(57)【要約】  ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５またはそのホモログまたはオーソログの発現または活性を改変することによるＨＤＬ関連疾患の処置に関する方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦａｒｐまたはＳｔｋ遺伝子またはそのホモログまたはオーソログによりコード化されたポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含む、単離抗体またはその機能性フラグメントの使用であって、該抗体または機能性フラグメントが細胞上の表面受容体に結合することにより、ＨＤＬ関連疾患の発症を阻止または改善する使用。
【請求項２】
Ｆａｒｐ遺伝子がＦａｒｐ２遺伝子またはそのホモログまたはオーソログである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
Ｓｔｋ遺伝子がＳｔｋ２５遺伝子またはそのホモログまたはオーソログである、請求項１記載の使用。
【請求項４】
有効量の請求項１〜３のいずれかに記載の抗体またはその機能性フラグメントを対象に投与することを含む、ＨＤＬ関連疾患の処置方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体または機能性フラグメントおよびそれに適した医薬上許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６】
有効量の請求項５記載の医薬組成物を処置を必要とする対象に投与することを含む、ＨＤＬ関連疾患の処置方法。
【請求項７】
ＨＤＬ関連疾患処置用の医薬の製造に関する単離抗体またはその機能性フラグメントの使用であって、該抗体または機能性フラグメントが、Ｆａｒｐ遺伝子またはＳｔｋ遺伝子またはそのホモログまたはオーソログによりコード化されたポリペプチドのエピトープに特異的である抗原結合領域を含む使用。
【請求項８】
Ｆａｒｐ遺伝子がＦａｒｐ２またはそのホモログまたはオーソログである、請求項７記載の使用。
【請求項９】
Ｓｔｋ遺伝子がＳｔｋ２５遺伝子またはそのホモログまたはオーソログである、請求項７記載の使用。
【請求項１０】
請求項１記載の抗体またはその機能性フラグメントをコード化する遺伝子をもつトランスジェニック動物。
【請求項１１】
ＦａｒｐまたはＳｔｋまたはそのホモログまたはオーソログの発現または活性の阻害を含む、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置方法。
【請求項１２】
ＦａｒｐがＦａｒｐ２遺伝子またはそのホモログまたはオーソログである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＳｔｋがＳｔｋ２５遺伝子またはそのホモログまたはオーソログである、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ＦａｒｐまたはＳｔｋの発現または活性を阻害する段階が、さらにＦａｒｐまたはＳｔｋ遺伝子またはそのホモログまたはオーソログによりコード化されるポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含む単離抗体またはその機能性フラグメントを用いて活性を阻害することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
抗原結合領域を含む単離抗体または機能性フラグメントが細胞上の表面受容体に結合することにより、ＨＤＬ関連疾患の発症を阻止または改善する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５またはそのホモログまたはオーソログの発現または活性の改変を含む、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置方法。
【請求項１７】
冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の指標であるＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５またはそのホモログまたはオーソログの対立遺伝子を検出することを含む、冠動脈疾患または冠動脈疾患に対する易罹患性の検出方法。
【請求項１８】
対立遺伝子がＬｅｕ８２１またはＰｒｏ８２１である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置の効力の測定方法であって、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症を処置し、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置の効力が決定されるようにＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５またはそのホモログまたはオーソログのレベルを対照標準と比較することを含む方法。
【請求項２０】
ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５またはそのホモログまたはオーソログの発現または活性を改変することにより、血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの増加を誘導することに基づいた、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の同定方法であって、生物試料を候補薬剤と接触させ、候補薬剤との接触の前後において試料中の総血漿リポタンパク質またはＨＤＬ−Ｃのレベルを測定することを含み、ＨＤＬ−Ｃの増加を、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の指標とする方法。
【請求項２１】
冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の同定方法であって、既知基質の存在下でＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５またはそのホモログまたはオーソログを候補薬剤と接触させることを含み、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５またはそのホモログまたはオーソログの活性の改変により、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤として候補薬剤を同定する方法。
【請求項２２】
接触段階を培養細胞で実施する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
接触段階をインビボで実施する、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５またはそのホモログまたはオーソログが内因性または外因性である、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
対象においてＨＤＬ−Ｃレベルを上昇させるモジュレーション剤の投与を含む、ＨＤＬ関連疾患のモジュレーション方法。
【請求項２６】
ＨＤＬ関連疾患が、アテローム性動脈硬化症、脂質障害、アルツハイマー病、酸化ストレス、肥満、心臓血管疾患、２型糖尿病およびインスリン抵抗性から成る群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
脂質障害が、高コレステロール、脂質異常症候群、高トリグリセリド、脂質異常症、異常リポタンパク血症、高脂血症、家族性高コレステロール血症および家族性高トリグリセリド血症から成る群から選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
薬剤が、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５またはそのホモログまたはオーソログの発現または活性を改変する、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
モジュレーション剤が、小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよび抗体から成る群から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ＨＤＬ関連疾患が、対象のＨＤＬ−Ｃレベルが一般に容認された正常ＨＤＬ−Ｃレベルを下回っている疾患である、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
ＨＤＬ関連疾患が、対象のＨＤＬ−Ｃレベルが関連集団の平均ＨＤＬ−Ｃレベルを下回っている疾患である、請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
薬剤を医薬上許容される担体と共に投与する、請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援
本発明は、アメリカ心臓協会交付金ＡＨＡ番号：０７２５９０５Ｔの下での交付金により一部支援された。合衆国政府は、本発明に対しある種の権利を有し得る。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置方法に関する。特に、本方法では、Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５の発現および／または活性を阻害・調節することにより、高比重リポタンパク質レベルを増加させることを含む。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アテローム性動脈硬化症は、脂質蓄積、炎症応答、細胞死および動脈壁での線維増多を特徴とする。アテローム性動脈硬化症は、特に米国および西欧諸国における罹病率および死亡率の主たる要因である。例えば家族歴など遺伝的に支配されている因子、高い血漿低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルおよび低い血漿高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）レベル、高血圧、糖尿病、老齢、男性であること、および喫煙、高脂肪で過度の加工食品の食べ過ぎおよび運動不足などの生活様式因子を含め、多くの危険因子がアテローム性動脈硬化症の発症に関与している。ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）はアテローム発生促進性であるため、血漿ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させ、心臓血管の有害事象の危険性を縮小させるためにスタチン薬剤が開発された。最近の研究は、現行の指針目標を下回るレベルまでＬＤＬ−Ｃレベルを低下させると、さらにアテローム発生が阻止され、冠動脈の有害事象も減少することを示唆している。スタチン薬剤は新たな心臓血管の有害事象を３分の１に減少させた。これは意義深いことであるが、追加治療が必要とされるのは明らかである。血漿ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）レベルの増加によりアテローム発生が阻止されるという証拠はあるが、有効なＨＤＬ上昇剤が多数存在するとは思われない。したがって、ＨＤＬレベルを高める薬剤の同定が要望されている。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要約
本発明は、Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５およびその適切なホモログおよびオーソログが、血漿中の高比重リポタンパク質レベルを調節するという予想外の発見に基づいている。Ｈｄｌｑ１４の存在は、同一のＳｏａｔＩ遺伝子を持ち、Ａｐｏａ２ＱＴＬを特定する鍵アミノ酸は異ならないが、Ｈｄｌｑ１４領域でのハプロタイプが異なる系統間で交雑を実施することにより確認される。この交雑によりＨｄｌｑ１４の存在が確認されたとき、ＱＴＬ領域は、交雑、比較ゲノム学、ハプロタイプ分析および発現および配列決定試験を組み合わせることにより狭められた。
【０００５】
すなわち、本発明は、Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５、およびその適切なホモログおよびオーソログが血漿中の高比重リポタンパク質レベルを調節するという新たな発見に関する。血漿リポタンパク質レベルに影響を及ぼすこのタンパク質の役割は、未だ判明していない。本発明は、Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５がＨＤＬコレステロールの血漿レベルに影響を及ぼすこと、具体的には、Ｆａｒｐ２活性調節およびＳｔｋ２５活性阻害を利用することにより、血漿ＨＤＬコレステロールレベルを上昇させ、アテローム性動脈硬化症を処置することができることを示す。
【０００６】
したがって、一態様において、本発明は、Ｆａｒｐ遺伝子（例えば、Ｆａｒｐ２遺伝子）またはＳｔｋ遺伝子（例えば、Ｓｔｋ２５遺伝子）によりコード化されるポリペプチドのエピトープに特異的である抗原結合領域を含む単離抗体またはその機能性フラグメントの使用であって、該抗体または機能性フラグメントは、細胞上の表面受容体に結合し、ＨＤＬ関連疾患の発症を阻止または改善する使用に関する。
【０００７】
一実施態様において、本発明は、有効量の抗体またはその機能性フラグメントを対象に投与することを含む、ＨＤＬ関連疾患の処置方法に関する。
【０００８】
本発明の抗体は、抗体またはその機能性フラグメントおよび医薬上許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物に製剤化され得る。医薬組成物は、有効量の抗体または機能性フラグメントを含む医薬組成物を処置を必要とする対象に投与することによるＨＤＬ関連疾患の処置方法として使用することができる。
【０００９】
本発明はまた、ＨＤＬ関連疾患処置用医薬の製造を目的とする単離抗体またはその機能性フラグメントの使用であって、該抗体または機能性フラグメントは、Ｆａｒｐ遺伝子またはＳｔｋ遺伝子、またはそのオーソログまたはホモログ（例えば、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５遺伝子、またはそのオーソログまたはホモログ）によりコード化されるポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含む使用に関する。
【００１０】
一実施態様において、本発明は、ＦａｒｐまたはＳｔｋの発現の調節を含む、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置方法に関する。特定の一実施態様において、ＦａｒｐはＦａｒｐ２遺伝子であり、ＳｔｋはＳｔｋ２５遺伝子である。別の実施態様において、ＦａｒｐまたはＳｔｋの発現および／または活性の阻害段階では、さらにＦａｒｐ遺伝子（例えば、Ｆａｒｐ２遺伝子）またはＳｔｋ遺伝子（例えば、Ｓｔｋ２５遺伝子）、またはそのホモログまたはオーソログによりコード化されるポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含む単離抗体またはその機能性フラグメントを用いて活性を阻害することを含む。特に、抗原結合領域を含む単離抗体またはその機能性フラグメントは、細胞上の表面受容体に結合し、ＨＤＬ関連疾患の発症を阻止または改善する。また、抗体または機能性フラグメントをコード化する遺伝子をもつトランスジェニック動物も本発明の範囲内に含まれる。
【００１１】
一実施態様において、本発明は、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５またはそのホモログまたはオーソログの発現または活性を改変することを含む冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置方法に関する。
【００１２】
別の実施態様において、本発明は、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の指標であるＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５の対立遺伝子またはそのホモログまたはオーソログの検出を含む、冠動脈疾患または冠動脈疾患に対する易罹患性の検出方法に関する。特定の一実施態様では、対立遺伝子は、ＦＡＲＰ２のＬｅｕ８２１またはＰｒｏ８２１である。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置の効力の測定方法であって、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症を処置し、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置の効力が決定されるようにＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５またはそのホモログまたはオーソログのレベルを対照標準と比較することを含む方法に関する。
【００１４】
別の実施態様において、本発明は、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５またはそのホモログまたはオーソログの発現または活性を改変することにより、血漿ＨＤＬ−Ｃレベルの増加を誘導する、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の同定方法であって、生物試料を候補薬剤と接触させ、候補薬剤との接触の前後において試料中の総血漿リポタンパク質またはＨＤＬ−Ｃのレベルを測定することを含み、ＨＤＬ−Ｃの増加を、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の指標とする方法に関する。
【００１５】
別の実施態様では、本発明は、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤の同定方法であって、既知基質の存在下でＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５またはそのホモログまたはオーソログを候補薬剤と接触させることを含み、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５またはそのホモログまたはオーソログの活性の改変により、冠動脈疾患またはアテローム性動脈硬化症の処置に有用な薬剤として候補薬剤を同定する方法に関する。特定の一実施態様では、接触段階を培養細胞で実施する。別の実施態様では、接触段階を生体内で実施する。別の実施態様において、ＦＡＲＰ２またはそのホモログまたはオーソログは、内因性または外因性である。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は、対象においてＨＤＬ−Ｃレベルを上昇させるモジュレーション剤の投与を含む、ＨＤＬ関連疾患のモジュレーション方法に関する。一実施態様において、ＨＤＬ関連疾患は、アテローム性動脈硬化症、脂質障害、アルツハイマー病、酸化ストレス、肥満、心臓血管疾患、２型糖尿病およびインスリン抵抗性から成る群から選択される。別の態様において、脂質障害は、高コレステロール、脂質異常症候群、高トリグリセリド、脂質異常症、異常リポタンパク血症、高脂血症、家族性高コレステロール血症および家族性高トリグリセリド血症から成る群から選択される。特定の一実施態様において、薬剤は、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５またはそのホモログまたはオーソログの発現または活性を改変する。一特定実施態様において、モジュレーション剤は、小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよび抗体から成る群から選択される。特定の一実施態様において、ＨＤＬ関連疾患は、対象のＨＤＬ−Ｃレベルが一般に容認された正常ＨＤＬ−Ｃレベルを下回っている疾患である。特定の一実施態様において、ＨＤＬ関連疾患は、対象のＨＤＬ−Ｃレベルが関連集団の平均ＨＤＬ−Ｃレベルを下回っている疾患である。特定の一実施態様では、薬剤を医薬上許容される担体と共に投与する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、マウスＨＤＬ ＱＴＬおよびそれらのヒトに一致したＱＴＬのＣｈｒ.（染色体）１地図である。垂直線は染色体を表し、頂点に動原体を記している。マウスＨＤＬ ＱＴＬを、染色体の左側のバーにより表す。各バーは、一交雑種からのＱＴＬを表す。ＱＴＬサイズは、９５％信頼区間（ＣＩ）、１.５−ＬＯＤドロップ間隔（９５％ＣＩが有効でない場合）、またはＬＯＤスコアピークを中心に±１０ｃＭ（ＣＩもＬＯＤスコアの数字も有効でない場合）のいずれかとして与えている。ヒトＨＤＬ ＱＴＬのマウス相同性領域を、染色体の右側のバーにより表し、これらのヒトＱＴＬの染色体番号をそれらの右側に付す。
【００１８】
【図２】図２は、Ｈｄｌｑ１４が、ＮＺＢ×ＮＺＷ交雑において確認されることを示す。（Ａ）２６４の雄および雌Ｆ２子孫の対数変換した血漿ＨＤＬ濃度の分布。（Ｂ）詳細なＬＯＤスコアは交雑種ＮＺＢ×ＮＺＷからのＣｈｒ１で血漿ＨＤＬに関して示され（黒線）、Ｈｄｌｑ１４は交雑種を合わせることにより縮小している（青線）。Ｘ軸は、センチモルガン単位でマーカー位置を示し、Ｙ軸は、ＬＯＤスコアを示す。交雑種の組み合わせにおいて、統計的手法を用いてＱＴＬを狭めることにより、現（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ２交雑種および前（Ｂ６×１２９）Ｆ２交雑種の両方からのＨｄｌｑ１４に関するデータを合わせた。青線におけるｃＭ９２での第２ピークは、Ｂ６および１２９間のＡｐｏａ２遺伝子差異が原因であるＱＴＬを表す。（Ｃ）血漿ＨＤＬでのピークマーカーＤ１Ｍｉｔ３３６での対立遺伝子効果。ＷＷ、ＢＢおよびＢＷは、それぞれマーカー遺伝子座においてＮＺＷ対立遺伝子、ＮＺＢ対立遺伝子について同型接合体および異型接合体であるＦ２マウスを示す。示された遺伝子座に特定遺伝子型をもつＦ２の平均ＨＤＬ±ＳＥＭとして値を表す（それぞれ、雄および雌においてＰ＝０.００８および０.０００２）。
【００１９】
【図３】図３は、異なる戦略により狭められたＨｄｌｑ１４領域を示す。（Ａ）９５％ＣＩは、Ｂ６×１２９交雑種におけるＭｂ８２〜１６２間である。（Ｂ）９５％ＣＩは、ＮＺＢ×ＮＺＷ交雑種におけるＭｂ８０〜１２５間である。（Ｃ）Ｈｄｌｑ１４は、交雑種を合わせることにより１２５−遺伝子２７.３−Ｍｂ領域（Ｍｂ８９.８〜１１７.１）に縮小された。（Ｄ）Ｈｄｌｑ１４を検出した交雑種ＮＺＢ×ＮＺＷおよびＢ６×１２９を用いると、ハプロタイプ分析により、領域は１９遺伝子を含む２.３Ｍｂに縮小された。（Ｅ）Ｈｄｌｑ１４を検出し得なかった交雑種Ｂ６×Ｃ３ＨおよびＮＯＮ×ＮＺＯを用いると、ハプロタイプ分析により、ＱＴＬはさらに２遺伝子に縮小された。
【００２０】
【図４】図４は、１２９、Ｂ６、ＮＺＢおよびＮＺＷ系統間におけるＣｈｒ１でのＭｂ８９.８〜９６の範囲にわたる領域の細かいハプロタイプ分析地図である。物理的位置の縦行は、Ensemblデータベース（ＮＣＢＩ build３６）に従って動原体からのメガ塩基での距離を示す。マウス系統を図の上部に示す。ＳＮＰは、系統間において各位置で観察されたヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧおよびＣとして示されている。小文字で記載されたＳＮＰは、周囲のハプロタイプに基づく予測であることを意味する。１２９およびＮＺＷ系統間で共有されるゲノム領域を緑色で強調しており、Ｂ６および１２９系統が共有する領域とは異なる領域を黄色で強調している。共通のハプロタイプブロックを、３またはそれより多い保存的共有対立遺伝子であるものとして定義する。共通ＳＮＰを、共遺伝仮説に従って四角で囲んだ部分として示す。
【００２１】
【図５】図５は、配列比較を示す。（Ａ）多形の原因のＰｒｏ８２１Ｌｅｕは、配列決定することにより１６系統で同定された。対立遺伝子Ｃ（上部）は、Ｂ６、Ｃ３Ｈ、ＣＡＳＴ、ＰＥＲＡ、ＮＯＮ、ＮＺＢ、ＮＺＯ、ＲIIIおよびＳＭ系統で同定され、対立遺伝子Ｔ（下部）は、１２９、Ａ／Ｊ、ＤＢＡ２、ＦＶＢ、Ｉ／ＬｎＪ、ＮＯＤ、ＮＺＷおよびＳＪＬ系統で同定された。（Ｂ）ＦＡＲＰ２におけるプロリン８２１は、哺乳類種間における保存領域にある。
【００２２】
【図６】図６は、位置および配列データを示す。（Ａ）ＬＯＤスコアは、交雑種ＮＺＢ×ＮＺＷ（黒色）、ＮＺＯ×ＮＯＮ（オレンジ色）、Ｂ６×Ｃ３Ｈ（赤色）およびＰｅｒａ×ＤＢＡ（青色）におけるＣｈｒ１でプロットされる。交雑種ＮＯＮ×ＮＺＯおよびＢ６×Ｃ３Ｈは、Ｈｄｌｑ１４を有さず、交雑種ＰＥＲＡ×ＤＢＡ２はその位置にＱＴＬを有する。（Ｂ）ＮＺＯおよびＮＯＮ、Ｂ６およびＣ３ＨおよびＰＥＲＡおよびＤＢＡ／２系統対間で遺伝子Ｅ０３００１０Ｎ０８Ｒｉｋ、Ｓｎｅｄ１、Ｍｔｅｒｆｄ２、Ｐａｓｋ、Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５をもつ領域に関するハプロタイプ地図。交雑種ＮＯＮ×ＮＺＯおよびＢ６×Ｃ３Ｈにおけるハプロタイプは、底部５つのＳＮＰについては同一であり、Ｆａｒｐ２におけるＣｎ ＳＮＰ（９５.４４８０Ｍｂ）およびＳｔｋ２５におけるＳＮＰ全部が含まれる。しかしながら、底部５より上のＳＮＰは全て異なる。交雑種ＰＥＲＡ×ＤＢＡ２は底部５つのＳＮＰが異なる。
【００２３】
【図７】図７は、バックグラウンドＡＰＯＡ２ Ａｌａ６１（上方パネル）およびＶａｌ６１（下方パネル）でそれぞれＦＡＲＰ２変異型Ｌｅｕ８２１およびＰｒｏ８２１をもつ近親交配マウス系統におけるＨＤＬ濃度を示す。上方パネル：３０系統を２タイプ（ＦＡＲＰ２ Ｌｅｕ８２１をもつ１２系統およびＦＡＲＰ２ Ｐｒｏ８２１をもつ１８系統）に分けた。下方パネル：１１系統を２タイプ（ＦＡＲＰ２ Ｌｅｕ８２１をもつ６系統およびＦＡＲＰ２ Ｐｒｏ８２１をもつ５系統）に分けた。血漿ＨＤＬ濃度（平均±ＳＥＭ、ｍｇ／ｄｌ）は、４時間絶食させた７〜１０週齢雌（左側２列）および雄（右側２列）の群から得られた（Mouse Phenome Database）。各群は、１０〜４０マウス（２４±７雄および２２±６雌、平均±ＳＤ）により構成された。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、染色体１におけるＨｄｌｑ１４の存在、およびＦａｒｐ２およびＳｔｋ２５が、量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）Ｈｄｌｑ１４について根元的であると思われる遺伝子であるという予想外の発見に関する。さらに試験すると、ＦＡＲＰ２ Ｌｅｕ８２１変異型は、ＦＡＲＰ２ Ｐｒｏ８２１変異型よりも著しく高い血漿ＨＤＬレベルを有していた。
【００２５】
心臓血管疾患は、合衆国における罹病率および死亡率の主原因である。ＣＶＤの約８％は、５０歳未満のアメリカ人で起こる。早発性ＣＶＤ患者の約４０％は、低い高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ）を示すと推定され、これが、ＣＶＤ患者における最も一般的なリポタンパク質疾患を示す（Genest, J. et al., Circulation, 85:2025-2033, 1992）。ＨＤＬレベルおよびＣＶＤ間のこの逆関係は、ＨＤＬレベルの変動の一因となる遺伝因子に対する関心を引き出した。ヒトにおいてＨＤＬに関する連鎖分析を実施する場合、固有の難しさがあるため、多くの哺乳類遺伝学者は、マウスモデルに転向した。この設定におけるマウス近親交配系統の使用は、環境、交配スキームおよび詳細な表現型分析などの実験パラメーターに対し影響が及ぼされ得る対照基準度を考慮すれば、ヒト遺伝研究にとって代わる現実味のある方法であることが判明した（Allayee, H. et al., Front. Biosci., 11:1216-1226, 2006）。
【００２６】
血漿ＨＤＬレベルに影響を及ぼす１００を超えるＱＴＬがマウスで同定され、最も高頻度のものは、交雑種のそれぞれにおけるＡｐｏａ２の遺伝子変異故に、遠位染色体１で同定されている。ＮＺＢ×ＮＺＷ交雑種におけるＡｐｏａ２の主要遺伝子効果について制御することにより、血漿ＨＤＬレベルに関して近位染色体１での別のＱＴＬの確認が本明細書では開示されている。この遺伝子座のピークはＤ１Ｍｉｔ３３６（５８.７ｃＭ、９８.４Ｍｂ）にあり、９５％信頼区間は、交雑種Ｂ６×１２９で以前に同定されたＨｄｌｑ１４と重複した８０Ｍｂから１２５Ｍｂまでである。マウスおよびヒト間のシンテニック分析は、マウスにおいてＨｄｌｑ１４が広がる染色体領域の部分が、ヒトにおける２ｑ３７.２−３７.３の染色体領域と相同性であることを示した。ヒトでは、血漿ＨＤＬは、染色体２ｑ３７.２−３７.３に連関しており（Elbein, S. & Hasstedt, S., Diabetes, 51:528-535, 2002）、従って、Ｈｄｌｑ１４の根元となる遺伝子は、マウスおよびヒトの両方におけるＨＤＬレベル変化に影響を及ぼすと思われ、この仮定は、他の形質、例えばアテローム性動脈硬化（Wang, X. et al., Nature Gen., 37:365-372, 2005）、体脂肪（Krude, H. et al., Nature Gen., 19:155-157, 1998）、肝臓線維生成（Hillebrandt, S. et al., Nature Gen., 37:835-843, 2005）、血圧（Stoll, M. et al., Genome Res., 10:473-482, 2000; Sugiyama, F. et al., Genomics, 71:70-77, 2001）でも見いだされている。
【００２７】
交雑種から同定されたＱＴＬは、限られた組換え事象から検出されたものであるため、大きな信頼区間を有することが多い（Korstanje, R. & Paigen, B., Nature Gen., 31:235-236, 2002）。幾つかの交配戦略を用いることにより、例えば選択的遺伝子解析、組換え子孫試験、間隔特異的共通遺伝子系、前進交雑種系（Darvasi, A. & Soller, M., Genetics, 141:1199-1207, 1995）、組換え近親交配分離試験、組換え近親交配交雑試験、および遺伝的異種ストック（Mott, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12649-12654; 2000; Talbot, C. et al., Nature Gen., 21, 305-308, 1999）など、ＱＴＬは細かく分割され得る（Darvasi, A., Nature Gen., 18:19-24, 1998; McPeek, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12389-12390, 2000; Flint, J. et al., Nature Rev., 6:271-286, 2005）。バイオインフォマティクスツールは、ＱＴＬを狭めるのに迅速かつ経済的な方法であり（DiPetrillo, K. et al., Trends Genet., 21:683-692, 2005）、公開配列、遺伝子型および発現データベースへの最近の投資、および統計的手法の新たな開発により可能となった。交配、比較ゲノム学およびハプロタイプ分析の組み合わせを含むこれらのツールにより、ＱＴＬマッピング間隔を段階的に狭め、最も有望な候補遺伝子を同定する可能性を秘めたさらなる分析用に候補遺伝子の優先順位を決定することが可能となった。このバイオインフォマティクス方法を用いることにより、交雑種ＮＺＢ×ＮＺＷにおいてＨｄｌｑ１４が広がりを見せる４５Ｍｂからの染色体領域は２.３Ｍｂまで効果的に縮小され、位置的候補の数は２２５から試験可能な１９まで縮小された。第２段階において、我々は、ＱＴＬを検出し得なかった２交雑種、ＮＺＯ×ＮＯＮおよびＢ６×Ｃ３Ｈ交雑種における親系統のハプロタイプを使用した。これら２交雑種についての原稿はまだ準備中であるため（Su, Paigen）、未処理遺伝子型および表現型データは、http://phenome.jax.org/pub-cgi/phenome/mpdcgi?rtn=projects/qtlprojlistに保管されている。これら２交雑種に関し、我々は、ＱＴＬが検出されなかったため、全４系統について同一であるハプロタイプについて検索した。これらの交雑種は、Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５遺伝子におけるＳＮＰについて同一ハプロタイプを有していたが、他の１７遺伝子についてハプロタイプは異なっていた。すなわち、これら２交雑種により、ＱＴＬ領域は２遺伝子のみに縮小され、他の１７遺伝子は排除された（図３、段階ｅ）。
【００２８】
Ｈｄｌｑ１４の位置的候補遺伝子について、遺伝子配列決定および発現解析によりさらに優先順位を決定した。ＱＴＬは、タンパク質の量またはタンパク質の機能における親系統間の差異から生じる。従って、ＱＴＬ検出に使用された系統間で配列多形を同定することは、原因遺伝子の決定に重要である。機能的結果は必ずしも明らかになるわけではないが、タンパク質の機能的差異は、ＤＮＡのコーディング領域での配列変化により生じる。Ｂ６、１２９、ＮＺＢおよびＮＺＷ由来のこれら１５の位置的候補遺伝子の完全コーディング配列を比較したところ、６遺伝子、Ｇｌｒｐ１、Ｅ０３００１０Ｎ０８Ｒｉｋ、Ｓｎｅｄ１、Ｍｔｅｒｆｄ２、ＰａｓｋおよびＦａｒｐ２のみが、アミノ酸を変える多形を有することが見出された。全位置的候補遺伝子について、Ｈｄｌｑ１４ ＱＴＬをもたらす１２９、Ｂ６およびＮＺＢ間におけるそれらの発現差異により調べた。Ｓｔｋ２５は、Ｈｄｌｑ１４について異なる対立遺伝子を有する親系統Ｂ６および１２９間または１２９およびＮＺＢ系統間で顕著な発現差異を有し、Ｈｄｌｑ１４について両方とも同一の対立遺伝子を有するＢ６およびＮＺＢ間では発現差異は無いことが見出された。発現差異のこの評価は、Ｓｔｋ２５が現実味のある候補遺伝子であることを示す。Ｆａｒｐ２は、系統全体で完全に一致しているわけではなく、ある程度の発現差異を有し、また保存領域に非同義コーディング領域差異（Ｌｅｕ８２１Ｐｒｏ）を有していた。ハプロタイプデータは、ＮＺＷおよび１２９が、Ｓｔｋ２５でのＡ／Ｊと同じ調節情報を有するが、Ｂ６およびＮＺＢ系統においては異なることを示している。Ａ／ＪおよびＢ６系統間での交雑におけるｅＱＴＬ試験は、Ｓｔｋ２５がそのｅＱＴＬにより調節されることを示しており、ＨＤＬレベルは、Ｂ６およびＡ／Ｊ系統に由来する交雑種においてＢ６同型接合体をもつマウスの場合よりＡ／Ｊ同型接合体をもつマウスの方で著しく高いため（５２.１±８.９対４４.８±７.９、ｐ＝８.８×１０−６）、Ａ／Ｊ、１２９およびＮＺＷ系統は、異なる交雑種におけるＨＤＬレベルに対し同じ高対立遺伝子を与える。すなわち、Ｓｔｋ２５の発現は、１２９およびＢ６、ＮＺＷおよびＮＺＢ系統間ではそれ自体で調節されると思われる。Ｓｔｋ２５は、セリン／トレオニンキナーゼ２５をコード化し、セリン／トレオニンキナーゼは、筋肉および肝細胞におけるＡＭＰＫ活性化の非常に重要な調節因子であり（Imai, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 351:595-601, 2006）、従って、その活性は我々が脂質代謝を理解する上でも重要である。
【００２９】
アミノ酸を変える変異型は遺伝子Ｇｌｒｐ１、Ｅ０３００１０Ｎ０８Ｒｉｋ、Ｓｎｅｄ１、Ｍｔｅｒｆｄ２およびＰａｓｋで同定されたが、交雑種ＮＺＯ×ＮＯＤ、Ｂ６×Ｃ３ＨおよびＰｅｒａ×ＤＢＡで同定されたＨＤＬ ＱＴＬは、これらの遺伝子における多形に起因するとは思われなかった。ＦＡＲＰ２の多形Ｐｒｏ８２１Ｌｅｕは、保存プレックストリン相同性（ＰＨ）ドメインにあり（Lemmon, M., Biochem. Soc. Symp., 81-93, 2007）、それ自体脂質と結合すると考えられている（Klopfenstein, D. & Vale, R., Mol. Biol Cell, 15:3729-3739, 2004）。Ｌｅｕ８２１変異型をもつマウス系統は、Ｐｒｏ８２１変異型をもつものより著しく高い血漿ＨＤＬレベルを有することが見出された。これらの発見は、根元的Ｈｄｌｑ１４遺伝子としてのＦａｒｐ２の存在を裏付けるものであり、Ｆａｒｐ２多形がＨｄｌｑ１４表現型に関与していることを示唆している。
【００３０】
Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５は、物理的位置が互いに非常に近いため、コンジェニックマウスなどの伝統的遺伝子戦略を用いてそれらを分離するのは困難であり、全近親交配系統間においてハプロタイプが同一であるため、別の交雑種で交差を発見することによりそれらを分離することも考えられない。
【００３１】
定義
本明細書で使用されている「ＨＤＬ」の語は、高比重リポタンパク質をいう。ＨＤＬは、血中でのコレステロール輸送体として機能する、ほぼ等量の脂質とタンパク質の複合体を含む。ＨＤＬは、主として肝臓および小腸の内皮細胞で合成され、分泌される。分泌直後、ＨＤＬは、その主要構成成分としてアポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉとも呼ばれる）およびリン脂質を含む円盤状粒子の形態を呈し、新生(nascent)ＨＤＬとも呼ばれる。この新生ＨＤＬは、血中で、末梢細胞の細胞膜からの遊離コレステロールまたは他のリポタンパク質の加水分解過程で生成されたコレステロールを受け取り、その疎水性中心でＬＣＡＴ（レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ）の作用により上記コレステロールから変換されたコレステロールエステルを保持しながら、成熟球状ＨＤＬを形成する。ＨＤＬは、血中で末梢組織からの過剰コレステロールを取り込み、それを肝臓に輸送する「コレステロール逆転送系」と呼ばれる脂質代謝に関する生理学的機能において非常に重要な役割を演じる。コレステロール逆転送系は、アテローム性動脈硬化症に対する予防的作用を誘発すると考えられるため、ＨＤＬのレベルが高いと、アテローム性動脈硬化症および冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）の危険性は低下する。
【００３２】
明細書で使用されている「ＨＤＬモジュレーション剤」の語は、ＨＤＬレベルの改変により、ＨＤＬ関連疾患または状態が改変されるようにＨＤＬの発現または機能性レベルを改変させることができる分子をいう。ＨＤＬモジュレーション剤は、ＨＤＬレベルに影響を及ぼす核酸またはポリペプチドと直接的または間接的に作用することができる。ＨＤＬモジュレーション剤の例としては、限定されるわけではないが、抗体、ｓｉＲＮＡ分子および低分子量化合物がある。一実施態様において、ＨＤＬモジュレーション剤は、Ｆａｒｐ遺伝子（例えば、Ｆａｒｐ２遺伝子）またはＳｔｋ遺伝子（例えば、Ｓｔｋ２５遺伝子）またはそのホモログまたはオーソログによりコード化されるポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合領域を含む単離抗体またはその機能性フラグメントである。抗体または機能性フラグメントは、細胞上の表面受容体に結合することにより、ＨＤＬ関連疾患の発症を予防または改善することができる。
【００３３】
本明細書で使用されている「生物試料」の語は、生物全体またはその組織、細胞または構成部分（例えば、限定されるわけではないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液および精液を含む体液）のサブセットをいう。さらに「生物試料」は、生物全体またはその組織、細胞または構成部分のサブセット、または限定されるわけではないが、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸および尿生殖器官の表面薄片、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、臓器を含むフラクションまたはその一部分から調製されるホモジネート、ライゼートまたは抽出物をいう。たいていの場合、試料を動物から取り出すが、「生物試料」の語は、例えば動物から採取せずに、生体内で分析される細胞または組織を指す場合もあり得る。典型的には、「生物試料」は動物からの細胞を含むが、この語はまた、血液、唾液または尿の非細胞性フラクションなどの非細胞性生物材料を指す場合もあり得、これらは癌関連ポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルの測定に使用され得る。さらに「生物試料」は、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含む、生物を増殖させていた栄養ブイヨンまたはゲルなどの培地も包含する。
【００３４】
本明細書で使用されている「核酸」の語は、１本または２本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびその重合体を包含する。この語は、合成的、天然的および非天然的に存在し、対照標準核酸と類似した結合特性を有し、対照標準ヌクレオチドと同様に代謝される既知ヌクレオチド類似体または修飾バックボーン残基または結合を含む核酸を包含する。上記類似体の例としては、限定は無いが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチドおよびペプチド−核酸（ＰＮＡ）がある。核酸配列はまた、上記核酸の天然に存在する対立遺伝子変異型を含む。
【００３５】
本明細書で使用されている「オリゴヌクレオチド」の語は、ホスホジエステル結合により連結された２またはそれより多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成り、好ましくは約６ないし約３００のヌクレオチド長を含む核酸分子をいう。オリゴヌクレオチドのサイズは、オリゴヌクレオチドの最終的機能または使用を含む多くの因子に依存する。好ましくは、例えば伸長プライマーとして機能するオリゴヌクレオチドは、触媒、例えばＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で伸長産物の合成を開始させるのに十分なほど長いものである。さらに、本明細書で使用されている「オリゴヌクレオチド」の語は、構造的に修飾されてはいるが（「修飾オリゴヌクレオチド」）、非修飾オリゴヌクレオチドと同様に機能するオリゴヌクレオチドも包含する。修飾オリゴヌクレオチドは、例えばホスホロチオエートのように、改変糖部分または糖間結合などの非天然部分を含み得る。
【００３６】
本明細書で使用されている「ポリペプチド」の語は、単量体がアミノ酸であり、ペプチドまたはジスルフィド結合により連結されている重合体をいう。またこの語は、約８ないし約５００アミノ酸長の完全長天然アミノ酸配列またはそのフラグメントを包含する。さらに、非天然アミノ酸、例えば、ベータ−アラニン、フェニル、グリシンおよびホモアルギニンも含まれ得る。本発明で使用されるアミノ酸は全て、Ｄ−またはＬ−光学異性体であり得る。また、ポリペプチド配列は、上記ポリペプチドの天然対立遺伝子変異型も包含する。
【００３７】
本明細書で使用されている「量的形質遺伝子座」（ＱＴＬ）分析は、複雑な特性を調節する新規遺伝子の発見手段をいう（Abiola, O. et al., Nature Rev., 4:911-916, 2003）。マウス疾患モデルで検出されるＱＴＬからヒト疾患ＱＴＬの位置を予測できることが多いため、ＱＴＬ分析は、生物医学研究にとって特に重要である。マウスおよびヒトの両方に関する相同性領域における疾患ＱＴＬのこの位置は、同一遺伝子が両種においてこれらの特性を調節することを示唆している。すなわち、マウスモデルを用いるＱＴＬ分析により、ヒト疾患において重要な遺伝子が潜在的に同定され得る。
【００３８】
本明細書で使用されている「対象」の語は、動物を包含する。好ましくは、動物は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類である。また好ましくは、対象は、例えば、霊長類（例えば、サル、類人猿およびヒト）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚類、鳥類などである。好ましい実施態様では、対象はヒトである。
【００３９】
本明細書で使用されている「効力」の語は、所望の効果が得られる程度をいう。具体的には、この語は、血漿リポタンパク質およびＨＤＬレベルがモジュレーション（例えば、上昇、増加、阻害、縮小または遅延）される程度をいう。本願明細書で使用されている「効力」の語はまた、冠動脈疾患（ＣＡＤ）の１つまたは複数の症状または臨床事象の軽減または縮小を指す。症状の軽減または縮小には、限定されるわけではないが、ホスファチジルコリン分解、酸化リン脂質の縮小または排除、アテローム性動脈硬化プラーク形成および破綻の縮小、心臓発作、アンギナまたは卒中などの臨床事象の縮小、高血圧の減少、炎症伝達物質生合成の減少、血漿コレステロールの減少などがある。また、症状の軽減または縮小は、アテローム性動脈硬化により影響される血管床への血流の改善を含み得る。
【００４０】
本明細書で使用されている「冠動脈疾患」（ＣＡＤ）または同意語の「冠動脈性心疾患」（ＣＨＤ）の語は、冠動脈の遮断により特徴付けられる心臓血管疾患をいう。遮断は、プラーク破綻または塞栓形成などの機構により突然起こり得る。遮断は、筋内膜過形成およびプラーク形成による動脈の狭窄を伴いながら漸進的に起こり得る。プラークが肥厚すると、動脈は狭まり、血流が減少することにより、心筋層への酸素供給が減少する。血流におけるこの減少により、心筋層に関する一連の重大な結果がもたらされる。例えば、心筋層への血流の中断により、一般に心臓発作として知られている「梗塞」（心筋梗塞）が誘発される。心臓に送達する動脈の遮断から起こるそれらの臨床徴候および症状が、ＣＡＤの症状発現である。ＣＡＤの症状発現には、アンギナ、虚血、心筋梗塞、心筋症、うっ血性心不全、不整脈および動脈瘤形成がある。冠動脈循環系における脆弱性プラーク疾患は、動脈血栓症またはそれ自体心筋梗塞として症状を発現する遠位塞栓形成と因果関係を示すことがわかる。ＣＡＤは、一連の病期を包含し得る。ＣＡＤの初期段階は、血流を遮断しているわけではない冠動脈の壁に生じたアテローム線条を特徴とする。何年もの期間にわたって、これらの線条は肥厚する。すなわち、ＣＡＤの次なる段階は、動脈壁および脈管内腔中へ拡大し、動脈を通る血流に影響を及ぼすプラークの形成を特徴とする。プラークが厚さを増し、脈管の直径の大部分を遮断したときに、対象は、閉塞性ＣＡＤまたは虚血性心疾患の症状を発現したと言われる。症状は、労作性狭心症または運動耐容能の減少を含むことが多い。ＣＡＤの度合いが進行すると、冠動脈の管腔がほぼ完全に遮断され、心筋層へ酸素を送達する血液の流れが厳しく制限され得る。ＣＡＤのこの段階は心筋梗塞（心臓発作）と呼ばれ、安静時狭心症および急性肺浮腫の症状を含む、慢性冠動脈虚血の徴候および症状を特徴とする。
【００４１】
本明細書で使用されている「アテローム性動脈硬化症」の語は、身体および身体諸器官の１本または数本の動脈および小動脈、例えば、限定されるわけではないが、冠動脈、大動脈、腎動脈、頸動脈、四肢および中枢神経系へ血液を供給する動脈の狭窄および／または閉塞をまねく、マクロファージ、平滑筋細胞および他のタイプの細胞におけるコレステロールおよびコレステロールエステルおよび関連脂質の異常な蓄積に至る過程をいう。アテローム性動脈硬化症は、血流からの物理的な力によりアテローム性動脈硬化病変部分が崩壊し、深動脈壁成分が流れている血液に露出されるまで何十年も続く全く潜行性のものであり、血栓症を誘発し、心臓または脳などの標的臓器への酸素供給に支障をきたすことになり得る。一理論によると、アテローム性動脈硬化症は、以下の段階：１）内皮細胞機能不全および／または損傷、２）単球リクルートおよびマクロファージ形成、３）脂質沈着および修飾、４）脈管平滑筋細胞増殖、および５）細胞外マトリックスの合成を含む。さらに、この病理学的過程の関連炎症反応および伝達物質もまたこの定義に包含される。
【００４２】
本明細書で使用されている「ＨＤＬ関連」疾患は、低ＨＤＬレベルを伴う疾患または形質、例えばアテローム性動脈硬化症をいう。これらの関連疾患としては、例えば、アテローム性動脈硬化症、脂質障害、アルツハイマー病、酸化ストレス、肥満、心臓血管疾患、２型糖尿病およびインスリン抵抗性（メタボリック症候群とも称される）が挙げられる。脂質障害としては、例えば、コレステロール上昇（１デシリットル当たり１３０ミリグラムまたはｍｇ／ｄＬを超えるＬＤＬレベル）、脂質異常症候群、トリグリセリド上昇（１５００ｍｇ／ｄＬ程度の高トリグリセリドレベル）、脂質異常症またはリポタンパク質異常血症（ＨＤＬが３５ｍｇ／ｄＬ未満である）、高脂血症または高コレステロール、家族性高コレステロール血症（総およびＬＤＬコレステロールを高める遺伝疾患）および家族性高トリグリセリド血症（遺伝的高トリグリセリド）が挙げられる。
【００４３】
本明細書で使用されている「発現レベルの著しい変化」という表現は、発現の評価に使用された検定法の標準誤差より大きい量での対照レベルからの発現レベルの増加または減少を指す。この表現はまた、好ましくは少なくとも約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、約７０％または約９０％、約１００％、約１５０％または約２００％またはそれを超える変化をさす。
【００４４】
本明細書で使用されている「遺伝子」の語は、ポリペプチドをコード化し、その発現を調節する核酸配列をいう。したがって、遺伝子は、調節エレメント、例えばプロモーター、スプライス部位、エンハンサー、リプレッサー結合部位などを含む。遺伝子は、ポリペプチド配列または発現レベルに影響を及ぼし得るか、またはポリペプチドに対して何ら影響を及ぼさない配列変異型である多くの異なる「対立遺伝子」を有し得る。遺伝子は、連続したポリペプチドをコード化する核酸配列である、１つまたはそれより多い「読み枠」を含み得る。遺伝子は、内因的または外因的に存在し得る。
【００４５】
本明細書で使用されている（例えばＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５の）「発現レベル」なる語は、生物試料中に存在する対応遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を指す。発現レベルは、対照試料からのレベルまたは対照試料の予測レベルとの比較を伴うかまたは伴わずに検出され得る。
【００４６】
本明細書で使用されている「対照レベル」の語は、変化を測定するためのバイオマーカーの標準レベルをいう。一実施態様では、「対照レベル」は、正常または健康な細胞、組織または対象から、または正常または健康な細胞、組織または対象の集団からのバイオマーカー核酸発現、またはバイオマーカーポリペプチド、またはバイオマーカー生物活性の正常レベルであり得る。非限定的な例として、対照レベルは、正常細胞、組織または対象におけるＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５ポリペプチドまたは生物活性のレベル、または血漿総リポタンパク質またはＨＤＬレベルであり得る。
【００４７】
本明細書で使用されている（例えばＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５の）「対照発現レベル」なる語は、健康な対象の典型を示す生物試料中に存在する対応遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を指す。また、「対照発現レベル」なる語は、健康な対象からの測定値に基づいて先に確立された健康な集団の典型を示す確立されたｍＲＮＡレベルを意味し得る。
【００４８】
本明細書で使用されている「検出する」とは、試料中における分子の存在または非存在を同定することをいう。検出すべき分子がポリペプチドである場合、検出段階は、例えば、検出可能な形で標識された抗体にポリペプチドを結合させることにより実施され得る。検出可能な標識は、刺激因子とは独立して、またはそれに応答して観察可能なシグナルを発し得る分子である。検出可能な標識は、限定されるわけではないが、蛍光性標識、色素原標識、発光標識または放射性標識であり得る。標識を「検出する」方法には、例えば、標準または共焦顕微鏡、ＦＡＣＳ分析に適合させた定量的および定性的方法、およびマルチウェルプレート、アレイまたはマイクロアレイを伴うハイスループット方法に適合させた同方法がある。当業者であれば、所与の蛍光性ポリペプチドまたは色素からの蛍光放出検出に適切なフィルターセットおよび励起エネルギー供給源を選択し得るはずである。本明細書で使用されている「検出する」はまた、検出すべきポリペプチドに対する複数の抗体の使用を含み得、複数の抗体は、検出すべきポリペプチド上の異なるエピトープに結合する。この方法で使用される抗体は、２つまたはそれより多い検出可能な標識を利用し得、例えばＦＲＥＴ対を含み得る。検出可能なシグナルのレベルが検出可能な標識のバックグラウンドレベルより実際に大きいとき、または測定されたポリペプチドのレベルが対照試料で測定されたレベルよりも実際に大きい場合、ポリペプチド分子は本発明に従って「検出」される。
【００４９】
本明細書で使用されている「検出する」はまた、例えば、直接的または間接的に標識された（血清試料中で標的とハイブリダイゼーションし得る）プローブ核酸分子により発せられるシグナルを測定または観察する方法により、標的核酸分子の存在を同定することをいう。プローブ核酸の検出は、標的核酸、例えばマーカー遺伝子をコード化する配列の存在を直接的に示すもの、すなわちその検出である。蛍光性、放射性および他の化学的標識を「検出する」ための方法および技術は、Ausubel et al.（1995, Short Protocols in Molecular Biology, 第３版、John Wiley and Sons, Inc.）により報告されている。
【００５０】
別法として、ある部分を標的とハイブリダイゼーションするプローブ核酸に結合させ、その部分が、例えば、適切な基質の存在下において標的の検出を可能にする酵素活性、または抗体または他の特異的指標の付加による検出を可能にする特異的抗原または他のマーカーを含んでいる、核酸は「間接的に検出され」得る。別法として、標的核酸分子は、標的核酸配列の一部分とハイブリダイゼーションするように特異的に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、患者臨床試料から調製された核酸試料を増幅することにより検出され得る。また、定量的増幅方法、例えば、限定されるわけではないが、TaqMan（登録商標）を用いて、本発明による標的核酸を「検出する」ことも可能である。（例えば定量的ＰＣＲにより）測定された核酸のレベル、または検出可能な標識により提供された検出可能なシグナルのレベルがバックグラウンドレベルより実際に上である場合、核酸分子は本明細書で使用されているとおり「検出される」。
【００５１】
さらに、本明細書で使用されている「検出する」は、対象におけるアテローム性動脈硬化症などのＣＡＤの少なくとも早期検出を指し、「早期」検出とは、好ましくは症状が目に見える時点より前の初期段階でＣＡＤを検出することを指す。さらに、本明細書で使用されている「検出する」は、上記で示したのと同一の検出基準を用いることによる対象におけるＣＡＤ再発の検出を指す。さらに、本明細書で使用されている「検出する」は、治療用化合物での処置の前後におけるＣＡＤの程度の変化の測定を指す。この場合、治療用化合物に応答したＣＡＤの程度の変化は、治療用化合物の非存在下での発現レベルに対して治療用化合物の存在に応答した、臨床試料中に提示された１つまたはそれより多いマーカー遺伝子の発現、または別法としてマーカー遺伝子ポリペプチドの量の少なくとも約１０％の割合の増加または減少を指す。
【００５２】
本明細書で使用されている「抗体」の語は、無傷の抗体またはその抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）または単鎖（すなわち、軽または重鎖）を指す。無傷の抗体は、ジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では略してＶＨ）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では略してＶＬ）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。さらにＶＨおよびＶＬ領域は、間にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性の高い領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に分けられ得る。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介し得る。
【００５３】
本明細書で使用されている抗体の「抗原結合部分」の語は、所与の抗原への特異的な結合能を保持している無傷抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、無傷抗体のフラグメントにより遂行され得る。抗体の「抗原結合部分」なる語に包含される結合フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る１価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂフラグメント（一般的に重鎖から１つおよび軽鎖から１つ）を含む２価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；ＶＨドメインから成る単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）がある。
【００５４】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して１価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても知られている；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426;およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883 参照）を形成している単タンパク質鎖としてそれらを構成させ得る人工ペプチドリンカーによる組換え技法を用いて連結され得る。上記の単鎖抗体は、抗体の１つまたは複数の「抗原結合部分」を含む。当業者に周知の慣用的技術を用いてこれらの抗体フラグメントを得、無傷抗体の場合と同様にして上記フラグメントを有用性についてスクリーニングにかける。
【００５５】
抗原結合部分はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、細胞内発現抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例えば、Hollinger および Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 参照）。抗体の抗原結合部分は、フィブロネクチンIII型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づいたスカホールドに移植され得る（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載している米国特許第６７０３１９９号参照）。
【００５６】
抗原結合部分は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単鎖分子に組み込まれ得る（Zapata et al., 1995  Protein Eng. 8(10):1057-1062;および米国特許第５６４１８７０号）。
【００５７】
「サイレンス」および「の発現を阻害する」という表現は、それらが標的遺伝子、例えばＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５について用いられている限り、本明細書では、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５遺伝子が転写され、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５遺伝子の発現が阻害されるように処理が為された第１細胞または細胞群から単離され得るＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を、第１細胞または細胞群と実質的に同一であるが、上記の処理は為されていない第２細胞または細胞群（対照細胞）の場合と比較したときの量の縮小により証明される、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５遺伝子発現の少なくとも部分的な抑制をいうものとする。阻害の程度は通常下式で表される。
【数１】
2011514327.tif 000002
【００５８】
別法として、阻害の程度は、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５遺伝子転写に機能的に結びついたパラメーター、例えば細胞により分泌されるＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５遺伝子によりコード化されるタンパク質の量、またはある種の表現型を呈する細胞数の縮小によって与えられ得る。原則として、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５遺伝子サイレンシングは、構成的またはゲノム遺伝子操作により標的を発現する細胞において、適切な検定法により測定され得る。
【００５９】
本発明の英文明細書（特に請求の範囲の部分で）で使用されている冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および本明細書で使用されている同様の語は、本明細書において特に断らなければ、または明らかに文脈と矛盾するものでなければ、単数および複数の両方の場合を包含するものと見なす。本明細書では値の範囲を列挙しているが、これは単にその範囲内に含まれる各独立値を個々に示す手短な方法としての役割を果たしているのに過ぎない。本明細書において特に断らなければ、個々の各値は、それが明細書において個々に列挙されているがごとく、明細書に組み入れられているものとする。本明細書記載の方法は全て、特に断らなければ、または文脈と明らかに矛盾するものでなければ、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書に記載された全ての例または例示的な表現（例えば、「例えば、など」）の使用は、本発明をよりわかり易くすることを意図しているのに過ぎず、別の形で請求された発明の範囲に限定を設けるものではない。本明細書中で、本発明の実施に不可欠な請求外の要素を示すものとしてみなされるべき表現は一切無いものとする。
【００６０】
本発明は、Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５が、ＣＡＤの発症および進行と相関関係をなすレベルである、血漿総リポタンパク質およびＨＤＬのレベルを調節するという驚くべき新発見に基づいている。特に、遺伝子産物の発現および活性を改変するＦａｒｐ２の対立遺伝子は、ＨＤＬレベルを増加させる。したがって、本発明の一態様は、ＦＡＲＰ２、ＳＴＫ２５および関連遺伝子および遺伝子産物（例えば、ホモログおよびオーソログ、例えば、ヒトオーソログ）の発現および／または活性を改変する化合物の同定方法を提供する。本発明の別の態様は、ＣＡＤの発症、進行または退縮をモニターするか、またはＣＡＤの処置における化合物の効力を評価するためのバイオマーカーとしてのＦＡＲＰ２、ＳＴＫ２５およびそのオーソログの使用に関する。
【００６１】
スクリーニング検定法
一態様において、本発明は、ＦＡＲＰ２、ＳＴＫ２５およびそのホモログおよびオーソログの活性または発現を改変することにより、ＨＤＬ−Ｃの血漿レベルを増加させる化合物のスクリーニング（同定）方法を提供する。スクリーニングは、例えば、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５遺伝子産物を含む生物試料と化合物を接触させ、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の活性に対する化合物の効果をモニターするか、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の発現をモニターするか、または試料中のリポタンパク質およびＨＤＬ−Ｃレベルに対する化合物の効果をモニターすることにより実施され得る。Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）は、内因性または外因性核酸分子（例えば、適切な読み枠を含む内因性遺伝子または外因性ベクター）またはポリペプチドまたはその機能性フラグメントの形態であり得る。
【００６２】
総血漿リポタンパク質またはＨＤＬ−Ｃレベルのモジュレーションに対する化合物の効果は、例えばＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の活性のモジュレーションによるものである。活性のモジュレーションは、限定されるわけではないが、１）ポリペプチドまたはその機能性フラグメントによるＨＤＬ分解の阻害または阻止、２）ポリペプチドまたはその機能性フラグメントの分解または分解の誘導、３）ポリペプチドまたはその機能性フラグメントの生物活性の不活化、４）核酸分子の発現の縮小または阻害、および５）核酸分子の分解または脱安定化を含み得る。
【００６３】
ＨＤＬに対する化合物の効果の測定を目的とする場合、化合物を投与していない並行試料についても対照としてモニターする。次いで、処理および未処理試料を、限定されるわけではないが、顕微鏡分析、生存能試験、複製能力、組織検査、特定ＲＮＡまたはポリペプチドまたはその複合体のレベル、酵素活性のレベル、および他の細胞または化合物と相互作用する細胞の能力などを含む適切な表現型基準により比較する。処理および未処理細胞間の差異は、化合物に起因すると考えられる効果を示す。一実施態様において、化合物は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％またはそれを超える率での活性の阻害または総血漿リポタンパク質またはＨＤＬ−Ｃレベルのモジュレーションについて同定され得る。スクリーニング方法は、１）ＨＤＬおよびＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の適切な供給源を含む第１生物試料と化合物を接触させ、第１生物試料中におけるＨＤＬのレベルを測定し、３）第２生物試料中におけるＨＤＬのレベルを測定し、ただし、第２生物試料は化合物に暴露されていないものとし、そして４）２）からのＨＤＬレベルが、３）からのＨＤＬレベルと比べて少なくとも約１.５倍である化合物を選択する段階を含む。
【００６４】
一実施態様において、スクリーニング検定法は、ＨＤＬおよび適切なＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）を含む無細胞生物試料を、化合物と接触させ、総血漿リポタンパク質またはＨＤＬ−Ｃレベルをモジュレーションする化合物の能力を測定する無細胞検定法である。ＨＤＬレベルの測定方法は、当業界では周知である（Sugiuchi, et al. Clin. Chem., 41:717-723, 1995; Izawa et al., J. Med. Pharm. Sci., 37:1385-1388, 1997）。
【００６５】
本明細書記載の無細胞スクリーニング検定法の場合、適切なＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドまたはその機能性フラグメントは、生物試料そのものに含有されるか、または他の供給源から生物試料中に添加され得る。例えば、ポリペプチドまたはその機能性フラグメントは、市販されているか、または適切な生物学的供給源、例えば培養細胞からかなりの量で精製され得る。別法として、タンパク質は、同じく当業界では周知のとおり、適切な原核生物または真核生物発現系での発現により単離遺伝子またはｃＤＮＡから遺伝子組換えにより製造され、その後に精製され得る。同様に、ＨＤＬは、生物試料それ自体に含有され得るか、または他の供給源から生物試料中に添加され得る。ＨＤＬは、完全に単離または部分的に単離され得る。ＨＤＬの部分的または完全単離方法は、当業界では周知である（Havel et al., J. Clin. Invest., 43:1345-1353, 1955; Navab et al., J. Clin. Invest., 99:2005-2019, 1997; Carroll および Rudel, J. Lipid Res., 24:200-207, 1983, McNamara et al., Clin. Chem., 40:233-239, 1994, Grauholt et al., Scandinavian J. Clin. Lab. Invest., 46:715-721, 1986; Warnick et al., Clin. Chem., 28:1379-1388, 1982; Talameh et al., Clin. Chimica Acta, 158:33-41, 1986）。
【００６６】
別の実施態様では、スクリーニング検定法は、インビボスクリーニング検定法である。インビボスクリーニング検定法をヒト以外の動物で実施することにより、動物においてＨＤＬの分解を効果的に阻害、縮小または遅延させる化合物を発見することができる。非限定的な一例では、化合物を、適量の時間適切な用量で、所望により高脂肪食餌摂取後でもよいヒト以外の動物に投与する。次いで、動物から採血し、血漿リポタンパク質を単離し、当業界で公知の方法によりＨＤＬレベルを測定する。化合物で処置した動物におけるＨＤＬレベルの増加を、化合物で処置しなかった動物におけるＨＤＬレベルと比較したところ、この化合物は、例えばＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の活性を阻害することにより、動物において総血漿リポタンパク質および／またはＨＤＬ−Ｃのレベルをモジュレーションすることが示された。好ましくは、増加は少なくとも約１.５倍である。また好ましくは、化合物は、動物における総血漿リポタンパク質および／またはＨＤＬ−Ｃのレベルを少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％またはそれを超える率でモジュレーションする。
【００６７】
所望により、動物に投与する前に、化合物を本明細書記載の無細胞スクリーニング検定法または細胞に基づくスクリーニング検定法によるプレ-スクリーニングにかけることも可能である。
【００６８】
細胞に基づくスクリーニング検定法では、適切なＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）またはその機能性フラグメント（複数も可）を発現する細胞を、化合物と接触させ、化合物が活性をモジュレーションする能力を測定する。活性をモジュレーションする化合物の能力の測定は、適切な基質についてのＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の生物活性、例えば触媒／酵素活性を評価することにより、化合物が呈するＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）への結合能力またはそれとの相互作用能力を評価することにより、検出可能なマーカーをコード化する核酸に機能し得るように結合された応答性エレメントを含むリポーター遺伝子の誘導を評価することにより、または適切に調節された細胞性応答、例えばシグナル伝達またはタンパク質／タンパク質相互作用を評価することにより実施され得る。細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、細菌細胞または酵母細胞などであり得る。
【００６９】
本発明の別の態様は、上記スクリーニング検定法から得られる化合物に関する。化合物は、化学的化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、非免疫グロブリン結合スカホールドまたは抗体であり得る。
【００７０】
抗体
一実施態様では、本発明は、抗体を用いることによるＨＤＬ核酸およびポリペプチドレベルのモジュレーションに関する。抗体としては、限定されるわけではないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメント、抗イディオタイプ抗体または他のエピトープ結合ポリペプチドを挙げることができる。本発明抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性であり得る。好ましくは、マウスＥＳ１またはヒトＣＥＳ１ポリペプチドの検出に関して本発明で有用な抗体は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｄ、単鎖抗体またはＦｖを含む、ヒト抗体またはそのフラグメントである。本発明で有用な抗体は、完全重または軽鎖定常領域またはその一部分を含むか、またはそれが欠如している場合もあり得る。一実施態様において、本発明で有用な抗体は、ヒト抗体と緊密に類似するようにアミノ酸が非抗原結合領域で置換されているが、元の結合能は依然として保持しているヒト化抗体であり得る。ヒト化抗体の製造方法は、当業界では公知である（Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4:7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92:3-16, 1982; 国際公開第９２／０６１９３号; および欧州特許第０２３９４００号）。
【００７１】
実施態様によっては、ＦａｒｐまたはＳｔｋポリペプチドに結合する抗体の抗原結合部分、（例えば、ＶＨおよびＶＬ鎖）が、「混合および対合」され、他の抗ＦａｒｐまたはＳｔｋ結合分子を作製し得る。上記の「混合および対合」抗体の結合は、結合検定法（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて試験され得る。ＶＨを選択して特定のＶＬ配列と混合および対合させるとき、典型的にはそのＶＨと構造上類似したＶＨを選択し、それをそのＶＬとの対合で置き換える。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長重鎖配列は、一般的に構造上類似した完全長重鎖配列と置換される。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＬ配列は、当然構造上類似したＶＬ配列と置換される。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長軽鎖配列は、構造上類似した完全長軽鎖配列により置換されるべきである。上記における構造類似性の同定は、当業界では公知のプロセスである。
【００７２】
抗体の可変領域または完全長鎖が配列供給源としてヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、ヒト抗体は、特定の生殖系配列「の産物」であるかまたはそこ「から誘導される」重または軽鎖可変領域または完全長重または軽鎖を含む。かかる一系では、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子をもつトランスジェニックマウスで産生される。トランスジェニックを、興味の対象である抗原（例えば、ＦａｒｐまたはＳｔｋポリペプチドのエピトープ）で免疫化する。
【００７３】
ヒト生殖系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそこ「から誘導される」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列と配列が非常に近似した（すなわち、最大同一性％の）ヒト生殖系免疫グロブリン配列を選択することによりそれ自体同定され得る。特定のヒト生殖系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそこ「から誘導される」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞突然変異または人工的位置指定突然変異導入に起因する、生殖系コード化配列との比較におけるアミノ酸差異を含み得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は、典型的にはヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子によりコード化されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、他種（例えば、ネズミ生殖系配列）の生殖系免疫グロブリンアミノ酸配列との比較に際しヒト由来であるものとしてヒト抗体を同定するアミノ酸残基を含む。ある種の場合、ヒト抗体は、生殖系免疫グロブリン遺伝子によりコード化されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を示し得る。
【００７４】
ラクダ抗体
例えばラマ種（ラマ・パコス（Lama paccos）、ラマ・グラマ（Lama glama）およびラマ・ビクグナ（Lama vicugna））などの新世界要員を含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（カメルス・バクトリアヌス（Camelus bactrianus）およびカレルス・ドロマデリウス（Calelus dromaderius））ファミリーの要員から得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造複雑度およびヒト対象に対する抗原性に関して特性確認されている。この哺乳類ファミリーで天然に見出されるある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠くため、他の動物からの抗体に典型的な２つの重鎖および２つの軽鎖を有する４つの鎖の４次構造とは構造的に区別される。国際公開第９４／０４６７８号参照。
【００７５】
ＶＨＨとして同定された小さな単一可変ドメインであるラクダ抗体の領域を遺伝子工学技術により作製して、標的に対し高い親和力を有する小タンパク質を生成することにより、「ラクダナノボディ」として知られる低分子量抗体由来タンパク質が得られる。米国特許第５７５９８０８号参照；また、Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62; および Lauwereys. et al., 1998 EMBO J. 17: 3512-3520 も参照。ラクダ抗体および抗体フラグメントの遺伝子工学的ライブラリーは、例えばAblynx（ゲント、ベルギー国）から市販されている。ヒト以外に由来する他の抗体の場合と同様、ラクダ抗体のアミノ酸配列を組換え技法で改変することにより、ヒト配列とより密接に類似した配列を得ることも可能である、すなわち、ナノボディの「ヒト化」が可能である。したがって、ヒトに対するラクダ抗体の天然の低抗原性はさらに低減化され得る。
【００７６】
ラクダナノボディは、ヒトＩｇＧ分子の約１０分の１の分子量を有し、このタンパク質は僅か数ナノメートルの物理的直径を有する。サイズが小さいことによる一つの結果は、ラクダナノボディが、大きな抗体タンパク質では機能的に見えないほど小さい抗原部位へ結合できることである、すなわち、ラクダナノボディは、古典的免疫学的技術を用いても普通なら曖昧なものである抗原を検出するための試薬として、また可能性のある治療剤として有用である。すなわち、サイズが小さいことによるさらに別の結果は、ラクダナノボディが、標的タンパク質の溝または狭い裂け目にある特異的部位へ結合することにより阻害し得、このため、古典的抗体の場合よりも古典的低分子量薬物の機能とさらに密接に類似した受容力で役割を果たし得ることである。
【００７７】
さらに、低分子量および小型サイズであることから、ラクダナノボディは、非常に熱安定性が高く、極端なｐＨおよびタンパク質分解的消化にも安定性を示し、抗原性も乏しい。別の結果は、ラクダナノボディが、循環系から組織中へ容易に移動し、そして血液脳関門さえも通過するため、神経組織に影響を及ぼす疾患を処置し得ることである。さらにナノボディにより、血液脳関門を超える薬物輸送を容易にする。２００４年８月１９日付公開の米国特許公開第２００４０１６１７３８号参照。これらの特徴をヒトでの低抗原性と組み合わせると、多大な治療的可能性が期待される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E.coli）などの原核生物細胞で十分に発現され得る。ラクダ抗体も、本発明の範囲内に含まれるものとする。したがって、本発明の一つの特徴は、ＦａｒｐまたはＳｔｋポリペプチドについての高い親和力を有するラクダ抗体またはラクダナノボディである。
【００７８】
ダイアボディ
ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが、単一ポリペプチド鎖で発現される２価の二重特異性分子であり、これらは同一鎖において２つのドメイン間で対を形成させるには短すぎるリンカーにより結合されている。ＶＨおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対をなすことにより、２つの抗原結合部位を形成する（例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123 参照）。ダイアボディは、同一細胞内で構造ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ立体配置）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ立体配置）を有する２本のポリペプチド鎖を発現させることにより製造され得る。それらのほとんどは、細菌において可溶性形態で発現され得る。
【００７９】
単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２本のダイアボディ形成ポリペプチド鎖を約１５アミノ酸残基のリンカーで連結することにより製造される（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36 参照）。ｓｃＤｂは、細菌において可溶性活性モノマー形態で発現され得る（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21 参照）。ダイアボディをＦｃと融合させることにより、「ジ−ダイアボディ（di-diabody）」が生成され得る（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65参照）。
【００８０】
遺伝子操作されたおよび修飾された抗体
出発材料として１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を用いて本発明の抗体を製造することにより、遺伝子工学的に修飾された抗体が作製され得、その修飾された抗体は、出発抗体から改変された特性を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つまたはそれより多いＣＤＲ領域内および／または１つまたはそれより多いフレームワーク領域内における１つまたはそれより多い残基を修飾することにより遺伝子工学的に作製され得る。さらに、または別法として、抗体は、定常領域（複数も可）内の残基に修飾を加えることにより、例えば抗体のエフェクター機能（複数も可）を改変するように遺伝子工学的に作製され得る。
【００８１】
実施され得る可変領域遺伝子操作の一つのタイプは、ＣＤＲグラフト技術である。抗体は、主に６つの重および軽鎖ＣＤＲに位置するアミノ酸残基を通して標的抗原と相互作用する。この理由により、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間で高い多様性を示す。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性をもつ異なる抗体からフレームワーク配列へグラフトされた特異的な天然抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的な天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例、Riechmann et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 米国特許第５２２５５３９号および米国特許第５５３０１０１、５５８５０８９、５６９３７６２および６１８０３７０号参照）。
【００８２】
フレームワーク配列は、生殖系抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から入手され得る。例えば、ヒト重および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖系ＤＮＡ配列は、「VBase」ヒト生殖系配列データベース（インターネットで利用可能、www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase）および Kabat et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ公開第91-3242号; Tomlinson et al., 1992  J. Mol. Biol. 227:776-798; および Cox et al., 1994 Eur. J. Immunol. 24:827-836 において見つけることができ、これらの内容については、出典明示で援用する。
【００８３】
ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が誘導される生殖系免疫グロブリン遺伝子で見いだされるのと同一の配列を有するフレームワーク領域へグラフトされ得るか、またはＣＤＲ配列は、生殖系配列と比べて１つまたは複数の突然変異を含むフレームワーク領域へグラフトされ得る。例えば、ある一定の場合には、フレームワーク領域内における残基に突然変異を導入して、抗体の抗原結合能力を維持または高めるのが有益であることが見出された（例えば、米国特許第５５３０１０１、５５８５０８９、５６９３７６２および６１８０３７０号参照）。
【００８４】
ＣＤＲはまた、免疫グロブリンドメイン以外のポリペプチドのフレームワーク領域へグラフトされ得る。適切なスカホールドは、グラフト残基が局在化した表面を形成し、興味の対象である標的と結合するようにそれらを提示する立体配座的に安定したフレームワークを形成する。例えば、ＣＤＲは、フレームワーク領域が、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタイン、シトクロムｂ、ＣＰ１亜鉛フィンガー、ＰＳＴ１、超らせん、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメインまたはテンドラミサット(tendramisat)に基づいているスカホールドへグラフトされ得る（例えば、Nygren および Uhlen, 1997 Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469参照）。
【００８５】
可変領域修飾の別のタイプは、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内におけるアミノ酸残基への突然変異導入であり、それにより「親和性成熟」として知られる、興味の対象である抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）が改善される。位置指定突然変異導入またはＰＣＲを通した突然変異誘発を実施することにより、突然変異（複数も可）が導入され得、抗体結合または興味の対象である他の機能的特性に対する効果を、本明細書記載のインビトロまたはインビボ検定法で評価することができる。保守的修飾が導入され得る。突然変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内における多くて１、２、３、４または５の残基が改変される。
【００８６】
本発明の遺伝子操作された抗体には、例えば抗体の特性を改善するように、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が加えられたものがある。典型的には、上記フレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減らすように行われる。例えば、一方法は、１つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系配列に「復帰突然変異させる」ことである。さらに具体的には、体細胞突然変異が誘発された抗体は、抗体が由来する生殖系配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。上記残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系配列と比較することにより同定され得る。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系立体配置に戻すために、体細胞突然変異を、例えば位置指定突然変異導入またはＰＣＲを通した突然変異誘発により生殖系配列に「復帰突然変異」させることが可能である。上記「復帰突然変異」抗体もまた、本発明に包含されるものとする。
【００８７】
フレームワーク修飾の別のタイプでは、フレームワーク領域内、または１つまたは複数のＣＤＲ領域内における１つまたは複数の残基に突然変異を誘発することにより、Ｔ細胞エピトープを除去し、抗体の潜在的免疫原性を低下させる。この方法は、「脱免疫化」とも称され、Carr et al.による米国特許公開第２００３０１５３０４３号に詳述されている。
【００８８】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内に行われる修飾に加えて、またはそれに代わるものとして、本発明の抗体の場合、遺伝子工学技術によりＦｃ領域内に修飾を加え、典型的には抗体の１つまたは複数の機能的特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存的細胞傷害性を改変させることも可能である。さらに、本発明の抗体を化学的に修飾するか（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に結合させ得る）、またはそのグリコシル化を改変して、再び抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように修飾することも可能である。
【００８９】
一実施態様では、ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数を改変する、すなわち増加または減少させるように、ヒンジ領域を修飾する。この方法は、Bodmer et al.による米国特許第５６７７４２５号に詳述されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数を改変することにより、例えば軽および重鎖の会合を促進するか、または抗体の安定性を増加または減少させる。
【００９０】
別の実施態様では、抗体のＦｃヒンジ領域に突然変異を導入して、抗体の生物学的半減期を減少させる。さらに具体的には、抗体が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインブドウ球菌（スタフィロコッカス(Staphylococcyl)）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合と比べて低下したＳｐＡ結合性を示すように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異をＦｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。この方法は、Ward et al.による米国特許第６１６５７４５号で詳細に記載されている。
【００９１】
別の実施態様では、抗体にその生物学的半減期を増すように修飾を加える。様々な方法が可能である。例えば、米国特許第６２７７３７５号は、そのインビボ半減期を増加させるＩｇＧにおける次の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆについて報告している。別法として、Presta et al.による米国特許第５８６９０４６および６１２１０２２号に記載されているように、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取り出したサルベージ受容体結合エピトープを含むようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変され得る。
【００９２】
さらに他の実施態様では、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換してＦｃ領域を改変することにより、抗体のエフェクター機能を改変させる。例えば、抗体が、エフェクターリガンドについての親和性が改変されているが、親抗体の抗原結合能は保持しているように、１個または複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置換することができる。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体系のＣ１成分であり得る。この方法は、両方ともWinter et al.による米国特許第５６２４８２１および５６４８２６０号で詳細に報告されている。
【００９３】
別の実施態様では、抗体においてＣ１ｑ結合性が改変されるか、そして／または補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）が低減化または排除されるように、アミノ酸残基から選択された１個または複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置換することも可能である。この方法は、Idusogie et al. による米国特許第６１９４５５１号で詳細に記載されている。
【００９４】
別の実施態様では、１個または複数のアミノ酸残基を改変することにより、抗体の補体固定能力を改変させる。この方法は、Bodmer et al. による国際公開第９４／２９３５１号に詳述されている。
【００９５】
さらに別の実施態様では、抗体の抗体依存的細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）の伝達能を高めるか、そして／または１個または複数のアミノ酸を修飾することによりＦｃγ受容体に関する抗体の親和性を増加させるようにＦｃ領域を修飾する。この方法は、Presta による国際公開第００／４２０７２号に詳述されている。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎについてのヒトＩｇＧ１での結合部位は既にマッピングされており、結合性が改善された変異型が報告されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604 参照）。
【００９６】
さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、アグリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば抗原に対する抗体の親和性を高めるように改変され得る。上記炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内における１つまたは複数のグリコシル化部位を改変することにより達成され得る。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらす１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことにより、その部位でのグリコシル化が排除され得る。上記アグリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が高められ得る。上記方法は、Co et al. による米国特許第５７１４３５０および６３５０８６１号でさらに詳細に報告されている。
【００９７】
さらに、または別法として、改変されたグリコシル化タイプを有する抗体、例えば低量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または高バイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が作製され得る。上記の改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが立証された。上記の炭水化物修飾は、例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞で抗体を発現させることにより達成され得る。グリコシル化機構が改変された細胞は、文献で報告されており、本発明の組換え抗体を発現させることによりグリコシル化が改変された抗体を産生させる宿主細胞として使用され得る。例えば、Hang et al. による欧州特許第１１７６１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコード化する、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子をもつセルラインに関するもので、結果的に上記セルラインで発現された抗体はフコシル化の低下を呈することを報告している。Presta によるＰＣＴ国際公開第０３／０３５８３５号は、Ａｓｎ（２９７）−結合炭水化物へのフコース結合能が低下した変異型ＣＨＯセルライン、Ｌｅｃ１３細胞に関するもので、この場合も、その宿主細胞で発現された抗体がフコシル化の低下を呈することを報告している（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740 も参照）。Umana et al. による国際公開第９９／５４３４２号は、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１,４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（ＧｎＴIII））を発現するように遺伝子操作されたセルラインに関するものであり、結果的に、遺伝子操作されたセルラインで発現された抗体はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈するため、抗体のＡＤＣＣ活性を高めることを報告している（また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180 参照）。
【００９８】
本発明により想到される本明細書の抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体をペグ化すると、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させることができる。抗体をペグ化するために、典型的には、抗体またはそのフラグメントを、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が抗体または抗体フラグメントに結合される条件下で、ＰＥＧ、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施され得る。本明細書で使用されている「ポリエチレングリコール」の語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質の誘導体化に使用されてきたＰＥＧのあらゆる形態を包含するものとする。ある種の実施態様では、ペグ化される抗体はアグリコシル化抗体である。タンパク質のペグ化方法は当業界では公知であり、本発明の抗体にも適用され得る。例えば、Nishimura et al.による欧州特許第０１５４３１６号およびIshikawa et al.による欧州特許第０４０１３８４号参照。
【００９９】
さらに、ペグ化は、非天然アミノ酸の導入により抗体の任意の部分で達成され得る。ある種の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang および Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004 または米国特許第７０８３９７０号に記載された技術により導入され得る。簡単に述べると、これらの発現系の中には、位置指定突然変異導入により、本発明のポリペプチドをコード化する読み枠へアンバーＴＡＧ等のナンセンスコドンを導入したものがある。次いで、上記発現ベクターを、導入されたナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを利用し得る宿主に導入し、選択された非天然アミノ酸を負荷する。本発明のポリペプチドに該当部分をコンジュゲートする目的にとって有益な特定の非天然アミノ酸は、アセチレンおよびアジド側鎖を伴うものである。次いで、これらの新規アミノ酸を含むポリペプチドは、タンパク質におけるこれらの選択された部位でペグ化され得る。
【０１００】
抗体の遺伝子操作方法
抗体に修飾を加えて、完全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列、またはそこに結合した定常領域（複数も可）を修飾することにより新たな抗体が作製され得る。例えば、抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域を、遺伝子組換え操作で既知フレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合わせることにより、新たな遺伝子組換え抗体を作製することができる。遺伝子操作方法についての出発材料は、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ配列、または１つまたは複数のそのＣＤＲ領域である。遺伝子組換え抗体を作製するために、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ配列、またはその１つまたは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に製造する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、配列（複数も可）に含まれる情報を出発材料として使用することにより、元の配列（複数も可）由来の「第２世代」配列（複数も可）を作製し、次いで「第２世代」配列（複数も可）を調製し、タンパク質として発現させる。
【０１０１】
標準分子生物学技術を用いることにより、改変された抗体配列を調製および発現させることができる。改変された抗体配列（複数も可）によりコード化される抗体は、由来する所望の機能的特性の一つ、幾つかまたは全部を保持しているものである。改変された抗体の機能的特性は、当業界で利用可能および／または本明細書記載の標準検定法（例、ＥＬＩＳＡ）により評価され得る。
【０１０２】
本発明の抗体の遺伝子操作方法のある種の実施態様では、突然変異が抗体コーディング配列の全部または一部に沿って無作為的または選択的に導入され得る。例えば、Short によるＰＣＴ国際公開第０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成的ライゲーションアセンブリまたはその組み合わせを用いた抗体突然変異の作製およびスクリーニング方法について記載している。別法として、Lazar et al. による国際公開第０３／０７４６７９号は、コンピュータースクリーニング方法の使用により抗体の物理化学特性を最適化する方法について報告している。
【０１０３】
非抗体結合分子
さらに本発明は、抗体の機能的特性を呈するが、それらのフレームワークおよび抗原結合部分が他のポリペプチド（例えば、抗体遺伝子によりコード化されるかまたは抗体遺伝子のインビボ組換えにより作製されたもの以外のポリペプチド）由来である、結合分子を提供する。これらの結合分子の抗原結合ドメインは、定向進化過程を通して生成される。米国特許第７１１５３９６号参照。抗体の可変ドメインの場合と類似した全体的折りたたみ（「免疫グロブリン様」折りたたみ）を有する分子は、適切なスカホールドタンパク質である。抗原結合分子の生成に適切なスカホールドタンパク質には、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン二量体、テナシン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＩＣＡＭ、チチン、ＧＣＳＦ−受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害剤、抗生物質色素タンパク質、ミエリン膜接着分子Ｐ０、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、ＩクラスＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＣＤ１、ＣＤ２およびＶＣＡＭ−１のＩ−セットドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−セット免疫グロブリンドメイン、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−セット免疫グロブリンドメイン、テロキンのＩ−セット免疫グロブリンドメイン、ＮＣＡＭ、トウィッチン、ニューログリアン、成長ホルモン受容体、エリスロポイエチン受容体、プロラクチン受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、β−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、トランスグルタミナーゼ、Ｔ細胞抗原受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、組織因子ドメイン、シトクロムＦ、緑色蛍光タンパク質、ＧｒｏＥＬおよびソーマチンがある。
【０１０４】
非抗体結合分子の抗原結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン様折りたたみ）は、１０ｋＤ未満または７.５ｋＤを超える分子量（例えば、７.５〜１０ｋＤの分子量）を有し得る。抗原結合ドメインの生成に使用されるタンパク質は、天然に存する哺乳類タンパク質（例えば、ヒトタンパク質）であり、抗原結合ドメインは、それが由来するタンパク質の免疫グロブリン様折りたたみと比較した場合５０％以下（例えば、３４％以下、２５％、２０％または１５％）の割合で突然変異アミノ酸を含む。免疫グロブリン様折りたたみを有するドメインは、一般的に５０〜１５０アミノ酸（例えば、４０〜６０アミノ酸）から成る。
【０１０５】
非抗体結合分子を作製するため、抗原結合表面を形成するスカホールドタンパク質の領域（例えば、抗体可変ドメイン免疫グロブリン折りたたみのＣＤＲと位置および構造が類似した領域）における配列がランダム化されているクローンのライブラリーを作製する。ライブラリークローンを、興味の対象である抗原への特異的結合性および他の機能について試験する。選択されたクローンをさらなるランダム化および選択についての基礎として用いることにより、抗原に対する親和性がさらに高い誘導体を製造することができる。
【０１０６】
例えば、スカホールドとしてフィブロネクチンIIIの第１０モジュール（１０Ｆｎ３）を用いることにより、高親和性結合分子が作製される。残基２３〜２９、５２〜５５および７８〜８７にある１０ＦＮ３の３つのＣＤＲ様ループのそれぞれについてライブラリーを構築する。各ライブラリーを構築するため、各ＣＤＲ様領域と重複する配列をコード化するＤＮＡセグメントをオリゴヌクレオチド合成によりランダム化する。選択可能な１０Ｆｎ３ライブラリーの作製技術は、米国特許第６８１８４１８および７１１５３９６号;  Roberts および Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297; 米国特許第６２６１８０４号; 米国特許第６２５８５５８号; および Szostak et al. 国際公開第９８／３１７００号に記載されている。
【０１０７】
非抗体結合分子を二量体または多量体として製造することにより、標的抗原についての結合活性を高めることができる。例えば、抗原結合ドメインは、Ｆｃ−Ｆｃ二量体を形成する抗体の定常領域（Ｆｃ）との融合体として発現される。例えば、米国特許第７１１５３９６号参照。
【０１０８】
ＲＮＡ干渉
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的一次転写物（未プロセッシング転写物）またはｍＲＮＡの全部または一部と相補的なポリヌクレオチドであり、標的遺伝子の発現を遮断する（米国特許第５１０７０６５号、国際公開第９９２８５０８号）。アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補性は、例えば５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、またはコーディング配列での特異的な遺伝子転写物のいずれかの部分とのものであり得る。
【０１０９】
ｓｉＲＮＡは、短い干渉性ＲＮＡを指し、二重らせんにおけるＲＮＡ鎖のどちらかと相同的なｍＲＮＡ配列を分解するように作用し、細胞、例えば哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）および身体、例えば哺乳類の身体（人体を含む）において特異的な遺伝子の転写後サイレンシングを誘導し得る。ＲＮＡ干渉現象は当業界では周知である（Bass, Nature, 411:428-29, 2001; Elbahir et al., Nature, 411:494- 98, 2001; Fire et al., Nature, 391:806-11, 1998; および国際公開第０１／７５１６４号）。本明細書で開示された遺伝子産物をコード化する配列および核酸に基づいたｓｉＲＮＡは、典型的には１００未満の塩基対を有し、例えば約３０ｐｂまたはそれより短いものであり得、相補性ＤＮＡ鎖の使用または合成的方法を含む、当業界で周知の方法により作製され得る。ｓｉＲＮＡは、干渉を誘導し得、細胞、例えば哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）および身体、例えば哺乳類の身体（人体を含む）における特異的な遺伝子の転写後サイレンシングを誘導し得る。本発明による典型的ｓｉＲＮＡは、２９ｂｐ以下、２５ｂｐ、２２ｂｐ、２１ｂｐ、２０ｂｐ、１５ｂｐ、１０ｂｐ、５ｂｐまたはその前後またはその間の整数値の塩基対を有し得る。最適な阻害性ｓｉＲＮＡを設計するためのツールとしては、DNAengine Inc.（シアトル、ワシントン）およびAmbion, Inc.（オースチン、テキサス）から入手できるものが挙げられる。
【０１１０】
また、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子も細胞または哺乳類における標的遺伝子（例えば、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５）の発現阻害に使用され得、その場合ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部分と相補的である相補性領域を含むアンチセンス鎖を含み、相補性領域は３０未満のヌクレオチド長、一般的には１９〜２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子を発現する細胞と接触したとき、標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、２５％または４０％阻害するものとする。
【０１１１】
ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイゼーションして二重らせん構造を形成するのに十分な程度相補的である２本のＲＮＡ鎖を含む。これら２鎖が、適切な条件下で組合わされたとき、ハイブリダイゼーションし、二重らせん構造を形成するように、ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列由来の、標的配列と実質的に相補的、さらに一般的には完全に相補的である相補性領域を含み、他方の鎖（センス鎖）はアンチセンス鎖と相補的である領域を含むものとする。一般的に、二重らせん構造は、１５ないし３０、さらに一般的には１８ないし２５、さらに一般的には１９ないし２４、そして最も一般的には１９ないし２１塩基対の長さである。同様に、標的配列との相補性領域は、１５ないし３０、さらに一般的には１８ないし２５、さらに一般的には１９ないし２４、そして最も一般的には１９ないし２１ヌクレオチド長である。本発明のｄｓＲＮＡは、さらに１つまたはそれより多い１本鎖ヌクレオチドオーバーハング（複数も可）を含み得る。ｄｓＲＮＡは、自動式ＤＮＡ合成装置、例えばBiosearch, Applied Biosystems, Inc.から市販されている装置の使用による当業界で周知の標準方法により合成され得る。
【０１１２】
当業者であれば、２０ないし２３、特に２１塩基対の二重らせん構造を含むｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導する上で特に有効であると認められていることを熟知しているはずである（Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888）。
【０１１３】
さらに別の実施態様では、安定性を高めるためにｄｓＲＮＡを化学的に修飾する。本発明の核酸は、当業界で十分に確立された方法、例えばCurrent Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, S.L. et al. (編), John Wiley & Sons, Inc.（ニューヨーク、ニューヨーク、米国）に記載された方法により合成および／または修飾され得、これについては、出典明示で援用する。化学的修飾としては、限定されるわけではないが、２’修飾、オリゴヌクレオチドの糖または塩基の他の部位での修飾、オリゴヌクレオチド鎖への非天然塩基の導入、リガンドまたは化学的部分への共有結合、およびチオリン酸基などの代替的結合によるヌクレオチド間リン酸結合の置換が挙げられる。複数の上記修飾が使用され得る。
【０１１４】
２本の別々のｄｓＲＮＡ鎖の化学的結合は、様々な公知技術のいずれかにより、例えば、共有結合、イオン結合または水素結合の導入、疎水性相互作用、ファンデルワールスまたはスタッキング相互作用、金属イオン配位手段またはプリン類似体の使用により達成され得る。一般的に、ｄｓＲＮＡの修飾に使用され得る化学基には、限定は無いが、メチレンブルー、二官能基、一般的にビス−（２−クロロエチル）アミン、Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン、４−チオウラシルおよびソラレンがある。一例では、リンカーは、ヘキサ−エチレングリコールリンカーである。この場合、ｄｓＲＮＡを固相合成により製造し、ヘキサ−エチレングリコールリンカーを標準的方法に従って組み込む（例えば、Williams, D.J., and K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670）。一実施態様では、アンチセンス鎖の５’−末端およびセンス鎖の３’−末端をヘキサエチレングリコールリンカーにより化学的に結合する。別の実施態様では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡの末端における化学結合は、一般的に三重らせん結合により形成される。
【０１１５】
さらに別の実施態様において、２本の単鎖のうちの一方または両方にあるヌクレオチドを修飾することにより、細胞性酵素、例えば、限定は無いが、ある種のヌクレアーゼ類の分解活性が阻止または阻害され得る。核酸に対する細胞性酵素の分解活性の阻害技術は、当業界では公知であり、例えば、限定されるわけではないが、２’−アミノ修飾、２’−アミノ糖修飾、２’−Ｆ糖修飾、２’−Ｆ修飾、２’−アルキル糖修飾、非荷電バックボーン修飾、モルホリノ修飾、２’−Ｏ−メチル修飾およびホスホルアミデートがある（例えば、Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8参照）。すなわち、ｄｓＲＮＡにおけるヌクレオチドの少なくとも１個の２’−ヒドロキシル基を、化学基、一般的には２’−アミノまたは２’−メチル基により置換する。また、少なくとも１個のヌクレオチドを修飾することにより、ロックト(locked)ヌクレオチドを形成させ得る。上記のロックトヌクレオチドは、リボースの２’−酸素をリボースの４’−炭素と結合するメチレン架橋を含む。ロックトヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630) および Obika, S. et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39: 5401-5404)で報告されている。オリゴヌクレオチドへのロックトヌクレオチドの導入により、相補的配列についての親和性が改善され、融解温度が数度高くなる（Braasch, D.A. and D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7）。
【０１１６】
バイオマーカーとしてのＦＡＲＰ２、ＳＴＫ２５またはそのホモログ／オーソログの使用
一態様において、発現差があるＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）遺伝子の発現レベルを、正常およびＣＡＤ細胞および／または組織で測定する。一実施態様において、遺伝子（複数も可）の発現レベルの測定方法は、任意の効果的な順序で以下の段階の１つまたはそれ以上、例えばポリヌクレオチドプローブと生物試料を、上記プローブが上記試料中のＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸分子と特異的にハイブリダイゼーションするのに有効な条件下で接触させ、上記試料中におけるＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）マーカー遺伝子核酸の存在または非存在を検出する段階を含み得る。また、明確で関連性のある多形を含む特異的な対立遺伝子も検出される。
【０１１７】
一実施態様では、正常およびＣＡＤ細胞および／または組織の両方から得られた試料にプローブを適用し、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸分子の存在を当業界で周知の方法により検出する。例えば、マーカー遺伝子の存在の検出方法は、有効な方法、例えばノーザン・ブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ、ＲＡＣＥ ＰＣＲ、in situ ハイブリダイゼーションなどにより実施され得る。
【０１１８】
別の実施態様では、正常およびＣＡＤ細胞および／または組織の両方から得られた試料にプローブを適用し、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸の量を当業界で周知の方法により検出する。上記方法は、例えばプローブと接触させ、ハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションしたプローブを検出する段階を含むが、さらに定量的な方法および／または標準との比較を使用し得る。プローブと標的間のハイブリダイゼーションの量は、適切な方法、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ ＰＣＲ、ノーザン・ブロット、ポリヌクレオチドマイクロアレイ、高速スキャン（Rapid-Scan）などにより測定され得、定量的および定性的測定値の両方を含む。
【０１１９】
別の実施態様では、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）特異的抗体を用いて、当業界で公知の方法により生物試料中におけるＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）またはそのフラグメント（複数も可）の存在を検出し得る。この方法には、少し例を挙げると、免疫検定法、例えばウエスタン・ブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、「サンドイッチ」免疫検定法、免疫沈降検定法、沈殿反応、ゲル内拡散沈降素反応、免疫拡散検定法、凝集検定法、補体固定化検定法、免疫放射線検定法、蛍光免疫検定法、プロテインＡ免疫検定法等の技術を用いる競合的および非競合的検定法系が含まれ得る。上記検定法は当業界では公知である（Ausubel et al.編、1994, Current Protocols in Molecular Biology, 第１巻 1, John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨーク、これについては出典明示で援用する）。さらにまた、本発明で有用な免疫検定法としては、ホモジニアスおよびヘテロジニアスの両方法、例えば蛍光偏光免疫検定法（ＦＰＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）およびネフロメトリー阻害免疫検定法（ＮＩＡ）などの方法が挙げられる。
【０１２０】
別の実施態様では、生物試料中におけるＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドのレベルが、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の発現レベルのモニター手段として測定され得る。かかる方法は、例えば、生物試料を入手し、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドまたはその適切なエピトープに特異的な抗体と試料を接触させ、抗体との免疫複合体形成の量を測定する段階を含み、免疫複合体形成の量をＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドのレベルの指標とする。ＣＡＤに罹患した対象から入手した生物試料中におけるＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドレベルを、正常対象から採取した生物試料中、または同一対象から予め、または後続的に入手した１つまたは複数の試料中のＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）のレベルと比較するとき、この測定法は有益である。
【０１２１】
また、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドの量の測定結果は、ＣＡＤの進行と相関関係を示し得る。ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドレベルは、生物試料がＣＡＤ罹患の傾向を示す細胞を含むか否かを評価するために予測的に使用され得るか、または特定の治療計画を立てるのに使用され得る。
【０１２２】
診断的検定法
正常対象と比べた場合のＣＡＤ罹患対象におけるＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の発現レベルの検出可能な増加または減少の測定は、病気の状態および／または治療にとって有益となる応答の診断またはモニター手段を提供する。したがって、本発明は、ＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症の検出方法、または別法として、対象においてＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症を発症する危険があるか否かの測定方法を提供する。
【０１２３】
臨床適用では、適切なＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）コード化核酸および／またはＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドの存在および／または非存在についてヒト組織試料をスクリーニングにかけ得る。上記試料は、例えば穿刺生検コア、外科的切除標本、リンパ節組織、血漿または血清を含む、組織試料、全細胞、細胞ライゼート、または単離核酸を含み得る。ある種の実施態様では、これらの試料から抽出された核酸を、当業界で公知の技術を用いて増幅し得る。検出されたＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）および／または血漿リポタンパク質またはＨＤＬ−Ｃのレベルを、正常組織試料の場合と比較する。
【０１２４】
一実施態様における診断方法では、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはポリペプチドレベルを検出することにより、対象がＣＡＤに罹患しているか否かを測定することを含む。健康な正常対象の場合と比較した対象における活性の発現レベルの著しい変化は、ＣＡＤまたはＣＡＤに対する易罹患性の指標である。好ましくは、変化は、少なくとも約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、約７０％または約９０％、約１００％、約１５０％または約２００％またはそれを超える％である。
【０１２５】
別法として、診断方法は、抗体を用いてＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドまたはその機能性フラグメントを検出することにより実施され得る。一実施態様において、本方法は、対象からの生物試料中における適切なＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチド分子のレベルと、ポリペプチド分子の対照レベルとの比較を含み、その場合、ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドレベルの著しい変化が対象におけるＣＡＤの指標となる。「著しい変化」の語は、健康な正常対象由来の生物試料の場合との比較におけるポリペプチドまたはその機能性フラグメントの量の少なくとも約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、約７０％または約９０％、約１００％、約１５０％または約２００％またはそれを超える変化をいう。
【０１２６】
冠動脈疾患の予後、病期分類およびモニター
一態様において、本発明は、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸、ポリペプチドおよび／またはその機能性フラグメントの発現レベルの検査に基づいたＣＡＤの発症、予後および病期の決定方法を提供する。本明細書で使用されている予後とは、疾患の可能性の高い経過および結果の予測をいう。
【０１２７】
一般的に、ＣＡＤの予後または病期分類に使用される方法では、興味の対象である試料中における適切なＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の量を対照試料のそれと比較することにより、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の発現レベルの相対的差異を検出する。この差異は、定性的および／または定量的に測定され得る。対照試料は、ＣＡＤではない、または正常試料、または進行していないことが判明している試料、または進行していることが判明している試料であり得る。
【０１２８】
本明細書で使用されているＣＡＤ病期（分類）とは、ＣＡＤが発生し、症状を誘発している事象の進行度をいう。さらに、病期分類は、ＣＡＤの病状が患者においていかなる形で進行しているかを述べるのに使用されるプロセスである。本発明の方法は、ＣＡＤの病期分類を検定するのに有用である。病期分類は、対照標準レベルに対して適切なＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の発現レベルを測定することにより達成され得る。対照標準レベルは、ＣＡＤではない、健康な状態の試料、または病気の発達における異なる病期のＣＡＤ試料からのものであり得る。
【０１２９】
さらに本発明は、適切なＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸またはポリペプチドまたはその機能性フラグメントの発現レベルを経時的に測定することによる、対象におけるＣＡＤの進行または再発のモニター方法を提供する。
【０１３０】
一実施態様において、本方法は、ａ）最初の時点で対象における適切なＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸分子の発現レベルを測定し、ｂ）後続時点で対象におけるＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸の発現を測定し、そしてｃ）最初の時点での発現レベルを後続時点でのそれと比較することを含み、その場合の発現レベルの著しい変化を、ＣＡＤの発症、進行または退縮の指標とする。
【０１３１】
別の実施態様では、本方法は、ａ）最初の時点で対象におけるＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチド分子の発現レベルを測定し、ｂ）後続時点で対象におけるＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドの発現を測定し、ｃ）最初の時点での発現レベルを後続時点でのそれと比較することを含み、その場合の発現レベルの著しい変化を、ＣＡＤの発症、進行または退縮の指標とする。
【０１３２】
初期の時点に対する後続時点でのＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸またはポリペプチドまたはその機能性フラグメントの発現レベルの増加は、病気がより深刻な段階に進行していることを示す。対照的に、後続時点での発現レベルの低下は、病気が深刻度の低い段階に移行していることを示す。
【０１３３】
治療および治療化合物の効力
別の態様において、本発明はまた、ＣＡＤに関する伝統的および非伝統的処置および治療の両方が奏功していると思われる患者の評価および／またはモニターを可能にする方法を提供する。本発明の利点は、時間経過に応じて利用可能な治療の一つまたは幾つかが奏功し得る患者を経時的にモニター、スクリーニングすることにより、患者が処置（複数も可）によりいかなる経過をたどっているか、処置の変更、改変または中止が正当化されるか否か、または患者の病状または病期が進行したか否かを決定できることである。
【０１３４】
本発明による特定の治療に対して正しい患者を同定することにより、処置の効力を高めることができ、治療の望ましくない生命を脅かす副作用に患者をさらすことが回避できる。本発明の方法を用いて１クールの治療を受けている患者をモニターできれば、患者が時間経過に応じて治療に対し適正に応答しているか否かを測定でき、投薬または用量または送達方法を改変または調節するべきか否かを決定し、患者が治療中に快方に向かっているか、回帰しているか、またはより深刻または進行した病期に突入しているか否かを確認できる。
【０１３５】
本発明によるモニター方法は、患者の体液試料をある一定期間、例えば処置または治療過程中、または患者の病気の経過中に試験または分析することにより、ＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症に罹患した患者の系列的または連続的な試験または分析結果を反映させる。例えば、系列試験では、本発明の方法に従って、処置過程中、および／または病気の経過中にＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）レベルを測定することにより、患者における適切なＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸またはポリペプチドまたはその機能性フラグメントの発現レベルを観察、チェックまたは検査する目的で、同一患者が体液試料、例えば血清または血漿を提供するか、または同一患者が試料を採取されている。
【０１３６】
同様に、男性または女性の病気の状態および／または男性または女性が受けている処置または治療に対する効力、反応および応答を測定する目的で、生物試料におけるＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）レベルを評価するために患者を経時的スクリーニングにかけることも可能である。１つまたは複数の生物試料を、処置または治療過程前に、または処置または治療の開始時点で患者から最適な形で採取することにより、患者が処置を受け、臨床的および医学的評価を受けている期間中における１または複数の後続時点での患者の進行および／または応答の分析および評価を補足するのが望ましい。
【０１３７】
レベルは、何日か、何週間か、何か月か、何年かのある一定期間にわたって、またはその様々な間隔でモニターされ得る。患者の体液試料、例えば血清または血漿試料を、医師または臨床研究者などの専門家が定めた間隔で集めて、処置または病気の経過に即して患者におけるＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）、リポタンパク質またはＨＤＬレベルを測定し、正常個体でのレベルと比較する。例えば、本発明に従って、患者試料を毎月、２か月ごとまたは１、２または３か月間隔の組み合わせで採取およびモニターし得る。年４回またはそれより頻繁な患者試料のモニターが賢明である。患者で見いだされるレベルを、正常個体でのレベル、以前の検査期間から得られた患者自身のレベルと比較することにより、処置または病気の進行または結果を測定する。
【０１３８】
総血漿リポタンパク質の減少および血漿ＨＤＬ−Ｃの増加を示す、好ましくは正常個体で見いだされるレベルまたはその前後またはそれを下回るレベルへの適切なＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）レベルの時間経過に伴う低下は、処置の進行または効力、および／または病気の改善、寛解などの指標となる。
【０１３９】
キット
本発明はまた、生物試料中の適切なＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）の発現レベル（核酸またはポリペプチドレベル）の検出に必要な試薬を含むキットを提供する。試薬は、上記の特異的なプローブ／プライマーおよび抗体を含み得る。またキットは、正常な状態および病気の様々な臨床的進行段階を示す対照／標準値または一連の対照／標準値を含み得る。好ましい実施態様では、対照／標準値または一連の対照／標準値は、正常な状態およびＣＡＤの様々な臨床的進行段階を示す。さらに、キットは、試験試料と比較するための陽性対照および／または陰性対照を含み得る。陰性対照は、Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸またはポリペプチドを持たない試料を含み得る。陽性対照は、様々な既知レベルの適切なＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸またはポリペプチドを有する試料を含み得る。キットはまた、検定を実施し、結果を解釈するための使用説明書を含み得る。抗体に基づくキットの場合、キットは、例えば（１）ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチドまたはその機能性フラグメントに結合する第１抗体（例えば、固体支持体に結合されている）および所望により（２）ＦＡＲＰ２またはＳＴＫ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）ポリペプチド、そのエピトープまたは第１抗体に結合し、検出可能な標識にコンジュゲートされた第２の異なる抗体を含み得る。オリゴヌクレオチドに基づくキットの場合、キットは、例えば、（１）適切なＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸配列とハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能な形で標識されたオリゴヌクレオチドまたは（２）Ｆａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその適切なホモログまたはオーソログ）核酸分子の増幅に有用な一対のプライマーを含み得る。またキットは、例えば緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定剤を含み得る。さらにキットは、検出可能な標識（例えば、酵素または基質）の検出に必要な成分を含み得る。キットはまた、検定にかけられ、試験試料と比較され得る一対照試料または一連の対照試料を含み得る。キットの各成分は、個別容器内に封入され得、様々な容器は全て、キットを用いて実施した検定の結果を解釈するための使用説明書と一緒に単一パッケージ内に収められ得る。
【０１４０】
上記キットは、対象がＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症に罹患しているかまたはその発症の危険が増しているか否かを決定するのに使用され得る。さらに、上記キットは、ＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症の予後を測定し、病期分類し、またはその進行をモニターするのに使用され得る。さらに、上記キットは、薬剤スクリーニングまたはＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症についての処置の選択に使用され得る。
【０１４１】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、医薬上許容される担体と一緒に製剤化された、本発明のＨＤＬモジュレーション剤（例えば、モノクローナル抗体または抗原結合部分（複数も可）、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子）の１つまたはその組み合わせを含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。上記組成物は、（例えば、２種またはそれより多い、異なる）結合分子の一つまたはその組み合わせを含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する抗体または薬剤の組み合わせを含み得る。
【０１４２】
本発明の医薬組成物はまた、併用療法で、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、併用療法は、ＨＤＬモジュレーション剤を少なくとも１種の他のコレステロール低下剤と組み合わせた形で含み得る。併用療法で使用され得る治療剤の例は、下記の本発明の薬剤の使用に関する項でさらに詳しく記載されている。
【０１４３】
本明細書で使用されている「医薬上許容される担体」は、生理学的に適合し得る溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを全て包含する。担体は、当然、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適したものである。投与経路により、活性化合物は、酸の作用および化合物を不活化し得る他の自然条件から化合物を保護する物質でコーティングされ得る。
【０１４４】
本発明の医薬組成物は、１種またはそれより多い医薬上許容される塩を含み得る。「医薬上許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持しており、望ましくない毒物学的作用をもたらすことのない塩をいう（例えば、Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19参照）。上記塩類の例には、酸付加塩および塩基付加塩がある。酸付加塩には、非毒性無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など、並びに非毒性有機酸、例えば脂肪族モノ−およびジ−カルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などから誘導されるものがある。塩基付加塩には、アルカリ土類金属等、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、並びに非毒性有機アミン類、例えばＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導されるものがある。
【０１４５】
本発明の医薬組成物はまた、医薬上許容される酸化防止剤を含み得る。医薬上許容される酸化防止剤の例としては、水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、油溶性酸化防止剤、例えばアスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど、および金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などがある。
【０１４６】
本発明の医薬組成物で使用され得る適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール類（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能有機エステル類、例えばエチルオレエートがある。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用により、分散液の場合に要求される粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持され得る。
【０１４７】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含み得る。微生物の存在の阻止は、滅菌処理、前出、および様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有の両方により確実に達成され得る。また、組成物中へ等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムなどを含有させることが望ましい場合もあり得る。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を含ませることにより、注射可能医薬形態の吸収を延長することも可能である。
【０１４８】
医薬上許容される担体は、無菌水溶液または分散液および無菌注射可能溶液または分散液をその場で調製するための無菌粉末を含む。医薬活性物質についての上記媒質および薬物の使用は当業界では公知である。慣用的媒質または薬剤が活性化合物と適合し得ない場合を除き、本発明の医薬組成物でのその使用も考慮に入れられる。補足的な活性化合物もまた組成物中に混合され得る。
【０１４９】
治療組成物は、典型的には製造および貯蔵条件下において無菌状態で安定していなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の整った構造として製剤化され得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール類（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒質であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用により、分散液の場合に要求される粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、ポリアルコール類、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含有させ得る。例えばモノステアリン酸塩類およびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物に含ませることにより、注射可能組成物の吸収を延長することも可能である。
【０１５０】
無菌注射可能溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を上記で列挙した成分の一つまたはその組み合わせと混合し、次いで、必要に応じて滅菌精密ろ過することにより調製され得る。一般的に、塩基性分散媒質および上記で列挙したものから選択される他の必要成分を含む無菌賦形剤中へ活性化合物を混ぜ込むことにより、分散液を調製する。滅菌注射可能溶液調製用の無菌粉末の場合、その製法は、有効成分と所望の追加成分の粉末を、その予め滅菌ろ過しておいた溶液から製造する真空乾燥および冷凍乾燥（凍結乾燥）である。
【０１５１】
担体材料と組み合わせて単一用量形態を形成させ得る有効成分の量は、処置されている対象および特定の投与方法により変動する。担体材料と組み合わせて単一用量形態を形成させ得る有効成分の量は、一般に治療効果をもたらす組成物の量である。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、医薬上許容される担体との組み合わせにおいて約０.０１パーセント〜約９９パーセントの有効成分、約０.１パーセント〜約７０パーセント、または約１パーセント〜約３０パーセントの割合の有効成分となる。
【０１５２】
最適な望ましい応答（例えば、治療応答）を引き出せるように投薬レジメンを調節する。例えば、単一ボーラスを投与することもあれば、時間をかけて数回の分割用量で投与することもあれば、治療状況の緊急性による指示に応じて用量を適宜増減することもあり得る。投与を容易にし、投薬量を均一にするためには単位用量形態で非経腸組成物を製剤化するのが、特に有利である。本明細書で使用されている単位用量形態は、処置される対象にとって単位用量として適切な物理的個別単位をいう。各単位は、必要とされる医薬用担体と連係して所望の治療効果を収めるように計算された予め定められた量の活性化合物を含む。本発明の単位用量形態に関する説明は、活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療効果、および個体における感受性に応じた処置に関する上記活性化合物の調合技術に内在する制限事項により規定され、直接左右される。
【０１５３】
ＨＤＬモジュレーション剤、例えば抗体の投与について、投薬量は、宿主の体重に基づいて約０.０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常は０.０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投薬量は、体重に基づいて０.３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。具体例としての処置レジメンは、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回または３〜６か月に１回の投与を必要とする。抗体に関する投薬レジメンは、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ（体重）または３ｍｇ／ｋｇ（体重）を含み、以下の投薬スケジュールの一つを用いて抗体を投与する：６回投薬について４週間ごと、次いで３か月ごと；３週間ごと；３ｍｇ／ｋｇ（体重）１回、次いで３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ（体重）。
【０１５４】
方法によっては、結合特異性が異なる２種またはそれより多い結合分子（例えば、モノクローナル抗体）を同時に投与することがあり、その場合、投与される各抗体の用量は指示範囲内に含まれるものとする。ＨＤＬモジュレーション剤は、通常多頻度で投与される。単一投薬間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３か月ごとまたは１年ごとであり得る。患者におけるＨＤＬモジュレーション剤（例えば、抗体）の血液レベルの測定結果によっては、不定期的な間隔が指示されることもあり得る。いくつかの方法では、約１〜１０００μｇ／ｍｌおよび方法によっては約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように投薬量を調節する。
【０１５５】
別法として、ＨＤＬモジュレーション剤は持効型製剤として投与され得、その場合投与頻度は少なくて済む。投薬量および頻度は、患者におけるＨＤＬモジュレーション剤の半減期により変動する。例えば抗体の場合、ヒト抗体が最長の半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体と続く。投与の用量および頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかにより異なり得る。予防的適用の場合、長期間にわたって比較的低用量を比較的低頻度間隔で投与する。患者によっては終生処置を受け続ける場合もある。治療的適用の場合、病気の進行が低下するかまたは終結するまで、または患者が病気の症状の部分的または完全な改善を示すまで比較的短い間隔で比較的高用量が要求されることもある。その後、患者は予防的投薬プログラムで投与され得る。
【０１５６】
本発明の医薬組成物中における有効成分の実際の用量レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与方式について所望の治療的応答を達成するのに有効な量の有効成分が得られるように変更され得る。選択される用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排泄速度、処置の持続期間、特定の使用される組成物と併用される他の薬物、化合物および／または物質、処置されている患者の年齢、性別、体重、病状、全般的健康状態および既往歴および医学界で周知の同様の因子を含む様々な薬物動態的因子により変化する。
【０１５７】
ＨＤＬモジュレーション剤の「治療有効量」は、病気の症状の重症度の減少（例えば、血漿コレステロールの減少またはコレステロール関連疾患の症状の減少）、疾患の無症状期間の頻度および持続時間の増加、または病気の苦痛に起因する欠陥または障害の阻止をもたらすものである。
【０１５８】
組成物は、当業界で公知の様々な方法の一つまたはそれ以上を用いる一つまたは複数の投与経路により投与され得る。投与経路および／または方法が所望の結果により異なることは、当業者が認めるところである。ＨＤＬモジュレーション剤の投与経路としては、限定されるわけではないが、例えば注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路がある。本明細書で使用されている「非経腸投与」という表現は、経腸および局所投与以外の通常注射による投与方式を意味し、限定ではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内(intrastemal)注射および注入を包含する。
【０１５９】
別法として、ＨＤＬモジュレーション剤は、非経腸経路により、例えば局所、表皮または粘膜投与経路により、例えば鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的に投与され得る。
【０１６０】
活性化合物は、急速な放出から化合物を保護する担体を用いて、例えば移植片、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御型製剤として調製され得る。生物分解性の生体適合性ポリマー、例えば酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類およびポリ酪酸などが使用され得る。上記製剤の多くの製造方法は、特許を取得しているかまたは当業者には公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson 編、Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク（1978）参照。
【０１６１】
治療組成物は、当業界で周知の医療器具により投与され得る。例えば、一具体例において、本発明の治療組成物は、針の無い皮下注射器具、例えば米国特許第５３９９１６３、５３８３８５１、５３１２３３５、５０６４４１３、４９４１８８０、４７９０８２４または４５９６５５６号で示された器具により投与され得る。本発明で有用な公知の移植片およびモジュールの例としては、制御された速度で薬剤を分配する移植可能な微量注入ポンプを示す米国特許第４４８７６０３号、皮膚を通して薬剤を投与する治療器具を示す米国特許第４４８６１９４号、正確な注入速度で薬剤を送達する薬剤注入ポンプを示す米国特許第４４４７２３３号、連続的薬剤送達用の可変流動性で移植可能な注入装置を示す米国特許第４４４７２２４号、マルチチャンバー区画を有する浸透性薬剤送達システムを示す米国特許第４４３９１９６号、および浸透性薬剤送達システムを示す米国特許第４４７５１９６号が挙げられる。これらの特許については出典明示で援用する。多くの他の上記移植片、送達システムおよびモジュールは、当業者には周知である。
【０１６２】
ある種の実施態様において、ＨＤＬモジュレーション剤は、確実に生体内で適正な分布をとるように製剤化され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを（所望ならば）確実に越えるようにするため、それらを例えばリポソームで製剤化することが可能である。リポソームの製造方法については、例えば米国特許第４５２２８１１、５３７４５４８および５３９９３３１号を参照。リポソームは、特定の細胞または臓器へ選択的に輸送される１または複数の部分を含むため、ターゲッティングされた薬剤送達を推進し得る（例えば、V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685参照）。ターゲッティング部分の例としては、葉酸塩またはビオチン（例えば、Low et al.、米国特許第５４１６０１６号参照）、マンノシド類（Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）、抗体（P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180）、界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134）、ｐ１２０（chreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090）がある。また、K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273も参照。
【実施例】
【０１６３】
典型的な具体例
実施例１
機能的ＨＤＬの血漿レベルが上昇すると、冠動脈疾患の危険性が減るということの強力な証拠がある（Gotto, A. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 43:717-724, 2004）。Ａｐｏａ２は、交雑種の全部ではないが多くについての原因となるＣｈｒ１ ＱＴＬ遺伝子として以前に同定された（Wang, X. et al., Genome Res., 14, 1767-1772, 2004）。Ｓｏａｔ１は、４種の追加交雑種；Ｃａｓｔ×１２９、Ｂ６×ＫＫ、Ｐｅｒａ×ＤＢＡ／２およびＲIII×１２９について最も可能性の高いＱＴＬ遺伝子として同定された。しかしながら、以下の情報は、Ｃｈｒ１に第３のＱＴＬがあり得ることを示していた。第一に、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）および１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ（１２９）交雑種についての広い信頼区間は、２つの密接に結びついたＱＴＬ、Ｈｄｌｑ１４およびＨｄｌｑ１５の存在を示すものであった（Ishimori, N. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 24:161-166, 2004）。Ａｐｏａ２はＨｄｌｑ１５についてのＱＴＬ遺伝子であるが、Ｓｏａｔ１はＢ６および１２９系統間において発現または配列差異を示さないため、Ｓｏａｔ１は、Ｈｄｌｑ１４領域内に位置するにしても、Ｈｄｌｑ１４についての原因遺伝子であるとは思われず、第３のＱＴＬおよび第３のＱＴＬ遺伝子が存在し得ることを示している。第二に、Ｃｈｒ ２ｑ３６.１−３７.１（図１）におけるヒトＨＤＬ ＱＴＬは、この領域と相同性を示すが、Ａｐｏａ２またはＳｏａｔ１を含んでおらず、この点からも、第３のＱＴＬが、ヒト２ｑ ＱＴＬと相同的なマウスＨｄｌｑ１４領域に存在し得ることが示唆される。
【０１６４】
交雑種Ｂ６×１２９で同定された染色体（Ｃｈｒ）１におけるＨｄｌｑ１４を確認し、ＱＴＬ遺伝子を同定するため、近くのＱＴＬに対して強い影響を及ぼさないようにＣｈｒ１におけるＡｐｏａ２が同じである、ＮＺＢおよびＮＺＷ系統から形成されたＦ２集団において、量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）分析を実施した。Ｈｄｌｑ１４が立証され、決定間隔は２２５遺伝子を擁する４５Ｍｂから、２種の遺伝子：Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５のみ含む領域に縮小された。遺伝的に多様な４３マウス系統において、ＦＡＲＰ２ Ｌｅｕ８２１変異型をもつ系統は、ＦＡＲＰ２ Ｐｒｏ８２１変異型をもつものより著しく高い血漿ＨＤＬレベルを有することが見出された。
【０１６５】
Ｃｈｒ１におけるＨＤＬに関するＱＴＬは複雑である。表現型としてＨＤＬを用いて公表された２３の交雑種において、それらのうちの１５からＣｈｒ１におけるＱＴＬを検出した（Rollins, J. et al., Trends Cardiovasc. Med., 16:220-234, 2006）。これらのＣｈｒ１ ＱＴＬの多くに関するＬＯＤスコアプロットが広範かつ複雑であることから、多数のＱＴＬが示唆される。一交雑種Ｂ６×１２９において、少なくとも２つのＱＴＬ、すなわちＨｄｌｑ１４およびＨｄｌｑ１５についての統計的証拠を得た（Ishimori, N. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 24:161-166, 2004）。１０４ｃＭにピークを有するＨｄｌｑ１５は、Ａｐｏａ２遺伝子におけるＡｌａ６１からＶａｌ６１へのアミノ酸変化により決定される。配列決定により、近親交配系統は、５種の異なるＡｐｏａ２遺伝子を有し、それらの間に９のアミノ酸変化を伴うが、ＱＴＬが検出された交雑種のみ６１位のアラニンまたはバリン間が異なることが示された。Ａｐｏａ２ ＱＴＬは強い効果を有するため、近くのＱＴＬの強い影響をのみ込み得る。Ａｐｏａ２多形では説明されなかったＣｈｒ１におけるＱＴＬで交雑を調べることにより、Ｓｏａｔ１が４交雑種におけるＱＴＬ遺伝子であることが示された。しかしながら、調べられた系統は、Ｓｏａｔ１のコーディング領域配列または発現レベルが異ならないため、Ｓｏａｔ１は、Ｂ６×１２９交雑種で検出され、ｃＭ８０に位置するＨｄｌｑ１４についてのＱＴＬ遺伝子ではあり得なかった。
【０１６６】
Broad Institute（それらのウェブサイト参照、broad.mit.edu/snp/mouse/）からの緻密なＳＮＰ地図を用いて、以下の特徴を有する交雑種を得るための系統を選択した：（１）系統はＳｏａｔ１遺伝子において同一ハプロタイプを有するため、Ｓｏａｔ１にＱＴＬが存在しない、（２）系統はＡｐｏａ２遺伝子における６１位に同じアミノ酸を有するため、Ａｐｏａ２にＱＴＬが存在しない、および（３）Ｈｄｌｑ１４領域における異なるハプロタイプの存在。容易に入手可能な系統のうちの一対のみが、これらの基準を満たしている。ＮＺＷ／ＬａｃＪ（ＮＺＷ）およびＮＺＢ／ＢＩＮＪ（ＮＺＢ）は、Ｓｏａｔ１遺伝子において同一のハプロタイプを有しており（データは示さず）、両方ともＡｐｏａ２における６１位にバリンを有している。Ｈｄｌｑ１４信頼区間により画定された８２〜１６２Ｍｂ領域の全部ではないが大部分にわたって、ＮＺＷは１２９と同一のハプロタイプを有しており、ＮＺＢはＢ６と同一のハプロタイプを有していた。８２〜１６２Ｍｂ領域の部分について、ＮＺＷのハプロタイプはＮＺＢと同一である。Ｈｄｌｑ１４の原因であるＱＴＬ遺伝子が、ＮＺＷおよびＮＺＢ間の血統により同一であると思われるこれらの領域に位置する場合、ＱＴＬは検出されない。しかしながら、ＱＴＬ遺伝子が、ＮＺＢとＮＺＷが相違している領域に位置する場合、我々は、当然、Ａｐｏａ２およびＳｏａｔ１遺伝子により誘発される差異の干渉を受けることなくこのＱＴＬをマッピングすることができる。
【０１６７】
Ｈｄｌｑ１４は、ＮＺＢおよびＮＺＷ間での交雑種で確認される。２６４の（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ２雄および雌マウスにおいて、８週間高脂肪食餌を与えた後、血漿ＨＤＬ濃度を測定した。Ｆ２子孫における対数変換したＨＤＬの分布はほぼ正常であった（図２Ａ）。Ｃｈｒ１についての区間マッピングにより、Ｄ１Ｍｉｔ３３６（５８.７ｃＭ、ＮＣＢＩ Build 36における９８.４４Ｍｂ）付近にピークをもち、３.０２の著しいＬＯＤスコア（図２Ｂ、ラインＩ）をもつ血漿ＨＤＬに影響を及ぼす遺伝子座が明らかとなった。ピークマーカーの片側におけるＬＯＤスコアの１単位減少により画定された９５％信頼区間は８０〜１２５Ｍｂであり、１２９×Ｂ６交雑種で同定された８２〜１６２Ｍｂ Ｈｄｌｑ１４領域と重複している。Ｄ１Ｍｉｔ３３６においてＮＺＷ同型接合であるＦ２マウスは、この遺伝子座に異型接合遺伝子型または同型接合ＮＺＢ遺伝子型をもつマウスと比べて著しく高いＨＤＬレベルを有したため（図２Ｃ）、高ＨＤＬに関する対立遺伝子は劣性であった。
【０１６８】
バイオインフォマティックスツールを用いることにより、Ｈｄｌｑ１４領域は１９遺伝子まで狭められる。これらの交雑種から同定されたＱＴＬについての信頼区間は非常に大きく、Ｂ６×１２９交雑種については４８７遺伝子を含む８０ＭｂおよびＮＺＢ×ＮＺＷ交雑種については２２５遺伝子を含む４５Ｍｂである（それぞれ、図３Ａおよび３Ｂ）。ＱＴＬ領域を狭め、候補遺伝子の数を絞るため、我々は、様々なバイオインフォマティックスおよび統計学的ツールを使用した。交配、比較ゲノム学およびハプロタイプ分析の組み合わせを含むこれらのツールにより、さらなる分析用に候補遺伝子の優先順位を決定するＱＴＬ区間の段階的絞り込みが可能となる。
【０１６９】
Ｈｄｌｑ１４は、交配を組み合わせることにより１２５遺伝子を含む２７.３Ｍｂまで狭められる。典型的ＱＴＬの大きな信頼区間は、限られた数の組換え事象によるものである。交配を組み合わせることにより、組換えの数は増加し、ＱＴＬ区間は縮小される（Li, R. et al., Genetics, 169:1699-1709, 2005）。現（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ２交雑種および元（Ｂ６×１２９）Ｆ２交雑種の両方からのＨｄｌｑ１４に関する未処理データを、単一低ＨＤＬ対立遺伝子としてＢ６およびＮＺＢ遺伝子型を、単一高ＨＤＬ対立遺伝子として１２９およびＮＺＷ遺伝子型を再コーディングすることにより組み合わせた。組み合わせた染色体１データの再解析により、Ｈｄｌｑ１４に関するＬＯＤスコアは５.０１に増加し（図２Ｂ、ラインII）、９５％信頼区間は、Ｍｂ８９.８〜１１７.１Ｍｂに及ぶ２７.３Ｍｂに狭められ（図３Ｃおよび２Ｂ、ラインII）、遺伝子の数は１２５に縮小した。
【０１７０】
Ｈｄｌｑ１４は、比較ゲノム学により８９遺伝子を含む６.２Ｍｂまで狭められる。同じ形質についてのげっ歯動物およびヒトＱＴＬを相同的ゲノム位置にマッピングする。哺乳類ゲノムは進化中に分解および再配置されているため、マウスとヒトの間には約３４０の相同性セグメントが存在する（LA., P., Mamm. Genome, 14:429-436, 2003）。したがって、２０ｃＭほどの各マウスＱＴＬは、３〜４の異なるヒト染色体と相同性であり得る。これらの相同性地図を比較することにより、相同性ＱＴＬが両種において同じ遺伝子によりもたらされると仮定すれば、両種においてＱＴＬのサイズは縮小され得る。この仮定は、マウスにおいて最初に同定され、次いでヒトで確認された多数の形質について真実であることが判明している（Stoll, M. et al., Genome Res., 10:473-482, 2000; Sugiyama, F. et al., Genomics, 71:70-77, 2001; Dwyer, J. et al., New Eng. J. Med., 350:29-37, 2004; Krude, H. et al., Nature Gen., 19:155-157, 1998; Hillebrandt, S. et al., Nature Gen., 37:835-843, 2005; Ueda, H. et al., Nature, 423:506-511, 2003; Wang, X. et al., Nature Gen., 37:365-372, 2005; Korstanje, R. & DiPetrillo, K., Am. J. Physiol. Renal Physiol., 287:F347-352, 2004; Klein, R., J. Musculoskel. Neuronal Int., 2:232-236, 2002）。マウスおよびヒト間のゲノム相同性を用いることにより、ヒトＣｈｒ ２ｑ３７.２〜３７.３で同定されたＨＤＬ ＱＴＬをＨｄｌｑ１４と比較した。このヒトＱＴＬは、Ｈｄｌｑ１４の８４〜９６Ｍｂ部分についてのみ相同性を示す。交配の組み合わせにより既に８９.８Ｍｂに近い領域が排除されたため、比較ゲノム学の使用により、ＱＴＬの遠位末端は狭められ、９６〜１１７Ｍｂの領域が排除される。この段階により、ＱＴＬ領域は６.２Ｍｂおよび８９遺伝子に絞られる（図３Ｄ）。
【０１７１】
Ｈｄｌｑ１４は、ハプロタイプ分析により１９遺伝子を含む２.３Ｍｂに絞られる。４種の全親系統からのハプロタイプを、縮小されたＱＴＬ区間（Ｍｂ８９.８〜９６）全体を通して比較することにより、ＮＺＷおよび１２９系統間では共有されているが、ＮＺＢおよびＢ６系統間では異なるゲノム領域を同定した。共通のハプロタイプブロックを、図４（領域の部分分析のみを示す）で説明されているとおり３またはそれより多い連続共有対立遺伝子であると定義した。遺伝子を含み得る領域を画定する際、エンドポイントの上下にあるＳＮＰを使用した（例えば、図４における９０.３５Ｍｂ〜９０.５１Ｍｂ）。８９.８〜９６Ｍｂ領域において１つのＳＮＰ／１４.３ｋｂの平均密度で４３９個のＳＮＰを有するBroad InstituteからのＳＮＰ地図を最初に使用し、多くのさらなるＳＮＰを有するが、４親系統の一つ、ＮＺＢについては含まないPerlegen データベースで確認した。ハプロタイプ分析により、ＱＴＬ領域は、１９遺伝子のみを含む２.３Ｍｂに狭められた（図３Ｅ、表１）。
【０１７２】
発現差異について縮小された候補リストの評価。遺伝子のいずれかが親系統間で発現差異を示すか否かを評価するため、我々は、Affymetrix 発現マイクロアレイを用いて、転写プロフィールを比較した。これらのデータは、普通の食餌または高脂肪食餌を与えた１２系統の雄および雌における肝臓発現を比較する別の実験（原稿準備中）から得られた。これらの交雑種の４親系統のうち３つ；１２９、Ｂ６およびＮＺＢ系統は、１２系統調査に含まれていた。試験した１５候補遺伝子のうち、２つのRiken クローンを除く全てが Affymetrix チップにおいてプローブを有していた。唯一の位置まで正確にブラスト(blast)するプローブについてのみ調べた。これら１３遺伝子のうち２種、Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５は、Ｂ６および１２９系統（交雑種の親）間で著しい発現差異を示した。マイクロアレイ実験はＮＺＷを含まないため、ＮＺＷおよびＮＺＢ間の比較は不可能である。しかしながら、ハプロタイプデータは、ＮＺＷが当然１２９と同じ調節情報を有することを示しているため、ＮＺＢを１２９と比較した。発現差異は、Ｆａｒｐ２ではなく、Ｓｔｋ２５について残っていた。Ｂ６およびＮＺＢは両方ともＨｄｌｑ１４について同じハプロタイプを有するため（表２）、どちらの遺伝子も、予想通りＢ６およびＮＺＢ間での発現差異を示さない。
【０１７３】
配列差異に関する候補の評価。ＱＴＬは、タンパク質の発現または機能における親系統間の差異によるものであり得る。機能的差異は、コーディング領域における配列差異によるものである。これらの遺伝子のいずれかがコーディング領域に多形を有するか否かを評価するため、我々は、系統間におけるコーディング差異について遺伝子ごとのやり方で Mouse Phenome DatabaseのＳＮＰを調べた。これらを表３に列挙する。コーディング領域変異をもつ８遺伝子について、塩基変化が、同一アミノ酸をもたらすか（コーディング領域−同義的についてＣｓ）、または変化したアミノ酸をもたらすか（コーディング−非同義的についてＣｎ）により、配列変化を分類した。タンパク質において機能的変化を誘発するためにはアミノ酸を変える必要があることは予測されるが、コドンの頻度が変えられる場合、同義変化でもタンパク質レベルおよび機能に影響し得ることが立証された。希有コドンにより誘発されるタンパク質合成の速度が緩慢な場合、タンパク質のレベルが変わるだけでなく、異常な折りたたみおよび二次構造を生じさせ得ることにより機能も変わり得る。コドン頻度表（ウェブサイトkazusa.or.jp/codonで利用可能）を用いて、各同義変化を評価した。２つのみ、コドン頻度の変化を誘発していた。E030010N08Rik 遺伝子では、使用されるコドンの頻度が１４％（ＧＴＴ）から２３％（ＧＴＣ）に変化していた。Ｓｔｋ２５遺伝子では、使用されるコドンの頻度が４１％（ＡＣＡ）から８％（ＡＣＧ）に変化していた（表３）。
【０１７４】
また、６遺伝子における非同義的各アミノ酸変化のそれぞれについても評価した（表３）。極性に影響する変化を有する遺伝子は無く、Ｇｌｒｐ１のみ、タンパク質の電荷に影響する変化を有していた。Ｍｔｅｒｆｄ２遺伝子で見られるシステインにおける変化は、重要なジスルフィド結合を変え得、Ｆａｒｐ２遺伝子で見られるプロリンにおける変化は、タンパク質の折りたたみ、すなわちその機能に影響を及ぼし得るものであった。
【０１７５】
ＳＮＰデータベースは、Perlegen 再配列決定からのものであっても、全部のＳＮＰを含んでいるわけではない。したがって、これらの遺伝子のうち５つを配列決定することにより、可能性のある多形が全て見出されたという確証を得た；その名称、ＨＤＬ結合タンパク質は、それがＨＤＬ遺伝子としてある一定の役割を有し得ることを示唆するものであることから、Ｈｄｌｂｐ、並びにそれぞれ非同義的アミノ酸変化を有することから、Ｓｎｅｄ１、Ｍｔｅｒｆｄ２、ＰａｓｋおよびＦａｒｐ２。各エキソンと隣接イントロンの少なくとも５０ヌクレオチドを各遺伝子について配列決定した。アミノ酸が変化した多形を有するものとして６遺伝子が同定された（表３）。
【０１７６】
また、これらの遺伝子のいずれかにおいて変化したアミノ酸が保存領域または既知機能性ドメインにあるか否かに関して問題が提起された。ＳＮＥＤ１、ＭＴＥＲＦＤ２およびＰＡＳＫにおけるアミノ酸変化は、保存領域または既知機能性ドメインでは生じなかった。遺伝子Ｇｌｒｐ１は、マウスでのみ見出され、相同性を示さなかった。ＦＡＲＰ２の変異型Ｐｒｏ８２１Ｌｅｕ（図５Ａ）は、哺乳類種間で保存された領域で見出されたものであり（図５Ｂ）、この領域は、ホスホリパーゼ類、ＧＴＰアーゼ調節タンパク質およびプロテインキナーゼ類、並びに脂質結合タンパク質などの多様な酵素的または調節機能をもつタンパク質において同定された（Blomberg, N. et al., Trends Biochem Sci., 24:441-445, 2007）、プレックストリン相同性（ＰＨ）ドメインとして認識される（Lemmon, M., Biochemical Society symposium, 81-93, 2007）。プレックストリンドメインそれ自体は、脂質と結合すると考えられている（Klopfenstein, D. & Vale, R., Mol. Biol. Cell, 15:3729-3739, 2004）。Ｆａｒｐ２は有望な候補であったため、遺伝子を１２系統（１２９、Ａ／Ｊ、Ｂ６、Ｃ３Ｈ、ＣＡＳＴ、ＤＢＡ２、ＦＶＢ、ＮＯＤ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲIII、ＳＭおよびＳＪＬ）において配列決定し、機能性ＳＮＰ（ｒｓ１３４７５９８８）を追加の４系統（Ｐｅｒａ、Ｉ／ＬｎＪ、ＮＺＯおよびＮＯＮ）で決定した。
【０１７７】
以前の交雑種による証拠は、ＱＴＬ遺伝子としてＦａｒｐ２およびＳｔｋ２５を指し示している。配列および発現の評価により、候補遺伝子の数が、可能性の高い２候補（発現差異およびコドン使用の大きな変化（ＡＣＡからＡＣＧへ）を伴うＳｔｋ２５および保存機能性ドメインにアミノ酸変化（Ｌｅｕ８２１Ｐｒｏ）を伴うＦａｒｐ２）および完全には除外され得ない数種の他の遺伝子（発現について試験されなかった２種のRiken クローン、非保存領域にアミノ酸変化を伴うＳｎｅｄ１、Ｍｔｅｒｆｄ２およびＰａｓｋ、および一アミノ酸変化を有するが、他の哺乳類種と共有されていないタンパク質であるＧｌｒｐ１）に縮小された。
【０１７８】
交雑種ＮＺＯ×ＮＯＮを調べた。これらの親系統は、Riken クローンおよびＳｎｅｄ１、Ｍｔｅｒｆｄ２、ＰａｓｋおよびＧｌｒｐ１遺伝子を含む領域に異なるハプロタイプを有するが、Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５については同一ハプロタイプを有する（図６Ｂ）。この交雑種はＨｄｌｑ１４領域にＱＴＬをもたないため（図６Ａ）、この交雑種はＱＴＬ遺伝子が異なることはない。これにより、領域の上部の遺伝子が排除され、候補遺伝子のリストは、同一ハプロタイプを伴う領域におけるものにのみ縮小される；Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５。これらの発見を確認するため、交雑種Ｂ６×Ｃ３Ｈを調べた。この交雑種は、Ｆａｒｐ２およびＳｔｋ２５領域に同一のハプロタイプを有する（図６Ｂ）。これら２遺伝子の一方がＱＴＬ遺伝子である場合、ｃＭ５５.３に当然ＱＴＬは存在しない。Ｂ６およびＣ３Ｈ間のＳｏａｔ１における差異および両交雑種についてのＡｐｏａ２における差異の結果、ｃＭ８１.６および９２.６にＱＴＬは存在するが、この交雑種からのＬＯＤスコアプロット（図６Ａ）は、ｃＭ５８にＱＴＬが無いことを示す。これら一連の証拠は、両方ともＱＴＬの欠如から推論され、否定的なデータについて確信をもつのは常に困難なものである。最終交配試験は肯定的な証拠を提供し、この発見をさらに確認することができ、おそらく実際の機能的多形を示すと思われる。交雑種×ＤＢＡ／２からのＣｈｒ１プロットを比較した。ＰＥＲＡ×ＤＢＡ／２交雑種は、Ｃｈｒ１上のｃＭ５５にさらなるＱＴＬを有し（図６Ａ）、これら２系統のハプロタイプの比較は、それらが、Ｆａｒｐ２およびＳｔｋの機能性ドメインにあるＳＮＡについて異なることを示すことから、ＱＴＬ遺伝子はＦａｒｐ２またはＳｔｋ２５（またはその両方）でなくてはならないことがわかる。
【０１７９】
ＦＡＲＰ２ ８２１Ｌｅｕ対立遺伝子をもつマウスは、ＦＡＲＰ２ ８２１Ｐｒｏ対立遺伝子をもつマウスより高い血漿ＨＤＬ濃度を有していた。ＦＡＲＰ２ ８２１Ｌｅｕ−Ｐｒｏ変異が血漿ＨＤＬレベル変異と関連しているか否かを測定するため、Mouse Phenome Databaseからの４３近親交配マウス系統の血漿ＨＤＬ濃度を分析した。ＨＤＬに対するＡＰＯＡ２の強い影響を回避するため、４３系統を、重要なアミノ酸変化Ａｌａ６１からＶａｌ６１に基づいて２群に分割した（７）。ＡＰＯＡ２ Ａｌａ６１群（３０系統）では、対立遺伝子８２１Ｌｅｕを有する系統（１２系統）のＨＤＬレベルは、雄および雌マウスの両方において対立遺伝子８２１Ｐｒｏを有する系統（１８系統）の場合よりも著しく高かった（それぞれ、８３.１±４.３対６３.６±５.７ｍｇ／ｄＬ、Ｐ＝０.０１、および６３.４±３.３対５０.５±３.２ｍｇ／ｄＬ、Ｐ＝０.００９）（図７Ａ）。同様の傾向は、Ａｐｏａ２ Ｖｌａ６１を有する系統（１３系統）でも見出された（雄では１１３.１±９.８対１０７.６±９.８ｍｇ／ｄＬおよび雌では９８.４±１１.４対７９.５±７.９ｍｇ／ｄＬ）（図７）が、系統の数が少ないためそれらの差異は統計的有意差には達しなかった。
【０１８０】
実施例２．材料および方法
動物および食餌：ＮＺＷおよびＮＺＢマウスを、The Jackson Laboratory（バーハーバー、メイン）から入手し、交配させて（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１子孫を作らせ、それらを交雑させて２７２ Ｆ２子孫を作り出した。１４時間明／１０時間暗周期により温度および湿度制御環境でマウスを維持し、食物および酸性化水へ無制限に接近させた。離乳したてのマウスには、８週齢になるまで標準飼料（１８％タンパク質げっ歯動物食餌、６％脂肪、製品２０１８；Harlan Teklad、マディソン、ウィスコンシン）を食べさせ、次いで１５％乳脂肪、１％コレステロールおよび０.５％コール酸を含む高脂肪食餌を食べさせた。実験結果は、The Jackson Laboratory の実験動物委員会により検討および是認された。
【０１８１】
血漿ＨＤＬの定量：高脂肪食餌開始の８週間後、動物を午前中４時間絶食させ、ＥＤＴＡを含む管中で後眼窩洞から採血し、５分間９０００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。血漿を新たな管に入れ、分析時まで−２０℃で冷凍した。血漿試料を採血の１週間以内に解凍し、渦状に撹拌し、分析した。各血液試料からの血漿ＨＤＬ濃度を、酵素試薬キット（番号６５０２０７、Beckman Coulter）を用いてSynchron CX Delta System（Beckman Coulter）に関する製造業者の推奨に従って直接測定した。
【０１８２】
遺伝子解析：プロテイナーゼＫ消化後、フェノール−クロロホルム抽出を用いて尾部試料からＤＮＡを調製し、１０ｍＭのトリス・Ｈｃｌ（ＰＨ：８.０）に再懸濁した。ＮＺＢおよびＮＺＷ対立遺伝子間を識別するＭＩＴマイクロサテライトマーカーＤ１Ｍｉｔ１、Ｄ１Ｍｉｔ３７３、Ｄ１Ｍｉｔ２１２、Ｄ１Ｍｉｔ１７７、Ｄ１Ｍｉｔ１３２、Ｄ１Ｍｉｔ３３６、Ｄ１Ｍｉｔ２１８、Ｄ１Ｍｉｔ１０３、Ｄ１Ｍｉｔ１４およびＤ１Ｍｉｔ１４８について、アガロースゲル電気泳動（NuSieve 3:1, FMC BioProducts、ロックランド、メイン）を用いてＦ２子孫で遺伝子解析した。ＳＮＰ ｒｓ3717961、ｒｓ3708797 およびｒｓ3022854を、KBiosciences（ホッデスドン、英国）と連係させたThe Jackson LaboratoryのAllele-Typing Serviceにより遺伝子解析した。報告された遺伝地図の位置を、Mouse Genome Databaseから検索する（ウェブサイトinformatics.jax.org参照）。
【０１８３】
ＱＴＬ分析：ＨＤＬ値を自然対数変換した：対数変換はＨＤＬ分布における右の非対称を縮小したが、さらに重要なことに、それはまた、交雑種間に定常分散をもたらした。交配集団を分析目的で合わせたとき、一集団が大きな表現型分散を有する場合、それが結果を支配する傾向がある。ＨＤＬに関連した単遺伝子座を、区間マッピングにより検出した。多重補填アルゴリズムを用いて、欠損マーカー遺伝子型を算出した。一方向ＡＮＯＶＡを、ＨＤＬレベルに関する全染色体走査で同定されたピークＱＴＬマーカーでの対立遺伝子効果の測定に使用した。結果が、順列解析により評価される、９５％全ゲノム調整閾値を満たすか超える場合、ＱＴＬは有意であるとみなされる。Pseudomarker １.１ソフトウェアを用いて、分析を実施した（ウェブサイトjax.org/staff/churchill/labsite 参照）。
【０１８４】
交雑種の統計的組み合わせ：異なる系統との交配で反復ＱＴＬを見出すことは、それらが共有された先祖伝来の対立遺伝子から生じたものであり得ることを示唆している。単一の低ＨＤＬ対立遺伝子としてＢ６およびＮＺＢ遺伝子型および単一の高ＨＤＬ対立遺伝子として１２９およびＮＺＷ遺伝子型を再コーディングすることにより、Ｂ６および１２９間の交配からのＣｈｒ１に関する未処理データを、ＮＺＢおよびＮＺＷマウスを用いた交雑種からの同データと合わせた（Li, R. et al., Genetics, 169:1699-1709, 2005）。ＬＯＤスコアを、各交雑種について別々に、次いで組み合わせた両交雑種についてＱＴＬ区間にわたる２−ｃＭ間隔でコンピューター処理した。データを合わせ、標準化された「ＨＤＬ表現型」および加算的共変量としての「交雑種」で解析した。
【０１８５】
Ｈｄｌｑ１４ハプロタイプの同定：ハプロタイプ分析で使用するためのＳＮＰを、ＳＮＰの広範な公開データベース、例えば Broad SNPs（それらのウェブサイトで入手可能、broad.mit.edu/snp/mouse）および Perlegen SNPs（それらのウェブサイトで入手可能、mouse.perlegen.com/mouse）から入手した。４種の全親系統（ＮＺＢ、ＮＺＷ、Ｂ６および１２９）からのハプロタイプを、Ｍｂ８９.８から９６への縮小された区間全体を通して比較することにより、高ＨＤＬについての対立遺伝子を与えるＮＺＷおよび１２９系統間では共有されているが、低ＨＤＬについての対立遺伝子を与えるＮＺＢおよびＢ６系統とは異なるゲノム領域を同定した。データセットは、８９.８〜９６Ｍｂに及ぶ４３９個のＳＮＰを含んでおり、ＳＮＰの平均スペーシングは１つのＳＮＰにつき〜１４.３ｋｂであった。
【０１８６】
比較ゲノム学の使用によるＨｄｌｑ１４の絞り込み：エクセルシートで一列に並べられた全マウス遺伝子およびヒト遺伝子を有するバイオインフォマティックスツールを見つけ、マウスおよびヒトＱＴＬをそれらの対応する位置に配置させた。このツールを使用し、文献に基づきながら、Ｈｄｌｑ１４領域を絞り込んだ。
【０１８７】
マイクロアレイ発現試験：この縮小された候補遺伝子リストを用いて、マイクロアレイデータベースを用いることにより、Ｈｄｌｑ１４ ＱＴＬをもたらす系統間に発現差異が存在するか否かを調べる。ＨＤＬ ＱＴＬを生じさせる交雑種の大部分の親である１２系統の肝臓からのマイクロアレイデータのセットを使用した。これらの系統は、Ｂ６、１２９およびＮＺＢを含む。マイクロアレイデータベースは、通常の食餌または高脂肪食餌を摂取させた１２系統のそれぞれの雄３匹および雌３匹から得たサンプルを有する。この段階に関する検索基準は、遺伝子が、Ｂ６および１２９系統（交雑種の親）間では著しい発現差異を有するが、Ｂ６およびＮＺＢ（両方ともＨｄｌｑ１４についての同一対立遺伝子を有する）間では発現差異を示さないことである。
【０１８８】
重要な配列差異がある場合にはＨｄｌｑ１４位置的候補を調べる：関連性のある組織で発現された候補遺伝子のリストを用いて、ＳＮＰデータベース（aretha.jax.org/pub-cgi/phenome/mpdcgi?Rtn= snps/door）を検索することにより重要な配列差異が存在するか否かを調べる。コーディング領域、ＵＴＲおよびスプライス部位を調べた。これまでのところ、１５の共通近親交配系統が Perlegen により配列決定され、ＳＮＰはPerlegenサイトで入手可能であり、他の容易に使用されるサイト（ＭＧＩおよびEnsembl）へ組み込まれている。これにより、興味の対象である領域でのこれらの系統における配列差異についての検索が可能となる。Ｈｄｌｑ１４を決定するために交雑種で使用される４系統のうちの３系統：Ｂ６、１２９およびＮＺＷについて配列決定した。
【０１８９】
遺伝子配列決定：全４系統ＮＺＷ、１２９、ＮＺＢおよびＢ６におけるコーディング領域を配列決定することにより、ＳＮＰデータベースで見出される配列差異を評価した。Ｂ６系統からの各遺伝子のゲノム配列を、ＵＣＳＣ（genome.ucsc.edu/）マウスゲノムアセンブリから入手し、各エキソンと隣接イントロンの少なくとも５０ヌクレオチドを共に増幅するようにプライマーを設計した。精製されたＰＣＲ産物をサーモサイクルシークエンサーにかけ、得られたフラグメントを、Jackson Laboratory DNA Sequence Laboratoryによる毛管に基づく機械で解析した。ゲノムＢ６配列に対し配列を整列させることにより、配列解析を行った（Sequencher バージョン４.１.４、GeneCodes Technology）。
【０１９０】
交雑種ＮＺＯ×ＮＯＮ、Ｂ６×Ｃ３ＨおよびＰｅｒａ×ＤＢＡからのＣｈｒ１におけるＱＴＬ分析：これらの交雑種に関する遺伝子型およびＨＤＬデータは、当研究所での他の実験によるものであった。Pseudomarker １.１ソフトウェアを用いて、分析を実施した（jax.org/staff/churchill/labsite）。
【０１９１】
データ検索：我々は、Mouse Phenome Databaseからの４３近親交配マウス系統の血漿ＨＤＬ濃度を検索した。マウスには、LabDiet ５Ｋ５２（６％脂肪）を摂取させておき、それらの血液試料の採取前に４時間絶食させた。血漿ＨＤＬ濃度を、Beckman Coulter Synchron CX5 化学分析装置で測定した。
【０１９２】
統計的差異の分析：Graphpad Prism（Windows v4.00, GraphPad Software、サンディエゴ、カリフォルニア）を用いて、データを分析した。スチューデントのｔ−検定を用いて、異なる群間において血漿ＨＤＬ濃度を比較した。
【０１９３】
表１．Ｈｄｌｑ１４に関する位置的候補
【表１】
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【０１９４】
表２．高脂肪食餌を摂取させたＢ６、ＮＺＢおよび１２９系統間におけるＦａｒｐ２発現差異
【表２】
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ＦＣ、倍率変化；ＦＤＲ、誤った発見割合
【０１９５】
表３．Ｈｄｌｑ１４位置的候補で同定されたコドン使用およびアミノ酸の特性の変化
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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