(57)【要約】  本発明は、ＧＳＫ−３の阻害剤などのタンパク質キナーゼの阻害剤として有用な化合物に関する。本発明は、本発明の化合物を含む薬学上許容される組成物および種々の障害の処置に該組成物を使用する方法を提供する。本発明は、本発明の化合物の製造方法を提供する。本発明は、糖尿病、糖尿病性神経障害、骨粗鬆症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、双極性障害、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）、統合失調症、白血球減少症、心筋細胞肥大、脳卒中、脳卒中後、脊髄損傷、外傷性脳損傷、シャルコー・マリー・トゥース病、末梢神経再生および関節リウマチの処置に有用な化合物を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量の式Ｉ
【化１】
2011513483.tif 000049
［式中、
Ｈｔは、
【化２】
2011513483.tif 000050
【化３】
2011513483.tif 000051
または
【化４】
2011513483.tif 000052
であり、
環Ｄは、フェニル、３〜８員単環式脂環式、１〜２個のヘテロ原子を含み、炭素環原子を介してピリジンまたはピリミジン環に結合している５〜８員単環式複素脂環式、アダマンチル、または８〜１０員二環式脂環式であり（ここで、このフェニル、複素脂環式、単環式、二環式または脂環式は所望により１〜２個の−Ｒ５で置換されていてもよい）；
ＲａはＨまたはハロゲンであり；
ＲｂはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
ＲｃはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｚ１はＮまたはＣＨであり；
Ｚ３はＮまたはＣＲＺであり；
ＲＸはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
ＲＹはＨ、ハロゲン、所望により１個のＲ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリル、または所望によりＮＲ１Ｒ２、１〜３個のハロ、−ＯＲで置換されていてもよいＣ１−４アルキル、またはＯ、ＮもしくはＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含み、所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルであるか、または
ＲＸおよびＲＹは、それらが結合している原子と一緒になってフェニル、６〜８員脂環式、またはＯ、ＮもしくはＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５〜８員単環式ヘテロシクリルを形成し；
ＲＺはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ１はＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ２はＨまたは所望により−Ｒ１１で置換されていてもよいＣ１−４アルキルであり；
各Ｒ５は独立にＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキルまたはハロであり；
各Ｒ１０は独立にＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキル、ハロ、ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、ＣＯ２Ｒ、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２Ｒ、ＳＲ、Ｎ（Ｒ４）２、ＣＯＮ（Ｒ４）２、ＳＯ２Ｎ（Ｒ４）２、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ４）ＣＯＲまたはＮ（Ｒ４）ＣＯ２Ｒから選択され；
各Ｒ１１は独立にハロ、ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、ＣＯ２Ｒ、Ｎ（Ｒ４）２、ＣＯＮ（Ｒ４）２、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ４）ＣＯＲまたはＮ（Ｒ４）ＣＯ２Ｒから選択され；
各Ｒ４は独立にＨ、Ｃ１−６アルキルまたはハロＣ１−６アルキルから選択され；かつ
各Ｒは独立にＨ、Ｃ１−６アルキルまたはハロＣ１−６アルキルから選択される］
の化合物またはその薬学上許容される塩を投与することを含む。ＧＳＫ−３介在症状の処置方法。
【請求項２】
Ｈｔが
【化５】
2011513483.tif 000053
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｚ１がＮである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｚ１がＣＨである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｒａがハロゲンである、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＲａがＦである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｈｔが
【化６】
2011513483.tif 000054
である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＲｂがＨである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＲｂがＣＨ３である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
Ｈｔが
【化７】
2011513483.tif 000055
である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＲｃがＨである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＲｃがＣＨ３である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
環Ｄが所望により−Ｒ５で置換されていてもよいフェニルである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
フェニルが−Ｒ５で置換されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
フェニルがピリジンまたはピリミジン環に対してオルト置換されている、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
フェニルがハロゲンで置換されている、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
フェニルがＣｌで置換されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
フェニルがＣ１−６アルキルで置換されている、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
フェニルがＣＨ３で置換されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
フェニルがハロＣ１−６アルキルで置換されている、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
フェニルがＣＦ３で置換されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
環Ｄが３〜８員単環式または８〜１０員二環式脂環式である（ここで、脂環式は所望により−Ｒ５で置換されていてもよい）、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
環Ｄが３〜８員単環式脂環式である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
環Ｄが８〜１０員二環式脂環式である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
環Ｄが５〜８員単環式複素環式である、請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項２６】
環Ｄがテトラヒドロピラニルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
環Ｄがアダマンチルである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ＲＹが所望によりＮＲ１Ｒ２で置換されていてもよいＣ１−４アルキルまたは所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルで所望により置換されていてもよいＣ１−４アルキルである、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ＲＹがＣＨ３である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＲＹが所望によりＮＲ１Ｒ２で置換されていてもよいエチルまたは所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルで所望により置換されていてもよいエチルである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＹが−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ１Ｒ２である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＲＹが所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい−ＣＨ２−ＣＨ２−（４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリル）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＲＸがＨまたはＣＨ３である、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
ＲＸがＣＨ３である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＲＸおよびＲＹが、それらが結合している原子と一緒になってフェニルを形成する、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ＲＸおよびＲＹが、それらが結合している原子と一緒になって６〜８員脂環式を形成する、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
ＲＸおよびＲＹが、それらが結合している原子と一緒になって５〜８員複素環を形成する、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
化合物が化合物Ｉ−１〜Ｉ−５５から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
ＧＳＫ−３介在症状がex vivoまたはin vitro生体サンプルにおいてＧＳＫ３活性を阻害することにより処置される、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
ＧＳＫ−３介在症状が糖尿病、骨粗鬆症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、双極性障害、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、統合失調症、白血球減少症、脳卒中、神経疾患、末梢神経再生および関節リウマチから選択される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が脳卒中である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患が糖尿病である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患が統合失調症である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患が双極性障害である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患が白血球減少症である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患が脳卒中、脊髄損傷、外傷性脳損傷、シャルコー・マリー・トゥース病および糖尿病性神経障害から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患が脳卒中である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
虚血が起こった後に化合物が投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記患者に糖尿病を処置するための薬剤、骨粗鬆症を処置するための薬剤、アルツハイマー病を処置するための薬剤、ハンチントン病を処置するための薬剤、パーキンソン病を処置するための薬剤、ＡＩＤＳ関連痴呆を処置するための薬剤、双極性障害を処置するための薬剤、筋萎縮性側索硬化症を処置するための薬剤、多発性硬化症を処置するための薬剤、統合失調症を処置するための薬剤、白血球減少症を処置するための薬剤、末梢神経再生を処置するための薬剤、脳卒中を処置するための薬剤および関節リウマチを処置するための薬剤から選択される付加的治療薬を投与する付加的ステップを含み、
ａ）該付加的治療薬が処置される疾患に適当であり；
ｂ）該付加的治療薬が単一投与形として前記組成物と一緒に、または複数投与形の一部として前記組成物とは別に投与される、
請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記患者に脊髄損傷を処置するための薬剤、外傷性脳損傷を処置するための薬剤、シャルコー・マリー・トゥース病を処置するための薬剤または糖尿病性神経障害を処置するための薬剤から選択される付加的治療薬を投与する付加的ステップを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、ＧＳＫ−３介在症状の処置方法。
【請求項５２】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載の化合物を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＧＳＫ−３介在症状が脳卒中後、脊髄損傷、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、白血球減少症、糖尿病、末梢神経再生または骨粗鬆症である、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＧＳＫ−３介在症状が脳卒中後である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、ニューロン細胞の軸策および樹状分枝を増加させる方法。
【請求項５６】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載の化合物を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、神経可塑性を促進する方法。
【請求項５８】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載されている化合物を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、脈管形成を促進する方法。
【請求項６０】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載されている化合物を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、神経発生を促進する方法。
【請求項６２】
薬剤が請求項１〜３８に記載されている化合物を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、神経精神障害を処置する方法。
【請求項６４】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載されている化合物を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
神経精神障害が躁病または鬱病である、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＧＳＫ−３介在症状の処置に有用な化合物を同定するための方法であって、１以上の試験化合物についてＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型に対するチロシンの自己リン酸化の量を測定することを含む、方法。
【請求項６７】
ＧＳＫ−３介在症状の処置に有用な化合物を同定するための方法であって、
ＧＳＫ−３酵素のチロシンの自己リン酸化の量を測定すること、および
β−カテニンのリン酸化の量を測定すること
を含む、方法。
【請求項６８】
測定のステップが、試験化合物に対するβ−カテニンのＩＣ５０値を得ること、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値を決定すること、およびβ−カテニンのＩＣ５０値をＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値で割ることを含む、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
ニューロン細胞の軸策および樹状分枝を増加させるのに有用な化合物を同定するための方法であって、１以上の試験化合物についてＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型に対するチロシン型の自己リン酸化の量を測定することを含む、方法。
【請求項７０】
ニューロン細胞の軸策および樹状分枝を増加させるのに有用な化合物を同定するための方法であって、
ＧＳＫ−３酵素のチロシンの自己リン酸化の量を測定すること、および
β−カテニンのリン酸化の量を測定すること
を含む、方法。
【請求項７１】
測定のステップが、試験化合物に対するβ−カテニンのＩＣ５０値を得ること、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値を決定すること、およびβ−カテニンのＩＣ５０値をＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値で割ることを含む、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０に対するβ−カテニンのＩＣ５０の比が約１０またはそれ以上を示す化合物を同定することをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記比が約３０またはそれ以上である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、脳卒中後の回復を提供する方法。
【請求項７５】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載されている化合物を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
薬剤が虚血中または虚血直後に投与される、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７７】
薬剤が虚血中または虚血直後および虚血後約６か月の期間投与される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
さらに理学療法を投与することを含む、請求項７４〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
化合物Ｉ−３９〜化合物Ｉ−５５から選択される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２００８年３月１０日出願の米国特許出願第６１／０３５，２９０号の利益を主張するものであり、その内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明は、タンパク質キナーゼの阻害剤として有用な化合物に関する。本発明はまた、本発明の化合物を含む薬学上許容される組成物および種々の障害の処置に該組成物を使用する方法を提供する。本発明はまた、本発明の化合物の製造方法を提供する。本発明はまた、糖尿病、糖尿病性神経障害、骨粗鬆症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、双極性障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）、多発性硬化症（ＭＳ）、統合失調症、白血球減少症、心筋細胞肥大、脳卒中、脳卒中後、脊髄損傷、外傷性脳損傷、シャルコー・マリー・トゥース病、末梢神経再生および関節リウマチを含むいくつかの障害の処置に有用な化合物を同定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）は、各々異なる遺伝子によりコードされているαおよびβイソ型からなるセリン／トレオニンタンパク質キナーゼである(Coghlan et al., Chemistry & Biology 2000, 7, 793-803;およびKim and Kimmel, Curr. Opinion Genetics Dev., 2000 10, 508-514)。
【０００４】
ＧＳＫ−３は種々の疾患、障害および症状に関連づけられている。ＧＳＫ−３は種々のシグナル伝達経路に関連する複数の下流エフェクターを調節する。これらのタンパク質には、グリコーゲン合成に必要な律速酵素であるグリコーゲンシンターゼ、微小管関連タンパク質Ｔａｕ、遺伝子転写因子β−カテニン、翻訳開始因子ｅ１Ｆ２Ｂ、ならびにＡＴＰクエン酸リアーゼ、ａｘｉｎ、熱ショック因子−１、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＣＲＥＢおよびＣＥＰＢαが含まれる。これらの多様なタンパク質標的は、細胞代謝、増殖、分化および発達の多くの局面でＧＳＫ−３に関わっている。
【０００５】
ＧＳＫ−３は、ＤＹＲＫキナーゼファミリーと同様に、チロシンおよびセリン／トレオニンキナーゼの双方として機能する。ＤＹＲＫキナーゼファミリーと同様に、ＧＳＫ−３はそのキナーゼドメインのチロシン残基を自己リン酸化する（ＧＳＫ−３ａ、Ｔｙｒ  ２７９およびＧＳＫ−３ｂ、Ｔｙｒ  ２１６）。このチロシンリン酸化はキナーゼ活性の正の調節に重要であることが示されている。Locheed et al.は、この自己リン酸化は分子内の翻訳後、成熟前の中間段階で起こり、シャペロンに依存することが実証されている。(Lochhead et al., Molecular Cell 24, 2006, pp. 627-633)。成熟後、ＧＳＫ−３はそのチロシンキナーゼ活性を喪失し、もっぱら外因性基質に対するセリンおよびトレオニンキナーゼとして働く。
【０００６】
β−カテニンは、ＧＳＫ−３がリン酸化する外因性のセリン／トレオニン基質の１つである。主にセリン／トレオニンキナーゼとして、ＧＳＫ−３は、増殖、分化および代謝などの複数の細胞の活動を制御する多くのシグナル伝達経路の中枢である。ＧＳＫ−３は多くのシグナル伝達経路で中枢的役割を果たすことから、この酵素を完全に遮断することなく、かつ、β−カテニンなどの複数の基質に影響を及ぼすことなく、ＧＳＫ−３活性を部分的に弱めることができる化合物の必要性がある。
【０００７】
タンパク質キナーゼの阻害剤として有用な化合物を開発する大きな必要性がある。特に、ＧＳＫ−の阻害剤として有用な化合物（特に、ＧＳＫ−３の活性化に関連づけられている障害の多くに対して、現在利用可能なものは十分な処置を与えているとは言えない）の開発が望まれる。
【発明の概要】
【０００８】
一態様において、本発明は、治療上有効な量の式Ｉ：
【化１】
2011513483.tif 000002
Ｉ
［式中、
Ｈｔは、
【化２】
2011513483.tif 000003
【化３】
2011513483.tif 000004
または
【化４】
2011513483.tif 000005
であり、
環Ｄは、フェニル、３〜８員単環式脂環式、１〜２個のヘテロ原子を含み、炭素環原子を介してピリジンまたはピリミジン環に結合している５〜８員単環式複素脂環式、アダマンチル、または８〜１０員二環式脂環式であり（ここで、このフェニル、複素脂環式、単環式、二環式または脂環式は所望により１〜２個の−Ｒ５で置換されていてもよい）；
ＲａはＨまたはハロゲンであり；
ＲｂはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
ＲｃはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｚ１はＮまたはＣＨであり；
Ｚ３はＮまたはＣＲＺであり；
ＲＸはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
ＲＹはＨ、ハロゲン、所望により１個のＲ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリル、または所望によりＮＲ１Ｒ２、１〜３個のハロ、−ＯＲで置換されていてもよいＣ１−４アルキル、またはＯ、ＮもしくはＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含み、所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルであるか、または
ＲＸおよびＲＹは、それらが結合している原子と一緒になってフェニル、６〜８員脂環式、またはＯ、ＮもしくはＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５〜８員単環式ヘテロシクリルを形成し；
ＲＺはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ１はＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ２はＨまたは所望により−Ｒ１１で置換されていてもよいＣ１−４アルキルであり；
各Ｒ５は独立にＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキルまたはハロであり；
各Ｒ１０は独立にＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキル、ハロ、ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、ＣＯ２Ｒ、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２Ｒ、ＳＲ、Ｎ（Ｒ４）２、ＣＯＮ（Ｒ４）２、ＳＯ２Ｎ（Ｒ４）２、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ４）ＣＯＲまたはＮ（Ｒ４）ＣＯ２Ｒから選択され；
各Ｒ１１は独立にハロ、ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、ＣＯ２Ｒ、Ｎ（Ｒ４）２、ＣＯＮ（Ｒ４）２、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ４）ＣＯＲまたはＮ（Ｒ４）ＣＯ２Ｒから選択され；
各Ｒ４は独立にＨ、Ｃ１−６アルキルまたはハロＣ１−６アルキルから選択され；かつ
各Ｒは独立にＨ、Ｃ１−６アルキルまたはハロＣ１−６アルキルから選択される］
の化合物またはその薬学上許容される塩を投与することを含む、ＧＳＫ−３介在症状の処置方法を特徴とする。
【０００９】
一実施形態において、Ｈｔは
【化５】
2011513483.tif 000006
である。
【００１０】
他の実施形態において、Ｚ１はＮまたはＣＨであり；ＲａはハロゲンまたはＦである。  
【００１１】
別の実施形態において、Ｈｔは
【化６】
2011513483.tif 000007
または
【化７】
2011513483.tif 000008
である。
【００１２】
他の実施形態において、ＲｂはＨまたはＣＨ３である。
【００１３】
さらなる実施形態において、環Ｄは所望により−Ｒ５で置換されていてもよいフェニルである。さらに、このフェニルはピリジンまたはピリミジン環との結合に対してオルト置換され得る。このフェニルはまた、Ｃｌを含むハロゲンで置換されていてもよい。このフェニルはまた、ＣＨ３を含むＣ１−６アルキルで置換されていてもよい。さらに、このフェニルは、ＣＦ３を含むハロＣ１−６アルキルで置換されていてもよい。
【００１４】
他の実施形態において、環Ｄはまた、３〜８員単環式または８〜１０員二環式脂環式であってもよく、ここで、脂環式は所望により−Ｒ５で置換されていてもよい。さらなる実施形態としては、環Ｄが３〜８員単環式脂環式および８〜１０員二環式脂環式であるものが含まれる。
【００１５】
さらなる実施形態において、環Ｄは、テトラヒドロピラニルを含む５〜８員単環式複素環式である。他の実施形態において、ＲＹは所望によりＮＲ１Ｒ２で置換されていてもよいＣ１−４アルキル、または所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルである。ＲＹはまたＣＨ３であり得る。Ｒｙはまた、所望によりＮＲ１Ｒ２で置換されていてもよいエチル、または所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルであり得る。さらなる実施形態において、ＲＹは−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ１Ｒ２または所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい−ＣＨ２−ＣＨ２−（４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリル）である。
【００１６】
他の実施形態において、ＲＸはＨまたはＣＨ３である。
【００１７】
さらに他の実施形態において、ＲＸおよびＲＹはそれらが結合している原子と一緒になってフェニル、６〜８員脂環式または５〜８員複素環を形成する。
【００１８】
なおさらに他の実施形態において、化合物は化合物Ｉ−１〜Ｉ−５５から選択される。
【００１９】
さらなる実施形態において、ＧＳＫ−３介在症状はex vivoまたはin vitro生体サンプルにおいてＧＳＫ３活性を阻害することにより処置される。
【００２０】
さらなる実施形態において、ＧＳＫ−３介在症状は糖尿病、骨粗鬆症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、双極性障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）、多発性硬化症（ＭＳ）、統合失調症、白血球減少症、脳卒中、神経疾患、脊髄損傷、外傷性脳損傷、関節リウマチ、シャルコー・マリー・トゥース病、末梢神経再生および糖尿病性神経障害から選択される。
【００２１】
さらなる実施形態において、化合物は虚血が起こった後に投与される。
【００２２】
さらに別の実施形態において、本方法は、該患者に糖尿病を処置するための薬剤、骨粗鬆症を処置するための薬剤、アルツハイマー病を処置するための薬剤、ハンチントン病を処置するための薬剤、パーキンソン病を処置するための薬剤、ＡＩＤＳ関連痴呆を処置するための薬剤、双極性障害を処置するための薬剤、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）を処置するための薬剤、多発性硬化症（ＭＳ）を処置するための薬剤、統合失調症を処置するための薬剤、白血球減少症を処置するための薬剤、末梢神経再生を処置するための薬剤、脳卒中を処置するための薬剤、脊髄損傷の処置、外傷性脳損傷を処置するための薬剤、シャルコー・マリー・トゥース病を処置するための薬剤、糖尿病性神経障害を処置するための薬剤および関節リウマチを処置するための薬剤から選択される付加的治療薬を投与する付加的ステップを含み、該付加的治療薬は処置される疾患に適当であり、該付加的治療薬は単一投与形として該組成物と一緒に、または複数投与形の一部として該組成物とは別に投与される。
【００２３】
別の態様において、本発明は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、ＧＳＫ−３介在症状の処置方法を特徴とする。一実施形態において、薬剤は上記のような化合物である。別の実施形態において、ＧＳＫ−３介在症状は脳卒中後、脊髄損傷、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、白血球減少症、糖尿病、末梢神経再生または骨粗鬆症である。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、ニューロン細胞の軸策および樹状分枝を増加させる方法を特徴とする。一実施形態において、薬剤は上記のような化合物である。
【００２５】
なおさらなる別の態様において、本発明は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、神経可塑性を促進する方法を特徴とする。一実施形態において、薬剤は上記のような化合物である。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、脈管形成を促進する方法を特徴とする。一実施形態において、薬剤は上記のような化合物である。
【００２７】
別の態様において、本発明は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、神経発生を促進する方法を特徴とする。一実施形態において、薬剤は上記に記載されているような化合物である。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、神経精神障害を処置する方法を特徴とする。一実施形態において、薬剤は上記のような化合物である。別の実施形態において、該神経精神障害は躁病または鬱病である。
【００２９】
さらに別の態様において、本発明は、１以上の試験化合物についてＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型に対するチロシンの自己リン酸化の量を測定することを含む、ＧＳＫ−３介在症状の処置に有用な化合物を同定する方法を特徴とする。一実施形態において、該方法は、ＧＳＫ−３酵素のチロシンの自己リン酸化の量を測定すること、およびβ−カテニンのリン酸化の量を測定することを含む。別の実施形態において、測定のステップは、試験化合物に対するβ−カテニンのＩＣ５０、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値を決定すること、およびβ−カテニンのＩＣ５０値をＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値で割ることを含む。
【００３０】
なおさらなる別の態様において、本発明は、１以上の試験化合物についてＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型に対するチロシン型の自己リン酸化の量を測定することを含む、ニューロン細胞の軸策および樹状分枝の増加に有用な化合物を同定する方法を特徴とする。一実施形態において、該方法は、ＧＳＫ−３酵素のチロシンの自己リン酸化の量を測定すること、およびβ−カテニンのリン酸化の量を測定することを含む。別の実施形態において、測定のステップは、試験化合物に対するβ−カテニンのＩＣ５０値、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値を決定すること、およびβ−カテニンのＩＣ５０値をＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値で割ることを含む。さらに別の実施形態において、該方法はさらに、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０に対するβ−カテニンのＩＣ５０の比が約１０もしくはそれ以上または３０またはそれ以上を示す化合物を同定することを含む。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、脳卒中後の回復を提供する方法を特徴とする。一実施形態において、薬剤は上記のような化合物である。別の実施形態において、薬剤は虚血中または虚血直後に投与される。薬剤はまた、虚血中または虚血直後および虚血後約６か月の期間投与することもできる。さらに別の実施形態において、理学療法もまた投与される。
【００３２】
別の態様において、本発明は、化合物Ｉ−３９〜化合物Ｉ−５５から選択される化合物を特徴とする。
【００３３】
有利にも、また、予期しないことに、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する化合物は、ニューロン成長および樹状突起形成の増強をもたらす。ニューロン成長および樹状突起形成の増強は、脳卒中、脳卒中後の回復、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、脊髄損傷、外傷性脳損傷、シャルコー・マリー・トゥース病、白血球減少症、糖尿病、糖尿病性神経障害、末梢神経再生および骨粗鬆症などの多種の変性症状を処置する際に有利である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
定義：
本発明の化合物としては、一般に上記のものが含まれ、さらに本明細書に開示されているクラス、サブクラスおよび種で例示される。本明細書においては、特に断りのない限り、以下の定義が当てはまる。本発明の目的では、化学元素は元素の周期表(CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed)に従って示される。さらに、有機化学の一般原則は、“Organic Chemistry”, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999および“March's Advanced Organic Chemistry”, 5th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001に記載されており、これらの全開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【００３５】
本明細書に記載されているように、示されている原子の数値範囲はその間の任意の整数を含む。例えば、１〜４個の原子を有する基は、１、２、３、４個の原子を含み得る。
【００３６】
本明細書に記載されているように、本発明の化合物は所望により、一般に上記に示されているもの、または特に本発明のクラス、サブクラスおよび種により例示されているものなどの１以上の置換基で置換されていてもよい。「所望により置換されていてもよい」という句は「置換または非置換」という句と互換的に用いられると考えられる。一般に、「置換されている」とは、「所望により」という用語が頭に付いているいないにかかわらず、ある構造の水素基を明示されている置換基の基に置き換えられていることを意味する。特に断りのない限り、所望により置換されていてもよい基は、その基の置換可能な各位置に置換基を有してよく、任意のある構造の１を超える位置が明示されている基から選択される１を超える置換基で置換されていてよい場合には、その置換基は同一であっても位置ごとに異なっていてもよい。本発明により考えられる置換基の組合せは、好ましくは、安定なまたは化学的に実現可能な化合物の形成をもたらすものである。
【００３７】
本明細書において「安定な」とは、それらの製造、検出、回収、精製および本明細書に開示されている１以上の目的での使用を許容する条件でも実質的に変化しない化合物を意味する。いくつかの実施形態において、安定な化合物または化学的に実現可能な化合物は、４０℃以下の温度で水分または他の化学的に反応性条件の不存在下で少なくとも１週間維持した際に実質的に変化しないものである。
【００３８】
本明細書において「脂肪族」または「脂肪族基」とは、完全に飽和しているか、または分子の残りの部分との単一の結合点を有する１以上の不飽和単位を含む、直鎖（すなわち、非分枝）または環式、分枝または非分枝、置換または非置換炭化水素鎖を意味する。特に断りのない限り、脂肪族基は１〜２０個の脂肪族炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、脂肪族基は１〜１０個の脂肪族炭素原子を含む。他の実施形態において、脂肪族基は１〜８個の脂肪族炭素原子を含む。さらに他の実施形態において、脂肪族基は１〜６個の脂肪族炭素原子を含み、さらに他の実施形態において、脂肪族基は１〜４個の脂肪族炭素原子を含む。好適な脂肪族基としては、限定されるものではないが、直鎖または分枝、置換または非置換アルキル、アルケニルまたはアルキニル基が挙げられる。特定の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、ｓｅｃ−ブチル、ビニル、ｎ−ブテニル、エチニルおよびｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
【００３９】
本明細書において「アルキル」とは、完全に飽和し、分子の残りの部分との単一の結合点を有する、分枝または非分枝、置換または非置換、炭化水素鎖を意味する。特に断りのない限り、アルキル基は１〜６個のアルキル炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は１〜４個のアルキル炭素原子を含む。他の実施形態において、アルキル基は１〜３個のアルキル炭素原子を含む。例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ブチルおよびｎ−ペンチルが挙げられる。
【００４０】
「脂環式」（または「炭素環式」または「カルボシクリル」または「シクロアルキル」）とは、完全に飽和しているか、または１以上の不飽和単位を含み、ただし芳香族ではなく、分子の残りの部分と単一の結合点を有する単環式Ｃ３−Ｃ８炭化水素または二環式Ｃ８−Ｃ１２炭化水素を意味する（ここで、該二環式環構造の個々の環は３〜７員を有する）。好適な脂環式基としては、限定されるものではないが、シクロアルキルおよびシクロアルケニル基が挙げられる。特定の例としては、限定されるものではないが、シクロヘキシル、シクロプロペニルおよびシクロブチルが挙げられる。
【００４１】
本明細書において「ヘテロ脂肪族」とは、１または２個の炭素原子が独立に１以上の酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素により置換されている脂肪族基を意味する。ヘテロ脂肪族基は置換または非置換、分枝または非分枝、環式または非環式であってよく、「複素環」、「テロシクリル」、「ヘテロ脂環式」または「複素環式」基を含む。
【００４２】
本明細書において「複素環」、「ヘテロシクリル」または「複素環式」とは、１以上の環員が独立に選択されるヘテロ原子である非芳香族、単環式、二環式または三環構造を意味する。いくつかの実施形態において、「複素環」、「ヘテロシクリル」または「複素環式」基は３〜１４環員を有し、１以上の環員が酸素、硫黄、窒素またはリンから独立に選択されるヘテロ原子であり、この系の各環が３〜７環員を含む。
【００４３】
好適な複素環としては、限定されるものではないが、３−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン、３−（１−アルキル）−ベンズイミダゾール−２−オン、２−テトラヒドロフラニル、３−テトラヒドロフラニル、２−テトラヒドロチオフェニル、３−テトラヒドロチオフェニル、２−モルホリノ、３−モルホリノ、４−モルホリノ、２−チオモルホリノ、３−チオモルホリノ、４−チオモルホリノ、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、１−テトラヒドロピペラジニル、２−テトラヒドロピペラジニル、３−テトラヒドロピペラジニル、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、５−ピラゾリニル、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、２−チアゾリジニル、３−チアゾリジニル、４−チアゾリジニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、５−イミダゾリジニル、インドリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、ベンゾチオラン、ベンゾジチアンおよび１，３−ジヒドロ−イミダゾール−２−オンが挙げられる。
【００４４】
環式基（例えば、脂環式および複素環）は、直鎖縮合型、架橋型またはスピロ環式であり得る。
【００４５】
「ヘテロ原子」とは、１以上の酸素、硫黄、窒素またはリン（窒素、硫黄またはリンの任意の酸化形態、任意の塩基性窒素の第四級化形態；または複素環式環の置換可能な窒素、例えば、Ｎ（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルの場合）、ＮＨ（ピロリジニルの場合）またはＮＲ＋（Ｎ−置換ピロリジニルの場合）を意味する。
【００４６】
本明細書において「不飽和」とは、ある部分が１以上の不飽和単位を有することを意味する。
【００４７】
本明細書において「アルコキシ」または「チオアルキル」とは、酸素（「アルコキシ」）または硫黄（「チオアルキル」）原子を介して主炭素鎖と結合している、これまでに定義されたアルキル基を意味する。
【００４８】
「ハロアルキル」、「ハロアルケニル」、「ハロ脂肪族」および「ハロアルコキシ」とは、１以上のハロゲン原子で置換されている場合のアルキル、アルケニルまたはアルコキシを意味する。「ハロゲン」、「ハロ」および「ｈａｌ」とは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する。
【００４９】
単独で用いる、または「アラルキル」、「アラルコキシ」もしくは「アリールオキシアルキル」の場合のように、より大きな部分の一部としての「アリール」は、全部で５〜１４環員を有し、その系の少なくとも１つの環が芳香族であり、その系の各環が３〜７環員を含む、単環式、二環式および三環式構造を意味する。「アリール」とは、「アリール環」と互換的に用いることができる。「アリール」とはまた、以下に定義されるヘテロアリール環構造を意味する。
【００５０】
単独で用いる、または「へテロアラルキル」もしくは「ヘテロアリールアルコキシ」の場合のように、より大きな部分の一部としての「ヘテロアリール」は、全部で５〜１４環員を有し、その系の少なくとも１つの環が芳香族であり、その系の少なくとも１つの環が１以上のヘテロ原子を含み、その系の各環が３〜７環員を含む、単環式、二環式または三環構造を意味する。「ヘテロアリール」とは、「ヘテロアリール環」または「複素芳香族」と互換的に用いることができる。好適なヘテロアリール環としては、限定されるものではないが、２−フラニル、３−フラニル、Ｎ−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、５−イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、Ｎ−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、ピリダジニル（例えば、３−ピリダジニル）、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、テトラゾリル（例えば、５−テトラゾリル）、トリアゾリル（例えば、２−トリアゾリルおよび５−トリアゾリル）、２−チエニル、３−チエニル、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、インドリル（例えば、２−インドリル）、ピラゾリル（例えば、２−ピラゾリル）、イソチアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、プリニル、ピラジニル、１，３，５−トリアジニル、キノリニル（例えば、２−キノリニル、３−キノリニル、４−キノリニル）およびイソキノリニル（例えば、１−イソキノリニル、３−イソキノリニルまたは４−イソキノリニル）が挙げられる。
【００５１】
本明細書において「保護基」は、多官能性化合物の１以上の必要とする反応性部分を一時的に遮断するために用いられる薬剤を意味する。特定の実施形態において、保護基は以下の特徴の１以上、または好ましくは全てを有する：ａ）良好な収率で官能基に選択的に付加され、保護された基質が得られること、ｂ）１以上の他の反応性部位で起こる反応に対して安定であること；およびｃ）再生され、脱保護された官能基を攻撃しない試薬により、良好な収率で選択的に除去可能であること。保護基の例は、Greene, T.W., Wuts, P. G in “Protective Groups in Organic Synthesis”, Third Edition, John Wiley & Sons, New York: 1999（およびこの書籍の他の版）に詳細に示されており、この全内容は出典明示により本明細書の一部とされる。本明細書において「窒素保護基」とは、多官能性化合物の１以上の所望の窒素反応性部位を一時的に遮断するために用いられる薬剤を意味する。好ましい窒素保護基はまた上記で例示された特徴を有し、特定の窒素保護基例もGreene, T.W., Wuts, P. G in “Protective Groups in Organic Synthesis”, Third Edition, John Wiley & Sons, New York: 1999の第７章に詳細に示されており、この全内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、アルキルまたは脂肪鎖は所望により別の原子または基で置換することができる。このような原子または基の例としては、限定されるものではないが、−ＮＲ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ２−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−、−Ｃ（＝Ｎ−ＣＮ）、−ＮＲＣＯ−、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＯ２ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２−、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−、−ＮＲＳＯ２ＮＲ−、−ＳＯ−または−ＳＯ２−（Ｒは本明細書に定義されている）が挙げられる。特に断りのない限り、任意の置換は化学的に安定な化合物を形成する。任意の置換は鎖内および鎖のいずれかの末端の双方で、すなわち、結合点および／または末端の双方で起こり得る。また、２つの任意の置換は、それが化学的に安定な化合物を生じる限り、鎖内で互いに隣接していてもよい。任意の置換はまた、鎖内の炭素原子の全てを完全に置換してもよい。例えば、Ｃ３脂肪族は所望により−ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）−および−ＮＲ−が挿入されるか、またはそれらにより置換され、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ−（尿素）を形成してもよい。
【００５３】
特に断りのない限り、置換が末端で起これば、その置換原子はその末端にあるＨと結合される。例えば、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３が所望により−Ｏ−で置換されていてもよい場合、得られる化合物は−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり得る。
【００５４】
特に断りのない限り、本発明に示されている構造はまた、その構造の全ての異性形（例えば、鏡像異性形、ジアステレオ異性型および幾何異性形（また配座異性型））；例えば、各不斉中心に関するＲ配置およびＳ配置、（Ｚ）および（Ｅ）二重結合異性体、ならびに（Ｚ）および（Ｅ）配座異性体を含むものとする。よって、本化合物の単一の立体化学異性体ならびに鏡像異性体、ジアステレオ異性体および幾何異性体（または配座異性体）混合物が本発明の範囲内にある。
【００５５】
特に断りのない限り、本発明の化合物の全ての互変異性形が本発明の範囲内にある。
【００５６】
特に断りのない限り、置換基は回転可能な結合の周囲を自由に回転することができる。例えば、
【化８】
2011513483.tif 000009
として描かれる置換基はまた
【化９】
2011513483.tif 000010
も表す。
【００５７】
さらに、特に断りのない限り、本明細書に示されている構造はまた、１以上の同位体が豊富な原子が存在することだけで異なる化合物を含むものとする。例えば、水素が重水素またはトリチウムで置換されていること、または炭素が１３Ｃ−または１４Ｃ−豊富な炭素で置換されていること以外は本構造を有する化合物は本発明の範囲内にある。このような化合物は、例えば、生物アッセイにおける分析ツールまたはプローブとして有用である。
【００５８】
また、本発明の化合物は処置のために遊離型で存在することもできるし、あるいは適当であれば、その薬学上許容される塩、複数の塩またはそれらの混合物として存在することもできると考えられる。
【００５９】
本明細書において「薬学上許容される塩」とは、堅実な医学的判断(sound medical judgement)の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずにヒトおよびより下等な動物と接触させて用いるのに好適であり、かつ、妥当なリスク／ベネフィット比が均衡した化合物の塩を意味する。
【００６０】
薬学上許容される塩は当技術分野で周知である。例えば、S. M. Berge et al.は、出典明示により本明細書の一部とされるJ. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19に薬学上許容される塩を詳細に記載している。本発明の化合物の薬学上許容される塩には、好適な無機および有機酸および塩基に由来するものが含まれる。これらの塩は化合物の最終的な単離および精製の間にin situで調製することができる。酸付加塩は、１）その遊離塩基形態の精製化合物を好適な有機または無機酸と反応させること、および２）このようにして形成された塩を単離することにより調製することができる。
【００６１】
薬学上許容される無毒な酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸を伴って、またはイオン交換などの当技術分野で用いられる他の方法によって形成されるアミノ基の塩がある。他の薬学上許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸炎、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パルモ酸塩(palmoate)、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適当な塩基塩から誘導される塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩およびＮ＋（Ｃ１−４アルキル）４塩が挙げられる。本発明はまた、本明細書に開示されている化合物の塩基性窒素含有塩の第四級化を意図する。このような第四級化により水または油溶性または分散性製品を得ることができる。
【００６２】
塩基付加塩は、１）その酸形態の精製化合物を好適な有機または無機塩基と反応させること、および２）そのようにして形成された塩を単離することにより調製することができる。塩基付加塩としては、アルカリまたはアルカリ土類金属塩が挙げられる。点典型的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらなる薬学上許容される塩としては、適当であれば、ハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、低級スルホン酸アルキルイオンおよびアリールスルホン酸イオンなどの対イオンを用いて形成される無毒なアンモニウム、第四級アンモニウムおよびアミン陽イオンが含まれる。他の酸および塩基も、それら自体薬学上許容されるものでなくとも、本発明の化合物およびそれらの薬学上許容される酸または塩基付加塩を得る際の中間体として有用な塩の製造に使用可能である。
【００６３】
化合物
ＧＳＫ−３介在症状の処置に有用な化合物には式Ｉ
【化１０】
2011513483.tif 000011
Ｉ
［式中、
Ｈｔは、
【化１１】
2011513483.tif 000012
【化１２】
2011513483.tif 000013
または
【化１３】
2011513483.tif 000014
であり、
環Ｄは、フェニル、３〜８員単環式脂環式、１〜２個のヘテロ原子を含み、炭素環原子を介してピリジンまたはピリミジン環に結合している５〜８員単環式複素脂環式、アダマンチル、または８〜１０員二環式脂環式であり（ここで、このフェニル、複素脂環式、単環式、二環式または脂環式は所望により１〜２個の−Ｒ５で置換されていてもよい）；
ＲａはＨまたはハロゲンであり；
ＲｂはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
ＲｃはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｚ１はＮまたはＣＨであり；
Ｚ３はＮまたはＣＲＺであり；
ＲＸはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
ＲＹはＨ、ハロゲン、所望により１個のＲ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリル、または所望によりＮＲ１Ｒ２、１〜３個のハロ、−ＯＲで置換されていてもよいＣ１−４アルキル、またはＯ、ＮもしくはＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含み、所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルであるか、または
ＲＸおよびＲＹは、それらが結合している原子と一緒になってフェニル、６〜８員脂環式、またはＯ、ＮもしくはＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５〜８員単環式ヘテロシクリルを形成し；
ＲＺはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ１はＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ２はＨまたは所望により−Ｒ１１で置換されていてもよいＣ１−４アルキルであり；
各Ｒ５は独立にＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキルまたはハロであり；
各Ｒ１０は独立にＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキル、ハロ、ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、ＣＯ２Ｒ、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２Ｒ、ＳＲ、Ｎ（Ｒ４）２、ＣＯＮ（Ｒ４）２、ＳＯ２Ｎ（Ｒ４）２、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ４）ＣＯＲまたはＮ（Ｒ４）ＣＯ２Ｒから選択され；
各Ｒ１１は独立にハロ、ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、ＣＯ２Ｒ、Ｎ（Ｒ４）２、ＣＯＮ（Ｒ４）２、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ４）ＣＯＲまたはＮ（Ｒ４）ＣＯ２Ｒから選択され；
各Ｒ４は独立にＨ、Ｃ１−６アルキルまたはハロＣ１−６アルキルから選択され；かつ
各Ｒは独立にＨ、Ｃ１−６アルキルまたはハロＣ１−６アルキルから選択される］
のものまたはその薬学上許容される塩である。
【００６４】
式Ｉの化合物の具体例は、次の特定の構造の１以上を含み得る。
【００６５】
Ｈｔの具体例：
Ｈｔは
【化１４】
2011513483.tif 000015
である。Ｈｔは
【化１５】
2011513483.tif 000016
であり、Ｚ１はＮである。Ｈｔは
【化１６】
2011513483.tif 000017
であり、Ｚ１はＣＨである。Ｈｔは
【化１７】
2011513483.tif 000018
であり、ＲａはＦなどのハロゲンである。Ｈｔは
【化１８】
2011513483.tif 000019
であり、ＲｂはＨまたはＣＨ３である。Ｈｔは
【化１９】
2011513483.tif 000020
であり、ＲｃはＨまたはＣＨ３である。
【００６６】
環Ｄの具体例：
環Ｄは所望により−Ｒ５で置換されていてもよいフェニルである。環Ｄは１個の−Ｒ５で置換されたフェニルである。環Ｄはピリジンまたはピリミジン環との結合に対してオルト置換されたフェニルである。環ＤはＣｌなどのハロゲンで置換されたフェニルである。環Ｄは１８である。請求項１３〜１５の方法では、フェニルはＣ１−６アルキルで置換されている。環ＤはＣＨ３で置換されたフェニルであり。環ＤはＣＦ３などのハロＣ１−６アルキルで置換されたフェニルである。環Ｄは３〜８員単環式または８〜１０員二環式脂環式であり、ここで、この脂環式は所望により−Ｒ５で置換されていてもよい。環Ｄは３〜８員単環式脂環式である。環Ｄは８〜１０員二環式脂環式である。環Ｄは５〜８員単環式複素環式である。環Ｄはテトラヒドロピラニルである。環Ｄはアダマンチルである。
【００６７】
ＲＹの具体例
ＲＹは所望によりＮＲ１Ｒ２で置換されていてもよいＣ１−４アルキルである。ＲＹは、所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルで所望により置換されていてもよいＣ１−４アルキルである。ＲＹはＣＨ３である。ＲＹは所望によりＮＲ１Ｒ２で置換されていてもよいエチルである。ＲＹは所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルである。ＲＹは−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ１Ｒ２である。ＲＹは所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい−ＣＨ２−ＣＨ２−（４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリル）である。ＲＹは所望によりＮＲ１Ｒ２で置換されていてもよいＣ１−４アルキルであり、Ｒ２は所望によりＣ（＝Ｏ）Ｒ、ＣＯ２Ｒ、Ｎ（Ｒ４）２またはＣＯＮ（Ｒ４）２で置換されていてもよいＣ１−４アルキルである。
【００６８】
ＲＸの具体例
ＲＸはＨである。ＲＸはＣＨ３である。
【００６９】
ＲＸおよびＲＹの具体例
ＲＸおよびＲＹはそれらが結合している原子と一緒になってフェニルを形成する。ＲＸおよびＲＹはそれらが結合している原子と一緒になって６〜８員脂環式を形成する。ＲＸおよびＲＹはそれらが結合している原子と一緒になって５〜８員複素環を形成する。
【００７０】
他の実施形態において、ＧＳＫ−３介在症状を処置するのに有用な化合物は式Ｉａ
【化２０】
2011513483.tif 000021
Ｉａ
［式中、
Ｈｔは
【化２１】
2011513483.tif 000022
であり、
環Ｄは式Ｉａのフェニル環のピリミジンまたはピリジン環との結合点に対してＲ５でオルト置換されたフェニルであり；
ＲａはＨまたはハロゲンであり；
ＲｂはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
ＲｃはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｚ１はＮまたはＣＨであり；
Ｚ３はＮまたはＣＲＺであり；
ＲＸはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
ＲＹはＨ、ハロゲン、または所望によりＮＲ１Ｒ２もしくは４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルで置換されていてもよいＣ１−４アルキルであり；ここで、このヘテロシクリルはＯ、ＮまたはＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含み；このヘテロシクリルは所望により−Ｒ１０で置換されていてもよく；
ＲＺはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ１はＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ２はＨまたは所望により−Ｒ１１で置換されていてもよいＣ１−４アルキルであり；
各Ｒ５は独立にＣ１−６アルキル、ハロＣ１-６アルキルまたはハロであり；
各Ｒ１０は独立にＣ１−６アルキル、ハロＣ１-６アルキル、ハロ、ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、ＣＯ２Ｒ、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２Ｒ、ＳＲ、Ｎ（Ｒ４）２、ＣＯＮ（Ｒ４）２、ＳＯ２Ｎ（Ｒ４）２、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ４）ＣＯＲまたはＮ（Ｒ４）ＣＯ２Ｒから選択され；
各Ｒ１１は独立にハロ、ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、ＣＯ２Ｒ、Ｎ（Ｒ４）２、ＣＯＮ（Ｒ４）２、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ４）ＣＯＲまたはＮ（Ｒ４）ＣＯ２Ｒから選択され；
各Ｒ４は独立にＨ、Ｃ-１−６アルキルまたはハロＣ１−６アルキルから選択され；かつ
各Ｒは独立にＨ、Ｃ-１−６アルキルまたはハロＣ１−６アルキルから選択される］
またはその薬学上許容される塩である。
【００７１】
ＧＳＫ−３介在症状を処置するのに有用な化合物の具体的な限定されない例を表１に示す。
【表１】
2011513483.tif 000023
【表２】
2011513483.tif 000024
【表３】
2011513483.tif 000025
【表４】
2011513483.tif 000026
【表５】
2011513483.tif 000027
【００７２】
合成方法
本発明の化合物は、一般に、下記の一般スキームおよび後述の調製例に示されているもののような方法により調製することができる。特に断りのない限り、下記のスキーム中の記号は全て、本明細書に定義されている通りである。
【化２２】
2011513483.tif 000028
【００７３】
試薬および条件：（ｉ）ＨＣｌ、Ｅｔ２Ｏ／ＭｅＯＨ、（ｉｉ）ＮＨ３、ＥｔＯＨ；（ｉｉｉ）Ｅｔ３Ｎ、ＥｔＯＨ、還流；（ｉｖ）ＰＯＣｌ３、還流；（ｖ）ＮＨ２Ｈｔ、ＤＩＰＥＡ、ＮａＩ、ＤＭＦ、１２０℃。
【００７４】
上記のスキーム１は、化合物５を調製するために用いられる一般合成経路を示す。式５の化合物は中間体１から調製することができる。アミジン２の形成は、メタノールの存在下でニトリル誘導体１をＨＣｌで処理した後、中間体イミデートをエタノール中、ＮＨ３で処理することにより達成される。次に、中間体２をＥｔＯＨ中で還流下、対応するβ−ケトエステルで処理する。この対応するヒドロキシピリミジン中間体をＰＯＣｌ３で処理し、クロロ誘導体４を得る。この反応は種々のアミジン２に対して反応性がある。クロロピリミジン４をＤＩＰＥＡおよびＮａＩの存在下、ＮＨ２Ｈｔのような多様なアミンで処理し、最終化合物５を得る。この反応もまた、ＮＨ２Ｈｔのような種々の複素環式アミンに対して反応性がある。
【化２３】
2011513483.tif 000029
試薬および条件：（ｉ）ｍＣＰＢＡ、ＥｔＯＡｃ；（ｉｉ）ＰＯＣｌ３；（ｉｉｉ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２、Ｂａ（ＯＨ）２、ＤＭＥ−Ｈ２Ｏ、１１０℃；（ｉｖ）ＨｔＮＨ、Ｐｄ（ＯＡｃ）２、Ｘａｎｔｐｈｏｓ、Ｋ２ＣＯ３、ジオキサン、１２０℃。
【００７５】
上記のスキーム２は、化合物５を調製するために用いられる一般合成経路を示す。式５の化合物は中間体１から調製することができる。クロロピリジン誘導体２の形成は、対応するピリジン１をＥｔＯＡｃ中ｍ−ＣＰＢＡで処理した後、それをＰＯＣｌ３で処理することにより対応するＮ−オキシドをクロロピリジンへ変換することにより達成される。次に、中間体２を対応するボロン酸誘導体と反応させて、当業者に周知の鈴木のカップリング条件を用いて化合物３を得る。この反応は種々のボロン酸誘導体に対して反応性がある。次に、ピリジン３を、ステップ１で用いたものと同じ二段階の手順を用いてクロロピリジン誘導体４に変換し、ｍ−ＣＰＢＡ酸化を行った後にＰＯＣｌ３で処理する。その後、中間体４を、触媒としてのＰｄの存在下、ＮＨ２Ｈｔのような多様なアミンで処理し、最終化合物５を得る。この反応もまたＮＨ２Ｈｔのような種々の複素環式アミンに対して反応性がある。
【化２４】
2011513483.tif 000030
【００７６】
試薬および条件：（ｉ）ＥｔＯＮａ、ＥｔＯＨ、還流；（ｉｉ）ＰＯＣｌ３、還流；（ｉｉｉ）ＨｔＮＨ２、ＮａＩ、ＤＭＦ、１１０℃、（ｉｖ）ＲＲ’ＮＨ、ｎ−ブタノール、１０８℃。
【００７７】
上記のスキーム３は、式９の化合物を調製するために用いられる一般合成経路を示す。式９の化合物は中間体７から調製することができる。中間体７の形成は、還流エタノール中、塩基としてのＥｔＯＮａの存在下、マロン酸ジエチル６を対応するアミジン２と反応させることにより達成される。次に、この粗物質をＰＯＣｌ３で処理してジクロロピリミジン中間体７を得る。このジクロロピリミジン中間体を複素環式アミンおよびその他の置換アミン誘導体で順次処理して最終化合物９を得る。これらの一連の二反応は種々の複素環式アミンおよび種々の置換アミンに対して反応性がある。
【００７８】
上記のスキーム３では、ＲおよびＲ’は、それらが結合している窒素原子と一緒になって所望により置換されていてもよい、Ｏ、ＮまたはＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５〜６員複素環式環を形成する。
【００７９】
治療的使用
本発明は、タンパク質キナーゼの阻害剤として有用な化合物および組成物を提供する。
【００８０】
タンパク質キナーゼの阻害剤として、本発明の化合物および組成物は、その疾患、症状または障害にタンパク質キナーゼが関連づけられている疾患、症状または障害を処置する、またはその重篤度を軽減するのに特に有用である。一態様において、本発明は、タンパク質キナーゼがその病態に関連づけられている疾患、症状または障害を処置する、またはその重篤度を軽減するための方法を提供する。別の態様において、本発明は、酵素活性の阻害がその疾患の処置に関連づけられている疾患、症状または障害を処置する、またはその重篤度を軽減するための方法を提供する。別の態様において、本発明は、タンパク質キナーゼと結合することにより酵素活性を阻害する化合物を用いて疾患、症状または障害を処置する、またはその重篤度を軽減するための方法を提供する。別の態様は、キナーゼの酵素活性をタンパク質キナーゼ阻害剤で阻害することによりキナーゼ疾患、症状または障害を処置する、またはその重篤度を軽減するための方法を提供する。
【００８１】
タンパク質キナーゼの阻害剤としての本発明の化合物および組成物はまた、生体サンプルにおいても有用である。本発明の一態様は、生体サンプルにおいてタンパク質キナーゼ活性を阻害することに関し、その方法は、該生体サンプルを式Ｉの化合物または該化合物を含む組成物と接触させることを含む。本明細書において「生体サンプル」とは、限定されるものではないが、細胞培養物またはその抽出物；哺乳類から得られた生検材料またはその抽出物；および血液、唾液、尿、糞便、精液、涙もしくはその他の体液またはその抽出物を含む、in vitroまたはex vivoサンプルを意味する。「生体サンプル」とは、in vivoサンプルを表さない。
【００８２】
生体サンプルにおけるタンパク質キナーゼ活性の阻害は、当業者に既知の種々の目的に有用である。このような目的の例としては、限定されるものではないが、輸血、臓器移植および生物検体の貯蔵が挙げられる。
【００８３】
本発明の別の態様は、生物学的および病理学的現象におけるタンパク質キナーゼの研究；このようなタンパク質キナーゼにより媒介される細胞内シグナル伝達経路の研究；および新しいタンパク質キナーゼ阻害剤の比較評価に関する。このような使用の例としては、限定されるものではないが、酵素アッセイおよび細胞に基づくアッセイなどの生物学的アッセイが挙げられる。
【００８４】
タンパク質キナーゼ阻害剤としての化合物の活性はin vitro、in vivoまたは細胞系統においてアッセイ可能である。in vitroアッセイは、キナーゼ活性か、または活性化されたキナーゼのＡＴＰアーゼ活性のいずれかの阻害を測定するアッセイを含む。別のin vitroアッセイでは、タンパク質キナーゼと結合する阻害剤の能力を定量し、結合前に阻害剤を放射性標識し、阻害剤／キナーゼ複合体を単離し、結合した放射性標識の量を測定するか、または新たな阻害剤を既知の放射性リガンドと結合させたキナーゼとともにインキュベートする競合実験を行うことにより測定することができる。
【００８５】
本発明の別の態様は、細胞分化の化学モジュレーターである化合物を提供する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、該タンパク質キナーゼ阻害剤はＧＳＫ−３阻害剤である。
【００８７】
ＧＳＫ−３
ＧＳＫ−３は、糖尿病、アルツハイマー病、ハンチントン病およびその他の神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、双極性障害、統合失調症、脳卒中、化学療法薬依存性白血球減少症および心肥大を含む種々の疾患、障害および症状に関連づけられている（ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９９／６５８９７およびＷＯ００／３８６７５；Haq et al., J. Cell Biol. 2000, 151, pp. 117-130; Hirotani et al, Circulation Research 101, 2007, pp. 1164-1174）。ＧＳＫ−３の阻害はこれらの疾患、障害および症状を処置するために求められるアプローチである。
【００８８】
心肥大では、活性ＧＳＫ−３は肥大の阻害に重要であり得る。しかしながら、ＧＳＫ−３の遮断は、肥大した心筋においてアポトーシスから保護するために重要であると思われる(Haq et al., J. Cell Biol. 2000, 151, pp. 117-130; Hirotani et al., Circulation Research 101, 2007, pp. 1164-1174)。
【００８９】
ＧＳＫ−３は、種々のシグナル伝達経路に関連する複数の下流エフェクターを調節する。これらのタンパク質には、グリコーゲン合成に必要な律速酵素であるグリコーゲンシンターゼ、微小管関連タンパク質Ｔａｕ、遺伝子転写因子β−カテニン、翻訳開始因子ｅ１Ｆ２Ｂ、ならびにＡＴＰクエン酸リアーゼ、ａｘｉｎ、熱ショック因子−１、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＣＲＥＢおよびＣＥＰＢαが含まれる。これらの多様なタンパク質標的は、細胞代謝、増殖、分化および発達の多くの局面でＧＳＫ−３に関わっている。
【００９０】
ＩＩ型糖尿病の処置に関連するＧＳＫ−３介在経路では、インスリンにより誘導されるシグナル伝達は、細胞のグルコース取り込みとグリコーゲン合成をもたらす。この経路に沿って、ＧＳＫ−３はインスリンにより誘導されるシグナルの負のレギュレーターである。通常、インスリンの存在は、ＧＳＫ−３により媒介されるリン酸化およびグリコーゲンシンターゼの不活性化を引き起こす。ＧＳＫ−３の阻害はグリコーゲン合成およびグルコース取り込みの増強をもたらす(Klein et al., PNAS 1996, 93, 8455-8459; Cross et al., Biochem. J. 1994, 303, pp. 21-26; Cohen, Biochem. Soc. Trans. 1993, 21, pp. 555-567;およびMassillon et al., Biochem J. 1994, 299, pp. 123-128)。しかしながら、インスリン応答が障害を受けている糖尿病患者では、比較的高い血中レベルのインスリンが存在するにもかかわらず、グリコーゲン合成およびグルコース取り込みが増強できない。これは異常に高い血中レベルのグルコースをもたらし、やがては心血管疾患、腎不全および失明をもたらす可能性のある急性的および長期的影響を伴う。このような患者では、通常のインスリンにより誘導されるＧＳＫ−３の阻害が生じ得ない。また、ＩＩ型糖尿病患者で、ＧＳＫ−３が過剰発現されることも報告されている（ＰＣＴ出願ＷＯ００／３８６７５参照）。従って、治療用のＧＳＫ−３阻害剤は、インスリン応答の障害に苦しむ糖尿病患者を処置するのに有用であり得る。
【００９１】
ＧＳＫ−３活性はアルツハイマー病に関連する。この疾患の特徴は、凝集したβアミロイドペプチドにより形成される細胞外病斑とｔａｕタンパク質を介した細胞内神経原繊維錯綜の形成である。
【００９２】
ＧＳＫ−３の阻害はアルツハイマー病の動物モデルにおいてアミロイド−βペプチドを減少させることが示されている（Phiel et. al., Nature 2003 423, 435-439, at pp. 435, 438参照）。アミロイドタンパク前駆体（ＡＰＰ）を過剰発現するマウスをリチウム（ＧＳＫ−３α阻害剤）で３週間処置したところ、アミロイド−βペプチド組織レベルに５０％を超える低下を示した。
【００９３】
神経原繊維錯綜は過剰にリン酸化されたＴａｕタンパク質を含み、この場合、Ｔａｕは異常な部位でリン酸化されている。ＧＳＫ−３は細胞および動物モデルにおいてこれらの異常な部位をリン酸化することが知られている。ＧＳＫ−３を過剰発現する条件付けトランスジェニックマウスは、ｔａｕの過剰なリン酸化、ニューロンのアポトーシスおよび空間学習の欠如を含むＡＤの様相を発症する。これらのマウスにおいてＧＳＫ−３を遮断すると、正常な挙動が戻り、Ｔａｕの過剰なリン酸化およびニューロンのアポトーシスが減少する(Engel et al., J Neuro Sci, 2006, 26, pp. 5083-5090およびLucas et al., EMBO J, 2001, 20, pp. 27-39)。また、ＧＳＫ−３の阻害剤が細胞におけるＴａｕの過剰なリン酸化を妨げることも示されている(Lovestone et al., Current Biology 1994, 4, pp. 1077-86;およびBrownlees et al., Neuroreport 1997, 8, pp. 3251-55)。
【００９４】
ＧＳＫ−３はまた、統合失調症および双極性疾患などの精神病および気分障害にも役割を担っている。ＧＳＫ−３活性の増大と相関するＡＫＴハプロタイプ欠乏が精神分裂病患者の一部で確認された。ＧＳＫ−３βの単一の対立遺伝子ノックアウトが、躁病の挙動モデルにおいてアンフェタミンに対する応答の機能亢進の弱化をもたらした。
【００９５】
精神分裂病および双極性患者の双方の処置に用いられるいくつかの抗精神病薬および気分安定剤はＧＳＫ−３を阻害することが示されている(Emamian et al., Nat Genet, 2004, 36, pp.131-137; Obrien et al., J Neurosci, 2004, 24, pp. 6791-6798; Beaulieu et al., PNAS, 2004, 101, pp. 5099-5104; Li et al., Int J Neuropsychopharmacol, 2006, pp 1-13; Gould TD, Expert Opin Ther Targets, 2006, 10, pp. 377-392)。さらに、最近の特許ＵＳ２００４／００３９００７には、適切なマウス挙動モデルにおいて抗精神分裂病作用および抗不安作用を示すＧＳＫ３阻害剤が記載されている。
【００９６】
ＧＳＫ−３活性はまた、脳卒中にも関連がある。Wang et al.は、既知のＧＳＫ−３阻害剤であるＩＧＦ−１（インスリン増殖因子−１）が、ラットにおける脳卒中モデルである一活性中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）の後にラットの脳の梗塞サイズを縮小したことを示した(Wang et al., Brain Res 2000, 859, pp. 381-5; Sasaki et al., Neurol Res 2001, 23, pp. 588-92; Hashimoto et al., J. Biol. Chem 2002, 277, pp. 32985-32991)。ＵＳ２００４／００３９００７には、ラットの脳卒中モデルであるＭＣＡＯにおけるＧＳＫ−３阻害剤の効果が記載されている。これらのＧＳＫ−３阻害剤はラットにおいて線条体の虚血性損傷を著しく軽減し、浮腫の形成を軽減した。さらに、これらのラットは「この試験の経時的推移において神経機能に顕著な改善を示した」（ＵＳ２００４／００３９００７、第３２段落４７〜５０頁）。
【００９７】
ＧＳＫ−３活性の阻害は、幹細胞の増殖、分化、ニューロンの可塑性および脈管形成に結びつけられている。これらの種々の機能は修復と再生に関連づけられる。ＧＳＫ−３の阻害剤は、胚幹細胞の自己再生を持続させ、ニューロン、β−細胞、骨髄および骨芽細胞の分化を促進することが示されている(Sato et al., Nature Medicine 2004, 10, pp. 55-63; Ding et al., PNAS 2003, 100, pp. 7632-37; Branco et al., J Cell Science 2004, 117, pp. 5731-37; Trowbridge et al., Nature Medicine 2006, 12, pp. 89-98; Mussmann et al., JBC (Epub ahead of print) 2007; Kulkarni et al., Journal of Bone and Mineral Res. 2006, 21, pp. 910-920)。ニューロンの可塑性に関しては、ＧＳＫ−３の阻害が極性、長期増強（ＬＴＰ）および神経突起／軸索成長の調節に重要であることが示されている(Hooper et al., European J of Neuroscience 2007, 25, pp. 81-86; Kim et al., Neuron 2006, 52, pp. 981-996; Jiang et al., Cell 2005, 120, pp. 123-135)。ＧＳＫ−３の阻害はまた、内皮細胞において脈管形成を誘導することが示されている(Skurk et al., Circulation Research 2005, 96, pp. 308-318)。全てを考え合わせると、ＧＳＫ−３小分子阻害剤は修復と再生の化学モジュレーターとして働く可能性を有する。これは、脳卒中、脳卒中後の回復、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）、多発性硬化症（ＭＳ）、脊髄損傷、外傷性脳損傷、シャルコー・マリー・トゥース病、白血球減少症、糖尿病、糖尿病性神経障害、末梢神経再生および骨粗鬆症などの多種の変性症状に関連を有する。
【００９８】
ＧＳＫ−３は、ＤＹＲＫキナーゼファミリーと同様に、チロシンおよびセリン／トレオニンキナーゼの双方として働く。ＤＹＲＫキナーゼファミリーと同様に、ＧＳＫ−３は、そのキナーゼドメイン中の鍵となるチロシン残基（ＧＳＫ−３ａ、Ｔｙｒ  ２７９およびＧＳＫ−３ｂ、Ｔｙｒ  ２１６）を自己リン酸化する。このチロシンのリン酸化は、キナーゼ活性に正の調節を行うのに重要であることが示されている。Locheed et alは、この自己リン酸化は成熟前の翻訳後中間段階において分子内で起こり、シャペロンに依存する(Lochhead et al, Molecular Cell 2006, 24, pp. 627-633)。成熟後、ＧＳＫ−３はそのチロシンキナーゼ活性を失い、もっぱら外因性基質に対してセリンおよびトレオニンキナーゼとして働く。
【００９９】
β−カテニンはＧＳＫ−３をリン酸化する外因性セリン／トレオニン基質の１つである。β−カテニンリン酸化の阻害はβ−カテニンレベルの増加をもたらし、それは次に核へ移動し、細胞の応答と機能に関与する多くの遺伝子を転写制御する。ＧＳＫ−３阻害剤に関する１つの潜在的な安全上の懸念点は、これらの阻害剤の使用がβ−カテニンの誘導を介して過剰増殖をもたらし得ることである。主要にはセリン／トレオニンキナーゼとして、ＧＳＫ−３は、増殖、分化および代謝などの多くの細胞の活動を制御する多くのシグナル伝達経路の中枢である。
【０１００】
ＧＳＫ−３は複数のシグナル伝達経路において中枢的役割を果たすので、酵素を完全に遮断することなく、また、β−カテニンなどの複数の基質に影響を及ぼすことなく、特にＧＳＫ−３活性を減弱することができる化合物を用いた場合に治療上有利である。いくつかの実施形態において、セリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン自己リン酸化型の酵素を選択的に阻害する化合物が種々のＧＳＫ−３関連障害に利点をもたらす。
【０１０１】
驚くべきことに、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する化合物は、ニューロン細胞における軸策および樹状分枝の増加などのニューロン成長および樹状突起形成の増大をもたらす。ＨＵＶＥＣからの新たな血管の生成の場合にも同様の結果が見られた。脳卒中後の回復、脊髄損傷、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、白血球減少症、糖尿病、末梢神経再生および骨粗鬆症などの多種の変性症状を処置する際にニューロン成長および樹状突起形成および脈管形成の増大は有利であり、治療効力の向上をもたらす。
【０１０２】
別の実施形態において、本発明は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する方法であって、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に調節する、治療上有効量の阻害剤を投与することによる方法を特徴とする。よって、ＧＳＫ−３  α／β  ｐ−ｔｙｒまたはＧＳＫ−３  ｐ−ｔｙｒを選択的に阻害するレベル、量または用量は、酵素のチロシン自己リン酸化によりも酵素のセリン／トレオニンリン酸化を阻害または調節するレベル、量または用量である。これらの阻害剤はin vitroまたはin vivoで使用可能である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、阻害剤は式Ｉの化合物である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、酵素はＧＳＫ−３αであり、他の実施形態では、酵素はＧＳＫ−３βである。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する化合物を投与することによりニューロン細胞の軸策および樹状分枝を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する化合物を投与することにより神経可塑性を促進することを含む。他の実施形態では、本方法は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する化合物を投与することにより脈管形成を促進することを含む。さらに他の実施形態では、本方法は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する化合物を投与することにより神経発生を促進することを含む。さらに他の実施形態では、本方法は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する化合物を投与することにより、躁病および鬱病などの神経精神障害を処置することを含む。以上の各実施形態では、化合物は、化合物Ｉ−１〜Ｉ−５５の１以上など、式Ｉの化合物であり得る。
【０１０６】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象に有効量の化合物、または化合物を含む薬学上許容される組成物を投与することを含む、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌などの増殖性または過剰増殖性疾患、免疫介在疾患、免疫不全障害、骨疾患、代謝疾患、神経または神経変性疾患、心血管疾患、アレルギー、糖尿病、喘息、アルツハイマー病またはホルモン関連疾患から選択される疾患、障害または症状を処置する、またはその重篤度を軽減するための方法を提供する。
【０１０７】
「癌」とは、限定されるものではないが、次の癌を含む：類表皮口腔：口内、唇、舌、口腔、咽頭；心臓：肉腫（血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫および奇形腫；肺：気管支原性癌腫（扁平上皮細胞または類表皮腫、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌腫、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫；胃腸：食道（扁平上皮癌、喉頭、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（腺管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（small bowelまたはsmall intestine）（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、繊維腫）、大腸（large bowelまたはlarge intestine）（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）、結腸、結腸直腸(colon-revtum, colorectal rectum)；尿生殖路：腎臓（腺癌、ビルムス腫瘍［腎芽細胞腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質性細胞癌、繊維腫、繊維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝細胞腫（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽細胞腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、胆道；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、繊維肉腫、悪性繊維組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍、脊索腫(malignant giant cell tumor chordoma)、骨軟骨腫（骨軟骨の外骨腫））、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液繊維腫、類骨骨腫および巨細胞腫瘍）；神経系：（頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経繊維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫；婦人科系（子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（頸部癌、前腫瘍状態の頸部異形成）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、ムチン性嚢胞腺癌、分類されていない癌］、顆粒膜−莢膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ(Sertoli-Leydig)細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮細胞癌、上皮内癌、腺癌、繊維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮細胞癌、ブドウ状肉腫［胎児性横紋筋肉腫］）、卵管（癌）、乳房；血液（血液（脊髄白血病［急性および慢性］、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（悪性リンパ腫）ヘアリー細胞；リンパ系障害；皮膚（悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、角化棘細胞腫、形成異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、ケロイド、乾癬；甲状腺：甲状腺乳頭癌、濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様癌、未分化甲状腺癌、２Ａ型多発性内分泌腺腫、２Ｂ型多発性内分泌腺腫、家族性甲状腺髄様癌、褐色細胞腫、傍神経節腫；および副腎：神経芽細胞腫。従って、「癌性細胞」は、本明細書に示される場合、上記で特定される症状のいずれか１つに罹患した細胞を含む。いくつかの実施形態では、癌は、直腸結腸癌、甲状腺癌または乳癌から選択される。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、該疾患はアレルギーまたはＩ型過敏感反応、喘息、糖尿病、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、双極性障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）、多発性硬化症（ＭＳ）、統合失調症、白血球減少症、心筋細胞肥大、再潅流／虚血、脳卒中、禿頭症、移植拒絶、移植片対宿主病、関節リウマチ、ならびに固形および血液性悪性腫瘍から選択される。いくつかの実施形態では、該疾患は糖尿病、双極性障害、統合失調症、脳卒中、ハンチントン病、白血球減少症および心筋細胞肥大から選択される。いくつかの実施形態では、該疾患は変性症状である。いくつかの実施形態では、該変性症状は脳卒中、脳卒中後の回復、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、脊髄損傷、外傷性脳損傷、シャルコー・マリー・トゥース病、白血球減少症、糖尿病、糖尿病性神経障害、末梢神経再生および骨粗鬆症から選択される。いくつかの実施形態では、該疾患は神経変性症状である。別の実施形態では、該神経変性症状は脳卒中、脳卒中後の回復、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、脊髄損傷、外傷性脳損傷、末梢神経再生、その他の神経疾患およびシャルコー・マリー・トゥース病から選択される。本明細書において、神経疾患は、脳、脊髄、神経または筋肉に影響を及ぼす障害である。本明細書において「脳卒中後」とは、脳卒中の結果（その結果には、限定されるものではないが、ニューロン障害、挙動変化、血管損傷ならびに細胞および組織損傷が含まれる）の処置または改善を含む脳卒中後の回復を含む。
【０１０９】
本発明の他の実施形態において、該疾患はタンパク質キナーゼ介在症状である。いくつかの実施形態において、該タンパク質キナーゼはＧＳＫ−３である(said protein kinase in GSK-3)。
【０１１０】
本明細書において「タンパク質キナーゼ介在症状」とは、タンパク質キナーゼが役割を果たす任意の疾患または他の有害な症状を意味する。このような症状としては、限定されるものではないが、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性および過剰増殖性疾患、免疫介在疾患、免疫不全障害、免疫調節または免疫抑制障害、骨疾患、代謝疾患、神経疾患および神経変性疾患、心血管疾患、ホルモン関連疾患、糖尿病、アレルギー、喘息およびアルツハイマー病が挙げられる。
【０１１１】
本明細書において「ＧＳＫ−３介在症状」とは、ＧＳＫ−３が役割を果たす任意の疾患または他の有害な症状を意味する。このような症状としては、限定されるものではないが、糖尿病、糖尿病性神経障害、骨粗鬆症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、双極性障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）、多発性硬化症（ＭＳ）、統合失調症、白血球減少症、心筋細胞肥大、脳卒中、脳卒中後の回復、脊髄損傷、外傷性脳損傷、シャルコー・マリー・トゥース病、末梢神経再生および関節リウマチが挙げられる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、該化合物は、β細胞再生を促進することにより糖尿病を処置するために用いられる。
【０１１３】
他の実施形態において、該化合物は、脳卒中回復中に脳卒中患者を処置するために用いられる。いくつかの場合では、該化合物は脳卒中後の投与に用いられる。処置の長さは１か月〜１年の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、該化合物は脳卒中が起こった後に投与される。いくつかの実施形態では、該投与は虚血中または虚血直後である。いくつかの実施形態では、該投与は虚血中または虚血直後に行い、その後、継続的に投与する。例えば、該投与は虚血中または虚血後に始め、１か月〜１年継続することができる。いくつかの実施形態では、該投与は虚血後４８時間以内に始め、約６ヶ月間継続する。以上の実施形態のいずれにおいても、脳卒中後の回復を提供するための投与は、患者が理学療法を受けている間に行うことができる。
【０１１４】
さらに他の実施形態では、該化合物は、骨芽細胞形成により骨粗鬆症を処置するために用いられる。
【０１１５】
さらに他の実施形態では、本発明は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型に対するチロシン型の自己リン酸化の量を測定することにより、ＧＳＫ−３介在症状の処置に有用な化合物を同定するための方法を特徴とする。いくつかの態様において、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型に対するチロシン型の自己リン酸化の量はβ−カテニン：ＧＳＫ−３の比に関連している。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ−３介在症状の処置に有用な試験化合物を同定するための方法は、試験化合物に対するβ−カテニンのＩＣ５０値を決定すること、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値を決定すること、およびβ−カテニンのＩＣ５０値をＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値で割ることを含む。
【０１１６】
本発明の別の態様は、治療上有効な量の化合物を投与することによりＧＳＫ−３介在症状を処置する方法を提供し、ここで、該ＧＳＫ−３介在症状は糖尿病、骨粗鬆症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、双極性障害、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、統合失調症、白血球減少症、脳卒中、神経疾患、末梢神経再生および関節リウマチから選択される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、該ＧＳＫ−３介在症状は脳卒中、糖尿病、統合失調症、双極性障害、白血球減少症、脊髄損傷、外傷性脳損傷、シャルコー・マリー・トゥース病および糖尿病性神経障害から選択される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、該ＧＳＫ−３介在症状は脳卒中であり、該化合物は虚血が起こった後に投与され得る。
【０１１９】
本発明の別の態様は、治療上有効な量の化合物を投与すること、およびまた、該患者に糖尿病を処置するための薬剤、骨粗鬆症を処置するための薬剤、アルツハイマー病を処置するための薬剤、ハンチントン病を処置するための薬剤、パーキンソン病を処置するための薬剤、ＡＩＤＳ関連痴呆を処置するための薬剤、双極性障害を処置するための薬剤、筋萎縮性側索硬化症を処置するための薬剤、多発性硬化症を処置するための薬剤、統合失調症を処置するための薬剤、白血球減少症を処置するための薬剤、末梢神経再生を処置するための薬剤、脳卒中を処置するための薬剤および関節リウマチを処置するための薬剤から選択される付加的治療薬を投与することによりＧＳＫ−３介在症状を処置する方法を提供し、ここで、該付加的治療薬は処置される疾患に適当であり、かつ、該付加的治療薬は単一投与形として該組成物と一緒に、または複数投与形の一部として該組成物とは別に投与される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、該付加的治療薬は、脊髄損傷を処置するための薬剤、外傷性脳損傷を処置するための薬剤、シャルコー・マリー・トゥース病を処置するための薬剤または糖尿病性神経障害を処置するための薬剤から選択される。
【０１２１】
本発明の別の態様は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、ＧＳＫ−３介在症状を処置する方法を提供する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、該薬剤は式Ｉの化合物を含む。いくつかの実施形態では、該ＧＳＫ−３介在症状は脳卒中後、脊髄損傷、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、白血球減少症、糖尿病、末梢神経再生または骨粗鬆症である。一実施形態において、該ＧＳＫ−３介在症状は脳卒中後である。
【０１２３】
本発明のさらに別の態様は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、ニューロン細胞の軸策および樹状分枝を増加させる方法を提供する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤は式Ｉの化合物である。
【０１２５】
本発明の別の態様は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、神経可塑性を促進する方法を提供する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、該薬剤は式Ｉの化合物である。
【０１２７】
本発明の別の態様は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、脈管形成を促進する方法を提供する。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、該薬剤は式Ｉの化合物である。
【０１２９】
本発明の別の態様は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、神経発生を促進する方法を提供する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、該薬剤は式Ｉの化合物である。
【０１３１】
本発明のさらに別の態様は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、神経精神障害を処置する方法を提供する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、該薬剤は式Ｉの化合物である。いくつかの実施形態では、該神経精神障害は躁病または鬱病である。
【０１３３】
本発明のさらに別の態様は、１以上の試験化合物についてＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型に対するチロシンの自己リン酸化の量を測定することを含む、ＧＳＫ−３介在症状の処置に有用な化合物を同定するための方法を提供する。
【０１３４】
本発明の別の態様は、ＧＳＫ−３酵素のチロシンの自己リン酸化の量を測定すること、およびβ−カテニンのリン酸化の量を測定することを含む、ＧＳＫ−３介在症状の処置に有用な化合物を同定するための方法を提供する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、測定のステップは、試験化合物に対するβ−カテニンのＩＣ５０値を得ること、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値を決定すること、およびβ−カテニンのＩＣ５０値をＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値で割ることを含む。
【０１３６】
本発明の別の態様は、１以上の試験化合物についてＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型に対するチロシン型の自己リン酸化の量を測定することを含む、ニューロン細胞の軸策および樹状分枝を増加させるのに有用な化合物を同定するための方法を提供する。
【０１３７】
本発明のさらに別の態様は、ＧＳＫ−３酵素のチロシンの自己リン酸化の量を測定すること、およびβ−カテニンのリン酸化の量を測定することを含む、ニューロン細胞の軸策および樹状分枝を増加させるのに有用な化合物を同定するための方法を提供する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、測定のステップは、試験化合物に対するβ−カテニンのＩＣ５０値を得ること、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値を決定すること、およびβ−カテニンのＩＣ５０値をＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値で割ることを含む。いくつかの実施形態では、該方法はまた、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０に対するβ−カテニンのＩＣ５０の比が約１０またはそれ以上を示す化合物を同定することを含む。
【０１３９】
本発明の別の態様は、ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を投与することを含む、脳卒中後の回復を提供する方法を提供する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、該薬剤は式Ｉの化合物を含む。いくつかの実施形態では、該薬剤は虚血中または虚血直後に投与される。いくつかの実施形態では、該薬剤は虚血中または虚血直後と虚血後約６か月の期間投与される。いくつかの実施形態では、脳卒中後の回復を提供する該方法は理学療法を投与することをさらに含む。
【０１４１】
本発明の別の態様は、化合物Ｉ−３９〜化合物Ｉ−５５から選択される化合物を提供する。
【０１４２】
処方物および投与経路
別の態様は、本明細書に記載されているいずれかの化合物を含み、所望により薬学上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含む薬学上許容される組成物を提供する。特定の実施形態では、これらの組成物は所望により１以上の付加的治療薬をさらに含む。
【０１４３】
特定の実施形態では、化合物または薬学上許容される組成物の「有効量」は、該疾患を処置するのに有効な量である。本発明の方法に従う該化合物および組成物は、該疾患を処置する、またはその重篤度を軽減するのに有効ないずれかの量およびいずれかの投与経路を用いて投与することができる。本明細書において「処置する」または「処置」とは、疾患の予防、疾患の重篤度の軽減または疾患の阻害を含む。本明細書において「予防する」とは、何らかの方法でその症状が起こらないよう、その症状を回避することを指す。「阻害する」とは、その症状の軽減またはその症状の進行を緩慢にすることを指す。「軽減する」とは、その症状を減らすこと、またはその症状の進行を緩慢にすることを指す。
【０１４４】
また、本発明のある特定の化合物は、処置のための遊離形態、または適当であればその薬学上許容される塩または薬学上許容される誘導体として存在し得ると考えられる。
【０１４５】
本発明は異なる薬学上許容される塩の混合物／組合せ、また、遊離形態の化合物と薬学上許容される塩の混合物／組合せを含むと理解すべきである。
【０１４６】
本明細書に記載されているように、本発明の薬学上許容される組成物は薬学上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルをさらに含み、本明細書においては、所望の特定の投与形に適合するような溶媒、希釈剤またはその他の液体ビヒクル、分散または懸濁酸、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などのいずれか、また全てを含む。Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)は、薬学上許容される組成物の処方に用いられる種々の担体およびその製造のための公知の技術を開示している。望まない生物作用をもたらしたり、そうでなければ薬学上許容される組成物の他のいずれかの成分と有害な相互作用をしたりすることなどで、慣例の担体媒体が本発明の化合物と不適合でない限り、その使用は本発明の範囲にあるもとする。
【０１４７】
薬学上許容される担体として働き得る材料のいくつかの例として、限定されるものではないが、イオン交換剤；アルミナ；ステアリン酸アルミニウム；レシチン；ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質；リン酸塩、グリシン、ソルビン酸またはソルビン酸カリウムなどのバッファー物質；飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物；水；硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、羊毛脂、糖類（ラクトース、グルコースおよびスクロースなど）などの塩または電解質；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末トラガカントガム；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油；プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の無毒な適合する滑沢剤、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および香料が挙げられる。保存剤および抗酸化剤も本組成物中に存在してよい。
【０１４８】
タンパク質キナーゼ阻害剤またはその医薬塩は、動物またはヒトへ投与するための医薬組成物へと処方することができる。タンパク質キナーゼ介在症状を治療または予防するのに有用な量のタンパク質阻害剤と薬学上許容される担体を含むこれらの医薬組成物は、本発明の別の態様である。いくつかの実施形態では、該タンパク質キナーゼ介在症状はＧＳＫ−３介在症状である。
【０１４９】
処置に必要な化合物の厳密な量は、対象の種、齢および健康状態、感染の重篤度、特定の薬剤、その投与様式などに応じて対象ごとに異なる。本発明の化合物は好ましくは投与が容易で用量が均一な単位投与形で処方される。本明細書において「単位投与形」とは、処置される患者に適当な、物理的に別個の薬剤単位を指す。しかしながら、本発明の化合物および組成物の総１日使用は、堅実な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されると理解される。特定の患者または生物に対する具体的な有効用量レベルは、処置される障害およびその障害の重篤度；使用する特定の化合物の活性；使用する特定の組成物；患者の齢、体重、健康状態、性別および食習慣；使用する特定の化合物の投与時間、投与経路および排泄速度；処置の期間；使用する特定の化合物と組み合わせて、または同時に使用される薬剤；および医学分野で周知の同様の因子を含む種々の因子によって異なる。本明細書において「患者」とは動物を意味する。一実施形態では、該動物は哺乳類であり、別の実施形態では、該動物はヒトである。
【０１５０】
本発明の薬学上許容される組成物は、ヒトおよび他の動物に、処置される感染の重篤度に応じて、経口投与、直腸投与、非経口投与、大槽内投与、腟内投与、腹膜内投与、局所投与（粉末、軟膏または滴剤による）、頬側投与、経口または鼻腔スプレーとして投与することができる。特定の実施形態において、本発明の化合物は、所望の治療効果を得るために約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ対象体重／日の用量レベルで１日１回以上、経口または非経口投与することができる。
【０１５１】
経口投与用の液体投与形としては、限定されるものではないが、薬学上許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。液体投与形は、有効化合物に加え、例えば、水またはその他の溶媒、可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、アメリカホドイモ(groundnut)油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油など）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルおよびその混合物といった当技術分野で慣用の不活性希釈剤を含み得る。経口組成物は、不活性希釈剤の他、湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤、甘味剤、香味剤および香料などのアジュバントを含み得る。
【０１５２】
注射用製剤、例えば、無菌注射水性または油性懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および沈殿防止剤を用い、公知の技術に従って処方することができる。無菌注射製剤はまた、無毒な非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射溶液、懸濁液またはエマルション、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であり得る。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒としては、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の硬化油も溶媒または懸濁媒として便宜に用いられる。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含むいずれの銘柄の硬化油も使用可能である。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も注射剤の調製に用いられる。
【０１５３】
注射処方物は、例えば細菌保持フィルターでの濾過、または使用前に無菌水またはその他の無菌注射媒中に溶解または分散させることができる無菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによるなどして滅菌することができる。
【０１５４】
本発明の化合物の効果を延長するためには、皮下または筋肉内注射から化合物の吸収を遅らせることが望ましい場合が多い。これは、水溶性の低い結晶性または非晶質物質の液体懸濁液を用いることにより達成することができる。その後の化合物の吸収速度はその溶解速度によって異なり、そしてこれは結晶の大きさおよび結晶形態によって異なり得る。あるいは、非経口投与化合物形態の遅延吸収は、化合物を油性ビヒクルに溶解または懸濁させることにより達成される。注射可能なデポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成させることにより作製される。化合物とポリマーの比および使用する特定のポリマーの性質によって、化合物の放出速度が制御できる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射処方物はまた、身体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルション中に化合物を封入することによっても製造される。
【０１５５】
直腸または膣投与用組成物は好ましくは、本発明の化合物をカカオ脂、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスなどの、周囲温度では固体であるが体温では液体であり、従って直腸または膣腔内で融解して有効化合物を放出する、好適な無刺激の賦形剤または担体と混合することにより製造可能な坐剤である。
【０１５６】
経口投与用の固体投与形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれる。このような固体投与形では、有効化合物をクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／またはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸などの増量剤(fillers or extenders)、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジン、スクロースおよびアラビアガムなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイトクレーなどの吸収剤、およびｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびその混合物などの滑沢剤といった少なくとも１種類の不活性な薬学上許容される賦形剤または担体と混合する。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合には、投与形は緩衝剤も含み得る。
【０１５７】
類似の種の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用い、充填ゼラチン軟カプセルおよび硬カプセルの増量剤として使用してもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体投与形は、腸溶コーティングおよび製薬分野で周知の他のコーティング剤などのコーティングおよび剤皮を用いて製造することができる。それらは所望により不透明化剤を含んでもよく、腸管の特定の部分でのみ、または好ましくは腸管の特定の部分で、所望により遅延して有効成分を放出する組成物であってもよい。使用可能な包理組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。類似の種の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用い、充填ゼラチン軟カプセルおよび硬カプセルの増量剤として使用してもよい。
【０１５８】
有効化合物はまた、上記のような１以上の賦形剤とともにマイクロカプセル化された形態であってもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体投与形は、腸溶コーティング、放出制御コーティングおよび製薬分野で周知の他のコーティング剤などのコーティングおよび剤皮を用いて製造することができる。このような固体投与形では、有効化合物をスクロース、ラクトースまたはデンプンなどの少なくとも１種類の不活性希釈剤と混合すればよい。このような投与形はまた、通常実施されるように、不活性希釈剤以外の付加的物質、例えば、錠剤滑沢剤ならびにステアリン酸マグネシウムおよび微晶質セルロースなどの他の錠剤補助剤を含んでもよい。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合には、これらの投与形は緩衝剤を含んでもよい。それらは所望により不透明化剤を含んでもよく、腸管の特定の部分でのみ、または好ましくは腸管の特定の部分で、所望により遅延して有効成分を放出する組成物であってもよい。使用可能な包理組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【０１５９】
本発明の化合物の局所投与または経皮投与用の投与形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチ剤が含まれる。有効成分を無菌条件下で薬学上許容される担体、および必要であれば必要な保存剤またはバッファーと混合する。眼用処方物、点耳剤および点眼剤も本発明の範囲内あるものとする。さらに、本発明は、身体への化合物の制御送達を提供する付加的利点を有する経皮パッチ剤の使用も意図する。このような投与形は化合物を適当な媒体に溶解または分散させることによって製造することができる。また、皮膚を通過する化合物の流量を増すために吸収促進剤を使用することもできる。この速度は、速度制御膜を設けるか、または化合物をポリマーマトリックスまたはゲルに分散させることによって制御することができる。
【０１６０】
本発明の化合物に加え、本発明の薬学上許容される誘導体またはプロドラッグも、上記で特定された障害を治療または予防するための組成物において使用することができる。
【０１６１】
「薬学上許容される誘導体またはプロドラッグ」とは、受容者に投与された際に、直接的または間接的に本発明の化合物または阻害活性代謝物またはその残基を与え得る、本発明の化合物の任意の薬学上許容されるエステル、エステルの塩またはその他の誘導体を意味する。特に好適な誘導体またはプロドラッグは、このような化合物が患者に投与された際に本発明の化合物のバイオアベイラビリティーを高める（例えば、経口投与された化合物がより容易に血中に吸収されるようにすることによる）もの、または生体コンパートメント（例えば、脳またはリンパ系）への親化合物の送達を親種よりも高めるものである。
【０１６２】
本発明の化合物の薬学上許容されるプロドラッグとしては、限定されるものではないが、エステル、アミノ酸エステル、リン酸エステル、金属塩およびスルホン酸エステルが挙げられる。
【０１６３】
これらの医薬組成物において使用可能な薬学上許容される担体としては、限定されるものではないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、バッファー物質（リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなど）、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【０１６４】
本発明の組成物は、経口、非経口、吸入スプレーにより、局所、直腸、鼻腔、口内、膣またはインプラントリザーバーを介して投与することができる。本明細書において「経口」とは、限定されるものではないが、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、滑液包内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術により投与することができる。特定の実施形態では、該組成物は経口、腹膜内または静脈内投与される。
【０１６５】
本発明の組成物の無菌注射形態は水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および沈殿防止剤を用い、当技術分野で公知の技術に従って処方することができる。無菌注射用製剤はまた、無毒な非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であり得る。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒としては、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の硬化油も溶媒または懸濁媒として便宜に用いられる。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含むいずれの銘柄の硬化油も使用可能である。天然の薬学上許容される油、例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化型と同様、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸も注射剤の製造に有用である。これらの油性溶液または懸濁液はまた長鎖アルコール希釈剤、またはカルボキシメチルセルロースなどの分散剤、またはエマルションおよび懸濁液を含む薬学上許容される投与形の処方に慣用される類似の分散剤を含み得る。他の慣用界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓおよび薬学上許容される固体、液体もしくはその他の投与形の製造に慣用されるその他の乳化剤またはバイオアベイラビリティー増強剤もこの処方の目的で使用可能である。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、限定されるものではないが、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または溶液を含むいずれの経口的に許容される投与形で経口投与してもよい。経口用の錠剤の場合、慣用の担体としては、限定されるものではないが、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も一般に添加される。カプセル形態での経口投与では、有用な希釈剤としてラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。経口用として水性懸濁液が必要な場合には、有効成分を乳化剤および沈殿防止剤と合わせる。所望により、特定の甘味剤、香味剤または着色剤を添加してもよい。
【０１６７】
あるいは、本発明の医薬組成物は、直腸投与用の坐剤の形態で投与してもよい。これらは薬剤を、室温では固体であるが、直腸温度では液体であり、従って、直腸内で融解して薬剤を放出する好適な無刺激の賦形剤と混合することにより製造することができる。このような物質としては、限定されるものではないが、カカオ脂、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１６８】
本発明の医薬組成物はまた、眼、皮膚または腸管下部をはじめ、特に処置の標的が局所適用により容易に接近可能な領域または器官を含む場合には、局所投与することもできる。好適な局所用処方物はこれらの領域または器官のそれぞれに対して容易に製造される。
【０１６９】
腸管下部に対する局所適用は、直腸坐剤処方物（上記参照）または好適な浣腸処方物で達成することができる。また、局所的経皮パッチも使用可能である。
【０１７０】
局所適用に関しては、該医薬組成物は、１以上の担体に懸濁または溶解させた有効成分を含有する好適な軟膏として処方することができる。本発明の化合物の局所投与用担体としては、限定されるものではないが、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられる。あるいは、該医薬組成物は、１以上の薬学上許容される担体に懸濁または溶解させた有効成分を含有する好適なローションまたはクリームとして処方することができる。好適な担体としては、限定されるものではないが、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられる。
【０１７１】
眼科用途では、該医薬組成物は、塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤を含む、または含まない、等張なｐＨ調整された無菌生理食塩水中の微細懸濁液、または好ましくは等張なｐＨ調整された無菌生理食塩水中の溶液として処方することができる。あるいは、眼科用途では、該医薬組成物はワセリンなどの軟膏として処方することができる。
【０１７２】
本発明の医薬組成物はまた、鼻腔エアゾールまたは吸入により投与することもできる。このような組成物は製剤分野で周知の技術に従って製造され、ベンジルアルコールまたはその他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティーを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボンおよび／またはその他の慣例の可溶化剤または分散剤を用い、生理食塩水中の溶液として製造することができる。
【０１７３】
単一投与形を製造するために担体材料と組み合わせることができるタンパク質キナーゼ阻害剤の量は処置される宿主および特定の投与様式によって異なる。好ましくは、該組成物は０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の用量の阻害剤がこれらの組成物を受容する患者に投与可能なように処方すべきである。
【０１７４】
特定の患者に対する具体的な用量および処置計画は、使用する特定の化合物の活性、患者の年齢、体重、健康状態、性別および食習慣、投与時間、排泄速度、薬剤組合せ、処置する医師の判断および処置される特定の疾患の重篤度を含む種々の因子によって異なると理解すべきである。阻害剤の量はまた、組成物中の特定の化合物によっても異なる。
【０１７５】
治療または予防される特定のタンパク質キナーゼ介在症状によって、その症状を治療または予防するために通常投与される付加的薬剤を本発明の阻害剤とともに投与してもよい。例えば、化学療法薬またはその他の抗増殖薬を、増殖性疾患を処置するために本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤と組み合わせてもよい。
【０１７６】
それらの付加的薬剤は、複数の投与計画の一部として、タンパク質キナーゼ阻害剤を含有する化合物または組成物とは別に投与してもよい。あるいは、それらの薬剤は、単一の組成物においてタンパク質キナーゼ阻害剤と混合した単一投与形の一部であってもよい。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、該タンパク質キナーゼ阻害剤はＧＳＫ−３キナーゼ阻害剤である。
【０１７８】
本発明はまた、患者への投与を含むもの以外の方法で用いてもよい。
【実施例】
【０１７９】
本発明の化合物は一般に当業者に公知の方法によって製造することができる。それらの化合物は、限定されるものではないが、ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）およびＮＭＲ（核磁気共鳴）を含む、公知の方法によって分析することができる。本発明の化合物はまた、これらの実施例に従って試験することができる。以下に示される特定の条件は単に例であって、本発明の化合物を製造、分析または試験するために使用可能な条件の範囲を限定するという意味ではないと理解すべきである。代わりに、本発明はまた、本発明の化合物を製造、分析および試験するための当業者に公知の条件も含む。
【０１８０】
本明細書において「Ｒｔ（分）」とは、化合物に関するＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）またはＬＣＭＳいずれかの保持時間（分）を指す。
【０１８１】
特に断りのない限り、報告されている保持時間を得るために用いたＨＰＬＣ法は次の通りである。
カラム：ＡＣＥ  Ｃ８カラム、４．６×１５０ｍｍ
勾配：０−１００％アセトニトリル＋メタノール６０：４０（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓリン酸）
流速：１．５ｍＬ／分
検出：２２５ｎｍ
【０１８２】
ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）サンプルは、エレクトロスプレーイオン化法を用いたシングルＭＳモードで作動するＭｉｃｒｏＭａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｍｉｃｒｏ質量分析計にて分析した。サンプルを、クロマトグラフィーを用いた質量分析計に導入した。全ての質量スペクトル分析の移動相は、修飾剤として０．２％ギ酸または０．１％ＴＦＡのいずれかを含むアセトニトリル−水混合物からなった。カラム勾配条件は、Ｗａｔｅｒｓ  ＹＭＣ  Ｐｒｏ−Ｃ１８  ４．６×５０ｍｍカラムにて勾配時間３分で１０％−９０％アセトニトリル、実施時間５分である。流速は１．５ｍｌ／分であった。
【０１８３】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ  ４００装置を用い、４００ＭＨｚで記録した。以下の式Ｉの化合物を製造し、次のように分析した。
【０１８４】
実施例１：中間体
中間体１
【化２５】
2011513483.tif 000031
シクロヘキサンカルボキシイミドアミド塩酸塩
Ｅｔ２Ｏ（１５０ｍｌ）およびＭｅＯＨ（３３ｍｌ）中、シクロヘキサンカルボニトリル（６０ｇ、５５０ｍｍｏｌ、１当量）の混合物の温度を０℃まで下げた後、ＨＣｌ（ｇ）を２０分間通じた。次に、この反応混合物を冷蔵庫Ｏ／Ｎに取り出した。得られた白色固体をＥｔ２Ｏに懸濁させ、濾過してメチルシクロヘキサンカルボイミデート中間体（１２５．１ｇ、１２８％）を得た。この粗固体を０℃にてＥｔＯＨ（４００ｍｌ）／ＥｔＯＨ中２ＭのＮＨ３（１００ｍｌ）の混合物に懸濁させた後、この懸濁液にＮＨ３（ｇ）を２時間通じた。次に、この反応混合物を一晩冷蔵庫に置いた。得られた固体を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄して濾液を得、次にこれを真空濃縮した。残渣をＭｅＯＨに取り、固体が沈殿し始めるまで真空濃縮し、この時にＥｔ２Ｏを加えた。結果として形成された固体を濾過して粘稠な固体を得、これを一晩、真空乾燥機に入れ、目的生成物を白色固体として得た（８７．８０ｇ、９８％）。1H (400MHz, DMSO) 1.00-1.88 (10H, m),2.35-2.57 (1H, m), 8.86-9.02 (3H, m)。
【０１８５】
中間体２
【化２６】
2011513483.tif 000032
２−シクロヘキシル−５，６−ジメチルピリミジン−４−オール
室温で攪拌しているナトリウムエトキシドの溶液（ナトリウム（６．３６ｇ、２７８ｍｍｏｌ、３当量）をＥｔＯＨ（３００ｍｌ）に溶解させることにより予め作製）を２−メチル−３−オキソブタン酸エチル（１６．９４ｍｌ、１２０ｍｍｏｌ、１．３当量）で処理した。次に、ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）中、シクロヘキサンカルボキシイミドアミド塩酸塩（１５ｇ、９２ｍｍｏｌ、１当量）のスラリーを加え、得られた混合物を還流下で８時間加熱した。得られた混合物を濃縮し、水を加え、２Ｎ  ＨＣｌでｐＨを〜７〜８に調整した。酸性化の後、白色固体が沈殿し、これを濾過し、真空乾燥機で乾燥させ、２−シクロヘキシル−５，６−ジメチルピリミジン−４−オールを白色固体として得た（２８．９１ｇ、１５１％）。1H (400MHz, DMSO) 1.03-1.86 (10H, m), 1.96 (3H, s), 2.16 (3H, s), 2.36-2.57 (1H, m), 12.05 (1H, brs); ES+207。
【０１８６】
中間体３
【化２７】
2011513483.tif 000033
４−クロロ−２−シクロヘキシル−５，６−ジメチルピリミジン
ＰＯＣｌ３（２２０ｍｌ、２．４ｍｏｌ、〜２６当量）を〜−５０℃に冷却した後、２−シクロヘキシル−５，６−ジメチルピリミジン−４−オール（２８．９ｇ、‘９２ｍｍｏｌ’、１当量）で注意深く処理した。次に、冷却浴を外し、このポットを室温まで温めた後、６時間加熱還流した。得られた混合物を濃縮し、氷と飽和ＮａＨＣＯ３で処理し、Ｅｔ２Ｏに抽出した後、乾燥させ（硫酸ナトリウム）／濃縮した。得られた油状物を、溶出剤としてＥｔＯＡｃ（１０％）：４０−６０ガソリン（９０％）を用いてカラムクロマトグラフィーに付し、４−クロロ−２−シクロヘキシル−５，６−ジメチルピリミジンを油状物として得た（５．７０１１ｇ、最初の２段階で２８％）。1H (400MHz, DMSO) 1.16-1.90 (10H, m), 2.26 (3H, s), 2.46 (3H, s), 2.60-2.75 (1H, m).  ES+225。
【０１８７】
中間体４
【化２８】
2011513483.tif 000034
５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−アミン５の合成のための全合成スキームを以下に示す。
【化２９】
2011513483.tif 000035
試薬および条件：ｉ．Ｐｄ（ＯＡｃ）２、ＰＰｈ３、Ｅｔ３Ｎ、Ｈ２ＣＯ２；ｉｉ．１）（ＣＯＣｌ）２、ＣＨ２Ｃｌ２、ｃａｔ．ＤＭＦ；２）ＮＨ３（ｇ）、ジオキサン、ｉｉｉ．ＴＦＡＡ、Ｅｔ３Ｎ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃；ｉｖ．Ｈ２ＮＮＨ２．Ｈ２Ｏ、ｎ−ブタノール、還流
【０１８８】
２−クロロ−５−フルオロニコチン酸（６）
Ｎ２雰囲気下、丸底フラスコに脱気したＤＭＦ（２７０ｍＬ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．０５当量、２．７ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ３（０．１当量、６．２ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）および脱気したＥｔ３Ｎ（６当量、２００ｍＬ、１４２８．６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を２０分間攪拌した後、ＨＣＯＯＨ（３当量、２８ｍＬ、７１４．３ｍｍｏｌ）を加え、５分後に２，６−ジクロロ−５−フルオロニコチン酸（５０ｇ、２３８．１ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を５０℃で攪拌した。この反応を後処理アリコートの分析（１Ｈ  ＮＭＲ）により追跡した。全ての出発材料が消費された際に（２４時間）、この混合物を０℃に冷却し、水（５００ｍＬ）を加えた。２０分後、この混合物をセライトパッドで濾過し、これを水ですすいだ。この混合物を３０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨ９まで塩基性化し、ＥｔＯＡｃで洗浄した（２回）。ＨＣｌ（１２Ｎ）をｐＨ１までゆっくり加え、この溶液をＮａＣｌで飽和させた。この混合物をＥｔＯＡｃで抽出した（３回）。合わせた有機抽出液をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮し、３７ｇ（８８％）のベージュ色の固体を得、これをそれ以上精製を行わずに次のステップで用いた。1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 8.16 (dd, 1H); 8.58 (d, 1H)。
【０１８９】
２−クロロ−５−フルオロニコチンアミド（３）
０℃にて、ＤＣＭ（４００ｍＬ）中、２−クロロ−５−フルオロニコチン酸６（５０ｇ、２８５ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（２ｍＬ、２８ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化オキサリル（６４ｍＬ、７４１ｍｍｏｌ）を滴下した。この反応混合物を室温で一晩攪拌し、真空濃縮した。得られた黄色液体を１，４−ジオキサン（６００ｍＬ）に溶解させ、０℃で冷却し、この溶液にＮＨ３（ｇ）を３０分間通じた。この混合物を室温で一晩攪拌した。得られた混合物を濾過し、濾液を濃縮し、化合物３（４４ｇ、８９％）をベージュ色の固体として得た。1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 7.84 (s, 1H), 7.96 (dd, 1H), 8.09 (s, 1H), 8.49 (d, 1H)。
【０１９０】
２−クロロ−５−フルオロニコチノニトリル（４）
ＤＣＭ（７００ｍＬ）中、粗化合物３（６５ｇ、３７２．４ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１１４ｍＬ、８１９．２ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃に冷却し、ＴＦＡＡ（５７ｍＬ、４０９．６ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた黄色溶液を０℃で９０分間攪拌し、ＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液およびブラインで洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。この混合物を濾過し、濃縮した。残渣のＫｕｇｅｌ  Ｒｏｈｒ蒸留（〜７０℃／１ｍｂａｒ）により、５０ｇ（８６％）の化合物４をベージュ色の固体として得た。また、化合物４はカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、８：１ヘプタン：ＥｔＯＡｃ）により精製することもできる。1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.78 (dd, 1H); 8.49 (d, 1H)。
【０１９１】
５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−アミン（５）
１−ブタノール（１Ｌ）中、化合物４（５０ｇ、３２１．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン一水和物（１５０ｍＬ、３．２ｍｏｌ）を加え、この混合物を４時間還流した。この混合物を室温まで冷却し、濃縮した。この沈殿をフィルター上で水（２回）およびＥｔ２Ｏ（２回）で連続的に洗浄し、一晩真空乾燥させ、化合物５（４４ｇ、８８％）を黄色固体として得た。1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 5.53 (s, 2H); 7.94 (dd, 1H); 8.35 (dd, 1H); 12.02 (s, 1H)。
【０１９２】
中間体５
【化３０】
2011513483.tif 000036
２−クロロベンズイミドアミド
窒素下、氷浴冷却しながら、エーテル（４００ｍＬ）中、ＬＨＭＤＳ（ＴＨＦ中１Ｍ、４００ｍＬ、４００ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、２−クロロベンゾニトリル（２６．８４ｇ、１９５ｍｍｏｌ）を６回に分け、２５分かけて加えた。５分後、冷却浴を外し、一晩攪拌を続けた。ＬＣＭＳは、この時反応が完了していたことを示す（３．５時間後では５０％前後の完了）。氷浴で冷却しながら、ＨＣｌ水溶液（３Ｍ、４００ｍＬ）を注意深く加えた後、エーテル（６００ｍＬ）および水（６００ｍＬ）を加え、抽出を行った。有機層をＨＣｌ水溶液（４００ｍＬ）で再抽出した。合わせた水層を固体ＮａＯＨで注意深くｐＨ１４まで塩基性化した後、ＤＣＭで抽出し（３回）、乾燥させ（Ｋ２ＣＯ３）、濾過し、真空濃縮し、アミジンを白色固体として得た（２６．９３ｇ、８９．３％）。1H NMR (DMSO) 6.34 (3H, s), 7.32-7.40 (3H, m), 7.46 (1H, dd)。
【０１９３】
中間体７
【化３１】
2011513483.tif 000037
２−（２−クロロフェニル）−５，６−ジメチルピリミジン−４−オール
エタノール（７５０ｍＬ）中、２−クロロベンズイミドアミド（３４．０７ｇ、２２０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４４．５０ｇ、４４０ｍｍｏｌ）に、２−メチル−３−オキソブタン酸エチル（３８．１３ｇ、２６４ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で４時間加熱した。エステル（６．３６ｇ）を追加し、３時間攪拌した。この反応物を５００ｍＬ前後に濃縮し、一晩放置した。所望のピリミジノールの沈殿（２２．７ｇ）が生じた。母液を濃縮し、ＤＣＭおよび１Ｍ  ＨＣｌを加えた。水層をＤＣＭで数回抽出し、濃縮すると、さらなる収量の目的生成物（全部で２８．９ｇ、５６％）が白色固体として得られた。1H NMR (DMSO) 1.97 (3H, s), 2.26 (3H, s), 7.44-7.47 (1H, m), 7.51-7.59 (3H, m), 12.70 (1H, br s)。
【０１９４】
中間体８
【化３２】
2011513483.tif 000038
４−クロロ−２−（２−クロロフェニル）−５，６−ジメチルピリミジン
以下の反応を２つに分け、２つの同一の反応容器で同時に行った。
【０１９５】
ピリミジノール（１４．４５ｇ、６１．６ｍｍｏｌ）にＰＯＣｌ３（５０ｍＬ）を注意深く加え、５分間攪拌した。次に、ＰＯＣｌ３（１００ｍＬ）を追加し、１０５℃に加熱した。この温度で１時間後、反応物を濃縮した。氷を加え、２通りで行った反応をＤＣＭの補助と組み合わせた。有機層をブラインおよび水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空濃縮し、クロロピリミジン（３１．１４ｇ、９９．８％）を無色の油状物として得た。1H NMR (CDCl3) 2.45 (3H, s), 2.65 (3H, s), 7.36-7.39 (2H, m), 7.49-7.51 (1H, m), 7.71-7.73 (1H, m)。
【０１９６】
実施例２：化合物Ｉ−３７
【化３３】
2011513483.tif 000039
Ｎ−（２−（２−クロロフェニル）−５，６−ジメチルピリミジン−４−イル）−５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−アミン
ＮＭＰ（２００ｍＬ）中、４−クロロ−２−（２−クロロフェニル）−５，６−ジメチルピリミジン（３１．１４ｇ、１２３ｍｍｏｌ）と５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−アミン（１９．６５ｇ、１２９ｍｍｏｌ）の混合物を１３５℃で３時間３０分加熱した。次いで、この混合物を１００ｍＬ前後まで真空濃縮した。その後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、水およびＥｔＯＡｃを加えたところ、有機層に沈殿が現れた。全混合物を濾過し、残渣を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、水、ＥｔＯＡｃおよびエーテルで洗浄した。この残渣に攪拌しながら煮沸エタノールを加え、純粋な目的化合物を濾過した。この液体を濃縮し、このトリチュレーション手順を４回繰り返し、目的物質（２５ｇ、５５％）を白色固体として得た。1H NMR (DMSO) 2.28 (3H, s), 2.43 (3H, s), 7.28-7.37 (2H, m), 7.40-7.46 (2H, m), 7.93 (1H, dd), 8.49 (1H, s), 9.28 (1H, br s), 13.39 (1H, br s)。
【０１９７】
実施例３：化合物Ｉ−３８
Ｎ−（５，６−ジメチル−２−（２−（トリフルオロメチル）フェニル）ピリミジン−４−イル）−５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−アミンは、以下に示されるようなスキームＩに従って製造される。
スキーム１
【化３４】
2011513483.tif 000040
【０１９８】
中間体３ａ
５，６−ジメチル−２−（２−（トリフルオロメチル）フェニル）ピリミジン−４（３Ｈ）−オン
エタノール（２５０ｍＬ）に溶解したβ−ケトエステル１（７．５ｍＬ、５８ｍｍｏｌ）の溶液を調製する。外付け氷浴を用いて０℃に冷却した後、この溶液に塩酸アミジン２（６３．８ｍｍｏｌ）およびナトリウムエトキシド（１５．８ｇ、２３２ｍｍｏｌ（４当量））を少量ずつ加える。添加中、反応温度を０℃に維持する。次に、この反応混合物を２０時間還流させた後、ＨＰＬＣ／ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）（６．２５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）により完了したかどうかを確認する。完了したところで溶媒を除去し、残渣をブラインとＥｔＯＡｃの混合物に取る。この反応物をＥｔＯＡｃで数回抽出する（注：水性部分から全ての材料を得るには何回も抽出する必要がある場合がある）。合わせた有機抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過する。溶媒を蒸発させて粗生成物を得、この材料をシリカゲルプラグにのせ、５−２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出することにより精製し、中間体３ａを得る。
【０１９９】
中間体４ａ
４−クロロ−５，６−ジメチル−２−（２−（トリフルオロメチル）フェニル）ピリミジン
ラクタム３（５８ｍｍｏｌ）をＰＯＣｌ３無希釈（２５〜５０ｍＬ）で処理し、全ての出発材料が消費されるまで（ＨＰＬＣ／ＴＬＣに基づいてモニタリングし、判定）数時間加熱還流する。溶媒を減圧下で除去した後、生成物を氷およびブラインでクエンチする。この生成物を、生成物が見られなくなるまでＥｔＯＡｃを用いて抽出する（ＴＬＣに基づいてモニタリングし、判定。注：水層から全ての材料を得るには何回も抽出する必要がある場合がある）。濾過し、溶媒を除去して粗クロロピリミジンを得、この材料をシリカゲルプラグにのせ、０−１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出することにより精製し、中間体４を得る。
【０２００】
化合物Ｉ−３８
Ｎ−（５，６−ジメチル−２−（２−（トリフルオロメチル）フェニル）ピリミジン−４−イル）−５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−アミン
クロロピリミジン４ａ（１０．０ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（５〜１０ｍＬ）に溶解させた後、アミン４（１．５ｇ、１１ｍｍｏｌ）を加える。この反応混合物を〜４時間還流させた後、ＨＰＬＣ／ＴＬＣ（６．２５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）により完了したかどうかを確認する。完了した反応物をブラインで希釈し、ＥｔＯＡで数回抽出する。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、生成物を濾過し、真空下で減量し、粗生成物を得る。シリカゲルプラグ（１０−７５％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製溶出を行う。均質な画分を合わせ、ストリッピングし、遊離塩基を得る。次に、この生成物をＭｅＯＨに溶解させ、ジオキサン中過剰量のＨＣｌを加えた後に真空下で溶媒を除去することによりＨＣｌ塩を製造する。得られたガラス質をＥｔＯＡｃでトリチュレートして塩を固体として得ることにより最終生成物を得る。次に、この塩を高真空下１００℃で乾燥させて全ての溶媒の痕跡を除去し、３段階で３３％収率の標題化合物を得る。LCMS rt(分) = 2.40; MH+ = 403.1。
【０２０１】
実施例４：化合物Ｉ−１６
【化３５】
2011513483.tif 000041
（Ｎ−（２−シクロヘキシル−５，６−ジメチルピリミジン−４−イル）−５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−アミン
室温で攪拌しているＮＭＰ（５０ｍｌ）中、４−クロロ−２−シクロヘキシル−５，６−ジメチルピリミジン（５．７０ｇ、２５．４ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−アミン（４．６３ｇ、３０．４ｍｍｏｌ、１．２当量）で処理した。得られた混合物を１３０℃で４時間加熱した後、室温まで冷却した。得られた混合物をＥｔＯＡｃ／水で希釈し、有機層をｓＮａＨＣＯ３および水で洗浄した。後処理の際に固体が生じ、これを濾過した。この固体をＤＣＭ／ＭｅＯＨ／４０−６０−ガソリンで処理すると（Ｎ−（２−シクロヘキシル−５，６−ジメチルピリミジン−４−イル）−５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−アミンが生じ、これを白色固体として単離した。この固体を真空乾燥機にて８０℃で一晩乾燥させ、ＶＲＴ−７６３６３３（ロット２）を白色固体として得た（５．２６０８ｇ、６１％）。1H (400MHz, DMSO) 0.87-1.22 (5H, m), 1.40-1-62 (5H, m), 2.04 (3H, s), 2.20 (3H, s), 2.25 (1H, quin), 7.67 (1H, dd), 8.40 (1H, dd), 8.91 (1H, s), 13.13 (1H, s). ES+341, ES-339。
【０２０２】
実施例５：化合物Ｉ−３２
【化３６】
2011513483.tif 000042
ステップ（ｉ）：
２−（２−クロロフェニル）−４−（トリフルオロメチル）ピリジン
ＤＭＥ（１４０ｍＬ）／水（３５ｍＬ）中、２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）ピリジン（４ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）、２−クロロフェニルボロン酸（５．０４ｇ、２４．２ｍｍｏｌ）、Ｂａ（ＯＨ）２（１２．５ｇ、６６．１ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（４６４ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の混合物を１１０℃で１時間加熱した。固体を濾去し、母液を８０ｍＬ前後まで濃縮し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をブライン、次いで水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（１／１石油エーテル／ＥｔＯＡｃ）により精製し、鈴木の付加物（５．０５ｇ、８９％）を無色の油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): 7.41-7.44 (2H, m), 7.51-7.56 (2H, m), 7.63-7.65 (1H, m), 7.94 (1H, s), 8.94 (1H, d)。
【０２０３】
ステップ（ｉｉ）、（ｉｉｉ）：
２−クロロ−６−（２−クロロフェニル）−４−（トリフルオロメチル）ピリジン
ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中、２−（２−クロロフェニル）−４−（トリフルオロメチル）ピリジン（５．４０ｇ、２１．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中のｍＣＰＢＡ（７．２５ｇ、４２．０ｍｍｏｌ）を３０分かけて加えた後、この混合物を３時間加熱還流した（注：遮蔽を用いる）。この反応混合物を冷却した後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で２回洗浄し、濃縮した。
【０２０４】
上記からの残渣をＰＯＣｌ３（５０ｍＬ）に溶解させ、４５分間還流させた。この混合物を濃縮した後、氷を加えた。１時間後、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した後、有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（１０／１石油エーテル／ＥｔＯＡｃ）により精製し、クロロピリジン（４．４８ｇ、７３％）を無色の油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): 7.41-7.45 (2H, m), 7.50-7.55 (1H, m), 7.59 (1H, s), 7.65-7.70 (1H, m), 7.88 (1H, s)。
【０２０５】
ステップ（ｉｖ）、（ｖ）：
Ｎ−（６−（２−クロロフェニル）−４−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル）−５−フルオロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−アミン
ジオキサン（２ｍＬ）中、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（７．３ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）にキサントホス（３７．７ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を加えた。３分後、この溶液を、窒素下、ジオキサン（１５ｍＬ）中、２−クロロ−６−（２−クロロフェニル）−４−（トリフルオロメチル）ピリジン（８５．４ｍｇ、０．３５９ｍｍｏｌ）、５−フルオロ−１−（（２−（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−アミン（９２ｍｇ、０．３２６ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（２２５ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）の混合物に加えた（１ｍＬジオキサンを補助とする）。この反応混合物を加熱し、８０分間還流下で攪拌した。ＥｔＯＡｃを加え、固体を濾去し、濾液を濃縮した。
【０２０６】
カラムクロマトグラフィー（１／２石油エーテル／ＥｔＯＡｃ）により精製して残渣を得、これをＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解させ、ＨＣｌ水溶液（２Ｍ、８ｍＬ）で処理した。１００℃で９０分後、この混合物を濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃと飽和ＮａＨＣＯ３水溶液とで分液した。有機層を分離し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。残渣をＦｒａｃｔｉｏｎｌｙｎｘ質量指示分取ＨＰＬＣ（水性ＴＦＡ／ＭｅＣＮ混合物による）により精製し、これらの画分を重炭酸Ｓｔｒａｔｏｓｐｈｅｒｅカートリッジに通した。濃縮し、アミノピリジン（１５ｍｇ、１１％）を白色固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO): 7.36 (1H, s), 7.48-7.51 (2H, m), 7.60-7.64 (2H, m), 8.31 (1H, s), 8.43 (1H, d), 8.56 (1H, s), 10.61 (1H, s), 13.17 (1H, s)。
【０２０７】
実施例６：物理データ
これらの化合物を本明細書に記載の、ならびに当技術分野で公知の方法により合成した。化合物Ｉ−１〜Ｉ−５５の物理データを表２に示す。
表２
【０２０８】
【表６】
2011513483.tif 000043
【０２０９】
【表７】
2011513483.tif 000044
【０２１０】
【表８】
2011513483.tif 000045
【０２１１】
【表９】
2011513483.tif 000046
【０２１２】
【表１０】
2011513483.tif 000047
【０２１３】
【表１１】
2011513483.tif 000048
【０２１４】
実施例７：ＧＳＫ−３阻害アッセイ
本発明の化合物を、標準的な結合酵素系を用い、それらのＧＳＫ−３（ＡＡ  １−４２０）活性阻害能に関してスクリーニングした(Fox et al., Protein Sci. 1998, 7, 2249)。１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、３００μＭ  ＮＡＤＨ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１．５％ＤＭＳＯを含有する溶液で反応を行った。アッセイにおける最終基質濃度は２０μＭ  ＡＴＰ(Sigma Chemicals, St Louis, MO)および３００μＭペプチド(American Peptide, Sunnyvale, CA)であった。反応を３０℃、２０ｎＭ  ＧＳＫ−３βで行った。この結合酵素系の成分の終濃度は２．５ｍＭピルビン酸ホスホエノール、３００μＭ  ＮＡＤＨ、３０μｇ／ｍｌピルビン酸キナーゼおよび１０μｇ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼであった。
【０２１５】
ＡＴＰと本発明の試験化合物を除いた上記の全ての試薬を含有するアッセイ保存バッファー溶液を作製した。このアッセイ保存バッファー溶液（１７５μｌ）を９６ウェルプレートにて、０．００２μＭ〜３０μＭにわたる終濃度の本発明の試験化合物５μｌとともに、３０℃で１０分間インキュベートした。一般に、ドータープレートにて、本発明の試験化合物のＤＭＳＯによる連続希釈液（１０ｍＭ化合物原液から）を作製することにより１２点滴定を行った。２０μｌのＡＴＰ（終濃度２０μＭ）を加えることにより反応を開始させた。反応速度は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー(Sunnyvale, CA)を用い、３０℃、１０分間で得た。Ｋｉ値は阻害濃度の関数として生データから求めた。本明細書に記載の化合物はＧＳＫ−３を阻害することが分かった。
【０２１６】
実施例８：ＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲ阻害アッセイ
化合物を、これらの化合物を投与したＪｕｒｋａｔ細胞のウエスタンブロッティングを用いて、チロシン（ＴＹＲ）残基のリン酸化を阻害するそれらの能力に関してスクリーニングする。試験した特定のＴＹＲ残基のリン酸化はＧＳＫ３α  ＴＹＲ  ２７９およびＧＳＫ３β  ＴＹＲ  ２１６である。
【０２１７】
細胞および細胞溶解液の調製
Ｊｕｒｋａｔ細胞を１２ウェルディッシュの飢餓培地（ＲＰＭＩ＋１％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ）中に２×１０５細胞／ウェルの密度で播種する。１６時間飢餓状態にした後、各ウェルに化合物を最終ＤＭＳＯ濃度０．３％で投与し、細胞を３７℃  ５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。翌日、細胞を１５００ｒｐｍで回転沈降させ、ＰＢＳで洗浄し、β−メルカプトエタノールを含む１００μＬ  Ｌａｅｍｌｉサンプルバッファーに溶解させた。
【０２１８】
ウエスタンブロットプロトコール
１５マイクロリットル（μＬ）の細胞溶解液を１０％トリス−グリシンゲルにのせ、１２０Ｖで２時間または色素前線がゲルを流れきるまで泳動させる。次に、タンパク質を１００Ｖで６０分、ＰＶＤＦ膜に転写する。その後、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ、例えば、ＰＢＳ  １Ｌ当たりＴｗｅｅｎ  １ｍｌ）を作製し、全ての洗浄と抗体のインキュベーションに用いる。このブロットを５％脱脂乳ＰＢＳＴ中で１時間ブロッキングする。
【０２１９】
次に、一次抗体（ＧＳＫ−３α／β  ｐＴＹＲ  ２７９／２１６  １：１０００希釈  Ｕｐｓｔａｔｅカタログ番号０５−４１３）を５％脱脂乳ＰＢＳＴに加え、４℃で一晩穏やかに振盪する。その後、このブロットをＰＢＳＴで５分間洗浄する。そして、これを４回繰り返す。二次抗マウス−ＨＲＰコンジュゲート抗体（１：５０００希釈）を５％乳ＰＢＳＴに６０分加える。次に、このブロットをＰＢＳＴで５分間洗浄する。これをまた４回繰り返す。３．０ｍＬの現像溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ製のＥＣＬ  ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム  カタログ番号ＲＰＮ２１３２）を作製して加える。この溶液を〜３０秒間ブロット上で攪拌する。次に、このブロットを、ＣＬ−ＸｐｏｓｕｒｅクリアブルーＸ線フィルムを用いて現像する。ＧＡＰＤＨ発現レベルをローディング対照として１：１００００希釈で用いる（ＧＡＰＤＨ抗体：santa cruz 25-778）。
【０２２０】
ＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３β  ｐＴＹＲ  ＩＣ５０の決定のため、特定の化合物濃度で各タンパク質の個々のバンドの濃度を、露光ごとに存在する化合物ＤＭＳＯで処置しない対照細胞サンプルと比較する。ＩＣ５０の数値は、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ−３βバンドの濃度が化合物を含まない対照の５０％である化合物濃度として定義する。
【０２２１】
実施例９：β−カテニン安定化プロトコール
β−カテニンのＧＳＫ−３リン酸化は、分解のためにそれをプロテオソームへ向ける。ＧＳＫ−３の阻害は細胞のサイトゾルにおけるβ−カテニンの蓄積をもたらし、これは転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦとの相互作用によって核へ転流し、Ｗｎｔ依存性遺伝子の転写を駆動する。このアッセイは、化合物を投与したＪｕｒｋａｔ細胞においてβ−ラクタマーゼリポーターアッセイを用い、β−カテニン依存性ＴＣＦ／ＬＥＦの転写活性のレベルを定量的に決定するよう設計されている。
【０２２２】
Ｊｕｒｋａｔ  β−カテニン細胞は、フラスコのアッセイ培地（１％ＦＢＳ、１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ、ＲＰＭＩ）中で一晩飢餓状態にする。翌日、Ｊｕｒｋａｔ  β−カテニン細胞を９６ウェル平底プレートにて、１００μＬ量のアッセイ培地中、５０，０００細胞／ウェルの密度で播種する。このウェルに化合物を最終ＤＭＳＯ濃度０．７５％で加え、３７℃で一晩インキュベートする。翌日、２０μＬの６×ＣＣＦ４色素をウェルに加え、室温で１〜２時間インキュベートする。プレートをＣｙｔｏｆｌｕｏｒ  ４０００系マルチウェルプレートリーダーで読み取り、４６０／５３０比を測定する。β−カテニンの誘導に対するＧＳＫ−３  ＩＣ５０を、化合物濃度（Ｌｏｇスケール）に対して４６０／５３０比をプロットし、傾きの方程式を用いて、その比が最大効果の５０％になる点を算出することにより決定する。
【０２２３】
実施例１０：β−カテニン：ＧＳＫ−３ウインドウ結果
β−カテニン：ＧＳＫ−３ウインドウは、実施例９で得られたβ−カテニン  ＩＣ５０値を実施例８で得られたＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲ  ＩＣ５０値で割ることにより算出した。
【０２２４】
次の化合物は３５〜５００倍の間のβ−カテニン：ＧＳＫ−３αウインドウを有することが分かった：Ｉ−４、Ｉ−１５、Ｉ−１９〜Ｉ−２２、Ｉ−３４〜Ｉ−３６、Ｉ−４０、およびＩ−５１〜Ｉ−５４。次の化合物は５００〜１０００倍の間のβ−カテニン：ＧＳＫ−３αウインドウを有することが分かった：Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−６、Ｉ−１２、Ｉ−２７、Ｉ−２８、Ｉ−３１、Ｉ−３２、Ｉ−３７〜Ｉ−３９、Ｉ−４４、Ｉ−４６〜Ｉ−４９およびＩ−５５。次の化合物は１０００〜２０００の間のβ−カテニン：ＧＳＫ−３αウインドウを有することが分かった：Ｉ−１３、Ｉ−１７、Ｉ−１８、Ｉ−４２およびＩ−４３。次の化合物は２０００〜６０００の間のβ−カテニン：ＧＳＫ−３αウインドウを有することが分かった：Ｉ−１、Ｉ−５、Ｉ−１６、Ｉ−２９、Ｉ−３３、Ｉ−４１、Ｉ−４５およびＩ−５０。
【０２２５】
次の化合物は４〜２５倍の間のβ−カテニン：ＧＳＫ−３βウインドウを有することが分かった：Ｉ−１９、Ｉ−２０、Ｉ−２２、Ｉ−２９、Ｉ−３４およびＩ−４５。次の化合物は２５〜４９倍の間のβ−カテニン：ＧＳＫ−３βウインドウを有することが分かった：Ｉ−１８、Ｉ−２８、Ｉ−３１、Ｉ−３５、Ｉ−３６、Ｉ−４０、Ｉ−４４、Ｉ−４６、Ｉ−４９、Ｉ−５１、Ｉ−５３およびＩ−５４。次の化合物は５０〜１００倍の間のβ−カテニン：ＧＳＫ−３βウインドウを有することが分かった：Ｉ−２〜Ｉ−４、Ｉ−６、Ｉ−１５、Ｉ−１７、Ｉ−２７、Ｉ−３２、Ｉ−３７〜Ｉ−３９、Ｉ−４１、Ｉ−４７、Ｉ−４８、Ｉ−５０およびＩ−５２。次の化合物は１００〜４００倍の間のβ−カテニン：ＧＳＫ−３βウインドウを有することが分かった：Ｉ−１、Ｉ−５、Ｉ−１６、Ｉ−２１、Ｉ−３３、Ｉ−４２、Ｉ−４３およびＩ−５５。
【０２２６】
実施例１１：ＣＲＭＰ２リン酸化アッセイ
ＧＳＫ−３のリン酸化は軸索の成長と分枝の制御に関与するＣＲＭＰ２を調節する(Yoshimura et al. 2005 Cell, Kim et al. 2006 Neuron)。ＧＳＫ−３によるＣＲＭＰ２のリン酸化はＣＲＭＰ２の微小管への結合を減らし、それにより、軸索の伸長と分枝を軽減する。逆に、特にＴＹＲ残基の自己リン酸化に選択的に影響を及ぼすレベルでのＧＳＫ−３の阻害はこれらの表現型を増強する。化合物はＥ１６ラット海馬または皮質ニューロンにおいて、軸索分枝のレベルを増強する能力を判定する試験を行う。
【０２２７】
１日目
細胞プレートの調製
１ｍｇ／ｍｌのＰＤＬ保存液をＤＩ水中、１００μｇ／ｍＬに希釈する。解剖を行う前に３７℃で少なくとも１時間カバーガラスをコーティングする。ＰＤＬを吸引し、プレートをＰＢＳですすぎ、フード内で風乾する。
【０２２８】
Ｅ−１６ラット皮質細胞の解離
皮質または海馬葉を９ｍＬの基本培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）と合わせ、氷上に置く。１ｍＬの１０×トリプシン溶液を加え、この混合物を穏やかに攪拌する。次に、組織を３７℃の水浴中で２０分間インキュベートすることにより消化する。２０分後、１０μＬ／ｍＬのＤＮアーゼ（１００μＬ  ＤＮアーゼ）を加え、この混合物をさらに５分間インキュベートする。
【０２２９】
細胞を１０００ｒｐｍで１分間回転させる。次に、底に沈んだ脳断片を取り出すことなく酵素溶液を除去する。この固体を洗浄培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１０％およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で３回洗浄する。３回目の洗浄後、細胞を５ｍＬの培養培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｂ２７、Ｌ−グルタミンおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に再懸濁させる。炎で細くしたガラスピペットで、気泡ができないように注意して数回静かに吸い出すことにより、機械的解離を行う。次に、細胞を７０μｍ細胞濾過器で濾過する。細胞を血球計で計数し、１２ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルで播種する。これらの細胞を３７℃で一晩インキュベートする。
【０２３０】
２日目
細胞の維持
翌日、培地の半分を、レチノイン酸（ＲＡ）を含有する新鮮な培養培地と交換する。化合物を、最終ＤＭＳＯ濃度０．３％で所望の濃度になるように加える。３日ごとにこの培地の半分を交換し、新鮮な化合物を加える。細胞を６日間化合物とともに培養インキュベートする。
【０２３１】
７日目
溶解液の回収およびウエスタンブロット
培養物をＰＢＳで洗浄し、β−メルカプトエタノールを加えた１００μＬのＬａｅｍｌｉサンプルバッファー中で直接溶解させる。
【０２３２】
ウエスタンブロットプロトコール
７マイクロリットル（μＬ）の細胞溶解液を１０％トリス−グリシンゲルにのせ、１２０Ｖで２時間または色素前線がゲルを流れきるまで泳動させる。次に、タンパク質を１００Ｖで６０分、ＰＶＤＦ膜に転写する。その後、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ、例えば、ＰＢＳ  １Ｌ当たりＴｗｅｅｎ  １ｍｌ）を作製し、全ての洗浄と抗体のインキュベーションに用いる。このブロットを５％脱脂乳ＰＢＳＴ中で１時間ブロッキングする。
【０２３３】
次に、一次抗体（１：１０，０００  ＣＲＭＰ２ウサギポリクローナル  Ａｂｃａｍ  ＃ａｂ３６２０１）を５％脱脂乳ＰＢＳＴに加え、４℃で一晩穏やかに振盪する。その後、このブロットをＰＢＳＴで５分間洗浄する。そして、これを４回繰り返す。二次抗マウス−ＨＲＰコンジュゲート抗体（１：５０００希釈）を５％乳ＰＢＳＴに６０分加える。次に、このブロットをＰＢＳＴで５分間洗浄する。これをまた４回繰り返す。
【０２３４】
３．０ｍＬの現像溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ製のＥＣＬ  ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム  カタログ番号ＲＰＮ２１３２）を作製して加える。この溶液を〜３０秒間ブロット上で攪拌する。次に、このブロットを、ＣＬ−ＸｐｏｓｕｒｅクリアブルーＸ線フィルムを用いて現像する。ＧＡＰＤＨ発現レベルをローディング対照として１：１００００希釈で用いる（ＧＡＰＤＨ抗体：santa cruz 25-778）。ＣＲＭＰ２抗体は非リン酸化型のＣＲＭＰ２とリン酸化型のＣＲＭＰ２（Ｔ５１４）（ＧＳＫ−３によりリン酸化された残基）の双方を検出する(Kim et al. 2006 Neuron)。ｐＣＲＭＰ２に対する化合物のＩＣ５０は、スーパーシフトｐＣＲＭＰ２バンドの濃度が化合物を含まない対照の５０％となる化合物濃度として定義する。
【０２３５】
結果
化合物Ｉ−３７で７日間処理したＥ１６海馬ニューロンにおいて、基質ＣＲＭＰ−２のＧＳＫ−３リン酸化の阻害は、ＧＳＫ−３  ｐＴＹＲの阻害と相関していた。ＣＲＭＰ−２は成長中の軸索に豊富であり、非リン酸化ＣＲＭＰ−２は微小管に結合し、軸索の分枝を促進する。
【０２３６】
実施例１２：ＨＵＶＥＣおよび皮膚繊維芽細胞を用いた脈管形成のin vitroモデル
神経可塑性に加え、新しい血管の形成である脈管形成も、脳卒中などの脳損傷からの帰納的回復に関与している可能性がある。ＧＳＫ−３の役割は、成熟の段階に応じて内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の増殖と分化の双方の駆動に関連づけられている。
【０２３７】
化合物をヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における脈管形成増強能に関してスクリーニングする。この方法はNakatsu et al., Microvas. Res. 2003から適合させ、新しい血管の成長に不可欠な主要事象：出芽、細胞移動、細胞増殖、管腔形成、分枝および融着を反復するプロトコールを表す。
【０２３８】
プロトコール：
ＨＵＶＥＣはＰ３とＰ４の間で用いる。１ｍｌのＥＧＭ−２（２％ＦＢＳ）培地(Clonetics)中、１ビーズ当たり４００個のＨＵＶＥＣの密度で、ＨＵＶＥＣをデキストランコーティングｃｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリア(Amersham Pharmacia)と混合する。次に、細胞を含むビーズを３７℃、５％ＣＯ２で４時間、２０分ごとに穏やかに振盪する。インキュベーション後、細胞を含むビーズをＴ−２５組織培養フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ２下、５ｍｌのＥＧＭ−２中で１２〜１６時間放置する。
【０２３９】
翌日、細胞を含むビーズをＥＧＭ−２で３回洗浄し、０．１５Ｕ／ｍｌのアプロチニン(Sigma)を含む２．５ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン(Sigma)、ｐＨ７．４中、細胞コーティングビーズ２００個／ｍｌの濃度で再懸濁させる。
【０２４０】
次に、５００μＬのフィブリノゲン／ビーズ溶液を、２４ウェル組織培養プレートの一ウェル中の０．６２５Ｕのトロンビン(Sigma)に加える。フィブリノゲン／ビーズ溶液を室温で５分間、次いで、３７℃、５％ＣＯ２で２０分間凝固させる。その後、０．１５Ｕ／ｍＬのアプロチニンを含む１ｍＬのＥＧＭ−２を各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間、フィブリンクロットで平衡化する。
【０２４１】
次に、このウェルから培地を除去し、１ｍＬの新鮮培地に置き換える。２０，０００個の皮膚繊維芽細胞（ＳＦ  ＡＴＣＣ  Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５５１）をこのクロットの上にプレーティングし、１日おきに培地を交換する。
【０２４２】
化合物阻害試験では、化合物を平衡化後のクロットに加え、６点用量応答試験を行う（上限濃度１μＭ  １：３希釈）。
【０２４３】
脈管形成を、倒立顕微鏡で取り込んだ１０倍および２０倍の画像を、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエアを用いてビーズ当たりの血管長、血管数および分枝数に関して定量することによりスコアリングする。所望により、アッセイ前に、ＨＵＶＥＣを、構成的に活性な最小ＴＫプロモーターの制御下で黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を発現するレトロウイルスベクターで回転形質導入し(spin transduced)、ＹＦＰ発現に関して選別し、可視化を促すこともできる。次に、ＹＦＰ陽性ＨＵＶＥＣを上記のように培養し、血管形成の定量は、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエアを用い、閾値蛍光下面積を算出することにより行う。同じ時点で化合物処理培養物とＤＭＳＯ対照培養物を比較することにより、両場合とも、脈管形成の増強が判定される。
【０２４４】
ＨＵＶＥＣ培養物を化合物Ｉ−３７（１０ｎＭ）で７日間処理すると、血管および血管網の形成が高まる。ＨＵＶＥＣ培養物を、β−カテニンを誘導することが示されている濃度で処置すると、血管形成が阻害され、さらにＧＳＫ−３α／β  ｐＴＹＲとβ−カテニンの間のウインドウの治療的役割を裏付ける細胞増殖の増強が見られた。
【０２４５】
実施例１３：白血球減少症動物モデル
定義：
ＡＮＣ：  好中球数
ＲＢＣ：  赤血球数
ＷＢＣ：  白血球数
５−ＦＵ：  ５−フルオロウラシル
ｒｈＧ−ＣＳＦ：  組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子
【０２４６】
この試験では、５−ＦＵ（骨髄破壊薬）で処理した後の末梢血および骨髄細胞の造血回復を評価し、種々の用量の試験化合物と回復を促進することが知られているサイトカインｒｈＧ−ＣＳＦの回復を比較する。化学療法薬の導入は、末梢血白血球数、特に、好中球数に低下をもたらす。さらに、大腿細胞数により評価される骨髄の細胞充実度に顕著な低下が見られる。５−ＦＵは全ての分裂細胞を死滅させ、比較的休止している始原幹細胞を助け、従って、処置により影響を受けないことで働く。処置の後、始原細胞は増殖および分化、従って通常の末梢血および大腿細胞数に動員される。このモデルは、始原細胞の動員および増殖を促進可能な化合物を評価するため、および血液中の骨髄ならびに成熟細胞集団（白血球、赤血球および血小板）の回復速度を評価するために使用可能である。
【０２４７】
動物および処置群：
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス１０５匹をJackson Labsから購入した。４匹の非処置対照マウス以外は全て、０日目に１５０ｍｇ／ｋｇ  ５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の腹腔内（ｉｐ）で処置した。４匹の非処置マウス（第１群）は１２日目に屠殺したが、それらは「血液および細胞数における通常の変動」を表す。５−ＦＵ処置マウスを４つの異なる群（第２群、３群、４群および５群）に均等に分けた。１日目（５−ＦＵ処置の前日）から１２日目に、第２群のマウスを午前８時と午後６時に溶媒のみ（２０％ＰＥＧ  ４００／１０％ビタミンＥ  ＴＰＧＳ／７０％水）で処置し、第４群およ５群の溶媒対照とした。
【０２４８】
この群からの４匹のマウスを、屠殺する前の朝に最後の溶媒投与を行った後、４日目、６日目、８日目、１０日目および１２日目に屠殺した。１日目から４日目に、第３群のマウスに６時間あけて一日用量５０μｇ／ｋｇ  ｒｈＧ−ＣＳＦを投与した。この群からの４匹のマウスもまた４日目、６日目、８日目、１０日目および１２日目に屠殺した。試験化合物の処置の第４群および５群では、毎日新しく調製した化合物を含む溶媒対照で上記に示されたように投与を行った（１日２回、午前８時と午後６時）。
【０２４９】
化合物Ｉ−３を１３本のバイアルに秤量し、３０ｍｇ／Ｋｇ（高用量）で投与するための終濃度になるように適当量の溶媒を加えた。この化合物を溶媒中で２〜３分間音波処理することにより可溶化した後、３０％量を除去し、溶媒で１：３希釈し、１０ｍｇ／Ｋｇ（低用量）で投与するための化合物を調製した。これを毎日行い、夕方と翌朝の投与のための午後１時に動物技術者に送った。使用しなかった化合物は戻し、翌朝、次の投与のためのサンプルを新しく調製する際に回した。１日目から１２日目に、第４群のマウスには低用量の化合物（１０μｇ／Ｋｇ）を、第５群のマウスには高用量の化合物（３０ｍｇ／Ｋｇ）を１日２回施した。４日目、６日目、８日目、１０日目および１２日目に各群４匹のマウスを屠殺した。
【０２５０】
サンプルおよび分析：
各時点でいずれの群からもマウスを屠殺し、心臓穿刺によりＥＤＴＡマイクロテイナーチューブに末梢血を採取した。およそ４００μＬの血液を、自動システムを用い、中央獣医学研究所での血液指標（ＷＢＣ、ＡＮＣ、血小板、ヘモグロビンおよびヘマトクリット）の分析に送った。残りの血液はＳＴＩに送り、８０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間の遠心分離により血漿を分離し、さらなるバイオアッセイのために−８０℃で保存した。両大腿も採取し、細胞を抽出し、処理した。大腿細胞を計数し、赤血球を溶解した後、細胞を調製し（５×１０６細胞／Ｌａｅｍｍｌｉバッファー１００μＬおよび等価な非処理細胞ペレット）、以降のタンパク質分析のために−８０℃で保存した。また、１２日目に動物を屠殺した際、肝臓を摘出し、さらなる分析のために１０％中性ホルマリン中で保存した。マウスは全て、処置の後、カナダ動物管理協会の指針に従って屠殺した。
【０２５１】
実施した試験：
骨髄有核細胞の計数
有核細胞の計数は、Ｎｅｕｂａｕｅｒカウンティングチャンバーを用いて、３％酢酸中で行った。これらの数から、大腿当たりの総有核骨髄細胞を算出した。
【０２５２】
ＣＦＣ数の統計分析：
マウス群間のＷＢＣ、ＡＮＣ、ＲＢＣ、血小板数、ヘモグロビンおよび大腿当たりの大腿細胞含量に対して統計分析を行った。動物群を比較した場合にｐ値＜０．０５を有意とみなした。特定集団の最下点と細胞回復速度を評価し、処置群間で比較した。
【０２５３】
結果：
末梢血分析：
第１群の全マウス（非処置マウス）は、高いリンパ球のためにＷＢＣが若干高かったこと以外は、獣医学診療所により定義されている正常参照範囲に沿った末梢血指標および骨髄大腿数を持っていた。
【０２５４】
白血球数
全ての処置群；５−ＦＵ＋溶媒、５−ＦＵ＋ｒｈＧ−ＣＳＦ、５−ＦＵ＋化合物Ｉ−３（１０ｍｇ／Ｋｇ）および５−ＦＵ＋化合物Ｉ−３（３０ｍｇ／Ｋｇ）で、ＷＢＣ最下点（見られた最低細胞数）は処置群間で同等であり、４日目に見られた。
【０２５５】
好中球数
好中球数（ＡＮＣ）は、４日目に、また５−ＦＵ＋ｒｈＧ−ＣＳＦ受容マウスでは６日目にほぼ検出できないレベルにまで、経時的に有意に低下した。しかしながら、これらのマウスの最下点は、５−ＦＵ＋溶媒（８日目）または５−ＦＵおよび試験化合物（６日目）のいずれかを受容した群よりも早く（４日目）、このことは溶媒受容マウスにおける保護効果の可能性を示唆する。
【０２５６】
５−ＦＵ＋試験化合物Ｉ−３（高用量）受容マウスではＷＢＣおよびＡＮＣ回復速度が高まり、８日目および１０日目の５−ＦＵおよび溶媒対照受容動物と比較して有意に高く、５−ＦＵおよびｒｈＧ−ＣＳＦ受容動物に匹敵した。
【０２５７】
血小板数
血小板数の減少はそれほどでもなく、８日目の、５−ＦＵ＋ｒｈＧ−ＣＳＦまたは５ＦＵ＋化合物Ｉ−３（高用量）のいずれかを受容した群では全て参照範囲を上回った。
【０２５８】
ヘモグロビンおよびヘマトクリットレベル
ヘモグロビンおよびヘマトクリットレベルは全ての５−ＦＵ受容動物で低下したが、群間でレベルに差はなかった。
【０２５９】
骨髄細胞充実度
骨髄細胞充実度は、５−ＦＵに応答して、全ての処置群で有意に低下し、高用量の試験化合物で処置したマウスの１０日目では他の全ての群の１２日目に比べ、正常値に回復していた。従って、骨髄細胞回復の速度は第５群のマウスが最も速く、次いで第３群、次いで第４群であった。５−ＦＵおよび高用量試験化合物、化合物Ｉ−３を受容したマウスは最下点が他の群ほど低くなく、８日目の５−ＦＵおよびｒｈＧ−ＣＳＦ受容マウスよりも骨髄細胞数が有意に高かった。
【０２６０】
白血球減少症のバイオマーカー
５−ＦＵ処置を受けたマウスにおいて化合物（Ｉ−３）の活性を追跡するため、屠殺時に化合物処置およびビヒクル処置の両マウスから末梢血を取り出し、赤血球を除去した後に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からタンパク質溶解液を得た。溶解液をウエスタンブロットにより分析し、ＧＳＫ−３  α／β  ｐＴＹＲレベルに関してプロービングした。化合物Ｉ−３は、β−カテニンが誘導されていないビヒクル処置動物に比べ、ＰＢＭＣにおいて全ての用量でｐＴＹＲシグナルの有意な減少を示した。
【０２６１】
実施例１４：脳卒中後回復モデルＩ
この試験では、ラットにおいて、中大脳動脈（ＭＣＡＯ）の塞栓性閉塞後の脳梗塞の体積、細胞増殖および機能回復に対する化合物の効果を調べる。
【０２６２】
ＭＣＡＯ(Zhang RL, et. al., 1997 # 1)を受けたラットをＭＣＡＯ後にビヒクルまたは化合物Ｉ−３のいずれかに無作為に割り付けた。ＭＣＡＯ２４時間後から開始して１４日間、処置を経口で１日１回行った。ＭＣＡＯ１日後と連続して６日間、５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ，Sigma；１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与した。機能評価をＭＣＡＯ前とＭＣＡＯ１日後、７日後および１４日後に、盲検試験者により行った。評価には、下記のような神経学的重篤度スコア（ｍＮＳＳ）および粘着除去試験(Adhesive removal test)スコアを含んだ。全部で１２匹のラットＭＣＡＯ１４日後に屠殺した。各群３つの反側半球を分析に割り付けた。同側脳室下領域（ＳＶＺ）の梗塞体積および細胞増殖を測定する。
【０２６３】
粘着除去試験
粘着除去試験(Schallert T, et. al., 1984 # 3)により、ラットの左前肢の体性感覚の欠如を試験する。各動物に包装用テープの切れ端を丸めたもの（直径１．２ｃｍ）を各試験日に置くことで３回試験を行い、左前肢から刺激を取り除くのに必要な平均時間（秒）を記録した。
【０２６４】
梗塞／虚血病巣体積：
全ての動物をケタミン（４４ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）およびキシラジン（１３ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）で麻酔し、ＭＣＡ閉塞１４日後に屠殺する。各ラットをヘパリン生理食塩水で心臓潅流する。頭蓋から脳を取り出し、各２ｍｍ厚の７つの冠状ブロックに切る。脳組織を処理し、包埋し、各ブロックから６μｍ厚のパラフィン切片を取り、ヘマトキシリンとエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色して虚血細胞の損傷を評価する。梗塞体積はＧｌｏｂａｌ  Ｌａｂ画像解析プログラム(Data Translation)を用いて測定する。両半球の面積および虚血ニューロン損傷を含む面積（ｍｍ２）は、コンピュータースクリーンで面積をトレーシングすることにより算出する。病巣体積（ｍｍ3）は、適当な面積に切片間の厚さを掛けることにより求める(Chen H, et al., 1992, # 4)。虚血体積は、対側半球の梗塞体積のパーセンテージとして表す（間接的体積算出）(Swanson RA, et al., 1990 #5)。
【０２６５】
ＳＶＺにおける細胞増殖：
免疫組織化学的反応の特異性を可視化するため、ＢｒｄＵの免疫染色（ＢｒｄＵに対するモノクローナル抗体、１：１００、ＤＡＫ）を用いる。ＭＣＩＤ画像解析システム(Imaging Research)をインターフェースとする３−ＣＣＤカラービデオカメラ（ＤＸＣ−９７０  ＭＤ；ソニー、東京、日本）を用い、ＳＶＺ面積を２０倍対物（ＢＸ２０  Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ）でデジタル化する(Chen J, et al., 2005, #6)。可視性を高めるためにコンピューターモニターでＳＶＺのＢｒｄＵ免疫反応核を計数する。ＢｒｄＵデータをＳＶＺ平方ミリメートル当たりの細胞数（平均±ＳＥ）として表す。
統計分析
データは、スチューデントのｔ検定を棄却限界値０．０５で用いて評価する。
結果
機能回復：
化合物Ｉ−３による処置が脳卒中後の機能的転帰を改善するかどうかを調べるため、一連の機能試験を行う。これらの機能試験からの結果は、化合物Ｉ−３で処理したラットがｍＮＳＳ試験および粘着除去試験でビヒクル群に比べて有意な（ｐ＜０．０５）改善を示したことを示唆した。
【０２６６】
病巣体積：
処置群とビヒクル群の間に虚血損傷の体積の有意な減少は無かった。
【０２６７】
ＳＶＺにおける細胞増殖：
化合物Ｉ−１による処置が同側ＳＶＺにおいて細胞増殖を促進するかどうかを調べるため、ＢｒｄＵ免疫染色を行う。化合物Ｉ−３による処置は、同側ＳＶＺにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の数をビヒクルに比べて有意に（ｐ＜０．０５）増加させた。
【０２６８】
ｐＴＹＲバイオマーカー分析
ＭＣＡＯを受けたラットのＣＮＳにおいて化合物Ｉ−３の活性を追跡するため、試験の終了時に、ビヒクル処置動物と化合物処置動物の双方から脳を取り出し、上記のようにタンパク質溶解液を得た。溶解液をウエスタンブロットにより分析し、ＧＳＫ−３  α／β  ｐＴＹＲレベルに関してプロービングした。化合物Ｉ−３は、β−カテニンが誘導されていないビヒクル処置動物に比べ、脳において全ての用量でｐＴＹＲシグナルの有意な減少を示した。
【０２６９】
結論：
データは、ラットにおいて、化合物Ｉ−３による処置が、ＧＳＫ−３α／β  ｐＴＹＲを選択的に阻害する用量で、脳卒中後に機能回復を改善し、同側ＳＶＺにおいて細胞増殖を促進することを実証する。
【０２７０】
実施例１５：脳卒中後回復モデルＩＩ
一般法
成体雄ウィスターラットを、トレーリーチ(tray reach)、グリッドウォーク(gridwalk)、前肢不対性(forelimb asymmetry)（シリンダー突っ張り(cylinder bracing)）、前肢制止（水泳試験）を含む一連の挙動試験で予め訓練する（試験の詳細な説明は下記を参照）。脳卒中前挙動評価の後、ラットに外科術を施し、その間に脳卒中が誘発される。ラットは、各処置群に同数の右および左脳卒中が含まれるように５つの均等な群（ｎ＝１２）に疑似ランダム的に分ける。第１群には処置としてビヒクルを用いた疑似手術を施す。試験化合物およびビヒクルの投与（用量、経路、タイミング）はスポンサーにより決定される。深部体温は３７℃（＋／−１℃）に維持する。
【０２７１】
外科術後、脳卒中１日後、７日後および１４日後に全ての動物に挙動評価を行う。挙動評価の結果で、全てのラットにＭＲＩを行って梗塞体積を決定する。群の挙動性および脳卒中体積を、一元配置分散分析を用いて群間で比較し、ラットにおける化合物の治療利益およびＭＣＡＯ脳卒中後の機能回復の程度を決定する。
【０２７２】
中脳動脈閉塞
各動物の体重を測定し（平均体重は３４０ｇであった）、その後、イソフランで麻酔する（４％イソフランを２ｌ／分の医学級酸素で運んでサージカルプランを誘導した後、２ｌ／分酸素を伴う２％でサージカルプランを維持）。麻酔の誘導後、各ラットを耳パンチで個々に標識し、皮下用量のブプレノルフィン（０．０２５ｍｇ／ｋｇ）を投与する。外科術の間とラットが覚醒して動くまで（およそ３時間）、直腸温度をモニタリングし、３７℃＋／−１℃に維持する
【０２７３】
次に、ラットを定位固定装置に入れ、頭の側面が正面を向くように設置する。左目と耳の間を剃毛し、手術用無菌スクラブで洗浄する。右眼窩と外耳道の正中を垂直に切開する。下層にある側頭筋を切開し、頭蓋から剥がし、顔面神経を傷つけないように注意しながら収縮させる。２本の縫合糸で側頭筋を頭蓋の側面から離して保つ。後方頬骨から腹側へ延びる頭蓋の側頭隆起に沿って開頭術を行い、中大脳動脈（ＭＣＡ）および嗅索を露出させる。硬膜を開き、ＭＣＡの基部と最初の分枝の前側部を嗅索より腹部側で電気凝固させて右側背大脳皮質の梗塞を起こす。
【０２７４】
ＭＣＡの電気凝固の完了時に脳卒中が起こった時間を記録する。出血が管理されれば、側頭筋を元の位置に戻し、皮膚を縫合する。その後、ラットを定位固定装置から出し、
回復室に移動させる。もう一度、皮下用量のブプレノルフィン（０．０２５ｍｇ／ｋｇ）を２ｃｃのリンゲル溶液とともに投与する。回復室では、水、ウェット・ラット・チャウ・マッシュ(wet rat chow mash)を与え、ケージの半分に防寒毛布を敷く。ラットが覚醒し、飲み食いが見られたら、そのケージの動物集団に戻す。
【０２７５】
挙動試験の方法
トレー・リーティング(Tray Reaching)
Whishaw, O'Connor, and Dunnett (1986)が提案している方法から適合させた手順を用いて前肢の使用を評価する。各動物に、毎日試験後に餌の時間をとるように食餌制限する。動物を端と端を９ｍｍ離して２ｍｍのバーを構成した床と面を有する試験ケージ（１０×１８×１０ｃｍ高）に入れる。ニワトリフィードペレットの入った幅４ｃｍ、深さ５ｃｍのトレーを各ボックスの外側に取り付ける。ラットはバーのギャップに前肢を伸ばし、餌をつかみ、取り出す(retract)必要がある。
【０２７６】
動物を１日２０〜３０分、最低１０日間、または５０％ヒットの基準に達するまで訓練する（注：これは両肢を合わせて５０％である）。ほとんどのラットはリーチのためにもっぱら利き足を用いる傾向にある。ラットが訓練１４日以内に５９％ヒットの基準に達しなければ、そのラットは試験から除外する。さらに、両利きであると思われるラットも試験から除外する。両利きのラットはリーチにどちらかの足を用いるか、またはどちらの足でも同等の成功率で同等の到達を見せることが多い。
【０２７７】
「ヒット」は、フードペレットをつかんで取り出すことの成功と定義し、これによりペレットの消費が起こる。「ミス」は、フードペレットの取り出しの不成功（ペレットを適切につかむことができないか、または取り出す間にペレットを落としてしまい、ペレットが消費されないこと）と定義される。ヒットのパーセンテージは、セッション中の全ヒット数を全リーチ数で割ったものとして算出される。これを左足および右足（すなわち、脳卒中後に影響を受けた方と受けていない方）に関してそれぞれ算出する。５０％成功（両足のリーチを含む）の基準に達すると、５分間のリーチセッション中のビデオテープに撮る。
【０２７８】
このセッションの結果は外科術前のベースラインとして働く。この外科術前試験セッションはまた、各ラットの利き腕を判定するためにも用いられる。脳卒中損傷は、リーチに用いる利き腕と反対側の脳半球内に起こす。外科術後試験は、動物が試験される毎週の５分のリーチ試験からなる。
【０２７９】
各セッションは、モニターで各リーチのコマ送り解析を用いて観察する。各セッションは２人の異なるスコアラーによりスコアリングする。各スコアラーの最終的なヒット％の計算は互いに５％の範囲内である。最終のスコア間にそれより大きな不一致が起これば、そのセッションは両観察者により再スコアリングする。
【０２８０】
各群の影響を受けた肢と影響を受けていない足のヒットパーセンテージを、一元配置分散分析を用いて群間で比較する。
【０２８１】
化合物Ｉ−３７を上記のモデルで試験した。脳卒中は外科術７日後および１４日後にリーチ性能に確実に欠陥をもたらした。化合物Ｉ−３７の添加は、脳卒中７日後および１４日後にビヒクル処置に比べて、この欠陥を有意に改善した。
【０２８２】
グリッドウォーク
前肢と後肢の協調を、一方の長端に沿って１ｃｍ間隔で孔を開けた長さ１ｍ、幅２５ｃｍ（厚さ５ｍｍ）の２枚のＰｌｅｘｉｇｌａｓパネルからなる装置を用いて評価する。これらのパネルを２．５ｃｍ離して置き、孔を通していく本かの金属バー（直径３ｍｍ）で接続する。これらのバーは１、２または３ｃｍ離してランダムに配置する。この装置を吊り下げ、高さ２５ｃｍの壁を用い、細い通路（幅２．５ｃｍ）が１ｍの長さとなるように向ける。
【０２８３】
各動物をこの装置に導き、試験のたびにゴールボックスから遠くなるようにラットを置いて３回試験する。すなわち、最初の試験では、ラットをゴールボックスに近いグリッドの端にゴールボックスの方に向けて置く。ラットがゴールボックスに入ったら、グリッドの半分の位置に、またゴールボックスの方に向けて置く。最終の３回目の試験では、ラットを入口に置き、全グリッドを横切ってゴールボックスに到達させる。
【０２８４】
この訓練手順は、各ラットに外科術前に１回のみ行う。その後の試験では、動物は個々に装置の入口に置き、ゴールボックスまで全グリッドを横切る必要がある。
【０２８５】
３回の試験のうち１回の試験セッションは脳卒中前に行う。脳卒中後の各試験セッションは３回の試験を含む。各試験は水平面から近距離でビデオテープに撮る。これらのテープは２人の観察者により、コマ送り解析を用いてスコアリングする。右および左（影響を受けている、および影響を受けていない）前肢および後肢の、グリッドの中央８０％からの踏み外し回数を数える。グリッドの中央８０％はマスキングテープで装置の外側にマークする。肢がバーの水平面を超える（部分的であれ完全であれ、すなわち、足だけであれ、脚全体であれ）場合は全て踏み外しである。前肢と後肢の踏み外しを同側および反対側の肢について、３回の試験をそれぞれ合計し、独立に分析する。一元配置分散分析を用い、群間でスコアを比較する。
【０２８６】
化合物Ｉ−３７を上記モデルで試験した。脳卒中は外科術７日後および１４日後にリーチ性能に確実に欠陥をもたらした。化合物Ｉ−３７は、脳卒中７日後および１４日後にこの欠陥を有意に改善した。
【０２８７】
前肢不対性（シリンダー試験）
動物の前肢不対性は直径２５ｃｍの透明アクリルシリンダーにラットを入れることにより評価する。シリンダーを、動物が下から撮影できるように鏡を配置した透明なテーブル上に置く。この有利な点により、シリンダーを探索する動物の前肢の鮮明な写真が得られる。
【０２８８】
探索中、ラットは何回も後肢で立つ傾向がある。後肢で立つたびに、ラットはシリンダーを調査する間、前肢をシリンダーの壁面に置いてバランスをとり、支える。調査は直立だけでなく、体の左右双方への傾けも含む（後肢立ちの間）。正常ラットは壁面に突っ張るのに左前肢と右前肢の双方を均等に使う。壁面を直立調査する場合、ラットは突っ張るために両足を使う。最初の２０回の後肢立ちの間に突っ張る足を記録する。後肢立ちの際にシリンダー壁面に触れる最初の足を数える。２０回の後肢立ちを記録するまで試験を続ける。ビデオ録画を２人の観察者によりスコアリングする。左足および右足の壁面接触を数える。従って、各後肢立ちごとに、スコアはＬまたはＲまたはＬ＆Ｒであり得る。
【０２８９】
１回の試験セッションは外科術前に行い、以降は示された外科術後試験日に行う。外科術前試験は、ラットが先在的な足の偏り（すなわち、一方の側への壁面接触が１５／２０回を超える）を持たないことを調べるために用いる。もしそれらが一方への偏りを示せば、それらを試験から除外する。外科術後スコアは、影響を受けた（脳卒中発作と反対側の）足を用いた接触のパーセンテージとして表す。このスコアについて一元配置分散分析を用いて群を比較する。
【０２９０】
化合物Ｉ−３７を上記モデルで試験した。脳卒中は外科術７日後および１４日後にリーチ性能に確実に欠陥をもたらした。化合物Ｉ−３７は低用量で、脳卒中１４日後にこの欠陥を有意に改善した。
【０２９１】
前肢阻害（水泳試験）
正常ラットにおいて、水泳は後肢の推進力を持つストロークにより達成される。前肢は通常、ストロークせずに制止され、動物の顎の下で合わさって動かずに保たれる。前肢の制止は水泳中の動物をフィルム撮影することにより評価する。動物を、室温の水（〜２５℃）を２５ｃｍの深さまで満たした水槽（３０ｗ×９０ｌ×４３ｈ  ｃｍ）の一方の端に入れ、反対側に置いた水面の上に２ｃｍ飛び出した９．５ｃｍ角の視認できるプラットフォームまで泳ぐところをフィルム撮影する。制止のスコアリングは、水槽に３回入れた際の左前肢および右前肢のストローク数を数えることにより行う。長さの中央８０％だけをスコアリングする。中央８０％は、マスキングテープを用いて水槽の外側にマークする。
【０２９２】
水泳試験中に動物が水槽の側面に触れない場合にのみ水泳はスコア可能と見なす。左および右（脳卒中後に影響を受けている、および受けていない）前肢の全ストローク数について一元配置分散分析を用いて群を比較する。
【０２９３】
化合物Ｉ−３７を上記モデルで試験した。脳卒中は外科術７日後および１４日後にリーチ性能に確実に欠陥をもたらした。化合物Ｉ−３７は脳卒中７日後および１４日後にこの欠陥を有意に改善した。
【０２９４】
ｐＴＹＲバイオマーカー分析
ＭＣＡＯを受けたラットのＣＮＳにおいて化合物Ｉ−３７の活性を追跡するため、試験の終了時にビヒクル処置動物および化合物処置動物の双方から脳を取り出し、タンパク質溶解液を得た（本明細書に記載のように）。溶解液をウエスタンブロットにより分析し、ＧＳＫ−３  α／β  ｐＴＹＲレベルでプロービングした。化合物Ｉ−３７は、β−カテニンが誘導されていないビヒクル処置ラットに比べて、脳において全ての用量でｐＴＹＲシグナルに有意な減少を示した。
【０２９５】
粘着除去試験
ラットを、粘着除去試験(Schallert T, et. al., 1984 # 3)を用い、前肢体性感覚の欠如に関して試験する。各動物に包装用テープの切れ端を丸めたもの（直径１．２ｃｍ）を各試験日に置くことで３回試験を行い、左前肢から刺激を取り除くのに必要な平均時間（秒）を記録した。
【０２９６】
化合物Ｉ−３７を上記モデルで試験したが、有意な効果を示さなかった。
【０２９７】
分子および組織学的分析の方法
分子分析
タンパク質溶解液を全てのビヒクルおよび化合物処置動物の脳から得、標的に対する化合物活性を確認するためのウエスタンブロットアッセイによるＧＳＫ３  α／β  ｐＴＹＲおよびβ−カテニンのバイオマーカー分析のために処理する。
【０２９８】
全てのビヒクルおよび化合物処置動物から脳脊髄液を得、ニューロン可塑性のサロゲートマーカーとしてのＢＤＮＦレベルをＥＬＩＳＡにより分析する。
【０２９９】
組織学的分析
パラフィン包埋脳サンプルをニューロインベスティゲーション(Neuroinvestigations)から得、６μｍ切片に切ってスライドガラスにのせ、脳卒中後の回復における有益な転帰と相関するマーカー／表現型の免疫組織化学または免疫蛍光により分析する。
幹細胞動員／増殖：脳室下領域（ＳＶＺ）におけるＢｒｄＵ陽性細胞の定量化のためのＢｒｄＵの染色とＡｐｅｒｉｏシステムを用いた分析。
神経発生：定量のための手による計数を用いたＳＶＺにおけるＢｒｄＵと組み合わせたダブルコルチン（ＤＣＸ）の免疫蛍光染色。
脈管形成：梗塞周囲のｖＷＦ陽性細胞の定量化のためのフォン・ウィルブランド因子ＶＩＩＩ（ｖＷＦ）の染色とＡｐｅｒｉｏシステムを用いた分析。
【０３００】
実施例１６：軸索分枝アッセイ
化合物の、Ｅ１６ラット海馬または皮質ニューロンにおける軸索分枝を像去する能力を調べた。
【０３０１】
１日目
細胞プレートの調製
ＰＤＬの１ｍｇ／ｍｌ保存液をＤＩ水で１００μｇ／ｍｌに希釈する。解剖を行う前少なくとも１時間３７℃でカバーガラスをコーティングする。ＰＤＬを吸引し、プレートをＰＢＳですすぎ、フード内で風乾する。
【０３０２】
Ｅ−１６ラット皮質細胞の解離
皮質または海馬葉を９ｍＬの基本培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）と合わせ、氷上に置く。１ｍＬの１０×トリプシン溶液を加え、この混合物を穏やかに攪拌する。次に、組織を３７℃の水浴中で２０分間インキュベーションすることにより消化する。２０分後、１０μｌ／ｍｌのＤＮアーゼ（１００μＬ  ＤＮアーゼ）を加え、この混合物をさらに５分間インキュベートする。
【０３０３】
細胞を１０００ｒｐｍで１分間回転させる。次に、底に沈んだ脳断片を取り出すことなく酵素溶液を除去する。この固体を洗浄培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋１０％およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）で３回洗浄する。３回目の洗浄後、細胞を５ｍＬの培養培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｂ２７、Ｌ−グルタミンおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）に再懸濁させる。炎で細くしたガラスピペットで、気泡ができないように注意して数回静かに吸い出すことにより、機械的解離を行う。次に、細胞を７０μｍ細胞濾過器で濾過する。細胞を血球計で計数し、２４ウェルプレートに５０００〜１００００細胞／ウェルで播種する。これらの細胞を３７℃ｏ／ｎで一晩インキュベートする。
【０３０４】
２日目
細胞の維持
翌日、培地の半分を、レチノイン酸（ＲＡ）を含有する新鮮な培養培地と交換する。化合物を、最終ＤＭＳＯ濃度０．３％で所望の濃度になるように加える。３日ごとにこの培地の半分を交換し、新鮮な化合物を加える。細胞を６日間化合物とともに培養インキュベートする。
【０３０５】
７日目
固定および染色
材料：
１．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−Ｇｉｂｃｏ  １４１９０−１４４
２．洗浄バッファー＝ＰＢＳ−Ｔ：
・ＰＢＳ
・０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ  Ｒａｄ、１７０−６５３１）
３．ブロッキングバッファー＝ＰＢＳ−Ｔ＋５％正常ロバ血清またはＨＢＳＳ−Ｔ＋５％正常ロバ血清
・１０ｍｌのＰＢＳ
・０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ  Ｒａｄ、１７０−６５３１）
・０．５ｍｌの正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＃  ０１７−０００−１２１）
５．Ｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔ  Ｃｉｔｉ−Ｆｌｕｏｒ（商標）（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ  ＡＦ−１）
６．Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ抗体  １：２５０  Ａｂｃａｍ、ＭＡＰ２抗体  １：２５０  Ａｂｃａｍ
７．抗ウサギＡｌｅｘａ  ４８８（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ）および抗マウスＡｌｅｘａ  ５６８（ＭＡＰ２）に対する二次抗体１：５００
方法
培地が血清を含んでいる場合には、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。細胞が血清フリー培地で増殖されている場合には洗浄の必要はない。
【０３０６】
固定
まず、培地またはＰＢＳを除去する。次に、５００μＬのＨｉｓｔｏＣｈｏｉｃｅを加えて細胞を覆う。これらの細胞を室温で１０分間インキュベートする。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、各洗浄の後に５分のインキュベーションを行う。量を以下に示す。
９６ウェル形式の１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ
４８ウェル形式の１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳ
２４ウェル形式のウェル当たり１４００μｌのＰＢＳ
【０３０７】
これらの細胞を室温で３０分間、ブロッキングバッファーとともにインキュベートする。次に、組織を室温で１時間、ブロッキングバッファーとともにインキュベートする。１°抗体をＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ＋５％ロバ血清で希釈する。ブロッキング溶液を除去し、ブロッキングバッファー中十分な量の１°抗体を加えて細胞を多く。１°抗体を４℃で一晩インキュベートする。翌日、１°抗体を除去し、カバーガラスをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、各洗浄の間に５分のインキュベーションを行う。ＰＢＳ−Ｔを除去し、ブロッキングバッファーを加える。細胞を３０分間インキュベートする。
【０３０８】
２°抗体をＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ＋５％ロバ血清で希釈する。この混合物を室温で３０分間インキュベートする。これらのスライドガラスをＰＢＳ−Ｔで３回、ＰＢＳで１回洗浄する。蛍光色素の消光を軽減するために包埋媒体を加える。これらのカバーガラスを取り出し、可視化のためにスライドガラスにのせる。
【０３０９】
分析
正立顕微鏡にて１０倍と２０倍で画像を取り込み、軸索分枝は、細胞当たりのｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  Ａｌｅｘａ  ４８８の閾値蛍光下面積の定量により測定する。樹状分枝は、細胞当たりのＭＡＰ２  Ａｌｅｘａ  ５６８の閾値蛍光下面積の定量により測定する。あるいは、分枝は細胞タリの分岐点を手で数えることにより測定することもできる。化合物の効果は、化合物処理培養物における閾値蛍光下面積と同じ時点でのＤＭＳＯ対照を比較することにより評価する。
【０３１０】
Ｅ１６海馬ニューロンを１０ｎＭの化合物Ｉ−３７で７日間処理すると、軸索分枝および樹状分枝および樹状(dentritic)分枝の増強が生じた。Ｅ１６海馬ニューロンを、β−カテニンを誘導することが示されている濃度で処理すると軸索成長は阻害され、ＧＳＫ−３  α／β  ｐＴＹＲとβ−カテニンの間のウインドウの治療的役割がさらに裏付けられた。
【０３１１】
実施例１７：脊髄損傷モデル
化合物Ｉ−３７を、Dill, et al, (2008) "Inactivation of Glycogen Sythase Kinase 3 Promotes Axonal Growth and Recover in CNS" The Journal of Neuroscience, 28(36): 8914-8928に記載されているものと同様の脊髄損傷モデルで試験した。化合物Ｉ−３７は機能回復の改善を表さなかったが、この所見の理由は明らかでない。
【０３１２】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載したが、以上の記載は例示を意図したものであって、付属の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。他の態様、利点および改変も以下の特許請求の範囲内にある。
【０３１３】
本明細書に引用された全ての参照文献は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【国際調査報告】
2011513483.tif 000056
2011513483.tif 000057
2011513483.tif 000058
2011513483.tif 000059
2011513483.tif 000060