(57)【要約】少なくとも酢酸およびＲＦ３ポリサッカリドがＣ．ｅｌｅｇａｎｓまたはヒトにおける寿命の延長に有効である、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてＤＡＦ−１６の発現をもたらす酢酸の組成物ならびに酢酸およびＲＦ３の組成物。少なくとも酢酸およびＲＦ３ポリサッカリドを含む組成物を投与する工程、細胞表面上の少なくとも１つの受容体に組成物を提供する工程、ＤＡＦ−１６発現を増加させる工程を含む、ＤＡＦ−１６発現を調節する方法。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命およびその基礎となる機構に影響を及ぼすかどうかを決定するための試験を行うために、生体生物モデルとしてＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使用した、いくつかの抗酸化ビタミン、伝統的な漢方薬、および酢を含む一連の化合物または化合物の構成部分をスクリーニングする方法。
2011517952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも酢酸とＲＦ３ポリサッカリドとを組み合わせて含む組成物であって、前記少なくとも酢酸および前記ＲＦ３ポリサッカリドが配列番号１９に対応する配列を有するＤＡＦ−１６の発現を増加させるのに有効である、組成物。
【請求項２】
前記組成物が約５０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの酢酸を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が約１００ｐｐｍと約５００ｐｐｍとの間のＲＦ３ポリサッカリドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が約５０ｐｐｍの酢酸および約１００ｐｐｍのＲＦ３ポリサッカリドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ抽出物およびＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓ抽出物の少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも酢酸および前記ＲＦ３ポリサッカリドがＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命を延長するのに有効である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも酢酸および前記ＲＦ３ポリサッカリドがヒトの寿命を延長するのに有効である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも酢酸とＲＦ３ポリサッカリドとを組み合わせて含む組成物であって、前記少なくとも酢酸および前記ＲＦ３ポリサッカリドが配列番号１９と少なくとも７０％の配列が相同であるアミノ酸配列を保有するタンパク質の発現を増加させる、組成物。
【請求項９】
ＤＡＦ−１６発現を調節する方法であって、
少なくとも酢酸およびＲＦ３ポリサッカリドを含む組成物を投与する工程、
細胞表面上の少なくとも１つの受容体に前記組成物を提供する工程、
配列番号１９に対応する配列を有するＤＡＦ−１６の発現を増加させる工程、
を含む、方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの受容体がＴＬＲ４を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＡＦ−１６の発現を増加させる工程がＭＡＰＫ経路を活性化することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＡＦ−１６の発現を増加させる工程がＲＡＢ−１発現を増加させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＡＦ−１６の発現を増加させる工程がＰＭＫ−１発現を増加させることを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＡＦ−１６の発現を増加させる工程がＤＡＦ−２発現を阻害することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＤＡＦ−１６発現への効果について化合物をスクリーニングする方法であって、
少なくとも１つの公知の化合物をＣ．ｅｌｅｇａｎｓに投与する工程、
前記少なくとも１つの公知の化合物を投与したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命を前記少なくとも１つの公知の化合物を投与しなかったコントロールＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命と比較する工程、
前記少なくとも１つの公知の化合物を投与したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命が選択した比率で通常の寿命を超えたかどうかを決定する工程、および
前記少なくとも１つの公知の化合物がＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて少なくともＤＡＦ−１６発現を増加させたかどうかを決定する工程、
を含む、方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの公知の化合物が酢酸を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの公知の化合物がＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて少なくともＤＡＦ−１６発現を増加させたかどうかを決定する工程を、前記少なくとも１つの公知の化合物を投与したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の単離および精製されたＲＮＡサンプルの逆転写の実施によって達成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記単離および精製されたＲＮＡサンプルがＤＡＦ−２、ＤＡＦ−１６、ＴＩＲ−１、ＲＡＢ−１、およびＰＭＫ−１の少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも酢酸を組み合わせて含む組成物であって、前記少なくとも酢酸が配列番号１９に対応する配列を有するＤＡＦ−１６の発現を増加させるのに有効である、組成物。
【請求項２０】
少なくともＲＦ３ポリサッカリドを組み合わせて含む組成物であって、前記少なくともＲＦ３ポリサッカリドが配列番号１９に対応する配列を有するＤＡＦ−１６の発現を増加させるのに有効である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＭＩＮＧ−ＨＯＮＧ  ＣＨＵＡＮＧ
ＷＥＮ−ＢＩＮ  ＹＡＮＧ，
ＳＨＹＨ−ＨＯＲＮＧ  ＣＨＩＯＵ
ＣＨＩ−ＨＵＥＹ  ＷＯＮＧ  。
【０００２】
（関連出願）
この出願は、２００８年４月１７日に出願された米国仮特許出願番号第６１／０４５，９１１号、および２００９年４月１６日に出願された米国特許出願番号第１２／４２５，３１９号に対する優先権を主張し、これらは、本明細書において完全に説明されたかのように、参照によって本明細書に援用される。この出願は、２００７年９月２１日に出願され米国特許公開第２００７／０１０５８１４号として公開された米国特許出願番号第１１／５３４２０４号、および２００６年１０月１３日に出願され米国特許公開第２００７／０２３１３３９号として公開された米国特許出願番号第１１／５４９，２１５号を、本明細書において完全に説明されたかのように、参照によって援用する。
【０００３】
（開示の分野）
本開示は、ＤＡＦ−１６／ＦＯＸＯの遺伝子発現の上昇のための化合物および方法、高等生物の寿命延長を増加させる可能性についてのスクリーニング系、ならびにかかる可能性（ＤＡＦ−１６／ＦＯＸＯの遺伝子発現の上昇が含まれるが、これに限定されない）を示す化合物の同定に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
老化は、固有の際立った多様性を有する基本的過程である。老化は、他の多くの生物学的過程と同様に、進化を通じて保存されてきた経路による調節を受ける。これらの経路内の単一遺伝子の変化は劇的に寿命を延長し得、実験動物を正常であるが通常よりゆっくり老化させることができる。これらの長命変異体には異常な寿命で生存するものもある。老化研究では、２つの一般的な無脊椎動物モデル生物（すなわち、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）が広く使用されていた。
【０００５】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、特に、近年大いに研究されている線虫である。これは、温暖な地域の土壌に生息し、細菌を常食とするたった１ｍｍ長の小さな蠕虫である。これは、１つにはその短く且つ一貫した寿命（２０℃で平均１４〜２０日間）により、老化研究のために広く使用されてきた。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命調節機構は、保存されたインスリン／ＩＧＦ−１  ＤＡＦ−２シグナル伝達経路に関連することが示されている。このインスリン−シグナル伝達経路は、ＤＡＦ−２膜貫通受容体、一連の細胞内キナーゼ、およびＤＡＦ−１６タンパク質（最終的に、代謝遺伝子、シャペロン遺伝子、細胞防御遺伝子、および他の遺伝子の転写を正および負の両方に制御するように機能する）を含む。種々の抗酸化酵素（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ））の発現調節におけるＤＡＦ−１６タンパク質は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命の調節で主要な役割を果たす。このインスリン様シグナル伝達カスケードを介した寿命の調節は、進化的に保存された機構であり、ハエおよびマウスで機能することも証明されている。しかし、ＤＡＦ−１６活性はまた、核内でＪＮＫシグナル伝達経路、ＳＩＲ−２．１デアセチラーゼ、ＨＳＦ−１、ＬＩＮ−１４、およびＳＭＫ−１によって調節されることが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（概要）
以前の研究により、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｌｕｃｉｄｕｍ由来のポリサッカリド画分３（ＲＦ３）がＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）を介した免疫調節効果を保有することが示されている。ポリサッカリドＲＦ３を与えた場合、腫瘍移植マウスは長寿命を享受し、これはおそらく宿主免疫応答の活性化に起因する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにＴＬＲの何らかのオルソログが存在するかどうか、およびその機能が何であり得るかについては依然として未確定である。しかし、Ｔｏｌｌ様受容体細胞内ドメイン（ＴＩＲ−１）は、この原始的な蠕虫に存在することが明確に証明されている。ＴＩＲ−１はまた、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ中の抗菌経路に関連することが示されている。したがって、ＲＦ３は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命に有益な効果を及ぼす候補である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示の実施形態によれば、少なくとも酢酸および／またはＲＦ３ポリサッカリドを組み合わせて含む組成物であって、少なくとも酢酸および／またはＲＦ３ポリサッカリドをＤＡＦ−１６発現を調節するために投与し、ＤＡＦ−１６が配列番号１９に対応する配列を有し得る、組成物を開示する。組成物は、約５０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍの酢酸および約１００ｐｐｍと約５００ｐｐｍとの間のＲＦ３ポリサッカリドを含むことができる。組成物は、さらに、Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ抽出物およびＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓ抽出物の少なくとも１つを含むことができる。
【０００８】
本開示の実施形態によれば、少なくとも酢酸および／またはＲＦ３ポリサッカリドを含む組成物を投与する工程、細胞表面上の少なくとも１つの受容体に組成物を提供する工程、ＤＡＦ−１６発現を増加させる工程であって、ＤＡＦ−１６が配列番号１９に対応する配列を有し得る工程、を含む、ＤＡＦ−１６発現の調節方法を開示する。少なくとも１つの受容体にはＴＬＲ４が含まれ得る。ＤＡＦ−１６発現の増加誘導には、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化、ＲＡＢ−１発現の増加誘導、ＰＭＫ−１発現の増加誘導、またはＤＡＦ−２発現の阻害が含まれ得る。
【０００９】
本開示の実施形態によれば、少なくとも１つの公知の化合物をＣ．ｅｌｅｇａｎｓに投与する工程、少なくとも１つの公知の化合物を投与したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命を少なくとも１つの公知の化合物を投与しなかったコントロールＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命と比較する工程、少なくとも１つの公知の化合物を投与したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命が選択した比率で通常の寿命を超えたかどうかを決定する工程、および少なくとも１つの公知の化合物がＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて少なくともＤＡＦ−１６発現を増加させたかどうかを決定する工程を含む、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＤＡＦ−１６発現への効果について化合物をスクリーニングする方法を開示する。少なくとも１つの公知の化合物は酢酸を含むことができる。少なくとも１つの公知の化合物がＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて少なくともＤＡＦ−１６発現を増加させたかどうかを決定する工程を、少なくとも１つの公知の化合物を投与したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の単離および精製したＲＮＡサンプルの逆転写の実施によって達成することができる。単離および精製したＲＮＡサンプルは、ＤＡＦ−２、ＤＡＦ−１６、ＴＩＲ−１、ＲＡＢ−１、およびＰＭＫ−１の少なくとも１つを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
（図面）
本開示の上記特徴および目的は、添付の図面と共に用いられる以下の説明を参照してより明らかになる。図中、同等の参照番号は同等の要素を示す。
【図１】図１Ａ〜Ｃは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命に及ぼす試験物質の効果を示すグラフである。示した生存曲線は、表示の物質での処理後に分析した種々の蠕虫組を示す。（Ａ）水（コントロール）、酢酸（５０ｐｐｍ）、および種々のビタミン（５０ｐｐｍ）で処理した蠕虫。（Ｂ）水（コントロール）、酢酸（５０ｐｐｍ）、およびＲＦ３（１００ｐｐｍ）で処理した蠕虫。（Ｃ）水（コントロール）および東洋の異なる種の薬用キノコ由来のポリサッカリド画分（１００ｐｐｍ）で処理した蠕虫。寿命測定実験を２０℃で行った。各生存率（％）を、表示時点での、最初の蠕虫数に対する生存蠕虫数の比から計算した。統計的Ｐ値を、表示物質で処理した各実験群から計算し、同一時点でのコントロール群と直接比較した。分析を三連で行い、類似の結果が得られ、＊Ｐ＜０．０１を使用して分析した。濃度を、重量／体積（ｗ／ｖ）比に基づいたｐｐｍ（１００万分率）で示した。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、処理２日後のＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＤＡＦ−２、ＤＡＦ−１６、ＴＩＲ−１、ＲＡＢ−１、ＰＭＫ−１、およびＣＬＫ−１  ｍＲＮＡの転写物の半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）検出である。各遺伝子の特異的プライマー（表１に列挙）を反応で使用し、ＡＣＴ−１を内部コントロールとして使用した。遺伝子の発現レベルの比較は、全ＲＴ−ＰＣＲデータにおいて内部コントロールに対する正規化に基づいて行った。（Ａ）処理後のＤＡＦ−１６発現。（上のパネル）Ｃ：コントロール；Ｆ：ＲＦ３（１００ｐｐｍ）；Ａ：酢酸（５０ｐｐｍ）；（下のパネル）Ｃ：コントロール；Ｆ３：ＲＦ３（１００ｐｐｍ）；ＡＣ：Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ菌糸の粗抽出物（１００ｐｐｍ）；ＨＥ：Ｈ．ｅｒｉｎａｃｅｕｓ菌糸の粗抽出物（１００ｐｐｍ）；（Ｂ）処理後のＤＡＦ−２およびＴＩＲ−１の発現。Ｃ：コントロール；Ｆ３：ＲＦ３（１００ｐｐｍ）；ＡＣ：Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ菌糸の粗抽出物（１００ｐｐｍ）；ＨＥ：Ｈ．ｅｒｉｎａｃｅｕｓ菌糸の粗抽出物（１００ｐｐｍ）；（Ｃ）ＲＦ３（１００ｐｐｍ）あり（Ｆ）またはなし（Ｎ）での２日間のＣ．ｅｌｅｇａｎｓのインキュベーション後のＤＡＦ−１６、ＣＬＫ−１、ＴＩＲ−１、ＲＡＢ−１、およびＰＭＫ−１の発現。ＲＡＢ−１およびＰＭＫ−１は、ＭＡＰＫ経路中に存在する２つの重要な遺伝子である。矢印はＲＦ３処理後の表示遺伝子の転写レベルの上昇を示し、横線はＲＦ３処理後のｍＲＮＡ転写に変化がないことを示す。（Ｄ）ＲＦ３刺激に応答したＴＩＲ−１およびＤＡＦ−１６のｍＲＮＡ転写の経時分析。全実験を三連で行った。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、ＲＦ３で処理したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命に及ぼすＲＮＡｉによる遺伝子ノックアウト実験の結果を示すグラフである。材料および方法に記載のようにＤＡＦ−１６遺伝子およびＴＩＲ−１遺伝子に特異的なＲＮＡｉ細菌を含むプレートを使用して寿命を測定した。（Ａ）コントロール蠕虫と比較すると、ＤＡＦ−１６  ＲＮＡｉは寿命を約２５％短縮した一方で、ＴＩＲ−１  ＲＮＡｉは寿命を約１８％延長させた。（Ｂ）ＤＡＦ−１６をターゲティングするＲＮＡｉにより、ＲＦ３処理による延命が完全に阻止された。ＲＦ３およびＤＡＦ−１６  ＲＮＡｉの両方で処理した蠕虫は、野生型コントロール群に類似の寿命を有していた。他方では、ＴＩＲ−１  ＲＮＡｉは、ＲＦ３で処理した蠕虫の延命に対してより弱い影響を示した。上記蠕虫はＴＩＲ−１をノックアウトしていない蠕虫より短い寿命を有していたが、コントロール群よりも依然として遥かに長く生存した（１８％超）。実験を三連で行い、結果を＊Ｐ＜０．０１を使用して分析した。注目すべきは、ＴＩＲ−１の活性化がＲＦ３処理によるＤＡＦ−１６媒介延命のための排他的シグナル伝達経路上に存在する可能性が低いことである。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける寿命調節および遺伝子発現に及ぼすＲＦ３およびＬＰＳの影響を示す。（Ａ）濃度１００ｐｐｍおよび５００ｐｐｍのＲＦ３および濃度１０ｐｐｍのＬＰＳで処理した蠕虫の寿命測定。通常の蠕虫（Ｎ、コントロール群）と比較して、１０ｐｐｍ  ＬＰＳで処理した蠕虫で寿命が約１３％短縮され、１００ｐｐｍ  ＲＦ３で３５％延命された。５００ｐｐｍのＲＦ３処理では１００ｐｐｍより寿命に及ぼす効果が弱かったことに留意すべきである。（Ｂ）５０ｐｐｍ酢酸（Ａ）、１００ｐｐｍ  ＲＦ３（Ｆ）、および１０ｐｐｍ  ＬＰＳ（Ｌ）で処理したｔｉｆ−１およびＤＡＦ−１６  ｍＲＮＡ転写レベルの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｃ）ＲＮＡｉによるＴＩＲ−１のノックアウトあり（白抜きのバー）またはなし（黒塗りのバー）での１００ｐｐｍ  ＲＦ３または１０ｐｐｍ  ＬＰＳでの処理後のＴＩＲ−１、ＤＡＦ−１６、およびＲＡＢ−１  ｍＲＮＡレベルのリアルタイムｑ−ＰＣＲ分析（＊Ｐ値＜０．０１、独立両側ｔ検定を使用した分析；エラーバー、ｓ．ｄ．）。半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムｑ−ＰＣＲ実験の両方についてｎ＝４。
【図５】図５は、酢酸ならびにレイシ（Ｒｅｉｓｈｉ（ＲＦ３））、それぞれＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａおよびＨ．ｅｒｉｎａｃｅｕｓ由来のポリサッカリド画分で処理したＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＤＡＦ−１６媒介寿命延長効果に関与する細胞シグナル伝達経路についてのスキームの略図である。上下の矢印は、シグナル伝達経路に関与する遺伝子の上方制御または下方制御を示す。酢酸およびＨ．ｅｒｉｎａｃｅｕｓについては、ＭＡＰＫ経路は見かけ上関連しないようである。その寿命延長促進効果は、おそらく、いくつかの未知の因子または細胞受容体を使用したいくつかの未同定の下流シグナル伝達調節によって、ＤＡＦ−２発現を減少させＤＡＦ−１６発現を間接的に増加させる経路によって媒介された。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命に及ぼす酢酸およびＲＦ３の相乗効果を示すグラフである。（Ａ）異なる比率または濃度でのＲＦ３と酢酸との混合物の効果。異なる比率の酢酸とＲＦ３との種々の混合物は全て、単独使用したいずれかの物質よりも高い活性を保有することを明確に示す。５０ｐｐｍの酢酸および１００ｐｐｍのＲＦ３を含む混合物を使用して最適な結果が得られた。（Ｂ）ＲＦ３（１００ｐｐｍ）と酢酸（５０ｐｐｍ）との混合物の長期安定性。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて試験した場合、２週間の静置後でさえ、混合物は依然として新たに調製したＲＦ３溶液と同一の活性を維持していた。生存率曲線下の表は、コントロール群と比較した酢酸とＲＦ３との種々の混合物についての延命力を一覧にしている。示した全ての値は、三連の実験から計算した平均±ＳＤである。
【図７】図７は、配列番号１〜１４によって識別した、反応で使用した各遺伝子の特異的プライマーを示す表である。図２Ａ〜Ｄに示すように、ＡＣＴ−１を、処理２日後のＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＤＡＦ−２、ＤＡＦ−１６、ＴＩＲ−１、ＲＡＢ−１、ＰＭＫ−１、およびＣＬＫ−１  ｍＲＮＡの転写物のＲＴ−ＰＣＲ検出の内部コントロールとして使用した。
【図８】図８は、図９Ａ〜Ｄに示すような、酢酸およびレイシポリサッカリド画分ＲＦ３で処理したＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて異なって発現したタンパク質のリストを示す表である。
【図９−１】図９Ａ〜Ｄは、ＲＦ３（１００ｐｐｍ）、酢酸（５０ｐｐｍ）、またはこれら２つの混合物で処理したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの２−ＤＥゲルパターンの比較を示す。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの溶解物由来の全タンパク質１５０μｇを、ＩＰＧゲルストリップ（ｐＨ３〜１０、１３ｃｍ）上にロードした。ＩＥＦ後のＩＰＧストリップを再水和し、２−ＤＥに供した。処理なしのコントロール（Ａ）、酢酸での処理（Ｂ）、ＲＦ３での処理（Ｃ）、およびこれらの混合物での処理（Ｄ）についてのＣ．ｅｌｅｇａｎｓの２−ＤＥタンパク質プロフィールを得た。マップ上に１〜１５番とマークしたタンパク質スポットは異なって発現することが見出された。これらを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによってさらに同定し、図８の表中に列挙した。２ＤＥ−ゲル画像を、蛍光画像スキャナＴｙｐｈｏｏｎ９４００を使用してスキャンし、ＰＤＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。各ゲル中のタンパク質スポットの強度レベルを、ゲル全体について検出された全タンパク質強度の比率としてゲル間で正規化した。
【図９−２】図９Ａ〜Ｄは、ＲＦ３（１００ｐｐｍ）、酢酸（５０ｐｐｍ）、またはこれら２つの混合物で処理したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの２−ＤＥゲルパターンの比較を示す。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの溶解物由来の全タンパク質１５０μｇを、ＩＰＧゲルストリップ（ｐＨ３〜１０、１３ｃｍ）上にロードした。ＩＥＦ後のＩＰＧストリップを再水和し、２−ＤＥに供した。処理なしのコントロール（Ａ）、酢酸での処理（Ｂ）、ＲＦ３での処理（Ｃ）、およびこれらの混合物での処理（Ｄ）についてのＣ．ｅｌｅｇａｎｓの２−ＤＥタンパク質プロフィールを得た。マップ上に１〜１５番とマークしたタンパク質スポットは異なって発現することが見出された。これらを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによってさらに同定し、図８の表中に列挙した。２ＤＥ−ゲル画像を、蛍光画像スキャナＴｙｐｈｏｏｎ９４００を使用してスキャンし、ＰＤＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。各ゲル中のタンパク質スポットの強度レベルを、ゲル全体について検出された全タンパク質強度の比率としてゲル間で正規化した。
【図１０−１】図１０（ａ）〜（ｄ）は、（ａ）１６種のタンパク質（ヒトＦＯＸＯタンパク質ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３ａ、およびＦＯＸＯ４、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＤＡＦ−１６、ならびにマウスＦｏｘａ３）のフォークヘッドドメインの多重配列アラインメントから計算した系統樹；（ｂ）哺乳動物ＦＯＸＯタンパク質と同一の方向に３つのＰＫＢリン酸化部位を有するｄＦＯＸＯ（この部位をタンパク質上に示した）。ＰＥＳＴ配列（破壊）、核局在化配列（ＮＬＳ）、核外輸送配列（ＮＥＳ）、およびＤＮＡ結合配列も示す；（ｃ）ｄＦＯＸＯ、ヒトＦＯＸＯ、およびＤＡＦ−１６のフォークヘッドドメインの複数のアミノ酸配列アラインメント（アラインメント上に二次構造を示し、類似および同一のアミノ酸残基にそれぞれ灰色および黒で陰をつけた）；および（ｄ）３１キロベース（ｋｂ）のゲノム領域にわたり、且つ１１個のエクソン（灰色のバー）を含むｄＦＯＸＯ遺伝子を示す。
【図１０−２】図１０（ａ）〜（ｄ）は、（ａ）１６種のタンパク質（ヒトＦＯＸＯタンパク質ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３ａ、およびＦＯＸＯ４、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＤＡＦ−１６、ならびにマウスＦｏｘａ３）のフォークヘッドドメインの多重配列アラインメントから計算した系統樹；（ｂ）哺乳動物ＦＯＸＯタンパク質と同一の方向に３つのＰＫＢリン酸化部位を有するｄＦＯＸＯ（この部位をタンパク質上に示した）。ＰＥＳＴ配列（破壊）、核局在化配列（ＮＬＳ）、核外輸送配列（ＮＥＳ）、およびＤＮＡ結合配列も示す；（ｃ）ｄＦＯＸＯ、ヒトＦＯＸＯ、およびＤＡＦ−１６のフォークヘッドドメインの複数のアミノ酸配列アラインメント（アラインメント上に二次構造を示し、類似および同一のアミノ酸残基にそれぞれ灰色および黒で陰をつけた）；および（ｄ）３１キロベース（ｋｂ）のゲノム領域にわたり、且つ１１個のエクソン（灰色のバー）を含むｄＦＯＸＯ遺伝子を示す。
【図１０−３】図１０（ａ）〜（ｄ）は、（ａ）１６種のタンパク質（ヒトＦＯＸＯタンパク質ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３ａ、およびＦＯＸＯ４、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＤＡＦ−１６、ならびにマウスＦｏｘａ３）のフォークヘッドドメインの多重配列アラインメントから計算した系統樹；（ｂ）哺乳動物ＦＯＸＯタンパク質と同一の方向に３つのＰＫＢリン酸化部位を有するｄＦＯＸＯ（この部位をタンパク質上に示した）。ＰＥＳＴ配列（破壊）、核局在化配列（ＮＬＳ）、核外輸送配列（ＮＥＳ）、およびＤＮＡ結合配列も示す；（ｃ）ｄＦＯＸＯ、ヒトＦＯＸＯ、およびＤＡＦ−１６のフォークヘッドドメインの複数のアミノ酸配列アラインメント（アラインメント上に二次構造を示し、類似および同一のアミノ酸残基にそれぞれ灰色および黒で陰をつけた）；および（ｄ）３１キロベース（ｋｂ）のゲノム領域にわたり、且つ１１個のエクソン（灰色のバー）を含むｄＦＯＸＯ遺伝子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（詳細な説明）
いくつかの例示的実施形態において、酢酸、ＲＦ３ポリサッカリド、Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ抽出物、およびＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓ抽出物の少なくとも１つを含む組成物を開示する。かかる組成物を投与してＤＡＦ−１６発現を調節することができる。ＤＡＦ−１６発現の増加は寿命延長の増大に関連すると考えられる。
【００１２】
組成物をＤＡＦ−１６発現を調節するために被験体に投与することができる。組成物が酢酸を含む実施形態において、酢酸は、組成物の約５０ｐｐｍ〜約１００ｐｐｍを構成することができる。組成物がＲＦ３ポリサッカリドを含む実施形態において、ＲＦ３ポリサッカリドは組成物の約１００ｐｐｍと約５００ｐｐｍとの間を構成することができる。
【００１３】
いくつかの例示的実施形態において、組成物は、ＲＦ３ポリサッカリド抽出物またはＡｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ抽出物を含むことができる。投与した場合、ＲＦ３ポリサッカリドまたはＡｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅを含む組成物は、細胞の１つまたは複数の受容体に作用してＭＡＰＫ経路を活性化させ、それにより、ＤＡＦ−１６発現が増加すると考えられる。ＭＡＰＫ経路は、ＰＭＫ−１およびＤＡＦ−１６の発現をもたらすＴＩＲ−１およびＲＡＢ−１の発現によって活性化され得、または、ＲＡＢ−１、ＰＭＫ−１、およびＤＡＦ−１６の発現をもたらす別の機構によって活性化され得る。したがって、ＲＦ３ポリサッカリドまたはＡｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅを含む組成物は、少なくともＴＩＲ−１、ＲＡＢ−１、ＰＭＫ−１、およびＤＡＦ−１６の発現を増加させると考えられる。
【００１４】
いくつかの例示的実施形態において、組成物は、酢酸またはＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓ抽出物を含むことができる。投与した場合、酢酸またはＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓを含む組成物は、細胞の１つまたは複数の受容体に作用してＤＡＦ−２発現を阻害し、それにより、ＤＡＦ−１６発現を増加させると考えられる。
【００１５】
酢酸およびＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓが作用する少なくともいくつかの受容体は、ＲＦ３ポリサッカリドおよびＡｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅが作用する少なくともいくつかの受容体と異なると考えられる。同様に、本明細書中に考察されるように、別の経路によってＤＡＦ−１６発現を増加させることができる。酢酸およびＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓの少なくとも１つ、ならびにＲＦ３ポリサッカリドおよびＡｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅの少なくとも１つを含む組成物は、より高いＤＡＦ−１６発現を引き起こすことができる。例えば、少なくとも酢酸およびＲＦ３ポリサッカリドを含む組成物を投与してＤＡＦ−１６発現を調製することができる。
【００１６】
いくつかの例示的実施形態において、ＤＡＦ−１６発現の制御方法を使用することができる。本方法は、少なくとも酢酸およびＲＦ３ポリサッカリドを含む組成物を投与する工程、細胞表面上の少なくとも１つの受容体に組成物を提供する工程、およびＤＡＦ−１６発現を増加させる工程を含む。組成物は、ＴＩＲ−１の発現に続くＲＡＢ−１の発現によってまたは何らかの他の機構によってＭＡＰＫ経路を活性化する受容体に対して作用することができる。ＭＡＰＫ経路の活性化は、少なくともＰＭＫ−１の発現を含むことができる。組成物はまた、ＤＡＦ−２発現を阻害する受容体に対して作用し得、それにより、ＤＡＦ−１６発現を増加させ得る。
【００１７】
いくつかの例示的実施形態における、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命およびその基礎をなす機構に影響を及ぼすかどうかについてのデータを取得するための、抗酸化ストレス作用があるとか免疫を高めるかまたは増強するとして促されている一連の市販の栄養補助食品（いくつかの抗酸化ビタミン、伝統的な漢方薬、および酢が含まれる）のスクリーニング方法。
【００１８】
本開示のいくつかの例示的実施形態において、種々の化合物の寿命延長可能性を試験および評価するための生体モデル生物としてＣ．ｅｌｅｇａｎｓを使用した化合物スクリーニング系を開示する。１つの態様では、上記生体モデルの寿命への効果について天然物質群をスクリーニングする。
【００１９】
いくつかの例示的実施形態における、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＤＡＦ−１６発現への効果について化合物をスクリーニングする方法。この方法は、少なくとも１つの公知の化合物をＣ．ｅｌｅｇａｎｓに投与する工程、少なくとも１つの公知の化合物を投与したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命を少なくとも１つの公知の化合物を投与しなかったコントロールＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命と比較する工程、少なくとも１つの公知の化合物を投与したＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命が選択した比率で通常の寿命を超えたかどうかを決定する工程、および少なくとも１つの公知の化合物がＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて少なくともＤＡＦ−１６発現を増加させたかどうかを決定する工程を含むことができる。少なくとも１つの公知の化合物は酢酸を含むことができる。少なくとも１つの公知の化合物がＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて少なくともＤＡＦ−１６発現を増加させたかどうかを決定する工程を、少なくとも１つの公知の化合物を投与したＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の単離および精製したＲＮＡサンプルの逆転写の実施によって達成することができる。単離および精製したＲＮＡサンプルは、ＤＡＦ−２、ＤＡＦ−１６、ＴＩＲ−１、ＲＡＢ−１、およびＰＭＫ−１の少なくとも１つを含むことができる。
【００２０】
別の態様によれば、酢酸、ＲＦ３ポリサッカリド、Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ抽出物、およびＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓ抽出物の少なくとも１つを含む組成物を、本開示を読んだ際に当業者が同定可能なさらなる活性薬剤、キャリア、ビヒクル、賦形剤、または助剤と共に、医薬組成物または栄養補助組成物中に含めることができる。
【００２１】
医薬組成物または栄養補助組成物は、好ましくは、少なくとも１つの薬学的に許容可能なキャリアを含む。かかる医薬組成物では、酢酸、ＲＦ３ポリサッカリド、Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ抽出物、およびＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓ抽出物の少なくとも１つを含む組成物は、「活性薬剤」とも呼ばれる「活性化合物」を形成する。本明細書中で使用する場合、用語「薬学的に許容可能なキャリア」には、薬学的投与に適合可能な、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などが含まれる。補助活性化合物を、組成物に組み込むこともできる。意図する投与経路に適合するように薬学的組成物を処方する。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（局所）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下への適用のために使用される溶液または懸濁物には以下の成分が含まれ得る：無菌希釈剤（注射用蒸留水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒など）；抗菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）；緩衝液（酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはリン酸緩衝液など）、および張性を調整するための薬剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）。酸または塩基（塩酸または水酸化ナトリウムなど）を使用してｐＨを調整することができる。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量バイアルに封入することができる。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、被験体は、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えば、ゴリラ（ｇｕｅｒｉｌｌａ）、マカク、マーモセット）、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、およびブタ）、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野性動物（例えば、キツネ、シカ）、および本開示の薬剤から利益を得ることができる任意の他の生物をいう。本明細書中に記載の薬剤から利益を得ることができる動物のタイプに制限はない。ヒトであるか非ヒト生物であるかとは無関係に、被験体を、患者、個体、動物、宿主、またはレシピエントということができる。
【００２３】
注射での使用に適切な医薬組成物には、滅菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射液もしくは分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌化注射用蒸留水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は無菌であるべきであり、且つ容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流体であるべきである。この組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されるべきである。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにこれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなど）によって達成することができる。多くの場合、組成物に、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）または塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによって達成され得る。
【００２４】
滅菌注射液を、必要に応じ、必要量の活性化合物を上に列挙した成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に組み込み、次いで濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散液を、基本的な分散媒および上で列挙されたものからの必要な他の成分を含む無菌のビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、前もって濾過滅菌された溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥を含む。
【００２５】
経口組成物は、一般に、不活性の希釈剤または可食キャリアを含む。経口による治療的投与の目的のために、活性化合物を、賦形剤を使用して組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態で使用することができる。経口組成物を、うがい薬としての使用のために、流体キャリアを使用して調製することもできる。薬学的に適合可能な結合剤またはアジュバント物質を、上記組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、およびトローチなどは、以下の任意の成分または類似の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなど）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトースなど）、崩壊剤（アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなど）；潤滑剤（ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなど）；流動促進剤（コロイド状二酸化ケイ素など）；甘味剤（スクロースまたはサッカリンなど）；または矯味矯臭薬（ペパーミント、メチルサリチレート、またはオレンジフレーバーなど）。
【００２６】
吸入による投与のために、化合物を、適切な噴霧体（例えば、二酸化炭素などのガス）含む加圧容器もしくはディスペンサーまたは噴霧器からのエーロゾルスプレーの形態で送達する。
【００２７】
全身投与はまた、経粘膜投与または経皮投与であり得る。経粘膜投与または経皮投与のためには、透過されるべきバリアに適切な浸透剤を処方物で使用する。かかる浸透剤は、当該分野で一般的に公知であり、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与を、鼻内噴霧または坐剤の使用によって達成することができる。経皮投与のために、活性化合物を、当該分野で一般的に公知の軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ、ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに処方する。化合物を、直腸送達のための坐剤（例えば、カカオ脂および他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使用）または停留浣腸の形態で調製することもできる。
【００２８】
実施形態によれば、活性化合物は、移植片およびマイクロカプセル化送達系を含む徐放性処方物のような、身体からの急速な排出に対してその化合物を保護するキャリアと共に調製される。生分解可能な生体適合性のポリマー（エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など）を使用することができる。かかる製剤の調製方法は、当業者に明らかである。物質を、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入することもできる。リポソーム懸濁物（細胞特異的抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞にターゲティングされるリポソームを含む）を、薬学的に受容可能なキャリアとして使用することもできる。これらを、当業者に公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（本明細書中で参照により援用される）に記載）にしたがって調製することができる。
【００２９】
投与を容易にし、そして投薬を均一にするために、単位投薬形態で経口組成物または非経口組成物を処方することが有利である。本明細書中で使用する場合、単位投薬形態は、処理（処置）される被験体のための単位投薬に適切な物理的に別個の単位をいい、各単位は、必要とされる薬学的キャリアと組み合わせて所望の治療効果を生じるように算出された活性化合物の所定の量を含む。
【００３０】
かかる化合物の毒性および治療効能を、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療有効性を示す用量）の決定のための手順によって決定することができる。有毒作用と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を使用することができるが、非感染細胞に対する潜在的傷害を最小にし、それにより副作用を軽減するように、罹患部位にかかる化合物をターゲティングする送達系をデザインするように注意を払うべきである。
【００３１】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータを、ヒトで用いる投薬量の範囲を処方するのに使用することができる。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、ＥＤ５０を含むが毒性がほとんどないか全くない循環血中濃度の範囲内である。投薬量は、使用する投薬形態および使用する投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本開示の方法で使用される任意の化合物に対して、治療有効用量を、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害が達成される試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて用量を処方することができる。かかる情報を使用して、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。血漿でのレベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定することができる。
【００３２】
本明細書中で定義されるように、活性化合物の治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、約０．００１〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲であり得、または過度の実験を行うことなく明らかであり且つ当業者によって理解される他の範囲であり得る。当業者は、一定の要因が被験体の有効な治療に必要な投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得、その要因としては、疾患または障害の重症度、以前受けた治療、被験体の一般的健康状態または年齢、他の疾患の存在が挙げられるが、これらに限定されないと認識する。
【００３３】
別の態様によれば、当業者は１つまたは複数の部品のキット（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔ）を想定することができる。この部品のキットは本明細書中に開示の方法の少なくとも１つを行うためのものである。部品のキットは２つ以上の組成物を含み、この組成物は、上記方法の少なくとも１つにしたがって、酢酸、ＲＦ３ポリサッカリド、Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ抽出物、およびＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓ抽出物の少なくとも１つを単独または組み合わせて有効量で含む。
【００３４】
キットは、おそらく、酢酸、ＲＦ３ポリサッカリド、Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ抽出物、およびＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓ抽出物以外の活性薬剤、生物学的事象の識別物、または本開示を読んだ際に当業者が同定することができる他の化合物を含む組成物も含む。用語「識別物」は、当業者が同定することができる手順で生物学的事象の存在、実在、または事実を発見または決定することができるか、そうでなければ検出することができる、分子、代謝産物、または他の化合物（抗体、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドなど）をいう。例示的な識別物は抗体であり、例示的手順はウェスタンブロット、亜硝酸塩アッセイ、およびＲＴ−ＰＣＲ、または実施例に記載の他の手順である。
【００３５】
キットはまた、有効量の、酢酸、ＲＦ３ポリサッカリド、Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ抽出物、およびＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓ抽出物、または細胞株の少なくとも１つを含む少なくとも１つの組成物を含むことができる。当業者が同定可能な手順にしたがって本明細書中に開示の少なくとも１つの方法を実施するために使用すべき部品のキットの組成物および細胞株。
【００３６】
本出願で使用する場合、「ＤＡＦ−１６」は、配列番号１９と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性、またはそれを超えるか、もしくは完全な（１００％）配列同一性を有する核酸、核酸産物、またはタンパク質を意味する。当業者は、本開示の実施による組成物および方法は種々の配列（配列番号１９とある程度の相同性を有する配列を含む）に関連するので有効であり得ると認識する。さらに、当業者は、用語「ＤＡＦ−１６」が当業者に公知であり且つ他の名称にて理解されていること、一般的特徴が配列番号１９との実質的な相同性であることを容易に認識する。
【００３７】
本出願で使用する場合、「ＡＣＴ−１」、「ＣＬＫ−１」、「ＤＡＦ−２」、「ＰＭＫ−１」、「ＲＡＢ−１」、および「ＴＩＲ−１」は、核酸、核酸産物、または核酸、核酸産物に対応するタンパク質、または当業者に一般に公知のタンパク質を意味する。
【００３８】
寿命延長促進性を有するといわれている天然産物の試験およびスクリーニングのために、野生型Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｎ２）を生体モデル生物として使用した。各寿命を、選択した天然物質および市販の健康食品製品の存在下または非存在下で測定した。これらには、ビタミン（ビタミンＥおよびＣ、ビタミンＢ複合体群など）、市販の酢、および酢酸（酢中に見出される一成分である）、さらに、いくつかの食用キノコ抽出物（ＲＦ３など）ならびにＡｎｔｒｏｄｉａ  ｃａｍｐｈｏｒａｔｅおよびＨｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓ（ヤマブシタケ（ｌｉｏｎ’ｓ  ｍａｎｅ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ））の菌糸体画分が含まれていた。寿命測定により、ネガティブコントロール群（処理なし）と比較した場合に上記物質のいくつかを使用した処理によって有意に延命された（図１）ことが示された。
【００３９】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに対して同時に試験した安息香酸およびクエン酸とは対照的に、酢酸は延命効果を示し、高等生物で使用される可能性がある。ＲＦ３ポリサッカリド画分（Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａ、およびＨ．ｅｒｉｎａｃｅｕｓ）も延命効果を示し、高等生物で使用される可能性がある。しかし、ビタミン群はＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて有意な寿命延長効果を示さないようであった。
【００４０】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける延命効果の基礎をなす機構をさらに調査した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いた一連の実験を行って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるいくつかの標的遺伝子の転写プロフィールの分析を実行した。これらの標的遺伝子には、ＤＡＦ−２およびＤＡＦ−１６（寿命決定で直接的役割を果たす経路に関与することが示された）ならびに３つの遺伝子ＴＩＲ−１、ＲＡＢ−１、およびＰＭＫ−１（宿主病原体免疫系のＴｏｌｌ様受容体およびＭＡＰＫ経路に関連する）が含まれる。図２Ａに示すように、３つ全てのキノコ抽出物および酢酸により、ＤＡＦ−１６発現が有意に増加した。以前の研究では、ＤＡＦ−１６の増加が抗酸化酵素（ＳＯＤなど）発現の活性化によって酸化的損傷から細胞を防御し得、それにより、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを延命することができることが示されている。したがって、この所見は、これらのキノコ抽出物がＤＡＦ−１６の誘導によって延命することができることを確証した。多数の研究によってＤＡＦ−１６誘導がＤＡＦ−２機能の減少または喪失に起因すると考えられていたにもかかわらず、試験した３つのキノコ抽出物のうちのたった１つのみ（Ｈ．ｅｒｉｎａｃｅｕｓ）が実際にＤＡＦ−２発現を減少させた。ＲＦ３およびＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａのいずれもＤＡＦ−２発現を有意に減少させなかったが、これらは共にＴＩＲ−１発現を顕著に刺激した（図２Ｂ）。ＴＩＲ−１活性化がＭＡＰＫ経路の活性化に先立っていたかどうかを理解するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＦ３処理後のＲＡＢ−１およびＰＭＫ−１の転写レベルをさらに分析した。その結果、ＲＦ３によるＴＩＲ−１刺激後にＭＡＰＫ経路が活性化されたことが明らかに示唆された。ＣＬＫ−１遺伝子発現（ＤＡＦ−１６発現調節に関与し、おそらくミトコンドリアエネルギー依存経路に関連する別の重要な要因である）もチェックした。ＣＬＫ−１  ｍＲＮＡシグナルの増強は認められなかった（図２Ｃ）。経時研究により、ＲＦ３処理後の第１日目にＴＩＲ−１は最大に誘導されたのに対して、ＤＡＦ−１６の最大誘導レベルは２日目に観察された（図２Ｄ）ことも明らかとなった。
【００４１】
次いで、ＲＦ３ポリサッカリドによって刺激した場合にＴＩＲ−１発現の増加がＤＡＦ−１６誘導の排他的且つ直接的な原因であったかどうか試験するために、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命に及ぼすＲＦ３の効果をＴＩＲ−１またはＤＡＦ−１６  ＲＮＡｉ細菌での処理によって分析した（図３）。結果は、ＤＡＦ−１６発現のノックアウトがＲＦ３の延命効果を完全に消失させ得、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命をその元の寿命に戻し得ることを示した。ＲＦ３の寿命延長促進効果がＴＩＲ−１  ＲＮＡｉでの処理によって低減したにもかかわらず、処理したＣ．ｅｌｅｇａｎｓは依然として処理無しの蠕虫またはＲＦ３およびＤＡＦ−１６  ＲＮＡｉで処理した蠕虫よりも長い寿命を達成した。これは、ＲＦ３ポリサッカリドに応答するＣ．ｅｌｅｇａｎｓの受容体がＴＩＲ−１に関連する受容体に限定されないという事実を示した。したがって、本明細書中に報告したＲＦ３の寿命延長効果に関連する他の依然として同定されていない受容体がおそらく存在する。
【００４２】
いくつかの以前の報告によれば、ＲＦ３は、ＴＬＲ４受容体への結合を介して動物における免疫調節を刺激し得、細菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）内毒素と同一の経路を開始することができる。したがって、ＲＦ３ポリサッカリドおよびＥ．ｃｏｌｉ由来のＬＰＳがＴＩＲ−１媒介ＭＡＰＫ活性化に同一の効果を及ぼし、それにより、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＤＡＦ−１６が発現するかどうかについても調査した（図４Ａ〜Ｃ）。蠕虫へのＲＮＡｉ細菌の投与およびその後のｍＲＮＡレベルのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ検出により、ＲＦ３およびＬＰＳの両方がＴＩＲ−１発現を同様の程度に（ＬＰＳがわずかに高い）誘導することができることが明らかとなった。しかし、ＲＦ３がＤＡＦ−１６発現を有意に誘導した一方で、その発現はＬＰＳによって類似の条件下で強く阻害された（図４Ｂ）。さらに、ＴＩＲ−１のノックアウト後、ＬＰＳによるＤＡＦ−１６の抑制は弱くなった（図４Ｃの右）。一方、どのような処理を適用しようとも、ＴＩＲ−１発現が阻害された場合にＲＡＢ−１発現は常に増加した（図４Ｃの下）。ＲＦ３と同一の条件下でＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａを使用した場合、ＲＦ３と同一の結果が得られた（データ示さず）。したがって、ＲＦ３およびＡ．ｃａｍｐｈｏｒａｔａが寿命延長を促進する機構が類似し得ると考えられる。したがって、ポリサッカリド画分ＲＦ３が細胞表面上の少なくとも２つの異なるタイプの受容体に結合すると示唆される。受容体の１つがＴＩＲ−１発現を増加させ、それにより、シグナルが下流に伝達され、ＲＡＢ−１発現が減少するように調節された。しかし、これらは同時に別の未知の受容体にも結合することができ、ＲＡＢ−１発現およびその後のＭＡＰＫ経路活性化を誘導し、ＤＡＦ−１６活性を増加させＣ．ｅｌｅｇａｎｓを延命することができるであろう。酢酸およびＨ．ｅｒｉｎａｃｅｕｓに対しては、ＭＡＰＫ経路は見かけ上関与しなかった。その寿命延長促進効果は、おそらく、いくつかの未同定の下流シグナル伝達調節によってＤＡＦ−２発現を減少させ、ＤＡＦ−１６発現を間接的に増加させる経路によって媒介された（図５）。
【００４３】
酢酸およびＲＦ３の両方は、異なる機構によってＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命を有意に増進した。これら２つの物質を組み合わせて生物に適用した場合に組み合わせ効果または相乗効果が存在するかどうかをさらに調査した。異なる比率の酢酸とＲＦ３との種々の混合物は全て、単独で使用したいずれかの物質よりも高い活性を有することが見出されたことが興味深い（図６Ａ）。これらのうち、５０ｐｐｍ（ｗ／ｖ）酢酸および１００ｐｐｍ  ＲＦ３を含む溶液が最も高い活性を示し、５０ｐｐｍ酢酸の単独使用の１．４倍、および１００ｐｐｍ  ＲＦ３の単独使用の１．３倍の延命が達成された。
【００４４】
サプリメント、活性化合物、または少なくともＤＡＦ−１６の発現を調節するための活性化合物としてのこの混合物の１つの態様を試験するために、５％酢酸（米国の酢製品に含まれるほぼ最小の酸性度）におけるＲＦ３の長期安定性も試験した。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて試験した場合、２週間の静置後でさえ、混合物は依然として新たに調製したＲＦ３溶液と同一の活性を維持していた（図６Ｂ）。
【００４５】
試験した物質のうち、酢酸およびレイシポリサッカリドＲＦ３は、劇的な正の効果（ＤＡＦ−１６（寿命関連転写因子）の遺伝子発現の上昇に付随した寿命の増加）を生じることが示された。延命シグナル伝達経路の基礎となる機構を、ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムｑＰＣＲと組み合わせたＲＮＡｉの使用によって同定および確証することができる。したがって、いくつかの天然物質または合成化合物の存在下でこの実験生物の生活環を観察することにより、酢酸のような単純な化合物と本明細書中で示されたレイシキノコ由来の活性成分ポリサッカリドＲＦ３との正しい組み合わせの選択によって延命のゴールを達成することが可能である。本研究によって、天然物質の医薬機能を評価するための有効且つ安価なｉｎ  ｖｉｖｏ系を開発するという急務も果たされる。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
株、細菌、天然産物、および化学物質。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの野生型Ｎ２株を全実験で使用した。この蠕虫を、線虫成長培地（ＮＧＭ）寒天プレート上または餌供給源としてＥ．ｃｏｌｉ  ＯＰ５０を含む液体培地中で維持および培養した。蠕虫を回収し、Ｍ９緩衝液（２２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、４２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、８６ｍＭ  ＮａＣｌ、および１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）で洗浄した。夾雑している餌および蠕虫のデブリをショ糖浮遊法によって除去した。ＯＰ５０に加えて、ＲＮＡｉのための２つのＥ．ｃｏｌｉ株を使用した（ＴＩＲ−１  ＲＮＡｉのためのＩＩＩ−１Ｎ２０およびＤＡＦ−１６  ＲＮＡｉのためのＩ−５Ｍ２４）。以前の論文に記載のように、ＲＦ３（Ａ．ｃａｍｐｈｏｒａｔｅおよびＨ．ｅｒｉｎａｃｅｕｓの粗菌糸体粉末）を調製した。各溶液を脱イオン水で希釈して、種々のアッセイに望ましい濃度の試験溶液を作製した。
（実施例２）
種々の物質での処理後の寿命分析。１２ウェル組織培養プレート中で寿命アッセイを行った。各ウェルは、１ｍｇ／ｍｌエリスロマイシン（細菌分裂防止のため）を補足した１〜２ｍｌのＮＧＭ培地および１００μｌの所望の濃度の試験物質の溶液を含んでいた。処理後の分析を、Ｌ４幼生または成虫期のみのいずれかで行った。処理前に、１００μＭの２フルオロ−５デオキシウリジン（ＦＵＤＲ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を培養培地に添加して、試験被験体のいかなる子孫の成体への成長も阻止した。簡潔に述べれば、蠕虫をＯＰ５０細菌を播種したＮＧＭプレート上でＬ４／幼年期まで成長させ、次いで、少なくとも６０匹の蠕虫を、三連のアッセイのための３つの各ウェルに移した。全プレートを、以前に記載のように穏やかに旋回震盪しながら２０℃に保持した。ウェルを、適切な時間間隔で生きている蠕虫および死んだ蠕虫についてスコアリングした。顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  １×７１、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して観察した場合に、プレートのタッピングまたは白金線で穏やかに触れることに蠕虫が応答することができなかった場合、蠕虫が死んだと見なした。統計分析のためにＡＮＯＶＡプログラムを使用して、平均およびパーセンタイルを決定した。全アッセイでは、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）法を使用してＰ値を計算した。
【００４７】
（実施例３）
ＲＮＡの調製および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して適切な時間間隔でＮＧＭ培地中のサンプルからＣ．ｅｌｅｇａｎｓのバッチの全ＲＮＡを単離した。次いで、各サンプル由来のＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲを行った。１ＰＣＲサイクルは以下の工程からなった：１．９４℃で１５秒間、５０〜５６℃で３０秒間、および７２℃で４５秒間。２．４０サイクル繰り返す。３．７２℃で７分間の最終伸長。プライマー配列を、表１に列挙のようにデザインした。ＰＣＲ産物を１．８％アガロースゲルで泳動し、０．４μｇ／ｍｌ臭化エチジウムで染色した。染色したバンドを、ＵＶ光下で視覚化し、カメラ（Ｎｉｋｏｎ  Ｅ４５００）で撮影した。
【００４８】
（実施例４）
定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析。各実験のために、約１００匹のＬ４幼生または若年成体の蠕虫をアッセイした。処理１日後のＴＩＲ−１およびＲＡＢ−１  ｍＲＮＡレベルを測定するために、２０℃でインキュベートした蠕虫から全ＲＮＡを単離した。しかし、全ＲＮＡをＤＡＦ−１６  ｍＲＮＡレベルについて試験する場合は、蠕虫を２日目に回収した。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの全ＲＮＡの単離、精製、および逆転写を前記のように行った。定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）をＲＧ−３０００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で行い、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅリアルタイム分析ソフトウェア６．１（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して分析し、ＡＣＴ−１のｍＲＮＡレベルを正規化のために使用した。要求に応じてプライマー配列は利用可能である。
【００４９】
（実施例５）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分析。ホールライフ（ｗｈｏｌｅ−ｌｉｆｅ）ＲＮＡｉ分析では、遺伝子特異的ＲＮＡｉ細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＴ１１５株）を播種した寒天プレートに卵を添加した。薬物処理実験では、ＯＰ５０を播種したプレートに卵を添加し、Ｌ４期まで蠕虫を成長させ、次いで、遺伝子特異的ＲＮＡｉ細菌を含む新鮮な液体ＮＧＭ培地に移した。１００μＭの２フルオロ−５デオキシウリジン（ＦＵＤＲ）も培地に添加して、試験被験体のいかなる子孫の成体への成長をも阻止した。２日後、蠕虫に試験物質を与えた。ＲＮＡｉを使用した動物の全寿命測定を上記のようにスコアリングした。全実験で、成虫期の前妊孕期を、寿命分析についてのｔ＝０として使用した。統計分析のためにＡＮＯＶＡも使用して、平均およびパーセンタイルを決定した。全アッセイで、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）法を使用してＰ値を計算した。
【００５０】
（実施例６）
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現アッセイ。ＤＡＦ−１６：：ｇｆｐ転写レポーター構築物を保有するトランスジェニック蠕虫を、ＧＦＰ発現アッセイのために使用した。ＧＦＰ発現がＤＡＦ−１６発現を特異的に例証したかどうかを試験するために、ＤＡＦ−１６およびＴＩＲ−１  ＲＮＡｉを使用してその特異性を決定した。ＲＦ３および／または酢酸での処理後に寿命分析に応じた適切な時間間隔にて、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ１×７１，ＮＹ，ＵＳＡ）および接続したデジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）にて蠕虫の蛍光画像を撮影した。全実験を、２回繰り返し、一定且つ類似の結果を得た。
【００５１】
（実施例７）
２−ＤＥおよび画像分析。Ｌ４幼生または若年成体の蠕虫を新たに調製した液体ＮＧＭ培地に移し、２０℃で４日間培養した。次いで、１００μＭ  ＦＵＤＲ、５０ｐｐｍ酢酸、および１００ｐｐｍ  ＲＦ３を培地に添加した。処理３日後、蠕虫を、８Ｍ尿素、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、およびプロテアーゼインヒビターカクテルを含む溶解緩衝液中で溶解し、液体窒素中で凍結し、次いで、乳鉢を使用して微粉末に粉砕した。ホモジネートを超音波処理し、遠心分離後の上清を回収し、これをタンパク質ローディングサンプルとして使用した。２−Ｄ  Ｑｕａｎｔキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したタンパク質含量量決定によって推定した１５０μｇの全タンパク質を、固定ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルストリップ（ｐＨ３〜１０、１３ｃｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードした。ＩＰＧストリップを一晩再水和した。一次元目の分離のために、Ｅｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒ  ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して３００〜８０００Ｖで１６時間ＩＥＦを行った。ＩＥＦ後、ＩＰＧストリップを２つの平衡化溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、３０％グリセロール（１００ｍｇジチオトレイトール（ＤＴＴ）または２５０ｍｇヨード酢酸をそれぞれ含む））で各１０分間平衡化し、二次元目の電気泳動を１３０〜２５０Ｖで５〜６時間行った。ゲルをＳｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙで一晩染色した。２−ＤＥゲル画像を、蛍光画像スキャナＴｙｐｈｏｏｎ９４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してスキャンし、ＰＤＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して分析した。ゲル全体について検出された全タンパク質強度の比率としてゲル間で強度レベルを正規化した。
【００５２】
（実施例８）
ゲル内消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ。異なる処理下でのサンプルの２−ＤＥ分析に基づいて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａのプロテオミックコア施設（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）でのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ナノＥＳＩ−Ｑ／ＴＯＦ）によるさらなる同定のために、１５の異なって発現されたタンパク質（コントロールと試験サンプルとの間のタンパク質発現の少なくとも２倍の変化に基づく）を選択した。タンパク質スポットを２−Ｄゲルから切り出し、次いで、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）を含む５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）での１時間の脱色を３回行った。ゲル片を１００％ＡＣＮ中で５分間脱水し、次いで、真空遠心分離機で３０分間乾燥させた。サンプルあたり０．５μｇトリプシンを含む２５ｍＭ重炭酸アンモニウムの添加によって３７℃で１６時間酵素消化を行った。ペプチドフラグメントを、５０μｌの５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡで２回抽出した。真空遠心分離機での遠心分離によるＡＣＮおよびＴＦＡの除去後、サンプルを０．１％ギ酸／５０％ＡＣＮに溶解し、ＬＣ−ナノＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。タンパク質を、ＭＡＳＣＯＴプログラムを使用したＭＳ／ＭＳイオン検索に基づきＮＣＢＩデータベースで同定した。
【００５３】
（実施例９）
図１０を参照して、ＤＡＦ−１６のヒトホモログは、ＤＡＦ−１６（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）とかなりの相同性を示し、特にＤＮＡ結合ドメイン内の重要な結合領域中の保存度が高い（図１０（ｃ）を参照のこと）。ヒトでは、ＦＯＸＯは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるＤＡＦ−１６機能と同じように、アポトーシス、細胞周期、ＤＮＡ損傷の修復、酸化ストレス、細胞分化、グルコース代謝、および他の細胞機能に関与する遺伝子発現を調整するための転写因子として機能する。したがって、酢酸、ＲＦ３、またはＲＦ３と酢酸との組み合わせの使用により、ヒトの寿命延長が調整される。
【００５４】
以下の刊行物は、本明細書中に完全に記載されているかのように本明細書中で参照によって援用される：Ａ．Ｓａｌｍｉｎｅｎａ，Ｊ．Ｏｊａｌａ，Ｊ．Ｈｕｕｓｋｏｎｅｎ，Ａ．Ｋａｕｐｐｉｎｅｎａ，Ｔ．Ｓｕｕｒｏｎｅｎ，Ｋ．Ｋａａｒｎｉｒａｎｔａｃ，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅｓ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＦｏｘＯｓ  ａｎｄ  ＳＩＲＴ１，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６５（２００８）１０４９−１０５８；Ｈａｏｊｉｅ  Ｈｕａｎｇ，Ｄｏｎａｌｄ  Ｊ．Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｄｙｎａｍｉｃ  ＦｏｘＯ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ，Ｊ．ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２０（２００７），２４７９−２４８７；およびＣｏｌｅｅｎ  Ｔ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ＤＡＦ−１６／ＦＯＸＯ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｔａｒｇｅｔｓ：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ４１（２００６），９１０−９２１。
【００５５】
図１０（ｃ）を参照して、配列番号１５（ｄＦＯＸＯ）；配列番号１６（ｈＦＯＸＯ１）；配列番号１７（ｈＦ０Ｘ０３ａ）；配列番号１８（ｈＦＯＸＯ４）；および配列番号１９（ＤＡＦ−１６）の多重アミノ酸配列アラインメントは、ＤＡＦ−１６／ＦＯＸＯのヒト、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、およびショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ）バージョンの相同性を示す。示したアミノ酸配列は、各タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに対応する。ｄＦＯＸＯ（ショウジョウバエ）、ｈＦＯＸＯ（ヒト）、およびＤＡＦ−１６（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）フォークヘッドドメインは、特にＤＮＡ結合ドメイン内の配列保存度が高い。二次構造をアラインメント上部に示す。類似および同一のアミノ酸残基に、それぞれ灰色および黒色の陰をつけた。ＤＮＡ二重らせんの主溝に接触するＤＮＡ認識ヘリックスであるフォークヘッドドメインのヘリックス３をコードする領域は、５つのタンパク質間で同一である。したがって、これらの各タンパク質は、ヘリックス３を介してインスリン応答エレメントに接触する。
【００５６】
最も実際的且つ好ましい実施形態であると現在考えられている事項の観点から装置および方法を記載しているが、開示が開示の実施形態に限定される必要はないと理解すべきである。特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の修飾形態および類似の改変を対象とすることを意図し、その範囲は全てのかかる修飾形態および類似の構造を包含するように最も広義の解釈に従うべきである。本開示は、以下の特許請求の範囲の任意および全ての実施形態を含む。
【図５】
2011517952.tif 000003
【図８】
2011517952.tif 000004
【図１０−１】
2011517952.tif 000005
【図１０−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
2011517952.tif 000011
【図７】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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