(57)【要約】本発明は、生理活性物質の生物学的、生化学的または化学的反応による電気的特性変化を精密に検出し、生理活性物質の存在可否および／または反応可否を検出する方法およびこれのために提供されるバイオチップに関する。本発明においては、検出対象試料の反応は、一般的な反応溶液下で施し、ただし、反応前に反応チェンバー内に水のような誘電定数の高いリレファレンス流体を満たし、インピーダンス値または静電容量値を測定し、反応完了後には反応溶液を除去し、前記誘電定数の高いレファレンス流体を再び満たし、インピーダンス値または静電容量値を測定した後、反応前後のインピーダンス値または静電容量値を比較することによって、検出対象試料内に生理活性物質の存在可否および／または反応可否を確認する方式を採択する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）検出対象試料が収容される反応チェンバーと、該反応チェンバー内に位置し、前記検出対象試料内の生理活性物質の検出のための複数個のセンシング電極とを具備する電気的検出装置を提供する段階と、
（ｂ）前記反応チェンバー内に誘電定数の高いレファレンス流体を導入した後、前記センシング電極間のインピーダンス値または静電容量値を測定する段階と、
（ｃ）前記反応チェンバー内から前記誘電定数の高いレファレンス流体を除去した後、前記反応チェンバー内に反応溶液および検出対象試料を提供する段階と、
（ｄ）前記反応溶液下において、前記検出対象試料を前記反応チェンバー内で反応させる段階と、
（ｅ）前記反応溶液を前記反応チェンバー内から除去する段階と、
（ｆ）前記反応チェンバー内に前記誘電定数の高いレファレンス流体を再び導入した後、前記センシング電極間のインピーダンス値または静電容量値を測定する段階と、
（ｇ）前記  （ｂ）段階にて測定されたインピーダンス値または静電容量値と、前記（ｆ）段階にて測定されたインピーダンス値または静電容量値とを比較する段階と、を含む生理活性物質を電気的に検出する方法。
【請求項２】
前記（ｂ）段階および（ｆ）段階においては、交流電源を利用する測定装置によりそれぞれの周波数別にインピーダンス値または静電容量値を測定することを特徴とする、請求項１に記載の生理活性物質を電気的に検出する方法。
【請求項３】
前記測定されたインピーダンス値または静電容量値は周波数値に対する曲線で表され、前記（ｂ）段階にて測定されたインピーダンス値または静電容量値の曲線が、前記（ｆ）段階にて測定されたインピーダンス値または静電容量値の曲線と区分される場合、前記検出対象試料内に生理活性物質が存在する、或いは生理活性物質が前記センシング電極と反応するものとして判断することを特徴とする、請求項２に記載の生理活性物質を電気的に検出する方法。
【請求項４】
前記誘電定数の高いレファレンス流体は、誘電定数が４以上である流体であることを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の生理活性物質を電気的に検出する方法。
【請求項５】
前記誘電定数の高いレファレンス流体は、蒸留水または脱イオン水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ）であることを特徴とする、請求項４に記載の生理活性物質を電気的に検出する方法。
【請求項６】
前記センシング電極はＩＤＥ（Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）として形成されることを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の生理活性物質を電気的に検出する方法。
【請求項７】
前記センシング電極のそれぞれの電極間の間隙は、１−４μｍであることを特徴とする、請求項６に記載の生理活性物質を電気的に検出する方法。
【請求項８】
前記センシング電極には、前記生理活性物質と相互作用をする受容体が結合されることを特徴とする、請求項１項ないし請求項３のいずれか一項に記載の生理活性物質を電気的に検出する方法。
【請求項９】
前記受容体は、プローブまたはプライマーであることを特徴とする、請求項８に記載の生理活性物質を電気的に検出する方法。
【請求項１０】
複数個のセンシング電極が形成された第１の基板と、
前記第１の基板上に一定の距離を置き、前記第１の基板と結合して反応チェンバー・スペースを形成する第２の基板を含み、
前記反応チェンバー・スペースを形成する前記第２の基板には、該第２の基板の厚み方向に流体流入口が貫通して形成されており、該流体流入口に対向する位置に、前記第２の基板の厚み方向に流出口が貫通して形成されており、
前記流入口と前記反応チェンバー・スペース、そして前記流出口と前記反応チェンバー・スペースは流体が流動されるように連通され、
前記流入口を通して誘電定数の高いレファレンス流体、反応溶液および検出対象試料が流入され、前記流出口を通して誘電定数の高いレファレンス流体、反応溶液および検出対象試料が流出されることを特徴とする、生理活性物質を電気的に検出するためのバイオチップ。
【請求項１１】
前記第２の基板上には第３の基板が積層され、前記流入口へ流体を導入案内する流入マイクロチャネルと、前記流入口から流体を排出案内する流出マイクロチャネルを形成し、
前記流入マイクロチャネルには前記誘電定数の高いレファレンス流体、反応溶液および検出対象試料が注入される注入口が連通され、前記第３の基板を貫通して形成されており、
前記流出マイクロチャネルには前記誘電定数の高いレファレンス流体、反応溶液および検出対象試料が排出される排出口が連通され、前記第３の基板を貫通して形成されていることを特徴とする、請求項１０に記載の生理活性物質を電気的に検出するためのバイオチップ。
【請求項１２】
前記流入マイクロチャネルまたは前記流出マイクロチャネルには、前記反応チェンバー・スペース内への流体の流入または前記反応チェンバー・スペースから流体の流出を制限することができるバルブ構造が提供されることを特徴とする、請求項１１に記載の生理活性物質を電気的に検出するためのバイオチップ。
【請求項１３】
前記バルブ構造は、前記注入口と前記反応チェンバー・スペースとの間において、或いは前記排出口と前記反応チェンバー・スペースとの間において、前記第３の基板の厚み方向に貫通してから延長された通路であって、このような延長された通路にはオイルが内蔵されていることを特徴とする、請求項１２に記載の生理活性物質を電気的に検出するためのバイオチップ。
【請求項１４】
前記第３の基板は、ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）重合体で形成されることを特徴とする、請求項１１ないし請求項１３のいずれか一項に記載の生理活性物質を電気的に検出するためのバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質の生物学的、生化学的または化学的反応による電気的特性変化を精密に検出し、生理活性物質の存否および／または反応可否を検出する方法およびこれのために提供されるバイオチップに関する。
【０００２】
詳しくは本発明は、反応チェンバー内の生理活性物質の生物学的、生化学的または化学的反応による電気的特性変化、さらに詳しくは、インピーダンス変化または静電容量変化を反応チェンバー内に提供されたセンシング電極を通して精密に検出する方法およびこれのために提供されるバイオチップに関する。
【０００３】
さらに詳しくは、本発明は、反応チェンバー内において、センシング電極に固定された受容体と検出対象となる生理活性物質間の反応による電気的特性変化、すなわち、インピーダンス変化または静電容量変化を精密に検出する方法およびこれのために提供されるバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００４】
バイオチップは、遺伝子およびたんぱく質の情報を大量にかつ自動に分析することができる、或いは生理活性物質の存否および機能を比較的簡単かつ迅速に分析することができる装置である。このようなバイオチップは、遺伝子およびたんぱく質の研究分野、医薬分野、農業、食品、環境および化学産業など、多様な分野において、その応用が活発に行われている。
バイオチップは、プローブを利用して特定遺伝子の存否をチェックする遺伝子型ＤＮＡチップ（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｃｈｉｐ）、特定疾患関連遺伝子の発現を解析する遺伝子発現解析ＤＮＡチップ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｈｉｐ）、そして血液や小便のような試料内の生理活性物質の存否および／反応可否をチェックするマイクロフルイディクス・チップ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｃｈｉｐ）に大きく分けられる。現在、研究分野および医療診断分野において、普遍的に常用化され、使用されているのが遺伝子型  ＤＮＡチップである。
一般に、マイクロアレイチップとは、数百から数万種類の遺伝子やタンパク質を、マイクロアレイ装置を利用して、ガラス基板上に一定の間隔で載せて配列したチップを意味する。このうち、プローブであるオリゴヌクレオチドをガラス基板上にマイクロアレイして特定遺伝子の存否を蛍光スキャナーで確認するものがＤＮＡチップである。
【０００５】
ＤＮＡチップは、研究用分野と診断分野において活発に活用されているが、遺伝子発現プロファイリング（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）分野および遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）分野などの技術を活用して細胞内の新陳代謝、生理学的現象および各遺伝子間の相互連関性など、遺伝子の機能を明かすことに活用されたり、癌のような特定疾患の発病機作および進行診断、薬物作用機作の究明、疾病原因菌の遺伝子情報の確認および変異抽出などのような診断分野などでも活用されている。
診断用ＤＮＡチップの開発は、１９９４年  ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＳｔｅｖｅ  Ｆｏｄｏｒ博士が開発したＨＩＶ遺伝子チップの常用化により市場が形成され始め、ＨＩＶ、リウマチ、自己免疫疾患、慢性腎臓炎、動脈硬化症、アトピー性皮膚およびアレルギー疾患などの慢性疾患を診断することのできる診断用ＤＮＡチップの研究が活発に進められている。特に、最近のＤＮＡチップ分野の研究は、研究用チップよりは診断用チップとして研究開発の方向が動いており、遺伝子型、病原菌またはウィルスの診断分野にのみ適用可能な遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）チップから癌、白血病などの多様な疾病の診断が可能な遺伝子発現解析（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）チップ分野に対する取り組みが行われている。  
また、最近はＩＴおよびナノ技術と組み合わせて１個のチップで数々の疾病を同時に感知し、各自の遺伝情報から発病の可能性まで予測できるマイクロフルイディクス・チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）技術が注目を集めている。生体バイオチップとも呼ばれるマイクロフルイディクス・チップは、微量の分析対象物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質など）をチップ内のチェンバー内へ流し込みながら、チップ内の各種生理活性物質の反応を解析するチップである。このような生体バイオチップは、反応チェンバー内の生理活性物質の反応による電気的特性の変化をチップ内に設けられた電極が感知し、生理活性物質の存否および／または反応可否を検出する。
このような生体バイオチップは、前述したＤＮＡチップに比べ、電気的信号の検出により比較的簡単で、速やかに生理活性物質の存否および／または反応可否を確認することができるため、医療診断分野において活用度が高い。  
例えば、子宮頸がんの発生原因のウィルスであるＨＰＶ陽性可否を診断するためのＨＰＶ  ＤＮＡチップは、ＨＰＶプローブ・オリゴヌクレオチドを準備し、これをガラス基板上にマイクロアレイしたものであるものの、子宮頸がんの高危険群から採集した試料をすぐに適用するだけではＨＰＶ陽性可否の診断が不可能である。すなわち、蛍光標識されたＨＰＶウィルス遺伝子のプライマーを別途に準備し、採集された試料をＰＣＲ増幅させた上、ＨＰＶ  ＤＮＡチップに載せ、蛍光の発光可否を蛍光スキャナーで確認しなければならない。したがって、ＤＮＡチップを用いたハイブリッド確認方式（レーザー誘発蛍光法；ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）は、操作に手間がかかり、時間のかかる作業であって、蛍光物質で試料ＤＮＡを標識するとき、高コストがかかり、高価の蛍光スキャナーの使用とこれにより携帯が不可能という点など、様々な問題点と短所を持つ。
これに対し、生体バイオチップは、電気的信号の検出により比較的簡単で速やかに生理活性物質の存否および／または反応可否を確認することができる。すなわち、生体バイオチップは、蛍光でない電気的信号を用いてハイブリッド形成可否ないしは生理活性物質（例えば、ＤＮＡ）の存在および反応可否を検出することができる。すなわち、生体バイオチップからは電極に固定された受容体と生理活性物質の反応によるインピーダンス（または静電容量）の変化を測定したり、チップのチェンバー内において生理活性物質間の反応によるインピーダンス（または静電容量）の変化を電極が感知し、これを電気的に検出する方式を利用している。  
例えば、ＰＣＲ過程において、ｄＮＴＰは、ｄＮＭＰと二リン酸塩に分解されるとともにｄＮＭＰは、テンプレートＤＮＡ序列に相補的なプライマーに重合され、ＤＮＡが合成され、ＤＮＡの濃度の増加に応じてＰＣＲ反応溶液内のインピーダンスは増加するとして知られている（特許文献１）。したがって、ＰＣＲ反応チェンバーをバイオチップ形態に製作し、このようなバイオチップに提供された電極により反応溶液内のインピーダンス変化を電気的に検出すると、ＰＣＲ反応の有無および特定ＤＮＡ塩基配列の存否を判断することができるようになる。また、バイオチップの電極にプライマーやプローブのようなオリゴヌクレオチドを固定し、ＰＣＲ反応またはハイブリッド反応を進行させた後、オリゴヌクレオチドが固定された電極における静電容量変化またはインピーダンス変化を測定すれば、ＰＣＲ反応またはハイブリッド反応の有無および／またはターゲット塩基配列の存在を電気的に容易に検出することができるようになる。
一般に、バイオチップにおいては、生理活性物質と他の反応物質（例えば、電極に固定された受容体）の反応によるインピーダンスの変化をバイオチップに提供された電極が感知し、反応有無および特定生理活性物質の存否を判断する方式を採択しているといえる。したがって、バイオチップの信頼性を確保するためには、電極においてインピーダンス値の変化の精密な感知が重要である。一般に、インピーダンス（Ｚ）は、実部である抵抗（Ｒ）と、虚部であるリアクタンス（Ｘ）の和で表示され（下記数式１参照）、その大きさは抵抗値（Ｒ）とリアクタンス値（Ｘ）との平方根に該当される（下記数式２参照）。
【０００６】
【数１】
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【０００７】
【数２】
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したがって、インピーダンス（Ｚ）は、リアクタンス（Ｘ）と相関関係を有する。また、リアクタンス（Ｘ）はωＬ−１／ωＣであるため、静電容量（Ｃ）と相関関係を有する。したがって、生物学的、生化学的または化学的反応による静電容量（Ｃ）値の変化は、インピーダンス値の変化として反映され、これを測定することによって生理活性物質の反応可否および／または存否をチェックすることができる。結局のところ、バイオチップにおいて静電容量値の変化は、インピーダンス値の変化を誘導し、これはバイオチップの検出感度に影響与えることを知ることができる。  
ところが、生理活性物質と他の反応物質（例えば、電極に固定された受容体）の反応によるインピーダンスの変化は、２つの静電容量値により影響を受けることができる。すなわち、バイオチップ内において電極によりインピーダンス値の変化を測定する場合、バイオチップ内の全静電容量変化値（Ｃｔ）は、センシング電極に固定された受容体と生理活性物質の反応によるセンシング電極表面における静電容量変化値（Ｃｄ）と、前記センシング電極表面における静電容量変化値（Ｃｄ）とは分離された仮想の電極板ともう一つのセンシング電極間の静電容量値（Ｃｔ）を含むようになる（下記数式３参照）。
【０００８】
【数３】
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通常、バイオチップにおいて生理活性物質は、反応チェンバーに収容された反応溶液の下、反応が進むが、前記反応溶液は、一般に緩衝溶液または電解質を含む。緩衝溶液と電解質はイオンを含んでいるため、バイオチップのセンシング電極間の導電性に影響を与える。また、このような緩衝溶液などのセンシング電極間の導電性に対する影響は、緩衝溶液を誘電体とする前記仮想の電極板ともう一つのセンシング電極間の静電容量値（Ｃｔ）に影響を与え、結局のところは、全静電容量変化値（Ｃｔ）に影響を与える。
一方、下記の数式４に定義されたとおり、静電容量は電極間の物質の誘電定数に影響され、電極間の物質の誘電定数が小さいと静電容量は小さいことが分かる。
【０００９】
【数４】
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ところが、前述した緩衝溶液のような反応溶液は、イオン成分の伝導性により誘電定数が小さいため、数式３の全静電容量変化値（Ｃｔ）を構成する成分である１／Ｃｔは大きくなる。したがって、バイオチップの反応チェンバーに収容された緩衝溶液の環境下において生理活性物質の反応を進行させると、センシング電極と生理活性物質間の反応による静電容量変化値（Ｃｄ）は、緩衝溶液を誘電体とする仮想の電極板とセンシング電極間の静電容量値（Ｃｔ）に吸収されてしまう。すなわち、前記数式３から知ることができように、緩衝溶液のようなイオンを含む反応溶液を誘電体とする仮想の電極板とセンシング電極間の静電容量値（Ｃｔ）の逆数値（１／Ｃｔ）が大きいため、センシング電極に固定された受容体と生理活性物質の反応によるセンシング電極表面における静電容量変化値（Ｃｄ）は、全静電容量変化値（Ｃｔ）に影響を与えることができない。したがって、バイオチップのセンシング電極による電気的検出では生理活性物質の存否および／または反応可否を判断することができなくなるという問題が発生する。
【００１０】
これと関連し、図１には測定対象となる特定ターゲットＤＮＡテンプレートが存在する場合もＰＣＲ反応前後において、周波数の変化に対するインピーダンス変化の曲線が同一であることが示されている。もし、従来技術のバイオチップが生理活性物質である特定ターゲットＤＮＡテンプレートのＰＣＲ反応を精密に測定するとすれば、センシング電極に固定されたプライマーとテンプレートｓｓＤＮＡ間のＰＣＲ反応によるセンシング電極表面における静電容量変化値（Ｃｄ）を電気的に検出しなければならない。また、このようなＰＣＲ反応によるＤＮＡ増幅後、センシング電極表面における静電容量変化値（Ｃｄ）は、インピーダンス変化として反映されなければならないため、ＰＣＲ反応前後においてインピーダンス変化曲線のパターンも変化されるのが観察されるべきである。  
ところが、前述したように、センシング電極と生理活性物質間の反応による静電容量変化値（Ｃｄ）は、緩衝溶液を誘電体とする仮想の電極板とセンシング電極間の静電容量値（Ｃｔ）に吸収されてしまうため、バイオチップ電極に連結されたインピーダンス測定装置にて測定されたインピーダンス変化曲線は、ＰＣＲ反応前後において変化がなく、単一曲線にのみ観察される（図１参照）。したがって、従来のバイオチップにおいては、センシング電極に固定された受容体と生理活性物質間の反応による静電容量変化値（Ｃｄ）が緩衝溶液を誘電体とする仮想の電極板とセンシング電極間の静電容量値（Ｃｔ）により全静電容量変化値（Ｃｔ）を反映する２つのインピーダンス変化曲線が測定されないため、実際、生理活性分子の反応可否および／または存否を感知し難いという問題点があった。  
これと関連し、米国公開特許公報ＵＳ２００４／０１１０２７７号（特許文献２）には、バイオセンサのセンサセルの電極にプローブＤＮＡが付着しており、該プローブとターゲットＤＮＡとのハイブリッドにより静電容量が変化し、これによりトランジスタの電流値が変動し、ハイブリッド反応をセンシングする方式が開示されている。しかしながら、前述したようなセンシング電極に固定された受容体と生理活性物質間の反応による静電容量変化値（Ｃｄ）が緩衝溶液による静電容量値（Ｃｔ）に吸収され、センシング電極に付着した受容体と検出対象となる生理活性物質間の反応が電気的に検出されないという問題については注目していない。
また、米国公開特許公報ＵＳ２００６／０２２６０３０号（特許文献３）には、基板、電極および基板に付着したキャッチャー分子から構成されたセンサであって、キャッチャー分子が金属性ボール（他の分析物質とは異なる誘電定数を有する）で表示された一本のＤＮＡ分子鎖とハイブリッドするとハイブリッドした結果、電極を上記標識が取り囲み、電極インピーダンスの静電容量部分が変化し、これを測定することによってハイブリッド反応をセンシングする技術が開示されている。しかしながら、これもやはりセンシング電極に固定された受容体と生理活性物質間の反応による静電容量変化値（Ｃｄ）が緩衝溶液による静電容量値（Ｃｔ）に吸収され、実際の反応による電気的特性の変化を詳細にチェックできないという問題については注目していない。
その他に従来技術は、バイオチップのセンシング敏感度向上のため、ＩＤＥにおいてセンサ電極の幅を減らし、センシング敏感度を向上させる方式が開示されているだけで、実際の反応による静電容量変化値（Ｃｄ）が緩衝溶液による静電容量値（Ｃｔ）に吸収され、静電容量変化およびインピーダンス変化を敏感に感知できないという問題については認識していない。
したがって、従来のバイオチップおよびこれを用いた生理活性物質の反応可否および／または存否を確認する方法には改善すべき問題点があった。
これに本発明の発明者は、バイオチップの反応チェンバー内の電極間の物質の誘電定数を高くし、センシング電極表面における実際の反応による静電容量変化量にずれが生じず、反応チェンバー内の生理活性物質の生物学的、生化学的または化学的反応の結果を正確に反映するようにした生理活性物質を検出する方法およびバイオチップを考案するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】韓国公開特許公報第１０−２００４−００４２０２１号
【特許文献２】米国公開特許公報  ＵＳ２００４／０１１０２７７号
【特許文献３】米国公開特許公報  ＵＳ２００６／０２２６０３０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、前述したような従来技術において、バイオセンサ電極における実際の反応による静電容量変化を敏感に感知できないという問題を解決することにその目的がある発明であって、反応チェンバー内の生理活性物質の生物学的、生化学的または化学的反応による電気的特性の変化、さらに詳しくは、インピーダンス変化および／または静電容量変化を反応チェンバー内に提供された電極を通して精密に検出する方法およびこれのためにバイオチップを提供することにその目的がある。
具体的に、本発明は、反応チェンバー内の生理活性物質の生物学的、生化学的または化学的反応による電気的特性の変化、より詳しくは、インピーダンス変化または静電容量変化を反応チェンバー内に提供されたセンシング電極を通して精密に検出する方法およびこれのためにバイオチップを提供することにその目的がある。  
さらに具体的に、本発明は、バイオチップの反応チェンバー内の電極間の物質の誘電定数を高くし、センシング電極表面における実際の反応による静電容量変化量にずれが生じず、反応チェンバー内の生理活性物質の生物学的、生化学的または化学的反応の結果を正確に反映するようにした生理活性物質を検出する方法およびこれのためのバイオチップを提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前述したような従来技術の問題点を解決するためには、センシング電極に固定された受容体と生理活性物質の反応による静電容量変化値（Ｃｄ）が緩衝溶液による静電容量値（Ｃｔ）に吸収されないようにする必要がある。これのため１／Ｃｔ値を小さくし、すなわち、Ｃｔ値を大きくする必要がある。  
ところが、前述したように静電容量は前記数式４の通り定義される。したがって、Ｃｔを大きくするためには、電極の面積を大きくする、或いは電極間の間隙を狭くしたり、または電極間の物質の誘電定数を大きくする方法がある。
従来技術は前述したように、バイオチップのＩＤＥにおいてセンサ電極の幅を減らし、Ｃｔを大きくすることによって、センシング敏感度を高める方式を用いているが、電極の幅を減らすことは高度の微細電極形成の技術が求められ、コストや効率の面において好ましくない。
このような点を勘案し、本願発明においては、バイオチップの反応チェンバー内の電極間の物質の誘電定数ε（または“誘電率”とする）を大きくする方式を採っている。このような方法は、高度の微細電極の形成技術が要されず、かつ電極間の静電容量の変化量にずれが生じず、反応チェンバー内の生理活性物質の生物学的、生化学的または化学的反応の結果を正確に反映することができる。
ところが、バイオチップの反応チェンバー内の電極間には検出対象試料の反応のための反応溶液が満たされる。したがって、このような反応溶液の誘電定数を高める必要がある。しかしながら、検出対象試料の反応のための反応溶液は、イオン成分により誘電定数の調整が難しい。
一般に、誘電定数は電極間に誘電体としてある物質を入れたときの静電容量と何も入れていない場合の静電容量との比であるとして定義されるが、一般に誘電体の誘電率は常に１より大きい。
液体の場合には水が誘電定数の最も高いものとして知られているが、室温における誘電定数は略８０程度だということが知られている。ところが、検出対象試料の反応のためには蒸留水や脱イオン水のような水を反応溶液として直接使用することができない。  
したがって、本発明においては、検出対象試料の反応は一般的な反応溶液下において行われるが、反応前に反応チェンバー内に水のような誘電定数の高いレファレンス流体を満たし、インピーダンス値または静電容量値を測定し、反応完了後には反応溶液を除去し、前記誘電定数の高いレファレンス流体を再び満たし、インピーダンス値または静電容量値を測定した後、反応前後のインピーダンス値または静電容量値を比較することによって、検出対象試料内に生理活性物質の存否および／または反応可否を確認する方式を採択する。
具体的には、本発明の生理活性物質を電気的に検出する方法として、（ａ）検出対象試料が収容される反応チェンバーと、該反応チェンバー内に位置し、前記検出対象試料内の生理活性物質の検出のための複数個のセンシング電極を具備する電気的検出装置を提供する段階と、（ｂ）前記反応チェンバー内に誘電定数の高いレファレンス流体を導入した後、前記センシング電極間のインピーダンス値または静電容量値を測定する段階と、（ｃ）前記反応チェンバーから前記誘電定数の高いレファレンス流体を除去した後、前記反応チェンバー内に反応溶液および検出対象試料を提供する段階と、（ｄ）前記反応溶液下において、前記検出対象試料を前記反応チェンバー内で反応させる段階と、（ｅ）前記反応溶液を前記反応チェンバーから除去する段階と、（ｆ）前記反応チェンバー内に前記誘電定数の高いレファレンス流体を再び導入した後、前記センシング電極間のインピーダンス値または静電容量値を測定する段階と、（ｇ）前記（ｂ）段階にて測定されたインピーダンス値または静電容量値と前記（ｆ）段階にて測定されたインピーダンス値または静電容量値を比較する段階とを含む。
本発明の一実施例において、前記（ｂ）段階および（ｆ）段階においては、交流電源を用いる測定装置によりそれぞれの周波数別にインピーダンス値または静電容量値を測定することができる。この場合、測定されたインピーダンス値または静電容量値は、周波数値に対する曲線で表すことができる。前記（ｂ）段階にて測定されたインピーダンス値または静電容量値の曲線が前記（ｆ）段階にて測定されたインピーダンス値または静電容量値の曲線と区分される場合、前記検出対象試料内に生理活性物質が存在したり、生理活性物質がセンシング電極と反応するものとして判断することができる。
本発明の一実施例において、前記誘電定数の高いレファレンス流体は、誘電定数が約４以上である流体であることが好ましく、より好ましくは、誘電定数が約８０以上であることが好ましい。前記誘電定数の高いレファレンス流体の例としては、蒸留水または脱イオン水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ）を挙げることができる。しかしながら、本発明はこれに制限されるものでなく、前述したように誘電定数が約４以上である流体であれば、適用可能である。
本発明の一実施例において、前記センシング電極は金、クロム、銅またはアルミニウムから形成されることが好ましい。前記センシング電極はＩＤＥ（Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）で形成され、各電極間の間隙は略  １−２０μｍが可能で、略１−４μｍであることが好ましい。
本発明の一実施例において、前記複数個のセンシング電極には前記生理活性物質と相互作用をする受容体が結合され得る。
発明の一実施例において、“生理活性物質（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）”は、前記センシング電極に結合された受容体と相互作用をする物質であって、一つないしそれ以上のヌクレオチドで構成された核酸、一つないしそれ以上のペプチドで構成されたタンパク質、アミノ酸、糖脂質または低分子化合物であり、好ましくは、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）とすることができる。
本発明の一実施例において、“受容体”は、前記センシング電極に結合され、生理活性物質と相互作用をする物質であって、一つないしそれ以上のヌクレオチドで構成された核酸または一つないしそれ以上のペプチドで構成されたタンパク質、アミノ酸、糖脂質または低分子化合物であり、好ましくは抗体、プローブまたはプライマーとすることができる。
また、本発明の好ましい一実施例として、前記受容体はオリゴヌクレオチド・プローブであり、前記生理活性物質は核酸であり、前記反応溶液は核酸ハイブリッド（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応溶液であることを特徴とする。また、本発明のもう一つの好ましい実施例として、前記受容体は、オリゴヌクレオチド・プライマーであり、前記生理活性物質は核酸であり、前記反応溶液はＰＣＲ反応溶液であることを特徴とす  る。
【００１４】
また、本発明の生理活性物質を検出する方法に用いられるバイオチップは、単一基板の形態に形成され得るが、二つの基板が接合された形態でもあり得る。このような本発明の一実施例のバイオチップの例として、ＤＮＡハイブリッド・チップまたはＰＣＲ反応チップが挙げられる。
二つの基板が接合された形態の本発明のバイオチップの一実施例は、生理活性物質と相互作用する受容体とが結合されている複数個のセンシング電極が形成された第１の基板と、前記第１の基板上に一定の距離を置いて、前記第１の基板と結合して反応チェンバー・スペースを形成する第２の基板と、を含む。
【００１５】
前記第１の基板は、Ｎ型またはＰ型シリコン基板上のＳｉＯ２絶縁層上に複数個のセンシング電極が形成されたものであって、生理活性物質の存否および／または反応可否を確認するための電気的な検出を行う。前記第２の基板は、前記第１の基板のセンシング電極が外部の環境と接触することを防止し、かつ前記第１の基板と結合して反応チェンバー・スペースを形成する。
前記反応チェンバーは、誘電定数の高いレファレンス流体が満たされた後、電極間のインピーダンスおよび／または静電容量が測定されるスペースである。また、前記反応チェンバーは、反応溶液および検出対象試料が満たされた後、検出対象試料内に存在する生理活性物質の反応が行われるスペースである。前記センシング電極に受容体が付着している場合には、前記反応チェンバー内の生理活性物質と前記受容体が反応し、このような反応結果により電極間のインピーダンスおよび／または静電容量の変化が起こる。
【００１６】
前記基板は、適用される受容体の種類および数、例えば、プローブまたはプライマーの種類および数などに応じて多様なサイズを有することができる。また、前記基板は正方形、長方形、円形の形状を有することができるが、本発明はこれに制限されるものではない。前記第１の基板はシリコン基板であり、前記第２の基板はガラス基板であることが好ましいが、これらの基板はこれ以外にもガラス、シリコン基板、融合シリカ、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリカーボネート、金、銀、銅または白金のうちのいずれかで構成されることができる。
【００１７】
また、前記反応チェンバー・スペースを形成する前記第２の基板には前記第２の基板の厚み方向に流体流入口が貫通して形成されており、前記流体流入口に対向する位置に前記第２の基板の厚み方向に流出口が貫通して形成されている。前記流入口と前記反応チェンバー、そして前記流出口と前記反応チェンバーは、流体が流動されるよう連通される。前記流入口を通して誘電定数の高いレファレンス流体、反応溶液および検出対象試料が流入され、前記流出口を通して誘電定数の高いレファレンス流体、反応溶液および検出対象試料が流出される。
また、前記第２の基板上には第３の基板が積層され、前記流入口へ流体を導入案内にする流入マイクロチャネルと、前記流出口から流体を排出案内する流出マイクロチャネルが形成されることができる。流入マイクロチャネルにはレファレンス流体、反応溶液および検出対象試料が注入される注入口が連通して上記第３の基板を貫通して形成されており、流出マイクロチャネルにはレファレンス流体、反応溶液および検出対象試料が排出される排出口が連通して前記第３の基板を貫通して形成されている。
また、前記流入マイクロチャネルおよび／または流出マイクロチャネルには反応チェンバー内への流体の流入および反応チェンバーから流体の流出を制限することができるバルブ構造が提供され得る。該バルブ構造は、前記注入口と前記反応チェンバーとの間において、または前記排出口と前記反応チェンバーとの間において、前記第３の基板の厚み方向に貫通した後、延長された通路であって、延長された通路にはオイルが内蔵されている。このようなバルブ構造の通路に窒素ガス（Ｎ２）が注入されると、通路に内蔵されたオイルが膨張し、オイルの膨張により前記チャネルが詰まってしまい、注入口から反応チェンバーへの流体の流入、そして反応チェンバーから排出口への流体の流出が遮断されるようになる。前記第３の基板は  ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）重合体で形成されることが好ましい。
前述したマイクロチャネルとバルブ構造は、当業界にて広く用いられているＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ−Ｓｙｓｔｅｍ）技術を利用してマイクロン単位ないしナノ単位で形成し、ただし、受容体の大きさ、電極の大きさまたは反応条件に応じてチャネルとバルブの大きさを調整することができる。
このようなチャネル構造とバルブ構造は、前述したような本発明の方法において、反応前には反応チェンバー内に誘電定数の高いレファレンス流体を満たし入れる過程、反応時には反応チェンバーから誘電定数の高い流体を除去し、反応溶液および検出対象試料を満たし入れる過程、そして、反応完了後には反応溶液を除去し、誘電定数の高い流体を再び満たし入れる過程の遂行を容易にする。これのため、流体、反応溶液および検出対象試料の注入および除去のための注入ポンプおよび排出ポンプが本発明のバイオチップに提供されることができ、ポンプ駆動手段として小型モーターやギアボックスが提供され得る。
一方、前記複数個のセンシング電極にはインピーダンス測定器（Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ）が電気的に連結され得る。バイオチップがＰＣＲ反応チップである場合には、ＰＣＲ反応を行うＰＣＲ機器にバイオチップが収容されるように構成すれば、バイオチップとＰＣＲ機器が一つのセットとして構成が可能である。このとき、ＰＣＲ機器は、インピーダンス測定装置を含むものを使用し、バイオチップのセンシング電極に前記内蔵されたインピーダンス測定装置を電気的に連結するようにセットとして構成すると好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、センシング電極表面における静電容量変化値（Ｃｄ）が緩衝溶液による静電容量値（Ｃｔ）に吸収されるという問題にも拘わらず、反応チェンバー内の生理活性物質の生物学的、生化学的または化学的反応による電気的特性変化を精密に検出することができる。
具体的に、本発明は、バイオチップの反応チェンバー内の電極間の物質の誘電定数を高くし、センシング電極に付着した受容体と、検出対象となる生理活性物質間の反応による静電容量変化量にずれが生じず、全静電容量変化量に正確に反映され、生理活性物質の存否および／または反応可否を正確に検出することができるという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】従来のＰＣＲ反応検出方式を利用して測定したインピーダンス変化曲線である。
【図２】本発明に用いられるＤＮＡハイブリッド・チップを製造する工程を説明する工程の流れ図である。
【図３】図２の工程に従って製作されたＤＮＡハイブリッド・チップの電極部分を示す平面図である。図３の（ａ）は、ＤＮＡハイブリッド・チップ電極部分の全体を示すものであり、図３の（ｂ）は図３の（ａ）に示す電極の一部を拡大し、模式的に示すものであり、図３の（ｃ）は指状の一対の電極（２０ａ、２０ｂ）を一部拡大して示すものである。
【図４】図３の（ｂ）の金属電極（２０）をＡ−Ａ’線に沿って切り取った横断面図である。
【図５】本発明に用いられるＰＣＲ反応チップを製造する工程を説明する工程の流れ図である。図５の（Ａ）はＰＣＲ反応チップのシリコン基板を製造する工程を説明しており、図５の（Ｂ）はＰＣＲ反応チップのガラス基板を製造する工程を説明しており、図５の（Ｃ）はシリコン基板とガラス基板とが接合された状態を示す図面である。
【図６】ＰＤＭＳ基板の流体制御基板が付着したＰＣＲ反応チップを示す断面図である。図６の（Ａ）は流体制御基板が先立って製作されたＰＣＲ反応チップのガラス基板上に付着したものを示すものであり、図６の（Ｂ）および（Ｃ）は流体制御基板のバルブ機能によりＰＣＲ反応チップ内における流体の流動が制御される過程を説明するものである。
【図７】電極アレイ型チップを示す図面である。
【図８】本発明のＤＮＡハイブリッド反応検出方法を利用して測定したインピーダンス変化曲線である。
【図９】本発明のＰＣＲ反応検出方法を利用して測定したインピーダンス変化曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳しく記述する。本発明の下記の実施例は、本発明を具体化するためのものに過ぎず、本発明の権利範囲を制限したり、限定するものでないことはもちろんである。本発明の詳細な説明および実施例より本発明が属す技術分野の専門家が容易に類推することができるものは、本発明の権利範囲に属するものとして解釈される。本発明に引用された参考文献は、本発明に参考として取り込まれる。
実施例
実施例  １：  ＤＮＡ  ハイブリッド・チップの製作
本発明の生理活性物質を検出する方法において、検出対象生理活性物質がＤＮＡであり、センシング電極に結合される受容体がオリゴヌクレオチド・プローブである場合、生理活性物質であるＤＮＡとプローブのハイブリッド反応のためのＤＮＡハイブリッド・チップを製作する。
ＤＮＡハイブリッド・チップのセンサは、当業界にて知られた一般的な方法を利用して製作するが、酸化シリコン薄膜形成技術、フォトリソグラフィ（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）技術、露光パターニング技術、現像技術、湿式および／または乾式エッチング技術などを用いて製作する。詳しくは  ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）技術を利用してシリコン基板上にＩＤＥ（Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）形態のセンシング金属電極を形成した後、オリゴヌクレオチド・プローブをセンシング電極に固定する方式で製作される。
以下では、本発明に用いられるＤＮＡハイブリッド・チップの製造過程を段階別に説明する。
実施例１−１：電極が形成されたシリコン基板の製作
以下では、図２を参照に本発明に用いられるＤＮＡハイブリッド・チップ（１００）の基板（１０）と電極（２０）を形成する過程を簡略に説明する。
厚さが５００μｍであるＮ−型シリコンウェーハ（１０）を熱酸化させ、酸化絶縁膜層である約１０，０００ÅのＳｉＯ２層（１２）を形成した（図２の（ａ）段階）。その次に、前記絶縁膜層（１２）をフォトレジストＡＺ  ５２１４（１４）で塗布した（図２の（ｂ）段階）。前記フォトレジスト（１４）上に金属電極パターンのマスク（図示しない）を載置し、紫外線に露光させた後、前記シリコンウェーハ（１０）をＡＺ３００ＭＩＦ現像液に漬けて現像し、エッチング処理した（図２の（ｃ）段階）。前記エッチング処理されたウェーハ（１０）上にクロム（Ｃｒ）（３００Å）および金（Ａｕ）（３０００Å）薄膜（２０）を蒸着させた（図２の（ｄ）段階）。前記クロムおよび金薄膜（２０）の蒸着は、化学気相蒸着（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ；ＣＶＤ）、真空蒸着（ｖａｃｕｕｍ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）またはスパッターリング（ｓｐｕｔｔｅｒｉｎｇ）を利用して行った。その次に、公知のリフト−オフ（ｌｉｆｔ−ｏｆｆ）工程を利用して残されたフォトレジスト層（１４）と、この残されたフォトレジスト層上の薄膜の一部を除去し、金属電極（２０）を形成した（図２の（ｅ）段階）。また、金属電極をＩＤＥ形態に形成するため、追加でフォトレジストＡＺ４６２０（１６）を塗布し、当業界によく知られたフォトリソグラフィ工程を利用し、微細なＩＤＥ（Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）形態に電極（２０）をパターニングした（図２の（ｆ）段階）。
完成したＤＮＡハイブリッド・チップ（１００）は、図３に示すとおりである。図３の（ａ）に示されたＤＮＡハイブリッド・チップ（１００）は、電極（２０）部分の直径（Ｒ）が略２．４ｍｍであるが、電極アレイ型ＤＮＡハイブリッド・チップ（図７参照）製作のためには、なるべく直径が小さいほどよい。電極（２０）面積は略３．６ｍｍ２である。
図３の（ｂ）は、図３の（ａ）に示された電極（２０）の一部を拡大し、模式的に示した図面である。理解を容易にするため、電極（２０）の形状は正方形に表したが、実際の電極（２０）は円形または楕円形とすることもできる。図３の（ｂ）から確認されるように、本発明に用いられるＤＮＡハイブリッド・チップ（１００）のセンシング電極（２０）は、指状の一対の電極（２０ａ、２０ｂ）が互いに一定の間隙を置いて、交差するように配列されていることが分かる。
【００２１】
一方、図３の（ｃ）には指状の一対の電極（２０ａ、２０ｂ）を一部拡大したものが示されている。各電極（２０ａ、２０ｂ）の幅（ｔ）は略１０μｍであり、電極間の間隙（ｄ）は略４μｍである。
実施例  １−２：電極にオリゴヌクレオチド・プローブ固定
まず、実施例１−１にて製作されたＤＮＡハイブリッド・チップ（１００）の電極（２０）を酸素プラズマ（１５０Ｗ、１００ｍｔｏｒｒ）で１０秒間洗滌し、電極（２０）上の不純物を完全に除去した。その次に、前記電極（２０）にプローブＤＮＡの一端（５’または３’）を固定させた。固定のため、オリゴヌクレオチドの５’末端にチオール（ｔｈｉｏｌ）基と炭素鎖（−ＣＨ２−）とを結合させた５’−ＳＨ−（ＣＨ２）２４−ＧＣＣ  ＡＴＴ  ＣｔＣ  ＡＣＣ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  Ｃ−３’のプローブを製作し、これを金属電極（２０）の表面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ）で固定させた。具体的に  １０  ｐｍｏｌ／μｌのＳＨ−ｓｓＤＮＡプローブをＭｇＣｌ２溶液環境下にて１８時間反応させた。その結果、プローブの−ＳＨ基と金属表面の反応により金属電極（２０）の表面にプローブＤＮＡ（２２）が固定される（図４参照）。
一方、チオール基以外にもプローブＤＮＡと伝導性ポリマーを結合させた後、ＤＮＡと結合されている伝導性ポリマーを公知のＳＡＭ（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ）方法を利用して金属電極表面に固定させることができる。前記伝導性ポリマーとしては公知の伝導性ポリマーがすべて使用され得、例えば、特に高伝導性ポリマーであるポリアセチレン（Ｐｏｌｙａｃｅｔｙｌｅｎｅ）、ポリ（ｐ−フェニレン）（Ｐｏｌｙ（ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）：ＰＰＰ）、ポリピロール（Ｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｅ：ＰＰｙ）、ポリアニリン（Ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ）、ポリチオフェン（Ｐｏｌｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）などが用いられ得る。伝導性ポリマーとプローブＤＮＡは、ポリマーとＤＮＡ間の公知の結合方法を利用して結合させることができる。
図４は図３の（ｂ）の金属電極（２０）をＡ−Ａ’線に沿って切り取った横断図面であって、酸化絶縁膜（１２）を間におき、シリコン基板（１０）上に形成された金属電極（２０ａ、２０ｂ）にプローブＤＮＡ（２２）が固定された様子が示されている。  
実施例２：  ＤＮＡハイブリッド・チップを利用したターゲット塩基配列の検出
実施例１−２にて製作された図４のＤＮＡハイブリッド・チップ（１００）を利用して検出対象試料内にターゲット塩基配列（５’−ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ−３’）が存在するか否かを検出した。
まず、ＤＮＡハイブリッド・チップ（１００）の電極（２０）間の反応スペース内に誘電定数の高いレファレンス溶液である脱イオン水を導入した後、交流を印加して電極（２０）間のインピーダンス値を室温で測定した。印加された交流電源の大きさは１００ｍＶであり、インピーダンス値が測定された周波数帯域は１〜３２ＭＨｚ範囲であった。
その次、ＤＮＡハイブリッド・チップ（１００）からレファレンス溶液を除去し、前述したターゲット塩基配列（１０ｐｍｏｌ／μｌのｓｓ−ＤＮＡ）を含む検出対象試料と、ＴＥ緩衝溶液をＤＮＡハイブリッド・チップ（１００）の反応スペース内に導入した。１８時間の間、室温でハイブリッド反応条件に応じてインキュベーションさせ、ＤＮＡハイブリッド・チップ（１００）の電極（２０）に固定されたプローブＤＮＡ（２２）と、ターゲット塩基配列（５’−ＧＡＣ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ−３’）を含むｓｓＤＮＡがハイブリッドするようにした。
再び、ＤＮＡハイブリッド・チップ（１００）から前記緩衝溶液を完全に除去し、脱イオン水を注入した後、交流を印加して電極（２０）間のインピーダンス値を室温で測定した。印加された交流電源の大きさは１００ｍＶであり、インピーダンス値が測定された周波数帯域は１〜３２ＭＨｚ範囲であった。
前述したようなハイブリッド反応前のインピーダンス測定値とハイブリッド反応後のインピーダンス測定値の結果を図８に示した。図８においては、従来技術の図１の場合とは異なり、ターゲット塩基配列を有するポジティブ検出対象試料を対象に実験を行った場合、ハイブリッド反応前のインピーダンス測定値の曲線とハイブリッド反応後のインピーダンス測定値の曲線が区分され、２つの曲線が観察された。図８から確認されるように、ハイブリッド反応進行後、反応溶液内にターゲットＤＮＡが存在した場合、インピーダンス値は減少することが分かる。したがって、ｓｓ−ＤＮＡがハイブリッド反応を通して、ｄｓ−ＤＮＡとなったとき、その伝導性が増加してインピーダンス値が減少したことを知ることができる。
すなわち、本発明の方法においては、センシング電極に固定されたプローブとターゲットｓｓＤＮＡのハイブリッド反応による静電容量変化値（Ｃｄ）が緩衝溶液による静電容量値（Ｃｔ）に吸収されず、全静電容量変化値（Ｃｔ）に反映される。したがって、本発明の方法においては、図８に示すように、ハイブリッド反応前後において、インピーダンス値の変化曲線が２つ観察されるため、ハイブリッド反応可否およびターゲットＤＮＡ存否を電気的に容易に検出することができる。
【００２２】
一方、ターゲット塩基配列のないネガティブ検出対象試料を対象に実験を行った場合には、図８に示すようにインピーダンス測定値がポジティブの場合のインピーダンス値より小さいことが分かる。
実施例３：  ＰＣＲ反応チップの製作
本発明の生理活性物質を検出する方法において、検出対象生理活性物質がＤＮＡであり、センシング電極に結合される受容体がオリゴヌクレオチド・プライマーの場合、プライマーおよびＰＣＲ反応溶液により生理活性物質であるＤＮＡが増幅するＰＣＲ増幅反応のための  ＰＣＲ反応チップを製作する。
ＰＣＲ反応チップもやはり、ＤＮＡハイブリッド・チップのセンサのように、当業界に知られた方法を利用して製作するが、シリコン基板と電極部分は酸化シリコン薄膜形成技術、フォトリソグラフィ（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）技術、露光パターニング技術、現像技術、湿式および／または乾式エッチング技術などを用いて製作した。ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）技術を利用してシリコン基板上にＩＤＥ（Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）形態のセンシング金属電極を形成した後、オリゴヌクレオチド・プライマーをセンシング電極に固定する方式で製作される。また、シリコン基板上に付着されるガラス基板部分は当業界に知られたガラス湿式エッチング（ｇｌａｓｓ  ｗｅｔ−ｅｔｃｈｉｎｇ）およびサンドブラスト（ｓａｎｄ  ｂｌａｓｔｉｎｇ）技術を利用して製作した。
以下では、本発明に用いられるＰＣＲ反応チップの製造過程を段階別に説明する。
実施例３−１：  シリコン基板、電極およびガラス基板の製造
図５を参照に本発明に用いられるＰＣＲ反応チップ（２００）の製造過程を説明する。
シリコン基板および金属電極の形成
厚さが５００μｍのＮ−型シリコンウェーハ（１０）を熱酸化し、酸化絶縁膜層である約５０００ÅのＳｉＯ２層（１２）を形成した（図５Ａの（ａ）段階）。通常のフォトリソグラフィ工程を利用してＴｉ／Ａｕ（３００Å／３０００Å）の金属電極（２０）をパターニングし、イオンミリング工程を利用した乾式エッチングでＩＤＥ電極に形成されない部分を除去し、微細なＩＤＥ（Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）電極部分を形成した（図５Ａの（ｂ）段階）。その次、前記パターニングされた金属電極（２０）上に化学気相蒸着法、真空蒸着法またはスパッターリングなどを利用し、１μｍ以上のＳｉＯ２膜（１８）を蒸着させた後（図５Ａの（ｃ）段階）、化学機械的研磨法（ＣＭＰ）を利用し、絶縁膜であるＳｉＯ２膜（１８）を平坦化した（図５Ａの（ｄ）段階）。そして、通常のフォトレジストとフォトリソグラフィ工程を利用し、ＩＤＥ電極部分のみを乾式エッチング（ＲＩＥ）または湿式エッチング（ＢＯＥ）を行い、Ａｕ金属電極の表面が露出されるようにし、後述するガラス基板（３０）と接合される絶縁膜（１８）部分を形成した（図５Ａの（ｅ）段階）。
図示しないものの、完成された金属電極（２０）のパターンは図３の（ａ）に示すＤＮＡハイブリッド・チップの金属電極（２０）のパターンと類似し、指状の一対の電極（２０ａ、２０ｂ）が互いに一定の間隙を置き、交差するように配列されている。電極（２０）部分の直径（Ｒ）は略８．６ｍｍであるが、電極アレイ型ＰＣＲ反応チップ（図７参照）製作のためには、なるべく直径が小さいほどよい。各電極（２０ａ、２０ｂ）の幅（ｔ）は略２０μｍであり、電極間の間隙（ｄ）は略２０μｍである。
ガラス基板の製作およびＰＣＲ反応チップの製作
図５Ｂに示すように、半導体工程において通常、用いられるガラス基板（Ｐｙｒｅｘ社製品）（３０）の上下面に  Ｃｒ／Ａｕ（３００Å／３０００Å）の金属薄膜（３２）を化学気相蒸着法、真空蒸着法またはスパッターリングなどを利用して蒸着させた（図５Ｂの（ａ）段階）。通常のフォトリソグラフィ工程を利用して上部に形成された金属薄膜（３２）をパターニングし、湿式エッチングを施し、ガラス基板（３０）のうち、後に工程処理される部分に対する保護層（３２）を形成した（図５Ｂの（ｂ）段階）。その次に、ＰＣＲ反応チップの反応チェンバー・スペース形成のため、保護層（３２）により遮蔽されないガラス基板（３０）部分を湿式エッチング処理した（図５Ｂの（ｃ）段階）。そして、上部および下部に形成された金属薄膜（３２）をすべて除去し、ＰＣＲ反応チップの流入／流出孔（３６ａ、３６ｂ）形成のため、ガラス基板（３０）の底面にはブルーテープ（パターニングできるブルーテープであれば使用可能）パターニング（３４）を行った（図５Ｂの（ｄ）段階）。その次、当業界にて知られたサンドブラスト工法によりガラス基板（３０）に対して厚み方向に流入／流出孔などの貫通孔を形成した（図５Ｂの（ｅ）段階）。
先に製作された金属電極（２０）が形成されたシリコン基板（１０）と、ガラス基板（３０）を図５Ｃに示すように、陽極接合法（ａｎｏｄｉｃ  ｂｏｎｄｉｎｇ）を利用して接合し、接合されたシリコン基板（１０）とガラス基板（３０）をダイシングして最終ＰＣＲ反応チップ（２００）を製作した。
前記陽極接合法は、シリコン基板とガラス基板とを接合するための方法であって、高い電氣場と熱を加え、ガラス基板内に存在する陽電荷を帯びたイオン（例えば、Ｎａ＋イオン）をシリコンとガラスとが接地する反対側に移動させ、シリコン基板とガラス基板の表面にて水素結合を形成させ、二つの基板を接合させる方法である。
【００２３】
二つの基板が接合された形態のＰＣＲ反応チップ（２００）において、前記シリコン基板（１０）には複数個のセンシング金属電極（２０）が形成されており（図５および図６Ａ参照）、該金属電極にはターゲットＤＮＡテンプレート（ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）に対するプライマー（２２）が固定されて結合されている（図６Ａ参照）。そして、このようなシリコン基板（１０）はガラス基板（３０）と一定した距離を置いて接合され、反応チェンバー・スペース（４６）を形成する（図５および図６Ａ参照）。
【００２４】
前記反応チェンバー・スペース（４６）は、脱イオン水のレファレンス溶液が満たされた後、電極間のインピーダンス値が測定されるスペースである。また、前記反応チェンバー・スペース（４６）は検出対象試料とＰＣＲ反応溶液が収容され、ＰＣＲ反応が行われるスペースであって、シリコン基板（１０）の金属電極（２０）に固定されたプライマー（２２）に検出対象試料内に存在するターゲットＤＮＡテンプレートが相補的結合をなすとＰＣＲ反応が進行されるスペースである。
したがって、このようなＰＣＲ反応による金属電極（２０）間、インピーダンス変化を電気的に検出すると、検出対象試料内にターゲットＤＮＡテンプレートが存在するか否かを検出することができるものである。
ガラス基板（３０）は、反応チェンバー・スペース（４６）を外部から保護する役割をする。また、ガラス基板（３０）には厚み方向に流体流入口（３６ａ）が貫通して形成されており、前記流体流入口（３６ａ）に対向する位置に厚み方向に流出口（３６ｂ）が貫通して形成されている（図５および図６Ａ参照）。図５および図６Ａに示すように、前記流入口（３６ａ）と前記反応チェンバー（４６）、そして、前記流出口（３６ｂ）と前記反応チェンバー（４６）は流体が流動されるように連通されている。前記流入口（３６ａ）を通して脱イオン水のレファレンス溶液、ＰＣＲ反応溶液および検出対象試料が流入され、前記流出口（３６ｂ）を通して脱イオン水のレファレンス溶液、ＰＣＲ反応溶液および検出対象試料が流出される。  
３．  ＰＤＭＳ基盤の流体制御基板の製作
一方、ＰＣＲ反応チップ（２００）内における流体の流動を制御するため、ＰＤＭＳ基盤の流体制御基板（４０）を製作し、先に製作されたＰＣＲ反応チップ（２００）のガラス基板（３０）上に付着する。  
本発明に用いられるＰＣＲ反応チップ（２００）の流体制御基板（４０）は、チップの内部が見られるよう透明な重合体で製作するのが好ましいが、特にＰＤＭＳ（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）重合体で製作するのが好ましい。ＰＤＭＳの長所はシリコンより価格が低廉で、工程が容易でかつ柔軟で、他の表面と接合するとき、防水が可能という点である。また、生物にやさしいため、生理活性物質に否定的な影響を与えない。しかし、タンパク質と細胞のような疎水性成分の非特異的吸着が発生し得るため、反応性塗料の蒸着またはグラフト共重合処理を施すのが好ましい。例えば、流体制御基板（４０）の注入口（４２）、チャネル（４４ａ、４４ｂ）および排出口（４８）を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でコーティングすれば、疎水性成分の非特異的吸着を最小化することができる。
【００２５】
まず、流体制御基板（４０）をＣＡＤ（ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ａｉｄｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ）プログラムにより考案した上、考案されたデザインをフォトマスク（ｐｈｏｔｏｍａｓｋ）に印刷し、不純物を除去した。シリコンウェーハ上にネガティブ型フォトレジストであるＳＵ−８をスピンコーティングし、流体制御基板（４０）の注入口（４２）、バルブ構造（５２）、マイクロチャネル（４４ａ、４４ｂ）および排出口（４８）パターンのフォトマスクを用いた露光および現像工程を通して鋳物を製作した。そして、液体状態のＰＤＭＳを前記ＳＵ−８鋳物に入れ、熱処理を加え固めた後、鋳物から分離した。分離されたＰＤＭＳ流体制御基板（４０）をＰＣＲ反応チップ（２００）の大きさに合わせて切り取った後、パンチを利用して注入口（４２）と排出口（４８）などの位置に希望する大きさで孔を空けた。その次に、前記製作された流体制御基板（４０）をプラズマ酸化し、ＰＣＲ反応チップ（２００）のガラス基板（３０）上に対応する位置に接着させた。  
このように流体制御基板（４０）が装着され、最終的に製作されたＰＣＲ反応チップ（２００）の縦断面図が図６Ａに示されている。
【００２６】
前記流体制御基板（４０）が前記ガラス基板（３０）上に付着されることによって、流入口（３６ａ）に流体を導入案内する流入マイクロチャネル（４４ａ）と、流出口（３６ｂ）から流体を排出案内する流出マイクロチャネル（４４ｂ）が形成される。流体制御基板（４０）には脱イオン水のレファレンス溶液、ＰＣＲ反応溶液および検出対象試料が注入される注入口（４２）が貫通して形成されているが、この注入口（４２）は前記流入マイクロチャネル（４４ａ）と連通して流体が反応チェンバー（４６）内に流入されるようにしてくれる。また、流体制御基板（４０）には脱イオン水のレファレンス溶液、ＰＣＲ反応溶液および検出対象試料が排出される排出口（４８）が貫通して形成されているが、該排出口（４８）は前記流出マイクロチャネル（４４ｂ）と連通して反応チェンバー（４６）より流体が外部へ排出されるようにしてくれる。
【００２７】
また、前記流体制御基板（４０）には前記注入口（４２）と前記反応チェンバー（４６）との間、そして、前記排出口（４８）と前記反応チェンバー（４６）との間において、流体制御基板（４０）の厚み方向に貫通した後、長手方向に延長された通路（５２）が形成されている（図６Ａおよび図６Ｂ参照）。このような通路（５２）は流入マイクロチャネル（４４ａ）および／または流出マイクロチャネル（４４ｂ）に対するバルブ機能を行う。すなわち、前記通路（５２）にはシリコンオイル（５０）が内蔵されているが、図６Ｃに示すように、シリコンオイル（５０）が内蔵された通路（５２）に窒素ガス（Ｎ２）が注入されると、通路（５２）に内蔵されたシリコンオイル（５０）が膨張し、シリコンオイル（５０）の膨張により前記チャネル（４４ａ、４４ｂ）が詰まる。したがって、流体制御基板（４０）は注入口（４２）より反応チェンバー（４６）への流体の流入そして反応チェンバー（４６）から排出口（４８）への流体の流出を遮断し、流体の流れを制御するようにするものである。
実施例３−２：  電極にオリゴヌクレオチド・プライマー固定
まず、実施例３−１にて製作されたＰＣＲ反応チップ（２００）の電極（２０）をＰｉｒａｈｎａ溶液（Ｈ２ＳＯ４およびＨ２Ｏ２を７０：３０に混合したもの）で３０分間洗滌し、電極（２０）上の不純物を完全に除去した。
その次、前記電極（２０）に上流プライマー（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｐｒｉｍｅｒ）と下流プライマー（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｉｍｅｒ）の一端（５’または３’）を電極（２０）に固定させる。上流プライマーと下流プライマーのいずれも電極（２０）に固定させることもでき、このうちの一つのプライマーのみを電極に固定させ、残りもう一つのプライマーはＰＣＲ反応溶液に混ぜて、ＰＣＲ反応を進行させることができる。固定させるため、オリゴヌクレオチドの５’末端にチオール（ｔｈｉｏｌ）基と炭素鎖（−ＣＨ２−）とを結合させた５’−ＳＨ−（ＣＨ２）２４−ＧＣＣ  ＡＴＴ  ＣｔＣ  ＡＣＣ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  Ｃ−３’の上流プライマーと５’−ＳＨ−（ＣＨ２）２４−ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＣＧＴ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＴＣＡ  Ｇ−３’の下流プライマーを製作し、これを金属電極（２０）の表面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ）で固定させる。具体的に１０ｐｍｏｌ／μｌのＳＨ−ｓｓＤＮＡ上流プライマーおよび／または下流プライマーをＴＥ緩衝溶液（ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ）環境下において、１８時間反応させた。その結果、プライマーの−ＳＨ基と金属表面の反応により金属電極（２０）表面にプライマーｓｓＤＮＡ（２２）が固定される。本実施例にて行われた金属表面へのプライマーの固定過程は図４に示すような実施例１−２におけるプローブの固定過程と実質的に同じである。
実施例４：ＰＣＲ  反応チップを用いた  ＰＣＲ反応分析
実施例３−２にて製作されたプライマーが固定されたＰＣＲ反応チップ（２００）（図６参照）を利用して検出対象試料内にターゲットＤＮＡテンプレートが存在するか否かおよびＰＣＲ反応遂行可否を検出した。
【００２８】
まず、ＰＣＲ反応チップ（２００）の反応チェンバー（４６）内に誘電定数の高いレファレンス溶液である脱イオン水を導入した後、交流を印加し、電極（２０）間のインピーダンス値を室温で測定した。印加された交流電源の大きさは１００ｍＶであり、インピーダンス値が測定された周波数帯域は１〜３２ＭＨｚ範囲であった。
その次に、ＰＣＲ反応チップ（２００）からレファレンス溶液を除去し、ＰｒｏｍｅｇａのＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ  ＰＣＲキット（ＰＣＲ反応を簡便に行うために販売するＰＣＲ反応溶液；米国  Ｐｒｏｍｅｇａ社製品）とＤＮＡテンプレートをＰＣＲ反応チップ（２００）の反応チェンバー（４６）内に導入した。Ｐｒｏｍｅｇａにて薦める各ＰＣＲサイクル毎のＰＣＲ反応時間と反応温度に合わせてＰＣＲ反応を２５ないし３５サイクルを進めた。  
さらに、ＰＣＲ反応チップ（２００）において、前記ＰＣＲ反応溶液を完全に除去し、脱イオン水を注入した後、交流を印加して電極（２０）間のインピーダンス値を室温で測定した。印加された交流電源の大きさは１００ｍＶであり、インピーダンス値が測定された周波数帯域は  １〜３２ＭＨｚ範囲であった。
前述したようなＰＣＲ反応前のインピーダンス測定値とＰＣＲ反応後のインピーダンス測定値の結果を図９に示した。図９においては、従来技術の図１の場合とは異なり、ターゲットＤＮＡテンプレートを有するポジティブ検出対象試料を対象に実験を行った場合、ＰＣＲ反応前のインピーダンス測定値の曲線とＰＣＲ反応後のインピーダンス測定値の曲線が区分され、２つの曲線が観察された。図９から確認されるように、ＰＣＲ反応進行後、反応溶液内にターゲットＤＮＡテンプレートが存在する場合、インピーダンス値は減少することが分かる。したがって、ｓｓ−ＤＮＡがＰＣＲ反応を通してｄｓ−ＤＮＡとなったとき、その伝導性が増加し、インピーダンス値が減少したことが分かる。
すなわち、本発明の方法においては、センシング電極に固定されたプライマーとターゲットＤＮＡテンプレートのＰＣＲ反応による静電容量変化値（Ｃｄ）が緩衝溶液による静電容量値（Ｃｔ）に吸収されず、全静電容量変化値（Ｃｔ）に反映される。したがって、本発明の方法において、図９に示すようにＰＣＲ反応前後において、インピーダンス値の変化曲線が２つ観察されるため、ＰＣＲ反応可否およびターゲットＤＮＡテンプレートの存在可否を電気的に容易に検出することができる。
一方、ターゲットＤＮＡテンプレートのないネガティブ検出対象試料を対象に実験を行った場合は、図９に示すとおり、インピーダンス測定値がポジティブの場合のインピーダンス値より小さいことが分かる。
以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに制限されるものでない。当業者であれば、本発明の趣旨および範囲を外れることなく、修正、変更することができ、このような修正と変更もまた本発明に属するものであることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図６（Ｃ）】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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