(57)【要約】  本発明は、ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞（Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ；以下、ＩＭＣ）を含む免疫治療及び予防用ワクチンに関するもので、具体的には、ナチュラルキラーＴ細胞リガンドと同時に糖脂質の一種であるα−ガラクトシルセラミド（ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ；以下、αＧａｌＣｅｒ）が積載された単核球またはＩＭＣを含む免疫治療及び予防用ワクチンに関するものである。本発明の組成物である単核球またはＩＭＣが樹状細胞に比べて得やすく、ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球またはＩＭＣの免疫化は、有意な水準の細胞毒性Ｔリンパ球反応を誘導するのみならず、悪性腫瘍の予防及び治療効果があるので抗癌免疫治療剤として用いることができる。【選択図】図３
2011503174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞（Ｉｍｍａｔｕｒｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓ；以下，ＩＭＣ）を含む免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項２】
ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドが、α−ガラクトロノシルセラミド、α−グルクロノシルセラミド、ホスファチジリノシトルテトラマンノサイド、イソグロボトリヘキソシルセラミド、ガングリオサイドＧＤ３、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スルファチド、β−ガラクトシルセラミド、リポホスホグリカン、グリコイノシトールホスホリピド、α−ガラクトシルセラミドの類似体であるβ−アノマガラクトシルセラミド及びα−アノマガラクトシルセラミド、バクテリア脂質抗原からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項３】
前記抗原が、病原菌、ウイルス及び寄生虫を含む病原体由来の抗原または癌抗原であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項４】
病原菌由来の抗原が、百日咳菌抗原（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ，ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）、破傷風菌抗原、ジフテリア菌抗原（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ）、ヘリコバクター・ピロリ抗原（ｃａｐｓｕｌａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ｓｅｒｏｇｒｕｐ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｙ及びＷ−１３５）、肺炎菌抗原（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｍｏｎｉａｅ  ｔｙｐｅ３  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、結核菌抗原、コレラ抗原（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ）、ブドウ状球菌抗原（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ）、赤痢菌抗原（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐ．）抗原、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）抗原及びプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）抗原からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項５】
ウイルス由来の抗原が、インフルエンザウイルス抗原（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ及びｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ抗原）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、小水泡性口内炎ウイルス抗原（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、肝炎ウイルス抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ（ＨＡＶ）、Ｂ（ＨＢＶ）、Ｃ（ＨＣＶ）、Ｄ（ＨＤＶ）及びＧ（ＨＧＶ）抗原）（ｃｏｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原、ヘルペスシンプレックスウイルス抗原、ヒト免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ）抗原（ＧＰ−１２０、ＧＰ−１６０、ｐ１８、Ｔａｔ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ）及びその組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項６】
癌抗原が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕによって発現される乳癌タンパク質、プロテイナーゼ３、ＷＴ−１、ムリノグロブリン（ＭＵＣ−１）、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｇ２５０、メラノ−マ抗原遺伝子（ＭＡＧＥ、ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｅｎｅ）、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、チロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）、ＴＲＰ−２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＭＣＩＲ、Ｉｇ  Ｉｄｉｏｔｙｐｅ、ＣＤＫ４、カスパーゼ−８、β−カテニン、ＣＩＡ、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７）、ＥＢＶ  ＬＭＰ２ａ、ＨＣＶ、ＨＨＶ−８、５Ｔ４、癌胚芽抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、ｐ５３及びα−フェトプロテイン（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項７】
抗原が、ペプチド、脂質多糖類、多糖類、糖蛋白質またはポリヌクレオチドの形態を有することを特徴とする請求項１に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項８】
前記抗原が、組換えウイルスによって導入されて発現することを特徴とする請求項１に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項９】
前記組換えウイルスが、抗原を発現する遺伝子が導入されたアデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス（Ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）であることを特徴とする請求項８に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項１０】
α−ガラクトシルセラミドと抗原が積載された単核球または未分化骨髄性細胞を含むナチュラルキラーＴ細胞活性化剤。
【請求項１１】
癌抗原を発現する単核球または未分化骨髄性細胞を含む細胞毒性反応誘導剤。
【請求項１２】
ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞を含む免疫治療及び予防用ワクチンを個体に投与する工程を含む前記抗原の発現を指標とする疾患の免疫治療方法。
【請求項１３】
ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞を含む免疫治療及び予防用ワクチンを個体に投与する工程を含む前記抗原の発現を指標とする疾患の免疫予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞（Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ；ＩＭＣ）を含む免疫治療及び予防用ワクチンに関するもので、より詳細には、ナチュラルキラーＴ細胞リガンドでもあり糖脂質の一種であるα−ガラクトシルセラミド（ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ；以下、αＧａｌＣｅｒ）が積載された単核球またはＩＭＣを含む免疫治療及び予防用ワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、医学の発達によって癌患者の生存率が増加しているが、変化する環境的要因と平均寿命の増加などによって癌発生の頻度も増加している。現在まで癌を治療するため多くの研究が進行されていて、癌に対する新しい薬剤と治療法が開発されていて癌患者等の治療効果が非常に向上してきている。しかし、悪性腫瘍の場合、微細手術療法と放射線治療の発達、化学療法のような新しい治療剤の開発によってもその治療効果が制限的であり、非特異的抗癌効果による副作用及び癌の再発などの限界点がある。これを補うために、現在活発に使用されたり開発されたりしている治療法が免疫療法である。腫瘍特異的毒性（ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を誘導することによって、全身毒性による副作用を減らし、癌及び癌抗原に対する能動的な記憶反応を確立することによって、既存の癌治療法を補うことができる特徴があるからである。
【０００３】
抗原提示細胞を用いた抗癌免疫細胞ワクチンは、効果的にＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することができるので、優秀な抗癌効果を示す。現在、抗原提示細胞ワクチンで最も多く使用される細胞は、樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）で抗原を捕食してエフェクタ−細胞に強い共刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ）とともに伝達してくれるので効率的にエフェクタ−細胞を活性化して強い免疫反応を誘導する。実際の臨床的に樹状細胞を用いた細胞治療剤は、まず、患者の骨髄や末梢血液から樹状細胞あるいはその前駆体である単核球を分離して大量増殖及び分化させた後、抗原を加えて活性化させて再び患者に注入する方法を使用する。体内に注入された樹状細胞は、特異的な抗原情報をＴ細胞に伝達してそれを活性化させて抗原特異的な免疫反応を効果的に誘導するようになる。このような長所があるにもかかわらず血液とリンパ組織から直接的に得ることができる樹状細胞の数が極めて少数で分離するのが難しく、単核球から分化させる場合、数日間体外で培養しなければならないので、樹状細胞を用いた細胞免疫治療剤開発の障害になっている。したがって、これを改善するか代替するのに値する他の細胞免疫治療剤の開発が切望されている。
【０００４】
不変性ナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ  ｃｅｌｌ）が多くの免疫反応及び免疫病理現象を総括する中枢的な役割を担当するということが、最近の研究を通じてよく知られている。一方、リガンドで活性化になった不変性ナチュラルキラーＴ細胞は、樹状細胞だけではなくＴ、Ｂ及びナチュラルキラー細胞の活性化を誘導することができ、不変性ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドであるα−ガラクトシルセラミド（以下、αＧａｌＣｅｒ）を注入するとナチュラルキラー細胞とＴ細胞の活性化を通じて抗癌免疫を起こすことが報告された（Ｍｏｏｄｙｃｌｉｆｆｅ  ＡＭ等，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００年，第１巻，ｐ．５２１−５２５）。前記ナチュラルキラーＴ細胞は、自家抗原及び外来抗原に対する反応を管理して、自家免疫または免疫反応を誘導するかどうかを決定すると報告されたことがある（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｍ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５年，第２３巻，ｐ．８７７−９００；Ｐａｒｋ  ＳＨ  ＆ Ｂｅｎｄｅｌａｃ  Ａ，Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０６巻，ｐ．７８８−７９２）。
【０００５】
α−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）は、元々海綿動物から抽出された糖脂質で、Ｖα１４＋Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有している不変性ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドで、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ，ＡＰＣ）表面に存在するＣＤ１ｄ分子によってＮＫＴ細胞に提示されることが知られている（Ｋａｗａｎｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７年，第２７８巻，ｐ．１６２６）。ナチュラルキラーＴ細胞リガンドによってナチュラルキラーＴ細胞が活性化になると、多量のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４を含む多くのサイトカインを生産し、これは特定疾病または感染に対する免疫反応を調節することができる（Ｃｈｅｎ等，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７年，第１５９巻，ｐ．２２４０；Ｗｉｌｓｏｎ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００３年，第１００巻，ｐ．１０９１３）。
【０００６】
一般人の場合とは異なり癌患者の場合、血液及び骨髄、そして癌組織において非活性化大食細胞、顆粒球、非活性化樹状細胞、単核球及び分化初期の骨髄性細胞を含む未分化骨髄性細胞（ＩＭＣ）が増殖して存在することが報告されている。そればかりでなく、癌細胞が移植された動物の血液、骨髄、脾臓、癌組織においても、ＩＭＣが有意に増加している。マウスモデルにおいてＩＭＣは、細胞表面に特徴的にＣＤ１１ｂとＧｒ−１を一緒に発現している。健康なマウスの血液と脾臓からＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ−１＋細胞が４％以内の少数存在し、これはＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ−１＋細胞は大食細胞、樹状細胞の前駆体なので適切なサイトカインが存在する環境では、成熟した大食細胞、顆粒球、樹状細胞に分化することができるからである。しかし、癌患者の場合、癌細胞が分泌する要素（ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど）などによって、ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ−１＋細胞がそれ以上分化することができずに蓄積されている。ＩＭＣは、癌患者の血液に多く蓄積されているので多量の細胞を得ることが容易で、樹状細胞ワクチンの製作などの目的に単核球を分離する場合、かなり多数のＩＭＣが混入することを防ぐのは大変な状況である。一般的に癌患者または癌移植動物に増殖して存在するＩＭＣは、免疫抑制機能をすると知られているが、適切な刺激を通じて免疫原性を増加させられ得ることが期待される。
【０００７】
最近、ナチュラルキラーＴ細胞活性化による免疫増強効果が樹状細胞を通じて現れるという証拠が提示され（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｍ等，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５年，第  ２３，ｐ．８７７−９００；Ｐａｒｋ  ＳＨ等，Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０６巻，ｐ．７８８−７９２）、このような結果を根拠にして、本発明者等によって最初にナチュラルキラーＴ細胞リガンドをＢ細胞に提示してナチュラルキラーＴ細胞を活性化し、その助けによってＢ細胞の免疫原性を増加させることで、Ｂ細胞に積載した抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞反応を誘導した。これは、樹状細胞ワクチンと類似の程度の効果を示すことを確認した（Ｃｈｕｎｇ  Ｙ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００６年，第６６（１３）巻，ｐ．６８４３−６８５０）。しかし、このようなナチュラルキラーＴ細胞活性化による免疫増強効果が、Ｂ細胞以外に樹状細胞の前駆体である単核球または未分化骨髄細胞でも示されると報告した例は全くないのが実情である。そこで、本発明者等は、単核球とＩＭＣが細胞治療ワクチンの製造に効果的に使用することができかどうか確認するために、αＧａｌＣｅｒが積載された単核球またはＩＭＣに抗原ペプチドを積載するか抗原を発現するアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）で形質導入して体内に投与する場合、抗原特異的な免疫反応を誘導することができ、有意な抗癌効果を示すことを確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｏｏｄｙｃｌｉｆｆｅ  ＡＭ等，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０００年，第１巻，ｐ．５２１−５２５
【非特許文献２】Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｍ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５年，第２３巻，ｐ．８７７−９００
【非特許文献３】Ｐａｒｋ  ＳＨ  ＆ Ｂｅｎｄｅｌａｃ  Ａ，Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０６巻，ｐ．７８８−７９２
【非特許文献４】Ｋａｗａｎｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７年，第２７８巻，ｐ．１６２６
【非特許文献５】Ｃｈｅｎ等，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７年，第１５９巻，ｐ．２２４０
【非特許文献６】Ｗｉｌｓｏｎ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００３年，第１００巻，ｐ．１０９１３
【非特許文献７】Ｃｈｕｎｇ  Ｙ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００６年，第６６（１３）巻，ｐ．６８４３−６８５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ナチュラルキラーＴ細胞リガンド、特にα−ガラクトシルセラミドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞（ＩＭＣ）を用いて、ナチュラルキラーＴ細胞を活性化して抗原特異的な免疫反応を誘導することができる免疫治療及び予防用ワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞（ＩＭＣ）を含む免疫治療及び予防用ワクチンを提供する。
【００１１】
また、本発明は、α−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）が積載された単核球またはＩＭＣを含むナチュラルキラーＴ細胞活性化剤を提供する。
【００１２】
また、本発明は、癌抗原を発現する単核球またはＩＭＣを含む細胞毒性反応誘導剤を提供する。
【００１３】
同時に、本発明は、ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞を含む免疫治療及び予防用ワクチンを個体に投与する工程を含む前記抗原の発現を指標とする疾患の免疫治療及び予防方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の組成物である単核球またはＩＭＣが樹状細胞に比べて得易く、ナチュラルキラーＴ細胞のリガンド、特に、α−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）と抗原を積載した単核球またはＩＭＣの免疫化は、有意水準の細胞毒性Ｔリンパ球反応を誘導するだけでなく、悪性腫瘍の予防及び治療効果があるので、前記細胞を含むワクチンは、癌予防及び治療剤として用いることができる。併せて、本発明のワクチンは、ＣＤ４＋Ｔ細胞がない場合にも免疫反応を誘導するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が著しく減少して免疫欠乏が現れるＨＩＶ患者を免疫化するのにも用いることができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載された単核球ワクチンの抗癌効果を示した図である。
【図２】αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入した単核球ワクチンの抗癌効果を示した図である。
【図３】αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載されたＩＭＣワクチンの抗癌効果を示した図である。
【図４】αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入したＩＭＣワクチンの抗癌効果を示した図である。
【図５】ＩＭＣワクチンによる抗癌効果を示す免疫細胞を確認した結果を示した図：ａ：ＮＫ細胞除去、及びｂ：ＣＤ４またはＣＤ８細胞除去。
【図６】αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載された単核球ワクチンによる抗原ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性を示した図である。
【図７】αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載された単核球ワクチンの用量別抗原ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性を示した図である。
【図８】αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入した単核球ワクチンによる抗原特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性を示した図である。
【図９】αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載されたＩＭＣワクチンの用量別抗原ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性を示した図である。
【図１０】αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載されたＩＭＣワクチンによる抗原ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性を示した図である。
【図１１】αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入したＩＭＣワクチンの用量別抗原ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性を示した図である。
【図１２】αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入した単核球ワクチンによって誘導される抗原特異的な抗体反応を示した図である。
【図１３】αＧａｌＣｅｒとＯＴ−１抗原ペプチドが一緒に積載されたＩＭＣワクチンの抗原ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１７】
すでに、α−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）が積載された樹状細胞（ＤＣ）が不変性ナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を活性化するということは、公知された事実なので（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ  ＨＪ等，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １，２００１年，第２４７（１−２）巻，ｐ．６１−７２）、本発明者等は、α−ガラクトシルセラミドが積載された単核球またはＩＭＣが前記の樹状細胞と類似の効果を示すのかどうかを確認した。
【００１８】
前記単核球は、樹状細胞（ＤＣ）または大食細胞に分化することができる骨髄由来の未分化前駆体細胞である。本発明者等は、マウスからＣＤ１１ｂを発現する単核球細胞を分離して、αＧａｌＣｅｒ及び抗原ペプチドを積載した単核球ワクチンを製造し、前記ワクチンの抗癌効果を細胞毒性Ｔリンパ球抗原決定基を含む癌抗原であるＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する癌細胞ＨＥＲ−２／ＣＴ２６（Ｐｅｎｉｃｈｅｔ  ＭＬ等，Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ，１９９９年，第４９巻，ｐ．１７９−８８）を用いて確認した結果、有意な抗癌効果を示すことを確認した（図１参照）。また、前記ワクチンがペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させて細胞毒性免疫反応を誘導することができるのかどうかを調べるために、生体内細胞毒性試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＴＬ  ａｓｓａｙ）を実施した結果、高い水準で標的を破壊する能力を有した細胞毒性反応を示し（図６参照）、１×１０６個の細胞だけでも効果的な細胞毒性反応を誘導させることができた（図７参照）。
【００１９】
しかし、抗原ペプチドを積載した細胞ワクチンは、臨床的に用いる場合、個人の主要組織適合性複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）のハプロタイプに制限的に使用されるので全ての人に普遍的に使用することはできず、単一抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）のみを提示する短所がある。これに比べて、前記抗原を発現することができるウイルスを用いる場合、全体抗原を導入することができて特定主要組織適合性複合体のハプロタイプに限られないですべての人に適用可能であり、細胞性免疫反応だけではなく体液性免疫反応も誘導することができるという長所を有する。それで、本発明者等は、抗原を発現するアデノウイルスで形質導入してαＧａｌＣｅｒが積載された単核球ワクチンを製造してその抗癌効果を確認した結果、前記単核球ワクチンを投与した場合、癌を投与したマウスの生存期間が顕著に延長されて実際に癌細胞に対して優れた抗癌効果を示すことが分かった（図２参照）。また、前記ワクチンがペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させて細胞毒性免疫反応を誘導することができるのかどうかを調べるために生体内細胞毒性試験を実施した結果、２×１０６個の細胞だけでも効果的な細胞毒性反応を誘導させることができた（図８参照）。この場合、抗原ペプチドが積載された単核球ワクチンと比べて細胞毒性反応がさらに低く測定されたが、実際の抗癌効果の面では、抗原ペプチドが積載された単核球ワクチンに比べて生存期間を延ばす能力がさらに優れていたので、アデノウイルスワクチンが細胞毒性Ｔ細胞反応以外の免疫反応を追加で生成させ得るということを類推してみることができた。そこで、抗原を発現するアデノウイルスで形質導入した単核球ワクチンが細胞性免疫反応だけでなく体液性免疫反応を誘導することができるかどうかを調べるため、前記単核球ワクチンの投与がＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的な抗体を生成させることができるかどうか詳しく調べた結果、２×１０６個の細胞を投与した群の抗体生成が最も高く示され、１×１０６または５×１０５個の細胞を投与した群でも有意に抗体生成が観察された（図１２参照）。しかし、２．５×１０５個の細胞以下で投与した群では抗体生成が観察されなかった。また、前記抗原ペプチドをオブアルブミン抗原に代替し同一な方法でＩＭＣワクチンを製造して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対象に細胞毒性を確認した結果、オブアルブミン抗原に対しても効果的な細胞毒性反応を示し得ることを確認し、これを通じて、ＩＭＣワクチンによる効果的な免疫反応が特定抗原に限ったものではなく、多様な抗原に対しても適用され得ることが分かった（図１３参照）。
【００２０】
マウスに移植癌または慢性炎症が生成される場合、癌と脾臓などで未分化骨髄性細胞（ＩＭＣ）が顕著に増加して、また実際の癌患者の末梢血液でもＩＭＣの増加が観察される。このようなＩＭＣは、多様な分化工程の骨髄性細胞の前駆体として、顆粒球、単核球、大食細胞、樹状細胞などを含み、アルギナーゼＩ、酸化窒素、活性酸素種、ＴＧＦ−βなどの作用を通じて癌抗原特異的あるいは非特異的なＴリンパ球機能を抑制することによって、癌の増殖をより悪化させることがよく知られている。また、癌細胞を移植したマウスで増殖して存在するＩＭＣは、表面にＧｒ−１とＣＤ１１ｂを同時に発現することが知られていて、単核球と類似の性格の細胞を高い割合で含む。それで、本発明者等は、単核球ワクチンと類似の方法でＩＭＣを使用して細胞ワクチンに製作した時、抗癌効果を示すことができるかどうか確認してみた。本発明者等は、ＨＥＲ−２／ＣＴ２６癌細胞を移植したマウスの脾臓から脾臓細胞を得て、Ｂ細胞及び樹状細胞を除去した後、αＧａｌＣｅｒを積載した後、ＣＤ１１ｂを発現する細胞を分離して抗原ペプチドを積載したＩＭＣワクチンを製造した。前記方法で製作されたワクチンの場合、培養する過程でナチュラルキラーＴ細胞がＩＭＣとともに存在するので、ナチュラルキラーＴ細胞がαＧａｌＣｅｒを積載したＩＭＣ表面のＣＤ１ｄを認識して、培養液中で活性化させてさらに効果的なワクチンとして作用することができるようにするという長所を有するようになる。前記ワクチンの抗癌効果をＨＥＲ−２／ＣＴ２６を用いて確認した結果、有意な抗癌効果を示すことを確認した（図３参照）。また、前記ワクチンがペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させて細胞毒性免疫反応を誘導することができるかどうか調べるために、生体内細胞毒性試験を実施した結果、顕著に高い水準の細胞毒性反応を示した（図９参照）。これは、ＩＭＣワクチンが効果的に抗原特異的な細胞毒性反応を誘導させて癌細胞を破壊することによって、有意な抗癌効果を示すことができたことを意味する。
【００２１】
また、抗原を発現するアデノウイルスで形質導入してαＧａｌＣｅｒが積載されたＩＭＣワクチンを製造してその抗癌効果を確認した結果、前記ＩＭＣワクチンを投与した場合、生存期間が顕著に延長されて実際の癌細胞に対して優れた抗癌効果を示すことが分かった（図４参照）。前記ＩＭＣワクチンは、ＮＫ細胞（図５ａ参照）またはＣＤ８＋細胞（図５ｂ参照）が除去された動物群では、前記ＩＭＣワクチンの抗癌治療効果が有意に低くなり、前記二つの細胞がＩＭＣワクチンの抗癌治療に重要な役割をする免疫細胞であることが分かった。反対に、ＣＤ４＋細胞が除去された動物群では、前記ＩＭＣワクチンの抗癌治療効果が、除去されない群と特別に差がないことから（図５ｂ参照）、前記ＩＭＣワクチンが、ＣＤ４＋Ｔ細胞がない場合にも免疫反応を誘導するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が著しく減少して免疫欠乏が示されるＨＩＶ患者を免疫化するのにも使用できることを予想することができた。また、前記ワクチンがペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させて細胞毒性免疫反応を誘導することができるのかどうか調べるために、生体内細胞毒性試験を実施した結果、高い水準の細胞毒性反応を示した（図１０参照）。ペプチドで積載されたＩＭＣワクチンを用いた結果と比較すると、その数値は高くはないが、ペプチドワクチンの場合、細胞毒性細胞の抗原決定基ペプチドのみを積載した一方、全体抗原を有するウイルスで形質導入した場合は抗原決定基のみを特異的に発現させたのではなく、形質導入効率が完璧ではないので相対的に特定抗原ペプチド特異的な細胞毒性反応が低く測定され得る。しかし、抗原ペプチド以外の免疫反応を同時に誘導することができるという長所があり、前記ワクチン８×１０６個の細胞で免疫化した場合において９０％に近い効果的な細胞毒性反応の示す結果は、ウイルスで形質導入したＩＭＣワクチンで効果的な細胞毒性反応を誘導することができることを示した（図１１参照）。
【００２２】
本発明は、ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球またはＩＭＣを含む免疫治療及び予防用ワクチンを提供する。
【００２３】
前記ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドは、スピンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）起源のα−ガラクトロノシルセラミド（ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）とα−グルクロノシルセラミド（ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，Ｍａｔｔｎｅｒ，Ｊ．等，Ｎａｔｕｒｅ，２００５年，第４３４巻，ｐ．５２５；Ｋｉｎｊｏ，Ｙ．等，Ｎａｔｕｒｅ，２００５年，第４３４巻，ｐ．５２０）。ＧＳＬ−４（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５年，第３５巻，ｐ．１６９２）、Ｍ．ツバクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のホスファチジリノシトルテトラマンノサイド（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌｔｅｔｒａｍａｎｎｏｓｉｄｅ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｋ．等，ＰＮＡＳ，２００４年，第１０１巻，ｐ．１０６８５）。自家抗原であるイソグロボトリヘキソシルセラミド（ｉｓｏｇｌｏｂｏｔｒｉｈｅｘｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，Ｚｈｏｕ，Ｄ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４年，第３０６巻，ｐ．１７８６）とガングリオサイドＧＤ３（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ＧＤ３，Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００３年，第１９８巻，ｐ．１７３）、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５年，第１７５巻，ｐ．９７７）、ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）とホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第１２巻，ｐ．２１１）、スルファチド（ｓｕｌｆaｔｉｄｅ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２００４年，第１９９巻，ｐ．９４７）、β−ガラクトシルセラミド（ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，ｂｅｔαＧａｌＣｅｒ，Ｏｒｔａｌｄｏ  ＪＲ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第１７２巻，ｐ．９４３）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ表面糖結合リポホスホグリカン（ｌｉｐｏｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃａｎ）とグリコイノシトールホスホリピド（ｇｌｙｃｏｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００４年，第２００巻，ｐ．８９５）、α−ガラクトシルセラミドの類似体であるβ−アノマガラクトシルセラミド等（ｂｅｔａ−ａｎｏｍｅｒｉｃ  ＧａｌＣｅｒ）とα−アノマガラクトシルセラミド等（ａｌｐｈａ−ａｎｏｍｅｒｉｃ  ＧａｌＣｅｒ；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４年，第１７３巻，ｐ．３６９３）、α−ガラクトシルセラミドの変異体（Ｎａｔｕｒｅ，２００１年，第４１３巻，ｐ．５３１；Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，２００４年，第４３巻，ｐ．３８１８；Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，２００４年，第１２６巻，ｐ．１３６０２；ＰＮＡＳ，２００４年，第１０２巻，ｐ．１３５１；ＰＮＡＳ，２００５年，第１２巻，ｐ．３３８３；Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，２００６年，第１２８巻，ｐ．９０２２；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００６年，第３１２巻，ｐ．３４；Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２００７年，第５０巻，ｐ．５８５；ＰＮＡＳ，２００７年，第１０４巻，ｐ．１０２９９）及びバクテリア脂質抗原、例えばノカルデアファルシニカ（Ｎｏｃａｒ���ｉａ  ｆａｌｃｉｎｉｃａ）由来のグルコースモノマイコレート（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｏｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ，Ｍｏｏｄｙ，Ｄ．Ｂ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０００年，第１９２巻，ｐ．９６５）を含む。
【００２４】
前記抗原は、ワクチンに使用されて免疫反応を起こすことができる抗原はすべて使用可能であり、病原菌、ウイルス及び寄生虫を含む病原体由来の抗原または癌抗原を含み、前記抗原の全長または断片であり得る。前記病原菌由来の抗原は、百日咳菌抗原（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ，ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）、破傷風菌抗原、ジフテリア菌抗原（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ）、ヘリコバクター・ピロリ抗原（ｃａｐｓｕｌａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ｓｅｒｏｇｒｕｐ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｙ及びＷ−１３５）、肺炎菌抗原（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｍｏｎｉａｅ  ｔｙｐｅ３  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、結核菌抗原、コレラ抗原（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ）、ブドウ状球菌抗原（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ）、赤痢菌抗原（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐ．）抗原、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）抗原及びプラスモジウム抗原を含み、前記ウイルス由来の抗原は、インフルエンザウイルス抗原（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ及びｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ抗原）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、小水泡性口内炎ウイルス抗原（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）ウイルス抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ（ＨＡＶ）、Ｂ（ＨＢＶ）、Ｃ（ＨＣＶ）、Ｄ（ＨＤＶ）及びＧ（ＨＧＶ）抗原）（ｃｏｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原、ヘルペスシンプレックスウイルス抗原、ヒト免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ）抗原（ＧＰ−１２０、ＧＰ−１６０、ｐ１８、Ｔａｔ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ）及びその組み合わせを含む。同時に、癌抗原は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕによって発現される乳癌タンパク質、プロテイナーゼ３、ＷＴ−１、ムリノグロブリン（ＭＵＣ−１）、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｇ２５０、メラノ−マ抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）、ＴＲＰ−２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＭＣＩＲ、Ｉｇ  Ｉｄｉｏｔｙｐｅ、ＣＤＫ４、カスパーゼ−８、β−カテニン、ＣＩＡ、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７）、ＥＢＶ  ＬＭＰ２ａ、ＨＣＶ、ＨＨＶ−８、５Ｔ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｐ５３及びα−フェトプロテインからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２５】
また、前記抗原は、ペプチド、脂質多糖類、多糖類、糖蛋白質またはポリヌクレオチドの形態を有することで単核球またはＩＭＣに直接積載することができ、組換えウイルスによって単核球またはＩＭＣに形質導入して発現させて積載することができる。ペプチドを積載した細胞ワクチンに比べて、ウイルスを媒介にして全体抗原を導入した細胞ワクチンは、主要組織適合性複合体のハプロタイプに限られないのですべての人に適用可能であり、多くの抗原決定基に特異的な免疫反応を誘導することができる。特に、体液性免疫反応と細胞性免疫反応を同時に誘導することができるという長所がある。
【００２６】
前記抗原発現のために単核球またはＩＭＣに導入するウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス（Ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等が可能であるが、これに限定されない。ウイルスを使用した方法の外にも、抗原遺伝子伝達で適用可能なものは、１）ＤＮＡをリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）に結合させて形質導入して酵素分解からＤＮＡを保護したりエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）で吸収するようにする方法、２）ＤＮＡにタンパク質で構成された分子コンジュゲートや合成リガンドを結合して細胞でＤＮＡを伝達効率を高める方法［例：アシアログリコプロテイン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、重合ＩｇＡ（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ＩｇＡ）］、３）ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）を使用した新しいＤＮＡ伝達システムで細胞へＤＮＡの伝達効率を高めることで、抗原遺伝子を伝達する方法［例：Ｍｐｈ−１］、４）前記方法の外にも、ペプチドを使用したり抗原タンパク質を単核球またはＩＭＣに適用することで、単核球またはＩＭＣが抗原を提示するようにできる。
【００２７】
本発明のワクチンは、ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと単核球またはＩＭＣに追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。前記ワクチンは、投与のために前記記載した有効成分以外に追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤成分を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形などに製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに開示されている方法を用いて各疾患によって、または成分によって好ましく製剤化することができる。
【００２８】
本発明のワクチンは、非経口で投与することができ、非経口投与は、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式による。非経口投与剤形に製剤化するためには、本発明のナチュラルキラーＴ細胞のリガンドを積載した単核球またはＩＭＣ、ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドとペプチドを積載した単核球またはＩＭＣまたは癌抗原を発現するウイルスで感染された単核球またはＩＭＣは、安定剤または緩衝剤とともに混合して溶液または懸濁液に製造してそれをアンプルまたはバイアルの単位投与型で製剤化する。
【００２９】
本発明のワクチンは、投与経路によって多様な形態に製造することができる。例えば、本発明のワクチンは、注射用途に相応しい滅菌水溶液または分散液の形態に製造することができ、または凍結乾燥技術を用いてフリーズドライされた形態に製造することができる。フリーズドライされたワクチンは、典型的に約４℃に維持され、補助剤を含むか含まない安定化溶液、例えば、食塩水または／及びＨＥＰＥＳによって復元することができる。
【００３０】
本発明の方法を実施するにおいて、投与されるワクチン量に影響を及ぼす因子としては、これに限定されるのではないが、投与方式、投与頻度、治療が進行中の特定疾病、疾病の深刻性、疾病の病歴、個体が他の治療剤とともに協力治療法が進行中であるかどうか、及び治療が進行中の個体の年齢、身長、体重、健康、及び身体条件を含む。一般的に治療が進行中の患者の体重が増加するほど、この製剤をより多く投薬することが好ましい。
【００３１】
ワクチンは、患者において免疫反応を刺激するのに効果的な量で投与することができる。例えば、ワクチンは、ヒトに１回ないし数回に分けて投与することができ、投与量は細胞数が１×１０３個／ｋｇ〜１×１０９個／ｋｇ、好ましくは１×１０４個／ｋｇ〜１×１０８個／ｋｇである。α−ガラクトシルセラミドを積載した単核球またはＩＭＣワクチンを製作する場合、単核球またはＩＭＣ１×１０６〜１×１０７個／ｍｌ当りα−ガラクトシルセラミド１〜２μｇ／ｍｌが入った培地を使用して培養する。α−ガラクトシルセラミドとペプチドを積載した単核球またはＩＭＣワクチンを製作する場合、単核球またはＩＭＣ細胞１×１０６〜１×１０７個／ｍｌ当りα−ガラクトシルセラミド１〜２μｇ／ｍｌが入った培地を使用して、ペプチドは単核球またはＩＭＣ細胞１×１０６〜１×１０７個／ｍｌを１〜１０μｇ／ｍｌペプチドが含まれた培地で培養して細胞に積載させる。
【００３２】
α−ガラクトシルセラミドは、げっ歯類及びサルにおいて毒性を誘導しないとみられている（Ｎａｋａｔａ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９８年，第５８巻，ｐ．１２０２−１２０７）。２２００μｇ／ｋｇのαＧａｌＣｅｒが注入されたマウスでも副作用は報告されていない（Ｇｉａｃｃｏｎｅ等，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００２年，第８巻，ｐ．３７０２）。進行中の臨床試験でも、αＧａｌＣｅｒの全身投与によって軽微な頭痛のような副作用が一部報告されたが（Ｍｉｅ  Ｎｉｅｄａ等，Ｂｌｏｏｄ，第１０３巻，ｐ．３８３−３８９，Ｇｉａｃｃｏｎｅ等，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００２年，第８巻，ｐ．３７０２）パラセタモール（ｐａｒａｃｅｔａｍｏｌ）投与によって予防することができ、これら対象においても微弱な全身的副作用が必ず現れるのではない（Ｇｉａｃｃｏｎｅ等，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００２年，第８巻，ｐ．３７０２）。
【００３３】
また、本発明は、α−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）が積載された単核球またはＩＭＣを媒介とするナチュラルキラーＴ細胞活性化剤を提供する。
【００３４】
前記のように、本発明のαＧａｌＣｅｒが積載された単核球またはＩＭＣは、生体内で不変性ナチュラルキラーＴ細胞を活性化して結果的に抗癌免疫を誘導した。したがって、本発明のαＧａｌＣｅｒが積載された単核球またはＩＭＣは、既存の樹状細胞と同様にナチュラルキラーＴ細胞活性化剤として用いることができる。
【００３５】
また、本発明は、癌抗原を発現する単核球またはＩＭＣを含む細胞毒性反応誘導剤を提供する。
【００３６】
アデノウイルスで形質導入した単核球またはＩＭＣワクチンは、細胞性免疫反応を誘導するためにペプチドを積載した単核球またはＩＭＣワクチンとは異なり、細胞性免疫反応及び体液性免疫反応を同時に誘導することができるという長所がある（図８、１０及び図１２参照）。
【００３７】
同時に、ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞を含む免疫治療及び予防用ワクチンを個体に投与する工程を含む、前記抗原の発現を指標とする疾患の免疫治療及び予防方法を提供する。
【００３８】
本発明が適用可能な個体は脊椎動物で、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトを除いた哺乳動物であり、それより好ましくはネズミ、ウサギ、ギニアピッグ、ハムスター、犬、猫のような実験動物で、チンパンジー、ゴリラのような類人猿類動物であることが最も好ましい。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例及び製剤例によって詳しく説明する。
但し、下記の実施例及び製剤例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例及び製剤例に限定されるのではない。
【００４０】
＜実施例１＞抗原とα−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）が一緒に積載された単核球ワクチンの抗癌効果
単核球は、樹状細胞（ＤＣ）または大食細胞に分化することができる骨髄由来の未分化前駆体細胞である。本発明では、樹状細胞または大食細胞に分化する以前状態の単核球がナチュラルキラーＴ細胞によって抗原特異的な抗癌効果を示すことができるかどうか確認した。
【００４１】
＜１−１＞αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載された単核球ワクチンの抗癌効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスから単核球を分離した。
まず、ＢＡＬＢ／ｃマウス（オリエント、韓国）の末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）と脾臓を摘出した後、均質化し、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ，米国）密度勾配を遂行して下に沈澱する顆粒球及び赤血球（ＲＢＣ）を除去した。続いて、抗−Ｂ２２０マイクロビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ，ドイツ）及び抗−ＣＤ１１ｃマイクロビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ，ドイツ）で表面にＢ２２０またはＣＤ１１ｃを発現するＢ細胞または樹状細胞を除去した後、再び、抗−ＣＤ１１ｂマイクロビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ，ドイツ）を使用してＣＤ１１ｂ＋細胞を得た。
【００４２】
前記方法で分離精製した単核球をα−ガラクトシルセラミド（１．５μｇ／ｍｌ）または溶媒（ＰＢＳ中  ０．５％ツイーン）とともに二酸化炭素培養器で１４時間培養した後、細胞毒性Ｔリンパ球の抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）ペプチドであるＨｅｒ−２／ｎｅｕ６３−７１（エニゼン、韓国）ペプチド２．５μｇ／ｍｌを１時間細胞培養液に入れてインキュベーションして積載し、積載しないペプチドを洗い流して単核球ワクチンを製作した。
【００４３】
最後に、前記αＧａｌＣｅｒ及び／または抗原ペプチドが積載された単核球ワクチンの抗癌効果を、特性がよく解明されていて細胞毒性Ｔリンパ球抗原決定基を含む癌抗原であるＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する癌細胞であるＨＥＲ−２／ＣＴ２６（Ｐｅｎｉｃｈｅｔ  ＭＬ等，Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ，１９９９年，第４９巻，ｐ．１７９−８８）を用いて確認した。
【００４４】
まず、２×１０５個のＨＥＲ−２／ＣＴ２６細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈注射で移植して一日後に、単核球／ｐｅｐ（抗原ペプチドのみ積載した群）、単核球／αＧＣ（αＧａｌＣｅｒのみ積載した群）及び単核球／ｐｅｐ／αＧＣ（抗原ペプチド及びαＧａｌＣｅｒを一緒に積載した群）ワクチンをそれぞれ投与した後、生存期間を比較した。
【００４５】
その結果、単核球／ｐｅｐを投与した場合には癌細胞のみ静脈注射したもの（対照群）と類似の生存を示し、単核球／αＧＣを投与した場合には生存期間を少し延長させた。しかし、単核球／ｐｅｐ／αＧＣワクチンを投与した場合、生存期間が有意に延長されて実際に癌細胞に対して抗癌効果を示すことが分かった（図１）。
【００４６】
＜１−２＞αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入した単核球ワクチンの抗癌効果
実施例１−１の方法で分離精製した単核球をＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原の細胞外領域及び細胞膜領域（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ＋  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）を発現する遺伝子を有したアデノウイルス（以下、ＡｄＨＭ；（株）バイロメド、大韓民国）を用いて血清を添加しない培地で１００ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で９０分間二酸化炭素培養器で感染させた後、血清を補ってαＧａｌＣｅｒ（１．５μｇ／ｍｌ）または溶媒（ＰＢＳ中０．５％ツイーン）を加えて１４時間さらに培養してワクチンを製作した。
【００４７】
最後に、前記αＧａｌＣｅｒの積載及び／または抗原を発現するアデノウイルスで形質導入した単核球ワクチンの抗癌効果を実施例１−１と同一な方法でＨＥＲ−２／ＣＴ２６を用いて確認した。
【００４８】
まず、２×１０５個のＨＥＲ−２／ＣＴ２６細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈注射して移植し、一日後に単核球／ＡｄＨＭ（抗原発現するアデノウイルスで形質導入した群）、単核球／αＧＣ（αＧａｌＣｅｒのみ積載した群）及び単核球／ＡｄＨＭ／αＧＣ（抗原発現するアデノウイルスで形質導入してαＧａｌＣｅｒを一緒に積載した群）ワクチンをそれぞれ投与した後、生存期間を比較した。
【００４９】
その結果、単核球／ＡｄＨＭを投与した場合には癌細胞のみ静脈注射したもの（対照群）と類似の生存を示し、単核球／αＧＣを投与した場合には生存期間を少し延長させた。しかし、単核球／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチンを投与した場合、生存期間が顕著に延長されて実際に癌細胞に対して優れた抗癌効果を示すことが分かった（図２）。
【００５０】
＜実施例２＞抗原とαＧａｌＣｅｒが一緒に積載された未分化骨髄性細胞（Ｉｍｍａｔｕｒｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓ；以下、ＩＭＣ）ワクチンの抗癌効果
【００５１】
＜２−１＞αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載されたＩＭＣワクチンの抗癌効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスからＩＭＣを分離した。
まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＨＥＲ−２／ＣＴ２６細胞を移植して約４週経過して癌細胞の体積が１５００ｍｍ３以上に成長した時、マウスから脾臓を摘出した後、均質化した。そこに抗−Ｂ２２０マイクロビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ，ドイツ）及び抗−ＣＤ１１ｃマイクロビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ，ドイツ）で表面にＢ２２０またはＣＤ１１ｃを発現するＢ細胞または樹状細胞を除去した。
【００５２】
前記方法で分離精製したＩＭＣをαＧａｌＣｅｒ（１．５μｇ／ｍｌ）、ビタミンＡ（ＡＴＲＡ，ａｌｌ  ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ，２０μＭ；Ｓｉｇｍａ，米国）、ＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｍｅｓ，米国）または溶媒（ＰＢＳ中０．５％ツイーン；Ｓｉｇｍａ，米国）と一緒に二酸化炭素培養器で１４時間培養した後、これから抗−ＣＤ１１ｂマイクロビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ，ドイツ）を用いてＣＤ１１ｂ＋細胞を得た。以後、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ６３−７１（エニゼン、韓国）ペプチド２．５μｇ／ｍｌで１時間積載してＩＭＣワクチンを製作した。
【００５３】
最後に、前記αＧａｌＣｅｒまたは抗原ペプチドが積載されたＩＭＣワクチンの抗癌効果を癌細胞であるＨＥＲ−２／ＣＴ２６を用いて確認した。
【００５４】
まず、２×１０５個のＨＥＲ−２／ＣＴ２６細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈注射で移植して一日後に、ＩＭＣ／ｐｅｐ（抗原ペプチドのみ積載した群）、ＩＭＣ／ｐｅｐ／ＡＴＲＡ（抗原ペプチド及びビタミンＡを一緒に積載した群）、ＩＭＣ／ｐｅｐ／ＧＭ−ＣＳＦ（抗原ペプチド及びＧＭ−ＣＳＦを一緒に積載した群）及びＩＭＣ／ｐｅｐ／αＧＣ（抗原ペプチド及びαＧａｌＣｅｒを一緒に積載した群）ワクチンをそれぞれ投与した後、生存期間を比較した。
【００５５】
その結果、ＩＭＣ／ｐｅｐ及びＩＭＣ／ｐｅｐ／ＡＴＲＡを投与した場合には生存期間を全く延長させることができず、ＩＭＣ／ｐｅｐ／ＧＭ−ＣＳＦを投与した場合はある程度生存期間を延長させた。しかし、ＩＭＣ／ｐｅｐ／αＧＣワクチンを投与した場合、有意に生存期間が延長され、実際の癌細胞に対して抗癌効果を示すことが分かった（図３）。
【００５６】
＜２−２＞αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入したＩＭＣワクチンの抗癌効果
αＧａｌＣｅｒを積載してアデノウイルスで形質導入したＩＭＣワクチンを得た。
【００５７】
実施例＜２−１＞の方法で分離精製したＩＭＣを血清を添加しない培地で１００ＭＯＩのＡｄＨＭで６０分間二酸化炭素培養器で感染させた後、血清を補って５時間さらに培養してＩＭＣワクチンを製作した。
【００５８】
続いて、２×１０５個のＨＥＲ−２／ＣＴ２６細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈注射で移植して一日後、ＩＭＣ、ＩＭＣ／ＡｄＨＭ（抗原発現するアデノウイルスで形質導入した群）、及びＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣ（抗原発現するアデノウイルスで形質導入してαＧａｌＣｅｒを一緒に積載した群）ワクチンをそれぞれ投与した後、生存期間を比較した。
【００５９】
その結果、ＩＭＣ／ＡｄＨＭを投与した場合には生存期間を少し延長させたが、ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチンを投与した場合に生存期間が顕著に延長され、実際の癌細胞に対して優れた抗癌効果を示すことが分かった（図４）。
【００６０】
＜実施例３＞ＩＭＣワクチンによる抗癌効果を示す免疫細胞確認
ＩＭＣワクチンによる抗癌効果を示す免疫細胞を確認した。
まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＨＥＲ−２／ＣＴ２６癌細胞を静脈注射する一日前から４日間隔で、それぞれの免疫細胞を除去するための抗体［抗ＣＤ４除去抗体：ＧＫ１．５  ｈｙｂｒｏｄｏｍａ（ＡＴＣＣ，米国）、抗ＣＤ８除去抗体：２．４３  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（ＡＴＣＣ，米国）、抗ＮＫ除去抗体（Ｗａｋｏ，米国）：α−ａｓｉａｌｏＧＭ１抗体（Ｗａｋｏ，米国）］を腹腔注射した後、癌細胞注入一日後に実施例＜２−２＞と同一な方法で製作されたＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチンを静脈注射してマウスの生存期間を比較した。
【００６１】
その結果、ＮＫ細胞を除去した群（ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣ／ａ−ＮＫ）では癌細胞のみを注入した群（対照群）と類似の生存率を示し、ＮＫ細胞がＩＭＣワクチンの抗癌治療効果を示すのに重要な免疫細胞であることが分かった（図５ａ）。また、ＣＤ８＋細胞を除去した群（ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣ／ａ−ＣＤ８）でも免疫細胞除去なしにＩＭＣワクチンを投与した群（ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣ）に比べて生存期間が有意に減少する傾向を示し、ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチンによる抗癌効果が、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介されることを確認した（図５ｂ）。しかし、ＣＤ４＋細胞を除去した群（ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣ／ａ−ＣＤ４）では、ワクチンのみを投与した群（ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣ）と類似か若干増加した程度の生存率を示し、ＣＤ４＋細胞が抗癌効果を示すのに特別な影響を及ぼすことができなかったことを示唆した（図５ｂ）。
【００６２】
＜実施例４＞抗原とαＧａｌＣｅｒが一緒に積載された単核球ワクチンによる抗原特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性化
単核球ワクチンが、ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させて細胞毒性免疫反応を誘導することができるのかどうかを調べるために、生体内細胞毒性試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＴＬ  ａｓｓａｙ）を実施した。
【００６３】
＜４−１＞αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載された単核球ワクチンによる抗原ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性化
αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載された単核球ワクチンが、ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させて細胞毒性免疫反応を誘導することができるのかどうかを調べるために、生体内細胞毒性試験を実施した。
【００６４】
具体的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスを実施例＜１−１＞の方法で得た単核球単独、単核球／ｐｅｐ、単核球／ｐｅｐ／αＧＣにそれぞれ免疫化した後、９日後に細胞毒性試験を行なった。まず、同種の免疫化されていないマウスの脾臓単一細胞を同量の二群に分けた後、一群はＨｅｒ−２／ｎｅｕ６３−７１ペプチド（２．５μｇ／ｍｌ）を積載した後、２０μＭのＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ．ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）で標識し（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）、他の群はペプチド積載なしに２．５μＭのＣＦＳＥで標識して対照細胞にした（ＣＦＳＥｌｏｗ）。前記二つの群の細胞を同量ずつ混合して免疫化したマウスに投与した後、一日後に脾臓単一細胞を摘出してＣＦＳＥｈｉｇｈとＣＦＳＥｌｏｗ細胞集団をフローサイトメーターを通じて測定した。ここで、ＣＦＳＥｈｉｇｈの割合が低いほど細胞毒性免疫反応が高く現れたことを意味する。
【００６５】
また、単核球／ｐｅｐ／αＧＣワクチンの細胞の数を５×１０６、１×１０６、２×１０５及び４×１０４に変えて免疫化した後、９日後にＣＦＳＥを用いた前記方法と同一に細胞毒性試験を行なった。
【００６６】
その結果、単核球単独、単核球／ｐｅｐを投与した群では、細胞毒性反応がほとんど示されず、単核球／ｐｅｐ／αＧＣを投与した群でのみ高い程度にペプチドが積載した標的を破壊する能力を有した細胞毒性反応を示した（図６）。また、単核球／ｐｅｐ／αＧＣワクチンの細胞数を異にして生体内細胞毒性試験を同一に進行した結果、１×１０６個の細胞だけでも効果的な細胞毒性反応を誘導させられることが分かった（図７）。
【００６７】
＜４−２＞αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入した単核球ワクチンによる抗原特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性化
【００６８】
αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入した単核球ワクチンがペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させて細胞毒性免疫反応を誘導することができるのかどうか調べるために、生体内細胞毒性試験を実施した。
【００６９】
具体的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに実施例＜１−２＞の方法で得た単核球／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチンの細胞数を２×１０６、１×１０６、５×１０５及び２．５×１０５に変えて免疫化した後、１０日後に実施例＜４−１＞の方法で細胞毒性試験を行なった。
【００７０】
その結果、２×１０６個の単核球ワクチンに免疫化した場合には効果的に細胞毒性反応が示されたが、１×１０６個以下で免疫化した場合には低い程度の細胞毒性反応が観察された（図８）。この場合、単核球／ｐｅｐ／αＧＣワクチンと比べて細胞毒性反応がさらに低く測定されたが、実際の抗癌効果の側面では単核球／ｐｅｐ／ａＧａｌＣｅｒワクチンに比べて生存期間を延ばす能力がさらに優れていたので、アデノウイルスワクチンが細胞毒性Ｔ細胞反応以外の免疫反応を追加で生成させ得ることが類推できる。
【００７１】
＜実施例５＞抗原とαＧａｌｃｅｒが一緒に積載されたＩＭＣワクチンによる抗原特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性化
ＩＭＣワクチンが、ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させて細胞毒性免疫反応を誘導することができるのかどうか調べるために、生体内細胞毒性試験を実施した。
【００７２】
＜５−１＞αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載されたＩＭＣワクチンによる抗原ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性化
αＧａｌＣｅｒと抗原ペプチドが一緒に積載された単核球ワクチンがペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させて細胞毒性免疫反応を誘導することができるのかどうか調べるために生体内細胞毒性試験を実施した。
【００７３】
具体的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスを実施例＜２−１＞の方法で得たＩＭＣ／ｐｅｐ、ＩＭＣ／ｐｅｐ／αＧＣ、ＩＭＣ／ｐｅｐ／ＡＴＲＡ、ＩＭＣ／ｐｅｐ／ＧＭ−ＣＳＦにそれぞれ免疫化した後、１０日後に実施例＜４−１＞の方法で細胞毒性試験を行なった。
【００７４】
その結果、ＩＭＣ／ｐｅｐ投与群及びＩＭＣ／ｐｅｐ／ＡＴＲＡ投与群では低い程度の細胞毒性が観察され、ＩＭＣ／ｐｅｐ／ＧＭ−ＣＳＦ投与群ではそれより少し高い程度の細胞毒性を示した。しかし、ＩＭＣ／ｐｅｐ／αＧＣワクチンを投与した群では顕著に高い水準の体内細胞毒性を誘導させることを確認することができた（図９）。これは、ＩＭＣ／ｐｅｐ／αＧＣワクチンが効果的に抗原特異的な細胞毒性反応を誘導させて癌細胞を破壊することにより、実施例＜２−１＞と同様に有意に抗癌効果を示すことができたことを意味する。
【００７５】
＜５−２＞αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入したＩＭＣワクチンによる抗原特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性化
αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入したＩＭＣワクチンが、ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させて細胞毒性免疫反応を誘導することができるのかどうか調べるために、生体内細胞毒性試験を実施した。
【００７６】
具体的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに実施例＜２−２＞の方法で得たＩＭＣ、ＩＭＣ／ＡｄＨＭ、ＩＭＣ／αＧＣ、ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣでそれぞれ免疫化した後、１０日後に実施例＜４−１＞の方法で細胞毒性試験を行なった。
【００７７】
また、ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチンの細胞の数を８×１０６、２×１０６、５×１０５及び１．２５×１０５に変えて免疫化した後、１０日後に実施例＜４−１＞の方法で細胞毒性試験を行なった。
【００７８】
その結果、ＩＭＣ単独、ＩＭＣ／αＧＣを投与した群に比べてＩＭＣ／ＡｄＨＭを投与した時、細胞毒性反応が有意に増加し、ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣを投与した群でさらに増加して示された（図１０）。実施例＜５−１＞のペプチドワクチンを用いた結果と比べると、その数値が高くはないが、ペプチドワクチンの場合は細胞毒性細胞の抗原決定基ペプチドのみを積載した一方、全体抗原を有するウイルスで形質導入した細胞ワクチンの場合は抗原決定基のみを特異的に発現させたのではなくて、形質導入効率が完璧ではないので相対的に特定抗原ペプチド特異的な細胞毒性反応が低く測定され得る。
【００７９】
また、ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチンの細胞数を異にして生体内細胞毒性試験を同一に行なった結果、８×１０６個の細胞で免疫化した場合で９０％に近い細胞毒性反応が示され、ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣが効果的に抗原特異的な細胞毒性反応を誘導することを確認することができた（図１１）。
【００８０】
＜実施例６＞αＧａｌＣｅｒを積載して抗原を発現するアデノウイルスで形質導入した単核球ワクチンによって誘導される抗原特異的な抗体反応
抗原を発現するアデノウイルスで形質導入した単核球ワクチンが細胞性免疫反応だけでなく体液性免疫反応を誘導することができるのかどうか調べるため、ＡｄＨＭに形質導入された単核球ワクチンの投与がＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的な抗体を生成させることができるのかどうか詳しく調べた。
【００８１】
具体的に、実施例＜１−２＞の方法で得た単核球／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチンを細胞数を変化させて、ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈投与した。いかなる処理もしていない同種のマウス血清を対照群にした。１０日後、眼窩採血でそれぞれのマウスから血液を抽出して常温で２時間放置した後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を分離した。血清中の抗−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗体の生成程度を調べるために、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを細胞表面に発現するマウス癌細胞であるＨＥＲ−２／ＣＴ２６細胞と４℃で６０分間培養した。そこに、ＦＩＴＣで標識されたマウス抗体に結合する２次抗体を使用してＨＥＲ−２／ＣＴ２６細胞に結合したマウス抗体の結合程度をフローサイトメーターによって確認した。
【００８２】
その結果、２×１０６個の細胞を投与した群の抗体生成が最も高く示され、１×１０６または５×１０５個の細胞を投与した群でも有意に抗体生成が観察された（図１２）。しかし、２．５×１０５個の細胞以下で投与した群では抗体生成が観察されなかった。
【００８３】
＜実施例７＞αＧａｌＣｅｒとオブアルブミンペプチドが一緒に積載されたＩＭＣワクチンによる抗原ペプチド特異的な細胞毒性Ｔリンパ球の活性化
ＩＭＣワクチンの投与に先立って確認したＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原以外の他の多様な抗原に対しても、特異的な細胞毒性Ｔリンパ球を活性化させて細胞毒性免疫反応を誘導することができるのかどうか調べるため、αＧａｌＣｅｒと一般的にモデル抗原として広く使用されているオブアルブミンのＯＴ−１ペプチド（Ｈ−２Ｋｂ−ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｏｖａｌｂｕｍｉｎ  ２５７−２６４  ａａ  ｐｅｐｔｉｄｅ、配列番号１  ＳＩＩＮＦＥＫＬ）が一緒に積載されたＩＭＣワクチンに対して生体内細胞毒性試験を実施した。
【００８４】
まず、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（オリエント、韓国）にマウス胸腺種細胞株（ｍｕｒｉｎｅ  ｔｈｙｍｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）であるＥＬ４細胞（ＡＴＣＣ、米国）を移植して約４週経て癌細胞の体積が１５００ｍｍ３以上に成長した時、マウスから脾臓を摘出した後、均質化し、抗−Ｂ２２０マイクロビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ，ドイツ）で表面にＢ２２０を発現するＢ細胞を除去した。
【００８５】
前記方法で分離精製したＩＭＣをαＧａｌＣｅｒ（１．５μｇ／ｍｌ）または溶媒（ＰＢＳ中０．５％ツイーン）とともに二酸化炭素培養器で１４時間培養した後、それから抗−ＣＤ１１ｂマイクロビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ，ドイツ）を用いてＣＤ１１ｂ＋細胞を得た。以後、ＯＴ−１ペプチド２μｇ／ｍｌで１時間積載してＩＭＣワクチンを製作した。
【００８６】
具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから前記方法で得たＩＭＣ／ｐｅｐまたはＩＭＣ／ｐｅｐ／αＧａｌＣｅｒでそれぞれ免疫化した後、１０日後に細胞毒性試験を行なった。まず、同種の免疫化されていないマウスの脾臓単一細胞を同量の二群に分けた後、一群はＯＴ−１ペプチド（２μｇ／ｍｌ；エニゼン、韓国）を積載した後、２０μＭのＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ．ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国）で標識した（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）、他の群はペプチド積載なしに２．５μＭのＣＦＳＥで標識して対照細胞にした（ＣＦＳＥｌｏｗ）。前記二群の細胞を同量ずつ混合して免疫化したマウスに投与した後、一日後に脾臓単一細胞を摘出して、ＣＦＳＥｈｉｇｈとＣＦＳＥｌｏｗ細胞集団をフローサイトメーターで測定した。
【００８７】
その結果、図１３に示されたようにＩＭＣ／ｐｅｐを投与した場合には、なにも投与しないマウスと類似に細胞毒性反応をほとんど誘導させることができなかった一方、ＩＭＣ／ｐｅｐ／αＧａｌＣｅｒで免疫化した場合には、ほとんど１００％に近い高水準の細胞毒性反応を誘導させることを確認した。すなわち、ＩＭＣ／ｐｅｐ／αＧａｌＣｅｒの投与がＩＭＣに抗原ペプチドのみを積載したもの（ＩＭＣ／ｐｅｐ）に比べて、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗原だけではなく異種の抗原であるオブアルブミン抗原に対しても効果的な細胞毒性反応を示すことができることを確認し、これを通じて、ＩＭＣワクチンによる効果的な免疫反応が特定抗原に限ったものではなく、多様な抗原に対しても適用され得ることが分かった。
【００８８】
＜製剤例１＞単核球／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチンを有効成分として含む注射液剤の製造方法
本発明の抗癌用ワクチンの注射液剤は、下記の方法で製造した。
α−ガラクトシルセラミド１〜２μｇ／ｍｌ、単核球／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチン５×１０６個／ｍｌ、ペプチド１〜２μｇ／ｍｌ、５’−クロロ−３，２’−ジヒドロカルコンまたは５’−クロロ−２，３’−ジヒドロカルコン塩酸塩１ｇ、塩化ナトリウム０．６ｇ及びアスコルビンサン０．１ｇを蒸留水に溶解させて１００ｍｌを作った。前記溶液を瓶に入れて２０℃で３０分間加熱して滅菌させた。
【００８９】
＜製剤例２＞ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチンを有効成分として含む注射液剤の製造方法
本発明の抗癌用ワクチンの注射液剤は、下記の方法で製造した。
α−ガラクトシルセラミド１〜２μｇ／ｍｌ、ＩＭＣ／ＡｄＨＭ／αＧＣワクチン８×１０６個／ｍｌ、ペプチド１〜２μｇ／ｍｌ、５’−クロロ−３，２’−ジヒドロカルコンまたは５’−クロロ−２，３’−ジヒドロカルコン塩酸塩１ｇ、塩化ナトリウム０．６ｇ及びアスコルビンサン０．１ｇを蒸留水に溶解させて１００ｍｌを作った。前記溶液を瓶に入れて２０℃で３０分間加熱して滅菌させた。
【００９０】
本発明内に記載された概念および具体的な実施形態は、本発明の目的を遂行する他の実施形態に変形させたり設計するにおいて、その基準として容易に使用できるであろう。また、そのような同等な実施形態等は、添付した請求項同様、本発明の技術的事項および範囲から逸脱するものではない。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号１：Ｈ−２Ｋｂ−提示オバルブミン  ２５７−２６４  ａａ  ペプチド
【図１】
2011503174.tif 000003
【図２】
2011503174.tif 000004
【図３】
2011503174.tif 000005
【図４】
2011503174.tif 000006
【図５】
2011503174.tif 000007
【図６】
2011503174.tif 000008
【図７】
2011503174.tif 000009
【図８】
2011503174.tif 000010
【図９】
2011503174.tif 000011
【図１０】
2011503174.tif 000012
【図１１】
2011503174.tif 000013
【図１２】
2011503174.tif 000014
【図１３】
2011503174.tif 000015
【配列表】
2011503174000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月19日(2008.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞（Ｉｍｍａｔｕｒｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓ；以下，ＩＭＣ）を含む免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項２】
ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドが、α−ガラクトロノシルセラミド、α−グルクロノシルセラミド、ホスファチジリノシトルテトラマンノサイド、イソグロボトリヘキソシルセラミド、ガングリオサイドＧＤ３、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スルファチド、β−ガラクトシルセラミド、リポホスホグリカン、グリコイノシトールホスホリピド、α−ガラクトシルセラミドの類似体であるβ−アノマガラクトシルセラミド及びα−アノマガラクトシルセラミド、バクテリア脂質抗原からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項３】
前記抗原が、病原菌、ウイルス及び寄生虫を含む病原体由来の抗原または癌抗原であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項４】
病原菌由来の抗原が、百日咳菌抗原（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ，ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）、破傷風菌抗原、ジフテリア菌抗原（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ）、ヘリコバクター・ピロリ抗原（ｃａｐｓｕｌａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ｓｅｒｏｇｒｕｐ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｙ及びＷ−１３５）、肺炎菌抗原（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｍｏｎｉａｅ  ｔｙｐｅ３  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、結核菌抗原、コレラ抗原（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ）、ブドウ状球菌抗原（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ）、赤痢菌抗原（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐ．）抗原、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）抗原及びプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）抗原からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項５】
ウイルス由来の抗原が、インフルエンザウイルス抗原（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ及びｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ抗原）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、小水泡性口内炎ウイルス抗原（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、肝炎ウイルス抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ（ＨＡＶ）、Ｂ（ＨＢＶ）、Ｃ（ＨＣＶ）、Ｄ（ＨＤＶ）及びＧ（ＨＧＶ）抗原）（ｃｏｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原、ヘルペスシンプレックスウイルス抗原、ヒト免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ）抗原（ＧＰ−１２０、ＧＰ−１６０、ｐ１８、Ｔａｔ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ）及びその組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項６】
癌抗原が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕによって発現される乳癌タンパク質、プロテイナーゼ３、ＷＴ−１、ムリノグロブリン（ＭＵＣ−１）、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｇ２５０、メラノ−マ抗原遺伝子（ＭＡＧＥ、ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｅｎｅ）、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、チロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＲＰ−１）、ＴＲＰ−２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＭＣＩＲ、Ｉｇ  Ｉｄｉｏｔｙｐｅ、ＣＤＫ４、カスパーゼ−８、β−カテニン、ＣＩＡ、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７）、ＥＢＶ  ＬＭＰ２ａ、ＨＣＶ、ＨＨＶ−８、５Ｔ４、癌胚芽抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、ｐ５３及びα−フェトプロテイン（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項７】
抗原が、ペプチド、脂質多糖類、多糖類、糖蛋白質またはポリヌクレオチドの形態を有することを特徴とする請求項１に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項８】
前記抗原が、組換えウイルスによって導入されて発現することを特徴とする請求項１に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項９】
前記組換えウイルスが、抗原を発現する遺伝子が導入されたアデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス（Ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）であることを特徴とする請求項８に記載の免疫治療及び予防用ワクチン。
【請求項１０】
α−ガラクトシルセラミドが積載された単核球または未分化骨髄性細胞を含むナチュラルキラーＴ細胞活性化剤。
【請求項１１】
癌抗原を発現する単核球または未分化骨髄性細胞を含む細胞毒性反応誘導剤。
【請求項１２】
ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞を含む免疫治療及び予防用ワクチンを個体に投与する工程を含む前記抗原の発現を指標とする疾患の免疫治療方法。
【請求項１３】
ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドと抗原を積載した単核球または未分化骨髄性細胞を含む免疫治療及び予防用ワクチンを個体に投与する工程を含む前記抗原の発現を指標とする疾患の免疫予防方法。
【請求項１４】
ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドを積載した単核球または未分化骨髄性細胞を含む免疫治療及び予防用ワクチンを個体に投与する工程を含む前記抗原の発現を指標とする疾患の免疫治療方法。
【請求項１５】
ナチュラルキラーＴ細胞のリガンドを積載した単核球または未分化骨髄性細胞を含む免疫治療及び予防用ワクチンを個体に投与する工程を含む前記抗原の発現を指標とする疾患の免疫予防方法。
【国際調査報告】
2011503174.tif 000016
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