(57)【要約】  本発明は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子を同定する方法であって、（ｉ）ＧＡＰドメインを含むＧＲＡＦタンパク質を提供するステップ、（ii）候補調節因子を提供するステップ、及び（iii）前記ＧＲＡＦタンパク質のＧＡＰ活性に対する前記候補調節因子の効果を決定するステップを含み、前記候補調節因子の存在下における前記ＧＲＡＦタンパク質のＧＡＰ活性における変化により、前記候補調節因子が、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子として同定される方法に関する。本発明はまた、ＧＲＡＦタンパク質及びＧＲＡＦ調節因子の製造の方法にも関する。
2011514154.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子を同定する方法であって、
（ｉ）ＧＡＰドメインを含むＧＲＡＦタンパク質を提供するステップ、
（ii）候補調節因子を提供するステップ、及び
（iii）前記ＧＲＡＦタンパク質のＧＡＰ活性に対する前記候補調節因子の効果を決定するステップを含み、
前記候補調節因子の存在下における前記ＧＲＡＦタンパク質のＧＡＰ活性における変化により、前記候補調節因子が、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子として同定される方法。
【請求項２】
（ｉ）ＧＡＰドメインを含む、ＧＲＡＦタンパク質の第１及び第２の試料を提供するステップ、
（ii）候補調節因子を提供するステップ、
（iii）前記ＧＲＡＦタンパク質の第２の試料を、前記候補調節因子と接触させるステップ、
（iv）前記ＧＲＡＦタンパク質の第１及び第２の試料のＧＡＰ活性をアッセイして、前記ＧＲＡＦタンパク質のＧＡＰ活性に対する前記候補調節因子の効果を決定するステップを含み、
前記ＧＲＡＦタンパク質の第１及び第２の試料の間におけるＧＡＰ活性の差異により、前記候補調節因子が、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子として同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＡＰ活性が、第１の試料よりも第２の試料において高い場合、候補調節因子が、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの刺激因子又は促進因子として同定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＧＡＰ活性が、第１の試料よりも第２の試料において低い場合、候補調節因子が、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの阻害因子又は抑制因子として同定される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＧＡＰ活性が、基質ＧＴＰアーゼとしてＲｈｏＡを使用してアッセイされる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＧＡＰ活性のアッセイが、ｔａｍｒａ−ＧＴＰ加水分解アッセイを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＧＲＡＦタンパク質が、少なくとも２００個のアミノ酸残基のポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、ヒトＧＲＡＦ１のアミノ酸配列３６４〜５６３に対して少なくとも６０％の同一性を有するＧＲＡＦ  ＧＡＰドメインを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドが、ヒトＧＲＡＦ１の少なくともアミノ酸３６４〜５６３に相当するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
エンドサイトーシスアッセイを実行するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
接着アッセイを実行するステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
選択性アッセイを実行するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
インビトロにおいてＦＡＫ活性の調節因子をアッセイするステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
インビトロにおいてＧＲＡＦ  ＲｈｏＧＡＰ活性の調節因子をアッセイするステップをさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
インビトロにおいてＧＲＡＦ−ＦＡＫ相互作用の調節因子をアッセイするステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細胞におけるＧＲＡＦ分布の変化をアッセイするステップをさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
インビボにおいてエンドサイトーシス経路に特異的な調節因子をアッセイするステップをさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ＧＲＡＦ１タンパク質の第３の試料のＧＡＰ活性に対する比較をさらに含み、前記第３の試料が、ヒトＧＲＡＦ１のＲ４１２Ｄ突然変異に相当する、そのＧＡＰドメインにおける突然変異を持つＧＲＡＦタンパク質を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
クラスリン非依存性エンドサイトーシスの、同定された調節因子を大量に製造するステップをさらに含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
免疫抑制のための医薬の製造における、請求項１〜１８のいずれかの方法によって同定されるクラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子の使用。
【請求項２０】
癌のための医薬の製造における、請求項１〜１９のいずれかの方法によって同定されるクラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子の使用であって、前記癌が細胞悪性固形腫瘍である使用。
【請求項２１】
ヒトＧＲＡＦ１のアミノ酸４１２に相当するアミノ酸残基に突然変異を含むＧＲＡＦポリペプチド。
【請求項２２】
Ｒ４１２突然変異がＲ４１２Ｄである、請求項２１に記載のＧＲＡＦポリペプチド。
【請求項２３】
ＧＲＡＦポリペプチドが、Ｒ４１２Ｄ突然変異と共にヒトＧＲＡＦ１のアミノ酸配列を含む、請求項２１又は２２に記載のＧＲＡＦポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子顕微鏡の出現と共に、ヒト細胞の解剖学的構造の並外れた複雑性が認識されるようになった。重要なことには、これは、研究者らが、各細胞中に存在する膜のネットワークを可視化することを可能にした。各ヒト細胞は、形質膜（plasma membrane）として知られている外膜に加えて、多くの内膜を共に有する。この形質膜は、空間における細胞の範囲を規定し、細胞の内部及びその外部環境の間の障壁として機能する。細胞がその環境と相互作用するのは形質膜においてである。これらの種々の相互作用は、この膜を構成する脂質と結合する又はそれを貫通するタンパク質によって媒介される。これらの重要な相互作用をコントロールするために、形質膜のタンパク質成分及び脂質成分の両方は、正確に調節されなければならない。エンドサイトーシスは、完全に、内膜が、形質膜の領域から新規に作製されるプロセスである。エンドサイトーシスにおいて、脂質及び脂質結合タンパク質は、細胞の中に完全に内部移行（internalize）される。エンドサイトーシスは、数秒又は数分以内に生じ得る、そのため、形質膜の組成を速やかに変化させることができる。エンドサイトーシスが起こるためには、形質膜は、最初に、適切な部位でくぼみをつけられなければならず、このくぼみは、形質膜陥入として知られている。形質膜は、相対的に平らな構造をしているが、陥入した膜は、非常に曲がっている。エンドサイトーシスによる陥入は、細胞タンパク質によって、能動的に生じさせられ、維持されなければならない。数十年間、エンドサイトーシスについての研究は、主として、クラスリンと呼ばれるタンパク質によって媒介されるただ１つのエンドサイトーシス経路（クラスリン媒介性エンドサイトーシス）に集中してきた。クラスリンは、この経路の内部移行している途中の膜のまわりにかご状の格子を形成する。クラスリン及びクラスリン媒介性エンドサイトーシスに関与する多数の他のタンパク質が、機能的なエンドサイトーシスイベントをどのようにもたらすかについて、多くのことが知られている。クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、確かに、重要なエンドサイトーシスメカニズムであるが、クラスリンに非依存性であるのみならず、形態学的に別個である他のエンドサイトーシスメカニズムが存在することが、最近明らかになった。少数の重要な例外はあるが、エンドサイトーシスのこれらのモードについての研究は、内部移行している膜を特異的にマークし、これらの経路が機能するのに必要であるタンパク質に関する知識の不足によって著しく妨げられてきた。いくつかのタンパク質が、これらのプロセスに極度に関係してきたが、クラスリン非依存性のエンドサイトーシスのメカニズムは、不明であり、これは、当技術分野における課題となっている。
【背景技術】
【０００２】
細胞遊走及び癌細胞浸潤の阻害に対して知られているアプローチは、むしろ非特異的であり、多くの経路に干渉する。
【０００３】
知られている技術には、タンパク質除去又は微小管脱重合などの破壊的技術に依存しない、クラスリン非依存性エンドサイトーシス経路を阻害するための方法がない。これは、当技術分野における課題となっている。
【０００４】
本発明は、浸潤性固形臓器悪性腫瘍の治療のための医学的適用及び特異的な免疫抑制のための医学的適用を含む、多数の医学的適用を包含する。これらのそれぞれについて知られている治療は、現在、多種多様であるが、大部分は、多くの副作用を伴う、急速に分裂する細胞の増殖の阻害に依存し、めったに治効がなく、これは、当分野における深刻な弱点となっている。
【０００５】
クラスリン非依存性エンドサイトーシス、細胞骨格、接着部位のターンオーバー、及び細胞遊走は、それぞれ、現在、乱雑な分野となっている。これらの分野は、複雑に関連づけられており、相互に依存している。これらの問題は、これらの分野における分子イベントに関する研究及び分析における課題を産み出すものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、先行技術と関連する課題を克服しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＧＲＡＦタンパク質及びクラスリン非依存性エンドサイトーシスの間の関係並びに細胞遊走などの、このプロセスに依存する又はそれによってコントロールされる種々の生物学的イベントを、初めて、本明細書において開示する。さらに、本発明者らは、これらの重要な細胞プロセスの協調におけるＧＲＡＦタンパク質（ＧＲＡＦ１タンパク質など）にとっての特異的な生物学的役割を開示する。さらに、本発明者らは、続いて、ＧＲＡＦ  ＧＡＰドメインが、これらのイベントの協調の中心であるという注目すべき発見を開示する。本発明は、これらの発見に基づくものである。
【０００８】
したがって、一態様において、本発明は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子を同定する方法であって、ＧＡＰドメインを含むＧＲＡＦタンパク質を提供するステップ、候補調節因子を提供するステップ、及び前記ＧＲＡＦタンパク質のＧＡＰ活性に対する前記候補調節因子の効果を決定するステップを含み、前記候補調節因子の存在下における前記ＧＲＡＦタンパク質のＧＡＰ活性における変化により、前記候補調節因子が、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子として同定される方法を提供する。
【０００９】
他の態様において、本発明は、上記の方法であって、ＧＡＰドメインを含む、ＧＲＡＦタンパク質の第１及び第２の試料を提供するステップ、候補調節因子を提供するステップ、前記第２の試料のＧＲＡＦタンパク質を、前記候補調節因子と接触させるステップ、前記ＧＲＡＦタンパク質の第１及び第２の試料のＧＡＰ活性をアッセイすることによって、前記ＧＲＡＦタンパク質のＧＡＰ活性に対する前記候補調節因子の効果を決定するステップを含み、前記ＧＲＡＦタンパク質の第１及び第２の試料の間におけるＧＡＰ活性の差異により、前記の候補調節因子が、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子として同定される方法に関する。
【００１０】
上述の第１の試料は、参照試料と呼ばれてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、参照試料及び１又は複数の試験試料は、同時に処理されなくてもよい。たとえば、参照値を決定、保管してもよく、次いで、さらに、試験値を、方法の各反復において参照試料の分析を繰り返す労力を省くために、それらの保管された参照値と比較してもよい。明らかに、本発明による試験又は方法は、試料が、同時に、同じ条件下で、並行して処理される場合、最も科学的に確実なものとなる。したがって、好ましい実施形態において、少なくとも１つの参照試料は、本発明の方法の各反復で、比較目的のために処理される。
【００１１】
他の態様において、本発明は、上記に記載される方法であって、上述のＧＡＰ活性が、上述の第１の試料よりも上述の第２の試料において高い場合、候補調節因子が、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの刺激因子又は促進因子として同定される方法に関する。
【００１２】
他の態様において、本発明は、上記に記載される方法であって、上述のＧＡＰ活性が、上述の第１の試料よりも上述の第２の試料において低い場合、候補調節因子が、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの阻害因子又は抑制因子として同定される方法に関する。
【００１３】
適切には、上述のＧＡＰ活性は、基質ＧＴＰアーゼとしてＲｈｏＡを使用してアッセイされる。ＧＡＰ活性のアッセイに適した方法は、下記に論じられる。
【００１４】
適切には、上述のＧＲＡＦタンパク質は、少なくとも２００個のアミノ酸残基のポリペプチドを含み、上述のポリペプチドは、ヒトＧＲＡＦ１のアミノ酸配列３６４〜５６３に対して少なくとも６０％の同一性（identity）を有するＧＲＡＦ  ＧＡＰドメインを含む。適切には、上述のポリペプチドは、ヒトＧＲＡＦ１の少なくともアミノ酸３６４〜５６３に相当するアミノ酸配列を含む。
【００１５】
他の態様において、本発明は、エンドサイトーシスアッセイを実行するステップをさらに含む、上記に記載される方法に関する。
【００１６】
他の態様において、本発明は、接着アッセイを実行するステップをさらに含む、上記に記載される方法に関する。
【００１７】
他の態様において、本発明は、選択性アッセイを実行するステップをさらに含む、上記に記載される方法に関する。
【００１８】
他の態様において、本発明は、インビトロにおいてＦＡＫ活性の調節因子をアッセイするステップをさらに含む、上記に記載される方法に関する。
【００１９】
他の態様において、本発明は、インビトロにおいてＧＲＡＦ  ＲｈｏＧＡＰ活性の調節因子をアッセイするステップをさらに含む、上記に記載される方法に関する。
【００２０】
他の態様において、本発明は、インビトロにおいてＧＲＡＦ−ＦＡＫ相互作用の調節因子をアッセイするステップをさらに含む、上記に記載される方法に関する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、細胞におけるＧＲＡＦ分布の変化をアッセイするステップをさらに含む、上記に記載される方法に関する。
【００２２】
他の態様において、本発明は、インビボにおいてエンドサイトーシス経路に特異的な調節因子をアッセイするステップをさらに含む、上記に記載される方法に関する。
【００２３】
他の態様において、本発明は、ＧＲＡＦ１タンパク質の第３の試料のＧＡＰ活性に対する比較をさらに含み、前記第３の試料が、ヒトＧＲＡＦ１のＲ４１２Ｄ突然変異に相当する、そのＧＡＰドメインにおける突然変異を持つＧＲＡＦタンパク質を含む、上記に記載される方法に関する。
【００２４】
他の態様において、本発明は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの、大量の同定された調節因子を製造するステップをさらに含む、上記に記載される方法に関する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、免疫抑制のための医薬の製造における、上記に記載される方法によって同定されるクラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子の使用に関する。
【００２６】
他の態様において、本発明は、癌のための医薬の製造における、上記に記載される方法によって同定されるクラスリン非依存性エンドサイトーシスの調節因子の使用であって、上述の癌が細胞悪性固形腫瘍（solid cell malignancy）である使用に関する。
【００２７】
他の態様において、本発明は、ヒトＧＲＡＦ１のアミノ酸４１２に相当するアミノ酸残基に突然変異を含むＧＲＡＦポリペプチドに関する。適切には、上述のＲ４１２突然変異は、Ｒ４１２Ｄである。適切には、上述のＧＲＡＦポリペプチドは、Ｒ４１２Ｄ突然変異と共にヒトＧＲＡＦ１のアミノ酸配列を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ＧＲＡＦ１は、細菌内毒素、ＧＰＩ連結タンパク質、及び細胞外液を含む因子の内部移行を担う主なクラスリン非依存性エンドサイトーシス経路を調節し、細胞遊走における中心の、調節性の役割を有する。
【００２９】
多くの膜再分布は、遊走、分化、細胞質分裂、及び樹状突起分枝（dendritic arborisation）を受ける細胞において生じる形態学的変化に必要である。接着斑キナーゼ−１と関連するＧＴＰアーゼ制御因子（ＧＲＡＦ１，GTPase Regulator Associated with Focal Adhesion Kinase-1）は、タンパク質のオリゴフレニン（oligophrenin）ファミリーの脳に豊富なメンバーである。オリゴフレニンは、正常な樹状突起棘の形態に必要であり、このタンパク質における突然変異は、Ｘ連鎖性非症候性精神遅滞をもたらす。ここで、本発明者らは、ＧＲＡＦ１の主な相互作用タンパク質が、ダイナミンであり、ＧＲＡＦ１のＮ末端ＢＡＲドメイン及びＰＨドメインが、本質的に、エンドサイトーシスによるものであり、クラスリン非依存性である、動的な微小管依存性膜小管及びＲｈｏＡ依存性膜小管の形成を調節することを示す。ＧＲＡＦ１はまた、接着斑ターンオーバーに関係するタンパク質とも複合体を形成する。さらに、多くのＧＲＡＦ１陽性小管は、接着斑から発出し、ＧＲＡＦ１は、接着斑の解体において役割を果たす。ＧＲＡＦ１陽性小管は、線維芽細胞において広く用いられており、ＧＲＡＦ１媒介性の輸送は、ゴルジ体への志賀毒素のエンドサイトーシスによる輸送に、外因性物質のバルクフェーズ（bulk phase）取り込み及び膜の輸送に、並びに正常な細胞の形態維持及び遊走に不可欠である。これらの結果は、本発明者らが、オリゴフレニンにおける突然変異と関連する神経細胞表現型の分子的基盤及び線維芽細胞エンドサイトーシスにおける標準的なクラスリン依存性経路と同じくらい重要であるように思われる経路を特徴づける分子的基盤を理解するのを助ける。
【００３０】
本発明者らは、ＧＡＰドメイン含有タンパク質ＧＲＡＦ１が、接着受容体のエンドサイトーシスに関与し、接着斑キナーゼと協力して、このエンドサイトーシスを細胞遊走の調整に結びつけることを示す。ＧＲＡＦ１は、造血細胞において古典的な腫瘍抑制因子として作用し、それは、生存促進性／増殖促進受容体の形質膜濃度の増加をもたらす可能性が高い。しかしながら、固形臓器癌では、ＧＲＡＦ１及びＦＡＫがアップレギュレートされており、本発明者らは、このタンパク質が、細胞遊走にとって不可欠であり、これが、腫瘍細胞浸潤及び転移のプロセスの間に生じることを示した。類似する遊走プロセスは、免疫系のエフェクター細胞において生じる。
【００３１】
本発明者らは、ＧＲＡＦ１の機能をどのように阻害し（たとえばｓｉＲＮＡ処理によって）、どのように活性化する（たとえばＲｈｏエフェクターキナーゼの阻害によって）ことができるかを示した。本発明者らは、本発明者らが、たとえば動物モデルにおいて、細胞遊走を阻害する際のその有効性を研究することができるように、この経路の特異的な阻害因子の提供に取り組む。そのような薬剤は、抗浸潤剤としての有用性を有し、強力な免疫抑制剤であるのと同様に浸潤癌を治療するために使用されてもよい。
【００３２】
先行技術とは対照的に、本発明者らのＧＲＡＦタンパク質標的は、１つのプロセスと非常に特異的に関与し、本発明者らの証拠から、本発明者らの標的の特異的な阻害が、現在知られている療法よりも高い治療指数を有するであろうということを予想することは合理的である。
【００３３】
一般に、本明細書において言及される技術は、当技術分野においてよく知られているが、特に、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)及びAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4thEd, John Wiley & Sons, Inc.が参照されてもよい。
【００３４】
ＧＲＡＦタンパク質
用語「ＧＲＡＦタンパク質」及び「ＧＲＡＦポリペプチド」は、本明細書において区別なく使用される。これらの用語は、ＧＲＡＦファミリーのメンバーであり、適切には、ＧＲＡＦ１ファミリーのメンバーである（１又は複数の）ポリペプチドを指すために使用される。
【００３５】
ＧＲＡＦファミリー又はＧＲＡＦ１ファミリーのメンバーは、詳細に明らかにされている。たとえば、このファミリーに属するタンパク質は、配列相同性（配列同一性）及び他のＧＲＡＦファミリーメンバーと共通する、タンパク質内の特定のドメイン又はモチーフの存在に基づいて典型的に規定される。
【００３６】
図４及び図５は、４つのＧＲＡＦパラログの系統樹を示す（一方は生物で及び一方は受託番号で）。本発明が、これらのそれぞれを含むことに注意されたい。系統樹、特に受託番号の系統樹は−ＧＲＡＦタンパク質（たとえばＧＲＡＦ様タンパク質を含む）の規定を提供するものとして解釈されてもよく−いくつかの実施形態において、これらは、本発明によるＧＲＡＦタンパク質の規定を表してもよい。これらのＧＲＡＦタンパク質がすべて、異なる細胞型において類似する方法において機能することは、本発明の利点である。これらのＧＲＡＦタンパク質は、実施例の部においてより詳細に論じられる。
【００３７】
適切には、ＧＲＡＦタンパク質は、ＧＲＡＦ１に由来する又はそれに関するタンパク質を含む。ＧＲＡＦ１ファミリータンパク質の例は、ＧＲＡＦ１、ＧＲＡＦ２、ＯＰＨＮ１、及びＧＲＡＦ３を含む。適切には、本発明のＧＲＡＦタンパク質は、ＢＡＲドメイン含有タンパク質であり、より適切には、本発明のＧＲＡＦ１タンパク質は、ＧＲＡＦ１ファミリーメンバーである。ＧＲＡＦ１ファミリーメンバー及びそれらの特異的な特性は、より詳細に下記に論じられる。
【００３８】
本発明によるＧＲＡＦタンパク質は、ＧＲＡＦ１  ＧＡＰ、ＧＲＡＦ２  ＧＡＰ、ＧＲＡＦ３  ＧＡＰ、ＯＰＨＮ１  ＧＡＰ、Ｐ５０  ＧＡＰ、Ｐ１９０  ＧＡＰ、及びＡｂｒＧＡＰからなる群から選択されてもよい。本発明によるＧＲＡＦタンパク質は、その代わりに、１又は複数のそのようなタンパク質の配列を含んでいてもよい。
【００３９】
本発明の、ＧＲＡＦ１タンパク質などのＧＲＡＦタンパク質は、所望のその生化学的機能を示すために十分なサイズとするべきである。通常、これは、ＧＲＡＦ１タンパク質が、機能的ＧＡＰドメイン（そのように含まれるＧＡＰドメインが実際に機能的である場合）を含むのに十分な大きさでなければならないことを意味する。言いかえれば、適切には、本発明のＧＲＡＦタンパク質は、ＧＲＡＦ１ファミリーメンバーなどのＧＲＡＦファミリーメンバーの少なくともＧＡＰドメインに相当するアミノ酸配列を含む。ＧＡＰドメインは、特に本明細書において提供される教示と関連して当業者によって容易に同定される。しかしながら、万一それ以上の教示が必要とされる場合、ＧＲＡＦ１（ヒトＧＲＡＦ１）のアミノ酸残基３６４〜５６３にＧＲＡＦ１のｇａｐドメインが見つけられることに注意されたい。
【００４０】
適切には、本発明のＧＲＡＦタンパク質は、哺乳動物ＧＲＡＦタンパク質である。より適切には、本発明のＧＲＡＦタンパク質は、ヒトＧＲＡＦタンパク質であるか、ヒトＧＲＡＦタンパク質、適切にはヒトＧＲＡＦ１と関連して、必要とされる特徴を持つ。この点に関して、適切には、本発明のＧＲＡＦタンパク質は、ヒトＧＲＡＦ１を含む、ヒトＧＲＡＦ１からのアミノ酸配列を含む、又はヒトＧＲＡＦ１に関連して規定される若しくはそれに由来する。言いかえれば、ヒトＧＲＡＦ１は、本明細書において記載されるＧＲＡＦタンパク質のための好ましい参照配列である。より具体的に、適切には、ヒトＧＲＡＦ１のための参照配列は、ＮＰ＿０５５８８６によって規定されるアミノ酸配列である。不確かさを回避するために、その受託番号において開示される配列は、参照によって本明細書において組み込まれる。さらに、不確かさを回避するために、このヒトＧＲＡＦ１受託番号によって含まれる配列は、本出願の出願日にその形式で参照によって本明細書において具体的に組み込まれる。さらに、本出願の添付の図面を参照されたい。これは、参照を容易にするために、ＧＲＡＦタンパク質配列を示す。
【００４１】
さらなる教示が必要とされる場合、好ましいＧＲＡＦ１配列は、以下のとおりである：
ＧＲＡＦ１完全長配列−８１４個のアミノ酸−受託番号ＮＰ＿０５５８８６；より好ましくは、ＧＲＡＦ１の完全な配列が７５９個のアミノ酸配列をもたらすスプライス変異体に相当する：
1 mglpalefsd ccldsphfre tlksheaeld ktnkfikeli kdgkslisal knlssakrkf
61 adslnefkfq cigdaetdde mciarslqef atvlrnlede rirmienase vlitplekfr
121 keqigaakea kkkydketek ycgilekhln lsskkkesql qeadsqvdlv rqhfyevsle
181 yvfkvqevqe rkmfefvepl laflqglftf yhhgyelakd fgdfktqlti siqntrnrfe
241 gtrseveslm kkmkenpleh ktispytmeg ylyvqekrhf gtswvkhyct yqrdskqitm
301 vpfdqksggk ggedesvilk sctrrktdsi ekrfcfdvea vdrpgvitmq alseedrrlw
361 meamdgrepv ynsnkdsqse gtaqldsigf siirkcihav etrgineqgl yrivgvnsrv
421 qkllsvlmdp ktasetetdi caeweiktit salktylrml pgplmmyqfq rsfikaakle
481 nqesrvseih slvhrlpekn rqmlqllmnh lanvannhkq nlmtvanlgv vfgptllrpq
541 eetvaaimdi kfqnivieil ienhekifnt vpdmpltnaq lhlsrkkssd skppscserp
601 ltlfhtvqst ekqeqrnsii nsslesvssn pnsilnssss lqpnmnssdp dlavvkptrp
661 nslppnpspt splspswpmf sapsspmpts stssdsspvr svagfvwfsv aavvlslars
721 slhavfsllv nfvpchpnlh llfdrpeeav hedsstpfrk akalyackae hdselsftag
781 tvfdnvhpsq epgwlegtln gktglipeny vefl
−２つ（８１４アミノ酸及び７５９アミノ酸変異体）の間の異なるアミノ酸に下線が引かれている。
【００４２】
他の実施形態において、ＧＲＡＦ参照配列は、本明細書において示されるＧＲＡＦコンセンサス配列であってもよい。適切には、ＧＲＡＦ参照配列は、上記に論じられるヒトＧＲＡＦ１配列である。
【００４３】
適切には、ＧＲＡＦタンパク質は、上記に説明されるように、ヒトＧＲＡＦ配列である又はそれに由来する。具体的には、本発明のＧＲＡＦタンパク質は、適切には、ヒトＧＲＡＦ１ポリペプチドの少なくとも約２００個のアミノ酸残基、適切には、少なくとも２５０個の残基、適切には、少なくとも３００個の残基、適切には、少なくとも４００個の残基、適切には、少なくとも５００個の残基、適切には、少なくとも実質的にすべての残基を含む。
【００４４】
適切には、本発明のＧＲＡＦタンパク質は、ヒトＧＲＡＦ１のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性、適切には、少なくとも６０％の同一性、適切には、少なくとも７０％の同一性、適切には、少なくとも８０％の同一性、適切には、少なくとも９０％の同一性、適切には、少なくとも９５％の同一性、適切には、少なくとも９８％の同一性、適切には、少なくとも９９％の同一性を持つ又は最も適切には、本発明のＧＲＡＦタンパク質は、ヒトＧＲＡＦ１ポリペプチドの完全なアミノ酸配列に相当する。
【００４５】
全配列未満のヒトＧＲＡＦ１ポリペプチドが、本発明によるＧＲＡＦタンパク質として使用される場合、適切には、ＧＲＡＦの、少なくともＧＡＰドメインに相当する配列が使用される。本発明のＧＲＡＦタンパク質のサイズ及び／又は配列同一性に関連する上記の言及は、これを考慮に入れて解釈されるべきである。より詳細には、２００個のアミノ酸残基のみが、本発明のＧＲＡＦタンパク質中に存在する場合、適切には、それらは、ＧＲＡＦのＧＡＰドメインの２００個のアミノ酸残基に相当する。参照を容易にするために、ＧＲＡＦのＧＡＰドメインは、ヒトＧＲＡＦ１の３６４〜５６３のアミノ酸配列である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、配列同一性は、ＧＡＰドメインを介して判断されてもよい。他の実施形態において、配列同一性は、参照配列の全長を介して判断されてもよい。他の実施形態において、配列同一性は、本発明のＧＲＡＦタンパク質配列などの標的配列の全長を介して判断されてもよい。
【００４７】
一般に、所望のドメインが、それらの天然に存在する隣接アミノ酸のコンテクスト中存在するように、その所望のタンパク質をできるだけ使用することが望ましい。したがって、適切には、より長いＧＲＡＦポリペプチドが使用され、最も適切には、完全長ＧＲＡＦポリペプチドが使用される。
【００４８】
適切には、ＧＲＡＦ１タンパク質は、単離されている。
【００４９】
適切には、ＧＲＡＦ１タンパク質は、精製されている。
【００５０】
適切には、ＧＲＡＦ１タンパク質は、組換え体である。
【００５１】
適切には、ＧＲＡＦ１タンパク質は、インビトロにおけるものである。
【００５２】
ＧＲＡＦタンパク質の分子構造
ＧＲＡＦ１は、４つの予測されるドメインを有し、これらのドメインのそれぞれの機能が、分析された。これらのドメインのうちの２つ（ＢＡＲドメイン及びＰＨドメイン）は、ＧＲＡＦがそれに沿って並ぶ、管状のエンドサイトーシス膜の高度な湾曲を正確に安定化するために共に作用することが示された。他の２つのドメイン（ＧＡＰドメイン及びＳＨ３ドメイン）は、他のタンパク質との相互作用を媒介することが示された。このエンドサイトーシス経路においても作用する新規なタンパク質を同定するために、いくつかの生化学的及び生物物理学的技術が使用された。ＧＲＡＦ１  ＳＨ３ドメインの主な相互作用パートナーは、ダイナミンであることが示され、これはまた、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスに必要であることが示された。興味深いことには、ＧＲＡＦ１の相互作用パートナーは、それらの機能について知られていたものに基づいて、３つのグループに分かれた：エンドサイトーシスに関係するタンパク質、低分子量Ｇタンパク質（細胞形態の主要な制御因子）の調節に関係するタンパク質、及び接着斑の解体に関係するタンパク質。接着斑は、細胞がその環境に密接に密着する細胞の領域である。これらの部位で、組織における細胞を囲む細胞外マトリックスは、細胞の細胞骨格を形成し、細胞の形態を決定するアクチンフィラメントに結合する。これらの接着斑は、その環境との細胞の重要な相互作用を表し、膜貫通インテグリンの連結に依存する。これらの部位は、常に再構築され、細胞が遊走する場合、これらの密接な結合は、細胞の後部で解体されなければならず、新しい接着点が、その前方で形成されなければならない。接着部位ターンオーバー及び細胞骨格における重要な変化に加えて、遊走細胞は、その前方に膜を送って、その細胞のこの側が遊走の方向に伸長することを可能にしなければならない。上記に要約される研究が、細胞遊走に必要な基本的なプロセスのすべてにＧＲＡＦ１を関係させたので、これにより、ＧＲＡＦ１が、細胞形態及び遊走イベントを調整するために理想的な位置にあり得るであろうと仮定された。細胞におけるＧＲＡＦ１のレベルは、細胞形態のタイプと相関することが示された。次いで、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスは、接着部位から優先的に生じることが示された。これは、エンドサイトーシスが優先的に生じる、特異的な形質膜領域についての、非神経細胞における第１の証拠を提供した。具体的には、ＧＲＡＦ１のレベルを枯渇させることによって、接着部位が解体されるのにこのタンパク質が必要であること、及び実際に、ＧＲＡＦ１（遺伝子又はタンパク質のレベルのいずれか）の非存在下において、細胞が遊走することができなかったことが示された。ＧＲＡＦ１依存性接着部位解体のためのモデルは、これらの結果を総合してもたらされた。多くの種におけるＧＲＡＦ１様タンパク質に関する進化論的な研究もまた実行され、哺乳動物におけるＧＲＡＦ１の近い類縁体に関する付随的な研究が実行された。結果は、そのようなタンパク質が、ＧＲＡＦ１に類似する方法で機能する可能性があることを強く示唆した。これらの研究は、エンドサイトーシス及び細胞遊走の連関を担う、新規で、広範で、動的な細胞の解剖学的構造を明���かにした。細胞遊走における膜輸送、接着部位解体、及び細胞骨格の変化の重要性は、数十年間、激しく議論されてきた。これらの研究は、３つのプロセスが、複雑に関連づけられ、相互に依存することを示し、多分野にまたがるアプローチが必要とされる理由及びそれらが、細胞遊走に関する今後の研究のためにどのようにアプローチされる可能性があるかについて見通しを提供する。それらはまた、ただ１つのタンパク質が、これらのイベントを結びつけるのにどのように必要となるかを示す。この研究の重要な結果は、膜輸送経路における変化が、異常な量のＧＲＡＦ１及び類似するタンパク質と関連する疾患をどのようにもたらし得るのかを示唆するためのものである。これらの研究は、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシス経路及び疾患におけるその役割に関するさらなる研究に使用することができる一連の新規なツールを提供した。これらの新しいツールは、経路のエンドサイトーシス膜のさらなるマーカー（Ｒａｂ８）、この経路の壊れやすい膜を保護するための方法、経路を特異的に阻害するために使用することができる方法、及び経路を刺激するために使用することができる小分子を含む。後者は、可能性として、ヒト白血病の治療における無毒性治療剤として使用することができ、この経路の阻害因子もまた、癌細胞浸潤及び転移を阻害することが予測され、かつ新規で、より完全な免疫抑制療法のための基盤を提供するであろう。
【００５３】
作用物質
本発明による候補調節因子は、ＧＲＡＦタンパク質活性に影響を与えることができる可能性のある任意の適した構成要素を含んでいてもよい。たとえば、候補調節因子は、化学的又は生化学的構成要素又は作用物質であってもよい。本明細書において使用されるように、用語「作用物質」は、ただ１つの構成要素であってもよい又はそれは、構成要素の組合せであってもよい。適切には、作用物質は、ＧＲＡＦの活性を調節する。
【００５４】
作用物質は、ＧＲＡＦのアンタゴニスト又はアゴニストであってもよい。適切には、作用物質は、ＧＲＡＦ  ＧＡＰ活性の阻害因子などのＧＲＡＦの阻害因子である。
【００５５】
作用物質は、有機化合物又は他の化学薬品であってもよい。作用物質は、天然又は人工のものにかかわらず、任意の適した供給源から入手できる又はそれによって生産される化合物であってもよい。作用物質は、アミノ酸分子、ポリペプチド、若しくはその化学的誘導体又はその組合せであってもよい。作用物質は、さらに、ポリヌクレオチド分子であってもよい−これは、センス分子又はアンチセンス分子であってもよい。作用物質は、さらに、抗体であってもよい。
【００５６】
作用物質は、設計されてもよく、又は化合物のライブラリーから得られてもよく、これは、ペプチド及び小さな有機分子などの他の化合物を含んでいてもよい。
【００５７】
例として、作用物質は、天然物質、生体高分子、細菌、菌類、若しくは動物（特に哺乳動物）の細胞若しくは組織などの生体物質から作製される抽出物、有機分子若しくは無機分子、合成剤、半合成剤、構造的模倣剤若しくは機能的模倣剤、ペプチド、ペプチド模倣剤、誘導体化剤、全タンパク質から切断されるペプチド、又は合成的に合成されるペプチドであってもよい（例として、ペプチド合成機を使用する又は組換え技術若しくはその組合せによる、組換え作用物質、抗体、天然又は非天然作用物質、融合タンパク質又はその等価物、及び突然変異体、誘導体、又はその組合せ）。
【００５８】
典型的に、作用物質は、有機化合物となるであろう。典型的に、有機化合物は、２又はそれ以上のヒドロカルビル基を含むであろう。ここで、用語「ヒドロカルビル基」は、少なくともＣ及びＨを含む基を意味し、１又は複数の他の適した置換基を含んでいてもよい。そのような置換基の例は、ハロ基、アルコキシ基、ニトロ基、アルキル基、環式基などを含んでいてもよい。環式基である置換基が可能であることに加えて、置換基の組合せは、環式基を形成してもよい。ヒドロカルビル基が、１を超えるＣを含む場合、次いで、それらの炭素は、必ずしも、互いに連結される必要はない。たとえば、炭素のうちの少なくとも２つは、適したエレメント又は基によって連結されてもよい。したがって、ヒドロカルビル基は、ヘテロ原子を含んでいてもよい。適したヘテロ原子は、当業者らに明白であろう、またたとえば硫黄、窒素、及び酸素を含む。いくつかの適用については、好ましくは、作用物質は、少なくとも１つの環式基を含む。環式基は、非縮合多環式基などの多環式基であってもよい。いくつかの適用については、作用物質は、他のヒドロカルビル基に連結される、上述の環式基の少なくとも１つを含む。
【００５９】
作用物質は、ハロ基、たとえばフルオロ基、クロロ基、ブロモ基、ヨード基を含んでいてもよい。
【００６０】
作用物質は、１又は複数のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキレン基、及びアルケニレン（alkenylene）基を含んでいてもよい−これらは、非分岐状鎖又は分岐状鎖であってもよい。
【００６１】
作用物質は、薬学的に許容される塩−酸付加塩若しくは塩基性塩−又はその水和物を含む、その溶媒和化合物の形態をしていてもよい。適した塩についての概説については、Berge et al, (1977) J. Pharm. Sci. 66, 1-19を参照されたい。
【００６２】
本発明の作用物質は、他の治療特性を表すことができてもよい。
【００６３】
作用物質は、１又は複数の他の薬学的に活性な作用物質と組み合わせて使用されてもよい。
【００６４】
活性な作用物質の組合せが投与される場合、それらは、同時に、別々に、又は順次投与されてもよい。
【００６５】
作用物質は、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在してもよい−たとえば、作用物質は、１又は複数の不斉中心及び／又は幾何学中心を持っていてもよく、したがって、２又はそれ以上の立体異性形態及び／又は幾何学的形態で存在してもよい。本発明は、それらの作用物質のすべての個々の立体異性体及び幾何異性体並びにその混合物の使用を企図する。
【００６６】
作用物質は、薬学的に許容される塩の形態で投与されてもよい。
【００６７】
薬学的に許容される塩は、当業者らによく知られており、たとえば、Berge et al, (1977) J. Pharm. Sci., 66, 1-19によって言及されるものを含む。適した酸付加塩は、無毒性塩を形成する酸から形成され、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、二硫酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコビル酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、及びｐ−トルエンスルホン酸塩を含む。
【００６８】
１又は複数の酸性成分が存在する場合、適した薬学的に許容される塩基付加塩は、無毒性塩を形成する塩基から形成することができ、アルミニウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、及びジエタノールアミン塩などの薬学的に活性なアミン塩を含む。
【００６９】
作用物質の薬学的に許容される塩は、必要に応じて、作用物質及び望ましい酸又は塩基の溶液を共に混合することによって容易に調製されていてもよい。塩は、溶液から沈殿し、濾過によって収集されてもよい又は溶媒の蒸発によって回収されてもよい。
【００７０】
作用物質は、多形性の形態で存在してもよい。
【００７１】
作用物質は、１又は複数の不斉炭素原子を含んでいてもよく、そのため、２又はそれ以上の立体異性形態で存在する。作用物質が、アルケニル基又はアルケニレン基を含む場合、シス（Ｅ）及びトランス（Ｚ）異性もまた生じてもよい。本発明は、作用物質の個々の立体異性体を含み、適切な場合、その混合物と共に、その個々の互変異性形態を含む。
【００７２】
ジアステレオマー又はシス異性体及びトランス異性体の分離は、従来の技術によって、たとえば、作用物質の立体異性混合物又はその適した塩若しくは誘導体の分別晶出、クロマトグラフィー、又はＨ．Ｐ．Ｌ．Ｃ．によって達成されてもよい。作用物質の個々の鏡像異性体はまた、必要に応じて、相当する光学的に純粋な中間体から又は適したキラル支持体を使用する、相当するラセミ化合物のＨ．Ｐ．Ｌ．Ｃ．によって又は適した光学的に活性な酸若しくは塩基との相当するラセミ化合物の反応によって形成されるジアステレオマー塩の分別晶出によってなどの分析によって、調製されていてもよい。
【００７３】
作用物質はまた、作用物質の適した同位体の異体又はその薬学的に許容される塩をすべて含んでいてもよい。作用物質の同位体の異体又はその薬学的に許容される塩は、少なくとも１つの原子が、同じ原子番号を有する原子と交換されるが、原子質量が、通常自然界において見つけられる原子質量と異なるものとして規定される。作用物質及びその薬学的に許容される塩の中に組み込むことができる同位体の例は、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌなどの、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素の同位体を含む。作用物質及びその薬学的に許容される塩のある種の同位体の異体は、たとえば、３Ｈ又は１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれるものであり、薬剤及び／又は基質組織分布研究において有用である。トリチウム化、つまり３Ｈ及び炭素１４、つまり１４Ｃ同位体は、調製及び検出性のそれらの容易さのために特に好ましい。さらに、重水素、つまり２Ｈなどの同位体との置換は、より優れた代謝安定性、たとえばインビボにおける半減期の増加又は投薬必要量の低下に起因する、ある種の治療上の利点を与える可能性があり、そのために、いくつかの状況において好ましい可能性がある。本発明の作用物質及びその薬学的に許容される塩の同位体の異体は、適した試薬の適切な同位体の異体を使用する従来の手順によって、一般に、調製することができる。
【００７４】
作用物質が、プロドラッグに由来してもよいことは当業者らによって十分に理解されるであろう。プロドラッグの例は、ある種の（１又は複数の）保護基を有し、そのため、薬理学的活性を持っていなくてもよいが、ある種の実例において投与されてもよく（経口的に又は非経口的になど）、その後、身体内で代謝されて、薬理学的に活性な作用物質を形成する構成要素を含む。
【００７５】
たとえば、"Design of Prodrugs" by H. Bundgaard, Elsevier, 1985（この開示は参照によってこれによって組み込まれる）において記載される「プロ成分（pro-moiety）」として知られているある種の成分は、作用物質の適切な官能性上に配置されてもよいことがさらに十分に理解されるであろう。そのようなプロドラッグもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００７６】
ＧＲＡＦ活性のアッセイ
適切には、ＧＲＡＦ活性は、所望のＧＲＡＦのＧＡＰ活性を決定することによってアッセイされる。言いかえれば、ＧＲＡＦ活性は、ＧＲＡＦタンパク質がＧＴＰアーゼを活性化する能力を決定することによって適切にアッセイされる。
【００７７】
ＧＲＡＦは、ＲｈｏＡ及びＣｄｃ４２に対する活性を有し、したがって、いずれに対してもアッセイすることができる。ＲｈｏＡ及びＣｄｃ４２は、本発明のアッセイにおいて、別々に又は同時に、適切には別々に使用されてもよい。
【００７８】
したがって、本発明はまた、ＧＲＡＦ１のＧＡＰ活性の阻害因子を求めた多様な小分子スクリーニングにも関する。
【００７９】
ＧＡＰアッセイは、ルーチン的に使用され、ＨＴＳ用に好都合に開発されていてもよい。蛍光リードアウト（readout）は、当技術分野において知られているように使用されてもよい（たとえばReza Ahmadian et al. Eberth et al. Biol Chem Nov 2005を参照されたい）。そのようなアッセイは、ヌクレオチド加水分解に際して誘発される、低分子量Ｇタンパク質におけるコンホメーション変化を感知するｔａｍｒａＧＴＰを使用する。
【００８０】
Ｔａｍｒａ−ＧＴＰ加水分解アッセイ：
Ｔａｍｒａ−ＧＴＰ加水分解アッセイは、０．２μＭ  ｔａｍｒａ−ＧＴＰ（Eberth et al., Biol. Chem., 2005）、０．２μＭ  精製ＲｈｏＡ及び／又はＣｄｃ４２、１μＭの精製刺激物質ＧＡＰタンパク質（つまり本発明のＧＲＡＦタンパク質）を使用して実行されてもよい。
【００８１】
アッセイは、試みられている治療／研究に依存して、精製タンパク質付加タンパク質又は小分子ありで又はなしで行われてもよい。各加水分解反応は、３０ｍＭ  Tris／ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び３ｍＭ  DTTを含む緩衝液中で、摂氏２５度で、ストップフロー分光光度計を使用して測定される。Ｔａｍｒａ−ＧＴＰは、５４６ｎｍで励起させられ、発光は、カットオフフィルターを使用して５７０ｎｍで記録される。
【００８２】
ＧＲＡＦタンパク質ＧＡＰ活性の阻害因子としての小分子の検証は、ＧＲＡＦタンパク質過剰発現が形態学的変化を誘発する能力をリードアウトとして使用して、細胞において実行されてもよい。
【００８３】
任意選択アッセイ条件
補助因子又は他の関連する物質は、本発明のアッセイに補足されてもよい。たとえば、膜又は膜成分は、望ましい場合、含まれてもよい。
【００８４】
ＧＲＡＦタンパク質は、精製形態で供給されてもよい。
【００８５】
ＧＲＡＦタンパク質は、管状形態で供給されてもよい。
【００８６】
ＧＲＡＦタンパク質は、ダイナミン及び／又はＧＩＴ１及び／又はＦＡＫ及び／又はＰＡＫ２と複合体を形成してもよい。ＧＲＡＦタンパク質は、ダイナミン及び／又はＧＩＴ１及び／又はＰＡＫ２及び／又はシナプトジャニン及び／又はｃａｓｋｉｎ１と複合体を形成してもよい。
【００８７】
適切には、本発明のアッセイは、インビトロアッセイである。
【００８８】
適切には、ＧＡＰ活性のアッセイのためのＧＴＰアーゼ基質は、ＲｈｏＡ又はＣｄｃ４２である。適切には、ＧＴＰアーゼ基質は、ＲｈｏＡであり、これは、インビボにおいてＧＲＡＦ１の主な標的である利点を有する。
【００８９】
任意選択アッセイステップ
下流の検証は、候補調節因子又は本発明の方法によって同定される他の作用物質に対して有利に行われる。そのような検証は、下記に論じられるように、ＧＲＡＦ機能の他の態様について調節因子又は作用物質の効果（もしあれば）を決定するために、（１又は複数の）さらなる試験の形態をとってもよい。
【００９０】
一実施形態において、方法は、エンドサイトーシスアッセイを実行するためのステップをさらに含む。これは、インビボにおける推定上の阻害因子を検証するための利点を有する。
【００９１】
一実施形態において、方法は、接着アッセイを実行するステップをさらに含む。これは、インビボにおける推定上の阻害因子を検証するための利点を有する。
【００９２】
一実施形態において、方法は、選択性アッセイを実行するステップをさらに含む。そのようなアッセイは、熟練した操作者によって容易に構築されてもよい。たとえば、ＥＬＩＳＡを介して、推定上の阻害因子を用いる処理に際して誘発される全体的な低分子量Ｇタンパク質のバランスに対する効果を試験することは望ましい可能性がある。
【００９３】
ＨｅＬａ細胞は、エンドサイトーシス／接着モデルにおいて特に有用である。
【００９４】
補足の試験もまた、たとえば感染症と戦う又は腫瘍進行を阻害するための能力を調査することによって、全動物モデルにおいて実行されてもよい。
【００９５】
インビトロにおいて同定、検証された分子に対するインビボモデルは、入手可能である。たとえば、多くの誘発可能で、自発性のマウス癌モデル及びマウス免疫エフェクター細胞活性アッセイがある。
【００９６】
より詳細には、アッセイは、適した構成の以下の例のうちの１つをとってもよい。
【００９７】
一実施形態において、方法は、インビトロにおいて、ＦＡＫ活性の調節因子をアッセイするためのステップをさらに含む。そのようなステップの特定の例は、
インビトロにおけるＦＡＫ基質のリン酸化アッセイの使用
放射性リン酸を用いるアッセイ、
他のチロシンキナーゼに対する効果を試験することによる検証（特異性の点から）、
細胞における検証を含んでいてもよい。
【００９８】
一実施形態において、方法は、インビトロにおいて、ＧＲＡＦ  ＲｈｏＧＡＰ活性の調節因子をアッセイするためのステップをさらに含む。そのようなステップの特定の例は、
ＧＲＡＦタンパク質が、Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質によるＧＴＰの加水分解を刺激する能力に対する効果を定量化するためのインビトロアッセイの使用；蛍光ベース（ｔａｍｒａ−ＧＴＰ又は等価物）、
他のＧＡＰドメイン含有タンパク質及び低分子量Ｇタンパク質ＧＴＰ加水分解を刺激するためのそれらの能力に対する効果を試験することによる検証（特異性の点から）、
細胞における検証を含んでいてもよい。
【００９９】
一実施形態において、方法は、インビトロにおいて、ＧＲＡＦ−ＦＡＫ相互作用の調節因子をアッセイするためのステップをさらに含む。そのようなステップの特定の例は、
インビトロにおけるタンパク質間相互作用アッセイの使用、
プルダウンベイトとして他のＳＨ３ドメインを使用する検証（特異性の点から）、
細胞における検証を含んでいてもよい。
【０１００】
一実施形態において、方法は、細胞におけるＧＲＡＦ分布の変化をアッセイするためのステップをさらに含む（たとえば検査によって、たとえばインビボにおいて）。そのようなステップの特定の例は、顕微鏡ベースの検査を含んでいてもよい。
【０１０１】
一実施形態において、方法は、インビボにおいて、エンドサイトーシスルートの特異的な調節因子をアッセイするためのステップをさらに含む。そのようなステップの特定の例は、クラスリン依存性、カベオラ、ＧＲＡＦ媒介性、並びにクラスリン非依存性、カベオラ非依存性、及びＧＲＡＦ非依存性エンドサイトーシスの特異的なマーカーを用いる顕微鏡ベースの検査を含んでいてもよい。
【０１０２】
エンドサイトーシスアッセイ：
リガンドは、ＧＲＡＦ依存性エンドサイトーシス経路の小分子阻害因子についての細胞生物学的スクリーニングにおいて使用されてもよい。たとえば、
ａ．トランスフェリン（クラスリン媒介性エンドサイトーシス）
ｂ．上皮成長因子（クラスリン媒介性及びクラスリン非依存性エンドサイトーシス）
ｃ．デキストラン（主にクラスリン非依存性エンドサイトーシス）
ｄ．ＳＶ４０ビリオン（クラスリン非依存性エンドサイトーシス）
ｅ．コレラ毒素Ｂサブユニット（クラスリン媒介性及びクラスリン非依存性エンドサイトーシス）
ｆ．志賀毒素Ｂサブユニット（クラスリン媒介性及びクラスリン非依存性エンドサイトーシス）。ｂ／ｃ／ｄ／ｅ／ｆの取り込み又は輸送に影響を与えるが、（ａ）をそのままにしておく小分子は、ＧＲＡＦ媒介性エンドサイトーシス／輸送の推定上の阻害因子として同定される（又は検証される）。
【０１０３】
一実施形態において、ネガティブコントロールは、さらなる参照試料として使用される。本実施形態において、適切には、Ａｒｆ６が使用される。
【０１０４】
接着アッセイもまた、本発明の方法によって同定される（１又は複数の）標的をさらに検証するために使用されてもよい。
【０１０５】
接着アッセイ：
細胞は、小分子（この時点から最後まで存在する）の存在下において、ＥＤＴＡベースの緩衝液中で基質から分離され、洗浄及び生体（着色）染料の追加の前に、５／１５／３０／６０／１８０／７２０分間、９６ウェルプレート上で再度平板培養される。下方に固着した細胞は、次いで、溶解され、生きた接着性の細胞の数は、間接的に、分光測定で測定される。これは、溶解の後に各ウェルにおけるタンパク質濃度を合計するために標準化されてもよい。
【０１０６】
ＧＲＡＦタンパク質の製造
ＧＲＡＦタンパク質は、当業者らに知られている任意の適した技術によって製造されてもよい。ＧＲＡＦタンパク質は、天然又は組換えの供給源から精製されてもよい又は単離されてもよい。ＧＲＡＦタンパク質は、インビトロ翻訳又は化学的合成手段によって合成的に作製されてもよい。多数の市販で入手可能なタンパク質合成サービスのうちのいずれも、本発明における使用のためのＧＲＡＦタンパク質を作製するために使用されてもよい。
【０１０７】
さらなる適用
他の態様において、本発明は、細胞遊走及び／又は接着斑の解体を調節する作用物質を同定するための方法であって、
（ａ）ＧＲＡＦ１を作用物質と接触させるステップ及び
（ｂ）上述の作用物質がＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスを調節するかどうかを決定するステップを含み、
上述の作用物質によるＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスの調整は、上述の作用物質が、細胞遊走及び／又は接着斑の解体を調節することを示す方法に関する。
【０１０８】
ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスは、ＧＲＡＦ１を用いる染色前に、ＤｉＩ又はデキストランのいずれかを使用してなどのように、当業者に知られている、任意の適した技術を使用してモニターされてもよい。ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスは、免疫蛍光法及び／又は量的な蛍光定量的アッセイを使用してモニターされてもよい。
【０１０９】
本発明はまた、インビボにおいて又はインビトロにおいて細胞遊走を調節するためのＧＲＡＦ１の使用などのＧＲＡＦ１の使用を含む、インビボにおいて又はインビトロにおいて細胞遊走を調節するための方法にも関する。
【０１１０】
本発明はまた、初めて、ＧＲＡＦ１が腫瘍抑制因子タンパク質であることの科学的な論理的根拠をも開示する（接着受容体の取り込みの低下、腫瘍細胞ニッチへの接着の増加などの点から）。
【０１１１】
本発明はまた、他の新規な治療上の論理的根拠として、Ｒｈｏキナーゼ阻害因子（又は経路の任意の他の活性化因子）の使用に関する。
【０１１２】
他の態様において、本発明は、ＧＲＡＦ１の使用を含む、インビボにおいて又はインビトロにおいてＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を含む形質膜にタンパク質を局在化させるための方法（又はＧＲＡＦタンパク質の使用）に関する。適切には、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２は、リポソーム、小管、接着斑膜として、又は遊走細胞の先端に存在していてもよい。
【０１１３】
ＧＲＡＦ１はまた、インビボにおいて又はインビトロにおいて、管状構造の形成を調節するために使用されてもよい。
【０１１４】
産業上の適用
明らかに、本発明は、対象におけるＧＲＡＦ１の活性及び／若しくは発現を調節することを含む、疾患の治療若しくは予防並びに／又は疾患の治療のための医薬の製造におけるＧＲＡＦ１の使用に並びにそれに関連する研究及びスクリーニングの適用に適用を見出す。関連する疾患は、精神遅滞及び癌、特に腫瘍などの固形癌を含む。
【０１１５】
本発明の方法は、ハイスループットスクリーニングなどのように、治療上の可能性を有するＧＲＡＦ１の調節因子をスクリーニングするのに適用されてもよい。特に適しているのは、ＧＲＡＦ１などのＧＲＡＦタンパク質のＧＡＰ活性、つまりＧＲＡＦタンパク質がＧＴＰアーゼを活性化する能力に関する方法である。
【０１１６】
さらに、本明細書において開示されるＧＲＡＦ１の不活性突然変異体（Ｒ４１２Ｄ）は、ＧＡＰドメイン活性が除去されており、本発明の方法におけるコントロールとしての有用性を見出す。
【０１１７】
ＧＲＡＦ１は、接着斑のターンオーバーを調節することが開示される。そのため、ＧＲＡＦは、血液学的悪性腫瘍（ここでそれは腫瘍抑制因子となる）及び固形細胞悪性腫瘍（ここで突然変異体は、細胞の浸潤／転移を引き起こし得る）において２重の役割を有する。ＧＲＡＦ１の阻害因子は、浸潤性癌を治療するのに適用される。
【０１１８】
さらに、ＧＲＡＦの阻害因子は、免疫抑制剤としての適用を見出す（細菌毒素及びウイルス侵入エンドサイトーシス経路のブロッキングによって）。
【０１１９】
本発明は、浸潤性固形臓器悪性腫瘍の治療のための医学的適用及び特異的な免疫抑制のための医学的適用を含む、多数の医学的適用に適用されてもよい。
【０１２０】
ＧＲＡＦ１及びＯＰＨＮの調節因子又はそれらに基づくスクリーニング方法は、上記に示される理由で疾患における産業上の適用を有する。さらに、ＧＲＡＦ２及びＧＲＡＦ３は、発癌性であると考えられ、したがって、操作者が有利に決定することができる組織／細胞型の発現／分布に依存して、異なる疾患についてそれらを標的とすることは望ましい。
【０１２１】
膜生物学
平らな膜を変形することができ、かつ非常に曲がった膜を安定化することができることで知られているタンパク質のいくつかのファミリーがある。そのため、これらは、エンドサイトーシスに必要とされる形質膜陥入の生成における役割のための有力候補となる。タンパク質の１つのそのようなファミリーのメンバーは、ＢＡＲドメインとして知られている領域を含むことが予測され、これは、二量体化して、非常に曲がった膜を感知し、生じさせることができるバナナ状のモジュールを形成する。多くのＢＡＲドメイン含有タンパク質は、自然界において多重ドメインである。ＢＡＲドメイン含有タンパク質の１つのサブファミリーは、ＧＲＡＦ１（接着斑キナーゼと関連するＧＴＰアーゼ制御因子のための）及びオリゴフレニン１を含む。ＧＲＡＦ１をコードする遺伝子の突然変異又はＧＲＡＦ１のレベルの低下が、以前に、ヒト患者における悪性白血病と関連したので、ＧＲＡＦ１は、白血球における重要なタンパク質であるように思われる。さらに、ＧＲＡＦ１レベルは、悪性肺癌において著しく増加する。ＧＲＡＦ１の近い類縁体、オリゴフレニン１をコードする遺伝子は、精神遅滞の患者において突然変異していることが頻繁に見つけられ、この遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルは、胃腸の悪性腫瘍において増加する。これらのタンパク質の正常な機能を理解するための明らかな重要性にもかかわらず、このタンパク質ファミリーについてほとんど知られていない。これらの正常な機能の理解は、それらの機能不全と関連する重要な疾患を理解することができる基盤の発展を可能にするであろう。ＧＲＡＦ１は、少なくとも１つのクラスリン非依存性エンドサイトーシス経路に必要であるように思われるタンパク質（接着斑キナーゼ）と相互作用することが知られている。この研究報告の主な仮説は、ＧＲＡＦ１が、１又は複数のこれらのエンドサイトーシス経路内で膜変形をもたらすように作用する可能性があること及びその正常な機能に関する研究が、ＧＲＡＦ１及びその密接なタンパク質類縁体の調節異常に関する疾患プロセスについての理解に貢献するであろうということであった。この研究報告において、様々な生化学的、生物物理学的、及び細胞生物学的技術が、哺乳動物細胞におけるＧＲＡＦ１の機能を分析するために使用された。ＧＲＡＦ１の局在性を決定するために、このタンパク質を特異的に認識する抗体が生産され、ヒト細胞における内在性ＧＲＡＦ１を検出するために使用された。分析的な細胞生物学と結びつけられたこのアプローチは、ＧＲＡＦ１がそれに沿って並ぶ管状の膜の広範で、新規な系を明らかにした。これらは、細胞周辺及び離れた細胞内膜結合コンパートメントの両方と直接連絡するように思われた。これらの膜は、自然界においてエンドサイトーシスによるものであり、細胞外液及びＧＰＩ連結タンパク質並びに重要なヒト疾患であるコレラ及び赤痢の原因である細菌毒素を内部移行することができることが示された。これらのエンドサイトーシス小管は、クラスリン又はクラスリン非依存性エンドサイトーシスイベントに関係してきた他のタンパク質（カベオリン１及びフロチリン１）を使用しなかった。蛍光マーカーでタグをつけたＧＲＡＦ１を使用して、このタンパク質の分布は、リアルタイムで生細胞において検査された。驚いたことに、これらの小管は、非常に動的であり、他のエンドサイトーシスイベントについて観察されてきたものよりもはるかに速い時間スケールでターンオーバーを受けることが示された。次いで、ＧＲＡＦ１が、それに沿って並ぶエンドサイトーシスによる小管の形成及び機能に必要であるかどうかを決定するために、次いで、細胞からＧＲＡＦ１を枯渇させた。ＧＲＡＦ１の非存在下において、管状の膜へのエンドサイトーシスの量は極めて低下したが、この処理はクラスリン媒介性のメカニズムを介してのエンドサイトーシスを破壊しなかった。さらなる分析は、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシス及びクラスリン媒介性エンドサイトーシスが、それぞれ、これらの細胞における形質膜ターンオーバーの約半分を占め、両方のタイプのエンドサイトーシスが枯渇した細胞が、生存しなかったことを明らかにした。これらの発見は、初めて、ＧＲＡＦ１に依存性である、広く用いられているエンドサイトーシス経路の広範な生化学的及び生物物理学的調査を可能にした。
【０１２２】
ＧＲＡＦ生物学
ＧＲＡＦ１は、本発明者らが、ＳＨ３ドメインを介してのフォーカルコンプレックス（focal complex）及び接着の解体に関与するタンパク質と相互作用することを示す、ＢＡＲ、ＰＨ、ＧＡＰ、及びＳＨ３ドメインを含有するタンパク質である。本発明者らは、それが、これらの接着の解体を担い、それによって、細胞の遊走イベントを調整する、主なクラスリン非依存性エンドサイトーシス経路を調節することを示した。ＧＲＡＦ１のＧＡＰドメインは、ＲｈｏＡ及びＣｄｃ４２に対するＧＴＰアーゼ活性化活性を有し、本発明者らは、ＲｈｏＡが、インビボにおいてその主な標的であると考える。ＧＲＡＦ１のＧＡＰ活性は、タンパク質の機能に必要であり、したがって、低分子量Ｇタンパク質のバランスにおける局所的な変化は、接着性の接触のエンドサイトーシスによる解体に必要である。
【０１２３】
機能的なＧＲＡＦ１発現は、転座、突然変異、欠失を通して又はプロモーターメチル化を通して、急性骨髄性白血病／骨髄異形成症候群患者の骨髄において低下する又は失われる。ＧＲＡＦ１依存性プロセスの調節に関与するＦＡＫは、乳癌を含む固形臓器悪性腫瘍においてアップレギュレートされる。
【０１２４】
細胞遊走及び癌細胞浸潤の阻害に対して知られているアプローチは、むしろ非特異的であり、多くの経路に干渉する。本発明者らは、どのように、ただ１つのタンパク質が、この細胞遊走に必要であるのか、したがって、標的としてのこのタンパク質に集中することが、伝統的なアプローチよりもはるかに大きな特異性を提供するのかを示す。ＧＲＡＦ１のＧＡＰドメインの活性は、その生物学的機能の鍵となり、本発明者らは、このタンパク質のＧＡＰドメインにおけるただ１つのアミノ酸変化が経路をブロッキングすることを発見した。そのため、このＧＡＰ活性の細胞透過性阻害因子は、類似する効果を有するであろう−したがって、適切には、本発明の候補調節因子は、細胞透過性である。もちろん、副作用が、成人の組織において遊走する（１又は複数の）細胞型について予想される可能性がある。しかしながら、細胞遊走のこのメカニズムは、本発明者らが考えるに、成熟エフェクター免疫細胞、創傷の治癒における細胞、及び癌細胞に限られる。これらのプロセスへの干渉は、薬剤（候補調節因子）が、免疫抑制性抗癌剤として作用することを可能にする。
【０１２５】
本発明者らは、これらの細胞が培養中に遊走しないという、ノックアウト細胞株からの証拠を開示する。疾患関連性の点から、経路の活性の増加が、細胞遊走／癌細胞浸潤を促進するという証拠は非常に強い。
【０１２６】
Ｒｈｏキナーゼ阻害因子の適用による標的プロセスの活性化は、予測される表現型を与え、さらに、本発明者らのアプローチを支持する。
【０１２７】
エンドサイトーシスイベントが、膜を形造る分子を必要とし、ＢＡＲドメイン含有タンパク質が、細胞における別個の位置において膜湾曲を生じさせ、安定化することができるので、そのようなタンパク質は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスイベントにおいてそのような役割を果たすために必要とされる可能性があり、そのようなタンパク質の同定及び分析は、それが調節するエンドサイトーシスイベントの細胞生物学的役割についての見通しを提供するはずである。さらに、ＦＡＫが、クラスリン非依存性エンドサイトーシスイベントの一部に必要であることがキノーム（kinome）スクリーニングにおいて示されることが示されたので、ＧＲＡＦ１（このキナーゼと相互作用する）は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスに関与する、ＢＡＲドメイン含有タンパク質ファミリーからの最も有望な候補の性質を呈した。本明細書において示される結果は、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路の第１の明らかに規定される非積荷マーカーとしてＧＲＡＦ１を記載し、ＧＲＡＦ１が、このプロセスが進行するのに必要であることを実証する。ＧＲＡＦ１のドメインごとの分析を通して、この広く用いられているエンドサイトーシス経路についての第１のメカニズムの見通しが明らかにされた。ＧＲＡＦ１は、そのＮ末端ＢＡＲドメイン及びＰＨドメインを介して、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２が豊富な管状で斑点状の膜にインビボにおいて局在化し、そのＳＨ３ドメインは、エンドサイトーシスのＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路に必要とされる膜切断タンパク質ダイナミンに直接結合する。ＧＲＡＦ１はまた、接着部位の解体に関係するタンパク質に結合する。この知識を使用して、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路が、接着部位から優先的に発出し、ＧＲＡＦ１は、これらが、細胞遊走が進行するために解体されることを可能にすることが示された。これらの研究は、それによって、エンドサイトーシス及び細胞遊走の連関を担う、新規で、動的な細胞の解剖学的構造を明らかにした。
【０１２８】
ＧＲＡＦ１及びエンドサイトーシス膜
エンドサイトーシスのクラスリン非依存性メカニズムに関する研究は、そのようなプロセスが分子レベルでどのように進行することができるかに関する明瞭さの苛立たしい不足によって著しく制限された。これらの制限にもかかわらず、多くの積荷が、これらのメカニズムによって内部移行されることが示され、これらの経路が進行するのに許容的な上流の脂質組成に関する多くの情報、同様に、薬剤に対するこれらの経路の感受性が、解明された（Zhao, Z. S., Manser, E., Loo, T. H. & Lim, L. Coupling of PAK-interacting exchange factor PIX to GIT1 promotes focal complex disassembly. Mol. Cell Biol. 20, 6354-63 (2000)）。さらに、フロチリン１及びカベオリン１が、クラスリン依存性メカニズムを介して積荷のエンドサイトーシスに関与するという発見は、この分野に著しく貢献した。クラスリン非依存性エンドサイトーシスメカニズムは、研究するのが困難であり、それらが、膜マイクロドメインの生理機能に関連づけられるので、そのような困難は、細胞の脂質ホメオスタシスについての本発明者らの不完全な理解から起こる可能性があることは明らかである。それは、また、クラスリン媒介性エンドサイトーシスに関与する種々のタンパク質の同定を可能にし、分子レベルで、時間及び空間においてこのプロセスがどのように調整されるかを決定するのを支援するＣＭＥ制御因子ＡＰ２に類似するハブタンパク質の不足から起こる可能性がある（非特許文献３６）。ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシスが広く用いられているにもかかわらず、この経路を調査する従来の研究は、それが内部移行することができる積荷の解明、その初期の担体の形態、並びに細胞のアクチン及び低分子量Ｇタンパク質に対するその依存性に限られている。そのような研究は、推測上、この経路の管状膜の効果的な保存に必要とされることがここで示される、厳密な（非標準的な）固定手順によって著しく妨げられてきた。ここで、ＧＲＡＦ１が、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路を通してエンドサイトーシスに必要であることもまた示された。ＧＲＡＦ１の非存在下において、この経路を通した内部移行は進行することができないだけではなく、この経路の管状膜は存在しない。ＧＲＡＦ１のＢＡＲドメイン及びＰＨドメインは、形質膜に豊富なホスホイノシチドＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を含有する、高度に曲がった膜に優先的に結合する、「一致（coincidence）検出器」として作用する脂質結合モジュールを含む。膜湾曲感知に加えて、このモジュールは、インビトロにおいて膜湾曲を生じさせることができる。ＢＡＲドメイン及びＮ−ＢＡＲドメインの、膜湾曲を感知する能力及びそれを生じさせる能力の間には幅がある。ＧＲＡＦ１  ＢＡＲドメインは、推定上の両親媒性ヘリックス（Ｎ−ＢＡＲドメインにおいて見つけられる）を含んでおらず、インビトロにおいて管状の相対的に弱い膜となる。インビボにおけるＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨの過剰発現は、Ｎ−ＢＡＲ過剰発現で観察されるように、広範な膜管形成表現型をもたらさない。その代わりに、このタンパク質は、可逆的な結合を通して、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路の初期のエンドサイトーシス担体に結合し、特異的に安定化する。そのため、ＧＲＡＦ１のＢＡＲドメイン及びＰＨドメインの役割は、上��のプロセスによって最初にもたらされた、この経路の管状膜の高度な湾曲を特異的に安定化することである（新規に生じさることではなく）可能性が高い。これらの上流のプロセスの性質は、知られていないが、適切な体積測定法を用いる特異的な脂質の蓄積を通しての、自発性の膜湾曲の生成を含む可能性がある。それらはまた、低分子量Ｇタンパク質又はＮ−ＢＡＲ若しくはＦ−ＢＡＲドメイン含有タンパク質などの膜湾曲を生じさせることができる他のタンパク質に依存性である可能性がある。一旦その機能が実行されたら、ＧＲＡＦ１がＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス膜からどのように除去される可能性があるのかに関する疑問が残る。低分子量Ｇタンパク質Ａｒｆ６もまた、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路を通してのエンドサイトーシスに関係する。ＧＴＰの加水分解は、エンドサイトーシスサイクリングにおけるＡｒｆ６の役割に必要とされることが知られている。ＧＲＡＦ１は、Ａｒｆ６  ＧＡＰ  ＧＩＴ１との複合体において見つけられ、これは、Ａｒｆ６によるＧＴＰ加水分解を促進するであろう。活性（ＧＴＰ結合）Ａｒｆ６が、形質膜でのＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２レベルの上昇をもたらすポジティブフィードバックサイクルをもたらすので、ＧＩＴ１によるＡｒｆ６  ＧＴＰ加水分解の活性化は、膜をエンドシトーシスする際にＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２レベルを低下させるであろう。ＧＲＡＦ１はまた、脂質ホスファターゼシナプトジャニン１にも結合し、これはまた、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２の脱リンをも触媒する。ＧＲＡＦ１は、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２含有膜に結合する。ＧＲＡＦ１が、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路の膜から離れる（及び再結合しない）ために、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２レベルは低下させる必要がある可能性が高い。一旦、十分なＧＲＡＦ１が、そのＮ末端を介してＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ膜に結合し、エンドサイトーシスが生じたら、他のドメインによる、シナプトジャニン１及びＧＩＴ１の動員は、その結合及び解離の反応速度が、ＧＲＡＦ１が膜から除去されるように、調節された方法で変化することを可能にする可能性がある。
【０１２９】
ＧＲＡＦ１、低分子量Ｇタンパク質、及び膜輸送
Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質及びエンドサイトーシスによる調節の間の関連は、調査されてきた。ここで示される研究は、このファミリーの過剰発現突然変異体が、エンドサイトーシス表現型を有する理由に関して明瞭さを提供する可能性がある。これらのタンパク質は、エンドサイトーシスそれ自体を特徴づける膜変形イベントにおいて直接的な役割を有していないが、接着部位及び細胞骨格の調節におけるそれらの重大な役割を考慮すれば、これらは、形質膜の特異的な領域から優先的に生じるエンドサイトーシスイベントに許容的である可能性がある可能性がある。ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路は、Ｃｄｃ４２依存性であり、Ｒｈｏキナーゼの急性の阻害は、このルートを通してエンドサイトーシスを増加させるが、より長い期間、ＲｈｏＡ活性がなければ、接着部位は成熟することができず、そのため、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路に許容的な、接着部位での形質膜脂質の大きなクラスターは存在しないであろう。そのため、Ｒｈｏファミリーメンバーが、問題の表現型をもたらすのにわずかに関与する可能性があるように、これらの方法に由来するデータが不可解である可能性があるので、特定のエンドサイトーシス経路の低分子量Ｇタンパク質依存性を決定するためにドミナントネガティブＲｈｏファミリー突然変異体の過剰発現を使用する場合、注意するべきである。低分子量Ｇタンパク質Ａｒｆ６は、脂質膜に結合することができ、これらの変形を誘発する。これは、Ｎ−ＢＡＲドメインにおける類似するヘリックスに類似する方法において膜の中に挿入する可能性があるＮ末端両親媒性ヘリックスの機能に依存性である。毒素は、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路のＡｒｆ６  Ｔ２７Ｎ陽性エンドサイトーシス担体においてなお見つけられるが、Ａｒｆ６  Ｔ２７Ｎ過剰発現は、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路を阻害し、ゴルジ装置へのこのルートを通してのコレラ毒素輸送をブロッキングするように思われる（Macia, E. et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Dev Cell 10, 839-50 (2006)）。これは、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路における初期のステップは、Ａｒｆ６−依存性であり、このタンパク質は、ＧＲＡＦ１による安定化を必要とする、エンドサイトーシス小管の最初の湾曲を誘発する可能性があることを示唆する。興味深いことには、Ａｒｆ６  ＧＡＰタンパク質ＧＩＴ１は、形質膜及びエンドソームの間の輸送に関係してきた（非特許文献１７５）。ＧＲＡＦ１は、ＧＩＴ１との複合体において見つけられ、これは、Ａｒｆ６への生化学的関連を提供する可能性がある。ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路の初期のエンドサイトーシス膜は、Ｒａｂ８陽性であることが示され、前のデータと一致しており、類似する膜輸送経路においてＲａｂ８についての役割を支持する。それらがこれを実行する正確なメカニズムは知られていないが、低分子量Ｇタンパク質のＲａｂファミリーの各メンバーは、別個の膜輸送ステップを調節するように思われる。Ｒａｂ８は、以前に、「マクロピノサイトーシス」構造及びこれらから出現するＡｒｆ６結合管状膜と関連することが示された。さらに、ａ１インテグリンは、Ｒａｂ８陽性小管において見つけられ、ａ１インテグリンの輸送はまた、Ａｒｆ６依存性でもある（非特許文献���８４）。Ｒａｂ８はまた、ゴルジ体へのコレラ毒素送達に必要であることも示された。まとめると、これらの観察は、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路の調節においてＧＲＡＦ１、Ｒａｂ８、及びＡｒｆ６が共に作動することを示唆する。さらなる研究は、これらのタンパク質の間の関係に直接取り組むであろう。
【０１３０】
ＧＲＡＦ１及びダイナミン
ＧＲＡＦ１は、ダイナミンに直接結合し、細胞表面で（しかしＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドソーム膜上でではなく）ダイナミンと共に見つけられ、形質膜からのＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路エンドソームの分離におけるこのタンパク質についての役割を示唆する。ダイナミンＫ４４Ａ（ヌクレオチド加水分解が欠損）の過剰発現が、明白なＣＴｘＢ内部移行を可能にするので、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路は、ダイナミン非依存性であることが、以前に示唆されてきた。しかしながら、この「内部移行された」ＣＴｘＢは、管状コンパートメントにおいてダイナミンＫ４４Ａと共在する。ダイナミンＫ４４Ａ陽性小管の少なくとも１つのサブセットは、形質膜に結合することが知られており、これらの小管の中に閉じ込められたいかなるＣＴｘＢも、厳密な洗浄条件に対してでさえ部分的に隔絶されている可能性がある。ダイナミンＫ４４Ａ陽性小管が、実際に、進行ができない「閉じ込められた」コンパートメントであるのか又は誘発性の構造であるのかもまた不明である。そのような過剰発現実験は、研究を実行することができる前に、必然的に、かなり長い期間を必要とし、ダイナミンＫ４４Ａ過剰発現細胞において、明白なダイナミン非依存性エンドサイトーシス経路は、機能的にアップレギュレートされる可能性がある。ダイナミン依存性についてのこの問題を明確にするために、細胞は、ダイナミン機能の細胞透過性阻害因子であるダイナソア（dynasore）を用いて急性的に処理された。ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路を通しての管状エンドサイトーシスの消失に加えて、ＧＲＡＦ１は、管状エンドサイトーシス膜から基底複合体に再分配することが分かった。これと一致して、ダイナミンＫ４４Ａ発現細胞において、ゴルジ体へのＣＴｘＢ送達−ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス膜の有望な目的地−は、極めて阻害された（Macia, E. et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Dev Cell 10, 839-50 (2006)）。まとめると、これらのデータは、それは、このプロセスにおいて複雑な役割を有する可能性があるが、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路が、実際に、ダイナミン依存性であることを強く示唆する。特異的なスプライス変異体が原因であるかどうか及び免疫電子顕微鏡が、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路におけるその時空間的分布を発見するために使用されるかどうかについて取り組まれてもよい。
【０１３１】
ＧＲＡＦ１構造、カベオラ構造、及びカベオラ様構造
特異的なマーカーの不足は、電子顕微鏡によってクラスリン非依存性エンドサイトーシス経路を完全に識別する際の大きな困難さをもたらした。ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路は、以前に、カベオリン１陽性構造及びカベオリン１ネガティブ構造の両方を含むことが示された。本明細書における結果は、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスが、カベオリン１非依存性であり、カベオリン１ネガティブ膜のみを含むように、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路の規定の改善を示唆することを示す。著者は、エンドサイトーシスのこのルートが、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスとしてよりよく規定されることを示唆する。この経路は、フロチリン１によってマークされず、これはまた、カベオラ様構造からのエンドサイトーシスに関係してきた。少なくともＨｅＬａ細胞において、ＧＲＡＦ１除去に際して区別することができる管状エンドサイトーシス膜は、ほとんど又は全くないが、クラスリン、カベオリン１、及びＧＲＡＦ１非依存性である管状経路が、存在するかどうかは、まだ決定されていない。さらに、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ様経路はまた、ＧＲＡＦ１が通常欠損した細胞型においても観察される可能性があり、ＧＲＡＦ２又はＯＰＨＮ１などの、ＧＲＡＦファミリーの他のＢＡＲドメイン含有タンパク質が、それに沿って並ぶ可能性がある。
【０１３２】
ＧＲＡＦ１及び細胞骨格
ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路は、Ｆ−アクチン及び微小管細胞骨格ネットワークの両方の統合に依存性である。ＧＲＡＦ１は、ａ−アクチン（Ｆ−アクチンフィラメントを架橋するタンパク質）と免疫共沈降し、そのため、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ膜及びアクチン細胞骨格の間の直接的な連結を提供する可能性がある。低分子量Ｇタンパク質のＲｈｏファミリーは、アクチン及び微小管細胞骨格の両方の調節において広範囲に関係し、ＧＲＡＦ１は、活性ＲｈｏＧＡＰドメインを有する。主なＲｈｏＡエフェクター、Ｒｈｏキナーゼの阻害は、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路を通してエンドサイトーシスを急性的に増加させ、このキナーゼの活性が、通常、この経路を阻害することを示唆する。ＧＲＡＦ１インタラクトームは、ＲｈｏＡ活性よりＣｄｃ４２活性及びＲａｃ１活性を促進する、ＰＡＫ２及びＰＩＸを含む、低分子量Ｇタンパク質調節ができる他のいくつかのタンパク質を含む。ＲｈｏＡは、成熟接着斑の構築及び維持に不可欠であるが、Ｃｄｃ４２活性は、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路に必要であり、活性Ｃｄｃ４２は、ＧＲＡＦ１と共在する。そのために、ＲｈｏＡからＣｄｃ４２への活性低分子量Ｇタンパク質のバランスの変化は、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路進行を可能にするためのＣｄｃ４２を通しての許容的なシグナルに付随して、接着斑構築及び維持シグナルの消失（ＲｈｏＡ不活性化を通して）を可能にするために、ＧＲＡＦ１及びその相互作用タンパク質の作用を介して生じる可能性がある。ＧＲＡＦ１相互作用タンパク質ＧＩＴ１は、Ａｒｆ６をネガティブに調節する。膜輸送における役割に加えて、Ａｒｆ６はまた、アクチン細胞骨格の調節もでき、これは、ＷＡＳＰ及びプロフィリンの活性を調節する形質膜でのＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２レベルの大きな上昇をもたらすためのその能力を介する可能性が高い。Ａｒｆ６活性は、膜のひだ（ruffle）形成を誘発するのに十分であり、局所的な細胞骨格の変化をさらに誘発するために、これらの部位にＲａｃ１を動員する可能性がある。他のタンパク質は、膜を細胞骨格エレメントに直接連結するのに関係し、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路において初期に役割を果たす可能性がある。たとえば、Ｆ−ＢＡＲドメイン含有タンパク質Ｔｏｃａ１、Ｃｉｐ４、及びＦＢＰ１７は、膜及びアクチン細胞骨格の両方と直接相互作用することができる。ＢＡＲドメイン含有タンパク質ＳＮＸ９は、クラスリン媒介性エンドサイトーシスイベントに必要であり、マウス腎臓上皮（ＢＳＣ１）細胞における液相取り込みの約６０％に必要であることが最近示された。このタンパク質は、クラスリン被覆ピットだけではなく、形質膜の背側の表面からのマクロピノサイトーシスのクラスリン非依存性エンドサイトーシスに参加することが知られている循環的な背側のひだとも関連すると思われる（非特許文献３０８）。ＳＮＸ９は、Ｎ−ＷＡＳＰと関連し、Ｎ−ＷＡＳＰ／Ａｒｐ２／３媒介性アクチン重合を刺激する。ＳＮＸ９のＰＸドメインは、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２に結合し、エンドサイトーシスルートの間のわずかな区別を伴って、ＢＡＲドメインと共に、形質膜で、アクチン構築を膜変形に関連づける際に役割を果たす可能性がある。ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路の初期の担体は、アクチン依存性であるように思われ（非特許文献８８）、ＳＮＸ９の機能的相同体（又はＧＲＡＦ１自体）は、同様に、この経路において、アクチン構築を最初の膜変形に関連づける可能性がある。ＧＲＡＦ１及びＳＮＸ９の間で知られている生化学的関連はない。しかしながら、興味深いことには、ＳＮＸ９は、細胞の基底面上のＧＦＰ−ＧＰＩの斑点と共在し（これがＧＦＰ−ＧＰＩエンドサイトーシスと関連づけられるかどうかは示されていないが）、このタンパク質が、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路におけるＧＲＡＦ１の上流の役割を果たす可能性があることを示唆する。おそらく、このタンパク質は、膜マイクロドメイン及びＦ−アクチンに対するエンドサイトーシスに許容的なそれらの関連するタンパク質の非特異的な（しかし直接的な）連結に関与する。
【０１３３】
ＧＲＡＦ１及び接着部位解体
クラスリン非依存性エンドサイトーシス経路についてのメカニズムの見通しの不足に加えて、本発明者らがまた、そのような経路がインビボにおいて必要とされ、そのため、何が、それらを、クラスリン媒介性メカニズムとは機能的に異なるものにする理由をも理解していないことは明らかである。本明細書における結果は、クラスリン非依存性エンドサイトーシス経路についての第１の細胞生理学的機能を示す。ＧＲＡＦ１の非存在下において、そのためＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路を通してのエンドサイトーシスの非存在下において、接着斑の解体は、生じ得ない。さらに、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス小管は、接着の部位から生じ、ＧＲＡＦ１は、接着斑の解体のマーカーと共に、フォーカルコンプレックスの解体時に見つけられる。接着斑の解体が急性的に刺激される場合、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路を通してのエンドサイトーシスの量が増加する。さらに、ＧＲＡＦ１は、斑点及び小管において、ａ１−インテグリンと共在することを見つけることができる。ａ１−インテグリンは、Ｒａｂ８陽性小管において輸送されることが知られており、Ａｒｆ６依存性であり、これらのタンパク質は、それぞれ、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路をマークし、それに必要である。ＧＲＡＦ１の非存在下において、細胞は、正常よりも多くの接着斑を有し、そのため、それらの表面上により多くのインテグリンを有する。まとめると、これらの結果は、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路が接着部位解体に必要であること、及び、これが、この経路を介して入るインテグリン及びＧＰＩ連結タンパク質を含めた接着タンパク質のエンドサイトーシスを通して起こる可能性があることを強く示唆する。接着斑の解体は、微小管及びダイナミンに依存性であることが以前に示された。これらの発見と一致して、初期のＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス担体は微小管依存性であり、この経路を通してのエンドサイトーシスはダイナミン依存性である。接着斑の解体は、微小管の成長末端が接着部位になんらかの「放出因子」を送った後に起こること、及びダイナミンがこれらの位置で変則的な役割を果たすことが、以前に示唆された。これらの示唆は、公開されている知見と一致したが、接着部位解体がどのように生じるかに関して、新しいモデルが、今、提唱されなければならない。簡潔さのために、下記に示されるモデルは、接着斑の解体に必要であることが知られている、いくつかの生化学的イベントを無視するが、著者が知っている限りでは、この分野におけるすべての公開データと完全に一致する。接着斑及びそれらの形成を再検査することが最初に必要である。これは、インテグリンをアクチン細胞骨格に連結するタンパク質複合体を構築するための、連結されたインテグリンから細胞の内部への単純なシグナル伝達プロセスと以前に考えられていた。これは、ほぼ確かに、プロセスの複雑性の粗末な過小評価である。細菌外毒素に対する少なくともいくつかの糖脂質受容体が、接着部位において豊富であることが知られている。さらに、多くの形質膜マイクロドメインが、周囲のマトリックス成分への接着によって調節されることが示された。これは、細胞外マトリックス成分によるインテグリンのクラスター形成からの下流の効果による可能性がある。インテグリン自体の膜貫通ドメインは、特異的なマイクロドメイン結合脂質に優先的に結合する可能性があり、したがって、マトリックス結合によるこれらのタンパク質のクラスター形成は、膜マイクロドメインの最初の形成を可能にする可能性がある。その代わりに、他のマイクロドメイン結合タンパク質もまた、マトリックスによってクラスター形成される可能性があるので（たとえばＧＰＩ連結タンパク質、これらの多くは接着に関与する）、これらは、マイクロドメインの最初の形成を刺激する可能性がある。一旦、そのような部位が形成されたら、結合活性相互作用は、そのような膜と結合することを選好する他のタンパク質の動員を可能にし、そのような部位の維持及び成長を可能にするであろう。インテグリン連結はまた、マイクロドメイン結合脂質の局所的な蓄積をさらに間接的に促進する可能性がある細胞内シグナル伝達カスケードをも刺激する。接着部位へのそれらの密接な連結により、これらのマイクロドメインは、接着斑形成及び機能に推測上必要である。連結されたインテグリンを通してのシグナル伝達は、多くの細胞質タンパク質の動員を可能にし、これは、成長するフォーカルコンプレックス／接着を形成し、最終的に、ＲｈｏＡ依存性の方法でのアクチンストレスファイバー形成の後に、成熟接着斑が形成される。このポイントで、成熟した接着の形質膜は、マイクロドメイン結合成分で豊富になり、インテグリンは、細胞外マトリックス及びアクチン細胞骨格の間の間接的であるが強い結合を形成する。接着斑は、非常に動的な構造であり、推測上、細胞外の手がかり及び適切なマトリックス成分の局所的な利用可能性に応じて、絶えず再構築される。おそらく、この再構築（又は活性な維持）のうちのいくらか、たとえば、接着部位の細胞質成分のリン酸化並びにインテグリン及びアクチンの間の連結に対するこれらのイベントの下流の効果を通して、局所的に生じる可能性がある。ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス小管は、相対的に長い生存期間を有することが知られている、成熟した接着から生じ、したがって、この絶え間ない再構築（活性な解体に対立するものとして）はまた、これらの部位からの恒常的なエンドサイトーシスによって提供される可能性がある。これらの接着部位において豊富な脂質は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスと最も関連するものを含む。そのため、これらの部位は、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシスについて観察されるように、クラスリン非依存性エンドサイトーシスイベントが優先的に起こる、エンドサイトーシスによる門戸を提供する可能性が最も高い。そのような恒常的なエンドサイトーシスは、それらの形質膜環境の調節を通して、接着タンパク質自体の性質に対して効果を有する可能性が高いであろう。それはまた、この部位の維持が生じるために、接着部位へのこれらのタンパク質のさらなる動員（及びそれらの続く連結）を必要とする膜貫通又は膜結合接着タンパク質自体をも内部移行する可能性がある。エンドサイトーシス経路を通して、成分が徐々に消失するのと一致して、接着斑の解体（活性な解体）は、断片的な方法で生じる。活性な接着部位解体のプロセスの間に、推測上、これらの接着部位と結合したマイクロドメインの内部移行を通して、規則的な形質膜の大部分が失われる。これは、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路を介して、接着部位結合脂質のエンドサイトーシスを通して生じる可能性が高い。活性な解体の間に、恒常的に生じるものよりもはるかに大きな規模である、より大規模なエンドサイトーシスが、結果として起こる。接着部位形成を刺激したものを含む（たとえばインテグリン）、より多くの接着部位タンパク質が、活性な維持のフェーズの間よりも、この経路を介して内部移行されるであろう。細胞質接着結合タンパク質のその部位への動員のためのシグナルは、そのため、失われ、接着マーカーは、最終的に、もはやこれらの部位で見つけられない。この消滅する部位での形質膜は、周囲マトリックスへの接着の消失に付随して、無秩序になる。活性な接着解体は、接着再編成の付随する阻害を必要とする可能性があり、これは、接着タンパク質の局所的な消失によって又はこれらの部位での低分子量Ｇタンパク質のバランスの変化によって提供される可能性がある。Ｒｈｏキナーゼは、接着斑の維持に必要とされ、それらの活性な解体及びＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路を通してのエンドサイトーシスを阻害するので、このキナーゼは、エンドサイトーシスによる手段による活性な解体が生じるために、局所的に不活性化される必要がある可能性が高い。Ｒｈｏキナーゼは、ＧＴＰ結合ＲｈｏＡによって活性化され、たとえばＧＲＡＦ１によるこの部位でのＧＴＰのＲｈｏＡ加水分解の刺激は、これが局所的に生じることを可能にする可能性がある。実際に、ＧＲＡＦ１のＧＡＰドメインは、その機能に必要とされる。これに加えて、Ｃｄｃ４２及びＲａｃ１の活性を促進するＰＩＸ及びＰＡＫ２は、解体している接着部位で、これらのタンパク質に有利なように、局所的な低分子量Ｇタンパク質のバランスを変化させるであろう。
【０１３４】
ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ対クラスリン媒介性エンドサイトーシス
上記に示されるモデルは、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路が、主として、脂質輸送経路であり、タンパク質は特異的な形質膜脂質とのそれらの結合によってこの経路を介して内部移行されるのみであることを示唆する。実際に、細胞外液は別にして、この経路について同定されるタンパク質積荷が、マイクロドメインに結合する。特定の脂質輸送経路は、クラスリン媒介性エンドサイトーシスルートと明確に対照をなし、これは、エンドサイトーシス機構によってクラスター形成された積荷を移入し、主としてタンパク質自体の特異的な輸送のための経路である可能性が高い。クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、およそ一定の直径の球状の小胞の形成を通して生じ、十分な数の特異的な積荷分子が、クラスリン被覆ピットにおいてクラスター形成された場合のみ生じるように思われる。さらに、この経路を介して入る多くの積荷は、主としてエンドソームコンパートメントからシグナル伝達するように思われる。おそらく、これは、タイマーのようなメカニズムを通してシグナル伝達の調節を可能にする。受容体連結は、受容体を活性化し、次いでクラスリン被覆ピットに動員され得るであろう。この段階は、受容体からの細胞内シグナル伝達にほとんど貢献しない。一旦、特定の数の活性化受容体が、ＣＣＰにおいて蓄積したら、エンドサイトーシス機構は、膜からのその陥入及び切断を誘発し、クラスリン被覆小胞を形成する。シグナル伝達は、そこで、この小胞の輸送と協力して進行することができる。シグナル伝達は、この受容体が、形質膜に再循環される、分解のためにリソソームコンパートメントに送られる、又はそのリガンドの解離を可能にするために酸性化される（エンドソームコンパートメントにおいて）まで継続するであろう。エンドサイトーシス（生産的なシグナル伝達が始まる）及びそのようなイベント（シグナル伝達が終了する）の間の時間は、各小胞タイプについておよそ一定である可能性が高いであろう。輸送は、積荷に駆動される方法で生じ、プロセスの多用途性及び特異性を可能にする。この新規なモデルに従って、特定の数の活性化受容体は、そのため、シグナル伝達カスケードを通して単一量の情報を細胞に送るであろう。そのようなモデルは、シグナル伝達が、エンドサイトーシスルートを通してどのように効率的に調節されるか及び細胞外環境の性質に関する細胞の内部に対する情報処理が、どのように生じる可能性があるかを説明するであろう。他方のスペクトルで、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路は、タンパク質のための直接的なシグナル伝達基盤としてではなく、情報処理を可能にする波及効果を有する脂質ホメオスタシスの方法として示される。おそらく、この経路は、形質膜の液体の無秩序な領域よりも、液体の秩序的な領域（マイクロドメイン）に対するそれらの優先的な親和性を介して以外に、タンパク質積荷を特異的にクラスター形成するための手段を有していない。この経路は、このタイプの内部移行イベントのための形質膜の液体の秩序的な領域の許容的な性質を通して進行する。それが正確に調節及び調整されているのではなく、むしろ、刺激された場合にエンドサイトーシスプロセスが生じるように指示するのが、これらの領域自体の性質であることは言うことではない。ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路のエンドソームコンパートメントにおいて見つけられるタンパク質からシグナル伝達が生じることができるかどうかは知られていない。腫瘍性タンパク質ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２上皮成長因子受容体ファミリータンパク質）が、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス膜において見つけられ、この発見は、そのような問題が、細胞質シグナル伝達ドメインとの他の積荷の同定のように、直接取り組まれることを可能にする可能性があることが最近示された。ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス膜の無傷の生化学的単離のための方法を確立することができる場合、（それらの脆弱性を考慮すれば、これはありそうもないが）、プロテオミクスアプローチは、そのような新規な積荷を明らかにする可能性がある。そのエフェクターキナーゼを通してのシグナル伝達ＲｈｏＡの阻害は別にして、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路が、どのように特異的に活性化される可能性があるのかは知られていない。この経路のための許容的な脂質が、接着の部位においてクラスター形成されるので、細胞内シグナル伝達タンパク質が、これらの部位に直接影響し得、これらが、マイクロドメイン自体又は低分子量Ｇタンパク質若しくはＧＲＡＦ１などの、この経路が進行するのに必要であるタンパク質の動員に影響を与える可能性がある。シグナル伝達について許容的であるので、そのため、クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、それ自体、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路の上流で作用する可能性があるが、この経路の阻害は、なお、クラスリン非依存性内部移行を可能にし、したがって、クラスリン非依存性エンドサイトーシスによる調節のためのありそうもないメカニズムのままとなっている。さらなる研究は、これらの関係について取り組むであろう。ここで報告された志賀毒素取り込みに関する研究は、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ及びクラスリン媒介性エンドサイトーシスルートが、細胞内の別個の位置に積荷を向け、そのため、これらは、重複した経路ではないという証拠を提供した。しかしながら、クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、志賀毒素の内部移行においてＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路を代償することができ、他のＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシスによる積荷が、通常、両方のルートによって内部移行することができるという観察と一致して、これらの経路の間で積荷の重複が存在することを示唆する。積荷タンパク質が、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ又はクラスリン媒介性エンドサイトーシス経路を介して入るかどうかは、形質膜の異なる相に対するその選択性、及びタンパク質がクラスリン媒介性エンドサイトーシス機構と直接相互作用する能力に依存性である可能性が高い。
【０１３５】
ＧＲＡＦ１及び細胞遊走
細胞遊走における膜輸送の役割は、激しく議論されてきた。重要な役割についての最も説得力のある証拠は、キイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）の温度感受性突然変異体の開発及び分析から得られ、Ｎエチルマレイミド感受性因子（ＮＳＦ，Nethylmaleimide sensitive factor；一旦、膜の融合が生じたら、ＳＮＡＲＥ複合体の解体に必要であり、そのため、膜輸送に必要である）の機能は、温度を変化させることによって急性的にオン／オフにすることができる。これらの細胞は、なお、ＮＳＦ機能の非存在下において走化性の刺激に応答することができ、これらの刺激に向かって先端をもたらす（これは、アクチン依存性の方法で生じる）。しかしながら、これらの細胞は、これらの刺激に向かって移動せず、膜輸送が、自由な遊走に対する進行に必要とされることを強く示唆する。細胞内膜流動の方向は、通常、刺激の方向に向かうものであり（形質膜が、反対方向に移動することが示されたので）、これは、多くの場合、細胞の表面積の大きな変化が伴うこともまた示された。この分野における証拠の最大の主要部は、接着受容体のエンドサイトーシスのための役割（おそらく遊走細胞の後部から）及びさらなる接着イベントに参加するための、膜へのそれらの最終的な再循環（おそらく、膜がマトリックスと直接接触する先端で）を支持する。しかしながら、それが成長することを可能にする膜に先端を供給するこの再循環が、同じ経路を通して生じるかどうかは知られていない。細胞遊走に必要とされる細胞骨格の変化の達成における低分子量Ｇタンパク質の役割は、激しい研究の対象となった。大量のＦアクチンの形成は、細胞の先端の形成に必要とされ、この部位で連結された受容体からのシグナル伝達は、Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質及びそれらのアクチン核形成エフェクターを通して、これらのフィラメントの形成を指示する。これらのシグナルの分子トランスデューサー及びこれらが作動するメカニズムは、十分に理解されている。しかしながら、そのようなプロセスが、膜輸送とどのように協力するかは知られていない。細胞の先端に向かう、正味の膜輸送があると思われるので、この部位への極性化エキソサイトーシス、この部位からのエンドサイトーシスの阻害、又はその両方が生じなければならない。遊走細胞において活性なＲｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質の極性化が存在し、これらのタンパク質は、以前に論じられるように、エンドサイトーシスイベントに直接関係した又はそれに許容的であることが示された。これらの活性の極性化は、極性化エンドサイトーシスが生じることを可能にする可能性がある。極性化された搬出が、生じる可能性があるメカニズムは、知られていないが、シナプスが、極性化されたエキソサイトーシスの高度に調節された部位であることがよく知られている領域であるので、これは、確かに制御することができることは明らかである。これはまた、低分子量Ｇタンパク質バランスにおける局所的な変動によっても調節される可能性がある。クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、細胞の先端に向かって豊富になり、したがって、必要とされる膜再分布を提供する役割を果たしそうにないが、おそらく、走化性の刺激の適切な伝達を可能にする。これ���、ＣＭＥが、細胞遊走調節において不可欠な成分である理由である可能性が高い。多くが知られていないにもかかわらず、細胞遊走は、膜輸送、接着ターンオーバー、及び低分子量Ｇタンパク質調節の複雑な調整を必要とすることが明らかになっている。そのインタラクトームにおけるＧＲＡＦ１の位置は、これらのプロセスの３つすべてを調整するために、タンパク質を理想的な生化学的／ネットワーク生物学的位置に配置する。さらに、本明細書において示される研究は、ＧＲＡＦ１が、細胞遊走、エンドサイトーシス、及び接着斑の解体に必要であることを示し、これらのプロセスが、直接関連づけられることをさらに示唆する。接着斑は、遊走細胞の後部で解体され、新しい接着は、膜が輸送される先端で形成される。細胞の後部からの、ＧＲＡＦ１エンドサイトーシス経路及びＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路による接着斑のエンドサイトーシスによる解体は、それらの先端へのこれらの膜（及び関連する接着受容体）の極性化された輸送と共に、細胞遊走が、進行する可能性がある見事なメカニズムを提供するであろう。これは、細胞後部から前方への膜の直接的な輸送によってもたらされない可能性が高く、細胞は、ソーティングが生じる可能性がある中間コンパートメントとしてゴルジ装置（ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路膜にとっての有望な目的地）を使用する可能性がある。インテグリンは、クラスリン非依存性メカニズムによって内部移行され得ることを示され、この研究は、それらが、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路を介して入ることを示唆する。さらに、インテグリンは、遊走細胞の後部から、ゴルジ装置を通して先端へ再循環すると思われる。膜輸送及び接着受容体サイクリングの極性化は、細胞骨格の変化と協力して、シグナル伝達低分子量Ｇタンパク質によって調整される可能性が高い。これらのプロセスの相互関係は、実験的に研究することが非常に複雑であり、困難である（これらのうちのいずれかに対する干渉が、他方に対する波及効果を有するので）。システム生物学及び情報科学アプローチは、さらに行われるであろう実験が基づき得る適したモデルを提供するために必要とされるであろう。本明細書において示される研究において使用される細胞型は、相対的に非極性化細胞であり（そのような細胞に関する研究に由来する多くの文献を考慮すれば、膜輸送を特徴づけるのに最も容易である）、より極性化された細胞及び走化作用を受け得る細胞におけるＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路に関する研究はまた、これらの未解決の問題のうちのいくつかに答えるのを助ける可能性がある。白血球遊走におけるこの経路を検査する予備実験は、進行中である。
【０１３６】
ＧＲＡＦ１ファミリーメンバー
ＧＲＡＦ１は、ＧＲＡＦ２、ＯＰＨＮ１、及び新規なＧＲＡＦ３を含む、ＢＡＲドメイン含有タンパク質のより広いサブファミリーの一部である。このファミリーの少なくとも１つのメンバーは、ハエからヒトまで保存されており、このファミリーが、後生動物において重要な役割を果たすことを示唆する。ハエにおけるこのファミリーの１つメンバーからのヒトにおける少なくとも４つへの分岐は、遺伝子重複イベントが、進化を通じて異なる機能に個々に選択される、このファミリーのいくつかの遺伝子をもたらしたことを示唆する。種の間の、ファミリーメンバーにおけるドメイン構造及び「保存」残基の密接な関係は、このファミリーが、収束進化メカニズムによってではなく、分岐進化メカニズムによって進化したことを強く示唆する。ＧＲＡＦ１及びＧＲＡＦ２は、ＯＰＨＮ１とよりも、より密接に互いに関係する。ここで示される研究は、これらのタンパク質が、推測上別個の細胞型において、インビボにおける類似する機能を有することを示した（これは、確立されていないが）。確かに、ＧＲＡＦ２は、この消失が研究された細胞型においてＧＲＡＦ１の消失を代償しない。しかしながら、ＧＲＡＦ１及びＧＲＡＦ２のＳＨ３ドメインは、共に、ダイナミン及びＦＡＫに結合し、それらが、類似するエンドサイトーシスルートを調節することを強く示唆する。これらのタンパク質及びここで同定された新規なＧＲＡＦ３タンパク質の間の正確な関係は、さらなる研究の対象になるであろう。ＧＲＡＦ１は、広く発現されるが、それは、脳に豊富であり、それが調節するのに必要とされるプロセスは、この臓器系の細胞において最も共通していることを示唆する。星状細胞は、非常に遊走性の細胞であり、ＧＲＡＦ１が、これらの細胞における豊富な管状コンパートメントについて見られ、星状細胞の遊走が、神経細胞ネットワーク機能の維持にとって重要である理由を示唆する。ＯＰＨＮ１もまた、脳に豊富なタンパク質であるが、主にニューロンにおいて見られ、ここで、それは、樹状突起棘形態形成（非特許文献２７８）に不可欠であり、それによって、シナプス可塑性において役割を果たす可能性が高い。この機能がタンパク質のＲｈｏＧＡＰ活性によって提供されることが示唆された。本明細書における研究は、ＯＰＨＮ１が、膜輸送タンパク質であり、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路におけるＧＲＡＦ１によって安定化される膜に類似した膜に結合し、安定化することを強く示唆する。実際に、樹状突起棘が成長するために、膜は、細胞遊走が進行することを可能にする輸送プロセスに類似した方法で、これらの部位に輸送されなければならない可能性が高い。過剰発現される場合、ＧＲＡＦ１及びＯＰＨＮ１の脂質結合ドメインは、類似する膜にインビボにおいて結合する。さらに、ニューロンにおけるＧＲＡＦ１過剰発現は、樹状突起分岐の広範な成長をもたらす。これらの発見は、これらのタンパク質が、別個の細胞型においてとはいえ、通常、インビボにおいて、類似する機能を実行する可能性がある。興味深いことには、ＧＩＴ１／ＰＩＸ複合体はまた、樹状突起棘形態及び細胞骨格の再構築を必要とする他のイベントにとって不可欠であることも示された。しかしながら、ＯＰＨＮ１は、他のファミリーメンバーにおいて存在するＳＨ３ドメインを欠くので、これは、一般化を困難にし、そのため、ニューロンにおける膜輸送に対するＯＰＨＮ１の正確な貢献は、直接的な実験の調査を必要とする。
【０１３７】
ＧＲＡＦ１ファミリーメンバー及び疾患
ＧＲＡＦファミリーメンバーの間に多くの類似性があることは明らかであるが、一方のメンバーの発現が、失われた又は低下した場合、それらが、互いに代償することができない（少なくとも完全に）ことは、明らかである。ＯＰＨＮ１における突然変異は、Ｘ連鎖性精神遅滞を有するヒト患者において頻繁に見つけられる。ＯＰＨＮ１関連精神遅滞は、非症候性状態であると以前に考えられていたが、これらの患者の脳は、様々な関連する臨床的及び構造的異常を有することが現在示されている。ＭＲＩによって、特定のパターンの小脳の発育不全及び皮質−皮質下線維の萎縮が、罹患者において見つけられた。これらの患者は、誕生後に低血圧になり、運動機能の発達における遅れ並びに小脳徴候及び中から重度の精神遅滞を有する。これらの徴候が、適切な樹状突起棘形態形成におけるこのタンパク質の必要性にどのように関係するのかは、知られていないが、適切な結合をなさないニューロンは、発達の間にアポトーシスを受けることが知られており、おそらく、これは、少なくとも、これらの患者の脳における発育不全及び萎縮の一因となる。ＧＲＡＦ１は、リンパ系起源の細胞において発現され、１つのＧＲＡＦ１対立遺伝子の欠失、切断、又は転座は、急性骨髄性白血病及び骨髄異形成症候群を有する患者において、他の対立遺伝子の突然変異と同時に見つけられる。これらの突然変異の性質は、ＧＲＡＦ１のＧＡＰドメインの機能を阻害することが予測されるもの及び本明細書における研究において特徴づけられるドミナントネガティブタンパク質に類似する切断タンパク質をもたらす可能性が高いフレームシフトを含む。急性骨髄性白血病又は骨髄異形成症候群を有する患者からの骨髄の生検材料の約３８％パーセントは、タンパク質発現の低下と関連するＧＲＡＦ１プロモーターメチル化を示す。通常、この部位は、メチル化されていない。急性骨髄性白血病は、増殖能力を保持し、組織幹細胞の内在性の挙動のようにあまり適切に分化しない病原性「芽細胞」の増殖の増加によって特徴づけられる。ＧＲＡＦ１発現の消失は、インビトロにおいて細胞増殖に対する観察可能な効果を有しておらず、したがって、このタンパク質は、細胞周期調節における直接的な役割を有しそうもない。興味深いことには、病原性芽細胞の表面上で大量にアップレギュレートされていることが見つけられるＣＤ４４に向けられるモノクローナル抗体の腹腔内の注射は、疾患のマウスモデルを根絶することができることが最近示された（ヒト急性骨髄性白血病細胞は、宿主マウスに移植される）。これは、ＣＤ４４阻害細胞が、増殖を生じさせるために、周囲のニッチ（滞在が必要とされる）を見つけることができないことから生じる可能性が高い。細胞の表面上のタンパク質の発現の増加は、発現の増加又はそのタンパク質のエンドサイトーシスの欠陥に起因し得る。ここで示される結果は、ＧＲＡＦ１発現の低下が、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路の機能の阻害によって、白血病誘発を促進する可能性があることを示唆する。これは、芽細胞が結合し、増殖が生じる可能性がある適したニッチに残るのに必要とされるプロセスである、細胞の接着の増加をもたらす、タンパク質の表面発現の増加をもたらすであろう。このモデルにおいて、ＧＲＡＦ１発現の消失は、白血病誘発を促進するであろうが、癌細胞が増殖する能力を増加させる可能性がある又は分化するそれらの能力を阻害する可能性がある、腫瘍遺伝子の発現の増加などの突然変異を発生させることを最初に必要とする可能性がある。上記のモデルが真実である場合、それは、ＧＲＡＦ１機能及び発現が正常であると予測される急性骨髄性白血病を有する患者又はＧＲＡＦ１機能が正常であるが、発現が、プロモーターメチル化を通して低下している患者のサブセットにとって可能性のある（かつ安価な）治療上のアプローチを示唆する。主なＲｈｏＡエフェクターＲｈｏキナーゼの阻害は、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣエンドサイトーシス経路（これは、これらの患者からの病原性の細胞において欠損していると予測される）をアップレギュレートすることができることが示された。そのため、そのような阻害因子を用いる患者の治療は、それらの病原性の細胞上の接着受容体の内部移行を増加させ、それによって、それらのニッチへのこれらの細胞のホーミングに必要とされる接着（１又は複数の）ステップを阻害する可能性がある。そのような阻害因子、ファスジルは、最近、急性虚血性発作のための臨床試験における試験に成功しており、無毒性であることが示された。この阻害因子は、今後の研究において、急性骨髄性白血病のマウスモデルにおいて試験されるであろう。正常なＧＲＡＦ１機能は、このアプローチが成功するのに必要とされるので、ドミナントネガティブとして作用することが予測されるＧＲＡＦ１突然変異を有する患者において、いかなる利点にもなりそうにない。腫瘍細胞は、周囲の組織へのそれらの浸潤及び転移に必要な遊走性の表現型を獲得する。そのため、一目したところ、造血細胞における腫瘍抑制因子としてのＧＲＡＦ１の役割は、その遊走促進性の役割を考慮すれば、対照的に見える。しかしながら、これは、骨髄由来の癌及びそれらの固形臓器相当物の間の重要な差異と関連して考慮されなければならない。骨髄において、細胞は、脾臓などの離れた部位において分解された血液細胞の正常な補充の一部として血行路に絶えず放出される。誕生及び放出のこのサイクルは、推測上、増殖を増加させる骨髄における前駆細胞における単一突然変異が、多くの場合、病原性となるのに十分である理由である。これは、転移するために多くの障壁を破らなければならない固形臓器悪性腫瘍の進行と全く対照的である。固形臓器悪性腫瘍は、それらの増殖を増強し、抗増殖シグナルを阻害し、アポトーシスシグナルを阻害し、栄養素を送り、かつ代謝老廃物を除去するために新しい血管の形成を誘発する突然変異を獲得する。その後、それらは、転移が、リンパ液又は血管へのそれらの遊走、それに続く、標的部位への接着、及びこの組織への管外溢出を通して生じ得る前に、遊走性になり、周囲の組織及び基底膜に浸潤するために突然変異を蓄積する。これは、事実上、白血病誘発の間に生じるイベントのシリーズよりもはるかに複雑なプロセスであり、多くの突然変異が協調して生じることを必要とする。これは、ＧＲＡＦ１が、白血球において腫瘍抑制因子として作用するが、それはまた、固形腫瘍の悪性進行の遊走及び浸潤のフェーズの間に癌遺伝子として作用する可能性があることを示唆する（ＧＲＡＦ１が、細胞遊走をポジティブに調節し、それに必要とされるので）。これは、これから集中的に研究されるが、ごく最近の研究は、ＧＲＡＦ１発現が原発性肺腺癌からの脳転移においてアップレギュレートされることを報告した。さらに、ＯＰＨＮ１は、結腸腺癌及び浸潤性胃がんにおいてアップレギュレートされることが示されている。ＧＲＡＦ２及びＧＲＡＦ３における突然変異もまたヒト疾患に関連づけられるかどうかはこれから調査される。
【０１３８】
本発明者らは、ＣＬＩＣ／ＧＥＥＣ経路を実験的に操作するための新規な方法を開示する。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１ａ−ｄ】ＧＲＡＦ１が、大量の膜再分布ができる、広く用いられている管状エンドサイトーシス経路に局在化することを示す図である。ａ、ＧＲＡＦ１のドメイン構造及び導入された機能的突然変異の部位（＊）。ｂ、ＰＨドメイン及びＧＡＰドメインに向けられるポリクローナル抗体を使用する免疫ブロット法によって検出される、培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫）細胞、ＨｅＬａ（ヒト線維芽細胞）細胞、Ｋ５６２（ヒト慢性骨髄性白血病）細胞、及びＭＥＦ（マウス胚線維芽細胞）細胞における成体ラット脳におけるＧＲＡＦ１の異なる形態及びそれらの差異的な存在／非存在。ｃ、初代星状細胞及びＨｅＬａ細胞における内在性ＧＲＡＦ１の管状及び斑点状の局在性を示す共焦点顕微鏡写真。ｄ、ＧＲＡＦ１陽性小管は、５分後に膜染料ＤｉＩを用いて同時標識することによって示されるように、形質膜に由来する。これらの構造は、１及び５分後に、内部移行されたデキストランを用いて広範囲に同時標識される。
【図１ｅ−ｆ】ｅ、ｓｉＲＮＡ治療が、ＧＲＡＦ１の発現を効率的に低下させることを実証する免疫ブロット。ｆ、ＧＲＡＦ１が枯渇した細胞は、ＦＩＴＣ標識デキストランの取り込みの減少によって示されるように、液相エンドサイトーシスにおける主な低下を示す（コントロールｓｉＲＮＡ（ｎ＝５）、ｓｉＲＮＡａ（ｎ＝８）、又はＡＰ２  ｓｉＲＮＡ（ｎ＝３））。誤差バーは、標準誤差を示す。
【図１ｇ−ｈ】ｇ、コントロールｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡａでトランスフェクトし、次いで、デキストランと共にインキュベートされたＨｅＬａ細胞の落射蛍光顕微鏡写真。ＧＲＡＦ１枯渇細胞において観察される管状デキストラン取り込みの大きな低下に注意されたい。
【図２ａ−ｂ】ＧＲＡＦ１は、非常に曲がった、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２が豊富な膜及びフォーカルコンプレックス／接着斑解体機構の成分と相互作用することを示す図である。ａ、ｂ、Ｎ末端ＢＡＲドメイン及びＰＨドメインは、リポソーム共沈降アッセイにおいて、より小さなサイズのリポソーム及びホスホイノシチドＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２を含有するリポソームへの結合に対して選択性を示す、ＧＲＡＦ１の膜結合領域を構成する。（ａ）における誤差バーは、各条件についての９５％信頼区間（ｔ−検定によって計算）を示す。
【図２ｃ−ｄ】ｃ、ラット脳細胞質ゾルからのＧＲＡＦ１の免疫沈降は、質量分析によって同定され、ウェスタンブロットによって確認されるように、ＧＲＡＦ１／ダイナミン１／ＧＩＴ１複合体を明らかにする。ｄ、ＧＲＡＦ１のＳＨ３ドメインは、ラット脳細胞質ゾルからのプルダウンアッセイにおいて、ダイナミン、ＦＡＫ、ｃａｓｋｉｎ１、及びシナプトジャニンに結合する。（右下）ラット脳細胞質ゾルからのｐＦＡＫの免疫沈降の後のＧＲＡＦ１の免疫ブロット。
【図２ｅ−ｆ】ｅ、接着斑ターンオーバー、低分子量Ｇタンパク質調節、及びＧＲＡＦ１媒介性膜輸送を細胞遊走のための機構に関連づける相互作用を示すＧＲＡＦ１インタラクトームの略図。点線は、他の表されるタンパク質の機能を直接活性化する／阻害することが知られている相互作用を示す。ｆ、ＨｅＬａ細胞におけるＧＲＡＦ１の過剰発現は、過剰発現細胞の周辺での、典型的なビンキュリン染色の消失によって示される、接着斑のダウンレギュレーションと一致した、大きな形態学的変化を誘発する。
【図３ａ−ｄ】ＧＲＡＦ１は、フォーカルコンプレックス／接着斑ターンオーバー及び細胞遊走に必要とされることを示す図である。ａ、パキシリンについて同時染色されたＨｅＬａ細胞における内在性ＧＲＡＦ１の落射蛍光顕微鏡写真（左パネル）又は過剰発現ｍｙｃタグつきＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨタンパク質（右パネル）。ＧＲＡＦ１陽性管の周囲の端が、接着斑の部位であることに注意されたい（矢印）。ｂ、ＧＲＡＦ１斑点は、成熟接着斑でではなく、フォーカルコンプレックスでビンキュリンと共に共在する（矢印）。ｃ、ＧＲＡＦ１のＧＴＰアーゼ活性化欠損突然変異体の過剰発現（ＧＦＰ−ＧＲＡＦ１  Ｒ４１２Ｄ）は、フォーカルコンプレックスでのビンキュリン及びＧＲＡＦ１の共在の量の大きな増加をもたらす。ｄ、ＲＯＣＫ阻害因子Ｙ−２７６３２によるＨｅＬａ細胞における接着斑ターンオーバーの誘発は、ＧＲＡＦ１陽性小管の数及びフォーカルコンプレックスへのＧＲＡＦ１の局在性を増加させ、それは、１−インテグリンのクラスターと共に共在する（囲んだエリアのマージを参照されたい）。
【図３ｅ−ｇ】ｅ、ＨｅＬａ細胞におけるＧＲＡＦ１発現の除去は、ビンキュリン陽性核内接着斑の数における大きな増加をもたらす。ｆ、（ｅ）からの細胞の定量化（コントロールｓｉＲＮＡ処理細胞についてｎ＝７８、ＧＲＡＦ１  ｓｉＲＮＡ処理細胞についてｎ＝９１）。ｇ、電気的にｉ（ｃ）誘発され、ｉ（ｃ）モニターされる創傷治癒アッセイの原理。コンフルエントＨｅＬａ細胞層の電気的な創傷治癒からの回復を示すグラフ、この中の細胞は、前にコントロールｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡａを用いてトランスフェクトされた。斜線のエリアは、各条件についての、平均値より上の及びそれより下の標準偏差を表す。
【図４】ＧＲＡＦ及びＯＰＨＮ１のファミリーメンバーの進化の図を示す図である。より詳細には、これは、一連の種からのＧＲＡＦ１様配列及びＯＰＨＮ様配列（つまりＧＲＡＦタンパク質ファミリーメンバー）について予測される（相対的に計られる）進化論的な距離を表す系統樹を示す。配列の起源の種のみが示される。同じグループにおけるタンパク質ノードは、同じ色で表される。高等真核生物において存在する３つの主なＧＲＡＦファミリー及び脊椎動物系列において存在するＧＲＡＦパラログの第４のファミリーとしてのＯＰＨＮファミリー配列の存在に注意されたい。ＧＲＡＦ１／ＧＲＡＦ２／ＧＲＡＦ３／ＯＰＨＮタンパク質ファミリーに明らかに入らない配列については、これらの配列において予測されるＳＨ３ドメインの存在又は非存在が注目される。
【図５】ＧＲＡＦ及びＯＰＨＮ１のファミリーメンバーの進化の図を示す図である。より詳細には、これは、図４において示されるように、一連の種からのＧＲＡＦ１様配列及びＯＰＨＮ様配列について予測される（相対的に計られる）進化論的な距離を表す系統樹を示す。配列の受託番号をここに示す。
【図６】ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスメカニズム及びクラスリン依存性エンドサイトーシスメカニズムのモデルを示す図である。ａ、小胞エンドサイトーシスメカニズムに対して、管状に関与する異なるエンドサイトーシスタンパク質を強調する、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスメカニズム及びクラスリン依存性エンドサイトーシスメカニズムの類似の性質を表す概要モデル。下のパネルは、低分子量Ｇタンパク質及びＧＲＡＦ依存性の方法で生じる、解体接着斑の局所的な解剖学的構造を表す。簡潔さのために、細胞骨格のエレメントは、省略する。
【図７】ＧＲＡＦ１媒介性輸送は、クラスリン依存性エンドサイトーシスと異なることを示す図である。ａ〜ｄ、示され、クラスリン（ａ）、トランスフェリン受容体（ｂ）、１０分間、３７度でエンドサイトーシスされたトランスフェリン（ｃ）、又は３７度で５分間、エンドサイトーシスされたＣＴｘＢ（ｄ）について同時染色された非トランスフェクトＨｅＬａ細胞又はｍｙｃタグつきＧＲＡＦ１を過剰発現するＨｅＬａ細胞共焦点顕微鏡写真。内在性ＧＲＡＦ１も過剰発現ＧＲＡＦ１も、クラスリン依存性エンドサイトーシスマーカーと共在しないが、ＣＴｘＢは、ＧＲＡＦ１陽性小管において見つけられることに注意されたい。ｅ、３７度、１５分間のトランスフェリンとのインキュベーションの前に、ＧＲＡＦ１に対するコントロールｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを用いて処理されたＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡写真。トランスフェリン取り込みが、ＧＲＡＦ１を枯渇させられた細胞において不変であることに注意されたい。
【図８】ＧＲＡＦ１媒介性輸送は、ダイナミン及び低分子量Ｇタンパク質に依存性であることを示す図である。ａ、固定並びにＧＲＡＦ１、デキストラン、及びパキシリンについての染色の前にさらに１５分間、これらの細胞にデキストランを追加する前に（ＤＭＳＯ／ダイナソア濃度は、最後まで保持）、１５分間、媒体（ＤＭＳＯ）又は５０μＭダイナソアを含む培地と共にインキュベートされたＨｅＬａ細胞。ダイナソア処理細胞における、ＧＲＡＦ１陽性管状構造及び細胞の周辺（ここで、それは、主に、細胞の基底面上に斑点状の環状構造で位置する）へのＧＲＡＦ１の再分布の低下に注意されたい。これらの細胞における管状デキストラン取り込みの大きな低下にも注意されたい。ｂ、ＨＡタグつきＲｈｏＡ  Ｎ１９又はＧＦＰタグつきｃｄｃ４２Ｑ６１Ｌを用いてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における内在性ＧＲＡＦ１の落射蛍光顕微鏡写真。トランスフェクト細胞においてＧＲＡＦ１陽性小管が存在しないことに注意されたい。スケールバー＝１０μＭ。
【図９】ＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨドメインによってインビボにおいて生成される膜小管は、微小管に依存性の移動性構造であることを示す図である。ａ、ＧＳＴタグつきＢＡＲ＋ＰＨ及び図２ａにおいて定量化される異なる直径のリポソームを用いる典型的なリポソーム共沈降アッセイの代表的なクーマシー染色ゲル（Ｐ＝ペレット、Ｓ＝上清）。ｂ、ＨｅＬａ細胞において過剰発現されたｍｙｃタグつきＢＡＲ＋ＰＨタンパク質の管の局在性及びＢＡＲドメイン突然変異（ＫＫ１３１／１３２ＥＥ）を有する同様に過剰発現されたタンパク質の細胞質局在性を示す共焦点顕微鏡写真。スケールバー＝１０μＭ。ｃ、ＧＳＴタグつきＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨタンパク質の存在下又は非存在下においてインキュベートされたネガティブ染色リポソームの電子顕微鏡写真。ＢＡＲ＋ＰＨタンパク質と共に存在する管状構造が存在すること及びコントロールインキュベーションにおいてそれらが存在しないことに注意されたい。スケールバー＝２００ｎｍ。ｄ、未処理のままの（パネル１）、１時間、１μＭノコダゾールを用いて処理され、直ちに固定された（パネル２）、又はノコダゾール洗い流しの後に３０分間回復させた（パネル３）、ＧＦＰタグつきＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨタンパク質を過剰発現する細胞の共焦点顕微鏡写真。次いで、細胞は、β−チューブリンについて染色した（下の画像）。ＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨ陽性管状構造は、ノコダゾール処理細胞において存在しなかったが、ノコダゾール洗い流しの後に回復し、ここで、それらは、β−チューブリンと共在することが観察される。ｅ、２０℃での、ＧＦＰタグつきＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨ過剰発現細胞の生細胞回転円板共焦点画像。これらの画像は、３７秒間隔で撮られ、マージされた画像における黄色の構造は、この時間に移動しなかったエレメントを示し、緑色及び赤色のエレメントは、移動した（緑色／赤色）、出現した（緑色）、又は消滅した（赤色）エレメントを示す。これらの移動のうちのいくつかは、オーバーレイで追跡される。この実験の全時間コースは、補足の動画１において見ることができる。
【図１０】ＧＲＡＦ１は、ダイナミン１及びダイナミン２に直接結合することを示す図である。ａ、コントロール予備免疫血清（プレ血清）又はＡｂ２（ＧＲＡＦ１  ＳＨ３ドメインに対して）のいずれかを用いて実行される、ラット脳細胞質ゾル（ｃｙｔ）における免疫共沈降実験のクーマシー染色ゲル及び確認のためのウェスタンブロット。ｂ、ＧＳＴ（コントロール）又はＧＳＴタグつきＧＲＡＦ１  ＳＨ３ドメインに結合したビーズを用いる、ＨｅＬａ細胞細胞質ゾルにおけるプルダウン実験のクーマシー染色ゲル及びウェスタンブロット。ダイナミン２は、記載されるような質量分析によって同定された。ｃ、ＧＳＴタグつきＧＲＡＦ１／ＧＲＡＦ２  ＳＨ３ドメイン、ＧＳＴタグつきアンフィファイシン２（Ａｍｐｈ）ＳＨ３ドメイン、又はＧＳＴのみを用いる、ラット脳細胞質ゾルからのプルダウン実験のクーマシー染色ゲル。ＧＲＡＦ１及びＧＲＡＦ２の両方が、ｃａｓｋｉｎ１、ＦＡＫ、及びダイナミンに結合することに注意されたい。ｄ、可溶性精製ダイナミンと共にインキュベートされた、等モルの量のＧＳＴ、ＧＳＴＧＲＡＦ１  ＳＨ３、アンフィファイシンＳＨ３、及びＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨタンパク質に結合されたビーズを用いるインビトロプルダウン実験。ペレット画分は、所望のタンパク質に結合したダイナミンを表す。
【図１１】ＧＲＡＦ１は、ＧＡＰドメイン依存性の方法で、細胞における大きな形態学的変化をもたらすことを示す図である。管状エンドサイトーシスは、接着斑から生じる。ａ、類似する管状で斑点状の染色を示すＨｅＬａ細胞における内在性ＧＲＡＦ１（左パネル）又は過剰発現ｍｙｃタグつきＧＲＡＦ１（右パネル）の共焦点顕微鏡写真。ｂ、ＧＴＰアーゼ活性化欠損ｍｙｃタグつきＧＲＡＦ１（Ｒ４１２Ｄ）ではなく、高度な過剰発現レベルのｍｙｃタグつきＧＲＡＦ１は、細胞形態の崩壊をもたらす。ｃ、３７度で１０分間のデキストラン取り込みの後の、ＨｅＬａ細胞におけるＧＲＡＦ１及びビンキュリンの局在性の落射蛍光顕微鏡写真。末端ＧＲＡＦ１陽性管及び末端デキストラン陽性管の共在並びに接着斑とのそれらの周囲の共在に注意されたい。
【図１２】接着斑ターンオーバーの誘発は、ＧＲＡＦ１陽性小管の数を極めて増加させ、ＧＲＡＦ１及びダイナミンを解体フォーカルコンプレックスに動員することを示す図である。ａ〜ｃ、固定及び示されるタンパク質に対する抗体を使用する免疫蛍光染色に先立って、４０分間、４０μｍのＲＯＣＫ阻害因子Ｙ−２７６３２を用いて処理されたＨｅＬａ細胞の落射蛍光顕微鏡写真。内在性ＧＲＡＦ１管は、ベータ１−インテグリンの環状内から生じることに注意されたい（ａ）。Ｙ−２７６３２と用いる治療の後に、ビンキュリンは、多くは、フォーカルコンプレックスにおいて見つけられ、ここで、それは、ＧＲＡＦ１と共在し（ｂ）、ダイナミンは、同様に、ＧＲＡＦ１（ｃ）と共在することに注意されたい。補足の動画１  運動性の管状／小胞構造に局在化するＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨ。これは、図９ｅにおいて記載される実験の全時間シリーズである。実験は、２０℃で実行された。再生速度は、収録よりも４０倍速い。補足の動画２陽性ＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨ小管は、伸長及び収縮ができる。運動性である場合、それらは、２０℃で、約０．２〜０．３μｍ／秒の速度で移動する。補足の動画３ＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨ陽性小管は、高速輸送ができる。０．６μｍ／秒までの速度は、２０℃で観察された。
【０１４０】
［実施例］
本発明は、ここで、実施例によって記載される。これらの実施例は、例証となるように意図され、添付の請求項を制限するようには意図されない。
【０１４１】
概要：
細胞遊走は、膜及びタンパク質の再分布、細胞骨格構造における変化、並びにフォーカルコンプレックス／接着斑ターンオーバーの複雑な調整を必要とする。しかしながら、この調整が生じるメカニズムは、不明である。遊走の細胞生物学的機構を解明する重要性は、このプロセスが、組織発達、免疫学、神経生物学、並びに発癌の浸潤及び転移のフェーズにおいて果たす基本的な役割によって強調される。低分子量Ｇタンパク質のＲｈｏファミリーのメンバーは、細胞遊走の主要な制御因子であることが示された。ここで、Ｒｈｏ  ＧＡＰドメイン含有タンパク質ＧＲＡＦ１は、細菌外毒素、ＧＰＩ連結タンパク質、及び細胞外液の内部移行を担う、主なクラスリン非依存性エンドサイトーシス経路を規定し、調節することが示される。このエンドサイトーシス経路は、クラスリン、カベオリン、及びフロチリンに非依存性であるが、Ｒａｂ８の存在によってさらに規定することができる。ＧＲＡＦ１は、多重ドメインタンパク質であるので、次いで、このエンドサイトーシスルートの生化学的分析を実行することができる。ＧＲＡＦ１は、Ｎ末端ＢＡＲドメイン及びＰＨドメインを介して、非常に動的なＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２が豊富な膜に局在化し、ダイナミン、ＧＩＴ１、ＦＡＫ、及びＰＡＫ２を含むタンパク質と相互作用する。これらの後者のタンパク質は、接着斑の解体を促進するので、これは、ある位置にＧＲＡＦ１を配置し、それによって、それは、膜再分布及び接着斑ターンオーバーを結びつけることを通して、細胞遊走イベントを調整する可能性がある。実際に、ＧＲＡＦ１は、フォーカルコンプレックス／接着斑ターンオーバーに必要であり、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスは、低分子量Ｇタンパク質依存性の方法でこれらの部位から生じる。さらに、ＧＲＡＦ１は、細胞遊走に必要である。それによって示される研究は、この広く用いられているエンドサイトーシス経路のための第１のマーカーを提供し、エンドサイトーシス及び細胞遊走の連関を担う、動的な細胞の解剖学的構造を明らかにする。
【実施例１】
【０１４２】
ＢＡＲドメイン含有タンパク質の接着斑キナーゼ（ＧＲＡＦ）ファミリーと関連するＧＴＰアーゼ制御因子
ヒトデータベースにおけるタンパク質配列相同性検索を使用すると、予測されるＢＡＲドメイン自体内の相同性に基づいて又は完全な予測されるタンパク質からのタンパク質配列から、ＢＡＲドメイン含有タンパク質のサブセットを同定することが可能である。そのような１つのサブセットは、オリゴフレニン１（ＯＰＨＮ１）、接着斑キナーゼ１と関連するＧＴＰアーゼ制御因子（ＧＲＡＦ１）、及びＧＲＡＦ２を含む。３つのタンパク質はすべて、予測されるＮ末端ＢＡＲドメイン、その後に、ＰＨドメイン、ＧＡＰドメイン、及びプロリンに富む領域を含む。ＧＲＡＦ１及びＧＲＡＦ２はまた、ＯＰＨＮ１において存在しない、予測されるＣ末端ＳＨ３ドメインを含有する。これは、前に、オリゴフレニンタンパク質ファミリーとして記載されたが、ＯＰＨＮ１は、このさらなるドメインを欠くので、このファミリーは、ＧＲＡＦタンパク質ファミリーとしてより適切に記載される。ＯＰＨＮ１は、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、及びＣｄｃ４２のＧＴＰアーゼ加水分解をインビトロにおいて増強することができることが示され、そのために、高度な特異性でこれらを区別しない（それは、空間の局在性に基づいてインビボにおいて区別する可能性があるが）。加水分解の最も大きな増強は、ＲｈｏＡについて観察された。興味深いことには、完全長ＯＰＨＮ１の過剰発現は、活性Ｃｄｃ４２レベルにおける穏やかな増加をインビボにおいてもたらしたが、タンパク質のＣ末端領域の過剰発現（予測されるＧＡＰドメイン及びプロリンに富むドメインのみを含む）は、ほぼ検出不可能なレベルの活性ＲｈｏＡ、Ｃｄｃ４２、又はＲａｃ１をもたらした。これらの結果は、通常、ＯＰＨＮ１のＧＡＰドメインが、ＢＡＲドメインを含むタンパク質のＮ末端領域によってネガティブに調節されることを示唆する。ＣＯＳ−７細胞における過剰発現ＯＰＨＮ１は、Ｆ−アクチンと共在していることが分かり、この共在は、タンパク質の最もＣ末端側のみ（多くとも最後の１２５アミノ酸）を必要とすることが示された。Ｆ−アクチンを用いる精製ＯＰＨＮ１  Ｃ末端の共沈降分析は、細胞骨格を用いるこの領域の相互作用が、直接的である可能性があることを示唆した。完全長ＯＰＨＮ１の過剰発現は、Ｆ−アクチン分布における観察可能な表現型の変化を引き起こさなかったが、葉状仮足及び糸状仮足の数は、ＧＡＰドメイン過剰発現細胞において特異的に低下した。これは、ＯＰＨＮ１のＮ末端領域が、そのＧＡＰ活性をネガティブに調節することをさらに示唆する。成体の脳におけるＯＰＨＮ１  ｍＲＮＡレベルは、嗅球、皮質、海馬錐体細胞層、並びに歯状回の顆粒細胞及び小脳のプルキンエ細胞において最も高度であることが示された。これらの領域の多くは、高度な程度のシナプス可塑性を示す。発現は、副交感神経系及び感覚体性神経系におけるニューロンを囲むミエリン鞘における神経細胞及びグリア細胞の両方において並びに副腎髄質及び交感神経節及び腸管神経叢のニューロンのクロム親和細胞において観察された。ＯＰＨＮ１  ｍＲＮＡは、成人の脳においてよりも、胎児において、より高度なレベルで見つけられ、ＯＰＨＮ１に特異的な抗体を使用すると、タンパク質レベルは、新生児及び成人の脳について類似していることが分かった。ＯＰＨＮ１レベルを低下させるための、培養ニューロンのｓｉＲＮＡ処理は、シナプス可塑性におけるこのタンパク質の役割と一致して、樹状突起棘の長さにおける一貫した低下をもたらした。実際に、ＯＰＨＮ１は、Ｘ連鎖性精神遅滞において頻繁に突然変異していることが分かる。しかしながら、これが生じるメカニズムは、現在不明である。ＧＲＡＦ１は、白血球における腫瘍抑制因子として作用するように思われ、両方の対立遺伝子における欠失、切断、及び突然変異は、急性骨髄性白血病及び骨髄異形成症候群と関連することが分かった。ＧＲＡＦ１のＧ：Ｃに富むプロモーターは、通常、メチル化されないが、これらの状態を有する患者からの骨髄の生検材料の約３８％パーセントは、タンパク質発現の低下と関連するＧＲＡＦ１プロモーターメチル化を示す（非特許文献２８９）。疾患におけるこのタンパク質の調節異常を理解するために、その正常細胞の（１又は複数の）生物学的及び生理学的機能を最初に解明することが不可欠である。しかしながら、ＧＲＡＦ１に関する研究は、構造的分析及び相互作用タンパク質の同定に限られている。ＳＨ３ドメインの溶液構造のように、ＧＲＡＦ１のＧＡＰドメインの結晶構造が、解明された（ＰＤＢ参照１ＵＧＶ）。これらの構造は、まだ、ＧＲＡＦ１の生物学についての本発明者らの理解をほとんど増やしていない。ＧＲＡＦ１は、ＲｈｏＡ及びＣｄｃ４２に対するＧＡＰ活性をインビトロにおいて示し、インビボにおいてＲｈｏＡ活性のダウンレギュレーションを促進する。それはまた、キナーゼＦＡＫ及びＰＫＮβと相互作用することが示された。興味深いことには、ＦＡＫを除去すると、ＳＶ４０内部移行の量が低下することが知られており、これは、カベオラ又はマイクロドメイン依存性エンドサイトーシスを介して生じる。さらに、ＦＡＫは、接着斑ターンオーバーを調節することが知られている。ＧＲＡＦ１は、ＢＡＲドメインを有するので、それは、膜輸送に関与し、エンドサイトーシスイベントに必要とされる膜変形をもたらす又は安定化するのに関与する可能性が高い。本明細書において示される研究は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスの分野に、記載されるように広範囲に特徴づけられるより優れた明瞭さを提供する。そのようなタンパク質は、クラスリン非依存性エンドサイトーシス経路に属するものとみなされていなかったが、エンドサイトーシス経路は、必然的に、膜湾曲に直接影響し得るタンパク質の機能を必要とする。ＢＡＲドメインは、膜を形造るイベントに関与し、哺乳動物プロテオームにおいて様々なＢＡＲドメイン含有タンパク質があるので、これらのタンパク質の少なくとも１つは、クラスリン非依存性のエンドサイトーシスイベントにおいて役割を果たす可能性がある。ＧＲＡＦ１は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスイベントに関係する、Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質に対する予測される調節性ドメインを有し、ＧＲＡＦ１は、膜変形及びこれらのタンパク質の活性の間の関連を提供する可能性がある。ＢＡＲドメイン含有タンパク質ＧＲＡＦ１は、ある種のクラスリン非依存性エンドサイトーシスイベントに必要であることが前に示された接着斑キナーゼに結合する。そ���ため、ＧＲＡＦ１は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスにおける役割を果たす可能性がある。ＧＲＡＦ１又は他のＢＡＲドメイン含有タンパク質が、クラスリン非依存性エンドサイトーシス経路に属するものとみなすことができる場合、その生化学と細胞生物学の分析は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスのさらなるマーカー及びそれについてのメカニズムの見通しを提供する可能性がある。細胞生物学的又は生理学的機能は、この研究の前に、いかなるクラスリン非依存性エンドサイトーシス経路にも明確に属するものとみなされていない。クラスリン非依存性エンドサイトーシス経路の決定的なマーカーの徹底した生化学的及び細胞生物学的分析は、それらの機能的な関連を明らかにする。ＧＲＡＦファミリーメンバーの正常細胞生物学的機能に関する研究は、それらの機能的な消失又は活動過剰が、どのように、そのような調節異常が関連づけられる疾患プロセスの一因となる可能性があるのかについての見通しを提供する。
【実施例２】
【０１４３】
ＧＲＡＦファミリーメンバーのキャラクタリゼーション  推定上のＢＡＲドメイン含有タンパク質のＧＲＡＦファミリーのインシリコキャラクタリゼーション：ＧＲＡＦ１は、推定上のＢＡＲドメイン含有多重ドメインタンパク質である。
ＢＡＲ配列アライメントは、前に解明されたキイロショウジョウバエアンフィファイシン及びＡｒｆａｐｔｉｎ２のＢＡＲドメイン構造にオーバーレイすることから生成し、ＢＡＲドメインを含有する可能性がある、予測されるヒトタンパク質配列の領域を同定するために、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）  の反復に使用した。次いで、これらの領域は、ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントによって検証し（１００の「オープンギャップペナルティー」、０．５の「エクステンドギャップペナルティー」、及び４０％の「ディレイダイバージェンスセッティング」を用いる）、ＢＡＲドメインのすべての公開された結晶構造における二次構造がこのタイプのものであるので、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（http://www.predictprotein.org）を使用して、予測されるα−ヘリックス含量をチェックした。それらはまた、これらのコイルドコイル成分をコードすることが予測される配列を除去するためにＦ−ＢＡＲ／ＩＭＤドメインをコードする配列と比較し、これらの領域は、例外なく、インプットＢＡＲ配列に対する相同性がより低かった。次いで、これらの技術によって同定したタンパク質配列は、所望の他の領域を同定するために、保存ドメインデータベースを用いてクロスチェックした。そのような技術は、知られている、推定上のＢＡＲドメインを有する、多様な範囲のタンパク質を同定することができた。その予測されるドメイン構成を有する、同定されたタンパク質ファミリーのそれぞれからの１つのメンバーを示す。同定されたドメインのサブセットは、予測されるＮ末端両親媒性ヘリックスを有した。そのようなタンパク質は、前に、Ｎ−ＢＡＲドメイン含有タンパク質として分類された。多くのＢＡＲ及びＮ−ＢＡＲドメイン含有タンパク質は、大きな多重ドメイン含有タンパク質であり、いくつかは、Ａｒｆファミリー及びＲｈｏファミリーの低分子量Ｇタンパク質の調節に関与することが知られている、予測されるＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）及びグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）ドメインを含む。他のものはまた、Ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）ドメイン、ＰＳＤ９５／ＤｌｇＡ／Ｚｏ１（ＰＤＺ）ドメイン、又はアンキリンリピートなどのタンパク質間相互作用領域を含有することが予測される。予測されるドメイン構成の点から、接着斑キナーゼ１と関連するＧＴＰアーゼ制御因子（ＧＲＡＦ１）、ＧＲＡＦ２、及びオリゴフレニン１（ＯＰＨＮ１）は、予測されるヒトタンパク質のうちの１つのサブファミリーのメンバーである。これらのタンパク質のそれぞれは、Ｎ末端ＢＡＲドメイン、続くＰＨドメイン、ＲｈｏＧＡＰドメイン、及びプロリンに富むドメインを含むことが予測される。ＧＲＡＦ１及びＧＲＡＦ２もまた、Ｃ末端ＳＨ３ドメインを有することが予測される。これらのタンパク質の完全長配列のアライメントを生成する。ＧＲＡＦ１及びＧＲＡＦ２は、約５８％の全長のアミノ酸同一性を共有するが、ＧＲＡＦ１及びＯＰＨＮ１は、約４５％の全長の同一性を共有する。ＧＲＡＦ２及びＯＰＨＮ１は、約４４％の全長の同一性を共有する。
【０１４４】
ＧＲＡＦタンパク質ファミリーの少なくとも１つのメンバーは、ハエからヒトまで保存されている。
次いで、生物の制限のない非重複配列データベースにおけるベイトとして完全長ＧＲＡＦ１配列を使用して、ｐＢｌａｓｔ検索を実行した。検索した配列は、可能性として重複した配列が含まれないことを確認するために手動でチェックした。不完全な配列又は同じタンパク質配列の異なるアイソフォームが検索されたように思われた場合、各タイプの最長の配列を保持し、残りは除いた。ＧＲＡＦ１／ＧＲＡＦ２よりもＯＰＨＮ１に配列が類似しているタンパク質は、この分析から除き、別々に処理した。保持した配列（選択手順の高度な厳密性及び参照データベースの不完全な性質により、配列の完全なアレイは過小評価されている）を、次いで、Ｂｌｏｓｕｍ６２コストマトリックス、１２の「ギャップオープンペナルティー」、及び３の「ギャップエクステンションペナルティー」を使用して、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｐｒｏ  ３．０．４中のＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルペアワイズアライメントにかけた。次いで、アライメントした配列は、近隣結合法を用い、Ｊｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒ遺伝的距離モデルを使用して、系統樹を構築するために使用した。これらのタンパク質配列についての受託番号のアノテーションを有する同じ木を生成した。この木から、ＧＲＡＦ１関連配列の５つのグループが同定された。配列の祖先のセット（オレンジ色のノード）は、昆虫及び蠕虫（worm）の種において同定された。予測されるドメインにおいて、ＧＲＡＦ１についての境界（保存ドメインデータベースから）は、２０〜２２０（ＢＡＲドメイン）、２６８〜３６７（ＰＨドメイン）、３６４〜５６３（ＧＡＰドメイン）、及び７０５〜７５７（ＳＨ３ドメイン）である。分析は、以下の配列を使用して行う：ラット（Rattus norvegicus）、ニワトリ（Gallus gallus）、ニワトリ（Gallus gallus）、ヒト（Homo sapiens）、ミドリフグ（Tetraodon nigroviridis）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）、イヌ（Canis lupus familiaris）、イヌ（Canis lupus familiaris）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）、マウス（Mus musculus）、ヒト（Homo sapiens）、エレガンス線虫（Caenorhabditis elegans）、ラット（Rattus norvegicus）、ニワトリ（Gallus gallus）、アカゲザル（Macaca mulatta）、アカゲザル（Macaca mulatta）、ヒト（Homo sapiens）、イヌ（Canis lupus familiaris）、ラット（Rattus norvegicus）、マウス（Mus musculus）、ハイイロジネズミオポッサム（Monodelphis domestica）、ウシ（Bos taurus）、ミツバチ（Apis mellifera）、ミドリフグ（Tetraodon nigroviridis）、チンパンジー（Pan troglodytes）、マウス（Mus musculus）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ハイイロジネズミオポッサム（Monodelphis domestica）、ミドリフグ（Tetraodon nigroviridis）、マウス（Mus musculus）、ブリグサ線虫（Caenorhabditis briggsae）、ウシ（Bos taurus）（受託番号ＸＰ＿２２５９８９  ＸＰ＿４１７１８５  ＣＡＧ３０９２８  ＢＡＢ６１７７１  ＣＡＧ１１０７０  ＮＰ＿００１０３８７１５  ＸＰ＿５３３９６８、ＸＰ＿５３５２２４  ＮＰ＿００１０８６６１１  ＸＰ＿９８９８３０  ＡＡＨ６８５５５  ＮＰ＿７４１１６３  ＸＰ＿００１０６５９２０  ＸＰ＿００１２３２９１５  ＸＰ＿００１０９６９４２、ＸＰ＿００１０９１４５０  ＸＰ＿００１１２７５９７  ＸＰ＿５３９７５７  ＸＰ���５７６３５４  ＸＰ＿９９６９３３  ＸＰ＿００１３６６８６７  ＮＰ＿００１０７０２９８  ＸＰ＿００１１２２８２２、ＣＡＧ００５０８  ＸＰ＿５１８００９  ＮＰ＿７８０３７３  ＮＰ＿００１０８８５６２  ＮＰ＿５７３０７０  ＸＰ＿００１３６５３７７  ＣＡＧ１１７１２  ＮＰ＿０８４３８９  ＣＡＥ６４３４２  ＸＰ＿６１８４１６）。ＧＲＡＦ１様配列（青色のノード；これらは、ＧＲＡＦ２よりもヒトＧＲＡＦ１に著しく類似している）は、フグ、カエル、ニワトリ、及び哺乳動物を含む種において見つけられた。ＧＲＡＦ２様配列（赤色のノード；これは、ＧＲＡＦ１よりもヒトＧＲＡＦ２に著しく類似している）もまた、カエル、ニワトリ、及び哺乳動物において見つけられた。興味深いことには、ＧＲＡＦ１又はＧＲＡＦ２よりもそれら自体に著しく類似している、配列のさらなるグループ（これらのそれぞれと、それらは、およそ等しい類似性を共有する）は、これらの分析によって同定した（緑色のノードを参照されたい）。そのような配列は、哺乳動物系列及びニワトリにおいて見つけることができる。これらの配列は、注釈されるが、多くの場合、混乱を引き起こす。たとえばヒトＸＰ＿００１１２７５９７は、予測されるＣ末端ＳＨ３ドメインはＯＰＨＮ１配列において見つけられず、ＯＰＨＮ１に対してよりもＧＲＡＦ１及びＧＲＡＦ２に対する配列同一性が大きいにもかかわらず、「オリゴフレニン１アイソフォーム２に類似している」と注釈される。そのため、タンパク質のこの新規なファミリーは、さらなるＧＲＡＦサブファミリー：タンパク質のＧＲＡＦ３ファミリーとしてここで指名される。これらの配列は、祖先／ＧＲＡＦ１／ＧＲＡＦ２／ＯＰＨＮ１配列よりも、それら自体に対して、より類似性を共有し、進化を通じて、いくつかの形態の正の選択を受けた可能性が高い。ＧＲＡＦ１／ＧＲＡＦ２／ＧＲＡＦ３ファミリーに入らない（が、ＯＰＨＮ１タンパク質配列に対してよりも、これらに類似している）、配列の最後のグループは、ダークグレーのノードとして示す。これらは、相違する配列を表すように思われ、魚類において見つけられる。まとめると、これらの結果は、遺伝子重複イベントは、鳥類、哺乳動物、及び魚類の１又は複数の共通の祖先の種において生じ、これは、虫又は昆虫と共有されないことを示唆する。ＧＲＡＦタンパク質配列と対照的に、各種における最大１つのＯＰＨＮ１型タンパク質配列のみが、同様の分析の後に同定された。ここで、より厳密に生成された系統樹は、進化論的ゲノム分析から生成されたものに類似していた。ネッタイシマカ（Aedes aegypti）におけるＯＰＨＮ１様配列の存在は、哺乳動物及びカの共通の先祖において生じる遺伝子重複イベント（推測上、ＧＲＡＦ１／ＧＲＡＦ２／ＧＲＡＦ３配列に最終的に関与する祖先の配列の）を示唆する。ＯＰＨＮ１様配列は、キイロショウジョウバエにおいて存在しない。ＯＰＨＮ１様タンパク質配列への収束進化は、高等哺乳動物におけるＯＰＨＮ１及びＧＲＡＦ１のタンパク質配列の間に観察される高度な類似性が、これが生じなかったことを示唆するが、無視することができない。
【０１４５】
図４及び図５は、４つのＧＲＡＦパラログの系統樹を示す（一方は生物で及び一方は受託番号で）。
【０１４６】
ＧＲＡＦファミリータンパク質における保存残基の同定
ヒトＧＲＡＦ１、ＧＲＡＦ２、及びＯＰＨＮ１において区別することができる、多くの保存残基がある。ＧＲＡＦ１ファミリー配列（予測されるＳＨ３ドメインを有さず、そのため、このドメインにおける保存部位の分析を混乱させるであろうミドリフグ配列以外の）は、次いで、ファミリーメンバーにおける進化的に保存された残基を同定するためにアライメントした。これらの配列は、８０％のペアワイズ類似性及び５５％の配列同一性を有する。相同性は、予測されるＢＡＲ、ＰＨ、及びＧＡＰのドメイン配列において最も大きく、プロリンに富む配列における相当な分岐がある。完全に保存された残基を同定するために、アライメントは、祖先の配列（キイロショウジョウバエからの）と共にこれらの配列を用いて実行した。このアライメントプロットから、イヌ（Canis lupus familiaris）及びラット（Rattus norvegicus）の配列の両方は、他種において存在しない、重要なＮ末端伸長部分を有することを見ることができる。この伸長部分は、犬において２６８残基長及びラットにおいて１００残基長である。推定上の球状で無秩序な配列を同定するためにＧｌｏｂｐｒｏｔ  ２を使用すると、これらのＮ末端伸長部分の両方は、両方の配列において大部分、無秩序であることが予測され、したがって、秩序的なドメインを含んでいない可能性が高い。これらの配列は、特に、ラットの配列と９２％同一である犬配列における１４９〜１７３の残基のストレッチにおいていくらかの同一性を共有する。イヌＮ末端配列は、それが、無秩序であることが予測され、そのため、第２のプロリンに富むドメインと考えることができるので、１４．５％プロリン、１６％アルギニンで、ラットよりも著しくプロリンに富む。次いで、このアライメントからのコンセンサス配列を抽出した。次いで、このコンセンサス配列は、その進化を通じて完全に保存されてきた、この配列における残基を同定するために、ヒトＧＲＡＦ１配列とアライメントした。予測されるＢＡＲドメインにおける３重リシンモチーフ（ヒト配列の残基１３１〜１３３；赤色のボックスにおいて強調）は、完全に保存されており、二量体アンフィファイシンＢＡＲモジュールの静電気的膜結合に必要である、キイロショウジョウバエアンフィファイシンＢＡＲドメインにおける残基とアライメントする。所望のさらなる保存残基は、Ｒ４１２である（ヒト配列；  青色のボックスにおいて強調）。これは、Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質によるＧＴＰ加水分解を刺激する際に、「フィンガー」として作用することが知られている他のＲｈｏＧＡＰドメインにおけるアルギニンとアライメントする。それはまた、その構造の分析から同定されるＧＲＡＦ１  ＧＡＰドメインにおけるおそらく触媒性の残基である。このアルギニンの正電荷側鎖は、低分子量Ｇタンパク質の活性な部位に入り、ＡＴＰのγ−リン酸の酸素原子の負電荷を中和し、それによって、加水分解反応の遷移速度を安定化する（非特許文献２９５）。３重リシンモチーフ及びアルギニンフィンガーの両方はまた、ＧＲＡＦ２及びＯＰＨＮ１のタンパク質配列においても見つけられる。他の完全に保存された残基もまた観察される。
【０１４７】
ＧＲＡＦファミリーメンバーは、それらのＮ末端を通して、インビボ及びインビトロにおいて膜に結合する
ＧＲＡＦ１ドメインに向けられる抗体は、ラット脳及び様々な細胞株において存在する約９４ｋＤａのタンパク質を認識する
ＧＲＡＦ１についての配列データベースにおいて存在する２つのスプライス変異体があり、一方は、７５９アミノ酸のタンパク質をコードすることが予測され（前の実施例におけるアライメントに使用）、他方の、より共通した配列は、８１４アミノ酸のタンパク質をコードすることが予測される。２つの変形は、長い形態における、プロリンに富むドメインのＣ末端の終わりに存在する５５残基のストレッチの存在又は非存在によってのみ異なる。ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎによるこの配列の検査により、その挿入物が、約５０％  α−ヘリックスであり、コンパクトな球状のドメインとして存在することが予測された。ＧＲＡＦ１完全長（残基１〜８１４）、ＧＲＡＦ１  ＰＨ＋ＧＡＰ（残基２６７〜５７６）、及びＧＲＡＦ１  ＳＨ３（残基７４９〜８１４）の長い変形をコードするｃＤＮＡ断片を、５’ＧＳＴタグを有するｐＧＥＸ−４−Ｔ２ベクターにクローニングした。これらのタンパク質は、大腸菌（E. Coli）において発現され、グルタチオンセファロースビーズ及びゲル濾過を使用して精製した。次いで、これらのタンパク質は、ウサギ及びニワトリ宿主を免疫するために使用した。免疫処置後に生成されたポリクローナル抗血清は、次いで、ＧＳＴを認識する抗体を取り出すために除去し、次いで、記載されるように親和性精製した。親和性精製は、血清を採取する動物を免疫するためのタンパク質を生成するために使用した異なる精製手順からの精製タンパク質に対して実行した。（あらゆる精製混入物に対して向けられる抗体の親和性精製についての可能性を低下させるため）。次いで、それらが、上記の精製タンパク質のそれぞれを認識することができるかどうかを決定するために、これらの親和性精製抗体は、免疫ブロット法によって試験した。完全長タンパク質に対して産生させられた抗体は、各ドメインに対して向けられる抗体の存在と一致して、３つの精製タンパク質をすべて認識することができた。ＳＨ３ドメインに対して産生させられた抗体は、同様に、このドメインのみを認識することができた。予想されるとおり、この抗体は、ＧＲＡＦ１  ＰＨ又はＧＡＰドメインを含むタンパク質のみを認識した。過剰な固定免疫タンパク質とのインキュベーションによって前に除去された抗体が使用された場合、シグナルは、検出されなかった。次いで、これらの抗体は、免疫ブロット法によって、ラット脳溶解物からの内在性ＧＲＡＦ１を認識するそれらの能力を試験した。抗体はすべて、約９４ｋＤａの１又は複数のバンドを認識した。ＰＨ＋ＧＡＰドメインに対して産生された抗体が、脳溶解物からの約９４ｋＤａの３つの密接に関連するバンド（他のバンドはない）を一貫して認識したので、この抗体は、最も多くの続く免疫ブロット法分析において使用した。この抗体は、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫）、及びＫ５６２からの溶解物において、差異的に、１又は複数のこれらのバンドを認識する。
【０１４８】
抗体及びＤＮＡ構築物
ＧＲＡＦ１に対するポリクローナル抗血清は、組換え発現ヒトＧＲＡＦ１タンパク質を用いて、ウサギ（ＲＡ−８３／Ａｂ１）、（ＲＡ−８４／Ａｂ２）、及びニワトリ（ＣＨ−９７９８／Ａｂ４、免疫蛍光法分析に使用）を免疫することによって生成した。購入した抗体は、マウス抗ｍｙｃクローン９Ｅ１０、マウス抗チューブリン（Sigma-Aldrich社製）、ウサギ抗ｍｙｃ（Cell-Signalling Technology社製）、マウス抗ダイナミン、マウス抗ＧＩＴ１（BD Transduction Laboratories社製）、ウサギ抗シナプトジャニンＲａ５９（Praefcke et al., 2004）、マウス抗パキシリン、マウス抗ビンキュリン、ウサギ抗ＦＡＫ（Abcam社製）、マウス抗ｐＦＡＫ（Biosource社製）、及びマウス抗赤血球凝集素（ＨＡ）クローン１２ＣＡ５（ROCHE Applied Science社製）であった。二次抗体及びストレプトアビジンはすべて、Alexa Fluor 488、546、又は647（Molecular Probes社製）に抱合した。ヒトＧＲＡＦ１（アミノ酸１〜７５９）、ＧＲＡＦ１−ＢＡＲＰＨ（アミノ酸１〜３８３）、ＧＲＡＦ１−ＳＨ３（６９４〜７５９）をコードするｃＤＮＡ構成物は、ＰＣＲを使用して、ＩＭＡＧＥクローン３０３４３８６３から増幅し、細菌発現のためのｐＧＥＸ−４Ｔ−２ベクター（Amersham Biosciences社製）及び哺乳動物発現のための、追加のＮｏｔ１部位（JGW Anderson社製）を有するｐＣＭＶｍｙｃベクター又はＥＧＦＰ−Ｃ３（Clontech社製）にクローニングした。アミノ酸置換Ｋ１３１Ｅ、Ｋ１３２Ｅ、及びＲ４１２Ｄは、ＰＣＲ定方向突然変異誘発（Stratagene社製）を使用して作製した。Ｙ−２７６３２は、Sigmaから得た。Praefcke, G. J., Ford, M. G., Schmid, E. M., Olesen, L. E., Gallop, J. L., Peak-Chew, S. Y., Vallis, Y., Babu, M. M., Mills, I. G., and McMahon, H. T. (2004)。Evolving nature of the AP2 alpha-appendage hub during clathrin-coated vesicle endocytosis. EMBO J. 23, 4371-4383。
【実施例３】
【０１４９】
Ｇｒａｆ１依存性エンドサイトーシスは、細胞遊走に必要である
概要：
細胞遊走は、膜及びタンパク質の再分布、細胞骨格の変化、及びフォーカルコンプレックス／接着斑ターンオーバーの複雑な調整を必要とする（de Curtis, I. Cell migration: GAPs between membrane traffic and the cytoskeleton. EMBO Rep 2, 277-81 (2001)）。この調整が生じるメカニズムは、不明である。浸潤癌細胞及び転移癌細胞によって獲得される、よく理解されていない遊走促進性の表現型（Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature 441, 444-50 (2006)）は、遊走の細胞生物学的メカニズムを解明する重要性を強調する。低分子量Ｇタンパク質のＲｈｏファミリーのメンバーは、細胞遊走の主要な制御因子であることが示された（Raftopoulou, M. & Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol 265, 23-32 (2004)）。ここで、本発明者らは、Ｒｈｏ  ＧＡＰドメイン含有タンパク質ＧＲＡＦ１が、細胞遊走に必要である主なクラスリン非依存性エンドサイトーシス経路を調節することを示す。ＧＲＡＦ１は、ＢＡＲドメイン及びＰＨドメインを介して、インビボにおいて、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２が豊富で、管状で、斑点状の脂質構造に局在化する。本発明者らは、ＧＲＡＦ１が、ダイナミン、ＧＩＴ１、ＦＡＫ、及びＰＡＫ２に結合することを示す。これらのタンパク質が、エンドサイトーシスによる方法で生じる、接着斑の解体を促進するので（Zhao, Z. S., Manser, E., Loo, T. H. & Lim, L. Coupling of PAK-interacting exchange factor PIX to GIT1 promotes focal complex disassembly. Mol. Cell Biol. 20, 6354-63 (2000)、Ezratty, E. J., Partridge, M. A. & Gundersen, G. G. Microtubule-induced focal adhesion disassembly is mediated by dynamin and focal adhesion kinase. Nat. Cell Biol. 7, 581-90 (2005)）、これは、細胞遊走イベントを調整するために、ある位置にＧＲＡＦ１を配置する。本発明者らは、ＧＲＡＦ１が、フォーカルコンプレックス／接着斑ターンオーバーに必要であり、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスが、低分子量Ｇタンパク質依存性の方法でこれらの部位から生じることを示す。そのため、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスは、エンドサイトーシスの、細胞遊走に必要な細胞の形態における変化との直接的な連関についての新規な細胞メカニズムを提供する。接着斑キナーゼ−１（ＧＲＡＦ１）と関連するＧＴＰアーゼ制御因子は、多様なＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）ファミリーのメンバーである。ＧＲＡＦ１のＧＡＰドメインは、インビトロにおいて、ＲｈｏＡ及びＣｄｃ４２に対するＧＡＰ活性を示し、インビボにおいてＲｈｏＡ活性のダウンレギュレーションを促進する（Hildebrand, J. D., Taylor, J. M. & Parsons, J. T. An SH3 domain-containing GTPase-activating protein for Rho and Cdc42 associates with focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 16, 3169-78 (1996)、Taylor, J. M., Macklem, M. M. & Parsons, J. T. Cytoskeletal changes induced by GRAF, the GTPase regulator associated with focal adhesion kinase, are mediated by Rho. J. Cell Sci. 112 ( Pt 2), 231-42 (1999)）。ＧＲＡＦ１は、ＰＨドメイン、ＧＡＰドメイン、及びＳＨ３ドメインを含有する脳に豊富なタンパク質であり、ＢＡＲドメインに対して相同性を有するＮ末端領域を有する（図１ａ）。それはまた、初代線維芽細胞並びに神経芽細胞腫及び線維芽細胞を含む、様々な細胞株において発現される（図１ｂ）。本発明者らは、免疫蛍光法によって星状細胞及びＨｅＬａ細胞における管状で斑点状の構造にＧＲＡＦ１が主に局在化す���ことを見つけた（図１ｃ）。ＧＲＡＦ１小管は、これらの細胞の周辺と頻繁に接触することが観察され、形質膜輸送におけるＧＲＡＦ１の役割を暗示したので、本発明者らは、ＧＲＡＦ１についての染色の前に、ＤｉＩ（形質膜由来構造を同定するため）又は液相マーカーデキストラン（エンドサイトーシス構造の管腔を強調）を用いてエンドサイトーシスをモニターした。ＧＲＡＦ１管状構造は、インキュベーションの５分後及びさらに１分後に、これらのマーカーの両方と広範囲に共在し、これらの小管についてのエンドサイトーシスによる役割を示す（図１ｄ、ｅ）。クラスリンポリマーは、管状の膜を幾何学的に安定化することができないはずであり、電子顕微鏡によって管状の膜上に見つけられない。実際に、ＧＲＡＦ１陽性小管は、クラスリンが欠けており、クラスリン非依存性エンドサイトーシスにおける役割と一致して、トランスフェリン受容体又は内部移行トランスフェリンと共在しなかった（図７ａ〜ｃ）。さらに、ＧＲＡＦ１陽性小管は、クラスリン非依存性エンドサイトーシス経路に関する研究のために使用されるマーカーであるコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴｘＢ）を蓄積した（Nichols, B. J. A distinct class of endosome mediates clathrin-independent endocytosis to the Golgi complex. Nat Cell Biol 4, 374-8 (2002)）（図７ｄ）。ＧＲＡＦ１が、これらの小管を介してのエンドサイトーシスに必要であるかどうかを決定するために、本発明者らは、ｓｉＲＮＡを使用してＧＲＡＦ１レベルを枯渇させた。この処理は、組織溶解物のウェスタンブロット及び免疫蛍光法によって評価されるように、ＧＲＡＦ１レベルをバックグラウンドまで低下させることができたが、トランスフェリンエンドサイトーシスに対する効果を有していなかった（図１ｆ、ｇ、及び図７ｅ）。次いで、ＧＲＡＦ１枯渇細胞は、免疫蛍光法及び量的蛍光測定アッセイの両方によって、デキストランをエンドサイトーシスするそれらの能力について評価した（図１ｇ、ｈ）。ＧＲＡＦ１枯渇は、デキストランエンドサイトーシスの５０〜６０％の低下をもたらし、ＡＰ２枯渇によって観察されたものに類似し（図１ｇ）、ＧＲＡＦ１媒介性のエンドサイトーシス及びクラスリン媒介性エンドサイトーシスが、これらの細胞においておよそ等しい容量の内部移行を占めることを示唆する。ＡＰ２及びＧＲＡＦ１の両方を枯渇した細胞は、生存可能ではなかった。さらに、ＧＲＡＦ１枯渇は、デキストランの管状エンドサイトーシスの量における、大きな低下をもたらし、ＧＲＡＦ１が、これらの構造の形成を調節することを示唆した。この管状エンドサイトーシスが、ダイナミン依存性であるかどうかを決定するために、本発明者らは、ダイナミン機能の細胞透過性の阻害因子であるダイナソアと共に細胞をインキュベートし（Macia, E. et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Dev Cell 10, 839-50 (2006)）、これらの細胞におけるデキストラン取り込みについて分析した。ダイナソア処理細胞は、管状構造においてデキストランをエンドサイトーシスするための能力が極めて低下しており、ＧＲＡＦ１は、これらの細胞において、管状構造から基底の斑点また環に再分配された。ドミナントｉ（ｃ）活性／ネガティブ低分子量Ｇタンパク質の過剰発現は、内在性ＧＲＡＦ１の管状形態を排除したので（図８）、低分子量Ｇタンパク質バランスもまた、このプロセスにとって重要であることが分かった。ＧＲＡＦ１の予測されるＮ末端ＢＡＲドメインの役割を検査するために、本発明者らは、可変の直径のリポソームと共に精製ＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨタンパク質をインキュベートし、共沈降アッセイによって脂質結合を検査した（図２ａ及び図９ａ）。ＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨは、膜の湾曲感知ＢＡＲドメインの存在と一致して、小さな直径のリポソームに最良に結合することが分かった。実際に、このタンパク質はまた、インビボにおいて管状構造にも結合することができ、その局在性は、他のＢＡＲドメインタンパク質における脂質結合に必要である、鍵となるリシン残基に依存性である（Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science 303, 495-9 (2004)、Gallop, J. L. et al. Mechanism of endophilin N-BAR domain-mediated membrane curvature. EMBO J. 25, 2898-2910 (2006)）。タンパク質はまた、電子顕微鏡によって検査されるように、球状のリポソームからインビトロにおいて小管を生成することができた（図９ｂ及びｃ）。可変のホスホイノシチド豊富化物のリポソームを用いる類似する共沈降アッセイを使用すると、本発明者らは、ＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨが、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２が豊富な膜に最良に結合することが分かった（図２ｂ）。ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２は、形質膜に豊富なホスホイノシチドであり、この発見は、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスについての本発明者らの観察と一致している。さらに、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２は、接着斑膜において及び遊走細胞の先端で豊富であることが見つけられ、ここで、それは、遊走性の刺激に対する応答をコントロールする複雑なライフサイクルを有する（Ling, K., Schill, N. J., Wagoner, M. P., Sun, Y. & Anderson, R. A. Movin' on up: the role of PtdIns(4,5)P(2) in cell migration. Trends Cell Biol 16, 276-84 (2006)）。管状膜は、インビボにおいて、細胞骨格エレメントによって安定化されることが予想される可能性があり、これはまた、細胞内標的への積荷の送達のための方向性を提供する可能性がある。実際に、微小管脱重合剤ノコダゾールを用いるＧＲＡＦ１  ＢＡＲ＋ＰＨ過剰発現細胞の処理は、この過剰発現タンパク質の管状の局在性を排除し、回復の間に、ＧＲＡＦ１及びチューブリンの共在は、観察される（図９ｄ）。リアルタイム蛍光顕微鏡を使用して、本発明者らは、これらの小管が、伸長、収縮、及び高速膜輸送ができる、非常に動的な構造であることを決定した（図９ｅ及び動画）。まとめると、これらの結果は、ＧＲＡＦ１のＢＡＲドメインが、インビボにおいて小管にタンパク質を局在化させ、それが、これらの非常に曲がった膜の生成及び安定化における役割を果たす可能性があり、その方向性及び程度は、微小管に依存性であることを非常に示唆する。ＧＲＡＦ１に対する相互作用パートナーを決定するために、本発明者らは、ＧＲＡＦ１に対して特異的な抗体を用いて、ラット脳細胞質ゾルから免疫共沈降実験を実行した。ＧＲＡＦ１は、膜切断タンパク質ダイナミン及びＡｒｆ６  ＧＡＰタンパク質ＧＩＴ１との複合体で見つけられた（図２ｃ  ｉ（ｃ）クーマシー染色バンドの質量分析によって決定し、ウェスタンブロットによって確認）。他の推定上の結合パートナーを同定するために。本発明者らは、ラット脳細胞質ゾルからのＧＲＡＦ１のＳＨ３ドメインを用いてプルダウン実験を実行した（図２ｄ）。本発明者らは、このセッティングにおけるこのドメインの主な相互作用パートナーが、ダイナミンであることを見つけ、本発明者らが決定した相互作用パートナーは、精製ダイナミンを用いるインビトロプルダウン実験を実行することによる直接的なものであった。本発明者らは、ＧＲＡＦ１が、ＨｅＬａ細胞溶解物において免疫共沈降及びプルダウン実験を使用して、ダイナミン２に結合すること及びＧＲＡＦ１の異なる領域に向けられる抗体が、ダイナミンと免疫共沈降したことを確証した（図１０）。本発明者らのプルダウン実験はまた、ＧＲＡＦ１に対する相互作用パートナーとしてＦＡＫ、ＰＡＫ２、シナプトジャニン、及びｃａｓｋｉｎ１をも同定した。ＦＡＫは、前に、インビトロにおいて、直接、ＧＲＡＦ１と相互作用することが示された（Hildebrand, J. D., Taylor, J. M. & Parsons, J. T. An SH3 domain-containing GTPase-activating protein for Rho and Cdc42 associates with focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 16, 3169-78 (1996)）。ｐＦＡＫに対して特異的な抗体を用いる免疫沈降によって（接着斑に存在するタンパク質の活性ｐＹ３９７形態（Schaller, M. D. et al. pp125FAK a structurally distinctive protein-tyrosine kinase associated with focal adhesions. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 5192-6 (1992)））、本発明者らは、ＧＲＡＦ１が、キナーゼのこの形態と相互作用することが分かった（図２ｄ）。さらなるプルダウン実験を用いて、本発明者らは、ＧＲＡＦ２がまた、
ＦＡＫ及びｃａｓｋｉｎ１にも結合することを示し、この相同タンパク質が、異なる細胞型において類似する役割を果たす可能性があることを示唆した（図１０ｃ）。本発明者らが決定した新規な相互作用及びヒトタンパク質参照データベースからの他の知られている相互作用は、図２ｅにおけるインタラクトームとして共に表される。ＰＡＫ、ＰＩＸ、ＧＩＴ１、及びｐＦＡＫは、フォーカルコンプレックス／接着斑解体の促進に極度に関係しており（Zhao, Z. S., Manser, E., Loo, T. H. & Lim, L. Coupling of PAK-interacting exchange factor PIX to GIT1 promotes focal complex disassembly. Mol. Cell Biol. 20, 6354-63 (2000)、Ezratty, E. J., Partridge, M. A. & Gundersen, G. G. Microtubule-induced focal adhesion disassembly is mediated by dynamin and focal adhesion kinase. Nat. Cell Biol. 7, 581-90 (2005)）、ＧＩＴ１／ＰＩＸ複合体は、形質膜及びエンドソームの間の輸送を調節することが示唆されてきた（Lahuna, O. et al. Thyrotropin receptor trafficking relies on the hScrib-betaPIXGIT1-ARF6 pathway. Embo J 24, 1364-74 (2005)）。さらに、ダイナミン及び微小管は、エンドサイトーシスによる方法で生じる、接着斑の解体に関与することが最近示された（Ezratty, E. J., Partridge, M. A. & Gundersen, G. G. Microtubule-induced focal adhesion disassembly is mediated by dynamin and focal adhesion kinase. Nat. Cell Biol. 7, 581-90 (2005)）。ＧＲＡＦ１がまた、接着斑／複合体解体をポジティブに促進するかどうかを決定するために、本発明者らは、ＨｅＬａ細胞において完全長タンパク質を過剰発現させた。低いレベルでの過剰発現ＧＲＡＦ１の分布は、内在性タンパク質の分布を模倣するが、より高度な発現レベルは、ＧＡＰドメインの活性に依存性である広範な膜突出及び分岐と共に、細胞の形態における用量及び時間依存性の変化をもたらす。それはまた、ビンキュリン及びパキシリンなどの接着斑マーカーの用量依存性の低下をもたらす（図２ｆ、図１１ａ及びｂ）。ＧＲＡＦ１及びフォーカルコンプレックス／接着斑の間の関連をさらに調査するために、本発明者らは、内在性ＧＲＡＦ１及びフォーカルコンプレックス／接着斑マーカーについてＨｅＬａ細胞を同時染色した。本発明者らは、これらの部位からの輸送における役割と一致して、ＧＲＡＦ１陽性小管の周囲の端が、接着斑の部位であることを見つけた（図３ａ）。実際に、デキストランを蓄積するエンドサイトーシス小管もまた、これらの部位から生じることが分かった（図１１ｃ）。線維芽細胞における管状の局在性に加えて、ＧＲＡＦ１はまた、細胞の至る所での斑点状の構造上で見つけられる。これらの斑点の多くは基底に位置し、本発明者らは、これらが、フォーカルコンプレックスと共在することが分かった（図３ｂ）。ＧＲＡＦ１のＧＡＰドメインにおけるアルギニンフィンガーの突然変異は、実質的に、そのような共在の総量を増加させ（図３ｃ）、ＧＡＰドメインが、通常、活性であること及びこの突然変異が、局所的な低分子量Ｇタンパク質バランスにおける変化によって通常破られるＧＲＡＦ１依存性のプロセスにおけるブロックを誘発することを示す。ＧＲＡＦ１媒介性の輸送が、接着斑の解体をポジティブに調節する場合、本発明者らは、接着斑の解体の刺激は、ＧＲＡＦ１陽性小管の数及びフォーカルコンプレックス／接着斑マーカーとの共在を急性的に増加させるはずであることを予測した。Ｒｈｏキナーゼ阻害因子を用いるＨｅＬａ細胞の処理（これは、複合体／接着解体を誘発する）は、劇的に、ＧＲＡＦ１陽性小管の数を増加させ、１−インテグリン、ビンキュリン、及びダイナミンとのＧＲＡＦ１の共在を増加させた（図３ｄ及び図１２）。まとめると、これらのデータは、タンパク質の作用の本発明者らの生化学的予測を確認し、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスが、解体フォーカルコンプレックス／接着斑の部位から生じることを示す。ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスが、それ自体、接着斑の解体に必要であるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＧＲＡＦ１を細胞から枯渇させ、これらの細胞における接着斑の数を検査した（図３ｅ及びｆ）。ＧＲＡＦ１が枯渇した細胞は、特にこれらの細胞の核内領域において、接着斑の数が大きく増加した。本発明者らは、次に、これらの細胞が、インピーダンス値の量的測定を使用して電子的に誘発される創傷に遊走する能力を検査した（創傷エリアへの細胞の遊走を反映するインピーダンスの増加ｉ（ｃ）図３ｇ）。ＧＲＡＦ１が枯渇した細胞は、遊走するためのそれらの能力が大いに欠損していた。これらのデータは、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスが、接着斑の解体及び細胞遊走に必要であることを示す。細菌毒素、ウイルス、及びＧＰＩ連結タンパク質によって使用されるクラスリン非依存性エンドサイトーシス経路は、十分に研究されてきた（Kirkham, M. et al. Ultrastructural identification of uncoated caveolinindependent early endocytic vehicles. J. Cell Biol. 168, 465-76 (2005)、Lamaze, C. et al. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol. Cell 7, 661-71 (2001)、Kirkham, M. & Parton, R. G. Clathrin-independent endocytosis: new insights into caveolae and non-caveolar lipid raft carriers. Biochim. Biophys. Acta 1746, 349-63 (2005)）が、しかし、そのような作業は、これらの経路に必要とされる輸送機構の特異的な内在性マーカーの不足によって妨げられてきた。カベオリン１及びフロチリン１は、クラスリン非依存性エンドサイトーシスプロセスに必要であることが示されたが、それらが機能するメカニズムは、不明なままである（Glebov, O. O., Bright, N. A. & Nichols, B. J. Flotillin-1 defines a clathrinindependent endocytic pathway in mammalian cells. Nat Cell Biol 8, 46-54 (2006)、Hommelgaard, A. M. et al. Caveolae: stable membrane domains with a potential for internalization. Traffic 6, 720-4 (2005)）。これらの経路の基礎となるメカニズムのキャラクタリゼーションは、特異的な低分子量Ｇタンパク質に対するそれらの依存性及びそれらの必要な上流の脂質ドメイン構成に極度に依存してきた。脂質ラフト様ドメインにおける特異的な積荷及び低分子量Ｇタンパク質の両方のクラスター形成は、エンドサイトーシスを支持するように思われる。興味深いことには、接着斑は、高度な膜構成を有するドメインであり、インテグリン接着の消失は、エンドサイトーシスによる輸送を促進することが示された（del Pozo, M. A. et al. Phospho-caveolin-1 mediates integrin-regulated membrane domain internalization. Nat Cell Biol 7, 901-8 (2005)）。本発明者らの作業は、ダイナミン及び低分子量Ｇタンパク質に依存性である、１つのそのような経路のための内在性マーカーを提供し、さらなる作業は、この経路を介してエンドサイトーシスされる、特異的な内在���積荷の性質に取り組み、電子顕微鏡技術によって特異的な積荷を蓄積することが観察されたクラスリン非依存性小管とのその正確な関係を決定するであろう（Kirkham, M. et al. Ultrastructural identification of uncoated caveolinindependent early endocytic vehicles. J. Cell Biol. 168, 465-76 (2005)）。本発明者らの研究はまた、エンドサイトーシスが優先的に生じる可能性がある細胞内の解剖学的部位についての証拠を提供する。本発明者らは、ただ１つのタンパク質が、細胞遊走に必要とされるエンドサイトーシス及び接着斑ターンオーバーを調整することができることを示す。本発明者らのデータは、低分子量Ｇタンパク質及び管輸送の調節を介した、接着斑のダウンレギュレーションにおけるＧＲＡＦ１／ＧＩＴ１／ＦＡＫ／ダイナミン複合体についての役割を支持する（図６）。膜輸送経路の欠乏は、既に、ヒト疾患に広範囲に関連づけられている（Howell, G. J., Holloway, Z. G., Cobbold, C., Monaco, A. P. & Ponnambalam, S. Cell biology of membrane trafficking in human disease. Int Rev Cytol 252, 1-69 (2006)）。興味深いことには、ＧＩＴ１／ＰＩＸ複合体及び密接なＧＲＡＦ１相同体であるオリゴフレニン１は、樹状突起棘の形態形成に不可欠であることが示されており（Govek, E. E. et al. The X-linked mental retardation protein oligophrenin-1 is required for dendritic spine morphogenesis. Nat. Neurosci. 7, 364-72 (2004)）、オリゴフレニン１は、多くの場合、症候性のＸ連鎖性精神遅滞を有する患者において突然変異していることが見つけられ（Zanni, G. et al. Oligophrenin 1 mutations frequently cause X-linked mental retardation with cerebellar hypoplasia. Neurology 65, 1364-9 (2005)）、類似する輸送経路の欠乏は、疾患の根本原因である可能性が高いであろう。ＧＲＡＦ１は、造血細胞における推定上の腫瘍抑制因子タンパク質であり（Borkhardt, A. et al. The human GRAF gene is fused to MLL in a unique t(5;11)(q31;q23) and both alleles are disrupted in three cases of myelodysplastic syndrome/acute myeloid leukemia with a deletion 5q. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 97, 9168-73 (2000)、Bojesen, S. E. et al. Characterisation of the GRAF gene promoter and its methylation in patients with acute myeloid leukaemia and myelodysplastic syndrome. Br. J. Cancer 94, 323-32 (2006)）、類似する経路の欠乏は、病原性の一因となる可能性がある。この経路の活動過剰はまた、固形臓器悪性腫瘍における癌細胞浸潤の一因となる可能性がある。実際に、ＦＡＫの過剰発現又は活性の増大は、種々様々のこれらの癌において見つけられ、現在、推定上の癌標的として研究されている（McLean, G. W. et al. The role of focal-adhesion kinase in cancer - a new therapeutic opportunity. Nat Rev Cancer 5, 505-15 (2005)）。本発明者らの結果は、類似薬発見プログラムの合理的な設計に特異性を提供するのに貢献する可能性がある。本発明者らは、膜輸送及び細胞生理学プロセスの間の連結にただ１つのタンパク質がどのように位置するのかを示した。本発明者らは、ＢＡＲドメイン含有タンパク質ファミリーの各メンバーに関する注意深い研究が、類似するイベントにおける役割を明らかにし、それによって、膜輸送及びそれらの他のエフェクター機能は、細胞内の規定される部位で特異的に調整されるであろうということを予測する。
【０１５０】
材料及び方法
タンパク質発現並びに使用される精製抗体及び構築物は、補足の方法において記載される。組換えタンパク質は、前に記載されるように、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌株において発現させ、グルタチオンセファロース４Ｂビーズ（Amersham Biosciences社製）及びセファクリルＳ−２００カラム上でのゲル濾過（Amersham社製）を使用して精製した（Praefcke, G. J. et al. Evolving nature of the AP2 alpha-appendage hub during clathrin-coated vesicle endocytosis. EMBO J. 23, 4371-83 (2004)）。内在性タンパク質発現の分析については、細胞株は、American Tissue Culture Collectionからの指示によって成長させ、採取し、プロテアーゼ阻害剤を補足したＰＢＳ中１％  ＮＰ−４０において溶解させた。２０，０００ｇ遠心分離の後に、上清は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法によって分析した。タンパク質及び脂質の相互作用アッセイ総脳脂質（ＦＯＬＣＨ画分Ｉ）（Sigma Aldrich社製）からのリポソーム、合成脂質（Avanti Polar Lipids社製）からのリポソーム、及び指定された直径のリポソームは、前に記載されるように生成した（Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science 303, 495-9 (2004)）。脂質特異性及び湾曲感受性についてのリポソーム結合アッセイは、前に記載されるように実行した（Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science 303, 495-9 (2004)）。手短に言えば、タンパク質は、リポソームとインキュベートし、その後、遠心分離並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色によるペレット及び上清の分析を続けた。免疫沈降実験については、ラット脳細胞質ゾルは、４で３０分間、５０，０００ｒｐｍでの遠心分離の前に、緩衝液（２５ｍＭ  HEPES、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  DTT、０．１％  Triton X-100、及びプロテアーゼ阻害剤）において、ラット脳の均質化によって生成した。上清は、取り出し、抗体を、あらかじめ結合させ、３時間、４℃でインキュベートしたプロテインＡセファロース４Ｂビーズ（Amersham Biosciensis社製）に追加した。ビーズは、免疫ブロット法又はクーマシー染色と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の前に、１％  ＮＰ−４０を補足した緩衝液（２５ｍＭ  HEPES、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）において３回、ＮＰ−４０を有していない緩衝液において１回洗浄した。精製タンパク質を使用するラット脳細胞質ゾルに対するプルダウン実験及び質量分析による同定は、前に記載されるように実行した（Praefcke, G. J. et al. Evolving nature of the AP2 alpha-appendage hub during clathrin-coated vesicle endocytosis. EMBO J. 23, 4371-83 (2004)）。インビトロリポソーム管形成アッセイは、前に記載されるように実行し、分析した（Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science 303, 495-9 (2004)）。細胞培養及びトランスフェクションＨｅＬａ細胞は、Ｌ−グルタミン及び１０％ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）において成長させ、一時的なタンパク質発現のためのＧｅｎｅｊｕｉｃｅ（Novagen社製）を使用してトランスフェクトした。初代培養については、ラット海馬ニューロン／星状細胞は、トリプシン消化及びＥ１８又はＰ１  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットからの機械的な���砕によって調製し、ポリＬ−リシン被覆カバーグラス上で平板培養した。細胞は、Ｂ２７を補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地において培養した。ＧＲＡＦ１枯渇について、ＨｅＬａ細胞は、メーカーの指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen社製）を使用して、ヒトＧＲＡＦ１（Invitrogen社製）に対して特異的なステルスｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞は、ＧＲＡＦ１発現の効率的なサイレンシングのためにさらに４８時間、培養した。ステルスＢｌｏｃｋ−ｉｔ  ｓｉＲＮＡ（Invitrogen社製）は、コントロールとして使用された。ＡＰ２  ｓｉＲＮＡは、前に記載されるように使用した（Motley, A., Bright, N. A., Seaman, M. N. & Robinson, M. S. Clathrin-mediated endocytosis in AP-2-depleted cells. J. Cell Biol. 162, 909-18 (2003)）。輸送アッセイ。免疫蛍光輸送アッセイのために、ビオチン化ｈｏｌｏ−トランスフェリン（Sigma Aldrich社製）、Alexa Fluor 546抱合ＣＴｘＢ、ＤｉＩ、ＦＩＴＣ−デキストラン（１０ｋＤａ  ＭＷ、蛍光測定取り込みアッセイに使用）、及びビオチン化デキストラン（１０ｋＤａ  ＭＷ、免疫蛍光取り込みアッセイに使用）（Molecular Probes社製）は、あらかじめ暖められた培地において希釈し、細胞に追加し、図の説明文において記載される期間及び温度でインキュベートした。洗浄後に、細胞は、下記に記載されるように、固定し、免疫蛍光分析にかけた。デキストランエンドサイトーシスの定量分析については、３５ｍｍ皿におけるＨｅＬａ細胞は、実験に先立って、ｓｉＲＮＡ／コントロールｓｉＲＮＡを用いて４８時間トランスフェクトした。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−デキストラン（Sigma Aldrich社製）は、１ｍｇ／ｍｌの濃度まで培地において希釈し、示された温度での１５分間のインキュベーションの前に、細胞に追加した。細胞は、プロテアーゼ阻害剤を補足したＰＢＳ中１％ＮＰ−４０における溶解の前に、培地において２回、ＰＢＳにおいて１回洗浄した。溶解物は、４℃で２０分間、２０，０００ｇで遠心分離し、上清におけるタンパク質濃度は、標準化のために、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce社製）を使用して測定した。上清におけるＦＩＴＣデキストランの量は、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（ＪＡＳＣＯ）と共に、ＦＰ−６５００分光蛍光光度計を使用して、４８８ｎｍで励起した後に５１５ｎｍでの発光として測定した。
画像化
免疫蛍光分析のために、ＨｅＬａ細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３％パラホルムアルデヒドにおいて３７で１５分間固定し（より低い温度での固定によって破壊される細胞内小管の保護）、標準的なプロトコールを使用して、ＰＢＳ中、１％ヤギ血清、０．１％サポニン中で適切な抗体を用いる染色前に、ＰＢＳ中、０．１％サポニンを有する５％ヤギ血清において洗浄し、ブロックした。共焦点画像は、ＢｉｏＲａｄ  Ｒａｄｉａｎｃｅシステム及びＬａｓｅｒＳｈａｒｐソフトウェア（BioRad社製）を使用して、順次得た。落射蛍光画像は、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェアと共にＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ  Ｚ１システムを使用して得た。リアルタイム顕微鏡については、グラス底ペトリ皿（WillCo Wells BV、Amsterdam）上のトランスフェクト細胞は、緩衝液（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び２５ｍＭ  HEPES）を用いて洗浄し、画像は、ＬＳＭ画像ブラウザ（Zeiss社製）、ＩｍａｇｅＪ、又はＶｏｌｏｃｉｔｙ（Improvision社製）における続く分析と共に、５−ライブスキャンニング顕微鏡（Zeiss社製）又は回転円板共焦点システム（Improvision社製）を使用して得た。生物物理学的細胞記録。
１０５  ＨｅＬａ細胞は、８Ｗ１Ｅ電極アレイ（Applied Biophysics社製）のチャンバーに平板培養する前に、２４時間、ＧＲＡＦ１に対するｓｉＲＮＡ又はコントロールｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、５％ＣＯ２と共に３７℃でインキュベートした。電極と対電極の間のインピーダンス値は、上昇フィールドモジュール（elevated field module）を有するＥＣＩＳ  １６００システム（Electronic Cell-substrate Impendence Sensing, Applied Biophysics社製）を使用して、各アレイから、１５ｋＨｚのオシレーター周波数で、絶えず記録した。細胞付着、広がり、及び層コンフルエンスは、１０秒間の４５ｋＨｚ、４Ｖでの電気的な創傷の前に電気的に顕微鏡で確証し、続いて、創傷前として、同じパラメーターを使用して電極から記録した。データは、各創傷実験について、最初の電極インピーダンス値に標準化した。
【実施例４】
【０１５１】
エンドサイトーシス及び細胞遊走におけるＧｒａｆ１の役割
細胞遊走は、膜及びタンパク質の再分布、細胞骨格の変化、及びフォーカルコンプレックス／接着斑ターンオーバーの調整を必要とする。この調整が生じるメカニズムは、先行技術において不明であった。Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質は、細胞遊走の主要な制御因子であることが示された。ここで、本発明者らは、Ｒｈｏ  ＧＡＰドメイン含有タンパク質ＧＲＡＦ１が、細菌外毒素、ＧＰＩ連結タンパク質、及び細胞外液の内部移行を担う、主なクラスリン非依存性エンドサイトーシス経路を調節することを示す。本発明者らは、ＧＲＡＦ１が、そのＮ末端ＢＡＲドメイン及びＰＨドメインを介して、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ−２が豊富な管状で斑点状の脂質構造にインビボにおいて局在化し、ＧＲＡＦ１が、ダイナミン、ＧＩＴ１、ＦＡＫ、及びＰＡＫ２に結合することを示す。これらの後者のタンパク質は、接着斑の解体を促進し、ある位置にＧＲＡＦ１を配置し、それによって、それは、細胞遊走イベントを調整する可能性がある。本発明者らは、ＧＲＡＦ１が、フォーカルコンプレックス／接着斑ターンオーバーに必要であり、ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスが、低分子量Ｇタンパク質依存性の方法でこれらの部位から生じ、ＧＲＡＦ１が、細胞遊走に必要であることを示す。
【実施例５】
【０１５２】
生物研究
ＧＲＡＦファミリー（ショウジョウバエＧＲＡＦについてＤ−ＧＲＡＦ）の１つのメンバーのみが、キイロショウジョウバエにおいて存在する。ハエは、ただ１つのＧＲＡＦファミリーメンバーを有する他の種よりも容易に遺伝子的に操作することができるので、この生物は、ＧＲＡＦファミリータンパク質の生理学的機能を研究するためのモデルに選んだ。ＵＡＳプロモーターのコントロール下で低い及び高いレベルでＤ−ＧＲＡＦ−ＧＦＰを発現する、２つの独立したキイロショウジョウバエのトランスジェニック系を生成した。これらは、その局在性及び過剰発現の効果を検査するために、発達の間に及びそれを越えて、特異的な組織においてＤＧＲＡＦ−ＧＦＰ発現を駆動するために、ＧＡＬ４系と交差されてもよい。精製Ｄ−ＧＲＡＦ−ＳＨ３は、ＧＲＡＦ１の内在性組織及び細胞下の分布を検査するために使用されるであろう、このタンパク質に対するポリクローナル抗体を生成するために、ウサギに注射し、最も大きな発現を有する細胞型は、トランスジェニック実験において注目されるであろう。Ｄ−ＧＲＡＦについての４つの独立したＲＮＡｉ系は、共同研究の供給源から得、ＲＮＡｉの発現は、発達及び成熟期の間に、これらの組織におけるその役割を検査するために、Ｄ−ＧＲＡＦが発現される組織に向けた。Ｄ−ＧＲＡＦヌルのハエもまた、他の、より厳密な方法によってこれを研究するために生産されるであろう。見つけられた任意の表現型もまた、広範囲に調査されるであろう。この研究報告においてＧＲＡＦ１について実行された、Ｄ−ＧＲＡＦ機能の生化学的及び細胞生物学的調査もまた、実行されるであろう。
【０１５３】
哺乳動物研究
ハエは、１つのＧＲＡＦファミリーオルソログを有するが、マウス及びヒトは、このファミリーの４つのメンバーを有する。ヒト生物学及び疾患についてのモデルとして、マウス（Mus musculus）は、十分に確立されている。そのため、哺乳動物におけるＧＲＡＦ１タンパク質の機能をよりよく理解するために（他のＧＲＡＦファミリーメンバーと関連して）、ＧＲＡＦ１−ヌルマウスを作製するためのアプローチが進行中であり（Andrew McKenzieと共同で）、完成に近づいている。ＧＲＡＦ１ヌル突然変異を運ぶ胚性幹細胞は、生産し、レシピエントマウスに次いで移植するマウス胚盤胞に注射した。これらの手順から生産したキメラマウスは現在飼育中である。結果として生じたノックアウトマウスは、ＧＲＡＦ１消失と関連する表現型（もしあれば）を同定するために、ヘテロ接合及び野生型の同腹仔と比較されるであろう。これらのマウスの最初の生存可能性は、ＧＲＡＦ１発現の低い胚レベル及び脳における発現の、出生後の急増によって一時的に予測される可能性がある。組織は、構造的欠陥について検査され、マウス全体は、行動の異常について検査されるであろう。ＧＲＡＦ１発現の消失と関連するあらゆる表現型もまた、広範囲に調査されるであろう。ＧＲＡＦ１が、細胞遊走に必要とされ、成体マウスにおける遊走細胞が、星状細胞及び白血球を含むので、これらの細胞は、異常について検査されるであろう。全動物セッティングにおいて、これは、ノックアウトマウスがグリア性瘢痕を形成し、皮下細菌移植片などの感染性の損傷を根絶する能力についての検査を含むであろう。ノックアウトマウスは、白血病の表現型を進行させるそれらの傾向について調査され、ＧＲＡＦ１ヌルバックグラウンドにおいてこの疾患の進行のあらゆる増強が存在するかどうかを検査するために、急性骨髄性白血病様の悪性腫瘍の傾向があるマウスと交差されるであろう。初代細胞は、これらの動物から単離され、インビトロエンドサイトーシスアッセイ及び細胞遊走アッセイにおいて試験されるであろう。
【０１５４】
要約
本明細書において示される結果は、腫瘍抑制因子タンパク質ＧＲＡＦ１が、クラスリン、カベオリン１、及びフロチリン１に非依存性の管状エンドサイトーシス膜の広範な系に沿って並ぶことを示した。ＧＲＡＦ１は、これらの膜へのエンドサイトーシスに必要であり、そのＮ末端部分（機能的なＢＡＲドメイン及びＰＨドメインを含む）は、それらの高度な湾曲を安定化するために作用する。これらの膜は、線維芽細胞における液相取り込みの半分を担い、主に細胞周辺の形質膜に由来し、ゴルジ装置への積荷の送達のために必要である。この経路についての積荷は、細菌外毒素及びＧＰＩ連結タンパク質を含む。ＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスは、接着部位から優先的に生じる。ＧＲＡＦ１のＣ末端部分は、その機能に必要であり、活性ＲｈｏＧＡＰドメイン及び接着斑の解体に関与する様々なタンパク質と相互作用するＳＨ３ドメインを含む。ＧＲＡＦ１は、接着斑の解体及び細胞遊走が進行するのに必要である。これらの研究は、細胞マトリックス接着タンパク質及び／又は関連するマイクロドメイン結合脂質のＧＲＡＦ１依存性エンドサイトーシスを通して生じる接着斑の解体及び細胞遊走についての新規なメカニズムを示唆する。ＧＲＡＦ１関連タンパク質は、類似する方法で機能するように思われる。これらの結果は、ＧＲＡＦ１及び関連するタンパク質の異常な発現が関連づけられる、精神遅滞及び悪性腫瘍などのヒト疾患プロセスについての理解のためのフレームワークを提供する。今後の研究は、ＧＲＡＦ１の正常な生理学的機能及びこれらが、どのようにして疾患において調節異常になっているのかをさらに調査するために、モデル生物を使用するであろう。
【０１５５】
（実施例の参考文献）
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【０１５６】
上記の明細書において言及される刊行物はすべて、参照によって本明細書において組み込まれる。本発明の、記載される態様及び実施形態の様々な修飾及び変形は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明白であろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されたが、主張される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際に、当業者らに明白である、本発明を実行するための、記載されるモードの様々な修飾は、以下のクレームの範囲内にあることが意図される。
【図１ａ−ｄ】
2011514154.tif 000003
【図１ｅ−ｆ】
2011514154.tif 000004
【図１ｇ−ｈ】
2011514154.tif 000005
【図２ａ−ｂ】
2011514154.tif 000006
【図２ｃ−ｄ】
2011514154.tif 000007
【図２ｅ−ｆ】
2011514154.tif 000008
【図３ａ−ｄ】
2011514154.tif 000009
【図３ｅ−ｇ】
2011514154.tif 000010
【図４】
2011514154.tif 000011
【図５】
2011514154.tif 000012
【図６】
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【図７】
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【図８】
2011514154.tif 000015
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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