(57)【要約】可溶性ハイブリッドＦｃγレセプター（ＦｃγＲ）ポリペプチド組成物、ならびにそのようなポリペプチドを用いてＩｇＧ媒介性および免疫複合体媒介性の炎症を処置する関連方法が開示される。可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドを生成するための関連する組成物および方法もまた開示される。別の局面の中で、本発明は、ＩｇＧ媒介性または免疫複合体媒介性の炎症を減少させる方法を提供し、その方法は、炎症を減少させるのに十分な量の可溶性ＦｃγＲの組成物を、炎症を有する哺乳動物に投与する工程を包含する。
2011526154.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４０のアミノ酸残基３６〜３０１；
配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０；
配列番号４４のアミノ酸残基２１〜２８６；または
配列番号４６のアミノ酸残基２１〜２８６；
からなる群から選択されるポリペプチド領域と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性ポリペプチドであって、
ここで、該ポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合することができる、単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド領域と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、
配列番号４０のアミノ酸残基３６〜３０１；
配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０；
配列番号４４のアミノ酸残基２１〜２８６；または
配列番号４６のアミノ酸残基２１〜２８６
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
分泌シグナル配列をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子が、
配列番号３９のヌクレオチド１０６〜９０３；
配列番号４１のヌクレオチド１２７〜９３０；
配列番号４３のヌクレオチド６１〜８５８；または
配列番号４５のヌクレオチド６１〜８５８
を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
以下の作動可能に連結されるエレメント：
ａ）転写プロモーター；
ｂ）請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；および
ｃ）転写ターミネーター
を含む、発現ベクター。
【請求項８】
前記ＤＮＡセグメントが、
配列番号３９のヌクレオチド１０６〜９０３；
配列番号４１のヌクレオチド１２７〜９３０；
配列番号４３のヌクレオチド６１〜８５８；または
配列番号４５のヌクレオチド６１〜８５８
を含む、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記発現ベクターが、分泌シグナル配列をさらに含む、請求項７または８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記分泌シグナル配列が、配列番号４０のアミノ酸残基１〜３５、配列番号４２のアミノ酸残基１〜４２、配列番号４４のアミノ酸残基１〜２０、配列番号４６のアミノ酸残基１〜２０、配列番号６０のアミノ酸残基１〜３５、配列番号６２のアミノ酸残基１〜１６、配列番号６４のアミノ酸残基１〜１９および配列番号６６のアミノ酸残基１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む培養細胞であって、ここで、該細胞は、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する、培養細胞。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の発現ベクターを含み、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現し、該ポリペプチドを分泌する、培養細胞。
【請求項１３】
ポリペプチドを生成する方法であって：
請求項７または８に記載の発現ベクターを導入された細胞を培養する工程であって、ここで、該細胞は、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する、工程；および
該発現されたポリペプチドを回収する工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
ポリペプチドを生成する方法であって：
請求項９または１０に記載の発現ベクターを導入された細胞を培養する工程であって、ここで、該細胞は、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現し、該ポリペプチドは、該細胞から分泌される、工程；および
該分泌されたポリペプチドを回収する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法によって生成された、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法によって生成された、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜４、１５および１６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド；および
薬学的に許容可能なビヒクル
を含む、組成物。
【請求項１８】
被験体におけるＩｇＧ媒介性炎症を減少させる方法であって、該方法は：
ＩｇＧ媒介性炎症を有する被験体に、請求項１〜４、１５および１６のいずれか１項に記載の有効量のポリペプチドを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記ＩｇＧ媒介性炎症が、免疫複合体媒介性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＩｇＧ媒介性炎症性疾患を処置する方法であって、該方法は：
該ＩｇＧ媒介性炎症性疾患を有する被験体に、請求項１〜４、１５および１６のいずれか１項に記載の有効量のポリペプチドを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記ＩｇＧ媒介性炎症性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；混合型クリオグロブリン血症；混合結合組織病；外因性抗原に関連する疾患；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギランバレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩｇＧ媒介性炎症性疾患が、免疫複合体媒介性疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫複合体媒介性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；混合型クリオグロブリン血症；混合結合組織病；および外因性抗原に関連する疾患からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記外因性抗原に関連する疾患が、Ｂ型肝炎に関連する結節性多発動脈炎である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＩｇＧ媒介性炎症性疾患が、自己免疫疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；混合結合組織病；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギランバレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
免疫系疾患は、蔓延の比率で増大している重大な医療問題である。このように、免疫系疾患は、新しい治療薬を開発するための新規の積極的なアプローチを必要としている。自己免疫疾患に対する標準的な治療は、長期間にわたる高用量で全身投与されるコルチコステロイドおよび免疫抑制剤である。使用される薬物は、３つの主要なカテゴリーに分類される：（１）糖質コルチコイド（例えば、プレドニゾンおよびプレドニゾロン）；（２）カルシニューリンインヒビター（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムス）；および（３）抗増殖性／代謝拮抗性の薬剤（例えば、アザチオプリン、シロリムスおよびミコフェノール酸モフェチル）。これらの薬物は、いくつかの自己免疫性状態の処置において臨床的に非常に成功しているが、そのような治療は、一生使用しなければならず、また、免疫系全体を抑制するように非特異的に作用する。したがって、患者は、感染症および癌に対して著しく高いリスクに曝される。カルシニューリンインヒビターおよびステロイドは、腎毒性および糖尿病誘発性でもあり、それらの臨床的有用性は限定されている（非特許文献１）。
【０００２】
自己免疫疾患に対する従来の治療に加えて、サイトカインおよびそれらのレセプターを標的化するモノクローナル抗体および可溶性レセプターが、種々の自己免疫性疾患および炎症疾患（例えば、関節リウマチ、臓器移植およびクローン病）において有効性を示している。それらの薬剤のうちのいくつかとしては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を標的化するインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））およびエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、Ｔ細胞抗原ＣＤ３を標的化するムロモナブ−ＣＤ３（ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ  ＯＫＴ３）、ならびに活性化Ｔ細胞上のＣＤ２５に結合してこの経路によるシグナル伝達を阻害するダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））が挙げられる。これらの薬物の使用は、ある特定の炎症状態を処置する際に有効であるが、「サイトカイン放出症候群」をはじめとした副作用および感染症の高いリスクによって限定される（非特許文献２）。
【０００３】
静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）による受動免疫が、主要抗体の欠乏を示す患者における補充療法のために米国において１９８１年に認可された。その後の調査から、ＩＶＩＧが、川崎病および免疫血小板減少紫斑病における自己免疫性症状の回復においても有効であることが示された（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。ＩＶＩＧは、成人皮膚筋炎、ギランバレー（Ｇｕｉｌｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅ）症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、多発性硬化症、血管炎、ブドウ膜炎、重症筋無力症およびランバート・イートン症候群における炎症を減少させるとも示されている（Ｌｅｍｉｅｕｘ（非特許文献３；非特許文献４）。
【０００４】
ＩＶＩＧは、多数（１０，０００〜２０，０００人）の健常ドナーの血漿から冷エタノール分画によって得られる。通常使用されるＩＶＩＧ製剤としては、Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、Ｆｌｅｂｏｇａｍｍａ、Ｇａｍｍａｇａｒｄ、ＯｃｔａｇａｍおよびＶｉｇａｍ  Ｓが挙げられる。一般に、自己免疫疾患において使用される２ｇ／ｋｇ／月という平均用量を用いて大量のＩＶＩＧが患者に注入されたときにだけ、有効性が見られる。ＩＶＩＧ処置の通常（１〜１０％の患者）の副作用としては、潮紅、発熱、筋肉痛、背痛、頭痛、悪心、嘔吐、関節痛および眩暈が挙げられる。稀な（０．１〜１％の患者の）副作用としては、アナフィラキシー、無菌性髄膜炎、急性腎不全、溶血性貧血および湿疹が挙げられる。ＩＶＩＧは、一般に安全であると考えられているが、プールされたヒト血漿の起源は、感染物質の伝達に対する危険因子であると考えられる。したがって、ＩＶＩＧの使用は、その可用性、高コスト（＄１００／ｇ（注入コストを含む））および重篤な有害反応の可能性によって限定される（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００５】
Ｆｃガンマレセプター発現の制御、新生児ＦｃレセプターＦｃＲｎの飽和に起因する病原性抗体の高いクリアランス、補体媒介性損傷の減弱ならびにＴおよびＢ細胞または細網内皮系の調節をはじめとした、数多くの機構がＩＶＩＧの作用機序を説明するために提案されている（Ｃｌｙｎｅｓ，前出）。ＩＶＩＧから精製されたＦｃドメインは、いくつかの炎症のインビトロモデルおよびインビボモデルにおいてインタクトなＩｇＧと同程度に活性であるので、ＩＶＩＧの抗炎症特性は、ＩｇＧのＦｃドメイン（非特許文献６）またはシアル化された細画分（非特許文献７）に存在すると認識されている。
【０００６】
ＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）は、生得免疫系と獲得免疫系との架け橋として作用することによって哺乳動物生物学において独特の役割を果たしている（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。ＦｃγＲは、ＩｇＧのＦｃ領域に結合することにより（非特許文献１１）、ＡＤＣＣ、補体媒介性細胞溶解、ＩＩＩ型過敏反応、寛容、食作用、抗原提示ならびに免疫複合体のプロセシングおよびクリアランスにおける種々のエフェクター機能を制御する（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。
【０００７】
ＦｃγＲは、ヒトにおいてＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を含む３つの主要な遺伝子ファミリーを含む（非特許文献８；非特許文献９）。ＦｃγＲＩは、単量体ＩｇＧに対する高親和性レセプターである（１０８〜１０９Ｍ−１）が、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、単量体ＩｇＧに対して低親和性を示す（１０７Ｍ−１）が、非常に高いアビディティーでＩｇＧ免疫複合体に結合する。ＦｃγＲＩＩサブファミリーは、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂという２つの主要な遺伝子のクラスから構成され、それらは、ＩｇＧに結合した後、対立するシグナルを細胞内部に伝達する。ＦｃγＲＩＩａは、その短い細胞質テイル内に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、ＦｃγＲＩＩｂは、その細胞質ドメイン内の免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を介して抑制シグナルを伝達する。ＦｃγＲＩＩＩサブファミリーもまた、２つの異なるレセプター遺伝子ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂを含む。ＦｃγＲＩＩＩａは、ＩｇＧ免疫複合体に結合した後に、関連するＩＴＡＭ含有共通γ鎖を介して活性化シグナルを伝達するヘテロ二量体のシグナル伝達レセプターである。ＦｃγＲＩＩＩｂは、ＧＰＩリンカーを介して細胞膜に結合されており、固有のシグナル伝達能力を欠いている。ＦｃγＲＩもまた、固有のシグナル伝達能力を欠いているが、ＦｃγＲＩＩＩａと同様に、Ｆｃが結合すると、共通γ鎖と会合して活性化シグナルを伝達する。ＦｃγＲを介したシグナル伝達は、ＩＴＡＭ／ＩＴＩＭ配列内におけるキナーゼ媒介性のリン酸化／脱リン酸化の事象が関与する（非特許文献１２）。
【０００８】
ヒトＦｃγＲは、免疫生物学において報告されているその役割と一致して、単量体ＩｇＧのサブクラスに対して異なる親和性を示す：ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ１≧ＩｇＧ３＞ＩｇＧ４＞＞ＩｇＧ２と結合する；ＦｃγＲＩＩａは、ＩｇＧ３≧ＩｇＧ１、ＩｇＧ２＞＞ＩｇＧ４と結合する；ＦｃγＲＩＩｂは、ＩｇＧ３≧ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２と結合する；ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ２、ＩｇＧ４と結合する（非特許文献８；非特許文献９）。
【０００９】
構造およびシグナル伝達能力の差に加えて、ＦｃγＲは、細胞の発現パターンの差も示す。ヒトでは、ＦｃγＲＩは、主にマクロファージ上、単球上および好中球上で発現されるが、好酸球上および樹状細胞上にも見られ得る。ＦｃγＲＩＩａは、ヒトにおいて最も広く発現されるＦｃγＲであり、血小板上、マクロファージ上、好中球上、好酸球上、樹状細胞上およびランゲルハンス細胞上で発現される。ＦｃγＲＩＩｂは、Ｂ細胞上で発現される唯一のＦｃγＲであるが、マスト細胞、好塩基球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞およびランゲルハンス（ｌａｎｇｅｒｈａｎ）細胞によっても発現される。ＦｃγＲＩＩＩａは、ヒトＮＫ細胞上で発現される唯一のＦｃγＲであり、マクロファージ上、単球上、マスト細胞上、好酸球上、樹状細胞上およびランゲルハンス細胞上に見られ、それら上で広く発現される。他方、ＦｃγＲＩＩＩｂの発現は、たいてい、好中球および好酸球に限定されている（非特許文献８；非特許文献９）。
【００１０】
マウスは、ヒトの高親和性ＦｃγＲＩおよび抑制性レセプターＦｃγＲＩＩｂのオルソログなどのヒトにおけるレセプターと同様に機能するＦｃγＲを発現する（非特許文献１０）。ヒトＦｃγＲＩＩａおよびＩＩＩａのマウスオルソログは、それぞれＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶであると考えられている。マウスは、ＦｃγＲＩＩＩｂを発現しないとみられる（非特許文献１０）。細胞の発現パターンのいくらかの差が述べられているが、ヒトにおけるＦｃγＲ遺伝子発現およびマウスにおけるそれらのオルソログは、概して似ている。
【００１１】
マウスにおける遺伝子ターゲティングによって、哺乳動物の免疫系におけるＦｃγＲの重要性が示唆されている（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０を広く参照のこと）。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶのシグナル伝達サブユニットである共通γ鎖が欠失すると、すべての活性化ＦｃγＲを介するシグナル伝達が無効になり、マウスは種々の自己免疫性状態および炎症状態に対して抵抗性になる。γ鎖を欠損しているマウスは、弱い免疫複合体肺胞炎、血管炎、糸球体腎炎、アルサス反応および自己免疫性溶血性貧血を示す。同様のデータが、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩのα鎖の欠失について報告されている。ＦｃγＲＩＩＩ−／−マウスは、弱い免疫複合体誘導性肺胞炎、自己免疫性溶血性貧血に対する低い感度および弱いアルサス反応を示す。ＦｃγＲＩ−／−マウスは、損なわれたマクロファージの食細胞機能、少ないサイトカイン放出、弱いＡＤＣＣおよび抗原提示、弱い関節炎、強い抗体応答および弱い過敏症を示す。対照的に、抑制性レセプターであるＦｃγＲＩＩｂの欠失によって、炎症および自己免疫性応答が増強する。ＦｃγＲＩＩｂ−／−マウスは、強いコラーゲン誘導関節炎、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおける糸球体腎炎の自然発症、強いアルサス反応、強い肺胞炎、強いＩｇＧ誘導性全身アナフィラキシーおよび強い抗ＧＢＭ誘導糸球体腎炎を示す。したがって、ＦｃγＲは、免疫系ホメオスタシスにおいて鍵となる役割を果たす。
【００１２】
種々の自己免疫疾患の処置において有用な、ＦｃγＲＩアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｓｉｓｔｓ）を含むＦｃレセプターアンタゴニストが必要である。具体的には、免疫系および造血系の制御の妨害が、炎症、止血、関節炎、免疫不全、ならびに他の免疫系および造血系の異常に関係する障害に関わり得るので、上記のようなアンタゴニストは、そのような制御を行うように機能し得る。ゆえに、そのような障害を予防するか、回復させるか、または是正するために使用され得るそのようなアンタゴニストの同定および特徴付けが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｈａｙｎｅｓ  ａｎｄ  Ｆａｕｃｉ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋａｓｐｅｒら、ｅｄｓ（２００５），ｐｐ  １９０７−２０６６
【非特許文献２】Ｋｒｅｎｓｋｙら、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｒｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，ｅｄｓ，（２００１），ｐｐ  １４６３−１４８４
【非特許文献３】Ｌｅｍｉｅｕｘら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２：８３９−８４８，２００５
【非特許文献４】Ｉｂａｎｅｚ  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｏｒｏ−Ｒｏｎｓａｎｏ  Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，４：２３９−２４７，２００３
【非特許文献５】Ｃｌｙｎｅｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１５：２５−２７，２００５
【非特許文献６】Ｄｅｂｒｅら、Ｌａｎｃｅｔ，３４２：９４５−９４９，１９９３
【非特許文献７】Ｋａｎｅｋｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：６７０−６７３，２００６
【非特許文献８】Ｄｉｊｓｔｅｌｂｌｏｅｍら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５１０−５１６，２００１
【非特許文献９】Ｔａｋａｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ２：５８０−５９２，２００２
【非特許文献１０】Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４：１９−２８，２００６
【非特許文献１１】Ｗｏｏｆ  ａｎｄ  Ｂｕｒｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：１−１１，２００４
【非特許文献１２】Ｄａｅｒｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１−２７，１９９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の簡単な要旨
１つの局面において、本発明は、配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１もしくは３９〜３０１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０もしくは４８〜３１０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６；または配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可溶性ハイブリッドＦｃγレセプター（ＦｃγＲ）ポリペプチドを提供し、ここで、その単離されたポリペプチドは、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃドメインと特異的に結合することができる。本明細書中に記載されるように、本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、免疫細胞において、ＩｇＧまたは免疫複合体に媒介されるシグナル伝達を中和することができる。いくつかの実施形態において、ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１、３９〜３０１、１〜３０１、３５〜３１１、３６〜３１１、３９〜３１１もしくは１〜３１１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０、４８〜３１０、１〜３１０、４３〜３２０、４８〜３２０もしくは１〜３２０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６、２４〜２８６、１〜２８６、１８〜２９６、２１〜２９６、２４〜２９６もしくは１〜２９６；または配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６、２４〜２８６、１〜２８６、１８〜２９６、２１〜２９６、２４〜２９６もしくは１〜２９６を含む。
【００１５】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるような可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。通常、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１または３９〜３０１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０または４８〜３１０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６または２４〜２８６；または配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６または２４〜２８６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可溶性ＦｃγＲポリペプチドをコードし、ここで、そのコードされるポリペプチドは、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃドメインと特異的に結合することができる。いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１もしくは３９〜３０１、１〜３０１、３５〜３１１、３６〜３１１、３９〜３１１もしくは１〜３１１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０、４８〜３１０、１〜３１０、４３〜３２０、４８〜３２０もしくは１〜３２０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６、２４〜２８６、１〜２８６、１８〜２９６、２１〜２９６、２４〜２９６もしくは１〜２９６；または配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６、２４〜２８６、１〜２８６、１８〜２９６、２１〜２９６、２４〜２９６もしくは１〜２９６を含む。特定のバリエーションにおいて、その核酸は、配列番号３９のヌクレオチド残基１０３〜９０３、１０６〜９０３、１１５〜９０３、１〜９０３、１０３〜９３３、１０６〜９３３、１１５〜９３３もしくは１〜９３３；配列番号４１のヌクレオチド残基１２７〜９３０、１４２〜９３０、１〜９３０、１２７〜９６０、１４２〜９６０もしくは１〜９６０；配列番号４３のヌクレオチド残基５２〜８５８、６１〜８５８、７０〜８５８、１〜８５８、５２〜８８８、６１〜８８８、７０〜８８８もしくは１〜８８８；または配列番号４５のヌクレオチド残基５２〜８５８、６１〜８５８、７０〜８５８、１〜８５８、５２〜８８８、６１〜８８８、７０〜８８８もしくは１〜８８８を含む。
【００１６】
別の局面の中で、本発明は、以下の作動可能に連結されるエレメント：（ａ）転写プロモーター；配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１もしくは３９〜３０１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０もしくは４８〜３１０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６、２４〜２８６；または配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可溶性ＦｃγＲポリペプチドをコードする第１ＤＮＡセグメント（ここで、コードされるポリペプチドは、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃドメインと特異的に結合することができる）；および転写ターミネーターを含む発現ベクターを提供する。ある特定の実施形態において、上で開示された発現ベクターは、第１ＤＮＡセグメントに作動可能に連結される分泌シグナル配列（例えば、配列番号４０のアミノ酸残基１〜３４もしくは１〜３５、配列番号４２のアミノ酸残基１〜４２、配列番号４４のアミノ酸残基１〜１７もしくは１〜２０、配列番号４６のアミノ酸残基１〜１７もしくは１〜２０、配列番号６０のアミノ酸残基１〜３５、配列番号６２のアミノ酸残基１〜１６、配列番号６４のアミノ酸残基１〜１９または配列番号６６のアミノ酸残基１〜２３をコードするＤＮＡ配列）をさらに含む。いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１、３９〜３０１、１〜３０１、３５〜３１１、３６〜３１１、３９〜３１１もしくは１〜３１１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０、４８〜３１０、１〜３１０、４３〜３２０、４８〜３２０もしくは１〜３２０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６、２４〜２８６、１〜２８６、１８〜２９６、２１〜２９６、２４〜２９６もしくは１〜２９６；配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６、２４〜２８６、１〜２８６、１８〜２９６、２１〜２９６、２４〜２９６もしくは１〜２９６；配列番号６０のアミノ酸残基３６〜３０１もしくは１〜３０１；または配列番号６６のアミノ酸残基２４〜２８９もしくは１〜２８９を含む。特定のバリエーションにおいて、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、配列番号３９のヌクレオチド残基１０３〜９０３、１０６〜９０３、１１５〜９０３、１〜９０３、１０３〜９３３、１０６〜９３３、１１５〜９３３もしくは１〜９３３；配列番号４１のヌクレオチド残基１２７〜９３０、１４２〜９３０、１〜９３０、１２７〜９６０、１４２〜９６０もしくは１〜９６０；配列番号４３のヌクレオチド残基５２〜８５８、６１〜８５８、ヌクレオチド残基５２〜８５８、６１〜８５８、７０〜８５８、１〜８５８、５２〜８８８、６１〜８８８、７０〜８８８もしくは１〜８８８；配列番号４５のヌクレオチド残基５２〜８５８、６１〜８５８、７０〜８５８、１〜８５８、５２〜８８８、６１〜８８８、７０〜８８８もしくは１〜８８８；配列番号５９のヌク���オチド残基１０６〜９０３もしくは１〜９０３；または配列番号６５のヌクレオチド残基７０〜８６７もしくは１〜８６７を含む。
【００１７】
別の局面の中で、本発明は、上で開示されたような発現ベクターを含む培養細胞を提供し、ここで、その細胞は、上記ＤＮＡセグメントによってコードされる可溶性ＦｃγＲポリペプチドを発現する。別の実施形態において、培養細胞は、可溶性ＦｃγＲポリペプチドを分泌する、上で開示されたようなものである。別の実施形態において、培養細胞は、ＩｇＧに結合するかまたはＩｇＧ活性と拮抗する可溶性ＦｃγＲポリペプチドを分泌する、上で開示されたようなものであり、ここで、そのＩｇＧは、単量体型で存在するか、または多量体の免疫複合体として存在する。特定のバリエーションにおいて、培養細胞は、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００１８】
別の局面の中で、本発明は、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドを生成する方法を提供し、その方法は、以下の工程：（ａ）上で開示されたような細胞を培養する工程；および（ｂ）その細胞によって産生された可溶性ＦｃγＲポリペプチドを単離する工程を包含する。いくつかの実施形態において、その方法は、上記のような発現ベクターを導入された細胞を培養する工程（ここで、その細胞は、上記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する）および発現されたポリペプチドを回収する工程を包含する。ある特定のバリエーションにおいて、発現ベクターは、上記ＤＮＡセグメントに作動可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含み、ここで、細胞は、そのＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現し、そのポリペプチドは、その細胞から分泌され、そして回収される。
【００１９】
別の局面の中で、本発明は、薬学的に許容可能なキャリアおよび本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。
【００２０】
別の局面の中で、本発明は、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドおよび異種ポリペプチドセグメントを含む融合タンパク質も提供する。特に適当な異種ポリペプチドセグメントは、免疫グロブリン部分を含む。ある特定のバリエーションにおいて、その免疫グロブリン部分は、免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、ヒトＦｃフラグメントである。本発明は、そのような融合タンパク質をコードする単離された核酸分子をさらに含む。
【００２１】
別の局面の中で、本発明は、ＩｇＧまたは免疫複合体に誘導される、造血細胞および造血細胞前駆体の増殖を阻害するための方法を提供し、その方法は、可溶性レセプターの非存在下において培養された骨髄細胞または末梢血細胞と比べて骨髄細胞中または末梢血細胞中の造血細胞の増殖を減少させるのに十分な量の可溶性ＦｃγＲを含む組成物とともに骨髄細胞または末梢血細胞を培養する工程を包含する。１つの実施形態において、その方法は、上で開示されたようなものであり、ここで、造血細胞および造血性前駆細胞は、リンパ系細胞である。１つの実施形態において、その方法は、リンパ系細胞がマクロファージ、Ｂ細胞またはＴ細胞である、上で開示されたようなものである。別の局面の中で、本発明は、骨髄由来細胞による抗原提示を減少させるのに十分な量の可溶性ＦｃγＲを含む組成物を用いて、骨髄系列の細胞（例えば、マクロファージまたは単球）による抗原提示を阻害するための方法を提供する。別の実施形態において、その方法は、細胞がＢ細胞である、上で開示されたようなものである。
【００２２】
別の局面の中で、本発明は、ＩｇＧ媒介性または免疫複合体媒介性の炎症を減少させる方法を提供し、その方法は、炎症を減少させるのに十分な量の可溶性ＦｃγＲの組成物を、炎症を有する哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００２３】
別の局面の中で、本発明は、哺乳動物において免疫応答を抑制する方法を提供し、その方法は、許容可能な薬学的ビヒクル中に可溶性ＦｃγＲポリペプチドを含む組成物を投与する工程を包含する。
【００２４】
さらに、細胞表面ＦｃγＲと、免疫複合体のＩｇＧ  Ｆｃドメインとの相互作用を阻止することにより、免疫複合体に対する細胞応答が減弱し得、ゆえに炎症が減少し得る。このように、本明細書中で示されるようにＩｇＧおよび免疫複合体に媒介される免疫応答を阻止する際に有効である本発明の可溶性ＦｃγＲポリペプチドは、炎症性疾患、例えば、関節炎（例えば、関節リウマチまたは乾癬性関節炎）、成人呼吸疾患（ＡＲＤ）、内毒素血症、敗血症性ショック、多臓器不全、炎症性肺損傷（例えば、喘息または気管支炎）、細菌性肺炎、乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎および接触皮膚炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病）ならびに細菌感染またはウイルス感染に対する異常な免疫応答の治療的な処置において有用である。
【００２５】
以下の詳細な説明を参照すると、本発明のこれらの局面および他の局面が明らかになるだろう。さらに、本明細書中で特定される様々な参考文献の全体が、参考として援用される。
【００２６】
定義
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関係がある分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中で使用されるとき、以下の用語および句は、別段明記されない限り、それらに帰する意味を有する。
【００２７】
本明細書中で使用されるとき、「核酸」または「核酸分子」とは、ポリヌクレオチド（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ））、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されたフラグメント、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成されたフラグメントのことを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）もしくは天然に存在するヌクレオチドのアナログ（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−鏡像異性型）またはその両方の組み合わせである単量体から構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾としては、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置き換えが挙げられるか、または糖は、エーテルまたはエステルとして官能化され得る。さらに、糖部分全体が、立体的および電子的に類似の構造（例えば、アザ糖および炭素環式糖アナログ）で置き換えられ得る。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式の置換物（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ）が挙げられる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはそのような結合のアナログによって連結され得る。ホスホジエステル結合のアナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。用語「核酸分子」には、いわゆる「ペプチド核酸」も含まれ、それは、ポリアミド骨格に付着された、天然に存在する核酸塩基または修飾された核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。
【００２８】
用語「核酸分子の相補体」とは、参照ヌクレオチド配列に対して、相補的なヌクレオチド配列かつ逆の配向を有する核酸分子のことを指す。
【００２９】
用語「縮重ヌクレオチド配列」は、ポリペプチドをコードする参照核酸分子に対する１つ以上の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列のことを表す。縮重コドンは、異なるヌクレオチドのトリプレットを含むが、同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵおよびＧＡＣトリプレットの各々は、Ａｓｐをコードする）。
【００３０】
用語「構造遺伝子」とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される核酸分子のことを指し、そのメッセンジャーＲＮＡは、次いで、特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列に翻訳される。
【００３１】
「単離された核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離されている、成長因子をコードするＤＮＡ分子は、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種由来の染色体の完全なＤＮＡ分子よりも小さい。
【００３２】
「核酸分子構築物」は、天然には存在しない配置で組み合わされ、並べられた核酸のセグメントを含むようにヒトの介入によって改変された、一本鎖または二本鎖の核酸分子である。
【００３３】
「直鎖ＤＮＡ」とは、遊離５’および３’末端を有する非環状ＤＮＡ分子のことを表す。直鎖ＤＮＡは、プラスミドなどの閉じた環状ＤＮＡ分子から、酵素消化または物理的破壊によって調製され得る。
【００３４】
「相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、逆転写酵素によってｍＲＮＡ鋳型から形成される一本鎖ＤＮＡ分子である。代表的には、ｍＲＮＡの一部に相補的なプライマーが、逆転写を開始するために使用される。当業者は、そのような一本鎖ＤＮＡ分子およびその相補ＤＮＡ鎖からなる二本鎖ＤＮＡ分子のことを指すためにも用語「ｃＤＮＡ」を使用する。用語「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡ鋳型から合成されたｃＤＮＡ分子のクローンのことも指す。
【００３５】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指示するヌクレオチド配列である。代表的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近位の遺伝子の５’非コード領域に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列エレメントは、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴づけられる。これらのプロモーターエレメントとしては、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化特異的エレメント（ＤＳＥｓ；ＭｃＧｅｈｅｅら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７：５５１（１９９３））、サイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥｓ）、血清応答エレメント（ＳＲＥｓ；Ｔｒｅｉｓｍａｎ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１：４７（１９９０））、糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥｓ）、および他の転写因子（例えば、ＣＲＥ／ＡＴＦ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９９３８（１９９２））、ＡＰ２（Ｙｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５７２８（１９９４））、ＳＰ１、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ；Ｌｏｅｋｅｎ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．３：２５３（１９９３））およびオクタマー因子（Ｗａｔｓｏｎら、ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  ｅｄ．（Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．１９８７）およびＬｅｍａｉｇｒｅ  ａｎｄ  Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：１（１９９４）を広く参照のこと）に対する結合部位が挙げられる。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、誘導物質に応答して転写速度が上昇する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写速度は、誘導物質によって制御されない。抑制性プロモーターもまた知られている。
【００３６】
「コアプロモーター」は、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始を含む、プロモーター機能にとって必須のヌクレオチド配列を含む。この定義によって、コアプロモーターは、活性を増強し得るかまたは組織特異的活性を付与し得る特定配列の非存在下において、検出可能な活性を有してもよいし、有しなくてもよい。
【００３７】
「調節エレメント」は、コアプロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節エレメントは、特定の細胞、組織または細胞小器官における転写を独占的または優先的に可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含み得る。これらのタイプの調節エレメントは、通常、「細胞特異的」、「組織特異的」または「細胞小器官特異的」様式で発現される遺伝子と関連する。
【００３８】
「エンハンサー」は、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または配向に関係なく転写効率を増加させ得る調節エレメントの１つのタイプである。
【００３９】
「異種ＤＮＡ」とは、天然には所与の宿主細胞内に存在しないＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の集団のことを指す。宿主ＤＮＡが、非宿主ＤＮＡ（すなわち、外来性ＤＮＡ）と組み合わされるならば、特定の宿主細胞に対して異種のＤＮＡ分子は、宿主細胞種に由来するＤＮＡ（すなわち、内因性ＤＮＡ）を含み得る。例えば、転写プロモーターを含む宿主ＤＮＡセグメントに作動可能に連結されるポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると考えられる。逆に、異種ＤＮＡ分子は、外来性プロモーターと作動可能に連結された内在性遺伝子を含み得る。別の例証として、野生型細胞に由来する遺伝子を含むＤＮＡ分子は、そのＤＮＡ分子が野生型遺伝子を欠く変異細胞に導入されている場合、異種ＤＮＡであると考えられる。
【００４０】
「ポリペプチド」は、天然に生成されたか合成的に生成されたかに関係なく、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約１０アミノ酸残基未満のポリペプチドが、通常、「ペプチド」と称される。
【００４１】
ポリペプチドの文脈において、用語「フラグメント」とは、代表的には、ポリペプチドの少なくとも２０個連続したまたは少なくとも５０個連続したアミノ酸を有する、ポリペプチドの一部のことを指す。「バリアント」は、第２のポリペプチドに対してアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有するポリペプチドもしくはそのフラグメント；または第２の分子の共有結合（例えば、異種ポリペプチドの付着）もしくはグリコシル化、アセチル化、リン酸化などによって改変されているポリペプチドもしくはそのフラグメントを含む。さらに「ポリペプチド」の定義の中に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然のアミノ酸など）を含むポリペプチド、非置換の結合ならびに当該分野で公知の他の修飾（天然に存在するものと天然に存在しないものの両方）を有するポリペプチドである。
【００４２】
「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質は、非ペプチド性の構成要素、例えば、炭水化物基も含み得る。炭水化物および他の非ペプチド性の置換基は、タンパク質が生成される細胞によってタンパク質に付加され得、細胞のタイプによって様々である。タンパク質は、アミノ酸骨格構造に関して本明細書中で定義される；炭水化物基などの置換基は、通常、特定されないが、それでも存在し得る。
【００４３】
非宿主ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。
【００４４】
「クローニングベクター」は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有する核酸分子、例えば、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージである。クローニングベクターは、代表的には、そのベクターの必須の生物学的機能を失うことなく、特定できる様式で核酸分子の挿入を可能にする１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択において使用するのに適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は、代表的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
【００４５】
「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。代表的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの支配下にあり、そのような遺伝子は、プロモーターに「作動可能に連結される」といわれる。同様に、調節エレメントが、コアプロモーターの活性を調節する場合、調節エレメントとコアプロモーターとは、作動可能に連結される。
【００４６】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞である。この文脈において、組換え宿主の例は、発現ベクターから可溶性ハイブリッドＦｃγＲを生成する細胞である。
【００４７】
「組み込みの形質転換体」は、異種ＤＮＡが細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている組換え宿主細胞である。
【００４８】
「融合タンパク質」は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば、融合タンパク質は、親和性マトリックスに結合するポリペプチドと融合されたＦｃγＲポリペプチドの少なくとも一部を含み得る。そのような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィを用いて大量のＦｃγＲＩＡを単離する手段を提供する。
【００４９】
用語「レセプター」は、「リガンド」と呼ばれる生物活性分子に結合する、細胞に会合されたタンパク質のことを表す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの効果を媒介する。レセプターは、膜結合型、サイトゾル型または核型；単量体（例えば、甲状腺刺激ホルモンレセプター、ベータ−アドレナリンレセプター）または多量体（例えば、ＰＤＧＦレセプター、成長ホルモンレセプター、ＩＬ−３レセプター、ＧＭ−ＣＳＦレセプター、Ｇ−ＣＳＦレセプター、エリトロポイエチンレセプターおよびＩＬ−６レセプター）であり得る。膜結合型レセプターは、代表的にはシグナル伝達に関与する、細胞外のリガンド結合ドメインおよび細胞内のエフェクタードメインを含む多ドメイン構造を特徴とする。ある特定の膜結合型レセプターでは、細胞外のリガンド結合ドメインおよび細胞内のエフェクタードメインは、完全な機能的レセプターを含む別個のポリペプチドに位置する。
【００５０】
一般に、リガンドとレセプターとが結合することにより、その細胞においてエフェクタードメインと他の分子との間に相互作用を引き起こすレセプターのコンフォメーション変化がもたらされ、そして細胞の代謝が変化する。レセプターとリガンドとの相互作用に関連することが多い代謝の事象としては、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックＡＭＰ産生の増加、細胞内カルシウムの動員、膜脂質の動員、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解およびリン脂質の加水分解が挙げられる。
【００５１】
「可溶性レセプター」は、細胞膜に結合されていないレセプターポリペプチドである。可溶性レセプターは、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、ならびにグリコホスホイノシトール（ｇｐｉ）を介する結合などの細胞膜に対する他の結合を有しない、最も一般的なリガンド結合レセプターポリペプチドである。可溶性レセプターは、追加のアミノ酸残基（例えば、ポリペプチドの精製を提供するかまたは基質にポリペプチドが付着するための部位を提供する親和性タグ）または免疫グロブリン定常領域配列を含み得る。多くの細胞表面レセプターは、タンパク質分解によって生成されるかまたは選択的スプライスによるｍＲＮＡから翻訳される、天然に存在する可溶性の対応物を有する。可溶性レセプターは、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体であり得、多量体レセプターは、通常、９個より多いサブユニットを含まず、好ましくは、６個より多いサブユニットを含まず、最も好ましくは、３個より多いサブユニットを含まない。レセプターポリペプチドは、膜アンカリングまたはシグナル伝達を提供するのに十分なこれらのセグメントの一部を欠くとき、それらは、それぞれ膜貫通および細胞内のポリペプチドセグメントを実質的に含まないと言われる。さらに、遺伝暗号を用いる当業者は、そのような可溶性レセプターポリペプチド（ｐｏｌｙｐｔｉｄｅｓ）をコードするポリヌクレオチドを容易に決定することができる。
【００５２】
用語「分泌シグナル配列」は、より大きなポリペプチドを、それが合成される細胞の分泌経路を通るように指示する、そのより大きなポリペプチドの構成要素としてのペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列のことを表す。より大きなポリペプチドは、通常、分泌経路の通過中に切断されることにより、分泌ペプチドが除去される。
【００５３】
「単離されたポリペプチド」は、細胞成分（例えば、炭水化物、脂質、または天然においてそのポリペプチドに関連する他のタンパク質性不純物）で本質的に汚染されていないポリペプチドである。代表的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態で、すなわち、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、９５％超純粋（例えば、９６％、９７％もしくは９８％またはそれ以上純粋）または９９％超純粋のポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が、単離されたポリペプチドを含むことを示す１つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびそのゲルのクーマシーブリリアントブルー染色の後の単一のバンドの出現によるものである。しかしながら、用語「単離された」は、別の物理的形態（例えば、二量体または別にグリコシル化された形態または誘導体化された形態）での同じポリペプチドの存在を除外しない。
【００５４】
用語「アミノ末端」および「カルボキシル末端」は、ポリペプチド内の位置を表すために本明細書中で使用される。文脈が許す場合、これらの用語は、近接または相対位置を表すために、ポリペプチドの特定の配列または一部に照らして使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端に位置するある特定の配列は、その参照配列のカルボキシル末端の近位に位置するが、必ずしも、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に位置しない。
【００５５】
用語「発現」とは、遺伝子産物の生合成のことを指す。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、ｍＲＮＡへの構造遺伝子の転写およびｍＲＮＡから１つ以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
【００５６】
用語「スプライスバリアント」は、遺伝子から転写された別の形態のＲＮＡのことを表すために本明細書中で使用される。スプライスバリエーションは、転写されたＲＮＡ分子内の選択的スプライシング部位またはそれほど多くはないが別個に転写されたＲＮＡ分子間の選択的スプライシング部位を使用することによって天然に生じ、同じ遺伝子から転写されたいくつかのｍＲＮＡをもたらし得る。スプライスバリアントは、アミノ酸配列が変更されたポリペプチドをコードし得る。スプライスバリアントという用語は、遺伝子から転写されたｍＲＮＡのスプライスバリアントによってコードされるポリペプチドのことを表すためにも本明細書中で使用される。
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、用語「免疫調節物質」には、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、共刺激分子、造血因子など、ならびにこれらの分子の合成アナログが含まれる。
【００５８】
本明細書中で使用されるとき、「治療薬」は、治療に有用な結合体を生成するように抗体部分に結合体化された分子または原子である。治療薬の例としては、薬物、トキシン、免疫調節物質、キレート剤、ホウ素化合物、光活性物質または色素および放射性同位体が挙げられる。
【００５９】
「検出可能標識」は、診断に有用な分子を生成するように抗体部分に結合体化され得る分子または原子である。検出可能標識の例としては、キレート剤、光活性物質、放射性同位体、蛍光物質、常磁性イオンまたは他のマーカー部分が挙げられる。
【００６０】
用語「親和性タグ」は、第２のポリペプチドに付着されることにより、その第２のポリペプチドの精製もしくは検出を提供し得るか、または第２のポリペプチドが基質に付着するための部位を提供し得る、ポリペプチドセグメントのことを表すために本明細書中で使用される。原則として（Ｉｎ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ）、抗体または他の特異的な結合物質が利用可能である任意のペプチドまたはタンパク質が、親和性タグとして使用され得る。親和性タグとしては、ポリヒスチジントラクト、プロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１０７５（１９８５）；Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３（１９９１））、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８））、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性タグ（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：７９５２（１９８５））、サブスタンスＰ、ＦＬＡＧペプチド（Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８））、ストレプトアビジン結合ペプチドまたは他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインが挙げられる。Ｆｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５（１９９１）を広く参照のこと。親和性タグをコードするＤＮＡ分子は、商業的供給源（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能である。
【００６１】
Ｆｃγレセプターポリペプチドまたはポリペプチド領域の文脈において、別の配列に対する「対応」（例えば、領域、フラグメント、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置など）は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置番号に従うナンバリング、そして配列同一性のパーセンテージを最大にする様式での配列のアラインメントの慣習に基づく。所与の「対応領域」内のすべての位置が同一である必要はないので、対応領域内のマッチしていない位置は、「対応する位置」とみなされ得る。したがって、本明細書中で使用されるとき、特定のＦｃγレセプタータンパク質の「アミノ酸位置［Ｘ］に対応するアミノ酸位置」に対する言及は、特定のＦｃγレセプタータンパク質のアミノ酸位置に対する言及に加えて、他の認識されるＦｃγレセプタータンパク質ならびに構造上のホモログおよびファミリーにおける等しい位置の集合物に対する言及に相当する。
【００６２】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」または「同一性パーセント」とは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いるかまたは手動のアラインメントおよび目視によって測定されるときに比較領域すなわち指定領域にわたって対応が最大となるように比較されてアラインメントされるとき、同一であるか、または特定のパーセンテージの同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基（例えば、特定の領域にわたって、少なくとも６０％同一、必要に応じて少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一）を有する２つ以上の配列もしくは部分配列のことを指す。配列は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である場合、互いに「実質的に同一」である。これらの定義は、試験配列の相補体のことも指す。必要に応じて、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長である領域、またはより代表的には１００〜５００もしくは１０００またはそれ以上のヌクレオチド長である領域にわたって存在する。
【００６３】
配列比較は、標準的なソフトウェアプログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって作製されているＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートに含められているもの）を用いて行われ得る。最適なアラインメントを決定することによって２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｐｅｒｕｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐｅｒｕｓｋｉ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）；Ｗｕら（ｅｄｓ．），“Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２３−１５１（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）；Ｂｉｓｈｏｐ（ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）を参照のこと）。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、互いに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する場合、それらの２つの配列は、「実質的に類似の配列同一性」または「実質的な配列同一性」を有すると考えられる。
【００６４】
パーセント配列同一性は、従来の方法によって決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３，１９８６およびＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５，１９９２を参照のこと。例えば、１０というギャップ・オープニング・ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）、１というギャップ伸長ペナルティおよび表１に示されるようなＨｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，前出の「ＢＬＯＳＵＭ６２」スコア行列を用いて、２つのアミノ酸配列をアラインメントして、アラインメントスコアを最適化することができる（アミノ酸は、標準的な１文字コードによって示される）。次いで、同一性パーセントを以下のとおり計算する：（［完全一致の総数］／［長い方の配列の長さ＋２つの配列をアラインメントするために長い方の配列に導入されたギャップの数］）（１００）。
【００６５】
【表１】
2011526154.tif 000003
当業者は、２つのアミノ酸配列をアラインメントするために利用可能な確立されたアルゴリズムが多数存在することを認識している。ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書中に開示されるアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とによって共有される同一性レベルを調べるために適したタンパク質アラインメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８およびＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３，１９９０によって説明されている。簡潔には、ＦＡＳＴＡは、まず、保存的なアミノ酸の置換、挿入または欠失を考慮せずに、クエリー配列（例えば、配列番号４０の残基３９〜３０１、配列番号４２の残基４８〜３１０、配列番号４４の残基２４〜２８６または配列番号４６の残基２４〜２８６）と、最も高い同一性の密度（ｋｔｕｐ変数が１である場合）または同一の対（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有する試験配列とによって共有されている領域を特定することによって配列類似性を特徴づける。次いで、最も高い同一性の密度を有する１０個の領域を、アミノ酸置換行列を用いてすべての対のアミノ酸の類似性を比較することによって再度スコア付けし、最も高いスコアに寄与する残基だけを含むようにその領域の末端を「切り取る」。「カットオフ」値（配列の長さおよびｋｔｕｐ値に基づいて所定の式によって計算される値）よりも大きいスコアを有する領域がいくつか存在する場合、切り取られた最初の領域を調べることにより、その領域が連結されて、ギャップを含む近似アラインメントを形成し得るか否かを判定する。最後に、２つのアミノ酸配列の最もスコアの高い領域を、アミノ酸の挿入および欠失を許容するＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４，１９７０；Ｓｅｌｌｅｒｓ，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２６：７８７，１９７４）の改変物を用いてアラインメントする。ＦＡＳＴＡ解析に対する実例的なパラメータは：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ・オープニング・ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝１および置換行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメータは、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３，１９９０のＡｐｐｅｎｄｉｘ２に説明されているようにスコア行列ファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を改変することによってＦＡＳＴＡプログラムに導入され得る。
【００６６】
ＦＡＳＴＡは、上で開示されたような比を用いて核酸分子の配列同一性を測定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列を比較するために、ｋｔｕｐ値は、１〜６の範囲、好ましくは、３〜６、最も好ましくは、３であり得、他のパラメータは、上に記載されたように設定される。
【００６７】
「保存的アミノ酸置換」とは、一般に、−１よりも大きいＢＬＯＳＵＭ６２値によって表されるアミノ酸置換のことを指す。ＢＬＯＳＵＭ６２表（表１，前出）は、５００を超える群の関連タンパク質の高度に保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局所多重アラインメントから得られたアミノ酸置換行列である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５，１９９２）。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、特定のアミノ酸配列に導入され得る保存的アミノ酸置換を定義するために使用され得る。例えば、置換が、０、１、２または３というＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴づけられる場合、そのアミノ酸置換は、保存的である。この系によれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２または３）というＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴づけられ、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２（例えば、２または３）というＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴づけられる。
【００６８】
「〜に対応する」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して使用されるとき、２つの配列が最適にアラインメントされたときに参照位置と並ぶ第２の配列における位置を示す。
【００６９】
本明細書中に記載されるようなＦｃγＲポリペプチドに関して、配列番号によって特定されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基に対する言及は、そのような残基の翻訳後修飾を含む。例えば、配列番号２の１６位に対応する位置におけるグルタミンに対する言及は、このグルタミンのピログルタミン酸への翻訳後修飾を包含する。
【００７０】
「免疫複合体」とは、本明細書中で使用されるとき、ＩｇＧ抗体がその同族抗原に結合する際に形成する複合体のことを指す。用語「免疫複合体」は、本明細書中で使用されるとき、すべての化学量論の抗原：抗体複合体を包含する。例えば、免疫複合体は、抗原に結合された単一のＩｇＧ抗体（単量体ＩｇＧ）を含むこともあるし、抗原に結合された複数のＩｇＧ抗体（多量体免疫複合体）を含むこともある。
【００７１】
「ＩｇＧ媒介性炎症」とは、本明細書中で使用されるとき、免疫複合体内に含まれるＩｇＧ抗体のＦｃ領域を介したＦｃγレセプターへの免疫複合体の結合によって少なくとも部分的に媒介される炎症反応のことを指す。「ＩｇＧ媒介性炎症」は、ＩｇＧ免疫複合体による補体経路の活性化も包含する。
【００７２】
「免疫複合体媒介性炎症」とは、本明細書中で使用されるとき、１つ以上の組織内における免疫複合体の沈着を少なくとも部分的に特徴とするＩｇＧ媒介性炎症のことを指す。
【００７３】
「ＩｇＧ媒介性疾患」または「ＩｇＧ媒介性炎症性疾患」とは、本明細書中で使用されるとき、免疫複合体内に含まれるＩｇＧ抗体のＦｃ領域を介したＦｃγレセプターへの免疫複合体の結合によって少なくとも部分的に媒介される炎症性疾患のことを指す。「ＩｇＧ媒介性疾患」または「ＩｇＧ媒介性炎症性疾患」は、ＩｇＧ免疫複合体による補体経路の活性化を少なくとも部分的に特徴とする疾患も包含する。
【００７４】
「自己免疫疾患」とは、本明細書中で使用されるとき、ＩｇＧ自己抗体、すなわち、１つ以上の自己抗原に特異的なＩｇＧ抗体の存在を少なくとも部分的に特徴とするＩｇＧ媒介性炎症性疾患のことを指す。自己免疫疾患には、例えば、自己抗体の産生ならびに１つ以上の組織における免疫複合体の沈着に関連する疾患が含まれる；そのような疾患としては、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）および混合結合組織病が挙げられる。自己免疫疾患には、自己抗体の産生に関連するが免疫複合体の沈着に明らかには関連しない疾患（例えば、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、シェーグレン症候群、抗リン脂質抗体症候群、皮膚筋炎、ギランバレー症候群およびグッドパスチャー症候群）も含まれる。他の自己免疫疾患としては、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬、アトピー性皮膚炎、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病および多発性硬化症が挙げられる。
【００７５】
「免疫複合体媒介性疾患」とは、本明細書中で使用されるとき、１つ以上の組織内における免疫複合体の沈着を少なくとも部分的に特徴とするＩｇＧ媒介性炎症性疾患のことを指す。免疫複合体媒介性疾患としては、例えば、混合型クリオグロブリン血症；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ（ＲＡ）；混合結合組織病；および外因性（ｅｘｏｎｅｇｏｕｓ）抗原に関連する疾患、例えば、ＨＢＶに関連する結節性多発動脈炎が挙げられる。
【００７６】
標準的な分析方法の不正確さに起因して、ポリマーの分子量および長さは、近似値であることが理解される。そのような値が、「約」Ｘまたは「およそ」Ｘと表現されるとき、述べられている値のＸは、±１０％の精度であると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いたときのインビトロにおける免疫複合体の析出の阻止を表している。実施例９，後掲に記載されるように、抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体析出アッセイを行った。各点は、２つ組で行われた３つの別個の実験の平均値を表している。丸：抗ＯＶＡ＋ＯＶＡ；三角：抗ＯＶＡ＋ＯＶＡ＋５００ｎＭ  ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６；四角：抗ＯＶＡ＋ＯＶＡ＋１５００ｎＭ  ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いたときのマスト細胞における炎症性サイトカインの免疫複合体媒介性産生の阻害を表している。実施例９，後掲に記載されるように、マウスＭＣ／９マスト細胞を増加量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６（「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」）の存在下において抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とともにインキュベートし、炎症性サイトカインの分泌を測定した。各点は、２つ組の測定の平均値を表しており、２つの別個の実験の代表である。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｄは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いたときのマスト細胞における炎症性サイトカインの免疫複合体媒介性産生の阻害を表している。実施例９，後掲に記載されるように、マウスＭＣ／９マスト細胞を増加量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６（「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」）の存在下において抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とともにインキュベートし、炎症性サイトカインの分泌を測定した。各点は、２つ組の測定の平均値を表しており、２つの別個の実験の代表である。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｄは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いたときのマスト細胞における炎症性サイトカインの免疫複合体媒介性産生の阻害を表している。実施例９，後掲に記載されるように、マウスＭＣ／９マスト細胞を増加量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６（「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」）の存在下において抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とともにインキュベートし、炎症性サイトカインの分泌を測定した。各点は、２つ組の測定の平均値を表しており、２つの別個の実験の代表である。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いたときのマスト細胞における炎症性サイトカインの免疫複合体媒介性産生の阻害を表している。実施例９，後掲に記載されるように、マウスＭＣ／９マスト細胞を増加量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６（「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」）の存在下において抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とともにインキュベートし、炎症性サイトカインの分泌を測定した。各点は、２つ組の測定の平均値を表しており、２つの別個の実験の代表である。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いたときのマウスアルサス反応における免疫複合体媒介性浮腫および好中球浸潤の阻害を表している。ウサギ抗オバルブミンの皮内送達およびオバルブミンの尾静脈注射を用いて、マウスにおいて皮膚の逆受身アルサス反応を確立した（実施例９，後掲を参照のこと）。抗ＯＶＡ単独または指示量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６との併用の抗ＯＶＡ（「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」）を動物に投与し、免疫複合体媒介性浮腫および好中球浸潤に対するＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の作用を評価した（同上を参照のこと）。各バーは、１群あたりｎ＝８匹の動物に対する平均±ＳＤを表している。０．１×、１．０×および７．０×ｐＦＣＧＲＩＡ−ＣＨ６は、注射された抗ＯＶＡの量に対して加えられた過剰なモル濃度のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を表し、それぞれ、１．３μｇ、１３．０μｇおよび９１．０μｇのＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６に等しい。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いたときのマウスアルサス反応における免疫複合体媒介性浮腫および好中球浸潤の阻害を表している。ウサギ抗オバルブミンの皮内送達およびオバルブミンの尾静脈注射を用いて、マウスにおいて皮膚の逆受身アルサス反応を確立した（実施例９，後掲を参照のこと）。抗ＯＶＡ単独または指示量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６との併用の抗ＯＶＡ（「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」）を動物に投与し、免疫複合体媒介性浮腫および好中球浸潤に対するＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の作用を評価した（同上を参照のこと）。各バーは、１群あたりｎ＝８匹の動物に対する平均±ＳＤを表している。０．１×、１．０×および７．０×ｐＦＣＧＲＩＡ−ＣＨ６は、注射された抗ＯＶＡの量に対して加えられた過剰なモル濃度のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を表し、それぞれ、１．３μｇ、１３．０μｇおよび９１．０μｇのＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６に等しい。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いたときのマウスアルサス反応における免疫複合体媒介性浮腫および好中球浸潤の阻害を表している。ウサギ抗オバルブミンの皮内送達およびオバルブミンの尾静脈注射を用いて、マウスにおいて皮膚の逆受身アルサス反応を確立した（実施例９，後掲を参照のこと）。抗ＯＶＡ単独または指示量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６との併用の抗ＯＶＡ（「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」）を動物に投与し、免疫複合体媒介性浮腫および好中球浸潤に対するＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の作用を評価した（同上を参照のこと）。各バーは、１群あたりｎ＝８匹の動物に対する平均±ＳＤを表している。０．１×、１．０×および７．０×ｐＦＣＧＲＩＡ−ＣＨ６は、注射された抗ＯＶＡの量に対して加えられた過剰なモル濃度のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を表し、それぞれ、１．３μｇ、１３．０μｇおよび９１．０μｇのＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６に等しい。
【図４】図４は、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の全身送達を用いたときのマウスのアルサス反応における炎症の阻害を表している。指示量の、ビヒクル単独または指示量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を含むビヒクル（「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」）を、アルサス反応を惹起する１時間前にマウスに注射した（実施例９，後掲を参照のこと）。実施例９に記載されるように、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の全身投与は、静脈内注射によって行い、皮膚の逆受身アルサス反応は、ウサギ抗オバルブミンの皮内送達を用いて行った。エバンスブルー色素の抗ＯＶＡ誘導血管外遊出によって浮腫を判定した。各バーは、ｎ＝８匹のマウス（ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の静脈内注射）またはｎ＝４匹のマウス（ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の皮内注射）に対する平均±ＳＤを表している。使用した省略形は：ｉｖ＝静脈内；ｉｄ＝皮内である。
【図５】図５は、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の全身送達を用いたときのマウスのアルサス反応における浮腫の阻害を表している。指示量の、ビヒクル単独または指示量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を含むビヒクル（「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」）を、アルサス反応を惹起する１時間前にマウスに注射した（実施例９，後掲を参照のこと）。実施例９に記載されるように、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の全身投与は、静脈内注射によって行い、皮膚の逆受身アルサス反応は、ウサギ抗オバルブミンの皮内送達を用いて行った。抗ＯＶＡによって誘導された、病変部位の組織重量の増加によって、浮腫を判定した。各バーは、ｎ＝８匹のマウス（ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の静脈内注射）またはｎ＝４匹のマウス（ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の皮内注射）に対する平均±ＳＤを表している。このデータは、非免疫ＩｇＧの注射に対して表示されている。使用した省略形は：ｉｖ＝静脈内；ｉｄ＝皮内である。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄは、ＦｃγＲ１配列を表している。図６Ａは、ＦｃγＲＩＡ（ＦｃγＲ１アイソフォームａ）をコードするポリヌクレオチド配列を示している（配列番号１）。図６Ｂは、ＦｃγＲＩＡのポリペプチド配列を示している（配列番号２）。図６Ｃは、ＦｃγＲＩＡの細胞外ドメインのポリペプチド配列を示している（配列番号３）。図６Ｄは、ＦｃγＲＩＡポリペプチド配列と、ＦｃγＲ１アイソフォームｂ１（配列番号４）およびｃ（配列番号５）ポリペプチド配列との比較を示している。図６Ｄにおける縦線は、対応する遺伝子にイントロンが存在する位置を示し；三角は、可溶性ＦｃγＲＩＡの特定の実施形態のＣ末端アミノ酸、あるいは、可溶性ＦｃγＲＩＡのある特定のタグ化バリエーション（例えば、Ｈｉｓ６−タグ化ＦｃγＲＩＡ）に対するＣ末端融合部位を示す。図６Ｄにおける１６位のアミノ酸のグルタミン（Ｑ）の上の「１６」は、成熟ＦｃγＲＩＡタンパク質に対するアミノ末端の開始部位を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｄは、ＦｃγＲ１配列を表している。図６Ａは、ＦｃγＲＩＡ（ＦｃγＲ１アイソフォームａ）をコードするポリヌクレオチド配列を示している（配列番号１）。図６Ｂは、ＦｃγＲＩＡのポリペプチド配列を示している（配列番号２）。図６Ｃは、ＦｃγＲＩＡの細胞外ドメインのポリペプチド配列を示している（配列番号３）。図６Ｄは、ＦｃγＲＩＡポリペプチド配列と、ＦｃγＲ１アイソフォームｂ１（配列番号４）およびｃ（配列番号５）ポリペプチド配列との比較を示している。図６Ｄにおける縦線は、対応する遺伝子にイントロンが存在する位置を示し；三角は、可溶性ＦｃγＲＩＡの特定の実施形態のＣ末端アミノ酸、あるいは、可溶性ＦｃγＲＩＡのある特定のタグ化バリエーション（例えば、Ｈｉｓ６−タグ化ＦｃγＲＩＡ）に対するＣ末端融合部位を示す。図６Ｄにおける１６位のアミノ酸のグルタミン（Ｑ）の上の「１６」は、成熟ＦｃγＲＩＡタンパク質に対するアミノ末端の開始部位を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｄは、ＦｃγＲ１配列を表している。図６Ａは、ＦｃγＲＩＡ（ＦｃγＲ１アイソフォームａ）をコードするポリヌクレオチド配列を示している（配列番号１）。図６Ｂは、ＦｃγＲＩＡのポリペプチド配列を示している（配列番号２）。図６Ｃは、ＦｃγＲＩＡの細胞外ドメインのポリペプチド配列を示している（配列番号３）。図６Ｄは、ＦｃγＲＩＡポリペプチド配列と、ＦｃγＲ１アイソフォームｂ１（配列番号４）およびｃ（配列番号５）ポリペプチド配列との比較を示している。図６Ｄにおける縦線は、対応する遺伝子にイントロンが存在する位置を示し；三角は、可溶性ＦｃγＲＩＡの特定の実施形態のＣ末端アミノ酸、あるいは、可溶性ＦｃγＲＩＡのある特定のタグ化バリエーション（例えば、Ｈｉｓ６−タグ化ＦｃγＲＩＡ）に対するＣ末端融合部位を示す。図６Ｄにおける１６位のアミノ酸のグルタミン（Ｑ）の上の「１６」は、成熟ＦｃγＲＩＡタンパク質に対するアミノ末端の開始部位を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｄは、ＦｃγＲ１配列を表している。図６Ａは、ＦｃγＲＩＡ（ＦｃγＲ１アイソフォームａ）をコードするポリヌクレオチド配列を示している（配列番号１）。図６Ｂは、ＦｃγＲＩＡのポリペプチド配列を示している（配列番号２）。図６Ｃは、ＦｃγＲＩＡの細胞外ドメインのポリペプチド配列を示している（配列番号３）。図６Ｄは、ＦｃγＲＩＡポリペプチド配列と、ＦｃγＲ１アイソフォームｂ１（配列番号４）およびｃ（配列番号５）ポリペプチド配列との比較を示している。図６Ｄにおける縦線は、対応する遺伝子にイントロンが存在する位置を示し；三角は、可溶性ＦｃγＲＩＡの特定の実施形態のＣ末端アミノ酸、あるいは、可溶性ＦｃγＲＩＡのある特定のタグ化バリエーション（例えば、Ｈｉｓ６−タグ化ＦｃγＲＩＡ）に対するＣ末端融合部位を示す。図６Ｄにおける１６位のアミノ酸のグルタミン（Ｑ）の上の「１６」は、成熟ＦｃγＲＩＡタンパク質に対するアミノ末端の開始部位を示す。
【図７】図７は、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いたときのコラーゲン抗体誘導関節炎マウスモデルにおける足のスコアの減少を表している。実施例１１，後掲に記載されるようにＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）抗体カクテルで処置することによってマウスにおいてコラーゲン抗体誘導関節炎を確立した。ビヒクル単独（ＰＢＳ）または指示濃度のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を含むビヒクル（「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」）で１日おきに合計５回の皮下注射をマウスに対して行った。各点は、１群あたりｎ＝８匹のマウスに対する平均±ＳＥＭを表している。反復測定分散分析による群間の差は、有意だった。
【図８】図８は、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いたときのコラーゲン抗体誘導関節炎マウスモデルにおける足の厚さの減少を表している。実施例１１，後掲に記載されるようにＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）抗体カクテルで処置することによってマウスにおいてコラーゲン抗体誘導関節炎を確立した。ビヒクル単独（ＰＢＳ）または指示濃度のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を含むビヒクル（「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」）で１日おきに合計５回の皮下注射をマウスに対して行った。各点は、１群あたりｎ＝８匹のマウスに対する平均±ＳＥＭを表している。反復測定分散分析による群間の差は、有意だった。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６によるアルサス反応における炎症の減少を表しているが、ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６とＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６の両方はアルサス反応において炎症を減少させなかったこと表している。実施例９および１０，後掲に記載されるように実験を行った。このデータは、非免疫ＩｇＧに対する値を各点から減算した後の、抗ＯＶＡ単独の存在下において観察されたデータに対して表されている。ＦｃγＲＩＡ（●）、ＦｃγＲＩＩＡ（▲）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（■）の各点は、６つの別個の実験からの、ｎ＝８〜１６病変部位（図９Ａおよび９Ｂ）およびｎ＝５〜１３病変部位（図９Ｃ）に対する平均±ＳＥＭを表している。差は、すべての用量群において分散分析により＊ｐ＜０．０００１で有意だった。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｃは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６によるアルサス反応における炎症の減少を表しているが、ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６とＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６の両方はアルサス反応において炎症を減少させなかったこと表している。実施例９および１０，後掲に記載されるように実験を行った。このデータは、非免疫ＩｇＧに対する値を各点から減算した後の、抗ＯＶＡ単独の存在下において観察されたデータに対して表されている。ＦｃγＲＩＡ（●）、ＦｃγＲＩＩＡ（▲）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（■）の各点は、６つの別個の実験からの、ｎ＝８〜１６病変部位（図９Ａおよび９Ｂ）およびｎ＝５〜１３病変部位（図９Ｃ）に対する平均±ＳＥＭを表している。差は、すべての用量群において分散分析により＊ｐ＜０．０００１で有意だった。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６によるアルサス反応における炎症の減少を表しているが、ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６とＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６の両方はアルサス反応において炎症を減少させなかったこと表している。実施例９および１０，後掲に記載されるように実験を行った。このデータは、非免疫ＩｇＧに対する値を各点から減算した後の、抗ＯＶＡ単独の存在下において観察されたデータに対して表されている。ＦｃγＲＩＡ（●）、ＦｃγＲＩＩＡ（▲）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（■）の各点は、６つの別個の実験からの、ｎ＝８〜１６病変部位（図９Ａおよび９Ｂ）およびｎ＝５〜１３病変部位（図９Ｃ）に対する平均±ＳＥＭを表している。差は、すべての用量群において分散分析により＊ｐ＜０．０００１で有意だった。
【図１０】図１０は、ＦｃγＲＩＡで処置することによる関節炎疾患スコアの減少を表している。実施例１３，後掲に記載されるようにマウスにおいてコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を確立した。確立された疾患が顕われたら、マウスをビヒクル単独（ＰＢＳ）（○）または０．２２ｍｇもしくは２．０ｍｇのＦｃγＲＩＡを含むビヒクル（「ＦＣＧＲ１Ａ」）で処置した（実施例１３，後掲を参照のこと）。各点は、１群あたり７〜１３匹の動物に対する平均±ＳＥを表している。差は、反復測定分散分析において＊ｐ＝０．００１で有意だった。
【図１１】図１１は、長期間のＦｃγＲＩＡ投薬レジメンを用いたときの関節炎スコアの減少を表している。実施例１３，後掲に記載されるようにマウスにおいてコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を確立した。１日おきのビヒクル単独（○）または１日おき（■）もしくは４日おき（▲）で投薬される２．０ｍｇのＦｃγＲＩＡを含むビヒクルでマウスを処置した（実施例１３，後掲を参照のこと）。各点は、１群あたり７〜１３匹の動物に対する平均±ＳＥを表している。反復測定分散分析よる差は、＊ｐ＝０．０１２５、＊＊ｐ＝０．００１で有意だった。４日おきの投薬は、合計１１日間にわたった。
【図１２】図１２は、ＦｃγＲＩＡで処置したときの関節炎の足の数の減少を表している。実施例１３，後掲に記載されるようにマウスにおいてコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を確立した。ビヒクル単独（○）または１日おきに投薬される０．２２ｍｇのＦｃγＲＩＡ（▲）もしくは２．０ｍｇ（■）のＦｃγＲＩＡを含むビヒクルでマウスを処置した（実施例１３，後掲を参照のこと）。各点は、１群あたり７〜１３匹のマウスの平均を表している。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｄは、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡならびに可溶性ハイブリッドＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡレセプターとともにインキュベートすることによる、培養されたマスト細胞における免疫複合体媒介性のサイトカイン産生の阻害を表している。増加量の天然の可溶性ＦｃγＲＩＡ（「天然のＦＣＧＲ１Ａ」）または２つの可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ２Ａ１Ａ」）もしくはＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ３Ａ１Ａ」）のうちの１つの存在下において抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とともにマウスＭＣ／９マスト細胞をインキュベートし、実施例２２，後掲に記載されるように炎症性サイトカインのＩＬ−６（図１３Ａ）、ＩＬ−１３（図１３Ｂ）、ＴＮＦα（図１３Ｃ）およびＭＣＰ−１（図１３Ｄ）の分泌（ｓｅｃｒｅｃｔｉｏｎ）を測定した。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｄは、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡならびに可溶性ハイブリッドＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡレセプターとともにインキュベートすることによる、培養されたマスト細胞における免疫複合体媒介性のサイトカイン産生の阻害を表している。増加量の天然の可溶性ＦｃγＲＩＡ（「天然のＦＣＧＲ１Ａ」）または２つの可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ２Ａ１Ａ」）もしくはＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ３Ａ１Ａ」）のうちの１つの存在下において抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とともにマウスＭＣ／９マスト細胞をインキュベートし、実施例２２，後掲に記載されるように炎症性サイトカインのＩＬ−６（図１３Ａ）、ＩＬ−１３（図１３Ｂ）、ＴＮＦα（図１３Ｃ）およびＭＣＰ−１（図１３Ｄ）の分泌（ｓｅｃｒｅｃｔｉｏｎ）を測定した。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｄは、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡならびに可溶性ハイブリッドＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡレセプターとともにインキュベートすることによる、培養されたマスト細胞における免疫複合体媒介性のサイトカイン産生の阻害を表している。増加量の天然の可溶性ＦｃγＲＩＡ（「天然のＦＣＧＲ１Ａ」）または２つの可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ２Ａ１Ａ」）もしくはＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ３Ａ１Ａ」）のうちの１つの存在下において抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とともにマウスＭＣ／９マスト細胞をインキュベートし、実施例２２，後掲に記載されるように炎症性サイトカインのＩＬ−６（図１３Ａ）、ＩＬ−１３（図１３Ｂ）、ＴＮＦα（図１３Ｃ）およびＭＣＰ−１（図１３Ｄ）の分泌（ｓｅｃｒｅｃｔｉｏｎ）を測定した。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｄは、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡならびに可溶性ハイブリッドＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡレセプターとともにインキュベートすることによる、培養されたマスト細胞における免疫複合体媒介性のサイトカイン産生の阻害を表している。増加量の天然の可溶性ＦｃγＲＩＡ（「天然のＦＣＧＲ１Ａ」）または２つの可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ２Ａ１Ａ」）もしくはＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ３Ａ１Ａ」）のうちの１つの存在下において抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とともにマウスＭＣ／９マスト細胞をインキュベートし、実施例２２，後掲に記載されるように炎症性サイトカインのＩＬ−６（図１３Ａ）、ＩＬ−１３（図１３Ｂ）、ＴＮＦα（図１３Ｃ）およびＭＣＰ−１（図１３Ｄ）の分泌（ｓｅｃｒｅｃｔｉｏｎ）を測定した。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡおよび可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡを用いたときの、マウスのアルサス反応における免疫複合体媒介性浮腫の阻害を表している。ウサギ抗オバルブミンの皮内送達およびオバルブミンの尾静脈注射を用いてマウスにおいて皮膚の逆受身アルサス反応を確立した（実施例２２，後掲を参照のこと）。抗ＯＶＡ単独、または指示量の天然の可溶性ＦｃγＲＩＡ（「天然のＦＣＧＲ１Ａ」）もしくは可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ２Ａ１Ａ」）との併用の抗ＯＶＡを動物に投与し、免疫複合体媒介性浮腫に対する各可溶性レセプターの作用を、エバンスブルー面積の減少（図１４Ａ）または病変部位の組織重量の減少（図１４Ｂ）のいずれかを判断することによって評価した（同上を参照のこと）。各点は、１群あたりｎ＝６匹の動物に対する平均±ＳＤを表している。分散分析による抗ＯＶＡ単独に対する差は、＊ｐ＜０．００１で有意だった。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡおよび可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡを用いたときの、マウスの皮膚アルサス反応における免疫複合体媒介性浮腫の阻害を表している。ウサギ抗オバルブミンの皮内送達およびオバルブミンの尾静脈注射を用いてマウスにおいて皮膚の逆受身アルサス反応を確立した（実施例２２，後掲を参照のこと）。抗ＯＶＡ単独、または指示量の天然の可溶性ＦｃγＲＩＡ（「天然のＦＣＧＲ１Ａ」）もしくは可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ３Ａ１Ａ」）との併用の抗ＯＶＡを動物に投与し、免疫複合体媒介性浮腫に対する各可溶性レセプターの作用を、エバンスブルー面積の減少（図１５Ａ）または病変部位の組織重量の減少（図１５Ｂ）のいずれかを判断することによって評価した（同上を参照のこと）。各点は、１群あたりｎ＝６匹の動物に対する平均±ＳＤを表している。差は、分散分析において＊ｐ＜０．００１で有意だった。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡならびに可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６を用いたときの、マウスの皮膚アルサス反応における好中球浸潤の阻害を表している。ウサギ抗オバルブミンの皮内送達およびオバルブミンの尾静脈注射を用いてマウスにおいて皮膚の逆受身アルサス反応を確立した（実施例２２，後掲を参照のこと）。抗ＯＶＡ単独、または指示量の天然の可溶性ＦｃγＲＩＡ（「ＦＣＧＲ１Ａ」；図１６Ａおよび１６Ｂ）もしくは可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ２Ａ１Ａ」；図１６Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６（「ＦＣＧＲ３Ａ１Ａ」；図１６Ｂ）のうちの１つとの併用の抗ＯＶＡを動物に投与し、パンチバイオプシーサンプルにおけるミエロペルオキシダーゼ活性を測定することによって好中球浸潤を評価した。各点は、１群あたりｎ＝６匹の動物に対する平均±ＳＤを表している。差は分散分析において＊ｐ＜０．００１で、差はマン・ホイットニー検定において＊＊ｐ＜０．００１で有意だった。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
発明の説明
Ｉ．概要
本発明は、Ｆｃγレセプターアンタゴニストを提供することによってＩｇＧおよび免疫複合体に媒介される疾患を処置するための新規治療法に対するニーズを満たす。特に、本発明に記載のＦｃγレセプターアンタゴニストは、ＦｃγＲＩＡの改変された細胞外ドメイン（ここで、第１Ｉｇドメイン（Ｄ１）は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢの第１Ｉｇドメインで置換される）を含む可溶性ハイブリッドレセプターである。そのようなハイブリッドレセプターは、天然のＦｃγＲＩＡの高親和性結合を維持し、免疫複合体の析出によって媒介される炎症性プロセスを含むＩｇＧ媒介性炎症を減少させるための方法において使用され得る。
【００７９】
可溶性ＦｃγＲＩＡは、皮膚アルサス反応における炎症を阻止するが、可溶性ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＡは、阻止しないことが見出された（実施例９および１０を参照のこと）。さらに、可溶性ＦｃγＲＩＡは、細胞のＦｃγＲを介した免疫複合体の結合およびシグナル伝達も阻止することが見出された（下記の実施例に詳細に記載される）。可溶性ＦｃγＲＩＡが、マウスにおける、皮膚アルサス反応、関節炎のコラーゲン抗体誘導モデルおよびコラーゲン誘導関節炎において炎症を阻止したという知見は驚くべきものだった。なぜなら、ＩｇＧ  Ｆｃに対する高親和性レセプターとしてのＦｃγＲＩＡは、循環中の単量体ＩｇＧで飽和されると予想され、ゆえに通常、免疫複合体への結合にはあまり利用可能でないからである。これらの知見は、可溶性ＦｃγＲＩＡが、自己免疫疾患および炎症を処置するために使用され得る強力な治療剤であることを示している。さらに、これらの結果は、本明細書中に記載されるようなハイブリッドＦｃγレセプターを含むＦｃγに対する他の可溶性で高親和性のレセプターを、そのような状態を処置するために使用することを支持する。
【００８０】
したがって、本明細書中に記載される可溶性Ｆｃγレセプターポリペプチドは、ＩｇＧおよび免疫複合体に媒介される疾患、例えば、自己免疫性糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、ウェゲナー肉芽腫症、チャーグ・ストラウス症候群、Ｂ型肝炎に関連する結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発血管炎、ヘノッホシェーンライン紫斑病、関節リウマチ（ＲＡ）、ランバート・イートン症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、本態性混合型クリオグロブリン血症、Ｃ型肝炎に関連するクリオグロブリン血症、混合結合組織病、自己免疫性血小板減少症（ＩＴＰおよびＴＴＰ）、成人型皮膚筋炎、ギランバレー症候群、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、抗リン脂質抗体症候群、血管炎、ブドウ膜炎、血清病、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）および外因性抗原に関連する疾患（例えば、ウイルスおよび細菌の感染症）を処置するために、免疫細胞（例えば、リンパ球、単球、白血球、マクロファージ（ｍａｃｒｏｈａｇｅｓ）およびＮＫ細胞）におけるＩｇＧおよび免疫複合体のシグナル伝達と拮抗するか、またはシグナル伝達を阻止するために有用である。喘息、アレルギーおよび他のアトピー性疾患もまた、本発明の可溶性Ｆｃγレセプターポリペプチドで処置されることにより、免疫応答が阻害され得るか、または問題を起こす細胞が枯渇され得る。本発明の可溶性Ｆｃγレセプターポリペプチドを使用することによってＦｃγレセプターを介してＩｇＧおよび免疫複合体のシグナル伝達を阻止するか、または阻害することもまた、膵臓、腎臓、下垂体および神経細胞の疾患に対して有益であり得る。本発明の可溶性Ｆｃγレセプターポリペプチドは、ＩｇＧおよび免疫複合体のアンタゴニストとして有用である。そのような拮抗作用は、直接的な中和またはＩｇＧおよび免疫複合体のＦｃドメインの結合によって達成され得る。
【００８１】
ＩＩ．可溶性ハイブリッドＦｃγレセプターならびにそれらを生成するための方法および材料
したがって、１つの局面において、本発明は、免疫細胞においてＩｇＧまたは免疫複合体によって媒介されるシグナル伝達を中和することができる単離された可溶性ハイブリッドＦｃγレセプター（ＦｃγＲ）ポリペプチドを提供する。そのハイブリッドＦｃγレセプターは、通常、少なくとも２つの異なるＦｃγレセプターサブファミリーの細胞外Ｉｇドメインに対応するポリペプチド領域を含み、膜貫通および細胞内のポリペプチドセグメントを実質的に含まない。特に、本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγレセプターは、通常、ヒトＦｃγＲＩＡの改変された細胞外ドメインを含み、ここで、第１Ｉｇドメイン（Ｄ１）は、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢの第１Ｉｇドメインに対応するポリペプチド領域で置換されている。
【００８２】
ヒトＦｃγＲＩＡ（ＦｃγＲＩのアイソフォームａ）をコードする実例的なヌクレオチド配列は、配列番号１によって提供される。配列番号１は、およそ２７７アミノ酸残基（配列番号２の残基１６〜２９２；配列番号３）の細胞外Ｆｃγ結合ドメインを含む３７４アミノ酸（配列番号２）をコードするオープンリーディングフレームを含む。ＦｃγＲＩは、アイソフォームｂ１およびｃも含み、その両方ともが、図６ＤにおいてＦｃγＲＩＡ（配列番号２）と比較して表されている。アイソフォームｂ１およびｃの細胞外ドメインは、３つのＩｇドメインを含むアイソフォームａとは対照的に、２つだけのＩｇドメインを含む。ＦｃγＲＩＡの第１、第２および第３のＩｇドメインは、それぞれ、配列番号２のアミノ酸残基２２〜１０１、１０４〜１８４および１９０〜２５０にほぼ対応する。
【００８３】
ヒトＦｃγＲＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩのアイソフォーム）の細胞外ドメインをコードする実例的なヌクレオチド配列は、配列番号６によって提供される。配列番号６は、およそ３４または３５アミノ酸残基（配列番号７の残基１〜３４または１〜３５）の分泌シグナル配列およびおよそ１７７または１７６アミノ酸残基（配列番号７の残基３５〜２１１または３６〜２１１）の細胞外のＦｃγ結合ドメインを含む２１１アミノ酸（配列番号７）をコードするオープンリーディングフレームを含む。ＦｃγＲＩＩＡの細胞外ドメインは、それぞれ配列番号７のアミノ酸残基３９〜１１９および１２２〜２０４にほぼ対応する２つのＩｇドメインを含む。
【００８４】
ヒトＦｃγＲＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩのアイソフォームｂ）の細胞外ドメインをコードする実例的なヌクレオチド配列は、配列番号８によって提供される。配列番号８は、およそ４２アミノ酸残基（配列番号９の残基１〜４２）の分泌シグナル配列およびおよそ１７４アミノ酸残基（配列番号９の残基４３〜２１６）の細胞外のＦｃγ結合ドメインを含む２１６アミノ酸（配列番号９）をコードするオープンリーディングフレームを含む。ＦｃγＲＩＩＢの細胞外ドメインは、それぞれ配列番号９のアミノ酸残基４８〜１２９および１３２〜２１３にほぼ対応する２つのＩｇドメインを含む。
【００８５】
ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＩのアイソフォームａ）の細胞外ドメインをコードする実例的なヌクレオチド配列は、配列番号１０によって提供される。配列番号１０は、およそ１７または２０アミノ酸残基（配列番号１１の残基１〜１７または１〜２０）の分泌シグナル配列およびおよそ１７８または１７５アミノ酸残基（配列番号１１の残基１８〜１９５または２１〜１９５）の細胞外のＦｃγ結合ドメインを含む１９５アミノ酸（配列番号１１）をコードするオープンリーディングフレームを含む。ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外ドメインは、それぞれ配列番号１１のアミノ酸残基２４〜１０５および１０８〜１８９にほぼ対応する２つのＩｇドメインを含む。
【００８６】
ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＩのアイソフォームｂ）の細胞外ドメインをコードする実例的なヌクレオチド配列は、配列番号１２によって提供される。配列番号１２は、およそ１７または２０アミノ酸残基（配列番号１３の残基１〜１７または１〜２０）の分泌シグナル配列およびおよそ１７８または１７５アミノ酸残基（配列番号１３の残基１８〜１９５または２１〜１９５）の細胞外のＦｃγ結合ドメインを含む１９５アミノ酸（配列番号１３）をコードするオープンリーディングフレームを含む。ＦｃγＲＩＩＩＢの細胞外ドメイン（ｄｏｍａｉｎｏ）は、それぞれ配列番号１３のアミノ酸残基２４〜１０５および１０８〜１８９にほぼ対応する２つのＩｇドメインを含む。
【００８７】
ある特定の実施形態において、本発明の可溶性ＦｃγＲポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１もしくは３９〜３０１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０もしくは４８〜３１０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６；または配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、単離されたポリペプチドは、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃドメインに特異的に結合することができる。本発明の可溶性ＦｃγＲポリペプチドは、少なくとも１０６Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ−１、より好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、最も好ましくは、少なくとも１０９Ｍ−１という結合親和性（Ｋａ）で単量体ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）に結合する場合、特異的に結合する。ある特定の実施形態において、本発明の可溶性ＦｃγＲポリペプチドは、１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１の結合親和性（Ｋａ）で単量体ヒトＩｇＧに結合する。可溶性ＦｃγＲポリペプチドの結合親和性は、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０，１９４９）によって、当業者によって容易に測定され得る。親和性定数（Ｋａ）の測定に加えて、親和性を判断する代替の手段は、平衡定数（Ｋｄ）であり、ここで、減少は、親和性が改善されるときに観察され得る。ある特定の実施形態において、本発明の可溶性ＦｃγＲポリペプチドは、１０−８Ｍ未満、好ましくは、１０−９Ｍ未満、より好ましくは、１０−１０Ｍ未満の平衡解離定数（Ｋｄ）でヒトＩｇＧ１に結合する。特定のバリエーションにおいて、本発明の可溶性ＦｃγＲポリペプチドは、約１．７×１０−１０Ｍという平衡解離定数（Ｋｄ）でヒトＩｇＧ１に結合する。いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＦｃγＲポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１もしくは３９〜３０１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０もしくは４８〜３１０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６；または配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６を含む。他の実施形態において、本発明の可溶性ＦｃγＲポリペプチドは、（ｉ）アミノ酸ｘからアミノ酸３０１までの配列番号４０に示されているようなアミノ酸配列（ここで、ｘは、３５以上３９以下の整数である）；（ｉｉ）アミノ酸ｘからアミノ酸３１０までの配列番号４２に示されているようなアミノ酸配列（ここで、ｘは、４３以上４８以下の整数である）；（ｉｉｉ）アミノ酸ｘからアミノ酸２８６までの配列番号４４に示されているようなアミノ酸配列（ここで、ｘは、１８以上２４以下の整数である）；および（ｉｖ）アミノ酸ｘからアミノ酸２８６までの配列番号４６に示されているようなアミノ酸配列（ここで、ｘは、１８以上２４以下の整数である）から選択される���ミノ酸配列を含む。
【００８８】
可溶性ハイブリッドＦｃγＲＩポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１もしくは３９〜３０１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０もしくは４８〜３１０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６；または配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％またはそれ以上の同一性を共有するいくつかの実施形態において、ＦｃγＲポリペプチドのアミノ酸配列と、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４または配列番号４６の対応するアミノ酸配列との間の任意の差は、１つ以上の保存的アミノ酸置換に起因する。
【００８９】
配列番号４０、４２、４４または４６に示されているような参照ポリペプチドに対して実質的な配列同一性を有するポリペプチドは、通常、参照ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有すると特徴づけられる。これらの変更は、好ましくは、軽度のもの、すなわち、保存的アミノ酸置換（例えば、いくつかの例示的な保存的アミノ酸置換を列挙している後掲の表２を参照のこと）およびタンパク質またはポリペプチドの折りたたみまたは活性に著しく影響しない他の置換；小さな欠失、代表的には、１〜約３０アミノ酸の欠失；およびアミノ末端またはカルボキシル末端の小さな伸長（例えば、アミノ末端のメチオニン残基）、最大約２０〜２５残基の小さなリンカーペプチドまたは精製を容易にする小さな伸長（親和性タグ）（例えば、ポリヒスチジントラクト、プロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１０７５，１９８５；Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３，１９９１）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ  ６７：３１，１９８８）または他の抗原性エピトープもしくは結合ドメイン）である（Ｆｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７，１９９１を広く参照のこと）。親和性タグをコードするＤＮＡは、商業的供給源（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能である。
【００９０】
【表２】
2011526154.tif 000004
本発明のレセプターポリペプチドにおける必須のアミノ酸は、当該分野で公知の手順（例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５，１９８９；Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４４９８−４５０２，１９９１））に従って同定され得る。後者の手法では、１つのアラニン変異を、その分子内のすべての残基に導入し、得られた変異体分子を生物学的活性（例えば、リガンド結合およびシグナル伝達）について試験することにより、その分子の活性にとって重大なアミノ酸残基を同定する。リガンドとレセプターとの相互作用の部位もまた、核磁気共鳴、結晶学または光親和性標識などの手法によって決定されるような結晶構造の解析によって決定され得る（例えば、ｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２，１９９２；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４，１９９２；Ｗｌｏｄａｖｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４，１９９２を参照のこと）。必須のアミノ酸の同定は、関連レセプターを用いたホモロジーの解析からも推論され得る。
【００９１】
Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７，１９８８またはＢｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６，１９８９によって開示されているものなどの突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を用いて、複数のアミノ酸置換物が作製され得、試験され得る。簡潔には、これらの著者らは、ポリペプチド内の２つ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで、突然変異誘発されたポリペプチドの配列決定を行うことにより、各位置における許容可能な置換の範囲を決定するための方法を開示している。使用され得る他の方法としては、ファージディスプレイ、例えば、Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７，１９９１；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅ，ＷＩＰＯ公開ＷＯ９２／０６２０４）および領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら、Ｇｅｎｅ  ４６：１４５，１９８６；Ｎｅｒら、ＤＮＡ  ７：１２７，１９８８）が挙げられる。
【００９２】
上で開示されたような突然変異誘発法は、ハイスループットスクリーニング法と組み合わされることにより、クローニングされ突然変異誘発されたレセプターの宿主細胞における活性を検出し得る。この点において好ましいアッセイとしては、細胞増殖アッセイおよびバイオセンサーベースのリガンド結合アッセイ（これらは下記で説明される）が挙げられる。活性なレセプターまたはその一部（例えば、リガンド結合フラグメント）をコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収され得、そして近代的装置を用いて速やかに配列決定され得る。これらの方法によって、目的のポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を迅速に判定することができ、これらの方法は、未知の構造のポリペプチドに対して適用することができる。
【００９３】
上で述べた方法を用いて、当業者は、配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１もしくは３９〜３０１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０もしくは４８〜３１０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６；または配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６の参照ポリペプチドと実質的に同一であり、かつ、その参照ポリペプチドのリガンド結合特性（すなわち、ＩｇＧ結合特性）を保持している、可溶性ＦｃγＲポリペプチドを含む種々のポリペプチドを調製することができる。レセプターポリペプチドのリガンド結合特性を測定するためのアッセイ系は、一般に当該分野で公知であり、本明細書中に記載されるような可溶性ハイブリッドＦｃγＲのＦｃγ結合特性を測定する際に使用するために容易に適合可能である。例示的なアッセイは、さらに本明細書中に記載される。
【００９４】
例えば、好ましいアッセイ系は、商業的に入手可能なバイオセンサー装置（ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用し、ここで、レセプターポリペプチドは、レセプターチップの表面上に固定される。この装置の使用は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５：２２９−２４０，１９９１）ならびにＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：５５４−５６３，１９９３）によって開示されている。本発明に従って使用するために、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、アミンまたはスルフヒドリル化学を用いて、フローセル内の金膜に付着されているデキストラン繊維に共有結合的に付着される。試験サンプルをそのセルに通す。リガンド（例えば、ＩｇＧ）が、サンプル中に存在する場合、そのリガンドは、固定されたハイブリッドＦｃγＲに結合し、媒質の屈折率を変化させ、それが、金膜の表面プラズモン共鳴の変化として検出される。この系によって、会合速度および解離速度の決定（それらから結合親和性が計算され得る）ならびに結合の化学量論の評価が可能になる。
【００９５】
可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、当該分野で公知の他のアッセイ系においても使用され得る。そのような系としては、結合親和性を決定するためのＳｃａｔｃｈａｒｄ解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９を参照のこと）および熱量アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５４５−５４８，１９９１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：８２１−８２５，１９９１を参照のこと）が挙げられる。
【００９６】
本発明に記載の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、天然のＦｃγＲに由来しない１つ以上の追加のポリペプチドセグメントも含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、Ｆｃγレセプターに対して異種のポリペプチドセグメントをさらに含む融合タンパク質である。特に適当な異種ポリペプチドは、例えば、米国特許第５，１５５，０２７号および同第５，５６７，５８４号に開示されているような二量体化タンパク質である。この点において、好ましい二量体化タンパク質は、免疫グロブリン定常領域ドメイン、例えば、ＩｇＧγ１およびヒトκ軽鎖を含む。免疫グロブリン−可溶性ＦｃγＲポリペプチド融合物は、種々のそのようなレセプターアナログを生成する遺伝的に操作された細胞において発現され得る。ある特定のバリエーションにおいて、二量体化タンパク質は、２つの定常領域ドメインおよびヒンジ領域を含むが可変領域を欠く、免疫グロブリン重鎖定常領域、代表的には、Ｆｃフラグメントである（Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉら、米国特許第６，０１８，０２６号および同第５，７５０，３７５号を参照のこと）。そのような融合物は、二量体化タンパク質が、互いに結合しており（例えば、ジスルフィド結合を介して）、２つのポリペプチドが、互いに近位に並んでいる、多量体分子として代表的には分泌される。
【００９７】
補助ドメインが、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドに融合されることにより、そのポリペプチドが、特異的な細胞、組織または高分子（例えば、コラーゲンまたは他のＦｃレセプターを発現している細胞）を標的化し得る。いくつかの実施形態において、親和性タグ（例えば、マルトースタンパク質；免疫グロブリンドメイン；または例えば、配列番号１８に示されるものなどのポリヒスチジンタグ）が、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドに融合されることにより、精製が容易になる。いくつかのバリエーションにおいて、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドが、２つ以上の部分（例えば、精製のための親和性タグおよび標的化ドメイン）に融合される。ポリペプチド融合物はまた、特にドメイン間に、１つ以上の切断部位を含み得る。例えば、Ｔｕａｎら、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４：１−９，１９９６を参照のこと。
【００９８】
本発明は、本明細書中に開示される可溶性ハイブリッドＦｃγレセプターポリペプチドをコードする、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含むポリヌクレオチド分子も提供する。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖分子と二本鎖分子の両方を含む。可溶性ハイブリッドＦｃγレセプターをコードする実例的なＤＮＡ配列が、本明細書中で開示される。本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγレセプターをコードする追加のＤＮＡ配列は、遺伝暗号に基づいて当業者によって容易に生成され得る。対応するＲＮＡ配列は、ＴのかわりにＵを用いる置換によって生成され得る。遺伝暗号の縮重を考慮すると、かなりの配列バリエーションが所与のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子の中に存在し得ることを当業者は容易に認識するだろう。
【００９９】
したがって、別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるような可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。通常、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１もしくは３９〜３０１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０もしくは４８〜３１０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６；または配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む可溶性ＦｃγＲポリペプチドをコードし、ここで、コードされるポリペプチドは、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃドメインと特異的に結合することができる。いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸残基３５〜３０１、３６〜３０１もしくは３９〜３０１；配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０もしくは４８〜３１０；配列番号４４のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６；または配列番号４６のアミノ酸残基１８〜２８６、２１〜２８６もしくは２４〜２８６を含む。他の実施形態において、コードされるポリペプチドは、（ｉ）アミノ酸ｘからアミノ酸３０１までの配列番号４０に示されているようなアミノ酸配列（ここで、ｘは、３５以上３９以下の整数である）；（ｉｉ）アミノ酸ｘからアミノ酸３１０までの配列番号４２に示されているようなアミノ酸配列（ここで、ｘは、４３以上４８以下の整数である）；（ｉｉｉ）アミノ酸ｘからアミノ酸２８６までの配列番号４４に示されているようなアミノ酸配列（ここで、ｘは、１８以上２４以下の整数である）；および（ｉｖ）アミノ酸ｘからアミノ酸２８６までの配列番号４６に示されているようなアミノ酸配列（ここで、ｘは、１８以上２４以下の整数である）から選択されるアミノ酸配列を含む。特定のバリエーションにおいて、その核酸は、配列番号３９のヌクレオチド残基１０３〜９０３、１０６〜９０３もしくは１１５〜９０３；配列番号４１のヌクレオチド残基１２７〜９３０もしくは１４２〜９３０；配列番号４３のヌクレオチド残基５２〜８５８、６１〜８５８もしくは７０〜８５８；または配列番号４５のヌクレオチド残基５２〜８５８、６１〜８５８もしくは７０〜８５８を含む。
【０１００】
本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγレセプターおよび核酸は、好ましくは、組換えである（合成的に生成されない限り）。組換えＤＮＡ法は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載されるようなＦｃγＲポリペプチドを生成するために容易に使用され得る。上で述べたように、本発明に記載のハイブリッドレセプターは、異なるサブクラスのＦｃγレセプター（例えば、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＡ）の第１Ｉｇドメインで置換された第１Ｉｇドメイン（Ｄ１）を有する、ヒトＦｃγＲＩＡの細胞外ドメインに由来する。したがって、組換えＤＮＡ法は、天然のＦｃγレセプターを発現している適当な組織または細胞に由来するＲＮＡまたはＤＮＡを用いるそれぞれの核酸領域のＰＣＲ増幅などによって、例えば、ハイブリッドレセプターの様々なポリペプチド領域をコードする特定の核酸セグメント（例えば、ＦｃγＲＩＡの第２および第３のＩｇドメインをコードする１つの核酸セグメントおよびＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＡの第１Ｉｇドメインをコードする第２セグメント）をクローニングするために使用され得る。次いで、ハイブリッドレセプターのそれぞれの領域をコードする核酸セグメントが、例えば、ライゲーションまたはオーバーラップＰＣＲなどの標準的な手法を用いて連結され得る。
【０１０１】
本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲが由来し得る１つ以上の天然のＦｃγレセプターをコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、当該分野で周知の方法に従って調製され得る。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンは、目的のポリペプチドをコードする大量のＲＮＡを生成する組織または細胞から単離されるＲＮＡから調製される。グアニジンＨＣｌ抽出の後のＣｓＣｌ勾配における遠心分離による単離を用いて全ＲＮＡが調製され得る（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２−９４，１９７９）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：１４０８−１４１２，１９７２）を用いて全ＲＮＡから調製される。相補ＤＮＡは、公知の方法を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡから調製される。代替として、ゲノムＤＮＡが単離され得る。いくつかの応用（例えば、トランスジェニック動物における発現）のために、ゲノムのクローンを使用すること、または少なくとも１つのゲノムのイントロンを含むようにｃＤＮＡクローンを改変することが、都合よいことがある。ｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンを同定するためおよび単離するための方法は、周知であり、当該分野における通常のスキルレベルの範囲内であり、ライブラリーを探索するためまたはプライミングするために本明細書中に開示される配列またはその一部を使用することを含む。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」，Ｍｕｌｌｉｓ，米国特許第４，６８３，２０２号）によって同定され、単離される。発現ライブラリーは、目的のポリペプチドに対する抗体、レセプターフラグメントまたは他の特異的な結合パートナーを用いて探索され得る。
【０１０２】
特異的なハイブリッドＦｃγレセプターのバリアントもまた、公知の手法を用いて調製され得る。参照配列に対して１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するバリアントは、バリアントをコードするＤＮＡを生成して、その後、組換え細胞培養においてそのＤＮＡを発現するように、例えば、カセット突然変異誘発もしくはＰＣＲ突然変異誘発または当該分野で周知の別の手法を用いる、対応するハイブリッドＦｃγレセプタータンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によって調製され得る。上で概要を述べたように、本発明に記載のＦｃγレセプターバリアントは、代表的には、天然のＦｃγＲＩＡと類似のＦｃγ結合性を示すが、追加のバリアント特性を有するバリアントもまた選択され得る。ランダム突然変異誘発が、標的のコドンまたは領域において行われ得、そして発現されたバリアントハイブリッドＦｃγＲタンパク質は、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされ得る。既知の配列を有するＤＮＡ内の所定部位における置換変異を作製するための手法は、周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発である。
【０１０３】
アミノ酸置換は、単一のアミノ酸残基または複数のアミノ酸残基の置換であり得る（例えば、２、３、４個またはそれ以上のアミノ酸が置換され得る）。挿入は、代表的には、約１〜約２０アミノ酸であるが、それよりもかなり長い挿入が許容され得る。欠失は、約１〜約２０残基、または約１〜約３０残基に及ぶが、いくつかの場合において、欠失は、もっと長いことがある。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせを用いることにより、最終的なバリアントハイブリッドレセプターに到達する。ある特定のバリエーションにおいて、分子の変更が最小限になるように、参照配列に対する改変が比較的少ないアミノ酸に関して行われる。しかしながら、もっと長い変更も、ある特定の状況では許容され得る。
【０１０４】
本発明のポリヌクレオチドは、自動化された合成によっても調製され得る。短い二本鎖セグメント（６０〜８０ｂｐ）の生成は、技術的に簡単であり、相補鎖を合成し、次いで、それらをアニーリングすることによって達成され得る。それよりも長いセグメント（代表的には、＞３００ｂｐ）は、２０〜１００ヌクレオチド長の一本鎖フラグメントからモジュール形式で構築される。ポリヌクレオチドの自動化された合成は、当該分野における通常のスキルレベルの範囲内であり、適当な装置および試薬は、商業的供給業者から入手可能である。Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９４）；Ｉｔａｋｕｒａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６，１９８４；およびＣｌｉｍｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３３−６３７，１９９０を広く参照のこと。
【０１０５】
本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγレセプターポリペプチドは、従来の手法に従って、遺伝的に操作された宿主細胞において生成され得る。適当な宿主細胞は、外来性ＤＮＡで形質転換され得るか、またはトランスフェクトされ得、そして培養液中で生育される、細胞型であり、それらとしては、細菌、真菌細胞および高等真核生物の培養細胞（多細胞生物の培養細胞を含む）、特に、哺乳動物の培養細胞が挙げられる。クローニングされたＤＮＡ分子を操作するための手法および外来性ＤＮＡを種々の宿主細胞に導入するための手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９３）によって開示されている。
【０１０６】
一般に、可溶性ハイブリッドＦｃγレセプターポリペプチドを発現させるために、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、その発現に必要な他の遺伝因子（通常、発現ベクター内の転写プロモーターおよびターミネーターを含む）に作動可能に連結される。そのベクターは、通常、１つ以上の選択マーカーおよび１つ以上の複製開始点も含むが、ある特定の系では、選択マーカーが別個のベクター上に提供され得ること、および外来性ＤＮＡの複製が、宿主細胞のゲノムに組み込まれることによって提供され得ることを当業者は認識するだろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクターおよび他のエレメントの選択は、当該分野における通常のスキルレベルの範囲内の通例の計画事項である。多くのそのようなエレメントは、文献に記載されており、商業的供給業者を通じて入手可能である。
【０１０７】
ポリペプチド融合物を宿主細胞の分泌経路に入るように指示するために、分泌シグナル配列が、発現ベクター内に提供される。その分泌シグナル配列は、天然のＦｃγレセプター（例えば、ハイブリッドレセプターが由来し得る天然のＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢ）の分泌シグナル配列であってもよいし、別の分泌タンパク質（例えば、ｔ−ＰＡ；米国特許第５，６４１，６５５号を参照のこと）に由来してもよいし、新規に合成されてもよい。操作された切断部位は、分泌ペプチドとポリペプチド融合物の残りの部分との間の接合点に含められることにより、宿主細胞におけるタンパク分解性のプロセシングが最適化され得る。分泌シグナル配列は、ポリペプチド融合物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結され、すなわち、その２つの配列は、正しい読み枠で結合され、新しく合成されるポリペプチド融合物が宿主細胞の分泌経路に入るように指示するように配置される。分泌シグナル配列は、通常、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して５’側に位置するが、ある特定のシグナル配列は、目的のＤＮＡ配列内の別の箇所に位置し得る（例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。本発明に従って使用するための例示的な分泌シグナル配列は、例えば、配列番号４０のアミノ酸残基１〜３８、配列番号４２のアミノ酸残基１〜４７、配列番号４４のアミノ酸残基１〜１７もしくは１〜２０、配列番号４６のアミノ酸残基１〜１７もしくは１〜２０、配列番号６０のアミノ酸残基１〜３５、配列番号６２のアミノ酸残基１〜１６、配列番号６４のアミノ酸残基１〜１９または配列番号６６のアミノ酸残基１〜２３をコードするＤＮＡ配列を含む。
【０１０８】
哺乳動物培養細胞は、本発明において使用するために適した宿主である。外来性ＤＮＡを哺乳動物宿主細胞に導入するための方法としては、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １４：７２５，１９７８；Ｃｏｒｓａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３，１９８１：Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６，１９７３）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−８４５，１９８２）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）およびリポソーム媒介性トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら、Ｆｏｃｕｓ  １５：７３，１９９３；Ｃｉｃｃａｒｏｎｅら、Ｆｏｃｕｓ  １５：８０，１９９３）が挙げられる。哺乳動物培養細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、米国特許第４，７１３，３３９号；Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４，９５０号；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４，５７９，８２１号；およびＲｉｎｇｏｌｄ，米国特許第４，６５６，１３４号によって開示されている。適当な哺乳動物培養細胞としては、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９７７）およびチャイニーズハムスター卵巣（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１，ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ  ６１；ＣＨＯ−ＤＧ４４，Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０，１９８０）細胞株が挙げられる。さらに適当な細胞株は、当該分野で公知あり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａなどの公的な寄託所から入手可能である。強力な転写プロモーター（例えば、ＳＶ−４０、サイトメガロウイルスまたは骨髄増殖性肉腫ウイルス由来のプロモーター）が、使用され得る。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号および米国特許出願公開番号２００３０１０３９８６を参照のこと。他の適当なプロモーターとしては、メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター（米国特許第４，５７９，８２１号および同第４，６０１，９７８号）およびアデノウイルス主要後期プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞において使用するための発現ベクターとしては、ｐＺＰ−１、ｐＺＰ−９およびｐＺＭＰ２１（これらは、それぞれ、アクセッション番号９８６６９、９８６６８およびＰＴＡ−５２６６としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ＵＳＡに寄託されている）ならびにこれらのベクターの誘導体が挙げられる。
【０１０９】
薬物選択は、一般に、外来ＤＮＡが挿入されている哺乳動物培養細胞について選択するために使用される。そのような細胞は、通常、「トランスフェクタント」と称される。選択的物質の存在下において培養され、そして目的の遺伝子を子孫に伝えることができる細胞は、「安定なトランスフェクタント」と称される。例示的な選択マーカーは、抗生物質作用のネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、Ｇ−４１８などのネオマイシンタイプの薬物の存在下において行われる。選択系は、「増幅」と称されるプロセスである、目的の遺伝子の発現レベルを増加させるためにも使用され得る。増幅は、低レベルの選択的物質の存在下においてトランスフェクタントを培養し、次いで、選択的物質の量を増加させることにより、高レベルの導入遺伝子産物を生成する細胞について選択することによって行われる。例示的な増幅選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素であり、これは、メトトレキサートに対する耐性を付与するものである。他の薬物耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多薬物耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）もまた使用され得る。細胞表面マーカーおよび他の表現型選択マーカーを用いることにより、トランスフェクトされた細胞の同定（例えば、蛍光励起細胞分取による）が容易になり得、それらのマーカーとしては、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、神経成長因子レセプター、緑色蛍光タンパク質などが挙げられる。
【０１１０】
昆虫細胞、植物細胞および鳥類細胞を含む他の高等真核細胞もまた、宿主として使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現させるためのベクターとしてのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの使用は、Ｓｉｎｋａｒら、Ｊ．ＢｉｏＳｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８，１９８７によって概説されている。昆虫細胞の形質転換およびその中での外来ポリペプチドの生成は、Ｇｕａｒｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２２号およびＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３によって開示されている。
【０１１１】
昆虫細胞は、通常Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する組換えバキュロウイルスに感染され得る。Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ（Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）；およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｅｄ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５）を参照のこと。組換えバキュロウイルスは、Ｌｕｃｋｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−４５７９、１９９３）によって報告されているトランスポゾンベースの系を使用することによっても作製され得る。この系は、トランスファーベクターを利用するものであり、キットの形態で商業的に入手可能である（ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣキット；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。トランスファーベクター（例えば、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを、「バクミド」と呼ばれる大型のプラスミドとしてＥ．ｃｏｌｉ内で維持されるバキュロウイルスゲノム中に移すためのＴｎ７トランスポゾンを含む。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１−９７６，１９９０；Ｂｏｎｎｉｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１５５１−１５５６，１９９４；およびＣｈａｚｅｎｂａｌｋ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５４３−１５４９，１９９５を参照のこと。当該分野で公知の手法を用いて、ポリペプチド融合物をコードするトランスファーベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞に形質転換され、そしてそれらの細胞は、組換えバキュロウイルスを示唆する中断されたｌａｃＺ遺伝子を含むバクミドについてスクリーニングされる。組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドＤＮＡは、通常の手法を用いて単離され、そのＤＮＡを用いて、Ｓｆ９細胞などのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞がトランスフェクトされる。その後、ポリペプチド融合物を発現する組換えウイルスが生成される。組換えウイルスの貯蔵物が、当該分野において通常使用される方法によって作製される。
【０１１２】
タンパク質の生成にむけて、宿主細胞、代表的には、ヤガの一種（ｆａｌｌ  ａｒｍｙｗｏｒｍ）であるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに由来する細胞株（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉに由来する細胞株（例えば、ＨＩＧＨ５細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を感染させるために組換えウイルスが使用される。Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ，前出を広く参照のこと。米国特許第５，３００，４３５号もまた参照のこと。無血清培地を用いて、それらの細胞を生育し、維持する。適当な培地の調合物は、当該分野で公知であり、商業的供給業者から得ることができる。それらの細胞は、およそ２〜５×１０５細胞の播種密度から１〜２×１０６細胞の密度で生育され、その時点において、組換えウイルス貯蔵物が、０．１〜１０、より代表的には、３付近の感染効率（ＭＯＩ）で加えられる。使用される手順は、利用可能な研究室のマニュアル（例えば、Ｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｅｅ，前出；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、前出；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，前出）に広く記載されている。
【０１１３】
酵母細胞を含む真菌細胞もまた、本発明において使用され得る。この点において、目的の特定の酵母種としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＰｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａが挙げられる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を外来性ＤＮＡで形質転換するための方法およびそこから組換えポリペプチドを生成する方法は、例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉら、米国特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ，米国特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；およびＭｕｒｒａｙら、米国特許第４，８４５，０７５号によって開示されている。形質転換された細胞は、選択マーカーによって決定される表現型（通常、薬物耐性、または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の非存在下において生育する能力）によって選択される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて使用するための例示的なベクター系は、Ｋａｗａｓａｋｉら（米国特許第４，９３１，３７３号）によって開示されているＰＯＴ１ベクター系であり、これによって、形質転換された細胞を、グルコース含有培地中での生育によって選択することができる。酵母における使用に適したプロモーターおよびターミネーターとしては、糖分解酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、米国特許第４，６１５，９７４号；およびＢｉｔｔｅｒ，米国特許第４，９７７，０９２号を参照のこと）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のものが挙げられる。米国特許第４，９９０，４４６号；同第５，０６３，１５４号；同第５，１３９，９３６号；および同第４，６６１，４５４号もまた参照のこと。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉおよびＣａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａをはじめとした他の酵母に対する形質転換系が、当該分野で公知である。例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９−３４６５，１９８６；Ｃｒｅｇｇ，米国特許第４，８８２，２７９号；およびＲａｙｍｏｎｄら、Ｙｅａｓｔ  １４：１１−２３，１９９８を参照のこと。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞は、ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号の方法に従って利用され得る。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏら、米国特許第５，１６２，２２８号によって開示されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａを形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ，米国特許第４，４８６，５３３号によって開示されている。Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおける組換えタンパク質の生成は、米国特許第５，７１６，８０８号；同第５，７３６，３８３号；同第５，８５４，０３９号；および同第５，８８８，７６８号において���示されている。
【０１１４】
細菌のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓおよび他の属の菌株を含む原核生物の宿主細胞もまた、本発明の範囲内において有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換するための手法およびその宿主内においてクローニングされた外来ＤＮＡ配列を発現するための手法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌においてポリペプチド融合物が発現されるとき、そのポリペプチドは、細胞質において代表的には不溶性顆粒として保持され得るか、または細菌の分泌配列によって細胞周辺腔に向かい得る。前者の場合、それらの細胞は、溶解され、その顆粒を回収し、例えば、グアニジンＨＣｌまたは尿素を用いて変性する。次いで、変性されたポリペプチドは、尿素溶液および還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとの組み合わせに対する透析の後の、緩衝食塩水溶液に対する透析などによって、その変性剤を希釈することによって再度折り畳まれ得る。代替において、そのタンパク質は、細胞質から可溶型として回収され得、そして変性剤を使用せずに単離され得る。そのタンパク質は、水性抽出物、例えば、リン酸緩衝食塩水中の水性抽出物として細胞から回収される。目的のタンパク質を捕捉するために、その抽出物を、固定化された抗体またはヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムなどのクロマトグラフィ媒質に直接適用する。分泌型のポリペプチドは、細胞を破壊し（例えば、超音波処理または浸透圧ショックによって）、タンパク質を回収することによって、可溶性かつ機能性の形態で細胞周辺腔から回収され得、それにより、変性および再折りたたみの必要性が不要になる。例えば、Ｌｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２６７：２１３−２２６，２００２を参照のこと。
【０１１５】
形質転換された宿主細胞またはトランスフェクトされた宿主細胞は、栄養分および選択された宿主細胞の生育に必要な他の成分を含む培養液中で、従来の手順に従って培養される。限定培地および複合培地（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｅｄｉａ）を含む種々の適当な培地は、当該分野で公知であり、それらは一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを含む。培地は、必要に応じて、成長因子または血清のような成分も含み得る。増殖培地は、一般に、外から加えられたＤＮＡを含む細胞について、例えば、薬物選択、または発現ベクター上に保有されている選択マーカーもしくは宿主細胞中に同時にトランスフェクトされた選択マーカーによって補完される必須栄養素の不足によって、選択する。
【０１１６】
本発明のタンパク質は、従来のタンパク質精製法によって、代表的には、クロマトグラフィ法の組み合わせによって、精製される。Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ，１９８８）；およびＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）を広く参照のこと。免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを含むタンパク質は、固定化されたプロテインＡに対するアフィニティークロマトグラフィによって精製され得る。ゲル濾過などの追加の精製工程を用いることにより、所望のレベルの純度を得ることできるか、または脱塩、緩衝液交換などを行うことができる。
【０１１７】
本発明のポリペプチドは、混入している高分子、特に、他のタンパク質および核酸に関して、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度または９５％超（例えば、９６％、９７％、９８％または９９％超）の純度まで精製され得、そして感染性物質および発熱性物質を含まないことがある。本発明のポリペプチドはまた、９９．９％超純粋の薬学的に純粋な状態まで精製され得る。ある特定の調製物において、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に、動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０１１８】
一般に、硫安塩析および酸抽出またはカオトロープ抽出が、サンプルの分画に使用され得る。例示的な精製工程としては、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣおよび逆相高速液体クロマトグラフィが挙げられ得る。適当なクロマトグラフィ媒質としては、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカなどが挙げられる。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥおよびＱ誘導体が適当である。例示的なクロマトグラフィ媒質としては、フェニル、ブチルまたはオクチル基で誘導体化された媒質（例えば、Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチル６５０（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）など）；またはＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ  ７１（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ）などのポリアクリル樹脂などが挙げられる。適当な固体支持体としては、使用される条件下において不溶性である、ガラスビーズ、シリカベースの樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂などが挙げられる。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基および／または炭水化物部分によるタンパク質の付着を可能にする反応基で修飾され得る。
【０１１９】
カップリング化学の例としては、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、ならびにカルボジイミドカップリング化学用のカルボキシルおよびアミノ誘導体が挙げられる。これらおよび他の固形媒質が、当該分野において周知で、広く使用されており、それらは、商業的供給業者から入手可能である。ポリペプチドを単離するためおよび精製するための特定の方法の選択は、通例の計画事項であり、一つには、選択される支持体の特性によって決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８８）およびＤｏｏｎａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）を参照のこと。
【０１２０】
可溶性ＦｃγＲの単離および精製のさらなるバリエーションが、当業者によって考案され得る。例えば、抗ＦｃγＲ抗体が、免疫親和性精製によって大量のタンパク質を単離するために使用され得る。
【０１２１】
本発明のポリペプチドは、特定の特性を活用することによっても単離され得る。例えば、固定化された金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィを用いることにより、ポリヒスチジンタグを含むタンパク質を含むヒスチジンリッチタンパク質が精製され得る。簡潔には、まず、ゲルを二価の金属イオンで帯電させることにより、キレートを形成する（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：１（１９８５））。ヒスチジンリッチタンパク質は、使用される金属イオンに応じて異なる親和性でこのマトリックスに吸着され、そして競合溶出、ｐＨの低下または強力なキレート剤の使用によって溶出される。他の精製方法としては、レクチンアフィニティークロマトグラフィおよびイオン交換クロマトグラフィによるグリコシル化タンパク質の精製（Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（ｅｄ．），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：５２９，１９９０）が挙げられる。本発明のさらなる実施形態の中で、目的のポリペプチドと親和性タグ（例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン、サブスタンスＰ、ＦｌａｇＴＭペプチドまたは抗体もしくは他の特異的な結合物質が利用可能な別のポリペプチドもしくはタンパク質）との融合物が、精製を容易にするために構築され得る。
【０１２２】
可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドまたはそのフラグメントは、上に記載されたように化学合成を通じても調製され得る。ＦｃγＲポリペプチドは、単量体または多量体（例えば、ホモ二量体）であり得；グリコシル化されてもよいし、グリコシル化されなくてもよく；ＰＥＧ化されてもよいし、ＰＥＧ化されなくてもよく；最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【０１２３】
いくつかのバリエーションにおいて、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、ポリマーへの連結によって化学修飾される。代表的には、そのポリマーは、水溶性であり、ハイブリッドＦｃγＲポリペプチド結合体は、生理学的環境などの水性環境において沈殿しない。適当なポリマーの例は、単一の反応基（例えば、アシル化のための活性なエステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように修飾されているものである。このようにして、重合の程度が制御され得る。そのポリマーは、分枝していてもよいし、分枝していなくてもよい。ハイブリッドＦｃγＲポリペプチド結合体は、そのような水溶性ポリマーの混合物も含み得る。ポリペプチドおよび水溶性ポリマー部分を含む結合体を作製するための一般的な方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚらに対する米国特許第５，３８２，６５７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄらに対する米国特許第５，７３８，８４６号；Ｎｉｅｆｏｒｔｈら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５９：６３６，１９９６；Ｍｏｎｋａｒｓｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７：４３４，１９９７を参照のこと）。そのような方法は、ハイブリッドＦｃγＲを含むホモ二量体、ヘテロ二量体または多量体の可溶性レセプター結合体を作製するために使用され得る。
【０１２４】
可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチド結合体の１つの例は、ＦｃγＲポリペプチドのＮ末端に付着されているポリアルキルオキシド部分を含む。ＰＥＧは、１つの適当なポリアルキルオキシドである。例証として、可溶性ハイブリッドＦｃγＲは、ＰＥＧで修飾され得る（「ＰＥＧ化」として知られるプロセス）。可溶性ハイブリッドＦｃγＲのＰＥＧ化は、当該分野で公知のＰＥＧ化反応のいずれかによって行われ得る（例えば、ＥＰ０１５４３１６；Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９，１９９２；Ｄｕｎｃａｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２７：２９０，１９９４；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ６８：１，１９９８を参照のこと）。例えば、ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子を用いるアシル化反応またはアルキル化反応によって行われる。代替のアプローチにおいて、ハイブリッドＦｃγＲ結合体は、活性化されたＰＥＧを縮合することによって形成される（ここで、ＰＥＧの末端のヒドロキシ基またはアミノ基は、活性化されたリンカーによって置き換えられている）（例えば、Ｋａｒａｓｉｅｗｉｃｚらに対する米国特許第５，３８２，６５７号を参照のこと）。ＰＥＧ化反応のために、ポリマー分子の代表的な分子量は、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａまたは約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａである。水溶性ポリマーと可溶性ハイブリッドＦｃγＲとのモル比は、通常、１：１〜１００：１の範囲内である。代表的には、水溶性ポリマーと可溶性ハイブリッドＦｃγＲとのモル比は、ポリＰＥＧ化に対して１：１〜２０：１およびモノＰＥＧ化に対して１：１〜５：１である。
【０１２５】
ＩＩＩ．可溶性ハイブリッドＦｃγレセプターを使用するための方法および組成物
本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、ＩｇＧに対して特異的に作用し、ＦｃγレセプターへのＩｇＧの結合を阻害し得るので、ＩｇＧおよびＦｃγレセプター活性を阻害するために有用である。したがって、本発明の別の局面では、本明細書中に記載されるような可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、ＩｇＧとＦｃレセプターとの相互作用を阻害するため、ならびにそのようなＩｇＧ−ＦｃＲ相互作用に生理学的に相関するもの（例えば、抗原抗体免疫複合体の析出、シグナル伝達、細胞表面Ｆｃレセプターを有する免疫細胞からのサイトカイン分泌）をインビボまたはインビトロにおいて阻害するために使用される。本発明の可溶性ＦｃγＲポリペプチドの活性は、例えば、ＩｇＧの存在下における増殖アッセイ、ルシフェラーゼアッセイまたは結合アッセイ、ならびに本明細書中に記載されるかまたは別途当該分野で公知であるような、ＩｇＧとＦｃγＲとの相互作用を評価するための他の生物学的アッセイもしくは生化学的アッセイにおいてアッセイされ得る。
【０１２６】
本明細書中に示されるように、可溶性ＦｃγＲＩＡポリペプチドは、免疫複合体の析出を完全に阻止し、また、免疫複合体の結合およびシグナル伝達も阻止した（下記の実施例において詳細に記載される）。さらに、可溶性ＦｃγＲＩＡは、皮膚アルサス反応ならびに関節炎のコラーゲン抗体誘発モデルおよびコラーゲン誘発モデルにおいて炎症を阻止した。これらの知見は、可溶性ＦｃγＲＩＡが、自己免疫疾患および炎症を処置するために使用され得る強力な治療剤であることを示し、そのような状態を処置するために、本明細書中に記載されるようなハイブリッドＦｃγレセプターを含むＦｃγに対する他の可溶性で高親和性のレセプターを使用することをさらに支持する。
【０１２７】
それゆえ、本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、ＩｇＧに結合することによって、およびＩｇＧと内在性Ｆｃγレセプターとの結合を阻害することによって、免疫応答を調節するために特に有用である。したがって、本発明は、炎症を有するか、または免疫疾患もしくは免疫障害を有する被験体を処置するために、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドを使用することを含む。適当な被験体としては、ヒトなどの哺乳動物が挙げられる。本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、ＳＬＥ、クリオグロブリン血症、自己免疫性血小板減少症（ＩＴＰおよびＴＴＰ）、成人型皮膚筋炎、Ｃ型肝炎に関連するクリオグロブリン血症、Ｂ型肝炎に関連する結節性多発動脈炎、ギランバレー症候群、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、抗リン脂質抗体症候群、血管炎、ブドウ膜炎、血清病、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡）、外因性抗原に関連する疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、炎症性の皮膚状態、内毒素血症、関節炎、喘息、ＩＢＤ、大腸炎、乾癬性関節炎、関節リウマチまたは他のＩｇＧもしくは免疫複合体に媒介される炎症状態に対して治療的に使用するために、インビボにおいてＩｇＧおよび／または免疫複合体の炎症性作用を阻害するために使用され得る。
【０１２８】
ある特定のバリエーションにおいて、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、ＩｇＧ媒介性炎症状態、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；狼瘡（腎炎、非腎性、円板状、脱毛症を含む）；クリオグロブリン血症；混合結合組織病；自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；血栓性血小板減少性紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ）（ＴＴＰ））；シェーグレン症候群；成人型皮膚筋炎；Ｃ型肝炎に関連するクリオグロブリン血症；Ｂ型肝炎に関連する結節性多発動脈炎；ギランバレー症候群；グッドパスチャー症候群；慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー；抗リン脂質抗体症候群；血管炎；ブドウ膜炎；血清病；外因性抗原に関連する疾患；関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎）；乾癬；アトピー性皮膚炎；炎症性の皮膚状態；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病、潰瘍性大腸炎）に関連する応答；憩室症；喘息；膵炎；Ｉ型（若年発症）糖尿病（ＩＤＤＭ）；膵癌；膵炎；バセドウ病；慢性自己免疫性じんま疹；多発性筋炎／皮膚筋炎；中毒性表皮壊死症；全身性強皮症および全身性硬化症；呼吸窮迫症候群；成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；髄膜炎；アレルギー性鼻炎；脳炎；大腸炎；糸球体腎炎；ＩｇＧ媒介性アレルギー性状態；アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎；多発性硬化症；アレルギー性脳脊髄炎；ウェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症であるサルコイドーシス；顆粒球減少症；再生不良性貧血；クームス陽性貧血；ダイアモンドブラックファン貧血；自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血；悪性貧血；赤芽球癆（ＰＲＣＡ）；第ＶＩＩＩ因子欠乏症；血友病Ａ；自己免疫性好中球減少症；汎血球減少症；白血球減少症；白血球漏出を伴う疾患；ＣＮＳ炎症性障害；多臓器障害症候群；重症筋無力症；抗糸球体基底膜病；ベーチェット（Ｂｅｃｈｅｔ）病；キャッスルマン症候群；イートン・ランバート筋無力症症候群；レイノー症候群；スティーブンス・ジョンソン症候群；骨髄移植片拒絶；実質臓器移植片拒絶（高いパネル反応性抗体価に対する前処置を含む）；移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）；水疱性類天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ  ｂｕｌｌｏｕｓ）；天疱瘡（尋常性、落葉状を含むすべて）；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター病；全身硬直症候群；免疫複合体腎炎；精巣または卵巣の自己免疫疾患（例えば、自己免疫性の（ａｕｔｏｉｍｕｎｅ）睾丸炎または卵巣炎）；原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性内分泌疾患、例えば、自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病または自己免疫性多腺症候群（または多腺性内分泌障害症候群）；自己免疫性肝炎；リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）；ＮＳＩＰに対する閉塞性細気管支炎（非移植）、大血管炎（リウマチ性多発筋痛症および巨細胞（高安）動脈炎を含む）；中血管炎（川崎病および結節性多発動脈炎を含む）；強直性脊椎炎；急速進行性糸球体腎炎；原発性胆汁性肝硬変；セリアックスプルー（グルテン性腸症）；ＡＬＳ；冠動脈疾患；またはＩｇＧもしくは免疫複合体の阻害が望まれる別の場合を処置するために使用される。
【０１２９】
本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、脳の脈絡膜神経叢による免疫複合体の沈着に関連する心理学的障害を処置するためにも使用され得る。そのような沈着は、例えば、全身性エリテマトーデスなどの疾患の中枢神経系および末梢神経系の症状発現（ｍａｎｉｓｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ）の根底にあることがある。一部の患者では、これらの症状発現は、罹患率および死亡率の主な原因であり、その徴候としては、認知機能不全、特に、記憶および論理的思考の困難、精神病、頭痛および発作が挙げられる。別の例として、脈絡膜神経叢内の免疫複合体の沈着は、本態性混合型クリオグロブリン血症に見られる末梢神経障害に関与し得る（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｋａｓｐｅｒらｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００５）を参照のこと）。
【０１３０】
本明細書中に記載される処置方法の各実施形態において、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、処置法が捜し求められている疾患または障害の管理に関連する従来の方法論と一致する様式で送達される。本明細書中の開示に従って、有効量の薬剤が、その疾患または障害を予防するかまたは処置するために十分な時間にわたって、かつ予防するかまたは処置するために十分な条件下において、そのような処置を必要とする被験体に投与される。
【０１３１】
本明細書中に記載されるような可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドの投与が適した被験体には、特定のＩｇＧ媒介性炎症状態を発症するリスクが高い患者、ならびにすでにＩｇＧ媒介性炎症状態を示している患者が含まれる。ある特定の実施形態において、その被験体は、処置法が捜し求められている疾患または障害を有すると診断されている。さらに、被験体は、その疾患または障害の任意の変化について（例えば、その疾患または障害の臨床上の症状の増加または減少について）、処置の経過中、モニターされ得る。また、いくつかのバリエーションにおいて、その被験体は、ＩｇＧとＦｃγレセプターとの相互作用の阻害を含む処置を必要とする別の疾患または障害に罹患していない。
【０１３２】
予防的な適用では、薬学的組成物または薬が、特定の疾患に罹患しやすいかまたは別途そのリスクのある患者に、その疾患のリスクを排除するかもしくは低下させるか、またはその疾患の発症を遅延させるのに十分な量で投与される。治療的な適用では、そのような疾患が疑われるかまたはそのような疾患にすでに罹患している患者に、その疾患の症状およびその合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、組成物または薬が投与される。このことを達成するのに適切な量は、治療的または薬学的に有効な用量または量と称される。予防レジメンと治療レジメンの両方において、本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、通常、十分な応答（例えば、ＩｇＧとＦｃγＲとの相互作用またはＩＣ沈着に関連する炎症性メディエーターの阻害）が達成されるまで、数回の投薬で投与される。代表的には、その応答は、モニターされ、そして所望の応答が弱まり始めると、投薬が繰り返される。
【０１３３】
本発明の方法に従う処置に適した被験体患者を同定するために、一般に認められたスクリーニング方法を用いて、特定のＩｇＧ媒介性炎症状態に関連する危険因子が測定され得るか、または被験体において特定されている既存の障害の状態が測定され得る。そのような方法は、例えば、個体が特定の疾患と診断されている親族を有するか否かを判定する工程を包含し得る。スクリーニング方法は、例えば、遺伝的要素を有すると知られている特定の疾患に対する家系の状態を判定する従来の精密検査も含み得る。このような目的で、ヌクレオチドプローブが、目的の特定疾患に関連する遺伝マーカーを有する個体を同定するために日常的に使用され得る。さらに、特定の疾患に対するマーカーを同定するために有用である多岐にわたる免疫学的方法が当該分野で公知である。例えば、モノクローナル抗体プローブを使用して特定の炎症性疾患に関連する抗原または自己抗体を検出する様々なＥＬＩＳＡイムノアッセイ法が、利用可能であり、当該分野で周知である。既知の患者の症候学、年齢因子、関連危険因子などによって示されるようなスクリーニングが実行され得る。これらの方法によって、臨床医は、本明細書中に記載される処置するための方法を必要とする患者を日常的に選択することが可能になる。これらの方法によれば、ＩｇＧ媒介性炎症の阻害は、独立した処置プログラムとして、または他の処置に対する追跡、補助もしくは同等の処置レジメンとして、実行され得る。
【０１３４】
投与のために、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、薬学的組成物として製剤化される。可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドを含む薬学的組成物は、薬学的に有用な組成物を調製する公知の方法に従って製剤化され得、ここで、治療的分子は、薬学的に許容可能なキャリアを含む混合物中に混合される。組成物は、その投与がレシピエント患者によって許容され得る場合、「薬学的に許容可能なキャリア」であるといわれる。薬学的に許容可能なキャリアは、処置される状態および送達様式にとって適切であるとき、水性であり得るか、脂質であり得るか、半固体もしくは固体であり得る。薬学的に許容可能な水性キャリアとしては、食塩水、緩衝食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）、５％デキストロース水溶液などが挙げられるがこれらに限定されない。他の適当なキャリアは、当業者に周知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ  ｅｄ．１９９５）を参照のこと）。製剤は、１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上におけるタンパク質損失を防ぐアルブミンなどをさらに含み得る。
【０１３５】
本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドを含む薬学的組成物は、有効量で被験体に投与される。したがって、その組成物は、通常、統計学的に有意な有益効果（例えば、疾患の進行または重症度の統計学的に有意な緩和または逆転）をもたらす量で投与される。正確な用量は、処置される状態の性質および重症度、患者の体質などを考慮し、一般に認められている標準に従って、臨床医によって決定される。用量の決定は、当該分野における通常のスキルレベルの範囲内である。本発明の方法に従って、ポリペプチドは、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、心房内、関節内、非経口、鼻腔内、肺内、経皮的、胸膜内、鞘内および経口の投与経路をはじめとした種々の投与様式によって、被験体に投与され得る。予防および処置の目的で、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、投与経路および投与方法に応じて、長時間にわたる連続的な送達による単回ボーラス送達（例えば、連続的な経皮的送達または長時間の注入）または反復投与プロトコルで（例えば、毎時間、毎日または毎週に基づいて）、被験体に投与され得る。静脈内投与は、ボーラス注射、または代表的には１時間〜数時間にわたる注入によるものであり得る。徐放製剤が使用され得る。
【０１３６】
有効な投薬量の決定は、代表的には、ヒト臨床試験によって追跡される動物モデル研究に基づき、モデル被験体において主題の疾患または障害の発生率または重症度を有意に低下させる有効な投薬量および投与プロトコルを決定することによって導かれる。本発明の組成物の有効な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の医薬、処置が予防的であるのか治療的であるのか、ならびに組成物自体の特定の活性および個体において所望の応答を誘発する能力をはじめとした多くの様々な因子に応じて変動する。通常、患者は、ヒトであるが、いくつかの疾患では、患者は、非ヒト哺乳動物であり得る。代表的には、投与レジメンは、最適な治療的応答をもたらすように、すなわち、安全性および有効性が最適になるように、調整される。したがって、治療的または予防的に有効な量は、ＩｇＧ媒介性炎症を阻害する有益な作用が、望まれない任意の副次的な作用にまさるものでもある。可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドを投与する場合、投薬量は、代表的には、約０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたは１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、１０μｇ〜５ｍｇ／ｋｇ被験体体重に及ぶ。より特定の実施形態において、その薬剤の有効量は、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。この範囲内の投薬量は、単回または複数回の投与（例えば、１日あたり複数回の投与、または毎日、毎週、隔週または毎月の投与を含む）によって達成され得る。例えば、ある特定のバリエーションにおいて、レジメンは、初回の投与の後の、毎週または隔週の間隔での複数回の投与からなる。別のレジメンは、初回の投与の後の、毎月または隔月の間隔での複数回の投与からなる。あるいは、投与は、ＩｇＧ媒介性炎症および／またはその疾患もしくは障害の臨床症状をモニターすることによって示されるような、不規則な基準に基づき得る。
【０１３７】
薬学的組成物の投薬量は、標的部位において所望の濃度を維持するように主治医によって変更され得る。例えば、静脈内の送達様式が選択されている場合、標的組織における薬剤の血流中の局所濃度は、被験体の状態および予定され測定される応答に応じて、１リットルあたり約１〜５０ナノモルの組成物、時折、１リットルあたり約１．０ナノモル〜１リットルあたり１０、１５または２５ナノモルであり得る。それより高いまたは低い濃度が、送達様式、例えば、経皮送達  対  粘膜表面への送達に基づいて、選択され得る。投薬量は、投与される製剤の放出速度、例えば、散剤に対する点鼻薬、徐放経口または注射される粒子、経皮的製剤などに基づいて調整されるべきである。同じ血清濃度レベルを達成するために、例えば、５ナノモル濃度という放出速度（標準的な条件下において）を有する緩効性粒子は、１０ナノモル濃度という放出速度を有する粒子の約２倍の投薬量で投与され得る。
【０１３８】
可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドを含む薬学的組成物は、液体の形態、エアロゾルまたは固体の形態で、供給され得る。液体の形態は、注射可能な溶液、エアロゾル、液滴、トポロジカル（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ）溶液および経口懸濁液によって例証される。例示的な固体の形態としては、カプセル、錠剤および放出制御型が挙げられる。後者の形態は、ミニ浸透圧ポンプおよび植込錠によって例証される（例えば、Ｂｒｅｍｅｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９，１９９７；Ｒａｎａｄｅ，“Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９５−１２３（Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｂｒｅｍｅｒら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｐｕｍｐｓ”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ２３９−２５４（Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ，ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；Ｙｅｗｅｙら、“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｉｍｐｌａｎｔ”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９３−１１７（Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ，ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）を参照のこと）。他の固体の形態としては、クリーム、ペースト、他のトポロジカル塗布物などが挙げられる。
【０１３９】
リポソームは、例えば、静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下に、または経口投与、吸入もしくは鼻腔内投与を介して、治療的なポリペプチドを被験体に送達する１つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を囲む１つ以上の脂質二重層からなる微視的ベシクルである（Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇら、Ｅｕｒ．．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ６１，１９９３；Ｋｉｍ，Ｄｒｕｇｓ  ４６：６１８，１９９３；Ｒａｎａｄｅ，“Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ”Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ３−２４（Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を広く参照のこと）。リポソームは、細胞膜と組成が似ており、結果として、リポソームは、安全に投与され得、生分解性である。調製方法に応じて、リポソームは、単層または多層であり得、リポソームは、サイズが様々であり得、直径は０．０２μｍから１０μｍ超に及ぶ。種々の薬剤が、リポソーム内に被包され得る：疎水性の薬剤は、二重層の中に分配され、親水性の薬剤は、内側の水性空間の中に分配される（例えば、Ｍａｃｈｙら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  １９８７）；Ｏｓｔｒｏら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．４６：１５７６，１９８９を参照のこと）。さらに、リポソームのサイズ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変更することによって、被包される薬剤の治療的な利用可能性を制御することが可能である。
【０１４０】
リポソームは、実質的にいずれのタイプの細胞にも吸着し得、次いで、被包された薬剤をゆっくり放出し得る。あるいは、吸収されたリポソームは、食作用性である細胞のエンドサイトーシスによって取り込まれ得る。エンドサイトーシスの後、リポソームの脂質がリソソーム内で分解され、被包されていた薬剤が放出される（Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４４６：３６８，１９８５を参照のこと）。静脈内投与の後、小さいリポソーム（０．１〜１．０μｍ）は、代表的には、主に肝臓および脾臓に位置する細網内皮系の細胞によって取り込まれる一方で、３．０μｍより大きいリポソームは、肺に沈着する。この細網内皮系の細胞によるより小さいリポソームの優先的な取り込みは、化学療法剤をマクロファージおよび肝臓の腫瘍に送達するために用いられている。
【０１４１】
細網内皮系は、大用量のリポソーム粒子による飽和または薬理学的手段による選択的なマクロファージの不活性化をはじめとしたいくつかの方法によって回避され得る（Ｃｌａａｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８０２：４２８，１９８４を参照のこと）。さらに、糖脂質またはポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｌｅｎｅ）グリコールによって誘導体化されたリン脂質をリポソーム膜に組み込むことによって、細網内皮系による取り込みが著しく少なくなることが示されている（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６８：１３３，１９９１；Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５０：９，１９９３を参照のこと）。
【０１４２】
リポソームは、リン脂質の組成を変更するか、またはレセプターもしくはカウンターレセプターをリポソームに挿入することによって、特定の細胞または臓器を標的化するようにも調製され得る。例えば、高含有量の非イオン性界面活性剤を用いて調製されたリポソームが、肝臓を標的化するために使用されている（例えば、Ｈａｙａｋａｗａらに対する日本国特許０４−２４４，０１８；Ｋａｔｏら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１６：９６０，１９９３を参照のこと）。これらの製剤は、ダイズホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、α−トコフェロールおよびエトキシ化硬化（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ）ひまし油（ＨＣＯ−６０）をメタノール中で混合し、その混合物を真空下で濃縮し、次いで、その混合物を水で再構成することによって調製された。ダイズ由来ステリルグルコシド混合物（ＳＧ）およびコレステロール（Ｃｈ）を含むジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）のリポソーム製剤もまた肝臓を標的化すると示されている（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：８８１，１９９７を参照のこと）。
【０１４３】
あるいは、様々な標的化カウンターレセプター（例えば、抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミンおよび輸送タンパク質）が、リポソームの表面に結合され得る。例えば、肝臓を標的化するために、リポソームは、分枝タイプのガラクトシル脂質誘導体で修飾されることにより、肝臓細胞の表面上でもっぱら発現されるアシアロ糖タンパク質（ガラクトース）レセプターを標的化することができる（Ｋａｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１４：２８７，１９９７；Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０：２５９，１９９７を参照のこと）。組織標的化のより一般的なアプローチでは、標的細胞を、その標的細胞によって発現されるカウンターレセプターに特異的なビオチン化抗体で予め標識する（Ｈａｒａｓｙｍら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３２：９９，１９９８を参照のこと）。遊離抗体を血漿から除去した後、ストレプトアビジン結合体化リポソームを投与する。別のアプローチでは、標的化抗体をリポソームに直接付着する（Ｈａｒａｓｙｍら、前出を参照のこと）。
【０１４４】
本発明のポリペプチドは、タンパク質マイクロカプセル化の標準的な手法を用いてリポソーム内に被包され得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１０９９，１９８１；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１８５３，１９９０；Ｃｏｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６３：９５，１９９１；Ａｌｖｉｎｇら、“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ”Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．ＩＩＩ）３１７（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９９３）；Ｗａｓｓｅｆら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１２４，１９８７を参照のこと）。上で述べたように、治療的に有用なリポソームは、種々の構成要素を含み得る。例えば、リポソームは、ポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含み得る（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５０：９，１９９３を参照のこと）。
【０１４５】
分解可能なポリマーミクロスフェアは、高い全身性レベルの治療的タンパク質を維持するように設計されている。ミクロスフェアは、分解可能なポリマー（例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、非生分解性酢酸エチルビニルポリマー）から調製され、ここで、タンパク質は、そのポリマーの中に封入される（例えば、Ｇｏｍｂｏｔｚ  ａｎｄ  Ｐｅｔｔｉｔ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：３３２，１９９５；Ｒａｎａｄｅ，“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ５１−９３（Ｒａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｒｏｓｋｏｓ  ａｎｄ  Ｍａｓｋｉｅｗｉｃｚ，“Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ４５−９２（Ｓａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｅｎ，ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；Ｂａｒｔｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１１６１，１９９８；Ｐｕｔｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：１５３，１９９８；Ｐｕｔｎｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５４８，１９９８を参照のこと）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされたナノスフェアもまた、治療的タンパク質を静脈内投与するためのキャリアを提供し得る（例えば、Ｇｒｅｆら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１６７，１９９７を参照のこと）。
【０１４６】
例えば、Ａｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ，５ｔｈ  ｅｄ．１９９０）；Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ  ｅｄ．１９９５）およびＲａｎａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）によって示されているように、他の剤形が当業者によって考案され得る。
【０１４７】
薬学的組成物は、本発明の可溶性ＦｃγＲポリペプチドを含む容器を備えるキットとして供給され得る。本発明のＦｃγＲポリペプチドは、単回投与もしくは反復投与が意図された注射可能な溶液の形態で、または注射の前に再構成される無菌粉末として、提供され得る。あるいは、そのようなキットは、治療的なポリペプチドを投与するための、乾燥粉末撒布器（ｄｉｓｐｅｒｓｅｒ）、液体エアロゾル発生器または噴霧器を備え得る。そのようなキットは、薬学的組成物の適応症および使用法についての書面による情報をさらに備え得る。さらに、そのような情報は、可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチド含有組成物が、ＦｃγＲに対する既知の過敏症を有する患者では禁忌であるという声明を含み得る。
【０１４８】
上で述べたように、本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、多岐にわたるＩｇＧ媒介性炎症性疾患に対する治療的な可能性を有する。生物が侵入物質をかわすための防御反応である炎症は、多くの細胞性および体液性のメディエーターが関与する、カスケードで生じる事象である。一方、炎症反応を抑制することにより、宿主は免疫無防備状態になり得る；しかしながら、炎症は、抑制しないままであると、例えば、慢性炎症性疾患を含む重篤な合併症をもたらし得る。重要なことには、これらの多種多様な疾患状態は、共通の炎症性メディエーターを共有する。炎症を特徴とする集合的な疾患は、ヒトの罹患率および死亡率に対して大きな影響を及ぼす。本明細書中に記載される研究は、とりわけ、可溶性ＦｃγＲが免疫複合体の結合およびシグナル伝達を阻止する能力、ならびに可溶性ＦｃγＲがＩｇＧ媒介性疾患を処置する能力を示す。したがって、本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、膨大な数のヒトおよび動物疾患、例えば、本明細書中で検討されるＩｇＧおよび免疫複合体に媒介される疾患に対して治療的な可能性を有する。可溶性ハイブリッドＦｃγＲを用いる処置を受け入れやすい例示的な疾患は、下記のＩＩＩ（Ａ）およびＩＩＩ（Ｂ）の項においてさらに記載される。
【０１４９】
Ａ．免疫複合体媒介性疾患
抗原とその同族抗体との結合によって免疫複合体が生成され、そして組織内におけるこれらの免疫複合体の沈着が種々の自己免疫疾患の根底にある発症機序である（Ｊａｎｃａｒ  ａｎｄ  Ｃｒｅｓｐｏ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：４８−５５，２００５を参照のこと）。これらの疾患としては、結合組織の自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚筋炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群および混合結合組織病）；多種多様な病因の疾患（例えば、クリオグロブリン血症、結節性多発動脈炎および抗リン脂質症候群）；ならびに外因性抗原に関連する疾患（細菌、ウイルスおよび寄生虫の感染症を含む）、有機塵に関連する疾患および血清病型の疾患（感染症、毒ヘビ咬傷および薬物過敏症に対する受動免疫療法を含む）が挙げられる。これらの状態の各々は、特定の抗原抗体対によって引き起こされ、それらによって示され、組織損傷に対する機構：循環免疫複合体の形成後のその複合体の組織内の沈着が、類似している（Ｊａｎｃａｒ  ａｎｄ  Ｃｒｅｓｐｏ，前出を参照のこと）。抗原抗体複合体は、免疫複合体が細胞表面Ｆｃγレセプターに結合することによって部分的に媒介されるプロセスである炎症の引き金を引くことによって、およびその抗原抗体複合体が補体を固定する能力によって、組織を損傷し得る。
【０１５０】
正常な状況において、免疫複合体は、細網内皮系の食作用性の細胞によって取り除かれる。しかしながら、いくつかの場合において、免疫複合体は、組織内に蓄積し、沈着することにより、ＩＩＩ型過敏反応を引き起こす（Ｊａｎｃａｒ  ａｎｄ  Ｃｒｅｓｐｏ，前出を参照のこと）。免疫複合体が血液中に形成されると、抗原が進入した部位から移動した部位において沈着が生じ得る。複合体の沈着は、例えば、血漿の濾過が生じる部位である、血管壁上、関節の滑膜内、腎臓の糸球体基底膜上および脳の脈絡膜神経叢上において日常的に観察される（Ｊａｎｃａｒ  ａｎｄ  Ｃｒｅｓｐｏ，前出を参照のこと）。これは、クリオグロブリン血症などの免疫複合体媒介性疾患において観察される関節炎、血管炎および糸球体腎炎の高発生率の理由である。
【０１５１】
免疫複合体は、組織内に沈着した後、ＩｇＧのＦｃドメインを介して細胞表面ＦｃγＲに結合する。前に述べたように、ＦｃγＲは、免疫系の体液性の部門と細胞性の部門とを結びつけるものとして重大な役割を果たす（Ｃｏｈｅｎ−Ｓｏｌａｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．９２：１９９−２０５，２００４；Ｈｏｇａｒｔｈら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：７９８−８０２，２００２；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  ９：１６９−１９０，２００５；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２８：３０５−３１９，２００６を参照のこと）。ＩｇＧのＦｃ部分によるこれらの細胞表面レセプターの連結は、種々の免疫エフェクター機能（例えば、抗原提示、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用および炎症性メディエーターの放出）の引き金を引くことができる。Ｆｃγレセプターの３つの主要なクラスであるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、ヒト免疫系の細胞の特定のサブセットおよび重複したサブセット内において発現され、その発現パターンは、免疫ホメオスタシスにおける多種多様な役割を説明する（Ｎａｋａｍｕｒａら、前出を参照のこと）。単量体ＩｇＧに対して高親和性を示すＦｃγＲＩを除いて、他のサブクラスのＦｃγＲは、低親和性ＩｇＧレセプターである（Ｃｏｈｅｎ−Ｓｏｌａｌら、前出；Ｈｏｇａｒｔｈら、前出を参照のこと）。しかしながら、これらの細胞レセプターは、複数のＦｃ：ＦｃγＲ相互作用を通じて抗原抗体免疫複合体（ＩＣ）と高アビディティーで結合する。この特性は、ＦｃγＲＩＩおよび／またはＦｃγＲＩＩＩを発現している細胞が、細胞外環境をサンプリングすることおよび飽和量の単量体ＩｇＧにもかかわらずＩＣに対して適切に応答することを可能にすると考えられる（Ｈｏｇａｒｔｈら、前出を参照のこと）。
【０１５２】
この能力を示す可溶性レセプターを同定するスクリーニングの試みの一部として、天然のヒトＦｃγＲの各々の可溶性細胞外ドメインが、ＣＨＯ細胞において発現され、その条件培地から均一に精製された。ｒｈ−ＦｃγＲの各々が、いくつかのインビトロ系において免疫複合体媒介性炎症性事象を減少させたのに対し、高親和性レセプターのＦｃγＲＩＡだけが、マウスの皮膚の逆受身アルサス反応における炎症を一貫して減少させた。この結果は、単量体ＩｇＧに対する高親和性レセプターとしてのＦｃγＲＩＡが、一般に、インビボにおいて循環単量体ＩｇＧとともに飽和されているのでＩＣへの結合には利用可能でないと予想される点において予想外だった。ＦｃγＲＩＡの全身送達もまた関節炎のマウスのコラーゲン抗体誘導モデルにおいて炎症を無効にしたという観察結果は、ＦｃγＲＩＡが、免疫複合体媒介性疾患を処置するための新規治療法であり得ることを示唆する。さらに、これらの結果は、そのような状態を処置するために、本明細書中に記載されるようなハイブリッドＦｃγレセプターを含むＦｃγに対する他の可溶性で高親和性のレセプターを使用することを支持する。
【０１５３】
したがって、細胞表面Ｆｃガンマレセプターへの免疫複合体の結合を阻止することによって、本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドは、炎症性サイトカインの分泌を減少させ得、好中球などの炎症細胞型の浸潤を減少させ得る。本明細書中に記載される研究によって証明されるように、可溶性ＦｃγＲＩＡは、抗原抗体免疫複合体の析出を阻止し、マスト細胞による免疫複合体媒介性のサイトカイン分泌を阻害した（実施例９および１０，後掲を参照のこと）。マウスにおける研究では、さらに、可溶性ＦｃγＲＩＡが、皮膚の逆受身アルサス反応において浮腫および好中球浸潤を減少させ、コラーゲン抗体誘導関節炎モデル、さらにマウスのコラーゲン誘導関節炎において足の炎症を減少させた（実施例９〜１１および１３，後掲を参照のこと）。したがって、可溶性ＦｃγＲＩＡならびに本明細書中に記載されるようなそのハイブリッド型は、ヒトまたは他の非ヒト種における様々な免疫複合体媒介性疾患の処置において使用される。
【０１５４】
１．クリオグロブリン血症（Ｃｒｙｏｂｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）
クリオグロブリン血症という用語は、３７℃未満の温度において可逆的に沈殿する１種の免疫グロブリン（モノクローナルクリオグロブリン血症）またはそれ以上の免疫グロブリン（混合型クリオグロブリン血症）の血清中の存在のことを指す（Ｍｅｌｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．４０：８２８−８３６，１９９６；Ｄａｍｍａｃｃｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３１：６２８−６３８，２００１；Ｓａｎｓｏｎｎｏら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）４６：５７２−５７８，２００７を参照のこと）。寒冷沈降反応の機構は、不明であるが、Ｉｇの構造の変化、Ｉｇ  Ｆｃドメインの自己会合および／またはＩｇＭリウマチ因子の活性が関与し得る（Ｓａｎｓｏｎｎｏ  ａｎｄ  Ｄａｍｍａｃｃｏ，Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：２２７−２３６，２００５を参照のこと）。クリオグロブリン血症は、３つのサブグループに分類される（Ｄａｍｍａｃｃｏら、前出を参照のこと）：Ｉ型は、単一のモノクローナルＩｇから構成され；ＩＩ型は、モノクローナルＩｇＭとポリクローナルＩｇＧとの混合物から構成され；そしてＩＩＩ型は、ポリクローナルＩｇＭ／ＩｇＧの混合物である。Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型のクリオグロブリン血症は、それぞれ、血清寒冷沈降物を有するすべての人のおよそ１０〜１５％、５０〜６０％および３０〜４０％を占める（Ｄａｍｍａｃｃｏら、前出；Ｓａｎｓｏｎｎｏら、前出を参照のこと）。
【０１５５】
クリオグロブリン血症（ｃｒｙｏｇｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）を有する患者は、ほとんどの場合、紫斑、脱力および関節痛という臨床的３主徴、ならびに糸球体腎炎、血管炎、末梢神経障害、関節炎ならびに／または喀血および呼吸困難の肺の症状を示す（Ｄａｍｍａｃｃｏら、前出；Ｓａｎｓｏｎｎｏら、前出；Ｆｅｒｒｉら、Ｃｌｅｖｅ．Ｃｌｉｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．６９  Ｓｕｐｐｌ  ２：ＳＩＩ２０−２３，２００２（「Ｆｅｒｒｉら、Ｉ」）；Ｆｅｒｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５５：４−１３，２００２（「Ｆｅｒｒｉら、ＩＩ」）を参照のこと）。クリオグロブリン血症は、多発性骨髄腫、リンパ増殖性障害、結合組織疾患、感染症および肝臓疾患をはじめとした種々の障害に関連して観察され得る（Ｆｅｒｒｉら、Ｉ，前出；Ｆｅｒｒｉら、ＩＩ，前出）。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の発見の前および抗ＨＣＶ抗体を検出する方法が開発される前に、根底にある同定可能な疾患を有しない患者は、特発性または「本態性」の混合型クリオグロブリン血症を有すると考えられていた。現在では、「本態性」混合型クリオグロブリン血症が、ＨＣＶ感染に強く関連し、ＩＩ型およびＩＩＩ型クリオグロブリン血症を有する患者の大部分を含んでいることが知られている（Ｓａｎｓｏｎｎｏら、前出を参照のこと）。最新のエビデンスから、本態性混合型クリオグロブリン血症は、Ｃ型肝炎感染に対する異常な免疫応答によって、Ｃ型肝炎抗原、ポリクローナルＣ型肝炎特異的ＩｇＧおよびモノクローナルＩｇＭリウマチ因子からなる免疫複合体が形成されるときに、生じることが示唆されている。感受性の組織部位内にこれらの免疫複合体が沈着すると、炎症性カスケードの引き金が引かれ、本態性混合型クリオグロブリン血症の臨床的な症候群がもたらされる（Ｄａｍｍａｃｃｏら、前出；Ｓａｎｓｏｎｎｏら、前出）。
【０１５６】
クリオグロブリン血症は、ＨＣＶに加えて、他の種々の感染症（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などのウイルス起源の感染症、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｙｍｏｎｉａｅ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  Ｂｕｒｎｅｔｔｉ  Ｑ熱、Ｂｒｕｃｅｌｌａを含む細菌起源の感染症、ならびにＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉなどの寄生生物による感染症および内臓リーシュマニア症を含む）にも関連する（Ｆｅｒｒｉら、ＩＩ，前出を参照のこと）。
【０１５７】
本態性混合型クリオグロブリン血症は、主要な血管炎障害であると考えられている。Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（ＣＨＣＣ）による血管炎の分類は、罹患血管のサイズに基づき、それらの疾患を、大血管、中血管または小血管を冒す疾患にグループ化する（Ｊｅｎｎｅｔｔｅら、Ｃｌｅｖｅ．Ｃｌｉｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．６９  Ｓｕｐｐｌ  ２：ＳＩＩ３３−３８，２００２；Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４８：３１１−３４０，２００３を参照のこと）。重要なことには、２つの血管炎症候群は、免疫複合体の沈着に関連する：ヘノッホシェーンライン紫斑病は、ＩｇＡ含有免疫複合体の沈着に関連し；そして本態性クリオグロブリン血症性血管炎は、ＩｇＧ／ＩｇＭ免疫複合体の沈着に関連する（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ，前出を参照のこと）。
【０１５８】
本態性混合型クリオグロブリン血症におけるＨＣＶ感染の発生率は、報告されている症例では、地理によって４０〜１００％に及ぶ。世界中でおよそ２億人が、慢性的にＨＣＶに感染しており、毎年、３５０万人の新たな感染が報告されている（Ｓｙ  ａｎｄ  Ｊａｍａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３：４１−４６，２００６を参照のこと）。米国における発生率および有病率は、１年あたり３０，０００の新たな感染であり、慢性感染は３９０万である（Ｓｙ  ａｎｄ  Ｊａｍａｌ，前出を参照のこと）。慢性的にＨＣＶに感染している患者のおよそ５０〜６０％が、血清中にクリオグロブリンを有し、約５％の症例において顕性のクリオグロブリン血症性症候群を発症している（Ｓａｎｓｏｎｎｏら、前出；Ｓａｎｓｏｎｎｏ  ａｎｄ  Ｄａｍｍａｃｃｏ，前出を参照のこと）。混合型クリオグロブリン血症を有する患者の５％において、Ｂ型肝炎ウイルスが病因物質として報告されている（Ｆｅｒｒｉら、Ｉ，前出を参照のこと）。
【０１５９】
クリオグロブリン血症に対する現在の治療としては、中程度の疾患に対して低用量ステロイドが挙げられ、より重篤な形態の疾患に対しては、ステロイド、シクロホスファミドまたはプラスマフェレシスの組み合わせが、使用される。活性なＨＣＶ媒介性肝炎を有する患者は、インターフェロン−αとリバビリンとの組み合わせで処置されることが多い。
【０１６０】
本発明のＦｃγＲＩＡポリペプチドの有効性は、疾患の動物モデルにおけるインビボにおいて試験され得る。クリオグロブリン血症を含む免疫複合体媒介性疾患に対する可溶性ＦｃγＲＩＡの有効性を評価するために特に適している動物モデルは、Ｂ細胞を促進する特性を有するインターロイキン−７（ＩＬ−７）様サイトカインである胸腺間質リンホポイエチン（ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）（ＴＳＬＰ）を過剰発現するマウスである。ＴＳＬＰマウスは、ＩｇＧ−ＩｇＭ混合組成の循環クリオグロブリンを大量に産生する（Ｔａｎｅｄａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９：２３５５−２３６９，２００１を参照のこと）。これらの動物における混合型クリオグロブリン血症の発症は、腎臓、肝臓、肺、脾臓および皮膚における免疫複合体沈着に起因して、これらの組織が関わる全身性の炎症性疾患に関連する（Ｔａｎｅｄａら、前出を参照のこと）。これらの動物における腎臓疾患は、ＨＣＶに感染している患者において見られるようなヒトクリオグロブリン血症糸球体腎炎に酷似している。この疾患プロセスにおけるＦｃγレセプターに対する役割は、抑制性レセプターであるＦｃγレセプターＩＩｂが欠失した後に罹患率および死亡率が高まることを伴う腎損傷の悪化によって示された（Ｍｕｈｌｆｅｌｄら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３：１１２７−１１３６、２００３を参照のこと）。本発明に記載の組換え可溶性ＦｃγＲによるＴＳＬＰトランスジェニックマウスの処置は、実施例１２，後掲にさらに記載される。
【０１６１】
２．全身性エリテマトーデス
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、病原性自己抗体の産生、それに続く免疫複合体の沈着（それにより、広範な組織損傷がもたらされる）を特徴とする複合的な多臓器（全身性）の自己免疫障害である。ＳＬＥの病因は、不明であるが、複数の遺伝的、環境的およびホルモン性の因子が、疾患において役割を果たすと考えられている（Ｈａｈｎ，“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ”Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｋａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００５）を参照のこと）。ＳＬＥは、臨床的に、漸増と漸減の経過、ならびに皮膚、腎臓および中枢神経系を含む複数の臓器が関与することを特徴とする（Ｌｕｐｕｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｋａｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｔｓｏｋｏｓ  ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｊ．，１ｓｔ  ｅｄ．１９９９）；Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｒｏｍａｔｏｓｕｓ（Ｌａｈｉｔａ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，３ｒｄ  ｅｄ．１９９９））。したがって、この疾患は、幅広い種類の症状および臨床的特徴（全身性、皮膚、腎臓、筋骨格および血液学的を含む）を示す。
【０１６２】
ＳＬＥの全体的な有病率は、２０００人に約１人であり、７００人の白人女性中、約１人が、生涯においてＳＬＥを発症する（Ｌａｈｉｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１１：３５２−６，１９９９）。米国単独では、５０万人を超える人が、ＳＬＥを有し、ほとんどが、妊娠可能年齢の女性である（Ｈａｒｄｉｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１０１−１１１１，２００３）。
【０１６３】
ＳＬＥを診断する単一の基準はない。米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）は、ＳＬＥを診断する１１の基準を開発しており、それは、皮膚、全身性および臨床検査の局面におけるＳＬＥの臨床スペクトラムに及ぶものである。これらの基準としては、頬部発疹、円板状発疹、太陽光に対する感受性、口腔潰瘍、関節炎、漿膜炎、腎臓および中枢神経系の炎症、血液の変質、ならびに抗核抗体の存在が挙げられる。ＳＬＥ患者として分類されるためには、患者は、これらの基準のうちの４つを満たさなければならない（Ｔａｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２５：１２７１−１２７７，１９８２）。ＳＬＥは、通常、検査によって確かめられ、その試験としては、抗核抗体を検出する血液検査；腎臓機能を評価する血液検査および尿検査；ＳＬＥに関連することが多い低レベルの補体の存在を検出する補体検査；炎症レベルを測定する沈降速度（ＥＳＲ）またはＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）；肺の損傷を評価するＸ線ならびに心臓の損傷を評価するＥＫＧが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
ＳＬＥに対する標準的な治療は、一般的な免疫応答インヒビターであるステロイドの糖質コルチコイドの投与である。これを用いることにより、症状を軽減することができる；しかしながら、現在、ＳＬＥの治癒は、達成可能でない。０．５ｍｇ／ｋｇ／日未満のレベルの低用量ｐ．ｏ．プレドニゾンが、通常、投与される。残念なことに、この治療は、患者を緩解にし続けるには不十分であり、この疾患の拡大が頻繁に見られる。発赤は、静脈内パルスを介した、３日間連続の３０ｍｇメチルプレドニゾロン／ｋｇ／日での高用量糖質コルチコイドによって管理され得る。しかしながら、高用量のステロイド処置は、患者に対して重篤な副作用をもたらし得る。
【０１６５】
これらの標準的な処置は、一般に非特異的であり、重篤な副作用を伴うことが多く、その疾患の進行または生命を危うくする腎臓合併症（ループス腎炎またはＬＮ）への移行に著しく影響しない。その結果として、ＳＬＥを処置するための新規方法の開発が、当該分野において長年にわたって必要とされている。
【０１６６】
３．関節リウマチ
関節リウマチ（ＲＡ）は、代表的には組織の損傷および関節の変形に導く関節の慢性炎症を特徴とする。正確な病因は、明らかではないが、関節リウマチは、一般に、免疫複合体、種々のリンパ系細胞型（Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、マクロファージ、いくつかの炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１β）が関与する自己免疫疾患であると考えられている（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｋａｓｐｅｒらｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００５）；Ｏｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：２１６７−２１７９，２００４を参照のこと）。
【０１６７】
関節リウマチは、全身を冒す全身性疾患であり、関節炎の最も一般的な形態の１つである。ＲＡは、免疫介在性であり、特に、炎症、ならびに重篤な障害および死亡率上昇をもたらすその後の組織損傷を特徴とする。特に、ＲＡは、関節を裏打ちする膜の炎症を特徴とし、それにより、疼痛、硬直、温感、発赤および腫脹が引き起こされる。炎症細胞は、骨および軟骨を消化し得る酵素を放出する。関節リウマチの結果として、炎症した関節の裏打ちである滑膜が、骨および軟骨を浸潤し、損傷し得ることにより、他の生理学的作用の中でも関節の劣化および重篤な疼痛がもたらされる。関与する関節は、その形状および配列を失い得、その結果、疼痛がもたらされ、動きを失う。
【０１６８】
種々のサイトカインが、リウマチの関節において局所的に産生される。数多くの研究によって、２つの原型炎症性サイトカインであるＩＬ−１およびＴＮＦ−αが、滑膜の炎症および進行性の関節破壊に関与する機構において重要な役割を果たすことが証明されている。実際に、ＲＡを有する患者にＴＮＦ−αインヒビターおよびＩＬ−１インヒビターを投与することによって、炎症の臨床的および生物学的な徴候が劇的に改善し、骨侵食および軟骨破壊の放射線学的徴候が減少した。しかしながら、これらの有望な結果にもかかわらず、かなりのパーセンテージの患者が、これらの薬剤に応答せず、このことは、他のメディエーターもまた関節炎の病態生理学に関与することを示唆している（Ｇａｂａｙ，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１３５−１４９，２００２）。ＲＡが、関節軟骨の主要な細胞外マトリックス成分であるＩＩ型コラーゲンに対する抗体の存在を特徴とするので、これらの抗体は、関節腔内における滑膜細胞または他の炎症細胞型との相互作用を通じて、上に記載されたものなどの炎症性サイトカインの放出を媒介すると考えられている。
【０１６９】
ＲＡの病原において重要であり得る免疫学的異常は、滑液細胞および血管炎に見られる免疫複合体も含む。これらの複合体の一因は、滑膜組織を浸潤し、炎症性サイトカインを産生し得る形質細胞およびＴヘルパー細胞によって産生される抗体（例えば、ＲＦ）である。マクロファージおよびそれらのサイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＧＭＣＳ−Ｆ）もまた、病的な滑膜に大量に存在する。高レベルの接着分子は、滑膜組織における炎症細胞の遊出および貯留に寄与する。いくつかのリンパ球とともに、マクロファージ由来の管壁細胞（ｌｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌ）の増加も、顕著である。
【０１７０】
ＲＡの確立された処置としては、疾患を緩和する抗リウマチ薬物（ＤＭＡＲＤ）（例えば、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、メトトレキサート、レフルノミド、リツキシマブ、インフリキシマブ、アザチオプリン、Ｄ−ペニシラミン、金（経口または筋肉内）、ミノサイクリンおよびシクロスポリン）、プレドニゾンなどのコルチコステロイド（ｃｏｒｉｔｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）および非ステロイド性抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤＳ）が挙げられる。これらの処置は、一般に非特異的であり、重篤な副作用を伴うことが多く、関節破壊の進行に著しく影響しない。その結果として、ＲＡを処置するための新規方法の開発が、当該分野において長年にわたって必要とされている。
【０１７１】
本発明の可溶性ＦｃγＲＩＡポリペプチドは、免疫複合体と、滑膜内の炎症細胞型との相互作用を阻止し、炎症を妨げることができた。ゆえに、本発明のＦｃγＲＩＡポリペプチドは、関節リウマチおよび他の関節炎の疾患において炎症を減少させる価値のある治療剤として機能し得る。
【０１７２】
当該分野で公知の関節リウマチに対するいくつかの動物モデルが存在する。例えば、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルでは、マウスが、ヒト関節リウマチによく似た慢性炎症性関節炎を発症する。ＣＩＡは、ＲＡと類似の免疫学的および病理学的な特徴を共有するので、このことにより、このモデルが潜在的なヒト抗炎症性化合物をスクリーニングするための理想的なモデルとなる。ＣＩＡモデルは、発生するために免疫応答と炎症反応の両方に依存するマウスの周知のモデルである。その免疫応答は、抗原として与えられるコラーゲンに応答したＢ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の相互作用を含み、抗コラーゲン抗体を産生させる。この炎症性の段階は、マウスの天然のコラーゲンに架橋し、細胞のＦｃレセプターおよび／または補体カスケードを活性化する、これらの抗体のいくつかの結果としての、炎症のメディエーターによる組織応答の結果である。ＣＩＡモデルを用いる際の利点は、その病原の基本的機構が公知である点である。ＩＩ型コラーゲン上の関連性のあるＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープが、同定されており、免疫媒介性関節炎に関係する様々な免疫学的パラメータ（例えば、遅延型過敏症および抗コラーゲン抗体）および炎症性パラメータ（例えば、サイトカイン、ケモカインおよびマトリクス分解酵素）が、確定されているので、それらを用いることにより、ＣＩＡモデルにおいて試験化合物の有効性を評価することができる（Ｗｏｏｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍ．３：４０７−２０，１９９９；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．８９：９７８４−７８８，１９９２；Ｍｙｅｒｓら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６１：１８６１−７８，１９９７；およびＷａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．９２：８９５５−９５９，１９９５）。
【０１７３】
これらのＣＩＡモデルマウスへの本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドの投与を用いることにより、症状を回復させ、疾患の経過を変更させるための可溶性ＦｃγＲの使用を評価することができる。限定ではなく例として、マウス１匹あたり０．１ｍｇ〜２．０ｍｇの本発明の可溶性ハイブリッドＦｃγＲポリペプチドの注射（ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．またはｉ．ｍ投与経路を介して、限定されないが最大４週間にわたって、１週間に１〜７回）が、疾患スコア（足のスコア、炎症のインシデントまたは疾患）を著しく減少させ得る。投与の開始（例えば、コラーゲン免疫の前もしくはコラーゲン免疫時、または２回目のコラーゲン免疫の後の任意の時点（疾患がすでに進行している時点を含む））に応じて、本発明のアンタゴニストは、関節リウマチの予防、ならびにその進行の予防において有効であり得る。本明細書中に記載される研究によって示されるように、可溶性ＦｃγＲＩＡポリペプチド（配列番号２の残基１６〜２８２）の投与は、マウスＣＩＡモデルにおいて症状を回復させ、疾患の経過を変更させた（実施例１３，後掲を参照のこと）。
【０１７４】
免疫複合体媒介性のリウマチ性疾患に対する別のモデルは、マウスにおける関節炎のコラーゲン抗体誘導モデルである（Ｔｅｒａｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８：２１０３−２１０８，１９９２を参照のこと）。関節疾患は、このモデルにおいて、ＩＩ型コラーゲンに対する４つのモノクローナル抗体のカクテル（例えば、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製のＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標））の静脈内注射によって誘導される。マウスにおいて関節炎を誘導するために使用されるＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）は、ＩＩ型コラーゲンのＣＢ１１ドメイン内の８３アミノ酸ペプチド内の個別のエピトープを認識する４つのクローンの混合物である（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｂｒｏｃｈｕｒｅ）。これらのエピトープは、ヒト、マウス、ウシ、ニワトリ、サルおよびラット由来のＩＩ型コラーゲンにおいて類似している。これらの抗体は、マウスの関節に局在化し、それらは、軟骨特異的ＩＩ型コラーゲンと免疫複合体を形成する。その抗原抗体免疫複合体は、関節内の炎症細胞型の表面上に位置するＦｃガンマレセプターとの相互作用を通じて疾患を誘導すると考えられている。代表的には、０日目に、２〜４ｍｇのＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡカクテルを、静脈内投薬によってマウスに注射する。これに続いて、３日後に、５０〜１００μｇのＬＰＳを腹腔内注射する（Ｔｅｒａｔｏら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１３７−１４７，１９９５を参照のこと）。赤いおよび腫脹した足として明らかな関節炎を、１〜２日後に発症する。代表的な実験において、それらのマウスを、適当なビヒクルに溶解された可溶性ＦｃγＲＩＡ（１００〜２０００μｇのタンパク質）の注射によって０日目または３日目に処置する。可溶性ハイブリッドＦｃγＲの投薬は、０日目または３日目に開始され、例えば、１日おきに与えられ得る。各動物に対する関節炎スコアは、関節腫脹および関節の厚さを毎日評価し得る。代表的な実験において、可溶性ハイブリッドＦｃγＲは、関節炎スコアを低下させる。
【０１７５】
４．混合結合組織病
混合結合組織病は、ＳＬＥ、全身性硬化症、多発性筋炎または皮膚筋炎およびＲＡの臨床的特徴、ならびにリボ核タンパク質（ＲＮＰ）抗原に対する循環抗核抗体の非常に高い力価を特徴とする稀な障害である（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出；Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３１：５４９−５６５，２００５；Ｖｅｎａｂｌｅｓ，Ｌｕｐｕｓ  １５：１３２−１３７，２００６を参照のこと）。本明細書中で抗Ｕ１ＲＮＰと称される高力価のこの抗体は、明確な臨床単位としてＭＣＴＤを考慮するための根拠である。ＭＣＴＤは、それをＳＬＥまたは強皮症のサブセットとして考える人によって、明確な障害として検証されている。他の人たちは、ＭＣＴＤを区別されていない結合組織疾患として分類しがちである。手の腫脹、レイノー現象、多発性関節痛、炎症性ミオパチー、食道運動低下および肺機能不全が、よく起こる。診断は、臨床的特徴と、ＲＮＰに対する抗体と、他の自己免疫疾患に特異的な抗体が存在しないこととの組み合わせによる。一部の患者において、この障害は、古典的な全身性硬化症またはＳＬＥに発展する。
【０１７６】
レイノー現象が他の症状発現よりも何年も前に生じ得る。最初の症状発現は、初期のＳＬＥ、強皮症、多発性筋炎もしくは皮膚筋炎またはＲＡに似ていることが多い。最初の症状に関係なく、限局的な疾患は、進行して広汎性になる傾向があり、その臨床パターンは、時間をかけて変化する。最も頻繁に見られる所見は、手の腫脹であり、それは最終的にはソーセージ状の外観の指をもたらす。皮膚の所見としては、狼瘡または皮膚筋炎様発疹が挙げられる。びまん性で強皮症様の皮膚の変化および虚血性ネクローシスまたは指先の潰瘍化は、ＭＣＴＤではほとんど見られない。ほぼすべての患者が、多発性関節痛を有し、７５％が、明白な関節炎を有する。しばしばこの関節炎は、非変形性であるが、ＲＡにおけるものと類似の糜爛性の変化および変形を示すことがある。圧痛を伴うかまたは伴わない近位筋の筋力低下が、よく起こる。腎疾患が、約１０％に生じ、これは軽度であることが多いが、時折、罹患率または死亡率を引き起こす。三叉神経の感覚性ニューロパチーが、他の結合組織疾患よりもＭＣＴＤにおいて頻繁に発症する。リウマチ因子が、陽性であることが多く、力価が高いことが多い。ＥＳＲは、頻繁に上昇する。
【０１７７】
ＳＬＥ、強皮症、多発性筋炎またはＲＡを有するとみられる患者において、さらなる特徴が重複するときに、ＭＣＴＤが、代表的に疑われる。患者は、まず、抗核抗体（ＡＮＡ）ならびに抽出可能な核抗原（ＥＮＡ）およびＲＮＰ抗原に対する抗体について試験される。これらの試験の結果が、ＭＣＴＤと適合する（例えば、ＲＮＰ抗体が非常に多い）場合、γ−グロブリンレベル、血清補体レベル、リウマチ因子、抗Ｊｏ−１（抗ヒスチジルｔ−ＲＮＡ合成酵素）およびＥＮＡのリボヌクレアーゼ耐性Ｓｍｉｔｈ（Ｓｍ）構成要素に対する抗体ならびに二本鎖ＤＮＡを試験することにより、他の可能性のある診断が排除される。さらなる精密検査は、症状および徴候に依存する；筋炎の症状発現、腎臓の関与または肺の関与は、それらの臓器の試験（例えば、筋炎を診断するためのＣＰＫ、ＭＲＩ、筋電図または筋生検）を促す。
【０１７８】
全体的な１０年生存率は、８０％であるが、予後は、どの症状発現が優勢であるかに大きく左右される。死因としては、肺高血圧症、腎不全、ＭＩ、結腸穿孔、播種性感染症および脳出血が挙げられる。一部の患者は、処置されずに長年にわたって緩解を持続する。
【０１７９】
混合結合組織病（ＭＣＴＤ）は、世界中で生じており、どの人種の中でも１０代および２０代が発生率のピークであるが、ＭＣＴＤは、小児および高齢者に見られる。女性が主に罹患する。発生率および有病率は、明確に確定されていない。ほとんどの研究では、ＭＣＴＤの臨床的特徴および血清学的特徴を有する患者の数は、ＳＬＥよりも約４倍少なく、約１０／１００，０００という全体的な有病率が示唆されている（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出；Ｖｅｎａｂｌｅｓ，前出を参照のこと）。
【０１８０】
ＭＣＴＤに対する現在の処置は、ＳＬＥに対する処置と同様であり、疾患が中程度または重度である場合はコルチコステロイドを用いる。中程度または重度の疾患を有するほとんどの患者が、特に初期に処置される場合、コルチコステロイドに応答する。軽度の疾患は、しばしば、サリチレート、他のＮＳＡＩＤ、抗マラリア薬または時折、低用量コルチコステロイドによって管理される。重篤な主要器官の関与は、通常、より高用量のコルチコステロイドを必要とする。
【０１８１】
５．ＨＢＶに関連する結節性多発動脈炎
１８６６年にＫｕｓｓｍａｕｌおよびＭａｉｅｒによって初めて報告された古典的な結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）は、多岐にわたる症状を特徴とする多臓器障害である（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４８：３１１−３４０，２００３；Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出を参照のこと）。ＰＡＮは、腎臓および内臓の動脈が特徴的に関与する、小さいサイズおよび中程度のサイズの筋性動脈の壊死性血管炎である。病変は、分節状であり、動脈の分岐および分枝を伴う傾向がある。この疾患の急性期では、好中球が、血管壁のすべての層および血管周囲の領域を浸潤し、その結果、内膜の増殖および血管壁の変性がもたらされる。病変が進行するにつれて、単核細胞がその領域を浸潤し、結果、管腔の障害を伴う脈管のフィブリノイド壊死、血栓症、その脈管によって供給されている組織の梗塞、および出血がもたらされる（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ，前出を参照のこと）。
【０１８２】
Ｂ型肝炎ウイルス抗原から構成される循環免疫複合体の単離とともに、Ｂ型肝炎抗原血症の存在が、全身性血管炎、特に、ＰＡＮ型の全身性血管炎を有する患者の１０〜３０％に存在し、このことは、この疾患の病原における免疫学的役割を示唆する。この考えは、この疾患を有する患者の血管壁におけるＢ型肝炎抗原、ＩｇＭおよび補体の沈着の所見によって裏付けられる（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ，前出を参照のこと）。
【０１８３】
患者は、通常、発熱、体重減少、関節痛および倦怠感を示す。筋肉るいそう、腹痛、複合性単神経炎（ｍｏｎｏｎｅｕｔｉｔｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、高血圧症、睾丸炎およびうっ血性心不全が、それぞれの臓器系の脈管の関与を示す主要な症状である。Ｂ型肝炎感染に続発する場合、これらの臨床所見は、同じである。無処置のＰＡＮの予後は、不良であり、５年生存率は１０〜２０％であると報告されている（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出を参照のこと）。通常、死亡は、胃腸の合併症、特に、腸の梗塞および穿孔（ｐｅｒｆｏｒａｔｏｎ）ならびに心臓血管の原因に起因する。
【０１８４】
これまでの報告は、ＰＡＮの発生率を顕微鏡的多発血管炎および関連する血管炎障害と併せているので、ＰＡＮの正確な発生率を確定することは、困難である。しかしながら、ＰＡＮの発生率は、１００万あたり５〜９症例であると推定され（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ，前出を参照のこと）、１０〜５４％の範囲の頻度が報告されているが、約６％の症例が、ＨＢＶ感染に起因すると推定されている（２６，２７）。
【０１８５】
ＰＡＮ患者は、現在、シクロホスファミド有りまたは無しのステロイドで処置されている（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ，前出を参照のこと）。ＨＢＶを有する患者の場合、ビダラビンおよびラミブジン有りまたは無しのインターフェロン−αによる抗ウイルス処置が、血漿交換と併用されるとき、有効である（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ，前出；Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出を参照のこと）。
【０１８６】
６．尋常性天疱瘡
尋常性天疱瘡（ＰＶ）は、高齢患者において最もよく観察される水疱形成皮膚疾患である。この疾患は、皮膚の表皮細胞間の接着の喪失、その結果として表皮内に水疱が形成されることを特徴とする。損傷性または無傷の患者皮膚の直接的な免疫蛍光解析によって、ケラチノサイトの表面上におけるＩｇＧの沈着が示される。このような沈着は、Ｃａ２＋依存性カドヘリンファミリーの膜貫通糖タンパク質であるデスモグレインに対する循環ＩｇＧ自己抗体に由来する。ＰＶは、生命を危うくすることがある。現在の治療の柱は、プレドニゾンなどの全身性ステロイドである。アザチオプリンまたはミコフェノール酸モフェチルなどの他の免疫抑制剤も使用される（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出を参照のこと）。
【０１８７】
７．外因性抗原に関連する疾患
外因性抗原は、ウイルス、細菌または寄生生物による感染によって引き起こされるものをはじめとした多岐にわたる免疫複合体疾患、ならびに外来タンパク質または薬物への曝露によって引き起こされる血清病をもたらす（Ｊａｎｃａｒ  ａｎｄ  Ｃｒｅｓｐｏ，前出；Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出；Ｋｎｏｗｌｅｓ  ａｎｄ  Ｓｈｅａｒ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．２５：２４５−２５３，２００７；Ｗｏｌｆら、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２３：１７１−１８１，２００５を参照のこと）。組織免疫複合体沈着に関連する細菌感染症としては：連鎖球菌性、ブドウ球菌性および髄膜炎菌性の感染症；バルトネラ症、ボレリア症、ハンセン病、梅毒およびレプトスピラ症が挙げられる。ウイルス感染症としては：Ｂ型肝炎（結節性多発動脈炎）、Ｃ型肝炎（クリオグロブリン血症）、ＨＩＶ関連免疫複合体腎症、ヒトパルボウイルスＢ１９感染症、ＣＭＶ感染症、伝染性単核球症およびデング出血熱が挙げられる。寄生虫病としては：Ｔｒｙｐａｎｓｏｍａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ＴｏｘｏｐｌａｓｍａおよびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａが挙げられる。
【０１８８】
現在、最も一般的な血清病様反応は、非タンパク質薬物への曝露に起因する。血清病様反応に関係づけられている薬物としては：アロプリノール（ａｌｌｏｐｕｒｉｎａｌ）、ヒ素誘導体および水銀誘導体、バルビツレート、ブプロピオン、セファロスポリン、フラゾリドン、金塩、グリセオフルビン、ヒドララジン、インフリキシマブ、ヨウ化物、メチルドパ、ペニシリン、フェニトイン、ピペラジン、プロカインアミド、ストレプトキナーゼおよびスルホンアミドが挙げられる。血清病様反応の他の原因としては、異種血清、アレルゲン抽出物、血液製剤、ホルモン、ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ  ｖｅｎｏｍおよびワクチンへの曝露が挙げられる。
【０１８９】
Ｂ．抗体産生が関与する他の疾患
１．特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）は、血小板の破壊（血小板減少症に導く）をもたらす特異的な血小板膜糖タンパク質に対する自己抗体の存在（ＩｇＧ＞ＩｇＭ）を特徴とし、また、広範な斑状出血および粘膜からの出血、貧血ならびに極度の脱力を特徴とする、全身性の自己免疫性疾病である（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出；Ｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５６：４２５−４４２，２００５；Ｓｔａｓｉ  ａｎｄ  Ｐｒｏｖａｎ，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７９：５０４−５２２，２００４を参照のこと）。
【０１９０】
血小板数が、きわめて少なくなり、歯肉、消化管および鼻からの自然出血が見られる。紫斑とは、血小板の減少の結果として出血が起きている、皮膚および粘膜（例えば、口の裏打ち）のやや紫色に見える領域のことを指す。理学的検査によって、脾臓の拡大が示されることがある。代表的な発疹は、皮膚における小血管の顕微鏡的出血に起因して生じる。１０，０００未満の血小板数は、脳に自然出血をもたらすことがあり、死に至ることがある。免疫性血小板減少性紫斑病、出血性紫斑病、血小板減少性紫斑病、ヴェルルホフ病とも呼ばれる。ほとんどの症例が無症候性であるが、非常に少ない血小板数によって、出血性素因および紫斑がもたらされ得る。小児に発症する急性ＩＴＰ（男性と女性で同様の発生率）および成人に発症する慢性ＩＴＰ（女性のほうが多い；２．６対１；１０歳より上のＩＴＰ患者の７２％が女性である）という２つのタイプのＩＴＰが存在する。ほとんどの小児は、処置なしで回復する。小児における有病率のピークは、２〜４歳であり、成人では、２０〜５０歳である；すべてのＩＴＰ患者のおよそ４０％が、１０歳より若い。
【０１９１】
ＩＴＰの発生率：１年あたり１００，０００人の小児あたり４〜８人、１００万人の成人あたり６６症例、１００万人の小児あたり５０症例。慢性難治性ＩＴＰの新症例は、１年あたり１００万人あたり約１０症例を含む。米国におけるＩＴＰを有する個体の数は、およそ２００，０００であると推定されている。合計して、１年あたり１００万人あたり約１００の新症例のＩＴＰが存在する。新症例のおよそ半数が、小児である。
【０１９２】
軽度のＩＴＰは、処置を必要としない。血小板数が、１マイクロリットルあたり１０，０００未満になるか、または出血（例えば、消化管における出血または重篤な鼻出血）が生じたときに５０，０００未満であるとき、一般に、ステロイドによる処置が開始される（Ｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ＭｃＭｉｌｌａｎ，前出を参照のこと）。生命を危うくする症例の場合は、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）が用いられる。その後で、いわゆるステロイド節約剤（あるいはＤＭＡＲＤｓと呼ばれる）を用いてもよい。これらのストラテジーが失敗に終わるときは、破壊のために標的にされた血小板は脾臓で最期を遂げることが多いので、脾臓摘出に着手することが多い。比較的新しいストラテジーは、通常Ｒｈ＋の赤ん坊によってアカゲザル抗原に感作された母親において使用される薬剤である抗Ｄによる処置である。他の化学療法薬（例えば、ビンクリスチン、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）、ダナゾール、シクロホスファミドおよびシクロスポリン）は、潜在的に有害な副作用を有するので、これらの薬物は、他の処置が有益でないと示された重篤な症例の患者にだけ処方される。ＩＶＩｇは、有効であるが高価であり、改善は一時的である（一般に、１ヶ月未満しか続かない）。しかしながら、血小板数が危険なほど少なく、かつ他の処置に対する応答が不良な脾臓摘出前のＩＴＰ患者の場合、ＩＶＩｇ処置によって、血小板数が増加し得、脾臓摘出手術が危険なものにならない。
【０１９３】
２．シェーグレン症候群
シェーグレン症候群（ＳＳ）は、ドライアイおよび口渇をもたらす唾液腺および涙腺のリンパ球浸潤を特徴とする慢性自己免疫障害である。シェーグレン症候群は、原発性（下にある結合組織の障害を伴わない自己免疫性の乾燥（乾き）症候群）または続発性（ＲＡ、ＳＬＥまたはＳＳｃのような進行中の結合組織障害を有する患者における自己免疫媒介性の乾燥症候群）に分類される（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出を参照のこと）。ＳＳに対する女性と男性との比率は、９：１であり、診断時の平均年齢は６０歳である。病原モデルは、ウイルスを仮定するか、または適切な遺伝的／ホルモン的バックグラウンドにおける環境的な傷害は、唾液腺および涙腺における上皮炎（ｅｐｉｔｈｅｌｉｉｔｉｓ）をもたらす。結果として生じる単核細胞浸潤物（約７０％のＣＤ４＋Ｔ細胞、２５％のＣＤ８＋Ｔ細胞、２０〜３０％のＢ細胞）は、サイトカイン（ＩＦＮγ）を放出し、そしてそれにより、炎症性サイトカイン：ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６を放出するマクロファージが活性化される。次いで、これらのサイトカインは、腺房細胞からのＭＭＰの放出を引き起こし、それにより、基底膜コラーゲンが分解される。やがて、腺組織は、瘢痕組織および脂肪で置き換えられる（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出を参照のこと）。
【０１９４】
口渇／眼の症状に加えて、他の症状としては：食道運動障害、末梢神経障害関節痛および線維筋痛症が挙げられ得る。患者の６０％が、自己抗体（リウマチ因子、ＡＮＡ、Ｒｏ／ＳＳ−Ａ、Ｌａ／ＳＳ−Ｂ）を示し、極度の疲労に苦しむ。ＳＳ患者は、リンパ腫を発症するリスクが４４倍高いと報告されている。
【０１９５】
ＳＳのために、ＮＳＡＩＤｓ、ステロイド、ヒドロキシクロロキンおよびメトトレキサートをはじめとした種々の処置が用いられている。いくつかの抗サイトカイン治療も使用されるが、第一選択療法としては推奨されない。これらとしては：ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＥＮＢＲＥＬ、ＩＦＮ−α、抗ＩＦＮ−γ、ＲＩＴＵＸＡＮ、シクロスポリン、タクロリムスおよび様々な局所用眼科調製物が挙げられる。
【０１９６】
３．抗リン脂質抗体症候群
抗リン脂質抗体症候群は、動脈血栓症および／または静脈血栓症、ならびに持続的に陽性の抗カルジオリピン抗体および／またはループス抗凝固因子に関連する妊婦罹患率（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）を特徴とする発生頻度の高い自己免疫性で血栓形成促進性の状態である（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出；Ｂｌｕｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｔｉｓ  ７８：４０９−４１５，２００６；Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２７：３５−４６，２００７を参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつか（ＩｇＧおよびＩｇＭ）が、リン脂質結合タンパク質（負に帯電したリン脂質自体ではなくＢ２−糖タンパク質１、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、ＴＰＡおよびアネキシンＶ）に直接対するという最近のエビデンス。ＡＰＳは、他の自己免疫疾患、最も一般的にはＳＬＥ（続発性ＡＰＳ）と合併して、または単離された障害（原発性ＡＰＳ）として、生じ得る。
【０１９７】
ＡＰＳは、身体の任意のサイズの血管および任意の臓器を冒す。臨床上の特徴としては、末梢静脈動脈血栓症（深部静脈血栓症）、胎児消失、皮膚疾患、心臓および肺の徴候、腎臓の関与ならびに神経性障害（脳卒中）が挙げられる。血栓性の合併症は、ＳＬＥ患者における死亡の主な原因である。
【０１９８】
ＡＰＳは、後天性の血栓形成傾向の一般的な原因であり、米国において１年あたり３５，０００新症例のＡＰＳ関連静脈血栓症および５０００新症例の動脈血栓症と推定されている。ＡＰＳ抗体を有する患者は、再発性の血栓症を有する可能性がこれらの抗体を有しない患者よりも３〜１０倍高い。米国では、一般集団の約２％が、ループス抗凝固因子、抗カルジオリピン抗体またはその両方を含む抗リン脂質抗体（ＡＡｓ）について陽性と試験される。ＡＡｓは、脳卒中または一過性脳虚血発作を有する５０歳未満の患者の４６％および心筋梗塞の若年生存者（４５歳未満）の２１％において検出された。ＳＬＥを有する患者におけるＡＡｓの有病率は、非常に高い（３０〜５０％）。透析患者における高ＡＡｓの有病率は、公開文献において０．７％〜６９％と様々である。ＡＰＳを有する患者では、女性と男性の割合は、原発性について約２対１およびＳＬＥに関連する症例について９対１である。
【０１９９】
ＡＰＳを有するが、血栓性の事象または皮膚の変化を起こしていない患者に対する現在の治療は、低用量アスピリンを用いた生涯続く治療である。中程度から高度のＡＡ力価または血栓症を有する患者は、ヘパリンなどの抗凝固因子を用いた速効性の処置を必要とする。長期間の治療は、ワルファリンを用いた抗凝固である。生命を危うくするＡＰＳを有する患者においてシクロホスファミドを使用する臨床試験の活動、およびＡＰＳに関連する妊娠損失を管理するためにステロイドを使用する臨床試験の活動が、いくつか存在する。ＡＡｓのレベルを管理するために抗Ｂ細胞治療を用いることについての十分な前例はない。
【０２００】
４．皮膚筋炎
皮膚筋炎は、筋肉酵素レベルの上昇、および皮膚の発疹、代表的には顔面上の赤紫色の発疹ならびに眼瞼および眼窩周囲組織の浮腫を伴う、対称性の近位筋の脱力を特徴とする進行性の状態である（Ｄａｌａｋａｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１：３００−３０６，２００１；Ｄａｌａｋａｓ，Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２：２１９−２２７，２００６を参照のこと）。罹患筋肉組織は、慢性炎症性反応による線維の変性を示し、小児および成人に生じ、後者の場合、内臓癌を伴うことがある。ＰＭ／ＤＭの原因は、不明である。それは、めったに家族の複数のメンバーに生じることはないが、ある特定のＨＬＡタイプに関連し得る（例えば、ＤＲ３、ＤＲ５またはＤＲ７）。ウイルスならびにＴｏｘｏｐｌａｓｍａおよびＢｏｒｒｅｌｉａ種を含む感染物質が、この疾患の可能性のあるトリガーとして提唱されている。薬物誘導疾患のいくつかの症例が、報告されている（例えば、ヒドロキシ尿素、ペニシラミン、スタチン、キニジンおよびフェニルブタゾン）。免疫学的異常および体液性異常が、共通する（例えば、筋肉におけるＴＮＦ−αの増加、循環筋炎特異的自己抗体；異常なＴ細胞およびＢ細胞の活性；他の自己免疫疾患の家族歴）。Ｂ細胞は、血管周囲部位に最も大量に存在する炎症細胞である。
【０２０１】
皮膚筋炎は、皮膚の問題（代表的には、顔面上の赤紫色の発疹ならびに眼瞼および眼窩周囲組織の浮腫）に関連し、関節、心臓、肺および胃腸の徴候が、患者の最大５０％に生じるので、この疾病は、重篤な罹患率に関連し得る。皮膚筋炎は、他の結合組織の自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥ、強皮症およびＲＡ）と関連することが多い。ＲＡとは異なり、ＤＭ／ＰＭと特異的に関連する関節炎は、糜爛性でないか、または変形性でない。ＳＬＥなどの他の自己免疫性の結合組織疾患に関連する皮膚の変化と一致して、その皮膚には、血管周囲の炎症性浸潤物が存在する。ＰＭ／ＤＭは、通常、生命を危うくするものではないが、患者は、脱力が残ること、障害および生活の質の低下を示すことが多い。重篤な筋力低下および／または心肺の関与が理由で、ＰＭ／ＤＭによって死に至ることがある。悪性疾患のリスクは、ＤＭを有する患者において非常に高い（発生率＝２６）が、ＰＭを有する患者ではそうではない；悪性疾患は、６０歳を超える成人においてより頻繁に生じる。皮膚または筋肉の石灰沈着症（堅い黄色または肌色の小結節を顕わす）は、成人では珍しいが、ＤＭを有する最大４０％の小児または青年に生じる；これは、非常に消耗性である。それらは、皮膚表面を通って突出することがあり、この症例では、２次感染が起き得る。
【０２０２】
炎症性ミオパチーの発生率（多発性筋炎単独、ならびに多発性筋炎と皮膚筋炎の複合型は、それぞれ１００，０００人あたり０．１および１と推定されており（人種のバイアスなし）、明らかに増加している。有病率は、ＰＭ単独およびＰＭ／ＤＭ複合型に対してそれぞれ１００，０００人あたり１および６である。女性が男性よりも多く罹患する（約２：１）。ＰＭ／ＤＭは、任意の年齢の人において生じ得る。２つの発症年齢のピークが存在する。成人では、発症年齢のピークは、およそ５０歳であり、小児では、年齢のピークは、およそ５〜１０歳である。
【０２０３】
処置の中心は、ステロイドである（Ｄａｌａｋａｓ，Ｊａｍａ  ２９１：２３６７−２３７５，２００４；Ｄａｌａｋａｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１０２：１７７−１９３，２００４を参照のこと）。メトトレキサート、アザチオプリンおよびミコフェノール酸モフェチルによる免疫抑制剤治療もまた用いられている。不応性の患者では、ＩＶＩｇが短期間の治療のために用いられている。この障害に対する新たに出現した治療には、Ｒｉｔｕｘａｎが含まれる。ＴＮＦアンタゴニストは、ＤＭに関連するリスクのいくつか（感染症、悪性疾患、他の自己免疫疾患の誘導）を増加させ得るという懸念がいくらかあるが、ＲＥＭＩＣＡＤＥおよびＥＮＢＲＥＬが、この障害に対する進行中の臨床試験において研究されている。
【０２０４】
５．ギランバレー症候群
ギランバレー症候群は、感染後の重篤な神経性障害である。ＧＢＳ患者において観察される神経損傷は、おそらく、交差反応性の抗ガングリオシド抗体によって引き起こされる。ＧＢＳにおける交差反応性抗体産生の細胞性免疫学的バックグラウンドは、ほとんど不明である。一部では、ＧＢＳにおける最も頻度の高い先行感染であるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに対する樹状細胞の特異な応答が、Ｂ細胞の増殖および自己反応性形質細胞への分化を増強させるという仮説がたてられている。宿主に関連する因子ならびに病原性の因子が、これに関係し得る（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出；Ｌｅｗｉｓ，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．２５：７１−８７，２００７；Ｓａｉｄ，Ｎｅｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．２５：１１５−１３７，２００７；Ｙｕｋｉ，Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  ３５：６９１−７１１，２００７を参照のこと）。
【０２０５】
ＧＢＳは、５〜１５％という死亡率の壊滅的な障害である。ＩＶＩｇは、これらの患者に対してまず選択される処置である（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前出を参照のこと）。なおも、約５０％の患者が、６ヶ月後に自力で歩行できない。ＧＢＳは、急性末梢神経障害の少なくとも４つのサブタイプからなる。急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＡＩＤＰ）サブタイプの組織学的な外観は、実験的自己免疫性神経炎と似ていて、それは、主に、ミエリンタンパク質Ｐ０、Ｐ２およびＰＭＰ２２由来のペプチドに対するＴ細胞によって引き起こされる。ＡＩＤＰにおけるＴ細胞性免疫の役割は、未だ不明であり、抗体および補体の関与についてのエビデンスが存在する。現在、ＧＢＳの軸索サブタイプである、急性運動性軸索性ニューロパチー（ＡＭＡＮ）および急性運動感覚性軸索型ニューロパチー（ＡＭＳＡＮ）が、ランビエ絞輪における軸索を浸潤するマクロファージを標的化するガングリオシドに対する抗体によって軸索鞘上で引き起こされるという強力なエビデンスが存在する。ＧＢＳを有する約４分の１の患者が、その近い時点においてＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに感染しており、この疾患の軸索の形態が、これらの人々において特に共通している。Ｃ  ｊｅｊｕｎｉ細菌細胞壁由来のリポオリゴ糖は、ガングリオシド様構造を含み、それをウサギに注射することにより、急性運動性軸索性ニューロパシーに似たニューロパチーが誘導される。ＧＭ１、ＧＭ１ｂ、ＧＤ１ａおよびＧａｌＮａｃ−ＧＤ１ａに対する抗体は、特に、急性運動性軸索性ニューロパチー、そしてＧａｌＮａｃＧＤ１ａを除いて急性運動感覚性軸索型ニューロパチーに関連づけられる。フィッシャー症候群のサブタイプは、特に、ＧＱ１ｂに対する抗体と関連し、Ｃ  ｊｅｊｕｎｉの細胞壁におけるガングリオシド構造と類似の交差反応性が見出されている。抗ＧＱ１ｂ抗体は、インビトロにおいて、補体媒介性機構によって運動神経末端を損傷すると示されている。
【０２０６】
ＧＢＳは、稀な障害であり、米国では男性と女性に等しく発症する（ＮＩＨ，Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｒｅ，２００４）。ＧＢＳは、米国において１００，０００人の集団あたり１人に発症する（ＮＩＨ，Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｒｅ，２００４）。ＧＢＳを含むすべての慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）の米国の有病率は、１００，０００あたり約１〜７．７である（米国において２，０００〜１５，０００症例）。しかしながら、これは、おそらく過小評価であり、ＣＩＤＰは、すべてのニューロパチー（１０００万症例）の５％を構成すると想定され、そして実際には、合計で約３００，０００（活動性）〜５００，０００症例が存在すると予想され得る。
【０２０７】
ＩＶＩｇおよびプラスマフェレシスが、ＧＢＳに対する治療として現在用いられている。ＧＢＳは、自己免疫性のニューロパチーであるので、Ｔ細胞、Ｂ細胞および／または補体を標的にした治療がこれらの疾患において有用であり得ると予想される。
【０２０８】
６．グッドパスチャー症候群
用語「グッドパスチャー症候群」（ＧＰＳ）は、Ｅｒｎｅｓｔ  Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅによる１９１９年の報告に由来する冠名であり、彼は、インフルエンザ感染に関連する肺出血の臨床的な症候群および急性半月体形成性糸球体腎炎の組織学的所見を報告した。年月を重ねるにつれて、この用語は、様々な人によって様々な方法で使用され、一部の人たちは、ＧＰＳのような腎機能障害を伴う肺出血のすべての原因を含める。他の人たちは、用語ＧＰＳを、抗ＧＢＭ抗体を伴うが肺出血を有しない糸球体腎炎とは対照的に、抗糸球体基底膜（抗ＧＢＭ）抗体に関連する肺出血を有する患者に限定した。さらに他の人たちは、ＧＰＳではなく抗ＩＶ型コラーゲンの疾患の概念を採用する。
【０２０９】
ＧＰＳの診断に対する必須条件は、腎臓の糸球体における結合した抗ＧＢＭ抗体の証明である。循環抗ＧＢＭ抗体は、抗ＧＢＭ疾患を有する９０％を超える患者に存在する。無処置のＧＰＳの臨床経過は厳しいものであり、処置されてもＧＰＳの臨床経過は厳しい；この疾患は、極度に不良な予後を伴う。
【０２１０】
ＧＰＳは、１００万人に約０．１症例という発生率の稀な疾患である。この疾患は、アフリカ系アメリカ人よりも白人において発生頻度が高く、ニュージーランドのマオリ族などのある特定の他の人種群において、より発生頻度が高いことがある。ＧＰＳは、一年中存在し得るが、その発生率は、春および初夏に増加するとみられる。
【０２１１】
ＧＰＳに対する現在の治療としては、ステロイド、免疫抑制剤および血漿交換が挙げられる。その腎臓病理学が、腎臓糸球体における抗ＧＢＭ抗体の蓄積に起因すると見られるので、Ｂ細胞を標的とした治療が、この疾患において有用であり得る。
【０２１２】
前述のことから、本発明の特定の実施形態は、例証の目的で本明細書中に記載されるが、様々な改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることが認識されるだろう。したがって、本発明は、以下の非限定的な例によってさらに例証され、添付の請求項によるときを除いて、限定されない。
【実施例】
【０２１３】
実施例１
ＦｃγＲＩＡ−ＣＥＥ、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨＩＳおよびＦｃγＲＩＡ−ＣＦＬＡＧタグ化タンパク質を発現する哺乳動物の可溶性ＦｃγＲＩＡ発現構築物の構築
Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＣＥＥ）、６Ｈｉｓ（ＣＨＩＳ）またはＦＬＡＧ（ＣＦＬＡＧ）というＣ末端タグを有する、ヒトＦｃγＲＩＡの細胞外ドメインを含む発現構築物を、ＦｃγＲＩＡをコードするＤＮＡフラグメント（配列番号１４）および発現ベクターｐＺＭＰ２０を用いるＰＣＲおよび相同組換えによって構築する。
【０２１４】
ＦｃγＲＩＡ−ＣＥＥをコードするＰＣＲフラグメントは、５’非翻訳領域内のｐＺＭＰ２０ベクター配列との５’オーバーラップ、配列番号１４のＦｃγＲＩＡ細胞外ドメインコード領域部分（ヌクレオチド１〜８４６）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ（ＧｌｕＧｌｕＴｙｒＭｅｔＰｒｏＭｅｔＧｌｕ；配列番号１５）コード配列、およびポリオウイルス配列内リボソーム進入部位領域内のｐＺＭＰ２０ベクターとの３’オーバーラップを含む。ＰＣＲ増幅反応は、５’オリゴヌクレオチド「１００」（ＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＧ；配列番号１６）、３’オリゴヌクレオチド「２００」（ＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＴＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＡＧＧ；配列番号１７）および鋳型として予め生成されたＦｃγＲＩＡのＤＮＡクローン（配列番号１４）を使用する。
【０２１５】
ＰＣＲ増幅反応条件は、以下のとおりである：９４℃５分を１サイクル；９４℃１分、その後の５５℃２分、その後の７２℃３分を３５サイクル；７２℃１０分を１サイクル。ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲル上で泳動し、予想サイズに対応するＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０４）を用いてゲルから抽出する。
【０２１６】
プラスミドｐＺＭＰ２０は、キメラＣＭＶエンハンサー／ＭＰＳＶプロモーター、酵母を組み換える前の直鎖化のためのＢｇｌＩＩ部位、ポリオウイルス由来の配列内リボソーム進入エレメント、膜貫通ドメインのＣ末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメイン；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサーおよび複製起点、ＤＨＦＲ遺伝子ならびにＳＶ４０ターミネーターを含む哺乳動物の選択マーカー発現単位；ならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける選択および複製のために必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物の発現ベクターである。
【０２１７】
ゲルから抽出されたＦｃγＲＩＡ−ＣＥＥ  ＰＣＲフラグメントで酵母を組み換える前に、プラスミドｐＺＭＰ２０をＢｇｌＩＩで消化する。１００μｌのコンピテント酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を１０μｌのＦｃγＲＩＡ−ＣＥＥ挿入ＤＮＡおよび１００ｎｇのＢｇｌＩＩ消化ｐＺＭＰ２０ベクターと混合し、そしてその混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移す。０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞ｏｈｍおよび２５μＦという電源（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の設定を用いて、その酵母／ＤＮＡ混合物に電気パルスをかける。６００μｌの１．２Ｍソルビトールをそのキュベットに加え、酵母を１００μｌおよび３００μｌのアリコートで２枚のＵＲＡ−Ｄプレート上にプレーティングし、３０℃でインキュベートする。約７２時間後、１枚のプレートからのＵｒａ＋酵母形質転換体を１ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁し、軽く遠心して酵母細胞をペレットにする。その細胞ペレットを０．５ｍｌの溶解緩衝液（２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁する。５００μｌの溶解混合物を、酸で洗浄された２５０μｌのガラスビーズおよび３００μｌのフェノール−クロロホルムが入ったＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに加え、３分間ボルテックスし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機において最高速度で５分間遠心する。３００μｌの水相を新しいチューブに移し、６００μｌのエタノールでＤＮＡを沈殿させた後、最高速度で３０分間遠心分離する。そのチューブをデカントし、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄する。そのチューブをデカントし、ＤＮＡペレットを３０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁する。
【０２１８】
エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、５μｌの酵母ＤＮＡ調製物および５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ細胞を用いて行う。その細胞に２．０ｋＶ、２５μＦおよび４００ｏｈｍで電気パルスをかける。エレクトロポレーションの後、１ｍｌのＳＯＣ（２％ＢａｃｔｏＴＭＴｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｍＭグルコース）を加え、次いで、その細胞を５０μｌおよび２００μｌのアリコートで２枚のＬＢ  ＡＭＰプレート（ＬＢブロス（Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％ＢａｃｔｏＴＭＡｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）上にプレーティングする。
【０２１９】
その構築物に対する３つのＤＮＡクローンのインサートを配列解析に供し、正しい配列を含む１つのクローンを選択する。商業的に入手可能なキット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って使用して、ラージスケールのプラスミドＤＮＡを単離する。
【０２２０】
同じプロセスを用いることにより、ＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓ（配列番号１８）から構成されるＣ末端ｈｉｓタグを有するＦｃγＲＩＡ（ＦｃγＲＩＡ−ＣＨＩＳ）またはＧｌｙＳｅｒＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ（配列番号１９）から構成されるＣ末端ＦＬＡＧタグを有するＦｃγＲＩＡ（ＦｃγＲＩＡ−ＣＦＬＡＧ）を調製する。これらの構築物を調製するために、３’オリゴヌクレオチド「２００」の代わりに、３’オリゴヌクレオチド「３００」（ＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＴＴＧＡＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＡＧＧ；配列番号２０）を用いてＦｃγＲＩＡ−ＣＨＩＳが生成されるか、または３’オリゴヌクレオチド「４００」（ＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＴＴＧＡＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＡＧＧ；配列番号２１）を用いてＦｃγＲＩＡ−ＣＦＬＡＧが生成される。
【０２２１】
実施例２
ＦｃγＲＩＡ−ＣＥＥ、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨＩＳおよびＦｃγＲＩＡ−ＣＦＬＡＧという、Ｃ末端タグ化タンパク質を発現する可溶性ＦｃγＲＩＡレセプター発現構築物のトランスフェクションおよび発現
２００μｇの可溶性ＦｃγＲＩＡタグ化発現構築物の各々の３セットを３７℃において３時間、２００単位のＰｖｕＩで別々に消化し、イソプロピルアルコールを用いて沈殿させ、１．５ｍＬ微量遠心チューブにおいて遠心分離する。上清をペレットからデカントし、そのペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温において５分間インキュベートする。そのチューブを微量遠心管において１４，０００ＲＰＭで１０分間遠心し、上清をペレットからデカントする。次いで、そのペレットを無菌環境において７５０μｌのＣＨＯ細胞組織培養液に再懸濁し、６０℃において３０分間インキュベートし、そして室温まで冷却する。およそ５×１０６個のＣＨＯ細胞を、３本のチューブの各々においてペレットにし、ＤＮＡ−培地溶液を用いて再懸濁する。そのＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベットに入れ、以下のパラメータを用いてエレクトロポレーションを行う；９５０μＦ、高キャパシタンス、３００Ｖ。次いで、そのキュベットの内容物を取り出し、プールし、ＣＨＯ細胞組織培養液で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬ振盪フラスコに入れる。そのフラスコを、１２０ＲＰＭで振盪している振盪機上の３７℃、６％ＣＯ２の恒温器に入れる。
【０２２２】
そのＣＨＯ細胞を栄養素選択に供した後、２００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）、次いで、１μＭ  ＭＴＸに段階的に増幅する。タグ化タンパク質の発現を、ウエスタンブロットによって確認し、そのＣＨＯ細胞プールを、タンパク質精製にむけて回収するためにスケールアップする。
【０２２３】
実施例３
ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の精製
Ｃ末端６Ｈｉｓ（ＣＨＩＳ）タグを有する、ヒトＦｃγＲＩＡの細胞外ドメインを含む発現構築物を、実施例１，前出に記載したように構築した。この構築物を、実施例２，前出に記載したようにＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、ＣＨＯ細胞において発現させた。上記の実施例において「ＦｃγＲＩＡ−ＣＨＩＳ」と称された、コードされたＨｉｓ−タグ化ＦｃγＲＩＡは、本明細書中で「ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６」または「ｐＦＣＧＲ１Ａ  ＣＨ６」とも称される。ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６に対するヌクレオチドコード配列は、配列番号２２に示され、対応するＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６アミノ酸配列は、配列番号２３に示されている。発現されたＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を、以下に記載されるように精製した。
【０２２４】
ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を、Ｎｉ  ＩＭＡＣ捕捉、Ｑ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅにおけるクロマトグラフィおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００におけるサイズ排除クロマトグラフィの組み合わせによってＣＨＯ条件培地から精製した。Ｎｉ  ＩＭＡＣ捕捉：ＣＨＯ条件培地をフィルター滅菌し（０．２２μｍ）、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ  ０．１ｍ２膜を備える蠕動ポンプシステムを用いて１０×濃縮した。濃縮された培地を、少なくとも５ＣＶの５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５と緩衝液交換し、最終濃度２５ｍＭイミダゾールに調整した。必要であれば濃ＮａＯＨまたは濃ＨＣｌのいずれかを用いてｐＨを７．５に調整した。Ｈｉｓタグ化ＦｃγＲＩＡタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂に結合しているＩＭＡＣを用いて捕捉した。培地を適用する前に、その樹脂を５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾールｐＨ７．５中で平衡化した。適切なサイズのローラーボトルを用いるバッチモードまたはクロマトグラフィステーションを用いるカラムモードのいずれかにおいて、４℃で一晩、結合させた。充填した後、樹脂を少なくとも１０ＣＶの５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２５ｍＭイミダゾールｐＨ７．５で洗浄した。５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５における、イミダゾールの勾配またはイミダゾール濃度を上げていく工程を用いて、結合したタンパク質を溶出させた（５００ｍＭイミダゾールが、溶出の終点だった）。分画を回収し、ウエスタンブロッティング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって解析し、そしてＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を含む分画を混合した。
【０２２５】
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅパッシブ（Ｐａｓｓｉｖｅ）クロマトグラフィ：ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を含むＩＭＡＣプールを、３×１０ｋＤ  ＭＷＣＯ  ０．１ｃｍ２膜を備えるＬａｂｓｃａｌｅ  ＴＦＦシステムを使用することによって１５ＣＶの５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．５に緩衝液交換した。７．５ｍｇのＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６あたり１．０ｍＬのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂サンプルを、少なくとも１０ＣＶの５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、２Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５を用いて負荷し、次いで、１０ＣＶの５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５で平衡化した。樹脂および調整されたＩＭＡＣプールを混合し、静かに撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。そのスラリーを重力流カラムに移し、フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を回収し、そのカラムを少なくとも５ＣＶの平衡緩衝液で洗浄した。そのフロースルーおよび洗浄画分を混合し、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の存在について評価した。
【０２２６】
サイズ排除クロマトグラフィ：Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅフロースルー＋洗浄画分を、画分の体積に応じて、１０ｋＤ  ＭＷＣＯ  ０．１ｃｍ２膜を備えるＴＦＦラボスケールシステム、適切な直径のＹＭ３０膜を備える撹拌セルシステム、または３０ｋＤ  ＭＷＣＯ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ遠心分離膜のいずれかを用いて少なくとも１０〜２０倍に濃縮した。濃縮されたＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６画分を、注入される体積および質量の量に適切なサイズのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに注入した。そのカラムを、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１０９ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．３または３５ｍＭ  ＮａＰＯ４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．２を含む調合緩衝液で平衡化した。そのカラムを、４５ｃｍ／時を超えない流速において均一濃度で溶出し、画分を回収して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣによってＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の存在について解析した。ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を含む画分を混合し、ＹＭ３０膜（３０ｋＤ  ＭＷＣＯ）を備える撹拌セル装置を用いて所望の濃度に濃縮した。最終的なＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６濃縮物を、０．２２ｕｍ滅菌フィルターで濾過し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０２２７】
実施例４
可溶性ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６の構築、発現および精製
実施例１、２および３，前出において上に記載されたようなＣ末端Ｈｉｓ６タグを有する可溶性単量体型のＦｃγＲＩＡの構築、発現および精製に加えて、同様の方法を用いて、可溶性単量体型のＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡも作製した。
【０２２８】
簡潔には、可溶性単量体型のＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡをコードする発現構築物を、天然のシグナル配列、細胞外ドメインおよびＣ末端Ｈｉｓ６タグ（ＧＳＧＧＨＨＨＨＨＨ；配列番号１８）をコードするＤＮＡ配列を用いて作製した。そのＤＮＡ配列は、ＦｃγＲＩＩＡに対してはアミノ酸１〜２１２（配列番号２５のアミノ酸１〜２１２）およびＦｃγＲＩＩＩＡに対しては１〜１９５（配列番号２７のアミノ酸１〜１９５）をコードした。レセプターを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＸＢ−１１細胞（Ｌａｒｒｙ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）に由来する上清から精製した。ＣＨＯ条件培地をフィルター滅菌し、濃縮し、そして５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）に緩衝液交換した。そのＨｉｓタグ化ＦｃγＲタンパク質（ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６）を、緩衝液Ａで平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて捕捉した。５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５中のイミダゾールの勾配（０〜５００ｍＭ）を用いて、結合したタンパク質を溶出した。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング（抗６×ヒスチジンＨＲＰマウスＩｇＧ１，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって可溶性ＦｃγＲについて解析した。
【０２２９】
可溶性ＦｃγＲを含むＮｉ−ＮＴＡ画分を５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）に緩衝液交換し、緩衝液Ｂで予め平衡化されたＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）とともに４℃において一晩インキュベートした。そのスラリーを重力流カラムに移し、フロースルーおよび洗浄画分を混合し、上に記載したように可溶性ＦｃγＲの存在について評価した。混合した画分を濃縮し、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１０９ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．３（緩衝液Ｃ）で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｈｉｌｏａｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラム上に注入した。そのカラムを緩衝液Ｃで溶出し、可溶性ＦｃγＲを含む画分を混合し、濃縮し、フィルター滅菌し、そして−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、Ｎ末端の配列決定およびサイズ排除多角度光散乱法（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｍｕｌｔｉ−ａｎｇｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によって、ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６を解析した。エンドトキシンレベルは、約２０ｍｇ／ｍＬで調合された各レセプター調製物について＜１．０エンドトキシン単位／ｍＬだった。
【０２３０】
ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６に対するヌクレオチドコード配列は、それぞれ配列番号２４および配列番号２６に示されている。ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６に対するコードされるポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号２５および配列番号２７に示されている。Ｎ末端の配列解析から、成熟ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６に対する開始部位としてＧｌｎ−３４、および成熟ＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６に対する開始部位としてＭｅｔ−１８とＧｌｕ−２１の両方が示された。したがって、シグナル配列を有しない成熟型のＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６ポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸残基３４〜２２２に対応し、成熟型のＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６は、配列番号２７のアミノ酸残基１８〜２０５および２１〜２０５に対応する。
【０２３１】
実施例５
固定化されたヒトＩｇＧ１への可溶性Ｈｉｓタグ化ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６、ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６）の結合
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、測定を行った。センサーチップ表面の活性化およびＩｇＧ１抗体（ヒトミエローマ血漿由来のラムダ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の共有結合固定化を、０．２Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノ−プロピル）カルボジイミドおよび０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドならびにＢｉａｃｏｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。１０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０において１１μｇ／ｍＬに希釈されたヒトＩｇＧ１抗体を固定化することにより、特異的結合フローセルを調製し、そして第２フローセルを活性化させるがＩｇＧ１に曝露しないことにより、参照フローセルを調製した。特異的結合フローセルと参照フローセルの両方における未反応のエステル部位を１Ｍエタノールアミン塩酸塩でブロックした。
【０２３２】
可溶性ＦｃγＲＩＡ結合の動態解析のために、ＩｇＧ１抗体を４５８レゾナンスユニット（ＲＵ）のレベルで固定化した。ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を活性フローセルと参照フローセルの両方の上に順次、注入した。ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６結合の動態解析のために、ＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイ緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％ポリソルベート２０）中の０．１６〜１０．３×１０−９Ｍの濃度範囲のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いた。ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を、４０μＬ／分の流速で３分間注入した。続いて、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６溶液をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液に切り替え、解離を３分間測定した。各ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の濃度を、ランダムな順序で２つ組において試験した。各測定の後、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ１．８の注入を５０μＬ／分で３０秒間にわたって１回行うことにより、ＩｇＧ１表面を再生した。
【０２３３】
可溶性ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡの結合の平衡解析のために、ＩｇＧ１抗体を１０１３ＲＵのレベルで固定化した。０．０３〜２４×１０−６Ｍの濃度範囲の可溶性ＦｃγＲを用いた。各可溶性ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６）を、１０μＬ／分の流速で１分間注入した。各ＦｃγＲに対する解離時間は、５分だった。ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６の各濃度をランダムな順序で２つ組において試験した。各測定の後、ＨＢＳ−ＥＰの注入を３０μＬ／分で３０秒間にわたって１回行うことにより、ＩｇＧ１表面を再生した。
【０２３４】
３つすべての可溶性ＦｃγＲに対する結合曲線を、特異的結合表面曲線から参照表面曲線を差し引くこと、ならびに緩衝液注入曲線を差し引くことによって処理した。処理された結合曲線を１：１の結合モデルに全体的にあてはめ、得られた速度定数および平衡定数を、Ｂｉａｃｏｒｅソフトウェアを用いて評価した。
【０２３５】
可溶性ＦｃγＲは、１：１結合相互作用に最も適合した様式で固定化ヒトＩｇＧ１に結合した。そのＩｇＧ１は、共有結合固定化の際に結合活性をいくらか損失し、表面の活性は、理論最大値の２６〜８１％に及んだ。ＩｇＧ１に結合するＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の会合段階および解離段階は、２００秒超にわたって測定可能であったことから、結合曲線の動態解析が可能だった。ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６は、それぞれ２．８×１０６Ｍ−１ｓ−１および４．６×１０−４ｓ−１という会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）でＩｇＧ１に結合し、このことから、１．７×１０−１０Ｍという平衡解離定数（ＫＤ）が得られた。ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６に対する会合／解離速度は、速すぎて正確に測定できなかったので、平衡解離定数は、定常状態において測定された。ＩｇＧ１へのＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６の結合は、飽和でき、それぞれ０．６３×１０−６Ｍおよび１．９×１０−６ＭというＫＤ推定値で低親和性だった。各可溶性ＦｃγＲは、ヒトＩｇＧ１で観察されたものと類似の速度および親和性で固定化ウサギ抗ＯＶＡ  ＩｇＧに結合した。
【０２３６】
実施例６
タグ化されていない可溶性単量体ＦｃγＲＩＡタンパク質を発現する哺乳動物の可溶性ＦｃγＲＩＡ発現構築物の構築
ヒトＦｃγＲＩＡの細胞外ドメインを含む２つの発現構築物を、短いバージョンのＦｃγＲＩＡ（配列番号２のアミノ酸１〜２８２）および長いバージョンのＦｃγＲＩＡ（Ｃ末端に追加の１０アミノ酸）（配列番号２のアミノ酸１〜２９２）の細胞外ドメインをコードするＤＮＡフラグメントならびに発現ベクターｐＺＭＰ３１を用いるＰＣＲおよび相同組換えによって構築した。
【０２３７】
５’非翻訳領域におけるｐＺＭＰ３１ベクター配列との５’オーバーラップ、それぞれ配列番号２のアミノ酸残基１〜２８２または１〜２９２に対応するＦｃγＲＩＡ細胞外ドメインコード領域、およびポリオウイルス配列内リボソーム進入部位領域におけるｐＺＭＰ３１ベクターとの３’オーバーラップを含むＦｃγＲＩＡの短いおよび長いバージョンをコードするＰＣＲフラグメントを構築した。短いバージョンと長いバージョンの両方に対するＰＣＲ増幅反応には、５’オリゴヌクレオチド「ｚｃ５７７０９」（ＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＣＴ；配列番号２８）を使用した。短いバージョンに対しては３’オリゴヌクレオチド「ｚｃ５７７１０」（ＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧＡＡＧＣＴＣＣＡ；配列番号２９）を使用し、長いバージョンに対しては３’オリゴヌクレオチド「ｚｃ５７７１２」（ＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＣＡＧＧＡＧＴ；配列番号３０）を使用した。ＦｃγＲＩＡ鋳型は、予め生成されたＦｃγＲＩＡのｃＤＮＡに由来した。
【０２３８】
ＰＣＲ増幅反応条件は、以下のとおりだった：９５℃２分を１サイクル；９５℃１５秒、その後の５５℃３０秒、その後の６８℃１分間を３０サイクル。ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲル上で泳動し、予想サイズに対応するＤＮＡフラグメントを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡおよびＧｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲルから抽出した。
【０２３９】
プラスミドｐＺＭＰ３１は、キメラＣＭＶエンハンサー／ＭＰＳＶプロモーター、酵母を組み換える前の直鎖化のためのＥｃｏＲＩ部位、ポリオウイルス由来の配列内リボソーム進入エレメント；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点およびアンピシリン選択マーカー；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサーおよび複製起点、ＤＨＦＲ遺伝子ならびにＳＶ４０ターミネーターを含む哺乳動物の選択マーカー発現単位；ならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける選択および複製のために必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物の発現ベクターである。
【０２４０】
ゲルから抽出された短いおよび長いバージョンのＦｃγＲＩＡ  ＰＣＲフラグメントの各々で酵母を組み換える前に、プラスミドｐＺＭＰ３１をＥｃｏＲＩで消化した。１００μｌのコンピテント酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を２０μｌのＦｃγＲＩＡの短いまたは長いインサートＤＮＡおよび約１００ｎｇのＥｃｏＲＩ消化ｐＺＭＰ３１ベクターと混合した。その混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞ｏｈｍおよび２５μＦという電源（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の設定を用いて、その酵母／ＤＮＡ混合物に電気パルスをかけた。６００μｌの１．２Ｍソルビトールをそのキュベットに加え、酵母を２つの３００μｌのアリコートで２枚のＵＲＡ−Ｄプレート上にプレーティングし、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、１枚のプレートからのＵｒａ＋酵母形質転換体を８００μｌのＨ２Ｏに再懸濁し、軽く遠心して酵母細胞をペレットにした。その細胞ペレットを０．５ｍｌの溶解緩衝液（２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。５００μｌの溶解混合物を、酸で洗浄された２５０μｌのガラスビーズおよび３００μｌのフェノール−クロロホルムが入ったＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに加え、３分間ボルテックスし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機において最高速度で５分間遠心した。３００μｌの水相を新しいチューブに移し、６００μｌのエタノールでＤＮＡを沈殿させた後、最高速度で１０分間遠心分離した。そのチューブをデカントし、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄した後、最高速度で１０分間遠心分離した。そのチューブをデカントし、ＤＮＡペレットを１０μｌのＨ２Ｏに再懸濁した。
【０２４１】
エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞（ＤＨ１０Ｂ）の形質転換を、１μｌの酵母ＤＮＡ調製物および２０μｌのＥ．ｃｏｌｉ細胞を用いて行った。その細胞に２．０ｋＶ、２５μＦおよび４００ｏｈｍで電気パルスをかけた。エレクトロポレーションの後、６００μｌのＳＯＣ（２％ＢａｃｔｏＴＭＴｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｍＭグルコース）を加え、その細胞を５０μｌおよび５５０μｌのアリコートで２枚のＬＢ  ＡＭＰプレート（ＬＢブロス（Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％ＢａｃｔｏＴＭＡｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）上にプレーティングした。
【０２４２】
コロニーＰＣＲによってコロニーをスクリーニングし、各構築物からの５つのＤＮＡクローンのインサートを配列解析に供した。正しい配列を含む１つのクローンを選択した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてＤＮＡ配列決定を行った。ＥｄｇｅＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｅｆｏｒｍａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｌｅｘ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて配列決定反応物を精製し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において泳動した。得られた配列データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｖ４．６ソフトウェア（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ．）を用いてアセンブルし、編集した。正しい配列を含む１つのクローンを選択し、商業的に入手可能なキット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って使用して、ラージスケールのプラスミドＤＮＡを単離した。
【０２４３】
インサートＤＮＡの短いおよび長いバージョンの配列は、それぞれ、配列番号３１および配列番号３３に示されている。非タグ化ＦｃγＲＩＡの短いおよび長いバージョンに対する対応するコードされるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３２および配列番号３４に示されている。ＦｃγＲＩＡに対するシグナル配列は、配列番号２のアミノ酸１〜１５（配列番号４０および４２の残基１〜１５）に対応することによって、配列番号３２および３４の１６位における、成熟非タグ化ＦｃγＲＩＡタンパク質に対する開始部位が得られる。
【０２４４】
実施例７
非タグ化ＦｃγＲＩＡタンパク質を発現する可溶性ＦｃγＲＩＡレセプター発現構築物のトランスフェクションおよび発現
２００μｇの可溶性ＦｃγＲＩＡの短いおよび長いバージョンの発現構築物を、３７℃において１８時間（一晩）、２００単位のＢｓｔＢ１で消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで洗浄し、エタノールで沈殿させ、そして１．５ｍＬ微量遠心チューブにおいて遠心分離した。上清をペレットからデカントし、そのペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温において５分間インキュベートした。そのチューブを微量遠心管において１４，０００ＲＰＭで１０分間遠心し、上清をペレットからデカントした。次いで、そのペレットを無菌環境において２００μｌのＣＨＯ細胞組織培養液に再懸濁し、３７℃において３０分間インキュベートした。およそ１×１０７個のＣＨＯ細胞を、ペレットにし、ＤＮＡ−培地溶液を用いて再懸濁した。そのＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベットに入れ、以下のパラメータを用いてエレクトロポレーションを行った；９５０μＦ、高キャパシタンス、３００Ｖ。次いで、そのキュベットの内容物を取り出し、プールし、ＣＨＯ細胞組織培養液で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬ振盪フラスコに入れた。そのフラスコを、１２０ＲＰＭで振盪している振盪機上の３７℃、５％ＣＯ２の恒温器に入れた。
【０２４５】
そのＣＨＯ細胞を栄養素選択に供し、２００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）への増幅に供した。タグ化タンパク質の発現を、ウエスタンブロットによって確認し、そのＣＨＯ細胞プールを、タンパク質精製にむけて回収するためにスケールアップした。
【０２４６】
実施例８
非タグ化ＦｃγＲＩＡの精製
以下の方法を、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞条件培地からの非タグ化ＦｃγＲ１Ａの精製に適用する。
【０２４７】
Ａ．ＩｇＧアフィニティークロマトグラフィ
未希釈（１×）の培地を回収し、ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含むカラムに１５ｃｍ／ｈの流速で充填した。１０Ｌの条件培地の場合、１５０ｍＬの充填樹脂を含む５ｃｍ直径のカラムを使用した。培地を充填した後、２１５ｎｍにおける吸光度およびＡ２８０ｎｍが少なくとも２カラム体積（ＣＶ）についてベースラインに戻るまで、そのカラムを１．６ｍＭクエン酸、２３ｍＭ二塩基性ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０で１００ｃｍ／ｈにて洗浄した。１０ＣＶの下降ｐＨ勾配の２０ｍＭクエン酸、５ｍＭ二塩基性ＮａＰＯ４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ３．０を６１ｃｍ／ｈの流速で用いて、結合したタンパク質を溶出した。ＦｃγＲ１Ａを含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって特定し、２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０を０．２Ｍという最終濃度になるまで加えることによって中和し、そして４Ｍ  ＮａＣｌを加えることによって１００ｍＭ  ＮａＣｌとした。
【０２４８】
Ｂ．陽イオン交換クロマトグラフィ
Ｔｗｅｅｎ−２０をＨＳ５０クロマトグラフィによってＦｃγＲ１Ａプールから除去した。ＦｃγＲ１Ａ溶出プールを、固体ＭＥＳおよびＨＣｌを用いて１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０に調整し、１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０を用いて＜５ｍＳ／ｃｍに希釈した。ＦｃγＲ１Ａ含有プールをＨＳ５０カラムに充填することにより、１４１ｃｍ／ｈの流速で定量的に捕捉し、Ａ２１５およびＡ２８０ｎｍ  ＵＶシグナルが少なくとも５ＣＶについてベースラインに戻るまで、その樹脂を３８２ｃｍ／ｈにて１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０で洗浄した。結合したＦｃγＲ１Ａを、１０ｍＭ  ＭＥＳ、２Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０からなる６０％溶出緩衝液の５ＣＶから最大量を使用して増加性のＮａＣｌ濃度の勾配を用いて３８２ｃｍ／ｈｒで溶出した。画分を回収し、ＦｃγＲ１ＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって同定した。
【０２４９】
Ｃ．サイズ排除クロマトグラフィ
タンパク質の量を２８０ｎｍにおける吸光度によって評価し、緩衝液交換されたＨＳ５０溶出プールのＦｃγＲ１Ａ含有画分を、存在するＦｃγＲ１Ａの量に応じて、３０ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｕｌｔｒａｃｅｌ遠心分離濃縮器またはＹＭ３０  ６３．５ｍｍ撹拌式セルメンブレンを用いて濃縮した。最終的な濃縮物の体積は、使用したゲル濾過カラムの体積の３％を超えなかった。濃縮されたＦｃγＲ１ＡプールをＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム上に注入し（＜１ｍｇのＦｃγＲ１Ａの場合、カラムサイズは１０／３００ｍｍだった；１〜１０ｍｇの場合、カラムサイズは１６／６０ｍｍだった；＞１０ｍｇの場合、カラムサイズは２６／６０ｍｍだった）、そのタンパク質を３４〜７６ｃｍ／ｈの流速において均一濃度で溶出した。使用した移動相は、３５ｍＭ  ＮａＰＯ４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．２だった。画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによってＦｃγＲ１Ａを同定した。そのＦｃγＲ１Ａ含有画分を、上に記載したように２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に濃縮し、０．２２μｍ滅菌フィルターに通し、−８０℃で保存した。ＦｃγＲ１ＡであることをＮ末端の配列決定およびアミノ酸解析によって確かめた。Ｎ末端の配列解析から、成熟タンパク質がピログルタミン酸から開始し、それが翻訳後に１６位のアミノ酸のグルタミン残基から変換されることが示された。
【０２５０】
実施例９
可溶性ＦｃγＲＩＡの抗炎症活性
Ａ．免疫複合体の析出
ニワトリ卵オバルブミン（ＯＶＡ）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中において１５．０μｇ／ｍＬの最終濃度になるように溶解し、指示濃度の可溶性ＦｃγＲＩＡの存在下および非存在下の２００μＬの最終体積において３００μｇのウサギポリクローナル抗ＯＶＡ抗体／ｍＬと混合した。その直後に、反応混合物の濁度を、３７℃で５〜１０分間にわたって３０秒ごとに分光光度計を活用して３５０ｎｍにおいてモニターした。線形回帰を用いて濁度曲線の直線部分の傾きを計算し、免疫複合体の析出のＦｃγＲ媒介性阻害を、抗ＯＶＡおよびＯＶＡのみを含むインキュベーションに対して表した。
【０２５１】
Ｂ．マスト細胞からのサイトカイン分泌
５．０ｍＬのＰＢＳの最終体積において、３００μＬのウサギポリクローナル抗ＯＶＡをＰＢＳにおける７５．０μＬの１ｍｇ  ＯＶＡ／ｍＬと混合することによって、免疫複合体を調製した。３７℃で３０〜６０分間インキュベートした後、その混合物を１８〜２０時間４℃に置いた。その免疫複合体を１２，０００ｒｐｍで５．０分間遠心分離することによって回収し、上清画分を取り出して廃棄し、その免疫複合体沈殿物を１．０ｍＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁した。その免疫複合体をさらに洗浄した後、１．０ｍＬの氷冷ＰＢＳの最終体積に再懸濁した。ＢＣＡアッセイを用いてタンパク質濃度を測定した。
【０２５２】
ＭＣ／９細胞を培地Ａ（１０％ウシ胎児血清、５０．０μＭ  Ｂ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ可欠アミノ酸、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、３６．０μｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギン、１．０ｎｇ／ｍＬ  ｒｍＩＬ−３、５．０ｎｇ／ｍＬ  ｒｍＩＬ−４、２５．０ｎｇ／ｍＬ  ｒｍＳＣＦを含むＤＭＥＭ）中において、０．５〜３×１０６細胞／ｍＬの密度にサブクローン化した。細胞を１５００ｒｐｍで５．０分間遠心分離することによって回収し、細胞ペレットを培地Ａ（サイトカインを含まない）で洗浄し、２．０×１０６細胞／ｍＬで培地Ａに再懸濁した。細胞のアリコート（２．０×１０５細胞）を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、２００μＬの緩衝液Ａの最終体積中、１０．０μｇ／ウェルのＯＶＡ／抗ＯＶＡ免疫複合体（ＩＣ）とともにインキュベートした。３７℃において４．０時間後、培地を取り出し、１５００ｒｐｍで５．０分間遠心分離した。無細胞の上清画分を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカインアッセイキットを用いて、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦαおよびＭＣＰ−１サイトカイン放出の存在についてアリコートを解析した。
【０２５３】
Ｃ．ＳＲＢＣの補体媒介性溶解
抗体感作ＳＲＢＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を調製し、様々な濃度の可溶性ＦｃγＲＩＡとともにインキュベートした。４℃において１５分後、ラット血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１：５０希釈物の２５μＬのサンプルを加え、そして製造者が記載しているようにその混合物の５４０ｎｍにおける吸光度をモニターすることによって、溶血を測定した。
【０２５４】
Ｄ．ヒトＩｇＧ１に対するＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６親和性の測定
ブランク参照として第２の誘導体化されていないセルを利用して、ＩｇＧ１抗体を１つのフローセルに固定化した。アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ）、およびＢｉａｃｏｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって操作されるＳｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎのための標準的なＷｉｚａｒｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅを用いてＩｇＧ１抗体の固定化を行った。ｐＨスカウティング研究に対するＷｉｚａｒｄの結果に基づいて、ＩｇＧ１抗体溶液を酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０中で１１μｇ／ｍＬに希釈した。アミンカップリング用のＷｉｚａｒｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅを用いることにより、抗体を１つのフローセルに固定化した。次いで、センサー表面上のカルボキシル基を、０．２Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む溶液を注入することによって活性化した。次いで、１５０〜２００ＲＵのレベルを標的として、抗体溶液を活性化表面の上に注入した。カルボキシメチルデキストラン表面上の残存エステル部位を１Ｍエタノールアミン塩酸塩でブロックすることによって、この固定化手順を終了した。
【０２５５】
アナライト溶液（ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６）を注入するための方法は、動態解析用のＢｉａｃｏｒｅ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅを用いて記載された。この方法は、２５℃において行われ、サンプルは、外界温度のオートサンプラー内に保存された。なお、Ｗｉｚａｒｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅを用いるとき、注入モードなどの動態にとって最適なある特定のパラメータが、Ｗｉｚａｒｄプログラムによって予め定義される。
【０２５６】
ＦｃγＲＩＡを解析するための方法を、動態速度定数ｋａおよびｋｄを決定するために最適化した。レセプターを両方のフローセル（すなわち、ブランクのフローセルおよび抗体誘導体化されたフローセルであるそれぞれ１および２）の上に順番に注入することにより、非修飾コントロール表面へのＦｃγＲＩＡの結合（ウサギ抗ＯＶＡ  ＩｇＧへの結合が判定されなかった）に対する、ヒトＩｇＧ１抗体へのＦｃγＲＩＡの結合の比較解析が可能になった。４０μＬ／分の流速で３分間、アナライトを注入した（会合時間）。各アナライト注入に対する解離時間は、３分間だった。アナライトの用量反応曲線の範囲は、０．１６〜１０．３ｎＭだった。各用量反応曲線の点について、Ｎ＝２回の反復注入を行った。装置のノイズおよびドリフトを差し引くための緩衝液の注入をこの順序に含めた。用量反応曲線サンプルをランダムな様式で注入した。ＦｃγＲＩＡの動態解析のために、各用量反応曲線サイクルの後に、グリシン，ｐＨ１．７５を５０μＬ／分で１回、３０秒間注入することにより、ＩｇＧ抗体表面を再生した。
【０２５７】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、データ解析を行った。まず、ベースラインの安定性を評価することにより、再生工程が、注入の順序全体を通して一貫した結合表面を提供することを確かめた。コントロール表面に対するＦｃγＲＩＡアナライトの非特異的結合のレベルを調べ、最小であることを確かめた。特異的結合表面曲線（すなわち、フローセル２）からコントロール表面曲線（すなわち、フローセル１）を差し引くこと、ならびに緩衝液注入曲線を用いて装置のノイズおよびドリフトを差し引くことによって、結合曲線を処理した。アナライト注入の再現性についてデータを調べ、次いで、得られた補正後の結合曲線を結合モデルに全体的に当てはめることにより、得られた当てはめおよび平衡定数を評価した。
【０２５８】
Ｅ．マウスにおける皮膚の逆受身アルサス反応
１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりｎ＝８匹のマウス）をイソフルランで麻酔し、背面の皮膚を剪毛し、各マウスの背中を７０％アルコールで拭いた。各マウスの背面の皮膚の異なる部位に、それぞれ０．０２ｍＬの皮内注射を２回行った。その注射溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ならびに４０．０μｇのウサギ抗オバルブミン（５６℃における３０〜４０分間のインキュベーションによって熱失活した抗ＯＶＡ）単独、または４０．０μｇの抗ＯＶＡおよび指示量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を含んでいた。コントロール群のマウスには、４０．０μｇの非免疫ウサギＩｇＧ（上に記載したように熱失活したもの）の皮内注射を２回行った。抗体調製物は、注射の前に、１４，０００ｒｐｍにおいて１０分間で遠心分離することにより、微粒子が除去された。皮内注射の直後に、１０．０ｍｇのＯＶＡ／ｍＬおよび１０．０ｍｇのエバンスブルー／ｍＬを含む１００．０μＬの溶液を各マウスの尾静脈に注射した。いくつかの場合において、尾静脈注射溶液は、１．０ｍｇ／ｋｇの用量のデキサメタゾンも含んでいた。注射の４時間後、ＣＯ２ガスによってマウスを安楽死させた。エバンスブルー色素の脈管漏出の面積（ｍｍ２）を測定すること、および病変部位から採取されたパンチバイオプシーの組織の重量（ｍｇ）を測定することによって、皮膚の浮腫を評価した。次いで、その組織サンプルを液体Ｎ２中で急凍し、−８０℃において保存した。
【０２５９】
Ｃｙｔｏｓｔｏｒｅ（Ｃａｌｇａｒｙ，Ａｌｂｅｒｔａ  Ｃａｎａｄａ）製のＭｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて、報告されているように（Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７８：２０６−２０９，１９８２）パンチバイオプシーサンプルにおけるミエロペルオキシダーゼ活性を測定することによって、好中球浸潤を評価した。
【０２６０】
ビヒクル単独または指示濃度のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を含むビヒクルの静脈内注射によって、マウスにおいてＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の全身投与を行った。アルサス反応を惹起する１．０時間前に、０．１ｍＬ最終体積の調合緩衝液（３５ｍＭリン酸ナトリウム、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）中の指示用量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を各マウスに投与した。マウスにおける皮膚アルサス反応を上に記載したように正確に行った。
【０２６１】
Ｆ．結果および考察
ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６が免疫複合体の析出を阻止できたか否かを評価するために、ＭＯｌｌｅｒ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８：６３１−６４０，１９７９）およびＧａｖｉｎら（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０２：６２０−６２５，１９９５）の方法に基づいて、抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体析出アッセイを確立した。３７℃において抗ＯＶＡとＯＶＡとをインキュベートすることにより、溶液混合物の光学濃度が時間依存的に増加した（図１、丸）（これは、不溶性抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体の形成と一致する観察結果だった）。アッセイの開始時にＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を加えることにより、免疫複合体の析出が用量依存的に減少した（図１、三角および四角）。免疫複合体の析出は、１５００ｎＭ  ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６によって完全に無くなった。非タグ化組換え可溶性ＦｃγＲＩＡを用いたときに、同一のデータが得られた。抗原：抗体免疫複合体の析出は、抗体Ｆｃ重鎖間の非共有結合性相互作用に依存するとみられ（ＭＯｌｌｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８：６３１−６４０）、また、Ｆｃγレセプターは、抗体のＦｃ部分に結合する（Ｄｉｊｓｔｅｌｂｌｏｅｍ  ＨＭら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５１０−５１６，２００１）ので、これらのデータから、可溶性ＦｃγＲＩＡが、抗ＯＶＡ抗体のＦｃ部分に結合することによって免疫複合体の析出を乱すことが示唆される。
【０２６２】
ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６と抗体Ｆｃとの相互作用を直接評価するために、固定化されたヒトＩｇＧ１へのＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の結合を表面プラズモン共鳴解析によって評価した。１つのＩｇＧ１分子に対して１つのＦｃγＲＩＡ分子という結合化学量論が推定されるので（Ｗｏｏｆ  ａｎｄ  Ｂｕｒｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１−１１，２００４）、モノクローナルヒトＩｇＧ１抗体を、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の動態解析に対する最適レベル内の密度レベルである４８５というＲＵ（レゾナンスユニット）レベルで１つのフローセルにおけるセンサー表面に固定化した。ＦｃγＲＩＡは、それぞれ２．８×１０６Ｍ−１ｓ−１および４．６×１０−４ｓ−１という会合速度および解離速度で急速に固定化ＩｇＧ１に結合した（この値から１．７×１０−１０Ｍという平衡解離定数が算出された）。これらのデータは、以前に報告されたデータ（Ｐａｅｔｚ  Ａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３８：１８１１−１８１７，２００５）と類似しており、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６が高親和性でヒトＩｇＧ１に結合することを証明している。
【０２６３】
マスト細胞は、ＩＩＩ型過敏反応などの種々の免疫障害において免疫複合体媒介性炎症を媒介すると考えられている（Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１７５９−１７６１，２００２；Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：３８７−３９０，１９９６；Ｊａｎｃａｒ  ａｎｄ  Ｃｒｅｓｐｏ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６：４８−５５，２００５）。マスト細胞のＦｃγレセプターへの免疫複合体の結合は、ＩＬ−６およびＴＮＦαなどの炎症性サイトカインの分泌を誘導すると考えられており（Ｒａｖｅｔｃｈ，前出；Ｊａｎｃａｒ  ａｎｄ  Ｃｒｅｓｐｏ，前出）、続いて、好中球浸潤および組織損傷がもたらされる。マスト細胞からのサイトカイン分泌が、免疫複合体によって刺激され得たか否かを評価するために、マウスマスト細胞株ＭＣ／９を、予め形成されたウサギ抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体の存在下および非存在下においてインキュベートした。抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とのインキュベーションによって、ＭＣ／９細胞条件培地中における炎症性サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦαおよびＭＣＰ−１の蓄積が時間依存的および濃度依存的に増加した。対照的に、等しい濃度のウサギ抗ＯＶＡ  ＩｇＧ単独とともにＭＣ／９細胞がインキュベートされたとき、サイトカインの産生は、変化しなかった。これらのデータは、ＭＣ／９細胞が、炎症性サイトカインの産生によって免疫複合体に反応することを証明する。
【０２６４】
増加量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の存在下において抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とともにＭＣ／９細胞をインキュベートすることにより、ＩＬ−６（図２Ａ）、ＩＬ−１３（図２Ｂ）、ＴＮＦα（図２Ｃ）およびＭＣＰ−１（図２Ｄ）の蓄積が用量依存的に減少した。非タグ化組換え可溶性ＦｃγＲＩＡを用いたとき、同一のデータが得られた。これらのデータは、可溶性ＦｃγＲＩＡが、マウスマスト細胞において免疫複合体の結合およびシグナル伝達を阻止し得ることを証明している。
【０２６５】
可溶性ＦｃγＲＩＡを、抗体感作ＳＲＢＣの補体媒介性溶解に対する作用についても評価した。抗体感作ＳＲＢＣをラット血清とともに３７℃でインキュベートすることにより、補体の活性化およびＳＲＢＣの溶解がもたらされた。そのインキュベーション混合物にＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を加えることにより、用量依存的様式でＳＲＢＣ溶解が阻止された。対照的に、無関係のコントロールタンパク質ＴＡＣＩ−Ｉｇを用いたとき、溶血の阻害は、ほとんどまたはまったく観察されなかった。
【０２６６】
上に記載した知見は、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６が、インビトロにおいて免疫複合体の形成を阻止し得ること、マスト細胞における免疫複合体媒介性シグナル伝達を阻害し得ること、およびＩｇＧ媒介性補体活性を阻止し得ることを証明している。これらのデータから、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６が、インビボの状況において、ＩｇＧまたは免疫複合体に媒介される炎症を阻止する際に有効であり得ることが示唆される。このことを試験するために、マウスにおいて皮膚の逆受身アルサス反応を確立し、免疫複合体媒介性浮腫および好中球浸潤に対するＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の作用を評価した。
【０２６７】
等しい濃度の非免疫ＩｇＧの皮内注射と比べて、抗ＯＶＡ抗体の注射によって、処置マウスの皮膚における浮腫が時間および濃度によって増加した。エバンスブルー色素の血管外遊出面積の増加（図３Ａ）と組織重量の増加（図３Ｂ）の両方として、浮腫は明らかだった。ＯＶＡの尾静脈注射の非存在下において浮腫が観察されなかったので、これらの作用は、免疫複合体に特異的だった。ミエロペルオキシダーゼの抽出可能な活性によって測定される病変部位内の好中球の蓄積もまた増加した（図３Ｃ）。
【０２６８】
増加量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６とともに抗ＯＶＡ抗体を皮内送達することにより、浮腫が濃度依存的に減少した（これは、エバンスブルー面積の減少（図３Ａ）または病変部位の組織重量の減少（図３Ｂ）のいずれかによって判断された）。病変バイオプシーにおけるミエロペルオキシダーゼ活性もまた、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６によって有意に減少した（図３Ｃ）。これらのデータは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６が、マウスのアルサス反応における免疫複合体誘導炎症の有効なインヒビターだったことを証明している。
【０２６９】
これらのデータは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の局所送達が、マウスのアルサス反応において免疫複合体媒介性の皮膚炎症を阻止し得ることを証明している。
【０２７０】
ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の全身送達が、皮膚の炎症を減少できたか否かを判定するために、アルサス反応を惹起する１．０時間前に、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６をマウスの尾静脈に注射した。ビヒクル単独の注射と比べて、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の注射は、浮腫の用量依存的減少をもたらした（これは、エバンスブルー色素の抗ＯＶＡ誘導血管外遊出（図４）または病変部位の組織重量の抗ＯＶＡ誘導増加（図５）のいずれかによって判断された）。最高用量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を用いたとき、浮腫は、実質的に無くなった（図４および５）。上に記載されたデータと同様に、このモデルでは、１３．０μｇのＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の皮内送達によっても、浮腫が減少した（図４および５）。最高用量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６が静脈内経路によって投与されたときに見られた浮腫の減少は、１３．０μｇのＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の皮内送達で観察された浮腫の減少と類似していた（図４および５）。抽出可能なミエロペルオキシダーゼ活性によって測定される病変部位内の好中球の蓄積もまた、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６で処置された動物において無くなった。
【０２７１】
実施例１０
組換えヒトＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡの抗炎症活性の比較
抗炎症活性に対する単量体ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６の評価（実施例９，前出を参照のこと）に加えて、単量体ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６（上の実施例４に記載したように調製されたもの）もまた、実施例９に記載された同じインビトロアッセイおよびインビボアッセイを用いて試験した。可溶性ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６を、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６と平行して、免疫複合体の析出、マスト細胞からのサイトカイン分泌およびＩｇＧ媒介性補体活性に対する作用について試験した。ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６と同様に、ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６とＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６の両方が、免疫複合体の析出を減少させ、抗体感作赤血球の補体媒介性溶解を阻止し、マスト細胞条件培地におけるＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−αの免疫複合体媒介性蓄積を阻止した。免疫複合体の析出の減少に関する効力の相対的順序は、ＦｃγＲＩＩＩＡ＞ＦｃγＲＩＡ＞ＦｃγＲＩＩＡであり、各可溶性ＦｃγＲに対して１〜１．５μＭ（およそ１：１のＦｃγＲ：抗ＯＶＡのモル比）を用いたときに最大阻害が見られた。補体媒介性溶解の阻止とマスト細胞のサイトカイン分泌の阻害の両方に対する効力の相対的な順序は、ＦｃγＲＩＡ＞ＦｃγＲＩＩＩＡ＞ＦｃγＲＩＩＡだった。サイトカイン分泌の阻害に関しては、各可溶性ＦｃγＲに対して、調べられた各サイトカインに対するＩＣ５０は類似していた。
【０２７２】
ＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６を、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６と平行して、マウスの皮膚アルサス反応における浮腫および好中球浸潤に対するインビボにおける作用についても試験した。可溶性ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６で観察された炎症の減少とは対照的に、同様の濃度範囲にわたって使用したとき、ＦｃγＲＩＩＩＡ−ＣＨ６もＦｃγＲＩＩＡ−ＣＨ６も、エバンスブルー色素の抗ＯＶＡ誘導血管外遊出、組織重量または組織ＭＰＯ活性を減少させなかった（図６Ａ〜Ｃを参照のこと）。
【０２７３】
ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡの二量体Ｆｃ５融合タンパク質バージョン（各々、エフェクター非応答バージョンのヒトＦｃ（Ｆｃ５）に融合されたＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外ドメインの２分子を含む）も調製し、上に記載されたアッセイにおいて試験した。ＦｃγＲＩＩＡ−Ｆｃ５に対するヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３５および配列番号３６に示されており、ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｆｃ５に対するヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３７および配列番号３８に示されている。Ｎ末端の配列解析から、成熟ＦｃγＲＩＩＡ−Ｆｃ５に対する開始部位としてのＧｌｎ−３４、ならびに成熟ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｆｃ５に対する開始部位としてのＭｅｔ−１８およびＧｌｕ−２１が示された。二量体Ｆｃ５融合タンパク質の各々は、上に記載されたインビトロアッセイのすべてにおいて各タンパク質の単量体バージョンと類似の活性を有した。単量体対応物と同様に、また、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６とは対照的に、ＦｃγＲＩＩＡ−Ｆｃ５もＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｆｃ５も、マウスの逆受身アルサス反応において炎症または好中球浸潤を減少させなかった。
【０２７４】
実施例１１
関節炎のコラーゲン抗体誘導モデル
雄ＤＢＡ／１Ｊマウス（８週齢、１群あたりｎ＝８匹のマウス）に、２ｍｇ（２００ｕＬ中）の抗ＩＩ型コラーゲン抗体カクテル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｌ．Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標））を尾静脈内注射によって０日目に投与した。注射されたｍＡｂカクテルの量は、文献の値および予備研究からのデータに基づき、ここで、２．０ｍｇの用量のＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）によって、雄ＤＢＡ／１マウスにおける関節炎の症状が無くなり、安定した。３日後、ビヒクル単独（ＰＢＳ）または指示濃度（０、０．６７または２．０ｍｇ）のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を含むビヒクルをマウスに皮下注射した。Ａｒｔｈｒｏｇｅｎキットにおいて提供されているように、３．５時間後、５０μＬのＰＢＳの最終体積に溶解された５０ｕｇのＬＰＳをすべてのマウスの腹腔内に注射した。マウスをビヒクルまたは指示濃度のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６で１日おきに合計５回の投薬で処置した。
【０２７５】
０日目から開始して毎日、Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）抗体カクテルの注射の前に、関節炎についてマウスのスコアリングを行った（視覚的スコアおよびノギスでの足の測定）。マウスを１１日目に屠殺した。血清を回収し、−８０℃で保存した。足を１０％ＮＢＦ中に回収し、組織学検査のために処理した。
【０２７６】
Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）抗体カクテルでマウスを処置することにより、足の炎症が時間依存的に増加した（これは、視覚的な足のスコア（図７、ＰＢＳ処置）または足の厚さ（図８、ＰＢＳ処置）によって判断された）。関節炎スコアの増加は、ビヒクル単独（ＰＢＳ）で処置された動物において容易に観察される。ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６で動物を処置することにより、足の炎症が濃度依存的に減少した。視覚的な足のスコア（図７）または足の厚さ（図８）として明らかな抗体誘導炎症は、最高用量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６を投与することによって完全に無くなった。これらのパラメータのより頑強でない減少が、０．６７ｍｇの用量のＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６が投与されたときに見られた。これらのデータは、ＦｃγＲＩＡ−ＣＨ６が、関節炎の状況において強力な抗炎症特性を有することを証明している。
【０２７７】
実施例１２
ＴＳＬＰトランスジェニックマウスにおける可溶性ハイブリッドＦｃγＲによるクリオグロブリン血症の処置
Ｂ細胞を促進する特性を有するインターロイキン−７（ＩＬ−７）様サイトカインである胸腺間質リンホポイエチン（ＴＳＬＰ）を過剰発現するマウスは、ＩｇＧ−ＩｇＭ混合組成の大量の循環クリオグロブリンを産生する（Ｔａｎｅｄａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９：２３５５−２３６９，２００１を参照のこと）。これらの動物における混合型クリオグロブリン血症の発症は、腎臓、肝臓、肺、脾臓および皮膚（同文献を参照のこと）における免疫複合体の沈着に起因して、これらの組織が関わる全身性の炎症性疾患に関連する。これらの動物における腎臓疾患は、ＨＣＶに感染した患者に見られるようなヒトクリオグロブリン血症糸球体腎炎に酷似している。この疾患プロセスにおけるＦｃγレセプターに対する役割は、抑制性レセプターであるＦｃγレセプターＩＩｂが欠失した後に罹患率および死亡率が高まることを伴う腎損傷の悪化によって示された（Ｍｕｈｌｆｅｌｄら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３：１１２７−１１３６，２００３を参照のこと）。これらのデータを考慮すると、免疫複合体媒介性炎症に対する可溶性ＦｃγＲＩＡの有効性を証明する本明細書中に記載される研究から、ＴＳＬＰトランスジェニックマウスが、クリオグロブリン血症を処置するための本明細書中に記載されるような可溶性ＦｃγＲＩＡまたは可溶性ハイブリッドＦｃγＲの有効性を評価するための適当なモデルであることが示唆される。
【０２７８】
１０匹のＴＳＬＰトランスジェニックマウス（３〜６週齢）の群を、ビヒクル単独、または０．１、０．３、０．９もしくは２．０ｍｇの可溶性ハイブリッドＦｃγレセプターを含むビヒクルで、皮下注射によって処置する。ビヒクル、または可溶性ハイブリッドＦｃγＲを含むビヒクルを、種々の投薬スケジュール（例えば、２１日間にわたる１日おき、または２１日間にわたる４日おき）によって動物に投薬する。
【０２７９】
投薬後の２１日目に、アルブミン尿を測定するために尿サンプルを回収し、その動物をハロタンで麻酔し（ａｎｅｓｔｈｅｓｉｚｅｄ）、心臓穿刺によって血液を採取する。脾臓、腎臓、肝臓、耳および肺を取り出し、組織学検査のために通例のとおり処理する。すべての臓器について、ホルマリン固定された組織およびパラフィン包埋された組織からの４μｍ切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した後、通例のプロトコルを行う。腎臓からは、２μｍ切片を、Ｈ＆Ｅ、過ヨウ素酸Ｓｃｈｉｆｆ試薬（ＰＡＳ）および過ヨウ素酸メセナミン銀染色で染色する。
【０２８０】
標準的な臨床化学分析器を用いて血中尿素窒素を測定し、４℃で保存された血清をクリオグロブリンの存在について視覚的検査によって評価する。尿中のアルブミンとクレアチニンとの比を算出することにより、標準的な手順によってアルブミン尿を評価する。
【０２８１】
Ｈ＆Ｅ染色されたスライドおよび銀染色されたスライドにおいて形態計測を行い、Ｈ＆Ｅ染色されたスライドにおける糸球体核（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｉ）の数および糸球体房の面積（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｔｕｆｔ  ａｒｅａ）、銀染色されたスライドにおける糸球体マトリックスの面積および糸球体房の面積、ならびにマクロファージについての染色が陽性の糸球体ＭＡＣ−２の面積および糸球体房の面積を測定することによって、腎臓の損傷を評価する。結果は、１糸球体あたりの細胞数、糸球体房の面積あたりの細胞数、各糸球体のマトリックス面積、マトリックスのパーセンテージ、１糸球体あたりのマクロファージの面積、および糸球体面積あたりのマクロファージの面積として表される。
【０２８２】
可溶性ハイブリッドＦｃγＲの有効性は、野生型コントロールと比べたときの、糸球体房の面積、マクロファージによって占められる糸球体の平均面積および１糸球体あたりの平均細胞数の減少として、ならびにマトリックス面積の減少によって、判断される。
【０２８３】
実施例１３
ＦｃγＲＩＡはマウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて疾患の発生率および進行を減少させる
Ａ．マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデル
関節炎のＣＩＡモデルは、ヒト関節炎を処置する薬物の治療的な可能性を評価するための、適切かつ十分に考慮されたモデルである。関節炎は、関節における炎症および／または不適切な免疫複合体形成を特徴とする疾患である。その免疫複合体は、重要な硝子軟骨マトリックスタンパク質であるＩＩ型コラーゲンに対する抗体から構成されることが多い。関節内において免疫複合体が形成されることにより、関節腔に免疫細胞が動員され、罹患関節内の軟骨および骨を破壊する炎症性サイトカインが産生される。したがって、マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎は、ヒトにおける関節リウマチと多くの生化学的、細胞性および構造上の類似点を共有する。
【０２８４】
８〜１０週齢の雄ＤＢＡ／１Ｊマウス（２５〜３０ｇ）をこれらの研究のために用いた。−２１日目に、フロイント完全アジュバント（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡによって調製されたもの）中で製剤化された０．１ｍＬの１ｍｇ／ｍｌニワトリＩＩ型コラーゲンを動物の尾に皮内注射した。３週間後の０日目において、フロイント不完全アジュバント中で調製されたこと以外同じ注射をマウスに行った。動物は、２回目のコラーゲン注射の後、関節炎の症状を示し始め、ほとんどの動物が、１〜２週間以内に炎症を示した。ノギスを用いて足の厚さを測定すること、および各足に臨床スコア（０〜３）を割り当てること（疾患スコアリングについては、下記の記載を参照のこと）によって、各足において疾患の程度を評価した。
【０２８５】
Ｂ．疾患のモニタリング
このモデルにおける疾患の発生率は、９５〜１００％であり、非応答者は、ほんの少し（０〜２匹）だった（６週間後の観察で判定）。動物は、著明で持続性の足腫脹を発症して初めて、確立された疾患を有すると考えられる。すべての動物を、毎日観察することにより、その足における疾患の状態を評価した（これは、定性的な臨床スコアを各足に割り当てることによって行った）。毎日、疾患の臨床状態に従って、各動物の４本の足にスコアをつけた。臨床スコアを決定するために、足は、３つのゾーン、すなわち、足指、足自体（手（ｍａｎｕｓ）または足（ｐｅｓ））および手首または足首の関節を有すると考える。これらのゾーンに対する炎症の程度および重症度に注目し、その程度および重症度としては：腫脹についての各足指の観察；爪の剥がれまたは足指の発赤；いずれかの足における浮腫または発赤の任意のエビデンスの記録；任意の腱または骨の微細な解剖的分界が失われているという記録；任意の浮腫または発赤についての手首または足首の評価；および炎症が脚の基部まで広がり尽くすという記録が挙げられる。１、２または３という足のスコアは、第１に、重症度の全体的な印象に基づき、第２に、どれくらい多くのゾーンが関与しているかに基づいた。臨床スコアリングに使用されるスケールを以下に示す：
臨床スコア
０＝正常
０．５＝１本以上の足指が関与しているが、足指が炎症しているだけである
１＝足（１つのゾーン）が関与する軽度の炎症で、足指（１本または複数）が含まれ得る
２＝足における中程度の炎症で、足指（複数）および／または手首／足首のうちのいくつか（２つのゾーン）が含まれ得る
３＝足、手首／足首および一部または全部の足指における重篤な炎症（３つのゾーン）
Ｃ．処置
確立された疾患は、１またはそれ以上の足炎症のランクの定性的スコアとして定義された。確立された疾患が顕れたら、日付を記録し、その動物の「疾患が確立された」１日目および処置開始の１日目とした。皮下に合計６回、１日おきにＰＢＳもしくは以下の用量のヒトＦｃγＲＩＡのうちの１つ（ｈＦｃγＲＩＡ；所望の濃度にＰＢＳ中で希釈）：２ｍｇ；０．６６７ｍｇ；０．２２ｍｇ；または皮下に合計３回、４日おきに以下の用量のｈＦｃγＲＩＡのうちの１つ（所望の濃度にＰＢＳ中で希釈）：２ｍｇ；０．６６７ｍｇでマウスを処置した。
【０２８６】
実験期間の終わりに血液を回収することにより、抗コラーゲン抗体の血清レベルならびに血清免疫グロブリンおよびサイトカインのレベルをモニターした。最後の処置の４８時間後に動物を安楽死させた。血清を得るために血液を回収し、組織学検査のために、すべての足および選択された組織を１０％ＮＢＦ中に回収した。血清を回収し、免疫グロブリンアッセイおよびサイトカインアッセイのために−８０℃で凍結した。
【０２８７】
ＩＩ型コラーゲンを注射され、ビヒクルで処置されたマウスは、ランダム化の後の日に、より高い疾患スコア（足のスコア）として明らかな足腫脹を発症した（図１０、白丸を参照のこと）。１２日間にわたって１日おきにＦｃγＲＩＡで処置することにより、臨床スコアの統計学的に有意な用量依存的減少がもたらされた（図１０、黒の符号を参照のこと）。０．２２ｍｇの用量で処置することにより、疾患の進行が５０％減少し、２．０ｍｇの用量は、疾患の重症度を９０％低下させた。長期間にわたってＦｃγＲＩＡを投与したとき、足のスコアの減少も見られた（図１１を参照のこと）。ＦｃγＲＩＡを１日おきに投与したときに見られた９０％減少に対して、９日間にわたって４日ごとに２．０ｍｇのＦｃγＲＩＡで処置することにより、ビヒクル単独（ＰＢＳ）での処置と比べて、臨床スコアが５０％減少した（図１１を参照のこと）。ｈＦｃγＲＩＡで処置されたマウスは、罹患した足の数も用量依存的に減少させた（図１２を参照のこと）。
【０２８８】
要約すれば、これらの結果は、マウスのコラーゲン誘導関節炎において、組換えヒトＦｃγＲＩＡの投与が、疾患の発生率および進行を減少させ得ることを示唆している。これらのデータは、ヒトにおける関節炎ならびに他のＩｇＧおよび免疫複合体に媒介される疾患を処置するための、新しい有効な治療としてのＦｃγＲＩＡの使用を支持する。
【０２８９】
実施例１４
ＦｃγＲＩＡはマウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいてＩＬ−６および抗ＩＩ型コラーゲン抗体のレベルを低下させる
足の炎症の程度および重症度を評価することによってマウスＣＩＡモデルにおける疾患の発症をモニターすることに加えて、上に記載されたＣＩＡ研究（実施例１３を参照のこと）において使用されるマウスを、以下で概要が述べられるように、ＩＬ−６および抗ＩＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅ）抗体のレベルについても評価した。
【０２９０】
Ａ．方法
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによる血清サイトカインの定量化
マウス血清中のサイトカインのレベルを、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＬｕｍｉｎｅｘサイトカインアッセイキットを用いて定量化した。各プレートを、０．２ｍＬのＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒで１０分間ブロッキングし、その緩衝液を除去し、そのプレートをブロットした。標準物質、コントロール、ブランクおよび試験サンプルの各々０．０２５ｍＬを適切なウェルに加えた後、０．０２５ｍＬのＳｅｒｕｍ  Ｍａｔｒｉｘのサンプルを加えた。０．０２５ｍＬの体積のＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを各サンプルウェルに加えた後、０．０２５ｍＬの捕捉ビーズを加え、超音波処理によって懸濁した。各プレートを密閉し、箔で覆い、４℃の振盪機上でインキュベートした。１８〜２４時間後、ウェルの内容物を吸引によって除去し、そのプレートをブロットした。次いで、各プレートを０．２ｍＬの洗浄緩衝液で２〜３回洗浄し、０．０２５ｍＬのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを各ウェルに加え、そのプレートを密閉し、箔で覆い、室温の振盪機上で６０分間インキュベートした。０．０２５ｍＬのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎのサンプルを各ウェルに加え、各プレートを密閉し、箔で覆い、室温の振盪機上で３０分間インキュベートした。各ウェルの内容物を吸引によって除去し、各プレートをブロットし、０．２ｍｌ／ウェルの洗浄緩衝液で２〜３回洗浄した。０．１ｍｌのＳｈｅａｔｈ  Ｂｕｆｆｅｒのサンプルを各ウェルに加え、各サンプルの吸光度をＬｕｍｉｎｅｘ装置において読み出した。
【０２９１】
抗ＩＩ型コラーゲン抗体の定量化
マウス血清中の抗ＩＩ型コラーゲン抗体のレベルを、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ製のＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ａｎｔｉ−Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｋｉｔを用いて定量化した。各プレートを、室温において６０分間、０．１ｍＬのＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒでブロッキングした。そのプレートをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、標準物質、サンプルまたはブランクを、０．１ｍＬの最終体積で適切なウェルに加えた。そのプレートを覆い、４℃において一晩インキュベートした。翌日、各プレートをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで６回洗浄し、０．１ｍＬ体積の２次抗体を各ウェルに加えた。次いで、そのプレートを室温においてインキュベートした。２．０時間後、各プレートを洗浄し、０．１ｍＬのＯＰＤ溶液を各ウェルに加え、室温において３０分間インキュベートした。０．０５ｍＬの２Ｎ硫酸を各ウェルに加えることによって、反応を終了させ、４９０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を測定した。
【０２９２】
Ｂ．結果
ＩＩ型コラーゲンの注射を受けなかった関節炎でないマウスと比べて、ＩＩ型コラーゲンを注射されたマウスのＩＬ−６の血清レベルは、１５日目の屠殺時に上昇していた。ＩＬ−６のレベルは、正常マウスでは検出レベル未満であり、コラーゲン誘導関節炎を発症し、ビヒクル単独で処置されたマウスでは、３２０ｐｇ／ｍＬに上昇していた。可溶性ヒトＦｃγＲＩＡでの処置（２週間にわたって２．０ｍｇを１日おきに投与した）によって、ＩＬ−６の血清レベルが１５日目に９５ｐｇ／ｍＬまで７０％低下した。
【０２９３】
ＩＬ−６レベルの低下に加えて、可溶性ヒトＦｃγＲＩＡでの処置は、関節炎マウスの血清中の抗ＩＩ型コラーゲン抗体のレベルも低下させた。２．０ｍｇのＦｃγＲＩＡを１日おきに投与することによって、ビヒクル単独で処置された関節炎マウスにおいて１５日目の屠殺時に観察されたレベルに対して、抗ＩＩ型コラーゲン抗体の量が４０〜５０％減少した。
【０２９４】
実施例１５
ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢの第１Ｉｇドメインの後ろにＦｃγＲ１Ａの第２および第３Ｉｇドメインを発現するハイブリッド可溶性Ｃ末端６ＨｉｓＦｃγＲＩＡ発現プラスミドの構築
Ｃ末端タグ６Ｈｉｓ（ｃ６ｘＨ）とともに、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢの第１細胞外Ｉｇドメインの後ろに、ヒトＦｃγＲＩＡの第２および第３細胞外Ｉｇドメインを含む発現構築物を作製した。これらのハイブリッドＦｃγＲ構築物は、それぞれ、ＦｃγＲＩＩＡ／ＲＩＡ−ＣＨ６、ＦｃγＲＩＩＢ／ＲＩＡ−ＣＨ６、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＲＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＢ／ＲＩＡ−ＣＨ６とも称される。これらの構築物を、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢの第１ＩｇドメインをコードするＤＮＡフラグメント、ＦｃγＲＩＡの第２および第３ＩｇドメインをコードするＤＮＡフラグメントならびに発現ベクターｐＺＭＰ３１を用いるＰＣＲおよび相同組換えによって作製した。
【０２９５】
５’非翻訳領域におけるｐＺＭＰ３１ベクター配列との５’オーバーラップ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢの第１ＩｇドメインおよびＦｃγＲＩＡの第２Ｉｇドメインとの３’オーバーラップをコードする４つのＰＣＲフラグメントを作製した。ＰＣＲ増幅反応には、５’オリゴヌクレオチド：ＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＡＴＧＴＣＴ（配列番号４７；ＦｃγＲＩＩＡリーダー配列に特異的な順方向プライマー）、ＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＴＡＣＣ（配列番号４８；ＦｃγＲＩＩＢリーダー配列に特異的な順方向プライマー）またはＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＡＣＴ（配列番号４９；ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢリーダー配列に特異的な順方向プライマー）を用いた。４つのＰＣＲ反応を、３’オリゴヌクレオチドＣＧＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＣＣＡＴＴＣＧＧＡＡＡＧＣＡＣＡＧＴＣＡＧＡＴＧＣＡＣ（配列番号５０；ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢのドメイン１（第１Ｉｇドメイン）に特異的で、ＦｃγＲＩＡのドメイン２（第２Ｉｇドメイン）との配列オーバーラップを含む逆方向プライマー）、ＣＧＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＣＣＡＧＣＣＧＡＴＡＴＧＧＡＣＴＴＣＴＡＧＣＴＧＣＡＣ（配列番号５１；ＦｃγＲＩＩＩＡのドメイン１（第１Ｉｇドメイン）に特異的で、ＦｃγＲＩＡのドメイン２（第２Ｉｇドメイン）との配列オーバーラップを含む逆方向プライマー）またはＣＧＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＣＣＡＧＣＣＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＴＡＧＣＴＧＣＡＣ（配列番号５２；ＦｃγＲＩＩＩＢのドメイン１（第１Ｉｇドメイン）に特異的で、ＦｃγＲＩＡのドメイン２（第２Ｉｇドメイン）との配列オーバーラップを含む逆方向プライマー）を用い、鋳型として、可溶性ＦｃγＲＩＩＡ（ＭＰＥＴ構築物＃１２０２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＭＰＥＴ構築物＃１２０４）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＭＰＥＴ構築物＃１２０５）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＭＰＥＴ構築物＃１２０７）に対する予め生成されたＤＮＡクローンを利用して行った。
【０２９６】
ＣＨ６（Ｃ末端６−Ｈｉｓ）タグとともにＦｃγＲＩＡの第２および第３Ｉｇドメインをコードする３つの追加のＰＣＲフラグメントを作製した；これらのフラグメントは、（ｉ）ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢの第１ＩｇドメインをコードするＰＣＲフラグメントとの５’オーバーラップ；（ｉｉ）ＦｃγＲＩＡ細胞外ドメインコード領域（Ｉｇドメイン２および３）；（ｉｉｉ）６Ｈｉｓタグコード配列；および（ｉｖ）ＭＣＳの下流のｐＺＭＰ３１ベクターとの３’オーバーラップを含んでいた。ＰＣＲ増幅反応には、以下の５’オリゴヌクレオチド：ＣＴＣＡＧＣＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＧＡＡＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号５３；ＦｃγＲＩＡのドメイン２（第２Ｉｇドメイン）に特異的で、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢの第１Ｉｇドメインとの配列オーバーラップを含む順方向プライマー）、ＣＴＣＡＧＴＧＡＣＣＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＡＧＡＡＧＴＣＣＡＴＡＴＣＧＧＣＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号５４；ＦｃγＲＩＡのドメイン２（第２Ｉｇドメイン）に特異的で、ＦｃγＲＩＩＩＡの第１Ｉｇドメインとの配列オーバーラップを含む順方向プライマー）またはＣＴＣＡＧＴＧＡＣＣＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＡＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＴＣＧＧＣＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号５５；ＦｃγＲＩＡのドメイン２（第２Ｉｇドメイン）に特異的で、ＦｃγＲＩＩＩＢの第１Ｉｇドメインとの配列オーバーラップを含む順方向プライマー）を用いた。この３つのＰＣＲ反応の各々が、３’オリゴヌクレオチドＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＣ（配列番号５６；ＦｃγＲＩＡ細胞外ドメインのＣ末端に特異的で、６Ｈｉｓタグおよび終止コドン配列を含む逆方向プライマー）および鋳型として予め生成されたＦｃγＲＩＡのＤＮＡクローン（ＭＰＥＴ構築物＃１１９８）を用いて行われた。
【０２９７】
ＰＣＲ増幅反応条件は、以下のとおりだった：９５℃５分を１サイクル；９５℃３０秒、その後の５５℃３０秒、その後の６８℃１分を２５サイクル；７２℃７分を１サイクル。ＰＣＲ反応混合物を１％アガロースゲル上で泳動し、予想サイズに対応するＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０４）を用いてゲルから抽出した。
【０２９８】
プラスミドｐＺＭＰ３１は、キメラＣＭＶエンハンサー／ＭＰＳＶプロモーター、酵母を組み換える前の直鎖化のためのＦｓｅＩ、ＮａｒＩおよびＢｇｌＩＩ部位、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；ＳＶ４０プロモーター、エンハンサーおよび複製起点、ＤＨＦＲ遺伝子ならびにＳＶ４０ターミネーターを含む哺乳動物の選択マーカー発現単位；ならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける選択および複製のために必要なＵＲＡ３およびＣＥＮ−ＡＲＳ配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。
【０２９９】
上で述べたゲルから抽出されたＰＣＲフラグメントの対応する以下の組み合わせ：ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡとＦｃγＲＩＡ、またはＦｃγＲＩＩＩＢとＦｃγＲＩＡを用いて、酵母における組換えの前に、プラスミドｐＺＭＰ３１をＦｓｅＩ、ＮａｒＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。５０μｌのコンピテント酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を、３μｌの各ＰＣＲフラグメントインサートＤＮＡ、ならびに３０ｎｇのＦｓｅＩ、ＮａｒＩおよびＢｇｌＩＩ消化ｐＺＭＰ３１ベクターと混合した。その混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移した。０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞ｏｈｍおよび２５μＦという電源（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の設定を用いて、その酵母／ＤＮＡ混合物に電気パルスをかけた。３００μｌの１．２Ｍソルビトールをそのキュベットに加え、酵母を７５μｌおよび２００μｌのアリコートで２枚のＵＲＡ−ＤＳプレート上にプレーティングし、３０℃でインキュベートした。約７２時間後、１枚のプレートからのＵｒａ＋酵母形質転換体を１００μｌの酵母溶解緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．００６２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．００３８Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅ、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、２％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）、および１０ＵのＺｙｍｏｌｙａｓｅ／１００ｕｌを含む１００μｌのＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＰｒｅｐキット緩衝液Ｐ１に再懸濁した。次いで、この混合物を３７℃においておよそ１５分間インキュベートし、後は、製造者の指示書に従ってＱｉａｇｅｎミニプレップキットのプロトコルを続けた。
【０３００】
エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞（ＤＨ１２Ｓ）の形質転換を、４μｌの酵母ＤＮＡ調製物および５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ細胞を用いて行った。その細胞に１．７５ｋＶ、２５μＦおよび４００ｏｈｍで電気パルスをかけた。エレクトロポレーションの後、０．５ｍｌのＬＢを加え、次いで、その細胞を１０μｌおよび３０μｌのアリコートで２枚のＬＢ  ＡＭＰプレート（ＬＢブロス（Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％ＢａｃｔｏＴＭＡｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）上にプレーティングした。
【０３０１】
構築物１つにつき５つのＤＮＡクローンのインサートを配列解析に供した。正しい配列を含む１つのクローンを選択する。商業的に入手可能なキット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って用いて、ラージスケールのプラスミドＤＮＡを単離した。ＦｃγＲＩＩＡ／ＲＩＡ−ＣＨ６、ＦｃγＲＩＩＢ／ＲＩＡ−ＣＨ６、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＲＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＢ／ＲＩＡ−ＣＨ６ハイブリッド構築物に対するヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号３９、４１、４３および４５に示されている。ＦｃγＲＩＩＡ／ＲＩＡ−ＣＨ６、ＦｃγＲＩＩＢ／ＲＩＡ−ＣＨ６、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＲＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＢ／ＲＩＡ−ＣＨ６に対する、対応するコードされるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４０、４２、４４および４６に示されている。
【０３０２】
同じプロセスを用いることにより、ＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓから構成されるＣ末端ｈｉｓタグを有する天然の可溶性配列ＦｃγＲＩＡ（天然の配列Ｉｇドメイン１、２および３を含む）（ＦｃγＲＩＡ−ＣＨＩＳ）を調製した。この構築物を調製するために、Ｃ末端ｈｉｓタグを有する天然の可溶性配列ＦｃγＲＩＡ（天然の配列Ｉｇドメイン１、２および３を含む）をコードするＰＣＲフラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマーＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣ（配列番号５７；ＦｃγＲＩＡリーダー配列に特異的な順方向プライマー）、オリゴヌクレオチドプライマーＴＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＣ（配列番号５８；ＦｃγＲＩＡ細胞外ドメインのＣ末端に特異的で、６Ｈｉｓタグおよび終止コドン配列を含む、逆方向プライマー）および鋳型として予め生成されたＦｃγＲＩＡのＤＮＡクローン（ＭＰＥＴ構築物＃１１９８）を用いて作製した。
【０３０３】
発現および凝集レベルの下流解析のために、２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションにおいてＭｅｇａ  Ｐｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを利用した。各構築物について、２５μｇのプラスミドＤＮＡを３００μｌの予め温められた３７℃のＯｐｔｉｍｅｍ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈し、室温において５分間インキュベートした。別個のチューブにおいて、３２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３００μｌの予め温められたＯｐｔｉｍｅｍ培地に希釈し、室温において５分間インキュベートした。その２本のチューブの内容物を共に加えて混合し、時折静かに混合しながら室温において３０分間インキュベートした。ＤＮＡ／ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体が形成された後、それらを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地中で培養された１×１０６細胞／ｍｌの２５ｍｌの２９３Ｆ細胞に加えた。９６時間にわたって培養を進め、そして低速で５分間遠心分離して細胞をペレットにすることによって培地を回収した。その培地を蓄え、発現および凝集レベルの解析に進めた（実施例１６，後掲を参照のこと）。
【０３０４】
実施例１６
一過性２９３Ｆ条件培地からの可溶性ハイブリッドＦｃγＲ構築物の解析
可溶性ＦｃγＲＩＡタンパク質は、自己会合複合体を形成する傾向を有し、通常の細胞培養温度において凝集する。可溶型の他のＦｃγレセプターファミリーメンバー（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ）は、ＦｃγＲＩＡが示す自己会合のレベルを示さないとみられる。
【０３０５】
ＦｃγＲＩＡの第１Ｉｇドメインを、上に記載したような（実施例１５を参照のこと）他のファミリーメンバー（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ）のうちの１つの第１Ｉｇドメインで置き換えた、可溶性ハイブリッドＦｃγＲ構築物を作製した。これらのハイブリッド構築物（ＦｃγＲＩＩＡ／ＲＩＡ−ＣＨ６、ＦｃγＲＩＩＢ／ＲＩＡ−ＣＨ６、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＲＩＡ−ＣＨ６およびＦｃγＲＩＩＩＢ／ＲＩＡ−ＣＨ６）を２９３Ｆ細胞株に一過性にトランスフェクトし、それらの細胞からの条件培地を、発現およびＩｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｒｅｓｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）における捕捉について評価した。他のファミリーメンバーの天然の可溶性バージョンも、同様の様式で発現させ、解析した。
【０３０６】
ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、単量体の凝集していないＦｃγＲＩＡにだけ結合すると実験的に示されている。したがって、様々なＦｃγＲ構築物がＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合する能力を、各構築物の自己凝集する傾向の基準として使用した（ここで、ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの結合が強いことは、自己凝集の傾向が低いことを示唆する）。
【０３０７】
天然およびハイブリッドの構築物を発現する条件培地をバッチモードでＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの結合に供した。３００ｕＬの充填樹脂を、１９．９ｍＭクエン酸（ＥＭＤ，Ｄａｒｎｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、５．１ｍＭ二塩基性ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄａｒｎｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ｐＨ３．０を用いて事前に溶出し、次いで、１．６１ｍＭクエン酸、２３．４ｍＭ二塩基性ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０で平衡化した。
【０３０８】
平衡化された樹脂を、１０〜２５ｍＬの条件培地と混合し、ゆっくり回転させながら４℃において１時間インキュベートした。１時間後、その混合物をＢｉｏＲＡＤ  Ｅｃｏｎｏカラム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に移し、重力流によってフロースルーを別個の容器に回収した。次いで、その樹脂を、８０カラム体積の平衡緩衝液で洗浄した。４ｍＬの溶出緩衝液を用い、およそ５分間、その樹脂（ｒｅｉｓｎ）とインキュベートして、結合したタンパク質を溶出した後、溶出画分を回収した。別の１ｍＬの溶出緩衝液を用いてその樹脂を追跡し、その追跡体積を同じ容器に溶出画分として回収した。その溶出画分を、０．５ｍＬの２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を用いて中和した。
【０３０９】
充填物、フロースルーおよび溶出画分を、調製されたサンプルが決して加熱されない非還元条件下のウエスタンブロットによってさらに解析した。サンプルを、ＭＥＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に充填し、すべてを体積について標準化し、そしてゲルを１５０Ｖ一定で泳動した。次いで、Ｉ−Ｂｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを０．２μｍニトロセルロースに転写した。次いで、そのブロット上の非特異的部位を、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａ緩衝液（０．０９７％（ｗ／ｗ）ＴＲＩＳ塩基、０．６６１％（ｗ／ｗ）Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．１８６１２％（ｗ／ｗ）ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｗ）Ｉｇｅｐａｌ、０．８７７％（ｗ／ｗ）ＮａＣｌ、０．２５％ゼラチン）中の２．５％脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）を用いてブロッキングした。そのブロットを、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａ緩衝液中の２．５％ＮＦＤＭにおいて１：１０００希釈された抗ＦｃγＲ１／ＣＤ６４モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、次いで、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用い、各々、室温において１時間インキュベートし、インキュベーションとインキュベーションの間にＷｅｓｔｅｒｎ  Ａ緩衝液で洗浄して、探索した。サンプルが調製されたら、充填物（凝集物および単量体）において発現された総量に対する、フロースルー中の標的のパーセント（凝集物の量）および溶出プール中のパーセント（単量体の量）についてサンプルを解析した。この解析は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  ｖ２００５ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を実行するＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＲＴ  ＥＣＬ撮像装置において行われた。
【０３１０】
２つのＦｃγＲハイブリッド構築物が、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡと比べて、発現された凝集物および単量体の量の改善（すなわち、凝集物の量の減少および単量体の量の増加）を示した。天然の可溶性ＦｃγＲＩＡは、発現された総量の６６％の平均凝集物量を示し、発現された総量の２１％が、ＩｇＧ樹脂から回収された（発現された総量の１３％が行方不明だった）。ＦｃγＲＩＩＡ／ＲＩＡハイブリッドは、１４．２％の平均凝集物量を示し、４０％のＩｇＧ回収量を示した（４８％が行方不明だった）。ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＲＩＡハイブリッドは、３６％の平均凝集物量を示し、８２％が、ＩｇＧ樹脂から回収された。これらの結果は、ｎ＝２である。
【０３１１】
実施例１７
ＣＨＯ細胞における可溶性ハイブリッドＦｃγＲ構築物の発現
ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＡの第１Ｉｇドメインの後ろに、ＦｃγＲＩＡの第２および第３のＩｇドメインを発現する可溶性Ｃ末端６−ｈｉｓＦｃγＲＩＡに対する配列を有するハイブリッド構築物について（実施例１５を参照のこと）、６００μｇの各発現構築物（ｍｅｇａ  ｐｒｅｐプラスミド）を３７℃において２．５時間、７２０単位のＢｓｔＢ１制限酵素で消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで洗浄した後、クロロホルム／イソアミルで洗浄し、次いで、エタノールを用いて一晩沈殿させ、１．５ｍＬ微量遠心チューブにおいて遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、室温において５分間インキュベートした。そのチューブを微量遠心管において１４，０００ＲＰＭで１０分間遠心し、上清をペレットからデカントした。そのペレットを組織培養フード上の無菌環境においておよそ５分間、開放空気において乾燥させ、３７℃に予め温められた１．２ｍｌのＣＨＯ細胞組織培養液に再懸濁し、３７℃において１０分間インキュベートした。そのＤＮＡペレットを可溶化する一方で、およそ５．６×１０７ＣＨＯ細胞をペレットにし、２．４ｍｌのＣＨＯ細胞組織培養液に再懸濁した。可溶化されたプラスミド調製物の各々を、３つの４００μｌの体積に分割し、次いで、最終体積が８００μｌとなるように４００μｌのＣＨＯ細胞懸濁液を加えた。そのＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍギャップキュベットに入れ、以下のパラメータを用いて、エレクトロポレーションを行った；９５０μＦ、高キャパシタンス、３００Ｖ。次いで、各プラスミドエレクトロポレーションセットについて、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ＣＨＯ細胞組織培養液で２５ｍＬに希釈し、１２５ｍＬ振盪フラスコに入れた。そのフラスコを、１２０ＲＰＭで振盪している振盪機上の３７℃、５％ＣＯ２の恒温器に入れた。
【０３１２】
そのＣＨＯ細胞を栄養素選択に供し、５００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）に増幅した。選択されたＣＨＯ株をＭＥＣＬ１３０８（ＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡハイブリッド）および１３０９（ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡハイブリッド）と命名した。
【０３１３】
発現について試験するために、エレクトロポレーション後７回継代のプールを用いて培養を始めた。細胞を遠心分離し、５０ｍｌの体積中の新鮮培地に０．６×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、前に記載したように９６時間にわたって進めた。タグ化タンパク質の発現をウエスタンブロットによって確認した。
【０３１４】
実施例１８
Ｗａｖｅ  Ｒｅａｃｔｏｒ内でのＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞におけるＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６タンパク質の発現
１０ＬのＷａｖｅｂａｇ  Ｒｅａｃｔｏｒ（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）内で、ＺＧ構築物１８９２でトランスフェクトされたＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞においてＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６タンパク質を発現させた。その細胞を、５ｍＭ  Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン，Ｇｉｂｃｏカタログ＃２５０３０−０８１からのもの）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭピルビン酸ナトリウム，Ｇｉｂｃｏカタロク＃１１３６０−０７０からのもの）および５００ｎＭメトトレキサートが加えられたＺＭ２培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｘ−ＣＥＬＬカタログ＃６８０４１）を用いて振盪フラスコ中でスケールアップした。Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含むがメトトレキサートを含まない４．５ＬのＺＭ２培地に、対数期の５００ｍＬの振盪フラスコ培養物を播種することによって反応器でのランを開始した。これにより、３．５×１０５細胞／ｍＬの密度を含む５Ｌの最終作用体積（ｆｉｎａｌ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）がもたらされた。
【０３１５】
ＣＯ２レベルを、３％〜６％に維持し、反応器の上部の空間に０．２ＬＰＭで連続して注ぎ込んだ。９．５度の角度設定において１分間に２５回揺り動かす速度で培養物をプラットホーム上で揺り動かすことによって、細胞の溶存酸素要求を満たした。ｐＨは、調節されなかったが、６．６〜７．０で留まっていた。密度が２．０×１０６細胞／ｍＬに達するまで温度を３７℃に維持し、次いで、残りのランの間は温度を３４℃に低下させた。グルコースレベルを２ｇ／Ｌ超に維持し、Ｌ−グルタミンを２ｍＭ超に維持した。
【０３１６】
播種の１１日後に、７．５×１０６細胞／ｍＬの密度および９６％の生存率の培養物を回収した。上清を３５００×ｇで１５分間遠心分離し、澄んだ条件培地を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐカタログ＃ＫＷＳＳＬ４ＨＢ３）に通し、タンパク質精製にまわした。
【０３１７】
実施例１９
Ｗａｖｅ  Ｒｅａｃｔｏｒ内でのＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞におけるＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６タンパク質の発現
１０ＬのＷａｖｅｂａｇ  Ｒｅａｃｔｏｒ（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）内で、ＺＧ構築物１８９４でトランスフェクトされたＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞においてＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６タンパク質を発現させた。その細胞を、５ｍＭ  Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン，Ｇｉｂｃｏカタログ＃２５０３０−０８１からのもの）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭピルビン酸ナトリウム，Ｇｉｂｃｏカタロク＃１１３６０−０７０からのもの）および５００ｎＭメトトレキサートが加えられたＺＭ２培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｘ−ＣＥＬＬカタログ＃６８０４１）を用いて振盪フラスコ中でスケールアップした。Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含むがメトトレキサートを含まない４．５ＬのＺＭ２培地に、対数期の５００ｍＬの振盪フラスコ培養物を播種することによって反応器でのランを開始した。これにより、３．１×１０５細胞／ｍＬの密度を含む５Ｌの最終作用体積がもたらされた。
【０３１８】
ＣＯ２レベルを、３％〜６％に維持し、反応器の上部の空間に０．２ＬＰＭで連続して注ぎ込んだ。９．５度の角度設定において１分間に２５回揺り動かす速度で培養物をプラットホーム上で揺り動かすことによって、細胞の溶存酸素要求を満たした。ｐＨは、調節されなかったが、６．６〜７．０で留まっていた。密度が１．４×１０６細胞／ｍＬに達するまで温度を３７℃に維持し、次いで、残りのランの間は温度を３４℃に低下させた。グルコースレベルを２ｇ／Ｌ超に維持し、Ｌ−グルタミンを２ｍＭ超に維持した。
【０３１９】
播種の１１日後に、６．３×１０６細胞／ｍＬの密度および９７％の生存率の培養物を回収した。上清を３５００×ｇで１５分間遠心分離し、澄んだ条件培地を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐカタログ＃ＫＷＳＳＬ４ＨＢ３）に通し、タンパク質精製にまわした。
【０３２０】
実施例２０
可溶性ＦｃγＲＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６の精製
１０ＬのＷａｖｅｂａｇ  Ｒｅａｃｔｏｒ（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）内で、ｒｈ−ＦｃγＲＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６のラージスケール生成を行った。細胞を、５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび５００ｎＭメトトレキサートが加えられたＺＭ２培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｘ−ＣＥＬＬ）を用いて振盪フラスコ中でスケールアップした。Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含むがメトトレキサートを含まない４．５ＬのＺＭ２培地に、対数期の５００ｍＬの振盪フラスコ培養物を播種することによって反応器でのランを開始した。これにより、３．１×１０５細胞／ｍＬの密度を含む５Ｌの最終作用体積がもたらされた。ＣＯ２レベルを、３％〜６％に維持し、反応器の上部の空間に０．２ＬＰＭで連続して注ぎ込んだ。９．５度の角度設定において１分間に２５回揺り動かす速度で培養物をプラットホーム上で揺り動かすことによって、細胞の溶存酸素要求を満たした。ｐＨは、調節されなかったが、６．６〜７．０で留まっていた。密度が１．４×１０６細胞／ｍＬに達するまで温度を３７℃に維持し、次いで、残りのランの間は温度を３４℃に低下させた。グルコースレベルを２ｇ／Ｌ超に維持し、Ｌ−グルタミンを２ｍＭ超に維持した。播種の１１日後に、６．３×１０６細胞／ｍＬの密度および９７％の生存率の培養物を回収した。上清を３５００×ｇで１５分間遠心分離し、澄んだ条件培地を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐ）に通した後、タンパク質精製を行った。
【０３２１】
実施例８，前出に記載したようにＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ−５０およびＳｕｐｅｒｄｅｘ７５における連続クロマトグラフィによって非タグ化ｒｈ−ＦｃγＲＩＡを精製した。
【０３２２】
Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００における連続クロマトグラフィによって、Ｈｉｓ−タグ化ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡを精製した。簡潔には、ＣＨＯ条件培地をフィルター滅菌し、濃縮し、そして５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）に緩衝液交換した。緩衝液Ａで平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、Ｈｉｓ−タグ化ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡタンパク質を捕捉した。５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５におけるイミダゾールの勾配（０〜５００ｍＭ）を用いて、結合したタンパク質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング（抗６×ヒスチジンＨＲＰマウスＩｇＧ１，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって、画分をＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡについて解析した。
【０３２３】
ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６を含むＮｉ−ＮＴＡ画分を、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５（緩衝液Ｂ）に緩衝液交換し、４℃において一晩、緩衝液Ｂで予め平衡化されたＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）とともにインキュベートした。スラリーを重力流カラムに移し、フロースルーおよび洗浄画分を混合し、上に記載したようにｒｈ−ＦｃｇＲの存在について評価した。混合した画分を濃縮し、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１０９ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．３（緩衝液Ｃ）で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｈｉｌｏａｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラム上に注入した。そのカラムを緩衝液Ｃにおいて溶出し、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６を含む画分を混合し、濃縮し、フィルター滅菌し、そして−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、Ｎ末端の配列決定およびサイズ排除多角度光散乱法によって、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６を解析した。
【０３２４】
実施例２１
凝集研究
天然の可溶性ＦｃγＲＩＡの凝集
哺乳動物細胞からの可溶性組換えヒトＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４Ａ）のラージスケール生成は、歴史的に不確実である（Ｂｅｒｎｔｚｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９８：９３−１０４，２００５；Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｏｏｓｔｈｕｉｚｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８１−４８６，２００２；Ｐａｅｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３８：１８１１−１８１７，２００５；Ｂｒｕｈｎｓら、Ｂｌｏｏｄ  ＤＯＩ  １０．１１８２，２００８／ｂｌｏｏｄ−２００８−０９−１７９７５４を参照のこと］。本発明者らは、２９３ｆまたはＣＨＯ  ＤＸＢ−１１細胞のいずれかからの可溶性組換えヒトＦｃγＲＩＡの低収量が、大きな可溶性凝集物をもたらすタンパク質の温度依存性の非共有結合性自己会合に大きく起因することを見出した。さらに、ＦｃγＲＩＡ凝集物が形成されることにより、細胞培養条件培地からのタンパク質の回収も制限される。より詳細に凝集プロセスを研究するために、上に記載したようにＣＨＯ  ＤＸＢ−１１細胞の条件培地からＦｃγＲＩＡを精製した。高度に精製されたＦｃγＲＩＡタンパク質を様々な時間にわたって４℃、２５℃および３７℃においてインキュベートし、凝集物の形成をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィによってモニターした。
【０３２５】
４℃または２５℃のいずれかにおいて最大４８時間にわたってインキュベートした後のＦｃγＲＩＡの溶出プロファイルは、ＦｃγＲＩＡの解凍したてのサンプルの溶出プロファイルと同一であり、すなわち、そのタンパク質は、１０．３分という溶出時間での単一の相同ピークとして、そのカラムから溶出された。対照的に、３７℃における０、２、５、２０または４８時間にわたるＦｃγＲＩＡのインキュベーションによって、７．８分に溶出される材料が定量的に増加しつつ、単量体ＦｃγＲＩＡとして溶出される材料の量が時間依存的に減少し、溶出プロファイルは、大きなＦｃγＲＩＡ凝集物の形成と一致した。３７℃において０、２、５、２０または４８時間にわたってインキュベートされたサンプルの場合、凝集物として回収された材料の量は、それぞれ、カラムに適用された総ＦｃγＲＩＡの０％、１７％、４３％、８３％および９３％だった。
【０３２６】
凝集したＦｃγＲＩＡが生物学的に活性であるか否かを評価するために、３７℃において２０時間インキュベートされた材料（８３％凝集）を、以前に報告されているように免疫複合体の析出の阻害について試験した（Ｅｌｌｓｗｏｒｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０，５８０−５８９，２００８を参照のこと）。オバルブミンと抗オバルブミンとの混合物を増加量の非インキュベート（単量体）ＦｃγＲＩＡとともにインキュベートすることにより、免疫複合体の析出が用量依存的に阻害され、最大阻害は、５．０μＭのＦｃγＲＩＡを用いたときに観察された。対照的に、同一濃度の凝集ＦｃγＲＩＡを用いたときは、阻害は、ほとんどまたはまったく観察されなかった。細胞条件培地または精製ＦｃγＲＩＡタンパク質が、ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの小さいカラムに適用されるＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出アッセイにおいて、同様の結果が得られた。このアッセイでは、ＦｃγＲＩＡサンプルをカラムに適用し、そのカラムをＰＢＳで洗浄し、結合したＦｃγＲＩＡを低ｐＨ緩衝液で溶出した。洗浄画分および低ｐＨ緩衝液溶出物を回収し、充填物、洗浄画分および溶出画分におけるＦｃγＲＩＡの量を、抗ＦｃγＲＩＡ特異的抗体によるウエスタンブロッティングによって評価した。３７℃において４８時間インキュベートされたＦｃγＲＩＡについては、総ＦｃγＲＩＡの９６％が、未結合の洗浄画分中に見られ、４％が、結合画分中に存在した。対照的に、４℃においてインキュベートされたＦｃγＲＩＡについては、サンプル全体が、結合画分中に見られた。これらのデータは、凝集したＦｃγＲＩＡがＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合しないことを証明している。まとめると、これらのデータは、凝集したＦｃγＲＩＡが生物学的に不活性であることを証明している。
【０３２７】
予め凝集された材料のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５溶出プロファイルが、４℃もしくは２５℃においてさらにインキュベートするか、または過剰量のヒトＩｇＧ１を加えることによって、変化しなかったので、ＦｃγＲＩＡの温度依存性の凝集は、不可逆的であるとみられる。
【０３２８】
０、５、１０、１５または２０時間にわたってリン酸緩衝液中、３７℃でＦｃγＲＩＡをインキュベートした後のＦｃγＲＩＡの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルの測定から、ＦｃγＲＩＡの温度によって誘導されるアンフォールディングについてのさらなる証拠がもたらされた。インキュベートされていないＦｃγＲＩＡ（０ｈ）について、約２８５ｎｍにおけるトラフによって分断されるおよそ２７０ｎｍおよび２９０ｎｍにおけるＣＤシグナルの２つのピークが観察された。３７℃において様々な時間にわたってインキュベートされたＦｃγＲＩＡにおいて、ＣＤシグナル強度の時間依存的減少が、これらの波長にわたって観察されたことから、ＦｃγＲＩＡに対する構造が時間および温度に依存して失われることが示唆される。
【０３２９】
これらのデータは、溶液中におけるＦｃγＲＩＡの安定性を動的光散乱（ＤＬＳ）によって評価することによって、さらに実証された。ＤＬＳ実験では、溶液中に拡散する分子に起因する光散乱強度の時間依存的ゆらぎを測定した。光散乱の変化は、分子サイズおよびコンフォメーションに関係する。拡散係数を測定し、次いで、それを用いてＦｃγＲＩＡの流体力学的半径（Ｒｈ）を算出した。ＦｃγＲＩＡを様々な時間にわたって２５℃および３７℃のリン酸緩衝液ｐＨ７．３中でインキュベートし、Ｒｈを評価した。インキュベートされていないＦｃγＲＩＡ（０ｈ）について、Ｒｈは、約３．４ｎｍだった。様々な時間にわたって２５℃においてインキュベートされたＦｃγＲＩＡについては、Ｒｈは変化しなかった（すべてのインキュベーション時間に対して、Ｒｈ約３．２ｎｍ）。対照的に、１．０ｈ、２．０ｈ、３．０ｈおよび４８ｈにわたってインキュベートされたサンプルに対するＦｃγＲＩＡのＲｈは、３７℃におけるインキュベーション時間を用いたとき、それぞれ４．１ｎｍ、５．２ｎｍ、６．４ｎｍおよび１２．８ｎｍに増加した。これらのデータから、ＦｃγＲＩＡが、この調合物中の３７℃において時間とともに、多量体形成したか、またはアンフォールディングしたことが示唆される。
【０３３０】
上に記載されたデータは、高度に精製されたＦｃγＲＩＡが、中性ｐＨのリン酸緩衝液中において３７℃でインキュベートされたときに、不安定かつ不活性な自己会合凝集物として形成されたことを証明した。凝集が、ＦｃγＲＩＡを発現しているＣＨＯ細胞の条件培地中でも生じるか否かを評価するために、３７℃に維持された細胞からの未希釈条件培地を、上に記載したＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合アッセイを用いて評価した。３７℃で培養されたＦｃγＲＩＡを発現しているＣＨＯ細胞について、１日経過した条件培地を回収し、ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに適用した。回収されたＦｃγＲＩＡの８０パーセントが、未結合画分（凝集タンパク質）中に見られ、残り（２０％）は、単量体ＦｃγＲＩＡとしてカラムから溶出された。これらのデータから、ＦｃγＲＩＡが、ＣＨＯ細胞の条件培地中で凝集し、このことが他の研究者たちが記録していた組換え可溶性ＦｃγＲＩＡの生成／回収が不良であることをおそらく説明すると示唆される（Ｂｅｒｎｔｚｅｎら、前出；Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｏｏｓｔｈｕｉｚｅｎ，前出；Ｐａｅｔｚら、前出；Ｂｒｕｈｎｓら、前出を参照のこと）。
【０３３１】
ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡの安定性研究
天然の可溶性ＦｃγＲＩＡの組換え体の温度誘導性凝集を回避するために、上に記載したプロトコルを用いて天然のＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）の膜遠位Ｉｇドメインを天然のＦｃγＲＩＡの膜遠位Ｉｇドメインの代わりに用いるドメインスワッピングプロトコルを用いて、ハイブリッドＦｃγＲ分子を作製した。上で述べたように、ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡのインビトロおよびインビボにおける生物学的活性は、天然のＦｃγＲＩＡの生物学的活性と同一だった。ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡが、温度誘導性凝集に感受性であるか否かを評価するために、天然のＦｃγＲＩＡおよびハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡを各々、様々な長さの時間にわたって３７℃のリン酸緩衝液、ｐＨ７．３中でインキュベートした。上に記載したようなサイズ排除クロマトグラフィによって各ＦｃγＲの凝集をモニターし、凝集物として存在する、総ＦｃγＲに関するパーセントを算出した。３７℃において０ｈ、２ｈ、４ｈ、２０ｈ、２４ｈまたは４８ｈにわたってインキュベートされた天然のＦｃγＲＩＡのパーセント凝集は、それぞれ、０、１４％、４０％、８１％、８４％および９５％だった。対照的に、同一条件下でインキュベートされたＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡに対するパーセント凝集は、０、２％、６％、３０％、３４％および５１％だった。天然のＦｃγＲＩＡとＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡとの凝集の差は、０．１Ｍスクシネート緩衝液，ｐＨ６．０中でより著明だった：０ｈ、２ｈ、４ｈ、２０ｈ、２４ｈまたは４８ｈにわたってインキュベートされた天然のＦｃγＲＩＡのパーセント凝集は、それぞれ０、５％、１３％、５２％、５５％および７７％だった。これらの条件下のＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡのパーセント凝集は、それぞれ０％、０％、０％、５％、８％および１６％だった。これらのデータから、ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡが、天然のＦｃγＲＩＡよりもかなり温度誘導性凝集に感受性でないことが示唆される。
【０３３２】
天然のＦｃγＲＩＡについて上に記載した条件と同一の条件下でのＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡの動的光散乱（ＤＬＳ）解析によって、同様のデータが得られた。天然のＦｃγＲＩＡを３７℃においてインキュベートした後にそのタンパク質の流体力学的半径（Ｒｈ）が増加したこととは対照的に、最大３．０時間にわたって３７℃でインキュベートした後のＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡについては、Ｒｈの変化は観察されなかった（これらの時間にわたって、Ｒｈ＝３．６〜３．８）。Ｒｈが５．１ｎｍにわずかに増加したことが、３７℃において４８時間にわたってインキュベートされたＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡについて見られた。上に記載したように、このＲｈの増加は、Ｒｈが１２．８ｎｍに増加した同一条件下においてインキュベートされた天然のＦｃγＲＩＡについて観察された増加よりもかなり小さかった。また、これらのデータは、ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡが、天然のＦｃγＲＩＡと比べて、温度誘導性凝集に感受性でないことを証明している。
【０３３３】
ＣＨＯ条件培地中の単量体ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡの回収が、天然のＦｃγＲＩＡの回収と比べて増加したか否かを評価するために、これらのレセプターの各々を発現しているＣＨＯ細胞の２４時間培養物中の単量体ＦＣＧＲの量と凝集ＦＣＧＲの量を比較した。上に記載したようにウエスタンブロッティングによって検出されるＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合アッセイを用いて、凝集をモニターした。カラムに適用された総ＦｃγＲに関するパーセントとして、５３％のＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡが、ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合し、低ｐＨ洗浄工程において溶出されたという点でそれが単量体であったのに対し、４７％のタンパク質が、凝集材料として洗浄物中に溶出された。対照的に、天然のＦｃγＲＩＡの場合、１４％のタンパク質しかＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合せず、８６％のタンパク質が、凝集材料として洗浄物中に溶出された。純粋なタンパク質と同様に、これらのデータから、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡが、ＣＨＯ条件培地中において温度誘導性凝集に対してそれほど感受性でなく、天然のＦｃγＲＩＡと比べて多い量で回収され得ることが示唆される。
【０３３４】
実施例２２
可溶性ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ／ＲＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡの抗炎症活性の比較
方法
１．免疫複合体の析出
ニワトリ卵オバルブミン（ＯＶＡ）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中において１５．０μｇ／ｍＬの最終濃度になるように溶解し、指示濃度の、天然のＦｃγＲＩＡ可溶性レセプターまたはハイブリッド可溶性レセプターであるＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６もしくはＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６のうちの１つ（この実施例ではそれぞれ「ＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ」（または「ＦＣＧＲ２Ａ１Ａ」）および「ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ」（または「ＦＣＧＲ３Ａ１Ａ」）とも称される）の存在下および非存在下の２００μＬの最終体積において３００μｇのウサギポリクローナル抗ＯＶＡ抗体／ｍＬと混合した。その直後に、反応混合物の濁度を、３７℃で５〜１０分間にわたって３０秒ごとに分光光度計を活用して３５０ｎｍにおいてモニターした。線形回帰を用いて濁度曲線の直線部分の傾きを計算し、免疫複合体の析出のＦｃγＲ媒介性阻害を、抗ＯＶＡおよびＯＶＡのみを含むインキュベーションに対して表した。
【０３３５】
２．マスト細胞からのサイトカイン分泌
５．０ｍＬのＰＢＳの最終体積において、３００μＬのウサギポリクローナル抗ＯＶＡをＰＢＳにおける７５．０μＬの１ｍｇ  ＯＶＡ／ｍＬと混合することによって、免疫複合体を調製した。３７℃で３０〜６０分間インキュベートした後、その混合物を１８〜２０時間４℃に置いた。その免疫複合体を１２，０００ｒｐｍで５．０分間遠心分離することによって回収し、上清画分を取り出して廃棄し、その免疫複合体沈殿物を１．０ｍＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁した。その免疫複合体をさらに洗浄した後、１．０ｍＬの氷冷ＰＢＳの最終体積に再懸濁した。ＢＣＡアッセイを用いてタンパク質濃度を測定した。
【０３３６】
ＭＣ／９細胞を培地Ａ（１０％ウシ胎児血清、５０．０μＭ  Ｂ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ可欠アミノ酸、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、３６．０μｇ／ｍＬ  Ｌ−アスパラギン、１．０ｎｇ／ｍＬ  ｒｍＩＬ−３、５．０ｎｇ／ｍＬ  ｒｍＩＬ−４、２５．０ｎｇ／ｍＬ  ｒｍＳＣＦを含むＤＭＥＭ）中において、０．５〜３×１０６細胞／ｍＬの密度にサブクローン化した。細胞を１５００ｒｐｍで５．０分間遠心分離することによって回収し、細胞ペレットを培地Ａ（サイトカインを含まない）で洗浄し、２．０×１０６細胞／ｍＬで培地Ａに再懸濁した。細胞のアリコート（２．０×１０５細胞）を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、２００μＬの緩衝液Ａの最終体積中、指示濃度の、天然のＦｃγＲＩＡ可溶性レセプターまたはハイブリッド可溶性レセプターＦｃｇＲＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６もしくはＦｃｇＲＩＩＩＡ／ＩＡ−ＣＨ６のうちの１つの存在下および非存在下において、１０．０μｇ／ウェルのＯＶＡ／抗ＯＶＡ免疫複合体（ＩＣ）とともにインキュベートした。３７℃において４．０時間後、培地を取り出し、１５００ｒｐｍで５．０分間遠心分離した。無細胞の上清画分を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカインアッセイキットを用いて、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦαおよびＭＣＰ−１サイトカイン放出の存在についてアリコートを解析した。
【０３３７】
３．ヒトＩｇＧ１に対するＦｃγＲ親和性の測定
ブランク参照として第２の誘導体化されていないセルを利用して、ＩｇＧ１抗体を１つのフローセルに固定化した。アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ）、およびＢｉａｃｏｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって操作されるＳｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎのための標準的なＷｉｚａｒｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅを用いてＩｇＧ１抗体の固定化を行った。ｐＨスカウティング研究に対するＷｉｚａｒｄの結果に基づいて、ＩｇＧ１抗体溶液を酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０中で１１μｇ／ｍＬに希釈した。アミンカップリング用のＷｉｚａｒｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅを用いることにより、抗体を単一のフローセルに固定化した。次いで、センサー表面上のカルボキシル基を、０．２Ｍ  Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む溶液を注入することによって活性化した。次いで、１５０〜２００ＲＵのレベルを標的として、抗体溶液を活性化表面の上に注入した。カルボキシメチルデキストラン表面上の残存エステル部位を１Ｍエタノールアミン塩酸塩でブロックすることによって、この固定化手順を終了した。
【０３３８】
アナライト溶液（天然の可溶性ＦｃγＲＩＡまたは可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ）を注入するための方法は、動態解析用のＢｉａｃｏｒｅ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅを用いて記載された。この方法は、２５℃において行われ、サンプルは、外界温度のオートサンプラー内に保存された。なお、Ｗｉｚａｒｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅを用いるとき、注入モードなどの動態にとって最適なある特定のパラメータが、Ｗｉｚａｒｄプログラムによって予め定義される。
【０３３９】
可溶性ＦｃγＲＩＡを解析するための方法を、動態速度定数ｋａおよびｋｄを決定するために最適化した。レセプターを両方のフローセル（すなわち、ブランクのフローセルおよび抗体誘導体化されたフローセルであるそれぞれ１および２）の上に順番に注入することにより、非修飾コントロール表面へのＦｃγＲの結合（ウサギ抗ＯＶＡ  ＩｇＧへの結合が判定されなかった）に対する、ヒトＩｇＧ１抗体へのＦｃγＲの結合の比較解析が可能になった。４０μＬ／分の流速で３分間、アナライトを注入した（会合時間）。各アナライト注入に対する解離時間は、３分間だった。アナライトの用量反応曲線の範囲は、０．１６〜１０．３ｎＭだった。各用量反応曲線の点について、Ｎ＝２回の反復注入を行った。装置のノイズおよびドリフトを差し引くための緩衝液の注入をこの順序に含めた。用量反応曲線サンプルをランダムな様式で注入した。ＦｃγＲ、各ＦｃγＲの動態解析のために、各用量反応曲線サイクルの後に、グリシン，ｐＨ１．７５を５０μＬ／分で１回、３０秒間注入することにより、ＩｇＧ抗体表面を再生した。
【０３４０】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、データ解析を行った。まず、ベースラインの安定性を評価することにより、再生工程が、注入の順序全体を通して一貫した結合表面を提供することを確かめた。コントロール表面に対するＦｃγＲアナライトの非特異的結合のレベルを調べ、最小であることを確かめた。特異的結合表面曲線（すなわち、フローセル２）からコントロール表面曲線（すなわち、フローセル１）を差し引くこと、ならびに緩衝液注入曲線を用いて装置のノイズおよびドリフトを差し引くことによって、結合曲線を処理した。アナライト注入の再現性についてデータを調べ、次いで、得られた補正後の結合曲線を結合モデルに全体的に当てはめることにより、得られた当てはめおよび平衡定数を評価した。
【０３４１】
４．マウスにおける皮膚の逆受身アルサス反応
１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりｎ＝８匹のマウス）をイソフルランで麻酔し、背面の皮膚を剪毛し、各マウスの背中を７０％アルコールで拭いた。各マウスの背面の皮膚の異なる部位に、それぞれ０．０２ｍＬの皮内注射を２回行った。その注射溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ならびに４０．０μｇのウサギ抗オバルブミン（５６℃における３０〜４０分間のインキュベーションによって熱失活した抗ＯＶＡ）単独、または４０．０μｇの抗ＯＶＡおよび指示量の天然の可溶性ＦｃγＲＩＡまたは可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡもしくはＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡのうちの１つを含んでいた。コントロール群のマウスには、４０．０μｇの非免疫ウサギＩｇＧ（上に記載したように熱失活したもの）の皮内注射を２回行った。抗体調製物は、注射の前に、１４，０００ｒｐｍにおいて１０分間で遠心分離することにより、微粒子が除去された。皮内注射の直後に、１０．０ｍｇのＯＶＡ／ｍＬおよび１０．０ｍｇのエバンスブルー／ｍＬを含む１００．０μＬの溶液を各マウスの尾静脈に注射した。いくつかの場合において、尾静脈注射溶液は、１．０ｍｇ／ｋｇの用量のデキサメタゾンも含んでいた。注射の４時間後、ＣＯ２ガスによってマウスを安楽死させた。エバンスブルー色素の脈管漏出の面積（ｍｍ２）を測定すること、および病変部位から採取されたパンチバイオプシーの組織の重量（ｍｇ）を測定することによって、皮膚の浮腫を評価した。次いで、その組織サンプルを液体Ｎ２中で急凍し、−８０℃において保存した。
【０３４２】
Ｃｙｔｏｓｔｏｒｅ（Ｃａｌｇａｒｙ，Ａｌｂｅｒｔａ  Ｃａｎａｄａ）製のＭｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて、報告されているように（Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７８：２０６−２０９，１９８２を参照のこと）パンチバイオプシーサンプルにおけるミエロペルオキシダーゼ活性を測定することによって、好中球浸潤を評価した。
【０３４３】
結果および考察
天然のＦｃγＲＩＡ可溶性レセプターならびにハイブリッドＦｃγＲ可溶性レセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡの、免疫複合体の析出に対する相対的な有効性を評価するために、ＭＯｌｌｅｒ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８：６３１−６４０，１９７９）およびＧａｖｉｎら（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０２：６２０−６２５，１９９５）の方法に基づいて、抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体析出アッセイを確立した。３７℃において抗ＯＶＡとＯＶＡとをインキュベートすることにより、溶液混合物の光学濃度が時間依存的に増加した（これは、不溶性抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体の形成と一致する観察結果だった）。アッセイの開始時に天然の可溶性ＦｃγＲＩＡを加えることにより、混合物の光学濃度が用量依存的に減少したことから、免疫複合体の析出の阻害が示唆された。免疫複合体の析出は、１５００ｎＭ可溶性ＦｃγＲＩＡによって完全に無くなった。同様に、可溶性ハイブリッドレセプターであるＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡとＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡの両方が、ＯＶＡ−抗ＯＶＡ免疫複合体の析出を阻止した。用量反応曲線は、３つすべてのＦｃγＲについて類似していたことから、これらのレセプターが等しい効力を有したことが示唆される。抗原：抗体免疫複合体の析出は、抗体Ｆｃ重鎖間の非共有結合性相互作用に依存するとみられ（ＭＯｌｌｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８：６３１−６４０，１９７９）、また、Ｆｃγレセプターは、抗体のＦｃ部分に結合する（Ｄｉｊｓｔｅｌｂｌｏｅｍら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５１０−５１６，２００１）ので、これらのデータから、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡならびに可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡおよびＦｃγＩＩＩＡ／ＩＡが、抗ＯＶＡ抗体のＦｃ部分に結合することによって免疫複合体の析出を乱すことが示唆される。
【０３４４】
天然のＦｃγＲＩＡおよび各ハイブリッドレセプターと抗体Ｆｃとの相互作用を直接評価するために、固定化されたヒトＩｇＧ１へのＦｃγＲの結合を表面プラズモン共鳴解析によって評価した。１つのＩｇＧ１分子に対して１つのＦｃγＲ分子という結合化学量論が推定されるので（Ｗｏｏｆ  ａｎｄ  Ｂｕｒｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１−１１，２００４）、モノクローナルヒトＩｇＧ１抗体を、ＦｃγＲの動態解析に対する最適レベル内の密度レベルである４８５というＲＵ（レゾナンスユニット）レベルで１つのフローセルにおけるセンサー表面に固定化した。天然のＦｃγＲＩＡ可溶性レセプターは、それぞれ２．８×１０６Ｍ−１ｓ−１および４．６×１０−４ｓ−１という会合速度および解離速度で急速に固定化ＩｇＧ１に結合した（この値から１．７×１０−１０Ｍという平衡解離定数が算出された）。これらのデータは、以前に報告されたデータ（Ｐａｅｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３８：１８１１−１８１７，２００５）と類似しており、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡが高親和性でヒトＩｇＧ１に結合することを証明している。可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩ／ＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡは、天然のＦｃγＲＩＡと類似の会合速度および解離速度で、固定化されたＩｇＧ１に迅速に結合した。これらのデータから、これらのハイブリッドレセプターが、固定化されたヒトＩｇＧ１に高親和性で結合したことが示唆される。
【０３４５】
マスト細胞は、ＩＩＩ型過敏反応などの種々の免疫障害において免疫複合体媒介性炎症を媒介すると考えられている（Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１７５９−１７６１，２００２；Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：３８７−３９０，１９９６；Ｊａｎｃａｒ  ａｎｄ  Ｃｒｅｓｐｏ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６：４８−５５，２００５）。マスト細胞のＦｃγレセプターへの免疫複合体の結合は、ＩＬ−６およびＴＮＦαなどの炎症性サイトカインの分泌を誘導すると考えられており（Ｒａｖｅｔｃｈ，前出；Ｊａｎｃａｒ  ａｎｄ  Ｃｒｅｓｐｏ，前出）、続いて、好中球浸潤および組織損傷がもたらされる。マスト細胞からのサイトカイン分泌が、免疫複合体によって刺激され得たか否かを評価するために、マウスマスト細胞株ＭＣ／９を、予め形成されたウサギ抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体の存在下および非存在下においてインキュベートした。抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とのインキュベーションによって、ＭＣ／９細胞条件培地中における炎症性サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦαおよびＭＣＰ−１の蓄積が時間依存的および濃度依存的に増加した。対照的に、等しい濃度のウサギ抗ＯＶＡ  ＩｇＧ単独とともにＭＣ／９細胞がインキュベートされたとき、サイトカインの産生は、変化しなかった。これらのデータは、ＭＣ／９細胞が、炎症性サイトカインの産生によって免疫複合体に反応することを証明する。
【０３４６】
増加量の天然のＦｃγＲＩＡ可溶性レセプターまたはハイブリッド可溶性レセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡもしくはＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡのうちの１つの存在下において抗ＯＶＡ／ＯＶＡ免疫複合体とともにＭＣ／９細胞をインキュベートすることにより、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦαおよびＭＣＰ−１の蓄積が用量依存的に減少した（図１３を参照のこと）。各レセプターに対する用量反応曲線の差がほとんどまたはまったく無かったことが注目され、このことにより、これらの各レセプターに対する効力が同一であることが示唆される。これらのデータは、天然のＦｃγＲＩＡおよびこれらのハイブリッド可溶性レセプターが、マウスマスト細胞において免疫複合体の結合およびシグナル伝達を阻止し得ることを証明している。
【０３４７】
上に記載した知見は、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡならびに可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡが、インビトロにおいて免疫複合体の形成を阻止し得ること、およびマスト細胞における免疫複合体媒介性シグナル伝達を阻害し得ることを証明している。これらのデータから、ＦｃγＲが、インビボの状況において、免疫複合体媒介性炎症を阻止する際に有効であり得ることが示唆される。このことを試験するために、マウスにおいて皮膚の逆受身アルサス反応を確立し、免疫複合体媒介性浮腫および好中球浸潤に対する各ＦｃγＲの作用を評価した。
【０３４８】
等しい濃度の非免疫ＩｇＧの皮内注射と比べて、抗ＯＶＡ抗体の注射によって、処置マウスの皮膚における浮腫が時間および濃度によって増加した。エバンスブルー色素の血管外遊出面積の増加と組織重量の増加の両方として、浮腫は明らかだった。ＯＶＡの尾静脈注射の非存在下において浮腫が観察されなかったので、これらの作用は、免疫複合体に特異的だった。ミエロペルオキシダーゼの抽出可能な活性によって測定される病変部位内の好中球の蓄積もまた増加した。
【０３４９】
増加量の天然の可溶性ＦｃγＲＩＡとともに抗ＯＶＡ抗体を皮内送達することにより、浮腫が濃度依存的に減少した（これは、エバンスブルー面積の減少（図１４Ａおよび１５Ａ）または病変部位の組織重量の減少（図１４Ｂおよび１５Ｂ）のいずれかによって判断された）。可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡ（図１４Ａおよび１４Ｂ）およびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡ（図１５Ａおよび１５Ｂ）のいずれかを用いたとき、同様の結果が得られた。
【０３５０】
両方のハイブリッドレセプターが、浮腫の両方の基準を減少させ、天然のＦｃγＲＩＡと等しい効力だった。病変バイオプシーにおけるミエロペルオキシダーゼ活性によって判断される好中球浸潤もまた、等しい効力で、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡおよび各可溶性ハイブリッドレセプターによって有意に減少した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。これらの結果は、天然の可溶性ＦｃγＲＩＡならびに可溶性ハイブリッドレセプターＦｃγＲＩＩＡ／ＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ／ＩＡの各々が、マウスの逆受身アルサス反応において浮腫および好中球浸潤を阻止し得ることを示している。
【０３５１】
前述の本発明は、理解を明確にする目的で詳細に記載されてきたが、ある特定の改変が添付の請求項の範囲内で実施され得ることが認識されるだろう。本明細書中で引用されたすべての刊行物および特許文書は、その各々が参考として援用されると個別に示されるのと同程度に、その全体がすべての目的のために本明細書によって参考として援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
2011526154.tif 000024
【図１１】
2011526154.tif 000025
【図１２】
2011526154.tif 000026
【図１３Ａ】
2011526154.tif 000027
【図１３Ｂ】
2011526154.tif 000028
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2011526154.tif 000030
【図１４】
2011526154.tif 000031
【図１５】
2011526154.tif 000032
【図１６】
2011526154.tif 000033
【配列表】
2011526154000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月22日(2011.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
標準的な分析方法の不正確さに起因して、ポリマーの分子量および長さは、近似値であることが理解される。そのような値が、「約」Ｘまたは「およそ」Ｘと表現されるとき、述べられている値のＸは、±１０％の精度であると理解される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）  配列番号４０のアミノ酸残基３６〜３０１；
配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０；
配列番号４４のアミノ酸残基２１〜２８６；または
配列番号４６のアミノ酸残基２１〜２８６；
からなる群から選択されるポリペプチド領域と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性ポリペプチドであって、
ここで、該ポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合することができる、単離された可溶性ポリペプチド。
（項目２）  前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド領域と少なくとも９５％の配列同一性を有する、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）  前記ポリペプチドが、
配列番号４０のアミノ酸残基３６〜３０１；
配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０；
配列番号４４のアミノ酸残基２１〜２８６；または
配列番号４６のアミノ酸残基２１〜２８６
を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４）  分泌シグナル配列をさらに含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目５）  項目１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
（項目６）  前記核酸分子が、
配列番号３９のヌクレオチド１０６〜９０３；
配列番号４１のヌクレオチド１２７〜９３０；
配列番号４３のヌクレオチド６１〜８５８；または
配列番号４５のヌクレオチド６１〜８５８
を含む、項目５に記載の核酸分子。
（項目７）  以下の作動可能に連結されるエレメント：
ａ）転写プロモーター；
ｂ）項目１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；および
ｃ）転写ターミネーター
を含む、発現ベクター。
（項目８）  前記ＤＮＡセグメントが、
配列番号３９のヌクレオチド１０６〜９０３；
配列番号４１のヌクレオチド１２７〜９３０；
配列番号４３のヌクレオチド６１〜８５８；または
配列番号４５のヌクレオチド６１〜８５８
を含む、項目７に記載の発現ベクター。
（項目９）  前記発現ベクターが、分泌シグナル配列をさらに含む、項目７または８に記載の発現ベクター。
（項目１０）  前記分泌シグナル配列が、配列番号４０のアミノ酸残基１〜３５、配列番号４２のアミノ酸残基１〜４２、配列番号４４のアミノ酸残基１〜２０、配列番号４６のアミノ酸残基１〜２０、配列番号６０のアミノ酸残基１〜３５、配列番号６２のアミノ酸残基１〜１６、配列番号６４のアミノ酸残基１〜１９および配列番号６６のアミノ酸残基１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、項目９に記載の発現ベクター。
（項目１１）  項目７から１０のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む培養細胞であって、ここで、該細胞は、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する、培養細胞。
（項目１２）  項目９または１０に記載の発現ベクターを含み、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現し、該ポリペプチドを分泌する、培養細胞。
（項目１３）  ポリペプチドを生成する方法であって：
項目７または８に記載の発現ベクターを導入された細胞を培養する工程であって、ここで、該細胞は、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する、工程；および
該発現されたポリペプチドを回収する工程
を包含する、方法。
（項目１４）  ポリペプチドを生成する方法であって：
項目９または１０に記載の発現ベクターを導入された細胞を培養する工程であって、ここで、該細胞は、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現し、該ポリペプチドは、該細胞から分泌される、工程；および
該分泌されたポリペプチドを回収する工程
を包含する、方法。
（項目１５）  項目１３に記載の方法によって生成された、単離されたポリペプチド。
（項目１６）  項目１４に記載の方法によって生成された、単離されたポリペプチド。
（項目１７）  項目１〜４、１５および１６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド；および
薬学的に許容可能なビヒクル
を含む、組成物。
（項目１８）  被験体におけるＩｇＧ媒介性炎症を減少させる方法であって、該方法は：
ＩｇＧ媒介性炎症を有する被験体に、項目１〜４、１５および１６のいずれか１項に記載の有効量のポリペプチドを投与する工程
を包含する、方法。
（項目１９）  前記ＩｇＧ媒介性炎症が、免疫複合体媒介性である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）  ＩｇＧ媒介性炎症性疾患を処置する方法であって、該方法は：
該ＩｇＧ媒介性炎症性疾患を有する被験体に、項目１〜４、１５および１６のいずれか１項に記載の有効量のポリペプチドを投与する工程
を包含する、方法。
（項目２１）  前記ＩｇＧ媒介性炎症性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；混合型クリオグロブリン血症；混合結合組織病；外因性抗原に関連する疾患；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギランバレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）  前記ＩｇＧ媒介性炎症性疾患が、免疫複合体媒介性疾患である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）  前記免疫複合体媒介性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；混合型クリオグロブリン血症；混合結合組織病；および外因性抗原に関連する疾患からなる群から選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）  前記外因性抗原に関連する疾患が、Ｂ型肝炎に関連する結節性多発動脈炎である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）  前記ＩｇＧ媒介性炎症性疾患が、自己免疫疾患である、項目２０に記載の方法。
（項目２６）  前記自己免疫疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；混合結合組織病；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギランバレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、項目２５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４０のアミノ酸残基３６〜３０１；
配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０；
配列番号４４のアミノ酸残基２１〜２８６；または
配列番号４６のアミノ酸残基２１〜２８６；
からなる群から選択されるポリペプチド領域と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された可溶性ポリペプチドであって、
ここで、該ポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合することができる、単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド領域と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、
配列番号４０のアミノ酸残基３６〜３０１；
配列番号４２のアミノ酸残基４３〜３１０；
配列番号４４のアミノ酸残基２１〜２８６；または
配列番号４６のアミノ酸残基２１〜２８６
を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
分泌シグナル配列をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子が、
配列番号３９のヌクレオチド１０６〜９０３；
配列番号４１のヌクレオチド１２７〜９３０；
配列番号４３のヌクレオチド６１〜８５８；または
配列番号４５のヌクレオチド６１〜８５８
を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
以下の作動可能に連結されるエレメント：
ａ）転写プロモーター；
ｂ）請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；および
ｃ）転写ターミネーター
を含む、発現ベクター。
【請求項８】
前記ＤＮＡセグメントが、
配列番号３９のヌクレオチド１０６〜９０３；
配列番号４１のヌクレオチド１２７〜９３０；
配列番号４３のヌクレオチド６１〜８５８；または
配列番号４５のヌクレオチド６１〜８５８
を含む、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記発現ベクターが、分泌シグナル配列をさらに含む、請求項７または８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記分泌シグナル配列が、配列番号４０のアミノ酸残基１〜３５、配列番号４２のアミノ酸残基１〜４２、配列番号４４のアミノ酸残基１〜２０、配列番号４６のアミノ酸残基１〜２０、配列番号６０のアミノ酸残基１〜３５、配列番号６２のアミノ酸残基１〜１６、配列番号６４のアミノ酸残基１〜１９および配列番号６６のアミノ酸残基１〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む培養細胞であって、ここで、該細胞は、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する、培養細胞。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の発現ベクターを含み、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現し、該ポリペプチドを分泌する、培養細胞。
【請求項１３】
ポリペプチドを生成する方法であって：
請求項７または８に記載の発現ベクターを導入された細胞を培養する工程であって、ここで、該細胞は、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する、工程；および
該発現されたポリペプチドを回収する工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
ポリペプチドを生成する方法であって：
請求項９または１０に記載の発現ベクターを導入された細胞を培養する工程であって、ここで、該細胞は、前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現し、該ポリペプチドは、該細胞から分泌される、工程；および
該分泌されたポリペプチドを回収する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法によって生成された、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法によって生成された、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜４、１５および１６のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド；および
薬学的に許容可能なビヒクル
を含む、組成物。
【請求項１８】
被験体におけるＩｇＧ媒介性炎症を減少させるための組成物であって、該組成物は、請求項１〜４、１５および１６のいずれか１項に記載の有効量のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１９】
前記ＩｇＧ媒介性炎症が、免疫複合体媒介性である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ＩｇＧ媒介性炎症性疾患を処置するための組成物であって、該組成物は、請求項１〜４、１５および１６のいずれか１項に記載の有効量のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２１】
前記ＩｇＧ媒介性炎症性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；混合型クリオグロブリン血症；混合結合組織病；外因性抗原に関連する疾患；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギランバレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＩｇＧ媒介性炎症性疾患が、免疫複合体媒介性疾患である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記免疫複合体媒介性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；混合型クリオグロブリン血症；混合結合組織病；および外因性抗原に関連する疾患からなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記外因性抗原に関連する疾患が、Ｂ型肝炎に関連する結節性多発動脈炎である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＩｇＧ媒介性炎症性疾患が、自己免疫疾患である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；混合結合組織病；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；シェーグレン症候群；抗リン脂質抗体症候群；皮膚筋炎；ギランバレー症候群；およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【国際調査報告】
2011526154.tif 000034
2011526154.tif 000035
2011526154.tif 000036
2011526154.tif 000037