(57)【要約】  本発明は、特に組織エンジニアリングに用い得る、再構築角膜、再構築角膜の調製に用い得る生体材料、および再構築角膜モデルの培養の再現性を高めることを可能にする培養デバイスに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜１００ミクロンで構成される多孔性の多孔性マトリックスの形態の少なくとも１種のバイオポリマーを含む、角膜細胞を培養するための細胞培養支持体。
【請求項２】
多孔性が、３０〜７０ミクロン、より好ましくは４０〜５０ミクロンで構成される、請求項１に記載の支持体。
【請求項３】
前記多孔性マトリックスが、少なくとも１種のバイオポリマーの水溶液、好ましくは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の高分子、好ましくは糖タンパク質の水溶液に基づき、より好ましくはコラーゲン水溶液に基づく、請求項１または２に記載の支持体。
【請求項４】
前記多孔性マトリックスが、少なくとも２種のバイオポリマーを混合物として含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の支持体。
【請求項５】
前記多孔性マトリックスが、少なくとも１種の糖タンパク質、好ましくはコラーゲンを、１種以上の任意により置換されている多糖、例えばグリコサミノグリカン、例えばコンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸もしくはヒアルロン酸、またはそれらの混合物、および／またはキチン、および／またはキトサン；および／または１種以上のプロテオグリカンと任意により組み合わせて、好ましくは、任意により修飾されている、少なくとも１種の多糖およびキトサンと組み合わせて含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の支持体。
【請求項６】
前記多孔性マトリックスが脱水された水性ゲルより得られる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の支持体。
【請求項７】
前記多孔性マトリックスが、任意により修飾されている、コラーゲン、少なくとも１種の多糖、およびキトサンの混合物に基づき、該混合物の総乾燥重量と比較した乾燥重量割合として、好ましくは６０％〜９０％のコラーゲン、０〜１５％のＧＡＧ、および１０％〜３０％のキトサンの割合を有する混合物に基づく、請求項１〜６のいずれか１項に記載の支持体。
【請求項８】
任意により修飾されている、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびキトサンの混合物に基づく前記水性ゲルが、水性媒体と比較して１．２５％〜１．６％（ｗ／ｗ）の、任意により修飾されているコラーゲン、グリコサミノグリカンおよびキトサンの混合物の濃度を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の支持体。
【請求項９】
前記多孔性マトリックスが、水性ゲルの凍結乾燥により、特に−３０℃〜−１９６℃の温度、好ましくは工業上の理由により−４０℃〜−８０℃の温度での凍結により得られる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の支持体。
【請求項１０】
角膜細胞のための細胞培養デバイスであって、凹部および請求項１〜９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの支持体を含んで培養対象の細胞を培養するための層を形成し、この層が、該デバイスの凹部に直接的に注入される少なくとも１種のバイオポリマーの水性ゲルの脱水により得られる、上記デバイス。
【請求項１１】
「間質ゾーン」として知られる間質細胞を培養するための第１ゾーンと、「上皮ゾーン」または「内皮ゾーン」として知られる上皮細胞または内皮細胞を培養するための第２ゾーンとを含む、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
「間質ゾーン」として知られる間質細胞を培養するための第１ゾーンと、「上皮ゾーン」として知られる上皮細胞を培養するための第２ゾーンと、「内皮ゾーン」として知られる内皮細胞を培養するための第３ゾーンとを含む、請求項１０または１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記間質ゾーンが、前記デバイスの凹部の容積への挿入に適した面積のインサート（またはナセル）中に配置された培養支持体を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記上皮ゾーンが、前記間質ゾーンとは別個のものであり、角膜実質細胞（keratocyte）を培養するための多孔性材料の層を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１５】
少なくとも角膜間質細胞、好ましくは角膜実質細胞と、角膜間質細胞を培養するための少なくとも１つの支持体とを含む、角膜間質モデル、特にヒト角膜間質モデルであって、該支持体が請求項１〜９のいずれか１項に記載のものである、上記モデル。
【請求項１６】
請求項１５に記載の角膜間質モデルと、角膜上皮細胞および／または内皮細胞、好ましくは角膜上皮細胞および内皮細胞とを含む、角膜モデル、特にヒト角膜モデル。
【請求項１７】
特に化粧品学および製薬学での、動物に対する毒性試験のための代替的試験モデルとしての、請求項１５または１６に記載のモデルの使用。
【請求項１８】
特に角膜移植または視力矯正手術での使用のための、再構築角膜の調製のための、請求項１５に記載の角膜間質モデルまたは請求項１６に記載の角膜モデルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織エンジニアリングにおける再構築角膜のモデル、再構築角膜の調製に用い得る生体材料、ならびに再構築角膜および再構築角膜間質のモデルの培養の再現性を高めることを可能にする培養デバイスに関する。
【０００２】
また、本発明は、粘膜モデルおよびこのモデルを調製するための培養デバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
組織エンジニアリングによる角膜の再構築は、薬理毒物学的（pharmacotoxicological）モデルの取得およびその治療的使用への進展の目的を有する（Germain et al. 2000; Carlsson et al. 2003）。現在のモデルは、支持体、一般にコラーゲンゲルから構成され、該支持体に角膜実質細胞（keratocytes）を分散させて間質を再構成する。その後、この間質に上皮細胞および場合により内皮細胞を播種して人工角膜を再構成する。十分な数でかつ十分に特徴付けられた細胞を有することが必須である。そのような培養物を得るための２つの方法が存在し、それは、トランスフェクトされた細胞株を使用する方法、または初代ヒト細胞で培養を開始する方法である。後者の方法は、生理機能に近いモデルを提供し、かつ実現可能な治療への道を開くという二倍の利点を有する。
【０００４】
角膜縁上に位置する角膜上皮幹細胞のみが特定され特徴付けられている（Pellegrini et al. 1999; 2001）。内皮細胞の培養はその乳児期に行なわれ、その低い増殖能のせいで、取得される量は依然として少なめである。内皮幹細胞は特定されていないが、シュワルベ株（Schwalbe line）に近い内皮前駆体の存在は疑われている。該モデルで使用される内皮細胞はトランスフェクトされた細胞株に由来する。（Reichl et al.; Griffith et al. 1999）。
【０００５】
角膜実質細胞は生理状態で静止しており、ｉｎ  ｓｉｔｕで形態学的に十分に特定される。それらは、環境条件に依存して、異なる表現型を有する。ｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも３つの角膜実質細胞表現型が存在し、それは静止性角膜実質細胞、活動性角膜実質細胞（線維芽細胞）および筋線維芽細胞である（Musselmann et al. 2003）。これらの３つの表現型に、角膜の厚み中のその位置に応じて形態学的に異なる３タイプの角膜実質細胞が加えられる。ヒトでは、前間質（０〜２００μｍ）、中央間質（２００〜４００μｍ）および後間質（４００〜６００μｍ）の角膜実質細胞間に形態計測上の差異が存在する。ｉｎ  ｓｉｔｕの細胞の平均サイズは、平板化されて展開された場合に、約３００〜４００μｍ（透過型電子顕微鏡観察によって測定）である。これらの細胞が懸濁状態である場合、それらは球状になり、そのサイズはずっと小さいが、ｉｎ  ｓｉｔｕのサイズに依然として比例する（約５〜２０μｍ）。これらの３集団間の最大の差異は細胞容積であり、前および中央の角膜実質細胞は約５×１０３μｍ３の同一容積を有し、一方、後間質の角膜実質細胞は約１４．４×１０３μｍ３の大きい容積を有する（Hahnel et al. 2000）。
【０００６】
表現型は特定のマーカーによって識別される。特に、抗原ＣＤ３４が角膜における角膜実質細胞表現型のマーカーとして特定されている。平滑筋α−アクチン（α−ＳＭＡ）は、筋線維芽細胞に特徴的なアクチンアイソフォームであり、それは、瘢痕化プロセス中の角膜実質細胞から筋線維芽細胞への形質転換中に出現する。瘢痕化プロセスでは正常な筋線維芽細胞のアポトーシスへの傾向、およびコラーゲン合成のその質的な差異は、この表現型からの組織エンジニアリングでの間質の再構築を可能にしない（Jester et al. 2003; Gabbiani 2003）。
【０００７】
他の細胞培養支持体が、異なる細胞タイプの培養に関して、出願人によって以前に報告されている。しかし、これらの支持体で使用される生体材料は大きい孔サイズを有し、平均の孔径は約１５０〜２００ミクロンである。そのような支持体は適正な増殖を可能にせず、ゆえに再構築間質の表面上の良好な上皮形成を可能にしない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ゆえに、先行技術は、角膜細胞の培養に実際に最適化されたモデルを提案しない。現時点で、満足な角膜モデルは存在せず、特に細胞回復能または細胞再生能を有する角膜モデルは存在しない。本発明は、これらの問題を克服するよう提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の目的
本発明の主目的は、新規の技術的問題を克服することであり、それは、角膜モデルを形成可能な細胞を培養するための新規支持体またはデバイス、および／または組織エンジニアリングにおける再構築角膜タイプの生体材料、および／または再構築角膜間質モデルおよび／または再構築角膜モデルを提供することにある。
【００１０】
本発明の目的は、再生能を有する再構築角膜モデルを提供することである。
【００１１】
本発明の目的は、特に自動化および工業的様式の、そのような培養デバイスを提供することである。ゆえに、本発明の目的は、そのような培養デバイスを、工業的および医学的使用のために大規模に、特にハイスループットスクリーニングの実施を可能にするために、再現可能に、安全に、かつ確実に製造するための無菌プロセスを提供することである。
【００１２】
また、本発明の目的は、特に化粧品学的および製薬学的適用のための動物での毒性試験の代替法として使用するための、角膜モデルを提供することである。
【００１３】
また、本発明の目的は、特にウサギ眼で得られるような、組織修復を刺激するための能力がある粘膜、特に角膜のモデルを提供することである。
【００１４】
また、本発明の目的は、特に角膜移植または視力矯正手術で使用するための、再構築角膜を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の生体材料が製造される種々の培養形式の例を示す。左から右へ、９６ウェルプレート、２４ウェルプレート、１２ウェルプレートおよび６ウェルプレートを示す。
【図２】図２ａは、本発明の生体材料が製造される培養インサートの遠近法の写真であり、図２ｂはその上方視点の写真である。ａはＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、直径２４ｍｍ）を示し、ｂはＳｎａｐｗｅｌｌ（登録商標）インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、直径１２ｍｍ）を示し、ｃはＮｅｔｗｅｌｌ（登録商標）インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、直径２４ｍｍ）を示し、ｄは培養インサート（Ｎｕｎｃ、直径２５ｍｍ）を示し、ｅはＴｈｉｎｃｅｒｔ（登録商標）インサート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、直径２４ｍｍ）を示し、ｆはＣｅｌｌＣｒｏｗｎインサート（Ｓｃａｆｆｄｅｘ、直径２４ｍｍ）を示す。図２ｂでは、６ウェル培養プレート中にインサートが配置されている。図２ｃは、他の培養プレートを示し、下部にＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、直径９ｍｍ）があり、左側に集合的支持体プレートがあり、右上に２４ウェルプレートがある。
【図３】図３は、正常ヒト角膜の上皮細胞および角膜実質細胞の培養の写真を示す。写真３ａは、照射された線維芽細胞の栄養層（nourishing layer）でのヒト角膜上皮細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を示す。写真３ｂはヒト角膜の角膜実質細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を示す。
【図４】図４は、７２％コラーゲン、８％グリコサミノグリカンおよび２０％キトサンから構成される本発明の生体材料の走査型電子顕微鏡観察による視覚化の研究を示す。これらの視覚化は、異なるパーセンテージの乾物量および異なる凍結乾燥温度で実施されている。
【図５】図５は、本発明の生体材料を用いる再構築ヒト角膜間質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産の組織学的研究を示す。図５ａは、−８０℃の温度での凍結ステップによって作製された１．６％乾物量を含む生体材料を示す。図５ｂは、−４０℃の温度での凍結ステップによって作製された１．４％乾物量を含む生体材料を示す。図５ｃは、−４０℃の温度での凍結ステップによって作製された１．２５％乾物量を含む生体材料を示す。
【図６】図６は、５５０ｎｍでのＯＤ（光学密度）値として表記される、異なる培養日数（Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２８）での、本発明の生体材料を用いる再構築ヒト角膜間質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産後の角膜実質細胞の細胞増殖の研究を示す。
【図７】図７は、刺激性ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）での再構築ヒト半角膜の処理の組織学的研究を示す。
【図８】図８は、ＳＤＳでの再構築ヒト半角膜の処理後の細胞生存率の研究を示す。
【図９】図９は、ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜による可溶性因子（この事例では、ＩＬ−６すなわちインターロイキン−６）の分泌の研究を示す。
【図１０】図１０は、ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜の回復の研究を示す組織学的分析を示す。
【図１１】図１１は、ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜の回復の研究を示す細胞生存率の分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の説明
本発明は、工業的で、確実で、安価でかつ自動化できる様式で、ヒト角膜メンブレンではない組織支持体上または組織支持体中で角膜細胞および／または粘膜細胞を培養することを可能にする。
【００１７】
本発明の関連で、特に言及されない限り、「角膜」とは、半角膜（hemicornea）等の少なくとも部分的に再構築された角膜および完全に再構築された角膜構造であると理解されなければならない。
【００１８】
本発明の関連で、「角膜間質（corneal stroma）」とは、少なくとも角膜間質細胞、好ましくは角膜の角膜実質細胞（kerotocytes）および１０〜１００ミクロンで構成される多孔性の多孔性マトリックスの形態の少なくとも１種のバイオポリマーを含む、角膜細胞を培養するための細胞培養支持体を含む、角膜間質、特にヒト角膜間質のモデルであると理解されなければならない。
【００１９】
第１の態様では、本発明は、角膜または粘膜間質細胞の培養に好適な少なくとも１種のバイオポリマーの任意により脱水された水性ゲルを含む、角膜または粘膜細胞を培養するための細胞培養支持体（または細胞培養基質または生体材料）に関する。
【００２０】
好ましい実施形態では、水性ゲルは脱水され、１０〜１００ミクロン、好ましくは３０〜７０ミクロン、より好ましくは４０〜５０ミクロンで構成される多孔性を有する。
【００２１】
また、任意により脱水された水性ゲルは、別の細胞タイプ、例えば角膜または粘膜上皮細胞および／または内皮細胞の培養に好適である。
【００２２】
有利には、該細胞は、ヒト細胞、例えば初代ヒト細胞または細胞株由来の細胞である。
【００２３】
有利には、本発明の支持体は、少なくとも１種のバイオポリマーの水溶液に基づく水性ゲルを含む。
【００２４】
表現「に基づく材料」とは、考慮される材料を含むかまたは考慮される材料から本質的に構成されるか、または考慮される材料だけで構成される材料を意味する。ゆえに、例えば、少なくとも１種のバイオポリマーに基づく材料は、好ましくは、少なくとも２種のバイオポリマーを混合物として含む。
【００２５】
用語「バイオポリマー」とは、構造的および機能的組織化、代謝プロセスおよび生命体の維持に関与し、生命体によって合成される可能性がある高分子を意味する。バイオポリマーは、概して、アミノ酸、および／またはヌクレオチド、および／または炭水化物間の共有結合を含む。また、用語「バイオポリマー」は、天然に見出されるバイオポリマーと同一であるが、他の手段によって、例えば合成等によって得られるバイオポリマーを意味する。生命体の高分子構造の形成に役割を果たす、好ましくは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中の高分子が好ましい。ゆえに、好ましいバイオポリマーは、糖タンパク質、例えばコラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニン、または純粋なタンパク質、例えばエラスチン、または任意により置換されている多糖、例えばキチンまたはキトサンから選択される。これらのバイオポリマーは、もちろん、組み換えまたは単離されたバイオポリマー（人工または天然起源）であってよい。
【００２６】
好ましくは、水性ゲルは、ＥＣＭの高分子、好ましくは少なくとも１種の糖タンパク質の水溶液に基づき、より好ましくはコラーゲンの水溶液に基づく。有利には、糖タンパク質、および好ましくはコラーゲンは、任意により置換されている少なくとも１種の多糖と組み合わされる。コラーゲンは、特にウシ、ブタ、ウマまたは海洋起源のコラーゲンであり、好ましくは任意によりＶ型コラーゲンと組み合わされたＩ／ＩＩＩ型コラーゲンであり、それはコラーゲンＩＶおよび／またはＶＩおよび／またはＶＩＩを添加されていてもいなくてもよい。
【００２７】
バイオポリマー、および好ましくは糖タンパク質、およびより好ましくはコラーゲンは、好ましくは、１種以上の任意により置換されている多糖、例えばグリコサミノグリカン、例えばコンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸もしくはヒアルロン酸、またはその混合物、および／またはキチン、および／またはキトサン；および／または１種以上のプロテオグリカンと組み合わされる。好ましくは、任意により修飾されている少なくとも１種の多糖およびキトサンを組み合わせる。
【００２８】
バイオポリマー間の最終乾物量に対する重量パーセンテージ分布は、コラーゲン（６０〜９０）、キトサン（１０〜３０）、グリコサミノグリカン（０〜１５）であり；有利には、コラーゲン（６２〜７２）、キトサン（２０〜２５）、グリコサミノグリカン（８〜１２）であり、特にコラーゲン（７２）、キトサン（２０）、グリコサミノグリカン（８）である。
【００２９】
細胞培養支持体は、特にマトリックスまたはスポンジを形成する、ゲルまたは脱水ゲルであってよい。脱水は加熱脱水または凍結乾燥によって達成することができる。
【００３０】
本発明で使用される用語「多孔性（porosity）」とは、平均の孔径であると理解されなければならない。平均の孔径は先行技術において公知の方法で測定することができる。例えば、走査型電子顕微鏡観察による分析で５０×〜７０００×の範囲の拡大率で測定される。ソフトウェア、例えばＮｉｋｏｎ（フランス）によって販売されるＬｕｃｉａＴＭ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０２を特に自動測定下で画像解析に使用することができる。
【００３１】
本発明で使用される用語「均一配分」とは、生体材料内のほぼ同一の孔配分であると理解されなければならない。製造プロセスを調節して、生体材料内の孔勾配を創出することができ、創出しなくてもよい。そのような均一配分は特に高速凍結乾燥ステップで達成することができる。
【００３２】
以前に記載されているように、全く驚くべきことに、１０〜１００ミクロン、好ましくは３０〜７０ミクロン、より好ましくは４０〜５０ミクロンで構成される多孔性を有する少なくとも１種のバイオポリマーを含むゲルの脱水によって調製された細胞培養支持体が角膜間質細胞の非常に良好な培養を可能にし、上皮形成を有しかつ良質な再構築角膜および／または再構築粘膜を調製することを可能にすることが発見されている。この関連で、バイオポリマーとしてＥＣＭの高分子、好ましくはコラーゲンを使用することが好ましい。
【００３３】
有利に使用し得る任意により置換されている多糖には、任意によりキチンまたはキトサンと組み合わされたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が含まれる。
【００３４】
有利には、培養支持体はコラーゲン、少なくとも１種の多糖および任意により修飾されているキトサンの混合物に基づく水性ゲルであり、特に脱水されている場合に、角膜および／または粘膜間質細胞の非常に良好な培養を可能にする。
【００３５】
言及される修飾キトサンの例は、想定される使用に応じて制御される、ある程度のアシル化、好ましくはアセチル化、当業者に周知で、特に、参照によりその全体がここに組み入れられる上述の欧州文献ＥＰ０２９６０７８に記載される異なる程度のアセチル化を有するキトサンである。
【００３６】
ゆえに、本発明はまた、角膜または粘膜間質細胞の培養を可能にする、この培養支持体によって形成される多孔性マトリックスに関する。多孔性構造のせいでそれはスポンジと称される。今日までの発明者の知識では、現在のモデルの間質部分の再構築において、筋線維芽細胞を除き、角膜実質細胞の表現型および形態の多様性は考慮されていない。この考慮は、良好な細胞培養のために重要であると思われる。現在市場で提案されている培養モデルは角膜細胞の培養に好適ではない。本発明は、角膜細胞の培養に好適な培養モデルを提案する。
【００３７】
本発明では、表現「細胞の培養に好適な」とは、細胞培養支持体またはモデルを製造する必要性のために満足な増殖を可能にするモデルを意味する。
【００３８】
特に、本発明は、角膜細胞の培養のための細胞培養支持体であって、支持体内での角膜間質細胞の拡散および接着を可能にし、かつ角膜間質細胞、特に角膜ケラチノサイトの増殖を可能にするように孔サイズが規定されている多孔性マトリックスの形態の少なくとも１種のバイオポリマーを含む支持体を含む。他の異なる細胞タイプの増殖および好ましくは上皮形成に好適な再構築間質が得られ、それは細胞回復能、特に上皮再生能を有する角膜を提供する。ゆえに、多孔性は、１０〜１００ミクロン、好ましくは３０〜７０ミクロン、より好ましくは４０〜５０ミクロンで構成される。
【００３９】
角膜実質細胞の増殖は実施例４で特に説明および実証された。ＳＤＳ処理後のこの再生能または細胞回復は実施例８および９で特に説明および実証された。
【００４０】
本発明の孔のサイズは、細胞が、表面に沈着した後にマトリックスに自然に浸透し、支持体の線維に接着する限り、勾配を必要としない。ゆえに、大きいサイズの孔を用いて細胞が浸透するようにし、材料の深さに伴って孔サイズを小さくすることによってそれらが接着するようにすることは要求されない。孔のサイズは、細胞、および特に間質細胞がマトリックス内に拡散または浸透することを可能にするために十分に大きいが、細胞が壁に接着し、マトリックスに接着せずにそれを通過しないために十分に小さい。有利には、孔のサイズ分布は均一である。本発明に記載の生体材料製造プロセスはそのような均一の孔サイズ分布を可能にする。
【００４１】
好ましい実施形態では、孔サイズ分布は、少なくとも５０％の孔径が目標とされた多孔性を有するような孔サイズ分布である。
【００４２】
有利には、孔は、本発明のバイオポリマーまたはバイオポリマー群を含む溶液から溶媒を除去（水溶液の場合は脱水）することによって形成される。バイオポリマーは本発明で説明されるように単独または混合物であってよい。
【００４３】
有利には、多孔性マトリックスは、コラーゲン、少なくとも１種の多糖、および任意により修飾されているキトサンの混合物に基づき、この混合物の総乾燥重量と比較した乾燥重量割合として、好ましくは６０％〜９０％のコラーゲン、０〜１５％のＧＡＧ、および１０％〜３０％のキトサンの割合を有する混合物に基づく。
【００４４】
多孔性マトリックスを調製するためのプロセスは本発明に記載の変形を含む。
【００４５】
脱水プロセスのパラメータは、達成しようとする多孔性に依存し、該多孔性は培養対象の角膜細胞または粘膜細胞のサイズに適したものである。ゆえに、本発明は、角膜または粘膜細胞を培養するための細胞培養支持体であって、角膜または粘膜間質細胞の培養に好適な少なくとも１種のバイオポリマーの任意により脱水されている水性ゲルを含み、任意により脱水されている該水性ゲルが、間質細胞、特に角膜間質細胞または粘膜間質細胞の培養に好適な多孔性を有する、支持体に関する。培養支持体は、概して、１０〜１００ミクロン（平均直径）の多孔性を有する。好ましくは、３０〜７０ミクロン、より特に４０〜５０ミクロン、例えば４２〜４９ミクロンの多孔性が目標とされる。多孔性の算出は５０×〜７０００×の範囲の拡大率での走査型電子顕微鏡観察研究によって実施された。
【００４６】
使用し得るコラーゲンゲルには、任意によりＶ型のコラーゲンと組み合わされたＩ／ＩＩＩ型のコラーゲンが含まれ、それは、コラーゲンＩＶおよび／またはＶＩおよび／またはＶＩＩを添加されていてもいなくてもよい。有利には、培養支持体は、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよび任意により修飾されているキトサンの混合物に基づく任意により脱水されている水性ゲルであり、間質細胞を培養しかつ特に脱水後にスポンジを得るために好適な濃度を有する。この濃度は、概して、水性媒体（概して水、好ましくは実験用水または蒸留水）と比較して１．２５％〜１．６％の、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよび任意により修飾されているキトサンの混合物である。この濃度は脱水後に得られるスポンジの多孔性に対して影響を有する。ゆえに、多孔性はゲルの粘性に依存する。
【００４７】
有利には、多孔性材料の層の調製は、水性ゲルの凍結乾燥により、特に−３０℃〜−１９６℃の温度、好ましくは工業上の理由により−４０℃〜−８０℃の温度での凍結により実施される。この温度は支持体の多孔性に対して影響を有し、所望の多孔性に適合させるべきである。
【００４８】
また、本発明は、角膜または粘膜細胞を培養するための細胞培養デバイスであって、凹部および上記で規定した少なくとも１つの支持体を含んで培養対象の細胞を培養するための層を形成し、この層が、該デバイスの凹部に直接的に注入される少なくとも１種のバイオポリマーの水溶液をゲル化することにより得られる、デバイスに関する。
【００４９】
１つの具体的実施形態では、角膜または粘膜細胞を培養するための細胞培養デバイスは、凹部および上記で規定した少なくとも１つの支持体を含んで培養対象の細胞を培養するための層を形成し、この層は、該デバイスの凹部に直接的に注入される少なくとも１種のバイオポリマーの水性ゲルを脱水することにより得られる。
【００５０】
特許ＦＲ２８８１４３４に記載のデバイスは本発明に特に好適であり、それは細胞培養支持体の自動化調製に好適であるから、ますます本発明に好適である。この細胞培養支持体デバイスは工業的使用に好適であり、特にハイスループットスクリーニングに好適である。
【００５１】
一実施形態では、デバイスは、「間質ゾーン」として言及される間質細胞を培養するための第１ゾーン、および「上皮ゾーン」または「内皮ゾーン」として言及される上皮細胞または内皮細胞を培養するための第２ゾーンを含む。別の実施形態では、デバイスは、「間質ゾーン」として言及される間質細胞を培養するための第１ゾーン、および「上皮ゾーン」として言及される上皮細胞を培養するための第２ゾーン、および「内皮ゾーン」として言及される内皮細胞を培養するための第３ゾーンを含む。
【００５２】
用語「間質ゾーン」、「上皮ゾーン」、および「内皮ゾーン」とは、それぞれ、間質細胞、上皮細胞または内皮細胞を本質的に含み、さらにそれらが分泌または合成する分子を含むそれらの細胞環境を含む区画を意味する。
【００５３】
１つの具体的実施形態では、上記細胞培養基質または支持体のボディは上記間質ゾーンを形成し、この培養基質または支持体の表面は上皮ゾーンまたは内皮ゾーンの基部を形成する。この実施形態では、例えば、細胞培養支持体の表面に間質細胞を播種することが可能である。間質細胞は、支持体のボディに浸透し、遊走し、細胞外マトリックスを合成し、支持体の孔の進行的な充填を可能にする。また、バイオポリマーの水溶液に間質細胞を播種し、播種された細胞を含む水性バイオポリマーゲルを得るためにこの水溶液をゲル化することが可能である。次に、培養支持体または基質の表面に上皮または内皮細胞を播種する。
【００５４】
有利には、上皮ゾーンは間質ゾーンとは別個のものであり、角膜実質細胞を培養するための多孔性材料の層を含む。
【００５５】
有利には、デバイスは、デバイスの凹部容積への挿入に適したサイズのインサート（またはナセル）を含む。細胞培養支持体基質をこのインサートまたはナセルに配置してよい。この実施形態では、少なくとも１種のバイオポリマーの水性ゲルをインサートの底に注入する。水溶液の場合、この溶液をインサートの底でゲル化する。好ましくは水性ゲルを脱水する。このゲルは、上記で規定した基質または支持体を構成する。
【００５６】
インサートを使用する場合、培養培地を、好ましくは、凹部の底に導入し、インサートに配置された基質上で細胞を培養する。しかし、細胞を培養するための培養培地に浸された凹部の底に基質を配置してもよい。有利には、水性ゲルを凹部および／またはナセルに直接的に注入する。ナセルの多孔性材料を調製するために使用される水性ゲルは、凹部の多孔性材料を調製するために使用される水性ゲルと異なってよい。有利には、ナセルの多孔性材料は、好ましくは多糖および／または任意により修飾されているキトサンと混合された、コラーゲンを含む。
【００５７】
特に、インサートは、凹部の縁の少なくとも一部分に段部を配置することによってインサートを凹部の適所で保持することが可能な段部を含む。
【００５８】
本発明の別の有利な特徴では、デバイスは、基質に対する縮み防止効果を発揮することによって、および好ましくはさらに該基質および底部の該基質に面する内側壁の周辺界面での漏出緊密性（leak-tightness）を確保することによって、任意により多孔性基質の層の少なくとも周辺端部を適所で保持するための要素を好ましくは含む点において特徴付けられる。
【００５９】
本発明の関連で、この周辺部の漏出緊密性は、有利には、周辺部での材料の交換を防ぐために、すなわち、基質の上面に沈着した物質と基質中に存在する培養培地または細胞の間での基質の外側縁を介する伝達を防ぐために提供される。
【００６０】
本発明の１つの具体的実施形態では、上述の位置を維持する要素は、基質の周辺端部に載るために十分なサイズの環状リングを含む。
【００６１】
本発明の別の有利な特徴では、デバイスは、ナセル底部が除去可能で、ナセルに固定可能であり、ナセル自体が凹部に固定可能である点において特徴付けられる。
【００６２】
本発明の別の有利な特徴では、デバイスは、除去可能なナセル底部がゆるやかな圧力ばめまたはクリップ留めによって凹部中に固定され、ゆえに安全かつ確実な漏出緊密性が確保される点において特徴付けられる。
【００６３】
本発明のさらに別の有利な特徴では、デバイスは、除去可能なナセル底部が凹部の外側またはナセルの外側に固定され、ゆえに凹部の側壁の下縁またはナセルの側壁の下縁が基質の周辺端部を適所で保持するための要素を構成する点において特徴付けられる。
【００６４】
本発明の別の有利な実施形態では、デバイスは、培養ウェルあたりに複数のナセルまたはインサートを含む点において特徴付けられる。
【００６５】
この実施形態の別の有利な実施バリエーションでは、このデバイスはまた、ナセルまたはインサートが存在するのと同数の穴を備えたふたを含み、各穴はナセルまたはインサートを受容して適所で保持することを可能にする。
【００６６】
本発明の１つの有利な特徴では、デバイスは、多孔性基質を含有する凹部またはナセルもしくはインサートの少なくとも底部が、脱水後に滅菌され、好ましくは漏出緊密パッケージング中にある点において特徴付けられる。
【００６７】
有利には、デバイスを滅菌する。好ましくは、培養デバイス全体を滅菌し、有利には、漏出緊密パッケージング中でコンディション調整する。
【００６８】
本発明の別の有利な特徴では、上述の滅菌は、好ましくはベータ線またはガンマ線の照射による滅菌、またはエチレンオキシド等の滅菌ガスでの処理からなる群より選択される。
【００６９】
有利には、底部またはナセルの少なくともいくつかの内壁を、物理的、化学的または生物学的に、またはその組み合わせで処理して、例えば細胞の接着および／または増殖を促進するコーティングを用いて、細胞培養を促進する。
【００７０】
本発明の関連で、壁の材料、有利にはプラスチック材料の全体のイオン電荷を修飾する任意の物理的または化学的プロセスを使用してよく、かつ／または細胞の接着および／または増殖を促進する任意の生物学的分子、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、等での壁のコーティングを使用してよい。
【００７１】
１つのバリエーションでは、底部またはナセルの内壁の少なくとも一部分は、特に天然組織、例えば上皮の線条または腔を模倣するための、表面の起伏を含んでよい。
【００７２】
本発明のさらに別の有利な実施形態では、デバイスは、凹部またはナセルの少なくとも底部が、例えば、合成材料、ニトロセルロースに基づく材料、ポリアミドに基づく材料、例えばナイロン、ポリテトラフルオロエチレンまたはテフロン（登録商標）に基づく材料、ポリカーボナートに基づく材料、半透性ポリエチレンまたはポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）に基づく材料、ポリエステルに基づく材料、例えばセルロースポリエステル、特にアセテート、半透性Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭ（登録商標）メンブレン、またはポリビニルピロリドンに基づく材料からなる群より選択される不活性支持体材料でできている点において特徴付けられる。
【００７３】
第２の態様では、本発明は、上記で規定したデバイスを製造するための自動化方法に関する。
【００７４】
有利には、ロボット化可能または自動化可能なプラットフォームを使用して、好ましくは、例えばそれ自体はコンピュータによって制御される、ロボットまたは自動装置によって制御される培養培地を注入または吸引するためのデバイス等の細胞培養デバイスを配置することを可能にすることができる。
【００７５】
有利には、上皮または内皮ゾーンを間質ゾーンの上に自動的に堆積させる。
【００７６】
有利には、自動化デバイスによって水性ゲルを注入し、かつ／または自動化デバイスによって細胞を播種する。
【００７７】
第３の態様では、本発明は、上記で規定したデバイスを含む漏出緊密パッケージングに関する。
【００７８】
第４の態様では、本発明は、少なくとも角膜または粘膜間質細胞（それぞれ）および上記で規定したそれぞれ角膜または粘膜間質細胞を培養するための少なくとも１つの支持体を含む、角膜または粘膜、特にヒト角膜または粘膜のモデルに関する。
【００７９】
有利には、モデルは、角膜または粘膜上皮細胞および／または内皮細胞、および好ましくは角膜または粘膜上皮細胞および／または内皮細胞をさらに含む。
【００８０】
播種される細胞のタイプは、細胞外マトリックスの新規合成に対してまたは上皮および内皮との相互作用において大きな影響を有する。角膜間質に類似の人工間質を再構築するために、角膜実質細胞の幹細胞または、そうでなければ、高い増殖能に恵まれかつそのｉｎ  ｖｉｖｏ対応物とできるだけ近い表現型特性を依然として示す角膜実質細胞を使用することが有利である。
【００８１】
また、本発明は、角膜の角膜実質細胞または間質細胞をその増殖能に応じて選択するための方法であって、組織、好ましくはヒト組織上のあらかじめ決められたサンプリングゾーンの選択、高い増殖能を有する細胞を選択するための、採取された角膜の角膜実質細胞または間質細胞の表現型選別のステップを含む方法に関する。
【００８２】
また、本発明は、特に化粧品学および製薬学での、動物での毒性試験の代替的試験モデルとしての、上記で規定した角膜または粘膜のモデルの使用に関する。
【００８３】
また、本発明は、特に角膜移植または視力矯正手術で使用するための、再構築角膜を調製するための、上記で規定した角膜のモデルの使用に関する。
【００８４】
有利には、上記で規定したデバイス中で、または上記で規定した方法によって、モデルを調製する。
【００８５】
本発明を用いて、上記で言及された種々の技術的問題が、工業的および医学的規模で、特に医薬品および化粧品規模で、単純に、安全に、確実に、および再現可能に、満足に解決されることが理解される。
【００８６】
再構築角膜を培養するための生体材料の使用に好都合に適合させた、本発明に記載の培養デバイスを図１および２に示す。
【００８７】
本発明の他の目的、特徴および利点は、説明のための記載を読むことにより当業者に自明であり、該説明のための記載は実施例を参照し、該実施例は純粋に説明目的で記載され、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。
【００８８】
実施例は本発明の不可分の部分を構成し、実施例を含む、全体と解釈される記載から、任意の先行技術と比較して新規であると思われる任意の特徴は、その機能およびその一般性において本発明の不可分の部分を構成する。
【００８９】
ゆえに、各実施例は一般的範囲を有する。
【００９０】
さらに、実施例では、特に指定されない限りすべてのパーセンテージは重量に基づいて与えられ、特に指定されない限り温度は摂氏温度で表記され、特に指定されない限り圧力は大気圧である。
【実施例】
【００９１】
実施例１：正常ヒト角膜の上皮細胞および角膜実質細胞の培養（図３）
倫理規定にしたがってヒト角膜を収集する。それは過剰に低い内皮密度のせいで治療的に使用することはできない。上皮細胞および角膜実質細胞の抽出時まで、角膜を器官培養として３１℃で保存する。
【００９２】
ヒト角膜上皮細胞の抽出および培養
角膜をトリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．０１％）の存在下で３７℃で８０分間インキュベートして、生検組織から上皮区画を回収する。トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．０１％）の存在下で上皮を解離させ、得られた上皮細胞を、照射された線維芽細胞の栄養層等の培養支持体に、好都合にはＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２（２／１）、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、アデニン（０．１８ｍＭ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、コレラ毒素（０．１ｎＭ）、トリヨードサイロニン（２ｎＭ）、グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリンＧ（１００ＩＵ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびアンホテリシンＢ（１μｇ／ｍＬ）から構成される培養培地中で、優先的に１．５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で、播種する。３日の培養後にＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を優先的に加える。３７℃で５％ＣＯ２で加湿雰囲気下で培養を実施する。
【００９３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された上皮細胞（図３ａ）を凍結し、かつ／または培養、例えば照射された線維芽細胞の栄養層に再播種し、かつ／または再構築ヒト半角膜／角膜のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産に使用することができる。
【００９４】
ヒト角膜の角膜実質細胞の抽出および培養
角膜をトリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．０１％）の存在下で３７℃で８０分間インキュベートし、生検組織から間質区画を回収する。この間質を、コラゲナーゼＡ（collegenase A）（３ｍｇ／ｍＬ）の存在下で撹拌しながら３１℃で３時間インキュベートする。得られた細胞抽出物を、例えば７０μｍスクリーンで、精製し、好都合にはＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２、１０％ウシ胎児血清、ｂ−ＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、ペニシリンＧ（１００ＩＵ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびアンホテリシンＢ（１μｇ／ｍＬ）から構成される培養培地中で、優先的に１．０×１０４細胞／ｃｍ２の密度で、培養する。
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された角膜実質細胞（図３ｂ）を凍結し、かつ／または培養に再播種し、かつ／または再構築ヒト角膜間質および半角膜／角膜のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産に使用することができる。
【００９６】
実施例２：再構築ヒト角膜間質および半角膜／角膜のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成のための、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびキトサンに基づく本発明の生体材料の多孔性の研究（図４）
再構築ヒト角膜間質および半角膜／角膜のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成において生体材料の孔のサイズが重要なパラメータであることを実証するために、その多孔性を３０μｍ〜１００μｍで変動させた。これを実施するために、本発明者らは、生体材料の孔径に直接的影響を有する以下の２つの製造パラメータを選択的に修飾した：（１）コラーゲン（７２％）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（８％）およびキトサン（２０％）の水性組成物中の乾物量のパーセンテージ、（２）凍結乾燥による脱水前の水性ゲルの凍結温度のキネティクス。
【００９７】
水性ゲルの３つの組成物（そのコラーゲン／ＧＡＧ／キトサン比は変化しない（それぞれ７２％／８％／２０％））を以下の様式で調製した：
・２％乾物量を含有する水性ゲル、すなわち５．６ｇのコラーゲン＋１．５６ｇのキトサン＋０．６２ｇのＧＡＧを調製した；
・２％ゲルを水で希釈することによって調製された１．６％乾物量を含有する水性ゲル；
・２％ゲルを水で希釈することによって調製された１．４％乾物量を含有する水性ゲル；
・２％ゲルを水で希釈することによって調製された１．２５％乾物量を含有する水性ゲル。
【００９８】
水性ゲルをＳｎａｐｗｅｌｌ（登録商標）タイプの培養インサートに４５０ｍｇ／インサートの量で注入した。
【００９９】
水性ゲルの凍結乾燥（Ｓｎａｐｗｅｌｌ（登録商標）インサート中）を−４０℃で実施する。この凍結乾燥ステップは事前の凍結ステップを必要とし、該凍結ステップは４つのバリエーションにしたがって以下の様式で実施した：
・−４０℃での水性ゲルの直接凍結（direct freezing）；
・−８０℃での水性ゲルの直接凍結；
・−１９６℃での水性ゲルの直接凍結；
・＋２０℃〜−４０℃で水性ゲルを徐々に凍結（好ましくは最低３０〜４５分の凍結時間）。
【０１００】
５０×〜７０００×の倍率での走査型電子顕微鏡観察による研究および自動画像解析研究によって生体材料の多孔性の評価を実施する。結果を図４に示す。４０〜５０μｍの多孔性を有する生体材料の製造に選択される製造条件は以下の通りである：
・１．６％乾物量を含有し、次いで−８０℃での凍結ステップに付された水性ゲルは、４２．３μｍの多孔性を有する；
・１．４％乾物量を含有し、次いで−４０℃での凍結ステップに付された水性ゲルは、４８．５μｍの多孔性を有する；
・１．２５％乾物量を含有し、次いで−４０℃での凍結ステップに付された水性ゲルは、４７．３μｍの多孔性を有する。
【０１０１】
実施例３：本発明の多孔性生体材料を用いる再構築ヒト角膜間質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産：組織学的研究（図５）
４０〜５０μｍの多孔性を有する生体材料がヒト角膜実質細胞の培養に好適であることを実証するために、本発明者らは、再構築ヒト角膜間質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の過程で、角膜実質細胞が生体材料中で統合され組織化される能力を研究した。
【０１０２】
多孔性生体材料中の再構築ヒト角膜間質の組織学的研究を以下の様式で実施した：
角膜実質細胞の調製：実施例１に記載の通り。 
多孔性生体材料の製造：実施例２に記載の通り。 
再構築ヒト角膜間質の調製：
２×１０５個の角膜実質細胞／５００μＬの培養培地を優先的に含有する細胞懸濁液を本発明の多孔性生体材料の表面に播種する。使用される培養培地は、優先的にＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２、１０％ウシ胎児血清、ｂ−ＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（１ｍＭ）、ペニシリンＧ（１００ＩＵ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびアンホテリシンＢ（１μｇ／ｍＬ）から構成される。角膜実質細胞を上記培養培地中で例えば１４日間培養する。
【０１０３】
組織学的研究：
１４日間の培養後、再構築ヒト角膜間質を培養培地、例えばＤＭＥＭですすぎ、例えばホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋する。ミクロトームによって優先的に５μｍの厚みでパラフィン切片を調製し、例えばヘマトキシリン、フロキシン（phloxin）およびサフランで染色する。結果を図５に示す：ａ／１．６％固形分を含有し、次いで−８０℃での凍結ステップに付された水性ゲル（多孔性４２．３μｍ）、ｂ／１．４％固形分を含有し、次いで−４０℃での凍結ステップに付された水性ゲル（多孔性４８．５μｍ）、ｃ／１．２５％固形分を含有し、次いで−４０℃での凍結ステップに付された水性ゲル（多孔性４７．３μｍ）。多孔性生体材料(４０〜５０μｍの多孔性)で培養された角膜実質細胞は組織を編成することが可能であり、いくつかの細胞層を形成し、自身の細胞外マトリックスを合成する。
【０１０４】
実施例４：多孔性生体材料を用いる再構築ヒト角膜間質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成：角膜実質細胞の細胞増殖の研究（図６）
実施例３にしたがって、本発明者らは再構築ヒト角膜間質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の経過での角膜実質細胞の増殖能を研究した。
【０１０５】
多孔性生体材料での角膜実質細胞の細胞増殖の研究を以下の様式で実施した：
角膜実質細胞の調製：実施例１に記載の通り。 
多孔性生体材料の製造：実施例２に記載の通り。 
再構築ヒト角膜間質の調製：実施例３に記載の通り。 
再構築ヒト角膜間質での角膜実質細胞の細胞増殖の研究：
７、１４または２８日間の培養後、再構築ヒト角膜間質を以下の様式で分析する：
・培養物を１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（メチルチアゾリルテトラゾリウム）２ｍＬ中で３７℃で２時間インキュベートする。陰性対照は、角膜実質細胞を含有しない生体材料に相当する；
・培養物を回収し、撹拌しながら４ｍＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中で４時間インキュベートする；
・各サンプルの培養上清のフラクション（２００μＬ）を回収し、分光光度比色分析（spectrophotocolorimetry）（５５０ｎｍ）によって分析する。光学密度読み取り値は生細胞数に直接比例する。結果を図６に示す。４０〜５０μｍの多孔性を有する生体材料は角膜実質細胞の増殖に好適である。実際、角膜実質細胞の細胞増殖キネティクスは、再構築ヒト角膜間質の培養時間に比例する。さらに、実施例２に記載の、本発明の生体材料の製造条件［１．６％、１．４％および１．２５％乾物量］に関係なく、角膜実質細胞は類似の程度の増殖を示す。
【０１０６】
実施例５：薬理毒物学的モデルとしての再構築ヒト半角膜のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成：組織学的研究（図７）
本発明者らは、生体材料を用いて再構築されたヒト半角膜に対する刺激性ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の影響を研究した。
【０１０７】
ＳＤＳでの処理後の再構築ヒト半角膜の組織学的研究を以下の様式で実施する：
細胞の調製：実施例１に記載の通り。 
多孔性生体材料の製造：実施例２に記載の通り。この研究では、本発明者らは、１．６％乾物量を含有する水性ゲル［コラーゲン（７２％），ＧＡＧ（８％）およびキトサン（２０％）］を使用し、該ゲルを−８０℃での凍結ステップに付した。
【０１０８】
再構築ヒト角膜間質の調製：実施例３に記載の通り。 
再構築ヒト半角膜の調製：
２×１０５個の角膜上皮細胞／５００μＬの培養培地を優先的に含有する細胞懸濁液を再構築ヒト角膜間質の表面に播種する。使用される培養培地は、優先的にＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２（２／１）、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、アデニン（０．１８ｍＭ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、コレラ毒素（０．１ｎＭ）、トリヨードサイロニン（２ｎＭ）、グルタミン（４ｍＭ）、アスコルビン酸（１ｍＭ）、ペニシリンＧ（１００ＩＵ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびアンホテリシンＢ（１μｇ／ｍＬ）から構成される。上記培地を用いて等量の（equivalent）角膜間質上の７日間の浸漬によって角膜上皮細胞を培養する。
【０１０９】
培養物を空気／液体界面に持ち上げ、優先的にＤＭＥＭ、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（１ｍＭ）、ペニシリンＧ（１００ＩＵ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびアンホテリシンＢ（１μｇ／ｍＬ）から構成される培養培地でさらに１４日間培養する。
【０１１０】
ＳＤＳでの再構築ヒト半角膜の処理：
ＳＤＳの漸増溶液（０．５％、１％、２％および３％）を用いて完全浸漬によって再構築ヒト半角膜を１０分間処理する。処理後、再構築ヒト半角膜を培養培地、例えばＤＭＥＭですすぎ、例えばホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋する。ミクロトームによって優先的には５μｍの厚みでパラフィン切片を調製し、例えばヘマトキシリン、フロキシンおよびサフランで染色する。組織学的な結果を図７に示す。漸増ＳＤＳ濃度と再構築角膜上皮の表在性細胞層の組織崩壊との間に直接の相関があることを示した。０．５％以上のＳＤＳで、再構築ヒト半角膜に対する組織学的影響が観察される。
【０１１１】
実施例６：薬理毒物学的モデルとしての再構築ヒト半角膜のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成：細胞生存率の研究（図８）
実施例５に続いて、本発明者らはまた、刺激性ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜の細胞生存率を以下の様式で研究した：
細胞の調製：実施例１に記載の通り。 
多孔性生体材料の製造：実施例２に記載の通り。この研究では、本発明者らは、１．６％固形分を含有する水性ゲル［コラーゲン（７２％）、ＧＡＧ（８％）およびキトサン（２０％）］を使用し、該ゲルを−８０℃での凍結ステップに付した。 
再構築ヒト角膜間質の調製：実施例３に記載の通り。 
ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜の調製：実施例５に記載の通り。 
ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜の細胞生存率の研究：再構築ヒト角膜間質に関しては実施例４に記載の通り。
【０１１２】
細胞生存率の結果を図８に示す。ＳＤＳ濃度の増加と細胞生存率のパーセンテージとの間に直接の相関があることを示した。０．５％ＳＤＳを超えると、再構築ヒト半角膜の細胞生存率はもはや十分ではなく、７５％未満である。ゆえに、再構築ヒト半角膜に対するＳＤＳの生物学的影響は０．５％に近い濃度で評価されるべきである。
【０１１３】
実施例７：薬理毒物学的モデルとしての再構築ヒト半角膜のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成：可溶性因子の分泌の研究（図９）
実施例５および６に続いて、本発明者らは、刺激性ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜によって産生される可溶性因子、例えば炎症促進性サイトカインの分泌を研究した。この研究は以下の様式で実施した：
細胞の調製：実施例１に記載の通り。 
多孔性生体材料の製造：実施例２に記載の通り。この研究では、本発明者らは、１．６％乾物量を含有する水性ゲル［コラーゲン（７２％）、ＧＡＧ（８％）およびキトサン（２０％）］を使用し、該ゲルを−８０℃での凍結ステップに付した。 
再構築ヒト角膜間質の調製：実施例３に記載の通り。 
ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜の調製：実施例５に記載の通り。
【０１１４】
ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜による炎症促進性サイトカインの分泌の研究：
・ＳＤＳでの処理後、再構築ヒト半角膜を培養培地、例えばＤＭＥＭですすぎ、再構築ヒト半角膜の調製に関して記載される培養培地中で少なくともさらに２４時間再培養する（実施例５）。 
・分泌された炎症促進性サイトカインをアッセイするために再構築ヒト半角膜の培養上清を回収する。任意により、使用時まで培養上清を凍結してよい。 
・本発明者らは、例えば「メンブレンＡＲＲＡＹ」法を用いて、実施例６で上記で研究された細胞生存率の関数としてＩＬ−６の分泌を評価した。ＩＬ−６アッセイの結果を図９に示す。ＩＬ−６の強い分泌と、細胞死を伴わないＳＤＳの刺激効果との間に直接の相関があることを示した。
【０１１５】
実施例８：薬理毒物学的モデルとしての再構築ヒト半角膜のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成：組織学的分析による細胞回復の研究（図１０）
実施例５〜７に続いて、本発明者らは、ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜の細胞回復、すなわち処置の影響後に、例えばこの研究では刺激の影響後に、再生するその能力を研究した。この回復研究は以下の様式で実施した：
細胞の調製：実施例１に記載の通り。 
多孔性生体材料の調製：実施例２に記載の通り。この研究では、本発明者らは、１．６％乾物量を含有する水性ゲル［コラーゲン（７２％）、ＧＡＧ（８％）およびキトサン（２０％）］を使用し、該ゲルを−８０℃での凍結ステップに付した。 
再構築ヒト角膜間質の調製：実施例３に記載の通り。 
ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜の調製：実施例５に記載の通り。
【０１１６】
ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜の細胞回復の研究：
ＳＤＳでの処理後、再構築ヒト半角膜を培養培地、例えばＤＭＥＭですすぎ、再構築ヒト半角膜の調製に関して記載した培養培地中で少なくともさらに２４時間再培養する（実施例５）。実施例５に記載したように組織学的研究を実施する。組織学的な結果を図１０に示す。本発明者らは、０．５％および１％ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜が、４８時間の細胞回復後に、未処理の半角膜の上皮組織化に近い上皮組織化を有することを示した。他方、２％および３％ＳＤＳでの処理は不可逆的な上皮損傷を誘発する。
【０１１７】
実施例９：薬理毒物学的モデルとしての再構築ヒト半角膜のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成：細胞生存率の分析による細胞回復の研究（図１１）
実施例８に続いて、本発明者らは、刺激性ＳＤＳでの処理後の、少なくとも２４時間の回復後の再構築ヒト半角膜の細胞生存率を研究した。この回復研究は以下の様式で実施した：
細胞の調製：実施例１に記載の通り。 
多孔性生体材料の製造：実施例２に記載の通り。この研究では、本発明者らは、１．６％乾物量を含有する水性ゲル［コラーゲン（７２％）、ＧＡＧ（８％）およびキトサン（２０％）］を使用し、該ゲルを−８０℃での凍結ステップに付した。
【０１１８】
再構築ヒト角膜間質の調製：実施例３に記載の通り。 
ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜の調製：実施例５に記載の通り。 
ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜の細胞回復の研究：実施例８に記載の通り。
【０１１９】
実施例６に記載したように細胞生存率の研究を実施する。結果を図１１に示す。本発明者らは、０．５％ＳＤＳで処理された、少なくとも２４時間の回復後（Ｔ＝４８ｈ）の再構築ヒト半角膜が、処理後（Ｔ＝０ｈ）の再構築ヒト半角膜の細胞生存率と極めて等価な細胞生存率を有することを示した。他方、１％、２％および３％ＳＤＳで処理された再構築ヒト半角膜は少なくとも２４時間の回復後（Ｔ＝４８ｈ）に、処理後（Ｔ＝０ｈ）より顕著に低い細胞生存率を有する。
【図１】
2011512133.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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