(57)【要約】  増殖性細胞核抗原の癌特異的アイソフォーム（ｃａＰＣＮＡ）に対応するペプチド変種は、細胞内タンパク質−タンパク質相互作用を妨げ、それによって、癌の増殖能の低減を引き起こす。細胞透過性のｃａＰＣＮＡ由来ペプチド及びこれらの変種は、癌細胞の増殖を低減させ、現存の癌治療の細胞傷害効果も増大させる、治療用組成物として機能する。これらの組成物は、癌の化学予防にも有用である。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＧＩＰＥＱＥＹ、ＬＡＩＰＥＱＥＹ、ＬＧＩＡＥＱＥＹ、ＬＧＩＰＡＱＥＹ、ＬＧＩＰＥＡＥＹ、ＬＧＩＰＥＱＡＹ、ＬＧＩＡＥＡＥＹ、ＬＧＩＰＥＡＡＹ、ＬＧＩＡＥＱＡＹ、ＬＧＩＡＥＡＡＹからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む細胞透過性ペプチド分子を含む、悪性細胞の細胞増殖を低減するための治療用組成物。
【請求項２】
ペプチド分子が合成分子である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ペプチド分子が細胞透過性因子を更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
細胞透過性因子が、アミノ酸配列のＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、及びＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲからなる群より選択される、細胞透過性ペプチドである、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
細胞透過性ペプチドが、ペプチド分子と共有結合又は結合している、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
細胞透過性ペプチドが、ペプチド分子と組み換え的に融合している、請求項４記載の組成物。
【請求項７】
細胞透過性ペプチドが、スペーサー又はリンカー配列を更に含む、請求項４記載の組成物。
【請求項８】
ペプチド分子が核局在化配列を更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
ペプチドがプロテアーゼ耐性である、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
ペプチドがレトロインベルソ異性体である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
化学療法剤を更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
化学療法剤がＤＮＡ損傷剤である。請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
ＤＮＡ損傷剤が、ドキソルビシン、イリノテカン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、メトトレキセート、シタラビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
悪性細胞がｃａＰＣＮＡアイソフォームを発現する、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
悪性細胞が、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、及び白血病からなる群より選択される、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
リポソームを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
組成物が細胞表面標的化因子を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
細胞表面標的化因子が、ＨＥＲ２、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＥＧＦＲからなる群より選択される、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
悪性細胞に接触させるために、請求項１記載の治療用組成物の治療有効量を投与することを含む、悪性細胞の細胞増殖を低減するための、請求項１記載の治療用組成物の使用方法。
【請求項２０】
組成物が静脈内投与される、請求項１９記載の使用方法。
【請求項２１】
組成物が腫瘍内に送達される、請求項１９記載の使用方法。
【請求項２２】
組成物が細胞透過性因子を含む、請求項１９記載の使用方法。
【請求項２３】
細胞透過性因子が、アミノ酸配列のＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、及びＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲからなる群より選択される、細胞透過性ペプチドである、請求項２２記載の使用方法。
【請求項２４】
化学療法剤を投与することを更に含む、請求項１９記載の使用方法。
【請求項２５】
化学療法剤がＤＮＡ損傷剤である。請求項２４記載の使用方法。
【請求項２６】
ＤＮＡ損傷剤が、ドキソルビシン、イリノテカン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、メトトレキセート、シタラビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２５記載の使用方法。
【請求項２７】
放射線療法を投与することを更に含む、請求項１９記載の使用方法。
【請求項２８】
放射線療法が、ビーム放射治療及びラジオアイソトープ治療からなる群より選択される、請求項２７記載の使用方法。
【請求項２９】
化学療法又は放射線療法が、組成物の投与の前に投与されるか、又は組成物の投与と共に投与される、請求項２７又は２８記載の使用方法。
【請求項３０】
組成物の治療有効量と、化学療法剤又は放射線療法とを投与することを含む、癌細胞を癌治療に対して感作又は促進するための、請求項１記載の治療用組成物の使用方法。
【請求項３１】
化学療法剤がＤＮＡ損傷剤である。請求項２８記載の使用方法。
【請求項３２】
組成物が細胞透過性因子を含む、請求項２８記載の使用方法。
【請求項３３】
細胞透過性因子が、アミノ酸配列のＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、及びＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬからなる群より選択される、細胞透過性ペプチドである、請求項３０記載の使用方法。
【請求項３４】
癌特異的増殖性細胞核抗原（ｃａＰＣＮＡ）アイソフォームを発現する細胞が、悪性状態へ形質転換すること、又は腫瘍を発生することを予防するための、癌の化学予防用の医薬としての請求項１記載の組成物の使用方法。
【請求項３５】
化学予防剤が、一つの癌型に対して危険度が高いと考慮される個体に投与される、請求項３４記載の使用方法。
【請求項３６】
化学予防剤が、前癌性細胞を有する個体に投与される、請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ペプチドに基づいた治療用組成物及び癌細胞の増殖を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、ＤＮＡ複製、修復、染色体組み換え、細胞周期チェックポイント制御及び他の細胞増殖活性のプロセスにおいて重要な役割を果たす。アダプタータンパク質である複製因子Ｃ（ＲＦＣ）と共に、ＰＣＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼデルタ及びイプシロンのドッキングポイントである移動クランプを形成する。酸性と塩基性の両方の等電点（ｐＩ）を示す増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の異なるアイソフォームが実証されている。二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ  ＰＡＧＥ）による悪性及び非悪性の両方の乳房細胞及び組織のＰＣＮＡ（非悪性ＰＣＮＡ又はｎｍＰＣＮＡと呼ばれる）の分析は、悪性細胞のみにおいて存在する酸性形態のＰＣＮＡを明らかにした（癌特異的ＰＣＮＡ又はｃｓＰＣＮＡ又はｃａＰＣＮＡと呼ばれる）。２つの形態のＰＣＮＡの間における等電点の差は、ＰＣＮＡペプチドを翻訳後修飾する悪性細胞の能力が変更されたことによりもたらされ、ＰＣＮＡ遺伝子内の遺伝子変化によるものではないと思われる。
【０００３】
ＰＣＮＡポリペプチドの構造を検査して、ｃａＰＣＮＡと、ＰＣＮＡの非悪性細胞アイソフォームとの構造差を確定する構造研究は、癌細胞においてのみ独自に露出しているｃａＰＣＮＡタンパク質の領域を明らかにした。癌細胞に独占的に発現しているＰＣＮＡアイソフォームに極めて選択的であるような、ＰＣＮＡの癌特異的アイソフォームの領域に対する抗体が開発された。
【０００４】
増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、２９kDaの核タンパク質であり、細胞周期のＳ及びＧ２期の細胞における発現は、このタンパク質を良好な細胞増殖マーカーにする。細胞の生死に関わる多くの分子経路においてもパートナーとなることが示されている。ＰＣＮＡの、Ｓ期核における周期的な出現は、ＤＮＡ複製における関与を示唆した。ＰＣＮＡは後に、哺乳類の細胞におけるＤＮＡポリメラーゼ補助因子として、また、インビトロにおけるＳＶ４０  ＤＮＡ複製の必須因子として同定された。ＰＣＮＡは、ＤＮＡスライディングクランプタンパク質として機能すること及び哺乳類細胞におけるＤＮＡポリメラーゼ補助因子として機能することに加えて、転写、細胞周期チェックポイント、クロマチン再構築、組み換え、アポトーシス及び他の形態のＤＮＡ修復に関与する多数の他のタンパク質と相互作用する。ＰＣＮＡの作用の多様性の他に、ＰＣＮＡの多くの結合パートナーは、それぞれの新世代の細胞による細胞機能の正確な遺伝に寄与することによって結びついている。ＰＣＮＡは、染色体プロセッシングを調整するマスター分子として作用することができる。
【０００５】
ＰＣＮＡは、ＦＥＮ−１、ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼのような他の因子と相互作用することも知られている。加えて、ＰＣＮＡは、複数のＤＮＡ修復経路における必須の当事者であることも示された。ミスマッチ認識タンパク質であるＭｓｈ２及びヌクレオチド除去修復エンドヌクレアーゼであるＸＰＧのようなタンパク質との相互作用は、ＤＮＡ合成と異なるプロセスにおけるＰＣＮＡの関与を示す。複数のパートナーとの相互作用は、一般に、ＰＣＮＡが規則正しく強力に好ましい方法で選択的に相互作用することを可能にする機構に依存する。
【０００６】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体の生成のために、短い合成ペプチドを用いる方法が使用され、かなりの成功を収めてきた。ペプチドは、化学誘引物質、強力な神経及び呼吸毒、並びにホルモンとして機能することが知られている。ペプチドは、生化学的研究において親和性標的及びプローブとしても使用されており、特定のタンパク質−タンパク相互作用の特徴及び特定の性質を理解する基礎を提供してきた。加えて、ペプチドホルモンは、強力な生理学的効果を発揮し、活性型のホルモンは、大型のタンパク質内に含有されているペプチドである場合もあるし、その生理学的効果の発揮に先だって、前駆体からプロセシングされて放出されるペプチドである場合もある。
【０００７】
ペプチドは、タンパク質−タンパク質相互作用を撹乱するために、これらの相互作用の高度に特異的な競合因子として作用することにより使用されてきた。ペプチド試薬を用いる生化学的研究は、タンパク質−タンパク質相互作用を必要とする細胞機能を撹乱することができる治療薬として、ペプチドの使用を進化させた。したがって、特定のタンパク質−タンパク質相互作用に依存しているアポトーシス及び細胞周期の進行のような特定の細胞プロセスを、これらのタンパク質−タンパク質相互作用が選択的に撹乱される場合に、阻害することができる。タンパク質−タンパク質相互作用に依存しているゲノムＤＮＡの複製も、これらのタンパク質相互作用のペプチド誘導阻害に感受性がある。
【０００８】
インビボでのＤＮＡ合成は、一連の複雑なタンパク質−タンパク質相互作用により仲介される無数の生化学的反応に依存している、高度に調節されたプロセスである。細胞分裂は、ＤＮＡ合成プロセスに依存しており、癌細胞増殖は、癌細胞のゲノムＤＮＡをコピーすることに関与するＤＮＡ合成機構の調節及び／又は活性を撹乱するあらゆる作用物質に対して実質的に感受性がある。加えて、乳癌の一つの兆候は、形質転換細胞が侵襲性の高い転移性の表現型を発現するので、ゲノムの不安定性の誘導であることが示された。ゲノムの不安定性は、ＤＮＡ合成の忠実度を変える、細胞内ＤＮＡ合成機構における一連の変化を介して生じる。
【０００９】
ｐ２１ｃｉｐタンパク質（ＰＣＮＡタンパク質と相互作用することが知られている）からのカルボキシル末端の２６アミノ酸を利用した研究は、このペプチドが細胞増殖プロセスを撹乱する能力を実証した。このｐ２１のペプチドフラグメントは、ＰＣＮＡを利用する１つ以上の細胞プロセスを撹乱する潜在力を有し、おそらく、ＤＮＡ合成プロセス、ならびに他の細胞周期チェックポイント制御の調節及びアポトーシスの誘導に参加する、重要なタンパク質−タンパク質相互作用を妨げる。
【００１０】
このｐ２１のペプチドフラグメントを利用する研究は、非カスパーゼ関連アポトーシス経路を活性化するｐ２１ペプチドの能力を実証した。同様に、ｐ２１タンパク質の３９アミノ酸ペプチドフラグメントを伴う研究は、インビボでＤＮＡ複製を部分的に阻害したが、これは、このｐ２１タンパク質のペプチドフラグメントが、ＰＣＮＡ−ｐ２１タンパク質相互作用を安定化し、細胞内のＤＮＡ合成活性に減少をもたらすことができることを示唆している。
【００１１】
加えて、細胞周期チェックポイント制御及びＤＮＡ合成に関与する他の細胞タンパク質と相互作用しうるような、ＰＣＮＡ分子の特定の領域のモデリングのために、計算化学法が使用されてきた。サイクリンＣＤＫ複合体の領域は、細胞増殖に必須である主要な細胞周期チェックポイント制御ポイントを撹乱する標的部位を同定するための、テンプレートとして機能することができる。
【００１２】
細胞増殖を阻害する合成ペプチドの使用、及び細胞増殖の阻害を仲介するために癌特異的ＰＣＮＡタンパク質を選択的に標的化する方法が、癌を治療するために必要である。ｃａＰＣＮＡの抗原部位又は標的部位と相互作用して、癌細胞に特有である特定のタンパク質−ｃａＰＣＮＡ相互作用を撹乱するペプチド模倣体が望まれる。本明細書に開示されている、ｃａＰＣＮＡ特異的エピトープに由来するペプチドは、特定の伝統的な化学療法レジメンの細胞傷害効果を有意に増大し、したがって、癌細胞を高度に選択的な方法で死滅させる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
癌特異的（ｃａＰＣＮＡ）相互作用タンパク質の特定の領域又はドメインに由来するペプチド変種は、細胞タンパク質とＰＣＮＡタンパク質とのインビボでの相互作用を妨げ、したがって癌細胞の生存に影響を与える。ｃａＰＣＮＡタンパク質のペプチドフラグメントを表す特定のアミノ酸配列は、ＰＣＮＡの調節活性を撹乱し、続いて、ＤＮＡ複製、修復、染色体組み換え及び細胞周期チェックポイント制御を含むＰＣＮＡを必要とする細胞プロセスの機能の撹乱を介して、癌細胞の増殖を阻害する。
【００１４】
１つ以上の位置でのアミノ酸置換は、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドの細胞傷害効果を向上させる。細胞内取り込みを増強するタグ又はドメインを有するアミノ酸置換ペプチドを含むｃａＰＣＮＡ由来ペプチドは、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドの細胞傷害効果を増加する。
【００１５】
悪性細胞の細胞増殖を低減する治療用組成物は、ＬＧＩＰＥＱＥＹ、ＬＡＩＰＥＱＥＹ、ＬＧＩＡＥＱＥＹ、ＬＧＩＰＡＱＥＹ、ＬＧＩＰＥＡＥＹ、ＬＧＩＰＥＱＡＹ、ＬＧＩＡＥＡＥＹ、ＬＧＩＰＥＡＡＹ、ＬＧＩＡＥＱＡＹ及びＬＧＩＡＥＡＡＹからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、細胞透過性ペプチド分子を含む。一つの実施態様において、ペプチド分子は合成分子である。
【００１６】
悪性細胞の細胞増殖を低減する治療用組成物は、ＬＧＩＰＥＱＥＹ、ＬＡＩＰＥＱＥＹ、ＬＧＩＡＥＱＥＹ、ＬＧＩＰＡＱＥＹ、ＬＧＩＰＥＡＥＹ、ＬＧＩＰＥＱＡＹ、ＬＧＩＡＥＡＥＹ、ＬＧＩＰＥＡＡＹ、ＬＧＩＡＥＱＡＹ及びＬＧＩＡＥＡＡＹからなる群より選択されるアミノ酸配列から実質的になる、細胞透過性ペプチド分子を含む。
【００１７】
一つの実施態様において、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド分子は、細胞透過性因子又は細胞内取り込み剤を更に含む。例えば、細胞透過性因子は、アミノ酸配列のＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、又は表４に提示されている因子の群から選択される、細胞透過性ペプチドである。幾つかの態様において、細胞透過性ペプチドは、ｃａＰＣＮＡに由来するペプチド分子と共有結合又は結合している。他の態様において、細胞透過性ペプチドは、ペプチド分子と組み換え的に融合している。特定の実施態様において、細胞透過性ペプチドは、スペーサー配列を更に含む。スペーサー配列は、約１〜１０個又は約１〜２０個のアミノ酸長さであってもよい。合成スペーサーも、細胞膜を貫通するペプチドの移行を妨げない限り適している。
【００１８】
一つの実施態様において、ペプチドは、未修飾の天然ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドと比較してプロテアーゼ耐性になるように操作される。一つの実施態様において、本明細書に開示されているペプチドは、レトロインベルソ異性体として生成される。
【００１９】
一つの実施態様において、ｃａＰＣＮＡ由来の移行性ペプチドを含む組成物は、化学療法剤を更に含むことができる。好ましくは、化学療法剤はＤＮＡ損傷剤である。ＤＮＡ損傷剤の例には、例えば、ドキソルビシン、イリノテカン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、メトトレキセート、シタラビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２０】
一つの実施態様において、ｃａＰＣＮＡ相互作用のペプチドインヒビターを含む組成物を、リポソームとして送達することができる。リポソームは、ナノ粒子を含むこともできる。一つの態様において、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドを含む医薬組成物の１つ以上の構成成分は、ナノ粒子を更に含むことができる。
【００２１】
癌細胞の増殖を阻害する方法は、
（ａ）本明細書に開示されているペプチドを含む組成物の治療有効量を得ること；
（ｂ）組成物を、作用物質が癌細胞の集団と接触するように、投与すること；及び
（ｃ）組成物により癌細胞の増殖を阻害すること
を含む。
【００２２】
一つの実施態様において、組成物は静脈内投与される。癌への直接的な送達を含む、任意の投与様式が可能である。化学療法剤を、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド又はその変種を含む組成物の投与の前に、それと共に、又はその後に、癌患者に投与することができる。一つの実施態様において、放射線療法を、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド又はその変種を含む組成物の投与の前に、それと共に、又はその後に、投与することもできる。放射線治療には、ビーム放射治療及びラジオアイソトープ治療が含まれる。
【００２３】
癌治療において癌細胞を感作する方法は、
（ａ）ＬＧＩＰＥＱＥＹ、ＬＡＩＰＥＱＥＹ、ＬＧＩＡＥＱＥＹ、ＬＧＩＰＡＱＥＹ、ＬＧＩＰＥＡＥＹ、ＬＧＩＰＥＱＡＹ、ＬＧＩＡＥＡＥＹ、ＬＧＩＰＥＡＡＹ、ＬＧＩＡＥＱＡＹ及びＬＧＩＡＥＡＡＹの群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド分子を含む組成物の治療有効量を、組成物が癌細胞の集団と接触して癌細胞を感作するように、投与すること；並びに
（ｂ）化学療法剤又は放射線治療を投与して、癌細胞の増殖を阻害すること
を含む。
【００２４】
癌の化学予防の方法は、
（ａ）ＬＧＩＰＥＱＥＹ、ＬＡＩＰＥＱＥＹ、ＬＧＩＡＥＱＥＹ、ＬＧＩＰＡＱＥＹ、ＬＧＩＰＥＡＥＹ、ＬＧＩＰＥＱＡＹ、ＬＧＩＡＥＡＥＹ、ＬＧＩＰＥＡＡＹ、ＬＧＩＡＥＱＡＹ及びＬＧＩＡＥＡＡＹの群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド分子を含む組成物を含む化学予防剤を、ＰＣＮＣの癌特異的アイソフォーム（ｃａＰＣＮＡ）を発現する可能性のある癌細胞の集団に組成物が接触するように、投与すること；並びに
（ｂ）ｃａＰＣＮＡアイソフォームを発現する細胞が悪性状態に形質転換する又は腫瘍を発生するのを予防すること
を含む。
【００２５】
一つの実施態様において、化学予防剤は、一つの癌型に対して危険性が高いと考慮される個体に投与される。一つの実施態様において、化学予防剤は、前癌性細胞を有する個体に投与される。
【００２６】
ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド（例えばアミノ酸配列ＬＧＩＰＥＱＥＹを有するペプチド）の構造又は配列情報に基づいて、ｃａＰＣＮＡ細胞相互作用に特異的なインヒビターを得るために、合理的薬剤設計の方法論を用いることもできる。一つの実施態様において、薬剤は、細胞内タンパク質に由来するペプチドフラグメントである。一つの実施態様において、細胞内タンパク質はｃａＰＣＮＡと相互作用することが知られている。
【００２７】
増殖性細胞核抗原の癌特異的アイソフォーム（ｃａＰＣＮＡ）を発現する悪性細胞のインビボ細胞増殖を低減するための治療用組成物では、組成物は、ポリアルギニン配列を含む細胞透過性ペプチド配列と共に、アミノ酸配列ＬＧＩＰＥＱＥＹを有するペプチド分子を含む。一つの実施態様において、細胞を経たペプチド取り込みを促進するペプチドドメインは、Ｒ９（非アルギニンタグ）である。
【００２８】
増殖性細胞核抗原の癌特異的アイソフォーム（ｃａＰＣＮＡ）を発現する悪性細胞のインビボ細胞増殖を低減するためのリポソーム組成物では、組成物は、１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列Ｒ９−ＬＧＩＰＥＱＥＹを含むペプチド分子、又はその機能的に同等な構造若しくはそのペプチド模倣体を含み、ここでＲ９は、化学的に結合しているか又は組み換え融合タンパク質の一部である。
【００２９】
本明細書に開示されている１つの以上の組成物と共に使用されるのに適した細胞表面標的化因子は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の群から選択される。
【００３０】
ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドを発現する組み換え細胞であり、ここでペプチドは、癌細胞のタンパク質−タンパク質相互作用を選択的に撹乱する。一つの実施態様において、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列ＬＧＩＰＥＱＥＹを含む。
【００３１】
１つ以上のアミノ酸置換を有し、ペプチド移行配列を有するアミノ酸配列ＬＧＩＰＥＱＥＹを含む、合成ペプチドである。
【００３２】
１つ以上のアミノ酸が置換されている、その他の適切なＰＣＮＡ由来ペプチドインヒビターとしては、１つ以上のアミノ酸置換を有する、ＱＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣ、ＶＥＱＬＧＩＰＥＱＥＹ、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶＫ、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶＫＭＰＳＧ、ＥＱＬＧＩＰＥＱＥＹ、ＱＬＧＩＰＥＱＥＹ、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶＫＭＰＳ、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶＫＭＰ、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶＫＭ、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶ、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶ、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣ、ＱＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣ、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳ、並びに、１つ以上のアミノ酸置換を有するＬＧＩＰＥＱＥＹに隣接する付加ＮＨ２及びＣＯＯＨ末端アミノ酸と、Ｒ９のような細胞透過性配列との組み合わせ、が挙げられる。
【００３３】
本明細書に開示されているペプチドを発現することができる複製欠損ウイルス発現ベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス及び他）も、適切な送達系である。 
【００３４】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その全体が参照として本明細書に組み込まれている、２００８年７月２４日出願の米国特許出願第６１／０８３，３９３号の優先権を主張する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドインヒビターについて、予想される作用様式、及びＤＮＡ損傷剤の存在下での癌の増殖阻害における役割を図示する。
【図２】図２は、（Ａ）Ｒ９、ｃａペプチド（１２６−１３３）及びＲ９−ｃａペプチドの細胞傷害効果を示す。Ｕ９３７細胞をそれぞれのペプチドの漸増量で処理し、アポトーシスのレベルを、フローサイトメトリーで評価した。（Ｂ）ドキソルビシンとＲ９−ｃａペプチドとを組み合わせた細胞傷害性を示す。Ｕ９３７細胞を２５μMのＲ９−ｃａペプチド及び漸増濃度のドキソルビシンで処理した。ドキソルビシンのＩＣ５０（太線）は、２５μMのＲ９−ｃａペプチドを添加すると、１４０nMから１１０nMに減少する。
【図３】図３は、Ｒ９−ｃａペプチドの核局在化を示す。Ｕ９３７細胞をＦＩＴＣ−Ｒ９−ｃａペプチドで処理し、サイトスピンにより被覆スライド上に収集した。ＤＡＰＩ染色された核（左側）及びＦＩＴＣ−Ｒ９−ｃａペプチド（右側）の蛍光画像を重ね合わせると（中央）、Ｒ９−ｃａペプチドの細胞内取り込み及び核局在化を示した。四角形は無傷細胞を示す。
【図４】図４は、ＦＥＮ−１とＰＣＮＡの構造的相互作用を示す。左側：ＰＣＮＡモノマーＡ及びＣの分子表面が示されている。ＦＥＮ−１モノマーＸ及びＺのａａ３３０〜３８０が、ワイヤフレーム表現で示されている。右側：ＰＣＮＡ／ＦＥＮ−１相互作用において保存されている強力な疎水的相互作用の領域のクローズアップである。ａａ１２６とａａ１３３は、ＦＥＮ−１がＰＣＮＡと相互作用する腔の端部を形成する。
【図５】図５は、結合ポケットにおけるａａ１２６−１３３ペプチドの相互作用を示す。
【図６】図６は、ＦＥＮ−１を取り囲むポケットにおけるアミノ酸１２６−１３３の配向を示す。ＰＣＮＡの分子表面提示により作り出された腔に適合するＦＥＮ−１のＸ及びＺ鎖の一部である。ＰＣＮＡペプチド１２６−１３３のそれぞれのアミノ酸の位置が示されている。右側のチャートに、それぞれのアミノ酸がアラニンに置換されたときの細胞傷害性の変化を列挙する。
【図７】図７は、ＰＣＮＡの結合パートナーの保存残基を示す。左側：多様なペプチド／タンパク質の配列保存、及びＰＣＮＡのａａ１２６−１３３により部分的に作り出された腔に結合する５つのアミノ酸配列である。右側：腔に示されたＰＣＮＡ結合パートナーの保存配列のオーバーレイである。最も保存されている残基が表及び図の両方に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本明細書に開示される方法及び組成物は、癌細胞において重要な細胞機能を選択的に撹乱する、ｃａＰＣＮＡペプチド変種と、そのペプチド模倣体、その機能的類似体に関する。これらのペプチドには少なくとも２つの作用様式がある。例えば、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド変種は、ｃａＰＣＮＡと競合してｃａＰＣＮＡ相互作用タンパク質と結合する、あるいは、ｃａＰＣＮＡ相互作用タンパク質上の相互作用を撹乱する部位に結合する。
【００３７】
ｃａＰＣＮＡタンパク質配列に由来する特定のペプチド変種は、癌細胞におけるＤＮＡ複製、修復、細胞周期制御、アポトーシス、転写、又は染色体組み換えに関与する幾つかの細胞タンパク質の結合を阻止する能力を有する。これらの細胞タンパク質へのｃａＰＣＮＡの結合は、ペプチドがこれらのタンパク質とＰＣＮＡの天然に生じる結合部位において競合することが可能である場合に撹乱される。ＰＣＮＡとＰＣＮＡに結合する又は相互作用するタンパク質との天然の相互作用を撹乱することによって、ＰＣＮＡを動員する正常な細胞機能が撹乱される。この重要な細胞機構の撹乱は、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド変種を、それ自体で、又は例えば癌治療薬のような他の分子と組み合わせて、細胞傷害性となるようにする。これらのペプチドは、単独で又は他の癌治療剤と組み合わされて、有用な癌化学療法剤であるか、又は特定の抗癌化学療法剤の薬力学的効果の増強剤である。本明細書に開示されているペプチドインヒビターは、腫瘍細胞を、ＤＮＡを損傷する化学療法剤に対して感作し、また、癌薬に対して一般に耐性である腫瘍をより反応性にする。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、用語「感作」は、治療目的において、一般に、所定の時間（例えば、２４、４８、７２時間）内に一群の癌細胞（例えば、腫瘍）の５０％を死滅させるために必要とされる増殖阻害剤又は細胞傷害剤（例えば、ドキソルビシン）の量を低下させることのできる、本明細書に開示されているペプチドの能力を意味する。
【００３９】
用語「前癌性」又は「前悪性」は、一般に、組織（臓器）内に癌の発生に関連することが知られている又は関連すると考えられていて、組織構造における形態的変化であると認識可能であってもなくてもよい状態のことを意味する。加えて、腫瘍組織に見出されるいくらかの割合の癌細胞と関連することが知られている遺伝子発現（又はタンパク質の特定のアイソフォームの発現）における初期の分子変化は、癌形質転換プロセスを受けているこれらの組織の細胞内における、容易に識別できる形態変化よりも先に生じうる。したがって、特定の遺伝子及び／又はタンパク質の発現パターンの初期変化は、癌の発生をもたらす分子レベルの形質転換プロセスに関連する最初の事象であることができる。これらの初期変化は、これら自体では、訓練された個体（病理学者）の光学顕微鏡レベルで認識できる程度にまでは細胞及び／又は組織の形態に変化を誘導しないので、分子レベルでしか認識することができない。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、用語「増大」又は「増大する」は、治療目的において、一般に、ある治療剤の薬力学的効果（効能と呼ばれる）の向上を意味する。したがって、用語「増大」は、ペプチドが、ある治療剤（例えば、ドキソルビシン）と共に投与されたとき、治療剤単独と比較して、治療剤の効能を上昇させて、同じ時間単位（例えば、２４、４８又は７２時間）にわたってより多くの癌細胞の数の死滅をもたらすペプチドの能力を意味する。
【００４１】
増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）タンパク質に由来するペプチド変種とは、本明細書において、ＤＮＡ損傷剤（例えば、ドキソルビシン）と共に、それらの薬剤の多様な癌細胞を治療するための治療効果を増強するように作用する能力を有するもののことであると特定される。ｃａＰＣＮＡに基づいたペプチドインヒビターの、予想される作用様式と、ＤＮＡ損傷剤の存在下での癌増殖の阻害におけるそれらの役割とを例示する図１を参照すること。本ペプチドは、ＰＣＮＡ内のアミノ酸配列に由来し、例えばアミノ酸１２６−１３３を包含して、且つ１つ又は複数のアミノ酸突然変異を含む。
【００４２】
ｃａＰＣＮＡ由来のペプチド変種及びペプチド模倣体は、新規の抗癌治療剤を表し、また、現行の癌療法に対して腫瘍細胞を促進又は感作する。
【００４３】
本明細書に開示されているペプチド配列は、癌細胞において一意的にほどけている可能性があるｃａＰＣＮＡの領域を標的化する。したがって、本明細書に開示されているペプチドは、以下の細胞プロセス：ＤＮＡ複製、修復、組み換え、転写、細胞周期チェックポイント制御及びアポトーシス、の少なくとも１つに関与するＰＣＮＡ内のアミノ酸配列と相互作用する特定のタンパク質の活性を調節するｃａＰＣＮＡと競合する能力によって、腫瘍細胞を選択的に標的化するように設計される。
【００４４】
本明細書に開示されているペプチドは、標準的ペプチド合成手順及び装置を使用して合成されてか、又は商業的に入手することもできる（例えば、United Biochemical Research Co., Seattle WA）。少なくとも１つのアミノ酸置換を含むヒトＰＣＮＡ分子のアミノ酸１２６−１３３（ＬＧＩＰＥＱＥＹ）、続いて、細胞内へのペプチドの取り込みを促進するための細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）配列、例えばポリアルギニン配列を有する、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドは、癌細胞をインビトロで選択的に阻害する。
【００４５】
インビトロ方法論を伴う特定の実施態様において、ｃａＰＣＮＡペプチド変種の取り込みは、このペプチドを、癌細胞と共に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中又は０．２〜２％のＤＭＳＯを含有する培地中のいずれかにおいて、血清なしで約４〜２４時間インキュベーションすることにより、開始した。これらのペプチドの取り込みは、リポソーム製剤へのペプチドの封入、続く癌細胞との３７℃で約４〜２４時間のインキュベーションによっても、効果的に仲介される。これらのペプチドは、ドキソルビシンのような化学治療剤の細胞傷害効果も増大した。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「薬剤」には、核酸、タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、合成ペプチド、ペプチド模様薬、その類似体、小型分子、インヒビター、及び、タンパク質−タンパク質相互作用又は細胞プロセスに影響を与えることができるような、任意の化学、有機、又は生物有機分子が含まれる。
【００４７】
用語「ｃａＰＣＮＡペプチド変種」又は「ペプチド変種」は、配列がｃａＰＣＮＡに由来し、置換突然変異若しくは欠失突然変異のような１つ以上の突然変異を含むような、ペプチド若しくはアミノ酸類似体、又はそれらの組み合わせを意味する。例えば、ＰＣＮＡのアミノ酸１２６−１３３を表すＬＧＩＰＥＱＥＹは、例えば、アミノ酸Ｇ、Ｐ、Ｑ及び最後から二番目のＥがアラニン（Ａ）のようなアミノ酸で置換されていることができる、ｃａＰＣＮＡ由来配列である。したがって、ＬＸ１ＩＸ２ＥＸ３Ｘ４Ｙはペプチド変種であり、ここでＸ１−４は、独立して又は集合的に置換されていることができる。一つの実施態様において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＱであり、そしてＸ４はＥである。別の実施態様において、Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＱであり、そしてＸ４はＥである。別の実施態様において、Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＡであり、そしてＸ４はＥである。別の実施態様において、Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＰであり、Ｘ３はＱであり、そしてＸ４はＡである。別の実施態様において、Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＡであり、Ｘ３はＡであり、そしてＸ４はＡである。「ｃａＰＣＮＡペプチド変種」又は「ペプチド変種」は、５〜１０個、５〜５０個、７〜５０個、８〜２０個、８〜２５個、８〜３０個、８〜４０個、８〜５０個のアミノ酸長さの範囲であることができる。例えば、「ｃａＰＣＮＡペプチド変種」又は「ペプチド変種」は、ｃａＰＣＮＡからの約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０個の連続アミノ酸から実質的になることができ、ここで１つ以上のアミノ酸は置換されている。「ｃａＰＣＮＡペプチド変種」又は「ペプチド変種」は、「ｃａＰＣＮＡペプチド変種」又は「ペプチド変種」を細胞膜を貫通して透過又は移行させることができるペプチド移行ドメイン又は配列を、更に含むことができる。「ｃａＰＣＮＡペプチド変種」又は「ペプチド変種」は、また、親油性に影響を与えるように修飾されて、癌細胞へのペプチド送達を増強する。ペプチドは、合成することも（「合成ペプチド」）、組み換え技術により産生することも（「組み換えペプチド」）、遺伝子発現技術を使用してインビボで発現させることもできる。これらのペプチドを操作して、ｃａＰＣＮＡ−タンパク質相互作用の阻害における効能に有意な影響を与えることなく、インビボ安定性を増加すること（例えば、プロテアーゼ耐性にすることによりペプチド安定性を増加すること）もできる。本明細書に開示されているペプチドの阻害活性に実質的に影響を与えない挿入、欠失、置換、アミノ酸修飾を含む突然変異は、範囲内である。１つ以上の突然変異を有する１２６−１３３配列ＬＧＩＰＥＱＥＹから実質的になるペプチドは、本明細書に開示されているペプチド変種の阻害機能に著しく影響を与えない他の異種配列を含むことができる。
【００４８】
本明細書に開示されているペプチドは、癌細胞よりも悪性細胞を死滅させる特異性を示す。例えば、本明細書に開示されているペプチドは、実質的に特異的であり、非悪性細胞と比較した場合、５０％を超えて、好ましくは６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は９５％を超えて、悪性癌細胞を優先的に死滅させる。
【００４９】
「ペプチド変種」又は「ペプチド誘導体」はまた、ＰＣＮＡ又はＰＣＮＡ相同体の一部と同様である領域のアミノ酸配列を有するが、１つ以上のアミノ酸側基、α炭素原子、末端アミノ基又は末端カルボン酸基の少なくとも１つの化学修飾を更に有するような分子も意味する。化学修飾には、化学的部分の付加、新たな結合の作成、及び化学的部分の除去が含まれる。アミノ酸側基の修飾には、リシン、εアミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン又はリシンのＮアルキル化、グルタミン酸又はアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化及びグルタミン又はアスパラギンの脱アミド化が含まれる。末端アミノ酸の修飾には、デスアミノ、Ｎ低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル及びＮアシル修飾が含まれる。末端カルボキシ基の修飾には、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド及び低級アルキルエステル修飾が含まれる。低級アルキルはＣ１〜Ｃ４アルキルである。更に、１つ以上の側基又は末端基を、通常の技能を持ったタンパク質化学者には既知の保護基により保護することができる。アミノ酸のα炭素を、モノ−又はジ−メチル化することができる。
【００５０】
アミノ酸残基を、本明細書に開示されているペプチド変種の阻害機能に実質的に影響を与えることなく同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換することができる点において、本ペプチドが上記に記載されたペプチドと実施的に同様であってもよいことを、当業者は認識する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、 セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基には、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン及びアスパラギン−グルタミンが含まれる。したがって、本明細書に開示されているペプチドインヒビターは、ペプチドの阻害機能に実質的に影響を与えることなく、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有することができる。
【００５１】
ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドの非天然産の変種は、組み換え技術又は化学合成を使用して容易に生成することができる。そのような変種は、開示されているペプチドのアミノ酸配列に、欠失、付加及び置換を含むが、これらに限定されない。例えば、１つの置換の部類は、保存的アミノ酸置換である。そのような置換は、開示されているｃａＰＣＮＡ由来ペプチドにおける所定のアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸で置換することである。保存的置換として典型的に許容されるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅのうちの互いの置換、ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの取り換え、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ及びＡｒｇの交換、並びに芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒの置換である。可能なアミノ酸置換のリストは、本明細書の表５に提示されている。
【００５２】
用語「変種」は、天然配列ペプチドといくらか異なるアミノ酸配列、すなわち、１つ以上のアミノ酸が、同じ特性及び立体配座の役割を有する別のものに置換されている保存的アミノ酸置換により、天然配列と異なるアミノ酸配列、を有するペプチドを意味する。アミノ酸配列変種は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失及び／又は挿入を有する。
【００５３】
ＰＣＮＡ由来ペプチド変種はまた、癌細胞に存在する細胞表面レセプターのリガンドと、融合させるか、そうでなければ結合させることもできる。リガンドは更に、切断可能であってもよく、それによって、ペプチド変種（インヒビター）が、腫瘍特異的リガンドを使用して腫瘍細胞を標的化できるが、ペプチド変種が腫瘍細胞に自由に進入できるように、腫瘍環境に存在するプロテアーゼにより切断される。例えば、細胞増殖のマーカーであるヒトトランスフェリンレセプター（ｈＴｆＲ）は、治療剤の標的として使用され、口腔癌、肝癌、膵癌、前立腺癌及び他の癌において少なくとも１００倍多く発現する（Lee et al., (2001) “Receptor mediated uptake of peptides that bind the human transferrin receptor” Eur. J. Biochem., 268: 2004-2012）。ＨＡＩＹＰＲＨ及びＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰというペプチドは、ｈＴｆＲに特異的に結合し、これらのペプチドは、ｈＴｆＲを関連巨大分子で標的化することができた（Lee、上記）。これらのペプチドは、天然リガンドのＴｆと重複しない部位に結合し、ｈＴｆＲ陽性細胞の飲食作用経路を巨大分子で標的化することにインビボにおいて有用である（Lee、上記）。そのようなペプチドを使用して、ＰＣＮＡ由来ペプチドを標的化して、ペプチド送達を増強することも、特異的送達を更に増強することもできる。
【００５４】
用語「細胞透過性因子」又は「細胞膜担体」又は「細胞透過性要素」は、因子がｃａＰＣＮＡ相互作用を阻害するペプチド変種の能力に実質的に影響を与えない限り、細胞膜を変位する本明細書に開示されているペプチド変種の能力を増強するペプチドを含む任意の成分を意味する。場合により、細胞透過性因子は、哺乳類細胞における非飲食作用及び非分解経路を介して作動する。これらの因子には、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）又は細胞透過性ペプチドが含まれうる。ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドに結合又は融合するのに適した細胞透過性ペプチド又はペプチドドメインの例には、例えば、ポリアルギニン（Ｒ６−Ｒ２１）のような特定のタンパク質の伝達ドメインに由来する小型多塩基性ペプチド、アンテナペディア（ＡｎＴｐ）ホモドメインの第３へリックス、ＲＹＩＲＳタグ配列及び本明細書の表４に提示されているものが挙げられる。
【００５５】
一つの実施態様において、細胞膜透過性担体は、ペプチド、好ましくはアルギニン豊富ペプチドである（例えば、Futaki S. et al., (2001) “Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery” J. Biol. Chem., 276, 5836）。細胞膜透過性担体ペプチドの多数のアルギニン残基は、６個を超えるアルギニン、好ましくは７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアルギニン残基、を含有することができる。アルギニン豊富ペプチドのアルギニン残基は、連続している必要はない。当業者は、適切な数のアルギニン残基を有する適切なアルギニン豊富ペプチドをどのように選択するかを知っている。
【００５６】
より多くの細胞外プロテアーゼ周囲腫瘍組織を使用して、本明細書に開示されているインヒビター（「積荷」）を送達するために、ペプチドヘアピンを使用することもできる（参照として本明細書に組み込まれている、ＵＳ２００７／００４１９０４を参照すること）。作成物は、ポリアニオン性セグメントに共有結合していて、アニオン性ドメインのタンパク質分解性切断によってのみ実質的に内部移行するような、ポリアルギニンペプチドを含む。標的にされるプロテアーゼは癌細胞上に過剰発現している可能性があるので、内部移行は、正常細胞と比較して腫瘍細胞で起こる可能性が高い。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（例えば、ポリアルギニンに基づいたもの）が負の帯電した残基から構成される阻害ドメインに融合している場合、これらの細胞会合は阻止される。ポリカチオン性とポリアニオン性のドメインの間のリンカーの（通常はプロテアーゼによる）切断が、ＣＰＰ部分を放出し、目的の結合ペプチド（「積荷」）を腫瘍細胞のような細胞に結合させて進入させるので、そのような融合は、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）と呼ばれる。
【００５７】
細胞への異種化合物の輸送の前の、ポリカチオン、カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性ペプチドによる細胞の前処理も有用である（例えば、参照として本明細書に組み込まれている、２００６／００８３７３７を参照すること）。
【００５８】
核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、ＶＱＲＫＲＱＫＬＭＰ、ＳＫＫＫＫＩＫＶ及びＧＲＫＲＫＫＲＴも、本明細書に開示されているペプチド変種を腫瘍細胞に輸送するのに有用である。他のＮＬＸを、例えばNair et al., (2003), NLSdb: database of nuclear localization signals, Nucl. Acids Res., 31:397-399から得ることができる（http://cubic .bioc xolumbia.edu/db/NLSdb/も参照すること）。
【００５９】
幾つかの実施態様において、本明細書に開示されているペプチド変種は、細胞膜透過性担体と結合し、場合によりスペーサーを含む。例えば、５〜９個のアルギニン残基を有するポリアルギニンペプチドは更に、非アルギニンに基づいたスペーサーペプチド又は非標準アミノ酸若しくはアミノ酸類似体を有するスペーサーを含んでもよい。スペーサーは、一般に、付加的な長さを提供して、例えば本明細書に開示されているペプチド変種の機能又は輸送に対する立体障害を最小限にする。スペーサーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５個又はそれ以上のアミノ酸を含むことができる。スペーサーとしての使用に適したアミノ酸には、例えばグリシンが含まれる。
【００６０】
ｃａＰＣＮＡペプチド変種及び細胞透過性ペプチドは、結合されるタンパク質を生物学的に活性にできる方法であれば、当該技術において既知の任意の適切な方法で、化学的結合により結合される。一つの態様において、結合特異性を増加する一つの方法は、架橋されるポリペプチドの一方又は両方において１回のみ又は数回見出される官能基と、直接化学結合することである。例えば、多くのタンパク質において、チオール基を含有する唯一のタンパク質アミノ酸であるシステインは、数回しか生じない。また、例えば、ポリペプチドがリシン残基を含有しない場合、第一級アミンに特異的な架橋試薬は、そのポリペプチドのアミノ末端に対して選択的である。結合特異性を増加するこの手法の利用における成功は、ポリペプチドが、分子の生物学的活性を失うことなく変更されうる分子の領域に、適度に希少であり反応性の残基を有することを必要とする。あるいは、修飾残基を有する合成ペプチドを、結合に対する特異性が増強されるように、合成することができる。
【００６１】
システイン残基が、架橋反応におけるそれらの参加が生物学的活性を妨げる可能性があるようなポリペプチド配列の部分に存在する場合は、それらを置換してもよい。システイン残基が置換される場合、典型的には、ポリペプチドの折り畳みにもたらされる変化を最小限にすることが望ましい。ポリペプチドの折り畳みにおける変化は、置換が化学的及び立体的にシステインと同様である場合に最小限である。これらの理由から、システインを置換するものとしては、セリンが好ましい。システイン残基が導入される場合、アミノ又はカルボキシ末端かその近傍に導入することが好ましい。目的のポリペプチドが化学的合成によるか又は組み換えＤＮＡの発現により産生されるかのいずれの場合でも、従来の方法をそのようなアミノ酸配列修飾に利用することができる。
【００６２】
２つの構成成分の結合は、カップリング剤又は結合剤を介して実施することができる。適切な分子間架橋試薬には、例えば、Ｊ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）若しくはＮ，Ｎ′−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（両方とも、スルフヒドリル基に対して高度に特異的であり、非可逆的結合を形成する）；Ｎ，Ｎ′−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）、又は６〜１１個の炭素メチレン架橋を有する他の試薬（スルフヒドリル基に対して比較的特異性がある）；及び１，５−ジフルオ−２，４−ジニトロベンゼン（アミノ基及びチロシン基と非可逆的結合を形成する）が含まれる。他の架橋試薬には、ｐ，ｐ′−ジフルオロ−ｍ，ｍ′−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ基及びフェノール基と非可逆的架橋を形成する）；ジメチルアジプイミデート（アミノ基に対して特異的である）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネート若しくはジイソチオシアネート又はアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（主にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（幾つかの異なる側鎖と反応する）並びにジスジアゾベンジジン（主にチロシン及びヒスチジンと反応する）が含まれる。
【００６３】
架橋試薬は、ホモ二官能性、すなわち、同じ反応を有する２つの官能基であってもよい。適切なホモ二官能架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。架橋試薬はヘテロ二官能性であってもよい。ヘテロ二官能架橋試薬は、２つの異なる官能基、例えばアミン反応基及びチオール反応基を有し、それぞれ遊離アミン及びチオールを有する２つのタンパク質を架橋する。ヘテロ二官能架橋試薬の例は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）、及びＭＢＳの延長鎖類似体であるスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）である。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、第一級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。スルホネート基のような親水性部分を架橋試薬に付加して、その水溶性を向上させることができる。スルホ−ＭＢＳ及びスルホ−ＳＭＣＣは、水溶性を持つように修飾された架橋試薬の例である。
【００６４】
多くの架橋試薬は、細胞条件下では非切断性であってもよい結合体を生じる。しかし、幾つかの架橋試薬は、ジスルフィドのような、細胞条件下で切断可能な共有結合を含有する。例えば、Traut試薬、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（「ＤＳＰ」）及びＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（「ＳＰＤＰ」）は、周知の切断性架橋剤である。切断性架橋剤の使用は、標的細胞に送達された後、輸送ポリペプチドから積荷部分が分離することを可能にする。直接ジスルフィド結合を使用することもできる。
【００６５】
上記に考察されたものを含む多数の架橋試薬は、市販されている。詳細な仕様説明書は、商業供給者から容易に入手可能である。タンパク質架橋及び結合体調製についての一般的な参照は、Wong, Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press (1991)である。
【００６６】
化学架橋は、スペーサーアームの使用を含むことができる。スペーサーアームは、分子内柔軟性を提供するか又は結合体部分の間の分子内距離を調整し、それによって、生物学的活性の保存に役立つことができる。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸を含むポリペプチド部分の形態、例えばプロリンであることができる。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（Pierce Chem. Co., Rockford, IL, Cat. No. 21651 H）のように、架橋試薬の一部であることができる。
【００６７】
あるいは、キメラペプチドを、大規模産生及び精製に適した既知の宿主細胞に発現させることができるような、細胞透過性配列及びｃａＰＣＮＡペプチド変種配列を含む融合ペプチドとして、産生することができる。本明細書に記載されている融合ペプチドは、上記に記載された標準的組み換えＤＮＡ技術に類似した方法により又は容易に適合させた方法により、形成及び使用することができる。
【００６８】
天然ペプチド（Ｌ型のもの）を、天然のプロテアーゼによる分解に付すことができ、本明細書に開示されているペプチドは、ペプチドのＤ型のもの及び／又は「レトロインベルソ異性体」を含むように調製することができる。この場合において、本明細書に開示されているｃａＰＣＮＡペプチド変種のペプチドの短フラグメント、及び変種のレトロインベルソ異性体が調製される。ｃａＰＣＮＡペプチド変種は、１つ以上のＬアミノ酸、Ｄアミノ酸、又は両方の組み合わせを有することができる。例えば、多様な実施態様において、ペプチドは、Ｄレトロインベルソペプチドである。用語「レトロインベルソ異性体」は、配列の方向が逆転し、それぞれのアミノ酸残基のキラリティーが逆転している、直鎖ペプチドの異性体を意味する。例えば、Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994)を参照すること。Ｄエナンチオマーを逆合成と組み合わせた全体的な結果は、それぞれのアミド結合におけるカルボニル及びアミノ基の位置が交換されおり、一方、それぞれのアルファ炭素における側鎖基の位置が保存されていることである。特に明確な記述のない限り、任意の所定のＬアミノ酸配列は、対応する天然Ｌアミノ酸配列と逆の配列を合成することによって、Ｄレトロインベルソペプチドにすることができると予測される。
【００６９】
適切な化学療法剤には、例えば、シクロホスファミド（CYTOXAN（商標））、カペシタビン（XELODA（商標））、クロラムブシル（LEUKERAN（商標））、メルファラン（ALKERAN（商標））、メトトレキセート（RHEUMATREX（商標））、シタラビン（CYTOSAR-U（商標））、フルダラビン（FLUDARA（商標））、６−メルカプトプリン（PURINETHOL（商標））、５−フルオロウラシル（ADRUCIL（商標））、パクリタキセル（TAXOL（商標））、ドセタール、アブラキサン、ドキソルビシン（ADRIAMYCIN（商標））、イリノテカン （CAMPTOSAR（商標））、シスプラチン （PLATINOL（商標））、カルボプラチン （PARAPLATIN（商標））、オキサリプラチン、タモキシフェン（NOLVADEX（商標））、ビカルタミド（CASODEX（商標））、アナストロゾール（ARIMIDEX（商標））、エキセメスタン、レトロゾール、イマチニブ（GLEEVEC（商標））、リッキシマブ （RITUXAN（商標））、トラツズマブ（HERCEPTIN（商標））、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、インターフェロン−アルファ、トレチノイン （RETIN-A（商標）、AVITA（商標）、RENOVA（商標））、三塩化二ヒ素、ベバシズマブ（AVASTIN（商標））、ボルテゾミブ（VELCADE（商標））、セツキシマブ（ERBITUX（商標））、エルロチニブ（TARCEVA（商標））、ゲフィチニブ（IRESSA（商標））、ゲムシタビン（GEMZAR（商標））、レナリドミド（REVLIMID（商標））、ソラフェニブ、スニチニブ（SUTENT（商標））、パニツムマブ（VECTIBIX（商標））、ペガスパルガーゼ（ONCASPAR（商標））及びトシツモマブ（BEXXAR（商標））、並びにこれらのプロドラッグ若しくは前駆体、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【００７０】
増殖阻害剤の例には、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤のような、細胞周期進行を（Ｓ期以外の場所で）阻止する薬剤が挙げられる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、並びにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンのようなトポイソメラーゼＩＩインヒビターが含まれる。Ｇ１期を停止する薬剤は、また、Ｓ期停止まで波及し、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル及びａｒａ−ＣのようなＤＮＡアルキル化剤である。
【００７１】
一つの実施態様において、化学療法剤の投与量は、本開示のペプチドと共に使用される場合、単剤療法に使用される投与量よりも低くなることができる。例えば、本開示のｃａＰＣＭＡペプチドと同時投与される（前に、又は間に、又は後で）場合のドキソルビシンでは、投与量は、標準用量より２５％又は３５％又は５０％又は６０％又は７５％又は８０％低くなることができる。他の要因に応じて、投与量は、３００mg/m2〜５００mg/m2の範囲であることができる。他の適切な用量は、それより低くなることができ、例えば、２０mg/m2、５０mg/m2、１００mg/m2、１５０mg/m2若しくは２００mg/m2であるか又はそれより高くなることができ、４００mg/m2、４５０mg/m2、５００mg/m2、５５０mg/m2若しくは６００mg/m2である。
【００７２】
本明細書に開示されているペプチドは、放射線療法（ＤＮＡ損傷性である全ての形態の電離放射線を含む）及び他の任意の形態の癌療法を受けている癌患者にも適している。放射線治療に使用される放射線の量は、グレイ（Gy）で測定され、治療される癌の種類及び病期によって変わることができる。治療の場合では、固形上皮腫瘍に典型的な線量は、約６０〜８０Gyであり、一方、リンパ腫は、約２０〜４０Gyで治療される。放射線の予防（補助）線量は、典型的には、１．８〜２Gyの分割でおよそ４５〜６０Gyである（例えば、それぞれ乳癌、頭部癌及び頸部癌）。患者が化学療法又は他の任意の療法を受けているかどうか、放射線治療が外科手術の前に投与されるのか又は後に投与されるのか、及び外科手術の成功の度合い、を含む、多くの他の要因が、線量を選択する場合に放射線腫瘍医により考慮される。成人に対する典型的な分割スケジュールは、１日あたり１．８〜２又は約３Gyである。本発明のペプチドが放射線療法と組み合わせて使用される場合、放射線の線量を、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％及び７５％低減することができる。放射線療法を行う様式には、例えば、従来の外部ビーム放射線療法（２ＤＸＲＴ）、３次元原体照射療法（３ＤＣＲＴ）、定位放射線療法、画像誘導放射線治療（ＩＧＲＴ）及び強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）が含まれる。
【００７３】
エネルギー性イオン化粒子（プロトン又は炭素イオン）を使用する粒子療法（プロトン療法）も適している。放射線同位体療法（ＲＩＴ）には、腫瘍組織を標的化するために放射線同位体を使用することを含む。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。
【００７４】
放射線免疫療法には、抗体のような生物学的製剤及び放射性同位体の使用が含まれる。イブリツモマブチウキセタン（Zevalin（商標））は、イットリウム９０の分子と結合しているモノクローナル抗体抗ＣＤ２０である。トシツモマブヨウ素１３１（Bexxar（商標））は、モノクローナル抗体抗ＣＤ２０に結合しているヨウ素の分子である。
【００７５】
本明細書に開示されているペプチドインヒビターは、特定の癌療法、例えば化学療法又は放射線療法の前に、その間に、及びその後に投与することができる適切な増強剤である。
【００７６】
「小型分子」は、本明細書において、約５００ダルトン未満の分子量を有することを意味する。
【００７７】
本明細書に開示されているペプチドを使用した治療に適した癌には、グリア芽細胞腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、黒色腫、結腸癌、肺癌、腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ芽球腫、白血病、骨肉腫、乳癌、肝癌、腎腫、副腎癌又は前立腺癌、食道癌のような多様な形態の悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されないことが理解されるべきである。悪性細胞がｃｓＰＣＮＡアイソフォームを発現する場合、本明細書に開示されている組成物は、ｃａＰＣＮＡアイソフォームと１つ以上のタンパク質との相互作用を撹乱することができる。癌の転移も、本明細書に開示されているペプチドインヒビターにより治療される。癌性又は前悪性又は前癌性のいずれかの細胞も、癌特異的ＰＣＮＡアイソフォームを発現してれば、細胞集団を低減することや化学予防に適している。
【００７８】
ペプチド配列を模倣する非ペプチド化合物は、当該技術において知られている（非ペプチド小型分子模倣体を同定する方法を記載している、Meli et al. J. Med. Chem., 49:7721-7730 (2006)）。ペプチド配列を模倣する非ペプチド化合物の合成も、当該技術において知られている（例えば、Eldred et al. J. Med. Chem., 37:3882, (1994); Ku et al. J. Med. Chem., 38:9, (1995); Meli et al. J. Med. Chem., 49:7721-7730 (2006)を参照すること）。ｃａＰＣＮＡに結合する、本明細書に開示されているｃａＰＣＮＡ由来ペプチド又はその変種を模倣するそのような非ペプチド化合物は、本発明に包含される。
【００７９】
用語「ペプチド模倣体」又は「ペプチドの模倣体」は、非天然アミノ酸のような非ペプチド要素を含む、小型タンパク質様鎖（ペプチド）を有する化合物を意味する。ペプチド模倣体は、特定の変化を誘導又は実行するために、標的タンパク質に結合させる目的で設計及び合成される。一般に、ペプチド模倣体は、模倣又は拮抗するように設計された母体ペプチド構造の主な相互作用を模倣又は拮抗することで機能する。ペプチド模倣体は、通常、酵素的に切断可能なペプチド結合のような、伝統的なペプチド特性を有さない。ペプチド模倣体の設計及び合成について入手可能な多様な技術の概説には、例えば、al-Obeidi et al., (1998), “Peptide and peptidomimetic libraries. Molecular diversity and drug design” Mol Biotechnol.; 9(3):205-23;及びHouben-Weyl: Synthesis of Peptides and Peptidomemetics, Thieme Medical Publishers, 4th edition (2003)を参照すること。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチドの模倣体」、「ペプチド模倣体」及び「ペプチド類似体」は、互いに交換可能に使用され、これらの用語は、本明細書に開示されているｃａＰＣＮＡペプチド又はその変種と実質的に同じ構造及び／又は機能特性を有するような、合成化合物を意味する。模倣体は、合成された非天然のアミノ酸類似体から完全に構成されていてもよいし、部分的に天然のペプチドアミノ酸と、部分的に非天然のアミノ酸類似体とのキメラ分子であってもよい。模倣体は、天然アミノ酸の保存的置換を、そのような置換が模倣体の構造及び／又は阻害若しくは結合活性を実質的に変更しない限り、任意の量で組み込むこともできる。ある模倣体が本開示の範囲内であるか、すなわち、その構造及び／又は機能が実施的に変更されていないかどうか、は日常的な実験によって決定されるであろう。したがって、ある模倣体組成物は、ｃａＰＣＮＡ仲介細胞増殖を特異的に阻害することができる限り、範囲内である。
【００８１】
ポリペプチド模倣体組成物は、非天然構造成分の任意の組み合わせを含有することができ、これらは典型的には、以下の３つの構造群である：ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）以外の残基結合基；ｂ）天然のアミノ酸残基の代わりの非天然残基；又はｃ）二次構造的模倣を誘導する、すなわち二次構造（例えばベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファヘリックス立体構造など）を誘導若しくは安定化させる残基。
【００８２】
あるポリペプチドの残基の全て又は幾つかが天然ペプチド結合以外の化学的手段によって結合される場合、そのポリペプチドは模倣体であると特徴決定することができる。個別のペプチド模倣残基を、ペプチド結合、他の化学的結合、又はカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ＝ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はＮ，Ｎ＝ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などにより結合することができる。伝統的なアミノ酸結合（「ペプチド結合」）の代替案となることができる結合基には、例えば、ケトメチレン（例えば−Ｃ＝Ｏ−ＮＨ−−の代わりに−Ｃ＝Ｏ−ＣＨ２）、アミノメチレン（ＣＨ２−−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（−ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、又はエステルが含まれる（例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, A Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NYを参照すること）。
【００８３】
あるポリペプチドを、天然産のアミノ酸残基の代わりに、全て又は幾つかの非天然の残基を含有することによって、模倣体であると特徴決定することもできる。非天然残基は、科学及び特許文献において十分に記載されており、幾つかの例示的な非天然組成物が天然アミノ酸残基の模倣体として有用である。
【００８４】
別の実施態様において、ｃａＰＣＮＡ相互作用を撹乱することができるペプチドには、１つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するペプチドであって、ＬＧＩＰＥＱＥＹのＮＨ２末端に約＋３連続又は不連続付加アミノ酸を含み、ＬＧＩＰＥＱＥＹのＣＯＯＨ末端に約＋９連続又は不連続アミノ酸を含むようなペプチドが含まれる。例えば、これらのペプチドの幾つかは、アミノ酸配列のＱＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣ（＋１−ＮＨ２末端、＋２−ＣＯＯＨ末端）、ＶＥＱＬＧＩＰＥＱＥＹ（＋３−ＮＨ２末端）、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶＫ（＋５−ＣＯＯＨ末端）、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶＫＭＰＳＧ（＋９−ＣＯＯＨ末端）、ＥＱＬＧＩＰＥＱＥＹ（＋２−ＮＨ２末端）、ＱＬＧＩＰＥＱＥＹ（＋１−ＮＨ２末端）、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶＫＭＰＳ（＋８−ＣＯＯＨ末端）、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶＫＭＰ（＋７−ＣＯＯＨ末端）、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶＫＭ（＋６−ＣＯＯＨ末端）、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶＶ（＋４−ＣＯＯＨ末端）、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣＶ（＋３−ＣＯＯＨ末端）、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳＣ（＋２−ＣＯＯＨ末端）、ＬＧＩＰＥＱＥＹＳ（＋１−ＣＯＯＨ末端）、並びに、ＬＧＩＰＥＱＥＹに隣接する付加ＮＨ２末端アミノ酸及び付加ＣＯＯＨ末端アミノ酸の組み合わせを含む。ｃｓＰＣＮＡ特異的抗体を生成するペプチドの特異性に影響を与えない置換を含むアミノ酸突然変異は、本開示の範囲内である。ペプチドにおける１つ以上のアミノ酸残基を、アミノ酸類似体、又は非天然若しくは非標準アミノ酸で置き換えることができる。
【００８５】
ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド変種の投与量は、ペプチドの効能、ペプチドのインビボでの安定性、投与様式、治療される癌の性質、患者の体重、年齢、及び当業者により一般的に考慮される他の要因によって決まる。例えば、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド変種薬の投与量は、約０．１〜１０．０マイクログラム（mcg）/kg体重又は約０．２〜１．０mcg/kg体重又は約０．５〜５．０mcg/kg体重又は約１０．０〜５０．０mcg/kg体重の範囲であることができる。毒性効果及び腫瘍死滅能力に応じて、投与量は、約１．０〜１０．０mg/kg体重及び０．１〜１．０mg/kg体重の範囲であることもできる。被験者に投与されるインヒビターの量は、インヒビターの種類、被験者及び特定の投与様式に応じて変更することができるし、変更されるであろう。当業者は、投与量を、Goodman & Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), Appendix II, pp. 1707-1711からの指針や、Goodman & Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition (2001), Appendix II, pp. 475-493からの指針によっても決定できることを理解する。
【００８６】
本明細書に開示されている組成物の投与は、通常の技能を有する医師により有効であることが知られている、任意の経路を介して実施することができる。非経口経路には、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与経路が含まれる。本明細書に開示されている組成物の静脈内、筋肉内及び皮下投与経路が適している。非経口投与では、本明細書に開示されているペプチドを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又はヒト被験者への投与においてＦＤＡ基準を満たした、任意の適切な発熱物質無含有医薬品等級緩衝剤、と組み合わせることができる。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される担体」には、所望の特定の投与形態に適した、あらゆる、溶媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、防腐剤、などが含まれる。Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, A. R. Gennaro（Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 2000）は、医薬組成物を配合するのに使用される多様な担体及びその調製のための既知の技術を開示する。本明細書に記載されている組成物の溶液又は懸濁液は、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ＥＤＴＡのようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝剤；及び、塩化ナトリウム又はデキストロースのような浸透圧を調整する薬剤、も含むことができる。組成物の非経口調合剤を、この分野の標準的な実施に従って、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、又は多回用量バイアルに封入することができる。本明細書に開示されている組成物を、再構成のためにバイアルに含有されている凍結乾燥滅菌粉末として保存することができ、再構成前の製品は−２０℃で保存することができる。
【００８７】
非経口的に、すなわち静脈内、筋肉内などに投与される薬剤は、水、食塩水のような滅菌希釈剤；グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール又は他の合成溶媒のような薬学的に許容されるポリオール；ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、チメロサールなどのような抗菌及び／又は抗真菌剤；アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；醋酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝剤；並びに／或いは塩化ナトリウム、デキストロース、又は、マンニトール若しくはソルビトール等のポリアルコールのような浸透圧を調節する薬剤、を含むことができる。溶液のｐＨを、塩酸又は水酸化ナトリウムのような酸又は塩基で調整することができる。経口投与用の調合剤は、一般に、不活性希釈剤又は食用担体を含む。これらには、微晶質セルロース、トラガカントガム又はゼラチンのような薬学的に適合される結合剤；デンプン又はラクトースのような賦形剤；アルギン酸、プリモゲル又はトウモロコシデンプンのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はステロートのような潤滑剤；コロイド二酸化ケイ素のような滑剤；スクロース又はサッカリンのような甘味剤；及び／或いはペパーミント、サリチル酸メチル又はカンキツ類香料のような風味剤が含まれうる。経口調合剤を、ゼラチンカプセルに封入することや、錠剤に圧縮することや、液体担体として調製することができる。吸入による投与では、薬剤は、一般に、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器若しくはディスペンサー、又は噴霧器から、エアロゾル噴霧の形態で送達される。局所（例えば、経皮又は経粘膜）投与では、一般に、透過される関門に適した浸透剤が調合剤に含まれる。経粘膜投与は、鼻噴霧剤又は坐剤の使用を介して達成することができ、経皮投与は、当該技術において一般に知られている軟膏剤、膏薬、ゲル剤、パッチ剤又はクリーム剤を介することができる。
【００８８】
本明細書に開示されているペプチド及び他の組成物を、任意の適切な方法により投与することができる。例えば、ペプチド組成物を食塩水又は適切な緩衝剤に希釈して、静脈内に直接投与することができる。例えば、ペプチド組成物をリポソームに封入して、任意の適切な方法により静脈内投与することができる。例えば、ペプチド組成物を、当業者に既知の延長放出薬剤送達系により送達することができる。腫瘍を標的化する他の様式も適している。例えば、ＵＳ特許出願公開第２００５／０００８５７２号（Prokop et al.）（この開示は参照として本明細書に組み込まれる）は、ナノ粒子腫瘍標的化及び治療に関する方法及び組成物を開示している。ＵＳ特許出願公開第２００３／０２１２０３１号（Huang et al.）（この開示は参照として本明細書に組み込まれる）は、安定した脂質含有薬剤送達複合体及びそれらの製造方法を開示している。
【００８９】
本明細書に開示されているペプチドを発現することができる複製欠損ウイルス発現ベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス及び他）も、適切な送達系である。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスに基づいたベクター、シンドビスウイルスに基づいたベクターのような、他の核酸送達系も有用である（Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439及びYing et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827を参照すること）。
【００９０】
本明細書に開示されているｃａＰＣＮＡ由来ペプチドは、適切なウイルスベクターにより発現される。ＰＣＮＡ遺伝子のｃＤＮＡ配列は、例えば、参照として組み込まれているTravali et al., (1989), J. Biol. Chem. 264 (13), 7466-7472において、また、例えばＮＭ＿００２５９２及びＮＭ＿１８２６４９のような幾つかのＧｅｎＢａｎｋ登録において見出される。ＰＣＲ及び部位特異的突然変異誘発技術に基づいた標準的クローニング法を使用して、癌細胞に変種ペプチドを発現するために、ｃａＰＣＮＡ領域のコード領域において１つ以上のＡｌａ置換又は他の保存的突然変異を操作する。
【００９１】
加えて、用語「薬学的有効量」又は「治療有効量」は、ある患者、例えば乳癌を有する患者、を治療するのに有効な量（用量）を意味する。例えば、インビトロ試験条件下において、適切な用量は、少なくとも５０％の癌細胞を死滅させる。また「薬学的有効量」は、１用量若しくは任意の投与量又は経路を、単独で又は他の治療剤と組み合わせて摂取したとき、所望の治療効果を与える量として解釈されうることが、本明細書において理解されるべきである。本開示の場合では、「薬学的有効量」は、例えば、ｃａＰＣＮＡ及び１つ以上のその相互作用パートナーの阻害を（例えば、完全に若しくは部分的に）抑制すること又は腫瘍増殖を低減すること又は癌細胞増殖を低減することができるｃａＰＣＮＡ由来ペプチド変種の量として理解することができる。
【００９２】
以下の実施例は例示的であり、本開示の範囲を制限することを意図しない。
【００９３】
〔実施例〕
＝＝実施例１＝＝
＜乳癌細胞に対する細胞透過性ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド変種の細胞傷害効果＞
乳癌細胞に導入されたｃａＰＣＮＡ由来ペプチド（表１及び表２）は、パートナータンパク質との結合においてＰＣＮＡと競合し、それによって、全長ＰＣＮＡがそれらと相互作用するのを阻害する。このペプチドは、ＰＣＮＡのドメイン間連結ループ（ＩＤＣＬ）の一部を表し、正確なＤＮＡ複製及び修復を実施するのに必要であるポリメラーゼδ、色素性乾皮症Ｇ群（ＸＰＧ）又はＦＥＮ−１のようなタンパク質との結合において、ＰＣＮＡと競合する。ＤＮＡを正確に複製及び修復する細胞の能力の減少は、最終的にアポトーシス細胞死をもたらす。このことは、ＤＮＡ複製及び修復の機能不全をもたらす可能性があり、結果的に癌細胞の死をもたらす。
【００９４】
非アルギニン結合ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド（Ｒ９−ｃａペプチド）を使用して、ｃａＰＣＮＡ相互作用を撹乱する効果を試験した。１群の細胞透過性ペプチドは、細胞内取り込みにおいて正に帯電したアミノ酸に依存する。ポリアルギニンは、細胞内取り込みの促進においてポリリシン及びポリヒスチジンよりも効率的であることが示された。具体的には、Ｄアルギニン配列は、Ｌアルギニン配列よりも効率的である。したがって、Ｄ非アルギニン結合ｃａペプチドを、配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＣＣＬＧＩＰＥＱＥＹ（Ｒ９−ｃａペプチド）により作成した。
【００９５】
Ｕ９３７単球性リンパ腫細胞は、懸濁液中で増殖するが、この細胞株は、非常に急速に増殖し、再現性の高い結果を提供するので、治療ペプチド評価に使用するためのモデルとなる細胞株であることが示された。ウエスタンブロット分析は、この細胞株が、ＰＣＮＡの酸性（ｃａＰＣＮＡ）と塩基性（ｎｍＰＣＮＡ）のアイソフォームを両方とも含有することを示した。最初に、Ｒ９配列単独がＵ９３７細胞に細胞傷害効果を有するかを試験した。Ｕ９３７細胞を、１００μMまでのＲ９配列で２４時間処理した。Ｒ９配列は、これらの細胞においてアポトーシスを促進しなかった（図２Ａ）。次に細胞を、増量濃度の非結合ｃａペプチドで処理して、Ｎ末端アルギニン配列がなく、細胞傷害活性を有さないことを確実にした。２００μMまでのｃａペプチドをＵ９３７細胞に２４時間加えた。ｃａペプチド単独では、細胞傷害活性を有さなかった（図２Ａ）。
【００９６】
Ｒ９−ｃａペプチドの細胞内取り込み及び核局在化を試験するために、Ｎ末端フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）残基を結合して、ペプチドの細胞内局在を顕微鏡下で可視化できるようにした。Ｕ９３７細胞を、１０μMのＦＩＴＣ−Ｒ９−ｃａペプチドで２４時間処理した。次に細胞をサイトスピンによりポリ−Ｌ−リシン被覆スライド上に収集し、二本鎖ＤＮＡと複合体を形成して核の位置を示すＤＮＡ染色染料である４′−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含有する培地を載せた。Leica DM500蛍光顕微鏡を使用して、染色を可視化した。図２Ｂは、ＤＡＰＩ染色核（青色）及びＦＩＴＣ標識Ｒ９−ｃａペプチド（緑色）が実際に重複していることを表し、これは、Ｒ９−ｃａペプチドが細胞により内部移行し、核に到達可能であったことを示す。
【００９７】
Ｒ９配列がペプチドの細胞内取り込みを促進したことが確立されると、増量のＲ９−ｃａペプチドをＵ９３７細胞に加えて、ペプチドの取り込みが細胞傷害効果を有するかを決定した。２０μMを超えるＲ９−ｃａペプチド濃度は、アポトーシス細胞の顕著な増加を誘導することが観察され、ほぼ９３％の細胞が５０uMのＲ９−ｃａペプチドの存在下でアポトーシス性であった（図２Ａ）。
【００９８】
Ｒ９−ｃａペプチドの核局在化を示す図３を参照すること。Ｕ９３７細胞をＦＩＴＣ−Ｒ９−ｃａペプチドで処理し、サイトスピンにより被覆スライド上に収集した。ＤＡＰＩ染色核（左側）及びＦＩＴＣ−Ｒ９−ｃａペプチド（右側）の蛍光画像を重ね合わせると（中央）、細胞内取り込み及びＲ９−ｃａペプチドの核局在化を示した。四角形は無傷細胞を示す。
【００９９】
Ｒ９−ｃａペプチドの細胞傷害性がＰＣＮＡペプチド配列それ自体に起因することを確認するために、同じ８個のアミノ酸を使用するスクランブルペプチドであるＲ９スクランブルを調製した（表３）。Ｒ９スクランブルによるＵ９３７細胞の処理は、細胞傷害性をほとんどもたらさなかった（表３）。これらのデータは、Ｒ９−ｃａペプチドの細胞傷害性がｃａＰＣＮＡペプチド配列に起因し、ペプチドの取り込みによるあらゆる潜在的な細胞損傷に起因しないことを示した。
【０１００】
ｃａペプチドをＵ９３７と共に２４時間インキュベートしたが、アポトーシスの増加は検出されなかった。大部分のペプチドは細胞の中に受動的に移動しないので、非アルギニンリンカーをｃａペプチドのＮ末端部分に結合して、Ｒ９−ｃａペプチドを作成した。Ｒ９−ｃａペプチドの蛍光可視化は、細胞内取り込みが生じること及びペプチドが核に配置されうることを明らかにした。Ｒ９配列単独を細胞毒性について試験すると、アポトーシスの増加を引き起こさなかった。しかし、Ｒ９−ｃａペプチドは、特に２０μMを超える濃度でアポトーシスに顕著な増加を引き起こし、５０μMでは、ほぼ１００％の細胞死を引き起こした。ｃａペプチドのアミノ酸配列をスクランブルしてＲ９リンカーに結合し、Ｒ９スクランブルを作成したとき、細胞傷害性は検出されなかった。
【０１０１】
更に、表６に示されているように、ｃａＰＣＮＡ阻害ペプチドは、非悪性細胞と比較して、癌細胞の死滅において実質的に特異的であった。Ｕ９３７細胞を用いた研究が我々の乳癌の研究と直接関係することを実証するため、Ｒ９−ｃａペプチドに対する乳癌細胞株（ＭＣＦ７）及び非悪性乳腺細胞株（ＭＣＦ−１０Ａ）の相対的感受性を決定した。Ｒ９−ｃａペプチドを非悪性（ＭＣＦ  １０Ａ）及び悪性（ＭＣＦ  ７）乳腺細胞における細胞傷害効果について評価した（表６）。細胞を５０μMのＲ９−ｃａペプチドで４８時間処理し、細胞死の程度をフローサイトメトリーにより評価した。Ｒ９−ｃａペプチドは、非悪性乳腺細胞（ＭＣＦ  １０Ａ）よりも悪性乳腺細胞（ＭＣＦ  ７）に対しておよそ５倍細胞傷害性があることが観察された。乳癌細胞における有意なレベルの細胞傷害性は、例えば観察されたＸＰＧタンパク質へのｃａＰＣＮＡの優先的な結合により示されているように、これらの細胞におけるｃａペプチドと特定のＤＮＡ修復タンパク質との結合相互作用の増強に起因する可能性があり、これらの細胞におけるＤＮＡ修復に阻害をもたらし、最終的に細胞死をもたらす。
【０１０２】
したがって、この実施例は、Ｒ９−ｃａペプチドが１つ以上の結合パートナーとのｃａＰＣＮＡ相互作用を選択的に撹乱し、細胞死をもたらすことを実証した。
【０１０３】
＝＝実施例２＝＝
＜Ｒ９−ｃａペプチドが、ドキソルビシンの作用を増大し、腫瘍細胞を化学療法に対して感作する＞
Ｒ９−ｃａペプチドは癌細胞の死滅に効果的であるので、ペプチドとＤＮＡ損傷化学療法剤との組み合わせが、使用される薬剤の濃度の低下を可能にするかを試験した。ドキソルビシンは、多くの種類の固形腫瘍及び急性白血病の治療に使用されるＤＮＡ損傷剤である。非常に効果的な薬剤であるが、その主な副作用の１つは心筋症である。ドキソルビシンが心臓に対して引き起こす損傷のせいで、一人の患者は、５００mg/m2未満の生涯総用量しか摂取することができない。細胞傷害用量のＲ９−ｃａペプチドと組み合わせた低用量のドキソルビシンが、高濃度のドキソルビシン単独と同じ量で細胞死を引き起こすことができるならば、有害な副作用を低減する可能性のある、少量でのドキソルビシンの使用が可能になる。Ｕ９３７細胞を、漸増濃度のドキソルビシンと共に２５μMのＲ９−ｃａペプチドで２４時間処理した。Ｒ９−ｃａペプチドとドキソルビシンの組み合わせは、ドキソルビシンの半阻害濃度５０（ＩＣ５０）をおよそ１４０nMから１１０nMに低減する（図２Ｂ）。ドキソルビシンと組み合わせたＲ９−ｃａペプチドの有する効果は、濃度が低くなるとより顕著になると思われる。Ｕ９３７細胞を１００nMのドキソルビシンで処理すると、３０％の細胞死が達成されるが、２５μMのＲ９−ｃａペプチドと組み合わせた場合、同じレベルの細胞傷害性を達成するために２５nMのドキソルビシンしか必要ではない。２５μMのＲ９−ｃａペプチドがドキソルビシンと組み合わせて投与される場合、ＩＣ５０に大きな低減はないが、必要なドキソルビシンの量におけるあらゆる低減は、薬剤が患者に対して有する有害な副作用を潜在的に低減することができる。
【０１０４】
ｃａＰＣＮＡアイソフォームを発現する細胞の種類（例えば、乳房、結腸、肺、白血病など）は、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドに対して感受性があるが、それは、これらのペプチドのコア構造が、ｃａＰＣＮＡアイソフォーム内の特有の構造に似ている（そしてこの構造は、ｃａＰＣＮＡアイソフォーム内の８個のアミノ酸（１２６〜１３３）の伸展における１つ以上の酸性アミノ酸の翻訳後修飾の欠失のせいで、非悪性（ｎｍ）ＰＣＮＡアイソフォームには存在しない）からである。これらのペプチドに対する白血病細胞及び神経芽細胞腫細胞の感受性を試験した。結腸癌細胞、子宮頸癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、食道感細胞、肝癌細胞、膵癌細胞、乳癌細胞、黒色腫癌細胞（及び他の形態の癌）は、全てｃａＰＣＮＡアイソフォームを発現する。したがって、これらの種類の癌の全て及びｃａＰＣＮＡを発現する他の任意の癌の種類は、これらの癌細胞に対するｃａＰＣＮＡ由来ペプチド又はその変種の細胞傷害効果に対して感受性がある。
【０１０５】
したがって、Ｒ９−ｃａペプチド（又は本明細書に開示されている他の任意のｃａＰＣＮＡ由来ペプチド若しくはその変種）は、単独の又は他のＤＮＡ損傷剤と組み合わせた治療剤として有用である。ドキソルビシンのような化学療法剤での治療によりもたらされる有害な副作用は、薬剤がＲ９−ｃａペプチドと組み合わせて使用される場合に実質的に低減される。この実施例は、Ｒ９−ｃａペプチドがＤＮＡ損傷剤の細胞傷害効果を増大することができ、また、耐性腫瘍を癌治療剤及び放射線治療に対して感受性にする可能性を実証している。
【０１０６】
＝＝実施例３＝＝
＜Ｒ９−ｃａペプチドの細胞傷害作用における相互作用アミノ酸の同定＞
ＰＣＮＡの癌関連エピトープも、ＰＣＮＡの可動ＩＤＣＬ領域の一部である。ＰＣＮＡのこの領域は、不規則構造を有すると考慮される。タンパク質における不規則構造は、通常、タンパク質−タンパク質相互作用部位と関連する。Ｒ９−ｃａペプチドの細胞傷害作用は、このペプチドが、全長ＰＣＮＡの結合パートナーと相互作用すること及びＰＣＮＡ結合を介して生じる正常なプロセスを阻害することを示す。Ｒ９−ｃａペプチド配列のどのアミノ酸が、ペプチドをこれらのタンパク質に結合するのに必要であるかを決定するために、それぞれのアミノ酸を個別にアラニンに突然変異させたペプチド作成物を生成した（表３）。ｃａＰＣＮＡのアラニン突然変異ペプチドをそれぞれ使用して、Ｕ９３７細胞を２４時間処理した。タンパク質結合に重要であるアミノ酸は、アラニンで置換された場合、細胞傷害性の減少を示すと推定される。結合にとって重要ではないアミノ酸は、非置換ペプチドと同様の細胞傷害レベルを示すと予測される。それぞれのアラニン置換Ｒ９結合ｃａペプチドの潜在的な細胞傷害効果の比較のため、Ｕ９３７細胞を３０μMのペプチドで処理した。これは、Ｒ９−ｃａペプチドがほぼ５０％の細胞死をもたらす濃度であった（図２Ａ）。この研究の結果を表３に示す。位置ａａ１２６又はａａ１３３にアラニン置換を含有するペプチドは、ほとんど細胞傷害活性を示さないことが観察され、したがって、ペプチドの活性にとって重要であると思われる。アミノ酸位置１２８にアラニン置換を有するペプチドは、細胞傷害性の減少を示したが、位置１２６又は１３３の置換において観察された程には至らなかった。驚くべきことに、アミノ酸位置１２９、１３１又は１３２のアラニン置換は、ペプチドの細胞傷害活性を有意に増加したことが観察された。
【０１０７】
したがって、この実施例は、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドにおけるアミノ酸置換が、治療用途の多様なペプチド変種を提供することを実証している。
【０１０８】
＝＝実施例４＝＝
＜細胞傷害性に対する観察されたｃａペプチドアラニン置換効果の分子モデリング＞
アラニン置換ｃａペプチドの観察された細胞傷害効果と、ＰＣＮＡパートナーによる代替ペプチドの認識に影響を与える能力との潜在的な関係を洞察する力を得るために、インシリコ分子モデリング研究を実施した。これらの研究を実施するために、ＰＣＮＡと既知の結合パートナーＦＥＮ−１との相互作用をモデル化した。ＦＥＮ−１は、Ｘ線結晶構造が実際に知られている、数少ないＰＣＮＡ結合パートナーのうちの１つであり、したがってモデリング研究を促進する。３つのＦＥＮ−１分子に結合しているＰＣＮＡホモ三量体の結晶構造を開発した。
【０１０９】
それぞれのＦＥＮ−１分子は、対応するＰＣＮＡモノマーに異なる配向で結合し、ＰＣＮＡ分子Ａ、Ｂ及びＣは、ＦＥＮ−１分子Ｘ、Ｙ及びＺにそれぞれ結合する。それぞれのＦＥＮ−１モノマーの配向における差は、対応するＰＣＮ／ＦＥＮ−１モノマー対Ａ−ＸとＣ−Ｚが重なる場合に明確に示される。しかし、ＦＥＮ−１のＸ及びＺ鎖の両方のＣ末端尾部領域（ａａ３３０〜３８０）は、ＰＣＮＡのＩＤＣＬ部分と相互作用する。（図５を参照すること。）この複合体を９０°回転させ、ＰＣＮＡ分子を空間充填モデルとして表した場合、ａａ１２６〜１３３ペプチドが、腔の領域において相互作用するＦＥＮ−１アミノ酸残基の周りに適合する腔を形成することが明らかとなった（図６）。この腔には、アラニン突然変異分析によりＲ９−ｃａペプチドの細胞傷害活性に重要であることが示されたアミノ酸である（表３）、ＰＣＮＡのａａ１２６及びａａ１３３が隣接していた。腔との関係において、ａａ１２６〜１３３のアミノ酸Ｒ群に注目すると、ａａ１２６、ａａ１２８及びａａ１３３が腔の方向を向き、ＰＣＮＡ／ＦＥＮ−１相互作用のために接触ポイントを提供していることが明らかである（図７）。しかし、ａａ１２７及びａａ１３０のＲ群は、ポケットと反対の方向を向き、ＰＣＮＡ／ＦＥＮ−１結合に関与しているとは思われない（図７）。アラニン突然変異分析により細胞傷害活性の増強が示されたアミノ酸のうち、ａａ１２９及びａａ１３１は腔の方向を向き、ａａ１３２は腔と反対の方向を向いている。これらのアミノ酸を突然変異させてアラニンとする場合、立体配座に変化が生じ、これは腔を結合パートナーの周囲にさらに密接させ、それによってより強力な相互作用を作り出すことができる。
【０１１０】
ＦＥＮ−１がこの研究にモデルとして使用されているが、ａａ１２３〜１３３により形成される腔は、ＰＣＮＡと多くのそのパートナーとの結合にとっても重要である。図７は、幾つかのＰＣＮＡ結合パートナー及びＰＣＮＡとの相互作用に使用される保存的配列を提示する。それぞれのペプチド又はタンパク質のうちの５個アミノ酸のコンセンサス結合配列を、相互作用することが報告されているＰＣＮＡ空間充填モデルに適合させたとき、ｃａペプチドにより形成されたポケット領域に全て重なった。ＰＣＮＡとその結合パートナーとの間に他の多くのアミノ酸相互作用ポイントがあるが、ｃａペプチド領域により形成された腔は、正確な結合のため及び相互作用により生じる細胞プロセスの開始のために必要でありうる。
【０１１１】
インシリコ分子モデリングを実施して、Ｒ９−ｃａペプチド細胞傷害性に対するＰＣＮＡアミノ酸配列の寄与を更に調査した。ａａ１２６〜１３３の位置を、ＦＥＮ−１に結合したＰＣＮＡの結晶構造から決定した。この分析は、ＰＣＮＡのａａ１２６〜１３３が、幾つかのＰＣＮＡの結合パートナーの保存的５アミノ酸配列が適合する腔を形成することを明らかにした。アラニン突然変異分析によりＲ９−ｃａペプチド活性にとって重要であることが決定されたアミノ酸は、腔の方を向いていてＰＣＮＡと結合パートナーに接触ポイントを提供する可能性のあるアミノ酸（ａａ１２６、ａａ１２８、及びａａ１３３）と同じものであった。Ｒ９−ｃａペプチドの細胞傷害活性にとって重要ではないアミノ酸は、ポケットと反対の方向を向き、ＰＣＮＡとパートナー（ａａ１２７及び１３０）の結合に参加しないと思われる。細胞傷害性に増加を引き起こすアミノ酸のうち、ａａ１２９及びａａ１３１は、ポケットの方向を向き、ａａ１３２は、ポケットと反対の方向を向いている。
【０１１２】
Ｒ９−ｃａペプチドにより示される細胞傷害性は、このペプチドがＰＣＮＡの結合パートナーのおとりとして作用することによって引き起こされると考えられる。このペプチドは、全長ＰＣＮＡのＩＤＣＬを模倣するので、ＸＰＧ、ポリメラーゼδ及びＦＥＮ−１のようなタンパク質に結合することができ、したがって、それらが無傷のＰＣＮＡに結合するのを妨げる。ペプチドによるこれらのタンパク質の隔離は、正確なＤＮＡ複製及び修復を妨げ、細胞死をもたらす。Ｒ９−ｃａペプチドの特定のアミノ酸（ａａ１２６、ａａ１２８及びａａ１３３）の突然変異は、ＰＣＮＡの結合パートナーにより認識される能力を減少し、ＰＣＮＡ−パートナー相互作用を撹乱するペプチドの能力を低減し、したがって細胞死の減少をもたらす。アミノ酸１２９、１３１及び１３２のアラニンへの突然変異は、立体配座に変化を引き起こすことができ、それはペプチドが潜在的なパートナーとより密接に結合することを可能にし、したがって細胞傷害性の増加を引き起こす。
【０１１３】
＝＝実施例５＝＝
＜ｃａＰＣＮＡペプチド及びその変種を使用する化学予防＞
ｃａＰＣＮＡペプチド及びその変種は、化学予防のために化学予防剤として使用されるが、この場合、本ペプチドは例えば前癌性細胞の癌性細胞又は検出可能な腫瘍への形質転換を制限するのに効果的である。ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド又はその変種の、癌細胞を選択的に死滅させるが、非癌細胞の生存力に対しては最小限の効果しか及ぼさないという能力のために、これらのペプチド又は変種は、発癌を防止するのに有用である。この手法は、ＰＣＮＡの癌特異的アイソフォーム（ｃａＰＣＮＡ）の発現が、悪性表現型をもたらす細胞の形質転換プロセスにおける比較的初期の事象であるので、ｃａＰＣＮＡと１つ以上の結合パートナーとの相互作用を初期段階で阻止することは、効果的な化学予防をもたらすという観察に基づいている。
【０１１４】
検出可能な腫瘍量又は悪性表現型を発生する前の初期段階でｃａＰＣＮＡアイソフォームを発現することができる任意の組織は、本明細書に開示されているｃａＰＣＮＡペプチド及びその変種を使用する化学予防治療に適している。本明細書に開示されているｃａＰＣＮＡ由来ペプチド又は変種の毒性に応じて、当業者は、有効な化学予防治療計画を実施する投与範囲を容易に認識し、最適化する。例えば、本明細書に開示されているｃａＰＣＮＡ由来ペプチド及び変種が正常な細胞に対して有意な毒性がない場合、癌と診断された患者に一般的に使用されるより高い用量が、高危険度の個体における化学予防に使用される。本明細書に開示されているｃａＰＣＮＡ由来ペプチド及び変種がいくらか毒性である場合、毒性に応じて、癌治療用量と比較して比較的低い投与量が化学予防治療に使用される。加えて、投与量は、例えば、癌の種類、個体が治療される病期、送達様式及び個体の年齢、身体全体の健康のような他の任意の臨床データに応じて変わることができる。
【０１１５】
例えば、ｃａＰＣＮＡ発現は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者において、疾患の急性期への形質転換から３年が経過している病期において容易に観察される。したがって、ｃａＰＣＮＡペプチド及びその変種は、これらの種類の初期形質転換細胞に対して、臨床的に認識又は検出される癌の発生の前に、それらの生存力を低減することもできる。
【０１１６】
一般に、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド又は変種は、ｃａＰＣＮＡアイソフォームを発現する可能性があって癌性になる可能性があるような初期形質転換細胞の数を排除又は低減するために、適切な方法により投与される。この種類の予防投与は、上皮由来（例えば、多様な腺癌）若しくは中皮由来（例えば、多様な肉腫）を含む良く知られている種類の癌を有するような「高危険度」群に属する個体、及び／又は職場若しくは家庭若しくは地域環境由来の多様な環境毒物に暴露された個体、及び／又は癌の治療を受け、疾患の再発（すなわち、再発の発生）がモニタリングされている個体の臨床管理に有用である。癌細胞又は形質転換プロセスを受けている細胞のみがｃａＰＣＮＡアイソフォームを発現するので、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド及び変種に感受性のある形質転換細胞が、選択的に標的化されて死滅する一方、非形質転換細胞の生存力は、ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド又はその変種によって実質的に影響を受けないと思われる。
【０１１７】
ｃａＰＣＮＡ由来ペプチド及び変種を化学予防剤として使用することの臨床的利益の長期的な基準としては、例えば、特定の悪性腫瘍を発生する「高危険度」の患者の数を減少すること、原発性癌病変部の切除後の癌再発の数を低減すること、個体が家庭、職場又は地域環境において遭遇する癌性又は突原変異誘発性物質への暴露によりもたらされる腫瘍の発生の数を低減すること、及び無関係の癌を治療する薬剤の化学療法投与によりもたらされる二次性腫瘍の発生の数を低減することが含まれる。
【０１１８】
例えば、非癌細胞と思われる細胞におけるｐ１６ＩＮＫ４（Bean et al., (2007), Clin. Cancer Res.; 13(22), 6834-41）及びｃａＰＣＮＡの両方の共発現は、化学予防における前癌性又は前悪性細胞の同定のためのマーカーとして機能する。例えば、タンパク質ｐ１６ＩＮＫ４の発現は、このタンパク質の発現が、ｐ１６ＩＮＫ４を発現する細胞の癌表現型への形質転換より先に生じることを示す。形質転換プロセスの初期に生じる個々の分子変化は、これらの細胞が癌細胞になる素因である場合があり、遺伝子発現におけるそのような変化の同定は、形態的に未だ認識されていない初期段階の形質転換事象の指標（マーカー）である。したがって、形質転換事象に関連する初期の分子変更は、形質転換プロセスを始めた細胞の形態に対しては識別可能な効果を有さないものの、それでもなお、癌細胞への形質転換を受けるように仕向けられている。ｃａＰＣＮＡの発現が悪性形質転換プロセスと普遍的に関連するので（現在まで試験された全ての癌細胞がｃａＰＣＮＡアイソフォームを発現するので）、場合によっては、乳癌上皮細胞に近接する（１cm以内）導管内の正常な乳腺上皮細胞の１つ以上も、ｃａＰＣＮＡを発現するであろう。ｐ１６ＩＮＫ４の、ｃａＰＣＮＡ発現細胞における共発現、及び非発現細胞における不在は、形質転換プロセスのマーカーとして機能することができる。そのようなｃａＰＣＮＡを発現する「正常」細胞は、本明細書に開示されている組成物を、ｃａＰＣＮＡ発現「正常」細胞を悪性になる前に選択的に死滅させるために使用するのに適した標的である。
【０１１９】
したがって、本明細書に開示されているｃａＰＣＮＡ由来ペプチド又は変種は、初期段階でｃａＰＣＮＡアイソフォームを発現する可能性がある組織の種類における癌の全体的な発生を低減するための、実行可能な化学予防的選択肢を提供する。開業医又は臨床医は、ｃａＰＣＮＡ特異的検出法、例えば国際特許出願公報第２００６／１１６６３１号に開示されているｃａＰＣＮＡ特異的抗体を使用して又は国際特許出願公報第２００７／００２５７４号（両公報の内容は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）に開示されているｃａＰＣＮＡアイソフォーム翻訳後修飾に基づいて、個体又は組織生検がｃａＰＣＮＡを発現しているかを容易に決定することができる。
【０１２０】
表１  アミノ酸１２６〜１３３の領域を含有する例示的なｃａＰＣＮＡペプチドドメイン
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１２６〜１３３配列を含有する領域は、下線により示されている。
【０１２１】
表２  Ｒ９結合ｃａＰＣＮＡ由来ペプチドのアミノ酸配列
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【０１２２】
表３  Ｒ９結合ｃａＰＣＮＡペプチドの細胞傷害効果
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Ｒ９は、ポリアルギニン配列、例えば９個の連続アルギニン残基を含む細胞透過性ペプチドを意味する。ｃａＰＣＮＡペプチドのアラニン置換は、細胞傷害作用に影響を与える。Ｕ９３７細胞を、アラニン置換ペプチド及びスクランブルペプチドでそれぞれ処理し、細胞死％をフローサイトメトリーで評価した。スクランブルペプチド、及びａａ１２６又はａａ１３３の位置でのアラニン置換は、細胞傷害活性の低減を示す。ａａ１２９、ａａ１３１又はａａ１３２での置換は、ペプチドの細胞傷害性に増加を引き起こす。中立の変化をもたらす置換には、ａａ１２７及びａａ１３０が含まれる。ａａ１２８での置換は、細胞傷害作用に減少をもたらすが、ａａ１２６又はａａ１３３のレベルまでではない。
【０１２３】
表４  細胞浸透性又は細胞透過性のペプチド
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上記に提示されたペプチドは、合成することができるか又は市販されており（例えば、AnaSpec, San Jose, CA）、本明細書に開示されているペプチド変種とのカップリングのためのＮＨ２部分を有する。
【０１２４】
表５  例示的なアミノ酸保存的置換のリスト
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【０１２５】
表６  Ｒ９−ｃａペプチドによる癌細胞の優先的死滅
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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