(57)【要約】  本発明は、改善された発酵プロセスによるリパーゼ阻害剤の生成プロセスを提供する。このプロセスの間に、リノール酸、またはそのエステル、またはそれらの塩と、オメガから９脂肪酸、好ましくはオレイン酸および／またはその誘導体とを組み合わせて供給することにより、改善された収率係数、生産性を与え、さらに容易に実施できることを特徴とするプロセスを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リプスタチンまたはその誘導体を生成する発酵プロセスであって、
前記プロセスは、リノール酸、またはそのエステル、またはそれらの塩と、少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸とを組み合わせて供給することを備える発酵プロセス。
【請求項２】
得られるリプスタチンまたはその誘導体の収率係数が、少なくとも約２０％から約７０％、好ましくは約２０％である請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項３】
前記プロセスにおいて使用される前記オメガ−９脂肪酸は、オレイン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、およびネルボン酸を含むグループから選択され、好ましくはオレイン酸である請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項４】
リノール酸と少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸との組み合わせは、それぞれ０．０１から５ｇ／Ｌおよび０．０１から１０．０ｇ／Ｌの濃度比で供給される請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項５】
リノール酸の残留濃度は、０．０１から５ｇ／Ｌの範囲内、好ましくは０．０２から０．１ｇ／Ｌの範囲内または０．１０から０．３０ｇ／Ｌの範囲内に維持される請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項６】
オメガ−９脂肪酸の残留濃度は、０．１から１０．０ｇ／Ｌの範囲内、好ましくは０．５から１．０ｇ／Ｌの範囲内または１．０から２．０ｇ／Ｌの範囲内に維持される請求項１に記載の発酵プロセス。
【請求項７】
微生物、炭素源、制限栄養因子源を有する培地の発酵を行い、前記微生物の成長および維持に十分な条件を提供する工程と、
リノール酸、またはそのエステル、またはそれらの塩と、少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸とを、それぞれ０．０１から５ｇ／Ｌおよび０．０１から１０．０ｇ／Ｌの濃度比で組み合わせて供給する工程と、
発酵を実施する間中、リノール酸および少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸の残留濃度を維持する工程とを備えるリプスタチンまたはその誘導体を生成する発酵プロセス。
【請求項８】
前記微生物は、ストレプトミセス種に属し、ストレプトミセス・トキシトリシニ、ストレプトミセス・チュイラス、ストレプトミセス・ビナセウス、ストレプトミセス・ビルギニエ、ストレプトミセス・ラテリタス、ストレプトミセス・フラボバリアビリス、ストレプトミセス・ジャンシナス、ストレプトミセス・プルプラセンス、ストレプトミセス・ロゼオスピナス、ストレプトミセス・ロゼオヴィオラセウス、ストレプトミセス・ビオラセウス、ストレプトミセス・ビオラセウス亜種コンフィナス、ストレプトミセス・ビオラセウス亜種ビシナス、ストレプトミセス・ビオララス、ストレプトミセス・ビオラタス、ストレプトミセス・ヨコスカネンシス、ストレプトミセス・アルボスポレウス、ストレプトミセス・オーランチアカス、ストレプトミセス・オーレオバーチシラタス、ストレプトミセス・オーリニ、ストレプトミセス・クレメウス、ストレプトミセス・ダヘスタニカス、ストレプトミセス・フラジエ、ストレプトミセス・フラジリス、ストレプトミセス・フマナス、ストレプトミセス・グロメロオーランチアカス、ストレプトミセス・グリセオビリジス、ストレプトミセス・ニベオルバー、ストレプトミセス・ピューセチアス、ストレプトミセス・フェオビリジス、ストレプトミセス・ロゼイスクレロチカス、ストレプトミセス・ロゼオフラバスを含むグループから選択され、好ましくはストレプトミセス・トキシトリシニである請求項７に記載の発酵プロセス。
【請求項９】
前記発酵プロセスは、種培養段階および主発酵段階を有し、
前記プロセスは、
前記種培養段階において接種物を生成するために微生物バイオマスを培養する工程と、
前記主発酵段階において前記接種物を発酵培地に移す工程と、
前記主発酵段階において定常状態条件を維持することによりリプスタチンを含む発酵培養液を生成する工程とを備える請求項７に記載の発酵プロセス。
【請求項１０】
前記定常状態条件は、炭素源、窒素源、ｐＨ制御、気泡制御、および溶存酸素制御を１つ以上供給することにより維持される請求項９に記載の発酵プロセス。
【請求項１１】
溶存酸素の濃度は、得られるリプスタチンまたはその誘導体の収率係数に影響を与えず、
前記溶存酸素の濃度は、０から１００％の間で変化する請求項９に記載の発酵プロセス。
【請求項１２】
使用される前記発酵培地は、少なくとも１つの炭素源、１つの窒素源、発酵微生物の成長および維持に十分なプロセス条件を有する請求項９に記載の発酵プロセス。
【請求項１３】
前記発酵培地は、大豆粉末、グリセロール、および酵母エキスを有し、油または脂肪源を任意に有する請求項１１に記載の発酵プロセス。
【請求項１４】
前記発酵培地は、油または脂肪源を含まない請求項１１に記載の発酵プロセス。
【請求項１５】
生成されるリプスタチンまたはその誘導体の収率係数は、油または脂肪源の残留濃度の有無によって影響を受けない、あるいは変化しないことを特徴とする請求項１または１１に記載の発酵プロセス。
【請求項１６】
リプスタチンまたはその誘導体の生成は、ロイシンを発酵培地に加える発酵の段階によって影響を受けない、あるいは変化しないことを特徴とし、
前記発酵培地に加えられるロイシンの濃度は少なくとも０．１ｇ／Ｌである請求項１または１１に記載の発酵プロセス。
【請求項１７】
ロイシンは、主発酵段階の初めに加えられることを特徴とする請求項１または１１に記載の発酵プロセス。
【請求項１８】
リプスタチンまたはその誘導体の生成は、発酵培地に加えられるロイシンの濃度によって影響を受けない、あるいは変化しないことを特徴とする請求項１または１１に記載の発酵プロセス。
【請求項１９】
リノール酸および少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸の添加は、種発酵培地または生成培地のどちらかに組み込まれてよいことを特徴とする請求項１または１１に記載の発酵プロセス。
【請求項２０】
大豆粉末の断続的または連続的供給が、リプスタチンまたはその誘導体の生成期を少なくとも５０％延ばすことを特徴とする請求項１または１１に記載の発酵プロセス。
【請求項２１】
得られるリプスタチンまたはその誘導体の収量が少なくとも５．０±１ｇ／Ｌである請求項１から２０のいずれか１項に記載の発酵プロセス。
【請求項２２】
リプスタチンまたはその誘導体へのリノール酸の変換率が少なくとも約１０％、または約２０％である請求項１から２１のいずれか１項に記載の発酵プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された発酵プロセスによるリパーゼ阻害剤の生成プロセスを提供する。このプロセスの間に、リノール酸、またはそのエステル、またはそれらの塩と、オメガ−９脂肪酸、好ましくはオレイン酸および／またはその誘導体とを組み合わせて供給することにより、改善された収率係数、生産性を与え、さらに容易に実施できることを特徴とするプロセスを提供する。
【背景技術】
【０００２】
リプスタチンは、有効性の高い、膵リパーゼの非可逆性阻害剤であり、ストレプトミセス・トキシトリシニから初めて単離された天然物である。（Ｗｅｉｂｅｌら（１９８７）"Ｌｉｐｓｔａｔｉｎ，  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｌｉｐａｓｅ，  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｏｘｙｔｒｉｃｉｎｉ．  Ｉ．  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ，  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ"  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  （Ｔｏｋｙｏ）  ４０（８）：１０８１−５．  ＰＭＩＤ  ３６８００１８）リプスタチンは、肥満に関連した病気の予防および治療において有用なテトラヒドロリプスタチン（オリスタット）の調製における主要な中間体として非常に重要性が高まっている。Ｅ．Ｈｏｃｈｕｌｉらは、リプスタチンの構造化学を記載している（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  Ｖｏｌ  ＸＬ，  Ｎｏ．８  ｐｐ１０８１−１０８５）。
【０００３】
その生成のための発酵プロセス、微生物からの単離のためのプロセス、およびテトラヒドロリプスタチンへの水素化プロセスは既知であり、米国特許第４，５９８，０８９号明細書に記載されている。本発明は、特定のストレプトミセス・トキシトリシニ株ＮＲＲＬ  １５４４３を使用し、栄養接種物の２段階の調製について記載する。
【０００４】
欧州特許出願公開第０８０３５６７号明細書は、リノール酸、カプリル酸、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシンまたはロイシン等の前駆体を用いたリプスタチンの発酵プロセスを記載している。リプスタチンの生成は、リノール酸およびロイシンの供給を含むプロセスである、ストレプトミセス発酵により提供される。ここで、ロイシンは最終分子に包含されているのに対し、リノール酸は最終分子の骨格を形成する。このプロセスは、供給されるリノール酸の量に対して、一般的に約２０％（ｗ／ｗ）のリプスタチン収量を与える。
【０００５】
国際公開第０３／０４８３３５号パンフレットは、リプスタチン生成のために、遊離脂肪酸の代わりに油（ｏｉｌ）を用いた別の発酵培地を記載している。
【０００６】
従って、発酵微生物に対して十分な栄養因子のサポートを与えて、適切な脂肪酸前駆体または出発物質からのリプスタチンの特有な高い生産性を可能とする、コストが低く、工業化が可能な発酵プロセスへの要求は依然として残っている。
【０００７】
上記の議論の他には、リノール酸を他のオメガ−９脂肪酸と組み合わせて使用し、リプスタチンの生成レベルを大きく増大させることに関する文献は見出されない。上記の参照文献にて提案されている方法とは異なり、本発明の方法は、次の３つの利点を与える。（１）リプスタチン収率係数の約１００％の改善を可能とする。（２）生産性、ならびに実施の容易さを改善する。（３）スケールアップが可能であり、工業化が可能なプロセスを提供する。
【０００８】
従って、本発明の目的は、より高い収量、収率係数の約１００％改善、および実施の容易さを提供するリプスタチン生成のための工業化可能なプロセスを提供することである。
【発明の開示】
【０００９】
本発明はリプスタチンの発酵生成のための改善されたプロセスを提供する。このプロセスは、リノール酸とオメガ−９脂肪酸、好ましくはオレイン酸とを組み合わせて供給することによって発酵培養液中で起こり、さらにこれらの成分の残留濃度を適切に維持して、リプスタチンの生産性を増大させることができる。
【００１０】
本発明の１つの側面に従うと、以下の工程を備えるリプスタチンの生成プロセスが提供される。すなわち、
ａ）微生物、炭素源、制限栄養因子源を有する培地の発酵を行い、微生物の成長および維持に十分な条件を提供する工程と、
ｂ）次にリノール酸と少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸とを、それぞれ０．０１から５ｇ／Ｌおよび０．０１から１０．０ｇ／Ｌの濃度比で組み合わせて供給する工程と、
ｃ）発酵を実施する間中、リノール酸および少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸の残留濃度を維持する工程とを備え、
ｄ）２０％  ｗ／ｗよりも大きな収量変換率を得るリプスタチンの生成プロセスが提供される。
【００１１】
本発明の１つの側面に従うと、リノール酸とオレイン酸とを組み合わせて供給することにより、生成されるリプスタチンの収率係数において約１００％の改善をもたらす。その供給は、断続的でよく、あるいは同時であってよい。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、リプスタチンまたはその誘導体を生成するための発酵プロセスに関するものであり、このプロセスは、リノール酸またはそのエステル、またはそれらの塩と、少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸とを組み合わせた供給を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明の別の実施形態においては、得られるリプスタチンまたはその誘導体の収率係数は少なくとも約２０％である。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態においては、得られるリプスタチンまたはその誘導体の収率係数は少なくとも約２０％から約７０％である。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態においては、このプロセスにおいて使用されるオメガ−９脂肪酸は、オレイン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸、およびネルボン酸を含むグループから選択される。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態においては、使用するオメガ−９脂肪酸はオレイン酸である。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態においては、リノール酸と少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸との組み合わせは、それぞれ０．０１から５ｇ／Ｌおよび０．０１から１０．０ｇ／Ｌの濃度比で供給される。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態においては、リノール酸の残留濃度は０．０１から５ｇ／Ｌの範囲に維持される。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態においては、リノール酸の残留濃度は０．０２から０．１ｇ／Ｌの範囲に維持される。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態においては、リノール酸の残留濃度は０．１０から０．３０ｇ／Ｌの範囲に維持される。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態においては、オメガ−９脂肪酸の残留濃度は０．１から１０．０ｇ／Ｌの範囲に維持される。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態においては、オレイン酸の残留濃度は０．５から１．０ｇ／Ｌの範囲に維持される。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態においては、オレイン酸の残留濃度は１．０から２．０ｇ／Ｌの範囲に維持される。
【００２４】
本発明は、リプスタチンまたはその誘導体を生成するための発酵プロセスに関するものであり、以下の工程を備える。すなわち、
ａ．微生物、炭素源、制限栄養因子源を有する培地の発酵を行い、微生物の成長および維持に十分な条件を提供する工程と、
ｂ．次にリノール酸、またはそのエステル、またはそれらの塩と、少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸とを、それぞれ０．０１から５ｇ／Ｌおよび０．０１から１０．０ｇ／Ｌの濃度比で組み合わせて供給する工程と、
ｃ．発酵を実施する間中、リノール酸および少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸の残留濃度を維持する工程とを備える。
【００２５】
本発明のさらに別の実施形態においては、微生物はストレプトミセス種に属する。
【００２６】
本発明のさらに別の実施形態においては、微生物は、ストレプトミセス・トキシトリシニ、ストレプトミセス・チュイラス、ストレプトミセス・ビナセウス、ストレプトミセス・ビルギニエ、ストレプトミセス・ラテリタス、ストレプトミセス・フラボバリアビリス、ストレプトミセス・ジャンシナス、ストレプトミセス・プルプラセンス、ストレプトミセス・ロゼオスピナス、ストレプトミセス・ロゼオヴィオラセウス、ストレプトミセス・ビオラセウス、ストレプトミセス・ビオラセウス亜種コンフィナス、ストレプトミセス・ビオラセウス亜種ビシナス、ストレプトミセス・ビオララス、ストレプトミセス・ビオラタス、ストレプトミセス・ヨコスカネンシス、ストレプトミセス・アルボスポレウス、ストレプトミセス・オーランチアカス、ストレプトミセス・オーレオバーチシラタス、ストレプトミセス・オーリニ、ストレプトミセス・クレメウス、ストレプトミセス・ダヘスタニカス、ストレプトミセス・フラジエ、ストレプトミセス・フラジリス、ストレプトミセス・フマナス、ストレプトミセス・グロメロオーランチアカス、ストレプトミセス・グリセオビリジス、ストレプトミセス・ニベオルバー、ストレプトミセス・ピューセチアス、ストレプトミセス・フェオビリジス、ストレプトミセス・ロゼイスクレロチカス、ストレプトミセス・ロゼオフラバスを含むグループから選択される。本発明のさらに別の実施形態においては、微生物はストレプトミセス・トキシトリシニである。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態においては、発酵プロセスは、種培養段階および主発酵段階を有し、その方法は以下の工程を備える。すなわち、
ａ．種培養段階において、接種物を生成するために微生物バイオマスを培養する工程と、
ｂ．主発酵段階において、接種物を発酵培地に転移させる工程と、
ｃ．主発酵段階において、定常状態条件を維持し、それによってリプスタチンを含んだ発酵培養液を生成する工程とを備える。
【００２８】
本発明のさらに別の実施形態においては、炭素源、窒素源、ｐＨ制御、気泡制御、および溶存酸素の制御のうち１つ以上を提供することにより、定常状態の条件を維持する。
【００２９】
本発明のさらに別の実施形態においては、溶存酸素の濃度は、得られるリプスタチンまたはその誘導体の収率係数に影響を与えない。
【００３０】
本発明のさらに別の実施形態においては、溶存酸素の濃度は０から１００％の間で変化してよい。
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態においては、使用される発酵培地は、少なくとも１つの炭素源、１つの窒素源、および発酵微生物の成長と維持に十分なプロセス条件を有する。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態においては、発酵培地は、大豆粉末、グリセロール、および酵母エキスを有する。
【００３３】
本発明のさらに別の実施形態においては、発酵培地は油または脂肪源を含んでもよい。
【００３４】
本発明のさらに別の実施形態においては、発酵培地は油または脂肪源を含まない。
【００３５】
本発明のさらに別の実施形態においては、生成されるリプスタチンまたはその誘導体の収率係数は、油または脂肪源の残留濃度の有無によって影響を受けることや変化することがない点を特徴とする。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態においては、リプスタチンまたはその誘導体の生成は、発酵培地にロイシンを加える発酵の段階によって影響を受けることや変化することがない点を特徴とする。
【００３７】
本発明のさらに別の実施形態においては、主発酵段階の最初にロイシンを加えることを特徴とする。
【００３８】
本発明のさらに別の実施形態においては、発酵培地に加えられるロイシンの濃度は少なくとも０．１ｇ／Ｌであることを特徴とする。
【００３９】
本発明のさらに別の実施形態においては、リプスタチンまたはその誘導体の生成は、発酵培地に加えられるロイシンの濃度によって影響を受けることや変化することがない点を特徴とする。
【００４０】
本発明のさらに別の実施形態においては、リノール酸および少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸の添加は、種発酵培地または生成培地のどちらかに組み込まれてよいことを特徴とする。
【００４１】
本発明のさらに別の実施形態においては、大豆粉末の断続的または連続的供給が、リプスタチンまたはその誘導体の生成期を少なくとも５０％伸ばす。
【００４２】
本発明のさらに別の実施形態においては、得られるリプスタチンまたはその誘導体の収量は少なくとも５．０±１ｇ／Ｌである。
【００４３】
本発明のさらに別の実施形態においては、リプスタチンまたはその誘導体へのリノール酸の変換率は、少なくとも約２０％である。
【００４４】
本発明のさらに別の実施形態においては、リプスタチンまたはその誘導体へのリノール酸の変換率は、少なくとも約１０％である。
【００４５】
請求項および実施例、あるいは別に指示されている場合の他は、含有物の量や反応条件を表すためにここで使用されている全ての数字は、"約"という用語により、全ての場合において修正され得るものであると理解される。
【００４６】
この記載および特許請求の範囲において、「備える」、「有する」、「含む」、およびそれらの活用形は、この用語に続く項目が含まれることを意味するために非制限的意義で使用されるものであるが、明示的に言及されていない項目を排除するものではない。さらに、「１つの」という不定冠詞を持つ要素は、文脈において明確に唯一の要素であることが必要とされない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。従って、不定冠詞「１つの」は、通常「少なくとも１つの」を意味する。
【００４７】
リプスタチン（ＬＳＴ）、およびその類似物であるテトラヒドロリプスタチン（ＴＨＬ）、およびＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシン（Ｓ）−１−［［（２Ｓ，３Ｓ）−３−エチル−４−オキソ−２−オキセタニル］メチル］オクタデシルエステル（ＬＯＣ）等のリパーゼ阻害剤が、発明の範囲内において使用される。ここで使用されているように、「リプスタチン」という語は、オリスタットの前駆体をさす。Ｅ．Ｈｏｕｃｈｕｌｉらは、リプスタチンの構造化学を記載している（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  Ｖｏｌ  ＸＬ，  Ｎｏ．８  ｐｐ１０８１−１０８５）。
【００４８】
本発明のプロセスは、リプスタチンおよびその誘導体の生成に関する。本発明のプロセスはまた、オリプスタチン（Ｏｌｉｐｓｔａｔｉｎ）の生成に関する。特に、本発明は、化学式、化１、化２、および化３の化合物を調製するプロセスに関する。
【化１】
2011515100.tif 000002
【化２】
2011515100.tif 000003
【化３】
2011515100.tif 000004
【００４９】
ここで使用されている"オメガ−９脂肪酸"とは、オメガ−９位にＣ＝Ｃ二重結合を持つ不飽和脂肪酸類である。本発明は、オレイン酸１８：１（ｎ−９）９−オクタデカン酸、エイコセン酸２０：１（ｎ−９）１１−エイコセン酸、ミード酸２０：３（ｎ−９）５，８，１１−エイコサトリエン酸、エルカ酸２２：１（ｎ−９）、１３−ドコセン酸、ネルボン酸２４：１（ｎ−９）、１５−テトラコセン酸等のオメガ−９脂肪酸の使用を包含および意図する
【００５０】
ここで使用されている"リノール酸"とは、オメガ−６脂肪酸をさす。リノール酸は、炭素数１８の主鎖および２つのシス二重結合を有する多価不飽和脂肪酸であり、１つめの二重結合はオメガ端から６番目の炭素に位置している。本発明は、リプスタチンの生産性を増大させる目的を達成するため、リノール酸、またはそのエステル、またはそれらの誘導体を使用することを意図している。
【００５１】
ここで使用されている"制限栄養因子源"とは、微生物の成長に必須であり、制限栄養因子が増殖培地から枯渇した場合に、無くなることによって、微生物が成長することまたはそれ以上複製することを実質的に制限する栄養因子源（栄養因子自体を含む）をさしている。しかしながら、その他の栄養因子が依然として豊富にあるので、微生物は細胞内および／または細胞外の生成物を生成および蓄積し続けることができる。特定の制限栄養因子を選択することにより、蓄積される生成物のタイプを制御することができる。従って、特定の速度で制限栄養因子源を供給することにより、微生物の成長速度および所望の生成物の生成または蓄積の両者を制御することができる。
【００５２】
本発明のさらに別の側面においては、微生物は、（酵母を含めた）菌類、原生生物、バクテリア、あるいはそれらの混合物を含むグループから選択され、選択された所望の発酵微生物は、適切な発酵条件下、発酵基質を変換して、所望の最終生成物を生成することができる。最も好ましい微生物は、ストレプトミセス種を含むが、ストレプトミセス・トキシトリシニ、ストレプトミセス・チュイラス、ストレプトミセス・ビナセウス、ストレプトミセス・ビルギニエ、ストレプトミセス・ラテリタス、ストレプトミセス・フラボバリアビリス、ストレプトミセス・ジャンシナス、ストレプトミセス・プルプラセンス、ストレプトミセス・ロゼオスピナス、ストレプトミセス・ロゼオヴィオラセウス、ストレプトミセス・ビオラセウス、ストレプトミセス・ビオラセウス亜種コンフィナス、ストレプトミセス・ビオラセウス亜種ビシナス、ストレプトミセス・ビオララス、ストレプトミセス・ビオラタス、ストレプトミセス・ヨコスカネンシス、ストレプトミセス・アルボスポレウス、ストレプトミセス・オーランチアカス、ストレプトミセス・オーレオバーチシラタス、ストレプトミセス・オーリニ、ストレプトミセス・クレメウス、ストレプトミセス・ダヘスタニカス、ストレプトミセス・フラジエ、ストレプトミセス・フラジリス、ストレプトミセス・フマナス、ストレプトミセス・グロメロオーランチアカス、ストレプトミセス・グリセオビリジス、ストレプトミセス・ニベオルバー、ストレプトミセス・ピューセチアス、ストレプトミセス・フェオビリジス、ストレプトミセス・ロゼイスクレロチカス、ストレプトミセス・ロゼオフラバスに限定されない。本発明の特に有用な微生物は、供給された発酵基質をリプスタチンに変換することのできる微生物である。リプスタチンを生成する最も好ましい微生物は、米国特許第４，５９８，０８９号明細書に記載されており、ストレプトミセス・トキシトリシニ  ＰｒｅｏｂｒａｚｈｅｎｓｋａｙａおよびＳｖｅｓｈｎｉｋｏｖａ（Ｂｅｒｇｅｙ'ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ８１１ページ参照）である。
【００５３】
本発明はリプスタチンの発酵生成のための改善されたプロセスを提供する。このプロセスは、リノール酸とオメガ−９脂肪酸、好ましくはオレイン酸とを組み合わせて供給することによって発酵培養液中で起こり、さらにこれらの成分の残留濃度を適切に維持して、リプスタチンの生産性を増大させることができる。このプロセスの第１の工程に従うと、リプスタチン生成微生物の細胞が、基礎培地／種培地中で成長する。このプロセスの第２の工程においては、いくつかの成分の組み合わせが基礎培地に加えられ、直接的に生化学的前駆体として働くか、あるいは生化学的変換を受け、次いで生合成経路の前駆体として働く。リノール酸に比べてオレイン酸によって加えられる毒性は低いので、残留濃度の適切なバランスによって、微生物の成長と維持のためのエネルギーに必要な条件が確実に満たされる。これにより、微生物は、所望の最終生成物であるリプスタチンを、はるかに高い濃度で合成できる。
【００５４】
使用される基質上に生成されるバイオマスの収率係数は、ここでは、使用される基質の量（単位はグラム）に対する、生成されるバイオマスの乾燥重量（単位はグラム）を意味する。基質上に生成される発酵生成物の収率係数は、使用される基質１Ｋｇ当りに生成される生成物のグラム単位で表されてもよい。特に、本発明の文脈においては、収率係数とは、消費されるリノール酸の量当りに生成されるリプスタチンの量をさしている。
【００５５】
基礎発酵培地は、発酵微生物の成長と維持に必要な以下の成分を含む。適切な代謝可能な炭素およびエネルギー源は、以下に限定されるものではないが、ブドウ糖、果糖、麦芽糖、グリセロール、でんぷん、でんぷんの加水分解物、メタノール、短鎖アルコール、およびそれらの混合物等を含む。ならびに、１つ以上の窒素源は、大豆粉末、綿実の粉末、糖蜜、コーンスティープ粉、またはコーンスティープリカー、動物由来酵母エキス成分、および無機アンモニウム塩等を含む。さらに、マクロ元素および微量元素を培地に加えてもよい。１つの側面においては、発酵培養液に含まれる酸素が散布されることによって発生する発泡体の形成および蓄積を防ぐために、消泡剤を発酵培地に加える。
【００５６】
炭素源およびその他の必須な細胞栄養因子のそれぞれを、徐々にあるいは連続的に発酵培地に加える。炭素源をバイオマスに変換する細胞の代謝機能または呼吸機能に基づいた所定の細胞成長曲線に従って、必要な栄養因子のそれぞれは、成長する細胞によって効率的に吸収されるために本質的に必要な最小レベルに維持される。このプロセスは、与えられた発酵システムにおいて、細胞生成の加速および増大における著しい改善を成す。
【００５７】
本発明の１つの側面に従うと、ここで使用される培養培地は、実質的に脂肪および油を含まない。本発明の別の側面に従うと、ここで使用される培養培地は、上記のように油および同化炭素源を有し、微生物による脂質生合成を調節するために、油と同化炭素源とのｗ／ｗ比が調節される。好ましくは、油は、天然油、合成油、またはそれらの混合物を含むグループから選択される。天然油は、ひまわり油、大豆油、ヤシ油、亜麻油、菜種油、およびトウモロコシ胚芽油を含むグループから選択される。本発明の発酵培地は、微生物の成長に必要な基礎栄養因子を満足する。
【００５８】
当業者には認識されるであろうが、実施される本発明の重要な側面は、発酵培地内の脂肪の残留物含有量によって影響されないことである。発酵培地内の脂肪の残留物含有量は、０から４０ｇ／Ｌの範囲で変化してよい。
【００５９】
発酵プロセスをさらに良くするために、様々なタイプの補助成分を本発明の発酵培地内に使用してもよい。その例としては、以下に限定されるものではないが、様々なタイプの微量金属、キレート剤、消泡剤等が含まれる。
【００６０】
本発明の特に好ましい実施形態においては、種培地は、大豆粉末１０．０グラム、グリセロール５．０グラム、および酵母エキス５．０グラムを水中（１リットル）に含む。培地のｐＨは７．０±０．１に調節される。
【００６１】
本発明の別の好ましい実施形態においては、生成培地は、大豆粉末３６０．０グラム、グリセロール１８０．０グラム、水６リットル中に消泡剤ＳＡＧを６グラム、および水（１０リットル）を含む。培地のｐＨは７．０±０．１に調節される。
【００６２】
主発酵段階の間に定常状態条件を得るために、ブドウ糖および／または還元糖の総含有率を制御すること、炭素源を適切な最小レベルに維持すること、有機および／または無機窒素源を供給すること、ｐＨを制御すること、発泡レベルを制御すること、供給と回収により培養液の質量を制御すること、撹拌速度および／または通気速度を変化させることによって溶存酸素レベルを制御すること等を含むプロセスパラメータ、工程、および／または変数を発明者達は見出した。
【００６３】
発酵微生物が成長可能であり、また所望の変換反応に触媒作用を及ぼすような任意のｐＨまたは温度範囲にわたってプロセスを実行してよい。好ましく、また特に有利なｐＨ範囲は酸性領域、すなわちｐＨが約７以下であり、好ましい温度範囲は約２７±１℃である。本発明のプロセスは、約２７℃から約３７℃、好ましくは約２７℃の温度で実行されてよい。ＮａＯＨ等の塩基、あるいはＨ２ＳＯ４またはＨＣｌ等の酸を加えることにより、ｐＨの変化を防ぐことができる。調整剤は、典型的には水酸化物、または有機酸、あるいは無機酸である。適切なｐＨ調整剤の例は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、および塩酸である。本発明の重要な側面は、所望の反応生成物に有利になるように、いくつかのプロセスパラメータを制御することである。従って、プロセスまたはプロセスの一部は、連続的に実施されてもよいし、あるいは様々な個別の単位として実施されてもよい。発酵プロセスが続くことのできる時間の長さは、発酵培地の組成、温度、接種物の量、所望の生成物の量等に依存する。典型的には、発酵プロセスは約８日から約１０日間行われる。
【００６４】
本発明のプロセスは、細胞の生育力および代謝を確実にするため、十分な滅菌条件下で実行される。
【００６５】
発酵の主要な部分の間、生成培地中の溶存酸素レベルを、大気飽和状態の約２０％から約８０％に維持することが好ましい。適切な溶存酸素レベルを達成する能力は、通気速度および／または撹拌速度を適切に調節することにより高められる。
【００６６】
本発明の１つの側面に従うと、以下の工程を備えるリプスタチンの生成プロセスが提供される。すなわち、
ａ）微生物、炭素源、制限栄養因子源を有する培地の発酵を行い、微生物の成長および維持に十分な条件を提供する工程と、
ｂ）次にリノール酸と少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸とを、それぞれ０．０１から５ｇ／Ｌおよび０．０１から１０．０ｇ／Ｌの濃度比で組み合わせて供給する工程と、
ｃ）発酵を実施する間中、リノール酸および少なくとも１つのオメガ−９脂肪酸の残留濃度を維持する工程とを備える。
【００６７】
本発明のさらに別の側面に従うと、発酵プロセスは、種培養段階および主発酵段階を有し、その方法は以下の工程を備える。すなわち、
ａ．種培養段階において、接種物を生成するために微生物バイオマスを培養する工程と、
ｂ．主発酵段階において、接種物を発酵培地に転移させる工程と、
ｃ．主発酵段階において、定常状態条件を維持し、それによってリプスタチンを含んだ発酵培養液を生成する工程とを備える。
【００６８】
本発明の重要な点は、リノール酸とオメガ−９脂肪酸、好ましくはオレイン酸とを組み合わせて供給することがリプスタチンの生成を非常に増大させることである。
【００６９】
本発明の１つの側面に従うと、リノール酸およびオレイン酸の添加は、同時に行われてもよいし、あるいは断続的に行われてもよい。
【００７０】
本発明の１つの好ましい側面に従うと、リノール酸の残留濃度は、好ましくは０．１０から０．３０ｇ／Ｌの間、より好ましくは０．０１から０．０５ｇ／Ｌの間、最も好ましくは０．０２から０．０５ｇ／Ｌの間に維持される。リノール酸は０．０１から５ｇ／Ｌの範囲内で培地に供給されてよい。
【００７１】
本発明の１つの好ましい側面に従うと、オレイン酸の残留濃度は、好ましくは０．２５から０．３０ｇ／Ｌの間、より好ましくは０．５０から１．０ｇ／Ｌの間、より好ましくは１．０から１．５ｇ／Ｌの間、最も好ましくは１．０から２．０ｇ／Ｌの間に維持される。オレイン酸は、０．０１から１０．０ｇ／Ｌの範囲内で培地に供給されてよい。
【００７２】
従って本発明の目的の１つは、条件を変化させることによって微生物の生成能力を引き出して、リプスタチン生成発酵処理効率、および発酵プロセスを実行する効率を改善することである。本発明の他の目的は、種発酵段階と主発酵段階のどちらか一方、あるいは両方において、微生物による代謝に対して最も都合のよい化学的条件および生理学的条件を提供することである。本発明のさらなる目的は、種発酵段階と主発酵段階のどちらか一方、あるいは両方において、定常状態条件下で成長速度を維持し、さらに長時間にわたって最大の生成物形成速度を維持することにより、微生物の代謝に対して最も都合のよい化学的および生理学的条件を提供することである。
【００７３】
最も重要な側面に従うと、本発明はリプスタチン生成の収率係数における約１００％の改善を与える。本発明のプロセスによって得られるリプスタチンの量は、少なくとも２．０±１ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも６．０±１ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも８．０±１ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１３±１ｇ／Ｌ、さらに好ましくは少なくとも１６±１ｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも２０±１ｇ／Ｌである。
【００７４】
本発明のプロセスによって得られるオリプスタチンの量は、少なくとも１．０±１ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも６．０±１ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも８．０±１ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１３±１ｇ／Ｌ、さらに好ましくは少なくとも１６±１ｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも２０±１ｇ／Ｌである。
【００７５】
本発明の側面を導入して達成されるオレイン酸からリプスタチンへの変換率は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、最も好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも６５％、および最も好ましくは少なくとも７０％である。本発明のさらに別の側面に従うと、得られる変換率は約１００％である。
【００７６】
本発明の側面を導入して達成されるリノール酸からリプスタチンへの変換率は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、最も好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも６５％、および最も好ましくは少なくとも７０％である。本発明のさらに別の側面に従うと、得られる変換率は約１００％である。
【００７７】
本発明の１つの利点に従うと、ロイシンが発酵培地に加えられる時の発酵段階、および加えられるロイシンの濃度は、所望の最終生成物の生成レベルに影響をおよぼさない、あるいは生成レベルを変えない。これにより、ロイシンは初期の種培地自体に加えられるのでよく、流加期（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｐｈａｓｅ）中には加えられなくてよい。あるいはロイシンは、通常行われているように発酵の流加期中に加えられてもよい。発酵培地に加えられるロイシンの濃度は０．１ｇ／Ｌから４０ｇ／Ｌの範囲内である。本発明の１つの側面に従うと、発酵培地に加えられるロイシンの好ましい濃度は、少なくとも５ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１５ｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも２０ｇ／Ｌである。さらに別の有利な側面に従うと、ロイシンの濃度は１６ｇ／Ｌより大きくてよい。
【００７８】
本発明のさらに別の有利な側面に従うと、リノール酸、オレイン酸、およびロイシンは、種培地または生成のバッチ期用の初期培地自体に組み込まれてよく、あるいは発酵の流加期中に組み込まれてもよい。
【００７９】
生合成プロセスの種培養段階および主発酵段階のどちらか、あるいは両者において、いくつかのプロセスパラメータ、工程、および／または変数の１つ以上を調節することにより、リプスタチンの最適な生合成が実行されることを発明者達は見出した。
【００８０】
本発明のプロセスのさらに特に好ましい実施形態においては、高濃度の大豆粉末懸濁液を断続的または連続的に供給することにより、リプスタチンならびにオリプスタチンの生成期が、ほぼ５０％延長する。大豆粉末懸濁液の断続的または連続的添加により、バッチサイクルを延ばすことが可能であり、これにより初期培地に高濃度の大豆粉末を加える必要がなくなり、プロセスのバッチ期における高い酸素要求量を避けることができる。
【００８１】
本発明のこれら、およびその他の非制限的実施形態は、ここに提供される開示および特許請求の範囲を読むことにより、当業者には容易に理解される。この発明は、記載された特定の方法およびプロセスに限定されるものではなく、所望の最終生成物および方法自体も多様なことが理解される。ここで使用されている用語は、特定の実施形態を記述することを目的としているだけであって、制限的であることを意図したものではないことも理解されるべきである。
【００８２】
本発明は、説明目的であり、いかなる点でも発明の範囲を制限することを意図していない以下の実施例を参照することで、より完全に記述され、また理解されるであろう。
【００８３】
実施例１
ａ）種培養の調合
大豆粉末１０．０グラム、グリセロール１０．０グラム、酵母エキス５．０グラムを水（１リットル）中に含む種培地を調製した。種培地のｐＨをＮａＯＨ溶液により７．０±０．１に調節した。接種物培地（５００ｍＬ）を２０００ｍＬの三角フラスコに注ぎ、綿栓で閉じ、滅菌した。滅菌は、１２１±２℃、１００±１０ｋＰａで４５分間行った。滅菌された接種物培地を、ストレプトミセス・トキシトリシニ懸濁液の芽胞薬瓶で接種し、好気条件下２７±１℃で２４から３６時間培養した。
【００８４】
ｂ）主発酵プロセス
約１から２容量％の上記種培養物を、実験室スケールで接種するために使用した。容器サイズ１０リットルの撹拌型発酵槽には、６．０リットルの生成培地が含まれる。生成培地には、大豆粉末３６０．０グラム、グリセロール１８０．０グラム、および６．０リットルの水中に消泡剤ＳＡＧが６．０グラム含まれる。発酵培地のｐＨを、滅菌前にＮａＯＨにより７．０±０．１に調節した。滅菌を１２１±２℃、１００±１０ｋＰａで１２０分間行った。発酵を、好気条件下（８００ｒｐｍ、１ｖｖｍ）、２７±１℃で８から１０日間実行した。
【００８５】
発酵は１０日間続けられた。リノール酸からリプスタチンへの最大変換率１９．４８％が得られた。別のバッチ（実験＃２）において、同一組成の培地を使用し、リノール酸およびロイシンと共にオレイン酸を追加供給した。発酵は１０日間続けられた。残留オレイン酸を、バッチの間中、０．２５から０．３０ｇ／Ｌの間に維持し、残留リノール酸レベルを０．１０から０．３０ｇ／Ｌの間に維持した。得られた最大変換率は２０．１２％であり、変換効率に大きな差異は見られなかった。２４０時間発酵した後、リプスタチンの濃度は８．０±１ｇ／Ｌであった。
【００８６】
実施例２
この実験においては、種培養培地および生成培地は、実施例１において使用したものと同一であった。バッチの間中、オレイン酸の残留レベルを０．５０から１．０ｇ／Ｌの間に維持し、残留リノール酸レベルを０．１０から０．３０ｇ／Ｌの間に維持した。
【００８７】
リノール酸からリプスタチンへの生成に対して得られた最大変換率は３９．５６％であった。２４０時間発酵した後、リプスタチンの濃度は８．０±１ｇ／Ｌであった。
【００８８】
実施例３
この実験においては、種培養培地および生成培地は、実施例１において使用したものと同一であった。バッチの間中、オレイン酸の残留レベルを１．０から２．０ｇ／Ｌの間に維持し、残留リノール酸レベルを０．１０から０．３０ｇ／Ｌの間に維持した。
【００８９】
リノール酸からリプスタチンへの生成に対して得られた最大変換率は４５．４６％であった。２４０時間発酵した後、リプスタチンの濃度は８．０±１ｇ／Ｌであった。
【００９０】
実施例４
この実験においては、種培養培地および生成培地は、実施例１において使用したものと同一であった。バッチの間中、オレイン酸の残留レベルを１．０から２．０ｇ／Ｌの間に維持し、残留リノール酸レベルを０．０２から０．０５ｇ／Ｌの間に維持した。
【００９１】
リノール酸からリプスタチンへの変換率は大きく改善され、４９．３１％であった。その上、リプスタチンの生成量がより高かった。発酵の最後には、オリプスタチンの滴定量は６．０５ｇ／Ｌであった。
【００９２】
実施例５
この実験においては、種培養培地は実施例１において使用したものと同一であった。生成培地には、大豆粉末３６０．０グラム、グリセロール１８０．０グラム、Ｌ−ロイシン１２０グラム、および６．０リットルの水中に消泡剤ＳＡＧが６．０グラムが含まれる。発酵培地のｐＨを、滅菌前にＮａＯＨにより７．０±０．１に調節した。滅菌を１２１±２℃、１００±１０ｋＰａで１２０分間行った。発酵を、好気条件下（８００ｒｐｍ、１ｖｖｍ）、２７±１℃で８から１０日間実行した。
【００９３】
バッチ期が完了した後、バッチの間中、リノール酸を供給した。残留リノール酸レベルを、バッチの間中、０．１０から０．３０ｇ／Ｌの間に維持した。発酵の最後（１６３時間）において、リプスタチンの滴定量は２．６７ｇ／Ｌであった。
【００９４】
別のバッチ（実験＃２）において、同一組成の培地を使用し、バッチの間中オレイン酸を供給した。残留オレイン酸レベルを、バッチの間中、１．０から１．５ｇ／Ｌの間に維持した。発酵の最後（１７０時間）において、オリプスタチンの滴定量は１．３８ｇ／Ｌであった。
【００９５】
実施例６
この実験においては、種培養培地および生成培地は、実施例１において使用したものと同一であった。バッチの間中、リノール酸を供給した。残留リノール酸レベルを、バッチの間中、０．１０から０．３０ｇ／Ｌの間に維持した。バッチを延ばすために、焙った脱脂大豆粉末の高濃度懸濁液（１５％）を、窒素補助剤として発酵の間供給した。発酵の最後において、リプスタチンの滴定量は１３．５ｇ／Ｌであった。
【００９６】
別のバッチ（実験＃２）において同一組成の培地を使用し、バッチの間中オレイン酸のみを供給した。残留オレイン酸レベルを、バッチの間中、１．０から１．５ｇ／Ｌの間に維持した。バッチを延ばすために、焙られた脱脂大豆粉末の高濃度懸濁液（１５％）を、窒素補助剤として発酵の間供給した。発酵の最後において、リプスタチンの滴定量は５．８６ｇ／Ｌであった。
【００９７】
本発明は、特定の方法論、手順、細胞株、種、あるいは属に限定されるものではなく、記載された培地の成分自体も多様であってよいことが理解されるべきである。ここで使用されている用語は、特定の実施形態を記述することを目的としているだけであって、本発明の範囲を制限することを意図したものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。上記の記載は、本発明をどのように実施するかを当業者に教示することを目的としており、記載を読むことにより当業者にとって明らかとなるであろう、全ての明白な修正や変更を列挙することを意図しているのではない。
【００９８】
ここに報告されている手段は、他の既知の手段に比べて生成に関連したコストがより低く、また容易に実行できるシステムを提供することにより、前述の略記した問題を克服し、技術を進歩させる。このシステムは、あらゆる既知のプロセスに比べて変換効率の増大を達成するここに記載された方法論を使用し、この技術分野において知られている主な不都合を克服することにより、コストを低減する。
【国際調査報告】
2011515100.tif 000005
2011515100.tif 000006
2011515100.tif 000007