(57)【要約】  本発明は、関心のある要素をそれぞれの母集団から最適に選択及び分離し、及び／又は、その後の一連の処理に利用するための方法及び装置に関する。より詳細には、本発明は、ａ）それぞれの粒子ごとに、複数の特性パラメータの中の少なくとも１つを識別するステップと、ｂ）関心のある粒子を選択し、それらのそれぞれの粒子ごとに、少なくとも１つのパラメータをそれぞれの参照パラメータと比較するステップとを備えた方法に関する。本発明によれば、この方法は、ｃ）これらのそれぞれの粒子ごとに、識別された少なくとも１つのパラメータを記憶するステップと、ｄ）記憶されたこのパラメータの関数の値を処理し、この関数を、考えられる選択基準からなるグループから選択された関心のある粒子の選択基準と関連づけるステップと、ｅ）それぞれの粒子ごとに、参照パラメータとして使用されるべきしきい値基準を設定するステップとをさらに備えたことを特徴とする。しきい値基準は、上述した処理の結果に基づいて、毎回設定される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）粒子の母集団に含まれるそれぞれの粒子ごとに、関心のある粒子の特性を示す複数のパラメータｐ１、ｐ２〜ｐｎの中の少なくとも１つを識別するステップと、
ｂ）関心のある前記粒子を前記粒子の中から選択し、それぞれの前記粒子ごとに、前記少なくとも１つのパラメータをそれぞれの参照パラメータと比較するステップと
を含む、粒子の母集団の中から関心のある粒子を同定及び操作する方法であって、
ｃ）それぞれの前記粒子ごとに、これまでに識別された前記少なくとも１つのパラメータｐ１、ｐ２〜ｐｎを記憶するステップと、
ｄ）記憶された前記少なくとも１つのパラメータの少なくとも１つの関数の値を処理し、関心のある前記粒子の選択基準と前記関数を組み合わせるステップであり、前記選択基準が、考えられる選択基準のグループから選択される、前記処理及び組み合わせるステップと、
ｅ）それぞれの前記粒子ごとに、前記参照パラメータとして使用されるべきしきい値基準を設定するステップであって、前記しきい値基準が、前記処理の結果に基づいて毎回設定される、ステップと
をさらに含む、方法。
【請求項２】
ｆ）前記粒子の中からこれまでに選択された関心のある前記粒子を分離し、前記粒子だけを操作するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子が、微小流体装置において、液体中に懸濁状態で維持される請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｇ）前記粒子の初期配置を記憶するステップをさらに含む請求項１から請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ｈ）前記選択された粒子をそれらの前記初期配置からそれぞれの移送配置へ移し、前記移送配置の位置もまた、その後のｉ）前記移送配置に存在するそれぞれの粒子を回収するため、記憶されるステップをさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ｉ）選択されかつ前記それぞれの移送配置へ移された前記粒子を回収する前記ステップが、前記粒子だけを操作することによって実行される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｌ）選択された関心のある前記粒子が、それらの前記初期配置から前記移送配置へ正しく移されたことを確認するステップをさらに含む請求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップが、前記粒子を操作することによって実行され、微小流体装置８の複数の場所の中の特定の場所において前記粒子のそれぞれを捕獲する請求項１から請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記場所が、アレイとして前記微小流体装置８内に配置される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記微小流体装置８が、お互いに区別され、液圧的に接続され、単一チップ８の底部壁によって、あるいは、複数の分離したチップによって、少なくとも１つの面上において画定された複数の異なるチャンバ（１１、１２）を備える請求項８か又は請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のパラメータの中の前記パラメータｐ１、ｐ２〜ｐｎが、前記微小流体装置の内部か又は外部に存在する少なくとも１つのセンサによって検出される請求項３から請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
関心のある前記粒子の選択を微調整するステップをさらに備え、微調整する前記さらなるステップが、すべての前記粒子に関係し、及び／又は、これまでに選択された前記粒子にしか関係しない請求項１から請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記微調整するステップが、選択されたそれぞれの粒子を制御するステップを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記制御するステップが、前記微小流体装置の内部及び／又は外部に存在する少なくとも１つのセンサによってそれぞれの粒子ごとに識別される複数のパラメータｐ１、ｐ２〜ｐｎを表示するステップを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
複数のパラメータｐ１、ｐ２〜ｐｎの中の少なくとも１つのパラメータが、カメラからなる外部センサによって検出されてもよく、前記制御するステップが、それぞれの粒子の画像を表示することを含む請求項１３又は請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
処理するステップをさらに備え、前記処理するステップにおいて、誤って選択する可能性を最小化する基準が、関心のある前記粒子に対する考えられる選択基準からなる前記グループから選択され、さらなる前記処理するステップが、すべての前記粒子に関係し、及び／又は、これまでに選択された前記粒子にしか関係しない請求項１から請求項１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
懸濁状態にある前記粒子母集団に含まれる前記粒子を、関心のある前記粒子に対する少なくとも１つの特定のマーカーによってマーキングするステップを含み、前記マーカーが、前記粒子母集団が前記液体中において懸濁状態にある微小流体装置の内部又は外部に存在する少なくとも１つのセンサによって検出可能である請求項１から請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記複数のパラメータの中の前記パラメータｐ１、ｐ２〜ｐｎが、
ａ．形態と、
ｂ．光学的特性と、
ｃ．生物電気的特性と、
ｄ．生物化学的特性と、
ｅ．機械的特性と、
ｆ．表面抗原の発現と、
ｇ．細胞質内抗原の発現と、
ｈ．誘電特性と、
あるいは、これらを組み合わせたものと
からなるグループから選択される請求項１から請求項１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ａ）それぞれの粒子ごとに、関心のある前記粒子の特性を示す複数のパラメータｐ１、ｐ２〜ｐｎの中の少なくとも１つを識別する手段と、
ｂ）関心のある前記粒子を前記粒子の中から選択し、それぞれの前記粒子ごとに、前記少なくとも１つのパラメータをそれぞれのしきい値基準と比較する手段と
を備えた、粒子母集団の中から関心のある粒子を同定及び操作する装置であって、
ｃ）それぞれの前記粒子ごとに、これまでに識別された前記少なくとも１つのパラメータｐ１、ｐ２〜ｐｎを記憶する手段と、
ｄ）記憶された前記少なくとも１つのパラメータの少なくとも１つの関数の値を処理し、関心のある前記粒子の選択基準と前記関数を組み合わせる手段であり、前記選択基準が、考えられる選択基準からなるグループから選択される、前記処理及び組み合わせる手段と、
ｅ）それぞれの前記粒子ごとに、前記しきい値基準を設定するステップであって、前記しきい値基準が、毎回、前記処理の結果に基づいて設定される、前記設定する手段と
をさらに備える、装置。
【請求項２０】
前記選択手段が、前記粒子の選択を微調整するための制御手段を備える請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記検出手段が、カメラと前記カメラの下方に配置された可動水平表面を有する顕微鏡を備える請求項１９又は請求項２０のいずれかに記載の装置。
【請求項２２】
前記可動水平表面が、使用中に液体中に懸濁状態で前記粒子を含む微小流体装置を収容するように設計されたハウジングを備える請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記水平表面が、前記粒子母集団を含む前記微小流体装置の表面全体の画像を前記検出手段によって取り込むため、実質的に水平なＸＹ平面上で移動することができ、Ｚ軸に沿って垂直に移動することができる請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
取り込まれた微小流体装置全体の画像に基づいて、検出されたそれぞれの前記粒子の画像が前記記憶手段によって記憶される請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
取り込まれた前記粒子の画像が、データベースからなる記憶手段に記憶される請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記データベースが、別個の波長に対する個々のチャンネルにおいてそれぞれ取り込まれたそれぞれの粒子の前記画像を記憶する請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
前記検出手段がカメラからなり、前記制御手段が、記憶されたそれぞれの前記粒子の前記画像を表示する手段を備える請求項２４から請求項２６のいずれかに記載の装置。
【請求項２８】
前記処理手段がコンピュータ及び処理プログラムを備える請求項１９から請求項２７のいずれかに記載の装置。
【請求項２９】
前記しきい値基準を設定する手段がコンピュータ及び第１の選択プログラムを備える請求項１９から請求項２８のいずれかに記載の装置。
【請求項３０】
前記選択手段が前記微小流体装置のための制御ユニット及び第２の選択プログラムを備える請求項１９から請求項２９のいずれかに記載の装置。
【請求項３１】
前記処理プログラムがそれぞれの前記粒子の寸法及び複数の形態学的パラメータに基づいて、前記粒子を分類するように構成されている請求項２８から請求項３０のいずれかに記載の装置。
【請求項３２】
前記処理プログラムが、それぞれの前記粒子の周囲からの蛍光強度の測定値に基づいて、前記粒子を分類するように構成されている請求項２８から請求項３１のいずれかに記載の装置。
【請求項３３】
前記検出手段が前記微小流体装置の内部及び／又は外部に存在するセンサを備え、前記手段が、
ａ．形態と、
ｂ．光学的特性と、
ｃ．生物電気的特性と、
ｄ．生物化学的特性と、
ｅ．機械的特性と、
ｆ．表面抗原の発現と、
ｇ．細胞質内抗原の発現と、
ｈ．誘電特性と、
あるいは、これらを組み合わせたものと、
からなるグループから選択された前記粒子の少なくとも１つのパラメータｐｉを検出するのに適したものである請求項１９から請求項３２のいずれかに記載の装置。
【請求項３４】
前記検出手段が、前記微小流体装置において懸濁状態にあるそれぞれの前記粒子ごとに、あるいは、選択的に、選択されかつ前記移送配置へ移された粒子からなる部分集合ごとに、複数のパラメータｐ１、ｐ２〜ｐｎの中の少なくとも１つの前記パラメータを検出するように構成されている請求項１９から請求項３３のいずれかに記載の装置。
【請求項３５】
前記処理手段が、初期配置に存在する前記部分集合に含まれる前記粒子に対する検出及び記憶された前記パラメータを、移送配置に存在する前記部分集合に含まれる同じ前記粒子に対する検出及び記憶されたそれぞれのパラメータと比較するように構成されている請求項３４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を操作するための小型化された方法及び装置に関する。より詳細には、本発明は、程度の差こそあれ大きな母集団から関心のある要素及び／又はその後の一連の処理に利用される要素を最適に選択及び分離するための方法及び装置に関する。
【０００２】
本発明は、主に、少量の懸濁媒体中に存在する細胞のサンプルに対して生物学的プロトコルを実施するのに使用され、それらの生物学的プロトコルは、個々の細胞又は粒子を操作するため、それらの細胞又は粒子を正確に制御することを必要とする。
【背景技術】
【０００３】
多くの実験プロトコルが存在し、それらの実験プロトコルは、サンプルを構成する母集団の中から特定の特性を有する粒子を正確かつ入念に選択することを必要とする。関心のある少なくとも１つのパラメータによって取得された値に基づいて、ある特定の基準を満たしその結果として実験プロトコルのその後の段階をうまく施されるのに適した母集団に含まれる粒子を同定できることは、実験的キャンペーンを迅速化する場合においてだけでなく、すなわち、一般的には、その実験的キャンペーンのコストを節減する場合においてだけでなく、特に、関心のある細胞が母集団内において微量である場合において重要なことである。
【０００４】
特に、細胞（又は、より一般的には粒子）の操作に基づいた診断実験プロトコルが、知られ、サンプル内におけるそれらの細胞の濃度は、とりわけ低く、そのために、関心のある細胞／粒子を見逃す危険性を冒さないために、関心のある細胞は、それらの独特の特性に基づいて、きわめて大きな感度で同定及び分離されなければならない。
【０００５】
例えば、ＥＰ０５００７２７（Ｂｉａｎｃｈｉ）は、末梢母体血のサンプルから有核胎児細胞（赤芽球）が豊富な母集団を得ること、そして、それらの有核胎児細胞は一連の遺伝子型診断手順（例えば、ＦＩＳＨ、ＱＦ−ＰＣＲ、など）を施されることに基づいた、染色体異常の出生前診断に関する実験プロトコルを記載している。
【０００６】
ＷＯ２００６０１８８４９（ＭｏｎａＬｉｚａ  Ｍｅｄｉｃａｌ）は、適切に豊富な母体経頸管的サンプル（ＴＣＣ）から得られた胎児栄養胚葉に対して類似する遺伝子型診断手順を実行できることを記載している。
【０００７】
これらのいずれの場合においても、公知の実験プロトコルに基づいて、その後に染色体遺伝物の分析に進むことができるように、どの細胞が有核であるかを同定しなければならない。さらにまた、偽陽性／偽陰性を回避するために、胎児細胞と母体細胞とを区別することが重要である。また、偽陽性となる可能性を排除するために、さらなる制御を実行しなければならない。
【０００８】
したがって、一般的には、１つか又はそれ以上の対応するセンサによって検出可能な関心のある細胞／粒子の１つか又はそれ以上の特性パラメータに対して、しきい値が、何が選択されるかに基づいて、設定される。
【０００９】
例えば、ＵＳ２００６０１３９６３８は、死細胞又は細胞クラスタをも含む細胞母集団から関心のある生細胞を誘電泳動によって同定及び選択するための方法を開示している。選択は、細胞内の明度分布を処理した後に実行され、これは、例えば、寸法のような細胞のいくつかの特性パラメータを取得することを可能にする。ある特定の値よりも小さい寸法を有する細胞だけが、関心のあるものとみなされるとして選択される。しかしながら、このように、寸法パラメータの値は、関心のある粒子を検査する前に設定されるので、多くの場合、母集団に含まれるほんの一部の細胞／粒子しか実際には分離されない。それどころか、関心のある細胞を、プロトコルのその後の段階のためにまったく選択しないことも可能である（必要がない）。しかしながら、このことは、母集団に含まれる細胞は実際にはまったく有効でないことを必ずしも意味するとは限らない。サンプリングごとに、細胞母集団における関心のある特性の分布が対象物ごとに大きく変動すると仮定すると、あるいは、さらに単純には、実験条件及び機器条件が変化する可能性のために、予め設定されたしきい値は、選択手順がその後の分析をうまく達成するにはあまりにも少なすぎる有効な細胞の分離しかもたらさないほどに高いものである可能性がある。一方、しきい値が低すぎれば、あるいは、例えば、細胞母集団における関心のあるパラメータ値の分布が多様なものであれば、選択手順は、十分に正確なものではない可能性があり（すなわち、有効でない細胞も選択される）、あるいは、細胞母集団全体を代表しない一部のサンプルが選択されることを可能にする可能性がある。
【００１０】
図１１は、公知技術の場合のように、すなわち、事前に決定されたしきい値すなわちサンプル全体を検査する前に決定されたしきい値を用いて、粒子の母集団において決定された粒子の選択を示す。
【００１１】
予め設定されたしきい値が、図１１（Ａ）に示されるように低すぎる場合、有効でない細胞も選択され、すなわち、選択された粒子は、汚染される。他方において、予め設定されたしきい値が、図１１（Ｂ）に示されるように高い場合、選択手順は、わずかな数の有効な細胞の分離をもたらす。
【００１２】
その結果として、検査は、しばしば繰り返されなければならず、新しいサンプルが、使用されなければならず、あるいは、より単純には、有効なサンプルの一部が無駄となり、それとともに、情報が、結果的に消失することになる。
【００１３】
幾つかの例では、サンプル特性の事前評価が実行され、サンプルの一部が検査される。この段階において収集された情報に基づいて、しきい値が、関心のあるパラメータに対して設定され、その後に、実際の選択が、残ったサンプルに対して実行される。この方法は、欠点を有するものである。なぜなら、第１に、この方法は、予備的評価のためにサンプルの一部を犠牲にしなければならないからであり、第２に、予め設定されたしきい値は、事前に検査されたサンプルの一部がサンプル全体の特性を代表していないことが結果的に判明すれば、もはや適切なものであるはずがないからである。
【００１４】
また、知られているように、微小流体装置内部の粒子を操作するための様々な技術がある。
【００１５】
ある方法は、誘電泳動電位ケージを使用し、また、ある方法は、レーザ顕微解剖又は光ピンセットを使用するものである。
【００１６】
レーザ顕微解剖による操作の欠点は、関心のある部分（単一細胞又はクラスタ等）が、サンプルが付着する支持体とともに、そのサンプルを解剖することによって操作されることである。さらにまた、レーザ顕微解剖段階は、流体に浸けられた細胞又は粒子には適用することはできない。
【００１７】
さらなる知られた方法は、本体を流体内部に配置し、光学的手段によってそれらの本体を操作することである。レーザピンセットによって、粒子を溶液内に高い精度で保持し、かつ、それらの粒子を予め定められたように動かすことが可能である。
【００１８】
しかしながら、この種類の操作は、欠点を有する。なぜなら、粒子を捕獲するレーザビーム内部の粒子は熱衝突の作用を受け、そのために、その粒子の位置は偶発的に無作為に変化させられることがあるからである。さらにまた、一度に一個の粒子しか動かすことができず、母集団内に存在するそれぞれの粒子の位置は制御することができない。
【発明の概要】
【００１９】
したがって、本発明の目的は、これまでに説明した欠点を克服した、関心のある母集団内に存在する微量な粒子を同定及び操作するための（その結果として、選択及び／又は分離するための）方法及び装置を提供することである。
【００２０】
より詳細には、本発明の１つの目的は、微量な粒子を迅速にかつ大きな感度で同定及び選択するための方法を提供し、分析コスト及び時間を節減し、かつ、有効なサンプルを無駄にすること又は情報が消失することを回避することである。
【００２１】
本発明の一態様によれば、請求項１に記載の方法が、提供される。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、請求項１５に記載の装置が、提供される。
【００２３】
本発明のさらなる利点及び特徴が、限定するものではない単なる例として提供される以下の好ましい実施形態の説明から、及び添付の図面を参照することによって、明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】粒子を最適に選択する本発明による方法を提供するシステムの概略図である。
【図２】本発明による方法の段階を示すフローチャートである。
【図３】粒子を最適に選択する本発明による方法を実施するプログラムのインタフェースを示すスクリーンショットの複写図であり、観察及び選択された粒子のリストを含む。これらのそれぞれの粒子ごとに、複数の実験パラメータのそれぞれの測定値及び様々な波長で１つか又はそれ以上の光チャンネルにおいてサンプルをスキャンすることによって取り込まれた画像が示される。
【図４】図３のプログラムのスクリーンショットのさらなる複写図であり、リスト内に存在する観察されたそれぞれの粒子ごとに、さらなる複数の実験パラメータのそれぞれの測定値及びサンプルをスキャンすることによって取り込まれた関連する画像を示す。
【図５】粒子を最適に選択するための本発明による方法を実施するためのプログラムのインタフェースを示すさらなるスクリーンショットの複写図であり、選択可能な観察された粒子ごとに、粒子ごとに測定された１つか又はそれ以上の実験パラメータの傾向を表現するヒストグラムの多様性を示す。
【図６】粒子を最適に選択する本発明による方法を実施するためのプログラムのインタフェースを示すさらなるスクリーンショットの複写図であり、それと同時に、スキャンされたサンプルにおける粒子の実際の配置を再現するため、観察されたすべての粒子を示す。
【図７】粒子を最適に選択するための本発明による方法を実施するプログラムのインタフェースを示すさらなるスクリーンショットの複写図であり、スキャンされたサンプル内に存在する粒子の実際の配置を再現するため、この方法に基づいて選択された粒子だけを示す。
【図８】粒子を最適に選択するための本発明による方法を実施するためのプログラムのインタフェースを示すさらなるスクリーンショットの複写図であり、粒子母集団に対して測定された２つの実験パラメータに関する値が分散図として示される。
【図９】本発明の方法に基づいて粒子を操作するための混成装置又はシリコン／プラスチックチップを示す画像である。
【図１０】図９に示される装置の部分概略図であり、本発明の方法に基づいて選択された粒子を廃棄／回収する段階の考えられる実施形態を示す。
【図１１】公知技術の場合において粒子母集団から決定された粒子を選択することを示す図であり、事前に、すなわち、サンプル全体を検査する前に決定されたしきい値を使用する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
図１に示される粒子を最適に選択するためのシステム１は、商業的技術の使用に基づくものであり、かつ、直立落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）２を備え、この直立落射蛍光顕微鏡２は、電動水平表面３（又は、ステージとも呼ばれる）と水平表面３の上方に配置された光学システム４とを支持するフレーム（図示しない）を備える。
【００２６】
水平表面３は、Ｘ−Ｙ平面上におけるきわめて高い位置決め精度（約±３ｍｍ）を備えたナノステッパモータを備え、支持体（図示しない）によって支持され、その支持体は、きわめて高い位置決め精度（約±０．０１ｍｍ）を備えたナノステッパモータを備え、顕微鏡フレームに接続された垂直スライド上を滑動するように取り付けられ、Ｚ軸上における焦点を正確に定めることを可能にする。
【００２７】
光学システム４は、照明装置（図示しない）、一組の蛍光フィルタ（図示しない）、及び可動光学ユニット５を備え、この可動光学ユニット５は、１６００×１２００メガピクセルの解像度を備えたＣＣＤカメラ（Ｏｒｃａ  ＥＲ  Ｈａｍａｍａｔｓｕ）６及び回転式タレット７を備え、この回転式タレット７は、異なる倍率を備えたいくつかのレンズを備え、選択されたレンズを電動表面３の上方に存在する位置まで回転させることができる。
【００２８】
落射蛍光システムを規定する照明装置及びフィルタシステムは、広域スペクトル白色光源と、４６０〜４９５ｎｍ（青色）の励起フィルタ（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）、５１５〜５５０ｎｍ（緑色）の発光フィルタ（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）、及び、５０５ｎｍにおける２色性ミラーを備えた第１のフィルタブロック（ＦＩＴＣブロック）と、明視野照明のための第２のフィルタブロックとを備え、顕微鏡２のフレームに固定される。
【００２９】
図９は、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ２００６，６，１２１−１２６に記載されるような液体中において懸濁状態にある粒子を操作するためのシリコン／プラスチック混成微小流体装置８（又は、チップとも呼ばれる）を例示する。チップ８は、１６ｍｍ×１６ｍｍの寸法である粒子操作チャンバ９を備え、この粒子操作チャンバ９は、底部壁と、底部壁に実質的に平行な上部壁と、底部壁と上部壁との間に配置されたスペーサエレメントとによって規定され、そのスペーサエレメントは、スペーサエレメントの高さに等しい所定の距離に底部壁と上部壁とを維持する。操作チャンバは、上部及び下部においては上部壁１３及び底部壁によってそれぞれ画定され、かつ横方向においてはスペーサエレメントによって画定される内部チャンバを有する。内部チャンバは、正方形の底部を備えた実質的に平行六面体の形状を有し、内部チャンバの側壁に平行に配置された分離壁１０を備え、この分離壁１０は、分離壁１０によって横方向に限定された実質的に平行六面体の形状及び長方形の底部を備えた２つのチャンバ１１及び１２を規定し、第１のチャンバ１１は、サンプル装填チャンバ（約２．９μｌ）を構成し、第２のチャンバ１２は、サンプル回収チャンバ（約０．６μｌ）を構成する。分離壁１０は、内部チャンバの側壁の近くに３００μｍの幅を備えた間隙１８を有し、この間隙１８は、サンプル装填チャンバ１１とサンプル回収チャンバ１２との間の連絡路１８を構成する。
【００３０】
実質的に平行六面体の形状及び正方形の底部を備えた操作チャンバの上部壁１３は、透明なものであり、ポリカーボネートからなり、４つの開口１４、１５、１６、及び、１７を有し、その４つの開口１４、１５、１６、及び、１７の中の２つの開口１４及び１５は、装填チャンバ内に配置され、２つの開口１６及び１７は、回収チャンバ内に配置され、それらの開口は、内部チャンバを外部と接続するのに適したものである。
【００３１】
内部チャンバの底部壁は、誘電泳動電極からなるアレイ又はグリッドを備え、それらの誘電泳動電極は、チップ８の表面を構成し、それらの電極のそれぞれは、個々に制御することができ、グリッド内部の個々の粒子を操作することのできる誘電泳動ケージを生成する。本発明による方法の一態様によれば、粒子は、粒子のそれぞれが、チップ８の表面を構成する電極を駆動することによって利用可能にされた複数の場所の中のある特定の場所において捕獲された後に、操作される。チップ８の物理的構造に類似して、粒子が捕獲される場所も、アレイに基づいて、操作装置の内部に配置される。
【００３２】
チップ８は、チップの底部壁の少なくとも一方の面上において液圧的に接続及び画定された異なる別個の２つのチャンバ（１１、１２）を備えることに留意されたい。あるいは、お互いに液圧的に接続された分離したチップを提供することも可能である。
【００３３】
チップ８は、さらにまた、操作チャンバが接着されるプリント回路を備え、このプリント回路において、アレイの個々の電極を個々に制御するための電子回路と、電子回路に通じる一組の接点とが規定される。
【００３４】
チップ８は、粒子、又は、好ましくは細胞を操作するための微小流体装置を構成し、この微小流体装置は、有利には使い捨て装置として使用されてもよい。
【００３５】
使用中、装填チャンバ１１の一方の開口１４（１６）が、オペレータによって、サンプル（実質的に液相の状態で）を内部チャンバ内に収容するのに使用される場合、装填チャンバ１１の他方の開口１６（１４）は、ベントの役割をなす。装填チャンバ１１と回収チャンバ１２との間の連絡路の小さい寸法を考慮すれば、空気／水のメニスカスが、連絡路内に発生し、このメニスカスは、サンプルが回収チャンバに侵入することを妨げる。その後、回収チャンバ１２は、サンプル溶液中に存在する粒子が回収チャンバ１２に侵入することを妨げる緩衝液で満たされる。
【００３６】
サンプルがチップ８内に収容されてしまえば、装置は、電動表面３上に配置され、電動表面において得られる適切なハウジング１９内のスクリュー（図示しない）によって位置決めされる。
【００３７】
このハウジング１９は、コネクタ（図示しない）を備え、このコネクタに、誘電泳動電極の制御システムが接続され、使用中、操作チップ８の接点と水平電動表面３内に存在するコネクタとの結合は、それぞれの誘電泳動電極を制御することを可能にする。
【００３８】
サンプル溶液中に存在する関心のある細胞を回収するために、通路Ｐが、チップ８の内部チャンバの底部壁に規定され、一組の誘電泳動電極からなる。この通路は、装填チャンバ１１の初期点Ｐ１から関心のある細胞を輸送するための連絡路１８を通り回収チャンバ１２の最終点Ｐ２まで延在する流出口を規定する。通路Ｐに存在する誘電泳動電極を次々に回収チャンバ１２の方向に駆動することによって、関心のある細胞は、サンプル溶液から緩衝液へ移され、それらの細胞は、その緩衝液に浸けられて回収される。
【００３９】
図１に示されるように、粒子を最適に選択するためのシステム１は、さらにまた、電気ケーブル（図示しない）によって顕微鏡２に接続された外部制御ユニット２０を備え、その外部制御ユニット２０は、１つか又はそれ以上の外部ユニット（図示しない）内に収容され、また、それらの外部ユニットのいくつかは、顕微鏡２のフレームによって機械的に支持されてもよい。より詳細には、制御ユニット２０は、電動ステージ３を管理するための第１の制御装置２１と、光学ユニットを管理しかつカメラから画像を取り込むための第２の装置２２と、誘電泳動電極の制御信号を管理するための第３の装置２３とを備える。
【００４０】
外部制御ユニット２０は、イーサネット（登録商標）ネットワーク（好ましくは、ＴＣＰ／ＩＰプロトコルに基づいて動作する）によって外部ユニットに接続された公知の種類の産業用コンピュータを備えてもよいこと、あるいは、イーサネット（登録商標）ネットワーク（好ましくは、ＴＣＰ／ＩＰプロトコルに基づいて動作する）によってお互いに接続された、専用電子機器によって提供される１つか又はそれ以上の外部ユニットを備えてもよいことに留意されたい。
【００４１】
さらにまた、粒子を最適に選択するためのシステム１は、「ＨＭＩ」（ヒューマン・マシン・インタフェース）装置とも呼ばれる１つか又はそれ以上のユーザインタフェース装置２４（図面にはそれらの１つだけが示される）を備える。それぞれのＨＭＩ装置２４は、データを表示するためのスクリーン（図１には示されない）とキー入力装置（図１には示されない）とを備えた公知の種類のコンピュータを備え、そのキー入力装置は、通常、キーボード及び／又はポインティングデバイスによって定義され、また、タッチパネル機能によってスクリーン内に統合されてもよい。それぞれのＨＭＩ装置２４は、オペレータが顕微鏡２の制御ユニット２０と対話することを可能にし、それによって、そのオペレータが、例えば、設定情報をカメラ６に送信し、レボルバー７のフィルタ又はレンズを選択し、その後に、選択されたフィルタ又はレンズを位置決めし、あるいは、電動ステージ３を所定の位置へ動かすことを可能にし、それによって、サンプルを装填した後の操作チップ８の表面上のある特定の位置に存在する細胞を表示する。
【００４２】
さらに、ローカルな構成又はリモートな構成で配置されてもよいコンピュータ３０、３１、及び３２が、イーサネット（登録商標）ネットワーク（好ましくは、ＴＣＰ／ＩＰプロトコルに基づいて動作する）を介して、ＨＭＩ装置２４に接続されてもよい。例えば、コンピュータ３０は、実験室に配置され、あるいは、いずれにしても、実験室分析のために確保された場所に配置された産業用コンピュータか又はオフィスコンピュータであり、コンピュータ３１は、オフィスコンピュータであり、かつ、実験室と同じ建物に配置され、コンピュータ３２は、オフィスコンピュータであり、実験室からかなり離れて配置される。コンピュータ３０及び３１は、ただ単に、イーサネット（登録商標）／イントラネット型ネットワークを介してＨＭＩ装置２４に接続されるが、コンピュータ３２は、インターネットを介してＨＭＩ装置２４に接続される。実験室からかなり離れて配置されたコンピュータは実験室に配置されたコンピュータと同じデータを表示できることに留意されたい。
【００４３】
ＨＭＩ装置２４は、粒子を最適に選択するためのシステムの制御ユニットと対話する（すなわち、データを双方向で交換する）第１の通信装置２５と、データベース（例えば、ＳＱＬ、ＳＱＬ  Ｌｉｇｈｔ、など）も実現する記憶装置２６と、ユーザと対話する（すなわち、データを双方向で交換する）第２の通信装置２７とを備える。第１の通信装置２５は、制御ユニットのデータへのアクセスプロトコルを提供し、かつ、存在するそれぞれの異なる周辺装置、例えば、電動ステージ３、可動光学ユニット５、カメラ６の制御コマンドを実行する。
【００４４】
第２の通信装置２７は、実際のグラフィックユーザインタフェースを提供する。
【００４５】
２つの通信装置は、多くの場合、間接的にしかお互いに対話しない。すなわち、それらの通信装置は、記憶装置２６を介してお互いに対話する。言い換えれば、ユーザが特定の装置を制御する特定のコマンドを除いて、第１の通信装置２５は、記憶装置２６のデータを読み出し／書き込み、それと同時に、第２の通信装置２７は、基本的には無作為に（すなわち、オペレータがユーザインタフェースを使用することを決心したとき）、記憶装置２６のデータを読み出し／書き込む。
【００４６】
第１の通信装置２５、第２の通信装置２７、及び記憶装置２６は、通常、粒子操作プログラム（ソフトウェア）を全体的に構成するそれぞれのプログラム（ソフトウェア）を提供される。より詳細には、第２の通信装置２７を提供するプログラム（ソフトウェア）は、グラフィックユーザインタフェースを構成し、画像処理手段を提供し、この画像処理手段によって、それぞれの粒子の特徴を示すパラメータｐ１〜ｐｎが、抽出される。同様に、第２の通信装置２７を提供するプログラム（ソフトウェア）は、より一般的に、検出されたパラメータの少なくとも１つの関数（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を処理するための手段を提供する。さらにまた、第２の装置２７を提供する同じプログラム（ソフトウェア）は、粒子を選択するための手段と、この選択を実行するための参照パラメータとして使用されるべき選択基準を設定するための手段とを構成する。
【００４７】
このプログラムは、通常、ＨＭＩ装置２４の一部を構成するコンピュータに常駐するが、その代わりとして、ローカルに又はリモートに配置されたその他のコンピュータに常駐し、イントラネットネットワーク及び／又はインターネットネットワークを介してデータを交換してもよい。
【００４８】
使用中、チップの表面全体がスキャンされ、いくつかの画像が、取り込まれ、記憶装置の領域２８に記憶され（合計で２０ラインであり、それぞれのラインごとに部分的に重なり合った１５枚の画像）、それによって、チップ内容を適切な解像度で正確に評価することを可能にする。記憶された画像は、グラフィック編集によって処理され、このグラフィック編集は、存在する細胞を同定することを可能にし、同定された細胞ごとに、それぞれの細胞の特性データ、すなわち、パラメータｐ１〜ｐｎを、データベースＳＱＬを実現する記憶装置の領域２９に記憶することを可能にする。
【００４９】
カメラのような外部センサによってチップの表面全体をスキャンする代わりに、あるいは、それと並行して、それぞれの細胞の特性データを検出するために、チップ内部のセンサ（図示しない）を使用することもできることに留意されたい。ＷＯ２００７／０４９１０３に記載されるように、当然ながら、このＷＯ２００７／０４９１０３の内容は、ただ単に参照しなければならない部分として本明細書に組み込まれるが、例えば、チップ８の表面は、誘電泳動電極と、それぞれの細胞の特性を示すパラメータｐ１〜ｐｎを検出することのできる光学センサ（又は、ｉｍｐｅｄｅｎｚｉｏｍｅｔｒｉｃセンサ）との両方を備えることもできる。
【００５０】
さらにまた、それぞれの細胞の操作は、細胞が微小流体装置内において操作され、それぞれの細胞は、個々に制御することのできる複数の場所の中の一般的な場所において捕獲されたものであるという条件下において、誘電泳動に代わる操作技術（例えば、光泳動捕獲（ｏｐｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｔｒａｐｐｉｎｇ）、誘電体上における電気的濡れ（ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ  ｏｎ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ−ＥＷＯＤ））によってうまく実行されてもよいことに留意されたい。
【００５１】
ここで、限定するものではない例として、本発明による方法の選択的な実施形態を図２に示されるフローチャートに基づいて説明する。
【００５２】
開始するために（ブロック１００）、実行されるべき実験が、オペレータと分析されるべきサンプルとに関する情報を収集することによって識別される。そして、システムは、顕微鏡２を構成する装置に関して、制御ユニット２０の接続及び／又は構成及び／又は較正が正しいかどうかを確認するための一連の処理を自動モードで実行し（ブロック１１０）、それによって、実験中の正しい処理を保証する。一般的には、汚染物質が、チップ８の表面上に、より詳細には、流出口の通路Ｐに沿って、存在しないことを保証するために、予備的検査がスケジュールされる（ブロック１２０）。この検査が、汚染物質が存在すると判定すれば、実験は中断され（ブロック１３０）、それに対して、結果が、汚染物質は存在しないと判定されたならば、サンプルが収容される（ブロック１４０）。汚染物質が存在しないことの確認が、この時点において繰り返され（ブロック１５０）、その他の望ましくない物質が分析されるべきサンプルとともにチップの表面上に取り込まれる可能性を排除する。汚染されている場合、オペレータは、当然ながら、これまでに収容されたサンプルを回収してもよく、それによって、そのサンプルは、別の実験において再利用されてもよい。
【００５３】
この検査が完了したら、実際の分析段階が、開始されてもよい。チップの表面全体が、自動モードで、かつ、適切なグラフィック編集処理によって、スキャンされ（ブロック１６０）、それぞれの粒子の一組の特性データ、すなわち、パラメータｐ１〜ｐｎが、識別され、データベース（又は記憶手段とも呼ばれる）に記憶される。
【００５４】
チップの表面全体の画像を取り込み、かつ、それぞれの粒子の特性パラメータを記憶したならば、サンプル全体に関する情報を取り込んだ後に、オペレータは、関心のある粒子を選択する基準を設定してもよい（ブロック１７０）（選択基準は、例えば、ある特定の形態を備えた粒子を選択すること、最も輝度の高い粒子を選択すること、又は、ある特定の特性を備えた微量な粒子を選択することであってもよい）。より詳細には、選択基準は、それぞれの粒子ごとに取り込まれたデータを処理した結果に基づいて設定される。
【００５５】
実務レベルにおいて、グラフィックインタフェースは、サンプル全体を光学的にスキャンすることによって観察された粒子のリスト（この具体的な場合においては細胞のリストであるが）を含むスクリーンショット（図３及び図４）をオペレータに表示する。それぞれの粒子ごとに、光学的パラメータ（透明度、不透明度、光度の均一性）、形態学的パラメータ（面積係数（ａｒｅａ  ｆａｃｔｏｒ）又は画素におけるビームの間接測定値、形状因子、丸み又は球形度、など）、チップ８のグリッドのセル（場所）内部における正しい位置決め、異なる波長に対応する光チャンネルにおいて測定された明度のような、スキャン中に測定された多様な実験パラメータの値が、表示されてもよい。一般的に言えば、粒子ごとに測定されたパラメータは、生物電気的特性及び／又は生物化学的特性（例えば、カルセインによってマーキングされた細胞の蛍光が減衰することを経時的に調べること、又は、ある特定の時間間隔において取り込まれた画像を分析して染料の吸収を測定すること、などによって、細胞は生きているか又は死んでいるかどうかを確定することもできる）、又は、機械的特性（例えば、粒子の弾性が、その粒子を変形させることのできる誘電泳動インパルスを粒子に印加することによって決定されてもよく、その粒子がそれの元の形に戻るのに要する時間を観察することによって、その粒子の弾性率を推定することができる）、又は、誘電特性（観察される粒子がチップ８のグリッドのセル内に存在するならば、ＮＤＥＰによって操作することのできる粒子を処理し、それに対して、粒子がチップ８のグリッドの隣接するセル間に存在するならば、ＰＤＥＰによって操作することのできる粒子を処理する）、又は、細胞の場合、細胞質の表面か又は内部の抗原の発現、あるいは、それらを適切に組み合わせたものを意味してもよい。データは、複数のセンサを使用することによって取り込まれ、それらのセンサは、混成装置８の内部か又は外部に存在してもよい。
【００５６】
この目的のために、本発明による方法は、また、チップの内部及び／又は外部に存在するそれらのセンサの１つによって検出することのできる少なくとも１つのマーカーによって懸濁状態にある粒子（又は、この場合には、細胞）をマーキングする段階を備えてもよい。さらにまた、それぞれの細胞ごとに、チップ８の表面に対してそれらの細胞の配置を定義する座標が、記憶されて表示される。
【００５７】
さらなるスクリーンショット（図５）を介して、オペレータは、細胞母集団に関して、スキャン中に測定されかつ記憶された実験パラメータｐ１、ｐ２〜ｐｎの値、及び／又は、システムによって適切に処理されたこれらのパラメータのうち少なくとも１つのパラメータの１つか又はそれ以上の関数の値の分布を示す画像を表示される。選択基準を適切に規定することによって、オペレータは、問題の母集団に含まれる粒子の部分集合を選択するために、インタフェースを使用してもよい。図５のヒストグラムにおいてカーソル３４の位置を変化させることによって、オペレータは、測定されたパラメータよりも大きい及び／又は小さいしきい値を設定してもよく、及び／又は、そのパラメータのそれぞれの関数よりも大きい及び／又は小さいしきい値に設定してもよい。
【００５８】
この上限しきい値又は下限しきい値及び／又は関心のあるこの間隔（例えば、処理されかつ選択基準に関連するパラメータｐｉの関数の関心のある部分に対応し、あるいは、粒子の母集団内においてその関数の値が分布する部分に対応し、したがって、下限しきい値と上限しきい値との間に存在する）は、「しきい値基準」を構成し、関心のある粒子を選択するために、パラメータｐｉの関数の値は、この「しきい値基準」と比較される。
【００５９】
このしきい値は、細胞サンプルの特性を全体的に評価した後に、より詳細には、記憶されたパラメータの関数のシステムによって処理された値に基づいて、オペレータによって選択されてもよく、あるいは、ある特定の選択基準に合致する粒子を同定する手順が、自動的に実行されてもよく、この選択基準は、検査される母集団全体から収集されたデータに基づいて、実験ごとに変化してもよい。
【００６０】
さらにまた、後者の場合、オペレータは、最終的な選択として、自動的選択手順を実行するかどうかを選択してもよく、あるいは、その代わりとして、自動選択計画を制御し、結果を人手によって検査することによって、その自動選択計画を微調整してもよいことに留意されたい。
【００６１】
実験において関心のある量のしきい値は、事前に設定されないこと、すなわち、スキャンによって得られたサンプル全体に関する情報に基づいて、選択基準、及び、その結果として、相対的なしきい値が、与えられた要件を満たす細胞を同定及び操作するために適切に選択されることを強調することは重要なことである。
【００６２】
したがって、本発明の方法によれば、予想されるその後の使用のために、総合的に最良の特性を有する細胞、すなわち、その時ごとに定義される適切なメリット関数（ｍｅｒｉｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の値が最適化された細胞を選択することが可能である。
【００６３】
このように、ユーザインタフェース２７は、粒子を選択するための手段を構成し、さらにまた、選択のために参照パラメータとして使用されるべきしきい値基準を設定するための手段を構成する。
【００６４】
細胞のその後の用途に基づいて、例えば、さらなる実験に使用するために、選択基準は、それらの細胞をその後の実験段階に適したものにする所定の要件を満たす十分な数の細胞を得るように変更されてもよい。
【００６５】
図５のインタフェースを介して、関心のある、しきい値を規定し（ブロック１７０）、それと同時に、オペレータは、母集団から粒子を選択し、パラメータｐ１、ｐ２〜ｐｎの値が測定された粒子と、カーソル３４によってグラフィック的に設定されたしきい値によって規定される関心のある間隔内に存在する関数の値が計算された粒子とを識別する。
【００６６】
オペレータは、必要であれば、図５のヒストグラムにおいてカーソル３４を位置決めすることを支援され、要求に応じて、インタフェースは、それぞれのヒストグラムバーごとのさらなるスクリーンショット（図示しない）を、そのバーに関連する粒子の画像とともに表示する。
【００６７】
限定するものではない例として、図５は、例えば、寸法、球形度、操作に使用された装置のセルの１つにおける位置決めの正確さのような、検査された母集団における粒子の形態学的特性の分布に関するヒストグラムを第１の列に示す。第１の列の右側にある第２の列には、適切な組み合わせ及び／又は測定された様々なパラメータの処理に基づいて、複雑な関数の傾向を示すヒストグラムが存在し、これは、間接的に測定可能な特性の指標として使用されてもよい。組み合わせの例として、様々な波長において実行された明度の測定値に関する結果が、組み合わせられてもよく、それぞれの測定値は、ある特定の特性（例えば、細胞核の特性、特定の抗原の特性、粒子の自発的蛍光の特性、など）の存在／不在に関連する特定のマーカーに対応する。処理の例として、明度測定値に関する結果が、考慮に入れるために、また、必要であれば、チップ８の異なる領域における照明装置による様々な照度を補償するために処理されてもよい。
【００６８】
図５のインタフェースによって粒子母集団から選択した後、ユーザは、その後に、すでになされた選択を微調整してもよい（ブロック１８０−選択の微調整）。図５のスクリーンショットを介して設定されたしきい値基準（ブロック１９０）を満たす粒子に対して、ユーザは、選択された粒子を検査してもよい。なぜなら、図３及び図４のスクリーンショットを介して、ユーザは、それぞれの粒子ごとに、粒子の特性パラメータ及びサンプルのスキャン中に取り込まれた画像の両方を観察することができるからである。異なる波長における１つか又はそれ以上の光チャンネルにおいて表示されるこれらの画像（図３及び図４における限定するものではない例として、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、及び、ＴＲＩＴＣチャンネルにおける細胞の画像が示される）は、オペレータが最初に事前選択された粒子を最終的に選択するかどうかを決心することを可能にし、そのために、図３及び図４のスクリーンショットは、すでになされた選択を微調整するための制御手段を構成する。実際に、粒子は、最初に事前選択されたとしても、その粒子は、不純物である可能性があり、したがって、その後の実験プロトコルのためには有効なものではない可能性がある。
【００６９】
グラフィックユーザインタフェース２７は、また、すでになされている選択を微調整するためのさらなる制御手段をオペレータに提供し、この制御手段は、顕微鏡接眼レンズを介して選択されたそれぞれの粒子を観察する能力を備える。制御ボタン（図示しない）を駆動することによって、選択された粒子は、顕微鏡レンズの真下に自動的に配置され、このことは、オペレータが接眼レンズを介して粒子を観察することを可能にする。
【００７０】
選択された粒子は、顕微鏡レンズの真下に自動的に配置されることに留意されたい。なぜなら、制御ボタンが、駆動されると、グラフィックユーザインタフェース２７は、チップ８のグリッド内に存在する関心のある粒子の座標を制御ユニット２０に通知し、その制御ユニット２０は、粒子（チップ８のグリッド内の位置）を顕微鏡レンズに整列させるために、Ｘ−Ｙ平面上に収容されたステージを正確に動かすからである。必要であれば、制御ユニット２０は、電動ステージをＺ軸に沿って自動的に動かし、選択された粒子に焦点を合わせる。
【００７１】
このさらなる制御段階の終了時点において、オペレータは、粒子が関心のあるものであるかどうか、あるいは、その粒子が不純物とみなされるべきかどうかを決定してもよい。
【００７２】
このように、グラフィックユーザインタフェース２７は、粒子を選択するための手段を構成し、さらにまた、関心のある粒子の選択を微調整するための制御手段を構成する。センサが、微小流体装置の外部に存在し、かつ、カメラからなる場合、あるいは、センサが、微小流体装置の内部に存在し、かつ、光学センサからなる場合でさえも、制御手段は、それぞれの粒子の画像を表示するための手段を備える。
【００７３】
インタフェースは、さらなる可能性をオペレータに提供する。すなわち、チップの表面上においてサンプルに含まれるすべての粒子の配置を観察することができ（図６）、あるいは、実際に選択された粒子だけの配置を観察することができ（図７）、上述したように、適応した形でしきい値を設定することができる。図６のインタフェースのスクリーンショットに示される粒子の座標は、チップ８のサンプルの座標に対応し、そのために、相対的な物理的構造を反映する分布を有することに留意されたい。より詳細には、図６のスクリーンショットの下部において、粒子が存在しない水平なバンドを識別することができ、このバンドは、選択された粒子の回収チャンバ１２に対応する。同様に、粒子は、上部には現れない。なぜなら、装填チャンバ１１のこの上部は、廃棄された粒子を収容するのに使用されるからである。
【００７４】
図８は、インタフェースのさらなるスクリーンショットを示し、このスクリーンショットにおいては、オペレータは、粒子母集団において関心のある２つのパラメータ又は関数の分布を分散図（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｄｉａｇｒａｍ）の形で観察することができる。限定するものではない例として、図８は、２つの異なる波長において測定された明度値を示し、それぞれが、特定のマーカーに対応している。適切なコマンドの使用を介して、オペレータは、類似する分散図において、その他のパラメータ及び／又は関数に関する値を観察することができる。また、この形の表示を介して、オペレータは、適切な選択基準を規定するようにしきい値を設定してもよく、それと同時に、ヒストグラムによる表現を参照してこれまでに説明したように、この要件に応じた粒子を選択してもよい。
【００７５】
この段階が終了し、選択基準を規定し、この基準を満たす粒子の初期選択を実質的に実行したら、手順の次の段階（ブロック１９０）は、これまでの段階において選択された粒子の制御（必要であれば、１つずつでさえも）を含み、必要であれば、その選択を微調整する。
【００７６】
そして、オペレータは、チップに含まれる母集団全体を総合的に分析したこれまでの段階においてなされた粒子の選択を確認し、オペレータの選択が正しいことを確認してもよい。なぜなら、オペレータは、個々のそれぞれの細胞の特定の特性を詳細に分析することができるからである。インタフェースによって提供される可能性は、利用可能な領域の中のいずれか１つの値に基づいて、例えば、意図が一連のその後の実験のために「最良」の細胞を選択することであれば、あるいは、ユーザが特定のチャンネルにおいてお互いに類似する光度値を備えた細胞を選択することを望んでいるならば、細胞の場合におけるＤＡＰＩ領域での増加する光度に基づいて粒子を整理する可能性を含む。
【００７７】
ユーザが、これまでに選択に満足しなければ、このユーザは、選択をさらに微調整するために、先行する段階に戻り、必要であれば、これまでに設定された選択基準を変更してもよい（ブロック１８０）。他方において、選択の結果が、定量的かつ定性的に満足できるものであれば、この方法における次の段階は、第１の移送段階又は送出段階、すなわち、選択された粒子をチップの表面上の最初に占めていた位置から、粒子を回収チャンバ１２へ運搬するために同様にシステムに収容された流出口の位置まで移送することを目的とした粒子の自動操作に進むことである（ブロック２００）。これは、選択された粒子が回収チャンバへ移動する経路の第１の部分を構成する。使用されるたびごとの操作装置の特定の幾何学的形状に基づいて、単一の中央流出口が、提供されてもよく、あるいは、操作装置は、送出処理を迅速化及び円滑化するために、いくつかの流出口を平行に備えてもよい。この送出処理は、これまでに選択された関心のある粒子を分離し、サンプル内のそれらの粒子だけを操作する。
【００７８】
この時点において、この方法は、新しいスキャン（ブロック２１０）を実行することによって得られた流出口に対するさらなる制御段階（ブロック２２０）をスケジュールし、その流出口及びその流出口に含まれる粒子の画像を取り込む。これらの画像から得られた情報に基づいて、ユーザは、第１の移送段階において選択されたすべての粒子の中から、どの粒子／細胞を廃棄し、かつ、どの粒子／細胞をチップから抽出し、回収チャンバ１２に運搬するかを決定する。
【００７９】
流出口の目的地に正しく到達しない可能性がある選択された粒子を第１の移送段階が実際に操作したことを保証するため、このさらなる制御段階は、それぞれの粒子ごとに、粒子の元の位置におけるその粒子の写真と流出口の位置におけるその粒子の写真とを比較することによって実行される。
【００８０】
図１０に示されるように、流出口の通路Ｐに沿って、廃棄ステーション３３は、選択電極のアレイ３４を備えていることがわかり、これらの選択電極は、流出口制御（ブロック２２０）の結果に基づいて、それぞれの粒子ごとに、その粒子が廃棄又は回収されるべきかどうかを確認する。粒子が、選択されたならば、その粒子は、回収チャンバへ進み、それに対して、その粒子が、廃棄されるならば、装填チャンバ１１の一部分に規定された廃棄流出口へ運搬される。この選択された粒子を回収する段階は、その粒子だけを操作することによって実行される。
【００８１】
これに続いて、第２の移送段階又は送出段階が、実行され、これらの段階の目的は、この時点までに選択されかつ確認されたすべての粒子を回収チャンバに運搬することである。そして、この回収チャンバから、粒子は、回収されてもよく、必要であれば、外部に存在する装置上で又はその場で、さらなる分析段階に使用されてもよい。
【００８２】
関心のある粒子を最適に選択するのに使用されるシステムは、手順が完了すれば、実行されたばかりの分析に関する情報を含むレポートを発行する（ブロック２６０）。
【実施例１】
【００８３】
クラスタの除去
本発明による方法の多くの潜在的な用途の１つは、クラスタを形成するように群をなす粒子の存在が、例えば、その後に単一の粒子だけを使用する場合に望ましいものでないならば、それらの粒子を粒子母集団から除去することである。このことは、例えば、生細胞を分離する場合に発生し、オペレータが、その後の分析を単一の細胞に対して実行したい場合、サンプル内にクラスタが存在することは、データの取り込みを変化させることがあり、あるいは、検査の結果を改変することさえもある。
【００８４】
この場合においては、オペレータは、本発明による方法を実施するインタフェースを介して、サンプルを構成する粒子及び粒子クラスタを観察してもよく、かつ、それぞれの粒子ごとに、複数のパラメータを確認することができる（図３）。より詳細には、この場合においては、粒子又はクラスタの半径が、操作装置の表面に対する対応する座標と組み合わせて測定され、また、粒子の球形度が、評価される。最後に、粒子が、操作に使用される誘電泳動細胞の１つに対応する場所に実際に使用中に存在することが確認される。また、選択をサポートするために、選択処理を開始する前に実行されるサンプルの全体的スキャン中に得られた粒子又はクラスタの画像が、処理される。
【００８５】
インタフェースのその後のスクリーンショットに関連するカーソルを適切に使用して（図５）、オペレータは、粒子の寸法（半径）又は丸みに対する上限しきい値を選択し、したがって、測定されたデータがそのしきい値を超える粒子を選択する（そして、それらの粒子を装置から除去する）。クラスタの確率指標（ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）は、細胞のいくつかの特性パラメータ、例えば、寸法及び丸みの関数であることに留意されたい。実際に、測定された大きな半径は、より大きな寸法を備えた単一の粒子に対応するのではなく、クラスタに対応する確率が高く、また、より長い形状は、単一の粒子を意味するのではなく、主方向に群をなすいくつかの粒子すなわちクラスタを意味する確率が高い。さらにまた、粒子が、装置の操作ケージの高さに存在するならば、測定されたデータは、粒子に関するものであり、装置の表面上に誤って存在している不純物に関するものではないと断言することができる。
【００８６】
検査される量に対するしきい値及び利用間隔が、適切に規定されたならば、オペレータは、サンプル中に存在するクラスタを選択し、必要であれば、事後に、そのオペレータの選択が正しいことを検査し、サンプルからそのクラスタを除去し、単一の粒子を操作装置内に選択的に維持してもよく、その単一の粒子に対して、オペレータは、その後の段階において、その装置内において分析を実行してもよい。
【実施例２】
【００８７】
出生前診断
様々な出生前診断プロトコルの場合、母体血からなるある濃度のサンプルを提供し、胎児赤血球をそのサンプルから選択し、それらの胎児赤血球に対して、遺伝分析を実行しなければならない。このために、実質的に、母体由来ではなく胎児由来の、核を備えた細胞を同定しなければならない。この種の判定は、１つか又はそれ以上の蛍光マーカー、例えば、細胞の核に結合する第１のマーカー（ＤＡＰＩ）及び母体由来ではなく胎児由来の抗原に選択的に結合する第２のマーカー（ＦＩＴＣ）によって細胞をマーキングすることによって、実行されてもよい。２つの個々の波長のそれぞれにおいて２つのマーカーの蛍光強度を検出することによって、両方のマーカーが存在する細胞を同定することができる。細胞が、非特異的自己蛍光の現象を呈する場合、すなわち、ある波長において検出することができる場合、蛍光検出は、誤差の影響を受けることがあるので、どの細胞がこの現象を呈しているのか、そのために、どの細胞が除去されなければならないのかを決定するために、第３の波長（ＴＲＩＴＣ）において第３の蛍光検出を実行することは好ましいことである。なぜなら、ＤＡＰＴチャンネル及びＦＩＴＣチャンネルにおいて蛍光を検出することは、それ自体、細胞が胎児有核細胞であることを保証しないからである。この意味において、本発明の方法によれば、選択基準が、胎児有核細胞に対して設定され、すなわち、測定及び記憶されたパラメータの関数を処理することに基づいてそれぞれの値又はしきい値間隔が、設定され、これは、事実上、誤って選択する可能性すなわち偽陽性を選択する可能性を最小限に抑制する。
【００８８】
本発明による方法を実施するインタフェースを使用すれば、オペレータは、操作装置の表面上に存在する粒子の座標を、スキャン中に識別された複数のパラメータの値に関連づけ、さらには、考察される様々な波長において得られた画像に関連づけ、また、識別されたパラメータに基づいて計算された１つか又はそれ以上のメリット関数の値に関連づけることができる。より詳細には（図３、図４、及び、図５）、オペレータは、細胞母集団内におけるいくつかの関数の値の分布を評価することができる。
【００８９】
第１の関数は、細胞が胎児有核細胞である確率の指標（「胎児」として図５に指示される）であり、また、照明装置によるチップ８の異なる領域における異なる照度を補償するために発現されるＦＩＴＣチャンネルにおける蛍光強度の指標である。第２の関数（Ｄａｐｉとして図５に指示される）は、ＤＡＰＩチャンネルにおける蛍光強度の指標であり、また、蛍光強度の処理された関数である。第３の関数は、実際に誤りを発生させているＤＡＰＩチャンネル及びＦＩＴＣチャンネルにおける蛍光検出の確率の指標である。なぜなら、問題の粒子は、自己蛍光の現象を呈するからである（図５に示される名称のないヒストグラム）。
【００９０】
このように、オペレータは、サンプル全体の観察に基づいて、かつ、適応した形で、これまでに説明された胎児関数及びその他の有効値の間隔を設定することができ、それによって、これまでに説明された基準が確認された細胞だけを選択することができる。
【図１】
2011501205.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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