(57)【要約】  本発明は、ヒト被験体における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）またはヒト被験体がＣＯＰＤを発症する危険性を診断するための方法に関し、以下の以下のステップを包含している：  −  ヒト被験体由来の試料を供与するステップ、  −  上記試料における、カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ−１８）、ヒストン群、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）、ヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）および／またはヒートショックプロテイン９０α（ＨＳＰ９０α）の量を決定するステップ、  −  ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量が、健康なヒト被験体におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量と比較して増加している場合に、ＣＯＰＤを診断するステップ、または  −  ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群および／またはＨＳＰ７０の量が、健康なヒト被験体におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群および／またはＨＳＰ７０の量と比較して減少している場合に、ＣＯＰＤを発症する危険性があると診断するステップ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験体における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）またはヒト被験体がＣＯＰＤを発症する危険性を診断するための方法であり、以下のステップを包含している方法：
−  ヒト被験体由来の試料を供与するステップ、
−  上記試料における、カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ−１８）、ヒストン群、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）、ヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）および／またはヒートショックプロテイン９０α（ＨＳＰ９０α）の量を決定するステップ、
−  ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量が、健康なヒト被験体におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量と比較して増加している場合に、ＣＯＰＤを診断するステップ、または
−  ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群および／またはＨＳＰ７０の量が、健康なヒト被験体におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群および／またはＨＳＰ７０の量と比較して減少している場合に、ＣＯＰＤを発症する危険性があると診断するステップ。
【請求項２】
さらにインターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）の量が決定され、
この場合、ＳＴ２の量が、健康なヒト被験体におけるＳＴ２の量と比較して増加しているときに、ＣＯＰＤであると診断されるか、または
ＳＴ２の量が、健康なヒト被験体におけるＳＴ２の量と比較して減少しているときに、ＣＯＰＤを発症する危険性があると診断されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記試料は、血液、血清または血漿であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびウエスタンブロットからなる群から選択される免疫学的検定によって、インターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）、カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ−１８）、ヒストン群、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）、ヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）および／またはヒートショックプロテイン９０α（ＨＳＰ９０α）の量が決定されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
健康なヒト被験体の血液試料におけるインターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）の量が、好ましくは５０〜１５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは６０〜１４０ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは７０〜１３０ｐｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サイトケラチン−１８の新たなエピトープＭ３０として測定される、健康なヒト被験体の血液試料におけるカスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ−１８）の量が、２００〜３５０Ｕ／ｌ、好ましくは２００〜３３０Ｕ／ｌ、より好ましくは２５０〜３００Ｕ／ｌの範囲であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
健康なヒト被験体の血液試料におけるヒストン群の量が、ＣＯＰＤに罹患しているヒト被験体の血液試料におけるヒストン群の量よりも、２０〜５０％少ない、好ましくは２５〜４０％少ないことを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
健康なヒト被験体の血液試料におけるヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）の量が、１５００〜２０００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは１６００〜２４００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは１７００〜２３００ｐｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
健康なヒト被験体の血液試料におけるヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）の量が、５０〜２００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは７０〜１９０ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは８０〜１８０ｐｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
健康なヒト被験体の血液試料におけるヒートショックプロテイン９０α（ＨＳＰ９０α）の量が、１０，０００〜１５，０００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは１１，０００〜１４，５００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは１２，０００〜１４，０００ｐｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
試料におけるインターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）、カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ−１８）、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量が、健康なヒト被験体におけるＳＴ２、ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰＯ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％増加している場合に、ＣＯＰＤであると診断されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
試料におけるインターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）、カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ−１８）、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量が、健康な被験体におけるＳＴ２、ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％減少している場合に、ＣＯＰＤを発症する危険性があると診断されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法
【請求項１３】
ヒト被験体において、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩとＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶとを識別するための方法であり、下記のステップを包含している方法：
−  ＣＯＰＤに罹患しているヒト被験体由来の試料を供与するステップ、
−  上記試料における、カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ-１８）、ヒストン群、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）および／またはヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）の量を決定するステップ、
−  ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたｃｃＣＫ−１８、ヒストン群および／またはＨＳＰ２７の量と比較して、ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、および／またはＨＳＰ２７の量が減少している場合、および／またはＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたＨＳＰ７０の量と比較して、ＨＳＰ７０の量が増加している場合に、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩであると診断するステップ、または、
−  ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたｃｃＣＫ−１８、ヒストン群および／またはＨＳＰ２７の量と比較して、ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群および／またはＨＳＰ２７の量が増加している場合、および／またはＣＯＰＤステージＩ／ＩＩに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたＨＳＰ７０の量と比較して、ＨＳＰ７０の量が減少している場合に、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶであると診断するステップ。
【請求項１４】
さらにインターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）の量が決定され、
この場合、ＳＴ２の量が、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたＳＴ２の量と比較して増加しているときに、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩであると診断されるか、または
ＳＴ２の量が、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたＳＴ２の量と比較して減少しているときに、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶであると診断されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト被験体における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の進行をモニタリングするための方法であり、以下のステップを包含している方法：
−  ヒト被験体由来の試料を供与するステップ、
−  上記試料におけるカスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ-１８）、ヒストン群、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）および／またはヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）の量を決定するステップ、
−  上記ヒト被験体の上記試料におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７および／またはＨＳＰ７０の量を、上記ヒト被験体の初期の試料において決定された上記ヒト被験体由来の試料におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７および／またはＨＳＰ７０の量と比較するステップ。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヒト被験体においてＣＯＰＤを診断するための方法に関する。
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患（慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））は、世界的に、主な死因の１つである。２０２０年に、虚血性の心疾患および脳血管の疾患は、世界の人口の中で、より高い死亡率を占めるだろう。罹患率および入院率は、過去数年にわたって劇的に傾斜している。全ての喫煙者がＣＯＰＤの臨床的な徴候を発現するわけではないが、いくつかの研究は、喫煙とＣＯＰＤの発症との間の強い相関関係を示している（Higenbottam T et al. (1980) Lancet 315:409-411）。発症機序は、気道の再構築と異常な炎症とによる気流の閉塞によって特徴付けられる。ＣＯＰＤは、慢性的な気管支炎と肺気腫とを包含し、両者の状態は、組織の破壊によって特徴付けられる。気流の制限は徐々に進行し、呼吸困難および身体の運動能力の制限をもたらす。しかし、ＣＯＰＤ患者は、心血管の疾患を含む全身性の障害の危険性も高いので、機能的な障害は肺に限定されない。慢性閉塞性肺疾患に関するグローバルイニシアチブ（the Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Diseases (GOLD)）の指針に従った気道の閉塞の診断は、スパイロメトリーの使用を求めている。気管支拡張剤投与後のＦＥＶ１／ＦＶＣ（１秒間の努力呼気肺活量／努力肺活量）比が７０％に満たない場合は、不可逆的な気流の閉塞を示唆し、それゆえ、ＣＯＰＤの診断のための主要なパラメーターであると考えられる（Global Strategy for Diagnosis, Management, and Prevention of COPD. Global Initiative FOR Chronic Obstructive Lung Disease, 2007, www.goldcopd.com）。現在、スパイロメトリーデータおよび臨床所見に従って、患者はＧＯＬＤのステージに分類される。疾患の活動性を示している血清マーカーの検出は、診断過程および治療過程において特に関心が寄せられている。
【０００３】
喫煙は、ＣＯＰＤの発症にとっての主要な危険因子として広く認知されているが、特定の発症経路および関与している機構の説明は曖昧なままである。肺の実質における酸化的ストレスは、タバコの煙への曝露に対する炎症性の反応の誘発に関与しているようである。自然免疫の一部としての好中球およびマクロファージは、ＣＯＰＤにおける気道の再構築の過程において極めて重要であると考えられていた。この再構築の過程は、ＣＯＰＤを有している患者または喫煙者の肺における慢性的なアポトーシス誘導の結果である。アポトーシスは、細胞の収縮、膜の小疱形成、クロマチンの凝縮およびＤＮＡの断片化を含む、“活発に”死んでいる細胞によって提示される形態学的な変化をいう。実質における上皮細胞はもちろん、アポトーシスは、肺胞および気管支の上皮細胞をも含む。制御されたアポトーシスは必要な過程であり、細胞の恒常性にとって不可欠である。しかし、過度のアポトーシスの誘発および肺胞細胞の増加したターンオーバーは、組織の破壊を引き起こすかもしれない。
【０００４】
ＣＯＰＤ患者に由来する肺組織における免疫組織化学的な観察は、可変的な数の肥満細胞、好中球、および好酸球と、Ｔリンパ球およびマクロファージとから構成された、炎症性の浸潤を明らかにした。免疫反応における進歩は、Ｔヘルパー１型細胞（ＴＨ１）およびＴヘルパー２型細胞（ＴＨ２）の不均衡が、種々の疾患の炎症性の反応における役割を担っていることを示した。研究は、ＣＯＰＤにおける浸潤性の間質性の炎症における優勢なＴＨ１サイトカインパターンを明らかにした。気道の上皮組織は、免疫反応の重要な要素であり、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）を含む炎症誘発性のサイトカイン、およびケモカインを産生する。肺の上皮細胞は、また、急性の悪化およびＣＯＰＤに罹患している患者において共通している病原体に対する反応を調節する。
【０００５】
ＣＯＰＤを診断するために臨床的な実務において用いられている唯一の方法は、スパイロメトリーであり、これは、肺の機能を測定する肺機能検査であり、具体的には、吸入および吐出され得る空気の量（体積）および／または速さ（流量）の測定である。しかし、そのような試験は、喘息や肺線維症のような他の肺疾患を診断するためにも用いられている。それゆえ、そのような方法は、ＣＯＰＤを確実に診断するための単独の試験としては機能し得ない。それゆえ、医師は、ＣＯＰＤを診断するために、呼吸困難、慢性的な咳もしくは喀痰等の症状、および／または危険因子に対する曝露の履歴を考慮する。ＣＯＰＤの診断またはＣＯＰＤの種々の形態の識別におけるそのような方法の使用は、誤診を招くかもしれないことは明白である。その結果、患者は、疾患の初期から直ちに最適な形態の治療を利用することができない。
【０００６】
それゆえ、本発明の目的は、疾患の初期からヒト被験体においてＣＯＰＤであると明確に診断すること、またはヒト被験体がＣＯＰＤを発症する危険性を決定することさえも可能にする方法および手段を提供することである。
【０００７】
本発明は、ヒト被験体における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）またはヒト被験体がＣＯＰＤを発症する危険性を診断するための方法に関し、以下のステップを包含している：
−  ヒト被験体由来の試料を供与するステップ、
−  上記試料における、カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（caspase-cleaved cytokeratin-18）（ｃｃＣＫ−１８）、ヒストン群（histones）、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）、ヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）および／またはヒートショックプロテイン９０α（ＨＳＰ９０α）の量を決定するステップ、
−  ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量が、健康なヒト被験体におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量と比較して増加している場合に、ＣＯＰＤを診断するステップ、または
−  ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群および／またはＨＳＰ７０の量が、健康なヒト被験体におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群および／またはＨＳＰ７０の量と比較して減少している場合に、ＣＯＰＤを発症する危険性があると診断するステップ。
【０００８】
ヒトの試料におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの濃度は、ＣＯＰＤ、特に、上記ヒト被験体におけるＣＯＰＤステージＩ／ＩＩおよびＩＩＩ／ＩＶであると診断することを可能にするマーカーとして機能し得ることが明らかになった。上記マーカーは、将来、ヒト被験体がＣＯＰＤを発症する危険性を決定することさえも可能にする。生活様式の理由からＣＯＰＤを発症する危険性があると考えられたヒト（例えば、煙を被っているヒト、喫煙者等）の全てが、ＣＯＰＤに罹患するわけではないだろう。それゆえ、ヒト被験体がＣＯＰＤを発症する危険性があることを診断することは、ＣＯＰＤの予防において非常に有用である。
【０００９】
本発明の方法において用いられる上記マーカーは、単独または組み合わせて用いられてもよく、それによってインターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）の量がさらに測定されてもよい。この場合、ＳＴ２の量が、健康なヒト被験体におけるＳＴ２の量と比較して増加しているときに、ＣＯＰＤであると診断されるか、またはＳＴ２の量が、健康なヒト被験体におけるＳＴ２の量と比較して減少しているときに、ＣＯＰＤを発症する危険性があると診断される。好ましい組合せは、ＳＴ２およびｃｃＣＫ−１８、ＳＴ２およびヒストン群、ｃｃＣＫ−１８およびヒストン群、ＳＴ２、ＨＳＰ２７、ＳＨＰ７０および／またはＨＳＰ９０αを包含している。
【００１０】
ＣＯＰＤの重症度を分類するために、スパイロメトリーのパラメーターが用いられる。これらのパラメーターは、ＣＯＰＤの重症度を４つのステージに分類することを可能にする（表Ａを参照）。スパイロメトリーは診断のために不可欠であり、そして、ＣＯＰＤにおける病理学的な変化の重症度の有用な説明を提供する。特定のスパイロメトリーの切点（cut-points）（例えば、気管支拡張剤投与後のＦＥＶ１／ＦＶＣ比  ＜０．７０、またはＦＥＶ１  ＜予測値の８０％、５０％、もしくは３０％）は、ＣＯＰＤのステージＩからＩＶを決定するために用いられる。
【００１１】
【化１】
2011526684.tif 000002
【００１２】
ＦＥＶ１およびＦＶＣを決定するための方法は、ＣＯＰＤを体系化するために用いられ得（表Ａを参照）、当該技術分野において周知である（例えば、Eaton T, et al. Chest (1999) 116:416-23; Schermer TR, et al. Thorax (2003) 58:861-6; Bolton CE, et al. Respir Med (2005) 99:493-500を参照）。
【００１３】
個々の患者におけるＣＯＰＤの影響は、気流の制限の程度のみならず、症状（特に、息切れや低下した運動能力）の重症度にもよる。気流の制限の程度と症状の存在との間には不完全な関連のみがある。ＣＯＰＤの特有の症状は、慢性的で且つ進行性の呼吸困難、咳、および喀痰である。慢性的な咳および喀痰は、気流の制限の発生に何年か先行するかもしれない。この傾向は、喫煙者およびＣＯＰＤの危険性がある他者を特定するための唯一の機会を提供し、そして、この疾患がまだ主たる健康問題ではない時期に起こる。
【００１４】
反対に、重大な気流の制限は、慢性的な咳および喀痰を伴わずに発生するかもしれない。ＣＯＰＤは、気流の制限に基づいて定義づけられるが、実際には、医学的な助けを求める（そして診断することを可能にする）ための決定は、通常、患者の生活様式における特有の症状の影響によって決定される。
【００１５】
ステージＩ：軽度のＣＯＰＤ  −  軽度の気流の制限（ＦＥＶ１／ＦＶＣ  ＜０．７０；ＦＥＶ１  ＜予測値の８０％）によって特徴付けられる。慢性的な咳および喀痰の症状が存在するかもしれないが、常にではない。このステージでは、個人は、通常、彼または彼女の肺機能が正常ではないことに気付かない。
【００１６】
ステージＩＩ：中等度のＣＯＰＤ  −  悪化する気流の制限（ＦＥＶ１／ＦＶＣ  ＜０．７０；５０％  ＦＥＶ１  ＜予測値の８０％）によって特徴付けられ、激しい活動によって一般的に息切れをおこし、且つ咳および喀痰も時々ある。患者は、通常、慢性的な呼吸器官の症状または疾患の悪化のせいで、医学的な手当てを求めるステージである。
【００１７】
ステージＩＩＩ：重度のＣＯＰＤ  −  さらに悪化した気流の制限（ＦＥＶ１／ＦＶＣ  ＜０．７０；３０％  ＦＥＶ１  ＜予測値の５０％）によって特徴付けられ、よりひどい息切れ、低下した運動能力、疲労を伴う。そして、ほとんどの場合に患者の生活の質に対して影響する悪化が繰り返される。
【００１８】
ステージＩＶ：極めて重度のＣＯＰＤ  −  重度の気流の制限（ＦＥＶ１／ＦＶＣ  ＜０．７０；ＦＥＶ１  ＜予測値の３０％またはＦＥＶ１  ＜予測値の５０％、加えて、慢性的な呼吸不全の存在）によって特徴付けられる。呼吸不全は、海面レベルで呼吸する際の６．７ｋＰａ（５０ｍｍＨｇ）より高いＣＯ２の動脈血分圧（ＰａＣＯ２）の有無に関わらず、８．０ｋＰａ（６０ｍｍＨｇ）よりも低いＯ２の動脈血分圧（ＰａＯ２）によって定義付けられる。呼吸不全は、肺性心（右心不全）のような心臓における影響も引き起こすかもしれない。肺性心の臨床的な徴候は、頚動脈圧の上昇および足首の圧痕水腫を含む。これらの合併症が存在している場合はいつでも、ＦＥＶ１が＞予測値の３０％であっても、患者は、ステージＩＶ：極めて重度のＣＯＰＤであるかもしれない。このステージでは、生活の質は極めて損なわれ、そして、悪化は生死に関わるかもしれない。
【００１９】
用語「ＣＯＰＤを発症する危険性」は、本明細書において用いられる場合、環境からの脅威を受けているか、またはＣＯＰＤを発症する遺伝的な要素を有していてもよいヒト被験体のプールをいう。ＣＯＰＤの形成を助ける要因は、遺伝的な要素、タバコの煙、職業的な塵（有機および無機）、通気性に乏しい住居におけるバイオマスを用いた加熱および冷却からの屋内大気汚染および屋外大気汚染といった粒子への曝露、肺の成長および発達、酸化的ストレス、性別、年齢、呼吸器官の感染症、社会的経済的な地位、栄養および共存症を含んでいる。ＣＯＰＤを発症する危険性があるヒトは、慢性的な咳、慢性的な喀痰を患い、そして正常なスパイロメトリーであるかもしれない。しかし、これらの症状を患っているヒト被験体は、必ず、ＣＯＰＤステージＩに向かって進行している。
【００２０】
本明細書において用いられる場合、用語「健康なヒト被験体」は、ＣＯＰＤまたはあらゆる他の肺疾患に罹患していないヒトをいう。さらに、これらのヒトは、人生において、いかなる重度の肺疾患も有していない。「健康なヒト」は、また、煙または他の有毒な物質のような危険因子に定期的に暴露されているヒトは含まない。
【００２１】
本発明によれば、「健康なヒト被験体」におけるマーカーの量は、少なくとも、５人、１０人、１５人、または２０人の「健康なヒト被験体」におけるこれらのマーカーを定量化することによって決定される。
【００２２】
本発明に係る方法を用いて決定されるＣＯＰＤマーカーは、血液において見出されるので、本発明に従って用いられる試料は、血液、血清または血漿である。試料のこれらの種類は、当該技術分野において公知の方法を用いてヒトから取得され得る。
【００２３】
試料中のインターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）、カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ−１８）およびヒストン群、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）、ヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）および／またはヒートショックプロテイン９０α（ＨＳＰ９０α）の量を明確に決定するために、上記のＣＯＰＤマーカーに対する抗体を含む方法を用いることが好ましい。抗体を用いる適切な方法は、好ましくは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびウエスタンブロットからなる群から選択される、免疫学的検定である。
【００２４】
用語「抗体」は、本明細書において用いられる場合、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体または抗原に結合可能なこれらの断片をいう。ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって選択される断片のみならず、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＦａｂもしくはＦｖ断片等の抗体断片等の、他の抗体および抗体断片等も、本明細書に記載された方法において有用である。
【００２５】
ポリクローナル抗体と同様、モノクローナル抗体の調製方法は十分に確立されている（Harlow E. et ah, 1988. Antibodies. New York: Cold Spring Harbour Laboratory）。ポリクローナル抗体は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダおよびウマを含む種々の種において、標準的な免疫および採血手段を用いて産生させられる。高い抗体価を有している動物の血液は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿等の所定の選択的な塩析手段によって分画され、そして特異的な免疫グロブリン画分は、標準的な方法に従って、プロテインＡセファロースおよびレプチンセファロースカラムにおける連続的な親和性クロマトグラフィーによって分離される。精製されたポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と同様に、その後、特異性に関して特徴付けられる。そのような特徴付けは、標識されていない可能性のある抗体結合に関する交差反応体のレベルを増加させた競合において、放射性同位体またはビオチンのようなトレーサーを用いて標識されたタンパク質を用いた標準的な方法によって実施される。結合研究は、還元条件または非還元条件下における、十分に確立されたドデシルスルホン酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタンイムノブロット法等の他の標準的な方法によってさらに評価される。
【００２６】
モノクローナル抗体は、十分に確立された標準的な実験手段に従って調製される（"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" by P. Tijssen (hi Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Eds: R.H. Burdon and P.H. van Kinppenberg; Elsevier Publishers Biomedical Division, 1985)）。この方法は、クーラーおよびミルスタインの元の技術に基づいている（Kohler G., Milstein C. Nature 256:495, 1975）。この技術は、免疫された動物から脾臓細胞を除去し、そしてミエローマ細胞と融合するまたはエプスタイン−バーウイルスを用いた形質転換によって抗体産生細胞を不死化し、そしてその後、所望の抗体を発現しているクローンをスクリーニングすることによって行われる。しかし、当該技術分野において公知の他の技術も用いられ得る。抗体は、限定されないが、特異的なＤＮＡを用いた免疫を含む、当業者にとって公知の他の方法によっても生産される。
【００２７】
好適に用いられるイムノアッセイは、興味のある抗原または固体の担体に結合された抗原に対して特異的に結合し得る捕捉抗体を利用する方法に基づいている。捕捉抗体は、望まれる分析的要件および／または固相の分離要件に応じて、標準的な非共有結合法もしくは共有結合法を用いて、種々の固層の担体と結合されているか、または連結されている。固体の担体は、試験管、ビーズ、微粒子、濾紙、膜、ガラスフィルター、磁気粒子、ガラスもしくはシリコンチップまたは他の材料の形態であり、そして、方法は当業者に公知である。抗体を用いて直接被覆された微粒子、特に、磁化できる粒子（磁気粒子−捕捉抗体）または一般的な結合剤（例えば、アビジンまたは抗種抗体）を用いて標識された粒子の使用は、検定のインキュベーション時間を大幅に短縮するために有用である。当該技術分野において公知の他の代替的な方法を加えたこれらの方法は、望まれる感度を制限することなく数分以内に検定を完了させることを可能にする。
【００２８】
興味がある抗原に対して特異的に結合し得る検出抗体は、レポーター分子と一緒に直接連結されるか、または二次的な検出系によって間接的に検出される抗原の検出のために用いられる。後者は、標識された抗種抗体および免疫学的または非免疫学的な架橋の他の形態による抗体認識、並びにシグナル増幅検出系（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン法）を含む、当該技術分野において公知のいくつかの異なる原理に基づいている。シグナル増幅の方法は、測定の感度および低レベルの再現性および性能を大幅に向上するために用いられる。直接的または間接的な抗体結合のために用いられる標識は、あらゆる検出可能なレポーター分子である。適切な標識の例は、酵素等の他の適切な薬剤によって検出され得た成分のみならず、蛍光体、発光標識、金属複合体および放射性標識等の免疫学的および非免疫学的な検出系の分野において広範に用いられているもの、または酵素等の直接的もしくは間接的な標識と発光性の基質との種々の組合せである。
【００２９】
ＣＯＰＤであるまたはＣＯＰＤを発症する危険性があると診断するために、それを上回るかまたはそれより低い場合に疾患が診断され得るカットオフレベルを規定することは有利である。健康なヒト被験体の血液試料におけるインターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）の量は、好ましくは、５０〜１５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは、６０〜１４０ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは７０〜１３０ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【００３０】
本発明の他の実施の形態によれば、健康なヒト被験体の血液試料におけるカスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ−１８）の量は、２００〜３５０Ｕ／ｌ、好ましくは２００〜３３０Ｕ／ｌ、より好ましくは２５０〜３００Ｕ／ｌの範囲であり、サイトケラチン−１８の新たなエピトープＭ３０として測定される。
【００３１】
本発明の他の実施の形態によれば、健康なヒト被験体の血液試料におけるヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）の量は、１５００〜２５００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは１６００〜２４００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは１７００〜２３００ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【００３２】
本発明の他の実施の形態によれば、健康なヒト被験体の血液試料におけるヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）の量は、５０〜２００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは７０〜１９０ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは８０〜１８０ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【００３３】
本発明の他の実施の形態によれば、健康なヒト被験体の血液試料におけるヒートショックプロテイン９０α（ＨＳＰ９０α）の量は、１０，０００〜１５，０００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは１１，０００〜１４，５００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは１２，０００〜１４，０００ｐｇ／ｍｌの範囲である。
【００３４】
本発明のさらなる実施の形態によれば、健康なヒト被験体の血液試料におけるヒストン群の量は、ＣＯＰＤに罹患しているヒトの血液試料における量よりも２０〜５０％低い、好ましくは、２５〜４０％低い範囲である。
【００３５】
本発明の好ましい実施の形態によれば、試料におけるインターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）、カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ−１８）、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αが、健康なヒト被験体におけるＳＴ２、ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量と比較して、少なくとも１０％、好ましくは２０％増加する場合に、ＣＯＰＤは診断される。もちろん、ＳＴ２、ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０αの量が、少なくとも１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％まで増加してもよい。
【００３６】
試料におけるインターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）、カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ−１８）および／またはヒストン群の量が、健康なヒト被験体におけるＳＴ２、ｃｃＣＫ−１８および／またはヒストン群の量と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％減少した場合に、ＣＯＰＤを発症する危険性があると望ましくは診断される。もちろん、ＳＴ２、ｃｃＣＫ−１８および／またはヒストン群の量が、少なくとも１５％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％まで減少してもよい。
【００３７】
本発明に係る方法は、他の種類の動物に対しても適用さえ得、当該動物は、ウマ、イヌ、ネコおよび畜牛からなる群から好ましく選択される。
【００３８】
本発明の他の局面は、ヒト被験体におけるＣＯＰＤステージＩ／ＩＩとＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶとを識別するための方法に関し、以下のステップを包含している：
−  ＣＯＰＤに罹患しているヒト被験体由来の試料を供与するステップ、
−  上記試料における、カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ-１８）、ヒストン群、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）および／またはヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）の量を決定するステップ、
−  ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたｃｃＣＫ−１８、ヒストン群および／またはＨＳＰ２７の量と比較して、ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、および／またはＨＳＰ２７の量が減少している場合、および／またはＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたＨＳＰ７０の量と比較して、ＨＳＰ７０の量が増加している場合に、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩであると診断するステップ、または、
−  ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたｃｃＣＫ−１８、ヒストン群および／またはＨＳＰ２７の量と比較して、ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、および／またはＨＳＰ２７の量が増加している場合、および／またはＣＯＰＤステージＩ／ＩＩに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたＨＳＰ７０の量と比較して、ＨＳＰ７０の量が減少している場合に、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶであると診断するステップ。
【００３９】
本発明の好ましい実施の形態によれば、インターロイキン−１受容体４（ＳＴ２）の量がさらに決定され、この場合、ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたＳＴ２の量と比較して、ＳＴ２の量が増加しているとき、またはＣＯＰＤステージＩ／ＩＩに罹患しているヒト被験体由来の試料において決定されたＳＴ２の量と比較して、ＳＴ２の量が減少しているときに、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩであると診断される。
【００４０】
本明細書に開示されたＣＯＰＤマーカーは、上記に規定されたように、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩに罹患しているヒトとＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶに罹患しているヒトとを識別するためにも適している。これらのＣＯＰＤステージ間の識別は、治療を決定するために重要である。少しまたは断続的な症状（ステージＩおよびＩＩ）を有している患者にとっては、例えば、呼吸困難を制御するための必要に応じた短時間作用型の吸入性の気管支拡張剤の使用で十分である。吸入性の気管支拡張剤が利用できない場合は、持続放出性のテオフィリンを用いた定期的な治療が考慮されるべきである。必要に応じた短時間作用型の気管支拡張剤を用いた治療にも関わらず、日常の活動の間の呼吸困難が軽減されないヒトにおいて、長時間作用型の吸入性の気管支拡張剤を用いた定期的な治療を追加することが推奨される。ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶに罹患しているヒトにおいて、吸入性のグルココルチコステロイドを用いた定期的な治療は、悪化の頻度を低下し、そして健康状態を改善する。これらのヒトにおいて、吸入性のグルココルチコステロイドを用いた定期的な治療が、長時間作用型の吸入性の気管支拡張剤に追加されるべきである。ＣＯＰＤステージＩＩＩ／ＩＶに罹患しているヒトに関して、慢性的な呼吸不全が起こる場合は、外科的治療および／または長期間の酸素が考慮されるべきである。
【００４１】
ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩとＩＩＩ／ＩＶとを識別することを可能にする参照値は、ＣＯＰＤステージＩ／ＩＩおよびＩＩＩ／ＩＶに罹患しているヒトから取得された試料のプールにおけるＳＴ２、ｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７および／またはＨＳＰ７０のそれぞれの量を決定することによって見積もられ得る。そのようなプールは、少なくとも５人、好ましくは少なくとも１０人、より好ましくは少なくとも２０人の、ＣＯＰＤに罹患しているヒトから取得された試料を含んでいてもよく、そして種々のＣＯＰＤステージは、代替的な方法（例えば、スパイロメトリー）によって診断される。
【００４２】
上記被険体の試料におけるＨＳＰ２７の量が、２，６００〜３，３００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは２，７００〜３，２００ｐｇ／ｍｌの範囲である場合に、ＣＯＰＤ  Ｉ／ＩＩがヒト被験体において診断され得る。もし、ヒト被験体の試料におけるＨＳＰ２７の量が、３，４００〜５，５００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは３，５００〜５，０００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは３，６００〜４，５００ｐｇ／ｍｌの範囲である場合、ＣＯＰＤ  ＩＩＩ／ＩＶであると診断される。
【００４３】
上記被験体の試料のＳＴ２の量が、１６０〜４００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは１７０〜３８０ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは１８０〜３５０ｐｇ／ｍｌの範囲である場合に、ＣＯＰＤ  Ｉ／ＩＩがヒト被験体において診断され得る。上記試料において、ＳＴ２の量が、１６０ｐｇ／ｍｌを超える、好ましくは１７０ｐｇ／ｍｌを超える、より好ましくは１８０ｐｇ／ｍｌを超える場合に、ＣＯＰＤ  Ｉ／ＩＩがさらに診断され得る。
【００４４】
ヒト被験体の試料におけるＨＳＰ７０の量が、少なくとも２５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも３００ｐｇ／ｍｌである場合に、ＣＯＰＤ  Ｉ／ＩＩおよびＣＯＰＤ  ＩＩＩ／ＩＶであると診断され得る。
【００４５】
ヒト被験体の試料におけるＨＳＰ９０αの量が、少なくとも１５，０００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１６，０００ｐｇ／ｍｌである場合に、ＣＯＰＤ  Ｉ／ＩＩおよびＣＯＰＤ  ＩＩＩ／ＩＶであると診断され得る。
【００４６】
本発明の他の局面は、ヒト被験体における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の進行をモニタリングするための方法に関し、以下のステップを包含している：
−  ヒト被験体由来の試料を供与するステップ、
−  上記試料におけるカスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ-１８）、ヒストン群、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）および／またはヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）の量を決定するステップ、
−  上記ヒト被験体の試料におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７および／またはＨＳＰ７０の量を、上記ヒト被験体の初期の試料において決定された上記ヒト被験体由来の試料におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７および／またはＨＳＰ７０の量と比較するステップ。
【００４７】
本明細書において開示された上記マーカーは、ＣＯＰＤの進行およびＣＯＰＤ療法の進展をモニタリングするためにも用いられ得る。そのような方法は、異なる時間間隔でヒトから取得された試料におけるｃｃＣＫ−１８、ヒストン群、ＨＳＰ２７および／またはＨＳＰ７０の量を比較することを包含している。上記方法から取得された結果は、医師が適切な療法を決定することを可能にする。
【００４８】
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。しかし、これらに制限されることはない。
【００４９】
図１は、抗体Ｍ３０を用いることによって検出された、可溶性のアポトーシス特異的カスパーゼ、すなわち、切断型サイトケラチン−１８の血清濃度を示している（＋／−  ＳＥＭ）。
【００５０】
図２は、血清試料における、循環しているヒストン関連ＤＮＡ断片の測定された光学濃度（Ｏ．Ｄ．）値を示している（＋／−  ＳＥＭ）。
【００５１】
図３は、対象患者の末梢の血清試料におけるカスパーゼ−１／ＩＣＥのレベルを示している（＋／−  ＳＥＭ）。
【００５２】
図４は、ＣＯＰＤ  ＩおよびＩＩを有している患者において最大となった可溶性のＳＴ２の血清濃度を示している（＋／−  ＳＥＭ）。
【００５３】
図５は、血清試料におけるＩＬ−１０は、試験群間で違いが無いことを示したことを表している（＋／−  ＳＥＭ）。
【００５４】
図６は、ＩＣＥの血清濃度と患者のパックイヤーの数との間の相関関係（Ａ）、循環しているヒストン関連ＤＮＡ断片と血清ＩＣＥレベルとの間の相関関係（Ｂ）、ＦＥＶ１％ＶＣと血清カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８との間の相関関係（Ｃ）、および抗炎症性マーカーＳＴ２とＩＬ−１０との間の相関関係（Ｄ）を、それぞれ示している。Ｒは、スピアマンの順位相関係数（spearman’s rank correlation coefficient）。
【００５５】
図７（ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）は、患者および対照群の全身の血流において決定されたヒートショックプロテインおよび２０Ｓプロテアソームの血清レベルを示している。結果は、平均値＋／−ＳＥＭとして表される。
【００５６】
図８ａ〜図８ｄは、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０と、炎症性サイトカインＩＬ−６および肺の機能パラメーターＦＥＷ１％ＶＣとの間のノンパラメトリックな相関関係を示している。Ｒ：相関係数
図９は、喫煙している試験群においてＣＯＰＤを診断するための、ＨＳＰ２７およびＨＳＰ７０の感度および特異性を表している受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示している。
【００５７】
〔実施例〕
実施例１：
材料および方法：
患者
総数６４名の患者を、この場合の対照試験に含んだ。有志で構成された健康な被験者（ｎ＝１５）、ＣＯＰＤを有していない喫煙者（ｎ＝１４）、軽度から中等度のＣＯＰＤを有している患者（ｎ＝１９）および重度または極めて重度のＣＯＰＤを有している患者（ｎ＝１６）を、４つの試験群において評価した。患者の特徴を表１に示す。
【００５８】
【表１】
2011526684.tif 000003
【００５９】
除外基準は、ＷＨＯの指針および慢性閉塞性肺疾患に関する国際指針（GOLD; www.goldcopd.com）または過去１４日以内の免疫調節剤の使用、喘息歴、自己免疫疾患、他の関連する肺の疾患（例えば、肺癌、公知のａ１−抗トリプシン欠乏症）、またはあらゆる公知の心臓および肺の並存疾患によって規定された急性の悪化であった。身長および体重（Seca; Vogel and Halke, Germany）を測定し、そして体格指数（ＢＭＩ）を決定した。肺機能のパラメータ−（ＦＥＶ１，ＦＶＣ，ＦＥＶ１：ＦＶＣ比）は、同じモデルの肺活量計（AutoboxV6200, SensorMedics, Austria）を用いて測定した。測定は、２００μｇサルブタモールの吸入前に行ない、もし、気流の閉塞に関する基準を満たした場合は、２００μｇサルブタモールの吸入後１５〜３０分で行った。動脈血ガス（ＰａＯ２、ＰａＣＯ２）は、座位にて室内の空気を呼吸しながら、安静時に取得した。動脈血ガスの測定は、ＡＢＬ  ５１０ガス分析器（Radiometer, Denmark）を用いて行った。結果は、絶対値として表し、そして鉄および石炭に関する欧州共同体が定めた予測方程式（the European Community for Steel and Coal prediction equations）（Quanje PH et al. Eur Respir J Suppl 16 (1993): 5-40）に従って、年齢、性別および身長に関する予測値の割合として表した。予測された正常値は、オーストリア肺医薬学会の参照値に由来した（Harnoncourt K et al., Osterreich Arztetg. 37 (1982): 1640-1642）。血液試料は、肺の評価時に収集した。血清は、遠心分離後に獲得し、そしてさらに試験を行うまで、一定分量に分けて−２０℃にて冷凍状態を維持した。
【００６０】
カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８（ｃｃＣＫ-１８）の定量化
M30-Apoptosense ELISA（Peviva, Sweden）を用いて、サイトケラチン−１８の新たなエピトープＭ３０のレベルを試料において測定した。つまり、このＥＬＩＳＡは、抗体、すなわちアポトーシスによって誘導されるサイトケラチン−１８の切断後に露呈する新たなエピトープを認識する抗体を用いる。製造業者によると、Ｍ３０抗原レベルは、リッターあたりの単位（Ｕ／Ｌ）にて測定し得る。すなわち、１Ｕ／Ｌは、Ｍ３０認識モチーフの合成されたペプチドの１．２４ｐｍｏｌに相当する。ＥＬＩＳＡの感度を、２５Ｕ／Ｌであると定めた。試験内および試験間の再現性は＜１０％であった。試料のＯＤ値を標準希釈物のＯＤ値と比較することによって、血清濃度を算出した。
【００６１】
血清ヒストン関連ＤＮＡ断片の評価
ヒストン−ＤＮＡ複合体の血清含有量を定量するために、市販のＥＬＩＳＡキットを用いた（Roche Applied Science, Germany）。９６ウェルマイクロタイトレーションプレートにおいて、ビオチン共役型マウスモノクローナル抗ヒストン抗体（クローンＨ１１−４）およびペルオキシダーゼ共役型マウスモノクローナル抗ＤＮＡ抗体（クローンＭＣＡ−３３）と共に、試料を、室温にて２時間にわたってインキュベートした。ウェルを洗浄した後に、ＡＢＴＳ溶液をそれぞれのウェルに加えた。十分な着色が達成されるまで酵素反応をモニタリングし、そしてプレートを４０５ｎｍにて読み取った。試料ウェルの平均からブランクウェルのＯＤ値を減じることによって、ＯＤ値を算出した。
【００６２】
血清カスペース−１／ＩＣＥの定量化
市販の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（BenderMedSystems, Austria）を、血清試料における可溶性のカスペース−１／ＩＣＥの血清含有量を決定するために用いた。ヒトＩＣＥに対するモノクローナル抗体を用いて前もって表面を覆ったマイクロタイトレーションプレートを、試料材料または希釈した標準濃度（４００ｐｇ／ｍｌ〜６．２５ｐｇ／ｍｌ、７段階希釈）と共に、室温にて１．５時間にわたってインキュベートした。プレートを、洗浄バッファーを用いて３回洗浄し、そしてポリクローナルウサギＩＣＥ抗血清を３０分間にわたって加えた。さらなる洗浄ステップ後に、西洋わさびペルオキシダーゼ共役型を３０分間適用した。ウェルを洗浄し、そして、ＴＭＢ基質溶液を、酵素活性を検出するために用いた。硫酸（２Ｎ）を用いて反応を停止した。プレートを、Wallac Multilabel counter 1420（PerkinElmer, USA）にて４５０ｎｍにて読み取った。試料の光学濃度（ＯＤ）値を既知の濃度の標準物質のＯＤと比較することによって、濃度を算出した。
【００６３】
インターロイキン−１受容体４／ＳＴ２の定量化
我々の試料におけるインターロイキン−１受容体４／ＳＴ２（ＳＴ２）の血清含有量を決定するために、市販の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（R&D Systems, USA）を用いた。マイクロタイトレーションプレートは、ヒトＳＴ２に対する捕捉抗体を用いて前もって表面を覆った。プレートを、その後洗浄し、そしてブロッキングした。試料および標準希釈物（２０００ｐｇ／ｍｌ〜３１．２５ｐｇ／ｍｌ）を、室温にてインキュベートした。ビオチン化ヤギ抗ヒトＩＬ−１  Ｒ４抗体を検出のために用いた。西洋わさびペルオキシダーゼに対して共役したストレプトアビジンの添加後に、ＴＭＢ基質溶液を酵素活性の検出のために用いた。硫酸（１Ｎ）を用いて反応を停止した。プレートを、Wallac Multilabel counter 1420（PerkinElmer, USA）にて、４５０ｎｍにて読み取った。試料の光学濃度（ＯＤ）値を既知の濃度の標準物質のＯＤと比較することによって、濃度を算出した。
【００６４】
インターロイキンー１０の定量化
全血の遠心分離後に取得された血清試料におけるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）のレベルを定量化するために、ＥＬＩＳＡ技術（BenderMedSystems, Austria）を用いた。９６ウェルプレートを、特異抗原に対するモノクローナル抗体を用いて表面を覆い、そして４℃にて一晩インキュベートした。洗浄ステップ後に、プレートを、試験バッファーを用いて２時間にわたってブロッキングした。さらなる洗浄ステップの後に、試料および規定された抗原濃度を有する標準物質を、製造業者によって記載されているようにインキュベートした。プレートを、その後洗浄し、そして酵素連結型ポリクローナル抗体を用いてインキュベートした。適切な時間のインキュベーションおよびさらなる洗浄ステップの後に、ＴＭＢ基質溶液を適用した。その後、Wallac Multilabel counter 1420（PerkinElmer, USA）を用いて着色をモニタリングした。得られたＯ．Ｄ．値を、既知の濃度の抗原を有している標準物質のＯ．Ｄ．値から算出した標準曲線と比較した。
【００６５】
統計的方法
全ての結果を算出するために、ＳＰＳＳソフトウェア（SPSS Inc., USA）を用いた。ｐ値＜０．０５を、統計的に有意であると考えた。マン−ホイットニーＵ検定（Mann-Whitney-U-Test）を用いて、グループ間のペアワイズ比較を行った。スピアマン相関係数（Spearman-Correlation-Coefficient）を用いて相関関係を算出した。結果を、複数の試験に対して補正しなかった。
【００６６】
結果
アポトーシス誘導性のカスパーゼ切断型サイトケラチン−１８は、ＣＯＰＤを有している患者において増加していた
健康な喫煙者（１１９．６７Ｕ／Ｌ［９３．８５〜１４５．４９］）の血清含有量と比較して、ＣＯＰＤ  Ｉ＆ＩＩを有している患者（２９４．９６Ｕ／Ｌ［８７．８１〜５０２．１１］，ｐ＝０．００８）およびＣＯＰＤ  ＩＩＩ＆ＩＶを有している患者（４６４．８６Ｕ／Ｌ［７９．６９〜８５０．０３］，ｐ＝０．００１）における新たなエピトープＭ３０の上昇した血清レベルが示された。健康な対照群は、Ｍ３０のレベルのわずかな上昇を示したが（２８４．０８Ｕ／Ｌ［６４．２６〜５０３．９０］）、この違いは統計的に有意ではなかった（図１）。
【００６７】
ヒストン関連ＤＮＡ断片の含有量は、重度または極めて重度のＣＯＰＤを有している患者において増大していた
ＣＯＰＤ  ＩＩＩ＆ＩＶを有している患者における平均ＯＤ値を、０．４３［０．２６〜０．６０］であると決定した。このレベルは、健康な対照群の血清におけるヒストンのレベル（０．２７［０．１２〜０．４２］，ｐ＝０．０３７）およびＣＯＰＤを有していない喫煙者におけるヒストンのレベル（０．２６［０．０８〜０．４５］，ｐ＝０．０２２）に対して統計的に有意に違っていた。ＣＯＰＤ  Ｉ＆ＩＩを有している患者は、血清のヒストン関連ＤＮＡ断片のレベルが上昇していた（０．４０［０．２２〜０．５９］）、しかし他の群と比較して統計的な効果はなかった（図２）。
【００６８】
血清カスペース−１／ＩＣＥレベルは、統計的に有意な違いを示さなかった
血清試料におけるＩＣＥの濃度は、健康な対照群に関して８４．８６ｐｇ／ｍｌ（［６４．８５〜１０４．８７］，９５％信頼区間［ＣＩ］）であり、ＣＯＰＤを有していない喫煙者に関して１０２．７６ｐｇ／ｍｌ［５６．５９〜１４８．９３］であった。ＣＯＰＤ  ＧＯＬＤステージ  Ｉ＆ＩＩを有している患者は、１１４．５６ｐｇ／ｍｌ［７８．９８〜１５０．１４］の中程度に高い平均含有量を示し、そして、ＣＯＰＤ  ＩＩＩ＆ＩＶを有している患者は、ＣＯＰＤ  Ｉ＆ＩＩと比較して、１１１．８７ｐｇ／ｍｌ［８２．２１〜１４１．５３］の平均血清レベルを有していた。いずれの群間にも有意な違いは無かった（図３）。
【００６９】
ＳＴ２の血清レベルは、ＣＯＰＤを有している患者において増大している
健康な喫煙者の血清含有量（９４．０１ｐｇ／ｍｌ［１１．５７〜１７６．４６］）と比較して、ＣＯＰＤ  Ｉ＆ＩＩを有している患者におけるＳＴ２の血清レベルの上昇を示すことができた（２５１．８０ｐｇ／ｍｌ［４５．７４〜４５７．８５］，ｐ＝０．０３１）。全ての他の群の比較は、有意な違いを示さなかった；健康な対照群（９９．８６ｐｇ／ｍｌ［４１．８６〜１５７．８６］），ＣＯＰＤ  ＩＩＩ＆ＩＶ（１２７．２４ｐｇ／ｍｌ［５１．７２〜２０２．７５］）（図４）。
【００７０】
血清ＩＬ−１０レベルは、統計的に有意な違いを示さなかった
血清試料におけるＩＬ−１０の濃度は、健康な対照群に関して８．８４ｐｇ／ｍｌ（［−６．１４〜２３．８１］）であり、ＣＯＰＤを有していない喫煙者に関して１０．２５ｐｇ／ｍｌ［−３．８４〜２４．３４］であった。ＣＯＰＤ  ＧＯＬＤステージＩ＆ＩＩを有している患者は、１１．５７ｐｇ／ｍｌ［−８．４９〜３１．６２］の含有量を示し、そしてＣＯＰＤ  ＩＩＩ＆ＩＶを有している患者は、０．６３ｐｇ／ｍｌ［−０．７１〜１．９７］のより低い平均血清レベルを有していた。いずれの群間にも有意な違いは無かった（図５）。
【００７１】
結論
慢性閉塞性肺疾患は、肺の組織の慢性的な炎症および他の臓器系の付随する疾患によって特徴付けられる。この過程は、長年の喫煙を通じて主に引き起こされると考えられる。パックイヤー（pack-years）の数と、炎症誘発性カスペース−１  ＩＣＥ（ＩＣＥ）の血清濃度との間の強い相関関係を示すことができた。これは、全身性の炎症反応における喫煙習慣の直接の影響を示唆している（図６Ａ）。アポトーシス特異的な可溶性のｃｃＣＫ−１８およびヒストン関連ＤＮＡ断片（ヒストン群）の上昇したレベルを、ＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  Ｉ＆ＩＩおよびＧＯＬＤ  ＩＩＩ＆ＩＶを有している患者において見出すことができた（図１、２）。生物活性タンパク質ＩＣＥの血清含有量は、ヒストン群のレベルと有意に相関していた（図６Ｂ）。アポトーシスを起こしている細胞において、エンドヌクレオソーム活性は、ＤＮＡの切断をもたらし、そして、細胞核に対して付着されていない、長いクロマチン断片、Ｈ１リッチな短いオリゴヌクレオソームおよびモノヌクレオソーム（ヒストン群と称される）を生成する。アポトーシス特異的なヒストン−ＤＮＡ複合体の放出は、免疫活性化に起因した恒常的な再構築の結果であると考えられる。
【００７２】
ＣＯＰＤの発症機序は、病気に感染し易い患者における自然免疫系および獲得免疫系の活性化およびアポトーシス誘発性シグナルの増加に起因した肺の組織の変性に関連している。慢性的な炎症は、ＩＣＥ、すなわち触媒残基として備えられたＣｙｓ２８５を有し、２１ｋＤａの生物学的に不活性型のＩＬ−１β前駆体をＡｓｐ１１６〜Ａｌａ１１７において切断し、ＩＬ−１βの１７．５ｋＤａの成熟した形態を生成する、タンパク質分解酵素のレベルの増加を引き起こす。活性型酵素は、２つの同一ではないサブユニット（ｐ１０およびｐ２０）からなり、これらの両方は、酵素の活性にとって不可欠であり、そしてそれゆえ、内皮および上皮細胞を含む種々の細胞のアポトーシスにおいて重要な役割を担っている。アポトーシスによるターンオーバーは、サイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）等の細胞の中間径フィラメントの遊離をもたらす。ＣＫ−１８は、中間径フィラメントの主要な構成要素であり、そして上皮および内皮組織によって広範囲にわたって発現されている。アポトーシスを起こしている細胞において、ＣＫ−１８は、リン酸化され、そしてマイクロフィラメントは速やかにに凝集する。細胞のストレスの異なる状態は、ＣＫ−１８の重合を変化させるだけでなく、細胞質性のマイクロフィラメントの再編成を増加させる。その結果、カスペース媒介型のＣＫ−１８の切断がアポトーシスの間にわたって生じ、そして抗体Ｍ３０によって認識される、特異的な新たなエピトープの形成を引き起こす。この抗体の結合特異性は、アポトーシス性のＣＫ−１８の変性産物（カスペース切断型ＣＫ−１８［ｃｃＣＫ−１８］）に制限される。興味深いことに、ＧＯＬＤ指針を用いたＣＯＰＤの分類によると、可溶性のｃｃＣＫ−１８の存在は、肺の機能の障害に関連していた（図６Ｃ）。
【００７３】
上記のデータは、血清試料におけるアポトーシスに依存した肺の変性を示唆している。サイトケラチン−１８の切断およびｃｃＣＫ−１８の血流への放出は、疾患の進行と共に起こり、そして患者の罹患をモニタリングするために用いられ得る。
【００７４】
以前の研究は、ＣＯＰＤ患者におけるＴＨ１サイトカイン環境の優位性を実証した。炎症は、ＩＬ−１０のような抗炎症特性を有していることが知られているタンパク質の分泌と常に付随して起こるので、Ｔ１／ＳＴ２と称される、自然免疫系に関連することが知られている他のタンパク質を調査した。この可溶性の分子は、ＴＨ１／ＴＨ２に関連した免疫反応を調節すると考えられる。ＣＯＰＤ  Ｉ＆ＩＩを有している患者における抗炎症性ＳＴ２血清レベルの有意な増大が観察されたが、重度のＣＯＰＤにおいては観察されなかった。これらの観察は、自己免疫疾患、敗血症、並びに線維症および喘息のような肺特異的な疾患と同様に、ＣＯＰＤは自然免疫の活性化および制御の増加したマーカーを明示することを示唆している。
【００７５】
最近の研究は、自然免疫細胞に対する微生物成分の存在下において、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）が、哺乳類のパターン認識受容体シグナルとして機能することを示した。少なくとも１０種類の哺乳類ＴＬＲファミリーが報告され、それぞれのＴＬＲは微生物の分子パターンに関する明確な特異性を示している。活性化リガンド、例えば、リポ多糖類（ＬＰＳ）のＴＬＲへの結合は、ＮＦ−κＢの活性化を誘導し、これによって、炎症誘発性サイトカインの産生および放出を引き起こす。ＬＰＳに対する前曝露は、ＬＰＳを用いた第２の暴露に対する感度を低下させ、その結果、げっ歯類およびヒトの両方における多数のサイトカインの産生の低下をもたらすことが一般に受け入れられている。ＴＬＲによって誘導される寛容の分子メカニズムは、ＴＬＲ４−ＭＤ２複合体の下方制御を含んでいてもよく、この複合体は、ＴＬＲシグナルの低下を引き起こすかもしれない。さらに、サイトカインシグナルの抑制因子（suppressor of cytokine signalling）（ＳＯＣＳ−１）と同様に、ＩＲＡＫ−ＭおよびＩＲＡＫ−１の発現は、内毒素耐性（endotoxin tolerance）に関与していることが示された。
【００７６】
いくつかの研究は、内毒素耐性の誘導におけるＴｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）ファミリーメンバーであるＳＴ２に関する重要な役割を想定している。ＳＴ２はＴＨ２細胞、肥満細胞およびマクロファージによって発現される。急性肺障害のモデルにおいて、ＬＰＳ刺激後に上方制御されることおよびサイトカインの発現を制御することが示されている。ＣＯＰＤの開始におけるＳＴ２の分泌は、ＭｙＤ８８の分離を介したＴＬＲ４およびＩＬ−１Ｒシグナルの負の制御因子として働く。臨床的な状況において、これは、過剰に活性化した獲得免疫系および自然免疫系による肺の破壊を予防するために、全身性のＴ１／ＳＴ２が防御性の血清タンパク質として機能することを意味しているかもしれない。この知見は、試験対象群におけるＴ１／ＳＴ２が血清ＩＬ−１０レベルに大いに相関しているという観察に関連している。
【００７７】
結果は、ＣＯＰＤを有している患者が、アポトーシス性のターンオーバー並びに全身性の血流におけるｃｃＣＫ−１８およびヒストン−ＤＮＡ複合体の放出の増加を明示することを示唆している。健康な喫煙者と比較して、ＣＯＰＤ  Ｉ＆ＩＩを有している患者における可溶性のＴ１／ＳＴ２の増加がさらに見出された。ＣＯＰＤの初期における抗炎症性ＳＴ２のレベルの増加は、慢性的な炎症反応を制御するための負のフィードバックループである可能性があるかもしれない。さらに、可溶性のＩＣＥが喫煙歴（パックイヤー）に大いに相関し、有害な吸引に起因する炎症の誘発を示唆していることを示すことができた。同定された血清マーカーは、ＣＯＰＤの発症および進行の危険性がある患者を特定するために役立つ。
【００７８】
実施例２：
材料および方法
患者
この実施例において用いられた患者のプールは、実施例１において用いられた患者のプールと同じであった。
【００７９】
ヒートショックプロテイン２７、６０および７０
ＨＳＰ２７、ＨＳＰ６０、およびＨＳＰ７０のレベルを、細胞内のＨＳＰの定量化に適した酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Duoset IC; R&D Systems, USA）を用いて決定した。９６ウェルマイクロタイタープレートを、１μｇ／ｍｌの濃度における捕捉抗体を用いて、４℃にて一晩、表面を覆った。プレートのブロッキングの後に、異なる濃度における血清試料および標準タンパク質をウェルに添加した。洗浄ステップの後に、ビオチン標識された抗体を、それぞれのウェルに添加し、そして１時間にわたってインキュベートした。プレートを洗浄し、そしてストレプトアビジン−ＨＲＰを添加した。着色反応をテトラメチルベンジジン（TMB; Sigma, USA）を用いて達成し、そして酸停止溶液によって停止した。光学濃度をＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍにて測定した。
【００８０】
ヒートショックプロテイン９０α
ＨＳＰ９０αの血清レベルを、市販の既製のＥＬＩＳＡキット（Stressgen, USA）を用いて測定した。つまり、抗ヒトＨＳＰ９０抗体を用いて前もって表面を覆った９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、血清試料および標準物質をインキュベートした。洗浄ステップ後に、抗ＨＳＰ９０：ＨＲＰ共役型抗体を添加し、そしてプレートを２４時間にわたってインキュベートした。プレートを洗浄し、そしてＴＭＢ基質を加えた。着色を酸停止溶液によって停止し、そして光学濃度を４５０ｎｍにて決定した。それぞれの試料におけるタンパク質の量を、既知のレベルのＨＳＰ９０に関して作成した光学濃度値の標準曲線に従って算出した。ＥＬＩＳＡの感度は、５０ｐｇ／ｍｌであると決定した；製造業者によって試験間のばらつきは１０％より小さいと述べられている。
【００８１】
２０Ｓプロテアソーム
マイクロタイタープレートを、２０Ｓプロテアソームのα６−サブユニットに対するモノクローナル抗体（Biomol, USA）を用いて、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、そしてリン酸緩衝生理食塩水における１％ＢＳＡを用いて、１時間にわたってブロッキングした。血清試料および異なる濃度の標準タンパク質（Biomol）を添加し、その後、プレートを密封し、そして４℃にて２４時間にわたってインキュベートした。検出抗体として、２０Ｓプロテアソームα／βサブユニットに対するウサギポリクローナル抗体（Biomol）を添加した；そして洗浄ステップの後で、ペルオキシダーゼ標識されたロバ抗ウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch, United Kingdom）を用いて、さらに２時間にわたってプレートをインキュベートした。テトラメチルベンジジンは、着色基質として働いた。１Ｎ硫酸を添加することによって反応を停止した。プレートを、Wallac Multilabel counter 1420（PerkinElmer, USA）を用いて４５０ｎｍにて読み取った。
【００８２】
インターロイキン−６
ＩＬ−６の血清レベルを、市販のＥＬＩＳＡキット（BenderMedSystems, Austria）を用いて決定した。検定を、製造業者の指示に従って実施した。プレートを、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４５０ｎｍにて読み取り、そして、試料の光学濃度値を、既知のＩＬ−６濃度の光学濃度値と比較することによってＩＬ−６含有量を算出した。
【００８３】
統計的方法
全ての結果を算出するために、ＳＰＳＳソフトウェア（SPSS Inc., USA）を用いた。ｐ値＜０．０５を、統計的に有意であると考えた。マン−ホイットニーＵ検定を用いて、グループ間でペアワイズ比較を行った。スピアマン相関係数を用いて相関関係を算出した。
【００８４】
結果
ＨＳＰ２７
ＨＳＰ２７の血清レベルは、健康な対照群において２０４２．５７ｐｇ／ｍｌ［１５９９．５８〜２４８５．５７］（平均値［９５％信頼区間］）、健康な喫煙者において２１９９．６４［１６４１．５２〜２７５７．７５］、ＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  Ｉ−ＩＩにおいて２８６２．６２［２２８０．４９〜３４４４．７４］、およびＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  ＩＩＩ−ＩＶにおいて３７１７．５８［３０７９．３５〜４３５５．８１］であった。健康な対照群とＣＯＰＤ  Ｉ−ＩＩとの間（ｐ＝０．０２５）、健康な対照群とＣＯＰＤ  ＩＩＩ−ＩＶとの間（ｐ＜０．００１）、健康な喫煙者とＣＯＰＤ  ＩＩＩ−ＩＶとの間（ｐ＝０．００１）、およびＣＯＰＤ  Ｉ−ＩＩとＣＯＰＤ  ＩＩＩ−ＩＶとの間（ｐ＜０．００１）には、統計的に有意な違いが見出された（図７ａ）。
【００８５】
ＨＳＰ６０
ＨＳＰ６０の血清レベルは、健康な対照群において１８３６．６９ｐｇ／ｍｌ［１５３．３０〜３５２０．０８］、健康な喫煙者において４３７８．４０［−３８５１．４８〜１２６０８．２８］、ＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  Ｉ−ＩＩにおいて３４９７．４２［−１５６１．３８〜８５５６．２３］、およびＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  ＩＩＩ−ＩＶにおいて５３１．８１［１３２．５７〜９３１．０５］であった。群間に統計的に有意な違いは見出されなかった（図７ｂ）。
【００８６】
ＨＳＰ７０
ＨＳＰ７０の血清レベルは、健康な対照群において１４０．５０ｐｇ／ｍｌ［６７．９７〜２１３．０４］、健康な喫煙者において１０８．５０［４３．３０〜１７３．６９］、ＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  Ｉ−ＩＩにおいて４５４．２９［３２７．０５〜５８１．５２］、およびＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  ＩＩＩ−ＩＶにおいて４３７．９２［１４３．４１〜７３２．４２］であった。健康な対照群とＣＯＰＤ  Ｉ−ＩＩとの間（ｐ＜０．００１）、健康な対照群とＣＯＰＤ  ＩＩＩ−ＩＶとの間（ｐ＝０．００９）、健康な喫煙者とＣＯＰＤ  Ｉ−ＩＩとの間（ｐ＜０．００１）、および健康な喫煙者とＣＯＰＤ  ＩＩＩ−ＩＶとの間（ｐ＜０．００１）において統計的に有意な違いが見出された（図７ｃ）。
【００８７】
ＨＳＰ９０α
ＨＳＰ９０αの血清レベルは、健康な対照群において１３１３３．７８ｐｇ／ｍｌ［９７９１．４０〜１６４７６．１５］、健康な喫煙者において１２８２７．９１［１０８３８．２１〜１４８１７．６２］、ＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  Ｉ−ＩＩにおいて１７８８４．５０［１３３０７．１４〜２２４６１．８５］、およびＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  ＩＩＩ−ＩＶにおいて１７２７３．０２［１２５７３．９６〜２１９７２．０８］であった。健康な対照群とＣＯＰＤ  Ｉ−ＩＩとの間（ｐ＝０．０２５）、および健康な対照群とＣＯＰＤ  ＩＩＩ−ＩＶとの間（ｐ＝０．０４９）において統計的に有意な違いが見出された（図７ｄ）。
【００８８】
２０Ｓプロテアソーム
２０Ｓプロテアソームの血清レベルは、健康な対照群において１９４．７８ｎｇ／ｍｌ［１６４．９４〜２２４．６２］、健康な喫煙者において１８８．２５［１５９．２６〜２１７．２５］、ＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  Ｉ−ＩＩにおいて１７２．３３［１３３．７８〜２１０．８８］、およびＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  ＩＩＩ−ＩＶにおいて１８７．５０［１４５．５４〜２２９．４６］であった。群間に統計的に有意な違いは見出されなかった（図７ｅ）。
【００８９】
インターロイキン−６
ＩＬ−６の血清レベルは、健康な対照群において５．１８ｐｇ／ｍｌ［０．１７〜１０．１９］、健康な喫煙者において１．６５［−０．１１〜３．４２］、ＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  Ｉ−ＩＩにおいて７．１４［１．１９〜１３．０９］、およびＣＯＰＤ  ＧＯＬＤ  ＩＩＩ−ＩＶにおいて２．９９［０．９９〜５．００］であった。健康な喫煙者とＣＯＰＤ  Ｉ−ＩＩとの間に統計的に有意な違いが見出された（ｐ＝０．０１７）。
【００９０】
相関関係および回帰モデル
ＨＳＰ、ＦＥＶ１％ＶＣおよびＩＬ−６間の相関を図８ａ〜８ｄに示す。健康な喫煙者およびＣＯＰＤを有している患者のみを含む一変量ロジスティック回帰モデルにおいて、ＨＳＰ２７は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線における曲線下面積（ＡＵＣ）が０．７６３（０．６２４〜０．９０２：９５％Ｃｌ；ｐ＝０．００４）であり、そしてＨＳＰ７０は、ＡＵＣが０．８８５（０．７８６〜０．９８３：９５％Ｃｌ；ｐ＜０．００１）であった。全ての他の変数は、一変量ロジスティック回帰検定によってもたらされる有意な結果を示さなかった（図９）。
【００９１】
結論：
慢性閉塞性肺疾患に罹患している患者は、気管支の気道、末梢の気道、および肺の実質の進行性の炎症を提示している。肺の生検は、自然免疫系および獲得免疫系の一部としての好中球、マクロファージ、およびリンパ球による、末梢気管支組織の広範囲の浸潤を明らかにした。これらの細胞の活性化は、肺の組織の再構築を引き起こすと信じられている。組織の再構築のゆっくりとした進行過程には、かなりの量の細胞の破壊が付随して起こる。ＣＯＰＤにおいて、好中球および細胞傷害性Ｔ細胞を含む両方の内因性の因子は、タバコの煙のような外因的な刺激と同様に、組織の破壊の一因となると考えられる。しかし、喫煙の停止によって、炎症性の反応の機能的な障害は変らない。
【００９２】
炎症性のシグナルの誘導および増加した細胞のターンオーバーは、細胞内のヒートショックプロテインの上方制御および細胞外環境への増大された放出をもたらす。この実施例において、健康な喫煙者と比較した場合の、ＣＯＰＤに罹患している患者の末梢の血流から取得された血清試料におけるＨＳＰ２７の有意な増加を示すことができた。ＨＳＰ２７は、アポトーシスによる細胞死の防止のみならず、細胞内のタンパク質の安定性および正確な翻訳後の折りたたみを目的とした修復機構として機能する。ＨＳＰ２７の上昇した血清レベルは、急性の冠不全症候群および慢性的な同種移植腎症を含む炎症性の障害において報告された。ＨＳＰ２７の発現は、ストレスイベントに対する応答として一時的に誘導される。急性的な誘発の終了は、ＨＳＰ２７濃度の正常レベルへの迅速な下方制御をもたらす。それゆえ、ＨＳＰ２７は、細胞保護作用が要求される場合に上方制御されるだけである。興味深いことに、結果は、疾病の重症度に付随した血清ＨＳＰ２７濃度の継続的な増加と、血清の炎症性ＩＬ−６との強い相関とを示す。この効果は、血管床へのＨＳＰ２７の全身性の漏出をもたらす、特にＣＯＰＤの後期における増加した組織の荒廃および他の臓器系への炎症性の疾患の広がりが原因であるかもしれない。ＨＳＰ２７は、一般に、抗アポトーシス媒介物として働き、そしてＣＯＰＤの臨床的な環境における過剰な炎症を制御するための、内因性の免疫抑制性の試みとして考えられ得る。さらに、ＨＳＰ２７の血清含有量は、ロジスティック回帰モデルにおいてＣＯＰＤの発症を決定するための高い感度と特異性とを示した。
【００９３】
細胞外のＨＣＰ６０の役割は十分に明らかにされていない。本明細書において提供されたデータは、ＣＯＰＤの発症機序における重要な要素であるＨＳＰ６０に関するいずれのサポートも提供していない。ＨＳＰ６０の血清濃度は、他のＨＳＰのレベルと相関しなかった。
【００９４】
ＨＳＰ７０の血清レベルは、ＣＯＰＤの初期および後期のＧＯＬＤステージにおける患者において上昇していた。症状のない喫煙者と比較したＧＯＬＤ  Ｉ−ＩＩ群において、４倍の増加が証明された。ＨＳＰ７０は、細胞死の結果としてまたは種々の分泌経路を使って細胞外の空間に放出される細胞内シャペロンである。細胞外のＨＳＰ７０は、自然免疫系および獲得免疫系の細胞を活性化し、そしてサイトカイン産生を刺激することが報告されている。ＣＯＰＤ試料における可溶性のＨＳＰ７０の増加した濃度が見出された。値は、ＣＯＰＤ  Ｉ−ＩＩ群において最大となった。これは、疾患の初期のステージにおいて最初の膨大な免疫活性化が開始することを示唆している。さらに、ＨＳＰ７０レベルは、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０αおよびＩＬ−６のレベルと有意に相関し、そしてそれゆえ、ＣＯＰＤにおける免疫活性化に付随する全身性の「危険シグナル」の一部である。さらに、ＨＳＰ２７の血清含有量は、ロジスティック回帰モデルにおいてＣＯＰＤの発症を決定するための高い感度と特異性を示した。
【００９５】
可溶性のＨＳＰ９０αは、健康な非喫煙者と比較した場合に、ＣＯＰＤ群における末梢の血流において有意に上方制御されていた。ＨＳＰ９０αの上昇したレベルは、オンポンプの冠動脈バイパス術および低酸素症後の創傷治癒において以前に示されていた。ＨＳＰ９０は、主要組織適合複合体クラスＩＩ分子（ＭＨＣＩＩ）を介したＴリンパ球に対する抗原提示における中心的な因子としても特徴付けられた。データを用いた概要において、ＣＯＰＤにおける細胞外のＨＳＰ９０αの上昇したレベルは、獲得免疫系の必須の誘導因子であり、自己抗原に対する可能性のある自己反応性の応答を引き起こす。ＨＳＰ９０αのこの機能は、関連付けられた抗原の免疫原性を変えるかもしれない。それゆえ、ＨＳＰ９０αは、主要組織適合複合体分子との関連において、関連付けられたペプチドのクロスプレゼンテーションを介した免疫調節作用を有している。
【００９６】
２０Ｓプロテアソームの細胞外の血清含有量は、調査された試験群において統計的に増加または減少していなかった。レベルは、全ての群において２００ｎｇ／ｍＬ未満にとどまり、そしてＣＯＰＤの進行において補助的に重要であるようである。
【００９７】
ＣＯＰＤを有している患者において、可溶性の免疫調節性ヒートショックプロテイン２７、７０および９０αの上昇した血清濃度をまとめることができた。血管床へのこの流出は、ＣＯＰＤの悪化における免疫系の継続的な活性化によって、内因性および外因性の誘発機構を介して、少なくとも部分的に引き起こされる。さらに、ＨＳＰ２７およびＨＳＰ７０は、ＣＯＰＤの初期のステージにおける気道の閉塞を検出する診断的マーカーとしての機能を果たすための優れた統計的な動向を示した。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】抗体Ｍ３０を用いることによって検出された、可溶性のアポトーシス特異的カスパーゼ、すなわち、切断型サイトケラチン−１８の血清濃度を示している（＋／−  ＳＥＭ）。
【図２】血清試料における、循環しているヒストン関連ＤＮＡ断片の測定された光学濃度（Ｏ．Ｄ．）値を示している（＋／−  ＳＥＭ）。
【図３】対象患者の末梢の血清試料におけるカスパーゼ−１／ＩＣＥのレベルを示している（＋／−  ＳＥＭ）。
【図４】ＣＯＰＤ  ＩおよびＩＩを有している患者において最大となった可溶性のＳＴ２の血清濃度を示している（＋／−  ＳＥＭ）。
【図５】血清試料におけるＩＬ−１０は、試験群間で違いが無いことを示したことを表している（＋／−  ＳＥＭ）。
【図６ａ】ＩＣＥの血清濃度と患者のパックイヤーの数との間の相関関係を示している。Ｒは、スピアマンの順位相関係数
【図６ｂ】循環しているヒストン関連ＤＮＡ断片と血清ＩＣＥレベルとの間の相関関係を示している。Ｒは、スピアマンの順位相関係数
【図６ｃ】ＦＥＶ１％ＶＣと血清カスパーゼ切断型サイトケラチン−１８との間の相関関係を示している。Ｒは、スピアマンの順位相関係数
【図６ｄ】抗炎症性マーカーＳＴ２とＩＬ−１０との間の相関関係を示している。Ｒは、スピアマンの順位相関係数
【図７ａ】患者および対照群の全身の血流において決定されたヒートショックプロテインの血清レベルを示している。結果は、平均値＋／−ＳＥＭとして表される。
【図７ｂ】患者および対照群の全身の血流において決定されたヒートショックプロテインの血清レベルを示している。結果は、平均値＋／−ＳＥＭとして表される。
【図７ｃ】患者および対照群の全身の血流において決定されたヒートショックプロテインの血清レベルを示している。結果は、平均値＋／−ＳＥＭとして表される。
【図７ｄ】患者および対照群の全身の血流において決定されたヒートショックプロテインの血清レベルを示している。結果は、平均値＋／−ＳＥＭとして表される。
【図７ｅ】患者および対照群の全身の血流において決定された２０ｓプロテアソームの血清レベルを示している。結果は、平均値＋／−ＳＥＭとして表される。
【図７ｆ】患者および対照群の全身の血流において決定されたヒートショックプロテインの血清レベルを示している。結果は、平均値＋／−ＳＥＭとして表される。
【図８ａ】ＨＳＰ２７と炎症性サイトカインＩＬ−６との間のノンパラメトリックな相関関係を示している。
【図８ｂ】ＨＳＰ２７と肺の機能パラメーターＦＥＷ１％ＶＣとの間のノンパラメトリックな相関関係を示している。
【図８ｃ】ＨＳＰ７０と炎症性サイトカインＩＬ−６との間のノンパラメトリックな相関関係を示している。
【図８ｄ】ＨＳＰ７０と肺の機能パラメーターＦＥＷ１％ＶＣとの間のノンパラメトリックな相関関係を示している。
【図９】喫煙している試験群においてＣＯＰＤを診断するための、ＨＳＰ２７およびＨＳＰ７０の感度および特異性を表している受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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