(57)【要約】  本発明は、哺乳動物の造血性腫瘍の治療のために有用な組成物と、同用途のためにその組成物を使用する方法に関するものである。
2011515069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子であって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸を有するポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ分子であって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸を有するポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ分子であって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域；又は
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の相補鎖
に対し、少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つヌクレオチド配列を有する、単離された核酸。
【請求項２】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸を有するポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸を有するポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域；又は
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の相補鎖
を有する単離された核酸。
【請求項３】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸を有するポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸であって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸を有するポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸であって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの、
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域；又は
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は  （ｆ）の相補鎖
にハイブリダイズする、単離された核酸。
【請求項４】
ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションが起こる、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
少なくとも約５ヌクレオチド長である、請求項３に記載の核酸。
【請求項６】
請求項１、２又は３の核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
前記核酸が、ベクターで形質転換した宿主細胞によって認識されるコントロール配列に対して作用可能に連結している、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
ＣＨＯ細胞、大腸菌又は酵母細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
ポリペプチドの生産方法において、前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養し、細胞培養物から前記ポリペプチドを回収する方法。
【請求項１１】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの、；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるポリペプチド
に対し、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ、単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるアミノ酸配列
を有する単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
異種ポリペプチドに融合した請求項１１又は１２に記載のポリペプチドを含むキメラポリペプチド。
【請求項１４】
前記異種ポリペプチドが、免疫グロブリンのエピトープタグ配列又はＦｃ領域である、請求項１３に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１５】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるポリペプチド
に対し、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つポリペプチドに結合する、単離された抗体。
【請求項１６】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるアミノ酸配列
を有するポリペプチドに結合する、単離された抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体である、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体断片である、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体。
【請求項１９】
キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体。
【請求項２０】
増殖抑制剤にコンジュゲートする、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体。
【請求項２１】
細胞傷害剤にコンジュゲートする、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体。
【請求項２２】
細胞傷害剤が、毒素、抗体、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群より選択される、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
細胞傷害剤が毒素である、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２４】
毒素が、メイタンシノイド、ドラスタチン誘導体及びカリケアマイシンからなる群より選択される、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
毒素がメイタンシノイドである、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２６】
細菌中で生産される、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体。
【請求項２７】
ＣＨＯ細胞中で生産される、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体。
【請求項２８】
結合する細胞に死滅を誘発する、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体。
【請求項２９】
検出可能に標識される、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体。
【請求項３０】
請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を有する、単離された核酸。
【請求項３１】
ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列に作用可能に連結している、請求項３０に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
ＣＨＯ細胞、大腸菌又は酵母細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
請求項３２に記載の宿主細胞を、前記抗体の発現に適した条件下で培養し、細胞培養物から前記抗体を回収する、抗体生産方法。
【請求項３５】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるポリペプチド
に対し、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する、単離されたオリゴペプチド。
【請求項３６】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるアミノ酸配列
を有するポリペプチドに結合する、単離されたオリゴペプチド。
【請求項３７】
増殖抑制剤にコンジュゲートする、請求項３５又は３６に記載のオリゴペプチド。
【請求項３８】
細胞傷害剤にコンジュゲートする、請求項３５又は３６に記載のオリゴペプチド。
【請求項３９】
細胞傷害剤が、毒素、抗体、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群より選択される、請求項３８に記載のオリゴペプチド。
【請求項４０】
細胞傷害剤が毒素である、請求項３８に記載のオリゴペプチド。
【請求項４１】
毒素が、メイタンシノイド、ドラスタチン誘導体及びカリケアマイシンからなる群より選択される、請求項４０に記載のオリゴペプチド。
【請求項４２】
毒素がメイタンシノイドである、請求項４０に記載のオリゴペプチド。
【請求項４３】
結合する細胞に死滅を誘発する、請求項３５又は３６に記載のオリゴペプチド。
【請求項４４】
検出可能に標識される、請求項３５又は３６に記載のオリゴペプチド。
【請求項４５】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるポリペプチド
に対し、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合するＴＡＨＯ結合有機分子。
【請求項４６】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるアミノ酸配列
を有するポリペプチドに結合する請求項４５に記載の有機分子。
【請求項４７】
増殖抑制剤にコンジュゲートする、請求項４５又は４６に記載の有機分子。
【請求項４８】
細胞傷害剤にコンジュゲートする、請求項４５又は４６に記載の有機分子。
【請求項４９】
細胞傷害剤が、毒素、抗体、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群より選択される、請求項４８に記載の有機分子。
【請求項５０】
細胞傷害剤が毒素である、請求項４８に記載の有機分子。
【請求項５１】
毒素が、メイタンシノイド、ドラスタチン誘導体及びカリケアマイシンからなる群より選択される、請求項５０に記載の有機分子。
【請求項５２】
毒素がメイタンシノイドである、請求項５０に記載の有機分子。
【請求項５３】
結合する細胞に死滅を誘発する、請求項４５又は４６に記載の有機分子。
【請求項５４】
検出可能に標識される、請求項４５又は４６に記載の有機分子。
【請求項５５】
（ａ）請求項１１に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１２に記載のポリペプチド；
（ｃ）請求項１５に記載の抗体；
（ｄ）請求項１６に記載の抗体；
（ｅ）請求項３３２に記載の抗体；
（ｆ）請求項３３３に記載の抗体；
（ｇ）請求項３３４に記載の抗体；
（ｈ）請求項３３５に記載の抗体；
（ｉ）請求項３３６に記載の抗体；
（ｊ）請求項３５に記載のオリゴペプチド；
（ｋ）請求項３６に記載のオリゴペプチド；
（ｌ）請求項４５に記載のＴＡＨＯ結合有機分子；又は
（ｍ）請求項４６に記載のＴＡＨＯ結合有機分子
を担体と組み合わせて含む組成物。
【請求項５６】
前記担体は製薬的に許容可能な担体である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
（ａ）容器：及び
（ｂ）前記容器中に収容される請求項５５に記載の組成物
を含む生産品。
【請求項５８】
前記組成物が癌の治療又は診断的検出に使用できることを記載した、前記容器に貼付されたラベル、又は前記容器内に含まれるパッケージ挿入物を更に含む、請求項５７に記載の生産品。
【請求項５９】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるポリペプチド
に対し、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞の、増殖を阻害する方法であって、前記細胞を、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド又は有機分子に接触させ、前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子の、前記タンパク質に対する結合により、前記細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項６０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗体が抗体断片である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗体が配列番号１１の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号９の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗体が配列番号３４の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号３２の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗体が配列番号４２の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号４０の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗体が表２４に記載の任意のＡＴＣＣ受託番号の下に寄託された単離された抗体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗体が配列番号１６及び配列番号１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に結合する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞傷害剤が、毒素、抗体、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
細胞傷害剤が毒素である、請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
毒素が、メイタンシノイド、ドラスタチン誘導体及びカリケアマイシンからなる群より選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
毒素がメイタンシノイドである、請求項６０に記載の方法。
【請求項７２】
前記抗体が細菌中で生産される、請求項５９に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗体がＣＨＯ細胞中で生産される、請求項５９に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞が造血細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項７５】
前記造血細胞が、リンパ球、白血球、血小板、赤血球及びナチュラルキラー細胞からなる群より選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記リンパ球がＢ細胞又はＴ細胞である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記リンパ球が癌細胞である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記癌細胞を、更に放射線治療又は化学療法剤に曝す、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記癌細胞が、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞及び白血病細胞かなる群より選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記タンパク質が、非造血細胞より造血細胞に多く発現する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞の死滅を誘発する、請求項５９に記載の方法。
【請求項８２】
前記タンパク質が、
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるアミノ酸配列
を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項８３】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるポリペプチド
に対し、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞を含む癌性腫瘍を持つ哺乳動物の治療法であて、前記哺乳動物に対し、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド又は有機分子の治療的有効量を投与することにより、前記哺乳動物を効果的に治療する方法。
【請求項８４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記抗体が抗体断片である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗体が配列番号１１の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号９の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記抗体が配列番号３４の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号３２の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
前記抗体が配列番号４２の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号４０の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項８３に記載の方法。
【請求項９０】
前記抗体が表２４に記載の任意のＡＴＣＣ受託番号の下に寄託された単離された抗体である、請求項８３に記載の方法。
【請求項９１】
前記抗体が配列番号１６及び配列番号１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に結合する、請求項８３に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞傷害剤が、毒素、抗体、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群より選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項９３】
細胞傷害剤が毒素である、請求項８３に記載の方法。
【請求項９４】
毒素が、メイタンシノイド、ドラスタチン誘導体及びカリケアマイシンからなる群より選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
毒素がメイタンシノイドである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記抗体が細菌中で生産される、請求項８３に記載の方法。
【請求項９７】
前記抗体がＣＨＯ細胞中で生産される、請求項８３に記載の方法。
【請求項９８】
前記腫瘍を、更に放射線治療又は化学療法剤に曝す、請求項８３に記載の方法。
【請求項９９】
前記腫瘍が、リンパ腫、白血病、又は骨髄腫である、請求項８３に記載の方法。
【請求項１００】
前記タンパク質が、前記腫瘍の非造血細胞より造血細胞に多く発現する、請求項８０に記載の方法。
【請求項１０１】
前記タンパク質が、前記腫瘍の正常造血細胞より前記腫瘍の癌性造血細胞に多く発現する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記タンパク質が、
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチド細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチド細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるアミノ酸配列
を有する、請求項８３に記載の方法。
【請求項１０３】
タンパク質を有すると思われる試料中における前記タンパク質の存在を決定する方法であって、前記タンパク質が：
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるポリペプチド
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド又は有機分子に前記試料を曝し、前記試料中の前記タンパク質に対する前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子の結合を測定することを含み、前記タンパク質に前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子が結合することにより、前記試料中における前記タンパク質の存在が示される方法。
【請求項１０４】
前記試料が、前記タンパク質を発現すると思われる細胞を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記細胞が癌細胞である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子を検出可能に標識する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０８】
前記抗体が抗体断片である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０９】
前記抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１０】
前記抗体が配列番号１１の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号９の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１１】
前記抗体が配列番号３４の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号３２の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１２】
前記抗体が配列番号４０の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号４２の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１３】
前記抗体が表２４に記載の任意のＡＴＣＣ受託番号の下に寄託された単離された抗体である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１４】
前記抗体が配列番号１６及び配列番号１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に結合する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記抗体が細菌中で生産される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記抗体がＣＨＯ細胞中で生産される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記タンパク質が、前記腫瘍の非造血細胞より造血細胞に多く発現する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１８】
前記タンパク質が、前記腫瘍の正常造血細胞より前記腫瘍の癌性造血細胞に多く発現する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１９】
前記タンパク質が：
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるアミノ酸配列
を有する、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１２０】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるポリペプチド
に対し、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の発現又は活性の増大に関連する増殖性傷害の治療又は予防法であって、そのような治療を要する患者に対し、前記タンパク質のアンタゴニストの有効量を投与することにより、前記細胞増殖性傷害を効果的に治療又は予防する方法。
【請求項１２１】
前記細胞増殖性傷害が癌である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記アンタゴニストが、抗ＴＡＨＯポリペプチド抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド、ＴＡＨＯ結合有機分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記抗ＴＡＨＯポリペプチド抗体が配列番号：１１の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：９の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１２０の方法。
【請求項１２４】
前記抗体が配列番号：３４の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：３２の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１２０の方法。
【請求項１２５】
前記抗体が配列番号：４２の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：４０の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１２０の方法。
【請求項１２６】
前記抗ＴＡＨＯポリペプチド抗体が表２４に記載の任意のＡＴＣＣ受託番号の下に寄託された単離された抗体である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２７】
前記抗ＴＡＨＯポリペプチド抗体が配列番号：１６及び配列番号：１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に結合する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２８】
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によってコードされるポリペプチド
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞に、抗体、オリゴペプチド又は有機分子を結合させる方法において、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子、細胞傷害剤にコンジュゲート化した抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子、又は増殖阻害剤にコンジュゲート化した抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子を前記細胞に接触させ、前記タンパク質に抗体、オリゴペプチド又は有機分子を結合させることにより、前記抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子、細胞傷害剤にコンジュゲート化した前記抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子、又は増殖阻害剤にコンジュゲート化した前記抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子の前記タンパク質への結合を起こし、前記細胞に結合させる方法。
【請求項１２９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記抗体が抗体断片である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記抗体が配列番号：１１の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：９の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１２８の方法。
【請求項１３３】
前記抗体が配列番号：３４の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：３２の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１２８の方法。
【請求項１３４】
前記抗体が配列番号：４２の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：４０の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１２８の方法。
【請求項１３５】
前記抗体が表２４に記載の任意のＡＴＣＣ受託番号の下に寄託された単離された抗体である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３６】
前記抗ＴＡＨＯポリペプチド抗体が配列番号：１６及び配列番号：１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に結合する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３７】
前記細胞傷害剤が、毒素、抗体、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群より選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３８】
細胞傷害剤が毒素である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１３９】
毒素が、メイタンシノイド、ドラスタチン誘導体及びカリケアマイシンからなる群より選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４０】
毒素がメイタンシノイドである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記抗体が細菌中で生産される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４２】
前記抗体がＣＨＯ細胞中で生産される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４３】
前記細胞が造血細胞である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４４】
前記造血細胞が、リンパ球、白血球、血小板、赤血球及びナチュラルキラー細胞からなる群より選択される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記リンパ球がＢ細胞又はＴ細胞である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記リンパ球が癌細胞である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
前記癌細胞を、更に放射線治療又は化学療法剤に曝す、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記癌細胞が、白血病細胞、リンパ腫細胞、及び骨髄腫細胞からなる群より選択される、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４９】
前記タンパク質が、非造血細胞より造血細胞に多く発現する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記細胞の死滅を誘発する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１５１】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項１から５又は請求項３０の何れかに記載の核酸の使用法。
【請求項１５２】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項１から５又は請求項３０の何れかに記載の核酸の使用法。
【請求項１５３】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項１から５の何れかに記載の核酸の使用法。
【請求項１５４】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項６に記載の発現ベクターの使用法。
【請求項１５５】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項６に記載の発現ベクターの使用法。
【請求項１５６】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項６に記載の発現ベクターの使用法。
【請求項１５７】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項８に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項１５８】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項８に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項１５９】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項８に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項１６０】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項１１又は１２に記載のポリペプチドの使用法。
【請求項１６１】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項１１又は１２に記載のポリペプチドの使用法。
【請求項１６２】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項１１又は１２に記載のポリペプチドの使用法。
【請求項１６３】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体の使用法。
【請求項１６４】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体の使用法。
【請求項１６５】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項１５、１６、３３４から３３８又は３３９から３４７に記載の抗体の使用法。
【請求項１６６】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項３５又は３６に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項１６７】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項３５又は３６に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項１６８】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項３５又は３６に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項１６９】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項４５又は４６に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項１７０】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項４５又は４６に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項１７１】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項４５又は４６に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項１７２】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項５５に記載の組成物の使用法。
【請求項１７３】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項５５に記載の組成物の使用法。
【請求項１７４】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項５５に記載の組成物の使用法。
【請求項１７５】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項５７に記載の生産品の使用法。
【請求項１７６】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項５８に記載の生産品の使用法。
【請求項１７７】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項５８に記載の生産品の使用法。
【請求項１７８】
細胞の増殖阻害方法であって、前記細胞の増殖が、
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード化ドメインによってコードされるポリペプチド
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の増殖促進効果に、少なくとも部分的に依存しており、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子、前記タンパク質に結合する細胞傷害剤にコンジュゲート化した抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子、又は増殖阻害剤にコンジュゲート化した抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子を前記細胞に接触させ、前記細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項１７９】
前記細胞が造血細胞である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記タンパク質が前記細胞によって発現される、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８１】
前記タンパク質への前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子の結合が、前記タンパク質の細胞増殖促進活性をアンタゴナイズする、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８２】
前記タンパク質への前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子の結合が前記細胞の死滅を誘発する、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８４】
前記抗体が抗体断片である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８５】
前記抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１７８記載の方法。
【請求項１８６】
前記抗体が配列番号：１１の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：９の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１７８の方法。
【請求項１８７】
前記抗体が配列番号：３４の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：３２の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１７８の方法。
【請求項１８８】
前記抗体が配列番号：４２の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：４０の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１７８の方法。
【請求項１８９】
前記抗体が表７８に記載の任意のＡＴＣＣ受託番号の下に寄託された単離された抗体である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記抗体が配列番号：１６及び配列番号：１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に結合する、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１９１】
前記細胞傷害剤が、毒素、抗体、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群より選択される、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１９２】
細胞傷害剤が毒素である、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１９３】
毒素が、メイタンシノイド、ドラスタチン誘導体及びカリケアマイシンからなる群より選択される、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
毒素がメイタンシノイドである、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９５】
前記抗体が細菌中で生産される、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１９６】
前記抗体がＣＨＯ細胞中で生産される、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１９７】
前記タンパク質が、
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード化配列によってコードされるアミノ酸配列
を有する、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１９８】
哺乳動物の腫瘍を治療する方法であって、前記腫瘍の増殖が、
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの細胞外ドメインであって、その関連するシグナルペプチドを欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されたヌクレオチド配列の完全長コード化配列によってコードされるポリペプチド
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の増殖促進効果に少なくとも部分的に依存し、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子、前記タンパク質に結合する細胞傷害剤にコンジュゲート化した抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子、又は増殖阻害剤にコンジュゲート化した抗体、オリゴペプチド若しくは有機分子を前記細胞に接触させ、前記腫瘍を効果的に治療する方法。
【請求項１９９】
前記タンパク質が前記腫瘍の細胞によって発現される、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
前記タンパク質への前記抗体、オリゴペプチド又は有機分子の結合が、前記タンパク質の細胞増殖促進活性をアンタゴナイズする、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０２】
前記抗体が抗体断片である、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０３】
前記抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１９８記載の方法。
【請求項２０４】
前記抗体が配列番号：１１の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：９の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１９８の方法。
【請求項２０５】
前記抗体が配列番号：３４の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：３２の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１９８の方法。
【請求項２０６】
前記抗体が配列番号：４２の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：４０の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体である、請求項１９８の方法。
【請求項２０７】
前記抗体が表７８に記載の任意のＡＴＣＣ受託番号の下に寄託された単離された抗体である、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０８】
前記抗体が配列番号：１６及び配列番号：１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に結合する、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０９】
前記細胞傷害剤が、毒素、抗体、放射性同位元素及び核溶解性酵素からなる群より選択される、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１０】
細胞傷害剤が毒素である、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１１】
毒素が、メイタンシノイド、ドラスタチン誘導体及びカリケアマイシンからなる群より選択される、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
毒素がメイタンシノイドである、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１３】
前記抗体が細菌中で生産される、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１４】
前記抗体がＣＨＯ細胞中で生産される、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１５】
前記タンパク質が、
（ａ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｃ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を伴うもの；
（ｄ）図２（配列番号２）、図４（配列番号４）、図６（配列番号６）及び図８（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列であって、その関連するシグナルペプチド配列を欠くもの；
（ｅ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；又は
（ｆ）図１（配列番号１）、図３（配列番号３）、図５（配列番号５）及び図７（配列番号７）に示すヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列の完全長コード化配列によってコードされるアミノ酸配列
を有する、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１６】
請求項１３に記載のキメラポリペプチドを含む組成物。
【請求項２１７】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項３０に記載の核酸の使用法。
【請求項２１８】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項７に記載の発現ベクターの使用法。
【請求項２１９】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項３１に記載の発現ベクターの使用法。
【請求項２２０】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項７に記載の発現ベクターの使用法。
【請求項２２１】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項３１に記載の発現ベクターの使用法。
【請求項２２２】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項７に記載の発現ベクターの使用法。
【請求項２２３】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項３１に記載の発現ベクターの使用法。
【請求項２２４】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項９に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項２２５】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項３２に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項２２６】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項３３に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項２２７】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項９に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項２２８】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項３２に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項２２９】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項３３に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項２３０】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項９に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項２３１】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項３２に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項２３２】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項３３に記載の宿主細胞の使用法。
【請求項２３３】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項１３に記載のポリペプチドの使用法。
【請求項２３４】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項１４に記載のポリペプチドの使用法。
【請求項２３５】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項１３に記載のポリペプチドの使用法。
【請求項２３６】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項１４に記載のポリペプチドの使用法。
【請求項２３７】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項１３に記載のポリペプチドの使用法。
【請求項２３８】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項１４に記載のポリペプチドの使用法。
【請求項２３９】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項１７に記載の抗体の使用法。
【請求項２４０】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項１８に記載の抗体の使用法。
【請求項２４１】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項１９に記載の抗体の使用法。
【請求項２４２】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項２０に記載の抗体の使用法。
【請求項２４３】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項２１に記載の抗体の使用法。
【請求項２４４】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項２２に記載の抗体の使用法。
【請求項２４５】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項２３に記載の抗体の使用法。
【請求項２４６】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項２４に記載の抗体の使用法。
【請求項２４７】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項２５に記載の抗体の使用法。
【請求項２４８】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項２６に記載の抗体の使用法。
【請求項２４９】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項２７に記載の抗体の使用法。
【請求項２５０】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項２８に記載の抗体の使用法。
【請求項２５１】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項２９に記載の抗体の使用法。
【請求項２５２】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項１７に記載の抗体の使用法。
【請求項２５３】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項１８に記載の抗体の使用法。
【請求項２５４】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項１９に記載の抗体の使用法。
【請求項２５５】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項２０に記載の抗体の使用法。
【請求項２５６】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項２１に記載の抗体の使用法。
【請求項２５７】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項２２に記載の抗体の使用法。
【請求項２５８】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項２３に記載の抗体の使用法。
【請求項２５９】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項２４に記載の抗体の使用法。
【請求項２６０】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項２５に記載の抗体の使用法。
【請求項２６１】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項２６に記載の抗体の使用法。
【請求項２６２】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項２７に記載の抗体の使用法。
【請求項２６３】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項２８に記載の抗体の使用法。
【請求項２６４】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項２９に記載の抗体の使用法。
【請求項２６５】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項１７に記載の抗体の使用法。
【請求項２６６】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項１８に記載の抗体の使用法。
【請求項２６７】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項１７に記載の抗体の使用法。
【請求項２６８】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項１８に記載の抗体の使用法。
【請求項２６９】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項１９に記載の抗体の使用法。
【請求項２７０】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項２０に記載の抗体の使用法。
【請求項２７１】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項２１に記載の抗体の使用法。
【請求項２７２】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項２２に記載の抗体の使用法。
【請求項２７３】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項２３に記載の抗体の使用法。
【請求項２７４】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項２４に記載の抗体の使用法。
【請求項２７５】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項２５に記載の抗体の使用法。
【請求項２７６】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項２６に記載の抗体の使用法。
【請求項２７７】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項２７に記載の抗体の使用法。
【請求項２７８】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項２８に記載の抗体の使用法。
【請求項２７９】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項２９に記載の抗体の使用法。
【請求項２８０】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項３７に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２８１】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項３８に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２８２】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項３９に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２８３】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項４０に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２８４】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項４１に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２８５】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項４２に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２８６】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項４３に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２８７】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項４４に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２８８】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項３７に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２８９】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項３８に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２９０】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項３９に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２９１】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項４０に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２９２】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項４１に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２９３】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項４２に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２９４】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項４３に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２９５】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項４４に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２９６】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項３７に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２９７】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項３８に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２９８】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項３９に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項２９９】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項４０に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項３００】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項４１に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項３０１】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項４２に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項３０２】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項４３に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項３０３】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項４４に記載のオリゴペプチドの使用法。
【請求項３０４】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項４７に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３０５】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項４８に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３０６】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項４９に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３０７】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項５０に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３０８】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項５１に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３０９】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項５２に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３１０】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項５３に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３１１】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項５４に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３１２】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項４７に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３１３】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項４８に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３１４】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項４９に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３１５】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項５０に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３１６】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項５１に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３１７】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項５２に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３１８】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項５３に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３１９】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項５４に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３２０】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項４７に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３２１】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項４８に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３２２】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項４９に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３２３】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項５０に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３２４】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項５１に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３２５】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項５２に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３２６】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項５３に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３２７】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項５４に記載のＴＡＨＯ結合有機分子の使用法。
【請求項３２８】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項５６に記載の組成物の使用法。
【請求項３２９】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項５６に記載の組成物の使用法。
【請求項３３０】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項５６に記載の組成物の使用法。
【請求項３３１】
癌の治療又は診断的検出用の薬物の調製における、請求項５８に記載の生産品の使用法。
【請求項３３２】
腫瘍の治療用の薬物の調製における、請求項５８に記載の生産品の使用法。
【請求項３３３】
細胞増殖性傷害の治療又は予防用の薬物の調製における、請求項５８に記載の生産品の使用法。
【請求項３３４】
配列番号：１１の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：９の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体。
【請求項３３５】
配列番号：３４の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：３２の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体。
【請求項３３６】
配列番号：４２の核酸配列によってコードされる重鎖及び配列番号：４０の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む単離された抗体。
【請求項３３７】
表２４に示される任意のＡＴＣＣ受託番号の下に寄託された単離された抗体。
【請求項３３８】
配列番号１６及び配列番号１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に結合する、単離された抗体。
【請求項３３９】
ＣＤ７９ｂに結合する抗体であって、配列番号：９８のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む抗体。
【請求項３４０】
ＣＤ７９ｂに結合する抗体であって、配列番号：９７のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体。
【請求項３４１】
ＣＤ７９ｂに結合する抗体であって、配列番号：９８のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：９７アミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む抗体。
【請求項３４２】
ＣＤ７９ｂに結合する抗体であって、配列番号：１００のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む抗体。
【請求項３４３】
ＣＤ７９ｂに結合する抗体であって、配列番号：９９のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体。
【請求項３４４】
ＣＤ７９ｂに結合する抗体であって、配列番号：１００のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：９９のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む抗体。
【請求項３４５】
ＣＤ７９ｂに結合する抗体であって、配列番号：１０２のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む抗体。
【請求項３４６】
ＣＤ７９ｂに結合する抗体であって、配列番号：１０１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む抗体。
【請求項３４７】
ＣＤ７９ｂに結合する抗体であって、配列番号：１０２のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号：１０１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む抗体。
【請求項３４８】
抗体が、一又は複数の遊離システインアミノ酸を含むシステイン改変抗体であって、ここで、システイン改変抗体が、親抗体の一又は複数のアミノ酸残基を遊離システインアミノ酸によって置換することを含む方法によって調製される、請求項１５から１６、３３４から３３８又は３３９から３４７の抗体。
【請求項３４９】
一又は複数の遊離システインアミノ酸が０．６から１．０の範囲のチオール反応性値を有する、請求項３４８に記載の抗体。  
【請求項３５０】
チオ反応試薬との反応性が親抗体よりも高い、請求項３４８に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３５１】
前記方法が、チオール反応性の試薬とシステイン改変抗体を反応させることによってシステイン改変抗体のチオール反応性を決定することをさらに含み、
このとき該システイン改変抗体がチオール反応試薬との反応性において親抗体よりも高い、請求項３４８に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３５２】
一又は複数の遊離システインアミノ酸残基が軽鎖に位置している、請求項３４８に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３５３】
抗体が、細胞傷害性剤に共有結合的に付着したシステイン改変抗体を含むイムノコンジュゲートである、請求項３４８に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３５４】
細胞傷害性剤が、毒素、化学療法剤、薬剤部分、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解性酵素から選択される、請求項３５３に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３５５】
抗体が捕捉標識、検出標識又は固形支持体に共有結合的に付着されている、請求項３４８に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３５６】
抗体がビオチン捕捉標識に共有結合的に付着されている、請求項３４８に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３５７】
抗体が蛍光色素検出標識に共有結合的に付着されている、請求項３５５に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３５８】
蛍光色素が、フルオレセインタイプ、ローダミンタイプ、ダンシル、リサミン、シアニン、フィコエリトリン、テキサスレッド及びこれらのアナログから選択される、請求項３５７に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３５９】
抗体が、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、及び２１３Ｂｉから選択される放射性核種検出標識に共有結合的に付着している、請求項３５５に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３６０】
抗体がキレートリガンドによって検出標識に共有結合的に付着されている、請求項３５５に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３６１】
キレートリガンドがＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡ及びＴＥＴＡから選択される、請求項３６０に記載のシステイン改変抗体。
【請求項３６２】
アルブミン結合ペプチドを含む、請求項１５から１６、３３４から３３８又は３３９から３４７のいずれか一に記載の抗体。
【請求項３６３】
アルブミン結合ペプチドが配列番号：２４６から２５０から選択される、請求項３６１に記載の抗体。
【請求項３６４】
抗体が、カバット番号付け表現法に従うところの軽鎖の１５、４３、１１０、１４４、１６８及び２０５と、カバット番号付け表現法に従うところの重鎖の４１、８８、１１５、１１８、１２０、１７１、１７２、２８２、３７５及び４００と、ＥＵ番号付け表現法に従うところの重鎖の１１８、１２０、２８２、３７５及び４００から選択される一又は複数の位置に一又は複数の遊離システインアミノ酸を更に含む、請求項１５から１６、３３４から３３８又は３３９から３４７のいずれか一に記載の抗体。
【請求項３６５】
システインが軽鎖の位置２０５にある、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項３６６】
システインが重鎖の位置１１８にある、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項３６７】
システインが重鎖の位置４００にある、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項３６８】
抗体がモノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体及びヒト化抗体から選択される、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項３６９】
抗体断片である、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項３７０】
抗体断片がＦａｂ断片である、請求項３６９に記載の抗体。
【請求項３７１】
キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体から選択される、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項３７２】
細菌において生産される、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項３７３】
ＣＨＯ細胞において生産される、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項３７４】
ＣＤ７９ｂタンパク質を含むことが疑われる試料においてＣＤ７９ｂタンパク質の存在を決定する方法であって、該試料を請求項３６４に記載の抗体にさらし、該試料中の該ＣＤ７９ｂタンパク質への該抗体の結合を決定することを含み、このとき該タンパク質に対する抗体の結合が該試料中の該タンパク質の存在を表すものである、方法。
【請求項３７５】
前記試料は、前記ＣＤ７９ｂタンパク質を発現することが疑われる細胞を含む、請求項３７４に記載の方法。
【請求項３７６】
前記細胞がＢ細胞である、請求項３７４に記載の方法。
【請求項３７７】
抗体が、蛍光色素、放射性同位体、ビオチン又は金属-錯体形成リガンドから選択される標識に共有結合的に付着している、請求項３７４に記載の方法。
【請求項３７８】
請求項３６４に記載の抗ＣＤ７９ｂ抗体と薬学的に許容可能な希釈液、担体又は賦形剤とを含有する薬学的製剤。
【請求項３７９】
抗体がアウリスタチン又はメイタンシノイド薬剤部分に共有結合的に付着しており、それによって抗体薬剤コンジュゲートが形成される、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項３８０】
抗体(Ａｂ)とアウリスタチン又はメイタンシノイド薬剤部分(Ｄ)とを含み、このときシステイン改変抗体がリンカー部分(Ｌ)によって一又は複数の遊離システインアミノ酸によってＤに付着しており、化合物が以下の式Ｉを有し、
2011515069.tif 000090
ここで、ｐが１、２、３又は４である、請求項３７９に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項３８１】
ｐが２である、請求項３８０に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項３８２】
Ｌが以下の式を有し、
2011515069.tif 000091
ここで：
Ａがシステイン改変抗体(Ａｂ)のシステインチオールに共有結合的に付着したストレッチャー単位であり、
ａが０又は１であり、
各々のＷが独立したアミノ酸単位であり、
ｗが０から１２までの整数であり、
Ｙが、薬剤部分に共有結合的に付着したスペーサー単位であり、ｙが０、１又は２である、請求項３８０に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項３８３】
以下の式を有し、
2011515069.tif 000092
ここで、ＰＡＢがパラ-アミノベンジルカルバモイルであり、Ｒ１７が、(ＣＨ２)ｒ、Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル、Ｏ-(ＣＨ２)ｒ、アリーレン、(ＣＨ２)ｒ-アリーレン、-アリーレン-(ＣＨ２)ｒ-、(ＣＨ２)ｒ-(Ｃ３−Ｃ８-カルボシクリル)、(Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル)-(ＣＨ２)ｒ、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル、(ＣＨ２)ｒ-(Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル)、(Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル)-(ＣＨ２)ｒ-、-(ＣＨ２)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２)ｒ-、-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ-、-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ-ＣＨ２-、-(ＣＨ２)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ-、-(ＣＨ２)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ-ＣＨ２-、-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ-、-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ-ＣＨ２-、及び-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２)ｒ-から選択される二価の基であり、このときＲｂがＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル又はベンジルであり、そして、ｒがそれぞれ１から１０までの整数である、請求項３８２に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３８４】
Ｗｗがバリン-シトルリンである、請求項３８２に記載の抗体-薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３８５】
Ｒ１７が(ＣＨ２)５又は(ＣＨ２)２である、請求項３８２に記載の抗体-薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３８６】
以下の式を有する、請求項３８２に記載の抗体-薬剤コンジュゲート化合物。
2011515069.tif 000093
【請求項３８７】
Ｒ１７が(ＣＨ２)５又は(ＣＨ２)２である、請求項３８６に記載の抗体-薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３８８】
以下の式を有する、請求項３８２に記載の抗体-薬剤コンジュゲート化合物。
2011515069.tif 000094
【請求項３８９】
ＬがＳＭＣＣ、ＳＰＰ、ＳＰＤＢ又はＢＭＰＥＯである、請求項３８０に記載の抗体-薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３９０】
ＤがＭＭＡＥであり、以下の構造を有し、
2011515069.tif 000095
ここで、波形の線がリンカーＬへの付着部位を示す、請求項３８０に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３９１】
ＤがＭＭＡＦであり、以下の構造を有し、
2011515069.tif 000096
ここで、波形の線がリンカーＬへの結合部位を示す、請求項３８０に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３９２】
ＤがＤＭ１であり、以下の構造を有し、
2011515069.tif 000097
ここで、波形の線がリンカーＬへの結合部位を示す、請求項３８０に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３９３】
抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及び抗体断片から選択される、請求項３７９に記載の抗体-薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３９４】
抗体断片がＦａｂ断片である、請求項３７９に記載の抗体-薬剤コンジュゲート化合物。
【請求項３９５】
以下の構造：
2011515069.tif 000098
2011515069.tif 000099
から選択され、
このとき、Ｖａｌがバリンであり、Ｃｉｔがシトルリンであり、ｐが１、２、３又は４であり、Ａｂが請求項３６４に記載の抗体である、抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項３９６】
アウリスタチンがＭＭＡＥ又はＭＭＡＦである、請求項３７９に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
【請求項３９７】
ＬがＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ又はＭＣである、請求項３８０に記載の抗体−薬剤コンジュゲート。
【請求項３９８】
Ｂ細胞を検出するためのアッセイにおいて、
（ａ）細胞を請求項３７９に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物にさらし、
（ｂ）抗体−薬剤コンジュゲート化合物の細胞への結合の程度を決定する
ことを含むアッセイ。
【請求項３９９】
請求項３７９に記載の抗体−薬剤コンジュゲート化合物にて、細胞培養培地中の哺乳類の癌性Ｂ細胞を処置することを含み、これによって癌性Ｂ細胞の増殖が抑制される、細胞増殖の阻害方法。
【請求項４００】
請求項３７９に記載の抗体−薬剤コンジュゲートと、薬学的に許容可能な希釈液、担体又は賦形剤とを含有する、薬学的製剤。
【請求項４０１】
請求項４００に記載の薬学的製剤を患者に投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項４０２】
癌が、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、高悪性度ＮＨＬ、再発性高悪性度ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項２２８に記載の方法。
【請求項４０３】
患者が、抗体−薬剤コンジュゲート化合物と組み合わせて細胞傷害性剤が投与される、請求項４０１に記載の方法。
【請求項４０４】
請求項４００に記載の薬学的製剤と、
容器と、
化合物がＣＤ７９ｂポリペプチドの過剰発現に特徴がある癌の治療に用いられることを示すパッケージ挿入物又はラベルと
を具備する生産品。
【請求項４０５】
癌が、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、高悪性度ＮＨＬ、再発性高悪性度ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項４０４に記載の生産品。
【請求項４０６】
請求項１９１に記載の抗ＣＤ７９ｂ抗体(Ａｂ)とアウリスタチン又はメイタンシノイド薬剤部分(Ｄ)とを含む抗体薬剤コンジュゲート化合物の生産方法であって、このとき該抗体がリンカー部分(Ｌ)によって一又は複数の改変システインアミノ酸によってＤに結合しており、該化合物が以下の式Ｉを有し、
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ）ｐ        Ｉ
ここで、ｐが４１、２、３又は４であり、
（ａ）  抗体の改変システイン基をリンカー試薬と反応させ、抗体−リンカー中間生成物Ａｂ−Ｌを形成させ、そして、
（ｂ）  活性化された薬剤部分ＤとＡｂ−Ｌを反応させ、これによって、抗体−薬剤コンジュゲートが形成される
工程を含むか、又は、
（ｃ）  薬剤部分の求核基をリンカー試薬と反応させ、薬剤−リンカー中間生成物Ｄ−Ｌを形成させ、
（ｄ）  Ｄ−Ｌを抗体の改変システイン基と反応させ、これによって、抗体−薬剤コンジュゲートが形成される
工程を含む方法。
【請求項４０７】
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞において抗体を発現させる工程をさらに含む、請求項４０６に記載の方法。
【請求項４０８】
発現された抗体を還元剤にて処理する工程をさらに含む、請求項４０７に記載の方法。
【請求項４０９】
還元剤がＴＣＥＰ及びＤＴＴから選択される、請求項４０８に記載の方法。
【請求項４１０】
還元剤にて処理した後に、発現された抗体を酸化剤にて処理する工程をさらに含む、請求項４０９に記載の方法。
【請求項４１１】
酸化剤が硫酸銅、デヒドロアスコルビン酸及び空気から選択される、請求項４１０に記載の方法。
【請求項４１２】
配列番号：１２又は５９のいずれか一から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖配列を含む、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項４１３】
配列番号：１０又は５８のいずれか一から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖配列を含む、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項４１４】
配列番号：１０のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖配列と、配列番号：５９のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖配列とを含む、請求項１９１に記載の抗体。
【請求項４１５】
配列番号：５８のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖配列と、配列番号：１２のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖配列とを含む、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項４１６】
配列番号：４３又は６１のいずれか一から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖配列を含む、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項４１７】
配列番号：４１又は９６のいずれか一から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖配列を含む、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項４１８】
配列番号：４１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖配列と、配列番号：６１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖配列とを含む、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項４１９】
配列番号：９６のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖配列と、配列番号：４３のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖配列とを含む、請求項３６４に記載の抗体。
【請求項４２０】
抗体が、
（ａ）配列番号：４のアミノ酸２９から３９を含むアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸３０から４０を含むアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号：１３のアミノ酸配列２９から３９を含むアミノ酸配列
を含む群から選択されるＣＤ７９ｂの領域中のエピトープに結合する、請求項１５から１６、３３４から３３８又は３３９から３４７の抗体。
【請求項４２１】
位置３０、３４及び３６のアミノ酸がＡｒｇである、配列番号：４のアミノ酸２９から３９からのＣＤ７９ｂの領域中のエピトープに抗体が結合する、請求項４２０の抗体。
【請求項４２２】
位置３５のアミノ酸がＬｅｕである、配列番号：８のアミノ酸３０から４０からのＣＤ７９ｂの領域中のエピトープに抗体が結合する、請求項４２０の抗体。
【請求項４２３】
抗体が、ＣＤ７９ｂの領域中のエピトープに結合し、ここで、前記エピトープが
（ａ）配列番号：４のアミノ酸２９から３９を含むアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸３０から４０を含むアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号：１３のアミノ酸配列２９から３９を含むアミノ酸配列
に対し、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１５から１６、３３４から３３８又は３３９から３４７の抗体。
【請求項４２４】
位置３０、３４及び３６のアミノ酸がＡｒｇである、配列番号：４のアミノ酸２９から３９からのＣＤ７９ｂの領域中のエピトープに抗体が結合する、請求項４２３の抗体。
【請求項４２５】
位置３５のアミノ酸がＬｅｕである、配列番号：８のアミノ酸３０から４０からのＣＤ７９ｂの領域中のエピトープに抗体が結合する、請求項４２３の抗体。
【請求項４２６】
請求項１５から１６、３３４から３３８又は３３９から３４７の抗体に競合する抗体及び／又は請求項１５から１６、３３４から３３８又は３３９から３４７の抗体の重鎖又は軽鎖を含む抗体。
【請求項４２７】
癌性腫瘍を有する哺乳類の治療の安全性を試験するための、請求項１５から１６、３３４から３３８又は３３９から３４７の何れかの抗カニクイザルＣＤ７９ｂ抗体又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂを含むＡＤＣを使用する方法において、前記治療が請求項１５から１６、３３４から３３８又は３３９から３４７の何れかの抗ヒトＣＤ７９ｂ抗体又は抗ヒトＣＤ７９ｂを含むＡＤＣの投与を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における造血性腫瘍の治療に有用な物質の組成物と、同用途のために該物質の組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍（癌）は、米国において心臓疾患に続き第２の主要な死亡原因である（Boring等, CA Cancel J. Clin. 43:7(1993)）。癌は、正常な組織から誘導されて腫瘍塊を形成する異常な又は腫瘍形成性の細胞の数の増加、これらの腫瘍形成性腫瘍細胞による隣接組織の侵襲、及び最終的に血液やリンパ系を介して局所のリンパ節や遠くの部位に転移と呼ばれる過程を介して広がる悪性細胞の生成を特徴とする。癌性状態においては、正常細胞が成長しない条件下で細胞が増殖する。癌自体は、異なる侵襲及び攻撃性の程度で特徴付けられる広範な種々の形態で顕現する。
血球新生、すなわちリンパ球、白血球、血小板、赤血球及びナチュラルキラー細胞等の血液の細胞要素が産生されるプロセスの間に産生される細胞に関与する癌を造血性癌と呼ぶ。血液及びリンパ組織中に見られるリンパ球は免疫応答に重要であり、２つの主要なリンパ球の種類に分類される。すなわち、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）及びＴリンパ球（Ｔ細胞）であり、これらはそれぞれ、体液性免疫と、細胞媒介性免疫を媒介する。
Ｂ細胞は骨髄中において成熟し、その細胞表面に抗原結合性抗体を発現して骨髄を出る。ナイーブなＢ細胞は、その膜結合性抗体が特異的に結合する抗原に初めて遭遇すると、急速に分裂を始め、その子孫は記憶Ｂ細胞及び「プラズマ細胞」と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。記憶Ｂ細胞の寿命は長く、元の親細胞と同じ特異性を持つ膜結合性抗体を発現し続ける。プラズマ細胞は膜結合性抗体を産生しないが、代わりに分泌可能な形態の抗体を産生する。分泌された抗体は、体液性免疫の主要なエフェクター分子である。
Ｔ細胞は、未成熟Ｔ細胞の増殖及び分化の環境となる胸腺の中で成熟する。Ｔ細胞が成熟する間に、Ｔ細胞では、Ｔ細胞レセプターを産生する遺伝子の再構成と、成熟Ｔ細胞の細胞表面における表現型を決定する助けとなるポジティブ及びネガティブ選択が行われる。成熟Ｔ細胞の特徴的な細胞表面マーカーは、ＣＤ３：Ｔ細胞レセプター複合体及びコアレセプターのＣＤ４又はＣＤ８の一方である。
【０００３】
癌の治療に効果的な細胞標的を発見する試みでは、研究者達は、一又は複数の正常な非癌牲細胞と比較し、一又は複数の特定の型の癌細胞の表面に特に発現する膜貫通又はさもなければ膜結合型のポリペプチドの同定を探求してきた。しばしば、このような膜結合ポリペプチドは非癌性細胞の表面と比べて癌細胞の表面により豊富に発現される。このような腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定は、抗体ベースの治療を介する癌細胞を標的として特異的に破壊する能力を生み出す。この点、抗体ベースの治療が、ある種の癌の治療において非常に効果的であることが証明されていることが留意される。例えば、ハーセプチン（登録商標）及びリツキサン（登録商標）（双方共にジェネンテック社, サウス サンフランシスコ, カリフォルニア）は、それぞれ乳癌及び非ホジキンリンパ腫を治療するのに成功裏に用いられている抗体である。より具体的には、ハーセプチン（登録商標）は、ヒト上皮成長因子レセプター２（ＨＥＲ２）プロト-オンコジーンの細胞外ドメインに選択的に結合する組換えＤＮＡ誘導ヒト化モノクローナル抗体である。ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現は、２５−３０％の原発性乳癌に観察される。リツキサン（登録商標）は、正常及び悪性Ｂリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対する遺伝子操作キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。これら抗体の双方共、ＣＨＯ細胞中で組換え操作によって産生される。
癌の治療に効果的な細胞標的を発見する他の試みでは、研究者達は、（１）非癌性正常細胞の一又は複数の特定の型による場合と比較して癌細胞の一又は複数の特定の型によって特異的に産生される非膜結合ポリペプチド、（２）一又は複数の正常な非癌性細胞のものより有意に高い発現レベルで癌細胞により産生されるポリペプチド、又は（３）癌性及び非癌性状態の双方（例えば正常な前立腺及び前立腺腫瘍組織）においてその発現が一つの組織型（あるいは非常に制限された数の異なった細胞型）のみに特異的に限られているポリペプチドを探求してきた。このようなポリペプチドは癌細胞によって分泌されるか又は細胞内に残ったままでありうる。更に、このようなポリペプチドは、癌細胞自体ではなく、癌細胞に増強又は成長亢進効果を有するポリペプチドを産生及び／又は分泌する細胞によってむしろ発現されうる。そのような分泌ポリペプチドは、しばしば正常細胞を超える成長有利性を癌細胞に与えるタンパク質であり、例えば血管形成因子、細胞付着因子、成長因子等の物を含む。このような非膜結合ポリペプチドのアンタゴニストの同定は、このような癌の治療のための効果的な治療剤となることが期待される。更に、このようなポリペプチドの発現パターンの同定は、哺乳動物における特定の癌の診断に役立つであろう。
哺乳動物の癌治療は上記のような進歩を見ているが、それぞれ哺乳動物における腫瘍の存在を検出することができ、腫瘍性の細胞成長を有効に抑制するためのさらなる治療薬に対する需要は依然大きい。従って、本発明の目的は、ポリペプチド、細胞膜関連ポリペプチド、単一（又は限定された数の）組織型に発現が限定された分泌ポリペプチド又は細胞内ポリペプチド、造血組織を、癌性及び非癌性状態の双方において同定し、それらポリペプチドとそれらのコード化核酸を使用して哺乳動物の造血性癌の治療的処置に有用な組成物を生成することである。
【０００４】
ＣＤ７９は、ＣＤ７９ａ(Ｉｇ、ｍｂ-１)及びＣＤ７９ｂ(Ｉｇ、Ｂ２９)を含有する共有結合性ヘテロ二量体からなるＢ細胞レセプターのシグナル伝達構成成分である。ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂは、各々細胞外イムノグロブリン(Ｉｇ)ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメイン、イムノレセプターチロシンベースの活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)ドメインを含有する。ＣＤ７９はＢ細胞上及び非ホジキンリンパ腫細胞(ＮＨＬ)において発現される(Cabezudo et al., Haematologica, 84:413-418 (1999)；D'Arena et al., Am. J. Hematol., 64: 275-281 (2000)；Olejniczak et al., Immunol. Invest., 35: 93-114 (2006))。ＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂ及びｓＩｇのすべては、ＣＤ７９の表面発現に必要である(Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol., 13(3): 270-7)(2001))。ＮＨＬ上のＣＤ７９ｂの平均表面発現は、正常なＢ細胞上の平均表面発現と同程度であるが、範囲は広い。
【０００５】
従って、特に慢性的な治療のために患者に投与した際に抗原性が最小であるか又は全くないＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂ抗原に対する治療的抗体を製造することが有益である。本発明はこれ及び他の必要を満たすものである。本発明は、現在の治療的組成物の制限を克服する抗ＣＤ７９ａ及び抗ＣＤ７９ｂ抗体を提供し、並びに以下の詳細な説明から明白となる更なる利点を示す。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、つまり、癌の治療において腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局所運搬のために抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)を使う(Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549；Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146；Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212；Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172；米国特許第４９７５２７８号)と、薬剤成分を腫瘍へ目的通りに運搬して、そこで細胞内蓄積させることが可能となる。コンジュゲートさせていない薬剤を全身投与すると、排除しようとする腫瘍細胞だけでなく正常な細胞に許容されないレベルの毒性が生じうる(Baldwin et al (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986): 603-05；Thorpe, (1985) &quot;Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review&quot;, Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al (ed.s), pp. 475-506)。治療的インデックス、つまりＡＤＣの最大の効率及び最小の毒性を改善するための努力は、ポリクローナル抗体(Rowland et al (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)及びモノクローナル抗体(ｍＡｂ)の選択、並びに薬剤結合及び薬剤放出性質(Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549)に集中していた。抗体薬剤コンジュゲートに用いられる薬剤成分には、ジフテリア毒素などの細菌性タンパク質毒素、リシンなどの植物タンパク質毒素、アウリスタチン、ゲルダナマイシン(Mandler et al (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581；Mandler et al (2000) Bioorganic and; Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(欧州特許第１３９１２１３号；Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、カリケアマイシン(Lode et al (1998) Cancer Res. 58: 2928；Hinman et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342)、ダウノマイシン、ドキソルビシン、及びビンデシン(上掲のRowland et al (1986))などの小分子毒素が含まれる。薬剤成分は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害などの細胞障害性及び細胞分裂停止性の機能に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０００６】
アウリスタチンペプチドである、アウリスタチンＥ(ＡＥ)とドラスタチンの合成類似体であるモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)(国際公開０２／０８８１７２)は、(i) キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(カルチノーマ上のルイスＹに特異的)、(ii) 血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的であるｃＡＣ１０(Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4): 765-773；Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7): 778-784；Francisco et al (2003) Blood 102(4): 1458-1465；米国公開特許２００４／００１８１９４)、(iii) ＣＤ２０発現癌及び免疫不全の治療のためのリツキサンなどの抗ＣＤ２０抗体(国際公開０４／０３２８２８)、(iv) 結腸直腸癌の治療のための抗ＥｐｈＢ２抗体２Ｈ９(Mao et al (2004) Cancer Research 64(3): 781-788)、(v) Ｅセレクチン抗体(Bhaskar et al (2003) Cancer Res. 63: 6387-6394)、(vi) トラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標)、米国公開特許２００５／０２３８６４９)、及び(vi) 抗ＣＤ３０抗体(国際公開０３／０４３５８３)へ、薬剤成分としてコンジュゲートされていた。アウリスタチンＥの変異体は、米国特許第５７６７２３７号及び米国特許第６１２４４３１号において開示される。モノクローナル抗体にコンジュゲートされるモノメチルアウリスタチンＥは、２００４年３月２８日に発表されたSenter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623において開示される。アウリスタチン類似体ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦは、様々な抗体にコンジュゲートされている(米国公開特許２００５／０２３８６４９)。
【０００７】
抗体に薬剤成分を付着させる、すなわち共有結合により結合させる従来の手段では、一般的に、薬剤成分が抗体上の多くの部位で付着している分子の不均一な混合物となる。例えば、典型的に、細胞毒性薬剤は、抗体の時に多くのリジン残基を介して抗体にコンジュゲートされ、不均一な抗体薬剤コンジュゲート混合物を生じていた。反応条件に応じて、典型的に、不均一な混合物は、０からおよそ８又はそれ以上の薬剤成分が付着している抗体の分布を含む。さらに、抗体に対する薬剤成分をある整数比で有するコンジュゲートの各サブグループ内では、薬剤成分が抗体上の様々な部位で付着している潜在的に不均一な混合物である。分析方法及び調製方法は、コンジュゲート反応により生じる不均一な混合物内の抗体−薬剤コンジュゲート種分子を分離し特徴付けるために不十分でありうる。抗体は大きく、複雑で、構造的に多様な生体分子であり、反応性の官能基を多く有することが多い。リンカー試薬及び薬剤−リンカー中間生成物との反応性は、ｐＨ、濃度、塩濃度及び共存溶媒などの因子に依存している。さらに、複数の工程のコンジュゲート工程は、反応条件の調節や反応物と中間生成物の特徴付けが難しいため、再現性がないかもしれない。
【０００８】
システインチオールは、陽子が付加される多くのアミンとは異なり、中性ｐＨで反応性であり、ｐＨ７付近ではほとんど求核性基でない。遊離チオール(ＲＳＨ、スルフヒドリル)基は相対的に反応性であるので、システイン残基を有するタンパク質は、ジスルフィド結合オリゴマーとして酸化型で存在することが多いか、又は内部で架橋したジスルフィド基を有する。細胞外タンパク質は、一般に遊離チオールを有しない(Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London, at page 55)。一般に、抗体システインチオール基は、求電子性のコンジュゲート試薬に対して、抗体アミンやヒドロキシ基よりも反応性が高い、すなわち求核性が高い。システイン残基は、リガンドへの共有的付着を形成させるため、ないしは新たに分子内ジスルフィド結合を形成させるために、遺伝学的操作技術によりタンパク質内に導入されていた(Better et al (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650；Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132；Greenwood et al (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255；Tu et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867；Kanno et al (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214；Chmura et al (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15): 8480-8484；米国特許第６２４８５６４号)。しかしながら、タンパク質の様々なアミノ酸残基をシステインアミノ酸に変異させることによるシステインチオール基の操作は、対になっていない(遊離Ｃｙｓ)残基又は相対的に反応又は酸化に接触しやすいものの場合に特に問題となりやすい。大腸菌周辺質、培養物上清又は一部ないし完全に精製されたタンパク質内のタンパク質が濃縮された溶液では、タンパク質の表面上の対になっていないＣｙｓ残基は対になり、酸化されて、分子内ジスルフィドを形成し、ゆえにタンパク質二量体又は多量体となることができる。ジスルフィド二量体形成は、新規のＣｙｓを、薬剤、リガンド又は他の標識へのコンジュゲートに対して非反応性にする。さらに、タンパク質が新たに操作されたＣｙｓと既存のＣｙｓ残基との間で分子内ジスルフィド結合を酸化的に形成する場合、両Ｃｙｓチオール基は活性部位関与にも相互作用にも利用されない。さらに、タンパク質は、三次構造の欠損又はミスホールドにより、不活性化ないしは非特異的になるかもしれない(Zhang et al (2002) Anal. Biochem. 311:1-9)。
【０００９】
システイン-改変抗体は、Ｆａｂ抗体断片(チオＦａｂ)として設定され、完全長ＩｇＧモノクローナル(チオＭａｂ)抗体として発現されていた(Junutula, J.R. et al. (2008) J Immunol Methods 332:41-52；米国特許公開２００７／００９２９４０、これらの内容は出典明記により援用される)。抗体薬剤コンジュゲート(ＴｈｉｏＡＤＣ)を調節するために、ＴｈｉｏＦａｂ及びＴｈｉｏＭａｂ抗体は、チオール反応性リンカー試薬及び薬剤−リンカー試薬によって新たに導入されたシステインチオールでリンカーによりコンジュゲートされていた。
特許公報及び出版物を含む本明細書において引用されるすべての文献は、出典明記によってその全体が援用される。
【００１０】
発明の概要
Ａ．実施態様
本明細書において、本出願人は、特定の種類の細胞、例えばリンパ球、白血球、赤血球及び血小板等の血液新生段階において産生される細胞の、腫瘍細胞及び正常細胞の両方が特異的に発現する種々の細胞性ポリペプチド（及びそれらのコード核酸又はその断片）の同定について最初に記載する。ここで、上記のポリペプチドは全て、造血系起源腫瘍抗原（Tumor-Antigens of Hematopoietic Origin polypeptide）ポリペプチド（「ＴＡＨＯ」ポリペプチド）と呼ばれ、哺乳動物における癌治療の効果的な標的となることが予想される。
本発明は、抗ＣＤ７９ａ及び抗ＣＤ７９ｂ抗体又はその機能化断片とその造血腫瘍の治療における使用法を提供する。
従って、本発明の一実施態様では、本発明は、造血系起源ポリペプチドの腫瘍抗原又はその断片（「ＴＡＨＯ」ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。
【００１１】
ある態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここで開示されるアミノ酸配列を有する完全長ＴＡＨＯポリペプチド、ここで開示されるシグナルペプチドを欠くＴＡＨＯポリペプチドアミノ酸配列、ここに開示される膜貫通ＴＡＨＯポリペプチドの細胞外ドメインで、シグナルペプチドを含む又は含まないもの、又はここに開示される完全長ＴＡＨＯポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定まった断片をコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここで開示される完全長ＴＡＨＯポリペプチドｃＤＮＡのコード化配列、ここで開示されるシグナルペプチドを欠くＴＡＨＯポリペプチドのコード化配列、ここに開示される膜貫通ＴＡＨＯポリペプチドの細胞外ドメインのシグナルペプチドを含む又は含まないコード化配列、又はここに開示される完全長ＴＡＨＯポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定まった断片のコード化配列、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
更なる態様では、本発明は、（ａ）ここで開示されるＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの何れかの完全長コード領域によってコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性化のいずれかである、又はそのようなコード化ヌクレオチド配列と相補的であるＴＡＨＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供し、そのようなポリペプチドの膜貫通ドメインはここで開示されている。従って、ここに記載のＴＡＨＯポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
【００１３】
他の態様では、本発明は、（ａ）ここで開示される完全長アミノ酸配列を有するＴＡＨＯポリペプチド、ここで開示されるシグナルペプチドを欠くＴＡＨＯポリペプチドアミノ酸配列、ここに開示される膜貫通ＴＡＨＯポリペプチドの細胞外ドメインで、シグナルペプチドを伴う又は伴わないもの、又はここで開示される完全長ＴＡＨＯポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定まった断片をコードするヌクレオチド配列、又は（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列の相補鎖とハイブリダイズする単離された核酸分子に関する。この点に関して、本発明の実施態様は、例えば、検出プローブ、アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとして有用なハイブリダイゼーションプローブとしての用途を見出し得る、ここに開示される、完全長ＴＡＨＯポリペプチドコード化配列の断片、又はその相補鎖、又は抗ＴＡＨＯポリペプチド抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯポリペプチドに結合する他の小有機分子の結合部位を含むポリペプチドを任意にコードし得る完全長ＴＡＨＯポリペプチドのコード化断片に関する。このような核酸断片は、通常は少なくとも約５のヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈において「約」という用語は、表示ヌクレオチド配列長にその表示長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。ＴＡＨＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、よく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用してＴＡＨＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのＴＡＨＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することによって、常套的に決定しうることが知られている。そのようなＴＡＨＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子断片によりコードされるＴＡＨＯポリペプチド断片、好ましくは抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯポリペプチドに結合する他の小有機分子に対する結合部位を含んでなるＴＡＨＯポリペプチド断片である。
【００１４】
ある実施態様では、本発明は、ここに開示される完全長アミノ酸配列を有するＴＡＨＯポリペプチド、ここに開示されるシグナルペプチドを欠くＴＡＨＯポリペプチドアミノ酸配列、ここに開示されるシグナルペプチドを有するか又は有しない膜貫通ＴＡＨＯポリペプチドタンパク質の細胞外ドメイン、ここに開示される核酸配列の任意のもの、又はここに開示される完全長ＴＡＨＯポリペプチドアミノ酸配列でその他の具体的に定まった断片によってコードされているアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＴＡＨＯポリペプチドに関する。
【００１５】
更なる態様では、本発明は、ここに開示されてＡＴＣＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの何れかによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＴＡＨＯポリペプチドに関する。
特定の態様では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たない単離されたＴＡＨＯポリペプチドを提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされている。これを製造する方法もまたここに開示され、これらの方法には、ＴＡＨＯポリペプチドの発現に適した条件下で適切なコード化核酸分子を含有するベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養物からＴＡＨＯポリペプチドを回収することを含む。
【００１６】
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失したか又は膜貫通ドメインが不活性化している単離されたＴＡＨＯポリペプチドを提供する。これを製造する方法もまたここに開示され、これらの方法には、ＴＡＨＯポリペプチドの発現に適した条件下で適切なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養物からＴＡＨＯポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の実施態様では、本発明は、ここで記載されているポリペプチドの何れかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であり得る。ここに開示されているポリペプチドの何れかの製造方法がさらに提供され、所望するポリペプチドの発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物からその所望するポリペプチドを回収することを含んでなる。
【００１７】
他の実施態様では、本発明は、異種（非-ＴＡＨＯ）ポリペプチドに融合した、ここに開示のＴＡＨＯポリペプチドの何れかを含む単離したキメラポリペプチドを提供する。そのようなキメラ分子の例は、例えば、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域等の異種ポリペプチドと融合したここに開示のＴＡＨＯポリペプチドの何れかを含む。
その他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの何れかと、好ましくは特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、その抗体はモノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片を含む抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体又は抗ＴＡＨＯポリペプチド抗体がその各抗原性エピトープと結合するのを競合的に阻害する抗体である。本発明の抗体は、例えば、メイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等と場合によってはコンジュゲートし得る。本発明の抗体は、場合によってはＣＨＯ細胞又は細菌細胞で産生され、好ましくは、それが結合する細胞の死を誘導する。検出のために、本発明の抗体は、検出可能に標識されたり、固体支持体に付着されたりする。
【００１８】
別の実施態様では、本発明は、抗ＴＡＨＯ抗体を提供し、ここで、そのような抗ＴＡＨＯ抗体が、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチドに結合し、ここで、このような抗ＴＡＨＯ抗体は、
（ａ）配列番号：９７、９９又は１０１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン；及び／又は
（ｂ）配列番号：９８、１００又は１０２から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。
【００１９】
別の実施態様では、本発明は、抗ＴＡＨＯ抗体を提供し、ここで、そのような抗ＴＡＨＯ抗体が、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチドに結合し、ここで、このような抗ＴＡＨＯ抗体は、
（ａ）配列番号：１０、３３又は４１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン；及び／又は
（ｂ）配列番号：１２、３５又は４３から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。
【００２０】
別の実施態様では、本発明は、抗ＴＡＨＯ抗体を提供し、ここで、そのような抗ＴＡＨＯ抗体が、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチドに結合し、ここで、このような抗ＴＡＨＯ抗体は、
（ａ）配列番号：４のアミノ酸２９から３９を含むアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸３０から４０を含むアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列番号：１３のアミノ酸２９から３９を含むアミノ酸配列；
からなる群から選択されるヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のようなＴＡＨＯポリペプチドの領域中のエピトープに結合する。
【００２１】
更なる実施態様では、本発明は、抗ＴＡＨＯ抗体を提供し、ここで、そのような抗ＴＡＨＯ抗体が、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチドに結合し、ここで、このような抗ＴＡＨＯ抗体は、エピトープに結合し、ここで、前記エピトープは、位置３０、３４及び３６のアミノ酸がＡｒｇである配列番号：４のアミノ酸２９から３９を含む。更なる実施態様では、本発明は、抗ＴＡＨＯ抗体を提供し、ここで、そのような抗ＴＡＨＯ抗体が、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチドに結合し、ここで、このような抗ＴＡＨＯ抗体は、エピトープに結合し、ここで、前記エピトープは、位置３５のアミノ酸がＬｅｕである配列番号：８のアミノ酸２９から３９を含む。
【００２２】
一態様では、本発明の抗体は、国際公開２００６／０３４４８８；米国公開特許２００７／００９２９４０(本明細書において出典明記によって全体が援用される)に開示されるように、親抗体の一又は複数のアミノ酸が遊離したシステインアミノ酸に置換されるシステイン改変抗体を包含する。抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体の任意の形態が改変、すなわち変異されてもよい。例えば、親Ｆａｂ抗体断片を改変して、本明細書中で「ＴｈｉｏＦａｂ」と称するシステイン改変Ｆａｂを形成してもよい。同様に、親のモノクローナル抗体を改変して、「ＴｈｉｏＭａｂ」を形成してもよい。単一の部位突然変異によりＴｈｉｏＦａｂの単一の改変したシステイン残基が生じるのに対して、ＩｇＧ抗体の二量体の性質のためにＴｈｉｏＭａｂでは、単一の部位突然変異により２つの改変したシステイン残基が生じる。抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、本発明のシステイン改変抗ＴＡＨＯ抗体には、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、細胞関連のＴＡＨＯポリペプチドを選択的に結合するモノクローナル抗体、ヒト化ないしはキメラのモノクローナル抗体、及び抗体の抗原結合断片、融合ポリペプチド及びアナログが含まれる。あるいは、システイン改変抗体は、必ずしも親抗体を変える必要はなく、例えばファージディスプレイ抗体の設定や選別によって、又は軽鎖及び／又は重鎖フレームワーク配列と定常領域のデノボ設定によって、抗体の配列設定及び／又は選別により生じる、抗体又はＦａｂの本明細書において開示される位置にシステインを含む抗体を包含する。システイン改変抗体は、０．６〜１．０、０．７〜１．０又は０．８〜１．０の範囲のチオール反応値を有する一又は複数の遊離したシステインアミノ酸を含む。遊離したシステインアミノ酸は、親抗体内で改変されているシステイン残基であり、ジスルフィド架橋の一部でない。システイン改変抗体は、例えばマレイミド又はハロアセチルによる改変されたシステインの部位での、細胞障害性化合物及び／又は造影(イメージング)化合物の接着に有用である。Ｃｙｓ残基のチオール官能基のマレイミド基に対する求核反応性は、リジン残基のアミノ基又はＮ末端アミノ基などのタンパク質の任意の他のアミノ酸官能基の、およそ１０００倍である。ヨードアセチル及びマレイミド試薬のチオール特異的官能基はアミン基と反応するが、より高いｐＨ(＞９．０)及びより長い反応時間が必要とされるであろう必要かもしれない(Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London)。
【００２３】
ある態様では、本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体は以下のいずれか一の位置に改変したシステインを含み、この位置は、軽鎖ではカバット等(Kabat等 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDを参照)に従った、重鎖(Ｆｃ領域を含む)ではＥＵ番号付け(上掲のKabat等 (1991)を参照)に従った数であり、図３０Ａ、３１Ａ、３５Ａ及び３６Ａの下線で示す軽鎖定常領域は位置１０９(カバット番号付け)で始まり、図３０Ｂ、３１Ｂ、３５Ｂ及び３６Ｂの下線で示す重鎖定常領域は位置１１８(ＥＵ番号付け)で始まる。また、位置は、図３０−３１及び４９に示す完全長軽鎖ないしは重鎖のアミノ酸を順次番号付けする際にその位置で表されてもよい。本発明の一実施態様では、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体は、ＬＣ-Ｖ２０５Ｃに改変されたシステインを含む(カバット番号：Ｖａｌ２０５、図２７Ａ及び４９Ａの順次番号２０９はその位置でＣｙｓになるように改変される)。軽鎖の改変されたシステインを図３０Ａ及び３６Ａにおいて太字の二重線で示す。一実施態様では、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体は、ＨＣ-Ａ１１８Ｃに改変されたシステインを含む(ＥＵ番号：Ａｌａ１１８；カバット番号１１４；図３１Ｂ又は３５Ｂの順次番号１１８はその位置でＣｙｓになるように改変される)。重鎖の改変されたシステインを３１Ｂ又は３５Ｂにおいて太字の二重線で示す。一実施態様では、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体は、Ｆｃ-Ｓ４００Ｃに改変されたシステインを含む(ＥＵ番号：Ｓｅｒ４００；カバット番号３９６、３１Ｂ又は３５Ｂの順次番号４００はその位置でＣｙｓになるように改変される)。他の実施態様では、重鎖(Ｆｃ領域を含む)の改変されたシステインは、以下の位置のいずれか一である(カバット番号付けに従い、ＥＵ番号付けは括弧内に示す)。５、２３、８４、１１２、１１４(１１８ＥＵ番号付け)、１１６(１２０ＥＵ番号付け)、２７８(２８２ＥＵ番号付け)、３７１(３７５ＥＵ番号付け)又は３９６(４００ＥＵ番号付け)。したがって、本発明の抗ヒト７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体のような、親キメラ抗ＴＡＨＯ抗体についてこれらの位置でのアミノ酸の変化は、Ｑ５Ｃ、Ｋ２３Ｃ、Ｓ８４Ｃ、Ｓ１１２Ｃ、Ａ１１４Ｃ(Ａ１１８Ｃ  ＥＵ番号付け)、Ｔ１１６Ｃ(Ｔ１２０Ｃ  ＥＵ番号付け)、Ｖ２７８Ｃ(Ｖ２８２Ｃ  ＥＵ番号付け)、Ｓ３７１Ｃ(Ｓ３７５Ｃ  ＥＵ番号付け)又はＳ３９６Ｃ(Ｓ４００Ｃ  ＥＵ番号付け)である。したがって、本発明の親抗カニクイザルＣＤ７９ｂ抗体（ＴＡＨＯ４０）についてこれらの位置でのアミノ酸の変化は、Ｑ５Ｃ、Ｔ２３Ｃ、Ｓ８４Ｃ、Ｓ１１２Ｃ、Ａ１１４Ｃ(Ａ１１８Ｃ  ＥＵ番号付け)、Ｔ１１６Ｃ(Ｔ１２０Ｃ  ＥＵ番号付け)、Ｖ２７８Ｃ(Ｖ２８２Ｃ  ＥＵ番号付け)、Ｓ３７１Ｃ(Ｓ３７５Ｃ  ＥＵ番号付け)又はＳ３９６Ｃ(Ｓ４００Ｃ  ＥＵ番号付け)である。他の実施態様では���軽鎖の改変されたシステインは、以下の何れか一である(カバット番号付けに従う)。１５、１１０、１１４、１２１、１２７、１６８、２０５。したがって、本発明の親キメラ抗ヒト７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体についてこれらの位置でのアミノ酸の変化は、Ｌ１５Ｃ、Ｖ１１０Ｃ、Ｓ１１４Ｃ、Ｓ１２１Ｃ、Ｓ１２７Ｃ、Ｓ１６８Ｃ又はＶ２０５Ｃである。したがって、本発明の親抗カニクイザルＣＤ７９ｂ抗体（ＴＡＨＯ４０）についてこれらの位置でのアミノ酸の変化は、Ｌ１５Ｃ、Ｖ１１０Ｃ、Ｓ１１４Ｃ、Ｓ１２１Ｃ、Ｓ１２７Ｃ、Ｓ１６８Ｃ又はＶ２０５Ｃである。
【００２４】
抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体は、一又は複数の遊離したシステインアミノ酸を含み、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体がヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチドに結合するものであり、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、親の抗ＴＡＨＯ抗体の一又は複数のアミノ酸残基をシステインに置換することを含む方法によって調製され、ここで、該親抗体が
（ａ）配列番号：９７、９９又は１０１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン；及び／又は
（ｂ）配列番号：９８、１００又は１０２から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン
を含む。
【００２５】
抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体は、一又は複数の遊離したシステインアミノ酸を含み、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体がヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチドに結合するものであり、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、親の抗ＴＡＨＯ抗体の一又は複数のアミノ酸残基をシステインに置換することを含む方法によって調製され、ここで、該親抗体が
（ａ）配列番号：１０、３３又は４１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン；及び／又は
（ｂ）配列番号：１２、３５又は４３から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する重鎖可変ドメイン
を含む。
【００２６】
ある態様では、本発明は、本明細書において開示した完全長アミノ酸配列を有するシステイン改変抗体、又は本明細書において開示したシグナルペプチドを欠くシステイン改変抗体アミノ酸配列に対して、少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくともおよそ８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体に関する。
【００２７】
より更なる態様では、本発明は、(a) 本明細書に開示した完全長アミノ酸配列を有するシステイン改変抗体、(b) 本明細書に開示したシグナルペプチドを欠くシステイン改変抗体アミノ酸配列、(c) 本明細書に開示した、シグナルペプチドを持つ又は持たない、膜貫通型システイン改変抗体タンパク質の細胞外ドメイン、(d) 本明細書に開示したいずれかの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、又は(e) 本明細書に開示した完全長システイン改変抗体アミノ酸配列の任意の他の特異的に定義される断片、をコードするＤＮＡ分子の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、単離された抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体に関する。
特定の態様では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列を持たない及び／又は開始メチオニンを持たない単離された抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体を提供し、この抗体は本明細書中に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。本明細書中ではまた、前記抗体を産生する方法を記載しており、これらの方法は、システイン改変抗体の発現に適切な条件下で適切なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養物からシステイン改変抗体を回収することを含んでなる。
【００２８】
本発明の他の態様では、膜貫通ドメインを削除するか膜貫通ドメインを不活性化してある単離された抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体を提供する。本明細書中ではまた、前記抗体を産生する方法を記載しており、これらの方法は、システイン改変抗体の発現に適切な条件下で適切なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、細胞培養物からシステイン改変抗体を回収することを含んでなる。
他の態様では、本発明は、異種性(非ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は非カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、非ＴＡＨＯ)のポリペプチドに融合させた、本明細書中に記載したいずれかのシステイン改変抗体を含む、単離された抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体キメラシステイン改変抗体を提供する。このようなキメラ分子の例は、例えばエピトープタグ配列又はイムノグロブリンのＦｃ領域などの異種性のポリペプチドに融合させた、本明細書中に記載したいずれかのシステイン改変抗体を含む。
【００２９】
抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体は、それぞれの抗原エピトープへの抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＴＡＨＯ抗体ポリペプチド抗体の結合を競合的に阻害するモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又は抗体であってもよい。本発明の抗体は場合によって、例えばアウリスタチン、メイタンシノイド、ドラスタチン誘導体又はカリケアマイシン、抗生物質、放射性同位体、核酸分解性の酵素などを含む毒素などの増殖阻害性剤ないしは細胞障害性剤にコンジュゲートさせてもよい。本発明の抗体は場合によって、ＣＨＯ細胞又は細菌内で産生され、結合する細胞の成長ないし増殖を阻害するか、又は死を誘導することが好ましい。診断目的のために、本発明の抗体は、固体担体などに付着して検出可能に標識されてもよい。
【００３０】
システイン改変抗体は癌の治療において有用であり、細胞表面及び膜貫通型レセプター、及び腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)に特異的な抗体が含まれる。このような抗体は、ネイキッド抗体(薬剤又は標識成分にコンジュゲートしていない)として、あるいは抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)として用いられてもよい。本発明のシステイン改変抗体は、チオール反応性の試薬と、部位特異的かつ効率的にカップリングしうる。チオール反応性の試薬は、多機能リンカー試薬、キャプチャ標識試薬、蛍光体試薬又は薬剤−リンカー中間生成物であってもよい。システイン改変抗体は、検出可能な標識により標識され、固相担体に固定され、及び／又は、薬剤成分とコンジュゲートされもよい。Ｌ１０−Ｌ２０、Ｌ１０５−Ｌ１１５、Ｌ１０９−Ｌ１１９、Ｌ１１６−Ｌ１２６、Ｌ１２２−Ｌ１３２、Ｌ１６３−Ｌ１７３、Ｌ２００−Ｌ２１０のアミノ酸範囲から選択される軽鎖の範囲内、及びＨ１−Ｈ１０、Ｈ１８−Ｈ２８、Ｈ７９−Ｈ８９、Ｈ１０７−Ｈ１１７、Ｈ１０９−Ｈ１１９、Ｈ１１１−Ｈ１２１のアミノ酸範囲から選択される重鎖の範囲内、及びＨ２７０−Ｈ２８０、Ｈ３６６−Ｈ３７６、Ｈ３９１−４０１から選択される範囲内のＦｃ領域において、反応性のシステインアミノ酸によるアミノ酸の置換を持つ抗体に対してチオール反応が生じうる。このとき、アミノ酸位の番号付けはカバット番号付けシステム(Kabat等 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)の位置１から始め、その後は国際公開第2006034488号に開示されるように、順次続ける。また、チオール反応は、抗体の特定のドメイン、例えば軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３に対して生じうる。０．６以上のチオール反応値となるシステイン置換は、インタクト抗体、つまりＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２を含むＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの重鎖定常ドメインα、δ、ε、γ及びμにあってもよい。このような抗体及びそれらの使用は、国際公開２００６／０３４４８８；米国公開特許２００７／００９２９４０に開示される。
【００３１】
本発明のシステイン改変抗体は、それらの野生型、親抗体相当物の抗原結合能を保持するのが好ましい。ゆえに、システイン改変抗体は、抗原へ結合することができる、好ましくは抗原に特異性がある。このような抗原には、例えば、腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)、細胞表面レセプタータンパク質及び他の細胞表面分子、膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達又は分化に関連する(例えば機能的に寄与することが公知であるか又は予測される)分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に伴う分子、脈管形成に伴う分子、及び血管新生に関連する(例えば機能的に寄与することが公知であるか又は予測される)分子が含まれる。腫瘍関連抗原はクラスター分化因子(すなわち、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチドに限定されないＣＤタンパク質)であってもよい。本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体はその親の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体相当物の抗原結合能を保持する。ゆえに、本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体は、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ヒト抗ＴＡＨＯアイソフォームβ及び／又はαを含むヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、(Ｂ細胞に限らず細胞の表面上に抗原が発現される場合も含む)ＴＡＨＯ抗原に対して、結合、好ましくは特異的に結合することができる。
【００３２】
一態様では、本発明の抗体は、反応性成分、活性化成分、又は反応性システインチオール基によって抗体に共有結合して付着されうる標識成分とコンジュゲートされてもよい(Singh等 (2002) Anal. Biochem. 304:147-15；Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL)。付着された標識は、(i) 検出可能なシグナルを提供する、(ii) 第二標識と反応して、例えばＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー転移)が生じるように第一又は第二標識によって生じる検出可能なシグナルを改変する、(iii) 抗原又はリガンドとの相互作用を安定させるか又は結合の親和性を増加する、(iv) 電荷、疎水性、形状又は他の物理学的なパラメータによって可動性、例えば電気泳動易動度又は細胞透過性に作用する、又は(v) キャプチャ成分を与えて、リガンド親和性、抗体／抗原結合又はイオン錯体形成を調節する、ように機能しうる。
【００３３】
標識されたシステイン改変抗体は、例えば、特定の細胞、組織又は血清における対象の抗原の発現を検出するための診断的検査法に有用となりうる。診断用適用のために、抗体は一般的に検出可能な成分ににより標識されるであろう。多くの標識が利用可能であり、通常、以下のカテゴリに分類することができる：
ラジオアイソトープ(放射性核種)、例えば３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、又は２１３Ｂｉ。放射性同位体標識抗体は、レセプター標的撮像実験において有用である。抗体は、Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen等, Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)のCurrent Protocolsに記載される技術を用いて、リガンド試薬が抗体の改変システインチオールと反応性がある場合に、キレートを結合するか、あるいはラジオアイソトープ金属と複合化する該リガンド試薬により標識することができる。金属イオンを複合化しうるキレートリガンドには、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡ及びＴＥＴＡ(Macrocyclics, Dallas, TX)が含まれる。放射性核種は、本発明の抗体−薬剤コンジュゲートとの複合体化によりターゲティングされうる(Wu等 (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146)。
【００３４】
ＤＯＴＡ-マレイミド(４-マレイミドブチルアミドベンジル-ＤＯＴＡ)などのリンカー試薬は、イソプロピルクロロフォルメート(Aldrich)によって活性化される４-マレイミド酪酸(Fluka)とアミノベンジル-ＤＯＴＡを反応させて、その後Axworthy等 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4): 1802-1807の手順によって調製されうる。ＤＯＴＡ-マレイミド試薬は、システイン改変抗体の遊離したシステインアミノ酸と反応して、抗体上の金属錯体形成リガンドを提供する(Lewis等 (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86)。ＤＯＴＡ-ＮＨＳ(１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-１,４,７,１０-四酢酸モノ(Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル)などのキレート化リンカー標識試薬は市販されている(Macrocyclics, Dallas, TX)。放射性核種標識抗体によるレセプター標的造影は、腫瘍組織の抗体の進行性蓄積の検出及び定量化によって経路活性化のマーカーとなりうる(Albert等 (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210)。コンジュゲートした放射性金属はリソソーム分解後に細胞内に残りうる。
造影実験のための抗体標識として好適な金属-キレート複合体は以下に開示される。米国特許第５３４２６０６号、米国特許第５４２８１５５号、米国特許第５３１６７５７号、米国特許第５４８０９９０号、米国特許第５４６２７２５号、米国特許第５４２８１３９号、米国特許第５３８５８９３号、米国特許第５７３９２９４号、米国特許第５７５０６６０号、米国特許第５８３４４５６号、Hnatowich等 (1983) J. Immunol. Methods 65:147-157；Meares等 (1984) Anal. Biochem. 142:68-78；Mirzadeh等 (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65；Meares等 (1990) J. Cancer1990, Suppl. 10:21-26；Izard等 (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350；Nikula等 (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90；Camera等 (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62；Kukis等 (1998) J. Nucl. Med. 39: 2105-2110；Verel等 (2003) J. Nucl. Med. 44: 1663-1670；Camera等 (1994) J. Nucl. Med. 21: 640-646；Ruegg等 (1990) Cancer Res. 50: 4221-4226；Verel等 (2003) J. Nucl. Med. 44: 1663-1670；Lee等 (2001) Cancer Res. 61: 4474-4482；Mitchell,等 (2003) J. Nucl. Med. 44: 1105-1112；Kobayashi等 (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111；Miederer等 (2004) J. Nucl. Med. 45: 129-137；DeNardo等 (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90；Blend等 (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363；Nikula等 (1999) J. Nucl. Med. 40: 166-76；Kobayashi等 (1998) J. Nucl. Med. 39: 829-36；Mardirossian等 (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74；Roselli等 (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20。
【００３５】
蛍光標識、例えば希有土類キレート(ユウロピウムキレート)、ＦＩＴＣ、５-カルボキシフルオレセイン、６カルボキシフルオレセインを含むフルオレセイン種；ＴＡＭＲＡを含むローダミン種；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；及びこれらの類似体。蛍光標識は、例えば、上記のImmunologyのCurrent Protocolsに開示される技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光色素及び蛍光標識試薬には、Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR)及びPierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL)から市販されているものが含まれる。
【００３６】
様々な酵素基質標識は利用可能であり、開示されてもいる(米国特許第４２７５１４９号)。一般に、酵素は、様々な技術を用いて測定することができる色素生産性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光測光法で測定することができる基質の変色を触媒するかもしれない。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変えうる。蛍光の変化を定量化する技術は上記の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、測定することができる(例えば化学ルミノメーターを用いて)か、又はエネルギーを蛍光受容基に与える光を発しうる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号)、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、リンゴ酸酵素、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ(例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環のオキシダーゼ(例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ)、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートする技術は、O'Sullivan等, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【００３７】
酵素基質の組合せの例には、例えば以下のものが含まれる：
(i) 基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、ここで水素ペルオキシダーゼが染料前駆(例えば、オルソフェニレン(orthophenylene)ジアミン(ＯＰＤ)又は３,３',５,５'テトラメチルのベンジジン塩酸塩(ＴＭＢ))を酸化する；
(ii) 色素生産性基質としてリン酸パラグラフ-ニトロフェニルを有するアルカリホスファターゼ(ＡＰ)；及び
(iii) 色素生産性基質(例えばｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ)又は蛍光発生基質４-メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)-β-Ｄ-ガラクトシダーゼを有するβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ(β-Ｄ-Ｇａｌ)。
多数の他の酵素基質の組合せは当業者にとって利用可能である。これらの一般的な概要については、米国特許第４２７５１４９号及び同第４３１８９８０号を参照。
【００３８】
標識は、アミノ酸側鎖、活性化されたアミノ酸側鎖、システイン改変抗体などと間接的にコンジュゲートされてもよい。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した大きな３つの分類のうちの何れかはアビジン又はストレプトアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にストレプトアビジンと結合し、したがって、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。あるいは、ポリペプチド変異体と標識とを間接的にコンジュゲートさせるために、ポリペプチド変異体は小ハプテン(例えばジゴキシン)とコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの１つは抗ハプテンポリペプチド変異体(例えば抗ジゴキシン抗体)とコンジュゲートさせる。したがって、ポリペプチド変異体と標識は間接的にコンジュゲートすることができる(Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego)。
【００３９】
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法、例えばＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ、直接的及び間接的なサンドイッチアッセイ及び免疫沈降アッセイに用いられてもよい(Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.)。
検出標識は、結合又は認識事象を局所化し、視覚化して、数量化するために有用となりうる。本発明の標識抗体は細胞表面レセプターを検出しうる。検出可能に標識した抗体についての他の使用は、蛍光標識抗体とビーズをコンジュゲートさせ、リガンド結合時の蛍光シグナルを検出することを含む、ビーズに基づく免疫キャプチャの方法である。同様の結合検出方法論は、表面プラスモン共鳴(ＳＰＲ)効果を利用して抗体-抗原相互作用を測定して検出するものである。
蛍光色素及び化学発光色素などの検出標識(Briggs等 (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058)は検出可能なシグナルを提供し、通常、好ましくは以下のような特性により標識化抗体に応用することができる。(i) 標識抗体は、少量の抗体が無細胞アッセイ及び細胞に基づくアッセイにおいて敏感に検出されるように低いバックグランドで非常に高いシグナルを産生するものである、さらに、(ii) 標識抗体は、有意に写真を退色させることなく蛍光シグナルが観察され、モニターされ、記録されるように、光安定性を有するものである。膜又は細胞表面、特に生きている細胞への標識抗体の細胞表面結合を伴う用途では、標識は、(iii) 有効なコンジュゲート濃度と検出感度が達成されるように良好な水溶性であり、(iv) 細胞の正常な代謝過程が破壊されないか、又は早期に細胞死を引き起こさないように生きている細胞に対して毒性がないことが好ましい。
【００４０】
細胞性蛍光強度の直接の定量化と蛍光標識事象、例えば、ペプチド-色素コンジュゲートの細胞表面結合の算出は、生きている細胞又はビーズによる非放射性アッセイである、混合と読み取り(mix-and-read)を自動化するシステム(ＦＭＡＴ(登録商標) ８１００ ＨＴＳシステム、Applied Biosystems, Foster City, Calif.)で実施してもよい(Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204)。また、標識抗体の使用には、細胞表面レセプター結合アッセイ、イムノキャプチャアッセイ、蛍光結合免疫吸着アッセイ(ＦＬＩＳＡ)、カスパーゼ切断(Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23；米国特許第６３７２９０７号)、アポトーシス(Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51)及び細胞障害性アッセイが含まれる。蛍光定量的マイクロ体積アッセイ技術を用いて、細胞表面を標識とする分子によって上方制御又は下方制御を同定することができる(Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51)。
【００４１】
本発明の標識抗体は、様々な方法及び以下のような生医学的かつ分子的撮像法の技術によってバイオマーカーやプローブを造影する際に有用である。(i) ＭＲＩ(磁気共鳴画像法)、(ii) ＭｉｃｒｏＣＴ(コンピューター断層撮影法)、(iii) ＳＰＥＣＴ(単一光子放射型コンピュータ断層撮影法)、(iv) ＰＥＴ(ポジトロン放出断層撮影) Chen等 (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49、(v) バイオルミネセンス、(vi) 蛍光、及び(vii) 超音波。イムノシンチグラフィは、放射性物質にによって標識された抗体が動物又はヒト患者に投与される造影手順であり、画像は抗体が局在する身体の部位のものである(米国特許第６５２８６２４号)。造影バイオマーカーは、客観的に測定され、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、又は治療的介入に対する薬理学的応答の指標として評価されてもよい。バイオマーカーはいくつかの種類がある。タイプ０は、疾患の自然な成長マーカーであって、公知の臨床指標、例えば関節リウマチの滑液炎症のＭＲＩ評価と縦方向に相関する。タイプＩマーカーは、例えばメカニズムが臨床転帰と関係していなくても、作用のメカニズム(mechanism-of-action)の関係として介入の効果を捕らえる。タイプＩＩマーカーは代理のエンドポイントとして機能するものであり、該バイオマーカーの変化又は該バイオマーカーのシグナルから、関節リウマチの骨浸食をＣＴで測定するなどの目的の応答を「有効と認める」ために臨床的な利点を予測する。したがって、造影バイオマーカーは、(i) 標的タンパク質の発現、(ii) 標的タンパク質に対する治療用の結合、すなわち選択性、及び(iii) クリアランス及び半減期の薬物動態学的データについての薬物動態学的(ＰＤ)治療的情報を提供しうる。研究室ベースのバイオマーカーと比較したときのインビボ造影バイオマーカーの利点には、非侵襲性処置、定量化できる、全身評価、反復性投与及び評価、すなわち複数の時点の投与と評価、及び臨床前(小動物)の結果を臨床(ヒト)の結果に潜在的に置き換えることができる結果が含まれる。用途によっては、バイオイメージングは、前臨床研究の多くの動物実験の代替となるか又は最小化する。
【００４２】
ペプチド標識方法は周知である。Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2；Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Glazer等 (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York；Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York；Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York；及びWong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.)；De Leon-Rodriguez等 (2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155；Lewis等 (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324；Li等 (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115；Mier等 (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237を参照。
十分近接した蛍光レポーターとクエンチャーの２つの成分にて標識されたペプチドとタンパク質は、蛍光共鳴エネルギー転移(ＦＲＥＴ)を受ける。レポーター基は、一般的に、特定の波長で光に励起され、エネルギーをアクセプター又はクエンチャーに転移して、その結果、最大の明るさで発光するための適切なストークスシフトが生じる蛍光色素である。蛍光色素には、広範な芳香族性を有する分子、例としてフルオレセイン及びローダミン、ないしこれらの誘導体が含まれる。蛍光レポーターは、完全なペプチドのクエンチャー成分によって部分的あるいは有意に失活されうる。ペプチダーゼ又はプロテアーゼによるペプチドの切断時に、蛍光の検出可能な増加が測定されうる(Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34)。
【００４３】
また、本発明の標識抗体は親和性精製剤として用いられてもよい。この方法では、標識抗体は、当分野で公知の方法を用いて、セファデックス樹脂又は濾紙などの固相に固定される。固定された抗体は、精製される抗原を含む試料と接触させ、その後、支持体を、精製される抗原以外の試料中の実質的にすべての物質を取り除く適切な溶媒にて洗浄し、固定されたポリペプチド変異体に結合させる。最後に、抗原をポリペプチド変異体から放すように、支持体を他の適切な溶媒、例えばグリシンバッファ、ｐＨ５．０にて洗浄する。
標識化試薬は、一般的に、(i) 標識抗体を形成するためにシステイン改変抗体のシステインチオールと直接、(ii) リンカー-標識中間生成物を形成するためにリンカー試薬と、又は(iii) 標識抗体を形成するためにリンカー抗体と、反応しうる反応官能基を保持する。標識試薬の反応性官能基には、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル(例えば、ＮＨＳ、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド)、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、２,６-ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、及びホスホラミダイトが含まれるが、他の官能基も用いられてよい。
【００４４】
例示的な反応性官能基は、検出可能な標識、例えばビオチンや蛍光色素のカルボキシル置換基のＮ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(ＮＨＳ)である。標識のＮＨＳエステルを予め造っても、単離しても、及び／又は特徴付けてもよく、あるいはインサイツで形成して、抗体の求核基と反応させてもよい。典型的には、標識のカルボキシル型を、カルボジイミド試薬、例としてジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、又はユーロニウム試薬、例としてＴＳＴＵ (Ｏ-(Ｎ-スクシンイミジル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルユーロニウム テトラフルオロボレート)、ＨＢＴＵ (Ｏ-ベンゾトリアゾール-１-イル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルユーロニウム ヘキサフルオロホスフェート)、又はＨＡＴＵ (Ｏ-(７-アザベンゾトリアゾール-１-イル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルユーロニウム ヘキサフルオロホスフェート)、標識のＮＨＳエステルを与えるためのアクチベーター、例えば１-ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢｔ)、及びＮ-ヒドロキシスクシンイミドのいくつかの組み合わせと反応させることによって活性化する。場合によって、標識のインサイツ活性化と抗体との反応によって標識と抗体をカップリングさせて、一工程で標識-抗体複合体を形成させてもよい。他の活性化試薬及びカップリング試薬には、ＴＢＴＵ (２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾ-１-イル)-１-１,３,３-テトラメチルユーロニウム ヘキサフルオロホスフェート)、ＴＦＦＨ (Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-テトラメチルユーロニウム ２-フルオロ-ヘキサフルオロホスフェート)、ＰｙＢＯＰ (ベンゾトリアゾール-１-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート、ＥＥＤＱ (２-エトキシ-１-エトキシカルボニル-１,２-ジヒドロ-キノリン)、ＤＣＣ (ジシクロヘキシルカルボジイミド)；ＤＩＰＣＤＩ (ジイソプロピルカルボジイミド)、ＭＳＮＴ (１-(メシチレン-２-スルホニル)-３-ニトロ-１Ｈ-１,２,４-トリアゾール、及びアリール スルホニル ハロゲン化物、例えばトリイソプロピルベンゼンスルホニル クロライドが含まれる。
【００４５】
本発明のアルブミン結合ペプチド-Ｆａｂ化合物：
一態様では、本発明の抗体はアルブミン結合タンパク質に融合される。血漿タンパク質結合は、生存が短い分子の薬物動態学的性質を向上させる有効な手段となりうる。アルブミンは血漿中で最も多いタンパク質である。血清アルブミン結合ペプチド類(ＡＢＰ)は、組織取り込み、浸透及び拡散の変更を含む、融合した活性なドメインタンパク質の薬物動態を変えうる。これらの薬物動態学的パラメータは、適切な血清アルブミン結合ペプチド配列を特異的に選別することによって調製されうる(米国特許公開２００４０００１８２７)。一連のアルブミン結合ペプチドは、ファージディスプレイスクリーニングによって同定された(Dennis等 (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043；国際公開第０１／４５７４６号)。本発明の化合物には、(i) Dennis等 (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 at Tables III and IV, page 35038、(ii) 米国特許公開２００４０００１８２７の[００７６] 配列番号９から２２、及び(iii) 国際公開第０１／４５７４６号の１２〜１３頁に示されるＡＢＰ配列が含まれ、これらの文献はすべて出典明記によって本明細書中に援用される。アルブミン結合(ＡＢＰ)-Ｆａｂは、１：１の化学量比(１ＡＢＰ／１Ｆａｂ)で、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にアルブミン結合ペプチドを融合させることによって作製した。アルブミンとのこれらＡＢＰ-Ｆａｂの会合により、抗体の半減期がウサギ及びマウスの２５倍以上に増加したことが示された。したがって、上記の反応性のＣｙｓ残基をこれらＡＢＰ-Ｆａｂに導入し、細胞障害性剤と部位特異的にコンジュゲートさせた後にインビボ動物実験に用いることができる。
例示的なアルブミン結合ペプチド配列には、以下に列挙する配列番号５２から５６のアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
ＣＤＫＴＨＴＧＧＧＳＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ      配列番号：５２
ＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ          配列番号：５３
ＱＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ          配列番号：５４
ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ            配列番号：５５
ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ                  配列番号：５６
【００４６】
抗体−薬剤コンジュゲート
他の態様では、本発明は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む、抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)を提供する。他の態様では、本発明はさらに、イムノコンジュゲートの使用方法を提供する。一態様では、イムノコンジュゲートは、細胞障害性剤又は検出可能な薬剤に共有結合して付着した前記いずれかの抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体を含む。
【００４７】
一実施態様では、本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体は、他の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、他のＴＡＨＯ抗体によって結合されるヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、ＴＡＨＯポリペプチド上の同じエピトープと結合する。他の実施態様では、本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体は、Rosewell Park Cancer Institute(Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993))から得たハイブリドーマから生成したＳＮ８モノクローナル抗体、配列番号：１０（図１０）及び配列番号：１２（図１２）の可変ドメインを含むモノクローナル抗体又はRosewell Park Cancer Institute(Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993))から得たハイブリドーマから生成した何れかの抗体の可変ドメイン及びＩｇＧ１からの不変ドメインを含むキメラ抗体、又は、配列番号：１０（図１０）及び配列番号：１１（図２）の配列を含むモノクローナル抗体の可変ドメインのＦａｂ断片によって結合されるヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、ＴＡＨＯポリペプチド上の同じエピトープに結合する。他の実施態様では、本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体は、他のＴＡＨＯ抗体(すなわち、ＣＢ３.１(BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA)、ＡＴ１０５-１(AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC)、ＡＴ１０７-２(AbD Serotec Catalog #MCA2209)、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体(BD Biosciences Catalog #557592; San Jose, CA))によって結合されるヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、ＴＡＨＯポリペプチド上の同じエピトープに結合する。
【００４８】
他の実施態様では、本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体は、他の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、他のＴＡＨＯ抗体によって結合されるエピトープとは異なる、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、ＴＡＨＯポリペプチド上のエピトープと結合する。他の実施態様では、本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体は、Rosewell Park Cancer Institute(Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993))から得たハイブリドーマから生成したＳＮ８モノクローナル抗体、配列番号：１０（図１０）及び配列番号：１２（図１２）の可変ドメインを含むモノクローナル抗体又はRosewell Park Cancer Institute(Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993))から得たハイブリドーマから生成した何れかの抗体の可変ドメイン及びＩｇＧ１からの不変ドメインを含むキメラ抗体、又は、配列番号：１０（図１０）及び配列番号：１２（図１２）の配列を含むモノクローナル抗体の可変ドメインのＦａｂ断片によって結合されるエピトープとは異なる、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、ＴＡＨＯポリペプチド上の同じエピトープに結合する。他の実施態様では、本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体は、他のＴＡＨＯ抗体(すなわち、ＣＢ３.１(BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA)、ＡＴ１０５-１(AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC)、ＡＴ１０７-２(AbD Serotec Catalog #MCA2209)、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体(BD Biosciences Catalog #557592; San Jose, CA))によって結合されるヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、ＴＡＨＯポリペプチド上の同じエピトープに結合する。
【００４９】
他の実施態様では、本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体は、Rosewell Park Cancer Institute(Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993))から得たハイブリドーマから生成したＳＮ８モノクローナル抗体、配列番号：１０（図１０）及び配列番号：１２（図１２）の可変ドメインを含むモノクローナル抗体又はRosewell Park Cancer Institute(Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993))から得たハイブリドーマから生成した何れかの抗体の可変ドメイン及びＩｇＧ１からの不変ドメインを含むキメラ抗体、又は、配列番号：１０（図１０）及び配列番号：１２（図１２）の配列を含むモノクローナル抗体の可変ドメインのＦａｂ断片とは異なる（すなわち、それではない）。他の実施態様では、本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体は、他のＴＡＨＯ抗体(すなわち、ＣＢ３.１(BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA)、ＡＴ１０５-１(AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC)、ＡＴ１０７-２(AbD Serotec Catalog #MCA2209)、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体(BD Biosciences Catalog #557592; San Jose, CA))のＦａｂ断片とは異なる（すなわち、それではない）。
【００５０】
一実施態様では、本発明の抗体は、第一動物種のＣＤ７９ｂに特異的に結合し、第二動物種のＣＤ７９ｂには特異的に結合しない。一実施態様では、第一動物種はヒト及び／又は霊長類(例えばカニクイザル)であり、第二動物種はマウス(例えばマウス)及び／又はイヌである。一実施態様では、第一動物種はヒトである。一実施態様では、第一動物種は霊長類、例えばカニクイザルである。一実施態様では、第二動物種はマウス、例えばマウスである。一実施態様では、第二動物種はイヌである。
【００５１】
本発明の他の実施態様では、本発明はここで開示されている、システイン改変抗体を含む、抗体の何れかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例を挙げると、この宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であり得る。ここに記載されている抗体の製造方法が更に提供され、所望する抗体の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養物からその所望する抗体を回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、上記の又は下記のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチドの何れかに、好ましくは特異的に、結合するオリゴペプチド（「ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）結合オリゴペプチド」又は「カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合オリゴペプチド」のような、「ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド」）を提供する。場合によっては、本発明のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）結合オリゴペプチド又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合オリゴペプチドのような、ＴＡＨＯ結合ポリペプチドは、例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等とコンジュゲートされうる。本発明のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）結合オリゴペプチド又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合オリゴペプチドのような、ＴＡＨＯ結合ポリペプチドは、場合によってはＣＨＯ細胞又は細菌細胞中で産生され、好ましくは、それが結合する細胞の死を誘導する。検出のために、本発明のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）結合オリゴペプチド又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合オリゴペプチドのような、ＴＡＨＯ結合ポリペプチドは、検出可能に標識されたり、固体支持体等に付着させられたりする。
本発明の他の実施態様では、本発明は、ここで記載されているヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合オリゴペプチドのような、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチドの何れかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母菌であり得る。ここに記載されているヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合オリゴペプチドのような、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチドの任意のものを製造する方法が更に提供され、所望するオリゴペプチドの発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養からその所望するオリゴペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、上記の又は下記のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチドの何れかに、好ましくは特異的に、結合する小有機分子（「ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）結合有機分子」又は「カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合有機分子」のような、「ＴＡＨＯ結合有機分子」）を提供する。場合によっては、本発明のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合有機分子のような、ＴＡＨＯ結合有機分子は、例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシンを含む毒素のような成長阻害剤又は細胞障害性剤、抗生物質、放射性同位体、核溶解性酵素等とコンジュゲートし得る。本発明のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合有機分子のような、ＴＡＨＯ結合有機分子は、好ましくは、それが結合する細胞の死を誘導する。検出のために、本発明のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合有機分子のような、ＴＡＨＯ結合有機分子は、検出可能に標識したり、固体支持体等に付着したりできる。
【００５２】
より更なる実施態様では、本発明は、担体と組み合わされて、ここに記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチド、ここに記載のキメラヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、キメラＴＡＨＯポリペプチド、ここに記載の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体、ここに記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合オリゴペプチドのような、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド、又はここに記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合有機分子のような、ＴＡＨＯ結合有機分子を含有する組成物に関する。場合によっては、この担体は薬学的に受容可能な担体である。
更に他の実施態様では、本発明は、容器及び容器内に収容された組成物を含む製造品に関し、その組成物には、ここに記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチド、ここに記載のキメラヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、キメラＴＡＨＯポリペプチド、ここに記載の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体、ここに記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合オリゴペプチドのような、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド、又はここに記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合有機分子のような、ＴＡＨＯ結合有機分子が含まれ得る。製造品は、更に場合によっては、治療的処置のためのこの組成物の使用に言及する、容器に添付したラベル、又は容器内に含まれるパッケージ挿入物を含みうる。
一態様では、本発明は、１以上の本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体を含む組成物を含む第１の容器とバッファを含む第２の容器を含むキットを提供する。一実施態様では、バッファは薬学的に許容可能である。一実施態様では、アンタゴニスト抗体を含む組成物は担体を更に含み、ある実施態様では、薬学的に許容可能なものである。一実施態様では、キットは、被検体への組成物(例えば抗体)の投与についての指示を更に含む。
【００５３】
本発明の他の実施態様は、ここに記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び／又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチド、ここに記載のキメラヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、キメラＴＡＨＯポリペプチド、ここに記載の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体、ここに記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合オリゴペプチドのような、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド、又はここに記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合有機分子のような、ＴＡＨＯ結合有機分子に反応する症状の治療に有用な医薬の調製のための、ここに記載のヒトＣＤ７９ポリペプチドのような、ＴＡＨＯポリペプチド、ここに記載のキメラヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ポリペプチドのような、キメラＴＡＨＯポリペプチド、ここに記載の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、抗ＴＡＨＯ抗体、ここに記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合オリゴペプチドのような、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド、又はここに記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）結合有機分子のような、ＴＡＨＯ結合有機分子の使用に関する。
【００５４】
一態様では、本発明は、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のような、ＴＡＨＯ抗体の使用を提供する。一実施態様では、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、進行性ＮＨＬ、再発性進行性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫から選択される。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の核酸の使用を提供する。一実施態様では、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、進行性ＮＨＬ、再発性進行性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫から選択される。
【００５５】
一態様では、本発明は、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の発現ベクターの使用を提供する。一実施態様では、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、進行性ＮＨＬ、再発性進行性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫から選択される。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の宿主細胞の使用を提供する。一実施態様では、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、進行性ＮＨＬ、再発性進行性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫から選択される。 
【００５６】
一態様では、本発明は、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の製造品の使用を提供する。一実施態様では、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、進行性ＮＨＬ、再発性進行性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫から選択される。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明のキットの使用を提供する。一実施態様では、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、進行性ＮＨＬ、再発性進行性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫から選択される。
【００５７】
一態様では、本発明は、任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドを発現する細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞を本発明の抗体と接触させることを含み、これによって該細胞の増殖の阻害が生じる方法を提供する。一実施態様では、抗体は細胞障害性剤にコンジュゲートされる。一実施態様では、抗体は増殖阻害性剤にコンジュゲートされる。
一態様では、本発明は、任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドを発現する細胞を含む癌性の腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、該哺乳動物に本発明の抗体の治療上有効量を投与することを含み、それによって、該哺乳動物を効果的に処置される方法を提供する。一実施態様では、抗体は細胞障害性剤にコンジュゲートされる。一実施態様では、抗体は増殖阻害性剤にコンジュゲートされる。
一態様では、本発明は、任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドの発現増加と関連する細胞増殖性疾患の治療又は予防方法であって、本発明の抗体の有効量を該処置が必要な被検体に投与することを含み、これによって該細胞増殖性疾患が効果的に治療又は予防される方法を提供する。一実施態様では、前記増殖性疾患は癌である。一実施態様では、抗体は細胞障害性剤にコンジュゲートされる。一実施態様では、抗体は増殖阻害性剤にコンジュゲートされる。
【００５８】
一態様では、本発明は、細胞の増殖の阻害方法であって、この細胞の増殖の少なくとも一部は任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドの増殖亢進作用に依存しているものであり、該細胞を有効量の本発明の抗体と接触させることを含み、これによって該細胞の増殖が阻害される方法を提供する。一実施態様では、抗体は細胞障害性剤にコンジュゲートされる。一実施態様では、抗体は増殖阻害性剤にコンジュゲートされる。
一態様では、本発明は、哺乳動物の腫瘍を治療的に処置する方法であって、この腫瘍の増殖の少なくとも一部は任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドの増殖亢進作用に依存しているものであり、該細胞を有効量の本発明の抗体と接触させることを含み、これによって該腫瘍が効果的に処置される方法を提供する。一実施態様では、抗体は細胞障害性剤にコンジュゲートされる。一実施態様では、抗体は増殖阻害性剤にコンジュゲートされる。
【００５９】
一態様では、本発明は、本明細書中に記載のイムノコンジュゲート、薬学的に許容可能な希釈液、担体又は賦形剤を含有する薬学的製剤を患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。一実施態様では、癌は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、進行性ＮＨＬ、再発性進行性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫から選択される。一実施態様では、患者は、抗体−薬剤コンジュゲート化合物と組み合わせた細胞障害性剤が投与される。
一態様では、本発明は、Ｂ細胞増殖の阻害方法であって、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドに対するイムノコンジュゲートの結合に許容される条件下で本発明の抗体を含むイムノコンジュゲートに細胞をさらすことを含む方法を提供する。一実施態様では、Ｂ細胞増殖は、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、進行性ＮＨＬ、再発性進行性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫から選択される。一実施態様では、Ｂ細胞は異種移植片である。一実施態様では、曝露はインビトロで行う。一実施態様では、曝露はインビボで行う。
【００６０】
一態様では、本発明は、任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドを含有することが疑われる試料において任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドの存在を決定する方法であって、該試料を本発明の抗体にさらし、該試料において任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドに対する該抗体の結合を決定することを含み、このとき該試料における任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドへの該抗体の結合が該試料における該タンパク質の存在を表す方法を提供する。一実施態様では、試料は生体試料である。さらなる実施態様では、生体試料はＢ細胞を含む。一実施態様では、生体試料は、限定するものではないが、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、進行性ＮＨＬ、再発性進行性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫を含む、Ｂ細胞疾患及び／又はＢ細胞増殖性疾患に罹患しているか、又は罹患することが疑われる哺乳動物から得る。
一態様では、本発明は、任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドを発現する、Ｂ細胞などの細胞の増加と関連する細胞増殖性疾患の診断方法であって、生体試料中の試験細胞を上記いずれかの抗体と接触させ、任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドに対する抗体の結合を検出することによって、試料において試験細胞に結合した抗体のレベルを決定し、そして、コントロール試料において細胞に結合した抗体のレベルを比較することを含み、このとき、結合した抗体のレベルが試験試料及びコントロール試料における任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）発現細胞のような、ＴＡＨＯ発現細胞の数に正規化され、コントロール試料と比較して試験試料において結合した抗体のレベルが高い場合に、任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドを発現する細胞と関連する細胞増殖性疾患の存在を示す方法を提供する。
【００６１】
一態様では、本発明は、血液又は血清における可溶性の任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドの検出方法であって、Ｂ細胞増殖性疾患の発症の疑いのある哺乳動物からの血液又は血清の試験試料を本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体を含む、抗ＴＡＨＯ抗体と接触させ、正常な哺乳動物からの血液又は血清のコントロール試料と比較して試験試料における可溶性の任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドの増加を検出することを含む方法を提供する。ある実施態様では、検出方法は、哺乳動物の血液又は血清中の可溶性の任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドの増加と関係しているＢ細胞増殖性疾患を診断する方法として有用である。
一態様では、任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドを発現する細胞への本発明の抗体の結合方法であって、本発明の抗体と該細胞を接触させることを含む。一実施態様では、抗体は細胞障害性剤にコンジュゲートされる。一実施態様では、抗体は増殖阻害性剤にコンジュゲートされる。
【００６２】
本発明の方法は、任意の好適な病理学的状態、例えば任意の上又は下に記載のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドの発現と関連する細胞及び／又は組織に作用するために用いられうる。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は、造血性細胞である。例えば、造血性細胞は、リンパ球、白血球、血小板、赤血球及びナチュラルキラー細胞からなる群から選択されるものであってもよい。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は、Ｂ細胞又はＴ細胞である。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は、癌細胞である。例えば、癌細胞は、リンパ腫細胞、白血病細胞又は骨髄腫細胞からなる群から選択されるものであってもよい。
本発明の方法は、更なる処理工程を更に含んでもよい。例えば、一実施態様では、方法はさらに、標的とされる細胞及び／又は組織(例えば癌細胞)が放射線治療又は化学療法剤にさらされる工程を含む。
【００６３】
本明細書において記述されるように、ＣＤ７９ｂはＢ細胞レセプターのシグナル伝達構成成分である。したがって、本発明の方法のある実施態様では、標的とされる細胞(例えば癌細胞)は、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドを発現しない細胞と比較して、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチドが発現されるものである。更なる実施態様では、標的とされる細胞は、同じ組織タイプの正常な非癌細胞と比較してヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯポリペプチド発現が亢進されている癌細胞である。一実施態様では、本発明の方法によって、標的とされる細胞の死が生じる。
本発明の他の態様は、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）を含む抗ＴＡＨＯポリペプチド抗体に応答する症状の治療に有用な医薬の調製のための、本明細書中に記載の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）を含む抗ＴＡＨＯポリペプチド抗体の使用に関する。
本発明の他の態様は、癌性腫瘍を有する哺乳類の治療の安全性を試験するための、ここに記載の、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体若しくはシステイン改変抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体、又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体若しくはシステイン改変抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体を含むＡＤＣの使用法を提供し、ここで、前記治療は、ここに記載の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体若しくはシステイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体、又は抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体若しくはシステイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体を含む。
本発明の他の態様は、抗体当たりの平均薬剤負荷がおよそ２からおよそ５、又はおよそ３からおよそ４である式Ｉの抗体−薬剤化合物の混合物を含む組成物である。
【００６４】
本発明の他の態様は、式Ｉ ＡＤＣ化合物を含む薬学的組成物、式Ｉ ＡＤＣ化合物、又はその薬学的に許容可能な塩ないしは溶媒和化合物と薬学的に許容可能な希釈液、担体ないしは賦形剤の混合物である。
他の態様は、式Ｉ ＡＤＣ化合物と、抗癌性質又は他の治療効果を有する第二化合物とを含む薬学的組合せを提供する。
他の態様は、腫瘍細胞又は癌細胞の増殖を殺傷又は阻害するための方法であって、腫瘍細胞又は癌細胞の増殖を殺傷するか又は阻害するために有効である、式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲート、又はその薬学的に許容可能な塩ないしは溶媒和化合物の有効量にて該細胞を処理することを含む方法である。
【００６５】
他の態様は、癌の治療方法であって、式Ｉ ＡＤＣを含む薬学的組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む方法である。
他の態様には、抗体−薬剤コンジュゲート、容器、及び処置を示唆するパッケージ挿入物又はラベルを具備する製造品、すなわちキットが包含される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ＴＡＨＯ４（ＰＲＯ３６２４８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示し、配列番号１は、本明細書において「ＤＮＡ２２５７８５」（「ＣＤ７９ａ」とも呼ぶ）と命名するクローンである。ヌクレオチド配列はＣＤ７９ｂをコードし、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図２】図１に示される配列番号７のコード配列に由来するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】ＴＡＨＯ５（ＰＲＯ３６２４９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を示し、配列番号３は、本明細書において「ＤＮＡ２２５７８６」（「ＣＤ７９ｂ」とも呼ぶ）と命名するクローンである。ヌクレオチド配列はＣＤ７９ｂをコードし、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図４】図３に示される配列番号３のコード配列に由来するアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】ＴＡＨＯ３９（ＰＲＯ２８３６２６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５）を示し、配列番号５は、本明細書において「ＤＮＡ５４８４５４」（「ｃｙｎｏＣＤ７９ａ」又は「カニクイザルＣＤ７９ａ」とも呼ぶ）と命名するクローンである。ヌクレオチド配列はＣＤ７９ａをコードし、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図６】図５に示される配列番号６のコード配列に由来するアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図７】ＴＡＨＯ４０（ＰＲＯ２８３６２７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７）を示し、配列番号７は、本明細書において「ＤＮＡ５４８４５５」（「ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ」又は「カニクイザルＣＤ７９ｂ」とも呼ぶ）と命名するクローンである。ヌクレオチド配列はＣＤ７９ａをコードし、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図８】図７に示される配列番号７のコード配列に由来するアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図９】キメラＳＮ８ＩｇＧ１(抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ｃｈＳＮ８）)の軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号：９)を示す。ヌクレオチド配列は、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ｃｈＳＮ８）の軽鎖をコードし、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図１０】図９に示される配列番号：９のコード配列から得られるアミノ酸配列(配列番号：１０)を示す(初めの１８のアミノ酸シグナル配列を欠く)。可変領域は下線を付していない領域である。
【図１１】キメラＳＮ８ＩｇＧ１(抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ｃｈＳＮ８）)の重鎖のヌクレオチド配列(配列番号：２４２)を示す。ヌクレオチド配列は、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ｃｈＳＮ８）の重鎖をコードし、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図１２】図１１に示される配列番号：１１のコード配列から得られるアミノ酸配列(配列番号：１２)を示す(初めの１８のアミノ酸シグナル配列と停止コドン前の最後のリジン(Ｋ)を欠く)。可変領域は下線を付していない領域である。
【図１３】ヒト(配列番号：４)、カニクイザル(ｃｙｎｏ)(配列番号：８)及びマウス(配列番号：１３)からのＣＤ７９ｂのアミノ酸配列のアラインメントを示す。ヒト及びｃｙｎｏ-ＣＤ７９ｂは８５％のアミノ酸同一性を有する。シグナル配列、試験ペプチド(実施例９に記載の１１のアミノ酸ペプチド)、膜貫通(ＴＭ)ドメイン及びイムノレセプターチロシンベースの活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)ドメインを示す。囲みで示す領域は、ＣＤ７９ｂのスプライス変異体には存在しないＣＤ７９ｂの領域である(実施例９に記載)。
【図１４】正常な試料及び患部試料におけるＴＡＨＯ４の発現、例えば、ＮＨＬ試料及び多発性骨髄腫（ＭＭ）、正常な小脳及び正常な血液における有意な発現を示しているマイクロアレイデータを示す。図中使用される省略形は、以下の通りである：非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、正常なリンパ節（ＮＬＮ）、正常なＢ細胞（ＮＢ）、多発性骨髄腫細胞（ＭＭ）、小腸（ｓ．ｉｎｔｅｓｉｎｅ）、胎児の肝臓（ｆ．ｌｉｖｅｒ）ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球（N'phil）、樹状細胞（ＤＣ）、記憶Ｂ細胞（ｍｅｍ  Ｂ）、プラズマ細胞（ＰＣ）、骨髄プラズマ細胞（ＢＭ  ＰＣ）。
【図１５】正常な試料及び患部試料におけるＴＡＨＯ５の発現、例えばＮＨＬ試料における有意な発現を示しているマイクロアレイデータを示す。図中使用される省略形は、以下の通りである：非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、正常なリンパ節（ＮＬＮ）、正常なＢ細胞（ＮＢ）、多発性骨髄腫細胞（ＭＭ）、小腸（ｓ．ｉｎｔｅｓｉｎｅ）、胎児の肝臓（ｆ．ｌｉｖｅｒ）ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球（N'phil）、樹状細胞（ＤＣ）、記憶Ｂ細胞（ｍｅｍ  Ｂ）、プラズマ細胞（ＰＣ）、骨髄プラズマ細胞（ＢＭ  ＰＣ）。
【図１６】抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ｃｈ２Ｆ２）の軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号：３２)を示す。抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ｃｈ２Ｆ２）をコードするヌクレオチド配列は、図１７に示す。
【図１７】図１６に示される配列番号：３２のコード配列から得られるアミノ酸配列(配列番号：３３)を示す。可変領域は下線を付していない領域である。
【図１８】抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ｃｈＦ２）の重鎖のヌクレオチド配列(配列番号：３４)を示す。抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（２Ｆ２）をコードするヌクレオチド配列は、図１９に示す。
【図１９】図１８に示される配列番号：３４のコード配列から得られるアミノ酸配列(配列番号：３５)を示す(停止コドン前の最後のリジン(Ｋ)を欠く)。可変領域は下線を付していない領域である。
【図２０】抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（ｃｈ１０ｄ１０）の軽鎖のヌクレオチド配列(配列番号：４０)を示す。ヌクレオチド配列は、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（ｃｈ１０ｄ１０）の軽鎖をコードし、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図２１】図２０に示される配列番号：４０のコード配列から得られるアミノ酸配列(配列番号：４１)を示す(初めの１８のアミノ酸シグナル配列を欠く)。可変領域は下線を付していない領域である。
【図２２】抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（ｃｈ１０ｄ１０）の重鎖のヌクレオチド配列(配列番号：２４２)を示す。ヌクレオチド配列は、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（ｃｈ１０ｄ１０）の重鎖をコードし、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図２３】図２２に示される配列番号：４２のコード配列から得られるアミノ酸配列(配列番号：４３)を示す(初めの１８のアミノ酸シグナル配列と停止コドン前の最後のリジン(Ｋ)を欠く)。可変領域は下線を付していない領域である。
【図２４】実施例９に記載のイムノグロブリン軽鎖を発現するためのプラスミドｐＤＲ１（配列番号：４８；５３９１ｂｐ）の配列を示す。ｐＤＲ１は、無関係抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体（Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)）の軽鎖をコードする配列を含み、、開始及び停止コドンを太字及び下線で示す。
【図２５】実施例９に記載のイムノグロブリン軽鎖を発現するためのプラスミドｐＤＲ２（配列番号：４９；６１３５ｂｐ）の配列を示す。ｐＤＲ２は、無関係抗体、ヒト化抗ＣＤ３抗体（Shalaby 等, 上掲）の軽鎖をコードする配列を含み、、開始及び停止コドンを太字及び下線で示す。
【図２６】実施例９（Shields等, J Biol Chem, 276: 6591-6604 (2000)）に記載のイムノグロブリン軽鎖の発現のためのｐＫＬ．ＬＰＧ３ヒトＫａｐｐａ（配列番号：５０）を示す。
【図２７】実施例９（Shields等, J Biol Chem, 276: 6591-6604 (2000)）に記載のイムノグロブリン重鎖の発現のためのｐＫＬ．ＬＰＧ４ヒトＫａｐｐａ（配列番号：５１）を示す。
【図２８】システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)を描写する。ここでは、軽鎖(ＬＣ-ＡＤＣ)；重鎖(ＨＣ-ＡＤＣ)；及びＦｃ領域(Ｆｃ-ＡＤＣ)内の改変システイン基に薬剤成分が付着されている。
【図２９】(i) 還元剤ＴＣＥＰ(トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロライド)による、システイン改変抗ＣＤ７９ｂ抗体(ＴｈｉｏＭａｂ)の鎖内及び鎖間のジスルフィドとシステインジスルフィド付加物を還元する、(ii) ｄｈＡＡ(デヒドロアスコルビン酸)により部分的に酸化させる、すなわち、再酸化させて鎖内及び鎖間のジスルフィドを再形成させる、そして、(iii) 再酸化させた抗体を薬剤−リンカー中間生成物とコンジュゲートさせ、システイン抗ＣＤ７９ｂ薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)を形成させる、という工程を示す。
【図３０】ヒト化システイン改変抗ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体(チオ−ｃｈＳＮ８−ＬＣ−Ｖ２０５Ｃ)の(Ａ)軽鎖配列(配列番号：５８)及び(Ｂ)重鎖配列(配列番号：５７)を示す。ここでは、軽鎖のカバット位置２０５のバリン(連続的な位置バリン２０８）はシステインに変えられている。薬剤成分は、重鎖の改変されたシステイン基に付着されてもよい。各々の図において、変えられたアミノ酸は、二重下線と共に太字で示す。一重下線は定常領域を示す。可変領域は下線を付していない領域である。Ｆｃ領域は斜体で示す。「Ｔｈｉｏ」はシステイン改変抗体を指す。
【図３１】ヒト化システイン改変抗ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体(チオ−ｃｈＳＮ８-ＨＣ-Ａ１１８Ｃ)の(Ａ)軽鎖配列(配列番号：６０)及び(Ｂ)重鎖配列(配列番号：５９)を示す。ここでは、重鎖のＥｕ位置１１８のアラニン(連続的な位置アラニン１１８；カバット位置１１４)はシステインに変えられている。薬剤成分は、重鎖の改変されたシステイン基に付着されてもよい。各々の図において、変えられたアミノ酸は、二重下線と共に太字で示す。一重下線は定常領域を示す。可変領域は下線を付していない領域である。Ｆｃ領域は斜体で示す。「Ｔｈｉｏ」はシステイン改変抗体を指す。
【図３２】ＦＡＣＳプロットは、ＢＪＡＢ-ルシフェラーゼ細胞の表面に発現されるＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）に対する本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５） チオＭＡｂ薬剤コンジュゲート(ＴＤＣ)の結合が、コンジュゲートされたＭＭＡＦを有するｃｈＭＡ７９ｂの(Ａ) ＬＣ(Ｖ２０５Ｃ) チオＭＡｂ変異体及び(Ｂ) ＭＭＡＦを用いたｃｈＳＮ８のＨＣ(Ａ１１８Ｃ) チオＭＡｂ変異体と同程度であることを示す。ＭＳ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥにより検出した。「Ｔｈｉｏ」はシステイン改変抗体を指す。
【図３３】ＦＡＣＳプロットは、ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）を発現するＢＪＡＢ-細胞の表面に発現されるＣＤ７９ｂに対する本発明の抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０） チオＭＡｂ薬剤コンジュゲート(ＴＤＣ)の結合が、(Ａ)抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)のネイキッド(コンジュゲートされていない)ＨＣ (Ａ１１８Ｃ) チオＭＡｂ変異体、及び示される異なる薬剤コンジュゲート((Ｂ) ＭＭＡＥ、(Ｃ) ＤＭ１及び(Ｄ) ＭＭＡＦ)を有する抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)のコンジュゲートされたＨＣ (Ａ１１８Ｃ) チオＭＡｂ変異体と同程度であることを示す。ＭＳ抗ｈｕＩｇＧ−ＰＥにより検出した。「Ｔｈｉｏ」はシステイン改変抗体を指す。
【図３４Ａ】Ｇｒａｎｔａ−５１９(ヒトマントル細胞リンパ腫)異種移植片モデルにおけるインビボ腫瘍増殖の阻害のグラフであり、ヒトＢ細胞腫瘍を有するＳＣＩＤマウスに対する、改変したシステインの位置が異なる(ＬＣ(Ｖ２０５Ｃ)又はＨＣ(Ａ１１８Ｃ))及び／又は薬剤用量が異なる抗ＣＤ７９ｂ ＴＤＣの投与が、腫瘍増殖を有意に阻害したことを示す。チオ ｃｈＳＮ８−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ、薬剤負荷はおよそ１．９(表２１)又はチオ ｃｈＳＮ８−ＬＣ(Ｖ２０５Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ、薬剤負荷はおよそ１．８(表２１)にて処置した異種移植片モデルは、試験の間、腫瘍増殖の有意な阻害を示した。コントロールは、ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＭＣ−ＭＭＡＦ及びチオ ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ及びｃｈＳＮ８−ＭＣ−ＭＭＡＦを含んだ。
【図３４Ｂ】Ｇｒａｎｔａ−５１９異種移植片試験(図３３Ａ及び表２１)からのマウスの体重変化の割合のプロットである。これは、試験開始の１４日間に体重の有意な変化がなかったことを示す。「Ｔｈｉｏ」はシステイン改変抗体を指し、「ｈｕ」はヒト化抗体を指す。
【図３５】システイン改変抗ｃｙｎｏ ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体(Ｔｈｉｏ−抗ｃｙｎｏ ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）-ＨＣ-Ａ１１８Ｃ)の(Ａ)軽鎖配列(配列番号：６２)及び(Ｂ)重鎖配列(配列番号：６１)を示し、ここでは、重鎖のＥｕ位置１１８のアラニン(連続的な位置アラニン１１８；カバット位置１１４)はシステインに変えられている。あるいは、重鎖のＥＵ位置６のアミノ酸Ｄ(図の影を付した部分)はＥであってもよい。薬剤成分は、重鎖の改変されたシステイン基に付着されてもよい。各々の図において、変えられたアミノ酸は、二重下線と共に太字で示す。一重下線は定常領域を示す。可変領域は下線を付していない領域である。Ｆｃ領域は斜体で示す。「チオ 」はシステイン改変抗体を指す。
【図３６】システイン改変抗ｃｙｎｏ ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体(Ｔｈｉｏ−抗ｃｙｎｏ ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）-ＬＣ-Ｖ２０５Ｃ)の(Ａ)軽鎖配列(配列番号：９６０)及び(Ｂ)重鎖配列(配列番号：９５)を示し、ここでは、軽鎖のカバット位置２０５のバリン(連続的な位置バリン２０８)はシステインに変えられている。あるいは、重鎖のＥＵ位置６のアミノ酸Ｄ(図の影を付した部分)はＥであってもよい。薬剤成分は、重鎖の改変されたシステイン基に付着されてもよい。各々の図において、変えられたアミノ酸は、二重下線と共に太字で示す。一重下線は定常領域を示す。可変領域は下線を付していない領域である。Ｆｃ領域は斜体で示す。「チオ 」はシステイン改変抗体を指す。
【図３７】ＢＪＡＢ−ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ(ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）を発現するＢＪＡＢ細胞)(バーキットリンパ腫)異種移植片モデルにおけるインビボ腫瘍増殖の阻害のグラフであり、これは、ヒトＢ細胞腫瘍を有するＳＣＩＤマウスに対する、異なるリンカー薬剤成分(ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１、ＭＣ-ＭＭＡＦ又はＭＣｖｃＰＡＢ−ＭＭＡＥ)にコンジュゲートさせた抗ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０） ＴＤＣの投与が腫瘍増殖を有意に阻害したことを示す。チオ 抗ｃｙｎｏ ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１、薬剤負荷はおよそ１．８(表２２)、チオ 抗ｃｙｎｏ ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ、薬剤負荷はおよそ１．９(表２２)又はチオ 抗ｃｙｎｏ ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣｖｃＰＡＢ-ＭＭＡＥ、薬剤負荷はおよそ１．８６(表２２)にて処置した異種移植片モデルは、試験の間、腫瘍増殖の有意な阻害を示した。コントロールは、抗ＨＥＲ２コントロール(チオ ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１、チオ ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣｖｃＰＡＢ-ＭＭＡＥ、チオ ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ)を含んだ。「チオ 」はシステイン改変抗体を指し、「ｈｕ」はヒト化抗体を指す。
【図３８】ＢＪＡＢ−ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ(ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）を発現するＢＪＡＢ細胞)(バーキットリンパ腫)異種移植片モデルにおけるインビボ腫瘍増殖の阻害のグラフであり、これは、ヒトＢ細胞腫瘍を有するＳＣＩＤマウスに対する、示されるように異なる用量で投与したＢＭＰＥＯ-ＤＭ１リンカー薬剤成分を有する抗ＣＤ７９ｂ （ＴＡＨＯ４０）ＴＤＣの投与が腫瘍増殖を有意に阻害したことを示す。チオ 抗ｃｙｎｏＣ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１、薬剤負荷はおよそ１．８(表２３)にて処置された異種移植片モデルは、試験の間、腫瘍増殖の有意な阻害を示した。コントロールは、抗ＨＥＲ２コントロール(チオ ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１)及びｈｕＭＡ７９ｂ.ｖ２８コントロール(チオ ｈｕＭＡ７９ｂ.ｖ２８-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)及び抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)コントロール(チオ 抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ))を含む。「チオ 」はシステイン改変抗体を指し、「ｈｕ」はヒト化抗体を指す。（好ましい実施態様の詳細な説明）Ｉ．定義  ここで使用される「ＴＡＨＯポリペプチド」及び「ＴＡＨＯ」という用語は、直後に数値表示がある場合には種々のポリペプチドを指し、完全な表示（つまり、ＴＡＨＯ／数字）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。「数字」という用語がここでは実際の数的表示として提供されている「ＴＡＨＯ／数字ポリペプチド」及び「ＴＡＨＯ／数字」という用語には、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド変異体及び天然配列ポリペプチドとポリペプチド変異体の断片（ここでさらに定義される）を包含する。ここに記載されているＴＡＨＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成法によって調製してもよい。「ＴＡＨＯポリペプチド」という用語は、ここに記載の各個々のＴＡＨＯ／数字ポリペプチドを指す。「ＴＡＨＯポリペプチド」を指すこの明細書の全ての開示は、各ポリペプチドを個々に指すと同時に集合的に指す。例えば、調製、精製、誘導、抗体の形成、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチドの形成、ＴＡＨＯ結合有機分子の形成、投与、含有する組成物、疾患の治療等の記載は、本発明の各ポリペプチドに関している。  「ＴＡＨＯ４」はここで、「ヒトＣＤ７９ａ」とも呼ぶ。「ＴＡＨＯ５」はここで、「ヒトＣＤ７９ｂ」とも呼ぶ。「ＴＡＨＯ３９」はここで、「ｃｙｎｏＣＤ７９ａ」又は「カニクイザルＣＤ７９ａ」とも呼ぶ。「ＴＡＨＯ４０」はここで、「ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ」又は「カニクイザルＣＤ７９ｂ」とも呼ぶ。「カニクイザル」はここで、「ｃｙｎｏ」とも呼ぶ。
【００６７】
特に明記しない限り、本明細書において用いられる「ＣＤ７９ｂ」なる用語は、霊長類(例えばヒト、カニクイザル(ｃｙｎｏ))及び齧歯動物(例えばマウス及びラット)のような哺乳動物を含む任意の脊椎動物供与源からの任意の天然のＣＤ７９ｂに関する。また、ＣＤ７９ｂは、本明細書中で「ＰＲＯ３６２４９」(配列番号：２)と称され、本明細書中で「ＤＮＡ２２５７８６」としても称されるヌクレオチド配列(配列番号：１)によってコードされる。また、カニクイザルＣＤ７９ｂは、本明細書中で「ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ」又は「ＰＲＯ２８３６２７」(配列番号：２３９)と称され、本明細書中で「ＤＮＡ５４８４５５」としても称されるヌクレオチド配列(配列番号：２３８)によってコードされる。「ＣＤ７９ｂ」なる用語は、「完全長」、プロセシングされていないＣＤ７９ｂ、並びに細胞内のプロセシングから生じるＣＤ７９ｂのいずれかの形態を包含する。また、この用語は、ＣＤ７９ｂの天然に生じる変異体、例えばスプライス変異体、対立遺伝子変異体及びアイソフォームを包含する。本明細書において記述されるＣＤ７９ｂポリペプチドは、ヒト組織種ないしは他の供給源のような、様々な供与源から単離されてもよいし、又は組み換え法又は合成法によって調製されてもよい。「天然配列ＴＡＨＯポリペプチド」には、天然由来のＴＡＨＯポリペプチドに対応する同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。このような天然配列ＴＡＨＯポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生成することもできる。「天然配列ＴＡＨＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＴＡＨＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明のある実施態様では、ここに開示される天然配列ＴＡＨＯポリペプチドは、添付図に示される完全長アミノ酸配列を含む成熟又は完全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドン（示されているならば）は、図において太字及び下線で示した。添付図に「Ｎ」で示した核酸残基は、任意の核酸残基である。しかし、添付図に開示したＴＡＨＯポリペプチドは、図面においてアミノ酸位置１としてここに表示されたメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をＴＡＨＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし、可能でもある。
【００６８】
ここで「Ｂ細胞表面上マーカー」又は「Ｂ細胞表面上抗原」とは、Ｂ細胞の表面上に発現する抗原であり、それを結合するアンタゴニスト、例えば限定するものではないが、天然に生じるＢ細胞抗原へのリガンドの結合をアンタゴナイズすることができるＢ細胞表面抗原ないしＢ細胞表面抗原の可溶型に対する抗体の標的となることができるものである。例示的Ｂ細胞表面上マーカーには、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５及びＣＤ８６白血球表面上マーカーが含まれる。(詳しくは、The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, Barclay等編集, Academic Press, Harcourt Brace & Co., New Yorkを参照)。他のＢ細胞表面上マーカーには、ＲＰ１０５、ＦｃＲＨ２、Ｂ細胞ＣＲ２、ＣＣＲ６、Ｐ２Ｘ５、ＨＬＡ-ＤＯＢ、ＣＸＣＲ５、ＦＣＥＲ２、ＢＲ３、ＢＡＦＦ、ＢＬｙＳ、Ｂｔｉｇ、ＮＡＧ１４、ＳＬＧＣ１６２７０、ＦｃＲＨ１、ＩＲＴＡ２、ＡＴＷＤ５７８、ＦｃＲＨ３、ＩＲＴＡ１、ＦｃＲＨ６、ＢＣＭＡ、及び２３９２８７などがある。特に対象とするＢ細胞表面上マーカーは、哺乳動物の他の非Ｂ細胞組織と比較してＢ細胞上に主にに発現しており、Ｂ細胞前駆細胞及び成熟Ｂ細胞の両方の細胞上に発現していてもよい。
【００６９】
ＴＡＨＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＴＡＨＯポリペプチドの形態を意味する。通常、ＴＡＨＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＴＡＨＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインの何れかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。場合によっては、従って、ＴＡＨＯポリペプチドの細胞外ドメインは、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン／細胞外ドメインの境界の何れかの側から約５を越えないアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、それらのポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
【００７０】
ここに開示する種々のＴＡＨＯポリペプチドの「シグナルペプチド」のおおよその位置は、本明細書及び／又は添付図に示されうる。しかし、シグナルペプチドのＣ末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ末端境界の何れかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうることに留意される（例えば、Nielsen等, Prot. Eng.10: 1-6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。更に、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナル配列の切断は完全に均一ではなく、一つ以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに同定されるシグナルペプチドのＣ末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
「ＴＡＨＯポリペプチド変異体」とはＴＡＨＯポリペプチド、好ましくは、ここに開示するような完全長天然配列ＴＡＨＯポリペプチド配列、ここで開示するようなシグナルペプチドを欠くＴＡＨＯポリペプチド配列、ここに開示するようなシグナルペプチドを有する又は有しないＴＡＨＯポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示する完全長ＴＡＨＯポリペプチド配列の任意の他の断片（例えば、完全長ＴＡＨＯポリペプチドの完全なコード配列の一部のみを示す核酸によってコードされるもの）と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するここで定義するような活性なＴＡＨＯポリペプチドを意味する。このようなＴＡＨＯポリペプチド変異体には、例えば、完全長天然アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＴＡＨＯポリペプチドが含まれる。通常、ＴＡＨＯポリペプチド変異体は、ここに開示する完全長天然配列ＴＡＨＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くＴＡＨＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示するＴＡＨＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長ＴＡＨＯポリペプチド配列の任意の具体的に定義した他の断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常、ＴＡＨＯ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００アミノ酸長、又はそれ以上である。場合によっては、ＴＡＨＯ変異体ポリペプチドは、天然ＴＡＨＯポリペプチド配列に比較して一つ以下の保存的アミノ酸置換、あるいは天然ＴＡＨＯポリペプチド配列に比較して２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以下の同類アミノ酸置換を有するにすぎない。
【００７１】
ここで同定したＴＡＨＯポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のＴＡＨＯポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＴＡＨＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「ＴＡＨＯ」は対象の仮想ＴＡＨＯポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は対象の「ＴＡＨＯ」ポリペプチドと比較され、これに対するポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は、それぞれ異なる仮定アミノ酸残基を表す。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて直ぐ上の段落に記載されるようにして得られる。
【００７２】
「ＴＡＨＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＴＡＨＯ変異体核酸配列」とは、ここで定義されるように、ＴＡＨＯポリペプチド、好ましくは活性ＴＡＨＯポリペプチドをコードし、ここに開示する完全長天然配列ＴＡＨＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた完全長天然配列ＴＡＨＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示するＴＡＨＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長ＴＡＨＯポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列（完全長ＴＡＨＯポリペプチドの完全なコード化配列の一部分のみを表す核酸によってコードされた）と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、ＴＡＨＯ変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示する完全長天然配列ＴＡＨＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠く完全長天然配列ＴＡＨＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示するＴＡＨＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する完全長ＴＡＨＯポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常、ＴＡＨＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、表示ヌクレオチド配列長にその表示長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
【００７３】
ここで同定されるＴＡＨＯコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、対象のＴＡＨＯ核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権庁,ワシントン D.C.，20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウスサンフランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、「ＴＡＨＯ-ＤＮＡ」が対象となる仮説的ＴＡＨＯコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象となる「ＴＡＨＯ-ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々が異なった仮想ヌクレオチドを表していて、表４及び５が「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＴＡＨＯ-ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００７４】
他の実施態様では、ＴＡＨＯ変異体ポリヌクレオチドとは、ＴＡＨＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに記載の完全長ＴＡＨＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションすることができる。ＴＡＨＯ変異体ポリペプチドは、ＴＡＨＯ変異体ポリヌクレオチドによってコードされているものであり得る。
ＴＡＨＯポリペプチドをコードする核酸に関して使用される場合の「完全長コード領域」という用語は、（添付図において開始及び停止コドンの間でしばしば示される）本発明の完全長ＴＡＨＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。ＡＴＣＣ寄託核酸に関して使用される場合の「完全長コード領域」という用語は、ＡＴＣＣに寄託されたベクター中に挿入されているｃＤＮＡのＴＡＨＯポリペプチドコード部分を意味する（添付図において開始及び停止コドンの間にしばしば示される。（開始コドンと停止コドンを太字及び下線で示す））。
【００７５】
ここに開示される種々のＴＡＨＯポリペプチドを記載するために使用される「単離」とは、自然環境の成分から同定され及び分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。単離されたポリペプチドには、ＴＡＨＯポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一つの精製工程により調製される。
「単離された」ＴＡＨＯポリペプチドをコードする核酸又は他のポリペプチドコード化核酸は、同定され、ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然の細胞中に存在する特異的なポリペプチドをコードする核酸分子とは区別される。しかし、ポリペプチドをコードする単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常は発現する細胞に含まれるポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。
【００７６】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列と、リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００７７】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience Publishers, 1995）を参照のこと。
ここで定義される「ストリンジェント条件」又は「高度のストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；又は（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液中で終夜ハイブリダイゼーション、４２℃で、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中にて１０分間の洗浄、ついで５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる１０分間高ストリンジェンシー洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記のストリンジェントより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃での終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中にて約３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
【００７８】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」と融合したＴＡＨＯポリペプチド又は抗ＴＡＨＯ抗体を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有し、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜５０のアミノ酸残基(好ましくは、約１０〜２０の残基)を有する。
ここでの目的に対する「活性な」又は「活性」とは、天然又は天然に生じるＴＡＨＯの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＴＡＨＯポリペプチドの形態を意味し、その中で、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＴＡＨＯが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘発する能力以外の、天然又は天然発生ＴＡＨＯによって引き起こされる生物機能（阻害又は刺激）を意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＴＡＨＯが保持する抗原性エピトープに対する抗体の生成を誘発する能力を意味する。
【００７９】
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、そしてここに開示した天然ＴＡＨＯポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和する任意の分子が含まれる。同じように、「アゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＴＡＨＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子が含まれる。適切なアゴニスト又はアンタゴニスト分子には、特にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、断片、又は天然ＴＡＨＯポリペプチドのアミノ酸配列変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小有機分子等が含まれる。ＴＡＨＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法は、ＴＡＨＯポリペプチドと候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子を接触させ、そして通常はＴＡＨＯポリペプチドに関連している一又は複数の生物学的活性の検出可能な変化を測定することが含まれ得る。
【００８０】
「精製」とは、分子が少なくとも９５重量％又は含有される試料の少なくとも９８重量％の濃度で試料中に存在することを意味する。
「単離された」核酸分子は、例えば天然の環境に通常付随している少なくとも一の他の核酸分子から分離された核酸分子である。さらに、単離された核酸分子は、核酸分子を通常発現するが、その核酸分子がその天然の染色体位置と異なる染色体位置にあるか又は染色体外に存在する、細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００８１】
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二本鎖ＤＮＡループを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」(又は単に「組み換えベクター」)と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
【００８２】
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、標的である病的症状又は疾患を防ぐか又は衰え（小さく）させることである。治療を必要とするものには、疾患に罹りやすいものと同時に疾患に既に罹っているもの、又は疾患が予防されるべきものを含む。本発明の方法に従って抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子の治療量を投与された後に、患者が次の一又は複数のものについて観察可能な及び／又は測定可能な減少又は消失を示したならば、被検体又は哺乳動物は、ＴＡＨＯポリペプチド発現癌に関して成功裏に「治療された」ことになる：癌細胞の数の減少、又は癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；軟部組織及び骨への癌の広がりを含む、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の阻害；及び／又は特定の癌に関連している一又は複数の症状のある程度の緩和；疾病率及び死亡率の減少、及び生命問題の質の改善。ある程度、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯ結合オリゴペプチドは、生存癌細胞の成長を防ぐ及び／又は死滅させることができ、それは、細胞増殖抑制及び／又は細胞障害性であり得る。これらの兆候又は症状の低減は、また、患者が感じることができる。
【００８３】
疾患における成功裏の治療及び改善を評価することに関する上記のパラメーターは、医師にとってよく知られている日常的手法によって容易に測定が可能である。癌治療では、有効性は、例えば、病気の進行までの時間（ＴＴＰ）の算定及び／又は反応速度（ＲＲ）を確かめることによって測定できる。転移は、ステージング試験によって、骨のスキャン及び骨への広がりを確かめるためのカルシウムレベル及び他の酵素に関する試験によって確かめることができる。ＣＴスキャンは、また、領域の骨盤及びリンパ節への広がりを探索することで行うことができる。胸のＸ線、及び既知の方法による肝臓の酵素レベルの測定を、それぞれ肺及び肝臓への転移を探索するために用いる。疾患をモニタリングする他の常套的方法には、経直腸的超音波断層法（ＴＲＵＳ）及び経直腸的針生検（ＴＲＮＢ）が含まれる。
より局所的な癌である膀胱癌に関しては、疾患の進行を確かめる方法には、膀胱鏡検査による尿細胞評価、尿中に存在する血液のモニタリング、超音波断層撮影又は静脈性腎盂像、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）及び磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）による尿路上皮性路の視覚化が含まれる。遠隔転移の存在は、腹部のＣＴ、胸ｘ線、又は骨格の放射性核種イメージングによって評価することができる。
【００８４】
「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
「個体」は脊椎動物である。ある実施態様では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、限定するものではないが、家畜動物(ウシなど)、スポーツ用動物、愛玩動物(ネコ、イヌ及びウマ)、霊長類、マウス及びラットが含まれる。ある実施態様では、哺乳動物はヒトである。
癌の治療、症状の緩和又は診断のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００８５】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(登録商標)を含む。
「固相」又は「固体支持体」とは、本発明の抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子が接着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、径の調整されたガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）を含むことができる。また、この用語は、米国特許第４２７５１４９号に記載されたような別々の粒子の不連続な固相も含む。
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えばＴＡＨＯポリペプチド、それらに対する抗体又はＴＡＨＯ結合オリゴペプチド）輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は細胞膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。
【００８６】
ここで定義されている「小」分子又は「小」有機分子とは、約５００ダルトン未満の分子量である。
「薬学的製剤」なる用語は、活性成分の生物学的活性が有効となるような形態であり、製剤が投与される被検体に対して許容できない毒性がある付加的化合物を含まない調製物を指す。このような製剤は無菌でもよい。
「無菌の」製剤はすべての生きている微生物及びそれらの胞子を含まないで無菌である。
【００８７】
ここに開示するポリペプチド、抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド、ＴＡＨＯ結合有機分子、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの「有効量」とは、特に述べた目的を実施するために十分な量のことである。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的及び常套的な形で決定することができる。
【００８８】
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体、ポリペプチド、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド、ＴＡＨＯ結合有機分子又は他の薬剤の量を指す。癌の場合、治療的に有効量の薬は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍成長をある程度まで阻害し；及び／又は癌に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。「治療する」のここでの定義を参照せよ。薬が存在する癌細胞の成長を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、それは、細胞分裂停止及び／又は細胞障害性であり得る。
抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯポリペプチド、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子の「成長阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のための抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯポリペプチド、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子の「成長阻害量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
【００８９】
抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯポリペプチド、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子の「細胞障害性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のための抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯポリペプチド、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子の「細胞障害性量」は、経験的及び常套的な形で決定することができる。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗ＴＡＨＯモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ(polyepitopic)特異性を持つ抗ＴＡＨＯ抗体組成物、ポリクローナル抗体、一本鎖抗ＴＡＨＯ抗体、及び所望する生物学的又は免疫学的活性を示す限りは抗ＴＡＨＯ抗体の断片（下記を参照）を包含する。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、ここでの抗体と相互に置き換え可能に用いられる。
【００９０】
「ＳＮ８」なる用語は、Biomeda (Foster City, CA)、 BDbioscience (San Diego, CA) 又はAncell (Bayport, MN)などから商業的な供与源から購入した抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）モノクローナル抗体、Roswell Park Cancer Institute (Okazaki 等, Blood, 81(1): 84-95 (1993))から入手したハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体又はRoswell Park Cancer Institute (Okazaki 等, Blood, 81(1): 84-95 (1993))から入手したハイブリドーマから得られる抗体を用いて生成したキメラ抗体（「ｃｈＳＮ８」とも呼ぶ）を指すためにここで使用される。
「１０Ｄ１０」なる用語は、２００６年７月１１日にＡＴＣＣにＰＴＡ−７７１５の抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）１０Ｄ１０（１０Ｄ１０．３）として寄託されたハイブリドーマから生成した抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）モノクローナル抗体又はＡＴＣＣにＰＴＡ−７７１５の抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）１０Ｄ１０（１０Ｄ１０．３）として寄託されたハイブリドーマから生成したキメラ抗体（ここで、「ｃｈ１０Ｄ１０」とも呼ばれる）を指すために使用される。
抗体を指す際に使用される「ｃｈ」はキメラ抗体を特異的に指すために使用される。
「抗カニクイザルＣＤ７９ｂ」又は「抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ」はカニクイザルＣＤ７９ｂ（図８の配列番号：８）に結合する抗体を示すためにここで使用される（２００６年８月３日に出願された米国出願第１１／４６２３３６号に以前に記載される）。「抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ｃｈ１０Ｄ１０）」又は「抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０））」又は「ｃｈ１０Ｄ１０」はカニクイザルＣＤ７９ｂ（図４３の配列番号：２３９）に結合するキメラ抗カニクイザルＣＤ７９ｂ抗体を示すためにここで使用される（２００６年８月３日に出願された米国出願第１１／４６２３３６号に以前に記載される）。抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ｃｈ１０Ｄ１０）又はｃｈ１０Ｄ１０は、配列番号４１（図２１）の軽鎖を含むキメラ抗カニクイザルＣＤ７９ｂ抗体である。抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ｃｈ１０Ｄ１０）又はｃｈ１０Ｄ１０は、配列番号４３（図２３）の重鎖を更に含むキメラ抗カニクイザルＣＤ７９ｂ抗体である。
【００９１】
「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって定量して９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％以上の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え体細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
基本的な４-鎖抗体ユニットは２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパクである(ＩｇＭ抗体は、基本的なヘテロ四量体ユニットとそれに付随するＪ鎖と称される付加的なポリペプチドの５つからなり、よって１０の抗原結合部位を有するが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、基本的４-鎖ユニットとそれ付随するＪ鎖のうち２-５つを含む多価集合を形成可能である)。ＩｇＧの場合、４-鎖ユニットは一般的に約１５００００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合するが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれのＨ及びＬ鎖はまた規則的な間隔を持った鎖内ジスルフィド結合を持つ。それぞれのＨ鎖は、α及びγ鎖の各々に対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)が、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)をＮ末端に有する。それぞれのＬ鎖は、その他端に定常ドメイン(ＣＬ)が続く可変ドメイン(ＶＬ)をＮ末端に有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＬとＶＨは共同して対になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性は、例えばBasic and Clinical Immunology, ８版, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(編), Appleton ＆ Lange, Norwalk, CT, 1994, ７１頁及び６章を参照のこと。
【００９２】
任意の脊椎動物種からのＬ鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。また、その重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンには異なったクラス又はアイソタイプを割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。さらにγ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能等の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えば、ヒトにおいては次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が発現する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合性を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定める。しかし、可変性は可変ドメインの１１０-アミノ酸スパンを通して均等には分布されていない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と称される極度の可変性を有するより短い領域によって分離された１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる比較的不変の伸展からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各々は、大きなβ-シート配置をとり、３つの高頻度可変領域により接続された４つのＦＲ領域を含み、それはループ状の接続を形成し、β-シート構造の一部を形成することもある。各鎖の高頻度可変領域はＦＲにより他の鎖からの高頻度可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ED. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係ないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)における抗体の寄与を示す。
【００９３】
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性の原因となる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、ＶＬにおいては、およそ残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及びＶＨにおいては、およそ１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高度可変ループ」からの残基(例えば、ＶＬにおいては、およそ残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)、及びＶＨにおいては、およそ２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって、細菌、真核細胞動物又は植物細胞から作ることができる(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００９４】
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。ここで対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば旧世界ザル、類人猿等)から由来する可変ドメイン抗原-結合配列及びヒト定常領域配列を含む「プリマタイズ(primatized)」抗体を含む。
「無傷」の抗体は、抗原-結合部位、並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、無傷の抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００９５】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残留「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は全長Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)、及び一つの重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合性に関して一価である、すなわち単一の抗原-結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ(ａｂ')２断片が生じ、これは２価の抗原結合部位を持つ２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、抗原を交差結合させることができるものである。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、通常はＦａｂ'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００９６】
Ｆｃ断片はジスルフィドにより一緒に保持されている双方のＨ鎖のカルボキシ末端部位を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され、その領域は、所定の型の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)によって認識される部位である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原-認識及び-結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００９７】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borrebaeck 1995, 以下を参照のこと。
「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、鎖間ではなく鎖内でＶドメインを対形成させ、結果として二価の断片、すなわち２つの抗原-結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨとＶＬドメインとの間に、短いリンカー(約５-１０残基)を持つｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築することにより調製される小型の抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディは２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロダイマーであり、そこでは２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
【００９８】
非ヒト(例えば齧歯類)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
「種依存性抗体」、例えば哺乳動物抗-ヒトＩｇＥ抗体は、二番目の哺乳動物種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも、一番目の哺乳動物種からの抗原に対してより強力な結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原（すなわち、約１ｘ１０−７Ｍ以下、好ましくは約１ｘ１０−８以下、最も好ましくは約１ｘ１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）と「特異的に結合」するが、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い、二番目の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上にて定義した種々の型の抗体のいずれでもあることが可能だが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
【００９９】
「ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド」はここで記載される様なＴＡＨＯポリペプチドに好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。ＴＡＨＯ結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成方法論を用いて化学的に合成することができ、あるいは組み換え技術を用いて調製及び精製することができる。ＴＡＨＯ結合オリゴペプチドは通常、少なくとも約５のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載される様なＴＡＨＯポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。ＴＡＨＯ結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
「ＴＡＨＯ結合有機分子」とは、ここに記載されるようなＴＡＨＯポリペプチドに、好ましくは特異的に、結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。ＴＡＨＯ結合有機分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号及びＷＯ００／３９５８５号参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。ＴＡＨＯ結合有機分子は通常、約２０００ダルトン未満の大きさであり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満の大きさであり、ここに記載される様なＴＡＨＯポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号及びＷＯ００／３９５８５号参照）。
【０１００】
対象の抗原、例えば腫瘍関連ポリペプチド抗原標的と「結合する」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、その抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子がその抗原を発現している細胞又は組織を標的とする治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意には交差反応しないように十分な親和性でその抗原と結合するものである。そのような実施態様では、抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子の「非標的」タンパク質との結合の程度は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析又は放射免疫沈降（ＲＩＡ）によって定量して、その特定の標的タンパク質との抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子の結合の約１０％よりも低い。標的分子への抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子の結合に関して、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープと「特異的に結合」又は「特異的に結合する」、又はそれに対して「特異的である」という用語は、非特異的な相互作用とは測定して異なる結合を意味する。特異的な結合は、例えば、一般に結合活性を持たない類似した構造の分子であるコントロール分子の結合性と比較して、分子の結合性を定量することによって測定することができる。例えば、特異的な結合性は、標的、例えば過剰の非標識標的に類似したコントロール分子とも競合にとって定量することができる。この場合、プローブに対する標識標的の結合が過剰の非標識標的によって競合的に阻害されるならば、特異的結合が表示される。ここで使用される特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープと「特異的に結合」又は「特異的に結合する」、又はそれに対して「特異的である」という用語は、例えば標的に対して少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、あるいはそれ以上のＫｄを持つ分子によって示されうる。一実施態様では、「特異的に結合する」という用語は、如何なる他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープへ実質的に結合することなく分子が特定のポリペプチド又は特定のポリペプチドのエピトープに結合する結合を意味する。
「ＴＡＨＯポリペプチドを発現する腫瘍細胞の成長を阻害する」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子、又は「成長阻害」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、適切なＴＡＨＯポリペプチドを発現又は過剰発現する癌細胞の測定可能な程の成長阻害を引き起こすものである。ＴＡＨＯポリペプチドは、癌細胞の表面上に発現される膜貫通ポリペプチドであることができ、癌細胞によって産生され分泌されるポリペプチドであり得る。好ましい成長阻害抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、一般的には、試験された抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子で処理されていない腫瘍細胞であるコントロールである、適切なコントロールと比較して、２０％より多く、好ましくは約２０％から約５０％、そしてさらに好ましくは５０％よりも多く（例えば、約５０％から約１００％）でＴＡＨＯ発現腫瘍細胞の成長を阻害する。一実施態様では、成長阻害は、細胞培養で約０．１から３０μｇ／ｍｌ又は約０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、抗体への腫瘍細胞の曝露の後、成長阻害を１−１０日で確かめる。インビボでの腫瘍細胞の成長阻害は、下記の実験実施例に記載しているような種々の方法で確かめることができる。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重の抗ＴＡＨＯ抗体の投与が、最初の抗体の投与から約５日から３ヶ月内、好ましくは約５から３０日内に腫瘍の大きさ又は腫瘍細胞増殖に減少を引き起こす場合、抗体はインビボで成長阻害性である。
【０１０１】
「アポトーシスを誘発する」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)等により決定されるようなプログラム細胞死を誘発するものである。細胞は、通常、ＴＡＨＯポリペプチドを過剰発現しているものである。好ましくは、細胞は腫瘍細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、好塩基球、好酸球、好中球、単球、血小板、又は赤血球等の造血細胞である。アポトーシスに伴う細胞のイベントを評価するために種々の方法が利用できる。例えば、ホスファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダーリングにより評価することができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／クロマチン凝結は低二倍体細胞の何らかの増加により評価することができる。好ましくは、アネキシン結合アッセイにおいて、アポトーシスを誘発する抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、未処理細胞の約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘発するという結果を生じるものである。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【０１０２】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型レセプター」）が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ）を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ）を含んでいる（Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧｓが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性レセプターＦｃＲｎ（Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))も含まれる。
【０１０３】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
【０１０４】
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に制御されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を関すか又は記述する。癌の例には、限定するものではないが、造血性癌又は血液関連の癌、例えばリンパ腫、白血病、骨髄腫又はリンパ系腫瘍、しかしまた、脾臓の癌やリンパ節の癌や、更にはカルチノーマ、芽細胞腫(ブラストーマ)及び肉腫が含まれる。癌のより具体的な例には、Ｂ細胞関連の癌、例えば高、中及び低悪性度リンパ腫(例えば粘膜関連のリンパ組織Ｂ細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)などのＢ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫及びホジキンリンパ腫、及びＴ細胞リンパ腫を含む)や、白血病(二次白血病、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、例えばＢ細胞白血病(ＣＤ５＋ Ｂリンパ球)、脊髄性白血病、例えば急性脊髄性白血病、慢性脊髄性白血病、リンパ白血病、例えば急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)及び脊髄形成異常を含む)や、他の血液学的な及び／又はＢ細胞ないしＴ細胞関連の癌が含まれる。また、好塩基球、好酸球、好中球及び単球のような多核白血球、樹状細胞、血小板、赤血球及びナチュラルキラー細胞を含む更なる造血性細胞の癌も含まれる。また、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、進行性ＮＨＬ、再発性進行性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫から選択される、癌性Ｂ細胞増殖性疾患も含まれる。Ｂ細胞癌の起源には、辺縁帯のメモリーＢ細胞の辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫起源、胚中心のライトゾーンの中心細胞内の濾胞性リンパ腫及びびまん性大Ｂ細胞リンパ腫起源、Ｂ１細胞(ＣＤ５＋)の慢性リンパ球性白血病及び小リンパ球性白血病起源、マントルゾーンのナイーブＢ細胞のマントル細胞リンパ腫起源、及び胚中心のダークゾーンの中心芽細胞のバーキットリンパ腫起源が含まれる。本明細書中で「造血性細胞組織」と称される造血性細胞を含む組織には、胸腺及び骨髄及び周辺リンパ組織、例えば脾臓、リンパ節、粘膜と関連したリンパ組織、例えば腸関連のリンパ組織、扁桃腺、パイエル板及び虫垂及び他の粘膜と関連するリンパ系組織、例えば気管支裏層が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌、膵癌、グリオーマ、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、白血病及び他のリンパ系増殖性疾患、及び様々なタイプの頭頸部癌が含まれる。
【０１０５】
本明細書中の「Ｂ細胞悪性腫瘍」には、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、例として軽度／濾胞性ＮＨＬ、小リンパ球(ＳＬ)ＮＨＬ、中程度／濾胞性ＮＨＬ、中程度のびまん性ＮＨＬ、高度免疫芽細胞ＮＨＬ、高度リンパ芽球ＮＨＬ、高度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、バルキー(bulky)疾患ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連のリンパ腫、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、リンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)、小リンパ球性リンパ腫(ＳＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、再発性低悪性度ＮＨＬ及びリツキシマブ抵抗性の低悪性度ＮＨＬを含む低悪性度ＮＨＬ；白血病、例として急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病；マントル細胞リンパ腫；及び他の血液学的な悪性腫瘍が含まれる。このような悪性腫瘍は、ＣＤ７９ｂなどのＢ細胞表面マーカーに対する抗体によって治療されてもよい。このような疾患は、ＣＤ７９ｂなどのＢ細胞表面マーカーに対する抗体の投与によって治療されることが本明細書において意図されるものであり、本明細書中で開示したようなコンジュゲートしていない(「ネイキッド」)抗体又は細胞障害性剤にコンジュゲートされた抗体の投与を含む。また、このような疾患は、他の抗体ないし抗体薬剤コンジュゲート、他の細胞障害性剤、放射線又は他の同時ないしは連続して施される治療と組み合わせて、本発明の抗ＣＤ７９ｂ抗体ないし抗ＣＤ７９ｂ抗体薬剤コンジュゲートを含む併用療法によって治療されることが、本願明細書において意図される。本発明の例示的な治療方法では、本発明の抗ＣＤ７９ｂ抗体は、抗ＣＤ２０抗体、イムノグロブリン又はこれらのＣＤ２０結合断片と組み合わされて、ともにないしは連続して投与される。抗ＣＤ２０抗体はネイキッド抗体又は抗体薬剤コンジュゲートであってもよい。併用療法の実施態様では、抗ＣＤ７９ｂ抗体は本発明の抗体であり、抗ＣＤ２０抗体はリツキサン(登録商標)(リツキシマブ)である。
【０１０６】
本明細書で使用する「非ホジキンリンパ腫」又は「ＮＨＬ」という用語は、ホジキンリンパ腫以外のリンパ系の癌を意味する。通常、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫とは、ホジキンリンパ腫にはリードシュテルンベルク細胞が存在し、非ホジキンリンパ腫には前記細胞が不在であることにより区別することができる。本明細書で使用する用語に含まれる非ホジキンリンパ腫の例は、従来技術に既知の分類方式、例えばColor Atlas of Clinical Hematology第３版; A. Victor Hoffbrand及びJohn E. Pettit(編)(Harcourt Publishers Limited 2000)(特に図11.57、11.58及び11.59参照)に記載の改訂版European-American Lymphoma (REAL)方式に従って当業者(腫瘍学者又は病理学者)によって認識されるあらゆるものを含む。より具体的な例としては、限定するものではないが、再発性又は抵抗性ＮＨＬ、前線低悪性度ＮＨＬ、第III／IV期ＮＨＬ、化学療法に抵抗性のＮＨＬ、前駆体Ｂリンパ芽球性白血病及び／又はリンパ腫、小リンパ球リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病及び／又は前リンパ球性白血病及び／又は小リンパ球リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、immunocytoma及び／又はリンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ系質細胞性リンパ腫周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、脾周辺帯リンパ腫、結節外周辺帯−ＭＡＬＴリンパ腫、結節周辺帯リンパ腫、有毛細胞白血病、プラズマ細胞腫及び／又は形質細胞骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞性中心リンパ腫(濾胞性)、中悪性度拡散性ＮＨＬ、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度ＮＨＬ(高悪性度前線ＮＨＬ及び高悪性度再発性ＮＨＬを含む)、自己幹細胞移植後の又は自己肝細胞移植に抵抗性のＮＨＬ再発、原発性縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、原発性浸出リンパ腫、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度非切断小細胞性ＮＨＬ、巨大(bulky)病変ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆体(周辺性)大顆粒リンパ球性白血病、菌状息肉腫及び／又はセザリー症候群、皮膚(皮膚性)リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管動原体リンパ腫が挙げられる。
【０１０７】
「疾患」は、本発明の物質／分子又は方法を用いた処置によって利益を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。限定的なものではなく、ここで処置される疾患の例には、悪性及び良性などの癌性状態；非白血病及びリンパ系腫瘍；ニューロン、グリア、アストロサイト(astrocytal)、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮性、間質性及びブラストコエリックの疾患；炎症性、免疫性、及び他の血管形成関連の障害が含まれる。さらに、疾患には、Ｂ細胞増殖性疾患及び／又はＢ細胞腫瘍などの癌性状態、例えばリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、進行性ＮＨＬ、再発性進行性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、毛様細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫が含まれる。 
【０１０８】
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
【０１０９】
「細胞死を誘導する」抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、生細胞を生育不能にするものである。細胞は、ＴＡＨＯポリペプチドを発現するものであり、ＴＡＨＯポリペプチドを特異的に発現するか、又は過剰発現する種類の細胞である。細胞は特定の細胞腫類の癌性細胞あるいは正常細胞でもよい。ＴＡＨＯポリペプチドは、癌細胞の表面上で発現される膜貫通ポリペプチドであることができ、癌細胞により生成され分泌されるポリペプチドであり得る。その細胞は癌細胞、例えば、B細胞又はT細胞である。インビトロ細胞死は、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性障害（ＣＤＣ）によって誘導される細胞死を識別するために、補体及び免疫エフェクター細胞の無い状態で確かめてもよい。従って、細胞死に関するアッセイは、熱不活性化血清（すなわち、補体の無い）を用いて、免疫エフェクター細胞が無い状態でおこなってもよい。抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子が細胞死を誘導するか否かを確かめるために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Moore等 Cytotechnology 17: 1-11(1995)）又は７ＡＡＤの取り込みによって評価した膜整合性の損失を、未処理細胞と関連して評価することができる。好ましい細胞死を誘導する抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子は、ＢＴ４７４細胞でのＰＩ取り込みアッセイで、ＰＩ取り込みを誘導するものである。
「ＴＡＨＯ発現細胞」は、細胞の表面上に又は分泌形態で内因性又は形質移入されたＴＡＨＯポリペプチドを発現する。「ＴＡＨＯ発現癌」は、細胞表面上に存在するＴＡＨＯポリペプチドを有する、又はＴＡＨＯポリペプチドを生成し分泌する細胞を含む癌である。任意には、「ＴＡＨＯ発現癌」は、その細胞の表面上に十分なレベルのＴＡＨＯポリペプチドを生成し、抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子はそれへ結合することができ、癌に関して治療的効果を有する。他の実施態様では、任意には「ＴＡＨＯ発現癌」は、抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子アンタゴニストが結合することができ、癌に対して治療的有効量を有するように十分なレベルのＴＡＨＯポリペプチドを産生及び分泌する。後者に関して、アンタゴニストは腫瘍細胞による分泌ＴＡＨＯポリペプチドの産生及び分泌を減少、抑制又は阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。ＴＡＨＯポリペプチドを「過剰発現」する癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、その細胞表面に顕著により高いレベルのＴＡＨＯポリペプチドを有する、或いは産生及び分泌するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅又は増大した転写又は翻訳によって生じ得る。ＴＡＨＯポリペプチド過剰発現は、検出又は予後アッセイにおいて、細胞の表面上に存在する、あるいは細胞により分泌されるＴＡＨＯタンパク質の増大したレベルを評価することによって定量されうる（例えば、ＴＡＨＯポリペプチドをコードする単離された核酸から、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる単離されたＴＡＨＯポリペプチドに対して調製した抗ＴＡＨＯ抗体を用いた免疫組織化学アッセイを介して；ＦＡＣＳ分析など）。あるいは、又は付加的に、例えば、ＴＡＨＯコード化核酸又はその相補鎖と一致する核酸ベースプローブを使用する蛍光インサイツハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月公開の国際公開９８／４５４７９を参照せよ）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）を介して、細胞のＴＡＨＯポリペプチドコード化核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定してもよい。また、例えば、抗体ベースアッセイを用いて、血清のような生物学的体液中に流れている抗原を測定することによって、ＴＡＨＯポリペプチド過剰発現を研究してもよい（同じく、例えば、１９９０年６月１２日に発行の米国特許第４９３３２９４号；１９９１年４月１８日に公開の国際公開９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行の米国特許第５４０１６３８号；Sias等, J. Immunol. Methods 132: 73-80(1990)を参照せよ）。上記のアッセイとは別に、種々のインビボアッセイは、熟練技術者に入手可能である。例えば、患者の体の中にある細胞を、例えば、放射活性アイソトープのような検出可能な標識で場合によって標識した抗体に曝してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば、放射活性の外部スキャンニングによって、又は以前に抗体へ曝した患者から取り出した生検を分析することによって評価することができる。
【０１１０】
ここで用いられているように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列(即ち「異種」)と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ(ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む)、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
「標識」という語は、ここで用いられる場合、「標識された」抗体、オリゴペプチド、又は他の有機分子を作製するために、抗体、オリゴペプチド、又は他の有機分子に直接的又は間接的に結合させる検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく(例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識)、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
【０１１１】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、又は他の挿入剤(intercalating agent)、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性剤が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「毒素」は、細胞の成長又は増殖に対して有害効果を有することが可能な任意の物質である。
【０１１２】
作用機構に関係なく、「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化学化合物である。化学療法剤の種類には、限定するものではないが、アルキル化剤(alkyating agent)、アンチメタボライ、紡錘体阻害剤植物アルカロイド、細胞障害性／抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害薬、抗体、光増感剤及びキナーゼ阻害薬が含まれる。化学療法剤は、「ターゲティング療法」と従来の化学療法とに用いられる化合物を含む。化学療法剤の例には、エルロチニブ(ＴＡＲＣＥＶＡ(登録商標), Genentech/OSI Pharm.)、ドセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標), Sanofi-Aventis)、５−ＦＵ(フルオロウラシル、５‐フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１-２１-８)、ゲムシタビン(ＧＥＭＺＡＲ(登録商標), Lilly)、ＰＤ-０３２５９０１(ＣＡＳ番号３９１２１０-１０-９, Pfizer)、シスプラチン(シス-ジアミン、ジクロロ白金(ＩＩ)、ＣＡＳ番号１５６６３-２７-１)、カルボプラチン(ＣＡＳ番号４１５７５-９４-４)、パクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、トラスツズマブ(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標), Genentech)、テモゾロミド(４-メチル-５-オキソ-２,３,４,６,８-ペントアザ二環式[４.３.０]ノナ-２,７,９-トリエン-９-カルボキシアミド、ＣＡＳ番号８５６２２-９３-１, ＴＥＭＯＤＡＲ(登録商標), ＴＥＭＯＤＡＬ(登録商標), Schering Plough)、タモキシフェン((Ｚ)-２-[４-(１,２-ジフェニルブト-１-エニル)フェノキシ]-Ｎ,Ｎ-ジメチル-エタンアミド, ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標), ＩＳＴＵＢＡＬ(登録商標), ＶＡＬＯＤＥＸ(登録商標))、及びドキソルビシン(ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ(登録商標))、Ａｋｔｉ-１／２、ＨＰＰＤ及びラパマイシンが含まれる。
【０１１３】
化学療法剤の他の例には、オキサリプラチン(ＥＬＯＸＡＴＩＮ(登録商標), Sanofi)、ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標), Millennium Pharm.)、スーテント(ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ(登録商標), ＳＵ１１２４８, Pfizer)、レトロゾール(ＦＥＭＡＲＡ(登録商標), Novartis)、メシル酸イマチニブ(ＧＬＥＥＶＥＣ(登録商標), Novartis)、ＸＬ-５１８ (Ｍｅｋインヒビター, Exelixis, 国際公開２００７／０４４５１５)、ＡＲＲＹ-８８６ (Ｍｅｋインヒビター, ＡＺＤ６２４４, Array BioPharma, Astra Zeneca)、ＳＦ-１１２６(ＰＩ３Ｋインヒビター, Semafore Pharmaceuticals)、ＢＥＺ-２３５(ＰＩ３Ｋインヒビター, Novartis)、ＸＬ-１４７(ＰＩ３Ｋインヒビター, Exelixis)、ＰＴＫ７８７/ＺＫ ２２２５８４ (Novartis)、フルベストラント(ＦＡＳＬＯＤＥＸ(登録商標), AstraZeneca)、リューコボリン(フォリン酸)、ラパマイシン(シロリムス, ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標), Wyeth)、ラパチニブ(ＴＹＫＥＲＢ(登録商標), ＧＳＫ５７２０１６, Glaxo Smith Kline)、ロナファーニブ(ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ, ＳＣＨ ６６３３６, Schering Plough)、ソラフェニブ(ＮＥＸＡＶＡＲ(登録商標), ＢＡＹ４３-９００６, Bayer Labs)、ゲフィチニブ(ＩＲＥＳＳＡ(登録商標), AstraZeneca)、イリノテカン(ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ(登録商標), ＣＰＴ-１１, Pfizer)、ティピファニブ(ＺＡＲＮＥＳＴＲＡＴＭ, Johnson & Johnson)、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ (Cremophor-free), パクリタキセルのアルブミン-変更ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il)、バンデタニブ(ｒＩＮＮ, ＺＤ６４７４, ＺＡＣＴＩＭＡ(登録商標), AstraZeneca)、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１(ＳＵ５２７１; Sugen)、テムシロリムス(ＴＯＲＩＳＥＬ(登録商標), Wyeth)、パゾパニブ(GlaxoSmithKline)、カンフォスファミド(ＴＥＬＣＹＴＡ(登録商標), Telik)、チオテパ、及びシクロフォスファミド(ＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標)、ＮＥＯＳＡＲ(登録商標))；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭ１を含む)； エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、ト��フォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、カリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシン(dynemicin)、ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin)； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；シクロホスファミド；チオテパ；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；エトポシド(ＶＰ-１６)；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン(ＸＥＬＯＤＡ(登録商標), Roche)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；、並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類及び誘導体が含まれる。
【０１１４】
また、「化学療法剤」の定義には、(i) 腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標)(クエン酸トレミフェン)；(ii) アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)(メゲストロールアセテート)、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)(エキセメスタン, Pfizer)、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)(ゾロゾール(vorozole))、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)(レトロゾール, Novartis)及びＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)(アナストロゾール, AstraZeneca)；(iii) 抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；(iv) プロテインキナーゼインヒビター、例えばＭＥＫインヒビター(国際公開２００７／０４４５１５)；(v) 脂質キナーゼインヒビター；(vi) アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ及びＨ−Ｒａｓ、オブリメルセン(ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ(登録商標), Genta Inc.)；(vii) リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ(登録商標))及びＨＥＲ２発現インヒビター；(viii) 遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)及びＶＡＸＩＤ(登録商標)などのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ(登録商標)ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)などのトポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)ｒｍＲＨ；(ix) ベバシズマブ(ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標), Genentech)などの抗血管形成剤；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
また、「化学療法剤」の定義には、治療的抗体、例として、アレムツズマブ(Ｃａｍｐａｔｈ)、ベバシズマブ(アバスチン(登録商標), Genentech)；セツキシマブ(ＥＲＢＩＴＵＸ(登録商標), Imclone)；パニツムマブ(ＶＥＣＴＩＢＩＸ(登録商標), Amgen)、リツキシマブ(ＲＩＴＵＸＡＮ(登録商標), Genentech/Biogen Idec)、ペルツズマブ(ＯＭＮＩＴＡＲＧＴＭ, ２Ｃ４, Genentech)、トラスツズマブ(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標), Genentech)、トシツモマブ(Bexxar, Corixia)、及び抗体薬剤コンジュゲート、ゲムツズマブオゾガマイシン(ＭＹＬＯＴＡＲＧ(登録商標), Wyeth)が含まれる。
【０１１５】
本明細書中で用いられる「増殖阻害性剤」は、インビトロ又はインビボで、細胞、特にＴＡＨＯ発現癌細胞の増殖を阻害する化合物又は組成物を指す。したがって、増側阻害性剤は、Ｓ期のＴＡＨＯ発現細胞の割合を有意に減少するものであってもよい。増殖阻害性剤の例には、細胞サイクルの進行を(Ｓ期以外の時点で)遮断する薬剤、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤が含まれる。典型的なＭ期遮断剤には、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン及びトポイソメラーゼＩＩ阻害薬、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニソン、デカルバジン(decarbazine)、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル及びａｒａ−ＣのようなＤＮＡアルキル化剤の場合でも、Ｓ期停止にずれ込むことがある。更なる情報は、Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13の、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs"にある。タキサン(パクリタキセル及びドセタキセル)は、両方ともイチイの木から得られる抗癌薬である。ヨーロッパイチイから得られるドセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標), Rhone-Poulenc Rorer)は、パクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標), Bristol-Myers Squibb)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管のアセンブリを促し、脱重合を予防することによって微小管を安定化し、その結果として細胞内の有糸分裂を阻害する。
【０１１６】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
【０１１７】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子、例えばＮＧＦ-α；血小板増殖因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、−γ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ−ＣＳＦ(Ｍ−ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)；及び顆粒球−ＣＳＦ(Ｇ−ＣＳＦ)；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、  ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のインターロイキン(ＩＬ)；ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【０１１８】
「パッケージ挿入物」という用語は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌及び／又はその治療薬の用途に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指すために用いられる。
【０１１９】
「細胞内代謝物」なる用語は、抗体-抗原コンジュゲート(ＡＤＣ)上の細胞内部で代謝プロセス又は反応から生じている化合物に関する。代謝プロセス又は反応はＡＤＣのペプチドリンカーのタンパク質切断や、ヒドラゾン、エステル又はアミドなどの官能基の加水分解といった酵素的な過程であってもよい。細胞内代謝物には、限定するものではないが、細胞内への移行、拡散、取り込み又は輸送後に細胞内切断が行われた遊離薬剤及び抗体が含まれる。
「細胞内に切断される」及び「細胞内切断」なる用語は、抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)に対する細胞内の代謝プロセス又は反応であって、これによって薬剤成分(Ｄ)と抗体(Ａｂ)間の共有結合、すなわちリンカーが壊れ、その結果、細胞内の抗体から遊離した薬剤が分離される。ゆえに、ＡＤＣの切断された成分は細胞内代謝物である。
【０１２０】
「生物学的利用能」なる用語は、患者に投与される薬剤の所定の量の全身有効性(すなわち、血液／血しょう濃度)を指す。生物学的利用能は、投与された用量形態から体循環に達する薬剤の時間(速度)と総量(程度)の測定値を示す絶対的な用語である。
「細胞障害活性」なる用語は、ＡＤＣ又はＡＤＣの細胞内代謝物の細胞殺傷効果、細胞増殖抑制効果又は増殖阻害効果を指す。細胞障害活性は、細胞の半分が生存する単位容量当たりの濃度(モル又は質量)であるＩＣ５０値として表されてもよい。
【０１２１】
本明細書中で用いられる「アルキル」なる用語は、１〜１２の炭素原子(Ｃ１−Ｃ１２)の飽和した線状又は分枝状の一価性炭化水素ラジカルを指し、このアルキル基が場合によって後述の一又は複数の置換基と独立して置換されていてもよい。他の実施態様では、アルキル基は、１〜８の炭素原子(Ｃ１−Ｃ８)、又は１〜６の炭素原子(Ｃ１−Ｃ６)である。アルキル基の例には、限定するものではないが、メチル (Ｍｅ、−ＣＨ３)、エチル (Ｅｔ、−ＣＨ２ＣＨ３)、１−プロピル (ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、２−プロピル (ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ(ＣＨ３)２)、１−ブチル (ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、２−メチル−１−プロピル (ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２)、２−ブチル (ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３)、２−メチル−２−プロピル (ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ(ＣＨ３)３)、１−ペンチル (ｎ−ペンチル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、２−ペンチル (−ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、３−ペンチル (−ＣＨ(ＣＨ２ＣＨ３)２)、２−メチル−２−ブチル (−Ｃ(ＣＨ３)２ＣＨ２ＣＨ３)、３−メチル−２−ブチル (−ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＣＨ３)２)、３−メチル−１−ブチル (−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２)、２−メチル−１−ブチル (−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３)、１−ヘキシル (−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、２−ヘキシル (−ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、３−ヘキシル (−ＣＨ(ＣＨ２ＣＨ３)(ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３))、２−メチル−２−ペンチル (−Ｃ(ＣＨ３)２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３)、３−メチル−２−ペンチル (−ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ３)、４−メチル−２−ペンチル (−ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)２)、３−メチル−３−ペンチル (−Ｃ(ＣＨ３)(ＣＨ２ＣＨ３)２)、２−メチル−３−ペンチル (−ＣＨ(ＣＨ２ＣＨ３)ＣＨ(ＣＨ３)２)、２,３−ジメチル−２−ブチル (−Ｃ(ＣＨ３)２ＣＨ(ＣＨ３)２)、３,３−ジメチル−２−ブチル (−ＣＨ(ＣＨ３)Ｃ(ＣＨ３)３、１−ヘプチル、１−オクチルなどが含まれる。
【０１２２】
「アルケニル」なる用語は、不飽和の少なくとも一部、すなわち炭素−炭素、ｓｐ２二重結合を有する２〜８の炭素原子(Ｃ２−Ｃ８)の線状又は分岐状の一価性炭化水素ラジカルを指し、このアルケニル基は場合によって本明細書中に記載の一又は複数の置換基と独立して置換されていてよく、「シス」及び「トランス」定位、あるいは「Ｅ」及び「Ｚ」定位を有するラジカルを含む。例には、エチレンイル又はビニル(-Ｃ＝ＣＨ２)、アリル(-ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２)などを含むが、これらに限定されるものではない。
「アルキニル」なる用語は、不飽和の少なくとも一部、すなわち炭素−炭素、ｓｐ三重結合を有する２〜８の炭素原子(Ｃ２−Ｃ８)の線状又は分岐状の一価性炭化水素ラジカルを指し、このアルキニル基は場合によって本明細書中に記載の一又は複数の置換基と独立して置換されていてよい。例には、エチニル(-Ｃ≡ＣＨ)、プロピニル(プロパルギル、−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ)などを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
「カルボシクリル」、「炭素環の」、「炭素環」及び「カルボシクロ」は、単環として３〜１２の炭素原子(Ｃ３−Ｃ１２)を、又は二重環として７〜１２の炭素原子を有する一価性非芳香族の飽和ないしは部分的不飽和の環を指す。７〜１２の原子を有する二環式の炭素環は、例えばビシクロ[４,５]、[５,５]、[５,６]又は[６,６]システムとして配置され、９又は１０の環状原子を有する二環式の炭素環は、ビシクロ[５,６]又は[６,６]システムとして、又はビシクロ[２.２.１]ヘプタン、ビシクロ[２.２.２]オクタン及びビシクロ[３.２.２]ノナンなどの架橋したシステムとして配置されうる。単環の炭素環の例には、限定するものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、１−シクロペント−２−エニル、１−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキス−１−エニル、１−シクロヘキス−２−エニル、１−シクロヘキス−３−エニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、シクロドデシルなどが含まれる。
「アリール」は、親芳香族環システムの単一の炭素原子から１の水素原子の除去によって得られる６〜２０の炭素原子(Ｃ６−Ｃ２０)の一価性芳香族炭化水素基を意味する。いくつかのアリール基は、「Ａｒ」として例示的な構造で表される。アリールには、飽和、部分的不飽和環、又は芳香族炭素環に融合した芳香族環を含む二環式ラジカルが含まれる。代表的なアリール基には、ベンゼン(フェニル)、置換されたベンゼン類、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル、インデニル、インダニル、１,２−ジヒドロナフタレン、１,２,３,４-テトラヒドロナフチルなどから得られるラジカルが含まれるが、これらに限定されるものではない。アリール基は場合によって、本明細書において記述される一又は複数の置換基に独立して置換される。
【０１２４】
「ヘテロサイクル」、「ヘテロシクリル」及び「複素環」は本明細書中で交換可能に用いられ、少なくとも一の環原子が窒素、酸素、リン及び硫黄から選択されるヘテロ原子である３〜２０の環原子の、飽和ないしは部分的に不飽和の(すなわち、環内に一又は複数の二重及び／又は三重の結合を有する)炭素環式基を指し、この一又は複数の環原子が場合によって後述の一又は複数の置換基と独立して置換されている。ヘテロサイクルは、３〜７員環を有するモノシクロ(２〜６の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜４のヘテロ原子)又は７〜１０員環を有するビシクロ (４〜９の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜６のヘテロ原子)、例えばビシクロ[４,５]、[５,５]、[５,６]、又は[６,６]システムであってもよい。複素環は、Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968)、特に第1, 3, 4, 6, 7及び9章；"The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley and; Sons, New York, 1950 to present)、特に13, 14, 16, 19及び28号；及び、J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566に記載される。また、「ヘテロシクリル」には、複素環式基がヘテロシクリル基が飽和、部分的に不飽和の環、又は芳香族の炭素環又は複素環に融合されているラジカルが含まれる。複素環の例には、例示のためであって限定するものではなく、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、２−ピロリニル、、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１,３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニルイミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ[３.１.０]ヘキサニル、３−アザビシクロ[４.１.０]ヘプタニル、アザビシクロ[２.２.２]ヘキサニル、３Ｈ−インドールイルキノリジニル及びＮ−ピリジルウレアが含まれる。また、スピロ部分もこの定義の範囲内に含まれる。２環炭素原子がオキソ(＝Ｏ)部分に置換されている複素環基の例は、ピリミジノニル及び１,１−ジオキソ−チオモルホリニルである。本明細書において複素環基は場合によって、本明細書中に記載される一又は複数の置換基によって、独立して置換されている。
【０１２５】
「ヘテロアリール」なる用語は、５員、６員又は７員環の一価性の芳香族基を指し、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される一又は複数のヘテロ原子を含む、５〜２０の原子の融合した環システム(少なくともその一つが芳香族である)を含む。ヘテロアリール基の例は、ピリジニル(例えば、２−ヒドロキシピリジニルを含む)、イミダゾリル、イミドアゾピリジニル、ピリミジニル(例えば、４−ヒドロキシピリミジニルを含む)、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、フリニル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル及びフロピリジニルである。ヘテロアリール基は場合によって、本明細書中に記載される一又は複数の置換基によって、独立して置換されている。
【０１２６】
複素環基又はヘテロアリール基は、可能な場合には、炭素(炭素結合)、又は窒素(窒素結合)結合されてもよい。限定ではなく例を挙げると、炭素結合した複素環又はヘテロアリールは、ピリジンの位置２、３、４、５又は６、ピリダジンの位置３、４、５又は６、ピリミジンの位置２、４、５又は６、ピラジンの位置２、３、５又は６、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール又はテトラヒドロピロールの位置２、３、４又は５、オキサゾール、イミダゾール又はイソチアゾールの位置３、４又は５、アジリジンの位置２又は３、アゼチジンの位置２、３又は４、キノリンの位置２、３、４、５、６、７又は８、又はイソキノリンの位置１、３、４、５、６、７又は８で結合される。
限定するものではないが、窒素が結合した複素環又はヘテロアリールは、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２-ピロリン、３-ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２-イミダゾリン、３-イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２-ピラゾリン、３-ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ-インダゾールの位置１、イソインドール又はイソインドリンの位置２、モルホリンの位置４、及びカルバゾール又はβ-カルボリンの位置９で結合される。
【０１２７】
「アルキレン」は、１〜１８の炭素原子であって、親のアルカンと同じ又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を取り除くことによって誘導される２つの一価基センターを有する飽和した、分岐鎖又は直鎖又は環式の炭化水素基を指す。典型的なアルキレン基には、限定するものではないが、メチレン(−ＣＨ２−) １,２−エチル(−ＣＨ２ＣＨ２−)、１,３−プロピル(−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−)、１,４−ブチル(−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−)などが含まれる。
「Ｃ１−Ｃ１０アルキレン」は、式 −(ＣＨ２)１−１０−の直鎖 の飽和した炭化水素基である。Ｃ１−Ｃ１０アルキレンの例には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、及びデカレンが含まれる。
【０１２８】
「アルケニレン」は、２〜１８の炭素原子であって、親のアルケンと同じ又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を取り除くことによって誘導される２つの一価基センターを有する不飽和の、分岐鎖又は直鎖又は環式の炭化水素基を指す。典型的なアルケニレン基には、限定するものではないが、１,２−エチレン(−ＣＨ＝ＣＨ−)が含まれる。
「アルキニレン」は、２〜１８の炭素原子であって、親のアルキンと同じ又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を取り除くことによって誘導される２つの一価基センターを有する不飽和の、分岐鎖又は直鎖又は環式の炭化水素基を指す。典型的なアルキニレン基には、限定するものではないが、アセチレン(−Ｃ≡Ｃ−)、プロパルギル(−ＣＨ２Ｃ≡Ｃ−)、及び ４−ペンチニル(−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡Ｃ−)が含まれる。
【０１２９】
「アリーレン」は２つの共有結合を有するアリール基であり、以下の構造で示すようなオルト、メタ又はパラの立体配置でありうる。
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ここで、フェニル基は置換されていなくても、限定するものではないが、−Ｃ１−Ｃ８ アルキル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ８ アルキル)、−アリール、−Ｃ(Ｏ)Ｒ'、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ'、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ'、−Ｃ(Ｏ)ＮＨ２ 、−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ'、−Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｒ')２ −ＮＨＣ(Ｏ)Ｒ'、−Ｓ(Ｏ)２Ｒ'、−Ｓ(Ｏ)Ｒ'、−ＯＨ、−ハロゲン、−Ｎ３ 、−ＮＨ２、−ＮＨ(Ｒ')、−Ｎ(Ｒ')２、及び−ＣＮを含む最大４つの基にて置換されてもよく、それぞれのＲ'は、Ｈ、−Ｃ１−Ｃ８アルキル及びアリールから個々に選択される。
【０１３０】
「アリールアルキル」は、炭素原子、典型的には末端又はｓｐ３炭素原子に結合した水素原子のうちの１つがアリール基に置換している非環式アルキル基を指す。代表的なアリールアルキル基には、限定するものではないが、ベンジル、２−フェニルエタン−１−イル、２−フェニルエテン−１−イル、ナフチルメチル、２−ナフチルエタン−１−イル、２−ナフチルエテン−１−イル、ナフトベンジル、２−ナフトフェニルエタン−１−イルなどが含まれる。アリールアルキル基は６〜２０の炭素原子を含み、例えば、アルカニル、アルケニル又はアルキニル基を含む、アリールアルキル基のアルキル部分は１〜６の炭素原子であり、アリール部分は５〜１４の炭素原子である。
「ヘテロアリールアルキル」は、炭素原子、典型的には末端又はｓｐ３炭素原子に結合した水素原子のうちの１つがヘテロアリール基に置換している非環式アルキル基を指す。典型的なヘテロアリールアルキル基には、限定するものではないが、２−ベンズイミダゾリルメチル、２−フリルエチルなどが含まれる。ヘテロアリールアルキル基は６〜２０の炭素原子を含み、例えば、アルカニル、アルケニル又はアルキニル基を含む、ヘテロアリールアルキル基のアルキル部分は１〜６の炭素原子であり、ヘテロアリール部分は５〜１４の炭素原子であり、１〜３のヘテロ原子はＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される。ヘテロアリールアルキル基のヘテロアリール部分は３〜７員環を有するモノシクロ(２〜６の炭素原子)又は７〜１０員環を有するビシクロ(４〜９の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜３のヘテロ原子)、例えばビシクロ[４,５]、[５,５]、[５,６]、又は[６,６]システムであってもよい。
【０１３１】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親化合物ないし薬剤に比較して細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される本発明の化合物の前駆体又は誘導体形態を指す。例としてWilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)及びStella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、本発明の化合物及び前記の化学療法剤が含まれる。
【０１３２】
「代謝産物」は、特定の化合物又は塩の体内の代謝によって生産される生成物である。化合物の代謝産物は当分野で公知の慣例技術を使用して同定されてもよく、それらの活性は本明細書中に記載のものなどの試験を用いて決定されてもよい。このような生成物は、例えば、投与される化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、アミド分解、エステル化、エステル分解、酵素の切断などから生じうる。したがって、本発明は、代謝産物が得られるために十分な時間、本発明の化合物を哺乳動物と接触させることを含む方法によって産生される化合物を含む、本発明の化合物の代謝産物を含む。
「リポソーム」は、哺乳動物への薬剤の運搬に有用である様々な種類の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から成る小さいベシクル(小胞)である。リポソームの構成成分は一般に二重層で配置され、これは生物学的膜の脂質配置と類似している。  
【０１３３】
「リンカー」は、共有結合を含む化学的な部分又は薬剤部分に抗体を共有結合させる原子の鎖を指す。様々な実施態様では、リンカーには、二価の基、例としてalkyldiyl、aryldiyl、heteroaryldiyl、アルキロキシ(例としてポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ)及びアルキラミノ(例えばポリエチレンアミノ、JeffamineTM)の繰り返しユニットである−(ＣＲ２)ｎＯ(ＣＲ２)ｎ−などの部分、及び、スクシナート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミドを含む二酸エステル及びアミドが含まれる。
【０１３４】
「キラル」なる用語は、鏡像パートナーの重ね合わすことができない特性を有する分子を指し、一方、「アキラル」なる用語は、鏡像パートナーの重ね合わすことができる分子を指す。
「立体異性体」なる用語は、同一の化学構造を有するが、空間の原子又は基の配列に関しては異なる化合物を指す。
「ジアステレオマー」はキラリティの２以上の中心を有し、その分子が互いの鏡像でない立体異性体を指す。ジアステレオマーは、異なる物理的性質、例えば融点、沸点、分光特性及び反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動及びクロマトグラフィなどの高分解能解析手順により分離されうる。
「鏡像異性体」は、互いに重ね合わせることができない鏡像である化合物の２つの立体異性体を指す。
【０１３５】
本明細書中で用いる立体化学的定義及び慣例は、一般にS. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York；及び、Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに従う。多くの有機化合物は光学的に活性な形態で存在する。すなわち直線偏光の平面を回転する能力を有する。光学的に活性な化合物を記載する場合、接頭語ＤとＬ又はＲとＳを用いて、キラル中心(一又は複数)の周りの分子の絶対配置を示す。接頭後ｄとｌ又は(＋)と(−)は、化合物による直線偏光の回転のサインを示すために用いるものであって、(−)又は１は化合物が左旋性であることを意味する。(＋)又はｄを接頭に付した化合物は右旋性である。所定の化学構造では、互いの鏡像であることを除いて、これらの立体異性体は同一である。また、特定の立体異性体は鏡像異性体とも称され、この異性体の混合物は鏡像異性体混合物と称されることが多い。鏡像異性体の５０：５０混合物は、化学的反応又は過程において立体選別でも立体特異性でもなくなった場合に生じうるラセミ混合物又はラセミ化合物を指す。「ラセミ混合物」及び「ラセミ化合物」なる用語は、光学的活性を欠く、２つの鏡像異性種を指す。
【０１３６】
「互変異性体」又は「互変異性型」なる用語は、低エネルギー障壁を経た相互転換性である異なるエネルギーの構造異性体を指す。例えば、陽子互変異性体(別名プロト親和性互変異性体)には、陽子の移動による相互変換、例えばケト‐エノール及びイミン-エナミン異性化が含まれる。原子価互変異性体には、いくつかの結合電子の再編成による相互転換が含まれる。
【０１３７】
本明細書中で用いる「薬学的に許容可能な塩」なる表現は、本発明の化合物の薬学的に許容可能な有機塩又は無機塩を指す。例示的な塩には、限定するものではないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ素、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、琥珀酸塩、マレイン酸塩、gentisinate、フマル酸塩、グルコン酸塩、グロクロン酸塩、糖酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシレート」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩(すなわち、１,１'-メチレンビス(２-ヒドロキシ-３-ナフトエート))が含まれる。薬学的に許容可能な塩は、他の分子、例えば酢酸イオン、琥珀酸イオン又は他の対イオンの包含を伴ってもよい。対イオンは、親化合物上の荷電を安定化する任意の有機又は無機の部分でもよい。さらに、薬学的に許容可能な塩は、その構造内に複数の荷電原子を有してもよい。複数の荷電原子が薬学的に許容可能な塩の一部である場合は複数の対イオンを有しうる。したがって、薬学的に許容可能な塩は、一又は複数の荷電原子及び／又は一又は複数の対イオンを有してもよい。
【０１３８】
本発明の化合物が塩基性である場合、当分野で有用な任意の好適な方法、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、リン酸などといった無機酸による遊離塩基の処理、又は酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、ピラノシジル酸、例としてグルクロン酸又はガラクツロン酸、αヒドロキシ酸、例えばクエン酸又は酒石酸、アミノ酸、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸、芳香族酸、例えば安息香酸又はニッケイ酸、スルホン酸、例えばｐ-トルエンスルホン酸又はエタンスルホン酸などといった有機酸による遊離塩基の処理によって調製されてもよい。  
本発明の化合物が酸である場合、所望の薬学的に許容可能な塩は、任意の好適な方法、例えば、アミン(一次、二次又は三次)、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物などといった無機塩基又は有機塩基による遊離酸の処理によって調製されてもよい。好適な塩の例示的な例には、限定するものではないが、アミノ酸、例えばグリシン及びアルギニン、アンモニア、一次、二次、三次のアミン、及び環状アミン、例えばピペリジン、モルホリン及びピペラジンから得られる有機塩、並びにナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム及びリチウムから得られる無機塩が含まれる。
【０１３９】
「薬学的に許容可能な」という表現は、物質又は組成物が製剤を含む他の成分と、及び／又は処置される哺乳動物と化学的及び／又は毒物学的に適合性がなければならないことを表す。
「溶媒和化合物」は、一又は複数の溶媒分子と本発明の化合物との結合又は複合体を指す。溶媒和化合物を形成する溶媒の例には、限定するものではないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンが含まれる。「水和物」なる用語は溶媒分子が水である場合の複合体を指す。
【０１４０】
「保護基」なる用語は、化合物上の他の官能基と反応する間に特定の官能性をブロック又は保護するために一般的に用いられる置換を指す。例えば、「アミノ-保護基」は、化合物内のアミノ官能性をブロックし又は保護するアミノ基が付着している置換基である。望ましいアミノ保護基には、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ-ブトキシカルボニル(ＢＯＣ)、ベンジルオキシカルボニル(ＣＢＺ)及び９-フルオレニルメチレンオキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)が含まれる。同様に、「ヒドロキシ-保護基」は、ヒドロキシ官能性をブロック又は保護するヒドロキシ基の置換基を指す。適切な保護基には、アセチル及びシリルが含まれる。「カルボキシ-保護基」は、カルボキシ官能性をブロック又は保護するカルボキシ基の置換基を指す。一般的なカルボキシ保護基には、フェニルスルホニルエチル、シアノエチル、２-(トリメチルシリル)エチル、２-(トリメチルシリル)エトキシメチル、２-(ｐ-トルエンスルホニル)エチル、２-(ｐ-ニトロフェニルスルフェニル)エチル、２-(ジフェニルホスフィノ)-エチル、ニトロエチルなどが含まれる。保護基の一般的な解説及びその使用については、T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991を参照のこと。
「脱離基」は、他の官能基によって置換されうる官能基を指す。特定の脱離基は当分野で公知であり、例として、限定するものではないが、ハロゲン化物(例えば、クロライド、ブロマイド、イオジド)、メタンスルホニル (メシル)、ｐ-トルエンスルホニル (トシル)、トリフルオロメチルスルホニル (トリフレート)、及びトリフルオロメチルスルホネートなどがある。
【０１４１】
省略記号
リンカー成分：
ＭＣ＝６-マレイミドカプロイル
Ｖａｌ−Ｃｉｔ又は「ｖｃ」＝バリン−シトルリン(プロテアーゼにより切断可能なリンカーの例示的なジペプチド)
シトルリン＝２-アミノ-５ウレイドペンタン酸
ＰＡＢ＝ｐ-アミノベンジルオキシカルボニル(「自己犠牲(self immolative)」リンカー成分の例)
Ｍｅ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ＝Ｎ−メチル−バリン−シトルリン(リンカーペプチド結合が、カテプシンＢによる切断を阻害するように修飾されているもの)
ＭＣ(ＰＥＧ)６−ＯＨ＝マレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール(抗体システインに結合しうる)
細胞障害性剤：
ＭＭＡＥ＝モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＷ７１８)
ＭＭＡＦ＝薬剤のＣ末端にフェニルアラニンを有するアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)の変異体(ＭＷ７３１．５)
ＭＭＡＦ−ＤＭＡＥＡ＝Ｃ末端のフェニルアラニンに対するアミド連結にＤＭＡＥＡ(ジメチルアミノエチルアミン)を有するＭＭＡＦ(ＭＷ８０１．５)
ＭＭＡＦ−ＴＥＧ＝フェニルアラニンにエステル化したテトラエチレングリコールを有するＭＭＡＦ
ＭＭＡＦ−ＮｔＢｕ＝ＭＭＡＦのＣ末端にアミドとして結合した、Ｎ-ｔ-ブチル
ＤＭ１＝Ｎ(２')-デアセチル-Ｎ(２')−(３-メルカプト-１-オキソプロピル)-メイタンシン
ＤＭ３＝Ｎ(２')-デアセチル-Ｎ２-(４-メルカプト-１-オキソペンチル)-メイタンシン
ＤＭ４＝Ｎ(２')-デアセチル-Ｎ２-(４-メルカプト-４-メチル-１-オキソペンチル)-メイタンシン
【０１４２】
さらに、略語は以下の通りである：ＡＥはアウリスタチンＥであり、ＢｏｃはＮ(ｔブトキシカルボニル)であり、ｃｉｔはシトルリンであり、ｄａｐはドラプロイン(dolaproine)であり、ＤＣＣは１,３-ジシクロヘキシルカルボジイミドであり、ＤＣＭはジクロロメタンであり、ＤＥＡはジエチルアミンであり、ＤＥＡＤはジエチルアゾジカルボキシレートであり、ＤＥＰＣはジエチルホスホリルシアニダートであり、ＤＩＡＤはジイソプロピルアゾジカルボキシレートであり、ＤＩＥＡはＮ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミンであり、ｄｉｌはドライソロイシンであり、ＤＭＡはジメチルアセトアミドであり、ＤＭＡＰは４-ジメチルアミノピリジンであり、ＤＭＥはエチレングリコールジメチルエーテル(又は１,２-ジメトキシエタン)であり、ＤＭＦはＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミドであり、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドであり、ｄｏｅはドラフェニン(dolaphenine)であり、ｄｏｖはＮ,Ｎ-ジメチルバリンであり、ＤＴＮＢは５,５'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸)であり、ＤＴＰＡはジエチレントリアミンペンタ酢酸であり、ＤＴＴはジチオトレイトールであり、ＥＤＣＩは１-(３-ジメチルアミノプロピル)-３-エチルカルボジイミド塩酸塩であり、ＥＥＤＱは、２-エトキシ-１-エトキシカルボニル-１,２-ジヒドロキノリンであり、ＥＳ-ＭＳはエレクトロスプレー質量分析であり、ＥｔＯＡｃは酢酸エチルであり、ＦｍｏｃはＮ-(９-フルオレニルメトキシカルボニル)であり、ｇｌｙはグリシンであり、ＨＡＴＵは、Ｏ-(７-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、ＨＯＢｔは１-ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィであり、ｉｌｅはイソロイシンであり、ｌｙｓはリジンであり、ＭｅＣＮ(ＣＨ３ＣＮ)はアセトニトリルであり、ＭｅＯＨはメタノールであり、Ｍｔｒは４-アニシルジフェニルメチル(又は４-メトキシトリチル)であり、(１Ｓ, ２Ｒ)-(＋)-ノルエフェドリンではなく、ＰＢＳはリン酸塩緩衝生理食塩水(ｐＨ７．４)であり、ＰＥＧはポリエチレングリコールであり、Ｐｈはフェニルであり、Ｐｎｐはｐ-ニトロフェニルであり、ＭＣは６-マレイミドカプロイルであり、ｐｈｅはＬ-フェニルアラニンであり、ＰｙＢｒｏｐは、ブロモトリス-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェイトであり、ＳＥＣはサイズ排除クロマトグラフィであり、Ｓｕはスクシンイミドであり、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ＴＬＣは薄層クロマトグラフィであり、ＵＶは紫外線であり、ｖａｌはバリンである。
【０１４３】
「遊離したシステインアミノ酸」は、親抗体内に改変されているシステインアミノ酸残基を指し、チオール官能基(−ＳＨ)を有し、分子内ないし分子間ジスルフィド架橋として対形成しない。
「チオール反応値」なる用語は、遊離したシステインアミノ酸の反応性の定量的特徴づけである。チオール反応値は、チオール反応試薬と反応するシステイン改変抗体の遊離したシステインアミノ酸の割合であって、１の最大値に変換される。例えば、ビオチン−マレイミド試薬などのチオール反応試薬と１００％の収率で反応してビオチン標識抗体を形成するシステイン改変抗体の遊離システインアミノ酸はチオール反応値が１．０となる。チオール反応試薬と８０％の収率で反応する同じ又は異なる親抗体内で改変された他のシステインアミノ酸はチオール反応値が０．８となる。チオール反応試薬と完全に反応しない同じ又は異なる親抗体内で改変された他のシステインアミノ酸はチオール反応値が０となる。特定のシステインのチオール反応値の測定は、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析、液体クロマトグラフィ、オートラジオグラフィ、又は他の定量的な分析試験によって行ってもよい。
【０１４４】
「親抗体」は、一又は複数のアミノ酸残基が一又は複数のシステイン残基に置き換わっているアミノ酸配列を含む抗体である。親抗体は、天然の又は野生型の配列を含んでいてもよい。親抗体は、他の天然、野生型又は修飾した形態の抗体と比較して既存のアミノ酸配列修飾(例えば付加、欠失及び／又は置換)を有してもよい。親抗体は、対象の標的抗原、例えば生物学上重要なポリペプチドに対するものであってもよい。また、非ポリペプチド抗原(例えば腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５０９１１７８号を参照)に対する抗体も考慮される。
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【０１４５】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
Ａ．抗ＴＡＨＯ抗体
一実施態様では、本発明は、ここで治療薬としての用途が見出され得る抗ＴＡＨＯ抗体を提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
【０１４６】
１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質へ、関連する抗原（特に、合成ペプチドが用いられる場合）を結合させるために有用である。例えば、この抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて結合させることができる。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０１４７】
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合のパートナーとも呼ばれる）の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【０１４８】
好ましい融合のパートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合しない親細胞に対して選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１およびＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【０１４９】
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、例えばマウスへの細胞の腹腔内注射によって、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティクロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロースを用いる）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等のような常套的な抗体精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【０１５０】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）の配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾してキメラ又は融合抗体ポリペプチドを生成することができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０１５１】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-ＴＡＨＯ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１５２】
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びＨＡＭＡ反応(ヒト抗-マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク（ＦＲ）をヒト化抗体のために受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１５３】
ヒト化抗ＴＡＨＯ抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫結合体を生成するために、状況に応じて一又は複数の細胞傷害剤(類)と結合していてもよい抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷ＩｇＧ１抗体であってもよい。
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（全てジェンファーム(GenPharm)）；同５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。
【０１５４】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
上述したように、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。
【０１５５】
４．抗体断片
ある状況下では、抗体全体よりも、抗体断片を用いることに利点がある。より小さな大きさの断片によって迅速なクリアランスが可能となり、固形腫瘍への接近の改良につながり得る。
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、すべて大腸菌で発現させ分泌させることができ、従って、大量のこれら断片の産生が容易となった。抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。インビボ半減期が増した、サルベージレセプター結合性エピトープ残基を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２が、米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【０１５６】
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＴＡＨＯタンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位とＴＡＨＯ結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＴＡＨＯアームは、ＴＡＨＯ-発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させ局在させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＴＡＨＯを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＴＡＨＯ結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公開第９６／１６６７３号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５８３７２３４号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＣＤ３抗体を教示するものである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティクロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１５７】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖の結合にあまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１５８】
米国特許第５７３１１６８号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
【０１５９】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０１６０】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１６１】
６．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
【０１６２】
７．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【０１６３】
８．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原-依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存細胞障害性（ＣＤＣ）を向上させることは望ましい。これは、抗体のＦｃ領域で一又は複数のアミノ酸置換を誘導することによりなされうる。あるいは又はさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes,  B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【０１６４】
９．イムノコンジュゲート(免疫抱合体)
また、本発明は、化学療法剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む、イムノコンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される)に関する。
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは抗体と化学療法剤又は他の毒素を含む。こういったイムノコンジュゲートの生成に有用な化学治療薬を上記に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣｌ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098 (1987)に記載されているように調製することができる。炭素-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合(コンジュゲート)のためのキレート剤の例である。国際公開公報第１９９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、アウリスタチンペプチド、例えばモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)(ドラスタチンの合成アナログ)、メイタンシノイド、例えばＤＭ１、トリコテセン、及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体もまた、ここで考察される。
【０１６５】
例示的なイムノコンジュゲート−抗体-薬剤コンジュゲート
本発明のイムノコンジュゲート(又は「抗体-薬剤コンジュゲート」(「ＡＤＣ」))は、以下の式Ｉのものであり、任意のリンカー(Ｌ)を介して、一又は複数の薬剤部分(Ｄ)に抗体がコンジュゲート(すなわち共有結合)しているものである。ＡＤＣはチオＭＡｂ薬剤コンジュゲート(「ＴＤＣ」)を含んでもよい。
2011515069.tif 000025
したがって、抗体は直接又はリンカーを介して薬剤にコンジュゲートしうる。式Ｉでは、ｐは抗体当たりの薬剤部分の平均数であり、例えば１抗体当たりおよそ１〜およそ２０の薬剤部分、ある実施態様では、抗体当たり１〜およそ８の薬剤部分の範囲でありうる。本発明には、式Ｉの抗体−薬剤化合物の混合物を含有する組成物であって、抗体当たりの平均薬剤負荷がおよそ２からおよそ５、又はおよそ３からおよそ４であるものが含まれる。
【０１６６】
ａ．例示的なリンカー
リンカーは、一又は複数のリンカー成分を含みうる。例示的なリンカー成分には、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」又は「ｖｃ」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボニル(「ＰＡＢ」)、及びリンカー試薬とのコンジュゲートから生じるもの：Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)が含まれる。様々なリンカー成分が当分野で公知であり、そのいくつかを以下に記載する。
リンカーは、細胞内での薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸に弱いリンカー(例えばヒドラゾン)、プロテアーゼ感受性(例えばペプチダーゼ感受性)リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari等，Cancer Research 52:127-131[1992]；米国特許第５２０８０２０号)を使用してもよい。
【０１６７】
ある実施態様では、リンカーは以下の式ＩＩに示される通りである。
2011515069.tif 000026
このとき、Ａはストレッチャーユニットであり、０から１の整数であり、Ｗはアミノ酸ユニットであり、ｗは０から１２の整数であり、Ｙはスペーサーユニットであり、ｙは０、１又は２であり、Ａｂ、Ｄ及びｐは式Ｉについて先に定義した通りである。このようなリンカーの例示的な実施態様は、米国公開２００５−０２３８６４９Ａ１に記述される。その内容は出典明記によって特別に本明細書中に援用される。
【０１６８】
いくつかの実施態様では、リンカー成分は、抗体を他のリンカー成分又は薬剤部分に連結する「ストレッチャーユニット」を含んでもよい。例示的なストレッチャーユニットを以下に示す(波線は抗体への共有結合の部位を示す)。
2011515069.tif 000027
【０１６９】
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸ユニットを含みうる。そのような実施態様では、アミノ酸ユニットにより、プロテアーゼによるリンカーの切断が可能となり、それによってリソソーム酵素などの細胞内プロテアーゼへの曝露によってイムノコンジュゲートからの薬剤放出が促される。例としてDoronina等 (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784を参照。例示的なアミノ酸ユニットには、限定するものではないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドには、バリン-シトルリン(ｖｃ又はｖａｌ-ｃｉｔ)、アラニン-フェニルアラニン(ａｆ又はａｌａ-ｐｈｅ)；フェニルアラニン-リジン(ｆｋ又はｐｈｅ-ｌｙｓ)；又はＮ-メチル-バリン-シトルリン(Ｍｅ-ｖａｌ-ｃｉｔ)が含まれる。例示的なトリペプチドには、グリシン-バリン-シトルリン(ｇｌｙ-ｖａｌ-ｃｉｔ)及びグリシン-グリシン-グリシン(ｇｌｙ-ｇｌｙ-ｇｌｙ)が含まれる。アミノ酸ユニットは、天然に生じるアミノ酸残基、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含みうる。アミノ酸ユニットは設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
【０１７０】
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸ユニットを含みうる。そのような実施態様では、アミノ酸ユニットにより、プロテアーゼによるリンカーの切断が可能となり、それによってリソソーム酵素などの細胞内プロテアーゼへの曝露によってイムノコンジュゲートからの薬剤放出が促される。例としてDoronina等 (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784を参照。例示的なアミノ酸ユニットには、限定するものではないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドには、バリン-シトルリン(ｖｃ又はｖａｌ-ｃｉｔ)、アラニン-フェニルアラニン(ａｆ又はａｌａ-ｐｈｅ)；フェニルアラニン-リジン(ｆｋ又はｐｈｅ-ｌｙｓ)；又はＮ-メチル-バリン-シトルリン(Ｍｅ-ｖａｌ-ｃｉｔ)が含まれる。例示的なトリペプチドには、グリシン-バリン-シトルリン(ｇｌｙ-ｖａｌ-ｃｉｔ)及びグリシン-グリシン-グリシン(ｇｌｙ-ｇｌｙ-ｇｌｙ)が含まれる。アミノ酸ユニットは、天然に生じるアミノ酸残基、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含みうる。アミノ酸ユニットは設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
【０１７１】
いくつかの実施態様では、リンカー成分は、直接又は、ストレッチャーユニット及び／又はアミノ酸ユニットにより、抗体を薬剤部分に連結する「スペーサー」ユニットを含みうる。スペーサーユニットは、「自己犠牲」又は「非自己犠牲」であってもよい。「非自己犠牲」のスペーサーユニットは、ＡＤＣの酵素的な(例えばタンパク質分解性の)切断によりスペーサーユニットの一部又はすべてが薬剤部分に結合したままとなるものである。非自己犠牲のスペーサーユニットの例には、限定するものではないが、グリシンスペーサーユニット及びグリシン-グリシンスペーサーユニットが含まれる。また、配列特異的な酵素的切断の影響を受けるペプチド性スペーサーの他の組合せも考慮される。例えば、グリシン-グリシンスペーサーユニットを含有するＡＤＣの腫瘍細胞関連のプロテアーゼによる酵素切断によって、残りのＡＤＣからグリシン-グリシン-薬剤部分が放出されるであろう。そのような実施態様では、グリシン-グリシン-薬剤部分は腫瘍細胞の異なる加水分解処理を受け、それによってグリシン-グリシンスペーサーユニットを薬剤部分から分離する。
【０１７２】
「自己犠牲」のスペーサーユニットは、異なる加水分解処置を経ずに薬剤部分を放出させる。ある実施態様では、リンカーのスペーサーユニットはｐ-アミノベンジルユニットが含まれる。このような実施態様では、ｐ-アミノベンジルアルコールはアミド結合によりアミノ酸ユニットに結合し、カルバメート、メチルカルバメート又はカルボネートがベンジルアルコールと細胞障害性剤との間に作られる。例としてHamann等 (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103を参照。一実施態様では、スペーサーユニットはｐ-アミノベンジルオキシカルボニル(ＰＡＢ)である。ある実施態様では、ｐ-アミノベンジルユニットのフェニレン部分はＱｍに置き換えられ、このＱは-Ｃ１-Ｃ８アルキル、-Ｏ-(Ｃ１-Ｃ８アルキル)、-ハロゲン、-ニトロ、又は-シアノであり、そしてｍは０〜４の範囲の整数である。さらに、自己犠牲のスペーサーユニットの例には、限定するものではないが、ｐ-アミノベンジルアルコールに電子工学的に類似している芳香族化合物(例として米国特許公開第２００５／０２５６０３０号Ａ１を参照)、例えば２-アミノイミダゾール-５-メタノール誘導体(Hay等 (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237)及びオルソ-ないしはパラ-アミノベンジルアセタール類が含まれる。アミド結合加水分解により環化されるスペーサー、例として、置換されたないしは置換されていない４-アミノ酪酸アミド類(Rodrigues等, Chemistry Biology, 1995, 2, 223)；適切に置換されたビシクロ[２.２.１]及びビシクロ[２.２.２]環システム(Storm,等, J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815)；及び、２-アミノフェニルプロピオン酸アミド類(Amsberry,等, J. Org. Chem., 1990, 55, 5867)が用いられうる。グリシンのａ-位置で置換されているアミン含有薬剤の除去(Kingsbury,等, J. Med. Chem., 1984, 27, 1447)もまたＡＤＣに有用な自己犠牲のスペーサーの例である。
【０１７３】
一実施態様では、以下に示すように、スペーサーユニットは分岐したビス(ヒドロキシメチル)スチレン(ＢＨＭＳ)ユニットであり、これを用いて複数の薬剤の取り込みと放出が行われうる。
2011515069.tif 000028
ここで、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ８アルキル)、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数であり、ｎは０又は１であり、そして、ｐは１〜およそ２０の範囲である。
【０１７４】
他の実施態様では、リンカーＬは、分岐状の、多機能リンカー成分により一又は複数の薬剤成分が抗体に共有結合するための樹枝型のリンカーであってもよい(Sun等 (2002) Bioorganic and; Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等 (2003) Bioorganic and; Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。樹枝状のリンカーは抗体に対する薬剤のモル比を増す、すなわち負荷することができ、これはＡＤＣの力価に関連がある。したがって、システイン改変抗体は１つの反応性のシステインチオール基のみを有する場合、多くの薬剤成分が樹枝状のリンカーを介して付着されうる。
例示的なリンカーは、上記いずれかの一又は複数のリンカー成分を含んでもよい。ある実施態様では、リンカーは、以下のＡＤＣ  式IIにおいて括弧で示す。
2011515069.tif 000029
ストレッチャー、スペーサー及びアミノ酸ユニットを含むリンカー成分は、例えば米国特許公開第２００５-０２３８６４９号Ａ１に記載のものなど、当分野で公知の方法によって合成されうる。
【０１７５】
ｂ．例示的な薬剤部分
(1) メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体(完全長又は断片)を含んでなる。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号；同4,248,870号；同4,256,746号；同4,260,608号；同4,265,814号；同4,294,757号；同4,307,016号；同4,308,268号；同4,308,269号；同4,309,428号；同4,313,946号；同4,315,929号；同4,317,821号；同4,322,348号；同4,331,598号；同4,361,650号；同4,364,866号；同4,424,219号；同4,450,254号；同4,362,663号；及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対するジスルフィド及び非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
【０１７６】
メイタンシノイド薬剤部分としての使用に適切なメイタンシン化合物は当分野で周知であり、公知の方法に従って天然の供給源から単離してもよいし、又は遺伝子工学技術及び発酵を用いて産生してもよい(米国特許第６７９０９５２号；米国公開特許２００５／０１７０４７５；Yu等 (2002) PNAS 99:7968-7973を参照)。また、マイタンシノール及びマイタンシノール類似体は、公知の方法に従って合成して調製されてもよい。
例示的なメイタンシノイド薬剤部分には、修飾した芳香族環を有するもの、例えば、C-19-デクロロ(米国特許第４２５６７４６号)(アンサマイトシンＰ２のリチウムアルミニウム水素化物の還元によって調製される)；Ｃ−２０−ヒドロキシ(又はＣ−２０−デメチル) ＋／−Ｃ−１９−デクロロ(米国特許第４３６１６５０号及び同第４３０７０１６号)(ストレプトミセス属ないしはアクチノミセス属を用いた脱メチル化又はＬＡＨを用いた脱塩素により調製される)；及びＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシロキシ(−ＯＣＯＲ)、＋／−デクロロ(米国特許第４２９４７５７号)(アシル塩化物を用いたアシル化により調製される)、及び他の位置に修飾を有するものが含まれる。
【０１７７】
また、例示的なメイタンシノイド薬剤部分には、修飾を有するもの、例えば、Ｃ−９−ＳＨ(米国特許第４４２４２１９号)(Ｈ２Ｓ又はＰ２Ｓ５を有するメイタンシノールの反応により調製される)；Ｃ−１４−アルコキシメチル(デメトキシ／ＣＨ２ ＯＲ)(米国特許第４３３１５９８号)；Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシロキシメチル(ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ) (米国特許第４４５０２５４号)；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシロキシ(米国特許第４３６４８６６号)(ストレプトミセス属によるメイタンシノールの変換によって調製される)；Ｃ−１５−メトキシ(米国特許第４３１３９４６号及び同第４３１５９２９号)(トレウィア ヌドロフローラ(Trewia nudlflora)より単離)；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル(米国特許第４３６２６６３号及び第４３２２３４８号)(ストレプトミセス属によるメイタンシノールの脱メチル化により調製される)；及び、４,５−デオキシ(米国特許第４３７１５３３号)(メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される)が含まれる。
【０１７８】
結合の種類に応じて、メイタンシン化合物上の多くの位置は結合位置として有用であることが知られている。例えば、エステル結合を形成するために、水酸基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルによって修飾されたＣ−１４位置、水酸基によって修飾されたＣ−１５位置、及び水酸基を有するＣ−２０位置はすべて適する(米国特許第５２０８０２０号；ＵＳ ＲＥ３９１５１；米国特許第６９１３７４８号；米国特許第７３６８５６５号；米国公開特許２００６／０１６７２４５；米国公開特許２００７／００３７９７２)。
メイタンシノイド薬剤成分は、以下の構造を有するものを含む。
2011515069.tif 000030
ここで、波線は、ＡＤＣのリンカーへのメイタンシノイド薬剤成分の硫黄原子の共有結合を示す。Ｒは、独立してＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであってもよい。硫黄原子にアミド基を付着しているアルキレン鎖は、メタニル、エタニル又はプロピルであってもよく、すなわち、ｍは１、２又は３である(米国特許第６３３４１０号；米国特許第５２０８０２０号；米国特許第７２７６４９７第；Chari et al (1992) Cancer Res. 52: 127-131；Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623)。
【０１７９】
メイタンシノイド薬剤成分のすべての立体異性体は、本発明の化合物炭素、すなわちＤのキラルの炭素でのＲとＳ配位の任意の組合が考慮される。一実施態様では、メイタンシノイド薬剤成分は、以下の立体化学を有するであろう。
2011515069.tif 000031
メイタンシノイド薬剤成分の例示的な実施態様には、以下の構造を有するＤＭ１；ＤＭ３；及びＤＭ４が含まれる。
2011515069.tif 000032
ここで、波線は、抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー(Ｌ)への薬剤の硫黄原子の共有結合を示す。(国際公開第２００５／０３７９９２号；米国特許公開２００５／０２７６８１２号Ａ１)。
【０１８０】
他の例示的メイタンシノイド抗体−薬剤コンジュゲートは以下のような構造と略記号を有している。(ここでＡｂは抗体であり、ｐは１〜およそ８である。)
2011515069.tif 000033
【０１８１】
ＤＭ１が抗体のチオール基にＢＭＰＥＯリンカーにより連結されている例示的な抗体−薬剤コンジュゲートは、以下のような構造及び略記号を有する。
2011515069.tif 000034
ここで、Ａｂは抗体であり、ｎは０、１又は２であり、そして、ｐは１、２、３又は４である。
【０１８２】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【０１８３】
治療的インデックスを改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドを、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体にコンジュゲートさせた。メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えばErickson, et al (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433；米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、米国特許公開第２００５／０２７６８１２号Ａ１、及び欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１に開示されており、その開示内容は出典を明示してここに援用する。
【０１８４】
メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えばErickson, et al (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433；米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、米国特許公開第２００５／０２７６８１２号Ａ１、及び欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１に開示されており、その開示内容は出典を明示してここに援用する。
抗ＴＡＨＯ抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗ＴＡＨＯ抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第5,208,020号(この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)を参照。メイタンシノイドは公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5,208,020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されており、例えばメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第5,208,020号又は欧州特許第0425235 B1号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び米国特許公開第2005/016993号A1(これらの開示内容は出典明記により特別に援用される)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、米国特許公開第2005/0276812号A1, "Antibody-drug conjugates and Methods."に開示されるように調製されうる。リンカーには、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれる。更なるリンカーを本願明細書中に記載し、例示する。
【０１８５】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤は、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)又はＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])を含む。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。一実施態様では、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０１８６】
(2) アウリスタチン類及びドラスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体ないしは誘導体、例えばアウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号；同第5780588号)にコンジュゲートした抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(US 5663149)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開第02/088172号)。
例示的なアウリスタチンの実施態様には、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦが含まれる(米国公開特許２００５／０２３８６４９、２００４年３月２８日に公開されたSenter等, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に援用される)。
【０１８７】
ペプチド性薬剤部分は以下の式ＤＥ及びＤＦから選択されうる。
2011515069.tif 000035
ここで、ＤＥ及びＤＦの波線は、独立して各々の位置で、抗体又は抗体−リンカー成分への共有結合部位を示す。
Ｒ２は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル-アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物)、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環)から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物)、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環)から選択され、
Ｒ５は、Ｈ及びメチルから選択され、
又はＲ４及びＲ５は共同で環状炭素を形成し、Ｒａ及びＲｂがＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル及びＣ３−Ｃ８炭素環式化合物からそれぞれ選択される式−(ＣＲａＲｂ)ｎ−を有し、ｎは２、３、４、５及び６から選択され、
Ｒ６は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物)、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環)から選択され、
各々のＲ８は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環及びＯ−(Ｃ１−Ｃ８アルキル)からそれぞれ選択され、
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ１０は、アリール又はＣ３−Ｃ８ヘテロ環から選択され、 
ＺはＯ、Ｓ、ＮＨ、又はＲ１２がＣ１−Ｃ８アルキルであるＮＲ１２であり、
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環、−(Ｒ１３Ｏ)ｍ−Ｒ１４、又は−(Ｒ１３Ｏ)ｍ−ＣＨ(Ｒ１５)２から選択され、 
ｍは、１〜１０００の範囲の整数であり、
Ｒ１３はＣ２−Ｃ８アルキルであり、
Ｒ１４は、Ｈ又はＣ１−Ｃ８アルキルであり、
各々のＲ１５の発生は、独立してＨ、ＣＯＯＨ、−(ＣＨ２)ｎ−Ｎ(Ｒ１６)２、−(ＣＨ２)ｎ−ＳＯ３Ｈ、又は−(ＣＨ２)ｎ−ＳＯ３−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、 
各々のＲ１６の発生は、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、又は−(ＣＨ２)ｎ−ＣＯＯＨであり、 
Ｒ１８は、−Ｃ(Ｒ8)２−Ｃ(Ｒ8)２−アリール、−Ｃ(Ｒ8)２−Ｃ(Ｒ8)２(Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環)、及び−Ｃ(Ｒ8)２−Ｃ(Ｒ8)２(Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物)から選択され、そして、ｎは０から６の範囲の整数である。
【０１８８】
一実施態様では、Ｒ３、Ｒ４及びＲ７は、それぞれイソプロピル又はｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ５は-Ｈ又はメチルである。ある例示的な実施態様では、Ｒ３及びＲ４は各々イソプロピルであり、Ｒ５は-Ｈであり、そしてＲ７はｓｅｃ−ブチルである。
さらに他の実施態様では、Ｒ２及びＲ６はそれぞれメチルであり、Ｒ９は−Ｈである。
さらに他の実施態様では、各々のＲ８の発生は-ＯＣＨ３である。
例示的な実施態様では、Ｒ３及びＲ４は各々イソプロピルであり、Ｒ２及びＲ６はそれぞれメチルであり、Ｒ５は-Ｈであり、Ｒ７はｓｅｃ−ブチルであり、各々のＲ８の発生は−ＯＣＨ３であり、そしてＲ９は−Ｈである。一実施態様では、Ｚは−Ｏ−又は−ＮＨ−である。
一実施態様では、Ｒ１０はアリールである。
ある例示的な実施態様では、Ｒ１０は−フェニールである。
ある例示的な実施態様では、Ｚが−Ｏ−の場合、Ｒ１１は−Ｈ、メチル又はｔ−ブチルである。
一実施態様では、Ｚが−ＮＨである場合に、Ｒ１１は−ＣＨ(Ｒ１５)２である。このＲ１５は−(ＣＨ２)ｎ−Ｎ(Ｒ１６)２であり、Ｒ１６は−Ｃ１−Ｃ８アルキル又は−(ＣＨ２)ｎ−ＣＯＯＨである。
他の実施態様では、Ｚが−ＮＨである場合に、Ｒ１１は−ＣＨ(Ｒ１５)２である。このＲ１５は−(ＣＨ２)ｎ−ＳＯ３Ｈである。
【０１８９】
式ＤＥの例示的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＥである。ここで、波線は抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー(Ｌ)への共有結合を示す。
2011515069.tif 000036
式ＤＦの例示的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＦである。ここで、波線は抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー(Ｌ)への共有結合を示す(米国特許公開第２００５／０２３８６４９号及びDoronina等 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124)を参照)。
2011515069.tif 000037
【０１９０】
他の例示的な実施態様には、ペンタペプチドアウリスタチン薬剤成分のＣ末端にフェニルアラニンカルボキシ修飾を有するモノメチルバリン化合物(国際公開２００７／００８８４８)及びペンタペプチドアウリスタチン薬剤成分のＣ末端にフェニルアラニン側鎖修飾を有するモノメチルバリン化合物(国際公開２００７／００８６０３)が含まれる。
他の薬剤部分には以下のＭＭＡＦ誘導体が含まれる。ここで、波線は抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー(Ｌ)への共有結合を示す。
2011515069.tif 000038
2011515069.tif 000039
2011515069.tif 000040
【０１９１】
一態様では、限定するものではないが、上記のようなトリエチレングリコールエステル(ＴＥＧ)を含む親水基はＲ１１で薬剤部分に結合することができる。ある特定の理論に縛られるものではないが、親水基は薬剤部分の内在化及び非凝集に存在する。
アウリスタチン／ドラスタチン又はその誘導体を含む式IのＡＤＣの例示的な実施態様は、米国特許公開第２００５-０２３８６４９号Ａ１及びDoronina等 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124に記載されており、これは出典明記によってここに明確に援用される。ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦと様々なリンカー成分を含む式IのＡＤＣの例示的な実施態様は、以下の構造及び略記号を有する(ここで、「Ａｂ」は抗体であり、ｐは１〜およそ８であり、「Ｖａｌ−Ｃｉｔ」はバリン-シトルリンジペプチドであり、そして「Ｓ」は硫黄原子である。
2011515069.tif 000041
2011515069.tif 000042
【０１９２】
さらに、ＭＭＡＦと様々なリンカー成分を含む式IのＡＤＣの例示的な実施態様には、Ａｂ-ＭＣ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ及びＡｂ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦが含まれる。興味深いことに、タンパク質分解性の切断を受けないリンカーによって抗体に結合しているＭＭＡＦを含むイムノコンジュゲートは、タンパク質分解で切断可能なリンカーによって抗体に結合しているＭＭＡＦを含むイムノコンジュゲートに比べて活性を有することが示されている。Doronina等 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124を参照。このような場合、薬剤放出は細胞内の抗体分解に影響を受けると思われる。同上。
一般的に、ペプチドベースの薬剤部分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤部分は、米国特許公開第2005-0238649号A1；米国特許公開第5635483号；米国特許第5780588号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863；及びDoronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784の方法に従って調製されうる。
特に、式ＤＦのアウリスタチン／ドラスタチン薬剤部分、例えばＭＭＡＦ及びその誘導体は、米国特許公開第２００５-０２３８６４９号Ａ１及びDoronina等 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124に記載の方法を用いて調製されうる。式ＤＥのアウリスタチン／ドラスタチン薬剤部分、例えばＭＭＡＥ及びその誘導体は、Doronina等 (2003) Nat. Biotech. 21:778-784に記載の方法を用いて調製されうる。薬剤−リンカー部分であるＭＣ-ＭＭＡＦ、ＭＣ-ＭＭＡＥ、ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ、及びＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥは、例えばDoronina等 (2003) Nat. Biotech. 21:778-784、及び米国特許公開第２００５／０２３８６４９号Ａ１に記載のような常套的な方法によって都合よく合成され、その後対象の抗体にコンジュゲートされてもよい。
【０１９３】
(3) カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートした抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体がコンジュゲート可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１９４】
ｃ．他の細胞障害性剤
抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同第５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【０１９５】
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
腫瘍の選択的な破壊のため、イムノコンジュゲートは高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。イムノコンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
【０１９６】
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１９７】
ある実施態様では、コンジュゲートは、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５を参照)を抗癌剤などの活性な薬剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へコンジュゲートした抗体を含みうる。このようなコンジュゲートは抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ療法(「ＡＤＥＰＴ」)に有用である。抗体にコンジュゲートされうる酵素には、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ；β-ラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβ-ラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。酵素が、当分野で周知の組み換えＤＮＡ技術によって抗体に共有結合されてもよい。例として、Neuberger等, Nature 312:604-608 (1984)を参照。
【０１９８】
ｄ．薬剤ローディング(負荷、Drug Loading)
薬剤ローディングは、式Iの分子において、抗体当たりの薬剤部分の平均数であるｐによって表される。薬剤ローディングは抗体当たり１〜２０の薬剤部分(Ｄ)の範囲であってもよい。式IのＡＤＣには、１から２０の薬剤部分の範囲でコンジュゲートされる抗体の集まりが含まれる。コンジュゲート反応からのＡＤＣの調製において抗体当たりの薬剤部分の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ及びＨＰＬＣなどの従来の方法によって特徴付けられうる。ｐに関するＡＤＣの定量的分布も決定されうる。いくつかの場合では、ｐが他の薬剤ローディングを有するＡＤＣの一定の値である場合の均質なＡＤＣの分離、精製及び特徴づけは、逆相ＨＰＬＣ又は電気泳動などの手段によって達成されうる。ゆえに、式Ｉ抗体−薬剤コンジュゲートの薬学的製剤は、１、２、３、４又はそれ以上の薬剤成分に結合した抗体とのコンジュゲートの異種性混合物であってもよい。
ある抗体−薬剤コンジュゲートでは、ｐは抗体上の結合部位の数によって限定されうる。例えば、結合がシステインチオールである場合、上記の例示的な実施態様のように、抗体はたった１つ又は複数のシステインチオール基を有してもよいし、結合しうるリンカーによってたった１つ又は複数の十分に活性なチオール基を有してもよい。ある実施態様では、薬剤ローディングが高いと、例えばｐ＞５であると、特定の抗体−薬剤コンジュゲートの凝集、難溶性、毒性又は細胞透過性の喪失が起こりうる。ある実施態様では、本発明のＡＤＣの薬剤ローディングは、１〜およそ８の範囲、およそ２〜およそ６、又は、およそ３〜およそ５の範囲である。実際、あるＡＤＣでは、抗体当たりの薬剤部分の適切な比は、８未満であってもよいし、およそ２〜およそ５であってもよい。米国特許公開第２００５-０２３８６４９号Ａ１を参照。
【０１９９】
ある実施態様では、理論的な最大よりも少ない薬剤部分がコンジュゲート反応の間に抗体にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、以下に検討するように、薬剤−リンカー中間体又はリンカー試薬と反応しないリジン残基を含みうる。一般に、抗体は薬剤部分に結合しうる多くの遊離した反応性のシステインチオール基を含まず、実際、抗体のほとんどのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在する。ある実施態様では、抗体は、反応性のシステインチオール基を生成するために、部分的ないしは完全に還元な条件下で、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)又はトリカルボニルエチルホスフィン(ＴＣＥＰ)などの還元剤により還元されうる。ある実施態様では、抗体は変性条件下に曝されるとリジンやシステインなどの反応性の求核基を現す。
ＡＤＣのローディング(薬剤／抗体比率)は、例えば、(i) 抗体に対して薬剤−リンカー中間体又はリンカー試薬のモル過剰量を限定する、(ii) コンジュゲートの反応時間又は温度を限定する、及び(iii) システインチオール修飾のための還元条件を限定することによるなど、異なる方法で制御しうる。
【０２００】
１以上の求核基が薬剤部分試薬が続くリンカー試薬又は薬剤−リンカー中間体と反応する場合、その結果生じる生成物は、抗体に結合した一又は複数の薬剤部分を有するＡＤＣ化合物の混合物であると考えられる。抗体当たりの薬剤の平均数は、抗体特異的かつ薬剤特異的である二重ＥＬＩＳＡアッセイによって混合物から算出されうる。個々のＡＤＣ分子は、質量分析によって混合物中で識別され、ＨＰＬＣ、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィによって分離されうる(例としてMcDonagh等 (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307；Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070；Hamblett, K.J.,等 "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate," Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004；Alley, S.C.,等 "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004を参照)。ある実施態様では、単一のローディング値をもつ均質なＡＤＣは、電気泳動又はクロマトグラフィによってコンジュゲート混合物から単離してもよい。
【０２０１】
ｅ．イムノコンジュゲートの調製方法
式IのＡＤＣは、当業者に公知の有機化学的反応、条件及び試薬を用いた様々な手段、例えば、(1) 共有結合によってＡｂ−Ｌを形成するための二価のリンカーと抗体の求核基との反応とその後の薬剤部分Ｄとの反応、及び(2) 共有結合によってＤ−Ｌを形成するための二価のリンカーと薬剤部分の求核基との反応とその後の抗体の求核基との反応などによって調製されてもよい。後者の手段による式IのＡＤＣを調製するための例示的な方法は米国特許公開第2005−0238649号A1に記載されており、出典明記によって本明細書中に明確に援用される。
抗体の求核基には、限定するものではないが、(i) Ｎ末端アミン基、(ii) 側鎖アミン基、例えばリジン、(iii) 側鎖チオール基、例えばシステイン、及び(iv) 抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基が含まれる。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性基により共有結合を形成することができる。このリンカー部分及びリンカー試薬には、(i) 活性エステル類、例えばＮＨＳエステル類、ＨＯＢｔエステル類、ハロギ酸類及び酸ハロゲン化物；(ii) アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド類；(iii) アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、抗体が完全ないしは部分的に還元されるように、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)又はトリカルボニルエチルホスフィン(ＴＣＥＰ)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２つの反応性のチオール求核基を形成する。リジン残基の修飾によって、例えば、チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリジンを反応させることによって、抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体に導入されてもよい。
【０２０２】
また、本発明の抗体−薬剤コンジュゲートは、アルデヒドないしはケトンカルボニル基などの抗体上の求電子性基とリンカー試薬や薬剤上の求核基との間の反応によって生成してもよい。リンカー試薬上の有用な求核基には、限定するものではないが、hydrazide, oxime, amino, hydrazine, thiosemicarbazone, hydrazine carboxylate, 及びarylhydrazideが含まれる。一実施態様では、抗体を修飾して、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる求電子性の部分を導入する。他の実施態様では、グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応しうるアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができる抗体のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含む抗体はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。 
薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基が含まれる。このリンカー部分及びリンカー試薬には、(i) 活性エステル類、例えばＮＨＳエステル類、ＨＯＢｔエステル類、ハロギ酸類及び酸ハロゲン化物；(ii) アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド類；(iii) アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。
【０２０３】
本発明の化合物は、限定するものではないが、以下の架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ(succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
また、抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。  抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
【０２０４】
別法として、抗体と細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの鎖長は、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域を含みうる。
さらに他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用して循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与してもよい。 
【０２０５】
例示的なイムノコンジュゲート−Ｔｈｉｏ-抗体薬剤コンジュゲート
ａ．システイン改変抗ＣＤ７９ｂ抗体の調製
本発明のシステイン改変抗ＣＤ７９ｂ抗体及び親抗ＣＤ７９ｂ抗体のアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは、限定するものではないが、(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合には)天然源からの単離、予め調製したポリペプチドをコードするＤＮＡの、部位特異的(又はオリゴヌクレオチド媒介性) 突然変異誘発(Carter (1985)等 Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443；Ho等 (1989) Gene (Amst.) 77:51-59；Kunkel等 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488；Liu等 (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260)、ＰＣＲ突然変異誘発(Higuchi, (1990) in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito等 (1991) Gene 102:67-70；Bernhard等 (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132；及びVallette等 (1989) Nuc. Acids Res. 17: 723-733)、及びカセット突然変異誘発(Wells等 (1985) Gene 34:315-323)を含む、様々な方法によって調製される。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ(登録商標)  多部位-特異的突然変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA)などの、突然変異誘発プロトコール、キット及び試薬は市販されている。また、ＰＣＲベースの突然変異誘発によって鋳型として二本鎖プラスミドＤＮＡを用いたオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって、単一突然変異が生成される(Sambrook and Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition；Zoller等 (1983) Methods Enzymol. 100:468-500；Zoller, M.J. and Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10: 6487-6500)。組み換え抗体の変異体も、制限酵素断片操作又は合成オリゴヌクレオチドによるオーバーラップ伸展ＰＣＲによって構築してもよい。突然変異誘発プライマーはシステインコドン置換(一又は複数)をコードする。標準的な突然変異誘発技術を用いて、このような変異体システイン改変抗体をコードするＤＮＡを生成することができる(Sambrook等 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；及びAusubel等 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993)。
【０２０６】
ファージディスプレイ技術(McCafferty等 (1990) Nature 348:552-553)を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロで抗ＣＤ７９ｂヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの主要又は微量コートタンパク質遺伝子のどちらかをフレーム内にクローン化し、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づく選別を行ってもそれらの性質を表す抗体をコードする遺伝子が選別される。ゆえに、ファージはＢ細胞の性質のいくつかを模倣する(Johnson等 (1993) Current Opinion in Structural Biology 3:564-571；Clackson等 (1991) Nature, 352:624-628；Marks等 (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597；Griffith等 (1993) EMBO J. 12:725-734；米国特許第５５６５３３２号；米国特許第５５７３９０５号；米国特許第５５６７６１０号；米国特許第５２２９２７５号)。
抗ＣＤ７９ｂ抗体は、公知のオリゴペプチド合成法を使用して化学的に合成されてもよいし、組み換え技術を用いて調製して精製されてもよい。適切なアミノ酸配列、又はその一部を、固相法技術を用いた直接的なペプチド合成によって生成してもよい(Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969)W.H. Freeman Co., San Francisco, CA；Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154)。インビトロタンパク質合成は、手動の技術又は自動化によって実行されてもよい。例えば、ｔ-ＢＯＣ又はＦｍｏｃ保護アミノ酸を使用して、そして製造業者の指示を用いたアプライドバイオシステムペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、自動固相合成法を行ってもよい。抗ＣＤ７９ｂ抗体又はＣＤ７９ｂポリペプチドの様々な部分は、別々に化学的に合成されて、化学的又は酵素的な方法を用いて組み合わせ、所望の抗ＣＤ７９ｂ抗体又はＣＤ７９ｂポリペプチドを生産させてもよい。
【０２０７】
抗体断片の産生のために様々な技術が開発されている。以前から、これらの断片はインタクトな抗体の蛋白分解によって生じるか(Morimoto等 (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及びBrennan等 (1985) Science, 229:81)、又は組換え宿主細胞によって直接生産された。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗ＣＤ７９ｂ抗体断片はすべて、大腸菌において発現され、大腸菌から分泌されるため、大量の断片を容易に生成することができる。抗体断片は、本明細書において述べられる抗体ファージライブラリから単離してもよい。あるいは、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングしてＦ(ａｂ')２断片を形成させてるか(Carter等 (1992) Bio/Technology 10:163-167)、又は組換え宿主細胞培養物から直接単離されうる。抗ＣＤ７９ｂ抗体は(ｓｃＦｖ)単鎖Ｆｖ断片であってもよい(国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；米国特許第５５８７４５８号)。また、抗ＣＤ７９ｂ抗体断片は「直鎖状抗体」であってもよい(米国特許第５６４１８７０号)。このような線形抗体断片は、単一特異性でも二重特異性でもよい。
以下の記載は主に、抗ＣＤ７９ｂ抗体をコードする核酸を含むベクターにて形質転換した又は該ベクターを形質移入した細胞を培養することによる、抗ＣＤ７９ｂ抗体の産生に関する。抗ＣＤ７９ｂ抗体をコードするＤＮＡは、抗ＣＤ７９ｂ抗体のｍＲＮＡを有し、検出可能なレベルに発現すると思われる組織から調製したｃＤＮＡライブラリから得てもよい。したがって、ヒト抗ＣＤ７９ｂ抗体ないしＣＤ７９ｂポリペプチドＤＮＡは、ヒト組織から調製したｃＤＮＡライブラリから従来通りに得ることができる。また、抗ＣＤ７９ｂ抗体コード遺伝子は、ゲノムライブラリから得るか、又は公知の合成手順(例えば自動核酸合成)によって得てもよい。
【０２０８】
本発明の設定、選別及び調製方法により、求電子性の官能性と反応するシステイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はヒトカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＴＡＨＯ抗体が可能である。これらの方法によりさらに、所定の設定した選択した部位に薬剤分子を有する抗体-薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)化合物などの抗体複合体化合物が可能である。抗体表面上の反応性のシステイン残基により、マレイミド又はハロアセチルなどのチオール反応基を介した薬剤成分の特異的なコンジュゲートが可能である。マレイミド基に対するＣｙｓ残基のチオール官能基の求核反応性は、リジン残基のアミノ基又はＮ-末端アミノ基などのタンパク質内の任意の他のアミノ酸官能性の、およそ１０００倍である。ヨードアセチル及びマレイミド試薬のチオール特異的官能性はアミン基と反応するが、より高いｐＨ(＞９．０)とより長い反応時間が必要である(Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London)。タンパク質内の遊離チオールの量は、標準的なエルマンのアッセイによって推定されてもよい。免疫グロブリンＭはジスルフィド結合五量体の例であるのに対し、免疫グロブリンＧは、サブユニットを一緒に結合している内部ジスルフィド架橋を有するタンパク質の例である。このタンパク質では、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)又はｓｅｌｅｎｏｌ(Singh等 (2002) Anal. Biochem. 304:147-156)などの試薬によるジスルフィド結合の還元は、反応性の遊離チオールを生成するために必要である。この手法により、抗体立体構造及び抗原結合特異性が失われうる。
【０２０９】
Ｐｈｅｓｅｌｅｃｔｏｒ(反応性チオールの選別のためのファージＥＬＩＳＡ)アッセイにより、ＥＬＩＳＡファージ様式での抗体の反応性システイン基の検出が可能であり、これによってシステイン改変抗体の設定の助けとなる（国際公開２００６／０３４４８８；国際公開２００７／００９２９４０)。システイン改変抗体をウェルの表面にコートし、ファージ粒子とインキュベートして、ＨＲＰ標識した二次抗体を添加して、吸光度を検出する。ファージにディスプレイされる変異タンパク質は、迅速で、強力な、ハイ-スループット方法でスクリーニングされうる。システイン改変抗体のライブラリを生成して同じ手法を用いて結合選別を行い、抗体又は他のタンパク質のランダムなタンパク質-ファージライブラリから遊離Ｃｙｓ取込みの反応性の部位を適切に同定することができる。この技術は、ファージにディスプレイされるシステイン変異タンパク質を、チオール反応性でもあるレポーターグループ又は親和性試薬と反応させることを含む。
ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイにより、抗体の反応性のチオール基のスクリーニングが可能である。この方法によるＡ１２１Ｃ変異の同定は一例である。完全なＦａｂ分子は、反応性チオール基を有するＴｈｉｏＦａｂ変異体をより多く同定するために、効果的に検索されうる。パラメーターである断片的な表面のアクセス容易性を用いて、ポリペプチド内のアミノ酸残基に対する溶媒のアクセスしやすさを同定して、定量化した。表面のアクセス容易性は、溶媒分子、例えば水が接触することができる表面積(Å２)として表されうる。水が占める面積は１．４Å半径球として概算される。アルゴリズムを用いて公知のＸ線結晶学由来の座標によりタンパク質の各アミノ酸の表面アクセス容易性を算出する結晶学プログラムのＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅとして("The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta. Cryst. D50: 760-763)、ソフトウェアは入手自由であるか許可されている(Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, United Kingdom, Fax: (+44) 1925 603825, or by internet: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html)。B.Lee and F.M.Richards (1971) J.Mol.Biol. 55:379-400のアルゴリズムに基づいて、表面アクセス容易性の算出を実行する２つの例示的なソフトウェアモジュールは、「ＡＲＥＡＩＭＯＬ」及び「ＳＵＲＦＡＣＥ」である。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、タンパク質のヴァンデルワールス表面を転がるので、プローブ球(溶媒分子を表す)の中心の座標としてタンパク質の溶媒にアクセスする表面を定義する。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、各原子の周りの拡がった球上(原子とプローブの半径の合計に等しい原子中心からの距離)に表面ポイントを生成して、周囲の原子と関連する同等の球内にあるものを除くことによって溶媒にアクセス容易な表面を算出する。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、ＰＤＢ座標ファイルに原子の溶媒にアクセス容易な領域を見つけ、残基、鎖、及び全分子がアクセス容易な領域をまとめる。個々の原子がアクセス容易な領域(又は、領域の相違)は、偽ＰＤＢ出力ファイルに書き込まれる。ＡＲＥＡＩＭＯＬは各エレメントについて単一の半径を仮定し、限られた数の異なるエレメントを認識するのみである。
【０２１０】
ＡＲＥＡＩＭＯＬ及びＳＵＲＦＡＣＥは、絶対的なアクセス容易性、すなわち正方形のオングストローム(Å)の数を示す。部分的な表面アクセス容易性は、ポリペプチド内のアミノ酸に関する標準の状態を参照することで算出される。基準状態はトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙであり、ここで、Ｘは対象のアミノ酸であり、基準状態は「伸展した」高次構造、すなわちβ鎖内の高次構造様でなければならない。伸展した高次構造はＸのアクセス容易性を最大にする。算出したアクセス容易な領域をＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙトリペプチド基準状態のアクセス容易な領域で割って、比率を比率を示す。これが部分的なアクセス容易性となる。アクセス容易性の割合は、１００を乗じた部分的アクセス容易性である。表面アクセス容易性を算出するための他の例示的なアルゴリズムは、ポリペプチドのＸ線座標に基づいて水球体に対するアミノ酸残基の部分的アクセス容易性を算出するプログラムｘｓａｅ (Broger, C., F. Hoffman-LaRoche, Basel)のＳＯＬＶモジュールに基づく。抗体のすべてのアミノ酸の部分的表面アクセス容易性は、利用できる結晶構造情報を使用して算出されてもよい(Eigenbrot等 (1993) J Mol Biol. 229:969-995)。
システイン改変抗体をコードするＤＮＡを容易に単離し、従来の手順を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)配列決定される。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの供与源として役立つ。単離した後、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、ついでそれを、大腸菌、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は他の哺乳動物の宿主細胞、例えば抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞(米国特許第５８０７７１５号；米国公開特許第２００５／００４８５７２号；米国公開特許第２００４／０２２９３１０)などの宿主細胞に形質移入して、組み換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成を得てもよい。
【０２１１】
設定及び選別の後、改変された、非常に反応性のある対になっていないＣｙｓ残基「遊離システインアミノ酸」を有するシステイン改変抗体、例えばＴｈｉｏＦａｂが、(i) 細菌、例えば大腸菌システム(Skerra等 (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262；Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151-188)又は哺乳類の細胞培養システム(国際公開第０１／００２４５号)、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)における発現、及び(ii) 一般的なタンパク質精製技術を用いた精製(Lowman等 (1991) J. Biol. Chem. 266(17): 10982-10988)によって産生されてもよい。
改変されたＣｙｓチオール基は、求電子性リンカー試薬及び薬剤−リンカー中間生成物と反応して、システイン改変抗体薬剤コンジュゲート及び他の標識したシステイン改変抗体を形成する。親抗体に存在し、鎖内及び鎖間のジスルフィド結合を形成するシステイン改変抗体Ｃｙｓ残基は、反応性チオール基を全く持っておらず(還元剤で処理されない限り)、求電子性のリンカー試薬又は薬剤-リンカー中間生成物と反応しない。新規に改変されたＣｙｓ残基は対形成せずに、反応することができる。すなわち求電子性のリンカー試薬又は薬剤−マレイミドなどの薬剤−リンカー中間生成物にコンジュゲートすることができる。例示的な薬剤-リンカー中間生成物には、ＭＣ−ＭＭＡＥ、ＭＣ−ＭＭＡＦ、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及びＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦが含まれる。重鎖及び軽鎖の改変したＣｙｓ残基の構造位置は連続する番号付けシステムに従って番号付けする。この連続する番号付けシステムは、Ｎ末端から始まるカバット番号付けシステム(Kabat等, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)に関連しており、ａ、ｂ、ｃで示す挿入がカバット番号付けスキーム(下列)とは異なる。カバット番号付けシステムを用いると、実際の直鎖のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲないしＣＤＲが短くなっているアミノ酸か、又はＦＲないしＣＤＲに挿入を含むアミノ酸を含みうる。システイン改変重鎖変異体部位は連続する番号付け及びカバット番号付けスキームによって同定される。
【０２１２】
一実施態様では、システイン改変抗ＣＤ７９ｂ抗体は、
(a) システインによって親抗ＣＤ７９ｂ抗体の一又は複数のアミノ酸残基を置換する、そして、
(b) チオール反応性の試薬とシステイン改変抗体を反応させることによって、システイン改変抗ＣＤ７９ｂ抗体のチオール反応性を決定する
ことを含む方法によって調製される。
システイン改変抗体は親抗体よりチオール反応性の試薬との反応性が高くてもよい。
遊離システインアミノ酸残基は、重鎖ないし軽鎖、又は定常ドメインないし可変ドメインに位置してもよい。また、抗体断片、例えばＦａｂは、抗体断片のアミノ酸を置換する一又は複数のシステインアミノ酸によって改変して、システイン改変抗体断片を形成してもよい。
本発明の他の実施態様は、
(a) 一又は複数のシステインアミノ酸を親抗ＴＡＨＯ抗体に導入して、システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体を生成する、そして、
(b) チオール反応性の試薬によりシステイン改変抗体のチオール反応性を決定する
ことを含み、
このとき、システイン改変抗体は親抗体よりもチオール反応性の試薬と反応性が高いものである、システイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はヒトカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＴＡＨＯ抗体を調製する(作製する)方法を提供する。
【０２１３】
システイン改変抗体を調製する方法の工程(a)は、 
(i) システイン改変抗体をコードする核酸配列を突然変異誘発する、
(ii) システイン改変抗体を発現させる、そして、
(iii) システイン改変抗体を単離して、精製する
ことを含む。
【０２１４】
システイン改変抗体を調製する方法の工程(b)は、ファージ又はファジミド粒子から選択されるウイルス粒子上にシステイン改変抗体を発現させることを含んでもよい。
また、システイン改変抗体を調製する方法の工程(b)は、
(i) システイン改変抗体をチオール反応性の親和性試薬と反応させ、親和性標識した、システイン改変抗体を生成させる、そして、
(ii) 親和性標識したシステイン改変抗体のキャプチャ培地への結合を測定する
ことを含んでもよい。
本発明の他の実施態様は、
(a) 親抗体に一又は複数のシステインアミノ酸を導入して、システイン改変抗体を生成する、
(b) システイン改変抗体をチオール反応性の親和性試薬と反応させ、親和性標識した、システイン改変抗体を生成させる、そして、
(c) 親和性標識したシステイン改変抗体のキャプチャ培地への結合を測定する、そして、
(d) チオール反応性の試薬によりシステイン改変抗体のチオール反応性を決定する
ことを含む、チオール反応のために高い反応性を有し、対形成をしないシステインアミノ酸を有するシステイン改変抗体をスクリーニングする方法である。
【０２１５】
システイン改変抗体をスクリーニングする方法の工程(a)は、
(i) システイン改変抗体をコードする核酸配列を突然変異誘発する、
(ii) システイン改変抗体を発現させる、そして、
(iii) システイン改変抗体を単離して、精製する
ことを含んでもよい。
システイン改変抗体をスクリーニングする方法の工程(b)は、ファージ又はファジミド粒子から選択されるウイルス粒子上にシステイン改変抗体を発現させることを含んでもよい。
また、システイン改変抗体をスクリーニングする方法の工程(b)は、
(i) システイン改変抗体をチオール反応性の親和性試薬と反応させ、親和性標識した、システイン改変抗体を生成させる、そして、
(ii) 親和性標識したシステイン改変抗体のキャプチャ培地への結合を測定する
ことを含んでもよい。
【０２１６】
ｂ．抗ＴＡＨＯ ＩｇＧ変異体のシステイン改変
システインは、本明細書中に記載のシステイン改変方法によって、完全長、キメラ親モノクローナル抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はヒトカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＴＡＨＯ抗体内の重鎖１１８(ＥＵ番号付け)(重鎖位置１１８に等しい、連続番号付け)、又は完全長、キメラ親モノクローナル抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はヒトカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＴＡＨＯ抗体内の軽鎖２０５(カバット番号付け)(軽鎖位置２０９に等しい、連続番号付け)に導入された。
生成された重鎖１１８(ＥＵ番号付け)にシステインを有するシステイン改変抗体は、(a) 重鎖配列(配列番号：５４)及び軽鎖配列(配列番号：５５)を有する、チオ−ｃｈＳＮ８-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)、図３１；(b) 重鎖配列(配列番号：５６)及び軽鎖配列(配列番号：５７)を有する、チオ−抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)、図３５であった。
【０２１７】
生成された軽鎖２０５(カバット番号付け)にシステインを有するシステイン改変抗体は、(a) 重鎖配列(配列番号：５２)及び軽鎖配列(配列番号：５３)を有するチオ−ｃｈＳＮ８−ＬＣ(Ｖ２０５Ｃ)、図３０及び(b) 重鎖配列(配列番号：９５)及び軽鎖配列(配列番号：９６)を有するチオ−抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)−ＬＣ(Ｖ２０５Ｃ)、図３６であった。
これらのシステイン改変モノクローナル抗体は、１ｍＭのシステインを含有する培地での一過性の発酵によってＣＨＯ(チャイニーズハムスター卵巣)細胞で発現された。
【０２１８】
一実施態様では、キメラＳＮ８システイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の重鎖配列(配列番号：６３−７１、表６)の一又は複数を含む。
表６：ｃｈＳＮ８システイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体変異体の連続、カバット及びＥＵ番号付けの比較
2011515069.tif 000043
【０２１９】
一実施態様では、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）キメラＭＡ７９ｂシステイン改変抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の重鎖配列(配列番号：７２−８０、表７)の一又は複数を含む。
表７：抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）システイン改変抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体変異体の連続、カバット及びＥＵ番号付けの比較
2011515069.tif 000044
【０２２０】
一実施態様では、キメラＳＮ８システイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の重鎖配列(配列番号：８１−８７、表８)の一又は複数を含む。
表８：キメラＳＮ８システイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体変異体の連続、カバット及びＥＵ番号付けの比較
2011515069.tif 000045
【０２２１】
一実施態様では、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）システイン改変抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の軽鎖配列(配列番号：８８−９４、表９)の一又は複数を含む。
表９：抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）システイン改変抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体変異体の連続、カバット及びＥＵ番号付けの比較
2011515069.tif 000046
【０２２２】
ｃ．標識したシステイン改変抗ＴＡＨＯ抗体
システイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗ヒトカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＴＡＨＯ抗体は部位特異的であり、チオール反応性の試薬と効率よくカップリングしうる。チオール反応性の試薬は、多機能性リンカー試薬、キャプチャ、すなわち親和性、標識試薬(例えばビオチン-リンカー試薬)、検出標識(例えば蛍光体試薬)、固相固定化試薬(例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、ポリスチレン又はガラス)、又は薬剤-リンカー中間生成物であってもよい。チオール反応性試薬の一例はＮ-エチルマレイミド(ＮＥＭ)である。ある例示的な実施態様では、ビオチン-リンカー試薬とのＴｈｉｏＦａｂの反応によりビオチン化されたＴｈｉｏＦａｂが生じ、これによって改変されたシステイン残基の存在及び反応性が検出され、測定されうる。多機能リンカー試薬とのＴｈｉｏＦａｂの反応により、薬剤成分試薬又は他の標識とさらに反応しうる官能化されたリンカーを有するＴｈｉｏＦａｂが生じる。薬剤-リンカー中間生成物とのＴｈｉｏＦａｂの反応により、ＴｈｉｏＦａｂ薬剤コンジュゲートが生じる。
本明細書中で記述される例示的な方法は一般に、抗体の同定及び産生、さらに一般的には、本明細書中に記載の設定及びスクリーニングの工程によって他のタンパク質に応用されてもよい。
【０２２３】
このような手法は、反応基が例えばマレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、又は他のチオール反応性の結合パートナーである他のチオール反応性試薬のコンジュゲーションに応用されてもよい(Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.；Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2；Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London；Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671)。チオール反応性の試薬は、薬剤成分、フルオロホア、例としてフルオレセイン又はローダミンのような蛍光染料、イメージング又は放射性治療用金属のためのキレート剤、ペプチジル又は非ペプチジル標識ないしは検出用タグ、又はポリエチレングリコールの各種アイソフォームなどのクリアランス-改変剤、第三成分に結合するペプチド、又は他の炭水化物又は親油性剤であってもよい。
【０２２４】
ｄ．システイン改変抗ＴＡＨＯ抗体の使用
システイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗ヒトカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＴＡＨＯ抗体とそのコンジュゲートは治療用及び／又は診断用の薬剤としての使用が明らかにされうる。本発明はさらに、Ｂ細胞関連疾患と関係する一又は複数の症状を予防するか、管理するか、治療するか又は、寛解する方法を提供する。特に、本発明は、癌、例えばリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、中悪性度ＮＨＬ、再発性中悪性度ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、抵抗性ＮＨＬ、抵抗性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、線毛細胞白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)及びマントル細胞リンパ腫などの細胞増殖性疾患と関係する一又は複数の症状を予防するか、管理するか、治療するか又は、寛解する方法を提供する。本発明はまた更に、ＣＤ７９ｂ関連の疾患又はこのような疾患を発達させる素因を診断するための方法、並びに好ましくはＢ細胞関連のＣＤ７９ｂポリペプチドを結合する抗体、及び抗体の抗原結合断片を同定するための方法を提供する。
本発明の他の実施態様は、Ｂ細胞関連の疾患に応答する状態の治療において有用な医薬の調製のためのシステイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗ヒトカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＴＡＨＯ抗体の使用に関する。
【０２２５】
ｅ．システイン改変抗体薬剤コンジュゲート(Ｔｈｉｏ-抗体薬剤コンジュゲート(ＴＤＣ))
本発明の他の態様は、システイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗ヒトカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＴＡＨＯ抗体と、アウリスタチン薬剤成分(Ｄ)を含む抗体−薬剤コンジュゲート化合物であって、このときシステイン改変抗体はリンカー成分(Ｌ)によって一又は複数の遊離したシステインアミノ酸を介してＤに付着され、この化合物は式Ｉを有するものであり、
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ          Ｉ
このときｐは１、２、３又は４であり、システイン改変抗体は、親抗ＣＤ７９ｂ抗体の一又は複数のアミノ酸残基を一又は複数の遊離したシステインアミノ酸に置換することを含む方法によって調製される。
【０２２６】
本発明の他の態様は、抗体当たりの平均薬剤負荷がおよそ２からおよそ５、又はおよそ３からおよそ４である、式Ｉの抗体−薬剤化合物の混合物を含有する組成物である。
図３０−３１及び３５−３６は、アウリスタチン薬剤成分が軽鎖(ＬＣ−ＡＤＣ)又は重鎖(ＨＣ−ＡＤＣ)内の改変したシステイン基に付着している、システイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗ヒトカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＴＡＨＯ抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)の実施態様を示す。
システイン改変抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗ヒトカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＴＡＨＯ抗体薬剤コンジュゲートの考えられる利点には、ＰＫパラメーターの改善である安全性の改善(より大きな治療係数)が挙げられ、コンジュゲートを安定化し、かつその活性な結合高次構造を保持しうる抗体鎖間ジスルフィド結合が保たれており、薬剤コンジュゲートの部位が決定され、そして、システイン改変抗体の薬剤−リンカー試薬へのコンジュゲートからシステイン改変抗体薬剤コンジュゲートを調製することでより均一な産物が得られる。
【０２２７】
リンカー
「リンカー」、「リンカーユニット」又は「連結」は、共有結合を含む化学的成分又は共有結合にて抗体を薬剤成分に付着させる原子の鎖を意味する。様々な実施態様では、リンカーはＬと表される。「リンカー」(Ｌ)は、一又は複数の薬剤成分(Ｄ)と抗体ユニット(Ａｂ)を連結させて、式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)を形成させるために用いられうる、二官能性成分又は多機能性成分である。抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)は、薬剤及び抗体への結合について反応性機能を有するリンカーを用いて都合良く調製されうる。システイン改変抗体(Ａｂ)のシステインチオールは、リンカー試薬、薬剤成分又は薬剤-リンカー中間生成物の求電子性の官能基と結合することができる。
一態様では、リンカーは、抗体に存在する求核性システインに反応することができる求電子性基を有する反応部位を有する。抗体のシステインチオールは、リンカー上の求電子性基と反応することができ、リンカーに共有結合する。有用な求電子性の基には、マレイミド及びハロアセトアミド基を含むが、これらに限定されるものではない。
リンカーには、二価の基、例としてalkyldiyl、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキロキシ(例としてポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ)及びアルキラミノ(例えばポリエチレンアミノ、JeffamineTM)の繰り返しユニットである−(ＣＲ２)ｎＯ(ＣＲ２)ｎ−などの成分、及び、スクシナート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミドを含む二酸エステル及びアミドが含まれる。
システイン改変抗体は、Klussman,等 (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4): 765-773の７６６ページのコンジュゲート法及び、実施例６のプロトコールに従って、マレイミド又はα−ハロカルボニルなどの求電子性の官能基を有するリンカー試薬又は薬剤−リンカー中間生成物と反応する。
【０２２８】
リンカーは一又は複数のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分には、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「ｖａｌ-ｃｉｔ」又は「ｖｃ」)、アラニン-フェニルアラニン(「ａｌａ-ｐｈｅ」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボニル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、Ｎ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)、一又は複数の繰り返しユニットとしてのエチレンオキシ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−(「ＥＯ」又は「ＰＥＯ」)が含まれる。更なるリンカー成分は当分野において周知であり、そのいくつかを本明細書中に記載する。
一実施態様では、ＡＤＣのリンカーＬは以下の式を有する。
2011515069.tif 000047
このとき、
−Ａ−は、抗体(Ａｂ)のシステインチオールに共有結合にて付着したストレッチャーユニットであり、
ａは０又は１であり、
各々の−Ｗ−は、独立したアミノ酸ユニットであり、
ｗはそれぞれ、０から１２まで変動する整数であり、
−Ｙ−は、薬剤成分に共有結合にて付着したスペーサーユニットであり、そして、ｙは０、１又は２である。
【０２２９】
ストレッチャーユニット
ストレッチャユニット(−Ａ−)は、存在する場合には、抗体ユニットをアミノ酸ユニット(−Ｗ−)に連結することができる。この点に関しては、抗体(Ａｂ)は、ストレッチャーの官能基と結合することができる官能基を有する。天然ないし化学的操作のいずれにかによって抗体に存在することができる有用な官能基には、スルフヒドリル(−ＳＨ)、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシ、炭水化物のアノマー水酸基及びカルボキシルが含まれるがこれらに限定されるものではない。一態様では、抗体官能基はスルフヒドリル又はアミノである。スルフヒドリル基は、抗体の分子内ジスルフィド結合の還元によって生成されうる。あるいは、２-イミノチオラン(トラウトの試薬)又は他のスルフヒドリル生成試薬を用いて、抗体のリジン成分のアミノ基を反応させることによって、スルフヒドリル基を生成することができる。一実施態様では、抗体(Ａｂ)は、ストレッチャーユニットの求電子性の官能基と結合することができる遊離したシステインチオール基を有する。式Ｉのコンジュゲートの例示的なストレッチャーユニットは、式ＩＩ及び式ＩＩＩで示すものであり、このときＡｂ、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗ及びｙは前記に定義した通りであり、Ｒ１７は、(ＣＨ２)ｒ、Ｃ３−Ｃ８ カルボシクリル、Ｏ−(ＣＨ２)ｒ、アリーレン、(ＣＨ２)ｒ−アリーレン、−アリーレン−(ＣＨ２)ｒ−、(ＣＨ２)ｒ−(Ｃ３−Ｃ８ カルボシクリル)、(Ｃ３−Ｃ８ カルボシクリル)−(ＣＨ２)ｒ、Ｃ３−Ｃ８ ヘテロシクリル、(ＣＨ２)ｒ−(Ｃ３−Ｃ８ ヘテロシクリル)、−(Ｃ３−Ｃ８ ヘテロシクリル)−(ＣＨ２)ｒ−、−(ＣＨ２)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２)ｒ−、−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−、−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−ＣＨ２−、−(ＣＨ２)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−、−(ＣＨ２)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−ＣＨ２−、−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−、−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−ＣＨ２−、及び−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２)ｒ−から選択される二価の基であり、ＲｂはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル又はベンジルであり、そして、ｒはそれぞれ、１から１０の範囲の整数である。
【０２３０】
アリーレンには、芳香族環システムから２つの水素原子を除去して得られる６〜２０の炭素原子の二価の芳香族炭化水素基が含まれる。代表的なアリーレン基には、ベンゼン、置換されたベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから得られる基が含まれるが、これらに限定されるものではない。
ヘテロシクリル基には、一又は複数の環原子がヘテロ原子、例えば窒素、酸素及び硫黄である環式システムが含まれる。複素環基は、１〜２０の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜３のヘテロ原子を含む。複素環は、３〜７員環を有するモノシクロ(２〜６の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜３のヘテロ原子)又は７〜１０員環を有するビシクロ (４〜９の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜３のヘテロ原子)、例えばビシクロ[４,５]、[５,５]、[５,６]、又は[６,６]システムであってもよい。複素環は、Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968)、特に第1, 3, 4, 6, 7及び9章；"The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present)、特に13, 14, 16, 19及び28号；及び、J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566に記載される。
【０２３１】
複素環の例には、例示のためであって限定するものではなく、ピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル (ピペリジル)、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化型テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、ビス−テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス−テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾチニル、トリアジニル、６Ｈ−１,２,５−チアジアジニル、２Ｈ,６Ｈ−１,５,２−ジチアジニル、チエニル、チアンスレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、チノリニル、プテリジニル、４ａＨ−カルバゾリル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナンスリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナンスロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシンドリル、ベンズオキサゾリニル、及びイサチノイルが含まれる。
「カルボシクリル基(Carbocyclyl)」には、単環として３〜７の炭素原子又は二環として７〜１２の炭素原子を有する飽和ないしは不飽和の環が含まれる。単環の炭素環は３〜６の環状原子、より一般的には５又は６の環状原子を有する。二環式の炭素環は、例えばビシクロ[４,５]、[５,５]、[５,６]又は[６,６]システムとして配置した７〜１２の環状原子、又はビシクロ[５,６]又は[６,６]システムとして配置した９又は１０の環状原子を有する。単環の炭素環の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、１−シクロペント−２−エニル、１−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキス−１−エニル、１−シクロヘキス−２−エニル、１−シクロヘキス−３−エニル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが含まれる。
【０２３２】
ＩＩからＶＩなどの式ＩのＡＤＣのすべての例示的な実施態様から、明確に示していない場合であっても、改変したシステイン残基の数に応じて、１から４の薬剤成分が抗体に連結している(ｐ＝１〜４)ことが理解される。
2011515069.tif 000048
図示する式ＩＩのストレッチャーユニットは、Ｒ１７が−(ＣＨ２)５−である、マレイミド−カプロイル(ＭＣ)から得られる。
2011515069.tif 000049
図示する式ＩＩのストレッチャーユニットは、Ｒ１７が−(ＣＨ２)２−である、マレイミド−プロパノイル(ＭＰ)から得られる。
2011515069.tif 000050
【０２３３】
他の図示する式ＩＩのストレッチャーユニットは、Ｒ１７が−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−ＣＨ２−であり、ｒが２である。
2011515069.tif 000051
他の図示する式ＩＩのストレッチャーユニットは、Ｒ１７が−(ＣＨ２)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−ＣＨ２−であり、ＲｂがＨであり、各々のｒが２である。
2011515069.tif 000052
図示する式ＩＩＩのストレッチャーユニットは、Ｒ１７が−(ＣＨ２)５−である。
2011515069.tif 000053
【０２３４】
他の実施態様では、ストレッチャーユニットは、抗体の改変されたシステイン硫黄原子とストレッチャーユニットの硫黄原子との間のジスルフィド結合により、システイン改変抗ＣＤ７９ｂ抗体に連結する。この実施態様の代表的なストレッチャーユニットは、式ＩＶで表され、Ｒ１７、Ａｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗ及びｙは前記に定義する通りである。
2011515069.tif 000054
さらに他の実施態様では、ストレッチャーの反応基は、抗体の遊離したシステインチオールと結合することができるチオール反応性の官能基を含む。チオール反応性の官能基の例には、限定するものではないが、マレイミド、α−ハロアセチル、活性エステル、例として、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸クロリド、塩化スルホニル、イソシアネート及びイソチオシアネートが含まれる。この実施態様の代表的なストレッチャーユニットは、式Ｖａ及びＶｂに表され、このとき、−Ｒ１７−、Ａｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗ及びｙは前記に定義した通りである。
2011515069.tif 000055
2011515069.tif 000056
他の実施態様では、リンカーは、分岐した多機能性リンカー成分を介して一より多い薬剤成分を抗体へ共有結合的に付着させるために樹枝状型である(Sun等 (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等 (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-176；King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990)。樹枝状のリンカーは抗体に対する薬剤のモル比を増やす、すなわち負荷することができ、これはＡＤＣの力価に関連がある。したがって、システイン改変抗体は１つの反応性のシステインチオール基のみを有する場合、多くの薬剤成分が樹枝状のリンカーを介して付着されうる。
【０２３５】
アミノ酸ユニット
リンカーはアミノ酸残基を含んでいてもよい。アミノ酸ユニット(−Ｗｗ−)は、存在する場合には、抗体(Ａｂ)を本発明のシステイン改変抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)の薬剤成分(Ｄ)に連結する。
−Ｗｗ−は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド又はドデカペプチドのユニットである。アミノ酸ユニットを含むアミノ酸残基には、天然に生じるもの、並びにシトルリンなどの微量アミノ酸及び天然に生じないアミノ酸類似体が含まれる。各々の−Ｗ−ユニットはそれぞれ、以下の角括弧で示す式を有し、ｗは、０から１２の範囲の整数である。
2011515069.tif 000057
このとき、Ｒ１９は、ヒドロゲン、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ-ブチル、ベンジル、ｐ-ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−(ＣＨ２)３ＮＨＣ(=ＮＨ)ＮＨ２、−(ＣＨ２)３ＮＨ２、−(ＣＨ２)３ＮＨＣＯＣＨ３、−(ＣＨ２)３ＮＨＣＨＯ、−(ＣＨ２)４ＮＨＣ(=ＮＨ)ＮＨ２、−(ＣＨ２)４ＮＨ２、−(ＣＨ２)４ＮＨＣＯＣＨ３、−(ＣＨ２)４ＮＨＣＨＯ、−(ＣＨ２)３ＮＨＣＯＮＨ２、−(ＣＨ２)４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＮＨ２、２-ピリジルメチル−、３−ピリジルメチル−、４-ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、
2011515069.tif 000058
であり、
Ｒ１９が水素以外である場合に、Ｒ１９が付着される炭素原子はキラルである。Ｒ１９が付着される各々の炭素原子は、独立して(Ｓ)又は(Ｒ)配位又はラセミ混合物にある。したがって、アミノ酸ユニットは、鏡像異性的に純粋であるか、ラセミ性であるか、又はジアステレオ異性であってもよい。
【０２３６】
例示的な−Ｗｗ−アミノ酸ユニットには、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドが含まれる。例示的なジペプチドには、バリン−シトルリン(ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ)、アラニン−フェニルアラニン(ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ)が含まれる。例示的なトリペプチドには、グリシン−バリン−シトルリン(ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ)及びグリシン−グリシン−グリシン(ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ)が含まれる。アミノ酸リンカーを含むアミノ酸残基には、天然に生じるもの、並びにシトルリンなどの微量アミノ酸及び天然に生じないアミノ酸類似体が含まれる。
アミノ酸ユニットは、腫瘍関連プロテアーゼを含む一又は複数の酵素によって切断され、薬剤成分(−Ｄ)を遊離する。この薬剤成分は、一実施態様では、薬剤(Ｄ)を提供するために、放出時にインビボでプロトン化される。アミノ酸リンカー構成成分は、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ、又はプラスミンプロテアーゼによって酵素的に切断されるために設定し、その選択性が最適化されうる。
【０２３７】
スペーサーユニット
スペーサユニット(−Ｙｙ−)は、存在する場合(ｙ＝１又は２)には、アミノ酸ユニットが存在する(ｗ＝１〜１２)場合に、アミノ酸ユニット(−Ｗｗ−)を薬剤部分(Ｄ)に連結する。あるいは、アミノ酸ユニットがない場合には、スペーサーユニットはストレッチャーユニットを薬剤成分に連結する。アミノ酸ユニット及びストレッチャーユニットがともにない(ｗ、ｙ＝０)場合には、スペーサーユニットも薬剤成分を抗体ユニットに連結する。スペーサーユニットは、自己犠牲型及び非自己犠牲型の２つの一般的なタイプである。非自己犠牲的なスペーサーユニットは、抗体−薬剤コンジュゲート又は薬剤成分−リンカーからアミノ酸ユニットが切断、特に酵素的に切断された後に、スペーサーユニットの一部ないしはすべてが薬剤成分に結合したままとなるものである。グリシン−グリシンスペーサーユニット又はグリシンスペーサーユニットを含むＡＤＣが腫瘍細胞関連プロテアーゼ、癌細胞関連プロテアーゼ又はリンパ球関連プロテアーゼによって酵素切断される場合、グリシン−グリシン−薬剤成分又はグリシン−薬剤成分がＡｂ−Ａａ−Ｗｗ−から切断される。一実施態様では、独立した加水分解反応が標的細胞の中で起こり、グリシン−薬剤成分の結合が切断され、薬剤が遊離される。
他の実施態様では、−Ｙｙ−は、フェニレン部分がＱｍに置換しているｐ-アミノベンジルカルバモイル(ＰＡＢ)ユニットであり、このときＱは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ８アルキル)、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、そして、ｍは０〜４の範囲の整数である。
【０２３８】
非自己犠牲型スペーサーユニット(−Ｙ−)の例示的な実施態様は、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−、−Ａｌａ−Ｐｈｅ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−である。
一実施態様では、スペーサーユニットがない(ｙ＝０)、又は薬学的に許容可能な塩ないしはその溶媒和化合物である、薬剤成分−リンカー又はＡＤＣが提供される。
あるいは、自己犠牲的なスペーサーユニットを含むＡＤＣは−Ｄを放出しうる。一実施態様では、−Ｙ−はＰＡＢグループのアミノ窒素原子を介して−Ｗｗ−に連結されるＰＡＢグループであり、カルボナート、カルバメート又はエーテル基を介して−Ｄに直接連結しており、このときＡＤＣは以下のような例示的な構造を有する。
2011515069.tif 000059
このとき、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ８アルキル)、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数であり、そして、ｐは１から４の範囲である。
【０２３９】
自己犠牲的なスペーサーの他の例には、ＰＡＢグループに電子的に類似している芳香族化合物、例として、２-アミノイミダゾール-５-メタノール誘導体(Hay等 (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237)、複素環式のＰＡＢ類似体(米国公開特許2005/0256030)、β-グルクロニド(国際公開２００７／０１１９６８)、及びオルトないしはパラ-アミノベンジルアセタールが含まれるが、これらに限定されるものではない。アミド結合加水分解の際に環化されるスペーサー、例として、置換した、及び、置換していない４-アミノ酪酸アミド(Rodrigues等 (1995) Chemistry Biology 2:223)、適切に置換されたビシクロ[２.２.１]、及び、ビシクロ[２.２.２]環システム(Storm等 (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94: 5815)、及び２-アミノフェニルプロピオン酸アミド(Amsberry,等 (1990) J. Org. Chem. 55:5867)などが使われてもよい。また、グリシンで置換されるアミン含有薬剤の除去(Kingsbury等 (1984) J. Med. Chem. 27:1447)は、ＡＤＣに有用な自己犠牲的スペーサーの例である。
例示的なスペーサーユニット(−Ｙｙ−)を式Ｘ〜ＸＩＩに示す。
2011515069.tif 000060
【０２４０】
樹枝状リンカー
他の実施態様では、リンカーＬは、分岐状の、多機能リンカー成分により一又は複数の薬剤成分が抗体に共有結合するために樹枝型のリンカーであってもよい(Sun等 (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等 (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。樹枝状のリンカーは抗体に対する薬剤のモル比を増す、すなわち負荷することができ、これはＡＤＣの力価に関連がある。したがって、システイン改変抗体は１つの反応性のシステインチオール基のみを有する場合、多くの薬剤成分が樹枝状のリンカーを介して付着されうる。分岐状の、樹枝状リンカーの例示的な実施態様には、２,６-ビス(ヒドロキシメチル)-ｐ-クレゾール及び２,４,６-トリス(ヒドロキシメチル)-フェノールデンドリマーユニット(国際公開２００４／０１９９３；Szalai等 (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125: 15688-15689；Shamis等 (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126: 1726-1731；Amir等 (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42: 4494-4499)が含まれる。
一実施態様では、スペーサーユニットは分岐状ビス(ヒドロキシメチル)スチレン(ＢＨＭＳ)であり、これを用いて複数の薬剤を取り込み、放出することができ、以下の構造を有し、
2011515069.tif 000061
２-(4-アミノベンジリデン)プロパン１,３-ジオールデンドリマーユニットを含み(国際公開２００４／０４３４９３；de Groot等 (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42: 4490-4494)、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ８アルキル)、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数であり、ｎは０又は１であり、そして、ｐは１から４の範囲である。
【０２４１】
式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲート化合物の例示的な実施態様には、ＸＩＩＩａ(ＭＣ)、ＸＩＩＩｂ(ｖａｌ−ｃｉｔ)、ＸＩＩＩｃ(ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ)、及びＸＩＩＩｄ(ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ)が含まれる。
2011515069.tif 000062
2011515069.tif 000063
【０２４２】
式Ｉａの抗体−薬剤コンジュゲート化合物の他の例示的な実施態様には、ＸＩＶａ−ｅが含まれる。
2011515069.tif 000064
このとき、Ｘは以下のものであり、
2011515069.tif 000065
Ｙは以下の通りであり、
2011515069.tif 000066
そして、ＲはそれぞれＨ又はＣ１−Ｃ６アルキルであり、そして、ｎは１〜１２である。
【０２４３】
他の実施態様では、リンカーは、抗体に存在する求電子性の基に反応することができる求核基を有する反応性の官能基を有する。抗体上の有用な求電子性の基は、アルデヒド及びケトンカルボニル基が含まれるが、これらに限定されるものではない。リンカーの求核基のヘテロ原子は抗体上の求電子性の基と反応して、抗体ユニットに共有結合することができる。リンカーの有用な求核基には、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアリールヒドラジドが含まれるが、これらに限定するものではない。抗体の求電子性の基は、リンカーへの付着に都合の良い部位を提供する。
一般的に、ペプチド−タイプのリンカーは、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野では周知である液相合成方法(E. Schroder and K. Lubke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press)に従って調製されうる。リンカー中間生成物は、スペーサー、ストレッチャー及びアミノ酸ユニットを含む反応のいずれかの組合せ又は連続によってアセンブリされてもよい。スペーサー、ストレッチャー及びアミノ酸ユニットは、天然で求電子性、求核性、又は遊離の基である反応性官能基を用いうる。反応性官能基には、カルボキシル、ヒドロキシル、パラ-ニトロフェニルカルボネート、イソチオシアネート、及びＯ−メシル、Ｏ−トシル、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉなどの脱離基、又はマレイミドが含まれるが、これらに限定されるものではない。
例えば、ＡＤＣを調製するために用いる合成手段に応じて、スルホン酸(−ＳＯ３−)又はアンモニウムなどの荷電性の置換基は、試薬の水溶性を増し、抗体又は薬剤成分とリンカー試薬とのカップリング反応を容易にしうるか、又はＤとＡｂ−Ｌ(抗体−リンカー中間生成物)とのカップリング反応、又はＡｂとＤ−Ｌ(薬剤−リンカー中間生成物)とのカップリング反応を容易にしうる。
【０２４４】
リンカー試薬
抗体とアウリスタチンとのコンジュゲートは、種々の二官能性リンカー試薬、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。
また、抗体薬剤コンジュゲートは、以下のリンカー試薬、ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ(スクシンイミジル-(４-ビニルスルホン)ベンゾアート)、及びビスマレイミド試薬、例えばＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、1,8-ビス-マレイミドジエチレングリコール(ＢＭ(ＰＥＯ)２)、及び１,１１-ビス-マレイミドトリエチレングリコール(ＢＭ(ＰＥＯ)３)にて調製されうる。これらはPierce Biotechnology, Inc.、ThermoScientific、Rockford, IL. 及び他の試薬提供者から市販されている。ビスマレイミド試薬により、連続した様式又は同時の様式で、チオール含有薬剤成分、標識又はリンカー中間生成物にシステイン改変抗体のチオール基が付着することができる。システイン改変抗体、薬剤成分、標識又はリンカー中間生成物のチオール基と反応することができるマレイミド以外の他の官能基には、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート及びイソチオシアネートが含まれる。
2011515069.tif 000067
【０２４５】
また、有用なリンカー試薬は、Molecular Biosciences Inc.(Boulder, CO)などの他の商業的供給源により得ることができるし、Toki等 (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872；Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355；Frisch等 (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186；米国特許第６２１４３４５号；国際公開０２／０８８１７２；米国特許公開２００３１３０１８９；米国特許公開２００３０９６７４３；国際公開０３／０２６５７７；国際公開０３／０４３５８３；及び国際公開０４／０３２８２８に記載の手段に従って合成してもよい。
【０２４６】
式(ＩＩＩａ)のストレッチャーは、以下のリンカー試薬をアミノ酸ユニットのＮ末端と反応させることによって、リンカーに導入することができる。
2011515069.tif 000068
このときｎは１〜１０の範囲の整数であり、Ｔは−Ｈ又は−ＳＯ３Ｎａであり、
2011515069.tif 000069
このときｎは０〜３の範囲の整数である。
2011515069.tif 000070
ストレッチャーユニットは、以下の二官能試薬をアミノ酸ユニットのＮ末端と反応させることによってリンカーに導入することができる。
2011515069.tif 000071
このときＸはＢｒ又はＩである。
【０２４７】
また、式のストレッチャーユニットは、以下の二官能試薬をアミノ酸ユニットのＮ末端と反応させることによってリンカーに導入することができる。
2011515069.tif 000072
【０２４８】
マレイミドストレッチャーとパラ−アミノベンジルカルバモイル(ＰＡＢ)自己犠牲的スペーサーとを有する例示的なバリン−シトルリン(ｖａｌ−ｃｉｔ又はｖｃ)ジペプチドリンカー試薬は、以下の構造を有する。
2011515069.tif 000073
マレイミドストレッチャーユニットとＰＡＢ自己−犠牲的スペーサーユニットとを有する例示的なｐｈｅ−ｌｙｓ(Ｍｔｒ、モノ−4−メトキシトリチル)ジペプチドリンカー試薬は、Dubowchik,等 (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60に従って調製されてもよく、以下の構造を有する。
2011515069.tif 000074
例示的な本発明の抗体−薬剤コンジュゲート化合物は、
2011515069.tif 000075
を含み、ここで、Ｖａｌはバリンであり；Ｃｉｔはシトルリンであり；ｐは１、２、３、又は４であり；Ａｂは抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はヒトカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、システイン改変ＴＡＨＯ抗体である。
【０２４９】
システイン改変抗ＣＤ７９ｂ抗体−薬剤コンジュゲートの調製
式ＩのＡＤＣは、当業者に公知の有機化学的反応、条件及び試薬を用いた様々な手段、例えば、(1) システイン改変抗体のシステイン基をリンカー試薬と反応させて、共有結合によって抗体−リンカー中間生成物Ａｂ−Ｌを形成させ、その後に薬剤成分Ｄと反応させる、及び(2) 薬剤成分の求核基をリンカー試薬と反応させて、共有結合によって薬剤−リンカー中間生成物Ｄ−Ｌを形成させ、その後にシステイン改変抗体のシステイン基と反応させる、などによって調製されてもよい。コンジュゲート方法(1)及び(2)は、様々なシステイン改変抗体、薬剤成分及びリンカーを用いて行い、式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲートを調製してもよい。
抗体システインチオール基は求核基であり、反応して、リンカー試薬及び薬剤−リンカー中間生成物の求電子基と共有結合することができる。このリンカー試薬及び薬剤−リンカー中間生成物には、(i) 活性エステル類、例えばＮＨＳエステル類、ＨＯＢｔエステル類、ハロギ酸類及び酸ハロゲン化物、(ii) アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド類、(iii) アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル及びマレイミド基、及び(iv) スルフィド交換による、ピリジルジスルフィドを含むジスルフィドが含まれる。薬剤成分の求核基には、リンカー成分及びリンカー試薬の求電子基と共有結合するために反応することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２５０】
システイン改変抗体は、ＤＴＴ(クリーランド試薬、ジチオトレイトール)又はＴＣＥＰ(トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロライド；Getz等 (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80；Soltec Ventures, Beverly, MA)などの還元剤にて処理した後に、鎖間及び鎖内のジスルフィド結合を再形成させるために再酸化させることによって、リンカー試薬とのコンジュゲートに対して反応性にしてもよい(実施例５)。例えば、ＣＨＯ細胞に発現される完全長のシステイン改変モノクローナル抗体(ＴｈｉｏＭａｂ)を、新たに導入したシステイン残基と培養培地中に存在するシステインとの間で形成しうるシステイン付加物のジスルフィド結合を還元するために、およそ５０倍モルの過剰なＴＣＥＰにて３７℃で３時間かけて還元する。還元されたＴｈｉｏＭａｂを希釈して、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５にてＨｉＴｒａｐ Ｓカラムに流し、０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含むＰＢＳにて溶出する。希釈(２００ｎＭ)硫酸銅水(ＣｕＳＯ４)、室温に終夜置くことにより親Ｍａｂに存在するシステイン残基間にジスルフィド結合が再構築された。あるいは、デヒドロアスコルビン酸(ＤＨＡＡ)は、システイン付加物の還元分解反応の後にシステイン改変抗体の鎖内ジスルフィド基を再構築させるための有効な酸化体である。当分野で公知の他の酸化体、すなわち酸化剤及び酸化条件が用いられてもよい。外気酸化も有効である。この低刺激性の部分的な再酸化工程により、高品位の鎖内ジスルフィドが効率よく形成され、新たに導入されたシステイン残基のチオール基が維持される。およそ１０倍過剰な薬剤−リンカー中間生成物、例えばＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを添加し、混合して、室温におよそ１時間置いて、コンジュゲートに作用させ、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、抗ＣＤ７９ｂ抗体−薬剤コンジュゲートを形成させた。コンジュゲート混合物をゲル濾過し、ＨｉＴｒａｐ Ｓカラムに流して溶出させ、過剰な薬剤−リンカー中間生成物と他の不純物を除去した。
【０２５１】
図２９は、コンジュゲートのために細胞培養物から発現されるシステイン改変抗体を調製するための一般的な方法を示す。細胞培養培地にシステインを含む場合、新たに導入されたシステインアミノ酸と培地のシステインとの間にジスルフィド付加物が形成しうる。これらのシステイン付加物(図２９の例示的なＴｈｉｏＭａｂ(左)に○で示す)は、コンジュゲートのために反応するシステイン改変抗体を生成するために還元されなければならない。システイン付加物は、おそらく様々な鎖間ジスルフィド結合とともに、ＴＣＥＰなどの還元剤によって抗体の還元型を生じさせるために、還元により切断される。対形成したシステイン残基間の鎖間ジスルフィド結合は、硫酸銅、ＤＨＡＡ又は周囲酸素への曝露による不完全酸化条件下で再形成される。新たに導入され、改変され、対形成しないシステイン残基は、リンカー試薬や薬剤−リンカー中間生成物と反応して本発明の抗体コンジュゲートを形成するために利用されうる状態にある。哺乳類の細胞株において発現されるＴｈｉｏＭａｂは、−Ｓ−Ｓ−結合形成によって外部からコンジュゲートされた改変ＣｙｓへのＣｙｓ付加物となる。したがって、精製されたＴｈｉｏＭａｂを、実施例５に記載の還元及び再酸化の手順にて処理して、反応性のＴｈｉｏＭａｂｓを生産する。これらのＴｈｉｏＭａｂを用いて、細胞障害性剤、蛍光体及び他の標識を含むマレイミドとコンジュゲートさせる。
【０２５２】
１０．免疫リポソーム
ここで開示されている抗ＴＡＨＯ抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【０２５３】
Ｂ．ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド
本発明のＴＡＨＯ結合オリゴペプチドはここで記載される様なＴＡＨＯポリペプチドに、好ましくは特異的に、結合するオリゴペプチドである。ＴＡＨＯ結合オリゴペプチドは、既知のオリゴペプチド合成法を用いて化学的に合成することができ、あるいは組換え技術を用いて調製及び生成することができる。ＴＡＨＯ結合オリゴペプチドは通常、少なくとも約５のアミノ酸長であり、或いは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００のアミノ酸長以上であり、このようなオリゴペプチドはここに記載される様なＴＡＨＯポリペプチドに対して好ましくは特異的に結合する能力がある。ＴＡＨＯ結合オリゴペプチドは、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定することができる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるオリゴペプチドのオリゴペプチドライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えば、米国特許第５５５６７６２号、同第５７５０３７３号、同第４７０８８７１号、同第４８３３０９２号、同第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、同第５６６３１４３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号、及びＷＯ８４／０３５６４号；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)；Geysen等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)；Geysen等, in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等, J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)；Schoofs等, J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla,S.E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378；Lowman,H.B.等 (1991) Biochemistry, 30:10832；Clackson,T.等 (1991) Nature, 352:624；Marks,J.D.等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581；Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363、及びSmith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668参照）。
【０２５４】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリーを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリーのメンバーを同定することを可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として表示されることによる技術である（Scott,J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムクローンｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）又はタンパク質（Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）ライブラーリのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。ランダム突然変異体のファージライブラリーの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号。
【０２５５】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ren等 Gene, 215:439 (1998); Zhu等Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang等, Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren等, Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5:1833 (1996); Efimov等, Virus Genes, 10:173 (1995)及びＴ７ファージディスプレイシステム（Smith及びScott, Methods in Enzymology, 217, 228-257 (1993); 米国特許第５７６６９０５号）も知られている。
【０２５６】
現在、基礎的なファージディスプレイ構想の多くの他の改良及び変形が開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングするための、及びこれらのタンパク質が所望の特性をスクリーニングする潜在能力で機能性タンパク質をディスプレイするためのディスプレイシステムの能力を増強する。ファージディスプレイ反応のための組み換え反応手段について記載があり（ＷＯ９８／１４２７７）及びファージディスプレイライブラリーは二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）及び拘束性へリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を分析及び制御するために使用されている。ＷＯ９７／３５１９６は、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリーを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法を記載する。ＷＯ９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリーをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌（Staphlylococcus aureus）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている（Li等, (1998) Mol Biotech., 9:187）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーでもよいコンビナトリアルライブラリーを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤における使用に適した酵素を選択する方法はＷＯ９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及びＷＯ９８／１５８３３に記載されている。
ペプチドライブラリーの作製及びこれらのライブラリーのスクリーニングの方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載される。
【０２５７】
Ｃ．ＴＡＨＯ結合有機分子
ＴＡＨＯ結合有機分子とは、ここに記載されるようなＴＡＨＯポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する、ここに定義されるようなオリゴペプチド又は抗体以外の有機分子である。ＴＡＨＯ結合有機分子は既知の方法（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）を用いて同定され、化学的に合成されうる。ＴＡＨＯ結合有機分子は通常、約２０００ダルトンの大きさ未満であり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトンの大きさであり、ここに記載される様なＴＡＨＯポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する能力のあるこのような有機分子は、よく知られた技術を用いて過度の実験をすることなしに同定されうる。この点において、ポリペプチド標的に結合する能力のある分子の有機分子ライブラリーを検索する技術は当分野でよく知られていることを注記する（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３及びＷＯ００／３９５８５号参照）。ＴＡＨＯ結合有機分子は、例えばアルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバミン酸塩、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホン酸、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸塩、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
【０２５８】
Ｄ．所望する特性を有する抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド及びＴＡＨＯ結合有機分子のスクリーニング
ＴＡＨＯポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチド及び有機分子を生成する技術を、上記にて記載した。所望するような、所定の生物学的特性を有する抗体、オリゴペプチド又は有機分子をさらに選択することができる。
本発明の抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子の成長阻害効果を、例えば、内因的又はＴＡＨＯ遺伝子によるトランスフェクション後のいずれかでＴＡＨＯポリペプチドを発現する細胞を用いる当該分野で周知の方法によって評価することができる。例えば、適切な腫瘍細胞株及びＴＡＨＯ形質移入細胞は、数日間（例えば、２−７）、種々の濃度の本発明の抗ＴＡＨＯモノクローナル抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子で処理し、クリスタル・バイオレット又はＭＴＴで染色、又は幾つかの他の比色アッセイによって分析し得る。増殖を測定するその他の方法は、本発明の抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子の存在又は非存在下で処理した細胞の３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。処理の後、細胞を収集し、ＤＮＡへ取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターで定量化した。適切なポジティブコントロールには、細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体でその選択した細胞株を処理することが含まれる。インビボでの成長阻害は、当該分野で知られている種々の方法で確かめることができる。腫瘍細胞は、ＴＡＨＯポリペプチドを過剰発現するものである。抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子は、ある実施態様では約０．５から３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、未処理腫瘍細胞と比べて約２５−１００％、より好ましくは約３０−１００％、そしてさらにより好ましくは約５０−１００％又は７０−１００％のＴＡＨＯ発現腫瘍細胞の増殖をインビトロ又はインビボで阻害する。成長阻害は、細胞培養で、約０．５から３０μｇ／ｍｌ又は０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、その成長阻害は、抗体への腫瘍細胞の曝露後１-１０日で確かめられる。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重での抗ＴＡＨＯ抗体の投与が、抗体の最初の投与から約５日から３ヶ月、好ましくは約５から３０日以内に腫瘍の大きさの減少又は腫瘍細胞増殖の減少を引き起こすならば、抗体はインビボで成長阻害作用がある。
【０２５９】
細胞死を誘発する抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子を選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いを対照と比較して求める。ＰＩ取込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で行われる。ＴＡＨＯポリペプチド発現細胞腫瘍細胞を、培地のみ、又は適切な抗ＴＡＨＯ抗体（例えば約１０μｇ／ｍｌ）、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子を含有する培地でインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、細胞を洗浄し、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２×７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。次いで、チューブへＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を与える。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(登録商標）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(登録商標）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析してもよい。ＰＩ取込みによって測定されるような、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発する抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子は、細胞死誘発抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子として選択することができる。
関心のある抗体が結合したＴＡＨＯポリペプチド上のエピトープに結合する抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。既知の抗ＴＡＨＯ抗体のように、試験抗体、オリゴペプチド又は他の有機分子が同じ部位又はエピトープと結合するならば、このアッセイを確定するために用いることができる。あるいは、又は付加的に、エピトープマッピングを、当該分野で周知の方法によって行うことができる。例えば、接触残基を同定するために、例えばアラニンスキャンニングによって抗体配列を変異させることができる。この変異体抗体は、適切なフォールディングを確かめるために、最初にポリクローナル抗体との結合について試験される。異なる方法では、ＴＡＨＯポリペプチドの異なる領域と一致するペプチドを、試験抗体群又は試験抗体及び特徴付けられた又は既知のエピトープを有する抗体による競合アッセイで用いることができる。
【０２６０】
Ｅ．抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５を参照)を活性な抗癌剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へ抗体をコンジュゲートすることによって、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公開８８／０７３７８及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に変換するようにプロドラッグへ作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを変換させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗ＴＡＨＯ抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neuberger等, Nature 312:604-608[1984])。
【０２６１】
Ｆ．完全長ＴＡＨＯポリペプチド
本発明は、本出願でＴＡＨＯポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のＴＡＨＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（部分及び完全長）が同定され単離された。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＴＡＨＯポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【０２６２】
Ｇ．抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチド変異体
ここに記載した抗ＴＡＨＯ抗体及び完全長天然配列ＴＡＨＯポリペプチドに加えて、抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチド変異体も調製できると考えられる。抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチド変異体は、コード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、及び／又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによって調製できる。当業者は、アミノ酸変化がグリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などの抗ＴＡＨＯ抗体の翻訳後プロセス又はＴＡＨＯポリペプチドの翻訳後プロセスを変え得るのを理解するであろう。
ここに記載した抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドの変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に示す保存的及び非保存的変異に関する技術及び指針のいずれかを用いて作成することができる。変異は、結果として天然配列抗体又はポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化を生じる、抗体又はポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。場合によっては、変異は、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの一つ又は複数のドメインにおける、少なくとも一つのアミノ酸の他の任意のアミノ酸との置換による。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失され得るかを確かめる指針は、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの配列を既知の相同タンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内で生じたアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果であるとすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内であり得る。許容され得る変異は、配列にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、生じた変異体を完全長又は成熟天然配列によって示される活性に関して試験することによって確かめられる。
【０２６３】
抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチド断片がここで提供されている。そのような断片は、例えば完全長天然抗体又はタンパク質と比較した時に、Ｎ末端又はＣ末端で切断しているか、又は内部残基を欠いている可能性がある。ある断片は、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの所望される生物学的活性にとって必修ではないアミノ酸残基を欠く。
抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチド断片は、多くの従来技術のいずれかによって調製してもよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法には、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基で確定した部位でタンパク質を切断することが知られた酵素によってタンパク質を処理することで、又は適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによって抗体又はポリペプチド断片を生成することが含まれる。さらにその他の好適な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望の抗体又はポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することが含まれる。ＤＮＡ断片の所望の末端を確定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチド断片は、ここに開示した天然抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０２６４】
特定の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換の項目で表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
2011515069.tif 000076
【０２６５】
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの適切なコンフォメーションを維持することに関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐために、概してセリンと置換され得る。逆に、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの安定性（特に、抗体がＦｖ断片のような抗体断片）を向上させるために、それにシステイン結合（複数でも）を加えてもよい。
【０２６６】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる開発のために得られた変異体は、それらが生成された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性成熟がふくまれる。簡潔に言えば、高頻度可変領域部位（例えば、６−７部位）を変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として一価形態で表示される。ファージ表示変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変の候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトＴＡＨＯポリペプチドとの接点を同定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここで詳しく記述した技術による置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択することができる。
抗ＴＡＨＯ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で周知の種々の方法によって調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、そして抗-ＴＡＨＯ抗体の早期に調製した変異体又は非変異体形のカセット突然変異誘発による、天然ソースからの単離（天然発生アミノ酸配列変異体の場合）又は調製が含まれる。
【０２６７】
Ｈ．抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドの修飾
抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型には、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることが含まれる。二官能性試薬による誘導体化は、例えば抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドを、抗ＴＡＨＯ抗体の精製方法で用いる水不溶性支持体マトリクス又は表面と架橋させるために有用であり、その逆も同じである。通常用いられる架橋剤には、例えば、１,１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸を有するエステル、３,３'-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬が含まれる。
他の修飾には、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０２６８】
本発明の範囲内に含まれる抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、抗体又はポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。ここで意図される「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドに見られる一又は複数の炭水化物部分を欠失させること（内在するグリコシル化部位を取り除くことによって、又は化学及び／又は酵素的手法でグリコシル化を欠失させることのいずれか）、及び／又は天然配列抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。更には、この語句には、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的な変化が含まれる。
抗体及び他のポリペプチドのグリコシル化とは、典型的にはＮ-結合又はＯ-結合のいずれかである。Ｎ-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付与を指す。トリペプチドは、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンの配列であり、アスパラギン側鎖への炭水化物部分が酵素的に付与される認識部位である。従って、ポリペプチドのこれらトリペプチド配列のいずれかの存在によって、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ-結合グリコシル化とは、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンも用いられるが、殆どの場合にはセリン又はスレオニンへＮ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの一つの糖をヒドロキシアミノ酸へ付与することを指す。
抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変して、それが上記に記載のトリペプチド配列（Ｎ-結合グリコシル化部位について）の一つ又は複数を含むようにすることによって簡便に完遂できる。この改変は、また、最初の抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの配列へ一つ又は複数のセリン又はスレオニン残基を付加、又は置換することによって生成される（Ｏ-結合グリコシル化部位について）。抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通して、特に、コドンが所望するアミノ酸へ翻訳される、あらかじめ選択した塩基での抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、場合によっては改変され得る。
【０２６９】
抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチド上に糖部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。そのような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行された国際公開８７／０５３３０、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)によって、そしてEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチド共有結合的修飾の他の型は、抗体又はポリペプチドを種々の非タンパク質様ポリマーの１つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることをを含む。また、抗体又はポリペプチドは、例えばコアセルベーション法によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションで捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, １６版, A. Oslo編(1980)に開示されている。
また、本発明の抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドは、その他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合した抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドを含むキメラ分子が形成される方法で修飾されてもよい。
【０２７０】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子は抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えて抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５４２８１３０号を参照のこと。
【０２７１】
Ｉ．抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドの調製
以下の説明は、主として、抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することにより抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドを産生させる方法に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いて抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動を使用することによってインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスター  シティー, カリフォルニア）を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望する抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドを生成させてもよい。
【０２７２】
１．抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドをコードするＤＮＡは、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒト抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。また抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法（例えば、自動核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、ＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【０２７３】
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookら，に示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【０２７４】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載した抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０２７５】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium）、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【０２７６】
完全長抗体、抗体断片、及び抗体融合タンパク質は、治療用の抗体が細胞傷害剤（例えば、毒素）と結合し、その免疫コンジュゲートそのものが腫瘍細胞の破壊において有効性を示す場合など、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に、細菌で産生させることができる。完全長抗体は、血液循環でより長い半減期を有する。大腸菌での産生が、より迅速でより費用効率的である。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Carter等）、米国特許第５７８９１９９号（Joly等）、及び翻訳開始部位（ＴＩＲ）及び発現と分泌を最適化するシグナル配列を記載している米国特許第５８４０５２３号（Simmons等）を参照のこと。これら特許は、ここに参考文献として取り入れられている。発現の後、抗体は、大腸菌細胞ペーストから可溶性分画へ分離し、例えば、アイソタイプによってプロテインＡ又はＧカラムを介して精製することができる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞で発現させた抗体を精製するための工程と同じようにして行うことができる。
【０２７７】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; １９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９３８３号）；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)（米国特許第４９４３５２９号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983]）、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（欧州特許第４０２２２６号）；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)（欧州特許第１８３０７０号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４５３８号）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開の国際公開９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０２７８】
グリコシル化抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59 (1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
宿主細胞は、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【０２７９】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＴＡＨＯは直接的に組換え手法によって生成されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生成される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入される抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(１９９０年４月４日発行の欧州特許第３６２１７９号)、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０２８０】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えばバシリのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子がある。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【０２８１】
発現及びクローニングベクターは、通常、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); 欧州特許第３６，７７６号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまた抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。
【０２８２】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(１９８９年７月５日公開の英国特許第２２１１５０４号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養での抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); 欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
【０２８３】
４．宿主細胞の培養
本発明の抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン（商品名）薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２８４】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＴＡＨＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＴＡＨＯ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０２８５】
６．抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドの精製
抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドは、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び抗ＴＡＨＯ抗体及びＴＡＨＯポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定の抗ＴＡＨＯ抗体又はＴＡＨＯポリペプチドの性質に依存する。
【０２８６】
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内に生成される場合、第１工程として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は超遠心分離にかけて取り除く。Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順について記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、３０分以上かけて解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。抗体が培地へ分泌されている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は抗体に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983]）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 15671575 [1986]）。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX(商標)樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンSEPHAROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製工程に続いて、対象とする抗体と汚染物とを含む混合物に、約２．５−４．５のｐＨでの溶離バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施してもよく、好ましくは低い塩濃度（例えば、約０−０．２５Ｍ塩）で実施される。
【０２８７】
Ｊ．製薬製剤
本発明の抗体-薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)は、治療される症状に適切な任意の手段によって投与されてもよい。典型的にＡＤＣは、非経口的に、すなわち注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下腔内及び硬膜外投与される。
これらの癌を治療するために、一実施態様では、抗体-薬剤コンジュゲートは静脈内注入により投与される。注入により投与される用量は、１用量当たりおよそ１μｇ／ｍ２からおよそ１００００μｇ／ｍ２の範囲で、一般に週１回、合計１、２、３又は４回の用量である。あるいは、用量範囲は、およそ１μｇ／ｍ２からおよそ１０００μｇ／ｍ２、およそ１μｇ／ｍ２からおよそ８００μｇ／ｍ２、およそ１μｇ／ｍ２からおよそ６００μｇ／ｍ２、およそ１μｇ／ｍ２からおよそ４００μｇ／ｍ２、およそ１０μｇ／ｍ２からおよそ５００μｇ／ｍ２、およそ１０μｇ／ｍ２からおよそ３００μｇ／ｍ２、およそ１０μｇ／ｍ２からおよそ２００μｇ／ｍ２、及びおよそ１μｇ／ｍ２からおよそ２００μｇ／ｍ２である。投薬は、１日１回、１週間に１回、１週間に複数回(１日１回より少ない)、１か月に複数回(１日１回より少ない)、１か月に複数回(１週間に１回より少ない)、１か月に１回又は疾患の症状が寛解又は緩和するように間欠的に投与されてもよい。投与は、腫瘍又はリンパ腫の症状、治療される白血病が寛解するまで開示したいずれかの間隔で継続されてもよい。このような寛解又は軽減がこのような継続的な投与によって延長される症状の寛解又は軽減が達成される後に、投与を続けてもよい。
【０２８８】
また、本発明は、自己免疫性疾患に罹っている患者に、治療的に有効な量の前記実施態様のいずれか一の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような抗ＴＡＨＯ抗体-薬剤コンジュゲートを投与することを含む、自己免疫性疾患の緩和方法を提供する。好ましい実施態様では、抗体は、静脈内又は皮下に投与される。抗体-薬剤コンジュゲートは１用量につきおよそ１μｇ／ｍ２からおよそ１００ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で静脈内投与され、そして具体的な実施態様では、用量は１μｇ／ｍ２からおよそ５００μｇ／ｍ２である。投薬は、１日１回、１週間に１回、１週間に複数回(１日１回より少ない)、１か月に複数回(１日１回より少ない)、１か月に複数回(１週間に１回より少ない)、１か月に１回又は疾患の症状が寛解又は緩和するように間欠的に投与されてもよい。投与は、治療される自己免疫性疾患の症状が寛解又は緩和するまで開示したいずれかの間隔で継続されてもよい。このような寛解又は軽減がこのような継続的な投与によって延長される症状の寛解又は軽減が達成される後に、投与を続けてもよい。
また、本発明は、Ｂ細胞増殖性疾患(リンパ腫及び白血病を含むがこれらに限定するものではない)又は自己免疫性疾患などのＢ細胞疾患を患っている患者に、治療的に有効な量の前記実施態様のいずれか一に記載のヒト化ＭＡ７９ｂ抗体であって、細胞障害性分子や検出可能な分子にコンジュゲートされていない抗体を投与することを含むＢ細胞疾患の治療方法を提供する。抗体は一般的に、およそ１μｇ／ｍ２からおよそ１０００ｍｇ／ｍ２の用量範囲で投与されるであろう。
【０２８９】
一態様では、本発明はさらに、少なくとも一の本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような抗ＴＡＨＯ抗体及び／又は少なくとも一のこのイムノコンジュゲート及び／又は少なくとも一の本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような抗ＴＡＨＯ抗体−薬剤コンジュゲートを含有する薬学的製剤を提供する。いくつかの実施態様では、薬学的製剤は、1) 本発明の抗体及び／又はこのイムノコンジュゲートと、2) 薬学的許容性のある担体とを含有する。いくつかの実施態様では、薬学的製剤は、1) 本発明の抗体及び／又はこのイムノコンジュゲートと、場合によって2) 少なくとも一の付加的治療剤とを含有する。更なる治療剤には以下に記載のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。典型的に、ＡＤＣは非経口的に、すなわち、注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内及び硬膜外に投与されるであろう。
【０２９０】
本発明に係る抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド、ＴＡＨＯ結合有機分子及び／又はＴＡＨＯポリペプチドの治療的製剤は、所望される程度の純度を持つ抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は有機分子を凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、最適な製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th 版, Osol, A. 編. [1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、酢酸、Ｔｒｉｓ、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド、ベンズエトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウムなどのトニシファイヤー；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ポリソルベート等の界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はトゥイーン(TWEEN)（登録商標）、プルロニクス(PLURONICS)（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。抗体は、好ましくは５−２００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１０−１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度の抗体で構成される。
【０２９１】
ここでの製剤は、また、治療すべき特定の徴候の必要に応じて一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。例えば、抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子に加えて、１つの製剤に、例えば、ＴＡＨＯポリペプチド上の異なるエピトープと結合する第二抗ＴＡＨＯ抗体、又は特定の癌の成長に影響を与える成長因子のような何らかの他の標的に対する抗体を含めることは望ましい。あるいは、又はさらに、この組成物は、更に化学療法剤、細胞障害性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗-ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤を含んでもよい。このような分子は、意図する目的にとって有効な量の組み合わせで適切に存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-（-）-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０２９２】
Ｋ．抗ＴＡＨＯ抗体、ＴＡＨＯ結合オリゴペプチド又はＴＡＨＯ結合有機分子を用いる治療
癌におけるＴＡＨＯ発現を定量するために、種々の検出アッセイが利用可能である。一実施態様では、ＴＡＨＯポリペプチド過剰発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析される。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイへ供してもよいし、次のようなＴＡＨＯタンパク質染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０ - 染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋ - わずかに／弱く認知できる程度の膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて検出される。細胞はそれらの膜の一部のみが染色される。
スコア２＋ - 弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋ - 中程度から強い完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
ＴＡＨＯポリペプチド発現に関して０又は１＋スコアの腫瘍は、ＴＡＨＯが過剰発現していないことを特徴としうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアの腫瘍はＴＡＨＯが過剰発現していることを特徴としうる。
【０２９３】
別に、又は付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばＩＮＦＯＲＭ（登録商標）(Ventana, Arizonaから販売)又はＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）(Vysis, Illinois)を、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織で実施して、腫瘍におけるＴＡＨＯ過剰発現の程度(生じているならば)を測定してもよい。
ＴＡＨＯ過剰発現又は増幅は、インビボ検出アッセイを使用して評価することができ、例えば検出される分子に結合し、検出可能な標識(例えば、放射性同位体又は蛍光標識)が付けられた分子(例えば抗体、オリゴペプチド又は有機分子)を投与し、標識の局在化について患者を外部スキャニングする。
上に記載したように、本発明の抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子には、種々の非治療的用途がある。本発明の抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、ＴＡＨＯポリペプチドを発現している癌のステージ分類に有用である（例えば、ラジオイメージングで）。他の細胞の精製の工程として、混合細胞の集団からＴＡＨＯ発現細胞を死滅させて除去するために、この抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、また、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにおいて、インビトロでＴＡＨＯポリペプチドの検出及び定量化のために、細胞からＴＡＨＯポリペプチドを精製又は免疫沈降するのに有用である。
【０２９４】
現在、癌の段階に応じて、癌の治療には、次の治療：外科手術による癌組織の除去、放射線治療、及び化学治療の一つ、又はそれらを組合せたものが含まれる。抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子による治療は、特に、化学治療における副作用や毒素に対する耐性がない老年の患者、及び放射線治療の有用性に限界がある転移性疾患において所望されている。本発明の腫瘍標的化抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、疾患の初期診断時及び再発中におけるＴＡＨＯ-発現癌の緩和に有用である。治療用途に関しては、抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、単独で、あるいは例えば、ホルモン、抗血管形成、又は放射標識された化合物と共に、又は外科手術、寒冷療法、及び／又は放射線治療と組み合わせてもよく、使用してもよい。抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子による治療は、従来的治療の前又は後のいすれかに連続させて、他の形態の従来的治療と共に実施することができる。化学療法剤、例えばタキソテレ(登録商標)(ドセタキセル)、タキソール(登録商標)(パリクタキセル)、エストラムスチン及びミトキサントロンは、癌、特に危険性の少ない患者の癌治療に使用される。癌を治療又は緩和するための本発明の方法において、上述した一又は複数の化学療法剤による治療と組合せて、癌患者に抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子を投与することができる。特に、パリクタキセル及び改変誘導体との組合せ治療が考えられる(例えば、欧州特許第０６００５１７号を参照のこと)。抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子は治療的有効量の化学療法剤と共に投与されるであろう。他の実施態様では、抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子は化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性及び効力を高めるための化学治療と組合せて投与される。医師用卓上参考書(ＰＤＲ)には、種々の癌治療に使用されるこれらの薬剤の用量が開示されている。治療的に有効な上述の化学療法剤の投薬計画及び用量は、治療される特定の癌、疾患の程度、及び当該技術分野の医師によく知られている他の因子に依存し、医師が決定することができる。
【０２９５】
特定の一実施態様では、細胞障害剤に結合した抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有する毒素コンジュゲートを患者に投与する。好ましくは、ＴＡＨＯタンパク質に結合した免疫コンジュゲートは細胞によりインターナリゼーションし、結果として、それが結合した癌細胞の殺傷性における免疫コンジュゲートの治療的効果が向上する。好ましい実施態様では、細胞障害剤は、癌細胞内の核酸を標的とするか、又はこれに干渉する。このような細胞障害剤の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子又はその免疫コンジュゲートは、公知の方法、例えばボーラス、もしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与される。抗体、オリゴペプチド又は有機分子の静脈内又は皮下投与が好ましい。
他の治療計画を抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子の投与と組合せてもよい。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び好ましくは両方(又は全ての)活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間があるいずれかの順での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療効果が生じることが好ましい。
【０２９６】
また、特定の癌に関連した他の腫瘍抗原に対する抗体の投与と共に、抗ＴＡＨＯ抗体又は抗体類、オリゴペプチド又は有機分子の投与を組合せることが望ましい。
他の実施態様では、本発明の治療方法は、異なる化学療法剤の混合物の同時投与を含む、抗ＴＡＨＯ抗体(又は抗体類)、オリゴペプチド又は有機分子と一又は複数の化学療法剤又は成長阻害剤との組合せ投与を含む。化学療法剤には、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５-フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素及びヒドロキシ尿素タキサン類(hydroxyureataxanes)(例えばパクリタキセル及びドキセタキセル)及び／又はアントラサイクリン抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service編 M.C.Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。
抗体、オリゴペプチド有機分子は、抗ホルモン化合物；例えばタモキシフェン等の抗-エストロゲン化合物；抗-プロゲステロン、例えばオナプリストン(onapristone)(欧州特許第６１６８１２号を参照)；又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドを、このような分子に対して既知の用量で組合せてもよい。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は予め抗アンドロゲン治療を受け、癌がアンドロゲン非依存性になった後、抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子(及び場合によってはここに記載した他の薬剤)を患者に投与してもよい。
【０２９７】
しばしば、心臓保護剤(治療に関連する心筋の機能不全を防止又は低減するため)又は一又は複数のサイトカインを患者に同時投与することも有益なことである。上述した治療摂生に加えて、抗体、オリゴペプチド又は有機分子治療の前、同時又は治療後に、外科的に癌細胞を取り除くか、及び／又は放射線治療を施してもよい。上述した任意の同時投与される薬剤の適切な用量は現在使用されている量であり、抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子と薬剤の組合せ作用(相乗作用)に応じてより少なくしてもよい。
疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、公知の基準に従い、医師により選択されるであろう。抗体、オリゴペプチド又は有機分子の適切な用量は、上記のような治療される疾患の種類、疾患の重症度及び過程、抗体、オリゴペプチド又は有機分子を予防目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体、オリゴペプチド又は有機分子の応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。抗体、オリゴペプチド又は有機分子は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。好ましくは、抗体、オリゴペプチド又は有機分子は静脈注入又は皮下注射により投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、体重１ｋｇ当たり約１μｇないし５０ｍｇ(例えば０．１−１５ｍｇ／ｋｇ／用量)の抗体を患者への最初の投与量の候補とすることができる。投薬計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷量、続いて１週間に約２ｍｇ／ｋｇの維持用量の抗ＴＡＨＯ抗体を投与することからなってよい。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、疾患の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。この治療の進行状態は、医師又は他の当業者に公知の基準をベースにした通常の方法やアッセイで容易にモニターされる。
【０２９８】
抗体タンパク質の患者への投与の他に、本出願は遺伝子治療による抗体の投与を考察する。抗体をコードする核酸の投与は「抗体を治療的有効量で投与する」という表現に含まれる。例えば、遺伝子治療を用いた細胞内抗体の産生に関する、１９９６年３月１４日に公開された国際公開第９６／０７３２１号を参照のこと。
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第４８９２５３８号及び第５２８３１８７号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
【０２９９】
現在好まれているインビボ核酸移入技術は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）での形質移入を含む。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第９３／２５６７３号及びそこに引用された参考文献も参照。
本発明の抗ＴＡＨＯ抗体は、ここでの「抗体」の定義により包含される様々な形態であってよい。よって、抗体には、完全長又は無傷抗体、抗体断片、天然配列抗体又はアミノ酸変異体、ヒト化、キメラ又は融合抗体、免疫コンジュゲート、及びそれらの機能的断片が含まれる。融合抗体において、抗体配列は異種ポリペプチド配列に融合している。抗体はＦｃ領域が修飾されて、所望のエフェクター機能を提供することができる。以下の段落に詳細に記載されるように、適切なＦｃ領域と共に、細胞表面に結合したそのままの抗体は、例えば抗体-依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を介して又は補体依存性細胞障害において補体を補充することにより、又は他のいくつかのメカニズムにより、細胞障害性を誘発し得る。また、副作用及び治療による合併症を最小にするようにエフェクター機能を除去又は低減することが望ましい場合には、所定の他のＦｃ領域が使用される。
一実施態様では、抗体は、本発明の抗体と同じエピトープとの結合に関して競合するか、又はこれに実質的に結合する。また、本発明の抗ＴＡＨＯ抗体の生物学的特徴を有する抗体、特にインビボ腫瘍ターゲティング及び任意の細胞増殖阻害又は細胞障害特性を含むものが考察される。
上述した抗体の産生方法をここで詳細に記載する。
【０３００】
本抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、哺乳動物におけるＴＡＨＯ-発現癌の治療又は一又は複数の癌の徴候の緩和に有用である。このような癌には、造血性癌又は血液関連癌、例えばリンパ腫、白血病、骨髄腫又はリンパ性悪性腫瘍、並びに脾臓の癌及びリンパ節の癌が含まれるが、これらに限定されない。そのようなＢ細胞関連癌の具体的な例として、例えば、高悪性度、中悪性度及び低悪性度のリンパ腫（例えば粘膜内リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫等のＢ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球リンパ腫、周辺帯リンパ腫、拡散性大細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びホジキンリンパ腫及びＴ細胞リンパ腫を含む）、白血病（二次性白血病、慢性リンパ性白血病、例えばＢ細胞白血病（ＣＤ５＋Ｂリンパ球）、骨髄性白血病、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病、例えば急性リンパ芽球性白血病及び骨髄異形成症候群を含む）、プラズマ細胞悪性腫瘍等の多発性骨髄腫、並びにその他血液学的及び／又はＢ細胞又はＴ細胞関連癌が挙げられる。癌には、上述した任意の転移性癌が含まれる。抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、哺乳動物においてＴＡＨＯポリペプチドを発現している癌細胞の少なくとも一部に結合可能である。好ましい実施態様では、抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、インビボ又はインビトロで細胞のＴＡＨＯポリペプチドに結合して、ＴＡＨＯ-発現腫瘍細胞を破壊又は死滅させるか、又はこのような腫瘍細胞の成長を阻害するのに効果的である。このような抗体には、裸の抗ＴＡＨＯ抗体(いかなる薬剤にも結合していない)が含まれる。細胞傷害性又は細胞成長阻害特性を有する裸の抗体は、細胞障害剤と併用すると、より強く腫瘍細胞を破壊することが可能である。例えば細胞障害剤と抗体とを結合させ、以下に記載するような免疫コンジュゲートを形成させることによって、細胞障害特性を抗ＴＡＨＯ抗体に付与することができる。この細胞障害剤又は成長阻害剤は、好ましくは小分子である。毒素、例えばカリケアマイシン又はメイタンシノイド、及びそれらの類似物又は誘導体が好ましい。
【０３０１】
本発明は、本発明の抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子と担体を含有する組成物を提供する。癌の治療のために、組成物はその治療の必要性に応じて患者に投与することができ、ここで組成物は免疫コンジュゲート又は裸の抗体として存在する一又は複数の抗ＴＡＨＯ抗体を含有し得る。さらなる実施態様においては、組成物は、他の療法剤、例えば化学療法剤を含む成長阻害剤又は細胞障害剤とこれらの抗体、オリゴペプチド又は有機分子を組合せて含有することもできる。また本発明は、本発明の抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子と担体を含有する製剤も提供する。一実施態様では、製剤は製薬的に許容可能な担体を含有する治療用製剤である。
本発明の他の態様は、抗ＴＡＨＯ抗体をコードする単離された核酸分子である。Ｈ及びＬ鎖、特に高頻度可変領域残基をコードする核酸、天然配列抗体及び変異体をコードする鎖、該抗体の修飾体及びヒト化形態を含む。
本発明は、抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子を治療的有効量、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＴＡＨＯポリペプチド-発現癌の治療又は癌の一又は複数の徴候を緩和するのに有用な方法を提供する。抗体、オリゴペプチド又は有機分子治療組成物は、医師の指示通りに、短い期間(急性)又は慢性的に、又は間欠的に投与することができる。また、ＴＡＨＯポリペプチド-発現細胞の成長を阻害し、該細胞を殺傷する方法も提供される。
本発明は少なくとも一つの抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有するキット又は製造品も提供する。抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有するキットは、例えばＴＡＨＯ細胞殺傷アッセイ、細胞からのＴＡＨＯポリペプチドの精製又は免疫沈降における用途が見出されている。例えば、ＴＡＨＯの単離及び精製のためには、キットはビーズ(例えばセファロースビース)に結合した抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有することができる。インビトロにおけるＴＡＨＯの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおける抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含有するキットを提供することもできる。検出に有用なこのような抗体、オリゴペプチド又は有機分子は、蛍光又は放射標識などの標識が付されて提供され得る。
【０３０２】
Ｌ．抗体−薬剤コンジュゲート治療
本発明の抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)は、例えば腫瘍抗原の過剰発現によって特徴付けられる様々な疾病又は疾患を治療するために使用することはできる。例示的症状又は過剰増殖疾患には、良性及び悪性腫瘍；白血病及びリンパ系腫瘍が含まれる。他のものには、自己免疫を含む、神経細胞、膠細胞、星状膠細胞、視床下部、腺性、マクロファージ、上皮、間質性、胞胚腔、炎症性、血管形成及び免疫性疾患が含まれる。
動物モデル及び細胞ベースアッセイにおいて同定されるＡＤＣ化合物は、腫瘍を持つ高等霊長類及びヒト臨床治験で更に試験することができる。ヒト臨床治験を、限定しないが、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、侵襲性ＮＨＬ、再発侵襲性ＮＨＬ、再発無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、ヘアリーセル白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、及びマントル細胞リンパ腫を含むＢ細胞増殖疾患を被っている患者において本発明の抗ＣＤ７９ｂモノクローナル抗体又は免疫コンジュゲートの効能を試験するために設計することができる。臨床治験は、放射線及び／又は既知の化学療法及び／又は細胞傷害剤を含む化学療法のような、既知の治療法と併用してのＡＤＣの効能を評価するために設計することができる。
【０３０３】
一般に、治療される疾病又は疾患は、Ｂ細胞増殖疾患及び／又はＢ細胞癌のような過剰増殖疾患である。ここで治療される癌の例には、限定するものではないが、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、侵襲性ＮＨＬ、再発侵襲性ＮＨＬ、再発無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、ヘアリーセル白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、及びマントル細胞リンパ腫から選択されるＢ細胞増殖疾患が含まれる。
癌は、本発明のＡＤＣが癌細胞に結合できるように、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）発現細胞のようなＴＡＨＯ発現細胞を含みうる。癌におけるヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のようなＴＡＨＯポリペプチドの発現を決定するために、様々な診断／予後アッセイが利用できる。一実施態様では、ＣＤ７９ｂの過剰発現はＩＨＣによって分析することができる。腫瘍バイオプシーからのパラフィン包埋組織切片にＩＨＣアッセイを施し、染色の程度及び検査される腫瘍細胞の割合に関してＣＤ７９ｂタンパク質の染色強度基準に一致させる。
【０３０４】
疾患の予防又は治療の場合、ＡＤＣの適切な投薬量は、上で定めた処置される疾患のタイプ、疾患の重篤度と経過、分子が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、過去の治療、患者の臨床歴、抗体に対する応答性、及び担当医の裁量に依存する。分子は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、体重１ｋｇ当たり約１μｇないし５０ｍｇ(例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ／用量)の分子を患者への最初の投与量の候補とすることができる。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。患者に投与されるＡＤＣの例示的投薬量は、約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲である。
症状に応じて数日又は更に長い間、繰り返して投与する場合、疾患症状の所望の抑制が得られるまで、治療が持続される。例示的な投薬計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷量、続いて１週間に約２ｍｇ／ｋｇの維持用量の抗ＥｒｂＢ２抗体を投与することを含む。他の投薬計画も有効であろう。この治療の進行状態は、通常の方法やアッセイで容易にモニターされる。
【０３０５】
Ｍ．併用治療法
本発明の抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)は、抗癌特性を有する第二化合物と、薬学的併用製剤、又は併用療法としての投薬計画において、組み合わせることができる。薬学的併用製剤又は投薬計画の第二化合物は、好ましくは、それらが互いに悪影響を及ぼさないように、併用のＡＤＣに対して相補的活性を有している。
第二化合物は、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は心臓保護薬でありうる。かかる分子は、好適には、意図された目的に対して効果的である量で組み合わせて存在する。本発明のＡＤＣを含む薬学的組成物は、チューブリン形成阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、又はＤＮＡバインダーのような化学療法剤の治療的有効量をまた有しうる。
一態様では、第一化合物は、本発明の抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のようなＴＡＨＯ ＡＤＣであり、第二化合物は抗ＣＤ２０抗体(ネイキッド抗体かＡＤＣの何れか)である。一実施態様では、第二化合物は抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ(リツキサン(登録商標))又は２Ｈ７(ジェネンテック社, South San Francisco, CA)である。本発明の抗ＣＤ７９ｂ ＡＤＣとの併用免疫療法に有用な他の抗体は、限定しないが、抗ＶＥＧＦ(例えばアバスチン(登録商標))を含む。
【０３０６】
限定しないが、放射線療法及び／又は骨髄及び末梢血移植、及び／又は細胞傷害剤、化学療法剤、又は増殖阻害剤を含む他の治療計画を、本発明に従って同定された抗癌剤の投与と併用することができる。かかる実施態様の一つでは、化学療法剤は、例えばシクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン(オンコビンＴＭ)、プレドニソロン、ＣＨＯＰ、ＣＶＰ、又はＣＯＰ、又は免疫療法剤、例えば抗ＣＤ２０(例えばリツキサン(登録商標))又は抗ＶＥＧＦ(例えばアバスチン(登録商標))のような薬剤又は薬剤の組合せである。
併用療法は、同時の又は連続的な投与計画として投与されうる。連続的に投与される場合、併用剤は二以上の投与で投与されうる。併用投与は、別個の製剤又は単一の薬学的製剤を使用する同時投与と、双方(又は全て)の活性剤がその生物学的活性を同時に作用させる時間が好ましくは存在する何れかの順の連続投与とを含む。
【０３０７】
一実施態様では、ＡＤＣでの治療は、ここで同定された抗癌剤と、異なった化学療法剤のカクテルの同時投与を含む一又は複数の化学療法剤又は増殖阻害剤の併用投与を含む。化学療法剤には、タキサン(例えばパクリタキセル及びドセタキセル)及び／又はアントラサイクリン抗生物質が含まれる。かかる化学療法のための調製及び投薬スケジュールは、製造者の指示書に従って、又は熟練者によって経験的に決定されるようにして、使用されうる。かかる化学療法のための調製及び投薬スケジュールは、また"Chemotherapy Service", (1992)Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Mdに記載されている。
上記の同時投与剤の何れかのための好適な投薬用量は現在使用されているものであり、新規に同定された薬剤と他の化学療法剤又は治療法との組合せ作用(相乗性)のために低くしてもよい。
併用療法は、「相乗性」をもたらし得、「相乗的」であり得、つまり活性成分が一緒に使用された場合に達成される効果が化合物を別個に使用することから得られる効果の合計よりも大きい。相乗効果は、(１)併用された単位投薬製剤の形で同時処方され同時に投与又は送達される場合；(２)別個の製剤として交互に又は平行して送達される場合；又は(３)ある他の療法によって、達成されうる。交互治療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が、例えば別個のシリンジでの異なった注入によって連続的に投与又は送達される場合に達成されうる。一般に、交互治療中においては、各活性成分の有効投薬量が連続的に、つまり連続して投与される一方、併用療法では、二以上の活性成分の有効投薬量が一緒に投与される。
【０３０８】
Ｎ．製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、抗ＴＡＨＯを発現する癌の治療に有用な物質を含む製造品である。該製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されうる。容器は、癌の症状の治療、予防及び／又は診断に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド、有機分子である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、癌患者に抗体、オリゴペプチド又は有機分子組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。更に、製造品は製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備しうる。他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
様々な目的、例えばＴＡＨＯ発現細胞殺傷アッセイ、細胞からのＴＡＨＯポリペプチドの精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。ＴＡＨＯポリペプチドの単離及び精製では、キットはビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合した抗ＴＡＨＯ抗体、オリゴペプチド又は有機分子を含むことが可能である。インビトロでのＴＡＨＯポリペプチドの検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのために抗体を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には少なくとも１つの本発明の抗ＴＡＨＯ抗体、ポリペプチド、又は有機分子を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又は能書は、組成物についての記載並びに意図されたインビトロ又は検出用途に関する注意書きを提供するものである。
【０３０９】
Ｏ．ＴＡＨＯポリペプチド及びＴＡＨＯ-ポリペプチドコード核酸の用途
ＴＡＨＯポリペプチドをコードする核酸配列（又はそれらの相補鎖）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡプローブの生成において種々の用途を有している。また、ＴＡＨＯコード化核酸は、ここに記載される組換え技術によるＴＡＨＯポリペプチドの調製に有用であり、これらＴＡＨＯポリペプチドは、例えば、ここで記載の抗ＴＡＨＯ抗体の調製において用途を見出し得る。
完全長天然配列ＴＡＨＯ遺伝子又はその一部は、完全長ＴＡＨＯｃＤＮＡの単離又はここに開示した天然ＴＡＨＯ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他のｃＤＮＡ（例えば、ＴＡＨＯの天然発生変異体又は他の種からのＴＡＨＯをコードするもの）の単離のために、ｃＤＮＡライブラリ用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。このハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的に完全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＴＡＨＯのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から判定され得る。例えば、スクリーニング法は、ＴＡＨＯ遺伝子のコード領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識され得る。本発明のＴＡＨＯ遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーにプローブがハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術を、以下の実施例において更に詳細に記載する。本出願に開示されている任意のＥＳＴ配列は、ここに開示している方法を利用して、同じようにプローブとして用い得る。
【０３１０】
ＴＡＨＯコード核酸の他の有用な断片には、標的ＴＡＨＯ ｍＲＮＡ（センス）又はＴＡＨＯ ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明によると、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＡＨＯ ＤＮＡのコード領域の断片を含む。そのような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを得る能力は、例えば、Stein及びCohen（Cancer Res. 48:2659, 1988）及び van der Krol等（BioTechniques 6:958, 1988）に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の未熟終止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。そのような方法は、本発明に含まれている。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＡＨＯタンパク質の発現を阻止するのに用いられ、それらＴＡＨＯタンパク質は、哺乳動物での癌の誘導を担い得る。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、国際公開９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドを更に含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（つまり、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０３１１】
アンチセンス結合の好適な遺伝子内部位には、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始／開始コドン（５'-ＡＵＧ／５'-ＡＴＧ）又は終結／停止コドン（５'-ＵＡＡ、５'-ＵＡＧ及び５-ＵＧＡ／５'-ＴＡＡ、５'-ＴＡＧ及び５'-ＴＧＡ）を含む領域が含まれる。これらの領域は翻訳開始又は終結コドンから何れかの方向（つまり５'又は３'）に約２５から約５０の近接ヌクレオチドを包含するｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を意味する。アンチセンス結合のための他の好適な領域には、イントロン；エキソン；イントロン-エキソン接合部；翻訳開始コドンと翻訳終結コドンの間の領域であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は「コード領域」；５'-５'トリホスフェート結合を介してｍＲＮＡの５'−最末端残基に結合したＮ７-メチル化グアノシン残基を含み、５'キャップ構造自体と同様にキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むｍＲＮＡの５'キャップ；翻訳開始コドンから５'方向のｍＲＮＡの部分で、ｍＲＮＡ又は遺伝子上の対応するヌクレオチドの翻訳開始コドンと５'キャップ部位の間のヌクレオチドを含む５'の未翻訳領域（５'ＵＴＲ）；及び翻訳終結コドンから３'方向のｍＲＮＡの部分で、ｍＲＮＡ又は遺伝子上の対応するヌクレオチドの３'末端と翻訳停止コドンの間のヌクレオチドを含む、３'未翻訳領域（３'ＵＴＲ）が含まれる。
ＴＡＨＯタンパク質の発現を阻害するのに有用な好適なアンチセンス化合物の特定の例には、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには骨格にリン原子を保持しているものと骨格にリン原子を有していないものが含まれる。この明細書の目的のために、また当該分野でしばしば引用されるように、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドはまたオリゴヌクレオシドであると考えることができる。好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオネート、キラルホスホロチオネート、ホスホロジチオネート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネートで、３'-アルキレンホスホネート、５'-アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むもの、ホスフィネート、ホスホルアミデートで、３'-アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むもの、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノ-ホスフェートで通常の３'-５'結合を持つもの、これらの２'-５'結合類似体、及び一又は複数のヌクレオチド間結合が３'から３'、５'から５'又は２'から２'結合である逆転された極性を持つものが含まれる。逆転した極性を持つ好適なオリゴヌクレオチドは単一の３'から３'結合を最も３'側のヌクレオチド間結合、つまり、非塩基性(abasic)でありうる単一の逆転ヌクレオシド残基（核酸塩基がないか、又はその代わりにヒドロキシル基を有する）を含む。様々な塩、混合された塩及び遊離の酸形態がまた含まれる。リン含有結合の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許３６８７８０８；４４６９８６３；４４７６３０１；５０２３２４３；５１７７１９６；５１８８８９７；５２６４４２３；５２７６０１９；５２７８３０２；５２８６７１７；５３２１１３１；５３９９６７６；５４０５９３９；５４５３４９６；５４５５２３３；５４６６６７７；５４７６９２５；５５１９１２６；５５３６８２１；５５４１３０６；５５５０１１１；５５６３２５３；５５７１７９９；５５８７３６１；５１９４５９９；５５６５５５５；５５２７８９９；５７２１２１８；５６７２６９７及び５６２５０５０が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
【０３１２】
リン原子をそこに含まない好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格は短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は一又は複数の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。このようなオリゴヌクレオチドの調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許５０３４５０６；５１６６３１５；５１８５４４４；５２１４１３４；５２１６１４１；５２３５０３３；５２６４５６２；５２６４５６４；５４０５９３８；５４３４２５７；５４６６６７７；５４７０９６７；５４８９６７７；５５４１３０７；５５６１２２５；５５９６０８６；５６０２２４０；５６１０２８９；５６０２２４０；５６０８０４６；５６１０２８９；５６１８７０４；５６２３０７０；５６６３３１２；５６３３３６０；５６７７４３７；５７９２６０８；５６４６２６９及び５６７７４３９が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
他の好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、糖とヌクレオシド間結合の双方、つまりヌクレオチド単位の骨格が新規な基と置換される。ベース単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。一つのそのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を持つことが示されているオリゴヌクレオチド擬態体はペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置き換えられている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許５５３９０８２；５７１４３３１；及び５７１９２６２が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。ＰＮＡ化合物の更なる教示はNielsen等, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出すことができる。
好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロチオネート骨格及び／又はヘテロ原子骨格、特に-ＣＨ２-ＮＨ-Ｏ-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｏ-ＣＨ２-［メチレン(メチルイミノ)又はＭＭＩ骨格として知られる］、-ＣＨ２-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-、-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ３)-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-、及び上で参照した米国特許第５４８９６７７号に記載された-Ｏ-Ｎ(ＣＨ３)-ＣＨ２-ＣＨ２-［ここで天然ホスホジエステル骨格は-Ｏ-Ｐ-Ｏ-ＣＨ２-と表される］及び上で参照された米国特許第５６０２２４０号のアミド骨格を含む。また好ましいものは上で参照した米国特許第５０３４５０６号のモルホリノ骨格構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０３１３】
修飾オリゴヌクレオチドはまた一又は複数の置換糖部分を含みうる。好適なオリゴヌクレオチドは２'位に次のものの一つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ-アルキル、Ｓ-アルキル、又はＮ-アルキル；Ｏ-アルケニル、Ｓ-アルケニル又はＮ-アルケニル；Ｏ-アルキニル、Ｓ-アルキニル又はＮ-アルキニル；又はＯ-アルキル-Ｏ-アルキルを含み、ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルでありうる。特に好ましいものはＯ[(ＣＨ２)ｎＯ]ｍＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、Ｏ(ＣＨ２)ｎＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＮＨ２、及びＯ(ＣＨ２)ｎＯＮ[(ＣＨ２)ｎＣＨ３]２であり、ここでｎ及びｍは１から約１０である。他の好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは２'位に次のものの一つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ-アルカリル又はＯ-アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬理的性質を改善する基、及び同様な性質を持つ他の置換基。好適な修飾は２'-メトキシエトキシ(２'-Ｏ-(２-メトキシエチル)又は２'-ＭＯＥとしても知られている２'-Ｏ-ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３)（Martin等, Helv. Chim. Acta., 1995, 78, 486-504）、つまりアルコキシアルコキシ基を含む。更に好適な修飾は、以下の実施例に記載されているように２'-ジメチルアミノオキシエトキシ、つまり２'-ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ(ＣＨ２)２ＯＮ(ＣＨ３)２基、及び２'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（２'-Ｏ-ジメチルアミノエトキシエチル又は２'-ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、つまり２'-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-ＣＨ２-Ｎ(ＣＨ２)を含む。
更に好適な修飾は、２'-ヒドロキシル基が糖環の３'又は４'炭素原子に結合され二環糖部分を形成する固定核酸(Locked Nucleic Acids: ＬＮＡｓ)を含む。結合は好ましくはｎが１又は２である２'酸素原子と４'炭素原子を架橋するメチレン（-ＣＨ２-）ｎ基である。ＬＮＡｓ及びその製造方法は国際公開９８／３９３５２及び国際公開９９／１４２２６に記載されている。
他の好適な修飾は２'-メトキシ(２'-Ｏ-ＣＨ３)、２'-アミノプロポキシ(２'-ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２)、２'-アリル(２'-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)、２'-Ｏ-アリル(２'-Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ=ＣＨ２)及び２'-フルオロ(２'-Ｆ)を含む。２'-修飾はアラビノ（上）位置又はリボ（下）位置においてでありうる。好適な２'-アラビノ修飾は２'-Ｆである。同様の修飾はまたオリゴヌクレオチドの他の位置、特に３'末端ヌクレオチドの糖の３'位又は２'−５'結合オリゴヌクレオチド及び５'末端ヌクレオチドの５'位になすことができる。オリゴヌクレオチドはまたペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬態体を有しうる。そのような修飾糖構造の調製を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許４９８１９５７；５１１８８００；５３１９０８０；５３５９０４４；５３９３８７８；５４４６１３７；５４６６７８６；５５１４７８５；５５１９１３４；５５６７８１１；５５７６４２７；５５９１７２２；５５９７９０９；５６１０３００；５６２７０５３；５６３９８７３；５６４６２６５；５６５８８７３；５６７０６３３；５７９２７４７；及び５７００９２０が含まれ、その各々は出典明示により全体がここに取り込まれる。
【０３１４】
オリゴヌクレオチドにはまた核酸塩基（当該分野ではしばしば単に「塩基」と称される）の修飾又は置換が含まれうる。ここで使用される場合、「未修飾の」又は「天然の」核酸塩基にはプリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基、例えば５-メチルシトシン（５-me-Ｃ）、５-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２-アミノアデニン、６-メチル及び他のアデニン及びグアニンのアルキル誘導体、２-プロピル及び他のアデニン及びグアニンのアルキル誘導体、２-チオウラシル、２-チオチミン及び２-チオシトシン、５-ハロウラシル及びシトシン、５-プロポニル（-Ｃ≡Ｃ-ＣＨ３又はＣＨ２-Ｃ≡ＣＨ）ウラシル及びシトシン及び他のピリミジン塩基のアルキル誘導体、６-アゾウラシル、シトシン及びチミン、５-ウラシル（プソイドウラシル）、４-チオウラシル、８-ハロ、８-アミノ、８-チオール、８-チオアルキル、８-ヒドロキシル及び他の８-置換アデニン類及びグアニン類、５-ハロ、特に５-ブロモ、５-トリフルオロメチル及び他の５-置換ウラシル類及びシトシン類、７-メチルグアニン及び７-メチルアデニン、２-Ｆ-アデニン、２-アミノ-アデニン、８-アザグアニン及び８-アザアデニン、７-デアザグアニン及び７-デアザアデニン及び３-デアザグアニン及び３-デアザアデニンが含まれる。更なる修飾核酸塩基には、三環系ピリミジン類、例えばフェノキサジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾキサジン-２(３Ｈ)-オン)、フェノチアジンシチジン(１Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾチアジン-２(３Ｈ)-オン)、Ｇ-クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば９-(２-アミノエトキシ)-Ｈ-ピリミド[５,４-ｂ][１,４]ベンゾキサジン-２(３Ｈ)-オン）、カルバゾールシチジン(２Ｈ-ピリミド[４,５-ｂ]インドール-２-オン)、ピリドインドールシチジン(Ｈ-ピリド[３',２'：４,５]ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-２-オン)が含まれる。修飾核酸塩基にはまたプリン又はピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられているもの、例えば７-デアザ-アデニン、７-デアザグアノシン、２-アミノピリジン及び２-ピリドンが含まれうる。更なる核酸塩基には米国特許第３６８７８０８号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, ８５８-８５９頁, Kroschwitz, J.I.編 John Wiley ＆ Sons, 1990に開示されているもの、及びEnglisch等, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30,613に開示されているものが含まれる。これらの核酸塩基のある種のものは本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらには、５-置換ピリミジン、６-アザピリミジン及びＮ-２、Ｎ-６及びＯ-６置換プリンで、２-アミノプロピルアデニン、５-プロピニルウラシル及び５-プロピニルシトシンを含むものが含まれる。５-メチルシトシン置換は０．６−１．２℃だけ核酸二重安定性を増大させることが知られており（Sanghvi等, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278）、より詳細には２'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合には、好適な塩基置換である。修飾核酸塩基の製造を教唆する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国��許３６８７８０８；並びに米国特許４８４５２０５；５１３０３０２；５１３４０６６；５１７５２７３；５３６７０６６；５４３２２７２；５４５７１８７；５４５９２５５；５４８４９０８；５５０２１７７；５５２５７１１；５５５２５４０；５５８７４６９；５５９４１２１；５５９６０９１；５６１４６１７；５６４５９８５；５８３０６５３；５７６３５８８；６００５０９６；５６８１９４１及び５７５０６９２が含まれ、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
【０３１５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを亢進する一又は複数の部分又はコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学的に結合させる。本発明の化合物は第１級又は第２級ヒドロキシル基のような官能基に共有結合したコンジュゲート基を含みうる。本発明のコンジュゲート基には、介入物（インターカレーター）、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬理的性質を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態学的性質を増強する基が含まれる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、カチオン脂質、リン脂質、カチオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が含まれる。この発明の文脈における薬理学的性質を増強する基には、オリゴマー取り込みを改善し、分解に対するオリゴマーの耐性を亢進し、及び／又はＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを補強する基が含まれる。この発明の文脈における薬物動態学的性質を増強する基には、オリゴマー取り込み、分散、代謝又は排出を改善する基が含まれる。コンジュゲート部分には限定されるものではないが、脂質分子、例えばコレステロール部分（Letsinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)、コール酸（Manoharan等, Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1063）、チオエーテル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan等, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660-306-309; Manoharan等, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser等, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Saison-Behmoaras等, EMBOJ., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov等, FEBS Lett., 1990, 259, 327-
330; Svinarchuk等, Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチル-アンモニウム１,２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-rac-グリセロ-３-Ｈ-ホスホナート（Manoharan等, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea等, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Manoharan等, Nucleosides ＆ Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、又はアダマンタン酢酸（Manoharan等、Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra等, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた活性な薬物物質、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(Ｓ)-(＋)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２,３,５-トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤又は抗生物質にコンジュゲートすることができる。オリゴヌクレオチド-薬剤コンジュゲート及びその製造方法は米国特許出願第０９／３３４１３０号（１９９９年６月１５日出願）及び米国特許４８２８９７９；４９４８８８２；５２１８１０５；５５２５４６５；５５４１３１３；５５４５７３０；５５５２５３８；５５７８７１７；５５８０７３１；５５８０７３１；５５９１５８４；５１０９１２４；５１１８８０２；５１３８０４５；５４１４０７７；５４８６６０３；５５１２４３９；５５７８７１８；５６０８０４６；４５８７０４４；４６０５７３５；４６６７０２５；４７６２７７９；４７８９７３７；４８２４９４１；４８３５２６３；４８７６３３５；４９０４５８２；４９５８０１３；５０８２８３
０；５１１２９６３；５２４１１３６；５０８２８３０；５１１２９６３；５２１４１３６；５２４５０２２；５２５４４６９；５２５８５０６；５２６２５３６；５２７２２５０；５２９２８７３；５３１７０９８；５３７１２４１；５３９１７２３；５４１６２０３；５４５１４６３；５５１０４７５；５５１２６６７；５５１４７８５；５５６５５５２；５５６７８１０；５５７４１４２；５５８５４８１；５５８７３７１；５５９５７２６；５５９７６９６；５５９９９２３；５５９９９２８及び５６８８９４１に記載され、その各々は出典明示によりここに取り込まれる。
【０３１６】
与えられた化合物の全ての位置を一様に修飾する必要はなく、実際、一を超える上述の修飾を単一化合物中に又はオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドにさえ導入することができる。本発明はまたキメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。本発明の文脈における「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」は、それぞれが少なくとも一のモノマー単位、つまりオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドからなる２以上の化学的に区別される領域を含むアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的にはオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する増大した耐性、増大した細胞性取り込み、及び／又は標的核酸に対する増大した結合親和性を付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも一の領域を含む。オリゴヌクレオチドの更なる領域はＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブロッドを切断可能な酵素の基質となりうる。例を挙げると、ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。故に、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の開裂を生じ、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効果を大きく向上させる。従って、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオネートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラオリゴヌクレオチドが使用される場合、より短いオリゴヌクレオチドで同等の結果をしばしば得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物は上述の二以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド擬態体の複合構造体として形成されてもよい。好適なキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性を付与するために３'末端に少なくとも一の２'修飾糖（好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３）とＲＮアーゼＨ活性を付与するために少なくとも４の隣接した２'-Ｈ糖を持つ領域を含む。このような化合物はまた当該分野においてハイブリッド又はギャプマー(gapmers)とも呼ばれている。好適なギャプマーは少なくとも４の隣接した２'-H糖を持つ少なくとも一の領域で分離した３'末端と５'末端２'修飾糖（好ましくは２'-Ｏ-(ＣＨ２)２-Ｏ-ＣＨ３）の領域を持ち、好ましくはホスホロチオネート骨格結合を含む。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第５０１３８３０；５１４９７９７；５２２０００７；５２５６７７５；５３６６８７８；５４０３７１１；５４９１１３３；５５６５３５０；５６２３０６５；５６５２３５５；５６５２３５６；及び５７００９２２が含まれ、これらのそれぞれが出典明示によりここに取り込まれる。
本発明において使用されるアンチセンス化合物は固相合成のよく知られた技術によって簡便かつ常套的に製造することができる。そのような合成のための装置は、例えばApplied Biosystems (Foster City, Calif.)を含む幾つかのメーカーによって販売されている。当該分野で知られているそのような合成のための任意の他の手段を付加的に又は別に使用してもよい。オリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオネート及びアルキル化誘導体を調製するために類似の技術を使用することはよく知られている。本発明の化合物は、また、取り込み、分散及び／又は吸収を補助するための他の分子、分子構造又は化合物混合物、例えばリポソーム、レセプター標的分子、経口、直腸、局所適用又は他の製剤と、混合、カプセル化、コンジュゲート又はその他、組み合わされてもよい。そのような取り込み、分散及び／又は吸収を補助する製剤の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第５１０８９２１；５３５４８４４；５４１６０１６；５４５９１２７；５５２１２９１；５５４３１５８；５５４７９３２；５５８３０２０；５５９１７２１；４４２６３３０；４５３４８９９；５０１３５５６；５１０８９２１；５２１３８０４；５２２７１７０；５２６４２２１；５３５６６３３；５３９５６１９；５４１６０１６；５４１７９７８；５４６２８５４；５４６９８５４；５５１２２９５；５５２７５２８；５５３４２５９；５５４３１５２；５５５６９４８；５５８０５７５；及び５５９５７５６が含まれ、これらのそれぞれが出典明示によりここに取り込まれる。
【０３１７】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、国際公開９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（国際公開９０／１３６４１参照）を含む。
【０３１８】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
【０３１９】
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、通常は少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈の「約」という用語は、参照ヌクレオチド配列長にその参照長の１０％を加えるか又は減じたものを意味する。
また、プローブをＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＴＡＨＯコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＴＡＨＯをコードするヌクレオチド配列は、そのＴＡＨＯをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
【０３２０】
ＴＡＨＯのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＴＡＨＯがレセプターである場合）、ＴＡＨＯは、結合相互作用に関わっている他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイに使用することができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。また、このような結合性相互作用に含まれるタンパク質は、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＴＡＨＯは関連するリガンドの単離に使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＴＡＨＯ又はＴＡＨＯのレセプターの生物学的活性を模倣するリード化合物を見出すために設計してよい。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングを施すことができるアッセイを含み、それらアッセイを特に小分子薬剤候補を同定することに適したものにする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く特徴付けられているタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
また、ＴＡＨＯ又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＴＡＨＯをコードするｃＤＮＡは、ＴＡＨＯをコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、ＴＡＨＯをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４７３６８６６号や第４８７０００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＴＡＨＯ導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＴＡＨＯをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＴＡＨＯをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。
【０３２１】
あるいは、ＴＡＨＯの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＴＡＨＯをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＴＡＨＯをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＴＡＨＯをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＴＡＨＯ「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＴＡＨＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＴＡＨＯをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＴＡＨＯをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失させたり、組み込みをモニターするために使用する選択性マーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターを胚幹細胞株に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編 (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照のこと］。その後、キメラ胚を適切な偽妊娠の雌性乳母動物に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＴＡＨＯポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
また、ＴＡＨＯポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞内に導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【０３２２】
生細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介トランスフェクションである（Dzau等, Trends  in Biotechnology 11, 205-210(1993)）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシス技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
ここに記載したＴＡＨＯポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、目下のところ新規な染色体マーカーの同定の必要である。本発明の各ＴＡＨＯ核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また、本発明のＴＡＨＯポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングの診断に使用でき、本発明のＴＡＨＯポリペプチドは、その他の組織と比較して１つの組織において、好ましくは同じ組織型の正常組織に比較して疾患性組織において特異的に発現する。ＴＡＨＯ核酸分子には、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【０３２３】
この発明は、ＴＡＨＯポリペプチド（アゴニスト）を模倣、又はＴＡＨＯポリペプチド（アンタゴニスト）の効果を防ぐものを同定するための化合物をスクリーニングする方法を含む。アンタゴニスト薬候補に関するスクリーニングアッセイは、ここで同定された遺伝子によってコードされたＴＡＨＯポリペプチドと結合又は複合化する、さもなければコードされているポリペプチドと他の細胞タンパク質の相互作用を妨害する化合物、例えば、細胞からのＴＡＨＯポリペプチドの発現を阻害するものを含む化合物を同定するように設計されている。そのようなスクリーニングアッセイには、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングを施すことができるアッセイが含まれ、それらアッセイを特に小分子薬剤候補の同定に適したものにする。
このアッセイは、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、そして細胞ベースアッセイを含む、当該分野で良く特徴付けられている種々の形式で行うことができる。
アンタゴニストに関する全てのアッセイは、薬候補をここで同定された核酸によってコードされているＴＡＨＯポリペプチドと、これら両成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間にわたって接触させることを必要とする点で共通である。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＴＡＨＯポリペプチド又は薬候補が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をＴＡＨＯポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきＴＡＨＯポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体の使用によって検出できる。
【０３２４】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子によってコードされる特定のＴＡＨＯポリペプチドと結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーのカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans Proc.Natl. Acad. Sci. USA,89:5789-5793 (1991)に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London),340,:245-246(1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０３２５】
ここで同定されたＴＡＨＯポリペプチドをコードする遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞内又は細胞外成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で調製される。候補化合物の結合阻害能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、ＴＡＨＯポリペプチドを、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともに細胞に添加してもよく、ＴＡＨＯポリペプチド存在下で対象とする活性を阻害する当該化合物の能力が、当該化合物がＴＡＨＯポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＴＡＨＯポリペプチド及び潜在的アンタゴニストを、膜結合ＴＡＨＯポリペプチドレセプター又は組換えレセプターと、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＴＡＨＯポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＴＡＨＯポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパニング及びＦＡＣＳソーティングにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは発現クローニングが用いられ、そこではポリアデニル化ＲＮＡがＴＡＨＯポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又は他のＴＡＨＯポリペプチドに反応性でない細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を、標識したＴＡＨＯポリペプチドへ曝露する。ＴＡＨＯポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフ分析を施す。ポジティブプールを同定し、対話型サブプール化及び再スクリーニング法を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０３２６】
レセプター同定の代替的方法として、標識したＴＡＨＯポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をＰＡＧＥで分離し、Ｘ線フィルムに曝す。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロシークエンシングを施してよい。マイクロシークエンシングから得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするディジェネレートオリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＴＡＨＯポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＴＡＨＯポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、よってＴＡＨＯポリペプチドの作用を競合的に阻害するＴＡＨＯポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なＴＡＨＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、三重螺旋形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＴＡＨＯポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重螺旋−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＴＡＨＯポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてｍＲＮＡ分子のＴＡＨＯポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。また上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＴＡＨＯポリペプチドの産生を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０３２７】
潜在的アンタゴニストは、ＴＡＨＯポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＴＡＨＯポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的開裂により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、国際公開 ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスティン(Hoogsteen)塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのかなり大きな伸張を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のＰＣＴ公報、国際公開９７／３３５５１を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０３２８】
単離されたＴＡＨＯポリペプチド-コード化核酸は、ここに記載されているような当該分野で良く知られている技術を用いて、組み換え的にＴＡＨＯポリペプチドを生成するために、ここで用いることが可能である。次に、生成されたＴＡＨＯポリペプチドは、ここに記載されているような当該分野で良く知られている技術を用いて、抗ＴＡＨＯ抗体を生成するために用いることが可能である。
ここで同定されるＴＡＨＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ＴＡＨＯポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に搬送するために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害性薬、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤のようなその機能を高める薬剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０３２９】
Ｍ．抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０３３０】
Ｎ．スクリーニング方法
本発明の更に他の実施態様は、ＴＡＨＯポリペプチドを含むと疑われる試料中のＴＡＨＯポリペプチドの存在を決定する方法であって、ＴＡＨＯポリペプチドに結合するその抗体薬剤コンジュゲートに試料を暴露し、試料中のＴＡＨＯポリペプチドへのその抗体薬剤コンジュゲートの結合を決定することを含み、かかる結合の存在が試料中のＴＡＨＯポリペプチドの存在を示す方法に関する。場合によっては、試料は、ＴＡＨＯポリペプチドを発現していることが疑われる細胞(癌細胞でありうる)を含みうる。本方法で用いられるその抗体薬剤コンジュゲートは、場合によっては検出可能に標識され、固体担体に結合等されうる。
本発明の他の実施態様は、哺乳動物中における腫瘍の存在を診断する方法であって、(ａ)ＴＡＨＯポリペプチドに結合するその抗体薬剤コンジュゲートに、哺乳動物から得られた組織細胞を含む試験試料を接触させ、(ｂ)その抗体薬剤コンジュゲートと試験試料中のＴＡＨＯポリペプチドの間の複合体形成を検出することを含み、複合体の形成が哺乳動物における腫瘍の存在を示す方法に関する。場合によっては、抗体薬剤コンジュゲートは、検出可能に標識され、固体担体に結合等され、及び／又は組織細胞の試験試料が癌性腫瘍を持つことが疑われる個体から得られる。
【０３３１】
ＩＶ．抗ＣＤ７９ｂ抗体及びイムノコンジュゲートの更なる使用方法
Ａ．診断法と検出の方法
一態様では、本発明の抗ＴＡＨＯ抗体及びイムノコンジュゲートは、生体試料中のＴＡＨＯポリペプチドの存在を検出するために有用である。本明細書中で用いる「検出する」なる用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。ある実施態様では、生体試料は、細胞又は組織を含む。ある実施態様では、このような組織には、他の組織、例えばＢ細胞及び／又はＢ細胞関連組織と比較して高いレベルでＴＡＨＯポリペプチドを発現する正常及び／又は癌性組織が含まれる。
一態様では、本発明は、生体試料中のＴＡＨＯポリペプチドの存在を検出する方法を提供する。ある実施態様では、前記方法は、ＴＡＨＯポリペプチドへの抗ＴＡＨＯ抗体の結合に許容される条件下で抗ＴＡＨＯ抗体と生体試料を接触させ、抗ＴＡＨＯ抗体と任意のＴＡＨＯポリペプチドとの間に複合体が形成されるか否かを検出することを含む。
一態様では、本発明は、ＴＡＨＯポリペプチドの発現増加と関係している疾患を診断する方法を提供する。ある実施態様では、前記方法は、抗ＴＡＨＯ抗体と試験細胞を接触させ、ＴＡＨＯポリペプチドへの抗ＴＡＨＯ抗体の結合を検出することによって試験細胞によるＴＡＨＯポリペプチドの発現レベル(量的に又は質的に)を測定し、そして、試験細胞によるＴＡＨＯポリペプチドの発現レベルをコントロール細胞(例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞、又はこの正常細胞と同等のレベルでＴＡＨＯポリペプチドを発現する細胞)によるＴＡＨＯポリペプチドの発現レベルと比較することを含み、コントロール細胞と比べて試験細胞によるＴＡＨＯポリペプチドの発現レベルが高い場合にＴＡＨＯポリペプチドの発現の増加に関連する細胞増殖性疾患の存在が示される。ある実施態様では、試験細胞は、ＴＡＨＯポリペプチドの発現の増加に関連する疾患があると疑われる患者から得られる。ある実施態様では、前記疾患は、癌又は腫瘍などの細胞増殖性疾患である。
【０３３２】
本発明の抗体を使用して診断されうる例示的な細胞増殖性疾患には、限定するものではないが、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、侵襲性ＮＨＬ、再発侵襲性ＮＨＬ、再発無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、ヘアリーセル白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、及びマントル細胞リンパ腫を含むＢ細胞疾患及び／又はＢ細胞増殖性疾患が含まれる。
ある実施態様では、上記のような診断ないし検出の方法は、表面にＴＡＨＯポリペプチドを発現する細胞から得た膜調整物中又は細胞の表面において発現されるＴＡＨＯポリペプチドに対する抗ＴＡＨＯ抗体の結合を検出することを含む。ある実施態様では、前記方法は、ＴＡＨＯポリペプチドへの抗ＴＡＨＯ抗体の結合に許容される条件下で抗ＴＡＨＯ抗体と細胞を接触させ、抗ＴＡＨＯ抗体と細胞表面上のＴＡＨＯポリペプチドとの間に複合体が形成されるか否かを検出することを含む。細胞の表面上に発現されたＴＡＨＯポリペプチドへの抗ＴＡＨＯ抗体の結合を検出するための例示的なアッセイは、「ＦＡＣＳ」アッセイである。
【０３３３】
ある他の方法は、ＴＡＨＯポリペプチドに対する抗ＴＡＨＯ抗体の結合を検出するために用いてもよい。前期の方法には、限定するものではないが、当分野で周知である抗原-結合アッセイ、例えばウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ(抗体結合免疫吸着検定)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、及び免疫組織化学(ＩＨＣ)が含まれる。
ある実施態様では、抗ＴＡＨＯ抗体は標識される。標識には、限定するものではないが、直接検出される標識又は分子(例えば、蛍光、発色、高電子密度、化学発光、及び放射性標識)、並びに、例えば酵素反応又は分子相互作用によって間接的に検出される酵素ないしはリガンドなどの分子が含まれる。例示的な標識には、限定するものではないが、放射性同位体である３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希有土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はマイクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化するために水素ペルオキシダーゼを用いる酵素とカップリングさせたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定したフリーラジカルなどが含まれる。
【０３３４】
ある実施態様では、抗ＴＡＨＯ抗体は不溶性基質に固定される。固定化は、溶液中で遊離したままであるいずれかのＴＡＨＯポリペプチドから抗ＴＡＨＯ抗体を分離することを伴う。これは従来、水不溶性基質ないしは表面に吸着させる(Bennich等, 米国特許第３７２０７６０号)又は共有的にカップリングさせる(例えば、グルタールアルデヒド架橋結合を使用する)などしてアッセイ手順の前に抗ＴＡＨＯ抗体を不溶化するか、又は抗ＴＡＨＯ抗体とＴＡＨＯポリペプチドとの複合体の形成の後に、例えば免疫沈降によって抗ＴＡＨＯ抗体を不溶化することによって達成される。
診断ないし検出の上記いずれかの実施態様は、抗ＴＡＨＯ抗体の代わりに、ないしは抗ＴＡＨＯ抗体に加えて本発明のイムノコンジュゲートを用いて行われうる。
【０３３５】
Ｂ．治療法
本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、例えばインビトロ、エクスビボ、及びインビボの治療法で使われてもよい。一態様では、本発明は、ＴＡＨＯポリペプチドへのイムノコンジュゲートの結合が許容される条件下で抗ＴＡＨＯ抗体ないしはそのイムノコンジュゲートに細胞を曝すことを含む、インビボ又はインビトロでの細胞の成長ないしは増殖を阻害するための方法を提供する。「細胞成長又は増殖を阻害する」ことは、細胞の成長ないしは増殖を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％低減することを意味し、細胞死を誘導することを含む。ある実施態様では、細胞は腫瘍細胞である。ある実施態様では、細胞はＢ細胞である。ある実施態様では、細胞は、例えば本明細書中に例示したような異種移植片である。
一態様では、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、Ｂ細胞増殖性疾患を治療するか又は予防するために用いる。ある実施態様では、細胞増殖性疾患は、ＴＡＨＯポリペプチドの発現及び／又は活性の増加と関係している。例えば、ある実施態様では、細胞増殖性疾患は、Ｂ細胞の表面上のＴＡＨＯポリペプチドの発現増加と関係している。ある実施態様では、Ｂ細胞増殖性疾患は腫瘍又は癌である。本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートによって処置されるＢ細胞増殖性疾患の例には、限定するものではないが、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、侵襲性ＮＨＬ、再発侵襲性ＮＨＬ、再発無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、ヘアリーセル白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、及びマントル細胞リンパ腫が含まれる。
【０３３６】
一態様では、本発明は、抗ＴＡＨＯ抗体ないしそのイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含むＢ細胞増殖性疾患を治療するための方法を提供する。ある実施態様では、Ｂ細胞増殖性疾患を治療するための方法は、抗ＴＡＨＯ抗体又は抗ＴＡＨＯイムノコンジュゲートと、場合によって以下に挙げるような少なくとも一の付加的治療剤とを含有する薬学的製剤の有効量を個体に投与することを含む。ある実施態様では、細胞増殖性疾患を治療するための方法は、１)抗ＴＡＨＯ抗体と細胞障害性剤とを含むイムノコンジュゲートと、場合によって２)以下に挙げるような少なくとも一の付加的治療剤とを含有する薬学的製剤の有効量を個体に投与することを含む。
一態様では、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートの少なくともいくつかは、ヒト以外の種のＴＡＨＯを結合しうる。したがって、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、例えば、ＴＡＨＯポリペプチドを含む細胞培養物において、ヒトにおいて、又は、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートが交差反応するＴＡＨＯポリペプチドを有する他の哺乳動物(例えばチンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル及びアカゲザル、ブタ又はマウス)においてＴＡＨＯポリペプチドを結合するために用いてもよい。一実施態様では、抗ＴＡＨＯ抗体ないしイムノコンジュゲートは、イムノコンジュゲートのコンジュゲートされている細胞毒性が細胞の内部にアクセスするように、抗体ないしイムノコンジュゲートをＴＡＨＯポリペプチドと接触させて抗体ないしイムノコンジュゲート−抗原複合体を形成させることによってＢ細胞上のＴＡＨＯポリペプチドをターゲティングするために使われてよい。一実施態様では、ＴＡＨＯポリペプチドはヒトＴＡＨＯポリペプチドである。
【０３３７】
一実施態様では、抗ＴＡＨＯ抗体ないしイムノコンジュゲートは、個体のＴＡＨＯポリペプチドが結合されるように抗体ないしイムノコンジュゲートを個体に投与することを含む、ＴＡＨＯポリペプチド発現及び／又は活性の増加と関係する疾患を患っている個体において抗体を結合させるための方法に用いられうる。一実施態様では、結合抗体又はイムノコンジュゲートはＴＡＨＯポリペプチド発現Ｂ細胞中に内部移行する。一実施態様では、ＴＡＨＯポリペプチドはヒトのＴＡＨＯポリペプチドであり、個体はヒト個体である。あるいは、個体は、抗ＴＡＨＯ抗体が結合するＴＡＨＯポリペプチドを発現している哺乳動物であってもよい。また更に、個体は、ＴＡＨＯポリペプチドが(例えば、ＴＡＨＯポリペプチドの投与によって、又はＴＡＨＯポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現によって)導入された哺乳動物であってもよい。
抗ＴＡＨＯ抗体ないしイムノコンジュゲートは、治療目的のためにヒトに投与されうる。さらに、抗ＴＡＨＯ抗体ないしイムノコンジュゲートは、獣医学の目的のため又はヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交差反応するＴＡＨＯポリペプチドを発現する非ヒト哺乳動物(例えば、霊長類、ブタ、ラット又はマウス)に投与されうる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートの治療有効性を評価するため(例えば、投与の用量及び時間経過の試験する)に有用となりうる。
【０３３８】
本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートが、治療において単独、又は他の組成物と組み合わせて使われてもよい。例えば、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、少なくとも一の付加的治療剤及び／又はアジュバントと同時に投与されてもよい。ある実施態様では、付加的治療剤は、細胞障害性剤、化学療法剤又は増殖阻害性剤である。このような実施態様のうちの一つでは、化学療法剤は、卵巣癌の治療に用いられる薬剤又はこの薬剤の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン、アドリアマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン(オンコビンＴＭ)、プレドニソロン、ＣＨＯＰ、ＣＶＰ、又はＣＯＰ、又は免疫療法剤、例えば抗ＣＤ２０(例えばリツキサン(登録商標))又は抗ＶＥＧＦ(例えばアバスチン(登録商標))であり、ここで、併用療法は、癌及び／又はＢ細胞疾患、例えばリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、侵襲性ＮＨＬ、再発侵襲性ＮＨＬ、再発無痛性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性無痛性ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、小リンパ球性リンパ腫、白血病、ヘアリーセル白血病(ＨＣＬ)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、及びマントル細胞リンパ腫を含むＢ細胞増殖疾患の治療に有用である。
【０３３９】
上記の併用治療には、併用投与(２以上の治療剤が同じか又は別の製剤に包含される)、及び別々の投与、別々の場合には、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは付加的治療剤及び／又はアジュバントの前、同時及び／又はその後に投与することができる。また、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、放射線療法と組み合わせて使われてもよい。
本発明の抗体ないしイムノコンジュゲート(及び任意の更なる治療剤又はアジュバント)は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、及び鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体ないしイムノコンジュゲートを、特に抗体ないしイムノコンジュゲートの用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって投与することができる。
【０３４０】
本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体ないしイムノコンジュゲートとを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の抗体ないしイムノコンジュゲートの量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の１〜９９％で、或いは経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で、用いられる。
【０３４１】
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートの好適な用量は(単独で用いる場合、又は化学療法剤などの一又は複数の他の付加的な治療剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体ないしイムノコンジュゲートのタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体ないしイムノコンジュゲートを予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体ないしイムノコンジュゲートへの応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体ないしイムノコンジュゲートは一時的又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ)の抗体ないしイムノコンジュゲートを、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、通常、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体ないしイムノコンジュゲートの用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの抗体ないしイムノコンジュゲートの一以上の用量を(又はそれらを組み合わせて)患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい(例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体ないしイムノコンジュゲートが投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
【０３４２】
Ｃ．活性アッセイ
本発明の抗ＴＡＨＯ抗体及びイムノコンジュゲートは、当分野で公知の様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的な性質及び／又は生物活性について特徴付けされうる。
【０３４３】
１．活性アッセイ
一態様では、アッセイは、生物学的な活性を有する抗ＴＡＨＯ抗体ないしそのイムノコンジュゲートを同定するために提供される。生物学的な活性には、例えば、細胞成長又は増殖の阻害能(例えば「細胞殺傷」活性)、又はプログラムされた細胞死(アポトーシス)を含む細胞死誘導能が含まれうる。また、インビボ及び／又はインビトロでのこのような生物学的な活性を有する抗体ないしイムノコンジュゲートが提供される。
ある実施態様では、抗ＴＡＨＯ抗体又はそのイムノコンジュゲートは、インビトロでの細胞成長又は増殖を阻害する能力について試験される。細胞成長又は増殖の阻害のためのアッセイは当分野で周知である。本明細中に記載の「細胞殺傷」アッセイにて例示した細胞増殖のためのあるアッセイは、細胞生存度を測定する。このようなあるアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ(Madison, WI)から市販されているＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ発光細胞生存率アッセイである。このアッセイは、代謝活性のある細胞の指標であるＡＴＰの存在の量に基づいて生細胞数を決定する。Crouch等 (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88、米国特許第６６０２６７７号を参照。アッセイは、自動ハイスループットスクリーニング(ＨＴＳ)に用いられるように９６-又は３８４-ウェルフォーマットで行ってもよい。Cree等 (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404を参照。アッセイ手順は、単一の試薬(ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(登録商標)試薬)を直接培養細胞に加えることを伴う。この結果、細胞溶解が生じ、ルシフェラーゼ反応によって生産される発光シグナルが生成される。この発光シグナルは、培養物中に存在する生細胞の数に直接比例している、ＡＴＰの存在の量に比例する。データは、ルミノメーター又はＣＣＤカメラ画像デバイスによって記録することができる。発光の結果は相対的な光の単位(ＲＬＵ)として表す。
【０３４４】
細胞増殖についての他のアッセイは「ＭＴＴ」アッセイであり、これは、ミトコンドリアレダクターゼによる３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロマイドのホルマザンへの酸化を測定する比色アッセイである。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭアッセイのように、このアッセイは、細胞培養物に存在する代謝活性のある細胞の数を表す。例としてMosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63及びZhang等 (2005) Cancer Res. 65: 3877-3882を参照。
一態様では、抗ＴＡＨＯ抗体は、インビトロでの細胞死を誘導する能力について試験される。細胞死の誘導についてのアッセイは当分野で周知である。いくつかの実施態様では、このようなアッセイは、例えば、プロピジウムヨウ素(ＰＩ)、トリパンブルー(Moore等 (1995) Cytotechnology, 17:1-11を参照)、又は７ＡＡＤの取り込みによって示される膜統合性の喪失を測定する。例示的なＰＩ取り込みアッセイでは、細胞は、１０％の熱不活性化ＦＢＳ(Hyclone)と２ｍＭのＬ-グルタミンを添加した、ダルベッコ変更イーグル培地(Ｄ-ＭＥＭ)：ハムＦ-１２(５０:５０)中で培養する。したがって、このアッセイは、補体と免疫エフェクター細胞の非存在下で行う。１００×２０ｍｍのディッシュにディッシュ当たり３×１０６の密度で細胞を播き、終夜接着させる。培地を取り除き、新鮮な培地のみ、又は様々な濃度の抗体ないしイムノコンジュゲートを含む培地と交換する。細胞を３日間インキュベートする。処置後、単層をＰＢＳにて洗浄し、トリプシン処理によって脱離させる。次いで、１２００ｒｐｍで４℃で５分間遠心して、ペレットを３ｍｌの冷却Ｃａ２＋結合バッファ(１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７.４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２.５ｍＭ ＣａＣｌ２)に再懸濁し、細胞凝集塊を取り除くために３５ｍｍのストレーナーを取り付けた１２×７５ｍｍチューブ(チューブ当たり１ｍｌ、１処理群につき３チューブ)に分注する。次いで、チューブにＰＩ(１０μｇ／ｍｌ)を加える。試料は、ＦＡＣＳＣＡＮＴＭフローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴＴＭＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて分析される。次いで、ＰＩ取り込みによって定まる統計学的に有意なレベルの細胞死を誘導する抗体ないしイムノコンジュゲートを同定する。
【０３４５】
一態様では、抗ＴＡＨＯ抗体ないしイムノコンジュゲートは、インビトロでのアポトーシス(プログラムされた細胞死)を誘導する能力について試験される。アポトーシスを誘導する抗体ないしイムノコンジュゲートの例示的なアッセイはアネキシン結合アッセイである。例示的なアネキシン結合アッセイでは、細胞を培養し、前段落で述べたようにディッシュに播く。培地を取り除き、新鮮培地のみ、又は０．００１〜１０μｇ／ｍｌの抗体ないしイムノコンジュゲートを含む培地と交換する。３日間のインキュベート後、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理によって脱離させる。次いで、細胞を遠心して、Ｃａ２＋結合バッファに再懸濁し、前段落で述べたようにチューブに分注する。その後、チューブに標識したアネキシン(例えばアネキシンＶ-ＦＩＴＣ)(１μｇ／ｍｌ)を加える。試料は、ＦＡＣＳＣＡＮＴＭフローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴＴＭＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア(BD Biosciences)を用いて分析される。次いで、コントロールと比べて統計学的に有意なレベルのアネキシン結合を誘導する抗体ないしイムノコンジュゲートを同定する。アポトーシスを誘導する抗体ないしイムノコンジュゲートの他の例示的なアッセイは、ゲノムＤＮＡのヌクレオソーム間分解を検出するためのヒストンＤＮＡ  ＥＬＩＳＡ比色アッセイである。このアッセイは、例えば細胞死検出ＥＬＩＳＡキット(Roche, Palo Alto, CA)を用いて行うことができる。
上記いずれかのインビトロアッセイに用いるための細胞には、天然でＴＡＨＯポリペプチドを発現する又はＴＡＨＯポリペプチドを発現するように操作された細胞ないしは細胞株が含まれる。このような細胞には、同じ細胞起源の正常細胞と比べてＴＡＨＯポリペプチドを過剰発現する腫瘍細胞が含まれる。また、このような細胞には、ＴＡＨＯポリペプチドを発現する細胞株(腫瘍細胞株を含む)や、正常にＴＡＨＯポリペプチドを発現しないがＴＡＨＯポリペプチドをコードする核酸を形質移入してある細胞株が含まれる。
【０３４６】
一態様では、抗ＴＡＨＯ抗体ないしそのイムノコンジュゲートは、インビボでの細胞成長又は増殖を阻害する能力について試験される。ある実施態様では、抗ＴＡＨＯ抗体ないしそのイムノコンジュゲートは、インビボでの腫瘍増殖を阻害する能力について試験される。異種移植片モデルなどのインビボモデルシステムが前記の試験のために用いられうる。例示的な異種移植片システムでは、好適に免疫を低下させた非ヒト動物、例えばＳＣＩＤマウスにヒト腫瘍細胞が導入される。本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは動物に投与される。抗体ないしイムノコンジュゲートの腫瘍増殖を阻害するか又は減少させる能力が測定される。上記の異種移植片システムのある実施態様では、ヒト腫瘍細胞はヒト患者の腫瘍細胞である。このような異種移植片モデルの調製に有用な細胞には、限定するものではないが、ＢＪＡＢ−ｌｕｃ細胞(ルシフェラーゼレポーター遺伝子を形質移入したＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞株)、Ｒａｍｏｓ細胞(ATCC, Manassas, VA, CRL-1923)、ＳｕＤＨＬ−４細胞(DSMZ, Braunschweig, Germany, AAC 495)、ＤｏＨＨ２細胞(Kluin-Neilemans, H.C.等, Leukemia 5:221-224 (1991)、及びKluin-Neilemans, H.C.等, Leukemia 8:1385-1391 (1994)を参照)、Ｇｒａｎｔａ−５１９細胞(Jadayel, D.M.等, Leukemia 11(1):64-72 (1997)を参照)ヒト白血病及びリンパ腫細胞株が含まれる。ある実施態様では、ヒト腫瘍細胞は、皮下注射によって又は哺乳動物の脂肪体などの好適な部位に移植することによって適切に免疫無防備状態にされた非ヒト動物に導入される。
【０３４７】
２．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、抗ＴＡＨＯ抗体はその抗原結合活性について試験される。例えば、ある実施態様では、抗ＴＡＨＯ抗体は、細胞の表面に発現されるＴＡＨＯポリペプチドに結合する能力について試験される。ＦＡＣＳアッセイがそのような試験に用いられてもよい。
一態様では、競合アッセイを用いて、ＴＡＨＯポリペプチドへの結合について、マウスＳＮ８抗体と競合するモノクローナル抗体を同定してもよい。ある実施態様では、前記の競争する抗体は、マウスＭＡ７９ｂ抗体、ヒト化ＭＡ７９ｂ．ｖ１７抗体及び／又はヒト化ＭＡ７９ｂ．ｖ１８及び／又はヒト化ＭＡ７９ｂ．ｖ２８及び／又はヒト化ＭＡ７９ｂ．ｖ３２が結合する同じエピトープ(例えば線形又は立体のエピトープ)に結合する。例示的な競合アッセイには、限定するものではないが、Harlow及びLane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)に挙げられるものなどの常套的アッセイが含まれる。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法は、Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)のMorris (1996) "Epitope Mapping Protocols"に示される。２つの抗体のそれぞれが５０％以上他の結合をブロックする場合、これらの抗体は同じエピトープに結合すると言える。
【０３４８】
例示的な競合アッセイでは、固定されたＴＡＨＯポリペプチドは、ＴＡＨＯポリペプチドに結合する第一標識抗体(例えばマウスＳＮ８抗体)と、ＴＡＨＯポリペプチドへの結合について第一抗体と競合する能力について試験されている第二非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。二次抗体はハイブリドーマ上清に存在してもよい。コントロールとして、固定したＴＡＨＯポリペプチドを第一標識抗体を含むが第二非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートする。ＴＡＨＯポリペプチドへの第一抗体の結合に許容される条件下でのインキュベートの後、過剰な結合していない抗体を取り除き、固定されたＴＡＨＯポリペプチドと結合している標識の量を測定する。固定されたＴＡＨＯポリペプチドと結合している標識の量がコントロール試料と比較して試験試料において実質的に減少している場合、二次抗体がＴＡＨＯポリペプチドへの結合について第一抗体と競合していることが示唆される。ある実施態様では、固定されたＴＡＨＯポリペプチドは、細胞の表面上に、又はその表面上にＴＡＨＯポリペプチドを発現する細胞から得た膜調製物中に存在する。
一態様では、精製した抗ＴＡＨＯ抗体はさらに、限定するものではないが、Ｎ末端配列決定法、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィ及びパパイン消化を含む、一連のアッセイによって特徴付けることができる。
【０３４９】
一実施態様では、本発明は、全てではないが幾つかのエフェクター機能を有する変更された抗体を考慮し、この抗体は、抗体のインビボ半減期が重要であり、更に特定のエフェクター機能(補体又はＡＤＣＣなど)が不要又は有害である多くの用途の好ましい候補となる。特定の実施態様では、抗体のＦｃ活性を測定して、所望の特性だけが維持されていることを確認する。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している(すなわちＡＤＣＣ活性を欠損していると思われる)が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを仲介する第一細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIのみを発現し、その一方で単核細胞はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現する。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの一例は、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes 等のPNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいてインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法を用いて行うことができる。
【０３５０】
以下の実施例は例示的な目的のみであって、いずれの場合においても本発明の範囲を限定するものではない。
本明細書において引用されるすべての特許及び文献は、出典明記によってそれらの全体がここに援用される。
【実施例】
【０３５１】
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。実施例で使用される抗体は市販されているもので、それらには、限定されないが、抗ＣＤ１８０(eBioscience社ＭＲＨ７３−１１、BD Pharmingen社Ｇ２８−８及びSerotec社ＭＨＲ７３）、抗ＣＤ２０（Ancell社２Ｈ７及びBD Pharmingen社２Ｈ７）、抗ＣＤ７２（BD Pharmingen社Ｊ４-１１７）、抗ＣＸＣＲ５（R&D Systems社５１５０５）、抗ＣＤ２２（Ancell社ＲＦＢ４、DAKO社Ｔｏ１５、Diatec社１５７、Sigma社ＨＩＢ−２２及びMonosan社ＢＬ−ＢＣ３４）、抗ＣＤ２２（Leinco社ＲＦＢ−４及びNeoMarkers社２２Ｃ０４）、抗ＣＤ２１（ＡＴＣＣ ＨＢ−１３５及びＡＴＣＣＨＢ５）、抗ＨＬＡ−ＤＯＢ（BD Pharmingen社ＤＯＢ．Ｌ１）、抗ＣＤ７９ａ（Caltag社ＺＬ７−４及びSerotec社ＺＬ７−４）、抗ＣＤ７９ｂ（Biomeda社ＳＮ８及びBD Pharmingen社ＣＢ−３）、抗ＣＤ１９（Biomeda社ＣＢ−１９）、抗ＦＣＥＲ２（Ancell社ＢＵ３８及びSerotec社Ｄ３．６及びBD Pharmingen社Ｍ−Ｌ２３３）が含まれる。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体の中で特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【０３５２】
実施例１：マイクロアレイを用いたＴＡＨＯ発現のデータ分析
マイクロアレイを用いたデータでは、組織及び培養細胞から採取した幅広い種類のＲＮＡ試料にＤＮＡマイクロアレイ分析を実施することにより、ＴＡＨＯ発現の分析を行う。試料は、静止状態と、外部から刺激を加えた直後両方の、正常及び癌性のヒト組織及び様々な精製済み免疫細胞を含む。これらＲＮＡ試料は、Agilent社のマイクロアレイを用いる標準的マイクロアレイプロトコルに従って分析することができる。
本実施例では、ＲＮＡを細胞から単離し、Agilent低出力ＲＮＡ蛍光線形増幅キット（Agilent社）を用いたインビトロ転写により、シアニン３及びシアニン５標識したｃＲＮＡプローブを生成した。ＰＲＯポリペプチド発現の試験対象となる、骨髄腫及びプラズマ細胞等の試料を、シアニン５を使用して標識し、試験試料の発現と比較するための汎用基準（Stratagene社の細胞株プール）をシアニン３を用いて標識した。０．１μｇ〜０．２ｍｇの、シアニン３及びシアニン５で標識したｃＲＮＡプローブを、インサイツハイブリダイゼーションキットＰｌｕｓ（Agilent）を用いてAgilent社の６０塩基長オリゴヌクレオチドアレイチップにハイブリダイズした。これらのプローブをマイクロアレイにハイブリダイズした。多発性骨髄腫の分析のため、標準Agilent社推奨条件及びバッファー（Agilent）を用いて、Agilent社の全ヒトゲノムオリゴヌクレオチドマイクロアレイにプローブをハイブリダイズした。
【０３５３】
４ＲＰＭのハイブリダイゼーションローテータセット上で、ｃＲＮＡプローブを６０℃で１７時間に亘りマイクロアレイにハイブリダイズする。洗浄後、シアニン３及びシアニン５蛍光分子（５３２及び６３３ｎｍレーザ線）を励起して検出することができるAgilent社のマイクロアレイスキャナを用いて、マイクロアレイをスキャンした。特徴の認識、背景のサブトラクション及び標準化を行うAgilent社の特徴抽出ソフトウエアを用いて、スキャンされたマイクロアレイ画像から６０塩基長オリゴヌクレオチドアレイにおける各遺伝子のデータを抽出し、結果として得られたデータを、Rosetta社のResolver遺伝子発現データ分析システム（Rosetta Inpharmatics, Inc.）として知られるソフトウエアパッケージにロードした。Rosetta Resolverは、強度又は割合で示す大量の遺伝子発現データの保存、検索及び分析を行うための多数の分析ツール及び関連データベースを含んでいる。
本実施例では、マイクロアレイを用いた分析のためにＢ細胞及びＴ細胞（コントロール）を取得した。ナイーブＢ細胞及び記憶Ｂ細胞、並びにプラズマ細胞を単離するため、４人の健常な男性ドナーから提供されたleukopack又は複数の健常なドナーの全血からヒト抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。ＭＡＣＳ（Miltenyi Biotec）磁性細胞選別システム及び抗ＣＤ１３８ビーズを用いてＣＤ１３８＋プラズマ細胞をＰＢＭＣから単離した。別法として、抗ＣＤ１９ビーズ及びＭＡＣＳ選別を用いて全ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択した。ＣＤ１９＋（純度約９０％）の濃縮後、ＦＡＣＳ（Moflo）選別を行って、ナイーブB細胞と記憶B細胞を分離した。試料を遠心分離することにより、選別した細胞を回収した。選別した細胞を直ちにＬＴＲバッファー中で溶解し、QIAshredder（Qiagen）のスピンカラムを用いて均一化し、RNeasyミニキットによりＲＮＡを精製した。ＲＮＡの収率は０．４〜１０μｇであり、それは細胞数に依存していた。
【０３５４】
コントロールとして、マイクロアレイ分析のためにＴ細胞を単離した。Stem Cell Technologies社のＣＤ８細胞単離キット（Rosette Separation）を用いた陰性選別により白血球層から抹消血ＣＤ８細胞を単離し、ＣＤ８細胞単離キットを用いたＭＡＣＳ磁性細胞選別システムにより更に精製し、ＣＤ４５ＲＯ細胞（Miltenyi Biotec）を除去するためにＣＤ４５ＲＯマイクロビーズを添加した。ＣＤ８  Ｔ細胞を３つの試料に分割し、各試料に対し次のような刺激、即ち、（１）抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８、並びにＩＬ−１２及び抗ＩＬ４抗体、（２）サイトカイン又は中和抗体を加えない抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２９、及び（３）抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８、並びにＩＬ−４、ＩＬ１２抗体及び抗ＩＦＮ−γ抗体を与えた。刺激から４８時間後、ＲＮＡを回収した。７２時間後、新鮮な培地で８倍に希釈することにより細胞を拡大させた。ＲＮＡを回収してから７日後、ＣＤ８細胞を回収、洗浄し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で再度刺激した。１６時間後、ＲＮＡの２回目の回収を行った。再刺激の４８時間後、ＲＮＡの３回目の回収を行った。ＲＮＡは、マニュアルの指示に従ってQiogen Midi prepsを用いて、１回目のＲＷ１洗浄ステップの後でオンカラムＤＮＡｓｅ  Ｉ消化を加えて回収した。ＲＮＡｓｅを含まない水にＲＮＡを溶出し、その後エタノール沈降により濃縮した。ヌクレアーゼを含まない水に沈降させたＲＮＡを採り、最終的な最小濃度を０．５μｇ／μｌにした。
ＣＤ４＋  ＴヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球（N’phil）、ＣＤ１４＋、ＣＤ１６＋及びＣＤ１６−単球及び樹状細胞（ＤＣ）から単離したＲＮＡに対し、追加的コントロールマイクロアレイを行った。
【０３５５】
加えて、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ）等の癌性組織から単離したＲＮＡに対し、マイクロアレイを行った。更に、正常細胞、例えば正常なリンパ節（ＮＬＮ）、正常Ｂ細胞、例えば中心芽細胞、中心細胞及び濾胞性マントル由来のＢ細胞、記憶Ｂ細胞、並びに正常プラズマ細胞から単離したＲＮＡに対してマイクロアレイを実施した。これらの細胞はＢ細胞系由来であり、扁桃腺プラズマ細胞、骨髄プラズマ細胞（ＢＭ  ＰＣ）、ＣＤ１９＋プラズマ細胞（ＣＤ１９＋  ＰＣ）、ＣＤ１９−プラズマ細胞（ＣＤ１９−  ＰＣ）等の、骨髄腫細胞の正常な対応物である。更に、小脳、心臓、前立腺、副腎、膀胱、小腸、大腸、胎児肝臓、子宮、腎臓、胎盤、胚、膵臓、筋肉、脳、唾液腺、骨髄（髄）、血液、胸腺、扁桃腺、脾臓、精巣、及び乳腺等の正常組織に対し、マイクロアレイを実施した。
非Ｂ細胞と比べてＢ細胞に有意に発現するものとして下記に列挙する分子が同定された。特に、これら分子は、非Ｂ細胞、例えばＴ細胞と比較した場合、ナイーブなＢ細胞、ＩｇＧＡ＋又はＩｇＭ＋である記憶Ｂ細胞、及びＰＢＭＣ又は骨髄由来のプラズマ細胞に異なって発現した。従って、これら分子は、哺乳動物の腫瘍の治療の良好な標的となる。
【０３５６】
分子                            特異的発現位置          比較対象
ＤＮＡ１０５２５０（ＴＡＨＯ１）      Ｂ細胞              非Ｂ細胞
ＤＮＡ１５０００４（ＴＡＨＯ２）      Ｂ細胞              非Ｂ細胞
【０３５７】
要約
図１４〜１５では、ｍＲＮＡの有意な発現は、２より大きな割合の値として示した（図１４〜１５の縦軸）。図１４〜１５では、前立腺、脾臓などの非Ｂ細胞における見かけ上の発現は全て、人為的結果、リンパ球による正常組織の浸潤又はベンダーによる試料統一性の欠如を表すと考えられる。
（１）ＴＡＨＯ４（ここではＣＤ７９ａとも呼ぶ）は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）多発性骨髄腫（ＭＭ）試料及び小脳及び正常血液正常に有意に発現した（図１４）。しかしながら、上述のように、前立腺、脾臓、血液、扁桃腺等の非Ｂ細胞における見かけ上の発現は、いずれも人為的結果、リンパ球による正常組織の浸潤又はベンダーによる試料統一性の欠如を示すものと考えられる。
（２）ＴＡＨＯ５（ここではヒトＣＤ７９ｂとも呼ぶ）は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に有意に発現した（図１５）。
ＴＡＨＯ４及びＴＡＨＯ５は、マイクロアレイ分析による検出を行った結果、非Ｂ細胞と比較して、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫及び多発性骨髄腫等のＢ細胞関連疾患由来の試料に有意に発現することが同定されたので、これら分子は、リンパ腫、白血病、骨髄腫及びその他造血細胞の癌等のＢ細胞関連癌を含む哺乳動物の腫瘍の治療の良好な標的である。 
【０３５８】
実施例２：ＴＡＨＯｍＲＮＡ発現の定量分析
このアッセイでは、５'ヌクレアーゼアッセイ（例えば、TaqMan（登録商標））及びリアルタイム定量ＰＣＲ（例えば、Mx3000P（登録商標）Real-Time PCRシステム（Stratagene, La Jolla, CA））を、他の一次白血球タイプ等の異なる細胞タイプと比較して、Ｂ細胞等の特定の組織型に有意に過剰発現し、更には特定の組織型の非癌性細胞と比較して特定の組織型の癌性細胞に過剰発現する遺伝子を見出すために使用した。５'ヌクレアーゼアッセイ反応は、Taq DNAポリメラーゼ酵素の５'エキソヌクレアーゼ活性を利用してリアルタイムでの遺伝子発現をモニターする蛍光ＰＣＲ-ベース技術である。２つのオリゴヌクレオチドプライマー（その配列は、対象である遺伝子又はＥＳＴ配列に基づく）を、ＰＣＲ反応で典型的な単位複製配列を生成するために使用する。三番目のオリゴヌクレオチド、又はプローブを、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計する。このプローブは、Taq DNAポリメラーゼ酵素によって伸長可能ではなく、レポーター蛍光色素及びクエンチャー 蛍光色素で標識する。レポーター色素からのどんなレーザー誘導放射も、プローブ上で２つの色素が近接して位置する場合には、消光色素によって消光する。ＰＣＲ増幅反応の間、Taq DNAポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的にプローブを切断する。この結果生じるプローブ断片は溶液中で分離し、放出レポーター色素からの信号は、二番目の蛍光物質の消火効果とは無関係である。レポーター色素の１つの分子は、各新規合成分子のために遊離され、非消光レポーター色素の検出によって、データの定量的解釈に関する根拠が提供される。
５’ヌクレアーゼ手法は、Mx3000P（登録商標）Real-Time PCRシステムのようなリアルタイム定量ＰＣＲ装置で行われる。このシステムは、サーモサイクラー、石英タングステンランプ、検出用の光電子増倍管（ＰＭＴ）及びコンピューターで構成される。このシステムでは、サーモサイクラー上の９６-ウェルフォーマットで試料を増幅する。増幅の間、レーザー誘導蛍光信号が、すべての９６ウェルの光ファイバー計測ケーブルを介してリアルタイムで集められ、ＣＣＤで検出される。このシステムには、装置を作動するため、そしてデータを分析するためのソフトウエアが含まれる。スクリーニングのための出発材料は、種々の異なる白血球タイプ（Neturophil (Neutr)、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、樹状細胞（Dend.）、単球（Mono）、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセット）、幹細胞（ＣＤ３４＋）、から単離したｍＲＮＡ（５０ｎｇ／ウェル、ラン、２通り）、並びに、ドナー多様性を試験するための、２０の別々のＢ細胞ドナー（ドナーＩＤ：３１０、３３０、３５７、３６２、５９７、６３５、８１６、１０１２、１０１３、１０２０、１０７２、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１０８６、１０９６、１０９８、１１０９、１１１２）であった。全てのＲＮＡは購入したものであり（AllCells, LLC, Berkeley, CA）、それぞれの濃度は受領時に正確に測定した。このｍＲＮＡは、例えば蛍光定量的に、正確に定量化される。
【０３５９】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔ、又は閾値サイクルとして表される。これは、レポーター信号が蛍光のバックグラウンドレベルを超えて蓄積するサイクルとして定義される。ΔＣｔ値は、核酸試料中の特定の標識配列の開始コピーの相対数の定量的測定として用いられる。１Ｃｔ単位は、１ＰＣＲサイクル、又は標準に対しておよそ２倍の相対増加に一致し、２単位は、４倍相対増加に一致し、３単位は８倍相対増加に一致する等々であり、２つ以上の異なる組織間のｍＲＮＡ発現の相対倍数増加を定量的に測定できる。試料中のＣｔ値が低い程、その特定遺伝子の開始コピー数は多い。検量線がアッセイに含まれている場合、各標的の相対的な量は推定可能であり、コピー数が多いと、それに比例して量も多いというようにデータを見ることができ（コピー数が多いと反対にＣｔ値は低い）、標準化された１Ｃｔは２倍の増加に等しいという規則に変化があるとそれを矯正する。この技術を用いて、下に列挙した分子が、特定の組織又は細胞のタイプ（同一及び異なるドナー由来）と比較して特定の組織又は細胞タイプの単一（又は限られた数）で有意に（２倍以上）過剰発現していることが同定されており、その一部はまた、特定組織又は細胞タイプの正常細胞と比較したとき、癌性細胞に有意に（すなわち２倍以上）過剰発現していることが同定されているので、哺乳動物における癌の治療にとって優れたポリペプチド標的を表す。
分子                特異的発現が見られる腫瘍          比較対象
ＤＮＡ２２５７８５（ＴＡＨＯ４）          Ｂ細胞                  非Ｂ細胞
ＤＮＡ２２５７８６（ＴＡＨＯ５）  Ｂ細胞／ＣＤ３４＋細胞          非Ｂ細胞
【０３６０】
要約
精製されたＢ細胞又は２０Ｂ細胞ドナー（３１０−１１１２）（AllCells）由来のＢ細胞から単離された総ＲＮＡにおけるＴＡＨＯ４及びＴＡＨＯ５の発現レベル、及び平均化したもの（Avg.B）は、それぞれ複数の白血球タイプ、好中球（Neutr）、ナチュラルキラー細胞（NK）(Ｔ細胞サブセット)、樹状細胞（Dend）、単球（Mono）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３４＋幹細胞（データは示さない）から単離した総ＲＮＡにおけるＴＡＨＯ４及びＴＡＨＯ５の発現レベルと比較して有意に高かった。
従って、ＴａｑＭａｎ分析により検出したところ、ＴＡＨＯ４及びＴＡＨＯ５が、非Ｂ細胞と比較してＢ細胞に有意に発現したことから、これらの分子は、Ｂ細胞関連癌を含む哺乳動物の腫瘍、例えばリンパ腫（つまり非ホジキンリンパ腫）、白血病（つまり慢性リンパ性白血病）、骨髄腫（つまり多発性骨髄腫）及びその他造血細胞癌の治療の良好な標的である。
【０３６１】
実施例３：インサイツハイブリダイゼーション
インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と局在化、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。
インサイツハイブリダイゼーションは、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコールの最適化バージョンに従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ-標識リボプローブを用いて実施される。簡単に述べると、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリダイゼーションする。(３３-Ｐ)ＵＴＰ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリダイゼーションする。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
３３Ｐ-リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の３３Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmol）をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ-ＵＴＰを含む各管に以下の成分を添加した：
２．０μｌの５ｘ転写バッファー
１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌのＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ: 各１０μｌの１０ｍＭ ＧＴＰ，ＣＴＰ及びＡＴＰ＋１０μｌのＨ２Ｏ）
１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌのＲＮａｓｉｎ
１．０μｌのＤＮＡテンプレート（１μｇ）
１．０μｌのＨ２Ｏ
１．０μｌのＲＮＡポメラーゼ（ＰＣＲ産物についてＴ３＝ＡＳ，Ｔ７＝Ｓ，通常）
管を３７℃で１時間インキュベートし、１．０μｌのＲＱ１ ＤＮａｓｅを添加し、ついで３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０）を添加し、混合物をＤＥ８１紙にピペットした。残りの溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットに充填し、プログラム１０を用いてスピンさせた（６分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（３分間）。最終回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終生成物をＤＥ８１紙にピペットし６ｍｌのＢＩＯＦＬＵＯＲ ＩＩで数えた。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。１−３μｌのプローブ又は５μｌのＲＮＡ  ＭｒｋＩＩＩを３μｌのローディングバッファーに添加した。加熱ブロック上で９５℃に３分間加熱した後、プローブを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルを流し、試料を充填し、１８０−２５０ボルトで４５分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から終夜露出した。
【０３６２】
３３Ｐ-ハイブリダイゼーション
Ａ．凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（２５ｍｌ ２０ｘＳＳＣ＋９７５ｍｌ ＳＱ Ｈ２Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（２５０ｍｌの予備加熱ＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の１０ｍｇ／ｍｌストック１２．５μｌ）、切片を０．５ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中、各２分間脱水した。
Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理：
スライドを脱パラフィンし、ＳＱ  Ｈ２Ｏ中に配置し、２ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅバッファー中１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く０．５ｘＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
Ｃ．プレハイブリッド化：
スライドをＢｏｘバッファー（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。
Ｄ．ハイブリダイゼーション：
スライド当たり１．０ｘ１０６ｃｐｍのプローブ及び１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり４８μｌのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスの後、５０μｌの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリダイゼーション５０μｌに添加した。スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
Ｅ．洗浄：
洗浄は、２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（２５０ｍｌＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣＥＤＴＡで室温において洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
【０３６３】
Ｆ．オリゴヌクレオチド
ここに開示した様々なＤＮＡ配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析に対して用いたオリゴヌクレオチドは添付図に示した核酸（又はその相補鎖）に相補的であるように得られた。
(１)ＤＮＡ２２５７８５（ＴＡＨＯ４）
ｐ１  5'-GGGCACCAAGAACCGAATCAT-3'  （配列番号１４）
ｐ２  5'-CCTAGAGGCAGCGATTAAGGG-3'  （配列番号１５）
Ｇ．結果
ここに開示した様々なＤＮＡ配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析からの結果は次の通りである：
（１）ＤＮＡ２２５７８５（ＴＡＨＯ４）
リンパ細胞に発現が観察された。特に、正常組織では、脾臓及びリンパ節に発現が観察され、それは胚中心、マントル、及び周辺帯といったＢ細胞領域と一致していた。また、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、拡散性大細胞リンパ腫、小リンパ球リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む様々な悪性リンパ腫の組織切片に有意な発現が観察された。このデータは、造血性腫瘍、特にＢ細胞腫瘍におけるこの分子の潜在的役割と一貫性を持つ。
【０３６４】
実施例４：ＴＡＨＯのハイブリダイゼーションプローブとしての使用
以下の方法は、ＴＡＨＯをコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとして、すなわち哺乳類におけるＴＡＨＯの存在を検出するための使用を記載する。
ここに開示した完全長又は成熟ＴＡＨＯのコード化配列を含んでなるＤＮＡを、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリーにおける相同的なＤＮＡ（例えば、ＴＡＨＯの天然に生じる変異体をコードするもの）のスクリーニングのためのプローブとしてもまた用いられる。
いずれかのライブラリーＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高ストリンジェント条件で実施した。放射標識ＴＡＨＯ誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２×デンハルト溶液、及び１０％硫酸デキストランの溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
ついで、完全長天然配列ＴＡＨＯをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０３６５】
実施例５：大腸菌中でのＴＡＨＯの発現
この実施例は、大腸菌中での組換え発現によるＴＡＨＯの非グリコシル化形態の調製を例証する。
ＴＡＨＯをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌由来のもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸化される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリ-Ｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴIIコドン、ポリ-Ｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＴＡＨＯコードする領域、ラムダ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、ついで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いて選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を所望の光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
さらに数時間の細胞培養の後、遠心分離による集菌が可能である。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化ＴＡＨＯタンパク質を、タンパク質が堅く結合する条件下で金属キレート化カラムを用いて精製した。
【０３６６】
以下の手法を用いて、ポリ-Ｈｉｓ（ポリ-ヒス）タグ形態でＴＡＨＯを大腸菌で発現させてもよい。ＴＡＨＯをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培地をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６gのShefield hycase SF、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させた。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞ペレットを精製及びリフォールディングまで凍結させた。
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸化によりブロックされた変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに充填した。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸収により見積もった。
【０３６７】
試料を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを最終濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加した。再生したタンパク質を、Poros R１/H逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。Ａ２８０吸収を持つ画分の一定分量をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最も緻密であり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折り畳みＴＡＨＯポリペプチドを含有する画分をプールし、弱い窒素流を溶液に向けながらアセトニトリルを除去した。透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８にタンパク質を調製した。
ここで記載されるＴＡＨＯポリペプチドのあるものは、この方法を使用して成功裏に発現させ精製した。
【０３６８】
実施例６：哺乳動物細胞中でのＴＡＨＯの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるＴＡＨＯの潜在的なグリコシル化形態の調製を例示する。
発現ベクターとしてｐＲＫ５（１９８９年３月１５日発行のＥＰ３０７２４７を参照のこと）を用いた。場合によっては、ＴＡＨＯＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＴＡＨＯＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、各々ｐＲＫ５-ＴＡＨＯと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては栄養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ＴＡＨＯ ＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードする約１μｇのＤＮＡと混合し[Thimmappaya等, Cell, 31:543(1982)]、５００μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を滴下添加し、２５℃で１０分間沈殿物を形成させた。沈殿物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（単独）又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＴＡＨＯポリペプチドの存在を現すとして選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０３６９】
これに換わる技術において、ＴＡＨＯは、Somparyrac等, Proc. Natl. Acad. Sci., １2:7575 (1981)に記載された硫酸デキストラン法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＴＡＨＯＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を２０%グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μg/mlウシインシュリン及び０．１μｇ/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＴＡＨＯを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＴＡＨＯをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＴＡＨＯは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＴＡＨＯポリペプチドの存在を判定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、ついで条件培地を収集する。ついで、発現されたＴＡＨＯを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
【０３７０】
また、エピトープタグＴＡＨＯは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＴＡＨＯは、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、ついで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-Ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ＨｉｓタグＴＡＨＯ挿入物は、ついで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ＨｉｓタグＴＡＨＯを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
また、ＴＡＨＯは、一過性発現法によって、ＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞中で、あるいは他の安定な発現法によってＣＨＯ細胞中で発現させることもできる。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は，以下の方法を用いて実施することが可能である。タンパク質を、各タンパク質の可溶形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現する。
ＰＣＲ増幅に続いて、それぞれのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.１6, John Wiley and Sons (１997)に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化(Shuttling)ができるように作製される。ベクターは、Lucas等, Nucl. Acids Res. 24: 9, １774-１779 (１996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）を用いいて約一千万のＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させた。約３×１０７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
【０３７１】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μｍ濾過ＰＳ２０、５％の０．２μｍ透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍｌスピナーに分けた。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択成長培地を満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートした。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３×１０５細胞／ｍＬで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５１２２４６９号に記載された生産培地を使用した。３Ｌの生産スピナーを１．２×１０６細胞／ｍＬで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプリングし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃に変え、５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の３０ｍＬとした。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μｍフィルターを通して濾過した。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
ポリ−Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール、ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）にポンプ供給した。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μＬの１Ｍトリスバッファー、ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン（Edman）分解によりＮ末端アミノ酸配列決定した。
ここに開示されるＴＡＨＯポリペプチドのあるものは、この方法を使用して成功裏に発現させ精製した。
【０３７２】
実施例７：酵母中でのＴＡＨＯの発現
以下の方法は、酵母中でのＴＡＨＯの組換え発現を記述する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＴＡＨＯの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＴＡＨＯをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＴＡＨＯの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＴＡＨＯをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＴＡＨＯシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又は転化酵素分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＴＡＨＯの発現のためのリンカー配列と共にクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、ついで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０%トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＴＡＨＯは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＴＡＨＯを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここに開示されるＴＡＨＯポリペプチドのあるものは、この方法を使用して成功裏に発現させ精製した。
【０３７３】
実施例８：バキュロウイルス感染昆虫細胞中でのＴＡＨＯの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＴＡＨＯの組換え発現を示す。
ＴＡＨＯをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単に述べると、ＴＡＨＯコード化配列，又はＴＡＨＯのコード化配列の所望する部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、ついで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １7１１）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【０３７４】
次に、発現されたポリ-ＨｉｓタグＴＡＨＯは、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:１75-１79 (１993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＭのHepes、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清をローディングバッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μmフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのローディングバッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに充填した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまでローディングバッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０%グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＴＡＨＯを含む画分をプールしてローディングバッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＴＡＨＯの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ここに開示されるＴＡＨＯポリペプチドのあるものは、この方法を使用して成功裏に発現させ精製した。
【０３７５】
実施例９：ＴＡＨＯに結合する抗体の調製
この実施例は、ＴＡＨＯに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。使用することができる免疫原には、精製ＴＡＨＯ、ＴＡＨＯを含む融合タンパク質、及び細胞表面上に組換えＴＡＨＯを発現する細胞が含まれる。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＴＡＨＯ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗ＴＡＨＯ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、免疫原の静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、免疫原に対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。抗原に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗免疫原モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
この技術を用いて、本明細書に記載したＴＡＨＯポリペプチドの一部を目的とする抗体を成功裏に生成することができる。より具体的には、ＴＡＨＯタンパク質のヒト及びカニクイザル形態を含む、ＴＡＨＯタンパク質を認識してそれに結合できる（標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析及び／又は免疫組織学的分析により測定）機能的モノクローナル抗体を、本明細書に記載する以下のＴＡＨＯタンパク質のヒト及びカニクイザル形態を含む、ＴＡＨＯタンパク質、即ち、ＴＡＨＯ４（ヒトＣＤ７９ａ）（ＤＮＡ２２５７８５）、ＴＡＨＯ５（ヒトＣＤ７９ｂ）（ＤＮＡ２２５７８６）、ＴＡＨＯ３９（ｃｙｎｏＣＤ７９ａ）（ＤＮＡ５４８４５４）及びＴＡＨＯ４０（ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ）（ＤＮＡ５４８４５５）に対して成功裏に生成できる。
本明細書に開示するＴＡＨＯポリペプチドのヒト及びカニクイザル形態を含むＴＡＨＯポリペプチドを目的とするモノクローナル抗体の調製に加えて、（インビトロ及びインビボの両方で）対象のＴＡＨＯポリペプチドを発現する細胞（又は組織）へ細胞毒素を方向付るのに使用される細胞毒素に、多数のモノクローナル抗体を成功裏に抱合することができる。例えば、毒素（例えばＤＭ１）誘導体化モノクローナル抗体は、以下のＴＡＨＯポリペプチド、即ち、ＴＡＨＯ４（ヒトＣＤ７９ａ）（ＤＮＡ２２５７８５）、ＴＡＨＯ５（ヒトＣＤ７９ｂ）（ＤＮＡ２２６７８６）、ＴＡＨＯ３９（ｃｙｎｏＣＤ７９ａ）（ＤＮＡ５４８４５４）及びＴＡＨＯ４０（ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ）（ＤＮＡ５４８４５５）に対して成功裏に生成することができる。
ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４、ＴＡＨＯ５）に対するモノクローナル抗体の生成
ＣＨＯ細胞へのＦｃ又はＨｉｓでタグを付けたヒトＣＤ７９ａ、ヒトＣＤ７９ｂ又はカニクイザルＣＤ７９ｂの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を発現するベクターを過渡的に形質移入することにより、マウスの免疫化用のタンパク質を生成した。形質移入した細胞の上清からニッケルカラムにてタンパク質を精製し、タンパク質の同一性をＮ末端配列決定により確認した。
ＣＤ７９ａ（ヒト）抗体については、１０のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Hollister, CA）を、ヒトＣＤ７９ａの組み換えＦｃタグ化ＥＤＣを用いて過剰免疫化した。ＣＤ７９ｂ（ヒト）抗体については、１０のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Hollister, CA）を、ヒトＣＤ７９ａの組み換えＦｃタグ化ＥＤＣを用いて過剰免疫化した。ＣＤ７９ｂ（カニクイザル）抗体については、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．／Hamilton, MO）中において、カニクイザルＣＤ７９ｂタンパク質の、組換えＦｃタグ化ＥＣＤを用いて過剰免疫化した。
ヒトＣＤ７９ａ抗体については、直接的ＥＬＩＳＡでヒトＣＤ７９ａ免疫原に対して強い抗体力価を示すマウス由来のＢ細胞、及びＲａｊｉ細胞（ＣＤ７９−Ｂ細胞株）に対しＲａｍｏｓ細胞（ＣＤ７９陽性Ｂ細胞株）に特異的に結合するＢ細胞を、前述（Hongo, J.S. et al., Hybridoma, 14:253-260(1995); Kohler, G. et al., Nature, 256:495-497(1975); Freud, Y. R. et al., J. Immunol., 129:2826-2830(1982))の通り、マウス骨髄腫細胞（Ｘ６３．Ａｇ８．６５３；  アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション／Rockville, MD）に融合した。ヒトＣＤ７９ｂ抗体については、直接的ＥＬＩＳＡでヒトＣＤ７９ｂ免疫原に対して強い抗体力価を示すマウス由来のＢ細胞、及びＲａｍｏｓ細胞に特異的に結合するＢ細胞を、前述（Hongo, J.S. et al., Hybridoma, 14:253-260(1995); Kohler, G. et al., Nature, 256:495-497(1975); Freud, Y. R. et al., J. Immunol., 129:2826-2830(1982))の通り、マウス骨髄腫細胞（Ｘ６３．Ａｇ８．６５３；  アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション／Rockville, MD）に融合した。カニクイザルＣＤ７９ｂ抗体については、直接的ＥＬＩＳＡでカニクイザルＣＤ７９ｂ免疫原に対して強い抗体力価を示すマウス由来のＢ細胞、及びカニクイザルの末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)に特異的に結合するＢ細胞集団を、前述（Hongo, J.S. et al., Hybridoma, 14:253-260(1995); Kohler, G. et al., Nature, 256:495-497(1975); Freud, Y. R. et al., J. Immunol., 129:2826-2830(1982))の通り、マウス骨髄腫細胞（Ｘ６３．Ａｇ８．６５３；  アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション／Rockville, MD）に融合した。
ヒトＣＤ７９ａ、ヒトＣＤ７９ｂ及びカニクイザルＣＤ７９ｂについては、１０〜１２日後に、上清を回収し、直接ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳによって抗体産生を検査した。２回のサブクローニングの後、最も高い免疫結合を示すクローンを、ヒトＣＤ７９ａ、ヒトＣＤ７９ｂ又はカニクイザルＣＤ７９ｂ特異性及び交差反応性の更なる特徴付けのために、播種して培養した。各々のハイブリドーマ系統から回収した上清は、既に開示されているもの(上掲のHongo et al.)に類似の変更プロトコールを用いて、親和性クロマトグラフィ(ファルマシア高速タンパク質液体クロマトグラフィ(Pharmacia, Uppsala, Sweden)(FPLC)によって、前述（Hongo, J.S. et al., Hybridoma, 14:253-260(1995); Kohler, G. et al., Nature, 256:495-497(1975); Freud, Y. R. et al., J. Immunol., 129:2826-2830(1982))の通り、精製した。次いで、精製された抗体調製物をフィルター滅菌し(０．２-μｍ細孔径；Nalgene, Rochester NY)、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)中で４℃に保存した。
（標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ選別分析及び／又は免疫組織化学分析により測定した場合）ＴＡＨＯタンパク質を認識し、ＴＡＨＯタンパク質に結合可能なモノクローナル抗体が、ヒトＴＡＨＯ４（ＣＤ７９ａ）に対して成功裏に生成し、抗ヒトＣＤ７９ａ−８Ｈ９（ここでは、「８Ｈ９」又は「８Ｈ９．１．１」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７１９（抗ヒトＣＤ７９ａマウスモノクローナル抗体８Ｈ９．１．１）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託され、抗ヒトＣＤ７９ａ−５Ｃ３（ここでは、「５Ｃ３」又は「５Ｃ３．１．１」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７１８（抗ヒトＣＤ７９ａマウスモノクローナル抗体５Ｃ３．１．１）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託され、抗ヒトＣＤ７９ａ−５Ｃ３（ここでは、「５Ｃ３」又は「５Ｃ３．１．１」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７１８（抗ヒトＣＤ７９ａマウスモノクローナル抗体５Ｃ３．１．１）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託され、抗ヒトＣＤ７９ａ−７Ｈ７（ここでは、「７Ｈ７」又は「７Ｈ７．１．１」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７１７（抗ヒトＣＤ７９ａマウスモノクローナル抗体７Ｈ７．１．１）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託され、抗ヒトＣＤ７９ａ−８Ｄ１１（ここでは、「８Ｄ１１」又は「８Ｄ１１．１．１」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７２２（抗ヒトＣＤ７９ａマウスモノクローナル抗体８Ｄ１１．１．１）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託され、抗ヒトＣＤ７９ａ−１５Ｅ４（ここでは、「１５Ｅ４」又は「１５Ｅ４．１．１」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７２１（抗ヒトＤ７９１マウスモノクローナル抗体１５Ｅ４．１．１）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託され、抗ヒトＣＤ７９ａ−１６Ｃ１１（ここでは、「１６Ｃ１１」又は「１６Ｃ１１．１．１」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７２０（抗ヒトＣＤ７９ａマウスモノクローナル抗体１６Ｃ１１．１．１）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託された。
（標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ選別分析及び／又は免疫組織化学分析により測定した場合）ＴＡＨＯタンパク質を認識し、ＴＡＨＯタンパク質に結合可能なモノクローナル抗体が、ヒトＴＡＨＯ５（ヒトＣＤ７９ｂ）に対して成功裏に生成し、抗ヒトＣＤ７９ａ−２Ｆ２（ここでは、「２Ｆ２」又は「２Ｆ２．２０．１」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７１２（抗ヒトＣＤ７９ｂ２Ｆ２．２０．１）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託された。
（標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ選別分析及び／又は免疫組織化学分析により測定した場合）ＴＡＨＯタンパク質を認識し、ＴＡＨＯタンパク質に結合可能なモノクローナル抗体が、カニクイザルＴＡＨＯ４０（ＣＤ７９ｂ）に対して成功裏に生成し、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ−３Ｈ３（ここでは、「３Ｈ３」又は「３Ｈ３．１．１」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７１４（抗カニクイザルＣＤ７９ｂ３Ｈ３．１．１）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託され、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ−８Ｄ３（ここでは、「８Ｄ３」又は「８Ｄ３．７．１」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７１６（抗カニクイザルＣＤ７９ｂ８Ｄ３．７．１）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託され、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ−９Ｈ１１（ここでは、「９Ｈ１１」又は「９Ｈ１１．３．１」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７１３（抗カニクイザルＣＤ７９ｂ９Ｈ１１．３．１）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託され、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ−１０Ｄ１０（ここでは、「１０Ｄ１０」又は「１０Ｄ１０．３」と呼ぶ）と命名され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７７１５（抗カニクイザルＣＤ７９ｂ１０Ｄ１０．３）として２００６年７月１１日にＡＴＣＣに寄託された。
キメラ抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ｃｈＳＮ８）の作製及びシークエンシング
キメラＳＮ８ＩｇＧ１の作製のために、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１０４）及び製造元提供のプロトコルを使用して、全長ＲＮＡをRoswell Park Cancer Institute (Okazaki et al., Blood, 81(1): 84-95 (1993))から得られたＳＮ８ハイブリドーマ細胞から抽出した。ＳＮ８モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の得られたＮ末端アミノ酸配列を使用して、それぞれの鎖に特異的なＰＣＲプライマーを設計した。ＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマーは、Ｎ末端配列に対応する遺伝子ファミリーのフレームワーク４に適合するように設計された。プライマーはまたクローニングのために所望の制限部位を添加するために設計された。軽鎖については、これらは、Ｎ末端のＥｃｏＲＶとフレームワーク４の３’末端のＲｓｒＩＩであった。重鎖については、添加した部位は、Ｎ末端のＰｖｕＩＩとＶＨ−ＣＨ１ジャンクションのわずかに下流のＡｐａＩであった。プライマーは以下の通りである。
ＣＡ１８０７．ＳＮｌｉｇｈｔ  （ＳＮ８軽鎖フォワードプライマー）：    
５’−  ＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧＣＴ  −  ３’  （配列番号：２８）
ＣＡ１８０８．ＳＮｌｉｇｈｔｒｅｖ  （ＳＮ８軽鎖リバースプライマー）：
５’−  ＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧＴＣＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣ  −  ３’  （配列番号：２９）
ＣＡ１７５５．ＨＦ  （ＳＮ８重鎖フォワードプライマー）：
５’−  ＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣ  −  ３’  （配列番号：３０）
ＣＡ１７５６．ＨＲ  （ＳＮ８重鎖リバースプライマー）：    
５’−  ＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣ  −  ３’  （配列番号：３１）
軽鎖及び重鎖のＲＴ−ＰＣＲ反応は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（カタログ番号２１０２１０）及び示唆された反応混合物と条件を使用して実施した。ＩｇＧの哺乳類細胞発現のためのｐＲＫベクターは以前に記載された(Gorman等., DNA Prot Eng Tech 2:3-10 (1990))。キメラＳＮ８の軽鎖可変ドメインのクローニングのためのベクターは、部位特異的変異によりＲｓｒＩＩ部位が導入され、ヒトｋａｐｐａ定常ドメインを含むｐＤＲ１の誘導体(Shalaby等,  J. Exp. Med., 175 (1): 217-225 (1992)；図２４もまた参照されたい)である。軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶとＲｓｒＩＩを用いて消化され、ゲル精製され、このベクターのＥｃｏＲＶ／ＲｓｒＩＩ部位にクローニングされる。
同様に、キメラＳＮ８の重鎖可変ドメインのクローニングのために、重鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物をＰｖｕＩＩ及びＡｐａＩで切断し、ベクターｐＤＲ２(Shalaby等,  J. Exp. Med., 175 (1): 217-225 (1992)；図２５もまた参照されたい)のＰｖｕＩＩ−ＡｐａＩ部位にクローニングした。このｐＤＲ２ベクターは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
ＤＮＡシークエンスは、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ｃｈＳＮ８）のための、得られたマウスヒトキメラ軽鎖（図９）及び重鎖（図１１）の全体のコード領域をのために得られた。ＤＮＡによってコードされるマウスヒトキメラ軽鎖及び重鎖のためのコードされたポリペプチドを図１０と１２にそれぞれ示す。ＤＮＡのシークエンス後、プラスミドの発現を解析した。
ＣＨＯ細胞についての上記の通り、プラスミドを一時的に２９３(アデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株 (Graham等, J. Gen. Virol., 36: 59-74 (1977))に形質転換した。具体的には、２９３細胞を形質転換の前日に継代し、血清を含む培地に播いた。翌日、リン酸カルシウムの沈殿として調製した二重鎖ＤＮＡ、次いで、ｐＡｄＶＡｎｔａｇe（商標）ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加し、細胞を３７℃で終夜インキュベートした。細胞を血清なしの培地で培養し、４日後に収穫した。抗体タンパク質をプロテインＡカラム上で形質転換した細胞の上清から精製し、次いで緩衝液を、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に交換し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮した。タンパク質の種類は、Ｎ末端シークエンシングで確認した。タンパク質濃度は、定量的なアミノ酸分析によって決定した。抗体は、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５０）への結合について、上記の通り、ＢＪＡＢ又はＲＡＭＯＳ細胞中においてＦＡＣＳによって試験した。
抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ｃｈ２Ｆ２）の作製及びシークエンシング
キメラ２Ｆ２ＩｇＧ１の作製のために、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１０４）及び製造元提供のプロトコルを使用して、全長ＲＮＡを２Ｆ２ハイブリドーマ細胞から抽出した。２Ｆ２モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の得られたＮ末端アミノ酸配列を使用して、それぞれの鎖に特異的なＰＣＲプライマーを設計した。ＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマーは、Ｎ末端配列に対応する遺伝子ファミリーのフレームワーク４に適合するように設計された。プライマーはまたクローニングのために所望の制限部位を添加するために設計された。軽鎖については、これらは、Ｎ末端のＥｃｏＲＶとフレームワーク４の３’末端のＫｐｎＩであった。重鎖については、添加した部位は、Ｎ末端のＢｓｉＷＩとＶＨ−ＣＨ１ジャンクションのわずかに下流のＡｐａＩであった。プライマーは以下の通りである。
９Ｃ１０ＬＣＦ．ＥｃｏＲＶ  （２Ｆ２軽鎖フォワードプライマー）：  
５’−  ＧＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＢＣＡＲＡＣＴＣＣＡＣＴ  −  ３’  （配列番号：３６）
（Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ  ，  Ｋ＝Ｇ／Ｔ，  Ｙ＝Ｃ／Ｔ，  Ｍ＝Ａ／Ｃ，  Ｒ＝Ａ／Ｇ，  Ｄ＝Ｇ／Ａ／Ｔ．  Ｓ＝Ｇ／Ｃ，  Ｈ＝Ａ／Ｔ／Ｃ）
Ｃ７Ｆ７ＬＣＲ．ＫｐｎＩ  （２Ｆ２軽鎖リバースプライマー）：
５’−  ＴＴＴＤＡＫＹＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣ−  ３’  （配列番号：３７）  （Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ  ，  Ｋ＝Ｇ／Ｔ，  Ｙ＝Ｃ／Ｔ，  Ｍ＝Ａ／Ｃ，  Ｒ＝Ａ／Ｇ，  Ｄ＝Ｇ／Ａ／Ｔ．  Ｓ＝Ｇ／Ｃ，  Ｈ＝Ａ／Ｔ／Ｃ）                                  
１３Ｇ５ＨＣＦ．ＢｓｉＷＩ  （２Ｆ２重鎖フォワードプライマー）：
５’−  ＧＡＴＣＧＡＣＧＴＡＣＧＣＴＣＡＧＧＴＹＣＡＲＣＴＳＣＡＧＣＡＲＣＣＴＧＧ−  ３’  （配列番号：３８）
（Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ  ，  Ｋ＝Ｇ／Ｔ，  Ｙ＝Ｃ／Ｔ，  Ｍ＝Ａ／Ｃ，  Ｒ＝Ａ／Ｇ，  Ｄ＝Ｇ／Ａ／Ｔ．  Ｓ＝Ｇ／Ｃ，  Ｈ＝Ａ／Ｔ／Ｃ）
Ｃ７Ｆ７ＨＣＲ．ＡｐａＩ  （２Ｆ２重鎖リバースプライマー）：  
５’−  ＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＭＲＧＡＧＡＣＤＧＴＧＡＳＨＲＤＲＧＴ−  ３’  （配列番号：３９）
（Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ  ，  Ｋ＝Ｇ／Ｔ，  Ｙ＝Ｃ／Ｔ，  Ｍ＝Ａ／Ｃ，  Ｒ＝Ａ／Ｇ，  Ｄ＝Ｇ／Ａ／Ｔ．  Ｓ＝Ｇ／Ｃ，  Ｈ＝Ａ／Ｔ／Ｃ）
軽鎖及び重鎖のＲＴ−ＰＣＲ反応は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（カタログ番号２１０２１０）及び示唆された反応混合物と条件を使用して実施した。ＩｇＧの哺乳類細胞発現のためのｐＲＫベクターは以前に記載された(Gorman等., DNA Prot Eng Tech 2:3-10 (1990))。ベクターは修飾され、クローニングと発現を容易にするために、特定のエンドヌクレアーゼ制限酵素認識部位を含む(Shields等, J Biol Chem 2000; 276: 6591-6604)。増幅したＶＬは、部位ＥｃｏＲＶとＲｓｒＩＩを用いて、ヒトｋａｐｐａ定常ドメイン（ｐＲＫ．ＬＰＧ３．ヒト  Ｋａｐｐａ；図２６）を含むｐＲＫ哺乳類細胞発現ベクターにクローン化された。増幅したＶＨは、部位ＢｓｉＷＩとＡｐａＩを用いて、全長ヒトＩｇＧ１定常ドメイン（ｐＲＫ．ＬＰＧ４．ＬＰＧ４．ヒトＨＣ；図２７）をコードするｐＲＫ哺乳類細胞発現ベクターにクローン化された。
ＤＮＡシークエンスは、抗ヒトＣＤ７９ｂ（２Ｆ２）のための、得られたマウスヒトキメラ軽鎖（図１６）及び重鎖（図１８）の全体のコード領域をのために得られた。ＤＮＡによってコードされるマウスヒトキメラ軽鎖及び重鎖のためのコードされたポリペプチドを図１７と１９にそれぞれ示す。ＤＮＡのシークエンス後、プラスミドの発現を解析した。
ＣＨＯ細胞についての上記の通り、プラスミドを一時的に２９３(アデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株 (Graham等, J. Gen. Virol., 36: 59-74 (1977))に形質転換した。抗体タンパク質をプロテインＡカラム上で形質転換した細胞の上清から精製し、タンパク質の種類は、Ｎ末端シークエンシングで確認した。抗体は、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５０）への結合について、上記の通り、ＢＪＡＢ又はＲＡＭＯＳ細胞中においてＦＡＣＳによって試験した。
抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（ｃｈ１０Ｄ１０）の作製及びシークエンシング
キメラカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（ｃｈ１０Ｄ１０）ＩｇＧ１の作製のために、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号７４１０４）及び製造元提供のプロトコルを使用して、全長ＲＮＡを１０Ｄ１０ハイブリドーマ細胞から抽出した。１０Ｄ１０Ｍａｂの軽鎖及び重鎖の得られたＮ末端アミノ酸配列を使用して、それぞれの鎖に特異的なＰＣＲプライマーを設計した。ＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマーは、Ｎ末端配列に対応する遺伝子ファミリーのフレームワーク４に適合するように設計された。プライマーはまたクローニングのために所望の制限部位を添加するために設計された。軽鎖については、これらは、Ｎ末端のＥｃｏＲＶとフレームワーク４の３’末端のＲｓｒＩＩであった。重鎖については、添加した部位は、Ｎ末端のＰｖｕＩＩとＶＨ−ＣＨ１ジャンクションのわずかに下流のＡｐａＩであった。プライマーは以下の通りである。
軽鎖フォワード：  ＣＡ１８３６
５’−ＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣＣＴＣＴＴＴＧＧＣ−３’  （配列番号：４４）
軽鎖リバース：  ＣＡ１８０８
５’−ＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＧＧＴＣＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣ−３’  （配列番号：４５）
重鎖フォワード：  ＣＡ１８３４：
５’−ＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧ−３’  （配列番号：４６）
重鎖リバース：  ＣＡ１８３５
５’−ＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣＣ−３’  （配列番号：４７）
軽鎖及び重鎖のＲＴ−ＰＣＲ反応は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（カタログ番号２１０２１０）及び示唆された反応混合物と条件を使用して実施した。重鎖については、ＲＴ−ＰＣＲのためのSuperscript III First Strand Synthesis System、Invitrogen カタログ番号18080-051を使用し、次いで、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅した。反応と条件は製造元によって提供された。ＩｇＧの哺乳類細胞発現のためのｐＲＫｂベクターは以前に記載された(Gorman等., DNA Prot Eng Tech 2:3-10 (1990))。キメラ１０Ｄ１０の軽鎖可変ドメインのクローニングのためのベクターは、部位特異的変異によりＲｓｒＩＩ部位が導入され、ヒトｋａｐｐａ定常ドメインを含むｐＤＲ１の誘導体(Shalaby等,  J. Exp. Med., 175 (1): 217-225 (1992)；図２４もまた参照されたい)である。軽鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＶとＲｓｒＩＩを用いて消化され、ゲル精製され、このベクターのＥｃｏＲＶ／ＲｓｒＩＩ部位にクローニングされる。
同様に、キメラ１０Ｄ１０の重鎖可変ドメインのクローニングのために、重鎖ＲＴ−ＰＣＲ産物をＰｖｕＩＩ及びＡｐａＩで切断し、ベクターｐＤＲ２(Shalaby等,  J. Exp. Med., 175 (1): 217-225 (1992)；図２２もまた参照されたい)のＰｖｕＩＩ−ＡｐａＩ部位にクローニングした。このｐＤＲ２ベクターは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
ＤＮＡシークエンスは、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ｃｈ１０Ｄ１０）のための、得られたマウスヒトキメラ軽鎖（図２０）及び重鎖（図２２）の全体のコード領域をのために得られた。ＤＮＡによってコードされるマウスヒトキメラ軽鎖及び重鎖のためのコードされたポリペプチドを図２１と２３にそれぞれ示す。ＤＮＡのシークエンス後、プラスミドの発現を解析した。
ＣＨＯ細胞についての上記の通り、プラスミドを一時的に２９３(アデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株 (Graham等, J. Gen. Virol., 36: 59-74 (1977))に形質転換した。具体的には、２９３細胞を形質転換の前日に継代し、血清を含む培地に播いた。翌日、リン酸カルシウムの沈殿として調製した二重鎖ＤＮＡ、次いで、ｐＡｄＶＡｎｔａｇe（商標）ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加し、細胞を３７℃で終夜インキュベートした。細胞を血清なしの培地で培養し、４日後に収穫した。抗体タンパク質をプロテインＡカラム上で形質転換した細胞の上清から精製し、次いで緩衝液を、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０に交換し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮した。タンパク質の種類は、Ｎ末端シークエンシングで確認した。タンパク質濃度は、定量的なアミノ酸分析によって決定した。抗体は、カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）への結合について、下記の通り、ＢＪＡＢカニクイザルＣＤ７９ｂ細胞（カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）発現ＢＪＡＢ細胞株中においてＦＡＣＳによって試験した。
ＣＤ７９ａ抗体の特徴付け
抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体と抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体が結合するエピトープを決定した。エピトープの決定のため、霊長類でもまた保存され得ることを示唆し、ヒトとマウスのＣＤ７９ｂの間で高度に保存されている、ＣＤ７９ｂ遺伝子の非コード領域の側面に位置するプライマーを用いて、カニクイザルと赤毛ザルの両者のＣＤ７９ｂ遺伝子をクローニングした。
ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）のオルタナティブスプライス形態、全長細胞外Ｉｇ類似ドメイン（ＣＤ７９ｂのスプライスされた切断形態中に存在しない細胞外のＩｇ類似ドメインを、図１３に四角で囲む）は、正常及び悪性Ｂ細胞中において記載される(Hashimoto, S.等, Mol. Immunol., 32(9): 651-9 (1995); Alfarano等, Blood, 93(7): 2327-35 (1999))。ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）の両者の形態が認識され、抗ヒトＣＤ７９ｂ抗体のエピトープであることを示唆する、ＣＢ３−１(BD Pharmingen; Cowley, United Kingdom) 及びＳＮ８  (Ancell; Bayport, MN and Biomeda) を含む、商業的な抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体は、膜透過ドメインの末端領域の細胞外ペプチド領域中に存在し、全長及び切断型のヒトＣＤ７９ｂ形態(Cragg, Blood, 100(9): 3068-76 (2002))として存在する。更に、上記（２Ｆ２）の商業的な抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＣＢ３−１及びＳＮ８）及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体は、カニクイザル又は赤毛ザルのＢ細胞を認識しない（データ示さず）。
膜透過ドメインの末端で、全長及び切断型ヒトＣＤ７９ｂ形態の両者で存在する細胞外ペプチド領域をカニクイザル及び赤毛ザルＣＤ７９ｂの同じ領域と比較した。この領域における、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）とカニクイザル（ＴＡＨＯ４０）又は赤毛ザルＣＤ７９ｂの、両者の唯一の差異は、シグナルペプチド配列を除いて、３個のアミノ酸の差異を伴う、１１アミノ酸領域である、ＡＲＳＥＤＲＹＲＮＰＫ（ヒト）（配列番号：１６）及びＡＫＳＥＤＬＹＰＮＰＫ（カニクイザル及び赤毛ザル）（配列番号：１７）であった。ヒト、カニクイザル及びマウスＣＤ７９ｂにおける１１アミノ酸領域を図１３に示し、「試験ペプチド」と標識した（ここで「１１ｍｅｒ」とも呼ぶ）。
１１アミノ酸領域を伴うペプチドが、抗体結合に競合することができるかどうかを決定するために、ＢＪＡＢ細胞を競合アッセイにおいて使用した。１１アミノ酸領域を含む２１ｍｅｒペプチドを、それぞれ配列が、配列番号：２６（ＡＲＳＥＤＲＹＲＮＰＫＧＳＡＣＳＲＩＷＱＳ）及び配列番号：２７（ＡＫＳＥＤＬＹＰＮＰＫＧＳＡＣＳＲＩＷＱＳ）のヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及びカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）について作製した。抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体を最初ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又はカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ）４０）タンパク質のＥＣＤ部位又はヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及びカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）で異なる領域をカバーする２１ｍｅｒのヒト又はカニクイザルペプチドと（１：１０の抗体：タンパク質比で）室温で３０分間インキュベートした。プレインキュベーションステップの後、抗体をＢＪＡＢ細胞に添加し、二次抗体として用いるラットの抗マウスＩｇＧ１−ＰＥ抗体（BD Bioscience、クローンＧ１８−１４５）を用いて、通常の染色とＦＡＣＳステップで進行した。
ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）２１ｍｅｒペプチドは、ＣＢ３−１（BDbioscience, San Diego, CA）ＳＮ８（Biomeda, Foster City, CA 又はBDbioscience, San Diego, CA)、ＡＴ１０５（Abcam, Cambridge, MA）、及び２Ｆ２（上記）を含む抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体の結合を阻害し、コントロール抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（３Ｈ３、８Ｄ３、９Ｈ１１又は１０Ｄ１０）又は抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）抗体（ＺＬ７−４；Ｃａｌｔａｇ又はＳｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）(Zhang, L.等, Ther. Immunol., 2:191-202 (1997))の結合を阻害しなかった。カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）２０ｍｅｒペプチドは、３Ｈ３、８Ｄ３、９Ｈ１１及び１０Ｄ１０（上記）を含む抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体の結合を阻害し、コントロール抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＣＢ３−１、ＳＮ８、ＡＴ１０５、２Ｆ２）又は抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）抗体（ＺＬ７−４）の結合を阻害しなかった。コントロールとして、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）のＥＣＤは、ＣＢ３−１（BDbioscinece, San Diego, DA）、ＳＮ８（Biomeda, Foster City, CA 又はBDbioscience, San Diego, CA）、ＡＴ１０５(Abcam, Cambridge, MA)、及び２Ｆ２（上記）を含む抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体の結合を阻害し、コントロールの抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）抗体（ＺＬ７−４；Ｃａｌｔａｇ又はＳｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ））(Zhang, L.等, Ther. Immunol., 2:191-202 (1997))の結合を阻害しなかった。
ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体のエピトープ結合を更に決定するために、１１ｍｅｒヒトＣＤ７９ｂペプチド（Ｎ末端−ＡＲＳＥＤＲＹＲＮＰＫ−Ｃ末端）の３個の１１ｍｅｒペプチドを、カニクイザルＣＤ７９ペプチドにおけるそれぞれの同じ場所におけるアミノ酸に変異させたヒトＣＤ７９ｂペプチドにおける３個のＡｒｇ残基の１アミノ酸残基変異を伴って作製し、ここで、ペプチド変異１から３と呼ぶ。ペプチド変異１（Ｎ末端−ＡＫＳＥＤＲＹＲＮＰＫ−Ｃ末端；配列番号：１８）は配列番号：１６の位置２にＡｒｇ残基の変異を含む。ペプチド変異２（Ｎ末端−ＡＲＳＥＤＬＹＲＮＰＫ−Ｃ末端；配列番号：１９）は配列番号：１６の位置６にＡｒｇ残基の変異を含む。ペプチド変異３（Ｎ末端−ＡＲＳＥＤＲＹＰＮＰＫ−Ｃ末端；配列番号：２０）は配列番号：１６の位置８にＡｒｇ残基の変異を含む。競合アッセイを上記の通り実施した。競合アッセイは更に、１１ｍｅｒヒトＣＤ７９ｂペプチドにおける、全ての３個のＡｒｇ残基（配列番号：１６における位置２、６、及び８）が、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（ＳＮ８）抗体の結合に
重要であり、１１ｍｅｒのヒトＣＤ７９ｂペプチドにおいて、中央のＡｒｇ残基（配列番号：１６における位置６）だけが、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（２Ｆ２）抗体の結合に重要であることを示す。
抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のエピトープ結合を更に決定するために、１１ｍｅｒカニクイザルＣＤ７９ｂペプチド（Ｎ末端−ＡＫＳＥＤＬＹＰＮＰＫ−Ｃ末端）の１１ｍｅｒペプチドを、カニクイザルＣＤ７９ペプチドにおけるそれぞれの同じ場所におけるアミノ酸に変異させたヒトＣＤ７９ｂペプチドにおける１個のＬｅｕ残基の１アミノ酸残基変異を伴って作製し「ペプチド変異４」と呼ぶ。ペプチド変異４（Ｎ末端−ＡＫＳＥＤＬＹＰＮＰＫ−Ｃ末端；配列番号：２５）は配列番号：１７の位置６にＡｒｇ残基の変異を含む。競合アッセイを上記の通り実施した。競合アッセイは更に、１１ｍｅｒカニクイザルＣＤ７９ｂペプチドにおける、Ｌｅｕ残基（配列番号：１７における位置６）が、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（１０Ｄ１０）の結合に重要であることを示す。
ＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞（実施例１１に記載のカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）発現ＢＪＡＢ 細胞株）において、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のＫｄスカッチャード解析は類似のＫｄ値を示した。抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）は、０．５ｎＭのｋＤで細胞に結合し、一方で、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（１０Ｄ１０）は、細胞に１．０ｎＭのＫｄで結合する。抗カニクイザルＣｄ７９ｂ（３Ｈ３）は、細胞に２．０ｎＭのＫｄで結合する。抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（８Ｄ３）は、細胞に２．５ｎＭのＫｄで結合する。抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（９Ｈ１１）は、細胞に２．６ｎＭのＫｄで結合する。
ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）、ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及びカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）に対する抗体の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の生成
抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のための抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)の生成に使用する薬剤には、メイタンシノイドＤＭ１及びドラスタチン１０誘導体モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)及びモノメチルアウリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)が含まれる。(米国公開特許２００５／０２７６８１２；米国公開特許２００５／０２３８６４９；Doronina et al., Bioconjug. Chem., 17:114-123 (2006)；Doronina et al., Nat. Biotechnol., 21: 778-784 (2003)；Erickson et al., Cancer Res., 66: 4426-4433 (2006)、これらのすべては出典明記によってその全体が本明細書中に援用される)。ＡＤＣの生成に有用なリンカーは、ＤＭ１にはＢＭＰＥＯ、ＳＰＰ又はＳＭＣＣ(本明細書中では「ＭＣＣ」とも称される)であり、ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦにはＭＣ又はＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢである。ＤＭ１では、抗体はＤＭ１のチオ基に、そしてリンカー試薬ＳＭＣＣを用いてリジンのε-アミノ基を介して結合した。あるいは、ＤＭ１では、抗体は、ＳＰＰリンカーを用いてリジンのｅアミノ基を介してＤＭ１に結合した。ＳＰＰ(Ｎ-スクシンイミジル４-(２'-ピリジルジチオ)ペンタノエート)はリジンのεアミノ基と反応して、タンパク質上の反応性２-ピリジルジスルフィドリンカーを残す。ＳＰＰリンカーについては、フリーなスルフヒドラル(例えばＤＭ１)と反応すると、ピリジル基が置換され、還元ジスルフィド結合により付着したＤＭ１を残す。ＳＰＰリンカーにより付着されたＤＭ１は還元条件下(すなわち、例えば細胞内)で放出されるのに対して、ＳＭＣＣリンカーにより付着されたＤＭ１は還元条件下で切断に耐性がある。さらに、ＡＤＣが内部移行され、リジン−Ｎε−ＤＭ１の放出を引き起こすリソソームにターゲティングされる場合、ＳＭＣＣ−ＤＭ１ ＡＤＣは細胞毒性を引き起こす。このリジン−Ｎε−ＤＭ１は細胞内で有効な抗有糸分裂薬剤であり、細胞から放出されると非毒性である(Erickson et al., Cancer Res., 66: 4426-4433 (2006))。ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦでは、抗体は、マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン(ｖｃ)-ｐ-アミノベンジルオキシカルボニル(ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ)によりシステインを介してＭＭＡＥ又はＭＭＡＦに結合した。あるいは、ＭＭＡＦでは、抗体は、マレイミドカプロイル(ＭＣ)リンカーによって、システインを介してＭＭＡＦに結合した。ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢリンカーは、カテプシンＢなどの細胞内プロテアーゼによって切断され得、切断されると遊離薬剤を放出する(Doronina et al., Nat. Biotechnol., 21: 778-784 (2003))のに対して、ＭＣリンカーは細胞内プロテアーゼによる切断に耐性がある。
ＳＭＣＣ及びＤＭ１を用いた、抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体のための抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)は、米国公開特許２００５／０２７６８１２において記述される手順と同様に生成した。抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）精製抗体は、５０ｍＭ リン酸カリウム及び２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０を含む溶液にバッファを交換した。ＳＭＣＣ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)は、ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)に溶解し、抗体溶液に加えて１０:１のＳＭＣＣ／Ａｂ最終モル比とした。混合しながら室温で３時間反応させた。続いて、ＳＭＣＣ修飾抗体は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０を有する３５ｍＭ クエン酸ナトリウムにて平衡化されたＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム(Ｇ-２５)で精製した。ＤＭＡに溶解したＤＭ１を、ＳＭＣＣ抗体調製物に添加して、１０:１の抗体に対するＤＭ１のモル比とした。混合しながら室温で４〜２０時間反応させた。ＤＭ１修飾抗体溶液は、反応していないＤＭ１を取り除くために２０容量のＰＢＳにてダイアフィルターし、フィルター滅菌して、４℃に貯蔵した。一般的に、この方法によって抗体の４０〜６０％の収率が達成された。ゲル濾過及びレーザー光散乱によって評価されるように、調製物は通常９５％より多くの単量体であった。ＤＭ１が２５２ｎｍで吸光度最大を有するので、抗体に結合した薬剤の量は、２５２及び２８０ｎｍでの差次的な吸光度測定によって決定されうる。一般的に、抗体に対する薬剤比率は３〜４であった。 
ＳＰＰ−ＤＭ１リンカーを用いた、本明細書中に記載の抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のための抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)は、米国公開特許２００５／０２７６８１２において記述される手順と同様に生成してもよい。抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）精製抗体は、５０ｍＭ リン酸カリウム及び２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０を含む溶液にバッファを交換する。ＳＰＰ(Immunogen)は、ＤＭＡに溶解し、抗体溶液に加えておよそ１０:１のＳＰＰ／Ａｂ最終モル比とした。この正確な比率は抗体の望ましい薬剤負荷に依存する。通常、１０：１の比率はおよそ３〜４の抗体に対する薬剤比率となる。ＳＰＰは、混合しながら室温で３〜４時間反応させる。続いて、ＳＰＰ修飾抗体は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０を有する３５ｍＭ クエン酸ナトリウム又はリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４にて平衡化されたＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム(Ｇ-２５)で精製する。ＤＭＡに溶解したＤＭ１を、ＳＰＰ抗体調製物に添加して、１０:１の抗体に対するＤＭ１のモル比とする。この結果、抗体上の利用可能なＳＰＰリンカーの３〜４倍のモル比となる。混合しながら室温で４〜２０時間、ＤＭ１と反応させる。ＤＭ１修飾抗体溶液は、反応していないＤＭ１を取り除くために２０容量のＰＢＳにてダイアフィルターし、フィルター滅菌して、４℃に貯蔵される。一般的に、この方法によって抗体の４０〜６０％以上の収率が達成される。ゲル濾過及びレーザー光散乱によって評価されるように、抗体−薬剤コンジュゲートは通常９５％より多くの単量体であった。ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの調製について記載したように(上記)、結合した薬剤の量は、２５２及び２８０ｎｍでの差次的な吸光度測定によって決定されうる。
ＭＣ-ＭＭＡＦ、ＭＣ-ＭＭＡＥ、ＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ (ｖｃ)-ＰＡＢ-ＭＭＡＥ又はＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ (ｖｃ)-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ薬剤リンカーを用いた、本明細書中に記載の抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のための抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)もまた、米国公開特許２００５／０２３８６４９において記述される手順と同様に生成されてもよい。精製された抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体は、ｐＨ８．０で５００ｍＭ ホウ酸ナトリウム及び５００ｍＭ 塩化ナトリウムに溶解し、さらに過剰量の１００ＭＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)にて処理される。３７℃でおよそ３０分間インキュベートした後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂による溶出によりバッファを交換し、１ｍＭ ＤＴＰＡを含むＰＢＳにて溶出する。チオール／Ａｂ値は、溶液の２８０ｎｍでの吸光度からの還元抗体濃度とＤＴＮＢとの反応によるチオール濃度とを測定し、４１２ｎｍでの吸光度を測定することによって調べられる。還元抗体はＰＢＳに溶解し、氷上で冷やす。ＤＭＳＯ中の例えばＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ (ｖｃ)-ＰＡＢ-ＭＭＡＥなどの薬剤リンカーをアセトニトリル及び水に溶解し、冷やした還元抗体を含むＰＢＳに加える。１時間のインキュベートの後、過剰量のマレイミドを加えて反応を止め、任意の反応していない抗体チオール基をキャップする。反応混合物は遠心限外濾過によって濃縮し、抗体薬剤コンジュゲートを精製し、ＰＢＳのＧ２５樹脂による溶出によって脱塩し、無菌条件下にて０．２μｍフィルターにて濾過し、貯蔵のために凍結させる。
【０３７６】
実施例１０：特異的抗体を用いたＴＡＨＯポリペプチドの精製
天然又は組換えＴＡＨＯポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-ＴＡＨＯポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-ＴＡＨＯポリペプチドは、対象のＴＡＨＯポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗ＴＡＨＯポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロースTM(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＴＡＨＯポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＴＡＨＯポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＴＡＨＯポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化ＴＡＨＯポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＴＡＨＯポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。ついで、カラムは、抗体／ＴＡＨＯポリペプチド結合を分解する条件下(例えば、約ｐＨ２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、ＴＡＨＯポリペプチドが回収される。
【０３７７】
実施例１１：インビトロでの腫瘍細胞死滅アッセイ
対象のＴＡＨＯポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を、標準的な発現ベクター及びクローニング法を使用して得る。あるいは、対象のＴＡＨＯポリペプチドを発現する多くの腫瘍細胞株は例えばＡＴＣＣから公的に入手可能であり、標準的なＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ分析法を使用して常套的に同定することができる。ついで抗ＴＡＨＯポリペプチドモノクローナル抗体（市販及びその毒素コンジュゲート誘導体）をアッセイで用いて、ＴＡＨＯポリペプチド発現細胞を死滅させるインビトロでの抗体の能力を定量することができる。
例えば、対象のＴＡＨＯポリペプチドを発現する細胞を上述のようにして得て、９６ウェルの皿に蒔く。一分析例では、抗体／毒素コンジュゲート（又は裸の抗体）を４日の期間の細胞インキュベーションの間、含ませる。第二の独立の分析例では、細胞を抗体／毒素コンジュゲート（又は裸の抗体）と共に１時間インキュベートし、ついで洗浄して、４日の期間、抗体／毒素コンジュゲートの不存在下でインキュベートする。ついで、細胞生存度を、PromegaのCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（カタログ番号Ｇ７５７１）を使用して測定する。未処理細胞はネガティブコントロールになる。
抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体については、Ｂ細胞株（ＡＲＨ−７７、ＢＪＡＢ、Ｄａｕｄｉ、ＤＯＨＨ−２、Ｓｕ−ＤＨＬ−４、Ｒａｊｉ及びＲａｍｏｓ）を、別々の無菌丸底９６ウェル組織培養物処理済プレート（Cellstar 650 185）に、１ウェル当たり細胞５０００個の密度で調製した。細胞は、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１４６０、１％のＬ−グルタミン、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Hyclone）及び１０ｍMのＨＥＰＥＳ）であった。細胞を３７℃のインキュベーターに一晩置いた。
抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体については、トランスジェニックカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）ＢＪＡＢ細胞株（ここでは、「ＢＪＡＢカニクイザルＣＤ７９ｂ」又は「ＢＪＡＢカニクイザルＣＤ７９ｂ」又は「ＢＪＡＢカニクイザルＣＤ７９ｂ」）を生成した。ＢＪＡＢ細胞株（ｔ（２；８）（ｐ１１２；ｑ２４）（ＩＧＫ−ＭＹＣ）転移、変異ｐ５３遺伝子を含み、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶ）陰性である、Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫細胞株）(Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego:  Academic Press, 2001) を、通常のＡＭＡＸＡヌクレオフェクションプロトコル(Solution T, Program T-16) (AMAXA Inc., Gaithersburg, MD)によって、カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ここでは、「ｐＲＫ．ＣＭＦ．ＰＤ．カニクイザルＣＤ７９ｂ」と呼ぶ）を含む発現ベクターを用いて形質転換した。ｐＲＫ．ＣＭＦ．ＰＤ．カニクイザルＣＤ７９ｂについては、カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）をクローニングした。カニクイザルＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ３９）及びＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のクローニングについては、カニクイザルＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ３９）及びカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のマウス及びヒトＤＮＡ配列を揃えた。オープンリーディングフレームに隣接する保存配列に対するプライマーは以下の通り生成した：
ｃｙｎｏＣＤ７９ａ  （ＴＡＨＯ３９）  フォワードプライマー：  ５’−ＴＣＡＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＣＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧ−３’  （配列番号：２１）
ｃｙｎｏＣＤ７９ａ  （ＴＡＨＯ３９）  リバースプライマー：  ５’−ＣＡＧＣＧＡＴＴＡＡＧＧＧＣＴＣＡＴＴＡＣＣＣ−３’  （配列番号：２２）
ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ  （ＴＡＨＯ４０）  フォワードプライマー：  ５’−ＴＣＧＧＧＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣ−３’  （配列番号：２３）
ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ  （ＴＡＨＯ４０）  リバースプライマー：  ５’−ＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧＧＧ−３’  （配列番号：２４）
カニクイザルＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ３９）及びＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）プライマーを用いて、カニクイザルＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ３９）及びＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）をカニクイザル脾臓ＤＮＡライブラリーから増幅した。ＰＣＲ産物をＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）にクローニングし、シークエンシングした。カニクイザルＣＤ７９ａ及びカニクイザルＣＤ７９ｂＯＲＦをピューロマイシン耐性遺伝子を含む（ここで「ｐＲＫ．ＣＭＶ．ＰＤ」と呼ぶ）ＣＭＶプロモーターによって制御される発現ベクターにサブクローニングした。
ｐＲＫ．ＣＭＦ．ＰＤ．カニクイザルＣＤ７９ｂをＢＪＡＢ細胞への形質転換とピューロマイシン（Calbiochem, San Diego, CA）セレクションの後、生存細胞を上位５％について抗カニクイザルＣＤ７９ｂ抗体（３Ｈ３）を用いてＦＡＣＳ自動クローニングした。カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）を発現する最良の発現ＢＪＡＢ細胞株をＦＡＣＳ解析により選択した。形質転換したカニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）を発現するＢＪＡＢ細胞はまたヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）及びヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）を発現する。コントロールとして、形質転換していないヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）及びヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）を発現するＢＪＡＢ  Ｂ細胞を使用した。
抗体薬コンジュゲート（実施例９に記載の、市販のＺＬ７−４のような抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）、ＳＮ８のような抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）、又は抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体を使用）をアッセイ培地において２×１０μｇ／ｍｌに希釈した。クロスリンカーのＳＭＣＣ又はジスルフィドリンカーＳＰＰを用いてコンジュゲートをＤＭ１毒素にリンクさせた（実施例９及び２００５年５月３１日出願の米国出願第１１／１４１３４４号及び２００４年１１月５日出願の米国出願第１０／９８３３４０号を参照されたい）。更に、ＭＣ−バリン−シトルリン（ｖｃ）−ＰＡＢ又はＭＣを用いて、コンジュゲートを、ドルスタチン１０誘導体、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）毒素又はモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）毒素（実施例９及び２００５年５月３１日出願の米国出願第１１／１４１３４４号及び２００４年１１月５日出願の米国出願第１０／９８３３４０号を参照されたい）にリンクさせてもよい。ハーセプチンを主成分とするコンジュゲート（ＳＭＣＣ−ＤＭ１又はＳＰＰ−ＤＭ１）をネガティブコントロールとして使用した。コンジュゲートの充填容量に対応する遊離型Ｌ−ＤＭ１相当物を、ポジティブコントロールとして使用した。希釈に先立ち、試料を攪拌して確実に混合物を均一化した。抗体薬コンジュゲートを更に１：３まで希釈し続けた。Rapidplate（登録商標） 96/384 Zymark自動化システムを用いて、この細胞株を一列当たり各試料５０μｌを充填した。プレート全体に充填したら、プレートを３日間に亘り再度インキュベートし、毒素の効果を出現させた。全てのウェルに１０分間に亘って１ウェル当たり１００μｌのCell Glo（Promega、カタログ番号G7571/2/3)を添加することにより反応を停止させた。停止させたウェルの内容物１００μｌを、底が透明な９６ウェル白組織培養物処理済プレート（Costar 3610）に移し、蛍光を読み取って相対的光単位（ＲＬＵ）として報告した。この実験に使用したＴＡＨＯ抗体には、抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）（ＺＬ７−４）及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（ＳＮ８）を含む市販の抗体が含まれる。
要約
ａ．抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）
ＤＭ１毒素（抗ヒトＣＤ７９ａ（ＺＬ７−４）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）（ＺＬ７−４）抗体は、抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）（ＺＬ７−４）抗体単独又はＲＡＭＯＳ細胞における（データ示さず）ＤＭ１毒素（抗ＨＥＲ２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートしたネガティブコントロールの抗ＨＥＲ２と比較して、有意な腫瘍細胞殺傷を示した。
ｂ−１．抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）
ＤＭ１毒素（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（ＳＮ８）抗体は、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（ＳＮ８）抗体単独又はＲＡＭＯＳ細胞におけるＤＭ１毒素（抗ＨＥＲ２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートしたネガティブコントロールの抗ＨＥＲ２と比較して、有意な腫瘍細胞殺傷を示した。
ｂ−２．抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）
（１）ＤＭ１  ＡＤＣ
（ａ）ＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞
ＤＭ１毒素（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（ＳＮ８）抗体は、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（ＳＮ８）抗体単独又はＲＡＭＯＳ細胞におけるＤＭ１毒素（抗ＨＥＲ２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートしたネガティブコントロールの抗ＨＥＲ２と比較して、有意な腫瘍細胞殺傷を示した。ポジティブコントロールとして、ＤＭ−１ダイマー単独、及びＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＳＮ８）をまた比較し、ＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞において、有意な腫瘍細胞殺傷を示した。
０．３３ｎＭのＩＣ５０を有する抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（１０Ｄ１０）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、ＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞において有意な腫瘍殺傷を示さなかった１．２ｎＭのＩＣ５０を有する抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又は２６ｎＭのＩＣ５０を有するハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１よりも多いＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞の殺傷を示した。
（ｂ）ＢＪＡＢ細胞
コントロールとして、ＤＭ１（抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（１０Ｄ１０）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートさせた抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（１０Ｄ１０）抗体を、ＢＪＡＢ細胞（形質転換せず）中で解析し、ＢＪＡＢ細胞中で、有意な腫瘍殺傷を示さなかった。ネガティブコントロールの、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（１０Ｄ１０）単独、ＤＭ１（ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートしたハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）抗体及び抗体無しは、ＢＪＡＢ細胞中で有意な腫瘍細胞殺傷を示さなかった。ポジティブコントロールとして、ＤＭ−１ダイマー単独、及びＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＳＮ８）をまた比較し、ＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞において、有意な腫瘍細胞殺傷を示した。
１０ｎＭのＩＣ５０を有する抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（１０Ｄ１０）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及び３０ｎＭのＩＣ５０を有するハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、ＢＡＪＢ細胞において有意な殺傷を示さなかったが、０．４ｎＭのＩＣ５０を有する抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、ＢＪＡＢ細胞の有意な殺傷を示した。
（２）ＭＭＡＦ  ＡＤＣ
（ａ）ＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞
ＭＭＡＦ（抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（１０Ｄ１０）−ＭＣ−ＭＭＡＦ）にコンジュゲートさせた抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（１０Ｄ１０）は、ＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞において有意な腫瘍殺傷を示さなかったネガティブコントロールの、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（１０Ｄ１０）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＳＮ８）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）抗体、ＭＭＡＦ（ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）−ＭＣ−ＭＭＡＦ）にコンジュゲートしたハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）と比較して、ＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞において、有意な腫瘍細胞殺傷を示した。ポジティブコントロールとして、ＭＭＡＦ（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ＭＭＡＦ）にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（ＳＮ８）抗体をまた比較し、ＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞において、有意な腫瘍細胞殺傷を示した。
０．０７ｎＭのＩＣ５０を有する抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（１０Ｄ１０）−ＭＣ−ＭＭＡＦは、０．６ｎＭのＩＣ５０を有する抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ＭＭＡＦよりも多いＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞の殺傷を示した。
（ｂ）ＢＪＡＢ細胞
コントロールとして、ＭＭＡＦ（抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（１０Ｄ１０）−ＭＣ−ＭＭＡＦ）にコンジュゲートさせた抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（１０Ｄ１０）抗体を、ＢＪＡＢ細胞（形質転換せず）中で解析し、ＢＪＡＢ細胞中で、有意な腫瘍殺傷を示さなかった。ネガティブコントロールの、抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（１０Ｄ１０）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＳＮ８）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）抗体、ＭＭＡＦ（ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）−ＭＣ−ＭＭＡＦ）にコンジュゲートしたハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）は、ＢＪＡＢ細胞中で有意な腫瘍細胞殺傷を示さなかった。ポジティブコントロールとして、ＭＭＡＦ（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ＭＭＡＦ）にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＳＮ８）をまた比較し、ＢＪＡＢ−カニクイザルＣＤ７９ｂ細胞において、有意な腫瘍細胞殺傷を示した。
６９４ｎＭのＩＣ５０を有する抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（１０Ｄ１０）−ＭＣ−ＭＭＡＦは、ＢＡＪＢ細胞において有意な殺傷を示さなかったが、０．２ｎＭのＩＣ５０を有する抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ＭＭＡＦは、ＢＪＡＢ細胞の有意な殺傷を示した。
有意な腫瘍細胞殺傷を示す抗ＴＡＨＯ抗体の能力を考慮すると、ＴＡＨＯ分子は、リンパ腫(すなわち非ホジキンリンパ腫)、白血病(すなわち慢性リンパ性白血病)、ミエローマ（すなわち多発性ミエローマ）及び他の造血系細胞の癌などのＢ細胞関連の癌を含む、哺乳動物の腫瘍の治療のための優れた標的であろう。抗ＴＡＨＯポリペプチドモノクローナル抗体は、リンパ腫(すなわち非ホジキンリンパ腫)、白血病(すなわち慢性リンパ性白血病)、ミエローマ（すなわち多発性ミエローマ）及び他の造血系細胞の癌などのＢ細胞関連の癌を含む、腫瘍のインビトロの増殖の低減に有用である。具体的には、エピトープにおける類似性を考慮すれば、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体を用いた抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）の親和性及びインビトロにおける効能は、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体のためのカニクイザルにおける毒性学の研究及び効能の研究において有力な代用となり得る。
【０３７８】
実施例１２：インビボ腫瘍細胞殺傷アッセイ
１．異種移植片
コンジュゲートするか又はコンジュゲートしていない抗ＴＡＨＯポリペプチドモノクローナル抗体の有効性を試験するために、マウスの腫瘍に対する抗ＴＡＨＯ抗体の効果を分析した。具体的には、ＲＡＪＩ細胞、ＲＡＭＯＳ細胞、ＢＪＡＢ細胞(ｔ(２;８)(ｐ１１２;ｑ２４) (ＩＧＫ-ＭＹＣ)転位、変異したｐ５３遺伝子を含み、エプスタイン-バーウイルス(ＥＢＶ)陰性であるバーキットリンパ腫細胞株)(Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001))、Ｇｒａｎｔａ５１９細胞(サイクリンＤ１(ＢＣＬ１)の過剰発現を引き起こすｔ(１１;１４)(ｑ１３;ｑ３２) (ＢＣＬ１-ＩＧＨ)転位を含み、Ｐ１６ＩＮＫ４Ｂ及びＰ１６ＩＮＫ４Ａ欠失を含み、ＥＢＶ陽性であるマントル細胞リンパ腫細胞株)(Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001))、Ｕ６９８Ｍ細胞(リンパ芽球性リンパ肉腫Ｂ細胞株)(Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)及びＤｏＨＨ２細胞(Ｉｇ重鎖によって作動されるＢｃｌ−２の過剰発現を引き起こす濾胞性リンパ腫ｔ(１４;１８)(ｑ３２;ｑ２１)の転位特徴を含み、Ｐ１６ＩＮＫ４Ａ欠失を含み、ｔ(８;１４)(ｑ２４;ｑ３２) (ＩＧＨ-ＭＹＣ)転位を含み、ＥＢＶ陰性である濾胞性リンパ腫細胞株)(Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)を含む複数の異種移植片モデルにおける抗体の腫瘍退行能を調べた。
抗ヒトＣＤ７９ａ又は抗ヒトＣＤ７９ｂ抗体の有効性の分析のために、雌ＣＢ17 ＩＣＲ ＳＣＩＤマウス(６−８週齢、Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA)の側腹部に、５×１０６のＲＡＪＩ細胞、５×１０６のＲＡＭＯＳ細胞、２×１０７のＢＪＡＢルシフェラーゼ細胞、２×１０７のＧｒａｎｔａ−５１９細胞、５×１０６のＵ６９８Ｍ細胞又は２×１０７のＤｏＨＨ２細胞を皮下接種した。平均２００ｍｍ２にまで異種移植片腫瘍を成長させた。以下特に示さない場合には、０日目は、腫瘍が平均２００ｍｍ２であり、処置の第一用量／又は唯一の用量が投与された日を指す。腫瘍体積は、二次元に基づいて算出され、カリパス用いて測定し、式：Ｖ＝０.５ａ×ｂ２に従ってｍｍ３で表した。このときａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長径及び短径である。各実験群から採取したデータは平均±ＳＥで表した。マウスは１００から２００ｍｍ３の平均腫瘍体積を有する８から１０匹のマウスのグループに分け、この点において静脈内（ｉ．ｖ．）治療を開始した。抗体又はＡＤＣの投与は、２から３週間の２００から５００μｇ／ｍ２の薬剤濃度に相当する２から１０ｍｇ／ｋｇの単回投与又は毎週２００から５００μｇ／ｍ２のそれぞれの投与が３から１０ｍｇ／ｋｇの複数回投与であった。抗体はＡＤＣ又はコンジュゲートしていない抗体をコントロールとした。実験期間の間、週に１回又は２回腫瘍を測定した。腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達する前、又は、腫瘍が切迫潰瘍化の徴候を示すときに、マウスを安楽死させた。すべての動物のプロトコールは、Institutional Animal Care and Use Committee(ＩＡＣＵＣ)の承認を得た。
使われた抗体と毒素間のリンカーは、ＤＭ１又はＭＣのためのジスルフィドリンカーＳＰＰ又はチオエーテル架橋剤ＳＭＣＣ、モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)又はモノメチルアウリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)のためのマレイミド成分とパラ−アミノベンジルカルバモイル(ＰＡＢ)自己犠牲的成分とを有するＭＣ−バリン−シトルリン(ｖｃ)−ＰＡＢ又は(バリン−シトルリン(ｖｃ))ジペプチドリンカー試薬が含まれうる。使用した毒素はＤＭ１、ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦであった。この実験に使用したＴＡＨＯ抗体には、抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）（ZL7-4）及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（ＳＮ８）、及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（２Ｆ２）及び抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）（８Ｈ９、５Ｃ３、７Ｈ７、８Ｄ１１、１５Ｅ４及び１６Ｃ１１）抗体を含む、実施例９に記載の抗体を含む市販の抗体が含まれた。実施例９に記載の抗カニクイザルＣｄ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（３Ｈ３、８Ｄ３、９Ｈ１１、及び１０Ｄ１０）をまた使用してもよい。
ネガティブコントロールには、限定するものではないが、抗ＨＥＲ２(ハーセプチン(登録商標）(トラスツズマブ))ベースのコンジュゲート(ＳＭＣＣ-ＤＭ１又はＳＰＰ−ＤＭ１又はＭＣ−ＭＭＡＦ又はＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ又はＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ)が含まれた。ポジティブコントロールは、限定されるものではないが、コンジュゲート搭載の投与量に等しいフリーのＬ−ＤＭ１が含まれた。
要約
抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）
（ａ）Ｒａｍｏｓ異種移植片
１８日間の経過では、ＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ａ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ７９ａ(ＴＡＨＯ４)抗体は、ネガティブコントロールの抗ハーセプチン−ＳＭＣＣ−ＤＭ１と比較して、ＲＡＭＯＳ腫瘍をもつＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害を示した。ＡＤＣは、０日目に単回用量で投与した。
（ｂ）ＢＪＡＢ異種移植片
１８日間の経過では、（表８に示す通り）単回用量で０日目に投与されたＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ａ（５Ｃ３、７Ｈ７、８Ｄ１１、１５Ｅ４又は１６Ｃ１１）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートされた、５Ｃ３、７Ｈ７、８Ｄ１１、１５Ｅ４及び１６Ｃ１１抗体を含む抗ヒトＣＤ７９ａ(ＴＡＨＯ４)抗体は、ネガティブコントロールのハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１と比較して、ＢＪＡＢルシフェラーゼ腫瘍をもつＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害を示した。ＡＤＣは、すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目に、単回用量で(表１１に示されるように)投与した。具体的には、抗ヒトＣＤ７９ａ （５Ｃ３、７Ｈ７、８Ｄ１１、１５Ｅ４又は１６Ｃ１１）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及び抗ヒトＣＤ７９ｂ （２Ｆ２又はＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、有意に腫瘍成長を阻害した(データは示さず)。さらに、表８では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示す。
2011515069.tif 000077
（ｃ）ＢＪＡＢ異種移植片
１４日間の経過では、（表１２に示す通り）単回用量で０日目に投与されたＤＭ１（それぞれ、抗ヒトＣＤ７９ａ（８Ｈ９）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートされた、８Ｈ９抗体、及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）抗体を含む抗ヒトＣＤ７９ａ(ＴＡＨＯ４)抗体は、ネガティブコントロールのＰＢＳ、抗糖タンパク質−１２０（ここでは、「ｇｐ１２０」と呼ぶ）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）、抗ヒトＣＤ７９ａ（８Ｈ９）及びＤＭ１（抗ｇｐ１２０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）とコンジュゲートした抗ｇｐ１２０と比較して、ＢＪＡＢルシフェラーゼ腫瘍をもつＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害を示した。ＡＤＣは、すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目に、単回用量で(表９に示されるように)投与した。具体的には、抗ヒトＣＤ７９ａ（８Ｈ９）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、有意に腫瘍成長を阻害した(データは示さず)。さらに、表８では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示す。
2011515069.tif 000078
（２Ａ）抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）
ＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）は、薬剤コンジュゲートの単回投与によって、Ｒａｍｏｓ異種移植片において、部分的な縮退（ＰＩ）又は完全寛解（ＣＲ）を示した。更に、ＤＭ１又はＭＭＡＦ（抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又は抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＭＣ−ＭＭＡＦ）とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体は、薬剤コンジュゲートの単回投与によって、ＢＪＡＢ、Ｇｒａｎｔａ５１９及びＤｏＨＨ２異種移植片において、部分的な縮退（ＰＩ）又は完全寛解（ＣＲ）を示した。
（ａ）Ｒａｍｏｓ異種移植片
１８日間の経過では、ＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ７９ｂ(ＴＡＨＯ５)抗体は、ネガティブコントロールの抗ハーセプチン−ＳＭＣＣ−ＤＭ１と比較して、ＲＡＭＯＳ腫瘍をもつＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害を示した。ＡＤＣは、０日目に単回用量で投与した。
（ｂ）ＢＪＡＢ異種移植片
１４日間の経過では、ＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートされた、抗ヒトＣＤ７９ｂ(ＴＡＨＯ５)抗体は、ネガティブコントロールの抗ハーセプチン−ＳＭＣＣ−ＤＭ１又は抗ハーセプチン抗体と比較して、ＢＪＡＢルシフェラーゼ腫瘍をもつＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害を示した。抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抗体による阻害のレベルは、抗ＣＤ２０抗体による阻害レベルに類似していた。具体的には、１５日目において、抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１で処理した１０匹のマウスのうち１匹が腫瘍の部分的な縮退を示し、抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１で処理した１０匹のマウスのうち９匹が腫瘍の完全寛解を示した。１５日目において、抗ハーセプチン−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、抗ハーセプチン抗体で処理した１０匹のマウスのうち１０匹は、腫瘍を誘発した。１５日目において、抗ＣＤ２０抗体で処理した１０匹のマウスのうち５匹が腫瘍の部分的縮退を示した。ＡＤＣは、すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目及び５日目に、複数回用量で(表１３に濃度でそれぞれの投与量が示されるように)投与した。更なる抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１による処理は、１４日目に行われた。具体的には、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及び抗ＣＤ２０は、有意に腫瘍倍加を阻害した(データは示さず)。さらに、表１３では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示す。
2011515069.tif 000079
（ｃ）ＢＪＡＢ異種移植片（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＤＭ１）
８０日間の経過では、ＭＭＡＦ（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ＭＭＡＦ又は抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ）、ＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）又はＭＭＡＦ（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）にコンジュゲートされた、抗ヒトＣＤ７９ｂ(ＴＡＨＯ５)抗体（ＳＮ８）は、ネガティブコントロールのＭＭＡＥ又はＭＭＡＦにコンジュゲートしたハーセプチン（登録商標）、ハーセプチン（登録商標）−ＭＣ−ＭＭＡＦ、ハーセプチン（登録商標）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及びハーセプチン（登録商標）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦと比較して、ＢＪＡＢルシフェラーゼ（Burkittリンパ腫）腫瘍をもつＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害を示した。ＡＤＣは、すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目に、単回用量で(表１４に示されるように)投与した。具体的には、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ＭＭＡＦ、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦは、有意に腫瘍倍加を阻害した(データは示さず)。コントロールのハーセプチン（登録商標）ＡＤＣ及びＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ハーセプチン（登録商標）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）ＡＤＣは、有意に腫瘍倍加を阻害した(データは示さず)。さらに、表１１では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示す。
2011515069.tif 000080
（ｄ）ＢＪＡＢ異種移植片
更に、３０日間の経過では、ＭＭＡＦ（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ＭＭＡＦ）又はＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートされた、抗ヒトＣＤ７９ｂ(ＴＡＨＯ５)抗体（ＳＮ８）は、ネガティブコントロールの抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＳＮ８）、抗ｇｐ１２０単独、ＭＭＡＦ（抗ｇｐ１２０−ＭＣ−ＭＭＡＦ又は抗ｇｐ１２０−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ）又はＭＭＡＥ（抗ｇｐ１２０−ＭＣ−ＭＭＡＦ）にコンジュゲートされた抗ｇｐ１２０又はＤＭ１（抗ｇｐ１２０−ＭＣ−ＭＭＡＦ）にコンジュゲートされた抗ｇｐ１２０と比較して、ＢＪＡＢルシフェラーゼ（Burkittリンパ腫）腫瘍をもつＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害を示した。ＡＤＣは、すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目に、単回用量で(表１５に示されるように)投与した。具体的には、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ＭＭＡＦ及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、有意に腫瘍倍加を阻害した(データは示さず)。さらに、表１２では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示す。
2011515069.tif 000081
（ｅ）ＢＪＡＢ異種移植片
更に、２０日間の経過では、ＭＭＡＦ（ＳＮ８−ＭＣ−ＭＭＡＦ）にコンジュゲートされた、抗ヒトＣＤ７９ｂ(ＴＡＨＯ５)抗体（ＳＮ８）は、ネガティブコントロールのＭＭＡＦ若しくはＤＭ１（抗ｇｐ１２０−ＭＣ−ＭＭＡＦ又は抗ｇｐ１２０−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ）又はＭＭＡＥ（抗ｇｐ１２０−ＭＣ−ＭＭＡＥ）にコンジュゲートされた、抗ｇｐ１２０と比較して、ＢＪＡＢルシフェラーゼ（Burkittリンパ腫）腫瘍をもつＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害を示した。ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦにコンジュゲートした抗ＣＤ２２のポジティブコントロールもまた比較した。ＡＤＣは、すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目に、単回用量で(表１６に示されるように)投与した。具体的には、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ＭＭＡＦ及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ及び上記に示すポジティブコントロールは、有意に腫瘍倍加を阻害した(データは示さず)。コントロールのＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを伴う抗ｇｐ１２０−ＡＤＣ及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）ＡＤＣ（抗ｇｐ１２０−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）は有意に腫瘍の倍加を阻害した（データ示さず）。さらに、表１３では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示す。
2011515069.tif 000082
（ｆ）Ｇｒａｎｔａ異種移植片
２１日間の経過では、ＭＭＡＦ（ＳＮ８−ＭＣ−ＭＭＡＦ）又はＤＭ１（ＳＮ８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートされた、抗ヒトＣＤ７９ｂ(ＴＡＨＯ５)抗体（ＳＮ８）、又は単独の抗ヒトＣＤ７９ｂ(ＴＡＨＯ５)抗体（ＳＮ８）は、ネガティブコントロールの抗ヒトＣＤ７９ｂ(ＴＡＨＯ５)抗体（ＳＮ８）、抗ｇｐ１２０又はＭＭＡＦ若しくはＤＭ１（抗ｇｐ１２０−ＭＣ−ＭＭＡＦ又は抗ｇｐ１２０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートされた、抗ｇｐ１２０と比較して、Ｇｒａｎｔａ−５１９（マントル細胞リンパ腫）腫瘍をもつＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害を示した。ＭＭＡＦ（１０Ｆ４ｖ３−ＭＣ−ＭＭＡＦ）にコンジュゲートした抗ＣＤ２２（１０Ｆ４ｖ３）のポジティブコントロールもまた比較した。ＡＤＣは、すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目に、単回用量で(表１７に示されるように)投与した。具体的には、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ＭＭＡＦ及び上記に示すポジティブコントロールは、１００ｇ／ｍ２及び３００ｇ／ｍ２の薬剤濃度において、有意に腫瘍倍加を阻害した(データは示さず)。さらに、表１４では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示す。
2011515069.tif 000083
（ｇ）ＤｏＨＨ２異種移植片
２１日間の経過では、ＭＭＡＦ又はＤＭ１（ＳＮ８−ＭＣ−ＭＭＡＦ又はＳＮ８−ＭＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートされた、抗ヒトＣＤ７９ｂ(ＴＡＨＯ５)抗体（ＳＮ８）、又は単独の抗ヒトＣＤ７９ｂ(ＴＡＨＯ５)抗体（ＳＮ８）は、ネガティブコントロールの抗ｇｐ１２０又はＭＭＡＦ若しくはＤＭ１（抗ｇｐ１２０−ＭＣ−ＭＭＡＦ又は抗ｇｐ１２０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートされた、抗ｇｐ１２０と比較して、ＤｏＨＨ２（濾胞性リンパ腫）腫瘍をもつＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害を示した。ＭＭＡＦ（抗ＣＤ２２（１０Ｆ４ｖ３−ＭＣ−ＭＭＡＦ））にコンジュゲートした抗ＣＤ２２（１０Ｆ４ｖ３）のポジティブコントロールもまた比較した。ＡＤＣは、すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目に、単回用量で(表１８に示されるように)投与した。具体的には、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＭＣ−ＭＭＡＦは、１００ｇ／ｍ２及び３００ｇ／ｍ２の薬剤濃度において、有意に腫瘍倍加を阻害した(データは示さず)。さらに、表１５では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示す。
2011515069.tif 000084
（ｈ）Ｕ６９８Ｍ異種移植片
２１日間の経過では、ＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＰＰ−ＤＭ１）にコンジュゲートされた、抗ヒトＣＤ７９ｂ(ＴＡＨＯ５)抗体（ＳＮ８）は、ネガティブコントロールのＤＭ１（ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）−ＳＰＰ−ＤＭ１）とコンジュゲートしたハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）と比較して、Ｕ６９８Ｍ（リンパ肉腫Ｂ）腫瘍をもつＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害を示した。ＡＤＣは、すべてのＡＤＣ及びコントロールについて２日目、８日目及び１５日目に、複数回用量で(表１９に示されるように)投与した。具体的には、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＰＰ−ＤＭ１は、有意に腫瘍倍加を阻害した(データは示さず)。さらに、表１６では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示す。
2011515069.tif 000085
（２Ｂ）抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）
コンジュゲート又は未コンジュゲート抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）モノクローナル抗体の効能を調べるために、上記の通り、マウスの腫瘍における抗ＴＡＨＯ抗体の効果を調べてもよい。具体的には、ＲＡＪＩ細胞、ＲＡＭＯＳ細胞、ＢＪＡＢ細胞(ｔ(２;８)(ｐ１１２;ｑ２４) (ＩＧＫ-ＭＹＣ)転位、変異したｐ５３遺伝子を含み、エプスタイン-バーウイルス(ＥＢＶ)陰性であるバーキットリンパ腫細胞株)(Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001))、Ｇｒａｎｔａ５１９細胞(サイクリンＤ１(ＢＣＬ１)の過剰発現を引き起こすｔ(１１;１４)(ｑ１３;ｑ３２) (ＢＣＬ１-ＩＧＨ)転位を含み、Ｐ１６ＩＮＫ４Ｂ及びＰ１６ＩＮＫ４Ａ欠失を含み、ＥＢＶ陽性であるマントル細胞リンパ腫細胞株)(Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001))、Ｕ６９８Ｍ細胞(リンパ芽球性リンパ肉腫Ｂ細胞株)(Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)及びＤｏＨＨ２細胞(Ｉｇ重鎖によって作動されるＢｃｌ−２の過剰発現を引き起こす濾胞性リンパ腫ｔ(１４;１８)(ｑ３２;ｑ２１)の転位特徴を含み、Ｐ１６ＩＮＫ４Ａ欠失を含み、ｔ(８;１４)(ｑ２４;ｑ３２) (ＩＧＨ-ＭＹＣ)転位を含み、ＥＢＶ陰性である濾胞性リンパ腫細胞株)(Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)を含む複数の異種移植片モデルにおける抗体の腫瘍退行能を調べた。
２．びまん性異種移植片
コンジュゲート又は非コンジュゲート抗ＴＡＨＯポリペプチドモノクローナル抗体の効能を更に試験するために、マウスのびまん性腫瘍における抗ＴＡＨＯ抗体の効果を解析した。
ルシフェラーゼを安定に発現するＢＪＡＢ細胞をＳＣＩＤマウスの尾静脈に注入した。バイオルミネセンスイメージングを腫瘍増殖を監視するために使用した。細胞注射の１０日後に、マウスはルミネセンスシグナルをベースにグループ化し、ＡＤＣで処理した。マウスは、（注射後７日と１４日に）２回、５ｍｇ／ｋｇの抗体投与量において、コントロールのハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（７匹のマウス）又はＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）（８匹のマウス）とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（ＳＮ８）で処理した。
コントロールグループのマウスは以下の通り犠牲死させた。７匹のマウスのうち２匹を２１日目、残りの５匹は、後肢麻痺のため、５日目。抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１で処理した８匹のマウスのうちの１匹は、７０日目にイメージングした際には腫瘍の兆候を示し、８１日目に犠牲死させたが、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１で処理した８匹のマウスのうちの７匹は、健康であり、１５２日目まで腫瘍の兆候は示さなかった。このように、これらの５ｍｇ／ｋｇの抗体投与量における抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、試験した動物の８７％において、びまん性のＢＪＡＢ腫瘍を取り除いた。
３．Ｂ細胞レセプターの内在化
ＡＤＣを用いた腫瘍の治療の効果を決定するために、Ｂ細胞レセプターの表面発現を腫瘍ＢＪＡＢ異種移植片において解析した。
Ｂ細胞レセプターの表面発現の解析のために、１３日間の時間経過ＢＪＡＢ異種移植片実験を、下記の差異はあるが、上記の通り開始した。ＢＪＡＢ腫瘍は、５００ｍｍ２まで成長させ、０日目において、ＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（ＳＮ８又は２Ｆ２）又はコントロール抗体、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）単独（ＳＮ８又は２Ｆ２）又は抗−ｇｐ１２０又はＤＭ１（抗−ｇｐ１２０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートした抗ｇｐ１２０を用いた（表１９に示す通り）単回投与量において治療した。抗体で処理した２日後に、それぞれの治療グループについて、２個の腫瘍を取り除き、Ｂ細胞レセプターの表面発現をフローサイトメトリーで調べた。
残りの腫瘍はフローサイトメトリー解析のために選択せず、残りの１３日の時間経過に従った。ＤＭ１（ＳＮ８−ＳＣＣ−ＤＭ１又は２Ｆ２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＳＮ８又は２Ｆ２）は、ネガティブコントロールの抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＳＮ８）、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（２Ｆ２）、抗ｇｐ１２０又はＤＭ１（抗−ｇｐ１２０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートした抗ｇｐ１２２０と比較して、ＢＪＡＢルシフェラーゼ腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖の阻害を示した。ＡＤＣは、すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目に、単回用量で(表１７に示されるように)投与した。具体的には、抗−ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８又は２Ｆ２）−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、有意に腫瘍成長を阻害した(データは示さず)。さらに、表８では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示す。 
2011515069.tif 000086
ＦＡＣＳ解析の要約
ＦＡＣＳ解析から、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＩｇＭの表面発現は、抗ｇｐ１２０又はＤＭ１（抗−ｇｐ−１２０−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートした抗ｇｐ１２０を用いて治療した腫瘍においてよりも、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＳＮ８又は２Ｆ２）又はＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体を用いて治療した腫瘍において、有意に低かった。ＣＤ２２の表面発現は、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体（ＳＮ８又は２Ｆ）又はＤＭ１（抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）抗体を用いた治療に影響を受けなかった。
異種移植片及びびまん性異種移植片における有意に腫瘍の倍加を阻害する抗ＴＡＨＯ抗体の能力を考慮すると、ＴＡＨＯ分子は、リンパ腫(すなわち非ホジキンリンパ腫)、白血病(すなわち慢性リンパ性白血病)、ミエローマ（すなわち多発性ミエローマ）及び他の造血系細胞の癌などのＢ細胞関連の癌を含む、哺乳動物の腫瘍の治療のための優れた標的であろう。さらに、抗ＴＡＨＯポリペプチドモノクローナル抗体は、リンパ腫(すなわち非ホジキンリンパ腫)、白血病(すなわち慢性リンパ性白血病)、ミエローマ（すなわち多発性ミエローマ）及び他の造血系細胞の癌などのＢ細胞関連の癌を含む、腫瘍のインビボの増殖の低減に有用である。
更に、抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）及び抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）ＡＤＣの（上記の異種移植片における）効能はタンパク質標的の表面発現レベル又はフリーの薬剤に対する感受性に相関していなかった。したがって、抗ＴＡＨＯポリペプチドモノクローナル抗体は、ＴＡＨＯポリペプチドが低い発現レベルである腫瘍のインビボにおける腫瘍増殖の低減のために有用であり得る。
【０３７９】
実施例１３：免疫組織化学
ＴＡＨＯポリペプチドの組織発現を決定し、実施例１のマイクロアレイの結果を確認するため、本出願人のヒト組織バンク由来の口蓋扁桃、脾臓、リンパ節及びパイエル板を含む、スナップ凍結したリンパ組織及びホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）リンパ組織において、ＴＡＨＯポリペプチド発現の免疫組織化学的検出を試験した。
ＴＡＨＯ標的発現の罹患率を、ＦＦＰＥリンパ組織マイクロアレイ（Cybrdi）及び２４の凍結ヒトリンパ検体において評価した。凍結組織検体を５μｍの切片にし、空気乾燥させ、免疫染色に先立って５分間アセトンで固定した。パラフィン包埋組織を５μｍの切片にし、SuperFrost Plus顕微鏡スライド（ＶＷＲ）に載せた。
凍結切片について、スライドをＴＢＳＴ、１％のＢＳＡ及び０．０５％のアジ化ナトリウムを含む１０％の正常ウマ血清に３０分間入れ、次いでアビジン／ビオチン遮断キット（Vector）試薬を用いてインキュベートし、その後一次抗体を添加した。マウスのモノクローナル一次抗体（市販）を、ビオチニン化したウマ抗マウスＩｇＧ（Vector）を用いて検出し、その後アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ABC Elite, Vector）及び金属増強ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド（DAB, Pierce）を用いてインキュベートした。コントロール切片は、アイソタイプの一致する無関係なマウスモノクローナル抗体（Pharmingen）を用いて同等の濃度でインキュベートした。ＡＢＣ−ＨＲＰ試薬の適用後、増幅希釈液中でビオチンチラミド（Perkin Elmer）を用いて５〜１０分に亘り切片をインキュベートし、洗浄し、ＡＢＣ−ＨＲＰ試薬を用いて再度インキュベートした。上述のように、ＤＡＢを用いて検出を行った。
ＦＦＰＥヒト組織切片を希釈水に入れて蝋を取り除き、沸騰水中で２０分間Target Retrieval溶液（Dako）で処理し、その後２０分間冷却した。残留する内在性のペルオキシダーゼ活性を１×遮断溶液（ＫＰＬ）を用いて４分間遮断した。アビジン／ビオチン遮断試薬、及び、１０％の正常ウマ血清を含む遮断バッファーを用いて切片をインキュベートした後、モノクローナル抗体を加え、遮断バッファー中において０．５〜５．０μｇ／ｍｌまで希釈した。次いで、ビオチン化した抗マウス二次抗体を用いて切片を連続的にインキュベートし、その後ＡＢＣ−ＨＲＰによる検出及びＤＡＢを用いた色素生産性検出を行った。上述のTyramide Signal Amplificationを使用して、ＴＡＨＯ標的（ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＯＢ）の数を求めるための染色の感受性を増大させた。
ＴＡＨＯ分子は、、Ｂ細胞関連癌を含む哺乳動物の腫瘍、例えばリンパ腫（つまり非ホジキンリンパ腫）、白血病（つまり慢性リンパ性白血病）、骨髄腫（つまり多発性骨髄腫）及びその他造血細胞癌の治療の良好な標的である。
【０３８０】
実施例１４：フローサイトメトリー
ＴＡＨＯ分子の発現を決定するため、正常細胞及び疾病細胞、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞を含めた様々な細胞を用いてＦＡＣＳ分析を行った。
Ａ．正常細胞：ＴＡＨＯ４（ヒトＣＤ７９ａ）及びＴＡＨＯ５（ヒトＣＤ７９ｂ）
扁桃腺Ｂ細胞のサブタイプについて、新鮮な扁桃腺を冷たいＨＢＳＳ中で分割し、７０ｕｍの細胞濾過器に通した。細胞を一度洗浄し、数を数えた。AutoMACS（Miltenyi)を用いてＣＤ１９＋Ｂ細胞を濃縮した。簡単に言うと、ヒトＩｇＧを用いて扁桃腺細胞を遮断し、抗ＣＤ１９マイクロビーズを用いてインキュベートし、AutoMACSでのポジティブ選択に先立って洗浄した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞の画分を、プラズマ細胞のフローサイメトリー分析のために保存した。Ｂ細胞の亜集団を検索するために、ＦＩＴＣ−ＣＤ７７、ＰＥ−ＩｇＤ、及びＡＰＣ−ＣＤ３８を用いて残りのＣＤ１９＋細胞を染色した。ＰＥ−Ｃｙ５−ＣＤ１９を用いてＣＤ１９＋濃縮を分析したところ、純度は９４〜９８％のＣＤ１９＋の範囲であった。扁桃腺Ｂ亜集団を、流速１８,０００−２０,０００個／秒でMoFlo by Michael Hamiltonにより検索した。濾胞性マントル細胞をＩｇＤ＋／ＣＤ３８−画分として、記憶Ｂ細胞をＩｇＤ−／ＣＤ３８−として、中心細胞をＩｇＤ−／ＣＤ３８＋／ＣＤ７７−として、及び中心芽細胞をＩｇＤ−／ＣＤ３８＋／ＣＤ７７＋として回収した。細胞は５０％の血清中に一晩保存するか、又は染色し、２％のパラホルムアルデヒドを用いて固定した。プラズマ細胞の分析のために、ストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ５によって検出される対象の標的に対し、Ｃｄ１３８−ＰＥ、ＣＤ２０−ＦＩＴＣ、及びビオチニン化した抗体を用いて総扁桃腺Ｂ細胞を染色した。ストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ５によって検出される対象の標的に対し、ビオチン化抗体を用いて扁桃腺Ｂ亜集団を染色した。BD FACSCaliberによりフロー分析を行い、FlowJoソフトウエアv ４.５.２（TreeStar)を用いてデータを更に分析した。ＴＡＨＯ４（ヒトＣＤ７９ａ）及びＴＡＨＯ５（ヒトＣＤ７９ｂ）等の市販されているビオチンコンジュゲート抗体をフローサイトメトリーに用いた。
正常細胞のＴＡＨＯ４（ヒトＣＤ７９ａ）（ＺＬ７−４）及びＴＡＨＯ５（ヒトＣＤ７９ｂ）（ＣＢ−３）の要約
対象のＴＡＨＯポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いて、検索した扁桃腺−Ｂサブタイプ上の発現パターンを行った。ＴＡＨＯ４（ヒトＣＤ７９ａ)（抗ヒトＣＤ７９ａを使用）及びＴＡＨＯ５（ヒトＣＤ７９ｂ)（抗ヒトＣＤ７９ｂを使用）は、記憶Ｂ細胞、濾胞性マントル細胞、中心芽細胞、及び中心細胞に有意な発現を示した（データは示さない）。
対象のＴＡＨＯポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いて扁桃腺プラズマ細胞上の発現パターンを実行した。ＴＡＨＯ４（ヒトＣＤ７９ａ)（抗ヒトＣＤ７９ａを使用）及びＴＡＨＯ５（ヒトＣＤ７９ｂ)（抗ヒトＣＤ７９ｂを使用）は、プラズマ細胞に有意な発現を示した（データは示さない）。
従って、ＦＡＣＳによって評価した、扁桃腺−Ｂサブタイプ上のＴＡＨＯ４及びＴＡＨＯ５の発現パターンを考慮すると、これらの分子は、Ｂ細胞関連癌を含む哺乳動物の腫瘍、例えばリンパ腫（つまり非ホジキンリンパ腫）、白血病（つまり慢性リンパ性白血病）、骨髄腫（つまり多発性骨髄腫）及びその他造血細胞癌の治療の良好な標的である。
【０３８１】
Ｂ．ＣＬＬ細胞：ＴＡＨＯ４（ヒトＣＤ７９ａ)及びＴＡＨＯ５（ヒトＣＤ７９ｂ)
以下の精製済み又は蛍光色素抱合ｍＡＢｓをＣＬＬ試料のフローサイトメトリーに使用した：ＣＤ５−ＰＥ、ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５、ＣＤ２０−ＦＩＴＣ、ＣＤ２０−ＡＰＣ（BD Pharmingenから購入)。更に、ＣＤ２２（Ancell社RFB4）、ＣＤ２３（BD Pharmingen社のM−L２３３）、ＣＤ７９A（Serotec社又はCaltag社のZL７−４）、ＣＤ７９Ｂ（BD Pharmingen社ＣＢ−３）、ＣＤ１８０（eBioscience社MHR７３−１１）、ＣＸＣＲ５（R&D Systems社５１５０５)に対する市販のビオチン化抗体、をフローサイトメトリーに使用した。ＣＤ５、ＣＤ１９及びＣＤ２０抗体を使用してＣＬＬ細胞に入れ、細胞生存率をチェックするためにＰＩ染色を実施した。
まず、細胞（容積１００ｍｌ中１０６個）を、それぞれ１ｍｇのＣＤ５、ＣＤ１９及びＣＤ２０抗体、並びにそれぞれ１０ｍｇのヒト及びマウスγグロブリン（Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove、PA）を用いてインキュベートし、非特異的結合を遮断し、次いで適切な濃度のｍＡｂｓを用いて３０分間暗所において４℃でインキュベートした。ビオチン化した抗体を使用した場合、次いで製造者の指示に従ってストレプトアビジン−ＰＥ又はストレプトアビジンＡＰＣ（Jackson ImunoResearch Laboratories)を加えた。FACS calibur（BD Biosciences、San Jose、CA)においてフローサイトメトリーを実行した。線形モードにおいて、前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）信号が記録され、対数モードで蛍光信号が記録された。死滅した細胞及び残骸を細胞の散乱特性を用いて外に出した。CellQuest Pro ソフトウエア（BD Biosciences)及びFlowJo（Tree Star Inc.)を用いてデータを分析した。
ＣＬＬ試料における、ＴＡＨＯ４（ヒトＣＤ７９ａ)及びＴＡＨＯ５（ヒトＣＤ７９ｂ）の要約
対象のＴＡＨＯポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いてＣＬＬ試料の発現パターンを実行した。ＴＡＨＯ４（ヒトＣＤ７９ａ)及びＴＡＨＯ５（ヒトＣＤ７９ｂ）は、ＣＬＬ試料に有意な発現を示した（データは示さない）。
従って、ＦＡＣＳによって評価した、慢性白血病（ＣＬＬ）試料における、ＴＡＨＯ４及びＴＡＨＯ５の発現パターンを考慮すると、これら分子は、Ｂ細胞関連癌を含む哺乳動物の腫瘍、例えばリンパ腫（つまり非ホジキンリンパ腫）、白血病（つまり慢性リンパ性白血病）、骨髄腫（つまり多発性骨髄腫）及びその他造血細胞癌の治療の良好な標的である。
【０３８２】
実施例１５：ＴＡＨＯの内部移行
ＴＡＨＯ抗体のＢ細胞株への内部移行を、ＡＲＨ７７、ＳｕＤＨＬ４、Ｕ６９８Ｍ、ｈｕＢ及びＢＪＡＢ細胞株を含むＲａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ及びその他Ｂ細胞株において評価した。
２０の反応に使用できる細胞を有するＢ細胞（〜５０×１０６個）の、ワンレディトゥスプリット(one ready-to-split)１５ｃｍディッシュを使用した。細胞はパッセージ２５以下（週齢８週未満）であり、マイコプラズマを起こすことなく健常に成長していた。
蓋を緩めた１５ｍｌのFalconチューブ中において、１μｇ／ｍｌのマウス抗ＴＡＨＯ抗体を、２ｍｌ中２．５×１０６個の細胞を有する正常な成長培地（例えばＰＲＭＩ／１０％ＦＢＳ／１％グルタミン）に加え、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベーターに２４時間入れた。培地は、１：１０のＦｃＲブロック（ＭＡＣＳキット、希釈してアジ化物を除去）、１％のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、５μＭのペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン（リソソームプロテアーゼインヒビター）及び２５μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ４８８−トランスフェリン（再循環経路を標識し、生存している細胞を示す；或いは、全ての経路を標識するために、Ａｘ４８８デキストラン液相マーカーを用いてもよい）を含むものであった。急速に内部移行する抗体について、５分毎のタイムポイントを採用した。１時間未満のタイムポイントについては、１ｍｌの完全な無炭酸塩培地（Gibco １８０４５−０８８ ＋ １０%のＦＢＳ、１%のグルタミン、１%のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４））を使用し、ＣＯ２インキュベーターではなく３７℃の水槽において反応を実施した。
所定の時間過程を終了後、遠心分離（１５００ｒｐｍのＧ６−ＳＲにおいて４℃で５分間、又は４℃のベンチトップ型エッペンドルフ遠心分離において２５００ｒｐｍで３分間）することにより細胞を回収し、１．５ｍｌの無炭酸塩培地（エッペンドルフ）、又は１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ用１０ｍｌの培地中で１度洗浄した。細胞に対し、２度目の遠心分離を行い、室温で２０分間ＰＢＳ中３％パラホルムアルデヒド（ＥＭＳ）０．５ｍｌに再懸濁し、細胞を固定させた。
以下のステップを全て行った後、遠心分離により細胞を回収した。細胞をＰＢＳ中において洗浄後、ＰＢＳ中５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ（Sigma）０．５ｍｌ中で１０分間消光し、４分間の遠心分離回転の間にＰＢＳ中０．１％のトリトン−Ｘ−１００  ５ｍｌで４分間透過処理した。ＰＢＳ中で細胞を洗浄し、遠心分離した。１μｇ／ｍｌのＣｙ３−抗マウス（又は抗種１°抗体）を加えることにより、室温で２０分間に亘り、２００μｌの完全無炭酸塩培地における抗体の取り込みを検出した。無炭酸塩培地中において細胞を２度洗浄し、２５μｌの無炭酸塩培地中に再懸濁し、ポリリジンでコーティングした８ウェルのLabtekIIスライドのうち１つのウェルに細胞を滴下し、少なくとも１時間（又は冷蔵庫で一晩）置いた。非結合細胞は全て吸引し、スライド上において、５０×２４ｍｍのカバーガラスの下に、Vectashieldを含むＤＡＰＩを１ウェル当たり１滴載せた。１００倍の対物レンズを用いて、抗体の内部移行について細胞を試験した。
【０３８３】
要約
（１）ＴＡＨＯ４／ＣＤ７９ａ（抗ヒトＣＤ７９ａ（ＴＡＨＯ４）抗体  Ｓｅｒｏｔｅｃ  ＺＬ７−４又はＣａｌｔａｇ  ＺＬ７−４を用いて検出した）は、１時間以内にＲａｍｏｓ細胞、１時間以内にＤａｕｄｉ細胞及び１時間以内にＳｕＤＨＬ４細胞に内部移行し、３時間でリソソームに送達された。
（２）ＴＡＨＯ５／ＣＤ７９ｂ（抗ＣＤ７９ｂ抗体 Ancell社ＳＮ８を用いて検出）は、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ及びＳｕ−ＤＨＬ４細胞内に２０分で内部移行し、１時間でリソソームに送達された。
従って、それぞれ、抗ＴＡＨＯ抗体を用いて免疫蛍光により評価した、ＴＡＨＯ４及びＴＡＨＯ５のＢ細胞株への内部移行を考慮すると、これら分子は、Ｂ細胞関連癌を含む哺乳動物の腫瘍、例えばリンパ腫（つまり非ホジキンリンパ腫）、白血病（つまり慢性リンパ性白血病）、骨髄腫（つまり多発性骨髄腫）及びその他造血細胞癌の治療の良好な標的である。
【０３８４】
実施例１６：ＴＡＨＯ共局在
細胞内への内部移行の際にどこに抗ＴＡＨＯ抗体が運搬されるか否かを決定するために、Ｂ細胞株へ内部移行された抗ＣＤ７９ｂ抗体の共局在試験をＲａｍｏｓ細胞株において評価してもよい。ＬＡＭＰ-１は後期エンドソーム及びライソソームのためのマーカーであり(Kleijmeer et al., Journal of Cell Biology, 139(3): 639-649 (1997)；Hunziker et al., Bioessays, 18:379-389 (1996)；Mellman et al., Annu. Rev. Dev. Biology, 12:575-625 (1996))、後期エンドソーム／ライソソーム様区画であるＭＨＣクラスII区画(ＭＩＩＣ)を含む。ＨＬＡ−ＤＭはＭＩＩＣのためのマーカーである。
Ｒａｍｏｓ細胞を、１μｇ／ｍｌ 抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＳＮ８）抗体、ＦｃＲブロック(Miltenyi)及び２５μｇ／ｍｌ Ａｌｅｘａ６４７-トランスフェリン(Molecular Probes)を含む完全無炭酸塩培地(Gibco)にて、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン(Roche)及び５μＭ ペプスタチン(Roche)の存在下で、３７℃で３時間インキュベートして、ライソソームの分解を阻害させる。次いで、細胞を２回洗浄し、３％ パラフォルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences)にて室温で２０分かけて固定し、５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ(Sigma)にて反応を止め、０.４% サポニン／２% ＦＢＳ／１% ＢＳＡにて２０分間透過させ、次いで、１μｇ／ｍｌ Ｃｙ３抗マウス(Jackson Immunoresearch)とともに２０分間インキュベートを行う。次いで、マウスＩｇＧ(Molecular Probes)にて２０分間反応をブロックした後、Ｉｍａｇｅ-ｉＴ ＦＸシグナルエンハンサー(Molecular Probes)とともに３０分間インキュベートを行う。最後に、細胞を、ライソソーム及びＭIIＣ(ＭＨＣクラスII経路の一部であるライソソーム様区画)のマーカーであるＺｅｎｏｎ Ａｌｅｘａ４８８-標識マウス抗LAMP1 (BD Pharmingen)と共に２０分間インキュベートし、その後３％ ＰＦＡにて固定する。２０μｌのサポニンバッファに細胞を再懸濁し、ポリ-リジン(Sigma)コートスライドに付着させ、ＤＡＰＩ含有ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ(Vector Laboratories)を有するカバーグラスをマウントする。ＭIIＣ又はライソソームの免疫蛍光のために、上記のように細胞を固定し、透過処理し、亢進させ、次いで製造業者(Molecular Probes)の指示に従って、過剰量のマウスＩｇＧの存在下にてZenon標識Alexa555-HLA-DM(BD Pharmingen)とAlexa488-Lamp1にて共染色する。
要約
抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）（ＳＮ８）抗体は１から３時間取り込まれたＬＡＭＰ１と共局在し、再生マーカーのトランスフェリンよりも有意に少ない共局在を示した。
したがって、それぞれの抗ＴＡＨＯ抗体の免疫蛍光によって評価される、抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）のＭIIＣ又はライソソームへの内在化を考慮すれば、分子が、リンパ腫(すなわち非ホジキンリンパ腫)、白血病(すなわち慢性リンパ性白血病)、ミエローマ（多発性ミエローマ）及び他の造血系細胞の癌などのＢ細胞関連の癌を含む、哺乳動物の腫瘍の治療のための優れた標的であることを示すであろう。
【０３８５】
実施例１７：システイン操作抗ＴＡＨＯ抗体の調製
本明細書において開示されるようにシステイン操作抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）及び抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような抗ＴＡＨＯ抗体の調製を行った。
ｃｈＳＮ８抗体をコードするＤＮＡ(軽鎖、配列番号：１０、図１０；及び重鎖、配列番号：１２、図１２)は、本明細書において開示される方法によって突然変異を誘発し、軽鎖及び重鎖を修飾した。また、ｃｈＳＮ８抗体をコードするＤＮＡ(重鎖、配列番号：１２；図１２)は、本明細書において開示される方法によって突然変異を誘発し、重鎖のＦｃ領域を修飾してもよい。
抗ｃｙｎｏ ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）抗体（ｃｈＤ１０）をコードするＤＮＡ(軽鎖、配列番号：４１；図２１及び重鎖、配列番号：４３、図２３)は、本明細書において開示される方法によって突然変異を誘発し、軽鎖及び重鎖を修飾した。また、抗ｃｙｎｏ ＣＤ７９ｂ抗体をコードするＤＮＡ(重鎖、配列番号：４３、図２３)は、本明細書において開示される方法によって突然変異を誘発し、重鎖のＦｃ領域を修飾してもよい。  
システイン操作抗ＣＤ７９ｂ抗体の調製において、軽鎖をコードするＤＮＡに突然変異を誘発し、図３０(ｃｈＳＮ８ チオＭＡｂの軽鎖、配列番号：５８)及び図３６(チオＭＡｂ抗ｃｙｎｏ ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)の軽鎖、配列番号：９６)に示すように、軽鎖のカバット位置２０５(連続した位置２０８)でシステインをバリンと置換させた。重鎖をコードするＤＮＡに突然変異を誘発し、図３５(チオＭＡｂ 抗ｃｙｎｏ ＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)抗体の重鎖、配列番号：６１)、図３１(ＭＡ７９ｂ チオＭＡｂの重鎖、配列番号：６０)に示すように、重鎖のＥＵ位置１１８(連続した位置１１８；カバット番号１１４)でシステインをアラニンと置換させた。表６〜７に示すように、抗ＣＤ７９ｂ抗体のＦｃ領域を、重鎖Ｆｃ領域のＥＵ位置４００(連続した位置４００；カバット番号３９６)でシステインをセリンに置換させてもよい。
【０３８６】
Ａ．還元及び再酸化によるコンジュゲートのためのシステイン操作抗ＴＡＨＯ抗体の調製
完全長のシステイン操作(engineered)抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような抗ＴＡＨＯ抗体は、ＣＨＯ細胞において発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィの後にサイズ排斥クロマトグラフィを行って精製した。精製された抗体は、５００ｍＭ ホウ酸ナトリウム及び５００ｍＭ 塩化ナトリウムにておよそｐＨ８．０に再構成し、およそ５０〜１００倍モル過剰量の１ｍＭ ＴＣＥＰ(トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロライド；Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80；Soltec Ventures, Beverly, MA)にて、３７℃でおよそ１〜２時間かけて還元させる。還元されたＴｈｉｏＭａｂを希釈し、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５のＨｉＴｒａｐ Ｓカラムに流し、０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含むＰＢＳにて溶出させる。溶出された稀釈ＴｈｉｏＭａｂは、ｐＨ７の２ｍＭ デヒドロアスコルビン酸(ｄｈＡＡ)にて３時間、又は２ｍＭ 水溶性硫酸銅(ＣｕＳＯ４)にて室温で終夜処理する。環境大気酸化も有効であろう。Sephadex G25樹脂による溶出によってバッファを交換し、１ｍＭ ＤＴＰＡを含むＰＢＳにて溶出する。チオール／Ａｂ値は、溶液の２８０ｎｍの吸光度からの還元抗体濃度とＤＴＮＢ(Aldrich, Milwaukee, WI)との反応及び４１２ｎｍの吸光度の測定によるチオール濃度とを決定することによって概算する。
【０３８７】
実施例１８：システイン操作抗ＴＡＨＯ抗体と薬剤−リンカー中間生成物のコンジュゲートによる、システイン操作抗ＴＡＨＯ抗体薬剤コンジュゲートの調製
実施例１７の還元及び再酸化手順の後、システイン操作抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯ抗体は、ＰＢＳ(リン酸緩衝食塩水)バッファにて再構成し、氷上で冷やす。マレイミドなどのチオール反応性官能基を有する、ＭＣ-ＭＭＡＥ (マレイミドカプロイル-モノメチルアウリスタチンＥ)、ＭＣ-ＭＭＡＦ、ＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥ、又はＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦなどのアウリスタチン薬剤リンカー中間生成物の抗体当たりの操作システインとおよそ１．５モル相当物をＤＭＳＯにて希釈し、アセトニトリルと水にて希釈し、冷却した還元、酸化抗体を含むＰＢＳに加える。およそ１時間後、過剰量のマレイミドを加えて反応を止め、任意の反応していない抗体チオール基をキャップする。反応混合物は遠心限外濾過によって濃縮し、システイン操作抗ヒトＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ５）又は抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）のような、ＴＡＨＯ抗体薬剤コンジュゲートは精製し、ＰＢＳのＧ２５樹脂による溶出によって脱塩し、無菌条件下で０．２μｍフィルターにて濾過し、貯蔵のために凍結する。
ｃｈＳＮ８-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ) チオＭＡｂ-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１の調製を以下のように行った。抗ｃｈＳＮ８-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ) チオＭＡｂ上の遊離システインは、抗体の表面上の反応しなかったマレイミド基を残す、ビス−マレイミド試薬ＢＭ(ＰＥＯ)３(Pierce Chemical)にて修飾した。これは、５０％エタノール／水混合物に１０ｍＭの濃度になるまでＢＭ(ＰＥＯ)３を溶解し、抗ｃｈＳＮ８-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ) チオＭＡｂをおよそ１．６ｍｇ／ｍｌ(１０マイクロモル)の濃度でリン酸緩衝生理食塩水に含む溶液に１０倍モル過剰量のＢＭ(ＰＥＯ)３を加え、それを１時間反応させることによって達成した。過剰量のＢＭ(ＰＥＯ)３は、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファを含む３０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ６のゲル濾過(HiTrapカラム、Pharmacia)によって除去した。ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)に溶解したおよそ１０倍モル過剰量のＤＭ1を、抗ｃｈＳＮ８-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ) チオＭＡｂ-ＢＭＰＥＯ中間生成物に加えた。また、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)を用いて、薬剤部分試薬を溶解してもよい。反応混合物を終夜反応させ、ゲル濾過又はＰＢＳへの透析を行い反応しなかった薬剤を除去した。ＰＢＳのＳ２００カラムのゲル濾過を用いて、高分子量集合体を取り除き、精製された抗ｃｈＳＮ８-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ) チオＭＡｂ-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１を供給した。
【０３８８】
同じプロトコールによって、チオコントロールｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１、チオコントロールｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ、チオコントロールｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣｖｃＰＡＢ−ＭＭＡＥを生成した。 
上記の手順によって、以下のシステイン操作抗ＴＡＨＯ抗体薬剤コンジュゲート(ＴＤＣ)を調製し、試験した。
１．Ａ１１８Ｃチオ 抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)とＭＣ−ＭＭＡＦとのコンジュゲートによるチオ 抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ；
２．Ａ１１８Ｃチオ 抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)とＢＭＰＥＯ-ＤＭ１とのコンジュゲートによるチオ 抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１；
３．Ａ１１８Ｃチオ 抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)とＭＣ-ｖａｌ-ｃｉｔ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥとのコンジュゲートによるチオ 抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣｖｃＰＡＢ-ＭＭＡＥ；
４．Ａ１１８Ｃチオ ｃｈＳＮ８-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)とＭＣ−ＭＭＡＦとのコンジュゲートによるチオ ｃｈＳＮ８−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ；
５．チオ ｃｈＳＮ８-ＬＣ(Ｖ２０５Ｃ)とＭＣ−ＭＭＡＦとのコンジュゲートによるチオ ｃｈＳＮ８−ＬＣ（Ｖ２０５Ｃ）−ＭＣ−ＭＭＡＦ。
【０３８９】
実施例１９：システイン操作ＴｈｉｏＭａｂ薬剤コンジュゲートの細胞表面抗原に対する結合親和性の特徴付け
ＢＪＡＢ-ルシフェラーゼ細胞に発現されるＣＤ７９ｂに対するチオ ｈｕＭＡ７９ｂ.ｖ１８、チオ ｈｕＭＡ７９ｂ.ｖ２８薬剤コンジュゲート及びチオ ＭＡ７９ｂ薬剤コンジュゲートの結合親和性を、ＦＡＣＳ分析にて測定した。さらに、ｃｙｎｏＣＤ７９ｂを発現しているＢＪＡＢ細胞に発現されるＣＤ７９ｂに対するチオ 抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ(ｃｈ１０Ｄ１０)薬剤コンジュゲートの結合親和性を、ＦＡＣＳ分析にて測定した。  
簡単にいうと、１００μｌ中およそ１×１０６個の細胞を、様々な量(１００万個のＢＪＡＢ−ルシフェラーゼ細胞又はｃｙｎｏＣＤ７９ｂを発現するＢＪＡＢ細胞につき、１．０μｇ、０．１μｇ又は０．０１μｇのＡｂ)の以下のいずれかの抗ＣＤ７９ｂ チオＭａｂ薬剤コンジュゲート又はネイキッド(コントロールとしてのコンジュゲートしていないＡｂ)と接触させた。(1) （１）チオｃｈＳＮ８−ＬＣ（Ｖ）２０５Ｃ）−ＭＣ−ＭＭＡＦ又は（２）チオｃｈＳＮ８−ＨＣ（Ａ１１８Ｃ）−ＭＣ−ＭＭＡＦ（それぞれ、図３２Ａ−Ｂ）；又は（３）チオ抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ）４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）−ＨＣ（Ａ１１８Ｃ）−ＭＣｖｃＰＡＢ−ＭＭＡＥ、（４）チオ抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ）４０）（ｃｈＤ１０）−ＨＣ（Ａ１１８Ｃ）−ＢＭＰＥＯ−ＤＭ１、又は(５) チオ抗カニクイザルＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）−ＨＣ（ＡＣ）１１８Ｃ）−ＭＣ−ＭＭＡＦ；(それぞれ図３３Ｂ−３３Ｄを参照)。ＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇを二次検出抗体(ＢＤ Ｃａｔ#５５５７８７)として用いた。
細胞表面に結合した抗ＣＤ７９ｂ抗体は、ＰＥコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇを用いて検出した。図３２−３３のプロット線は、抗原結合が試験したチオＭＡｂ薬剤コンジュゲートのすべてについておよそ同じであったことを示す。 
【０３９０】
実施例２０：抗ＴＡＨＯ ＴｈｉｏＭａｂ薬剤コンジュゲートによるインビトロ細胞増殖低減についてのアッセイ
抗ＴＡＨＯ ＴｈｉｏＭＡｂ-薬剤コンジュゲートのインビトロ作用強度は、細胞増殖アッセイにて測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(登録商標)発光細胞生存率アッセイは、甲虫類ルシフェラーゼの組み換え発現に基づいた、市販されている(Promega Corp., Madison, WI)均質アッセイ法である(米国特許第５５８３０２４号；同第５６７４７１３号；同第５７００６７０号)。細胞増殖アッセイは、代謝的に活性な細胞の指標であるＡＴＰの存在量に基づいて、培養中の生きている細胞数を決定する(Crouch et al., J. Immunol. Metho., 160: 81-88 (1993)；米国特許第６６０２６７７号)。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(登録商標)アッセイは、自動化ハイスループットスクリーニング(ＨＴＳ)を実施しやすいように９６ウェルフォーマットで行った(Cree et al., AntiCancer Drugs, 6:398-404 (1995))。均質なアッセイ手順は、血清添加培地にて培養した細胞に単一試薬(ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(登録商標)試薬)を直接添加することを伴う。
均質な「ａｄｄ−ｍｉｘ−ｍｅａｓｕｒｅ」フォーマットにより細胞溶解と、ＡＴＰ存在量と比例した発光シグナルの生成が生じる。基質であるカブトムシルシフェリンは、ＡＴＰのＡＭＰへの同時転換と光子の生成と共に、組み換えホタルルシフェラーゼにより酸化的に脱炭酸される。生きている細胞は、相対的な発光単位(ＲＬＵ)に反映される。データは、ルミノメーター又はＣＣＤカメラ画像形成装置によって記録されうる。発光出力は、経時的に測定されたＲＬＵとして表される。％ＲＬＵは「非薬剤コンジュゲート」コントロールと比較した規準化したＲＬＵ割合である。あるいは、発光からの光子をシンチラントの存在下でシンチレーション計測器にて計測することもできる。次いで、光単位はＣＰＳ(数／秒)として表されうる。
【０３９１】
チオＭＡｂ−薬剤コンジュゲートの有効性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ(Promega Corp. Technical bulletin TB288；Mendoza et al., Cancer Res., 62: 5485-5488 (2002))を変更した、以下のプロトコールを用いた細胞増殖アッセイにより測定した。
１．およそ３０００のＢＪＡＢ、Ｇｒａｎｔａ-５１９又はＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を培地に含む４０μｌの細胞培養物分量を、３８４ウェルの不透明な壁のプレートの各ウェルに置いた。
２．ＴＤＣ(ＴｈｉｏＭａｂ薬剤コンジュゲート)(１０μｌ)を、４通りの実験ウェルに加え、１００００、３３３３、１１１１、３７０、１２３、４１、１３．７、４．６又は１．５ｎｇ／ｍｌの終濃度にし、「非薬剤コンジュゲート」コントロールウェルは培地のみとし、３日間インキュベートした。
３．プレートは、およそ３０分かけて室温にした。
４．ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ試薬(５０μｌ)を加えた。
５．内容物を環状振とう器上で２分間混合した。
６．プレートは、室温で１０分間インキュベートし、発光シグナルを安定化させた。
７．発光は、％ＲＬＵ(相対的な発光単位)として記録し、グラフに表した。無薬剤−コンジュゲート培地にてインキュベートした細胞からのデータは０．５１ｎｇ／ｍｌにプロットした。
培地：ＢＪＡＢ、Ｇｒａｎｔａ-５１９及びＷＳＵ-ＤＬＣＬ２細胞は、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ／２ｍＭ グルタミン中で生育させた。  
【０３９２】
実施例２１：抗ＴＡＨＯ ＴｈｉｏＭａｂ薬剤コンジュゲートによるインビトロ腫瘍増殖の抑制のためのアッセイ
Ａ．Ｇｒａｎｔａ-５１９(ヒトマントル細胞リンパ腫)
投与した薬剤コンジュゲートと用量を変え、実施例１２(上記参照)に開示したのと同じ異種移植片試験プロトコールを用いた類似の試験において、ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスのＧｒａｎｔａ−５１９異種移植片(ヒトマントル細胞リンパ腫)におけるチオＭＡｂ薬剤コンジュゲートの有効性を調べた。薬剤コンジュゲート及び用量(すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目に投与された)は以下の表２１に示す。
コントロールＡｂは、ｃｈＳＮ８−ＭＣ−ＭＭＡＦ又はＭＡ７９ｂ−ＭＣ−ＭＭＡＦとした。コントロールＨＣ(Ａ１１８Ｃ) チオＭＡｂは、チオ ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＭＡＦ チオＭＡｂとした。結果を表２１及び図３４に示す。
図３４Ａは、表２１に示す用量の、重鎖Ａ１１８Ｃ又は軽鎖Ｖ２０５Ｃ 抗ＣＤ７９ｂ ＴＤＣにて処置したＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスのＧｒａｎｔａ-５１９異種移植片の経時的な平均腫瘍体積の変化をプロットするグラフである。具体的には、チオ ｃｈＳＮ８−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ及びチオ ｃｈＳＮ８−ＬＣ(Ｖ２０５Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦの投与は、ネガティブコントロール(抗ｈｕ−ＨＥＲ２−ＭＣ−ＭＭＡＦ及びチオ−ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ)と比較すると、腫瘍増殖の阻害を示した。他のコントロールにはＭＡ７９ｂ-ＭＣ-ＭＭＡＦが含まれた。
さらに、同じ試験では、初めの１４日間の体重変化の割合を各投与群で測定した。結果(図３４Ｂ)は、これらチオＭａｂ薬剤コンジュゲートの投与によりこの期間では体重の割合の有意な減少も体重減少も起こらなかったことを示した。 
さらに、表２１では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示し、ＮＡは不適用である。(ＤＡＲ＝抗体に対する薬剤比)
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Ｂ．ＢＪＡＢ-ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）異種移植片
投与した薬剤コンジュゲートと用量を変え、実施例１２(上記)に開示したのと同じ異種移植片試験プロトコールを用いた類似の試験において、ＣＢ１７ ＳＣＩＤのｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）を発現するＢＪＡＢ(バーキットリンパ腫)細胞(ＢＪＡＢ-ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ)異種移植片におけるチオＭＡｂ薬剤コンジュゲートの有効性を調べた。薬剤コンジュゲート及び用量(すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目に投与された)は以下の表２２に示す。
コントロールＡｂはベヒクル(バッファ単独)とした。コントロールチオ ＭＡｂは、チオ−ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１、チオ−ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ及びチオ−ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣｖｃＰＡＢ-ＭＭＡＥ抗体チオＭＡｂとした。結果を表２２及び図３７に示す。
図３７は、表２２に示す用量の、重鎖Ａ１１８Ｃ抗ＣＤ７９ｂ ＴＤＣにて処置したＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスのＢＪＡＢ-ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ異種移植片の経時的な腫瘍増殖の阻害をプロットするグラフである。具体的には、チオ抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）−ＨＣ（Ａ１１８Ｃ）−ＢＭＰＥＯ−ＤＭ１、チオ抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈＤ１０）−ＨＣ（Ａ１１８Ｃ）−ＭＣｖｃＰＡＢ−ＭＭＡＥ及びチオ抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）（ｃｈ１０Ｄ１０）−ＨＣ（Ａ１１８Ｃ）−ＭＣ−ＭＭＡＦは、ネガティブコントロール(チオ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１、チオ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣｖｃＰＡＢ-ＭＭＡＥ及びチオ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＭＣ−ＭＭＡＦ及びＡ−ベヒクル)と比較して、腫瘍増殖の阻害を示した。
さらに、表２２では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示し、ＮＡは不適用である。(ＤＡＲ＝抗体に対する薬剤比)
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【０３９３】
Ｃ．ＢＪＡＢ-ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）異種移植片
投与した薬剤コンジュゲートと用量を変え、実施例１２(上記)に開示したのと同じ異種移植片試験プロトコールを用いた類似の試験において、ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスのｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）を発現するＢＪＡＢ(バーキットリンパ腫)(ＢＪＡＢ-ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ)異種移植片におけるチオＭＡｂ薬剤コンジュゲートの有効性を調べた。薬剤コンジュゲート及び用量(すべてのＡＤＣ及びコントロールについて０日目に投与された)は以下の表２３に示す。
コントロールチオ ＭＡｂは、チオ−ｈｕ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１及びチオ−抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)抗体チオＭＡｂとした。結果を表２３及び図３８に示す。
図３８は、表２３に示す用量の重鎖Ａ１１８Ｃ抗ＣＤ７９ｂ ＴＤＣにて処置したＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスのＢＪＡＢ-ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ異種移植片の経時的な腫瘍増殖の阻害をプロットするグラフである。具体的には、チオ−抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１は、ネガティブコントロール(チオ−抗ＨＥＲ２−ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)-ＢＭＰＥＯ-ＤＭ１)と比較して、腫瘍増殖の阻害を示した。他のコントロールには、チオ-抗ｃｙｎｏＣＤ７９ｂ（ＴＡＨＯ４０）(ｃｈ１０Ｄ１０)-ＨＣ(Ａ１１８Ｃ)が含まれた。
結果を以下の表２３に示す。表２３では、ＰＲ＝部分再生(投与後いずれかの時の腫瘍体積が０日目に測定した腫瘍体積の５０％以下に落ち込んだ場合)又はＣＲ＝完全再生(投与後のいずれかの時の腫瘍体積が０ｍｍ３に落ち込んだ場合)を示す、試験したマウスの合計数のうちのマウス数を示し、ＮＡは不適用である。(ＤＡＲ＝抗体に対する薬剤比)
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【０３９４】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，１０８０１ ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア２０１１０-２２０９米国(ＡＴＣＣ)に寄託した：
材料                 ATCC寄託番号      寄託日
DNA194917-3044      PTA-2985        2006年7月11日
抗ヒト CD79a-8H9 (8H9.1.1)  PTA-7719 2006年7月11日
抗ヒト CD79a-5C3 (5C3.1.1)  PTA-7718 2006年7月11日 
抗ヒト CD79a-7H7 (7H7.1.1)  PTA-7717 2006年7月11日 
抗ヒト CD79a-8D11 (8D11.1.1)  PTA-7722 2006年7月11日 
抗ヒト CD79a-15E4 (15E4.1.1)  PTA-7721 2006年7月11日
抗ヒト CD79a-16C11 (16C11.1.1)  PTA-7720 2006年7月11日
抗ヒト CD79b-2F2 (2F2.20.1)  PTA-7712 2006年7月11日
抗カニクイザル CD79b-3H3 (3H3.1.1) PTA-7714 2006年7月11日
抗カニクイザル CD79b-8D3 (8D3.7.1) PTA-7716 2006年7月11日
抗カニクイザル CD79b-9H11 (9H11.3.1) PTA-7713 2006年7月11日 
抗カニクイザル CD79b-10D10 (10D10.3) PTA-7715 2006年7月11日 
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテック社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に８８６ＯＧ６３８を参照しての３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ−１】
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【図２６Ａ−２】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ−１】
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【図２７Ａ−２】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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