(57)【要約】  対象となる標的微生物のサンプルを分析する方法が記載される。特に、該方法は、ザイモサンなどの偏在する細胞壁構成成分の存在に基づいて様々な酵母及びカビ微生物を検出するのに有用である。リポソーム及び／又は培養基を使用して真菌微生物のサンプルを分析する方法も記載される。
2011515656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的微生物又はその構成要素を検出するための方法であって、
ザイモサンに選択的に結合する認識要素を用意する工程と、
前記認識要素を前記標的微生物を含有している疑いのあるサンプルと接触させる工程と、
前記標的微生物を検出する工程と、を含む方法。
【請求項２】
標的微生物又はその構成要素を検出するための方法であって、
ザイモサンに選択的に結合する認識要素を用意する工程と、
検出可能なシグナルを生成し、連結部分を含む、シグナリング要素を用意する工程と、
前記認識要素及び前記シグナリング要素を、前記標的微生物を含有している疑いのあるサンプルと接触させる工程と、
前記検出可能なシグナルを検出する工程と、を含む方法。
【請求項３】
標的微生物又はその構成要素を検出するための方法であって、
ザイモサンに選択的に結合する認識要素を用意する工程と、
検出可能なシグナルを生成し、前記認識要素がそれに連結されるシグナリング要素を用意する工程と、
前記認識要素及び前記シグナリング要素を、前記標的微生物を含有している疑いのあるサンプルと接触させる工程と、
前記検出可能なシグナルを検出する工程と、を含む方法。
【請求項４】
標的微生物又はその構成要素を検出するための方法であって、
脂質二重層と検出可能なシグナルを生成するシグナリング要素とを含む脂質小胞を用意する工程と、
細胞壁構成成分に選択的に結合する認識要素を用意する工程と、
前記脂質小胞と、前記標的微生物が存在する場合、その標的微生物との結合を引き起こすのに有効な条件下で、前記脂質小胞及び前記認識要素を、前記標的微生物を含有している疑いのあるサンプルと接触させる工程と、
前記検出可能なシグナルを検出する工程と、を含む方法。
【請求項５】
前記脂質二重層が少なくとも１つのビオチン分子を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記認識要素が少なくとも１つのビオチン分子を含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
ビオチン結合分子を用意する工程を更に含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｉ）培養デバイスの中に培養液を用意する工程と、ｉｉ）少なくとも１つの細胞分裂が可能な条件下で前記サンプルを培養する工程と、を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
生存微生物を前記培養デバイスから除去する工程を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプル中の微生物を溶解する工程を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｉ）捕捉試薬を用意する工程と、ｉｉ）前記標的微生物又はその構成要素を捕捉する工程と、を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記シグナリング要素が、脂質小胞、磁性粒子、ポリマー粒子、又は金粒子を含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記シグナリング要素がポリペプチドを含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記シグナリング要素がポリヌクレオチドを含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記シグナリング要素が、検出可能なシグナルに転換される潜在シグナル成分を含む、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ｉ）シグナル生成要素を用意する工程と、ｉｉ）前記潜在シグナル成分を検出可能なシグナルに転換するために、前記シグナル生成要素を前記シグナリング要素と接触させる工程と、を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記シグナル生成要素が活性化可能なシグナル生成要素であり、かつ前記活性化可能なシグナル生成要素を活性化する工程を更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記活性化可能なシグナル生成要素がポリペプチドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、活性化されると膜の透過性を調節する前記ポリペプチドの能力を高める活性化可能な構造体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記活性化可能な構造体が加水分解性結合を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドがｐＨ変化によって活性化される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルの中の前記標的微生物を計数する工程を更に含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出可能なシグナルが光学的に検出されることができる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
光学的に検出することが、比色検出、蛍光検出、あるいは光測量検出を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
光学的に検出することが機器を用いて検出することを含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
ザイモサンに選択的に結合する認識要素と、
検出可能なシグナルを生成する粒子を含むシグナリング要素と、を含む、標的微生物を検出するための組成物。
【請求項２７】
前記粒子が脂質小胞を含む、請求項２６に記載のシグナリング要素。
【請求項２８】
前記粒子が蛍光分子を含む、請求項２６に記載のシグナリング要素。
【請求項２９】
前記粒子が磁性粒子を含む、請求項２６に記載のシグナリング要素。
【請求項３０】
前記粒子がポリマー粒子を含む、請求項２６に記載のシグナリング要素。
【請求項３１】
前記粒子が金粒子を含む、請求項２６に記載のシグナリング要素。
【請求項３２】
前記粒子がポリペプチドを含む、請求項２６に記載のシグナリング要素。
【請求項３３】
連結部分を更に含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３４】
前記認識要素が前記シグナリング要素に連結される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記シグナリング要素が、検出可能なシグナルに転換される潜在シグナリング要素を含む、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記潜在シグナリング要素が酵素基質を含む、請求項３５に記載のシグナリング要素。
【請求項３７】
前記シグナリング要素がポリペプチドを含む、請求項３５に記載のシグナリング要素。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが酵素活性を含む、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
シグナル生成要素を更に含み、前記シグナル生成要素が前記潜在シグナリング要素を検出可能なシグナルに転換する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
前記シグナル生成要素が活性化可能である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記活性化可能なシグナル生成要素がポリペプチドを含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、活性化されると膜の透過性を調節する前記ポリペプチドの能力を高める活性化可能な構造体を含む、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記活性化可能な構造体が加水分解性結合を含む、請求項４１又は４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記加水分解性結合がエステル結合又はアミド結合である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記シグナル生成要素がｐＨ変化によって活性化される、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
捕捉剤を更に含む、請求項２６〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記捕捉剤が固体支持体に付着される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記固体支持体が、プラスチックフィルム、プラスチック物品、金属フィルム、粒子、膜、ヒドロゲル、セルロース組成物、不織布、繊維、及びマイクロチャネルからなる群から選択される、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記捕捉剤又は前記認識要素がザイモサンに選択的に結合する、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記捕捉剤及び前記認識要素がザイモサンに選択的に結合する、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記捕捉剤又は前記認識要素が、ザイモサン結合ドメインを有するポリペプチドを含む、請求項２６〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ポリペプチドが、ザイモサンに選択的に結合する、抗体又は前記抗体から誘導される抗原結合断片を含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記抗体の抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ）ａｂ）２断片、単鎖Ｆｖ、及びＦｖ断片からなる群から選択される、請求項５２に記載の抗体の抗原結合断片。
【請求項５４】
前記ポリペプチドが受容体を含む、請求項５１に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記受容体がデクチン−１からの糖鎖認識ドメインを含む、請求項５４に記載の受容体。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが、デクチン−１の前記糖鎖認識ドメインによって認識されるザイモサンの同じエピトープに結合する、請求項５１に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年２月１４日に出願された米国仮出願第６１／０２８，８９８号の利益を主張するものであり、該仮出願は、参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
真菌微生物（例えば、酵母及びカビ）は自然界に偏在している。これらは抗生物質又は酵素製造などの一部の分野においては有用であり得るが、真菌微生物（例えば、酵母及びカビ）は食品の損傷の原因となることが知られており、特定の種は、毒素を作り出す、又はヒト若しくは動物の感染の原因になることが知られている。
【０００３】
真菌微生物は、非常に大きく且つ多種多様な有機栄養種を含む。約１５００種の酵母が存在する。ほとんどの酵母種は単細胞生物として存在し、出芽によって増殖する。多細胞形態で存在する種もあれば、二分裂で増殖する種もある。カビには、長い多細胞菌糸を形成することができる糸状菌が挙げられる。カビは、典型的には極端に高い、あるいは低い温度等のいくつもの悪い環境条件に耐性がある小胞子を形成して増殖する。
【０００４】
真菌微生物の存在は、典型的には、標準的な培養技術で検出される。サンプルを培養液の中に置き、微生物の増殖が可能な期間培養する。培養後、コロニーが目に見える場合があり、又は、別の方法としては、微生物を観察しかつ同定するために、サンプルを顕微鏡的に見ることができる。成長ベースの培養試験は、依然として、真菌微生物を検出及び計数するための最も一般的な方法である。
【０００５】
真菌微生物は様々な速度で成長する。ある酵母種は約３０〜４０分間隔で細胞分裂することができる。これら酵母生物は、約１〜２日で検出及び計数することができる。これに対して、あるカビはそれぞれの細胞分裂に数時間を要する。これらのカビは、４〜５日後に検出及び計数することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
真菌微生物を検出及び計数するために現在利用可能である方法は多く存在するが、真菌微生物を検出及び計数するための、より速く、より高感度な方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、サンプル中の酵母及び／又はカビ微生物の検出及び、任意に、計数に関する。真菌微生物の遺伝的多様性及び生化学的多様性にかかわらず、本発明の方法及び組成物は、サンプル中の様々な酵母及びカビ微生物の簡単で且つ同時検出の手だてとなっている。
【０００８】
一態様において、本開示は、標的微生物又はその構成要素を検出するための方法を提供する。該方法は、認識要素、及び標的微生物を含有している疑いのあるサンプル、を用意する工程を含み、この認識要素はザイモサンに選択的に結合する。該方法は、サンプルと認識要素との間の接触をもたらす工程と、標的微生物を検出する工程と、を更に含む。任意に、該方法は、培養デバイスの中に培養液を用意する工程と、少なくとも１つの細胞分裂が可能な条件下でサンプルを培養する工程と、を更に含に含んでもよい。
【０００９】
別の態様において、本開示は、標的微生物又はその構成要素を検出するための方法を提供する。該方法は、ザイモサンに選択的に結合する認識要素、検出可能なシグナルを生成するシグナリング要素、及び標的微生物を含有している疑いのあるサンプルを用意する工程を含むことができる。シグナリング要素は連結部分を含むことができる。該方法は、サンプルと認識要素との間の接触をもたらす工程と、検出可能なシグナルを検出する工程と、を更に含むことができる。任意に、該方法は、培養デバイスの中に培養液を用意する工程と、少なくとも１つの細胞分裂が可能な条件下でサンプルを培養する工程と、を更に含んでもよい。
【００１０】
別の態様において、本開示は、標的微生物又はその構成要素を検出する方法を提供する。該方法は、認識要素、検出可能なシグナルを生成するシグナリング要素、及び標的微生物を含有している疑いのあるサンプルを用意する工程を含むことができる。認識要素はシグナリング要素に連結されることができ、かつ、ザイモサンに選択的に結合することができる。該方法は、サンプルと認識要素との間に接触をもらす工程と、検出可能なシグナルを検出する工程と、を更に含むことができる。任意に、該方法は、培養デバイスの中に培養液を用意する工程と、少なくとも１つの細胞分裂が可能な条件下でサンプルを培養する工程と、を更に含んでもよい。
【００１１】
別の態様において、本開示は、標的微生物又はその構成要素を検出するための方法を提供する。該方法は、脂質二重層と検出可能なシグナルを生成するシグナリング要素とを含む脂質小胞、細胞壁構成成分に選択的に結合する認識要素、及び標的微生物を含有している疑いのあるサンプル、を用意する工程を含むことができる。該方法は、脂質小胞と、存在する場合には、標的微生物との結合を引き起こすのに有効な条件下で、認識要素、及び脂質小胞を、サンプルと接触させる工程と、検出可能なシグナルを検出する工程と、を更に含むことができる。任意に、該方法は、培養デバイスの中に培養液を提供する工程と、少なくとも１つの細胞分裂が可能な条件下でサンプルを培養する工程と、を更に含に含んでもよい。
【００１２】
別の態様において、本開示は、標的微生物を検出するための組成物を提供する。該組成物は、ザイモサンに選択的に結合することができる捕捉剤と、検出可能なシグナルを生成するシグナリング要素と、を含むことができる。
【００１３】
用語「検体」及び「抗原」は、交換可能に使用され、対象となる微生物（即ち、病原菌）に特徴的な種々の分子（例えば、ザイモサン）、若しくは分子のエピトープ（例えば、ザイモサンの異なる結合部位）、又は微生物の全細胞を指す。これらは、細胞壁の構成要素（例えば、細胞壁タンパク質）、外部細胞壁構成成分（例えば、マンナン、キチン又はザイモサン）、内部細胞構成要素（例えば、細胞質膜タンパク質）等を含む。
【００１４】
用語「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の状況下で、特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は他の状況下において、他の実施形態もまた好ましい可能性がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の詳細説明は、他の実施形態が有用でないことを示すものではなく、本発明の範囲内から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
【００１５】
用語「有する（含む）」及びこの変形は、これらの用語が明細書及び特許請求の範囲中に現れる場合、制限する意味を有さない。
【００１６】
本明細書で使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」は、同じ意味で使用される。したがって、１つの（ａ）標的微生物を含有している疑いのあるサンプルは、サンプルが「１つ以上の」標的微生物を含んでいる可能性があるということを意味すると解釈することができる。
【００１７】
用語「及び／又は」は、列記されている要素の１つ若しくはすべて、又は列記されている要素の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００１８】
また本明細書において、端点による数の範囲の列挙には、その範囲内に包含される全ての数（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等）が包含される。
【００１９】
本発明の上記の「課題を解決するための手段」は、本発明が開示するそれぞれの実施形態又は全ての実施例を説明することを意図したものではない。以下の説明により、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本明細書にわたっていくつかの箇所で、実施例の一覧を通してガイダンスを提供するが、実施例は様々な組み合わせにおいて使用できる。それぞれの事例において、列挙された一覧は、代表的な群としてのみ役目を果たすのであって、排他的な一覧として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明は、以下に列挙される図面を参照して更に説明され、類似構造は、いくつかの図にわたって、類似番号によって参照される。
【図１】本発明の一実施形態による、シグナリング要素と標的微生物との間の結合相互作用を示している。
【図２ａ】本発明の一実施形態による、標的微生物と、認識要素と、標識した第２の認識要素との間の結合相互作用を示している。
【図２ｂ】本発明の一実施形態による、標的微生物と、ビオチンで標識した認識要素と、ストレプトアビジンで標識したシグナリング要素との間の結合相互作用を示している。
【図３】本発明の一実施形態による、支持材料に付着している捕捉剤と、細胞壁構成成分と、ビオチンで標識した認識要素と、ストレプトアビジン（streptaidin）で標識したシグナリング要素との間の結合相互作用を示している。
【図４ａ】本発明の一実施形態による、標的微生物と、ビオチンで標識した認識要素と、潜在シグナリング要素を含有するビオチンで標識した脂質小胞との間の結合相互作用を示している。
【図４ｂ】図４ａの潜在シグナリング要素の活性化を示している。
【図５ａ】本発明の一実施形態による、標的微生物、ビオチンで標識した認識要素、ストレプトアビジン、及び潜在シグナリング要素を含有するビオチンで標識した脂質小胞の結合相互作用を示している。
【図５ｂ】図５ａの潜在シグナリング要素の活性化を示している。
【図６ａ】本発明の一実施形態による、支持材料に付着している捕捉剤、細胞壁構成成分、ビオチンで標識した認識要素、ストレプトアビジン、及び潜在シグナリング要素を含有するビオチンで標識した脂質小胞の結合相互作用を示している。
【図６ｂ】図６ａの潜在シグナリング要素の活性化を示している。
【図７ａ】サンプル中の標的微生物を検出するために捕捉剤を使用する方法のブロック図。
【図７ｂ】サンプル中の標的微生物の検出方法のブロック図。
【図７ｃ】サンプル中の標的微生物を検出するために増殖段階を用いる方法のブロック図。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
酵母及びカビ微生物の多様性は、これらの群内のほとんど又は全ての種を検出するための迅速な方法を開発しようと試みる場合の課題を提示する。多様性は、真菌微生物のゲノム及びプロテオームの違いに見ることができる。多様性は、従来の培養基上の微生物の比較的広範囲にわたる増殖速度にも反映される。
【００２２】
本開示は、多種多様な酵母及びカビ微生物を迅速に検出するための方法及び組成物に関する。該方法は、多数の多様性のある真菌微生物に存在する検体（例えば、細胞壁構成成分）に選択的に結合して、微生物を検出するためにシグナリング要素を送達する認識要素の使用を含む。多くの真菌微生物の細胞壁に見られるグルカンであるザイモサンは、酵母及びカビ微生物を検出するために好ましい検体である。
【００２３】
菌類の細胞壁マトリックスの主な多糖類は、ザイモサン及びグリコーゲン様化合物などの非セルロースグルカン、マンナン（マンノースのポリマー）、キトサン（グルコサミンのポリマー）、並びにガラクタン（ガラクトースのポリマー）で構成される。少量のフコース、ラムノース、キシロース、及びウロン酸が存在してもよい。
【００２４】
多くの菌類、特に酵母は、可溶性ペプチドマンナンを、α−及びβ−グルカンのマトリックス内の外側細胞壁の構成要素として有する。マンナン、ガラクトマンナン、及び、それほど多くはないが、ラムノマンナン（rhamnomannans）は、多くの医学的に重要な酵母及びカビに対する免疫応答に関与している。マンナンは、α−Ｄ−マンナン主鎖を有するマンノース又はヘテログルカンのポリマーである。構造上、マンナンは、内核、外鎖、及び塩基反応性オリゴマンノシドで構成される。
【００２５】
微生物を検出するために使用するシグナリング要素は、顕在シグナリング要素と潜在シグナリング要素の２つの主要な種類に分類される。顕在シグナリング要素は、蛍光等の多くの手段のうちの少なくとも１つによって容易に検出可能な分子又は組成物である。顕在シグナリング要素の非限定的な例には、染料（例えば、蛍光染料）、粒子（例えば、任意に染料で標識されていてもよい磁性、ポリマー、又は金粒子）、ポリペプチド（例えば、酵素、又はＧＦＰ若しくはＹＦＰなどの蛍光タンパク質）、及び、検出可能な部分（例えば、フルオレセイン）で標識されることができ、認識要素（例えば、抗体）に付着させることができるその他の化学基（例えば、ポリオキシアルキレン）が挙げられる。シグナリング要素の認識要素への付着は、認識要素とその対応する結合パートナーとの間の相互作用を妨げないのが好ましい。
【００２６】
潜在シグナリング要素は、シグナリング要素が検出可能になる程度まで隔離又は遮蔽が低下されるまでは容易に検出できないように隔離された又は遮蔽された、分子又は組成物である。潜在シグナリング要素の非限定的な例には、脂質小胞内に隔離された酵素、酵素基質、染料、及び／又は蛍光分子が挙げられる。酵素を対応する基質から隔離することによって、発色性又は蛍光発生反応を防止する。蛍光分子は、蛍光消光を促進するのに十分な高濃度で脂質小胞の中にパッケージ化されてもよい。あるいは、蛍光分子は消光剤と共に脂質小胞の中にパッケージ化されてもよい。脂質小胞が破壊すると、蛍光分子及び／又は消光剤の濃度は消光効果を克服するのに十分な程度に希釈され得るので、検出可能な程度に蛍光になる。
【００２７】
図１は、認識要素に直接付着される顕在シグナリング要素を使用する、標的微生物を検出するための方法の一実施形態を示す。この実施形態では、検体１２２（例えば、ザイモサン）を含む標的微生物１２０を含有するサンプルを、検体１２２に選択的に結合する認識要素１３０（例えば、抗体）と混合する。認識要素１３０は、認識要素１３０に直接付着されるシグナリング要素１４０（例えば、蛍光染料）を更に含む。小分子（例えば、ビオチン若しくは蛍光染料）又はポリペプチド（例えば、酵素）を抗体に付着させる様々な方法が当該技術分野において既知であり、例えば、（「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」；Ｅ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．；１９８８；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、認識要素に直接付着させることができる蛍光シグナリング要素の一例である。
【００２８】
図１には任意の支持材料１１５も示されている。本発明の方法では、標的微生物１２０は液相中に自由に懸濁させることができ、あるいは、支持材料１１５に付着させることができる。支持材料１１５の非限定的な例には、プラスチックフィルム、粒子、若しくは基質（例えば、マイクロタイタープレート）；ガラスフィルム、粒子、若しくは基質（例えば、ガラスビーズ又はスライドガラス）；金属フィルム、粒子、若しくは基質；膜及び／若しくはフィルタ（例えば、ガラス繊維フィルタ、ナイロン又は硝酸セルロース）；セラミックス粒子若しくは基質；ヒドロゲル（例えば、アガロース又はポリアクリルアミド）；又はこれらの任意の２つ以上の組合せが挙げられる。標的微生物１２０を支持材料１１５に固定する多くの方法が当該技術分野において既知である。標的微生物１２０を固定する非限定的な例には、熱固定、化学的架橋（例えば、グルタルアルデヒドを使用する）、抗体捕捉等が挙げられる。標的微生物１２０を固定する方法は、認識要素１３０が検体１２２に選択的に結合するのを防ぐように、検体１２２の全てをマスクしない、変質させない、又は破壊しないように選択されるべきである。
【００２９】
図２ａは、認識要素に間接的に付着される顕在シグナリング要素を使用する、標的微生物を検出するための方法の実施形態を示す。この実施形態では、検体２２２（例えば、ザイモサン）を含む標的微生物２２０を含有するサンプルは、検体２２２に選択的に結合する認識要素２３０（例えば、抗体）と混合される。シグナリング要素２４０で標識される第２の認識要素２３５（例えば、第２の抗体）は、認識要素２３０に選択的に結合する。この実施形態では、シグナリング要素２４０は、酵素基質２５４を検出可能な酵素生成物２５６に転換する酵素活性を含む。酵素反応は、例えば、色変化（例えば、光吸収又は反射率）によって、蛍光によって、インピーダンス若しくはコンダクタンスによって、又は発光によってなど、当該技術分野において既知多くの手段によって検出可能であってもよい。上述のように、標的微生物２２０は液相中に自由に懸濁させることができ、あるいは、支持材料（図示せず）に付着させることができる。
【００３０】
図２ｂは、認識要素に間接的に付着される顕在シグナリング要素を使用する、標的微生物を検出するための方法の代替実施形態を示す。この実施形態では、検体２２２（例えば、ザイモサン）を含む標的微生物２２０を含有するサンプルは、検体２２２に選択的に結合し、かつビオチン基２３６を含む認識要素２３０（例えば、抗体）と混合される。シグナリング要素２４０で標識されるビオチン結合分子２３８（例えば、アビジン又はストレプトアビジン）は、ビオチン基２３６に選択的に結合する。この実施形態では、シグナリング要素２４０は、酵素基質２５４を検出可能な酵素生成物２５６に転換する酵素活性を含む。シグナリング要素２４０は、リンカー２３７を介してビオチン結合分子２３８に付着される。２つのポリペプチドのような様々な分子を連結するために使用されるリンカー２３７は当該技術分野において既知であり、以下により詳細に説明がなされる。酵素反応は、上記のような多くの手段によって検出可能であり得る。上述のように、標的微生物２２０は液相中に自由に懸濁させることができ、あるいは、支持材料（図示せず）に付着させることができる。
【００３１】
図３は、サンドイッチ型アッセイにおいて、顕在シグナリング要素を使用して標的微生物を検出するための方法の実施形態を示す。この実施形態では、捕捉剤３３０ａ（例えば、ザイモサンに選択的に結合する抗体又は受容体）が支持材料３１５に付着される。検体３２２（例えば、ザイモサン）を含有するサンプルは、ビオチン３３６で標識される認識要素３３０ｂ（例えば、ザイモサンに選択的に結合する抗体又は受容体）、シグナリング要素３５２で標識されるビオチン結合分子３３８（例えば、アビジン又はストレプトアビジン）、及び（支持材料３１５に付着される）捕捉剤３３０ａと接触して、図３に示される複合体を形成する。この実施形態では、シグナリング要素３５２は、酵素基質３５４を検出可能な酵素生成物３５６に転換する酵素活性を含む。この実施形態及びその他の実施形態では、シグナリング要素３５２は、任意のリンカー３３７を介してビオチン結合分子３３８に付着され得るが、リンカー３３７が、ビオチン結合分子３３８がビオチン３３６に結合するのを妨げず、シグナリング要素３５２の酵素活性をブロックしないことを条件とする。リンカー３３７の例は以下に記載する。支持材料３１５は、多くの形態（例えば、フィルム、膜、粒子）に構成されることができ、多くの異なる材料から構成されることができる。支持材料１１５の非限定的な例は上述されている。
【００３２】
図４ａは、潜在シグナリング要素を使用して標的微生物を検出するための実施形態を示している。この実施形態では、検体４２２（例えば、ザイモサン）を含む標的微生物４２０を含有するサンプルは、検体４２２に選択的に結合する認識要素４３０（例えば、デクチン−１からの糖鎖認識ドメインを含む抗体又は組成物）、及びリポソーム４５０と混合される。この実施形態では、リポソーム４５０と、認識要素４３０と、標的微生物４２０との間の相互作用それ自体は検出可能なシグナルを必ずしももたらさないので、リポソーム４５０は潜在シグナリング要素として機能する。むしろ、この実施形態では、付加工程（図４ｂに示される）が検出可能なシグナルを生成することができる。この実施形態では、認識要素４３０は、任意のリンカー４３７を介して認識要素に付着されるビオチン結合分子４３８（例えばアビジン又はストレプトアビジン）を更に含む。あるいは、ビオチン結合因子４３８は、認識要素４３０に直接付着されることができる。
【００３３】
リポソーム４５０は、酵素４５２と、ビオチン結合因子４３８によって選択的に結合されるビオチン４３６とを含む。リポソーム４５０は、ビオチン４３６を含むリン脂質で構成されてもよい。例えば、二分子膜４５８は、実施例３に記載のように、Ｎ−ビオチニル−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から合成することができ、及び／又は非ビオチニル化リン脂質から合成することができる。酵素４５２は、（図４ａに示されるように）リポソーム４５０内に（例えば水性懸濁液中に）存在してもよい。あるいは、酵素４５２は、リポソーム４５０の二分子膜４５８と物理的に結合されてもよい。本明細書で使用するとき、「物理的に結合する」とは、酵素が二分子膜４５８の両方の脂質層にまたがってもよいこと（例えば、酵素の少なくとも一部分が二分子膜４５８の両側にある）、又は酵素４５２が二分子膜４５８の内側又は外側の脂質層に分配され得ることを意味する。いくつかの実施形態では、二分子膜４５８との物理的結合を促進するために、酵素４５２を化学的付加物で修飾してもよい。
【００３４】
図４ｂは、図４ａの潜在シグナリング要素（酵素４５２）がどのように活性化されて検出可能なシグナルを生成することができるのかを示している。この実施形態では、リポソーム４５０の二分子膜４５８は破壊され、その結果、酵素４５２が酵素基質４５４と接触して、酵素基質４５４を生成物４５６に転換することができる。酵素基質４５４の生成物４５６への転換は、検出可能なシグナルの生成を引き起こすことができる。検出可能なシグナルは、光学的に検出可能であってもよい。光学的検出の非限定的手段には、比色検出、蛍光検出、光測量（lumimetric）（例えば、生物発光又は化学発光）検出が挙げられる。検出可能なシグナルは、視覚的に観測されてもよく、別の方法としては、例えば、分光光度計、蛍光光度計、又は照度計などの機器で検出されてもよい。あるいは、シグナルは、混合物のインピーダンス若しくはコンダクタンスの変化によって、又は混合物のｐＨ変化によって検出されてもよい。
【００３５】
二分子膜４５８の透過性は、リポソームの断片４５１の形成をもたらすことができる多くの手段によって破壊されることができる。破壊手段の非限定的な例には、音波振盪、凍結融解プロセス、加熱、化学（例えば界面活性剤）破壊、浸透破壊（例えば、浸透圧溶解）、又は細胞傷害性ペプチドなどの孔形成剤による透過処理によるものが挙げられる。二分子膜４５８の透過性の破壊は、酵素４５２のリポソーム４５０の外への通過、酵素基質４５４のリポソーム４５０の中への通過、又はその両方を可能にすることができる。更に、図４ｂには、認識要素４３０をビオチン結合分子４３８に連結するリンカー４３７が示されている。
【００３６】
図５ａは、潜在シグナリング要素使用して標的微生物を検出するための方法の代替実施形態を示す。この実施形態では、検体５２２（例えば、ザイモサン）を含む標的微生物５２０を含有するサンプルは、検体５２２に選択的に結合するビオチン５３６で標識される認識要素５３０（例えば、デクチン−１からの糖鎖認識ドメインを含む抗体又は組成物）、ビオチン結合分子５３８、及びビオチン５３６を含むリポソーム５５０と混合される。ビオチン結合分子５３８は、認識要素５３０とリポソーム５５０との間にブリッジを形成することができる。この実施形態では、リポソーム５５０と、認識要素５３０と、標的微生物５２０との間の相互作用それ自体は検出可能なシグナルを必ずしももたらさないので、リポソーム５５０は潜在シグナリング要素として機能する。むしろ、この実施形態では、付加工程（図５ｂに示される）が検出可能なシグナルを生成することができる。この実施形態では、認識要素５３０はビオチン５３６を更に含む。また、図５ａには酵素基質５５４が示されている。
【００３７】
リポソーム５５０は、酵素５５２と、ビオチン結合分子５３８によって選択的に結合されるビオチン５３６とを含む。リポソーム５５０は、ビオチン５３６を含むリン脂質で構成されてもよい。例えば、二分子膜５５８は、実施例３に記載のように、Ｎ−ビオチニル−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から合成することができ、及び／又は非ビオチニル化リン脂質から合成することができる。酵素５５２は、（図５ａに示されるように）リポソーム５５０内に（例えば水性懸濁液中に）存在してもよい。あるいは、酵素５５２は、リポソーム５５０の二分子膜５５８と物理的に結合してもよい。いくつかの実施形態では、二分子膜５５８との物理的結合を促進するために、酵素５５２を化学的付加物（例えば、アルキル付加物）で修飾してもよい。
【００３８】
図５ｂは、図５ａの潜在シグナリング要素（酵素５５２）がどのように活性化されて検出可能なシグナルを生成することができるのかを示している。この実施形態では、リポソーム５５０の二分子膜５５８は破壊され、その結果、酵素５５２が酵素基質５５４と接触して、酵素基質５５４を生成物５５６に転換することができる。酵素基質５５４の生成物５５６への転換は、検出可能なシグナルの生成を引き起こすことができる。検出可能なシグナルは、上述のように光学的に検出可能であってもよく、あるいは、シグナルは、混合物のインピーダンス若しくはコンダクタンスの変化によって、又は混合物のｐＨ変化によって、検出されてもよい。上述のように、二分子膜５５８の透過性は、リポソームの断片５５１の形成をもたらすことができる多くの手段によって破壊されることができる。二分子膜５５８の透過性の破壊は、酵素５５２のリポソーム５５０の外への通過、酵素基質５５４のリポソーム５５０の中への通過、又はその両方を可能にすることができる。
【００３９】
図６ａは、サンドイッチ型アッセイにおいて、潜在シグナリング要素を使用して標的微生物を検出するための方法の実施形態を示す。この実施形態では、捕捉剤６３０ａ（例えば、ザイモサンに選択的に結合する抗体）が支持材料６１５に付着される。検体６２２（例えば、ザイモサン）を含有するサンプルは、ビオチン６３６で標識される認識要素６３０ｂ（例えば、ザイモサンに選択的に結合する抗体又は受容体）、ビオチン結合分子６３８（例えば、アビジン又はストレプトアビジン）、ビオチン６３６を含むリポソーム、及び（支持材料６１５に付着される）捕捉剤６３０ａと接触して、図６ａに示される複合体を形成する。あるいは、検体６２２は、標的微生物又はその断片（図示せず）に付着されてもよい。リポソーム６５０は酵素６５２を更に含む。この実施形態では、リポソーム６５０と、認識要素６３０ａ及び６３０ｂと、検体６２２との間の相互作用それ自体は検出可能なシグナルを必ずしももたらさないので、リポソーム６５０は潜在シグナリング要素として機能する。むしろ、この実施形態では、付加工程（図６ｂに示される）が酵素６５２と酵素基質６５４との接触を可能として、検出可能なシグナルを生成することができる。
【００４０】
リポソーム６５８は、酵素６５２と、ビオチン結合分子６３８によって選択的に結合されるビオチン６３６とを含む。リポソーム６５８はビオチン６３６を含むリン脂質で構成されてもよい。例えば、二分子膜６５８は、実施例３に記載のように、Ｎ−ビオチニル−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から合成することができる。酵素６５２は、（図５ａに示されるよう）リポソーム６５０内に（例えば水性懸濁液中に）存在してもよい。あるいは、酵素６５２は、リポソーム６５０の二分子膜６５８と物理的に結合してもよい。いくつかの実施形態では、二分子膜６５８との物理的結合を促進するために、酵素６５２を化学的付加物（例えば、アルキル付加物）で修飾してもよい。
【００４１】
図６ｂは、図６ａの潜在シグナリング要素（酵素６５２）がどのように活性化されて検出可能なシグナルを生成することができるのかを示している。この実施形態では、リポソーム６５０の二分子膜６５８は、孔形成ポリペプチド（図示せず）などのシグナル生成要素によって破壊されて、酵素基質６５４が孔６５７を通ってリポソームに入って酵素６５２と接触するのを可能にする。あるいは、リポソーム６５０は、上記のその他の化学的及び／又は機械的手段によって破壊されてもよい。
【００４２】
リポソームを透過性にすることができる例示的なポリペプチドのリストが表１に示されている。ポリペプチドによるリポソーム粒子の溶解は、「ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ」と題された国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３０７１号、及び「ＡＲＭＥＤ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ」と題された国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ０２／０００３３号に開示されており、当該両特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。二分子膜６５８の透過処理の後、酵素６５２は、酵素基質６５４を生成物６５６に転換する。上述のように、酵素基質６５４の生成物６５６への転換は、検出可能なシグナルの生成を引き起こすことができる。二分子膜６５８の透過性の破壊は、酵素６５２のリポソーム６５０の外への通過、酵素基質６５４のリポソーム６５０の中への通過、又はその両方を可能にすることができる。支持材料６１５は上記のように構成され得る。
【表１】
2011515656.tif 000003
【００４３】
サンプル
特定の実施形態において、流体サンプルは食物又は飲料を含む。微生物分析のための食物サンプルの調製方法は既知である。既知の、多量の食物材料（例えば、２５グラム）を比較的多い容量の希釈剤（例えば、２２５ミリリットル）内に懸濁させることを含む、食物サンプルのためのサンプルの調製方法のいくつかは既知である。サンプルは、ブレンド又は攪拌（stomaching）など激しい混合プロセスを実施し、比較的均一な懸濁液を形成する。サンプルはしばしば、ストマックカーバックと呼ばれる、プラスチックのサンプルリザーバ内で処理される。本開示の方法及び組成物は、食物又は飲料サンプルを分析する方法を提供する。微生物に関して定期的に検査されている食物の非限定的な例には、肉（例えば、ひき肉、鶏肉、魚、魚介類）、生の又は加工された農産物（例えば、果物、野菜）、乳製品（例えば、牛乳又は乳製品、乳清、チーズ）並びに飲料（例えば、牛乳、水、果汁、野菜ジュース、お茶）が挙げられる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、処理されるべき、及び分析されるべきサンプルは、水体からのサンプルを含む。かかる水体の非限定的な例には、表面水、ヒト若しくは動物が消費するための水並びに工業プロセスのために使用される水が挙げられる。表面水には、海、湖、川、用水路、池、貯水池、水路等が挙げられる。プロセス水には、地方自治体又は工業目的で使用される水、例えば、洗浄、洗浄、すすぎ、冷却塔、水処理汚水槽等が挙げられる。代表的な洗浄プロセスは、ヒト若しくは動物消費用の肉又は農産物の洗浄、すすぎ及び殺菌などの食物加工プロセスが挙げられる。
【００４５】
他の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、例えば、食料品、飲料、及び医薬品の溶液、混合物、ホモジネート、又は懸濁液などの、プロセシング及び微生物検出に適しているサンプルを分析するために使用される。特定の実施形態において、液体サンプルは、砂糖、塩又はタンパク質など、１つ以上の溶解溶質を含む。他の実施形態において、液体サンプルは、アルコール又は界面活性剤などの、１つ以上の溶媒を含んでもよい。溶媒及び界面活性剤を含むサンプルを本発明に従って使用することができるが、溶媒又は界面活性剤は、検出可能なシグナルの検出を妨げない、又は潜在シグナリング要素の検出可能なシグナルへの不慮の転換を引き起こす（例えば、サンプルに標的微生物が存在しない場合に検出可能なシグナルをもたらす）ことのない濃度で存在することを条件とする。サンプルを、ｐＨ感受性のシグナリング要素（例えば、４−メチルウンベリフェロンなどの蛍光標識）又はｐＨ応答性シグナル生成要素（例えば、ｐＨにより誘発される細胞傷害性ペプチド）と混合する場合、サンプルは、ｐＨ感受性又はｐＨ応答性要素と混合される前に、適合性のあるｐＨにバッファリング及び／又は調整されてもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物は、環境又は臨床サンプル内の微生物を検出するために使用することができる。典型的に、環境又は医療サンプルは、微生物で汚染される恐れがある表面（例えば、カウンター（countertop）、床、皮膚、傷口）から残留物を収集するために、スワブ、スポンジ、ワイプ等を使用して収集される。収集デバイスは、サンプルリザーバに移され、溶媒（例えば、標準方法緩衝剤（Standard Methods Buffer）、緩衝ペプトン水、緩衝食塩水、若しくは蒸留水）と混合されるか、又は均質化され、微生物を溶媒の中に放出することができる。その後、溶媒は微生物の存在に関して分析することができる。あるいは、標的微生物は、収集デバイスを含有する溶液中で分析されてもよい。
【００４７】
個々の液体サンプルは、ほとんど任意の数及び種類の微生物を含有してもよい。液体サンプル内の微生物の数は、殺菌状況にさらされたサンプルにおける１ミリリットル当たり０の生物体から、高度に汚染されたサンプルにおける１ミリリットル当たり約１０９までの生物体の範囲であってもよい。本発明のデバイス及び方法は、多種多様な微生物濃度を含有する液体サンプルの分析の手だてとなる。
【００４８】
認識要素
本発明は、標的微生物のザイモサンなどの細胞壁構成成分に選択的に結合する認識要素の使用を含む。いくつかの実施形態では、認識要素は、単クローン抗体又はポリクローナル抗体などの抗体を含む。抗体は、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」に記載されているもののような当該技術分野において周知の方法を用いて、マウス、ウサギ、ヤギ等の多くの生物体から得ることができる。
【００４９】
本発明にはまた種々の抗体断片が含まれるが、これはまた抗原結合断片とも呼ばれ、非損傷抗体（antibody）の一部分のみを含み、一般に非損傷抗体の抗原結合部位を含み、それゆえに抗原を結合する能力を維持する。無傷の又は非損傷抗体又は抗体鎖の化学的又は酵素的処理によって、断片を得ることができる。組換え手段によって、断片を得ることもできる。抗抗体断片の例には、例えば、タンパク質分解及び／又はジスルフィド架橋を還元して生成されるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、ｄＡＢ、及びＦ（ａｂ’）２断片、及びＦａｂ発現ライブラリーから生成される断片が挙げられる。そのような抗体断片は、当該技術分野において周知の技術により生成することができる。本発明の抗体は、可変領域（１つ又は複数）を単独で又はヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及び／又はＦｃドメインの全て又は一部と組み合わせて含むことができる。用語「抗原結合性断片」は、抗原に結合する、又は抗原結合（すなわち、特異結合）において非損傷抗体（すなわち、その断片を誘導した非損傷抗体）と競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を意味する。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体として、ヒト化抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、Ｆａｂ発現ライブラリーから生成される直鎖抗体断片、ＶＬドメイン又はＶＨドメイン全体を含む断片、細胞内で生成された抗体（すなわち、細胞内抗体）、及びこれらの抗原結合抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明のモノクローナル抗体は、任意のアイソタイプであることができる。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥであってもよい。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥであってもよい。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体はマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ３であってもよい。本発明について、所与の重鎖は、κ又はλ形状のいずれかの軽鎖と対になってもよい。
【００５２】
代替実施形態において、認識要素は、細胞壁構成成分にポリペプチド受容体を含む。ポリペプチド受容体は、典型的には、特定の検体に選択的に結合する少なくとも１つのドメインを含む。ザイモサンの例示的なポリペプチド受容体は、デクチン−１受容体である。デクチン−１は糖鎖認識ドメインを含む。いくつかの実施形態では、認識要素は、ポリペプチド受容体（例えば、デクチン−１の糖鎖認識ドメイン）のリガンド結合断片を更に含む。受容体は、デクチン−１の場合はヒト単球細胞などの天然原料から精製されてもよい。あるいは、ポリペプチド受容体は、好適な宿主細胞の中で、デクチン−１ポリペプチド又はその炭水化物認識ドメインをコード化する遺伝物質をクローニング又は発現することによって生成されてもよい。
【００５３】
認識要素を化学成分で修飾することができるが、化学修飾が認識要素が検体（例えば細胞壁構成成分）に結合するのを妨げないことを条件とする。化学成分は、例えばシグナリング要素であってもよい。標的細胞上の所定の構造に結合する認識要素を、リポソームの二分子膜の中に挿入してもよい。例えば、デクチン−１受容体又はその誘導体をリポソームの中に挿入して、ザイモサンに結合するために使用してもよい。誘導体は、ポリペプチドとリポソームの結合を促進することができる長鎖アルキル基（例えば、ミリスチン酸誘導体）を含むことができる。
【００５４】
シグナリング要素
シグナリング要素は、標的微生物と結合されると、サンプルの中の標的微生物の存在を示すことができる検出可能なシグナルを用意する働きをする。シグナリング要素は、認識要素に直接付着（例えば、共有結合）させることができる。あるいは、シグナリング要素は、間接的付着（例えば、ビオチニル化認識要素、ストレプトアビジン、及びビオチニル化シグナル要素で構成される複合体の形成）によって認識要素と結合することができるようになる。シグナリング要素は、ポリペプチド（例えば、グリーン蛍光タンパク質若しくは黄色蛍光タンパク質などの蛍光ポリペプチド、又は酵素）、あるいはポリヌクレオチド（例えば、標識したポリヌクレオチド）を含んでもよい。
【００５５】
シグナリング要素は、即時型の及び／又は明白な検出可能なシグナル（例えば、蛍光染料）を用意することができるような、顕在シグナリング要素であってもよい。あるいは、シグナリング要素は、検出可能なシグナルを用意するために活性化されなければならないような、潜在シグナリング要素であってもよい。潜在シグナリング要素の非限定的な例には、例えば、蛍光エネルギー移動で消光される蛍光染料、及び対応する酵素基質から隔離される酵素が挙げられる。
【００５６】
シグナリング要素を、脂質小胞又はリポソームの中に組み込んでもよい。粒子内に組み込まれるシグナリング要素は、任意の選択された化合物であることができる。例えば、シグナリング要素は、染料又は電気化学メディエータ（例えば、電気化学伝導度に影響を及ぼし得る高分子電解質）などの比較的小さい分子であってもよい。シグナリング要素はまた、蛍光分子（ラテックス又はポリスチレン）、抗体、ホルモン、又は酵素であってもよい。
【００５７】
シグナル生成要素
本明細書で使用するとき、「シグナル生成要素」は、潜在シグナリング要素に検出可能なシグナルを生成させることができる分子（例えば、ポリペプチド又は化学薬品）を指す。脂質小胞の中に隔離されており、したがって、対応する酵素基質と自由に反応することができない酵素は、潜在シグナリング要素の一例である。例示的なシグナル生成要素は、酵素基質及び／又は酵素が脂質小胞の二分子膜を通過することにより酵素反応を進行させることができるように、脂質小胞の透過性を調節することが可能な細胞傷害性リペプチドであることができる。脂質小胞（シグナリング要素を含む）は、種が多くの方法で活性化され得るように適合されてもよい。例えば、脂質小胞の脂質二重層の透過性は、この二重層全体の透過性が所定の代謝シグナルに応答して増加することができるように、制御されてもよい。本発明の一態様によると、これは、細胞傷害剤として作用するぺプチドを小胞に組み込むことによって達成されてもよい。例示的な細胞障害性ペプチドが表１に示され、かつ、「ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ」と題された国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３０７１号、「ＡＲＭＥＤ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ」と題された国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ０２／０００３３号、及び「ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＦＯＲ  ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ」と題された、２００８年２月１４日に出願された米国特許出願第６１／０２８，８９６号に記載されており、これら特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。粒子の透過性を調節することが可能であれば、ぺプチドは、巨大タンパク質であっても又は短鎖ポリペプチドであってもよい。
【００５８】
シグナル生成要素は、分子（例えば、酵素基質）を小胞の中に入れ、それによって検出可能なシグナルを生成するために、脂質二重層内の孔又はチャネルを開く、又は開くのを媒介する役割を果たす。あるいは、又は加えて、脂質二重層内の孔又はチャネルが開くことによって、物質を小胞の外の環境へと放出させることができる。細胞傷害剤は、脂質小胞の破裂を引き起こして、その中に含有されている種を放出させることもできる。細胞傷害剤は活性化可能であってもよい（例えば、細胞から放出される化学物質又は生化学に応答して）。細胞障害性ペプチドは、イオン（例えばＨ’、Ｎａ＋、Ｃｌ’、ＨＣＯ’、Ｋ’等）に応答して「開く」イオンチャネルを作ることができる。あるいは、イオンチャネルは、標的細胞から誘導されるより大きな分子の結合に応答してもよい（例えば、増殖因子、哺乳類細胞の細胞外マトリックスの構成要素、又は微生物のカプセル多糖類）。ペプチドを、選択された細胞からの所定の代謝シグナルに応答するように遺伝子操作することも可能である。
【００５９】
特定の実施形態において、ペプチドは脂質二重層の内在性タンパクであることができる（即ち、ペプチドは脂質二重層にまたがる）。しかしながら、ペプチドは、他の手段（例えば、外側の脂質層への非共有結合的な付着）により脂質二重層と相互作用し得ることは理解されよう。
【００６０】
いくつかの実施形態では、シグナル生成要素は、活性化可能な構造、例えば化学結合又は化学成分を含むポリペプチド（例えば、細胞障害性ペプチド）であってもよい。活性化可能な構造は、活性化されると、膜の透過性を調節するポリペプチドの能力を高めることができる。いくつかの実施形態では、活性化可能な構造は、ｐＨに応答するリン酸基などの化学物質であってもよい。例えば、リン酸基のプロトン化は、シグナル生成要素の細胞傷害活性を活性化させることができる。このようなプロトン化は、標的微生物の代謝活性（例えば、酸性代謝物の生成）によって媒介される。いくつかの例示的な細胞障害性ペプチド、ＧＡＬＡ及びＬＡＧＡ、は、ｐＨが７から約５．０に下降すると活性化する（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５６，（２００４）９６７〜９８５）。反対に、別の細胞障害性ペプチド、ＫＡＬＡ、は、ｐＨが５から約７．５に上昇すると活性化する。国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ０２／０００３３号は、６．５〜７．４で活性化するいくつかのペプチド、及び６．０未満又は５．５で誘発されるその他のペプチドを開示している。
【００６１】
代替実施形態において、活性化可能な構造は、リン酸エステルなどの化学結合の加水分解によって活性化する。結合の加水分解は、例えば、細胞障害性ペプチドの極性（親水性）を低減させることができ、及び／又は、ペプチドの等電点を変化させて、ポリペプチドに膜の透過性を調節させることができる。こよのうな結合の加水分解は、標的微生物の代謝活性（例えば、ホスファターゼ酵素活性）によって媒介されてもよい。
【００６２】
シグナル生成要素としての役割を果たすことができる化学薬品には、潜在シグナリング要素に検出可能なシグナルを生成させることができる化学物質が挙げられる。例えば、検出可能なシグナルが脂質小胞内で隔離されている場合、脂質小胞の透過性を高めることができる化学物質（例えば、洗剤又は界面活性剤）はシグナル生成要素としての機能を果たすことができる。加えて、脂質小胞の原形質溶解を引き起こすのに有効な濃度の塩（例えば、ＮａＣｌ）は、シグナル生成要素としての機能を果たすことができる。
【００６３】
連結部分
連結部分は、２つ以上のその他の分子（例えば、ポリペプチド）を連結するのに使用することができる分子である。連結部分は、２つの連結された分子の間に距離を設けて、結合部位又は酵素活性部位の立体障害の可能性を減少させるために使用され得る。１つの連結部分の例には、カルボキシル基を有する分子を、アミン基を有する別の分子に結合させるのに使用することができる、塩酸１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドが挙げられる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、連結部分は、ビオチン結合ポリペプチド（例えば、アビジン又はストレプトアビジン）などの結合パートナーを含んでもよい。ビオチン化キットは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）等の多くの商業的供給源から入手可能である。特定のビオチン化剤は、ポリエチレンオキシド及び／又はポリエチレングリコールを含む「スペーサーアーム」を有する。例えば、ヒドラジド修飾ストレプトアビジンは、ビオチン結合パートナーとして使用するためにストレプトアビジンをポリペプチド（例えば、抗体又は受容タンパク）に連結するために使用され得る。
【００６５】
検出方法
一態様において、本開示は、非増殖依存型アッセイ中の標的微生物を検出するための方法を提供する。本明細書で使用するとき、「非増殖依存型アッセイ」は、増殖栄養素を供給して、標的微生物を増殖及び繁殖させることが意図された条件下で培養工程が行われる工程を含まない、標的微生物の試験を指す。非増殖依存型アッセイは、その方法の構成要素として増殖段階を必要としないが、非増殖依存型アッセイの前に、比較的数の少ない標的微生物を検出する能力を改善することができる増殖段階が行われてもよいことに、留意すべきである。
【００６６】
図７ａは、例示的な非増殖依存型アッセイのブロック図を示す。この例示の実施形態では、サンプルは、任意に、（例えば、濾過又は遠心分離によって）濃縮されてもよい。サンプルは、任意に、認識要素（例えば、抗体）と、それに対応する結合パートナー（例えばザイモサンなどの細胞壁構成成分）との間の相互作用を高めるために、溶解剤で処理されてもよい。好適な溶解剤には、洗剤等の化学薬品、並びに／又は、熱若しくは超音波震動等の物理的手段（physical agent）を挙げることができる。濃縮工程及び／又は溶解工程のいずれかが所望の場合には、これら工程の後に、真菌微生物がサンプルの中に存在する場合は１つ以上の真菌微生物に特徴的な１つ以上の検体を捕捉するのに有効な条件下で、標的微生物（又はその構成要素）を支持材料に付着している捕捉剤に接触させて（図３参照）、１つ以上の捕捉された検体を形成する。いくつかの実施形態では、検体は、完全な微生物の細胞表面の構成要素である。捕捉された検体と、認識要素と、シグナリング要素との間の結合を引き起こすのに有効な条件下で、捕捉された検体を、認識要素及びそれらの対応するシグナリング要素と接触させる。
【００６７】
溶解工程、標的捕捉工程、及び認識部位とシグナリング要素とを結合する工程は、個別に、又は個々の工程の２つ以上を組み合わせて行うことができることにも留意すべきである。結合工程に続いて、非特異的に結合した及び／又は非結合シグナリング要素を除去するために、支持材料を洗浄することができる。洗浄工程の後、潜在シグナリング要素がアッセイに存在する場合には、この潜在シグナル成分を活性化させて検出可能なシグナルを生成することができる。活性化は、例えば、混合物への酵素基質の添加、及び／又は、化学的若しくは物理的手段による脂質小胞の破壊を含むことができる。検出可能なシグナルを検出して、サンプル中の標的微生物の存在を判定することができる。任意に、検出可能なシグナルを測定することが可能であり、オリジナルのサンプル中の標的微生物の数を推定することが可能である。
【００６８】
図７ｂは、代替的な例示的非増殖依存型アッセイのブロック図を示す。例示の実施形態において、サンプルは、任意に（例えば、濾過又は遠心分離によって）濃縮されてもよい。サンプルは、認識要素とその対応する結合パートナー（例えば、ザイモサンなどの細胞壁構成成分）との間の相互作用を高めるために、任意に溶解剤で処理されてもよい。好適な溶解剤には、洗剤、及び／又は熱若しくは超音波震動等の物理的手段など化学薬品を挙げることができる。濃縮工程及び／又は溶解工程のいずれか一方が含まれる場合は、これらの工程の後に、少なくとも１つの標的微生物が存在する場合にこの標的微生物と、認識要素と、グナリング要素との間の結合を引き起こすのに有効な条件下で、標的微生物（又はその構成要素）を認識要素及びそれらの対応するシグナリング要素と接触させることができる。非標的微生物に非特異的に結合されたシグナリング要素を除去するために、混合物を洗浄することができるが、蛍光粒子を含む方法（以下に記載）は、洗浄工程は任意とすることができることを示している。
【００６９】
混合物を、検出器を備えるフローサイトメーター等のフローシステムに通過させることができる。任意に、標的微生物と捕捉剤との間の結合を引き起こすのに有効な条件下で、サンプルを支持材料に結合している捕捉剤に接触させてもよい。いくつかの実施形態において、支持材料は、第１の波長で蛍光を発する蛍光粒子であってもよい。認識要素と、存在する場合には、捕捉された標的微生物（又はその構成要素）との間の結合を引き起こすのに有効な条件下で、捕捉された材料を、シグナリング要素（例えば、第２の波長で蛍光を発する蛍光染料を含む）で標識される認識要素と接触させることができる。次に、支持材料をフローサイトメーター等のフローシステムに通過させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、第１及び第２の波長の両方において蛍光を発するフローセル中の蛍光粒子の検出は、サンプル中に標的微生物が存在することを示すことができる。任意に、フローセルシステムでは、粒子を選別することができ、例えば、陽性粒子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験又は培養方法などの確証試験を受けることができる。
【００７０】
別の態様において、本開示は、増殖依存型アッセイにおいて標的微生物を検出するための方法を提供する。増殖依存型アッセイは、標的微生物が増殖、代謝、及び／又は細胞分裂できるようにする環境（例えば、栄養素、温度）を提供することによって、標的微生物の数を増やす工程を含む。
【００７１】
図７ｃは、例示的な増殖依存型アッセイのブロック図を示す。例示の実施形態では、サンプルは、任意に、増殖段階の前に（例えば、濾過又は遠心分離によって）濃縮されてもよい。サンプルは、培養液を含有する培養デバイスの中に置くことができる。培養液及び培養温度は、標的微生物の増殖要件に従って選択され得る。様々な培養デバイス、例えば、ペトリ皿、再水化可能な培養デバイス（例えば、３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから商品名ＰＥＴＲＩＦＩＬＭで市販のフィルム培養デバイス（film culture device））、マイクロタイタープレート、フラスコ、管等、の中に培養液を入れることができる。増殖工程の前に、又は任意に、増殖工程の後に、認識部位及びシグナリング要素と標的微生物（又はその構成要素）との結合を引き起こすのに有効な条件下で、認識部位及びシグナリング要素をサンプル混合物に添加することができる。
【００７２】
この実施形態では、標的微生物の代謝活性によって活性化される潜在シグナリング要素を使用することができる。例えば、潜在シグナリング要素は、シグナル生成要素（例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０３０７１号又は同ＰＣＴ／ＧＢ０２／０００３３号に記載のものような細胞障害性ペプチド）を含むことができる。かかる細胞障害性ペプチドは、（例えば、栄養素から酸性副産物への代謝によって）周囲のｐＨが変化すると脂質小胞に孔を形成するので、孔の形成が可能となる。あるいは、細胞障害性ペプチドのリン酸基等の官能基は加水分解され得るので、脂質小胞への孔の形成が可能となる（孔の形成が検出可能なシグナルをどのようにもたらすことができるのかを示している図６を参照のこと）。酵母及びカビ微生物は、細胞障害性ペプチドの活性化に使用することができるホスファターゼ酵素を生成することが知られている。潜在シグナリング要素の活性化後、シグナルを検出すること可能である。
【００７３】
栄養成長培地を含むいくつかの実施形態では、（増殖及びシグナル検出工程の後に）個々のコロニー又は微小コロニーの位置を観察することができるように、サンプルからの個々の標的微生物は空間的に分離されてもよい（例えば、寒天プレートの表面上で）。オリジナルのサンプルからの標的微生物の空間的分離を含む実施形態は、個々のコロニー又は微小コロニーをカウントする任意の計数工程を含んでもよい。更なる任意の工程には、続いて行われるアーカイビング又は追加試験（例えば、ＰＣＲ分析）用に標的微生物を復元する工程が挙げられる。
【００７４】
増殖依存型アッセイにおける工程のいくつかを同時に実施してもよいことを理解すべきである。例えば、潜在シグナルを活性化させるための増殖細胞の代謝活性に依存して、図７ｃの破線のブロック内に示される工程は、同時に行われてもよい。示されている工程が同時に行われる場合、検出可能なシグナルを観察するために、培養デバイスを連続的に又は各時点においてモニタすることが可能であり得る。このプロセスは、標的微生物の早期検出をもたらすことができる。
【００７５】
好ましくは、上記方法において、サンプルと、固定化された抗体と、標識した認識要素（例えば、抗体）との間の接触を用意する工程は、サンプルに存在する場合、特定の標的微生物に特徴的な１つ以上の検体を捕捉するのに有効な条件下で、サンプルを固定化された抗体と接触させて、１つ以上の捕捉された検体を形成する工程と、１つ以上の捕捉された検体と標識した認識要素との間の結合を引き起こすのに有効な条件下で、存在する場合、１つ以上の捕捉された検体を標識した認識要素と接触させる工程と、を含む。好ましくは、サンプルを捕捉剤と接触させる工程は、サンプルとそれぞれの捕捉剤との間の接触を同時に用意する工程を含む。好ましくは、存在する場合、１つ以上の捕捉された標的微生物を標識した認識要素と接触させる工程は、捕捉された標的微生物とそれぞれの標識した認識要素との間の接触を同時に用意する工程を含む。
【実施例】
【００７６】
（実施例１）．
ウサギ抗ザイモサン抗体は間接ＥＬＩＳＡによってザイモサンを認識する。
【００７７】
Ａ．一般材料及び方法
１０００ｍＬの蒸留水の中で３．０３ｇのＮａ２ＣＯ３及び６．０ｇのＮａＨＣＯ３を混合することによって、被覆緩衝液（０．１Ｍの重炭酸塩／炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６）を１Ｘ原液として調製した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１５５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸緩衝液中、ｐＨ７．４）を、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した１０Ｘ原液から調製した。ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ（商標）９６ウェル表面強化型ＥＬＩＳＡプレートを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。すべての手順は、他に特定されない限り、室温で実施された。すべてのＥＬＩＳＡ洗浄手順は、１ウェルあたり２００マイクロリットルの容積の３回順次洗浄を含み、すべての洗浄は、ＰＢＳ緩衝液で行われた。西洋ワサビペルオキシダーゼ発色性基質、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手した。硫酸、２Ｍ、を、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から入手したストック濃縮物（１８．４Ｍ）で調製した。この実験ではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＰＢＳ中１％溶液として使用し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【００７８】
この実験で使用した抗原は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手のザイモサン（カタログ番号ｔｌｒｌ−ｚｙｎ）を含んだ。ザイモサンを１ｍｇ／ｍＬ水溶液に戻し、４℃で保管した。
【００７９】
この実験で使用した抗原は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手のウサギ抗ザイモサン（Ｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−Ｚｙｍｏｓａｎ）（カタログ番号Ｚ２８５０）と、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）固定ロバ抗ウサギＩｇＧ（カタログ番号ＮＡ９３４Ｖ）と、を含んだ。
【００８０】
Ｂ．ＥＬＩＳＡ条件
このアッセイではザイモサンを被覆抗原として使用した。ザイモサンを被覆緩衝液中で冷却貯蔵出発濃度からマイクロウェル被覆濃度（１ウェル当たり２０マイクログラム）まで希釈した。２００マイクロリットルの被覆溶液が、マイクロウェルプレートのウェルに加えられた。プレートを、速度１００ｒｐｍのロッキングプラットフォーム（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ  Ｍａｘｉ  Ｒｏｔａｔｏｒ，Ｄｕｂｕｑｕｅ，Ｉｏｗａ）の上で、周囲温度で１２０分間培養した。ブロッキング工程の前にＰＢＳで洗浄して被覆溶液を除去した。
【００８１】
マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中で希釈された１ウェル当たり２００マイクロリットルの１％ＢＳＡで、ロッキングプラットフォームの上で周囲温度で６０分間ブロッキングした。ＰＢＳで洗浄してブロッキング溶液を除去した。
【００８２】
４００マイクロリットルのＰＢＳ中で２０００ｎｇ／ｍＬに希釈したウサギ抗ザイモサン抗体（分子プローブ＃Ｚ−２８５０）をＡ列に加えた。ウェルの残りは２００マイクロリットルのＰＢＳを含んでいた。この列を次のように２倍に希釈した：Ａ列から２００マイクロリットルを取り出してＢ列に希釈し、次に、Ｂ列から２００マイクロリットルを取り出してＣ列に希釈し、Ｃ列をＤ列に希釈し、Ｄ列をＥ列に希釈し、Ｅ列をＦ列に希釈し、及びＦ列をＧ列に希釈した。Ｈ列はブランクとしてウサギ抗ザイモサンを含んでいなかった。１ウェル当たりの容積を２００マイクロリットルに一貫して維持するために、Ｇ列から２００マイクロリットルを廃棄した。ウサギ抗ザイモサン抗体の濃度は２０００ｎｇ／ｍＬ〜３１．２５ｎｇ／ｍＬの範囲であった。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で１２０分間培養した。次に、プレートをＰＢＳで洗浄した。
【００８３】
ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃ＮＡ９３４Ｖ）を係数１：６２５でＰＢＳ中で希釈した。４００マイクロリットルの（希釈された？）ロバ抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ固定化をカラム１１及び１２に加えた。ウェルの残りは２００マイクロリットルのＰＢＳを含んでいた。類似サンプルを得るために、プレートに対してＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧを２倍に希釈した。カラム１１から２００マイクロリットルを取り出してカラム９に加え、次に、カラム９から２００マイクロリットルを取り出してカラム７に加え、次に、カラム７から２００マイクロリットルを取り出してカラム５に加え、次に、カラム５から２００マイクロリットルを取り出してカラム３に加え、次に、カラム３から２００マイクロリットルを取り出してカラム１に加えた。１ウェル当たりの容積を２００マイクロリットルに一貫して維持するために、カラム１から２００マイクロリットルを廃棄した。同様に、カラム１２から２００マイクロリットルを取り出してカラム１０に加え、次に、カラム１０から２００マイクロリットルを取り出してカラム８に加え、次に、カラム８から２００マイクロリットルを取り出してカラム６に加え、次に、カラム６から２００マイクロリットルを取り出してカラム４に加え、次に、カラム４から２００マイクロリットルを取り出してカラム２に加えた。１ウェル当たりの容積を２００マイクロリットルに一貫して維持するために、カラム２から２００マイクロリットルを廃棄した。ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧの希釈係数は１：６２５〜１：２０，０００の範囲であった。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で６０分間培養した。プレートをＰＢＳで洗浄した。
【００８４】
１００マイクロリットルのＴＭＢ基質を各ウェルに加えた。プレートを室温で１５分間培養し、発色を観察した。１００マイクロリットルの２Ｍ硫酸を各ウェルに加えてペルオキシダーゼ反応を止めた。プレートリーダーの中にプレートを置いて、４５０ｎｍ波長における吸光度を読み取った。
【００８５】
これらの実験で使用した抗体はウサギ抗ザイモサン抗体であった。使用した第２の抗体は、ウサギで産生された全ての一次抗体を認識するＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧであった。これらの抗体がザイモサンを認識するかどうかを判定するために滴定曲線を描いた。表２に示されるように、滴定は、標的ザイモサンに対する抗体の線形応答を提供した。
【表２】
2011515656.tif 000004
【００８６】
（実施例２）．
ビオチニル化抗ザイモサンはビオチン―ストレプトアビジンＥＬＩＳＡによってザイモサンを認識する。
【００８７】
Ａ．一般材料及び方法
被覆緩衝液、ＰＢＳ、ＥＬＩＳＡプレート、培養イオン、及び洗浄手順は実施例１に記載の通りに実施された。アルカリホスファターゼ発色性基質、ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（ｐＮＰＰ、カタログ番号３７６２１）をＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。水酸化ナトリウム、２Ｎ、を５Ｍのストック濃度から調製し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。この実験ではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＰＢＳ中１％溶液として使用し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合イムノピュア（Immunopure）ストレプトアビジンをＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。
【００８８】
実施例１に記載の通りにザイモサン抗原を調製して保管した。
【００８９】
この実験で使用した抗体は、分子プローブからのウサギ抗ザイモサン（カタログ番号Ｚ２８５０）を含んでいた。ウサギ抗ザイモサンを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手したＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してビオチニル化した。
【００９０】
Ｂ．ＥＬＩＳＡ条件
ＥＬＩＳＡ条件は実施例１に記載のものと同様であったが、ｉ（ウサギ抗ザイモサン抗体の代わりにビオチニル化ウサギ抗ザイモサン抗体）カタログ番号Ｚ−２８５０、分子プローブ（を使用したこと、ｉｉ）ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧの代わりにアルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合ストレプトアビジン（カタログ番号２１３２４、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用したこと、ｉｉｉ）以下に記載のようにＴＭＢ基質の代わりにｐＮＰＰ基質を使用したこと、が異なっていた。
【００９１】
１００マイクロリットルのｐＮＰＰ基質を各ウェルに加えた。プレートを室温で１５分間培養し、発色を観察した。１００マイクロリットルの２Ｎ水酸化ナトリウムを各ウェルに加えてホスファターゼ反応を止めた。プレートリーダーの中にプレートを置いて、４０５ｎｍ波長における吸光度を読み取った。
【表３】
2011515656.tif 000005
【００９２】
実施例３及び５で使用したリポソームはビオチニル化リン脂質を有し、これは、抗体がビオチン−ストレプトアビジンの化学的性質によってこれらのリポソームに結合したことを意味する。この実験は、抗体をリポソームに結合するためにビオチン−ストレプトアビジンの化学的性質を用いるための条件を最適化して行われた。この実験では、抗ザイモサン抗体はビオチニル化され、抗体結合ザイモサンの検出はＡＰ結合ストレプトアビジンを使用して行われた。滴定データは、ザイモサンに対するビオチニル化抗体及びストレプトアビジンの線形応答を示した（表３）。
【００９３】
（実施例３）．
リポソームは抗ザイモサン抗体相互作用によってザイモサンを認識する。
【００９４】
Ａ．一般材料及び方法
被覆緩衝液、ＰＢＳ、ＥＬＩＳＡプレート、培養イオン、及び洗浄手順は実施例１に記載の通りに実施された。この実験ではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＰＢＳ中１％溶液として使用し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。イムノピュア（Immunopure）ストレプトアビジンはＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。
【００９５】
０．２５％ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００水溶液を使用してリポソームを溶解した。西洋ワサビペルオキシダーゼ発色性基質、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。硫酸、２Ｍ、を、実施例１に記載の通りにストック濃縮物から調製した。
【００９６】
ザイモサン抗原を実施例１に記載の通りに調製及び保管した。
【００９７】
ビオチニル化ウサギ抗ザイモサン抗体を実施例２に記載の通りに調製した。
【００９８】
Ｂ．ＨＲＰリポソームの合成
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）の２０ｍｇ／ｍＬＣＨＣｌ３溶液１．２５ｍＬをフラスコの中に量り取った。次に、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ビオチニル）（ナトリウム塩）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）の５０ｍｇ／ｍＬＣＨＣｌ３溶液５μＬを加えた。続いて、この混合溶液をロータリーエバポレーターの上で乾燥させ、真空下に置いて余分な溶媒を除去した。
【００９９】
次に、乾燥された脂質膜を、１０ｍｍｏｌのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）中で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈより入手）の５ｍｇ／ｍＬ溶液１ｍＬで水和し、ｐＨを１ＮのＨＣｌで６．５に調節した。
【０１００】
続いて、この溶液を超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ  ２５１０，Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）の中に置いて、５０℃で１時間超音波処理した。
【０１０１】
超音波処理の後、リポソーム溶液をドライアイス／アセトン浴で交互に凍結させ、次に温水で５回解凍した。濁った溶液は、まず、５０℃〜５５℃で４００ｎｍのポリカーボネート膜（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を通して１５回押し出され、次に、同じ温度で２００ｎｍの膜を通して押し出された。
【０１０２】
包まれていない余剰ＨＲＰを、まず、Ｑ−ＸＬ陰イオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を介して、続いて、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００サイズ排除カラムで、カラムクロマトグラフィーによって除去し、いずれのケースも１０ｍＭのＴＥＳで溶出された。脂質濃度を、４．１３ｍｇ／ｍＬでＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  Ｃテスト（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ＶＡ）により評価し、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によってｚ−平均粒子径は１２ｎｍであることが判明した。
【０１０３】
Ｃ．ＥＬＩＳＡ条件
このアッセイではザイモサンを被覆抗原として使用した。ザイモサンを被覆緩衝液中で冷却貯蔵出発濃度からマイクロウェル被覆濃度（１ウェル当たり２０マイクログラム）まで希釈した。２００マイクロリットルの被覆溶液が、マイクロウェルプレートのウェルに加えられた。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で１２０分間培養した。ブロッキング工程の前にＰＢＳで洗浄して被覆溶液を除去した。
【０１０４】
マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中で希釈された１ウェル当たり２００マイクロリットルの１％ＢＳＡで、ロッキングプラットフォームの上で周囲温度で６０分間ブロッキングした。ＰＢＳで洗浄してブロッキング溶液を除去した。
【０１０５】
ＰＢＳ中で２０００ｎｇ／ｍＬに希釈したビオチニル化ウサギ抗ザイモサン抗体（分子プローブ＃Ｚ−２８５０）２００マイクロリットルをＡ、Ｂ、Ｅ、及びＦ列に加えた。Ｃ、Ｄ、Ｇ、及びＨ列は２００マイクロリットルのＰＢＳを含んでいた。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で１２０分間培養した。次に、プレートをＰＢＳで洗浄した。
【０１０６】
ＰＢＳ中で５０００ｎｇ／ｍＬに希釈したイムノピュア（Immunopure）ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃２１１２２）２００マイクロリットルをＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ列に加えた。Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨ列は２００マイクロリットルのＰＢＳを含んでいた。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で６０分間培養した。次に、プレートをＰＢＳで洗浄した。
【０１０７】
ビオチニル化リポソームを６２５分の１でＰＢＳの中で希釈した。４００マイクロリットルのリポソームをカラム６の全てのウェルに加えた。ウェルの残りは２００マイクロリットルのＰＢＳを含んでいた。プレートに対してリポソームを２倍に希釈した。カラム６から２００マイクロリットルを取り出してカラム５に加え、次に、カラム５から２００マイクロリットルを取り出してカラム４に加え、次に、カラム４から２００マイクロリットルを取り出してカラム３に加え、次に、カラム３から２００マイクロリットルを取り出してカラム２に加え、次に、カラム２から２００マイクロリットルを取り出してカラム１に加えた。１ウェル当たりの容積を２００マイクロリットルに一貫して維持するために、カラム１から２００マイクロリットルを廃棄した。リポソームの希釈係数は１：６２５〜１：２０，０００の範囲であった。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で６０分間培養した。プレートをＰＢＳで洗浄した。
【０１０８】
２５マイクロリットルの０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を各ウェルに加えてリポソームを溶解した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加直後に、１００マイクロリットルのＴＭＢ基質を各ウェルに加えた。プレートを室温で１５分間培養し、発色を観察した。１００マイクロリットルの２Ｍ硫酸を各ウェルに加えてペルオキシダーゼ反応を止めた。プレートリーダーの中にプレートを置いて、４５０ｎｍ波長における吸光度を読み取った。
【０１０９】
表４において、結果は、リポソームは抗体相互作用を介してザイモサンを認識したことを示した。ビオチニル化リン脂質含有リポソームはストレプトアビジンリンカーを介してビオチニル化抗ザイモサン抗体に結合した。グラフに示される対照群は、抗ザイモサン抗体の省略、ストレプトアビジンの省略、又は抗体及びストレプトアビジンの省略を含んでいた。
【表４】
2011515656.tif 000006
【０１１０】
（実施例４）．
ビオチニル化抗ザイモサンはビオチン−ストレプトアビジンＥＬＩＳＡによって酵母及びカビの全細胞可溶化物中のザイモサンに結合する。
【０１１１】
Ａ．一般材料及び方法
被覆緩衝液、ＰＢＳ、ＥＬＩＳＡプレート、培養イオン、及び洗浄手順は実施例１に記載の通りに実施された。西洋ワサビペルオキシダーゼ発色性基質、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。硫酸、２Ｍ、は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から入手した１８．４Ｍのストック濃縮物で調製した。この実験ではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＰＢＳ中１％溶液として使用し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合イムノピュア（Immunopure）ストレプトアビジンはＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。
【０１１２】
実施例１に記載の通りにザイモサン抗原を調製して保管した。
【０１１３】
この実験で使用した酵母は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（ＡＴＣＣ  ＃２４２９７）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（ＡＴＣＣ  ＃２０１３９０）、及びカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ  ＃１０２３１）を含んでいた。この実験で使用したカビは、アスペルギルス・フラバス（ＡＴＣＣ  ＃９６４３）、アスペルギルス・ニゲル（ＡＴＣＣ  ＃１６４０４）、クラドスポリウム・ヘルバレム（ＡＴＣＣ  ＃７６２２６）、及びペニシリウム・フニクロスム（ＡＴＣＣ  ＃１１７９７）を含んでいた。酵母は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手したＤｉｆｃｏ（商標）サブロー寒天培地で培養した。カビは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手したＤｉｆｃｏ（商標）ポテトデキストロース寒天培地で培養した。カンジダ・アルビカンス培養物を３７℃で増殖させた。他の培養物の全ては２８℃で増殖させた。
【０１１４】
この実験で使用した抗体は、捕捉抗体として分子プローブからのウサギ抗ザイモサン（カタログ番号Ｚ２８５０）を含んでいた。ウサギ抗ザイモサンを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手したＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してビオチニル化し、酵母及びカビの全細胞可溶化物中のザイモサンを検出するための一次抗体として使用した。
【０１１５】
Ｂ．酵母及びカビの全細胞可溶条件
この実験で使用した酵母は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（ＡＴＣＣ  ＃２４２９７）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（ＡＴＣＣ  ＃２０１３９０）、及びカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ  ＃１０２３１）を含んでいた。この実験で使用したカビは、アスペルギルス・フラバス（ＡＴＣＣ  ＃９６４３）、アスペルギルス・ニゲル（ＡＴＣＣ  ＃１６４０４）、クラドスポリウム・ヘルバレム（ＡＴＣＣ  ＃７６２２６）、及びペニシリウム・フニクロスム（ＡＴＣＣ  ＃１１７９７）を含んでいた。酵母は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手したＤｉｆｃｏ（商標）サブロー寒天培地で培養した。カビは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手したＤｉｆｃｏ（商標）ポテトデキストロース寒天培地で培養した。ＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム，２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加して菌叢を採取した。ＲＩＰＡ緩衝液の化学物質は全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ＲＩＰＡ緩衝液の添加後、スパチュラを使用してプレートからコロニーをこすり取り、このコロニーを１．５ｍＬの微小遠心管に移した。グラスウールを通してカビを濾過して胞子を除去した。Ｋｉｍｂｌｅ／Ｋｏｎｔｅｓ（Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）から入手したＭｉｃｒｏ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒを使用して、細胞を５０Ｈｅｒｔｚで１時間超音波処理し、次に、溶解物を１３，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間スピンしてペレット化した。上清を新しい管に移し、全タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手したＢＣＡ（商標）タンパクアッセイキットを使用して測定した。それぞれの細胞可溶化物の２０マイクログラムを分析に使用した。
【０１１６】
Ｃ．ＥＬＩＳＡ条件
このアッセイの捕捉抗原としてウサギ抗ザイモサンを使用した。ウサギ抗ザイモサンを被覆緩衝液中で冷凍保存出発濃度からマイクロウェル被覆濃度（１ウェル当たり２０マイクログラム）まで希釈した。２００マイクロリットルの被覆溶液をマイクロウェルプレートのウェルに加えた。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で１２０分間培養した。ブロッキング工程の前にＰＢＳで洗浄して被覆溶液を除去した。
【０１１７】
マイクロタイタープレートを、１ウェル当たり２００マイクロリットルのＰＢＳ中で希釈された１％ＢＳＡで、ロッキングプラットフォームの上で周囲温度で６０分間ブロッキングした。ＰＢＳで洗浄してブロッキング溶液を除去した。
【０１１８】
サッカロマイセス・セレヴィシエ（ＡＴＣＣ  ＃２４２９７）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（ＡＴＣＣ  ＃２０１３９０）、カンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ  ＃１０２３１）、アスペルギルス・フラバス（ＡＴＣＣ  ＃９６４３）、アスペルギルス・ニゲル（ＡＴＣＣ  ＃１６４０４）、クラドスポリウム・ヘルバレム（ＡＴＣＣ  ＃７６２２６）、及びペニシリウム・フニクロスム（ＡＴＣＣ  ＃１１７９７）からの全細胞可溶化物２０マイクログラムを、ＰＢＳの中で全容積２００マイクロリットルまで希釈した。ザイモサンを２００マイクロリットルのＰＢＳ中で冷却貯蔵出発濃度から１ウェル当たり２０マイクログラムまで希釈した。ザイモサンをカラム１のＡ、Ｂ、及びＣ列に加え、サッカロマイセス・セレヴィシエ（ＡＴＣＣ  ＃２４２９７）をカラム２の対応する列に加え、サッカロマイセス・セレヴィシエ（ＡＴＣＣ  ＃２０１３９０）をカラム３に加え、カンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ  ＃１０２３１）をカラム４に加え、アスペルギルス・フラバス（ＡＴＣＣ  ＃９６４３）をカラム５に加え、アスペルギルス・ニゲル（ＡＴＣＣ  ＃１６４０４）をカラム６に加え、クラドスポリウム・ヘルバレム（ＡＴＣＣ  ＃７６２２６）をカラム７に加え、及びペニシリウム・フニクロスム（ＡＴＣＣ  ＃１１７９７）をカラム８に加えた。カラム１２はあくまでブランクとして２００マイクロリットルのＰＢＳを含んでいた。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で６０分間培養した。プレートをＰＢＳで洗浄した。
【０１１９】
ＰＢＳ中で５０００ｎｇ／ｍＬに希釈された２００マイクロリットルのビオチニル化ウサギ抗ザイモサン抗体（分子プローブ＃Ｚ−２８５０）をＡ列に加えた。ＰＢＳ中で２５００ｎｇ／ｍＬに希釈された２００マイクロリットルのビオチニル化ウサギ抗ザイモサン抗体をＢ列に加えた。ＰＢＳ中で１２５０ｎｇ／ｍＬに希釈された２００マイクロリットルのビオチニル化ウサギ抗ザイモサン抗体をＣ列に加えた。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で１２０分間培養した。プレートをＰＢＳで洗浄した。
【０１２０】
ＰＢＳ中で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジンを、作用濃度１００ｎｇ／ｍＬに希釈した。２００マイクロリットルのＨＲＰ結合ストレプトアビジンを各ウェルに加えた。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で６０分間培養した。プレートをＰＢＳで洗浄した。
【０１２１】
１００マイクロリットルのＴＭＢ基質を各ウェルに加えた。プレートを室温で１５分間培養し、発色を観察した。１００マイクロリットルの２Ｍ硫酸を各ウェルに加えてペルオキシダーゼ反応を止めた。プレートリーダーの中にプレートを置いて、４５０ｎｍ波長における吸光度を読み取った。
【０１２２】
表５に示される結果は、ビオチニル化ウサギ抗ザイモサン抗体は酵母及びカビからの全細胞可溶化物の中のザイモサンを認識したこを示した。精製されたザイモサンを対照として使用した。
【表５】
2011515656.tif 000007
【０１２３】
（実施例５）．
リポソームは抗体相互作用を介して酵母及びカビの全細胞可溶化物の中のザイモサンを認識する。
【０１２４】
Ａ．一般材料及び方法
被覆緩衝液、ＰＢＳ、ＥＬＩＳＡプレート、培養イオン、及び洗浄手順は実施例１に記載の通りに実施された。この実験ではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＰＢＳ中１％溶液として使用し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。イムノピュア（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ）ストレプトアビジンはＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。
【０１２５】
使用したリポソームは、１０ｍＭのＴＥＳ中の５ｍｇ／ｍＬのＨＲＰと共にＤＰＰＣ／ビオチンを含み、ｐＨは６．５であった。０．２５％ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００水溶液を使用してリポソームを溶解した。西洋ワサビペルオキシダーゼ発色性基質、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、はＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。硫酸、２Ｍ、を、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から入手した１８．４Ｍのストック濃縮物でで調製した。
【０１２６】
この実験で使用した抗原は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手のザイモサン（カタログ番号ｔｌｒｌ−ｚｙｎ）を含んだ。ザイモサンを１ｍｇ／ｍＬ水溶液に戻し、４℃で保管した。
【０１２７】
この実験で使用した酵母及びカビは、実施例４に記載の通りに調製した。この実験で使用した抗体は、実施例４に記載の通りに調製した。
【０１２８】
Ｂ．酵母及びカビの全細胞可溶条件
酵母及びカビの全細胞可溶条件及び手順は実施例４に記載の通りであった。
【０１２９】
Ｃ．ＨＲＰリポソーム合成
実施例３に記載の通りにリポソームを合成した。
【０１３０】
Ｄ．ＥＬＩＳＡ条件
実施例４に記載の通りに、プレートをウサギ抗ザイモサンで被覆して、ＢＳＡでブロッキングした。
【０１３１】
実施例４に記載の通りに、全細胞可溶化物及びザイモサンをプレートのウェルに加え、プレートを培養して洗浄した。
【０１３２】
ＰＢＳ中で５０００ｎｇ／ｍＬに希釈したビオチニル化ウサギ抗ザイモサン抗体（分子プローブ＃Ｚ−２８５０）２００マイクロリットルを各ウェルに加えた。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で１２０分間培養した。プレートをＰＢＳで洗浄した。
【０１３３】
ＰＢＳ中で５０００ｎｇ／ｍＬに希釈したイムノピュア（Immunopure）ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃２１１２２）２００マイクロリットルを各ウェルに加えた。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で６０分間培養した。次に、プレートをＰＢＳで洗浄した。
【０１３４】
ビオチニル化リポソームを係数１：６２５でＰＢＳ中で希釈した。４００マイクロリットルのリポソームをＡ列の全てのウェルに加えた。列の残りは２００マイクロリットルのＰＢＳを含んでいた。プレートに対してリポソームを２倍に希釈した。Ａ列から２００マイクロリットルを取り出してＢ列に加え、次に、Ｂ列から２００マイクロリットルを取り出してＣ列に加え、次に、Ｃ列２００マイクロリットルを取り出してＤ列に加え、次に、Ｄ列から２００マイクロリットルを取り出してＥ列に加え、次に、Ｅ列から２００マイクロリットルを取り出してＦ列に加え、次に、Ｆ列から２００マイクロリットルを取り出してＧ列に加え、次に、Ｇ列から２００マイクロリットルを取り出してＨ列に加えた。１ウェル当たりの容積を２００マイクロリットルに一貫して維持するために、Ｈ列から２００マイクロリットルを廃棄した。リポソームの希釈係数は１：６２５〜１：４０，０００の範囲であった。プレートをロッキングプラットフォームの上で周囲温度で６０分間培養した。プレートをＰＢＳで洗浄した。
【０１３５】
２５マイクロリットルの０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を各ウェルに加えてリポソームを溶解した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加直後に、１００マイクロリットルのＴＭＢ基質を各ウェルに加えたプレートを室温で１５分間培養し、発色を観察した。１００マイクロリットルの２Ｍ硫酸を各ウェルに添加することによってペルオキシダーゼ反応は停止された。プレートリーダーの中にプレートを置いて、４５０ｎｍ波長における吸光度を読み取った。
【０１３６】
表６に示される結果は、リポソームは、抗体相互作用を介して酵母及びカビからの全細胞可溶化物の中のザイモサンを認識したこを示した。
【表６】
2011515656.tif 000008
【０１３７】
ここで、本発明は、可能な記述が実施可能な発明者によって予測される、いくつかの特定の実施形態を参照して記載されている。現在予測されていない修正を含む、本発明の実体の無い修正は、それでもなお、それらと同等であると定めることができる。したがって、本発明の範囲は、本明細書において説明した詳細及び構造に限定されるべきではなく、むしろ、以下の特許請求の範囲、及びそれらと同等の物によって単に限定されるべきである。
【図１】
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【図２ａ】
2011515656.tif 000010
【図２ｂ】
2011515656.tif 000011
【図３】
2011515656.tif 000012
【図４ａ】
2011515656.tif 000013
【図４ｂ】
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【図５ａ】
2011515656.tif 000015
【図５ｂ】
2011515656.tif 000016
【図６ａ】
2011515656.tif 000017
【図６ｂ】
2011515656.tif 000018
【図７ａ】
2011515656.tif 000019
【図７ｂ】
2011515656.tif 000020
【図７ｃ】
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【国際調査報告】
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