(57)【要約】  ２つのドメインを含み、それぞれのドメインが、第１ヘリックスの始点からＣ末端ループの終点まで少なくとも広がる親のI-CreI単量体の部分を含み、該２つのドメインが、それぞれの親のホモ二量体I-CreIメガヌクレアーゼ標的配列の一方の異なる半分を含むキメラDNA標的に結合して切断できるI-CreI二量体に前記２つのドメインが折り畳まれることを可能にするペプチドリンカーにより連結されている、新しいI-CreI由来単鎖メガヌクレアーゼ。該I-CreI由来単鎖メガヌクレアーゼの、遺伝子工学、ゲノム療法及び抗ウイルス療法のための使用。【選択図】図１
2011514144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドリンカーにより連結された２つのドメインを含み：
(a) 親のI-CreI単量体に由来するそれぞれのドメインが、I-CreIの第１アルファヘリックスの始点(α1)からＣ末端ループの終点まで少なくとも広がりかつα1β1β2α2β3β4α3コアドメインと、α4及びα5ヘリックスと、I-CreIのＣ末端ループとを連続的に含む前記親のI-CreI単量体の部分を含み、
(b) それぞれの親のホモ二量体I-CreIメガヌクレアーゼ標的配列の一方の異なる半分を含むキメラDNA標的と結合しそれを切断できるI-CreI二量体として前記２つのドメインが折り畳まれることを可能にするペプチドリンカーにより、前記２つのドメインが連結されている、
単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項２】
Ｎ末端ドメインがI-CreI の１位又は６位から始まり、Ｃ末端ドメインがI-CreIの２位又は６位から始まる請求項１に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項３】
Ｎ末端及び／又はＣ末端ドメインが、I-CreIの145位にて終結する請求項１又は２に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項４】
Ｎ末端及び／又はＣ末端ドメインが、少なくともI-CreIのアルファ６ヘリックスをさらに含む請求項１又は２に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項５】
Ｎ末端及び／又はＣ末端ドメインが、I-CreIの152位、156位、160位又は163位で終結する請求項４に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項６】
リンカーが、15〜35アミノ酸の配列からなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項７】
リンカーが、配列番号２〜12及び14〜19の配列からなる群より選択される請求項６に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項８】
両方のドメインが、I-CreIの26位〜40位及び／又は44位〜77位にて異なる変異を含み、単鎖I-CreIメガヌクレアーゼが非パリンドロームDNA配列を切断でき、前記DNA配列の少なくとも+3位〜+5位、+8位〜+10位、-10位〜-8位及び-5位〜-3位のヌクレオチドが、興味対象の遺伝子からのDNA標的の+3位〜+5位、+8位〜+10位、-10位〜-8位及び-5位〜-3位のヌクレオチドに相当する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項９】
少なくとも一方のドメインが、I-CreI部位の±１〜２、６〜７及び／又は11〜12位のヌクレオチドに対する単鎖I-CreIメガヌクレアーゼの特異性を改変する変異を、I-CreIの137位〜143位に含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項１０】
変異が、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L及びWからなる群より選択されるアミノ酸での元のアミノ酸の置き換えである請求項８又は９に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項１１】
２つのドメインからの機能的ホモ二量体の形成を損なう変異を含む請求項１〜10のいずれか１項に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項１２】
それぞれのドメインが、それぞれ第１及び第２のドメインについて、K7E又はK7DとE8K又はE8R；F54G又はF54AとL97F又はL97W；K96D又はK96EとE61R又はE61K；R51D又はR51EとD137R又はD137Kからなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む請求項11に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項１３】
一方のドメインが、７位及び96位のリジン残基の、酸性アミノ酸による置換を含み、他方のドメインが、８位及び61位のグルタミン酸残基の塩基性アミノ酸による置換を含む請求項12に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項１４】
一方のドメインが、G19S変異を含む請求項１〜10のいずれか１項に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項１５】
他方のドメイン又は両方のドメインが、請求項11〜13のいずれか１項で規定される機能的ホモ二量体の形成を損なう少なくとも１つの変異を含む請求項14に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項１６】
配列番号95又は97の配列を含む請求項１〜15のいずれか１項に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ。
【請求項１７】
請求項１〜16のいずれか１項に記載の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項１８】
２つのドメインをコードするヌクレオチド配列同士が、80%未満の核酸配列同一性を有する請求項17に記載のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項１９】
２つのドメインをコードする配列が、それぞれ配列番号22及び配列番号24の配列に由来する請求項18に記載のポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項２０】
単鎖I-CreIメガヌクレアーゼの生成を可能にする調節配列に機能可能に連結された請求項17〜19のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドフラグメントを含む発現ベクター。
【請求項２１】
単鎖I-CreIメガヌクレアーゼのゲノムDNA標的を取り囲む領域と相同性を有する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む請求項20に記載のベクター。
【請求項２２】
ターゲティングDNA構築物が、a)前記ゲノムDNA標的を取り囲む領域と相同性を有する配列と、b) a)の配列と接する、導入される配列とを含む請求項21に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項17〜19のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドフラグメント又は請求項20〜22のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
請求項17〜19のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドフラグメントを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２５】
請求項17〜19のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドフラグメントを含むトランスジェニック植物。
【請求項２６】
請求項１〜16のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ、請求項16〜18のいずれか１項に記載の１つのポリヌクレオチドフラグメント、又は請求項20〜22のいずれか１項に記載の１つのベクターを含む医薬組成物。
【請求項２７】
興味対象のゲノム部位と相同性を有する配列で挟まれた前記ゲノム部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物をさらに含む請求項26に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１〜16のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ、請求項17〜19のいずれか１項に記載の１つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項20〜22のいずれか１項に記載の１つのベクター、請求項23に記載の１つの宿主細胞、請求項25に記載の１つのトランスジェニック植物、請求項24に記載の１つの非ヒトトランスジェニック哺乳動物の、非治療目的での、分子生物学、インビボ又はインビトロでの遺伝子工学、及びインビボ又はインビトロでのゲノム工学のための使用。
【請求項２９】
請求項１〜16のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ、請求項17〜19のいずれか１項に記載の１つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項20〜22のいずれか１項に記載の１つのベクターの、必要とする個体における遺伝病を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
【請求項３０】
単鎖I-CreIメガヌクレアーゼが、配列番号95又は配列番号97の配列を含み、前記遺伝病が、ヒトRAG1遺伝子における変異に関連するSCID症候群である請求項29に記載の使用。
【請求項３１】
請求項１〜16のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ、請求項17〜19のいずれか１項に記載の１つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項20〜22のいずれか１項に記載の１つのベクターの、必要とする個体においてDNA媒介物を示す感染性因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒するための医薬品の製造のための使用。
【請求項３２】
請求項１〜16のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ、請求項17〜19のいずれか１項に記載の１つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項20〜22のいずれか１項に記載の１つのベクターの、生物由来製品又は生物学的使用若しくは物体の消毒を意図する製品において、インビトロにおいて、DNA媒介物を示す感染性因子の増殖を阻害するか、不活性化するか若しくは欠失させるための使用。
【請求項３３】
前記感染性因子がウイルスである請求項31又は32に記載の使用。
【請求項３４】
前記メガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物が、請求項21、22及び27のいずれか１項で規定されるターゲティングDNA構築物とともにある請求項28〜33のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
請求項１〜16のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ、請求項17〜19のいずれか１項に記載の１つのポリヌクレオチドフラグメント、請求項20〜22のいずれか１項に記載の１つのベクターの、他のメガヌクレアーゼを工学的に作製するための足場としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しいI-CreI由来単鎖メガヌクレアーゼ、該新しいI-CreI由来単鎖メガヌクレアーゼをコードするベクター、該ベクターで改変された細胞、動物又は植物、並びに該I-CreI由来単鎖メガヌクレアーゼ及び派生生成物の、遺伝子工学、ゲノム療法及び抗ウイルス療法のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある所定の遺伝子座を工学的に操作する(engineer)ストラテジーのうちで、メガヌクレアーゼのようなレアカットDNAエンドヌクレアーゼの使用が、DNA二本鎖破断(DSB)の作製による相同遺伝子ターゲティングを増大させるための強力なツールとして出現している。メガヌクレアーゼは、大きい(＞12 bp)配列を認識し、よって、全体的なゲノム完全性に影響することなくそれらの同種の部位を切断できる。天然メガヌクレアーゼであるホーミングエンドヌクレアーゼは、可動性のイントロン又はインテインによりコードされるタンパク質のいくつかの大きいファミリーを構成する。それらの標的配列は、イントロン又はインテインを欠く相同対立遺伝子中で通常見出され、切断は、DSB誘導相同組換えの機構により破断された配列内への可動性要素の移動を開始する。I-SceIは、哺乳動物細胞中のゲノム標的にて1000倍を超えて相同組換えを刺激するために用いられた最初のホーミングエンドヌクレアーゼであった(Choulikaら, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968〜1973; Cohen-Tannoudjiら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 1444〜1448; Donohoら, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4070〜4078; Alwinら, Mol. Ther., 2005, 12, 610〜617; Porteus, M. H., Mol. Ther., 2006, 13, 438〜446; Rouetら, Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096〜8106)。最近、I-SceIは、マウス肝臓中でインビボにて標的にされた組換えを刺激するためにも用いられ、組換えは、肝細胞の１%までで観察できた(Goubleら, J. Gene Med., 2006, 8, 616〜22)。
【０００３】
しかし、このような方法論の固有の制限は、天然切断部位を興味対象の遺伝子座に予め導入することが必要であることである。この制限を回避するために、仕立てられた切断特異性を有するエンドヌクレアーゼを作製するための著しい努力が過去数年にわたってなされている。このようなタンパク質は、本来の染色体配列を切断するために用いることができ、広範囲の使用においてゲノム工学のための新しい展望を開く。例えば、メガヌクレアーゼは、単遺伝子性遺伝病につながる突然変異の修正を誘導し、現在の遺伝子療法アプローチにおいて用いられる無作為に挿入されたトランスジーンによる危険性を回避できるだろう(Hacein-Bey-Abinaら, Science, 2003, 302, 415〜419)。
【０００４】
クラスIIS制限エンドヌクレアーゼであるFokIの触媒ドメインとのジンクフィンガータンパク質(ZFP)の融合体を用いて、機能的配列特異的エンドヌクレアーゼが作製された(Smithら, Nucleic Acids Res., 1999, 27, 674〜681; Bibikovaら, Mol. Cell. Biol., 2001, 21, 289〜297 ; Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175 ; Bibikovaら, Science, 2003, 300, 764 ; Porteus, M.H.及びD. Baltimore, Science, 2003, 300, 763〜; Alwinら, Mol. Ther., 2005, 12, 610〜617; Urnovら, Nature, 2005, 435, 646〜651; Porteus, M.H., Mol. Ther., 2006, 13, 438〜446)。このようなヌクレアーゼは、最近、リンパ球系統からのヒト細胞においてILR2G遺伝子を工学的に改変するために用いることができた(Urnovら, Nature, 2005, 435, 646〜651)。
Cys2-His2型のジンクフィンガータンパク質の結合特異性は、おそらくこれらが単純(フィンガーあたり実質的に4残基により駆動される特異性)でモジュール性の(modular)システムを示すことを理由として、操作するのが容易である(Paboら, Annu. Rev. Biochem., 2001, 70, 313〜340 ; Jamiesonら, Nat. Rev. Drug Discov., 2003, 2, 361〜368)。 Pabo (Rebar, E.J.及びC.O. Pabo, Science, 1994, 263, 671〜673 ; Kim, J.S.及びC.O. Pabo, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1998, 95, 2812〜2817)、Klug (Choo, Y.及びA. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163〜11167; Isalan M.及びA. Klug, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656〜660)並びにBarbas (Choo, Y.及びA. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 11163〜11167 ; Isalan M.及びA. Klug, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 656〜660)の実験室からの研究は、ほとんどのG/ANNG/ANNG/ANN配列に結合できる新規な人工ZFPの大きいレパートリーをもたらした。
【０００５】
にもかかわらず、ZFPは、特に、治療用途のような非常に高レベルの特異性を必要とする用途について制限があるだろう。融合体でのFokIヌクレアーゼ活性は二量体として作用するが、最近、２つの単量体の１つのみがDNAに結合するか、又は２つの単量体が２つの離れたDNA配列に結合したときに、これがDNAを切断できることが示された(Cattoら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, 1711〜1720)。よって、特異性は、哺乳動物細胞(Porteus, M.H.及びD. Baltimore, Science, 2003, 300, 763)及びショウジョウバエ(Drosophila) (Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175; Bibikovaら, Science, 2003, 300, 764〜)における毒性により示されるように、非常に退化している。
【０００６】
それらの例外的な特異性に鑑みて、ホーミングエンドヌクレアーゼは、仕立てられたエンドヌクレアーゼを工学的に操作するために理想的な足場であり得る。いくつかの研究が、最も広範なホーミングエンドヌクレアーゼである(Chevalier, B. S.及びStoddard B. L., Nucleic Acids Res. 2001; 29:3757〜74)LAGLIDADGタンパク質からのDNA結合ドメインを工学的に操作できることを示している。LAGLIDADGとは、このファミリーを通して実際に保存されている唯一の配列のことであり、タンパク質中で１コピー、より頻繁には２コピーが見出される(Lucasら, Nucleic Acids Res., 2001, 29:960〜969)。単一モチーフを有するタンパク質、例えばI-CreI (タンパク質データベースアクセッション番号1G9Y)及びI-MsoIは、ホモ二量体を形成し、パリンドローム又は偽パリンドロームのDNA配列を切断するが、より大きい二重モチーフタンパク質、例えばI-SceI及びI-DmoIは単量体であり、非パリンドローム標的を切断する。いくつかの異なるLAGLIDADGタンパク質が結晶化されており、これらは、１次配列レベルでの類似性がないこととは対照的に、非常に著しいコア構造の保存を示す(Juricaら, Mol. Cell., 1998; 2:469〜476; Chevalierら, Nat. Struct. Biol. 2001; 8:312〜316; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329:253〜69, Moureら, J. Mol. Biol., 2003, 334:685〜695; Moureら, J. Mol. Biol., 2003, 334, 685〜695; Moureら, Nat. Struct. Biol., 2002, 9:764〜770; Ichiyanagiら, J. Mol. Biol., 2000, 300:889〜901; Duanら, Cell, 1997, 89:555〜564; Bolducら, Genes Dev., 2003, 17:2875〜2888; Silvaら, J. Mol. Biol., 1999, 286:1123〜1136)。このコア構造において、２つの単量体又は二重LAGLIDAGタンパク質中の２つのドメインが寄与する２つの特徴的なαββαββα折り畳みが、２回回転対称により互いに面している。DNA結合は、逆平行βシートに折り畳まれ、DNAヘリックス主溝上のサドルを形成する、それぞれのドメインからの４つのβ鎖に依存する。触媒コアは中央にあり、両方の対称単量体／ドメインが寄与する。このコア構造に加えて、その他のドメインを見出すことができる。例えば、インテインであるPI-SceIは、タンパク質スプライシングドメインと、さらなるDNA結合ドメインとを有する(Moureら, Nat. Struct. Biol., 2002, 9:764〜70, Grindlら, Nucleic Acids Res. 1998, 26:1857〜1862)。それぞれのI-CreI単量体は、３つのヘリックス(アルファ４(α4)、アルファ５(α5)及びアルファ６(α6))でできたＣ末端サブドメインと、α5及びα6ヘリックスの間のループ(Ｃ末端ループ；図１)とを含み、これは部位認識、DNA結合及び切断にとって必須である(Prietoら, Nucleic Acids Res., 2007,, 35, 3267〜3271)。
【０００７】
PI-SceI (Gimbleら, J. Mol. Biol., 2003, 334:993〜1008)、I-CreI (Seligmanら, Nucleic Acids Res. 2002, 30:3870〜3879; Sussmanら, J. Mol. Biol., 2004, 342:31〜41; 国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495及びWO 2007/049156; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Rosenら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, 4791〜4800 ; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)、I-SceI (Doyonら, J Am Chem Soc., 2006, 128:2477〜2484)並びにI-MsoI (Ashworthら, Nature, 2006, 441:656〜659)を含むいくつかのLAGLIDAGタンパク質は、合理的又は半合理的突然変異誘導及びスクリーニングにより改変して、新しい結合又は切断特異性を獲得できた。
【０００８】
別のストラテジーは、I-CreIとI-DmoIとの間のドメイン交換による新しいメガヌクレアーゼの創出であり、これは２つの半分の親の標的配列(two half parent target sequences)に対応するハイブリッド配列を切断するメガヌクレアーゼの作製を導いた (Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31:2952〜2962; Chevalierら, Mol. Cell. 2002, 10:895〜905; 国際PCT出願WO 03/078619及びWO 2004/031346)。
最近、ハイスループットスクリーニング法により補助された半合理的設計により、I-CreIからの数千の新規タンパク質を導くことが可能になった(Smithら, Nucleic Acids Res. 2006, 34, e149; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355:443〜458; 国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495及びWO 2007/049156)。このようなアプローチにおいて、タンパク質残基の制限された組を、タンパク質/DNA共結晶構造の分析の後に選択して、無作為化する。ハイスループットスクリーニング(HTS)技術と組み合わせて、この方法は、数百の特異性が改変されたホーミングエンドヌクレアーゼ誘導体の同定を迅速にもたらすことができる。
【０００９】
さらに、変異体のコンビナトリアル組み立てを可能にするのに充分に独立したDNA結合サブドメインが同定された(Smithら, Nucleic Acids Res. 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781)。これらの発見は、選択された標的を切断する工学的I-CreI誘導体の第２世代の生成を可能にした。このコンビナトリアルストラテジーは、ヒトRAG1及びXPC遺伝子内にある天然DNA標的配列を切断するメガヌクレアーゼの作製により記載された(Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2007, 371:49〜65; 国際PCT出願WO 2007/093836、WO 2007/093918及びWO 2008/010093)。
【００１０】
ヒトRAG1又はXPC遺伝子からの天然DNA標的を切断する工学的メガヌクレアーゼはヘテロ二量体であり、これは２つの別々に工学的に操作された単量体を含み、それぞれが標的の一方の半分に結合する。ヘテロ二量体形成は、同じ細胞内での２つの単量体の同時発現により得られる(Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)。２つの単量体のこのような同時発現は、３つの分子種の形成をもたらす：興味対象の標的を切断するヘテロ二量体、及び副産物とみなし得る２つのホモ二量体(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; 国際PCT出願WO 2006/097854及びWO 2007/057781; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149)。しかし、別個のホモ二量体は、高レベルの毒性の原因になり得る場合がある(Bibikovaら, Genetics, 2002, 161, 1169〜1175; Beumerら, Genetics, 2006, 172, 2391〜2403)。よって、I-CreIのような単一LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼの広範な使用のためにまだ残されている制限因子は、タンパク質がホモ二量体であるということである。この問題を克服し得る２つの可能性がある：機能的ホモ二量体形成の抑制をもたらす二量体形成界面の再設計による偏性(obligatory)ヘテロ二量体の作製、又は別個のαββαββα折り畳みの分子内相互作用が分子間相互作用よりも好ましくなるようにするための、タンパク質結合若しくはリンカーを用いる単鎖分子中での２つの単量体の融合。この最後のストラテジーは、１つのコード配列のみへの方向付けの点でさらなる利点を有するか、又はタンパク質を核内へ導入しなければならないだろう。よって、２つの異なるベクター又はバイシストロニックなベクターの使用を緩和するだろう。少なくとも理論上では、単鎖分子は、リンカーが長く柔軟性である場合は特に、別個の分子からのαββαββα折り畳み同士の相互作用を必ずしも緩和しないが、同じ分子からのαββαββα折り畳み間の相互作用に少なくとも好ましいはずであることに注目されたい。さらに、単鎖分子の作製及び二量体形成界面の再設計は、排他的なストラテジーではなく、併せて用い得る。
【００１１】
I-CreIの単鎖バージョン(scI-CreI)の作製は、すでに試されている(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 3, 2952〜2962, 国際PCT出願WO 03/078619)。この最初のバージョンにおいて、単鎖メガヌクレアーゼのＮ末端ドメイン(I-CreIアミノ酸配列の１〜93位)は、I-CreI単量体のαββαββα折り畳み(コアドメイン)のみから本質的になるが、Ｃ末端(I-CreIアミノ酸配列の８〜163位)は、ほぼ完全なI-CreI単量体であった。リンカー(MLERIRLFNMR; 配列番号１)は、I-DmoIの２つのドメインを連結するループに由来した。
【００１２】
最初のscI-CreIは機能的メガヌクレアーゼであったが、これはI-CreIよりも安定性が低く、これはおそらくその天然の対応物と比較して最適折り畳みがより低いことによるのであろう。最初のscI-CreIの設計は、二重LAGLIDADGエンドヌクレアーゼの構造に適合し、よって、I-CreIのものとは、Ｎ末端ドメインがＣ末端ドメインよりも短く、いくつかの二重LAGLIDADGエンドヌクレアーゼのＣ末端ドメイン中に存在し得る３つのαヘリックスで形成されるＣ末端サブドメインを欠く点で異なる。
最初の単量体から３つのＣ末端ヘリックスを除くことは、最初のscI-CreIの折り畳み、安定性、よって切断活性に影響するだろう。なぜなら、最近の研究は、I-CreIのＣ末端サブドメインの、タンパク質DNA結合特性及びDNA標的切断活性における重要な役割を示しているからである(Prietoら, Nucleic Acids Res., 2007,), 35, 3267〜3271)。
【００１３】
しかし、３つのＣ末端ヘリックスは、LAGLIDADGモチーフを含むＮ末端ヘリックスからは遠く離れたI-CreIの二量体構造の反対側で終結する(図1)。一方のドメインのＣ末端残基と他方のドメインのＮ末端残基とを連結する柔軟性リンカーの長さ(融合体の端から端まで)は、かなりのものであろう。また、このようなリンカーを工学的に操作することは、タンパク質表面の大部分を横切る必要があるので、困難であろう。よって、適切なパッキングが得られるかは確実でない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
今回、本発明者は、I-CreIホモ二量体メガヌクレアーゼに由来する単鎖分子を設計する新しい様式を示す。このストラテジーは、コアαββαββα(α1β1β2α2β3β4α3)折り畳み及び２つの連結されたI-CreIユニットのＣ末端部分を保存する。
この設計は、オフサイト切断及び毒性を大きく低減する一方、効力を増進する。この単鎖分子の構造及び安定性は、ヘテロ二量体変異型のものと非常によく似ており、この分子は溶液中で単量体であるようである。さらに、得られるタンパク質は、生細胞中のヒト細胞における内因性遺伝子座(SCID遺伝子)にて非常に効率的な相同遺伝子ターゲティング(パーセントレベルで)を惹起する一方、可能性のある遺伝毒性に対してより効率的に保護する。全ての点において、この単鎖分子は、特異性の点で最高の基準であると考えられる単量体ホーミングエンドヌクレアーゼであるI-SceIと同様に良好に挙動する。これらの特性により、この新世代のメガヌクレアーゼは、ゲノム手術ストラテジーについて利用可能な最良の分子はさみの中に含まれることとなり、これらの特性は、単遺伝子疾患、例えば重症複合免疫不全(SCID)についての遺伝子修正療法を促進しながら、以前の遺伝子療法アプローチの有害な影響を避ける可能性を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の主題は、ペプチドリンカーにより連結された２つのドメイン(Ｎ末端及びＣ末端)を含む単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ(scI-CreI)であって：
(a) 親のI-CreI単量体に由来するそれぞれのドメインが、I-CreIの第１アルファヘリックスの始点(α1)からＣ末端ループの終点まで少なくとも広がりかつα1β1β2α2β3β4α3コアドメインと、α4及びα5ヘリックスと、I-CreIのＣ末端ループとを連続的に含む前記親のI-CreI単量体の部分を含み、
(b) それぞれの親のホモ二量体I-CreIメガヌクレアーゼ標的配列の一方の異なる半分(one different half)を含むキメラDNA標的と結合しそれを切断できるI-CreI二量体として前記２つのドメインが折り畳まれることを可能にするペプチドリンカーにより、前記２つのドメインが連結されている
メガヌクレアーゼである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
- ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、１文字コードに従って表し、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。
- ヌクレオチドは、次のように表す：１文字コードは、ヌクレオシドの塩基を表すために用いる：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについて、rはg又はa (プリンヌクレオチド)を表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はc (ピリミジンヌクレオチド)を表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。
【００１８】
- 「メガヌクレアーゼ」により、12〜45 bpの２本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼを意図する。該メガヌクレアーゼは、各ドメインが単量体上にある二量体酵素、又は単一ポリペプチド上に２つのドメインを含む単量体酵素のいずれかである。該メガヌクレアーゼは、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばI-CreIに由来し得る。
- 「メガヌクレアーゼドメイン」又は「ドメイン」により、メガヌクレアーゼのDNA標的の一方の半分と相互作用し、かつDNA標的の他方の半分と相互作用する同じメガヌクレアーゼの他方のドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能的メガヌクレアーゼを形成できる領域を意図する。
- 「単鎖メガヌクレアーゼ」により、ペプチドスペーサーで連結された２つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメインを含むメガヌクレアーゼを意図する。単鎖メガヌクレアーゼは、２つの親のメガヌクレアーゼ標的配列の一方の異なる半分を含むキメラDNA標的配列を切断できる。単鎖メガヌクレアーゼは、単鎖誘導体、単鎖メガヌクレアーゼ、単鎖メガヌクレアーゼ誘導体又はキメラメガヌクレアーゼとも命名される。
【００１９】
-「コアドメイン」により、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼの特徴的なα1β1β2α2β3β4α3折り畳みである「LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメイン」を意図する。該コアドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する逆平行ベータシートに折り畳まれた４つのベータ鎖(β1β2β3β4)を含む。このコアドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断できる機能エンドヌクレアーゼを形成できる。例えば、二量体ホーミングエンドヌクレアーゼI-CreI (163アミノ酸)の場合、コアドメインは、I-CreIの残基６〜94を含む。
- 「ベータヘアピン」により、ループ又はターンにより連結されたLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆平行ベータシートの２つの連続するベータ鎖(β1β2又はβ3β4)を意図する。
【００２０】
- 「サブドメイン」により、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的ハーフサイトの別個の部分と相互作用するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域を意図する。
- 「メガヌクレアーゼ変異型」又は「変異型」により、野生型メガヌクレアーゼ(天然のメガヌクレアーゼ)のアミノ酸配列における少なくとも1つの残基の、別のアミノ酸での置き換えにより得られるメガヌクレアーゼを意図する。
- 「機能的変異型」により、DNA標的配列、好ましくは、親のメガヌクレアーゼにより切断されない新しい標的を切断できる変異型を意図する。例えば、このような変異型は、DNA標的配列に接触するか、又は直接若しくは間接的に該DNA標的と相互作用する位置にてアミノ酸変動を有する。
【００２１】
- 「新規な特異性を有するメガヌクレアーゼ変異型」により、親のメガヌクレアーゼのものとは異なる切断標的パターンを有する変異型を意図する。等価であり同等に用いられる用語「新規な特異性」「改変された特異性」「新規な切断特異性」「新規な基質特異性」は、DNA標的配列のヌクレオチドに対する変異形の特異性のことをいう。
- 「I-CreI」により、配列表内の配列番号20の配列に相当する野生型I-CreI (タンパク質データバンクアクセッション番号1g9y)を意図する。
- 「親のI-CreI単量体」又は「I-CreI単量体」は、全長野生型I-CreIアミノ酸配列である配列番号20(163アミノ酸)又は配列番号20中にアミノ酸置換を含むその機能的変異形を意図する。I-CreIは二量体として機能し、これは２つのI-CreI単量体から形成される。
【００２２】
- 「I-CreIの第１アルファヘリックスの始点からＣ末端ループの終点まで少なくとも広がりかつα1β1β2α2β3β4α3コアドメインと、α4及びα5ヘリックスと、Ｃ末端ループとを連続的に含む前記親のI-CreI単量体の部分」により、I-CreIの少なくとも８〜143位に相当するアミノ酸配列を意図する。
- 「I-CreI部位」により、I-CreIにより切断される22〜24 bpの２本鎖DNA配列を意図する。I-CreI部位は、野生型(天然)非パリンドロームI-CreIホーミング部位と、C1221ともよばれる配列5'-c-11a-10a-9a-8a-7c-6g-5t-4c-3g-2t-1a+1c+2g+3a+4c+5g+6t+7t+8t+9t+10g+11 (配列番号21；図３)のような派生パリンドローム配列を含む。
- 「DNA標的」、「DNA標的配列」、「標的配列」、「標的部位」、「標的」、「部位」、「興味対象の部位」、「認識部位」、「認識配列」、「ホーミング認識部位」、「ホーミング部位」、「切断部位」により、I-CreIのようなLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、又は変異型、又はI-CreIに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼにより認識されかつ切断される20〜24 bpの２本鎖パリンドローム、部分的パリンドローム(偽パリンドローム)又は非パリンドロームのポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、そこでメガヌクレアーゼにより２本鎖破断(切断)が誘導される特定のDNAの場所、好ましくはゲノムの場所のことをいう。DNA標的は、C1221について上で示したように、２本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5'から3'の配列により定義される。DNA標的の切断は、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれについて、+2位及び-2位のヌクレオチドで生じる。そうでないと記載しない限り、I-Cre Iメガヌクレアーゼ変異型又は単鎖誘導体によるDNA標的の切断が生じる位置は、DNA標的のセンス鎖上の切断部位に相当する。
【００２３】
- 「DNA標的ハーフサイト」、「ハーフ切断部位」又は「ハーフサイト」により、それぞれのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが結合するDNA標的の部分を意図する。
- 「キメラDNA標的」又は「ハイブリッドDNA標的」により、２つの親のメガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合を意図する。さらに、該標的の少なくとも一方の半分は、少なくとも２つの別々のサブドメインが結合するヌクレオチドの組み合わせ(組み合わせたDNA標的)を含み得る。
【００２４】
- 「それぞれの親のホモ二量体I-CreIメガヌクレアーゼ標的配列の一方の異なる半分を含むキメラDNA標的」により、一方の親の単量体の２つの同一単量体で作られるホモ二量体メガヌクレアーゼにより切断されるパリンドローム標的配列の左部分と、他方の親の単量体の２つの同一単量体で作られるホモ二量体メガヌクレアーゼにより切断されるパリンドローム標的配列の右部分とを含む標的配列を意図する。
- 「ベクター」により、連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を意図する。
- 「相同な」により、配列同士の間の相同組換えを導くのに充分な別の配列との同一性を有する、より具体的には少なくとも95%の同一性、好ましくは97%の同一性、より好ましくは99%を有する配列を意図する。
【００２５】
- 「同一性」は、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性のことをいう。同一性は、比較の目的のために整列させ得るそれぞれの配列中の位置の比較により決定できる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、その分子同士は、その位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一又は一致するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを用いて、2つの配列間の同一性を計算することができ、GCG配列解析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部分として利用可能であり、例えばデフォルト設定で用い得るFASTA又はBLASTを含む。
【００２６】
- 「個体」は、哺乳動物、及びその他の脊椎動物(例えば鳥類、魚類及び爬虫類)を含む。用語「哺乳動物」及び「哺乳類」は、本明細書で用いる場合、その子に授乳し、生存する子を出産する(真獣類(eutharian)又は胎盤哺乳類(placental mammals))又は産卵する(後獣類(metatharian)又は無胎盤哺乳類(nonplacental mammals))単孔類、有袋類及び有胎盤類(placental)を含むいずれの脊椎動物のことをいう。哺乳動物の種の例は、ヒト、及びその他の霊長類(例えばサル、チンパンジー)、げっ歯類(例えばラット、マウス、モルモット)、並びにその他、例えばウシ、ブタ及びウマを含む。
【００２７】
- 「変異」により、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)又はポリペプチド配列内の１つ又は複数のヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図する。上記の変異は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響し得る。これは、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造／安定性にも影響し得る。
- 「部位特異的突然変異」により、ランダム突然変異とは反対の、ヌクレオチド配列中の特定のヌクレオチド/コドンの変異を意図する。
【００２８】
本発明による単鎖I-CreIメガヌクレアーゼは、scI-CreIメガヌクレアーゼ又はsc-I-CreIとも命名される。
本発明によると、リンカーの配列は、sc-I-CreIの２つのドメインがI-CreI二量体として折り畳まれ、それぞれの親のホモ二量体I-CreIメガヌクレアーゼ標的配列の一方の異なる半分を含むキメラDNA標的と結合しそれを切断することが可能になるように選択される。
【００２９】
I-CreI二量体形成は、Prietoら, Nucleic Acids Research, 2007, 35, 3267〜3271に以前に記載されたような、分析遠心分離により行われる沈降平衡実験のような公知のアッセイによりアッセイできる。
DNA結合は、例えば、Prietoら, Nucleic Acids Research, 2007, 35, 3267〜3271に以前に記載されたような、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)のような公知のアッセイによりアッセイできる。
【００３０】
本発明による単鎖メガヌクレアーゼの切断活性は、国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Arnouldら, J. Mol. Biol., Epub 10 May 2007に記載されるもののような、任意の公知のインビトロ又はインビボ切断アッセイにより測定できる。
例えば、本発明の単鎖メガヌクレアーゼの切断活性は、直列反復組換えアッセイ(direct repeat recombination assay)により、酵母又は哺乳動物細胞内で、レポーターベクターを用いて、対応するヘテロ二量体メガヌクレアーゼ又は同一の親のI-CreI単量体に由来する別の単鎖メガヌクレアーゼのものとの比較により測定できる。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた介在配列内に、レポーター遺伝子の２つの切り詰められた非機能的コピー(直列反復)と、(非パリンドロームの)ゲノムDNA標的配列とを含む。ゲノムDNA標的配列は、それぞれの(パリンドローム又は偽パリンドローム)の親のホモ二量体I-CreIメガヌクレアーゼ標的配列の一方の異なる半分を含む。メガヌクレアーゼの発現は、ゲノムキメラDNA標的配列の切断をもたらす。この切断は、直列反復同士の相同組換えを誘導し、機能的レポーター遺伝子(例えばLacZ)をもたらし、その発現を、適切なアッセイによりモニターできる。さらに、単鎖メガヌクレアーゼの、そのゲノムDNA標的に対する活性は、同じゲノム遺伝子座にて、哺乳動物細胞における染色体アッセイ(Arnouldら, J. Mol. Biol., Epub 10 May 2007)を用いて、I-CreIの、I-CreI部位に対する活性と比較できる。さらに、単鎖メガヌクレアーゼによる切断の特異性は、親のI-CreIホモ二量体メガヌクレアーゼにより切断される２つのパリンドローム配列のものと、キメラDNA標的配列の切断を比較することによりアッセイできる。
【００３１】
sc-I-CreIの２つのドメインのＮ末端配列は、I-CreIの１位、２位、３位、４位、５位、６位又は８位から始まり得る。好ましい実施形態において、Ｎ末端ドメインはI-CreI の１位又は６位から始まり、Ｃ末端ドメインはI-CreIの２位又は６位から始まる。
２つのドメインのＣ末端配列は、Ｃ末端ループの直後、例えばI-CreIの143位又は145位で終結する。或いは、ドメインのＣ末端配列は、少なくともアルファ６ヘリックス(I-CreIの145〜150位)と、結局はさらなるＣ末端残基とをさらに含む。この場合、ドメインのＣ末端配列は、I-CreIの150位、151位、152位、153位、154位、155位、156位、157位、158位、159位、160位、161位、162位又は163位で終結し得る。好ましくは、152位〜160位である。例えば152位、156位、160位又は163位である。好ましい実施形態において、Ｎ末端ドメインは、I-CreIの163位で終結する。より好ましくは両方のドメインがI-CreIの163位で終結する。
【００３２】
sc-I-CreIメガヌクレアーゼの別の好ましい実施形態において、リンカーは、10〜100の連続するアミノ酸、好ましくは15〜50アミノ酸、より好ましくは20〜35アミノ酸、さらにより好ましくは25〜35アミノ酸の直鎖状配列を含むか又はそれからなる。リンカーの配列は、アルファヘリックス(SOPMA：Self-Optimized Prediction Method with Aligmentによる予測；Geourjon及びDeleage, 1995)又はII型ポリプロリンヘリックスのいずれかのヘリックスを形成するように予測される。このようなポリプロリンヘリックスの例は、配列番号15又は16に示される(表Ｉ)。より好ましくは、リンカーはアルファヘリックスを含む。リンカーは、有利には、配列番号２〜19を含むか又はそれらからなる配列からなる群より選択される。好ましくは、これは、配列番号２〜12及び14〜19の配列からなる群より選択される。より好ましくは、リンカーは、配列２、４〜８、11、16、18及び19からなる群より選択される。さらにより好ましくは、リンカーは配列番号２の配列からなる。
【００３３】
本発明による単鎖I-CreIメガヌクレアーゼは、野生型I-CreI単量体又はその機能的変異型に由来し得る。さらに、親の単量体のNH2末端及び／又はCOOH末端に挿入される１つ又は複数の残基。さらなるコドンを親の単量体の5'又は3'の終点に付加して、種々のベクターへのクローニングのために用いられる制限部位を導入できる。該配列の例は配列番号23であり、これは、１番目のメチオニン残基の後に挿入されたアラニン(A)残基と、Ｃ末端プロリン残基の後に挿入されたアラニン及びアスパラギン酸(AD)残基とを有する。これらの配列により、種々のベクターへのクローニングのために用いられるNcoI (ccatgg)及びEagI (cggccg)制限部位を含むDNAコード配列が可能になる。例えば、タグ(エピトープ又はポリヒスチジン配列)をＮ末端ドメインのNH2末端及び／又はＣ末端ドメインのCOOH末端に導入することもできる。上記のタグは、sc-I-CreIメガヌクレアーゼの検出及び／又は精製のために有用である。
好ましくは、sc-I-CreIメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体I-CreI変異型、より好ましくは以前に記載されたような新規な切断特異性を有する変異型(Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149 ; Arnouldら, J. Mol. Biol., Epub 10 May 2007; 国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/049095、WO 2007/057781、WO 2007/060495、WO 2007/049156、WO 2007/093836及びWO 2007/093918)の単量体に由来する。
【００３４】
よって、単鎖I-CreIメガヌクレアーゼのドメインは、DNA標的配列と接触するか、又はDNA主鎖若しくはヌクレオチド塩基と直接若しくは水素結合を介して相互作用するI-CreIアミノ酸残基の位置にて変異を含み得る。これらの残基は当該技術において公知である(Juricaら, Molecular Cell., 1998, 2, 469〜476; Chevalierら, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253〜269)。好ましくは、上記の変異は、メガヌクレアーゼの切断特異性を改変し、興味対象の遺伝子からのDNA標的を切断できる新規な特異性を有するメガヌクレアーゼをもたらす。より好ましくは、上記の変異は、以前に記載されたような(国際PCT出願WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495、WO 2007/049156、WO 2007/049095及びWO 2007/057781; Arnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006)、DNA標的の±８〜10位のヌクレオチドに対する特異性を変更する、I-CreIアミノ酸配列の26〜40位にあるものに相当する第１機能的サブドメイン中の１つ又は複数のアミノ酸の置換、及び／又はDNA標的の±３〜５位のヌクレオチドに対する特異性を変更する、I-CreIアミノ酸配列の44〜77位にあるものに相当する第２機能的サブドメイン中の置換である。置換は、有利には、I-CreIアミノ酸配列の26位、28位、30位、32位、33位、38位及び／又は40位、44位、68位、70位、75位及び／又は77位に相当する。n-4がtであるか又はn+4がaであるDNA標的を切断するために、上記のI-CreIドメインは、有利には、44位にグルタミン(Q)を有する。n-4がaであるか又はn+4がtであるDNA標的を切断するために、上記のドメインは44位にアラニン(A)又はアスパラギンを有し、n-9がgであるか又はn+9がcであるDNA標的を切断するために、上記のドメインは、有利には、38位にアルギニン(R)又はリジン(K)を有する。
【００３５】
上記のscI-CreIメガヌクレアーゼの別の好ましい実施形態によると、少なくとも一方のドメインは、I-CreIの26〜40位及び／又は44〜77位にて変異を有し、該scI-CreIメガヌクレアーゼは、非パリンドロームDNA配列を切断でき、該DNA配列の+3〜+5位、+8〜+10位、-10〜-8位及び-5〜-3位のヌクレオチドは、興味対象の遺伝子からのDNA標的の+3〜+5位、+8〜+10位、-10〜-8位及び-5〜-3位のヌクレオチドに相当する。好ましくは、scI-CreIメガヌクレアーゼの両方のドメインが、26〜40位及び／又は44〜77位にて変異されている。より好ましくは、両方のドメインが、I-CreIの26〜40位及び44〜77位にて異なる変異を有する。
【００３６】
上記のscI-CreIメガヌクレアーゼの別の好ましい実施形態において、少なくとも一方のドメインは、DNA標的配列と相互作用するI-CreIのその他のアミノ酸残基の位置にて１つ又は複数の変異を含む。特に、リン酸主鎖と接触する位置にて、例えば最後のＣ末端ループ(137〜143位; Prietoら, Nucleic Acids Res., 2007, 35, 3262〜3271)中にさらなる置換を導入できる。好ましくは、上記の残基は、該DNA切断部位の結合及び切断に関与する。より好ましくは、上記の残基は、I-CreIの138位、139位、142位又は143位である。２つの残基を１つのドメインにおいて変異させ得るが、但し、それぞれの変異が、138位と139位との残基の対、及び142位と143位との残基の対から選択される異なる残基の対にあることを条件とする。導入される変異は、最終Ｃ末端ループの上記のアミノ酸と、I-CreI部位のリン酸主鎖との相互作用を改変する。好ましくは、138位又は139位の残基が、DNA切断部位のリン酸主鎖との水素結合の形成を回避するように疎水性アミノ酸で置換される。例えば、138位の残基がアラニンにより置換されるか、又は139位の残基がメチオニンにより置換される。142位又は143位の残基を、有利には、小さいアミノ酸、例えばグリシンにより置換して、これらのアミノ酸残基の側鎖のサイズを低減させる。より好ましくは、最終Ｃ末端ループ中の上記の置換は、I-CreI部位の±1〜2位、±6〜7位及び／又は±11〜12位のヌクレオチドに対するscI-CreIメガヌクレアーゼの特異性を改変する。
【００３７】
上記のscI-CreIメガヌクレアーゼの別の好ましい実施形態において、少なくとも一方のドメインは、興味対象の遺伝子からのDNA標的配列に対するscI-CreIメガヌクレアーゼの切断活性及び／又は特異性を含む、結合及び／又は切断の特性を改善する１つ又は複数のさらなる置換を含む。変異されるさらなる残基は、I-CreI配列全体上にあり得る。
上記のsc-I-CreIメガヌクレアーゼのより好ましい実施形態によると、上記のさらなる変異は、sc-I-CreIメガヌクレアーゼのドメインからの機能的ホモ二量体の形成を損なう。
【００３８】
それぞれの親の単量体は、それぞれ同じ親の単量体の残基Z'及びZと相互作用して(相互作用する残基ZZ'の２対)２つのホモ二量体と１つのヘテロ二量体を形成する、二量体形成界面の少なくとも２つの残基Z及びZ'を有する。本発明によると、二量体形成界面の相互作用残基の２対のうちの一方が交換されて、２つの残基Z又はZ'を有する第１ドメインと、２つの残基Z'又はZを有する第２ドメインとをそれぞれ得る。その結果、２つの残基Z又は２つの残基Z'をそれぞれ有する第１及び第２ドメインは、親の対応物よりもホモ二量体を形成しにくくなる(sc-I-CreIドメイン間相互作用)が、sc-I-CreIの２つのドメインの界面に相互作用残基ZZ'の２対が存在することが、ヘテロ二量体の形成を好ましいものにする(sc-I-CreIドメイン内相互作用)。
【００３９】
よって、sc-I-CreIメガヌクレアーゼのドメインは、有利には、第１(Ｎ末端又はＣ末端ドメイン)及び第２ドメイン(Ｃ末端ドメイン又はＮ末端ドメイン)についてそれぞれ、以下の変異の対の少なくとも１つを有する：
a)８位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第１ドメイン)、及び７位のリジンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第２ドメイン)；第１ドメインは、７位及び96位のリジン残基の少なくとも１つのアルギニンによる置換をさらに含み得る、
b) 61位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第１ドメイン)、及び96位のリジンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第２ドメイン)；第１ドメインは、７位及び96位のリジン残基の少なくとも１つのアルギニンによる置換をさらに含み得る、
c) 97位のロイシンの芳香族アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンでの置換(第１ドメイン)、及び54位のフェニルアラニンの小さいアミノ酸、好ましくはグリシンでの置換(第２ドメイン)；第１ドメインは、54位のフェニルアラニンのトリプトファンによる置換をさらに含むことができ、第２ドメインは、58位のロイシン又は57位のリジンのメチオニンによる置換をさらに含み得る、
d) 137位のアスパラギン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換(第１ドメイン)、及び51位のアルギニンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換(第２ドメイン)。
【００４０】
例えば、第１ドメインは変異D137Rを、第２ドメインは変異R51Dを有し得る。
或いは、sc-I-CreIメガヌクレアーゼは、上記のa)、b)、c)又はd)で定義される変異の少なくとも２対を含む。変異の対のうちの１つは、有利にはc)又はd)で定義されるとおりである。好ましくは、一方のドメインは、７位及び96位のリジン残基の酸性アミノ酸(D又はE)による置換を含み、他方のドメインは、８位及び61位のグルタミン酸残基の塩基性アミノ酸(K又はR)による置換を含む。より好ましくは、sc-I-CreIメガヌクレアーゼは、上記のa)、b)及びc)で定義される変異の３対を含む。sc-I-CreIメガヌクレアーゼは、有利には、(i) E8R、E8K又はE8H、E61R、E61K又はE61H及びL97F、L97W又はL97Y; (ii) K7R、E8R、E61R、K96R及びL97F、或いは(iii) K7R、E8R、F54W、E61R、K96R及びL97Fから選択される変異を少なくとも有する第１ドメイン(A)と、(iv) K7E又はK7D、F54G又はF54A及びK96D又はK96E; (v) K7E、F54G、L58M及びK96E、或いは(vi) K7E、F54G、K57M及びK96Eの変異を少なくとも有する第２ドメイン(B)とからなる。
【００４１】
sc-I-CreIメガヌクレアーゼのドメインからの機能的ホモ二量体の形成を損なう変異の別の例は、G19S変異である。G19S変異は、有利には、sc-I-CreIメガヌクレアーゼの２つのドメインの一方に導入されることにより、切断活性が増進され、切断特異性が増進された単鎖メガヌクレアーゼが得られる。さらに、切断特異性をさらに増進させるために、他方のドメイン又は両方のドメインが、機能的ホモ二量体の形成を損なうか、又はヘテロ二量体sc-I-CreIメガヌクレアーゼの形成に好ましい上記で定義されるような別個の変異を有し得る。例えば、それぞれ、一方の単量体がG19S変異とK7E及びK96E又はE8K及びE61R変異とを含み、他方の単量体がE8K及びE61R又はK7E及びK96E変異を含む。
【００４２】
上記のsc-I-CreIメガヌクレアーゼの別の好ましい実施形態において、上記の変異は、元のアミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L及びWからなる群より選択されるアミノ酸での置き換えである。
【００４３】
本発明の主題は、配列番号95又は97の配列を含むsc-I-CreIメガヌクレアーゼでもある。これらのsc-I-CreIメガヌクレアーゼは、ヒトRAG1遺伝子に存在するRAG1標的(RAG1.10；配列番号41及び図16)を切断する。このsc-I-CreIメガヌクレアーゼは、SCID症候群に関連するRAG1変異を修正するため、又はRAG1遺伝子座にてゲノムを工学的に操作するために用いることができる。RAG1.10はコード配列の上流にあるので(図16)、これらのsc-I-CreIメガヌクレアーゼは、国際PCT出願WO 2008/010093に記載されるように、RAG1遺伝子中の任意の変異を、エキソンノックインにより修復するために用いることができる。
【００４４】
本発明の主題は、上記で規定される単鎖メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメントでもある。上記のポリヌクレオチドの好ましい実施形態によると、上記の単鎖メガヌクレアーゼの２つのI-CreIドメインをコードする核酸配列同士は、80%未満の核酸配列同一性、好ましくは70%未満の核酸配列同一性を有する。このことにより、２つの配列間の組換えの危険性が低減され、その結果、ポリヌクレオチド構築物及び得られるベクターの遺伝子的安定性が増加する。このことは、I-CreI配列をコドン使用及び遺伝子コード縮重を用いて書き換えることにより得ることができる。例えば、ドメインの一方が野生型I-CreIコード配列(配列番号22)に由来し、他方のドメインがI-CreIコード配列の書き換えられたバージョン(配列番号24)に由来する。さらに、単鎖メガヌクレアーゼをコードするcDNAのコドンは、該タンパク質の、所望の発現系における発現に好ましいように選択される。
【００４５】
本発明の主題は、本発明による単鎖メガヌクレアーゼの発現のための組換えベクターでもある。組換えベクターは、上記で定義される、単鎖メガヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドフラグメントを含む。
本発明において用い得るベクターは、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、或いは染色体、非染色体、半合成又は合成の核酸からなり得る直鎖状若しくは環状のDNA又はRNA分子を含む。好ましいベクターは、自律複製できるもの(エピソームベクター)及び／又は連結された核酸の発現を可能にするもの(発現ベクター)である。多数の適切なベクターが当業者に知られ、商業的に入手可能である。
【００４６】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えばアデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルトミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス１及び２型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)及びポックスウイルス(例えばワクシニア、鶏痘及びカナリア痘)を含む二本鎖DNAウイルスを含む。その他のウイルスは、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスを含む。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルスを含む(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, 第3版, B. N. Fieldsら編, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
好ましいベクターは、レンチウイルスベクター、特に自己不活化レンチウイルスベクター(self inactivacting lentiviral vectors)を含む。
【００４７】
ベクターは、選択マーカー、例えば真核細胞培養についてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；エス・セレビシエ(S. cerevisiae)についてTRP1、URA3及びLEU2；大腸菌(E. coli)においてテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性を含み得る。
【００４８】
好ましくは、上記のベクターは、本発明の単鎖メガヌクレアーゼをコードする配列が、適切な転写及び翻訳制御要素の制御下に位置して、該メガヌクレアーゼの生成又は合成を許容する発現ベクターである。よって、上記のポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。より具体的には、該ベクターは、複製始点、該コードポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位(ゲノムDNAを用いる場合)、ポリアデニル化部位、及び転写終結部位を含む。これは、エンハンサーも含み得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドが発現される細胞に依存する。適切なプロモーターは、組織特異的及び／又は誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターの例は、重金属のレベルの増加により誘導される真核メタロチオネインプロモーター、イソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド(IPTG)に応答して誘導される原核lacZプロモーター、及び温度の増加により誘導される真核熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺特異的抗原(PSA)、α-アンチトリプシンプロテアーゼ、ヒトサーファクタント(SP)タンパク質A及びB、β-カゼイン及び酸性ホエータンパク質遺伝子である。
上記のベクターの別の有利な実施形態によると、これは、上記で定義されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列を含むターゲティング構築物を含む。
【００４９】
或いは、単鎖メガヌクレアーゼをコードするベクターと、ターゲティング構築物を含むベクターとは、異なるベクターである。
より好ましくは、上記のターゲティングDNA構築物は：
a) 上記で定義されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列と、
b) a)に記載の配列で挟まれた、導入される配列と
を含む。
好ましくは、少なくとも50 bp、好ましくは100 bpを超える、より好ましくは200 bpを超える相同配列が用いられる。よって、ターゲティングDNA構築物は、好ましくは200 pb〜6000 pb、より好ましくは1000 pb〜2000 pbである。実際に、共有されるDNA相同性は、破断の部位の上流及び下流に接する領域に位置し、導入されるDNA配列は、２つの腕の間に位置するべきである。導入される配列は、好ましくは、ゲノム療法のために、興味対象の遺伝子の変異を修復する配列である(遺伝子修正又は機能的遺伝子の回復)。或いは、これは、特定の配列を改変するため、興味対象の遺伝子を減弱若しくは活性化するため、興味対象の遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は削除するため、興味対象の部位に変異を導入するため、或いは外因性遺伝子又はその一部分を導入するために用いられる配列を含む、ある特定の様式で染色体DNAを変更させるために用いられる任意のその他の配列であり得る。このような染色体DNAの変更は、ゲノム工学(動物モデル/ヒト組換え株化細胞)のために用いられる。
【００５０】
本発明は、上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクター、好ましくは発現ベクターで改変された原核又は真核宿主細胞にも関する。
本発明は、細胞の全て又は一部分が上記で定義されるポリヌクレオチド又はベクターで改変されたことを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物にも関する。
本明細書で用いる場合、細胞とは、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物若しくは酵母細胞のことである。
【００５１】
本発明の主題は、さらに、メガヌクレアーゼ、好ましくは発現ベクターに含まれるポリヌクレオチド、上記で定義される細胞、トランスジェニック植物、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の、非治療目的での分子生物学、インビボ若しくはインビトロの遺伝子工学、及びインビボ若しくはインビトロのゲノム工学のための使用である。
分子生物学は、限定されないが、DNA制限及びDNAマッピングを含む。非治療目的の遺伝子工学及びゲノム工学は、例えば、(i) タンパク質生産のための細胞パッケージング系統における特定の遺伝子座の遺伝子ターゲティング、(ii) 株の改良及び代謝工学のための農作植物の特定の遺伝子座の遺伝子ターゲティング、(iii) 遺伝子改変された農作植物におけるマーカーの除去のための標的された組換え、(iv) (例えば抗生物質生産のために)遺伝子改変された微生物株におけるマーカーの除去のための標的された組換えを含む。
【００５２】
上記の使用の有利な実施形態によると、これは、DNA標的配列を含む興味対象の部位において２本鎖破断を誘導することにより、DNA組換え事象、DNA欠失又は細胞死を誘導するためである。
本発明によると、上記の２本鎖破断は、特定の配列を修復するため、特定の配列を改変するため、変異された遺伝子の代わりに機能的遺伝子を回復させるため、興味対象の内因性遺伝子を減弱若しくは活性化させるため、興味対象部位に変異を導入するため、外因性遺伝子若しくはその一部分を導入するため、内因性遺伝子若しくはその一部分を不活性化又は検出するため、染色体腕を転座させるため、又はDNAを修復されないままにして分解させるためである。
【００５３】
本発明の主題は、上記で定義されるDNA標的を含むベクター上に位置する興味対象の部位中で、該ベクターを上記で定義されるメガヌクレアーゼと接触させることにより２本鎖核酸を破断させ、そのことにより、該メガヌクレアーゼの切断部位を取り囲む配列と相同性を示す別のベクターとの相同組換えを誘導するステップを含むことを特徴とする遺伝子工学の方法でもある。
【００５４】
本発明の主題は、1) 上記で定義されるメガヌクレアーゼの少なくとも１つのDNA標的を含むゲノム遺伝子座の２本鎖を、該標的を該メガヌクレアーゼと接触させることにより破断させるステップと、2) 該破断したゲノム遺伝子座を、標的にされた遺伝子座との相同性を有する配列で挟まれた、該遺伝子座に導入される配列を含むターゲティングDNA構築物との相同組換えに適する条件下に維持するステップとを含むことを特徴とするゲノム工学の方法でもある。
【００５５】
本発明の主題は、1) 上記で定義されるメガヌクレアーゼの少なくとも１つのDNA標的を含むゲノム遺伝子座の２本鎖を、該切断部位を該メガヌクレアーゼと接触させることにより破断させるステップと、2) 該破断したゲノム遺伝子座を、切断部位を取り囲む領域との相同性を有する染色体DNAとの相同組換えに適する条件下に維持するステップとを含むことを特徴とするゲノム工学の方法でもある。
【００５６】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも１つのメガヌクレアーゼ、１つ又は２つの派生ポリヌクレオチド、好ましくは発現ベクターに含まれるものの、必要とする個体における遺伝病を予防、改善又は治癒するための、該個体に任意の手段により投与される医薬品の製造のための使用でもある。
【００５７】
本発明の主題は、必要とする個体に、上記で定義されるメガヌクレアーゼを少なくとも含む組成物を、任意の手段により投与するステップを含む、該個体における遺伝病を予防、改善又は治癒するための方法でもある。
この場合、上記で定義されるメガヌクレアーゼの使用は、(a) 個体の体組織に、該メガヌクレアーゼの少なくとも１つの認識及び切断部位を含む遺伝子の興味対象部位にて２本鎖切断を誘導するステップと、(b) 個体にターゲティングDNAを導入するステップとを少なくとも含み、該ターゲティングDNAは、(1) 切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、(2) ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に興味対象部位を修復するDNAとを含む。ターゲティングDNAは、個体に、興味対象部位にターゲティングDNAを導入するのに適する条件下で導入される。
【００５８】
本発明によると、上記の２本鎖切断は、該メガヌクレアーゼを個体に投与することにより全体として(in toto)、又は個体から回収して、改変の後に個体に戻す体細胞に該メガヌクレアーゼを導入することによりエクスビボで誘導される。
上記の使用の好ましい実施形態において、上記のメガヌクレアーゼは、上記で定義されるような、該メガヌクレアーゼのゲノムDNA切断部位を取り囲む遺伝子の領域と相同性を有する配列で挟まれた、遺伝子中の変異を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物と組み合わせる。変異を修復する配列は、正しい配列を有する遺伝子のフラグメント又はエキソンノックイン構築物のいずれかである。
【００５９】
遺伝子を修正するために、遺伝子の切断は、変異の近傍、好ましくは変異から500 bp以内で生じる。ターゲティング構築物は、切断を修復するためのゲノムDNA切断部位に接する相同配列の少なくとも200 bpを有する遺伝子フラグメント(最小修復マトリクス)を含み、変異を修復するための遺伝子の正しい配列を含む。その結果、遺伝子修正のためのターゲティング構築物は、最小修復マトリクスを含むか又はそれからなり、これは、好ましくは200 pb〜6000 pb、より好ましくは1000 pb〜2000 pbである。
【００６０】
機能的遺伝子を回復させるために、遺伝子の切断は、変異の上流で生じる。好ましくは、上記の変異は、遺伝子の配列内で最初のわかっている変異であり、そのことにより、遺伝子の全ての下流の変異が、同時に修正できる。ターゲティング構築物は、(cDNAとして)インフレームで融合され、3'における転写を停止するためのポリアデニル化部位を含む、ゲノムDNA切断部位の下流のエキソンを含む。導入される配列(エキソンノックイン構築物)は、切断部位を取り囲むイントロン又はエキソンの配列で挟まれており、そのことにより、工学的な遺伝子(エキソンノックイン遺伝子)を、機能的タンパク質をコードできるmRNAに転写することが可能になる。例えば、エキソンノックイン構築物は、上流及び下流の配列で挟まれる。
【００６１】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも１つのメガヌクレアーゼ、１つのポリヌクレオチド、好ましくは発現ベクターに含まれるものの、必要とする個体において、DNA媒介物(intermediate)を示す感染性因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒するための、任意の手段により個体に投与される医薬品の製造のための使用でもある。
【００６２】
本発明の主題は、必要とする個体に、上記で定義される組成物を、任意の手段により投与するステップを少なくとも含む、該個体における、DNA媒介物を示す感染性因子により引き起こされる疾患を予防、改善又は治癒する方法でもある。
【００６３】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも１つのメガヌクレアーゼ、１つのポリヌクレオチド、好ましくは発現ベクターに含まれるものの、生物由来製品又は生物学的使用若しくは物体の消毒を意図する製品において、インビトロにおいて、DNA媒介物を示す感染性因子の増殖を阻害するか、不活性化するか若しくは欠失させるための使用でもある。
【００６４】
本発明の主題は、生物由来製品、生物学的使用を意図する製品又は物体を、上記で定義される組成物と、感染性因子の増殖の阻害、不活性化又は欠失に充分な時間接触させるステップを少なくとも含む、DNA媒介物を示す感染性因子から、製品又は物質を除染する方法でもある。
具体的な実施形態において、上記の感染性因子は、ウイルスである。例えば、該ウイルスは、アデノウイルス(Ad11、Ad21)、ヘルペスウイルス(HSV、VZV、EBV、CMV、ヘルペスウイルス6、7又は8)、ヘパドナウイルス(HBV)、パポバウイルス(HPV)、ポックスウイルス又はレトロウイルス(HTLV、HIV)である。
【００６５】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも１つのメガヌクレアーゼ、１つのポリヌクレオチド、好ましくは発現ベクターに含まれるものを含むことを特徴とする組成物でもある。
上記の組成物の好ましい実施形態において、これは、上記で定義される標的された遺伝子座と相同性を有する配列に挟まれた興味対象部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物を含む。好ましくは、該ターゲティングDNA構築物は、組換えベクターに含まれているか、又は本発明で定義されるメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに含まれるかのいずれかである。
【００６６】
本発明の主題は、メガヌクレアーゼ又は該メガヌクレアーゼをコードする１つの発現ベクターと、上記で定義されるターゲティング構築物を含むベクターとを少なくとも含む、遺伝病の予防又は治療における同時、別々又は逐次的な使用のための組み合わせ製剤としての製品でもある。
治療の目的のために、メガヌクレアーゼと、医薬的に許容される賦形剤とは、治療有効量で投与される。このような組み合わせは、投与される量が、生理的に効果をもたらす場合に「治療有効量」で投与されるという。ある因子は、その存在が、受容者の生理機能における検出可能な変化をもたらす場合に、生理的に効果をもたらす。この関係において、ある因子は、その存在が、標的にされた疾患の１つ又は複数の症状の重篤さの減少と、損傷又は異常のゲノム修正をもたらす場合に、生理的に効果をもたらす。
【００６７】
本発明による使用のある実施形態において、メガヌクレアーゼは、実質的に非免疫原性であり、すなわち、有害な免疫学的応答をほとんど又は全く生じない。この種の有害な免疫学的反応を緩和又は排除する種々の方法を、本発明に従って用いることができる。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｎ-ホルミルメチオニンを実質的に有さない。望まない免疫学的反応を回避する別の方法は、メガヌクレアーゼを、ポリエチレングルコール(「PEG」)又はポリプロピレングリコール(「PPG」) (好ましくは、500〜20,000ダルトンの平均分子量(MW)のもの)とコンジュゲートさせることである。例えばDavisら(US 4,179,337)により記載されるPEG又はPPGとのコンジュゲート形成は、抗ウイルス活性を有する、非免疫原性で、生理活性で、水溶性のエンドヌクレアーゼコンジュゲートを提供できる。ポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを用いる同様の方法は、Saiferら(US 5,006,333)に記載されている。
【００６８】
メガヌクレアーゼは、ポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物/ベクターとして用い得る。これは、細胞に、インビトロ、エクスビボ又はインビボで、具体的な種類の細胞に適する当該技術において公知の任意の簡便な手段により、単独で、又は少なくとも適切なビヒクル若しくは担体、及び／又はターゲティングDNAとともに、導入される。細胞内に一旦入ると、メガヌクレアーゼと、存在するならばターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、細胞質から、核の作用部位へと、細胞により移入されるか又は輸送される。
【００６９】
メガヌクレアーゼ(ポリペプチド)は、リポソーム、ポリエチレンイミン(PEI)及び／又は膜輸送ペプチド(membrane translocating peptides) (Bonetta, The Scientist, 2002, 16, 38; Fordら, Gene Ther., 2001, 8, 1〜4 ; Wadia及びDowdy, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 52〜56)と会合しているのが有利であり得る。後者の場合、メガヌクレアーゼの配列は、膜輸送ペプチドの配列と融合される(融合タンパク質)。
ターゲティングDNA及び／又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターは、細胞に、種々の方法により導入できる(例えば、注入、直接摂取、発射衝撃、リポソーム、エレクトロポレーション)。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて、細胞内で安定的又は一過的に発現させ得る。真核細胞における発現の方法は、当該技術において公知である(Current Protocols in Human Genetics: 12章 「Vectors For Gene Therapy」及び13章「Delivery Systems for Gene Therapy」を参照)。所望により、組換えタンパク質中に、核局在化シグナルを組み込んで、核内でそれが発現されることを確実にすることが好ましい。
【００７０】
本発明の主題は、上記で定義される少なくとも１つのメガヌクレアーゼの、他のメガヌクレアーゼを作製するための足場としての使用でもある。例えば、さらなる回の突然変異誘導及び選択/スクリーニングを、新規なホーミングエンドヌクレアーゼを作製する目的で、単鎖メガヌクレアーゼに対して行うことができる。
【００７１】
本発明によるメガヌクレアーゼの使用、及び該メガヌクレアーゼを用いる方法は、上記で定義される、上記のメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物の使用も含む。
本発明の使用及び方法の別の有利な実施形態によると、上記のメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、上記のターゲティングDNA構築物と関連する。好ましくは、メガヌクレアーゼをコードする該ベクターは、上記で定義されるターゲティングDNA構築物を含む。
【００７２】
新規な切断特異性を有するI-CreI変異型を作製する方法は、以前に記載されている(Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178,及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458; Smithら, Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149 ; Arnouldら, J. Mol. Biol., Epub 10 May 2007; 国際PCT出願WO 2004/067736、WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/049095、WO 2007/057781、WO 2007/060495、WO 2007/049156、WO 2007/093836、WO 2007/093918、WO2008/010009、WO2008/010093、WO2008/059317、WO2008/059382、WO2008/093152、WO2008/093249、WO2008/02198、WO2008/02199、WO2008/02274、WO2008/149176、WO2008/152523、WO2008/152524及びWO2009/001159)。本発明の単鎖メガヌクレアーゼは、公知の組換えDNA及び遺伝子工学技術により、I-CreI又はその機能的変異型から導くことができる。例えば、Ｎ末端ドメインコード配列の3'終点又はＣ末端ドメインコード配列の5'終点のいずれかとインフレームでのリンカーコード配列を含む配列を、DNA鋳型から、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。PCRフラグメントを、次いで、適切な制限部位を用いることにより他方のドメインをコードする配列を含むベクターにクローニングする。本発明で規定される単鎖メガヌクレアーゼは、上記で規定されるポリペプチドを発現させることにより生成される。好ましくは、ポリペプチドは、１つの発現ベクターで改変された宿主細胞又はトランスジェニック動物／植物において、該ポリペプチドの発現に適切な条件下で発現され、単鎖メガヌクレアーゼ誘導体を、宿主細胞培養又はトランスジェニック動物／植物から回収する。
【００７３】
本発明の実行は、そうでないと記載しない限り、当該技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の通常の技術を用いる。このような技術は、文献に充分に説明されている。例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)：Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第3版(Sambrookら, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984)；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries及びS. J. Higgins編 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames及びS. J. Higgins編 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson及びM. Simon編, Academic Press, Inc., New York)のシリーズ、特に154巻及び155巻(Wuら編)及び185巻「Gene Expression Technology」(D. Goeddel編)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及びM. P. Calos編, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及びWalker編, Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology, I〜IV巻(D. M. Weir及びC. C. Blackwell編, 1986)；並びにManipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【００７４】
上記の特徴に加えて、本発明は、本発明の単鎖I-CreIメガヌクレアーゼ及び本発明によるその使用を説明する実施例並びに添付の図面に言及する以下の記載から明らかになるその他の特徴も含む。添付の図面において；
- 図１は、I-CreIのCαリボン図である。
- 図２は、ヒトXPC遺伝子(GenBankアクセッション番号NC_000003)の模式図である。XPCエキソンを箱で囲む。XPC4.1 (又はC1：配列番号26)配列(20438位)は、エキソン９内にある。
- 図３は、I-CreI又はいくつかのその派生変異型(それぞれ配列番号21、27〜29、26、30及び31)により切断される22 bp DNA標的を表す。C1221はI-CreI標的である。10GAG_P、10GTA_P及び5TCT_Pはパリンドローム標的であり、C1221とは箱で囲んだモチーフが異なる。C1はXPC標的である。C3及びC4はパリンドローム標的であり、それぞれC1の左及び右の部分から導かれる。図に示すように、10GAG_P、10GTA_P及び5TCT_Pからの箱で囲んだモチーフは、C1標的で見出される。
【００７５】
- 図４は、ヘテロ二量体コンビナトリアル変異体によるC1標的の切断を示す。この図は、C1標的を用いる、C3及びC4カッターの組み合わせの２次スクリーニングを示す。H33変異体は、７つのC3カッターのうちであり、X2は８つのC4カッターのうちであり、X2/H33ヘテロ二量体によるC1標的の切断は、黒い丸で囲む。
- 図５は、pCLS0542メガヌクレアーゼ発現ベクターマップを表す。pCLS0542は、LEU2栄養要求性遺伝子をマーカーとして有し、メガヌクレアーゼの発現を駆動する誘導性Gal10プロモーターを有する２ミクロンベースの複製可能ベクターである。
- 図６は、哺乳動物細胞におけるメガヌクレアーゼの発現のためのプラスミドであるpCLS1088のマップを表す。
- 図７は、pCLS1058レポーターベクターマップを表す。レポーターベクターは、ブラストサイジン及びアンピシリン耐性遺伝子をマーカーとして有する。LacZタンデム反復は、800 bpの相同性を共有し、1.3 kbのDNAで分けられている。これらは、EF1-アルファプロモーター及びターミネーター配列で囲まれている。標的部位を、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いてクローニングして、CmR及びccdB遺伝子を選択された標的部位で置き換える。
【００７６】
- 図８は、18個の単鎖構築物の、３つのXPC標的であるC1、C3及びC4に対する酵母スクリーニングを示す。それぞれの単鎖分子は、表Ｉに記載するその番号により参照する。それぞれの４ドット酵母クラスタについて、２つの左のドットは実験の結果であり、２つの右のドットは実験の質及び有効性を評価するための種々の内部対照である。
- 図９は、C1、C3及びC4 XPC標的の、２つのX2-L1-H33及びX2-RM2-H33単鎖構築物による、CHO細胞での染色体外アッセイにおける切断を示す。バックグラウンドは、空の発現ベクターでの細胞の形質移入に相当する。S1234 I-SceI標的の、I-SceIによる同じ実験における切断を、陽性対照として示す。
- 図10は、C1、C3及びC4 XPC標的の、X2/H33ヘテロ二量体並びに２つのX2-L1-H33G19S及びX2-RM2-H33G19S単鎖構築物による、CHO細胞での染色体外アッセイにおける切断を示す。バックグラウンドは、空の発現ベクターでの細胞の形質移入に相当する。S1234 I-SceI標的の、I-SceIによる同じ実験における切断を、陽性対照として示す。
【００７７】
- 図11は、３つのXPC単鎖分子であるX2-L1-H33、SCX1及びSCX2の、３つのXPC標的(C1、C3及びC4)に対する酵母スクリーニングを示す。SCX1はX2(K7E)-L1-H33(E8K,G19S)分子であり、SCX2はX2(E8K)-L1-H33(K7E,G19S)分子のことである。それぞれの４ドット酵母クラスタについて、２つの左のドットは実験の結果であり、２つの右のドットは実験の質及び有効性を評価するための種々の内部対照である。
- 図12は、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)のヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT) mRNA (GenBankアクセッション番号J00060.1)の模式図である。ORFを灰色の箱で示す。HprCH3標的部位は、その配列(配列番号34)及び位置で示す。
- 図13は、I-CreI又はいくつかのその派生変異型(それぞれ配列番号21、27及び32〜36)により切断される22 bp DNA標的を表す。C1221はI-CreI標的である。10GAG_P、10CAT_P及び5CTT_Pはパリンドローム標的であり、C1221とは箱で囲んだモチーフが異なる。HprCH3はHPRT標的であり、HprCH3.3及びHprCH3.4はパリンドローム標的であり、それぞれHprCH3の左及び右の部分から導かれる。図に示すように、10GAG_P、10CAT_P及び5CTT_Pは、HprCH3標的で見出される。
【００７８】
- 図14は、MA17及びH33ホモ二量体、HPRTヘテロ二量体、並びに３つのHPRT単鎖分子の、３つのHPRT標的であるHprCH3、HprCH3.3及びHprCH3.4に対する酵母スクリーニングを示す。Hは、MA17/H33ヘテロ二量体である。これはMA17とH33の同時発現により得られるので、酵母内には実際には３つの分子種：２つのMA17及びH33ホモ二量体と、MA17/H33ヘテロ二量体が存在する。ホモ二量体形成は、HprCH3.3及びHprCH3.4標的の切断を説明する。SC1〜SC3は、それぞれMA17-L1-H33、MA17-L1-H33G19S及びMA17-RM2-H33である。それぞれの４ドット酵母クラスタについて、２つの左のドットは実験の結果であり、２つの右のドットは実験の質及び有効性を評価するための種々の内部対照である。
- 図15は、HprCH3、HprCH3.3及びHprCH3.4 HPRT標的の、MA17/H33ヘテロ二量体及び４つのHPRT単鎖構築物(MA17-L1-H33、MA17-L1-H33G19S、MA17-RM2-H33及びMA17-RM2-H33G19S)による、CHO細胞での染色体外アッセイにおける切断を示す。バックグラウンドは、空の発現ベクターでの細胞の形質移入に相当する。S1234 I-SceI標的の、I-SceIによる同じ実験における切断を、陽性対照として示す。
【００７９】
- 図16は、ヒトRAG1遺伝子(GenBankアクセッション番号NC_000011)の模式図である。エキソン配列を箱で囲み、エキソン-イントロン結合部を示す。ORFは灰色の箱で示す。RAG1.10配列を、その配列(配列番号41)及び位置で示す。
- 図17は、I-CreI又はいくつかのその派生変異型(それぞれ配列番号21及び37〜43)により切断される22 bp DNA標的を表す。C1221はI-CreI標的である。10GTT_P、5CAG_P、10TGG_P及び5GAG_Pはパリンドローム標的であり、C1221とは箱で囲んだモチーフが異なる。RAG1.10はRAG1標的であり、RAG1.10.2及びRAG1.10.3はパリンドローム標的であり、それぞれRAG1.10の左及び右の部分から導かれる。図に示すように、10GTT_P、5CAG_P、10TGG_P及び5GAG_Pからの箱で囲んだモチーフは、RAG1.10標的で見出される。
- 図18は、４つのRAG1単鎖分子の、３つのRAG1標的であるRAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3に対する酵母スクリーニングを示す。SC1〜SC4は、それぞれM2-L1-M3、M2G19S-L1-H33、M2-RM2-H33及びM2G19S-RM2-M3を表す。M2及びM3 I-CreI変異体並びにM2/M3 ヘテロ二量体の、３つのRAG1標的に対する活性も示す。それぞれの４ドット酵母クラスタについて、２つの左のドットは実験の結果であり、２つの右のドットは実験の質及び有効性を評価するための種々の内部対照である。
【００８０】
- 図19は、２つの単鎖分子SC1及びSC2の、３つのRAG1.10標的に対する酵母スクリーニングを示す。SC1はM3-RM2-M2分子であり、SC2はM3(K7E K96E)-RM2-M2(E8K E61R)分子のことである。それぞれの４ドット酵母クラスタについて、２つの左のドットは実験の結果であり、２つの右のドットは実験の質及び有効性を評価するための種々の内部対照である。
- 図20は、６つのRAG1単鎖分子の、３つのRAG1標的であるRAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3に対する酵母スクリーニングを示す。M2/M3ヘテロ二量体の、３つのRAG1標的に対する活性も示す。それぞれの４ドット酵母クラスタについて、２つの左のドットは実験の結果であり、２つの右のドットは実験の質及び有効性を評価するための種々の内部対照である。
- 図21は、RAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3標的の、４つの単鎖構築物による、CHO細胞での染色体外アッセイにおける切断を示す。バックグラウンドは、空の発現ベクターでの細胞の形質移入に相当する。結果は、同じ３つの標的に対するM2/M3ヘテロ二量体の活性のパーセンテージで表す。
【００８１】
- 図22は：Ａ.CHO細胞における染色体アッセイの原理、Ｂ.M2/M3ヘテロ二量体、並びに２つの単鎖分子M3-RM2-M2G19S及びM3--RM2-M2+G19Sの遺伝子修正活性を示す。LacZ陽性細胞の頻度を、形質移入された発現プラスミドの量の関数で表す。
- 図23は、５つの単鎖分子の、３つのRAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3標的に対する活性を示す。それぞれの酵母クラスタにおいて、２つの左のドットは単鎖分子であり、２つの右のドットは実験内部対照である。
- 図24は、内因性RAG1遺伝子座にて用いた遺伝子ターゲティングストラテジーの図である。RAG1標的配列(RAG1.10：配列番号41)は、Rag1タンパク質をコードするエキソン２のすぐ上流にある。エキソン２を箱で囲み、オープンリーディングフレームを白で示す。メガヌクレアーゼによる天然RAG1遺伝子の切断により、相同組換えのための基質が生成し、これは相同腕で挟まれた1.7 kbの外因性DNAを含む修復マトリクスを修復マトリクスとして用い得る。
【００８２】
- 図25は、pCLS1969ベクターマップを表す。
- 図26は、遺伝子ターゲティング事象のPCR分析を示す。RAG1遺伝子座について野生型のクローンと、ドナー修復プラスミドのランダム挿入を有するクローンは、PCR増幅をもたらさない。RAG1遺伝子座にて遺伝子ターゲティング事象を有するクローンは、2588bpのPCR生成物をもたらす。
- 図27は、細胞クローンのサザンブロット分析を示す。ゲノムDNA調製物をHindIIIで消化し、サザンブロッティングを、右の相同腕の外側にあるRAG1遺伝子のフラグメントを用いて行った。遺伝子座地図は、野生型遺伝子座(5.3 kb)及び標的遺伝子座(3.4 kb)の制限パターンを示す。プローブは、塗りつぶした黒い箱で示す。単一形質移入細胞に由来する５つのクローン(1〜5)試料を、非形質移入細胞(293)からのDNAとともに分析する。３つの試料において、対立遺伝子の１つが標的にされている。H、HindIII部位。
【００８３】
- 図28は、ヘテロ二量体及び単鎖分子の生物物理学的分析を示す。Ａ；単鎖メガヌクレアーゼ及び対応するヘテロ二量体タンパク質の円偏光２色性スペクトル。Ｂ；全てのヘテロ二量体及び単鎖変異型の熱変性。Ｃ；分配計数(KAV) 対 分析用Superdex- 200 10-300GLカラムについての４つのタンパク質標準物質(塗りつぶしていない丸)の分子質量の対数の検量グラフ。単鎖メガヌクレアーゼの値は、塗りつぶした丸で示す(測定されたMW = 34 kDa、理論的MW = 41 kDa)
- 図29は、毒性研究を示す。Ａ.用量応答研究。CHO株化細胞に、種々のメガヌクレアーゼについての種々の量の発現ベクター及び固定された量の修復プラスミドを形質移入した。◆M2 / M3 ヘテロ二量体；■M2G19S / M3ヘテロ二量体；▲M2+ / M3-ヘテロ二量体；×M2+ G19S / M3-；＊M3-RM2-M2G19S；●M2+G19S-RM2-M3-；□I-SceI。Ｂ.細胞生存アッセイによりモニターされる工学的メガヌクレアーゼの毒性。種々の量のメガヌクレアーゼ発現ベクターと一定量のGFPをコードするプラスミドとを用いて、CHO-K1細胞を同時形質移入した。細胞の生存を、材料及び方法に記載するように、形質移入の６日後にGFPを発現する細胞のパーセンテージとして表す。完全に不活性なM2G19S/M3G19Sヘテロ二量体を、非毒性の対照として示す(◇)。Ｃ.DNA損傷も、DNA二本鎖破断でのγH2AX増殖巣(foci)の形成により視覚化した。メガヌクレアーゼの活性用量の10倍で処置した細胞の代表的な画像。
【実施例】
【００８４】
実施例１：ヒトXPC遺伝子を切断する単鎖I-CreI由来メガヌクレアーゼの作製。
色素性乾皮症(XP)は、紫外線(UV)への曝露に対する過敏症と皮膚癌を発生する高い素因とを特徴とする、希な常染色体劣性遺伝疾患である。色素性乾皮症に関与するヒトXPC遺伝子を、可能性のある標的配列についてスキャンした。C1と呼ばれる可能性のある22bpのDNA標的(cgagatgtcacacagaggtacg; 配列番号26)は、XPCの９番目のエキソンの終点に存在した(図2)。C1標的を切断できるI-CreI由来変異体を工学的に操作することは、以前に記載されている(Arnouldら, J. Mol. Biol., Epub 10 May 2007; 国際PCT出願WO 2007/093836及びWO 2007/093918)。簡単に、C1配列をC3及びC4と呼ばれる２つのパリンドローム半分標的に分けた(図３)。C3標的は±６位での単一の違い以外は10GAG_P標的と同一であるので、10GAG_P標的を切断できるI-CreI由来変異体をC3標的に対してスクリーニングした。I-CreI野生型配列と比較して単一の変異Y33H (33位のチロシンのヒスチジン残基による置換)を有する変異体H33を、強いC3カッターとして単離した。C4標的は、10GTA_P及び5TCT_P標的の組み合わせである。以前に記載されるようにして(Smithら, Nucleic Acids Research, 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781)、10GTA_Pを切断できるI-CreI変異体と、5TCT_P標的を切断できるI-CreI変異体とを組み合わせ、C4 DNA標的に対してスクリーニングした。X2と呼ばれるI-CreI変異体を、強いC4カッターとして単離した。X2変異体は、I-CreI野生型配列と比較して以下の変異を有する：Y33H、Q38A、S40Q、Q44K、R68Q、R70S及びD75N。最後のステップは、以前に記載されたような(国際PCT出願WO 2006/097854及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)、H33及びX2 I-CreI変異体の酵母同時発現からなり、これによりXPC C1 DNA標的の強い切断がもたらされた(図4)。
【００８５】
２つの変異体の同時発現により得られるX2/H33 XPCヘテロ二量体は、C1標的を切断するが、２つのホモ二量体の存在により、C3及びC4標的も切断する。これらの副作用を回避するために、２つのI-CreI由来変異体X2及びH33で構成される単鎖分子を設計するための新しい様式を考案した。この目的のために、全長X2 Ｎ末端変異体を単鎖設計に維持し、X2-L-H33 (ここで、Lはタンパク質リンカーである)の型のいくつかの構築物を工学的に作製した。この命名において、X2はＮ末端変異体、H33はＣ末端変異体である。別の重要な問題は、単鎖分子内の２つの変異体の配列同一性であった。実際に、２つのI-CreI変異体X2及びH33は、ほぼ同じ核酸配列を有し、このことは、２つのほぼ同一の配列間での組換え事象の危険性を有する、このような構築物の安定性の問題を提起する。この可能性を回避するか少なくとも低減するために、I-CreI CLSと呼ばれる別のI-CreIバージョンを用いて、H33変異体をコードした。I-CreI CLSの核酸配列(配列番号24)は、コドン使用及び遺伝子コード縮重を用いてI-CreI野生型配列(I-CreI wt；配列番号22)から書き換えた。このことは、I-CreI CLSが73%の核酸配列同一性をI-CreI wtと共有し、I-CreI活性を変更しない３つの単一アミノ酸変異(T42A、E110W及びQ111R)を有することを意味する。次いで、Y33HをI-CreI CLSバージョンに導入した(配列番号25)。H33 CLS変異体の活性をC3標的に対して確認し、I-CreI wtバージョンにおけるH33変異体についてと同様に強いことが示された。
【００８６】
H33 CLS変異体を用いて、X2-L-H33型(ここで、Lは18個のバージョンのそれぞれで異なるリンカーである)の18個の単鎖バージョンを構築した。G19S変異も、Ｃ末端H33変異体中に、２つの単鎖分子について導入した。C1 XPC標的並びにその２つの誘導体であるC3及びC4に対するこれらの異なる単鎖構築物の活性を、次いで、酵母、及びそれらのいくつかについて染色体外アッセイを用いてCHO細胞においてモニターした。
【００８７】
1) 材料及び方法
a) I-CreI CLS バージョンへのY33H変異の導入
２つのオーバーラップPCR反応を、２組のプライマーを用いて行った：第１フラグメントについてGal10F (5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3';配列番号44)及びH33Revp60 (5'-ctggtgtttgaacttgtgagattgatttggttt-3'; 配列番号45)、第２フラグメントについてH33Forp60 (5'-aaaccaaatcaatctcacaagttcaaacaccag-3'; 配列番号46)及びGal10R (5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'; 配列番号47)。およそ25 ngのそれぞれのPCRフラグメントと、NcoI及びEagIでの消化により直鎖状にした75 ngのベクターDNA pCLS0542 (図5)とを用いて酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) FYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz, R. D.及びWoods R. A., Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。Y33H変異を含むインタクトなコード配列を、酵母にてインビボ相同組換えにより作製する。
【００８８】
b) 変異体の配列決定
変異体発現プラスミドを回収するために、酵母DNAを標準的なプロトコルを用いて抽出し、大腸菌を形質転換するために用いた。変異ORFの配列決定を、次いで、プラスミドに対してMILLEGEN SAにより行った。
【００８９】
c) 18個のXPC単鎖分子のクローニング
18回の独立したPCR反応を、I-CreI CLSバージョンのH33変異体に対して行った。それぞれのPCR反応は、同じリバースプライマーCreCterR60 (5'-tagacgagctcctaaggagaggactttttcttctcag-3'; 配列番号48)及び特異的フォワードプライマーを用いる。用いた18個のフォワードプライマーは、以下のとおりである：
- L1EagI: 5'-tatcggccggtggcggaggatctggcggcggtggatccggtggtggaggctccggaggaggtggctctaacaaagagttcctgctgtatcttgctgga-3' (配列番号49)
- YPP: 5'-tatcggccggtaaatcttccgattccaagggtattgatctgactaatgttactctgcctgatacccctacttattccaaagctgcctctgatgctattcctccagctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号50)
- AOL: 5'-tatcggccggtctggagtatcaggctccttactcttcccctccaggtcctccttgttgctccggttcctctggctcctctgctggttgttctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号51)
-CXT:5'-tatcggccggtctgtcctatcattattctaatggtggctcccctacttctgatggtccagctctgggtggcatttctgatggtggcgctactaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号52),
- BQY: 5'-tatcggccggtgattcctctgtttctaattccgagcacattgctcctctgtctctgccttcctctcctccatctgttggttctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号53)
- VSG: 5'-tatcggccggtgcttctcagggttgtaaacctctggctctgcctgagctgcttactgaggattcttataatactgataacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号54 )
- BYM: 5'-tatcggccggtaatcctattcctggtctggatgagctgggtgttggcaactctgatgctgccgctcctggcactaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3' (配列番号55)
- MCJ: 5'-tatcggccggtgctcctactgagtgttctccttccgctctgacccagcctccatccgcttctggttccctgaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号56)
- GSmid: 5'-tatcggccggtggaggcggttctggaggcggtggctctggtggaggcggttccggtggaggcggatctggtggaggcggttctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号57)
- GSshort: 5'-tatcggccggtggaggcggttctggaggcggtggctctggtggaggcggttccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号58)
- GSxshort: 5'-tatcggccggtggaggcggttctggaggcggtggctctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3(配列番号59) 
- PPR: 5'-tatcggccggtcaggttacttctgctgccggtcctgctactgttccatctggtaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号
60)
-SBA1: 5'-tatcggccggtggatctcctctgaagccttctgccccaaagattcctataggtggctccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号61)
- SBA2: 5'-tatcggccggtggatctcctctgaagccttctgccccaaagattcctataggtggctccccactgaaaccttccgcacctaaaatcccaattggtggctctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号62)
- LP1: 5'-tatcggccggtggatctcctctgtctaaaccaattccaggcggttccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号63) 
- LP2: 5'-tatcggccggtggatctcctctgtctaaaccaattccaggcggttccccactgtcaaagccaatccctggcggttctaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号64)
- RM1: 5'-tatcggccggtggatctgataagtataatcaggctctgtctgagcgtcgcgcctacgttgtcgccaataacctggtttccggtggaggcggttccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号65) 
- RM2: 5'-tatcggccggtggatctgataagtataatcaggctctgtctaaatacaaccaagcactgtccaagtacaatcaggccctgtctggtggaggcggttccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'(配列番号66)。
【００９０】
全てのPCRフラグメントを精製し、EagI及びSacIにより消化し、それぞれのPCRフラグメントを、これもまたEagI及びSacIで消化したX2変異体についての酵母発現ベクターにライゲーションした。クローンの配列決定の後に、酵母発現ベクター中の全ての単鎖分子を得た。
【００９１】
d)２つの単鎖分子のＣ末端H33変異体X2-L1-H33及びX2-RM2-H33へのG19S変異の導入
２回のオーバーラップPCR反応を、２組のプライマーを用いて行った：第１フラグメントについてGal10F (5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3': 配列番号44)及びG19SRev (5'gcaatgatggagccatcagaatccacaaatccagc-3': 配列番号67)、第２フラグメントについてG19SFor60 (5'-gctggatttgtggattctgatggctccatcattgc-3': 配列番号68)及びGal10R (5'-acaaccttgattggagacttgacc-3': 配列番号47)。およそ25 ngのそれぞれのPCRフラグメントと、NcoI及びEagIでの消化により直鎖状にした75 ngのベクターDNA (pCLS0542；図5)とを用いて酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz, R. D.及びWoods R. A., Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。G19S変異を含むインタクトなコード配列を、酵母にてインビボ相同組換えにより作製する。
【００９２】
e) XPC X2-L1-H33単鎖分子へのK7E、E8K及びG19S変異の導入
まず、G19S変異をX2-L1-H33分子に導入した。２回のオーバーラップPCR反応を、pCLS0542酵母発現ベクターにクローニングした単鎖分子に対して行った。第１のPCR反応は、プライマー：Gal10F (5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3'; 配列番号44)及びG19SRev60 (5'-gcaatgatggagccatcagaatccacaaatccagc-3'; 配列番号67)を用い、第２のPCR反応は、プライマーG19SFor60 (5'-gctggatttgtggattctgatggctccatcattgc-3; 配列番号68)及びGal10R (5'-acaaccttgattggagacttgacc-3'; 配列番号47)を用いる。およそ25 ngのそれぞれのPCRフラグメントと、NcoI及びEagIでの消化により直鎖状にした75 ngのベクターDNA (pCLS0542；図5)とを用いて酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz, R. D.及びWoods R. A., Methods Enzymol., 2002, 350, 87〜96)を用いて形質転換した。G19S変異を含むインタクトなコード配列を、酵母にてインビボ相同組換えにより作製した。
【００９３】
第２ステップにおいて、K7E及びE8K変異を、X2-L2-H33(G19S)分子中に、３回のオーバーラップ変異を行うことにより導入した。SCX1分子について、３回のPCR反応はそれぞれ以下のとおりである３組のプライマーを用いる：Gal10FとK7ERev (5'-gtacagcaggaactcttcgttatatttggtattgg-3')、K7EFor (5'-aataccaaatataacgaagagttcctgctgtacc-3'; 配列番号69)とE8KRevSC (5'-aagatacagcaggaactttttgttagagccacc-3'; 配列番号70)、E8KForSc (5'-ggtggctctaacaaaaagttcctgctgtatctt-3'; 配列番号71)とGal10R。SCX2分子について、３回のPCR反応はそれぞれ以下のとおりである３組のプライマーを用いる：Gal10FとE8KRev (5'-caggtacagcaggaactttttgttatatttgg-3'; 配列番号72)、E8KFor (5'-accaaatataacaaaaagttcctgctgtacctgg-3'; 配列番号73)とK7ERevSC (5'-aagatacagcaggaactcttcgttagagccacc-3'; 配列番号74)、K7EForSc (5'-ggtggctctaacgaagagttcctgctgtatctt-3'; 配列番号75)とGal10R。両方の構築物について、およそ25 ngのそれぞれのPCRフラグメントと、NcoI及びEagIでの消化により直鎖状にした75 ngのベクターDNA (pCLS0542；図5)とを用いて酵母サッカロミセス・セレビシエFYC2-6A株(MATα, trp1Δ63, leu2Δ1, his3Δ200)を、高効率LiAc形質転換プロトコル(Gietz R D及びWoods R A Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 2002; 350:87-96) を用いて形質転換した。SCX1又はSCX2構築物についてのインタクトなコード配列を、酵母にてインビボ相同組換えにより作製した。
【００９４】
f)メガヌクレアーゼ発現クローンの交配及び酵母でのスクリーニング
スクリーニングは、以前に記載されたようにして行った(国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。交配は、コロニーグリッダー(QpixII, Genetix)を用いて行った。変異体を、YPDプレートを覆うナイロンフィルタ上に、低格子密度(gridding density) (約4スポット/cm2)を用いてグリッドした。２回目のグリッド手順を同じフィルタ上に行って、それぞれの標的について異なるレポーターを有する酵母株からなる第２層をスポットした。メンブレンを固形寒天YPDリッチ培地上に置き、30℃にて一晩インキュベートして交配を可能にした。次に、フィルタを、ロイシン及びトリプトファンを欠き、ガラクトース(2%)を炭素源として有する合成培地上に移し、37℃にて５日間インキュベートして、発現及び標的ベクターを有する二倍体を選択した。５日後にフィルタを、0.5Mリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.0中の0.02% X-Gal、0.1% SDS、6%ジメチルホルムアミド(DMF)、7 mM β-メルカプトエタノール、1%アガロースを含む固形アガロース培地上に置き、37℃にてインキュベートして、β-ガラクトシダーゼ活性をモニターした。結果をスキャンにより分析し、定量を、適切なソフトウェアを用いて行った。
【００９５】
g) 哺乳動物発現ベクターへのXPC単鎖構築物のクローニング
それぞれの変異体ORFを、PCRによりプライマーCCM2For (5'-aagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaccatggccaataccaaatataacaaagagttcc-3': 配列番号76)及びCCMRev60 (5'-ctgctctagactaaggagaggactttttcttctcag-3': 配列番号77)を用いて増幅した。PCRフラグメントを、制限酵素SacI及びXbaIにより消化し、次いで、これもまたSacI及びXbaIにより消化したベクターpCLS1088 (図6)にライゲーションした。得られたクローンを、配列決定により確認した(MILLEGEN)。
【００９６】
h) CHO細胞での染色体外アッセイのためのベクターへのC1、C3及びC4標的のクローニング
興味対象の標的を、次のようにしてクローニングした。ゲートウェイクローニング配列と接する標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを、PROLIGOに注文した。１本鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製した２本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコル(INVITROGEN)を用いてCHOレポーターベクター(pCLS1058、図7)にクローニングした。
【００９７】
i) CHO細胞における染色体外アッセイ
CHO細胞を、Polyfect形質移入試薬を供給業者(QIAGEN)のプロトコルに従って用いて形質移入した。形質移入の72時間後に、培養培地を回収し、150μlの溶解/明示(revelation)バッファーをβ-ガラクトシダーゼ液体アッセイのために加えた(1リットルのバッファーは、以下のものを含んでいた：100 mlの溶解バッファー(Tris-HCl 10 mM pH7.5、NaCl 150 mM、Triton X100 0.1%、BSA 0.1 mg/ml、プロテアーゼ阻害剤)、10 mlのMg 100×バッファー(MgCl2 100 mM、β-メルカプトエタノール35%)、110 ml ONPG 8 mg/ml及び780 mlのリン酸ナトリウム0.1M pH7.5)。37℃でのインキュベーションの後に、ODを420 nmにて測定した。プロセス全体を、自動化Velocity11 BioCelプラットフォームで行った。
【００９８】
2) 結果
a) ３つのXPC標的に対する18個のXPC単鎖メガヌクレアーゼの切断活性
表Ｉは、異なる単鎖分子の構築のために用いた異なるリンカーを示す。それぞれの単鎖分子について、リンカーはＮ末端X2変異体の最後の残基(P163)の後で始まり、リンカーの後でＮ末端H33変異体が残基N6にて始まる。
【００９９】
【表１】
2011514144.tif 000003
【０１００】
18個のXPC単鎖分子の切断活性を、３つのXPC標的C1、C3及びC4に対して、以前に記載された酵母スクリーニングアッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)を用いてモニターした。図８に示すように、全ての単鎖構築物はC1標的を切断し、C3標的も強く切断するが、C4標的に対する活性も検出可能である。２つの単鎖分子X2-L1-H33及びX2-RM2-H33を、哺乳動物発現ベクターにクローニングして、３つのXPC標的に対するそれらの活性を、CHO細胞において染色体外アッセイを用いて確認した(図９)。このアッセイにより、酵母切断プロファイルを確認した(図９)。さらに、X2-RM2-H33は、CHO細胞において、X2-L1-H33よりもC1標的に対してより活性である。C4切断は、CHO細胞においてかろうじて検出可能である。C3の切断はX2を用いて観察されず、同様に、H33はC4を切断しない(データ示さず)。よって、単鎖分子を用いてのC3標的の強い切断は、２つの別個の分子からのH33ユニットの二量体形成界面間の相互作用に起因する分子間種の形成をリンカーが消失させないことを示唆する。偽H33ホモ二量体の形成が、次いで、C3切断の原因であろう。
【０１０１】
b) XPC単鎖メガヌクレアーゼの切断の特異性に対するG19S変異単独の影響
この仮説を試験するために、G19S変異を、２つの単鎖分子のH33 Ｃ末端変異体に導入した。G19S変異(pdb 1G9Y番号付けに従う、I-CreIからの残基19の変異)は、機能的ホモ二量体の形成を消失させる一方で、G19S単量体を示すヘテロ二量体の活性を増進させることが以前に示されている(国際PCT出願WO 2008/010093)。得られた２つの単鎖分子(X2-L1-H33G19S及びX2-RM2-H33G19S)の、３つのXPC標的に対するプロファイルを、次いで、CHO細胞における染色体外アッセイを用いて決定した。図10は、G19S変異がC1標的に対する活性を増加させるだけでなく、C3標的に対する活性も大きく低減させることを示す。３つのXPC標的に対するX2/H33ヘテロ二量体のプロファイル切断も、比較のために図10に示す。
【０１０２】
これらの結果により、２つのH33ユニットの相互作用に起因する分子間種の形成の仮説が確認される。同様に、２つのX2ユニット間の相互作用は、C4標的の弱い切断をおそらく説明する(図８及び９)。よって、X2単量体とH33単量体との間のリンカーの導入は分子内相互作用に好ましいかもしれないが(例えばC4の切断の低減をもたらす)、これは分子間相互作用を消失させない。
にもかかわらず、工学的なXPC単鎖分子X2-RM2-H33G19Sは、C1 XPC標的を、X2/H33ヘテロ二量体よりも強く切断し、２つのパリンドロームC3及びC4標的に対する切断活性が、同じヘテロ二量体よりも大きく低減されている。単鎖分子X2-RM2-H33G19Sは、X2/H33ヘテロ二量体よりもかなりよい特異性を示し、DNA二本鎖破断により誘導される相同組換えの分野の最高の基準であるI-SceIのものに匹敵する活性レベルを有する。
【０１０３】
c) G19S変異と、機能的ホモ二量体の形成を損なう別の変異との組み合わせの、XPC単鎖メガヌクレアーゼの切断の特異性に対する影響
図11は、３つの単鎖分子X2-L1-H33、SCX1及びSCX2の、３つのXPC標的に対する酵母スクリーニングアッセイにおける活性を示す。元の単鎖分子は、C1及びC3標的に対して強い切断活性を有するが、K7E/E8K及びG19S変異を導入してSCX1及びSCX2分子を作製することにより、C1標的に対する切断活性の増加と、C3標的に対する切断活性の完全な消失とが促進される。よって、変異K7E/E8K及びG19Sは、単鎖分子にうまく導入されて、興味対象のDNA標的に対するその切断活性に影響することなく、その特異性を改善できる。
【０１０４】
実施例２：チャイニーズハムスターHPRT遺伝子を切断する単鎖I-CreI由来メガヌクレアーゼの作製
チャイニーズハムスターからのヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)遺伝子を、可能性のある標的部位についてスキャンした。HprCH3と呼ばれる22bpの配列(cgagatgtcatgaaagagatgg: 配列番号34)を、遺伝子ORFにおいて同定した(図12)。２つの派生パリンドローム標的HprCH3.3及びHprCH3.4は、HprCH3標的から導かれた(図13)。HprCH3.3標的は、実施例１に記載されたC3標的と同一であるので、H33 I-CreI変異体は、HprCH3.3 (C3)を強く切断できる。HprCH3.4標的は、10CAT_P標的と5CTT_P標的との組み合わせである。10CAT_P標的を切断できるI-CreI変異体を、Smithら, Nucleic Acids Research, 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/049156及びWO 2007/060495に以前に記載されたようにして得て、5CTT_P標的を切断できるI-CreI変異体を、Arnouldら, J Mol. Biol., 2006; 355, 443〜458; 国際PCT出願WO 2006/097784及びWO 2006/097853に以前に記載されたようにして得た。変異体は、Smithら, Nucleic Acids Research, 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/049095及びWO 2007/057781に以前に記載されたようにして組み合わせ、HprCH3.4 DNA標的に対してスクリーニングした。MA17と呼ばれるI-CreI変異体が、HprCH3.4カッターとして単離された。しかし、これは、弛緩された特異性のために、HprCH3.3標的も切断することが見出された(図14を参照)。MA17変異体は、I-CreI野生型配列と比較して、以下の変異を有する：S32T、Y33H、Q44R、R68Y、R70S、S72T、D75N及びI77N。最後のステップは、以前に記載されたような(国際PCT出願WO 2006/097854及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)、H33及びMA17 I-CreI変異体の酵母同時発現からなり、これにより、HprCH3 DNA標的が切断された。
【０１０５】
２つのHPRT単鎖構築物は、実施例１と同じスキームに従って工学的に操作された。２つのL1及びRM2リンカー(実施例１の表Ｉを参照)を用いて、MA17-L1-H33及びMA17-RM2-H33単鎖分子の生成がもたらされた。第２ステップにおいて、G19S変異をＣ末端H33変異体に導入して、２つの他の単鎖メガヌクレアーゼであるMA17-L1-H33G19S及びMA17-RM2-H33G19Sを得た。これらの異なる構築物の活性を、次いで、酵母及びCHO細胞において、HprCH3標的及びその２つの誘導体であるHprCH3.3及びHprCH3.4標的に対してモニターした。
【０１０６】
1) 材料及び方法
実施例１を参照されたい。
【０１０７】
2) 結果
３つのHPRT標的HprCH3、HprCH3.3及びHprCH3.4に対する３つの単鎖分子(MA17-L1-H33、MA17-L1-H33G19S及びMA17-RM2-H33)の活性を、以前に記載された酵母アッセイを用いてモニターした(国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)。図14に示すように、MA17-L1-H33はHprCH3標的を切断せず、これはその他の２つの単鎖分子により切断される。よって、RM2リンカーは、実施例１ですでに観察されたように、我々が単鎖構築物を工学的に操作した様式によりよく順応したようである。これらの結果により、G19S変異の存在がヘテロ二量体活性を増進させることも確認される。全ての３つの単鎖分子は、HprCH3.3 (実施例１からのC3標的と同一)を非常に強く切断するが、MA17/H33ヘテロ二量体とは対照的に、HprCH3.4を切断しない。この場合、HprCH3.3 (C3)の切断は、分子間種の形成を原因として、必須ではない。MA17及びH33変異体がともにHprCH3.3標的をホモ二量体として切断するので、MA17/H33ヘテロ二量体又はMA17-RM2-H33単鎖単量体は、原則的に、HprCH3.3を切断できた。この仮説は、MA17-L1-H33G19S及びMA17-RM2-H33G19SによるHprCH3.3の堅固な切断により確認される。次いで、４つの単鎖分子(MA17-L1-H33、MA17-L1-H33G19S、MA17-RM2-H33及びMA17-RM2-H33G19S)を、３つのHPRT標的の切断について用いる、CHO細胞において試験された哺乳動物発現ベクターにクローニングした(図15)。MA17-RM2-H33G19S単鎖分子は、強い活性を示した。ここでもまた、HprCH3.3 (C3)の強い切断が観察されたが、HprCH3.4の切断は低いか又はなかった。
【０１０８】
実施例３：ヒトRAG1遺伝子を切断する単鎖I-CreI由来メガヌクレアーゼの作製
RAG1は、免疫グロブリン及びＴリンパ球受容体(TCR)の成熟における必須ステップであるV(D)J組換えプロセスに関与する遺伝子である。RAG1遺伝子における変異は、リンパ球Ｂにおける機能的欠陥と常に関連するリンパ球Ｔ成熟における欠陥をもたらし、これは、重症複合免疫不全(SCID)を導く。ヒトRAG1のイントロンと第２エキソンとの間の結合部にあるRAG1.10と呼ばれる22 bpのDNA配列(配列番号41；図16)が、我々のメガヌクレアーゼによる可能性のある切断可能配列として同定されている(Smithら, Nucleic Acids Research, 2006, 34, e149 国際PCT出願WO 2008/010093)。RAG1.10配列から、２つのパリンドロームRAG1.10.2及びRAG1.10.3配列を導いた(図17)。RAG1.10.2標的は、10GTT_P及び5CAG_P標的の組み合わせであり、RAG1.10.3標的は、10TGG_P及び5GAG_P標的の組み合わせである。RAG1.10.2及びRAG1.10.3標的の両方についての強いカッターが、一方で10GTT_P及び5CAG_P標的、他方で10TGG_P及び5GAG_P標的を切断できるI-CreI変異体を、Smithら, Nucleic Acids Research, 2006, 34, e149; 国際PCT出願WO 2007/049095、WO 2007/057781、WO 2007/049156、WO 2007/060495、WO 2006/097784及びWO 2006/097853; Arnouldら, J Mol. Biol., 2006; 355, 443〜458に以前に記載されたようにして組み合わせることにより得られた。以前に記載されたようなカッターの同時発現(国際PCT出願WO 2006/097854及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)は、次いで、RAG1.10標的の強い切断を導く。M2/M3 RAG1.10ヘテロ二量体は、酵母において最も強く切断する(国際PCT出願WO 2008/010093)。M2はRAG1.10.2カッターであり、I-CreI野生型配列と比較して以下の変異を有する：N30R、Y33N、Q44A、R68Y、R70S及びI77R。M3はRAG1.10.3カッターであり、I-CreI野生型配列と比較して以下の変異を有する：K28N、Y33S、Q38R、S40R、Q44Y、R70S、D75Q及びI77V。
【０１０９】
実施例１及び２と同じ実験スキームに従って、３つの単鎖構築物を、２つのリンカーL1及びRM2 (実施例１の表Ｉを参照)を用いて工学的に操作し、３つの単鎖分子：M2-L1-M3、M2-RM2-M3及びM3-RM2-M2を生成した。第２ステップにおいて、G19S変異を、M2-L1-M3及びM2-RM2-M3単鎖分子からのＮ末端M2変異体に導入して、２つのさらなる構築物を得た。さらに、変異K7E、K96EをM3-RM2-M2のM3変異体に、E8K、E61RをM3-RM2-M2のM2変異体に導入して、単鎖分子：M3(K7E K96E)-RM2-M2(E8K E61R)を創出したが、これをさらにSC_OHと称する。６つの単鎖構築物を、次いで、酵母においてRAG1.10標的並びにその２つのRAG1.10.2及びRAG1.10.3誘導体の切断について試験した。
【０１１０】
1) 材料及び方法
元に戻したI-CreI CLSの変異(T42A、E110W及びQ111R)以外については実施例１を参照されたい。
【０１１１】
SC_OH単鎖分子のクローニング
PCR反応を、pCLS0542酵母発現ベクターにクローニングされた、K7E及びK96E変異を有するM2変異体に対して行った。PCR反応は、リバースプライマーCreCterSacI (5'-tagacgagctcctacggggaggatttcttcttctcgct-3'; 配列番号78)とフォワードプライマーRM2 (5'-tatcggccggtggatctgataagtataatcaggctctgtctaaatacaaccaagcactgtccaagtacaatcaggccctgtctggtggaggcggttccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt-3'; 配列番号66)とを用いる。
PCRフラグメントを精製し、EagI及びSacIにより消化し、これもまたEagI及びSacIで消化された変異E8K及びE61Rを有するM3変異体のための酵母発現ベクターにライゲーションした。クローンの配列決定の後に、SC_OH単鎖分子を得た。
【０１１２】
2) 結果
４つのRAG1単鎖分子(M2-L1-M3、M2G19S-L1-M3、M2-RM2-M3及びM2G19S-RM2-M3)の活性を、３つのRAG1標的RAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3(図18)に対して、以前に記載された酵母アッセイ(国際PCT出願WO 2004/067736; Epinatら, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952〜2962; Chamesら, Nucleic Acids Res., 2005, 33, e178及びArnouldら, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443〜458)を用いてモニターした。実施例１及び２で観察されたように、RM2リンカーは、単鎖構築物が工学的に操作された様式によりよく順応されたようである。RAG1.10標的の切断は、M2-RM2-M3分子を用いて観察されたが、M2-L1-M3では観察されなかった。さらに、M2-RM2-M3は、RAG1.10.2も切断することが見出された。M3はRAG1.10.2 (図18)を切断しないので、これらの結果は、分子間相互作用が、パリンドロームRAG1.10.2標的の切断を担うホモ二量体又は偽ホモ二量体の種を形成するであろう２つのM2ユニット同士の接触をまだもたらし得ることを示唆する。
【０１１３】
M2変異体へのG19S変異の導入は、両方の分子の活性を改善した。なぜなら、M2G19S-L1-M3がRAG1.10標的を切断し、M2G19S-RM2-M3がM2-L1-M3よりも活性であるからである。さらに、機能的ホモ二量体の形成を損なうと以前に示されたG19S変異が(本願の 実施例１及び国際PCT出願WO 2008/010093を参照)、RAG1.10.2切断を消失させる。この結果は、別個のM2-RM2-M3単鎖分子からのM2ユニット同士の相互作用が、まだ可能であるという仮説と一貫している。しかし、M3とは対照的に、M2-RM2-M3分子はRAG1.10.3を切断しないので、単鎖構造は、ある程度は分子内相互作用に好ましいであろう。結論として、M2G19S-RM2-M3 RAG1単鎖分子は、RAG1.10標的を、M2/M3ヘテロ二量体を用いて観察されたものに匹敵して酵母において飽和レベルで切断し、２つの派生パリンドローム標的RAG1.10.2及びRAG1.10.3のいずれの切断も示さない。
【０１１４】
図19に示す、２つの単鎖分子M3-RM2-M2及びSC_OHの、３つのRAG1.10標的に対する酵母スクリーニングは、K7E/E8K及びE61R/K96Eの導入が、RAG1.10.2標的に対するホモ二量体活性を、RAG1.10標的についての単鎖分子切断活性を低減させることなく消失させ得ることを示す。よって、これらの変異を単鎖分子に導入して、興味対象のDNA標的に対するその活性に影響することなく、その特異性を改善することが可能である。
【０１１５】
実施例４：単鎖分子を構成する２つの変異体について異なる位置と、G19S変異の異なる配置を有するRAG1単鎖分子の作製
それぞれの変異体とG19S変異との配置が単鎖分子活性に与える影響を評価するために、６つの構築物(M2-RM2-M3、M2G19S-RM2-M3、M2-RM2-M3G19S、M3-RM2-M2、M3G19S-RM2-M2、M3-RM2-M2G19S)を、３つのRAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3標的に対する活性について、我々の酵母スクリーニングアッセイを用いて試験した。
【０１１６】
1) 材料及び方法
実施例１を参照されたい。
【０１１７】
2) 結果
図20に示すように、全ての６つの単鎖分子(M2-RM2-M3、M2G19S-RM2-M3、M2-RM2-M3G19S、M3-RM2-M2、M3G19S-RM2-M2、M3-RM2-M2G19S)は、RAG1.10標的に対して高度に活性であり、活性は同じ標的に対する元のM2/M3ヘテロ二量体と同等である。単鎖中の単量体M2又はM3の相対的な位置(Ｎ末端又はＣ末端)は、分子の全体的な活性に影響しない。例えば、M2-RM2-M3タンパク質は、M3-RM2-M2分子と同じ切断パターンを示し、RAG1.10及びRAG1.10.2標的を同じ強度で切断するが、RAG1.10.3標的(RR標的)を切断しない。
いくつかの構築物について、RAG1.10.2パリンドローム標的が切断可能であり、このことは、分子間相互作用が生じることができ、活性なヌクレアーゼを創出できることを示唆する。しかし、この残存活性は、G19S変異の導入により消失する。図20における分子２及び３(M2G19S-RM2-M3及びM2-RM2-M3G19S)の活性プロファイルの比較は、G19S変異の配置がRAG1.10標的に対する活性に影響しないが、この活性を担う変異体(ここでは変異体M2)がG19S変異を有する場合に、残存ホモ二量体活性が消失することを示す。
【０１１８】
実施例５：CHO細胞における染色体外アッセイにより示される、単鎖分子におけるG19S変異の重要性
RAG1.10切断活性の点で、上記の６つの単鎖分子、及び実施例３に示したSC_OH単鎖分子は、酵母スクリーニングアッセイにおいて同等であるようである。しかし、これらは全て飽和レベルにてこの標的を切断する。よって、G19S変異を有するか又は有さない２つの単鎖分子の、３つの標的RAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3標的に対する活性を、CHO細胞において、実施例１に記載した染色体外SSAアッセイを用いて評価した。このアッセイのために選択した４つの単鎖分子は、M3-RM2-M2、M3-RM2-M2G19S、M3--RM2-M2+及びM3--RM2-M2+G19Sであった。M3-は、K7E及びK96E変異を有するM3変異体のことであり、M2+は、E8K及びE61R変異を有するM2変異体を表す。
【０１１９】
1) 材料及び方法
M3--RM2-M2+及びM3--RM2-M2+G19S分子の、哺乳動物発現ベクターへのクローニング
方法論は、実施例１に記載したものと全く同じであるが、CCM2Forプライマーを、CCM2ForE8Kプライマー(5'-AAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGACCATGGCCAATACCAAATATAACAAAAAGTTCC-3': 配列番号93)に置き換えた。
【０１２０】
2) 結果
図21は、４つの単鎖分子M3-RM2-M2、M3-RM2-M2G19S、M3--RM2-M2+及びM3--RM2-M2+G19Sについての、３つのRAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3に対するCHO細胞における染色体外SSA活性を示す。３つの標的に対する活性を、同じ３つの標的に対する元のM2/M3ヘテロ二量体の活性のパーセンテージとして表す。４つの単鎖タンパク質は、バックグラウンドレベルと同等のホモ二量体活性を有する(RAG1.10.2及びRAG1.10.3標的に対して)。図21も、G19S変異が単鎖分子活性に必須であることを示す。なぜなら、G19S変異を有する２つの単鎖タンパク質だけが、M2/M3ヘテロ二量体活性と同等又はそれより大きいRAG1.10標的切断活性を示すからである。
【０１２１】
実施例６：RAG1単鎖分子は、CHO-K1細胞において高レベルの遺伝子ターゲティングを誘導する。
２つの単鎖分子M3-RM2-M2G19S (配列番号94のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号95)及びM3--RM2-M2+G19S (配列番号96のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号97)の切断活性をさらに評価するために、CHO細胞における染色体レポーター系を用いた(図22)。この系において、CMVプロモーターにより駆動される単コピーLacZ遺伝子にはRAG1.10配列が介在し、よって非機能的である。株化細胞へのRAG1単鎖メガヌクレアーゼをコードするプラスミド及びLacZ修復プラスミドの形質移入により、相同組換えによる機能的LacZ遺伝子の回復が可能になる。二本鎖破断が相同組換えを誘導できることは以前に示されている。よって、LacZ遺伝子が修復される頻度は、ゲノムRAG1.10標的部位の切断効率の指標である。
【０１２２】
1) 材料及び方法
CHO-K1細胞での染色体アッセイ
レポーター系を有するCHO-K1株化細胞を、10 cmのウェルあたり2×105細胞の密度で、完全培地(2 mM L-グルタミン、ペニシリン(100 UI/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、アンホテリシンＢ(フォンギゾン) (0.25μg/ml) (INVITROGEN-LIFE SCIENCE)及び10% FBS (SIGMA-ALDRICH CHIMIE)を補ったKaighnの改変F-12培地(F12-K))中に播種した。次の日に、細胞にPolyfect形質移入試薬(QIAGEN)を用いて形質移入した。簡単に、２μgのlacz修復マトリクスベクターを、種々の量のメガヌクレアーゼ発現ベクターとともに同時形質移入した。37℃にて72時間のインキュベーションの後に、細胞を0.5%グルタルアルデヒド中で４℃にて10分間固定し、0.02% NP40を含む100 mMリン酸バッファーで２回洗浄し、以下の染色バッファーで染色した(10 mMリン酸バッファー、1 mM MgCl2、33 mMヘキサシアノ鉄(III)酸Ｋ、33 mMヘキサシアノ鉄(II)酸Ｋ，0.1% (v/v) X-Gal)。37℃にて一晩のインキュベーションの後に、プレートを光学顕微鏡下で観察して、LacZ陽性細胞クローンの数を計数した。LacZ修復の頻度を、形質移入細胞の数(5×105)で除し、形質移入効率で補正したLacZ+増殖巣の数として表す。
【０１２３】
2) 結果
図22は、２つの単鎖分子M3-RM2-M2G19S及びM3--RM2-M2+G19Sが、CHO細胞において高レベルの遺伝子ターゲティングを誘導できることを示す。これらは、遺伝子修正頻度を、元のM2/M3ヘテロ二量体と比較して3.5倍の係数で増加させさえする。
【０１２４】
実施例７：両方のサブユニットについて異なるＮ末端及びＣ末端終点を有するRAG1単鎖分子の作製
M2-RM2-M3 RAG1単鎖分子を用いて、両方のサブユニットについて異なるＮ末端及びＣ末端終点を有する新しい単鎖構築物を工学的に操作した。これらの新しい構築物は、２つのI-CreI由来変異体を連結するリンカーの最良の可能な位置を正確に指摘することを可能にした。I-CreIのＮ末端は、６残基ループと、その後の残基K7で開始するLAGLIDADGα-ヘリックスとからなる。I-CreI構造(PDBコード1G9Y)において、最後の10個のＣ末端残基は、おそらく混乱しているために、見ることができない。この構造において、Ｃ末端は残基D153で終結し、ヘリックスα6が残基145〜150を覆う。よって、M2又はM3変異体のＮ末端が残基M1、N2又はN6で始まり、Ｃ末端が異なる位置、それぞれS145、L152、S156及びK160で終結するいくつかの単鎖構築物を作製した。これらの異なるRAG1単鎖構築物の活性を、以前に記載された酵母スクリーニングアッセイを用いてモニターした(実施例１を参照)。
【０１２５】
1) 材料及び方法
a) 酵母発現ベクターへのM2変異体の切り詰めバージョンのクローニング
RAG1 M2-RM2-M3単鎖のクローニングは、まず、酵母発現ベクター(pCLS0542)にクローニングされたM2変異体を得ることを必要とする(実施例３の材料及び方法を参照)。M2変異体の切り詰めバージョンをクローニングするために、いくつかのPCR反応を、異なるプライマー対を用いて行った：CreNter6 / CreCter、CreNter / CreCter160、CreNter / CreCter156、CreNter / CreCter152、CreNter / CreCter145。異なるプライマーの配列は、以下の表IIに列挙する。異なるPCRフラグメントを、次いで、制限酵素NcoI及びEagIで消化し、これもまたNcoI及びEagIで消化されたpCLS0542ベクターにライゲーションした。次いで、クローンを配列決定した。M2変異体の切り詰めバージョンはそれぞれ：M2 (6-163)、M2(1-160)、M2(1-156)、M2(1-152)及びM2(1-145) (番号はM2変異体コード配列に含まれるI-CreI残基を示す)である。
【０１２６】
b) 両方のサブユニットについて異なる終点を有するRAG1単鎖分子のクローニング
異なるPCR反応を、I-CreI CLSバージョンのM3変異体に対して行った。それぞれのPCR反応は、１つのフォワードプライマーと、１つのリバースプライマーとを用いる。２つの可能なフォワードプライマー(RM2及びRM2N2)と、５つの可能なリバースプライマー(CreCterR60、Cre160R60、Cre156R60、Cre152R60及びCre145R60)とがある。フォワードプライマーは、残基N6又はN2で開始するM3コード配列を得ることを可能にし、リバースプライマーは、それぞれ残基P163、K160、S156、L152及びS145で終結するM3コード配列を得ることを可能にする。異なるPCRフラグメントを精製し、EagI及びSacIにより消化し、それぞれのPCRフラグメントを、これもまたEagI及びSacIで消化した上記のM2変異体の１つについての酵母発現ベクターにライゲーションした。クローンを配列決定した後に、酵母発現ベクター中の全ての可能な単鎖分子を得た。
【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
2) 結果
RAG1 M2-RM2-M3単鎖分子から始まって、Ｎ末端M2変異体がそのＣ末端にて切り詰められた４つの新しい単鎖分子を構築した。これらのタンパク質は、SCtr1、SCtr2、SCtr3及びSCtr4と呼ばれ、M2変異体配列がそれぞれ残基145、152、156及び160で終結する単鎖分子に相当する。これらの４つの分子、及び元のM2-RM2-M3単鎖を、３つのRAG1.10、RAG1.10.2及びRAG1.10.3標的に対する切断について、我々の酵母スクリーニングアッセイを用いて試験した。図23は、SCtr1が３つの標的に対して不活性であり、３つのその他の切り詰めバージョンの単鎖がRAG1.10標的と、わずかにRAG1.10.2標的とを切断することを示す。この結果は、ヘリックスα6を形成するM2変異体の残基145〜152が、単鎖活性に必要であることを示唆する。
【０１２９】
実施例８：ヒト細胞での内因性Rag1遺伝子座での遺伝子ターゲティング
工学的単鎖Rag1メガヌクレアーゼの切断活性をさらに検証するために、内因性ヒトRAG1遺伝子座にて相同組換えを刺激するそれらの能力について評価した(図24)。細胞に、２つの単鎖分子M3-RM2-M2G19S (配列番号95)及びM3--RM2-M2+G19S (配列番号97)のうちの１つについての哺乳動物発現プラスミドと、ヒトRAG1遺伝子座に相同な2 kb及び1.2 kbの長さの２つの配列で挟まれた1.7 kbの外因性DNA配列を含むドナー修復プラスミドpCLS1969 (図25)とを形質移入した。メガヌクレアーゼによる天然RAG1遺伝子の切断は、相同組換えをのための基質を生じ、これが、相同腕で挟まれた1.7 kbの外因性DNAを含むドナー修復プラスミドを修復マトリクスとして用い得る。よって、RAG1遺伝子座にて標的にされた組み込みが生じる頻度は、ゲノムRAG1.10標的部位の切断効率を示す。
【０１３０】
1) 材料及び方法
a) メガヌクレアーゼ発現プラスミド
この実施例で用いたRag1メガヌクレアーゼは、哺乳動物発現ベクターpCLS1088 (図6)にクローニングされたM3-RM2-M2G19S (配列番号95)及びM3--RM2-M2+G19S (配列番号97)である。
【０１３１】
b) ドナー修復プラスミド
遺伝子ターゲティング実験のためのドナープラスミドは、RAG1遺伝子座のPCRにより作製された2075 bpのフラグメント(第11染色体上の36549341位〜36551416位、NC_000011.8)を左の相同腕として、かつRAG1遺伝子座の1174 bpフラグメント(第11染色体上の36551436位〜36552610位、NC_000011.8)を右の相同腕として含む。SV40プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子及びIRES配列を含む外因性1.8 kb DNAフラグメントを、２つの相同腕の間に、RAG1遺伝子座のPCR増幅中に導入されたEcoRI及びBamHI部位を用いて挿入した。得られたプラスミドはpCLS1969 (図25)である。
【０１３２】
c) Rag1遺伝子ターゲティング実験
ヒト胚性腎臓293H細胞(Invitrogen)を、10 cmディッシュあたり１×106細胞の密度で、完全培地(2 mM L-グルタミン、ペニシリン(100 UI/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、アンホテリシンＢ(フォンギゾン) (0.25μg/ml) (Invitrogen-Life Science)及び10% FBSを補ったDMEM)中に播種した。次の日に、細胞にLipofectamine 2000形質移入試薬(Invitrogen)を供給業者のプロトコルに従って用いて形質移入した。簡単に、２μgのドナープラスミドを、３μgの単鎖メガヌクレアーゼ発現ベクターとともに同時形質移入した。37℃にて72時間のインキュベーションの後に、細胞をトリプシン処理し、96ウェルプレート中のウェルあたり10細胞又は10 cmプレートあたり200細胞にて完全培地中に播種した。個別のクローンをその後、10cmプレートからClonePixロボット(Genetix)を用いて採取した。ゲノムDNA抽出を、ZR-96ゲノムDNAキット(Zymo research)を供給業者のプロトコルに従って用いて行った。
【０１３３】
d) 遺伝子ターゲティング事象のPCR分析
遺伝子ターゲティングの頻度を、PCRにより、ゲノムDNAに対して、2588bpの遺伝子ターゲティング特異的PCR生成物(図26)をもたらすプライマーF2-neo:5'-AGGATCTCCTGTCATCTCAC-3' (配列番号98)及びRagEx2-R12: 5'-CTTTCACAGTCCTGTACATCTTGT-3' (配列番号99)を用いて決定した。F2プライマーは、ネオマイシンコード配列中にあるフォワードプライマーである。R12プライマーは、ドナー修復プラスミドの右の相同腕の外側のヒトRAG1遺伝子内にあるリバースプライマーである。
【０１３４】
e) サザンブロット分析
サザンブロット分析は、HindIIIで消化したゲノムDNAを用いて行い、ドナー修復プラスミドの右の相同腕の3'である830 bp RAG1特異的プローブとハイブリッド形成させた。
【０１３５】
2) 結果
ヒト胚性腎臓293H細胞に、２つのベクター：２つの単鎖Rag1メガヌクレアーゼのうちの１つを発現するプラスミドとドナー修復プラスミドpCLS1969 (図25)とを同時形質移入した。自発的組換えについての対照として、293H細胞に、ドナー修復プラスミドのみを形質移入した。次いで、細胞を96ウェルマイクロプレートのウェルあたり10細胞にて播種するか、又は10 cmディッシュに播種し、個別のクローンを、その後、採取した。これらの細胞に由来するゲノムDNAを、遺伝子ターゲティングについてPCRにより、材料及び方法に記載されたようにして分析した。結果を表IIIに示す。メガヌクレアーゼの非存在下(修復プラスミドのみ)では、10細胞のプールで分析した2,560個の細胞、又は調べた94個の個別のクローンのうちで、PCR陽性シグナルは検出されなかった。対照的に、M3-RM2-M2G19Sメガヌクレアーゼの存在下では、10細胞のプールで分析した2,560個の細胞のうち11個の陽性が検出され、このことは、0.4%の組換え頻度を示す。調べた94個の個別のクローンのうち、陽性はなかった。M3--RM2-M2+G19Sの存在下では、34個の陽性クローン(1.4%)が、分析した2560個の細胞(10のプールにおいて)のうちで検出され、分析した94個の個別のクローンのうち、４個が陽性であった(4.3%)。これらの４個の個別のクローンのサザンブロット分析により、３つが、Rag1遺伝子座での遺伝子ターゲティング事象と矛盾しないことが示される(図27)。これらの結果は、２つの単鎖分子M3-RM2-M2G19S及びM3--RM2-M2+G19Sが、内因性Rag1遺伝子座にて高レベルの遺伝子ターゲティングを誘導できることを示す。
【０１３６】
【表３】
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【０１３７】
実施例９： I-CreI由来単鎖メガヌクレアーゼは安定である
1) 材料及び方法
a) タンパク質の発現及び精製
ヘテロ二量体I-CreI誘導体を同時発現させるために、それぞれの単量体ORFを、６×Hisタグ又はStrepタグをＣ末端に有するCDFDuet-1ベクター(NOVAGEN)にクローニングし、二重タグ付加されたヘテロ二量体の精製を、以前に記載されたようにして行った(P. Redondoら, Nature, 2008, 456, 107〜1)。Ｃ末端にHis6タグを有する単鎖M3-RM2-M2G19Sタンパク質配列(実施例4)を、pET24d(+)ベクターにクローニングし、カナマイシン及びクロラムフェニコールを加えたLB中で成長した大腸菌Rosetta(DE3)pLysS細胞(NOVAGEN)で発現させた。IPTGを用いて37℃にて５時間、又は20℃にて15時間の誘導により高発現レベルが得られたが、50 mMリン酸ナトリウムpH 8.0、300 mM NaCl、5%グリセロール及びプロテアーゼ阻害剤(Complete EDTA-フリータブレット、ROCHE)を含有する溶解バッファー中での超音波破砕及び20,000 gにて１時間の超遠心分離の後に、タンパク質は、抗His抗体を用いるウェスタンブロットにより検出されるように、不溶性画分中でもっぱら見出された。よって、タンパク質を、まず、８M尿素を加えた溶解バッファー中で可溶化することによる変性条件下で精製した。超遠心分離(40,000 gにて２時間)による清澄化の後に、試料を、同じバッファーで平衡化したQ-Sepharose XL樹脂(GE Healthcare)が充填されたカラムにアプライした。この精製ステップは、全ての核酸(カラム内に保持される)を、タンパク質から分離し、その後の精製ステップの性能を改善した。タンパク質は、８M尿素を加えた溶解バッファーで平衡化した、Co2+を載せたHiTrap Chelating HP 5 mlカラム(GE Healthcare)によるフロースルーから回収される。試料を載せ、カラムを洗浄した後に、タンパク質は、0.5Mイミダゾールを加えた同じバッファーを用いて溶出される。タンパク質に富む画分(SDS-PAGEにより決定)を回収し、20 mMリン酸ナトリウムpH 6.0、300 mM NaCl中へ４℃にて20倍希釈(１滴ずつ)することにより(0.13 mg/mlの最終タンパク質濃度)リフォールディングした。リフォールディングされたタンパク質を、同じバッファーで平衡化した5 ml HiTrapヘパリンカラムに載せ、１M NaClへの勾配を用いて溶出した。純粋タンパク質を含む画分をプールし、1.4 mg/ml (35.6 nM、280 nmでの吸光度により決定)まで濃縮し、直ちに用いたか、又は液体窒素中で急速凍結させて-80℃にて貯蔵した。
【０１３８】
b) タンパク質の生化学的及び生物物理学的特徴決定
円偏光２色性(CD)測定は、Jasco J-810分光偏光計にて、0.2 cm経路長の石英キュベット及びリン酸生理食塩水中の10-4μMタンパク質溶液を用いて行った。平衡アンフォールディングを、１℃/分の割合で増加する温度により誘導した(プログラム設定可能なPeltier熱電器を用いて)。分析ゲルろ過クロマトグラフィーを、室温にて、AKTA FPLCシステム(GE)で、Superdex 200 10/300GLカラムを20 mMリン酸ナトリウムバッファーpH 6.0、１M NaCl中で用いて行った。0.3 mg/mlの濃度の100μLのSC-v3v2G19S構築物の試料を注入し、流速0.2 ml/分で溶出した。カラムをブルーデキストラン(排除体積)及び17〜670 kDaの分子量マーカー(BioRad)を用いて校正した。
【０１３９】
2) 結果
タンパク質は、精製ポリペプチド鎖において最初のメチオニンが存在しないことを示す質量分析により、それであることを確認した。精製タンパク質は、野生型と類似の構造に折り畳まれていることが、円偏光２色性及びNMRにより見出され、溶液中で二量体であることが分析超遠心分離及びゲルろ過により見出された。単鎖分子の構造及び安定性は、ヘテロ二量体変異型のものと非常によく似ており、この分子は溶液中で単量体であるようである(図28)。
【０１４０】
実施例10：I-CreI由来単鎖メガヌクレアーゼは毒性でない
1) 材料及び方法
a) 細胞生存アッセイ
CHO-K1株化細胞を、10cmディッシュあたり2×105細胞の密度にて播種した。次の日に、種々の量のメガヌクレアーゼ発現ベクターと、一定量のGFPをコードするプラスミドとを、CHO-K1細胞に、10 cmプレート中で同時形質移入した。GPF発現を、形質移入後第１日及び第６日に、フローサイトメトリー(Guava EasyCyte, Guava technologies)によりモニターした。第１日に測定した形質移入効率により補正した細胞生存を、[(第６日にGFPを発現するメガヌクレアーゼ形質移入細胞)/ (第１日にGFPを発現するメガヌクレアーゼ形質移入細胞)]/ [(第６日にGFPを発現する対照形質移入細胞)/ (第１日にGFPを発現する対照形質移入細胞)の比として計算した。
【０１４１】
b) γH2AX免疫細胞化学
γH2AX免疫細胞化学のために、CHO-K1細胞に、Polyfect試薬(Qiagen)により、HAタグ付加メガヌクレアーゼをコードする種々の量のプラスミドと、4μgまでを満たすための空のベクターとを含有する4μgのDNA混合物を形質移入した。形質移入の48時間後に、２%パラホルムアルデヒドを30分間用いて細胞を固定し、0.5% TritonをRTにて５分用いて透過にした。洗浄の後に、細胞を、10%正常ヤギ血清(NGS)及び3% BSAを含有するPBS/triton 0.3%バッファーと１時間インキュベートして、非特異的染色をブロックした。次いで、細胞を、RTにて１時間、3% BSA及び10% NGS含有PBS/triton 0.3%で希釈した抗γH2AX (Upstate: 1/10000)及び抗HA (Santa Cruz:1/100)抗体とインキュベートし、その後、PBS/triton 0.3%、3% BSA及び10% NGSで希釈した２次抗体Alexa Fluor 488ヤギ抗マウス(Invitrogen-Molecular probes: 1/1000)及びAlexa Fluor 546ヤギ抗ウサギと１時間インキュベートした。１μg/mlの4,6-ジアミノ-2-フェニルインドール(DAPI; Sigma)とインキュベートした後に、カバーガラスを載せ、γH2AX増殖巣を、形質移入された(HA陽性)細胞中で蛍光顕微鏡により視覚化した。
【０１４２】
2) 結果
毒性は、特に治療用途でのDSB誘導組換え技術についての大きな問題であり、このために活性/毒性比が主な関心事である。RAG1メガヌクレアーゼ(実施例４及び５)の毒性を、以前に記載されたようにして(M.L. Maederら, Mol. Cell., 2003, 31, 2952〜)、細胞生存アッセイにおいて評価した。活性用量応答アッセイのために用いたCHO-K1細胞を用いる使用についてこのアッセイを適合させることにより、効率と毒性とのつながりを調べた。活性用量(メガヌクレアーゼがそれらの最大レベルの活性を示す用量、図29A)にて、用いたメガヌクレアーゼにかかわらず毒性がかろうじて検出された(図29B)。しかし、M2/M3ヘテロ二量体は、高い用量では著しい毒性を示し、これは、偏性ヘテロ二量体設計により部分的に緩和された。単鎖設計は、最良のバージョンがI-SceIを用いて得られるパターンを再現したので、改善も示した。配列特異的エンドヌクレアーゼの毒性は、通常、オフサイト切断に帰するものであり、これは、変異、欠失、転位、及びその他の全体的なゲノム変更をもたらし得る(M.H. Porteus, D. Carroll, Nat. Biotechnol., 2005, 23, 967〜)。オフサイト切断は、リン酸化H2AXヒストン(γ-H2AX)増殖巣の形成をモニターすることにより評価した。γ-H2AX増殖巣形成は、DNA ２本鎖破断(DSB)に対する細胞の最初の応答の１つであり、生細胞におけるDSBのモニターの簡便な手段を提供する(E.P. Rogakouら, J. Biol. Chem., 1998, 273, 5858)。CHO-K1細胞に、２つの用量のメガヌクレアーゼ発現ベクター(活性用量及び10倍過剰)を形質移入した。M2(G19S)/M3(G19S)ヘテロ二量体を非毒性についての対照として用いた。なぜなら、この分子は、アッセイにおいて完全に不活性であったからである。活性用量において、用いたメガヌクレアーゼ変異型にかかわらず、バックグランドを超えるシグナルは観察されず、これは発表された結果と矛盾しなかった(P. Redondoら, Nature, 2008, 456, 107〜)。以前のデータに従って、M2(G19S)/M3ヘテロ二量体は、活性用量の10倍で用いたときに、図29Cに示すように、著しいレベルの増殖巣の形成を誘導したが、偏性ヘテロ二量体又は単鎖設計のいずれかを用いることにより、オフサイト切断が最小化された。つまり、単鎖分子M3-RM2-M2+G19Sを用いて得られたシグナルは、I-SceIメガヌクレアーゼを用いて得られたものとよく似ていた。
【図１】
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【図２３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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