(57)【要約】  光投影トモグラフィ・システムが、光源（１３０）を用いて照らされる。対象物を含むチューブ（１０７）の一部が光源（１３０）により照らされる領域内に配置される、対象物を含むチューブ（１０７）が、関心のあるフィーチャを有する関心のある対象物（１１４）を含む。ディテクタ（１１２）が、関心のある対象物（１１４）から発生する放射を受けるように配置される。光場拡大要素（１）を含むレンズ（１０３）が、対象物領域とディテクタ（１０４）の間の光路の中に配置され、それにより対象物を含むチューブ（１０７）の中の複数の対象物面（Ｚｎ）からの光線（１３０）が、ディテクタ（１０４）上に同時に合焦する。対象物を含むチューブ（１０７）が、相対的にディテクタ（１０４）の方に動き、レンズ（１０３）が各ビューにおいて関心のあるフィーチャの画像を作成するために対象物領域の複数のビューをもたらすように動作する。
2011503530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心のある対象物を結像させるための光投影トモグラフィ・システムであって、
（ａ）光源（１３０）と、
（ｂ）対象物を含むチューブ（１０７）であって、チューブ（１０７）の一部分が前記光源（１３０）で照らされる領域の中に配置され、前記関心のある対象物（１１４）が、前記対象物を含むチューブ（１０７）の内部に配置された少なくとも１つの関心のあるフィーチャを有する、チューブ（１０７）と、
（ｃ）前記関心のある対象物（１１４）から生じる放射を受けるように配置される、少なくとも１つのディテクタ（１０４）と、
（ｄ）前記対象物の領域と前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）との間の光路の中に配置される少なくとも１つのレンズ（１０３）であって、前記対象物を含むチューブ（１０７）の中の複数の対象物面（Ｚｎ）からの光線（１０５）が、前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）上に同時に合焦するように、少なくとも１つの光場拡大要素（１）を含む、レンズ（１０３）とを備える、システム。
【請求項２】
前記対象物（１１４）が、前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）に対して動き、前記少なくとも１つのレンズ（１０３）が、各ビューにおいて前記少なくとも１つの関心のあるフィーチャの少なくとも１つの画像を作成するために、前記対象物の領域の複数のビューを提供するように動作する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記関心のある対象物が生体細胞（１１４）を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）のうちの少なくとも１つの上の焦点に至る、前記複数の対象物面（Ｚ１）のそれぞれが、異なる光波長（λｎ）の光（１３０）を前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）上に重ね合わせる、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）により広げられる間隔が、前記関心のある対象物（１１４）の厚さ全体にわたる間隔である、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記関心のある対象物（１１４）が、前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）上に重ね合わせる少なくとも１つの波長の吸収係数を与えるために染色される、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）により広げられる間隔が、前記対象物を含むチューブ（１０７）の直径の太さ全体にわたる間隔である、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記少なくとも１つのレンズ（１０３）と前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）との間に配置される色フィルタ配列（２０１）をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記関心のある対象物（１１４）が前記複数の対象物面（Ｚｎ）により広げられる間隔内に留まるように、前記対象物領域の複数のビューのそれぞれの間の光路に沿って前記少なくとも１つのレンズ（１０３）を動かすために、前記少なくとも１つのレンズ（１０３）と結合される圧電変換器（１１３）をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
少なくとも１つのレンズ（１７０３）と少なくとも１つのディテクタ（１７０７）との間に配置される波面コード化光学要素（１７０５）をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）が、電荷結合素子（１１２）と、相補形金属酸化膜半導体素子と、ソリッド・ステート画像センサと、ソリッド・ステート画像センサ・ディテクタ配列とから成る群から選択されたディテクタを備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記関心のある対象物（１１４）が、ヘマトキシリンで染色される、請求項６に記載のシステム。
【請求項１３】
複数の対象物面（Ｚｎ）からの前記光（１３０）が、５０ミクロンまでの焦点間隔にまたがって５５０ｎｍ〜６２０ｎｍの範囲の波長を有する光を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記対象物を含むチューブ（１０７）が、少なくとも５０ミクロンの直径を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記関心のある対象物（１１４）が前記焦点間隔内に留まるように、前記対象物領域の前記複数のビューのそれぞれの間の光路に沿って前記少なくとも１つのレンズ（１０３）を動かすために、前記少なくとも１つのレンズ（１０３）に取り付けられる圧電変換器（１１３）をさらに備える、請求項２に記載のシステム。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのレンズ（１０３）と前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）との間に配置される色フィルタ配列（２０１）をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）により広げられる間隔が、少なくとも１２ミクロンの焦点間隔を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
複数の対象物面（Ｚｎ）からの前記光が５５０ｎｍ〜６２０ｎｍの範囲の波長を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）に到達する光の帯域限界に位置する５５０ｎｍ〜６２０ｎｍの範囲内で光を通すための帯域通過フィルタ（２０１）をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
前記光源が、前記対象物を含むチューブ（１０７）に到達する光（１３０）にフィルタをかけるために配置される色フィルタ（１１０）を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのレンズがハイパークロマティック・レンズ（１０３）を備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
関心のある対象物（１１４）を観察するための光トモグラフィ・システムであって、
前記関心のある対象物（１１４）を位置決めするための、ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）の観察領域と、
少なくとも１つのディテクタ（１０４）と、
ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）に取り付けられ、ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）を回すために配置されるモータと、
５５０ｎｍと６２０ｎｍの間の波長を有する広帯域光（１３０）を前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）の観察領域の中に伝送するための手段と、
前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）の観察領域を通して伝送される光（１３０）を受けるために配置されるハイパークロマティック・レンズ（１０３）と、
前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）の観察領域の中の複数の対象物面（Ｚｎ）からの光線が、前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）上に同時に合焦するように、前記ハイパークロマティック・レンズ（１０３）を通して伝送される光線（１３０）を合焦させるために配置されるチューブ・レンズ（１１１）とを備える、システム。
【請求項２３】
前記関心のある対象物が生体細胞（１１４）を含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記ハイパークロマティック・レンズ（１０３）および前記チューブ・レンズ（１１１）が、前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）の観察領域からの複数の対象物面（Ｚｎ）を前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）上に同時に合焦させるように動作する、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）により広げられる間隔が、前記生体細胞（１１４）の厚さ全体にわたる間隔である、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記生体細胞（１１４）が、前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）上に重ね合わせる少なくとも１つの波長の吸収係数を与えるために染色される、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２７】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）により広げられる間隔が、前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）の観察領域の厚さ全体にわたる間隔である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２８】
前記ハイパークロマティック・レンズ（１０３）と前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）との間に配置される色フィルタ配列（２０１）をさらに備える、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２９】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）からの前記光（１３０）が、５０ミクロンまでの焦点間隔にまたがって５５０ｎｍ〜６２０ｎｍの範囲の波長を有する光を含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３０】
前記ハイパークロマティック・レンズ（１０３）と前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）との間に配置される色フィルタ配列（２０１）をさらに備え、それにより前記ディテクタ（１０４）上の焦点（Ａ’）に至る光（１３０）が２つ以上の波長帯域（λｎ）に分割され、各波長帯域（λ１）が、前記色フィルタ配列（２０１）を通して前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）上のピクセル（２０３）の別々のセットに伝送される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３１】
関心のある対象物（１１４）を観察するための光トモグラフィ・システムであって、
前記関心のある対象物（１１４）を含むミクロキャピラリ・チューブ（１０７）と、
前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）に取り付けられ、前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）を回すためのモータと、
前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）を照らす（１３０）ために配置される光源と、
前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）を通して伝送される光（１３０）を受けるために配置されるハイパークロマティック・レンズ（１０３）と、
前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）の中の複数の対象物面（Ｚｎ）の中で始まる複数の光路（５０２）を、前記ハイパークロマティック・レンズ（１０３）を通して伝送されるときに分割するために配置される、２色ビーム・スプリッタ（５０１）と、
少なくとも２つのディテクタ（１０４）であって、前記少なくとも２つのディテクタ（１０４）のうちの第１のディテクタ（１０４）が前記複数の光路（５０２）のうちの１つの光路に沿って伝送される光を受けるように配置され、前記少なくとも２つのディテクタ（１０４）のうちの第２のディテクタ（５０９）が前記複数の光路（５０３）のうちの別の１つの光路に沿って伝送される光（１３０）を受けるように配置され、前記複数の対象物面（Ｚｎ）からの光線（１３０）が前記少なくとも２つのディテクタ（１０４）のうちの少なくとも１つのディテクタ上に同時に合焦される（Ｃ）、ディテクタ（１０４）とを備える、システム。
【請求項３２】
前記ハイパークロマティック・レンズ（１０３）と結合される圧電変換器（１１３）をさらに備える、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記関心のある対象物が生体細胞（１１４）を含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３４】
焦点に至る前記複数の対象物面（Ｚｎ）のそれぞれが、前記少なくとも２つのディテクタ（１０４）のうちの少なくとも１つのディテクタ上に、異なる光波長の光（１３０）を重ね合わせる、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３５】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）により広げられる間隔が、前記関心のある対象物（１１４）の厚さ全体にわたる間隔である、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３６】
前記生体細胞（１１４）が、少なくとも１つの波長の吸収係数を与えるために染色される、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３７】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）により広げられる間隔が、前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）の厚さ全体にわたる間隔である、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３８】
前記ハイパークロマティック・レンズ（１０３）と前記少なくとも２つのディテクタ（１０４）のそれぞれとの間に配置される色フィルタ配列（２０１）をさらに備える、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３９】
前記関心のある対象物（１１４）がヘマトキシリンで染色される、請求項３６に記載のシステム。
【請求項４０】
複数の対象物面（Ｚｎ）からの前記光（１３０）が、５０ミクロンまでの焦点間隔をカバーする５５０ｎｍ〜６２０ｎｍの範囲の波長を有する光を含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項４１】
前記対象物を含むチューブ（１０７）が、少なくとも５０ミクロンの直径を有する、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）により広げられる間隔が、少なくとも１２ミクロンの焦点間隔を含む、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４３】
複数の対象物面（Ｚｎ）からの前記光が５５０ｎｍ〜６２０ｎｍの範囲の波長を含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項４４】
前記少なくとも２つのディテクタ（１０４）に到達する光の帯域限界に位置する５５０ｎｍ〜６２０ｎｍの範囲内で光を通すための帯域通過フィルタ（２０１）をさらに備える、請求項３１に記載のシステム。
【請求項４５】
前記光源が、前記対象物を含むチューブ（１０７）に到達する光にフィルタをかけるために配置される色フィルタ（１１０）を含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項４６】
焦点不変光トモグラフィ・システムの中で焦点不変領域の中点を見出す方法であって、前記光トモグラフィ・システムが、光軸を有する対物レンズ（１０３）と、関心のある対象物（１１４）を含む、回転するチューブ（１０７）とを含み、
関心のある対象物の複数の画像を取得するために、前記対物レンズを前記光軸に沿ってパンすること（７０１）と、
各画像に対する焦点品質を評価すること（７０２）と、
焦点不変領域の上および下の境界を決定すること（７０３）と、
スキャン範囲が、前記上の境界（６０２）と下の境界（６０３）の間に中心を置かれる疑似射影画像を取得すること（７０４）と、
複数の投影角において複数の疑似射影が取得されるまで、前記チューブを回転させ、パンすること、評価すること、および取得することの上記工程を繰り返すこと（７０５）とを含む、方法。
【請求項４７】
焦点不変光トモグラフィ・システムの中で焦点不変領域の中点を見出すことにより３Ｄ再構成を計算する方法であって、前記光トモグラフィ・システムが、光軸を有する対物レンズ（１０３）と、関心のある対象物を含むミクロキャピラリ・チューブ（１０７）とを含み、
前記対物レンズをインクリメント方式で段階的に進めて複数の焦点面において合焦させ、前記関心のある対象物の複数の疑似射影を、前記ミクロキャピラリ・チューブの中の複数の焦点面（８１３）において取得すること（８０１）と、
焦点面の範囲における制限条件が適合するまで繰り返すこと（８０２）と、
複数の視角を通して前記チューブを回転させ、焦点面の範囲における制限条件が各視角に対して合致するまで、上記の段階的に進める工程と繰り返す工程を繰り返すことと、
各視角に対して、その視角において取得された、前記取得された疑似射影を合計し、合計された疑似射影の１セットを生成すること（８０３）と、
前記合計された疑似射影を使用して３Ｄ再構成を計算すること（８０４）とを含む、方法。
【請求項４８】
前記制限条件が、式、εｎＤ＝チューブ径、ここで０＜ε＜１およびｎはインクリメントされる段階の値、によって求めた制限に合致するかまたはその制限を超えること（８０２）を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
最良焦点を有する疑似射影を識別するために焦点スコアを適用する方法であって、
対物レンズをインクリメント方式で段階的に進めて複数の焦点面において合焦させ、関心のある対象物の複数の疑似射影を、ミクロキャピラリ・チューブの中の複数の焦点面（８１３）において取得すること（８０１）と、
焦点面の範囲における制限条件が適合するまで繰り返すこと（８０２）と、
２．５Ｄ焦点評価を実施して（８０５）、現在の視角に対してマッピングされた最良焦点を決定することと、
複数の視角を通して前記チューブを回転させ、上記の段階的に進める工程（８０１）と繰り返す工程（８０２）を各視角に対して繰り返すことと、
各視角に対して、その視角に対して最良焦点で取得された、前記取得された疑似射影を合計し、合計された疑似射影の１セットを生成することと、
前記合計された疑似射影を使用して３Ｄ再構成を計算すること（８０６）とを含む、方法。
【請求項５０】
前記制限条件が、式、εｎＤ＝チューブ径、ここで０＜ε＜１およびｎはインクリメントされる段階の値、によって求めた制限に合致するかまたはその制限を超えること（８０２）を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
第１の自動焦点カメラ（２００２）と、
第２の自動焦点カメラ（２００４）と、
前記第１の自動焦点カメラ（２００２）および前記第２の自動焦点カメラ（２００４）からディジタル化された入力を受けるように結合され、フィードバック信号（２００８）をもたらす画像比較器（２００６）と、
前記フィードバック信号（２００８）を受けるように結合される変換器ドライブ（２０１０）と、
前記第１の自動焦点カメラ（２００２）および前記第２（２００４）の視野内に、関心のある対象物（２００１）を含むミクロキャピラリ・チューブ（１０７）とを備え、前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）が回転モータと結合され、上側スペクトルの対象物ボリューム（２０１２）および下側スペクトルの対象物ボリューム（２０１４）からの別々の画像が、前記第１の自動焦点カメラ（２００２）および前記第２（２００４）によって捕捉され、
前記別々の画像が、前記フィードバック信号（２００８）をもたらして前記変換器ドライブ（２０１０）を駆動する前記比較器（２００６）によって比較されて解析され、前記変換器ドライブ（２０１０）が、次いで、対物レンズ（２１０３）の焦点範囲がピントの甘い焦点品質の領域に近づくように対物レンズ焦点ドライブ（２０１６）を制御し、前記２つの画像の間の焦点品質の差が十分小さくなったときに前記変換器ドライブが前記焦点範囲をシフトすることを停止し、
前記ミクロキャピラリ・チューブ（１０７）から画像を受けるように配置される画像カメラ（２０２０）を備える、自動焦点システム。
【請求項５２】
一次ビーム・スプリッタ（２０２８）と、
二次ビーム・スプリッタ（２０３０）と、
光線を前記第２の自動焦点カメラ（２００４）に向けるように配置されるミラー（２０３２）と、
前記一次ビーム・スプリッタ（２０２８）から第１の画像形成レンズ（２０２３）を通して前記画像カメラ（２０２０）まで光線を通すように配置された第１のフィルタ（２０２２）と、
前記二次ビーム・スプリッタ（２０３０）から第２の結像レンズ（２０２５）を通して前記第１の自動焦点カメラ（２００２）に向けられた光線を通すように配置された第２のフィルタ（２０２４）と、
前記ミラー（２０３２）から第３の結像レンズ（２０２７）を通して前記第２の自動焦点カメラ（２００４）に光線を向けるように配置された第３のフィルタ（２０２６）とをさらに備える、請求項５１に記載の自動焦点システム。
【請求項５３】
前記第１のフィルタ（２０２２）が、５５０ｎｍと６２０ｎｍの間の波長を有する光を通す、請求項５２に記載の自動焦点システム。
【請求項５４】
前記第２のフィルタ（２０２４）が、５８５ｎｍと６２０ｎｍの間の波長を有する光を通す、請求項５２に記載の自動焦点システム。
【請求項５５】
前記第３のフィルタ（２０２６）が、５５０ｎｍと５８５ｎｍの間の波長を有する光を通す、請求項５２に記載の自動焦点システム。
【請求項５６】
関心のある対象物（２００１）を観察するように位置決めされた対物レンズ（２１０３）と一直線上にある画像カメラ（２０２０）の視野内の関心のある対象物（２００１）を照らすように配置された、スペクトル的に一様な光照明の光源（２０６０）と、
一次ビーム・スプリッタ（２０２８）と、
二次ビーム・スプリッタ（２０３０）と、
ミラー（２０３２）と、
前記一次ビーム・スプリッタ（２０２８）から第１の画像形成レンズ（２０２３）を通して前記画像カメラ（２０２０）まで光線を通すように配置された第１のフィルタ（２０２２）と、
前記二次ビーム・スプリッタ（２０３０）と光学的に整列された第２のフィルタ（２０２４）と、
前記ミラー（２０３２）と光学的に整列された第３のフィルタ（２０２６）と、
前記第２のフィルタ（２０２４）から第１のフーリエ面空間フィルタ（２０５２）を通して第１のフォト・センサ（２０５４）まで光を伝送するように配置された第１のフーリエ面形成レンズ（２０５０）と、
前記第３のフィルタ（２０２６）から第２のフーリエ面空間フィルタ（２０５８）を通して第２のフォト・センサ（２０５４）まで光を伝送するように配置された第２のフーリエ面形成レンズ（２０５６）とを備え、
前記第１のフーリエ空間フィルタ（２０５２）および前記第２のフーリエ空間フィルタ（２０５８）が第１および第２のフォト・ダイオード（２０５４）を通して焦点制御コントローラ（２０４２）にアナログ・フィードバックを提供し、さらに、焦点範囲の上部（２０１２）および下部（２０１４）の高周波数コンテンツがそれぞれ、信号調整および差増幅プロセッサ（２０６２）の中で比較され、前記信号調整および差増幅プロセッサが、前記対物レンズ（２１０３）の位置を制御する（２０１６）ように接続されたドライブ（２０４２）に対して使用される出力（２０４０）を提供する、自動焦点システム。
【請求項５７】
前記第１のフィルタ（２０２２）が、５５０ｎｍと６２０ｎｍの間の波長を有する光を通す、請求項５６に記載の自動焦点システム。
【請求項５８】
前記第２のフィルタ（２０２４）が、５８５ｎｍと６２０ｎｍの間の波長を有する光を通す、請求項５６に記載の自動焦点システム。
【請求項５９】
前記第３のフィルタ（２０２６）が、５５０ｎｍと５８５ｎｍの間の波長を有する光を通す、請求項５６に記載の自動焦点システム。
【請求項６０】
焦点不変光学素子を使用する光トモグラフィのための２．５次元画像解析方法であって、
画像スタックＳｋの中のフィーチャＧｉ＝Ｇ１、．．．ＧΩを識別すること（１１０１）と、
各フィーチャＧｉに対して、Ｓｋの中の最良焦点のピクセルＸｉ、Ｙｉ、Ｚｉを識別すること（１１０２）と、
空白合成画像ＰＰｋを生成すること（１１０３）と、
Ｘｉ、Ｙｉ、Ｚｉの強度値をＰＰｋの中のピクセルＸｉ、Ｙｉの強度値に加算すること（１１０４）と、
すべてのフィーチャがＰＰｋの中に組み込まれるまで、すべてのフィーチャ（Ｇ１、Ｇ２、．．．ＧΩ）に対して繰り返すこと（１１０５）と、
複数の視点に対して繰り返すこと（１１０６）とを含む、方法。
【請求項６１】
前記焦点不変光学素子が、４色ＣＦＡを含み、前記方法が、前記最良焦点を含むピクセルを選択することにより、４色ＣＦＡの２×２ブロックのそれぞれを処理することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記焦点不変光学素子が、複数の２×２ブロックを含む４色ＣＦＡを含み、前記方法が、２つ以上のピクセルの加重和を使用して４色ＣＦＡの２×２ブロックのそれぞれを処理することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記焦点不変光学素子が、複数の２×２ブロックを含むＰＦＡを含み、前記方法が、前記最良焦点を含むピクセルを選択することによりＰＦＡの２×２ブロックのそれぞれを処理することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記焦点不変光学素子が、複数の２×２ブロックを含むＰＦＡを含み、前記方法が、２つ以上のピクセルの加重和を使用してＰＦＡの２×２ブロックのそれぞれを処理することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
コリメート光を伝送するための対物レンズ（１２０５）と、
前記対物レンズ（１２０５）により伝送される前記コリメート光を第１のアーム（１２０２）と第２のアーム（１２０４）に分割するための、前記対物レンズ（１２０５）の下流に配置された第１の２色ビーム・スプリッタ立方体（１２０６）とを備え、
前記第１のアーム（１２０２）が、λ１の波長を有し、第１の焦点面（１２０１）に始まり、
一次チューブ・レンズが、二次ビーム・スプリッタ立方体（１２０７）を通してカメラ・センサの活性領域（１２１１）の第１の領域上に、前記第１のアーム（１２０２）を伝送するように位置決めされ、
前記第２のアーム（１２０４）が、λ２の波長を有し、第２の焦点面（１２０３）に始まり、
第２の２色ビーム・スプリッタ立方体（１２０７）内で反射した後、チューブ・レンズ（１２１０）を通してカメラ・センサの活性領域（１２１１）の第２の領域上に前記第２のアームを通すように位置決めされた第１のミラー（１２０８）および第２のミラー（１２０９）を備え、前記カメラの前記第１の領域（１２１１）および前記第２の領域（１２１１）が、対象物空間の中の異なる焦点面（１２０１）から始まる集束された画像を取得する、光トモグラフィのための折り畳みシステム。
【請求項６６】
画像における相対的な横シフトが前記第２の２色ビーム・スプリッタ立方体（１２０７）を横にシフトすることにより達成され、それにより前記第２のアーム（１２０４）の反射光が、前記第１のアーム（１２０２）および前記一次チューブ・レンズに対して横にシフトされる、請求項６５に記載のシステム。
【請求項６７】
一次対物レンズ（１３０２）と、
前記一次対物レンズ（１３０２）を通して伝送される光を受けるように配置された、第１（１３０４Ａ）および第２（１３０４Ｂ）のミラーと、
異なる光路に沿って光を向けるように配置された少なくとも３つのビーム・スプリッタ（１３０３Ａ）と、
前記光路のうちの１つに沿ってそれぞれ配置された少なくとも４つの一次チューブ・レンズ（１３１０）と、
前記光路のうちの１つに沿ってそれぞれ配置された少なくとも４つの二次対物レンズ（１３１２）と、
前記光路のうちの１つに沿ってそれぞれ配置された少なくとも４つの二次チューブ・レンズ（１３０８）と、
前記光路のうちの１つに沿ってそれぞれ配置された少なくとも４つのカメラ（１３０９）とを備え、前記少なくとも４つの一次チューブ・レンズ（１３１０）のうちの１つと前記少なくとも４つの二次対物レンズ（１３１２）のうちの１つとの間の空間が各光路に対して異なり、それにより異なる対象物面が前記少なくとも４つのカメラ（１３０９）のそれぞれの上に合焦される、光トモグラフィのための複数カメラ・システム。
【請求項６８】
前記少なくとも４つのカメラ（１３０９）により取得された画像が、前記少なくとも４つのカメラ（１３０９）の前記画像面において同じ向きを維持する、請求項６７に記載のシステム。
【請求項６９】
前記一次対物レンズ（１３０２）および前記少なくとも４つの一次チューブ・レンズ（１３１０）が少なくとも１０倍の倍率をもたらし、前記二次対物レンズ（１３１２）およびチューブ・レンズ（１３０８）が追加の少なくとも１０倍の倍率をもたらす、請求項６７に記載のシステム。
【請求項７０】
一次対物レンズ（１３０２）と、
前記一次対物レンズ（１３０２）を通して伝送される光を受けるように配置された、第１（１３０４Ａ）および第２（１３０４Ｂ）のミラーと、
異なる光路に沿って光を向けるように配置された少なくとも３つのビーム・スプリッタ（１３０３Ａ）と、
前記光路のうちの１つに沿ってそれぞれ配置された少なくとも４つの一次チューブ・レンズ（１３１０）と、
前記光路のうちの１つに沿ってそれぞれ配置された少なくとも４つの二次対物レンズ（１３１２）と、
前記光路のうちの１つに沿ってそれぞれ配置された少なくとも４つの二次チューブ・レンズ（１３０８）と、
前記光路のうちの１つに沿ってそれぞれ配置された少なくとも４つのカメラ（１３０９）と、
異なる対象物面が前記少なくとも４つのカメラ（１３０９）のそれぞれの上に合焦するように、前記一次対物レンズ（１３０２）と前記少なくとも４つのカメラ（１３０９）の間に位置決めされた波面コード化光学素子（１７０５）とを備える、光トモグラフィのための複数カメラ・システム。
【請求項７１】
前記少なくとも１つの光場拡大要素（１）が、前記少なくとも１つのレンズ（１０３）と前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）との間に配置された偏光フィルタ配列を備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの光場拡大要素（１）が、前記ハイパークロマティック・レンズ（１０３）と前記少なくとも２つのディテクタ（１０４）のそれぞれとの間に配置された波面コード化要素（１７０５）を備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項７３】
前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）上の焦点に至る前記複数の対象物面（Ｚｎ）のそれぞれが、異なる偏光を有する光によって形成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項７４】
関心のある対象物（１１４）を結像させるための光投影トモグラフィの方法であって、
（ａ）関心のある対象物（１１４）を照らすことと、
（ｂ）前記関心のある対象物（１１４）における複数の対象物面（Ｚｎ）からの光線を、複数の異なるビューに対して少なくとも１つのディテクタ（１０４）の上に同時に合焦させることとを含む、方法。
【請求項７５】
５５０ｎｍ〜６２０ｎｍの範囲内の波長を有する光線だけを通すために、前記光線（１３０）をフィルタにかけることをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記フィルタをかけることが、少なくとも１つのディテクタ（１０４）に到達する光を制限するように配置された帯域通過フィルタ（２０１）を通して前記光を通すことをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記関心のある対象物（１１４）を結像のために対象物を含むチューブ（１０７）から送達することをさらに含み、前記対象物を含むチューブ（１０７）が、毛細管チューブと、ミクロキャピラリ・チューブと、ミクロキャピラリ・チューブの束と、ミクロキャピラリ・チューブのカセットとから成る群から選択されるチューブ（１０７）を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記対象物を含むチューブ（１０７）が、少なくとも５０ミクロンの直径を有する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
同時に合焦させることが、ハイパークロマティック・レンズ・システム（１０３）の少なくとも１つのレンズを少なくとも１つのディテクタ（１０４）に対して動かすことを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
第１の複数の光線経路をビーム・スプリッタ（５０１）を介して分割することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８１】
前記同時に合焦させることが、ハイパークロマティック・レンズ（１０３）を合焦させることを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８２】
前記同時に合焦させることが、前記光を少なくとも１つの色フィルタ配列（２０１）を通して伝送することにより前記光にフィルタをかけることをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）が、電荷結合素子（１１２）と、相補形金属酸化膜半導体素子と、ソリッド・ステート画像センサと、ソリッド・ステート画像センサ・ディテクタ配列とから成る群から選択されたディテクタ（１０４）を備える、請求項７４に記載の方法。
【請求項８４】
前記ディテクタ（１０４）上の焦点に至る光が、２つ以上の波長帯域（λｎ）に分離され、各波長帯域が、前記色フィルタ配列（２０１）を通して前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）上のピクセルの別々のセットまで伝送されるように、前記少なくとも１つの色フィルタ配列（２０１）を、前記ハイパークロマティック・レンズ（１０３）と前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）との間に配置することをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記少なくとも１つの色フィルタ配列（２０１）が、少なくとも１つの偏光フィルタ配列で置き換えられる、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）を同時に合焦させることが、前記関心のある対象物（１１４）の厚さにまたがる焦点間隔を通して合焦させることを拡大することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８７】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）を前記同時に合焦させることが、少なくとも１２ミクロンの焦点間隔を通して合焦させることを拡大することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８８】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）を前記同時に合焦させることが、５０ミクロンまでの焦点間隔を通して合焦させることを拡大することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８９】
前記光線（１３０）を波面コード化光学要素（１７０５）上に衝突させることをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項９０】
少なくとも１つの波長（λｎ）の吸収係数を与えるために、前記関心のある対象物（１１４）を染色することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項９１】
前記関心のある対象物（１１４）を前記染色することが、ヘマトキシリンで実施される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記複数の対象物面（Ｚｎ）を同時に合焦させることが、自動焦点システムで同時に合焦させることを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項９３】
自動焦点システムで前記同時に合焦させることが、色バランスを使用して合焦させることを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
光線を同時に合焦させることが、前記光線（１３０）を偏光フィルタ配列を通して伝送することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項９５】
光線を同時に合焦させることが、前記光線（１３０）を波面コード化要素（１７０５）を通して伝送することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項９６】
光線を同時に合焦させることが、前記複数の対象物面（Ｚｎ）のそれぞれを、前記少なくとも１つのディテクタ（１０４）上に、異なる偏光を有する光によって合焦させることを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項９７】
光線を同時に合焦させることが、最良焦点を決定するために２．５Ｄ焦点評価（８０５）を実施することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項９８】
前記関心のある対象物が生体細胞（１１４）を含む、請求項７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、光トモグラフィ結像システムに関し、より詳細には、生体細胞など、微小対象物が、顕微鏡による結像のために毛細管チューブの中に位置づけられる、光投影トモグラフィに関する。
【背景技術】
【０００２】
光トモグラフィを使用して生体細胞を結像させることにおける進歩は、例えば、参照によりその全開示が組み込まれている、２００３年２月１８日に発行の、「Apparatus and method for imaging small objects in a flow stream using optical tomography」という名称の米国特許第６，５２２，７７５号に開示されるように、Ｎｅｌｓｏｎによって開発されている。その分野におけるさらなる発達は、参照によりその全開示が組み込まれている、Ｆａｕｖｅｒらの「Method and apparatus of shadowgram formation for optical tomography」という名称の、２００３年１１月１８日に米国特許出願第１０／７１６，７４４号として出願され、２００４年４月２２日に公開された米国特許出願公開第２００４／００７６３１９号（Ｆａｕｖｅｒ‘７４４）、および、参照によりその全開示が組み込まれている、２００６年９月１８日に出願された、Ｆａｕｖｅｒらの「Focal plane tracking for optical microtomography」という名称の米国特許出願第１１／５３２，６４８号（Ｆａｕｖｅｒ‘６４８）の中で教示されている。
【０００３】
そのような光トモグラフィ・システムにおける処理は、被検物の準備から始まる。典型的には、患者から採取された被検物は、病院または外来患者診療所から受領され、診断に無用の要素を除去するために処理され、固定され、次いで、染色される。染色された被検物は、次いで、オプティカル・ゲルと混合され、ミクロキャピラリ・チューブの中に挿入され、被検物の中の、細胞などの対象物の画像が、光トモグラフィ・システムを使用して作成される。得られた画像は、「疑似射影画像」と呼ばれる、異なる視点からの拡大された被写界深度の画像の１セットを含む。疑似射影画像のセットは、関心のある細胞の３Ｄ再構成をもたらすために、逆投影およびフィルタリングの技術を使用して、再構成されうる。
【０００４】
したがって、３Ｄ再構成は、関心のある構造、分子または分子プローブの位置の定量化および測定を可能にするための解析に、依然として利用可能である。生体細胞などの対象物は、少なくとも１つの染色またはタグ付き分子プローブで標識されることができ、このプローブの測定された量および位置が、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、および卵巣癌などの様々な癌を含むがそれらに限定されない、細胞の病状についての重要な情報をもたらすことができる。
【０００５】
上述の光投影トモグラフィ顕微鏡検査（ＯＰＴＭ）システムにおいて、例えば、Ｆａｕｖｅｒ‘６４８において、１８０度回転にわたって採取された約２５０のサンプル画像が、５０ミクロンの毛細管チューブ内のフローストリームの中にランダムに分配された細胞核のボリュームを、十分にサンプル抽出するために必要とされる。
【０００６】
本開示は、許容できる解像度を維持しながらサンプリングの必要条件を削減するために、より高い解像度と改善された信号対ノイズ比をもたらすための、新しく今までにない技術を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，５２２，７７５号
【特許文献２】米国特許出願第１０／７１６，７４４号（米国特許出願公開第２００４／００７６３１９号）
【特許文献３】米国特許出願第１１／５３２，６４８号
【特許文献４】米国特許第５，５１７，３６０号
【特許文献５】米国特許第４，０８１，２７７号
【特許文献６】米国特許第６，８４２，２９７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】RJ Pieper and A Korpel、「Image processing for extended depth of field」、Applied Optics 22、1449 (1983)
【非特許文献２】VN Mahajan、「Aberration Theory Made Simple」、（Bellingham、WA: SPIE Press、1991）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｆａｕｖｅｒ‘７４４の中に記載され、ＶｉｓｉｏｎＧａｔｅ社により構築されるように、光トモグラフィ・システムの１つの種類において、結像光学素子の被写界深度が、被検物を含む毛細管チューブに対して、対物レンズを横にスキャンすることにより拡大される。圧電変換器（ＰＺＴ）アクチュエータが、被検物を通る一連の焦点面をスキャンするために、毎秒数回、正弦波状に、対物レンズを横に動かす。対物レンズを動かすのにＰＺＴアクチュエータを使用することにより、被検物を通して動く焦点面は、被検物を通して光軸に沿って急速に対物レンズの質量を動かすことにおいて、固有の慣性により制限される、その速度を有する。典型的には、スキャン速度の上限は、およそ毎秒６０サイクルである。回転と対物レンズのスキャンが十分に同期されると、ＰＺＴアクチュエータの往行程および復行程において画像が取得可能であり、毎秒１２０画像までが取得されることを可能にする。これは、有用な取得速度であるが、その取得速度は、本明細書の中で開示される装置、システムおよび方法により、著しく改善されうる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
光投影トモグラフィ・システムが、光源と共に示される。対象物を含むチューブの一部が光源により照らされる領域内に配置される、対象物を含むチューブは、関心のある少なくとも１つのフィーチャを有する関心のある少なくとも１つの対象物を含む。少なくとも１つのディテクタが、関心のある対象物から発生する放射を受けるように配置される。対象物を含むチューブの中の複数の対象物面からの光線が、少なくとも１つのディテクタ上に同時に合焦するように、光場拡大要素を含むレンズが、対象物領域とディテクタの間の光路の中に配置される。対象物を含むチューブは、少なくとも１つのディテクタに対して相対的に動き、レンズは、各ビューにおいて、関心のある少なくとも１つのフィーチャの少なくとも１つの画像を作成するために、対象物領域の複数のビューをもたらすように動作する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ハイパークロマティック光学レンズ・システムのための設計の一例を示す概略図である。
【図２】Ａ〜Ｄは、４つの波長のそれぞれに対する、シミュレーションされたモノクロマティック変調伝達関数（ＭＴＦ）が、４つの別々の画像面で評価されうる場合の、定性的な例を概略的に示すグラフである。
【図３】Ａ〜Ｄは、ある範囲の波長にわたる、シミュレーションされたポリクロマティック変調伝達関数が、４つの別々の画像面で評価されうる場合の、定性的な例を概略的に示すグラフである。
【図４Ａ】ハイパークロマティック光学レンズを組み込む光トモグラフィ・システムの中の、１つの視角における物体空間の詳細を概略的に示す図である。
【図４Ｂ】図４Ａに概略的に図示される光トモグラフィ・システムの動作を概略的に示す図である。
【図４Ｃ】ハイパークロマティック光学レンズを組み込む光トモグラフィ・システムの中の、第２の視角における物体空間の詳細を概略的に示す図である。
【図４Ｄ】図４Ｃに概略的に図示される光トモグラフィ・システムの動作を概略的に示す図である。
【図５】クロマティック・フィルタ配列のための設計の一例を概略的に示す図である。
【図６Ａ】クロマティック・フィルタ配列を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対する第１の視角を概略的に示す図である。
【図６Ｂ】クロマティック・フィルタ配列を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対する第１の視角を概略的に示す図である。
【図７Ａ】長い被写界深度を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対する第１の視角に対する物体空間を概略的に示す図である。
【図７Ｂ】長い被写界深度を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対する第１の視角を概略的に示す図である。
【図７Ｃ】長い被写界深度を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対する第２の視角に対する物体空間を概略的に示す図である。
【図７Ｄ】長い被写界深度を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対する第２の視角を概略的に示す図である。
【図８Ａ】複数の検出経路を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対する第１の視角を概略的に示す図である。
【図８Ｂ】複数の検出経路を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対する第２の視角を概略的に示す図である。
【図９】あるＭＴＦ範囲内の焦点不変の一例を示すグラフである。
【図１０】焦点不変光トモグラフィ・システムにおける焦点不変領域の中点を見出す方法を示すブロック線図である。
【図１１Ａ】焦点不変光トモグラフィ・システムにおける焦点不変領域の中点を見出す他の方法を示すブロック線図である。
【図１１Ｂ】焦点不変光トモグラフィ・システムにおける焦点不変領域の中点を見出すさらに他の方法を示すブロック線図である。
【図１２】色バランスを使用する自動焦点システムの一実施形態を概略的に示す図である。
【図１３】空間周波数フィルタリングを有する２個のフォトダイオードを使用する、焦点不変光トモグラフィ・システムにおける焦点不変領域の中点を見出す他の方法を示す図である。
【図１４】焦点不変光トモグラフィ・システムにおける２．５Ｄ結像のための方法を概略的に示すブロック線図である。
【図１５】単一カメラ上の２つの焦点面の同時結像が可能な折り畳み光学システムの一例を示す図である。
【図１６】光トモグラフィ・システムにおいて、焦点面のある範囲を得るための複数カメラ装置を概略的に示す図である。
【図１７】波面コード化光学素子を含むＯＰＴＭシステムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図において、同じ参照数字は類似の要素または部品を示す。図における要素の寸法および相対的な位置は、必ずしも縮尺どおりに描かれていない。例えば、様々な要素の形状および角度は縮尺どおりに描かれておらず、これらの要素のうちのいくつかは、図面の読みやすさを改善するために、適宜拡大され、配置されている。さらに、図示されているように、要素の特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関するいかなる情報をも伝えることを意図されておらず、単に、図面の理解を容易にするように選択されている。
【００１３】
以下の開示は、関心のある対象を結像するための、いくつかの実施形態およびシステムを説明する。本発明の例示的実施形態による方法およびシステムのいくつかの特徴が、図の中で説明され、記載される。本発明の他の例示的実施形態による方法およびシステムが、図において示されるものとは異なる付加的な手段または特徴を含むことができることが、理解されよう。例示的実施形態は、本明細書の中で、生体細胞に関して説明される。しかし、これらの例は、本発明の原理を示すためであり、本発明が、そのように限定されるものではないことが理解されよう。
【００１４】
さらに、本発明のいくつかの例示的実施形態による方法およびシステムは、これらの図の中で示される特徴のすべてを含んでなくてもよい。図を通して、同じ参照番号は、類似または同一の部品または手段を示す。
【００１５】
文脈が他を必要としない場合は、以下の本明細書および特許請求の範囲を通して、単語「含む（comprise）」およびその変形、「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などは、「含むが限定されない（including, but not limited to）」のような、開かれた包括的な意味に解釈されるものである。
【００１６】
本明細書を通して、「一例（one example）」または「例示的一実施形態（an example embodiment）」、「一実施形態（one embodiment）」、「一実施形態（an embodiment）」あるいはこれらの用語の様々な組合せに対する言及は、本実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態の中に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な場所で句「一実施形態において（in one embodiment）」または「一実施形態において（in an embodiment）」の出現は、必ずしもすべて、同じ実施形態に言及してはいない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わされうる。
【００１７】
定義
全体として、本明細書で使用されるように、以下の用語は、光学顕微鏡検査プロセスの文脈内で使用されるときに、以下の意味を有する：
「毛細管チューブ」は、一般的に受け入れられる意味を有し、１００ミクロン以下の内径を有する透明なミクロキャピラリ・チューブおよびその同等物を含むように意図される。
「被写界深度」は、その長さの範囲内で、許容されない画像ぼけが生じる前に焦点面がシフトされうる、光軸に沿った長さである。
「対象物」は、個々の細胞または他の実体を意味する。
「疑似射影」は、光学素子の本来の被写界深度より広い範囲のサンプルされたボリュームを表す単一画像を含む。
「被検物（specimen）」は、個々の患者からの単一の検査または処置から得られる完全な生成物（例えば、分析用に取られた唾液、生検、または鼻腔スワブ）を意味する。被検物は、１つまたは複数の対象物から構成されうる。被検物の診断の結果は、症状診断の一部となる。
「試料」は、すべてのまたは一部のアリコートまたは被検物を含む、分析の準備ができた、完成された細胞標本を意味する。
【００１８】
色収差被写界深度拡張
大部分の簡単なレンズは、色焦点ずれとして知られる、波長に依存する焦点位置を生じる。通常、色収差は、レンズにおいて望ましくない。しかし、生体試料における、十分に広い吸収スペクトルに対して、色収差の分散は、吸収性の対象物またはフィーチャの画像の被写界深度を、実質的に拡大することができる。
【００１９】
波長に依存するレンズ材料が、色収差を持つレンズを生み出す。ほぼすべてのレンズ材料は、波長に対して正負両方の屈折率のずれを有する可能性がある。通常、レンズ設計者は、色焦点面ずれを補償して、結果として正味の色焦点ずれがほぼゼロになるように、レンズ材料を選択する。球面および軸上色収差に対して補正された液浸顕微鏡対物レンズの一例に対して、１９９６年５月１４日発行のＴ  Ｓｕｚｕｋｉの「Immersion microscope objective」という名称の米国特許第５，５１７，３６０号を参照されたい。
【００２０】
設計パラメータを最小化するのではなく強調するように変化させることにより、色焦点ずれは、光学経路の中で、大きな色収差、またはハイパークロマティック収差を生成することができる。そのようなハイパークロマティック収差は、ディテクタ上の複数の焦点深度を同時に合焦することができ、各光波長は対象物内の個々の焦点面のディテクタにおいて像を形成する。このことは、制限された所望の波長範囲を超えて、焦点位置の範囲を広げる。染色剤または造影剤の中で狭い吸収ピークを有する被検物に対して、レンズは、狭い波長範囲に対して拡張された被写界深度の光学システムを形成するために、多くのミクロンにわたって分散を拡大するように、光場拡大要素を含むように設計されうる。光学部品および光学材料は、染色剤吸収範囲内で色分散を最適化するように選択される。
【００２１】
色収差を利用するときは、画像の構成に影響を与えうる要因を補償するように、スペクトル成分の相対的構成を変えることが有利であろう。これらは、造影剤または染色剤の波長依存性、カメラ応答、および光学材料を通る伝達を含むことができるが、それらに限定されない。スペクトル構成は、例えば、照明、収集、および／または結像用光学素子の中に、いくつかの波長を他の波長よりも多く減衰するフィルタを組み込むことにより、変更されうる。
【００２２】
一例として、被写界深度の限定された拡大が、ヘマトキシリン族の染色剤など、現存の染色剤吸収曲線を収容する、狭い範囲の波長に対して達成されうる。ヘマトキシリン族の中の染色剤は、５５０〜６２０ナノメートルの波長範囲の中で吸収ピークを示す。
【実施例１】
【００２３】
ハイパークロマティック・システムの中での使用に適する、ハイパークロマティック対物レンズ１０３の一例を、図１に示す。この複合レンズは、その光学素子のうちの１と２が共に結合されて第１の二重レンズを形成し、光学素子３と４が共に結合されて第２の二重レンズを形成し、光学素子５と６が共に結合されて第３の二重レンズを形成し、光学素子７と８が共に結合されて第４の二重レンズを形成する、８個の光学素子１〜８を備える。光学素子１の第１の面は平坦またはわずかに凸であり、それにより、この面が油または水などの浸漬液に接触するときに、空洞内に空気を閉じ込めることが避けられる。対物レンズ１０３に対する例示的処方は以下の通りである。
【００２４】
【表１】
2011503530.tif 000003
開口絞りの位置は、テレセントリシティをもたらし、横方向の色（倍率色収差としても知られる）を最小化するように選択されうる。部品材料は、例えば、Schott North America, Inc.、Elmsford, NY 10523から市販されている。
【００２５】
以下の明細書の中で図面を参照しながら説明される例で示すように、レンズ・システム１０３は、１８０ｍｍの焦点距離を有するチューブ・レンズの前に置かれるとき、第１の素子１の前面と、レンズの視野の中に位置決めされるカバーガラスの上面との間の空間が、水で満たされているならば、５５０ｎｍ〜６２０ｎｍの波長範囲にわたって、０．９に等しい開口数（ＮＡ）において６０倍の倍率をもたらす。通常、カバーガラスは、約１３０ミクロンの厚さであり、一方、カバーガラスとレンズの間の、水で満たされた空間は、約２００ミクロンの厚さであってよい。対象物は、２００ミクロンの直径の視野にわたって個々の波長において１５ミクロンの範囲にわたってカメラの結像面上に合焦される。この例示的実施形態において、第１の面内の対象物の一部は、入射光の５５０ｎｍの部分によって合焦され、第１の面より５ミクロン下に配置される第２の面は、入射光の５７３ｎｍの部分によって合焦され、第１の面より１０ミクロン下に配置される第３の面は、入射光の５９７ｎｍの部分によって合焦され、第１の面より１５ミクロン下に配置される第４の面は、入射光の６２０ｎｍの部分によって合焦される。
【００２６】
システムＭＴＦ
次に、図２Ａ〜図２Ｄを参照すると、４つの波長のそれぞれに対する、シミュレーションされたモノクロマティック変調伝達関数（ＭＴＦ）が、４つの別々の画像面で評価される場合の定性的な例が、示される。図２Ａ〜図３Ｄを通して、垂直軸はシステムＭＴＦを表し、水平軸は０〜遮断周波数、ｆｃの範囲の周波数を表し、ここでｆｃは、非ゼロＭＴＦに対する最高周波数である。図２Ａに示すＭＴＦと類似のＭＴＦが、物体空間の中に２Ｄ光学試験対象を置き、その対象を約５５０ｎｍの波長を有する狭帯域光で照明し、最良焦点を見出すことにより、原理上、測定されうる。波長を約５７３ｎｍに変更し、焦点位置を５ミクロン動かすことで、図２Ｂに示すＭＴＦが作成されうる。このプロセスを、約５９７ｎｍに対して繰り返し、さらに約６２０ｎｍに対して繰り返すと、それぞれ図２Ｃおよび図２Ｄに示すＭＴＦが得られる。１つの対象物の全ボリュームからの焦点の合った情報が、１５ミクロンまでの厚さの対象物に対して、同時に取得されうる。
【００２７】
次に、図３Ａ〜図３Ｄを参照すると、照明が約５５０ｎｍと６２０ｎｍの間の波長の帯域から成る光学投影システムに対して、シミュレーションされたポリクロマティック変調伝達関数（ＭＴＦ）の定性的な例が示される。図３Ａに示すＭＴＦと類似のＭＴＦが、物体空間の中に２Ｄ光学試験対象を置き、その対象を約５５０〜６２０ｎｍの範囲内の波長の帯域を有する広帯域光で照明し、最良焦点、ΔＺ＝０、を見出すことにより、原理上、測定されうる。焦点位置を５ミクロンだけ動かしてΔＺ＝５ミクロンに合焦することにより、図３Ｂに示すＭＴＦが定性的に得られる。焦点位置を１０ミクロンだけ動かしてΔＺ＝１０ミクロンに合焦することにより、また、焦点位置を１５ミクロンだけ動かしてΔＺ＝１５ミクロンに合焦することにより、それぞれ、図３Ｃおよび図３Ｄに示すＭＴＦが、定性的に得られる。他の処方および光学的設計が、本実施形態の趣旨を逸脱することなく使用されうることを理解されたい。
【００２８】
有利には、ハイパークロマティック光学システムが、ＯＰＴＭシステムの中に組み込まれうる。変換素子、例えば、圧電変換器（ＰＺＴ）などが、３６０度設定のスキャンにわたって、対物レンズの単一の、低速度の遷移を作用させるために使用されうる。レンズの遷移は、たとえ、チューブ回転が対象物に、３６０度スキャンの間、回転する毛細管の内径と同程度だけ光軸に沿った遷移を生じさせるとしても、関心のある対象物を、約１５ミクロンの焦点間隔内に保持する。前の実施形態とは対照的に、各視点において行われる高速スキャンは、もはや必要とされない。結果として、画像取得速度は、もはや、ＰＺＴ変換素子の速度によって制限されない。さらに、チューブ回転とレンズの遷移運動の間の同期は、もはや、それほど正確である必要はなく、それにより、ＯＰＴＭ機器制御システムの複雑さが低減される。
【００２９】
次に、図４Ａを参照すると、ハイパークロマティック光学レンズを組み込む光トモグラフィ・システムの中の１つの視角における物体空間の詳細が、概略的に示される。細胞１１４が、ミクロキャピラリ・チューブ１０７の内部の、第１の対象物面Ｚ１と第２の対象物面Ｚ２との間に位置する。チューブ１０７は、例えば、５０ミクロンの内径を有してよく、第１の対象物平面と第２の対象物平面との間の間隔は、例えば、１５ミクロンであってよい。好ましくは、ミクロキャピラリ・チューブ１０７は、内部屈折率をチューブの屈折率と整合させる、光学整合媒体１２３で満たされる。
【００３０】
例示的一実施形態において、好ましくは、アッセンブリ１２１は、標準的顕微鏡スライドを含んでよい、第１の平坦な光学面１２０と、標準的な顕微鏡カバーガラスを含んでよい、第２の平坦な光学面１０８との間の視野内に置かれるミクロキャピラリ・チューブ１０７を含む。チューブ１０７と平面１０８、１２０との間の隙間は、チューブ１０７、平面１０８、１２０、およびオプティカル・ゲル１２３の屈折率と、同じく実質的に整合する屈折率を有するオプティカル・オイル１２４、または相当物で満たされる。アッセンブリ１２１は、顕微鏡の上に搭載可能であり、例えば、オイル、水、または空気を含む光学浸漬液１０９が、（図４Ｂに示すような）ハイパークロマティック光学素子に面する、アッセンブリ１２１の側面上に配置される。チューブ１０７の外径は、例えば、約２５０ミクロンであってよく、カバーガラス１０８の厚さは約１７０ミクロンであってよく、浸漬液１０９の厚さは約１００〜３００ミクロンの間であってよい。
【００３１】
第１の波長λ１（例えば、λ１＝約５５０ｎｍ）と第２の波長λ２（例えば、λ２＝約６２０ｎｍ）の間の波長を有する広帯域光１３０が、例えば、集光レンズ・システムによりチューブ１０７の中に伝送される。波長λ１を有する光の光路の第１のセット１０５が、第１の対象物面Ｚ１から浸漬液１０９の中へ進む。波長λ２を有する光の光路の第２のセット１０６が、第２の対象物面Ｚ２から浸漬液１０９の中へ進む。図４Ａに示されていないが、波長λｎ、ここでλｎはλ１とλ２の間の波長である、を有する光が、第１の対象物面と第２の対象物面の間に位置する中間対象物面Ｚｎから１０５および１０６に類似の光路に沿って進むことが理解できる。
【００３２】
図４Ｂを参照すると、このシステムの動作がより深く理解されうる。色フィルタ１１０および集光レンズ１１５が、所望の上限および下限波長（λ１、λ２）を有する照明１３０Ｆをもたらす。入射光は、例えば、生体細胞１１４を含むチューブ・アッセンブリ１２１を通過する。λ１およびλ２の波長を有し、細胞１１４近傍の対象物面Ｚ１およびＺ２それぞれから始まる光路１０５および１０６が、浸漬液１０９およびハイパークロマティック対物レンズ・システム１０３を通過し、光路がチューブ・レンズ１１１に到達するときに実質的にコリメートされる。次いで、光路は、例えば、約１８０ｍｍの焦点距離を有してよいチューブ・レンズ１１１を通過し、ＣＣＤカメラ１１２の画像面１０４上に焦点Ａを結ぶ。対物レンズ１０３はＰＺＴ１１３上に搭載され、ＰＺＴ１１３は、対物レンズ１０３を、チューブ・レンズ１１１から遠ざかり、対象物面Ｚ１およびＺ２に近づくように動かすことができる。
【００３３】
波長λｎ、ここでλｎの波長はλ１とλ２の間の値を有する波長である、を有する光が、平面Ｚ１および平面Ｚ２の間に位置する中間対象物面Ｚｎから、１０５および１０６に類似の光路に沿って、やはり画像面１０４上の焦点に到達する。λ１およびλ２に対してλｎの波長は、中間対象物面が画像面１０４上に合焦されるために、対象物面Ｚ１およびＺ２に対して中間対象物面が位置する場所を決定する。
【００３４】
次に、図４Ｃを参照すると、ミクロキャピラリ・チューブ１０７が回転し、細胞１１４に、その位置と向きを変えさせた後の、図４Ａのシステムが示される。この運動を補償するために、ＰＺＴ１１３（例えば、図４Ｂに示すように）は、画像面１０４上に合焦した光を、波長λ１の光に対する対象物面Ｚ３からの光路１１８を介して、また波長λ２の光に対する対象物面Ｚ４からの光路１１９を介して、対象物面Ｚ３およびＺ４の第２のセットから開始させるのに十分な量だけ、対物レンズ１０３を動かす。λ１とλ２の間で変わる波長λｎを有する光が、対象物面Ｚ３およびＺ４の間に位置する中間対象物面Ｚｎから、光路１１８および１１９の間の光路に沿って進み、やはり画像面１０４上の焦点に到達することは、本開示の恩恵を受ける当業者には理解されよう。λ１およびλ２に対してλｎの波長は、対象物面Ｚｎが画像面１０４上に合焦されるために、Ｚ３およびＺ４に対して対象物面Ｚｎが位置しなければならない場所を決定する。図４Ｄは、図４Ｃで詳述されたシステムを示し、特に、ＰＺＴ１１３が対物レンズ１０３を動かしており、それにより、合焦した画像が画像面１０４上の焦点Ｂに移されることを示す。
【００３５】
図４Ａ〜図４Ｄに示すシステムは、対物レンズ１０３を、ＰＺＴスキャン機構１１３の高周波数駆動により高速度で動かす必要なく、カメラ１１２が、細胞１１４の厚さ全体にわたって十分に補正された対物レンズをスキャンすることにより作成された、画定された疑似射影に類似する画像を取得することを可能にし、さらに複数の角度から複数の疑似射影を取得することを可能にすることは、本開示の恩恵を受ける当業者には理解されよう。
【００３６】
他の実施形態は、染色剤による一定の吸収の範囲内の波長に対して、対象物の厚さ（例えば、１５ミクロン）にわたって焦点を生成する収差を有する、前述のハイパークロマティック光路を利用する。この実施形態は、光路の中、好ましくは画像面１０４の直前に配置された色フィルタ配列（ＣＦＡ）をさらに含む。ＣＦＡは、２種類以上のピクセルから成ることができ、各ピクセルは、カメラ１１２の結像面１０４のピクセル・サイズに相当するサイズを有する。各種類のピクセルは、個々の波長の範囲を通過させる。本発明の一部として記載される帯域通過範囲より十分に広い帯域通過範囲を有するＣＦＡの一例が、１９７８年３月２８日にＢｒａｕｌｔらに発行された「Method for making a solid-state color imaging device having an integral color filter and the device」という名称の米国特許第４，０８１，２７７号に記載されるような、Ｂａｙｅｒフィルタである。
【００３７】
次に、図５を参照すると、色フィルタ配列のための設計の一例が、概略的に示される。ＣＦＡ２０１は、単位セル２０２の中に複数のピクセルの種類を含む。一例において、複数のピクセルの種類は、単位セル２０２の中に含まれる４つのピクセルの種類２０３、２０４、２０５、２０６を含む。４つのピクセルの種類はそれぞれ、５５０〜５６７ｎｍ、５６７〜５８４ｎｍ、５８４〜６０１ｎｍ、および６０１〜６１８ｎｍの波長だけを通過させる。ＣＦＡ２０１は、画像面１０４の相当な部分をカバーするのに十分な数の単位セル２０２を含まなければならない。例えば、画像面１０４が９００×１６００ピクセルを含む場合、ＣＦＡ２０１は、有利には、４５０×８００の単位セル２０２を含むことができ、各単位セル２０２は、フィルタ・ピクセルの種類２０３、２０４、２０５、および２０６のそれぞれの１つから成る２×２マトリックスを含む。この設計は、各波長に対するピクセルの４分の１だけを使用するため、空間解像度を２分の１に制限することがある。しかし、このことは、ピクセルにより制限される解像可能なサイズ（ＣＦＡを含めて、４×［ピクセル・サイズ］／倍率に相当）が、所望の光学的分解能（この例では５００ｎｍ）より小さい限り、実際には問題とならない。カメラのピクセル・サイズ＝７．４ミクロンおよび倍率＝６０の典型的な条件のもとでは、この必要条件は満足される。本実施形態における各ＣＣＤピクセルに到達する光強度は、４波長ＣＦＡのため、４分の１に減少される。この減少は、やはり実際には問題ではない。というのは、光源強度が、より長いカメラ露出時間を必要とすることなく、より高い光レベルをもたらすように増大されうるからである。
【００３８】
図６Ａおよび図６Ｂを共に参照すると、ＣＦＡ２０１を組み込むハイパークロマティック・システムの動作の他の例が示される。そのシステムは、図４Ａおよび図４Ｃに示すシステムに類似し、カメラ２０１の画像面１０４上にＣＦＡ２０１が付加されている。システムの光軸に沿って対物レンズ１０３が遷移するため、焦点は、図６Ａの焦点Ａ’から図６Ｂの焦点Ｂ’まで移動する。
【００３９】
ＣＦＡ２０１を含むことで、信号を２からそれ以上（この例では４）の集束範囲に分割することが可能となり、それにより、焦点の合った信号の品質を落とすピンぼけの量を減少させる。各集束範囲を別々に保存することにより、各集束範囲は、取得後の処理の間にディジタル処理で組み合わされてよく、組み合わされた画像のダイナミック・レンジの増加が可能となり、結果として組み合わされた画像の空間解像度およびコントラストが改善される。代わりに、各波長からもたらされる画像は、２以上の異なるデータ・セットとして処理が可能であり、それぞれが別々に、トモグラフィ的に再構成され終わるまでは組み合わされず、そのようにして空間解像度およびコントラストの改善がもたらされる。
【００４０】
次に、図７Ａおよび図７Ｂを共に参照すると、長い被写界深度を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対して、第１の視角Θ１に対する物体空間が、概略的に示される。拡大された集束範囲の限界が、ＣＦＡ２０１と組み合わされて、ＰＺＴ１１３などのレンズ変換器を、システムの動作に対して不要にする。対象物面Ｚ５およびＺ６の他の対は、それぞれλ１およびλ２の波長に対応する。対象物面は、ミクロキャピラリ・チューブ１０７の内径の極値に位置する。対象物面Ｚ５およびＺ６は、ミクロキャピラリ・チューブ１０７の内径の極値に位置するので、対象物面Ｚ５およびＺ６の位置は、チューブ１０７が回転するときでさえ、対物レンズに対して一定のままであり、細胞１１４が対物レンズに対してその位置を変化させられる。５０ミクロンの内径を有するミクロキャピラリ・チューブ１０７に対して、対象物面Ｚ５とＺ６の間隔は、少なくとも５０ミクロンあることが好ましい。λ１およびλ２の波長の光をそれぞれ含む光路４０５および４０６は、それぞれ対象物面Ｚ５およびＺ６を通って進み、ＣＦＡ２０１に到達する。ここでλ１は、例えば、第１の種類２０３のＣＦＡピクセルだけを通って伝送され、λ２は、例えば、最後の種類２０６のＣＦＡピクセルだけを通って伝送される。
【００４１】
ＣＦＡの単位セルの中に複数のピクセルの種類が存在するため、各ピクセルの種類は対象物面Ｚ５とＺ６の間の間隔の一部分からの光だけを集める。上述の通り、図５に示す４色のＣＦＡ２０１に対して、各間隔は、重ならないことが好ましく、それゆえ全間隔の４分の１だけが、任意のピクセルの種類を通して伝送され、カメラ１１２により集められる。
【００４２】
一例として、焦点面間隔が５０ミクロンで、波長範囲が５５０〜６１８ｎｍの場合、ピクセルの種類２０３の直後にあるカメラ・ピクセルは、対象物面Ｚ５とＺ５＋１２．５の間の対象物面に対応する、５５０ｎｍと５６７ｎｍの間の波長を有する光だけを検出する。同様に、ピクセルの種類２０４の直後にあるカメラ・ピクセルは、Ｚ５＋１２．５ミクロンとＺ５＋２５ミクロンの間に位置する複数の対象物面の間の焦点面に対応する、５６７ｎｍと５８４ｎｍの間の波長を有する光だけを検出する。ピクセルの種類２０５の直後にあるカメラ・ピクセルは、Ｚ５＋２５ミクロンとＺ５＋３７．５ミクロンの間の対象物面に対応する、５８４ｎｍと６０１ｎｍの間の波長を有する光だけを検出し、ピクセルの種類２０６の直後にあるカメラ・ピクセルは、Ｚ５＋３７．５ミクロンとＺ６（すなわち、Ｚ５＋５０ミクロン）の間の対象物面に対応する、６０１ｎｍと６１８ｎｍの間の波長を有する光だけを検出する。
【００４３】
次に、図７Ｂを参照すると、長い被写界深度を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対する第１の視角が、概略的に示される。システムを構成する部品は、ＰＺＴなど、対物レンズのための機械的遷移器がもはや不要であることを除いて、図６Ｂの部品に類似する。光路４０５および４０６は、チューブ１０７の対向する両側から始まり、類似の経路を通って焦点Ａ”において画像センサ１０４に至る。ＣＦＡ２０１がやはり示されているが、ＣＦＡ２０１は、本実施形態においては任意選択である。
【００４４】
次に、図７Ｃを参照すると、長い被写界深度を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対する第２の視角に対する物体空間が概略的に示される。ここに、細胞１１４は、第２の視角Θ２まで回される。細胞１１４は、常に、拡大された被写界深度（すなわち、平面Ｚ５とＺ６の間）の境界内にあるので、ＰＺＴを使用して対物レンズ１０３を動かす必要はない。
【００４５】
次に、図７Ｄを参照すると、長い被写界深度を組み込むハイパークロマティック光トモグラフィ・システムに対する第２の視角が、図７Ｃに詳述されるシステムを示しながら、概略的に図示される。図７Ｂとは対照的に、対物レンズ１０３の焦点が、画像面１０４上の焦点Ｂ”に移動していることに留意されたい。ＣＦＡ２０１がやはり示されているが、ＣＦＡ２０１は、本実施形態においては任意選択である。
【００４６】
次に、図８Ａを参照すると、被検物を保持するキャピラリ・チューブが第１の回転角にある、複数のカメラ・システムの一例が示される。複数のカメラ・システムは、図４Ａおよび図４Ｂに関して本明細書で前述したように、実質的に、色フィルタ１１０および集光レンズ１１５、ならびに例えば、生体細胞１１４を含むチューブ・アッセンブリ１２１を含む。細胞１１４の近傍の対象物面Ｚ１およびＺ２それぞれにおいて始まる光路は、浸漬液１０９およびハイパークロマティック対物レンズ・システム１０３を通過する。図４Ａおよび図４Ｂに関して上述されたシステムから離れて、複数のカメラ・システムは、ここでは２色性ビーム・スプリッタ立方体５０１を包含し、第１の複数の光路５０２および５０３を分離する。第１の複数の光路５０２および５０３は、対象物面Ｚ１およびＺ２と類似の対象物面の中で始まる。各カメラは、任意選択で、色フィルタ配列２０１、５０８によりフィルタをかけられてよい。代替の一実施形態において、偏光フィルタ配列が、各色フィルタ配列と置き換えられうる。広い被写界深度が望まれる場合、本実施形態に類似する他の実施形態は、上述の他の実施形態と同様に、対物レンズを動かすための遷移機構１１３を排除しながら、ＣＦＡ２０１および５０８を使用する。
【００４７】
次に、図８Ｂを参照すると、被検物を保持するキャピラリ・チューブが第２の回転角にある、図８Ａの複数のカメラ・システムの一例が示される。ここでは、２色性ビーム・スプリッタ立方体５０１が、第２の複数の光路５０４および５０５を分離する。第２の複数の光路５０４および５０５は、対象物面Ｚ３およびＺ４と類似の対象物面の中で始まる。
【００４８】
次に、図８Ａおよび図８Ｂを共に参照すると、同じ波長である光線５０２および５０４が、一次チューブ・レンズ１１１を通って進み、第１のカメラ１１２に至る。光線５０２および５０４と異なる波長である光線５０３および５０５が、二次チューブ・レンズ５０６を通って進み、第２のカメラ５０７のセンサ領域５０９に至る。追加の２色性ビーム・スプリッタおよびカメラが、容易に想定されうる。
【００４９】
焦点スコア
拡張された被写界深度の光学素子を組み込むＯＰＴＭシステムの１つの特性は、固定焦点面画像が、もはや、拡張された被写界深度の光路を通しては、取得され得ないことである。平らな対象物の焦点性能が、広範囲の焦点位置にわたって保持される。この特性は、時には、焦点不変と呼ばれる。
【００５０】
単一の焦点面に閉じ込められない対象物に対して、関心のある対象物が、データ取得を通して焦点間隔内に保持されうるように、関心のある対象物の中点を見出すことが、依然として必要である。このことを達成する１つの方法は、色収差を導入する前に、光路を分離することであり、それにより、ディテクタを包含する別々の光路が利用可能となる。色収差のないこの別々の光路では、システムが固定焦点面画像を取得することが、可能になる。ハイパークロマティック結像システムの中に組み込まれうる類似の方法において、光路が分割可能であり、一方のアームは、色フィルタをかけられてほぼ単色性となって、単一焦点面が、単独のカメラで結像可能となる一方で、他方のアームが、疑似射影をもたらす。他の方法は、スキャンを始める前に広範囲にわたって対物レンズをパンして、各位置における画像を取得し、各画像に対して焦点スコアを割り当てることを含む。焦点スコアづけの方法は、自己相関、エントロピー、および／または他の同等の方法を使用することができる。
【００５１】
次に、図９を参照すると、ＭＴＦ範囲内の焦点不変の一例が示される。一空間周波数におけるＭＴＦに対する焦点不変範囲、ＭＴＦ（ｆ１）  ６０１は、光軸上で、上の焦点面６０２および下の焦点面６０３により境界をつけられる。これらの境界の中で、ＭＴＦ  ６０１は、ずっと低いレベルに低下する前は、ほぼ一定の平坦域の値に留まる。そのような方法を使用して、以下にさらに説明するように、ＭＴＦ（ｆ１）  ６０１の中の平坦域の２つの端点６０２、６０３が特定可能であり、好ましい焦点が、例えば、端点６０２、６０３の間の中点６０４により選択される。
【００５２】
焦点不変領域の上および下の境界６０２、６０３が、ミクロキャピラリ・チューブの内側を通過しない場合は、焦点スコアづけを繰り返すことは、ミクロキャピラリ・チューブの内径を超える被写界深度を有するシステムに対しては、不要である。この条件は、機器が最初に設定されるときの最初の焦点のスコアづけにより確認されうる。
【００５３】
次に、図１０を参照すると、焦点不変光トモグラフィ・システムの中の焦点不変領域の中点を見出すための例示的方法のブロック線図が、概略的に示される。例示的方法によれば、中点は、
１．光軸を通してパンし、パン中にミクロキャピラリ・チューブの中の対象物の複数の画像を取得すること（７０１）、
２．光軸に沿って、各位置における焦点品質を評価すること（７０２）、
３．焦点品質が低下し始める光軸上の２つのブレイクポイントを決定すること（７０３）、ここで２つのブレイクポイントは、焦点不変領域の上および下の境界６０２、６０３に相当する、
４．疑似射影像を取得すること（７０４）、疑似射影のスキャンの範囲の中心は、焦点不変領域の上および下の境界６０２と６０３の間の中心に置かれる、
５．ミクロキャピラリ・チューブを次の投影角まで回転させること、
６．複数の疑似射影が複数の投影角において取得され終わるまで、１〜５のステップを繰り返すこと（７０５）、
７．取得された疑似射影を使用して、３Ｄ再構成を計算すること（７０６）、
により、対象物の３Ｄ再構成を計算するために見出され、使用される。
【００５４】
次に、図１１Ａを参照すると、焦点不変光トモグラフィ・システムの中の焦点不変領域の中点を見出すための他の方法のブロック線図が、示される。この代替の例示的方法によれば、中点は、
１．第１の視角に対して、焦点を段階的に変化させることにより（すなわち、対物レンズを、ｎ＝ｎ＋１で表される短い距離だけ動かすことにより、ここで、ｎはインクリメント方式の段数である）複数の焦点面において疑似射影を取得すること８０１、および、各焦点面において疑似射影データを取得すること８１３、
２．次の視角まで動かし、疑似射影の取得８０１を上のように焦点を段階的に変化させることによって対象のボリュームがカバーされるまで繰り返すこと８０２、
３．各視角に対するすべての疑似射影を合計し８０３、合計された疑似射影の１セットを作成すること、
４．合計された疑似射影のセットを使用して、３Ｄ再構成を計算すること８０４、
により対象物の３Ｄ再構成を計算するために、見出され、使用される。一例において、疑似射影は、下式が８０２において合致するかまたは超えるまで、取得される：
εｎＤ＝チューブ径、ここで０＜ε＜１。
【００５５】
次に、図１１Ｂの参照は、焦点不変光トモグラフィ・システムの中の焦点不変領域の中点を見出すためのさらに他の方法のブロック線図を示す。この代替の例示的方法によれば、中点は、
１．第１の視角に対して、焦点を段階的に変化させることにより（すなわち、対物レンズを、ｎ＝ｎ＋１で表される短い距離だけ動かすことにより、ここで、ｎはインクリメント方式の段数である）、複数の焦点面において疑似射影を取得すること８０１、および、各焦点面において疑似射影データを取得すること８１３、
２．制限式に従って、次の視角まで動かし、疑似射影の取得８０１を上のように焦点を段階的に変化させることによって対象のボリュームがカバーされるまで繰り返すこと８０２、
３．２．５Ｄ焦点評価を実施して８０５、各視角に対して最良焦点の疑似射影を決定すること、
４．各角度に対する最良焦点において取得された最良焦点の疑似射影の１セットを使用して、３Ｄ再構成を計算すること８０６、
により対象物の３Ｄ再構成を計算するために見出され、使用される。上記の方法は、２．５Ｄ焦点評価を除けば、図１１Ａの方法と類似している。
【００５６】
次に、図１２を参照すると、色バランスを使用する自動焦点システムの一実施形態が、概略的に示される。ここでは、２つの自動焦点カメラ２００２、２００４が、ディジタル化された入力を画像比較器２００６にもたらし、画像比較器２００６が、今度は、フィードバック信号２００８を、ＰＺＴコントローラなど、変換器ドライブ２０１０にもたらす。関心のある対象物２００１は、（上述のように）ミクロキャピラリ・チューブ内で回されるので、上部対象物ボリューム２０１２および下部対象物ボリューム２０１４からの別々の画像が、自動焦点カメラ２００２、２００４で捕捉される。画像は、比較器２００６によって比較され、解析される。比較器２００６からのフィードバック信号２００８が、変換器ドライブ２０１０を駆動し、変換器ドライブ２０１０が、今度は、対物レンズのフォーカス・ドライブ２０１６を制御し、それにより対物レンズ２１０３の焦点範囲が、よりピントの甘い焦点品質の領域に近づくように動く。２つの画像の間の焦点品質の差が十分小さくなると、変換器ドライブは、もはや、焦点範囲をシフトする必要がなくなる。このプロセスは、各投影角に対して繰り返されてよく、このプロセスは、チューブが回転するのにつれて、関心のある対象物を含む平面が、光軸を上下に動くので、必要でありうる。画像は、画像カメラ２０２０によって取得される。
【００５７】
一実施形態において、一次ビーム・スプリッタ２０２８、二次ビーム・スプリッタ２０３０およびミラー２０３２により、光線が方向づけられる。画像カメラ２０２０に向けられた光線は、第１のフィルタ２０２２によってフィルタをかけられ、ここで第１のフィルタは、５５０ｎｍと６２０ｎｍの間の波長を有する光を、第１の画像形成レンズ２０２３を通して通過させる。第１の自動焦点カメラ２００２に向けられた光線は、第２のフィルタ２０２４によってフィルタをかけられ、ここで第２のフィルタは、５８５ｎｍと６２０ｎｍの間の波長を有する光を、第２の画像形成レンズ２０２５を通して通過させる。ミラー２０３２に衝突した光線は、第３のフィルタ２０２６によってフィルタをかけられた後、第２の自動焦点カメラ２００４に向けられ、ここで第３のフィルタは、５５０ｎｍと５８５ｎｍの間の波長を有する光を、第３の画像形成レンズ２０２７を通して通過させる。
【００５８】
次に、図１３を参照すると、色バランスを使用する自動焦点システムの他の実施形態が、概略的に示される。スペクトル的に一様な光照明の光源２０６０が、画像カメラ２０２０により結像される、関心のある対象物２００１を照らす。上述の自動焦点システムと同様に、光線は、一次ビーム・スプリッタ２０２８、二次ビーム・スプリッタ２０３０およびミラー２０３２により方向づけられる。画像カメラ２０２０に向けられた光線は、第１のフィルタ２０２２によってフィルタをかけられ、ここで第１のフィルタは、５５０ｎｍと６２０ｎｍの間の波長を有する光を、第１の画像形成レンズ２０２３を通して通過させる。二次ビーム・スプリッタ２０２８を通過する光線の一部は、第２のフィルタ２０２４によってフィルタをかけられ、ここで第２のフィルタは、５８５ｎｍと６２０ｎｍの間の波長を有する光を通過させる。ミラー２０３２に衝突した光線は、第３のフィルタ２０２６によってフィルタをかけられ、ここで第３のフィルタは、５５０ｎｍと５８５ｎｍの間の波長を有する光を通過させる。レンズ２０５０を形成する第１のフーリエ面は、第２のフィルタ２０２４から、第１のフーリエ面空間フィルタ２０５２を通して第１のフォト・センサ２０５４まで、光を伝送する。レンズ２０５６を形成する第２のフーリエ面は、第３のフィルタ２０２６から、第２のフーリエ面空間フィルタ２０５８を通して第２のフォト・センサ２０５４まで、光を伝送する。
【００５９】
フーリエ空間フィルタ２０５２、２０５８は、２つの焦点経路上で動作し、アナログ・フィードバックを、フォト・ダイオード２０５４を介して焦点制御コントローラ２０４２にもたらす。空間フィルタは、フォト・ダイオードが、焦点面の高空間周波数成分だけを受けることを確実にする。高空間周波数コンテンツは、十分に合焦された対象物に関連する。収束範囲の上半分２０１２と下半分２０１４の高周波数コンテンツが、信号調整および差増幅プロセッサ２０６２の中で比較される。差増幅プロセッサ２０６２は、上述のように、駆動器２０４２を制御するために使用される出力２０４０をもたらして、変換器２０１６に、２つの収束域の高周波数強度が実質的に類似するまで対物レンズ２１０３の位置合わせをさせる。連続照明の下で、この方法は、常時、対象物をフォーカス・バランス内に保持しながら対象物の運動を追跡するという利点を有する。
【００６０】
３Ｄ結像のための偏光依存性光学素子（複屈折）
焦点面の位置は、光の偏光に依存する。このシステムは、複屈折光学素子の中で屈折率が光波面の電場分極により変化する複屈折光学素子を使用して実施されうる。複屈折の光学材料の一例は、５９０ｎｍにおける屈折率が、偏光によって１．６５８か１．４８６のいずれかになるカルサイト（ＣａＣＯ３）である。
【００６１】
上述のハイパークロマティック・システムの実施形態に類似する実施形態が使用されうる。これらの技術においては、結像する光の偏光は、その光が始まる対象物焦点面に依存する。例えば、水平偏光の（０度の電場ベクトル）光の成分が、対象物面ＺＨに対して焦点画像をもたらすことができ、一方、垂直偏光の（９０度の電場ベクトル）光の成分が、例えば、平面ＺＨよりディテクタに１５ミクロン近く配置された対象物面ＺＶに対して焦点画像をもたらすことができる。０度と９０度の間の偏光を有する光は、ＺＨとＺＶの間の対象物面に対して焦点画像をもたらす。
【００６２】
照明光の偏光は、回転する偏光フィルタを使用することによって時間をかけて変更されてよく、収束された（偏光されない）光が、画像センサに到達する前に偏光フィルタを通過し、または全収束範囲が同時に収束されてよい。
【００６３】
一実施形態において、収束範囲は、対象物の厚さ、例えば、１５ミクロンと同程度でありうる。この実施形態において、ＰＺＴは、図６Ａおよび図６Ｂに描かれたシステムと類似のシステムにおける、回転で誘導される細胞の遷移を補償するために組み入れられうる。
【００６４】
図７Ａ〜図７Ｄに描かれる実施形態と類似の、他の実施形態において、焦点面の範囲は、ミクロキャピラリ・チューブの直径（例えば、５０ミクロン）と同等であることができ、偏光フィルタ配列（ＰＦＡ；図５に示す色フィルタ配列のアナログの偏光）が、図７Ａ〜図７Ｄに示すＣＦＡの代わりにシステムの中に組み込まれる。
【００６５】
さらに他の実施形態において、焦点面の範囲は、ミクロキャピラリ・チューブの直径と同等であることができ、一連の同期されたカメラの露出が、対象物面がディテクタ上の焦点の中に入るときに対象物面を取得する間、光の偏光は、時間をかけて変化されうる。
【００６６】
２．５Ｄ結像
拡張された被写界深度の光学素子を組み込む任意のＯＰＴＭシステムにおいて、取得後の処理が、ピクセル毎の解析を実施し、視野内のモザイク状の焦点が合ったフィーチャを計算するために、組み込まれうる。２．５Ｄ結像の１つの種類の一例が、RJ Pieper and A Korpel、「Image processing for extended depth of field」、Applied Optics 22、1449 (1983)に見出される。２．５Ｄ結像方法は、色または偏光フィルタ配列（ＣＦＡまたはＰＦＡ）および広い収束範囲をカバーすることを利用するような実施形態、ならびに複数のカメラの露出を利用する実施形態において、最も有利に使用されうる。これらのシステムにおいて、１つの要素の種類に割り当てられるウェイトは、対象物が異なる焦点面領域を通して回されるのにつれて、１つの疑似射影から次の疑似射影へと変わることができる。
【００６７】
このことを達成するために、個々のフィーチャが、画像スタックを形成する短焦点面画像の収集の中で識別される。同じフィーチャが、スタック内のいくつかの画像の中に現れうるが、それらの画像のサブセットだけが、そのフィーチャの十分に合焦された表現を含む。
【００６８】
次に、図１４を参照すると、２．５Ｄ集束方法のブロック線図が、概略的に示される。画像スタックＳｋの中の各フィーチャ、Ｇｉ＝Ｇ１、．．．ＧΩが、識別される１１０１。画像スタックＳｋの中の各フィーチャＧｉに対して、Ｇｉが最良焦点にある画像が識別される１１０２。空白を合成された画像ＰＰｋが生成される１１０３。最も良く焦点が合ったフィーチャを構成するピクセル（Ｘｉ、Ｙｉ、Ｚｉ）が、合成画像ＰＰｋに加算される１１０４。このプロセスは、すべてのフィーチャがＰＰｋの中に組み込まれるまで、すべてのフィーチャ（Ｇ１、Ｇ２．．．ＧΩ）に対して繰り返される。単一のフィーチャはＳｋの中の２つ以上の画像にまたがる可能性があるので、ＰＰｋの中の単一のピクセルは、Ｓｋの中で十分に焦点が合ったＧｉの表現を含む各画像に対して１つの強度値を、２つ以上累積する可能性がある。さらに、２つ以上のフィーチャが、（Ｚ座標は異なるが）同じＸＹ座標を共有する可能性があり、そのことが、ＰＰｋの中のいくつかのピクセルが、２つ以上のフィーチャからの強度値を累積する結果をもたらす可能性がある。下付き文字ｌ、ｋなどが、インデックス番号を表すことに留意されたい。
【００６９】
すべての画像スタック（Ｓ１、Ｓ２．．．Ｓｋｍａｘ）が解析され、それらに関連する合成画像（ＰＰ１、ＰＰ２．．．ＰＰｋｍａｘ）が計算されるまで、そのプロセスが、すべての画像スタックに対して繰り返される１１０５。次いで、トモグラフィ再構成が、ＰＰｋのセットを入力画像として使用して、計算されうる１１０６。この方法を使用する一例において、４色ＣＦＡまたはＰＦＡの２×２ブロックのそれぞれが、最良焦点を含む単一のピクセルを選択することにより、または２つ以上のピクセルの加重和として処理されうる。
【００７０】
ビーム・スプリット多重焦点面
ＯＰＴＭ動作に対して、より短い一体化疑似射影の、いくつかの基本的利点が存在する。最初に、より小さい大きさの疑似射影（一体化された光軸スキャン）は、空間スペクトルの中で支配的な低周波数情報の影響を減少させる。第２に、同じボリュームをサンプルする画像をより多く加えることにより、使用された画像数の平方根に比例する信号対ノイズ比が改善される。第３に、複数画像が、屈折コントラストによる、画像内の異常のホット・スポットの検出および補償を可能にする。
【００７１】
被写界深度をセグメントに分割することで、多くの他の被写界深度エクステンダーが、より少ない複雑さでより良く動作しながら、より限定された解を供給するように働くことを可能にする。
【００７２】
減少された動作範囲または拡大された深さが、直接的対物レンズ・スキャンおよび複数カメラの焦点面を用いて可能になる。
【００７３】
複数の集束範囲の生成は、必ずしも複数のカメラを必要としない。十分なカメラ・センサ面積を用いて、複数画像を融合し、それらを単一センサ上に捕捉することが可能である。このことは、１つのセンサを複数のゾーンに分割する光ファイバ・フェース・プレート、または複数の画像を単一のＣＣＤ上に融合する折り畳み光学システムを使用して実施されうる。
【００７４】
次に、図１５を参照すると、折り畳みシステムの一例が描かれている。対物レンズ１２０５を出る実質的にコリメートされた光が、第１の２色ビーム・スプリッタ立方体１２０６により分割される。一方のアーム１２０２は、λ１の波長を有し、第１の焦点面１２０１の中で始まる。一方のアーム１２０２は、一次チューブ・レンズを通り、二次ビーム・スプリッタ立方体１２０７を通り、カメラのセンサの活性領域１２１１の右半分の上に至る。他方のアーム１２０４は、λ２の波長を有し、第２の焦点面１２０３の中で始まる。他方のアーム１２０４は、２つのミラー１２０８、１２０９で反射し、チューブ・レンズ１２１０を通過し、第２の２色ビーム・スプリッタ立方体１２０７の内部で反射し、カメラのセンサの活性領域１２１１の左半分の上に至る。カメラの２つの半分の部分が、実質的に同一の倍率を有するが、対象物空間内の異なる焦点面１２０１、１２０３から始まる、合焦された画像を取得する。画像内の相対的な横シフトは、第２の２色ビーム・スプリッタ立方体１２０７を横にシフトすることにより達成され、それにより、第２のアーム１２０４の反射光が、第１のアーム１２０２およびチューブ・レンズ１２１０に対して横にシフトされる。
【００７５】
２段階倍率
対象物空間内で１０ミクロン離隔される画像を取得することは、１００倍のレンズに対して、二乗された倍率に比例する、画像空間の経路長（すなわち、１００ｍｍ）の差を必要とする。チューブ・レンズが同じ焦点距離を有するが、異なる背面側焦点面を有する場合、カメラの２つの半分の部分は、実質的に同一の倍率を有するが、対象物空間において異なる焦点面から始まる合焦画像を取得する。例として、一次チューブ・レンズに対するより二次チューブ・レンズに対して１００ｍｍ接近してカメラを配置することで、１００／Ｍ２ミクロンの焦点面における差が結果的にもたらされ、ここで、Ｍは横倍率である。Ｍ＝１００の場合、１００／Ｍ２＝１０ミクロンである。
【００７６】
しかし、光軸におけるよりずっと小さな変化が、２つの１０倍の倍率段階を使用して、二次対物レンズの焦点面をほんのわずかに変化させることにより、達成可能である。１０倍の倍率の画像において、被検物面の中での１０ミクロンのシフトが、中間像面の１ｍｍのシフトで達成される。
【００７７】
分割焦点面法を使用することにより、２つ以上のカメラ（図１６の例で４つが示される）が、被検物の焦点深度のある範囲をそれぞれ収集することが可能となる。極限では、カメラの数は、被検物を照らすためにもたらされうる光の量と、光路のコストおよび複雑さによって、実際には制限される。より多くのカメラを組み入れるシステムは、カメラの良好な性能が十分に完全に近く、各画像が視野の深さの中で伝えなければならない範囲を縮小するとすれば、信号対ノイズ比を改善する。より短い視野の深さは、結果として得られる疑似射影において、高空間周波数のより良い表現を生み出すことを促進する。
【００７８】
図１６に示すこの実施形態の一例において、光学システムは、一次対物レンズ１３０２と、第１および第２のミラー１３０４Ａ、１３０４Ｂと、３つのビーム・スプリッタ１３０３Ａ〜１３０３Ｃと、４つの一次チューブ・レンズ１３１０と、４つの二次対物レンズ１３１２と、４つの二次チューブ・レンズ１３０８と、４つのＣＣＤカメラ１３０９とを備える。一次対物レンズ１３０２および一次チューブ・レンズ１３１０は、少なくとも１０倍の倍率をもたらし、二次対物レンズおよびチューブ・レンズは少なくとも追加の１０倍の倍率で、合計で少なくとも１００倍の倍率をもたらす。
【００７９】
各光路は、ビーム・スプリッタ２つ分の厚さを通過し、各光路は、ビーム・スプリッタを通るか、またはミラーによるかのいずれかにより、２回または０回のいずれかの反射を受ける。ビーム・スプリッタを通過する光路長が等しいことは、ガラスを通過することによる収差が等しいことを意味する。反射の回数が常に偶数（または常に奇数）であることは、４つの画像すべてが４つのカメラ１３０９の画像面において同じ向きを維持することを意味する。一次チューブ・レンズと二次対物レンズの間の間隔は、各光路に対して異なり、それにより異なる対象物面が、各カメラ上に集束される。減少された動作範囲または拡大された深さが、対物レンズの後ろでスキャンする焦点面および複数のカメラの焦点面により可能となる。
【００８０】
複数のカメラの光学素子を２０超の焦点面に拡大することで、１０ミクロンの被写界深度を５００ｎｍ毎にサンプリングすることが、理論的に可能となる。複数のカメラの配列は、２つ同時のボリューム・サンプリングの様式を可能にし、そのことが、それらの相対的強度を、より正確なボリューム再構成に寄与するように、それぞれ使用されうる。具体的には、試料媒体の界面における屈折および回折の影響により生成されるコントラストが、純粋に吸収性の影響から選び出されることが可能であり、すべてのデータは、焦点面の運動または回転のぶれなく、高速に捕捉されうる。
【００８１】
波面コード化光学素子
次に、図１７を参照すると、波面コード化光学素子を含むＯＰＴＭシステムの概略図が示される。上述のように、ミクロキャピラリ・チューブ１７０７が、関心のある対象物１７０１を保持し、対物レンズ１７０３で観察される様々な視角を通して回転される。対物レンズ１７０３を通して伝送される光は、対物レンズ１７０３と結像カメラ１７０７の間に配置される波面コード化光学素子１７０５上に衝突する。波面コード化光学素子の使用が、そのボリューム全体を通して低いが一定の周波数応答を生み出す、拡大された被写界深度内に、関心のある対象物が含まれるように、光波面をプリディストーションする方法を提供する。こうして、光軸に沿った限定された範囲内のすべての焦点面が、均等にデフォーカスされる。このことが、波面コード化を構成する。波面コード化素子は、CDM Optics, Inc. (Boulder, CO)から入手可能であり、例えば、ER Dowskiの、「Wavefront coding optics」という名称の米国特許第６，８４２，２９７号（２００５年）に記載されている。
【００８２】
波面コード化の限界は、被写界深度において約１２：１の改善である。光トモグラフィ用途に対して、そのような改善は、必要な深さの約半分をもたらす。したがって、有利には、波面コード化は、完全な解を達成するために、本明細書に記載される多くの他の実施形態のうちの１つと組み合わせられうる。  
【００８３】
VN Mahajan、「Aberration Theory Made Simple」、（Bellingham、WA: SPIE Press、1991）に詳細に記載されるように、０．６４波のデフォーカスにおいて、整合された集光レンズと対物レンズのＮＡに対して、第１のコントラスト反転（ＭＴＦがゼロより小）の点が発生する。この点は、光学的深さにおける変化、ΔＺに関して、ΔＺ＝±１．２８λｎ／（ＮＡｏｂｊ）２として容易に表現され、ここでλは集められる光の波長、ｎは対物レンズと対象物の間の領域の屈折率、およびＮＡｏｂｊは対物レンズの開口数である。λ＝５５０ｎｍ、ｎ＝１、およびＮＡｏｂｊ＝０．９に対して、この距離は、ΔＺ＝±０．８７ミクロンである。したがって、１２ミクロンの深さの対象物に対して、６ミクロンのデフォーカス（約４．４波のデフォーカス）におけるコントラスト反転を避けるために、被写界深度において少なくとも５倍の改善が必要である。
【００８４】
波面コード化を用いる結像の他の実施形態は、拡大された深さを維持しながらシャープな合焦画像を回復するために、抑圧された高周波数成分を増強する相補形伝達関数を用いる画像のディジタル増強を組み込む。
【００８５】
他の実施形態は、上に示されるような複数のカメラを使用して、各光路をレンズ伝達関数でコード化することにより被写界深度を拡大し、それにより１つのセグメントから次のセグメントへ被写界深度を拡大する、波面コード化光学素子法を利用する。このメカニズムでは、ストロボ照明など、単一の簡単な露出で、機械的運動なしに、広い被写界深度を速やかにサンプリングすることが可能になる。
【００８６】
本発明は、特許法に従い、本発明の新しい原理を適用し、必要とされる例示的、専門的構成部品を構築し使用するために必要な情報を当業者に提供するために、本明細書の中で相当詳細に説明した。しかし、本発明は、明確に異なる機器およびデバイスにより実施されうること、ならびに、機器の詳細および動作手段の両方に関して様々な改変が、本発明の真の主旨および範囲を逸脱することなく達成されうることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
2011503530.tif 000021
【図１１Ａ】
2011503530.tif 000022
【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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2011503530.tif 000031
2011503530.tif 000032