(57)【要約】  免疫グロブリンを細菌培養において産生させる方法であって、（ａ）第１の細菌宿主細胞において、免疫グロブリンの軽鎖を含む第１のポリペプチドを、前記免疫グロブリンの軽鎖を含む封入体を形成させるように発現させること；（ｂ）第２の細菌宿主細胞において、免疫グロブリンの重鎖を含む第２のポリペプチドを、前記免疫グロブリンの重鎖を含む封入体を形成させるように発現させること；（ｃ）再構成された重鎖および再構成された軽鎖を得るように、前記封入体から前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドを回収すること；および（ｄ）前記再構成された重鎖および再構成された軽鎖を、前記再構成された軽鎖および前記再構成された重鎖を主に無傷の免疫グロブリンとしてリフォールディングすることを可能にする条件のもとでリフォールディングすることを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンを細菌培養において産生させる方法であって、
（ａ）第１の細菌宿主細胞において、免疫グロブリンの軽鎖を含む第１のポリペプチドを、前記免疫グロブリンの軽鎖を含む封入体を形成させるように発現させること；
（ｂ）第２の細菌宿主細胞において、免疫グロブリンの重鎖を含む第２のポリペプチドを、前記免疫グロブリンの重鎖を含む封入体を形成させるように発現させること；
（ｃ）再構成された重鎖および再構成された軽鎖を得るように、前記封入体から前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドを回収すること；および
（ｄ）前記再構成された重鎖および再構成された軽鎖を、前記再構成された軽鎖および前記再構成された重鎖を主に無傷の免疫グロブリンとしてリフォールディングすることを可能にする条件のもとでリフォールディングすること
を含む方法。
【請求項２】
前記条件は約１：２の重鎖−軽鎖モル比を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の細菌宿主および前記第２の細菌宿主のそれぞれがグラム陰性細菌に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記グラム陰性細菌は大腸菌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫グロブリン分子をプロテインＡ／Ｇ／Ｌで精製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
２．５のＯ．Ｄ．６００を誘導時に有する場合、重鎖の１リットルの細菌培養液あたり少なくとも５０ｍｇの精製された免疫グロブリン分子の収量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの少なくとも一方が治療用成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの少なくとも一方が確認用成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
主に前記無傷の免疫グロブリンとして前記リフォールディングすることが、免疫グロブリンの少なくとも８０％を前記無傷の免疫グロブリンとして含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記重鎖はγファミリーに属する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記軽鎖はκファミリーに属する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記軽鎖はλファミリーに属する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法に従って産生される免疫グロブリン。
【請求項１４】
グラム陰性調製残留物と、少なくとも９０％の免疫グロブリンとを含む組成物。
【請求項１５】
最大でも１０％の免疫グロブリンフラグメントを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧからなる群から選択される、請求項１に記載の方法または請求項１４もしくは１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む、請求項１６に記載の方法または組成物。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンは、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト型抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法または請求項１４もしくは１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンは二重特異的抗体である、請求項１に記載の方法または請求項１４もしくは１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記免疫グロブリンは、霊長類免疫グロブリン、ブタ免疫グロブリン、マウス免疫グロブリン、ウシ免疫グロブリン、ヤギ免疫グロブリンおよびウマ免疫グロブリンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法または請求項１４もしくは１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、免疫グロブリン組成物およびその製造方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
様々な抗体が近年では有望な治療用タンパク質になってきており、抗体は、年間売上高が２００億ドルを越えるバイオ医薬品の主要なカテゴリーである。相次ぐ技術の波はモノクローナル抗体分野の成長を推し進めており、その成長は近年までは、市場シェアを２００８年の終わりまでは追い続けるであろうキメラ抗体（例えば、ＲｅｍｉｃａｄｅおよびＲｉｔｕｘａｎなど）が優位であった。しかしながら、傾向が変わりつつあり、ヒト化モノクローナル抗体および完全にヒト型のモノクローナル抗体が、組換え抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖおよびコンジュゲート化抗体）とともに、２０．９％の予測された複合年間成長率でのモノクローナル抗体市場の成長の原動力としてますます重要になる。
【０００３】
組換え抗体フラグメントが今でも着実な進歩を遂げ続けているが、抗体市場は依然として、全長型ＩｇＧ抗体によって優位が占められる。小さい抗体フラグメントは通常、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現システム（Ｗａｒｄ、１９９３；ＫｉｐｒｉｙａｎｏｖおよびＬｉｔｔｌｅ、１９９９）で産生されるのに対して、全長型モノクローナル抗体は、それらの起源がハイブリドーマに由来することのために、また、分子の複雑さのために哺乳動物細胞培養で従来から産生されている（Ｓｉｍｍｏｎｓ他、２００２）。全長型ＩｇＧのためのいくつかの代替発現システム、例えば、植物における代替発現システム（ＫｏおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ、２００５）、または、トランスジェニック動物の乳汁における代替発現システム（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ、２００２）などが実際に存在するが、これらは普及していない（ＫｉｐｒｉｙａｎｏｖおよびＬｅ  Ｇａｌｌ、２００４）。
【０００４】
２０年以上前に、Ｃａｂｉｌｌｙおよび共同研究者ら（Ｃａｂｉｌｌｙ他、１９８４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８１、３２７３〜７）が、ＩｇＧを産生させるという彼らの試みを報告した。Ｃａｂｉｌｌｙ他は、低い品質および不良な収量の生成物を得た。このことが、ＩｇＧを大腸菌において産生させることが２０年以上にわたって実用的でないと見なされた理由の１つであった。
【０００５】
米国特許第６３３１４１５号は、免疫グロブリン、または、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含有する免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを製造するためのプロセスを開示する。このプロセスでは、重鎖および軽鎖またはそれらのフラグメントの両方をただ１つの細胞において、または、別々の宿主細胞培養において産生させる１つまたは複数のベクターが使用され得る。もたらされた結果（図８Ｂおよび図９）は明瞭に、臨床適用のためには不適切である不均一な生成物を示す。
【０００６】
近年には、大腸菌における全長型抗体の組み立てが２つのグループによって報告されている（Ｓｉｍｍｏｎｓ他、２００２；Ｍａｚｏｒ他、２００７ｂ）。両グループは、可溶性の重鎖および軽鎖が可溶性の活性なＩｇＧ分子に組み立てられる細菌ペリプラズムへの可溶性の重鎖および軽鎖の分泌を行わせるベクターシステムを使用した。第１の研究（Ｓｉｍｍｏｎｓ他（２００２）、ならびに、米国特許第６９７９５５６号および米国特許出願公開第２００７００１５２４４号）では、組み立てられたＩｇＧに加えて、部分的に組み立てられた化学種（例えば、重鎖ダイマー、または、軽鎖のみと対形成したそのようなダイマーなど）を含有した抗体調製物が産生された。Ｓｉｍｍｏｎｓ他は、結論として、記載された技術が、全長型の非グルコシル化抗体を大腸菌において効率的に産生させるプロセスにおける重要な工程であること、および、収量が、研究目的のための材料を提供するには十分に大きいことを述べた。Ｓｉｍｍｏｎｓ他はさらに、治療剤としてのこれらのタンパク質の使用が、力価におけるさらなる増大とともに到来するにちがいないことを示唆した。第２の研究（Ｍａｚｏｒ他、２００７ｂ）では、発現条件のさらなる改善が、分泌のための１組のやや異なるプラスミドを使用して行われた。Ｍａｚｏｒ他は匹敵する質の様々なＩｇＧを得たが、それらは依然として、部分的に組み立てられた化学種を含有した（Ｍａｚｏｒ他、２００７ｂ、補足的な図４）。Ｍａｚｏｒ他（２００７ｂ）によって報告された産生収量は、低密度振とうフラスコ培養液から、約０．２ｍｇ／ｌ〜１ｍｇ／ｌであり、一方、Ｓｉｍｍｏｎｓ他（２００２）は、４０ＯＤ５５０の細胞密度に達した後、さらに８０時間にわたって誘導された高密度発酵について、１リットルの培養液あたり１５０ｍｇのＩｇＧもの大きい収量を報告した。比較することは困難であるが、Ｓｉｍｍｏｎｓ他の収量はおそらくは、振とうフラスコ培養液あたり数ｍｇに相当する。
【０００７】
米国特許出願公開第２００８０３０５５１６号は、免疫グロブリン分子、または、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインの機能的な部分を少なくとも含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントをグラム陽性細菌または真核生物細胞において産生させるための方法を教示する。この方法は、重鎖および軽鎖を２つの別個の宿主細胞において産生させ、免疫グロブリンの分子またはフラグメントをエクスビボにおいてリフォールディングすることを含む。この特許出願は、高分子量の生成物をグラム陰性の培養物において得ることにおける困難さのために、グラム陰性細胞における抗体の発現を明らかに教示していない。加えて、米国特許出願公開第２００８０３０５５１６号は、多量の所望されるタンパク質を大腸菌において産生させることの結果は多くの場合、収量および品質を低下させる封入体の形成およびその後のリフォールディングであると述べている。
【０００８】
Ｂｏｓｓおよび共同研究者ら（１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：３７９１〜３８０６）は、マウスＩｇＭの軽鎖および重鎖をただ１つの大腸菌の培養または別々の大腸菌の培養において産生させることを教示する。残存抗体活性のみが、封入体からの再構成およびリフォールディングが行われたときに検出された。示された収量は、放射能に基づく分析でのみ、生成物が特定されたように、不良であった（その図３を参照のこと）。
【発明の概要】
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、免疫グロブリンを細菌培養において産生させる方法であって、
（ａ）第１の細菌宿主細胞において、免疫グロブリンの軽鎖を含む第１のポリペプチドを、免疫グロブリンの軽鎖を含む封入体を形成させるように発現させること；
（ｂ）第２の細菌宿主細胞において、免疫グロブリンの重鎖を含む第２のポリペプチドを、免疫グロブリンの重鎖を含む封入体を形成させるように発現させること；
（ｃ）再構成された重鎖および再構成された軽鎖を得るように、封入体から第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを回収すること；および
（ｄ）再構成された重鎖および再構成された軽鎖を、再構成された軽鎖および再構成された重鎖を主に無傷の免疫グロブリンとしてリフォールディングすることを可能にする条件のもとでリフォールディングすること
を含む方法が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、そのような条件は約１：２の重鎖−軽鎖モル比を含む。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１の細菌宿主および第２の細菌宿主のそれぞれがグラム陰性細菌に属する。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、グラム陰性細菌は大腸菌である。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の方法はさらに、免疫グロブリン分子をプロテインＡ／Ｇ／Ｌで精製することを含む。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、２．５のＯ．Ｄ．６００を誘導時に有する場合、重鎖の１リットルの細菌培養液あたり少なくとも５０ｍｇの精製された免疫グロブリン分子の収量を有する。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの少なくとも一方が治療用成分を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの少なくとも一方が確認用成分を含む。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、主に無傷の免疫グロブリンとしてリフォールディングすることが、免疫グロブリンの少なくとも８０％を無傷の免疫グロブリンとして含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、重鎖はγファミリーに属する。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、軽鎖はκファミリーに属する。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、軽鎖はλファミリーに属する。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、上記で記載される方法に従って産生される免疫グロブリンが提供される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、グラム陰性調製残留物と、少なくとも９０％の免疫グロブリンとを含む組成物が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、組成物は最大でも１０％の免疫グロブリンフラグメントを含む。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧからなる群から選択される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫グロブリンは、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト型抗体からなる群から選択される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫グロブリンは二重特異的抗体である。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫グロブリンは、霊長類免疫グロブリン、ブタ免疫グロブリン、マウス免疫グロブリン、ウシ免疫グロブリン、ヤギ免疫グロブリンおよびウマ免疫グロブリンからなる群から選択される。
【００２９】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００３１】
【図１】図１は、各種Ｉｎｃｌｏｎａｌの発現ベクターの概略図である。ヒトγ１重鎖を発現させるためのプラスミドｐＨＡＫ−ＩｇＨ、ヒトκ軽鎖を発現させるためのプラスミドｐＨＡＫ−ＩｇＬ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体外毒素Ａ（ＰＥ３８）の短縮型形態に融合されるヒトγ１重鎖を発現させるためのプラスミドｐＨＡＫ−ＩｇＨ−ＰＥ３８、ＰＥ３８に融合されるヒトκ軽鎖を発現させるためのプラスミドｐＨＡＫ−ＩｇＬ−ＰＥ３８のマップ。
【００３２】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜図２Ｂは、Ｔ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌの大腸菌における発現および精製を示すタンパク質ゲル画像である。図２Ａ−１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ。レーン１、誘導前の大腸菌培養物。レーン２、誘導された重鎖。レーン３、誘導された軽鎖。レーン４、精製前のリフォールディングされたＩｇＧ。レーン５、プロテインＡ精製されたＩｇＧ。Ｍ、ＭＷマーカー（ｋＤａ）。レーン６、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ。レーン７、プロテインＡ精製されたＴ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌ。レーン１〜レーン５が還元条件下で分析され、一方、レーン６〜レーン７は還元条件下で分析されなかった。タンパク質が、ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）による染色によって可視化された。図２Ｂは、ＨＲＰコンジュゲート化抗ヒト抗体およびＥＣＬ発色を使用する免疫ブロットである。レーン配置は、レーンＥ＝Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）を除いて、Ａの場合と同様である。
【００３３】
【図３】図３は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる、Ｔ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌ対Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）の分析を示すグラフである。ＩｇＧサンプルがＴＳＫ３０００カラムで分離された。矢印はこのカラムにおける市販サイズマーカーの移動パターンを表す。
【００３４】
【図４Ａ−Ｃ】図４Ａ〜図４Ｃは、Ｔ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌの結合特性を示すグラフである。図４Ａは、検出がＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧによるＥＬＩＳＡアッセイによって求められるようなＭＢＰ−ＣＤ３０に対する結合を示す。図４Ｂは、ＦＡＣＳ分析によって求められるようなＴ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌ抗体の結合を示す。左側パネル−安定なＡ４３１／ＣＤ３０トランスフェクション細胞（左側パネル、１）が、哺乳動物細胞で産生されたｃｈＴ４２７−ＩｇＧの１０ｎＭと、または、Ｔ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌとインキュベーションされた。右側パネル−競合剤としての３０倍モル過剰のＴ４２７（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８イムノトキシンの存在下におけるＴ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌの結合のＦＡＣＳ分析。結合が、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒト抗体を使用して検出された。図４Ｃは、Ｔ４２７−ＺＺ−ＰＥ３８の特異的な細胞毒性を示すグラフである。Ａ４３１／ＣＤ３０細胞が、示された濃度のＩｇＧ−ＺＺ−ＰＥ３８イムノコンジュゲートと、または、Ｔ４２７ＩｇＧだけと４８時間インキュベーションされた。生細胞の相対的な数が、酵素ＭＴＴアッセイを使用して求められた。それぞれの点が、３回の独立した実験において三連で求められる１組のデータの平均を表す。誤差棒がデータの標準偏差を表す。
【００３５】
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ〜図５Ｃは、ＩｇＧ−トキシン融合タンパク質およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによるそれらの分離を概略的に例示する。図５Ａは、本研究において作製されたｉｎｃｌｏｎａｌの概略図である。図５Ｂは、プロテインＡ精製されたＴ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌの非還元条件下での免疫ブロットである。レーン１、ＩｇＧ；レーン２、ＩｇＧ−（ジ）−ＰＥ３８；レーン３、ＩｇＧ−（テトラ）−ＰＥ３８。図５Ｃは、プロテインＡ精製されたＴ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌ−ＰＥ３８融合タンパク質の還元条件下での免疫ブロットである。レーン１、ＩｇＧ−（ジ）−ＰＥ３８；レーン２、ＩｇＧ−（テトラ）−ＰＥ３８。Ｍ、ＭＷマーカー（ｋＤａ）。
【００３６】
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａ〜図６Ｂは、Ｔ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌ−トキシン融合タンパク質を特徴づけるグラフである。図６Ａは、ＥＬＩＳＡにおけるＭＢＰ−ＣＤ３０に対する結合の評価を示す。検出が、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧと混合されるマウス抗ＰＥ血清により行われる。図６Ｂは、ｉｎｃｌｏｎａｌ−トキシン融合物の特異的な細胞毒性を示す：Ａ４３１／ＣＤ３０細胞が、示された濃度の組換えＩｇＧ−ＰＥ３８融合タンパク質と、または、参照物としてのＴ４２７（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８と４８時間インキュベーションされた。生細胞の相対的な数が、酵素ＭＴＴアッセイを使用して求められた。それぞれの点が、３回の独立した実験において三連で求められる１組のデータの平均を表す。誤差棒がデータの標準偏差を表す。
【００３７】
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ〜図７Ｂは、抗ＥＧＦＲ  ２２５Ｉｎｃｌｏｎａｌの結合特性を示すグラフである。図７Ａ−全細胞ＥＬＩＳＡによって調べられる、Ａ４３１細胞で発現されたＥＧＦＲに対する結合。検出がＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧにより行われる。図７Ｂ−ＦＡＣＳ分析：（ｂ１）Ａ４３１細胞が、１０ｎＭの２２５Ｉｎｃｌｏｎａｌと、または、コントロールとして使用される市販の抗ＥＧＦＲ抗体Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）とインキュベーションされた。（ｂ２）ＥＧＦＲを発現しないＧ４３メラノーマ細胞に対する、ｂ１の場合と同様なＦＡＣＳ分析。（ｂ３）競合剤としての３０倍モル過剰の２２５（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８イムノトキシンの存在下におけるＡ４３１細胞に対する２２５Ｉｎｃｌｏｎａｌ結合のＦＡＣＳ分析。結合が、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒト抗体を使用して検出された。
【００３８】
【図８Ａ−Ｃ】図８Ａ〜図８Ｃは、２２５Ｉｎｃｌｏｎａｌ−ＺＺ−ＰＥ３８の分析を示すグラフである。図８Ａ−下記細胞株のＥＧＦＲ発現レベルのＦＡＣＳ分析：Ａ４３１（濃いライトグレー）、ＨＥＫ２９３（濃いダークグレー）およびコントロールのＧ４３（薄いライトグレー）。ＥＧＦＲレベルが、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒト抗体と混合されるＣｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）による染色によって検出された。図８Ｂ−（高レベルのＥＧＦＲを発現する）Ａ４３１細胞に対する２２５Ｉｎｃｌｏｎａｌ−ＺＺ−ＰＥ３８の細胞殺傷アッセイ。図８Ｃ−細胞が、示された濃度のＩｇＧ−ＺＺ−ＰＥ３８イムノコンジュゲートと、または、ＩｇＧだけと４８時間インキュベーションされた、（低レベルのＥＧＦＲを発現する）ＨＥＫ２９３細胞に対する２２５Ｉｎｃｌｏｎａｌ−ＺＺ−ＰＥ３８の細胞殺傷アッセイ。生細胞の相対的な数が、酵素ＭＴＴアッセイを使用して求められた。それぞれの点が、３回の独立した実験において三連で求められる１組のデータの平均を表す。誤差棒がデータの標準偏差を表す。
【００３９】
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ〜図９Ｂは、１００％ウシ血清においてインキュベーションされたときの、哺乳動物細胞により産生されるＴ４２７の安定性、および、Ｔ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌの安定性の分析を示すグラフである。ＩｇＧが１００％ウシ血清において３０μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈され、示された時間にわたって３７℃でインキュベーションされた。それぞれの一部分の、ＭＢＰ−ＣＤ３０に対する残存結合活性が、図４Ａにおいて記載されるようなＥＬＩＳＡによって評価された。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、免疫グロブリン組成物およびその製造方法に関連する。
【００４１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
【００４２】
組換え抗体が今では診断および治療における中心的な様式になっており、非常に多数のモノクローナル抗体が臨床試験の様々な段階にある。したがって、組換え抗体の産生収量を最大にすることが非常に望ましい。これは、組換え抗体の産生収量を最大にすることにより、費用効率的な産生がもたらされるからである。
【００４３】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、封入体として発現されるときの原核生物細胞システムからの免疫グロブリンの産生収量および組み立てを最大にする条件を発見している。本発明の教示に従って作製される組換え抗体調製物は非常に均一であり、それによって、調製物における優勢な化学種が無傷の免疫グロブリンであり、一方、抗体フラグメントの存在は残余にすぎない。本明細書中に記載されるプロセスは、本質的に簡便であり、費用効果的であり、容易に規模拡大することができ、かつ、形質転換、タンパク質の精製およびリフォールディングの間における比較的短い継続期間によって特徴づけることができ、これらのことは、本明細書中に記載されるプロセスを細菌における抗体の工業的製造のために効果的にする。
【００４４】
従って、本発明の１つの局面によれば、免疫グロブリンを細菌培養において産生させる方法であって、
（ａ）第１の細菌宿主細胞において、免疫グロブリンの軽鎖を含む第１のポリペプチドを、免疫グロブリンの軽鎖を含む封入体を形成させるように発現させること；
（ｂ）第２の細菌宿主細胞において、免疫グロブリンの重鎖を含む第２のポリペプチドを、免疫グロブリンの重鎖を含む封入体を形成させるように発現させること；
（ｃ）再構成された重鎖および再構成された軽鎖を得るように、封入体から第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを回収すること；および
（ｄ）再構成された重鎖および再構成された軽鎖を、再構成された軽鎖および再構成された重鎖を主に（即ち、抗体種の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上）無傷の免疫グロブリンとしてリフォールディングすることを可能にする条件のもとでリフォールディングすること
を含む方法が提供される。
【００４５】
本明細書中で使用される「抗体種」は、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、重鎖モノマー、軽鎖モノマー、ヘテロマー状の重鎖−軽鎖）を示す。
【００４６】
用語「無傷の免疫グロブリン」または用語「無傷の抗体」は、本明細書中で使用される場合、典型的には免疫化を必要とするこの技術分野において広く知られている方法によって産生されるすべての抗体を示す（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。抗体は典型的にはモノクローナル抗体である。
【００４７】
完全な抗体または無傷の抗体は、少なくとも、ジスルフィド結合によって相互に連結される２つの重鎖（Ｈ鎖）および２つの軽鎖（Ｌ鎖）を含む。それぞれの重鎖が、重鎖可変領域（これは本明細書中ではＶＨと略記される）と、重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域が３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される。それぞれの軽鎖が、軽鎖可変領域（これは本明細書中ではＶＬと略記される）と、軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域が１つのドメイン（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、より保存されている領域（これはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）により中断される超可変性の領域（これは相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に分割され得る。それぞれのＶＨおよびＶＬが３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲはアミノ末端からカルボキシ末端に向かって下記の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の最初の成分（Ｃ１ｑ）を含めて、宿主の様々な組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。重鎖における定常ドメインのタイプに依存して、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの主要なクラスの１つに特定され、したがって、本発明の実施形態では、これらまたは下記の抗体サブタイプおよび抗体クラスのいずれもが想定される。これらのいくつかはさらに、サブクラスまたはイソタイプに分けられる（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２およびＩｇＡｓｅｃなど）。軽鎖は「κ」クラスまたは「λ」クラスに属し得る。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメインがそれぞれ、「α」、「δ」、「ε」、「γ」および「μ」と呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および三次元立体配置が広く知られている。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは、生理学的／臨床的状況において一般に使用されるものであり、本発明において用いられる抗体の例示的なクラスである。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態の抗体は、ヒト、ブタ、マウス、ウシ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコおよびヒツジなどを含めて、任意の哺乳動物起源に由来し得る。抗体は異種抗体である場合がある。本明細書中で使用される「異種抗体」は、トランスジェニック宿主（例えば、前記抗体を発現する植物など）に関連して定義される。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は、単離された無傷の抗体である（すなわち、異なる抗原的特異性を有する抗体以外の細胞物質、および／または、他の化学物質を実質的に含まない）。
【００５０】
本明細書中で使用される「組換え抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作出または単離される無傷の抗体を示し、例えば、（ａ）免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）について遺伝子導入されている動物（例えば、マウス）から単離される抗体、または、そのような動物から調製されるハイブリドーマから単離される抗体；（ｂ）抗体を発現させるために形質転換される宿主細胞から単離される抗体；（ｃ）組換え抗体ライブラリーから単離される抗体；および（ｄ）他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う何らかの他の手段によって調製、発現、作出または単離される抗体などを示す。特定の実施形態において、本発明の免疫グロブリンは、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有し得る。他の実施形態において、そのような組換えヒト抗体はインビトロ変異誘発に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、かつ、関連づけられる一方で、自然の状態ではインビボにおけるヒト抗体の生殖系列レパートリーにおいて存在しないかもしれない配列を含む。
【００５１】
免疫グロブリンの下記の例示的な実施形態が本発明の範囲によって包含される。
【００５２】
本明細書中で使用される「ヒト抗体」は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方が、例えば、Ｋａｂａｔ他によって記載されるようなヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する無傷の抗体を示す（Ｋａｂａｔ、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２）を参照のこと）。ヒト抗体の定常領域もまた、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって導入される変異、あるいは、インビボでの体細胞変異）を含むことができる。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウスなど）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列にグラフト化されている抗体を含むようには意図されない。
【００５３】
本明細書中で使用される「キメラな免疫グロブリン」は、可変領域が第１の生物種に由来し、定常領域が第２の生物種に由来する無傷の免疫グロブリンまたは抗体を示す。キメラな免疫グロブリンは、異なる生物種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから遺伝子操作によって構築することができる。
【００５４】
本明細書中で使用される「ヒト化免疫グロブリン」は、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）からの最小限のマウス部分がヒト抗体に移し替えられる無傷の抗体を示す；一般に、ヒト化抗体は５％〜１０％がマウス部分であり、９０％〜９５％がヒト部分である。
【００５５】
一般に、ヒト化抗体は、実質的にはすべての可変ドメインまたは１つ以上の（典型的には２つ）可変ドメインを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部を、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を少なくとも含む［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。
【００５６】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの技術においては広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、輸入残基と呼ばれており、この輸入残基は、典型的には、輸入可変ドメインに由来する。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って本質的には行うことができる［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全でないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この場合、一部のＣＤＲ残基およびおそらくは一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換される。
【００５７】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含む、この分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他およびＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されている遺伝子組換え動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、ヒト抗体の産生が認められ、この場合、その産生は、遺伝子再配置、組み立ておよび抗体レパートリーを含むすべての点に関してヒトにおいて見られる産生と非常に似ている。この方法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および下記の科学的刊行物：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。
【００５８】
本明細書中で使用される「二重特異的」抗体または「二機能性」抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体を示す。二重特異的抗体を、ハイブリドーマの融合を含む様々な方法によって作製することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ（１９９０）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５〜３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ他（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７〜１５５３を参照のこと。
【００５９】
本発明において適用されるＶＨ配列およびＶＬ配列は、この技術分野では知られている様々な技術のいずれか１つによって産生される抗体から得ることができる。
【００６０】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法がこの技術分野では広く知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００６１】
典型的には、抗体が、非ヒト動物（好ましくは、マウス）を、所望される抗原または免疫原を含む免疫原により免疫化することによってもたらされる。代替では、抗体が、例えば、Ｗａｒｄ他（Ｎａｔｕｒｅ、３４１（１９８９）、５４４）において開示されるように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によって提供され得る。したがって、免疫グロブリン抗体が最終的には細菌宿主において発現される限り、どのような抗体作製方法も、本発明の教示に従って想定される。
【００６２】
非ヒト哺乳動物を抗原により免疫化する工程を、マウスにおける抗体の産生を刺激することについてこの技術分野では広く知られているいずれかの様式で行うことができる（例えば、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））を参照のこと）。好ましい実施形態において、非ヒト動物は哺乳動物であり、例えば、齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどである。述べられたように、非ヒト哺乳動物は、「ヒト」抗体を産生させるために遺伝子改変または遺伝子操作することができる（例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ）またはＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ）など）。典型的には、免疫原が、必要な場合にはアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントなど）とともに緩衝液に懸濁または溶解される。免疫原の量、緩衝液のタイプおよびアジュバントの量を決定するための様々な方法が当業者には広く知られており、これらの方法は本発明に関して決して限定的ではない。これらのパラメーターは免疫原毎に異なり得るが、容易に明らかにされる。
【００６３】
同様に、抗体の産生を刺激するために十分な免疫化の場所および頻度もまた、この技術分野では広く知られている。典型的な免疫化プロトコルにおいて、非ヒト動物には、抗原が１日目に腹腔内注射され、約１週間後に再び腹腔内注射される。この後、２０日目前後での抗原のリコール（ｒｅｃａｌｌ）注射が、必要な場合にはアジュバント（不完全フロイントアジュバントなど）とともに行われる。リコール注射は静脈内に行われ、数日間連続して繰り返すことができる。この後、４０日目でのブースター注射が、典型的にはアジュバントを伴うことなく、静脈内または腹腔内のどちらかで行われる。このプロトコルにより、抗原特異的な抗体を産生するＢ細胞の産生が約４０日後にもたらされる。免疫化において使用される抗原に対する抗体を発現するＢ細胞の産生がもたらされる限り、他のプロトコルもまた利用することができる。
【００６４】
代替となる実施形態において、免疫化されていない非ヒト哺乳動物からのリンパ球が単離され、インビトロで成長させられ、その後、細胞培養において免疫原にさらされる。その後、リンパ球が集められ、下記で記載される融合工程が行われる。
【００６５】
モノクローナル抗体については、その次の工程が、免疫化された非ヒト哺乳動物からの脾臓細胞の単離、および、抗体産生ハイブリドーマを形成するための、そのような脾臓細胞と、不死化細胞とのそれに続く融合である。非ヒト哺乳動物からの脾臓細胞の単離はこの技術分野では広く知られており、典型的には、脾臓を麻酔された非ヒト哺乳動物から取り出すこと、脾臓を小片に切り刻むこと、および、単細胞懸濁物を作製するように、脾臓細胞を脾臓被膜から、細胞ろ過器のナイロンメッシュに通して、適切な緩衝液の中に絞り出すことを伴う。細胞は洗浄され、遠心分離され、（赤血球が存在すれば）赤血球を溶解する緩衝液に再懸濁される。溶液が再び遠心分離され、ペレットにおける残留するリンパ球が最後に、新鮮な緩衝液に再懸濁される。
【００６６】
いったん単離され、単細胞懸濁物で存在すると、リンパ球は不死性細胞株に対して融合される。これは典型的にはマウスのミエローマ細胞株であるが、ハイブリドーマを作出するために有用な多くの他の不死性細胞株がこの技術分野では知られている。好ましいマウスミエローマ系統には、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、米国）から入手可能な、ＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するミエローマ系統、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ、米国）から入手可能なＸ６３  Ａｇ８６５３細胞およびＳＰ−２細胞が含まれるが、これらに限定されない。融合が、ポリエチレングリコールなどを使用して達成される。得られたハイブリドーマは、その後、融合されていない親ミエローマ細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含有する選択培地において成長させられる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を有しないならば、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、この場合、そのような物質により、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長が妨げられる。
【００６７】
ハイブリドーマは典型的には、マクロファージのフィーダー層の上で成長させられる。マクロファージは、好ましくは、脾臓細胞を単離するために使用される非ヒト哺乳動物の同腹子に由来し、典型的には、ハイブリドーマを置床する数日前に、不完全フロイントアジュバントなどにより抗原刺激処理される。様々な融合方法が、Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、５９頁〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）に記載される。
【００６８】
細胞は、コロニー形成および抗体産生のための十分な期間、選択培地において成長させられる。これは通常、７日〜１４日の間である。その後、ハイブリドーマのコロニーが、免疫原／抗原と結合する抗体の産生についてアッセイされる。アッセイは典型的には、比色法によるＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマが成長させられるウエルに適合化され得るアッセイはどれも用いることができる。他のアッセイには、免疫沈降および放射免疫アッセイが含まれる。所望される抗体産生について陽性であるウエルが、１つまたは複数の異なるコロニーが存在するかどうかを明らかにするために調べられる。２つ以上のコロニーが存在するならば、細胞は、ただ１つの細胞が、所望される抗体を産生するコロニーを生じさせていることを確実にするために再クローン化し、成長させることができる。ただ１つの明らかなコロニーを有する陽性のウエルが典型的には、１つのモノクローナル抗体のみが検出および産生され続けることを保証するために再クローン化および再アッセイされる。
【００６９】
モノクローナル抗体を産生し続けていることが確認されるハイブリドーマが、その後、適切な培地において、例えば、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０などにおいて、より大きな量で成長させられる。代替では、ハイブリドーマ細胞を動物における腹水腫瘍としてインビボで成長させることができる。
【００７０】
所望されるモノクローナル抗体を産生させるために十分に成長させた後、モノクローナル抗体を含有する成長培地（または腹水）が細胞から分離され、それに存在するモノクローナル抗体が精製される。精製は典型的には、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用するクロマトグラフィー、あるいは、固体担体（例えば、アガロースビーズまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズなど）に連結された抗マウスＩｇによって達成される（これらはすべてが、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、刊行物番号１８−１０３７−４６、Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＡＣ）に記載される。その開示は本明細書により参照によって組み込まれる）。結合した抗体が典型的には、低いｐＨの緩衝液（ｐＨ３．０以下のグリシン緩衝液または酢酸塩緩衝液）を使用することによって、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムまたはプロテインＬカラムから溶出され、抗体含有分画物が直ちに中和される。これらの分画物はプールされ、透析され、必要に応じて濃縮される。
【００７１】
抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡが、（例えば、抗体（例えば、マウスまたはヒト）の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）従来の手順を使用して容易に単離され、配列決定される。単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに連結することができ、その後、発現ベクターが細菌宿主細胞にトランスフェクションされる。
【００７２】
免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、組換えＤＮＡ手法に都合よく供され得る、任意のベクターであり得る別々の組換えベクターに独立して挿入される。ベクターの選択は多くの場合、ベクターが導入されることになる宿主細胞に依存する。
【００７３】
具体的な実施形態によれば、重鎖コード配列および軽鎖コード配列の少なくとも一方はさらに、治療用成分または確認用成分の、読み枠を合わせた配列を含み、その結果、（例えば、治療適用において、例えば、ガン細胞を殺すことなどにおいて使用される）イムノトキシンを生じさせるようにされ、また、（例えば、診断適用において使用される）免疫標識を生じさせるようにされる。したがって、本発明の実施形態によれば、重鎖が、そのような成分の、読み枠を合わせた融合を含み、または、軽鎖が、そのような成分の、読み枠を合わせた融合を含み、または、重鎖および軽鎖の両方が、そのような成分の、読み枠を合わせた融合を含む（図５Ａを参照のこと）。
【００７４】
確認用成分は、結合対のさらなる構成要素とのその相互作用を介して特定可能である結合対の構成要素、および、直接に可視化される標識であり得る。１つの例において、結合対の構成要素は、対応する標識された抗体によって特定される抗原である。１つの実施形態において、標識は、蛍光性タンパク質、または、比色反応を生じさせる酵素である。
【００７５】
下記の表１は確認用成分の配列の例を提供する。
【表１】
2011514161.tif 000002
【００７６】
治療用成分は、例えば、細胞毒性成分、毒性成分、サイトカイン成分および二重特異的抗体成分であり得、それらの例が下記において提供される。
【００７７】
下記の表２は治療用成分の配列の例を提供する。
【表２】
2011514161.tif 000003
【００７８】
そのような融合はまた、化学的なコンジュゲート化を使用して、（すなわち、組換えＤＮＡ技術によることなく）達成され得ることが理解される。
【００７９】
ベクターの構成成分には一般に、下記の１つまたは複数が含まれるが、それらに限定されない：プロモーター、複製起点、１つまたは複数の選択マーカー、および、転写終結配列。したがって、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製とは無関係であるベクター（例えば、プラスミド）であり得る。代替として、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、ベクターが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであり得る。
【００８０】
ベクターは好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ＤＮＡの転写のために要求されるさらなるセグメントに機能的に連結される発現ベクターである。一般に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するか、あるいは、両者のエレメントを含有する場合がある。用語「機能的に連結される」は、セグメントがそれらの意図された目的のために協調して機能するように、例えば、転写がプロモーター内で始まり、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を介して進行するように、セグメントが配置されることを示す。
【００８１】
組換えタンパク質（すなわち、重鎖および軽鎖）を封入体（すなわち、染色性物質の核凝集物または細胞質凝集物）として生じさせることができる細菌宿主が選択される。
【００８２】
使用される宿主細胞（例えば、第１の宿主細胞および第２の宿主細胞）は、同一の生物種または異なる生物種に属し得る。
【００８３】
本発明の具体的な実施形態によれば、宿主細胞はグラム陰性細菌から選択される。
【００８４】
本明細書中で使用される「グラム陰性細菌」は、特徴的な染色特性を顕微鏡下で有する細菌を示し、この場合、グラム陰性細菌はグラム染色法の期間中に染色されないか、または、アルコールによって脱色されるかのどちらかである。グラム陰性細菌は一般に、下記の特徴を有する：（ｉ）それらの細胞壁は、（グラム陽性細菌においてはるかにより大きいレベルで存在する）ペプチドグリカンのほんの数層を含む；（ｉｉ）細胞が、ペプチドグリカン層の外側にある、（リピドＡ（コア多糖）およびＯ−多糖からなる）リポ多糖を含有する外膜によって取り囲まれる；（ｉｉｉ）ポーリンが外膜に存在し、特定の分子に対する細孔のように作用する；（ｉｖ）細胞周辺腔と呼ばれる、ペプチドグリカンの層と、二次的細胞膜との間の空間が存在する；（ｖ）Ｓ層が、ペプチドグリカンではなく、外膜に直接に結合する；（ｖｉ）リポタンパク質が多糖骨格に結合し、これに対して、グラム陽性細菌では、リポ多糖が存在しない。
【００８５】
本発明の教示に従って使用することができるグラム陰性細菌の例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ｅｒｗｉｎｉａ、および、Ｓｅｒｒａｔｉａが含まれるが、これらに限定されない。大腸菌以外のそのようなグラム陰性細菌、例えば、シュードモナス属細菌などを宿主細胞として使用することは、シュードモナス属細菌の代謝特性および生理学的特性の両方のために大きい経済的価値をもたらすことに留意しなければならない。特定の条件のもとで、例えば、シュードモナス属細菌は、大腸菌よりも大きい細胞培養密度に成長させることができ、したがって、潜在的により大きい生成物収量をもたらすことができる。
【００８６】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモーター（例えば、構成的または誘導可能）、および、必要な場合にはターミネーター配列をそれぞれ連結し、かつ、それらを、複製のために必要な情報を含有する好適なベクターに挿入するために使用される手順が、当業者には広く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）を参照のこと）。
【００８７】
本発明の教示に従った使用のために好適な細菌発現ベクターの例には、この分野では広く知られているｐＥＴ（商標）システム、Ｔ７システムおよびｐＢＡＤ（商標）システムが含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
発現ベクターを細菌宿主細胞に導入する様々な方法がこの分野では広く知られており、これらの方法は主に、使用される宿主システムに依存する。
【００８９】
宿主細胞は、同じ培地において共培養することができ、または、別々に培養することができる。
【００９０】
宿主細胞は、多量の組換え重鎖および組換え軽鎖の発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、組換えタンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素の条件が含まれるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細菌が、本発明の組換えタンパク質を産生させるために培養される任意の培地を示す。そのような培地には典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（例えば、ビタミンなど）を有する水溶液が含まれる。本発明の細菌宿主は、所望される量に依存して、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿において培養することができる。培養を、組換え宿主のために適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量で行うことができる。そのような培養条件は当業者の専門的知識の範囲内である。
【００９１】
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の適切な発現レベルが得られると、ポリペプチドが封入体から回収される。組換えタンパク質を細菌の封入体から回収する様々な方法がこの技術分野では広く知られており、そのような方法は典型的には、細胞溶解、それに続く、変性剤での可溶化を伴う［例えば、Ｄｅ  Ｂｅｒｎａｒｄｅｚ−ＣｌａｒｋおよびＧｅｏｒｇｉｏｕ、「封入体および凝集状態からのタンパク質の回収」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １：１〜２０（１９９１）。同様にまた、「大腸菌におけるＩｎｃｌｏｎａｌの発現」と題される下記の実施例の節を参照のこと］。
【００９２】
簡単に記載すると、封入体を、効果的な精製戦略を与える簡単な遠心分離によって細胞質タンパク質の大部分から分離することができる。その後、封入体は、尿素（例えば、８Ｍ）またはグアニジニウム塩酸塩のような強い変性剤によって、また、時には極端なｐＨまたは温度を伴って可溶化することができる。変性剤濃度、暴露時間および暴露温度はそれぞれのタンパク質について標準化されなければならない。完全に可溶化される前に、封入体は、混入タンパク質のいくらかを除くために、変性剤および界面活性剤の薄い溶液により洗浄することができる。
【００９３】
最後に、可溶化された封入体を変性条件下でのクロマトグラフィー技術によるさらなる精製に直接に供することができ、または、重鎖および軽鎖が精製前において生来の立体配座にリフォールディングされる場合がある。
【００９４】
したがって、再構成／リフォールディングされた重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチド（すなわち、可溶化されている還元されたポリペプチド）のさらなる精製を、リフォールディングの前において、および、代替として、または、加えて、リフォールディングの後において行うことができる。
【００９５】
抗体精製の様々な方法がこの技術分野では広く知られており、本明細書中上記および下記の実施例の節において記載される。ＩｇＧを精製するための他の方法が、「親イオウ様（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ−ｌｉｋｅ）相互作用を発現させるシアル酸によりグラフト化される担体でのＩｇＧおよびインスリンの精製」、Ｈａｍｉｄ  ＬａｋｈｉａｒｉａおよびＤａｎｉｅｌ  Ｍｕｌｌｅｒｂ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、第８１８巻、第１号、２００５年４月１５日、５３頁〜５９頁に記載される。
【００９６】
代替として、または、加えて、精製は、確認用成分または治療用成分を介して、（例えば、ＰＥ３８と結合する抗体カラムを使用して）親和性に基づくことができる。
【００９７】
リフォールディング収率を改善するために、再構成された重鎖および再構成された軽鎖は、免疫グロブリン（すなわち、無傷）の形成を最大限にするために選択される比率で提供される。この目的を達成するために、約１：１から１：３まで、１：１．５から１：３まで、１：２から１：３までの重鎖対軽鎖のモル比が提供される。例示的な実施形態において、重鎖対軽鎖のモル比は約１：２である。
【００９８】
したがって、上記で記載された方法論の実施形態により、様々な免疫グロブリンがもたらされる。そのような免疫グロブリンはｉｎｃｌｏｎａｌとも呼ばれる。そのようなｉｎｃｌｏｎａｌが配列番号１〜配列番号１２において提供される。
【００９９】
上記で記載された方法論は、前例のない収量の正しく折り畳まれている高度に精製された免疫グロブリンを原核生物細胞から得るために効率的である。正しい折り畳みを機能的および構造的に調べることができる。活性をアッセイする様々な方法が、下記の実施例の節において詳しく記載される（例えば、抗原認識、細胞殺傷）。
【０１００】
本発明の教示により、２．５のＯ．Ｄ．６００を誘導時に有する場合、重鎖の１リットルの細菌培養液あたり少なくとも５０ｍｇの精製された免疫グロブリン分子の免疫グロブリン収量がもたらされる。
【０１０１】
したがって、本発明の実施形態は、（本明細書中上記で記載されるような、例えば、リポ多糖を含むなどする）グラム陰性調製残留物と、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の免疫グロブリンとを含む組成物を提供する。
【０１０２】
本発明の組成物は好ましくは、２０％、１５％、１０％、５％またはさらにそれ以下を越える抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、重鎖モノマー、軽鎖モノマー、ヘテロマー状の重鎖−軽鎖、治療用成分および確認用成分）を含まない。
【０１０３】
グラム陰性残留物はさらに、この技術分野では広く知られている方法を使用して、（インビボでの）臨床適用のために除くことができる。
【０１０４】
所望されるとき、免疫グロブリンは、管理されたインビトロでのグリコシル化に供することができ、この場合、グリコシル化は、Ｉｓａｂｅｌｌｅ  Ｍｅｙｎｉａｌ−ｓａｌｌｅｓおよびＤｉｄｉｅｒ  Ｃｏｍｂｅｓ（タンパク質のインビトログリコシル化：酵素的アプローチ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４６巻、第１号、１９９６年４月１８日、１頁〜１４頁）によって記載される方法に従って行うことができる。
【０１０５】
免疫グロブリン、および、免疫グロブリンを含む組成物（例えば、医薬組成物）は、診断適用および治療適用において使用することができ、また、そのようなものとして、治療キットまたは診断キットに含めることができる。
【０１０６】
従って、本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分（即ち、免疫グロブリン）を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパック）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用担体に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上でさらに詳述されたように、示された症状を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１０７】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１０８】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。この用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【０１０９】
表現「から本質的になる」は、さらなる成分および／または工程が、特許請求される組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物または方法がさらなる成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１１１】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１１２】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１１３】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０１１５】
用語「例示的」は、本明細書では「例（ｅｘａｍｐｌｅ，ｉｎｓｔａｎｃｅ又はｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として作用する」ことを意味するために使用される。「例示的」として記載されたいかなる実施形態も必ずしも他の実施形態に対して好ましいもしくは有利なものとして解釈されたりかつ／または他の実施形態からの特徴の組み入れを除外するものではない。
【０１１６】
用語「任意選択的」は、本明細書では、「一部の実施形態に与えられるが、他の実施形態には与えられない」ことを意味するために使用される。本発明のいかなる特定の実施形態も対立しない限り複数の「任意選択的」な特徴を含むことができる。
【０１１７】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１１８】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１１９】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１２０】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａ��ｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１２１】
一般的な材料および方法
可溶性抗原としてのＭＢＰ−ＣＤ３０の調製。組換えＣＤ３０（ＧＥＮＥＢＡＮＫアクセション番号ＡＡＡ５１９４７）を大腸菌においてマルトース結合タンパク質融合物として発現させた。ヒトＣＤ３０の細胞外ドメイン（全長遺伝子産物の残基５１〜残基３８３）に対応するＤＮＡフラグメントを、テンプレートとしてのプラスミドｐＨＲ３０ＨＮＢ［Ｒｏｚｅｍｕｌｌｅｒ，Ｈ．、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．、Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．＆Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、ファージディスプレーによるＤＮＡ免疫化マウスからの新しい抗ＣＤ３０ｓｃＦｖの単離および短縮型シュードモナス菌体外毒素との融合によって作製される組換えイムノトキシンの生物学的活性、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、９２、８６１〜８７０（２００１）］をプライマーのＣＤ３０（Ｎ）−ＢｓｐＨＩ−ＦＯＲおよびＣＤ３０（Ｎ）−ＮｏｔＩ−ＲＥＶとともに使用するＰＣＲによって回収した（これらのＰＣＲプライマーのすべてが下記の表３に記載される）。
【表３】
2011514161.tif 000004
【０１２２】
ＰＣＲ生成物をＢｓｐＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＭＡＬｃ−ＮＨＮＮベクターにクローン化した（ｐＭＡＬｃ−ＮＨＮＮは、ＭＢＰコード配列の５’末端でのＨＩＳタグの付加によってｐＭＡＬｃ−ＮＮ［これは最初、Ｂａｃｈ，Ｈ．他、組換え細胞内細胞質単鎖抗体のための分子シャペロンとしての大腸菌のマルトース結合タンパク質、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３１２、７９〜９３（２００１）に記載された］から改変された、ＭＢＰ融合タンパク質の発現のためのプラスミドである）。タンパク質を本質的には他のＭＢＰ融合タンパク質について記載される通りに産生させ、精製した［Ｂａｃｈ，Ｈ．他、組換え細胞内細胞質単鎖抗体のための分子シャペロンとしての大腸菌のマルトース結合タンパク質、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３１２、７９〜９３（２００１）］。
【０１２３】
組換え２２５（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８イムノトキシンの調製。抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２２５の可変ドメインを、テンプレートとしてのプラスミドｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ＥＲ−２２５（ｓｃＦｖ）［Ｓｈａｋｉ−Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．、Ｚｆａｎｉａ，Ｒ．、Ｈｙｌａｎｄ，Ｓ．、Ｗｅｌｓ，Ｗ．Ｓ．＆Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．、安定な細胞内抗体のための普遍的戦略、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３０３、１９〜３９（２００５）］をプライマーの２２５−ＮｄｅＩ−ＦＯＲおよび２２５−ＮｏｔＩ−ＲＥＶとともに使用するＰＣＲによって回収した。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素を使用して線状化されたｐＲＢ９８−Ａｍｐ発現ベクター［Ｎａｇａｔａ，Ｓ．他、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメントを含有する新規な抗ＣＤ３０組換えイムノトキシン、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、８、２３４５〜２３５５（２００２）］の誘導体にクローン化した。（この誘導体では、ｓｃＦｖをクローン化するための３’末端部位として使用されるＨｉｎｄＩＩＩ部位が、この誘導体を一般的なファージディスプレーベクターからのサブローニングのために適合可能にするようにＮｏｔＩ部位により置き換えられた）。得られたプラスミド（これはｐＲＢ９８−Ａｍｐ−２２５（ｓｃＦｖ）−ＰＥ３８と名づけられた）を、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＢＳ５００細胞におけるｓｃＦｖ−ＰＥ３８単鎖イムノトキシンとしての発現のために使用した［Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．、Ｍａｔｔｅｓ，Ｒ．Ｅ．＆Ｂｕｃｋｅｌ，Ｐ．、大腸菌における組換え遺伝子の高レベル発現はｄｎａＹ遺伝子産物の利用可能性に依存する、Ｇｅｎｅ、８５、１０９〜１１４（１９８９）］。組換え単鎖イムノトキシンの発現、リフォールディングおよび精製を記載の通りに行った［Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．＆Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．、単鎖イムノトキシンとしての抗炭水化物ｍＡｂ（Ｂ１およびＢ５）のＦｖフラグメントのクローニング、発現および特徴づけ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、７、１５０９〜１５１５（１９９４）；Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．、Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．＆Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．、正しく折り畳まれた組換え融合タンパク質の収量を増大させるための方法：細菌の封入体の再生からの単鎖イムノトキシン、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０５、２６３〜２７０（１９９２）］。組換えイムノトキシンＴ４２７（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８の発現、リフォールディングおよび精製を記載の通りに行った（Ｎａｇａｔａ，Ｓ．、Ｏｎｄａ，Ｍ．、Ｎｕｍａｔａ，Ｙ．、Ｓａｎｔｏｒａ，Ｋ．、Ｂｅｅｒｓ，Ｒ．、Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．およびＰａｓｔａｎ，Ｉ．（２００２）、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメントを含有する新規な抗ＣＤ３０組換えイムノトキシン、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、８、２３４５〜２３５５）。
【０１２４】
キメラＩｇＧ１を哺乳動物細胞において発現させるためのベクターの構築
重鎖ベクター：抗ＣＤ３０抗体Ｔ４２７［Ｎａｇａｔａ，Ｓ．他、標識を用いない競合的免疫アッセイによるそれらのトポグラフィー的エピトープに基づくモノクローナル抗体の迅速な分類、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９２、１４１〜１５５（２００４）］のＶＨ可変ドメインを、プラスミドｐＲＢ９８Ａｍｐ−Ｔ４２７ＶＨ（Ｃ４４）−ＰＥ３８（ｄｓＦｖ−イムノトキシンのＶＨ−ｃｙｓ−ＰＥ３８成分のための発現ベクター）をテンプレートとして使用するＰＣＲによって回収した。Ｔ４２７のＶＨの５’末端側半分を、（ｄｓＦｖ立体配置においてｃｙｓに変異させられた）Ｇ４４を復活させるプライマーのＴ４２７ＶＨ−ＢｓｓＨＩＩ−ＦＯＲおよびＴ４２７ＶＨ−Ｃ４４Ｇ−ＲＥＶを使用して増幅した。Ｔ４２７のＶＨの３’末端側半分を、プライマーのＴ４２７ＶＨ−Ｃ４４Ｇ−ＦＯＲおよびＴ４２７ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＲＥＶを使用して増幅した。得られたＰＣＲ生成物を一緒にし、プライマーのＴ４２７ＶＨ−ＢｓｓＨＩＩ−ＦＯＲおよびＴ４２７ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＲＥＶを使用して無傷のＶＨドメインに組み立てた。ＶＨのＰＣＲ生成物をＢｓｓＨＩＩおよびＮｈｅＩで消化し、同じ酵素を使用して線状化されたｐＭＡＺ−ＩｇＨベクター［Ｍａｚｏｒ，Ｙ．、Ｂａｒｎｅａ，Ｉ．、Ｋｅｙｄａｒ、Ｉ．＆Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．、新規なＩｇＧ結合性トキシン融合体を使用して研究される抗体内部移行、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３２１、４１〜５９（２００７）］にクローン化した。得られたプラスミド（ｐＭＡＺ−ＩｇＨ−Ｔ４２７）を使用して、Ｔ４２７の重鎖（配列番号１、配列番号２）をキメラなＩｇＧ１形式で哺乳動物細胞において発現させた。
【０１２５】
軽鎖ベクター：抗ＣＤ３０抗体Ｔ４２７のＶ−κ可変ドメインを、プラスミドｐＲＢ９８Ａｍｐ−Ｔ４２７ＶＬ（Ｃ１０５）（ｄｓＦｖ−イムノトキシンのＶＬ−ｃｙｓ成分のための発現ベクター）をテンプレートとして使用するＰＣＲによって回収した。Ｔ４２７のＶＬを、（ｄｓＦｖ立体配置においてｃｙｓに変異させられた）Ｇ１０５を復活させたプライマーのＴ４２７ＶＬ−ＢｓｓＨＩＩ−ＦＯＲおよびＴ４２７ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＲＥＶを使用して増幅した。ＶＬのＰＣＲ生成物をＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、同じ酵素を使用して線状化されたｐＭＡＺ−ＩｇＬベクター（Ｍａｚｏｒ他、上掲）にクローン化した。得られたプラスミド（ｐＭＡＺ−ＩｇＬ−Ｔ４２７）を使用して、Ｔ４２７の軽鎖（配列番号３、配列番号４）をキメラなＩｇＧ１形式で哺乳動物細胞において発現させた。
【０１２６】
Ｉｎｃｌｏｎａｌを発現させるためのベクターの構築
重鎖ベクター：ヒトＩｇＧ１のＣ領域を有する抗ＣＤ３０抗体Ｔ４２７のＶＨ可変ドメインを、下記のように、ｐＭＡＺ−ＩｇＨ−Ｔ４２７（上記）から、Ｔ７に基づくＩＰＴＧ誘導可能な細菌発現ベクターにサブクローン化した：重鎖全体を、テンプレートとしてのプラスミドｐＭＡＺ−ＩｇＨ−Ｔ４２７をプライマーのＣＭＶ−ＳｅｑおよびＣＭＶ−ａｎｔｉｓｅｑ−ＥｃｏＲＩ−ＲＥＶとともに使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物をＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同じ酵素を使用して線状化されたｐＲＢ９８Ａｍｐ−Ｔ４２７ＶＨ（Ｃ４４）−ＰＥ３８ベクターにクローン化した。得られたプラスミド（ｐＨＡＫ−ＩｇＨ−Ｔ４２７）は、Ｔ４２７の重鎖をキメラなＩｇＧ１形式で大腸菌において発現させるために使用することができる。ＶＨドメインを、ＮｄｅＩ−ＮｈｅＩフラグメントとしてこのプラスミドに入れて交換することができる。Ｔ４２７ｉｎｃｌｏｎａｌの重鎖のＤＮＡ配列は、哺乳動物発現ベクターｐＭＡＺ−ＩｇＨによってコードされる重鎖配列（上掲）と同一である。
【０１２７】
抗ＥＧＦＲ抗体２２５の重鎖を大腸菌において発現させるための類似プラスミドを下記のように構築した：ＶＨ可変ドメインを、テンプレートとしてのプラスミドｐＣＭＶ／Ｈ６ｍｙｃ／ｃｙｔｏ−２２５（Ｆｖ）［Ｓｈａｋｉ−Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．、Ｚｆａｎｉａ，Ｒ．、Ｈｙｌａｎｄ，Ｓ．、Ｗｅｌｓ，Ｗ．Ｓ．＆Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．、安定な細胞内抗体のための普遍的戦略、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３０３、１９〜３９（２００５）］をプライマーの２２５ＶＨ−Ｎｄｅｌ−ＦＯＲおよび２２５ＶＨ−ＮｄｅＩ−ＲＥＶとともに使用するＰＣＲによって回収した。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、同じ酵素を使用して線状化されたｐＨＡＫ−ＩｇＨ−Ｔ４２７ベクター（上記）にクローン化した。得られたプラスミドをｐＨＡＫ−ＩｇＨ−２２５と名づけた（重鎖、配列番号５、配列番号６）。
【０１２８】
軽鎖ベクター：ヒトのＣ−κ領域を有する抗ＣＤ３０抗体Ｔ４２７の軽鎖を、下記のように、ｐＭＡＺ−ＩｇＬ−Ｔ４２７（上記）から、Ｔ７に基づくＩＰＴＧ誘導可能な細菌発現ベクターにサブクローン化した：軽鎖全体を、テンプレートとしてのプラスミドｐＭＡＺ−ＩｇＬ−Ｔ４２７をプライマーのＣＭＶ−ＳｅｑおよびＣＭＶ−ａｎｔｉｓｅｑ−ＥｃｏＲＩ−ＲＥＶとともに使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物をＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、同じ酵素を使用して線状化されたｐＲＢ９８Ａｍｐ−Ｔ４２７ＶＬ（Ｃ１０５）プラスミドベクターにクローン化した。得られたプラスミド（ｐＨＡＫ−ＩｇＬ−Ｔ４２７）は、Ｔ４２７の軽鎖をキメラなＩｇＧ１形式で大腸菌において発現させるために使用することができる。ＶＬドメインを、ＮｄｅＩ−ＢｓｉＷＩフラグメントとしてこのプラスミドに入れて交換することができる。Ｔ４２７ｉｎｃｌｏｎａｌの軽鎖のＤＮＡ配列は、哺乳動物発現ベクターｐＭＡＺ−ＩｇＬによってコードされる軽鎖配列（上掲）と同一である。
【０１２９】
抗ＥＧＦＲ抗体２２５の軽鎖を大腸菌において発現させるための類似プラスミドを下記のように構築した：Ｖ−κ可変ドメインを、テンプレートとしてのプラスミドｐＣＭＶ／Ｈ６ｍｙｃ／ｃｙｔｏ−２２５（Ｆｖ）［Ｓｈａｋｉ−Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．、Ｚｆａｎｉａ，Ｒ．、Ｈｙｌａｎｄ，Ｓ．、Ｗｅｌｓ，Ｗ．Ｓ．＆Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．、安定な細胞内抗体のための普遍的戦略、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３０３、１９〜３９（２００５）］をプライマーの２２５ＶＫ−Ｎｄｅｌ−ＦＯＲおよび２２５ＶＫ−ＢｓｉＷＩ−ＲＥＶとともに使用するＰＣＲによって回収した。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、同じ酵素を使用して線状化されたｐＨＡＫ−ＩｇＬ−Ｔ４２７ベクター（上記）にクローン化した。得られたプラスミドをｐＨＡＫ−ＩｇＬ−２２５と名づけた（配列番号７、配列番号８）。
【０１３０】
ＩｇＧ−ＰＥ３８融合タンパク質を発現させるためのベクターの構築。重鎖または軽鎖−ＰＥ３８融合タンパク質発現ベクターを、下記のように、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩのクローニング部位を抗体の定常領域の３’末端に挿入することによって改変されたｐＨＡＫベクター（上掲）の骨格上で構築した：重鎖ベクターについては、クローニング部位を、テンプレートとしてのプラスミドｐＨＡＫ−ＩｇＨをプライマーのＲＧＤ／ＴＡＴ−ＢｓｒＧＩ−ＦＯＲおよびＣＨ３−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＲＥＶとともに使用するＰＣＲによって挿入した。軽鎖ベクターについては、ｐＨＡＫ−ＩｇＬを、プライマーのＢｓｉＷＩ−Ｂａｃｋ−ＩｇＬおよびＣκ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＲＥＶとともにテンプレートとして使用した。ＰＣＲ生成物を、重鎖についてはＢｓｒＧＩおよびＥｃｏＲＩにより、軽鎖についてはＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩによりそれぞれ消化し、同じ酵素を使用して線状化されたｐＨＡＫ−ＩｇＨベクターおよびｐＨＡＫ−ＩｇＬベクターにそれぞれクローン化した。得られたベクターをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで線状化し、同じ酵素を使用してプラスミドｐＲＢ９８Ａｍｐ−Ｔ４２７ＶＨ（Ｃ４４）−ＰＥ３８から回収されたＰＥ３８ＤＮＡフラグメントと連結した。得られたベクターをｐＨＡＫ−ＩｇＨ−ＰＥ３８およびｐＨＡＫ−ＩｇＬ−ＰＥ３８と名づけた。
【０１３１】
哺乳動物細胞におけるキメラＩｇＧの発現。キメラなＴ４２７ＩｇＧ１を、本質的には記載される通りに（Ｍａｚｏｒ他、上掲）、プラスミドｐＭＡＺ−ＩｇＨ−Ｔ４２７およびプラスミドｐＭＡＺ−ＩｇＬ−Ｔ４２７と共トランスフェクションされ、Ｇ４１８およびヒグロマイシンにより選択されたＨＥＫ２９３細胞において発現させた。高発現クローンを選択した後、そのクローンを、１０％ＦＢＳ、グルタミンおよび抗生物質が補充されたＤＭＥＭにおいて拡大培養した。集める７２時間前に、細胞をＤＣＣＭ１（血清非含有）培地（Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）に移した。培地を４８時間〜７２時間の間隔で数回集めた。ＩｇＧを、記載される通りに（Ｍａｚｏｒ他、上掲）、プロテインＡクロマトグラフィーによって馴化培地から精製した。精製タンパク質のタンパク質濃度を、ＢＳＡを標準物とするＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって、または、２８０ｎｍにおける吸光度を求め、タンパク質濃度をその吸光係数に基づいて計算することによって求めた。精製ＩｇＧを４℃で貯蔵した。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）をＭｅｒｃｋから購入した。
【０１３２】
大腸菌におけるＩｎｃｌｏｎａｌの発現。Ｉｎｃｌｏｎａｌおよびｉｎｃｌｏｎａｌ−ＰＥ３８融合タンパク質を、発現ベクターにより形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＵＢＳ５００細胞［Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．、Ｍａｔｔｅｓ，Ｒ．Ｅ．＆Ｂｕｃｋｅｌ，Ｐ．、大腸菌における組換え遺伝子の高レベル発現はｄｎａＹ遺伝子産物の利用可能性に依存する、Ｇｅｎｅ、８５、１０９〜１１４（１９８９）］において発現させた。ＩｇＧの産生のために、細胞をｐＨＡＫ−ＩｇＨおよびｐＨＡＫ−ＩｇＬにより形質転換した。ＩｇＧ−（ジ）ＰＥ３８の産生のために、細胞をｐＨＡＫ−ＩｇＨ−ＰＥ３８およびｐＨＡＫ−ＩｇＬにより形質転換した。ＩｇＧ−（テトラ）ＰＥ３８の産生のために、細胞をｐＨＡＫ−ＩｇＨ−ＰＥ３８およびｐＨＡＫ−ＩｇＬ−ＰＥ３８により形質転換した。細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが補充されたＳＢ培地（３５ｇｒ／Ｌのトリプトン（Ｄｉｆｃｏ、米国）、２０ｇｒ／Ｌの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ、米国）、５ｇｒ／ＬのＮａＣｌ、６．３ｇｒ／Ｌのグリセロール（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル）、１２．５ｇｒ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、３．８ｇｒ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．４８ｇｒ／ＬのＭｇＳＯ４、０．４％（ｗ／ｖ）のグルコース）において、２５０ＲＰＭで振とうしながら、３７℃で成長させた。細菌の培養を、後期指数増殖期（２．５のＯＤ６００）におけるタンパク質発現のために１ｍＭのイソプロピル−ｌ−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドにより３７℃で３時間誘導した。不溶性の封入体として蓄積した組換えタンパク質を、遠心分離によって、溶解された細菌細胞から単離した。５００ｍｌの培養物から、約３ｇｒの湿った細胞ペーストが集められた。細胞を、ティッシュマイザー（ｔｉｓｓｕｅｍｉｚｅｒ）を使用して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ＨＣｌ）（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁した。細胞を溶解するために、リゾチームを５００ｍｇ／Ｌの最終濃度に加え、細胞を２５℃で１時間放置した。細胞溶解物を３００ｍＭのＮａＣｌおよび１．５％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ１００（ＳＩＧＭＡ、イスラエル）に調節し、ティッシュマイザーを使用して破砕した。不溶性画分を４℃における３０分間の１００００ＲＰＭ（ＧＳＡローター（Ｓｏｒｖａｌｌ））での遠心分離によって集めた。この封入体粗調製物をさらに、同じ緩衝液（１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ１００を伴う）におけるさらに２サイクルのホモジネーション、それに続く遠心分離によって精製した。最後に、封入体を、界面活性剤を含まない同じ緩衝液においてさらに１回処理し、遠心分離によって集めた。封入体を、６Ｍグアニジン塩酸塩、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ＨＣｌ）（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡにおいて完全に可溶化し、１：２の重鎖−軽鎖モル比で混合した。１リットルの振とうフラスコ培養液から、２００ｍｇ〜３００ｍｇの可溶化された封入体タンパク質が日常的に得られた。その後、この封入体ミックスを、２５℃で２時間、１０ｍｇ／ｍｌのジチオエリトリトール（ＳＩＧＭＡ、イスラエル）（６５ｍＭ）により還元した。
【０１３３】
具体的には、５０ｍｇの可溶化された重鎖タンパク質（５０ｋＤａのＭＷ）を、リフォールディング混合物として還元される前に、５０ｍｇの可溶化された軽鎖タンパク質（２５ｋＤａのＭＷ）と混合した。ＰＥ３８融合タンパク質の場合には、相対的な比率を分子量に合わせて調節した。例えば、約７０ｍｇの可溶化された重鎖−ＰＥ３８融合タンパク質（６８ｋＤａのＭＷ）を約３０ｍｇの可溶化された軽鎖（２５ｋＤａのＭＷ）と混合した。
【０１３４】
可溶化されている還元されたタンパク質を、レドックスシャフリング添加物および凝集防止添加物を含有するリフォールディング溶液（０．１ＭのＴｒｉｓ（ＨＣｌ）（ｐＨ９．５）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．９ｍＭの酸化型グルタチオンおよび１０５ｇｒ／ＬのＬ−アルギニン）に１：１００で希釈することによって８℃で３６時間リフォールディングした。リフォールディング後、タンパク質を、リン酸塩／尿素緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４を含有する２０ｍＭ、ならびに、１００ｍＭの尿素）に対して、７．４の最終ｐＨになるまで徹底的に透析した。その後、リフォールディングされた活性なタンパク質を、０．４５μｍのフィルターを使用してフィルター滅菌し、プロテインＡクロマトグラフィーによって、混入している細菌タンパク質、過剰な軽鎖および不適切に折り畳まれたタンパク質から分離した。精製ＩｇＧを４℃で貯蔵した。典型的には、５０ｍｇの重鎖を５０ｍｇの軽鎖タンパク質と混合することによって開始されるリフォールディングから、１５ｍｇに至るまでの純粋なＩｎｃｌｏｎａｌを得ることが可能である。
【０１３５】
抗ＥＧＦＲ  ２２５Ｉｎｃｌｏｎａｌを、ｐＨＡＫ−ＩｇＨ−２２５およびｐＨＡＫ−ＩｇＬ−２２５を有する細胞の培養物を使用して同じ方法で作製した。
【０１３６】
ＩｇＧ−ＺＺ−ＰＥ３８免疫複合体の調製。ｃｈＴ４２７ＩｇＧまたはｃｈ２２５ＩｇＧと、ＺＺ−ＰＥ３８融合タンパク質との免疫複合体を、本質的には記載される通りに（Ｍａｚｏｒ他、上掲）、ＩｇＧをＺＺ−ＰＥ３８融合タンパク質と混合し、免疫複合体をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、現在は、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（米国））ゲルろ過クロマトグラフィーによって精製することによって行った。
【０１３７】
ゲルろ過クロマトグラフィー。キメラＩｇＧの分析的分離を、供給者の推奨法に従って、３０ｍｌのＴＳＫ３０００カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ、日本）を高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ−Ｐｕｍｐ−Ｐ５００）で使用するゲルろ過クロマトグラフィーによって行った。約２００マイクログラムのサンプルを５００μｌにおいて負荷し、ＰＢＳを０．５ｍｌ／分の流速で緩衝液として用いた。
【０１３８】
ＥＬＩＳＡおよび全細胞ＥＬＩＳＡによる抗原結合の評価。キメラＩｇＧによる抗原結合を下記のようにＥＬＩＳＡで調べた：ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳにおける５μｇ／ｍｌのＭＢＰ−ＣＤ３０の溶液により４℃で２０時間被覆し、ＰＢＳにおける３％（ｖ／ｖ）脱脂乳により３７℃で１時間〜２時間ブロッキング処理した。すべてのその後の工程は室温（２５℃）で行った。プロテインＡ精製されたＩｇＧまたはＩｇＧ−ＰＥ３８融合タンパク質を５倍希釈系列でプレートに加え、ＭＢＰ−ＣＤ３０と結合するそれらの親和性について調べた。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴにより３回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒト抗体（ＩｇＧの場合）、または、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体と混合されるマウス抗ＰＥ血清（ＩｇＧ−ＰＥ３８融合タンパク質の場合）を、ＰＢＳＴにおいて５０００倍希釈で希釈された二次抗体として使用した。ＥＬＩＳＡを、発色性ＨＲＰ基質のＴＭＢを使用して発色させ、発色を１ＭのＨ２ＳＯ４により停止させた。結果を４５０ｎｍにおける吸光度としてプロットし、結合アビディティーを、最大シグナルの５０％を生じさせるＩｇＧ濃度として大まかに推定した。
【０１３９】
２２５ＩｎｃｌｏｎａｌおよびＣｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）による細胞ＥＧＦＲ結合を下記のように全細胞ＥＬＩＳＡによって調べた；ヒト類表皮ガンＡ４３１細胞を、９６ウエルプレートに、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭにおいて２Ｘ１０４細胞／ウエルの密度で１６時間播種した。培地を吸引し、細胞を、２５℃で１５分間、３％グルタルアルデヒドにより固定処理した。ウエルをＰＢＳにおける３％（ｖ／ｖ）脱脂乳により３７℃で１時間〜２時間ブロッキング処理した。次いで、ＩｇＧを、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡにおける５倍希釈系列でウエルに加え、２５℃で１．５時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳ＋３％ＢＳＡにより３回洗浄した後、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒト（ＰＢＳ＋３％ＢＳＡにおける５０００倍希釈）を２５℃で１時間加えた。洗浄サイクルをさらに１回行った後、細胞と結合した抗体の検出を、発色性ＨＲＰ基質のＴＭＢをそれぞれのウエルに加えることによって行い、発色を１ＭのＨ２ＳＯ４により停止させた。吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【０１４０】
フローサイトメトリー。細菌または哺乳動物により産生されたｃｈＴ４２７  ＩｇＧ１を用いた、Ａ４３１／ＣＤ３０トランスフェクション細胞［Ｒｏｚｅｍｕｌｌｅｒ，Ｈ．、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．、Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．＆Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、ファージディスプレーによるＤＮＡ免疫化マウスからの新しい抗ＣＤ３０ｓｃＦｖの単離および短縮型シュードモナス菌体外毒素との融合によって作製される組換えイムノトキシンの生物学的活性、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、９２、８６１〜８７０（２００１）］において発現するＣＤ３０に対する、Ｔ４２７に基づく分子の結合分析を、フローサイトメトリーによって調べた。イムノチューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）（５ｍｌのポリスチレンチューブ、Ｎｕｎｃ、スウェーデン）におけるおよそ５ｘ１０５個の細胞をそれぞれの実験において使用した。トリプシン処理の後、細胞をＰＢＳにおける２％のウシ胎児血清（ＦＡＣＳ緩衝液）で１回洗浄した。次いで、キメラＩｇＧをＰＢＳ＋３％ＢＳＡにおいて１０ｎＭの最終濃度で加え、細胞を４℃で１．５時間インキュベーションした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液により３回洗浄し、ＦＩＴＣ標識されたヤギ抗ヒト抗体（ＰＢＳ＋３％ＢＳＡにおける５０倍の希釈）を適切なチューブに４℃で４５分間加えた。結合した抗体の検出をＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＣＡ）でのフローサイトメトリーによって行い、結果をＣＥＬＬＱｕｅｓｔプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。特異性を確認するために、抗体を、１．５時間のインキュベーション期間の期間中に、３０倍過剰の競合タンパク質とともに、または、競合タンパク質を伴うことなくインキュベーションした。
【０１４１】
Ａ４３１細胞において発現するＥＧＦＲに対する、２２５に基づく分子の結合分析を、同じ様式で行った。
【０１４２】
細胞生存性アッセイ。キメラなＩｇＧ−ＺＺ−ＰＥ３８免疫複合体のインビトロ細胞殺傷活性およびＩｇＧ−ＰＥ３８融合タンパク質のインビトロ細胞殺傷活性をＭＴＴアッセイによって測定した。被試験細胞を、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭにおいて１ｘ１０４細胞／ウエルの密度で９６ウエルプレートに播種した。免疫複合体、ＩｇＧ−ＰＥ３８融合タンパク質またはコントロールタンパク質を１０倍希釈系列で（三連で）加え、細胞を５％ＣＯ２雰囲気において３７℃で４８時間インキュベーションした。４８時間後、培地を、１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（チアゾリルブルーテトラゾリアムブロミド、ＰＢＳに溶解）試薬を含有する新鮮な培地（１００μｌ／ウエル）によって取り換え、細胞をさらに４時間インキュベーションした。ＭＴＴ−ホルマザン結晶を、２０％ＳＤＳ、５０％ＤＭＦ（ｐＨ４．７）（１００μｌ／ウエル）を加え、３７℃で１６時間インキュベーションすることによって溶解した。５７０ｎｍでの吸光度を自動マイクロタイタープレートリーダーで記録した。結果が、下記の式を使用して、同時に処理された非処理コントロールに対する生細胞の百分率として表される：（処理サンプルのＯＤ５７０／非処理サンプルのＯＤ５７０）ｘ１００。ＩＣ５０値を、細胞成長を５０％阻害した免疫複合体濃度またはＩｇＧ−ＰＥ３８融合タンパク質濃度として定義した。
【０１４３】
血清におけるＩｇＧ安定性の評価
Ｉｎｃｌｏｎａｌ  ＩｇＧ  Ｔ４２７の安定性を、哺乳動物細胞の培養で産生された対応するｃｈＴ４２７ＩｇＧの安定性と比較するために、血清中での安定性アッセイを下記のように行った：ＩｇＧを１００％のウシ血清（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）において３０μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、示された期間、３７℃でインキュベーションした。それぞれの一部分のＭＢＰ−ＣＤ３０に対する残存結合活性を、上記で記載されるようにＥＬＩＳＡによって評価した。
【０１４４】
結果
本発明の教示は、本明細書中では「Ｉｎｃｌｏｎａｌ」とも呼ばれる、大腸菌における全長型ＩｇＧおよび全長型ＩｇＧ−トキシン融合タンパク質のための非常に効率的な産生方法を提供する。この方法は、タンパク質を不溶性の封入体として発現させること、その後、リフォールディングすることを伴う。Ｔ７に基づくベクターシステムを、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、あるいは、短縮型形態のシュードモナス菌体外毒素Ａ（ＰＥ３８）に融合される対応する重鎖または軽鎖を別々に発現させるために構築した。発現ベクターは、哺乳動物細胞でのＩｇＧ発現システムの構築のために使用される定常領域と同一であったヒトγ１重鎖およびヒトκ軽鎖の定常領域を含有した［Ｍａｚｏｒ，Ｙ．、Ｂａｒｎｅａ，Ｉ．、Ｋｅｙｄａｒ、Ｉ．＆Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．、新規なＩｇＧ結合性トキシン融合体を使用して研究される抗体内部移行、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３２１、４１〜５９（２００７）、図１］。
【０１４５】
モデル抗体は抗ＣＤ３０抗体Ｔ４２７であった［Ｎａｇａｔａ，Ｓ．他、標識を用いない競合的免疫アッセイによるそれらのトポグラフィー的エピトープに基づくモノクローナル抗体の迅速な分類、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２９２、１４１〜１５５（２００４）］。Ｔ４２７を、上記で記載されたように発現ベクターにクローン化し、産生させた。キメラなＴ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌの高度に精製された調製物の高収量が得られた（図２ａ〜図２ｂ）。比較のために、哺乳動物細胞により産生されたキメラなＴ４２７ＩｇＧ（Ｔ４２７ｃｈＩｇＧ）の回分処理物を、本質的には記載［Ｍａｚｏｒ他、２００７、上掲］の通りに調製した。細菌により産生されたＩｎｃｌｏｎａｌを、ゲルろ過クロマトグラフィー、抗原結合特性および細胞殺傷活性によって、哺乳動物細胞により産生されたＩｇＧと比較した。精製されたＴ４２７ＩｎｃｌｏｎａｌのアリコートをＴＳＫ３０００カラムでのゲルろ過クロマトグラフィーによって分析した。示されるように（図３）、Ｔ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌ（１４７５００の計算されたＭＷ）がモノマーとしてカラムから溶出した。コントロールの、哺乳動物細胞により産生されたｍＡｂであるＣｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）（１５１８００の計算されたＭＷ）は、おそらくは、大腸菌により産生されたＩｇＧには存在しない翻訳後修飾（グリコシル化）のために、わずかにより大きいモノマータンパク質として移動した。抗原結合をＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって調べた。図４ａに示されるように、Ｔ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌは、哺乳動物細胞培養で産生された対応するＴ４２７ｃｈＩｇＧに対する類似したアビディティーによりＥＬＩＳＡにおいて可溶性抗原と結合した。同様に、同一の結合特性をＣＤ３０発現細胞に対するフローサイトメトリー分析において認めることができた（図４ｂ１）。結合特異性を、（図４ｂ２）に示されるように、（上記で記載されるように調製される）Ｔ４２７（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８組換えイムノトキシンによるＴ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌの結合シグナルの競合によって明らかにすることができた。Ｉｎｃｌｏｎａｌ抗体が腫瘍細胞をインビトロで標的化することができるかを、（Ｍａｚｏｒ他（２００７、上掲）に記載されるように）抗体結合性トキシン融合タンパク質（ＺＺ−ＰＥ３８）との複合体を形成することによって評価した。細胞毒性評価ではまた、Ｔ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌが、哺乳動物細胞により産生された抗体の成績に匹敵することが明らかにされた（図４ｃ）。
【０１４６】
したがって、本発明の教示は、細胞毒性成分に遺伝子融合される全長型ＩｇＧを作製するための機会を提供し、また、結果として、ＩｇＧ−酵素融合タンパク質を検討するための機会を提供する。Ｔ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌのシュードモナス菌体外毒素融合タンパク質を調製した。２つの誘導体を調製した；Ｔ４２７（ジ）−ＰＥ３８誘導体（ＰＥ３８が抗体の重鎖に融合される）およびＴ４２７（テトラ）−ＰＥ３８（ＰＥ３８が抗体の重鎖および軽鎖の両方に融合される）。これらのＩｎｃｌｏｎａｌ−トキシン融合誘導体はそれらの分子量において異なり（ジトキシンについては約２２５ｋＤａであり、テトラトキシンについては約３００ｋＤａである）、また、それぞれの結合事象のために送達されるトキシン分子ペイロードの数において異なる（図５ａ）。Ｔ４２７（ジ）−ＰＥ３８およびＴ４２７（テトラ）−ＰＥ３８はともに、高純度（図５ｂ〜図５ｃ）で、かつ、ＩｇＧＩｎｃｌｏｎａｌについて得られる収量と類似する高い収量で産生された。これらの新規なタンパク質をそれらの結合特性およびそれらの細胞殺傷活性について評価した。示されるように（図６ａ）、Ｔ４２７（ジ）−ＰＥ３８およびＴ４２７（テトラ）−ＰＥ３８の両方についてのＥＬＩＳＡシグナルから評価されるような見かけの結合親和性は約０．２ｎＭであり、これは、（図４ａに示される）Ｔ４２７ＩｎｃｌｏｎａｌおよびＴ４２７ｃｈＩｇＧの見かけの結合親和性と類似している。両方のＩｇＧが、対応する一価の組換えイムノトキシンであるＴ４２７（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８の親和性よりも１０倍大きかった見かけのアビディティーで結合した。
【０１４７】
Ｔ４２７（ジ）−ＰＥ３８ｉｎｃｌｏｎａｌ−トキシン融合タンパク質およびＴ４２７（テトラ）−ＰＥ３８ｉｎｃｌｏｎａｌ−トキシン融合タンパク質の細胞殺傷能を、培養されたＣＤ３０発現細胞に対して調べた。図６ｂに示されるように、両方の分子が約３０ｐＭのＩＣ５０により標的細胞の成長を阻害し、これに対して、一価のイムノトキシンであるＴ４２７（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８は約６０ｐＭのＩＣ５０を有した。
【０１４８】
さらなる例として、抗ＥＧＦ受容体抗体２２５のＩｎｃｌｏｎａｌ誘導体を作製した。ＭＡｂ２２５は、治療用抗体Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）が由来した元のマウスモノクローナル抗体である［Ｒｏｗｉｎｓｋｙ，Ｅ．Ｋ．、ｅｒｂＢファミリー：ガンに対する治療剤開発のための標的ならびにモノクローナル抗体およびチロシンキナーゼ阻害剤を使用する治療戦略、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ、５５、４３３〜４５７（２００４）］。２２５Ｉｎｃｌｏｎａｌを、抗原結合特性について（図７ａ〜図７ｂ）、また、ＺＺ−ＰＥ３８免疫複合体としての細胞殺傷活性について（図８ａ〜図８ｃ）、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）と比較した。図７ａ〜図７ｂに示されるように、２２５ＩｎｃｌｏｎａｌはＣｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）の親和性の約１／１０の親和性でＥＧＦＲ発現細胞と特異的に結合した。同様に、２２５Ｉｎｃｌｏｎａｌ−ＺＺ−ＰＥ３８免疫複合体は、高ＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞株および低ＥＧＦＲ発現２９３細胞株の両方に対する細胞毒性活性を有したが、これは、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）−ＺＺ−ＰＥ３８免疫複合体の約１／１０の強さであった（図８ａ〜図８ｃ）。この違いは、２２５ｍＡｂとの比較においてＣｅｔｕｘｉｍａｂ（登録商標）について報告される報告された１０倍の親和性増大と一致している［Ｒｏｗｉｎｓｋｙ他、上掲］。
【０１４９】
Ｉｎｃｌｏｎａｌ  ＩｇＧ  Ｔ４２７の性状を、哺乳動物細胞培養で産生された対応するｃｈＴ４２７ＩｇＧの性状とさらに比較するために、血清中での安定性アッセイを下記のように行った：ＩｇＧを１００％のウシ血清（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）において３０μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、示された期間、３７℃でインキュベーションした。それぞれの一部分のＭＢＰ−ＣＤ３０に対する残存結合活性を、図４ａにおいて記載されるようにＥＬＩＳＡによって評価した。図９ａ、図９ｂに示されるように、哺乳動物細胞により産生されたｃｈＴ４２７ＩｇＧと、Ｔ４２７Ｉｎｃｌｏｎａｌとは同等に安定であり、結合活性を３７℃での４日の試験期間にわたって全く失わなかった。
【０１５０】
本発明の実施形態は、抗体の重鎖および軽鎖の大腸菌産生による封入体をリフォールディングすることによって全長型ＩｇＧおよび全長型ＩｇＧ−トキシン融合タンパク質を製造するために開発された発現プロトコルおよび精製プロトコルを明らかにする。このプロトコルを使用することによって、１リットルの振とうフラスコ培養液からの、５０ｍｇに至るまでの純粋なＩｇＧの収量、および、高度に精製された生成物を得ることができた。Ｉｎｃｌｏｎａｌは、結合特性において、同様にまた、トキシンを培養された標的細胞に送達するそれらの能力において、従来の哺乳動物細胞培養を使用して産生された同じＩｇＧの成績と等しかった。
【０１５１】
本明細書中に記載されるＩｎｃｌｏｎａｌ技術は、全長型抗体を製造するための迅速、かつ、一般に適用可能な、潜在的に費用のかからない方法を提供する。治療目的、診断目的または研究目的のために潜在的に使用され得る抗体のほとんど（例えば、ウイルス中和抗体、積み荷を標的細胞に運ぶために使用される抗体、または、二重特異的抗体など）は、効果的であるためにはＦｃのグリコシル化に依存しない。そのうえ、本発明の実施形態はコンジュゲートの不均一性の問題を解決しており、このことは広範囲の様々な細胞毒性タンパク質に関して適用可能であるにちがいない。研究目的のために、現在、ヒトのプロテオームを詳しく研究するためのタンパク質特異的な親和性試薬を作製することが非常に求められている。更新可能な抗体を作製するためのハイスループット方法は依然として未完成である［Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．、Ｇｒａｓｌｕｎｄ，Ｓ．＆Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｍ．、ヒトタンパク質に対する親和性試薬を作製するためのパイロットプロジェクト、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、５、８５４〜８５５（２００８）］。「Ｉｎｃｌｏｎａｌ」技術によって作製することができる抗体−酵素融合タンパク質または抗体−蛍光団融合タンパク質は、そのような目的のために非常に有用になり得る。この迅速かつ費用効果的なＩｇＧ製造プロセスおよびＩｇＧ−融合タンパク質製造プロセス、ならびに、得られる生成物の高品質は、全長型ＩｇＧおよび全長型ＩｇＧ−融合タンパク質の細菌での産生を抗体作製のための実行可能かつ魅力的な選択肢にし得ると考えられる。
【０１５２】
本発明の実施形態は、改変された発現−リフォールディングシステムが大腸菌における全長型ＩｇＧの効果的な産生を可能にすることを明らかにする。この新規なシステムを適用することによって、２つの異なる抗体、すなわち、抗ＣＤ３０  Ｔ４２７抗体および抗ＥＧＦＲ  ２２５抗体を得ることが可能であった（より多くの抗体を得ることが可能であったが、これらについてはデータが示されない）。封入体からの抗体鎖の製造プロセスでは、多量の比較的純粋なタンパク質が明らかにされた。リフォールディングおよび精製のプロセス全体は、１リットルの振とうフラスコ培養液からの、５０ｍｇに至るまでのＩｇＧタンパク質で終了した。これは、低密度培養での抗体産生のための細菌発現システムを使用する以前には報告されなかった収量である。これらの産生収量は、工業的実験室とは対照的に、高密度発酵装置を一般には備えていない研究実験室に利益をもたらし得る。このシステムのもう１つの重要な利益が、最終生成物の純度である；プロテインＡ精製の後、モノマー形態の抗体が、注目すべきことに、得られた主要な形態である。精製されたタンパク質は、（以前の研究（Ｓｉｍｍｏｎｓ（２００２、上掲）およびＭａｚｏｒ（２００７、上掲））では認められた）部分的に組み立てられた化学種をほとんど含まない。時間消費における大腸菌での製造システムの利点はかなりであった。トランスフェクションから高発現クローンの選択を介し、クローンの拡大を介して、ＩｇＧ精製までの哺乳動物システムにおける全プロセスが、最も良い場合で約８週間を要し、一方、形質転換からリフォールディングを介してＩｇＧ精製までの細菌システムでは、ほんの約８日〜９日を要しただけであった。
【０１５３】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１５４】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【０１５５】
配列番号１及び５は、２２５  Ｉｎｃｌｏｎａｌ重鎖ポリヌクレオチド配列である。
配列番号２は、Ｔ４２７重鎖ポリペプチド配列である。
配列番号３は、Ｔ４２７軽鎖ポリヌクレオチド配列である。
配列番号４は、Ｔ４２７軽鎖ポリペプチド配列である。
配列番号６は、２２５  Ｉｎｃｌｏｎａｌ重鎖ポリペプチド配列である。
配列番号７は、２２５  Ｉｎｃｌｏｎａｌ軽鎖ポリヌクレオチド配列である。
配列番号８は、２２５  Ｉｎｃｌｏｎａｌ軽鎖ポリペプチド配列である。
配列番号９は、Ｔ４２７  Ｉｎｃｌｏｎａｌ重鎖−ＰＥ３８融合タンパク質ＤＮＡコーディング配列である。
配列番号１０は、Ｔ４２７  Ｉｎｃｌｏｎａｌ重鎖−ＰＥ３８融合タンパク質配列である。
配列番号１１は、Ｔ４２７  Ｉｎｃｌｏｎａｌ軽鎖−ＰＥ３８融合タンパク質ＤＮＡコーディング配列である。
配列番号１２は、Ｔ４２７  Ｉｎｃｌｏｎａｌ軽鎖−ＰＥ３８融合タンパク質配列である。
配列番号１３は、ＣＤ３０細胞外ドメインコーディング配列である。
配列番号１４は、ＣＤ３０細胞外ドメインポリペプチド配列である。
配列番号１５〜３２は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【図１】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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