(57)【要約】  基準膜成分は、Ｇタンパク質共役受容体マイクロアレイを使用している、結合と関連する規格化しシグナルまたは機能的アッセイのために、アッセイの間、前標識または標識化される。基準成分は質膜に含まれ、ここで、標的ＧＰＣＲは包埋され、または、マイクロスポット上の標的質膜と協動して印刷される他の質膜に存在してもよい。すなわち、標的ＧＰＣＲは印刷マイクロスポットでの欠陥における露出基質上の標識に協働することにより前標識され得る。
2011503611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のアッセイ可能なマイクロスポットから成る基準前標識Ｇ−タンパク質被結合受容体質膜アレイであって、
多数のマイクロスポットのうちの１つ以上は、（ｉ）質膜に埋設された標的Ｇタンパク質共役受容体および（ｉｉ）質膜膜成分から成る質膜と、膜成分に結合した標識試薬と、から成ることを特徴とするアレイ。
【請求項２】
質膜はＧタンパク質共役受容体を過剰発現している細胞から分離されていることを特徴とする請求項１記載のアレイ。
【請求項３】
標識試薬がコレラトキシンまたは標識ＧＰＣＲリガンドの標識βサブユニットから成ることを特徴とする請求項１記載のアレイ。
【請求項４】
複数のアッセイ可能なマイクロスポットから成る基準前標識Ｇ−タンパク質被結合受容体質膜アレイであって、
多数のマイクロスポットのうちの１つ以上は、質膜に埋設された標的Ｇタンパク質共役受容体から成る第１の質膜と、膜成分から成る第２の質膜と、膜成分に結合した標識試薬と、とから成り、並びに、
第１の質膜はＧタンパク質共役受容体を過剰発現している細胞から分離され、かつ、第２の質膜は非過剰発現している細胞から分離されていることを特徴とするアレイ。
【請求項５】
第１および第２の質膜は、それらのそれぞれの系統の共通のオリジンを有する細胞から分離されていることを特徴とする請求項４記載のアレイ。
【請求項６】
標識試薬がコレラトキシンのβサブユニットから成ることを特徴とする請求項４記載のアレイ。
【請求項７】
Ｇタンパク質共役受容体を過剰発現している細胞から分離されかつ成分から成る質膜を用意すること、
成分を結合して前標識質膜を産生するために構成される標識試薬に質膜を接触させること、並びに、
基質上のマイクロスポットとして前標識質膜を印刷すること、を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
標識試薬に質膜を接触させることは、標識質膜を形成するためにＧタンパク質共役受容体を過剰発現している細胞からの質膜を有する標識試薬を含んでいる印刷緩衝液を超音波処理することを含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
標識試薬は色素標識タンパク質であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
標識タンパク質がｃｙ３またはｃｙ５標識ストレプトアビジンであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
標識試薬に質膜を接触させることは、最小の体積の保存溶液にて標識試薬に質膜を直接接触させることを含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１２】
印刷は、前標識質膜の凍結に介入することなく、接触させることに続いて起こることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１３】
遠心分離に続く前標識質膜の回収を強化するために構成されるキャリアを含む溶液にて前標識質膜を洗浄することを更に含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１４】
キャリアは前標識質膜の印刷のために使用される溶液に存在することを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｇタンパク質共役受容体を過剰発現している細胞から第１の質膜を用意すること、
非過剰発現している細胞から、成分から成る第２の質膜を分離すること、
成分を結合して前標識された第２の質膜を産生するために構成される標識試薬に第２の質膜を接触させること、並びに、
基質上のマイクロスポットとして第１の質膜および前標識された第２の質膜を印刷すること、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
第１の質膜および前標識された第２の質膜を混ぜることを更に含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
第１および第２の質膜がそれらのそれぞれの系統の共通のオリジンを有する細胞から分離されることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
標識試薬に第２の質膜を接触させることは、コレラトキシンのβサブユニットから成る標識試薬に第２の質膜を接触させることから成ることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
Ｇタンパク質共役受容体質膜アレイのマイクロスポットを標識非加水分解性ＧＴＰ類似体に接触させること、
基準標識質膜を産生するためにＧタンパク質共役受容体以外の膜成分を結合するために構成される第１の標識試薬にマイクロスポットを接触させること、
Ｇタンパク質共役受容体と機能的に相互に作用し得ると疑われるリガンドにマイクロスポットを接触させること、
マイクロスポットを洗浄して、非結合の標識非加水分解性ＧＴＰ類似体、非結合の第１の標識試薬、および非結合のリガンドをマイクロスポットから除去すること、
マイクロスポットと関連した標識非加水分解性ＧＴＰ類似体と関連する第１のシグナルを定量化すること、
膜成分に結合される第１の標識試薬と関連した第２のシグナルを定量化すること、並びに、
第２のシグナルと第１のシグナルを比較して、Ｇタンパク質共役受容体で、試薬の機能上の相互作用の範囲を決定すること、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
標識非加水分解性ＧＴＰ類似体にマイクロスポットを接触させ、第１の標識試薬にマイクロスポットを接触させ、リガンドにマイクロスポットを接触させることは、標識非加水分解性ＧＴＰ類似体、第１の標識試薬およびリガンドから成る組成にマイクロスポットを接触させることを含むことを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
シグナルを産生することができ第１の標識試薬に結合するために構成される第２の標識試薬に基準標識質膜を接触させることを更に含むこと、並びに、第１の標識試薬と関連する第２のシグナルを定量化することは、第２の標識試薬と関連するシグナルを定量化することから成ることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
第１の標識試薬はガングリオシドＧＭ１．を結合するために構成されることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
Ｇタンパク質共役受容体質膜アレイのマイクロスポットを第１の標識試薬に接触させること、
膜成分を結合するために構成される第２の標識試薬にマイクロスポットを接触させること、
マイクロスポットを洗浄して、非結合の第１の標識試薬、および非結合の第２の標識試薬を除去すること、
マイクロスポットと関連した第１の標識試薬と関連する第１のシグナルを定量化すること、
膜成分に結合される第２の標識試薬と関連した第２のシグナルを定量化すること、並びに、
第２のシグナルと第１のシグナルを比較して、膜成分への第２の標識試薬の結合の範囲を決定すること、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
第１の標識試薬にマイクロスポットを接触させ、第２の標識試薬にマイクロスポットを接触させることは、第１および第２の標識試薬から成る組成にマイクロスポットを接触させることから成ることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
シグナルを産生することができ第１の標識試薬に結合するために構成される第３の標識試薬に標識質膜を接触させることを更に含むこと、並びに、第３の標識試薬と関連するシグナルを定量化することは、第３の標識試薬と関連するシグナルと第１の標識試薬と関連するシグナルを比較することを含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、２００７年１１月１９日に出願のアメリカ国特許出願番号第１１／９８５，９９０号、「Ｇタンパク質共役受容体質膜アレイのための規格化方法」の利益を請求する。
【技術分野】
【０００２】
本開示はなかでも、質膜マイクロアレイ、特にＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）質膜アレイに関し、さらに、ＧＰＣＲ質膜マイクロアレイを使用してアッセイ実行と関連する変動性のための説明をするために構成されたアレイおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
−−分野−−
質膜関連のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）アレイ技術は、ＧＰＣＲリガンド結合アッセイおよび機能的アッセイの両方、たとえば、グアニンヌクレオチド−結合タンパク質（ＧＴＰ結合タンパク質）の状態を結合しているＧＴＰの変化を成し遂げるＧＰＣＲリガンドの機能に有効である。かかるＧＰＣＲ質膜アレイは、医薬品発見、調査目的、などのための多くの推定のリガンドの大規模スクリーニングのための潜在性を有する。しかし、かかる質膜アレイは、ヌクレオチドまたはタンパク質に基づくアレイと関連していくつかの欠点を有する。
【０００４】
たとえば、ＧＰＣＲ質膜アレイ・アッセイは、ＤＮＡマイクロアレイアッセイより大いに複合している傾向がある。比較的純粋で均一なＤＮＡサンプルに対して、細胞から分離される質膜調製物は、種々雑多である。加えて、ＧＰＣＲアッセイは、ヌクレオチド相互作用に対するどのヌクレオチドが起こるか、ＤＮＡマイクロアレイアッセイより非常に合併していることがある。たとえば、機能的にＧＰＣＲと相互に作用し得るリガンドは、ずっと変化して、生体アミン、ペプチドおよびタンパク質、脂質、ヌクレオチド、興奮性アミノ酸、そして、イオン（小さい化学化合物）その他を含む。特定ＧＰＣＲが１つ以上の三量体ＧＴＰ結合タンパク質に連結し得る。ＧＰＣＲに対するアゴニストの結合能は、そのＧＴＰ結合タンパク質を有する受容体の結合状態に依存し得る。加えて、受容体を結合する化合物は、異なる官能性（たとえばアゴニズム、抗作用、スーパーアゴニズムまたは逆アゴニズム）を有することがある。更に、結合部は同じ受容体に異なる化合物結合のために異なるかもしれない。緩衝液組成の変化は、ＧＰＣＲおよびＧＴＰ結合タンパク質を含む膜タンパク質の官能性に影響を及ぼすことができるだけでなくて、受容体にまた、リガンドの結合能に影響を及ぼし得るので、ＧＰＣＲ質膜アッセイのための緩衝液適合および最適化はまた、慎重に考慮する必要がある。ＧＰＣＲ質膜アレイ・アッセイの複雑度のために、一部は、アッセイ変動性に対するアッセイは、ＤＮＡアレイでの場合よりＧＰＣＲアレイでの場合の方が大きくなる傾向がある。
【０００５】
かかる変動性の他の供与源はＧＰＣＲ質膜調製物のヘテロジェニック性状から起こり、そして、特にそれらが細胞から分離される。或る製法は単一の遠心分離手順で天然のままの細胞溶菌液から直接に得られる。その一方で、他は特別な蔗糖勾配純化手順を経ることもできる。細胞において過剰発現される細胞型およびＧＰＣＲに従い、ＧＰＣＲ質膜調製物は、異なる断片分布を有することができる。ＧＰＣＲ質膜調製物も、貯蔵中、凝集する傾向がある。
【０００６】
基質上への質膜の印刷に関連する問題は、ＧＰＣＲ質膜アレイ・アッセイと関連する変動性の他の供与源として役立つ。印刷問題は、詰まるピン、消失したスポットおよびパターン−印刷を含むことができ、部分的には質膜調製物の複合した化学的性質による。たとえば、細胞から分離される質膜調製物は、リン脂質、脂肪酸、末梢で必要不可欠な膜タンパク質、コレステロールおよびオリゴ糖を含む。
【０００７】
加えて、ＧＰＣＲ質膜アレイ・アッセイは、一般にＤＮＡアレイ・アッセイがしばしばするのような固有の規格化方法を有しない。たとえば、ＤＮＡアレイ・アッセイは型（たとえば癌細胞）が第２の細胞型（たとえば非癌化細胞）から発現される第１の標識およびＲＮＡによって標識第１の細胞から発現されるＲＮＡを交雑させることを含み得。そして、第２の標識によって標識化される。アレイ上の特定のＤＮＡマイクロスポットに、ハイブリダイゼーションに続いている第１および第２の標識からのシグナルの相対的な強度は、差形質発現が第１および第２の細胞型の間に存在するかどうか決定するために、比較され得る。シグナル比の比較能力のゆえに、いかなるマイクロスポット（または所定マイクロスポットでのＤＮＡの減量に結果としてなるかもしれないアッセイ条件）に印刷されたＤＮＡ量の変動性は、にかかるＤＮＡアレイ・アッセイから価値ある情報を得る能力に影響を非常に大きく及ぼすことはない。反対に、ＧＰＣＲ質膜アレイ・アッセイから得られたデータの品質は、アッセイ条件（たとえばマイクロスポットから質膜損失が生ぜしめ得る洗浄）のためにかかる印刷変動性および可変減量によって非常に影響を受ける。
【０００８】
典型的ＧＰＣＲ質膜アレイ・アッセイ、すなわちリガンド結合アッセイまたは機能アッセイにおいて、所定のマイクロスポットでのシグナルの相対的強度はしばしば他のマイクロスポットでの相対的強度と比較される。質膜の可変量がマイクロスポットに印刷される場合、または、質膜の可変量がアッセイ中にマイクロスポットから消失する場合、ＧＰＣＲアッセイから意味があるデータを得る能力は非常に減少する。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、なかでも、ＧＰＣＲ質膜マイクロアレイのマイクロスポットと関連した質膜の量の変動性のアッセイ効果を減らすアレイおよび方法を示し、そして、変動性の供与源への洞察を提供することができる。質膜の基準成分を結合する標識試薬は、ＧＰＣＲ結合または機能的アッセイと関連するシグナルを規格化するための基礎を提供する。基準成分は、標的ＧＰＣＲが包埋される質膜に含まれることができ、またはマイクロスポット上の標的質膜と協動して印刷される他の質膜に存在してもよい。
【００１０】
実施例において、基準の前標識されたＧＰＣＲ質膜アレイが記載されている。アレイは、アッセイ可能なマイクロスポットの多数を有する。マイクロスポットの多数のうちの１つ以上は、（ｉ）  質膜膜成分および（ｉｉ）質膜に埋設された直接インスポットの標的ＧＰＣＲを有する質膜を含む。１つ以上のマイクロスポットは、膜成分に結合される標識試薬を更に含む。膜成分に結合される標識試薬は、標的ＧＰＣＲの結合または機能的アッセイと関連するシグナルが規格化され得るシグナルを提供することができる。
【００１１】
実施例において、基準前標識ＧＰＣＲ質膜アレイは、記載されている。アレイは、アッセイ可能なマイクロスポットの多数を有する。マイクロスポットの多数のうちの１つ以上は、質膜に包埋された標的ＧＰＣＲから成る第１の質膜を含む。１つ以上マイクロスポットは、膜成分から成る第２の質膜および膜成分に結合される標識試薬を更に含む。膜成分に結合される標識試薬は、標的ＧＰＣＲの結合または機能的アッセイと関連するシグナルが規格化され得るシグナルを提供することができる。
【００１２】
実施例において、方法は記載されている。方法は、ＧＰＣＲを過剰発現している細胞から質膜を分離することを含む。質膜は成分を含む。方法は、成分を結合して前標識質膜を産生するために構成される標識試薬に質膜を接触させることを更に含む。加えて、方法は基質上のマイクロスポットとして前標識質膜を印刷することを含む。
【００１３】
実施例において、方法は記載されている。方法は、ＧＰＣＲを過剰発現していて、非過剰発現している細胞から第２の質膜を分離している細胞から第１の質膜を分離することを含む。第２の質膜は、成分を有する。方法は、成分を結合して前標識された第２の質膜を産生するために構成される標識試薬に第２の質膜を接触させることを更に含む。加えて、方法は基質上のマイクロスポットとして第１で前標識された第２の質膜を印刷することを含む。方法は、前標識された第２の質膜を産生するために複数の標識試薬に第２の質膜を接触させることを含む。
【００１４】
実施例において、方法は記載されている。方法は、標識非加水分解性ＧＴＰ類似体にＧＰＣＲ質膜アレイのマイクロスポットを接触させることを含む。方法はまた、基準標識質膜を産生するためにＧＰＣＲ以外の膜成分を結合するために構成される第１の標識試薬にマイクロスポットを接触させることを含む。方法は、ＧＰＣＲと機能的に相互に作用することができると疑われるリガンドにマイクロスポットを接触させることを更に含む。加えて、方法は、マイクロスポットを洗浄して、非結合の標識非加水分解性ＧＴＰ類似体、非結合の第１の標識試薬、および非結合のリガンドをマイクロスポットから除去することを含む。方法はまた、マイクロスポットと関連する標識非加水分解性ＧＴＰ類似体と関連する第１のシグナルを定量化すること、そして、膜成分に結合される第１の標識試薬と関連した第２のシグナルを定量化することを含む。更に、方法はＧＰＣＲを有する試薬の機能上の相互作用の範囲を決定するために第１のシグナルを第２のシグナルと比較することを含む。
【００１５】
実施例において、方法は記載されている。方法は、標識リガンドにＧＰＣＲ質膜アレイのマイクロスポットを接触させることを含む。方法はまた、基準標識質膜を産生するためにＧＰＣＲ以外の膜成分を結合するために構成される標識試薬にマイクロスポットを接触させることを含む。方法は、マイクロスポットを洗浄して、非結合の第１の標識試薬、および非結合の第２の標識試薬を除去することを含む。加えて、方法は、マイクロスポットと関連する標識リガンドと関連する第１のシグナルを定量化すること、そして、膜成分に結合される標識試薬と関連した第２のシグナルを定量化することを含む。更に、方法はＧＰＣＲに試薬の結合の範囲を決定するために第１のシグナルを第２のシグナルと比較することを含む。
【００１６】
実施例において、方法は記載されている。方法は、標識リガンドにＧＰＣＲ質膜アレイのマイクロスポットを接触させることを含む。方法は、標識試薬がＧＰＣＲに結合するために構成され得る標識試薬にマイクロスポットを接触させること、そして、他の標識試薬にマイクロスポットを接触させることを含み、ここで、第２の標識試薬は、質膜もしくは膜成分に、またはたとえば基質の領域などの質膜での被覆であってはならないＧＰＣＲ質膜アレイのマイクロスポットの範囲内の領域に結合するために構成され得る。標識試薬は、サイトゾルタンパク質のような、親水性である。方法は、さらに、マイクロスポットを洗浄して、非結合の標識リガンドおよび非結合の標識試薬を除去することを含む。加えて、方法は、マイクロスポットと関連する標識リガンドと関連する第１のシグナルを定量化すること、そして、膜成分に結合される標識試薬と関連した第２のシグナルを定量化することを含む。更に、方法は、ＧＰＣＲへの試薬の結合の範囲を決定するために第１のシグナルを第２のシグナルと比較することを含み、ＧＰＣＲアレイ・アッセイの変動性の供与源を説明するアレイおよび方法を提供することにより、かかるアッセイのための潜在性がより充分に実現することができる。加えて、ＧＰＣＲ質膜アレイ・アッセイと関連する減少されたシグナルかどうかを決定する能力は、アレイに結合されている質膜の減少された量に依存し、たとえば、アッセイを経た損失、または、印刷問題、または、リガンド結合もしくは機能的相互作用に影響を及ぼしているアッセイ条件に依存するが、トラブルシューティングのための価値ある供与源として役立つことができる。これらの、そしてまた他の効果は添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明から容易に理解される
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、代表的なＧＰＣＲ質膜マイクロアレイの図解の斜視図である。
【図２】図２は、代表的なＧＰＣＲ質膜マイクロアレイおよび関連するアッセイ反応のブロック線図である。
【図３】図３は、代表的なＧＰＣＲ質膜マイクロアレイおよび関連するアッセイ反応のブロック線図である。
【図４Ａ】図４Ａは、代表的なＧＰＣＲ質膜マイクロアレイおよび関連するアッセイ反応のブロック線図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、代表的なＧＰＣＲ質膜マイクロアレイおよび関連するアッセイ反応のブロック線図である。
【図５Ａ】図５Ａは、代表的なＧＰＣＲ質膜マイクロアレイおよび関連するアッセイ反応のブロック線図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、代表的なＧＰＣＲ質膜マイクロアレイおよび関連するアッセイ反応のブロック線図である。
【図６Ａ】図６Ａは、全結合および非特異的結合のシグナルの規格化の後のプロットしたグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、全結合および非特異的結合のシグナルの規格化の前のプロットしたグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、マイクロアレイに印刷される前標識および非前標識質膜調製物のための全結合およびアッセイ特異性の棒グラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、マイクロアレイに印刷される前標識および非前標識質膜調製物のための全結合およびアッセイ特異性の棒グラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、マイクロアレイに印刷される前標識および非前標識質膜調製物のための全結合およびアッセイ特異性の棒グラフである。
【図７Ｄ】図７Ｄは、マイクロアレイに印刷される前標識および非前標識質膜調製物のための全結合およびアッセイ特異性の棒グラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、アレイのマイクロスポットからの蛍光性シグナルの画像である。検出シグナルは、標的ＧＰＣＲに結合するリガンドの結合の標的質膜の基準成分に関連する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、アレイのマイクロスポットからの蛍光性シグナルの画像である。検出シグナルは、試薬のアッセイの前の標的質膜の基準成分に関連する。
【図８Ｃ】図８Ｃは、アレイのマイクロスポットからの蛍光性シグナルの画像である。検出シグナルは、試薬のアッセイの後の標的質膜の基準成分に関連する。
【図９Ａ】図９Ａは、ここで記載されているような結合アッセイシグナルのアッセイから得た棒グラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ここで記載されているような結合アッセイシグナルのアッセイから得た棒グラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ここで記載されているようなアッセイから得られるアッセイＣＶの棒グラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ここで記載されているようなアッセイのＺファクタの棒グラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ここで記載されているようなプレスキャン蛍光、自己蛍光およびアッセイから得られたアッセイ全シグナルの棒グラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ここで記載されているようなプレスキャン蛍光、自己蛍光およびアッセイから得られたアッセイ全シグナルの棒グラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ここで記載されているようなプレスキャン蛍光、自己蛍光およびアッセイから得られたアッセイ全シグナルの棒グラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ここで記載されているアッセイに関する特異性をよびＺファクタを例示する棒グラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ここで記載されているアッセイに関する特異性をよびＺファクタを例示する棒グラフである。
【００１８】
図面が、必ずしも比例することになっているというわけではない。図において使用される数の様に、成分、ステップなどの類を言及する。しかし、与えられた図の成分に関連する数の使用が同じ数によって標識化される他の図の成分を制限することを目的としないと理解される。加えて、成分に関連する異なる数の使用は、異なる番号をつけられた成分が同じものまたは同様であるはずではないことを示すことを目的としない。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の詳細な説明において、そして、いずれが実例として装置（システムおよび方法）の具体的ないくつかの実施例を示し、この部分を形成する添付の図面が参照される。他実施例が考察されて、本開示の範囲または精神から逸脱することなく、作成され得ると理解される。以下の詳細な説明は、したがって、限定的にされることになっていない。
【００２０】
本願明細書において用いられる全ての科学技術用語は、特に明記しない限り従来技術において共通して使う意味を有する。ここで提供される定義は、しばしばここで使用する特定語の理解を容易にするためであり、本開示の範囲を制限するものではない。
【００２１】
この明細書および添付の請求の範囲において用いられているように、単数が生ずる「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」含む用語は、含量が明らかに別を書き取らせない限り、複数の指示物を有する実施例を含む。この明細書および添付の請求の範囲において用いられているように、語「または」は、含量が明らかに別を書き取らせない限り、その感覚の一般に使用する「および／または」を含む。
【００２２】
ここで使用しているように、「アレイ」および「マイクロアレイ」が、取り換え自在にて使われる。
【００２３】
ここで使用しているように、「マイクロスポット」は個別または明確な領域、基質の表面上の位置または点を意味しており、生物学的または化学的プローブを含む。
【００２４】
ここで使用しているように、「ＧＰＣＲ」はグアニンヌクレオチド−結合タンパク質被結合受容体を意味する。ＧＰＣＲは、自然型か修飾された配列を有することができる。
【００２５】
ここで使用しているように、「標識」は、蛍光性であるか放射性のシグナルのような検出可能シグナルを産生する分子、たとえば、蛍光性標識アビジンを結合するように構成されるビオチンのような検出可能シグナルを産生する分子と結合する（直接または間接的に）ために構成されるまたは分子を意味する。このように、「標識」分子は、標識が結合された分子である。
【００２６】
ここで使用されるように、ＧＰＣＲに対するリガンドまたは質膜成分に対する試薬の前後関係における、「結合」、「結合する」、「結合している」等は、ＧＰＣＲ質膜アッセイ条件に支配されるとき、リガンドまたは試薬のＧＰＣＲまたは膜成分への近い近接を保持するＧＰＣＲまたは質膜成分に対するリガンドまたは試薬の会合を言う。「結合」は、非共有結合または共有結合であってもよい。非共有結合の例は、非特異的吸着、静電（たとえばイオン、イオン対相互作用）に基づく結合、疎水的相互作用、水素結合形成相互作用、表面水和力などを含む。ＧＰＣＲまたは膜成分に「選択的に、結合した」リガンドまたは試薬は、ＧＰＣＲまたは膜成分が質膜の他成分のための大きな親和性を有する。リガンドは、また、表面に結合することができる。
【００２７】
ここで使用しているように、アレイの前後関係またはアレイのマイクロスポットにおいて、「アッセイ可能」は、アレイまたはマイクロスポットが典型的アッセイ条件の下で分析され得る材料を含むことを意味する。たとえば、アッセイにまだ支配されなかったマイクロスポットまたはアレイは、典型的なアッセイ可能なマイクロスポットである。
【００２８】
ここで使用しているように、膜成分の前後関係において、「前標識」は、アレイまたはマイクロスポット上にてアッセイに支配される前に、膜成分が標識化されることを意味し、すなわち、典型的にはアレイまたはマイクロスポット上の印刷の前に標識化された成分を有する質膜を言う。「基準前標識Ｇタンパク質共役受容体質膜アレイ」は、アッセイに支配される前に標識化される膜成分または他機能を有するマイクロスポットを有するＧＰＣＲ質膜アレイである。
【００２９】
ここで使用しているように、ＧＰＣＲを過剰発現している細胞と関連して、「非過剰発現細胞」はＧＰＣＲを過剰発現するように構成されない細胞を意味する。
【００３０】
ここで使用しているように、「ＣＶ」は変異係数を意味する。ＣＶは、確率分布のばらつきの測定または大きいデータセットのための変異の測定である。ＣＶは、平均に対する標準偏差の比であって、１００×（標準偏差／平均シグナル強度）として、数学的に算出される。
【００３１】
本開示は、なかでも、ＧＰＣＲ質膜マイクロアレイのマイクロスポットと関連した質膜の量の変動性のアッセイ効果を減らすアレイおよび方法を記載する。本開示は、所定のマイクロスポットと関連する質膜の量と他のマイクロスポットのそれとを比較するために用い得る量を測れるシグナルを提供することにより、ＧＰＣＲ質膜アレイ・アッセイのマイクロスポットからのシグナルの規格化を提供する様々な実施例を示す。
【００３２】
−−アレイ−−
図１に関連して、ここで記載されているように、アレイ１０は表面１２を有する基質１５を含む。複数のマイクロスポット２０は、表面１２に置かれる。アレイ１０のマイクロスポット２０のうちの１つ以上は、既知または未知の組成の質膜を含む。質膜は、質膜に埋設され込まれるＧＰＣＲを含むことができる。様々な実施例において、複数種類のタンパク質は、マイクロスポット２０の質膜に含まれる。たとえば、質膜は２つの包埋されたＧＰＣＲを含むことができ、たとえば、それは、それらの生物学的な機能のためにヘテロ二量体化するＧＰＣＲにとって望ましくてもよい。加えて、機能上のＧＰＣＲ活性のために、マイクロスポット２０の質膜は、必然的コエフェクタおよび／またはアダプタを含むことができる。（Angers, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 3684-3689）さらに、多数の細胞表面分子を含む可溶化された細胞からの生体膜は、直接生体膜アレイ１０を作るために用い得る。
【００３３】
マイクロスポット２０は、１つの、２つの以上質膜を含むことができる。アレイ１０のマイクロスポット２０はいかなる便利な形でもあってもよいが、典型的な円形で、楕円面で、広楕円形で、環形である、または、いくつかの他は類似して形をカーブさせた形である。ここで、形は、特定の実施例において、アレイ１０を産生するために使用される特定の方法の結果であってもよい。マイクロスポット２０は、円形のパターン等において、格子を形成するために列およびカラムにおいてアレイ１０の表面１２全体または上のいかなる便利なパターンにも配置され得る。
【００３４】
マイクロスポット２０は、欠陥２１（質膜によって層にされないマイクロスポット２０の範囲内の領域）を含むことができる。これらの欠陥２１の範囲内で、下にある基質は、暴露され得る。その標識試薬がこれらの欠陥領域２１において暴露される下にある基質表面に結合することができる。
【００３５】
マイクロスポット２０の質膜は、一般に安定して基質１５の表面１２と関連しており、すなわち、マイクロスポット２０の質膜は、条件を結合しておよび／または洗浄することの下で基質１５と関連して一般にそれらの位置を維持する。しかし、いくつかの質膜がアッセイ中（たとえば、ステップを洗浄することの間）、アレイ１０の表面１２から除去され得ると理解される。スポット２０を解決する質膜は、非共有結合にまたは共有結合して基質表面１２と会合することができる。非共有会合の例は、非特異的吸着、静電（たとえばイオン、イオン対相互作用）に基づく結合、疎水的相互作用、水素結合形成相互作用、表面水和力等、または、固定された結合パートナーおよび質膜結合タンパク質の特異な相互作用に基づく特異結合を含む。たとえば、特異な結合−誘導固定化は、抗体−テスト相互作用、一般的なリガンド−受容体結合、レクチン−糖残基相互作用、その他を含む。共有結合の例は、質膜および基質１５の表面１２に存在する官能基たとえば−ＮＨ２またはＣｏＯＨの間で形成される共有結合を含み、そこで、官能基は誘導された被覆材料の構成メンバとして自然に生じまたは存在し得る。他の例において、ＧＰＣＲまたは膜タンパク質のヒスチジンを付着の突然変異体は、キレート性結合によりＮｉ−存在表面に結合することができる。
【００３６】
様々な実施例において、アレイ１０は第１の包埋されたＧＰＣＲを有する質膜またはＧＰＣＲの組み合わせを有する第１のマイクロスポット２０および第２の異なる包埋されたＧＰＣＲを有する質膜またはＧＰＣＲの組み合わせを有する第２のマイクロスポット２０を含む。もちろん、アレイ１０は、ＧＣＰＲで異なって埋設されたＧＰＣＲまたは組み合わせを有する異なる質膜を有するマイクロスポット２０のいかなる異なる数も有することができる。たとえば、アレイ１０は、１０か、５０か、１００か１０００の以上異なるマイクロスポット２０を有することができる。そして、各々ＧＰＣＲの異なるＧＰＣＲまたは組み合わせを有する。アレイ１０の各々のマイクロスポット２０は、ＧＰＣＲの異なるＧＰＣＲまたは組み合わせを含むことができる。たとえば、約１００のマイクロスポットを含んでいるアレイ１０は、約１００の異なるタンパク質を含んでもよい。あるいは、各々の異なるＧＰＣＲは、アレイ１０の分離した複数のマイクロスポット２０に含まれ得る。たとえば、ＧＰＣＲの各々の異なるＧＰＣＲまたは組み合わせは、２乃至６の異なるマイクロスポット２０に任意に存在してもよい。
【００３７】
様々な実施例において、アレイ１０は細胞膜製法を使用して作られる。かかる細胞膜製法は、ＧＰＣＲまたは組み合わせに加えて関心あるＧＰＣＲで異なる多数の細胞表面タンパク質を含む。或る実施例において、アレイ１０は正常および病気にかかった組織から得られる細胞膜製法を含む。結果として生じるアレイ１０は、組織の薬理学的、生理学的な特性を比較するために用いることができる。
【００３８】
様々な実施例において、アレイ１０のマイクロスポット２０のうちの１つ以上は、異なる量でまたは異なる包埋された環境においてであるが、関心のある同じＧＰＣＲまたはＧＰＣＲの組み合わせを含む。たとえば、同じ受容体は、可溶化された細胞膜製法からまたはリポソームにおいて再構成される精製された受容体または異なる組成のミセルから得られ得る。結果として生じるアレイは、安定度上の環境および受容体の官能性の効果を検討するために用い得る。様々な実施例において、アレイ１０のマイクロスポット２０のうちの１つ以上は、異なる突然変異（たとえば点突然変異体）であるが関心のある同じＧＰＣＲを含む。結果として生じるアレイ１０は、受容体の構造および機能類縁を使って組織的に検討する。
【００３９】
様々な実施例において、アレイ１０は、使用中の異なる検体（標的）で処理される実質的に同一のマイクロスポット２０（たとえば同じＧＰＣＲを含んでいるマイクロスポット２０）または一連の実質的に同一のマイクロスポット２０を含む。たとえば、アレイ１０は２０のマイクロスポット（異なるＧＰＣＲを含んでいる各々のマイクロスポット２０）の「ミニアレイ」を含むことができる。ここで、ミニアレイはより大きいアレイ１０の一部としての２０回繰り返される。
【００４０】
様々な実施例において、１つのマイクロスポット２０のＧＰＣＲまたはＧＰＣＲの組み合わせがもう一方のそれと異なるけれども、ＧＰＣＲは互いに関連する。或る実施例において、２つの異なるＧＰＣＲまたはＧＰＣＲの組み合わせは、同じファミリの構成メンバである。異なるＧＰＣＲは、機能的に関連し、または、ちょうど機能的に関連があると疑うことができる。しかし様々な実施例において、固定されたＧＰＣＲの機能は、未知でもよい。そのような場合、アレイ１０の異なるマイクロスポット２０上の異なるＧＰＣＲは、構造または配列の類似性を共有され得るか、または単に構造または配列の類似性を共有することで疑われ得る。或る実施例において、ＧＰＣＲはタンパク質ファミリの異なる構成メンバの断片であってもよい。或る実施例において、ＧＰＣＲは薬理学的であるか生理学的な分布または役割の類似を共有する。
【００４１】
−−基質−−
図１によると、ここで記載されているように、アレイ１０の基質１５はマイクロスポット２０のパターンがある少なくとも１つの表面１２を含む。表面１２は、平滑、実質的に平坦、不規則（たとえば沈下または隆起）を有するか、または多孔性とすることができる。様々な実施例において、米国出願公開２００６／０１４７９９３号、２００６年７月６日、「質膜アレイおよび製造の方法」（U.S. pregrant application publication no. 2006/0147993, entitled “Membrane arrays and methods of manufacture”, July 6, 2006）にて説明したように、基質は多孔性である。
【００４２】
基質１５は、セラミック物質、ガラス、金属、結晶性材料、プラスチック、重合体または共重合体もしくは、（それのいかなる組み合わせも）または交互に積層した材料をも含むことができる。かかる基質１５は、たとえば、制限しないが、たとえば、金または銀などの（半）貴金属、ガラス材料（たとえばソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、バイコール（登録商標）ガラス、石英ガラス）、金属性または非金属酸化物、シリコン、リン酸モノアンモニウム、そして、他かかる結晶性材料、遷移金属、プラスチック、または、ポリ（ビニル塩化物）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリル酸エステル）、ポリ（ビニル酢酸塩−無水マレイン酸）、モノメタクリル酸、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン、環状オレフィンのような樹枝状重合体を含む、重合体、ポリ（ビニル酢酸塩−ｃｏ−無水マレイン酸）、ポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−アクリル酸）、環状オレフィン共重合体のような共重合体またはこれらの誘導体等を含む。
【００４３】
基質１５は、アレイ１０の意図された使用に従い、単純から複合体まで変動している様々な配位をすることができる。このように、基質１５は全体的なスライドまたはプレート配位、たとえば矩形またはディスク配位、を有してもよい。標準の複数のウエルマイクロプレート配位が、使われ得る。たとえば、ウエルの表面は米国出願公開２００２／００９４５４４号、２００２年７月１８日、「生体膜およびその使用方法のアレイ」（US pregrant patent application publication no. 2002/0094544, entitled “Arrays of biological membranes and methods of use thereof”, July 18, 2002）。にて説明したように、修飾され得る。
【００４４】
スポット２０のパターンがある表面１２は、望ましい方法の表面１２の性状を修飾するのに役立つ化合物の１つ以上の異なる層によって修飾され得る。たとえば、アレイ１０は典型的なマイクロスポット２０を有する被覆材料（図示せず）または一部の基質１５を含むことができる。被覆材料は、基質のためのマイクロスポット２０の質膜の親和性を強化するために用いてもよい。被覆材料は、マイクロスポット２０の範囲内で欠陥２１において暴露され得る基質のための標識リガンドの親和性を強化するために用いてもよい。いかなる適切な被覆材料も、使用され得る。適切な被覆材料の非限定例は、シラン、チオール、ジスルフィドまたは重合体を有するそれらを含む。適切な被覆材料に関する更なる詳細は、米国出願公開２００２／００９４５４４号に記載されている。
【００４５】
−−生体膜−−
ここで使用しているように、「質膜」はＧＰＣＲが包埋され得る複数の両性分子を有する構造を意味する。形態質膜に使用され得る両性分子は、リン脂質、スフィンゴミエリン、コレステロールまたはそれらの誘導体を含む。質膜は、合成薬品または自然に起こるものであってもよい。たとえば、質膜はベシクル、リポソーム、単層脂質膜、二重層−脂質膜、細胞膜の全部または一部、リポソーム、デタージェント・ミセル、等の中で形成され得る。
【００４６】
ＧＰＣＲが取り入れられる質膜のために、固定された受容体がそれらのコエフェクタ（たとえばＧＴＰ結合タンパク質またはＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫｓ））のうちの１つ以上と関連することは、特定の実施例において好ましい。様々な実施例において、所望の受容体およびそのコエフェクタを共に過剰発現している細胞株からの細胞膜製法が、使われる。或る実施例において、リポソームまたはミセルの再構成された受容体が使われる。そこにおいて、受容体は好ましい比の１つ以上の好適なコエフェクタと関連する。受容体が配列される前に、または、その後に、そのコエフェクタを有する受容体の結合は実行され得る。コエフェクタは、いずれの精製された自然のタンパク質も、生来配列を有する組換え型タンパク質類またはサブユニット（たとえば突然変異体およびキメラ）のユニークな組み合わせを有する組換え型タンパク質でありえる。
【００４７】
質膜に取り入れられるタンパク質は、従来技術において通常の熟練のそれらにとって知られている技術の変動性のいずれにでもよって生成され得る。タンパク質は、自然型供与源から得られるかまたは組換えＤＮＡ方法を使用して、任意に過剰発現され得る。たとえば、タンパク質はＧＰＣＲ（たとえばアドレナリン受容体、アンギオテンシン受容体、コレシストキニン受容器、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ニューロテンシン受容器、ガラニン受容体、ドーパミン受容体、オピオイド受容体、セロトニン受容体、ソマトスタチン受容体、その他）、ＧＴＰ結合タンパク質および他の膜結合タンパク質を含む。かかるタンパク質の突然変異体または一時変異体が、また、使われ得る。たとえば、単一または多発性点突然変異体を所有している或るＧＰＣＲは、生物学的官能性を保持して、疾患に関係していることができる。（Stadel, et al., Trends in Pharmocological Review, 1997, 18, 430-437、参照。）
【００４８】
また、タンパク質はまた、Ｎ末端で付着したアゴニスト（またはペプチド）を含むために修飾され（または個別に）得る。かかる方法で修飾されるＧＰＣＲは、構成的に活性化され得る（Nielsen, S. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 10277-10281）。
【００４９】
様々な実施例において、ＧＰＣＲは指向の方法で固定される。たとえば、リガンド・スクリーニングのためのＧＰＣＲアレイの性能を改良するために、ＧＰＣＲは基質に直面している溶液および菌体内ドメインに、それらのリガンド−結合部（細胞外ドメイン）によって指向される。これは、多くの方法によって完成され得る。たとえば、基質の表面は、基またはエチレンジアミン・トリ酢酸（ＥＤＴＡ）基がニッケルにキレート化したニトリロ三酢酸（ＮＡＴ）を含むために修飾される。この表面が、それらのＣ末端でヒスチジン標識を有する組換え型ＧＰＣＲを固定するために使われ得る。ＮＴＡ基を示している表面またはＥＤＴＡ基は、ガラスまたは金属酸化物表面上のまたは金−被覆表面上のチオール化学作用を経たシラン化学作用によって、便利に得られ得る。これらの界面化学のための化合物は、市販の（たとえばＮ−［（３−トリメトキシシリル）プロピル）プロピル］エチレンジアミン・トリ酢酸；Ｈｕｌｓ社）である。
【００５０】
溶液に暴露されるそれらの細胞外のドメインを有するＧＰＣＲを固定するための他のアプローチにおいて、反ＧＴＰ結合タンパク質抗体が、使われ得る。このアプローチは、ＧＴＰ結合タンパク質がヒスチジン標識によって発現される必要はないという効果がある。
【００５１】
あるいは、機能的アッセイのためのＧＰＣＲアレイの性能を改良するために、ＧＰＣＲは溶液に直面しているそれらの細胞内の側面および基質に直面している細胞外のドメインによって指向される。これは多くの方法によって完成され得、そして、たとえば、小麦胚凝集素（ＷＧＡ）のようなレクチンを有する基質表面を修飾することを含む。これらの表面が、受容体のＮ末端または細胞膜に存在する他の細胞表面部分のグリコシル化された部分によるＧＰＣＲの固定化のために使われ得る。
【００５２】
−−アレイのマイクロスポットとしての質膜の印刷−−
質膜は、アレイ１０を生成するために基質１５の表面１２上のマイクロスポット２０として印刷される。いかなる適切な印刷技術も、使用され得る。ここで使用しているように、「印刷」は基質の上へ材料の沈着を意味する。質膜は、典型的な技術、マイクロパターニングを使用して基質１５に印刷される。かかる技術は、公知技術である。様々な実施例において、プローブ（また、「ピン」と称する）の先端は、質膜の溶液に浸漬される。先端は、付着される溶液に先端を提供するために溶液から除去される。溶液は、それによって溶液を先端から表面１２まで移すために基質１５の表面１２によって接触する。
【００５３】
質膜をアレイ１０の表面１２に印刷するためのピンは、いかなる形、大きさおよび寸法とすることができる。たとえば、プロセスを印刷しているピンは、環形とされたピン、四角ピンまたは点ピン、その他を含むことができる。或る実施例において、直接の密着焼付け法は、単一ピン印刷または多重ピン印刷、すなわち供与源プレートを含んでいる単一ピン印刷方法またはいかなるフォーマットにもおいて作られる多重ピンのレイアウトアレイを使用している多重ピン印刷方法を含む。
【００５４】
印刷器具は、印字ヘッド、プレート、基質処理単位、ＸＹかＸＹＺ位置決めステップ、環境管理、機器コントロール・ソフトウェア、サンプル・トラッキング・ソフトウェア、その他を含むことができる。たとえば、かかる器具は、デカルト技術社（Cartesian Technologies, Inc）で販売される羽軸根ピン−プリンタを含む。
【００５５】
高密度アレイを形成するために、各々のプローブが対応する供与源ウエル、たとえばミクロタイタープレートからのウエルの嵌るように整列配置されたプローブのマトリックスを有する印刷プローブ・アレイを用いてもよい。
【００５６】
ここで記載されているように、様々な他の手技はまた、アレイ１０を産生するために用いてもよい。アレイ１０は、たとえばマイクロスタンピング（米国特許第５，７３１，１５２号）や、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）スタンプを使用しているマイクロ接触印刷（Hovis and Baxter, Langmuir, 2000、16(3):894-897）や、キャピラリ分配装置（米国特許第５，８０７，５２２号）や、マイクロピペット装置（米国特許第５，６０１，９８０号）にて製造ができる。質膜アレイ１０を使用している放射性のアッセイのために、数百ミクロン乃至数ｍｍまでの範囲でより大きい大きさの点を生み出すことができる技術なので、ピペットベース液体移入技術はアレイ１０を作ることに役立つ。
【００５７】
−−アレイの使用−−
ここで記載されているように、アレイ１０が様々なＧＰＣＲ結合および機能的アッセイにおいて使われることができて、薬物開発、医学の診断、プロテオームまたはバイオセンサにおいて使用され得る。アレイに分配されるサンプルは、典型的な流体である。
【００５８】
広範囲にわたる検査法は、ここで記載されているアッセイに適用できる。必要に応じ、検出は量的でも、半定量的でも、質的でもよい。アレイ１０は、たとえば可視または赤外線の範囲の生体吸収、化学発光および蛍光（寿命、偏光、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）および蛍光−共振エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を含む）のような、光学検出設備を使用している方法に結びつけられ得る。さらに、適宜または必要に応じ、光学導波管（ＰＣＴ公開公報ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）や、表面プラスモン共振、表面電荷センサー、表面力センサーおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳのような技術に基づく他の検出態様が使用され得る。
【００５９】
ＧＰＣＲに関するかぎり、アッセイは直接的な非侵襲的なアッセイまたは間接的な競争アッセイであってもよい。非侵襲的な方法では、ＧＰＣＲ上の結合部のための親和性は、直接決定される。かかる方法で、マイクロスポットのタンパク質は、直接検体（「標的」）に暴露される。リガンドは、標識化され得るかまたは標識化されない。ＧＰＣＲを結合することで疑われるリガンドが標識化される場合、検出の方法は蛍光、ルミネセンス、放射活性、その他を含むことができる。リガンドが標識化されない場合、結合の検出は表層膜で或る物性の変化に基づいてもよい。この物性は、屈折率または電気インピーダンスでもよい。非標識標的の結合の検出は、また、質量分析によって実行されてもよい。競争的方法では、結合部占有は、間接的に決定される。かかる方法で、アレイのＧＰＣＲは、ＧＰＣＲのためのリガンドと標識化される同族を含んでいる溶液およびＧＰＣＲを結合する疑いがある非標識標リガンドに暴露される。同族の標識リガンドおよび非標識標の推定のリガンドは、ＧＰＣＲ上の結合部に匹敵する。同族リガンドと関連するＧＰＣＲのための推定のリガンドの親和性は、標識リガンドの結合の量の減少によって決定される。疑われたリガンドの結合の検出はまた、サンドイッチ・アッセイを使用して実行され得、これにおいて、初期の結合の後、アレイ１０は、結合リガンドのために親和性を有する標識抗体のような分子を含んでいる第２の溶液によってインキューベートされて、そして、リガンドの結合の量はＧＰＣＲ−標的錯体に対する標識抗体の結合の量に基づいて決定される。推定のリガンドの結合の検出は、アレイ１０が関心のある化合物を含んでいる第２の溶液によってインキューベートされて、これにおいて、標識リガンドを初期に結合した後、置換アッセイを使用して、実行され得る。疑われたリガンドの結合の結合能力および量は、予め結合した標識リガンドの数における減少に基づいて決定される。
【００６０】
様々な実施例において、アッセイは標的サンプルの特定の成分を結合するそれらの能力のための複数のＧＰＣＲをスクリーニングする方法を提供する。かかる方法は、スクリーニングされるＧＰＣＲを含んでいるアレイ１０にサンプルを分配して、直接間接的に、各々のマイクロスポット２０で保持される特定の成分の存在または量を検出することを含む。アッセイは、検出ステップの前にアレイ１０からサンプルのいかなる非結合または非特定に結合された成分も除去するためにアレイ１０を洗浄することを更に含むことができる。或る実施例において、アッセイは少なくとも１つのマイクロスポット１０に保持される特定の成分を特徴づけることを更に含む。
【００６１】
様々な実施例において、方法は、アレイ１０上のＧＰＣＲのうちの１つ以上と化学反応することができるサンプルの複数の推定のリガンドの存在を平行にアッセイすることを含む。この方法は、アレイ１０に対するサンプルを摘出して、ＧＰＣＲたとえば各々のマイクロスポット２０との推定のリガンドの相互作用を検出することを含む。
【００６２】
ここで記載されているように、アレイおよび方法を使用して、実行され得る追加の結合アッセイは、米国出願公開２００２／００９４５４４号に記載されている。
【００６３】
−−ＧＰＣＲアレイのための機能的アッセイ−−
様々な実施例において、アレイ１０は、活性化を識別するマイクロアレイに基づく異質のアッセイおよびＧＰＣＲのコエフェクタのために使われ得る。或る実施例において、アッセイは、標識加水分解抵抗性ＧＴＰ（たとえば放射性［３５Ｓ］ＧＴＰγＳまたはその蛍光性類似体（たとえばＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＧＴＰγＳまたはユウロピウム標識ＧＴＰγＳ（ｅｕ−ＧＴＰ））を使用して、過剰発現されたＧＰＣＲおよびＧＴＰ結合タンパク質を含む細胞質膜調整物または関心のある受容体およびそのコエフェクタを含んでいる再構成のベシクル／ミセルのアレイへのＧＴＰγＳのリガンド刺激結合をモニタする。このアプローチによって、高い流量方法のＧＰＣＲに対して、アゴニストをスクリーニングするのを人に可能とするだけでなくて、人がＧＰＣＲのコエフェクタ（たとえば被結合ＧＴＰ結合タンパク質）を識別可能ともする。
【００６４】
アゴニスト結合にあたって、ＧＰＣＲは以前に遮蔽されたＧＴＰ結合タンパク質−結合部を開放する立体配置的変化を被り、そして、それによってヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質との相互作用を進める。この相互作用はグアニンヌクレオチド交換に触媒作用を及ぼし、そして、ＧＴＰ結合タンパク質のサブユニットにＧＴＰ結合に結果としてなる。ＧＴＰ結合は、ＧβγサブユニットからＧα−ＧＴＰ錯体の解離まで至る。Ｇサブユニットの内因性ＧＴＰアーゼ活性の結果として、結合されたＧＴＰはＧＤＰに加水分解され、そして、それによってそのヘテロ三量体の休止状態に系を戻す。
【００６５】
ＧＴＰγＳは、ＧＴＰの加水分解抵抗性類似体である。放射性で蛍光性のＧＴＰγＳの結合が、溶液に基づくアッセイの均質のアゴニスト−結合されたＧＰＣＲによって、測定ＧＴＰ結合タンパク質活性化に広く使われている。
【００６６】
組織および細胞型にてＧＴＰ結合タンパク質の多種多様基が見つけられる（Morris, A.J. and Malbon C.C., Physiol. Rev., 1999, 79, 1373-1430）。ＧＴＰα結合タンパク質は、るそれらの生物学的な機能およびアミノ酸相同基づき、４つのファミリ（Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、そして、Ｇ｛ｆｒａｃｔｉｏｎ（１２／１３）｝）に分類され得る。さらに、文献において報告された、少なくとも５つのＧβおよび７つのＧＴＰγ結合タンパク質がある。したがって、ヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質は非常に多種多様であり、３つのサブユニットの組み合わせの複雑度を考慮に入れる。ＧＰＣＲは、少なくとも１つのＧＴＰα結合タンパク質を連結することができる。さらに、ほとんどすべての細胞株は、優先して全てのＧＴＰα結合タンパク質よりむしろいくつかを発現する。これは、ＧＰＣＲ−ＧＴＰ結合タンパク質経路に対するリガンドの作用を分析および規格化する複雑度を上げる。たとえば、関心のあるＧＰＣＲを過剰発現している与えられた細胞株において、ＧＰＣＲコエフェクタが不在の場合、リガンド・スクリーニング・アッセイの結果はあまり意味がある事はない。
【００６７】
Ｇαサブユニットのリガンド−誘導活性化の欠ける場合、ＧＴＰγＳおよびその類似体は異なる親和性を有するＧＴＰα結合タンパク質の構成メンバに結合する。たとえば、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＧＴＰγＳは、再構成された小胞系において、ＧＴＰ結合タンパク質Ｇｏ、Ｇｓ、Ｇｉ１およびＧｉ２（それぞれ６、７０、１５０および３００ｎＭのＫｄを有する）の非活性形態に結合する（McEwen, D. P., et al., Anal.Biochem、2001、291、109-117）。これは、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＧＴＰγＳを使用している蛍光強度のための異なる基礎のラインを引き起こす（または、放射活性はもしもを計数する［３５Ｓ］ＧＴＰγＳが使われる）。しかし、アゴニスト−誘導Ｇα活性化は、非常にＧＴＰγＳの結合を進める。
【００６８】
−−図２−５−−
代表的なＧＰＣＲ質膜マイクロアレイ１０および関連するアッセイ反応の様々な実施例は、図２−６に示される。図１と同様に、図２、３、４Ａ、５Ａおよび６Ａは、表面１２に配置した複数のマイクロスポット２０を有するアレイ１０を示す。図２および３を参照すると、ＧＰＣＲ４０は、マイクロスポット２０の質膜３０と会合する。表される質膜３０は脂質二重層であるが、しかし、質膜３０が上で示したようにいかなる適切な質膜でもあってもよいと理解される。ＧＰＣＲ４０以外の膜成分５０は、また、質膜３０と会合する。膜成分５０は、質膜３０と会合して、標識化されて、質膜と会合すると確認され得るできるいかなる成分でもあってもよい。様々な実施例において、膜成分５０は細胞から分離される質膜の成分である。たとえば、膜成分５０はリン脂質、脂肪酸、末梢であるか必要不可欠な膜タンパク質、コレステロール、オリゴ糖、等であってもよい。或る実施例において、膜成分５０はガングリオシドがＧＭ１であるか、または含む。或る実施例において、膜成分は、ホスファチジルセリンのようなリン脂質であるか、または含む。追加の実施例において、標識試薬は、マイクロスポット２０と会合することができる。たとえば、標識タンパク質は、基質（マイクロスポットの範囲内の欠陥）の露出した領域を結合、または会合することができる。この結合は、また、ＧＰＣＲアッセイへの基準または規格化動機として役立つことができる。或る実施例において、膜成分５０は第１のＧＰＣＲ４０と異なる第２のＧＰＣＲである。
【００６９】
追加の実施例において、ＧＰＣＲアッセイの規格化は、標識を質膜調製物に組み込むことによって完成していてもよい。たとえば、印刷する前に、標識ストレプトアビジン（Ｓｖ）または類似した標識タンパク質類はＧＰＣＲ質膜調製物に組み込まれ得る。これは、ｃｙ５を含んでいる一般の印刷緩衝液またはＳｖと分類されるｃｙ３の音波処理によって完成していてもよい。この音波処理ステップは、ＧＰＣＲ質膜調製物に標識Ｓｖの会合に至る。理論によって結合されることなく、標識Ｓｖは疎水性色素、たとえばｃｙ３または、ｃｙ５によってＧＰＣＲ質膜調製物と会合させて、脂質膜と会合できるようになる。または、標識Ｓｖは、堆積したマイクロスポット２０において印刷質膜調製物の欠陥２１を介して暴露され得る基質と会合する（Fang, et al., Air-Stable G Protein-Coupled Receptor Microarrays and Ligand Binding Characteristics, Anal. Chem. 2006, 78:149-155、参照）。
【００７０】
図２を参照すると、標的質膜の膜成分が、ＧＰＣＲアッセイの規格化のための基準として使われ得る。図２に示すように、選択的に膜成分５０に結合する試薬７０は、第１の標識７５によって標識化され（集合的に「標識試薬」７８）、そして、アッセイ溶液に添加されて、そして、膜成分５０と会合る質膜３０を含んでいるマイクロスポット２０に接触される。試薬７０は、選択的に膜成分５０を結合するいかなる試薬でもあってもよい。一般に、試薬７０は膜成分５０のための高親和性を有しなければならなくて、ＧＰＣＲ４０を有するリガンド６０またはＧＴＰ結合タンパク質のようなその下流コエフェクタを有するＧＰＣＲ４０の相互作用の結合を、妨げない大きさの中でなければならない。膜成分が質膜のいかなる位置にも位置することができる間に、好ましくは、膜成分５０は、ＧＰＣＲ４０およびその下流コエフェクタから充分な距離を配置され、リガンド６０での結合または機能的アッセイの干渉を避けるようにする。様々な実施例において、試薬７０は抗体または抗体フラグメント、たとえば膜成分５０のエピトープを認識するＦａｂ断片である。しかし、或る例において、抗体は目標とされた結合または機能的アッセイを妨げるのに十分大きくてもよい。多数の実施例において、試薬はコレラトキシンのβサブユニットを含み、そして、それは選択的に質膜３０に組み込まれ得るかまたは自然に細胞から分離される質膜で見つけられ得るガングリオシドＧＭ１に結合する。様々な実施例において、試薬は選択的にホスファチジルセリンに結合するアネキシンＶ（Annexin V)を含む。標識アプタマー（aptmer）がほとんどいかなる膜成分のためものプローブのために使われ得ると理解される。
【００７１】
アッセイ溶液は、また、第２の標識６５によって標識化されるＧＰＣＲリガンド６０を含むことができる（集合的に「標識リガンド」６８）。ここで使用しているように、ＧＰＣＲの前後関係において、「リガンド」はＧＰＣＲに結合する分子を意味する。「リガンド」は、場合によっては、機能的にＧＰＣＲと相互に作用することができる。たとえば、リガンドはアゴニストおよびアンタゴニスト（逆作動薬等）であってもよい。
【００７２】
アッセイ溶液を有する接触の後、アレイ１０またはマイクロスポット２０は洗浄され得る。そして、ＧＰＣＲ４０に結合されるリガンド６８に標識化されていて、膜成分５０に結合される試薬７８に標識質膜３０を残す。第１のマイクロスポット２０からの第１の標識７５から得られるシグナルは、第２のマイクロスポット２０から得られたシグナルと比較されてもよく、マイクロスポット２０の質膜３０の量の変動性を説明し、第１のマイクロスポット２０からの第２の標識６５から検出されるシグナルと第２のマイクロスポット２０からの第２の標識６５から検出されるシグナルとの規格化された比較を可能とする。与えられた質膜調製物の範囲内で、膜成分５０に対するＧＰＣＲ４０の比は、アッセイの間、定常的なままでなければならない。したがって、膜成分５０は効果的な規格化標的として役立ち得る。図２に示される実施例は規格化のための改善の結果となると共に、質膜３０が表面１２に結合されるときに、膜成分５０に標識試薬７８の制限されたアクセスのために膜成分５０の均一標識を達成することは或る状況において困難となる場合がある。加えて、典型的アッセイと関連する洗浄条件の下で標識フリー試薬７８を除去することは或る状況において困難となる場合があり、それは規格化を混乱させるかもしれない。
【００７３】
したがって、かかる状況において、たとえば、図３に示すように質膜３０を表面１２に印刷する前に前標識質膜３０が望ましい。図３に示すように、前標識質膜３０は、基質１２に印刷される。前標識アッセイまたはマイクロスポット２０は、第２の標識によって標識化された第２の標識６５（集合的な標識リガンド６８）によって標識化されたＧＰＣＲリガンド６０で処理され得る。結合活性およびアッセイ特異性をすることを維持するために、凍結／融解過程を通すことなくアレイ印刷が起こり標識化を直接続けることを確実にするために最小限の必要なステップでＧＰＣＲ４０を標識化することが望ましい。たとえば、活性的前標識ＧＰＣＲ質膜を産生した簡略化された前標識プロトコルは、下記の実施例３に記載されている。実施例３において、標識は保存溶液において小体積で直接提供され、そして、質膜はＢＳＡのようなキャリアータンパク質を加えることによって洗浄される。これらのステップは、同日の質膜調製物および質膜印刷を提供することを可能にする。
【００７４】
印刷はたとえば５時間かかる冗長なプロセスであるので、前標識に必要な回数を減らすことによって研究者が１日で印刷ステップと同様に前標識ステップの全てを完了することができる。全てのプロトコルが１日で完了され得る場合、凍結融解サイクルは必要でない。
【００７５】
従来の方法は、適切に凍結融解サイクルが必要なステップの全てを完了することを必要とした。加えて、従来方法では回収率（プロトコルの終わりに残る標識質膜の百分率）は非常に低かった（３０％未満）が、一方、本発明方法の実施例では回収率が９０％を超える回収率を得られる。
【００７６】
本発明の実施例において、保存溶液の最小体積にてステップを実行することが、好ましい。保存溶液は、ＧＰＣＲ質膜調製物の製造業者または供給元によって提供され得る。液体の最小体積中に浮遊したタンパク質または質膜は、製法からの沈殿または回収がより簡単である。しかし、最小限体積は質膜材料の体積を収容するため、たとえば１５μｌ以下であることはありえない。好適な最小体積は、１００μｌ未満で、２０乃至７５μｌの間に、２５乃至５０μｌの間に、２５乃至４０μｌの間にすることがよい。
【００７７】
アレイ印刷より前の前標識ＧＰＣＲ４０は、標識化効率を向上させ、バックグラウンド・シグナルを減らし、結果として改善された規格化を可能とする。加えて、前標識ＧＰＣＲ４０によって、人が質膜保持をモニタできるようになり、アッセイの印刷、洗浄、結合に関連したスポットを見逃がすトラブルシューティングを可能とする。これによって、人は、アッセイ中のＧＰＣＲ４０に対するリガンド６０の減少結合がアッセイ中（たとえば、洗浄中）の質膜３０の減少か、不完全な印刷か、未知の理由（実施例３参照）による結合活性する減少、によるかどうか決定することができる。結合アッセイの複雑なプロセスが起こる前に、前標識ＧＰＣＲ４０によって人が精度管理を実行することができ、時間および経費の節減に非常に有益である。
【００７８】
本発明の実施例は、ＧＰＣＲアッセイのために有意な効果を用意することができる。たとえば、前標識質膜の使用は、結合アッセイ中の質膜保持をモニタするために用い得る。図８Ｂ（アッセイ前）および図８Ｃ（アッセイ後）に示すように７を除き質膜の全てが存在し、図８Ｂおよび８Ｃは質膜（７）の印刷失敗を示す。しかし、図８Ａに示される結果は、カラム１および２のシグナルがないことを示す。前の方法を使用して、人は質膜がカラム１および２において適切に印刷されなかったことを示すとして結果を読み込むことができるようになった。しかし、前標識方法を用いて、カラム７だけが印刷することに失敗したことが分かる。実施例３（Ｃ）を参照のこと。精度管理もまた、改良され得る。先の方法は、アッセイ前であるが、印刷後に品質をモニタするための自己蛍光を使用した。前標識質膜については、前標識された蛍光に注目することによって直接印刷する品質を点検することが可能である。これは、アッセイの最終結果を分析することに関してより正確である。たとえば、図１１Ａ−１１Ｃを参照のこと。加えて、この前標識方法は規格化のために使われ得る。
【００７９】
図４および５を参照すると、第２の基準質膜２３０は、規格化のために役立つように使用され得る。標的質膜３０および基準質膜２３０は、一緒にマイクロスポット２０に印刷される。標的質膜３０および基準質膜２３０は、印刷の前に混合していてもよい。基準質膜２３０は、好ましくは標的質膜３０に類似している。たとえば、標的質膜３０はＧＰＣＲ４０を過剰発現している細胞から分離される質膜であってもよい、そして、いずれがＧＰＣＲ４０を過剰発現しないか、標的質膜３０が得られる細胞として、基準質膜２３０は共通の系統を有する細胞から分離され得る。基準質膜２３０は、印刷前に前標識され得、または標的質膜３０に向けたＧＰＣＲアッセイ中に標識化され得る。
【００８０】
図４Ａに示される本実施例において、標的ＧＰＣＲ４０を含んでいる標的質膜３０および基準ＧＰＣＲ２４０を含んでいる基準質膜２３０は、アレイ１０のマイクロスポット２０に印刷される。図４Ｂに示されるアッセイ反応において、標的ＧＰＣＲ４０に対する標識リガンド６８および基準ＧＰＣＲ２４０に対する標識試薬７８を含んでいるアッセイ溶液は、標的質膜３０および基準質膜２３０を含んでいるマイクロスポットに接触される。標識リガンド６８は標的ＧＰＣＲ３０に結合し、そして、標識試薬７８は基準ＧＰＣＲ２４０に結合する。マイクロスポットから非結合の標識リガンド６８および標識試薬７８を洗浄した後に、シグナルは標識試薬７８の第１の標識７５と関連し、そして、標識リガンド６８の第２の標識６５と関連するシグナルはたとえば、上記の通り検出され得る。シグナルは第１の標識７８と関連し、そして、このように、基準質膜２４０は第２の標識６８およびこのように標的質膜から検出されるシグナルを規格化するために、たとえば、上記の通り用いてもよい。しかし、基準質膜２４０がたとえばＧＴＰ結合タンパク質のような基準ＧＰＣＲ２４０の下流エフェクタのかなりの量を含む場合、ＧＰＣＲ４０に結合している下流効果リガンド６０の指示薬たとえば結合した標識ＧＴＰγＳが測定される機能的アッセイは、試薬７０が基準ＧＰＣＲ２４０に結合に下流効果を成し遂げ得るように、基準質膜２３０および基準ＧＰＣＲ２４０と関連する効果によってマスキングされ得ると理解される。
【００８１】
マイクロスポット２０に関して議論されるように、そこでは、膜成分５０が標的質膜３０（図２および３に関連して説明した）の成分であるが、基準質膜２３０の前標識は同様に有利である。図５Ａを参照すると、ＧＰＣＲ５０を含む標的質膜３０および前標識された膜成分５０（標識試薬７８によって前標識された）を含む基準質膜２３０は、アレイ１０のマイクロスポット２０に印刷される。実施例において、標的質膜３０は膜成分５０を含み、たとえば同じ細胞型から得られ、標的質膜が標的ＧＰＣＲ４０を含むことを除いては基準質膜２３０に類似している。アッセイ溶液は、図５Ｂに示すように、マイクロスポット２０に接触することができる標識リガンド６８を含むことができ、リガンド６０が標的ＧＰＣＲ４０を結合することができるようになる。基準質膜２３０と関連する第１の標識７５からのシグナルは、上記の通りに標的ＧＰＣＲ４０と関連する第２の標識６５からのシグナルを規格化するために用いることができる。
【００８２】
規格化のために基準質膜２３０を使用する有効性は標的質膜３０に対する基準質膜２３０の相対的な量が印刷プロセスおよびアッセイ手順の全体にわたって定常的なままであるという仮定に基づく。規格化のための良好な結果は基準質膜２３０を使用して得られ得る（実施例  ２を参照のこと）。しかし、或る状況において、アレイ１０の表面１２によって保持される質膜の機能が使用される質膜の型、質膜に取り入れられるＧＰＣＲの量、などに従い変化し得ると理解される。したがって、基準質膜２３０および標的質膜３０はオリジンおよび成分の同様であることが好ましい。
【００８３】
図２−５がアッセイを結合している受容体を表す一方、機能的アッセイは類似した方法で実行され得ると理解される。機能的アッセイにおいて、受容体結合の影響を受ける下流であってもよい分子は、第２の標識６５によって標識化され得る。標識分子は、下流効果を成し遂げるためにリガンド６０の機能の指示薬として機能する。たとえば、ＧＴＰ結合タンパク質のαサブユニットへのＧＴＰの結合を起こすリガンド６０の機能を決定するために、上記のように、ＧＴＰγＳは標識化され得る。
【００８４】
以下において、非限定の実施例が示されるが、それはアレイの様々な実施例および上記の方法を記載する。
【実施例】
【００８５】
−−実施例１：規格化のための基準としての標的質膜の膜成分の使用−−
図２に参照されるように、例１は規格化のための基準として標的膜成分の使用を例示する。標的細胞膜の多くの成分（タンパク質、脂質、コレステロール、多糖、その他）が、基準として使われ得る。たとえば、我々はガングリオシドＧＭ１を基準に選んだ。ガングリオシドＧＭ１は形質膜において選択的に微小ドメインに仕切る。微小ドメインは、脂質ラフトと呼ばれている。脂質ラフトは、形質膜において側生芽会合体を形成する、洗浄不溶性のスフィンゴ脂質およびコレステロールの豊富な微小ドメインである。脂質ラフトは、多くのシグナリング・タンパク質および受容体を隔離して、様々な細胞過程で役割を演ずる。コレラトキシン（ＣＴＢ）のβサブユニットは、高親和性を有する形質膜ガングリオシドＧＭ１の五糖連鎖に結合すると知られている。ＧＰＣＲ標的および基準からの蛍光性シグナル間のクロストークを最小にするために、ＧＰＣＲ標的のための基準のプローブおよびＣｙ３標識リガンドとしてのモレキュラープローブから入手可能なAlexa FL（登録商標）６４７標識ＣＴＢ（ＣＴＢ６４７）を我々は選んだ。
【００８６】
ＣＴＢ６４７の１ｎｇ／ｍｌは、ＧＰＣＲアレイでのインキュベーション前にＣｙ３標識リガンドを含むＧＰＣＲ結合アッセイ溶液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、１：４０のブロッカーカゼイン（ピアス、ブラッドフォード、ＷＩ）および０．０５％のＢＳＡ））に添加された。１時間のインキュベーションの終わりに、ＧＰＣＲアレイはBio-Tek（登録商標）Instruments Inc. （Winooski, Vermont）からのＥＬｘ５０（登録商標）のオートメーション化した細片洗浄器を使用して蒸留水によって洗浄され、そして、Ｃｙ３およびＣｙ５経絡のため撮影された。Ｃｙ５経絡に対するＣｙ３経絡の結合シグナルの比は、規格化を実行するために算出された。全９６ウエルマイクロプレートのアッセイＣＶは、ＣＴ−Ｂ６４７規格化の有無にかかわらず算出された。ＣＴＢ６４７が規格化のために使われる場合、アッセイ結果はアッセイＣＶ％の有意な改善を示した。（表１）。たとえば、ブラジキニン受容体のアッセイＣＶは、規格化前の３９．５％であった。規格化の後、アッセイＣＶは、１１．５％に落ちた。他の例は、ムスカリニックＭ２である。そのアッセイＣＶは、３７．８％から１９．５％まで減少した。
【００８７】
【表１】
2011503611.tif 000003
ＣＶｂは規格化の前のアッセイＣＶであり、ＣＶｎは規格化後のアッセイである。
アッセイ溶液：５Ｃｙ３標識ＧＰＣＲリガンドと１ｎｇ／ｍｌのＣＴＢ６４７との反応混液。
【００８８】
上記の２色標的質膜参照方法は、三色または多色参照方法まで広げられ得る。
たとえば、２つの蛍光経絡がアッセイのために使われ得、そして、第３の経絡が参照するために使われ得る。たとえば、両Ｃｙ３およびＣｙ５標識プローブがＧＰＣＲ標的のために使われ得、そしてAlexa FL（登録商標）４８８標識ＣＴＢが参照のために使われ得る。表２の結果は、参照方法として三色の標的質膜を使用してアッセイＣＶ％の有意な改善を示した。両Ｃｙ３およびＣｙ５標識プローブがＧＰＣＲ標的のため、そしてAlexa FL（登録商標）４８８標識ＣＴＢが規格化のために使われる。
【００８９】
簡潔に、ＣＴ−Ｂ４８８の１ｎｇ／ｍｌは、ＧＰＣＲアレイでのインキュベーション前に両Ｃｙ３およびＣｙ５標識リガンドを含むＧＰＣＲ結合アッセイ溶液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、１：４０のブロッカーカゼインおよび０．０５％のＢＳＡ））に添加された。１時間のインキュベーションの終わりに、ＧＰＣＲアレイは、オートメーション化した細片洗浄器（Bio-Tek（登録商標）Instruments Inc.からのＥＬｘ５０（登録商標））を使用して蒸留水によって洗浄され、そして、３つの経絡、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＦＩＴＣのため撮影された。ＦＩＴＣ経絡に対するＣｙ３経絡の結合シグナルの比およびＦＩＴＣ経絡に対するＣｙ５経絡の結合シグナルの比は、規格化を実行するために算出された。全９６ウエルマイクロプレートのアッセイＣＶは、規格化の有無にかかわらず算出された。ＣＴＢ４８８が規格化のために使われる場合、表１のアッセイ結果はアッセイＣＶ％の有意な改善を示した。たとえば、規格化の前のブラジキニン受容体（Ｃｙ３経絡）のアッセイＣＶは、１８．９％であった。規格化の後、アッセイＣＶは、４．６％に落ちた。他の例は、ニューロテンシン（Ｃｙ５経絡）である。そのアッセイＣＶは、１４．３％から６．７まで減少した。
【００９０】
【表２】
2011503611.tif 000004
ＣＶｂは規格化の前のアッセイＣＶであり、ＣＶｎは規格化後のアッセイである。
アッセイ溶液：５Ｃｙ３／２  Ｃｙ５標識ＧＰＣＲリガンドと１ｎｇ／ｍｌのＣＴＢ４８８との反応混液。
【００９１】
−−実施例２：規格化ための基準質膜の使用−−
実施例２は、図４Ａおよび４Ｂで示す規格化のための基準質膜の使用を例示する。
【００９２】
標的ＧＰＣＲ質膜調製物（ウロテンシンＩＩ）は基準ＧＰＣＲ質膜調製物（ＧａｌＲ２）と混ぜ合わせられ、そして、２つの質膜調製物の混合液はアレイの基質上に点状に供給された。それぞれ、Ｃｙ３ウロテンシンＩＩおよびＣｙ５ガラニンが標的および基準ＧＰＣＲのためのプローブとして使われた。簡潔に、２ｍｇ／ｍｌのウロテンシン受容体は、最初にガラニン受容体の１ｍｇ／ｍｌを混ぜ合わせられた。混合液は、アレイの基質上に点状に供給された。アレイは、それからＣｙ３ウロテンシンＩＩおよびＣｙ５ガラニンを含んでいるアッセイ溶液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２（１：４０のブロッカーカゼインおよび０．０５％のＢＳＡ））によってインキューベートされた。１時間のインキュベーションの終わりに、ＧＰＣＲアレイは、オートメーション化した細片洗浄器（Bio-Tek（登録商標）Instruments Inc.からのＥＬｘ５０（登録商標））を使用して蒸留水によって洗浄され、そして、Ｃｙ３およびＣｙ５経絡のため撮影された。Ｃｙ５経絡に対するＣｙ３経絡の結合シグナルの比は算出されて、そして、規格化を実行するため使用された。全９６ウエルマイクロプレートのアッセイＣＶは、規格化の有無にかかわらず算出された。アッセイ結果は、アッセイＣＶ％およびＺファクタ（図６）の有意な改善を示した。アッセイＺファクタは、アッセイウインドウ係数に関連する。
【００９３】
図６に示すように、基準としてＧＰＣＲ質膜調製物を使用するときに、アッセイ性能の有意な改善が起こる（ＣＶおよびＺ’ファクタ）。上記定義のＣＶは、変異の計測値である。アッセイのこれらのタイプに関して、小さいＣＶ値が厳しく管理されたアッセイを示すように、小さいＣＶ値が好ましい。Ｚ’は、Ｚ＝１−３×（ＳＤｂ＋ＳＤｉ）／（Ｓｂ−Ｓｉ）として算出され、式中、Ｓｂが競争化合物の非存在下での平均結合シグナルであり、各結合シグナルはＲＦＵにおいて測定された非特異的結合より低いＲＦＵにおいて測定された特異な結合であり、ＳＤｂがＳｂの標準偏差であり、Ｓｉが競争化合物の存在下での平均結合シグナルであり、そして、ＳＤｉはＳｉの標準偏差である。Ｚ’はアッセイの品質の計測値で０−１の範囲にある。高いＺ’数は、より良いアッセイを示す。アッセイが失敗するときに、負のＺ’が得られる。Ｚ’の計算のための、９６ウエルフォーマット（カラムＣ１、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９およびＣ１１）の奇数カラムが全結合シグナルを測定するために使われ、そして、偶数カラム（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０およびＣ１２）は非特異的結合を測定するために使われた。値は、３つの９６ウエルプレートまたは２８８マイクロスポットを通じて平均値とした。
【００９４】
図６Ａは、規格化前の全結合および非特異的結合シグナルをプロットしたグラフである。結合シグナルは、ＲＦＵ、相対蛍光単位、結合シグナルの測定において測定された。測定結果は、非特異的結合（暗い四角）および全結合（明るい四角）でなされた。アッセイＣＶは、算出された。ＣＶｂ、アッセイ前（規格化なし）のＣＶ測定は、２１．３％であった（ＣＶｂ＝１００×ＳＤｂ／Ｓｂ、ここで、Ｓｂが競争化合物の非存在下での平均結合シグナルであり、ＳＤｂがＳｂの標準偏差である）。ＣＶｉ、アッセイ後に計算されたＣＶは、１８．０％であった（規格化なし）。（ＣＶｉ＝１００×ＳＤｉ／Ｓｉ、ここで、ＳＤｉがＳｉの標準偏差であり、Ｓｉが競争化合物の存在下での平均結合シグナルである）。規格化の前のアッセイのためのＺ’は、０．１であった。図６Ｂは、全結合（明るい四角）および、規格化の後、ＲＦＵにおいて測られる非特異的結合（暗い四角）のプロットしたグラフである。アッセイＣＶは、この情報に基づいて算出された。ＣＶｂ、規格化を伴うアッセイ前のＣＶの測定は、７．２％であった（規格化の無しで２１．３％から減少した）。ＣＶｉ、規格化を伴うアッセイ後のＣＶの測定は、８．４％であった（規格化の無しで１８．０％から減少した）、そして、Ｚ’ファクタは規格化を伴い０．７と算出された（０．１からの増加）。
【００９５】
他の実験において、蛍光染料標識コントロール質膜調製物が基準質膜調製物として使われた。それは、印刷前に最初に標的ＧＰＣＲ質膜調製物を混合された。標的のためのプローブは、基準質膜調製物上の標識から異なった波長を有する。たとえば、ＨＥＫコントロール質膜調製物は、ＣＴＢ６４７によって標識化された。ＧＰＣＲ  ＡＰＪ、Ｂ１、ＢＫ２、Ｍ１およびＵＴのためのプローブは、Ｃｙ３色素によってすべて標識化された。多重化結合アッセイ性能は、標識質膜調製物を基準（表３）として使用して大幅に改善された。
【００９６】
簡潔に、ＨＥＫ２９３細胞株から分離されたコントロール細胞質膜の５０μｇは、３０分間、４℃でＣＴ−Ｂ６４７の５μｇによってインキューベートされた。それから質膜は、ＣＴ−Ｂ６４７をなくし除去するためにＰＢＳ（リン酸塩天秤緩衝液）で３回洗浄された。各々のＧＰＣＲの２ｍｇ／ｍｌは、最初にＣＴ−Ｂ６４７標識ＨＥＫ２９３質膜の１ｍｇ／ｍｌと混合され、そして、アレイの基質上に点状に供給された。それからアレイは、ＢＴ−アペリン、ＢＴ−ＣＧＰ１２１７７、ＢＴ−Ｈｏｅ１４０、Ｃｙ３Ｂ−テレンゼピンおよびＢＴウロテンシンＩＩを含んでいるアッセイ溶液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２（１：４０のブロッカーカゼインおよび０．０５％のＢＳＡ））によってインキューベートされた。１時間のインキュベーションの終わりに、ＧＰＣＲアレイはBio-Tek（登録商標）Instruments Inc.からのＥＬｘ５０（登録商標）のオートメーション化した細片洗浄器を使用して蒸留水によって洗浄され、そして、Ｃｙ３およびＣｙ５経絡のため撮影された。Ｃｙ５経絡シグナルにシグナルを結合しているＣｙ３経絡の比が、算出されて、規格化のために使われた。全９６ウエルマイクロプレートのアッセイＣＶは、規格化の有無にかかわらず算出された。アッセイ結果（表３）は、アッセイＣＶ％およびＺファクタの有意な改善を示した。たとえば、アペリンのＺファクタは、−０．２から０．５まで改善された。アペリンのＣＶは、１５．４％から５．４％まで改善された。
【００９７】
【表３】
2011503611.tif 000005
ＣＶｂは規格化の前のアッセイＣＶであり、ＣＶｎは規格化後のアッセイである。
Ｚ'ｂは規格化の前のアッセイＺ’であり、Ｚ’ｎは規格化後のアッセイＺ’である。
アッセイ溶液：５Ｃｙ３標識ＧＰＣＲリガンドの反応混液。
【００９８】
−−実施例３：規格化のための標的質膜の前標識化−−
実施例３において、前標識標的質膜が、図５Ａおよび５Ｂで示すように規格化のために使われる。ＧＰＣＲアレイ技術の展開中、ＧＰＣＲ結合アッセイ後の消失または弱いスポットは、しばしば重要な供与源である。消失または弱いスポットの理由は、以下から成る。１）質膜調製物が基質に残ったが、それは機能的に活性でなかった。２）そして、質膜調製物は、基質にゆるく付着した、そして、アッセイ後、洗浄プロセス間に洗い出された。現在、問題を識別するためのツールが、ない。研究者は、アッセイ／洗浄プロセス後の消失スポットは洗い出された堆積した質膜によると共通に仮定している。しかし、これは必ずしも例であってはならない。
【００９９】
凍結／融解過程中のいかなる活性減失も避けるために同日アレイ印刷を可能にする簡略化された前標識プロトコルが、開発された。従来の結合アッセイ結果と比較すると、前標識ＧＰＣＲ質膜は等価結合活性およびアッセイ特異性を呈し、それはＧＰＣＲ質膜の機能上の保全を評価するための２つの基準である。結果も、前標識されたシグナルがアッセイシグナルに対して比例的であることを示した。前標識シグナル（一般の経絡、ＦＩＴＣ経絡で刺激された）に対する標的シグナル（Ｃｙ３またはＣｙ５経絡で刺激された）の比を使用する規格化は、有意にアッセイＣＶを減らして、Ｚファクタを増やした。規格化に加えて、ＧＰＣＲ質膜の成功した前標識化は、全アッセイ全体にわたって質膜保持をモニタする応用、アッセイを規格化する応用、印刷およびアッセイ間の製法の精度管理の応用を含む様々な重要な応用を可能にした。
【０１００】
−−Ａ．ＧＰＣＲ質膜調製物の前標識−−
以下の従来の質膜標識化方法による前標識ＧＰＣＲ質膜は、活性ＧＰＣＲ質膜を産生しない。前標識ＧＰＣＲ質膜は従来の結合アッセイと比較して、回収率が非常に低い（＜３０％）だけでなく、非常に低い結合活性およびアッセイ特異性を示した。したがって、本発明の実施例において、ＧＰＣＲ質膜は、改良されたプロトコルによって前標識された。
【０１０１】
改良されたプロトコルは、大きく減少した体積における製造により供給されるように保存溶液にてＧＰＣＲ質膜を直接標識化すること含むので、洗浄プロセス中の質膜の損失を減らす。加えて、キャリア（ＢＳＡ）を含む洗浄液は、回収（＞９０％）を増やして、次の結合アッセイのための充分な前標識質膜を有するために更にタンパク質濃度の定量化する必要を避ける。洗浄に続いて、質膜は印刷に適している緩衝液の中に沈殿して直接再懸濁された。改良されたプロトコルは、試料調整時間を劇的に減少し、同日印刷を可能とし、従来のプロトコルと関連して改良された結合特性を提供する。
【０１０２】
ＧａｌＲ２質膜調製物の適切な前標識の例は、次のように実行された。４０μｇのＧａｌＲ２（パーキンエルマーからの１４μｌ保存溶液中）、２μｌのAlexa FL（登録商標）４８８標識ＣＴＢ（ＣＴＢ４８８、モレキュラープローブ）（１０μｇ／ｍｌ）、および１５μｌのＰＢＳが、３０分間、氷上で混合された。待機中、洗浄溶液および改良緩衝液が調製された。洗浄溶液は、０．５％のＢＳＡで補充されるＰＢＳから調整された。この成分は、印刷のために使用される次の改良緩衝液に存在する。したがって、０．５％のＢＳＡの添加は、次のアレイ印刷に影響を及ぼさない。３０分のインキュベーション後、質膜調製物は５分間の１４，０００回転数／分で遠心分離によって沈殿され、そして、上澄は捨てられ、そして、ペレットは上記の洗浄している溶液の中に再懸濁された。非特定結合の無い色素を除去するために、ペレットは２０μｌの洗浄緩衝液にてピペット上下操作で再懸濁され、３０秒間、水浴において超音波処理された。それから、質膜調製物は、５分間、１４，０００回転数／分で、遠心分離によって沈殿された（上記の洗浄プロセスは、二回繰り返された）。最終的なペレットは、印刷緩衝液（７５ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ  ７．４）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、５％のグリセロール、１０％のスクロース、０．５％のＢＳＡ）の中に再懸濁された。質膜調製物を均質にするために、前標識ＧａｌＲ２調製物は、オートメーション化したプログラム条件（パワー８、１期間１０秒プラス２５パルス（１秒オン１秒オフ））を使用しているカップホーン超音波処理器によって超音波処理された。超音波処理されたサンプルは、ＧＰＣＲアレイ印刷のために直接使われた。アレイは、Cartesian（登録商標）プリンタを使用して３×９フォーマット（各カラムに３組でアレイにつき９カラム）で印刷された。
【０１０３】
代わりの実施例において、ストレプトアビジン（Ｓｖ）標識されたｃｙ３またはｃｙ５の溶液（またはｃｙ３およびｃｙ５の混合液）は、質膜印刷（ＢＳＡを有するＰＢＳ緩衝液）のために使用する一般の緩衝液に含まれ、そして、このｃｙ３またはｃｙ５標識Ｓｖ一般の緩衝液にＧＰＣＲ質膜調製物が音波処理によって導入され得る。音波処理ステップはＧＰＣＲ質膜への標識Ｓｖの会合を導く。標識Ｓｖは基準として使われ得る。このアプローチは、公知技術の追加の色素標識タンパク質で使われてもよい。
【０１０４】
Ｂ．前標識は、ＧＰＣＲ官能性に影響を及ぼさない。
【０１０５】
質膜調製物の前標識に対する初期の懸念は、標識質膜がその官能性を失うことである。前標識の有効性を示すためには、結合活性およびアッセイ特異性に関して、前標識質膜調製物および非標識の対応物での全結合アッセイ結果が比較された。非標識質膜調製物のための結合アッセイは実行され、ここで、実施例２にて説明したように、類似した原理に基づいて、標的質膜（ＧａｌＲ２）が規格化の目的のための基準質膜（ユーロスクリーンからのムスカリニックＭ１）を混合された。
【０１０６】
図７の棒グラフで示すように、これは全結合シグナルを示し、前標識（従来法）平均ＲＦＵとして測定したもので、前標識しないもの（図７Ａ）、そして、前標識をしたもの（図７Ｂ）を示し、前標識はＧＰＣＲ結合活性およびアッセイ特異性に影響を及ぼすように見えない。図７において示される結果は、９６ウエルマイクロプレートにおいて実行されたアッセイからある。結合アッセイフォーマットは、以下の通りである。カラム１−１１（Ｃ１−Ｃ１１）が全結合シグナルを測定するために使われ、そこでは、蛍光標識リガンドの混合液（１ｎＭのＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ−ＣＧＰ１２１７７と、β１アドレナリン受容体のためのリガンドと、０．８ｎＭのＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ−アペリン１３と、アペリン受容体のためのリガンドと、１ｎＭまたは２ｎＭのＣｙ５ガラニンと、ガラニン受容体のためのリガンドと、０．５ｎＭのＣｙ３Ｂ−テレンゼピンと、ムスカリニックＭ１およびＭ２受容体のためのリガンドと、２ｎＭのＣｙ５−ニューロテンシン２−１３と、ニューロテンシン受容体のためのリガンドと、０．１２５ｎＭのＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−ＴＭＲ−ＨＯＥ１４０と、ブラジキニン受容体のためのリガンドとからなる）がアッセイ溶液（実施例２にて説明したような）に添加された。カラム１２が、非特異的結合シグナルを測定するために使われ、そこでは、化合物混合液（１μＭのＣＧＰ１２１７７と、１μＭのアペリン１２（ヒト、ウシ、ハツカネズミ、ラット）と、１μＭのニューロテンシン１−８と、１μＭのガラニンと、１μＭのブラジキニンと、１μＭのＨＯＥ１４０とからなる）がＣ１−Ｃ１１のためにアッセイ溶液に補充された。
【０１０７】
値は、各ウエルに３組を有する９６ウエルまたは２８８マイクロスポットを通じて平均値になされた。アッセイ特異性は、（（Ｃ１−Ｃ１１からの全結合シグナルの平均値）−（Ｃ１２からの非特異シグナルの平均値））×１００％で算出された。
【０１０８】
図７Ａおよび７Ｃの得られたデータは、予め混合して共に印刷されたＧａｌＲ２（標的）およびＭ１（基準）受容体からのものであった。ＧａｌＲ２／Ｍ１の９つの管は、個々に調製された。Ｐ１およびＰ２はプレート１およびプレート２を示す。ここで、２つの実験は２回、実行された。
【０１０９】
図７Ｂおよび７Ｄの得られたデータは、「前標識」のもの、上記の通りに前標識されたＧａｌＲ２質膜からのものであった。前標識化は、次のようにされた。ＧａｌＲ２受容体調製物の４つの管は個々に標識化された、そして、各々の標識ＧａｌＲ２は２回、実行された。第１＝第５；第２＝第６；第３＝第７；第４＝第８。
【０１１０】
ＧａｌＲ２質膜調製物の同じ量が、両方の例（非前標識と前標識）のために使われた。Ｃｙ５−ＧａｌＲ２の濃度が「従来」のアッセイのための２．０ｎＭでありかつ「前標識」されたアッセイのための１．０ｎＭであったことを除いて、結合アッセイは、同じ条件の下で実行された。
【０１１１】
図７Ｃおよび７Ｄは、従来法で特に測定されたアッセイ（図７Ｃ）および前標識質膜を使用していたアッセイ（図７Ｄ）を示す。
【０１１２】
Ｃ．前標識質膜調製物の使用による質膜保持のモニタ並びに問題の分離と識別
ＧａｌＲ２は上記プロトコルに従ってＣＴＢ−４８８によって前標識された、そして、アレイは３×９フォーマットで印刷された。図８において示されるイメージは、ＧｅｎｅＰｉｘＰｒｏ６．０から得られた。図８Ａは、Ｃｙ５−ＧａｌＲ２のＧａｌＲ２受容体への結合の結果としてＣｙ５経絡でのＧａｌＲ２アッセイ結合結果を示している。図８Ｂは、ＣＴＢ−４８８での前標識質膜の結果としてアッセイ／洗浄プロセスの前のＦＩＴＣ経絡（ＰＭＴ利得１８０）での印刷アレイスポット結果を示している。図８Ｃは、アッセイ／洗浄プロセス後にＦＩＴＣ経絡（ＰＭＴ利得２００）で残されたアレイスポットを示している。図８ＢおよびＣの画像は、ＰＭＴ利得を除いてイメージ獲得過程の間、同じセッティングで得られたものである。結合アッセイの間、アレイスポットは、１時間、Ｃｙ５−ＧａｌＲ２プローブを含んでいる蛍光標識プローブの混合物を含んでいる溶液に浸されている。それから、アレイは、オートメーション化した細片洗浄器（Bio-Tek（登録商標）Instruments Inc.からのＥＬｘ５０（登録商標））を使用して蒸留水によって洗浄された。ＧａｌＲ２受容体およびそのＣｙ５色素標識リガンド（Ｃｙ５−ＧａｌＲ２）間の親和性結合により、アレイスポットはＣｙ５経絡でのスキャンによって視覚化され得る。
【０１１３】
図８Ａのカラム１、２および７は、他のスポットと比較して非常に弱いシグナルまたはシグナルがないことを示した。以前から、この現象は過剰の洗浄の結果として、ゆるく結合された質膜調製物は洗浄プロセス中で洗い出されると判断されていた。しかし、ＦＩＴＣ経絡でのアッセイ／洗浄プロセス前後の蛍光シグナル比較をすると、それは、Ｃ１およびＣ２のアレイスポットがアッセイ／洗浄プロセス後に残ったことを明らかに示し、それは、Ｃ１およびＣ２でのアッセイ後の弱いシグナルは、洗浄されている質膜を原因として生じるのではなく、むしろ未知の理由のための結合活性の損失によったことを示唆している。
【０１１４】
反対に、アッセイ後のＣ７の消失したスポットは、印刷問題によると見える。前標識アプローチでは、印刷、アッセイおよび洗浄プロセスと関連する問題は分けられる。
【０１１５】
図９Ａおよび９Ｂは、アッセイが実行された前（図９Ａ）および後（図９Ｂ）の印刷されたアレイから測定された蛍光シグナルを示す。これらの測定は、追加の精度管理計測を考慮に入れて、前標識方法を使用して、残留する蛍光を測定するためにアッセイ前後で計測がなされたことを例示する。
【０１１６】
Ｄ．標的シグナルとその前標識されたシグナルの比を使用する規格化
Ｃｙ５経絡でのアッセイシグナルとＦＩＴＣ経絡での前標識シグナルからのシグナルとの比を使用することによるアッセイ・データの規格化は、アッセイＣＶをかなり減らして、図１０Ａ−Ｂで示すアッセイＺファクタを増加した。図１０Ａは、定義されるように、ＣＶ（％）が変化の測定であることを示す。図１０Ｂは、Ｚを示す。Ｚは１−３×（ＳＤＣ１−Ｃ１１＋ＳＤＣ１２）／（ＳＣ１−Ｃ１１−ＳＣ１２）として算出され、ＳＤは標準偏差であり、Ｓは平均結合シグナルである。Ｐ１およびＰ２はプレート１およびプレート２を示し、ここで、２つの実験は同一にして実行された。負のＺは、負のアッセイを示す。示されるように、規格化プロセスを使用して、アッセイＺファクタがかなり改善された。
【０１１７】
Ｅ．前標識質膜調製物の使用によるプレスキャンでの精度管理チェック
複合プロセスがアレイ技術に関係しているので、結合または機能的アッセイを実行する前に精度管理チェックを実行することが望ましい。効率的方法の不足のために、人々は自己蛍光を経た５３２ｎｍのＣｙ３経絡での印刷ＧＰＣＲアレイをスキャンすることによって、共通に品質チェックを実行している（本質的に、全ての物質は５３２ｎｍで蛍光シグナルを発するが、それは、質膜自体、株緩衝液からの成分、たとえばＢＳＡおよび塩を含み、または、ガラス製の底挿入の上に偶然に残ったダストさえまたは指紋さえ含む）。したがって、自己蛍光は、印刷された質膜調製物の量と相関しない。これに反して、質膜調製物の量は、前標識蛍光に対して比例する。低いプレスキャンＣＶは、低いアッセイＣＶを意味する。
【０１１８】
図１１Ａおよび１１Ｃ（図７Ｂおよび７Ｄに関して）に示すように、Ｃｙ５経絡でのアッセイシグナルは、ＦＩＴＣでの前標識蛍光シグナルに良く相関するが、Ｃｙ３経絡での自己蛍光シグナルでは相関しない。図１１Ａは、アッセイ（プレスキャン）前以外の印刷後のＦＩＴＣ経絡での全蛍光シグナルを示す。図１１Ｃは、アッセイ後のＣｙ５経絡での全結合蛍光シグナルを示す。図１１Ｂは、プレスキャン（印刷後以外のアッセイ前）での自己蛍光シグナルを示す。図１１Ｂは、周知方法を使用したアッセイ前（印刷後以外）に品質を点検する方法を示す。図１１Ａおよび１１Ｃに示されるデータは、自己蛍光を使用している図１１Ｂに示されるそれより良い相関を有する。前標識された製法を使用している予めスキャンされたシグナルは、前標識なしの自己蛍光を使用することより密接に最終的なアッセイを予測することができる。Ｃ１を除いて、プレスキャンでのシグナルが高くなればなるほど、アッセイでの全結合シグナルはより高くなる。たとえば、図１１Ａに示すように、プレスキャンシグナルは、僅かにアレイカラム第２から第４まで、そして、アレイカラム第５から第８まで増加する。したがって、図１１Ｃ（アッセイ全シグナル）に示すように、アッセイシグナルは、それぞれ、僅かにアレイカラム第２から第４まで、そして、アレイカラム第５から第８まで増加する。しかし、同じ傾向は、図１１Ｂにおいて観察されない。加えて、前標識経絡（ＦＩＴＣ）でのプレスキャンＣＶは、最終的なアッセイＣＶにＣｙ３経絡（自己蛍光）でのそれより良い相関を示した。したがって、人は前標識経絡でプレスキャンを実行することによって、自己蛍光経絡でより、より良くアッセイ結果を予測することができる。前標識質膜は、自己蛍光を使用している周知の方法より良い精度管理を提供することができる。
【０１１９】
アッセイ前後で得られる前標識シグナルの比較については、我々はまた、アレイの９つのカラム中の質膜保持を比較可能である。典型的に、アレイの端にシグナルは、他のアレイカラムと比較して、Ｃ１（或るＣ９）において頻繁により多くの質膜を離す。Ｃ１またはＣ９の低いアッセイシグナルは、洗浄マニホルドでの不均一力に関すると考えられる。図９Ｂに示すように、Ｃ１は最も高いプレスキャンシグナルを示し、Ｃ３およびＣ６は後とに続く。しかし、アッセイ後、Ｃ３およびＣ６は、図９Ａに示すように、同じ程度のままであるが、Ｃ１はより長く最も高いものでない。したがって、本発明の実施例を使用して、洗浄に関連する問題は、容易に検出可能である。
【０１２０】
Ｆ．標識をＧＰＣＲ質膜調製物に組み込むことによる規格化
ＧＰＣＲアッセイの規格化もまた、標識を質膜調製物に組み込むことによって達成できる。たとえば、ストレプトアビジン（Ｓｖ）は音波処理によって調製物に組み込まれ得る。ＧＰＣＲ膜試料Ｂ１＿ＳｖおよびＭ２＿Ｓｖは、結合アッセイの間、規格化の目的のためのサンプルに添加されるＣｙ（ＴＭ）５−ストレプトアビジンを有する。サンプルＧＡＬ＿Ｓｖは、結合アッセイの間、規格化の目的のためのサンプルに添加されるＣｙ（ＴＭ）３−ストレプトアビジンを有する。サンプルは１０分間、４℃で１４，０００回転数／分にて遠心分離され、そして、上澄は除去されて、捨てられ、そして、４５ｕｌ改良緩衝液は各々のサンプルに添加された。Ｃｙ（ＴＭ）５−ストレプトアビジンは１：１２００希釈の改良緩衝液に添加され、Ｃｙ（ＴＭ）３−ストレプトアビジンは１：８００の希釈の改良緩衝液に添加された。
【０１２１】
ペレットサンプルは、それからカップホーン超音波処理器を使用して、改良緩衝液を含んでいるマイクロチューブ内にて４℃、２５秒間超音波処理された。９，０００回転数／分での速い遠心分離と、１秒のパルス×１５パルスが４℃での速い音波処理と、６，０００回転数／分での速い他の遠心分離と、１秒のパルス×４パルスが４℃での他の音波処理とが、実行された。
【０１２２】
改質されたサンプルはそれから、３８４低体積プレートへの装填によって印刷されて、４℃程度に保たれたると共に、界面化学処理で被覆されたガラス基質上へ印刷される。サンプルはＴｅｌｅｃｈｅｍ  ９４６ＭＰ３マイクロスポッティングピンで印刷された。相対湿度は、４０−４５％の間で保たれた。印刷後、印刷ＧＰＣＲアレイを有するガラス基質は、４５分間での室温で約７０％の相対湿度においてインキューベートされた。湿度処理に続いて、印刷ＧＰＣＲアレイを有するガラス基質は、４５分間での室温で窒素気圧の約１０％の相対湿度においてインキューベートされた。印刷ＧＰＣＲアレイを有するガラス・シートは、結合アッセイまで４℃へ移された。
【０１２３】
記載されているように、結合アッセイは実行された。印刷ＧＰＣＲアレイは、室温に暖められた。印刷ＧＰＣＲアレイは、印刷ＧＰＣＲのものを再水和するために約７０％の相対湿度においてインキューベートされた。結合アッセイ溶液は、調製された。標識リガンドは結合アッセイ溶液に添加され、そして、標識リガンドを含む結合アッセイ溶液は競合アッセイのために加えられる非標識リガンドを受けるために、二分の一に分けられた。標識リガンドを含む結合アッセイ溶液および標識／非標識リガンドは、印刷ＧＰＣＲアレイを含むマイクロウエルプレートに添加された。室温で、１時間のインキュベーションの後、プレートは洗浄されて、マイクロプレート洗浄器を使用して乾燥させた。プレートは、Ｃｙ３およびＣｙ５波長を利用しているテカン（Ｔｅｃａｎ）スキャナを使用してスキャンされた。標識リガンドの結合シグナルは、Ｃｙ（ＴＭ）３−ストレプトアビジンもしくはＣｙ（ＴＭ）５−ストレプトアビジンに、または印刷の前にサンプルに添加された第２のＧＰＣＲに規格化された。パーセント阻害または特異性は、標識化されて非標識リガンドの混合液を含んでいるサンプルのシグナルと、シグナルを結合している標識リガンドを比較することによって算出された。これらの実験の結果は、図１２Ａおよび１２Ｂに示される。図１２Ａおよび１２Ｂは、第２の受容体方法、図４Ａおよび４Ｂに示される方法、を使用して得られた結果と比較した、特異性およびこのストレプトアビジン方法に関連したＺファクタ（それぞれ）を示す。
【０１２４】
このように、Ｇタンパク質共役受容体質膜アレイのための規格化方法の実施例は、開示される。当業者は、アレイ、組成、キットおよびここで記載されている方法が開示されるそれら以外の実施例によって実施され得ると認識するであろう。開示された実施例は、図のために示されるが、限定とはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月21日(2010.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質共役受容体を過剰発現している細胞から分離されかつ成分から成る質膜を用意すること、
成分を結合して前標識質膜を産生するために構成される標識試薬に質膜を接触させること、並びに、
基質上のマイクロスポットとして前標識質膜を印刷すること、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
標識試薬に質膜を接触させることは、標識質膜を形成するためにＧタンパク質共役受容体を過剰発現している細胞からの質膜を有する標識試薬を含んでいる印刷緩衝液を超音波処理することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
標識試薬は色素標識タンパク質であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
標識タンパク質がｃｙ３またはｃｙ５標識ストレプトアビジンであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
印刷は、前標識質膜の凍結に介入することなく、接触させることに続いて起こることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ｇタンパク質共役受容体質膜アレイのマイクロスポットを標識非加水分解性ＧＴＰ類似体に接触させること、
基準標識質膜を産生するためにＧタンパク質共役受容体以外の膜成分を結合するために構成される第１の標識試薬にマイクロスポットを接触させること、
Ｇタンパク質共役受容体と機能的に相互に作用し得ると疑われるリガンドにマイクロスポットを接触させること、
マイクロスポットを洗浄して、非結合の標識非加水分解性ＧＴＰ類似体、非結合の第１の標識試薬、および非結合のリガンドをマイクロスポットから除去すること、
マイクロスポットと関連した標識非加水分解性ＧＴＰ類似体と関連する第１のシグナルを定量化すること、
膜成分に結合される第１の標識試薬と関連した第２のシグナルを定量化すること、並びに、
第２のシグナルと第１のシグナルを比較して、Ｇタンパク質共役受容体で、試薬の機能上の相互作用の範囲を決定すること、を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
標識非加水分解性ＧＴＰ類似体にマイクロスポットを接触させ、第１の標識試薬にマイクロスポットを接触させ、リガンドにマイクロスポットを接触させることは、標識非加水分解性ＧＴＰ類似体、第１の標識試薬およびリガンドから成る組成にマイクロスポットを接触させることを含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
第１の標識試薬はガングリオシドＧＭ１．を結合するために構成されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
Ｇタンパク質共役受容体質膜アレイのマイクロスポットを第１の標識試薬に接触させること、
膜成分を結合するために構成される第２の標識試薬にマイクロスポットを接触させること、
マイクロスポットを洗浄して、非結合の第１の標識試薬、および非結合の第２の標識試薬を除去すること、
マイクロスポットと関連した第１の標識試薬と関連する第１のシグナルを定量化すること、
膜成分に結合される第２の標識試薬と関連した第２のシグナルを定量化すること、並びに、
第２のシグナルと第１のシグナルを比較して、膜成分への第２の標識試薬の結合の範囲を決定すること、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
シグナルを産生することができ第１の標識試薬に結合するために構成される第３の標識試薬に標識質膜を接触させることを更に含むこと、並びに、第３の標識試薬と関連するシグナルを定量化することは、第３の標識試薬と関連するシグナルと第１の標識試薬と関連するシグナルを比較することを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【国際調査報告】
2011503611.tif 000031
2011503611.tif 000032
2011503611.tif 000033