(57)【要約】本発明は、治療目的および研究目的のために、ＡＴＰによって媒介されるＴ細胞活性化のインヒビター（例えば、酸化型ＡＴＰ）を用いて少なくとも１つのＴ細胞依存性の免疫応答を調節するための方法および組成物を提供する。１つの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＴ細胞活性を阻害するための方法を提供し、その方法は、Ｔ細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質と接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、そのＴ細胞活性は、活性化、増殖、分化、生存、細胞溶解活性およびサイトカイン産生からなる群から選択される。好ましい実施形態において、少なくとも１つのＴ細胞活性を阻害するための方法は、インビボにおいて行われる。
2011513403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＴ細胞活性を阻害するための薬物を製造するための、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質の使用。
【請求項２】
前記Ｔ細胞活性が：活性化、増殖、分化、生存、細胞溶解活性およびサイトカイン産生からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する前記作用物質が、Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記作用物質が、ｏＡＴＰである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する前記作用物質が、パネキシンヘミチャネルの機能を阻害する作用物質である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記作用物質が、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
Ｔ細胞アネルギーを誘導するための薬物を製造するための、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質の使用。
【請求項８】
前記作用物質が、ｏＡＴＰである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
Ｔ細胞アネルギーを誘導するための薬物を製造するための、パネキシンヘミチャネルの機能を阻害する作用物質の使用。
【請求項１０】
前記作用物質が、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞が、ＩＬ−１７分泌Ｔ細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
細胞死または組織損傷を処置するための薬物を製造するための、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質の使用。
【請求項１３】
免疫状態または炎症状態を処置するための薬物を製造するための、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質の使用。
【請求項１４】
前記免疫状態または炎症状態が、Ｔリンパ球依存性の炎症状態である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチおよび乾癬から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、移植片拒絶または移植片対宿主病である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、皮膚科学的状態である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
前記皮膚科学的状態が、乾癬、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、円形脱毛症、白斑、薬物関連皮疹、接触過敏症、エリテマトーデス、痘瘡状苔癬状粃糠疹、慢性苔癬状粃糠疹、湿疹および扁平苔癬から選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記薬物が、インビボ投与のために製剤化されている、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記作用物質が、ナノカプセルの中に封入されている、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記薬物が、結節内投与のために製剤化されている、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記薬物が、局所的投与のために製剤化されている、請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
哺乳動物の前駆細胞をＴｒｅｇ細胞に分化させることを促進するための薬物を製造するための、ｏＡＴＰを含む組成物の使用。
【請求項２４】
ｏＡＴＰを含む前記組成物が：
（ａ）Ｔ細胞の一次刺激物質；
（ｂ）細胞成分；および
（ｃ）可溶性メディエーター
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記Ｔ細胞の一次刺激物質が、Ｔ細胞レセプターに結合するリガンドおよびプロテインキナーゼＣアクチベーターから選択される１つ以上の作用物質を含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記Ｔ細胞の一次刺激物質が、抗ＣＤ３抗体である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記細胞成分が、照射された脾細胞、動員された細胞産物、白血球フェレーシス細胞産物、腸骨稜細胞産物および／または椎体から選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２８】
前記細胞成分が、照射された同系脾細胞である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記可溶性メディエーターが、レチノイン酸、ラパマイシン、５−アザシチジン、トリコスタチンＡ、アルファ１−抗トリプシン、ＴＧＦ−ベータ、インターロイキン（ＩＬ）−２）、ＣＤ８０、４−１ＢＢ、ＣＤ５２アゴニスト、ＣＤ２８抗体、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＯＸ−２、ＣＤ７０およびＣＤ８２から選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項３０】
前記組成物が、ｏＡＴＰ、Ｔ細胞の一次刺激物質および細胞成分を含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項３１】
前記組成物が、ｏＡＴＰ、抗ＣＤ３抗体および照射された同系脾細胞を含む、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
インビトロにおいて制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増大を促進するための方法であって、該Ｔｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３３】
ｏＡＴＰを含む前記組成物が：
（ａ）Ｔ細胞の一次刺激物質；
（ｂ）細胞成分；および
（ｃ）可溶性メディエーター
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｔ細胞の一次刺激物質が、Ｔ細胞レセプターに結合するリガンドおよびプロテインキナーゼＣアクチベーターから選択される１つ以上の作用物質を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｔ細胞の一次刺激物質が、抗ＣＤ３抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞成分が、照射された脾細胞、動員された細胞産物、白血球フェレーシス細胞産物、腸骨稜細胞産物および／または椎体から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞成分が、照射された同系脾細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記可溶性メディエーターが、レチノイン酸、ラパマイシン、５−アザシチジン、トリコスタチンＡ、アルファ１−抗トリプシン、ＴＧＦ−ベータ、インターロイキン（ＩＬ）−２）、ＣＤ８０、４−１ＢＢ、ＣＤ５２アゴニスト、ＣＤ２８抗体、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＯＸ−２、ＣＤ７０およびＣＤ８２から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が、ｏＡＴＰ、Ｔ細胞の一次刺激物質および細胞成分を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が、ｏＡＴＰ、抗ＣＤ３抗体および照射された同系脾細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
インビボにおいて制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増大を促進するための薬物を製造するための、ｏＡＴＰを含む組成物の使用。
【請求項４２】
細胞死または組織損傷を処置するための薬物を製造するための、請求項３２〜４１のいずれか１項に記載の増大されたＴｒｅｇ細胞の使用。
【請求項４３】
免疫状態または炎症状態を処置するための薬物を製造するための、請求項３２〜４１のいずれか１項に記載の増大されたＴｒｅｇ細胞の使用。
【請求項４４】
前記免疫状態または炎症状態が、Ｔリンパ球依存性の炎症状態である、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、マスト細胞の脱顆粒に関連する状態である、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
マスト細胞の脱顆粒に関連する前記状態が、喘息、アレルギーおよびアナフィラキシーショックから選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記免疫状態または炎症状態が、自己免疫性状態、移植片拒絶または移植片対宿主病である、請求項４３に記載の使用。
【請求項４８】
Ｔｒｅｇ細胞を必要とする被験体を処置するための薬物を製造するための、請求項３２〜４１のいずれか１項に記載の増大されたＴｒｅｇ細胞の使用。
【請求項４９】
インビトロにおいてＴｒｅｇ細胞を非Ｔｒｅｇ細胞に変換することを阻害するための方法であって、該Ｔｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５０】
前記非Ｔｒｅｇ細胞が、病原性Ｔ細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記病原性Ｔ細胞が、Ｔｈ１７細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
インビトロにおいて非Ｔｒｅｇ細胞をＴｒｅｇ細胞に変換するための方法であって、該非Ｔｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５３】
前記非Ｔｒｅｇ細胞が、病原性Ｔ細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記病原性Ｔ細胞が、Ｔｈ１７細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
インビトロにおいてＴｒｅｇ細胞の活性を増強するための方法であって、該Ｔｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５６】
前記活性が、免疫抑制性の活性である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
インビボにおいてＴｒｅｇ細胞を非Ｔｒｅｇ細胞に変換することを阻害するための薬物を製造するための、ｏＡＴＰを含む組成物の使用。
【請求項５８】
インビボにおいて非Ｔｒｅｇ細胞をＴｒｅｇ細胞に変換するための薬物を製造するための、ｏＡＴＰを含む組成物の使用。
【請求項５９】
インビボにおけるＴｒｅｇ細胞の活性を増強するための薬物を製造するための、ｏＡＴＰを含む組成物の使用。
【請求項６０】
前記ｏＡＴＰが、ナノカプセルの中に封入されている、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６１】
前記被験体が、細胞死または組織損傷を有する、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６２】
前記被験体が、免疫状態または炎症状態を有する、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６３】
前記免疫状態または炎症状態が、自己免疫性状態、移植片拒絶または移植片対宿主病である、請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
前記免疫状態または炎症状態が、炎症性腸疾患である、請求項６２に記載の使用。
【請求項６５】
前記免疫状態または炎症状態が、Ｔリンパ球依存性の炎症状態である、請求項６２に記載の使用。
【請求項６６】
前記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、マスト細胞の脱顆粒に関連する状態である、請求項６５に記載の使用。
【請求項６７】
マスト細胞の脱顆粒に関連する前記状態が、喘息、アレルギーおよびアナフィラキシーショックから選択される、請求項６６に記載の使用。
【請求項６８】
前記薬物が、経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、消化器、脊髄内、関節腔内、関節内、皮下、頬側、膣、直腸、皮膚、経皮的、眼、耳、粘膜、鼻、気管、気管支、舌下、結節内にか、任意の非経口経路によってか、または吸入を介して、投与するために製剤化されている、請求項１、７、９、１２、１３、２３、４１および５７〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６９】
前記薬物が、経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、消化器、脊髄内、関節腔内、関節内、皮下、頬側、膣、直腸、皮膚、経皮的、眼、耳、粘膜、鼻、気管、気管支、舌下、結節内にか、任意の非経口経路によってか、または吸入を介して、投与するために製剤化されている請求項４８に記載の使用。
【請求項７０】
少なくとも１つのＴ細胞活性を阻害するための方法であって、Ｔ細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７１】
Ｔ細胞アネルギーを誘導するための方法であって、Ｔ細胞を、パネキシンヘミチャネルの機能を阻害する作用物質と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７２】
細胞死または組織損傷を処置するための方法であって、Ｔ細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７３】
免疫状態または炎症状態を処置するための方法であって、Ｔ細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７４】
哺乳動物の前駆細胞をＴｒｅｇ細胞に分化することを促進するための方法であって、Ｔｒｅｇ細胞に分化することができる細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７５】
制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増大を促進するための方法であって、該Ｔｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７６】
Ｔｒｅｇ細胞を非Ｔｒｅｇ細胞に変換することを阻害するための方法であって、該Ｔｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７７】
非Ｔｒｅｇ細胞をＴｒｅｇ細胞に変換するための方法であって、該非Ｔｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７８】
Ｔｒｅｇ細胞の活性を増強するための方法であって、該Ｔｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
Ｔリンパ球集団は、何百万もの細胞を含んでおり、それらの各々は、細胞表面に独特のレセプター（ＴＣＲ，Ｔ細胞レセプター）を発現している。この異質性によって、異なるＴ細胞が様々な病原体由来抗原を特異的に認識することが可能になる。自己寛容の誘導によって、自己抗原の認識が回避される。しかしながら、病理学的状態における自己抗原の認識は、自己免疫および自滅的な炎症性障害に導く。Ｔリンパ球依存性の炎症性障害としては、例えば、喘息、アレルギー、関節リウマチ、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、多発性硬化症、移植片拒絶、移植片対宿主病、筋萎縮性側索硬化症、脱髄性障害、強皮症、シェーグレン症候群、エルドハイム・チェスター症候群、クローン病症候群、高安動脈炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、ヴェルルホフ特発性血小板減少症候群（Ｗｅｒｌｈｏｆ’ｓ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｅｎｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および皮膚科学的状態（例えば、乾癬、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、円形脱毛症、白斑、薬物関連皮疹、接触過敏症、エリテマトーデス、痘瘡状苔癬状粃糠疹、慢性苔癬状粃糠疹、湿疹および扁平苔癬）が挙げられる。
【０００２】
Ｔ細胞の活性化は、カルシウムシグナル伝達に依存する。サイトゾルのカルシウム増加は、獲得免疫応答の制御における重要な手がかりである。Ｂ細胞レセプターまたはＴ細胞レセプターの引き金が引かれることによって、カルシウム（Ｃａ２＋）がＥＲから放出され、そしてこれにより、原形質膜におけるＣａ２＋放出関連（ＣＲＡＣ）チャネルの開口が活性化されて、容量性カルシウム流入（ＣＣＥ）がもたらされる（非特許文献１）。ホスファターゼであるカルシニューリン（転写因子ＮＦＡＴを脱リン酸化し、その核移行を決定する）の活性化は、Ｔ細胞活性化の成功に欠かせないＣａ２＋依存性事象の例を構成する（非特許文献２）。
【０００３】
サイトゾルのＣａ２＋の増加は、活発なミトコンドリアのＣａ２＋取り込みと平行する。ミトコンドリアは、大容量のＣａ２＋シンク（ｓｉｎｋ）として機能し、これは、細胞のＣａ２＋過負荷を回避するように助け、さらに、空間的に限定された領域内のＣａ２＋の迅速な清掃化に寄与する。ミトコンドリアの後者の機能は、Ｃａ２＋感受性タンパク質の活性を決定的に調節する。例えば、ＥＲ上のＩＰ３レセプター付近におけるミトコンドリアのＣａ２＋緩衝作用は、ＣＲＡＣ活性化にとって十分なＩＰ３の動的範囲を増加させると示された（非特許文献３）一方で、ＣＲＡＣチャネル付近におけるＣａ２＋緩衝作用は、そのチャネルのＣａ２＋依存性の不活性化の速度を低下させる（非特許文献４；非特許文献５）。最終的には、ミトコンドリアのＣａ２＋取り込みは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼおよびイソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性化を介して、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の好気性合成を刺激する（非特許文献６；非特許文献７）。このＡＴＰのＣａ２＋依存性の生成は、刺激された細胞のより多いエネルギー需要を賄うが、ＡＴＰによって制御される他のプロセスも調節し得る。
【０００４】
実際に、ＡＴＰは、遍在性の細胞外メッセンジャーでもあり（Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２７：１６６−１７６（２００６））；Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  ２７６：２６−４８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ４８−５７，２７５−２８１（２００６））、ＡＴＰは、分泌小胞のエキソサイトーシスによって、またはギャップ結合ヘミチャネルを通じて、細胞外の空間に放出され得る（Ｃｏｃｏら、ＪＢＣ  ２７８：１３５４−１３６２（２００３）；Ｃｏｔｒｉｎａら、ＰＮＡＳ  ９５：１５７３５−１５７４０（１９９８）；Ｂａｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５７２：６５−６８（２００４））。ＡＴＰは、様々な組み合わせで実質的にすべての細胞によって発現される、Ｐ２レセプターと呼ばれる、細胞外ヌクレオチドに対する原形質膜レセプターを活性化する（Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  ２７６：２６−４８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ４８−５７，２７５−２８１（２００６））。Ｐ２レセプターは、Ｐ２ＸおよびＰ２Ｙレセプターと呼ばれる２つのサブグループに分類される。Ｐ２Ｘ１〜７レセプターのすべてが、ＡＴＰに結合し、しばしば迅速に脱感作する非選択的なイオンチャネルに通ずる。Ｐ２Ｙ１、２、４、６、１１〜１４レセプターは、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰまたはＵＤＰ−グルコースに優先的に結合し、それらは、Ｇタンパク質共役レセプターのファミリーに属するものであり、そしてそれらの活性化は、ＣＣＥに関係がある。
【０００５】
リンパ球上、特にＴ細胞上のＰ２レセプターの活性化が、ＴＣＲ刺激の結果に重大に寄与するという証拠がますます増えている（Ｓｃｒｉｖｅｎｓ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １４６：４３５−４４４（２００５）；Ｂａｒｉｃｏｒｄｉら、Ｂｌｏｏｄ  ８７：６８２−６９０（１９９６）；Ｌｏｏｍｉｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：４５９０−４５９６（２００３））。ＡＴＰは、エクトアピラーゼ（ＣＤ３９）およびエクト−５’−ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）の組み合わされた作用によってアデノシンに容易に分解されるので、細胞外の環境におけるＡＴＰの半減期は、かなり短い（Ｙｅｇｕｔｋｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３６７：１２１−１２８（２００２））。興味深いことに、Ｔｒｅｇ細胞は、これらの表面酵素活性の作用によってＴ細胞の抑制を媒介することが示されている（Ｄｅａｇｌｉｏら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０４：１２５７−１２６５（２００７）；Ｂｏｒｓｅｌｌｉｎｏら、Ｂｌｏｏｄ  １１０（４）：１２２５−１２３２（２００７））。免疫応答中のＡＴＰの制御的な役割についてのこれらの新たな証拠にもかかわらず、その供給源は、はっきりと同定されていない。機械的な刺激からと同様に、瀕死の細胞または損傷を受けた血小板からのＡＴＰ放出が、提唱されている（Ｃｏｔｒｉｎａら、ＰＮＡＳ  ９５：１５７３５−１５７４０（１９９８）；Ｂａｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５７２：６５−６８（２００４））。
【０００６】
本発明者らは、最近、免疫不全マウスを、カルレティキュリン（ＣＲＴ）欠損胚の胎児肝由来の造血前駆細胞で再構成した実験モデルを報告した。ＣＲＴは、シャペロンタンパク質であって、ＥＲにおける最も重要なＣａ２＋緩衝物であり（Ｅｌｌｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４：１８１−１９１（２００３））；ノックアウトマウスにおけるその欠失は、妊娠１２〜１３日目に致死性となる（Ｍｅｓａｅｌｉら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４４：８５７−８６８（１９９９））。ＣＲＴに結合しているＣａ２＋のＥＲ中の量は、細胞運命に劇的に影響を及ぼし得、例えば、ＣＲＴの過剰発現は、アポトーシスの刺激に対する高い感受性をもたらす（Ｐｉｎｔｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０：２６９０−２７０１（２００１））のに対し、ＣＲＴ欠損細胞は、アポトーシスに対してより抵抗性である（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：７３１−７４０（２０００））。Ｃｒｔ−／−Ｔ細胞は、抗原性の刺激に対して過反応性であり、この混乱したＴ細胞反応性は、ｃｒｔ−／−胎児肝キメラ（ＦＬＣ）におけるいくつかの局面において、移植片対宿主病の表現型を模倣する重篤な免疫病理学的状態を決定する。この重篤な免疫病理学的状態は、ＭＡＰＫ経路の長期の活性化およびＮＦＡＴ１の長期の核局在化によるＴＣＲトリガリングに対する振動したＣａ２＋反応によって促進される（Ｐｏｒｃｅｌｌｉｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：４６１−４７１（２００６））。
【０００７】
本発明者らは、本明細書中で、ｃｒｔ−／−Ｔ細胞が、ＣＣＥにおけるミトコンドリアの高いＣａ２＋緩衝作用（これによって、より速い速度のＡＴＰ合成がもたらされる）によって特徴づけられることを示す。活性化中のＴ細胞からのＡＴＰの放出は、ＭＡＰＫ活性化によるＰ２Ｘレセプターのオートクライン活性化をもたらす。これは、増殖性Ｔ細胞の活性化および増大に対する必須の共刺激因子に相当する。本発明者らは、活性によって誘導されるＡＴＰの合成および放出が、Ｔ細胞依存性の炎症の結果において決定的な役割を果たし、そしてＴ細胞免疫抑制に対して可能性のある薬理学的標的になることを示す。
【０００８】
Ｐ２Ｘレセプターの活性化は、酸化型ＡＴＰ（ｏＡＴＰ）などのＡＴＰアンタゴニストによって阻害される。それゆえ、ｏＡＴＰは、炎症および組織破壊に関係する免疫系の様々な細胞、例えば、Ｔ細胞に対するＡＴＰの炎症促進性作用に拮抗することによって抗炎症性効果を発揮することができる。
【０００９】
本発明者らは、本明細書中で、ｏＡＴＰが、抗ＣＤ３および照射された同系の脾細胞と併せて、高発現レベルのＦｏｘｐ３を有する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）に対する偏りを誘導することも示す。Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞の増殖およびサイトカインの産生を能動的に抑制し、エフェクターＴ細胞における非反応性の状態の発生とは異なるＴ細胞寛容の機序（Ｔ細胞アネルギー）をもたらす。Ｔｒｅｇ細胞の抑制性の活性は、抗原特異的または抗原非特異的であり得る。少ない数のＴｒｅｇとともにＣＤ４＋ナイーブ細胞によって誘導される炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において、ｏＡＴＰによる処置は、ＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３発現を著しく増加させ、腸における免疫病理学を完全に妨げた。Ｔｒｅｇは、マスト細胞の脱顆粒を阻害することが示されており（Ｇｒｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９：７７１−７８１（２００８））、ゆえに、マスト細胞の脱顆粒に関連する状態（例えば、喘息、アレルギーおよびアナフィラキシーショック）に関わる免疫応答を抑制する際に役割を果たすことができる。Ｔ細胞寛容を確立し、維持する際のＴｒｅｇ細胞の重要性は、治療的な目的、例えば、Ｔｒｅｇ細胞の養子療法のために、Ｔｒｅｇ細胞をインビトロにおいて増大するための方法への大きな関心を抱かせた。増大したＴｒｅｇ細胞の注入を用いることにより、例えば、免疫応答を調節すること；細胞、組織および臓器移植に対して寛容を誘導すること；ならびに自己免疫性状態を処置することができる。しかしながら、そのような臨床適用は、エフェクター細胞、例えば、Ｆｏｘｐ３＋選抜から出現し得るＴｈ１７細胞が著しく混入することなく、Ｔｒｅｇ亜集団を首尾よく増大するという難題によって遅れている。そのような混入細胞は、Ｔｒｅｇ細胞よりも速く成長し得る。さらに、Ｔｒｅｇ細胞は、インビトロにおける反復性の刺激の後、抑制性の活性を失うことがある。これらの理由のために、適切な細胞生成物を用いてＴｒｅｇ細胞の分化および／または増大を始めること、ならびにインビトロにおいて混入細胞よりもＴｒｅｇ細胞の産生および増大を選択的に支持することが重大である。本発明者らは、本明細書中で、ｏＡＴＰでの処置が、ＲＯＲγＴ発現によってスコア付けされるとき、インビトロにおいてＴｒｅｇ細胞がＴｈ１７系列に変換するのを阻害したことを示す。
【００１０】
上に記載されたように、本発明者らは、活性化されたときに、活性化されたＴ細胞によってＡＴＰが放出されること、および分泌されたＡＴＰが、長期のＴ細胞活性化に対して、オートクラインならびにパラクリン刺激として作用するＴ細胞表面上のレセプターと相互作用することを発見した。ｏＡＴＰによるこの相互作用の遮断は、抗原遭遇時にＴ細胞活性化の失敗をもたらし、また、Ｔ細胞の「不応答」の状態をもたらし、最終的に組織破壊を減少させる。さらに、上に記載されたように、本発明者らは、ｏＡＴＰを含む組成物を用いることにより、免疫抑制性のＴｒｅｇ細胞の分化と著しい増大の両方を誘導すること、そのＴｒｅｇ細胞の表現型を維持すること、およびＴｒｅｇ細胞の免疫抑制性の活性を増強することができること（これらもまた、組織破壊を減少させる）を発見した。それゆえ、ｏＡＴＰによる処置は、Ｔ細胞媒介性の拒絶を回避するために臓器移植前、臓器移植中または臓器移植後に、および骨髄移植前、骨髄移植中または骨髄移植後にＴ細胞媒介性移植片対宿主病に苦しんでいる患者において、有益であり得る。
【００１１】
したがって、Ｔ細胞を、Ｔ細胞依存性の免疫応答を調節する少なくとも１つの作用物質（例えば、ＡＴＰによって媒介されるＴ細胞の活性化を阻害する作用物質、ならびに／またはＴｒｅｇ細胞の分化および増大を誘導する作用物質；例えば、ｏＡＴＰ、ＰＸ１０ペプチドもしくはカルベノキソロン）と接触させることによって免疫状態または炎症状態を処置することが、本発明の目的である。そのような効果は、例えば、免疫寛容、自己免疫、免疫抑制および免疫療法に関係する処置において、複数の治療的な応用法を有し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＰｕｔｎｅｙおよびＢｉｒｄ，Ｃｅｌｌ（１９９３）７５：１９９−２０１
【非特許文献２】Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０：１０２９−１０３１
【非特許文献３】Ｇｉｌａｂｅｒｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ（２００１）２０：２６７２−２６７９
【非特許文献４】Ｈｏｔｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１０６０７−１０６１２
【非特許文献５】Ｈｏｔｈら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９７）１３７：６３３−６４８
【非特許文献６】Ｊｏｕａｖｉｌｌｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９９）９６：１３８０７−１３８１２
【非特許文献７】Ｈａｊｎｏｃｚｋｙら、Ｃｅｌｌ（１９９５）８２：４１５−４２４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
本発明は、１つ以上のＴ細胞依存性の免疫応答を調節するための方法において具体化され得る。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＴ細胞活性を阻害するための方法を提供し、その方法は、Ｔ細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質と接触させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、そのＴ細胞活性は、活性化、増殖、分化、生存、細胞溶解活性およびサイトカイン産生からなる群から選択される。好ましい実施形態において、少なくとも１つのＴ細胞活性を阻害するための方法は、インビボにおいて行われる。
【００１５】
１つの実施形態において、ＡＴＰによって媒介されるＴ細胞の活性化を阻害する前記作用物質は、Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニスト、例えば、Ｐ２Ｘ７レセプターアンタゴニストである。好ましい実施形態において、前記作用物質は、ｏＡＴＰである。別の実施形態において、前記作用物質は、パネキシン（ｐａｎｎｅｘｉｎ）ヘミチャネルの透過性を阻害する作用物質である。好ましい実施形態において、前記作用物質は、ＰＸ１０ペプチド（配列番号１）またはカルベノキソロンである。
【００１６】
本発明は、Ｔ細胞アネルギーを誘導するための方法も提供し、その方法は、Ｔ細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化のインヒビターと接触させる工程を包含する。好ましい実施形態において、Ｔ細胞アネルギーを誘導するための方法は、インビボにおいて行われる。１つの実施形態において、ＡＴＰによって媒介されるＴ細胞の活性化を阻害する前記作用物質は、Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニスト、例えば、Ｔ細胞Ｐ２Ｘ７レセプターアンタゴニストである。好ましい実施形態において、前記作用物質は、ｏＡＴＰである。別の実施形態において、前記作用物質は、パネキシンヘミチャネルの透過性を阻害する作用物質である。好ましい実施形態において、前記作用物質は、ＰＸ１０ペプチド（配列番号１）またはカルベノキソロンである。
【００１７】
１つの実施形態において、接触されるＴ細胞は、ＩＬ−１７分泌Ｔ細胞（すなわち、ＴＨ１７細胞）である。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、Ｔｒｅｇ細胞の分化および／または増大を誘導するための方法を提供し、その方法は、Ｔｒｅｇ細胞を、Ｔｒｅｇ細胞の分化および／または増大を誘導する作用物質と接触させる工程を包含する。好ましい実施形態において、その方法は、インビトロにおいて行われる。例示的な実施形態において、その作用物質は、ｏＡＴＰを含む組成物である。その組成物は、好ましくは、（１）Ｔ細胞の一次刺激物質（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）；および（２）細胞成分または可溶性メディエーターも含む。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、Ｔｒｅｇ細胞を非Ｔｒｅｇ細胞に変換することを阻害するための方法を提供し、その方法は、Ｔｒｅｇ細胞を、Ｔｒｅｇ細胞を非Ｔｒｅｇ細胞に変換することを阻害する作用物質と接触させる工程を包含する。その非Ｔｒｅｇ細胞は、病原性Ｔ細胞、例えば、Ｔｈ１７細胞であり得る。好ましい実施形態において、その作用物質は、ｏＡＴＰを含む組成物である。その方法は、例えば、インビトロまたはインビボにおいて行われ得る。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、非Ｔｒｅｇ細胞をＴｒｅｇ細胞に変換するための方法を提供し、その方法は、非Ｔｒｅｇ細胞を、非Ｔｒｅｇ細胞をＴｒｅｇ細胞に変換することを増強する作用物質と接触させる工程を包含する。その非Ｔｒｅｇ細胞は、ナイーブＴ細胞または病原性Ｔ細胞、例えば、Ｔｈ１７細胞であり得る。好ましい実施形態において、その作用物質は、ｏＡＴＰを含む組成物である。その方法は、例えば、インビトロまたはインビボにおいて行われ得る。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、Ｔｒｅｇ細胞を、Ｔｒｅｇ細胞活性を増強する作用物質と接触することによって、Ｔｒｅｇ細胞活性、例えば、免疫抑制性の活性を増強するための方法を提供する。好ましい実施形態において、その作用物質は、ｏＡＴＰを含む組成物である。その方法は、例えば、インビトロまたはインビボにおいて行われ得る。
【００２２】
本発明は、細胞死または組織損傷を処置するための方法においても具体化され得、その方法は、Ｔ細胞を、１つ以上のＴ細胞依存性の免疫応答を調節する作用物質と接触させる工程を包含する。１つの実施形態において、その方法は：（１）Ｔ細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質と接触させる工程；（２）Ｔｒｅｇ細胞を、非Ｔｒｅｇ細胞への変換を阻害する作用物質および／またはその免疫抑制性の活性を増強する作用物質と接触させる工程、；ならびに（３）Ｔｒｅｇ細胞を、その分化および／または増大を誘導する作用物質と接触させる工程の１つ以上を包含し得る。好ましい実施形態において、工程（１）は、インビボにおいて行われる。好ましい実施形態において、工程（３）は、インビトロにおいて行われ、その後、分化したおよび／または増大したＴｒｅｇ細胞のインビボ投与が行われる。好ましい実施形態において、その作用物質または組成物は、ｏＡＴＰを含む。
【００２３】
本発明は、自己免疫性状態または炎症状態を処置するための方法においても具体化され得、その方法は、Ｔ細胞を、少なくとも１つのＴ細胞依存性の免疫応答を調節する作用物質と接触させる工程を包含する。１つの実施形態において、その方法は：（１）Ｔ細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質と接触させる工程；（２）Ｔｒｅｇ細胞を、非Ｔｒｅｇ細胞へのその変換を阻害する作用物質および／またはその免疫抑制性の活性を増強する作用物質と接触させる工程；ならびに（３）Ｔｒｅｇ細胞を、その分化および／または増大を誘導する作用物質と接触させる工程の１つ以上を包含し得る。好ましい実施形態において、工程（１）は、インビボにおいて行われる。好ましい実施形態において、工程（３）は、インビトロにおいて行われ、その後、分化したおよび／または増大したＴｒｅｇ細胞のインビボ投与が行われる。好ましい実施形態において、その作用物質は、ｏＡＴＰを含む。１つの実施形態において、前記自己免疫性状態または炎症状態は、獲得免疫系の自己免疫性状態または炎症状態、例えば、Ｔリンパ球依存性の炎症状態である。好ましい実施形態において、前記Ｔリンパ球依存性の炎症状態は、例えば、喘息、アレルギー、関節リウマチ、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、多発性硬化症、移植片拒絶、移植片対宿主病、筋萎縮性側索硬化症、脱髄性障害、強皮症、シェーグレン症候群、エルドハイム・チェスター症候群、クローン病症候群、高安動脈炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血およびヴェルルホフ特発性血小板減少症候群に関連する。別の好ましい実施形態において、Ｔリンパ球依存性の炎症状態は、皮膚科学的状態、例えば、乾癬、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、円形脱毛症、白斑、薬物関連皮疹、接触過敏症、エリテマトーデス、痘瘡状苔癬状粃糠疹、慢性苔癬状粃糠疹、湿疹および扁平苔癬に関連する。
【００２４】
好ましい実施形態において、本発明は、インビボにおいて被験体における免疫状態または炎症状態を処置する方法を具体化する。その方法は、例えば、（１）ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質；（２）少なくとも１つのＴｒｅｇ細胞の活性、例えば、Ｔｒｅｇ細胞の分化および／もしくは増大またはＴｒｅｇ細胞の免疫抑制性の活性を調節する作用物質；ならびに（３）インビトロにおいて、本発明の作用物質と接触することによって分化したおよび／または増大したＴｒｅｇ細胞、のうちの少なくとも１つをインビボにおいて被験体に投与する工程を包含し得る。好ましい実施形態において、工程（１）および／または工程（２）の作用物質は、ｏＡＴＰを含む。
【００２５】
１つの実施形態において、少なくとも１つのＴ細胞依存性の免疫応答を調節する作用物質（例えば、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質および／または少なくとも１つのＴｒｅｇ細胞の活性を調節する作用物質）は、ナノカプセルの中に封入されることにより、例えば、ナノ粒子が形成される。別の実施形態では、本発明の作用物質と接触することによって分化したおよび／または増大したＴｒｅｇ細胞が、ナノカプセルの中に封入されることにより、例えば、ナノ粒子が形成される。１つの実施形態において、そのナノ粒子は、特定の細胞または組織に対して標的化される。好ましい実施形態において、そのナノ粒子は、インビボにおいて特定の細胞または組織に対して標的化される。
【００２６】
本発明は、Ｔ細胞依存性の免疫応答を調節する作用物質を、それを必要とする被験体に投与する方法も提供する。１つの実施形態において、その作用物質は、結節内に投与される。別の実施形態では、その作用物質は、局所的に投与される。別の実施形態では、その作用物質は、静脈内に、または注射によって投与される。
【００２７】
本発明は、本発明の作用物質による分化および／または増大の誘導によって産生されたＴｒｅｇ細胞を投与することによって、被験体においてＴ細胞依存性の免疫応答（例えば、自己免疫障害またはアレルギー）を調節する方法も提供する。その方法は、（ａ）ナイーブＴ細胞（例えば、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞）の集団を被験体から得る工程；（ｂ）分化および増大によって、そのナイーブＴ細胞からＴｒｅｇ細胞を産生させる工程；および（ｃ）産生されたＴｒｅｇ細胞を被験体に導入することにより、その被験体においてＴ細胞依存性の免疫応答を調節する、例えば、抑制する工程を包含する。
【００２８】
本発明のこれらおよび他の目的および利点は、添付の図面と併せて以下の本発明のより詳細な説明を考察することによって、より完全に理解され、認識されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１：ｃｒｔ−／−Ｔ細胞におけるミトコンドリアの高いＣａ２＋緩衝作用。ａ）タプシガルジン（ｔａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）を用いてＥＲにおけるＣａ２＋を枯渇させた後、細胞外の培地に０．５ｍＭ  Ｃａ２＋を加えることによってｃｒｔ−／−およびｃｒｔ＋／＋Ｔ細胞クローンにおいてＣＣＥを誘導した（実施例１参照）。細胞外のＣａ２＋を完全に洗浄した後、イオノマイシンを加えることによって、ミトコンドリアのＣａ２＋緩衝作用を可視化した。ｂ）ｃｒｔ−／−およびｃｒｔ＋／＋Ｔ細胞クローンにおける０．５、１および２ｍＭの細胞外Ｃａ２＋を用いたＣＣＥ後のミトコンドリアのＣａ２＋含有量を表しているヒストグラム。ｃ）ｃｒｔ−／−Ｔ細胞におけるミトコンドリアの高いＣａ２＋緩衝作用は、ＣＲＡＣ不活性化を遅延させる。細胞をタプシガルジンで処理した後、細胞外の培地にＣａ２＋を２回、別々に加えた（実施例１参照）（図２Ｃもまた参照のこと）。Ｃａ２＋を加えた１回目および２回目におけるサイトゾルのＣａ２＋濃度の上昇速度を計算した。ｃｒｔ＋／＋においては、明らかな減少が観察されたが、ｃｒｔ−／−Ｔ細胞では観察されなかった。ｄ）ミトコンドリア脱共役剤（ＣＣＣＰ）の存在下において同じ実験を繰り返したところ、ＣＲＡＣの不活性化は、ｃｒｔ＋／＋Ｔ細胞とｃｒｔ−／−Ｔ細胞との間で類似していた（＊，Ｐ＜０．０５、＊＊，Ｐ＜０．００１、＊＊＊，Ｐ＜０．０００１）。
【図２】図２：ｃｒｔ−／−Ｔ細胞内の、ＥＲにおける低いＣａ２＋、変化しないミトコンドリアの膜電位および低いＣＲＡＣ不活性化。ａ）Ｆｕｒａ−２が負荷されたＤＯ１１．１０ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞クローンのＥＲのＣａ２＋含有量を、Ｃａ２＋を欠いている培地にＳＥＲＣＡポンプインヒビターのタプシガルジンを加えることによって、評価した（実施例１参照）。ＥＲからサイトゾルへのＣａ２＋の受動的な漏出が、サイトゾルのＣａ２＋濃度のゆっくりとした一過性の上昇として見られる。ｃｒｔ−／−Ｔ細胞は、曲線下面積として計算されるとき、ｃｒｔ＋／＋細胞と比べて少ないＥＲのＣａ２＋含有量を有する。ｂ）ｃｒｔ−／−およびｃｒｔ＋／＋ＦＬＣから単離され選別されたナイーブおよびエフェクター／記憶（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−）ＣＤ４細胞のＴＭＲＭ染色は、ＣＲＴ欠失がミトコンドリア膜電位を改変しないことを示している。ｃ）ＣＲＡＣ不活性化をスコア付けするために、Ｔ細胞にＦｕｒａ−２を負荷し、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたカバーガラスの上にプレーティングした（実施例１参照）。Ｃａ２＋を欠いている培地中にタプシガルジンを加えることによって、ＥＲのカルシウム貯蔵を枯渇させた。完全にＥＲ貯蔵を枯渇させた後、１００秒間にわたってＣａ２＋を２回加えた。両方のＣａ２＋添加によって、ＣＲＡＣを通るＣａ２＋の流入がもたらされる。これらのチャネルは、Ｃａ２＋によって不活性化されるので、２回目のＣａ２＋上昇は、より遅い速度および振幅を有する。Ｃｒｔ−／−細胞は、低いＣＲＡＣ不活性化を示した。
【図３】図３：Ｔ細胞活性化中のミトコンドリアのＣａ２＋取り込みは、ＡＴＰの合成および放出をもたらす。ａ）選別されたｃｒｔ−／−およびｃｒｔ＋／＋ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞においてＣＤ３抗体を用いてＴ細胞を活性化した後の異なる時間におけるＡＴＰ合成（実施例２参照）。ｂ）ＡＴＰ合成酵素インヒビターのオリゴマイシンの非存在下（コントロール）または存在下におけるＴ細胞活性化時におけるＡＴＰ産生。ｃ）プレートに結合したＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体による活性化の３８時間後の、選別されたナイーブＣＤ４ｃｒｔ−／−およびｃｒｔ＋／＋Ｔ細胞の表面上におけるＣＤ６２Ｌ発現のＦＡＣＳプロファイル。ｏＡＴＰの存在下において同じ実験を行った。ｄ）ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ヌクレオチド結合化合物のキナクリンで染色した（実施例２参照）。均質なサイトゾルの染色から、ＡＴＰを含む分泌小胞が存在しないことが示唆される。ｅ）連続的なスクロース勾配における、刺激されていないおよび活性化されたナイーブＴ細胞の細胞成分分画（実施例２参照）。ＡＴＰは、サイトゾルタンパク質Ｚａｐ−７０も含む画分にだけ検出され、小さい小胞のマーカーのセルブレビン（ｃｅｌｌｕｂｒｅｖｉｎ）を特徴とする画分中では検出されなかった。
【図４】図４：ＤＯ１１．１０ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞クローンにおける選択的アゴニストによるＰ２レセプターの転写およびＣａ２＋応答。ａ）Ｐ２レセプターについてのＲＴ−ＰＣＲは、Ｐ２Ｘ１、４、７が、Ｔ細胞クローンにおいてＰ２Ｙ１、１２、１３、１４とともに同時発現されることを示している（実施例３参照）。ｂ）通常の培地（１つ目のパネル）またはＣａ２＋を欠いている培地（２つ目のパネル）におけるＣａ２＋イメージング実験から、ＣＤ４Ｔ細胞クローン上におけるイオンチャンネル型と代謝型（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｂｉｃ）のＰ２レセプターの両方の存在が確認される。ｃ）Ｐ２Ｘレセプター（αβＭｅＡＴＰ：Ｐ２Ｘ１、ＭｅＳＡＴＰ：すべてのＰ２Ｘ、ＢｚＡＴＰ：Ｐ２Ｘ７）に対する優先的なアゴニストが、それらのレセプターの機能上の適格性をより詳細に確認される。ｄ）優先的なアゴニストに対する応答によって示されるように、機能的なＰ２Ｙレセプターが、Ｔ細胞クローン上に存在している（ＭｅＳＡＤＰ：Ｐ２Ｙ１、１２、１３およびＵＤＰ−グルコース：Ｐ２Ｙ１４）。
【図５】図５：ＴＣＲ刺激後の長期のＭＡＰＫ活性化における細胞周囲ＡＴＰの役割。ａ）ＯＶＡ特異的ｃｒｔ−／−Ｔ細胞クローンをビオチン化ＣＤ３抗体で刺激した後、アビジンで架橋した（実施例３参照）。刺激の３０分後、細胞を無処理のままにするか（左から１つ目のパネル）、あるいはｓｒｃ様キナーゼインヒビターＰＰ２の単独（２つ目のパネル）またはｏＡＴＰと併用（３つ目のパネル）もしくはＡＲＬと併用（４つ目のパネル）で処理した。ＰＰ２は、Ｚａｐ−７０の脱リン酸化（ｄｅｐｈｏｓｐｏｒｙｌａｔｉｏｎ）によって示されるようにＴＣＲシグナル伝達を効率的に阻害したのに対し、長期のＥｒｋ活性化は、それほど影響されなかった。ＰＰ２とｏＡＴＰとの併用によって、Ｅｒｋリン酸化がほぼ完全に無効になったのに対し、ＰＰ２とエクトヌクレアーゼインヒビターＡＲＬとの併用は、遅い時点においてＥｒｋ活性化を増加させた。ｂ）ｃｒｔ−／−Ｔ細胞クローンを、架橋されたＣＤ３抗体で１６時間にわたって刺激した（実施例３参照）。左から１つ目のパネルは、ｐ３８ＭＡＰＫおよびＥｒｋの特徴的な長期のリン酸化を示している。これらの長期の活性化は、ミトコンドリアのＡＴＰ合成のインヒビターとしてのオリゴマイシンによって、ならびに２つのＰ２レセプターアンタゴニストのｏＡＴＰおよびＰＰＡＤＳによって、無効になった。
【図６】図６：Ｐ２レセプターの薬理学的阻害は、Ｔ細胞の増殖ならびにＩＬ−２の分泌を損ない、アネルギーをもたらす。ａ）ｏＡＴＰの非存在下（上のパネル）または存在下（下のパネル）において、プレートに結合したＣＤ３およびＣＤ２８で刺激された、選別されたナイーブＣＤ４＋細胞における（方法の項参照）ＣＦＳＥ蛍光の低下を示しているＦＡＣＳプロファイル（実施例４参照）。ＩＬ−２（中央パネル）またはＰＭＡ（右パネル）の存在下における同じ実験が示されている。指定の時間における取得において検出可能なマーカーを有する細胞（増殖中の細胞）の数が記載されている。ｂ）ｏＡＴＰまたはＰＰＡＤＳの存在下において、プレートに結合したＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体で４８時間にわたって刺激されたナイーブＣＤ４＋細胞の培養上清におけるＥＬＩＳＡによって測定されたＩＬ−２濃度を示している代表的な実験。灰色のバーは、ＰＭＡがサンプルに加えられたときに得られたＩＬ−２濃度を表している。ｃ）ｏＡＴＰの非存在下または存在下において、選別されたナイーブＣＤ４＋細胞を、プレートに結合したＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体で刺激した２および１６時間後のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＥｇｒ２およびＥｇｒ３転写物の定量化（実施例４参照）。＊，Ｐ＜０．０５ｄ）イオノマイシン、ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体のみとともに、またはｏＡＴＰもしくはｏＡＴＰおよびＰＭＡと組み合わせて１６時間プレインキュベートされたＯＶＡ特異的Ｔ細胞クローンのＣＤ３刺激後のサイトゾルのＣａ２＋プロファイル（実施例４参照）。
【図７】図７：ｏＡＴＰ処置によるＩＮＳ−ＨＡトランスジェニックＲＡＧ−２−／−マウスにおける糖尿病の防止。ａ）ＴＣＲ６．５抗ＨＡトランスジェニックＣＤ４＋Ｔ細胞の養子移入後の１２日目にラットインスリンプロモーターの支配下においてＨＡを発現しているＲＡＧ−２−／−マウスにおける血糖値（実施例５参照）。マウスを無処置のままにするか、または移入後の１〜１０日目に、ＰＢＳもしくはｏＡＴＰの２用量を静脈内および腹腔内に毎日、注射した。ｂ）ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ）−エオシン染色された切片（１００×）の組織病理学検査は、ＰＢＳ処置マウス由来の膵臓において重篤な破壊的な膵島炎を示しているのに対し、ｏＡＴＰ処置動物由来の膵臓では、関連性のある病理所見は観察されなかった。ｃおよびｄ）ＰＢＳおよびｏＡＴＰで処置された動物の脾臓ｃ）および膵臓ｄ）から回収されたトランスジェニックＴＣＲ６．５＋細胞の数を表すヒストグラム。右側のヒストグラムは、記載されているマウスの膵臓から回収されたＣＤ６９＋ＴＣＲ６．５＋細胞のパーセンテージを表している。ｎ．ｄ．，検出不能。ｅ）ＰＢＳおよびｏＡＴＰで処置されたマウス由来の脾細胞を、インビトロにおいて、ＨＡペプチドで刺激し、記載されているサイトカインを細胞数測定ビーズアレイによって測定した（実施例５参照）。ヒストグラムは、１０４個のＴＣＲ６．５＋細胞あたりのｐｇ／ｍｌとして表されている上清中のＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−６の濃度を示している（平均±ＳＤ、ｎ＝５）＊，Ｐ＜０．０５、＊＊，Ｐ＜０．００１、＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。
【図８】図８：ｏＡＴＰ処置による炎症性腸疾患の回復。ａ）ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞およびＣＤ４＋細胞を養子移入されたｃｄ３ε−／−マウス由来の代表的な腸間膜リンパ節、脾臓および結腸の写真（実施例５参照）。下のパネルは、ＣＤ４細胞で再構成され、ｏＡＴＰで処置されたマウス由来の器官を示している。バー＝１ｃｍｂ）記載されているとおり処置された動物における炎症スコアを表しているヒストグラム（方法の項参照）（平均値±ＳＤ；ｎ＝５、ＣＤ４＋／２５＋健常コントロール群；ｎ＝７、ＣＤ４＋無処置群；ｎ＝８、ＣＤ４＋ｏＡＴＰ処置群）。ｃ）記載されている動物由来の結腸切片のヘマトキシリン／エオシン（上のパネル）およびＡｌｃｉａｎ／ＰＡＳ（下のパネル）染色（四角内のすべての顕微鏡写真が、同じ倍率で撮影されたものである；スケールバー＝５０μｍ）。ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞で再構成されたマウスでは、炎症の変化は明らかではなく、容積の大きいＡｌｃｉａｎ−ＰＡＳ陽性液滴を有する多数の杯細胞が、結腸陰窩を裏打ちしている（矢頭）；ＣＤ４＋細胞を養子移入され、ｏＡＴＰを注射されたマウスでは、固有層が、炎症細胞浸潤物によって限局的に拡大し（矢印）、結腸陰窩の上皮は、中程度の過形成を示している。部分的な杯細胞の枯渇およびＡｌｃｉａｎ−ＰＡＳ陽性液滴のサイズの減少もまた、注目に値する（矢頭）；ＣＤ４細胞で再構成され、ＰＢＳで処置されたマウスでは、陰窩膿瘍（ｃｒｙｐｔ  ａｂｓｃｅｓｓａｔｉｏｎ）の限局的な所見とともに、固有層が炎症細胞浸潤によって著しく拡大した（矢印）。杯細胞がほぼ完全に喪失していて、結腸陰窩もまた激しく形成異常である。ｄ）記載されている動物の腸間膜リンパ節および脾臓からの細胞の回収率。ｅ）記載されているマウス由来の腸間膜リンパ節におけるＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＩＬ−１７を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数（平均値±ＳＤ；ｎ＝５、ＣＤ４＋／２５＋健常群；ｎ＝７、ＣＤ４＋無処置群；ｎ＝８、ＣＤ４＋ｏＡＴＰ処置群）。＊，Ｐ＜０．０５、＊＊，Ｐ＜０．００１、＊＊＊，Ｐ＜０．０００１ｆ）記載されている群の動物の腸間膜リンパ節および脾臓から回収されたＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−エフェクター／記憶細胞およびＣＤ６９＋ＣＤ４細胞の絶対数（バーは、平均値を表している）。
【図９】図９：パネキシンヘミチャネル構築の阻害は、Ｔ細胞の活性化および増殖を阻害する。ａ）ＣＦＳＥを負荷されたヒトＴ細胞を、プレートに結合した抗ＣＤ３／２８抗体で刺激し、ＦＡＣＳ解析によって増殖を測定した（実施例６参照）。パネキシン遮断ペプチドＰＸ１０が、ｏＡＴＰに匹敵するほどＴ細胞増殖を阻害したことに注意すること。ｂ）ＣＤ３＋／２８＋で刺激されたマウスＴ細胞から培地中へのＩＬ−２分泌は、ＰＸ１０とｏＡＴＰの両方によって強く阻害された。
【図１０】図１０：パネキシン遮断ペプチドＰＸ１０は、ＴＣＲトリガリングにおいて細胞内ＡＴＰ濃度を増加させる。ＴＣＲトリガリング中のパネキシン遮断ペプチドＰＸ１０の存在は、細胞内ＡＴＰ濃度を増加させることから（実施例６参照）、パネキシンヘミチャネルが、Ｔ細胞活性化の間のＡＴＰ分泌にとって重要な経路であることが示唆される。
【図１１】図１１：ｏＡＴＰは、Ｔｒｅｇ細胞の分化および増大を誘導する。ａ）ｏＡＴＰの存在下におけるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージを有意に増加させた。ｂ）ｏＡＴＰの存在下における、天然Ｔｒｅｇ細胞を含む選別されたＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞の刺激は、より高いＦｏｘｐ３の発現レベルを有するＴｒｅｇ細胞の増大を誘導した。ｃ）抗ＣＤ３刺激後の最初の６日間の定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＴｈ１（Ｔ−ｂｅｔ）、Ｔｈ１７（ＲＯＲγＴ）およびＴｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３）系列についての主要な転写因子の解析から、無処理培養物におけるＴ−ｂｅｔの漸進的なアップレギュレーションとは対照的に、ｏＡＴＰの存在下におけるＦｏｘｐ３の漸進的なアップレギュレーションが明らかになった。
【図１２】図１２：ｏＡＴＰ処置は、Ｔｈ１７分化を阻害し、Ｆｏｘｐ３発現を促進する。ａ）ｏＡＴＰは、Ｔｈ１７に偏った条件下（ＴＧＦβおよびＩＬ−６条件培地）において抗ＣＤ３によって刺激されたＴ細胞におけるＲＯＲγＴの発現を抑制しつつ、Ｆｏｘｐ３の発現を徐々に増加させた。ｂ）ＦＡＣＳ解析によるＦｏｘｐ３を発現しているＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞の絶対数は、ｏＡＴＰの存在下におけるＴｈ１７に偏った条件下において増加した。ｃ）選別されたＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ天然Ｔｒｅｇ細胞のＴｈ１７系列への脱分化は、ｏＡＴＰによって妨げられた。
【図１３】図１３：不十分な数のＴｒｅｇ細胞が養子移入された動物におけるｏＡＴＰ処置による炎症性腸疾患の回復。ａ）炎症を管理するには不十分ないくつかのＴｒｅｇ細胞がそれらの動物に養子移入されたＩＢＤのマウスモデルにおけるＴｒｅｇ細胞内のＦｏｘｐ３発現が、静脈内投与される１００μｌの３ｍＭ  ｏＡＴＰによる毎日の処置によって、増加した。ｂ）ｏＡＴＰ処置動物は、腸の炎症の徴候、ならびに脾臓および腸間膜リンパ節のサイズの増加を示さなかった。ｃ）ｏＡＴＰ処置動物は、腸間膜リンパ節において少ない数のエフェクター／記憶Ｔ細胞を示した。ｄ）腸間膜リンパ節におけるＴｒｅｇ／ＥＭ細胞の比は、ｏＡＴＰ処置によって有意に変化しなかった。
【図１４】図１４：炎症性腸疾患のマウスモデルにおけるＴｒｅｇ産生についての実験プロトコル。ＣＤ３ε−／−マウスに、２×１０５個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞；ｏＡＴＰとともに２×１０５個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞；移入の１６時間後にｏＡＴＰの投与とともに２×１０５個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞；または１０５個の天然Ｔｒｅｇ細胞とともに２×１０５個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を養子移入した。ｏＡＴＰ処置動物に、２〜５日目はｏＡＴＰを毎日静脈内投与し、６および７日目はｏＡＴＰ投与を行わず、そして８〜１２日目にｏＡＴＰを毎日静脈内投与した。２８日目にＣＤ４＋亜集団についてマウスを解析した（実施例１２参照）。
【図１５】図１５：炎症性腸疾患のマウスモデルにおけるｏＡＴＰ処置によるＴｒｅｇ細胞産生。ａ）ｏＡＴＰの最後の注射の１４日後に、試験動物の結腸、脾臓および腸間膜リンパ節を炎症について評価した（実施例１２を参照のこと）。ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘｐ３制御性Ｔ細胞のパーセンテージを同定しているＦＡＣＳ解析。ｃ）ＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋としてエフェクター記憶Ｔ細胞を同定しているＦＡＣＳ解析。エフェクター記憶Ｔ細胞に対するＴｒｅｇ細胞の比が示されている。
【図１６】図１６：ｏＡＴＰ処置によるＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１マウスにおけるタンパク尿の回復。ＰＢＳ（コントロール）またはｏＡＴＰで処置されたＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１マウス由来の尿中のタンパク質濃度を表しているグラフ。２５週齢の雌マウスに、ＰＢＳまたはｏＡＴＰ（１００μｌ中３ｍＭ、５日間処置、２日間中断）を６週間にわたって静脈内投与した（実施例１４を参照のこと）。１０匹の動物にＰＢＳを投与し、１０匹の動物にｏＡＴＰを投与した。
【図１７】図１７：ｏＡＴＰ処置によるＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１マウスにおけるＳＬＥの回復。２５週齢のＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１雌マウスに、ＰＢＳまたはｏＡＴＰ（１００μｌ中３ｍＭ、５日間処置、２日間中断）を６週間にわたって静脈内注射し、タンパク尿（上のパネル）および他の記載のパラメータ（下のパネル）について調べた（実施例１４参照）。＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図１８】図１８：全身性エリテマトーデスにおけるＴ細胞エフェクター機能のｏＡＴＰによる阻害。ＰＢＳまたはｏＡＴＰで処置された２５週齢のＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１雌マウスの脾臓から回収されたエフェクター／記憶（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−）ＣＤ４＋細胞（上のパネル）；ＥＬＩＳＡによって検出された、プレートに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で４８時間にわたって刺激されたＣＤ４＋エフェクター／記憶Ｔ細胞によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の分泌（下のパネル）（実施例１４参照）。＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図１９】図１９：コラーゲン誘導関節リウマチモデルにおける臨床スコアの変動。５日間処置、２日間中断および５日間処置という投薬スケジュールにおいて、０日目から開始し、１２日間にわたってｏＡＴＰ（１００μｌ中の３ｍＭ）またはコントロールＰＢＳを静脈内投与してコラーゲン誘導ＲＡマウスにおいて評価された、最初の疾患重症度の臨床スコアからの平均値の変動を表しているグラフ（実施例１５参照）。
【図２０】図２０：ｏＡＴＰ処置によるコラーゲン特異的抗体の減少。コラーゲン誘導関節リウマチモデルにおいて、ＩＩ型コラーゲンＥＬＩＳＡをｏＡＴＰ処置マウスおよびコントロールマウス由来のサンプルにおいて行った（実施例１５参照）。
【図２１】図２１：ｃｒｔ−／−およびｃｒｔ＋／＋胎児肝前駆体によるリコンビナーゼ欠損マウスの再構成。ｃｒｔ＋／−×ｃｒｔ＋／−交配からのＥ１３胚の遺伝子型を判定し、ｃｒｔ−／−およびｃｒｔ＋／＋胚を選択し、そして胎児肝前駆体をリコンビナーゼ欠損マウスに注射した（例えば、Ｐｏｒｃｅｌｌｉｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：４６１−４７１（２００６）参照）（実施例１６参照）。
【図２２】図２２：カルレティキュリン欠損胎児肝キメラマウスの移植片対宿主病様の表現型。造血前駆細胞移入の１２週間後におけるｃｒｔ＋／＋胎児肝キメラ（ＦＬＣ）、ならびに８、１０および１２週間後におけるｃｒｔ−／−ＦＬＣの表現型。脱毛症、眼瞼炎、猫背の姿勢および消耗症候群の進行性悪化が、ｃｒｔ−／−ＦＬＣにおいて見られる（実施例１６参照）。
【図２３】図２３：ｃｒｔ欠損胎児肝キメラにおける上皮の限局性浸潤を伴う、皮膚表面における上皮過形成および大量の顆粒球。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された切片は、炎症細胞が実質的に存在していないｃｒｔ＋／＋ＦＬＣとは対照的に、ｃｒｔ−／−ＦＬＣの皮膚において重篤な皮膚の顆粒球性の炎症性浸潤を示している（左パネルのバー＝５０μｍ；右パネルのバー＝１０μｍ）（実施例１６参照）。
【図２４】図２４：ｏＡＴＰを注射されたｃｒｔ−／−マウスにおける眼瞼炎の回復。処置前および２週間にわたるＰＢＳまたは６ｍＭ  ｏＡＴＰ（１００μｌ）による毎日の静脈内処置後のｃｒｔ−／−ＦＬＣの表現型（実施例１６参照）。
【図２５】図２５：２週間にわたってｏＡＴＰを注射されたｃｒｔ−／−胎児肝キメラにおける眼瞼炎の組織学的な改善。皮膚バイオプシーの病理組織学的な評価を盲検様式で行った。これらのグラフは、ｏＡＴＰ処置において見られた劇的な結果の選択された例を示している（実施例１６参照）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
定義および一般的手法
本発明は、概して、例えば、免疫寛容、自己免疫、免疫抑制および免疫療法に関する多様な処置のための複数の治療的な応用法を有する、少なくとも１つのＴ細胞活性を調節するための方法に関する。
【００３１】
本明細書中で別段定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者が通常理解している意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般に、本明細書中に記載される、細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質化学および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される術語および手法は、当該分野において周知であり、一般に使用されるものである。
【００３２】
用語「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、本明細書中で総称的に使用されるとき、文脈によって別段示されない限り、例えば、ヘルパーＴ細胞（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ９およびＴＨ１７細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、制御性／サプレッサーＴ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞および／または自己攻撃性（ａｕｔｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）Ｔ細胞（例えば、ＴＨ４０細胞）のことを指すことがある。ある特定の実施形態において、用語「Ｔ細胞」は、詳細には、ヘルパーＴ細胞のことを指す。ある特定の実施形態において、用語「Ｔ細胞」は、より詳細には、ＴＨ１７細胞（すなわち、ＩＬ−１７を分泌するＴ細胞）のことを指す。ある特定の実施形態において、用語「Ｔ細胞」は、Ｔｒｅｇ細胞のことを指す。
【００３３】
用語「Ｔｒｅｇ細胞」は、本明細書中で使用されるとき、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ２５＋ｂｒｉｇｈｔＴ細胞）のことを指す。本発明の方法における、制御能力を有する他のＴ細胞（例えば、Ｔｒ１細胞およびＴｈ３細胞）の使用もまた、企図される。
【００３４】
「Ｔ細胞活性」は、本明細書中で使用されるとき、例えば、Ｔ細胞の活性化、増殖、分化および生存、ならびに細胞溶解活性（Ｔｃ細胞）およびサイトカイン産生（Ｔｈ細胞）を含む関連するエフェクター免疫機能の免疫学的プロセスの１つ以上のことを指す。１つの実施形態において、本明細書中に開示される組成物および方法を用いることにより、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）応答、例えば、Ｔｈ１７細胞応答を減少させることができる。別の実施形態では、本明細書中に開示される組成物および方法を用いることにより、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ）応答を減少させることができる。別の実施形態では、本明細書中に開示される組成物および方法を用いることにより、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の分化、増大および／または免疫抑制性活性を誘導することができる。本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも１つのヘルパーＴ細胞活性が、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％低下する。本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも１つのＴｒｅｇ細胞活性が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％または１０００％低下する。Ｆｏｘｐ３は、単純な分子スイッチではなくＴｒｅｇ抑制性機能の量的な制御因子として作用するものであり、用量依存的様式で反応細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｃｅｌｌ）におけるエフェクター機能を阻害する（Ａｌｌａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：３２８２−３２８９（２００８））。上記の活性を検出するためおよび／またはモニターするためのアッセイは、数多く存在し、当該分野で周知であり、例えば、免疫細胞の増殖、サイトカインの放出、細胞表面マーカーの発現、細胞傷害性などに対するアッセイである。
【００３５】
用語「ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化」は、Ｔ細胞の活性化および／または増大をもたらす、Ｔ細胞上のＰ２レセプターへのＡＴＰの結合のことを指す。例えば、Ｔ細胞の活性化および／または増大が、Ｔ細胞上のＰ２レセプターへのＡＴＰの結合を特異的に阻止する作用物質（例えば、ｏＡＴＰ）によって、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻止され得る場合、Ｔ細胞の活性化は、ＡＴＰ媒介性である。ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化は、例えば、ＡＴＰによって刺激されたＴ細胞集団におけるＭＡＰＫの活性化、ＥＲＫのリン酸化および／またはＩＬ−２の発現を解析することによってアッセイされ得る（例えば、実施例３および４参照）。ある特定の実施形態において、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質を用いて処置するとき、Ｔ細胞集団におけるＭＡＰＫの活性化、ＥＲＫのリン酸化および／またはＩＬ−２の発現は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％減少する。ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化は、例えば、Ｔ細胞からのカリウムの流出またはＴ細胞へのナトリウムもしくはカルシウムの流入を測定する電気生理学的アッセイを通じて、例えば、イオンチャネルのＡＴＰ媒介性の開口をモニターすることによってもアッセイされ得る。１つの実施形態において、ＡＴＰは、活性化の間にＴ細胞から放出され、Ｐ２レセプターのオートクラインおよび／またはパラクリン活性化をもたらす。
【００３６】
用語「ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化」は、Ｔ細胞の活性化および／または増大をもたらす、Ｔ細胞上のＰ２ＸレセプターへのＡＴＰの結合を含むと理解される。これは、「Ｐ２Ｘレセプターを介したＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化」と称されることがある。用語「ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化」は、Ｔ細胞上のＰ２Ｘ７レセプターへのＡＴＰの結合（すなわち、「Ｔ細胞上のＰ２Ｘ７レセプターを介したＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化」）を含むと理解される。例えば、Ｔ細胞の活性化および／または増大が、Ｔ細胞上のＰ２ＸレセプターへのＡＴＰの結合を特異的に阻止する作用物質（例えば、ｏＡＴＰ）を用いて少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％阻止され得る場合、Ｐ２Ｘレセプターを介したＴ細胞の活性化は、ＡＴＰ媒介性である。Ｐ２Ｘレセプターを介したＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化は、例えば、ＡＴＰによって刺激されたＴ細胞集団におけるＭＡＰＫの活性化、ＥＲＫのリン酸化および／またはＩＬ−２の発現を解析することによってアッセイされ得る（例えば、実施例３および４参照）。ある特定の実施形態において、Ｐ２Ｘレセプターを介したＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質を用いて処置するとき、ＭＡＰＫの活性化、ＥＲＫのリン酸化および／またはＩＬ−２の発現は、Ｔ細胞集団において１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％減少する。Ｐ２Ｘレセプターを介したＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化は、例えば、Ｔ細胞からのカリウムの流出またはＴ細胞へのナトリウムもしくはカルシウムの流入を測定する電気生理学的アッセイを通じて、例えば、イオンチャネルのＡＴＰ媒介性の開口をモニターすることによってもアッセイされ得る。当業者によって理解されるように、他のＰ２レセプターサブタイプ、例えば、Ｐ２Ｙレセプターの活性化をモニターするために、類似のアッセイが使用され得る。１つの実施形態において、ＡＴＰは、活性化の間にＴ細胞から放出され、Ｐ２Ｘレセプターのオートクラインおよび／またはパラクリン活性化をもたらす。
【００３７】
用語「Ｔ細胞アネルギー」は、Ｔ細胞の低い活性の状態、例えば、抗原と接触したときのＴ細胞の無反応性の状態のことを指す。Ｔ細胞アネルギーは、例えば、Ｔ細胞の増殖を妨げる、同時刺激の欠如および同時に生じるＩＬ−２産生の不足に起因し得る。
【００３８】
用語「分化」は、Ｔ細胞に関して本明細書中で使用されるとき、より特殊化されていない細胞型がより特殊化された細胞型になるプロセスのことを指す。
【００３９】
用語「増大」は、Ｔ細胞に関して本明細書中で使用されるとき、Ｔ細胞の数の増加のことを指す。
【００４０】
用語「阻害する」または「〜の阻害」は、本明細書中で使用されるとき、測定可能な量が減少することを意味する。阻害は、部分的であってもよいし、完全であってもよい。
【００４１】
用語「誘導する」または「〜の誘導」は、本明細書中で使用されるとき、測定可能な量が増加することを意味する。
【００４２】
用語「免疫状態」は、免疫成分が関連している任意の状態、および／または免疫応答もしくは自己免疫性応答を特徴とする任意の状態を含むと当業者によって理解されるだろう。用語「獲得免疫状態」は、獲得免疫系の成分が関連する任意の状態を含むと当業者によって理解されるだろう。
【００４３】
用語「炎症」は、身体的な外傷、感染、慢性疾患（例えば、上で述べたようなもの）ならびに／または外部刺激に対する化学的および／もしくは生理学的反応によって（例えば、アレルギー性反応の一部として）誘発され得る、局所的または全身性の防御反応を特徴とする任意の状態を含むと当業者によって理解されるだろう。有害な作用物質と損傷組織の両方を破壊するか、弱めるか、または隔離するように働き得るそのような任意の応答は、例えば、熱感、腫脹、疼痛、発赤、血管の拡張および／もしくは血流の増加、白血球による患部の浸潤、機能喪失、ならびに／または炎症状態に関連すると知られている他の任意の症状によって現れ得る。
【００４４】
したがって、用語「炎症」は、任意の炎症性の疾患、障害もしくは状態のそれ自体、炎症性成分が関連する任意の状態、ならびに／またはとりわけ、急性、慢性、潰瘍性、特異性、アレルギー性および壊死性の炎症ならびに当業者に公知の他の形態の炎症を含む症状としての炎症を特徴とする任意の状態も含むと理解されるだろう。したがって、この用語は、本発明の目的のために、炎症性疼痛および／または炎症によって引き起こされる発熱も含む。
【００４５】
用語「Ｐ２レセプター」は、例えば、Ｐ２ＸおよびＰ２Ｙレセプターを含む、細胞外ヌクレオチドに対するレセプターのタイプのことを指す。用語「Ｐ２Ｘレセプター」は、種々の細胞型上に存在するＡＴＰ開口型陽イオンチャネルのことを指す。Ｐ２Ｘ１〜７レセプターのすべてが、ＡＴＰに結合し、しばしば迅速に脱感作する非選択的なイオンチャネルを開口する。Ｐ２Ｘ７レセプターは、例えば、炎症／免疫プロセスに関与する細胞型上；詳細には、マクロファージ、マスト細胞およびリンパ球（ＴおよびＢ）上に広く存在する。細胞外ヌクレオチド、特にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）によるＰ２Ｘ７レセプターの活性化は、とりわけ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の成熟および放出をもたらすと知られている。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、用語「Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニスト」は、以下に記載されるアッセイおよび参照されるアッセイなどの任意の適当なアッセイによって測定されるとき、Ｐ２Ｘレセプター（Ｐ２Ｘ１〜７）の活性化を完全または部分的に関係なく妨げることができる化合物または他の物質である。Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストは、例えば、Ｐ２Ｘレセプターへの結合についてＡＴＰと競合する作用物質、例えば、ｏＡＴＰであり得る。Ｐ２Ｘ７レセプターアンタゴニストは、例えば、Ｐ２Ｘ７レセプターへの結合についてＡＴＰと競合する作用物質であり得る。Ｔ細胞Ｐ２Ｘ７レセプターアンタゴニストは、例えば、Ｔ細胞上のＰ２Ｘ７レセプターへの結合についてＡＴＰと競合する作用物質であり得る。
【００４７】
Ｐ２Ｘレセプター拮抗作用をアッセイするための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，７２０，４５２号では、エチジウムブロマイド（蛍光性ＤＮＡプローブ）の存在下においてレセプターアゴニストを用いてＰ２Ｘ７レセプターが活性化されるときに、細胞内のＤＮＡに結合したエチジウムブロマイドの蛍光の増加が観察される観察結果に基づいたアッセイが記載されている。したがって、蛍光の増加は、Ｐ２Ｘ７レセプター活性化の尺度として使用され得、ゆえに、それを使用することにより、Ｐ２Ｘ７レセプター上の化合物または物質の阻害性の効果が定量化され得る。
【００４８】
Ｐ２Ｘ７レセプターアンタゴニストの例としては、米国特許第６，４９２，３５５号；同第６，７２０，４５２号；同第６，８８１，７５４号および同第７，１２９，２４６号（その全体の内容が本明細書中で参考として援用される）に記載されている化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書中で使用されるとき、用語「パネキシン」は、無脊椎動物のイネキシンファミリーのタンパク質と相同性であるヘミチャネル形成タンパク質のことを指す。パネキシンヘミチャネルは、赤血球および味覚レセプター細胞においてＡＴＰを通過させ、マクロファージにおけるＩＬ１−βの分泌を決定すると知られている。明確に示されない限り、「パネキシン」は、パネキシン−１またはパネキシン−２のいずれかを指し得る。ある特定の実施形態において、用語「パネキシン」は、パネキシン−１のことを指す。
【００５０】
本明細書中で使用されるとき、用語「ｏＡＴＰ」は、酸化型ＡＴＰのことを指し、それは、リボースの２’位および３’位に存在するヒドロキシルのジアルデヒドへの酸化によってＡＴＰから得られ得る。この酸化は、Ｐ．Ｎ．Ｌｏｗｅら、“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ７：１１３１−１１３３（１９７９）に記載されているように過ヨウ素酸塩を用いて行われ得る。ｏＡＴＰは、Ｐ２ｚ／Ｐ２Ｘ７プリン受容体アンタゴニストとして作用すると考えられている（Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５（３）：５７９−５８２（１９９７））。
【００５１】
本明細書中で使用されるとき、用語「パネキシンインヒビター」は、パネキシンヘミチャネルの機能を阻害する作用物質のことを指す。パネキシンインヒビターは、例えば、パネキシンヘミチャネルの機能を干渉する、小分子、抗体、ペプチドまたは他の任意の物質であり得る。１つの実施形態において、パネキシンインヒビターは、ペプチドである。好ましい実施形態において、パネキシンインヒビターは、ＰＸ１０ペプチド、または配列がＷＲＱＡＡＦＶＤＳＹ（配列番号１）であるＰＸ１０ペプチドと少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のペプチドであり、ここで、Ｎ末端およびＣ末端は、ある特定の実施形態において、遊離型であり、修飾されていない。
【００５２】
本明細書中で使用されるとき、２０個の従来のアミノ酸およびそれらの省略形は、従来の慣例に従う。本明細書中で参考として援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照のこと。その２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えば、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸および他の非従来型のアミノ酸もまた、本発明のペプチドにとって適当な構成要素であり得る。非従来型のアミノ酸の例としては：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書中で使用されるペプチド表記法では、標準的な慣例および慣習に従って、左側の方向が、アミノ末端の方向であり、右側の方向が、カルボキシ末端の方向である。
【００５３】
ペプチドに適用されるとき、用語「実質的な同一性」は、プログラムのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによってデフォルトのギャップウェイト（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔｓ）を用いて最適にアラインメントされたとき、２つのペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５パーセントの配列同一性、最も好ましくは、少なくとも９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換によって異なる。保存的なアミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の互換性のことを指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸置換の群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸およびアスパラギン−グルタミンである。
【００５４】
本明細書中で考察されるように、ペプチドのアミノ酸配列における重大でない変化は、アミノ酸配列における変化が、非バリアント配列の少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、９０％または９５％、最も好ましくは、９６％、９７％、９８％または９９％を維持する場合、本発明によって包含されると企図される。特に、保存的なアミノ酸の置き換えが、企図される。保存的な置き換えは、側鎖において関係するアミノ酸のファミリー内で生じるものである。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に、以下のファミリー：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）無極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。より好ましいファミリー：セリンおよびトレオニンは、脂肪族−ヒドロキシファミリーであり；アスパラギンおよびグルタミンは、アミド含有ファミリーであり；アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族ファミリーであり；そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族ファミリーである。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの孤立した置き換え、または構造的に関係するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置き換えは、特に、その置き換えが、フレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、生じる分子の結合性または特性に対して主要な効果を有しないと予想されることが妥当である。アミノ酸の変更によって機能性ペプチドがもたらされるか否かは、そのペプチド誘導体の特定の活性、例えば、少なくとも１つのＴ細胞の活性の阻害をアッセイすることによって、容易に判定され得る。
【００５５】
好ましいアミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるもの、（２）酸化に対する感受性を低下させるもの、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更するもの、（４）結合親和性を変更するもの、および（５）そのようなアナログの他の物理化学的または機能的な特性を付与するか、または改変するものである。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々なムテインを含み得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的なアミノ酸置換）が、天然に存在する配列（好ましくは、分子間の接触を形成するドメイン外のペプチドの部分）において行われ得る。保存的なアミノ酸置換は、親配列の構造的な特徴を実質的に変更するべきでない（例えば、置き換えのアミノ酸は、親配列に存在するヘリックスを壊すか、または親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を破壊する傾向があるべきでない）。当該分野において認められているペプチドの二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）（その各々が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００５６】
ペプチドアナログは、鋳型ペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬物として製薬業界において通常使用されるものである。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ  １５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ３０：１２２９（１９８７）（本明細書中で参考として援用される）。そのような化合物は、コンピュータを使用した分子モデリングの助けによって開発されることが多い。治療的に有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣物を用いることにより、等価な治療的または予防的な効果がもたらされ得る。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体などの模範ペプチド（すなわち、生化学的な特性または薬理学的な活性を有するペプチド）に構造的に類似しているが、当該分野で周知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合によって必要に応じて置き換えられた１つ以上のペプチド結合を有する。同じタイプのＤ−アミノ酸によるコンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の体系的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を用いることにより、より安定なペプチドが生成され得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列バリエーションを含む拘束性ペプチドが、当該分野で公知の方法によって（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６１：３８７（１９９２）、本明細書中で参考として援用される）；例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を内部に付加することによって、生成され得る。
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、用語「被験体」は、治療的な処置のレシピエントのことを指し、すべての動物を含む。例示的な実施形態において、被験体は、ヒトである。
【００５８】
本明細書中で使用されるとき、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置」は、状態もしくは疾患、またはその少なくとも１つの臨床的症状を減少させるか、軽減するか、または回復することを指すために使用され得る。処置が、そのような症状または状態が測定可能である前に施されるとき、その処置は、「予防する」と考えられ得る。
【００５９】
用語「作用物質」は、本明細書中で言及されるとき、分子、化合物または組成物のことを指す。いくつかの実施形態において、「作用物質」は、細胞、例えば、Ｔｒｅｇ細胞を含み得る。
【００６０】
用語「治療薬」は、本明細書中で言及されるとき、治療効果を果たす分子、化合物または組成物のことを指す。
【００６１】
用語「有効量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて投与されたときに、処置される患者に対して治療効果を付与する治療薬の量のことを指す。その効果は、客観的（すなわち、いくつかの試験またはマーカーによって測定可能）であってもよいし、主観的（すなわち、被験体が効果の徴候を示すか、または効果を感じる）であってもよい。
【００６２】
用語「Ｔ細胞依存性の免疫応答を調節する作用物質」は、例えば、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化のインヒビター、ならびに少なくとも１つのＴｒｅｇ細胞の活性、例えば、Ｔ細胞の分化および／もしくは増大、またはＴ細胞の免疫抑制性の活性の調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）のことを指す。いくつかの実施形態において、「Ｔ細胞依存性の免疫応答を調節する作用物質」は、免疫抑制性の活性を有するＴｒｅｇ細胞を含む組成物である。
【００６３】
ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化の阻害
本発明は、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化のインヒビターを用いて、少なくとも１つのヘルパーＴ細胞活性、例えば、Ｔ細胞の活性化、増殖および／またはエフェクター機能を阻害する方法を提供する。１つの実施形態において、そのようなインヒビターは、Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニスト、例えば、Ｔ細胞Ｐ２Ｘ７レセプターアンタゴニストである作用物質を含む。好ましい実施形態において、そのインヒビターは、ｏＡＴＰである。別の実施形態では、そのようなインヒビターは、パネキシンヘミチャネルの透過性を阻害する作用物質を含む。別の好ましい実施形態では、そのインヒビターは、ＰＸ１０ペプチド（そのアナログまたは化学的に改変された誘導体を含む）またはカルベノキソロンである。例示的な実施形態において、本発明の方法は、インビボにおいて行われる。
【００６４】
１つの実施形態において、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を特徴とする免疫状態を処置するための方法が、提供される。１つの実施形態において、これらの方法は、本明細書中に開示されるＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化のインヒビターの少なくとも１つを、単独で、または代替の免疫療法プロトコルもしくは免疫抑制的プロトコルと組み合わせて哺乳動物被験体に投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化の少なくとも１つのインヒビターが、被験体に投与され、ここで、前記インヒビターは、ＡＴＰとＰ２レセプター、例えば、Ｐ２Ｘレセプター、例えば、Ｔ細胞Ｐ２Ｘ７レセプターとの相互作用を干渉することおよびＡＴＰシグナル伝達を阻害することができる。例示的な実施形態において、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化のインヒビターは、ｏＡＴＰである。
【００６５】
Ｔｒｅｇ細胞の分化および／または増大の誘導
本発明は、Ｔｒｅｇ細胞の分化および／または増大の恩恵を受ける免疫状態を処置するための方法を提供する。１つの実施形態において、これらの方法は、単独で、または代替の免疫療法プロトコルもしくは免疫抑制的プロトコルと組み合わせて、本明細書中に開示される少なくとも１つの作用物質と接触させることによって分化したおよび／または増大したＴｒｅｇ細胞を、哺乳動物被験体に投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞は、本発明の方法に従ってインビトロにおいて分化され、そして／または増大され、続いて、被験体に投与される。
【００６６】
好ましい実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞の分化および／または増大を誘導する作用物質は、ｏＡＴＰを含む組成物である。その組成物は、好ましくは、（１）Ｔ細胞の一次刺激物質；および（２）細胞成分または可溶性メディエーターも含む。
【００６７】
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞の一次刺激物質は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合し、主要な刺激シグナルを開始するリガンド（例えば、ＣＤ３または抗ＣＤ３）である。Ｔ細胞の一次刺激物質は、他の天然および合成のリガンドを含む。天然のリガンドは、ペプチドを提示しているかまたはしていないＭＨＣを含み得る。他のリガンドとしては、ペプチド、ポリペプチド、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、糖ペプチド、可溶性レセプター、ステロイド、ホルモン、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）、他のスーパー抗原、ペプチド−ＭＨＣ複合体および可溶性ＭＨＣ複合体が挙げられ得るが、これらに限定されない。他の実施形態において、Ｔ細胞刺激物質は、代理の機構によって働く。そのような刺激物質としては、例えば、プロテインキナーゼＣ活性化因子、例えば、ホルボールエステル（例えば、酢酸ミリスチン酸ホルボール）およびカルシウムイオノフォア（例えば、細胞質のカルシウム濃度を上昇させるイオノマイシン）が挙げられる。そのような作用物質の使用は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を迂回するが、Ｔ細胞に刺激性のシグナルを送達する。
【００６８】
ある特定の実施形態において、細胞成分または可溶性メディエーターは、例えば、抗原提示細胞（例えば、自家、同系間、同種間または異種間の照射された脾細胞由来）、動員される細胞の産物（白血球フェレーシス細胞産物および／または骨髄由来細胞産物（例えば、腸骨稜細胞産物および／または椎体）を含むがこれらに限定されない）、ならびにリンパ節および脾臓などのリンパ系組織の他の供給源からの細胞産物から選択される１つ以上の細胞産物を含む。他の実施形態において、細胞成分または可溶性メディエーターは、レチノイン酸（例えば、Ｈｉｌｌら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９：７５８−７７０（２００８）を参照のこと）、ラパマイシン、ＤＮＡメチル化のインヒビター（例えば、５−アザシチジン；例えば、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４（７）：１５４３−１５５１（２００７）を参照のこと）、サイトカイン（例えば、ＴＧＦ−ベータおよびインターロイキン（ＩＬ）−２）、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）のインヒビター、例えば、トリコスタチンＡ（Ｔａｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３：１２９９（２００７））およびα１−抗トリプシン（Ｌｅｗｉｓら、ＰＮＡＳ  １０５：１６２３６（２００８））から選択される１つ以上の可溶性の作用物質を含む。
【００６９】
本組成物は、ＣＤ８０、４−１ＢＢ、ＣＤ５２アゴニスト、ＣＤ２８抗体、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＯＸ−２、ＣＤ７０およびＣＤ８２を含むがこれらに限定されない他の作用物質も含み得る。
【００７０】
例示的な実施形態において、組成物は、ｏＡＴＰ、抗ＣＤ３抗体および照射された同系脾細胞を含む。本組成物は、ＩＬ−２をさらに含み得る。
【００７１】
１つの実施形態において、組成物は、ｏＡＴＰ、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含む組成物よりも効果的にＴｒｅｇ細胞の分化／増大を誘導する。
【００７２】
分化されるおよび／または増大されるＴ細胞は、例えば、哺乳動物の供給源（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットまたはそれらのトランスジェニック種）から得ることができる。Ｔ細胞、例えば、ナイーブＴ細胞またはＴｒｅｇ細胞は、例えば、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、脾臓組織、腫瘍またはＴ細胞株から単離され得る。
【００７３】
Ｔｒｅｇ細胞に分化することができる細胞は、哺乳動物の前駆細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、例えば、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞）を含む。本発明は、他のタイプのＴ細胞、例えば、Ｔｈ１７細胞をＴｒｅｇ系列に逆転させる本発明の作用物質の使用および方法も企図する。したがって、本発明の作用物質を使用することにより病原性Ｔ細胞の表現型を保護的なＴ細胞の表現型に逆転させる方法が、提供される。本発明は、例えば、Ｔｒｅｇ細胞が非Ｔｒｅｇ細胞型（例えば、Ｔｈ１７細胞などの病原性Ｔ細胞型）に変換することを阻害することによって、本発明の作用物質を使用してＴｒｅｇ細胞の表現型を維持する方法もまた提供する。
【００７４】
上述の供給源からＴ細胞を得る方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬＴＭ分離を用いて、抽出された血液から得ることができる。あるいは、Ｔ細胞は、アフェレーシスまたは白血球搬出法によって被験体の循環血から得ることができる。Ｔ細胞の特定の亜集団、例えば、ナイーブＣＤ４＋細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の濃縮および／または単離は、当該分野で公知のポジティブおよびネガティブ選択手法を用いて行われ得、それらの選択手法としては：蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィ、モノクローナル（ｍｏｎｏｃｏｎａｌ）抗体に結合された、またはモノクローナル抗体とともに使用される、細胞傷害性作用物質、例えば、補体および細胞毒、ならびに固体マトリックス、例えば、プレートに接着された抗体を用いた「パニング」、または他の簡便な手法が挙げられるがこれらに限定されない。ポジティブ選択は、所望でないＴ細胞型に特異的な表面マーカー（ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｋｅｒｓ）を含むＴ細胞に対するネガティブ選択と組み合わされ得る。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ナイーブＣＤ４＋細胞が、その後のＴｒｅｇ細胞への分化のために精製される。ナイーブＣＤ４＋細胞は、例えば、ネガティブ選択を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞およびエフェクター記憶Ｔ細胞（ＣＤ５４Ｒ０）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞および好中球を除去することによって、単離され得る。好ましい実施形態において、上述の選択手法に由来する組成物の細胞の少なくとも５５％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％が、ナイーブＣＤ４＋細胞である。
【００７６】
Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋である細胞を含み、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）−４、糖質コルチコイド誘導性ＴＮＦレセプター（ＧＩＴＲ）およびフォークヘッド／翼状ヘリックス転写因子Ｆｏｘｐ３の発現も特徴とする。Ｔｒｅｇ細胞は、当該分野で公知の方法を用いて、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４およびＦｏｘｐ３の発現に基づいて細胞の混合集団（例えば、末梢血単核球を含む集団または分化したＴｒｅｇ細胞とナイーブＣＤ４＋細胞との混合物を含む集団）から単離され得る。いくつかの実施形態において、制御性Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞においてダウンレギュレートされるＣＤ１２７を発現するすべての細胞を除去することによって、他の細胞から単離され得る。１つの実施形態において、制御性Ｔ細胞は、死細胞と特異的に会合する色素（例えば、ヨウ化プロピジウム、エチジウムモノアザイド）を使用することによって、死細胞に対して選択され得る。他の実施形態において、制御性Ｔ細胞は、例えば、米国特許公開番号２００６００６３２５６、２００６０２３３７５１、２００６０２４００２４および２００８０２７９８３４（それらの全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されているような当該分野で公知の他の方法を用いて得られる。好ましい実施形態において、上述の選択手法および単離手法に由来する組成物の細胞の少なくとも５５％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％が、制御性Ｔ細胞である。
【００７７】
１つの実施形態において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞は、２工程の方法において末梢血サンプルから直接単離される。第１工程は、赤血球をサンプル中の不必要な細胞に架橋するＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）技術を用いる、所望でない細胞のネガティブ選択によるＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮を含む。次いで、架橋された細胞は、濃縮培地（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｅｄｉｕｍ）に対する遠心分離によってペレットにされ、廃棄され得る。第２工程は、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団からの、カラムを用いない免疫磁気選択によるＣＤ２５＋ｂｒｉｇｈｔ細胞のポジティブ選択を含む。この工程は、例えば、立ち去らせる真の能力（ｔｒｕｅ  ｗａｌｋ−ａｗａｙ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）を備えたピペッティングロボットであるＲｏｂｏＳｅｐｔ（登録商標）を用いて自動化され得る。この２工程プロセスは、高度に精製されたＴｒｅｇサンプルを全血から得るために必要な時間を著しく短縮する。このプロセスは、例えば、米国特許第７，１３５，３３５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に詳細に記載されている。Ｔｒｅｇ細胞の高度に精製された集団を分離するための当該分野で公知のいくつかの他の任意の方法が、本発明に従って用いられ得る。
【００７８】
１つの実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞は、高用量のＩＬ−２およびラパマイシンを用い、ＣＤ３／ＣＤ２８増大ビーズを使用して増大される。この増大プロトコルは、例えば、米国特許公開番号２００５０１９６３８６（その全体が本明細書中で参考として援用される）に詳細に記載されている。Ｔｒｅｇ細胞の増大するための当該分野で公知のいくつかの他の任意の方法が、本発明に従って用いられ得る。
【００７９】
Ｔｒｅｇ細胞の刺激および増大は、任意の細胞培養環境、例えば、培養フラスコ、培養バッグ、または細胞を保持することができる任意の容器（例えば、バイオリアクター）、好ましくは、無菌の環境において、行われ得る。Ｔｒｅｇ細胞の分化および／または増大を誘導する作用物質の１つ以上の成分は、可溶性の形態であってもよいし、固体支持体（例えば、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）または組織培養皿）上に固定化されていてもよい。固相表面は、プラスチック、ガラスまたは他の任意の適当な材料であり得る。その刺激および増大は、細胞培養の１つ以上のステージにおいて行われ得る（例えば、米国特許公開番号２００６０２８６０６７を参照のこと）。Ｔｒｅｇ細胞は、好ましくは、少なくとも２倍、より好ましくは、少なくとも１０、５０、１００、２００、３００、５００、８００または１０００倍増大される。
【００８０】
Ｔｒｅｇ細胞は、いったん単離され、分化し、そして／または増大されると、Ｆｏｘｐ３の発現に基づいて、ならびにＴＧＦ−ベータの産生、そしてＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＦＮ−ガンマを産生しないことによって特徴づけられ得る。単離されたＴｒｅｇ細胞の抑制性の活性は、例えば、反応Ｔ細胞との共培養によって試験され得る。本発明は、例えば、サイトカイン刺激を通じて、または被験体に投与する前に目的の遺伝子（ｇｅｎｅｓ  ｏｒ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（例えば、治療的な遺伝子またはノックアウト遺伝子）を付加することによって、増大された細胞を操作することも予想する。例えば、Ｔｒｅｇ細胞は、抑制性の因子または他の生物学的な因子、例えば、ＩＬ−４、幹細胞成長因子、血管新生制御因子、遺伝的欠損などを炎症部位に送達する「トロイの木馬」として働き得る。さらに、Ｆｏｘｐ３の過剰発現は、病原性Ｔ細胞を制御性Ｔ細胞に別途変換すると示されており、ポリクローナル的に増大されたＴ細胞は、抗原特異的なＴＣＲ＋Ｆｏｘｐ３をコードする遺伝子を形質導入されることにより、強力な抗原特異的制御性Ｔ細胞を非常に多く産生し得る。これらの抗原特異的なアプローチは、制御性Ｔ細胞の特異性および機能を最大にしつつ、最初に多数の細胞数が必要であることを低下させる。
【００８１】
Ｔ細胞依存性免疫応答を調節する方法
本発明は、概して、免疫寛容、自己免疫、免疫抑制および免疫療法に対する複数の治療的な応用法を有するＴ細胞活性を調節するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、（１）少なくとも１つのＴ細胞活性を阻害する方法（ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質とＴ細胞を接触させる工程を包含する）、および（２）少なくとも１つのＴｒｅｇ細胞活性、例えば、Ｔｒｅｇ細胞の分化、増大および／または免疫抑制性の活性を調節する方法（少なくとも１つのＴｒｅｇ細胞活性を調節する作用物質とＴｒｅｇ細胞を接触させる工程を包含する）を提供する。ある特定の実施形態において、方法（１）は、インビボにおいて行われ；方法（２）は、インビトロにおいて行われ、それに続いて、調節された活性を有するＴｒｅｇ細胞（例えば、分化したおよび／もしくは増大したＴｒｅｇ細胞、または免疫抑制性の活性が高いＴｒｅｇ細胞）のインビボ投与が行われる。
【００８２】
本明細書中で初めて開示されたように、活性化の間にＴ細胞から放出されるＡＴＰは、ＭＡＰＫ活性化によってＰ２Ｘレセプターのオートクライン活性化をもたらす。これは、増殖性Ｔ細胞の活性化および増大に対して不可欠な共刺激因子を意味する。
【００８３】
また、本明細書中で初めて開示されたように、パネキシンは、Ｔ細胞上に発現されるものであり、Ｔ細胞活性の正の制御因子として作用し、ここで、ＡＴＰによって媒介されるシグナル伝達は、パネキシンヘミチャネル形成をもたらし、Ｔ細胞活性化に導く。
【００８４】
したがって、ＡＴＰシグナル伝達は、Ｔ細胞応答（例えば、細胞周期の進行、分化、生存、サイトカイン産生および細胞溶解活性化）の促進に関与する。これらの知見から、他の状態の中でも自己免疫性状態および移植関連の免疫応答を処置する目的で、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を干渉することができる治療薬（例えば、Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニスト、またはパネキシンヘミチャネル形成を阻止する作用物質、またはＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化に関連するチャネルを阻止する作用物質）を使用することによりＴ細胞の活性（例えば、ヘルパーＴ細胞の活性）の調節が可能になる。
【００８５】
本明細書中で初めて開示されたように、Ｔｈ１７細胞（ＩＬ−１７を分泌するＴ細胞）の分化は、ｏＡＴＰによって阻害される。このＴ細胞サブセットは、現在、Ｔリンパ球依存性の炎症性応答の主要な成分とみられている。したがって、本発明は、Ｔｈ１７細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化の少なくとも１つのインヒビターと接触させることによって、Ｔｈ１７細胞の分化および／またはＩＬ−１７分泌を阻害するための方法を提供する。本発明は、保護的なＴ細胞、例えば、Ｔｒｅｇ細胞がＴｈ１７細胞に変換することを阻害するため、およびＴｈ１７細胞が保護的なＴ細胞、例えば、Ｔｒｅｇ系列に変換することを促進するための方法も提供する。本発明の前記方法は、例えば、インビトロまたはインビボにおいて行われ得る。
【００８６】
さらに、本明細書中で初めて開示されたように、抗ＣＤ３、ＩＬ−２および照射された同系脾細胞と併用されるｏＡＴＰは、Ｆｏｘｐ３の発現レベルが高い活性な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の分化と著しい増大の両方を誘導する。したがって、ｏＡＴＰ、特に、ある特定の他の作用物質を含む組成物中のｏＡＴＰは、Ｔｒｅｇの分化および／または増大を誘導し得る。これらの知見から、他の状態の中でも自己免疫性状態および移植関連の免疫応答（例えば、移植片対宿主病）を処置する目的で、ｏＡＴＰを含む組成物を使用することによりＴ細胞の活性（例えば、制御性Ｔ細胞の活性）の調節が可能になる。
【００８７】
本発明は、炎症性および自己免疫性の状態を処置する際に使用するための、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化のインヒビターならびにＴｒｅｇの分化および／または増大の誘導物質に対する新規の用途を提供する。本発明のインヒビターおよび誘導物質は、特定の状態（例えば、喘息、アレルギー、関節リウマチ、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、多発性硬化症、移植片拒絶、移植片対宿主病、筋萎縮性側索硬化症、脱髄性障害、強皮症、シェーグレン症候群、エルドハイム・チェスター症候群、クローン病症候群、高安動脈炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、ヴェルルホフ特発性血小板減少症候群、乾癬、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、円形脱毛症、白斑、薬物関連皮疹、接触過敏症、エリテマトーデス、痘瘡状苔癬状粃糠疹、慢性苔癬状粃糠疹、湿疹、扁平苔癬、および本明細書中に開示されるかまたは当該分野で公知である他のいくつかの任意の免疫状態の処置においてＴ細胞の活性を調節するため、作動させる（ａｇｏｎｉｚｅ）ため、阻止するため、増加させるため、阻害するため、減少させるため、拮抗するため、または中和するために使用され得る。そのようなインヒビターおよび誘導物質は、現在知られているか、または後に発見される任意のＴ細胞媒介性の免疫状態にとって有益であり得る。好ましい実施形態において、前記インヒビターおよび誘導物質は、ｏＡＴＰを含む。
【００８８】
１つの実施形態において、本発明の方法は、炎症状態を処置するために使用され、ここで、前記炎症状態は、先天性免疫系の炎症状態でないか、または前記炎症状態は、完全に先天性免疫系の炎症状態ではない。ある特定の実施形態において、本発明の方法は、炎症状態を処置するために使用され、ここで、前記炎症状態は、部分的または完全に、獲得免疫系の炎症状態である。その先天性免疫系は、非特異的な様式で病原体に対して応答する細胞および機構を含む。先天性免疫系の細胞によって引き起こされる炎症は、疼痛レセプターを感作し、血管の拡張を引き起こし、そして食細胞を誘引する、メディエーター（例えば、ヒスタミン、ブラジキニン、セロトニン、ロイコトリエンおよびプロスタグランジン）を産生する。これらの反応は、自己免疫疾患の病原性の応答に直接関与しない。対照的に、Ｔリンパ球依存性の炎症性応答を含む獲得免疫系は、抗原特異的な様式で病原体に対して応答し、自己免疫疾患の媒介に直接関与し得る。先天性免疫系の細胞およびプロセスは、獲得免疫系の細胞およびプロセスとは異なる。ある特定の実施形態において、本発明の方法は、獲得免疫系の炎症状態および／または自己免疫性状態を処置するために使用される。１つの実施形態において、本発明の方法は、Ｔ細胞の活性化に関係する開始期（ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）の炎症性および／または自己免疫性のプロセスを処置するために使用される。例示的な実施形態において、本発明の前記方法は、インビボにおいて行われる。
【００８９】
好ましい実施形態において、抗原性の刺激に対する宿主の免疫応答を抑制するための方法が提供され、その方法は、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化の上述のインヒビターの少なくとも１つ、Ｔｒｅｇ細胞の分化および／もしくは増大を誘導する上述の作用物質のうちの１つ、ならびに／または上述の作用物質の１つとの接触によって分化したおよび／もしくは増大したＴｒｅｇ細胞を宿主に投与することを包含する。例えば、抗原性の刺激は、自己免疫疾患の状況における自己抗原によるものであり得るか、または移植された臓器および組織に存在するドナー抗原によるものであり得る。例示的な実施形態において、前記方法は、インビボにおいて行われる。
【００９０】
本発明は、薬学的に許容可能なキャリア、ならびにＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化の少なくとも１つのインヒビターならびに／またはＴｒｅｇ細胞の分化および／もしくは増大の１つの誘導物質を含む薬学的組成物を用いて炎症状態または免疫状態を処置するための方法も提供する。いくつかの実施形態において、その薬学的組成物は、前記誘導物質によって分化したおよび／または増大したＴｒｅｇ細胞を含む。例示的な実施形態において、前記処置方法は、インビボにおいて行われる。
【００９１】
本発明の方法は、例えば、炎症性腸疾患（例えば、クローン病およびセリアック病）、過敏性腸症候群、片頭痛、頭痛、腰痛、線維筋痛症、筋筋膜障害（ｍｙｏｆａｓｃｉａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、ウイルス感染（例えば、Ｃ型肝炎、および特に、インフルエンザ、感冒、帯状疱疹およびＡＩＤＳ）、自己免疫性肝炎、細菌感染、真菌感染、月経困難、やけど、外科的手技または歯科的手技、悪性腫瘍（例えば、乳癌、結腸癌および前立腺癌）、アテローム性動脈硬化症、腸原性（ｅｎｔｅｒｏｇｅｎｉｃ）脊椎関節症、痛風、関節炎、変形性関節症、若年性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、熱（例えば、リウマチ熱）、強直性脊椎炎（ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｏｄａｌｉｔｉｅｓ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血管炎、膵炎、腎炎、滑液包炎、結膜炎、虹彩炎、強膜炎、ブドウ膜炎、創傷治癒、皮膚科学的状態（例えば、乾癬、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、円形脱毛症、白斑、薬物関連皮疹、接触過敏症、エリテマトーデス、痘瘡状苔癬状粃糠疹、慢性苔癬状粃糠疹、湿疹および扁平苔癬）、脳卒中、真性糖尿病、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病および多発性硬化症）、自己免疫疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症、脱髄性障害、強皮症、シェーグレン症候群、エルドハイム・チェスター症候群、クローン病症候群、高安動脈炎、自己免疫性溶血性貧血およびヴェルルホフ特発性血小板減少症候群）、骨粗鬆症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、アレルギー性障害、鼻炎、潰瘍、冠状動脈心疾患、サルコイドーシス、移植片拒絶、移植片対宿主病、ならびに免疫成分または炎症性成分による他の任意の疾患の処置において有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の方法は、獲得免疫成分による疾患を処置するために使用される。
【００９２】
さらなる局面では、Ｔリンパ球依存性の炎症状態または免疫状態を処置するための方法が提供される。好ましい実施形態において、Ｔリンパ球依存性の炎症状態または免疫状態は、例えば、喘息、アレルギー、関節リウマチ、乾癬性関節炎、関節炎、内毒素血症、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、多発性硬化症、移植片拒絶、移植片対宿主病、筋萎縮性側索硬化症、脱髄性障害、強皮症、シェーグレン症候群、エルドハイム・チェスター症候群、クローン病症候群、高安動脈炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、ヴェルルホフ特発性血小板減少症候群および皮膚科学的状態（例えば、乾癬、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、円形脱毛症、白斑、薬物関連皮疹、接触過敏症、エリテマトーデス、痘瘡状苔癬状粃糠疹、慢性苔癬状粃糠疹、湿疹および扁平苔癬）からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、炎症状態または免疫状態は、マスト細胞の脱顆粒に関連する。好ましい実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、前記方法は、インビボにおいて行われる。１つの実施形態において、その方法は、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化の上述のインヒビターのうちの少なくとも１つ、Ｔｒｅｇ細胞の分化および／もしくは増大を誘導する上述の作用物質のうちの１つ、ならびに／または上述の作用物質のうちの１つとの接触によって分化したおよび／もしくは増大したＴｒｅｇ細胞を、単独で、あるいは代替の免疫療法ならびに／または免疫抑制剤および／もしくは免疫抑制的プロトコルとともに、被験体、例えば、哺乳動物の被験体に投与する工程を包含する。
【００９３】
１つの実施形態において、臓器移植および組織移植の結果を改善するため、ならびに移植片の生存を延長するための方法が提供される。１つの実施形態において、これらの方法は、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化の上述のインヒビターの少なくとも１つ、Ｔｒｅｇ細胞の分化および／もしくは増大を誘導する上述の作用物質のうちの１つ、ならびに／または上述の作用物質のうちの１つとの接触によって分化したおよび／もしくは増大したＴｒｅｇ細胞を、単独で、または代替の免疫療法プロトコルおよび／もしくは免疫抑制的プロトコルとともに移植レシピエントに投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化の少なくとも１つのインヒビターが、移植レシピエントに投与され、ここで、前記インヒビターの投与は、移植片に存在するドナー抗原に対するレシピエントの免疫応答、例えば、Ｔ細胞の活性化を減少させるために有効である。別の好ましい実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞の分化および／または増大を誘導する少なくとも１つの作用物質が、移植レシピエントに投与され、ここで、前記作用物質の投与は、移植片に存在するドナー抗原に対するレシピエントの免疫応答を抑制するために有効である。さらに別の好ましい実施形態では、前記誘導剤との接触によって分化したおよび／または増大したＴｒｅｇ細胞が、移植レシピエントに投与され、ここで、前記Ｔｒｅｇ細胞の投与は、移植片に存在するドナー抗原に対するレシピエントの免疫応答を抑制するために有効である。例えば、Ｔａｙｌｏｒら、Ｂｌｏｏｄ  ９９：３４９３−３４９９（２００２）を参照のこと。１つの実施形態において、移植片は、同種移植片である。別の実施形態では、移植片は、異種移植片である。
【００９４】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、移植された組織の生存を延長するために使用され得る。急性および／または慢性の移植片拒絶を予防する際に使用するための好ましい組成物は、ＡＴＰアンタゴニスト、例えば、ｏＡＴＰ、および／またはパネキシンヘミチャネルの構築を阻止する作用物質、例えば、ＰＸ１０を含む。特に好ましい作用物質としては、ＡＴＰとＡＴＰに対するレセプターとの天然の相互作用を模倣する小分子化学組成物が挙げられる。Ｔｒｅｇ細胞の分化および／または増大を誘導する組成物は、好ましくは、（１）Ｔ細胞の一次刺激物質；および（２）細胞成分または可溶性メディエーターも含む。本発明の方法は、インビトロにおいて行われてもよいし、インビボにおいて行われてもよい。
【００９５】
１つの実施形態において、Ｔ細胞依存性の免疫応答を調節する少なくとも１つの作用物質は、デバイス内に含められた生物学的材料からなる埋没物のレシピエントに投与されることにより、そのレシピエントの免疫応答が低下し、そして／または移植された組織の生存が延長する。そのデバイスは、患者に生物学的材料を埋め込むための任意のデバイスであり得、例えば、米国特許公開番号２００６／００２４２７６、米国特許第６，７１６，２４６号またはＰＣＴ特許公開番号ＷＯ０８／０９７４９８（これらの各々が、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載されているようなデバイスであり得る。１つの実施形態において、Ｔ細胞依存性の免疫応答を調節する少なくとも１つの作用物質は、前記デバイスのレシピエントに対して、局所的に、すなわち、デバイスを埋め込む部位に、またはその部位の近傍に、投与される。部位の「近傍における」作用物質の投与とは、本明細書中で使用されるとき、前記部位と細胞で連絡されている細胞または組織への作用物質の投与のことを指す。１つの実施形態において、Ｔ細胞依存性の免疫応答を調節する少なくとも１つの作用物質は、前記デバイスのレシピエントに対して、デバイスを埋め込む部位付近または部位周囲の１つ以上のリンパ節に投与される。
【００９６】
１つの実施形態において、Ｔ細胞依存性の免疫応答を調節する少なくとも１つの作用物質は、物質を投与するためのデバイスを含む埋没物のレシピエントに投与されることにより、例えば、レシピエントの免疫応答または炎症性応答が低下する。そのデバイスは、患者において生物学的材料を埋め込むための任意のデバイスであり得、例えば、米国特許公開番号２００６／００２４２７６、米国特許第５，３２４，５１８号、米国特許第６，７１６，２４６号またはＰＣＴ特許公開番号ＷＯ０８／０９７４９８（これらの各々の全体が、本明細書中で参考として援用される）に記載されているようなデバイスであり得る。１つの実施形態において、Ｔ細胞依存性の免疫応答を調節する少なくとも１つの作用物質は、前記デバイスのレシピエントに対して、局所的に、すなわち、デバイスを通じて、またはデバイスを埋め込む部位に、もしくはその部位の近傍に、投与される。１つの実施形態において、Ｔ細胞依存性の免疫応答を調節する少なくとも１つの作用物質は、前記デバイスのレシピエントに対して、デバイスを埋め込む部位付近または部位周囲の１つ以上のリンパ節に投与される。
【００９７】
ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化のインヒビターおよび少なくとも１つの他の免疫抑制剤または抗炎症剤を含む薬学的組成物を用いて、Ｔ細胞活性、例えば、Ｔ細胞の活性化、増殖およびエフェクター機能を阻害するための方法もまた提供される。例示的な実施形態において、本発明の前記方法は、インビボにおいて行われる。
【００９８】
ｏＡＴＰおよび少なくとも１つの他の免疫抑制剤または抗炎症剤を含む薬学的組成物を用いて、Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制性の活性を増加させるための方法もまた提供される。いくつかの実施形態において、その薬学的組成物は、（１）Ｔ細胞の一次刺激物質；および（２）細胞成分または可溶性メディエーターも含む。例示的な実施形態において、Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）は、インビトロにおいて上述の組成物と接触され、分化し、そして、生じたＴｒｅｇ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞の集団に増大され、そしてそれは、その必要のある被験体へのインビボ投与のために、少なくとも１つの他の免疫抑制剤もしくは抗炎症剤、または抗原特異的な様式でＴｒｅｇ表現型を促進および維持するのを助ける少なくとも１つの作用物質を含み得る薬学的組成物として投与される。別の実施形態では、ｏＡＴＰ（単独で、または他の作用物質とともに）が、その必要のある被験体に投与されることにより、Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制性の活性がインビボにおいて増加する。
【００９９】
免疫抑制剤は、例えば、シクロスポリン、ラパマイシン、キャンパス（ｃａｍｐａｔｈ）−１Ｈ、ＡＴＧ、Ｐｒｏｇｒａｆ、抗ＩＬ−２ｒ、ＭＭＦ、ＦＴＹ、ＬＥＡ、インターフェロン、インターロイキン−２、シクロスポリンＡ、ジフチトキス（ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、デニロイキン（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ）、レバミゾール、アザチオプリン、ブレキナル、グスペリムス、６−メルカプトプリン、ミゾリビン、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、メトトレキサート、ピリトレキシム（ｐｉｒｉｔｒｅｘｉｍ）、プテロプテリン、ＴｏｍｕｄｅｘＲＴＭおよびトリメトレキサート）、プリンアナログ（例えば、クラドリビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）およびチアグアニン（ｔｈｉａｇｕａｎｉｎｅ））、ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフール（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）、エノシタビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビンおよびテガフール）フルオシノロン、トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｉｎｏｌｏｎｅ）、酢酸アネコルタブ、フルオロメトロン、メドリゾン、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｌｏｎｅ）などのうちの１つ以上を含み得る。
【０１００】
抗炎症剤は、例えば、ＮＳＡＩＤｓ、インターロイキン−１アンタゴニスト、ジヒドロオロテートシンターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｏｒｏｔａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）インヒビター、ｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビター、ＴＮＦ−αインヒビター、ＴＮＦ−α隔離剤（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ）およびメトトレキサートのうちの１つ以上を含み得る。より詳細には、抗炎症剤は、例えば、抗ＴＮＦ−α、リソフィリン（ｌｙｓｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）、アルファ１−抗トリプシン（ＡＡＴ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｙｆｉｌｌｉｎｅ）、ＣＯＸ−２インヒビター、２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメタゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド（ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコルト（ｆｌｕａｚａｃｏｒｔ）、フルクロロニド（ｆｌｕｃｌｏｒｏｎｉｄｅ）、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチン（ｆｌｕｏｃｏｒｔｉｎ）ブチル、フルオコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニソロン、フルランドレノリド、プロピオン酸フルチカゾン、ホルモコータル（ｆｏｒｍｏｃｏｒｔａｌ）、ハルシノニド、プロピオン酸ハロベタソール、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、エタボン酸ロテプレドノール、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フロ酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２５−ジエチルアミノ−アセテート、リン酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾン、プレドニバル（ｐｒｅｄｎｉｖａｌ）、プレドニリデン、リメキソロン（ｒｉｍｅｘｏｌｏｎｅ）、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド、トリアムシノロンヘキサセトニド、アミノアリールカルボン酸誘導体（例えば、エンフェナム酸、エトフェナマート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸、タルニフルマート、テロフェナマート、トルフェナム酸）、アリール酢酸誘導体（例えば、アセクロフェナク、アセメタシン、アルクロフェナク、アンフェナク、アムトルメチングアシル、ブロムフェナク、ブフェキサマック、シンメタシン、クロピラク、ジクロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロズ酸、フェンチアザク、グルカメタシン、イブフェナク、インドメタシン、イソフェゾラク、イソキセパク、ロナゾラク、メチアジン酸、モフェゾラク、オキサメタシン（ｏｘａｍｅｔａｃｉｎｅ）、ピラゾラク（ｐｉｒａｚｏｌａｃ）、プログルメタシン、スリンダク、チアラミド、トルメチン、トロペシン（ｔｒｏｐｅｓｉｎ）、ゾメピラク）、アリール酪酸誘導体（例えば、ブマジゾン、ブ��ブフェン、フェンブフェン、キセンブシン）、アリールカルボン酸（例えば、クリダナク、ケトロラク、チノリジン）、アリールプロピオン酸誘導体（例えば、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ベルモプロフェン（ｂｅｒｍｏｐｒｏｆｅｎ）、ブクロクス酸、カルプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、イブプロキサム、インドプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピケトプロレン（ｐｉｋｅｔｏｐｒｏｌｅｎ）、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、スプロフェン、チアプロフェン酸、キシモプロフェン（ｘｉｍｏｐｒｏｆｅｎ）、ザルトプロフェン）、ピラゾール（例えば、ジフェナミゾール、エピリゾール）、ピラゾロン（例えば、アパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピフェナゾン、ラミフェナゾン、スキシブゾン、チアゾリノブタゾン）、サリチル酸誘導体（例えば、アセトアミノサロール、アスピリン、ベノリレート（ｂｅｎｏｒｙｌａｔｅ）、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、ジフルニサル、エテルサラート、フェンドサール、ゲンチシン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リジン、メサラミン、サリチル酸モルホリン（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、１−ナフチルサリチレート、オルサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド、サリチルアミドｏ−酢酸、サリチル硫酸、サルサラート、スルファサラジン）、チアジンカルボキサミド（例えば、アンピロキシカム、ドロキシカム、イソキシカム、ロルノキシカム、ピロキシカム、テノキシカム）、．イプシロン．−アセトアミドカプロン酸、ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、α−ビサボロール、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、フェプラジノール（ｆｅｐｒａｄｉｎｏｌ）、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、プロカゾン（ｐｒｏｑｕａｚｏｎｅ）、スーパーオキシドジスムターゼ、テニダプ、ジロートン（ｚｉｌｅｕｔｏｎ）、カンデリラろう、アルファビサボロール、アロエベラ、マンジスタ（Ｍａｎｊｉｓｔｈａ）、グガール（Ｇｕｇｇａｌ）、コラ抽出物、カモミール、ムチサンゴ（ｓｅａ  ｗｈｉｐ）抽出物、グリシルレチン酸、グリチルリチン酸、油溶性カンゾウ抽出物、グリチルリチン酸モノアンモニウム、グリチルリチン酸一カリウム、グリチルリチン酸二カリウム、１−ベータ−グリシルレチン酸、グリチルレチン酸ステアリルおよび３−ステアリルオキシ−グリシルレチン酸、３−スクシニルオキシ−ベータ−グリチルレチン酸二ナトリウムなどのうちの１つ以上を含み得る。
【０１０１】
Ｔｒｅｇ表現型の促進および維持を助ける作用物質は、例えば、ｏＡＴＰ、ＴＧＦ−ベータ、レチノイン酸、ラパマイシン、５−アザシチジンおよびトリコスタチンＡの１つ以上を含み得る。
【０１０２】
対象の組成物および方法は、他のＴ細胞共刺激経路の調節（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４および／またはＢＴＬＡの調節）に基づいて、免疫療法と相乗的に組み合わされ得ることがさらに企図される。
【０１０３】
薬学的処方物
本発明の方法は、治療薬のみの投与を含み得るが、好ましくは、経口投与のための錠剤、カプセルまたはエリキシル剤、直腸投与のための坐剤、非経口または筋肉内投与のための無菌の溶液または懸濁液、リポソーム処方物またはカプセル化処方物、治療薬が単独であるかまたは送達剤もしくはビヒクルに結合体化されている処方物などを含む公知の薬学的処方物による投与を含み得る。
【０１０４】
そのような処方物は、標準的および／または一般に認められた薬務に従って調製され得る。
【０１０５】
本発明の治療実体は、適当なキャリア、賦形剤、および／または移行、送達、寛容などの改善をもたらす処方物に組み込まれた他の作用物質とともに投与され得ることが認識されるだろう。多数の適切な処方物が、すべての製薬化学者に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１５ｔｈ  ｅｄ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５））、特に、その中のＢｌａｕｇ，ＳｅｙｍｏｕｒによるＣｈａｐｔｅｒ８７に見られ得る。これらの処方物としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ろう、油、脂質、脂質（陽イオン性または陰イオン性）含有ベシクル（例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。処方物中の活性成分が、その処方物によって不活性化されず、その処方物が、生理的に適合性であり、かつ投与経路に対して容認できるならば、前述の混合物のいずれもが、本発明に記載の処置および治療において適切であり得る。Ｐｏｗｅｌｌら、“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”  ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１（１９９８）、ならびに製薬化学者に周知の賦形剤およびキャリアに関する追加情報についてのその中の引用もまた参照のこと。
【０１０６】
１つの実施形態において、治療薬は、局所用処方物として投与される。局所用の投与形態は、例えば、水性および非水系のゲル、クリーム、多重エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水溶液および非水溶液、ローション、エアロゾル、皮膚パッチ、炭化水素基剤および粉末からなり得、賦形剤（例えば、可溶化剤、透過促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン））を含み得る。１つの実施形態において、薬学的に許容可能なキャリアは、リポソームまたは経皮促進剤である。
【０１０７】
本発明の局所用処方物は、皮膚科学的に許容可能なキャリア、例えば、それらの成分の許容可能な適用または皮膚による吸収によってその処方物の他の成分を皮膚に送達することができる物質を含み得る。そのキャリアは、代表的には、治療薬、および必要に応じて、１つ以上の賦形剤または他のビヒクル成分を溶解するかまたは分散する溶媒を含む。本発明の局所用処方物に従って有用なキャリアは、非限定的な例として、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、アクリレート共重合体、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油、バター、アロエ、タルク、植物の油、植物のジュース、植物の抽出物、植物の粉末、他の植物の誘導体、ラノリン、尿素、石油調製物、タール調製物、植物または動物の脂肪、植物または動物の油、石けん、トリグリセリドおよびケラチンが挙げられ得る。本発明の局所用処方物は、当該分野において周知の方法、例えば、標準的な参照テキスト、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１５７７−１５９１，１６７２−１６７３，８６６−８８５（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．１９ｔｈ  ｅｄ．１９９５）；およびＧｈｏｓｈら、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９７）に提供されている方法に従って、本発明の化合物を局所用キャリアと混合することによって調製される。
【０１０８】
さらに、所望であれば、保湿剤もしくは湿潤剤、遮光剤、芳香、色素および／または増粘剤（例えば、パラフィン、ホホバ、ＰＡＢＡおよびろう）、界面活性物質、閉塞剤（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅｓ）、吸湿剤、乳化剤、軟化薬、脂質を含まないクレンザー（ｌｉｐｉｄ−ｆｒｅｅ  ｃｌｅａｎｓｅｒ）、酸化防止剤ならびに親油性剤が、本発明の局所用処方物に加えられ得る。
【０１０９】
本発明の局所用処方物は、皮膚上に残留したままであるように、および適用後すぐに洗浄されないように、設計され得る。あるいは、局所用処方物は、適用後、所与の長さの時間内に洗い流されるように設計され得る。
【０１１０】
送達方法
本発明の方法は、薬学的に許容可能な剤形における、任意の望ましい手段による、例えば、経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、消化器（ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｌｙ）、脊髄内、関節腔内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ）、関節内（ｉｎｔｒａ−ｊｏｉｎｔ）、皮下、頬側、膣、直腸、皮膚、経皮的、眼、耳、粘膜、鼻、気管、気管支、舌下、結節内にか、任意の非経口経路によるか、または吸入を介した、単独で、または組成物の形態での、治療薬の投与を含み得る。
【０１１１】
１つの実施形態において、治療薬は、その治療活性の部位、例えば、リンパ節に直接投与される。例えば、治療薬は、リンパ節に直接注射され得る。Ｔ細胞依存性の活性化のインヒビターの結節内注射に対する好ましいリンパ節は、鼠径部、腋下および頸部の領域に位置する主要なリンパ節である。別の実施形態では、治療薬は、その治療活性の部位に対して遠位に投与される。
【０１１２】
１つの実施形態において、治療薬は、局所的に投与される。ある特定のこれらの実施形態において、治療薬は、皮膚科学的状態を処置するために局所的に投与される。適用される局所用処方物の量は、例えば、最終的な組成物の意図される用法、すなわち、維持レジメンに対する治療レジメン、および処方物に対する個別の被験体の感度に依存するが、１つの実施形態において、本発明の局所用処方物は、罹患した身体部分に一定間隔で適用される。ある特定の実施形態において、組成物は、所望の効果が達成されるまで、処置の初期段階の間は、より頻繁に適用され、そして維持が望まれるようになると、より低い頻度で適用される。
【０１１３】
本発明の局所用処方物は、様々な方法によって適用され得る。１つの実施形態において、処方物は、炎症を起こしている皮膚の領域に適用される。次いで、その処方物が均等に分配されるかまたは消えるまで、その領域をマッサージするか、または擦る。このプロセスは、１日に１、２、３、４、５、６回またはそれ以上、繰り返され得る。別の方法では、局所用処方物は、皮膚パッチに適用され、次いで、それを皮膚の患部の上に３０分間から数時間、数日間、数週間またはそれ以上にわたって乗せる。別の実施形態では、本発明の局所用処方物は、イオン導入を用いて患部に送達される。この方法では、局所用処方物は、電極に接続された容器またはパッチに入れられている。次いで、その容器を患部の上に置き、電極を活性化させる。これにより電流が発生し、その電流が電気的な反発によって皮膚を通って局所用処方物を送達する。
【０１１４】
皮膚を通って本発明の局所用処方物を送達するための他の適当な方法としては、フォノフォレーシスおよびセロハン包装が挙げられる。フォノフォレーシスでは、まず、局所用処方物を皮膚上の患部に適用する。次いで、超音波装置を患部の上に置く。その装置は、いったん活性化されると、超音波エネルギーによって皮膚を通って処方物を送達する。セロハン包装では、処方物を患部に適用し、そして概ね数分から数時間、数日間、数週間または数カ月、セロハンフィルムで覆う。
【０１１５】
本発明の１つの実施形態において、本発明の１つ以上の作用物質は、送達用のナノ粒子にナノカプセル化される。ナノカプセル化材料は、生分解性であってもよいし、非分解性であってもよい。ナノカプセル化材料は、合成のポリマー、天然ポリマー、オリゴマーまたはモノマーから作製され得る。合成のポリマー、オリゴマーおよびモノマーとしては、ポリアルキレンオキシド前駆体分子（例えば、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびポリ（プロピレンオキシド）との共重合体（ＰＥＧ−ｃｏ−ＰＰＯ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチルオキサゾリン）（ＰＥＯＸ）、ポリアミノ酸およびプソイドポリアミノ酸（ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ））から得られるもの、ならびにこれらのポリマーの共重合体が挙げられる。Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１−５８７（１９９３）。結合体が水溶性であるならば、共重合体は、他の水溶性ポリマーまたは水不溶性ポリマーを用いても形成され得る。水溶性の結合体の例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ．ＴＭ．界面活性物質（ＢＡＳＦ）として市販されている、ポリエチレングリコールとポリプロピレンオキシドとのブロック共重合体である。
【０１１６】
天然のポリマー、オリゴマーおよびモノマーとしては、タンパク質、例えば、フィブリノゲン、フィブリン、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、ゼインおよびアルブミン（これらは、天然の供給源から生成されるか、組換えの供給源から生成されるかに関係ない）、および多糖、例えば、アガロース、アルギネート、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、キトサン、ジェランガム（ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍ）、キサンタンガム、グアーゴム、水溶性セルロース誘導体およびカラギーン（ｃａｒｒａｇｅｅｎ）が挙げられる。これらのポリマーは、利用することができるナノカプセル化材料の単なる例示的なタイプであって、封入が可能なすべてのナノカプセル化材料を表すと意図されない。
【０１１７】
「放出制御」とは、組成物または剤形からの薬などの作用物質の放出のことを指し、ここで、その作用物質は、長時間にわたって所望のプロファイルに従って放出される。放出制御プロファイルとしては、例えば、徐放、持続放出、パルス放出および遅延放出のプロファイルが挙げられる。放出制御組成物は、即時放出組成物とは対照的に、所定のプロファイルに従って長時間にわたる被験体への作用物質の送達を可能にする。そのような放出速度は、従来の迅速な放出剤形と比べて、長時間にわたって治療的に有効なレベルの作用物質を提供することができ、それにより、長期間の薬理学的または診断的な応答を提供することができる。そのようなより長い応答期間は、対応する短時間作用性の即時放出調製物によって達成されない多くの固有の利点を提供する。例えば、慢性疼痛の処置では、放出制御処方物が、従来の短時間作用性の処方物よりも非常に好ましいことが多い。
【０１１８】
放出制御の薬学的組成物および剤形は、作用物質（例えば、薬、薬物、活性な作用物質、診断用の作用物質、またはヒトを含む動物に内部的に投与される任意の物質）の送達プロファイルを改善するように設計される。代表的には、放出制御組成物を使用することにより、送達動態が最適化され、それにより、バイオアベイラビリティ、利便性および患者のコンプライアンスが上昇し、ならびに速い初期放出速度などの不適切な即時放出速度、および望まれない場合は不均等な血中レベルまたは組織内レベルに関連する副作用を最小にすることによって、投与される物質の効果が改善される。
【０１１９】
活性な化合物の放出制御をもたらす組成物の調製および使用の従来技術の教示は、投与後の薬の放出を延長するための様々な手法を提供する。当該分野で公知の例示的な放出制御処方物としては、特別にコーティングされた小丸剤、微小粒子、ナノ粒子、埋没物、錠剤、ミニ錠剤（ｍｉｎｉｔａｂｓ）およびカプセルが挙げられ、ここで、薬の放出制御は、例えば、調製物のコーティングの選択的な崩壊、コーティングを通る放出、薬の放出に影響する特殊なマトリックスとの混合、またはこれらの手法の組み合わせによってもたらされる。いくつかの放出制御処方物は、投与後の所定の期間において活性な化合物の単一用量のパルス放出をもたらす。
【０１２０】
１つの実施形態において、Ｔ細胞依存性の免疫応答を調節する少なくとも１つの作用物質を含む放出制御処方物は、特定の細胞型または組織に対して標的化される。これは、米国特許公開番号２００７／０１９０１６０に記載されているように、その処方物が標的細胞内などの所望の標的部位に曝露されるまで、それをインビボまたはインビトロ（例えば、細胞培養またはエキソビボ）において外側から介入される恐れがないように、例えば、標的薬／標的物質を放出制御処方物に結合することによって達成され得る。好ましい実施形態において、放出制御処方物は、被験体のリンパ節に対して標的化される。別の好ましい実施形態では、放出制御処方物は、移植片（例えば、移植された臓器）もしくは埋没物（例えば、生物学的材料を含む埋め込まれたデバイス）の部位に対して、またはそれらの近傍に対して、標的化される。
【０１２１】
本発明の方法は、様々な用量で治療薬を投与する工程を包含し得る。経口、肺および局所用の投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日（ｍｇ／ｋｇ／日）〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは、約０．１〜約５．０ｍｇ／ｋｇ／日に及び得る。例えば、経口投与の場合、組成物は、代表的には、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、好ましくは、約１ｍｇ〜約１００ｍｇの活性成分を含む。静脈内の場合、最も好ましい用量は、一定速度の注入における約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／時に及び得る。好都合なことに、治療薬は、単回の１日量として投与されてもよいし、１日の合計投薬量が、１日に２、３または４回の分割量として投与されてもよい。ある特定の実施形態において、作用物質は、当業者によって適当であると判断されるとき、１、２、３または４週間、２ヶ月、３ヶ月、１年、２年、数年またはそれ以上にわたって投与される。
【０１２２】
本発明の方法によって分化したおよび／または増大されたＴｒｅｇ細胞は、被験体における免疫機能の抑制に有用である。特に、自己細胞が、単離され得；インビトロにおいて改変、分化および／または増大され得；続いて、被験体に投与または再移植され得る。治療有効量のＴｒｅｇ細胞が、薬学的に許容可能なキャリアとともに投与され得る。投与経路としては、経口、直腸、膣、頬側、局所的、経鼻、皮膚、経皮的、気管、舌下、結節内、非経口、静脈内、腹腔内注射、鼻腔内吸入、肺吸入、皮下、眼（ｏｐｈｔｈａｍｌｉｃ）、粘膜、耳介、関節内および髄腔内の経路、ならびに消化管を介する（例えば、パイエル板を介する）経路を含むがこれらに限定されない任意の適当な手段が挙げられ得る。局所的な投与経路としては、関節内、筋肉内および髄腔内投与、ならびに膵臓に流れ出る脈管（例えば、前および後膵十二指腸動脈）を介する投与が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のＴｒｅｇ細胞、およびそれらの細胞を含む薬学的組成物は、筋肉内、腹腔内もしくは静脈内注射によって、または患者のリンパ節への直接的な注射によって、被験体に投与される。例示的な実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞は、炎症部位に局所的に投与される。選択される投与経路は、特定の処置に依存し得る。それらの細胞は、用量を設定するために、単回用量で、または選択された時間間隔における数回の用量で、投与され得る。ある特定の実施形態において、１０４／ｋｇ〜１０９／ｋｇの処理細胞、好ましくは、１０５／ｋｇ〜１０７／ｋｇの細胞、より好ましくは、約１０６／ｋｇの細胞が、被験体に投与される。それらの細胞は、１回で、または例えば、１２、２４、４８、７２または９６時間にわたって；例えば、１週間、１０日間、２週間、１ヶ月、３ヶ月もしくは６ヶ月という長期間にわたって；またはその投与が治療的に有益である限りずっと、投与され得る。
【０１２３】
移植の場合、Ｔｒｅｇ細胞は、レシピエント細胞を用いてアロ活性化され（ａｌｌｏａｃｔｉｖａｔｅｄ）得る。好ましい実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞は、移植手術より前に、インビトロにおいて分化し、そして／または増大され、移植片対宿主病を処置するためまたは予防するために、手術中に投与される。ある特定の実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞は、放出制御機構（例えば、人工的なゲルまたは凝固した血漿）を用いて投与される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞は、免疫応答を引き起こす事象（例えば、輸血または移植）を予想して被験体に投与される。この場合、制御性Ｔ細胞が、例えば、輸血の１週間前または６、５、４、３、２もしくは１日前または１２時間未満前、４時間未満前、または２時間未満前に、投与され得る。
【０１２５】
いずれにしても、医師、すなわち当業者は、個別の患者にとって最も適当である実際の投薬量を決定することができ、その投薬量は、投与経路、処置される状態のタイプおよび重症度、ならびに処置される特定の患者の種、年齢、体重、性別、腎機能、肝機能および応答によって変動する可能性がある。上述の投薬量は、平均的な場合の例であり；当然のことながら、より多いまたは少ない投薬量の範囲が正当である個別の場合が存在し得、そのような場合は、本発明の範囲内である。
【０１２６】
本発明がよりよく理解され得るように、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示のみの目的であって、いかなる様式においても本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１２７】
実施例１：ｃｒｔ−／−Ｔ細胞内の、ＥＲにおけるＣａ２＋の減少およびミトコンドリアのＣａ２＋取り込みの増加
以前の研究から、ＣＲＴの発現レベルが、ＥＲ内に貯蔵されているＣａ２＋の量と直接相関することが示されている（Ｐｉｎｔｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０：２６９０−２７０１（２００１）；Ａｒｎａｕｄｅａｕら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４６６９６−４６７０５（２００２））。本発明者らは、ＣＲＴが、オバルブミンペプチド３２３−３３９（ＯＶＡｐ）に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞クローンにおいて類似の機能を発揮するか否かを調査した。これらのクローンは、ｃｒｔ＋／＋またはｃｒｔ−／−のＤＯ．１１．１０ＴＣＲトランスジェニック胚由来の造血前駆細胞を用いて作製されたＦＬＣから得られた（Ｐｏｒｃｅｌｌｉｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：４６１−４７１（２００６））。細胞にＣａ２＋指示薬のＦｕｒａ−２を負荷し、細胞外カルシウムの非存在下において、筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）のインヒビターであるタプシガルジンを用いてその細胞を刺激した。ＥＲからの受動的なＣａ２＋漏出によってもたらされるゆっくりとしたサイトゾルＣａ２＋の増加の定量化によって、ｃｒｔ−／−細胞内のＥＲのＣａ２＋含有量がｃｒｔ＋／＋細胞と比べて２０％減少したことが示された（図２Ａ）。
【０１２８】
細胞を刺激した後のＣａ２＋の増加は、ミトコンドリアによって感知され、それにより、サイトゾルＣａ２＋を緩衝することによってＣａ２＋シグナル伝達が制御される（Ｒｉｚｚｕｔｏ  ａｎｄ  Ｐｏｚｚａｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８６：３６９−４０８（２００６））。本発明者らは、Ｔ細胞内のミトコンドリアのＣａ２＋取り込みがｃｒｔ欠失によって影響されるか否かを調べた。本発明者らは、Ｃａ２＋非含有培地中においてタプシガルジンを用いてＣａ２＋の貯蔵を枯渇させた後、０．５ｍＭ  Ｃａ２＋を加えることによって、ｃｒｔ−／−およびｃｒｔ＋／＋Ｔ細胞においてＣＣＥを誘導した。細胞外Ｃａ２＋を十分に洗い流した後、Ｃａ２＋イオノフォアのイオノマイシンを加えることにより、ＣＣＥ時にミトコンドリアに蓄積されていたＣａ２＋が放出された（Ｈｏｔｈら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３７：６３３−６４８（１９９７））。図１Ａは、Ｃａ２＋が、ｃｒｔ＋／＋細胞よりもｃｒｔ−／−細胞内に多く蓄積したが、ＣＣＥ中のサイトゾルのカルシウム増加の振幅は、これらの２つの細胞型において似ていたことを示している。０．５ｍＭ  Ｃａ２＋を加える前にイオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｉｎ）を加えた場合は、ｃｒｔ−／−Ｔ細胞とｃｒｔ＋／＋Ｔ細胞の間に差は観察されなかったことから（図示せず）、Ｃａ２＋が、ＣＣＥ中にミトコンドリア内に蓄積されたことが示唆される。このことから、ｃｒｔ−／−細胞における恒常的なミトコンドリアのＣａ２＋過負荷が排除される。Ｃａ２＋貯蔵が枯渇した後の細胞外カルシウム濃度の増加は、ｃｒｔ＋／＋においてミトコンドリアのカルシウム取り込みの増加と平行したが、ｃｒｔ−／−細胞では平行しなかった（図１Ｂ）。実際に、ミトコンドリアの緩衝作用は、ｃｒｔ−／−Ｔ細胞において０．５〜２ｍＭの細胞外Ｃａ２＋の範囲内で一定のままだった。
【０１２９】
ミトコンドリアのＣａ２＋緩衝作用は、チャネルの開口部付近におけるＣａ２＋イオンを枯渇させることによって、ＣＲＡＣチャネルのＣａ２＋依存性の不活性化に影響を及ぼす（Ｇｉｌａｂｅｒｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０：２６７２−２６７９（２００１）；Ｈｏｔｈら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１０６０７−１０６１２（２０００）；およびＧｉｌａｂｅｒｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １９：６４０１−６４０７（２０００））。本発明者らは、この特性を利用することにより、ミトコンドリアのＣａ２＋取り込みがｃｒｔ−／−Ｔ細胞において増強されるかをさらに確認した。本発明者らは、Ｃａ２＋非含有培地中においてＦｕｒａ−２負荷細胞のタプシガルジン感受性の貯蔵を枯渇させ、そしてそれらの細胞を０．５ｍＭ  Ｃａ２＋の２回の連続的な添加に供した（図１Ｃおよび図２Ｃ）。サイトゾルのＣａ２＋増加の速度は、ＣＲＡＣチャネルの活性に依存するので、細胞外Ｃａ２＋の１回目および２回目の添加においてこのパラメータを定量化することによって、ＣＲＡＣチャネルのＣａ２＋依存性の不活性化の程度を推定することが可能になる（Ｈｏｔｈら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３７：６３３−６４８（１９９７））。ｃｒｔ＋／＋細胞において、本発明者らは、２回目に細胞外Ｃａ２＋を加えたときのＣＲＡＣ活性の５７％の減少を算出した。しかしながら、ｃｒｔ−／−細胞では、２回目に細胞外カルシウムを加えたとき、ＣＲＡＣチャネルは、たった１４％の不活性化しか示さなかったことから（図１Ｃ）、ＣＲＡＣチャネルのＣａ２＋依存性の不活性化がｃｒｔ−／−細胞において減少したことが証明される。この現象に対するミトコンドリアの寄与を確認するために、本発明者らは、ミトコンドリアの脱共役剤であるＣＣＣＰの存在下において同じ実験を繰り返した。ミトコンドリアのカルシウム取り込みが阻害されたとき、ＣＲＡＣチャネルのＣａ２＋依存性の不活性化は、ｃｒｔ−／−細胞とｃｒｔ＋／＋細胞の両方において同程度だった（図１Ｄ）。
【０１３０】
ノルアクリジンオレンジ（ｎｏｒａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ）で染色された細胞のＦＡＣＳ解析によるミトコンドリアの質量の測定から、ｃｒｔ−／−細胞とｃｒｔ＋／＋細胞の間に差がないことが明らかになった（図示せず）。同様に、蛍光色素のＴＭＲＭ（電圧依存的様式でミトコンドリア内に保持される）で染色された細胞のＦＡＣＳ解析によって測定されたミトコンドリアの膜電位から、ｃｒｔ−／−細胞とｃｒｔ＋／＋細胞との間の差は明らかにならなかった（図２Ｂ）。したがって、ｃｒｔ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高いミトコンドリアのＣａ２＋緩衝作用能力とともに、ＥＲにおいて低いＣａ２＋貯蔵能を有し、これにより、より遅いＣａ２＋依存性のＣＲＡＣ不活性化がもたらされる。
【０１３１】
実施例２：ｃｒｔ−／−Ｔ細胞におけるＡＴＰ産生の増加
ミトコンドリアのＣａ２＋取り込みの別の重要な結果は、ＡＴＰ合成の改善を伴うミトコンドリアの代謝活性の刺激である（Ｊｏｕａｖｉｌｌｅら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：１３８０７−１３８１２（１９９９）；Ｈａｊｎｏｃｚｋｙら、Ｃｅｌｌ  ８２：４１５−４２４（１９９５））。それゆえ、ｃｒｔ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原活性化によって誘導されるＣＣＥは、ｃｒｔ＋／＋細胞よりも多いＡＴＰ産生と関係し得る。実際に、エキソビボにおいて単離されたナイーブ（図３Ａ）およびエフェクター／記憶（図示せず）ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激した後、本発明者らは、ｃｒｔ＋／＋細胞に対してｃｒｔ−／−においてより高いＡＴＰレベルを検出した。活性化によって誘導されたＡＴＰ合成が、オリゴマイシンでの処理によって無効になったので、それはミトコンドリアの呼吸に起因するものだった（図３Ｂ）。
【０１３２】
サイトゾルのカルシウム増加の結果としてのＡＴＰ産生は、細胞活性化中の細胞のエネルギー要求を賄うと考えられる。さらに、ＡＴＰによるプリン作動性レセプターの刺激は、Ｔ細胞の分裂促進的な刺激に関与すると考えられる（Ｂａｒｉｃｏｒｄｉら、Ｂｌｏｏｄ  ８７：６８２−６９０（１９９６））。ＡＴＰは、分泌顆粒内またはサイトゾル内に貯蔵され得る。Ｔ細胞におけるＡＴＰの細胞内分布を解析するために、本発明者らは、培養液中で３０分間、エキソビボにおいて精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を４ｎＭキナクリンとともにインキュベートした。この蛍光性化合物は、高親和性でヌクレオチドに結合するものであり、ＡＴＰ含有ベシクルを可視化するために使用される（Ｂｅｌａｉ  ａｎｄ  Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １１：５−８（２０００））。図３Ｄに示されるように、キナクリン染色によって、分泌顆粒を暗示する小胞の染色のいかなる証拠も無く、均質なサイトゾル分布が示された。Ｔ細胞におけるＡＴＰの独占的なサイトゾルの局在化をさらに確認するために、本発明者らは、連続的なスクロース勾配においてＴ細胞可溶化物を分画した。生物発光アッセイ（Ｌｙｍａｎ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｖｉｎｃｅｎｚｏ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：４３５−４４３（１９６７））を用いて、その勾配画分をＡＴＰの存在について解析した。キナクリンの分布と一致して、本発明者らは、ウエスタンブロット解析におけるＺａｐ７０の存在によって定義されるサイトゾルに対応する画分中にだけ、検出可能な量のＡＴＰを見出した。興味深いことに、分画する前のＣＤ３抗体によるＴ細胞刺激によって、サイトゾル画分中に多くのＡＴＰが回収された（図３Ｅ）。これらの結果から、活性化されたＴ細胞からの制御されたＡＴＰの分泌放出が排除され、また、ＡＴＰが、コネキシン／パネキシンヘミチャネルまたはＰ２Ｘ７プリン作動性レセプターを通って放出され得ることが示唆される。
【０１３３】
細胞外ＡＴＰは、膜メタロプロテアーゼを活性化することによって、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の脱落を引き起こすと示されている。この脱落は、Ｐ２ＸレセプターアンタゴニストであるｏＡＴＰによって阻害されると考えられる（Ｇｕら、Ｂｌｏｏｄ  ９２：９４６−９５１（１９９８））。ＣＤ４ナイーブＴ細胞のインビトロにおけるＴ細胞活性化は、ＣＤ６２Ｌの脱落を引き起こし、ＣＤ６２Ｌは、ＴＣＲトリガリングの後、次第に再発現される。ｃｒｔ−／−Ｔ細胞において、活性化後のＣＤ６２Ｌの再発現が、野生型細胞に対して損なわれたことから、より高い細胞周囲のＡＴＰ濃度の存在が示唆される。実際に、ｏＡＴＰを培養物に加えることによって、ｃｒｔ−／−細胞と野生型細胞の両方において高いおよび同一の再発現効率がもたらされた（図３Ｃ）。したがって、ＣＤ６２Ｌ陰性細胞が、ｃｒｔ−／−ＦＬＣの末梢リンパ系器官において著しく増加する（Ｐｏｒｃｅｌｌｉｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：４６１−４７１（２００６））。
【０１３４】
実施例３：Ｐ２Ｘレセプターのオートクライン活性化によるｃｒｔ−／−Ｔ細胞における遅延性ＭＡＰＫ活性化
ＡＴＰは、共刺激物質としてＴ細胞の分裂促進的な応答に関与すると示唆されている（Ｂａｒｉｃｏｒｄｉら、Ｂｌｏｏｄ  ８７：６８２−６９０（１９９６））。それゆえ、本発明者らは、ｃｒｔ−／−Ｔ細胞の過反応性が、長期のＭＡＰキナーゼ活性化およびＮＦＡＴ核移行をもたらす、抗原と遭遇したときのＡＴＰの産生および放出の増加に起因し得るという仮説を立てた（Ｐｏｒｃｅｌｌｉｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：４６１−４７１（２００６））。Ｔ細胞における潜在的なオートクラインＡＴＰシグナル伝達を理解するために、まず、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞クローンによって発現されているプリン作動性レセプターの組成を測定した。Ｐ２Ｘ１、４および７が、Ｐ２Ｙ１、１２、１３および１４と共に同時発現していると見出された（図４Ａ）。細胞外の培地中にＣａ２＋が存在するとき、１ｍＭ  ＡＴＰでの刺激によって、それらの細胞の５２％においてカルシウムが増加した。ＡＴＰは、細胞外Ｃａ２＋の非存在下において適用されるとき、ＥＲ貯蔵からのＩＰ３媒介性のＣａ２＋放出に起因して、中程度のサイトゾルのカルシウム増加も引き起こしたことから、代謝型（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｈｉｃ）Ｐ２Ｙレセプターの存在が確認された（図４Ｂ）。Ｐ２Ｘサブタイプを好むアゴニストを用いて、本発明者らは、それらの細胞の１８％が、Ｐ２Ｘ１および３に特異的なアゴニストであるαβＭｅＡＴＰによる刺激の後に活性化されること、それらの細胞の３５％が、Ｐ２Ｘアゴニスト（ａｇｏｉｎｓｔ）であるＭｅＳＡＴＰに対して応答性であり、３３％が、Ｐ２Ｘ７特異的アゴニストであるＢｚＡＴＰに対して応答したことを見出した（図４Ｃ）。それらの細胞の３１％が、Ｐ２Ｙ１、１２および１３を活性化する２ＭｅＳＡＤＰに対して応答し、３６％が、Ｐ２Ｙ１４アゴニストのＵＤＰ−グルコースに対して応答性だった（図４Ｄ）。それゆえ、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されたＰ２レセプターサブタイプもまた、培養されたＤＯ１１．１０Ｔ細胞クローンにおいて機能的に適格であった。
【０１３５】
ｃｒｔ−／−Ｔ細胞におけるより高い活性依存性のＡＴＰ合成と仮定して、本発明者らは、Ｐ２レセプターのオートクライン活性化がＴ細胞の過反応性において役割を果たし得るか否かを、ｃｒｔ−／−Ｔ細胞において長期のＭＡＰＫ活性化を解析することによって調査した。この目的を達成するために、ｃｒｔ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｃａ２＋で刺激されたミトコンドリアのＡＴＰ合成を阻害するオリゴマイシン、非特異的なＰ２レセプターアンタゴニストとしてのＰＰＡＤＳ、またはＰ２Ｘ７レセプターを優先的に阻害するｏＡＴＰの存在下において、ＣＤ３抗体で１６時間刺激した。無処理細胞において検出されたＭＡＰＫの長期の活性化は、様々な薬理学的物質によってほぼ完全に無くなった（図５Ｂ）。しかしながら、同じ処理は、ＮＦＡＴ１の核移行に有意に影響しなかった（図示せず）。処理された細胞のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって、無処理の対応物とのいかなる差異も明らかにされなかったので（図示せず）、オリゴマイシン、ＰＰＡＤＳまたはｏＡＴＰを用いて処理した後のＭＡＰＫ活性化の低下は、毒性に起因する細胞の損傷によって引き起こされたものではなかった。これらの結果から、Ｔ細胞シグナル伝達における、活性化によって誘導されるＡＴＰの合成および放出に対する共刺激の役割が示唆される。この仮説をさらに確認するために、本発明者らは、ＣＤ３抗体による刺激時におけるＥＲＫ活性化を追跡した。図５Ａの１つ目のパネルに示されているように、ＥＲＫ活性化は、ＣＤ３刺激のおよそ１．５時間後にピークに達し、３．５時間後に一過性に減少して、５．５〜７．５時間後に高レベルに戻る。ＴＣＲ依存性ＥＲＫ活性化とＴＣＲ非依存性ＥＲＫ活性化とを識別するために、ＴＣＲ依存性のｌｃｋ／ｆｙｎ  ｓｒｃ様キナーゼ活性を阻害するチロシンキナーゼインヒビターＰＰ２を用いてＣＤ３活性化の３０分後にＴＣＲシグナル伝達を遮断した。図５Ａの２つ目のパネルに示されているように、ＰＰ２処理が、ＺＡＰ−７０のＴＣＲ依存性のリン酸化に影響したのに対し、より後の時点においてＥＲＫリン酸化には有意に影響しなかったことから、ＥＲＫ活性化が、ＴＣＲシグナル伝達とは独立して維持され得ることが示唆される。しかしながら、ＰＰ２がＰＰＡＤＳ（図示せず）またはｏＡＴＰ（図５Ａ）と組み合わせて加えられるとき、ＥＲＫリン酸化の著しい阻害が観察された。したがって、本発明者らは、ＰＰ２が、エクト−ＡＴＰアーゼのインヒビターであるＡＲＬ６７１５６（細胞外の培地中におけるＡＴＰの半減期を延長する）と併用されるとき、ＥＲＫ活性の増加を見出した。これらの結果から、Ｔ細胞活性化を持続する際のＰ２Ｘレセプター依存性のシグナル伝達の重要な役割が暗示される。
【０１３６】
実施例４：細胞外ＡＴＰに対するＩＬ−２発現およびＴ細胞増殖の依存
Ｔ細胞活性化の後期におけるＥＲＫのリン酸化は、ＩＬ−２発現にとって決定的な役割を果たすと示されている（Ｋｏｉｋｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：１５６８５−１５６９２（２００３））。それゆえ、本発明者らは、ｏＡＴＰの存在下におけるＴ細胞刺激がＩＬ−２発現を阻害し得ると推論した。実際に、エキソビボにおいて単離されたナイーブ（図６Ｂ）ならびにエフェクター／記憶（図示せず）ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ｏＡＴＰの存在下において、プレートに結合したＣＤ３およびＣＤ２８ｍＡｂで刺激することにより、無処理の細胞に対して、細胞培養上清中のＩＬ−２が有意に減少した。ＰＰＡＤＳで処理することにより、類似の阻害が観察された。ＭＡＰＫ活性化における仮定されたＡＴＰの役割と一致して、ｏＡＴＰおよびＰＰＡＤＳに依存性のＩＬ−２発現の阻害は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化するホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）の同時の添加によってレスキューされた（図６Ｂ）。末梢血Ｔ細胞増殖に対するｏＡＴＰの阻害性の効果が、報告されている（Ｂａｒｉｃｏｒｄｉら、Ｂｌｏｏｄ  ８７：６８２−６９０（１９９６））。図６Ａに示されているように、ｏＡＴＰは、プレートに結合したＣＤ３およびＣＤ２８ｍＡｂで刺激されたナイーブＣＤ４Ｔ細胞におけるＣＦＳＥの低下として測定されるＴ細胞増殖をほぼ完全に阻害した。この阻害は、２５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を加えることによって部分的にレスキューされ、ＰＭＡを加えることによって完全に復帰した。それゆえ、本発明者らは、活性化されたＴ細胞から放出されるＡＴＰが、増殖性Ｔ細胞の活性化において不可欠な役割を果たすオートクラインループの一部であると仮説を立てる。
【０１３７】
イオノマイシン処理によって得ることができる、同時に生じるＭＡＰＫ活性化なしのＮＦＡＴ核移行が、Ｔ細胞アネルギーに導く転写プログラムを実行する（Ｍａｃｉａｎら、Ｃｅｌｌ  １０９：７１９−７３１（２００２））。顕著なＭＡＰＫ阻害にもかかわらず、ｏＡＴＰは、ＮＦＡＴ核移行に影響しなかった。次いで、本発明者らは、ｏＡＴＰの存在下におけるＴ細胞の活性化が、Ｔ細胞アネルギーを誘導し得ると仮説を立てた。アネルギー誘導後の早い時点でＴＣＲシグナル伝達の低下を示す以前の結果と一致して、本発明者らは、ｏＡＴＰの存在下において予め刺激されたＴ細胞のカルシウムイメージング実験において応答性の低下を見出した。イオノマイシンで処理された細胞を用いて、同様の結果が観察された（図６Ｄ）（Ｈｅｉｓｓｍｅｙｅｒら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５：２５５−２６５（２００４）もまた参照のこと）。ＦＡＣＳ解析によって測定したところ、ｏＡＴＰの効果は、細胞表面におけるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の代謝回転の変化に起因しなかった（データ示さず）。ｏＡＴＰの存在下におけるＴ細胞刺激がアネルギー関連遺伝子をアップレギュレートし得ることを確認するために、本発明者らは、アネルギー誘導時に特異的に誘導される２つの転写因子であるＥｇｒ２およびＥｇｒ３のリアルタイムＰＣＲ解析を行った（Ｓａｆｆｏｒｄら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：４７２−４８０（２００５））。図６Ｃは、ｏＡＴＰを培養物に加えたとき、Ｔ細胞活性化後の早い（２時間）および遅い（１６時間）時点におけるＥｇｒ２転写物とＥｇｒ３転写物の両方の有意なアップレギュレーションを示している。ＭＡＰＫ活性化の不足を克服するＰＭＡをｏＡＴＰと共に加えることにより、Ｅｇｒ２およびＥｇｒ３の転写が強く低下した。これらの結果から、Ｔ細胞活性化時のＰ２Ｘシグナル伝達の不足が、ＭＡＰＫ活性化を鈍らせ、アネルギーに特徴的な転写プログラムを実行することが示唆される。
【０１３８】
実施例５：Ｔ細胞媒介性炎症におけるｏＡＴＰの効果
本発明者らは、Ｔ細胞媒介性炎症を制限する薬理学的物質として可能性のあるｏＡＴＰの用途を探求した。ラットインスリンプロモーター（ＩＮＳ−ＨＡ）の支配下においてインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）を発現するＲＡＧ−２−／−マウスに、ＨＡ特異的トランスジェニックＴＣＲ６．５（ＴＣＲ−ＨＡ）ＣＤ４細胞を養子移入することによって、膵島炎および糖尿病の迅速な発症が惹起される。本発明者らは、再構成の後、１〜１０日目に１日２回、静脈内および腹腔内注射によってＰＢＳ（ネガティブコントロール）またはｏＡＴＰでマウスを処置した。ｏＡＴＰ処置マウスの１２日目の血糖は、正常だったのに対し、無処置マウスとＰＢＳ処置マウスの両方が、重篤な高血糖症を示した（図７Ａ）。ｏＡＴＰ処置マウスの膵臓に、関連性のある病理所見は存在しなかった。対照的に、膵島に置き換わる多巣性から癒着性の炎症性病変が、ＰＢＳ処置動物において検出された（図７Ｂ）。養子移入されたマウスのＴＣＲ−ＨＡ＋細胞は、脾臓において有意に減少し（図７Ｃ）、ｏＡＴＰ処置動物の膵臓ではかろうじて検出可能だった（図７Ｄ）。さらに、ＰＢＳ処置マウスの膵臓では、ほとんどのトランスジェニックＴ細胞が活性化され、ＣＤ６９を発現したのに対し、ｏＡＴＰ処置動物の膵臓では、ＣＤ６９＋細胞は、検出不可能だった（図７Ｄ）。ＨＡ１１０−１２０ペプチドでパルスされた脾細胞のエキソビボ培養、ならびにＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αについての培養上清の解析から、ＰＢＳ処置コントロール群と比べて、ｏＡＴＰ処置マウスからの培養物中の細胞１個あたりのこれらのサイトカインの有意な減少が明らかになった（図７Ｅ）。
【０１３９】
Ｔ細胞媒介性炎症の非トランスジェニックモデルにおいてｏＡＴＰを試験するために、本発明者らは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を注射することによって、Ｔリンパ球減少性のｃｄ３ε−／−マウスにおいて炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を誘導した。健常なコントロールとして、本発明者らは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含むＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞とともにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を注射されたｃｄ３ε−／−マウスを用いた。実際に、制御性リンパ球および免疫抑制的サイトカインによる活発な抑制が、粘膜免疫および器官の完全性を支配すると示された。細胞移入後の１５日目に開始して、ＩＢＤ群に、ＰＢＳまたはｏＡＴＰの静脈内注射を毎日行った。再構成の５週間後における肉眼での腸の解析から、ＣＤ４＋細胞を養子移入されたマウスおよびＰＢＳを注射されたマウスにおける腸壁の肥厚および糞便の非形成または非存在が明らかになった。この表現型は、ｏＡＴＰ処置動物では有意に回復し；さらに、脾臓および腸間膜リンパ節は、正常なサイズだった（図８Ａ）。ｏＡＴＰ処置マウスの炎症スコアは、ＣＤ４＋およびＴｒｅｇ細胞を注射された動物と有意に異ならなかった（図８Ｂ）。著しいことに、ｏＡＴＰ処置マウスの腸間膜リンパ節および脾臓におけるＣＤ４＋エフェクター／記憶サブセット（ＣＤ４４＋６２Ｌ−）およびＣＤ６９＋細胞の細胞性ならびに提示は、健常なコントロールと区別がつかなかった（図８Ｄ、Ｆ）。さらに、ｏＡＴＰは、炎症性サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）分泌細胞の数を有意に減少させた。興味深いことに、重篤な腸管の炎症を惹起する際にＩＦＮ−γ産生細胞と相乗作用を示すと最近示されたＩＬ−１７分泌細胞（Ｋｕｌｌｂｅｒｇら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：２４８５−２４９４（２００６））の数は、ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋Ｔ細胞が注射されたコントロールマウスにおける数と類似していた（図８Ｅ）。要するに、これらの結果は、ｏＡＴＰによるＰ２Ｘレセプターの阻害が、Ｔ細胞の活性化、増殖ならびにエフェクター機能を減衰させ、Ｔ細胞依存性炎症において組織損傷を阻害するという見解を強く支持している。
【０１４０】
実施例６：Ｔ細胞媒介性炎症におけるＰＸ１０投与の効果
本発明者らの結果は、Ｔ細胞内のＡＴＰ放出におけるパネキシンヘミチャネルに対する役割を指摘するものである。この仮説をさらに試験するために、本発明者らは、パネキシンヘミチャネル構築の阻害が、ｏＡＴＰに匹敵するほどＴ細胞活性化を阻害し得るか否かを調べた。ＣＦＳＥを負荷されたヒトＴ細胞を、１００μＭ  ｏＡＴＰまたは２００μＭのＰＸ１０ペプチドの存在下において、プレートに結合した抗ＣＤ３／２８抗体で刺激した。４日後、増殖をＦＡＣＳ解析により測定した。ＰＸ１０ペプチドとｏＡＴＰの両方がＴ細胞増殖を強く阻害した（図９Ａ）。同じように、ＥＬＩＳＡアッセイによって検出したとき、ｏＡＴＰまたはＰＸ１０ペプチドの存在下におけるマウスＴ細胞の刺激が、ＩＬ−２分泌を強く阻害した（図９Ｂ）。
【０１４１】
最後に、本発明者らは、パネキシン媒介性のＡＴＰ放出を阻害することによって、Ｔ細胞活性化後にＡＴＰの急速な蓄積がもたらされ得るか否かを試験した。Ｔ細胞クローンを２００μＭ  ＰＸ１０とともに３０分間、プレインキュベートした。次いで、それらをビオチン化抗ＣＤ３抗体で刺激した後、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎｅ）を用いて架橋した。記載されている時点においてサンプルを回収し、界面活性剤で可溶化し、細胞のＡＴＰ含有量を測定する標準的なルシフェラーゼアッセイにおいて使用するまで凍結した。図１０に示されているように、ＰＸ１０は、ＡＴＰの迅速な細胞内増加をもたらしたので、パネキシンヘミチャネルが、Ｔ細胞における細胞外培地へのＡＴＰ放出に対して重要な経路であることが示唆される。
【０１４２】
実施例７：炎症性腸疾患を処置するためのｏＡＴＰの投与
炎症性腸疾患についてヒトを処置するために、１００μＭという局所濃度に達するようにｏＡＴＰが静脈内に投与され得る。ｏＡＴＰは、数週間、数ヶ月間もしくは数年間にわたって、またはｏＡＴＰ処置が患者に治療効果をもたらす限りずっと、１日に１回または数回投与され得る。これは、症状（例えば、腸壁の肥厚および糞便の非形成または非存在、ならびに炎症性サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γＴＮＦ−αおよびＩＬ−１７）分泌細胞の数の減少）を回復させると予想される。
【０１４３】
実施例８：糖尿病を処置するためのｏＡＴＰの投与
糖尿病についてヒトを処置するために、１００μＭという局所濃度に達するように、静脈内および／または腹腔内注射によってｏＡＴＰが投与され得る。ｏＡＴＰは、数週間、数ヶ月間もしくは数年間にわたって、またはｏＡＴＰ処置が患者に治療効果をもたらす限りずっと、１日に１回または数回投与され得る。ｏＡＴＰ処置は、血糖レベルを正常化するのを助けると予想される。
【０１４４】
実施例９：移植片拒絶を抑制するためのｏＡＴＰの投与
糖尿病を有する患者は、島細胞を含むデバイスを埋め込まれる。好ましくは、その島は、同種異系または同系である。１００μＭという局所濃度に達するように、移植部位の近傍、近辺または周囲におけるリンパ節に対してｏＡＴＰが結節内に投与される。
【０１４５】
移植後、患者の血糖値を毎日モニターする。血糖値の制御は、デバイスの埋め込みおよびｏＡＴＰ投与において改善すると予想される。ｏＡＴＰは、数週間、数ヶ月間もしくは数年間にわたって、またはｏＡＴＰ処置が患者に治療効果をもたらす限りずっと、１日に１回または数回投与され得る。
【０１４６】
実施例１０：ｏＡＴＰによるＴｒｅｇ細胞の分化および増大
選別されたナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（１０５個）を、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体を含み、１００μＭ  ｏＡＴＰおよび５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２が補充された培地中において、Ｔ細胞が枯渇され照射された（５０Ｇｙ）２．５×１０５個の脾細胞とともに培養した。培養の２〜６日後、細胞を洗浄し、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む培地に再懸濁した。培養の７〜１０日後にフローサイトメトリーによってＴｒｅｇ細胞産生を解析した。１００μＭのｏＡＴＰの存在下におけるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激によって、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージが有意に増加した（図１１Ａ）。抗ＣＤ３刺激後の最初の６日間において、Ｔｈ１（Ｔ−ｂｅｔ）、Ｔｈ１７（ＲＯＲγＴ）およびＴｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３）系列に対する主要な転写因子を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって解析することにより、無処理培養物におけるＴ−ｂｅｔの漸進的なアップレギュレーションとは対照的に、ｏＡＴＰの存在下におけるＦｏｘｐ３の漸進的なアップレギュレーションが明らかになった。さらに、１００μＭのｏＡＴＰがその培養液に加えられたとき、同じ条件下における天然のＴｒｅｇ細胞を含む選別されたＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞の刺激によって、より高い発現レベルのＦｏｘｐ３を有するＴｒｅｇ細胞の増大が誘導された（図１１Ｂ）。
【０１４７】
１００μＭのｏＡＴＰによる処置は、Ｔｈ１７分化を阻害し、Ｆｏｘｐ３発現を促進する。定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、本発明者らは、１００μＭのｏＡＴＰが、Ｔｈ１７に偏った条件下において、抗ＣＤ３によって刺激されたＴ細胞においてＲＯＲγＴの発現を抑制しつつ、Ｆｏｘｐ３の発現を徐々に増加させたことを示した（例えば、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβおよび２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６；例えば、Ｂｅｔｔｅｌｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：２３５−２３８（２００６）もまた参照のこと）（図１２Ａ）。ＦＡＣＳ解析によってＦｏｘｐ３を発現しているＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞の絶対数は増加した（図１２Ｂ）。さらに、刺激後の、選別されたＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ天然Ｔｒｅｇ細胞のＴｈ１７系列への脱分化（Ｋｏｅｎｅｎら、Ｂｌｏｏｄ  １１２（６）：２３４０−２３５２（２００８））は、１００μＭのｏＡＴＰによって妨げられた（図１２Ｃ）。
【０１４８】
実施例１１：ｏＡＴＰで処置した際のＴｒｅｇ細胞による炎症性腸疾患の効率的な抑制
ＩＢＤのマウスモデルにおいて、炎症を管理するには不十分ないくつかのＴｒｅｇ細胞が、動物に養子移入されたとき、養子移入の１４日目に開始し、静脈内に投与される１００μｌの３ｍＭ  ｏＡＴＰによる毎日の処置によって、２８日目に測定されたＴｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３発現が増加した（図１３Ａ）。ｏＡＴＰ処置動物は、腸の炎症の徴候ならびに脾臓および腸間膜リンパ節のサイズの増加を示さず（図１３Ｂ）、腸間膜リンパ節におけるエフェクター／記憶Ｔ細胞の数の減少を示した（図１３Ｃ）。腸間膜リンパ節におけるＴｒｅｇ／ＥＭ細胞の比がｏＡＴＰ処置によって有意に変化しなかったので、ｏＡＴＰ投与後のより高いＦｏｘｐ３発現は、この設定におけるＴｒｅｇ細胞のより高い抑制性の活性を説明し得る（図１３Ｄ）。
【０１４９】
実施例１２：炎症性腸疾患のマウスモデルにおけるＴｒｅｇ細胞産生に対するｏＡＴＰの効果
本発明者らは、炎症性腸疾患のマウスモデルにおいて新しいＴｒｅｇ細胞の産生を観察した。このモデルは、内因性のＴ細胞区画を有しないＣＤ３ε−／−動物における、選別されたナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋）の養子移入に基づくものである。移入されたＴ細胞は、腸管内の細菌によって迅速に活性化されるので、同時移入される制御性Ｔ細胞によって活性化／増大が管理されない場合、４週間以内に大規模な腸の炎症がもたらされる。
【０１５０】
ＣＤ３ε−／−マウスの４つの実験群をＴｒｅｇ産生について試験した（図１４）。群（１）（ネガティブコントロール）には、２×１０５個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を養子移入した。群（２）には、１００μｌ中の３ｍＭ  ｏＡＴＰとともに２×１０５個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を養子移入した。群（３）には、２×１０５個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を養子移入し、養子移入の１６時間後に１００μｌ中の３ｍＭ  ｏＡＴＰでの最初の処置を行った。群（４）には、１０５個の天然Ｔｒｅｇ細胞とともに２×１０５個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を養子移入した（ポジティブコントロール）。群２および３には、２〜５日目および８〜１２日目に毎日、１００μｌ中の３ｍＭ  ｏＡＴＰを静脈内投与し、６および７日目にはｏＡＴＰ投与を行わなかった。マウスを２８日目に解析した。
【０１５１】
最後のｏＡＴＰ注射の１４日後に、それらの動物の結腸を炎症について評価した（図１５Ａ）。さらに、脾臓および腸間膜リンパ節（ＬＮ）（流入領域リンパ節として）を、ＣＤ４＋亜集団の存在について評価した。ＦＡＣＳ解析を行うことにより、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘｐ３制御性Ｔ細胞を同定した（図１５Ｂ）。エフェクター記憶Ｔ細胞をＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋と同定した。この実験モデルにおいて、腸間膜ＬＮにおけるＴｒｅｇとエフェクター記憶Ｔ細胞との比は、疾患の発症の予防にとって重大であるようにみえるが、脾臓ではそのようにみえない（図１５Ｃ）。さらに、ナイーブＴ細胞の最初の活性化の間にｏＡＴＰが存在するとき、ナイーブＴ細胞からのＴｒｅｇ産生は、最も効率的である。
【０１５２】
実施例１３：移植片拒絶または移植片対宿主病を処置するための、分化したおよび／または増大したＴｒｅｇ細胞の使用
移植手術の前に、レシピエント細胞を用いるアロ活性化によって、実施例１０に記載されたようにＴｒｅｇ細胞を分化し、増大する。次いで、生じたＴｒｅｇ細胞集団を、細胞の生存能および増殖不能、ならびに移植の部位および／または部位周辺における投与前の任意の夾雑物の存在について、手術前および／または手術時に試験する。必要であれば、投与が有益である限り、同様に分化し、増大したＴｒｅｇ細胞のその後の用量が被験体に投与される。
【０１５３】
実施例１４：ｏＡＴＰで処置する際のＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１マウスにおける糸球体腎炎の回復
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）またはそのマウスモデルＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１（Ａｎｄｒｅｗｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：１１９８−１２１５（１９７８））は、その後の高ガンマグロブリン血症、および免疫複合体の沈着によって引き起こされる器官損傷を伴う、ポリクローナルＢ細胞活性化を特徴とする慢性炎症性疾患である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、この疾患の発症および伝播において決定的な役割を果たすので、本発明者らは、ｏＡＴＰ処置が、疾患症状を回復させ得るか否かを解析した。２５週齢（ほとんどの動物がタンパク尿を示すとき）の雌ＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１マウスに、６週間にわたってＰＢＳまたはｏＡＴＰを静脈内に投与した（１００μｌ中３ｍＭ、５日間処置、２日間中断）。最初の処置の前およびｏＡＴＰ投与の３週間後に一定間隔で、タンパク尿値を測定した。ＰＢＳ処置動物の大部分が、タンパク尿値の漸進的な増加を示したのに対し、ｏＡＴＰ処置マウスでは、タンパク尿レベルは、処置前のレベルと同じままだった（図１６および図１７、上のパネル）。腎臓の病理組織学的なスコアリングは、ｏＡＴＰ処置動物において、糸球体増殖、リンパ単球性（ｌｙｍｐｈｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ）浸潤および免疫複合体沈着の有意な減少を示した（図１７、下のパネル）。さらに、ｏＡＴＰ投与は、脾臓およびリンパ節におけるエフェクター／記憶Ｔ細胞の数を有意に減少させた（図１８、上のパネル）。選別されたエフェクター／記憶Ｔ細胞の再刺激は、ｏＡＴＰ処置動物に由来する細胞におけるＩＬ−４およびＩＦＮγの分泌レベルを低下させた（１８．１６、下のパネル）。
【０１５４】
実施例１５：関節リウマチのマウスモデルに対するｏＡＴＰの効果
コラーゲン誘導関節炎の影響を受けやすいＤＢＡ／１マウスは、関節リウマチ（ＲＡ）のマウスモデルである（Ｓｔｕａｒｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：６７３−６８３（１９８２））。０．２ｍｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含むフロイント完全アジュバント中の２００μｇのウシＩＩ型コラーゲンから構成される０．２ｍｌのエマルジョンを尾の基部の皮内に注射することによって、ＤＢＡ／１マウスを免疫した（日数＝０）。一般に、この手順は、約１８〜２０日目から開始されて、１本以上の肢に影響する炎症徴候の出現をもたらす。
【０１５５】
１８日目から開始して、以下のとおり構成される臨床スコアを用いて、それらの動物を疾患の重症度について個別に類別した：
ａ）前足および後足の指における炎症の存在についての視覚的臨床スコア
０＝疾患の徴候なし
０．５＝１〜５本の指／足指が炎症の徴候を有する
１＝６〜１０本の指／足指が炎症の徴候を有する
１．５＝１１〜１５本の指／足指が炎症の徴候を有する
２＝１６〜２０本の指／足指が炎症の徴候を有する
ｂ）前足および後足における足の浮腫の存在についての臨床腫脹スコア。精密ノギスを用いて足の厚さについて前足および後足を毎日測定する。
前足：
０＝疾患の徴候なし（１．２９ｍｍまでの足の厚さ）
０．５＝１．３０〜１．４９ｍｍの足の厚さ
１＝１．５０〜１．８９ｍｍの足の厚さ
２＝１．９０〜２．２０ｍｍの足の厚さ
３＝＞２．２０ｍｍの足の厚さ
後足：
０＝疾患の徴候なし（１．９９ｍｍまでの足の厚さ）
０．５＝２．００〜２．１９ｍｍの足の厚さ
１＝２．２０〜２．５９ｍｍの足の厚さ
２＝２．６０〜３．００ｍｍの足の厚さ
３＝＞３．００ｍｍの足の厚さ
これらの２つの別個の臨床スコア（指および足における炎症の徴候についての）の合計から、総臨床スコアが求められる。ゆえに、動物１匹あたりの最大腫脹スコアは、１４である。
【０１５６】
少なくとも１．５という臨床スコアに達した免疫の１８〜２０日後にマウスを処置した。５日間処置、２日間中断および５日間処置という投薬スケジュールにおいて、０日目から開始し、合計１２日間にわたって、マウスにｏＡＴＰ（１００μｌ中の３ｍＭ）またはコントロールＰＢＳを静脈内に投与した。最初の臨床スコアからの平均値の変動を、ｏＡＴＰ処置群およびコントロール群について毎日評価した。それらのマウスを１３日目に屠殺した。最初の５日間の処置の後、ｏＡＴＰ処置群における臨床スコアの変動は、コントロール群における臨床スコア変動よりも一貫して低いままだった（図１９）。
【０１５７】
ｏＡＴＰ処置マウスおよびコントロールマウス由来のサンプルにおいて、ＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｕｒｏｐｅ，ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｒｗｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ製のマウスＩｇＧ抗ＩＩ型コラーゲンＥＬＩＳＡ  ｃａｔ．＃ＣＩＩＡＢ９６−Ｍを用いてＩＩ型コラーゲンＥＬＩＳＡを行った。ｏＡＴＰ処置は、コントロールマウスと比べて処置マウス内のコラーゲン特異的抗体の存在を減少させた（図２０）。
【０１５８】
実施例１６：ｏＡＴＰで処置された際のｃｒｔ−／−マウスにおける表現型の回復
リコンビナーゼ欠損Ｂａｌｂ／ｃマウスを、カルレティキュリン（ｃｒｔ）−／−および＋／＋Ｅ１３胚の胎児肝由来の造血前駆細胞で再構成した（図２１）。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を模倣する、得られたｃｒｔ−／−胎児肝キメラ（ＦＬＣ）の表現型（例えば、Ｐｏｒｃｅｌｌｉｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：４６１−４７１（２００６）参照）を、移入の８、１０および１２週間後に評価し、１２週間後のｃｒｔ＋／＋ＦＬＣの表現型と比較した。ｃｒｔ＋／＋ＦＬＣと比べると、ｃｒｔ−／−ＦＬＣは、脱毛症、眼瞼炎、猫背の姿勢および消耗症候群の進行性の悪化を示した（図２２）。皮膚のヘマトキシリンおよびエオシン染色から、炎症細胞が存在しなかったｃｒｔ＋／＋ＦＬＣとは対照的に、ｃｒｔ−／−ＦＬＣの皮膚では重篤な皮膚の顆粒球性の炎症性浸潤を示した（図２３）。
【０１５９】
ｃｒｔ＋／＋およびｃｒｔ−／−ＦＬＣに毎日、ＰＢＳまたは６ｍＭ  ｏＡＴＰ（１００μＬ）による静脈内処置を２週間行った。ｏＡＴＰでの処置によって、ｃｒｔ−／−マウスにおける眼瞼炎が劇的に回復した（図２４）。さらに、盲検様式で行われた皮膚バイオプシーの病理組織学的な評価から、ｏＡＴＰでの処置によって、ｃｒｔ−／−ＦＬＣにおける眼瞼炎（炎症と上皮過形成の両方）の組織学的な改善がもたらされたことが示された（図２５）。
【０１６０】
本明細書において引用されたすべての刊行物および特許出願は、各々個別の刊行物または特許出願が、参考として援用されると明確かつ個別に記載されるかのように、本明細書中で参考として援用される。
【図１４】
2011513403.tif 000003
【図２３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年11月5日(2010.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明のこれらおよび他の目的および利点は、添付の図面と併せて以下の本発明のより詳細な説明を考察することによって、より完全に理解され、認識されるだろう。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）  少なくとも１つのＴ細胞活性を阻害するための薬物を製造するための、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質の使用。
（項目２）  上記Ｔ細胞活性が：活性化、増殖、分化、生存、細胞溶解活性およびサイトカイン産生からなる群から選択される、項目１に記載の使用。
（項目３）  ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する上記作用物質が、Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストである、項目１に記載の使用。
（項目４）  上記作用物質が、ｏＡＴＰである、項目３に記載の使用。
（項目５）  ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する上記作用物質が、パネキシンヘミチャネルの機能を阻害する作用物質である、項目１に記載の使用。
（項目６）  上記作用物質が、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドである、項目５に記載の使用。
（項目７）  Ｔ細胞アネルギーを誘導するための薬物を製造するための、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質の使用。
（項目８）  上記作用物質が、ｏＡＴＰである、項目７に記載の使用。
（項目９）  Ｔ細胞アネルギーを誘導するための薬物を製造するための、パネキシンヘミチャネルの機能を阻害する作用物質の使用。
（項目１０）  上記作用物質が、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドである、項目９に記載の使用。
（項目１１）  上記Ｔ細胞が、ＩＬ−１７分泌Ｔ細胞である、項目１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
（項目１２）  細胞死または組織損傷を処置するための薬物を製造するための、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質の使用。
（項目１３）  免疫状態または炎症状態を処置するための薬物を製造するための、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質の使用。
（項目１４）  上記免疫状態または炎症状態が、Ｔリンパ球依存性の炎症状態である、項目１３に記載の使用。
（項目１５）  上記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチおよび乾癬から選択される、項目１４に記載の使用。
（項目１６）  上記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、移植片拒絶または移植片対宿主病である、項目１４に記載の使用。
（項目１７）  上記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、皮膚科学的状態である、項目１４に記載の使用。
（項目１８）  上記皮膚科学的状態が、乾癬、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、円形脱毛症、白斑、薬物関連皮疹、接触過敏症、エリテマトーデス、痘瘡状苔癬状粃糠疹、慢性苔癬状粃糠疹、湿疹および扁平苔癬から選択される、項目１７に記載の使用。
（項目１９）  上記薬物が、インビボ投与のために製剤化されている、項目１２〜１８のいずれか１項に記載の使用。
（項目２０）  上記作用物質が、ナノカプセルの中に封入されている、項目１９に記載の使用。
（項目２１）  上記薬物が、結節内投与のために製剤化されている、項目１９に記載の使用。
（項目２２）  上記薬物が、局所的投与のために製剤化されている、項目１９に記載の使用。
（項目２３）  哺乳動物の前駆細胞をＴｒｅｇ細胞に分化させることを促進するための薬物を製造するための、ｏＡＴＰを含む組成物の使用。
（項目２４）  ｏＡＴＰを含む上記組成物が：
（ａ）Ｔ細胞の一次刺激物質；
（ｂ）細胞成分；および
（ｃ）可溶性メディエーター
のうちの少なくとも１つをさらに含む、項目２３に記載の使用。
（項目２５）  上記Ｔ細胞の一次刺激物質が、Ｔ細胞レセプターに結合するリガンドおよびプロテインキナーゼＣアクチベーターから選択される１つ以上の作用物質を含む、項目２４に記載の使用。
（項目２６）  上記Ｔ細胞の一次刺激物質が、抗ＣＤ３抗体である、項目２５に記載の使用。
（項目２７）  上記細胞成分が、照射された脾細胞、動員された細胞産物、白血球フェレーシス細胞産物、腸骨稜細胞産物および／または椎体から選択される、項目２４に記載の使用。
（項目２８）  上記細胞成分が、照射された同系脾細胞である、項目２７に記載の使用。
（項目２９）  上記可溶性メディエーターが、レチノイン酸、ラパマイシン、５−アザシチジン、トリコスタチンＡ、アルファ１−抗トリプシン、ＴＧＦ−ベータ、インターロイキン（ＩＬ）−２）、ＣＤ８０、４−１ＢＢ、ＣＤ５２アゴニスト、ＣＤ２８抗体、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＯＸ−２、ＣＤ７０およびＣＤ８２から選択される、項目２４に記載の使用。
（項目３０）  上記組成物が、ｏＡＴＰ、Ｔ細胞の一次刺激物質および細胞成分を含む、項目２４に記載の使用。
（項目３１）  上記組成物が、ｏＡＴＰ、抗ＣＤ３抗体および照射された同系脾細胞を含む、項目３０に記載の使用。
（項目３２）  インビトロにおいて制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増大を促進するための方法であって、このＴｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３３）  ｏＡＴＰを含む上記組成物が：
（ａ）Ｔ細胞の一次刺激物質；
（ｂ）細胞成分；および
（ｃ）可溶性メディエーター
のうちの少なくとも１つをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）  上記Ｔ細胞の一次刺激物質が、Ｔ細胞レセプターに結合するリガンドおよびプロテインキナーゼＣアクチベーターから選択される１つ以上の作用物質を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）  上記Ｔ細胞の一次刺激物質が、抗ＣＤ３抗体である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）  上記細胞成分が、照射された脾細胞、動員された細胞産物、白血球フェレーシス細胞産物、腸骨稜細胞産物および／または椎体から選択される、項目３３に記載の方法。
（項目３７）  上記細胞成分が、照射された同系脾細胞である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）  上記可溶性メディエーターが、レチノイン酸、ラパマイシン、５−アザシチジン、トリコスタチンＡ、アルファ１−抗トリプシン、ＴＧＦ−ベータ、インターロイキン（ＩＬ）−２）、ＣＤ８０、４−１ＢＢ、ＣＤ５２アゴニスト、ＣＤ２８抗体、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＯＸ−２、ＣＤ７０およびＣＤ８２から選択される、項目３３に記載の方法。
（項目３９）  上記組成物が、ｏＡＴＰ、Ｔ細胞の一次刺激物質および細胞成分を含む、項目３３に記載の方法。
（項目４０）  上記組成物が、ｏＡＴＰ、抗ＣＤ３抗体および照射された同系脾細胞を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）  インビボにおいて制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増大を促進するための薬物を製造するための、ｏＡＴＰを含む組成物の使用。
（項目４２）  細胞死または組織損傷を処置するための薬物を製造するための、項目３２〜４１のいずれか１項に記載の増大されたＴｒｅｇ細胞の使用。
（項目４３）  免疫状態または炎症状態を処置するための薬物を製造するための、項目３２〜４１のいずれか１項に記載の増大されたＴｒｅｇ細胞の使用。
（項目４４）  上記免疫状態または炎症状態が、Ｔリンパ球依存性の炎症状態である、項目４３に記載の使用。
（項目４５）  上記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、マスト細胞の脱顆粒に関連する状態である、項目４４に記載の使用。
（項目４６）  マスト細胞の脱顆粒に関連する上記状態が、喘息、アレルギーおよびアナフィラキシーショックから選択される、項目４５に記載の使用。
（項目４７）  上記免疫状態または炎症状態が、自己免疫性状態、移植片拒絶または移植片対宿主病である、項目４３に記載の使用。
（項目４８）  Ｔｒｅｇ細胞を必要とする被験体を処置するための薬物を製造するための、項目３２〜４１のいずれか１項に記載の増大されたＴｒｅｇ細胞の使用。
（項目４９）  インビトロにおいてＴｒｅｇ細胞を非Ｔｒｅｇ細胞に変換することを阻害するための方法であって、このＴｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目５０）  上記非Ｔｒｅｇ細胞が、病原性Ｔ細胞である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）  上記病原性Ｔ細胞が、Ｔｈ１７細胞である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）  インビトロにおいて非Ｔｒｅｇ細胞をＴｒｅｇ細胞に変換するための方法であって、この非Ｔｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目５３）  上記非Ｔｒｅｇ細胞が、病原性Ｔ細胞である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）  上記病原性Ｔ細胞が、Ｔｈ１７細胞である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）  インビトロにおいてＴｒｅｇ細胞の活性を増強するための方法であって、このＴｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目５６）  上記活性が、免疫抑制性の活性である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）  インビボにおいてＴｒｅｇ細胞を非Ｔｒｅｇ細胞に変換することを阻害するための薬物を製造するための、ｏＡＴＰを含む組成物の使用。
（項目５８）  インビボにおいて非Ｔｒｅｇ細胞をＴｒｅｇ細胞に変換するための薬物を製造するための、ｏＡＴＰを含む組成物の使用。
（項目５９）  インビボにおけるＴｒｅｇ細胞の活性を増強するための薬物を製造するための、ｏＡＴＰを含む組成物の使用。
（項目６０）  上記ｏＡＴＰが、ナノカプセルの中に封入されている、項目５７〜５９のいずれか１項に記載の使用。
（項目６１）  上記被験体が、細胞死または組織損傷を有する、項目５７〜５９のいずれか１項に記載の使用。
（項目６２）  上記被験体が、免疫状態または炎症状態を有する、項目５７〜５９のいずれか１項に記載の使用。
（項目６３）  上記免疫状態または炎症状態が、自己免疫性状態、移植片拒絶または移植片対宿主病である、項目６２に記載の使用。
（項目６４）  上記免疫状態または炎症状態が、炎症性腸疾患である、項目６２に記載の使用。
（項目６５）  上記免疫状態または炎症状態が、Ｔリンパ球依存性の炎症状態である、項目６２に記載の使用。
（項目６６）  上記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、マスト細胞の脱顆粒に関連する状態である、項目６５に記載の使用。
（項目６７）  マスト細胞の脱顆粒に関連する上記状態が、喘息、アレルギーおよびアナフィラキシーショックから選択される、項目６６に記載の使用。
（項目６８）  上記薬物が、経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、消化器、脊髄内、関節腔内、関節内、皮下、頬側、膣、直腸、皮膚、経皮的、眼、耳、粘膜、鼻、気管、気管支、舌下、結節内にか、任意の非経口経路によってか、または吸入を介して、投与するために製剤化されている、項目１、７、９、１２、１３、２３、４１および５７〜５９のいずれか１項に記載の使用。
（項目６９）  上記薬物が、経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、消化器、脊髄内、関節腔内、関節内、皮下、頬側、膣、直腸、皮膚、経皮的、眼、耳、粘膜、鼻、気管、気管支、舌下、結節内にか、任意の非経口経路によってか、または吸入を介して、投与するために製剤化されている項目４８に記載の使用。
（項目７０）  少なくとも１つのＴ細胞活性を阻害するための方法であって、Ｔ細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質と接触させる工程を包含する、方法。
（項目７１）  Ｔ細胞アネルギーを誘導するための方法であって、Ｔ細胞を、パネキシンヘミチャネルの機能を阻害する作用物質と接触させる工程を包含する、方法。
（項目７２）  細胞死または組織損傷を処置するための方法であって、Ｔ細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質と接触させる工程を包含する、方法。
（項目７３）  免疫状態または炎症状態を処置するための方法であって、Ｔ細胞を、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する作用物質と接触させる工程を包含する、方法。
（項目７４）  哺乳動物の前駆細胞をＴｒｅｇ細胞に分化することを促進するための方法であって、Ｔｒｅｇ細胞に分化することができる細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目７５）  制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増大を促進するための方法であって、このＴｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目７６）  Ｔｒｅｇ細胞を非Ｔｒｅｇ細胞に変換することを阻害するための方法であって、このＴｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目７７）  非Ｔｒｅｇ細胞をＴｒｅｇ細胞に変換するための方法であって、この非Ｔｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目７８）  Ｔｒｅｇ細胞の活性を増強するための方法であって、このＴｒｅｇ細胞を、ｏＡＴＰを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔリンパ球依存性の免疫状態または炎症状態を処置するための薬物を製造するための、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害し、かつさらに以下：
ａ）Ｔ細胞アネルギーを誘導する、または
ｂ）パネキシンヘミチャネルの機能を阻害する
特性のうちの一方または両方を有する作用物質の使用。
【請求項２】
前記作用物質が、ｏＡＴＰまたは配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が、ＩＬ−１７分泌Ｔ細胞である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、移植片拒絶、移植片対宿主病または皮膚科学的状態から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記作用物質が、ナノカプセルの中に封入されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストならびに以下：
（ａ）Ｔ細胞レセプターに結合するリガンドまたはプロテインキナーゼＣアクチベーターから選択される１つ以上の作用物質を含む、Ｔ細胞の一次刺激物質；
（ｂ）照射された脾細胞、動員された細胞産物、白血球フェレーシス細胞産物、腸骨稜細胞産物および／または椎体から選択される、細胞成分；および
（ｃ）レチノイン酸、ラパマイシン、５−アザシチジン、トリコスタチンＡ、アルファ１−抗トリプシン、ＴＧＦ−ベータ、インターロイキン（ＩＬ）−２）、ＣＤ８０、４−１ＢＢ、ＣＤ５２アゴニスト、ＣＤ２８抗体、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＯＸ−２、ＣＤ７０およびＣＤ８２から選択される、可溶性メディエーター
のうちの少なくとも１つをさらに含む、組成物。
【請求項７】
前記Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストが、ｏＡＴＰである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストを含む組成物であって、該組成物は、Ｔｒｅｇ細胞に分化することが可能な細胞と接触させたときに、該組成物が、哺乳動物の前駆細胞をＴｒｅｇ細胞に分化させることを促進することを特徴とする、組成物。
【請求項９】
Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストを含む組成物であって、該組成物は、Ｔｒｅｇ細胞と接触させたときに、該組成物が、
（ａ）該Ｔｒｅｇ細胞の増大／分化を促進するか；
（ｂ）非Ｔｒｅｇ細胞への該Ｔｒｅｇ細胞の変換を阻害するか；または
（ｃ）該Ｔｒｅｇ細胞の活性を増強する、
ことを特徴する、組成物。
【請求項１０】
前記組成物が：
（ａ）Ｔ細胞の一次刺激物質；
（ｂ）細胞成分；および
（ｃ）可溶性メディエーター
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、以下：
（ａ）Ｔ細胞レセプターに結合するリガンドまたはプロテインキナーゼＣアクチベーターから選択される１つ以上の作用物質を含む、Ｔ細胞の一次刺激物質；
（ｂ）照射された脾細胞、動員された細胞産物、白血球フェレーシス細胞産物、腸骨稜細胞産物および／または椎体から選択される、細胞成分；および
（ｃ）レチノイン酸、ラパマイシン、５−アザシチジン、トリコスタチンＡ、アルファ１−抗トリプシン、ＴＧＦ−ベータ、インターロイキン（ＩＬ）−２）、ＣＤ８０、４−１ＢＢ、ＣＤ５２アゴニスト、ＣＤ２８抗体、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＯＸ−２、ＣＤ７０およびＣＤ８２から選択される、可溶性メディエーター
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストが、ｏＡＴＰである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストが、ナノカプセルの中に封入されている、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
インビボ投与のために処方される、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
ａ）Ｔｒｅｇ細胞を必要とする被験体；または
ｂ）被験体の免疫状態または炎症状態
を処置するためのものである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記免疫状態または炎症状態が、以下：
ａ）移植片拒絶；
ｂ）移植片対宿主病；
ｃ）炎症性腸疾患；
ｄ）Ｉ型糖尿病；
ｅ）多発性硬化症；
ｆ）関節リウマチ；
ｇ）乾癬、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚移植片対宿主病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、円形脱毛症、白斑、薬物関連皮疹、接触過敏症、エリテマトーデス、痘瘡状苔癬状粃糠疹、慢性苔癬状粃糠疹、湿疹および扁平苔癬から選択される、皮膚科学的状態；ならびに
ｈ）喘息、アレルギーおよびアナフィラキシーショックから選択される、マスト細胞の脱顆粒に関連する状態；
から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫状態または炎症状態が、Ｔリンパ球依存性の炎症状態である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｔリンパ球依存性の免疫状態または炎症状態を処置するための、ＡＴＰ媒介性Ｔ細胞活性化を阻害し、かつさらに以下：
ａ）Ｔ細胞アネルギーを誘導する、または
ｂ）パネキシンヘミチャネルの機能を阻害する
特性のうちの一方または両方を有する作用物質を含む組成物。
【請求項１９】
前記作用物質が、ｏＡＴＰまたは配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞が、ＩＬ−１７分泌Ｔ細胞である、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記Ｔリンパ球依存性の炎症状態が、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、関節リウマチ、移植片拒絶、移植片対宿主病または皮膚科学的状態から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記作用物質が、ナノカプセルの中に封入されている、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
インビトロで哺乳動物の前駆細胞をＴｒｅｇ細胞に分化することを促進するための方法であって、Ｔｒｅｇ細胞に分化することができる細胞を、Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストを含む組成物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２４】
インビトロでＴｒｅｇ細胞とＰ２Ｘレセプターアンタゴニストを含む組成物とを接触させる工程を含む方法であって、該組成物が、
（ａ）該Ｔｒｅｇ細胞の増大／分化を促進するか；
（ｂ）非Ｔｒｅｇ細胞への該Ｔｒｅｇ細胞の変換を阻害するか；または
（ｃ）該Ｔｒｅｇ細胞の活性を増強する、
方法。
【請求項２５】
前記Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストを含む組成物が：
（ａ）Ｔ細胞の一次刺激物質；
（ｂ）細胞成分；および
（ｃ）可溶性メディエーター
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、以下：
（ａ）Ｔ細胞レセプターに結合するリガンドまたはプロテインキナーゼＣアクチベーターから選択される１つ以上の作用物質を含む、Ｔ細胞の一次刺激物質；
（ｂ）照射された脾細胞、動員された細胞産物、白血球フェレーシス細胞産物、腸骨稜細胞産物および／または椎体から選択される、細胞成分；および
（ｃ）レチノイン酸、ラパマイシン、５−アザシチジン、トリコスタチンＡ、アルファ１−抗トリプシン、ＴＧＦ−ベータ、インターロイキン（ＩＬ）−２）、ＣＤ８０、４−１ＢＢ、ＣＤ５２アゴニスト、ＣＤ２８抗体、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、ＣＤ２、ＣＤ４０、ＣＤ８０／Ｂ７−１、ＣＤ８６／Ｂ７−２、ＯＸ−２、ＣＤ７０およびＣＤ８２から選択される、可溶性メディエーター
のうちの少なくとも１つを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストが、ｏＡＴＰである、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｐ２Ｘレセプターアンタゴニストが、ナノカプセルの中に封入されている、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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