(57)【要約】本発明は、急性心障害または心臓移植拒絶の発症または急性心障害または心臓移植拒絶の提示の直後に対象から採取される試料におけるＡＮＰシグナルペプチドレベルを測定することによって、急性心障害、心臓移植拒絶を予測する、診断する、もしくはモニターするため、または急性心障害を肺障害と区別するための方法を提供する。本発明の方法において有用な抗体もまた提供される。一実施形態において、測定工程は、（ａ）ＡＮＰ−ＳＰを結合剤と結合させる工程および（ｂ）結合したＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰアミノ酸配列１６〜２５（配列番号１２）もしくは１〜１０（配列番号１６）、
（ｂ）配列番号１３もしくは配列番号１７から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の変異体もしくは断片に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
ＡＮＰ（１６〜２５）またはＡＮＰ（１〜１０）に選択的に結合する、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、もしくはヒト化抗体または断片である、請求項１または２に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
検出可能なマーカーを用いて標識される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、前記ＡＣＤの発症の４時間以内にまたは前記ＡＣＤの提示の４時間以内に前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルをコントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤを示す方法。
【請求項６】
対象における、急性心障害（ＡＣＤ）の治療に対する応答をモニターするための方法であって、前記ＡＣＤの発症の４時間以内にまたは前記ＡＣＤの提示の４時間以内に前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルをコントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルからのＡＮＰ−ＳＰの前記測定レベルにおける変化は、前記治療に対する応答を示す方法。
【請求項７】
対象における心臓移植拒絶エピソードを予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、心臓移植の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、移植拒絶を示す方法。
【請求項８】
対象における肺障害と急性心障害（ＡＣＤ）とを区別するための方法であって、前記障害の提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルよりも高い、測定ＡＮＰ−ＳＰレベルは、ＡＣＤを示す方法。
【請求項９】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の最初の４時間以内に、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の最初の４時間以内に、前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含み、ＡＮＰ−ＳＰの前記測定レベルは、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較され、前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤまたは移植拒絶を示す方法。
【請求項１０】
ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルは、ＡＣＤの発症の最初の２時間、１時間、または３０分以内に測定されるか、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の最初の２時間、１時間、または３０分以内に測定される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
繰り返し測定は、発症もしくは臨床提示の４〜６時間以内になされるかまたは最初の測定の２〜３時間以内になされる、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
４０〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４２〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の、前記試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＡＣＤもしくは心臓移植拒絶を示すまたはＡＣＤを肺障害と区別する、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記コントロールレベルよりも３〜８倍高い、前記試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＡＣＤもしくは心臓移植拒絶を示すまたはＡＣＤを肺障害と区別する、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＣＤは、急性冠動脈症候群：提示されるＥＣＧ上でのＳＴ上昇を伴うＡＭＩ、不安定狭心症、および非ＳＴ上昇ＭＩ；心虚血、急性心外傷、急性薬物中毒に起因する急性心損傷、急性心筋症、ならびに心臓移植拒絶から成る群から選択される、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＣＤは、非ＳＴ上昇ＭＩである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＣＤは、急性心虚血である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的試料は、血液、血漿、血清、唾液、間質液、尿、または心臓組織試料である、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記測定工程は、
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰを結合剤と結合させる工程および
（ｂ）結合したＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む、請求項５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合剤は、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が結合するまたは選択的に結合するＡＮＰ−ＳＰは、ＡＮＰ−ＳＰ（配列番号１４）またはその抗原性断片もしくは変異体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体は、ＡＮＰ−ＳＰのＮ末端またはＣ末端に結合する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体または抗原結合断片は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または断片である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＡＮＰ−ＳＰの結合は、固相上に固定されている抗体または抗原結合断片を使用して測定される、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、質量分析、蛍光免疫測定、免疫蛍光アッセイ、およびイムノラジオメトリックアッセイから選択されるアッセイを使用して測定される、請求項５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、質量分析を使用して測定される、請求項５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記質量分析は、ＳＥＬＤＩ、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ、またはＦＴＩＣＲである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＡＣＤまたは心臓移植拒絶またはＡＣＤ／肺障害の１つまたは複数の非ＡＮＰ−ＳＰマーカーのレベルを測定する工程および前記レベルをコントロールからのマーカーレベルと比較する工程をさらに含み、前記コントロールレベルからの前記測定レベルにおける偏差は、ＡＮＰ−ＳＰの前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルと共に、前記ＡＣＤを予測するもしくは診断するものとなる、または前記ＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害をモニターするために使用することができる、請求項５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記非ＡＮＰ−ＳＰマーカーは、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰ、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびＨ−ＦＡＢＰから成る群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記コントロールレベルからの測定レベルにおける前記偏差は、前記非ＡＮＰ−ＳＰマーカーの、より高い測定レベルを含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記モニタリングは、再灌流治療に対する応答のモニタリングである、請求項５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の発症から４時間以内、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰについてのアッセイであって、任意の公知の方法を使用して、前記試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを検出し、測定する工程を含むアッセイ。
【請求項３２】
ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＡＮＰ−ＳＰに結合するまたは選択的に結合する結合剤へのＡＮＰ−ＳＰの結合を通して前記試料において検出される、請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項３３】
（ａ）生物学的試料からの１つまたは複数のＡＮＰ−ＳＰポリペプチドを結合させる工程であって、前記ＡＮＰ−ＳＰポリペプチドは、群ＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）およびＡＮＰ−ＳＰ  １６〜２５（配列番号１２）またはその変異体もしくは断片から選択される工程ならびに
（ｂ）結合したＡＮＰ−ＳＰポリペプチドのレベルを測定する工程を含む、ＡＮＰ−ＳＰについてのアッセイ。
【請求項３４】
前記ＡＮＰ−ＳＰポリペプチドは、ＡＮＰ−ＳＰ結合剤、または請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片を使用して結合される、請求項３３に記載のアッセイ。
【請求項３５】
前記ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、マススペクトロメトリーを使用して測定される、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３６】
前記マススペクトロメトリーは、ＳＥＬＤＩ、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ、またはＦＴＩＣＲである、請求項３５に記載のアッセイ。
【請求項３７】
前記測定は、基質に結合したＡＮＰ−ＳＰ抗体または抗原結合断片を含むＳＥＬＤＩプローブを提供する工程、前記抗体または断片が、生物学的試料からの１つまたは複数のＡＮＰ−ＳＰポリペプチドを捕捉するように、前記抗体または断片を前記生物学的試料と接触させる工程、およびＳＥＬＤＩを使用して、結合したＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む、請求項３６に記載のアッセイ。
【請求項３８】
前記ＳＥＬＤＩは、クロマトグラフィー表面でＳＥＬＤＩバイオチップを使用して実行される、請求項３７に記載のアッセイ。
【請求項３９】
前記ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光アッセイ、およびイムノラジオメトリックアッセイから選択されるアッセイを使用して測定される、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４０】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするのに使用される、ＡＮＰ−ＳＰ（配列番号１４）またはその断片もしくは変異体に結合するＡＮＰ−ＳＰ結合剤であって、前記ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰの出現によって特徴づけられるＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
【請求項４１】
ＡＮＰ−ＳＰは、４０〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４２〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲で前記試料において存在する、請求項４０に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
【請求項４２】
ＡＮＰ−ＳＰは、ＡＮＰ−ＳＰの平均コントロールよりも３〜７倍高いレベルで前記試料において存在する、請求項４０に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
【請求項４３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片である、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
【請求項４４】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を評価するための予後ツール、診断ツール、またはモニターツールの製造における、ＡＮＰ−ＳＰ結合剤の使用であって、評価は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に実行される使用。
【請求項４５】
前記予後ツール、診断ツール、またはモニターツールは、０．１〜５００ｐｍｏｌ／Ｌまたは１〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは２〜１００ｐｍｏｌ／Ｌまたは５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記予後ツール、診断ツール、またはモニターツールは、ＡＮＰ−ＳＰコントロールレベルよりも３〜７倍高い範囲のＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の予測、診断、またはモニタリングのためのＡＮＰ−ＳＰ結合剤の使用であって、予後、診断、またはモニタリングは、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に実行される使用。
【請求項４８】
前記予測、診断、またはモニタリングは、請求項５〜３０のいずれか一項に記載の方法または請求項３１〜３９のいずれか一項に記載のアッセイを使用して達成される、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記結合剤は、ＡＮＰ−ＳＰ（配列番号１４）またはその断片もしくは変異体に結合するまたは選択的に結合する結合剤である、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５０】
前記結合剤は、抗体またはその抗原結合断片である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記抗体または抗原結合断片は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を評価するための予後ツール、診断ツール、またはモニターツールの製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項５３】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の予測、診断、またはモニタリングのための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項５４】
請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤を含む、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキットであって、前記キットは、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内に、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料を用いる使用のためのものであるキット。
【請求項５５】
請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の結合剤を含む、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓（cardia）移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキットであって、前記キットは、０．１〜５００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１〜３００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２〜１００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正されるキット。
【請求項５６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ抗体またはその抗原結合断片を含む、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキット。
【請求項５７】
前記結合剤または抗体が固定されている固相をさらに含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
発症または臨床提示の４時間以内に得られた前記生物学的試料において測定されるＡＮＰ−ＳＰレベルから、発症または臨床提示の４時間以内に、対象におけるＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニタリングするための説明書をさらに含む、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）（配列番号１２）もしくはＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）をコードする核酸分子またはその断片もしくは変異体であって、前記核酸は、
（ａ）配列番号１３もしくは配列番号１７またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）配列番号１３または配列番号１７に対して７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する配列、
（ｃ）配列番号１３もしくは配列番号１７に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列またはその断片もしくは変異体、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列にハイブリダイズすることができる、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの配列、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの相補体であり、
ただし、前記配列が配列番号１５ではないということを条件とする、核酸分子またはその断片もしくは変異体。
【請求項６０】
請求項５９に記載の核酸分子を含む遺伝子構築物。
【請求項６１】
発現構築物である、請求項６０に記載の遺伝子構築物。
【請求項６２】
請求項６０または６１に記載の遺伝子構築物を含むベクター。
【請求項６３】
請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項６４】
請求項５９に記載の核酸分子によってコードされるＡＮＰ−ＳＰポリペプチドまたはその変異体もしくは断片。
【請求項６５】
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）（配列番号１２）またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）ＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）またはその変異体もしくは断片、または
（ｃ）配列番号１２または配列番号１６のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列から選択されるＡＮＰ−ＳＰポリペプチドまたはその変異体もしくは断片。
【請求項６６】
（ａ）請求項６４または６５に記載のポリペプチドを発現することができる、請求項６０または６１に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞を培養する工程および
（ｂ）本発明の前記ポリペプチドを発現する細胞を選択する工程、
（ｃ）前記細胞から前記発現ポリペプチドを分離する工程、ならびに任意選択で
（ｄ）前記発現ポリペプチドを精製する工程を含む、請求項６４または６５に記載のポリペプチドの組換え生産のための方法。
【請求項６７】
前記構築物を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトするためのプレ工程を含む、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＮＰシグナルペプチド（ＡＮＰ−ＳＰ）ならびに血行路へのバイオマーカーの放出をもたらす対象における、急性冠動脈症候群を含む急性心障害の予後、診断、およびモニタリングにおけるその使用に関する。特に、本発明は、障害の発症の直後にまたは障害の臨床提示のときに採取された試料におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定することによって、対象における急性心障害を予測する、診断する、またはモニターするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）を含む急性心障害は、不安定狭心症から急性心筋梗塞（ＡＭＩ）まで及ぶ、広い範囲の心性虚血性事象を包含する。ＡＭＩはこれらの事象のうちで最も重篤なものとして現れ、そのため、迅速で正確な診断を必要とする。２つまたはそれを超える記載される特徴（虚血性の胸部不快感の病歴、連続心電図（ＥＣＧ）トレース上の漸進的変化、ならびに血漿心性バイオマーカーの上昇および低下）の症状を示す患者は、ＡＭＩを被っているとして明らかに同定される２５。しかしながら、疑わしいＡＭＩの症状を示す、かなりの割合の患者（４０％〜５０％）は、ＥＣＧ上の連続変化または典型的な症状を有しておらず、したがって、正確な診断のために、循環バイオマーカー濃度に関し大きな重点が置かれる２５、２６。
【０００３】
心筋梗塞の正確な早期診断は、有効な経皮的血管再生または血栓溶解血管再生ならびに付属的な抗凝固療法および抗血小板療法を含む再灌流治療の即時の導入を容易にする。そのような治療は、診断および管理におけるそれぞれの時間遅延を伴い、死亡率および罹患率を低下させるのに、漸進的に有効性が低下する２〜４。この臨床的状況における意思決定の加速に対する必要性を考慮すれば、たとえば急性心障害、特にＡＭＩの早期で、特異的な診断を提供する循環バイオマーカーの同定に対する相当な関心がある。
【０００４】
実際に、現在の臨床ガイドラインは、心筋梗塞および急性冠動脈症候群の同定において、バイオマーカー測定の重要性を強調する２５。クレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、トロポニンＴ（ＴｎＴ）、トロポニンＩ（ＴｎＩ）、およびミオグロビンを含む多くのバイオマーカーは、この目的のために提案されてきたが、それらの使用に限界がある。血漿心性バイオマーカーの検出可能なまたは異常な上昇に対する時間は、６時間（ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ）〜１２時間（ＴｎＴ、ＴｎＩ）であり得、ピークレベルは、傷害の発症の２４〜４８時間後まで生じず、的確な診断および治療に際して、時間の遅延を課す１〜４。さらに、ミオグロビンおよびＣＫ−ＭＢの両方は、非特異的であり、とりわけ外傷または外科手術の間に、心外性の源から分泌され得る１。この目的に有用な他のバイオマーカーは、ＡＮＰ（プレプロＡＮＰ（１２４〜１５１））、Ｎ−ＡＮＰ（プレプロＡＮＰ  ２６〜１２３）（図１を参照されたい）、ＢＮＰ（プレプロＢＮＰ  １０３〜１３４）、およびＮ−ＢＮＰ（ＮＴ−プロＢＮＰとしても公知のプレプロＢＮＰ（２７〜１３４））である。これらのペプチドは、血行路へ分泌される６。
【０００５】
ＡＭＩ後早期のＡＮＰおよびＮ−ＡＮＰの血漿濃度の測定は、有力な予後的価値を有し２、３、７、治療レジメンへのこれらのペプチドの血漿濃度の組み込みは、心不全を有する患者の臨床的結果を改善し得る８。これは、ＡＮＰよりも約２０倍長い半減期を有するＮ−ＡＮＰに特に該当し５、したがって、ＡＭＩの後の長期的な心機能に関するさらなる重要な情報を提供する。
【０００６】
上記の心臓バイオマーカーがそうであるように、ＡＮＰおよびＮ−ＡＮＰは、傷害の発症後の６〜１２時間の間に、検出可能なまたは異常なレベルに達しない可能性があり、ピークレベルは、発症後の２４〜４８時間まで生じない可能性がある。そのため、ＡＮＰおよびＮ−ＡＮＰの長期的な診断／予測能力は、臨床提示の最初の数時間以内に、急性心外傷などの急性心障害の早期の特異的な診断を提供する特異的マーカーの付随的な能力を欠く。そのような早期マーカーに対するその必要性は、存在する。
【０００７】
より最近では、ＡＮＰ−ＳＰおよびＢＮＰ−ＳＰは、心臓病を診断するのに有用であり得ることが示唆された（特許文献１、特許文献２）。ＡＮＰ−ＳＰおよびＢＮＰ−ＳＰのレベルは、普通の患者よりも心不全患者において高いということが、一般的に示されている。いつＡＮＰ−ＳＰまたはＢＮＰ−ＳＰのレベルを測定するべきかに関する時間的経過の情報は、提供されていない。ＢＮＰ−ＳＰレベルがＮ−ＢＮＰと関連して上昇することが述べられている。
【０００８】
本発明の目的は、急性心障害の早期マーカーの必要性を満たすおよび／または有用な選択肢を公衆に少なくとも提供するのにいくらか役立つことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２４４９０４号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５／０５２５９３号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ヒト心房性ナトリウム利尿シグナルペプチド（ＡＮＰ−ＳＰ）またはプレプロＡＮＰ（１〜２５）は、プレプロＡＮＰ（１〜１５１）配列番号１から切断される２５アミノ酸ペプチドである。ＡＮＰ−ＳＰ（１〜２５）を、配列番号１４に単独で示す。
【００１１】
出願人らは、驚いたことに、ＡＮＰ−ＳＰの循環濃度が、疑わしい急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）の発症後の最初の数時間においてまたは疑わしい急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）の臨床提示のときに最も高いことを発見した。ピークは、これらの最初の時間において、正常コントロール集団よりも、約５〜１５倍、一般的に３〜７倍高い。
【００１２】
したがって、第１の態様において、本発明は、対象における急性心障害（ＡＣＤ）を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、ＡＣＤの発症の４時間以内にまたはＡＣＤの提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および上述のＡＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤを示す方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、対象における、急性心障害（ＡＣＤ）の治療に対する応答をモニターするための方法であって、ＡＣＤの発症の４時間以内にまたはＡＣＤの提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および上述のＡＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルからのＡＮＰ−ＳＰの測定レベルにおける変化は、治療に対する応答を示す方法をも提供する。
【００１４】
他の態様において、本発明はまた、対象における心臓移植拒絶エピソードを予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、心臓移植の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および上述のＡＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、移植拒絶を示す方法をも提供する。
【００１５】
本発明はまた、対象における肺障害および急性心障害（ＡＣＤ）を区別するための方法であって、障害の提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および上述のＡＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤを示す方法をも提供する。
【００１６】
本発明はまた、対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症またはその臨床提示の最初の４時間以内に、対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含み、ＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較され、コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤまたは心臓移植拒絶を示す方法をも提供する。
【００１７】
一実施形態において、本発明の方法は、インビトロ方法である。
【００１８】
一実施形態において、ＡＮＰ−ＳＰレベルの測定は、発症または臨床提示の２時間以内もしくは１時間以内にまたは３０分以内に実行される。
【００１９】
一実施形態において、生物学的試料は、血液、唾液、間質液、血漿、尿、血清、または心臓組織である。
【００２０】
一実施形態において、測定工程は、
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰを結合剤と結合させる工程および
（ｂ）結合したＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む。
【００２１】
一実施形態における結合剤は、抗体または抗体の断片である。最も一般的に、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である。一実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００２２】
代替の実施形態において、ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、質量分析を使用して測定される。
【００２３】
抗体が結合するＡＮＰ−ＳＰは、完全長ヒトＡＮＰ−ＳＰ分子（配列番号１４）またはその変異体もしくは断片である。一実施形態において、結合は、選択的である。一実施形態において、断片は、長さが少なくとも４つの隣接するアミノ酸である。望ましくは、抗体は、ＡＮＰ−ＳＰのＮ末端またはＣ末端に結合する。
【００２４】
結合剤が結合するまたは選択的に結合する特異的な抗原性ペプチドは、ヒトＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）（配列番号１２）、ヒトＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）、またはその抗原性結合断片もしくは変異体を含む。
【００２５】
一実施形態におけるＡＮＰ−ＳＰの結合は、固相上に固定されている抗体または抗体断片を使用して測定される。
【００２６】
ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定、免疫蛍光アッセイ、マススペクトロメトリー、およびイムノラジオメトリックアッセイから選択されるアッセイを用いて有用に測定されてもよい。
【００２７】
したがって、本発明はまた、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症から４時間以内にまたはその臨床提示の４時間以内に、対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰについてのアッセイであって、任意の公知の方法を使用して、試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを検出し、測定する工程を含むアッセイをも提供する。
【００２８】
本発明はまた、ＡＮＰ−ＳＰについてのアッセイであって、
（ａ）生物学的試料からの１つまたは複数のＡＮＰ−ＳＰポリペプチドを結合させる工程であって、ＡＮＰ−ＳＰポリペプチドは、群ＡＮＰ−ＳＰ  １〜１０（配列番号１６）およびＡＮＰ−ＳＰ  １６〜２５（配列番号１２）またはその変異体もしくは断片から選択される工程ならびに
（ｂ）結合したＡＮＰ−ＳＰポリペプチドのレベルを測定する工程を含むアッセイをも提供する。
【００２９】
一実施形態において、アッセイは、インビトロアッセイである。
【００３０】
本発明の方法は、上述のＡＣＤまたは心臓移植拒絶またはＡＣＤ／肺障害の１つまたは複数の非ＡＮＰ−ＳＰマーカーのレベルを測定する工程およびそれらのレベルをコントロールからのマーカーレベルと比較する工程をさらに含み、非ＡＮＰ−ＳＰマーカーのコントロールレベルからの測定レベルにおける偏差は、ＡＮＰ−ＳＰのコントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルと共に、ＡＣＤを予測するもしくは診断するものとなるまたは上述のＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害をモニターするために使用することができる。
【００３１】
急性冠動脈症候群との関連において使用されるマーカーは、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、および心臓特異的脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）を含む。
【００３２】
他の態様において、本発明はまた、対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするのに使用される、ＡＮＰ−ＳＰ（配列番号１４）またはその抗原性結合断片もしくは変異体に結合するまたは選択的に結合するＡＮＰ−ＳＰ結合剤であって、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内にまたはその臨床提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰの出現によって特徴づけられるＡＮＰ−ＳＰ結合剤をも提供する。
【００３３】
一実施形態において、結合剤は、抗体またはその抗原結合断片である。
【００３４】
本発明はまた、
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰアミノ酸配列１６〜２５（配列番号１２）もしくは１〜１０（配列番号１６）、
（ｂ）配列番号１３もしくは配列番号１７から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の変異体もしくは断片に結合する抗体またはその抗原結合断片をも提供する。
【００３５】
抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であってもよい。
【００３６】
本発明はまた、対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を評価するための予後ツール、診断ツール、またはモニターツールの製造における、ＡＮＰ−ＳＰ結合剤の使用であって、評価は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内にまたはその臨床提示の４時間以内に実行されるＡＮＰ−ＳＰ結合剤の使用にも関する。
【００３７】
本発明はまた、対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を評価するための予後ツール、診断ツール、またはモニターツールの製造における、本発明の抗体または抗原結合断片の使用にも関する。
【００３８】
本発明はまた、予後ツール、診断ツール、またはモニターツールが、０．１〜５００ｐｍｏｌ／Ｌまたは１〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは２〜１００ｐｍｏｌ／Ｌまたは５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正される、本発明の使用にも関する。
【００３９】
他の態様において、本発明は、ＡＮＰ−ＳＰ結合剤を含む、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキットであって、キットは、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症またはその臨床提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料を用いて使用するためのものであるキットを提供する。
【００４０】
本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合断片を含む、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキットをも提供する。
【００４１】
本発明はまた、本発明の結合剤または抗体もしくは抗原結合断片を含む、急性心障害（ＡＣＤ）を予測する、診断する、またはモニターするためのキットをも提供する。一実施形態において、キットは、０．１〜５００ｐｍｏｌ／Ｌまたは１〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは２〜１００ｐｍｏｌ／Ｌまたは５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正される。
【００４２】
一実施形態において、キットはまた、発症または臨床提示の４時間以内に得られた生物学的試料において測定されるＡＮＰ−ＳＰレベルから、発症または臨床提示の４時間以内の、対象におけるＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニタリングするためのおよび測定レベルをコントロールレベルと比較するための説明書をも含む。コントロールレベルよりも高く測定されたＡＮＰ−ＳＰレベルは、ＡＣＤまたは移植拒絶を示す。
【００４３】
他の態様において、本発明は、ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）（配列番号１２）またはＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）をコードする核酸分子であって、上述の核酸は、
（ａ）配列番号１３または配列番号１７またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）配列番号１３または配列番号１７に対して７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する配列、
（ｃ）配列番号１３または配列番号１７に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列またはその断片もしくは変異体、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列にハイブリダイズすることができる、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの配列、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの相補体であり、
ただし、上記配列が配列番号１５ではないということを条件とする、核酸分子に関する。
【００４４】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含む遺伝子構築物、遺伝子構築物を含むベクター、遺伝子構築物またはベクターを含む宿主細胞、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチド、本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体、および本発明のポリペプチドを組換えで生産するための方法をも提供する。
【００４５】
したがって、他の態様において、本発明は、
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）（配列番号１２）またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）ＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）またはその変異体もしくは断片、または
（ｃ）配列番号１２または配列番号１６のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列から選択されるＡＮＰ−ＳＰポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を提供する。
【００４６】
本発明は、ここでは、添付図面における図に関連して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、遊離シグナル、Ｎ−ＡＮＰ、およびＡＮＰペプチドの生成をもたらすヒトプレプロＡＮＰのプロセシングを概説する概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、６種におけるプレプロＡＮＰシグナルペプチド配列のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ  バージョン１．８３  ＪＡＬＶＩＥＷマルチプル配列アライメントを示す図である。デフォルトＣｌｕｓｔａｌ  Ｗパラメーターは、このアライメントにおいて以下のように使用した：ＤＮＡ  Ｇａｐオープンペナルティー＝１５．０；ＤＮＡ  Ｇａｐエクステンションペナルティー＝６．６６；ＤＮＡマトリックス＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ；タンパク質Ｇａｐオープンペナルティー＝１０．０；タンパク質Ｇａｐエクステンションペナルティー＝０．２；タンパク質マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ；タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ＝−１；タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ＝４。アミノ酸は、Ｐｅａｒｓｏｎ（ｆａｓｔａ）フォーマットに従った９。
【図２Ｂ】図２Ｂは、単一文字表記フォーマットの、６種におけるプレプロＡＮＰ配列を示す図である。シグナルペプチド領域は、太字で示す。
【図３】図３は、ＡＮＰ−ＳＰ標準曲線（黒丸）と並行に希釈したヒト血漿抽出物（白四角）を用いるラジオイムノアッセイの結果を示す図である。
【図４】図４Ａは、ラジオイムノアッセイ結果を示す図である。上パネル：入院からの示される時間にＡＭＩ患者（ｎ＝３）から採取された血漿におけるＡＮＰ−ＳＰの濃度。最も高いＡＮＰ−ＳＰのレベルは、入院の１〜２時間後に見られ、正常で健康な個人において測定されたレベル（下の黒丸、ｎ＝８、百分位数の範囲を示す）よりも平均でおよそ６〜７倍高い。下パネル：上パネルと同じ患者における、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、およびＴｎＴの、一致する時間的経過濃度プロファイル。図４Ｂは、ラジオイムノアッセイ結果を示す図である。上パネル：入院からの示される時間にＡＭＩ患者（ｎ＝２３）から採取された血漿におけるＡＮＰ−ＳＰの濃度。最も高いＡＮＰ−ＳＰのレベルは、入院の１〜２時間後に見られ、正常で健康な個人において測定されたレベル（下の黒丸、ｎ＝６６、百分位数の範囲を示す）よりも平均でおよそ５〜７倍高い。下パネル：上パネルと同じ患者における、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン（myglobin）、およびＴｎＴの、一致する時間的経過濃度プロファイル。
【図５】図５は、ＡＮＰ−ＳＰ抗血清の交差反応性データの表である。
【図６】図６は、患者における循環ＡＮＰ−ＳＰ濃度が、心性の源に由来することを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
定義
急性心障害（ＡＣＤ）は、提示されるＥＣＧ上でのＳＴ上昇を伴う急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、不安定狭心症、および急性非ＳＴ上昇心筋梗塞（ＭＩ）；心虚血；急性心外傷；急性薬物中毒に起因する急性心損傷、急性心筋症、および心臓移植拒絶を含むが、これらに限定されない。これらの障害の十分な説明的な定義は、参考文献１において見つけられる。
【００４９】
ＡＣＤ／肺障害は、診断未確定のまたは疑わしいＡＣＤまたは肺障害を有する対象を指す。
【００５０】
急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）は、不安定狭心症、主要心電図（ＥＣＧ）上でのＳＴ上昇を伴う急性心筋梗塞、およびＥＣＧ上でのＳＴセグメント上昇を伴わない急性心筋梗塞を含む広い範囲の心虚血事象を包含する。
【００５１】
用語「抗体」は、抗体を合成するために使用される抗原を含む分子と特異的に相互作用する（結合する）かまたはそれと密接に関係する抗原と特異的に相互作用する（結合する）特異的な構造を有する免疫グロブリン分子を指す。本明細書において使用されるように、用語「抗体」は、完全長抗体を広く含み、そのある種の抗体断片を含んでいてもよい。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、多価抗体および一価抗体、多特異的抗体（たとえば二特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびに親和性成熟した抗体もまた含まれる。抗体が、ＡＮＰ−ＳＰに優先的に結合する、たとえば、非ＡＮＰ−ＳＰポリペプチドと２５％未満または１０％未満または１％未満または０．１％未満の交差反応性を有する場合、抗体は、本発明のＡＮＰ−ＳＰポリペプチドに選択的にまたは特異的に結合する。通常、抗体は、抗原またはエピトープに対して、１０−６もしくは１０−７Ｍ以下のまたは約１０−８Ｍもしくは１０−９Ｍもしくは１０−１０もしくは１０−１１もしくは１０−１２Ｍ未満の結合親和性（解離定数（Ｋｄ）値）を有する。結合親和性は、表面プラズマ共鳴を使用して評価されてもよい。
【００５２】
本明細書において使用されるように、「抗原結合断片」または「抗体断片」は、好ましくは、その抗体断片の正常な機能のほとんどまたはすべてまたは最小ではその抗体断片の正常な機能の少なくとも１つを保持する、完全な抗体（ｉｎｔａｃｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の部分を意味する。抗体断片は、たとえば、完全な抗体における対応するＦｃ領域の機能のすべてまたはほとんどまたはいくつかを保持するＦｃ領域を含んでいてもよい。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、直鎖状抗体、ダイアボディ、一本鎖抗体（ＳｃＦＶ）、ならびに多特異的抗体を含む。
【００５３】
本明細書において使用されるように、「モノクローナル抗体」は、たった１つの標的抗原に対して向けられる、高度に特異的な抗体である抗体を意味する。モノクローナル抗体は、同種の抗体または実質的に同種の抗体の集団から得られてもよく、それぞれのモノクローナル抗体は、若干、生じる可能性のある自然突然変異を除いて、同一でありそして／または同じエピトープに結合する。
【００５４】
「単離抗体」は、その自然環境の構成要素から分離されたもしくは回収されたかまたはその両方である、同定された抗体である。たとえば、酵素およびホルモンを含むタンパク質から分離される。一実施形態において、抗体は、抗体の少なくとも９５重量％または９６重量％または９７重量％または９８重量％または９９重量％まで精製される。純度は、たとえばローリー法によって決定することができる。通常、抗体は、少なくとも１回の精製工程によって調製される。
【００５５】
本明細書において使用される用語「結合剤」は、ＡＮＰ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体に結合することができる任意の固体または非固体物質を指す。一実施形態において、この用語は、ＡＮＰ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体に結合する任意の天然分子または非天然分子を指す。結合剤の例は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、および小分子化合物を含む。選択的なまたは特異的な結合剤は、抗体またはその抗原結合断片である。
【００５６】
本明細書において使用される生物学的試料は、スクリーニングされることとなる対象に由来する任意の試料を意味する。試料は、ＡＮＰ−ＳＰが検出することができる、当技術分野において公知の任意の試料であってもよい。血漿、血液、唾液、間質液、血清、尿、滑液、脳脊髄液、リンパ液、精液、羊膜液、心臓周囲液、および腹水などの任意の体液ならびに心組織などの組織もまた含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンおよび／またはＴ細胞受容体への特異的な結合ができる任意のタンパク質決定基を含む。それは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位である。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの、分子の化学的に活性な表面の群（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）から成り、通常、特異的な３次元構造の特徴および特異的な電荷の特徴を有する。エピトープは、典型的に、３個、５個、または通常８〜１０個のアミノ酸を含む。アミノ酸は、隣接アミノ酸または三次フォールディングによって近接する非隣接アミノ酸であってもよい。
【００５８】
「発症または臨床提示の４時間以内」という用語は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、または診断未確定のもしくは疑わしいＡＣＤ／肺障害の発症または医療施設での提示から、２４０分を含め、１分〜２４０分を含む。好ましくは、測定は、発症または症状から２時間（１２０分を含め、１分〜１２０分）以内に、または１時間（６０分を含め、１分〜６０分）以内に、発症または提示の５〜４５分以内、１５〜４０分以内、２０〜３５分以内に、または２５〜３０分以内になされてもよい。
【００５９】
コントロールよりも「高い」もしくは「低い」レベルまたはコントロールからの変化、もしくは偏差は、一実施形態において、統計的に有意である。レベルが、コントロールレベルと比較して、５％以上、１０％以上、２０％以上、または５０％以上、コントロールレベルと異なる場合、コントロールレベルまたは平均コントロールレベルからのより高いレベル、より低いレベル、それからの偏差またはそれからの変化は、存在すると考えることができる。統計的に有意は、その代わりに、Ｐ≦０．０５として計算されてもよい。さらなる代替において、より高いレベル、より低いレベル、偏差および変化は、アッセイ対照標準限界またはアッセイ対照標準範囲により決定することができる。これらは、直感的な評価またはノンパラメトリック法から計算することができる。全体的に、これらの方法は、０．０２５および０．９７５の分位点（ｆｒａｃｔｉｌｅ）を０．０２５＊（ｎ＋１）および０．９７５（ｎ＋１）として計算する。そのような方法は、当技術分野において周知である２２、２３。コントロールにおいて不在のマーカーの存在もまた、より高いレベル、偏差、または変化として予期される。コントロールにおいて存在するマーカーの不在もまた、より低いレベル、偏差、または変化として予期される。
【００６０】
ＡＣＤの病歴を有していない正常で健康な対象ならびに急性冠動脈症候群：提示されるＥＣＧ上でのＳＴ上昇を伴う（ＡＭＩ）、不安定狭心症、および急性非ＳＴ上昇ＭＩ；心虚血；急性心外傷；急性物中毒に起因する急性心損傷、急性心筋症、および心臓移植拒絶を含むが、これらに限定されない様々なＡＣＤを有する対象からなどの、任意の対象に由来する試料が含まれる。
【００６１】
用語ＡＮＰ−ＳＰは、ヒトプレプロＡＮＰ配列（配列番号１）についての、完全な２５アミノ酸ＡＮＰシグナルペプチドを指す。ＡＮＰ−ＳＰ（１〜２５）は、配列番号１４に単独で示し、図２Ｂにおいて下線を引く。ＡＮＰ−ＳＰの変異体または断片もまた用語ＡＮＰ−ＳＰの範囲内に包含される。一実施形態において、ＡＮＰ−ＳＰは、シグナルポリペプチドとしてまたは抗体が結合することができる抗原性ポリペプチドとして機能する。ＡＮＰ−ＳＰの変異体および断片は、これらの機能のどちらかまたは両方を保持する変異体および断片を含む。
【００６２】
本明細書において使用される用語「心筋症」は、心筋層の疾患を指し、ここで、心筋層または心臓筋肉は、弱っている。これは、心臓のポンピングの低下をもたらし得る。心筋症の一般的な原因は、心臓発作、ウイルス感染症、高血圧、アルコール中毒症、および自己免疫疾患である。
【００６３】
本明細書および特許請求の範囲において使用される用語「含む（comprising）」は、「〜から少なくとも部分的に成る（consisting  at  least  in  part  of）」ことを意味する、すなわち、「含む（comprising）」を含む本明細書および特許請求の範囲における記載を解釈する場合、それぞれの記載においてこの用語によって前置きされた特徴はすべて、存在する必要があるが、他の特徴もまた、存在することができる。「含む（comprise）」および「含まれる（comprised）」などの関連する用語は、同様に解釈されることとなる。
【００６４】
本明細書において使用される用語「（１つまたは複数の）ポリヌクレオチド」は、任意の長さの単鎖または二本鎖デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、非限定的な例として、遺伝子のコード配列および非コード配列、センス配列およびアンチセンス配列、エキソン、イントロン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、組換えポリヌクレオチド、単離されそして精製された天然に存在するＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、合成ＲＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列、核酸プローブ、プライマー、断片、遺伝子構築物、ベクター、ならびに修飾ポリヌクレオチドを含む。核酸分子に対する言及は、同様に理解されることとなる。
【００６５】
本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列の「断片」は、所望の標的に対する特異的なハイブリダイゼーションができる隣接するヌクレオチドの部分配列であり、たとえば、長さが少なくとも１０ヌクレオチドである配列である。本発明の断片は、配列番号１５のポリヌクレオチドの少なくとも１０、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３または７４の隣接するヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチド配列の断片は、マイクロアレイ中に含ませて、プライマー、プローブとして使用することができるか、または本明細書におけるポリヌクレオチドベースの選択方法において使用することができる。本発明の他のポリヌクレオチドの断片（配列番号１３もしくは配列番号１７など）または本明細書において記載されるポリヌクレオチドの断片は、同様に理解されるはずである。
【００６６】
用語「プライマー」は、鋳型にハイブリダイズし、標的に相補的なポリヌクレオチドのポリメリゼーションのプライミングに使用される、通常遊離３’ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドを指す。
【００６７】
用語「プローブ」は、ハイブリダイゼーションベースのアッセイにおいて、プローブに相補的なポリヌクレオチド配列を検出するために使用される短いポリヌクレオチドを指す。プローブは、本明細書において定義される、ポリヌクレオチドの「断片」から成ってもよい。
【００６８】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸鎖を包含するが、一般的に、アミノ酸残基が、共有ペプチド結合によって連結される、完全長ＡＮＰ−ＳＰタンパク質（配列番号１４）の少なくとも４つのアミノ酸、少なくとも５つのアミノ酸、または少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、もしくはすべての２５のアミノ酸のアミノ酸鎖を包含する。本発明において有用なポリペプチドは、精製天然産物であっても、または組換え技術もしくは合成技術を使用して部分的にもしくは全体的に生産されてもよい。その用語は、ポリペプチド、二量体もしくは他の多量体などのポリペプチドの集合体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、またはその誘導体を指してもよい。本発明の他のポリペプチド（配列番号１２もしくは配列番号１６など）または本明細書において記載される他のポリペプチドに対する言及は、同様に理解されるべきである。
【００６９】
ポリペプチドの「断片」は、生物学的活性もしくは結合に必要とされるおよび／またはポリペプチドの３次元構造を提供する機能を果たす、ポリペプチドの部分配列である。その用語は、ポリペプチド、二量体もしくは他の多量体などのポリペプチドの集合体、融合ポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリペプチド変異体、またはその誘導体を指してもよい。一実施形態において、断片は、上記のシグナルペプチド活性を果たすことができるかまたはＡＮＰ−ＳＰ（１〜２５）、ＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）、もしくはＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）または本発明の他のポリペプチドもしくは本明細書において記載されるポリペプチドの抗原性結合特性を保持する。
【００７０】
本明細書において開示されるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用される用語「単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、それらの自然の細胞環境から取り出される配列を指すために使用される。単離分子は、生化学的技術、組換え技術、および合成技術を含む任意の方法または生化学的技術、組換え技術、および合成技術を含む方法の組み合わせによって得られてもよい。ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、少なくとも１つの精製工程によって調製されてもよい。
【００７１】
本明細書において使用される用語「精製（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」は、完全な純度を必要としない。精製は、一実施形態において、試料におけるポリヌクレオチド、ポリペプチド抗体、または宿主細胞の少なくとも９０％または９５％または９８％または９９％の均一性を指す。用語は、本明細書において記載される他の分子および構築物に関して同様に理解されるはずである。
【００７２】
細胞または宿主細胞に適用される用語「単離」は、生物からまたはその自然環境から得られたかまたは取り出され、引き続いて、当技術分野において公知である実験室環境において維持される細胞または宿主細胞を記載する。その用語は、それ自体、単細胞類（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ）自体に限定されないが、細胞培養物中に含まれる細胞または宿主細胞を指し、単細胞（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）または単一の宿主細胞を含むことができる。
【００７３】
用語「組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」は、その自然の状況においてそれを囲む配列から取り出されそして／またはその自然の状況において存在しない配列で組換えられるポリヌクレオチド配列を指す。
【００７４】
「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」ポリペプチド配列は、「組換え」ポリヌクレオチド配列から翻訳によって生産される。
【００７５】
本明細書において使用されるように、用語「変異体」は、明確に同定される配列とは異なるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を指し、１またはそれを超えるヌクレオチドまたはアミノ酸残基が、欠失している、置換されている、または追加されている。変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体または天然に存在しない変異体であってもよい。変異体は、同じ種または他の種からのものであってもよく、相同体、パラログ、およびオルソログを包含していてもよい。ある実施形態において、本発明において有用なポリペプチドの変異体は、親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドと同じかまたは類似しているシグナルペプチド活性または抗原性結合特性を含む生物学的活性を有する。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関しての用語「変異体」は、本明細書において定義されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの形態をすべて包含する。
【００７６】
変異体ポリヌクレオチド配列は、本発明の配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を呈する。同一性は、少なくとも１０のヌクレオチド位置、少なくとも１５のヌクレオチド位置、少なくとも２０のヌクレオチド位置、少なくとも２７のヌクレオチド位置、少なくとも４０のヌクレオチド位置、少なくとも５０のヌクレオチド位置、少なくとも６０、もしくは少なくとも７０のヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたり見つけられるかまたは配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７のポリヌクレオチドまたは本明細書において開示される他のポリヌクレオチドの全長にわたり見つけられる。
【００７７】
ポリヌクレオチド配列同一性は、グローバル配列アライメントプログラム（global  sequence  alignment  program）を使用して、候補ポリヌクレオチド配列および対象ポリヌクレオチド配列の間の重複の全長にわたり計算し得る（たとえばNeedleman,  S.  B.およびWunsch,  C.  D.（１９７０年）J.  Mol.  Biol.  ４８巻、４４３〜４５３頁）。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムの完全な実装は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／から得ることができるＥＭＢＯＳＳパッケージにおけるニードルプログラム（needle  program）において見つけられる（Rice,P.  Longden,I.、およびBleasby,A.  EMBOSS:  The  European  Molecular  Biology  Open  Software  Suite、Trends  in  Genetics  ２０００年６月、１６巻、６号、２７６〜２７７頁）。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅサーバーもまた、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／で、２つの配列の間でＥＭＢＯＳＳ−ニードルグローバルアライメントをオンラインで実行するための機能を提供している。
【００７８】
その代わりに、末端ギャップにペナルティーを課さずに、２つの配列の最適なグローバルアライメントを算出するＧＡＰプログラムが、使用されてもよい。ＧＡＰは、以下の論文において記載されている。Huang,  X.（１９９４年）On  Global  Sequence  Alignment（Computer  Applications  in  the  Biosciences  １０巻、２２７〜２３５頁）。
【００７９】
ポリヌクレオチド変異体はまた、それらの配列の機能的等価性を保つであろう１つまたは複数の明確に同定された配列に対して類似性を呈し、偶然によって生じたことを合理的に予想することができないものをも包含する。このプログラムは、配列間での、類似性の領域を見つけ、それぞれのそのような領域について、ランダム配列を含有する固定基準サイズのデータベースにおいて、そのようなマッチが偶然見られることを予想することができる回数の期待数である「Ｅ値」を報告する。このデータベースのサイズは、ｂｌ２ｓｅｑプログラムにおいてデフォルトに設定されている。１よりもかなり低い、小さなＥ値については、Ｅ値は、ほぼ、そのようなランダムマッチの蓋然性がある。
【００８０】
変異体ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、明確に同定された配列のいずれか１つと比較した場合、１×１０−５未満、１×１０−６未満、１×１０−９未満、１×１０−１２未満、１×１０−１５未満、１×１０−１８未満、または１×１０−２１未満のＥ値を呈する。
【００８１】
ポリヌクレオチド配列同一性および類似性はまた、以下の方法において決定することもできる。対象ポリヌクレオチド配列は、配列アライメントアルゴリズムならびにＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴおよび他のデータベースなどの配列類似性検索ツールを使用して、候補ポリヌクレオチド配列と比較される。Nucleic  Acids  Res  ２９巻：１〜１０頁および１１〜１６頁、２００１年は、オンラインリソースの例を提供する。
【００８２】
ＢＬＡＳＴＮの使用は、本発明によるポリヌクレオチド変異体についての配列同一性の決定において使用するのに好ましい。
【００８３】
ＢＬＡＳＴＮ（ｂｌ２ｓｅｑにおけるプログラムのＢＬＡＳＴスーツ、バージョン２．２．１８  ２００８年４月から）（Tatiana  A.ら、FEMS  Microbiol  Lett.  １７４巻：２４７〜２５０頁（１９９９年）、Altschulら、Nuc.Acis  Res  ２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））は、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）またはＢｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡのＮＣＢ１から公的に入手可能である。ローコンプレキシティパート（low  complexity  part）のフィルタリングをオフにするべき以外は、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメーターが利用される。
【００８４】
ポリヌクレオチド配列の同一性は、以下のＵＮＩＸ（登録商標）コマンドラインパラメーターを使用して検査されてもよい。
ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ１  −ｊ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑ２  −Ｆ  Ｆ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ
パラメーター−Ｆ  Ｆは、ローコンプレキシティセクション（low  complexity  section）のフィルタリングをオフにする。パラメーター−ｐは、配列のペアに適切なアルゴリズムを選択する。ｂｌ２ｓｅｑプログラムは、「同一性＝」という行において同一のヌクレオチドの数およびパーセンテージの両方として配列同一性を報告する。
【００８５】
その代わりに、変異体ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、指定されるポリヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【００８６】
用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」およびその文法的な等価物は、温度および塩濃度の規定された条件下で、標的ポリヌクレオチド分子にハイブリダイズするポリヌクレオチド分子の能力を指す（サザンブロットまたはノーザンブロットなどのＤＮＡブロットまたはＲＮＡブロット上に固定された標的ポリヌクレオチド分子など）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力は、それほどストリンジェントではない条件下で最初にハイブリダイズし、次いで、望ましいストリンジェンシーまでストリンジェンシーを増加させることによって決定することができる。
【００８７】
長さが約１００塩基よりも大きなポリヌクレオチド分子に関して、典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、未変性二重鎖の融解温度（Ｔｍ）以下の、２５〜３０℃以下（たとえば１０℃）である（一般的に、参照によって本明細書において組み込まれるSambrookら編、１９８７年、Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual、第２版  Cold  Spring  Harbor  Press;Ausubelら、１９８７年、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Greene  Publishingを参照されたい）。約１００塩基よりも大きなポリヌクレオチド分子についてのＴｍは、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１％（Ｇ＋Ｃ−ｌｏｇ（Ｎａ＋）によって計算することができる（Sambrookら編、１９８７年、Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Manual、第２版  Cold  Spring  Harbor  Press;BoltonおよびMcCarthy、１９６２年、PNAS  ８４巻：１３９０頁）。長さが１００塩基よりも大きなポリヌクレオチドについての典型的なストリンジェントな条件は、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液中での予洗；６５℃、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで、一晩のハイブリダイズ；その後、６５℃での、それぞれ１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での３０分間の２回の洗浄、および６５℃での、それぞれ０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での３０分間の２回の洗浄などのハイブリダイゼーション条件になるであろう。
【００８８】
一実施形態において、ストリンジェントな条件は、４２℃の５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを使用し、５５℃の０．２×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中での４２℃での洗浄、その後、５５℃での、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる洗浄液で洗浄する。
【００８９】
１００基礎未満の長さを有するポリヌクレオチド分子に関して、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ以下の５〜１０℃である。平均で、１００ｂｐ未満の長さのポリヌクレオチド分子のＴｍは、ほぼ、（５００／オリゴヌクレオチド長）℃、低下する。
【００９０】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）として公知のＤＮＡ模倣物に関して（Nielsenら、Science.  １９９１年１２月６日；２５４巻（５０３７号）：１４９７〜５００頁）、Ｔｍ値は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドについてのものよりも高く、Giesenら、Nucleic  Acids  Res.  １９９８年１１月１日;  ２６巻（２１号）：５００４〜６頁において記載される式を使用して計算することができる。１００塩基未満の長さを有するＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドについての例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ以下の５〜１０℃である。
【００９１】
変異体ポリヌクレオチドはまた、本発明の配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重の結果として、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに類似する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをも包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない配列改変は、「サイレント変異」である。ＡＴＧ（メチオニン）およびＴＧＧ（トリプトファン）を除いて、同じアミノ酸についての他のコドンは、たとえば、特定の宿主生物においてコドン発現を最適化するために、当技術分野で認識されている技術によって変化させてもよい。
【００９２】
その生物学的活性を著しく変えることなく、コードされたポリペプチド配列における１つまたはいくつかのアミノ酸の保存的置換をもたらすポリヌクレオチド配列改変もまた、本発明において含まれる。当業者は、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をなすための方法を認識しているであろう（たとえばBowieら、１９９０年、Science  ２４７巻、１３０６９頁を参照されたい）。
【００９３】
コードされたポリペプチド配列におけるサイレント変異および保存的置換による変異体ポリヌクレオチドは、上記に記載されるように、ｔｂｌａｓｔｘアルゴリズムを介して、ｂｌ２ｓｅｑプログラムを使用して決定されてもよい。
【００９４】
ポリペプチドに関しての用語「変異体」はまた、天然に存在するポリペプチド、組換えで生産されたポリペプチド、および合成的に生産されたポリペプチドをも包含する。変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、本発明の配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を呈する。同一性は、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２４のアミノ酸位置の比較ウィンドウにわたり見つけられるかまたは配列番号１２、配列番号１４または配列番号１６のポリペプチドまたは本発明において開示されるかもしくは使用される他のポリペプチドの全長にわたり見つけられる。
【００９５】
ポリペプチド変異体はまた、それらの配列の機能的等価性を保つ可能性がある１つまたは複数の明確に同定された配列に対して類似性を呈し、偶然によって生じたことを合理的に予想することができないものをも包含する。上記に論じられるように、ＡＮＰ−ＳＰ変異体の場合には、機能は、シグナルポリペプチドもしくは抗原性ポリペプチドまたはその両方であってもよい。
【００９６】
ポリペプチド配列同一性および類似性は、以下の方法において決定することができる。対象ポリペプチド配列は、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌ２ｓｅｑにおけるプログラムのＢＬＡＳＴスーツ、バージョン２．２．１８［２００８年４月］から）を使用して、候補ポリペプチド配列と比較されるが、これは、ＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公的に入手可能である。ローコンプレキシティ領域（low  complexity  region）のフィルタリングをオフにするべき以外は、ｂｌ２ｓｅｑのデフォルトパラメーターが利用される。
【００９７】
ポリペプチド配列の類似性は、以下のＵＮＩＸ（登録商標）コマンドラインパラメーターを使用して検査されてもよい。
ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ１  −ｊ  ｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑ２  −Ｆ  Ｆ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ
パラメーター−Ｆ  Ｆは、ローコンプレキシティセクションのフィルタリングをオフにする。パラメーター−ｐは、配列のペアに適切なアルゴリズムを選択する。このプログラムは、配列の間での、類似性の領域を見つけ、それぞれのそのような領域について、ランダム配列を含有する固定基準サイズのデータベースにおいて、そのようなマッチが偶然見られることを予想することができる回数の期待数である「Ｅ値」を報告する。１よりもかなり低い、小さなＥ値については、これは、ほぼ、そのようなランダムマッチの蓋然性がある。
【００９８】
変異体ポリペプチド配列は、一般的に、明確に同定された配列のいずれか１つと比較した場合、１×１０−５未満、１×１０−６未満、１×１０−９未満、１×１０−１２未満、１×１０−１５未満、１×１０−１８未満、または１×１０−２１未満のＥ値を呈する。
【００９９】
ポリペプチド配列同一性もまた、グローバル配列アライメントプログラムを使用して、候補ポリペプチド配列および対象ポリペプチド配列の間の重複の全長にわたり計算し得る。ＥＭＢＯＳＳ−ニードル（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／で入手可能）およびGAP（Huang,  X.（１９９４年）On  Global  Sequence  Alignment  Computer  Applications  in  the  Biosciences  １０巻、２２７〜２３５頁）はまた、上記に論じられるように、ポリペプチド配列同一性を計算するのに適したグローバル配列アライメントプログラムでもある。
【０１００】
上記に記載されるＢＬＡＳＴＰの使用は、本発明によるポリペプチド変異体の決定において使用するのに好ましい。
【０１０１】
一実施形態において、変異体は、配列が、１またはそれを超える保存的アミノ酸置換、欠失、または追加もしくは挿入によって、本明細書におけるヒトＡＮＰ−ＳＰ（１〜２５）配列番号１４、ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）配列番号１２、またはＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）配列番号１６とは異なるペプチドであって、これらは、ペプチドの生物学的活性に影響しないペプチドを含む。保存的置換は、典型的に、一つのアミノ酸による、類似する特徴を有する別のアミノ酸を代える置換、たとえば以下のグループ内の置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンを含む。保存的置換の例はまた、ヒト配列と比較される、異なる哺乳動物種における置換が示される図２Ａおよび図２Ｂ中の、ＡＮＰ−ＳＰの配列においても見つけることができる。他の保存的および半保存的置換の例は、下記の表１から得ることができる。
【０１０２】
【表１】
2011514156.tif 000002
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、グループ分けされる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ：
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、他のクラスのメンバーとの交換を伴うであろう。例えば、ＡＮＰ−ＳＰ２において、ＳはＭによって置換されることを参照のこと。
【０１０３】
他の変異体は、ペプチド安定性に影響を及ぼす改変を有するペプチドを含む。そのような類似体は、たとえば、ペプチド配列において、１つまたは複数の非ペプチド結合（ペプチド結合に取って代わる）を含有していてもよい。天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、たとえば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸、たとえばベータアミノ酸もしくはガンマアミノ酸および環状類似体を含む類似体もまた含まれる。
【０１０４】
置換、欠失、追加、または挿入は、当技術分野において公知の突然変異誘発方法によってなされてもよい。当業者は、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をなす方法を認識しているであろう。たとえばBowieら、１９９０年、Science  ２４７巻、１３０６頁９、Kunkel,  T;  １９８５年、PNAS,  ８２巻４８８頁２７を参照されたい。
【０１０５】
合成の間にまたは合成の後に、たとえばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、リン酸化、アミド化によって、ブロッキング基／保護基を使用する誘導体化、およびその他同種のものによって改変されたものもまた本発明のポリペプチドに含まれる。そのような改変は、ポリペプチドの安定性または活性を増加させてもよい。そのような改変は、当技術分野において周知である。たとえばSambrookおよびAusubel（前掲）ならびにLundblad,  R、CRC  Press、１９９５年２８を参照されたい。
【０１０６】
用語「遺伝子構築物」は、ポリヌクレオチド分子、通常二本鎖ＤＮＡを指し、これは、これに限定されないが、ｃＤＮＡ分子などの他のポリヌクレオチド分子（挿入ポリヌクレオチド分子）をそれに挿入していてもよい。遺伝子構築物は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写し、任意選択で、転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする、必要なエレメントを含有していてもよい。挿入ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞に由来してもよいしまたは異なる細胞もしくは異なる生物に由来してもよいしかつ／または組換えポリヌクレオチドであってもよい。一度、宿主細胞の内部に入ると、遺伝子構築物は、宿主染色体ＤＮＡ中に組み込まれるようになり得る。遺伝子構築物は、ベクターに連結されてもよい。
【０１０７】
用語「ベクター」は、ポリヌクレオチド分子、通常二本鎖ＤＮＡを指し、これは、宿主細胞へ遺伝子構築物を運搬するために使用される。ベクターは、E.  coliなどの少なくとも１つのさらなる宿主系において複製ができてもよい。
【０１０８】
用語「発現構築物」は、挿入ポリヌクレオチド分子を転写し、任意選択で、転写物をポリペプチドに翻訳することを可能にする、必要なエレメントを含む遺伝子構築物を指す。発現構築物は、典型的に、５’から３’方向に、
（ａ）構築物が形質転換される宿主細胞における機能的なプロモーター、
（ｂ）発現されることとなるポリヌクレオチド、および
（ｃ）構築物が形質転換される宿主細胞における機能的なターミネーターを含む。
【０１０９】
用語「コード領域」または「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、適切な調節配列のコントロール下で、転写産物および／またはポリペプチドを生産することができる、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列のセンス鎖を指す。コード配列は、５’翻訳開始コドンおよび３’翻訳終止コドンの存在によって同定される。遺伝子構築物に挿入される場合、「コード配列」は、それが、プロモーター配列およびターミネーター配列ならびに／または他の調節エレメントに作動可能に連結される場合、発現することができる。
【０１１０】
「調節エレメント」および「ポリヌクレオチド調節エレメント」は、ベクター、遺伝子構築物、または発現カセットからのポリヌクレオチド挿入物の発現をコントロールするかまたはそれに影響を及ぼし、プロモーター、転写コントロール配列、翻訳コントロール配列、複製開始点、組織特異的調節エレメント、一過性調節エレメント、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リプレッサー、およびターミネーターを含む任意のエレメントを意味する。調節エレメントは、本発明によるベクター、遺伝子構築物、または発現カセットから発現されることとなるポリヌクレオチド挿入物に対して同種または異種であってもよい。
【０１１１】
ポリヌクレオチド調節エレメント（ＰＲＥ）およびＰＲＥが遺伝子構築物において作動可能に連結される配列の間の関係に関して本明細書において使用される「同種」は、ＰＲＥが、それが構築物において作動可能に連結されるコード配列と、通常、自然状態では関連することを意味する。同種のポリヌクレオチド調節エレメントは、所望のポリヌクレオチドが、本発明によるベクター、遺伝子構築物、または発現カセットから発現することができるように、所望のポリヌクレオチドに作動可能に連結されてもよい。
【０１１２】
ポリヌクレオチド調節エレメント（ＰＲＥ）およびＰＲＥが遺伝子構築物において作動可能に連結される配列の間の関係に関して本明細書において使用される「異種」は、ＰＲＥが、それが構築物において作動可能に連結されるコード配列と、通常、自然状態では関連していないことを意味する。そのようなＰＲＥは、通常、異なる遺伝子（ＡＮＰ以外の）と関連するプロモーターおよび／または任意の他の細菌、ウイルス、真核生物、もしくは哺乳動物の細胞から単離されるプロモーターを含んでいてもよい。
【０１１３】
「作動可能に連結される」は、発現されることとなる配列が、プロモーター、転写コントロール配列、翻訳コントロール配列、複製開始点、組織特異的調節エレメント、一過性調節エレメント、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、リプレッサー、およびターミネーターを含む調節エレメントのコントロール下に配置されることを意味する。
【０１１４】
用語「非コード領域」は、翻訳開始部位の上流および翻訳終止部位の下流にある非翻訳配列を指す。これらの配列はまた、それぞれ、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲとも呼ばれる。これらの領域は、転写開始および転写終結ならびに翻訳効率の調節に必要とされるエレメントを含む。
【０１１５】
ターミネーターは、転写を終結させ、翻訳配列の下流の遺伝子の３’非翻訳末端において見つけられる配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡ安定性の重要な決定基で、いくつかの場合には、空間的な調節機能を有することが見つけられた。
【０１１６】
用語「プロモーター」は、遺伝子転写を調節する、コード領域の上流の非転写シス調節エレメントを指す。プロモーターは、転写開始部位およびＴＡＴＡボックスなどの保存ボックスならびに転写因子が結合するモチーフを特定するシスイニシエーターエレメントを含む。
【０１１７】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「発現を改変する」および「発現の改変」という用語は、本発明のポリヌクレオチドに対応するゲノムＤＮＡが、改変され、したがって、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の改変に至る状況を包含するように意図される。ゲノムＤＮＡの改変は、遺伝子形質転換または突然変異を誘発するための、当技術分野において公知の他の方法によるものであってもよい。「発現の改変」は、生産されるメッセンジャーＲＮＡおよび／またはポリペプチドの量の増加または減少に関するものとすることができ、また、生産されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列における改変により、ポリペプチドの活性の改変をもたらしてもよい。
【０１１８】
本明細書において使用される「対象」は、好ましくは、哺乳動物であり、ヒトならびにネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、シカ、マウス、ラット、霊長動物（ゴリラ、アカゲザル、およびチンパンジーを含む）、ポッサム、ならびに他の家畜動物または動物園の動物などの非ヒト哺乳動物を含む。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【０１１９】
本明細書において使用される用語「提示」は、クリニックまたは病院などの医療施設での対象の提示を指す。
【０１２０】
本明細書において使用される「治療有効量」または「治療有効用量」は、望ましい生理的効果をもたらすのに十分な量または特に、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状もしくは徴候を低下させるかもしくは取り除くことを含む、所望の疾患または状態の治療に対し、望ましい結果を達成することができる量を意味する。
【０１２１】
用語「治療する」「治療すること」、または「治療」および「予防すること」は、ＡＣＤ、もしくは心臓移植拒絶またはその影響、特にＡＣＳの影響を緩和する、回復させる、管理する、予防する、抑制する、停止させる、または逆戻りさせる治療手段または予防手段を指す。対象は、ＴｎＩ、ＴｎＴ  ＢＮＰ、Ｎ−ＢＮＰおよび、改善を示す、当業者らに公知の他の通例の臨床的マーカーのうちの１つまたは複数における、観察可能なまたは測定可能な（統計的に有意な）低下を示し得る。
【０１２２】
本明細書において使用される用語「マススペクトロメトリー」は、電荷に対するイオンの質量比に基づき、イオンを濾過し、検出し、測定するための方法を指す。たとえば米国特許第５，７１９，０６０号、米国特許第６，２０４，５００号、米国特許第６，１０７，６２３号、米国特許第６，１２４，１３７号、米国特許第６，２２５，０４７号、米国特許第６，２６８，１４４号、米国特許第７，０５７，１６５号、および米国特許第７，０４５，３６６号を参照されたい。一般的なマススペクトロメトリー技術は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）および表面増強レーザー脱離イオン化法（surface-enhanced  laser  desorption  ionization）（ＳＥＬＤＩ）を含む。両方とも、非常に短いイオンパルスでフェムトモルレベルで分析物の分析を可能にする飛行時間型分析機器とつながれてもよい（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）。
【０１２３】
本発明において有用である、たとえば米国特許第５，７１９，６００号、米国特許第６，１２４，１３７号、および米国特許第６，２２５，０４７号において論じられるＳＥＬＤＩのバージョンは、表面増強アフィニティーキャプチャー（Surface-Enhanced  Affinity  Capture）（ＳＥＡＣ）、表面増強ニート脱離（Surface-Enhanced  Neat  Desorption）（ＳＥＮＤ）、ならびに表面増強感光性アタッチメントおよびリリース（Surface-Enhanced  Photolabile  Attachment  and  Release）（ＳＥＰＡＲ）を含む。
【０１２４】
本明細書において開示される一連の数に対する言及（たとえば１〜１０）は、また、その範囲内のすべての関連する数に対する言及をも組み込み（たとえば１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９、および１０）、また、その範囲内の有理数の任意の範囲をも組み込むことが意図され（たとえば２〜８、１．５〜５．５、および３．１〜４．７）、そのため、本明細書において明確に開示されるすべての範囲のすべての部分範囲は、明確に開示される。これらは、明確に意図されるものについてのほんの例であり、列挙される最低値および最高値の間の数値の可能なすべての組み合わせが、同様に、本出願において明確に述べられると考えられる。
【０１２５】
発明の詳細な説明
ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）は、心臓ナトリウム利尿ペプチドファミリーのメンバーである。図１において示されるように、プレプロＡＮＰは、１５１アミノ酸分子である。シグナルペプチドＡＮＰ−ＳＰ（１〜２５）（図２Ｂにおいて太字で示す）が、切断されて、プレプロＡＮＰ（２６〜１５１）を生じる。プレプロＡＮＰ（２６〜１５１）は、順に、さらに処理されて、生理活性形態のプレプロＡＮＰ（１２４〜１５１）およびプレプロＡＮＰ（２６〜１２３）を生じる。プレプロＡＮＰは、心房筋細胞によって合成され、貯蔵され、放出される２８アミノ酸ペプチドである。成熟ヒトＡＮＰは、図２Ｂに下線を引いて示す。ＡＮＰ−ＳＰは、通常ＡＮＰ−ＳＰ（１〜２５）配列の疎水性の中心の領域の近くで、シグナルペプチダーゼ（ＳＰＰ）によってより小さな断片へ分解されうる。
【０１２６】
ＡＮＰ−ＳＰの機能的役割は、小胞体におけるＡＮＰの輸送のコントロールに限られていると長く考えられてきた。一度、これが達成されると、次いで、シグナルペプチドは、細胞からなお分泌されることなく分解されると仮定されてきた。
【０１２７】
ごく最近では、ＡＮＰ−ＳＰが、血行路中に出現する可能性があることが推論された（しかし証明されていない）（ＷＯ２００５／０５２５９３；ＵＳ２００５／０２４４９０４）。この推論に基づいて、ＡＮＰ−ＳＰは、心疾患についての循環バイオマーカーとしての使用について示唆されてきた。本発明の出願人らは、さらに非常に予想外の発見をした。急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を有する患者において、ＡＮＳ−ＳＰの循環濃度が、患者の症状の発症後の最初の数時間において−実際に、病院またはクリニックへの提示のときに最も高い。これは、ＡＮＰ−ＳＰレベルが、Ｎ−ＡＮＰレベルと相互に関連し、そのため、ＡＣＤ、心臓移植拒絶の発症または臨床提示から、またはＡＣＤもしくは肺障害の診断未確定の発症または臨床提示から、もしくは疑わしいＡＣＤもしくは肺障害の発症または臨床提示から１２〜２４時間でそれらのピークに達することを予想することができるという予想に反する。最初の数時間において観察されるレベルは、驚いたことに、非常に高く、多くの場合、正常なコントロール集団におけるレベルよりもおよそ５〜１５倍、一般的に３〜７倍高いピークに達する。
【０１２８】
このＡＮＰ−ＳＰのレベルは、コントロール集団におけるＡＮＰ−ＳＰレベルよりも高いままである。これらの発見は、ＡＮＰ−ＳＰが、心臓移植拒絶、ＡＭＩなどの急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）を含むＡＣＤ、特に非ＳＴ上昇ＭＩ、急性心虚血の非常に明瞭な初期段階マーカーとして有用であり、ＡＣＤを肺障害から区別するために使用できることを示唆する。
【０１２９】
これらの驚くべき発見に基づいて、本出願人らは、それが、障害の発症の４、もしくは２時間以内にまたは障害の臨床提示のときに、対象から採取した生物学的試料中の循環ＡＮＰ−ＳＰまたはその変異体もしくは断片ならびにまたは代わりに、ＡＮＰ−ＳＰもしくはその変異体および断片をコードするヌクレオチド配列に対してスクリーニングするのに有用であろうということを初めて決定した。
【０１３０】
本発明において有用なのは、長さが最小４または５のアミノ酸であるＡＮＰ−ＳＰの抗原性断片または変異体である。わずか４つのアミノ酸を有するペプチドは、生物学的に活性であることが公知である。たとえば、Gilchristら、Biology  and  Reproduction,  ２１巻、７３２〜７３９頁、２００４年ならびにSelaら、Behring  Ins.  Mitt.,  ９１巻、５４〜６６頁、１９９２年を参照されたい。特に有用な断片は、ＡＮＰ−ＳＰのＮ末端（１〜１３）またはＣ末端（１６〜２５）にある。特異的な抗原性ペプチドの例は、ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）配列番号１２およびＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）配列番号１６である。これらの対応するヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１３および１７に示す。これらの配列は、出願人らによって初めて提供される。核酸分子およびペプチド形態の両方は本発明の態様として形成する。
【０１３１】
したがって、第１の態様において、本発明は、ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）（配列番号１２）またはＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）またはその変異体もしくは断片をコードする単離核酸分子であって、上述の核酸は、
（ａ）配列番号１３または配列番号１７またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）配列番号１３または配列番号１７に対して７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する配列、
（ｃ）配列番号１３または配列番号１７に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列またはその断片もしくは変異体、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列にハイブリダイズすることができる、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの配列、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの相補体であり、
ただし、上記配列が配列番号１５ではないということを条件とする、単離核酸分子を提供する。
【０１３２】
本発明はまた、本発明の核酸分子によってコードされる、単離ＡＮＰ−ＳＰポリペプチドを提供する。
【０１３３】
本発明の特定のポリペプチドは、すべて添付の配列表に記載される配列番号１２または配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本明細書において規定されるこれらのポリペプチドの変異体および断片または配列番号１２もしくは配列番号１６のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列もまた本発明の一部として企図される。一実施形態において、変異体または断片は、機能的に等価な変異体または断片である。すなわち、変異体または断片は、抗原またはシグナルペプチドとしての配列番号１２または配列番号１６の機能を維持する。
【０１３４】
本発明のまたはそうでなければ本明細書において記載される核酸分子は、一実施形態において、単離される。それらは、当業者らに公知の様々な技術を使用して、生物学的試料から単離されてもよい。例として、そのようなポリヌクレオチドは、Mullisら編、１９９４年  The  Polymerase  Chain  Reaction、Birkhauserにおいて記載されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を通して単離することができる。本発明の核酸分子は、本発明のポリヌクレオチド配列に由来する、本明細書において規定されるプライマーを使用して増幅することができる（たとえば、Mullis,  Sambrook前掲およびMolecular  Diagnostic  PCR  Handbook  Gerrit,  Vら、Springer、２００５年を参照されたい）。
【０１３５】
ポリヌクレオチドを単離するためのさらなる方法は、ハイブリダイゼーションプローブとしての、本発明のポリヌクレオチド、特に配列番号１３または配列番号１７において記載される配列を有するポリヌクレオチドのすべてまたは部分の使用を含む。ニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜などの固体支持体上に固定されたポリヌクレオチドに、標識ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズするための技術は、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。同様に、プローブは、ビーズに結合し、標的配列にハイブリダイズされてもよい。単離は、磁気分離などの公知の技術プロトコールを使用して達成することができる。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、上記に示されるとおりである。
【０１３６】
ポリヌクレオチド断片は、制限エンドヌクレアーゼ消化およびオリゴヌクレオチド合成などの、当技術分野において周知の技術によって生産されてもよい。
【０１３７】
部分的なポリヌクレオチド配列は、試料における対応する完全長ポリヌクレオチド配列を同定するために、当技術分野において周知の方法において、プローブとして使用されてもよい。そのような方法は、ＰＣＲベースの方法、５’ＲＡＣＥ（Methods  Enzymol.  ２１８巻：３４０〜５６頁（１９９３年）；Sambrookら、前掲）、およびハイブリダイゼーションベースの方法、コンピューター／データベースベースの方法を含む。放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、および生物発光標識などの検出可能な標識は、検出を容易にするために使用されてもよい。逆ＰＣＲはまた、公知の領域に基づくプライマーから始めて、本明細書において開示されるポリヌクレオチド配列の側面に位置する未知の配列の獲得を可能にする（Trigliaら、Nucleic  Acids  Res  １６巻、８１８６頁、（１９９８年））。方法は、遺伝子の公知の領域において適した断片を生成するためにいくつかの制限酵素を使用する。次いで、断片は、分子内ライゲーションによって環状化され、ＰＣＲ鋳型として使用される。異なるプライマーは、公知の領域から設計される。完全長クローンを物理的に構築するために、標準的な分子生物学アプローチを利用することができる（Sambrookら、前掲）。本発明のポリヌクレオチドの増幅を可能にするプライマーおよびプライマーペアはまた、本発明のさらなる態様をも形成する。
【０１３８】
変異体（オルソログを含む）は、記載される方法によって同定されてもよい。変異体ポリヌクレオチドは、ＰＣＲベースの方法を使用して同定されてもよい（Mullisら編  １９９４年  The  Polymerase  Chain  Reaction、Birkhauser）。典型的に、ＰＣＲによってポリヌクレオチド分子の変異体を増幅するのに有用なプライマーのポリヌクレオチド配列は、対応するアミノ酸配列の保存領域をコードする配列に基づいてもよい。
【０１３９】
変異体ポリヌクレオチドを同定するためのさらなる方法は、上記に記載されるように、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、ハイブリダイゼーションプローブとしての特定されるポリヌクレオチドのすべてまたは部分の使用を含む。典型的に、対応するアミノ酸配列の保存領域をコードする配列に基づくプローブが使用されてもよい。ハイブリダイゼーション条件もまた、プローブに同一の配列をスクリーニングする場合に使用される条件よりもストリンジェントではなくてもよい。
【０１４０】
ポリヌクレオチド変異体およびポリペプチド変異体の両方を含む変異体配列はまた、上記に論じられる、コンピューターベースの方法によって同定されてもよい。さらに、関連する配列のグループの複数回の配列アライメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Thompsonら、Nucleic  Acids  Research,  ２２巻：４６７３〜４６８０頁（１９９４年）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ＢｉｏＩｎｆｏ／ＣｌｕｓｔａｌＷ／Ｔｏｐ．ｈｔｍｌ）またはＴ−ＣＯＦＦＥＥ（Cedric  Notredameら、J.  Mol.  Biol.  ３０２巻：２０５〜２１７頁（２０００年）））または累進的ペアワイズアライメントを使用するＰＩＬＥＵＰ（Fengら、J.  Mol.  Evol.  ２５巻、３５１頁（１９８７年））を用いて実行することができる。
【０１４１】
パターン認識ソフトウェアアプリケーションは、モチーフまたはシグネチャ配列を発見するのに利用可能である。たとえば、ＭＥＭＥ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｍ  ｆｏｒ  Ｍｏｔｉｆ  Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ）は、配列のセットにおけるモチーフおよびシグネチャ配列を見つけ、ＭＡＳＴ（Ｍｏｔｉｆ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）は、クエリー配列における類似するまたは同じモチーフを同定するために、これらのモチーフを使用する。ＭＡＳＴ結果は、適切な統計データおよび見つけられたモチーフの視覚的全体像と共に、一連のアライメントとして提供される。ＭＥＭＥおよびＭＡＳＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏで開発された。
【０１４２】
ＰＲＯＳＩＴＥ（Bairochら、Nucleic  Acids  Res.  22巻、３５８３頁（１９９４年）；Hofmannら、Nucleic  Acids  Res.  ２７巻、２１５頁（１９９９年））は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列から翻訳される、特徴づけられていないタンパク質の機能を同定するための方法である。ＰＲＯＳＩＴＥデータベース（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ）は、生物学的に有意なパターンおよびプロファイルを含有し、タンパク質の公知のファミリーに新しい配列を割り当てるために、またはどの（１つもしくは複数の）公知のドメインが配列中に存在するかを決定するために、適切なコンピューターツールと共にそれを使用することができるように設計されている（Falquetら、Nucleic  Acids  Res.  ３０巻、２３５頁（２００２年））。Ｐｒｏｓｅａｒｃｈは、所与の配列パターンまたはシグネチャを用いてＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＥＭＢＬのデータベースを検索することができるツールである。
【０１４３】
タンパク質は、同じゲノム（パラログ）または異なるゲノム（オルソログ）における他のタンパク質に対するそれらの配列関連性に従って分類することができる。オルソロガス遺伝子は、共通の祖先の遺伝子からの種分化によって進化し、それらが進化させるのと同じ機能を通常保持する遺伝子である。パラロガス遺伝子は、ゲノム内で重複している遺伝子であり、遺伝子は、本来のものに関する可能性がある新しい特異性または修飾機能を獲得する可能性がある。系統発生解析法は、Tatusovら、Science  ２７８巻、６３１〜６３７頁、１９９７年において概説される。
【０１４４】
上記に述べられるように、本発明はまた、本発明の核酸分子によってコードされるＡＮＰ−ＳＰポリペプチドにも関し、これらのポリペプチドの変異体および断片を含む。
【０１４５】
上記に記載されるコンピューター／データベース方法に加えて、ポリペプチド変異体は、物理的方法によって、たとえば、本発明のポリペプチドに対して産生させた抗体を使用して発現ライブラリーをスクリーニングすることによって（Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第２版  Cold  Spring  Harbor  Press、１９８７年）、またＳａｍｂｒｏｏｋらによって記載される組換えＤＮＡ技術によって、またはそのような抗体の助けによって自然源からポリペプチドを同定することによって同定されてもよい。
【０１４６】
変異体ポリペプチドを含むポリペプチドは、固相技術を使用する直接的なペプチド合成（たとえばMerrifield、１９６３年、in  J.  Am  Chem.  Soc.  ８５巻、２１４９頁；Stewartら、１９６９年、Solid-Phase  Peptide  Synthesis、WH  Freeman  Co、San  Francisco  California；Matteucciら  J.  Am.  Chem.  Soc.  １０３巻：３１８５〜３１９１頁、１９８１年、およびAthertonら、Solid  Phase  Peptide  Synthesis:  a  practical  approach,.  IRL  press（１９８９年））またはたとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）からのシンセサイザーを使用する自動合成などの、当技術分野において周知のペプチド合成方法を使用して調製されてもよい。ポリペプチドの突然変異形態はまた、Adelmenら；  DNA  ２巻、１８３頁（１９８３年）によって記載されるように、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発などの合成方法を使用して生産されてもよい。Protein  Protocols  Handbook;  Walker,  J.  Humana  Press  ２００２年もまた参照されたい。
【０１４７】
本明細書におけるポリペプチドおよび変異体ポリペプチドは、一実施形態において単離される。それらは、当技術分野において周知の様々な技術を使用して、自然源から単離されてもよいしまたは精製されてもよい（たとえばDeutscher、１９９０年編、Methods  in  Enzymology、１８２巻、Guide  to  Protein  Purification,  および  Protein  Protocols  Handbook、前掲）。技術は、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。
【０１４８】
その代わりに、ポリペプチドおよび変異体ポリペプチドは、下記論じられるように、適した宿主細胞において組換えで発現され、細胞から分離されてよい。ポリペプチドおよび変異体は、他の使用の中でも、抗体を生成する際のおよびリガンドを生成する際の有用性を有する。
【０１４９】
本明細書において記載される遺伝子構築物は、本発明の開示されるポリペプチドをコードする、１つまたは複数の開示されるポリヌクレオチド配列および／またはポリヌクレオチドを含んでいてもよく、たとえば、細菌、菌類、昆虫、哺乳動物、または植物の生物体を形質転換するのに有用であり得る。本発明の遺伝子構築物は、本明細書において規定される発現構築物を含むように意図される。ベクター（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵ１９、Ｍｐ１８、Ｍｐ１９、ＣｏｌＥ１、ＰＣＲ１、およびｐＫＲＣなど）、ファージ（ラムダｇｔ１０など）、ならびにＭ１３プラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＴ１２７、ＲＰ４、ｐ１Ｊ１０１、ＳＶ４０、およびＢＰＶなど）、コスミド、ＹＡＣＳ、ＢＡＣ、ｐＳＡ３などのシャトルベクター、ＰＡＴ２８トランスポゾン（米国特許第５，７９２，２９４号において記載されるものなど）、ならびにその他同種のものが含まれる。
【０１５０】
構築物は、好都合に、選択遺伝子または選択可能マーカーを含んでいてもよい。典型的に、アンピシリン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンなどの抗生物質抵抗性マーカーが使用される。
【０１５１】
構築物において有用なプロモーターは、当技術分野においてすべて周知のβ−ラクタマーゼプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター系、トリプトファンプロモーター系、およびｔａｃプロモーター系を含む。酵母プロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グルコキナーゼ、およびグリセルアルデヒドレート−３−ホスホネートデヒドロゲナーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１５２】
エンハンサーもまた、転写を増強するためにプロモーターに作用するように使用されてもよい。本明細書における使用に適したエンハンサーは、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス（cytomeglovirus）初期プロモーターエンハンサー、グロビン、アルブミン、インスリン、およびその他同種のものを含む。
【０１５３】
遺伝子構築物およびベクターを生産するおよび使用するための方法は、当技術分野において周知であり、一般的に、Sambrookら（前掲）およびAusubelら、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Greene  Publishing、１９８７年において記載される。選択された宿主細胞をベクターを用いて形質転換するための方法、たとえば、Cohen,  SN;  PNAS  ６９巻、２１１０頁、１９７２年によって記載される塩化カルシウム処理もまた公知である。
【０１５４】
構築物、プロモーター、エンハンサー、および宿主細胞の全般的な議論については、Principles  of  Gene  Manipulation  and  Genomics;  Primrose,  Sら、Blackwell  Publishing  ２００６年、第７版およびFrom  Genes  to  Genomes:  Concepts  and  Applications  of  DNA  Technology、Dale,  Jら、Wiley-Interscience、２００７年、第２版を参照されたい。
【０１５５】
記載される遺伝子構築物およびベクターを含む宿主細胞は、原核生物または真核生物、たとえば酵母、細菌、菌類、昆虫（たとえばバキュロウイルス）、動物、哺乳動物、または植物の生物体の源に由来してもよい。一実施形態において、宿主細胞は、単離宿主細胞である。宿主細胞として最も一般的に使用される原核生物は、E.  coliの株である。他の原核生物宿主は、Pseudomonas、Bacillus、Serratia、Klebsiella、Streptomyces、Listeria、Saccharomyces、SalmonellaおよびMycobacteriaを含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
組換えタンパク質の発現のための真核細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、２９３、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、およびＣＯＳ細胞ならびにＰｒＥＣ、ＬＮＣａＰ、Ｄｕ  １４５、およびＲＷＰＥ−２などの前立腺癌細胞系を含むが、これらに限定されない。細胞は、ＡＴＣＣ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡから入手可能である。
【０１５７】
本発明の核酸分子の発現と適合性の原核生物プロモーターは、公知技術の構成的プロモーター（バクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーターおよびｐＢＲ３２２のベータ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーターなど）ならびに調節可能プロモーター（ｌａｃＺ、ｒｅｃＡ、およびｇａｌなど）を含む。コード配列の上流のリボソーム結合部位もまた、発現に必要とされ得る。
【０１５８】
発現構築物などの遺伝子構築物を含む宿主細胞は、ポリペプチドの組換え生産のための方法において有用である。そのような方法は、当技術分野において周知である（たとえばSambrookら  前掲を参照されたい）。方法は、一般的に、本発明のポリペプチドの発現および選択に適したまたは本発明のポリペプチドの発現および選択を促す条件の適切な培地における宿主細胞の培養を含む。選択可能マーカーを有する細胞は、本発明のポリペプチドを発現する宿主細胞の選択に適切な培地上でさらに成長させてもよい。本発明のポリペプチドを発現する形質転換宿主細胞は、ポリペプチドの発現に適した条件下で選択され、培養される。発現組換えポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、およびその他同種のものを含む、当技術分野において周知の方法を使用して、培地から分離され、精製されてもよい（たとえばDeutscher編、１９９０年、Methods  in  Enzymology、１８２巻、Guide  to  Protein  Purification）。宿主細胞はまた、本発明の発現ポリペプチドによって生成される産物の生産のための方法において有用である可能性がある。
【０１５９】
他の態様において、本発明は、対象における急性心障害（ＡＣＤ）を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、
ＡＣＤの発症の４もしくは２時間以内にまたはＡＣＤの提示の４もしくは２時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および
上述のＡＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤを示す方法を提供する。。
【０１６０】
他の態様において、本発明は、対象における、急性心障害（ＡＣＤ）の治療に対する応答をモニターするための方法であって、ＡＣＤの発症の４もしくは２時間以内にまたはＡＣＤの提示の４もしくは２時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および上述のＡＮＰ−ＳＰのレベルをコントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルからのＡＮＰ−ＳＰの測定レベルにおける変化は、治療に対する応答を示す方法を提供する。
【０１６１】
ＢＮＰ前駆体、たとえばＢＮＰ２７〜１０２などの他の心臓ナトリウム利尿ペプチドが、心臓移植拒絶エピソードを予測するまたは診断するのにならびに呼吸困難（息切れ）に関する肺の原因と心血管の原因との間を区別するために使用することができることは当技術分野において公知である。ＵＳ２００５／０２４４９０２を参照されたい。したがって、ＡＮＰ−ＳＰが、心組織分析に基づく心臓移植拒絶の早期マーカーとしておよび急性心障害と肺障害を区別するために使用することができることは同様に予測可能である。
【０１６２】
したがって、本発明はまた、対象における心臓移植拒絶エピソードを予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、心臓移植の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および上述のＡＮＰ−ＳＰのレベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、移植拒絶を示す方法をも提供する。
【０１６３】
本発明はまた、対象における肺障害と急性心障害（ＡＣＤ）と区別するための方法であって、障害の提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および上述のＡＮＰ−ＳＰのレベルをコントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、コントロールレベルよりも高い、測定ＡＮＰ−ＳＰレベルは、ＡＣＤを示す方法をも提供する。
【０１６４】
一実施形態において、本発明は、対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、ＡＣＤ、移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症またはその臨床提示の最初の４時間以内に、対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む方法を提供する。ＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較され、コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤまたは移植拒絶を示す。
【０１６５】
当業者ならば、評価目的のために、ＡＮＰ−ＳＰレベルが、対照標準値またはコントロール値との相互関係を必要とすることを十分に理解するであろう。
【０１６６】
本明細書において使用されるように、コントロールは、ＡＮＰ−ＳＰ試料が採取され、平均ＡＮＰ−ＳＰレベルが決定される個人または群のものとすることができる。通常、個人または群は、正常で健康な個人またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害に罹患していることが知られていない個人の群を含む。ほとんどの個人におけるＡＮＰ−ＳＰレベルは、１４〜２６ｐｍｏｌ／Ｌの間にあり、平均コントロールレベルは、約２０．８ｐｍｏｌ／Ｌである。その代わりに、コントロールレベルは、以前に試験された個人または群からの複数の読み取り値に基づいて評価されてもよい。コントロールレベルの他の例は、心組織におけるＡＮＰ−ＳＰおよびＡＮＰのレベルの間のレシオメトリックな尺度（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅ）である。対象のＡＮＰ−ＳＰレベルは、そのコントロール集団についての平均ＡＮＰ−ＳＰレベルと比較することができる。心組織コントロール集団におけるＡＮＰ−ＳＰレベルは、正常なコントロール集団におけるＡＮＰ−ＳＰレベルよりも、約１．５〜３倍、一般的に２〜３倍、または２．５〜３倍高くあり得る。その代わりに、コントロールは、より早期の時間に、同じ対象からとられる１つまたは複数の読み取り値またはそのような読み取り値の平均値であってもよい。特定の方法に適切なコントロールおよびコントロールレベルの確認は、当技術分野において周知である。
【０１６７】
試料におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定する工程は、１つの試料に対する１回の測定またはいくつかの試料に対する繰り返しの測定としてもよいことが理解されるであろう。したがって、一実施形態において、測定は、臨床提示開始の、または臨床提示の最初の４時間以内に、２時間以内に、または１時間以内の異なる時間において対象から採取された試料におけるＡＮＰ−ＳＰの１〜２０回の測定、１〜１０回、１〜５回、１〜３回、１もしくは２回、または２もしくは３回の測定を含んでいてもよい。上記４時間または２時間の期間外の１回のまたは繰り返しの測定もまた、ＡＮＰ−ＳＰレベルが、正常なコントロールレベルまたは心組織コントロールレベルに対して低下したかどうかを確証するためになされてもよい。
【０１６８】
一実施形態において、方法は、発症または提示の１時間内に採取された１つまたは２つの試料におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定する工程、その後の、発症もしくは提示またはＡＮＰ−ＳＰレベルの最初の測定の２〜４時間以内または２〜３時間以内に採取された１つまたは２つの試料におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定する工程を含む。
【０１６９】
上記に述べられるように、発症または提示の最初の４または２時間以内に測定されるＡＮＰ−ＳＰレベルは、正常なコントロールにおいて測定されるＡＮＰ−ＳＰレベルよりも通常３〜７倍または５〜７倍高い。上記に述べられるように、３〜６、３〜５、３〜４、４〜７、４〜６、４〜５、および５〜６倍高い特定の範囲もまた範囲内に含まれる。
【０１７０】
他の実施形態において、４０〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４２〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の、試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＡＣＤ、心臓移植拒絶を示すまたはＡＣＤを肺障害と区別する。
【０１７１】
上記に述べられるように、範囲はまた、５０〜１３０ｐｍｏｌ／Ｌ、５５〜１２０ｐｍｏｌ／Ｌ、６０〜９０ｐｍｏｌ／Ｌ、およびその他同種のものなどの範囲内の任意の値を含む。
【０１７２】
上記に規定される生物学的試料は、ＡＮＰ−ＳＰがそこに存在し得るかまたは分泌され得る任意の生物学的物質とすることができる。一実施形態において、上記生物学的試料は、循環性生物学的試料、たとえば血液、血清、または血漿である。一実施形態において、生物学的試料は、心組織である。
【０１７３】
核酸アッセイ
試料におけるＡＮＰ−ＳＰの存在およびその発現レベルは、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＦＩＳＨ、もしくはｍＲＮＡの転写を定量するための定量的ＰＣＲ［（Thomas、Proc.  Nat,  Acad.  Sci.  USA  ７７巻：５２０１〜５２０５頁  １９８０年）、（Jain  KK、Med  Device  Technol.  ２００４年５月；１５巻（４号）：１４〜７頁）］、ドットブロッティング、ＤＮＡ分析、または本明細書において提供される配列に基づいて、適切に標識されたプローブを使用するインサイツハイブリダイゼーションなどの、当技術分野において公知の方法に従って決定されてもよい。
【０１７４】
したがって、本発明はまた、試料における、本発明の核酸分子の存在の検出のためのアッセイであって、該方法は、
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブと試料を接触させる工程および
（ｂ）試料におけるハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含むアッセイをも提供する。
【０１７５】
一実施形態において、核酸分子は、配列番号１３もしくは配列番号１７またはその変異体もしくは断片である。
【０１７６】
好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブは、標識プローブである。標識の例は、蛍光標識、化学発光標識、放射性酵素標識、およびビオチン−アビジン標識を含む。標識プローブの標識および可視化は、上記のものなどの公知の技術の方法に従って実行される。
【０１７７】
便宜上、核酸プローブは、樹脂（ポリアクリルアミドなど）、炭水化物（セファロースなど）、プラスチック（ポリカーボネートなど）、およびラテックスビーズを含む固体支持体上に固定されてもよい。
【０１７８】
上記に論じられるように、核酸分子プローブは、好ましくは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡ分子であってもよい。一実施形態において、プローブは、配列番号１３および配列番号１７であるかまたは配列番号１３および配列番号１７を含む。
【０１７９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上記に論じられるとおりである。
【０１８０】
核酸マーカーの発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む電気泳動技術などの、公知技術の技法を使用して決定されてもよい。これらの技法を使用して、本発明の核酸分子のＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列は、対象試料において増幅され、ＤＮＡもしくはｃＤＮＡまたはＲＮＡのレベルが測定される。
【０１８１】
代替方法において、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡのレベルは、増幅を伴わないで試料において直接測定されてもよい。
【０１８２】
最近の好ましい方法は、ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析である。ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析における使用のためのプローブは、本明細書において同定されるマーカー配列に基づいて調製されてもよい。一実施形態において、プローブは、対照標準配列の少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２４、少なくとも３０、少なくとも３６、少なくとも４２、少なくとも５１、少なくとも６０、もしくは少なくとも７０、またはそれを超える隣接するヌクレオチドを含む。
【０１８３】
その代わりに、発現レベルは、核酸配列に特異的なプライマーを使用して、逆転写ベースのＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを使用して測定されてもよい。望ましい場合、試料におけるマーカーのレベルの比較は、コントロール核酸分子に関してなすことができ、この発現は、測定されているパラメーターまたは条件に非依存性である。コントロール核酸分子は、レベルが障害または移植拒絶状態と健康な状態との間で異ならない分子を指す。コントロール分子のレベルは、比較集団におけるレベルを標準化するために使用することができる。そのようなコントロール分子の例は、ＧＡＰ−ＤＨである。本発明のマーカーは、障害で、レベルを変化させる。
【０１８４】
ペプチドアッセイ
一実施形態において、測定工程は、ＡＮＰ−ＳＰおよびＡＮＰ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体に結合する（選択的にまたは特異的に結合することを含む）結合剤の間の結合を検出する工程を含む。測定におけるプレ工程として、ＡＮＰ−ＳＰは、ＡＮＰ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体に結合する結合剤と結合されてもよい。
【０１８５】
したがって、一実施形態において、本発明は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の発症から４時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰについてのアッセイであって、任意の公知の方法を使用して、試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを検出し、測定する工程を含むアッセイを提供する。
【０１８６】
他の実施形態において、本発明は、ＡＮＰ−ＳＰについてのアッセイであって、
（ａ）生物学的試料からの１つまたは複数のＡＮＰ−ＳＰポリペプチドを結合させる工程であって、ＡＮＰ−ＳＰポリペプチドは、群ＡＮＰ−ＳＰ  １〜１０およびＡＮＰ−ＳＰ  １６〜２５またはその変異体もしくは断片から選択される工程ならびに
（ｂ）結合したＡＮＰ−ＳＰポリペプチドのレベルを測定する工程を含むアッセイを提供する。
【０１８７】
一実施形態において、結合剤は、選択的（特異的）結合剤である。すなわち、それは、生物学的事象の他のマーカー、より具体的にはＡＮＰまたはＮＴ−ＡＮＰと低い交差反応性を有する。一実施形態における結合剤は、抗体またはその抗原結合断片である。
【０１８８】
本発明はまた、そのような抗体または抗体の抗原結合断片に関する。抗体は、単離形態または精製形態であってもよい。ＡＮＰ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体に結合する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、および遺伝的組換えによって生産されるキメラ抗体のすべてのクラスを含む任意の形態であってもよい。マウス、ラットまたはウサギなどの動物を、ＡＮＰ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体で免疫することによって得られる抗血清も含まれる。抗体は、ＡＮＰ−ＳＰ断片のグループにおける共通のＡＮＰ−ＳＰ配列にまたは特異的なＡＮＰ−ＳＰ断片にまたはＡＮＰ−ＳＰ断片のセットに結合してもよい。
【０１８９】
抗体の断片または修飾抗体もまた、それが、ＡＮＰ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体に結合する限り、本明細書において使用されてもよい。抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｃ、またはＦｖ断片もしくはＨ鎖およびＬ鎖からのＦｖ断片が、適切なリンカーによってライゲーションされる一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であってもよい（Hustonら  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：５８７９〜８３頁（１９８８年））。抗体の「Ｆｃ」部分は、１つまたは複数の重鎖定常領域ドメイン；ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含むが重鎖可変領域を含まない免疫グロブリン重鎖の部分を指す。
【０１９０】
抗体の「Ｆｖ」部分は、完全抗原認識部位および抗原結合性部位を含有する最小の抗体断片である。領域は、密接な非共有結合の１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体から成る。
【０１９１】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨＩ）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む、ＣＨＩドメインのＦａｂカルボキシ末端に追加された少数の残基を有する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、分離された、Ｆａｂ’断片の間にシステインヒンジを有する、Ｆａｂ’断片の対を表す。Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの抗原結合性部位を有する。Ｆａｂ断片は、抗体のパパイン消化によって生産され得る。
【０１９２】
抗体および断片の議論については、たとえば、PNAS  USA  ８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年）、Protein  Eng  ８巻（１０号）１０５７〜１０６２頁（１９９５年）；The  Pharmacology  of  Monoclonal  Antibodies、１１３巻、Springer-verlag  １９９４年、RosenburgおよびMoore編；PNAS  USA  ９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）；Nature  ３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Nature  ３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）、ならびにＷＯ２００５／００３１５４を参照されたい。
【０１９３】
抗体を調製し、抗体を検出し、改変し、単離するための方法は、当技術分野において周知である（たとえばMaintaining  and  using  Antibodies:  A  Practical  Handbook、Howard,  Gら、CRC  Press  ２００６年；Protein-protein  Interactions:  A  Molecular  Cloning  Manual、Golemis  E（編）、CSHL  Press、２００２年；HarlowおよびLane（１９９８年）１０、Milstein１８、Suresh１９、およびBrennan２０）参照。一実施形態において、使用される抗体は、適した宿主哺乳動物を免疫することによって生産される。ＡＮＰ−ＳＰを含む融合タンパク質もまた、免疫原として使用されてもよい。
【０１９４】
抗体は、本明細書において論じられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ビオチン、ストレプトアビジン、ならびに化学発光標識、蛍光標識、熱量測定標識、および放射性免疫測定標識などの様々な分子との抱合によって改変されてもよい。改変抗体は、抗体を化学的に改変することによって得ることができる。これらの改変方法は、本分野において従来のものである。
【０１９５】
その代わりに、抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域およびヒト抗体に由来する定常領域の間のキメラ抗体として得ることができるかまたは非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域、（ＦＲ）、および定常領域を含むヒト化抗体として得られてもよい。そのような抗体は、公知技術の方法を使用して調製することができる１６、１７、２２。
【０１９６】
手短に言えば、ポリクローナル抗体を調製するための方法は、当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、たとえば、免疫剤および望ましい場合、アジュバントの１回または複数回の注射によって、哺乳動物において産生させることができる。典型的に、免疫剤および／またはアジュバントは、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって哺乳動物に注射される。免疫剤は、ＡＮＰ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体またはその融合タンパク質を含んでいてもよい。免疫されている哺乳動物において免疫原性であることが公知のタンパク質に免疫剤を結合させることは有用である可能性がある。そのような免疫原性タンパク質の例は、キーホールリンペットヘモシニアン、ウシ血清アルブミン、ウシチログロブリン、およびダイズトリプシン阻害剤を含むが、これらに限定されない。用いられてもよいアジュバントの例は、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ  ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）を含む。免疫プロトコールは、不必要な実験を伴わないで当業者によって選択されてもよい。
【０１９７】
モノクローナル抗体は、当技術分野において周知のハイブリドーマ方法を使用して調製されてもよい。たとえばKohlerおよびMilstein、１９７５年１１、米国特許第４，１９６，２６５号、米国特許第４，８１６，５６７号、およびGolemis（前掲）を参照されたい。ハイブリドーマ細胞は、適した培地において培養されてもよい、その代わりに、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物における腹水としてインビボで成長させてもよい。好ましい不死化細胞系は、マウス骨髄腫系であり、これは、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡから得ることができる。イムノアッセイは、所望の抗体を分泌する不死化細胞系をスクリーニングするために使用することができる。ＡＮＰ−ＳＰまたはその断片もしくは変異体の配列は、スクリーニングにおいて使用されてもよい。
【０１９８】
したがって、ＡＮＰ−ＳＰ特異的モノクローナル抗体を分泌することができる不死化細胞系であるハイブリドーマもまた本明細書において企図される。
【０１９９】
ハイブリドーマ細胞によって生産されるモノクローナル抗体の結合特異性を確証するための周知の手段は、免疫沈降、放射結合免疫アッセイ（ｒａｄｉｏｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、およびウエスタンブロットを含む（Lutzら、Exp.  Cell.  Res.  １７５巻：１０９〜１２４頁（１９８８年）、Golemis（前掲）、およびHoward（前掲））。たとえば、モノクローナル抗体の結合親和性は、たとえば、Munsonら、Anal  Biochem  １０７巻：２２０頁（１９８０年）において記載されるスキャッチャード分析によって決定することができる。免疫動物からの試料は、ポリクローナル抗体の存在について同様にスクリーニングされてもよい。
【０２００】
モノクローナル抗体はまた、組換え宿主細胞から得ることもできる。抗体をコードするＤＮＡは、ハイブリドーマ細胞系から得ることができる。次いで、ＤＮＡは、発現ベクターの中に配置され、宿主細胞（たとえばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）の中にトランスフェクトされ、抗体は、宿主細胞において生産される。次いで、抗体は、標準的な技術を使用して単離されてもよいしかつ／または精製されてもよい。
【０２０１】
ファージライブラリーからなどのモノクローナル抗体生産のための他の公知の技術の技術もまた使用されてもよい。たとえばNature  ３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）を参照されたい。
【０２０２】
検出を容易にするために、本明細書における抗体および断片は、蛍光化合物、生物発光化合物、および化学発光化合物ならびに放射性同位体、磁気ビーズ、ならびに親和性標識（たとえばビオチンおよびアビジン）などの検出可能なマーカーを用いて標識されてもよい。結合の間接的な測定を可能にする標識の例は、基質が有色蛍光産物を提供できる酵素を含み、適した酵素は、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびその他同種のものを含む。蛍光色素（たとえばテキサスレッド、フルオレスセイン、フィコビリタンパク質、およびフィコエリトリン）は、蛍光活性化セルソーターと共に使用することができる。標識技術は、当技術分野において周知である。
【０２０３】
細胞によって分泌されるモノクローナル抗体は、たとえば逆相ＨＰＬＣ、プロテインＡ−セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地または腹水から単離されてもよいしまたは精製されてもよい。たとえばScopes、Protein  Purification:  Principles  and  Practice、Springer-Verlag、NY（１９８２年）を参照されたい。
【０２０４】
モノクローナル抗体または断片はまた、組換えＤＮＡ手段によって生産されてもよい（たとえば米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。同種のマウス配列の代わりにヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインについてのコード配列を置換する（上記の米国特許第４，８１６，５６７号）などのＤＮＡ改変もまた可能である。抗体は、一価抗体であってもよい。一価抗体を調製するための方法は、当技術分野において周知である（米国特許第５，３３４，７０８号、第５，８２１，０４７号、および第７，４７６，７２４号）。キメラ（米国特許第４，８１６，５６７号）、二価抗体（米国特許第５，８４３，７０８号）、および多価抗体の生産もまた、本明細書において企図される（米国特許第６，０２０，１５３号）。
【０２０５】
キメラモノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来するまたは特定の抗体（サブ）クラスに属する抗体における対応する配列と同一であるまたは同種である抗体である。鎖の残りは、それらが、必要とされる生物学的活性を呈する限り、他の種に由来するまたは他の抗体（サブ）クラスに属する抗体における対応する配列およびその断片に同一であるまたは同種である。（米国特許第４，８１６，５６７号  前掲を参照されたい）。
【０２０６】
本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含んでいてもよい。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が非ヒト種のＣＤＲからの残基で交換されるヒト免疫グロブリンを含む。ウサギ、ラット、およびマウスなどの非ヒト源からのヒト化抗体の生産は、周知である１２、１３、１４。
【０２０７】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー１５およびトランスジェニック方法を含む、当技術分野において公知の様々な技術を使用して生産することができる。たとえばNeuberger  １９９６年１６およびVaughanら、１９９８年１７を参照されたい。
【０２０８】
二重特異性抗体もまた、有用であり得る。これらの抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体である。ＡＮＰ−ＳＰまたはその変異体もしくは断片およびプレプロＡＮＰ、ＡＮＰ、ＣＫ−ＭＢ、ＴｎＴ、ＴｎＩ、ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰ、およびミオグロビンを含む群から選択される抗原。２つを超える特異性を有する抗体、たとえば三重特異性抗体もまた、本明細書において企図される。
【０２０９】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野において公知である。たとえばMilsteinおよびCuello  １９８３年１８、Sureshら、１９８６年１９、およびBrennanら、１９８５年２０を参照されたい。
【０２１０】
抗体が結合するまたは選択的に結合するＡＮＰ−ＳＰは、上記に論じられるＡＮＰ−ＳＰまたはその変異体もしくは断片である。
【０２１１】
一実施形態において、抗体は、ＡＮＰ−ＳＰのＣ末端（１６〜２５）に結合する。結合剤が選択的に結合する特異的な抗原性ペプチドの例は、ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）配列番号１２である。他の例は、ＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）配列番号１６である。
【０２１２】
ＡＮＰ−ＳＰの結合は、特異的（抗体ベース）および非特異的（ＨＰＬＣ固相など）を含む、当技術分野において公知の任意の手段によって検出することができる。最も一般的に、本明細書における抗体は、上記に述べられるＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどのアッセイを使用して検出される。単独のまたはクロマトグラフィーフォーマットなどの非特異的結合剤と組み合わせた競合的結合測定、サンドイッチアッセイ、非競合的アッセイ、蛍光免疫測定、免疫蛍光アッセイ、またはイムノラジオメトリックアッセイ、ルミネセンスアッセイ、ケミルミネセンス（chemiluniescence）アッセイ、および表面増強レーザー脱離イオン化法（ＳＥＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴＩＣＲ）などのマススペクトロメトリー分析もまた実行可能である。たとえばGolemis,  EおよびHoward  G.（前掲）を参照されたい。
【０２１３】
好都合に、抗体は、ＡＮＰ−ＳＰ／抗体複合体の洗浄および単離を容易にするために固体基質に固定することができる。固体支持体への抗体の結合は、公知技術の技法を使用して達成されてもよい。たとえばHandbook  of  Experimental  Immunology、第４版、Blackwell  Scientific  Publications、Oxford（１９８６年）を参照されたい。抗体に有用な固体基質は、ガラス、ナイロン、紙、およびプラスチックを含む。同様に、ＡＮＰ−ＳＰは、イオン交換、逆相（たとえばＣ１８コーティング）、または他の材料を用いて任意選択でコートされたかまたは誘導体化された吸着性シリカまたは樹脂粒子またはシリコンチップなどの固体基質上に吸着することができる。基質は、ビーズ、プレート、チューブ、スティック、またはバイオチップの形態をしていてもよい。バイオチップの例は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＡ、ＵＳＡ））およびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡから入手可能なＰａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＣｈｉｐを含む。米国特許第６，２２５，０４７号および米国特許第６，３２９，２０９号を参照されたい。バイオチップは、クロマトグラフィー表面を含んでいてもよい。アドレス指定可能な位置を有するバイオチップまたはプレートおよび別々の（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）マイクロタイタープレートは、特に有用である。複数の分析物に向けられる抗体を含有するビーズが、単一の試料における分析物のレベルを測定するために使用される多重システムもまた使用に好ましい。測定されることとなる分析物は、他の心性のマーカーおよびＡＮＰ−ＳＰまたはその変異体もしくは断片を含んでいてもよい。本明細書における使用に適した多重ビーズシステムの１つの例は、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｆｌｕｒｏｋｉｎｅ  Ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇシステム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）である。
【０２１４】
抗体アッセイ方法は、当技術分野において周知である。たとえば米国特許第５，２２１，６８５号、米国特許第５，３１０，６８７号、米国特許第５，４８０，７９２号、米国特許第５，５２５，５２４号、米国特許第５，６７９，５２６号、米国特許第５，８２４，７９９号、米国特許第５，８５１，７７６号、米国特許第５，８８５，５２７号、米国特許第５，９２２，６１５号、米国特許第５，９３９，２７２号、米国特許第５，６４７，１２４号、米国特許第５，９８５，５７９号、米国特許第６，０１９，９４４号、米国特許第６１１３，８５５号、米国特許第６，１４３，５７６号ならびに非標識アッセイについては、米国特許第５，９５５，３７７号および米国特許第５，６３１，１７１号を参照されたい。アッセイフォーマットおよび条件の記載についてはZola、Monoclonal  Antibodies:  A  Manual  of  Techniques  １４７〜１５８頁（CRC  Press,  Inc  １９８７年）、HarlowおよびLane（１９９８年）Antibodies,  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbour  Publications、New  York、ならびにＵＳ  ２００５／００６４５１１も参照されたい。上記の参考文献はすべて、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【０２１５】
イムノアッセイ分析機器もまた、周知であり、十分に記載されるものの中でもＢｅｃｋｍａｎ  Ａｃｃｅｓｓシステム、Ａｂｂｏｔｔ  ＡｘＳｙｍシステム、Ｒｏｃｈｅ  ＥｌｅｃＳｙｓシステム、およびＤａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｓｔａｔｕｓシステムが挙げられる２１。
【０２１６】
ＡＮＰ−ＳＰおよび抗体の結合による複合体の形成を、直接または間接的に検出することができる。直接的な検出は、蛍光、ルミネセンス、放射性核種、金属、染料、およびその他同種のものなどの標識を使用して実行される。間接的な検出は、ジゴキシンなどの検出可能な標識またはホースラディシュペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素を結合させて標識ＡＮＰ−ＳＰ抗体を形成し、その後の工程で、検出試薬の添加により標識を検出することが含まれる。
【０２１７】
ホースラディシュペルオキシダーゼは、たとえば、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）およびペルオキシドなどの基質とインキュベートすることによって吸光度を測定することができる有色産物を生成することができるか、またはルミノールおよびペルオキシドとインキュベートすることによって当技術分野において公知なルミノメーターにおいて測定することができる化学発光の光を生じさせることができる。ビオチンまたはジゴキシンは、それらに強く結合する結合剤と反応させることができる。たとえば、タンパク質アビジンおよびストレプトアビジンは、ビオチンに強く結合する。次いで、さらなる測定可能な標識は、タンパク質との直接反応によってもしくはＭＣＳおよびカルボジイミドなどの一般的に使用可能な架橋剤の使用を通してもしくはキレート剤の追加によってのいずれかでそれに共有結合させるかまたはそれに連結させる。
【０２１８】
一般的に、複合体は、たとえば遠心分離によって複合体を形成していない試薬から分離される。抗体が標識される場合、複合体の量は、検出される標識の量によって反映される。その代わりに、ＡＮＰ−ＳＰは、抗体に結合させることによって標識されてもよく、抗体標識ＡＮＰ−ＳＰが、非標識ＡＮＰ−ＳＰを含有する生物学的試料とインキュベートされる場合に、結合した標識ＡＮＰ−ＳＰにおける低下を測定することによる競合的アッセイにおいて検出されてもよい。他のイムノアッセイ、たとえばサンドイッチアッセイが、使用されてもよい。
【０２１９】
一実施形態において、通常一晩の１８〜２５時間、４℃での、または１〜２〜４時間、２５℃〜４０℃での抗体との接触後に、結合剤（抗体）に結合した標識ＡＮＰ−ＳＰは、非結合の標識ＡＮＰ−ＳＰから分離される。液相アッセイにおいて、分離は、セルロースまたは磁気物質などの固相粒子に結合した抗ガンマグロブリン抗体（二次抗体）の添加によって達成されてもよい。二次抗体は、一次抗体に使用される種と異なる種において産生され、一次抗体に結合する。そのため、一次抗体はすべて、二次抗体を介して固相に結合する。この複合体は、遠心分離または磁気引力によって溶液から取り出され、結合した標識ペプチドは、それに結合した標識を使用して測定される。遊離標識から結合した標識を分離するための他の選択肢は、溶液から沈殿する免疫複合体の形成、ポリエチレングリコールによる抗体の沈殿または遊離標識ペプチドの木炭への結合、およびろ過液の遠心分離による溶液からの取り出しを含む。分離した結合相または遊離相における標識は、上記に示されるものなどの適切な方法によって測定される。
【０２２０】
競合的結合測定はまた、固相アッセイとして構成することもでき、これらは、実行するのに、より容易であり、そのため、上記のものに好ましい。このタイプのアッセイは、ウェルを有するプレート（ＥＬＩＳＡプレートもしくはイムノアッセイプレートとして一般的に公知）、固体ビーズ、またはチューブの表面を使用する。一次抗体は、プレート、ビーズ、もしくはチューブの表面に吸着させるかまたは共有結合させるかまたはプレートに吸着されるもしくは共有結合させた二次抗ガンマグロブリンもしくは二次抗Ｆｃ領域抗体を通して間接的に結合する。試料および標識ペプチド（上記）は、共にまたは連続的にプレートに添加され、試料中のＡＮＰ−ＳＰと標識ペプチドとの間の抗体結合についての競合を可能にする条件下でインキュベートされる。非結合標識ペプチドは、引き続いて、吸引除去することができ、プレートをすすぎ、プレートに付着した抗体結合標識ペプチドを残す。次いで、標識ペプチドは、上記に記載される技術を使用して測定することができる。
【０２２１】
サンドイッチタイプアッセイは、より高い特異性、より速い速度、およびより広い測定範囲を有する。このタイプのアッセイにおいて、ＡＮＰ−ＳＰに対する過剰な一次抗体は、固相競合結合アッセイについて上記に記載されるように、吸着、共有結合、または抗Ｆｃ抗体もしくは抗ガンマグロブリン抗体を介して、ＥＬＩＳＡプレートのウェル、ビーズ、またはチューブに結合させる。試料液体または抽出物は、固相に結合した抗体と接触させられる。抗体が過剰にあるので、この結合反応は、通常、迅速である。ＡＮＰ−ＳＰに対する二次抗体もまたは、一次抗体と同時にまたは連続的に試料とインキュベートされる。この二次抗体は、一次抗体の結合部位とは異なるＡＮＰ−ＳＰ上の部位に結合するように選ばれる。これらの２つの抗体反応は、２つの抗体の間でサンドイッチにされた試料由来のＡＮＰ−ＳＰのサンドイッチをもたらす。二次抗体は、競合的結合測定について上記に詳述されるように、容易に測定可能な化合物を用いて通常標識される。その代わりに、二次抗体に特異的に結合する標識三次抗体が、試料と接触させられてもよい。非結合物質を洗い流した後に、結合した標識抗体は、競合的結合測定について概説される方法によって測定し、定量することができる。
【０２２２】
ディップスティックタイプアッセイもまた、使用されてもよい。これらのアッセイは、当技術分野において周知である。それらは、たとえば、特異的な抗体が結合した、金粒子または有色ラテックス粒子などの小さな粒子を用いる。測定されることとなる液体試料を、粒子を用いて前負荷された（ｐｒｅｌｏａｄｅｄ）膜または紙のストリップの一方の末端に添加し、ストリップに沿って移動させてもよい。粒子への試料中の抗原の結合は、さらにストリップに沿って、抗原または抗体などの、粒子に対する結合剤を含有するトラッピング部位に結合する粒子の能力を修飾する。これらの部位での有色粒子の蓄積は、色の発生をもたらし、これは、試料における競合抗原の濃度に依存する。他のディップスティック法は、試料における抗原をトラップするために、紙または膜のストリップに共有結合される抗体を用いてもよい。ホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素に結合した二次抗体を用いて基質とのインキュベーションを行う続く反応により、色、蛍光、または化学発光の光出力がもたらされ、試料における抗原の定量を可能にする。
【０２２３】
以下の実施例において論じられるように、一実施形態において、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、使用される実験室技術である。あるＲＩＡにおいて、放射標識抗原および非標識抗原は、抗体との競合的結合において用いられる。共通の放射標識物は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、および１４Ｃを含む。
【０２２４】
特異的な抗体および放射標識抗体結合タンパク質と共にＡＮＰ−ＳＰの沈殿を伴うラジオイムノアッセイは、試料におけるＡＮＰ−ＳＰの量に比例する、沈殿物における標識抗体の量を測定することができる。その代わりに、標識ＡＮＰ−ＳＰが、生産され、非標識抗体結合タンパク質が使用される。次いで、試験されることとなる生物学的試料が、添加される。標識ＡＮＰ−ＳＰからのカウントの減少は、試料におけるＡＮＰ−ＳＰの量に比例する。
【０２２５】
ＲＩＡにおいて、遊離ＡＮＰ−ＳＰから結合したＡＮＰ−ＳＰを分離することもまた実行可能である。これは、二次抗体によるＡＮＰ−ＳＰ／抗体複合体を沈殿させることを含んでいてもよい。たとえば、ＡＮＰ−ＳＰ／抗体複合体がウサギ抗体を含有する場合、次いで、ロバ抗ウサギ抗体を用いて、複合体を沈殿させ、標識の量を計数する。たとえばＬＫＢ、Ｇａｍｍａｍａｓｔｅｒカウンターにおいて。Huntら２１を参照されたい。
【０２２６】
本発明の方法は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の１つまたは複数の非ＡＮＰ−ＳＰマーカーのレベルを測定する工程をさらに含む。他の１つまたは複数のマーカーのレベルは、コントロール集団からの平均コントロールレベルと比較することができる。平均コントロールレベルからの測定レベルにおける偏差は、グルコース処理障害、糖尿病もしくはそれに対する素因、ＡＣＤ、または心臓移植拒絶を予測するものまたは診断するものである。
【０２２７】
本発明の方法は、ＡＣＤまたは心臓移植拒絶を示す、ＡＮＰ−ＳＰレベルのより高いレベルまたは増加に関して記載されてきたが、いくつかの事象または障害において、ＡＮＰ−ＳＰのレベルが、低下するもしくはより低くなるという可能性もある。コントロールレベル以下の偏差の測定もまた企図される。
【０２２８】
本明細書において特に有用な他のマーカーは、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチン（creatin）キナーゼＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰ、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｈ−ＦＡＢＰ、エンドセリン、アドレノメデュリン、レニン（rennin）、およびアンギオテンシンＩＩを含む１。これらのマーカーはすべて、心臓機能障害または疾患に関係する。ＡＮＰ−ＳＰのレベルが他のマーカーと相互に関連すると、ＡＮＰ−ＳＰの予測、診断、またはモニターの価値を増加させ得る。ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の場合には、公知の心臓マーカーとＡＮＰ−ＳＰマーカーレベルを組み合わせると、患者の結果の予測または診断の価値を増加させ得る。
【０２２９】
いくつかのペプチドマーカーの分析は、単一の試験試料を使用して、同時にまたは単独で実行することができる。同時の、２部位または多部位のフォーマットアッセイが、好ましい。多重ビーズ、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ）、またはバイオチップのシステムは、特に有用である。ビーズ、アレイ（ａｓｓａｙ）、またはチップは、ＡＮＰ−ＳＰを含む１つまたは複数のマーカーに対する抗体を含む、多くの、別々の、多くの場合アドレス指定可能な位置を有することができる。１つまたは複数のマーカーは、１つを超えるＡＮＰ−ＳＰマーカーを含む。たとえば、Ｎ末端およびＣ末端のＡＮＰ−ＳＰ断片をアッセイし、アッセイ結果を組み合わせることは有用であり得る。多くの他のそのようなマーカーの組み合わせが、実行可能である。ＵＳ２００５／００６４５１１、米国特許第６，０１９，９４４号、およびNgおよびIlang,  J.  Cell  Mol.  Med.,  ６巻：３２９〜３４０頁（２００２年）は、本発明において有用なマイクロアレイ、チップ、キャピラリーデバイス、および技術の記載を提供する。Ｌｕｍｉｎｅｘは、本発明において有用な多重ビーズシステムを提供する。The  Protein  Protocols  Handbook、前掲もまた参照されたい。個別または系列のアッセイでの使用に適した実験室分析機器は、ＡｘＳｙｍ（Ａｂｂｏｔｔ、ＵＳＡ）、ＥｌｅｃＳｙｓ（Ｒｏｃｈｅ）、Ａｃｃｅｓｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ）、ＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ）、およびＮｉｃｈｏｌｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）（Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）イムノアッセイシステムを含む。
【０２３０】
一実施形態において、複数のポリペプチドの同時のアッセイは、チップまたはアレイなどの単一の表面上で実行される。
【０２３１】
対象が、モニターされることになっている場合、多くの生物学的試料は、ある期間にわたって採取されてもよい。連続的な試料採取は、ある期間にわたって測定されることとなるマーカーレベル、特にＡＮＰ−ＳＰにおける変化を可能にする。試料採取は、事象のおよその発症時間、事象の重症度についての情報を提供することができ、どの治療レジメンが、適切であり得るかを示すことができ、用いられる治療レジメンに対する応答、または長期予後を示すことができる。分析は、救急車および診療所において、臨床提示において、入院の間に、外来患者において、またはルーチン的な健康スクリーニング（ｈｅａｌｔｈ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）の間になど、医療の時点で実行されてもよい。
【０２３２】
本発明の方法はまた、これらに限定されないが、年齢、体重、性別、ならびに心性の事象などの事象の家族歴などの１つまたは複数の危険因子の分析と関連して実行されてもよい。試験結果はまた、本発明の方法と関連して使用することができる。たとえばＥＣＧ結果、および臨床検査。ＡＮＰ−ＳＰの循環レベルにおける統計的に有意な増加は、１つまたは複数のさらなる危険因子または試験結果と共に、より正確に対象の状態を診断するまたはその予後を判定するために使用されてもよい。
【０２３３】
本明細書における方法はまた、療法の指標として使用することもできる。たとえば、どの療法を開始すべきか、いつ療法のモニタリング、療法の正の影響または有害な影響の検出（たとえば有糸分裂阻害薬の心臓毒性）を開始するか、治療レジメンの調節が必要かどうか、ならびにいつ必要かは結果に依存する。これは、患者についての短期の、中期の、および長期の結果を改善し得る。治療の指標については、Ｔｒｏｕｇｈｔｏｎらを参照されたい２４。
【０２３４】
急性心障害
出願人らは、完全長ＡＮＰ−ＳＰ分子（１〜２５）およびその種々の断片の濃度が急性心障害と相互に関連することを示した。さらに、ＡＮＰ−ＳＰレベルは、疑わしい急性心筋梗塞（ＡＭＩ）または心臓発作の症状を示す患者の場合には、臨床提示に際して最も高い。（心臓筋肉または心筋層において瘢痕を残す心臓発作）によって引き起こされる急性心障害、特に急性心性虚血冠動脈疾患の症状を示す患者は、続く心筋梗塞（ＭＩ）を経験するまたは経験しない可能性がある。ＭＩを経験しないグループは、現在の臨床的技術およびマーカーを使用して、容易に診断することができない。初めて、本出願人らは、それゆえ、ＭＩと関連する心筋損傷についての有用な早期で特異的なマーカーを提供した。これは、有害事象（ＡＥ）による心筋損傷の早期診断を可能にし得、医師が、他の急性冠動脈症候群とおよび胸痛の他の原因とそのような症例を区別することを可能にし得る。たとえば狭心症、胃腸疾患、肺／胸膜障害、およびその他同種のもの。これは、ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ、ＴｎＴ、およびＴｎＩなどの現在の心性のバイオマーカーのレベルの上昇についての、６時間〜１２時間の現在経験する待ち時間のウインドウを有意に短くする。そのため、より的確な診断および治療は、より早期に達成し、罹患率および死亡率を低下させ、より良好な予後の結果を示すことができる。
【０２３５】
他の実施形態において、本発明は、心性の患者における再灌流治療をモニターする際の適用を有する。再灌流治療は、一般的に、経皮的冠状動脈インターベンション（たとえば血管形成術）および／または薬理学的治療を含む。血管再生のための血栓溶解薬は、薬理学的治療において一般的に用いられる。補助的療法は、抗凝固療法および抗血小板療法を含む。再灌流治療は、診断の後にできるだけ早く用いられた場合、最も有効となる。診断を加速するためのＡＮＰ−ＳＰ試験は、再灌流治療の即座の導入を可能にする。治療の有効性もまた、繰り返し試験によってモニターすることができ、療法は、適切なように調節することができる。再灌流治療の包括的な議論については、本明細書におけるＢｒａｕｎｗａｌｄらを参照されたい１。
【０２３６】
心疾患
本発明の方法はまた、対象における心疾患を診断するまたは予測するのに有用となり得る。
【０２３７】
出願人らは、急性心障害を有する患者において、ＡＮＰ−ＳＰのレベルが、心臓イベントの後に上昇することを示した。心疾患を有するまたは心疾患の危険性がある患者が、コントロール集団における平均コントロールレベルよりも高いレベルのＡＮＰ−ＳＰを呈するということは、同様に可能性がある。これは、ＡＮＰ−ＳＰが、心疾患のマーカーとして広範な適用を有することを示唆する。
【０２３８】
心臓移植拒絶
本発明はまた、ＡＮＰ−ＳＰ測定を使用する、移植の間のおよびその後の、心臓移植、一般的に心性の同種移植片移植、通常の組織バイオプシーを通しての拒絶をモニターする際の適用を有する。コントロールレベルと比較した、心臓移植の４、または２時間以内に測定されたＡＮＰ−ＳＰレベルの増加は、拒絶エピソードを予測するまたは診断するものであり得る。
【０２３９】
本発明はまた、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症から４、もしくは２時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４、もしくは２時間以内に対象から得られた生物学的試料における、ＡＮＰ−ＳＰについてのアッセイをも提供する。アッセイは、任意の公知の方法を使用する、試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを検出する工程および測定する工程を含む。好ましくは、アッセイは、インビトロアッセイである。そのような方法は、上記に論じられる公知のアッセイ技術のすべておよびこれらに限定されないが、ゲル電気泳動技術、ウエスタンブロット、気相分光法、原子間力顕微鏡、表面プラズモン共鳴、質量分析を含む２２。
【０２４０】
一実施形態において、アッセイは、本発明の１つまたは複数のＡＮＰ−ＳＰ核酸配列に結合する１つまたは複数の核酸配列を含む。広い範囲のセンスおよびアンチセンスのプローブおよびプライマーは、本明細書における核酸配列から設計することができる。ＡＮＰ−ＳＰ配列の発現レベルは、上記に論じられる公知技術の技法を使用して同定される。アレイは、固体基質、たとえば米国特許第５，７４４，３０５号において記載される「チップ」またはニトロセルロース膜とすることができる。有用なアレイの議論については、たとえばMicroarray  Technology  and  its  Application、Muller,  Uら、Springer  ２００５年およびGene  Expression  Profiling  by  Microarrays:  Clinical  Implications、Hofmann,  W-K;  Cambridge  University  Press  ２００６年を参照されたい。
【０２４１】
本明細書におけるＡＮＰ−ＳＰマーカーによって発現されるタンパク質はまた、アッセイにおいて使用されてもよく、結果は、正常なコントロール試料において発現される同じタンパク質の発現レベルと比較されてもよい。タンパク質の存在および量は、当技術分野において公知であり、本明細書において議論されるアッセイフォーマットを使用して評価できる。
【０２４２】
ＡＮＰ−ＳＰの存在は、好ましくは、ＡＮＰ−ＳＰを、本発明の抗体を含む、抗体などの結合剤に結合させ、結合したＡＮＰ−ＳＰの量の存在を測定することによって試料において検出される。
【０２４３】
上記に述べられるように、その変異体および断片を含むＡＮＰ−ＳＰのために選択される抗体は、本発明のさらなる態様を形成し、抗体は、上記に論じられる技術によって調製されてもよい。抗体は、本発明の方法およびアッセイにおいて有用である。
【０２４４】
さらなる態様において、本発明は、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキットであって、本発明の抗体または抗原結合断片を含むＡＮＰ−ＳＰ結合剤を含むキットを提供する。一実施形態において、キットは、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症またはその臨床提示の４時間以内または２時間以内に対象から得られる生物学的試料を用て使用するためのものである。公知技術のＡＮＰ結合剤もまた、本キットにおいて有用であり得る。
【０２４５】
本発明はまた、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、評価する、またはモニターするためのキットであって、本発明の結合剤を含み、該キットは、０．１〜５００ｐｍｏｌ／Ｌ、または１〜３００ｐｍｏｌ／Ｌ、または２〜１００ｐｍｏｌ／Ｌ、または５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正されるキットを提供する。
【０２４６】
アッセイの較正は、たとえば、公知のレベルのＡＮＰ−ＳＰを有する血液試料またはそれぞれ異なる公知のレベルのＡＮＰ−ＳＰを用いる較正のセットを使用して、公知技術の技法に従って達成することができる。診断キットにおける使用のための試験ストリップは、製造の間に一般的に較正される。たとえば米国特許第６，７８０，６４５号を参照されたい。キットは、生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定するのに有用である。検出試薬は、ＡＮＰ−ＳＰに相補的なオリゴヌクレオチド配列またはＡＮＰ−ＳＰマーカーの断片またはマーカーによってコードされるポリペプチドに結合する抗体であってもよい。試薬は、上記に論じられるような固体マトリックスまたはそれらをマトリックスに結合させるための試薬と包装される固体マトリックスに結合されてもよい。固体マトリックスまたは基質は、すべて上記に論じられるように、ビーズ、プレート、チューブ、ディップスティック、ストリップ、またはバイオチップの形態をしていてもよい。
【０２４７】
検出試薬は、洗浄試薬および結合した抗体を検出することができる試薬（標識二次抗体など）または標識抗体と反応することができる試薬を含む。
【０２４８】
キットはまた、好都合に、コントロール試薬（ポジティブおよび／もしくはネガティブ）ならびに／または核酸、もしくは抗体を検出するための手段を含む。ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を伴う提示の４、または２時間以内に対象から生物学的試料を採取すること、試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定すること、試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルをコントロールレベルと比較すること、および結果を、心性のステータスと関連させることなどの使用についての説明書もまたキットに含まれていてもよい。一般的に、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰマーカーレベルにおける増加は、ＡＣＤもしくは心臓移植拒絶または肺障害に対比してのＡＣＤを示す。
【０２４９】
最も通常では、キットは、当技術分野において公知のアッセイに対してととのえられ（ｆｏｒｍａｔｔｅｄ）そして一実施形態において、当技術分野において公知であるＰＣＲ、ノーザンハイブリダイゼーション、またはサザンＥＬＩＳＡアッセイに対してととのえられる。
【０２５０】
キットはまた、ＡＣＤ、移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害についての１つまたは複数のさらなるマーカーを含んでいてもよい。ＡＣＳの場合には、さらなるマーカーアッセイは、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰ、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｈ−ＦＡＢＰ、エンドセリン、アドレノメデュリン、レニンおよびアンギオテンシンＩＩの１つまたは複数についての１つまたは複数のアッセイを含んでいてもよい。一実施形態において、マーカーはすべて、キットに含まれる。
【０２５１】
キットは、１つまたは複数の容器からなり、さらに、収集用具、たとえばボトル、バッグ（静脈内液体バッグなど）、バイアル、注射器、および試験管を含んでいてもよい。少なくとも１つの容器は、ＡＣＤ（特にＡＣＳ）、移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするのに有効である産物を保持する。産物は、通常、核酸分子、ポリペプチド、もしくは結合剤、特に本発明の抗体もしくは抗原結合断片、またはこれらのいずれかを含む組成物である。好ましい実施形態において、容器上のまたは容器と関連する説明書またはラベルは、組成物が、ＡＣＤ（特にＡＣＳ）、移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするために使用されることを示す。他の構成要素は、針、希釈剤、および緩衝剤を含んでいてもよい。有用に、キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝剤を含む少なくとも１つの容器を含んでいてもよい。
【０２５２】
ＡＮＰ−ＳＰに選択的に結合する結合剤は、望ましくは、キットに含まれる。一実施形態において、結合剤は、抗体であり、好ましくは本発明の抗体または抗原結合断片である。アッセイおよびキットにおいて使用される抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、上記に論じられるように、任意の哺乳動物において調製されてもよい。抗体は、本発明のＡＮＰ−ＳＰ核酸配列、ＡＮＰ−ＳＰ（１〜２５）によってコードされるまたは示される天然ペプチドに対して調製されてもよく、または本発明のＡＮＰ−ＳＰ核酸配列、ＡＮＰ−ＳＰ（１〜２５）に基づく合成ペプチドに対して調製されてもよく、あるいは本発明のＡＮＰ−ＳＰペプチドをコードする核酸配列に融合される外因性配列に対して産生されてもよい。
【０２５３】
キットの一実施形態において、ＡＮＰ−ＳＰ検出試薬は、少なくとも１つのＡＮＰ−ＳＰ検出部位を形成するために、多孔性ストリップまたはチップなどの固体マトリックス上に固定される。多孔性ストリップの測定領域または検出領域は、ＡＮＰ−ＳＰ検出試薬を含有する検出部位などの複数の検出部位を含んでいてもよい。部位は、バー、クロス、ドット、または他の配置で配置されてもよい。試験ストリップまたはチップはまた、ネガティブコントロールおよび／またはポジティブコントロールのための部位を含有していてもよい。コントロール部位は、その代わりに、異なるストリップかチップ上にあってもよい。異なる検出部位は、異なる量の固定核酸または固定抗体、たとえば、第１の検出部位においてより多い量および続く部位においてより低い量を含有していてもよい。試験生物学的試料の添加に際して、検出可能なシグナルを示す部位の数は、試料中に存在するＡＮＰ−ＳＰの量の定量的または半定量的指標を提供する。
【０２５４】
試料試験を実行するための適切な構成要素（マーカー、抗体、および試薬）を有する使い捨ての試験カートリッジを含む、試料分析のためのデバイスもまたキットに含まれていてもよい。デバイスは、好都合に、試験ゾーンおよび試験結果ウィンドウを含む。免疫クロマトグラフィーカートリッジは、そのようなデバイスの例である。たとえば米国特許第６，３９９，３９８号、米国特許第６，２３５，２４１号、および米国特許第５，５０４，０１３号を参照されたい。
【０２５５】
その代わりに、デバイスは、測定マーカーのレベルの入力、記憶、ならびにコントロールレベルおよび他のマーカーレベルに対する測定マーカーのレベルの評価を可能にする電子デバイスであってもよい。ＵＳ２００６／０２３４３１５は、そのようなデバイスの例を提供する。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ（登録商標）ソフトウェアパッケージを使用してＳＥＬＤＩ結果を処理するために使用することができるＣｉｐｈｅｒｇｅｎ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ（登録商標）もまた本発明において有用である。
【０２５６】
特許明細書、他の外部文書、または他の情報源について言及がなされる本明細書において、これは、一般的に、本発明の特徴を論じるための背景を提供するためのものである。特に別記しない限り、そのような外部文書への言及は、任意の管轄のそのような文書またはそのような情報源が、先行技術となるまたは当技術分野における共通の一般知識の一部分を形成することを許可するものとして解釈されない。
【０２５７】
本発明は、ここでは、以下の実施例への参照によって非限定的に例証される。
【実施例】
【０２５８】
（実施例１）
方法
ヒトプロトコールはすべて、Ｕｐｐｅｒ  Ｓｏｕｔｈ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄによって承認され、ヘルシンキ宣言に合わせて実行した。
【０２５９】
化学薬品
合成ヒトＡＮＰシグナルペプチドＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）（配列番号１２）およびＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）は、温和なＦｍｏｃ固相合成法を使用して、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって合成された２９。緩衝剤試薬はすべて、ＢＤＨ（登録商標）（ＵＫ）および／またはＳｉｇｍａ（Ｍｏ、ＵＳＡ）から購入した。ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）は、方向性のキャリヤー結合のためにシステインで伸長させたＣ末端を用いて合成した。ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）は、さらに、同じペプチド上でのトレーサー調製のためにチロシル残基を用いてＣ末端で伸長させた。
【０２６０】
ヒトでの試験
健康なボランティアの対照標準の範囲の試験のために、血液試料を、８人の健康なボランティア（５人の女性、３人の男性、平均年齢４７±８歳（範囲３１〜６５歳）、ＢＭＩ  ２５．１±３．２ｋｇ／ｍ２）から一晩の絶食の後に最初に得た。
【０２６１】
試験は、引き続いて、６６人の健康なボランティア、平均年齢４７±８歳（範囲３１〜６５歳）、ＢＭＩ  ２５．１±３．２ｋｇ／ｍ２に拡張した。血液試料はまた、一晩の絶食の後にこの群からも得た。
【０２６２】
急性心外傷におけるＡＮＰ−ＳＰ濃度の分析のために、本発明者らは、胸痛の発症および血漿トロポニンＴ（ＴｎＴ）の上昇、次いで低下と共にＳＴ上昇急性ＭＩの明瞭な証拠のある４時間以内に、Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの冠疾患集中治療室に来る連続した３人の患者（３人の男性、平均年齢６７±３歳（範囲６５〜７０歳））を最初に試験した。心臓性ショックを有する患者は、除外した。試験は、引き続いて、２３人の患者（平均年齢６７±３歳（範囲６５〜７０歳））を含むように拡張した。ＢＭＩは測定しなかった。
【０２６３】
１８ゲージ静脈内カニューレは、血液試料採取のために前腕静脈に挿入した。静脈試料（１０ｍｌ）は、冠疾患集中治療室に入院する時点で（０時間）、その後、入院患者として０．５、１、４、８、１２、２４、および７２時間に採取した。試料は、氷上のチューブの中に採取し、５分間、２７００ｇで＋４℃で遠心分離し、血漿は、分析するまで−８０℃で保管した。
【０２６４】
血漿抽出
血漿試料はすべて、先に記載されるように、ＳｅｐＰａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）で抽出し２１、乾燥させ、ＲＩＡおよびＨＰＬＣの前に−２０℃で保管した。
【０２６５】
ホルモン濃度分析
血漿試料は、標準的なメーカーのプロトコール、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓに従って、ルテニウム標識ビオチン化抗体を使用して、Ｅｌｅｃｓｙｓ  ２０１０（Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）で、不均質イムノアッセイ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を使用して、ＴｎＴ、ＣＫ−ＭＢ、およびミオグロビンについてアッセイした１７。ＡＮＰ−ＳＰは、特異的なＲＩＡによって以下のように測定した。
【０２６６】
ＡＮＰ−ＳＰ  ＲＩＡ
推定上のヒトＡＮＰ−ＳＰ  ＩＲペプチドの測定のために、本発明者らは、ヒトプレプロＡＮＰ（１〜２５）シグナル配列（配列番号１）のアミノ酸１６〜２５に対して向けられる、新規で特異的なＲＩＡを生み出した。
【０２６７】
抗体生成
プレプロＡＮＰＣｙｓ１５（１６〜２５）を、室温での緩やかな混合によって、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中のマレイミド（malemide）処理Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）誘導体化ＢＳＡに結合させた。結合したペプチドは、フロイントアジュバント（２ｍｌ）を用いて乳化し、月１回の間隔で４〜５部位にわたり２羽のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギに皮下注射した（合計２ｍｌ）。適当なレベルが達成されるまで、抗体価を評価するために、注射の１２日後にウサギから採血した。ＲＩＡについては、ＡＮＰ−ＳＰ  ＩＲは、１：１５，０００の最終の希釈度の抗血清を使用して決定した。この抗血清は、ヒトプロＢＮＰ（１〜１３）、プロＢＮＰ（１〜７６）、プロＡＮＰ（１〜３０）、ＡＮＰ、ＡＮＰ−ＳＰｎ（１〜１０）、ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰｎ（１〜１０）、ＢＮＰ−ＳＰｃ（１７〜２６）、エンドセリン１、アンギオテンシンＩＩ、アンギオテンシン（１〜７）、ウロテンシンＩＩ、ＣＮＰ、プロＣＮＰ（１〜１５）、アドレノメデュリン、ウロコルチンＩ、およびウロコルチンＩＩ（すべて≦０．０１％）を含む、図５において示されるペプチドおよび薬剤との検出可能な交差反応性を有していない。交差反応性は、Klee  GG.  Interference  in  hormone  immunoassays  Clin  Lab  Med、２００４年、２４巻:１〜１８頁に従って評価した。
【０２６８】
ヨウ素化およびアッセイ方法
プレプロＡＮＰ  Ｔｙｒ１５（１６〜２５）は、先に記載されるように、クロラミンＴ法を介してヨウ素化し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で精製した２１。この調製物から、ＲＰ−ＨＰＬＣの後の２つのヨウ素化トレーサー形態を試験した。試料、標準物、放射性トレース、および抗血清溶液はすべて、カリウムベースのアッセイ緩衝液中に希釈した２１。アッセイインキュベートは、１００μＬ抗血清と組み合わせた１００μＬ試料または標準物（０〜６４０ｐｍｏｌヒトプレプロＡＮＰ（１６〜２５）から成り、それをボルテックスし、２４時間４℃でインキュベートした。次いで、１００μＬのトレース１またはトレース２（４０００〜５０００ｃｐｍ）を追加し、４℃で２４時間さらにインキュベートした。遊離免疫反応性（ｆｒｅｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）および結合免疫反応性は、固相二次抗体法（ロバ抗ウサギＳａｃ−Ｃｅｌ（登録商標）、ＩＤＳ  Ｌｔｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）によって最終的に分離し、Ｇａｍｍａｍａｓｔｅｒカウンター（ＬＫＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で計数した。
【０２６９】
統計分析
結果はすべて、平均値±ＳＥＭとして示す。時間的経過データは、繰り返しの測定のための二元配置ＡＮＯＶＡ、その後に最小有意差の事後試験（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）を使用して分析した。血漿ホルモン濃度の相関分析は、一般線形回帰モデルを使用して実行した。すべての分析において、Ｐ値＜０．０５は、有意であるとみなした。
【０２７０】
結果
ＡＮＰの２５アミノ酸シグナルペプチドまたはそれに由来する断片が、ヒトの血行路中に存在するかどうかを決定するために、本発明者らは、プレプロＡＮＰ（１〜２５）（ＡＮＰ−ＳＰ、図２）の残基１６〜２５に対して向けられる特異的なラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を開発した。血漿抽出物の希釈は、標準曲線との平行性を実証し（図３）、トレース１を使用した場合、健康なヒトにおけるＡＮＰ−ＳＰの血漿濃度は、２．３±０．７ｐｍｏｌ／Ｌ（ｎ＝８）であった。
【０２７１】
免疫反応性（ＩＲ）ＡＮＰ−ＳＰペプチドがヒト血漿中に存在することを確証したので、次いで、本発明者らは、再びトレース１を使用して、立証されたＡＭＩを有する患者におけるＩＲ  ＡＮＰ−ＳＰの連続的な濃度を測定した（ｎ＝３、図４Ａ）。ＩＲ  ＡＮＰ−ＳＰの最も高い濃度は、入院の１〜２時間後に観察され、７２時間にわたり安定レベルまで徐々に減少した。重要なことには、平均ピークレベルは、正常で健康なボランティアにおけるレベルよりも５〜１５倍高く（範囲３〜７）、７２時間まで、より高いままであった。ミオグロビンのピーク濃度は、入院の１〜２時間後に生じたが、ＴｎＴレベルおよびＣＫ−ＭＢレベルは、入院の８〜１２時間後までピークに到達しなかった。
【０２７２】
本発明者らは、トレース２に基づくＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）ＲＩＡを使用して上記の発見および比を再検査した。したがって、本発明者らは、トレース２を使用する、健康なヒトにおけるＡＮＰ−ＳＰの血漿濃度が、２０．８±５．７ｐｍｏｌ／Ｌ（ｎ＝６６）であることを発見した。これに続いて、本発明者らは、トレース２アッセイを使用して、立証されたＡＭＩを有する２３人の患者における連続的なＡＮＰ−ＳＰ血漿濃度を再測定した。再び、ＡＮＰ−ＳＰの最も高い濃度は、病院提示の１〜２時間後に観察され（Ｐ＜０．００１、ｎ＝２３）、７２時間にわたりベースラインまで徐々に減少した。平均ピークレベルは、正常なボランティアレベルよりも５〜１５倍高く（範囲３〜８）、これらのピークは、ＣＫ−ＭＢおよびトロポニンのピークよりも十分前に生じた。
【０２７３】
（実施例２）
臨床的に安定した、疑わしいＡＣＳを有する８人の患者にカテーテルを挿入し、複数の器官部位から血液試料を採取した：複数の器官部位は、大腿動脈（ＦＡ）、肝静脈（ＨＶ、下大静脈（ＩＶＣ）、心臓冠状静脈洞静脈（ＣＳ）、および肺動脈（ＰＡ）であった。血液は、冷蔵ＥＤＴＡチューブの中に収集し、遠心分離によって血漿から調製し、血漿は、ＡＮＰ−ＳＰ  ＲＩＡにかけた。図６は、ＡＮＰ−ＳＰ濃度の最も高い部位が、ＣＳ、心臓に注ぐ静脈、とりわけ心室であることを明らかに示す。これは、心臓が、ＡＮＰ−ＳＰ分泌の主な部位であるという強い証拠であり、心臓において最も高いＡＮＰの公知の遺伝子発現パターンと一致している。
【０２７４】
結論
臨床的に安定した患者における循環ＡＮＰ−ＳＰ濃度は、心性の源に由来する。有意な心分泌は、心臓ホルモンであるＡＮＰ−ＳＰと一致している。
【０２７５】
考察
この証拠は、プレプロＡＮＰのシグナルペプチドが、ＡＣＤの症状を示す患者の２時間以内にまたはＡＣＤの発症の２時間以内に血行路および細胞外スペースに存在することを立証する最初のものである。本発明者らは、第１の実例において、血液中のＡＮＰ−ＳＰの測定が、急性心虚血および／または続く傷害の迅速なバイオマーカーとしての潜在力を有することならびに第２の実例において、その事象の後のＡＮＰ−ＳＰの測定が、長期予後および長期結果のマーカーとして潜在的な長所を有することを示す。
【０２７６】
当業者らは、もちろん、上記の記載が、例として提供され、本発明がそれに限定されないことを十分に理解するであろう。
【０２７７】
（参考文献）
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特許明細書を含む、このリストにおけるおよび本明細書の全体にわたる参考文献および引用文はすべて、それらの全体が本明細書によって組み込まれる。
【図１】
2011514156.tif 000003
【図２Ａ】
2011514156.tif 000004
【図２Ｂ】
2011514156.tif 000005
【図３】
2011514156.tif 000006
【図４】
2011514156.tif 000007
【図５】
2011514156.tif 000008
【図６】
2011514156.tif 000009
【配列表】
2011514156000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月21日(2010.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰアミノ酸配列１６〜２５（配列番号１２）もしくは１〜１０（配列番号１６）、
（ｂ）配列番号１３もしくは配列番号１７から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の変異体もしくは断片に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
ＡＮＰ（１６〜２５）またはＡＮＰ（１〜１０）に選択的に結合する、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、もしくはヒト化抗体または断片である、請求項１または２に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
検出可能なマーカーを用いて標識される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）を予測する、診断する、またはモニターするのを補助する方法であって、前記ＡＣＤの発症の４時間以内にまたは前記ＡＣＤの提示の４時間以内に前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルをコントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤを示す方法。
【請求項６】
対象における、急性心障害（ＡＣＤ）の治療に対する応答をモニターするのを補助する方法であって、前記ＡＣＤの発症の４時間以内にまたは前記ＡＣＤの提示の４時間以内に前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルをコントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルからのＡＮＰ−ＳＰの前記測定レベルにおける変化は、前記治療に対する応答を示す方法。
【請求項７】
対象における心臓移植拒絶エピソードを予測する、診断する、またはモニターするのを補助する方法であって、心臓移植の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、移植拒絶を示す方法。
【請求項８】
対象における肺障害と急性心障害（ＡＣＤ）とを区別するのを補助する方法であって、前記障害の提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルよりも高い、測定ＡＮＰ−ＳＰレベルは、ＡＣＤを示す方法。
【請求項９】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするのを補助する方法であって、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の最初の４時間以内に、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の最初の４時間以内に、前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含み、ＡＮＰ−ＳＰの前記測定レベルは、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較され、前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤまたは移植拒絶を示す方法。
【請求項１０】
ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルは、ＡＣＤの発症の最初の２時間、１時間、または３０分以内に測定されるか、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の最初の２時間、１時間、または３０分以内に測定される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
繰り返し測定は、発症もしくは臨床提示の４〜６時間以内になされるかまたは最初の測定の２〜３時間以内になされる、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
４０〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４２〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の、前記試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＡＣＤもしくは心臓移植拒絶を示すまたはＡＣＤを肺障害と区別する、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記コントロールレベルよりも３〜８倍高い、前記試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＡＣＤもしくは心臓移植拒絶を示すまたはＡＣＤを肺障害と区別する、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＣＤは、急性冠動脈症候群：提示されるＥＣＧ上でのＳＴ上昇を伴うＡＭＩ、不安定狭心症、および非ＳＴ上昇ＭＩ；心虚血、急性心外傷、急性薬物中毒に起因する急性心損傷、急性心筋症、ならびに心臓移植拒絶から成る群から選択される、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＣＤは、非ＳＴ上昇ＭＩである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＣＤは、急性心虚血である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的試料は、血液、血漿、血清、唾液、間質液、尿、または心臓組織試料である、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記測定工程は、
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰを結合剤と結合させる工程および
（ｂ）結合したＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む、請求項５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合剤は、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が結合するまたは選択的に結合するＡＮＰ−ＳＰは、ＡＮＰ−ＳＰ（配列番号１４）またはその抗原性断片もしくは変異体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体は、ＡＮＰ−ＳＰのＮ末端またはＣ末端に結合する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体または抗原結合断片は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または断片である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＡＮＰ−ＳＰの結合は、固相上に固定されている抗体または抗原結合断片を使用して測定される、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、質量分析、蛍光免疫測定、免疫蛍光アッセイ、およびイムノラジオメトリックアッセイから選択されるアッセイを使用して測定される、請求項５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、質量分析を使用して測定される、請求項５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記質量分析は、ＳＥＬＤＩ、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ、またはＦＴＩＣＲである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＡＣＤまたは心臓移植拒絶またはＡＣＤ／肺障害の１つまたは複数の非ＡＮＰ−ＳＰマーカーのレベルを測定する工程および前記レベルをコントロールからのマーカーレベルと比較する工程をさらに含み、前記コントロールレベルからの前記測定レベルにおける偏差は、ＡＮＰ−ＳＰの前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルと共に、前記ＡＣＤを予測するもしくは診断する指標であり、または前記ＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の状態を示す、請求項５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記非ＡＮＰ−ＳＰマーカーは、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰ、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびＨ−ＦＡＢＰから成る群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記コントロールレベルからの測定レベルにおける前記偏差は、前記非ＡＮＰ−ＳＰマーカーの、より高い測定レベルを含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記モニタリングは、再灌流治療に対する応答のモニタリングである、請求項５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の発症から４時間以内、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に対象からの生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰについてのアッセイであって、任意の公知の方法を使用して、前記試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを検出し、測定する工程を含むアッセイ。
【請求項３２】
ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＡＮＰ−ＳＰに結合するまたは選択的に結合する結合剤へのＡＮＰ−ＳＰの結合を通して前記試料において検出される、請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項３３】
（ａ）生物学的試料からの１つまたは複数のＡＮＰ−ＳＰポリペプチドを結合させる工程であって、前記ＡＮＰ−ＳＰポリペプチドは、群ＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）およびＡＮＰ−ＳＰ  １６〜２５（配列番号１２）またはその変異体もしくは断片から選択される工程ならびに
（ｂ）結合したＡＮＰ−ＳＰポリペプチドのレベルを測定する工程を含む、ＡＮＰ−ＳＰについてのアッセイ。
【請求項３４】
前記ＡＮＰ−ＳＰポリペプチドは、ＡＮＰ−ＳＰ結合剤、または請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片を使用して結合される、請求項３３に記載のアッセイ。
【請求項３５】
前記ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、マススペクトロメトリーを使用して測定される、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項３６】
前記マススペクトロメトリーは、ＳＥＬＤＩ、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ、またはＦＴＩＣＲである、請求項３５に記載のアッセイ。
【請求項３７】
前記測定は、基質に結合したＡＮＰ−ＳＰ抗体または抗原結合断片を含むＳＥＬＤＩプローブを提供する工程、前記抗体または断片が、生物学的試料からの１つまたは複数のＡＮＰ−ＳＰポリペプチドを捕捉するように、前記抗体または断片を前記生物学的試料と接触させる工程、およびＳＥＬＤＩを使用して、結合したＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む、請求項３６に記載のアッセイ。
【請求項３８】
前記ＳＥＬＤＩは、クロマトグラフィー表面でＳＥＬＤＩバイオチップを使用して実行される、請求項３７に記載のアッセイ。
【請求項３９】
前記ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光アッセイ、およびイムノラジオメトリックアッセイから選択されるアッセイを使用して測定される、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項４０】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするのに使用される、ＡＮＰ−ＳＰ（配列番号１４）またはその断片もしくは変異体に結合するＡＮＰ−ＳＰ結合剤であって、前記ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰの出現によって特徴づけられるＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
【請求項４１】
ＡＮＰ−ＳＰは、４０〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４２〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲で前記試料において存在する、請求項４０に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
【請求項４２】
ＡＮＰ−ＳＰは、ＡＮＰ−ＳＰの平均コントロールよりも３〜７倍高いレベルで前記試料において存在する、請求項４０に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
【請求項４３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片である、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
【請求項４４】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を評価するための予後ツール、診断ツール、またはモニターツールの製造における、ＡＮＰ−ＳＰ結合剤の使用であって、評価は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に実行される使用。
【請求項４５】
前記予後ツール、診断ツール、またはモニターツールは、０．１〜５００ｐｍｏｌ／Ｌまたは１〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは２〜１００ｐｍｏｌ／Ｌまたは５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記予後ツール、診断ツール、またはモニターツールは、ＡＮＰ−ＳＰコントロールレベルよりも３〜７倍高い範囲のＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の予測、診断、またはモニタリングのためのＡＮＰ−ＳＰ結合剤の使用であって、予後、診断、またはモニタリングは、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に実行される使用。
【請求項４８】
前記予測、診断、またはモニタリングは、請求項５〜３０のいずれか一項に記載の方法または請求項３１〜３９のいずれか一項に記載のアッセイを使用して達成される、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記結合剤は、ＡＮＰ−ＳＰ（配列番号１４）またはその断片もしくは変異体に結合するまたは選択的に結合する結合剤である、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５０】
前記結合剤は、抗体またはその抗原結合断片である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記抗体または抗原結合断片は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を評価するための予後ツール、診断ツール、またはモニターツールの製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項５３】
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の予測、診断、またはモニタリングのための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項５４】
請求項４０〜４３のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤を含む、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキットであって、前記キットは、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内に、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料を用いる使用のためのものであるキット。
【請求項５５】
請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の結合剤を含む、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓（cardia）移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキットであって、前記キットは、０．１〜５００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１〜３００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２〜１００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正されるキット。
【請求項５６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ抗体またはその抗原結合断片を含む、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキット。
【請求項５７】
前記結合剤または抗体が固定されている固相をさらに含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
発症または臨床提示の４時間以内に得られた前記生物学的試料において測定されるＡＮＰ−ＳＰレベルから、発症または臨床提示の４時間以内に、対象におけるＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニタリングするための説明書をさらに含む、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）（配列番号１２）もしくはＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）をコードする核酸分子またはその断片もしくは変異体であって、前記核酸は、
（ａ）配列番号１３もしくは配列番号１７またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）配列番号１３または配列番号１７に対して７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する配列、
（ｃ）配列番号１３もしくは配列番号１７に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列またはその断片もしくは変異体、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列にハイブリダイズすることができる、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの配列、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの相補体であり、
ただし、前記配列が配列番号１５ではないということを条件とする、核酸分子またはその断片もしくは変異体。
【請求項６０】
請求項５９に記載の核酸分子を含む遺伝子構築物。
【請求項６１】
発現構築物である、請求項６０に記載の遺伝子構築物。
【請求項６２】
請求項６０または６１に記載の遺伝子構築物を含むベクター。
【請求項６３】
請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項６４】
請求項５９に記載の核酸分子によってコードされるＡＮＰ−ＳＰポリペプチドまたはその変異体もしくは断片。
【請求項６５】
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）（配列番号１２）またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）ＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）またはその変異体もしくは断片、または
（ｃ）配列番号１２または配列番号１６のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列から選択されるＡＮＰ−ＳＰポリペプチドまたはその変異体もしくは断片。
【請求項６６】
（ａ）請求項６４または６５に記載のポリペプチドを発現することができる、請求項６０または６１に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞を培養する工程および
（ｂ）本発明の前記ポリペプチドを発現する細胞を選択する工程、
（ｃ）前記細胞から前記発現ポリペプチドを分離する工程、ならびに任意選択で
（ｄ）前記発現ポリペプチドを精製する工程を含む、請求項６４または６５に記載のポリペプチドの組換え生産のための方法。
【請求項６７】
前記構築物を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトするためのプレ工程を含む、請求項６６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰアミノ酸配列１６〜２５（配列番号１２）もしくは１〜１０（配列番号１６）、
（ｂ）配列番号１３もしくは配列番号１７から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の変異体もしくは断片に結合する抗体またはその抗原結合断片。
（項目２）
ＡＮＰ（１６〜２５）またはＡＮＰ（１〜１０）に選択的に結合する、項目１に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３）
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、もしくはヒト化抗体または断片である、項目１または２に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４）
検出可能なマーカーを用いて標識される、項目１〜３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５）
対象における急性心障害（ＡＣＤ）を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、前記ＡＣＤの発症の４時間以内にまたは前記ＡＣＤの提示の４時間以内に前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルをコントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤを示す方法。
（項目６）
対象における、急性心障害（ＡＣＤ）の治療に対する応答をモニターするための方法であって、前記ＡＣＤの発症の４時間以内にまたは前記ＡＣＤの提示の４時間以内に前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルをコントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルからのＡＮＰ−ＳＰの前記測定レベルにおける変化は、前記治療に対する応答を示す方法。
（項目７）
対象における心臓移植拒絶エピソードを予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、心臓移植の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、移植拒絶を示す方法。
（項目８）
対象における肺障害と急性心障害（ＡＣＤ）とを区別するための方法であって、前記障害の提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程および前記ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルを、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較する工程を含み、前記コントロールレベルよりも高い、測定ＡＮＰ−ＳＰレベルは、ＡＣＤを示す方法。
（項目９）
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするための方法であって、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の最初の４時間以内に、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の最初の４時間以内に、前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含み、ＡＮＰ−ＳＰの前記測定レベルは、コントロールからのＡＮＰ−ＳＰレベルと比較され、前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルは、ＡＣＤまたは移植拒絶を示す方法。
（項目１０）
ＡＮＰ−ＳＰの前記レベルは、ＡＣＤの発症の最初の２時間、１時間、または３０分以内に測定されるか、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の最初の２時間、１時間、または３０分以内に測定される、項目５〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
繰り返し測定は、発症もしくは臨床提示の４〜６時間以内になされるかまたは最初の測定の２〜３時間以内になされる、項目５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
４０〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４２〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲の、前記試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＡＣＤもしくは心臓移植拒絶を示すまたはＡＣＤを肺障害と区別する、項目５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記コントロールレベルよりも３〜８倍高い、前記試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＡＣＤもしくは心臓移植拒絶を示すまたはＡＣＤを肺障害と区別する、項目５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記ＡＣＤは、急性冠動脈症候群：提示されるＥＣＧ上でのＳＴ上昇を伴うＡＭＩ、不安定狭心症、および非ＳＴ上昇ＭＩ；心虚血、急性心外傷、急性薬物中毒に起因する急性心損傷、急性心筋症、ならびに心臓移植拒絶から成る群から選択される、項目５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ＡＣＤは、非ＳＴ上昇ＭＩである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＡＣＤは、急性心虚血である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記生物学的試料は、血液、血漿、血清、唾液、間質液、尿、または心臓組織試料である、項目５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記測定工程は、
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰを結合剤と結合させる工程および
（ｂ）結合したＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む、項目５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記結合剤は、抗体またはその抗原結合断片である、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記抗体が結合するまたは選択的に結合するＡＮＰ−ＳＰは、ＡＮＰ−ＳＰ（配列番号１４）またはその抗原性断片もしくは変異体である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記抗体は、ＡＮＰ−ＳＰのＮ末端またはＣ末端に結合する、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記抗体または抗原結合断片は、項目１〜４のいずれか一項に記載の抗体または断片である、項目１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
ＡＮＰ−ＳＰの結合は、固相上に固定されている抗体または抗原結合断片を使用して測定される、項目１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、質量分析、蛍光免疫測定、免疫蛍光アッセイ、およびイムノラジオメトリックアッセイから選択されるアッセイを使用して測定される、項目５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、質量分析を使用して測定される、項目５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記質量分析は、ＳＥＬＤＩ、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ、またはＦＴＩＣＲである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ＡＣＤまたは心臓移植拒絶またはＡＣＤ／肺障害の１つまたは複数の非ＡＮＰ−ＳＰマーカーのレベルを測定する工程および前記レベルをコントロールからのマーカーレベルと比較する工程をさらに含み、前記コントロールレベルからの前記測定レベルにおける偏差は、ＡＮＰ−ＳＰの前記コントロールレベルよりも高いＡＮＰ−ＳＰの測定レベルと共に、前記ＡＣＤを予測するもしくは診断するものとなる、または前記ＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害をモニターするために使用することができる、項目５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記非ＡＮＰ−ＳＰマーカーは、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ＢＮＰ、ＢＮＰ−ＳＰ、ＬＤＨ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびＨ−ＦＡＢＰから成る群から選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記コントロールレベルからの測定レベルにおける前記偏差は、前記非ＡＮＰ−ＳＰマーカーの、より高い測定レベルを含む、項目２７または２８に記載の方法。
（項目３０）
前記モニタリングは、再灌流治療に対する応答のモニタリングである、項目５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
ＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の発症から４時間以内、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、もしくはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰについてのアッセイであって、任意の公知の方法を使用して、前記試料におけるＡＮＰ−ＳＰのレベルを検出し、測定する工程を含むアッセイ。
（項目３２）
ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＡＮＰ−ＳＰに結合するまたは選択的に結合する結合剤へのＡＮＰ−ＳＰの結合を通して前記試料において検出される、項目３１に記載のアッセイ。
（項目３３）
（ａ）生物学的試料からの１つまたは複数のＡＮＰ−ＳＰポリペプチドを結合させる工程であって、前記ＡＮＰ−ＳＰポリペプチドは、群ＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）およびＡＮＰ−ＳＰ  １６〜２５（配列番号１２）またはその変異体もしくは断片から選択される工程ならびに
（ｂ）結合したＡＮＰ−ＳＰポリペプチドのレベルを測定する工程を含む、ＡＮＰ−ＳＰについてのアッセイ。
（項目３４）
前記ＡＮＰ−ＳＰポリペプチドは、ＡＮＰ−ＳＰ結合剤、または項目１〜４のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片を使用して結合される、項目３３に記載のアッセイ。
（項目３５）
前記ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、マススペクトロメトリーを使用して測定される、項目３１〜３４のいずれか一項に記載のアッセイ。
（項目３６）
前記マススペクトロメトリーは、ＳＥＬＤＩ、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ、またはＦＴＩＣＲである、項目３５に記載のアッセイ。
（項目３７）
前記測定は、基質に結合したＡＮＰ−ＳＰ抗体または抗原結合断片を含むＳＥＬＤＩプローブを提供する工程、前記抗体または断片が、生物学的試料からの１つまたは複数のＡＮＰ−ＳＰポリペプチドを捕捉するように、前記抗体または断片を前記生物学的試料と接触させる工程、およびＳＥＬＤＩを使用して、結合したＡＮＰ−ＳＰのレベルを測定する工程を含む、項目３６に記載のアッセイ。
（項目３８）
前記ＳＥＬＤＩは、クロマトグラフィー表面でＳＥＬＤＩバイオチップを使用して実行される、項目３７に記載のアッセイ。
（項目３９）
前記ＡＮＰ−ＳＰのレベルは、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光アッセイ、およびイムノラジオメトリックアッセイから選択されるアッセイを使用して測定される、項目３１〜３４のいずれか一項に記載のアッセイ。
（項目４０）
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするのに使用される、ＡＮＰ−ＳＰ（配列番号１４）またはその断片もしくは変異体に結合するＡＮＰ−ＳＰ結合剤であって、前記ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に前記対象から得られる生物学的試料におけるＡＮＰ−ＳＰの出現によって特徴づけられるＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
（項目４１）
ＡＮＰ−ＳＰは、４０〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４２〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜２００ｐｍｏｌ／Ｌまたは４５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲で前記試料において存在する、項目４０に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
（項目４２）
ＡＮＰ−ＳＰは、ＡＮＰ−ＳＰの平均コントロールよりも３〜７倍高いレベルで前記試料において存在する、項目４０に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
（項目４３）
項目１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片である、項目４０〜４２のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤。
（項目４４）
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を評価するための予後ツール、診断ツール、またはモニターツールの製造における、ＡＮＰ−ＳＰ結合剤の使用であって、評価は、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に実行される使用。
（項目４５）
前記予後ツール、診断ツール、またはモニターツールは、０．１〜５００ｐｍｏｌ／Ｌまたは１〜３００ｐｍｏｌ／Ｌまたは２〜１００ｐｍｏｌ／Ｌまたは５〜１５０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正される、項目４４に記載の使用。
（項目４６）
前記予後ツール、診断ツール、またはモニターツールは、ＡＮＰ−ＳＰコントロールレベルよりも３〜７倍高い範囲のＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正される、項目４４に記載の使用。
（項目４７）
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の予測、診断、またはモニタリングのためのＡＮＰ−ＳＰ結合剤の使用であって、予後、診断、またはモニタリングは、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内にまたはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に実行される使用。
（項目４８）
前記予測、診断、またはモニタリングは、項目５〜３０のいずれか一項に記載の方法または項目３１〜３９のいずれか一項に記載のアッセイを使用して達成される、項目４７に記載の使用。
（項目４９）
前記結合剤は、ＡＮＰ−ＳＰ（配列番号１４）またはその断片もしくは変異体に結合するまたは選択的に結合する結合剤である、項目４４〜４８のいずれか一項に記載の使用。
（項目５０）
前記結合剤は、抗体またはその抗原結合断片である、項目４９に記載の使用。
（項目５１）
前記抗体または抗原結合断片は、項目１〜４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片である、項目５０に記載の使用。
（項目５２）
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を評価するための予後ツール、診断ツール、またはモニターツールの製造における、項目１〜４のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ抗体またはその抗原結合断片の使用。
（項目５３）
対象における急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の予測、診断、またはモニタリングのための、項目１〜４のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ抗体またはその抗原結合断片の使用。
（項目５４）
項目４０〜４３のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ結合剤を含む、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキットであって、前記キットは、ＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の発症の４時間以内に、またはＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害の臨床提示の４時間以内に対象から得られる生物学的試料を用いる使用のためのものであるキット。
（項目５５）
項目４０〜４３のいずれか一項に記載の結合剤を含む、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓（cardia）移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキットであって、前記キットは、０．１〜５００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１〜３００ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２〜１００ｐｍｏｌ／Ｌの範囲におけるＡＮＰ−ＳＰレベルを測定するために較正されるキット。
（項目５６）
項目１〜４のいずれか一項に記載のＡＮＰ−ＳＰ抗体またはその抗原結合断片を含む、急性心障害（ＡＣＤ）、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニターするためのキット。
（項目５７）
前記結合剤または抗体が固定されている固相をさらに含む、項目５４〜５６のいずれか一項に記載のキット。
（項目５８）
発症または臨床提示の４時間以内に得られた前記生物学的試料において測定されるＡＮＰ−ＳＰレベルから、発症または臨床提示の４時間以内に、対象におけるＡＣＤ、心臓移植拒絶、またはＡＣＤ／肺障害を予測する、診断する、またはモニタリングするための説明書をさらに含む、項目５４〜５７のいずれか一項に記載のキット。
（項目５９）
ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）（配列番号１２）もしくはＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）をコードする核酸分子またはその断片もしくは変異体であって、前記核酸は、
（ａ）配列番号１３もしくは配列番号１７またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）配列番号１３または配列番号１７に対して７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する配列、
（ｃ）配列番号１３もしくは配列番号１７に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列またはその断片もしくは変異体、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの配列にハイブリダイズすることができる、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの配列、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの相補体であり、
ただし、前記配列が配列番号１５ではないということを条件とする、核酸分子またはその断片もしくは変異体。
（項目６０）
項目５９に記載の核酸分子を含む遺伝子構築物。
（項目６１）
発現構築物である、項目６０に記載の遺伝子構築物。
（項目６２）
項目６０または６１に記載の遺伝子構築物を含むベクター。
（項目６３）
項目６０〜６２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物またはベクターを含む宿主細胞。
（項目６４）
項目５９に記載の核酸分子によってコードされるＡＮＰ−ＳＰポリペプチドまたはその変異体もしくは断片。
（項目６５）
（ａ）ＡＮＰ−ＳＰ（１６〜２５）（配列番号１２）またはその変異体もしくは断片、
（ｂ）ＡＮＰ−ＳＰ（１〜１０）（配列番号１６）またはその変異体もしくは断片、または
（ｃ）配列番号１２または配列番号１６のポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列から選択されるＡＮＰ−ＳＰポリペプチドまたはその変異体もしくは断片。
（項目６６）
（ａ）項目６４または６５に記載のポリペプチドを発現することができる、項目６０または６１に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞を培養する工程および
（ｂ）本発明の前記ポリペプチドを発現する細胞を選択する工程、
（ｃ）前記細胞から前記発現ポリペプチドを分離する工程、ならびに任意選択で
（ｄ）前記発現ポリペプチドを精製する工程を含む、項目６４または６５に記載のポリペプチドの組換え生産のための方法。
（項目６７）
前記構築物を用いて前記宿主細胞をトランスフェクトするためのプレ工程を含む、項目６６に記載の方法。
本発明は、ここでは、添付図面における図に関連して記載される。
【国際調査報告】
2011514156.tif 000010
2011514156.tif 000011
2011514156.tif 000012
2011514156.tif 000013
2011514156.tif 000014