(57)【要約】  たとえばＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）４０００自動血液分析器およびＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅなどの自動血液分析器によって、細菌から赤芽球を区別する方法である。細菌細胞の光および蛍光の散乱の仕方は、赤血球、白血球、赤芽球核、および血小板とは異なる。赤芽球核によって生成された信号は、細菌によって生成された信号から赤芽球核が区別可能であるほど十分に固有なので、細菌によって生成された信号は、赤芽球の信号と区別することができる。ノイズによって生成された信号は全てＡＮＤ／ＯＲ閾値未満なので、血小板、溶解赤血球ゴースト、およびその他の細胞残屑によって生成された信号は、血液分析器の三重トリガ回路によって遮断される。システムのソフトウェアに含まれるアルゴリズム（複数可）は、細菌によって生成された信号の位置および形状によって、細菌によって生成された信号を検出および計数し、単位体液あたりの細胞の濃度を計算する。さらに、たとえば滑液などの特定の体液は、自動血液分析器によって体液の試料を分析する前に体液の粘度を低下させるために、粘度低下剤で短時間だけ前処理されてもよい。
2011529186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中の細菌を分画および正確に計数する方法において、
（ａ）マルチアングル光散乱および蛍光発光の測定が可能な、三重トリガシステムを有する自動血液分析器を提供するステップと、
（ｂ）赤血球を溶解することが可能な、白血球の形態を保存することも可能である試薬を提供するステップと、
（ｅ）体液の試料を提供するステップと、
（ｆ）試薬および体液の試料を混合するステップと、
（ｅ）体液中に赤血球および赤芽球が存在する場合、赤血球および赤芽球の膜を同時に溶解するステップと、
（ｆ）体液中に赤芽球が存在する場合、赤芽球核を核染色剤で染色するステップと、
（ｇ）マルチアングル光散乱によって白血球を分画するステップと、
（ｈ）体液中に赤芽球が存在する場合、マルチアングル光散乱および蛍光発光のうちの少なくとも１つによって、赤芽球核を検出するステップと、
（ｉ）蛍光発光およびマルチアングル光散乱を測定する検出器を含む回路によって、細菌を分画および計数するステップと、を含む方法。
【請求項２】
体液の試料を希釈剤で希釈するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
赤血球を検出および計数するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
溶解された体液の試料をフローセルを通じて搬送するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
体液の試料の分析用データを保存するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
体液の試料の分析の結果を報告するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
白血球、赤血球、および細菌を分画するために、少なくとも１つのアルゴリズムによって体液の試料を分析するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
赤芽球および細菌が、マルチアングル散乱測定および蛍光発光測定によって計数される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのマルチアングル光散乱測定が、約０°から約１°の角度で取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのマルチアングル光散乱パラメータ閾値が、白血球からの全ての信号を承認してその他の全ての信号を識別するように設定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのマルチアングル光散乱測定が、約３°から約１０°の角度で取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのマルチアングル光散乱パラメータ閾値および少なくとも１つの蛍光発光閾値が、前記少なくとも１つの蛍光発光閾値からスプリアス正ノイズ信号をおよび少なくとも１つの蛍光発光閾値からスプリアス負ノイズ信号を除去し、白血球、赤芽球、および細菌集団からの信号を取得された信号に含ませるように設定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの蛍光発光閾値、ならびに信号を取得および承認するための少なくとも１つのマルチアングル光散乱パラメータ閾値からの散乱光の強度信号の三次元グラフを作成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
作成された三次元グラフおよび承認された信号から、白血球、赤芽球、および細菌を分画し、前記白血球、赤芽球、および細菌の細胞数を判断するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
細菌の集団が、散乱および蛍光発光の両方のパルスの振幅、ならびに各細胞集団の信号の位置およびパターンに基づく少なくとも１つのアルゴリズムによって、赤芽球の信号から分画される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
光学血小板経路の２つの浮遊閾値の内側および外側の両方の信号の密度を確認することにより、前記少なくとも１つのアルゴリズムによって細菌信号の存在が裏付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記体液が、血液、脳脊髄液、胸膜液、腹膜液、心膜液、滑液、腹水、排出液、および透析液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記体液の粘度を低下させるために粘度低下剤を使用するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自動血液分析器によって体液中の白血球、赤芽球、および細菌を分類および計数する方法に関する。より具体的には、本発明は、三次元空間においてマルチアングル光散乱、蛍光発光、および三重トリガ回路によって体液中の白血球集団、赤芽球、および細菌を同時に分画および計数する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な体液の検査は、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎または肺膿瘍、腹膜腔感染、および敗血症性関節炎の診断に重要である。細菌感染の有無を判断するために体液を分析する従来の方法は、生体試料の希釈、血球計による細胞の計数、細胞培養の調製、グラム染色、および顕微鏡検査を含み、面倒で、時間がかかり、労働集約的で、細菌性髄膜炎などのいくつかの臨床例においては、未治療症例は致命的あり得るので、緊急治療を必要とする。このように、高速血液分析器で体液を分析する能力は、非常に有益である。
【０００３】
このような体液はあまり安定的ではなく、およそ２時間以内に劣化すると予想され得るので、入院患者から採取されたほとんどの体液の分析は、可能な限り早く病院内で実行されなければならない。脳脊髄液は、１時間以内に劣化すると予想され得る。たとえば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｄｙ  Ｆｌｕｉｄｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｎｉｏｔｉｃ，ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ，ｓｅｍｉｎａｌ，ｓｅｒｏｕｓ，＆ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄｓ：ａ  ｔｅｘｔ  ｂｏｏｋ  ａｔｌａｓ／Ｃ．Ｋｊｅｌｄｓｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｊ．Ｋｎｉｇｈｔ，ｅｄｓ．３ｒｄ  ｅｄ．ＡＳＣＰ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３を参照されたい。このように、自動血液分析器で体液を迅速に分析することは、病院検査室において望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，３２５，１６８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６３１，１６５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９３９，３２６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５１６，６９５号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６４８，２２５号明細書
【特許文献６】米国特許第５，５５９，０３７号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６５６，４９９号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｏｄｙ  Ｆｌｕｉｄｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｎｉｏｔｉｃ，ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ，ｓｅｍｉｎａｌ，ｓｅｒｏｕｓ，＆ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄｓ：ａ  ｔｅｘｔ  ｂｏｏｋ  ａｔｌａｓ／Ｃ．Ｋｊｅｌｄｓｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｊ．Ｋｎｉｇｈｔ，ｅｄｓ．３ｒｄ  ｅｄ．ＡＳＣＰ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３
【非特許文献２】ＷＨＩＴＮＥＹ  ＷＩＬＬＩＡＭＳ．Ｈｅｍ  Ｉ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ［ｏｎｌｉｎｅ］，［２００８年７月１５日取得］、インターネット：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｔ．ａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｗｗｉｌｌｉａｍｓ／ｎｅｗ＿ｐａｇｅ＿４．ｈｔｍｌ＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多くの血液分析器の製造元は、細胞数計数のために体液の分析を利用するシステムを有する。Ｂｅｃｋｍａｎ−ＣｏｕｌｔｅｒのＬＨ７５０血液分析器は、白血球分画の分析に、ＶＣＳ技術（インピーダンスによる容積（Ｖｏｌｕｍｅ）、高周波による複雑性（Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）、およびレーザー光線散乱（Ｓｃａｔｔｅｒ））を使用する。しかしながら、ＶＣＳ技術は、細菌細胞によって生成された信号をその他の細胞残屑によって生成された信号と区別することができない。ＢａｙｅｒのＡＤＶＩＡ（Ｒ）２１２０血液分析器は、白血球を分画するために、ミエロペルオキシダーゼ染色および光散乱を使用する。小葉性／核密度経路としても知られる、好塩基球経路において、好塩基球を除く全ての白血球から細胞膜を剥がすために、低張界面活性剤溶液が使用される。ＡＤＶＩＡ（Ｒ）２１２０血液分析器のミエロペルオキシダーゼ経路も好塩基球経路も、細菌によって生成された信号を赤芽球核またはその他の細胞残屑によって生成された信号と区別することはできない。
【０００７】
ＳｙｓｍｅｘのＸＥ−２１００血液分析器は、白血球数の計数および核染色に前方光散乱および側方光散乱を使用し、分画分析に側方光散乱および蛍光発光を使用する。しかしながら、分析器は、細胞残屑によって生成された細かいノイズ信号を細菌によって生成された信号と区別することができない。米国特許第５，３２５，１６８号明細書は、大きさを判断するための光散乱および分画ＤＮＡ染色強度を判断するための蛍光発光の両方を使用して、尿中の細胞を分析する方法および装置を開示している。この特許は、小さい細菌によって生成された信号が、細胞残屑によって生成されたノイズ信号から、または赤芽球核から、どのように区別されるかを開示していない。光散乱対蛍光発光のサイトグラム、すなわち米国特許第５，３２５，１６８号明細書の図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃは、ノイズ信号と小さな細菌信号との顕著な区別を示していない。
【０００８】
上述の問題を解決するため、ほとんどの臨床検査室で利用可能な自動血液分析器による体液の迅速な分析は、患者の病状の迅速な診断およびそれに続く患者の治療によって感染患者の命を救うために、非常に望ましい。
【０００９】
たとえばＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）４０００自動血液分析器およびＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（ＴＭ）自動血液分析器など、特定の自動血液分析器からの赤芽球の特徴は、細菌の特徴と容易に識別可能であり、すなわち細菌細胞の光および蛍光の散乱の仕方は、赤血球、白血球、赤芽球核、および血小板とは異なることが分かっている。ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）４０００自動血液分析器と同じくＣＥＬＬ−ＤＹＮ（Ｒ）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（ＴＭ）自動血液分析器もいずれもＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより市販されているが、これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６３１，１６５号明細書および第５，９３９，３２６号明細書に記載されているように、マルチアングル光散乱および蛍光発光を測定することができる光学ベンチを備えている。さらに、米国特許第５，５１６，６９５号明細書および第５，６４８，２２５号明細書は、いずれも参照により本明細書に組み込まれるが、白血球を赤芽球から区別するために、赤血球を溶解して、膜溶解赤芽球の核ＤＮＡを染色するのに適した試薬を記載している。膜溶解赤芽球は、その膜が溶解された赤芽球である。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５５９，０３７号明細書は、三重トリガ回路（ＡＮＤ／ＯＲ）による赤芽球および白血球分画の同時検出を記載しており、これは、サイトグラムの軸方向光損失（ＡＬＬ）軸に沿ってリンパ球クラスタの下方に位置する、たとえば溶解された赤血球の膜などの細胞残屑からのノイズ信号を除去するために使用される。
【００１０】
ほとんどの血液分析器は、たとえば赤血球ゴースト、血小板、およびその他の細胞残屑など、体液の試料のその他の成分から、細菌によって生成された信号を区別することができない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、体液中の細菌（微生物）を分画および計数する方法を提供する。一態様において、方法は、
（ａ）マルチアングル光散乱および蛍光発光の測定が可能な、三重トリガシステムを有する自動血液分析器を提供するステップと、
（ｂ）赤血球を溶解することが可能な白血球の形態を保存することも可能な試薬を提供するステップと、
（ｃ）体液の試料を提供するステップと、
（ｄ）試薬および体液の試料を混合するステップと、
（ｅ）体液中に赤血球および赤芽球が存在する場合、赤血球および赤芽球の膜を同時に溶解するステップと、
（ｆ）体液中に赤芽球が存在する場合、赤芽球核を核染色剤で染色するステップと、
（ｇ）マルチアングル光散乱によって白血球を分画するステップと、
（ｈ）体液中に赤芽球が存在する場合、マルチアングル光散乱および蛍光発光のうちの少なくとも１つによって、赤芽球核を検出するステップと、
（ｉ）蛍光発光およびマルチアングル光散乱を測定する検出器を含む回路によって、細菌を分画および計数するステップと、を含む。
【００１２】
本明細書に記載される方法は、同時に計数開口部を最小数の細胞が通過することができるようにするために、体液の試料の一部を希釈剤で希釈するステップを含むことができる。希釈剤は一般的に、赤血球を計数する経路に使用される。方法は、一般的に、しかし必須ではないが、インピーダンス測定によって、赤血球を検出および計数するステップも含むことができる。溶解された体液の試料は、マルチアングル光散乱および蛍光発光を測定するためにフローセルを通じて搬送される。本明細書に記載される方法は、（ａ）体液の試料の分析用のデータを保存するステップと、（ｂ）体液の試料の分析の結果を報告するステップと、（ｃ）白血球、赤血球、および細菌を分画するために、少なくとも１つのアルゴリズムによって、体液の試料を分析するステップと、をさらに含むことができる。
【００１３】
赤芽球核によって生成された信号は、細菌によって生成された信号から赤芽球核が区別可能であるほど十分に固有なので、細菌によって生成された信号は、赤芽球の信号と区別することができる。ノイズによって生成された信号は全てＡＮＤ／ＯＲ閾値未満なので、血小板、溶解赤血球ゴースト、およびその他の細胞残屑によって生成された信号は、血液分析器の三重トリガ回路によって遮断される。システムのソフトウェアに含まれるアルゴリズム（複数可）は、細菌によって生成された信号の位置および形状によって、細菌によって生成された信号を検出および計数し、単位体液あたりの細胞の濃度を計算する。
【００１４】
一実施形態において、体液は、血液分析器の開放モードでのいかなる手動準備も行わずに分析される。試薬システムは、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５１６，６９５号明細書および第５，６４８，２２５号明細書に記載されているように、もともと免疫表現型検査のために白血球およびその細胞表面抗原を保存し、同時に赤血球および赤芽球の膜を溶解して赤芽球の検出のためにそれらの核を染色するために、開発された。この試薬システムを細菌の分析に使用するために、試薬システムによって血液分析器用に調製された試料は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６５６，４９９号明細書に記載される電気光学システムの中を一列になって通過し、その際に、システムの電子論理、三重トリガ回路、およびシステムのアルゴリズム（複数可）が、細胞の容積、細胞の複雑性、細胞の小葉性、細胞の屈折率、細胞の蛍光発光強度、ならびに細胞の核クラスタの位置およびパターンに基づいて、各細胞集団を分画する。三重トリガ回路は、細胞残屑からの信号を除去し、白血球、赤芽球、および細菌からの信号を承認（ｑｕａｌｉｆｉｅｓ）する。有効な細菌信号、すなわち細菌によって生成された信号として承認されるためには、信号の振幅が、ＯＲゲート、ＡＬＬトリガ未満であるが、ＡＮＤゲート、ＦＬ３およびＩＡＳトリガより大きくなければならない、システムのアルゴリズム（複数可）は、ＡＬＬ信号の大きさ、細菌からのＦＬ３＋信号の強度、ならびにＦＬ３クラスタ、すなわち細菌信号用の単一のまばらに分布するクラスタとは対照的な、赤芽球の特徴的な２つのクラスタの形状および数によって、赤芽球によって生成された信号から細菌信号を区別する機能を実行する。
【００１５】
米国特許第５，５１６，６９５号明細書および第５，５５９，０３７号明細書に記載の装置および方法は、もともと血液試料中の白血球分画および赤芽球の分析を同時に実行するように設計されていたが、同じ装置および方法が、たとえば脳脊髄液、胸膜液、腹膜液、心膜液、滑液、腹水、排出液、および透析液などの体液中の細菌に見られる、遺伝物質ＤＮＡまたはＲＮＡを含むものなど、赤芽球の核よりもさらに微細な粒子を分析するためにも使用されることが可能であることが分かっている。本明細書に記載の方法が、血液中の細菌を検出および計数するためにも使用され得ること、すなわち血液が体液の階級の構成要素と見なされることも考えられる。
【００１６】
別の実施形態において、たとえば滑液などの特定の体液の試料は、たとえば参照により本明細書に組み込まれる米国特許番号第５，９３９，３２６号明細書に記載される分析器などの自動血液分析器によって試料を分析する前に、体液の試料の粘度を低下させるために、たとえばヒアルロニダーゼなどの粘度低下剤で、短時間だけ前処理されることが可能である。有効な細菌信号として承認されるために、信号の振幅は、ＯＲゲートおよびＡＬＬトリガ未満であるが、ＡＮＤゲート、ＦＬ３およびＩＡＳトリガより大きくなければならない、また、システムのアルゴリズム（複数可）は、ＡＬＬ信号の大きさ、細菌からのＦＬ３＋信号の強度、ならびにＦＬ３クラスタ、すなわち細菌信号用の単一のまばらに分布するクラスタとは対照的な、赤芽球の特徴的な２つのクラスタの形状および数によって、赤芽球によって生成された信号から細菌信号を分画する機能を実行する。
【００１７】
ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、およびＦＬ３信号のパターン、ならびに細菌信号の位置は、白血球サブセットまたは赤芽球の信号とは異なる。したがって、細菌信号は、細菌信号を赤芽球または白血球の信号と分画するために、細胞の大きさ、蛍光発光強度、ならびにクラスタのパターンおよび位置の適切な論理を使用することによって、システムのアルゴリズム（複数可）によって容易に識別される。
【００１８】
参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５５９，０３７号明細書に記載されるように、細菌のクラスタが、具体的に選択された角度での光散乱および蛍光発光軸の両方によって明確に識別可能であること、ならびに残屑からのノイズ信号が、白血球および赤芽球によって生成されたものなどの有効な信号を承認する三重トリガ回路によって遮断されることが、好ましい。さらに、細菌クラスタは赤芽球のクラスタと識別可能であることが好ましく、そうでなければ、赤芽球核は細菌のように見えてそのように計数され、細菌数の多い誤った結果となる。信号を分析するためのソフトウェアアルゴリズム（複数可）は、各クラスタがどこにあるかを判断して細菌クラスタが存在する場所を判断し、その後しかるべく事象の数を計数する。赤芽球核からの信号は、いつもＦＬ３軸に沿って、１つは大きく１つは小さい２つの異なるクラスタを形成するが、その一方で細菌からのＦＬ３信号は、いつも赤芽球からの信号よりも高いＦＬ３＋信号振幅を有して、２つの異なるクラスタではなく、まばらに分布する単一のクラスタを形成し、これが赤芽球の分布を特徴付ける。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】分画分析のため、白血球、赤芽球、および細菌からの三次元信号を生成するのに適した装置の照明および検出光学系を示す模式図である。
【図２】本明細書に記載の装置での使用に適した、三重トリガ回路を示すブロック図である。この回路は、残屑からの信号を除去し、白血球、赤芽球核、および細菌からの信号を承認する。
【図３Ａ】正常な血液の試料の白血球のサイトグラムであり、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸は３°から１０°の中間角度光散乱（ＩＡＳ）信号に対応し、Ｙ軸は軸方向光損失（ＡＬＬ）信号に対応する。
【図３Ｂ】図３Ａと同じ血液の試料の白血球のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸は赤色蛍光（ＦＬ３）信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図３Ｃ】図３Ａと同じ血液の試料の白血球のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸は９０°偏光側方散乱（ＰＳＳ）信号に対応し、Ｙ軸は９０°偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）信号に対応する。
【図３Ｄ】図３Ａと同じ血液の試料のサイトグラムであるが、ただしこのサイトグラムの散乱信号は異なる電子はかりから来ており、これはより高い電子利得を使用し、血小板を測定するように設計されている。細菌からの光散乱信号もこのサイトグラムに現れているので、血小板（ＰＬＴ）経路のサイトグラムが含まれており、それによって試料中の細菌の存在の照合能力を提供する。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図４Ａ】赤芽球を含む臨床血液試料の白血球のサイトグラムであり、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図４Ｂ】図４Ａと同じ血液の臨床試料の白血球のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図４Ｃ】図４Ａと同じ血液の臨床試料の白血球のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図４Ｄ】図４Ａと同じ血液の臨床試料のサイトグラムであるが、ただし信号はＰＬＴ経路から来ている。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応している。
【図５Ａ】非常に高い濃度の赤芽球を含有する臨床血液試料の白血球のサイトグラムであり、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図５Ｂ】図５Ａと同じ血液のサイトグラムであるが、ただしＸ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図６Ａ】いかなる感染症も疑われない、脳脊髄液（ＣＳＦ）の臨床試料のサイトグラムであり、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図６Ｂ】図６Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図６Ｃ】図６Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図６Ｄ】図６Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただしただし信号はＰＬＴ経路から来ており、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図７Ａ】髄膜炎菌性敗血症の診断を受けた患者からのＣＳＦの臨床試料のサイトグラムである。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図７Ｂ】図７Ａと同じＣＳＦからの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図７Ｃ】図７Ａと同じＣＳＦからの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図７Ｄ】図７Ａと同じＣＳＦからの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし信号はＰＬＴ経路から来ており、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図８Ａ】腹膜炎の診断を受けた男性患者からの体液、腹腔内透析液の臨床試料のサイトグラムである。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図８Ｂ】図８Ａと同じ体液からの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図８Ｃ】図８Ａと同じ体液からの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図８Ｄ】図８Ａと同じ体液からの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし信号はＰＬＴ経路から来ており、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図９Ａ】放線菌感染症の診断を受けた女性患者からの体液、腹腔内透析液の臨床試料のサイトグラムである。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図９Ｂ】図９Ａと同じ体液の臨床試料であるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図９Ｃ】図９Ａと同じ体液の臨床試料であるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図９Ｄ】図９Ａと同じ体液の臨床試料であるが、ただし信号はＰＬＴ経路から来ており、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図１０Ａ】コアグラーゼ陰性連鎖球菌による重症膵炎の診断を受けた患者からのＣＳＦの臨床試料のサイトグラムである。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図１０Ｂ】図１０Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【図１０Ｃ】図１０Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【図１０Ｄ】図１０Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし信号はＰＬＴ経路から来ており、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において使用される際に、「軸方向光損失」および「ＡＬＬ」という表現は、粒子が光線を通過するときに約０°から約１°のレーザー光線から失われた全ての光の測定を指す。このパラメータは、光学検出システムを通過する細胞または粒子の大きさの測定に関する。本明細書において使用される際に、「中間角度散乱」および「ＩＡＳ」という表現は、３°から１０°の中間角度での前方光散乱の測定を指す。このパラメータは、細胞の複雑性の測定に関する。本明細書において使用される際に、「複雑性」という用語は、細胞の組成を指す。いくつかの細胞は、ミトコンドリア、リボソーム、核を有するが、その一方でその他の細胞は、上記の成分のうち１つ以上を欠いている。ＩＡＳの測定強度はある程度、血球計算機の照明光線を通過する細胞（または粒子）の内容物の多様性に依存する。「ＩＡＳ」信号の密度は、細胞の内容物の複雑性の測定、すなわち、たとえば核、液胞、小胞体、ミトコンドリアなどの細胞小器官の存在と考えられることも可能である。本明細書において使用される際に、「偏光側方散乱」および「ＰＳＳ」という表現は、９０°の角度での偏光散乱を指す。このパラメータは、小葉性の測定に関する。細胞の核は、１つから５つの小葉となり得る様々な形状を有する。多小葉核を備える細胞の代表的な例は、分葉好中球である。本明細書において使用される際に、「偏光解消側方光散乱」および「ＤＳＳ」という表現は、９０°の角度で偏光解消された光散乱を指す。このパラメータは、血球の亜集団の測定に関する。血球は、細胞の膜内に、様々な数の亜集団を有する。白血球について、これらの亜集団の例は、好酸球、好中球、好塩基球、単球、およびリンパ球である。本明細書において使用される際に、「ＦＬ１」という表現は、５３０ナノメートルのエミッション信号波長での蛍光発光測定、すなわち緑色蛍光発光を指す。本明細書において使用される際に、「ＦＬ２」という表現は、５８０ナノメートルのエミッション信号波長での蛍光発光測定、すなわち黄色から橙色蛍光発光を指す。本明細書において使用される際に、「ＦＬ３」という表現は、６３０ナノメートルのエミッション信号波長での蛍光発光測定、すなわち赤色蛍光発光を指す。このパラメータは、試薬システムで使用される核染色剤によって染色されたＤＮＡまたはＲＮＡの測定に関する。
【００２１】
本明細書において使用される際に、「トリガ」という用語は、有効と見なされるために電気信号が越えなければならない最小電圧を意味する。本明細書において使用される際に、「三重トリガ」という表現は、承認された信号が第二散乱信号閾値よりも大きくなければならず、それと同時に第一散乱信号閾値またはＦＬ３閾値のいずれかよりも大きくなければならない、ＡＮＤ／ＯＲ論理に基づいて信号を処理する回路を指す。
【００２２】
本明細書において使用される際に、「赤芽球」という用語は、後に赤血球となる、骨髄の中の有核細胞のいずれをも意味する。本明細書において使用される際に、「赤血球」という用語は、ヘモグロビンを含有して血液の色を構成する、黄褐色で、無核の、円盤形の血球を意味する。本明細書において使用される際に、「赤芽球核」という表現は、赤芽球の核を指す。
【００２３】
前方中間角度散乱（ＩＡＳ）および小角光散乱（ＳＡＳ）または軸方向光損失（ＡＬＬ）のいずれかを測定するために、好ましくは１つ以上の検出器が光路内に配置される。光損失は通常、散乱に起因し、その光線を通る細胞の通路のため、レーザー光線の経路内の検出器に到達する光エネルギーの減少として定義される。通常、ＡＬＬは、約０°から約１°の角度で検出される。ＳＡＳは、光線を通過する細胞からの散乱のため、入射レーザー光線の外側であるが約１°から約３°の狭い角度内にある検出器に到達する、光エネルギーである。ビームストップは、通常、レーザー光線が検出器に進入するのを防止するために設けられている。ＡＬＬ測定システムは、レーザー照明の入射円錐内の光を収集するが、その一方で小角散乱システムは、この円錐の外側の光を収集する。ＡＬＬ測定システムにおいて、対象の信号は、定常状態レーザー信号から減じられた負の信号であるのに対して、小角前方散乱測定では、信号は、非常に低い背景光レベルに与えられた小さな正の信号である。中間角度前方散乱（ＩＡＳ）は小角光散乱と似ているが、ただし光が入射レーザー光線から大きい角度で散乱している。より具体的には、ＩＡＳは、入射レーザー光線またはレーザー光線の中心線から３°から１０°離れた輪の中で散乱する光に関する。好適な実施形態において、ＡＬＬは、レーザー軸から水平方向に０．３°未満、垂直方向に１．２°未満の角度内で収集され、ＩＡＳはレーザー軸から３°から１０°の間で収集される。
【００２４】
本明細書において使用される際に、「排出」という用語はドレナージ、つまり体腔の傷からの流体および分泌物の系統的な引き出しを意味する。
【００２５】
本明細書において使用される際に、「開放モード」という表現は、試料が人間の作業者によって自動機器に直接もたらされることを意味する。本明細書において使用される際に、「閉鎖モード」という表現は、試料がロボット機構によって自動機器に直接もたらされることを意味する。
【００２６】
本明細書において使用される際に、「細胞を測定する」という表現は、大きさ、粒度、小葉性、および、細胞が蛍光色素の特定の染料で染色されているときには蛍光発光を判断するために、光散乱法によって細胞を列挙することを指す。
【００２７】
本明細書において使用される際に、「細胞表面抗原」という表現は、抗体の発生を促進する物質を意味する。細胞表面抗原は、正常な細胞代謝の結果として、またはウイルス性もしくは細胞内細菌感染のため、細胞内に発生した内在性抗原である。ＭＨＣクラスＩ分子と複合した細胞表面上に、断片がもたらされる。
【００２８】
「赤血球ゴースト」という表現は、低張媒体によって、または溶解試薬によって、赤血球が溶解された後に残っている、赤血球膜を指す。
【００２９】
対象物の名称の後に続く記号「（ｓ）」は、対象物（複数可）への言及をとりまく記述の文脈に応じて、対象物のみ、または複数の対象物のいずれかが言及されていることを示す。
【００３０】
自動血液分析器は、ＷＨＩＴＮＥＹ  ＷＩＬＬＩＡＭＳ．Ｈｅｍ  Ｉ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ［ｏｎｌｉｎｅ］，［２００８年７月１５日取得］の中で説明されている。これはインターネット：＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｔ．ａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｗｗｉｌｌｉａｍｓ／ｎｅｗ＿ｐａｇｅ＿４．ｈｔｍｌ＞より取得され、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
本明細書に記載される方法は、血液の分析用に設計された、同じ試薬システムおよび光学検出システムによる血液分析器上の、たとえば血液、脳脊髄液、腹水、胸膜液、腹膜液、心膜液、滑液、透析液、および排出液などの、体液中の白血球分画、赤芽球、および細菌の同時分析のための自動化された方法を含む。
【００３２】
図１を参照すると、装置１０は、光源１２、光線を曲げるための前部鏡１４および後部鏡１６、第一円柱レンズ２０および第二円柱レンズ２２を含む光線拡大器モジュール１８、焦点レンズ２４、精密光線調整器２６、フローセル２８、前方散乱レンズ３０、ブルズアイ検出器３２、第一光電子増倍管３４、第二光電子増倍管３６、および第三光電子増倍管３８を含む。ブルズアイ検出器３２は、０°光散乱用の内部検出器３２ａ、および７°光散乱用の外部検出器３２ｂを有する。
【００３３】
光源１２は、垂直偏光４８８ｎｍ空冷アルゴンイオンレーザー、または線形偏光青色（４８８ｎｍ）ダイオード励起固体（ＤＰＳＳ）レーザーであってもよい。レーザー、フローセル、レンズ、焦点レンズ、精密光線調整機構、およびレーザー焦点レンズに関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６３１，１６５号明細書、特にコラム４１、３２行目からコラム４３、１１行目までに、見出すことができる。
【００３４】
図１に示される好適な前方光路システムは、球形平凸レンズ３０、およびレンズの後焦点面に位置する２素子フォトダイオード検出器３２を含む。この構成において、２素子フォトダイオード検出器３２内の各点は、フローセル２８を通って移動する細胞からの光の特定収集角度をマッピングする。検出器３２は、軸方向光損失（ＡＬＬ）および中間角度前方散乱（ＩＡＳ）を検出することが可能なブルズアイ検出器であってもよい。米国特許第５，６３１，１６５号明細書は、コラム４３、１２から５２行目に、この検出器の様々な代替品を記載している。
【００３５】
第一光電子増倍管３４（ＰＭＴ１）は、偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）または緑色蛍光発光（ＦＬ１）を測定する。第二光電子増倍管３６（ＰＭＴ２）は、偏光側方散乱（ＰＳＳ）または黄色から橙色蛍光発光（ＦＬ２）を測定し、第三光電子増倍管３８（ＰＭＴ３）は赤色蛍光発光（ＦＬ３）を測定する。ＦＬ１の緑色蛍光発光は、約５１５から５４５ｎｍの間で検出される。ＦＬ２の黄色から橙色蛍光発光は、約５６５から５９５ｎｍの間で検出される。ＦＬ３の赤色蛍光発光は、約６１５から６４５ｎｍの間で検出される。側方散乱および蛍光発光放射は、二色性光分割器４０、４２によってこれらの光電子増倍管に配向されるが、これらの分割器は、十分な検出を可能にするために、必要とされる波長において十分に透過および反射する。米国特許第５，６３１，１６５号明細書は、コラム４３、５３行目からコラム４４、４行目までにおいて、光電子増倍管に関する様々な追加的詳細を記載している。
【００３６】
浸漬収集システムを使用して、蛍光発光を測定するとき、光電子増倍管３４、３６、および３８において感度が強化される。浸漬収集システムは、屈折率一致層によって第一レンズ３０をフローセル２８に光学的に結合させるものであり、広い角度にわたって光の収集を可能にする。米国特許第５，６３１，１６５号明細書は、コラム４４、５から３１行目に、この光学システムの様々な追加的詳細を記載している。
【００３７】
コンデンサ４４は、高分解能顕微鏡法で使用される回折限界撮像に十分な収差補正を備える光学レンズ系である。米国特許第５，６３１，１６５号明細書は、コラム４４、３２から６０行目に、この光学システムの様々な追加的詳細を記載している。
【００３８】
図１に示されるその他の構成要素、すなわちスリット４６、視野レンズ４８、および第二スリット５０の機能は、米国特許第５，６３１，１６５号明細書のコラム４４、６３行目からコラム４５、１５行目までに記載されている。光電子増倍管３４、３６、および３８は、側方散乱（その軸が入射レーザー光線に対してほぼ直交する円錐内で散乱する光）、または蛍光発光（入射レーザー光線とは異なる波長で細胞から放射される光）を検出する。光電子増倍管３４の光路内に配置された可動偏光子５２は、偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）および偏光側方散乱（ＰＳＳ）をそれぞれ検出するための光電子増倍管３４を構成し、その一方で可動フィルタ５４、５６、５８は、細胞からの特定の波長での蛍光放射の検出を可能にする。
【００３９】
測定処理は、細胞ストリームがフローセル２８を通過すると開始するが、これはすでに、シース溶液によって囲まれている層流試料ストリームの中で、レーザー照射された容積を一列になって細胞が通過するように、溶解剤で希釈されている。照射された容積は、流体力学的に合焦された細胞ストリームによって流軸に対して直角な２つの方向に、ならびに約１７マイクロメートルの、レーザー光線の垂直なビームウエストによって流軸に対して平行な次元に、境界を設けられている。試料の流量は１秒あたり約２．５マイクロリットルであり、白血球および赤芽球の対応する照射検知容積は、約８０μｍ×５μｍ×１７μｍの寸法を有する楕円柱に近似している。１７μｍの寸法は、楕円柱の軸に沿って測定される。
【００４０】
照射領域における細胞の存在は、フォトダイオードおよび光電子増倍管、ならびに３つの特徴空間次元で動作可能な三重閾値トリガ回路によって検出される。つまり、三重閾値トリガ回路は、ＡＬＬ、ＩＡＳ、およびＦＬ３の３つのパラメータを処理し、ＡＮＤ／ＯＲ論理を使用して、デジタル処理のために信号を承認する。承認された信号は、ＩＡＳ閾値よりも大きくなければならず、それと同時にＡＬＬ閾値またはＦＬ３閾値のいずれかよりも大きくなければならない。このトリガ回路と溶解特性との組合せ（白血球を軽く固定してその表面抗原を保存し、それと同時に赤血球核を迅速に染色させる）は、白血球分画数から赤芽球を除外する。細菌信号は、システムのアルゴリズム（複数可）によって、大きさ、形状、およびそれぞれの信号の分布の位置によって、赤芽球の信号と区別される。本明細書に記載される方法は、背景信号、蛍光および非蛍光発光、赤血球ストローマ、および血小板が一般的に遭遇する干渉なしに、白血球集団、赤芽球、および細菌を計数する。米国特許第５，６３１，１６５号明細書は、コラム５５、４８行目からコラム５９、４３行目までにおいて、測定処理の様々な追加的詳細を記載している。
【００４１】
ここで図２を参照すると、（ＡＮＤ／ＯＲ）回路は、残屑からの信号を除去し、白血球の信号の他に、赤芽球核または細菌からの信号も承認する。有効な信号として承認されるためには、信号は、ＡＬＬ  ＯＲ  ＦＬ３トリガより上であって、ＩＡＳ  ＡＮＤ  ＦＬ３であるＡＮＤゲートよりいつも上でなければならない。電気パルス機構は、３つの異なる測定を実行することになる。第一に、ＡＬＬの正または負の測定が実行される。次に、ＦＬ３の正または負の測定が実行される。最後に、ＩＡＳの正または負の測定が実行される。正と負のパルスを分離することによって、三重トリガ回路は、白血球を赤芽球と分画するために、ゲーティング機構を利用する。最終ゲーティング機構は、たとえば血小板などの最も微細な粒子をさらに分離および識別する。ＦＬ３＋細菌信号の振幅はＦＬ３閾値よりも上なので、細菌信号（ＦＬ３＋）は、赤芽球によって生成される信号とともに回路によって承認される。細菌からのＡＬＬ信号の振幅は赤芽球によって生成された信号よりも低く、細菌からのＦＬ３信号の強度は高いので、細菌信号は、ソフトウェアアルゴリズムによって、赤芽球の信号と分画される。これらの信号は有効であると見なされるので、最小電圧を超える全ての信号が使用される。ＡＮＤ／ＯＲ回路１００の構成要素は、以下の通りである：
１０２  ＡＬＬ電圧比較器
１０４  ＡＬＬ信号
１０６  ＡＬＬ閾値電圧（Ｖｔｈ１）
１０８  ＡＬＬ電圧比較器出力
１１２  ＦＬ３電圧比較器
１１４  ＦＬ３信号
１１６  ＦＬ３閾値電圧（Ｖｔｈ２）
１１８  ＦＬ３電圧比較器出力
１２２  ＩＡＳ電圧比較器
１２４  ＩＡＳ信号
１２６  ＩＡＳ閾値電圧（Ｖｔｈ３）
１２８  ＩＡＳ電圧比較器出力
１３０  ＯＲゲート
１３２  ＯＲゲート出力
１３４  ＡＮＤゲート
１３６  有効トリガ出力
【００４２】
それぞれの経路からのリアルタイム信号は、電圧比較器の入力に存在する。電圧比較器１０２、１１２、１２２は、「＋入力」１０４、１１４、１２４と「−入力」１０６、１１６、１２６と比較して、結果的な出力１０８、１１８、１２８を導き出すことによって機能する。「＋入力」が「−入力」よりも高い電圧である場合、出力は高くなる。「＋入力」が「−入力」よりも低い電圧である場合、出力は低くなる。
【００４３】
閾値電圧は、システムのパラメータによって決定される独立した電圧である。比較器１０２および１１２の出力は、結果的なＯＲゲート出力１３２を与えるためのＯＲゲート１３０への入力である。ＯＲゲートは、その入力を比較することによって機能する。片方、または両方の入力が高ければ、出力は高くなる。
【００４４】
ＯＲゲート１３０の出力１３２および比較器１２２の出力は、ＡＮＤゲート１３４への入力である。ＡＮＤゲートは、やはり有効なトリガ出力である、その出力１３６を導くために、その入力を比較することによって機能する。両方の入力が高ければ、出力は高くなる。
【００４５】
ＩＡＳ信号１２４がその閾値電圧１２６よりも大きい場合にのみ、およびＡＬＬ信号１０４がその閾値１０６より大きいか、またはＦＬ３信号１１４がその閾値１１６より大きいか、またはＡＬＬ信号１０４がその閾値電圧１０６よりも大きくてＦＬ３信号１１４がその閾値電圧１１６よりも大きい場合に、有効なトリガ出力１３６が高くなる。
【００４６】
一実施形態において、体液は、開放モード特性にあるシステム上でいかなる手動準備もすることなく、分析されることが可能である。体液の試料の一部は、小数の細胞が計数開口部を同時に通過できるようにするために、希釈剤で希釈されることが可能である。希釈剤は一般的に、赤血球を計数する経路に使用される。体液の試料は、もともとは免疫表現型検査、すなわち、特定の細胞表面抗原の位置を特定するために特定の蛍光色素と結合された特定のモノクローナル抗体で標識された細胞を分析および測定するために使用される技術のために白血球およびその細胞表面抗原を保存するように設計された試薬システムと混合され、同時に赤血球および赤芽球の膜が溶解されて、赤芽球および細菌ＤＮＡまたはＲＮＡの核が染色される。その後、上述の試薬システムで処理された細胞は、一列になって図１に記載された電気光学システムを通過し、電子論理、システムの三重トリガ回路、およびシステムのアルゴリズム（複数可）は、細胞の容積、すなわち細胞の大きさ、細胞の複雑性、細胞の小葉性、細胞の屈折率、蛍光発光強度、ならびに各細胞クラスタの位置およびパターンに基づいて、各細胞集団を分画する。三重トリガ回路は、細胞残屑からの信号を除去し、白血球、赤芽球、および細菌からの信号を承認する。除去される信号は、特定の切り捨て値未満の値を有し、除去された信号は残屑と見なされる。承認される信号は、特定の切り捨て値よりも上の値を有し、承認された信号は白血球、赤芽球、および細菌と見なされる。有効な細菌信号として承認されるためには、信号の振幅が、ＯＲゲート、ＡＬＬトリガ未満であるが、ＡＮＤゲート、ＦＬ３およびＩＡＳトリガより大きくなければならない。システムのソフトウェアアルゴリズム（複数可）は、ＡＬＬ信号の大きさ、細菌からのＦＬ３＋信号の強度、ならびにＦＬ３クラスタ、すなわち細菌信号用の単一のまばらに分布するクラスタとは対照的な、赤芽球の特徴的な２つのクラスタの形状および数によって、赤芽球の信号から細菌信号を区別するために使用されることが可能である。
【００４７】
第一論理分析は、完全なシステムおよびその全ての属性のものである。第二論理分析は、完全なシステムの論理分析の派生物であり、赤芽球と細菌との間の区別に関する。細菌からのＡＬＬ信号の振幅は、赤芽球からのＡＬＬ信号の振幅よりも低く、したがって、細菌からのＡＬＬ信号は、赤芽球信号のクラスタより低くなる。さらに、赤芽球のクラスタは、細菌信号の単一のまばらに分布するクラスタとは対照的に、いつも２つの異なるクラスタとして現れる。さらに、細菌からのＦＬ３＋信号の振幅は、赤芽球からのＦＬ３＋信号の振幅よりもはるかに高い。
【００４８】
以下の非限定的な例は、本明細書に記載される方法をさらに説明する。図中、文字「Ｎ」はサイトグラム中の好中球の位置を示し、文字「Ｍ」はサイトグラム中の単球の位置を示し、文字「Ｌ」はサイトグラム中のリンパ球の位置を示し、文字「Ｅ」はサイトグラム中の好酸球の位置を示し、文字「Ｂ」はサイトグラム中の好塩基球の位置を示し、文字「Ｐ」（または前に数字の付いた文字「Ｐ」）はサイトグラム中の血小板の位置を示し、文字「Ｘ」（または前に数字の付いた文字「Ｘ」）はサイトグラム中の細菌の位置を示す。「Ｅｒｂ１」、「Ｅｒｂ２」、および「Ｅｒｂ１＋２」という用語は、それぞれ赤芽球の第一クラスタ、赤芽球の第二クラスタ、および赤芽球の２つのクラスタを組み合わせたクラスタの位置を示す。
【００４９】
実施例
比較例Ａ、Ｂ、およびＣは、米国特許第５，６３１，１６５号明細書、第５，６５６，４９９号、および第５，９３９，３２６号明細書に記載されている自動血液分析器において、本明細書に記載される方法の結果として得られたサイトグラムがどのように白血球を特徴付けるかを示す。実施例１、２、３、４、および５は、米国特許第５，６３１，１６５号明細書、第５，６５６，４９９号、および第５，９３９，３２６号明細書に記載されている自動血液分析器において、本明細書に記載される方法の結果として得られたサイトグラムが、どのように細菌と白血球を分画して細菌細胞を計数するかを示す。
【００５０】
比較例Ａ
ここで図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、および図３Ｄを参照すると、いずれも先に参照により本明細書に組み込まれた、米国特許第５，５１６，６９５号明細書および５，５５９，０３７号明細書に記載されている試薬システムで、正常な血液の試料が処理された。この試薬システムは、比較例ＢおよびＣ、ならびに実施例１、２、３、４、および５においても使用された。試薬システムは、赤血球溶解成分、白血球保存成分、および核染色剤を含む。図１および図２の装置は、患者の血液試料のサイトグラムを用意するためにも使用されることが可能である。試料は、６．０８×１０３／μＬの濃度の白血球、リンパ球（３５．１％）、好中球（５４．５％）、単球（６．９５％）、好酸球（３．３４％）、および好塩基球（０．０７％）を含有していた。
【００５１】
赤血球（ＲＢＣ）指数が、インピーダンス測定によって、同じ試薬で分析された。図３Ａは、正常な血液の試料の白血球のサイトグラムであり、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸は３°から１０°の中間角度光散乱（ＩＡＳ）信号に対応し、Ｙ軸は軸方向光損失（ＡＬＬ）信号に対応する。図３Ｂは、図３Ａと同じ血液の試料の白血球のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸は赤色蛍光（ＦＬ３）信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。図３Ｂに見られるように、もともとは赤血球の検出のために設計された、ＦＬ３トリガの上の領域は空白であり、これにより、試料中に赤血球が見られないことを示す。
【００５２】
図３Ｃは、図３Ａと同じ血液の試料の白血球のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸は９０°偏光側方散乱（ＰＳＳ）信号に対応し、Ｙ軸は９０°偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）信号に対応する。好酸球からのＤＳＳ信号の振幅は、その他の全ての白血球からの信号よりもはるかに高い。したがって、好酸球は、システムのアルゴリズム（複数可）によって残りの白血球から分離され、計数される。好酸球は粒度が高い。
【００５３】
図３Ｄは、図３Ａと同じ血液の試料のサイトグラムであるが、ただしこのサイトグラムの散乱信号は異なる電子はかりから来ており、これはより高い電子利得を使用し、血小板を測定するように設計されている。図３Ｄにおいて、システムの血小板アルゴリズムによって生成された２つの浮遊閾値線によって囲まれた血小板集団の外側の背景が、空白であることがわかる。図３Ｄのサイトグラム上、ならびに図４Ｄ、図６Ｄ、図７Ｄ、図８Ｄ、図９Ｄ、および図１０Ｄのサイトグラム上に現れている２つの平行な線は、２つの浮遊閾値を表す。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【００５４】
比較例Ｂ
比較例Ｂを実行するために、比較例Ａで使用されたのと同じ方法および装置が使用された。
【００５５】
図４Ａは、赤芽球を含む臨床血液試料の白血球のサイトグラムであり、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。白血球の濃度は２０．９×１０３／μＬであって、赤芽球の濃度は２．３８×１０３／μＬであった。図３Ａとは異なり、図４Ａのリンパ球クラスタの下方には、非常に高いノイズ状信号が現れている。
【００５６】
図４Ｂは、図４Ａと同じ血液の臨床試料の白血球のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。図４Ｂにおいて、ＡＬＬトリガより下だがＦＬ３トリガよりも上の領域は、特徴的な一対のＦＬ３＋赤芽球によって占められており、１つはＸ軸の経路１２５を中心とした大きい方の一次クラスタ、およびＸ軸の経路２２０を中心とした第二の小さい方のクラスタである。Ｘ軸が、０値から２５６値までの２５６個の経路を有することは、留意すべきである。赤芽球核の大きさは白血球よりもはるかに小さいので、赤芽球核のＡＬＬ信号は、ＡＬＬトリガを下回る。図４Ａでリンパ球クラスタの下方に現れている、密なノイズ状信号もまた、赤芽球集団に属する。
【００５７】
図４Ｃは、図４Ａと同じ血液の臨床試料の白血球のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。顆粒球（好中球および好酸球）は、その形態的複雑性のため、単核球（リンパ球および単球）または好塩基球よりもはるかに大きいＰＰＳ信号を生成し、それによってシステムのアルゴリズム（複数可）に、Ｙ軸に沿った残りの白血球集団から顆粒球集団を分離させる。
【００５８】
図４Ｄは、図４Ａと同じ血液の臨床試料のサイトグラムであるが、ただし信号はＰＬＴ経路から来ている。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応している。血小板経路において、ＰＳＳ、ＩＡＳの両方の散乱信号の電子利得は、小さい血小板によって生成された信号を増幅するために、はるかに高く設定されている。
【００５９】
比較例Ｃ
比較例Ｃを実行するために、比較例Ａで使用されたのと同じ方法および装置が使用された。
【００６０】
図５Ａは、非常に高い濃度の赤芽球を含有する臨床血液試料のサイトグラムであり、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。赤芽球の濃度は４．９３×１０３／μＬである。ＦＬ３＋赤芽球核のパターンおよび位置は、１つは大きいクラスタで１つは小さいクラスタである、２つのはっきりと見える赤芽球のクラスタとして現れている。白血球の濃度は２７．５×１０３／μＬであり、好中球（８６．６％）、リンパ球（７．９６％）、単球（４．４９％）、および好酸球（０．８４％）である。赤芽球の一次クラスタは、Ｘ軸の経路１２７を中心としており、赤芽球の二次クラスタは、Ｘ軸の経路２２０を中心としている。
【００６１】
図５Ｂは、図５Ａと同じ血液であるが、ただしＸ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。図５Ｂに見られるように、ＡＬＬトリガの下方のノイズ領域に位置する非常に微細な粒子からは、目立った量のＰＳＳ信号は生成されない。
【００６２】
実施例１
実施例１を実行するために、比較例Ａで使用されたのと同じ方法および装置が使用された。
【００６３】
図６Ａは、いかなる感染症も疑われない、脳脊髄液（ＣＳＦ）の臨床試料のサイトグラムであり、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。図６Ｂは、図６Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される同じ装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。図６Ｃは、図６Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。図６Ｄは、図６Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし信号はＰＬＴ経路から来ており、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。白血球および赤芽球のＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、およびＦＬ３の全ての領域は空白であり、標本中に細胞が発見されなかったことを示している。光学血小板経路の図６Ｄのサイトグラムもまた空白であり、ＣＳＦのこの試料中に、細菌などの微細な粒子が存在しないことを裏付けている。
【００６４】
実施例２
実施例２を実行するために、比較例Ａで使用されたのと同じ方法および装置が使用された。
【００６５】
図７Ａは、髄膜炎菌性敗血症の診断を受けた５６歳の女性患者からのＣＳＦの臨床試料のサイトグラムである。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【００６６】
試料は、５．０６×１０３／μＬの濃度の白血球、０．００３×１０６／μＬの濃度の赤血球、好中球（８６．８％）、リンパ球（５．４％）、および単球（５．４％）を含有している。
【００６７】
図７Ｂは、図７Ａと同じＣＳＦからの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。図７Ｂのサイトグラムの右端の角にあるＡＬＬ経路２５の下方の円の中の点は、いずれも参照により先に本明細書に組み込まれた、米国特許第５，５１６，６９５号明細書および第５，５５９，０３７号明細書に記載されている試薬システムによってＤＮＡが明るく染色された、細菌細胞に対応する。細菌からの信号パターンおよび点の位置は、細菌信号が図４Ｂおよび図５Ａに見られるような赤芽球のクラスタの特徴的な一次および二次のペアを示さないという点において、赤芽球と識別可能である。さらに、細菌の細胞容積は赤芽球の細胞容積よりも小さく、その結果、細菌からのＡＬＬ信号はＸ軸に沿った点を中心とした赤芽球信号を下回り、細菌ＤＮＡ染色の強度は赤芽球核よりもはるかに明るい。
【００６８】
図７Ｃは、図７Ａと同じＣＳＦからの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。細菌からの側方散乱信号（ＰＳＳ）は、図４Ｃの赤芽球核よりも、図７Ｃにおいてはるかに目立っている。
【００６９】
図７Ｄは、図７Ａと同じＣＳＦからの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし信号はＰＬＴ経路から来ており、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。光学血小板経路において、細菌信号は、図７Ｄに見られるように、２つの浮遊血小板閾値の内側および外側の両方に分散したノイズ信号として現れる。図７Ｃは、経路２５を下回る小さなＡＬＬ信号を示すが、細菌からのＰＳＳ信号は、赤芽球の信号よりもはるかに見やすい。
【００７０】
実施例３
実施例３を実行するために、比較例Ａで使用されたのと同じ方法および装置が使用された。
【００７１】
図８Ａは、腹膜炎の診断を受けた５７歳の男性患者からの体液、腹腔内透析液の臨床試料のサイトグラムである。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。
【００７２】
白血球の濃度は１．４３×１０３／μＬであり、赤血球の濃度は０．００２×１０６／μＬであり、好中球（８３．４％）、リンパ球（８．７５％）、単球（６．９５％）、および好酸球（０．８９％）である。
【００７３】
図８Ｂは、図８Ａと同じ体液からの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。図８Ｂの右下の角の円の中の明るく染色された点は、この試料中の細菌の存在を示す。
【００７４】
図８Ｃは、図８Ａと同じ体液からの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。この試料中の細菌の存在は、Ｘ軸の下端およびＹ軸の下端の図８Ｃにおける微細な粒子からのＰＳＳ信号によって示される。
【００７５】
図８Ｄは、図８Ａと同じ体液からの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし信号はＰＬＴ経路から来ており、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。図８Ｄにおいて、微細な粒子は、２つの浮遊血小板閾値の内側および外側の両方で、血小板経路内の密なノイズ信号として現れる。
【００７６】
実施例４
実施例４を実行するために、比較例Ａで使用されたのと同じ方法および装置が使用された。
【００７７】
図９Ａは、放線菌感染症を伴うＣＡＰＤ腹膜炎の診断を受けた６０歳の女性患者からの体液、腹腔内透析液の臨床試料のサイトグラムである。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。白血球の濃度は１０．３０×１０３／μＬであり、赤血球の濃度は０．００１×１０６／μＬであり、好中球（６０．４％）、リンパ球（１１．８％）、単球（８．３２％）、および好酸球（０．６９％）である。
【００７８】
図９Ｂは、図９Ａと同じ体液の臨床試料であるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。図９Ｂの右下の角の円の中の明るく染色されたＦＬ３＋の点は、細菌を示す。
【００７９】
図９Ｃは、図９Ａと同じ体液の臨床試料であるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。図９Ｄは、図９Ａと同じ体液の臨床試料であるが、ただし信号はＰＬＴ経路から来ており、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【００８０】
白血球経路（図９Ｃ）および光学結晶板経路（図９Ｄ）の両方における細菌からのＰＳＳ信号が、明白である。図９Ｄでは、非常に高密度な細菌信号が、通常は２つの浮遊血小板閾値の外側だけではなく、内側でも分散したノイズ信号として見られる。
【００８１】
実施例５
実施例５を実行するために、比較例Ａで使用されたのと同じ方法および装置が使用された。
【００８２】
図１０Ａは、コアグラーゼ陰性連鎖球菌（ＣＮＳ）感染による重症膵炎の診断を受けた６３歳の女性患者からのＣＳＦの臨床試料のサイトグラムである。図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。図１０Ｂは、図１０Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＦＬ３信号に対応し、Ｙ軸はＡＬＬ信号に対応する。図１０Ｃは、図１０Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＡＬＬ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。図１０Ｄは、図１０Ａと同じＣＳＦの臨床試料のサイトグラムであるが、ただし信号はＰＬＴ経路から来ており、図１および図２に描写される装置によって測定されたとおり、Ｘ軸はＩＡＳ信号に対応し、Ｙ軸はＰＳＳ信号に対応する。
【００８３】
ＡＬＬ経路２５−３０の下方の高密度なＦＬ３＋細菌信号（図１０Ｂの円を参照）、ならびに白血球経路（図１０Ｃ）および血小板経路（図１０Ｄ）の両方のＰＳＳ信号が、はっきりと見える。光学結晶板経路において、細菌信号の高密度な筋が、上限血小板閾値のすぐ上に見られる。
【００８４】
本明細書に記載される装置および試薬システムは、ＲＮＡまたはＤＮＡ核などの遺伝物質が試薬システムによって染色されているので、細胞残屑を除去して、細菌からの信号など、赤芽球の核よりも小さい信号を承認するために使用されることが可能であり、ＦＬ３信号はＦＬ３トリガよりもはるかに高いので、大きさ信号であるＡＬＬがＡＬＬトリガを下回ったとしても、三重トリガ回路は細菌信号を有効にすることができる。
【００８５】
図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄ、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、および図１０Ｄに示されるように、ＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、およびＦＬ３の信号パターン、ならびに細菌信号の位置は、白血球および赤芽球のサブセットとは異なり、その結果、細菌信号は、細胞の大きさにとって適切な論理、蛍光発光強度、ならびにクラスタのパターンおよび位置を使用して、システムのアルゴリズム（複数可）によって容易に識別されることが可能である。
【００８６】
別の実施形態において、たとえば滑液などの特定の体液の試料は、システム開放モードで試料を分析する前に体液の試料の粘度を低下させるために、たとえばヒアルロニダーゼなどの粘度低下剤で、短時間だけ前処理されてもよい。白血球、免疫表現型検査のための細胞表面抗原を保存し、および同時に、試料中に赤血球が存在する場合には赤血球と、試料中に赤芽球が存在する場合には赤芽球の膜とを溶解し、試料中に赤芽球の核が存在する場合には赤芽球の核、および細菌を染色するように設計された、試薬システムと試料が混合された後に、調製された細胞は、図１に記載される電気光学システムを一列になって通過する。電子論理、システムの三重トリガ回路、およびシステムのアルゴリズム（複数可）は、細胞の容積、細胞の複雑性、細胞の小葉性、細胞の屈折率、蛍光発光強度、ならびに各細胞集団の位置およびパターンに基づいて、各細胞集団を分画する。三重トリガ回路は、細胞残屑によって生成された小さな信号を除去し、細菌信号、すなわち＜ＡＬＬトリガ、＞ＦＬ３およびＩＡＳトリガを有効にする。システムのアルゴリズム（複数可）は、ＡＬＬ信号の大きさ、細菌からのＦＬ３＋信号の強度、ならびにＦＬ３クラスタ、すなわち細菌信号の単一でまばらに分布するクラスタとは対照的な、赤芽球の特徴的な２つのクラスタの形状および数によって、赤芽球の信号から細菌信号を分画することになる。
【００８７】
更に別の実施形態において、自動モードを利用するために十分な量の体液の試料が入手可能な場合、体液は自動モードで流されることが可能である。体液は、体液の試料がロボット機構によって自動機器に直接供給されることを除き、開放モードについて先に記載された方法の自動モードで処理される。
【００８８】
本発明の様々な改良および変更は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当業者には明らかとなり、本発明が上記の説明的実施形態に不当に限定されるものではないことは理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【国際調査報告】
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