(57)【要約】  本発明は、新規バクテリオファージに関し、さらに詳しくは、腸炎菌、ネズミチフス菌、家禽チフス菌およびひな白痢菌よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ菌に対して特異的死滅能を有するバクテリオファージに関する。また、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む腸炎菌またはネズミチフス菌により誘発されるサルモネラ症とサルモネラ食中毒、家禽チフス菌により誘発される家禽チフス、ひな白痢菌により誘発されるひな白痢などの感染性疾病の予防または治療用組成物に関する。また、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、家畜飼料、飲用水、洗浄剤および消毒剤に関する。
2011514802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸炎菌(Salmonella Enteritidis)、ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ菌に対して特異的死滅能を有し、形態学上(morphotype)マイオウイルス科(Myoviridae)に属し、全体ゲノムのサイズが１５７〜１５９ｋｂｐであり、４４〜４６ｋＤａ、６１〜６３ｋＤａおよび７９〜８１ｋＤａサイズのタンパク質を主要構造タンパク質として有することを特徴とする、新規バクテリオファージ。
【請求項２】
前記バクテリオファージは、寄託番号ＫＣＣＭ１０９７７Ｐであることを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３】
前記バクテリオファージは、形態学的に図１に示された形態型を有することを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項４】
前記バクテリオファージは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４よりなる群から選ばれた一つ以上の核酸分子を全体ゲノムの一部として含むことを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項５】
前記バクテリオファージは、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、および配列番号１１と１２よりなる群から選ばれた一つ以上のプライマーセットでＰＣＲを行った場合、それぞれ１ｋｂｐのＰＣＲ産出物を有することを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項６】
前記バクテリオファージは、下記１）〜３）の一つ以上の特性を有することを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ：
１）ｐＨ３．５〜ｐＨ９．０で耐酸性を有すること；
２）３７℃〜６０℃で耐熱性を有すること；および、
３）３７〜６０℃で０〜１２０分間乾燥させる際に耐乾性を有すること。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項のバクテリオファージを有効成分として含む、家禽チフス菌(Salmonella Gallinarum)、ひな白痢菌(Salmonella pullorum)、ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)および腸炎菌(Salmonella Enteritidis)よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ菌により誘発された感染性疾病の予防または治療用組成物。
【請求項８】
前記腸炎菌(Salmonella Enteritidis)またはネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)感染性疾病はサルモネラ症またはサルモネラ食中毒であり、家禽チフス菌感染性疾病は家禽チフスであり、ひな白痢菌(Salmonella pullorum)感染性疾病はひな白痢であることを特徴とする、請求項７に記載の感染性疾病の予防または治療用組成物。
【請求項９】
抗生剤として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の感染性疾病の予防または治療用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項のバクテリオファージを有効成分として含む家畜用飼料または飲用水。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項のバクテリオファージを有効成分として含む消毒剤または洗浄剤。
【請求項１２】
請求項１〜６のバクテリオファージを用いて腸炎菌、ネズミチフス菌、家禽チフス菌およびひな白痢菌よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ菌により誘発された感染性疾病を予防または治療する方法。
【請求項１３】
請求項７の組成物を用いて、腸炎菌、ネズミチフス菌、家禽チフス菌およびひな白痢菌よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ菌により誘発された感染性疾病を予防または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規バクテリオファージに係り、より具体的には、腸炎菌(Salmonella Enteritidis)、ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、家禽チフス菌(Salmonella Gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ属菌を特異的に死滅させることが可能なバクテリオファージに関する。また、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、腸炎菌またはネズミチフス菌により誘発されるサルモネラ症およびサルモネラ食中毒、家禽チフス菌により誘発される家禽チフス、およびひな白痢菌により誘発されるひな白痢などの感染性疾病の予防または治療用組成物に関する。また、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、家畜飼料、飲用水、洗浄剤および消毒剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ菌は、腸内菌とのグラム陰性の通性嫌気性細菌１属（条件無酸素菌である）で無芽胞性の桿菌であり、一般に周毛性鞭毛による運動性を有する。サルモネラ菌の遺伝子の場合、塩基中の５０〜５２％程度がＧＣなので、大腸菌(Escherichia coli)および赤痢菌(Shigella)のそれと類似である。サルモネラ菌属は、ヒトにだけでなく、各種家畜に感染して多様な疾病を起こす病原性微生物である。サルモネラ種としての腸炎菌(Salmonella enterica)を血清学的に区分すると、Gallinarum、Pullorum、Typhimurium、Enteritidis、Typhi、Choleraesuis、derbyなどを含んだ多くの血清型(serovar)を有する(Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strokebine NA. Escherichia, Shigella, Salmonella. In Murry PR, Baron EJ, et al eds Manual of clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC American Society for Microbiology 1999;467-74 ; Ryan KJ. Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9)。これらのうち、家禽に特異的なGallinarumとPullorum、ヒトに特異的なTyphi、豚に特異的なSalmonella Choleraesuisとderby、および疾病を起こす対象動物が様々な人畜共通血清型の腸炎菌(Salmonella enterica)とネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)などにより誘発された疾病は、農家および消費者に莫大な被害を与えることもある。
【０００３】
サルモネラ菌が家禽に誘発する疾病の一例として、家禽チフス菌（Salmonella gallinarum、以下「ＳＧ」という）を病原体とする家禽チフス（Fowl Typhoid、ＦＴ）がある。この家禽チフス（ＦＴ）は、鳥および七面鳥などの鳥類に発生する急・慢性の伝染病であって、全ての日齢に現れる敗血症による高い斃死率がその特徴である。最近、家禽チフスはヨーロッパ、南米、アフリカおよび東南アジアなどでは発生頻度が高いと報告されており、その被害が毎年増加している。韓国では、１９９２年以来、主に家禽チフスの発生が褐色産卵鶏農場を中心として全国的に拡散してきた(Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on avian diseases. Information publication by National Veterinary Research & Quarantine Service. March, 2001; Kim Ae-Ran et al., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347-353)。
【０００４】
ひな白痢(pullorum disease)もサルモネラ菌を原因とする疾病であって、ひな白痢菌（Salmonella Pullorum、以下「ＳＰ」という。）によって発病する。ひな白痢は、日齢または季節を問わずに発病するが、初生雛時期に最も感受性が高いことが特徴である。ひな白痢は、去る１世紀の間、韓国を含んだ全世界にわたって、母鶏から卵への経卵伝染によって１〜２週齢未満の日齢ひなに発生し、その被害が深刻であった疾病であって、去る１９８０年代以後にその発生が非常に減少したが、近年１９９０年代中盤以後にさらに増加する趨勢にある(Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on avian diseases. Information publication by National Veterinary Research & Quarantine Service. March, 2001; Kim Ae-Ran et al., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347-353)。
【０００５】
韓国では、１９９０年代以後、家禽チフスとひな白痢の発病率が増加している趨勢にあり、濃家に大きい経済的損失を与えている。このため、２００４年から弱毒化ＳＧ生菌ワクチンを若鶏（ブロイラー）に使用して家禽チフスを予防しようとしたが(Kim Ae-Ran et al., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347-353)、ワクチンの効果に対する疑いが提起されており、産卵鶏(Layer)では経卵伝染の懸念で生菌ワクチンの使用が許可されていない。家禽チフスとは異なり、ひな白痢は現在商業化された予防策はない。よって、家禽チフスとひな白痢を予防することが可能な方法の模索が至急な実情である。
【０００６】
一方、腸炎菌(Salmonella Enteritidis、以下「ＳＥ」と命名する。)、ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium、以下「ＳＴ」と命名する。)は、ＳＧまたはＳＰとは異なり、宿主特異性なしで疾病を起こす人畜共通伝染菌である(Zoobises Report; United Kingdom 2003)。
【０００７】
ＳＥとＳＴは、家禽、豚および牛などにおいてサルモネラ症(salmonellosis)を誘発する。サルモネラ症は、サルモネラ菌により誘発される、家畜における急性または慢性の消化器伝染病であって、発熱、腸炎および敗血症を主な症状とし、肺炎、関節炎、流産および乳腺炎も誘発するおそれがある。サルモネラ症は、全世界的に発生し、季節的には主に夏季に最も多く発病する(T.R. Callaway et al. Gastrointestinal microbial ecology and the safety of our food supply as related to Salmonella. J Anim Sci 2008.86:E163-E172)。牛の場合、一般に食欲不振、発熱、黄色下痢、および血の混じった粘液便などの症状が特徴であるが、子牛の場合は、急性感染の際に数日内に斃死し、妊娠中には血流を通じて胎牛に感染して敗血症により斃死して早流産が発生するおそれがある(www.livestock.co.kr)。豚の場合、急性敗血症型、急性腸炎型および慢性腸炎型に分けられる。急性敗血症型は、２〜４ヶ月齢の子豚に発生し、発病２〜４日以内に大部分が斃死してしまう。急性腸炎型は、肥育期に発病し、下痢、高熱、肺炎および神経症状を伴い、重症の場合には皮膚変色も現れる。慢性腸炎型は下痢を伴い続ける(www.livestock.co.kr)。
【０００８】
ＳＥとＳＴにより家禽、豚、牛にサルモネラ症が発病すると、治療薬剤のみで完治させることが非常に難しい。これはサルモネラ菌が各種薬剤に強い耐性を有し、臨床症状を示す間には一般な抗菌剤が浸透し得ない細胞内に寄生するためであり、抗生剤を含んで、ＳＥとＳＴにより発病するサルモネラ症を抑制するための効果的な方法が未だない(www.lhca.or.kr)。
【０００９】
また、ＳＥとＳＴは、家畜の疾病を誘発するうえ、家畜および製品を介してヒトに感染してサルモネラ食中毒を誘発することもある。感染した家畜（すなわち、肉類、家禽類、卵およびこれらの副産物）を食材として使用した、煮込んでいない飲食物を摂取したときに人体に伝染される。ヒトにサルモネラ食中毒が発病すると、一般に頭痛、発熱、激しい腹痛、下痢、悪心、嘔吐などの症状が生ずる。症状は、通常、感染６〜７２時間後に現れて４〜７日間持続し、場合によっては一層持続することもある(NSW+HEALTH. 2008.01.14.)。
【００１０】
米国の疾病管理センター（ＣＤＣ）の統計によれば、２００５年〜２００８年の間に発生したヒトの食中毒を起こす原因菌のうちサルモネラが１６％を占めており、特にＳＥが２０％、ＳＴが１８％にも至る。また、１９７３年〜１９８４年の間に発生したヒトのサルモネラ感染症のうち、鶏が中間媒介体として作用した場合が５％の比率を示し、牛肉が１９％、豚肉が７％、酪農製品が６％、七面鳥が９％の比率をそれぞれ示すと報告されたことがある。１９７４〜１９８４年に屠鶏処理段階で若鶏（ブロイラー）に対して微生物学的調査を行った結果、サルモネラ菌が３５％以上を占めると報告された。また、１９８３年には、サルモネラ菌の存在は、鶏の屠体では５０．６％、七面鳥では６８．８％、グースでは６０％、豚肉では１１．６％、牛肉では１．５％であった。これと共に２００７年の統計によれば、サルモネラ菌は生家禽肉と生豚肉でそれぞれ５．５％、１．１％発見された。特に、ＳＥは大部分が汚染した卵または家禽肉に由来し、ＳＴは大部分が汚染した豚肉、家禽肉または牛肉に由来すると明らかにされた(www.cdc.gov (Centers for Disease Control and Prevention (CDC)))。例えば、１９８８年以後、米国、カナダおよびヨーロッパではＳＥによる食中毒の事例が急激に増加したが、疫学的な追跡結果、卵または卵含有料理がその原因であることを解明したことがある(Agre-Food Safety Information Service(AGROS). Domestic and foreign food poisoning occurrence and management trend. 2008. 02)。また、２００２年にＦＡＯとＷＨＯが行ったリスク評価では、卵と家禽肉を介して伝播されたサルモネラ食中毒の発病率が家禽類のサルモネラ菌有病率と密接な関係にあることを明らかにした。すなわち、家禽類のサルモネラ菌有病率が減少すると、ヒトのサルモネラ食中毒の発病率も減少するという意味である(Salmonella control at the source; World Health Organization. International Food Safety Authorities Network (INFOSAN) Information Note No. 03/2007)。最近では、家畜だけでなく、ピーナッツ、ほうれん草、トマト、ピスタチオ、コショウ、クッキー生地などの多様な飲食材料からのサルモネラ菌が起こす発病により、飲食物の安全に対する懸念が提起されている(Jane Black and Ed O'Keefe. Overhaul of Food Safety Rules in the Works. Washington Post Staff Writers Wednesday, July 8, 2009)。
【００１１】
このようにサルモネラ菌による被害のため、ドイツではサルモネラ菌による感染が報告されるように義務付けられている(§6 and §7 of the German law on infectious disease prevention, Infektionsschutzgesetz)。１９９０年〜２００５年にわたって２０万件から約５万件に減少したと公式的に記録されたが、５名中の約１名がサルモネラ菌保菌者として推定されており、米国ではサルモネラ菌感染が約４万件程度毎年報告されている趨勢である(en.wikipedia.org/wiki/Salmonella#cite_note-2)。
【００１２】
したがって、家畜のサルモネラ症および家畜由来ヒトにおけるサルモネラ食中毒を起こすＳＥとＳＴの統制方法の模索が至急な状況である。米国ＦＤＡとＵＳＤＡは、米国内で１００万件超過の病気を誘発する原因菌としてのサルモネラ菌を予防するための多様な措置を具体化した。これらのうち、ＦＤＡによって提起された最終法案は卵における汚染を防止するためのものであるが、米国内の卵製造社は致命的なサルモネラ菌の感染伝播を防ぐために卵の生産、貯蔵および輸送の際に強力な安全措置を取ることにより、毎年卵の摂取によって誘発されるＳＥ感染７万９０００件を予防し、これによる死亡３０件も減らすことができるだろうと期待した(Jane Black and Ed O'Keefe. Overhaul of Food Safety Rules in the Works. Washington Post Staff Writers Wednesday, July 8, 2009)。デンマーク飼育場におけるサルモネラ菌管理費用に対する費用効果分析結果によれば、サルモネラ菌を管理することにより、２００１年度に少なくとも１４１０万ドルを節約することができるという報告がある(Salmonella control at the source; World Health Organization. International Food Safety Authorities Network (INFOSAN) Information Note No. 03/2007)。
【００１３】
一方、バクテリオファージは、特定の細菌にのみ感染して細胞の成長を統制する細菌特異的ウイルスであって、細菌宿主なしでは自己増殖が不可能である。バクテリオファージは、一本鎖或いは二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが遺伝物質として核酸を構成しており、この核酸をタンパク質外皮で包んでいる単純な構造である。バクテリオファージは、形態学的な構造、遺伝物質によって分類される。形態学的な構造によって、二十面体の頭に尾がある形態、二十面体の頭に尾がない形態、およびフィラメント形態の３つの基本型構造に分けられる。二本鎖ＤＮＡを遺伝物質として有し且つ二十面体の頭からなるバクテリオファージは、尾の模様によって収縮性尾形態のマイオウイルス(Myoviridae)、長い無収縮性尾形態のシフォビラーダ(Siphoviridae)、および短い無収縮性尾形態のポドウイルス(Podoviridae)に分類される。ＲＮＡまたはＤＮＡを遺伝物質として有し且つ二十面体の頭に尾がないバクテリオファージは、頭の形態、頭の構成成分、および外皮有無によって分類される。最後に、ＤＮＡを遺伝物質として有するフィラメント形態のバクテリオファージは、大きさ、模様、外皮およびフィラメント構成成分によって分類される(H.W.Ackermann. Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000; Arch Virol (2001) 146:843-857; Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application; CRC press)。
【００１４】
細菌を感染させるとき、バクテリオファージは細菌の表面にくっ付いて自分の遺伝物質を細胞内に注入した後、溶菌性(lytic)または溶原性(lysogenic)を示す。溶菌性の場合、バクテリオファージが細胞機構を用いて自分の構造物を作った後、新規のバクテリオファージ粒子を放出させることにより、細胞を破壊または溶解する。溶原性の場合、自分の核酸を細菌宿主細胞の染色体に取り入れ、細菌を破壊することなく細胞と共に複製されるが、一定の条件になると溶菌性に転換される(Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application. CRC press)。
【００１５】
バクテリオファージの発見以来、これを感染疾病治療剤として用いるための研究が行われてきたが、広範囲な宿主範囲(broad target spectrum)を有する抗生剤の特性に比べて、バクテリオファージは、宿主特異性(specific target spectrum)を有するので、競争から外されて関心を受けていない。ところが、抗生剤の誤・濫用により抗生剤耐性菌の問題が深刻になり、食品内の抗生剤残留による人体への悪影響に対する懸念が加えられている(Cislo, M et al. Bacteriophage treatment of suppurative skin infections. Arch Immunol.Ther.Exp. 1987.2:175-183; Kim sung-hun et al., Bacteriophage; New Alternative Antibiotics. biological research information center, BRIC)。特に、動物の成長促進のために飼料に添加する抗生剤（antimicrobial growth promoters、ＡＧＰ）が抗生剤耐性誘発の主要原因であることが明らかにされることにより、ＡＧＰの使用を禁止する政策が立案され、ヨーロッパ連合では２００６年から全てのＡＧＰの使用が禁止されており、韓国では、２００９年に一部ＡＧＰの使用禁止が施行されており、向後２０１３〜２０１５年には全面禁止が予想されている。
【００１６】
このような趨勢に伴い、バクテリオファージの研究にさらに関心が集められている。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ菌を統制するための７種のバクテリオファージが２００２年に登録された米国特許第６，４８５，９０２号(Use of bacteriophages for control of Escherichia coli O157)に記述されている。また、Ｎｙｍｏｘ社では、多様な種の微生物を統制する２種のバクテリオファージが２００５年に登録された米国登録特許第６，９４２，８５８号に記述されている。バクテリオファージに関する研究が盛んに行われるにつれて、産業界ではバクテリオファージを用いた多様な商品を開発している。ヨーロッパのＥＢＩ ｆｏｏｄ ｓｙｓｔｅｍ社では、バクテリオファージを用いて、リステリア菌による食中毒を防止する食品添加剤製品Ｌｉｓｔｅｒｉｘ−Ｐ１００を開発して最初に米国ＦＤＡの承認を受けたとともに、同一概念のリステリア菌統制食品添加型バクテリオファージ製品ＬＭＰ−１０２を開発してＧＲＡＳ(Generally regarded as safe)の認証を受けた。また、２００７年には、ＯｍｎｉＬｙｔｉｃｓ社により、屠畜過程中に大腸菌Ｏ１５７が牛肉製品を汚染させることを防ぐための洗浄液として、バクテリオファージを用いた製品が開発され、ＵＳＤＡ'ｓ ＦＳＩＳ(USDA's Food Safety and Inspection Service)から承認された。Clostridium sporogenes phage NCIMB 30008およびClostridium tyrobutiricum phage NCIMB 30008は、それぞれ２００３年と２００５年にヨーロッパで飼料保存剤として登録され、飼料内の汚染したクロストリジウム菌の統制を目的とする製品として開発された。これは、バクテリオファージを用いて、抗生剤治療の難しい細菌、或いは畜産物などを汚染させる人畜共通伝染菌などを食品段階で統制するための目的を達成しようとする多くの研究が持続的に行われていることを示唆する。
【００１７】
しかし、大部分のバクテリオファージに関する研究は、大腸菌、リステリア菌、クロストリジウム属菌を統制することに注力している。サルモネラ菌も人畜共通伝染菌であって、このサルモネラ菌に対する被害が減っていない。特に、ＳＥ、ＳＴは様々な薬剤に対して耐性を有し易いため、現在韓国では伝染病予防法施行令（大統領令第１６９６１号）、伝染病予防法施行規則（保健福祉部令第１７９号）および国立保健院職制（大統領令第１７１６４号）によって耐性監視を行っている。よって、サルモネラ菌を統制することが可能なバクテリオファージの開発が必要である。
【発明の概要】
【００１８】
本発明者らは、広範囲な抗生剤の使用により発生する問題点を解決するために、家畜の主要疾病を起こすサルモネラ菌に感染するバクテリオファージを自然源から分離し、これらの形態的、生化学的および遺伝的特性を確認した結果、前記バクテリオファージが、これらの益菌には影響を与えることなく腸炎菌（ＳＥ）、ネズミチフス菌（ＳＴ）、家禽チフス菌（ＳＧ）およびひな白痢菌（ＳＰ）を全て死滅させることができるうえ、耐酸性、耐熱性および耐乾性にも優れることを確認した。本発明者は、本発明に係る新規のバクテリオファージを用いると、腸炎菌またはネズミチフス菌により誘発される家畜サルモネラ症、家畜由来サルモネラ食中毒、および家禽チフス菌とひな白痢菌により誘発される疾患、特に家禽チフスおよびひな白痢の予防および治療が可能であることを確認した。また、本発明に係るバクテリオファージは、サルモネラ菌を統制することが可能な各種製品、すなわち、家畜飼料添加剤、家畜飲用水、畜舎消毒剤および肉加工洗浄剤にも適用可能であることを確認し、本発明を完成した。
【００１９】
本発明の目的は、腸炎菌、ネズミチフス菌、家禽チフス菌およびひな白痢菌よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ属菌に対して特異的死滅能を有するバクテリオファージを提供することにある。
【００２０】
本発明の他の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む腸炎菌、ネズミチフス菌、家禽チフス菌およびひな白痢菌よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ属菌により誘発された感染性疾病の予防または治療用組成物を提供することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家畜用飼料または飲用水を提供することにある。
【００２２】
本発明の別の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む消毒剤または洗浄剤を提供することにある。
【００２３】
本発明の別の目的は、前記バクテリオファージ、または前記バクテリオファージを有効成分として含む組成物を用いて、腸炎菌、ネズミチフス菌、家禽チフス菌およびひな白痢菌よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ菌により誘発された感染性疾病を予防または治療する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の新規バクテリオファージは、腸炎菌、ネズミチフス菌、家禽チフス菌およびひな白痢菌よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ属菌に対して特異的死滅能を有し、耐酸性、耐熱性および耐乾性にも優れる。よって、新規バクテリオファージは、腸炎菌、ネズミチフス菌、家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病であるサルモネラ症、サルモネラ食中毒、家禽チフスまたはひな白痢の予防および治療用途として利用可能であるうえ、腸炎菌、ネズミチフス菌、家禽チフス菌およびひな白痢菌の統制用途としても利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ΦＣＪ３の電子顕微鏡写真である。形態学上、正二十面体の頭(an isometric capside)および収縮性のある尾(a long contractile tail)からなる形態型(morphotype)マイオウイルス科(Myoviridae)に属する。
【図２】分離されたバクテリオファージΦＣＪ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。バクテリオファージのタンパク質パターンを示すもので、約４５ｋＤａ、６２ｋＤａおよび８０ｋＤａの主タンパク質が観察され、その他にも１７ｋＤａ、２８ｋＤａ、１１０ｋＤａおよび１７０ｋＤａのタンパク質が観察された。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｅｅ−ｂｌｕｅ ｐｌｕｓ ２ ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ−ｓｔａｎｄａｒｄ をマーカーとして使用した。
【図３】分離されたバクテリオファージΦＣＪ３のＰＦＧＥ結果である。ΦＣＪ３の全体ゲノムサイズは約１５８ｋｂｐ程度である。Ｂｉｏ−ｒａｄ社の５ｋｂｐ ＤＮＡ ｓｉｚｅ ｓｔａｎｄａｒｄをサイズマーカーとして使用した。
【図４】ΦＣＪ３のゲノムＤＮＡの各プライマーセットを用いたＰＣＲ結果を示すものである。Ａ；配列番号５と６のプライマーセットでＰＣＲ増幅、Ｂ；配列番号７と８のプライマーセットでＰＣＲ増幅、Ｃ；配列番号９と１０のプライマーセットでＰＣＲ増幅、Ｄ；配列番号１１と１２のプライマーセットでＰＣＲ増幅。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ ｌａｎｅはいずれも約１．０ｋｂｐ程度のＰＣＲ産出物を持つ。
【図５】バクテリオファージΦＣＪ３の一段増殖(one-step growth)実験結果である。家禽チフス菌、ひな白痢菌、ネズミチフス菌および腸炎菌において、全て放出量が約２×１０2 ｐｆｕ以上である。
【図６】バクテリオファージΦＣＪ３の一段増殖(one-step growth)実験結果である。家禽チフス菌、ひな白痢菌、ネズミチフス菌および腸炎菌において、全て放出量が約２×１０2 ｐｆｕ以上である。
【図７】バクテリオファージΦＣＪ３の一段増殖(one-step growth)実験結果である。家禽チフス菌、ひな白痢菌、ネズミチフス菌および腸炎菌において、全て放出量が約２×１０2 ｐｆｕ以上である。
【図８】バクテリオファージΦＣＪ３の一段増殖(one-step growth)実験結果である。家禽チフス菌、ひな白痢菌、ネズミチフス菌および腸炎菌において、全て放出量が約２×１０2 ｐｆｕ以上である。
【図９】バクテリオファージΦＣＪ３の耐酸性実験結果であって、ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、６．９、７．４、８．０および９．０における生存バクテリオファージの数を示す。対照群と比較して、ｐＨ３．５まではバクテリオファージΦＣＪ３の活性を失わないが、ｐＨ３．０以下では活性を完全に失う。
【図１０】バクテリオファージΦＣＪ３の耐熱性実験結果であって、３７、４５、５３、６０、７０および８０℃で０、１０、３０、６０および１２０分毎に時間別に静置しておいたときの生存バクテリオファージの数を示す。６０℃で２時間まで曝露されても活性を殆ど失わないが、７０℃以上では１０分曝露後に活性を完全に失う。
【図１１】バクテリオファージΦＣＪ３の耐乾性実験結果である。スプレードライヤーを用いてデキストリンと砂糖を安定化剤として入れて乾燥処理した結果であって、乾燥の前後で力価の変化を比較して相対的な安定性を調べたところ、活性が約５×１０3 程度に減少することが分かった。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
一様態において、本発明は、腸炎菌(Salmonella Enteritidis)、ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ菌に対して特異的死滅能を有し、形態型(morphotype)マイオウイルス科(Myoviridae)に属し、全体ゲノムのサイズが１５７〜１５９ｋｂｐであり、４４〜４６ｋＤａ、６１〜６３ｋＤａおよび７９〜８１ｋＤａサイズのタンパク質を主要構造タンパク質として有することを特徴とする、新規バクテリオファージに関する。
【００２７】
具体的に、本発明のバクテリオファージは、サルモネラ菌のうち、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)、ひな白痢菌(Salmonella pullorum)、ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)および腸炎菌(Salmonella Enteritidis)を選択的に感染させ、他の種は感染させない種特異性を有する。
【００２８】
本発明のバクテリオファージは、遺伝学的に全体ゲノムサイズが１５７〜１５９ｋｂｐであり、好ましくは全体ゲノムサイズが約１５８ｋｂｐである。配列番号１、２、３および４よりなる群から選ばれた一つ以上の核酸分子を全体ゲノムの一部として含むことができ、好ましくは配列番号１〜４に記載された核酸分子を全体ゲノムの一部として含む。
【００２９】
本発明のバクテリオファージは、遺伝学的に配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、および配列番号１１と１２よりなる群から選択された一つ以上のプライマーセットでＰＣＲを行った場合、それぞれ１ｋｂｐ程度のＰＣＲ産出物を有する。好ましくは、前記プライマーセット全てでＰＣＲを行った場合、それぞれ１ｋｂｐ程度のＰＣＲ産出物を有する。
【００３０】
本発明のバクテリオファージは、形態学上、正二十面体の頭(an isometric capside)および収縮性のある尾(a long contractile tail)からなる形態型(morphotype)マイオウイルス科(Myoviridae)に属し、好ましくは図１に示した形態型を有することを特徴とする。
【００３１】
本発明において、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子における基本構成単位のヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体(analogue)を含む概念である。
【００３２】
本発明のバクテリオファージは、遺伝学的に主要構造タンパク質として４４〜４６ｋＤａ、６１〜６３ｋＤａおよび７９〜８１ｋＤａサイズのタンパク質を有し、好ましくは約４５ｋＤａ、６２ｋＤａおよび８０ｋＤａサイズのタンパク質である。
【００３３】
また、本発明のバクテリオファージは、耐酸性、耐熱性および耐乾燥性の生化学的特徴を一つ以上有する。
【００３４】
より具体的には、ｐＨ３．５〜ｐＨ９．０の広いｐＨ範囲で安定的に生存する耐酸性を有し、３７℃〜６０℃範囲の温度、すなわち高温でも安定的に生存することが可能な耐熱性を有する。また、高温乾燥（６０℃で１２０分）させた後にも安定的に生存する耐乾性を有する。このような耐酸性、耐熱性および耐乾性は本発明のバクテリオファージの多様な温度およびｐＨ範囲への適用を可能にして家畜または家畜由来ヒトに誘発できる疾病の予防および治療用組成物、並びに多様な製品への利用を可能にする。
【００３５】
本発明者は、屠鶏場近くの下水から試料を採取し、ＳＥ、ＳＴ、ＳＧおよびＳＰに対して死滅能を有し且つ前述した特徴を持つ本発明のバクテリオファージを同定し、これをΦＣＪ３と命名し、２００８年１２月１７日に韓国微生物保存センター（Korean Culture of Microorganisms、ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１）に寄託番号第ＫＣＣＭ１０９７７Ｐ号で寄託した。
【００３６】
本発明の具体的な実施例によれば、屠鶏場近くの下水から試料を採取し、試料から、ＳＴを宿主細胞としてＳＴを溶菌するバクテリオファージを分離し、これらがＳＥ、ＳＴ、ＳＧおよびＳＰを溶菌させることができることを確認した。また、これらのバクテリオファージΦＣＪ３を電子顕微鏡によって形態学的に観察した結果、形態型(morphotype)マイオウイルス科(Myoviridae)に属することを確認した（図１）。
【００３７】
また、ΦＣＪ３のタンパク質パターンを分析した結果、バクテリオファージの主要構造タンパク質として４５ｋＤａ、６２ｋＤａおよび８０ｋＤａのタンパク質を含むことを確認した（図２）。
【００３８】
また、ΦＣＪ３の全体ゲノムサイズを分析した結果、約１５８ｋｂｐのサイズを持つことを確認した（図３）。これらの遺伝的特性を分析した結果、配列番号１〜４の核酸分子を全体ゲノムの一部として含むことを確認し、これらに基づいて他種間の類似性を比較した結果、現在まで知られているバクテリオファージとの類似性が非常に低いため、新規のバクテリオファージであることを確認した（表２）。遺伝的特性をさらに具体的に分析した結果、ΦＣＪ３に特異的なプライマーセット(primer set)、すなわち配列番号５と６、配列番号７と８、および配列番号９と１０、配列番号１１と１２のプライマーセットでＰＣＲを行ったとき、特定サイズのＰＣＲ産出物であるそれぞれ１ｋｂｐ程度の産出物が得られることを確認した（図４）。
【００３９】
また、ΦＣＪ３をＳＥ、ＳＴ、ＳＧおよびＳＰに感染させたとき、溶菌斑（ファージプラーク）（ソフトアガ(soft agar)で一つのバクテリオファージによって宿主細胞が溶菌されて形成されるクリアゾーン）の大きさおよび濁度などが同一であることを確認した。
【００４０】
また、ΦＣＪ３の安定性を多様なｐＨ範囲および温度で調査した結果、ｐＨ３．５〜９．０（図９）および３７℃〜６０℃の広い範囲（図１０）で安定的に生存するうえ、高温乾燥の際にも安定性を維持（図１１）することを確認した。これは、本発明のバクテリオファージΦＣＪ３を、サルモネラ菌を統制することができる多様な製品へ適用することが容易であることを意味する。
【００４１】
他の様態において、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)、ひな白痢菌(Salmonella pullorum)、ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)および腸炎菌(Salmonella Enteritidis)よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ菌により誘発された感染性疾病の予防または治療用組成物に関する。
【００４２】
好ましくは、腸炎菌(Salmonella Enteritidis)またはネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)感染性疾病としてはサルモネラ症またはサルモネラ食中毒を、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)感染性疾病としては家禽チフスを、ひな白痢菌(Salmonella pullorum)感染疾病としてはひな白痢をそれぞれ挙げることができるが、これに限定されない。
【００４３】
本発明のバクテリオファージは、家禽チフス菌、ひな白痢菌、ネズミチフス菌および腸炎菌を特異的に死滅させることが可能な抗菌活性を有するので、これらの菌により誘発される疾病を予防または治療するための目的で利用できる。具体的に好ましい一様態として、抗生剤を含むことができる。
【００４４】
本発明において、用語「予防」とは、組成物の投与により疾病を抑制させ或いは発病を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、組成物の投与により前記疾病の症状が好転され或いは有利に変更される全ての行為を意味する。
【００４５】
本発明の前記組成物は、５×１０2 〜５×１０12ｐｆｕ／ｍＬのΦＣＪ３を含み、好ましくは１×１０6 〜１×１０10ｐｆｕ／ｍＬのΦＣＪ３を含む。
【００４６】
本発明の前記組成物を適用することが可能な家禽チフス菌感染性疾病の例としては家禽チフス、ひな白痢菌感染性疾病の例としてはひな白痢、ネズミチフス菌または腸炎菌による感染性疾病の例としてはサルモネラ症またはサルモネラ食中毒が好ましいが、これに限定されない。
【００４７】
本発明において、用語「サルモネラ症」は、サルモネラ菌感染により発熱頭痛、下痢、嘔吐などを伴う症状を総称する。すなわち、サルモネラ菌属の細菌により起こる疾病を総称し、サルモネラ症は、腸チフスなどの症状を示す敗血症型と食中毒としての急性胃腸炎型に大別され、腸炎、食中毒、急性菌血症などが含まれる。
【００４８】
本発明の前記組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化されて食品、医薬品および飼料添加剤として提供できる。
【００４９】
本発明において、用語「薬学的に許容される担体」とは、生物体を刺激せず、投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬剤学的担体としては、滅菌および生体に適したものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分の少なくとも一つを混合して使用することができ、必要に応じて他の通常の添加剤、例えば抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などを添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して、例えば水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００５０】
本発明の予防または治療用組成物は、疾患部位へ塗布または噴霧する方法で用いることができ、その他にも経口投与または非経口投与によって投与することもでき、非経口投与の場合には静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与または局部投与を用いて投与することもできる。
【００５１】
本発明の前記組成物の適切な塗布、噴霧および投与量は、製剤化方法、投与方式、対象となる動物および患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によって異なり、通常熟練した医師または獣医師は目的の治療に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。
【００５２】
本発明の組成物を有効成分として含む経口投与剤形としては、例えば錠剤、トローチ剤、ローゼンジ(lozenge)、水溶性または油性懸濁液、調製粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップ、またはエリキシル剤に製剤化することができる。錠剤およびカプセルなどの剤形に製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチまたはサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油を含むことができ、カプセル剤形の場合、前述した物質以外にも、脂肪油などの液体担体をさらに含むことができる。
【００５３】
本発明の組成物を有効成分として含む非経口投与用剤形としては、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用形態、坐剤注入方式または呼吸器を介して吸入可能にするエアロゾル剤などのスプレー用に製剤化することができる。注射用剤形に製剤化するためには、本発明の組成物を安定剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用に製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレー用に剤形化する場合、水に分散した濃縮物または湿潤粉末が分散するように推進剤などが添加剤と共に配合できる。
【００５４】
本発明において、用語「抗生剤」とは、薬剤として動物に提供されて菌を死滅させることが可能な製剤を意味し、防腐剤、殺菌剤および抗菌剤を総称する。前記動物は、ヒトを含む哺乳動物であり、好ましくは家禽類である。本発明のバクテリオファージは、既存の抗生剤に比べてサルモネラに対する特異性が非常に高いので、益菌は死滅させず、特定の病原菌のみを死滅させることができ、薬物耐性を誘導しないため、既存の抗生物質に比べて製品寿命が長い新規抗生剤として提供できる。
【００５５】
本発明の具体的な一実施例によれば、家禽チフス予防用バクテリオファージとしてのΦＣＪ３の産卵鶏において安全性、残留量および卵継代評価によって毒性実験を行い、ΦＣＪ３投与群の産卵率が対照群の産卵率とはほぼ同様であり（表４）、集卵した卵からΦＣＪ３が分離されていないことを確認し（表５）、ΦＣＪ３をＳＧで感染させた鶏の飼料として使用した結果、ΦＣＪ３投薬群が無投薬群より有意に高い防御率を示すことを確認し（表７）、予防および治療の可能性があることを確認した。
【００５６】
別の様態において、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家畜用飼料または飲用水に関する。
【００５７】
畜産、水産業で使用される飼料添加用抗生剤は予防目的で使用されているが、予防目的の抗生剤投与は、耐性菌の発生可能性を高め、且つ家畜に残留する抗生剤がヒトに伝達されるおそれがある。抗生剤が肉類を介して人体に吸収されると、抗生剤耐性を誘発して疾病の拡散をもたらすこともある。また、飼料に混ぜて食べさせる抗生剤の種類が多く、これは多剤耐性菌の発生確率が高くなるという問題点があるため、さらに自然親和的でありながら、既存の抗生剤の使用時に発生した問題を解決する新規の飼料添加用抗生物質として、本発明の前記バクテリオファージを用いることができる。
【００５８】
本発明の家畜用飼料は、バクテリオファージを飼料添加剤の形で別途製造して飼料に混合させ、或いは飼料製造の際に直接添加させて製造することができる。本発明の飼料内バクテリオファージは液状または乾燥状態であり、好ましくは乾燥した粉末形態である。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥および凍結乾燥が使用できるが、これに限定されない。本発明のバクテリオファージは粉末形態で飼料重量の０．０５〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％の成分比で混合できる。また、前記家畜用飼料は、本発明のバクテリオファージの他にも、飼料の保存性を高めることが可能な通常の添加剤をさらに含むことができる。
【００５９】
本発明の飼料添加剤には、非病原性の他の微生物がさらに添加できる。添加可能な微生物としては、タンパク質分解酵素、脂質分解酵素および糖転換酵素を生産することが可能なバシラスサブチリス(Bicillus subtilis)などの枯草菌、牛の胃などの嫌気的条件で生理的活性および有機物分解能のあるラクトバシラス菌株(Lactobacillus sp.)、家畜の体重を増加させ且つ牛乳の産乳量を増やし且つ飼料の消化吸収率を高める効果を示すアスペルギルスオリザエ(Aspergillus oryzae)などの糸状菌(J AnimalSci 43: 910-926, 1976)、およびサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などの酵母(J Anim Sci 56:735-739, 1983)よりなる群から選択できる。
【００６０】
本発明におけるΦＣＪ３を含む飼料は、植物性としては穀物類、堅果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、澱粉類、粗びき粉類、穀物副産物類などがあり、動物性としてはタンパク質類、無機物類、油脂類、単細胞タンパク質、動物性プランクトン類、残りの飲食物などがあり、これに限定されない。
【００６１】
本発明におけるΦＣＪ３を含む飼料添加剤には、品質低下を防止するために添加する結合剤、乳化剤、保存剤などがあり、効用増大のために飼料に添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤、オリゴ糖などがあり、その他にも、飼料混合剤などをさらに含むことができ、これに限定されない。
【００６２】
また、飲用水に混合して供給することにより、持続的に腸内のサルモネラ菌の数を減少させることができ、サルモネラ清浄家畜の生産を模索することができる。
【００６３】
別の様態において、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む消毒剤または洗浄剤に関する。
【００６４】
前記バクテリオファージを有効成分として含む消毒剤は、サルモネラ菌の除去にも活用され、家畜の活動領域、家畜屠畜場、家畜斃死地域、家畜調理場所および調理設備に使用でき、場所はこれに限定されない。
【００６５】
また、前記バクテリオファージを有効成分として含む洗浄剤は、生きている家畜の汚れた皮膚表面、毛および身体の各部位に適用され、感染可能なサルモネラ菌の除去に使用できる。
【００６６】
別の様態において、本発明は、前記バクテリオファージまたは前記組成物を用いて、腸炎菌(Salmonella Enteritidis)、ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、家禽チフス菌(Salmonella Gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ属菌により誘発された感染性疾病を予防または治療する方法に関する。
【００６７】
本発明の前記組成物は、薬学的製剤として動物に投与されるか、或いは家畜の飼料または飲用水に混合してこれを摂食させる方法によって投与されることが可能であり、好ましくは飼料添加剤として飼料に混合されて投与できる。
【００６８】
本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達することが可能な限りは、経口または非経口の多様な経路を介して投与でき、具体的に、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、経鼻、吸入などを介して通常の方式で投与できる。
【００６９】
本発明の治療方法は、本発明の組成物を薬学的有効量で投与することを含む。適切な総１日使用量が正しい医学的判断範囲内において処置医によって決定できることは、当業者には自明である。特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共にまたは同時に使用される薬物などの多様な因子、および医薬分野によく知られている類似因子に応じて異ならせて適用することが好ましい。
【００７０】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。ところが、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７１】
実施例１：サルモネラ菌に感染するバクテリオファージの分離
１−１．バクテリオファージのスクリーニングおよび単一バクテリオファージの分離
屠鶏場および近くの下水終末処理場の試料５０ｍＬを遠心分離管に移して４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を０．４５μｍのフィルターを用いて濾過した。１５０μＬのＳＴ振とう培養液（ＯＤ600 ＝２）と２ｍＬの１０×Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（以下「ＬＢ培地」という。トリプトン１０ｇ；酵母抽出液５ｇ；ＮａＣｌ１０ｇ；最終体積が１Ｌとなるように）に１８ｍＬの試料濾過液を混ぜた。これを３７℃で１８時間培養した後、培養液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄み液を０．２μｍのフィルターを用いて濾過した。ＬＢプレートに３ｍＬの０．７％寒天（ｗ／ｖ）、１５０μＬのＳＴ振とう培養液（ＯＤ600 ＝２）を混ぜ注いで固めた後、その上に１０μＬの試料培養濾過液を滴下して３７℃で１８時間培養した（０．７％寒天をｔｏｐ−ａｇａｒとし、ｔｏｐ−ａｇａｒで成長する宿主細胞を用いて、バクテリオファージの溶菌を観察する方法をソフトアガオーバーレイ(soft agar overlay)方法と定義する）。
【００７２】
溶菌の起こった試料培養濾過液を適当に希釈して１５０μＬのＳＴ振とう培養液（ＯＤ600 ＝２）と混ぜた後、ソフトアガオーバーレイを行って単一溶菌斑を獲得した。一つの溶菌斑が一つのバクテリオファージからなっていると見なすから、単一バクテリオファージを純粋分離するために一つの溶菌斑を取って４００μＬのＳＭ溶液（ＮａＣｌ、５．８ｇ；ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ、２ｇ；１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＬ；Ｈ2 Ｏ、最終体積が１Ｌとなるように）に入れて４時間室温に静置して単一バクテリオファージを純粋分離した。分離されたバクテリオファージを大量確保するために単一バクテリオファージ溶液の上澄み液１００μＬを取った後、１２ｍＬの０．７％寒天および５００μＬのＳＴ振とう培養液と混合して、直径１５０ｍｍのＬＢ培地でソフトアガオーバーレイを実施した。完全に溶菌の起こったプレートに１５ｍＬのＳＭ溶液を注いだ後、４時間室温で若干振とうしてトップアガ内のバクテリオファージを流出させた。バクテリオファージの流出したＳＭ溶液を回収した後、最終体積の１％となるようにクロロホルムを添加して１０分間よく混ぜた後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ここで、得られた上澄み液を０．２μｍのフィルターで濾過して冷蔵保管した。
【００７３】
１−２．バクテリオファージの大量培養
選別されたバクテリオファージを、ＳＴを用いて大量培養した。ＳＴを振とう培養して１．５×１０10ｃｆｕ(colony forming unit)となるように分注して４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、これを４ｍＬのＳＭ溶液に再浮遊させた。ここに７．５×１０7 ｐｆｕ(plaque forming unit)のバクテリオファージを接種してＭＯＩ(multiplicity of infection)＝０．００５に作った後、３７℃で２０分間静置した。これを１５０ｍＬのＬＢ培地が入ったフラスコに接種した後、５時間３７℃で培養した。最終体積の１％となるようにクロロホルムを添加し、２０分間振とうした。ＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡをそれぞれ最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加し、３０分間３７℃で静置させた。最終濃度がそれぞれ１Ｍと１０％（ｗ／ｖ）になるようにＮａＣｌおよびＰＥＧ(polyethylene glycol)を入れた後、４℃で３時間追加静置させた。４℃、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。５ｍＬのＳＭ溶液に沈殿物を再浮遊させた後、２０分間室温に静置させた。ここに４ｍＬのクロロホルムを添加した後、よく攪拌し、４℃、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み液を０．２μｍのフィルターで濾過して、グリセロール密度勾配法（密度：４０％、５％グリセロール）を用いた超遠心分離（３５，０００ｒｐｍ、１時間、４℃）によってバクテリオファージを精製し、これをΦＣＪ３と命名した。精製したΦＣＪ３は３００μＬのＳＭ溶液に再浮遊させた後、滴定した。前記ΦＣＪ３は、２００８年１２月１７日に韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１）に寄託番号第ＫＣＣＭ１０９７７Ｐ号で寄託した。
【００７４】
実施例２：ΦＣＪ３のサルモネラ菌感染有無の調査
選別されたバクテリオファージがＳＴ以外に他種のサルモネラ菌に対して溶菌活性を示すかを検査するために、他種のサルモネラ菌に交差感染を試みた。その結果、ΦＣＪ３はＳＣ(Salmonella enterica Serotype Choleraesuis)、ＳＤ(Salmonella enterica Serotype Derby)、ＳＡ(Salmonella enterica subsp. Arizonae)、およびＳＢ(Salmonella enterica subsp. Bongori)には感染せず、ＳＧ、ＳＰ、ＳＴおよびＳＥに感染した（実施例１２参照）。その結果は表１のとおりである。ＳＧを宿主として用いて生産したΦＣＪ３は、ＳＴで生産されたものと同一の溶菌斑模様、形成された溶菌の透明性程度、タンパク質パターンおよびゲノムサイズを示した。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
実施例３：ΦＣＪ３の形態観察
精製されたΦＣＪ３を０．０１％のゼラチン溶液に希釈した後、２．５％のグルタルアルデヒド溶液で固定した。これをｃａｒｂｏｎ−ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃａ ｐｌａｔｅ（ｃａ．２．５×２．５ｍｍ）に滴下して１０分間適応させた後、滅菌蒸留水で洗浄した。カーボンフィルムを銅グリッド(copper grid)に挿入して４％の酢酸ウラニル(uranyl acetate)で３０〜６０秒間染色し、乾燥を行った後、透過電子顕微鏡（ＪＥＭ−１０１１トランスミッションエレクトロンマイクロスコープ(transmission electron microscope)、８０ｋＶ、倍率×１２０，０００〜×２００，０００）で検鏡した。その結果、分離されたΦＣＪ３の形態は図１のとおりであり、形態学上、正二十面体の頭と収縮性のある尾からなる形態型マイオウイルス科(Myoviridae)に属することが分かった。
【００７７】
実施例４：ΦＣＪ３のタンパク質パターン分析
力価１０11ｐｆｕ／ｍＬの精製されたΦＣＪ３溶液１５μＬと５Ｘ ＳＤＳ試料溶液３μＬを混ぜた後、５分間沸騰した。４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ゲルでΦＣＪ３の全体タンパク質を展開した。クマシーブルー染色溶液を用いてゲルを１時間常温で染色した。その結果、タンパク質パターンは、図２に示すように４５ｋＤａ、６２ｋＤａおよび８０ｋＤａの主要タンパク質が観察され、その他にも１７ｋＤａ、２８ｋＤａ、１１０ｋＤａおよび１７０ｋＤａのタンパク質が観察された。
【００７８】
実施例５：ΦＣＪ３の全体ゲノムＤＮＡサイズの分析
超遠心分離によって精製されたΦＣＪ３のゲノムＤＮＡを抽出した。具体的に、精製されたΦＣＪ３培養液にＥＤＴＡ(ethylenediaminetetraacetic acid（ｐＨ８．０）)、プロテイナーゼＫ、およびＳＤＳ(sodium dodecyl sulfate)をそれぞれ最終濃度２０ｍＭ、５０μｇ／ｍＬ、および０．５％（ｗ／ｖ）となるように添加した後、５０℃で１時間静置した。同量のフェノール（ｐＨ８．０）を添加し、よく混ぜた後、室温で、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液を収得して同量のＰＣ（フェノール：クロロホルム＝１：１）を添加し、よく混ぜた後、室温で、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、上澄み液を収得して同量のクロロホルムをよく混ぜた後、室温で、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液を収得した後、３Ｍの酢酸ナトリウムを全体体積の１／１０だけ混ぜ、２倍量の冷たい９５％のエタノールを添加した後、−２０℃で１時間静置させた。しかる後に、０℃で、１０分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を完全に除去した後、底部のＤＮＡを５０μＬのＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））溶液に溶かした。抽出したＤＮＡを１０倍希釈してＯＤ260 で吸光度を測定することにより濃度を測定した。１μｇの全体ゲノムＤＮＡを１％ＰＦＧＥ(pulse-field gel electrophoresis)アガロースゲルにロードした後、ＢＩＯＲＡＤ ＰＦＧＥシステムの７番プログラム(size range 25-100kbp; switch time ramp 0.4-2.0 seconds, linear shape; forward voltage 180V; reverse voltage 120V)を用いて常温で２０時間展開した。ΦＣＪ３のゲノムＤＮＡのサイズは図３に示すように約１５８ｋｂｐ程度であった。
【００７９】
実施例６：ΦＣＪ３の遺伝的特性分析
分離したΦＣＪ３の遺伝的特性を調べるために、ΦＣＪ３のゲノムＤＮＡ５μｇをＥｃｏＲＶとＳｃａＩ制限酵素で同時に処理した。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をＥｃｏＲＶ制限酵素で切断した後、ＣＩＰ(calf intestinal alkaline phosphatase)処理したものを使用した。ｇＤＮＡ切片とベクターの量が３：１となるように反応条件を合わせて混ぜた後、１６℃で５時間ライゲーションを行った。これを、大腸菌の一種であるＤＨ５α細胞に導入させた。このように形質転換された転換体をアンピシリンおよびＸ−ｇａｌ(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)含有のＬＢ平板培地にプレートし、通常の青白コロニー選別法によって４つのコロニーを選別した。選別されたコロニーをアンピシリン含有の培養培地で１６時間振とう培養した。ここで、プラスミド精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてプラスミドを抽出した。
【００８０】
前記プラスミドのクローニング有無をＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースのプライマーセットを用いてＰＣＲによって確認し、挿入断片のサイズが１ｋｂｐ以上となるものを選んでＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーセットを用いて塩基配列を分析した。こうして得た遺伝子塩基配列が配列番号１〜４に示され、それぞれの大きさはいずれも１ｋｂｐ程度であった。その解読塩基配列の類似性をＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｘプログラムを用いて分析した結果が下記表２に示されている。
【００８１】
表２に示すように、ΦＣＪ３は、配列番号１の解読塩基配列の前部は類似性を示すタンパク質がなく、中間部から後部までは逆方向にＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｐｈａｇｅの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と約４０％の類似性を示した。配列番号２の解読塩基配列の前部は、逆方向にＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｐｈａｇｅのｓｌｉｄｉｎｇ ｃｌａｍｐ ｐｒｏｔｅｉｎと約３２％の類似性を示した。後部も逆方向にｅｃｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ ｐｈａｇｅ ｐｈｉ１のＵｖｓＷ ＲＮＡ−ＤＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ−ＤＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅ ＡＴＰａｓｅと３２％の類似性を示した。配列番号３の解読塩基配列の場合にはバクテリオファージのタンパク質との相同性を示さなかった。配列番号３の解読塩基配列の後部は、ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓのＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮＡ ｈｌｉｃａｓｅ ＲｅｃＧと約２９％の類似性を示し、前部はｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒのｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎと約３８％の類似性を示すことを確認することができた。配列番号４の解読塩基配列の前部は、逆方向にｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ ｐｈａｇｅのＵｖｓＸ ＲｅｃＡ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎと約４６％の類似性を示した。
【００８２】
また、ΦＣＪ３の配列番号２と配列番号３の場合には、ｅ−ｖａｌｕｅが非常に高いうえ、配列番号３の場合には、検索結果、バクテリオファージのタンパク質と分析されなかった。しかも、配列番号１〜４をＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｎプログラムを用いてＤＮＡ塩基配列を分析した結果、塩基配列の相同性は見えなかった。よって、ΦＣＪ３は新規のバクテリオファージと判断された。
【００８３】
【表２】
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【００８４】
実施例７：ΦＣＪ３特異的プライマー塩基配列の製作
ΦＣＪ３を同定するために、ΦＣＪ３特異的プライマーを、配列番号１〜４に基づいて製作した。配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、よび配列番号１１と１２をそれぞれプライマーセットとしてＰＣＲを行った。０．１μｇのバクテリオファージ全体ゲノムＤＮＡと０．５ｐｍｏｌのプライマーをｐｒｅ−ｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）に添加し、最終体積が２０μＬとなるように合わせた。これを変性(denaturation)；９４℃３０秒、アニーリング(annealing)；６０℃で３０秒、重合(polymeration)；７２℃で１分の条件で３０サイクルＰＣＲした。その結果、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、および配列番号１１と１２をプライマーセットとして用いた場合、いずれも約１ｋｂｐ程度のＰＣＲ産物を得た。その結果を図４に示した。
【００８５】
実施例８：バクテリオファージの感染能力の確認
ΦＣＪ３の感染能力を確認するために、一段増殖(one-step growth)実験を行った。
【００８６】
５０ｍＬのＳＧ培養液（ＯＤ600 ＝０．５）を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、２５ｍＬの新しいＬＢ培地に再浮遊させた。ここに分離したバクテリオファージをＭＯＩ＝０．０００５で接種した後、５分間静置させた。反応液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を分離した後、これをさらに新しいＬＢ培地に再浮遊させた。その後、３７℃で培養し、１０分の間隔で２つずつ培養液を収集して１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液のみを取った。処理した実験培養液を段階希釈し、ソフトアガオーバーレイ方法で各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下させた後、３７℃で１８時間培養して溶菌を滴定した。このような実験をＳＰ、ＳＴおよびＳＥに対しても同様に行った。ＳＧ、ＳＰ、ＳＴ、ＳＥを宿主細胞として用いたとき、一段増殖結果をみれば、放出量(burst size)はいずれも２×１０2 以上であることが分かった。その結果を図５〜図８に示した。
【００８７】
実施例９：バクテリオファージのｐＨによる安定性の調査
ΦＣＪ３が家畜の胃内の低いｐＨで安定性を保有するかを確認するために、多様なｐＨ範囲（ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、６．９、７．４、８．２および９．０）で安定性調査実験を行った。多様なｐＨ溶液（酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ２．１、ｐＨ４．０、ｐＨ５．５およびｐＨ６．４）、クエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ２．５、ｐＨ３．０およびｐＨ３．５）、リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ６．９およびｐＨ７．４）、およびトリス溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２およびｐＨ９．０）をそれぞれ２Ｍに製作した。１００μＬのｐＨ溶液と同量の力価１．０×１０10ｐｆｕ／ｍＬのバクテリオファージ溶液を混ぜて各ｐＨ溶液の濃度が１Ｍとなるようにした後、１時間常温で静置した。これらを段階希釈し、ソフトアガオーバーレイ方法を用いて各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して溶菌有無によって溶菌を滴定した。ｐＨの違いによる力価の変化を比較して相対的な安定性を調べた結果、ｐＨ３．５までは活性を失わず非常に安定であることが分かった。しかし、ｐＨ３．０以下のｐＨでは活性を失った。その結果を図９に示した。
【００８８】
実施例１０：バクテリオファージの温度による安定性の調査
バクテリオファージの製品剤形のうち飼料添加剤として用いる場合、バクテリオファージの剤形過程から発生する熱に対する安定性を確認するための実験を行った。力価１．０×１０10ｐｆｕ／ｍＬのΦＣＪ３の溶液２００μＬを３７℃、４５℃、５３℃、６０℃、７０℃および８０℃の温度条件下でそれぞれ０分、１０分、３０分、６０分および１２０分間静置させた。処理した実験培養液を段階希釈し、ソフトアガオーバーレイ方法を用いて各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して溶菌を滴定した。温度および曝露時間による力価の変化を比較して相対的な安定性を調べた結果、６０℃で２時間まで曝露されても活性を多く失わないことが分かった。しかし、７０℃以上では活性を失ってしまうことを確認することができた。その結果を図１０に示した。
【００８９】
実施例１１：バクテリオファージの乾燥に対する安定性の調査
バクテリオファージの製品剤形のうち飼料添加剤として用いる場合、バクテリオファージの剤形過程から発生する乾燥条件に対する安定性を確認した。耐熱性確認実験によって導出した結果に基づき、６０℃で１２０分間高温乾燥実験を行った。力価１．０×１０11ｐｆｕ／ｍＬのΦＣＪ３の溶液２００μＬをスピードバキューム（ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃｕｕｍ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ５３０１、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて乾燥させた。乾燥の後に得られたペレットを、初期溶液と同量のＳＭ溶液に４℃で１日間完全に再浮遊させた。処理した実験培養液を段階希釈し、ソフトアガオーバーレイ方法で各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下させた後、３７℃で１８時間培養して溶菌を滴定した。乾燥の前後で力価の変化を比較して相対的な安定性を調べたところ、活性が約５×１０3 程度に減少することが分かった。その結果を図１１に示した。
【００９０】
実施例１２：バクテリオファージの野生分離株に対する感染範囲の調査
ΦＣＪ３が、実験に使用されたＳＧ（ＳＧ ＳＧＳＣ２２９３）、ＳＰ（ＳＰＳＧＳＣ２２９５）、ＳＴ（ＳＴ ＡＴＣＣ１４０２８）およびＳＥ（ＳＥ ＳＣＳＧ２２８２）以外に、ソウル大学校獣医科大学鳥類疾病学室、国立獣医科学検疫院および疾病管理本部から得た韓国の野生分離株ＳＥ３８株、ＳＴ２２株、ＳＧ５６株およびＳＰ１９株に対して溶菌活性を持つか否かについて確認した。各菌株の振とう培養液（ＯＤ600 ＝２）１５０μＬを混ぜてソフトアガオーバーレイ方法を行い、力価１０10ｐｆｕ／ｍＬのΦＣＪ３の溶液を１０μＬずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して溶菌斑形成有無を観察した。野生分離株ＳＥ９５％、ＳＴ５８％、ＳＧ１００％およびＳＰ８１％の溶菌率を示すことを確認することができた。その結果は下記表３に示した。
【００９１】
【表３】
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【００９２】
実施例１３：バクテリオファージの毒性評価
家禽チフス予防用バクテリオファージとしてΦＣＪ３の産卵鶏における安全性、残留量および卵継代評価によって毒性評価を行った。産卵鶏実験はさらに３つのグループに分けて病原性試験、卵継代試験、並びに病変有無および盲腸糞内のファージ濃度調査を行った。
【００９３】
病原性試験は、産卵中の褐色産卵鶏１３羽をΦＣＪ３投与群に８羽、対照群には５羽割り当てて行った。投与群にはΦＣＪ３を飼料と混合して供給（飼料ｇ当たり１０8 ｐｆｕ以上）し、対照群にはファージを含有していない飼料を供給し、産卵率および臨床症状有無をファージ投与時点から３週間観察した。その結果は表４に示すとおりであり、ΦＣＪ３投与群は約５０％、対照群は約５０％の産卵率を示した。また、ファージ投与後の臨床症状観察結果、およびΦＣＪ３投与後２４日間の観察結果によれば、呼吸器および消化器の異常症状は観察されておらず、活動性においても対照群とほぼ同様なので、ΦＣＪ３投与による問題はないことを確認した。
【００９４】
卵継代試験は、ΦＣＪ３投与３日、６日、９日に集卵した卵１０個内外の表面を７０％エタノールで洗浄し破卵して卵黄と卵白を混合した後、５ｍＬの混合液を４５ｍＬのＰＢＳで１０-1、１０-2、１０-3まで希釈した。各希釈液２５ｍＬに１０6 ｃｆｕのＳＮＵＳＧ０１９７を添加して３７℃で３時間培養した後、遠心分離によって菌体分離した。５００μＬの上澄み液と１００μＬのＳＮＵＳＧ０１９７（１０9 ｃｆｕ／ｍＬ）とを混合してｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ａｇａｒ ｐｌａｔｅにトップアガオーバーレイ方法で塗抹し、３７℃で１８時間培養した後、溶菌斑(plaque)の数から卵１ｍＬ当たりのファージ数を計算した。表５に示すように、３日、６日、９日に集卵した卵２６個におけるΦＣＪ３の有無を検査した結果、ΦＣＪ３が分離されなかった。
【００９５】
産卵鶏における最後の実験として、ΦＣＪ３投与時の病変有無および盲腸糞内のΦＣＪ３濃度を調査した。ΦＣＪ３投与３週後に試験鶏を安楽死させ、剖検して肝臓、脾臓、腎臓および卵胞の肉眼的病所有無を観察し、肝臓試料を綿棒で無菌的に採取してＭａｃ Ｃｏｎｋｅｙ寒天培地に塗抹した後、家禽チフス菌の有無も確認した。また、盲腸糞を採取し、投与したΦＣＪ３の濃度を個体別に測定したが、これは、盲腸糞１ｇを９ｍＬのＰＢＳに浮遊させ、１５０００ｇで３０分間遠心分離した後、上澄み液１ｍＬをＰＢＳで１０-1〜１０-4まで希釈した後、５００μＬの希釈液と１００μＬのＳＧ０１９７（１０9 ｃｆｕ／ｍＬ）を混合して１０×ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ寒天培地にトップアガオーバーレイ方法で塗抹した。これを３７℃で１８時間培養した後、形成された溶菌斑(plaque)の数を数えて段階別希釈倍数を考慮して盲腸糞グラム当たりのバクテリオファージ数を算出した。
【００９６】
その結果、観察期間特異的な臨床症状が観察されておらず、盲腸糞では盲腸糞ｇ当たり約３．７×１０4 ｐｆｕのΦＣＪ３が測定された。これにより、飼料として供給したファージが胃を通過して腸にまで到達していることが分かった。
【００９７】
バクテリオファージの内部臓器分布調査は、１０羽の１１日齢ＳＰＦ雛を５羽ずつ２グループに分け、投与群にはΦＣＪ３飼料ｇ当たりそれぞれ１０8 ｐｆｕを添加した飼料を、対照群にはΦＣＪ３を添加していない飼料をそれぞれ３日間供給した後、犠牲にし、肝臓、腎臓および盲腸糞を採取してΦＣＪ３の有無を確認した。採取した肝臓、腎臓および盲腸糞と同量のＰＢＳを添加して乳化させた後、肝臓は１ｍＬを採取し、腎臓と盲腸糞は全て１．５ｍＬのチューブに入れて１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。１ｍＬの上澄み液をＰＢＳで１０-1〜１０-4まで希釈した後、５００μＬの希釈液と１００μＬのＳＧ０１９７（１０9 ｃｆｕ／ｍＬ）を混合して１０×ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ寒天培地にトップアガオーバーレイ方法で塗抹した。これを３７℃で１８時間培養した後、形成された溶菌斑の数を数えて段階別希釈倍数を考慮し、盲腸糞ｇ当たりのバクテリオファージ数を算出した。その結果、表６に示すように、肝臓および腎臓ではΦＣＪ３が観察されておらず、盲腸糞でのみΦＣＪ３が観察された。
【００９８】
【表４】
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【００９９】
【表５】
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【０１００】
【表６】
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【０１０１】
実施例１４：バクテリオファージの効能評価
ΦＣＪ３のＳＧに対する予防および治療程度の可能性を確認するために、鶏で効能評価実験を行った。
【０１０２】
２０羽の１日齢褐色産卵鶏を１０羽ずつ１０個の試験群（ΦＣＪ３投与群＋無投与攻撃群１つ）に割り当て、試験鶏に、ΦＣＪ３をｇ当たり１０7 ｐｆｕで混合した飼料およびｍＬ当たり１０7 ｐｆｕで混合した飲み水を１週間供給し、１週目に羽当たり１０6 ｃｆｕのＳＧ０１９７と１０7 ｐｆｕの各ファージ（ＭＯＩ＝１０）を５００μＬのＴＳＢに混合した後、氷上に放置してから１時間以内に口腔を介して接種した。２週間斃死率を観察した。生存した試験鶏は、剖検して病変有無を確認し、細菌を分離した。その結果は表７に示した。ΦＣＪ３投与群は無投与群に比べて有意に高い（Ｐ＜０．０５）防御率を示すことが分かった。
【０１０３】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明の新規バクテリオファージは、腸炎菌(Salmonella Enteritidis)、ネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)よりなる群から選ばれた一つ以上のサルモネラ属菌に対して特異的死滅能を有するが、益菌は死滅させず、耐酸性、耐熱性および耐乾性にも優れるので、腸炎菌、ネズミチフス菌、家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病、特にサルモネラ症、サルモネラ食中毒、家禽チフスまたはひな白痢を予防および治療する目的で治療剤、家畜用飼料、家畜飲用水、消毒剤および洗浄剤などに広範囲に利用できる。
【受託番号】
【０１０５】
ＫＣＣＭ１０９７７Ｐ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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