(57)【要約】  本発明は、遺伝子組換え微生物からポリグリコレート（ＰＧＡ）を生産し調製するための方法に関する。より詳しくは、本発明は、２つの工程；１）グリコール酸を含むまたは含まない培地において、グリコレートをグリコリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子と、グリコリル−ＣｏＡを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼをコードする遺伝子とを発現する微生物を培養し、２）ポリグリコレートポリマーを回収する、ことを含んでなる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を用いてグリコール酸を重合してＰＧＡを得る方法であって、
炭素源を含む培地において、異種由来のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼをコードする遺伝子を発現する微生物を培養し、かつ
重合されたグリコール酸（ＰＧＡ）を回収する
ことを含んでなり、
該微生物が、さらに、グリコール酸をグリコリルＣｏＡに変換する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する、方法。
【請求項２】
グリコール酸が、ＰＨＡシンターゼと、グリコール酸をグリコリルＣｏＡに変換する少なくとも１つの酵素とをコードする遺伝子を発現する同じ微生物により生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グリコール酸が、培養培地の中の微生物に対して外来的に供給される、請求項１に記載する方法。
【請求項４】
グリコール酸のグリコリル−ＣｏＡへの変換が、
ａ．アシル−ＣｏＡシンテターゼ
ｂ．アシル−ＣｏＡ転移酵素
ｃ．ブチレートキナーゼに関連するホスホトランスブチリラーゼ
の中から選ばれる少なくとも１つの酵素によりなされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、方法。
【請求項５】
アシル−ＣｏＡシンテターゼおよびアシルＣｏＡ転移酵素が、ｐｒｐＥまたはａｃｓ遺伝子によりコードされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ホスホトランスブチリラーゼが、ｐｔｂ遺伝子によりコードされ、かつ、ブチレートキナーゼが、ｂｕｋ遺伝子によりコードされる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子が過剰発現される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子が、微生物に導入されたプラスミドにより発現される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子が、前記微生物の染色体に組み込まれている、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
異種由来のＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子が、ｐｈａＣ、ｐｈａＥＣまたはｐｈａＣＲの中から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子が過剰発現される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子が、微生物に導入されたプラスミドにより発現される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子が、前記微生物の染色体に組み込まれている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
微生物が、ＰｈａＲ／ＰｈａＰ調節系を発現する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により得られる、重合されたグリコール酸。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の、異種由来のＰＨＡシンターゼとグリコール酸をグリコリルＣｏＡに変換する少なくとも１つの酵素とをコードする遺伝子を発現する微生物。
【請求項１７】
前記微生物が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）である、請求項１６に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＧＡと呼ばれるポリグリコール酸ポリマーの製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、
遺伝子組み換え微生物を、グリコール酸を含むまたは含まない、適切な炭素源を用いて、培養し、前記微生物は、グリコレート（glycolate）をグリコリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードする遺伝子と、ＰＨＡ合成にかかわる酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子とを発現する微生物であり、かつ
ポリグリコレート（polyglycolate）ポリマーを回収する
ことを含んでなる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＬＡおよびＰＧＡポリマーは、広範な工業上および生物医学上の用途を有する、生分解性の熱可塑性物質である(Williams and Peoples, 1996, CHEMTECH 26, 38-44)。
【０００３】
これらのポリエステルは、工業用プラスチックとしてだけでなく、薬剤送達キャリア(Drug delivery and targeting. Nature 392, 5-10(1998), Langer, R.)、生体材料足場および医療機器(Biodegradable polyesters for medical and ecological applications. Macromol. Rapid Commum. 21, 117-132(2000), Ikeda, Y.& Tsuji, H.; Sterilization, toxicity, biocompatibility and clinical applications of polylactic acid/polyglycolic acid copolymers. Biomaterials 17, 93-102(1996), Athanasiou, K. A. et al)などの用途における医療用バイオポリマーとしても、重要な役割を果たす。ＰＧＡは、良好な性質、湿度８０％未満でさえとても高いガス不浸透性、生分解性、高い機械的強度、および高い成形性、を有するポリエステル樹脂である(Poly(glycolic acid)In polymer data handbook(ed. Mark, J. E.)566-569(Oxford University Press, New York, 1999)Lu, L; Mikos, A. G)。この性質の特有の組合せにより、ＰＧＡは、高性能の包装および工業的用途に理想的に適合したものとなる。今日、ＰＧＡにとってターゲットとなる用途は、炭酸のソフトドリンクおよびビールのための多層ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）ボトルである。ＰＧＡは、ＰＥＴのものより１００倍も高いガスバリアを提供するので、これらのボトルに使われているＰＥＴの量を２０パーセント以上引き下げることが可能であるとともに、ＣＯ２損失に対する同等のバリアを維持する。このボトルのリデザインは、生産コスト削減の可能性を有する。おそらく最も重要なことには、ＰＧＡの特有の加水分解性により、ＰＧＡは、広く実施されている工業的なＰＥＴリサイクルプロセスとの高い適合性を有し、材料がリサイクルされたＰＥＴの純度および質を確実に妨げないようにする。もう１つの包装用途では、ＰＧＡ多層デザインは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）などのバイオポリマーのガスおよび水分バリアを高めることが示されている。生分解性用途での使用の拡大により、ＰＧＡはさらに環境保全に貢献するだろう。
【０００４】
現在、ＰＧＡは、環状ジエステルの開環重合、または２−ヒドロキシカルボン酸の重縮合の、２つの異なる化学的経路により調製されている。環状ジエステルの開環重合は、以下の３つの工程である：（ｉ）α−ヒドロキシカルボン酸の重縮合、（ｉｉ）熱アンジッピング反応による環状ジエステルの合成、および（ｉｉｉ）環状ジエステルの開環重合(Preparative Methods of Polymer Chemistry2nd edition, Interscience Publishers Inc, New York 1963, Sorensen, W.R.& Campbell, T. W.; Controlled Ring-opening Polymerization of Lactide and Glycolide. Chem. Rev. 104, 6147-6176(2004), Dechy-Cabaret, O. et al.,)。あるいは、低分子量ＰＧＡが、グリコール酸の直接重縮合により製造可能なことは、周知である。低分子量ポリマーのみの獲得は、解重合を助ける、水、重合での副生成物の除去の困難が、主に原因である(Synthesis of polylactides with different molecular weights. Biomaterials 18, 1503-1508(1997), Hyon, S.-H. et al.,)。よって、配位開始剤を使った環状ジエステルの開環重合は、高分子量ポリマーの合成に好まれる。しかしながら、このプロセスは、除去が簡単ではない溶媒または鎖カップリング剤（阻害剤）の付加という不利益を有する。
【０００５】
一方、バクテリアポリエステル（微生物ポリエステルおよびポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）とも呼ばれる）は、必須栄養素の制限された供給およびの炭素源の過剰な存在を原因とするアンバランスな成長への代謝性ストレスの結果として、細胞内グラニュールとして蓄積される(Lenz and Marchessault 2005; Lenz 1993; Sudesh et al., 2000; Sudesh and Doi 2005; Steinbuchel and Fuchtenbusch 1998; Steinbuchel and Valentin 1995; Steinbuchel 1991)。ＰＨＡは、広範囲の異なるグラム陽性およびグラム陰性菌により、ならびに古細菌により、天然に合成される。ＰＨＡは、それらの伸張強度および剛性に関して、通常の石油化学ベースのポリプロピレンに対するこのバイオポリマーの物理的性質の類似により、最近数十年間、多数の注目をひきつけている(Sudesh et al., 2000)。しかしながら、通常のプラスチックとは違って、ＰＨＡは、自然において生分解およびリサイクルが可能であるため、この種のポリマーは環境に対して優しい。
【０００６】
側鎖の長さによって２つのタイプのＰＨＡが区別されている。
【０００７】
１のタイプは、ｓｃｌＰＨＡという短鎖長のヒドロキシアルカン酸と、短いアルキル側鎖（３〜５炭素原子）とからなり、ラルストニア  ユートロファ（Ralstonia eutropha）により生産される(Lenz and Marchessault 2005)。
【０００８】
２のタイプは、ｍｃｌＰＨＡという中鎖長のヒドロキシアルカン酸と、長いアルキル側鎖（６〜１４炭素原子）とからなり、シュードモナス  オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）およびその他シュードモナス属により生産される(Timm and Steinbuchel, 1990)(Nomura, C.T. & Taguchi, S., 2007; Steinbuchel, A. & Hazer, B., 2007)。最も良く研究されているＰＨＡは、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）のポリマーである、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）であるが、１５０以上の構成するモノマーがある(Steinbuchel A. Valentin AE. FEMS Microbiol Lett 1995, 128:219-228; Madison L. and Huisman G. Microbiol and Mol Biol Reviews, 1999, 63:21-53; Rehm B. Biochem J 2003, 376:15-33)。この広い多様なモノマーは、ポリマー組成に依存する種々の物性を有するＰＨＡを産する。
【０００９】
微生物におけるＰＨＡの合成のための最小要件は、（＞３）−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡ源および適当なＰＨＡシンターゼである(Gerngross and Martin, PNAS 92: 6279-83, 1995)。ポリエステルシンターゼは、ポリエステル生合成の重要な酵素であり、付随するＣｏＡの放出と一緒に、（Ｒ）−（＞３）−ヒドロキシアシル−ＣｏＡチオエステルのポリエステルへの変換を触媒する。これらのポリエステルシンターゼは、生化学的に特徴づけられている。これらの最近の知見の概略は、(Rehm, 2003)において提供されている。ＰＨＡシンターゼの配列、それらの基質特異性、およびそれらのサブユニット構成によって、ＰＨＡシンターゼの主要なクラスは４つに分けられる(Rhem B. H. A. Biochem J. 2003, 376: 15-33)。ＰＨＡ生合成のための重要な酵素を表すＰＨＡシンターゼの低い基質特異性のために、発酵により直接生産できるバクテリアＰＨＡの変動性は、並外れて大きい。適当な生産株ならびに適切な培養条件および炭素源の選択により、テーラーメードの組成のＰＨＡを生産することができる。ラルストニア  ユートロファ（Ralstonia eutropha）、メチルバクテリウム（Methylbacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属のような天然のプロデューサーの生物による、および大腸菌（E.coli）のようなものではない、組換えバクテリアの天然のプロデューサーによる、ＰＨＡの生産を示す、文献上多くの例がある(Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997; Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998; Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997; Madison L. and Huisman G., 1999; WO01/55436; U.S.Pat.No.6.143.952; WO98/54329; WO99/61624)。
【００１０】
ＰＨＡシンターゼは、基質として（＞３）−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを使ってＰＨＡを合成する。よって、重合の最初の工程は、シンターゼの基質である、（＞３）−ヒドロキシアシル−ＣｏＡチオエステルの獲得である。そのため、ヒドロキシ酸の（Ｒ）−（＞３）−ヒドロキシアシル−ＣｏＡチオエステルへの変換は、ポリエステルの生合成のための重要な工程である。
【００１１】
次の酵素は、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ；ラルストニア  ユートロファよりクローニングされた、β−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素（ＰｈａＢ）、３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰ：シュードモナス属よりクローニングされたＣｏＡ転移酵素（ＰｈａＧ）、エロモナス  キャビエ（Aeromonas caviae）およびシュードモナス  エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）に由来する（Ｒ）−特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＲｈａＪ）(Fukui et al., J. Bacteriol. 180:667, 1998; Tsage et al., FEMS Microbiol. Lett., 184:193, 2000)、大腸菌およびシュードモナス  エルギノーサに由来する３−ケトアシル−ＡＣＰ還元酵素（ＦａｂＧ）(Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett. 176:183, 1999; Ren et al., J. Bacteriol. 182:2978, 2000; Park et al., FEMS Microbiol. Lett. 214:217, 2002)、を生ずることができる酵素として知られている。様々な種類のＰＨＡは、炭素鎖における様々な位置をヒドロキシル化されたヒドロキシアルカノエート（主に３、４、５、および６位）を使うこれらの酵素を用いて合成されている。しかしながら、それは、２位をヒドロキシル化されたヒドロキシアルカノエートでは少しのＰＨＡシンターゼ活性を有することが報告されている(Zhan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:131, 2001; Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:699, 1994; Yuan et al., Arch. Biochem. Biophysics. 394:87, 2001)。
【００１２】
サルモネラ  エンテリカ（Salmonella enterica）由来の遺伝子をコードするプロピオニルコエンザイムＡシンテターゼは、２０００年にクローニングされ、ＰｒｅｐＥと名付けられた。参照資料を示す(Valentin et al., 2000)。報告されたこの酵素の基質は、プロピオネート、アセテート、３−ヒドロキシプロピオネート、およびブチレートである。この酵素は、これら基質のこれらに対応するコエンザイムＡエステルへの変換を触媒する。この酵素が、組換え大腸菌におけるラルストニア  ユートロファ由来のＰＨＡシンターゼと共に共発現された場合、ＰＨＡコポリマーの形成が見られる。
【００１３】
大腸菌由来の遺伝子をコードするアセチル−ＣｏＡシンテターゼは、２００６年にクローニングされ、ａｃｓと名付けられた。参照資料を示す(Lin et al., 2006)。大腸菌において過剰発現した場合、この酵素は、前記アセテートをアセチル−ＣｏＡに変換することにより、微生物へのアセテート蓄積を減らす。
【００１４】
１５０以上の異なるモノマーが、生物におけるＰＨＡの中に組み込まれているとはいえ、２位でヒドロキシル化されたグリコレートのようなヒドロキシアルカノエートは、ＰＨＡシンターゼに対して適切な基質ではないため、生合成のポリグリコライドＰＧＡの生産は未だ報告されていない。
【００１５】
２つの特許出願は、生細胞中のＰＨＡシンターゼの作用によってポリマー中に２−ヒドロキシ酸モノマーが組み込まれることを述べている。
【００１６】
ＵＳ２００７／０２７７２６８(Cho et al.)は、細胞または植物によるポリラクテート（ＰＬＡ）またはそのコポリマーの生物生産に関する。
【００１７】
ＷＯ２００４／０３８０３０(Martin et al.)は、グリコリル−ＣｏＡのモノマーと３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ吉草酸などからなる群から選択される少なくとも１つの他のモノマーとを含むコポリマーの形成を示す。この場合、基質グリコリル−ＣｏＡは、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ分子およびＦａｄＥ、ＡｔｏＢおよびチオラーゼＩＩを必要とする反応を経て、得られる。
【００１８】
現在のところ、入手できる先行技術文献には、微生物の発酵によるグリコール酸のホモポリマー（ＰＧＡ）の生産プロセスは、未だ報告されていない。
【００１９】
本明細書において、本発明者らは、微生物を使った高分子量ＰＧＡを生産する方法を開発した。開示した本明細書では、本発明者らは、ポリグリコール酸ホモポリマーが、ＰＨＡシンターゼ遺伝子と、グリコレートをグリコリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードする遺伝子とを用いて形質転換された組換え微生物を、適切な炭素源を含む生産培地において、培養することにより生産されることを述べる。
【発明の概要】
【００２０】
本発明の目的は、グリコール酸のホモポリマーであるＰＧＡの生合成のための方法を提供することである。
【００２１】
該方法は、以下を発現している組換え微生物を使用することに基づいている：
１．異種由来のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼをコードする遺伝子、および
２．グリコール酸をグリコリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子。
【００２２】
本発明の他の目的は、本発明による方法により得られるような生合成ＰＧＡ、および本発明によるＰＧＡの生合成のための遺伝子を発現する微生物である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＰＧＡであるポリグリコール酸ポリマーの生産のための連続反応を示す。１段目の反応は、グリコリル−ＣｏＡの式であり、グリコリル−ＣｏＡは、ＰＨＡシンターゼにより引き起こされる２段目の重合反応の基質である。
【図２】図２は、グリコレートを加えたグルコースを含む培地で培養した細胞を用いて、ポリグリコレートを合成するための経路を示す概略図である。
【図３】図３は、いかなる外来のグリコレートを含まないグルコースを含む培地で培養した細胞を用いて、ポリグリコレートを合成するための経路を示す概略図である。
【図４】図４は、ＬＢ＋グルコースの三角フラスコの中で育ったＡＧ１１２２株の顕微鏡観察（×１００）を示す。光学顕微鏡ＡＶＡＮＴＥＣ３８０４９２１。
【図５】図５は、ＬＢ＋グルコースのファーメンターの中で育ったＡＧ１１２２株の顕微鏡観察（×１００）を示す。光学顕微鏡ＡＶＡＮＴＥＣ３８０４９２１。
【図６】図６は、モディファイドＭ９＋グルコースの三角フラスコの中で育ったＡＧ１３２７株の顕微鏡観察（×１００）を示す。光学顕微鏡ＡＶＡＮＴＥＣ３８０４９２１。
【図７】図７は、ＡＧ１３５４株の粗細胞抽出物でのグリコレートに対する反応のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。
【図８】図８は、精製ＰｒｐＥｓｔタンパク質でのグリコレートに対する反応のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本発明は、微生物を用いてグリコール酸を重合してＰＧＡを得る方法であって、
炭素源を含む培地において、異種由来のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）シンターゼをコードする遺伝子を発現する微生物を培養し、かつ
重合されたグリコール酸（ＰＧＡ）を回収する
ことを含んでなり、
該微生物が、さらに、グリコール酸をグリコリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する方法に関する。
【００２５】
「重合」または「単独重合（homopolymeraization）」という用語は、モノマーの分子が互いに結合して、分子量がもとの物質の倍数である大きな分子を形成する、化学反応を意味する。２種またはそれ以上の異なるモノマーが含まれている場合は、該プロセスは共重合またはヘテロ重合（heteropolymerization）と呼ばれる。
【００２６】
「ＰＧＡ」は、図１および下記式Ｉに表されたグリコール酸繰り返し単位からなるポリグリコレートとも呼ばれる、ポリグリコール酸を示す：
−（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−）−      式Ｉ
【００２７】
ＰＧＡは、上記グリコール酸繰り返し単位（グリコレートとも呼ばれる）を少なくとも５５重量％含んでなるホモポリマーである。ＰＧＡ樹脂における上記グリコール酸繰り返し単位の含有量は、少なくとも５５重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、さらに好ましくは９０重量％である。
【００２８】
ＰＧＡは、好ましくは、ヘキサフルオロイソプロパノール溶媒を使ったＧＰＣ測定により、１０，０００〜６００，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有してもよい。１５０，０００〜３００，０００ダルトンの重量平均分子量が、さらに好ましい。
【００２９】
本発明によれば、「培養」または「発酵」という用語は、代替可能に使用され、炭素源を含む適当な増殖培地におけるバクテリアの増殖を意味する。
【００３０】
「培養培地から重合されたグリコール酸を回収する」というセンテンスは、当業者により周知なようなＰＧＡを回収する行為を示す。特に、遠心分離または凍結乾燥により、産生細胞を集めた後、菌株に蓄えられたポリマー物質は、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシドまたはクロロホルムなどの溶媒を使って回収される(Lageveen et al., 1988; Amara et al., 2002)。ＰＧＡは、上記溶媒の１つを使って、最も優先的にはＨＦＩＰ溶媒を使って、凍結乾燥された細胞から抽出され、その後エタノールまたはメタノール中に沈殿される。該沈殿物は、遠心分離により得て、クロロホルム中に溶かされ、そして高精度のＰＧＡのために再沈殿される。ポリマーは、ＮＭＲによりさらに解析される。
【００３１】
「微生物」という用語は、バクテリア、酵母または菌類を示す。優先的には、微生物は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、バチルス科（Bacillaceae）、ストレプトマイセス科（Streptomycetaceae）およびコリネバクテリア科（Corynebacteriaceae）の中で選択される。より優先的には、微生物は、エシェリヒア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、パントエア属（Pantoea）、サルモネラ属（Salmonella）またはコリネバクテリウム属（Corynebacterium）の１種である。さらにより優先的には、微生物は、大腸菌（Escherichia coli）である。
【００３２】
本発明による「炭素源」という用語は、微生物の一般的な増殖を支えるために当事者により使用できる炭素のいずれかの起源を意味し、それは、六単糖（グルコース、ガラクトースまたはラクトースなど）、五単糖、単糖、二糖類（スクロース、セロビオースまたはマルトースなど）、オリゴ糖、糖蜜、澱粉またはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびその組合せでありうる。特に好ましい単一の炭素源は、グルコースである。もう一つの好ましい単一の炭素源は、スクロースである。
【００３３】
「グリコール酸をグリコリル−ＣｏＡに変換する酵素」という用語は、グリコール酸分子を、重合プロセスの中でＰＨＡシンターゼの基質である、グリコリル−ＣｏＡへと活性化できる酵素を示す。
【００３４】
本発明の第１の態様によれば、グリコール酸は、ＰＨＡシンターゼと、グリコール酸をグリコリル−ＣｏＡに変換する少なくとも１つの酵素とをコードする遺伝子を発現する同じ微生物により生産される。炭素の再生可能資源から発酵により高レベルのグリコール酸を生産する微生物は、以前に述べられている。詳しくは、ＷＯ２００７／１４０８１６およびＷＯ２００７／１４１３１６を参照する。
【００３５】
さらに、このグリコール酸生産微生物からのグリコール酸の排出（expotation）を削減することは、有利となる。当業者は、特定の代謝産物の輸送の前記削減を得るための非常に多くの方法を知っており、詳しくは、グリコール酸を該微生物から培地に排出させることができる輸送タンパク質の活性および／または発現を減らすまたは阻害する方法を知っている。
【００３６】
本発明の第２の態様によれば、グリコール酸は、培養培地中の微生物に対して、外来的に提供される。
【００３７】
詳しくは、少なくとも２ｇ／Ｌのグリコール酸の量は、培養培地に加えられ、好ましくは、少なくとも１０ｇ／Ｌである。当業者であれば、３０ｇ／Ｌのようなグリコール酸の高濃度の毒性を避けるように、投与量を調整するであろう。前記のとおり、グリコール酸の排出は、削減されてもよく、または本発明による微生物の中にさらに全部阻止されてもよい。培養培地に存在するグリコール酸の導入（import）を改良することは、さらに有利となる。当業者は、特定の代謝産物の輸送の前記改良を得るための非常に多くの方法を知っており、詳しくは、微生物に対して培地からグリコール酸を導入することができる透過酵素タンパク質の活性および／または発現を増加する方法を知っている。詳しくは、グリコレートインポーターをコードするｇｌｃＡ、ｌｌｄＰおよびｙｊｃＧ遺伝子を過剰発現することは、有利となる(Nunez, F. et al., 2001 Microbiology, 147, 1069-1077; Nunez, F. et al., 2002, Biochem. And Biophysical research communicaton 290, 824-829; Gimenez, R. et al., 2003 J. of Bacteriol. 185, 21, 6448-6455 )。
【００３８】
本発明の好ましい態様では、グリコール酸をグリコリル−ＣｏＡに変換する酵素は、以下の中から選択される：
アシル−ＣｏＡシンテターゼまたはアシル−ＣｏＡ転移酵素、
ブチレートキナ−ゼに関連するホスホトランスブチリラーゼ。
【００３９】
嫌気性細菌の中から見つかったアシル−ＣｏＡ転移酵素は、短鎖長ＣｏＡ−チオエステルの中鎖長ＣｏＡ−チオエステルへの変換を触媒することが知られている(Mack, M. and Buckel, W., 1997)。
【００４０】
本発明の第１の態様では、グリコール酸をグリコリル−ＣｏＡに変換する酵素は、腸内細菌科の種に属する遺伝子の中から選択され、最も好ましくは以下である：
ｐｒｐＥ遺伝子によりコードされる大腸菌またはサルモネラ  チピムリウム（Salmonella Thyphimurium）由来のプロピニルコエンザイムＡシンテターゼ、または
ａｃｓ遺伝子によりコードされる大腸菌由来のアセチル−ＣｏＡ転移酵素。
【００４１】
本発明の第２の実施形態では、ホスホトランスブチリラーゼは、ｐｔｂ遺伝子によりコードされ、かつ、ブチレートキナーゼは、ｂｕｋ遺伝子によりコードされる。
【００４２】
「コードする（encoding）」または「コードする（coding）」という用語は、ポリヌクレオチドが、転写および翻訳のメカニズムを介して、アミノ酸配列を生成するプロセスを言う。このプロセスは、遺伝子コードにより許可され、それは、ＤＮＡに基づく配列と、タンパク質におけるアミノ酸配列との関係である。遺伝子コードの主要なものは縮重されており、それは塩基３個の組合せ（１つの「コドン」）１つ以上により１つのアミノ酸がコードされ得ることを意味する。直接的な結果は、同じアミノ酸配列が、異なるポリヌクレオチドによりコードされ得ることとなる。コドンの使用は、生物により多様となり得ることは、当業者から周知である。同じアミノ酸をコードするコドンの中で、いくつかは、既知の微生物により優先的に使われることができる。つまり、この生物における対応するタンパク質の発現を最適化するためには、特有の微生物のコドンの用法に対して適合させたポリヌクレオチドを設計することが重要である。
【００４３】
本発明の明細書では、遺伝子およびタンパク質は、大腸菌における対応する遺伝子の名称を使って特定されている。しかしながら、および別段の記載がない限り、これらの名称の使用は、本発明による、より一般的な意味を有し、他の生物、より詳しくは微生物における、全ての対応する遺伝子およびタンパク質に及ぶ。
【００４４】
ＰＦＡＭ（アライメントおよび隠れマルコフモデルのタンパク質ファミリーデータベース、http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アライメントの膨大なコレクションである。各ＰＦＡＭは、多数のアライメントを視覚化したり、タンパク質ドメインを見たり、生物の中での分布を評価したり、他のデータベースへのアクセスを獲得したり、および既知のタンパク質の構造を視覚化することを可能にする。
【００４５】
ＣＯＧｓ（タンパク質の相同分子種群のクラスター、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）は、完全に解読されたゲノム６６からのタンパク質配列を比較することによって得られ、３０の主要な系統学的系列を表している。各ＣＯＧは、少なくとも３つの系統から定義され、以前に保存されたドメインの同定を可能にする。
【００４６】
相同配列およびその相同性パーセントを同定する手段は、当業者に周知であり、そして特に、BLASTプログラムを包含し、それは、そのウェブサイトで示されたデフォルトパラメータを用いて、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から利用することができる。得られた配列は、その後、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）またはＭＵＬＴＡＬＩＮ（http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl）といったプログラムを使い、それらウェブサイトで示されたデフォルトパラメータを用いて、利用される（例えば、配列される）。
【００４７】
既知の遺伝子に対してＧｅｎＢａｎｋで示された参照資料を使って、当業者は、他の生物、バクテリア株、酵母、菌類、哺乳類、植物などにおいて相当する遺伝子を決定することができる。この所定の作業は、他の微生物由来の遺伝子との配列アライメントを実行することにより決定され得る共通配列を使って、およびその他の生物における対応遺伝子をクローンニングするための縮重プローブを設計することで、有利に行われる。分子生物学のこれら所定の方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの論文(1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
【００４８】
本発明はさらに、宿主微生物における調節要素機能の制御下で、グリコール酸をグリコリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現カセットに関する。
【００４９】
「発現」という用語は、その遺伝子の産物である、対応するタンパク質の生産に至る、遺伝子配列の転写および翻訳を意味する。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、グリコール酸をグリコリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードする遺伝子は、微生物の中に過剰発現される。
【００５１】
「増加発現」、「増強発現」または「過剰発現」は、本願明細書において、代替可能に使用され、かつ、似た意味、すなわち細胞内への酵素の量増加に至る、遺伝子の転写および翻訳が、非組換え微生物と比較して増加されたこと、を意味する。
【００５２】
遺伝子の発現を増加するため、該分野の専門家は、遺伝子発現操作をするための異なる方法を知っている。詳しくは、遺伝子は、異なった強度のプロモーターを使って発現されてもよく、それは誘導されてもよい。これらのプロモーターは、同種のまたは異種のでもよい。当業者は、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、ＰｌａｃまたはラムダプロモーターｃＩは広く使えるなど、どのプロモーターが最も適切なのかを知っている。
【００５３】
本発明の実施態様では、遺伝子は、微生物に導入されたプラスミドまたはベクターにより発現されてもよい。前記微生物は、その後「宿主微生物」と呼ばれ、外部のまたは異種の遺伝子またはそれ自身の遺伝子の余分なコピーを受け取ることができ、そして活性タンパク質産物を生産するためのそれらの遺伝子を発現することができる微生物である。
【００５４】
「形質転換」という用語は、宿主微生物への新しい遺伝子または既存遺伝子の余分なコピーの導入を意味する。例としては、大腸菌では、宿主生物へのＤＮＡの形質転換の方法は、エレクトロポレ−ションである。
【００５５】
「形質転換ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを宿主生物に導入するために使われるいずれかのビヒクルを意味する。前記ビヒクルは、例えば、プラスミド、ファージまたは、使われる生物によって当業者から知られている他の要素でありうる。形質転換ベクターは、通常、ポリヌクレオチドまたは発現カセットに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する他の要素を含む。発現ベクターは、該カセットに産出される遺伝子の適切な発現を許可する発現カセットと、宿主生物へのベクターの複製を許可する付加要素とを含んでなる。発現ベクターは、宿主生物において単一のコピーまたは複数のコピーで存在しうる。当業者は、複製のプラスミドの起源および細胞内でのその結果のプラスミドコピー数の点で相違する異なるタイプのプラスミドを知っている。それらは、１〜５コピー数で存在してもよく、約２０または５００コピー未満で、厳密な複製をともなう低コピー数プラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数プラスミド（ｐＡＣＹＣ、ＰＲＳＦ１０１０）または高コピー数プラスミド（ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ）に相当する。
【００５６】
本発明は、グリコール酸をグリコリル−ＣｏＡに変換する酵素をコードする遺伝子を含んでなる形質転換ベクターを提供する。
【００５７】
本発明のもう１つの実施形態では、前記遺伝子は、微生物の染色体に組み込まれていてもよい。そこには、当業者により周知の組換えの方法により、生物のゲノムの中に導入されることができる遺伝子の１つまたは数個のコピーがあってもよい。
【００５８】
遺伝子の過剰発現を得るためのもう１つの方法は、対応するメッセンジャーＲＮＡを安定させる要素の発現または調節を変更することであり(Carrier et al. Biothechnol Bioeng. 59: 666-72, 1998)、ｍＲＮＡの翻訳を最適化すれば、その後、有効な酵素の量は増加する。
【００５９】
本発明で使用される組換え微生物は、さらに、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼをコードする遺伝子を発現する。ＰＨＡの４つの主要なクラスが識別できている(Rhem, B., 2003)。クラスＩおよびクラスＩＩのＰＨＡシンターゼは、サブユニット（ＰｈａＣ）の１つのタイプのみからなる酵素を含んでなる。それらのインビボ（in vivo）およびインビトロ（in vitoro）特異性によると、（例えば、ラルストニア  ユートロファの）クラスＩのＰＨＡシンターゼは、優先的に、３から５の炭素原子を含んでなる様々なヒドロキシ脂肪酸のＣｏＡ−チオエステルを利用し、一方、（例えば、シュードモナス  エルギノーザの）クラスＩＩのＰＨＡシンターゼは、優先的に、６から１４の炭素原子を含んでなる様々なヒドロキシ脂肪酸のＣｏＡ−チオエステルを利用する。（例えば、アロコロマチウム  ビノスム（Allochromatium vinosum）の）クラスＩＩＩのシンターゼは、２つの異なるタイプのサブユニット、ＰｈａＣおよびＰｈａＥサブユニット、からなる酵素を含んでなる。これらのＰＨＡシンターゼは、３から５の炭素原子を含んでなるヒドロキシ脂肪酸のＣｏＡ−チオエステルを好む。（例えば、バチルス  メガテリウム（Bacillus megaterium）の）クラスＩＶのＰＨＡシンターゼは、クラスＩＩＩのＰＨＡシンターゼに似ているが、ＰｈａＥが、ＰｈａＲにより置き換わる。
【００６０】
本発明の特定の実施形態では、異種由来のＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子は、ｐｈａＣ、ｐｈａＥＣまたはｐｈａＣＲの中から選択され、好ましくはｐｈａＣおよびｐｈａＥＣの中から選択され、そして最も好ましくは、選択された遺伝子は、クラスＩのＰＨＡシンターゼの酵素をコードするｐｈａＣである。前記のとおり、「ｐｈａＣ」、「ｐｈａＥＣ」および「ｐｈａＣＲ」というこれらの名称の使用は、他の生物における、より詳しくは微生物における、全ての対応する遺伝子およびタンパク質に及ぶ。従って、既知の遺伝子に対してＧｅｎＢａｎｋで示された参照資料を使って、当業者は、他の生物、バクテリア株、酵母、菌類、哺乳類、植物などにおいて相当する遺伝子を決定することができる。この所定の作業は、他の微生物由来の遺伝子との配列アライメントを実行することにより決定され得る共通配列を使って、および他の生物における対応遺伝子をクローンニングするための縮重プローブを設計することで、有利に行われる。全ての相当する遺伝子は、参照により本願明細書に組み込まれる。
【００６１】
優先的には、異種由来のＰＨＡシンターゼをコードする前記遺伝子は、過剰発現される。前記のとおり、遺伝子の過剰発現は、当業者により知られた異なる方法により得られてもよい。遺伝子は、微生物に導入された発現ベクターにより発現されてもよく、または前記微生物の染色体に組み込まれてもよい。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、該方法に用いられる組換え微生物は、さらにＰｈａＲ／ＰｈａＰ調節系を発現し、特に微生物は、ファシン（phasin）およびその転写発現調節因子をそれぞれコードするＷ．ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈａＰおよびｐｈａＲ遺伝子を発現する。ＰｈａＰというファシンタンパク質は、ＰＨＡシンターゼの最適な細胞内環境の維持に関係しているようであり、グラニュール形成のプロセスの間、誘導を提供する(Wieczorek, R. et al. 1995)。ＰｈａＲ相同体は、インビトロおよびインビボの双方で研究されており(Wieczorek R. et al. 1995 およびYork G.M. et al. 2002)、そしてｐｈａＰ転写の調節因子としての働きを提唱されている。
【００６３】
「ｐｈａＰ」および「ｐｈａＲ」というこれらの名称の使用は、他の微生物における全ての対応する遺伝子およびタンパク質に及ぶ。
【００６４】
本発明は、さらに、本発明による方法により得られた重合したグリコール酸（ＰＧＡ）に関する。
【００６５】
本発明の主な利点は、グリコール酸から生産するのが難しい化合物である、グリコライドの使用を必要とする化学的方法よりも、簡単に、安い方法で、ＰＧＡを生産することである。
【００６６】
本発明は、さらに、異種由来のＰＨＡシンターゼと、グリコール酸をグリコリル−ＣｏＡに変換する少なくとも１つの酵素とをコードする遺伝子を発現する微生物に関する。
【００６７】
優先的には、前記微生物は、腸内細菌科であり、より優先的には大腸菌である。
【実施例】
【００６８】
【表１】
2011527367.tif 000002
オペレーターおよびＲＢＳ配列を付けたＰｔｒｃ０１プロモーター  配列番号７：
ｇａｇｃｔｇｔｔｇａｃａａｔｔａａｔｃａｔｃｃｇｇｃｔｃｇｔａｔａａｔｇｔｇｔｇｇａａｔｔｇｔｇａｇｃｇｇａｔａａｃａａｔｔＴＡＣＧＴＡｔａａｇｇａｇｇｔａｔａｔｔ
大文字記載：ＳｎａＢＩ制限酵素認識部位
【００６９】
（例１）
アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする遺伝子を含む組換えベクターの構築
ｐＳＣＢ−ａｃｓ、ｐＳＣＢ−ｐｒｐＥおよびｐＳＣＢ―ｐｒｐＥｓｔの構築
ｐｒｐＥ（大腸菌由来またはＳ．ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来）によりコードするプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、またはａｃｓによりコードするアセチル−ＣｏＡシンテターゼの、２つのタンパク質が、グリコール酸をグルコリルＣｏＡに変換するために使用される。各遺伝子は、ＰＨＡシンターゼをコードする、ラルストニア  ユートロファ由来のｐｈａＣ１遺伝子と共に、細胞内で、共発現される。
【００７０】
ａｃｓおよびｐｒｐＥ遺伝子を増幅するために、テンプレートとして大腸菌の染色体ＤＮＡと、ａｓｃ  Ｆおよびａｃｓ  Ｒと呼ばれるａｃｓ増幅のための、ならびにｐｒｐＥ  ＦおよびｐｒｐＥ  Ｒと呼ばれるｐｒｐＥ増幅のための、上記プライマー（表１参照）とを用いてＰＣＲが行われる。
【００７１】
ａｃｓのＰＣＲ断片を、ｐＳＣＢベクター（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＣＡＴ  ２４０２０７−５）にクローンニングし、プラスミドｐＳＣＢ−ａｃｓを得る。
【００７２】
ｐｒｐＥのＰＣＲ断片を、ｐＳＣＢベクターにクローンニングし、プラスミドｐＳＣＢ−ｐｒｐＥを得る。
【００７３】
サルモネラ  エンテリカ  チピムリウム（Salmonella enterica thyphimurium）由来のｐｒｐＥ遺伝子を増幅するために、テンプレートとしてプラスミドｐＰＲＰ４５(Alexander R Horswill,Jorge C Escalante-Semerena“Characterization of the Propionyl-CoA Synthetase(prpE) enzyme of Salmonella enterica:Residue Lys592 Is Required for propionyl-AMP synthesis”から）と、ｐｒｐＥｓｔ  ＦおよびｐｒｐＥｓｔ  Ｒと呼ばれるｐｒｐＥｓｔ増幅のための、上記プライマー（表１参照）とを用いてＰＣＲが行われる。
【００７４】
ｐｒｐＥｓｔのＰＣＲ断片を、ｐＳＣＢベクター（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＣＡＴ  ２４０２０７−５）にクローンニングし、プラスミドｐＳＣＢ−ｐｒｐＥｓｔを得る。
【００７５】
（例２）
ＰＨＡシンターゼおよびアシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする遺伝子を含む組換えベクターの構築
ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２の構築
ラルストニア  ユートロファ由来のｐｈａＣ１の遺伝子を有するプラスミドは、企業により供給され、大腸菌において、最高の転写速度を得るための最適系列を備える遺伝子を合成する。
【００７６】
コドン使用の相対的頻度は、生物および細胞小器官により広く異なる。配列をコードする合成タンパク質のための多くのデザインプログラムは、生物の選択を許可する。コドン用法データベースは、多くの普通株やおよび大腸菌のような解析された生物のためのコドン用法統計データを有する。
【００７７】
ＰＨＡシンターゼをコードする合成遺伝子ｐｈａＣ１は、即使用可の形で企業により提供される。該遺伝子を、該遺伝子の上流に位置するオペレーターおよびＲＢＳ配列を付けたＰｔｒｃ０１プロモーター（配列番号１）と、ｐｈａＣ１ｒｅの下流に位置するターミネータ−配列の下、クローンニングし、ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２プラスミドとした。
【００７８】
ｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２の構築
プラスミドｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２
を、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとを用いて切断し、得られたＰｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２を含むＤＮＡ断片を、同じ制限酵素により切断したｐＢＢＲ１ＭＣＳ５ベクターにクローンニングする。得られたプラスミドはｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２と呼ばれる。
【００７９】
プラスミドｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２
を、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとを用いて切断し、得られたＰｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２を含むＤＮＡ断片を、同じ制限酵素により切断したｐＵＣ１９ベクターにクローンニングする。得られたプラスミドはｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２と呼ばれる。
【００８０】
ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ａｃｓ−ＴＴ０２，ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２の構築
ｐＳＣＢ−ａｃｓおよびｐＳＣＢ−ｐｒｐＥプラスミドを、ＸｂａＩと、ＮｈｅＩとを用いて切断し、得られたａｃｓまたはｐｒｐＥのいずれかを含むＤＮＡ断片を、同じ制限酵素により切断したｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２ベクターにクローンニングする。得られたプラスミドは、ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ａｃｓ−ＴＴ０２およびｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２と呼ばれる。
【００８１】
ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥｓｔ−ＴＴ０２およびｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥｓｔ−ＴＴ０２の構築
ｐＳＣＢ−ｐｒｐＥｓｔプラスミドを、ＰａｃＩとＮｈｅＩとを用いて切断し、得られたｐｒｐＥｓｔを含むＤＮＡ断片を、同じ制限酵素により切断したｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２ベクターにクローンニングする。得られたプラスミドは、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥｓｔ−ＴＴ０２と呼ばれる。
【００８２】
ｐＳＣＢ−ｐｒｐＥｓｔプラスミドを、ＰａｃＩとＮｈｅＩとを用いて切断し、得られたｐｒｐＥｓｔを含むＤＮＡ断片を、同じ制限酵素により切断したｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ＴＴ０２ベクターにクローンニングする。得られたプラスミドは、ｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥｓｔ−ＴＴ０２と呼ばれる。
【００８３】
（例３）
グリコレート存在下で培養した場合、ＰＧＡを生産する組換え大腸菌株の構築およびポリグリコレートポリマーの調製
ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ａｃｓ−ＴＴ０２およびｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２ベクターを、エレクトロポレーションにより、大腸菌ＭＧ１６５５野生株に導入し、それぞれＭＧ１６５５（ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ａｃｓ−ＴＴ０２）およびＭＧ１６５５（ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２）株を得た。
【００８４】
ｐＢＢＲＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥｓｔ−ＴＴ０２およびｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥｓｔ−ＴＴ０２ベクターを、エレクトロポレーションにより、大腸菌ＭＧ１６５５野生株に導入し、それぞれＭＧ１６５５（ｐＢＢＲＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ａｃｓ−ＴＴ０２）およびＭＧ１６５５（ｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２）株を得た。
【００８５】
得られた菌株（図２）を、約５ｇ／ｌのグリコレートを含むＬＢまたはＭＭ培地で培養し（条件の詳細は以下の実施例）、次に菌株を回収するために遠心分離した。回収された菌株を、ヘキサフルオロイソプロパノールまたはクロロホルムのような溶媒を用いて、細胞内に蓄積されたポリマー物質を回収するために、凍結乾燥した。得られたポリマーが、ポリグリコレートであることを確認するために、ＮＭＲ解析を、回収されたポリマー物質に対して行った。
【００８６】
グルコースのみで培養した場合、ＰＧＡを生産する組換え大腸菌株の構築およびポリグリコレートポリマーの調製
炭素源としてグルコースからグリコール酸を生産するように遺伝子組換えされた菌株は、特許ＷＯ２００７／１４１３１６Ａ、ＷＯ２００７／１４０８１６Ａ、ＵＳ６１／１６２，７１２およびＥＰ０９１５５９７１，６に公開されている。該菌株は、本明細書では、グルコースのみからＰＧＡの生産を可能にするプラスミドの導入のために使われる。
【００８７】
ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２およびｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ａｃｓ−ＴＴ０２ベクターを、エレクトロポレーションにより、グリコール酸を生産するように遺伝子改変された大腸菌株に導入した。
【００８８】
ｐＢＢＲＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥｓｔ−ＴＴ０２およびｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥｓｔ−ＴＴ０２ベクターを、エレクトロポーションにより、グリコール酸を生産するように遺伝子改変された大腸菌株に導入した。
【００８９】
（例４）
三角フラスコにおけるグルコースからポリグルコール酸ポリマーを生産する菌株の発酵
発酵によるＰＧＡの生産は以下の、遺伝子型（ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２））を有するＡＧ１１２株を用いて行われた。
【００９０】
細胞内でのＰＧＡ生産は、５００ｍｌバッフル付き三角フラスコ中で（本例）、およびファーメンターバッチの中で（例５）行った。
【００９１】
ＡＧ１１２２を、１２．５ｇ／ｌのグルコースが補充された、それ自体に５ｇ／ｌのＭＯＰＳと、５ｇ／ｌのグルコースとを含む、ＬＢ培地（LB broth）(Bertani,1951,J.Bacteriol.62:293-300)またはモディファイドＭ９培地(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:120-128)、を用いて、５００ｍｌバッフル付き三角フラスコ中で育てた。培地のｐＨを、その時、ｐＨ６．８に調整した。
【００９２】
スペクチノマイシンおよびカナマイシン抗生物質を、最終濃度５０ｍｇ／ｌになるように加えた。一晩培養した前培養を、ＯＤ６００ｎｍが０．３になるように、５０ｍｌ培養に、植え継いだ。培養は、培地中のグルコースが尽きるまで、３７℃、２００ｒｐｍで、シェーカー上で行った。ポリグルコール酸産物を、Ａｖａｎｔｅｃ３８０４９２１の光学顕微鏡を用いて顕微鏡観察した。
【００９３】
増殖の数時間後の細胞の写真を、図１に示す。細胞の中の白い部分は、ポリマーグラニュールを示す。
【００９４】
（例５）
バッチ式ファーメンターにおけるグルコースからポリグルコール酸ポリマーを生産する菌株の発酵
ＡＧ１１２２株（ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２））によるＰＧＡの生産を、供給バッチプロトコールを用いて、６００ｍｌのファーメンターの生産条件で、評価した。
【００９５】
ユニークな前培養は、３７℃で２４時間、１２．５ｇ／ｌのグルコースを補充したＬＢ培地(Bertani,1951,J.Bacteriol.62:293-300)２００ｍｌで満たした２ｌ三角フラスコで行われた。該前培養は、ファーメンターの植え継ぎ用に使われた。
【００９６】
２０ｇ／ｌのグルコースおよび５０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンとカナマイシンとを補充したＬＢ培地４００ｍｌで満たしたファーメンターを、初期吸光度（ＯＤ）が１．５になるように植菌した。培養を、溶存酸素飽和度３０％以上を維持するために調整された撹拌とエアレーションと共に、３７℃で行った。ｐＨを、塩基を加えることで、６．８に調整した。培養を、バッチモードで、２４時間またはＯＤ６００ｎｍ＞１０になるまで、行った。
【００９７】
ポリグリコール酸ポリマー産物を、顕微鏡観察した。顕微鏡下の該菌株の写真が、図２に示されている。
【００９８】
該培養により得られたグリコール酸の最終滴定濃度（titer）は、１．５ｇ／ｌであった（分離のためのＢｉｏｒａｄ  ＨＰＸ９７Ｈカラムを用いたＨＰＬＣおよび検出するための屈折率測定器により解析した上清）。
【００９９】
同じ発酵を、グルコースを補充したモディファイドＭ９培地で行った。生産は、ＬＢ培地によるものよりも、遅かった。
【０１００】
（例６）
三角フラスコにおけるグリコール酸のバイオコンバーションによるポリグリコール酸を生産する菌株の発酵
グリコール酸のＰＧＡへのバイオコンバーションを、ＡＧ１３２７株（ＭＧ１６５５（ｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥｓｔ−ＴＴ０２））により確認した。
【０１０１】
ＡＧ１３２７によるバイオコンバージョンを、５ｇ／ｌのＭＯＰＳと、５ｇ／ｌのグルコースと、５ｇ／ｌのグリコール酸とを補充し、ｐＨ６．８に調整されたモディファイドＭ９培地を用いて、５００ｍｌバッフル付き三角フラスコ培養で、評価した。１０％ｖ／ｖでのＬＢ培地の補給も、バイオマス成長を高めるために、加えられた。アンピシリンまたはカルベニシリンを、濃度１００ｍｇ／ｌで、加えた。一晩培養した前培養を、ＯＤ６００ｎｍが０．３になるように、５０ｍｌ培養に植え継ぎされた。培養は、３０℃、２００ｒｐｍで、シェーカー上で行われ、ポリマー産物は、顕微鏡観察にされた。
【０１０２】
培養の最後に、グルコースおよびグリコール酸は、分離のためのＢｉｏｒａｄ  ＨＰＸ９７Ｈカラムを用いたＨＰＬＣおよび検出するための屈折率測定器により解析した。
【０１０３】
ポリマーのグラニュールは、グリコール酸の存在下で観察され、グリコール酸の添加の無いコントロール（図３）では観察されなかった。
【０１０４】
本発明を、特別な特徴に言及することで、詳細を述べているが、この明細書は、好ましい実施形態についてのみであり、そして本発明の範囲を制限しないことは当業者にとって明らかである。よって、本発明の実質上の範囲は、添付されたクレームおよびそれに相当するものにより定義される。
【０１０５】
（実施例７）
サルモネラ  チピムリウム由来のプロピオニル−ＣｏＡシンテターゼによるグリコール酸のグリコリル−ＣｏＡへの変換
［ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）（ｐＰＡＬ−ｐｒｐＥｓｔ）組換え株の構築］
サルモネラ  エンテリカ  チピムリウム由来のｐｒｐＥ遺伝子を増幅するために、テンプレートとしてのプラスミドｐＰＲＰ４５と、ｐＰＡＬ−ｐｒｐＥｓｔ  ＲおよびｐＰＡＬ−ｐｒｐＥｓｔ  Ｆと呼ばれるプライマー
ｐＰＡＬ−ｐｒｐＥｓｔ  Ｒ（配列番号８）
ＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＴＣＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＣＧ
ｐＰＡＬ−ｐｒｐＥｓｔ  Ｆ（配列番号９）
ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＴＴＴＴＡＧＣＧＡＡＴＴＴＴＡＴＣＡＧＣＧ
とを用いてＰＣＲを行う。
【０１０６】
ＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩと、ＥｃｏＲＩとを用いて切断し、同じ制限酵素で切断したｐＰＡＬ７ベクター（Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ  ｐＰＡＬ７  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｒａｄ）に、クローンニングする。得られたプラスミドは、ｐＰＡＬ−ｐｒｐＥｓｔと呼ばれる。
【０１０７】
ｐＰＡＬ−ｐｒｐＥｓｔベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）ケミカルコンピテントセルに導入し、ＡＧ１３５４と呼ばれるＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）（ｐＰＡＬ−ｐｒｐＥｓｔ）株を得た。
【０１０８】
［プロピオニル−ＣｏＡシンテターゼ、ＰｒｐＥｓｔの過剰生産］
ＰｒｐＥｓｔタンパク質の過剰生産は、２ｌ三角フラスコの中で行う。
ユニークな前培養を、５ｇ／ｌのグルコース、１００ｐｐｍのアンピシリンおよび１ｇ／ｌの硫酸マグネシウムを補充したＬＢ培地(Bertani,1951,J.Bacteriol.62:293-300)５０ｍｌで満たした５００ｍｌ三角フラスコで行う。前培養を、ＯＤ６００＝０．５になるまで、３７℃、２００ｒｐｍで培養し、その後、５ｇ／ｌのグルコース、１００ｐｐｍのアンピシリンおよび１ｇ／ｌの硫酸マグネシウムを補充したＬＢ培地５００ｍｌで満たされた２ｌフラスコの植え継ぎ用に使う。培養を、最初は、ＯＤ６００が０．６〜０．８になるまで、３７℃、２００ｒｐｍで行い、５００μＭＩＰＴＧを用いた誘導前に、２つ目の工程として２５℃に移動する。培養は、ＯＤ６００が約４になる時、止められた。細胞を、４℃で、７０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、その後、−２０℃で保管する前に、リン酸緩衝液で洗浄した。
【０１０９】
［ＰｒｐＥｓｔタンパク質の精製］
細胞（４５ｍｇ）を、超音波処理により溶解し、細胞片を、１２０００ｇ（４℃）、３０分間で遠心分離することにより取り除いた。タンパク質を、製造会社が推薦するプロトコールに従いＰｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（ＢＩＯＲＡＤ，Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅｘａｃｔ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）の親和性により、粗細胞抽出物から精製した。標識を、室温、３０分間、１００ｍＭフッ化物を用いた開裂により、タンパク質から取り除いた。溶出バッファーは、１００ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０％グリセロールから成る溶液に対する透析により、交換した。
【０１１０】
Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量法を、タンパク質濃度を測定するために使った（すなわち、乾燥重量４５ｍｇに対して０．２３μｇ／μｌ）。
【０１１１】
［ＬＣ−ＭＳによるグリコリル−ＣｏＡの検出］
グリコレートにおけるＰｒｐＥの活性を、ＬＣ−ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ／ＤＩＯＮＥＸ）により、得られた分子、グリコリル−ＣｏＡ（式１の化学的特徴）の検出により、測定する。反応混合物（２５０μｌ）は、７５ｍＭのリン酸緩衝バッファー（ｐＨ７．５）、１．５ｍＭ  ＡＴＰ、０．７５ｍＭ  ＣｏＡと、粗細胞抽出物１０〜４０μｇまたは精製タンパク質９μｇのいずれかとを含む。
【０１１２】
反応混合液を、グリコレートの異なる濃度（２０、４０および１００ｍＭ）で始めた。サンプルは、ＬＣ−ＭＳの機械に導入される前に、３７℃で３０分間インキュベートされた（反応は２５μｌまたは７５μｌ装填された）。コントロールとして、１）ＣｏＡ無し、２）酵素無し、および３）グリコレート無しの３つの反応混合液を用いた。
【０１１３】
結果は、図７、８に示される。
図７：反応は、１００ｍＭグリコレートおよびＰｒｅｐＥｓｔタンパク質を過剰生産するＡＧ１３５４菌株の粗細胞抽出物４０μｇを用いて行った。
図８：反応は、４０ｍＭグリコレートおよび精製タンパク質９μｇを用いて行った。
【０１１４】
どちらの場合も、得られた唯一のものは、グリコリル−ＣｏＡに相当するｍａｓｓ８２５（Ｍａｓｓ−１＝８２４．０）が検出された。
【化１】
2011527367.tif 000003
分子質量  ＝８２５，５８
計算精密質量（Exact Mass）＝８２５
分子式  ＝Ｃ２３Ｈ３８Ｎ７Ｏ１８Ｐ３Ｓ
【０１１５】
参考文献
米国特許文献
2,772,268 A                    11/2007 Cho J-H. et al. 
6,143,952 A                    11/2000 Srienc F. et al.
国際特許文献
WO 2004/038030 A2              05/2004 Martin D. et al.
WO 2007/141316 A               12/2007 Soucaille P.
WO 2007/140816 A               12/2007 Soucaille P. 
WO 01/55436                    08/2001 Green P. R. 
WO 98/54329                    12/1998 Witholt B. et al.
WO 99/61624                    12/1999 Skraly F. et al.
【０１１６】
他の刊行物
-  Williams and Peoples, CHEMTECH 26, 38-44, 1996,
-  Langer, R., Drug delivery and targeting. Nature 392, 5-10 (1998), 
-  Ikada, Y. & Tsuji, H. Macromol. Rapid Commum. 21, 117-132, 2000, 
-  Athanasiou, K. A. et al. Biomaterials 17, 93-102, 1996, 
-  Lu, L. & Mikos, A. G. Poly (glycolic acid) in polymer data handbook (ed. 
Mark, J. E.) 566-569, Oxford University Press, New York, 1999,  
-  Sorensen, W. R. & Campbell, T. W. Preparative Methods of Polymer Chemistry 
2nd edition, Interscience Publishers Inc, New York, 1963,  
-  Dechy-Cabaret, O. et al. Chem. Rev. 104, 6147-6176, 2004, 
-  Hyon, S. -H. et al. Biomaterials, 18, 1503-1508, 1997, 
-  Lenz R. W. and Marchessault R. H. Biomacromolecules. 6:1-8, 2005
-  Lenz R. W. Adv Polym Sci 107:1-40, 1993
-  Sudesh K. et al. Progr Polym Sci 25:1503-1555, 2000
-  Sudesh K. and Doi Y. Handbook of biodegradable polymers. Rapra technology, 
UK, pp 219-256, (Bastioli C. Editions), 2005
-  Steinbuchel A. and Fuchtenbusch B. TIBTECH 16:419-427, 1998
-  Steinbuchel A. Valentin AE. FEMS Microbiol Lett 1995, 128:219-228
-  Steinbuchel A. Biomaterials. Macmillan, New York, pp 123-213, Byrom D. 
Editions, 1991 
-  Timm A. and Steinbuchel A. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:3360-3367, 1990
-  Nomura, C. T. & Taguchi, S. Appl Microbiol Biotechnol.73:969-79, 2007
-  Hazer B. & Steinbuchel A. Appl Microbiol Biotechnol. 74:1-12, 2007 
-  Madison L. and Huisman G. Microbiol and Mol Biol Reviews, 63:21-53, 1999
-  Rehm B. Biochem J. 376:15-33, 2003
-  Gerngross T. and Martin D. Proc Natl Acad Sci U S A. 92:6279-83, 1995
-  Qi et al. FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997
-  Qi et al. FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998
-  Langenbach et al. FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997 
-  Amara A. et al. Appl Microbiol Biotechnol. 59:477-82, 2002
-  Fukui et al. J. Bacteriol. 180:667, 1998
-  Tsage et al. FEMS Microbiol. Lett. 184:193, 2000
-  Taguchi et al. FEMS Microbiol. Lett. 176:183, 1999
-  Ren et al., J. Bacteriol. 182:2978, 2000
-  Park et al, FEMS Microbiol. Lett. 214:217, 2002
-  Zhan et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:131, 2001
-  Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:699, 1994
-  Yuan et al., Arch. Biochem. Biophysics. 394:87, 2001 
-  Valentin et al. Appl Environ Microbiol. 66:5253-8, 2000
-  Lin H. et al.  Appl Microbiol Biotechnol. 71:870-4, 2006
-  Mack, M. and Buckel, W. FEBS Lett. 405:209-12, 1997
-  Sambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring 
Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York. 1989
-  Carrier et al. Biotechnol Bioeng. 59:666-72, 1998 
-  Wieczorek R. et al. J. Bacteriol. 177: 2425-2435, 1995
-  York G.M. et al. J. Bacteriol. 184: 59-66, 2002
【図１】
2011527367.tif 000004
【図４】
2011527367.tif 000005
【図５】
2011527367.tif 000006
【図６】
2011527367.tif 000007
【図７】
2011527367.tif 000008
【図８】
2011527367.tif 000009
【図２】
2011527367.tif 000010
【図３】
2011527367.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月8日(2011.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
（例４）
三角フラスコにおけるグルコースからポリグルコール酸ポリマーを生産する菌株の発酵
発酵によるＰＧＡの生産は以下の、遺伝子型（ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ５０／ＲＢＳＢ／ＴＴＧ−ｉｃｄ：：Ｃｍ  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ＋ｅｄａ  ΔｐｏｘＢ  ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ（ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１）（ｐＭＫ−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ｐｈａＣ１ｒｅ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２））を有するＡＧ１１２２株を用いて行われた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
増殖の数時間後の細胞の写真を、図４に示す。細胞の中の白い部分は、ポリマーグラニュールを示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
ポリグリコール酸ポリマー産物を、顕微鏡観察した。顕微鏡下の該菌株の写真が、図５に示されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
ポリマーのグラニュールは、グリコール酸の存在下で観察され、グリコール酸の添加の無いコントロールでは観察されなかった（図６）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2011527367.tif 000012
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2011527367.tif 000013
【国際調査報告】
2011527367.tif 000014
2011527367.tif 000015
2011527367.tif 000016
2011527367.tif 000017