(57)【要約】本発明は、減少したＮ−結合グリコシル化および低下した免疫原性を有する改変された因子ＶＩＩＩ分子に関する。本発明はまた、例えば、血友病にかかっている患者を処置するために、改変された因子ＶＩＩＩ分子を使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたはそれ以上の天然に存在するＮ−結合グリコシル化部位のアミノ酸配列内において１つまたはそれ以上のアミノ酸変異を導入することによって改変されたアミノ酸配列を含む、組み換え因子ＶＩＩＩ分子であって、前記変異が、Ｎ−結合グリコシル化部位をグリコシル化から防ぐものである分子。
【請求項２】
Ｎ−結合グリコシル化部位のアミノ酸配列が、因子ＶＩＩＩ分子のアミノ酸位置４１〜４３、２３９〜２４１、５８２〜５８４、１８１０〜１８１２、および２１１８〜２１２０からなる群から選択されるものである、請求項１記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項３】
アミノ酸位置が、２３９〜２４１、１８１０〜１８１２、および２１１８〜２１２０である、請求項２記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項４】
１つまたはそれ以上のアミノ酸変異が、２３９位、１８１０位、および２１１８位における１つまたはそれ以上のアミノ酸変異を含むものである、請求項２記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項５】
変異が、２３９位および１８１０位における変異を含むものである、請求項２記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項６】
変異が、２３９位および２１１８位における変異を含むものである、請求項２記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項７】
変異が、１８１０位および２１１８位における変異を含むものである、請求項２記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項８】
変異が置換を含むものである、請求項１から７のいずれか記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項９】
置換が、２３９位におけるアスパラギンのグルタミンへの置換を含むものである、請求項８記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項１０】
置換が、１８１０位におけるアスパラギンのグルタミンへの置換を含むものである、請求項８記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項１１】
置換が、２１１８位におけるアスパラギンのグルタミンへの置換を含むものである、請求項８記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項１２】
置換が、Ｎ２３９ＱおよびＮ２１１８Ｑの置換を含むものである、請求項８記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項１３】
因子ＶＩＩＩ分子が、Ｂ−ドメイン欠失因子ＶＩＩＩ分子である、請求項１から１２のいずれか記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子をコードする、単離された核酸。
【請求項１５】
請求項１４記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５記載の発現ベクターを含む、グリコシル化能力のある宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１６記載のグリコシル化能力のある宿主細胞を含む、細胞培養物。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれか記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
保存のために凍結乾燥され、投与のために液体中で再構成することができる、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
因子ＶＩＩＩ療法を必要とする患者を処置する方法であって、前記患者に、治療上有効な量の請求項１から１３のいずれか記載の組み換え因子ＶＩＩＩ分子または請求項１８記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項２１】
遺伝子療法による因子ＶＩＩＩ療法を必要とする患者を処置する方法であって、前記患者に、因子ＶＩＩＩ分子をコードする治療用ベクターを含む組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年６月２５日に出願した米国仮出願第61/075,494号の利益を主張し、その内容は出典明示により全体が本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、一般に、変異型因子ＶＩＩＩ分子（因子ＶＩＩＩ変異タンパク質）であって、特定の非キャップ化Ｎ−結合グリコシル化部位に変異を有する分子に関する。これらの変異タンパク質は、治療に用いられる場合に、抗原提示樹状細胞による取り込みの減少および免疫原性の低下を示す。
【背景技術】
【０００３】
天然物から単離されるか、または組み換え方法によって合成されたヒト治療用タンパク質（生物製剤）は、ヒト患者に投与した際に免疫応答を誘導することができる。これらの免疫応答は、わずかな皮膚の炎症ないし治療用薬物の有効性の減少に及ぶ効果を生じることがあり、重度の臓器不全または死を引き起こすこともあり得る。
【０００４】
組み換え因子ＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）で処理した患者の約３０％は、免疫応答を示す。これらの患者の約３人に１人は、因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）に対する中和抗体（ｎＡｂ）を示し、そしてこれらの抗体は、ＦＶＩＩＩ療法の有効性を妨げうる（Ehrenforth, et al., Lancet 339:594-598, 1992；Gringeri, et al., Blood 102:2358-2363, 2003）。ＦＶＩＩＩの高用量投与がこの患者集団のｎＡｂの効果を減少させることができる一方で、より高い用量の処置計画に付随するコンプライアンスの負担およびコストは望ましくない。
【０００５】
免疫を誘発する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の主なタイプは、樹状細胞（ＤＣ）である。ＤＣは、異なるタイプの細胞表面受容体を介してタンパク質を取り込むことができる。エンドサイトーシスは、タンパク質のペプチドへのプロセッシング、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）タンパク質における各ペプチドの積み込み（loading）、および細胞表面上のペプチドＭＨＣＩＩ複合体の提示を引き起こす（Trombetta, et al., Annu Rev Immunol 23:975-1028, 2005）。Ｔヘルパー細胞によるこれらのペプチドの認識は、免疫原性および／または免疫毒性を生じ得る下流の事象を誘導する。
【０００６】
最近の報告は、マンノース特異的受容体であるＣＤ２０６がＡＰＣによるＦＶＩＩＩの取り込みにおいて役割を果たすことを示唆する。ＦＶＩＩＩとＣＤ２０６間の相互作用は、ＦＶＩＩＩ／ＣＤ２０６複合体のエンドサイトーシスおよびｒＦＶＩＩＩタンパク質のペプチドへの分解を引き起こし、次いで、前記ペプチドがＡＰＣの表面上のＭＨＣクラスＩＩタンパク質により提示される（Dasgupta, et al., Proc Natl Acad Sci USA 104:8965-8970, 2007）。ＣＤ２０６は、様々な親和性を有する多くの異なる糖鎖構造（マンノース、フコース、およびＮ−アセチルグルコサミン）を認識することが示されている（Lee, et al., Science 295:1898-1901, 2002）。しかしながら、マンノース受容体ファミリーのメンバーのうち、ＣＤ２０６がマンノースに対して最も高い親和性を有するようである。ＦＶＩＩＩは、キャップされた（シアル化によりキャップされた）グリコシル化部位と、キャップされていない（シアル化されていない）グリコシル化部位の両方を含むことが示されている（Kaufman, et al., J Biol Chem 263:6352-6362, 1988；Medzihradszky, et al., Anal Chem 69:3986-3994, 1997）。非キャップ化部位はマンノース残基で終結しており、それゆえマンノース末端（mannose-ending）グリコシル化部位と呼ばれることもある。ＦＶＩＩＩにおいてキャップされていないグリコシル化はマンノース残基で終結することから、それらはＣＤ２０６の認識部位として作用しうる。
【０００７】
キャップされているか、またはキャップされていないグリコシル化のいずれかのための可能性のある部位は、ＦＶＩＩＩ分子上でＮ−結合グリコシル化部位で生じる。Ｎ−結合グリコシル化は、アミノ酸配列モチーフＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（Ｘが、プロリン以外のいずれかのアミノ酸でありうる）内のアルパラギン残基上で起こる。全長成熟ＦＶＩＩＩは、２４個の推定上のＮ−結合グリコシル化部位を含む。
【０００８】
ヒトＦＶＩＩＩは、構造ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を含む（Thompson, Semin Hematol 29:11-22, 2003）。Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）もＡ型血友病の補充療法として有効であることから、ＦＶＩＩＩのＢ−ドメインは不必要である。
【０００９】
Ｂ−ドメイン内には１９個の推定上のＮ−結合グリコシル化部位が存在しており、それゆえ、完全なＢ−ドメインの除去は、アミノ酸位置４１、２３９、５８２、１８１０、および２１１８でＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）に５個の残存Ｎ−結合グリコシル化部位を残す。アミノ酸位置２３９、１８１０、および２１１８のＮ−結合グリコシル化部位は、通常、アミノ酸位置４１および５８２の該部位より高いレベルのＮ−結合グリコシル化を示す。
【００１０】
変化したグリコシル化パターンを有する組み換えタンパク質の産生は、組み換え培養物からの産生収量における減少の可能性および／または組み換えタンパク質の活性の低下を含むいくつかの課題を提示する。
【００１１】
ＦＶＩＩＩ免疫原性の課題は、当該技術分野で認められており、その治療効果を改善する目的で、ＦＶＩＩＩの免疫原性を低下させるための多くのアプローチが提案されてきた。
【００１２】
ＦＶＩＩＩの免疫原性は、ＦＶＩＩＩをポリエチレングリコール（ペグ化）などのアルコールポリマーに抱合することによって低下されうる（米国特許第4,970,300号）。米国特許第7,351,688号は、ＦＶＩＩＩなどの治療用タンパク質と、リン脂質などの結合剤との複合体を形成させることを開示する。ヒト／動物のＦＶＩＩＩハイブリッド分子であって、ヒトＦＶＩＩＩ分子の特定の免疫原性部分がブタＦＶＩＩＩ配列で置換された分子は、ヒトＦＶＩＩＩよりヒトにおいて低い免疫原性を示すものとして記載される（例えば、米国特許第5,364,771号；第6,180,371号；第6,458,563号；および第7,012,132号を参照のこと）。ＦＶＩＩＩの免疫原性は、Ｎ−結合グリコシル化のためのさらなる部位を、抗ＦＶＩＩＩ抗体と反応することが知られているＦＶＩＩＩエピトープに導入することによって低下させることができる（米国特許第6,759,216号）。
【００１３】
提案されている別の方策は、抗ＦＶＩＩＩ抗体と結合するＦＶＩＩＩ分子の領域に変異を導入することによってＦＶＩＩＩの免疫原性を低下させることである（例えば、米国特許第7,211,559号；第7,122,634号；第7,033,791号；第6,770,744号；および第6,376,463号を参照のこと）。
【００１４】
位置２３９、１８１０、１８１２、および２１１８を含むＦＶＩＩＩ分子中のいくつかのアミノ酸位置においてシステイン残基を導入する変異を含むＦＶＩＩＩ変異タンパク質であって、前記導入されたシステイン残基がＦＶＩＩＩ変異タンパク質のペグ化のための部位を提供するＦＶＩＩＩ変異タンパク質（米国公開特許出願第20060115876 A1号）。
【００１５】
それゆえ、抗原提示樹状細胞による取り込みの減少および免疫原性の低下を示すＦＶＩＩＩなどの治療用タンパク質は、ＦＶＩＩＩ療法を必要とする患者、例えば、血友病のための有用な治療を提供するであろう。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、組み換えＦＶＩＩＩ分子であって、ＦＶＩＩＩ分子のアミノ酸位置４１〜４３、２３９〜２４１、５８２〜５８４、１８１０〜１８１２、および２１１８〜２１２０で生じる、１つまたはそれ以上の天然に存在する非キャップ化Ｎ−結合グリコシル化配列モチーフ内の変異を含む組み換えＦＶＩＩＩ分子を提供する。一つの具体例において、変異は、アミノ酸位置４１、２３９、１８１０、１８１２、または２１１８においてシステイン残基を導入していない。これらの変異は、ｒＦＶＩＩＩ分子がグリコシル化能力のある宿主細胞において発現される際に、変異が導入された部位をグリコシル化から防ぐ。一つの具体例において、変異は、アミノ酸位置２３９〜２４１、１８１０〜１８１２、および２１１８〜２１２０の１箇所またはそれ以上で生じる。
【００１７】
別の具体例において、ＦＶＩＩＩ分子は、Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ変異タンパク質（ＢＤＤ変異タンパク質）である。非キャップ化Ｎ−結合グリコシル化部位における置換を有するＢＤＤ変異タンパク質は、組み換え技術により比較的高いレベルで発現されることが見出されており、それらは、変異が入っていないＢＤＤと比較して同等のまたは増加した活性レベルを示す。
【００１８】
さらなる具体例において、本発明は、ｒＦＶＩＩＩ分子をコードする単離された核酸を含む。
【００１９】
別の具体例において、本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクターを含む。
【００２０】
別の具体例において、本発明は、本発明の発現ベクターを含むグリコシル化能力のある宿主細胞を含む。
【００２１】
別の具体例において、本発明は、本発明のグリコシル化能力のある宿主細胞を含む細胞培養物を含む。
【００２２】
別の具体例において、本発明は、本発明の組み換えＦＶＩＩＩ分子および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を含む。この組成物は、当該技術分野で慣用されているように、保存のために凍結乾燥され、投与のために液体中に再構成され得る。
【００２３】
なお別の具体例において、本発明は、ＦＶＩＩＩ療法を必要とする患者を処置する方法であって、前記患者に、治療上有効な量の本発明の組み換えＦＶＩＩＩ分子を投与することを含む方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、樹状細胞（ＤＣ）によるインビトロにおける全長ｒＦＶＩＩＩおよび脱グリコシル化された全長ｒＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ  Ｄｅｇｌｙ）の取り込みを示す。脱グリコシル化前に、ＦＡＣＳ解析による検出のために蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）でｒＦＶＩＩＩを標識した。Ｅｎｄｏ−Ｆ１を用いて６０分間、ｒＦＶＩＩＩを脱グリコシル化し、ＤＣと共に３０分間共培養し、次いで洗浄した。次に、ＤＣによるＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ  Ｄｅｇｌｙの取り込みをＦＡＣＳにより解析した。ＦＶＩＩＩの取り込みを１００％として、ＦＶＩＩＩ  Ｄｅｇｌｙの取り込みをＦＶＩＩＩの取り込みと比較して示す。ＦＶＩＩＩ  ＤｅｇｌｙとＦＶＩＩＩとを比較して、独立スチューデントＴ−検定を行った；ＦＶＩＩＩについて、＊＊ｐ＜０．０１。
【図２】図２は、Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）ならびに３つのＢＤＤ変異タンパク質（Ｎ２３９Ｑ、Ｎ２１１８Ｑ、Ｎ２３９Ｑ／Ｎ２１１８Ｑ）の活性（図２Ａ）および濃度（図２Ｂ）を示す。用いられる名称は、指示する位置でのアミノ酸置換を表し、例えば、Ｎ２３９Ｑは、当該分子のアミノ酸位置２３９におけるグルタミンからアスパラギンへの置換を示す。Ｎ２３９Ｑ、Ｎ２１１８Ｑ、およびＮ２３９Ｑ／Ｎ２１１８ＱをコードするＢＤＤ変異体構築物により、ＨＫＢ１１細胞を別々にトランスフェクトさせた。タンパク質の発現後、トランスフェクションの９６時間後に、条件培地を発色アッセイによる活性についてアッセイし（図２Ａ）、濃度をＥＬＩＳＡによりアッセイした（２Ｂ）。
【図３】図３は、樹状細胞（ＤＣ）による全長ｒＦＶＩＩＩ、Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）、およびＮ−グリコシル化部位ＢＤＤ単独（Ｎ２１１８Ｑ）、および二重変異タンパク質（Ｎ２３９Ｑ／Ｎ２１１８Ｑ）の取り込みを示す。ＤＣを、ＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ、ＢＤＤＮ２１１８Ｑ、またはＢＤＤ  Ｎ２３９Ｑ／Ｎ２１１８Ｑと共に４℃（４Ｃ）および３７℃（３７Ｃ）で３０分間共培養した。次いで、細胞を洗浄し、細胞抽出物中のＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ、ＢＤＤ  Ｎ２１１８ＱおよびＢＤＤ  Ｎ２３９Ｑ／Ｎ２１１８Ｑの濃度（ｐＭ）をＥＬＩＳＡにより測定した。Ｎ２１１８ＱおよびＮ２３９Ｑ／Ｎ２１１８Ｑと、ＦＶＩＩＩおよびＢＤＤとを比較して、独立スチューデントＴ検定を行った；ＦＶＩＩＩおよびＢＤＤの両方について、＊＊ｐ＜０．０１。
【図４】図４は、Ｎ２１１８Ｑに対するＦＶＩＩＩ−特異的Ｔ細胞クローンＢＯ１−４のＩＦＮγ（図４Ａ）および増殖性（図４Ｂ）応答の減少を示す。簡単に説明すると、ＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ、またはＮ２１１８ＱをＤＣと共に２４時間インキュベートし、その後、ＦＶＩＩＩ−特異的Ｔ細胞クローンと共培養した。２４時間後に、ＩＮＦγ応答をＥＬＩＳＡにより測定した。６日後に、３Ｈ−チミジン取り込みを調べることにより増殖性応答を測定した。Ｎ２１１８Ｑと、ＦＶＩＩＩおよびＢＤＤとを比較して独立スチューデントＴ検定を行った；ＦＶＩＩＩおよびＢＤＤの両方について、＊＊ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法、プロトコル、細胞株、動物種または属、構築物、および試薬に限定されるものではないと理解されるべきであり、それら自体は変更されてもよい。また、本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態について記載するだけの目的で使用されており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【００２６】
単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いるとき、文中が異なることを明確に示していない限り、複数についての記載を含むことに留意しなければならない。それゆえ、例えば、「アミノ酸」との記載は、１個またはそれ以上のアミノ酸についての記載であり、当業者に知られているその同等物などを含む。
【００２７】
異なることが定義されていない限り、本明細書で用いる全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野で当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法、装置および材料が本発明の実施または試験に使用可能であるが、好ましい方法、装置および試験が本明細書に記載される。
【００２８】
本明細書に記載される全ての刊行物および特許文献は、例えば、本発明に関連して使用可能な刊行物に記載の構築物および方法を記載および説明する目的で、出典明示により本明細書に取り込まれる。上記および本明細書を通じて記載される刊行物は、単に、本願の出願日前の開示を提供する。本明細書において、本発明者らが先願発明を理由にそのような開示に先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【００２９】
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で用いられる一定の用語および成句の意味は、以下に提供される。
【００３０】
因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）は、肝臓で合成され、血流中に放出される糖タンパク質である。トロンビンによる活性化によって、それは複合体から解離して凝固カスケード中のその他の凝固因子と相互作用し、最終的に血栓の形成を生じる。ヒト全長ＦＶＩＩＩは、配列番号：１のアミノ酸配列を有するが、対立遺伝子多型が可能である。この定義は、ＦＶＩＩＩの元々の形態ならびに組み換えの形態を含むと理解されるべきである。本願のポリペプチドを記載する場合、用語「変異タンパク質」および「変異型」は、生物学的機能または活性を保持する、当該ポリペプチドの変異タンパク質および変異型を意味する。
【００３１】
本明細書で用いるとき、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）は、ＦＶＩＩＩのＢ−ドメインの１４アミノ酸を除いた全ての欠失を含むアミノ酸配列を有することにより特徴付けられる。Ｂドメインの最初の４アミノ酸（ＳＦＳＱ、配列番号：２）は、Ｂ−ドメインの１０個の最後の残基（ＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ、配列番号：３）に連結されている（Lind, et al, Eur. J. Biochem. 232:19-27, 1995）。本明細書で用いられるＢＤＤは、配列番号：４のアミノ酸配列を有する。ＢＤＤポリペプチドの例は、出典明示により本明細書に取り込まれる米国公開特許第20060115876 A1号に記載されている。
【００３２】
ＦＶＩＩＩ分子を記載するために本明細書で用いられる「変異」は、Ｎ−結合グリコシル化配列モチーフをコードする核酸における少なくとも１つの置換であって、コードされる変異タンパク質において少なくとも１つのアミノ酸の差異を生じ、グリコシル化モチーフを除去し、それにより該変異分子の当該モチーフでＮ―結合グリコシル化が生じるのを防ぐ置換を意味する。用語「変異」はまた、変異核酸から生じた変化したモチーフを含む。
【００３３】
下記の実施例において、変異タンパク質は、当該技術分野で慣用的な方法で名付けられる。変異体を命名する方法は、配列番号：１として提供される成熟全長ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列に基づく。例えば、変異Ｎ２３９Ｑは、アミノ酸位置２３９におけるアスパラギンがグルタミンに変化されることを示す。
【００３４】
一例として、ＦＶＩＩＩ変異タンパク質は、アミノ酸の保存的置換を含んでもよい。保存的置換は、あるアミノ酸から同様の特性を有する別のアミノ酸への置換として当該技術分野で認識されており、例えば、アラニンからセリン；アルギニンからリジン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リジンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；ならびにバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化を含む。
【００３５】
特定のアミノ酸、その対応するアミノ酸の一文字表記、および三文字表記は、以下の通りである：Ａ、アラニン（Ａｌａ）；Ｃ、システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ、グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ、イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ、リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ、ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ、メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ、アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ、プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ、グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ、アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ、セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ、スレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ、バリン（Ｖａｌ）；Ｗ、トリプトファン（Ｔｒｐ）；Ｙ、チロシン（Ｔｙｒ）；およびノルロイシン（Ｎｌｅ）。
【００３６】
本明細書で用いるとき、タンパク質とポリペプチドは同義語である。
【００３７】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、Ｎ−結合またはＯ−結合である。Ｎ−結合は、糖部分とアスパラギン残基の側鎖との結合を意味する。トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒおよびＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（「Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ」）（ここで、Ｘは、プロリンを除くいずれかのアミノ酸である）は、糖部分とＡｓｎ側鎖との酵素的結合のための認識配列である。それゆえ、ペプチド中のこれらのトリペプチド配列（またはモチーフ）のいずれかの存在は、潜在的なＮ−結合グリコシル化部位を作り出す。
【００３８】
これらの配列モチーフ（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）がＮ−結合グリコシル化に必要であることから、いくつかの異なるタイプの変異は、これらの部位においてＮ−結合グリコシル化を防ぐことができる。これらの変異は、例えば、アスパラギン残基（Ｎ）の別の残基による置換、第二残基（Ｘ）のプロリンによる置換、あるいは第三残基（Ｓ／Ｔ）のセリンまたはスレオニンを除くいずれかのアミノ酸による置換を含む。
【００３９】
Ｎ−結合されたグリコシル化配列モチーフにおける特定の置換、例えば、第三位置におけるセリンのスレオニンへの置換は、モチーフ内のグリコシル化を防げないであろう。当業者は、置換が、変異の入ったグリコシル化部位でのグリコシル化を防ぐか、または防げないかを容易に調べることができる。
【００４０】
一つの具体例において、変異は、モチーフ（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）のうちの１つの位置におけるアスパラギン残基のグルタミンなどの同様のアミノ酸残基による置換であってもよい。Ｎ−結合グリコシル化部位においてアスパラギン残基をグルタミン残基で置換することにより、一般に、これらの位置における元々の分子の極性およびハイドロパシーを維持する一方で、これらの部位でのグリコシル化を阻害することができる。
【００４１】
別の具体例において、変異は、位置２３９におけるアスパラギンのグルタミン残基による置換（Ｎ２３９Ｑ）である。別の具体例において、変異は、位置２１１８におけるアスパラギンのグルタミン残基による置換（Ｎ２１１８Ｑ）である。さらなる具体例において、変異は、位置２３９および２１１８におけるアスパラギンのグルタミン残基による置換（Ｎ２３９Ｑ／Ｎ２１１８Ｑ）である。
【００４２】
本発明のｒＦＶＩＩＩ分子は、全長ＦＶＩＩＩ分子またはその機能的な変異型のいずれかであり得る。ただし、当該分子はＦＶＩＩＩ分子のアミノ酸位置４１〜４３、２３９〜２４１、５８２〜５８４、１８１０〜１８１２、および２１１８〜２１２０で生じる配列モチーフの１個でのグリコシル化を防ぐ変異を含むものとする。ＦＶＩＩＩ分子は、任意選択的に、その他のアミノ酸位置において変異が導入されてもよいが、活性が保持されることを条件とする。ＦＶＩＩＩ分子における変異は、システイン残基がシステイン結合を含む望ましくない反応の形成を生じ得るため、システイン残基を変異タンパク質に導入すべきではない。
【００４３】
一つの具体例において、ＦＶＩＩＩ分子は、Ｂドメインが、部分的にまたは全体として欠失されているＢ−ドメイン欠失変異型（ＢＤＤ）である。ＢＤＤは、Ｂドメインで見出される１つまたはそれ以上のＮ−結合グリコシル化部位を保持しうる（例えば、米国特許第4,868,112号およびEP294910を参照のこと）。別の具体例において、ＢＤＤは、本質的に全てのＢ−ドメインを欠失する。「本質的に全ての」は、少なくともＢドメイン内の公知のグリコシル化部位の全てを含む領域を意味する。ＢＤＤのこの具体例の一例は、ＦＶＩＩＩのＢ−ドメインの１４アミノ酸を除く全てが欠失されているアミノ酸配列を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ分子である。Ｂ−ドメインの最初の４アミノ酸は、Ｂ−ドメインの１０個の最後の残基に連結されている（例えば、米国特許第20060115876号を参照のこと）。あるいは、ＢＤＤは、Ｂ−ドメイン全体を欠いていてもよい（例えば、米国特許第6,130,203号）。
【００４４】
アミノ酸配列の変化は、様々な技術、例えば、部位特異的変異導入による対応する核酸配列の改変により達成されてもよい。部位特異的変異導入のための技術は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Zollerら（DNA 3:479-488, 1984）またはHortonら（Gene 77:61-68, 1989, pp. 61-68）に記載されている。例えば、ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列は、Stratagene cQuickChange（商標）II部位特異的変異導入キット（カリフォルニア州、ラ・ホーヤのStratagene社）を用いて変異を導入することができる。成功した変異導入は、ＤＮＡ配列決定法により確認することができ、変異を含む好適なフラグメントは、例えばハイグロマイシンＢ（Hyg B）に対する抵抗性を付与する哺乳類発現ベクター中のＦＶＩＩＩ骨格に移すことができる。移した後、変異は、再度、配列により確認することができる。それゆえ、ＦＶＩＩＩのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を用いて、選択した変化（複数でもよい）を導入してもよい。同様に、特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いてＤＮＡ構築物を調製するための手法は、当業者によく知られている（例えば、PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USAを参照のこと）。
【００４５】
ＦＶＩＩＩをコードする核酸構築物はまた、確立された一般的な方法、例えば、Beaucageら（Gene Amplif. Anal. 3:1-26, 1983）により記載されるホスホラミダイト法により合成的に調製されてもよい。ホスホラミダイト法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機中で合成され、精製され、アニール化され、連結され、適切なベクターにクローン化される。ＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡ配列はまた、例えば、米国特許第4,683,202号；またはSaikiら（Science 239:487-491, 1988）に記載されるように、特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって調製してもよい。さらに、核酸構築物は、一般的な技術に従って、全体の核酸構築物の様々な部分に対応する、合成、ゲノム、またはｃＤＮＡの複製起点のフラグメントを（必要に応じて）連結することによって調製された、混合された合成およびゲノム、混合された合成およびｃＤＮＡ、または混合されたゲノムおよびｃＤＮＡの複製起点のものであってもよい。
【００４６】
ＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡ配列は、組み換えＤＮＡ法を用いて組み換えベクターに挿入されてもよい。ベクターの選択は、多くの場合、ベクターが導入される宿主細胞に依存する。ベクターは、自律的に複製するベクターまたは組み込みベクターであってもよい。自律的に複製するベクターは、染色体外のものとして存在し、その複製は、染色体の複製とは独立し、例えば、プラスミドである。組み込みベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるベクターである。
【００４７】
ベクターは、改変されたＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡ配列が、プロモーター、ターミネーター、およびポリアデニル化部位などのＤＮＡの転写、翻訳、またはプロセッシングに必要とされるさらなる断片に作動可能に連結される発現ベクターであってもよい。一般に、発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来してもよく、あるいはその両方のエレメントを含んでもよい。用語「作動可能に連結される」は、断片がそれらの意図する目的に合わせて機能するように、例えば転写がプロモーターで開始し、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を通るように配置されることを意味する。
【００４８】
ＦＶＩＩＩを発現させるのに用いるための発現ベクターは、クローン化された遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指示することができるプロモーターを含んでもよい。プロモーターは、選んだ宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列のいずれかであってもよく、宿主細胞に対して同種性または異種性のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。哺乳類細胞におけるＤＮＡの転写を指示するためのプロモーターの例は、例えば、ＳＶ４０プロモーター（Subramani, et al., Mol. Cell Biol. 1:854-864, 1981）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983）、ＣＭＶプロモーター（Boshart, et al., Cell 41:521-530, 1985）、またはアデノウイルス２主要後期プロモーター（Kaufman et al., Mol. Cell Biol, 2:1304-1319, 1982）である。
【００４９】
ＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡ配列はまた、必要であれば、好適なターミネーターに作動可能に連結されてもよい（例えば、Palmiter, et al., Science 222:809-814, 1983；Alber et al., J. MoI. Appl. Gen. 1:419-434, 1982；McKnight, et al., EMBO J. 4:2093-2099, 1985を参照のこと）。発現ベクターはまた、挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルを含んでもよい。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０に由来する初期または後期ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５Ｅｌｂ領域に由来するポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーターを含む（DeNoto, et al., Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981）。発現ベクターはまた、ＳＶ４０エンハンサーのごときエンハンサー配列を含んでもよい。
【００５０】
ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ変異タンパク質をコードするＤＮＡ配列、プロモーター、ターミネーター、および任意選択的に他の配列を連結し、複製に必要な情報を含む好適なベクターにそれらを挿入するのに用いられる方法は、当業者に周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照のこと）。
【００５１】
ＦＶＩＩＩ変異タンパク質をコードする核酸を含む好適な発現ベクターは、グリコシル化能力のある細胞に導入されてもよい。次いで、ＦＶＩＩＩ発現は、ＥＬＩＳＡによりアッセイすることができ、活性は、Coatest色原体アッセイ（Coatest chromogenic assay）（オハイオ州、ウェストチェストのdiaPharma）などの常套のアッセイを用いてアッセイすることができる。
【００５２】
哺乳類細胞にトランスフェクトさせ、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は、例えば、Kaufmanら（J. Mol. Biol. 159:601-621, 1982）；Southernら（J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341, 1982）；Loyterら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:422-426, 1982）；Wiglerら（Cell 14:725-731, 1978）；Corsaroら（Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981）、Grahamら（Virology 52:456-467, 1973）；およびNeumannら（EMBO J. 1:841-845, 1982）に記載されている。クローン化されたＤＮＡ配列は、例えば、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン−介在トランスフェクション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿法、レトロウイルス送達、エレクトロポレーション、ソノポレーション（sonoporation）、レーザー照射、マグネトフェクション、自然形質転換、および遺伝子銃形質転換によって、培養された哺乳類細胞に導入してもよい（例えば、Mehier-Humbert, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 57:733-753, 2005を参照のこと）。外因性ＤＮＡを発現する細胞を同定し、選択するために、選択可能な表現形（選択マーカー）を付与する遺伝子は、一般に、目的の遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞に導入される。選択マーカーは、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン（ハイグロマイシンＢ、Ｈｙｇ  Ｂ）、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子を含む。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであってもよく、それは、該配列が連結されると、マーカーおよび外因性ＤＮＡの増幅を可能にする。典型的な増幅可能な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびアデノシン脱アミノ酸酵素を含む。好適な選択マーカーを選択することは、当該技術分野の範囲内である（例えば、米国特許第5,238,820号を参照のこと）。
【００５３】
細胞をＤＮＡでトランスフェクトした後、目的の遺伝子を発現させるために、それらを適切な増殖培地中で増殖する。本明細書で用いるとき、用語「適切な増殖培地」は、細胞の増殖およびＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ変異タンパク質の発現に必要な栄養素およびその他の構成成分を含有する培地を意味する（例えば、米国特許第5,171,844；5,422,250；5,422,260；5,576,194；5,612,213；5,618,789；5,804,420；6,114,146；6,171825；6,358,703；6,780,614；および7,094,574号を参照のこと）。
【００５４】
培地は、一般に、例えば、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必要な糖、ビタミン、リン脂質、タンパク質、および増殖因子を含む。次に、薬物選択は、安定な様式にて選択マーカーを発現している細胞の増殖について選択するのに適用される。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクトされた細胞に関して、クローン化された配列のコピー数の増加、それによる発現レベルの増加のために、薬物濃度を上昇させてもよい。次いで、安定にトランスフェクトされた細胞のクローンは、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ変異タンパク質の発現についてスクリーニングされる。
【００５５】
例えば、トランスフェクトされた細胞は、５％  ＦＢＳを補充した増殖培地において５０μｇ／ｍＬのＨｙｇ  Ｂによる選択圧下に置かれてもよい。ＦＶＩＩＩ発現のために、Ｈｙｇ  Ｂ−耐性コロニーが選択され、スクリーニングされる。次に、安定な形質転換体は、組み換え発現のための培地に適用される。ＦＶＩＩＩ変異タンパク質の作成および発現は、いくつかの文献に記載されている（例えば、米国公開出願第20060115876号；Kaufman, et al., J Biol Chem 263:6352-6362, 1988；Hironaka, et al., J Biol Chem 267:8012-8020, 1992を参照のこと）。
【００５６】
本発明に用いるための哺乳類細胞株の例は、ＣＯＳ−１（ATCC CRL 1650）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ＨＫＢ１１細胞（Cho, et al., J. Biomed. Sci, 9:631-638, 2002）、およびＨＥＫ−２９３（ATCC CRL 1573；Graham, et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）細胞株を含む。さらに、ラットＨｅｐ１（ラット肝細胞腫；ATCC CRL 1600）、ラットＨｅｐＩＩ（ラット肝細胞腫；ATCC CRL 1548）、ＴＣＭＫ−１（ATCC CCL 139）、Ｈｅｐ−Ｇ２（ATCC HB 8065）、ＮＣＴＣ  １４６９（ATCC CCL 9.1）、ＣＨＯ−Ｋ１（ATCC CCL 61）、およびＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞（Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980）を含む、多くのその他の細胞株が、本発明において用いられてもよい。
【００５７】
一定の細胞株は、組み換えタンパク質をグリコシル化することができ、本明細書において「グリコシル化能力のある」細胞株と称される。グリコシル化能力のある細胞株の一例は、アメリカンタイプカルチャーセンターから入手可能なＨＫＢ１１（ATCC番号CRL-12568）である。本発明で有用なその他のグリコシル化能力のある細胞株は、ＣＯＳ−１、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、およびＢＨＫ細胞を含む。
【００５８】
ＦＶＩＩＩ変異タンパク質をコードする核酸配列を含有する宿主細胞を含む組み換え培養物は、好適な条件下で増殖して、変異タンパク質を発現させ、回収する。一つの具体例において、ＦＶＩＩＩ変異タンパク質が、宿主細胞から分泌形態で発現され、増殖培地から回収され、次いで、任意選択的に、さらに精製して医薬品を製造してもよい。
【００５９】
ＦＶＩＩＩポリペプチドは、細胞培養培地から回収されてもよく、次いで、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水、等電点、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点（ＩＥＦ）、異なる溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿））、抽出（例えば、Protein Purification, Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）、またはそれらの様々な組み合わせを含むが、これらだけに限定されない当該技術分野で知られている様々な手法により精製してもよい。典型的な具体例において、ポリペプチドは、抗−ＦＶＩＩＩ抗体カラムにおけるアフィニティークロマトグラフィーによって精製してもよい。さらなる精製は、高速液体クロマトグラフィーなどの常套の化学的精製法により達成されてもよい。精製のその他の方法は、当該技術分野で既知であり、改変されたＦＶＩＩＩポリペプチドの精製に適用できる（例えば、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照のこと）。
【００６０】
一般に、「精製された」は、分画されて様々なその他の構成成分が除去され、実質的に、その発現された生物学的活性を保持するタンパク質またはペプチド組成物を意味する。用語「実質的に精製された」が用いられる場合、この表現は、タンパク質またはペプチドが、組成物中に約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、またはそれ以上のタンパク質を構成するような、組成物の主な構成成分を形成する組成物を意味する。
【００６１】
ポリペプチドの精製の程度を定量するための様々な方法は、当業者に知られている。これらは、例えば、活性なフラクションの比活性を調べること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析によりフラクション内のポリペプチド量を測定することを含む。フラクションの純度を測定するための典型的な方法は、フラクションの比活性を算出し、その活性を最初の抽出物の比活性と比較し、それにより純度を算出することであり、本明細書では「−比率純化数（fold purification number）」により測定した。活性量を表すのに用いられる実際の単位は、当然、具体的なアッセイ技術に依存している。
【００６２】
組み換えＦＶＩＩＩは、商業的規模において産生することができる。いずれかの好適な培養方法および培地が、本発明のプロセスにおいて細胞を培養するのに用いられてもよい。好適な培養方法、条件、および培地は、細胞培養分野においてよく知られている。バッチおよび連続的な発酵方法、懸濁および接着培養のいずれか、例えば、マイクロキャリア培養方法、ならびに撹拌槽および空気撹拌発酵槽が必要に応じて用いられてもよい。宿主細胞は、発酵容器などのいずれのタイプの培養装置で培養されてもよい。細胞は、接着細胞培養として、または懸濁細胞培養として培養されてもよい。組み換えタンパク質を発現する細胞の懸濁細胞培養のための装置は、当業者によく知られている（例えば、米国特許第7,294,484；7,157,276；6,660,501；および6,627,426号を参照のこと）。一般に、足場非依存性懸濁細胞培養のための原理、プロトコル、装置、および実施技術は、Chuら（Curr Opin Biotechnol 12:180-7, 2001）およびWarnockら（Biotechnol Appl Biochem 45:1-12, 2006）において見出すことができる。
【００６３】
細胞を培養するのに用いる培地は、様々な公知かつ利用可能な増殖培地を含んでもよい。血清が補充されているか、または血清が含まれていない培地のいずれかを用いてもよい。治療用タンパク質の産生に関して、培地は、血清を含まないか、および／またはタンパク質を含まない培地であってもよい（例えば、米国特許第5,804,420および7,094,574号；WO97/05240；およびEP0872487を参照のこと）。
【００６４】
医薬組成物
本発明はまた、治療上有効な量の本発明のＦＶＩＩＩ変異タンパク質および医薬上許容される担体を含む非経口投与用医薬組成物に関する。医薬上許容される担体は、有効成分に添加されて調製物の製剤化、または安定化を補助し、患者に著しく有害な毒物学的な効果を生じ得ない物質である。用語「医薬上または薬理学上許容される」は、動物またはヒトに投与したときに、有害な、アレルギー性の、またはその他の所望されない反応を生じない分子および組成物を意味する。本明細書で用いるとき、「医薬上許容される担体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、ならびにこれらの類似物質のいずれかおよび全てを含む。医薬上活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野においてよく知られている。補助的な有効成分もまた、当該組成物に取り込まれてもよい。
【００６５】
本発明の組成物は、典型的な医薬調製物を含む。これらの本発明の組成物の投与は、一般的な経路のいずれを介してもよい。医薬組成物は、いずれかの常套の方法、例えば、静脈、皮内、筋肉内、皮下、または経皮送達によって患者に導入されてもよい。処置は、単回投与または長期間にわたる複数回投与からなってもよい。
【００６６】
注射用途に適する医薬形態は、滅菌水溶液または分散剤、および滅菌注射用水溶液または分散剤の即時調製のための滅菌粉末を含む。形態は、無菌であるべきであり、容易な注入可能性（syringability）が存在する程度まで流動性であるべきである。製造および保存の条件下で安定である必要があり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から守られる必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、スクロース、Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート８０、またはそれらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であってもよい。好適な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、ならびに界面活性剤の使用により維持されてもよい。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、およびそれらの類似物質によりもたらされてよい。注射用組成物は、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含んでもよい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされてもよい。
【００６７】
ＦＶＩＩＩ医薬組成物はまた、充填剤、安定化剤、緩衝化剤、界面活性剤、塩化ナトリウム、カルシウム塩、およびその他の賦形剤を含んでもよい。これらの賦形剤は、凍結乾燥された調製物中および液体製剤中で、ＦＶＩＩＩの安定性を最大にするように選択されうる。
【００６８】
充填剤は、例えば、マンニトール、グリシン、アラニン、およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含むことができる。安定化剤は、スクロース、トレハロース、およびラフィノースなどの糖、ソルビトールおよびグリセロールなどの糖アルコール、またはアルギニンなどのアミノ酸を含んでもよい。
【００６９】
ＦＶＩＩＩ分子が凍結乾燥時のｐＨ変化によって悪影響を受けうることから、緩衝化剤がこれらの製剤中に存在してもよい。ｐＨは、凍結乾燥の間、６から８の間の範囲、例えば、約７のｐＨで維持されてもよい。緩衝化剤は、ヒスチジン、トリス、ＢＩＳ−トリスプロパン、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、およびＮ−［カルバモイルメチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）を含む緩衝化剤として作用する能力を有する、生理学的に許容される化学物質または化学物質の組み合わせのいずれかであり得る。
【００７０】
滅菌注射液は、好適な溶媒に、必要に応じて上記の様々なその他の成分と共に、必要な量の活性化合物（例えば、ＦＶＩＩＩ変異タンパク質）を加え、次いでろ過滅菌することによって調製できる。
【００７１】
一般に、分散剤は、基礎分散媒および上記の必要なその他の成分を含む滅菌ビヒクルに様々な滅菌された有効成分を加えることによって調製してもよい。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、例えば、前もって滅菌ろ過された溶液から有効成分といずれかのさらなる所望の成分との粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥技術を含む。
【００７２】
剤形に応じて、溶液は、投薬剤形に適合する方法で、治療上有効とされるような量で投与してよい。本明細書で用いられる「治療上有効な量」は、血流において、または標的組織において、ポリペプチドの所望されるレベルを提供するのに必要とされるポリペプチドの量を意味する。正確な量は、多くの因子、例えば、具体的なＦＶＩＩＩ変異タンパク質、治療用組成物の構成成分および物理的特性、意図される患者集団、送達様式、個々の患者の考慮事項などに依存し、本明細書で提供される情報に基づいて当業者によって容易に決定される。
【００７３】
製剤は、注射液などの様々な投薬形態で容易に投与されてもよい。水溶液中の非経口投与のために、例えば、溶液は、必要ならば、適宜緩衝化し、液体希釈剤は、最初に十分な塩またはグルコースで等張化するべきである。これらの特定の水溶液は、静脈、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。
【００７４】
皮下、静脈、筋肉内などに適する剤形；好適な医薬担体；ならびに剤形および投与のための技術は、当該技術分野でよく知られている方法のいずれかによって調製されてもよい（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20th edition, 2000を参照のこと）。
【００７５】
ＦＶＩＩＩの医薬組成物の例は、例えば、米国特許第5,047,249号、第5,656,289号、第5,665,700号、第5,690,954号、第5,733,873号、第5,919,766号、第5,925,739号、第6,835,372号、および第7,087,723号に開示される。
【００７６】
処置方法
哺乳類において上記同定される状態の処置に対する有効性を調べるのに用いられる周知のアッセイに基づいて、ならびに、これらの結果を、これらの状態を処置するために用いられる公知の医薬の結果と比較することによって、各所望される適応症の処置についての本発明の変異タンパク質の有効な用量は容易に決定され得る。これらの状態のうちの１つの処置に投与される有効成分の量は、用いられる具体的なポリペプチドおよび単位用量、投与様式、処置期間、処置する患者の年齢および性別、ならびに処置する状態の性質および程度などの検討事項に従って広範囲に変化しうる。
【００７７】
適切な用量は、関連する用量応答データと連動した血液凝固レベルを調べるための確立されたアッセイの使用によって確認されてもよい。最終的な投薬計画は、薬物の作用を変化させる因子、例えば、薬物の比活性、傷害の重症度、ならびに患者の応答性、年齢、状態、体重、性別および患者の食事、感染の重症度、投与時間、およびその他の臨床因子を考慮して、主治医により決定されてもよい。
【００７８】
本明細書に記載される組成物は、ＦＶＩＩＩの結合特性の変化、ＦＶＩＩＩの遺伝子異常、およびＦＶＩＩＩの血漿濃度の減少などのＦＶＩＩＩの機能欠損またはＦＶＩＩＩの欠乏に関連する出血性疾患のいずれかを処置するために用いることができる。ＦＶＩＩＩの遺伝子異常は、例えば、ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列における塩基の欠失、付加、および／または置換を含む。一つの具体例において、出血性疾患は血友病であってもよい。かかる出血性疾患の症状は、例えば、重度の鼻血、口腔粘膜の出血、関節血症、血腫、持続性血尿、胃腸出血、後腹膜出血、舌／咽頭後出血、頭蓋内出血、および外傷に関連する出血を含む。
【００７９】
本発明の組成物は予防のために用いられてもよい。いくつかの具体例において、ＦＶＩＩＩ変異タンパク質は、対象自身の凝固能力を高めるために、病状または損傷に感受性を有する、あるいはリスクの高い対象に投与されてもよい。かかる量は、「予防上有効な用量」であると定義されてもよい。予防のためのＦＶＩＩＩ変異タンパク質の投与は、血友病にかかっている患者が外科手術を受けようとしており、ポリペプチドが外科手術の１〜４時間前に投与される状況を含む。さらに、ポリペプチドは、任意選択的に、血友病にかかっていない患者における、コントロール不良の出血に対する予防としての使用に好適である。それゆえ、例えば、本ポリペプチドは、外科手術前にコントロール不良の出血のリスクのある患者に投与されてもよい。
【００８０】
本発明の一つの具体例において、患者にＦＶＩＩＩ変異タンパク質の医薬組成物を静脈内点滴して、血友病患者におけるＦＶＩＩＩ欠乏によるコントロール不良の出血（例えば、関節内、頭蓋内、または胃腸出血）を処置してもよい。
【００８１】
一例として、インビトロにおけるＦＶＩＩＩの凝固活性を用いて、ヒト患者における点滴のためのＦＶＩＩＩの用量を算出してもよい（Lusher, et al., New Engl J Med 328:453-459, 1993；Pittman, et al., Blood 79:389-397, 1992；Brinkhous, et al., Proc Natl Acad Sci 82:8752-8755, 1985）。一つの具体例において、ＦＶＩＩＩ変異タンパク質の投与を介して患者で達成されるべき血漿ＦＶＩＩＩレベルは、通常の３０〜１００％の範囲内であってもよい。
【００８２】
別の具体例において、本組成物は、約５から５０単位／ｋｇ体重の範囲内の用量で、または１０〜５０単位／ｋｇ体重の範囲で、または２０〜４０単位／ｋｇ体重の用量で静脈内に投与してよい。処置は、必要に応じて、組成物の単回静脈内投与または長期間にわたる定期的もしくは連続的投与の形態であり得る。投薬間隔は（重症の血友病において）約８から２４時間の範囲であり、処置期間は１から１０日の範囲内であるか、または出血エピソードが解消されるまでである。
【００８３】
本発明のＦＶＩＩＩ変異タンパク質はまた、インビボで発現されてもよく、すなわち、これらの変異タンパク質は遺伝子療法に用いられてもよい。細胞は、エクスビボでＦＶＩＩＩ変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で改変されてもよく、次いで、改変された細胞は、ポリペプチドで処置されるべき患者に提供されてもよい。かかる方法は当該技術分野でよく知られている。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用により当該技術分野で知られる手法によって改変されてもよい。投与される遺伝子は、当該技術分野内の通常の分子生物学および組み換えＤＮＡ技術を用いて単離され、精製されてもよい。次いで、単離された遺伝子は、好適なクローニングベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニア、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスおよびレトロウイルス、パルボウイルス、レンチウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター）に挿入されてもよい。送達される遺伝子のコード配列は、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、ならびにその他のシグナル配列などの発現制御配列に作動可能に連結されてもよい。
【００８４】
治療用ベクターの患者への送達は直接的であってよく、この場合患者がベクターまたは送達複合体に直接曝露され、あるいは間接的であってもよく、この場合細胞が最初にインビトロにてベクターで形質転換され、次いで患者に移植される。これらの２つのアプローチは、それぞれインビボおよびエクスビボ遺伝子療法として知られている。例えば、治療用ベクターは、裸のＤＮＡの直接注入により、あるいは微粒子照射（例えば、遺伝子銃）の使用によりインビボで直接投与されてもよい。
【００８５】
潜在的な治療用遺伝子を規定の細胞集団に移行させるためのいくつかの方法が知られている（例えば、Mulligan, Science 260:926-31, 1993を参照のこと）。これらの方法は、例えば、１）直接遺伝子トランスファー（例えば、Wolff, et al., Science 247:1465-68, 1990を参照のこと）；２）リポソーム介在ＤＮＡトランスファー（例えば、Caplen, et al., Nature Med 3:39-46, 1995；Crystal, Nature Med. 1:15-17, 1995；Gao and Huang, Biochem Biophys Res Comm 179:280-85, 1991を参照のこと）；３）レトロウイルス介在ＤＮＡトランスファー（例えば、Kay, et al., Science 262:117-19, 1993；Anderson, Science 256:808-13, 1992を参照のこと）；４）ＤＮＡウイルス介在ＤＮＡトランスファーを含む。かかるＤＮＡウイルスは、アデノウイルス（例えば、Ａｄ−２またはＡｄ−５を基礎としたベクター）、ヘルペスベクター（例えば、単純ヘルペスウイルスを基礎としたベクター）、およびパルボウイルス（例えば、ＡＡＶ−２を基礎としたベクターのごとき、アデノ随伴ウイルスを基礎としたベクター）を含む（例えば、Ali, et al., Gene Therapy 1:367-84, 1994；米国特許第4,797,368号；米国特許第5,139,941号を参照のこと）。遺伝子療法のその他の方法は、Goldspielら（Clin Pharm 12:488-505, 1993）；WuおよびWu（Biotherapy 3:87-95, 1991）；Tolstoshev（Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573-596, 1993）；ならびにMorganおよびAnderson（Ann Rev Biochem 62:191-217, 1993）により記載される。用いることができる組み換えＤＮＡ技術の分野で一般に知られる方法は、Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993）；Kriegler（Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990）；Dracopoliら（Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY, 1994）；およびColosimoら（Biotechniques 29:314-324, 2000）に記載される。
【００８６】
目的の遺伝子を移行させるための特定のベクター系の選択は、様々な因子に依存する。当業者は、本発明のポリペプチドをコードする適切な遺伝子療法ベクターのいずれかがこの具体例に従って用いることができると認識するであろう。かかるベクターを構築するための技術は知られている（例えば、Anderson, Nature 392:25-30, 1998；Verma and Somia, Nature 389:239-242, 1998を参照のこと）。ベクターの標的部位への導入は、公知の技術を用いて達成されてもよい。
【００８７】
好適な遺伝子治療用ベクターは、１つまたはそれ以上のプロモーターを含む。用いられ得る好適なプロモーターは、ウイルスプロモーター（例えば、Miller, et al., Biotechniques 7:980-990, 1989に記載される、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、呼吸器合胞体ウイルスプロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）、細胞プロモーター（例えば、ヒストン、ｐｏｌＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーター）、および誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター、および熱ショックプロモーター）を含むが、これらだけに限定されない。好適なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示に基づいて当業者にとって明らかである。
【００８８】
レトロウイルスプラスミドベクターが由来しうるレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病肉腫ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレトロウイルスを含むが、これらだけに限定されない。レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入して産生細胞株を形成するために用いてもよい。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例は、Miller（Human Gene Therapy, 1:5-14, 1990）に記載されるごとき、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ＰＡ１２、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、およびＤＡＮ細胞株を含むが、これらだけに限定されない。ベクターは、当該技術分野で知られるいずれかの手法を用いてパッケージング細胞を形質導入しうる。かかる手法は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿を含むが、これらだけに限定されない。一つの別法において、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソーム中に封入されるか、または脂質に共役され、次いで、宿主に投与されてもよい。産生細胞株は、本発明の変異タンパク質をコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を作成する。次いで、かかるレトロウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで真核細胞を形質導入するのに用いられてもよい。形質導入された真核細胞は、本発明の変異タンパク質をコードする核酸配列を発現する。導入され得る真核細胞は、胚性幹細胞、胚性癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を含むが、これらだけに限定されない。
【００８９】
一つの具体例において、本発明のＦＶＩＩＩ変異タンパク質をコードするＤＮＡは、血友病のごとき疾患のための遺伝子療法に用いられる。この具体例によると、本発明のＦＶＩＩＩ変異タンパク質をコードするＤＮＡを用いる遺伝子療法は、診断と同時に、または診断の直後に、それを必要とする患者に提供されてもよい。
【００９０】
本明細書に記載される変異タンパク質、材料、組成物、および方法は、本発明の代表的な例とされ、本発明の範囲は、これらの例の範囲に限定されるものではないものと理解される。当業者は、本発明が、開示されるポリペプチド、材料、組成物および方法の変形で実施されてよく、かかる変形は本発明の範囲内とされると認識する。
【００９１】
下記の実施例は、本明細書に記載される本発明を例示するために提示されるものであるが、決して、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００９２】
実施例
本発明がより理解されうるために、下記の実施例を示す。これらの実施例は、例示のみを目的とするものであり、決して発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書で言及される全ての刊行物は、出典明示により全体が本明細書に取り込まれる。
【実施例１】
【００９３】
実施例１．樹状細胞によるＦＶＩＩＩのエンドサイトーシス
インビトロでのＤＣによる取り込みに対するＦＶＩＩＩグリコシル化の効果を調べた。全長ｒＦＶＩＩＩを、ＦＡＣＳ解析のために最初に標識し、次いで脱グリコシル化した。ＦＡＣＳ解析用のｒＦＶＩＩＩの標識のために、ＰＢＳ中６μｇの蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ｐＨ９）を、１００μｇの脱グリコシル化ＦＶＩＩＩに添加し、４℃で２時間混合した。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のスクロース、および１００ｐｐｍのＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０（ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート）のｐＨ７．５の溶液中において５０Ｋメンブレンを用い、４℃で２時間透析して、抱合されなかったＦＩＴＣを取り除いた。ＦＶＩＩＩ濃度をブラッドフォードアッセイによって定量し、ＦＶＩＩＩ活性を発色アッセイにより調べた。次いで、タンパク質を変性させることなくＮ−結合オリゴ糖を特異的に切断するエンドグリコシダーゼＦ１（Ｅｎｄｏ−Ｆ１）を用いて、標識されたｒＦＶＩＩＩを酵素学的に脱グリコシル化した。ｒＦＶＩＩＩを、Ｅｎｄｏ−Ｆ１と共に３７℃で１時間インキュベートした。ｒＦＶＩＩＩを５０Ｋメンブレンに注入し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のスクロース、および１００ｐｐｍのＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０のｐＨ９の溶液に対して４℃で２時間透析した。脱グリコシル化をウェスタンブロット解析により確認した。
【００９４】
樹状細胞（ＤＣ）を作成するために、接着した単球を、３％のヒトＡＢ血清、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよび１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ユタ州、ローガンのHyclone/Thermo Scientific）中で５日間培養した。ＤＣ生存率をフローサイトメトリーにより確認した。全ての細胞を、５％のＣＯ２および９５％の空気の加湿型細胞インキュベーター中にて３７℃で培養した。ＤＣによる取り込みに対するｒＦＶＩＩＩ脱グリコシル化の効果を調べるために、ＤＣを、脱グリコシル化されたｒＦＶＩＩＩと共に３０分間インキュベートし、インキュベート後、ＦＡＣＳによりＤＣによるＦＶＩＩＩの取り込みを解析した。図１は、ＤＣによるＦＶＩＩＩの取り込みが、Ｅｎｄｏ−Ｆ１による脱グリコシル化後に著しく減少することを示す。これらの結果は、ＤＣによるＦＶＩＩＩの取り込みが、少なくとも部分的にＮ−グリコシル化に依存することを示し、さらに、取り込みがＮ−結合非キャップ化オリゴ糖を認識するＣＤ２０６によって介在されることを示唆する。
【００９５】
実施例２．ＨＫＢ１１細胞におけるＦＶＩＩＩ変異タンパク質の発現
ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩおよびこのＦＶＩＩＩの３つの変異タンパク質を、ＨＫＢ１１細胞において発現させた。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩは、Ｂ−ドメインの最初の４アミノ酸がＢ−ドメインの１０個の最後の残基に連結されるように、Ｂ−ドメインの１４アミノ酸以外の欠失を含有した。１つのＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ変異タンパク質は、位置２３９におけるグルタミンのアスパラギンへの一置換（Ｎ２３９Ｑ）を含有し、もう１つは、位置２１１８におけるグルタミンのアスパラギンへの一置換（Ｎ２１１８Ｑ）を含有し、第３のものは、両方の変異（Ｎ２３９Ｑ／Ｎ２１１８Ｑ）を含有する。
【００９６】
Lipofectamine（商標）2000（カリフォルニア州、カールズバッドのInvitrogen）を用い、製造業者の説明書に従って、ＨＫＢ１１細胞をＢＤＤ  ＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ変異タンパク質発現プラスミドで一過的にトランスフェクトした。ＨＫＢ１１細胞をＢＤＤおよびＢＤＤ変異タンパク質プラスミドで一過的にトランスフェクトし、これらの細胞からの上澄み液を、発色アッセイによりＦＶＩＩＩ活性について、およびＥＬＩＳＡによりＦＶＩＩＩ濃度について試験した。３つの変異タンパク質の比活性が、未変異形態の各グリコシル化部位を含有するＢＤＤと同様であることを見出した（図２Ａ）。Ｎ２１１８Ｑ変異タンパク質がＢＤＤと同様の発現レベルを示す一方で、Ｎ２３９ＱおよびＮ２３９Ｑ／Ｎ２１１８Ｑ変異タンパク質の発現レベルが、ＢＤＤよりそれぞれ約２５％および５０％低くなった（図２Ｂ）。したがって、この典型的な系においていくつかの変異タンパク質の収量は減少したが、それにもかかわらず、変異タンパク質は有効な量で回収された。
【００９７】
実施例３．樹状細胞によるＦＶＩＩＩ変異タンパク質の取り込みの減少
樹状細胞（ＤＣ）によるＦＶＩＩＩの取り込みは、実施例１に記載されるように、ＦＶＩＩＩ上のマンノース−末端グリカンとのＣＤ２０６相互作用によって介在されると考えられることから、Ｎ２３９Ｑ／Ｎ２１１８Ｑ  ＢＤＤ変異タンパク質を取り込むＤＣの能力をテストした。ＤＣを上記のとおり調製した。２人のドナーに由来するＤＣをプールし、次いで、全長ｒＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ（実施例２に記載）、またはＮ２３９Ｑ／Ｎ２１１８Ｑ  ＢＤＤ変異タンパク質と共に共培養した。細胞を９６ウェルプレートのウェル中で３０分間共培養した。１ウェルあたりの最終体積は１００μｌであり、ｒＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ、または変異タンパク質の最終濃度は１０ｎＭであった。次に、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。コントロールとして、対応する取り込みアッセイもまた４℃で行った。４℃、３００ｇで５分間プレートを遠心して、細胞を沈殿させた。培地を吸引し、１ウェルあたり２５μＬの氷冷ＰＢＳ／１０ｍＭのＥＤＴＡ／０．０１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０で細胞を３回洗浄した。次いで、プロテアーゼ阻害剤を含有するCytobuster（商標）緩衝液（ウイスコンシン州、マディソンのNovagen）によって、細胞沈殿物を４℃で１５分間溶解させた。ＥＬＩＳＡ前に、プレートを３００ｇで１０分間遠心した。ＥＬＩＳＡ（コネティカット州、スタンフォードのAmerican Diagnostica）用に、細胞抽出物を１／２５で希釈した。ＦＶＩＩＩおよびＢＤＤについての標準曲線（８０から１．２５μモル）を組み換えタンパク質から作成した。製造業者の説明書に従ってＥＬＩＳＡを実施した。
【００９８】
図３は、ＤＣによるＮ２１１８Ｑ変異タンパク質およびＮ２３９Ｑ／Ｎ２１１８Ｑ  ＦＶＩＩＩ変異タンパク質の取り込みがｒＦＶＩＩＩおよびＢＤＤのものより極めて低いことを示す。
【００９９】
ＢＤＤ  ２１１８Ｑの薬物動態試験において、スプラーグドーリーラットにＢＤＤ  Ｎ２１１８Ｑ変異タンパク質を０．０５ｍｇ／ｋｇで血管内注入した（ｎ＝４）。血液サンプルを様々な時点で採取し、ＢＤＤ  Ｎ２１１８Ｑの濃度を、２８０ｎｍの吸光度により測定した。ラットにおける単独変異体の半減期は、ＢＤＤと同様の４．４±０．７時間であった。
【０１００】
実施例４．ＦＶＩＩＩ−特異的Ｔ細胞クローンのインビトロＩＦＮγ応答の減少
Ｎ２１１８Ｑの取り込みの減少がＦＶＩＩＩに対するＴ細胞活性の低下を生じるかどうかをテストするために、ＦＶＩＩＩ−特異的Ｔ細胞クローンＢＯ１−４によるＩＦＮγの分泌をテストした（図４Ａ）。ＨＬＡ−適合ＤＣを、自己血漿中にてＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ、またはＮ２１１８Ｑと共に、３７℃において２４時間インキュベートして、ＤＣにより各タンパク質を取り込ませ、プロセッシングさせ、提示させた。次いで、ＤＣを、ＦＶＩＩＩ−特異的Ｔ細胞クローン（Ｔ細胞：ＤＣが１０：１の比率）と共に、３７℃にて２４時間共培養させた。次に、上澄み液（５０μＬ）を採取し、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）によるＩＦＮγの測定のために２倍に希釈した。
【０１０１】
実施例５．ＦＶＩＩＩ−特異的Ｔ細胞クローンのインビトロ増殖性応答の減少
Ｎ２１１８Ｑの取り込みの減少が、ＦＶＩＩＩに反応してＴ細胞増殖の減少を生じるかどうかをテストするために、ＦＶＩＩＩ−特異的Ｔ細胞クローンＢＯ１−４によるＩＦＮγの分泌をテストした（図４Ｂ）。ＨＬＡ−適合ＤＣを、自己血漿中にてＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ、またはＮ２１１８Ｑと共に３７℃にて２４時間インキュベートして、ＤＣにより各タンパク質を取り込ませ、プロセッシングさせ、提示させた。次に、ＤＣを、ＦＶＩＩＩ−特異的Ｔ細胞クローン（Ｔ細胞：ＤＣが１０：１の比率）と共に３７℃にて共培養させた。３日目に２０μＣｉ  ３Ｈ−チミジン（チミジン）をさらに３６時間添加した。細胞を採取し、チミジン取り込みについてテストした。
【０１０２】
図４Ａおよび４Ｂは、ＢＯ１−４  Ｔ細胞クローンによるＮ２１１８Ｑに対するＩＦＮγおよび増殖性応答の顕著な減少を示す。これらのデータは、ＤＣによるＮ２１１８Ｑの取り込みの減少が、ＤＣによるＦＶＩＩＩ−特異的Ｔ細胞クローンに対してＦＶＩＩＩペプチドを提示する能力の低下を生じることを支持する。
【０１０３】
上記明細書で言及される全ての刊行物および特許文献は、出典明示により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載の方法の様々な改変および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者にとって明らかである。
【０１０４】
本発明は、特定の具体例に関して記載されているが、かかる特定の具体例に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための上記様式の様々な改変は、生化学またはその関連分野の当業者にとって明らかであり、以下の特許請求の範囲の範囲内であるものとされる。当業者は、本明細書に記載される発明の特定の具体例に対する多くの均等物を認識するか、または日常的な実験により確かめることができる。かかる均等物は、下記の特許請求の範囲により包含されるものとされる。
【図１】
2011526151.tif 000002
【図２−１】
2011526151.tif 000003
【図２−２】
2011526151.tif 000004
【図３】
2011526151.tif 000005
【図４Ａ】
2011526151.tif 000006
【図４Ｂ】
2011526151.tif 000007
【配列表】
2011526151000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月25日(2011.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011526151000001.app
【国際調査報告】
2011526151.tif 000008
2011526151.tif 000009
2011526151.tif 000010