(57)【要約】本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質の製造中に不純物を分離するための方法および組成物を提供する。本発明の方法に従って除去され得る不純物の例としては、不活性形態のＩｇ融合タンパク質および／または凝集体が挙げられる。本発明はまた、抗体ベースの生物製剤、すなわち、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質の精製中に、複数の生成物関連の不純物を除去することが可能な高分解能の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程を提供する。
2011514895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性なリンホトキシン−β−受容体免疫グロブリン（ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ）融合タンパク質を含む組成物であって、該ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の６％未満が生物学的に不活性であり、該ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の２％未満が凝集している組成物。
【請求項２】
前記ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の５％未満が生物学的に不活性である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の１％未満が生物学的に不活性である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の０．５％未満が生物学的に不活性である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
２％未満の凝集ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
１％未満の凝集ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質がＩｇＧ１アイソタイプのＩｇ定常領域を含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が配列番号２で記述されるアミノ酸配列を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が標準インビトロＩＬ−８抑制アッセイにおいてＩＬ−８放出を抑制し得る請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物および製薬上許容可能な担体を含む製剤組成物。
【請求項１１】
自己免疫障害の治療方法であって、それを必要とする被験者に請求項１０に記載の製剤組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記自己免疫障害が多発性硬化症である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記自己免疫障害が、続発性進行性多発性硬化症または再発寛解型多発性硬化症である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
生物学的に活性なリンホトキシン−β受容体免疫グロブリン（ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ）融合タンパク質を生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離するための方法であって、以下の：
生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質および生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む混合物をブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂上に充填するステップ、ならびに
該樹脂を塩勾配を含む溶液と接触させて、生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第一溶出物および生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第二溶出物を得るステップ、
を包含する方法。
【請求項１５】
前記塩勾配が段階的または連続的勾配である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記塩勾配が１．６Ｍ〜０．０ＭのＮａＣｌを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む前記第二溶出物が、１．５ＭのＮａＣｌ洗浄液で前記ＨＩＣ樹脂を洗浄することにより得られる請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記塩勾配が０．６Ｍ〜０．０ＭのＮａ２ＳＯ４を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記段階的勾配が０．６Ｍ〜０．０Ｍの範囲のＮａ２ＳＯ４の増分を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ブチルＨＩＣ樹脂が６００〜７５０Ａの孔サイズを有する請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＩＣ樹脂が約８ｍｇ〜約２０ｍｇのタンパク質／樹脂１Ｌの充填容量を有する請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む前記第二溶出物が、２％未満の生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む前記第二溶出物が、１％未満の生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
非凝集化生物学的活性リンホトキシン−β−受容体免疫グロブリン（ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ）融合タンパク質を、凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離するための方法であって、以下の：
非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質および凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む混合物をフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂上に充填するステップ（ここで、該樹脂は、約１０〜２０ｇのタンパク質／樹脂１Ｌの充填容量および約３０〜３１ｃｍの層高を有する）、ならびに
該樹脂を約５０〜１５０ｃｍ／時間の流速で溶液と接触させて、生物学的非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第一溶出物および凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第二溶出物を得るステップ、
を包含する方法。
【請求項２５】
前記非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む前記第一溶出物が２％未満の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む前記第一溶出物が１％未満の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
生物学的に活性なリンホトキシン−β−受容体免疫グロブリン（ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ）融合タンパク質を、生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離するための方法であって、以下の：
ｉ）生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質をブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させる条件下で、該生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質および生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む混合物を該ブチル樹脂上に充填するステップ、
ｉｉ）該ブチルＨＩＣ樹脂を塩勾配を含む溶液と接触させて、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の存在に関して濃化された第一溶出物を得るステップ、
ｉｉｉ）該生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を第二ＨＩＣ樹脂に結合させる条件下で、ステップｉｉ）の第一溶出物を該第二ＨＩＣ樹脂上に充填するステップ、そして
ｉｖ）該第二ＨＩＣ樹脂を溶液と接触させて、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の存在に関してさらに濃化された第二溶出物を得るステップ、を包含し、
それにより、該生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を該生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離する方法。
【請求項２８】
前記（ｉｉ）の塩勾配が段階的または連続的勾配である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ブチルＨＩＣ樹脂がヒドロキシル化メタクリレート主鎖を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ブチルＨＩＣ樹脂が６００〜７５０Ａの孔サイズを有する請求項２７〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第一溶出物が２％未満の前記不活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の第一形態（不活性型−１）を含む請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第一溶出物が１％未満の前記不活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の第一形態（不活性型−１）を含む請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第二溶出物が２％未満の前記不活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の第二形態（不活性型−２）を含む請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第二溶出物が１％未満の前記不活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の第二形態（不活性型−２）を含む請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記混合物中のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の濃度が少なくとも３００ｍｇ／Ｌである請求項１４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記混合物中のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の濃度が少なくとも８００ｍｇ／Ｌである請求項１４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記混合物中のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の濃度が少なくとも１３５０ｍｇ／Ｌである請求項１４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記混合物の体積が少なくとも５０００Ｌである請求項１４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記混合物の体積が少なくとも１００００Ｌである請求項１４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記混合物の体積が少なくとも１５０００Ｌである請求項１４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離するための方法であって、以下の：
ｉ）生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を混合モード樹脂に結合させる条件下で、該生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質および生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む混合物を該混合モード樹脂上に充填するステップ、
ｉｉ）溶液でステップｉ）の混合モード樹脂から該生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を溶出して、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の存在に関して濃化された第一溶出物を得るステップ、
ｉｉｉ）該生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させる条件下で、ステップｉｉ）の第一溶出物を該ＨＩＣ樹脂上に充填するステップ、そして
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を溶液で溶出して、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の存在に関してさらに濃化された第二溶出物を得るステップを、包含し、
それにより、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離する方法。
【請求項４２】
非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離するための方法であって、以下の：
ｉ）生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を混合モード樹脂に結合させる条件下で、該非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質および凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む混合物（ここで、該混合物中の約３０％より多いかまたは約３０％のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が凝集している）を該混合モード樹脂上に充填するステップ、
ｉｉ）溶液を用いてステップｉ）の混合モード樹脂から該生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を溶出して、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の存在に関して濃化された第一溶出物を得るステップ、
ｉｉｉ）該生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させる条件下で、ステップｉｉ）の第一溶出物を該ＨＩＣ樹脂上に充填するステップ、そして
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を溶液を用いて溶出して、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の存在に関してさらに濃化された第二溶出物を得るステップ、を包含し、
それにより、該凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を該凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離する方法。
【請求項４３】
前記混合モード樹脂が、イオン相互作用能力および疎水性相互作用能力をともに有するものと特徴付けられる請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記混合物が約５．０のｐＨで前記混合モード樹脂上に充填される請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記充填された混合モード樹脂が、ステップ（ｉｉ）前に、約７．０〜７．２のｐＨを有する緩衝液で洗浄される請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記緩衝液がビス・トリスである請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＨＩＣ樹脂がフェニル樹脂である請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記フェニル樹脂がフェニルセファロースである請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇが硫酸アンモニウムで前記フェニル樹脂から溶出される請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇが０．３〜０．５Ｍの硫酸アンモニウムで前記フェニル樹脂から溶出される請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記フェニル樹脂の流速が５０〜１５０ｃｍ／時である請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記流速が約１００ｃｍ／時である請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質および凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む混合物から少なくとも９７％の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を除去するための方法であって、以下の：
ｉ）該非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を混合モード樹脂に結合させる条件下で、該混合物を該混合モード樹脂上に充填するステップ、
ｉｉ）溶液でステップｉ）の混合モード樹脂から該非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を溶出して、非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の存在に関して濃化された第一溶出物を得るステップ、
ｉｉｉ）該非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させる条件下で、ステップｉｉ）の第一溶出物を該ＨＩＣ樹脂上に充填するステップ、そして
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を溶液で溶出して、非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の存在に関してさらに濃化された第二溶出物を得るステップ、を包含し、
それにより、少なくとも９７％の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、非凝集化生物学的活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質および凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む該混合物から除去する方法。
【請求項５４】
前記第一溶出物が２５％未満の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第一溶出物が２０％未満の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記第一溶出物が１５％未満の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記第一溶出物が約１０％の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記第二溶出物が２％未満の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記第二溶出物が１％未満の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記混合物を、ステップ（ｉ）前に、組換えプロテインＡ（ｒプロテインＡ）と接触させることをさらに含む請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
組換えプロテインＡと接触させられる前記混合物が哺乳類細胞培養上清である請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記哺乳類細胞培養上清が２８℃で培養された哺乳類細胞から得られる請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞培養上清が非イオン性界面活性剤を含む請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記非イオン性界面活性剤がトリトンＸ−１００である請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む組成物を製造する方法であって、該組成物は１％未満の該ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の第一不活性形態（不活性型−１）、１％未満の該ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の第二不活性形態（不活性型−２）および１％未満の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含み、該方法は以下の：
ｉ）該ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された哺乳類宿主細胞を含む哺乳類細胞培養系から細胞培養上清を得るステップ、
ｉｉ）該細胞培養上清を組換えプロテインＡ（ｒプロテインＡ）と接触させてＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質混合物を得るステップ、
ｉｉｉ）該ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を混合モード樹脂に結合するような条件下で、約５．０のｐＨで、ｉｉ）のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質混合物を該混合モード樹脂上に充填するステップ、
ｉｖ）該混合モード樹脂を、約７．０〜７．２のｐＨを有する緩衝液で洗浄するステップ、
ｖ）ステップｉｉｉ）の混合モード樹脂を溶液と接触させて、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の存在に関して濃化された第一溶出物を得るステップ、
ｖｉ）該ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させる条件下で該ＨＩＣ樹脂上にステップｉｖ）の第一溶出物を充填するステップ、そして
ｖｉｉ）ステップｖｉ）のＨＩＣ樹脂を溶液と接触させて、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の存在に関してさらに濃化された第二溶出物を得る（ここで、該第二溶出物は、１％未満の該第一不活性形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、１％未満の該第二不活性形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および１％未満の凝集化ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む）ステップ、を包含する方法。
【請求項６６】
請求項１４〜６５の方法のいずれか１つにより調製される少なくとも９７％の生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む組成物。
【請求項６７】
被験者における自己免疫障害の治療方法であって、請求項６７に記載の組成物を該被験者に投与することを包含する方法。
【請求項６８】
前記自己免疫障害が多発性硬化症である請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記混合物を、ステップ（ｉ）前に、陰イオン交換膜吸着装置と接触させることをさらに包含する請求項５３〜６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
生物製剤が、認可された治療法としてますます受け入れられていることを考慮すれば、これらの種類の薬剤の詳細な特性評価は重要である。不測の生成物分解または不純物の存在によって、治療的有効性および患者の安全性が脅かされ得る。生物製剤の製造中に見られる不純物の例としては、生成物の凝集体が挙げられ得る。凝集体は免疫原性となる場合があり、インビボ使用の安全性に対する懸念があり得るため、製剤組成物においては望ましくない。凝集体は、患者体内で産生される抗体を中和するため、生成物のインビボでの安定性を低下させる場合もある。
【０００２】
さらに、不活性タンパク質もまた、製造中に生成される場合がある。不活性タンパク質は、製造工程中の誤ったフォールディングに起因し得る。例えば、特許文献１（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら）には、哺乳動物細胞中で発現した場合のリンホトキシンβ受容体免疫グロブリン（ＬＴβＲ−Ｉｇ）融合タンパク質の、活性型および不活性型という２つの型が記載されている。また特許文献１は、Ｉｇ融合タンパク質産生中の細胞培養温度を低下させることにより、調製物中の不活性分子の割合が減少し得ることを教示している。この公開公報には、リガンドと結合する能力のない不活性型のＬＴβＲ−Ｉｇが１種のみ記載されている。
【０００３】
生物製剤の製造において、このような生成物関連の不純物により、精製の困難さが生じ得る。これらの不純物は、目的とする活性型の治療用タンパク質に匹敵する特性をしばしば有するため、多くの場合同定が困難であり得、したがってしばしば検出が困難である。さらに、このような不純物が同定された場合でも、医薬品から不純物を分離することは困難であり得る。したがって、生物製剤の生産および精製工程中に存在し得る生成物関連の不純物同定のためのみならず、不純物が一旦同定されたら、それを除去するための方法も依然必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００３９５８０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、生じる組成物が、大量のタンパク質の製造可能性および純度の両方に関して薬学的使用に適するように、哺乳動物細胞培養、例えばＣＨＯ細胞における生物製剤の発現中に生じる不純物から、抗体ベースの生物製剤、例えばＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を精製する際の問題に取り組む。
【０００６】
本明細書に記載のように、哺乳動物細胞中でのＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質発現では、２種類の不活性型のＬＴ−β−Ｒ−ＩｇおよびＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ凝集体が生じる。患者に使用するために十分な純度を提供するためには、このような不純物を、生物学的に活性なモノマー型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇから分離しなければならない。不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、精製工程において固有の難題を生じさせる。例えば、本明細書に記載されている２種類の不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、例えば、大きさおよび電荷に関して、活性のあるモノマー型の融合タンパク質によく似ている。さらに、（治療剤の製造に求められるように）ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの生産規模が拡大されて生産量が増加すると、高濃度の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇが生じる。したがって、活性のあるモノマー型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、十分な濃度および臨床使用に要求される純度で製造するために、凝集を最小限に抑え、不活性型のタンパク質の存在を最小化し、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の損失を最小限に抑える工程が必要とされていた。本発明は、この複雑な問題に対する解決法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
より具体的には、本発明は、抗体ベースの生物製剤、すなわち、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質の精製中に、複数の生成物関連の不純物を除去することが可能な高分解能の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程を提供する。本発明は、リンホトキシンβ受容体免疫グロブリン（ＬＴβＲ−Ｉｇ）のような活性型のＩｇ融合タンパク質を、不活性型のタンパク質から精製するための手段を提供する。本発明のさらなる態様は、（例えば、哺乳動物細胞中でのタンパク質発現に起因する場合が多い、他のタンパク質、不適切にフォールディングされて完全な生物製剤活性をもたない変異体およびタンパク質凝集体の夾雑が最少量である）精製されたＩｇ融合タンパク質組成物を含む。本発明はさらに、不活性型のタンパク質および／またはタンパク質凝集体のような不純物を３０％を超えて含むタンパク質混合物、例えば哺乳動物細胞培養液由来の出発供給材料（例えば、バイオリアクター中の培養液由来の大量の供給材料）を精製するための手段を提供する。一実施形態において、本発明は、５０％を超える不純物、例えば、約３５％の凝集タンパク質と約１９％の不活性タンパク質とを有する出発タンパク質混合物を精製するための手段を提供する。
【０００８】
本発明は、生物学的に活性なリンホトキシンβ受容体免疫グロブリン（ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ）融合タンパク質を、生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離するための方法を含み、この方法は、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質と生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質とを含む混合物を、ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に充填するステップならびに樹脂を塩勾配、例えば１．６Ｍ〜０．０ＭのＮａＣｌを含む溶液と接触させて、生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第１の溶出物および生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第２の溶出物を得るステップを含む。一実施形態において、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第２の溶出物は、ＨＩＣ樹脂を１．５ＭのＮａＣｌ洗浄液で洗浄することにより得られる。一実施形態において、塩勾配は段階的勾配または連続勾配である。一実施形態において、塩勾配は０．６Ｍ〜０．０ＭのＮａ２ＳＯ４を含む。一実施形態において、塩勾配は０．４〜０．５のＮａ２ＳＯ４の逆勾配であり、段階的勾配およびカラムストリップがこれに続く。一実施形態において、Ｎａ２ＳＯ４の段階的勾配を順次用いて、最初に不活性型−１を（洗浄画分中）、次いで活性のあるモノマー型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを（溶出画分）、次いで不活性型−２を（ストリップ画分）を除去する。一実施形態において、ブチルＨＩＣ樹脂は６００〜７５０Ａの細孔径を有する。一実施形態において、ＨＩＣ樹脂は約８ｇ（タンパク質）／１Ｌ（樹脂）の充填容量を有する。一実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、Ｎａ２ＳＯ４の存在下で約２０ｇ（タンパク質）／１Ｌ（樹脂）の充填容量を有する。一実施形態において、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第２の溶出物は、２％未満の生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第２の溶出物は、１％未満の生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。
【０００９】
本発明は、凝集していない生物学的に活性なリンホトキシン−β受容体免疫グロブリン（ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ）融合タンパク質を、凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離するための方法を提供し、この方法は、生物学的に凝集していない、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第１の溶出物および凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第２の溶出物を得るために、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質と凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質とを含む混合物をフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に充填するステップであって、当該樹脂が約１０〜２０ｇ（タンパク質）／１Ｌ（樹脂）の充填容量および約２９〜３１ｃｍの層高を有するステップと、樹脂を流速約５０〜１５０ｃｍ／ｈｒ（センチメートル／時間）で溶液と接触させるステップとを包含する。一実施形態において、樹脂を流速約１００ｃｍ／ｈｒで溶液と接触させる。一実施形態において、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第１の溶出物は、２％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む第１の溶出物は、１％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。
【００１０】
本発明はまた、生物学的に活性なリンホトキシン−β受容体免疫グロブリン（ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ）融合タンパク質を、生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離するための方法も提供し、前述の方法は、以下のステップ：生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質と生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質とを含む混合物を、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質がブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合できるような条件下で、ブチル樹脂に充填するステップ；ブチルＨＩＣ樹脂を塩勾配、例えば連続塩勾配または段階塩勾配を含む溶液と接触させ、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が豊富に存在する第１の溶出物を得るステップ；ステップｉｉ）の第１の溶出物を、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が第２のＨＩＣ樹脂に結合できるような条件下で、第２のＨＩＣ樹脂に充填するステップ；および第２のＨＩＣ樹脂を溶液に接触させて、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質がさらに豊富に存在する第２の溶出物を得るステップを含み、これにより生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離する。一実施形態において、ブチルＨＩＣ樹脂は、ヒドロキシル化メタクリレートポリマーの主鎖を含む。
【００１１】
一実施形態において、ブチルＨＩＣ樹脂は６００〜７５０Ａの細孔径を有する。一実施形態において、第１の溶出物は、２％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）を含む。一実施形態において、第１の溶出物は、１％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）を含む。一実施形態において、第２の溶出物は、２％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）を含む。一実施形態において、第２の溶出物は、１％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）を含む。
【００１２】
本発明はまた、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、混合モード樹脂を用いて生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離する方法も提供する。一実施形態において、この方法は、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質と生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質との混合物を混合モード樹脂に、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が混合モード樹脂に結合できるような条件下で充填するステップを包含する。この方法はさらに、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、溶液を用いて混合モード樹脂から溶出し、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が豊富に存在する第１の溶出物を得て、次いで第１の溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質がＨＩＣ樹脂に結合できるような条件下で充填するステップ；および溶液を用いて生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を溶出し、最終的に、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質がさらに豊富に存在する第２の溶出物を得るステップを含む。一実施形態において、不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを除去し、凝集型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを一部除去するために使用する予備溶出の洗浄工程に、混合モード樹脂を接触させる。このような方法により、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が、生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離される。
【００１３】
本発明はさらに、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離する方法を提供し、この方法は、一実施形態において混合モード樹脂を使用する。一実施形態において、この方法は、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質と凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質とを含む混合物であって、混合物中の約３０％を超えるまたは約３０％のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が凝集している混合物を、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が混合モード樹脂に結合できるような条件下で、混合モード樹脂に充填するステップ；生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、溶液を用いてステップｉ）の混合モード樹脂から溶出し、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が豊富に存在する第１の溶出物を得るステップ；ステップｉｉ）の第１の溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質がＨＩＣ樹脂に結合できるような条件下で充填するステップ；およびステップｉｉｉ）の生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を溶液を用いて溶出して、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質がさらに豊富に存在する第２の溶出物を得るステップを含む。一実施形態において、不活性型−１ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを除去し、凝集形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを一部除去するために使用する予備溶出の洗浄工程に、混合モード樹脂を接触させる。このような方法を用いて、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が、凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から分離され得る。
【００１４】
一実施形態において、混合モード樹脂は、イオン相互作用能および疎水性相互作用能の両方を有するものと特徴付けられる。別の実施形態において、混合物をｐＨ約５．０で混合モード樹脂に充填する。さらに別の実施形態において、ステップ（ｉ）の前に（最初の溶出工程の前に）、充填された混合モード樹脂を、ｐＨが約７．０〜７．２の緩衝液、例えばビス−トリスまたはクエン酸ナトリウムで洗浄する。
【００１５】
一実施形態において、ＨＩＣ樹脂は、特に限定されないが、フェニルセファロースなどのフェニル樹脂である。一実施形態において、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、硫酸アンモニウムを用いてフェニル樹脂から溶出する。一実施形態において、硫酸アンモニウムの濃度は、０．３１Ｍ、０．３２Ｍ、０．３３Ｍ、０．３４Ｍ、０．３５Ｍ、０．３６Ｍ、０．３７Ｍ、０．３８Ｍ、０．３９Ｍ、０．４Ｍ、０．４１Ｍ、０．４２Ｍ、０．４３Ｍ、０．４４Ｍ、０．４５Ｍ、０．４６Ｍ、０．４７Ｍ、０．４８Ｍおよび０．４９Ｍを含めて、０．３〜０．５Ｍの範囲にある。一実施形態において、流速は５０〜１５０ｃｍ／時である。一実施形態において、流速は１００ｃｍ／時である。別の実施形態において、流速は１３０〜１７０ｃｍ／時である。
【００１６】
本発明は、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質と凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質とを含む混合物から、存在する凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の少なくとも９７％を除去するための方法を含む。一実施形態において、この方法は、混合物を混合モード樹脂に、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が混合モード樹脂に結合できるような条件下で充填するステップ；凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、溶液を用いてステップｉ）の混合モード樹脂から溶出して、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が豊富に存在する第１の溶出物を得るステップ；ステップｉｉ）の第１の溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質がＨＩＣ樹脂に結合できるような条件下で充填するステップ；および凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を溶液を用いて溶出して、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質がさらに豊富に存在する第２の溶出物を得るステップを包含する。このような方法を用いて、凝集していない生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質と凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質とを含む混合物から、少なくとも９７％の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を除去し得る。一実施形態において、第１の溶出物は、２５％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。別の実施形態において、第１の溶出物は、２０％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。さらに別の実施形態において、第１の溶出物は、１５％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。さらに別の実施形態において、第１の溶出物は、約１０％の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、第２の溶出物は、２％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。別の実施形態において、第２の溶出物は、１％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。
【００１７】
本明細書に記載の精製方法は、細胞ベースの製造に起因する不要な型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇまたはその他の不純物を最小化する方法で生産されてきた組成物あるいは精製を促進する薬剤を含む組成物に対して用いてもよい。例えば、本発明の一実施形態において、本発明の方法は、最初に混合物を組換えプロテインＡ（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ）に接触させるステップを含む。一実施形態において、組換えプロテインＡと接触させる混合物は、哺乳動物細胞培養上清である。一実施形態において、哺乳動物細胞培養上清は、２８℃で培養された哺乳動物細胞から採取する。一実施形態において、細胞培養上清は、特に限定されないが、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００１８】
本発明の一実施形態において、本発明の方法は、混合物を、混合モード樹脂に充填する前に陰イオン交換膜吸着装置と接触させるステップを含む。一実施形態において、ウイルス不活性化のステップ（例えば、低ｐＨウイルス不活性化）の後に、混合物を陰イオン交換膜吸着装置と接触させる。一実施形態において、混合物を組換えプロテインＡ（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ）と接触させた後に、混合物を陰イオン交換膜吸着装置と接触させる。
【００１９】
本発明はさらに、生物学的に活性な単量体型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が実質的に豊富な精製組成物を調製するための方法を提供する。一実施形態において、精製組成物は５０％未満の凝集体を含む。一実施形態において、精製組成物は減少した量のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ凝集体を含む。別の実施形態において、精製組成物は４０％未満の凝集体を含む。別の実施形態において、精製組成物は３０％未満の凝集体を含む。別の実施形態において、精製組成物は２０％未満の凝集体を含む。別の実施形態において、精製組成物は１０％未満の凝集体を含む。別の実施形態において、精製組成物は７．５％未満の凝集体を含む。別の実施形態において、精製組成物は５％未満の凝集体を含む。別の実施形態において、精製組成物は３％未満の凝集体を含む。別の実施形態において、精製組成物は２％未満の凝集体を含む。別の実施形態において、精製組成物は１％未満の凝集体を含む。別の実施形態において、精製組成物は検出不可能な量の凝集体を含む。
【００２０】
別の実施形態において、精製組成物は減少した量の不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は２０％未満の不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は１０％未満の不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は７．５％未満の不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は５％未満の不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は４％未満の不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は３％未満の不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は２％未満の不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は１％未満の不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。別の実施形態において、精製組成物は検出不可能な量の不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。
【００２１】
さらに別の実施形態において、精製組成物は６％未満の不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は５％未満の不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。別の実施形態において、精製組成物は４％未満の不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。別の実施形態において、精製組成物は３％未満の不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は２％未満の不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は１％未満の不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。別の実施形態において、精製組成物は検出不可能な量の不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。
【００２２】
別の実施形態において、本発明の精製組成物は、出発組成物中に存在する濃度から減少した濃度の、凝集形態、不活性型−１および／または不活性型−２のうちの１つ以上を含む。例えば、一実施形態において、精製組成物は、７．５％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、７．５％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および７．５％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。例えば、一実施形態において、精製組成物は、５％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、５％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および５％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。例えば、一実施形態において、精製組成物は、３％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、３％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および３％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。例えば、一実施形態において、精製組成物は、２％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、２％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および２％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。例えば、一実施形態において、精製組成物は、１％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、１％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および１％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。
【００２３】
これらの生成物の夾雑濃度は等しくなくてもよく、上記の例は単なる例示に過ぎないことを、当業者は理解する。例えば、一実施形態において、精製組成物は、５％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、１０％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および２０％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は、２％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、５％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および５％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は、２％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、５％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および１０％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は、２％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、５％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および１０％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。一実施形態において、精製組成物は、５％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、５％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および１％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む。
【００２４】
一実施形態において、本発明の方法は、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された哺乳動物宿主細胞を含む哺乳動物細胞培養系から、細胞培養上清を得るステップ；細胞培養上清を組換えプロテインＡ（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ）と接触させて、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質混合物を得るステップ；ｉｉ）のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質混合物を、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が混合モード樹脂に結合するような条件下で、約５．０のｐＨで混合モード樹脂に充填するステップ；混合モード樹脂を、ｐＨが約７．０〜７．２の緩衝液で洗浄するステップ；混合モード樹脂を溶液と接触させて、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が豊富に存在する第１の溶出物を得るステップ；第１の溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質がＨＩＣ樹脂に結合できるような条件下で、充填するステップ；およびステップｖｉ）のＨＩＣ樹脂を溶液と接触させて、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質がさらに豊富に存在する第２の溶出物を得るステップを包含する。一実施形態において、このような方法により、第２の溶出物が、１％未満の第１の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１）、１％未満の第２の不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−２）および１％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む、組成物を得る。
【００２５】
一実施形態において、混合物中のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の濃度は、少なくとも３００ｍｇ／Ｌである。一実施形態において、混合物中のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の濃度は、少なくとも８００ｍｇ／Ｌである。一実施形態において、混合物中のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の濃度は、少なくとも１３５０ｍｇ／Ｌである。
【００２６】
一実施形態において、混合物の体積は少なくとも５０００Ｌである。一実施形態において、混合物の体積は少なくとも１００００Ｌである。一実施形態において、混合物の体積は少なくとも１５０００Ｌである。
【００２７】
本発明は、実質的に凝集体を含まない、生物学的に活性なリンホトキシン−β−受容体免疫グロブリン（ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ）融合タンパク質を含む組成物を含む。一実施形態において、６％未満のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が生物学的に不活性であり、２％未満のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が凝集している。例えば、一実施形態において、５％未満のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が生物学的に不活性である。一実施形態において、３％未満のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が生物学的に不活性である。一実施形態において、１％未満のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が生物学的に不活性である。一実施形態において、０．５％未満のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が生物学的に不活性である。一実施形態において、本発明は、２％未満の凝集したＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む組成物に関する。一実施形態において、１％未満のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が凝集している。一実施形態において、１％未満のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が生物学的に不活性であり、１％未満のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質が凝集している。
【００２８】
一実施形態において、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質は、ＩｇＧ１アイソタイプのＩｇ定常領域を含む。一実施形態において、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質は、配列番号１で記述されるＬＴ−β−Ｒの細胞外ドメインを含む。一実施形態において、本発明の生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質は、単量体である。本発明の生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質は、ＬＴβに結合する能力があり、ＬＴβＲのＬＴβへの結合により誘導される細胞中の生物学的活性を阻止し得る。このことは、一実施形態において、標準的インビトロＩＬ−８阻害アッセイにおいて、ＬＴ−β−Ｒ−ＩｇがＩＬ−８の産生を阻害する能力および／またはＩＬ−８の放出を阻止する能力により測定することができる。例えば、一実施形態において、ＬＴβＲ発現細胞をＬＴα１β２およびＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇに接触させ、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇがこの細胞によるＩＬ−８放出を阻害する能力を（適当な対照、例えば、結合分子が存在しないものと比較して）測定する。
【００２９】
本発明はまた、本発明の組成物と薬学的に許容される担体とを含む製剤組成物を含む。
【００３０】
本発明はさらに、少なくとも９７％の生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む（すなわち、不活性型−１、不活性型−２またはその両方を欠く）組成物を含む。本発明はさらに、単量体ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む（すなわち、実質的に凝集体を欠く）組成物を含む。このような組成物は、本明細書に記載の本発明の方法を用いて生成し得る。
【００３１】
本発明はさらに、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、クローン病または多発性硬化症の治療法であって、それを必要とする被験者に製剤組成物を投与することを含む治療法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】サイクル１−１の工程の概略を示す図である。
【図２】サイクル１−１のＨＩＣ−１ブチル樹脂工程の結果ならびに不活性型−１および不活性型−２のＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質が溶出する条件を示す図である。
【図３】工程中間体のＨＰＬＣを用いた概略を表す図である。
【図４】ブチル−６５０ＭでのＬＴβＲ−Ｉｇ精製（サイクル１−１）の溶出画分中の活性型および不活性型−２の割合をグラフで示した図である。充填および洗浄濃度が１．６５ＭのＮａＣｌでのＬＴβＲ−Ｉｇ精製。カラムには８ｍｇ／ｍＬ樹脂に二重反復充填した。０．７ＭのＮａＣｌで溶出し、溶出画分を順次収集して（棒グラフは画分ごとのデータを示し、累積データではない）、ＬＴβＲ−Ｉｇの各型を測定した。
【図５】サイクル１−２の工程の概略を示す図である。
【図６】サイクル１−２の段階的／勾配洗浄法を表す図である。
【図７】サイクル−１の３つの分離法、すなわちプロテインＡ、ＨＩＣ−１（ブチル）およびＨＩＣ−２（フェニル）後の不純物分離度の向上をまとめた表である。
【図８】充填、層高および流速の影響を含む、ＨＩＣ−２（フェニル）ステップによる凝集体クリアランスを表す図である。図８Ａは、フェニル工程後の凝集ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質および活性ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質の割合に及ぼす充填の影響を表す。図８Ｂは、サイクル２のＨＩＣ（フェニル）工程の展開による活性なＬＴβＲ−Ｉｇ（活性な単量体）の収率に及ぼす、層高および速度の影響を表す。
【図９】サイクル２の工程の概略を示す図である。
【図１０】ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質の模式図である。
【図１１】混合モード樹脂カラムの操作条件を表す図である。
【図１２】サイクル２の第３カラムのクロマトグラフィー条件をグラフで表した図である。
【図１３】１５０００製造における修正されたダウンストリーム工程の主要な性能上の特徴を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書中に記載される本発明が十分に理解され得るために、以下の詳細な説明を記述する。
Ｉ．定義
【００３４】
本明細書中で互換的に用いられる「活性な」または「生物学的に活性な」という用語は、その同族結合パートナーと（例えば、受容体に対するリガンドと）結合し、ＬＴとの細胞関連ＬＴβＲの結合の生物学的作用を遮断し得るタンパク質の形態を指す。生物学的に活性なという定義に含まれないのは、タンパク質に対する生物学的または免疫学的応答である。生物学的活性は、特性化されているタンパク質の型によって決定され得る。例えば、受容体（またはその可溶性形態）であるタンパク質は、それがそのそれぞれのリガンドと結合し得る場合、生物学的に活性であることが示され得る。代替的には、タンパク質は、活性形態のタンパク質に特異的な抗体により結合され得る。別の実施形態では、タンパク質の生物学的作用は、細胞ベースのアッセイを用いて測定され得る。このようなアッセイは、当該技術分野でよく知られている（例えば、ＬＴβＲ活性は、標準ＩＬ−８抑制アッセイを用いて確定され得る）。
【００３５】
「不活性な」または「生物学的に不活性な」という用語は、その同族結合パートナーと結合できない、したがって、系における生物学的応答を修飾できないか、または生物学的応答を生じるには不十分な親和性で結合するタンパク質を指す。例えば、一実施形態では、受容体またはその可溶性形態の場合、不活性形態の受容体はリガンドと結合できず、それにより活性形態の生物学的活性を媒介できない。別の実施形態では、不活性形態の受容体は、例えば低減された親和性でリガンドと結合し得るが、適切な生物学的応答を生じないか、あるいは（可溶性形態での場合）細胞ベースの形態の受容体とそのリガンドとの結合時に伝達される生物学的シグナルを完全には遮断しない。
【００３６】
本明細書中で用いる場合、「活性単量体」という語句は、凝集しておらず、かつジスルフィド結合により連結されるＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの２つの鎖を含む生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を指す。活性単量体の一例は、図１１に提示されている。したがって、単量体は、凝集していない二鎖Ｆｃ融合タンパク質である。
【００３７】
「凝集体」という用語は、誤って折り畳まれた剛性タンパク質群または高分子量材料（タンパク質の多量体を含む）を指す。一実施形態では、凝集体は、Ｆｃ融合タンパク質の２つより多い鎖を含む、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ単量体の多量体形態を指し、例えば二量体またはそれより高次の多量体形態（四量体、八量体形態）を指す。凝集体は、生物学的に活性であるかまたは不活性であり得る。
【００３８】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書中で互換的に用いられ、中性（無電荷）形態でまたは塩として存在し、そしてグリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化により修飾されないかまたは修飾される、種々の長さのアミノ酸配列を指す。ある実施形態では、アミノ酸配列は、全長ネイティブタンパク質である。他の実施形態では、アミノ酸配列は、全長タンパク質より小さい断片である。他の実施形態では、アミノ酸配列は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部ならびに第二の非免疫グロブリン分子の第二の少なくとも一部を含むキメラタンパク質をコードする。一実施形態では、非免疫グロブリン分子は、分子の生物学的に活性な部分、例えばリガンドの受容体結合部分または受容体のリガンド結合部分、例えばＴＮＦ受容体またはその断片を含む。
【００３９】
「融合タンパク質」という用語は、個々のペプチド主鎖を介した共有結合により連結される、最も好ましくは、それらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現により生成される２個もしくはそれより多くのタンパク質またはその断片を含む分子を指す。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンドメインを包含する。
【００４０】
「リンホトキシン−β受容体」または「ＬＴβＲ」という用語は、リンホトキシンαおよびβ鎖の三量体複合体からなる表面リンホトキシン（ＬＴ）（Ｃｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４）ならびにリガンドＬＩＧＨＴ（リンホトキシンと相同であり、誘導性発現を示し、そしてＴリンパ球により発現される受容体であるＨＶＥＭに関して単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄと競合する）と結合する受容体のＴＮＦファミリーの一成員を指す。ＬＴ−β−Ｒは、末梢免疫系の発達に、ならびに成熟免疫系におけるリンパ節および脾臓における事象の調節に関与する（Ｗａｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９９５；Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７；Ｒｅｎｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６；Ｒｅｎｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７；Ｃｈａｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｆｕ，  １９９８）。
【００４１】
一実施形態では、ＬＴβＲ−免疫グロブリン（ＬＴβＲ−Ｉｇ）融合タンパク質は、ＬＴβＲの細胞外ドメインのリガンド結合部分およびＩｇＧ定常領域、例えばＩｇのＦｃ部分を含む。ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質は、濾胞性樹状細胞の機能的状態に関する結果を伴って、表面ＬＴリガンドとＬＴβＲとの間のシグナル伝達を遮断し得る（Ｍａｃｋａｙ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，  １９９８）。この遮断は、さらに、齧歯類モデルにおける自己免疫疾患減少をもたらし得る（Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，米国特許出願第０８／５０５，６０６号（１９９５年７月２１日出願）および米国特許出願第６０／０２９，０６０号（１９９６年１０月２６日出願））。ＬＴβＲの配列は、配列番号１で提示される：
ヒトＬＴβＲ配列（ＰＵＢＭＥＤ  ＡＡＨ２６２６２およびＰ３６９４１）
【化１】
2011514895.tif 000003
一実施形態では、ＬＴ−Ｂ−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質は、ヒトＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの細胞外ドメインの全部またはその断片を包含し得る（例えば、それは、ヒトＬＴ−β−Ｒの残基４０〜２００、３５〜２００、４０〜２１０、３５〜２２０、３２〜２２５または２８〜２２５を包含し得る）。いくつかの実施形態では、ＬＴ−β−Ｒ融合タンパク質は、配列番号１の残基３２〜２２５により表されるようなＬＴ−β−Ｒ分子の細胞外ドメインを包含する。
【００４２】
本発明の方法および組成物に包含され得るＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質の一例は，以下に記述される（配列番号２）：
【化２】
2011514895.tif 000004
（イタリック体のアミノ酸は、シグナル配列を示す。下線を付したアミノ酸は、ＬＴ−β−Ｒの細胞外領域由来の配列を示す。そして太字のアミノ酸は、ＩｇＧ  Ｆｃ配列を示す。ＬＴ−β−Ｒ配列をＩｇＧ−Ｆｃ配列と連結するバリンは人工であり、ＬＴ−β−ＲまたはＩｇＧ−Ｆｃ配列に由来しない。下線を付した配列は、ＬＴ−β−Ｒの細胞外ドメインの実質的部分であり、配列番号１のアミノ酸３２〜２２５に対応する）。一実施形態では、本発明の方法および組成物に用いられるＬＴ−β−Ｒ融合タンパク質は、配列番号２で記述されるアミノ酸配列を包含し、シグナル配列を有さない。
【００４３】
「表面ＬＴリガンド」は、ＬＴβＲと特異的に結合し得る表面ＬＴ複合体またはその誘導体を指す。
【００４４】
「リガンド結合ドメイン」または「リガンド結合部分」という用語は、本明細書中で用いる場合、少なくとも定性的リガンド結合能力、好ましくは対応するネイティブ受容体の生物学的活性を保持するネイティブ受容体（例えば、細胞表面受容体）あるいはその領域または誘導体を指す。
【００４５】
「免疫グロブリン融合タンパク質」という用語は、ポリペプチドの機能的部分（一般的に、細胞表面タンパク質の細胞外ドメインを含む）と、免疫グロブリン定常領域（例えばＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインあるいはその組合せ）の１つ以上の部分との融合物を指す。一実施形態では、ポリペプチドは、受容体のＴＮＦファミリーの一成員である。Ｉｇ分子の部分は、種々の免疫グロブリンアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＭ、ＩｇＡ等のいずれかに由来し得る。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明の方法および組成物に用いられるタンパク質は、免疫グロブリン融合タンパク質である。例えば、融合タンパク質は、受容体、またはそのリガンド結合部分、および二量体化ドメイン、例えばＦｃドメインを含み得る。
【００４７】
遺伝用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別され得る５つの異なるクラスの抗体を含む。全５クラスの抗体は、明らかに、本発明の範囲内であり、以下の考察は一般的に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けられる。
【００４８】
「ＴＮＦファミリーの受容体」という語句は、天然で膜に結合されるにせよ、分泌されるにせよ（オステオプロテゲリンの場合のように）、標準的ＴＮＦファミリーシステイン架橋パターンを有する受容体、あるいはＴＮＦファミリーのリガンドの規定された成員（例えば、Ｂａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）と結合する任意の受容体を指す。他の実施形態において主張される本発明は、本明細書中で考察される方法により得られるＴＮＦファミリー受容体−Ｉｇ融合物に、ならびにそれらを含む薬学的調製物に関する。
【００４９】
「およそ」および「約」という用語は、数の言及に際して本明細書中で用いる場合、一般的には、別記しない限り、当該数のどちらかの方向で（当該数より大きいかまたはそれ未満）１０％の範囲内にある数をふくむか、あるいはそうでなければ、文脈から明らかである（このような数が考え得る値の１００％を超える場合を除く）。
ＩＩ．異なる形態の不活性Ｉｇ融合タンパク質および／または凝集化Ｉｇ融合タンパク質の分離
【００５０】
本発明は、活性形態のタンパク質を、不活性形態から分離することにより、および／または活性形態のタンパク質を凝集体から分離することにより、精製活性形態の免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質、例えばＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質を生成する能力に関する。
【００５１】
哺乳類細胞におけるＩｇ融合タンパク質の発現は多数の形態の不活性Ｉｇ融合タンパク質を生じ得ることが知られていたが、夾雑の程度および融合タンパク質を適切に精製する手段は不明であった。さらに具体的には、ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質がサルｃｏｓ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞において２つの形態で発現される、ということを当該技術分野は教示した。一形態は、高親和性でリガンドを結合することが教示され（「活性」形態）たが、他方（「不活性」形態）はリガンドを結合しないと教示された（ＵＳ  ２００２００３９５８０号）。しかしながら、実際、２つの異なる不活性形態のＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１および不活性型−２）が存在するという認識は従来知られておらず、したがって、調製物中のこれらの不活性形態（不活性型−１および不活性型−２）の両方の存在を最小限にするための分離方法は過去に開発されなかった。例えば、以下の実施例に記載されるように、ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質の哺乳類発現は、活性ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質の混合物を生じ、この混合物は、第一不活性形態のＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質（本明細書中で「不活性型−１」として言及され、これは図３のＨＩＣ−１充填ＨＩＣ−ＨＰＬＣパネル中の主ピーク前の第一肩として観察され得る）、および第二不活性形態のＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質（本明細書中で「不活性型−２」として言及され、これは図３のＨＩＣ−１充填ＨＩＣ−ＨＰＬＣパネル中の主ピーク後の肩として観察され得る）、ならびに凝集化形態のＬＴβＲ−Ｉｇを含む。
【００５２】
本発明は、複数の形態の不活性タンパク質および／またはＩｇ融合タンパク質、ならびにタンパク質凝集体からの、所望の活性単量体形態のＬＴβＲ−Ｉｇ分離に関する。本発明の方法は、異なる型のクロマトグラフィー、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の組合せに依って、混合物から不活性Ｉｇ融合タンパク質（両形態を含む）および／または凝集体Ｉｇ融合タンパク質のパーセンテージを効果的に低減する。
【００５３】
本発明は、生物学的に活性な免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質、不活性なＩｇ融合タンパク質および凝集体を含有する混合物を分離するための方法を提供する。一態様において、分離は、混合モード樹脂を含む第一ステップと、その後のフェニルＨＩＣステップにより達成される。本発明の工程における第一ステップは、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質を混合モード樹脂に結合させる条件下で、混合物を混合モード樹脂と接触させることを包含する。活性Ｉｇ融合タンパク質を結合している混合モード樹脂に伝導性である条件は、不純物結合にも伝導性であり得る、ということに留意すべきである。このようなものとして、洗浄および溶出条件を用いて、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質から不純物を分離し得る。例えば、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの精製のために、混合モード樹脂にタンパク質混合物を充填後、ある前溶出洗浄条件および溶出条件を用いて、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを不活性型１から分離し得る。このような洗浄／溶出条件の例は、以下の実施例で提供される。次に、溶出物が得られるよう、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質が第一混合モード樹脂ステップから溶出される。
【００５４】
精製工程における第二ステップは、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させる条件下で、第一ステップの溶出物をＨＩＣ樹脂と接触させることを包含する。活性Ｉｇ融合タンパク質が次に溶出される。その結果生じる溶液は、両不活性形態のＩｇ融合タンパク質およびタンパク質凝集体から分離された生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質を含有する。好ましい実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、フェニル樹脂、例えばフェニルセファロースである。以下の実施例でさらに詳細に記載されるように、フェニルステップを用いたＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の精製に関しては、生成物（活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質）、凝集体および不活性型−２は、全て、充填時にフェニルカラムと結合するが、しかし適切な洗浄／溶出条件を用いて分離される。溶出条件は、カラム上に優先的に残留する凝集体および不活性型−２を生じ得るが、一方、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ生成物は純形態で溶出する。
【００５５】
活性Ｉｇ融合タンパク質を不活性形態および／または凝集体から分離するための一方法は、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質をブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させる条件下で、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質および生物学的に不活性なＩｇ融合タンパク質を含む混合物を、ブチル樹脂と接触させることを包含する。活性Ｉｇ融合タンパク質を結合しているブチル樹脂に伝導性である条件は、不純物結合にも伝導性であり得る、ということに留意すべきである。このようなものとして、洗浄および溶出条件を用いて、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質から不純物を分離し得る。例えば、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの精製のために、ブチル樹脂にタンパク質混合物を充填後、ある前溶出洗浄条件および溶出条件を用いて、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを不活性型から分離し得る。不活性型−１は、ＮａＣｌ濃度を下げることにより洗い落とされ得る。活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇおよび凝集体は、ＮａＣｌ濃度をさらに下げることにより溶出され得るが、一方、不活性型−２は、水（ＮａＣｌ含有せず）で取り除かれるまで、カラムに結合されたままである。このような洗浄／溶出条件の例は、以下の実施例で提供される。
【００５６】
生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質の溶出後、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質が第二ＨＩＣ樹脂と結合するように、溶出物はその後、第二ＨＩＣ樹脂と接触させられる。生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質の溶出後、その結果生じた溶液は、不活性形態および／または凝集体から分離された生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質を含有する。一実施形態では、ブチルＨＩＣ樹脂は、ヒドロキシル化メタクリレート主鎖を含む。
【００５７】
代替的には、本発明の精製方法は、フェニルＨＩＣステップの組合せを用いて達成され得る。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質に関しては、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ、不活性形態（すなわち、不活性型−１および不活性型−２）ならびに凝集体は各々、フェニル樹脂と結合する。このようなものとして、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、洗浄および溶出緩衝液の適切な組合せを用いて精製され得る。
【００５８】
本発明の重要な一態様は、２つの不活性型のタンパク質ならびにタンパク質凝集体からの生物学的に活性なＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質の精製である。このような不純物は、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の産生、特に哺乳類細胞株における産生に起因するが、本明細書中に記載される精製工程に従って低減され得る。
【００５９】
本発明は、生物学的に活性なＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質、不活性ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質および凝集体を含有する混合物を分離するための方法を提供する。一態様では、分離は、混合モード樹脂を含む第一ステップとその後のフェニルＨＩＣステップにより達成される。当該工程における第一ステップは、生物学的に活性なＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質を混合モード樹脂に結合させる条件下で、混合物を混合モード樹脂と接触させることを包含する。活性Ｉｇ融合タンパク質を結合している混合モード樹脂に伝導性である条件は不純物結合にも伝導性であり得る、ということに留意すべきである。このようなものとして、洗浄および溶出条件を用いて、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質から不純物を分離し得る。生物学的に活性なＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質は、次に、溶離物が得られるよう、第一混合モード樹脂ステップから溶出される。一実施形態では、混合モード樹脂からの溶出物は、有意に低減した量の不活性型−１形態のＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質を有し、すなわち、第一溶出物は、２％未満、１％未満、または０．５％未満の不活性型１形態のＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質を含有する。さらに、凝集体は、クロマトグラフィー条件によって、充填物中の２８％から溶離物中の８％に低減され得る。精製工程における第二ステップは、生物学的に活性なＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質（不純物も含み得る）を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させる条件下で、第一ステップの溶出物をＨＩＣ樹脂と接触させることを包含する。次に、不活性型−２形態のＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質およびタンパク質凝集体がともに有意に低減されるように、活性ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質は溶出される。一実施形態では、ＨＩＣ樹脂からの溶出物は、有意に低減された量の不活性型−２形態のＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質を有し、すなわち、第一溶出物は、２％未満、１％未満、または０．５％未満の不活性型２形態のＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質を含有する。その結果生じる溶液は、不活性型のＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質およびタンパク質凝集体の両方から分離された生物学的に活性なＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質を含有する。好ましい一実施形態では、ＨＩＣ樹脂はフェニル樹脂、例えばフェニルセファロースである。
【００６０】
活性Ｉｇ融合タンパク質を不活性形態および／または凝集体から分離するための別の方法は、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質をブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させる条件下で、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質および生物学的に不活性なＩｇ融合タンパク質を含む混合物を、ブチル樹脂と接触させることを包含する。次に、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質は溶出され、第一溶出物中に収集される。その後、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質が第二ＨＩＣ樹脂と結合するように、溶出物は第二ＨＩＣ樹脂と接触させられる。生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質の溶出後、生じた溶液は、不活性形態および／または凝集体から分離された生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質を含有する。一実施形態では、ブチルＨＩＣ樹脂はヒドロキシル化メタクリレート主鎖を含む。
【００６１】
生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質およびタンパク質凝集体を含む混合物から少なくとも９７％のタンパク質凝集体を除去するための方法も特徴となる。当該方法は、クロマトグラフィー工程の上記の組合せ、例えばＨＩＣフェニルまたは混合モード／ＨＩＣフェニルを基礎にする。一実施形態では、当該方法は、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質をフェニルＨＩＣまたは混合モード樹脂に結合させる条件下で混合物をフェニルＨＩＣ樹脂または混合モード樹脂と接触させて、その後、フェニルＨＩＣまたは混合モード樹脂から生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を溶出して第一溶出物を得ることを包含する。第一溶出物は、低減された量のタンパク質凝集体、例えば２５％未満のタンパク質凝集体、２０％未満のタンパク質凝集体、１５％未満のタンパク質凝集体、または約１０％のタンパク質凝集体を有する。一実施形態では、第一ＨＩＣステップ後、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質をＨＩＣ樹脂に結合させる条件下で、溶出物は第二樹脂、例えばフェニルＨＩＣと接触させられ得る。生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を溶出して、２％未満のタンパク質凝集体、または１％未満のタンパク質凝集体を含有する第二溶出物を得る。この方法は、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質およびタンパク質凝集体を含む最初の混合物から少なくとも９７％のタンパク質凝集体を除去する。
【００６２】
本明細書中に記載される方法の特別な利点は、出発物質の５０％が望ましくない不活性種および凝集体種を含む場合、種々の工程を用いて、生成物、例えばＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質を精製し得る、という点である。一実施形態では、混合モード樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ）ステップは、凝集体を２８％から８％に低減し得るし、サイクル−２フェニルカラムは凝集体を２４％から１．０％未満に低減し得る。
【００６３】
本発明の別の態様は、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む組成物の製造方法である。本明細書中で上記されたように、一例示的実施形態では、組成物は、１％未満の第一不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１タンパク質）、１％未満の第二不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型２タンパク質）および１％未満のタンパク質凝集体を含む。当該方法は、不活性Ｉｇ融合タンパク質およびタンパク質凝集体の除去を提供するクロマトグラフィー工程のある組合せを基礎にする。当該方法は、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された哺乳類宿主細胞を含む哺乳類細胞培養系から細胞培養上清を得ることを包含する。発現後、細胞培養上清は組換えプロテインＡ（ｒプロテインＡ）と接触されて、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質混合物を得る。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合混合物は、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させる条件下で、樹脂と接触される。活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の溶出後、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を第二疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させる条件下で、溶出物はＨＩＣ樹脂と接触される。一実施形態では、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の溶出後、溶出物は、１％未満の第一不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１タンパク質）、１％未満の第二不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型２タンパク質）および１％未満のタンパク質凝集体を含む。一実施形態では、本発明は、１％未満の第一不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型−１タンパク質）、１％未満の第二不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質（不活性型２タンパク質）および１％未満のタンパク質凝集体を含む組成物に関する。
【００６４】
一実施形態では、細胞培養中で発現されるＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質のフェニルベースの精製は、カラムが１Ｍ硫酸アンモニウムで充填され、０．４４Ｍで溶出される段階的溶出を包含する。凝集体および不活性型−２形態のＬＴＢＲ−Ｉｇは、当該生成物より「後に」溶出する。
【００６５】
一実施形態では、細胞培養中で発現されるＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質のブチルベースの精製は、ＮａＣｌ濃度を段階的に下げることにより、カラム充填後、不活性型１ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を洗浄することを包含する。次いで、ブチル溶出のために、ＮａＣｌ濃度はさらに段階的に下げられ、生成物（および凝集物）は溶出するが、しかし不活性型−２は溶出しない。最後に、ＮａＣｌ塩濃度をゼロに下げることにより、不活性型−２がブチルカラムから取り除かれる。
【００６６】
活性型および不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質は、当該技術分野で知られた任意数のパラメーター、例えばＬＴリガンドとの結合によって確定され得る。一実施形態では、結合相互作用の親和性が測定され得る。別の実施形態では、生物学的応答を引き起こすＬＴ−β−Ｒ分子の能力を測定する当該技術分野で既知のインビトロアッセイ、例えばＩＬ−８抑制アッセイを用いて、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、生物学的に不活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質と区別し得る。
【００６７】
例えば、一実施形態では、ＩＬ−８放出アッセイはＩＬ−８の分泌に基づいており、これは、可溶性組換えヒトリンホトキシンα１β２がＡ３７５細胞（ヒト黒色腫細胞株）上の細胞表面リンホトキシンβ受容体と結合した後に観察される。ＩＬ−８放出アッセイは、可溶性リンホトキシンα１β２と結合して、それがリンホトキシンβ受容体と結合しないようにすることにより、このＩＬ−８分泌を遮断する結合分子（例えば、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ）の能力を測定する。培地上清中に分泌されるＩＬ−８は、その後、ＥＬＩＳＡアッセイで測定される。結合分子は適切な濃度に希釈されて、可溶性組換えヒトリンホトキシンα１β２（１７０ｎｇ／ｍl）とともに、室温で１時間、９６ウエル微小滴定プレート中でインキュベートされる。リンホトキシンα１β２の濃度は、最大量のＩＬ−８放出を確定する滴定実験により最適化される。次いで、２００００個のＡ３７５細胞が各ウエルに付加され、３７℃で５％ＣＯ２で１７時間、インキュベートされる。インキュベーション期間の終了時に、プレートは遠心分離されて、上清が採取される。上清は、標準サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイでＩＬ−８濃度に関して試験される。ＩＬ−８濃度は、抗体濃度に対してプロットされ、データの４−パラメーター曲線適合からＩＣ５０が確定される。
【００６８】
一般的に、抑制％が対照参照の７５％〜１３５％である場合、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質は、ＩＬ−８抑制アッセイにおいて活性であるとみなされる。代替的には、活性型および不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質は、一方の型または他方の型に特異的な抗体を用いて確定され得る。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の活性または機能型に特異的な抗体（不活性型を結合できない抗体）の例としては、ＡＧＨ１（ハイブリドーマＡＧ．Ｈ１．５．１；ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１７９６により産生される）およびＢＤＡ８（マウス抗ヒトＬＴ−β−Ｒ  ｍＡｂ  ＢＤＡ８を産生するハイブリドーマ細胞株（ＢＤ．Ａ８．ＡＢ９）は、ブダペスト条約の規定に従って、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ．）に１９９５年１月１２日に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１７９８を割り当てられた）が挙げられ、これらは各々、ＵＳ  ２００２０１９７２５４号、ＵＳ  ２００２００３９５８０号および米国特許第７，００１，５９８号（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。さらに、活性および不活性なタンパク質は、本明細書中に記載されるクロマトグラフィー工程に従って、それらの溶出特性により特徴づけされ得る。例えば、ブチルＨＩＣカラムを用いて、不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質は、１．５５ＭのＮａＣｌの第一洗浄液中に溶出される。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質およびタンパク質凝集体は、溶出緩衝液として０．７ＭのＮａＣｌを用いてカラムから溶出され、そして不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質は、純水の剥離洗浄を用いて溶出される。以下の実施例でさらに詳細に記載されるように、同様の精製は、塩化ナトリウムの代わりに硫酸ナトリウムの段階的勾配を用いて達成され得る。
【００６９】
上記の方法は、大規模製法を用いて実施され得る、ということに留意すべきである。例えば、本明細書中に記載される方法を用いて、少なくとも５０００Ｌ、少なくとも１００００Ｌ、少なくとも１５０００Ｌ、１５０００Ｌまたは１５０００Ｌより多い体積を有する混合物から不純物を効果的に分離し得る。
【００７０】
さらに、あるカラムパラメーターは、タンパク質回収を最大にするよう調整され得る。一実施形態では、当該方法の第二ＨＩＣステップは、２５〜３５センチメートル、２９〜３０ｃｍ、または約３０センチメートルの高さを有するカラムを包含する。
【００７１】
本明細書中に記載される方法を用いて得られる組成物も本発明に包含される、と理解されるべきである。例えば、一実施形態では、本発明は、生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質、例えばＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む組成物を提供し、この場合、Ｉｇ融合タンパク質の１０％未満が生物学的に不活性である。別の実施形態では、５％未満のＩｇ融合タンパク質が生物学的に不活性であり；１％未満のＩｇ融合タンパク質が生物学的に不活性であり；あるいは０．５％未満のＩｇ融合タンパク質が生物学的に不活性である。低減されたレベルの凝集体を含有する組成物、例えば生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質および２％未満のタンパク質凝集体を含む組成物も記載される。
ＩＩＩ．クロマトグラフィー技術
【００７２】
本発明の分離方法は、ポリペプチドの非精製集団（例えば、培養上清または原核生物封入体から単離されるＩｇ融合タンパク質の調製物）で実施され得る。このような培養上清の獲得方法は、ＩＶ節において以下でさらに詳細に記載される。代替的には、本発明の分離方法は、１回または複数回の初期選択ステップまたは精製ステップ後に、例えば不活性型および活性型を含む調製物が親和性マトリックス（例えばプロテインＡ）から溶出された後に、得られるポリペプチド混合物に関して用いられ得る。
【００７３】
好ましい一実施形態では、本明細書中に記載されるクロマトグラフィー工程は、他のタンパク質精製手法により部分的に精製された混合物に適用され得る。「部分的に精製される」という用語は、本明細書中で用いる場合、当該Ｉｇ融合タンパク質が少なくとも５重量％、さらに好ましくは少なくとも１０重量％、最も好ましくは少なくとも４５重量％の濃度で存在するタンパク質調製物を包含する。初期またはその後の精製工程を用いて、例えば免疫グロブリン凝集体、誤って折り畳まれたタンパク質、宿主細胞タンパク質、前のクロマトグラフィー工程からの残留物質（例えば、用いられた場合はプロテインＡ）を除去し得る。したがって、本明細書中に記載される特定のクロマトグラフィー工程の適用は、全体的精製プロトコールの状況においても理解され得る。精製の前または後に用いられ得る精製工程の例としては、以下のものが挙げられる：アフィニティークロマトグラフィー（例えば、孔径が制御されたガラスに共有結合したプロテインＡから構成されるＰＲＯＳＥＰ−Ａ（登録商標）（ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌｔｄ，  Ｕ．Ｋ．）、またはプロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０ＭプロテインＡ（ＴｏｓｏＨａａｓ））。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に関して選択され、プロテインＧはマウスアイソタイプに関して選択される。当該分子がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸｔｍ樹脂が用いられ得る。
【００７４】
本発明の方法に用いられ得るクロマトグラフィーの一例は、混合モードクロマトグラフィーである。好ましい混合モード樹脂は、３０ｍＳ／ｃｍで４５ｍｇのＢＳＡ／培地のｍＬより大きい動的結合能力を有するものであり、マルチモード弱陽イオン交換体である。用いられ得る混合モード樹脂の一例は、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。
【００７５】
用いられ得るクロマトグラフィーの一例は、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはＨＩＣである。「ＨＩＣ」という用語は、本明細書中で用いる場合、カラムとＩｇ融合タンパク質との間に疎水性相互作用を用いて、不活性型のタンパク質およびその他の夾雑物、例えば凝集体を、再折畳み生成物、すなわち生物学的に活性なＩｇ融合タンパク質から分離する疎水性相互作用クロマトグラフィーを指す。
【００７６】
炭化水素スペーサーアームを含むがアフィニティーリガンドを欠くアフィニティーゲル上にタンパク質が保持され得るという観察後に、疎水性相互作用クロマトグラフィーは初めて展開された。ＨＩＣ支持体からの溶出は、溶媒、ｐＨ、イオン強度の変更により、あるいはカオトロピック剤または有機修飾剤、例えばエチレンまたはプロピレングリコールの付加により実行され得る。疎水性相互作用クロマトグラフィーの一般原理についての記載は、例えば米国特許第３，９１７，５２７号に、ならびに米国特許第４，０００，０９８号に見出され得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の状況におけるＨＩＣは、単一段階プロトコールにおいて、重鎖部分を欠く抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）を無傷抗体分子から分離するために用いられてきた（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈ．  ２４：  １０７  （１９９２））。
【００７７】
イオン交換クロマトグラフィーも、本発明の方法に用いられ得る。これに関しては、クロマトグラフィーのための陰イオン性または陽イオン性支持体を形成するために、種々の陰イオン性または陽イオン性置換基がマトリックスに結合され得る。陰イオン交換置換基としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）および第四級アミン（Ｑ）基が挙げられる。陽イオン交換置換基としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）が挙げられる。セルロースイオン交換樹脂、例えばＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２およびＣＭ−５２は、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．  Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，  Ｋｅｎｔ，  Ｕ．Ｋ．から入手可能である。セファデックス（登録商標）ベースのイオン交換体および低架橋イオン交換体も既知である。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−およびＳＰ−セファデックス（登録商標）、ならびにＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−およびＳ−セファロース（登録商標）、ならびにセファロース（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗは、全て、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢから入手可能である。さらに、ＤＥＡＥおよびＣＭ誘導体化エチレングリコール−メタクリレートコポリマー、例えばＴＯＹＯＰＥＡＲＬ、ＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０ＳまたはＭはともに、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａから入手可能である。
【００７８】
疎水性相互作用は高イオン強度で最強であり、したがって、この型の分離は、塩析またはイオン交換手法に従って都合よく実施される。ＨＩＣカラムへのタンパク質の吸着は高い塩濃度により促進されるが、しかし実際の濃度は、タンパク質の性質ならびに選択される特定のＨＩＣリガンドによって広範囲に亘って変わり得る。種々のイオンは、それらが疎水性相互作用を促進する（塩析作用）か、または水の構造を崩壊（カオトロピック作用）して疎水性相互作用を弱めるか否かによっていわゆるソルボホビック（ｓｏｌｕｐｈｏｂｉｃ）シリーズに配置され得る。陽イオンは、Ｂａ＋＋＜；Ｃａ＋＋＜；Ｍｇ＋＋＜；Ｌｉ＋＜；Ｃｓ＋＜；Ｎａ＋＜；Ｋ＋＜；Ｒｂ＋＜；ＮＨ４＋のような塩析作用の漸増に関して等級付けされるが、一方、陰イオンは、ＰＯ−−−＜；ＳＯ４−−＜；ＣＨ３ＣＯＯＯ−＜；Ｃｌ−＜；Ｂｒ−＜；ＮＯ３−＜；ＣｌＯ４−＜；Ｉ−＜；ＳＣＮ−のようなカオトロピック作用の漸増に関して等級付けされ得る。ＨＩＣクロマトグラフィーは、結合および溶出モードで用いられ得る。代替的には、ＨＩＣはフロースルーモードで用いられ得る。
【００７９】
概して、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４の硫酸塩は、ＨＩＣにおけるリガンド−タンパク質相互作用を効果的に促進する。以下の関係により示されるような、相互作用の強度に影響を及ぼす塩が処方され得る：（ＮＨ４）２ＳＯ４＞；Ｎａ２ＳＯ４＞；ＮａＣｌ＞；ＮＨ４Ｃｌ＞；ＮａＢｒ＞；ＮａＳＣＮ。概して、約０．７５〜約２Ｍの硫酸アンモニウムの塩濃度または約１〜約４ＭのＮａＣｌの塩濃度が有用である。一実施形態では、０．３〜０．６ＭのＮａ２ＳＯ４が、ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質をＨＩＣに結合するために用いられる。ＨＩＣからのＮ．Ｂ溶出は、ここで記述されるものより低い塩濃度、例えば０．３Ｍ未満のＮａ２ＳＯ４でも達成され得る。一実施形態では、タンパク質生成物を溶出するために０．０〜０．５Ｍの硫酸アンモニウム、例えば０．３〜０．５Ｍの硫酸アンモニウム（これらに限定されない）が用いられる。
【００８０】
付加的精製プロトコール、例えば以下の：さらなるイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ウイルス不活性化、濃縮および凍結乾燥、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（商標）上でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＰＥＧ沈降、または硫酸アンモニウム沈降が付加され得るが、必ずしもこれらに限定されない。
【００８１】
本発明の実施形態に見出される付加的精製工程としては、陰イオン交換膜濾過（例えば、Ｑ膜吸着装置によるタンパク質調製物の精製）が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｑ膜吸着装置によるタンパク質精製は、６．２より高いｐＨで、高導電性の溶液中で実施される。本明細書中で用いる場合、「高導電性」は、約５０ｍＳ／ｃｍまたはそれより高い導電性を指す。
【００８２】
多数のクロマトグラフィー支持体はカラムの調製に用いられ得、最も広範に用いられるのは、アガロース樹脂、シリカ樹脂および有機ポリマー樹脂またはコポリマー樹脂である。疎水性相互薬剤は、一般的には、疎水性リガンド（例えば、アルキルまたはアリール基）が結合する塩基マトリックス（例えば、親水性炭水化物（例えば、架橋アガロース）または合成コポリマー材料）である。一実施形態では、ＨＩＣ物質は、フェニル基で置換されたアガロース樹脂を含む。ＨＩＣ物質の例としては、以下のものが挙げられる：フェニルセファロース（商標）、低または高置換を伴うＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＡＢ，  Ｓｗｅｄｅｎ）；フェニルセファロース（商標）高速カラム；フェニルまたはブチル−セファロース（登録商標）  ＣＬ−４Ｂ、ブチル−セファロース（登録商標）ＦＦ、オクチル−セファロース（登録商標）ＦＦおよびフェニル−セファロース（登録商標）ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＡＢ，  Ｓｗｅｄｅｎ）；フラクトゲル（商標）ＥＭＤプロピルまたはフラクトゲル（商標）ＥＭＣフェニルカラム（Ｅ．  Ｍｅｒｃｋ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）；マクロプレプ（商標）メチルまたはマクロプレプ（商標）ｔ−ブチル支持体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＷＰ  ＨＩ−プロピル（Ｃ３）（商標）カラム（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）。
【００８３】
代表的なＨＩＣ物質は、トヨパール  エーテル６５０、フェニル６５０、ブチル６５０（ＥＭＤ  Ｍｅｒｃｋ）、ブチル６００（ＥＭＤ  Ｍｅｒｃｋ）、エーテル−５ＰＷ−ＨＲまたはフェニル−５ＰＷ−ＨＲの製品名で東ソー株式会社（日本、東京）から；アルキル−アガロース（ここで、アルキル基は２〜１０個の炭素原子を含有する）の製品名でＭｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ，  Ｒｅｈｏｖｏｔ，  Ｉｓｒａｅｌから；ベイカーボンドＷＰ−ＨＩ−プロピルの製品名でＪ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，  Ｎ．Ｊ．からも入手可能である。慣用的化学を用いて、所望のＨＩＣカラムを調製することも可能である（例えば、Ｅｒ−ｅｌ．  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ４９：  ３８３  （１９７２）またはＵｌｂｒｉｃｈ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ  Ｃｏｌｌ．  Ｃｚｅｃｈ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｍ．  ９：  １４６６  （１９６４）参照）。
【００８４】
特定のゲルの選択は、当業者により確定され得る。概して、タンパク質とリガンドとの相互作用の強さは、アルキルリガンドの鎖長に伴って増大するが、しかし約４〜８個の炭素原子を有するリガンドはほとんどの分離に適している。フェニル基はペンチル基とほぼ同じ疎水性を有するが、しかし選択性は、タンパク質上の芳香族基とのパイ−パイ軌道相互作用の可能性のために異なり得る。選択性も、支持樹脂の化学的性質によっても影響を及ぼされ得る。
【００８５】
リガンド密度は、それが相互作用の強度および特異性だけでなく、カラムの容量にも同様に影響を及ぼす点で、重要なパラメーターである。市販のフェニルまたはオクチルフェニルゲルのリガンド密度は、４０ｐモル／ゲル床のｍlのオーダーである。ゲル容量は、当該特定タンパク質、ならびにｐＨ、温度および塩型の関数であるが、しかし一般的には、濃度は３〜２０ｍｇ／ゲルのｍlの範囲であると予期され得る。
【００８６】
概して、温度が下がると、クロマトグラフィー物質との相互作用は低減する。しかしながら、温度を上げることにより生じる任意の利益はまた、上昇がタンパク質の安定性に及ぼし得るような悪作用に対しても影響力を有するはずである。
【００８７】
一実施形態では、Ｉｇ融合タンパク質は、アイソクラチカルに溶出され得る。アイソクラチック溶出では、化合物は全て、開始時にカラムを通して移動し始める。しかしながら、各々が異なる速度で移動して、速い溶出速度や遅い溶出速度を生じる。
【００８８】
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、カラムと結合され得、例えば段階的溶出または勾配溶出を用いて溶出され得る。溶出は、段階的であれ、勾配形態であれ、以下のような種々の方法で成し遂げられ得る：（ａ）塩濃度を変えることによる、（ｂ）溶媒の極性を変えることによる、あるいは（ｃ）界面活性剤を付加することによる。塩濃度を低減することにより、吸着タンパク質は、疎水性が低いものから順に溶出される。極性の変化は、溶媒、例えばエチレングリコールもしくはプロピレングリコールまたは（イソ）プロパノールの付加によって、疎水性相互作用の強度を低減することにより、影響され得る。界面活性剤は、タンパク質の置換剤として機能し得、かつ膜タンパク質の精製と関連して主に用いられ得る。
【００８９】
分離を実施するに際して、ポリペプチド混合物は、例えば、バッチ精製技法を用いて、またはカラムを用いて、クロマトグラフィー物質と接触させられ得る。精製前に、例えば、混合物を予備カラムに通すことにより、任意のカオトロピック剤または極疎水性の物質を除去することが望ましくあり得る。
【００９０】
例えば、バッチ精製のために、クロマトグラフィー物質は、所望の出発緩衝液中で調製されるか、または平衡化される。物質のスラリーが得られる。ポリペプチド溶液はスラリーと接触させられて、クロマトグラフィー物質に、分離されるべきポリペプチドの少なくとも１つが吸着される。クロマトグラフィー物質と結合しないポリペプチドを含有する溶液は、例えば、スラリーを固めさせ、上清を除去することにより、スラリーから分離される。スラリーは、１回または複数回の洗浄ステップに付され得る。所望により、スラリーは、より低い導電性の溶液と接触させられて、ＨＩＣ物質と結合しているポリペプチドを脱着し得る。結合ポリペプチドを溶出するために、塩濃度は低減させられ得る。
【００９１】
一実施形態では、クロマトグラフィー物質は、カラム中に詰め込まれ得る。分離されるべきポリペプチドを含む混合物はカラムに適用され得、分離されるべきポリペプチドのうちの少なくとも１つはカラムに吸着させられ得る。カラムに吸着しないポリペプチドは、通過して、収集され得る。結合ポリペプチドを溶出するために、例えば、段階的に、または塩勾配（例えば連続的もしくは段階的塩勾配）を用いて、塩濃度が低減され得、そして示差脱着により結合物質の分離を達成し得る。
【００９２】
不活性型のＩｇ融合タンパク質および／またはタンパク質凝集体を分離するのに有効であると確認されている具体的なクロマトグラフィー組合せは、本明細書中でさらに説明される。
ＩＶ．Ｉｇ融合タンパク質の発現
【００９３】
本発明の方法は、当該技術分野で知られた技法、例えば細胞培養技法を用いて最初に成されるＩｇ融合タンパク質の混合物を精製するために用いられる。
【００９４】
要するに、Ｉｇ融合タンパク質をコードする核酸は、典型的には、用いられ得る宿主細胞中への導入のために発現ベクター中に挿入されて、所望量のポリペプチドを生じ、これは順次、本明細書中に記載される方法に従う精製のためにＩｇ融合タンパク質を提供する。
【００９５】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、細胞中に所望の遺伝子を導入し、発現するためのビヒクルとして本発明に従って用いられるベクターを意味し、本明細書および特許請求の範囲の目的のために、本明細書中で用いられる。当業者に既知であるように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から容易に選択され得る。概して、本発明と適合性のベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを促す適切な制限部位、ならびに真核生物細胞中または原核生物細胞中に進入しおよび／またはその中で複製する能力を有する。
【００９６】
本発明の目的のために、多数の発現ベクター系が用いられ得る。例えば、一クラスのベクターは、動物ウイルス、例えば牛パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスから得られるＤＮＡエレメントを利用する。他のものは、内部リボソーム結合部位を有する多シストロン系の使用を包含する。付加的には、染色体中にＤＮＡを組込んでいる細胞は、トランスフェクト化宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば抗生物質）、または重金属、例えば銅に対する耐性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列と直接的に連結され得るか、あるいは同時形質転換により同一細胞中に導入され得る。付加的エレメントも、ｍＲＮＡの最適合成のために必要とされ得る。これらのエレメントとしては、シグナル配列、スプライス配列、ならびに転写プロモーター、エンハンサーおよび終結シグナルが挙げられ得る。特に好ましい実施形態では、クローン化可変領域遺伝子が、上記のように合成の（好ましくはヒト）重鎖および軽鎖定常領域遺伝子とともに、発現ベクター中に挿入される。好ましくは、これは、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれるＩＤＥＣ，  Ｉｎｃ．の独占的な発現ベクター（米国特許第６，１５９，７３０号）を用いて実行される。このベクターは、サイトメガロウイルス・プロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ・エキソン１およびエキソン２、ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子およびリーダー配列を含有する。ベクター系は、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）においても教示されている。この系は、高発現レベル、例えば３０ｐｇ超／細胞／日を提供する。他の代表的なベクター系は、例えば米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【００９７】
他の好ましい実施形態では、Ｉｇ融合タンパク質は、同時係属中の米国特許仮出願第６０／３３１，４８１号（２００１年１１月１６日出願）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に開示されたものと同様の多シストロン構築物を用いて、発現され得る。これらの新規の発現系において、当該する複数の遺伝子産物、例えば抗体の重鎖および軽鎖が、単一多シストロン構築物から産生され得る。これらの系は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を用いて、真核生物宿主細胞中に相対的に高レベルの本発明のポリペプチドを提供することが有益である。匹敵するＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号（この記載内容もまた参照により本明細書中で援用される）に開示されている。本出願中に開示される全範囲のポリペプチドを効果的に産生するためにこのような発現系が用いられ得る、と当業者は理解する。
【００９８】
さらに一般的には、Ｉｇ融合タンパク質をコードするベクターまたはＤＮＡ配列が一旦調製されれば、発現ベクターは適切な宿主細胞中に導入され得る。すなわち、宿主細胞は形質転換され得る。宿主細胞中へのプラスミドの導入は、当業者によく知られた種々の技法により成し遂げられ得る。これらの例としては、トランスフェクション（例えば、電気泳動および電気穿孔）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡによる細胞融合、マイクロインジェクション、ならびに無傷ウイルスによる感染が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，  Ａ．Ａ．Ｇ．  “Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，  ｐｐ．４７０−４７２  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，  Ｅｄｓ．  （Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  Ｍａｓｓ．  １９８８）を参照されたい。最も好ましくは、宿主中へのプラスミド導入は、電気穿孔による。形質転換細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適した条件下で増殖させられ、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成に関してアッセイされる。アッセイ技法の例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学等が挙げられる。
【００９９】
本明細書中で用いる場合、「形質転換」という用語は、遺伝子型を変えて、その結果、レシピエント細胞に変化を生じる、レシピエント宿主細胞中へのＤＮＡの任意の導入を指すために広義で用いられる。
【０１００】
同様に、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、かつ少なくとも１つの非相同遺伝子をコードするベクターで形質転換された細胞を指す。組換え宿主からの抗体の単離のための工程の記載に際して、「細胞」および「細胞培養」という用語は、それが明らかに別記されない限り、抗体の供給源を意味するために互換的に用いられる。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心沈殿全細胞から、または培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養からを意味し得る。
【０１０１】
タンパク質発現のために用いられる宿主細胞株は、最も好ましくは、哺乳類起源のものである；その中で発現されるべき所望の遺伝子産物に最も適している特定の宿主細胞株を選択的に確定する能力を、当業者は有している。宿主細胞株の例としては、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター繊維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス繊維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞株は、典型的には、業者であるアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から、または刊行された文献から入手可能である。
【０１０２】
インビトロ産生は、多量の所望のポリペプチドを生じるよう増大し得る。組織培養条件下での哺乳類細胞培養のための技法は当該技術分野で知られており、例えばエアリフト型反応器中または連続撹拌反応器中での均質懸濁培養、あるいは例えば中空繊維中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上、またはセラミックカートリッジ上での固定化または封入細胞培養を包含する。
【０１０３】
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、非哺乳類細胞、例えば細菌または酵母または植物細胞でも発現され得る。この点で、種々の非哺乳類の単細胞性微生物、例えば細菌も形質転換され得る；すなわち、それらは培地でまたは発酵しながら増殖し得る、と理解される。形質転換に感受性である細菌としては、腸内細菌科、例えば大腸菌またはサルモネラの系統；バシラス科、例えば枯草菌；肺炎球菌属；連鎖球菌属およびインフルエンザ菌の成員が挙げられる。さらに、細菌中で発現される場合、ポリペプチドは、典型的には、封入体の一部になる、と理解される。ポリペプチドは、単離され、精製され、次いで機能性分子に集合されなければならない。
【０１０４】
原核生物のほかに、真核生物微生物も用いられ得る。出芽酵母、または一般的パン酵母は、真核生物微生物の中でも最も一般的に用いられるが、しかし、多数の他の系統も一般的に利用可能である。酵母菌属における発現に関しては、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８２：  ３９  （１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ７：  １４１  （１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １０：  １５７  （１９８０））が一般に用いられる。このプラスミドは、ＴＲＰ１遺伝子をすでに含有し、この遺伝子は、トリプトファン存在下で増殖する能力を欠く変異系統の酵母（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ８５：  １２  （１９７７））に対する選択マーカーを提供する。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ損傷の存在は、この場合、トリプトファンの非存在下での増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【０１０５】
一実施形態では、本発明のＩｇ融合タンパク質は、低培養温度、すなわち慣用的な３７℃より下の温度、または２８℃〜３２℃の温度で、哺乳類細胞培養を用いて発現される。Ｉｇ融合タンパク質、特にＴＮＦ受容体−Ｉｇ融合タンパク質の低温培養は、不活性融合タンパク質の全体的パーセンテージを低減する。
【０１０６】
低温でのＩｇ融合タンパク質の培養方法は、ＵＳ  ２００２００３９５８０号（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ等）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【０１０７】
一実施形態では、本発明の方法を用いる精製のための出発物質は、組換えＩｇ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞からの上清である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞は、約２８℃〜３２℃の温度で培養される。一実施形態では、精製のための出発物質は、約２０〜４０％の凝集物質を含む。一実施形態では、精製のための出発物質は、約３０％の凝集物質を含む。一実施形態では、出発物質は、約５０％、または５０％より多い凝集物質を含む。
【０１０８】
本発明の方法を用いる精製の前に、分離されるべきポリペプチドの混合物を含む組成物は、好ましくは、酸性またはほぼ中性のｐＨを有する緩衝液中に入れられる。これは、例えば、濃縮した緩衝液を付加し、試料を緩衝液中に懸濁し、（例えば、透析または限外濾過を用いて）緩衝液を交換することにより、実行され得る。代替的には、試料緩衝液のｐＨは、所望の範囲内であるよう簡単に調整され得る。
Ｖ．免疫グロブリン融合タンパク質
【０１０９】
本明細書中に記載される方法は、例えば多重ジスルフィド架橋のため、不適切なフォールディングをおそらくは有すると思われるＩｇ融合タンパク質に関して有用である。このようなタンパク質は、おそらくは不完全なまたは異常なフォールディングを有し、その結果、サイズおよび特質が活性タンパク質に非常によく似ているにもかかわらず、不活性で治療的使用に望ましくない異なる形態の不活性タンパク質を生じる。
【０１１０】
一態様では、本発明の方法を用いて、複雑なフォールディングを有する融合タンパク質、例えば、ジスルフィド結合を形成する多数のシステイン残基を有するタンパク質を精製し得る。
【０１１１】
一実施形態では、Ｉｇ融合タンパク質は、リガンドまたは受容体の結合ドメイン（例えば、受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ））（単数または複数）が、少なくとも１つの重鎖ドメインおよび連結ペプチド（単数または複数）と結合している。一実施形態では、本発明の融合タンパク質を調製する場合、リガンドの結合ドメインまたは受容体ドメインをコードする核酸は、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸と、Ｃ末端で融合される。Ｎ末端融合もあり得る。一実施形態では、融合タンパク質は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端となされ得、あるいは重鎖のＣＨ１または軽鎖の対応する領域のＮ末端と直接なされ得る。
【０１１２】
一実施形態では、リガンドまたは受容体結合ドメインの配列は、免疫グロブリン分子のＦｃドメインのＮ末端に融合される。全重鎖定常領域をリガンドまたは受容体結合ドメイン配列と融合することも可能である。一実施形態では、パパイン切断部位（すなわち残基２１６、重鎖定常領域の最初の残基を１１４であるとみなす）のすぐ上流のヒンジ領域で開始する配列（化学的にＩｇＧ  Ｆｃと定義する）または他の免疫グロブリンの類似の部位が、融合に用いられる。融合が成される正確な部位は重要ではない；特定部位はよく知られており、分子の生物学的活性、分泌または結合特質を最適化するために、選択され得る。融合タンパク質の製造方法は、当該技術分野で知られている。一実施形態では、結合ドメインを含有するタンパク質は、例えば１〜５アミノ酸長であるアミノ酸リンカーを介してＦｃドメインに連結される。一実施形態では、ＴＮＦ受容体およびＦｃドメインは、単一アミノ酸を介して連結される。
【０１１３】
好ましい一実施形態では、本明細書中に記載される精製方法は、ＴＮＦ受容体Ｉｇ融合タンパク質を分離するために用いられ得る。他の実施形態において特許請求される本発明は、本明細書中で考察される方法により得られるＴＮＦファミリー受容体−Ｉｇ融合タンパク質、ならびにそれらを含む薬学的調製物に関する。ＴＮＦ受容体の一例は、ＬＴβＲである。他の例としては、ＨＶＥＭが挙げられる。
【０１１４】
一態様では、本発明の方法は、ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質の精製組成物を達成する。
【０１１５】
一実施形態では、ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質は、ヒトＬＴβＲの細胞外ドメイン（膜貫通ドメインを欠く形態）および免疫グロブリンＦｃ領域（ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン）を含む。配列番号１は、細胞外ドメインを含めたヒトＬＴβＲの全長配列を記載する。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合物のスキームは、図１０で提供される。
【０１１６】
他の融合タンパク質も、本発明に含まれる。文献で報告された融合タンパク質の例としては、Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：  ２９３６−２９４０  （１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：  ５２５−５３１  （１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：  ６８−７０  （１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ＵＳＡ  ９：  ３４７−３５３  （１９９０）；およびＢｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：  ６６７−６７０  （１９９０））；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１０：  ２２２１−２２２９  （１９９０）；およびＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：  １６４−１６７  （１９９１））；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ６１：  １３０３−１３１３  （１９９０））；ＣＤ２８およびＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３：  ７２１−７３０  （１９９１））；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉsｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７４：  ５６１−５６９  （１９９１））；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ６６：  １１３３−１１４４  （１９９１））；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：  １０５３５−１０５３９  （１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７：  ２８８３−２８８６  （１９９１）；およびＰｅｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７４：  １４８３−１４８９  （１９９１））；ならびにＩｇＥ受容体ａ（Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．１１５，  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１４４８  （１９９１））の融合物が挙げられる。
【０１１７】
本発明の融合タンパク質に含まれうるリガンドおよびそれらの受容体のさらなる例としては、以下のものが挙げられる。
サイトカインおよびサイトカイン受容体
【０１１８】
サイトカインは、リンパ球の増殖、分化および機能的活性化に及ぼす多面的作用を有する。種々のサイトカインまたはそれらの受容体結合部分は、本発明の融合タンパク質で利用され得る。サイトカインの例としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＩＬ−１８）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および単球マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ））、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよびβ、ならびにインターフェロン、例えばインターフェロン−α、βまたはγが挙げられる（米国特許第４，９２５，７９３号および第４，９２９，５５４号）。サイトカイン受容体は、典型的には、リガンド特異的α鎖および共通β鎖からなる。サイトカイン受容体の例としては、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３（米国特許第５，６３９，６０５号）、ＩＬ−４（米国特許第５，５９９，９０５号）、ＩＬ−５（米国特許第５，４５３，４９１号）、ＩＦＮγ（ＥＰ０２４０９７５）およびＴＮＦファミリーの受容体（例えば、ＴＮＦα（例えばＴＮＦＲ−１（ＥＰ４１７，５６３）、ＴＮＦＲ−２（ＥＰ４１７，０１４）リンホトキシンβ受容体）に関するものが挙げられる。
接着タンパク質
【０１１９】
接着分子は、細胞を互いに相互作用させる膜結合タンパク質である。その受容体結合部分の、白血球ホーミング受容体および細胞接着分子を含めた種々の接着タンパク質は、本発明の融合タンパク質中に組み入れられ得る。白血球ホーミング受容体は、炎症中に白血球細胞表面上で発現され、ならびに、細胞外マトリックス構成成分との結合を媒介するβ−１インテグリン（例えば、ＶＬＡ−１、２、３、４、５および６）および血管内皮上の細胞接着分子（ＣＡＭ）を結合するβ２−インテグリン（例えば、ＬＦＡ−１、ＬＰＡＭ−１、ＣＲ３およびＣＲ４）を包含する。代表的なＣＡＭとしては、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１およびＭＡｄＣＡＭ−１が挙げられる。他のＣＡＭとしては、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチンおよびＰ−セレクチンを含めたセレクチンファミリーのものが挙げられる。
ケモカイン
【０１２０】
感染の部位に向かう白血球の移動を刺激する走化性タンパク質であるケモカインも、本発明の融合タンパク質に組み入れられ得る。ケモカインの例としては、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−αおよびＭＩＰ−１−β）、好中球走化性因子、ならびにＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ（正常Ｔ細胞発現および分泌の活性化制御タンパク質））が挙げられる。
増殖因子および増殖因子受容体
【０１２１】
増殖因子またはそれらの受容体（またはその受容体結合またはリガンド結合部分）は、本発明の融合タンパク質中に組み入れられ得る。増殖因子の例としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびそのアイソフォーム（米国特許第５，１９４，５９６号）；繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）；肝臓増殖因子（ＨＧＦ；米国特許第５，２２７，１５８号および第６，０９９，８４１号）、神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、あるいは神経増殖因子、例えばＮＧＦ−β血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（米国特許第４，８８９，９１９号、第４，８４５，０７５号、第５，９１０，５７４号および第５，８７７，０１６号）；形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β（ＷＯ  ９０／１４３５９）、骨誘導因子、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ；米国特許第６，４０３，７６４号および第６，５０６，８７４号）；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポイエチン（ｃ−Ｍｐｌリガンド）およびＷｎｔポリペプチド（米国特許第６，１５９，４６２号）が挙げられる。本発明のターゲッティング受容体ドメインとして用いられ得る増殖因子受容体の例としては、ＥＧＦ受容体；ＶＥＧＦ受容体（例えばＦlｔ１またはＦlｋ１／ＫＤＲ）；ＰＤＧＦ受容体（ＷＯ  ９０／１４４２５）；ＨＧＦ受容体（米国特許第５，６４８，２７３号および第５，６８６，２９２号）および神経栄養因子受容体、例えばＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３を結合する低親和性受容体（ＬＮＧＦＲ）（ｐ７５ＮＴＲまたはｐ７５とも呼ばれる）および受容体チロシンキナーゼのｔｒｋファミリーの成員（例えば、ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ（ＥＰ４５５，４６０）、ｔｒｋＣ（ＥＰ５２２，５３０））である高親和性受容体が挙げられる。
ホルモン
【０１２２】
本発明の融合タンパク質に用いるための成長ホルモンの例としては、レニン、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ；米国特許第５，８３４，５９８号）、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；サイロキシン；プロインスリンおよびインスリン（米国特許第５，１５７，０２１号および同第６，５７６，６０８号）；濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、カルシトニン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、レプチン、グルカゴン；ボンベシン；ソマトロピン；ミュラー管抑制物質；リラキシンおよびプロリラキシン；ゴナドトロピン関連ペプチド；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；ＯＢタンパク質；またはミュラー管抑制物質が挙げられる。
凝固因子
【０１２３】
本発明の融合タンパク質に用いるための血液凝固因子の例としては、凝固因子（例えば、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子）；組織因子（米国特許第５，３４６，９９１号、第５，３４９，９９１号、第５，７２６，１４７号および第６，５９６，８４号）；トロンビンおよびプロトロンビン；フィブリンおよびフィブリノーゲン；プラスミンおよびプラスミノーゲン；プラスミノーゲン活性剤、例えばウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性剤（ｔ−ＰＡ）が挙げられる。
【０１２４】
他の代表的な融合タンパク質は、例えばＷＯ００６９９１３Ａ１およびＷＯ００４０６１５Ａ２に教示されている。本発明の融合タンパク質に包含され得る別の代表的な分子は、ＩＧＳＦ９である。
【０１２５】
融合タンパク質は、当該技術分野でよく知られている方法を用いて調製され得る（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号および第５，２２５，５３８号参照）。普通は、リガンドまたはリガンド結合パートナーは、重鎖（または重鎖部分）の定常領域のＮ末端に、Ｃ末端が融合され、可変領域と置き換わる。リガンド結合受容体の任意の膜貫通領域あるいは脂質またはリン脂質アンカー認識配列は、好ましくは、融合前に不活性化されるかまたは欠失される。リガンドまたはリガンド結合パートナーをコードするＤＮＡは、所望のＯＲＦセグメントをコードするＤＮＡの５’末端および３’末端でまたはその近位で制限酵素により切断される。その結果生じるＤＮＡ断片は、次に、重鎖定常領域をコードするＤＮＡ中に容易に挿入される。融合が成される正確な部位は、可溶性融合タンパク質の分泌または結合特質を最適化するよう経験的に選択され得る。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、次いで、発現のために宿主細胞中にトランスフェクトされる。
ＶＩ．製剤組成物
【０１２６】
不活性および／またはタンパク質凝集体は、療法において被験者に投与される場合、有害作用を有し得るので、本発明の方法および組成物は、製剤処方物に用いるためのＩｇ融合タンパク質の精製のために特に十分に適している。例えば、不活性型の融合タンパク質およびタンパク質凝集体は、Ｉｇ融合タンパク質の効能の損失または免疫原性増大を生じ得る。
【０１２７】
したがって、本発明は、治療的使用に適している精製された生物学的タンパク質の組成物を提供する。本発明の方法を用いて得られるタンパク質の調製方法および被験者への投与方法は、当業者によく知られているか、あるいは容易に確定される。
【０１２８】
一実施形態では、本発明は、精製ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む製剤組成物に関する。可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、例えば、自己免疫障害、例えば脱髄障害、例えば多発性硬化症を治療するために被験者に投与するための製剤組成物として処方され得る。典型的には、製剤組成物は、製薬上許容可能な担体を含む。本明細書中で用いる場合、「製薬上許容可能な担体」としては、生理学的に適合性である溶媒、分散媒質、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が挙げられる。組成物は、製薬上許容可能な塩、例えば酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えばＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６：  １−１９，  １９７７参照）。
【０１２９】
可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、標準方法に従って処方され得る。製剤処方物は十分に確立された技術分野であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ  （ｅｄ．），  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２０ｔｈ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  ａｍｐ；  Ｗｉｌｋｉｎｓ  （２０００）  （ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）；Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ７ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  ａｍｐ；  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （１９９９）  （ＩＳＢＮ：  ０６８３３０５７２７）；およびＫｉｂｂｅ  （ｅｄ．），  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  （２０００）  （ＩＳＢＮ：  ０９１７３３０９６Ｘ）にさらに記載されている。
【０１３０】
一実施形態では、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、賦形剤物質、例えば塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム七水和物、リン酸一水素ナトリウムおよび安定剤を用いて処方され得る。それは、例えば、適切な濃度で緩衝溶液中で提供され得るし、２〜８℃で保存され得る。
【０１３１】
製剤組成物は、種々の形態であり得る。これらの例としては、例えば液体、半固体および固体剤形（例えば液体溶液（例えば注射用および注入用溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソームおよび坐剤）が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与方式および治療用途に依存し得る。典型的には、本明細書中に記載される薬剤のための組成物は、注射用または注入用溶液の形態である。
【０１３２】
このような組成物は、非経口方式（例えば静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射または筋肉内注射）により投与され得る。「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、本明細書中で用いる場合、経腸投与および局所投与以外の、通常は注射による投与方式を意味し、例としては、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、角皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、大脳内、頭蓋内、頚動脈内および胸骨内注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
組成物は、高濃度での安定保存に適した溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソームまたはその他の指示された構造物として処方され得る。
【０１３４】
滅菌注射用溶液は、上で列挙された成分の１つまたは組合せを有する適切な溶媒中に、必要量で本明細書中に記載される薬剤を組み入れ、必要な場合は、その後、濾過滅菌することにより調製され得る。一般的には、分散液は、塩基性分散媒質および上記のものからの必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、本明細書中に記載される薬剤を組み入れることにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、本明細書中に記載される薬剤の粉末＋任意の付加的な所望の成分を、予め滅菌濾過されたそれらの溶液から生じる真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適正な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合に必要な粒子サイズの保持により、ならびに界面活性剤の使用により、保持され得る。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによりもたらされ得る。
【０１３５】
ある実施形態では、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含めた制御放出組成物のように、迅速放出に対して化合物を保護する担体を用いて調製され得る。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられ得る。
【０１３６】
このような処方物の多数の調製方法が特許権を受けているか、または一般的に知られている（例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７８参照）。
【０１３７】
可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、例えばその安定化および／または例えば血液、血清またはその他の組織中の循環での保持を、例えば少なくとも１．５，２、５、１０または５０倍改善する部分で修飾され得る。修飾薬剤は、（例えば、標識化形態の薬剤を用いることにより）多発性硬化症のような脱髄障害において起こり得るような炎症（例えば病変または硬化）の部位にそれが到達し得るか否かを査定するために評価され得る。
【０１３８】
例えば、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、ポリマー、例えば実質的に非抗原性のポリマー、例えばポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドと会合され得る。適切なポリマーは、重量が実質的に様々である。約２００〜約３５，０００ダルトン（または約１，０００〜約１５，０００および２，０００〜約１２，５００）の範囲の数平均分子量を有するポリマーが用いられ得る。
【０１３９】
例えば、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、水溶性ポリマー、例えば親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンと結合体化され得る。このようなポリマーの非限定的一覧は、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーを包含するが、但し、ブロックコポリマーの水溶性は保持される。さらに有用なポリマーとしては、ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ならびにポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー（プルロニック）；ポリメタクリレート；カルボマー；ならびに分枝鎖または非分枝鎖多糖が挙げられる。
【０１４０】
可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇが第二薬剤と組合せて用いられる場合、２つの薬剤は、別個にまたは一緒に処方され得る。例えば、それぞれの製剤組成物は、例えば、投与の直前に混合されて、一緒に投与され得るし、あるいは別々に、例えば同時にまたは別の時間に、投与され得る。
【０１４１】
可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、種々の方法により、被験者、例えばヒト被験者に投与され得る。多数の用途のために、投与経路は、以下のうちの１つである：静脈内注射または注入（ＩＶ）、皮下注射（ＳＣ）、腹腔内注射（ＩＰ）、あるいは筋肉内注射。いくつかの場合、投与は、ＣＮＳに直接、例えばくも膜下腔内、脳室内（ＩＣＶ）、大脳内または頭蓋内であり得る。薬剤は、固定用量で、またはｍｇ／ｋｇ用量で投与され得る。
【０１４２】
用量は、薬剤に対する抗体の産生を低減するかまたは回避するようにも選択され得る。
【０１４３】
可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの投与の経路および／または方式は、例えば、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、拡散強調画像（ＤＷ−ＩまたはＤＷ−ＭＲＩ）、拡散テンソル画像、骨髄造影、磁化移動を用いて、例えば被験者における硬化の位置、数またはサイズを確定することにより、個々の症例に関しても適応させられ得る。脱髄障害の重症度または程度は、腰椎穿刺（例えば、脳脊髄液中の白血球増大を調べるため）、神経機能の測定としての誘発電位試験、および／または脱髄障害（例えば多発性硬化症）と関連した任意の他の標準パラメーター、例えば本明細書中に記載される査定判定基準のいずれかからも確定され得る。
【０１４４】
投薬レジメンは、所望の応答、例えば治療的応答または組合せ治療効果を提供するよう調整される。投薬レジメンは、例えば髄鞘再生を増大させる。一般的には、必要に応じて適切な用量の第二治療薬と別々にまたは一緒に処方される可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの用量は、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを被験者に提供するために用いられ得る。
【０１４５】
可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇに関する適切な投薬量および／または用量範囲は、被験者における髄鞘再生増大を生じるのに十分な量を包含する。適切な投薬量は本明細書中に記載されるもののいずれかであり得るし、例えば、少なくとも約０．００１ｍｇの可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ／被験者（例えばヒト患者）体重１ｋｇの用量を包含し得る。
【０１４６】
髄鞘再生を増大するのに必要とされる可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの用量は、例えば、治療されるべき被験者の年齢、性別および体重を含めた種々の因子に依存し得る。被験者に投与される用量に影響を及ぼす他の因子としては、例えば脱髄障害の種類または重症度が挙げられる。例えば急性劇症多発性硬化症を有する患者は、より軽症の多発性硬化症を有する患者とは異なる投薬量の可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの投与を要し得る。他の因子としては、例えば、患者に同時に作用しているまたは以前作用した他の障害、患者の全身の健康状態、患者の遺伝的素質，食餌、投与時間、排泄率、薬剤組合せ、ならびに患者に施される任意の他の付加的治療が挙げられ得る。任意の特定患者に関する具体的な投薬および治療レジメンは、治療する医者の判断に依る、ということも理解されるべきである。活性成分の量は、特定の記載化合物、ならびに組成物中の付加的抗ウイルス薬の存在または非存在および性質にも依っている。
【０１４７】
投薬単位形態または「固定用量」は、本明細書中で用いる場合、治療されるべき被験者のための単位投薬量として適合させられた物理的に別々な単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的担体と共に、必要に応じて他の薬剤と共に、所望の治療効果（例えば、被験者における髄鞘再生の増大）を生じるよう算定された所定量の活性化合物を含有する。
【０１４８】
製剤組成物は、治療的有効量の本明細書中に記載される可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを含み得る。このような有効量は、投与される薬剤の作用、あるいは１つより多い薬剤が用いられる場合には薬剤と第二薬剤との組合せ作用に基づいて決定され得る。薬剤の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重のような因子、ならびに個体において所望の応答、例えば少なくとも１つの障害パラメーターの改善、例えば自己免疫障害（例えば多発性硬化症などの脱髄障害）の少なくとも１つの症候の改善、を引き出す化合物の能力によっても変わり得る。例えば、治療的有効量の可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは髄鞘再生を増大し、さらにまた、脱髄も遅らせるかおよび／または改善し得る。治療的有効量は、組成物の任意の有毒作用または有害作用よりも治療的に有益な作用が勝っている量でもある。
【０１４９】
可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを含む製剤組成物のためのデバイスおよびキットは、医療機器を用いて投与され得る。当該デバイスは、例えば訓練されていない被験者により、または野外で救急職員により緊急時に用いられ得、医療施設およびその他の医療設備に移され得るよう、携帯性、室温保存性および易使用性のような特徴を伴って設計され得る。当該デバイスは、例えば、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを含む薬学的調製物を保存するための１つ以上のハウジングを包含し得、１つ以上の単位用量の薬剤を送達するよう改造され得る。
【０１５０】
例えば、製剤組成物は、経皮送達デバイス、例えば注射器（皮下注射器またはマルチチャンバー型注射器を含む）用いて投与され得る。その他の適切な送達デバイスとしては、ステント、カテーテル、経皮パッチ、顕微針、および埋込み型制御放出デバイスが挙げられる。デバイス（例えば注射器）は、髄鞘再生を生じるのに十分な用量で、乾燥または液体形態の可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを含み得る。デバイスは、１つのチャンバーが被験者における髄鞘再生を増大させるのに十分な単位用量の凍結乾燥された可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを含有し、第二のチャンバーが凍結乾燥された単位用量の可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを再構成するための液体（例えば緩衝液）を含有する二重チャンバー型デバイスでもあり得る。
【０１５１】
他の例では、製剤組成物は、無針皮下注射デバイス、例えば米国特許第５，３９９，１６３号；第５，３８３，８５１号；第５，３１２，３３５号；第５，０６４，４１３号；第４，９４１，８８０号；第４，７９０，８２４号；または第４，５９６，５５６号に記載されたデバイスを用いて投与され得る。よく知られた埋込み物およびモジュールの例は、例えば米国特許第４，４８７，６０３号（制御速度で薬剤を分配するための埋込み型顕微注入ポンプを開示する）；米国特許第４，４８６，１９４号（皮膚を通して薬剤を投与するための治療用デバイスを開示する）；米国特許第４，４４７，２３３号（正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する）；米国特許第４，４４７，２２４号（連続薬剤送達のための可変流量埋込み型注入装置を開示する）；米国特許第４，４３９，１９６号（マルチチャンバー区画を有する浸透性薬剤送達システムを開示する）；ならびに米国特許第４，４７５，１９６号（浸透性薬剤送達システムを開示する）に記載されている。多数の他のデバイス、埋込み物、送達システムおよびモジュールも知られている。
【０１５２】
可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、キット中で提供され得る。一実施形態では、キットは、（ａ）１つ以上の単位用量の可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを含む組成物を含入する容器、および必要に応じて（ｂ）情報材料を包含する。
【０１５３】
可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの単位用量は、被験者における所望の結果、例えば被験者における疾患の緩徐進行または改善を生じるのに十分である。情報材料は、本明細書中に記載される方法および／または治療的利益のための薬剤の使用に関する説明的な、指示的な、市場的なまたはその他の材料であり得る。当該キットは、髄鞘再生に関する試験（アッセイ）に有用な試薬および使用説明書も包含し得る。髄鞘再生に関するアッセイ方法としては、本明細書中に記載される試験方法のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、キットは、脱髄障害を治療するための１つ以上の付加的薬剤、例えば多発性硬化症を治療するための１つ以上の薬剤を包含する。例えばキットは、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを含む組成物を含入する第一容器、ならびに１つ以上の付加的薬剤を含む第二容器を包含する。
【０１５４】
キットの情報材料は、その形態において限定されない。一実施形態では、情報材料は、化合物の生産、化合物の分子量、濃度、有効期限、バッチまたは生産拠点情報等についての情報を包含し得る。一実施形態では、情報材料は、脱髄障害を有するか、または発症する危険があるかあるいは脱髄障害に関連した事象を経験している被験者を治療するための、適切な用量、剤形または投与方式（例えば、本明細書中に記載される用量、剤形または投与方式）での、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの投与方法に関する。情報は、種々のフォーマットで、例えば印刷テキスト、コンピューター読取材料、ビデオ記録またはオーディオ記録、あるいは実在の材料へのリンクまたはアドレスを提供する情報で提供され得る。
【０１５５】
薬剤のほかに、キット中の組成物は、他の成分、例えば溶媒または緩衝液、安定剤または防腐剤を含み得る。薬剤は、任意の形態で、例えば液体、乾燥形態または凍結乾燥形態でにおいて、好ましくは実質的に純粋および／または滅菌性で、提供され得る。薬剤が溶液で提供される場合、溶液は、好ましくは、水溶液である。薬剤が乾燥形態で提供される場合、再構成は一般的には、適切な溶媒の付加による。溶媒、例えば滅菌水または緩衝液は、任意にキット中に提供され得る。
【０１５６】
キットは、薬剤を含有する１つ以上の組成物のための１つ以上の容器を包含し得る。いくつかの実施形態では、キットは、組成物および情報材料のための別個の容器、仕切りまたは区画を含有する。例えば組成物は、瓶、バイアルまたは注射器中に含入され得、情報材料はプラスチック製のスリーブまたはパケット中に含入され得る。他の実施形態では、キットの別個の素子は、単一の非分割容器内に含入される。例えば、組成物は、ラベルの形態の情報材料を貼り付けた瓶、バイアルまたは注射器中に含入される。いくつかの実施形態では、キットは、各々が薬剤の１つ以上の単位剤形（例えば、本明細書中に記載される剤形）を含有する個々の容器を複数（例えば多数）包含する。容器は、組合せ単位投与量、例えば可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇおよび第二薬剤の両方を、例えば所望の比率で含む単位を含み得る。例えば、キットは、例えば各々が単一組合せ単位用量を含有する、注射器、アンプル、箔パケット、ブリスターパックまたは医療デバイスを複数包含する。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、湿度の変化または蒸発に対して不浸透性）および／または遮光性であり得る。
【０１５７】
キットは、任意に、組成物の投与に適したデバイス、例えば注射器またはその他の適切な送達デバイスを包含する。デバイスは、一方または両方の薬剤の充填前に提供されてもよく、あるいは中身がない状態であるが充填に適し得るデバイスであってもよい。
ＶＩＩＩ．治療方法
【０１５８】
本明細書中に記載される方法に従って精製される活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて製造される処方物は、ＬＴ−β−Ｒ遮断薬で治療可能である多数の疾患を治療するために用いられ得る。このような疾患の例としては、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、腸疾患、例えばクローン病、ならびに神経学的疾患、例えば多発性硬化症が挙げられる。本明細書中に記載される組成物を用いて治療され得る疾患の他の例は、ＵＳ２００２０１９７２５４号および米国特許第７，２５５，８５４号（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【０１５９】
一実施形態では、本発明の精製ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を含む製剤組成物は、脱髄障害を治療するために用いられる。本明細書中で用いる場合、「脱髄障害」は、神経からの、神経繊維を取り囲み、絶縁する脂肪鞘である髄鞘の破壊または除去に関連した任意の疾患である。脱髄障害としては、例えば多発性硬化症（例えば再発／寛解型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症、進行再発型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症および急性劇症多発性硬化症）、橋中心髄鞘崩壊、急性散在性脳脊髄炎、進行性多巣性白質脳症；亜急性硬化性全脳炎、感染後脳脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ギラン・バレー症候群、進行性多巣性白質脳症、デビック病、バロー同心円硬化症、ならびに白質の変性疾患（例えば異染性白質変性疾患、クラッベ病、副腎白質変性疾患、ペリツェウス・メルツバッハー病、カナバン病、中枢性低髄鞘形成による小児期運動失調、アレキサンダー病またはレフサム病）が挙げられる。脱髄障害を有するヒト患者は、脱髄障害の１つ以上の症候、例えば視覚障害、麻痺、四肢の脱力、振顫もしくは痙攣、熱不耐性、言語障害、失禁、眩暈または固有感覚障害（例えば、平衡、協調、肢位感覚）（これらに限定されない）を有し得る。
【０１６０】
脱髄障害の家族歴（例えば脱髄障害の遺伝的素質）を有するか、あるいは上記の脱髄障害の軽症のまたは稀な症候を示すヒト（例えばヒト患者）は、本発明の目的のために、脱髄障害（例えば多発性硬化症）を発症する危険があるとみなされ得、本明細書中に記載されるような製剤組成物で治療され得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、被験者における症状を改善するのに十分な量で、頻度で、および／または時間の間、被験者に投与され得る。一実施形態では、本発明の組成物を用いて、被験者における髄鞘再生を誘導するかまたは促進し得る。
【０１６２】
一実施形態では、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、１回、被験者に投与される。他の実施形態では、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、１回より多く、例えば３〜１０日毎に１回；少なくとも２回、５〜２０日毎に１回以下で；少なくとも２回、２８〜３１日毎に１回以下で；毎週１回；２週間毎に；毎月１回；少なくとも４週間の間毎週１回；少なくとも６週間の間２週間毎に１回；少なくとも３ヶ月の間、毎月１回；または少なくとも６ヶ月の間毎月１回、被験者に投与される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、投薬量（例えば被験者において髄鞘再生を誘導するのに十分な量）を確定するための試験における可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの適切な出発用量は、０．００１ｍｇの可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ／被験者体重１ｋｇである。いくつかの実施形態では、適切な用量または出発用量は、多数の本発明の患者特異的因子、例えば性別、年齢、体重、身体健康状態または本明細書中に記載される任意の他の因子（これらに限定されない）により確定される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、静脈内でまたは非経口的に（例えばくも膜下腔内、皮下、筋肉内、鼻内または経口的に）、被験者に投与される。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、単一療法として被験者に投与され得る。いくつかの実施形態では、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、別の治療、例えば自己免疫障害、例えば脱髄障害（例えば本明細書中に記載される脱髄障害のいずれか（例えば多発性硬化症））のための別の治療との併用療法として、被験者に投与され得る。例えば、併用療法は、自己免疫障害、例えば脱髄障害を有するかまたは発症する危険のある被験者に治療的利益を提供する１つ以上の付加的薬剤を被験者（例えばヒト患者）に投与することを包含し得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇおよび１つ以上の付加的薬剤は、同時に投与される。他の実施形態では、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇが最初に投与され、１つ以上の付加的薬剤が次いで投与される。いくつかの実施形態では、１つ以上の付加的薬剤が先ず投与され、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇが次に投与される。可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、以前または最近、施された療法に取って代わるかまたは増大し得る。例えば、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇで治療する場合、１つ以上の付加的薬剤の投与は中止または縮小し得、例えば低レベルで投与され得る。他の実施形態では、以前の療法の投与は保持される。いくつかの実施形態では、以前の療法は、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇのレベルが治療効果を提供するのに十分なレベルに到達するまで保持される。２つの療法は、組合せて投与され得る。
【０１６７】
一実施形態では、本明細書中に記載されるような製剤組成物を用いて脱髄障害のために治療されている被験者は、髄鞘再生に関してモニタリングされ得る。髄鞘再生に関する被験者（例えばヒト患者）のモニタリングは、本明細書中で定義されるように、変化、例えば髄鞘再生を示す１つ以上のパラメーターにおける改善に関して被験者を評価することを意味し、例えば、脱髄障害の１つ以上の症候の改善をモニタリングし得る。そのような症候は、本明細書中に記載される脱髄障害の任意の症候を含む。髄鞘再生は、被験者における髄鞘の状態の直接的確定を包含する方法によってもモニタリングされ得、例えば磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて白質量を測定するか、または磁気共鳴分光分析（ＭＲＳ）脳スキャンを用いて髄鞘繊維の厚みを測定し得る。いくつかの実施形態では、評価は、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの投与後、好ましくは最初の投与後、少なくとも１時間、例えば少なくとも２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間または４８時間、あるいは少なくとも１日、２日、４日、１０日、１３日、２０日またはそれ以上、あるいは少なくとも１週間、２週間、４週間、１０週間、１３週間、２０週間またはそれ以上、実施される。被験者は、以下の期間のうちの１つ以上で評価され得る：治療の開始前；治療中；または１つ以上の治療要素が投与された後。評価は、さらなる治療の必要性を評価すること、例えば投薬量、投与頻度、または治療持続期間が変更されるべきか否かを評価することを包含し得る。それは、選択した治療様式を付加するかまたは終える必要性を、例えば、本明細書中に記載される脱髄障害のための治療のうちのいずれかを付加するかまたは終える必要性を、評価することも包含し得る。例えば、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの継続投与は、必要な場合、１つ以上の付加的治療薬を用いて実行され得る。好ましい一実施形態では、評価についての予め選択した結果が得られる場合、付加的工程が取られ、例えば被験者は、別の治療を施され、あるいは別の評価または試験が実施される。
【０１６８】
例えば、腰椎穿刺（すなわち脊椎穿刺）は、脳脊髄液の試料を得るために患者で実施され得る。次いで、脳脊髄液は、例えば（ｉ）異常タンパク質、例えば髄鞘の小断片、（ｉｉ）リンパ球のレベル上昇またはその特定の型、および／または（ｉｉｉ）異常レベルの免疫グロブリン（ＩｇＧ）分子の存在に関して試験される。脱髄障害に関する定量的試験の別の例は誘発電位試験であり、これは、眼、耳または皮膚からの神経インパルスが脳に到達するのに要する時間の関数として神経活動を測定する。脱髄障害は、いくつかの画像診断法、例えば磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、拡散強調画像（ＤＷ−ＩまたはＤＷ−ＭＲＩ）、拡散テンソル画像、骨髄造影、磁化移動（これらに限定されない）のうちのいずれかを用いて、中枢神経系に存在する炎症病変（すなわち硬化）のサイズおよび／または数を評価することによっても査定され得る。患者は、例えば、上記の多発性硬化症の症候のいずれかを含む患者により提示される彼等の神経心理学知見（例えば、記憶、算術、注意、判断および推理のような種々の能力の状態）あるいは症候（臨床パラメーター）の種々の半定量的または定量的査定を用いても、診断され得る。さらに、脱髄障害の程度または進行は、髄鞘塩基性タンパク質様物質（（ＭＢＰＬＭ）この物質は、疾患進行中に軸索損傷が起きると増大するようになる）のレベル上昇に関して患者の尿を試験することにより検出され得る（例えば、Ｗｈｉｔａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒａｌ．  ３８（４）：  ６３５−６３２参照）。色盲に関するある種の試験も、眼に及ぼす脱髄障害の作用を追跡するのに役立ち得る。
【０１６９】
上記のこのような診断方法は、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇによる治療後の被験者（例えば患者）における髄鞘再生増大を評価するためにも用いられ得る。例えば、髄鞘再生は、本明細書中に記載される画像診断法のいずれかにより確定される、患者に存在する硬化部位（sclerose）のサイズまたは数の低減と同時に起こり得る。さらにまた、被験者における髄鞘再生は、誘発電位試験により確定される、耳、眼または皮膚から脳へのシグナルの伝達速度の増大として測定され得る。いくつかの症例では、特に、脱髄障害が神経萎縮を生じていた場合、髄鞘再生は、白質体積（例えば脊髄または脳の神経塊）の増大として評価され得る。いくつかの場合、被験者における髄鞘再生の程度または発生は、例えば磁気共鳴分光分析スキャンを用いて、被験者における髄鞘の厚みを直接測定することにより査定され得る。
【０１７０】
本発明は、脱髄症状を引き起こし得る療法または薬剤と組合せた本明細書中に記載される方法および組成物の使用も包含する。例えば、関節リウマチの治療のための抗ＴＮＦ療法は、副作用として、脱髄症状の一型を生じ得る。したがって、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇは、抗ＴＮＦ療法と組合せて投与されて（例えば同時投与されて）、脱髄副作用を防止し、改善し、または逆転し、髄鞘再生を促し得る。抗ＴＮＦ療法としては、アダリムマブ（フミラ）、エタネルセプト（エンブレル）またはインフリキシマブ（レミケード）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７１】
いくつかの場合、可溶性ＬＴ−β−Ｒ（例えばＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ）は、第二選択療法として用いられる。例えば、脱髄障害（例えば多発性硬化症）のための１つ以上の療法に対して非応答性であると確定されている患者は、１つ以上の治療を受けるのを中止し、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇによる治療を開始する。
【０１７２】
前記の開示は、本発明の態様、例えば本発明の製造および使用方法を、当業者に教示する。以下の実施例は、本発明のさらなる説明を提供するよう意図されるが、しかし本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１７３】
以下の実施例は、生成物関連不純物から抗体ベースの生物製剤、すなわちＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを精製するための方法を記載する。ＣＨＯ細胞中で発現される場合、３つの生成物関連不純物がＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇと同時発現される。これらの生成物関連不純物は、精製工程において攻撃誘発を呈する。この不純物としては、２つの、単量体であるが構造的に異なる不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ（「不活性型−１」および「不活性型−２」と呼ばれる）および凝集体（これらは二量体およびより高分子量の物質を含んだ）が挙げられる。ＣＨＯ細胞中のＦｃ融合タンパク質の発現後の不純物のパーセンテージ対タンパク質生成物のパーセンテージの例は、約４６％生成物（活性単量体タンパク質）、約３５％凝集体、約１３％不活性型−２および約６％不活性型−１である。
実施例１：抗体ベースの生物製剤の精製中に、多数の生成物関連不純物を除去し得る高分解能疎水性相互作用クロマトグラフィー工程の開発（サイクル１）
【０１７４】
２つの、単量体であるが不活性な生成物関連不純物を抗体ベースの生成物から除去し得るＨＩＣステップを、第一相臨床製造のために開発した。その後の開発中に、クロマトグラフィー分解能を保持しながら、容量および頑強性の改良を追求した。代替的ＨＩＣ樹脂および結合塩を探究し、実験計画アプローチにより分離効率に重要なパラメーターを同定した開発試験を記載する。異なる分解能を有する第二のＨＩＣステップを、第三の生成物関連不純物の除去のために前述の工程の下流に用いた。製造規模の臨床生産に適した堅調な工程の確立に際して遭遇する問題および難題を考察する。
【０１７５】
以下の実施例は、臨床製造のために開発された抗体ベースの生成物から生成物関連不純物、例えば２つの不活性型のタンパク質を除去し得る疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程を説明する。以下の実施例は、ＨＩＣブチルおよびフェニル樹脂、結合塩および分離効率に重要であると確認されたパラメーターを説明する。
【０１７６】
全体的に、以下の工程（「サイクル１−１」および「サイクル１−２」と呼ばれる）は、第一ＨＩＣブチルカラム、例えばブチル−６５０Ｍ樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、その後の第二ＨＩＣフェニルカラムを用いた。ＨＩＣ工程の組合せは、不活性型および凝集化分子の低減を生じた。ブチル−６５０Ｍ樹脂は、他の形態、すなわち、不活性型−１、不活性型−２および凝集体形態から活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを分離するのに有効であると確定された。サイクル１−１は、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの２０００Ｌ製造のために用い、一方、サイクル１−２は、高力価出発物質に関して最適化した（すなわち８００ｍｇ／ｍＬ）。サイクル１−１および１−２はともに、第一ブチルＨＩＣ分離および第二フェニルＨＩＣ分離を包含した。
材料および方法
【０１７７】
この実施例に用いられる樹脂は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチル−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびフェニルセファロース６Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を包含した。ブチル−６５０Ｍクロマトグラフィー工程は、平衡および洗浄ステップ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１．６５ＭのＮａＣｌを含む溶液を使用）、ならびに溶出ステップ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、０．７ＭのＮａＣｌを含む溶液を使用）を包含した。
【０１７８】
ＰｈａｒｍａｃｉａＵＶ−１検出器を用いて吸光度２８０ｎｍ（Ａ２８０）により、カラム溶出物をモニタリングした。ＰｈａｒｍａｃｉａからのＡＫＴＡ  ＦＰＬＣおよびＵｎｉｃｏｒｎソフトウェア  バージョン３．２．６を、種々の実験のために用いた。
【０１７９】
特に言及する場合を除いて、１８〜２８℃の温度でクロマトグラフィーを実施した。Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＨＰＬＣカラム冷却器／加熱器モデルＣ０３０を用いて、特定の場合においてカラム温度を調節した。いくつかの実験では、Ｎｅｓｌａｂ水浴モデルＲＴＥ−２１１を用いて、精製溶液の温度を制御した。
【０１８０】
ＪＭＰ（登録商標）ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）バージョン３．２．６を用いて、統計分析を実施し、実験計画および結果分析のために利用した。
【０１８１】
この報告全体を通してのＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質濃度は、吸光係数１．２５に基づいている。
１．１  サイクル１−１
【０１８２】
哺乳動物細胞培養中で発現されるＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇから不純物を除去するために、サイクル１−１を開発した。除去される必要がある不純物は、２つの異なる不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質、すなわち、不活性型−１形態および不活性型−２形態、ならびに凝集体を包含した。サイクル１−１の工程の要約を、図１に記載する。
【０１８３】
フェド・バッチ工程を用いて、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で、ＬＴＢＲ−Ｉｇを先ず発現させた。サイクル１−１では、力価は約３００ｍｇ／Ｌで、凝集体は約１２％、不活性型−１は約５％および不活性型−２は約９％であった。発現後、細胞培養物を採取し、遠心分離した。清澄化状態調節培地を、プロテインＡ捕捉カラム上で処理した。その結果生じたＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ混合物をブチル樹脂ＨＩＣカラム（ＨＩＣ−１と呼ばれる）（ブチル−６５０Ｍ；Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で処理したが、この場合、樹脂は８ｇ／Ｌの容量を有した。ＨＩＣ−１ステップは、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの不活性型１および２の混合物を取り除いた。ＨＩＣ−１ステップを、タンパク質容量に関して最適化した。
【０１８４】
他の試験樹脂に勝る多数の理由のため、例えば以下の好ましい特質のために、ブチル−６５０Ｍ樹脂を選択した：１）強固なメタクリレート主鎖；２）４０〜９０μｍの粒子サイズ；３）操作速度８０〜３００ｃｍ／時；ならびに４）可能なストリンジェント清浄条件、例えば、１ＮのＮａＯＨ、５０％メタノール。ブチル樹脂は、９９％より多くの不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを除去し得た。
【０１８５】
不活性型形態および凝集体形態からＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質生成物を分離するのに最も有効なものを確定するために、多数の塩をスクリーニングした。ＮａＣｌおよびＮａ２ＳＯ４はともに、ＬＴＢＲ−Ｉｇ生成物から不純物を分離し得ると確認された。ＬＴＢＲ−Ｉｇに関する不活性型−１および不活性型−２形態を、それぞれ洗浄ＮａＣｌ溶液および除去ＮａＣｌ溶液においてブチル樹脂から溶出した。ブチルＨＩＣ−１ステップは、不活性型−１および不活性型−２を溶出画分中１．０％未満に低減した。
【０１８６】
図３は、ＨＩＣ−１後の工程中間体のＨＰＬＣ分析を記載し、これは、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇおよび凝集体から不活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの両方を分離するＨＩＣ−ＨＬＰＣ、ならびに活性単量体ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質から凝集体を分離するサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を含む。
【０１８７】
ＨＩＣ−１ブチルステップ後の結果の要約を図２に示すが、この場合、２つの不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇから分離した。図２に示すように、０．７ＭのＮａＣｌを用いて、ＨＩＣ−１ブチル樹脂からＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ生成物を溶出した。ＨＩＣ−１に関する最終サイクル１−１条件は、以下のとおりである：１．６５ＭのＮａＣｌで結合させ（全て結合される）、次いで、１．５５ＭのＮａＣｌで洗浄し（不活性型−１をカラムから洗い落とす）、次いで、０．７ＭのＮａＣｌで溶出し（生成物および凝集体が溶出）、次に、０ＭのＮａＣｌで除去する（不活性型−２がカラムから出る）（図２も参照）。
【０１８８】
次に、低ｐＨ工程を用いてＨＩＣ−１ステップからの溶出物をウイルス不活性化し、その後、フェニルセファロース（フェニルセファロース６Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉ  Ｓｕｂ）を用いて第二ＨＩＣクロマトグラフィーカラム上で処理した。
【０１８９】
第二ＨＩＣステップ（フェニル）は、タンパク質凝集体を除去し、溶出物の分離を最適化した。ＨＩＣ−２（フェニル）ステップによる凝集体クリアランスを示す結果を、図８Ａで説明する（図８Ａは、充填の作用を含む）。
【０１９０】
第二ＨＩＣ（ＨＩＣ−２）ステップ後、ウイルス除去フィルター（ＶＦ）および限外濾過／膜分離（ＵＦ／ＤＦ）により、溶出物をさらに処理した。
１．２  サイクル１−２
【０１９１】
サイクル１−２は、上記のサイクル１−１の変更バージョンであって、この場合、サイクル１−２は、容量を増大する能力改善を示した（出発物質におけるタンパク質力価増大）。サイクル１−２の概要を、図５に示す。以下に記載するように、サイクル１−２では、硫酸ナトリウムを用いて（塩化ナトリウムの代わりに）、ブチルカラム上の容量を８〜２０ｇ／Ｌ樹脂に増大させた。
【０１９２】
容量特性の改良と活性型ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇから不活性型（１型および２型）ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを分離する能力との両方に関して、種々のリオトロピック塩をスクリーニングした。スクリーニングを実施して、力価増大後に不活性型および凝集体型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを効果的に除去し得る塩および樹脂を確定した。リオトロピック塩のスクリーニングからの結果を、表１に示す。
【０１９３】
【表１】
2011514895.tif 000005
【０１９４】
低塩濃度で高容量を促進するその能力のために硫酸ナトリウムを選択したが、これは、経費の点でＮａＣｌに匹敵し、温度および他の塩に対して溶解度感受性であるという事実にもかかわらず廃棄物管理が好都合であり、周囲温度で約１．３Ｍの最大溶解度を有する。
【０１９５】
樹脂スクリーニングからの結果を、表２に示す。種々の結合塩を用いたＨＩＣ樹脂のスクリーニングは、試験した他の組合せも、不純物を分離するのに有効であることを立証したが、０．６ＭのＮａ２ＳＯ４で充填されたブチル樹脂−２（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチル６００Ｍ樹脂）はサイクル１−２のＨＩＣ−１ステップのための最適組合せである、ということを示唆した。したがって、０．６Ｍ硫酸ナトリウムで充填されたブチル樹脂−２（７５０Ａの孔サイズを有する）が、最良の候補であることを立証した。
【０１９６】
【表２】
2011514895.tif 000006
【０１９７】
一般的に、サイクル１−２の工程は、ウイルス不活性化の順序とブチルステップに関する硫酸ナトリウムベースの洗浄の使用を除いて、サイクル１−１に関して上記したものと同様であった。フェド・バッチ工程を用いて、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを先ず発現させた。細胞発現からの力価は約８００ｍｇ（ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ）／Ｌで、これは、５％の不活性型−１  ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ、１４％の不活性型−２  ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇおよび２２％のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ凝集体を含んだ。発現後、細胞培養を採取し、遠心分離した。清澄化状態調節培地を、プロテインＡ捕捉カラム上で処理した。低ｐＨ工程を用いてウイルスを不活性化した。その結果生じたＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ混合物をブチル樹脂ＨＩＣカラム（ＨＩＣ−１と呼ばれる）（ブチル−６００Ｍ；Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で処理したが、この場合、樹脂は２０ｇ／Ｌを超える容量を有した。ＨＩＣ−１ステップは、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの不活性型１および２の混合物を取り除いた。ＨＩＣ−１ステップを、タンパク質容量に関して最適化した。
【０１９８】
２つの洗浄戦略を用いて、容量を増大するための、ブチル樹脂洗浄の最適パラメーターを確定した（すなわち、硫酸ナトリウム段階洗浄および硫酸ナトリウム段階洗浄／その後の逆勾配洗浄）。これら２つの戦略の結果を図６に示すが、この場合、戦略Ｂ−段階および勾配洗浄は、より良好に分離された溶出を提供することを立証した。異なる量の充填、硫酸ナトリウム洗浄濃度、および硫酸ナトリウム溶出溶液濃度を試験した（以下の表３および４に記載）。
【表３】
2011514895.tif 000007
【表４】
2011514895.tif 000008
【０１９９】
等高線プロットを分析して、サイクル１−２のＨＩＣ−１ブチル精製ステップに関する重要な因子を確定した。不活性型−１クリアランスに関して同定された重要因子は、カラム充填（１８〜２６ｇ／Ｌの範囲で）およびＮａ２ＳＯ４洗浄濃度（０．４５５〜０．４６５Ｍの範囲、狭い導電率およびモル浸透圧濃度仕様を使用）を包含した。不活性型−２クリアランスに関する重要因子は、０．２２Ｍより上で保持されるＮａ２ＳＯ４溶出濃度であった。精製工程において重要でないと確定された因子は、充填体積（Ｎａ２ＳＯ４濃度が０．５６Ｍ超であった場合）および溶出体積（Ｎａ２ＳＯ４濃度が０．２２Ｍ超であった場合）を包含した。他の潜在的に重要な因子としては、洗浄体積、温度、樹脂ロット導電率および充填タンパク質濃度が挙げられた。
サイクル１−１および１−２の要約
【０２００】
したがって、ＨＩＣカラムの組合せを用いてＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質の精製を達成し、その結果、３つの異なる生成物関連不純物、すなわち２つの異なる不活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質およびＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの凝集体から、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質（薬剤物質）を分離した（結果の要約に関しては、図７参照）。
【０２０１】
活性ＬＴＢＲ−Ｉｇタンパク質の分離を保持しながら、容量増大のためにＨＩＣ−１カラムステップ（ブチル樹脂）を最適化した。ブチルＨＩＣカラムは、２つの異なる不活性型のタンパク質から活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質を分離し得た、すなわち、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇのジスルフィド・スクランブル化単量体種（不活性型−１および不活性型−２）を除去し得た。生成物収率を、ＨＩＣ−１カラムステップでの不活性種のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇのクリアランスに対して評価した。硫酸ナトリウムは、高容量かつ上記種の高い分離を促進した。生成物収率に対する不活性形態のクリアランスを最大にする上で重要な因子は、カラム充填およびＮａ２ＳＯ４の洗浄濃度を包含した（サイクル１−２に関して）。
【０２０２】
２つの工程は、第三カラムステップ、すなわちＨＩＣ−２（フェニル樹脂）の最適化も包含し、これは、凝集体形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質ならびに残留不活性型−２を含まない物質を生じた。ＨＩＣ−２ステップに関して同定された重要因子は、カラム充填、層高および流速を包含した。
実施例２：生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質の精製：サイクル２
【０２０３】
以下の実施例は、Ｉｇ融合生物製剤、すなわちＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を、高パーセンテージの生成物関連不純物、すなわち約５０％の生成物関連不純物を含有する供給材料から精製する工程を説明する。上記のように、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの供給材料は、異なる型の不純物、すなわち凝集化種および２つの異なるジスルフィドスクランブル化形態の物質（不活性型−１形態および不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒと呼ばれる）を含有する。これらの不純物はＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ（生成物）と密接に関連するので、所望の生成物の精製は難題を呈する。
【０２０４】
ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇに関する製造工程は、最初は初期臨床試験のために開発され、後に、商業化のために十分なレベルに生産性を増大するよう修正された。これを達成するために、４つのうちの１つの因子により、細胞培養生産性を増大した。しかしながら、この変化は、総生成物関連タンパク質の２０％から約５０％への、生成物変異体の増大を伴なった。最も注目すべきは、凝集体レベルが２倍より多くなったことであり、それらは全体の約１２％から約３５％に増大した。供給物質は、１３５０ｍｇ／Ｌまでの力価を含み、これは、約６％の不活性型−１  ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質、約１４％の不活性型−２  ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質および約２８〜３５％の凝集体を包含した。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質産生の増大は、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ（薬剤物質）を増大させただけでなく、この融合タンパク質に関連した３つの不純物も増大させた。
【０２０５】
したがって、哺乳類細胞発現からのＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質力価の増大に応答して、特に、精製に関する難題を呈するタンパク質凝集体の大きな増大に関して、サイクル−２を設計した。細胞培養採取物からこれらの不純物を除去するために、最適化工程を開発した。これは、第一混合モードＨＩＣ樹脂および第二フェニルＨＩＣ樹脂を用いた２部分離を基礎にした。不純物の増大についての概要を、以下の表５に示す。
【表５】
2011514895.tif 000009
生成物関連不純物は、下流プロセスのための供給材料中に、総タンパク質の５０％を超えて存在した（４６％生成物；３５％凝集体；６％不活性型−１；および１３％不活性型−２）。
【０２０６】
サイクル２は、出発供給材料の５０％より多くが望ましくない不活性型変異体および凝集化変異体で構成された場合、生成物の精製を成功させた。サイクル２工程を用いて、１５０００Ｌ製造規模で、生物学的に活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ融合タンパク質を首尾よく精製した。不活性型−１はクロマトグラフィーのいくつかの方式で生成物（凝集していない活性なＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ）と同時に精製されたが、これら２つの形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質の効率的分離を、混合モード樹脂を用いて達成した。不活性型−２を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて、堅調に生成物から分離した。薬剤物質中１％未満に凝集体をクリアランスすることは、混合モードクロマトグラフィーおよびＨＩＣクロマトグラフィー、ならびに混合モード樹脂上の洗浄−１ステップの正確な制御により達成し、この正確な制御を、重要パラメーターを同定し、検査するための要因設計実験により誘導した。
【０２０７】
サイクル−２工程では、混合モードクロマトグラフィーは、約２８％（充填中）から約１０〜２４％（溶出物中）に凝集体を低減した。その後のフェニルステップは、残存凝集体を除去した。すなわち、凝集体は除去されて少なくとも２３％（フェニル充填中）から１％（フェニル溶出物中）未満となった。
【０２０８】
サイクル−２の概要を図９に示し、以下のように要約する。遠心分離前に、バイオリアクター材料（１４、１５または１６日）をｐＨ４．７〜５．３に調整して、工程関連不純物の除去を促進した。採取物遠心分離後、プロテインＡ捕捉のための充填材料にトリトンＸ−１００を０．０５％で付加して、レトロウイルス不活性化を促した。２１ｇ／Ｌの容量でプロテインＡカラムを用いて、その後のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質の捕捉を実施した。プロテインＡ捕捉後、低ｐＨウイルス不活性化を実施し、その後、さらなるパルボウイルスクリアランスのためにＱ膜吸着装置を用いた。次に、３１ｇ／Ｌの容量で混合モードＨＩＣカラムを用いて、不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇおよび凝集体の一部の混合物を除去した。混合モードカラム工程後、溶出物を、１５ｇ／Ｌの容量および約３０ｃｍ＋の層高でフェニルを含有するＨＩＣカラムに付した。このＨＩＣカラムは、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇタンパク質を凝集体および不活性型−２形態から分離した。フェニルカラムを約３０ｃｍに増大して不純物のクリアランスを最適化した。この高さのための最適充填範囲は、約１０〜１５ｇ／Ｌであった。
【０２０９】
したがって、より高いタンパク質力価／高度に不純物を含む供給材料を処理するために用いられる下流の変化は、クロマトグラフィー工程への修正を包含した。以前のサイクル−１工程と比較して、サイクル−２は、採取前にバイオリアクターの低ｐＨ調整が存在するよう、修正された。これが、生成物関連不純物の沈殿および除去を改良させ、ＤＮＡクリアランス増大およびカラムのための「清浄な」供給物を提供した。採取物材料中の限定された生成物安定性のため、低ｐＨ修正と共に迅速処理を要した。高容量プロテインＡ親和性樹脂も用いたが、これは、容量の約１４０％増大、ならびに生産性を増大しながら供給材料を処理するのに要するサイクル数の低減を提供した。イオン交換膜吸着装置も、パルボウイルスクリアランスのためのさらなる能力を提供するために工程に付加された。新規の第二のカラム（混合モード）を工程に付加して、容量および生成物関連不純物のクリアランスを改良した。この新規の第二のカラムは、容量を３８０％より上に増大し、堅調な不活性型−１除去、ならびに凝集体のクリアランスを提供した。サイクル−２工程に関するさらなる詳細を、以下で記載する。
採取およびウイルス不活性化
【０２１０】
単量体活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ（生成物）の精製の前に、哺乳類ＣＨＯ細胞中でタンパク質を産生し、採取し、その後、清澄化した。採取時に、状態調節培地を２〜８℃に冷却し、ｐＨを４．７〜５．３に調整した。ｐＨ調整状態調節培地を、ディスクスタック遠心分離ボウルに供給した。細胞および細胞破砕屑をボウル沈殿物保持空間に収集し、採取操作中に断続的に除去した。清澄化無細胞遠心分離物はボウル上部に上がり、遠心分離ポンプによる圧力下で連続的に放出された。遠心分離工程完了時に、収集遠心分離物を混合し、中和して、ｐＨ６．９〜７．５とした。
【０２１１】
活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇおよび関連不純物をともに含有する混合物の採取および遠心分離後、生成物を損傷することも非許容可能な高レベルの凝集体を生じることもなく、外因性ウイルスを不活性するために、トリトンＸ−１００を付加した。中和遠心分離物の温度を１５〜２５℃に調整し、トリトンＸ−１００を、最終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）で付加した。このトリトンＸ−１００調整遠心分離物を最低２時間保持した後、さらに処理した。
【０２１２】
混合物（不活性および活性型のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇおよび凝集体を含有する）を、組換えプロテインＡカラム上で動かした。この樹脂がＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇに対して示す高結合親和性および特異性のため、組換えプロテインＡ（ｒプロテインＡ）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂を捕捉工程用に選択した。工程関連不純物からのＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの精製を、工程中のこのクロマトグラフィー工程で行った。さらに、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅステップは、潜在的ウイルス夾雑物、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質のクリアランスを提供し、工程体積を８分の１に低減した。１８〜２６℃で、このクロマトグラフィー工程を操作した。
【０２１３】
第二カラムステップ（混合モード）のための新規のクロマトグラフィー樹脂の導入は容量および生成物関連不純物のクリアランスを改良したが、しかし潜在的パルボウイルスのクリアランスに関する能力を低減した。外因性パルボウイルスの高い（excess）クリアランスを、最も容易に（optimal facility-fit）回復させるために、Ｑ膜吸着装置単位操作をこの工程で履行した。展開は、約１００％の生成物収率を提供しながら、モデルパルボウイルス−マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）−のクリアランスのための最適ｐＨ（約ｐＨ６．４）および導電率（高導電率）を確認した。Ｑ膜をプロテインＡアフィニティーと第二カラムステップとの間で実行し、ＧＭＰ材料を用いて、縮小ウイルススパイク試験で３Ｌｏｇ１０超を提供した。
【０２１４】
各サイクルのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ溶出物を、低ｐＨウイルス不活性化およびＱ膜濾過により処理した後、プールした。この工程は、生成物を損傷することも非許容可能な高レベルの凝集体を生じることもなく、ｐＨ感受性ウイルスを不活性化することを意図した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ溶出物をｐＨ３．５〜３．９であるよう調整し、次に、１８〜２６℃で２〜２．５時間保持した。次いで、溶液をｐＨ６．２〜６．６に調整し、パルボウイルスクリアランスのための吸着装置である陰イオン交換装置（ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ膜吸着装置（ＱＭＡ））を含めた次のステップへと続けて処理した。
混合モード樹脂
【０２１５】
混合モード樹脂、すなわち、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣクロマトグラフィー（ＧＥ／Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、サイクル−２のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ精製工程における第二クロマトグラフィーステップであった（第一工程はプロテインＡ）。Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣは混合モード樹脂であるが、しかしそれを陽イオン交換モードで操作した。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇに関するその高結合容量ならびに工程関連不純物および生成物関連不純物から活性単量体ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを分離するその能力のために、混合モード樹脂を選択した。さらに、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣステップは、宿主細胞タンパク質、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラムｒプロテインＡ溶脱液および潜在的ウイルス夾雑物のクリアランスを提供した。Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣクロマトグラフィーは、生成物関連不純物、例えばＬＴＢＲ−Ｉｇの凝集体および不活性種も低減した。このステップは、１６〜２４℃で実行した。Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣステップならびに不活性型−１および凝集体不純物の両方の除去のための条件としては、以下のものが挙げられる：４．８〜５．２の充填ｐＨで２６〜３１ｇ／Ｌの充填比。さらに、第一洗浄液は、７．０〜７．２のｐＨを有した。カラム充填ステップおよび洗浄ステップは、収率および凝集体クリアランスに影響を及ぼした。
【０２１６】
サイクル−１  ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ精製工程における第二カラムステップの主な役割（第一カラムはプロテインＡである）は、活性単量体ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ生成物から、ジスルフィド・スクランブル化生成物関連不純物、すなわち不活性型−１種を除去することであった。サイクル−１では、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ブチル６５０Ｍ樹脂を用いて、この分離を実施した。しかしながら、ブチル６５０Ｍ樹脂は、それが相対的に低い結合容量であるため、力価増大に適していない、という点で制限された。したがって、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ  サイクル−２工程開発のための課題は、サイクル−１で達成したものに匹敵する不活性型−１クリアランスを保持しながら、（カラムサイクルを最小にしながら増大された力価に対応するために）第二カラムステップの容量を増大するための条件を確定することであった。高容量ＩＥＸ樹脂を用い、そして中間洗浄ステップを用いて堅調な不活性型−１クリアランスを可能にした。
【０２１７】
選択された陽イオン交換／ＨＩＣ混合モード樹脂は、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（ＧＥ／Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。０．６６ｃｍ（Ｉ．Ｄ．）×１５〜２０ｃｍ層高のガラスカラム（Ｏｍｎｉｆｉｔ）を用い、実験を室温（２２〜２６℃）で実施した。
【０２１８】
Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ樹脂は、混合モードリガンド（ＧＥ／Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で誘導体化された架橋アガロースビーズで構成される。リガンドは、イオン相互作用および疎水性型相互作用を包含する、標的タンパク質との相互作用のためのいくつかの多重官能基を含有する。したがって、樹脂を、疎水性モードおよび陽イオン性モードの両方のクロマトグラフィーで操作し得る。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ精製工程に関しては、陽イオンモードでＣａｐｔｏ  ＭＭＣカラムを操作したが、この場合、緩衝液ｐＨおよび／または緩衝液導電性を増大することにより、樹脂からＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを溶出した。
【０２１９】
Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ展開中に実施したアッセイは、分析的ＨＩＣおよび分析的ＳＥＣであった。
【０２２０】
収率を確定するためにＯＤ２８０を用いるほかに、方程式（１）で定義されるような「活性単量体収率」を用いても、ＬＴＢＲ−Ｉｇ回収を定量した：
【数１】
2011514895.tif 000010
式中、Ｖは溶液体積（ｍＬ）であり、ＯＤ２８０は２８０ｎｍ／ｍＬでの吸光度である。ＨＰＬＣ−ＳＥＣおよび分析的ＨＩＣをそれぞれ用いて、単量体％および「活性」種％を測定した。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ凝集体は、二量体（ジスルフィド結合分子の４つの鎖を含有する多量体として定義される）および高分子量種の両方を包含した。
【０２２１】
Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣに関する５％貫流での動的結合容量（ＤＢＣ）を、方程式（２）を用いて算定した：
【数２】
2011514895.tif 000011
式中、Ｃ０は充填中のタンパク質の濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり、ＶＢＴは５％貫流時点で充填された体積（ｍＬ）であり、ＶＢは樹脂層の総体積であり、そしてＶＤＶは系およびカラムデッドボリュームである。
【０２２２】
Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ樹脂（混合モード）は、活性単量体ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ（所望の生成物）から、不活性型−１形態を効果的に分離し得、凝集化形態を部分的に分離し得た。Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣは、活性形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ、ならびに凝集体種の一部をともに分離し得た。
【０２２３】
３つの実験を実施して、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ樹脂のための操作条件を限定し、ならびに初期細胞培養開発研究からの供給材料を用いて操作条件の変化に対する樹脂の感受性を調べた。これらの試験の結果は、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣの性能が、カラム充填、洗浄緩衝液ｐＨ、および洗浄緩衝液濃度に対して感受性であることを示した。カラム充填範囲を、２０〜３１ｍｇ  ＬＴＢＲ−Ｉｇ／樹脂１ｍＬであると確定し、洗浄−１緩衝液ｐＨをｐＨ７．０〜７．２に設定し、洗浄−１緩衝液濃度を約８０ｍＭ  Ｂｉｓトリスに設定した。第二洗浄液（洗浄−２）は、５．５〜５．７のｐＨ（例えばｐＨ５．６）、ならびに約２０〜３０ｍＭの酢酸ナトリウムの濃度を有した。５０ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を用いて、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを混合モード樹脂から溶出した。
【０２２４】
クロマトグラフィー条件の因子分析は、カラム充填比および洗浄溶液条件が分離のためには重要である、ということを確認した。
【０２２５】
展開中、バイオリアクター力価の増大は、混合モード第二カラムステップによる凝集体の部分的クリアランスを必要とする、凝集体レベルの増大を伴った。洗浄条件のストリンジェンシーを増大することにより、凝集体クリアランスを得た。しかしながら、生成物からの凝集体の完全分離は達成されなかった−洗浄中の部分的な生成物損失を犠牲にして、凝集体クリアランスを得た。生成物収率および凝集体クリアランスはカラム充填比および洗浄条件に依っていたため、最適操作範囲が両パラメーターに関して必要とされた。
【０２２６】
混合モードカラム操作条件ならびに不活性型−１および／または凝集体を分離する性能を、図１１に示す。不活性型−１クリアランスは堅調で、広範囲の充填および洗浄条件に亘って高生成物収率を伴った。これに対して、凝集体クリアランスは、最適範囲内でさえ、生成物収率に負の影響を及ぼし、かつ収率および凝集体クリアランスをカラム充填および洗浄条件に依存させる、よりストリンジェントな洗浄条件を要した。製造中、洗浄溶液に関して必要とされる最適範囲仕様は、緩衝構成成分におけるロット毎の可変性を示し、このため、溶液ロット記録の変更を要した。
【０２２７】
混合モード樹脂を用いた不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇおよび凝集体における低減の要約を、以下の表６に示す。表６は、同様の条件下でのＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ産生および精製の複数回の実行の分析を示す。混合モード樹脂の使用は、不活性型−１形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを、細胞培養工程から得られた元の混合物における約６％から、１％未満または検出不可能量に低減した。さらに、表６に示したように、凝集体のパーセンテージも約３０％（２８〜３５％）から約１０〜２４％に低減した。
【表６】
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Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ洗浄−１および溶出ステップ中の生成物関連不純物の脱着
【０２２８】
Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣステップ中の生成物関連不純物のクロマトグラフィー的挙動を調べるために、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ洗浄−１および溶出を通して、画分を収集した。吸光度、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＨＩＣ−ＨＰＬＣ、ならびに確定された各々の個々の生成物関連種の総量により、各画分を分析した。用いた条件下では、不活性型−１種は洗浄−１工程中に効率的に除去され、溶出画分中で検出不可能であった、ということをこの分析は明示した。これに対して、高分子量変異体および二量体（集合的に凝集体と呼ばれる）は、洗浄−１および溶出プール中で回収された。注目すべきは、凝集体の脱着が、ｐＨ７．０での洗浄−１工程終了前に、ならびに洗浄−２（ｐＨ５．６）の開始前に減少したことであった。したがって、わずかな塊の凝集体が洗浄−１（８０ｍＭのＢｉｓ−トリス中、ｐＨ７．０）中のカラムから生じたが、一方、さらなる凝集体はカラムが５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶出されるまで依然として結合したままであった。活性単量体および不活性型−２が、洗浄−１ステップ中および溶出ステップ中にカラムから脱着した。溶出プールの分析は、それが活性単量体に関して濃化された、ということを明示した。充填物質中および溶出プール中の不活性型−２のパーセントが同様であったため、これは主に、洗浄−１ステップ中の不活性型−１および凝集体の優先的損失によるものであった。
フェニルセファロース樹脂
【０２２９】
フェニルセファロース６Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉ  Ｓｕｂ（フェニルセファロース）は、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ精製工程における最終（第三）クロマトグラフィーステップであった。フェニルセファロースは、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇに対するその高結合容量ならびに工程関連不純物および生成物関連不純物から生成物を分離する能力のため、最終仕上げカラムとして選択される疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂である。当該ステップは、凝集体および不活性型−２形態のＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを除去することを見出した。供給材料中に存在する高レベルの凝集体を除去するために、層高を２０ｃｍから３０ｃｍに拡大することにより、ＨＩＣ第三カラムの分離力を増大させた。さらに、フェニルステップは、宿主細胞ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラムｒプロテインＡ溶脱液および潜在的ウイルス夾雑物のさらなるクリアランスを提供した。リスク査定と組合せたクロマトグラフィー条件の因子分析は、図１２に示したように、カラム充填および樹脂ロット（リガンド密度）が分離のための重要因子である、ということを確認した。硫酸アンモニウムによる充填調整後、Ｃａｐｔｏ  ＭＭ溶出物プールをフェニルセファロースカラム（フェニルセファロース６Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （ｈｉ  ｓｕｂ）；０．６６ｃｍ（Ｉ．Ｄ．）×２０〜４０ｃｍ層高ガラスカラム）上に充填した。充填範囲および層高を、凝集体および不活性型−２のクリアランスのために最適化したが、この場合、凝集体パーセンテージは１％未満であり、不活性型−２はＬＬＯＱ未満であった。
【０２３０】
ＨＩＣスクリーニングおよびフェニルセファロースＦ．Ｆ．クロマトグラフィー工程の展開中に用いたアッセイは、分析的ＨＩＣおよび分析的ＳＥＣであった。
【０２３１】
収率を確定するためにＯＤ２８０を用いるほかに、方程式（１）で定義されるような「活性単量体収率」を用いても、ＬＴ−β−Ｒ回収を定量化した：
【数３】
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式中、Ｖは溶液体積（ｍＬ）であり、ＯＤ２８０は２８０ｎｍ／ｍＬでの吸光度である。
【０２３２】
ＨＰＬＣ−ＳＥＣおよび分析的ＨＩＣをそれぞれ用いて、単量体％および「活性」種％を測定した。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ凝集体種は、二量体および高分子量種の両方を包含した。
【０２３３】
凝集体クリアランスに及ぼす層高の作用を調べるために、フェニルセファロースを３つの層高（２０ｃｍ、３０ｃｍおよび４０ｃｍ）で詰め込んだ。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを、約１５ｍｇ  ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ／樹脂１ｍＬを目標にして、フェニルセファロースカラム上に充填し、次いで、３ＣＶの平衡溶液で洗浄した。カラムを洗浄し、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを硫酸アンモニウム緩衝液を用いて溶出した。画分を溶出中に収集し、収率および単量体含量に関して分析した。カラム充填および生成物回収を、吸光度（ＯＤ２８０）の測定により確定した。
【０２３４】
表７は、ＬＴ−β−Ｒ凝集体除去および回収に及ぼす層高および操作速度の作用を示す（供給：１５％凝集体、９％不活性型−２；カラム充填：１５ｍｇのＬＴ−β−Ｒ／樹脂１ｍＬ、硫酸アンモニウム溶出緩衝液濃度：０．３２５Ｍ、溶出体積：６ＣＶ）。ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇおよび凝集体タンパク質の最適分離を提供したパラメーターは、３０ｃｍの層高（サイクル−１フェニル層高における２０ｃｍに対して）および５０ｃｍ／時の流速を包含した。さらに、これらのパラメーターに伴う最適充填範囲は、１０〜２０ｇ／樹脂１Ｌであった。代替的には、１００ｃｍ／時の流速、および０．４４Ｍの硫酸アンモニウム（０．３〜０．５の範囲）の溶出溶液も有効であると確定した。
【表７】
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【０２３５】
表７で分かり得るように、フェニルカラムの層高を増大させると、活性ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ（上記では「活性単量体」）の全体的収率が改良し、凝集体パーセンテージは低減した。
【０２３６】
収率および凝集体クリアランスはカラム充填および樹脂リガンド密度に大きく依存しているため、それらのパラメーターに関しては最適操作範囲を要した（以下でさらに詳細に記載）。分離（２０％超の凝集体の除去）の難しさは、リガンド密度仕様と相関する樹脂性能におけるロット毎の可変性を示した。
【０２３７】
一般的に、フェニルステップは室温で、充填層高３０ｃｍで実行した。充填後、カラムを２．６ｍＭの酢酸、１．０Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．８で洗浄した（洗浄−１）。その後、２．６ｍＭの酢酸、０．４４Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．８を用いた洗浄後に、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇを溶出した。
【０２３８】
フェニル樹脂を用いたＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの凝集体不純物形態の低減についての要約を表８に示すが、これは、同様条件下でのＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇ産生および精製の複数回の実行の分析を提供する。
【表８】
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【０２３９】
要するに、フェニルＨＩＣ工程の使用は、凝集体のパーセンテージを１％未満に低減した。フェニルＨＩＣステップは、不活性型−２形態のＬＴＢＲ−Ｉｇも１％未満に低減した。
１５，０００Ｌ規模のためのサイクル−２の使用
【０２４０】
サイクル−２を大規模で、すなわち１５，０００Ｌで首尾よく用いて、望ましくない不純物、例えば凝集体および２つの不活性形態のタンパク質からＬＴＢＲ−Ｉｇを精製した。１５，０００Ｌ規模への最初の移行時には、工程を保存的に操作して、生成物の品質に対するリスクを最小限にした。採取は１４日目または１５日目に行い、３０％の凝集体がバイオリアクター中に含まれていた。サイクル−２は、不活性型−１および凝集体のクリアランスを促進するための第二カラム上への高充填量、ならびに凝集体および不活性型−２クリアランスを促進するための第三カラム上への低充填量を包含した。
【０２４１】
バッチ１〜３における工程実施に基づいて、その後、より高収率の条件下で工程を操作した（バッチ４〜７）が、この場合、採取は１６日目で、３５％の凝集体がバイオリアクター中に含まれていた。第三カラム上の高充填量を実施して、高収率を促進した。図１３は、１５ｋ製造における、変更した下流工程の重要な実施特徴の要約を提供する。
要約
【０２４２】
全体的工程を要約するために、細胞培養採取物の清澄化はディスクスタック遠心分離を用いた。トリトンＸ−１００を、ウイルス不活性化のために清澄化状態調節培地に付加した。清澄化状態調節培地を組換えプロテインＡ（ｒプロテインＡ）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅクロマトグラフィーカラム上で処理して、生成物を捕捉した。次に、低ｐＨウイルス不活性化を実施した。次いで、このウイルス不活性化ｒプロテインＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ溶出物を、外因性パルボウイルスクリアランスのためにＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ膜吸着装置（ＱＭＡ）を通して濾過した。生成物を、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ混合モードクロマトグラフィーにより精製し、その後、フェニルセファロース６Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉ  Ｓｕｂ（フェニルセファロース）を用いて疎水性相互作用クロマトグラフィー処理した。次に、フェニルセファロース溶出物を、Ｐｌａｎｏｖａ１５Ｎウイルス除去フィルターを通して濾過し、次いで、限外濾過（ＵＦ）により濃縮し、膜分離した。ＵＦ残存物をその後、１００ｇ／Ｌの生成物濃度で最終処方緩衝液中に処方して、−７０℃で保存した。
【０２４３】
サイクル２工程（特に、混合モードとその後のフェニルＨＩＣ）は、例えば１５，０００Ｌ規模の製造目的のための、ＬＴ−β−Ｒ−Ｉｇの産生および精製のスケールアップのために有効であることを立証した。サイクル−２工程を用いた不活性型−１、不活性型−２および凝集体パーセンテージの低減についてのパーセンテージの要約を、以下の表９に示す。
【表９】
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等価物
【０２４４】
本発明は、精製活性形態のＩｇ融合タンパク質、例えばＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ融合物に関する改良方法および組成物を特に提供する。本発明の具体的実施形態を考察してきたが、上記明細書は例証のためのものであり、本発明を限定するものではない。この明細書を再検討すれば、本発明の多数の変更が当業者に明らかになる。本発明の全範囲は、その全範囲の等価物とともに特許請求の範囲を、ならびに本明細書をこのような変更とともに参照することにより確定されるべきである。
【０２４５】
本明細書中で言及される出版物および特許は全て、各々の個々の出版物または特許が具体的に且つ個別に参照により援用されるべきであると示されているように、その記載内容が参照により本明細書中で援用される。
【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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