(57)【要約】  本発明は概して分子生物学及び増殖因子調節の分野に関するものである。具体的には、本発明は、癌などの病態を治療するための併用療法に関する。
2011513432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的に有効な量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストとＨＥＲアンタゴニストとを対象に投与することを含む、対象の癌の治療法。
【請求項２】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体が一価の抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗体が一価であって、さらにＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域が第１及び第２ポリペプチドを含み、第１ポリペプチドが図１２に示すＦｃ配列（配列番号３３）を含んでおり、第２ポリペプチドが図１３に示すＦｃ配列（配列番号３４）を含んでいる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗体が、（ａ）配列：QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS（配列番号３５）と、図１２に示すＣＨ１配列（配列番号３２）と、図１２に示すＦｃ配列（配列番号３３）とを有する重鎖可変ドメインを含む第１ポリペプチド、（ｂ）配列：DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK（配列番号３６）と、図１２に示すＣＬ１配列（配列番号２４）とを有する軽鎖可変ドメインを含む第２ポリペプチド、並びに（ｃ）図１３に示すＦｃ配列（配列番号３４）を含む第３ポリペプチドを含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＨＥＲアンタゴニストがＨＥＲ２アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＨＥＲアンタゴニストがＨＥＲ３アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＨＥＲアンタゴニストが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗体が抗ＨＥＲ２抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗体が抗ＨＥＲ３抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＥＲアンタゴニストがＨＥＲ二量体形成阻害薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
癌が、乳癌、大腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド細胞腫、頭部及び頚部の癌、胃癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
癌が、非小細胞肺癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
対象に化学療法剤を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照について)
この出願は、米国特許法１１９(ｅ)に基づき、2008年3月6日に出願の米国仮出願第61/034,446号及び2008年4月11日に出願の同第61/044,438号の優先権を主張し、出典明記によりここにその内容全体を援用するものである。
【０００２】
(技術分野)
本発明は、一般に、分子生物学及び増殖因子調節の分野に関する。具体的には、本発明は、癌などの病態の治療を目的とした併用療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
(背景)
ＨＧＦは、多くの異なる種類の細胞に対して分裂促進活性、細胞運動促進活性及び形態形成活性を有する肝葉由来の多能性因子である。ＨＧＦ作用は特定のチロシンキナーゼであるｃ-ｍｅｔに媒介されており、異常なＨＧＦ及びｃ-ｍｅｔの発現は様々な腫瘍において観察されることが多い。例としてMaulik ら, Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59、 Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7): 863-867を参照。ＨＧＦ／ｃ-Ｍｅｔシグナル伝達経路の調節機能は腫瘍発達及び転移に関係する。例としてTrusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300を参照。
【０００４】
ＨＧＦは、Ｍｅｔレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の細胞外ドメインを結合して、多様な生物学的プロセス、例えば細胞分散、増殖及び生存を制御する。ＨＧＦ-Ｍｅｔシグナル伝達は、正常な胚発生、特に筋肉始原細胞の移動と肝臓及び神経系の発達に必須である(Bladt 等, Nature (1995), 376, 768-771；Hamanoue 等, Faseb J (2000), 14, 399-406；Maina 等, Cell (1996), 87, 531-542；Schmidt 等, Nature (1995), 373, 699-702；Uehara 等, Nature (1995), 373, 702-705)。ＭｅｔノックアウトマウスとＨＧＦノックアウトマウスの発生上の表現型は非常に類似しており、ＨＧＦがＭｅｔレセプターの同種リガンドであることが示唆される(Schmidt 等, 1995, 上掲；Uehara 等, 1995, 上掲)。また、ＨＧＦ-Ｍｅｔは、肝再生、血管新生及び創傷治癒の役割も担っている(Bussolino 等, J Cell Biol (1992), 119, 629-641；Matsumoto及びNakamura, Exs (1993), 65, 225-249；Nusrat 等, J Clin Invest (1994) 93, 2056-2065)。Ｍｅｔレセプター前駆体は、タンパク質分解的切断により、ジスルフィド結合により結合する細胞外αサブユニットと膜架橋βサブユニットとなる(Tempest 等, Br J Cancer (1988), 58, 3-7)。βサブユニットは細胞質キナーゼドメインを含有しており、アダプタータンパク質が結合してシグナル伝達を開始する多基質ドッキング部位をＣ末端に有している(Bardelli 等, Oncogene (1997), 15, 3103-3111；Nguyen 等, J Biol Chem (1997), 272, 20811-20819；Pelicci 等, Oncogene (1995), 10, 1631-1638；Ponzetto 等, Cell (1994), 77, 261-271；Weidner 等, Nature (1996), 384, 173-176)。ＨＧＦが結合すると、Ｇａｂ１及びＧａｂ２/ＳｏｓがＰＩ３キナーゼ及びＲａｓ/ＭＡＰＫそれぞれの活性化を媒介することによって、Ｍｅｔが活性化され、チロシンリン酸化及び下流へのシグナル伝達が起こり、細胞運動及び細胞増殖が促進される(Furge 等, Oncogene (2000), 19, 5582-5589；Hartmann 等, J Biol Chem (1994), 269, 21936-21939；Ponzetto 等, J Biol Chem (1996), 271, 14119-14123；Royal 及び Park, J Biol Chem (1995), 270, 27780-27787)。
【０００５】
Ｍｅｔは、発癌物質処理した骨肉腫細胞株においてトランスフォーミングすることが示された(Cooper 等, Nature (1984), 311, 29-33；Park 等, Cell (1986), 45, 895-904)。Ｍｅｔの過剰発現又は遺伝子増幅は、様々なヒト癌において観察されている。例えば、Ｍｅｔタンパク質は、結腸直腸癌において少なくとも５倍過剰発現しており、肝転移巣における遺伝子増幅も報告されている(Di Renzo 等, Clin Cancer Res (1995), 1, 147-154；Liu 等, Oncogene (1992), 7, 181-185)。また、Ｍｅｔタンパク質は、経口扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、腎臓細胞上皮癌、胸部上皮癌及び肺上皮癌において過剰発現することが報告されている(Jin 等, Cancer (1997), 79, 749-760；Morello 等, J Cell Physiol (2001), 189, 285-290；Natali 等, Int J Cancer (1996), 69, 212-217；Olivero 等, Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868；Suzuki 等, Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868)。加えて、ｍＲＮＡの過剰発現は、肝細胞癌、胃上皮癌及び結腸直腸上皮癌において観察されている(Boix 等, Hepatology (1994), 19, 88-91；Kuniyasu 等, Int J Cancer (1993), 55, 72-75；Liu 等, Oncogene (1992), 7, 181-185)。
【０００６】
Ｍｅｔのキナーゼドメインの多くの突然変異は、腎臓乳頭上皮癌において観察され、恒常的なレセプター活性化を引き起こしている(Olivero 等, Int J Cancer (1999), 82, 640-643；Schmidt 等, Nat Genet (1997), 16, 68-73；Schmidt 等, Oncogene (1999), 18, 2343-2350)。これらの活性化突然変異により恒常的なＭｅｔチロシンリン酸化が起こり、その結果ＭＡＰＫ活性化、フォーカス形成及び腫瘍形成が生じる(Jeffers 等, Proc Natl Acad Sci U S A (1997), 94, 11445-11450)。加えて、これらの突然変異は細胞運動及び浸潤を亢進する(Giordano 等, Faseb J (2000), 14, 399-406；Lorenzato 等, Cancer Res (2002), 62, 7025-7030)。形質転換細胞のＨＧＦ依存性Ｍｅｔ活性化は、転移、拡散及び移動性の増加を媒介し、最終的に浸潤性腫瘍増殖及び転移を引き起こす(Jeffers 等, Mol Cell Biol (1996), 16, 1115-1125；Meiners 等, Oncogene (1998), 16, 9-20)。
【０００７】
Ｍｅｔは、レセプター活性化、形質転換及び浸潤を作動する他のタンパク質と相互作用することが示されている。新生細胞において、Ｍｅｔは、ラミニンなどの細胞外基質(ＥＣＭ)構成成分のレセプターであるα６β４インテグリンと相互作用して、ＨＧＦ依存性浸潤性増殖を促進することが報告されている(Trusolino 等, Cell (2001), 107, 643-654)。加えて、Ｍｅｔの細胞外ドメインは、セマフォリンファミリーのメンバーであるプレキシンＢ１と相互作用して、浸潤性増殖を増やすことが示されている(Giordano 等, Nat Cell Biol (2002), 4, 720-724)。さらに、腫瘍形成及び転移に関係しているＣＤ４４ｖ６は、Ｍｅｔ及びＨＧＦと複合体を形成して、Ｍｅｔレセプター活性化を引き起こすことも報告された(Orian-Rousseau 等, Genes Dev (2002), 16, 3074-3086)。
【０００８】
Ｍｅｔは、Ron 及び Seaを含むレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)のサブファミリーのメンバーである(Maulik 等, Cytokine Growth Factor Rev (2002), 13, 41-59)。Ｍｅｔの細胞外ドメイン構造の予測から、セマフォリン及びプレキシンとの相同性の共有が示唆される。ＭｅｔのＮ末端は、すべてのセマフォリン及びプレキシンにおいて保存されるおよそ５００のアミノ酸のセマドメインを含有する。セマフォリン及びプレキシンは、神経発達における役割について最初に記載された、分泌型及び膜結合型のタンパク質の大きなファミリーに属する(Van Vactor and Lorenz, Curr Bio (1999),l 9, R201-204)。しかしながら、最近では、セマフォリン過剰発現は腫瘍浸潤及び転移と相関している。プレキシン、セマフォリン及びインテグリンにおいてみられるシステインリッチＰＳＩドメイン(Ｍｅｔ関連配列ドメインとも称される)は、プレキシン及び転写因子にみられるイムノグロブリン様領域である４つのＩＰＴリピートが続くセマドメインに近接して存在する。最近の研究では、Ｍｅｔセマドメインが十分にＨＧＦ及びヘパリンに結合することが示唆される(Gherardi 等, Proc Natl Acad Sci U S A (2003), 100(21):12039-44)。
【０００９】
上記のように、Ｍｅｔレセプターチロシンキナーゼはその同種リガンドであるＨＧＦによって活性化され、レセプターリン酸化はＭＡＰＫ、ＰＩ-３キナーゼ及びＰＬＣ-γの下流の経路を活性化する（L. Trusolino及びP. M. Comoglio, Nat Rev Cancer 2, 289 (2002); C. Birchmeiertら、Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003)）。下流のシグナル伝達経路の活性化を媒介するために、キナーゼドメイン内のY1234／Y1235のリン酸化はＭｅｔキナーゼ活性化に重要であるのに対して、多基質ドッキング部位のY1349及びY1356はｓｒｃホモロジー-２(ＳＨ２)、ホスホチロシン結合(ＰＴＢ)及びＭｅｔ結合ドメイン(ＭＢＤ)タンパク質の結合に重要である（C. Ponzettoら、Cell 77, 261 (1994);  K. M. Weidnerら、Nature 384, 173 (1996); G. Pelicciら、Oncogene 10, 1631 (1995)）。更なる膜近傍リン酸化部位であるY1003は、Ｃｂｌ Ｅ３-リガーゼのチロシンキナーゼ結合(ＴＫＢ)ドメインに対するその結合にとても特徴があるとされている(P. Peschardら、Mol Cell 8, 995 (2001); P. Peschard, N. Ishiyama, T. Lin, S. Lipkowitz, M. Park, J Biol Chem 279, 29565 (2004))。Ｃｂｌ結合は、エンドフィリン媒介性レセプターエンドサイトーシスであるユビキチン化と、その後のレセプター分解を起こすことが報告される(A. Petrelliら、Nature 416, 187 (2002))。このレセプター下方制御のメカニズムは、類似のＣｂｌ結合部位も有するＥＧＦＲファミリーにおいて既に開示されている(K. Shtiegman, Y. Yarden, Semin Cancer Biol 13, 29 (2003);  M. D. Marmor, Y. Yarden, Oncogene 23, 2057 (2004); P. Peschard, M. Park, Cancer Cell 3, 519 (2003))。Ｍｅｔ及びＨＧＦの調節不全は様々な腫瘍において報告されている。リガンド作動性Ｍｅｔ活性化はいくつかの癌において観察されている。血清及び腫瘍内ＨＧＦの上昇は、肺癌、乳癌及び多発性骨髄腫において観察される(J. M. Siegfried et al., Ann Thorac Surg 66, 1915 (1998); P. C. Ma et al., Anticancer Res 23, 49 (2003);  B. E. Elliott et al. Can J Physiol Pharmacol 80, 91 (2002);  C. Seidel, et al, Med Oncol 15, 145 (1998))。Ｍｅｔ及び／又はＨＧＦの過剰発現、Ｍｅｔ遺伝子増幅又は突然変異は、結腸直腸癌、肺癌、胃癌及び腎臓癌などの様々な癌において報告されており、リガンド非依存性レセプター活性化を起こすと考えられる(C. Birchmeierら、Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003);  G. Maulikら、Cytokine Growth Factor Rev 13, 41 (2002))。加えて、肝臓マウスモデルにおけるＭｅｔの誘導性過剰発現が肝細胞癌を生じさせることから、レセプター過剰発現がリガンド非依存性の腫瘍形成を起こすことが示される(R. Wangら、J Cell Biol 153, 1023 (2001))。癌におけるＭｅｔの関連を最も強く表す所見は家族性の散発性腎臓乳頭上皮癌(ＲＰＣ)患者において報告される。レセプターの恒常的活性化を引き起こすＭｅｔのキナーゼドメインの突然変異は、ＲＰＣの生殖細胞系及び体細胞の突然変異として同定された(L. Schmidtら、Nat Genet 16, 68 (1997))。トランスジェニックマウスモデルにおけるこれらの突然変異の導入により腫瘍形成及び転移が引き起こされる。(M. Jeffersら、Proc Natl Acad Sci U S A 94, 11445 (1997))。
【００１０】
ｃ−ｍｅｔ及びｃ−ｍｅｔのアンタゴニストに関する刊行物には、Martens, T,ら(2006) Clin Cancer Res 12(20 Pt 1) 6144；米国特許第６４６８５２９号；国際公開第２００６/０１５３７１号；国際公開第２００７/０６３８１６号；国際公開第２００６/１０４９１２号；国際公開第２００６/１０４９１１号；国際公開第２００６/１１３７６７号；米国特許出願公開第２００６-０２７０５９４号；US２００６−米国特許第７４８１９９３号；国際公開第２００９/００７４２７号；国際公開第２００５/０１６３８２号；国際公開第２００９/００２５２１号；国際公開第２００７/１４３０９８号；国際公開第２００７/１１５０４９号；国際公開第２００７/１２６７９９が含まれる。
【００１１】
レセプターチロシンキナーゼのＨＥＲファミリーは、細胞成長、分化及び生存の重要な介在物質である。該レセプターファミリーは、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ1又はＨＥＲ１)、ＨＥＲ２(ＥｒｂＢ２又はｐ１８５neu)、ＨＥＲ３(ＥｒｂＢ３)、及びＨＥＲ４(ＥｒｂＢ4又はtyro2)を含む４つの明らかなメンバーを含む。
【００１２】
ｅｒｂＢ１遺伝子にコードされるＥＧＦＲは、ヒト悪性腫瘍の原因と示唆されている。特にＥＧＲＦの発現の増加は、乳房、膀胱、肺、頭部、首部及び胃癌、並びに膠芽細胞腫で観察されている。増大したＥＧＦＲ発現は、自己分泌刺激経路によるレセプターの活性化となる、同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンド、トランスフォーミング増殖因子−アルファ(ＴＧＦ-α)の生成の増加にしばしば関連していると報告されている。Baselga及びMendelson Pharmac Ther., 64:127-154 (1994))。ＥＧＦＲ、又はそのリガンドＴＧＦ-α及びＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、そのような悪性腫瘍の治療における治療剤として評価されている。例えば、Baselga及びMendelson 上掲；Masui等, Cancer Research, 44:1002-1007(1984)；及びWu等, J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995)参照。
【００１３】
ＨＥＲファミリーの第２のメンバーであるｐ１８５neuは、元々は、化学的に処理されたラットの神経芽細胞種由来のトランスフォーミング遺伝子の産物として同定された。neuプロト癌遺伝子の活性化型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域の点突然変異(バリンからグルタミン酸へ)から生じる。ｎｅｕのヒト相同体の増幅は、乳房及び卵巣癌で観察され、乏しい予後と相関している(Slamon等, Science, 235:177-182 (1987)；Slamon等, Science, 244:707-712 (1989)；及び米国特許第4,968,603号)。今日まで、ｎｅｕプロト癌遺伝子におけるものに類似した点突然変異はヒトの腫瘍に対しては報告されていない。ＨＥＲ２の過剰発現(増幅のためしばしば見られるが均一にではない)が、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓及び膀胱の癌腫を含む他の癌腫においても観察されている。特に、King等, Science, 229:974 (1985)；Yokota等, Lancet, 1:765-767 (1986)；Fukushige等, Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986)；Guerin等, Oncogene Res., 3:21-31 (1988)；Cohen等, Oncogene., 4:81-88 (1989)；Yonemura等, Cancer Res., 51:1034 (1991)；Borst等, Gynecol.Oncol., 38:364 (1990)；Weiner等, Cancer Res., 50:421-425 (1990)；Kern等, Cancer Res., 50:5184 (1990)；Park等, Cancer Res., 49:6605 (1989)；Zhau等, Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990)；Aasland等, Br. J. Cancer 57:358-363 (1988)；Williams等, Pathobiology, 59:46-52 (1991)；及びMcCann等, Cancer, 65:88-92 (1990)参照。ＨＥＲ２は前立腺癌で過剰発現されうる(Gu等 Cancer Lett. 99:185-9(1996)；Ross等 Hum. Pathol. 28:827-33(1997)；Ross等 Cancer 79:2162-70(1997)；及びSadasivan等 J. Urol. 150:126-31(1993))。
【００１４】
ラットｐ１８５neu及びヒトＨＥＲ２タンパク質産物に対する抗体が記述されている。
【００１５】
Drebinとその仲間は、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５neuに対する抗体を言及している。例えば、Drebin等, Cell 41:695-706(1985)；Myers等, Meth. Enzym. 198:277-290(1991)；及び国際公開第９４／２２４７８号参照。Derbin等, Oncogene 2:273-277(1988)は、ｐ１８５neuの２つの異なる領域と反応性のある抗体混合物が、ヌードマウス中に移植されたｎｅｕ形質転換ＮＩＨ-３Ｔ３細胞に相乗的な抗腫瘍効果を生じることを報告している。また1998年10月20日発行の米国特許第5,824,311号参照。
【００１６】
Hudziak等,  Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172(1989)には、ヒトの乳房腫瘍株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３を使用して特徴付けられたＨＥＲ２抗体パネルの作製が記載されている。抗体への暴露に続いてＳＫ-ＲＢ-３細胞の相対的細胞増殖が、７２時間後の単層のクリスタルバイオレット染色により測定された。このアッセイを使用して、４Ｄ５と呼ばれる抗体により最大の阻害度が得られ、これは細胞増殖を５６％阻害した。パネルの他の抗体は、このアッセイにおいてより少ない度合いで細胞増殖を低減した。さらに、抗体４Ｄ５は、ＴＮＦ-αの細胞障害効果に対し、ＨＥＲ２過剰発現乳房腫瘍株化細胞を感作させることが見出されている。また、1997年10月14日に発行された米国特許第5,677,171号参照。Hudziak等により検討されたＨＥＲ２抗体は、Fendly等 Cancer Research 50:1550-1558(1990)；Kotts等 In Vitro 26(3):59A(1990)；Sarup等 Growth Regulation 1:72-82(1991)；Shepard等 J. Clin. Immunol. 11(3):117-127(1991)；Kumar等 Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986(1991)；Lewis等 Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263(1993)；Pietras等 Oncogene 9:1829-1838(1994)；Vitetta等 Cancer Research 54:5301-5309(1994)；Sliwkowski等 J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665(1994)；Scott等 J. Biol. Chem. 266:14300-5(1991)；D'souza等 Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206(1994)；Lewis等 Cancer Research 56:1457-1465(1996)；及びSchaefer等 Oncogene 15:1385-1394(1997)においてもさらに特徴付けられている。
【００１７】
マウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化体(ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、トラスツズマブ又はハーセプチン(登録商標)；米国特許第5,821,337号)は、広範な抗癌治療を前に受けたＨＥＲ２過剰発現転移性乳癌を持つ患者において臨床的に活性であった(Baselga等, J. Clin. Oncol. 14:737-744(1996))。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を発現する転移性乳癌を有する患者の治療のために、1998年9月25日、食品医薬品局から販売許可を受けた。
【００１８】
ＨＥＲシグナル伝達経路を標的とするために、他のＨＥＲレセプターによりＨｅｒ２の二量体形成を阻害し、それによりＲＡＳ及びＡＫＴ経路の下流における活性化と、リガンドによるリン酸化及び活性化とを阻害するヒト化抗体として、ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４（ペルツズマブ）が開発された。固形腫瘍の治療のための単剤としてのペルツズマブの第一相試験において、ペルツズマブを用いて進行卵巣癌に罹患した３名の対象を治療した。一名は耐久性の部分応答を呈し、別の対象は１５週間に亘って安定な疾病を有していた。Agusら、Proc Am Soc Clin Oncol 22: 192, Abstract 771 (2003)。
【００１９】
様々な特性を有する他のＨＥＲ２抗体は、Tagliabue等 Int. J. Cancer 47:933-937(1991)；McKenzie等 Oncogene 4:543-548(1989)；Maier等 Cancer Res. 51:5361-5369(1991)；Bacus等 Molecular Carcinogenesis 3:350-362(1990)；Stancovski等 PNAS(USA)88:8691-8695(1991)；Bacus等 Cancer Research 52:2580-2589(1992)；Xu等 Int. J. Cancer 53:401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等 Cancer Research 52:2771-2776(1992)；Hancock等 Cancer Res. 51:4575-4580(1991)；Shawver等 Cancer Res. 54:1367-1373(1994)；Arteaga等 Cancer Res. 54:3758-3765(1994)；Harwerth等 J. Biol. Chem. 267:15160-15167(1992)；米国特許第5,783,186号；及びKlapper等 Oncogene 14:2099-2109(1997)に記載されている。
【００２０】
相同性スクリーニングは、結果的に他の２つのＨＥＲレセプターファミリーメンバーを同定した；ＨＥＲ３(米国特許第5,183,884号及び第5,480,968号、並びにKraus等 PNAS(USA) 86: 9193-9197(1989))、及びＨＥＲ４(欧州特許出願第599,274号、Plowman等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750(1993)、及びPlowman等, Nature 366: 473-475(1993))。これらのレセプターはどちらも、少なくともいくつかの乳癌株での増加した発現を示す。
【００２１】
ＨＥＲレセプターが一般に、細胞内で様々な組み合わせで発見され、ヘテロ二量化は様々なＨＥＲリガンドに対する細胞応答の多様性を増加すると考えられる(Earp等 Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132(1995))。ＥＧＦＲは６つの異なるリガンド；上皮増殖因子(ＥＧＦ)；トランスフォーミング増殖因子アルファ(ＴＧＦ-α)、アンフィレグリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子(ＨＢ-ＥＧＦ)、ベータセルリン及びエピレグリンにより結合される(Groenenら Growth Factors 11:235-257(1994))。単一の遺伝子の選択的スプライシングから生じるヘレグリンタンパク質のファミリーはＨＥＲ３及びＨＥＲ４のリガンドである。ヘレグリンファミリーは、α、β及びγヘレグリン(Holmes等, Science, 256:1205-1210(1992)；米国特許第5,641,869号；及びSchaeferら Oncogene 15:1385-1394(1997))；ｎｅｕ分化因子(ＮＤＦ)、グリア増殖因子(ＣＧＦ)；アセチルコリンレセプター促進活性(ＡＲＩＡ)；及び感覚、運動神経由来因子(ＳＭＤＦ)を含む。概説については、Groenenら Growth Factors 11:235-257(1994)；Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262(1996)及びLeeら Pharm. Rev. 47:51-85(1995)参照。最近になって更に３つのＨＥＲリガンドが同定された；ＨＥＲ３又はＨＥＲ４のどちらかに結合すると報告されたニューレグリン-２(ＮＲＧ-２)(Chang等 Nature 387 509-512(1997)；及びCarraway等 Nature 387:512-516(1997))；ＨＥＲ４に結合するニューレグリン-３(Zhang等 PNAS(USA)94(18):9562-7(1997))；及びＨＥＲ４に結合するニューレグリン-４(Harariら Oncogene 18:2681-89(1999))ＨＢ-ＥＧＦ、ベータセルリン及びエピレグリンもまたＨＥＲ４に結合する。
【００２２】
ＥＧＦ及びＴＧＦαはＨＥＲ２に結合しないが、ＥＧＦはヘテロ二量体を形成するようにＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を促進し、ＥＧＦＲを活性化し、その結果ヘテロ二量体でＨＥＲ２のトランスリン酸化を生じる。ヘテロ二量体及び／又はトランスリン酸化はＨＥＲ２チロシンキナーゼを活性化するように見える。上掲のEarp等, 参照。同様に、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と共に発現しているとき、活性シグナル伝達複合体が形成され、ＨＥＲ２に対する抗体はこの複合体を分裂させる能力がある(Sliwkowski等, J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665(1994))。更に、ヘレグリン(ＨＲＧ)に対するＨＥＲ３の親和性はＨＥＲ２と共に発現するときの高い親和性にまで増加される。また、ＨＥＲ２-ＨＥＲ３タンパク質複合体に関しては、Levi等, Journal of Neuroscience 15:1329-1340(1995)；Morrissey等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1431-1435(1995)；及びLewis等, Cancer Res., 56:1457-1564(1996)参照。ＨＥＲ３と同様にＨＥＲ４はＨＥＲ２と活性シグナル伝達複合体を形成する(Carraway and Cantley, Cell 78:5-8(1994))。
【００２３】
ＨＥＲ抗体に関する特許文献には以下のものがある：米国特許第５６７７１７１号、米国特許第５７２０９３７号、米国特許第５７２０９５４号、米国特許第５７２５８５６号、米国特許第５７７０１９５号、米国特許第５７７２９９７号、米国特許第６１６５４６４号、米国特許第６３８７３７１号、米国特許第６３９９０６３号、米国特許出願公開第２００２/０１９２２１１A１号、米国特許第６０１５５６７号、米国特許第６３３３１６９号、米国特許第４９６８６０３号、米国特許第５８２１３３７号、米国特許第６０５４２９７号、米国特許第６４０７２１３号、米国特許第６７１９９７１号、米国特許第６８００７３８号、米国特許出願公開第２００４/０２３６０７８A１号、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第６２６７９５８号、米国特許第６６８５９４０号、米国特許第６８２１５１５号、国際公開第９８/１７７９７号、米国特許第６１２７５２６号、米国特許第６３３３３９８号、米国特許第６７９７８１４号、米国特許第６３３９１４２号、米国特許第６４１７３３５号、米国特許第６４８９４４７号、国際公開第９９/３１１４０号、米国特許出願公開第２００３/０１４７８８４A１号、米国特許出願公開第２００３/０１７０２３４A１号、米国特許出願公開第２００４／００３７８２３Ａ１号、米国特許出願公開第２００５/０００２９２８A１号、米国特許第６５７３０４３号、米国特許第６９０５８３０号、米国特許出願公開第２００３/０１５２９８７A１号、国際公開第９９/４８５２７号、米国特許出願公開第２００２/０１４１９９３A号、米国特許出願公開第２００５／０２４４４１７Ａ１号、米国特許第６９４９２４５号、米国特許出願公開第２００３/００８６９２４号、米国特許出願公開第２００４/００１３６６７A１号、国際公開第００/６９４６０号、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３５Ａ１号、米国特許第７０４１２９２号、国際公開第０１/００２３８号、米国特許出願公開第２００６／００８３７３９号、国際公開第０１/１５７３０号、米国特許第６６２７１９６号B１号、米国特許第６６３２９７９号B１号、国際公開第０１/００２４４号、米国特許出願公開第２００２／０００１５８７Ａ１号、米国特許出願公開第２００２/００９０６６２A１号、米国特許第６９８４４９４号、国際公開第０１/８９５６６号、米国特許出願公開第２００２/００６４７８５号、米国特許出願公開第２００３/０１３４３４４号、国際公開第２００５／０９９７５６号、米国特許出願公開第２００６／００１３８１９号、国際公開第２００６／０７３９８Ａ１号、米国特許出願公開第２００６／００１８８９９号、国際公開第２００６／３３７００号、米国特許出願公開第２００６／００８８５２３号、米国特許出願公開第２００６／００３４８４０号、国際公開第 ０４/２４８６６号、米国特許出願公開第２００４/００８２０４７号、米国特許出願公開第２００３/０１７５８４５A１号、国際公開第０３/０８７１３１号、米国特許出願公開第２００３/０２２８６６３号、国際公開第２００４/００８０９９A２号、米国特許出願公開第２００４/０１０６１６１号、国際公開第２００４/０４８５２５、米国特許出願公開第２００４/０２５８６８５A１号、国際公開第２００５／１６９６８、米国���許出願公開第２００５／００３８２３１Ａ１号、米国特許第５９８５５５３号、米国特許第５７４７２６１号、米国特許第４９３５３４１号、米国特許第５４０１６３８号、米国特許第５６０４１０７号、国際公開第 ８７/０７６４６号、国際公開第 ８９/１０４１２号、国際公開第 ９１/０５２６４、欧州特許４１２１１６ B１号、欧州特許４９４１３５ B１号、米国特許第５８２４３１１号、欧州特許４４４１８１ B１号、欧州特許１００６１９４ A２号、米国特許出願公開第 ２００２/０１５５５２７A１号、国際公開第 ９１/０２０６２号、米国特許第５５７１８９４号、米国特許第５９３９５３１号、欧州特許５０２８１２ B１号、国際公開第 ９３/０３７４１、欧州特許５５４４４１ B１号、欧州特許６５６３６７ A１号、米国特許第５２８８４７７号、米国特許第５５１４５５４号、米国特許第５５８７４５８号、国際公開第 ９３/１２２２０号、国際公開第 ９３/１６１８５号、米国特許第５８７７３０５号、国際公開第 ９３/２１３１９、国際公開第 ９３/２１２３２号、米国特許第５８５６０８９号、国際公開第 ９４/２２４７８号、米国特許第５９１０４８６号、米国特許第６０２８０５９号、国際公開第 ９６/０７３２１号、米国特許第５８０４３９６号、米国特許第５８４６７４９号、欧州特許７１１５６５号、国際公開第 ９６/１６６７３号、米国特許第５７８３４０４号、米国特許第５９７７３２２号、米国特許第６５１２０９７号、国際公開第 ９７/００２７１、米国特許第６２７０７６５号、米国特許第６３９５２７２号、米国特許第５８３７２４３号、国際公開第 ９６/４０７８９号、米国特許第５７８３１８６号、米国特許第６４５８３５６号、国際公開第 ９７/２０８５８号、国際公開第 ９７/３８７３１号、米国特許第６２１４３８８号、米国特許第５９２５５１９号、国際公開第 ９８/０２４６３号、米国特許第５９２２８４５号、国際公開第 ９８/１８４８９号、国際公開第 ９８/３３９１４号、米国特許第５９９４０７１号、国際公開第 ９８/４５４７９号、米国特許第６３５８６８２号 B１号、米国特許出願公開第２００３/００５９７９０号、国際公開第 ９９/５５３６７号、国際公開第 ０１/２００３３号、米国特許出願公開第２００２/００７６６９５ A１号、国際公開第 ００/７８３４７号、国際公開第 ０１/０９１８７号、国際公開第 ０１/２１１９２号、国際公開第 ０１/３２１５５号、国際公開第 ０１/５３３５４号、国際公開第 ０１/５６６０４号、国際公開第 ０１/７６６３０号、国際公開第０２/０５７９１号、国際公開第 ０２/１１６７７号、米国特許第６５８２９１９号、米国特許出願公開第２００２/０１９２６５２A１号、米国特許出願公開第 ２００３/０２１１５３０A１号、国際公開第 ０２/４４４１３号、米国特許出願公開第２００２/０１４２３２８号、米国特許第６６０２６７０号 B２、国際公開第０２/４５６５３号、国際公開第０２/０５５１０６号、米国特許出願公開第２００３/０１５２５７２号、米国特許出願公開第２００３/０１６５８４０号、国際公開第０２/０８７６１９号、国際公開第０３/００６５０９号、国際公開第０３/０１２０７２号、国際公開第０３/０２８６３８号、米国特許出願公開第２００３/００６８３１８号、国際公開第０３/０４１７３６号、欧州��許１３５７１３２、米国特許出願公開第２００３/０２０２９７３号、米国特許出願公開第２００４/０１３８１６０号、米国特許第５７０５１５７号、米国特許第６１２３９３９号、欧州特許６１６８１２ B１号、米国特許出願公開第２００３/０１０３９７３号、米国特許出願公開第２００３/０１０８５４５号、米国特許第６４０３６３０号B１号、国際公開第００/６１１４５号、国際公開第００/６１１８５号、米国特許第６３３３３４８号B１号、国際公開第 ０１/０５４２５号、国際公開第 ０１/６４２４６号、米国特許出願公開第２００３/００２２９１８号、米国特許出願公開第２００２/００５１７８５A１号、米国特許第６７６７５４１号、国際公開第 ０１/７６５８６号、米国特許出願公開第２００３/０１４４２５２、国際公開第０１/８７３３６号、米国特許出願公開第２００２/００３１５１５A１号、国際公開第０１/８７３３４号、国際公開第０２/０５７９１号、国際公開第０２/０９７５４号、米国特許出願公開第２００３/０１５７０９７号、米国特許出願公開第２００２/００７６４０８号、国際公開第０２/０５５１０６号、国際公開第０２/０７０００８号、国際公開第０２/０８９８４２号及び国際公開第０３/８６４６７号。
【００２４】
癌の治療が大きく進歩したとはいえ、治療法の向上が依然として求められている。
【００２５】
特許出願及び刊行物を含む、本明細書中で引用したすべての文献は、出典明記によってそれらの全体を援用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、癌などの病態を治療するための併用療法であって、ｃ−ＭｅｔアンタゴニストをＨＥＲアンタゴニストと組み合わせることにより有意な抗腫瘍活性を生む療法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
一態様において、本発明は、対象の癌を治療する方法であって、対象に治療的に有効な量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストとＨＥＲアンタゴニストとを投与することを含む方法を提供する。
【００２８】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストの例には、限定しないが、可溶性ｃ−ｍｅｔレセプター、可溶性ＨＧＲ変異体、ｃ−ｍｅｔ又はＨＧＦに特異的なアプタマー又はペプチボディ（peptibodies）、ｃ−ｍｅｔ小分子、抗ｃ−ｍｅｔ抗体、及び抗ＨＧＦ抗体が含まれる。幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは抗ｃ−ｍｅｔ抗体である。
【００２９】
一実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、図２（配列番号２９−３１）に示すＣＤＲ１−ＨＣ、ＣＤＲ２−ＨＣ及びＣＤＲ３−ＨＣ配列のうちの一又は複数を含む重鎖可変ドメインを含む。幾つかの実施態様では、抗体は図１２（配列番号１１、１２、２３）に示すＣＤＲ１−ＬＣ、ＣＤＲ２−ＬＣ、及びＣＤＲ３−ＬＣのうちの一又は複数を含む軽鎖可変ドメインを含む。幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインは、図１２（配列番号２５−２８）に示すＦＲ１−ＨＣ、ＦＲ２−ＨＣ、ＦＲ３−ＨＣ、及びＦＲ４−ＨＣ配列を含む。幾つかの実施態様では、軽鎖可変ドメインは、図１２（配列番号７−１０）に示すＦＲ１−ＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、ＦＲ３−ＬＣ、及びＦＲ４−ＬＣ配列を含む。幾つかの実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、一価であってＦｃ領域を含む。幾つかの実施態様では、この抗体は、図１２（配列番号３３）に示すＦｃ配列を含む。
【００３０】
幾つかの実施態様では、本抗体は、一価であってＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域は第１及び第２ポリペプチドを含んでおり、第１ポリペプチドは図１２（配列番号３３）に示すＦｃ配列を含んでおり、且つ第２ポリペプチドは図１３（配列番号３４）に示すＦｃ配列を含んでいる。
【００３１】
一実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、（ａ）配列：QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS（配列番号３５）と、図１２（配列番号３２）に示すＣＨ１配列と、図１２（配列番号３３）に示すＦｃ配列とを有する重鎖可変ドメインを含む第１ポリペプチド、（ｂ）配列：DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK（配列番号３６）と、図１２（配列番号２４）に示すＣＬ１配列とを有する軽鎖可変ドメインを含む第２ポリペプチド、及び（ｃ）図１３（配列番号３４）に示すＦｃ配列を含む第３ポリペプチドを含む。
【００３２】
一態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、抗体断片内のＦｃ配列のヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を最小化する少なくとも一つの特徴を含んでいる。このような特徴は、免疫グロブリンの集合の、産生量及び／又は純度及び／又は均一性を向上させる。一実施態様では、抗体は、国際公開第２００５／０６３８１６に記載されているような「ノブ(knob)」及び「ホール（hole)」を構成するＦｃ変異を含む。例えば、孔変異には、ＦｃポリペプチドのＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ、及び／又はＹ４０７Ｖがあり、キャビティ(Cavity)変異にはＴ３３６Ｗがある。
【００３３】
幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ＳＧＸ−５２３、ＰＦ−０２３４１０６６、ＪＮＪ−３８８７７６０５、ＢＭＳ−６９８７６９、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ５４１６、ＳＵ１２７４、ＸＬ−８８０、ＭＧＣＤ２６５、ＡＲＱ１９７、ＭＰ−４７０、ＡＭＧ１０２、抗体２２３Ｃ４又はヒト化抗体２２３Ｃ４（国際公開第２００９／００７４２７）、Ｌ２Ｇ７、ＮＫ４、ＸＬ−１８４、ＭＰ−４７０、又はＣｏｍｐ−１である。
【００３４】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストを使用して、ＨＧＦ／ｃ−ｍｅｔに関連する作用の一又は複数の側面を低減又は阻害することができる。ＨＧＦ／ｃ−ｍｅｔに関連する作用には、限定しないが、ｃ−ｍｅｔの活性化、下流分子シグナル伝達（例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）リン酸化、ＡＫＴリン酸化、ｃ−ｍｅｔリン酸化、ＰＩ３キナーゼ媒介性シグナル伝達）、細胞増殖、細胞遊走、細胞生存、細胞形態形成、及び血管新生が含まれる。これらの作用は、ｃ−ｍｅｔに結合するリガンド（例えばＨＧＦ）の破壊、ｃ−ｍｅｔリン酸化、及び／又はｃ−ｍｅｔ多量体化を含む、生物学的に関連する任意の機序により調節することができる。
【００３５】
幾つかの実施態様では、ＨＥＲアンタゴニストは、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３アンタゴニストである。幾つかの実施態様では、ＨＥＲアンタゴニストはＨＥＲ２アンタゴニストである。他の実施態様では、アンタゴニストはＨＥＲ３アンタゴニストである。幾つかの実施態様では、ＨＥＲ２アンタゴニストはＨＥＲ２に結合する。幾つかの実施態様では、ＨＥＲ３アンタゴニストはＨＥＲ３に結合する。幾つかの実施態様では、ＨＥＲアンタゴニストはＨＥＲニ量体形成の阻害薬（例えばペルツズマブ）である。幾つかの実施態様では、ＨＥＲアンタゴニストは抗体（例えば、ペルツズマブ又はトラスツズマブ）である。特定の一実施態様では、抗体はＨＥＲ２に結合し、例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメインのドメインＩＩ、又はＨＥＲ２細胞外ドメインのドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩの間の接合部に結合する。
【００３６】
ＨＥＲ２アンタゴニストを使用して、ＨＥＲ２−ＨＥＲ２リガンドに関連する作用の一又は複数の側面を低減又は阻害することができる。ＨＥＲ２−ＨＥＲ２リガンドに関連する作用には、限定しないが、ＨＥＲ２の活性化、下流分子シグナル伝達、細胞増殖が含まれる。これらの作用は、ＨＥＲ２に結合するリガンドの破壊、及びＨＥＲ２ニ量体形成の破壊を含む、生物学的に関連する任意の機序により調節することができる。
【００３７】
ＨＥＲ３アンタゴニストを使用して、ＨＥＲ３−ＨＥＲ３リガンドに関連する作用の一又は複数の側面を低減又は阻害することができる。ＨＥＲ３−ＨＥＲ３リガンドに関連する作用には、限定しないが、ＨＥＲ３の活性化、下流分子シグナル伝達、細胞増殖が含まれる。これらの作用は、ＨＥＲ３に結合するリガンドの破壊、及びＨＥＲ３リン酸化の破壊を含む、生物学的に関連する任意の機序により調節することができる。
【００３８】
本発明の方法を使用して、何らかの適切な病的状態に働きかけることができる。例えば、本発明の方法を使用して、固形腫瘍及び軟組織腫瘍の両方を差別なく、種々の癌を治療することができる。本発明の治療を適用可能な癌の非限定的な例には、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、神経膠芽腫、カポジ肉腫、カルチノイド細胞腫、頭部及び頚部の癌、メラノーマ、卵巣癌、胃癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫が含まれる。特定の態様では、癌は転移性である。他の態様では、癌は非転移性である。
【００３９】
特定の実施態様では、癌はＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、エルロチニブ又はゲフィチニブ）耐性癌ではない。特定の実施態様では、癌はエルロチニブ又はゲフィチニブ耐性癌ではない。
【００４０】
特定の実施態様では、癌はチロシンキナーゼ阻害薬耐性癌ではない。特定の実施態様では、癌は小分子ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬耐性癌ではない。
【００４１】
特定の実施態様では、癌は野生型ＥＧＦＲ遺伝子を示す。特定の実施態様では、癌は、野生型ＥＧＦＲ遺伝子とｃ−ｍｅｔ増殖及び／又はｃ−ｍｅｔ変異を示す。
【００４２】
特定の実施態様では、癌はＥＧＦＲ変異を示す。変異は、ＥＧＦＲ遺伝子のあらゆる部分、又はＥＧＦＲ遺伝子に関連する調節領域に位置しうる。例示的ＥＧＦＲ変異には、例えば、エクソン１８、１９、２０、又は２１における変異、キナーゼドメインにおける変異、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｓ７６８Ｉ、Ｌ８５８Ｐ、Ｅ７４６−Ｒ７４８ｄｅｌ、Ｒ７４８−Ｐ７５３ｄｅｌ、Ｍ７６６−Ａ７６７ＡＩ  ｉｎｓ、Ｓ７６８−Ｖ７６９  ＳＶＡ  ｉｎｓ、Ｐ７７２−７７３  ＮＳ  ｉｎｓ、２４０２ＯＣ、２４８２ＯＡ、２４８６Ｔ＞Ｃ、２４９１Ｇ＞Ｃ、２４９４ＯＣ、２５１  ０ＯＴ、２５３９ＯＡ、２５４９ＯＴ、２５６３ＯＴ、２８１９Ｔ＞Ｃ、２４８２−２４９０ｄｅｌ、２４８６−２５０３ｄｅｌ、２５４４−２５４５  ｉｎｓ  ＧＣＣＡＴＡ、２５５４−２５５５  ｉｎｓ  ＣＣＡＧＣＧＴＧＧ、又は２５６２−２５６３  ｉｎｓ  ＡＡＣＴＣＣが含まれる。ＥＧＦＲを活性化する変異体の他の例は従来技術に既知である（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７２０８３号参照）。特定の実施態様では、細胞又は細胞株は、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を含まない。
【００４３】
特定の実施態様では、癌は、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの発現、増幅、又は活性化を示す。特定の実施態様では、癌はｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの発現、増幅、又は活性化を示さない。
【００４４】
特定の実施態様では、癌はｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲ活性化を示す。特定の実施態様では、癌はｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲ活性化を示さない。
【００４５】
特定の実施態様では、癌は恒常的なｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの活性化を示す。幾つかの実施態様では、恒常的ＨＥＲは、チロシンキナーゼドメインに変異を含む。特定の実施態様では、癌は、恒常的なｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの活性化を示さない。
【００４６】
特定の実施態様では、癌は、リガンド依存性のｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの活性化を示す。特定の実施態様では、癌は、リガンド依存性のｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの活性化を示さない。
【００４７】
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの増幅を示さない」癌又は生体試料は、診断試験において、増幅したｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲ遺伝子を有さないものである。
【００４８】
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの増幅を示す」癌又は生体試料は、診断試験において、増幅されたｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲ遺伝子を有するものである。
【００４９】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、同一の組成として、又は別個の組成として、ＨＥＲアンタゴニストと連続して又は組み合わせて投与することができる。ｃ−ｍｅｔアンタゴニストとＨＥＲアンタゴニストとは、同時に、例えば単一の組成として、又は二つ以上の別個の組成として、同じ又は異なる投与経路を使用して投与することができる。あるいは又はさらに、投与は順番に関係なく連続して行うことができる。あるいは又はさらに、順番に関係なく、連続的投与と同時投与の両方を組み合わせて、段階的投与を実行することができる。特定の実施態様では、二つ以上の組成を投与する間に、数分から数日、数週間から数ヶ月に亘る間隔を空けることができる。例えば、ＨＥＲアンタゴニストを最初に投与し、続いてｃ−ｍｅｔアンタゴニストを投与することができる。しかしながら、同時投与、又はｃ−ｍｅｔアンタゴニストを最初に投与することも考慮可能である。したがって、一態様では、本発明は、ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト（例えば抗ｃ−ｍｅｔ抗体）を投与し、次いでＨＥＲアンタゴニストを投与することを含むことができる。特定の実施態様では、二つ以上の組成を投与する間に、数分から数日、数週間から数ヶ月に亘る間隔を空けることができる。
【００５０】
一態様では、本発明は、癌の治療に使用される、有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストと製薬的に許容可能な担体とを含んでなる組成物を提供し、前記使用は、ＨＥＲアンタゴニストを連続して又は同時に投与することを含む。幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは抗ｃ−ｍｅｔ抗体である。
【００５１】
一態様では、本発明は、癌の治療に使用される、有効量のｃ−ｍｅｔアンタゴニストと製薬的に許容可能な担体とを含んでなる組成物を提供し、前記使用は、ＨＥＲアンタゴニストを連続して又は同時に投与することを含む。幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは抗ｃ−ｍｅｔ抗体である。
【００５２】
治療対象である特定の癌の徴候に応じて、本発明の併用療法は、化学療法剤のような別の治療剤、或いは放射線療法又は外科的手術といった別の療法と組み合わせることができる。多くの既知の化学療法剤を、本発明の併用療法に使用することができる。好ましくは特定の兆候の治療の標準であるこれら化学療法剤が使用されるであろう。併用に使用される各治療剤の用量又は投与頻度は、好ましくは、他の薬剤無しで使用されるときの対応する薬剤の用量又は投与頻度と同じか、又はそれより小さい。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１はＨＥＲ２タンパク質の構造と、その細胞外ドメインのドメインＩ−ＩＶ（それぞれ配列番号１９−２２）のアミノ酸配列である。
【図２】Ａ及びＢは、マウスのモノクローナル抗体２Ｃ４の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（図２Ａ）及び重鎖可変(ＶＨ)ドメイン（図２Ｂ）（それぞれ配列番号１及び２）と、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＬ及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号３及び４）と、ヒトＶＬ及びＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍ  κ１、軽鎖κサブグループＩ、ｈｕｍＩＩＩ、重鎖サブグループＩＩＩ）のＶＬ及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号５及び６）とのアミノ酸配列の配列比較を示している。アスタリスクは、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４とマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間、又はヒト化２Ｃ４バージョン５７４とヒトフレームワークとの間の差異を特定している。相補性決定領域（ＣＤＲ）が大括弧で示されている。
【図３】Ａ及びＢは、ペルツズマブの軽鎖（配列番号１５）及び重鎖（配列番号１６）のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。糖鎖が重鎖のＡｓｎ２９９に付着している。
【図４Ａ】図４Ａは、インタクトなアミノ末端シグナルペプチド配列を含むペルツズマブ軽鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号１７）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、インタクトなアミノ末端シグナルペプチド配列を含むペルツズマブ重鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号１８）。
【図５】図５は、ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位における２Ｃ４の結合により、活性化されたＥＧＦＲ又はＨＥＲ３によるヘテロ二量体形成が阻止されている様子を概略的に示している。
【図６】図６は、ＭＡＰＫ及びＡｋｔ経路に対するＨＥＲ２／ＨＥＲ３の結合を示している。
【図７】図７は、トラスツズマブの活性とペルツズマブの活性との比較である。
【図８Ａ】図８Ａは、トラスツズマブの軽鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号１３）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、トラスツズマブの重鎖のアミノ酸配列を示す（配列番号１４）。
【図９Ａ】図９Ａは、変異ペルツズマブの軽鎖配列を示す（配列番号５１）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、変異ペルツズマブの重鎖配列を示す（配列番号５２）。
【図１０】コントロール培地（Ｃｏｎ）又は０．１ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリン類似体Ｄｏｘｉｃｙｃｌｉｎｅ（Ｄｏｘ）を有する培地中において、４８時間に亘り、ｍｅｔに対して方向付けたテトラサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡ又はＧＦＰ（ｓｈＧＦＰ２）に対して方向付けたコントロールｓｈＲＮＡを含むＥＢＣ１  ｓｈＭｅｔ４．１２細胞（ｓｈＭｅｔ４．１２）を増殖させた。２時間に亘って血清を枯渇させた後、細胞を、そのままにするか（−）、或いはＴＧＦα（Ｔ、２０ｎＭ）又はヘレグリンｂ１（Ｈｒｇ、２ｎＭ）で２０分間処理した。全細胞の可溶化液を、全体のリン酸化タンパク質の発現について評価したものを示す。
【図１１】コントロール培地又は０．１ｕｇ／ｍｌのＤｏｘ（Ｄｏｘ）を有する培地中において、４８時間に亘り、ｃ−ｍｅｔに対して方向付けたｓｈＲＮＡ又はＧＦＰに対して方向付けたコントロールｓｈＲＮＡを含むＮＳＣＬＣ  Ｈ４４１細胞を増殖させた。２時間に亘って血清を枯渇させた後、細胞を無処理にするか（−）、或いはＴＧＦα（Ｔ）又はヘレグリンｂ１（Ｈ）で２０分間処理した。
【図１２】図１２は、抗ｃ−ｍｅｔ抗体の一実施態様のフレームワーク領域（ＦＲ）、高頻度可変領域（ＨＶＲ）、第１の定常ドメイン（ＣＬ又はＣＨ１）、及びＦｃ領域（Ｆｃ）のアミノ酸配列を示している。図示のＦｃ配列は、国際公開第２００５／０６３８１６号に記載の変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含んでいる。
【図１３】図１３は、国際公開第２００５／０６３８１６号に記載されているような、変異Ｔ３６６Ｗを含むＦｃポリペプチドの配列を示している。一実施態様では、この配列を含むＦｃポリペプチドは、図７のＦｃ配列を含むＦｃポリペプチドとの複合体を形成してＦｃ領域を生成する。
【図１４】Ａは、そのまま（−）の、或いはＤｏｘで２４、４８、又は７２時間処理した（＋）ＥＢＣｓｈＭｅｔ４．１２又はＥＢＣｓｈＧＦＰ２細胞を示している。ウエスタンブロットにより、Ｍｅｔ、ｐＥＧＦＲ、又はＨｅｒ３についてタンパク質可溶化液を評価した。Ｂは、ＥＢＣｓｈＭｅｔ４．１２細胞をＤｏｘ（１００ｎｇ／ｍｌ）で４８時間処理し、細胞表面のＨｅｒ３についてＦＡＣＳにより分析した結果を示している。Ｃは、ＥＢＣｓｈＭｅｔ４．１２腫瘍を有するマウスに対し、５％のショ糖中に１ｍｇ／ｍｌのＤｏｘを含む（Ｄｏｘ）か、又は５％のショ糖のみ（ショ糖）を含む飲料水を与えた場合を示す。ウエスタンブロットにより、Ｈｅｒ３タンパク質について腫瘍可溶化液を評価した。
【図１５】図１５は、ＥＢＣ−１  ＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおけるｃ−ＭｅｔのｓｈＲＮＡノックダウンとペルツズマブとの併用の有効性を示している。ヌード（ＣＲＬ  ｎｕ／ｎｕ）動物にＥＢＣ−１−ｓｈＭｅｔ−４．５腫瘍が生じており、これらを、５％のショ糖を含む飲料水、ショ糖５％に調製した飲料水に１ｍｇ／ＭＬのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を加えたもの、ペルツズマブ、又はショ糖５％に調製した飲料水にペルツズマブと１ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンを加えたもので処理した。２〜３日毎にボトルを取り替えて、ショ糖又はＤｏｘを含む水を試験期間中に亘って維持した。腫瘍の容積及びＳＥＭは、実施例に記載のように算出された。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
（詳細な説明）
Ｉ．定義
本明細書中で用いる「肝細胞増殖因子」又は「ＨＧＦ」なる用語は、特に別途示されない限り、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達過程を起こす条件下においてこの経路を活性化しうる任意の(天然に生じるもの又は合成のもののいずれにせよ)天然の又は変異形のＨＧＦポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦタンパク質のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦにおいてみられるアミノ酸配列を指す。ｃ-ｍｅｔは、そのレセプターによってＨＧＦ細胞内シグナル伝達が生物学的に達成されるＨＧＦの公知のレセプターである。
【００５５】
本明細書中で用いる「ＨＧＦ変異体」は、天然ＨＧＦ配列に一又は複数のアミノ酸突然変異を含むＨＧＦポリペプチドを指す。場合によっては、一又は複数のアミノ酸突然変異はアミノ酸置換を含む。
【００５６】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。よって、天然配列ポリペプチドは、任意の哺乳動物由来の天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、あるいは組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列」ポリペプチドという用語は特にポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型(例えば細胞外ドメイン配列)、ポリペプチドの天然に生じる変異体型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
【００５７】
ポリペプチド「変異体」は、天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、一又は複数のアミノ酸残基が、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加されているか、又は欠失しているポリペプチドが含まれる。通常、変異体は、天然配列ポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００５８】
「ＥＧＲＦ」（用語「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、及び「上皮増殖因子レセプター」と互換可能）とは、Ullrichら、Nature (1984) 309:418425に記載されているレセプターチロシンキナーゼポリペプチド上皮増殖因子レセプターを意味し、Ｈｅｒ−１及びｃ−ｅｒｂＢ遺伝子産物、並びにＥＧＦＲｖＩＩＩのようなそれらの変異体と呼ばれることもある。ＥＧＦＲの変異体は、欠失、置換及び挿入を有する変異体も含み、例えば、Lynchら(New England Journal of Medicine 2004, 350:2129), Paezら(Science 2004, 304:1497), Paoら(PNAS 2004, 101:13306)に記載のものが含まれる。
【００５９】
「ＨＥＲレセプター」は、ＨＥＲレセプターファミリーに属するレセプタープロテインキナーゼであり、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３レセプターを含むが、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４レセプターを含まない。ＨＥＲレセプターは一般に、ＨＥＲリガンドと結合する、及び／又は他のＨＥＲレセプター分子と二量体形成する細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；及びリン酸化されうるいくつかのチロシン残基を抱合するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含んでなる。ＨＥＲレセプターは、「天然配列」ＨＥＲレセプター又はそのアミノ酸配列「変異体」であってもよい。好ましくは、ＨＥＲレセプターは天然配列ヒトＨＥＲレセプターである。
【００６０】
「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」なる表記は、ここで互換可能に使用され、例えばSemba等, PNAS(USA)82:6497-6501(1985)及びYamamoto等, Nature 319:230-234(1986)(Genebank受託番号X03363)に記載されているヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。「ｅｒｂＢ２」という用語は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を指し、「ｎｅｕ」はラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を指す。好ましくは、ＨＥＲ２は天然配列ヒトＨＥＲ２である。
【００６１】
ここで、「ＨＥＲ２の細胞外ドメイン」又は「ＨＥＲ２  ＥＣＯ」は、細胞の外側に位置するＨＥＲ２のドメインを指し、細胞膜に固定されているか、又は循環しており、その断片を含んでいる。一実施態様では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、４つのドメイン：「ドメインI」(およそ１−１９５のアミノ酸残基、配列番号：１９)、「ドメインII」(およそ１９６−３１９のアミノ酸残基、配列番号：２０)、「ドメインIII」(およそ３２０−４８８のアミノ酸残基：配列番号：２１)及び「ドメインIV」(およそ４８９−６３０のアミノ酸残基、配列番号：２２)(シグナルペプチドを含まない残基番号付け)を含む。Garrett 等 Mol. Cell.. 11:495-505 (2003)、Cho 等 Nature 421: 756-760 (2003)、Franklin 等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)、及びPlowman 等 Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1746-1750 (1993)、並びに本明細書中の図１を参照のこと。
【００６２】
「ＥｒｂＢ３」及び「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第５１８３８８４号及び第５４８０９６８号、並びにKraus等, PNAS(USA) 86:9193-9197(1989)に開示されたレセプターポリペプチドを指す。
【００６３】
本明細書中で用いる用語「ＥｒｂＢ４」及び「ＨＥＲ４」は、例えば、欧州特許出願第５９９２７４号；Plowman等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750(1993)；及びPlowman等, Nature 366: 473-475(1993)に開示されたレセプターポリペプチドを指し、例えば1999年4月22日発行の国際公開第９９／１９４８８に開示されているような、そのアイソフォームを含む。
【００６４】
本明細書で使用される「ＥｒｂＢ」とは、レセプターポリペプチドＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４を意味する。
【００６５】
本明細書中の「ＨＥＲ二量体」は、少なくとも２つのＨＥＲレセプターを含んでなる非共有結合的に結合する二量体である。このような複合体は、２以上のＨＥＲレセプターを発現する細胞がＨＥＲリガンドに曝される場合に形成され、免疫沈降によって単離することができ、例えば、Sliwkowski 等, J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)に記載のように、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析されうる。サイトカインレセプターサブユニット(例えばｇｐ１３０)などの他のタンパク質は二量体と結合しうる。好ましくは、ＨＥＲ二量体は、ＨＥＲ２を含んでなる。
【００６６】
本明細書の「ＨＥＲヘテロ二量体」は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３から選択された少なくとも２つの異なるＨＥＲレセプターを含んでなる非共有結合的に結合するヘテロ二量体である。このようなＨＥＲ二量体の例には、ＥＧＦＲ-ＨＥＲ２、又はＨＥＲ２-ＨＥＲ３ヘテロ二量体が含まれる。
【００６７】
「ＨＥＲリガンド」とは、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３レセプターに結合する及び／又はＨＥＲ２又はＨＥＲ３レセプターを活性化するポリペプチドを意味する。ここで特に対象とするＨＥＲリガンドは、例えば上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)(Savage等, J. Biol. Chem. 247:7612-76721(1972))；トランスフォーミング増殖因子-α(ＴＧＦ-α)(Marquardt等, Science 223:1079-1082 (1984))；シュワン細胞腫由来増殖因子又はケラチノサイト自己分泌増殖因子としても知られているアンフィレグリン(Shoyab等, Science 243:1074-1076(1989)；Kimura等, Nature 348:257-260(1990)；及びCook等, Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557(1991))；ベーターセルリン(Shing等, Science 259:1604-1607(1993)；及びSasada等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173(1993))；ヘパリン結合上皮細胞増殖因子(ＨＢ-ＥＧＦ)(Higashiyama等, Science 251:936-939(1991))；エピレグリン(Toyoda等, J. Biol. Chem. 270: 7495-7500(1995)；及びKomurasaki等, Oncogene 15:2841-2848(1997))；ヘレグリン(以下参照)；ニューレグリン-２(ＮＲＧ-２)(Carraway等, Nature 387: 512-516(1997))；ニューレグリン-３(ＮＲＧ-３)(Zhang等, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567(1997))；及びニューレグリン-４(ＮＲＧ-４)(Harariら Oncogene 18:2681-89(1999))又はクリプト(ＣＲ-１)(Kannan等 J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335(1997))のような天然配列ヒトＨＥＲリガンドである。ＥＧＦＲに結合するＨＥＲリガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦ-α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＨＢ-ＥＧＦ及びエピレグリンを含む。ＨＥＲ３に結合するＨＥＲリガンドは、ヘレグリンを含む。
【００６８】
ここで使用される「ヘレグリン」(ＨＲＧ)は、米国特許第５６４１８６９号又はMarchionniら, Nature, 362:312-318(1993)に開示されているようなヘレグリン遺伝子産物にコードされるポリペプチドを指す。ヘレグリンの例は、ヘレグリン-α、ヘレグリン-β１、ヘレグリン-β２、及びヘレグリン-β３（Holmes等, Science, 256:1205-1210(1992)；米国特許第５６４１８６９号）；ｎｅｕ分化因子(ＮＤＦ)（Peles等, Cell 69:205-216(1992)）；アセチルコリンレセプター誘発活性(ＡＲＩＡ)（Falls等, Cell, 72:801-815(1993)）；グリア増殖因子(ＧＧＦ)（Marchionni等, Nature, 362:312-318(1993)）；感覚及び運動神経由来因子(ＳＭＤＦ)（Ho等, J. Biol. Chem. 270:14523-14532(1995)）；γ-ヘレグリン（Schaefer等, Oncogene 15:1385-1394(1997)）を含む。
【００６９】
「ＨＥＲアンタゴニスト」（「ＨＥＲ阻害薬」と互換可能）とは、ＨＥＲ活性化又は機能を妨害する薬剤である。ＨＥＲ阻害薬の例には、ＨＥＲ抗体（例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３抗体）；小分子ＨＥＲアンタゴニスト、ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害薬が含まれる。好ましくは、ＨＥＲ阻害薬は、ＨＥＲレセプターに結合する抗体又は小分子である。特定の一実施態様では、ＨＥＲ阻害薬は、約１０００ｎＭ以下のＨＥＲに対する結合親和性（解離定数）を有する。別の実施態様では、ＨＥＲ阻害薬は、約１００ｎＭ以下のＨＥＲに対する結合親和性を有する。別の実施態様では、ＨＥＲ阻害薬は、約５０ｎＭ以下のＨＥＲに対して結合親和性を有する。特定の一実施態様では、ＨＥＲ阻害薬は、ＨＥＲに対して共有結合性に結合している。特定の一実施態様では、ＨＥＲ阻害薬は、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０でＨＥＲシグナル伝達を阻害する。別の実施態様では、ＨＥＲ阻害薬は、５００ｎＭ以下のＩＣ５０でＨＥＲシグナル伝達を阻害する。別の実施態様では、ＨＥＲ阻害薬は、５０ｎＭ以下のＩＣ５０でＨＥＲシグナル伝達を阻害する。
【００７０】
「ＨＥＲ二量体形成阻害薬」は、ＨＥＲ二量体又はＨＥＲへテロ二量体の形成を阻害する。好ましくは、ＨＥＲ二量体形成阻害薬は抗体であり、例えば、ＨＥＲ２のヘテロ二量体の結合部位に結合する抗体である。本明細書で最も好ましいＨＥＲ二量体形成阻害薬は、ペルツズマブ又はＭＡｂ  ２Ｃ４である。ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位への２Ｃ４の結合を図４に示す。ＨＥＲ二量体形成阻害薬の他の例には、ＨＥＲ３に結合して、一又は複数の他のＨＥＲレセプターとの二量体形成を阻害する抗体、アンチセンス二量体形成阻害薬等が含まれる。
【００７１】
「ＨＥＲ２二量体形成阻害薬」は、ＨＥＲ２を含んでなる二量体又はヘテロ二量体の形成を阻害する薬剤である。
【００７２】
「ＨＥＲ活性化」は、何れかの一又は複数のＨＥＲ２又はＨＥＲ３レセプターの活性化又はリン酸化を指す。通常、ＨＥＲ活性化により、シグナル伝達が生じる(例えば、ＨＥＲレセプター又は基質ポリペプチドのチロシン残基をリン酸化するＨＥＲレセプターの細胞内キナーゼドメインによって、生じる)。ＨＥＲ活性化は、対象のＨＥＲレセプターを含んでなるＨＥＲ二量体に、ＨＥＲリガンドが結合することにより媒介されうる。ＨＥＲ二量体へのＨＥＲリガンドの結合により、二量体のＨＥＲレセプターの一又は複数のキナーゼドメインが活性化され、このことにより一又は複数のＨＥＲレセプターのチロシン残基のリン酸化、及び／又は更なる基質ポリペプチド(一又は複数)、例えばＡｋｔ又はＭＡＰＫ細胞内キナーゼのチロシン残基のリン酸化が生じる。
【００７３】
「リン酸化」は、タンパク質、例えばＨＥＲレセプター又はその基質への一又は複数のリン酸基の付加を指す。
【００７４】
「ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３二量体形成を阻害する」抗体は、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３二量体形成を阻害又は妨害する抗体である。好ましくは、このような抗体は、そのヘテロ二量体結合部位でＨＥＲ２に結合する。本明細書中で最も好適な二量体形成阻害抗体は、ペルツズマブ又はＭＡｂ  ２Ｃ４である。
【００７５】
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体は、ドメインＩＩの残基に結合し（且つ場合によってはＨＥＲ２細胞外ドメインのうちの他のドメイン内の残基、例えばドメインＩ及びＩＩにも結合し）、少なくともある程度は、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ、又はＨＥＲ２−ＨＥＲ３へテロ二量体の形成を立体的に妨げることができる。Franklinら Cancer Cell 5:317-328 (2004)において、ＨＥＲ２−ペルツズマブ結晶構造の特徴付けが行われており、これはＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＩＤコードＩＳ７８）に寄託されて、ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する例示的な抗体を例証している。
【００７６】
ＨＥＲ２の「ドメインＩＩに結合する」抗体は、ドメインＩＩ内の残基と、場合によってはドメインＩ及びＩＩＩといったＨＥＲ２の他のドメイン内の残基とに結合する。好ましくは、ドメインＩＩに結合する抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩの間の接合部に結合する。
【００７７】
「ＨＥＲ二量体形成を阻害する」抗体は、ＨＥＲ二量体の形成を阻害又は妨害する抗体である。好ましくは、このような抗体は、ヘテロ二量体結合部位においてＨＥＲ２に結合する。本明細書において最も好ましい二量体形成を阻害する抗体は、ペルツズマブ又はＭＡｂ  ２Ｃ４である。ＨＥＲ２の二量体結合部位に対する２Ｃ４の結合を図４に示す。ＨＥＲのヘテロ二量体形成を阻害する抗体の他の例は、ＨＥＲ３に結合して、一又は複数の他のＨＥＲレセプターとＨＥＲ３との二量体形成を阻害する抗体である。
【００７８】
「トラスツズマブより効果的にＨＥＲ二量体形成を阻害する」抗体は、トラスツズマブより効果的に(例えば少なくともおよそ２倍効果的に)、ＨＥＲレセプター又はＨＥＲ二量体を減弱又は除去する抗体である。好ましくは、このような抗体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４のＦａｂ断片、ペルツズマブ及びペルツズマブのＦａｂ断片と、少なくともおよそ同じくらい効果的にＨＥＲレセプターのＨＥＲリガンド活性化を遮断する。ＨＥＲ二量体を直接調べることによって、又はＨＥＲ二量体形成の結果生じる下流のシグナル伝達、又はＨＥＲ活性化を評価することによって、及び／又は抗体-ＨＥＲ２結合部位を評価すること等によって、ＨＥＲレセプターのリガンド活性化遮断能を評価することができる。トラスツズマブより効果的にＨＥＲレセプターのリガンド活性化を阻害する能力を有する抗体についてのスクリーニングのアッセイは、Agus 等 Cancer Cell 2:127-137 (2002)及び米国特許第６９４９２４５号(Adams 等)に記載されている。例えば、ＨＥＲ二量体形成の阻害(例としてAgus 等 Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図１Ａ-Ｂ、及び米国特許第６９４９２４５号を参照)、ＨＥＲ二量体を発現する細胞のＨＥＲリガンド活性の減少(例えば、米国特許第６９４９２４５号、及びAgus 等 Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図２Ａ-Ｂ)、ＨＥＲ二量体を発現する細胞へのＨＥＲリガンド結合の遮断(例えば、米国特許第６９４９２４５号、及びAgus 等 Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図２Ｅ)、ＨＥＲリガンドの存在(又は不在)下でＨＥＲ二量体を発現する癌細胞(例えばＭＣＦ７、ＭＤＡ-ＭＤ-１３４、ＺＲ-７５-１、ＭＤ-ＭＢ-１７５、Ｔ-４７Ｄ細胞)の細胞成長阻害(例えば、米国特許第６９４９２４５号、及びAgus等 Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図３Ａ-Ｄ)、下流のシグナル伝達の阻害(例えば、ＨＲＧ依存性ＡＫＴリン酸化の阻害又はＨＲＧ-又はＴＧＦα-依存性ＭＡＰＫリン酸化の阻害)(例えば、米国特許第６９４９２４５号、及びAgus等 Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図２Ｃ-Ｄ参照)について、アッセイを行うことができる。また、抗体-ＨＥＲ２結合部位を調べること、例えばＨＥＲ２に結合した抗体の構造又はモデル、例えば結晶構造を評価することによって、抗体がＨＥＲ二量体形成を阻害するかどうかを評価してもよい(例えば、Franklin 等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)を参照)。
【００７９】
ＨＥＲ２上の「ヘテロ二量体結合部位」は、二量体形成の際にＥＧＦＲ、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４の細胞外ドメインの領域と接触するか又は相互作用するＨＥＲ２の細胞外ドメインの領域を指す。この領域は、ＨＥＲ２のドメインIIにみられる。Franklin等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
【００８０】
ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブより効果的に(例えば少なくとも２倍効果的に)「ＨＲＧ-依存性ＡＫＴリン酸化を阻害」及び／又は「ＨＲＧ-又はＴＧＦα-依存性ＭＡＰＫリン酸化」を阻害することができる(例えば、Agus等 Cancer Cell 2:127-137 (2002)及び米国特許第６９４９２４５号を参照)。
【００８１】
ここで使用される「ＥＧＦＲ標的薬」という用語は、ＥＧＦＲに結合してＥＧＦＲ活性化を阻害する治療薬を指す。このような薬剤の例は、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子を含む。ＥＧＦＲに結合する抗体の例は、ＭＡｂ５７９(ATCC CRL HB8506)、ＭＡｂ４５５(ATCC CRL HB8507)、ＭＡｂ２２５(ATCC CRL 8509)、ＭＡｂ５２８(ATCC CRL HB8509)(米国特許第４９４３５３３号、Mendelsohnら参照)及びその変異体、例えばキメラ２２５(Ｃ２２５又はセツキシマブ；ＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標）)及び再構成ヒト２２５(Ｈ２２５)(例えば、国際公開第９６／４０２１０号、Imclone Systems社参照)；ＩＭＣ−１１Ｆ８の、完全ヒトＥＧＦＲ標的抗体（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；タイプII変異ＥＧＦＲに結合する抗体(米国特許第５２１２２９０号)；米国特許第５８９１９９６号に記載のＥＧＦＲに結合するヒト化及びキメラ抗体；及びＡＢＸ-ＥＧＦのようなＥＧＦＲに結合するヒト抗体(国際公開第９８／５０４３３号、Abgenix参照)；EMD 55900 (Stragliotto 等. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996))；ＥＧＦＲ結合についてＥＧＦ及びＴＧＦ−αの両方と競合するＥＧＦＲを目標としたＥＭＤ７２００（マツズマブ）ヒト化ＥＧＦＲ抗体；及びmAb 806又はヒト化mAb 806 (Johns等, J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004))を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞障害剤とコンジュゲートされ、よって免疫コンジュゲートを作る(例えば、欧州特許第６５９４３９Ａ２、Merck Patent GmbH)。ＥＧＦＲに結合する小分子の例は、ZD1839又はゲフィチニブ(IRESSATM；Astra Zeneca)；CP-358774又はエルロチニブＨＣＬ(TARCEVATM；Genentech/OSI)；AG1478、AG1571(SU5271；Sugen)；ＥＭＤ−７２００を含む。
【００８２】
ここで使用される「ｃ−ｍｅｔ標的薬」という用語は、ｃ−ｍｅｔに結合してｃ−ｍｅｔ活性化を阻害する治療薬を指す。ｃ−ｍｅｔ標的薬の一例は、ＭｅｔＭＡｂ（ＯＡ５Ｄ５．ｖ２）である。
【００８３】
ここで使用される「ＨＥＲ標的薬」という用語は、ＨＥＲに結合してＨＥＲ活性化を阻害する治療薬を指す。
【００８４】
「ＥＧＦＲ耐性」癌は、患者がＥＧＦＲアンタゴニスト療法を受ける間に進行する癌（即ち、患者は「ＥＧＦＲ抵抗性」である）、又はＥＧＦＲアンタゴニストに基づく治療計画の完了後１２ヶ月以内（例えば、１、２、３、又は６ヶ月後）に進行する癌を意味する。例えば、Ｔ７９０Ｍ変異ＥＧＦＲを取り込む癌は、エルロチニブ及びゲフィチニブ療法に対して耐性である。
【００８５】
「エルロチニブ又はゲフィチニブに耐性」の癌は、エルロチニブに基づく療法又はゲフィチニブに基づく療法を受ける間に進行する癌（即ち、患者は「エルロチニブ又はゲフィチニブ耐性」である）、又はエルロチニブに基づく治療計画又はゲフィチニブに基づく治療計画の完了後１２ヶ月以内（例えば、１、２、３、又は６ヶ月以内）に進行する癌を意味する。
【００８６】
「ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト」（「ｃ−ｍｅｔ阻害薬」と互換可能）は、ｃ−ｍｅｔの活性化又は機能を妨害する薬剤である。ｃ−ｍｅｔ阻害薬の例には、ｃ−ｍｅｔ抗体；ＨＧＦ抗体；小分子ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト；ｃ−ｍｅｔチロシンキナーゼ阻害薬；アンチセンス及び阻害性ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ）分子（例えば、国際公開第２００４／８７２０７号参照）が含まれる。好ましくは、ｃ−ｍｅｔ阻害薬は、ｃ−ｍｅｔに結合する抗体又は小分子である。特定の一実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害薬は、約１０００ｎＭ以下のｃ−ｍｅｔに対して結合親和性（解離定数）を有する。別の実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害薬は、約１００ｎＭ以下のｃ−ｍｅｔに対して結合親和性を有する。別の実施態様では、ｃ−ｍｅｔは、約５０ｎＭ以下のｃ−ｍｅｔに対して結合親和性を有する。特定の一実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害薬は、ｃ−ｍｅｔに共有結合性に結合している。特定の一実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害薬は、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０でｃ−ｍｅｔシグナル伝達を阻害する。別の実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害薬は、５００ｎＭ以下のＩＣ５０でｃ−ｍｅｔシグナル伝達を阻害する。別の実施態様では、ｃ−ｍｅｔ阻害薬は、５０ｎＭ以下のＩＣ５０でｃ−ｍｅｔシグナル伝達を阻害する。
【００８７】
「ｃ−ｍｅｔ活性化」は、ｃ−ｍｅｔレセプターの活性化又はリン酸化を指す。一般に、ｃ−ｍｅｔ活性化によりシグナルトランスダクションが起こる（例えば、ｃ−ｍｅｔ又は基質ポリペプチド内のｃ−ｍｅｔレセプターリン酸化チロシン残基の細胞内キナーゼドメインにより引き起こされるもの）。ｃ−ｍｅｔの活性化は、対象のｃ−ｍｅｔレセプターに結合するｃ−ｍｅｔリガンド（ＨＧＦ）により媒介されうる。ｃ−ｍｅｔに対するＨＧＦの結合は、ｃ−ｍｅｔのキナーゼドメインを活性化し、それによりｃ−ｍｅｔ内のチロシン残基のリン酸化及び／又は別の基質ポリペプチド内のチロシン残基のリン酸化を引き起こしうる。
【００８８】
本明細書の目的のために、「トラスツズマブ」、「ハーセプチン（登録商標）」、及び「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」は、それぞれ配列番号１３及び１４に示される軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含む抗体を意味する。
【００８９】
ここで、「ペルツズマブ」及び「ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４」は、それぞれ配列番号３及び４に示される可変軽鎖アミノ酸配列及び可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。ペルツズマブは、それがインタクトな抗体である場合、好ましくは、それぞれ配列番号１５及び１６に示される軽鎖アミノ酸配列及び重鎖アミノ酸配列を含む。
【００９０】
ＨＥＲ２抗体は、「ＨＥＲ２外部ドメイン切断を阻害しない」抗体である（Molinaら Cancer Res. 61:4744-4749(2001)。
【００９１】
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体は、ドメインＩＩ内の残基に結合し（且つ場合によってはＨＥＲ２の細胞外ドメインのうち、ドメインＩ及びＩＩＩのような他のドメイン内の残基にも結合し）、少なくとも有る程度は、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、又はＨＥＲ２−ＨＥＲ４へテロ二量体の形成を立体的に妨げることができる。Franklinら Cancer Cell 5:317-328 (2004)によってＨＥＲ２−ペルツズマブ結晶構造が特徴付けられており、これは、ＲＣＳＢタンパク質データバンクに寄託されて（ＩＤコードＩＳ７８）、ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する例示的抗体を例証している。
【００９２】
ＨＥＲ２の「ドメインＩＩに結合する」抗体は、ドメインＩＩ内の残基と、場合によってはドメインＩ及びＩＩＩのような、ＨＥＲ２の他のドメイン内の残基とに結合する。
【００９３】
「ＨＥＲ陽性癌」は、細胞表面に存在するＨＥＲタンパク質を有する細胞を含む癌である。
【００９４】
「エピトープ２Ｃ４」は抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するか否かを評価するために、従来技術に既知の方法を用いてエピトープマッピングを行うことができる、及び／又はＨＥＲ２のいずれのドメインに抗体が結合するかを見るために、抗体−ＨＥＲ２構造を系休することができる（Franklinら Cancer Cell 5:317-328 (2004)）。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインII由来の残基を有する。２Ｃ４及びペルツズマブは、ドメインI、II及びIIIの結合部においてＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklin 等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
【００９５】
「エピトープ４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５(ATCC CRL 10463)及びトラスツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープは、ＨＥＲ２の膜貫通領域に近接しており、且つＨＥＲ２のドメインIV内にある。４Ｄ５エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載のような、通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープに結合するか否かを評価するために、エピトープマッピングを行うことができる(例えば、図１の、約残基５２９から約残基６２５までを含む領域における任意の一又は複数の残基)。
【００９６】
「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は、７Ｃ２及び／又は７Ｆ３抗体(それぞれATCCに寄託、下記参照)が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインI内のＮ末端領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載のような、通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＨＥＲ２の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合するか否かを確認するために、エピトープマッピングを行うことができる(例えば、図１のＨＥＲ２の約残基２２から約残基５３までの領域における任意の一又は複数の残基)。
【００９７】
「生体試料」(「試料」又は「組織ないし細胞試料」と互換可能)は、個体から入手した様々なタイプの試料を包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに用いられうる。この定義には、血液及び生体起源の他の液体試料、生検標本や組織培養物やそれらに由来する細胞などの固形組織試料、及びこれらのプロジェニーが包含される。また、この定義には、入手後何らかの方法、例えば試薬で処理された試料、可溶化された試料、又はタンパク質やポリヌクレオチドなどの特定の成分について濃縮された試料、又は切片化のために半流動性基質ないしは固形基質に包埋することによって操作された試料が含まれる。「生体試料」なる用語は、臨床試料を包含し、培養物中の細胞、細胞上清物、細胞溶解物、血清、血漿、体液、及び組織試料も含む。生体試料の供給源は、新鮮な、凍結された及び／又は保存されていた臓器や組織試料、又は生検、又は吸引液から得られた固形組織；血液又は何らかの血液成分；大脳脊髄液、羊水、腹水又は間質液などの体液；被検体の妊娠期又は発生期の任意の時期の細胞であってよい。いくつかの実施態様では、生体試料は、原発性腫瘍又は転移性腫瘍から採取されたものである。生体試料は、防腐剤、抗凝血物質、バッファ、固定液、栄養分、抗生物質など天然の組織にはもともと混在していない化合物を含んでもよい。
【００９８】
本明細書において使用され、例えばレセプターシグナル伝達活性に適用される「リガンド非依存性」という用語は、リガンドの存在に依存しないシグナル伝達活性を指す。リガンド非依存性キナーゼ活性を有するレセプターは、リガンドがそのようなレセプターに結合してキナーゼ活性を更に活性化することを必ずしも妨げない。
【００９９】
本明細書において使用され、例えばリセプターキナーゼ活性に適用される「恒常的」という用語は、リガンド又はその他の活性化分子の存在に依存しないレセプターの継続的なシグナル伝達活性を指す。例えば、多形神経膠芽腫に広く見られるＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）では、その細胞外ドメインの大部分が削除されている。リガンドは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合できないが、活性であり続け、異常な増殖及び生存に関連する。レセプターの性質に応じて、活性の全てが継続するか、又は他の分子（例えばリガンド）の結合によってレセプターの活性は更に活性化される。レセプターの活性化に繋がる細胞事象は、当業者には周知である。例えば、活性化は、二量体形成、三量体形成といった、高次のレセプター複合体へのオリゴマー形成を含みうる。複合体は、単一種のタンパク質、即ちホモマー複合体を含みうる。或いは、複合体は、少なくとも二つの異なるタンパク質種、即ちヘテロマー複合体を含みうる。複合体形成は、例えば、細胞表面上におけるレセプターの正常な又は異常な形態の発現により引き起こされうる。複合体形成は、レセプターにおける一又は複数の特異的な変異によっても引き起こされることがある。
【０１００】
「遺伝子増幅」なる語句は、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞株において形成されるプロセスを意味する。複製された領域(増幅されたＤＮＡのストレッチ)は、しばしば「アンプリコン」と称される。通常は、生成されるメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の量、即ち遺伝子発現レベルも、発現された特定遺伝子の作製されたコピー数に比例して増加する。
【０１０１】
タンパク質の「発現」とは、遺伝子にコードされた情報のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転換と、それに続くタンパク質への転換とを指す。
【０１０２】
本明細書では、対象のタンパク質（例えばＨＥＲレセプター又はＨＥＲリガンド）を「発現する」試料又は細胞は、そのようなタンパク質をコードするｍＲＮＡ、又はその断片を含むタンパク質が、試料又は細胞中に存在することが確認されているものである。
【０１０３】
「チロシンキナーゼ阻害薬」は、ｃ−ｍｅｔレセプターなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を有る程度阻害する分子である。
【０１０４】
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの発現、増幅、又は活性化を示す」癌又は生体試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲを発現（過剰発現を含む）する、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲ遺伝子を増幅している、及び／又はｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの活性化又はリン酸化を示すものである。
【０１０５】
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの発現、増幅、又は活性化を示さない」癌又は生体試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲを発現（過剰発現を含む）しない、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲ遺伝子を増幅していない、及び／又はｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの活性化又はリン酸化を示さないものである。
【０１０６】
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲ活性化を示す」癌又は生体試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は、直接的に（例えば、ＨＥＲによるｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲのリン酸化を測定することにより）、或いは間接的に、確認することができる。
【０１０７】
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲ活性化を示さない」癌又は生体試料は、診断試験において、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの活性化又はリン酸化を示さないものである。このような活性化は、直接的に（例えば、ＥＬＩＳＡによりｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲのリン酸化を測定することにより）、或いは間接的に、確認することができる。
【０１０８】
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの過剰発現又は増幅」を有する癌細胞は、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲタンパク質又は遺伝子のレベルが、同じ組織種類の非癌細胞より有意に高いものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅、又は転写又は翻訳の増加により生じうる。ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの過剰発現又は増幅は、診断又は予後アッセイにおいて、細胞の表面上に存在するｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲタンパク質のレベルの上昇を評価することによって確認することができる（例えば、免疫組織化学アッセイ;ＩＨＣにより）。あるいは、又は付加的に、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション；（FISH；1998年10月公開の国際公開９８／４５４７９参照）、サザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）により、細胞のｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲコード化核酸のレベルを測定してもよい。上記のアッセイとは別に、種々のインビボアッセイは、熟練技術者に入手可能である。例えば、患者の体内にある細胞を、例えば、放射活性アイソトープのような検出可能な標識で場合によって標識した抗体に曝してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば、放射活性の外部スキャンニングによって、又は以前に抗体へ曝した患者から取り出した生検を分析することによって、評価することができる。
【０１０９】
「ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲを過剰発現しない」癌細胞は、同じ組織種類の非癌性細胞と比較したとき、正常レベルを上回るｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲタンパク質又は遺伝子を有さないものである。
【０１１０】
本明細書で使用される「変異」とは、特定のタンパク質又は核酸（遺伝子、ＲＮＡ）のアミノ酸配列又は核酸配列が、それぞれ野生型のタンパク質又は核酸とは異なることを意味する。変異したタンパク質又は核酸は、遺伝子の、一方の対立遺伝子（ヘテロ接合性）又は両方の対立遺伝子（ホモ接合性）に発現されるか、又はそのような対立遺伝子に見られ、体細胞性又は生殖系列でありうる。本発明では、変異は通常体細胞性である。変異には、挿入、削除、及び点変異（単一のヌクレオチド／アミノ酸多形を含む）のような配列再構成が含まれる。
【０１１１】
タンパク質の「発現」は、遺伝子にコードされた情報のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転換と、それに続くタンパク質への転換とを指す。
【０１１２】
ここでは、対象のタンパク質（例えばＨＥＲレセプター又はＨＥＲリガンド）を「発現する」試料又は細胞は、そのようなタンパク質をコードするｍＲＮＡ、又はその断片を含むタンパク質が、試料又は細胞に存在することが確認されているものである。
【０１１３】
「阻害する」とは、基準より活性、機能、及び／又は量を減少させる又は低減させることである。
【０１１４】
「イムノコンジュゲート」（「抗体−薬剤コンジュゲート」、又は「ＡＤＣ」と互換可能）は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害薬、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物を起源とする、酵素的に活性の毒素又はその断片）、或いは放射性同位元素（例えばラジオコンジュゲート）といった一又は複数の細胞障害剤を意味する。
【０１１５】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」なる用語は、概して、Ｃ末端ポリペプチド配列がインタクト抗体のパパイン消化によって取得されうる免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含んでなる二量体複合体を指す。Ｆｃ領域は、天然Ｆｃ配列又は変異形Ｆｃ配列を含むことができる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変化しうるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ配列はおよそＣｙｓ２２６の位置又はおよそＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からＦｃ配列のカルボキシル末端まで伸びると定義される。免疫グロブリンのＦｃ配列は、通常、二つの定常ドメイン、即ちＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の精製中に又は抗体をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって、取り除かれてもよい。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体を含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体、又はＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体との混合物を含みうる。
【０１１６】
ここでの「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃ領域を形成するポリペプチドの一つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の好適な免疫グロブリンから得ることができる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、野生型のヒンジ配列の一部又はすべてを（一般的にはそのＮ末端に）含有してなる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、機能的ヒンジ配列又は野生型ヒンジ配列を含有していない。
【０１１７】
ここで用いる「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」及びその変形例は、例えば、Janeway等, Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (第４版, 1999); Bloom等, Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys等, J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202に示される、当該分野に既知の意味を含む。
【０１１８】
本明細書及び請求の範囲を通じて、免疫グロブリン重鎖内の残基の番号付けは、Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載のようなEU指標によるものであり、この文献は、ここで明示したことにより本明細書に包含される。「Kabatに記載のEU指標」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基の番号付けを指す。
【０１１９】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び一価の抗体、多価抗体、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を含む。
【０１２０】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部のみを含有するものであり、この部分は、インタクト抗体中に存在する場合にその部分に通常伴う機能の少なくとも一、好ましくはほとんど又はすべてを保持する。一実施態様では、抗体断片は、インタクト抗体の抗原結合部位を含有するため、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含有するものは、完全抗体に存在するＦｃ領域が通常関連する生物学的機能の少なくとも一つ、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を保持する。一実施態様では、抗体断片は、インタクト抗体と実質的に同じインビボ半減期を有する一価の抗体である。例えばそのような抗体断片は、該断片にインビボ安定性を供与しうるＦｃ配列に結合した抗原結合アーム上に含みうる。一実施態様では、本発明の抗体は、国際公開第２００５／０６３８１６に記載の一アーム形抗体である。一実施態様では、一アーム形抗体は、「ノブ(knob)」及び「ホール(hole)」を構成するFc突然変異を含む。例えば、ホール(hole)突然変異は、Ｆｃポリペプチド内のＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖの一又は複数でありえ、腔(cavity)突然変異はＴ３６６Ｗでありうる。
【０１２１】
「ブロッキング」抗体及び抗体「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原の生物機能を抑制又は低減するものである。好ましいブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に又は完全に抑制する。
【０１２２】
特に示さない限り、「多価抗体」なる表現は、本明細書全体を通して、３つ以上の抗原結合部位を含んでなる抗体を示すために用いられる。多価抗体は、３つ以上の抗原結合部位を持つように遺伝子操作するのが好ましく、一般に、天然配列のＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
【０１２３】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識及び結合部位を含む抗体断片である。この領域は、堅く結合した重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つの二量体から成り、その結合は自然界では例えばｓｃＦｖにおけるように共有結合である。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を画定するのはこの構成である。この６つのＣＤＲ又はそのサブセットは、共同して抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含んでいないＦｖの半分)でさえ、通常は結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
【０１２４】
本明細書で使われるように、「抗体可変ドメイン」は相補性決定領域(ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３)ならびにフレームワーク領域(ＦＲ)のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖及び重鎖の部分を指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。本発明で使用される方法によると、ＣＤＲとＦＲに割り当てられるアミノ酸位置はカバットに従って規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987及び1991))。抗体又は抗原結合断片のアミノ酸のナンバリングも、カバットのそれに準じる。
【０１２５】
本明細書で使われるように、用語「相補性決定領域(ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３)は、抗原結合のために存在している必要がある抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、一般的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と同定される３つのＣＤＲ領域を持つ。各相補性決定領域はカバットが記載しているような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２４〜３４(Ｌ１)、５０〜５６(Ｌ２)、及び８９〜９７(Ｌ３)ならびに重鎖可変ドメインの３１〜３５(Ｈ１)、５０〜６５(Ｈ２)及び９５〜１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))、及び／又は「超可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２６〜３２(Ｌ１)、５０〜５２(Ｌ２)及び９１〜９６(Ｌ３)ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２(Ｈ１)，５３〜５５(Ｈ２)及び９６〜１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk, J.Mol.Biol.196:901-917頁(1987))を含んでもよい。いくつかの場合には、相補性決定領域はカバットの記載により定義されているＣＤＲ領域及び超可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１は、アミノ酸２６〜３５を含む。
【０１２６】
「フレームワーク領域」(以下ＦＲと称す)は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、一般的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と同定される４つのＦＲを持つ。ＣＤＲがカバットの定義に従うならば、軽鎖ＦＲ残基は残基約１〜２３(ＬＣＦＲ１)、３５〜４９(ＬＣＦＲ２)、５７〜８８(ＬＣＦＲ３)及び９８〜１０７(ＬＣＦＲ４)に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜３０(ＨＣＦＲ１)、３６〜４９(ＨＣＦＲ２)、６６〜９４(ＨＣＦＲ３)及び１０３〜１１３(ＨＣＦＲ４)に位置する。ＣＤＲが超可変ループからのアミノ酸残基を含むならば、軽鎖ＦＲ残基は軽鎖の残基約１〜２５(ＬＣＦＲ１)、３３〜４９(ＬＣＦＲ２)、５３〜９０(ＬＣＦＲ３)及び９７〜１０７(ＬＣＦＲ４)に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜２５(ＨＣＦＲ１)、３３〜５２(ＨＣＦＲ２)、５６〜９５(ＨＣＦＲ３)及び１０２〜１１３(ＨＣＦＲ４)に位置する。いくつかの場合には、ＣＤＲがカバットの定義によるＣＤＲと超可変ループのそれの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに応じて調節されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５を含むとき、重鎖ＦＲ１残基は位置１〜２５にあり、ＦＲ２残基は位置３６〜４９にある。
【０１２７】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと重鎖の可変ドメイン及び第１の定常ドメイン(ＣＨ１)を含む。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は一対のＦａｂ断片を含み、通常これらはその間にあるヒンジシステインによってそのカルボキシ末端の近くで共有結合により連結される。抗体断片の他の化学的結合も当技術分野で公知である。
【０１２８】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーはｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖのレビューに関しては、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁(1994)を参照。
【０１２９】
「ダイアボディ(diabody)」なる用語は、抗原結合部位を２つ備える小さな抗体断片を指し、この抗体断片は同じポリペプチド鎖(ＶＨ及びＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に連結した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む。同じ鎖の上の２つのドメインの間で対合させるにはあまりに短いリンカーを用いて、このドメインを他の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位をつくる。ダイアボディについては、例えば欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger他, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448(1993)でさらに詳しく記載されている。
【０１３０】
「線状抗体」なる表現はZapata等, Protein Eng., 8(10):1057-1062頁(1995)に記載されている抗体を指す。つまり、これらの抗体は相補性の軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント(ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１)を含む。線状抗体は二重特異性又は単一特異性でありうる。
【０１３１】
「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1992)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、WO1998/24893; WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；及び同第5,661,016号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。
【０１３２】
ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。キメラ抗体は、抗体の抗原結合領域が、例えば、対象の抗原を有するマカクザルを免疫化することにより生成される抗体に由来するＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体を含む。
【０１３３】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種の高頻度可変領域からの残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部をまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【０１３４】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、当該分野で知られている様々な技術を使用することによって生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ここでファージライブラリーがヒト抗体を発現する(Vaughan等, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996):Sheets等, PNAS, (USA)95:6157-6162(1998)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウス中に導入することにより産生することができる。免疫刺激時に、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison等, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して抗体を生産するヒトＢリンパ球の不死化によって調製されてもよい(そのようなＢリンパ球は、個体から回収されてもよいし、インビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；及び米国特許第５７５０３７３号を参照のこと。
【０１３５】
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の改変を有する抗体であって、そのような改変を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が向上している。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks等は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier等、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【０１３６】
設計された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、同じ抗原に結合する他の抗体からそれ自体を区別する抗体の生物学的特徴のうちの一又は複数を有するものである。
【０１３７】
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane (1988)に記載されているような常套的クロスブロッキングアッセイを実行することができる。
【０１３８】
本発明のアミノ酸配列を含む抗体又はポリペプチドの半減期を延ばすために、米国特許第５７３９２７７号等に記載されているように、抗体（特に抗体断片）に対してサルベージレセプター結合エピトープを付着させることができる。例えば、遺伝子操作された核酸分子により発現される融合タンパク質がサルベージレセプター結合エピトープと本発明のポリペプチド配列とを有するように、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸分子は、フレーム内で、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸にリンクすることができる。本明細書で使用される「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボでの血清半減期を延長するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す（例えば、Ghetie等、Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000), 表１）。Ｆｃ領域に置換を有する抗体と、血清半減期の延長は、国際公開第００／４２０７２号、同第０２／０６０９１９号、Shields等、J. Biool. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)）にも記載されている。別の実施態様では、血清半減期は、例えば、他のポリペプチド配列を付着させることによっても延ばすことができる。例えば、血清アルブミンが抗体又はポリペプチドに結合するように、本発明の方法に有用な抗体又はその他のポリペプチドを、ＦｃＲｎレセプターに結合する血清アルブミン又は血清アルブミンの一部、或いは血清アルブミン結合エピトープに付着させることができる。そのようなポリペプチド配列は、国際公開第０１／４５７４６号に開示されている。好ましい一実施態様では、付着させる血清アルブミンペプチドは、ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含んでなる。別の実施態様では、Ｆａｂの半減期をこのような方法により延長する。血清アルブミン結合ペプチド配列については、例えばDennis等, J. Biol. Chem. (2002)を参照することができる。
【０１３９】
「単離された」ポリペプチド又は「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定されて分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、ポリペプチド又は抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含む。好ましい実施態様では、ポリペプチド又は抗体は、(1)ローリー(Lowry)法により定量したポリペプチド又は抗体の９５重量％を上回るまで、好ましくは９９重量％を上回るまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(3)クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一性が得られるまで、精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチド又は単離された抗体には、組換え細胞内にインサイツのポリペプチド又は抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチド又は単離された抗体は、少なくとも一の精製工程により調製される。
【０１４０】
「断片」とは、基準の核酸又はポリペプチドの全長の、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれを上回る長さを含むポリペプチド又は核酸分子の一部分を意味する。一つの断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、又はそれより多くのヌクレオチド、或いは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、１９０、２００、又はそれより多くのアミノ酸を含みうる。
【０１４１】
「治療」は、治療的処置及び予防的又は防止的な処置を指す。治療を必要とするものには、既に良性、前癌性、又は非転移性の腫瘍を有するもの、並びに癌の発生又は再発を予防すべきものが含まれる。
【０１４２】
「治療的有効量」という用語は、哺乳動物の疾患又は疾病を治療又は予防するための薬剤の量を指す。癌の場合、治療的に有効量の薬剤は、癌細胞の数を減じ；原発腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍増殖をある程度まで阻害し；及び／又は疾病に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。既存の癌細胞の増殖を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、薬剤は、細胞分裂停止及び／又は細胞障害性であり得る。癌治療の場合、インビボでの有効性は、生存期間、細胞増殖停止時間（ＴＴＰ）、奏功率（ＲＲ）、奏功期間、及び／又は生活の質を評価することにより測定することができる。
【０１４３】
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に調節されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指す又は表わす。この定義には、良性及び悪性の癌が含まれる。「初期癌」又は「初期腫瘍」とは、侵襲性又は転移性でない癌を意味するか、或いはステージ０、Ｉ、又はＩＩの癌を意味する。癌の例には、限定するものではないが、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽腫及び網膜芽細胞腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫及び滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリン産生腫瘍、及び島細胞癌を含む）、中皮腫、シュワン腫（聴神経腫瘍を含む）、髄膜腫、腺癌、メラノーマ、及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌（例えば上皮の扁平細胞癌）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃(gastric、stomach)癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌（転移性乳癌を含む）、大腸癌、直腸癌、大腸直腸癌、子宮内膜ないし子宮細胞腫、唾液腺細胞腫、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞腫、食道細胞腫、肝細胞腫、肛門部の細胞腫、陰茎細胞腫、精巣癌、食道癌、胆道癌、並びに頭部及び頚部の癌が含まれる。
【０１４４】
「前癌性」は、一般に、癌に先行又は進行する状態又は増殖を指す。「前癌性」の増殖は、異常な細胞周期制御、増殖、又は分化を特徴とする細胞を有し、異常な細胞周期制御、増殖、又は分化はそのマーカーにより確認することができる。
【０１４５】
「異形成」とは、組織、器官、又は細胞のあらゆる異常増殖又は発達を意味する。好ましくは、異形成は高悪性度又は前癌性である。
【０１４６】
「転移」とは、癌が原発部位から身体の他の場所へ広がることを意味する。癌細胞は、原発腫瘍を離れてリンパ管及び血管に侵入し、血流により循環し、身体の他の部分の正常組織中の遠隔病巣内で増殖（転移）しうる。転移は、局所性又は遠隔でありうる。転移は、連続的プロセスであり、原発腫瘍を離れた腫瘍細胞に随伴性であり、血流によって移動し、遠隔部位で停止する。新規部位において、細胞は血液供給を確立し、成長して致命的な腫瘤を形成しうる。
【０１４７】
腫瘍細胞内部の刺激性及び抑制性の分子経路は共にこのような挙動を制御し、遠隔部位における腫瘍細胞と宿主細胞との間の相互作用も著しい。
【０１４８】
「非転移性」とは、良性である癌又は原発部位に留まっており、リンパ管又は血管に、或いは原発部位以外の組織中に浸潤していない癌を意味する。一般に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ、又はＩＩのいずれかの癌であり、場合によってはステージＩＩＩの癌である。
【０１４９】
「原発腫瘍」又は「原発癌」とは、最初の癌を意味し、患者の身体の別の組織、器官、又は位置にある転移性の病変を意味しない。
【０１５０】
「良性腫瘍」又は「良性癌」とは、最初の部位に局在性に留まり、遠隔部位に湿潤、浸潤、又は転移する能力を持たない腫瘍を意味する。
【０１５１】
「腫瘍組織量」とは、身体における癌細胞の数、腫瘍の大きさ、又は癌の量を意味する。腫瘍組織量（tumor burden）は腫瘍量（tumor load）とも呼ばれる。
【０１５２】
「腫瘍数」とは腫瘍の数を意味する。
【０１５３】
「対象」とは、限定しないが、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコを含む哺乳動物を意味する。好ましくは、対象はヒトである。
【０１５４】
「抗癌治療」は、癌の治療に有用な治療法を指す。抗癌治療剤の例には、限定しないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害薬、細胞障害剤、放射線治療に使用される薬剤、血管新生抑制剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、及び癌を治療するための他の薬剤、抗ＣＤ２０抗体、血小板から得られた増殖因子阻害薬（例えば、グリベックＴＭ（イマチニブメシル酸塩））、ＣＯＸ−２阻害薬（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、標的であるＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプター、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、及びその他の生理活性有機化学薬品などのうちの一又は複数に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）が含まれる。これらの組み合わせも本発明に含まれる。
【０１５５】
本明細書の目的のために「トラスツズマブ」、「ハーセプチン（登録商標）」、及び「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」は、それぞれ配列番号１３及び１４に含まれる軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含んでなる抗体を指す。
【０１５６】
本明細書では、「ペルツズマブ」及び「OMNITARGＴＭ」及び「ｒｈｕＭａｂ  ２Ｃ４」は、それぞれ配列番号３及び４に含まれる軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含んでなる抗体を指す。ペルツズマブは、インタクトな抗体であるとき、好ましくは、それぞれ配列番号１５及び１６に含まれる軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を含んでなる。
【０１５７】
ここで用いられる「細胞障害性剤」は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び／又は細胞破壊を起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６)、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片を意味する。
【０１５８】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、癌の治療に有用な化学的化合物が含まれる。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、KW-2189及びCBI-TM1を含む)； エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin)； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマ���シン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標)ドキセタキセル、(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；ミトキサントン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標)ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン(カンプトサル(Camptosar)、ＣＰＴ-１１)(５−ＦＵ及びリューコボリンとのイリノテカンの治療処方を含む)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；コンブレタスタチン(combretastatin)；リューコボリン(leucovorin)(ＬＶ)；オキサリプラチン(oxaliplatin)、オキサリプラチン治療処方(FOLFOX)を含む；ＰＫＣ−αのインヒビター、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ(例として、エルロチニブ(erlotinib)(ＴａｒｃｅｖａＴＭ))及び細胞増殖を減少させるＶＥＧＦ−Ａ、並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【０１５９】
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTON*トレミフェン(Fareston)；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ゾロゾール(vorozole)、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾール及びＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾール；；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ−ａｌｐｈａ、ラルフ及びＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ(登録商標)リボザイム)及びＨＥＲ２発現インヒビター；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン)などのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ(登録商標)ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)rmRH；ビノレルビン(Vinorelbine)及びエスペラミシン(Esperamicins)(米国特許第４６７５１８７号を参照)並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【０１６０】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【０１６１】
「放射線治療」とは、定方向γ線又はβ線を使用して細胞に十分な損傷を誘発することにより、細胞の正常に機能する能力を制限すること、又は細胞全体を破壊することを意味する。この治療の線量及び継続期間を決定する多数の方法が従来技術に既知である。一般的な治療は、一回の照射で行われ、典型的な線量範囲は一日当たり１０〜２００単位（Grays）である。
【０１６２】
治療薬
本発明は、併用療法においてｃ−ｍｅｔアンタゴニストとＨＥＲアンタゴニストとを使用することにより、腫瘍などの対象の病態を治療することを特徴とする。
【０１６３】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニスト
本発明の方法に有用なｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ−ｍｅｔに特異的に結合するポリペプチド、抗ｃ−ｍｅｔ抗体、ｃ−ｍｅｔ小分子、ｃ−ｍｅｔに特異的に結合するレセプター分子及び誘導体、並びに融合タンパク質を含む。ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、ｃ−ｍｅｔポリペプチドの拮抗性変異体、ＲＮＡアプタマー、並びにｃ−ｍｅｔ及びＨＧＦに対するペプチボディも含む。本発明の方法に有用なｃ−ｍｅｔアンタゴニストとして、更に、抗ＨＧＦ抗体、抗ＨＧＦポリペプチド、ｃ−ｍｅｔレセプター分子、及びＨＧＦに特異的に結合する誘導体が含まれる。これらの各々の例について後述する。
【０１６４】
本発明の方法において有用な抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、ｃ−ｍｅｔに対して十分に親和性且つ特異性に結合して、ｃ−ｍｅｔ活性を低減又は抑制するあらゆる抗体を含む。選択される抗体は、通常はｃ-ｍｅｔに対して十分に強力な結合親和性を有し、例えば、抗体は１００ｎＭ−１ｐＭのＫｄ値でヒトｃ−ｍｅｔに結合することができる。抗体の親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴法に基づくアッセイ（例えば、ＰＣＴ出願公開第２００５／０１２３５９号に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）；及び拮抗実験（例えばラジオイムノアッセイ）により決定することができる。好ましくは、本発明の抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、ｃ−ｍｅｔ／ＨＧＦ活性が関与する疾病又は状態を標的としてそれに干渉する治療薬として使用することができる。また、抗体に対して、例えば治療薬としての有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイを行うことができる。このようなアッセイは、従来技術に既知であり、標的抗原に依存しており、その使用目的は抗体である。
【０１６５】
抗ｃ−ｍｅｔ抗体は従来技術に既知である（例えば、Martens, Tら (2006) Clin Cancer Res 12(20 Pt 1):6144；米国特許第６４６８５２９号；国際公開第２００６／０１５３７１号；同第２００７／０６３８１６号；米国特許第７４０８０４３号；国際公開第２００９／００７４２７号；同第２００５／０１６３８２号；同第２００７／１２６７９９号を参照）。一実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、図１２に示すＣＤＲ１−ＨＣ、ＣＤＲ２−ＨＣ、及びＣＤＲ３−ＨＣ配列の一又は複数を含む重鎖可変ドメインを含んでなる（配列番号２９−３１）。幾つかの実施態様では、抗体は、図１２に示すＣＤＲ１−ＬＣ、ＣＤＲ２−ＬＣ、及びＣＤＲ３−ＬＣ配列の一又は複数を含む重鎖可変ドメインを含んでなる（配列番号１１、１２、２３）。幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインは、図１２に示すＦＲ１−ＨＣ、ＦＲ２−ＨＣ、及びＦＲ３−ＨＣ及びＦＲ４−ＨＣ配列の一又は複数を含む重鎖可変ドメインを含んでなる（配列番号２５−２８）。幾つかの実施態様では、軽鎖可変ドメインは、図１２に示すＦＲ１−ＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、及びＦＲ３−ＬＣ及びＦＲ４−ＬＣ配列の一又は複数を含む軽鎖可変ドメインを含んでなる（配列番号７−１０）。幾つかの実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、一価であり、Ｆｃ領域を含んでなる。幾つかの実施態様では、抗体は、図１２に示すＦｃ配列を含んでなる（配列番号３３）。
【０１６６】
幾つかの実施態様では、抗体は、一価であってＦｃ領域を含んでなり、このＦｃ領域は第１及び第２のポリペプチドを含み、この第１ポリペプチドは図１２に示すＦｃ配列を含み（配列番号３３）、第２ポリペプチドは図１３に示すＦｃ配列を含む（配列番号３４）。
【０１６７】
一実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、（ａ）配列：QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS（配列番号３５）、図１２に示すＣＨ１配列、及び図１２に示すＦｃ配列を有する重鎖可変ドメインを含む第１ポリペプチドと、（ｂ）配列：DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK（配列番号３６）、及び図１２に示すＣＬ１配列を有する軽鎖可変ドメインを含む第２のポリペプチドと、（ｃ）図１３に示すＦｃ配列を含む第３ポリペプチドとを含んでなる。
【０１６８】
他の実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション受入番号ＡＴＣＣ  ＨＢ−１１８９４（ハイブリドーマ１Ａ３．３．１３）又はＨＢ−１１８９５（ハイブリドーマ５Ｄ５．１１．６）の下に寄託されたハイブリドーマ細胞株により生成されるモノクローナル抗体である。他の実施態様では、抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション受入番号ＡＴＣＣ  ＨＢ−１１８９４（ハイブリドーマ１Ａ３．３．１３）又はＨＢ−１１８９５（ハイブリドーマ５Ｄ５．１１．６）の下に寄託されたハイブリドーマ細胞株により生成されるモノクローナル抗体のＣＤＲ配列のうちの一又は複数を含んでなる。
【０１６９】
他の実施態様では、本発明のｃ−ｍｅｔ抗体は、ｃ−ｍｅｔ  Ｓｅｍａドメインの少なくとも一部、又はその変異体に特異的に結合する。一実施例では、本発明のアンタゴニスト抗体は、LDAQT（配列番号３８）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基２６９−２７３）、LTEKRKKRS（配列番号３９）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３００−３０８）、KPDSAEPM（配列番号４０）(例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３５０−３５７)、及びNVRCLQHF（配列番号４１）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３８１−３８８）からなる群より選択された配列の少なくとも一つに特異的に結合する。一実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は、LDAQT（配列番号３８）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基２６９−２７３）、LTEKRKKRS（配列番号３９）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３００−３０８）、KPDSAEPM（配列番号４０）(例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３５０−３５７)、及びNVRCLQHF（配列番号４１）（例えば、ｃ−ｍｅｔの残基３８１−３８８）からなる群より選択された配列の少なくとも一つの一部又は全部により形成された立体構造エピトープに対して特異的に結合する。一実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は、LDAQT（配列番号３８）、LTEKRKKRS（配列番号３９）、KPDSAEPM（配列番号４０）、及び／又はNVRCLQHF（配列番号４１）と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列に対して特異的に結合する。
【０１７０】
抗ＨＧＦ抗体は、従来技術に周知である。例えば、,ら  (2006) 12(4):1292-8；国際公開第２００７／１１５０４９号、同第２００９／００２５２１号；同第２００７／１４３０９８号；同第２００７／０１７１０７号；同第２００５／０１７１０７号；Ｌ２Ｇ７；ＡＭＧ−１０２を参照されたい。
【０１７１】
ｃ−ｍｅｔレセプター分子又はＨＧＦに特異的に結合するその断片を本発明の方法において使用して、例えば、ＨＧＦに結合させて隔絶することにより、シグナル伝達を防止することができる。好ましくは、ｃ−ｍｅｔレセプター分子、又はそのＨＧＦ結合断片は、可溶形態である。幾つかの実施態様では、レセプターの可溶形態は、ＨＧＦに結合してｃ−ｍｅｔタンパク質の生物学的活性に対する阻害効果を発揮することにより、標的細胞の表面上に存在するその天然レセプターにＨＧＦが結合することを防止することができる。更にはｃ−ｍｅｔレセプター融合タンパク質が含まれる。その例について後述する。
【０１７２】
本発明の可溶性ｃ−ｍｅｔレセプタータンパク質又はキメラｃ−ｍｅｔタンパク質には、膜貫通ドメインを介して細胞の表面に固定されていないｃ−ｍｅｔレセプタータンパク質が含まれる。したがって、ｃ−ｍｅｔレセプターの可溶形態は、キメラレセプタータンパク質を含めて、ＨＧＦに結合してＨＧＦを不活性化できる一方で、膜貫通ドメインを含まず、したがって通常は分子が発現されている細胞の細胞膜に結合しない。例えば、Kong-Beltran, Mら Cancer Cell (2004) 6(1): 75-84を参照されたい。
【０１７３】
ｃ−ｍｅｔに特異的に結合してｃ−ｍｅｔの活性を遮断又は低減することにより、ｃ−ｍｅｔのシグナル伝達を防止するＨＧＦ分子又はその断片は、本発明の方法に使用可能である。
【０１７４】
アプタマーは、ＨＧＦポリペプチドのような標的分子に特異的に結合する三次構造を形成する核酸分子である。アプタマーの生成及び治療的使用は、従来技術において確立されている。例えば、米国特許第５４７５０９６号を参照されたい。ＨＧＦアプタマーは、ペグ化され且つ修飾されたオリゴヌクレオチドであり、細胞外ＨＧＦへの結合を可能にする三次元立体構造を取っている。アプタマーに関する更なる情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見ることができる。
【０１７５】
ペプチボディは、免疫グロブリン分子の断片又は一部をコードするアミノ酸配列にリンクするペプチド配列である。ポリペプチドは、ファージディスプレイ技術を含むがこれに限定されない特異的な結合のための任意の方法により選択された、無作為化配列から得ることができる。好ましい一実施態様では、選択されたポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ部分をコードするアミノ酸配列にリンクすることができる。ＨＧＦ又はｃ−ｍｅｔに特異的に結合してこれをアンタゴナイズするペプチボディも、本発明の方法に有用である。
【０１７６】
ｃ−ｍｅｔアンタゴニストは、米国特許第５７９２７８３号；同第５８３４５０４号；同第５８８０１４１号；同第６２９７２３８号；同第６５９９９０２号；同第６７９０８５２号；米国特許出願公開２００３／０１２５３７０号；同第２００４／０２４２６０３号；同第２００４／０１９８７５０号；同第２００４／０１１０７５８号；同第２００５／０００９８４５号；同第２００５／０００９８４０号；同第２００５／０２４５５４７号；同第２００５／０１４８５７４号；同第S２００５／０１０１６５０号；同第２００５／００７５３４０号；同第２００６／０００９４５３号；同第２００６／０００９４９３号；国際公開第９８／００７６９５号；同第２００３／０００６６０号；同第２００３／０８７０２６号；同第２００３／０９７６４１号；同第２００４／０７６４１２号；同第２００５／００４８０８号；同第２００５／１２１１２５号；同第２００５／０３０１４０号；同第２００５／０７０８９１号；同第２００５／０８０３９３号；同第２００６／０１４３２５号；同第２００６／０２１８８６号；同第２００６／０２１８８１号；同第２００７／１０３３０８）号に記載の化合物のような小分子を含む。PHA-665752は、小分子であり、ｃ−Ｍｅｔの触媒活性と、様々な腫瘍細胞の細胞増殖、細胞運動性、侵襲、及び形態との、ＡＴＰ−競合性の活性部位阻害薬である（Maら (2005) Clin. Cancer Res. 11:2312-2319; Christensenら (2003) Cancer Res. 63:7345-7355)。
【０１７７】
ＨＥＲアンタゴニスト
本発明の方法に有用な抗ＨＥＲ抗体は、十分に親和性且つ特異性にＨＥＲに結合して、ＨＥＲ活性を低減又は抑制することができるあらゆる抗体を含む。選択される抗体は、通常、ＨＥＲに対して十分に強い結合親和性を有し、例えば、抗体は、１００ｎＭ−１ｐＭのＫｄ値でヒトＨＥＲに結合することができる。抗体の親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴法に基づくアッセイ（例えば、ＰＣＴ出願公開第２００５／０１２３５９号に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）；及び拮抗実験（例えばラジオイムノアッセイ）により決定することができる。好ましくは、本発明の抗ＨＥＲ抗体は、ＨＥＲ／Ｈｅｒリガンド活性が関与する疾病又は状態を標的としてそれに干渉する治療薬として使用することができる。また、抗体に対して、例えば治療薬としての有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイを行うことができる。このようなアッセイは、従来技術に既知であり、標的抗原に依存しており、その使用目的は抗体である。
【０１７８】
例示的なＨＥＲチロシンキナーゼ阻害薬は、例えば、Takedaから市販されているTAK165；CP-724,714；ＥｒｂＢ２レセプターチロシンキナーゼの内服用選択的阻害薬（Pfizer及びOSI）；PKI-166（Novartisから市販されている）；カネルチニブのようなｐａｎ−ＨＥＲ阻害薬（CI-1033；Pharmacia）といった小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害薬を含む。
【０１７９】
米国特許第６９４９２４５号は、ＨＥＲ２に結合してＨＥＲレセプターのリガンド活性を遮断する例示的ヒト化ＨＥＲ２抗体の製造について記載している。本明細書において特に注目するヒト化抗体は、基本的に、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４（又はそのＦａｂ断片）と同じくらい効率的に、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α及び／又はＨＲＧ媒介性のＭＡＰＫ活性を遮断し、及び／又は、基本的に、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４（又はそのＦａｂ断片）と同じくらい効率的に、ＨＥＲ２に結合する。本明細書のヒト化抗体は、例えば、ヒト化変性重鎖ドメインに取り込まれた非ヒト高頻度可変性領域残基を含み、更には、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に規定された可変ドメイン番号付けシステムを利用して６９Ｈ、７１Ｈ、及び７３Ｈからなる群より選択された位置にフレームワーク領域（ＦＲ）置換を含むことができる。一実施態様では、ヒト化抗体は、６９Ｈ、７１Ｈ、及び７３Ｈのうちの二つ又は全部にＦＲ置換を含む。
【０１８０】
本明細書で注目する例示的ヒト化抗体は、可変重鎖ドメイン相補性決定残基GFTFTDYTMXを含み、ここでＸは好ましくはＤ又はＳ（配列番号４２）、DVNPNSGGSIYNQRFKG（配列番号４３）；及び／又はNLGPSFYFDY（配列番号４４）であり、場合によってはそれらＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含み、例えば、このような修飾は基本的に抗体の親和性を維持又は改善するものである。例えば、対象の抗体変異体は、上記可変重鎖ＣＤＲ配列に約１〜約７又は約５のアミノ酸置換を有しうる。このような抗体変異体は、例えば上記のような親和性成熟により調製することができる。例示的なヒト化抗体は、図５Ｂに示す可変重鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
【０１８１】
ヒト化抗体は、例えば、前パラグラフに記載の可変重鎖ドメインＣＤＲ残基に加えて、可変軽鎖ドメイン相補性決定残基、即ちKASQDVSIGVA（配列番号４５）、SASYX1X2X3（Ｘ１は好ましくはＲ又はＬであり、Ｘ-は好ましくはＹ又はＥであり、Ｘ３は好ましくはＴ又はＳ）（配列番号４６）、及び／又はQQYYIYPYT（配列番号４７）を含むことができる。このようなヒト化抗体は、場合によっては、上記ＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含み、例えば、このような修飾は、基本的に抗体の親和性を維持又は改善するものである。例えば、対象の抗体変異体は、約１〜約７又は約５のアミノ酸置換を上記可変軽鎖ＣＤＲ配列に有することができる。このような抗体変異体は、例えば上記のような親和性成熟により調製することができる。例示的ヒト化抗体は、図５Ａに示す可変軽鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
【０１８２】
本出願は、ＨＥＲ２に結合してＨＥＲレセプターのリガンド活性を遮断する親和性成熟抗体も考慮する。親抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり、例えば、それぞれ図５Ａ及び５Ｂに示す可変軽鎖配列及び／又は可変重鎖配列を含む（即ち、ペルツズマブのＶＬ及び／又はＶＨを含む）ものでありうる。親和性成熟抗体は、好ましくは、マウス２Ｃ４又はペルツズマブを上回る親和性で（例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＥＬＩＳＡを用いて評価した場合、約２又は約４倍〜約１００倍又は約１０００倍の親和性で）ＨＥＲ２レセプターに結合する。置換される例示的可変重鎖ＣＤＲ残基には、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３４、Ｈ３５、Ｈ６４、Ｈ９６、Ｈ９９又は２つ以上（これらの残基の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つ）の組み合わせが含まれる。改変される可変軽鎖ＣＤＲ残基には、Ｌ２８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６、Ｌ９７又は２つ以上（これらの残基の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つ）の組み合わせが含まれる。
【０１８３】
ヒト化抗体又は親和性成熟抗体の様々な形態が考慮される。例えば、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、随意で一又は複数の細胞障害性剤と抱合して免疫複合体を産生する、Ｆａｂのような抗体断片でありうる。或いは、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、インタクトなＩｇＧ１抗体のようなインタクトな抗体でありうる。例示的な一のインタクトなＩｇＧ１抗体は、図６Ａに示す軽鎖配列と図６Ｂに示す重鎖配列とを含む。
【０１８４】
ヒトＨＥＲ２抗体は、1998年6月30日発行の米国特許第５７７２９９７号と、1997年1月3日公開の国際公開第９７／００２７１号とに記載されている。
【０１８５】
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＨＥＲタンパク質とｃ−ｍｅｔとに結合することができる。別の実施例では、例示的な二重特異性抗体は、ＨＥＲ２タンパク質の二つの異なるエピトープに結合することができる。他のこのような抗体は、ＨＥＲ２結合部位と、ＨＥＲ３に対する結合部位とを結合することができる。或いは、ＨＥＲ２のアームを、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２又はＣＤ３）のような白血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のような、ＩｇＧのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）に結合させることにより、細胞防護の機序をＨＥＲ２発現細胞に集中させることができる。二重特異性抗体は、ＨＥＲ２を発現する細胞に細胞障害性剤を局在化させるために使用することもできる。このような抗体は、ＨＥＲ２結合アームと、細胞障害性剤（例えば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート又は放射性同位元素ハプテン）とに結合するアームとを有している。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１８６】
国際公開第９６／１６６７３には、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５８３７２３４号には、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩ抗体ＩＤＭ１（Osidem）が開示されている。二重特異性ＨＥＲ２／Ｆｃα抗体は、国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体について教示している。ＭＤＸ−２１０は二重特異性ＨＥＲ２−ＦｃγＲＩＩＩ  Ａｂである。
【０１８７】
併用療法
本発明は、特定の治療計画の一部としてｃ−ｍｅｔアンタゴニストとＨＥＲアンタゴニストとを併用することにより、これらの治療薬の活性の組み合わせによる薬効を提供することを特徴とする。このような併用の薬効には、限定されないが、治療薬の併用による薬物動態学的又は薬力学的同時作用が含まれる。本発明は、様々な段階における様々な種類の癌の治療に特に有用である。
【０１８８】
癌という用語は、増殖異常の集合を包含し、限定しないが、前癌性の増殖、良性腫瘍、及び悪性腫瘍を含んでいる。良性腫瘍は、原発部位に局在したままであり、遠隔部位への浸潤能、侵入能、又は転移能を有していない。悪性腫瘍は周辺の他の組織に侵入してそれらの組織を損傷する。悪性腫瘍は、通常は血流を介して又はリンパ節が位置するリンパ系を介して、原発部位を離れて身体の他の部分へ広がる能力を獲得することができる。原発腫瘍は、腫瘍が生じた組織の種類により分類され、転移性腫瘍は、癌細胞が由来する組織によって分類される。時間の経過に伴い、悪性腫瘍の細胞は異常性となって、正常細胞とは外観を異にする。このような癌細胞の外観の変化は腫瘍悪性度と呼ばれ、癌細胞は、高分化型（低悪性度）、中程度に分化型、低分化型、又は未分化型（高悪性度）と表わされる。高分化型細胞は、極めて正常な外観を有し、それらの細胞の起源である正常細胞に類似している。未分化細胞は、異常性が高いためにもはやそれら細胞の起源を決定することができない細胞である。
【０１８９】
癌ステージ分類システムは、解剖学的に癌がどの程度まで広がっているかを表わして、同じステージグループ内において、患者に対して同じような予後及び治療を付与しようとするものである。幾つかの試験を実行することにより、癌のステージ分類を補助することができ、そのような試験には、組織診と、胸部レントゲン検査、マンモグラフィ、骨スキャン、ＣＴスキャン、及びＭＲＩスキャンのような特定の画像化とが含まれる。患者の全体的な健康状態を評価し、癌が特定の器官に広がっているかどうかを検出するために、血液検査及び臨床評価も使用される。
【０１９０】
癌のステージ分類を行うために、アメリカ癌合同委員会（the American Joint Committee on Cancer）は、まず、癌、特に固形腫瘍を、ＴＮＭ分類システムを用いて文字により分類している。これは、癌を、文字Ｔ（腫瘍の大きさ）、Ｎ（触知可能なリンパ節）、及び／又はＭ（転移）で表わすものである。Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、及びＴ４は、原発病巣が大きくなっていることを表わし、Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３は、徐々にリンパ節の合併症が進行していることを表わし、Ｍ０及びＭ１は遠隔転移の有無を示している。
【０１９１】
第２のステージ分類法は、全病期分類（Overall Stage Grouping）又はローマ数字式分類（Roman Numeral Staging）として知られ、原発病巣の大きさとリンパ節への伝播と遠隔転移の存在を組み合わせて、癌を段階０〜ＩＶに分類するものである。このシステムでは、症例は、ローマ数字Ｉ〜ＩＶにより示される４つのステージにグループ分けされるか、又は「再発性」と分類される。乳癌の腺管上皮内癌又は非浸潤性小葉癌といった幾つかの症例の場合、ステージ０は「上皮内」又は「Tis」と呼ばれる。高悪性度の腺腫もステージ０に分類される。概して、ステージＩの癌は小さく局在化した癌であり、通常治癒可能であるが、ステージＩＶは、通常、手術不可能な癌又は転移性の癌を表わす。ステージＩＩ及びＩＩＩの癌は、通常、局所的に進行しており、及び／又は局所的リンパ節の関与を示している。一般に、ステージの番号が大きい程、腫瘍の大きさ、及び／又は近くのリンパ節及び／又は原発腫瘍に隣接する器官への伝播を含め、疾病が広範囲に亘ることを示す。このようなステージは正確に規定されているが、定義は、各種の癌によって異なっており、当業者に周知である。
【０１９２】
ＮＣＩの監視、疫学、及び遠隔成績プログラム（ＳＥＥＲ）のような多くの癌の記録では、略式のステージ分類を使用する。このシステムは、多くの種類の癌に使用されており、癌の症例を以下の５つの主要なカテゴリにグループ分けするものである。
インサイツは、それが生じた細胞の層にのみ存在する早期癌である。
限局は、転移の証拠は無く、それが生じた器官に限定されている癌である。
隣接転移は、最初の（原発）部位を越えて近くのリンパ節又は器官及び組織に広がった癌である。
遠隔転移は、原発部位から遠隔器官又は遠隔リンパ節に広がった癌である。
不明は、ステージを示す十分な情報がない症例を表わすために使用される。
【０１９３】
加えて、原発腫瘍が除去されてから数ヶ月又は数年後に、癌が再発することは珍しくない。可視の腫瘍が全て根絶された後に再発する癌は、再発性癌と呼ばれる。原発腫瘍の領域において再発する疾病は、局所的に再発性であり、転移として再発する癌は遠隔再発と呼ばれる。
【０１９４】
腫瘍は固形腫瘍であるか、或いは非固形腫瘍又は軟組織腫瘍でありうる。軟組織腫瘍の例には、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、又はヘアリーセル白血病）、或いはリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又はホジキン病）が含まれる。固形腫瘍には、血液、骨髄、又はリンパ系以外の身体組織のあらゆる癌が含まれる。固形腫瘍は更に、上皮細胞を起源とするものと、非上皮細胞を起源とするものとに分けられる。上皮細胞固形腫瘍の例には、胃腸管、大腸、乳房、前立腺、肺、腎、肝、膵臓、卵巣、頭頚部、口腔、胃の腫瘍、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、大陰唇、上咽頭、皮膚、子宮、雄性生殖器、尿路、膀胱、及び皮膚の腫瘍が含まれる。非上皮起源の固形腫瘍には、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が含まれる。
【０１９５】
幾つかの実施態様では、本発明の患者に対し、例えば治療前、及び／又は治療中、及び治療後に診断試験を行う。一般に、診断試験が実施される場合、治療を必要とする患者から試料を採取することができる。対象が癌に罹患している場合、試料は腫瘍試料、又はその他生物学的試料でありえ、例えば、限定しないが、血液、尿、唾液、腹水、又は血清及び血漿のような派生物などを含む生物学的流体である。
【０１９６】
幾つかの実施態様では、癌はＨＥＲ陽性であるので、例えばＨＥＲ抗体が癌細胞に結合できる。一実施態様では、癌はＨＥＲ３を低発現する（例えば卵巣癌）か、又はＨＥＲ２、３レートの上昇を示している（例えば卵巣癌）。幾つかの実施態様では、癌はｃ−ｍｅｔ陽性であるので、例えばｃ−ｍｅｔ抗体が癌細胞に結合できる。
【０１９７】
本明細書において、生物学的試料は、固定された試料、例えばホルマリン固定されてパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）試料であるか、又は凍結された試料である。
【０１９８】
ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を決定する種々の方法は、限定しないが、遺伝子発現プロファイリング、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣ）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ法、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、大規模並行シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析、プロテオミクス、免疫組織化学（ＩＨＣ）などを含む。好ましくは、ｍＲＮＡは定量される。このようなｍＲＮＡ分析は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術を使用して、又はマイクロアレイ分析により実行される。ＰＣＲを使用する場合、ＰＣＲの好ましい形態は定量的リアルタイムＰｃＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。一実施態様では、上記遺伝子のうちの一又は複数の発現は、例えば同じ腫瘍種類の他の試料と比較して、中央値以上である場合に陽性発現とみなされる。中央値発現レベルは、基本的に、遺伝子発現の測定と同時に決定することができるか、又は事前に決定することができる。
【０１９９】
ＲＮＡ源として固定パラフィン包埋組織を用いる遺伝子発現プロファイリングの典型的なプロトコールのステップは、ｍＲＮＡの単離、精製、プライマーの伸張、及び増幅を含み、様々な出版物の記事に記載されている（例えば、Godfrey ら J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Spechtら、Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)）。簡単に説明すると、典型的なプロセスは、厚さ約１０マイクログラムのパラフィン包埋腫瘍組織の試料を切断することから開始される。次いでＲＮＡを抽出し、タンパク質及びＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の分析後に、必要に応じてＲＮＡ修復ステップ及び／又は増幅ステップを含み、遺伝子に特異的なプロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、その後ＰＣＲを行う。最後に、データを分析することにより、試験した腫瘍試料において特定された特徴的な遺伝子発現に基づいて、患者が受けることができる最善の治療オプションを特定する。
【０２００】
遺伝子又はタンパク質の発現の検出は、直接的に又は間接的に決定することができる。
【０２０１】
（直接的に又は間接的に）癌におけるｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの発現又は増幅を決定することができる。様々な診断／予後判定アッセイが、このために利用可能である。一実施態様では、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲ過剰発現は、ＩＨＣによって分析することができる。腫瘍生検由来のパラフィン包埋組織切片に対してＩＨＣアッセイを行い、次のようなＨＥＲタンパク質染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０：染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋：わずかに／弱く認知できる程度の膜染色が１０％を上回る腫瘍細胞に検出される。細胞膜の一部のみが染色される。
スコア２＋：弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋：中程度から強い完全な膜染色が１０％を上回る腫瘍細胞に観察される。
【０２０２】
幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの過剰発現に関して０又は１＋スコアを呈する腫瘍は、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲを過剰発現しないことを特徴としうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアを呈する腫瘍は、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲの過剰発現を特徴としうる。
【０２０３】
幾つかの実施態様では、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲを過剰発現する腫瘍は、細胞１つ当たりに発現されるｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲ分子のコピーの数に対応する免疫組織化学的スコアにより評価することができ、生化学的に定量化することができる。すなわち：
０＝０〜１０，０００コピー／細胞
１＋＝少なくとも約２００，０００コピー／細胞
２＋＝少なくとも約５００，０００コピー／細胞
３＋＝少なくとも約２，０００，０００コピー／細胞
【０２０４】
或いは、又は加えて、ＦＩＳＨアッセイを、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織に実施して、腫瘍におけるｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲ増幅の範囲を決定することができる。
【０２０５】
ｃ−ｍｅｔ又はＨＥＲ活性は、直接的に（例えば、ホスホ−ＥＬＩＳＡ試験、又はリン酸化したレセプターを定量化する他の方法により）、或いは間接的に（例えば、活性化した下流のシグナル伝達経路成分の検出、レセプター二量体（例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体）の検出、遺伝子発現プロファイルの検出などにより）、定量化することができる。
【０２０６】
同様に、ｃ−ｍｅｔ又はＨＥＲの恒常的活性化、或いはリガンド独立性ＨＥＲ又はｃ−ｍｅｔの存在は、直接的又は間接的に（例えば、恒常的活性と相関するレセプター変異の検出、恒常的活性と相関するレセプター増幅の検出などにより）、定量化することができる。
【０２０７】
核酸突然変異の検出のための方法は当分野で公知である。しばしば、必ずしもそうではないが、突然変異が存在するかどうかの決定のために望ましい量の材料を得るために、試料中の標的核酸を増幅する。増幅技術は公知技術である。例えば、増幅された産物は、突然変異が予測される特定のアミノ酸配列位置／核酸配列位置を含む限り、対象とするタンパク質をコードするすべての核酸配列を包含してもよいし、しなくてもよい。
【０２０８】
一例では、変異の存在は、試料からの核酸を、突然変異した核酸をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させ、該ハイブリダイゼーションを検出することによって決定することができる。一実施態様では、プローブは例えば放射性同位元素(３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ等)、蛍光剤(ローダミン、フルオレセン等)又は発色剤で検出可能に標識される。いくつかの実施態様では、プローブはアンチセンスオリゴマー、例えばＰＮＡ、モルホリノ-ホスホロアミデート類、ＬＮＡ又は２'-アルコキシアルコキシである。プローブは約８ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、又は約１０から約７５、あるいは約１５から約５０、又は約２０から約３０でありうる。他の態様では、本発明の核酸プローブは試料中においてｃ-ｍｅｔ突然変異を同定するためのキットとして提供され、該キットは、例えばｃ-ｍｅｔをコードする核酸中の突然変異の部位に隣接して又は特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。該キットはキットを使用してハイブリダイゼーション試験の結果に基づいてｃ-ｍｅｔアンタゴニストで例えばｃ-ｍｅｔ突然変異を含む腫瘍を有する患者を治療するための指示書を更に含みうる。
【０２０９】
また、突然変異は、野生型ｃ-ｍｅｔをコードする対応する核酸の電気泳動移動度と増幅された核酸の電気泳動移動度とを比較することによって検出することができる。移動度の相違は、増幅された核酸配列での突然変異の存在を示すものである。電気泳動移動度は、例えばポリアクリルアミドゲル上での、任意の適切な分子分離技術により測定されうる。
【０２１０】
また、核酸を、酵素突然変異検出法(Enzymatic Mutation Detection (EMD))(Del Tito等, Clinical Chemistry 44:731-739, 1998)を使用して突然変異の検出について分析することができる。ＥＭＤはバクテリオファージリゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼVIIを使用し、これは、点突然変異、挿入及び欠失などの核酸変異から生じる塩基対ミスマッチによって引き起こされる構造的歪みを検出し切断するまで二本鎖ＤＮＡに沿ってスキャンする。例えばゲル電気泳動によってリゾルベース切断により形成された２つの短い断片の検出は突然変異の存在を示している。ＥＭＤ法の利点は、増幅反応から直接アッセイされた点突然変異、欠失及び挿入を同定する単一のプロトコールであり、試料を精製する必要がなく、ハイブリダイゼーション時間を短縮し、信号対雑音比を増大させることである。２０倍までの過剰な正常核酸及び４ｋｂのサイズまでの断片を含む混合試料をアッセイすることができる。しかしながら、ＥＭＤスキャンは突然変異陽性試料中に生じる特定の塩基変化を同定せず、必要ならば特異的な突然変異を同定するために更なる配列決定手順を必要とする。ＣＥＬI酵素は米国特許第５８６９２４５号に実証されているようにリゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼVIIと同様にして使用することができる。
【０２１１】
突然変異を検出するための他の簡便なキットは、ヘモクロマトーシスを引き起こすＨＦＥ、ＴＦＲ２及びＦＰＮ１遺伝子における多重突然変異の検出のためのヘマクロマトーシスストリップアッセイ(Haemochromatosis  StripAssayTM)(Viennalabs http://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)に類似したリバースハイブリダイゼーションテストストリップである。そのようなアッセイは、ＰＣＲによる増幅に続く配列特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。単一突然変異アッセイに対しては、マイクロプレートベースの検出系を適用することができる一方、多重突然変異アッセイに対しては、ストリップは「マクロ-アレイ」として使用することができる。キットは試料調製、増幅及び突然変異検出のための直ぐに使用できる試薬を含みうる。多重増幅プロトコルは利便性を提供し、非常に限られた体積の試料の試験を可能にする。直接的なストリップアッセイ(StripAssay)態様を使用して、２０及びそれ以上の突然変異の試験を、高価な装置を用いないで５時間未満で完了させることができる。ＤＮＡが試料から単離され、標的核酸がインビトロで増幅され(例えばＰＣＲ)、一般的には単一(「多重(multiplex)」)増幅反応においてビオチン標識される。増幅産物は、プローブが平行線又はバンドとして固定されているストリップのような固体担体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブ(野生型及び変異型特異的)に選択的にハイブリダイズされたものである。結合したビオチン標識単位複製配列はストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ及び有色基質を使用して検出される。そのようなアッセイは本発明の突然変異の全て又は任意のサブセットを検出することができる。特定の突然変異プローブバンドに対しては３種のシグナル伝達パターンの一つが可能である：(i) 正常な核酸配列を示す野生型プローブに対してのみのバンド、(ii) ヘテロ接合遺伝子型を示す野生型及び突然変異双方のプローブに対するバンド、及び(iii) ホモ接合突然変異遺伝子型を示す突然変異プローブだけに対するバンド。従って、ある態様では、本発明は、本発明の突然変異を検出する方法であって、増幅産物がリガンドを含むように、試料から標的のｃ-ｍｅｔ核酸配列を単離及び／又は増幅し、増幅産物を、リガンドに対する検出可能な結合対を含むプローブであって本発明の突然変異体に特異的にハイブリダイズ可能なプローブに接触させ、ついで上記増幅産物に対する上記プローブのハイブリダイゼーションを検出する方法が更に提供される。一実施態様では、リガンドはビオチンであり、結合対はアビジン又はストレプトアビジンを含む。一実施態様では、結合対は、有色基質で検出可能なストレプトアビジン-アルカリ性である。一実施態様では、プローブは例えばストリップ上に固定されており、そこで、異なった突然変異に相補的であるプローブが互いに分離される。あるいは、増幅された核酸は、放射性同位元素で標識され、その場合、プローブは検出可能な標識を含む必要はない。
【０２１２】
野生型遺伝子の改変は、挿入、逆位、削除、及び／又は点変異といった突然変異の全ての形態を包含する。一実施態様では、突然変異は体細胞性である。体細胞性突然変異は、特定の組織、例えば腫瘍組織においてのみ発生し、生殖系列細胞に遺伝しないものである。生殖系列細胞突然変異は、あらゆる身体組織において見られる。
【０２１３】
標的核酸を含有する試料は、当分野で周知な、腫瘍の特定の種類や位置に適した方法によって入手できる。組織生検は、腫瘍組織の代表的な部分を得るために用いることが多い。これに対して、腫瘍細胞は、対象とする腫瘍細胞を含むことがわかっている又は含むと思われる組織／体液の形態で間接的に入手できる。例えば、肺癌病変の試料は、切除術、気管支鏡検査法、細針吸引、気管支のブラッシングによって、又は、痰、肋膜体液又は血液から入手してもよい。突然変異遺伝子又は遺伝子産物は、腫瘍から、又は、他の体試料、例えば尿、痰又は血清から検出できる。腫瘍試料中の突然変異標的遺伝子ないし遺伝子産物の検出のための上記に記載の同じ技術を他の体試料に応用できる。癌細胞は腫瘍からはがれて、このような体試料中に出現する。このような体試料のスクリーニングによって、癌などの疾患の診断を簡単かつ迅速に行うことができる。加えて、治療の経過は、突然変異標的遺伝子ないし遺伝子産物についてこのような体試料を試験することによって、より容易にモニタリングすることができる。
【０２１４】
腫瘍細胞の組織調製物を濃縮する方法は公知技術である。例えば、組織は、パラフィン切片又はクリオスタット切片から単離してもよい。また、癌細胞は、フローサイトメトリ又はレーザー捕獲顕微解剖によって正常細胞から切り離してもよい。正常細胞から腫瘍を分離するためのこれら並びに他の技術は公知技術である。腫瘍組織が正常細胞と非常に混濁している場合、突然変異の検出はより難しいが、混入及び／又は偽陽性／陰性の結果を最小化する技術が公知である。そのいくつかを以下に記述する。例えば、試料は、対象とする腫瘍細胞と結合するが対応する正常細胞とは結合しない、又はその逆も可であることがわかっているバイオマーカー(突然変異を含む)の存在について評価してもよい。
【０２１５】
標的核酸中の点突然変異の検出は、当該分野でよく知られている技術を使用して標的核酸を分子クローニングし、核酸を配列決定することによって達成することができうる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を使用して、腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製物から直接的に標的核酸配列を増幅させることができる。ついで、増幅された配列の核酸配列を決定し、それから突然変異を同定することができる。増幅技術は当該分野でよく知られており、Saiki等, Science 239:487, 1988；米国特許第４６８３２０３号；及び米国特許第４６８３１９５号に記載されている。
【０２１６】
適切なプライマーの設計及び選択は、従来技術において確立されていることに注意されたい。
【０２１７】
また、当該分野で知られているリガーゼ連鎖反応を、標的核酸配列を増幅させるために使用することができる。例としてWu等, Genomics, Vol. 4, pp.560-569 (1989)を参照。さらに、対立遺伝子特異的ＰＣＲとして知られている技術を使用することができる。例としてRuano及びKidd, Nucleic Acids Research, Vol. 17, p. 8392, 1989を参照。この技術によれば、特定の標的核酸突然変異にその３'末端でハイブリダイズするプライマーが使用される。特定の突然変異が存在していない場合は、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公開第０３３２４３５号及び Newton等, Nucleic Acids Research, Vol. 17, p.7, 1989に開示されたAmplification Refractory Mutation System (ARMS) もまた使用することができる。遺伝子の挿入及び欠失もまたクローニング、配列決定及び増幅によって検出することができる。また、遺伝子又は周りのマーカー遺伝子に対する制限酵素断片長多型(ＲＦＬＰ)プローブを、多型断片における対立遺伝子の改変又は挿入をスコア付けするために使用することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型(ＳＳＣＰ)解析もまた対立遺伝子の塩基変化変異体を検出するために使用することができる。例としてOrita等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989,及びGenomics, Vol. 5, pp. 874-879, 1989を参照。また、当該分野で知られているような挿入及び欠失を検出する他の方法を使用することができる。 
【０２１８】
野生型遺伝子の改変は野生型遺伝子発現産物の改変に基づいて検出することもできる。そのような発現産物にはｍＲＮＡ並びにタンパク質産物の双方が含まれる。点突然変異は、ｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの分子クローニングによって又はｍＲＮＡを増幅し配列決定することによって、検出することができる。クローン化ｃＤＮＡの配列は当該分野でよく知られたＤＮＡ配列決定法を使用して決定することができる。ｃＤＮＡはまたポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって配列決定することもできる。
【０２１９】
ミスマッチは、１００％相補的ではないハイブリダイズした核酸二本鎖である。完全な相補性の欠如は欠失、挿入、逆位、又は置換又はフレームシフト突然変異によりうる。ミスマッチの検出は標的の核酸中における点突然変異を検出するために使用することができる。これらの技術は配列決定よりも感受性が低いが、より簡便に多数の腫瘍試料に対して実施することができる。ミスマッチ切断技術の一例はリボヌクレアーゼ保護法であり、これは、Winter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p.7575, 1985及びMeyers等, Science, Vol. 230, p.1242, 1985に詳細に記載されている。例えば、本発明の方法は、ヒトの野生型標的核酸に相補的である標識されたリボプローブの使用を伴いうる。リボプローブと腫瘍試料由来の標的核酸は一緒にアニール(ハイブリダイズ)され、続いて二本鎖ＲＮＡ構造中の幾らかのミスマッチを検出することができる酵素リボヌクレアーゼＡで消化される。ミスマッチがリボヌクレアーゼＡによって検出される場合、それはミスマッチ部位で切断される。よって、アニールされたＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックスで分離されると、ミスマッチがリボヌクレアーゼＡによって検出され切断された場合、リボプローブとｍＲＮＡ又はＤＮＡに対する完全長二本鎖ＲＮＡよりも小さいＲＮＡ産物が見られる。リボプローブは標的核酸ｍＲＮＡ又は遺伝子の完全長である必要はないが、標的核酸の一部であり、変異していると思われる部位を含むものである。リボプローブが標的核酸ｍＲＮＡ又は遺伝子のセグメントのみを含む場合、多くのこれらプローブを使用してミスマッチに対する全標的核酸配列をスクリーニングすることが望ましい。
【０２２０】
同様な形で、ＤＮＡプローブを用いて、酵素的又は化学的切断などを介して、ミスマッチを検出することができる。例としてCotton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, 4397, 1988；及びShenk等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, p. 989, 1975を参照のこと。あるいは、ミスマッチは、マッチした二本鎖に対するミスマッチの二本鎖の電気泳動移動度における変化によって検出することができる。例としてCariello, Human Genetics, Vol. 42, p.726, 1988を参照のこと。リボプローブかＤＮＡプローブの何れかを用いて、突然変異を含みうる標的核酸ｍＲＮＡ又はＤＮＡはハイブリダイゼーション前に増幅させることができる。標的核酸のＤＮＡの変化は、例えば欠失及び挿入のように特に変化が全体的な再配列である場合は、サザンハイブリダイゼーションを使用して検出することもできる。
【０２２１】
また、増幅された標的核酸のＤＮＡ配列を、対立遺伝子特異的プローブを使用してスクリーニングすることもできる。これらのプローブは核酸オリゴマーであり、その各々が既知の突然変異を有する標的核酸遺伝子の領域を含む。例えば、一つのオリゴマーは、標的遺伝子配列の一部に対応する、約３０ヌクレオチド長でありうる。そのような一連の対立遺伝子特異的プローブの使用によって、標的核酸増幅産物をスクリーニングし、標的遺伝子中における過去に同定された突然変異の存在を同定することができる。増幅された標的核酸配列との対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションは例えばナイロンフィルターで実施することができる。ストリンジェントなハイブリダイズ条件下での特定のプローブのハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブにおけるものと同じ突然変異が腫瘍組織に存在していることを示している。
【０２２２】
野生型標的遺伝子の改変はまた対応する野生型タンパク質の改変についてスクリーニングすることによっても検出することができる。例えば、標的遺伝子産物と免疫反応性であるモノクローナル抗体、その例として遺伝子産物(タンパク質)の特定の変異した位置に結合することがわかっている抗体を用いて組織をスクリーニングすることができる。例えば、用いる抗体が、欠失したエキソン(例えば、エキソン１４)に結合する抗体又は、標的タンパク質の欠失した部位を含んでなる立体配位的なエピトープに結合する抗体でありうる。同種抗原の欠如が突然変異を示すであろう。また、突然変異対立遺伝子の産物に特異的な抗体を突然変異遺伝子産物の検出に使用することができる。抗体はファージディスプレイライブラリーから同定することができる。そのような免疫学的アッセイは当該分野で知られている任意の簡便な形態で行うことができる。これらには、ウエスタンブロット、免疫組織化学的アッセイ及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。改変されたタンパク質を検出するための任意の手段を、野生型標的遺伝子の改変を検出するために使用することができる。
【０２２３】
プライマー対はポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅技術を用いて標的核酸のヌクレオチド配列の決定のために有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーの対は標的配列を刺激増幅するために標的核酸配列内又は該標的核酸配列を囲む配列にアニーリングすることができる。対立遺伝子特異的プライマーもまた使用することができる。このようなプライマーは特定の突然変異標的配列にのみアニールし、よって鋳型としての突然変異標的配列の存在下でのみ産物を増幅する。引き続いての増幅された配列のクローニングを容易にするために、プライマーはその末端に付属した制限酵素部位配列を有しうる。そのような酵素及び部位は当該分野でよく知られている。そのプライマー自体は、当該分野でよく知られている技術を使用して合成することができる。一般に、プライマーは、商業的に入手できるオリゴヌクレオチド合成機を使用して作製することができる。特定のプライマーの設定は十分に当業者の技量の範囲内である。
【０２２４】
核酸プローブは多くの目的のために有用である。それらはゲノムＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーションにおいて、また上で既に検討した点突然変異を検出するためのリボヌクレアーゼ保護法において使用することができる。プローブは標的核酸増幅産物を検出するために使用することができる。それらはまた他の技術を使用して野生型遺伝子又はｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用することもできる。ミスマッチは酵素(例えばＳ１ヌクレアーゼ)か、化学物質(例えばヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム及びピペリジン)か、又は完全にマッチしたハイブリッドと比較した場合のミスマッチハイブリッドの電気泳動移動度の変化の何れかを使用して検出することができる。これらの技術は当該分野で知られている。Novack等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.83, p.586, 1986を参照。一般に、プローブはキナーゼドメイン外の配列に相補的である。一連の核酸プローブを用いて、標的核酸中の突然変異を検出するためのキットを構成することができる。そのキットにより、対象とする標的配列の広い領域へのハイブリダイゼーションが可能になる。プローブは互いにオーバーラップしていてもよいし又は近接していてもよい。
【０２２５】
リボプローブをｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用する場合、それは標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的である。よって、リボプローブは、センス鎖に相補的であるため、対応する遺伝子産物をコードしていない点でアンチセンスプローブである。リボプローブは一般に放射性、比色性、又は蛍光定量物質で標識され、これは当該分野で知られている任意の手段によって達成することができる。リボプローブがＤＮＡとのミスマッチを検出するために使用される場合、それは何れの極性でも、センス又はアンチセンスでもありうる。同様に、ＤＮＡプローブを、ミスマッチを検出するために使用することもできる。
【０２２６】
場合によっては、癌は、ｃ−ｍｅｔ及び／又はＨＥＲを過剰発現するか、又はしない。レセプターの過剰発現は、細胞表面上に存在するレセプタータンパク質のレベルの上昇を（例えば免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣにより）評価することにより、診断又は予後判定アッセイにおいて決定することができる。或いは又は加えて、例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ、1998年10月に公開の国際公開第９８／４５４７９号参照)、サザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)によって、細胞内のレセプターコード化核酸のレベルを測定してもよい。上記のアッセイを除き、技術者は様々なインビボアッセイを利用することができる。例えば、場合によって、検出可能な標識、例えば放射性同位体で標識した抗体に患者の体内の細胞を曝し、例えば放射能の外的スキャンによって、又は前もって抗体に曝される患者から採取した生検を分析することによって、患者の細胞に対する抗体の結合を評価してもよい。
【０２２７】
化学療法剤
本発明の併用療法は、更に、一又は複数の化学療法剤を含むことができる。併用投与は、別個の製剤又は単一の医薬的製剤を用いた同時投与又は同時発生的投与と、好ましくは両方（又は全て）の活性剤の生物学的活性が同時に発揮される期間を提供する、順序を問わない継続的投与とを含む。
【０２２８】
投与される場合、化学療法剤は普通、そのような薬剤に既知の用量で投与されるか、場合によっては薬剤の併用作用又は代謝拮抗性の化学療法剤の投与に起因する有害な副作用により用量が低減される。このような化学療法剤の調製及び投与計画は、製造者の指示に従って、又は当業者の経験的決定により、使用することができる。
【０２２９】
併用可能な様々な化学療法剤は上記に開示した。組み合わせる好ましい化学療法剤は、タキソイド（ドセタキセル及びパクリタキセルを含む）、ビンカ（例えばビノレルビン又はビンブラスチン）、白金化合物（例えばカルボプラチン又はシスプラチン）、アロマターゼ阻害薬（例えばレトロゾール、アナストロゾール、又はエキセメスタン）、抗エストロゲン（例えばフルベストラント又はタモキシフェン）、エトポシド、チオテパ、シクロホスファミド、メトトレキサート、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、カペシタビン、ゲムシタビン、ＣＯＸ−２阻害薬（例えば、セレコキシブ）、又はプロテアソーム阻害薬（例えばＰＳ３４２）からなる群より選択される。
【０２３０】
製剤、用量、及び投与
本発明に使用される治療薬の製剤、用量、及び投与は、良質な医療慣行（good medical practice）に則って決定される。この文脈で考慮すべき要素には、治療対象となる特定の障害、特定の治療対象、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、併用される薬剤同士の相互作用、及び医療従事者に既知のその他の要素が含まれる。
【０２３１】
治療的製剤は、従来技術に既知の標準的方法を用いて、所望の純度を有する有効成分と、任意の生理学的に許容可能な担体と、賦形剤又は安定剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences (第20版)、A. Gennaro編, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）とを混合することにより調製される。許容可能な担体には、生理食塩水又はリン酸塩のようなバッファと、クエン酸塩及びその他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミンなどのタンパク質と、ゼラチン又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコースを含むその他の炭水化物、マンノース、又はデキストリン；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、又はＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２３２】
随意で、しかし好ましくは、製剤は、製薬的に許容可能な塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくはほぼ生理的濃度で含んでいる。随意で、本発明の製剤は、製薬的に許容可能な保存料を含むことができる。幾つかの実施態様では、保存料の濃度は０．１〜２．０％（典型的にｖ／ｖで）である。適切な保存料には、薬剤的従来技術において既知のものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベンが好ましい保存料である。場合によっては、本発明の製剤は、製薬的に許容可能な界面活性剤を０．００５〜０．０２％の濃度で含むことができる。
【０２３３】
本明細書における製剤は、治療される特定の徴候に必要な二つ以上の活性化合物、好ましくは互いに逆に作用しない相補的活性を有する化合物を含むこともできる。このような分子は、適切には、意図された目的に有効な量で併用される。
【０２３４】
有効成分は、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合、例えばそれぞれコロイド性薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及び名のカプセル）又はマクロエマルシンの、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、マイクロカプセルに封入された形態に調製することもできる。このような技術は、上掲のRemington’s Pharmaceutical Sciencesに開示されている。
【０２３５】
徐放性製剤を調整してもよい。徐放性製剤の適切な例として、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透性基質を上げることができ、この基質は、有形物、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌグルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミンの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOTTM（乳酸−グリコール酸共重合体及びリュープロリド酢酸塩からなる注射可能な微粒子）のような、分解性の乳酸−グリコール酸の共重合体、並びにポリ−Ｄ−（−）３−ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレンビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日に亘る分子の放出を可能にし、一方、特定のハイドロゲルは、それよりも短期間に亘ってタンパク質を放出する。カプセル封入された抗体は、体内に長時間留まるとき、３７℃で水分に曝されることにより、変性又は凝集し、その結果生物学的活性を失い、場合によっては免疫原生が変化する。関与する機序に応じて、安定化のために合理的な戦略を講じることができる。例えば、凝集の機序が、チオ−ジスルフィド交換により分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液の凍結、水分含有率の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマー基質組成物の開発により、安定化させることができる。
【０２３６】
本発明の治療薬は、ヒト患者に対し、ボーラスとしての静脈内投与、或いは、一定の時間に亘る持続点滴、筋肉内投与、口腔内投与、脳脊髄内投与、皮下投与、関節内投与、髄膜内投与、くも膜下腔内投与、経口投与、局所投与、又は吸入といった既知の方法に従って、投与することができる。治療的適用のために、ex vivo戦略も使用することができる。ex vivo戦略では、対象から採取した細胞に、ｃ−ｍｅｔ又はＨＥＲアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを形質移入又は形質導入する。次いで、形質移入又は形質導入された細胞を対象に戻す。細胞は、限定しないが、造血性細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞）、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、又は筋細胞を含む、広範な種類のあらゆる細胞とすることができる。
【０２３７】
例えば、ｃ−ｍｅｔ又はＨＥＲアンタゴニストが抗体である場合、この抗体は、非経口的投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、局所的免疫抑制治療に望ましい場合は病巣内投与を含む任意の適切な手段により投与される。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。加えて、抗体は、特に抗体の用量を減らしながら、パルス注入により適切に投与される。好ましくは、投薬は、投与期間の長短に応じて、注射により、最も好ましくは静脈内注入又は皮下注入により、行われる。
【０２３８】
別の実施例では、ｃ−ｍｅｔ又はＨＥＲアンタゴニスト化合物は、障害又は腫瘍の位置が許す場合、局所的に、例えば直接的注入により投与され、注入は周期的に反復可能である。また、ｃ−ｍｅｔ又はＨＥＲアンタゴニストは、局所的再発又は転移を防止又は低減するために、患者の全身に、又は腫瘍細胞に直接、例えば腫瘍の外科的切除後に、腫瘍又は腫瘍病床に対して送達することができる。
【０２３９】
併用療法における治療薬の投与は、所定の期間（通常は、選択される組み合わせに応じて、数分、数時間、数日、又は数週）に亘って行うことができる。併用療法は、このような治療薬を連続して、即ち各治療薬を異なる時間に投与する投与方法、並びに、このような治療薬、又は少なくとも二つの治療薬をほぼ同時に投与する投与方法を包含する。
【０２４０】
治療薬は、同じ経路又は異なる経路により投与することができる。例えば、組み合わせたＨＥＲ又はｃ−ｍｅｔアンタゴニストを静脈内注により投与し、組み合わせたプロテインキナーゼ阻害薬を経口投与することができる。別の方法では、例えば、特定の治療薬に応じて、両方の治療薬を経口投与するか、又は両方の治療薬を静脈内注入することができる。治療薬を投与する順番は、特定の薬剤に応じて変更することもできる。
【０２４１】
例えば、一又は複数の別個の投与を行うか、又は連続注入を行うかに関係なく、疾病の種類及び重症度に応じて、患者に投与される各治療薬の初回の候補用量は、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）である。典型的な一日当たりの用量は、上記要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上に亘りうる。数日間以上に亘って反復投与する場合、状態に応じて、上記方法によって測定した場合に癌が治療されるまで、治療を持続する。しかしながら、他の投与計画も有用でありうる。一実施例では、ｃ−ｍｅｔ又はＨＥＲアンタゴニストが抗体である場合、本発明の抗体は、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で、２〜３週間毎に投与される。ｃ−ｍｅｔ又はＨＥＲアンタゴニストが内服用小分子化合物である場合、薬剤は毎日、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与される。更に、本発明の内服用化合物は、伝統的な高用量間欠的投与計画で、又は中断を設けずに用量を減らし且つ頻度を上げて（「メトロノミック療法」と呼ぶ））投与することができる。間欠的投与計画を使用する場合、例えば、薬剤の投与は、１日当たりの用量及び特定の徴候に応じて、２〜３週間に亘って毎日行った後、１週間中断するか；又は、４週間に亘って毎日行った後、２週間中断する。本発明の療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０２４２】
本出願では、遺伝子療法によるｍｅｔ及び／又はＨＥＲアンタゴニストの投与を考慮する。例えば、1996年3月14日に公開された、細胞内抗体を生成するための遺伝子療法の使用に関する国際公開第９６／０７３２１号を参照されたい。
【０２４３】
核酸(場合によってはベクター内に含まれたもの)を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は患者の、抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する(米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって、異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【０２４４】
現在インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス)、及び脂質ベースのシステム(例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、DOTMA、DOPE、及びDC-Cholである)での形質移入を含む。幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞、標的細胞上のレセプターのリガンドなどに特異的な抗体とともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を用いて、ターゲティング及び／又は取り込みを促す。そのタンパク質は、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて、内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)、及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公報 93/25673及びそこに引用された参考文献も参照。
【０２４５】
後述は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上述した概要に基づいて、他に様々な実施態様が実施可能であることを理解されたい。
【実施例】
【０２４６】
実施例１：ＮＳＣＬＣ細胞のｃ−ｍｅｔタンパク質発現の低減によりＥＧＦＲファミリーのリガンド誘導活性化が増す
材料及び方法
レトロウイルスｓｈＲＮＡコンストラクト。  ｃ−ｍｅｔに対するオリゴヌクレオチドコードｓｈＲＮＡ配列(5'-GATCCCCGAACAGAATCACTGACATATTCAAGAGATATGTCAGTGATTCTGTTCTTTTTTGGAAA-3'(配列番号：４８)(ｓｈＭｅｔ３)、及び、5'GATCCCCGAAACTGTATGCTGGATGATTCAAGAGATCATCCAGCATACAGTTTCTTTTTTGGAAA (配列番号：４９)(ｓｈＭｅｔ４))をＨ１プロモーター(David Davis, GNE)の下流のｐＳｈｕｔｔｌｅ-Ｈ１ベクターのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。太字は標的のハイブリダイズ配列を示す。これらのコンストラクトは、クロナーゼＩＩ酵素(Invitrogen)を用いてレトロウイルスｐＨＵＳＨ-ＧＷベクター(Gray D et al BMC Biotechnology. 2007; 7:61)に再結合させ、ｓｈＲＮＡ発現が誘導性プロモーターの制御下にあるコンストラクトを生成した。テトラサイクリンアナログドキシサイクリンによる処置によりｓｈＲＮＡ発現が生じる。ＧＦＰに対するｓｈＲＮＡを含むｓｈＧＦＰ２コントロールレトロウイルスコンストラクト(Hoeflich et al. Cancer Res. (2006) 66(2): 999-1006)は、David Davis, Genentech, Incから提供を受けた。ｓｈＧＦＰ２は以下のオリゴヌクレオチドを含む：
(ＥＧＦＰ) ｓｈＲＮＡ 
(センス鎖) 5'-GATCCCCAGATCCGCCACAACATCGATTCAAGAGATCGATGTTGTGGCGGATCTTGTTTTTTGGAAA-3 (配列番号：５０)。
【０２４７】
細胞培養。  ＧＰ-２９３を内包する細胞(Clontech)は、１０％Ｔｅｔ-Ｆｒｅｅ ＦＢＳ(Clontech)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(GNE)、及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン(Gibco)を添加したＨＧＤＭＥＭ(GNE)中で維持した。Ｈ４４１細胞(ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ-１７４)は、１０％Ｔｅｔ-Ｆｒｅｅ ＦＢＳ(Clontech)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(GNE)、及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン(Gibco)を添加した５０：５０培地(ＤＭＥＭ：Ｆ１２、MediaTech)中で維持した。ＥＢＣ-１細胞(Japanese Health Sciences Resources；Cancer Res. (2005) 65(16): 7276-82を参照)は、１０％Ｔｅｔ-Ｆｒｅｅ ＦＢＳ(Clontech)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン(GNE)、及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン(Gibco)を添加したＲＰＭＩ１６４０(GNE)中で維持した。細胞は５％ＣＯ２にて３７℃に維持した。
【０２４８】
組み換えレトロウイルス及び安定株の開発。  ＧＰ-２９３を内包する細胞は、ＦｕＧｅｎｅ６(Roche)及びＣａｌＰｈｏｓ哺乳動物形質移入キット(Clontech)を用いて、ｐＶＳＶ-Ｇ(Clontech)及び上記の組み換えレトロウイルスコンストラクトと同時形質移入した。次いで、組み換えウイルスを含む培地をＥＢＣ-１細胞及びＨ４４１細胞に加え、細胞をピューロマイシン(Clontech)において選択した。次いで、レトロウイルスコンストラクトを安定して発現する細胞は９６ウェルプレートへのＦＡＣＳにより自動クローニングした。 
【０２４９】
ウエスタンブロット。  タンパク質を分析するために、２０ｕｇの全細胞溶解物を、ＭＯＰＳバッファ(Invitrogen)を有する４−１２％ビス-トリスＮｕＰＡＧＥゲルに流した。ゲルは、抗酸化剤バッファを有する２×ＮＵＰＡＧＥ転写バッファにおいて平衡化し、次いでｉＢｌｏｔによって０．２ｕｍのＰＶＤＦメンブランに転写した。メンブランを、５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ(１０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ツイーン２０)中で室温で１時間ブロックし、次いでブロッキングバッファにて希釈した一次抗体中で４℃で終夜インキュベートした。メンブランはＴＢＳＴにて洗浄し、次いで、５％の脱脂乳を有するＴＢＳＴ中のＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体(GE Healthcare)と共に室温で１時間インキュベートした。抗体は化学発光(GE Healthcare, ECL Plus)にて検出した。
【０２５０】
安定細胞株のスクリーニング。  レトロウイルスコンストラクトにて安定して形質導入されたクローンは、適切な培地＋／−１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン(Clontech)中で生育し、ｓｈＲＮＡの発現を誘導し、そして抗−ｃ−ｍｅｔ Ｃ−１２抗体(Santa Cruz Biotech)を用いてｃ−ｍｅｔノックダウンについてウエスタンブロットにてスクリーニングした。ホスホ−ｃ−ｍｅｔは、抗ホスホ-ｃ-ｍｅｔ Ｙ１００３(Biosource)及び抗ホスホ−ｃ−ｍｅｔ Ｙ１２３４／１２３４(Cell Signaling)抗体を用いてブロットした。コントロールとして、アクチンは、抗アクチンＩ-１９抗体(Santa Cruz Biotech)を用いてブロットした。ＥＢＣクローン３．１５及びＥＢＣクローン４．１２はｍｅｔ発現及びホスホｃ-ｍｅｔレベルの強い低減を示し、Ｈ４４１クローン３．１１及びＨ４４１クローン３．１はｃ−ｍｅｔ発現及びホスホ-ｍｅｔ発現の中程度の低減を示し、ＥＢＣクローン４．５はｃ−ｍｅｔ及びホスホ−ｃ−ｍｅｔ発現の小さな低減を示した。
【０２５１】
細胞株ＥＢＣクローン４．５、ＥＢＣクローン４．１２はコンストラクトｓｈＭｅｔ４を含み、細胞株Ｈ４４１クローン３．１、Ｈ４４１クローン３．１１及びＥＢＣクローン３．１５はコンストラクトｓｈＭｅｔ３を含んだ。  
【０２５２】
リガンド応答実験。  ４８時間(ＥＢＣ ｓｈＭｅｔ)又は６日間(Ｈ４４１ ｓｈＭｅｔ)の間にドキシサイクリンの有無の下で継代した細胞を、１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ中のＤｏｘ(０．１ｕｇ／ｍｌ)有無の６ウェルディッシュに１×１０６細胞／ウェルで播き、次いで３７℃で終夜インキュベートした。細胞をＰＢＳにて洗い流し、培地を(ドキシサイクリン有無の)０．５％ＢＳＡ−ＲＰＭＩに変え、３７℃で２時間かけて細胞を血清不足にした。リガンド(２０ｎＭ ＴＧＦａ又は２ｎＭ ＨＲＧ)を含む培地をウェルに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。ウェルを低温のＴＢＳにて洗い流し、次いでＴＢＳ、１％ＮＰ−４０、完全プロテアーゼインヒビター反応混液(Roche)及びホスファターゼ阻害薬反応混液１及び２(Sigma)にて溶解した。単層及び上清をウェルから削り取り、溶解物が氷上で１０〜３０分間インキュベートされる微量遠心管チューブへ移した。細胞片を微量遠心管にてペレット化し、上清を新鮮なチューブへ移した。タンパク質濃度はＢＣＡアッセイ(Pierce)にて定量化し、電気泳動のために解凍するまで溶解物を−２０℃に保存した。２０ｕｇ(ＥＢＣ１)又は１５ｕｇ(Ｈ４４１)の全細胞溶解物をゲルに流し、ホスホ−ｃ−ｍｅｔ(ＹＹ１２３４／３５、Cell Signaling Technologyの３１２６)、総ｃ−ｍｅｔ(Ｃ１２、San Cruz Biotechnologyのｓｃ−１０)、ｂ−アクチン(Ｉ−１９、Santa Cruz Biotechnologyのｓｃ−１６１６)、ホスホ-ＥＧＦＲ(Ｙ１１７３、Upstateの０４−３４１)、総ＥＧＦＲ(ＭＩ−１２−１、MBLから)、ホスホ-Ｈｅｒ２(ＹＹ１１２１／２２、Cell Signaling Technologyの２２４３)、総Ｈｅｒ３(Ｃ１８、ｓｃ−２８４、San Cruz Biotechnologyから)、ホスホ-Ｈｅｒ３(Ｙ１２８９、４７９１、Cell Signaling Technologyから)、又は総Ｈｅｒ３(Ｃ１７、ｓｃ−２８５、Santa Cruz Biotechnologyから)についてブロットした。 
【０２５３】
結果
ｃ−ｍｅｔを標的とするテトラサイクリン誘導性短型ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)を保持するレトロウイルスを用いて、ｃ-ｍｅｔ発現をノックダウンするためにｓｈＲＮＡを発現するように誘導されうるＮＳＣＬＣ細胞安定株クローンを生成した。ＮＳＣＬＣ細胞株ＥＢＣ１におけるＥＧＦＲファミリーメンバーの発現とリン酸化に対するｃ-ｍｅｔノックダウンの影響を調べるために、ｍｅｔに対する誘導性ｓｈＲＮＡ又はＧＦＰに対するコントロールｓｈＲＮＡを含むＥＢＣ１ ｓｈＭｅｔ４.１２細胞を、コントロール培地又は０．１ｕｇ／ｍｌのＤｏｘを含む培地（Ｄｏｘ）中で４８時間生育させた。２時間の血清欠乏の後に、細胞を、ＴＧＦα又はヘレグリンｂ１にて２０分間処理したものと処理しないものにした。示したように、全細胞溶解物は合計及びリン-タンパク質の発現について評価した。
【０２５４】
ｃ-ｍｅｔタンパク質発現がｓｈＲＮＡを用いてノックダウンされたＤｏｘ処理ＥＢＣ１(図１０；ＥＢＣｓｈＭｅｔ４．１２、Ｄｏｘ、左パネル)は、ＴＧＦａ処理に応答してｐＥＧＦＲ及びｐＨｅｒ２の増加とヘレグリン処理に応答してｐＨｅｒ３の増加、並びにＴＧＦａ又はヘレグリン処理によるｐＡＫＴの増加を示したが、Ｄｏｘ処理コントロールＥＢＣ１細胞(図１０；ｓｈＧＦＰ２、右パネル)では示さなかった。Ｄｏｘ処理ＥＢＣ ｓｈＭｅｔ４．１２細胞(リガンド刺激なし)は、総Ｈｅｒ２及び総Ｈｅｒ３の増加と、ｐＥＧＦＲ及びｐＨｅｒ３の低減を示した。ＥＢＣ１細胞は、ｃ−ｍｅｔノックダウンの非存在下では、ＴＧＦａ又はヘレグリン処理に応答してｐＥＧＦＲ、ｐＨｅｒ２、ｐＨｅｒ３又はｐＡＫＴの強力な誘導を示さなかった。
【０２５５】
他のＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＧＦＲファミリーメンバーの発現及びリン酸化に対するｃ-ｍｅｔノックダウンの影響を調べるために、ｍｅｔに対する誘導性ｓｈＲＮＡ又はＧＦＰに対するコントロールｓｈＲＮＡを含むＮＳＣＬＣ Ｈ４４１細胞を、コントロール培地又は０．１ｕｇ／ｍｌのＤｏｘを含む培地（Ｄｏｘ）中で４８時間生育させた。２時間の血清欠乏の後に、細胞を、ＴＧＦα又はヘレグリンｂ１にて２０分間処理したものと処理しないものにした。示したように、全細胞溶解物は合計及びリン-タンパク質の発現について評価した。
【０２５６】
ｃ-ｍｅｔがｓｈＲＮＡを用いてノックダウンされたＨ４４１細胞(図１１；Ｄｏｘ処理ｓｈＭｅｔ３．１、左パネル、Ｄｏｘ処理ｓｈＭｅｔ３．１１、中パネル)はヘレグリン処理に応答してｐＨｅｒ２及びｐＨｅｒ３の亢進を示したが、Ｄｏｘ処理コントロールＨ４４１細胞(図１１；ｓｈＧＦＰ１、右パネル)は示さなかった。Ｄｏｘ処理ｓｈＭｅｔ３．１及びｓｈＭｅｔ３．１１細胞もまた総Ｈｅｒ３の増加及びｐＥＧＦＲの低減を示す。ＥＢＣ１細胞とは異なり、Ｈ４４１細胞は、ｃ−ｍｅｔノックダウンのない場合、ＴＧＦα(ｐＥＧＦＲ)及びヘレグリン(ｐＨｅｒ２及びｐＨｅｒ３)にわずかに応答する。ＥＢＣ１細胞は、Ｈ４４１細胞より高いｃ−ｍｅｔレベルを有する。
【０２５７】
これらの実験は、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるｃ−ｍｅｔ発現の低減により、ＥＧＦＲ(ｐＥＧＦＲ)の基礎活性化の低減とＨｅｒ２及びＨｅｒ３のリガンド誘導性活性化の増加が生じることを示したことから、Ｍｅｔ阻害がレセプターのＥＧＦファミリーのリガンドに対する感度を上げることが示唆される。これらの結果は、ｃ−ｍｅｔとｈｅｒ２及び／又はｈｅｒ３アンタゴニストとの併用による治療が有意な抗腫瘍活性を提供することを示唆するものである。
【０２５８】
実施例２：Ｃ-ｍｅｔ活性はＨＥＲ３発現を制御する
材料及び方法
ｐＥＧＦＲ及びＨｅｒ３タンパク質のウエスタンブロット分析：  １×１０６の細胞をプレーティングし、ＲＰＭＩ  １６４０中１０％Ｔｅｔ認可ＦＢＳ中で３７℃で１８時間インキュベートした。次の日に、培地を取り除き、０．１ｕｇ／ｍｌのＤｏｘ有無の新鮮通常培地と交換した。培地交換の２４、４８及び７２時間後に、タンパク質は、冷温のＴＢＳにてすすいだ後に、１％ＮＰ−４０／ＴＢＳ／ロッシュの完全プロテアーゼインヒビター反応混液／シグマのホスファターゼ阻害薬反応混液１及び２にて抽出した。１５ｕｇの総タンパクは、ＭＯＰＳバッファを有するインビトロゲンの４−１２％ビス-トリスＮＵＰＡＤＥゲルに流し、インビトロゲンのｉＢｌｏｔによってＰＶＤＦに転写した。メンブランは、リン酸化されたタンパク質(５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中１:１０００の希釈のｐＥＧＦＲ(Ｙ１１７３) Ｕｐｓｔａｔｅ０４−３４１)についてイムノブロットし、ピアスのリストアストリッピングバッファにて剥離し、次いで、総タンパク(５％脱脂粉ミルク及びＴＢＳＴ中、１：１００００希釈のｃ-ｍｅｔ：ＳＣＢＴ ｓｃ-１０；１：２０００希釈のＨｅｒ３：ＳＣＢＴ ｓｃ-２８５)について再プローブした。タンパク質は、製造業者の指示に従ってアマシャムのＥＣＬプラス化学発光キットを用いて、アマシャムのＨＲＰコンジュゲート二次抗体(Amersham 抗ウサギＨＲＰ、＃ＮＡ９３４Ｖ；Amersham抗マウスＨＲＰ)により検出した。
【０２５９】
Ｈｅｒ３ ＦＡＣＳ：  ＥＢＣ-１ｓｈＭｅｔ４−１２細胞はＲＰＭＩ１６４０中１０ｃｍプレートにつき１０６細胞で播き(上記)、プレートを終夜インキュベートした。Ｄｏｘをプレートに添加して１００ｎｇ／ｍｌの終濃度にした。プレートを４８時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、次いで、冷温の２００μＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ(ＦＡＣＳバッファ)に再懸濁し、９６ウェルプレートへ移した。細胞を遠沈し、ジェネンテクのＨｅｒ３：１６３８(３Ｅ９.２Ｇ６)抗体を１０μｇ／ｍｌ加えたＦＡＣＳバッファに再懸濁した。細胞は氷上で１時間インキュベートし、次いで、冷温のＦＡＣＳバッファにて洗浄し、そして、ＦＡＣＳバッファ＋１:２００のＲＰＥコンジュゲートＦ(ａｂ')２ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ(Ｈ＋Ｌ)(Jackson Immuno カタログ番号１１５-１１６-０６８)に再懸濁した。細胞は氷上で３０分間インキュベートし、次いで、冷温のＦＡＣＳバッファにて１回洗浄し、そして、ＦＡＣＳバッファ＋７ＡＡＤ(BD Pharmingen カタログ番号５５９９２５)に再懸濁した。ＦＡＣＳ分析は製造業者の指示に従って実施した。
【０２６０】
腫瘍溶解物：  ＥＢＣ-１-ｓｈＭｅｔ異種移植片腫瘍を次のようにして生成した：Charles River Laboratories (CRL)からヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を入手し、試験に使用する前に少なくとも一週間に亘って気候順応させた。動物は、高性能微粒子フィルターを有する部屋の換気されたケージシステムに収容した。健康に見える、明らかな異常がない動物のみを、試験に用いた。
【０２６１】
ＥＢＣ−１  ｓｈＭｅｔ４−１２細胞は、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Invitrogen）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１０％ウシ胎児血清からなる増殖培地中で培養した。マウスに接種する細胞を調製するために、細胞をトリプシン処理し、１０ミリリットルの滅菌１×リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)にて洗浄した。細胞のサブセットはトリパンブルー排除によって計数し、残りの細胞は１００μｌの滅菌１×ＰＢＳに再懸濁して、１ミリリットルにつき５×１０７細胞の濃度にした。マウスの右肩甲下領域に、５×１０６個のＥＢＣ−１細胞を皮下接種した。腫瘍は、平均体積が３００ｍｍ３に達するまでモニターした。グループ１（コントロール群）のマウスを、５％スクロースを含む飲料水に切り換えた。グループ２（ｃ−ｍｅｔノックダウン群）のマウスは、１００μＬのＭＣＴ、ＱＤ、ＰＯで処理し、但し５％スクロース中に１．０ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を含む飲料水に切り換えた。マウスのすべての研究及び取扱いは、Institutional Animal Care and Use Committee(ＩＡＣＵＣ)ガイドラインに従った。
【０２６２】
処理の３日後、マウスを屠殺して腫瘍を回収した。新鮮凍結ＥＢＣ-１-ｓｈＭｅｔ-４．１２異種移植片腫瘍試料を、２ｍｌの冷温溶解バッファ(ＰＢＳ＋１％トリトンＸ-１００＋(３×)ホスファターゼ反応混液２(Sigmaカタログ番号Ｐ5726))及び完全ＭｉｎｉＥＤＴＡ-フリープロテアーゼインヒビター(Roche＃１１ ８３６ １７０ ００１)に置いた。腫瘍は携帯型ホモジナイザーにて均一にし、溶解物は時々かき混ぜながら氷上で１時間インキュベートした。溶解物を１００００×Ｇにて４℃で１０分間遠沈し、新しいチューブに移し、Ｈｅｒ３タンパク質を、ＢＣＡアッセイ(Pierceカタログ番号２３２２５)を用いて定量化した。
【０２６３】
結果
ｓｈＲＮＡによるｃ−ｍｅｔ発現のノックダウンによりｐＥＧＦＲレベルが低減し、ＨＥＲ３タンパク質レベルが有意に増加した(図１４Ａ)。ＦＡＣＳ分析により、ｃ−ｍｅｔノックダウン後の表面ＨＥＲ３レベルの増加が明らかになった(図１４Ｂ)。ＥＢＣ-１ｓｈＭｅｔ-４.１２異種移植片腫瘍でのＣ-ｍｅｔノックダウンによりＨＥＲ３タンパク質レベルが増加した(図１４Ｃ)。  
これらのデータは、ｃ−ｍｅｔ活性がＨＥＲ３発現レベルを制御しうることを示す。具体的には、ｃ-ｍｅｔが阻害されると、ＨＥＲ３タンパク質レベルの増加とｐＥＧＦＲレベルの減少が起こった。ｃ−ｍｅｔ阻害後のｐＥＧＦＲの減少はおそらくＥＧＦＲリガンドによる自己分泌シグナル伝達の減少によるためであり、ＨＥＲ３レベルの増加はエルロチニブ感度を増しうる。これは他者によっても示されている(例としてYauch et al. Clin Cancer Res (2005) 11:8686-98)。これらの結果からＨＥＲ３活性(例えばＨＥＲ２によるシグナル伝達)がｃ-ｍｅｔシグナル伝達のその後の阻害を増やしうることが示唆され、さらにｃ-ｍｅｔとＨＥＲ３阻害薬による併用療法の癌治療への使用を裏付けるものである。
【０２６４】
実施例３：ｃ−ｍｅｔノックダウンとＨＥＲ２阻害薬ペルツズマブによる処置の組合せにより、腫瘍増殖が有意に阻害された
ｃ−ｍｅｔ機能が部分的に阻害されている細胞における腫瘍生存の維持に、ＨＥＲ２と、結合パートナーであるＨＥＲ３との二量体形成が重要であるか否かを試験するために、ＥＢＣ-１ ｓｈＭｅｔ-４．５腫瘍保持動物を、ペルツズマブとＤｏｘの組合せにて処置した。
【０２６５】
材料及び方法
試験材料。  ペルツズマブは、GenentechのAntibody Engineering部門から清澄な液状で提供され、１Ｘ  ＰＢＳ中で希釈された。コントロール抗体のマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ１０Ｄ９−１Ｅ１１−１Ｆ１２（抗ブタクサ）抗体と、ヒトＩｇＧ１アイソタイプｈｕ５Ｂ６（抗ｇＤ）抗体は、GenentechのAntibody Engineering部門から清澄な液状で提供され、１Ｘ  ＰＢＳ中で希釈された。０．５又は１ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を５％スクロース水中において新たに調製し、３日ごとに取り替えた。Ｄｏｘ試験では、コントロール動物に５％スクロース水を与え、３日ごとに取り替えた。材料は、４℃〜８℃の温度範囲に維持するように設定された冷蔵庫に保存した。
【０２６６】
動物種。  ６〜８週齢のヌードマウス(ｎｕ／ｎｕ)は、Charles River Laboratories(CRL)から入手し、試験を行う前に少なくとも１週間Genentechの飼育器に慣れさせた。動物は、高性能微粒子を供給するフィルター(ＨＥＰＡ)を有する部屋の換気されたケージシステムに収容した。健康に見え、明らかな異常がない動物のみを、研究に用いた。
【０２６７】
試験設定。  ＥＢＣ-１−ｓｈＭｅｔ−４．５細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen)、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１０％ウシ胎児血清からなる増殖培地中で培養した。マウスへの接種のための細胞を調製するために、細胞をトリプシン処理し、１０ミリリットルの滅菌１×リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)にて洗浄した。細胞のサブセットはトリパンブルー排除によって計数し、残りの細胞は１００μｌの滅菌１×ＰＢＳに再懸濁し、１ミリリットルにつき５×１０７細胞の濃度にした。マウスの右肩甲下領域に、５×１０６のＥＢＣ-１細胞を皮下注射した。２００ｍｍ３の平均体積に達するまで、腫瘍をモニターした。
【０２６８】
マウスをランダムに各１０匹のマウスからなる４つのグループに分け、処置を開始した(表Ｘにまとめる)。グループ１のマウスは、抗ブタクサコントロール抗体（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、週に１回、５週間）で処置し、５％スクロースを含む飲料水を与えた。グループ２のマウスは、抗ブタクサコントロール抗体（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、週に２回、５週間）で処置し、５％スクロース中ドキシサイクリン（１ｍｇ／ｍＬ））を含む飲料水を与えた。グループ３のマウスは、ペルツズマブ（２Ｃ４、５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、週に１回、４週間）で処置し、５％スクロースの飲料水を与えた。グループ４のマウスは、ペルツズマブで処置し、及び５％スクロース中ドキシサイクリンを含む飲料水を与えた（上述と同様）。抗体投与を５週間続け、その後は動物のドキシサイクリン処置を維持したが、抗体の投与は停止した。２９日目まで腫瘍体積をモニターした。
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【０２６９】
ここに報告される全ての試験において、腫瘍が２０００ｍｍ３超に達するか、又は壊死病変を示す場合、動物を試験から除外した。いずれかのグループにおいて５０％を上回る動物が除外された場合、そのグループの処置を停止し、全ての動物を試験から除外した。マウスのすべての研究及び取扱いは、Institutional Animal Care and Use Committee(ＩＡＣＵＣ)ガイドラインに従った。
【０２７０】
腫瘍及び体重の測定。  腫瘍の体積を、UltraCal-IVノギス（Model 54-10-111, Fred V. Fowler Company, Inc.; Newton, MA) を使用して二次元（長さと幅）で測定した。Excel v11.2に以下の式を使用して、腫瘍の体積を算出した：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）×０．５
【０２７１】
有効性データ分析。  腫瘍阻害は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ３．６(Synergy Software; Reading, PA)を使用してプロットした。パーセント増殖阻害(％Ｉｎｈ)を以下のようにして算出した：
％Ｉｈｎ＝１００×（１−[腫瘍サイズ(処置済み)／腫瘍サイズ(ベヒクル)]）
【０２７２】
腫瘍発生は、試験終了時の各グループの測定可能な腫瘍の数によって決定した。部分的な退縮(ＰＲ)は、研究の間の何れかの日での開始腫瘍体積の５０％超かつ１００％未満の腫瘍退縮と定義される。完全な退縮(ＣＲ)は、研究の間の何れかの日での開始腫瘍体積からの１００％の腫瘍退縮と定義される。
【０２７３】
平均腫瘍体積及び平均値の標準誤差(ＳＥＭ)は、ＪＭＰソフトウェア、バージョン５.１.２(SAS Institute; Cary, NC)）を使用して算出した。データ分析及びスチューデントｔ検定又はダネットｔ検定用いたｐ値の生成も、ＪＭＰソフトウェア、バージョン５.１.２を使用して行った。 
【０２７４】
結果
ｃ−ｍｅｔ発現をノックダウンするためにｓｈＲＮＡを発現するように誘導されうるＥＢＣ-１安定クローンを、ｃ−ｍｅｔを標的とするテトラサイクリン誘導性短型ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)を保持するレトロウイルスを使用して生成した。ＥＢＣ-１非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)細胞株は、ｃ-ｍｅｔについて高度に増幅され、リガンド非依存性様式で細胞及び腫瘍の増殖を促進するように働くｃ-ｍｅｔレセプターを大量に発現する。ＥＢＣ−１  ｓｈＭｅｔ−４．５クローンは、ＤｏｘによるｓｈＲＮＡ発現の誘導に続き、ｃ−ｍｅｔ発現の部分的ノックダウンを示した。ｃ−ｍｅｔ発現の減少は、このクローンの細胞増殖及び生存にも影響した：インビトロ細胞生存率アッセイにてアッセイした場合、ｓｈＲＮＡ発現の誘導により細胞数が減少し、異種移植片モデルの腫瘍形成の後にｓｈＲＮＡ発現を誘導すると腫瘍増殖が阻害されたが、腫瘍退縮は生じなかった。後述するように、ｃ−ｍｅｔ発現のノックダウンとペルツズマブによる処置との組み合わせの効果を評価する実験に使用するために、クローンｓｈＭｅｔ−４．５が選択された。
【０２７５】
ｃ−ｍｅｔ機能が部分的に阻害される細胞での腫瘍生存の維持に、ＨＥＲ２と、結合パートナーであるＨＥＲ３との二量体形成が重要であるか否かを試験するために、ＥＢＣ−１  ｓｈＭｅｔ４．５−腫瘍を有する動物を、ペルツズマブとＤｏｘの併用により処置した。
【０２７６】
ＥＢＣ−１  ｓｈＭｅｔ−４．５ＮＳＣＬＣ細胞株をヌードマウスに接種し、次いで移植された細胞が約２００ｍｍ３の腫瘍を形成するまで腫瘍の増殖をモニターした。次に、マウスを４つの治療群、即ち、グループ１：コントロール、グループ２：ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）、グループ３：ペルツズマブ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）、及びグループ４：ペルツズマブ＋Ｄｏｘ（表１参照）にグループ分けした。
【０２７７】
Ｄｏｘを含む飲料水での処置によるｃ−ｍｅｔ遺伝子発現のノックダウンによって、総Ｍｅｔタンパク質レベルが低下し、最終的に、２９日目においてスクロースコントロールと比較した場合、有意であるが不完全な腫瘍増殖の阻害を引き起こした（５４％の腫瘍阻害：スチューデントｔ検定、ρ＝０．０１１）（図１５）。ペルツズマブのみによる処置により４３．６％の腫瘍が阻害されたが、この処置は２９日目においてスクロースコントロールと比較した場合、有意なレベルには達していなかった（スチューデントｔ検定、ρ＝０．０８４）。
【０２７８】
ペルツズマブとＤｏｘの併用による処置により、有効性が有意に向上し、２９日目においてスクロースコントロールと比較した場合、腫瘍増殖に７９．４％の減少をみた（スチューデントｔ検定、ρ＝０．００１、図１５）。ペルツズマブ及びＤｏｘで処置した腫瘍は、４〜５週に亘る実験期間を通して固定的であった。ペルツズマブ＋Ｄｏｘ治療群で観察された有効性の上昇は、Ｄｏｘ処置のみの群に観察されたものより有意に良好であった（スチューデントｔ検定、ρ＝０．０３）；しかし、ペルツズマブとＤｏｘの併用治療は、２９日目においてペルツズマブのみで処置した群と比較した場合、単剤としてのペルツズマブに対する応答に観察された高い可変性のため、わずかに有意とは言えなかった（スチューデントｔ検定、ρ＝０．０８３）。
【０２７９】
これらの結果は、ＥＢＣ-１ｓｈＭｅｔ-４．５異種移植片モデルにおけるｃ−ｍｅｔの阻害とＨｅｒ２二量体形成の阻害とが、腫瘍増殖を有意に低減させたことを示す。ゆえに、ｃ−ｍｅｔ発現及び活性が部分的に阻害される腫瘍は、ＨＥＲ経路を利用して腫瘍増殖及び生存を確認する。これは、ｃ−ｍｅｔが阻害される腫瘍の増殖及び腫瘍生存にＨＥＲが参画していることを示す。
【０２８０】
参考文献の部分的リスト
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【０２８１】
上記の発明について、その明瞭な理解のために、説明及び例示としてある程度詳細な説明を行ったが、その説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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