの異なる希釈、１：５０または１：１００のいずれかを使用して、ＩＦＡを、２回を超えて行ったところ、類似する首尾よい結果が得られた。
【０１１０】
ウエスタンブロット分析では、ｐＣＩ−ＰＤＣＳまたはｐＣＩ−ｎｅｏトランスフェクト細胞を、１０６個の細胞あたり１２５μＬのＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｍ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で溶解した。タンパク質抽出物を回収し、アリコートに分け、そして−２０℃で凍結した。サンプルおよびタンパク質マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解し、そしてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に移し、続いて、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で１晩、４℃でブロックした。ＴＢＳ中１：２００希釈のｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗体を、９０分間、室温で使用し、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と共に９０分間、室温でインキュベーションを行って、ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質を検出した。次いで、クロロナフトールで膜を発色させた。
【０１１１】
ＲＴ−ＰＣＲによって検出されるｐＤＣ−ＳＩＧＮの組織分布：ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用し、続いて、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ  Ｉの処理により、ホモジナイズしたブタ組織、選択された細胞集団および細胞系統から全ＲＮＡを単離し、そしてオリゴ−ｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を逆方向プライマーとして使用するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって、ｃＤＮＡを合成した。胸腺および骨髄のような単離するのが困難なブタ組織では、それらの組織ｃＤＮＡは、Ｚｙａｇｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子のエキソン５とエキソン６との間の境界にわたるプライマーＰＤＣＳ−Ｅ５６Ｆおよびエキソン７とエキソン８との間の境界にわたるプライマーＰＤＣＳ−Ｅ７８Ｒ（上記の表１の配列を参照のこと）を使用するＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により、５０μＬ反応中でＰＣＲを実施した。ＰＣＲパラメータは、９５℃で２０秒間、６８℃で１分間の３０サイクルを含み、テンプレートＤＮＡの初期変性は、２分間であった。ハウスキーピング遺伝子、ブタグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）もまた、ＰＣＲ（９５℃で１分間、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で４０秒間および７２℃で３分間の３０サイクル）によって、プライマーＧＡＰＤＨ５（配列番号２９に対応する５’−ＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣ−３’）およびＧＡＰＤＨ３（配列番号３０に対応する５’−ＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴ−３’）を使用して、増幅した。ＰＣＲ産物の予想されるサイズは、それぞれ、ｐＤＣ−ＳＩＧＮで３０１ｂｐおよびブタＧＡＰＤＨで２８５ｂｐであった。
【０１１２】
免疫組織化学（ＩＨＣ）：ブタリンパ節および肝臓のパラフィン切片（Ｚｙａｇｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、先に記載の方法（W. Li et al., “Chronic Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis: Effects of Insulin-like Growth Factor-I Treatment on Clinical Deficits, Lesion Severity, Glial Responses, and Blood Brain Barrier Defects,” J. Neuropath. Exp. Neurol. 57:426-38 (1998)）によるアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）で免疫染色した。簡単に説明すると、内因性ペルオキシダーゼ活性および非特異的免疫染色を阻止するために、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）による３０分間の室温での処理の前に、切片を、３％Ｈ２Ｏ２に１０分間、浸漬した。第一抗体のｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗ペプチドポリクローナル抗体、および第二抗体のビオチン化抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を、両方とも、ＰＢＳ緩衝液中２％ＮＧＳに希釈した。第一および第二抗体を、それぞれ、４℃で１晩および室温で３０分間、インキュベートした。ＡＢＣ試薬を調製し、そしてＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡの登録商標で市販されているＡＢＣと標示されたアビジンまたはストレプトアビジンとビオチン化酵素との間の複合体）の製造者の指示に従って使用し、続いて、ＤＡＢ／Ｎｉ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を５分間、適用した。コントロールでは、第一または第二抗体を省略したもの、または第一抗体をウサギＩｇＧ、正常ウサギ血清、または抗原−抗体複合体（プレ抗体吸収）に置き換えたものを含んだ。切片を、ヘマトキシリン染色で対比染色し、そしてＰｅｒｍｏｕｎｔスライドマウンティング溶液でシールした。ＩＨＣデータは、Ｎｉｋｏｎ  ＤＳ−Ｆｉ１デジタルカメラおよびＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹから市販されている）で獲得した。
【０１１３】
結果および考察
インビトロで培養したブタＭＤＤＣからの、全長ブタｃＤＮＡ相同体のヒトＤＣ−ＳＩＧＮへの分子クローニング：初めに、ブタのＤＣ−ＳＩＧＮ相同体は、ｈＤＣ−ＳＩＧＮに類似の発現および分布パターンを有し、それ故、未知のｐＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡのクローニングの供給源として使用することができるブタＭＤＤＣの表面上で、主に高いレベルで発現され得ることが仮定されたが、ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび完全な遺伝子を得るためには、未知のクローニングパラメータのさらなる実験および決定が必要であった。ブタＭＤＤＣの作製については、いくらかのグループによって、先に報告されている（C. P. Carrasco et al., “Porcine dendritic cells generated in vitro: morphological, phenotypic and functional properties,” Immunology 104:175-84 (2001)；R. Paillot et al., “Functional and phenotypic characterization of distinct porcine dendritic cells derived from peripheral blood monocytes,” Immunology 102:396-404 (2001)；C. L. Loving et al., “Differential type I interferon activation and susceptibility of dendritic cell populations to porcine arterivirus” Immunology 120:217-29 (2007)）。ｒｐＧＭ−ＣＳＦおよびｒｐＩＬ−４の存在下、付着性ブタＣＤ１４陽性単球の３日間の培養後、文献に記載の手順を使用して、単一および凝集したベール形状細胞を観察した。培養した皿において単球からほぼ形質転換された細胞の特徴的な樹状形態学は、７日後、さらに顕著であった（図１（ａ））。細胞の表現型解析の結果は、ＭＨＣ  ＩＩ＋ＣＤ１＋ＣＤ１１ｂ／ｃ＋ＣＤ８０／８６＋であり、これは、他の報告と一致し、それ故、ＭＤＤＣと認識された（同上）。ＮＣＢＩにおけるＳｗｉｎｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＳＧＳＰ、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db= genomeprj&cmd=ShowDetailView&TermToSearch=13421）のデータベースの配列類似性検索からは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮのブタＤＣ−ＳＩＧＮ相同体の配列が得られなかった。加えて、本発明に関する実験を開始した時点では、家畜種由来の他の推定ＤＣ−ＳＩＧＮ相同体は、ゲノムデータベースからは公開されていない。従って、新規のブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子を同定するために、最初に、既知のヒト、非ヒト霊長類およびマウスＤＣ−ＳＩＧＮ関連ｃＤＮＡの複数の配列アラインメントに基づく保存配列に基づいて、一連の縮重プライマーを設計した（T. B. Geijtenbeek et al., “Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses,” Cell 100:575-585 (2000)；Bashirova et al., 2001、上掲；F. Baribaud et al., “Functional and antigenic characterization of human, rhesus macaque, pigtailed macaque, and murine DC-SIGN,” J. Virol. 75:10281-10289 (2001)；Park et al., 2001、上掲；A. A. Bashirova et al., “Novel member of the CD209 (DC-SIGN) gene family in primates,” J. Virol.77:217-27 (2003)）。最初に、ＭＤＤＣの全ＲＮＡから、プライマーＮＦ−０５およびＮＲ−０５で、約２１０ｂｐの産物を、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅した（図１（ｂ））。同じ順方向プライマーＮＦ−０５およびプライマーＮＲ−０５の上流の新たな逆方向プライマーＮＲ−０６を伴う、ゲル精製されたフラグメントをテンプレートとして使用するネステッドＰＣＲもまた、より小さなサイズを有するフラグメントを作製（即ち、増幅）し、ＰＣＲの特異性が示された。配列解析は、この最初のＰＣＲフラグメントの配列が、ＤＣ−ＳＩＧＮのＣＲＤにおける領域を表すヒトＤＣ−ＳＩＧＮ、ヒトＬ−ＳＩＧＮおよびマウスＤＣ−ＳＩＧＮ  （ＳＩＧＮＲ５）ｃＤＮＡ配列の対応する領域に対して、それぞれ、６２．６％、６１．２％、および５７．６％配列同一性を共有することを示した。
【０１１４】
この最初の配列に基づいて、２つの遺伝子特異的プライマーは、それぞれ、５’−および３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによってｃＤＮＡの５’−および３’−近位領域を増幅するように設計され得る。５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲの逆方向プライマーＰＤＲ−１は、３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲプライマーＰＤＦ−１の下流に局在するため、増幅された５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物は、８２−ｎｔの重複領域を有し、それ故、ｃＤＮＡの全長配列を含むことが予想された。それぞれ、それぞれのＲＡＣＥ  ＰＣＲ由来の約６００ｂｐを有する２つの得られるＰＣＲ産物（図１（ｃ））を、全長ｃＤＮＡ配列に集成させた。このｃＤＮＡによるＢＬＡＳＴ検索では、ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）において相同体の配列が得られなかったことから、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに対応する新規のブタＤＣ−ＳＩＧＮ等価物（即ち、種相同体）が示された。新たに発見されたｃＤＮＡを、ブタＤＣ−ＳＩＧＮ（ｐＤＣ−ＳＩＧＮ）と標示した。
【０１１５】
ブタＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡおよびその推定タンパク質産物の特徴付け：１０６９ｂｐのｐＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡは、２４０個のアミノ酸を有するタンパク質をコードする２６〜７２８位の７２３個のヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を包含する（図２）。他のＣ型レクチンと同様に、推定ｐＤＣ−ＳＩＧＮ産物は、推定３９ａａの細胞質尾部（ＣＴ）から開始して、推定３１ａａの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）が後に続くＩＩ型膜貫通タンパク質であると推定される。細胞外ドメインは、３８ａａのネック領域、その後に続く、１３２ａａのＣＲＤからなった（図２）。内在化モチーフ、ａａ２７〜２８位におけるジロイシンに基づくモチーフが、ＣＴにおいて見出された。膜貫通受容体のＣＴにおける内在化モチーフは、リガンド−受容体複合体の内在化に重要であるため、ブタＤＣ−ＳＩＧＮは、エンドサイトーシスを仲介し、そして潜在的な結合型病原体をＤＣの細胞質に移行させることが可能であるようである。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ、ｈＬ−ＳＩＧＮ、非ヒト霊長類ＤＣ−ＳＩＧＮおよびｍＳＩＧＮＲ１は、ネック領域内に可変反復配列を含有するが、ＳＩＧＮＲ２およびＳＩＧＮＲ６を除く残りのｍＳＩＧＮＲメンバーは、反復配列を有さない。ｐＤＣ−ＳＩＧＮのネック領域の配列は反復せず、そして長さはＳＩＧＮＲ３〜５により近似するが、マウスＳＩＧＮＲ７およびＳＩＧＮＲ８に高度に関連した。
【０１１６】
ｐＤＣ−ＳＩＧＮのＣＲＤは、他のすべての既知のＤＣ−ＳＩＧＮ相同体タンパク質に類似のサイズを有したが、それらの全体のサイズは、ネック領域にばらつきがあるため、かなり異なる。ＣＲＤはまた、Ｃａ２＋−結合部位および炭水化物−結合部位を形成する重要な残基を包含するブタおよび他の非ブタＤＣ−ＳＩＧＮ相同体タンパク質と共有する最も保存された領域であった。ｈＤＣ−ＳＩＧＮのＣＲＤは、緊密であるが、異なる２つの部位を使用して、２つのカルシウムイオンに結合することが示されている（T. B. Geijtenbeek et al., “Identification of different binding sites in the dendritic cell-specific receptor DC-SIGN for intercellular adhesion molecule 3 and HIV-1,” J. Biol. Chem. 277:11314-11320 (2002)）。Ｃａ２＋部位１は、ＤＣ−ＳＩＧＮとそのリガンドとの相互作用に必須であるアミノ酸残基Ａｓｐ１７６、Ｇｌｕ１８０、Ａｓｎ２０３およびＡｓｐ２０８を含有する。これらの４つのすべての残基は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮにおいて保存されていた。ブタＤＣ−ＳＩＧＮはまた、共通のＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ配列（ＥＰＮ配列、ａａ２００〜２０２位）およびＧｌｕ２０７、ならびにマンノース−、フコース−またはガラクトース−含有オリゴ糖への結合に極めて重要であるＣａ２＋部位２に関与するＡｓｎ２１８を有した。加えて、ジスルフィド結合を形成することが推定される８個の保存されたシステインが、ＣＲＤにおいて見出された。
【０１１７】
ウマ、オポッサム、イヌおよびウシＤＣ−ＳＩＧＮ相同体をコードするコンピュータにより推定されたｃＤＮＡは、ゲノムデータベースにおいて利用可能であるため、それらのコードタンパク質の推定完全アミノ酸配列は、霊長類およびマウスＤＣ−ＳＩＧＮ関連タンパク質由来のアミノ酸と共に、系統解析を実施するために含まれた。また、新規のブタＬＳＥＣｔｉｎには、近隣結合系統樹を構築するための外群としてのＤＣ−ＳＩＧＮに緊密に関連するが個別のＣ型レクチンが含まれる。結果は、ブタおよびウシのタンパク質が、他のタンパク質より、最も相互に緊密に関連することを示した。意外な所見は、ｍＳＩＧＮＲ７、ｍＳＩＧＮＲ８、イヌおよびウマＤＣ−ＳＩＧＮが、ブタおよびウシのタンパク質と共にクラスター化され、他のマウスおよび霊長類相同体を含有するクラスターとは異なる個々のクラスター（即ち、クレード）を形成することであった。完全なｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質と他の種由来のＤＣ−ＳＩＧＮ相同体との対配列比較は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮが、他のＤＣ−ＳＩＧＮ相同体（５０％未満）よりも、ウシ、イヌおよびウマタンパク質ならびにＳＩＧＮＲ７およびＳＩＧＮＲ８（５０％を超える）により相同であることを表し、これは、ＣＲＤ配列の系統的比較と一致した。
【０１１８】
ブタＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質のインビトロ発現：ｐＤＣ−ＳＩＧＮが効率的に翻訳されるかどうか、そうであるならば、翻訳された産物が推定膜貫通特性を有するかどうかを決定するため、ＢＨＫ−２１細胞を使用して、トランスフェクション実験を行った。７２０ｂｐを有するｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の全長コード領域を、ブタＭＤＤＣのＲＮＡ抽出物からＰＣＲによって増幅し、続いて、真核細胞発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏにサブクローニングして、プラスミドｐＣＩ−ＤＣＳを得た。ＢＨＫ−２１細胞を、この構築物かまたはベクター単独でトランスフェクトした。ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の発現を、ＣＲＤにおける２つのペプチドに対して惹起されたｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗ペプチド抗体を使用するＩＦＡによって検出した。ＩＦＡの結果は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮを発現するほとんどの細胞において、細胞質および膜の染色が散見されたことを示した（図３ａ）。いくつかの細胞は、細胞膜のみに局在する蛍光シグナルを示した（図３ｂ）。対照的に、ｐＣＩ−ｎｅｏベクターでトランスフェクトした細胞は、陽性のＩＦＡシグナルを示さなかった（図３ｃ）。これらの結果から、ブタＤＣ−ＳＩＧＮをコードするｃＤＮＡは、インビトロで効果的に翻訳されること、および得られる産物は、実際に、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、即ち、ｐＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡは、ＩＩ型膜貫通タンパク質をコードすることが結論付けられた。結果は、効果的な翻訳を例示した一方、アッセイは、ｐＣＩ−ＰＤＣＳプラスミドの一過性トランスフェクションによって、ｐＤＣ−ＳＩＧＮの僅か約３０％の陽性発現しか示さなかった。抗ｐＤＣ−ＳＩＧＮ抗体はまた、ｐＣＩ−ＰＤＣＳでトランスフェクトした細胞の溶解物において約４８ｋＤａの特異的バンドを検出したが、空のベクターコントロールでトランスフェクトした細胞では検出しなかった（図３ｄ）。分子サイズは、推定アミノ酸配列から推定される分子サイズ（２８ｋＤａ）より大きかったが、ｐＤＣ−ＳＩＧＮは、ネック領域において推定Ｎ−結合型グリコシル化部位（ａａ１０２）を含有するため、おそらく、これはグリコシル化によるものである。
【０１１９】
ブタＤＣ−ＳＩＧＮ  タンパク質をコードする全長遺伝子の特徴付け：ｐＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定後、次いで、ｐＤＣ−ＳＩＧＮの遺伝子配列を調べ、そして入手した。ワンステップゲノムＰＣＲを使用することによって、ＰＣＲサイクルのアニーリングおよび伸長工程が、６８℃で共に組み合わされた場合にのみ、約３．５ｋｂの独特なバンドを増幅した（図４（ａ））。ＰＣＲ産物のＴＡベクターへのクローニング後、タンデム重複領域を共有するそれぞれのシークエンシングプライマーを使用するＤＮＡ配列決定によって決定された個々の５つの配列を、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子をコードするゲノム配列を表すコンティグに集成させた（図４（ｂ））。３４３８ｂｐ長を有するｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子のコンセンサス配列を、３つの異なる独立したクローン間の配列の比較によって決定した。配列解析およびｃＤＮＡ配列との対のアラインメントは、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子が、エキソン１および８のサイズが決定されていない遺伝子の完全なコード領域にわたる８つのエキソンによってコードされたことを示した。決定されたブタｃＤＮＡの非コード領域の両末端における余分のヌクレオチド配列は、遺伝子に含まれなかったが、８つのすべてのエキソンの配列は、ｃＤＮＡのコード領域および部分的３’末端非コード領域の配列に完全に同一であり、遺伝子の確実性が示された（図５−１〜５−２）。
【０１２０】
イントロンのサイズは１１３〜６８９ｂｐで変動し、そしてイントロン上のすべてのアクセプターおよびドナー配列は、ＧＴ−ＡＧ規則に従った。さらなる代替的にスプライシングされたｍＲＮＡアイソフォームが、コンピュータソフトウェアプログラムＡＳＰｉｃによって推定されなかったことから、ブタ単球由来樹状細胞由来の同定されたｃＤＮＡは、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現の唯一存在するアイソフォームであるようであり、これは、本明細書に記載のＲＡＣＥ−ＰＣＲ結果に一致することが示唆される。詳細な配列を、図５−１〜５−２に示す。翻訳開始部位は、エキソン１において開始する。エキソン１の３’末端、エキソン２全体およびエキソン３の５’末端は、細胞質尾部（ＣＴ）をコードする。エキソン３の残りの部分およびエキソン４の５’末端は、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）をコードする。ネック領域は、エキソン４のＴＭＤ配列より後方にあり、エキソン５全体およびエキソン６の最初の８個のヌクレオチドにまで及ぶ。エキソン６の残りの部分、エキソン７全体およびエキソン８の５’末端は、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）をコードする。
【０１２１】
ｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子は、８つのエキソンの類似の構造およびサイズを、対応するエキソンに対する４つのドメインの局在化を含め、推定されるウシ、イヌＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子および同定されたマウスＳＩＧＮＲ８遺伝子と共有する。ｐＤＣ−ＳＩＧＮのゲノム配列とウシＤＣ−ＳＩＧＮ、イヌＤＣ−ＳＩＧＮまたはマウスＳＩＧＮＲ８との対比較は、ＣＲＤをコードする最後の３つのエキソンが、最も高い配列同一性（７０〜８５％）を有することを表した。ｐＤＣ−ＳＩＧＮゲノム配列と他の種との全体的同一性（ウシＤＣ−ＳＩＧＮ＞イヌＤＣ−ＳＩＧＮ＞マウスＳＩＧＮＲ８）もまた、ＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の系統解析から得られる結果と一致した。全体のイントロン配列における制限された配列同一性が４つの遺伝子において示されたが、エキソンに隣接するイントロン領域のいくつかは、特に、ブタとウシのＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子間ならびにブタとイヌのＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子間で保存された。これらの保存配列は、遺伝子発現を調節する共通のエレメントを含有してもよい。
【０１２２】
ブタＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子が、非霊長類大型哺乳動物種間で最初の実験的に同定された遺伝子であることをさらに確認するために、ヒトゲノムとのブタ転写物およびＵｎｉｇｅｎｅクラスターアラインメントを、ＮＣＢＩウェブサイトにおけるマップビュアーによって実施した。ブタゲノムに対するＳｓｃ  ＵｎｉＧｅｎｅおよびＳｓｃ  ＲＮＡを含むヒトおよびブタ染色体セグメント間のＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）の比較マッピングを、ＮＣＢＩ  Ｍａｐ  Ｖｉｅｗｅｒ  Ｂｕｉｌｄ  ３６．２から７，４００Ｋ〜８，０４０Ｋの間の領域ディスプレイを使用して行った。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子は、ＮＣＢＩ  Ｍａｐ  Ｖｉｅｗｅｒ  Ｂｕｉｌｄ  ３６．２に従えば、染色体１９ｐ１３．３上に局在する。ヒトおよびブタ染色体セグメント間の対応に基づいて、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子は、ブタ染色体２のＳＳＣ  ２ｑ１．１〜ｑ２．１の間に割り当てられる（局在する）ことが推定される。
【０１２３】
ｐＤＣ−ＳＩＧＮの組織および細胞分布：ｐＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡの発現が、ＲＴ−ＰＣＲによって、ブタの一次（胸腺および骨髄）ならびに二次リンパ器官（リンパ節および脾臓）の両方ならびに肺および骨格筋において検出されたが、十二指腸、腎臓、心臓または肝臓では検出されなかった（図６ａ）。リンパ節および骨髄の発現レベルが最も高かった。筋肉において発現されたＤＣ−ＳＩＧＮの検出は興味深かったが、マウスＳＩＧＮＲ７および８もまた、骨格筋において発現することが見出された。
【０１２４】
様々なリンパ器官におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現を考慮すると、ｐＤＣ−ＳＩＧＮは、ＭＤＤＣに加えて、特定の造血細胞集団によっても発現されることが推測された。従って、フローサイトメトリー解析を実施して、ＰＢＬ、単球、ＭＤＤＣ、ＭＤＭΦおよびＰＡＭ上のｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の表面発現を検出した（図６ｂ〜６ｄ）。ブタＰＢＭＣの散乱光プロファイルから、明らかに、それらの形態学に従って、２つの細胞集団、ＰＢＬおよび単球が示された。ＣＤ１４分子はブタ単球の表面マーカーであるため、これらの２つの細胞集団は、抗ブタＣＤ１４モノクローナル抗体を使用する免疫磁気標識ＭＡＣＳシステムによって、分離され得る。ＣＤ１４＋単球をさらに使用して、サイトカインの非存在下、それぞれｒｐＧＭ−ＣＳＦおよびｒｐＩＬ−４またはＭＤＭΦの添加を伴って、ＭＤＤＣを発達させた。ＰＢＬおよび単球は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現を示さなかったが、ｈＤＣ−ＳＩＧＮまたはＬ−ＳＩＧＮはリンパ球または単球において発現されないため、このことはいくらか予想されていた。従って、ブタ単球細胞系統３Ｄ４／３１上では、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現は検出されなかった（図６ｂ〜６ｄ）。培養物における単球からＭＤＤＣへの分化時に、３日目〜７日目に、中央値蛍光強度を約８倍増加させ、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現をアップレギュレートさせた。ブタＤＣ−ＳＩＧＮ発現もまた、ＭＤＭΦ上で見出された。ＭＤＤＣと比較して、大多数のＭＤＭΦは、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ表現型を示した。ＰＡＭは、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ表現型が優勢であったが、発現レベルは、ＭＤＭΦ上での発現レベルより低かった。ブタ腎臓においてｐＤＣ−ＳＩＧＮのｍＲＮＡの発現が検出できなかったことと一致して、タンパク質は、ブタ腎臓由来の上皮細胞系統ＰＫ１５において発現されなかった（図６ｂ〜６ｄ）。
【０１２５】
ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質が、リンパ組織の特定の細胞集団において実際に発現されるかどうかをさらに確認するために、ブタリンパ節および肝臓組織のパラフィン切片に対するＩＨＣ解析を実施した。ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質は、リンパ節における発現の優勢な類洞パターンを示したことが見出された（図７（ａ））。しかし、ブタ肝臓では、検出可能な発現は認められず（図７（ｂ））、このことは、ＲＴ−ＰＣＲの結果と一致した（図６ａ）。リンパ節の類洞におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗ペプチド抗体によって免疫染色された細胞のほとんどが、マクロファージ様細胞および樹状細胞様細胞であった（図７（ｃ））。実質組織のリンパ管における内皮細胞もまた、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗ペプチド抗体で免疫染色された（図７（ｄ））。ブタリンパ節におけるｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の発現パターンは、ヒトリンパ節におけるｈＤＣ−ＳＩＧＮの発現パターンに類似し、ここで、ｈＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質は、ＩＨＣによって、類洞マクロファージ上だけではなく、内皮細胞上においても同定された。推定されたブタＬ−ＳＩＧＮは、存在する場合、ＬＳＥＣ上で強力に発現されるはずであるため、ブタ肝臓においてｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現が認められなかったことは、クローニングされたｐＤＣ−ＳＩＧＮがＬ−ＳＩＧＮ相同体ではないことを支持する。
【０１２６】
実施例２
ブタＤＣ−ＳＩＧＮを発現する安定な細胞系統の作製
材料および方法
ブタＤＣ−ＳＩＧＮを所有する２シストロン性発現ベクターの構築：ｐＤＣ−ＳＩＧＮの完全なコード領域（７２３ｂｐ）を、プライマーＮｃｏ−ＤＣＳ−５（５’−ＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＴＧ−３’（配列番号２５に対応する））およびＸｈｏ−ＤＣＳ−３（５’−ＡＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＧＡ−３’（配列番号２６に対応する））を使用するＰＣＲによって増幅し、続いて、Ｎｃｏ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限部位を使用して、ニワトリβ−アクチンプロモーターに融合したＣＭＶ前初期エンハンサーからなるハイブリッドプロモーターの下流で、２シストロン性発現ベクターｐＴｒｉＥｘ−１．１  Ｎｅｏベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから市販されている）（ｐＴｒｉＥｘ−１．１  Ｎｅｏベクターの配列およびマップは、http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB293.pdfに示されている）にクローニングした。「ｐＴｒｉＥｘ−ＰＤＣＳ」と標示される構築物を配列決定して、同一性を確認し、そして７２４３ｂｐ長であることを決定した（骨格ベクターｐＴｒｉＥｘ−１．１  Ｎｅｏ（６６６４ｂｐ）＋ブタＤＣ−ＳＩＧＮのタンパク質コード領域（７２３ｂｐ）の挿入およびベクター上のＮｃｏ  ＩとＸｈｏ  Ｉとの間の配列（１４４ｂｐ）を差し引くことを含む）。続いて、ｐＴｒｉＥｘ−ＰＤＣＳ構築物を使用して、ｐＤＣ−ＳＩＧＮを安定に発現する安定な細胞系統（ＢＨＫ−２１）を作製した。
【０１２７】
トランスフェクションおよび安定な細胞系統選択：ＢＨＫ−２１細胞を、トランスフェクション前に、６ウェルプレートに、１ウェルあたり２×１０５個の細胞で播種し、そして抗生物質を含まない完全増殖培地（ＤＭＥＭ中１０％ウシ胎児血清）において約２４時間、細胞が８０％〜９０％コンフルエンシーに到達するまで増殖させた。細胞の個々のウェルを、製造者の指示に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、それぞれ、プラスミドｐＴｒｉＥｘ−ＰＤＣＳまたは空のベクターｐＴｒｉＥｘ−１．１  Ｎｅｏでトランスフェクトした。簡単に説明すると、２μｇのプラスミドＤＮＡを、６μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００および５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と、室温で、２０分間、混合し、次いで、細胞に添加した。トランスフェクト細胞を、約３６時間、インキュベートして、増殖培地を伴わずに標的ｐＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の発現を可能にし、次いで、完全増殖培地＋１ｍｇ／ｍＬの濃度のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）選択的抗生物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから市販のＧｅｎｔａｍｉｃｉｎに関連する硫酸ネオマイシンのアミノグリコシドアナログであるＧ−４１８試薬）で置き換えた。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）含有培地を２日間ごとに交換して、死細胞または死にかかっている細胞を取り出した。
【０１２８】
１２日間後、生存している細胞をトリプシンで処理し、そして６０ｍｍ皿において、単一の細胞が、良好に分離された個々のコロニーを生じるような希釈でプレート化した。数百細胞の個々のコロニーが存在し、そしてクローニングリング技術によって単離されるまで、細胞を約２週間、増殖させた。取り出そうとするコロニーの位置に印を付し、そしてクローニングリングを注意深く配置して、コロニーを取り囲んだ。コロニーリング中の細胞をトリプシン処理し、次いで２４ウェルプレートの個々のウェルに移した。移した細胞が十分な密度に増殖した場合、それらを、Ｔ−２５フラスコに置き換え、細胞が１００％コンフルエンシーに到達し、そして操作された細胞系統として認識されるまで、増殖させた。
【０１２９】
ヒトＩＣＡＭ−３およびＩＣＡＭ−２結合アッセイ：ヒトＩＣＡＭ−３またはＩＣＡＭ−２のｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質への接着を、ＦＡＣＳ解析を介して可溶性免疫接着因子に結合した検出可能な細胞を測定することによって、ＢＨＫ−ＰＤＣＳおよびＢＨＫ−２１細胞で評価した。３Ｔ３−ＨＤＣＳ細胞を、陽性コントロールとして使用した。細胞（１サンプルあたり１〜３×１０５個）を、２％ＦＢＳを含有する１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、そして６０分間、４℃で、１μｇの組み換えヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（ｈＦｃ）、ヒトＩＣＡＭ−３−Ｆｃ（ｈＩＣＡＭ３−Ｆｃ）キメラまたはｈＩＣＡＭ２−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）と共に、マンナン（１００μｇ／ｍＬ）またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ、１０ｍＭ）の存在または非存在下で、インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、そしてさらに４５分間、４℃で、２％ＦＢＳを含有する１００μＬのＰＢＳ中０．５μｇのＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と共にインキュベートした。ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、蛍光をモニターした。
【０１３０】
フローサイトメトリー解析：表面染色に使用したＢＨＫ、３Ｄ４／３１、ＰＫ１５および３Ｔ３−ＨＤＣＳ細胞を、トリプシン処理により回収し、計数し、そして冷却した洗浄緩衝液（０．１％アジ化ナトリウムおよび０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液）中１×１０６個の細胞／ｍＬに調整した。ブタＰＢＬ、ＰＡＭ、ＭＤＤＣおよびＭＤＭΦのそれぞれについて、細胞濃度を、２〜５×１０５個の細胞／ｍＬに調整した。緩衝液の微量遠心分離および取り出し後、約２〜１０×１０５個の細胞を、ブタＤＣ−ＳＩＧＮに対するｐＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗ペプチド抗体１０μＬと共に、ＰＢＳ中最適希釈（ＢＨＫ細胞では１：２５およびブタ細胞では１：１００、但し、ブタ細胞について１：５０希釈で実施した早期のフローサイトメトリー解析もまた良好に作動した）で、３０〜６０分間、インキュベートした。細胞を洗浄して、非結合抗体を取り出し、そしてＰＢＳ中１：１００希釈の１０μＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で３０分間、染色した。２つの染色手順を４℃で行った。３Ｔ３−ＨＤＣＳ上で発現するヒトＤＣ−ＳＩＧＮの検出のために、マウス抗ｈＤＣ−ＳＩＧＮ  ｍＡｂ（クローン１２０５０７、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）およびＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を染色に使用した。蛍光を、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）またはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してモニターし、そして結果を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して解析した。フローサイトメトリー解析によって確認された表面上でブタＤＣ−ＳＩＧＮを発現する代表的な細胞系統を、「ＢＨＫ−ＰＤＣＳ」と標示した。高レベルのｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現を得るために、細胞系統ＢＨＫ−ＰＤＣＳを、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を使用して、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によってさらに分取した。
【０１３１】
結果および考察
ブタＤＣ−ＳＩＧＮを発現する安定な細胞系統の作製：２シストロン性発現ベクターｐＴｒｉＥｘ−１．１  Ｎｅｏを使用して、標的遺伝子を発現する細胞系統を作製することができる。ベクターは、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）から誘導される内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用し、挿入された標的遺伝子およびネオマイシン−耐性遺伝子を、単一のｍＲＮＡから翻訳させることを可能にする。ｐＤＣ−ＳＩＧＮの完全なコード領域をコードするＰＣＲアンプリコンを、ハイブリッドプロモーターの下流にキャップ依存的第１のシストロンとして導入し、一方、ネオマイシン−耐性遺伝子は第２のシストロンとしてＩＲＥＳの制御下にある。このベクター系であれば、おそらく、両方の遺伝子の連結された発現のため、ｐＴｒｉＥｘ−ＰＤＣＳでトランスフェクトされた安定な細胞系統の選択が、ｐＣＩ  ｎｅｏベクター由来構築物（ｐＣＩ−ＰＤＣＳ）を使用するよりも、より効率的に達成される。
【０１３２】
ｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現プラスミドｐＴｒｉＥｘ−ＰＤＣＳでトランスフェクトした代表的なＢＨＫ−２１細胞コロニーを、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）抗生物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから市販のＧｅｎｔａｍｉｃｉｎに関連する硫酸ネオマイシンのアミノグリコシドアナログであるＧ−４１８試薬）の選択下で細胞系統へと発達させ；そして細胞系統をＢＨＫ−ＰＤＣＳと標示した。ｐＤＣ−ＳＩＧＮを細胞表面上で発現させることができるかどうかを決定するために、細胞系統ＢＨＫ−ＰＤＣＳおよびＢＨＫ−２１を、フローサイトメトリー解析のためのポリクローナルｐＤＣ−ＳＩＧＮ抗体で染色した。図８ａに示されるように、ＢＨＫ−２１細胞上では、抗体による検出可能の染色は認められなかったが、ＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞上では、ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質の表面発現が検出され、これは、ＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞系統が、ｐＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質を合成することが可能であることを示した。また、結果から、ｐＤＣ−ＳＩＧＮが、ＩＩ型内在性膜タンパク質ファミリーに属することが確認された。ＦＡＣＳによって、ＢＨＫ−ＰＤＣＳをさらに富化および分取して、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ発現を伴う、より純粋な細胞集団を入手し、そして以後の結合実験に使用した。加えて、ｈＤＣ−ＳＩＧＮ特異的ｍＡｂによる染色によって確認される（L. Wu et al., “Functional evaluation of DC-SIGN monoclonal antibodies reveals DC-SIGN interactions with ICAM-3 do not promote human immunodeficiency virus type 1 transmission,” J. Virol. 76:5905-14 (2002)により記載の）ｈＤＣ−ＳＩＧＮを安定に発現する３Ｔ３−ＨＤＣＳ細胞系統（図８ａ）を、陽性コントロールに使用した。
【０１３３】
ヒトＩＣＡＭ−３およびＩＣＡＭ−２免疫接着因子のｐＤＣ−ＳＩＧＮを安定に発現するＢＨＫ細胞への結合：可溶性ｈＦｃ、ｈＩＣＡＭ−３−ＦｃおよびｈＩＣＡＭ−２−ＦｃのｐＤＣ−ＳＩＧＮ陰性ＢＨＫ−２１細胞への結合は、マンナンまたはＥＧＴＡのいずれかが存在してもまたは存在しなくても、観察されなかった（図８ｂ〜８ｅ）。しかし、ｈＩＣＡＭ−３−ＦｃまたはｈＩＣＡＭ−２−ＦｃのいずれかのＤＣ−ＳＩＧＮ陽性細胞の両方への結合は観察された。ｈＩＣＡＭ−３−ＦｃのＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞への結合は、ｈＩＣＡＭ−２−ＦｃのＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞への結合よりも高い親和性を有した。ｈＦｃ単独のＢＨＫ−ＰＤＣＳまたは３Ｔ３−ＨＤＣＳへの結合は陰性であったため、結合は特異的であった。さらに加えて、マンナンの添加により、ｈＩＣＡＭ−３−ＦｃおよびｈＩＣＡＭ−２−Ｆｃの両方の結合とも阻止され、ＥＧＴＡが存在する場合も同様であった。ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性細胞の両方において、ＥＧＴＡによる阻害は、マンナンによる阻害よりも効率的であった（図８ｂ〜８ｅ）。結果は、ｐＤＣ−ＳＩＧＮが、ヒトＩＣＡＭ−３またはＩＣＡＭ−２と交差反応することが可能であり、そして相互作用がＣａ２＋に対して依存的であり、そしてｐＤＣ−ＳＩＧＮのＣＲＤによって仲介されることを示した。
【０１３４】
実施例３
ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の伝播または感染に対するブタＤＣ−ＳＩＧＮの関与
材料および方法
ＰＲＲＳＶウイルスストックの作製：異なる遺伝子型由来の２つのＰＲＲＳＶ株を、本研究に使用した。本研究の目的のために「ＰＧＸＧ」と標示された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する遺伝子型１  ＰＲＲＳＶのウイルスストックを、ＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンによりＰＲＲＳＶ感染を支持することが可能なＭＡＲＣ−１４５細胞（Ｄｒ．  Ｙｉｎｇ  Ｆａｎｇ，Ｓｏｕｔｈ  Ｄａｋｏｔａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより恵与された）のトランスフェクションによって作製した。感染性ＰＲＲＳＶ  ｃＤＮＡクローンを、かなりより高い効率でＤＮＡからラウンチ（ｌａｕｎｃｈｅｄ）されるように改変し、続いて、ＭＡＲＣ−１４５細胞に対する２代連続継代を行った。細胞破砕物が遠心分離によって除去され、ウイルスストックは、それらを有さないＰＲＲＳＶ含有上清であった。貯蔵条件で保持されたＰＧＸＧおよび遺伝子型２北米型ＰＲＲＳＶ株ＶＲ２３８５のウイルス力価を、ＩＦＡによるＭＡＲＣ−１４５細胞に対する限界希釈によって決定し、そしてそれぞれ、１ｍＬあたりの蛍光焦点形成単位（ＦＦＵ）として定量した。
【０１３５】
ＰＲＲＳＶ結合アッセイ：ＢＨＫ−ＰＤＣＳおよびＢＨＫ−２１細胞単層を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから市販の酵素を含まないＰＢＳベースの緩衝液）を伴うインキュベーションによって分散させ、そして２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄した。懸濁液中合計で５×１０５個の細胞に、１個の細胞あたり１０ＦＦＵの感染効率（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）のＰＲＲＳＶ株ＶＲ２３８５を播種した。４℃で６０分間のウイルス吸着および２回の洗浄後、細胞を、ＰＲＲＳＶ  ｍＡｂ  ＳＤＯＷ１７−Ａ（Ｒｕｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｏｋｉｎｇｓ，ＳＤ）と共に、１：１０００希釈で３０分間、４℃でインキュベートした。続いて、細胞を２回洗浄して、遊離の抗体を除去し、次いで、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と共に、１：５０希釈でインキュベートして、ＦＡＣＳ解析により、ＰＲＲＳＶの細胞への結合を決定した。ＰＲＲＳＶ−ブロッキングＩＣＡＭ−３結合アッセイでは、ＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞を、ｈＩＣＡＭ−３−Ｆｃ添加の前に、ＰＧＸＧまたはＶＲ２３８５（１個の細胞あたりＭ．Ｏ．Ｉ．＝１０ＦＦＵ）のいずれかと共に、６０分間、４℃で、インキュベートした。
【０１３６】
ＰＲＲＳＶ捕捉およびトランスでの伝播アッセイ：ＢＨＫ−ＰＤＣＳ、ＢＨＫ−２１またはＭＡＲＣ−１４５ドナー細胞（それぞれについて２．５×１０５個の細胞）を、ＰＧＸＧまたはＰＲＲＳＶ  ＶＲ２３８５ウイルスのいずれかと共に、１個の細胞あたり０．５ＦＦＵのＭ．Ｏ．Ｉ．で、５００μＬの容積で、３時間、インキュベートして、ウイルスの吸着を可能にした。次いで、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、２％ＦＢＳを補充したＭＥＭの１ｍＬ中ＭＡＲＣ−１４５標的細胞（１．０×１０５個）と混合し、そして１２ウェルプレートの個々のウェルに播種した。感染の３日後、細胞を掻き取り、そしてＰＲＲＳＶウイルスを３サイクルの凍結融解によって回収した。ウイルス力価を上記のように決定した。
【０１３７】
結果および考察
ＢＨＫ細胞の表面上で発現されたブタＤＣ−ＳＩＧＮは、ＰＲＲＳＶウイルスの進入には関与しないが、ＰＲＲＳＶ伝播を増強して、トランスでＭＡＲＣ−１４５細胞を標的にする：ＢＨＫ−２１は、細胞内のエンベロープＰＲＲＳＶ複製を支持するが、ウイルスの細胞間の拡大は可能にしないことが示された（J. J. Meulenberg et al., “Infectious transcripts from cloned genome-length cDNA of porcine reproductive and respiratory syndrome virus,” J. Virol. 72:380-7 (1998)の早期の研究を参照のこと）。ｐＤＣ−ＳＩＧＮは、ＰＡＭ（高度にグリコシル化されたエンベロープウイルスタンパク質を含有するＰＲＲＳＶの感受性宿主細胞）上で発現されたため、細胞表面上で発現されるｐＤＣ−ＳＩＧＮが、ＰＲＲＳＶ付着および進入に関与するかどうかを調べることは重要である。遺伝子型１  ＰＲＲＳＶ感染性ｃＤＮＡクローンによるＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞のトランスフェクションにより、その後、標的ＭＡＲＣ−１４５細胞において繁殖するＧＦＰ発現を伴うウイルスを回収（ｒｅｃｏｖｅｒ）し得る（図９ａ）。しかし、細胞培養培地に放出されたウイルス（ＰＧＸＧ）は、非トランスフェクトＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞に感染することができなかったことから、ｐＤＣ−ＳＩＧＮは、ＰＲＲＳＶ進入に関与しないことが実証された。ＢＨＫ−２１細胞系統はまた、ＰＲＲＳＶ結合に感受性であることが公知であったため（例えば、D. Therrien et al., “Preliminary characterization of protein binding factor for porcine reproductive and respiratory syndrome virus on the surface of permissive and non-permissive cells,” Arch. Virol. 145:1099-16 (2000)を参照のこと）、続いて、ＰＲＲＳＶ特異的結合アッセイを実施して、細胞表面に対するウイルス付着を、ＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞とＢＨＫ−２１細胞との間で比較した。ＰＲＲＳＶは、実際に両方の細胞系統に結合することが見出されたが、差異を定量することは困難であった（図９ｂ）。ＢＨＫ−ＰＤＣＳ細胞に対するＰＲＲＳＶの付着が、ｐＤＣ−ＳＩＧＮ−ｈＩＣＡＭ−３相互作用を干渉し得るかどうかを決定するために、ｈＩＣＡＭ−３−Ｆｃ結合の前に、細胞を遺伝子型１  ＰＲＳＶ株ＰＧＸＧまたは遺伝子型２  ＰＲＲＳＶ株ＶＲ２３８５のいずれかで前処理した。結果は、ＰＲＲＳＶ株は両方とも、ｈＩＣＡＭ−３結合を阻止したことを示し、ＰＲＲＳＶ付着と、ＢＨＫ細胞表面上でのｐＤＣ−ＳＩＧＮの発現との間に予想外の相関が示唆された（図９ｃ）。
【０１３８】
さらに加えて、ｈＤＣ−ＳＩＧＮは、ウイルスを効率的に標的細胞に伝播することが示されているため、ｐＤＣ−ＳＩＧＮが、トランスでのドナー細胞−標的細胞接触によりＰＲＲＳＶ伝播を容易にする類似の能力を有するかどうかについて問題となった。ＢＨＫ−ＰＤＣＳおよびＢＨＫ−２１細胞を、ドナー細胞として使用したが、感受性ＭＡＲＣ−１４５細胞を、ＰＲＲＳＶ捕捉および伝播アッセイにおける標的細胞（またはコントロールにおけるドナー細胞）として使用した。ドナー細胞を、それぞれ、培養培地（疑似インキュベーションコントロールとして）、ＰＲＲＳＶ  ＰＧＸＧ株およびＰＲＲＳＶ  ＶＲ２３８５株と共にインキュベートした。１×１０７ＦＦＵ／ｍＬにまで到達し得る１個の細胞あたり０．５ＦＦＵの同じＭ．Ｏ．Ｉ．でのＰＲＲＳＶによるＭＡＲＣ−１４５細胞の直接感染から得られるウイルス力価と比較して、３つのタイプのドナー細胞によって伝播されるＭＡＲＣ−１４５細胞において増殖したＰＲＲＳＶのウイルス力価はかなり低く、２．９×１０２ＦＦＵ／ｍＬ〜２．５×１０４ＦＦＵ／ｍＬの範囲であり（図９ｄ）、低い効率にもかかわらず、ＰＲＲＳＶの伝播を定量し得ることが示された。ＭＡＲＣ−１４５細胞によって伝播されるＰＲＲＳＶは、さらなる細胞の存在（ドナー細胞をまた、標的細胞としても使用した）のため、２つのＢＨＫ細胞よりも効率的であった。ＢＨＫ−ＰＤＣＳによるＰＲＲＳＶ伝播は、それぞれ、ＢＨＫ−２１細胞と比較して、ＰＲＲＳＶ  ＰＧＸＧ株では５２％（ｐ＝０．０７）増強され、そしてＰＲＲＳＶ  ＶＲ２３８５株では、７２％（ｐ＝０．０２）増強された（図９ｄ）ことから、ｐＤＣ−ＳＩＧＮはおそらく、これらの条件下でトランスでのＰＲＲＳＶ伝播に関連することが示唆される。
【０１３９】
実施例４
ブタＩＣＡＭ−３  ｃＤＮＡアイソフォームのクローニングおよび特徴付け
材料および方法
ブタ：３〜７週齢の健常な雑種の従来のブタから、静脈血サンプルを回収した。ブタを、実験条件下、隔離された部屋で維持した。
【０１４０】
ブタからのＣＤ１４陽性単球の調製および培養：ブタから回収したヘパリン処理血液を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１：２に希釈し、そしてＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）上、１０００ｇで４０分間、室温で遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含有するバフィーコート層を単離し、そして２５０ｇのＰＢＳで３回、１０分間４℃で洗浄した。ＰＢＭＣの表面上のＣＤ１４陽性単球を、抗ＣＤ１４ｍＡｂ（Ｍ−Ｍ９，ＶＭＲＤ  Ｉｎｃ．，Ｐｕｌｌｍａｎ，ＷＡ，ＵＳＡ）およびヤギ抗マウスＩｇＧ１−磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、細胞の免疫磁気標識ＭＡＣＳシステムによって分取した。精製された単球を、１×１０５個の細胞／ｍＬで、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５５μｍｏｌ／Ｌのβ−メルカプトエタノールおよび抗生物質を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に再懸濁した。次いで、単球を、６ウェルプレートまたは６０ｍｍペトリ皿において、３７℃で、２５ｎｇ／ｍＬの組み換えブタ顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｒｐＧＭ−ＣＳＦ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および２５ｎｇ／ｍＬ組み換えブタインターロイキン−４（ｒｐＩＬ−４，Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の存在下で培養した。３日ごとに、培養培地の半分を、新鮮培地で置き換えた。
【０１４１】
ＲＮＡ抽出：インビトロで培養したブタ単球を、７日目〜１０日目の間に回収し、そしてブタ単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）として使用した。ブタＭＤＤＣ由来の全ＲＮＡを、製造者のプロトコルに従い、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、単離した。
【０１４２】
５’−ＲＡＣＥ、３’−ＲＡＣＥおよびＲＴ−ＰＣＲ：ＲＴおよびＲＡＣＥ−ＰＣＲを、製造者の取扱説明書に従って、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キットおよびＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって実施した。５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥに使用した遺伝子特異的プライマーは、それぞれ、ＰＩＣ５４（５’−ＧＣＧＴＣＣＡＧＧＴＴＡＡＧＡＣＡＣＧＣＣＧ−３’（配列番号２０に対応する））およびＰＩＣ５１（５’−ＴＣＣＧＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＣＣＡＣＧ−３’（配列番号２１に対応する））であり、既知の部分的ブタＩＣＡＭ−３遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  受託番号ＡＪ６３２３０３）に基づいて設計した（Ｌｅｅｂ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ，  ２００４、上掲）。ＲＡＣＥ反応産物を、それぞれのプライマーで直接配列決定し、続いて、ＴＡクローニングストラテジーによって、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、そしてＶｉｒｇｉｎｉａ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ，ＶＡ）において、Ｍ１３順方向および逆方向プライマーで配列決定した。
【０１４３】
全長ブタＩＣＡＭ−３の２つのアイソフォームの完全性を確認するために、順方向プライマーＰＩＣ５Ｅ（５’−ＣＴＧＴＧＧＧＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号２２に対応する））および逆方向プライマーＰＩＣ５８（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＧＧＡＡＣＧＴＣＡ−３’（配列番号２３に対応する））を使用して、全長ブタＩＣＡＭ−３のｃＤＮＡを増幅した。得られた２つのＰＣＲ産物を、それぞれｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングし、配列決定し、そしてｐＰＩＣ３ＬおよびｐＰＩＣ３Ｓと標示した。
【０１４４】
ゲノムＰＣＲ：ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を、ブタＭＤＤＣ、全血またはＰＢＭＣからのＤＮＡの単離に使用した。ブタＩＣＡＭ−３ゲノム配列の増幅に使用したプライマーを、本研究から同定された全長ブタＩＣＡＭ−３のｃＤＮＡ配列に基づいて設計した。順方向プライマーＰＩＣ５３（５’−ＣＣＣＡＣＧＡＧＡＴＴＧＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＣ−３’（配列番号２４に対応する））および逆方向プライマーＰＩＣ５８は、それぞれ、エキソン４およびエキソン７に局在する。ＫＯＤ高正確性のＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＧＣ緩衝液を伴うＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社、日本）またはＡｄｖａｎｔａｇｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、それぞれ製造者のプロトコルに従って、ゲノムＰＣＲ増幅に使用した。ブタＩＣＡＭ−３ゲノムフラグメントのＰＣＲ産物を、両鎖について直接配列決定した。
【０１４５】
配列解析：ＤＮＡおよびアミノ酸配列の解析を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して実施した。
【０１４６】
結果および考察
培養した付着性ＰＢＭＣからのブタＭＤＤＣの作製：付着性ブタＣＤ１４陽性ＰＢＭＣ細胞を、ｒｐＧＭ−ＣＳＦおよびｒｐＩＬ−４を補充した培地において増殖させた。１日間の培養後、初めに、単一およびベール形状細胞が出現した。細胞体からの長いベール状の突起を伴う不規則な形状およびクラスター形成を伴うより大きな細胞が７日目に認められ、ブタＭＤＤＣの発生が示された。ｒｐＧＭ−ＣＳＦおよびｒｐＩＬ−４の添加を伴わない培養細胞は、形態学的変化または凝集を何ら示さなかった。
【０１４７】
ブタＩＣＡＭ−３のｃＤＮＡの２つのアイソフォームのクローニングおよび特徴付け：部分的ブタＩＣＡＭ−３遺伝子について報告されている（Leeb and Muller, 200４、上掲）が、ブタＩＣＡＭ−３のｃＤＮＡは、これまで同定されていなかった。推定された部分的ブタＩＣＡＭ−３コード領域に基づいて、２つのプライマーＰＩＣ５４およびＰＩＣ５１を設計し、そしてブタＭＤＤＣから抽出された全ＲＮＡを使用して、５’−および３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを実施した。５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲの逆方向プライマーＰＩＣ５４は、３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲプライマーＰＩＣ５１の下流に局在するため、増幅された５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物は、５５−ｎｔの重複領域を有し、それ故、ブタＩＣＡＭ−３の全長配列を含む。
【０１４８】
それぞれ約８５０ｂｐおよび７５０ｂｐを有する２つのフラグメントを、５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲから増幅したが（図１０（ａ））、３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ由来の約７００ｂｐのただ１つのバンドが、１％アガロースゲル上で可視化された（図１０（ｂ））。得られる配列の集成および解析により、５’−末端領域で異なるブタＩＣＡＭ−３のｃＤＮＡの２つのアイソフォームが同定された。続いて、ＩＣＡＭ−３の全長の大きなおよび小さなアイソフォームを、それぞれ利用可能な配列の両末端に相補的な２つのプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ増幅によって入手した。２つのアイソフォーム産物の配列解析によって、５’−および３’−ＲＡＣＥ産物の集成の結果が確認された。
【０１４９】
大きなアイソフォーム（ＩＣＡＭ−３Ｌ）は１，４９３ｂｐ長であり、それぞれ、ｎｔ１３位または２５８位で開始する２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する（図１１ａ〜１１ｂ）。第１のＯＲＦは、第２のＯＲＦと重複しない６３−ａａの小さなペプチドをコードする。１，１１９ｂｐ長を有する第２のＯＲＦは、ブタＩＣＡＭ−３をコードすることが推定されており、後方に、１１７ｂｐの３’非コード領域、ｎｔ１４５２位のポリアデニル化シグナルおよびｎｔ１４６９位で開始するポリ（Ａ）尾部が続く。推定ＩＣＡＭ−３タンパク質は、３４−ａａの推定シグナルペプチドを有し、後方に、３３８アミノ酸の成熟タンパク質が続く。ａａ３２１位から開始する推定２６−ａａの疎水性膜貫通ドメインの後方に、２６−ａａの推定細胞質尾部が続く。
【０１５０】
大きなアイソフォームＩＣＡＭ−３Ｌと比較した場合、１，３７９ｂｐ長を有する小さなアイソフォーム（ＩＣＡＭ−３Ｓ）は、ｎｔ１４５位から開始する１１４−ｎｔの欠失を有する（図１１ａ〜１１ｂ）。欠失は、インフレームでａａ４５位の第１のＯＲＦから開始し、そして後方に、第２のＯＲＦのＡＴＧ開始コドンが続き、第２のＯＲＦと第１の短縮型ＯＲＦとの融合が生じている。従って、小さなアイソフォームブタＩＣＡＭ−３Ｓは、４１６アミノ酸を有する１つのＯＲＦのみをコードする。大きなアイソフォームのブタＩＣＡＭ−３Ｌにおける小さなＯＲＦが、機能的なペプチドを発現することが可能であるかどうか、または小さなアイソフォームＩＣＡＭ−３Ｓにおける単一のＯＲＦがｎｔ１３位で開始するかどうかについては、未だ決定されていない。両方のアイソフォームは、推定シグナルペプチドから開始する主要なコード領域を共有する（図１１ａ〜１１ｂ）。
【０１５１】
所見：結果は、ブタＩＣＡＭ−３アイソフォームが、３つのＩｇ様ドメインのみからなることを示す。ヒト、非ヒト霊長類およびウシＩＣＡＭ−３は、それらを、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーのサブファミリーとして定義する５つのＩｇ様ドメインからなるため、非ヒト霊長類以外では、ブタはヒトに最も近い種であることから、ブタＩＣＡＭ−３は、類似の構造を有するべきであることが予想される。しかし、意外なことに、クローニングされたブタＩＣＡＭ−３は、Ｉｇ様ループに典型的な鎖内ジスルフィド結合を有する３つの細胞外Ｉｇ様ドメインのみをコードしたことが見出された。報告されている部分遺伝子から推定される部分的ブタＩＣＡＭ−３のｃＤＮＡと比較して、現存の３つのＩｇ様ドメインは、同一であり、そしてドメイン１〜３として認識される。加えて、ブタＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２において対応するドメインがある各ドメインの最も高い配列同一性はまた、クローニングされたＩＣＡＭ−３が、ドメイン１〜３を有することを示した（以下の表２を参照のこと）（C. J. Stocker et al., “Cloning of porcine intercellular adhesion molecule-1 and characterization of its induction on endothelial cells by cytokines,” Transplantation 70:579-586 (2000)；J.W. Godwin et al., “Characterization of pig intercellular adhesion molecule-2 and its interaction with human LFA-1,” Am J Transplant. 4:515-525 (2004)）。ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２に類似して、Ｉｇ様ドメイン１（Ｄ１）は、２つの推定ジスルフィド結合を含有する。ブタ−ヒトまたはブタ−ウシＩＣＡＭ−３の個々のドメイン間の配列比較は、ドメイン２（Ｄ２）およびドメイン３（Ｄ３）の両方が、比較的保存されていることを表したが、ブタとヒトとの間では、Ｄ２で６７％およびＤ３で６８．８％であり、そしてブタとウシとの間では、Ｄ２で７１．４％およびＤ３で６６％であった。Ｄ１は、ブタとヒトとの間、ならびにブタとウシとの間でより低い配列同一性を示す。興味深いことに、ウシＩＣＡＭ−３は５つのＩｇ様ドメインからなるが、そのブタＩＣＡＭ−３との系統的関係は、霊長類との関係よりも近く、４０．７％のアミノ酸同一性を有し、そして霊長類ＩＣＡＭ−３から個々のクラスターを形成する。この関係は、ウシおよびブタＩＣＡＭ−３が、相違する経路から進化したことを示唆する。
【０１５２】
表２．ブタＩＣＡＭ  ＩｇＳＦドメイン間のアミノ酸配列同一性
【表２】
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＊Ｉｇ様ドメイン間のアミノ酸配列同一性パーセントを、Ｍｅｇａｌｉｇｎプログラムによって計算した。ブタＩＣＡＭ−３ドメイン１〜３とブタＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−２における対応するドメインとの比較を、太字で示した。
【０１５３】
８つの潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位は、３つのドメイン上に局在することが推定されている（図１１ａ〜１１ｂ）。Ｄ１の第１の部位は、ＬＦＡ−１結合に極めて重要であったヒトＩＣＡＭ−３に同一な保存された残基Ａｓｎ５７およびＳｅｒ５９を含み（L.B. Klickstein et al., “Localization of the binding site on intercellular adhesion molecule-3 (ICAM-3) for lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1),” J. Biol. Chem. 271:23920-23927 (1996)）、ブタにおけるＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−３との間の分子相互作用が、ヒトＩＣＡＭ−３と類似のパターンを有することが示唆される。
【０１５４】
ブタＩＣＡＭ−３の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）および細胞質尾部（ＣＴ）は、ブタＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２またはヒトおよびウシＩＣＡＭ−３とでほとんど保存が認められない。ヒトおよびウシＩＣＡＭ−３のＣＴにおけるセリン残基は独特であり、そしてヒト、ラットまたはマウスＩＣＡＭ−１もしくはＩＣＡＭ−２はいずれも、それらのＣＴにおいてセリン残基を含有しないことが見出されている（F. Lozano et al., “Effect of protein kinase C activators on the phosphorylation and the surface expression of the CDw50 leukocyte antigen,” Eur. J. Biochem. 203:321-326 (1992)）。興味深いことに、ヒトおよびウシＩＣＡＭ−３と同様に、ブタＩＣＡＭ−３ならびにブタＩＣＡＭ−１および−２はすべて、それらのＣＴにおいてセリン残基を含有する。ヒトＩＣＡＭ−３におけるセリン残基は、一過的なリン酸化を経験し、異なる細胞内シグナルおよび細胞接着において異なる役割がもたらされることが示されている。ブタＩＣＡＭメンバーが、ヒトＩＣＡＭ−３と同様に、シグナル伝達にリン酸化型セリン残基を使用するかどうかについては、明らかになっていない。
【０１５５】
ＩＣＡＭメンバーの各Ｉｇ様ドメインは、異なるエキソンによってコードされる。ＩＣＡＭ−１−欠損マウスでは、マウスＩＣＡＭ−１遺伝子の完全なエキソンスキッピングにより、Ｉｇ様ドメイン２、３、および／または４の欠失を伴うスプライシング変異体が生じた。しかし、これらの変異体の出現は、病理学的条件による可能性がある。病理学的条件または正常な生理学的条件下にかかわらず、ヒトＩＣＡＭ−３のスプライシングアイソフォームについては、報告されていない。ヒトおよびウシＩＣＡＭ−３の両方の遺伝子は、次の７つのエキソンを有する：エキソン１はシグナルペプチドをコードし、エキソン２〜６は、それぞれＤ１〜Ｄ５をコードし、そしてエキソン７はＴＭＤ＋ＣＴをコードする。ブタＩＣＡＭ−３遺伝子の利用可能な配列は、完全ではなく、そしてエキソン１〜部分的エキソン５の領域のみを含有する。本研究から同定されたＤ４およびＤ５欠失を伴うブタＩＣＡＭ−３アイソフォームは、ブタＩＣＡＭ−３遺伝子のエキソン５および６の連続スキッピングの結果であるようである（図１２ａ）。従って、スプライシングの機構をさらに良好に理解するために、ブタＩＣＡＭ−３遺伝子の残りの未知領域のクローニングおよび配列決定を行った。
【０１５６】
ブタＩＣＡＭ−３遺伝子の３’−近位領域のクローニングおよび特徴付け：ブタＩＣＡＭ−３のＴＭＤならびにＣＴ領域は、おそらく、エキソン７によってコードされる。エキソン７の配列を、本研究では、ブタＩＣＡＭ−３のｃＤＮＡから決定し、それ故、遺伝子の未知の３’−近位領域を同定するために、この配列を使用して、ゲノムＰＣＲのための逆方向プライマーを設計した。ＧＣリッチ領域のＰＣＲ増幅による所望されない変異を最小限にし、そして潜在的な人工的欠失を回避するために、異なる３つの市販のキットを、ゲノムＰＣＲ増幅に使用した。３つのすべてのＰＣＲキットを使用して得られるＰＣＲ産物は、約１．５ｋｂ長のサイズを有した。これらの１．５ｋｂＰＣＲ産物の配列解析により、それらがすべて同一であり、従って、７２ｂｐのエキソン４、すべてで２７３ｂｐのイントロン４、すべてで２５５ｂｐのエキソン５、すべてで１１９ｂｐのイントロン５、すべてで２４４ｂｐのエキソン６、すべてで３６０ｂｐのイントロン６、および２１７ｂｐのエキソン７を包含するブタＩＣＡＭ−３遺伝子の３’−近位領域を表すことが示された（図１２ｂ）。先に報告された部分的ブタＩＣＡＭ−３遺伝子を、本研究において同定された残りの配列と共に継ぎ合わせた場合、完全なブタＩＣＡＭ３遺伝子の構成が、ヒト、非ヒト霊長類およびウシ（すべて、７ｋｂに及ぶ７つの推定エキソンを含有する）と同様に示された。エキソン３〜７は、遺伝子の３’側の半分においてクラスター化された。
【０１５７】
ブタＩＣＡＭ−３のエキソン５、６および７の未知の境界配列を、それぞれ、解析し、そして配列を、ヒトおよびウシの配列と比較した（以下の表３を参照のこと）。イントロン６のスプライスアクセプター部位（ＳＡＳ）を含むエキソン７の境界配列は、ヒトの配列に類似する。エキソン７は、ＴＭＤおよびＣＴ領域の初めのセリン部位をコードするトリプレット（ＡＧＴ）うちの２つ（ＧＴ）から開始し、これは、ブタＩＣＡＭ−３のｃＤＮＡ構造と一致する（図１１ａ〜１１ｂ）。エキソン５および６では、イントロン６のスプライスドナー部位（ＳＤＳ）を除いて、他の境界配列が、スプライシングに関与することが公知であるコンセンサスエレメントを満たし、そして３つの種の間で保存されている（表３、図１２ｂ）。ほとんどのイントロンは配列ＧＴから開始するため、イントロン６の推定ＳＤＳにおける点変異（ＧからＡ）は、同様に、スプライシングシグナルを排除し、それ故、エキソン６のスキッピングがもたらされる。他の代替的ＳＤＳは、下流配列において見出されなかった。
【０１５８】
エキソン５の推定されたコード領域では、ヒトおよびウシＩＣＡＭ−３遺伝子における対応する位置と比較して、ＣＴＴからＴＧＡへの有意な３ｎｔ置換が、エキソンの開始配列からｎｔ１４１位において観察された。変異はインフレームであるが、ロイシン残基を終止コドンに変更する。ブタにおけるエキソン５の２５５ｂｐサイズは、ヒトおよびウシにおけるそれと同じである。
【０１５９】
推定エキソン６の配列はさらに複雑であった。４ｎｔ欠失および１ｎｔ欠失が、それぞれ、エキソンの開始配列からｎｔ５３位および終止配列からｎｔ−７位で見出された。４ｎｔ欠失は、フレームシフトを生じ、従って、以後に、４つのインフレームでの終止コドンがもたらされる（図１２ｂ）。
【０１６０】
エキソン５および６の得られた配列情報に基づいて、エキソン５または６を包含するＲＮＡ転写物が失われないことを確実にするために、特に、順方向プライマーＰＩＣ５３およびエキソン５またはエキソン６の配列に相補的ないくらかの逆方向プライマーでｃＤＮＡフラグメントを増幅することを、試みた。特定のフラグメントは増幅されず、ブタＩＣＡＭ−３遺伝子は、エキソン５および６がスキッピングされている成熟ｍＲＮＡのみを産生するようであることが示唆された。
【０１６１】
表３．ヒト、ウシ、およびブタＩＣＡＭ−３遺伝子におけるエキソン５〜７のイントロン／エキソン境界配列の比較
【表３】
2011501958.tif 000004
ＳＡＳ：スプライスアクセプター部位、（Ｓｐｌｉｃｅ  Ａｃｃｅｐｔｏｒ  Ｓｉｔｅ）；ＳＤＳ：スプライスドナー部位（Ｓｐｌｉｃｅ  Ｄｏｎｏｒ  Ｓｉｔｅ）；Ｎ／Ａ：該当なし
イントロン配列を小文字で表す一方、エキソン配列を大文字で表す。イントロン開始配列「ｇｔ」および終止配列「ａｇ」に下線を付す。ブタＩＣＡＭ−３遺伝子におけるイントロン６の推定ＳＤＳにおける点変異（ｇからａ）を斜体太字で示す。
【０１６２】
エキソン５および６におけるインフレームでの終止コドンまたは中途終止コドン（ＰＴＣ）の存在は、ブタＩＣＡＭ−３の成熟ｍＲＮＡからのそれらの排除に関連する。ナンセンス変異に伴う選択的スプライシング（ＮＡＳ）として公知の現象が、少数の疾患を引き起こす遺伝子において認められている。しかし、情報および信条に基づいて述べれば、種関連のＮＡＳについては、これまで報告されていない。ブタＭＤＤＣから同定されたエキソン５および６を欠くブタＩＣＡＭ−３アイソフォームは、ブタ種におけるＩＣＡＭ−３のＲＮＡ転写物の天然の形であり得る。エキソン５のスキッピングは、おそらく、ＴＧＡナンセンス変異の結果であるが、エキソン６のスキッピングは、４つのナンセンスコドンまたはイントロン６のＳＤＳにおける点変異から生じ得る。ＮＡＳ機構を確認し、そしてさらにブタＩＣＡＭ−３遺伝子の関連スプライシング機構を同定するためには、変異誘発解析のような本研究の範囲にはないさらなる研究が必要である。
【０１６３】
ヒトＩＣＡＭ−３タンパク質におけるＩｇ様ドメイン４および５の正確な機能については、特徴付けられていない。第１のＮ−結合型グリコシル化部位においてＡｓｎ５７およびＳｅｒ５９を含むいくつかの極めて重要な残基を含有するドメイン１は、ＬＦＡ−１結合に必要かつ十分である。ドメイン２は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮと相互作用すると考えられる。クローニングされたブタＩＣＡＭ−３アイソフォームは、ブタＬＦＡ−１およびＤＣ−ＳＩＧＮとの潜在的な接着特性を保持し、それ故、対応するブタ免疫応答において類似の役割を果たすべきである両方のドメインからなる。
【０１６４】
実施例５
ブタＬＳＥＣｔｉｎ  ｃＤＮＡおよび遺伝子のクローニングおよび特徴付け
材料および方法
ＲＮＡ抽出および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）：７週齢の健常な雑種の従来のブタを、組織サンプルの回収に使用した。ブタを、実験条件下、隔離された部屋で維持した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用し、続いて、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅＩの処理により、ホモジナイズしたブタ肝臓組織から全ＲＮＡを単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、オリゴ−ｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を逆方向プライマーとして使用するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって、全ＲＮＡから合成した。遺伝子特異的プライマーの対、ＰＬＳＴ−Ｆ（配列番号３１に対応する５’−ＴＡＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＧＣＡＣＣ−３’）およびＰＬＳＴ−Ｒ（配列番号３２に対応する５’−ＧＧＧＣＴＡＧＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＧＣ−３’）を、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ２３２６０３を有するブタＥＳＴ配列に従うｐＬＳＥＣｔｉｎ  ｃＤＮＡの完全なコード領域の増幅のために設計した。ＰＣＲを、５０μＬ反応液中、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により、次のＰＣＲパラメータを使用して実施した：９４℃で２分間、９４℃で１５秒間、６０．０℃で３０秒間および７２℃で９０秒間の３０サイクル、および７２℃で３分間の最終インキュベーション。得られたＰＣＲ産物を、個別に切り出し、精製し、続いて、ＴＡクローニングストラテジーによってｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、続いて配列決定を行った。
【０１６５】
ゲノムＰＣＲおよび遺伝子配列決定：同じプライマーＰＬＳＴ−Ｆ（配列番号３１）およびＰＬＳＴ−Ｒ（配列番号３２）を、ワンステップゲノムＰＣＲに使用した。ゲノムＰＣＲを、５０μＬの全容積中、１５０ｎｇのブタゲノムＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから購入した）を使用するＰｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  ＨｉＦｉ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって実施した。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒間、６８℃で４分間の３５サイクルであり、テンプレートＤＮＡの初期変性は、９４℃で２分間であった。得られたフラグメントを、ＴＡクローニングストラテジーによってｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。Ｍ１３順方向および逆方向プライマーを、遺伝子特異的プライマーＰＬＳＴ−Ｅ３Ｆ（配列番号３３に対応する５’−ＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＴＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＧ−３’）と共に、配列決定に使用した。
【０１６６】
ＲＴ−ＰＣＲによって検出されるＬＳＥＣｔｉｎの組織分布：ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用し、続いて、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅＩの処理により、脾臓、十二指腸、胸腺、腎臓、肺、リンパ節、心臓、骨髄、肝臓および筋肉を含む１０のホモジナイズしたブタ組織から全ＲＮＡを単離し、オリゴ−ｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を逆方向プライマーとして使用するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって、ｃＤＮＡを合成した。ゲノムＤＮＡの混入を回避するために、ゲノム配列決定によって決定されているｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子配列のエキソン６とエキソン７との間の境界にわたるプライマーＰＬＳＴ−Ｅ６７Ｆ（配列番号３４に対応する５’−ＧＡＧＡＧＴＣＣＧＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴ−３’）、ならびにエキソン８およびエキソン９の境界にわたるプライマーＰＬＳＴ−Ｅ８９Ｒ（配列番号３５に対応する５’−ＴＣＣＣＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＡＧ−３’）を使用して、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により、５０μＬ反応において、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲパラメータは、９５℃で２０秒間、６８℃で１分間の３０サイクルを含み、テンプレートＤＮＡの初期変性は、９４℃で２分間であった。ハウスキーピング遺伝子、ブタグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）もまた、ＰＣＲ（９５℃で１分間、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で４０秒間および７２℃で３分間の３０サイクル）によって、プライマーＧＡＰＤＨ５（配列番号２９に対応する５’−ＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣ−３’）およびＧＡＰＤＨ３（配列番号３０に対応する５’−ＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴ−３’）を使用して、増幅した。ＰＣＲ産物の予想されるサイズは、それぞれ、ｐＬＳＥＣｔｉｎで３０３ｂｐおよびブタＧＡＰＤＨで２８５ｂｐであった。
【０１６７】
配列および系統解析：ＤＮＡおよびアミノ酸配列の解析ならびにアラインメントを、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して実施した。
【０１６８】
結果および考察
ブタＬＳＥＣｔｉｎ  ｃＤＮＡおよび遺伝子の分子クローニングおよび構造：ｈＬＳＥＣｔｉｎのブタ相同体を見出すために、ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＳＴデータベースにおける一連の配列類似性検索を行った。ｈＬＳＥＣｔｉｎのｃＤＮＡと有意な相同性を共有する  ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ２３２６０３を有するＥＳＴ配列を見出した。この配列に基づいて、本発明者らは、遺伝子特異的プライマーを設計し、そしてブタ肝臓由来のＥＳＴ配列に同一であるｐＬＳＥＣｔｉｎのｃＤＮＡの完全なコード領域を含有する９０９ｂｐフラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲによって首尾よく増幅した（図１３）。微量のフラグメントにより、膜貫通ドメイン（８０７ｂｐ）を欠くもう１つのｐＬＳＥＣｔｉｎアイソフォームも同定されたことが表された（図１３）。これらの２つのアイソフォーム以外に、一連のより高分子量のバンドが増幅された（図１３）が、これは、スプライシング中のｐＬＳＥＣｔｉｎプレｍＲＮＡの中間産物として認識される（以下の考察を参照のこと）。ブタゲノムプロジェクトの公開ドラフト集成体において利用可能でないｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子（２７２１ｂｐ）もまた、ＰＣＲプライマーの同じ対によるゲノムＰＣＲに従って、クローニングした（図１３）。
【０１６９】
図１４ａに例示されるように、ｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子は、エキソン１および９のサイズが決定されていない遺伝子の完全なコード領域にわたる９つのエキソンによってコードされた。すべての９つのエキソンの配列は、クローニングされた９０９ｂｐのｃＤＮＡならびにｐＬＳＥＣｔｉｎ  ＥＳＴの配列に完全に同一であり、遺伝子の確実性が示された。８つのイントロンのサイズは１１０〜３２０ｂｐで変動し、そしてイントロン上のすべてのアクセプターおよびドナー配列は、ＧＴ−ＡＧ規則に従った。他のＩＩ型のＣ型レクチンと同様に、ｐＬＳＥＣｔｉｎの推定コード領域は、アミノ末端からカルボキシル末端までの４つのドメイン、ＣＴ、ＴＭＤ、ネックおよびＣＲＤをコードする（図１４ｂ）。エキソン１の３’末端およびエキソン２の５’末端は、ＣＴをコードする。エキソン２の残りの部分は、ＴＭＤをコードする。ネック領域は、エキソン３〜６の全体およびエキソン７の最初の５ヌクレオチドにわたる。エキソン７の残りの部分、エキソン８全体およびエキソン９の５’末端は、ＣＲＤをコードする（図１４ａ）。
【０１７０】
ｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子とゲノムデータベースから利用可能な他の推定哺乳動物ＬＳＥＣｔｉｎ相同体との比較：ｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子は、４つのドメインの対応するエキソンへの局在を含む、９つのエキソンの類似の構造およびサイズを、ヒトならびに推定ウシ、イヌ、マウスおよびラットＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子と共有する（図１８）。本発明の目的のためにウマＬＳＥＣｔｉｎ１〜３と命名された３つのＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子相同体が、ウマゲノムデータベースにおいて見出された。ウマＬＳＥＣｔｉｎ１およびＬＳＥＣｔｉｎ２はまた、同じ遺伝子構造を伴う９つのエキソンを有するが、ウマＬＳＥＣｔｉｎ３だけは、８つのエキソンを含有する。通常の（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）９エキソン含有ＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子の２つのネックドメインをコードするエキソン（ｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子に対応するエキソン３および４）を１つのエキソンに融合することによって、ウマＬＳＥＣｔｉｎ３において１つのエキソンが失われる。同様に、通常の９エキソン含有ＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子のエキソン３および４を１つのエキソンに融合することにより、推定ヒトＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子に存在する合計で８つのエキソンが生じた。しかし、ヒト偽遺伝子のタンパク質をコードする能力の消失は、チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子と共に、提示された開始コドンＡＴＧにおける点変異（ＧからＡ）によるものである（図１５）。２つのアカゲザルＬＳＥＣｔｉｎ相同体、ＬＳＥＣｔｉｎ１およびＬＳＥＣｔｉｎ２を、ゲノム配列決定データに基づいて推定した。しかし、９つのエキソンが存在するにもかかわらず、相同体のいずれも、エキソン３における１ｎｔ挿入（ＬＳＥＣｔｉｎ１の場合）またはエキソン５における１ｎｔ欠失（ＬＳＥＣｔｉｎ２の場合）（偽遺伝子としても認識されている）により、ＣＲＤ欠失を伴うカルボキシル末端短縮型タンパク質産物をコードする（図１５）。
【０１７１】
２つのアカゲザルＬＳＥＣｔｉｎ偽遺伝子を除いて、すべての同定されたＬＳＥＣｔｉｎ相同体は、ＣＲＤが常に最後の３つのエキソンにわたる重要な構造的特徴を共有する。これまでに同定された哺乳動物におけるＤＣ−ＳＩＧＮ相同体は、同じ特徴を有する。
【０１７２】
ｍＶＩＳＴＡプログラムを使用するｐＬＳＥＣｔｉｎのゲノム配列とウシ、イヌ、ウマ、ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マウス、ラット、オポッサムまたはカモノハシとの一対比較により、エキソン（特に、ＣＲＤをコードする最後の３つのエキソン）およびイントロン（特に、イントロン１、３、５、６および８）配列の両方における有意な保存が、家畜および霊長類由来のｐＬＳＥＣｔｉｎおよびＬＳＥＣｔｉｎ相同体の間に存在することが示された（図１５）。ｐＬＳＥＣｔｉｎおよびげっ歯類ＬＳＥＣｔｉｎ相同体の間では、エキソン配列においてそれほど保存が認められない一方、オポッサムおよびカモノハシＬＳＥＣｔｉｎでは、保存が最も少ない。ｐＬＳＥＣｔｉｎとｐＤＣ−ＳＩＧＮとの間では、有意な同一性が認められなかった（図１５）。
【０１７３】
ＬＳＥＣｔｉｎ  ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）における複数種保存性マイクロＲＮＡ標的配列の推定によるｐＬＳＥＣｔｉｎコード産物の配列および系統解析：１，３２７ｂｐのｐＬＳＥＣｔｉｎ  ｃＤＮＡは、ｎｔ１０位または３７位において、それぞれ２つのインフレームの開始コドンＡＴＧを有する（図１４ｂ）。対応する位置で最初のＡＴＧを含まない他のＬＳＥＣｔｉｎ相同体と比較して、推定ｐＬＳＥＣｔｉｎタンパク質は、第２のインフレームＡＴＧで開始することが推定され、そして２９０個のアミノ酸のタンパク質をコードする８７３個のヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を包含する（図１４ｂ）。ブタＬＳＥＣｔｉｎタンパク質は、２８ａａの細胞質尾部から開始して、後方に推定２２ａａのＴＭＤが続く推定ＩＩ型膜貫通タンパク質である。細胞外ドメインは、１１１ａａのネック領域、その後に続く、１２９ａａのＣＲＤからなる（図１７ｂ）。２つの潜在的な内在化モチーフ、ａａ６位〜９位および１４位〜１５位におけるＹＳＫＷおよびＥＥが、ヒト、チンパンジー、ウシ、ヒツジおよびイヌＬＳＥＣｔｉｎにおいて保存されているＣＴ内で見出された。変異誘発分析により、ｈＬＳＥＣｔｉｎの内在化能力が、両方のモチーフの完全性に依存的であることが示された。ウマＬＳＥＣｔｉｎ１および３、マウス、ラットおよび２つのカモノハシＬＳＥＣｔｉｎ相同体はまた、潜在的内在化シグナルとしてチロシンベースのモチーフを有する。ｈＬＳＥＣｔｉｎのネック領域は、２つの潜在的なＮ−結合型グリコシル化部位を含有し、そしてα−ヘリックスコイル状構造を形成することが予想される典型的な７残基反復パターンを有する。また、最近の研究により、ｈＬＳＥＣｔｉｎは、ネック領域における２システイン残基によるジスルフィド結合二量体として存在することが表された（A. S. Powlesland et al., “A novel mechanism for LSECtin binding to Ebola virus surface glycoprotein through truncated glycans,” J. Biol. Chem. 283(1):593-602 (2008)）。これらのすべての特徴は、ｐＬＳＥＣｔｉｎ、ならびにウマＬＳＥＣｔｉｎ３、オポッサムおよびカモノハシＬＳＥＣｔｉｎを除く他の哺乳動物ＬＳＥＣｔｉｎにおいて同一である。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ、Ｌ−ＳＩＧＮ、非ヒト霊長類ＤＣ−ＳＩＧＮおよびマウスＳＩＧＮＲ１は、ネック領域内に可変反復配列を含有するが、ＳＩＧＮＲ２およびＳＩＧＮＲ６を除く残りのマウスＳＩＧＮＲメンバーは、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌおよびウマＤＣ−ＳＩＧＮと共に、反復配列を有さないことが先に見出されている。データから、ＬＳＥＣｔｉｎファミリーメンバーのネック領域の進化は、ＤＣ−ＳＩＧＮファミリーメンバーの進化ほど相違しないことが示唆された。
【０１７４】
ｐＬＳＥＣｔｉｎのＣＲＤは、Ｃａ２＋−および炭水化物−結合部位を形成する重要な残基を含有するブタおよび他のすべてのＬＳＥＣｔｉｎ相同体タンパク質と共有する最も保存された領域であった。ジスルフィド結合を形成することが推定された８つの保存されたシステインが、余分な１１９ａａの尾部を有するオポッサムＬＳＥＣｔｉｎ１を除いて、すべてのＬＳＥＣｔｉｎ相同体のＣＲＤにおいて見出された。すべてのＬＳＥＣｔｉｎならびにＤＣ−ＳＩＧＮファミリーメンバーは、カルシウム−結合部位２について、５つの保存アミノ酸残基、Ｇｌｕ２６０、Ａｓｎ２６２、Ａｓｎ２６８、Ａｓｎ２８０およびＡｓｐ２８１（ｐＬＳＥＣｔｉｎに対応するａａ位置）、ならびにマンノース−、フコース−またはガラクトース−含有オリゴ糖に結合するのに極めて重要な共通のＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ配列（ＥＰＮ配列；ａａ２６０位〜２６２位）を所有する。しかし、カルシウム−結合部位１を形成する４つの残基（ａａ２３３位、２３７位、２６３位および２６９位）のうちの３つは、ＬＳＥＣｔｉｎファミリーメンバーにおいて独特である。すべての胎盤哺乳動物のＬＳＥＣｔｉｎは、ａａ２３３においてＤＣ−ＳＩＧＮと異なる独特なＡｌａ残基を共有するが、ａａ２３７の残基は、ＬＳＥＣｔｉｎ相同体間で可変的である。すべてのＬＳＥＣｔｉｎメンバーは、ａａ２６３において保存されたＡｓｎ残基の代わりにＡｓｐ残基を共有する。Ｃ型レクチンの保存されたＡｓｐ２６９は、ＬＳＥＣｔｉｎタンパク質のほとんどにおいて同一であるが、ヒトおよびチンパンジーＬＳＥＣｔｉｎならびにオポッサムＬＳＥＣｔｉｎ１ではＡｓｎ残基によって置換される。加えて、すべての哺乳動物ＬＳＥＣｔｉｎタンパク質および胎盤哺乳動物ＬＳＥＣｔｉｎは、それぞれ、ＣＲＤの９および２９個の独特な残基を共有する。これらの独特な置換は、ＬＳＥＣｔｉｎファミリーメンバーが、異なる糖結合親和性を有することが予想されることを示唆する。
【０１７５】
最近、ヒトＬＳＥＣｔｉｎは、ＥＰＮモチーフを介して新規の二糖（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎ）および２つの付近の残基Ｇｌｙ２５９およびＴｒｐ２６５に結合することが示された（Powlesland et al., 2008、上掲）。ＧｌｃＮＡｃ残基とＴｒｐ２６５の側鎖との間の接触は、ＧｌｃＮＡｃのＮ−アセチル置換基のメチル基に対するトリプトファンのインドール環のパッキングによって仲介されることが予測された（同上）。しかし、Ｇｌｙ２５９は、すべてのＬＳＥＣｔｉｎタンパク質において保存されているが、チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎのみは、ｈＬＳＥＣｔｉｎとＴｒｐ２６５を共有する。この位置の残基は、他のＬＳＥＣｔｉｎタンパク質の間で可変である：ｐＬＳＥＣｔｉｎにおけるＬｅｕ、ウシ、ヒツジおよびイヌＬＳＥＣｔｉｎにおけるＭｅｔ、および３つのウマＬＳＥＣｔｉｎにおけるＧｌｎ。
【０１７６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにおける不完全に相補的な部位に結合する小さな（約２２ｎｔ長）内因性非コードＲＮＡのクラスであり、それ故、ｍＲＮＡ発現を抑制する（D. P. Bartel, “MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function,” Cell 116(2):281-97 (2004)；B. R. Cullen, “Transcription and processing of human microRNA precursors,” Mol. Cell 16(6):861-5 (2004)）。多細胞生物およびいくつかのウイルス由来の異なる数千のｍｉＲＮＡが同定されており、そしてほとんどすべての生物学的プロセスを調節すると考えられる組織特異的および発達段階特異的発現の両方を有することが示されている。３分の１を超えるヒト遺伝子は、マイクロＲＮＡによって制御され得ることが推定されている（同上）。ＭｉＲＮＡにより仲介される抑制には、しばしば、ｍｉＲＮＡシード領域（ｍｉＲＮＡ５’−末端からｎｔ２〜７）のｍＲＮＡ標的配列の３’−ＵＴＲへの完全な塩基対形成が必要である（Bartel, 2004、上掲；Cullen, 2004、上掲）。ｍｉＲＮＡおよびそれらの３’−ＵＴＲ結合部位の両方とも、多くの場合進化保存性である。これまで、機能的Ｃ型レクチンの発現が、ｍｉＲＮＡ調節と関連付けられることはなかった。異なる哺乳動物ＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子由来の３’−ＵＴＲ配列について利用可能な情報により、複数の哺乳動物種間で保存されているｍｉＲＮＡ標的配列が存在するかどうかを調べるための実験を案出した。
【０１７７】
ＴａｒｇｅｔＳｃａｎプログラムを使用して、ポリアデニル化シグナル（ＡＡＵＡＡＡ）の２７ｎｔ上流に局在する独特な部位を、イヌｍｉＲＮＡ  ｃｆａ−ｍｉＲ−３５０の標的であることが推定されている推定イヌＬＳＥＣｔｉｎ  ｍＲＮＡに見出した。この部位上の７ｎｔ配列ＵＵＵＧＵＧＡは、ブタ、ウシおよびヒツジＬＳＥＣｔｉｎならびに２つのウマ相同体ＬＳＥＣｔｉｎ１および３間で完全に保存されていた。３’−ＵＴＲにおける他の保存配列は、６ｎｔ未満であることが観察され、ｍｉＲＮＡシード領域の提示された完全な塩基対形成を満たさなかった。ブタ、ウシ、ヒツジおよびウマにおけるｍｉＲ−３５０相同体は、ｍｉＲＢａｓｅから利用することはできないが、それらは、進化保存性により同一の配列を有するはずである。興味深いことに、ｈＬＳＥＣｔｉｎ  ｍＲＮＡの同じ位置の８ｎｔ配列ＡＡＣＵＧＧＡＡもまた、ヒトｍｉＲＮＡ  ｈａｓ−ｍｉＲ−１４５の標的であった。この独特な配列は、チンパンジーＬＳＥＣｔｉｎおよびウマＬＳＥＣｔｉｎ２にも存在するが、他の霊長類偽遺伝子には存在しない。げっ歯類および非胎盤性ＬＳＥＣｔｉｎメンバーでは、同じ部位を認識する特異的ｍｉＲＮＡが認められなかったが、これはおそらく、これらの種のｍｉＲＮＡについて、ｍｉＲＢａｓｅから利用することができるデータが限られていたためである。家畜および霊長類由来のＬＳＥＣｔｉｎメンバーの位置保存性および複数種保存性ｍｉＲＮＡ標的配列のコンピュータに基づく同定は、ＬＳＥＣｔｉｎの潜在的なｍｉＲＮＡ仲介調節の機構を理解するのに有用である。
【０１７８】
それ故、哺乳動物種において利用可能なすべてのＤＣ−ＳＩＧＮ、ＬＳＥＣｔｉｎおよびＣＤ２３ファミリーメンバーの全長コードタンパク質の系統解析を実施して、それらの相違レベルおよび進化関係を決定した。それらを、ＬＳＥＣｔｉｎファミリーが、ＣＤ２３ファミリーよりＤＣ−ＳＩＧＮファミリーに緊密に関連する３つの個々のクラスターに分けた。ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマおよびイヌを含む家畜のＬＳＥＣｔｉｎが、共にクラスター化されたが、これは、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＣＤ２３タンパク質の進化の関係に類似する。
【０１７９】
スプライシング中間産物の同定およびｐＬＳＥＣｔｉｎプレｍＲＮＡのイントロンの取り出しの提示された順序：ブタ肝臓由来のｐＬＳＥＣｔｉｎ  ｃＤＮＡのコード領域を増幅した場合、予想された成熟ｍＲＮＡに加えて、一連の高分子量フラグメントの出現によって特徴付けられたｐＬＳＥＣｔｉｎプレｍＲＮＡの可能なプロセシングが観察された（図１３ａ）。これらのフラグメントのそれぞれを切り出し、そしてＴ−Ａクローニングして、それぞれの配列を決定した。これらの転写物は、決定されたｐＬＳＥＣｔｉｎ遺伝子（２７２１ｂｐ）と比較して、様々なイントロンを保持するそれぞれ１７０７、１４９１、１３８１および１１７６ｂｐのサイズを有するｐＬＳＥＣｔｉｎ  ｍＲＮＡ前駆体のスプライシング中間産物であることが判明した。これらのスプライシング中間産物のイントロンの取り出しに基づいて、ｐＬＳＥＣｔｉｎプレｍＲＮＡのスプライシング経路の時間的順序を提示した（図１６）。最初に、イントロンＡ、Ｅ、ＧおよびＨは、同時か、またはＲＴ−ＰＣＲ結果からは推定され得ない順序のいずれかで取り出されて、１７０７ｂｐの中間産物を生じたようであり、最後の３つのエキソンによってコードされたＣＲＤならびに最初の２つのエキソンによってコードされたＣＴが完全な状態でもたらされた。１７０７ｂｐの中間体のさらなるプロセシングは、イントロンＦのスプライシングによって１４９１ｂｐのプレｍＲＮＡを生成する。その後のイントロンＤの取り出しによって、１３８１ｂｐであるｍＲＮＡが生じる。イントロンＣは、この時点でスプライシングされて、イントロンＢのみを保持する１１７６ｂｐのプレｍＲＮＡを生じるようである。９０９ｂｐの産物として検出される成熟ｐＬＳＥＣｔｉｎ  ｍＲＮＡは、イントロンＢの取り出しによって生成される。ネック領域をコードするｐＬＳＥＣｔｉｎエキソンのプロセシングは、３’側のエキソンＥから５’側のエキソンＢまで、関連イントロンの１つずつのスプライシングによる厳密な時間的および位置の順序に従うようである。さらに加えて、エキソン２が、成熟ｍＲＮＡ産物から取り出されて、ＴＭＤを欠く８０７ｂｐのアイソフォームを生じる。あるいは、エキソン２およびイントロンＢは共に連結しているため、アイソフォームは、１１７６ｂｐのプレｍＲＮＡからのそれらの同時スプライシングによって、作製され得る（図１６）。
【０１８０】
スプライシング経路の時間的順序は、スプライシング中間産物の量がＲＴ−ＰＣＲによって検出され得、それ故、スプライシング中間産物がすべての中間産物の大部分を占めたことを示すレベルに到達した事実に基づいて、提示した。検出は、インビボでこれらのプレｍＲＮＡのプロセシング経路を正確に反映させるために、肝臓で行った。ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮのような他のＣ型レクチンにおいてもまた、ここで観察されるＴＭＤおよびネック領域より先にＣＲＤおよびＣＴドメインをコードするエキソンのプロセシングが存在し得るかどうかについては、未だ明らかになっていない。これまでに同定された既知のＤＣ−ＳＩＧＮ／Ｌ−ＳＩＧＮ  ｍＲＮＡならびにｈＬＳＥＣｔｉｎアイソフォームは、ＴＭＤをコードするエキソンがスキッピングされるおよび／またはネック領域をコードするエキソン上に不明なスプライシング部位が存在するため、ＴＭＤを欠くかまたは部分的タンデム−ネック反復を欠く変異体として存在する（A. Dominguez-Soto et al., “The DC-SIGN-related lectin LSECtin mediates antigen capture and pathogen binding by human myeloid cells,” Blood 109(12):5337-45 (2007)；S. Mummidi et al., “Extensive repertoire of membrane-bound and soluble dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin 1 (DC-SIGN1) and DC-SIGN2 isoforms. Inter-individual variation in expression of DC-SIGN transcripts,” J. Biol. Chem. 276(35):33196-212 (2001)）。このことは、後のスプライシング事象中に、異なるパターンの異常なスプライシングが発生する点で、スプライシングの時間的順序に関連し得る。さらに、Ｌ−ＳＩＧＮの変異体ネック領域タンデム反復は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＨＩＶ−１、ＨＣＶおよびヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のようないくつかの感染性疾患の感染性に関連している（U. S. Khoo et al., “DC-SIGN and L-SIGN: the SIGNs for infection,” J. Mol. Med. 86(8):861-74 (2008)）。ドナー／アクセプター部位の「品質」、スプライスエンハンサーもしくはサプレッサー、ＲＮＡ二次構造またはイントロンおよびエキソンのサイズを含む他の因子もまた、イントロンの取り出しの順序を制御するのに寄与し得る（A. L. Lear et al., “Hierarchy for 5' splice site preference determined in vivo,” J. Mol. Biol.  211(1):103-15 (1990)；B. L. Robberson et al., “Exon definition may facilitate splice site selection in RNAs with multiple exons,” Mol. Cell Biol. 10(1):84-94 (1990)；A. J. McCullough and S. M. Berget, “G triplets located throughout a class of small vertebrate introns enforce intron borders and regulate splice site selection,” Mol. Cell Biol. 17(8):4562-71 (1997)）。ｐＬＳＥＣｔｉｎプレｍＲＮＡの連続スプライシング中間産物のインビボでの同定は、スプライシング機構が、Ｃ型レクチンにおいてイントロンが順番に取り出されることを確実にするために、スプライス部位の正確な対を選択する仕方について、およびこれらが病原体との相互作用に関連し得るかどうかについて研究するための良好なモデルを提供し得る。
【０１８１】
ｐＬＳＥＣｔｉｎの組織分布：ｐＬＳＥＣｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ブタの脾臓、リンパ節および肝臓において検出されたが、十二指腸、胸腺、腎臓、肺、心臓、骨髄または骨格筋では検出されなかった（図１７）。リンパ節の発現レベルが最も高かった。ｈＬＳＥＣｔｉｎは、ＬＳＥＣにおいてだけではなく、単球由来マクロファージおよび樹状細胞（W. Liu et al., “Characterization of a novel C-type lectin-like gene, LSECtin: demonstration of carbohydrate binding and expression in sinusoidal endothelial cells of liver and lymph node,” J. Biol. Chem. 279(18):18748-58 (2004)；Dominguez-Soto et al., 2007、上掲）、リンパ節および骨髄類洞（T. Gramberg et al., “Interactions of LSECtin and DC-SIGN/DC-SIGNR with viral ligands: Differential pH dependence, internalization and virion binding,” Virology 373(1):189-201 (2008)）においても発現されることが報告されている。しかし、ｈＬＳＥＣｔｉｎ発現は、末梢血リンパ球、ＮＫ細胞、ＣＤ３４＋由来内皮様細胞（Dominguez-Soto et al., 2007、上掲）、肝クッパー細胞、胸腺または胎盤（Gramberg et al., 2008、上掲）では認められなかった。その時点で、ｐＬＳＥＣｔｉｎ発現は、ｈＬＳＥＣｔｉｎと類似のパターンを共有することが観察された。
【０１８２】
上記において、限定ではなく例示の目的のために、本発明の特定の実施形態の詳細な説明を提供してきた。本開示に基づいて当業者に明らかな他のすべての変更、派生物および均等物は、本発明の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることが理解されるべきである。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図１（ｃ）】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図３（ｃ）】
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【図３（ｄ）】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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【図７（ｃ）】
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【図７（ｄ）】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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