(57)【要約】  本発明は、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、培地で酵母菌株を独立して増殖させるステップと、酵母菌株を、培地から、水にキシロースを含むフィード溶液に移すステップと、前記フィード溶液からキシリトール分離するステップと、を含む方法を提供する。
2011512866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、
培地で前記酵母菌株を独立して増殖させるステップと、
前記酵母菌株を、前記培地から、水にキシロースを含むフィード溶液に移すステップと、
前記フィード溶液からキシリトールを分離するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、
培地で前記酵母菌株を独立して増殖させるステップと、
前記酵母菌株を、前記培地から、水にキシロースを含むフィード溶液に移すステップと、
前記フィード溶液からキシリトールを回収するステップと、
前記酵母菌株を少なくとも１回リサイクルするステップであって、前記リサイクルは、前記酵母菌株を、水にキシロースを含む別のフィード溶液に移すことを含む、ステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、
キシロースを含む培地で前記酵母菌株を増殖させて、キシリトールを得るステップと、
培地からキシリトールを回収し、前記酵母菌株を、前記培地から、水にキシロースを含むフィード溶液に移すステップと、
前記フィード溶液からキシリトールを分離するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、
キシロースを含む培地で、前記酵母菌株を増殖させてキシリトールを得るステップと、
培地からキシリトールを回収し、前記酵母菌株を、前記培地から、水にキシロースを含むフィード溶液に移すステップと、
前記フィード溶液からキシリトールを回収するステップと、
酵母菌株を少なくとも１回リサイクルするステップであって、前記リサイクルは、前記酵母菌株を、水にキシロースを含む別のフィード溶液に移すことを含む、ステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記リサイクルステップは、好ましくは２回、最も好ましくは３回、連続して実施することを特徴とする請求項２または４のいずれかに記載の、キシロースからキシリトールを製造する方法。
【請求項６】
酵母菌株は、カンジダ種であることを特徴とする前記請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
酵母菌株は、好ましくは、カンジダトロピカリスまたはその変異体であり、最も好ましくは、カンジダトロピカリスＡＴＣＣ１３８０３であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酵母菌株は、流加培養法によって増殖させることを特徴とする前記請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
キシロースは、培地に漸次添加されることを特徴とする請求項３または４に記載の方法。
【請求項１０】
水中のキシロース濃度は、１００ｇ／Ｌから２００ｇ／Ｌの範囲であり、好ましくは、水中のキシロース濃度は、１５０ｇ／Ｌであることを特徴とする前記請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
培地は、複合培地または化学的培地であることを特徴とする前記請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
培地のｐＨは、好ましくは６に維持されることを特徴とする前記請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
温度は、好ましくは２６から３０℃の範囲に維持されることを特徴とする前記請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
実質的に本明細書に記載されている、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシリトールの製造に関する。より詳細には、本発明は、キシロースの微生物変換による、水中でのキシリトールの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
キシリトールは、医療および商業上の重要な用途を有する５炭素糖アルコールであり、また、代替低カロリー甘味料として広く利用されている。キシリトールは、多くの果物や野菜中に天然に産生し、また、ヒトおよび他の動物のグルコース代謝ならびに数種の植物や微生物の代謝において、天然の中間生成物としても天然に産生する。
【０００３】
キシリトールは、ショ糖と同じ甘味を有するが、カロリーが３分の１で、かつ不快な後味がないという点を含めて、多くの利点がある。さらに、溶解熱が負のために、口腔内で、清涼感および爽快感が付与され、これにより、キシリトールは、キャンディーおよび菓子類に人気のある甘味料になっている。また、キシリトールは、人体においてインシュリン非依存性で代謝されるので、糖尿病患者に好都合である。キシリトールは、また治療的特性をも有することが示されており、免疫力をつけ、慢性退行性疾患に抵抗性があり、老化防止作用を有し、既知の毒性レベルはないと報告されている。
【０００４】
食品、医薬品、および口腔衛生製品への使用に加えて、キシリトールは、ベニア合板産業界で商業的に応用されており、その粘着特性のために、フェノール樹脂の代わりになることができる。
【０００５】
様々な産業における、キシリトール、およびその用途の重要性により、この糖アルコールの製造を効率的に最大化する方法が必要とされる。キシリトールは、野菜や果物中に低濃度で存在するため、これらの供給源からキシリトールを抽出するのは非経済的である。商業的なキシリトールは、木材、稲藁、雑穀などに存在するヘミセルロースの加水分解物である、キシロースを化学的に還元することによって製造される。この方法の一例は、特許文献１に記載されており、商業規模でのキシリトールの製造は、木材、トウモロコシの穂軸、わら、ぬか、および綿実のもみ殻などのペントサン含有原材料の、酸加水分解によって実施される。キシロースの加水分解は、通常、ラネーニッケル触媒（Ｎｉ／Ａｌ2Ｏ3）を用いて、高温高圧で実施される。この化学的方法の１つの制約は、ヘミセルロース画分から誘導される別の高分子糖類の加水分解物からのキシロースまたはキシリトールの分離、精製が困難なことである。純粋なキシリトールを得るには、機械的ろ過やクロマトグラフィーを含めた多段階分離技術が必要とされる。これらの工程は、５０〜６０％の範囲の収率で製造するには、コストに不利な影響を及ぼす。さらに、このような工程には、高温、高圧に伴うリスクがある。酸またはアルカリの使用に起因する廃棄物処理は、キシリトールの化学的製造に関連する別の重大な問題である。これらの要因が、キシリトールを日常的に製造する化学的方法を困難で、高価で、および非効率的にしている。
【０００６】
一方、生物工学的方法は、高収率で選択的な変換であり、副生成物は低毒性／無毒性であるという利点があり、この場合、キシロースは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性キシロースリダクターゼ（ＸＲ）を使用して微生物によりキシリトールに変換される。
【０００７】
キシロースからキシリトールを製造するための微生物を利用する生物学的方法がいくつか知られている。ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、およびクルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の種のものを含むいくつかの酵母は、キシロースの代謝／生物変換において最初の段階としてキシロースをキシリトールへ還元することができる。微生物を使用したキシリトールの製造は、回分法（ｂａｔｃｈ）、流加法（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ）、および細胞リサイクル法（ｃｅｌｌ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）により実施されている。
【０００８】
キシリトールの微生物製造のコストは、発酵培地、発酵状態の維持のコスト、および発酵培地からキシリトールを回収するコストを含めた多くの要因で決まる。キシリトールの製造に、現在のところ利用できる微生物法では、細胞増殖を促進する栄養素と共にキシロースを含んだ培地が使用される。添加される栄養素は、ペプトン、酵母抽出液などのような複雑な有機化合物、または化学的化合物のいずれかである。
【０００９】
これらの栄養素は、高価なので、製造コストを増加させる。さらに、このような培地を使用することによって、発酵培地から、副生物、培地成分、および微生物由来の物質を、効果的かつ選択的に除去して、キシリトールを回収するのは困難である。さらに、これは、キシリトールの製造コストを増加させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，００８，２８５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
キシリトールの製造で直面するこのような難点を鑑みると、容易で、費用効率よく、環境に優しいキシリトール製造方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、培地で酵母菌株を独立して増殖させるステップと、酵母菌株を、培地から、水にキシロースを含むフィード溶液に移すステップと、前記フィード溶液からキシリトールを分離するステップと、を含む方法に関する。
【００１３】
本発明は、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、培地で酵母菌株を独立して増殖させるステップと、酵母菌株を、培地から、水にキシロースを含むフィード溶液に移すステップと、前記フィード溶液からキシリトールを回収するステップと、酵母菌株を少なくとも１回リサイクルするステップであって、リサイクルは、酵母菌株を、水にキシロースを含む別のフィード溶液に移すことを含む、ステップと、を含む方法に関する。
【００１４】
本発明は、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、キシロースを含む培地で酵母菌株を増殖させて、キシリトールを得るステップと、キシリトールを培地から回収し、酵母菌株を、培地から、水にキシロースを含むフィード溶液に移すステップと、前記フィード溶液からキシリトールを分離するステップと、を含む方法に関する。
【００１５】
本発明は、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、キシロースを含む培地で酵母菌株を増殖させてキシリトールを得るステップと、キシリトールを培地から回収し、酵母菌株を、培地から、水にキシロースを含むフィード溶液に移すステップと、フィード溶液からキシリトールを回収するステップと、酵母菌株を少なくとも１回リサイクルするステップであって、リサイクルは、酵母菌株を、水にキシロースを含む別のフィード溶液に移すことを含む、ステップと、を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
添付した図面は、本発明の好ましい実施形態を例示し、以下の詳細な記述と共に本発明の原理を説明するものである。
【図１】カンジダトロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ１３８０３を用い、３０℃、２５０ｒｐｍ、およびｐＨ６．０で行った、キシリトール製造の震とうフラスコ実験結果を示す図である。
【図２】カンジダトロピカリスＡＴＣＣ１３８０３を用いて、３０℃、２５０ｒｐｍ、およびｐＨ６．０で行った、キシリトール製造（％）の実験結果を示す図である。
【図３】カンジダトロピカリスＡＴＣＣ１３８０３を用いて、３０℃、２１５ｒｐｍで行った、キシロース（１００ｇ／Ｌ）からキシリトールを製造する、細胞リサイクル実験の実験結果を示す図である。
【図４】カンジダトロピカリスＡＴＣＣ１３８０３を用いて、３０℃、２１５ｒｐｍで行った、キシロース（１５０ｇ／Ｌ）からキシリトールを製造する細胞リサイクル実験を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の原理の理解を促すために、図面に例示した実施形態が参照され、それを説明するために、特定の用語が使用されるであろう。それにもかかわらず、これにより、本発明の範囲を制限する意図はなく、記載された方法に関するそのような変更およびさらなる改変、ならびに本明細書中に例示された本発明の原理のそのようなさらなる応用は、本発明に関係する当業者には通常想起される通りであることが企図される。
【００１８】
前述の一般的説明および以下の詳細な説明は、本発明の例示および説明的なものであり、本発明を限定する意図がないことは、当業者に理解されるであろう。
【００１９】
本発明は、キシロースの水溶液からキシリトールを微生物製造する方法を提供する。より詳細には、本発明は、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースの水溶液からキシリトールを製造する方法に関する。
【００２０】
本発明は、酵母菌株をキシロースの水溶液に接種して、キシリトールを生成させる、キシロースの水溶液からキシリトールを製造する方法に関する。
【００２１】
一態様によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法が開示される。本方法は、培地で酵母菌株を独立して増殖させること、および酵母菌株を、培地からフィード溶液に移すことを含む。フィード溶液は、水にキシロースを含む。フィード溶液中で生成したキシリトールを回収する。
【００２２】
酵母菌株は、富栄養培地で独立して増殖させ、これは、必要な細胞塊に到達するまで、富栄養成長培地で酵母菌株を増殖させることを含む。こうして増殖させた酵母細胞を成長培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に移す。
【００２３】
一態様によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法が開示される。本方法は、培地で酵母菌株を独立して増殖させること、および酵母菌株を培地からフィード溶液に移すことを含む。フィード溶液は、水にキシロースを含む。フィード溶液中で生成したキシリトールは回収し、酵母菌株は少なくとも１回リサイクルする。リサイクルは、酵母菌株を、水にキシロースを含む別のフィード溶液に移すことを含む。
【００２４】
酵母菌株は、富栄養培地で独立して増殖させ、これは、必要な細胞塊に到達するまで、富栄養成長培地で、酵母菌株を増殖させることを含む。こうして増殖させた酵母細胞は、成長培地から分離し、水にキシロースを含むフィード溶液に移す。生成したキシリトールをフィード溶液から回収し、キシロース水溶液を含む別のフィード溶液に酵母菌株を導入することによって、酵母菌株を少なくとも１回リサイクルする。
【００２５】
一態様によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、キシロースを含む培地で酵母菌株を増殖させることを含む方法が開示される。生成したキシリトールを培地から回収し、酵母菌株は培地からフィード溶液に移す。フィード溶液はキシロース水溶液からなる。生成したキシリトールをフィード溶液から回収する。
【００２６】
酵母菌株は、キシロースを含む富栄養培地で独立して増殖させ、これは、必要な細胞塊に到達するまで、キシロースを含む富栄養成長培地で、酵母菌株を増殖させることを含む。こうして増殖させた酵母細胞を、成長培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に移す。キシリトールを両方の培地から回収する。
【００２７】
一態様によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、キシロースを含む培地で酵母菌株を増殖させることを含む方法が開示される。本方法は、キシロースを含む培地で、酵母菌株を増殖させること、および酵母菌株を培地からフィード溶液に移すことを含む。生成したキシリトールを培地から回収する。フィード溶液はキシロース水溶液からなる。フィード溶液中で生成したキシリトールを回収し、酵母菌株は少なくとも１回リサイクルする。リサイクルは、酵母菌株を、水にキシロースを含む別のフィード溶液に移すことを含む。
【００２８】
酵母菌株は、キシロースを含む富栄養培地で増殖させ、これは、必要な細胞塊に到達し、かつキシリトールが生成するまで、富栄養成長培地で酵母菌株を増殖させることを含む。こうして増殖させた酵母細胞を培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に移す。生成したキシリトールをフィード溶液から回収し、酵母菌株は、キシロースの水溶液を含む培地に、酵母菌株を導入することによって、少なくとも１回リサイクルする。
【００２９】
一態様によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法が開示される。本方法は、栄養素が漸次添加される培地で、酵母菌株を独立して増殖させること、および酵母菌株を培地からフィード溶液に移すことを含む。フィード溶液は、水にキシロースを含む。フィード溶液中で生成したキシリトールを回収する。
【００３０】
酵母菌株は、栄養素が漸次添加される富栄養培地で独立して増殖され、これは、栄養素が漸次補給される成長培地で、必要な細胞塊に到達するまで酵母菌株を増殖させることを含む。こうして増殖させた酵母細胞を成長培地から分離され、キシロースのフィード水溶液に移す。
【００３１】
一態様によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法が開示される。本方法は、栄養素が漸次添加される培地で、酵母菌株を独立して増殖させること、および酵母菌株を、培地からフィード溶液に移すことを含む。フィード溶液は、水にキシロースを含む。フィード溶液中で生成したキシリトールを回収し、酵母菌株は少なくとも１回リサイクルする。リサイクルは、酵母菌株を、キシロースの水溶液からなる別のフィード溶液に移すことを含む。
【００３２】
酵母菌株は、栄養素が漸次添加される富栄養培地で独立して増殖させ、これは、栄養素が漸次補給される成長培地で、必要な細胞塊に到達するまで酵母菌株を増殖させることを含む。こうして増殖させた酵母細胞を成長培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に移す。生成したキシリトールをフィード溶液から回収し、酵母菌株は、水にキシロースを含む別のフィード溶液に酵母菌株を導入することによって、少なくとも１回リサイクルする。
【００３３】
一態様によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、キシロースを含み、栄養素およびキシロースが漸次添加される培地で、酵母菌株を増殖させることを含む方法が開示される。生成したキシリトールを培地から回収し、酵母菌株は、培地からフィード溶液に移す。フィード溶液は、水にキシロースを含む。生成したキシリトールをフィード溶液から回収する。
【００３４】
酵母菌株は、栄養素およびキシロースが漸次添加される富栄養培地で増殖され、これは、栄養素およびキシロースが漸次補給される成長培地で、必要な細胞塊に到達するまで酵母菌株を増殖させることを含む。こうして増殖させた酵母細胞を培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に移す。キシリトールを両方の培地から回収する。
【００３５】
一態様によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、キシロースからキシリトールを製造する方法であって、キシロースを含み、栄養素およびキシロースが漸次添加される培地で酵母菌株を増殖させることを含む方法が開示される。本方法は、キシロースを含む培地で、酵母菌株を増殖させること、および酵母菌株を、培地からフィード溶液に移すことを含む。生成したキシリトールを培地から回収する。フィード溶液は、水にキシロースを含む。フィード溶液中で生成したキシリトールを回収し、酵母菌株は少なくとも１回リサイクルする。リサイクルは、酵母菌株を、水にキシロースを含む別のフィード溶液に移すことを含む。
【００３６】
酵母菌株は、栄養素およびキシロースが漸次添加される富栄養培地で増殖させ、これは、栄養素およびキシロースが漸次補給される成長培地で、必要な細胞塊に到達し、かつキシリトールが生成するまで酵母菌株を増殖させることを含む。生成したキシリトールを培地から回収する。こうして増殖させた酵母細胞を培地から分離され、キシロースのフィード水溶液に移す。生成したキシリトールをフィード溶液から回収し、酵母菌株は、キシロースの水溶液を含む培地に酵母菌株を導入することによって、少なくとも１回リサイクルする。
【００３７】
使用される富栄養培地は、酵母菌株の細胞増殖の最大化を促進するものが好ましい。本発明の実施形態によれば、細胞増殖に使用される培地は、複合体であってもよく、化学的に規定されているものであってもよい。細胞増殖に使用される培地はまた、細胞の増殖過程に、キシリトールが生成するように、キシロースを含んでもよい。
【００３８】
成長培地は、窒素源としてペプトンおよび酵母抽出液を含むがこれらに限定されるものではない複雑な有機化合物を含有する複合培地であってもよい。グルコース、キシリトール、またはその他の任意の炭素源を、個別に使用してもよく、または互いに併用して使用してもよい。グルコースおよびキシロースは、別々に加圧滅菌して、培地に加えてもよい。
【００３９】
一態様によれば、培地のｐＨは、好ましくは６．０に維持され、細胞濃度は、好ましくは、６００ｎｍで比濁分析（ｔｕｒｂｉｄｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）によりモニターされる。
【００４０】
培地またはフィード溶液からの酵母細胞の分離は、ろ過および遠心分離を含むがそれらに限定されない任意の分離法により実施してよい。キシリトールは、培地またはフィード溶液から、一般的な精製法によって回収することができる。
【００４１】
キシリトール製造に使用される酵母菌株は、キシロースをキシリトールに変換する能力を有するべきである。好ましい実施形態によれば、酵母は、カンジダ属のものであってよい。より好ましくは、菌株の属は、カンジダトロピカリス、またはその変異体であってよい。最も好ましくは、菌株はカンジダトロピカリスＡＴＣＣ１３８０３であってよい。
【００４２】
一実施形態によれば、富栄養培地で独立して増殖させた、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、水中でキシロースを変換させることによりキシリトールが生成する、キシリトールの製造方法が記載される。酵母菌株を、成長培地を含有する寒天プレート上に接種し、コロニーが発達するまで増殖させる。次に、酵母菌株のコロニーをプレートから採取して、接種培地上に接種し、必要な接種期間、増殖させる。必要量の接種材料を富栄養培地に加え、必要な細胞塊に到達するまで酵母菌株を増殖させる。次いで、酵母菌株を富栄養培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に移し、キシリトールの製造に必要なインキュベーション期間、インキュベートする。キシリトールは、一般的な精製法によって、フィード溶液から回収する。
【００４３】
一態様によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株は、富栄養培地で独立して増殖させ、キシロースのフィード水溶液中にリサイクルする、キシリトールの製造方法が記載される。酵母を、成長培地を含有する寒天プレート上に接種し、コロニーが発達するまで増殖させる。酵母のコロニーをプレートから採取して、接種培地上に接種し、必要なインキュベーション期間、増殖させる。必要量の接種材料を、富栄養成長培地に加え、必要な細胞塊に到達するまでインキュベートする。酵母菌株を富栄養成長培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に添加し、必要なインキュベーション期間、インキュベートする。酵母菌株を再度分離し、フィード溶液に再導入し、必要なインキュベーション期間、インキュベートする。これらの工程は少なくとも１回繰り返される。各細胞リサイクル段階からのフィード溶液を集め、キシリトールを一般的な精製法によって回収する。
【００４４】
一実施形態によれば、キシロースを含む富栄養培地で独立して増殖させた、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、水中でキシロースを変換させることによってキシリトールを生成する、キシリトールの製造方法が記載される。酵母菌株を、成長培地を含有する寒天プレート上に接種し、コロニーが発達するまで増殖させる。次に、酵母菌株のコロニーをプレートから採取して、接種培地上に接種し、必要な接種期間、増殖させる。必要量の接種材料を、キシロースを含有する富栄養培地に加え、必要な細胞塊に到達するまで酵母菌株を増殖させる。キシリトールを培地から回収する。次に、酵母菌株を富栄養培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に移し、キシリトールの製造に必要なインキュベーション期間、インキュベートする。キシリトールを一般的な精製法によってフィード溶液から回収する。
【００４５】
一実施形態によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株を、キシロースを含む成長培地で増殖させ、キシロースの水溶液中にリサイクルする、キシリトールの製造方法が記載される。酵母を、成長培地を含有する寒天プレート上に接種し、コロニーが発達するまで増殖させる。酵母のコロニーをプレートから採取して、接種培地上に接種し、増殖させる。必要量の接種材料を、キシロースを含む富栄養成長培地に加え、必要な細胞塊に到達し、キシロースがキシリトールに変換されるまで、インキュベートする。酵母菌株を培地から分離し、キシロール水溶液であるフィード溶液に加え、必要なインキュベーション期間、インキュベートする。キシリトールを培地から回収する。必要なインキュベーション期間後、酵母菌株は再度分離し、キシロース水溶液であるフィード溶液に再導入し、必要なインキュベーション期間、インキュベートする。これらの工程を少なくとも１回繰り返す。各段階の細胞リサイクルからのフィード溶液を集め、キシリトールを、一般的な精製法によって回収する。
【００４６】
一実施形態によれば、栄養素が漸次添加される培地で独立して増殖させたキシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、水中で、キシロースを変換させることによってキシリトールを生成する、キシリトールの製造方法が記載される。酵母菌株を、成長培地を含有する寒天プレート上に接種して、コロニーが発達するまで増殖させる。次いで、酵母のコロニーを採取して、接種培地上に接種し、増殖させる。必要量の接種材料を、栄養素が漸次補給される成長培地に加える。酵母菌株を、必要な細胞塊が得られるまで増殖させる。次いで、酵母菌株を成長培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に添加して、必要な滞留時間反応させる。キシリトールをフィード溶液から一般的な精製法によって回収する。
【００４７】
一態様によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株を、栄養素が漸次補給される培地で独立して増殖させ、キシロースの水溶液中にリサイクルする、キシリトールの製造方法が記載される。酵母細胞を、成長培地を含有する寒天プレート上に接種し、コロニーが発達するまで増殖させる。次に、酵母のコロニーを採取して、接種培地上に接種し、増殖させた。必要量の接種材料を、栄養素が漸次補給される成長培地に加える。酵母菌株を、必要な細胞塊が得られるまで、増殖させる。酵母菌株を成長培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に添加し、必要なインキュベーション期間、インキュベートする。必要な時間後、酵母菌株を再度分離し、キシロースのフィード水溶液に再導入し、インキュベートする。これらの工程は少なくとも１回繰り返す。各段階の細胞リサイクルからのフィード溶液を集め、キシリトールを一般的な精製法によって回収する。
【００４８】
一実施形態によれば、栄養素およびキシロースが漸次添加される培地で増殖させた、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株によって、水中で、キシロースを変換させることによってキシリトールを生成する、キシリトールの製造方法が記載される。酵母菌株を、成長培地を含有する寒天プレート上に接種し、コロニーが発達するまで増殖させる。次いで、酵母のコロニーを採取して、接種培地上に接種し、増殖させる。必要量の接種材料を、栄養素およびキシロースが漸次補給される成長培地に加える。酵母菌株を、必要な細胞塊が得られ、かつキシロースがキシリトールに変換されるまで増殖させる。キシリトールを成長培地から回収する。酵母菌株を成長培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に添加し、必要なインキュベーション期間、インキュベートする。キシリトールを一般的な精製法によってフィード溶液から回収する。
【００４９】
一実施形態によれば、キシロースをキシリトールに変換する能力がある酵母菌株を、栄養素およびキシロースが漸次補給される成長培地で増殖させ、キシロースの水溶液にリサイクルする、キシリトールの製造方法が記載される。酵母菌株を、成長培地を含有する寒天プレート上に接種し、コロニーが発達するまで増殖させる。次いで、酵母のコロニーを採取して、接種培地上に接種し、増殖させた。必要量の接種材料を、栄養素およびキシロースが漸次補給される成長培地に加える。酵母菌株を、必要な細胞塊が得られ、かつキシロースがキシリトールに変換されるまで、増殖させる。次に、酵母菌株を成長培地から分離し、キシロースのフィード水溶液に添加して、必要な滞留時間反応させる。キシリトールを成長培地から回収する。必要な時間後、細胞を再度分離し、キシロースの水溶液に再導入し、インキュベートする。これらの工程は少なくとも１回繰り返す。各段階の細胞リサイクルからのフィード溶液を集め、キシリトールを一般的な精製法によって回収する。
【００５０】
キシリトール製造の温度は、好ましくは、２６から３０℃の範囲であり、３０℃が好ましい温度である。
【００５１】
実施形態の一態様によれば、キシリトールの生成過程では、酵母菌株は、１５０から２５０ｒｐｍの速度範囲で攪拌され、２１５ｒｐｍが好ましい速度である。
【００５２】
一実施形態によれば、細胞のリサイクル工程は、少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、最も好ましくは３回、連続して実施される。
【００５３】
水中のキシロースの濃度は、１００ｇ／Ｌから２００ｇ／Ｌの範囲であり、好ましいキシロースの濃度は、１５０ｇ／Ｌである。
【００５４】
一実施形態の一態様によれば、細胞増殖段階では、細胞は２６から３０℃の温度範囲でインキュベートし、好ましい温度は３０℃である。培養物は、１５０から２５０ｒｐｍの速度範囲で攪拌し、好ましい速度は、２５０ｒｐｍである。
【００５５】
キシリトールは、一般的な精製法によってフィード溶液から回収する。
【００５６】
以下の例は、本発明の方法の、ある好ましい実施形態を説明、かつ例示するために提供される。
【００５７】
［実施例１］
５０ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出液、２０ｇ／Ｌバクトペプトン、および１５ｇ／Ｌ寒天を含有するＹＰＸ寒天プレート上にカンジダトロピカリスＡＴＣＣ１３８０３を接種した。次に、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出液、２０ｇ／Ｌバクトペプトン、および２５ｇ／Ｌグルコースを含有するｐＨ６．０の接種培地に、酵母菌株を接種した。５％の接種材料を成長培地に加えた。酵母菌株の増殖は、１００ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出液、２０ｇ／Ｌバクトペプトン、および３０ｇ／Ｌグルコースを含有し、ｐＨ６．０に調節した培地中、３０℃、２５０ｒｐｍで実施した。グルコースおよびキシロースを個別に加圧滅菌し、培地に加えた。基質および生成物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＲＮＭ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｏｌｕｍｎ（５０×７．８０ｍｍ、８ミクロン）、およびＲＩＤ検出器を備えたＨＰＬＣにより測定した。細胞濃度は、６００ｎｍで比濁分析によりモニターした。キシリトールの生成は、７２時間の終了時点で、４７．３ｇ／Ｌ（キシロース１ｇあたり、０．５ｇのキシリトール収率）であった（図１および図２）。
【００５８】
［実施例２］
５０ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出液、２０ｇ／Ｌバクトペプトン、および１５ｇ／Ｌ寒天を含有するＹＰＸ寒天プレート上に、カンジダトロピカリスＡＴＣＣ１３８０３を接種した。次に、２５ｇ／Ｌキシロース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出液、２０ｇ／Ｌバクトペプトン、および２５ｇ／Ｌグルコースを含有するｐＨ６．０の接種培地に酵母細胞を接種した。５％の接種材料を成長培地に加えた。０時間時、７２時間後、および１４４時間後に１００ｇ／Ｌのキシロースを、０時間時に３０ｇ／Ｌ、２４時間後に１０ｇ／Ｌ、７２時間後および１４４時間後に５ｇ／Ｌのグルコースを、それぞれ成長培地に供給した。成長培地は、キシロースおよびグルコースの他に、１０ｇ／Ｌの酵母抽出液、２０ｇ／Ｌのバクトペプトンを含有し、培地のｐＨは、６．０に調節した。発酵は、３０℃、２５０ｒｐｍで実施した。基質および生成物は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＲＮＭ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｏｌｕｍｎ（５０×７．８０ｍｍ、８ミクロン）、およびＲＩＤ検出器を備えたＨＰＬＣにより測定した。細胞濃度は、６００ｎｍで比濁分析によりモニターした。１９６時間後のキシリトールへの転化率は５０％であった。
【００５９】
［実施例３］
回分培養または流加培養した酵母菌株を含有する成長培地を、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み液をデカンテーションすることにより、培地から菌株を分離した。菌株を、キシロース水溶液（１００〜２００ｇ／Ｌ）が入ったフラスコにリサイクルして戻し、所望の温度（２６〜３０℃）およびｒｐｍ（１５０〜２５０）で、シェーカーを用いてインキュベートした。この手順を、４回繰り返し、各サイクルで収集した上澄み液を、キシリトールの分析および精製に使用した。キシロース（１５０ｇ／Ｌ）からキシリトールへの変換結果には、一貫性が認められた（５０〜６０％）（図３、図４、および表１）。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
（表１）異なるキシロース濃度での細胞リサイクル実験で得られた結果のまとめ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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