(57)【要約】本開示は、ＴＧＦアンタゴニストドメインと、異種標的（ＩＬ６、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＧＦなど）に対してアンタゴニスト作用を有するかまたは異種標的（ＧＩＴＲなど）に対してアゴニスト作用を有する別の結合ドメインとから構成される多重標的融合タンパク質を提供する。また、この多重特異性融合タンパク質は、これらの結合ドメインを分離し、二量体化を可能にする介在ドメインも含むことができる。また、本開示は、これらの多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、これらの融合タンパク質の組成物、ならびにこれらの多重特異性融合タンパク質および組成物を使用する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端からカルボキシ末端までに、以下の構造のうちの１つを有する多重特異性融合タンパク質：
（ａ）ＢＤ−ＩＤ−ＥＤ、
（ｂ）ＥＤ−ＩＤ−ＢＤ、または
（ｃ）ＥＤ１−ＩＤ−ＥＤ２
［式中、
ＥＤは、ＴＧＦβアンタゴニストであり、ＥＤ１とＥＤ２とは、異なるアンタゴニストであり、ＥＤ１またはＥＤ２は、ＴＧＦβアンタゴニストであり、
ＩＤは、介在ドメインであり、そして
ＢＤは、ＴＮＦアンタゴニスト、ＩＬ６アンタゴニスト、ＩＬ１０アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＨＧＦアンタゴニスト、ＩＧＦアンタゴニストまたはＧＩＴＲアゴニストである］。
【請求項２】
前記結合ドメインが、免疫グロブリン可変結合ドメインである、請求項１に記載の多重特異性融合タンパク質。
【請求項３】
前記外部ドメインが、受容体リガンドドメインである、請求項１または２に記載の多重特異性融合タンパク質。
【請求項４】
前記介在ドメインが、以下の構造：−Ｌ１−ＣＨ２ＣＨ３−
［式中、
Ｌ１は、免疫グロブリンヒンジリンカーであって、場合により、第１システインが異なるアミノ酸で置換されているＩｇＧ１ヒンジであり、
−ＣＨ２ＣＨ３−は、ＩｇＧ１のＦｃドメインのＣＨ２ＣＨ３領域であって、場合により、突然変異させて、ＦｃＲｎの相互作用は保持されるが、ＦｃγＲＩ−ＩＩＩの相互作用が除かれている］
を有する、請求項１から３のいずれかに記載の多重特異性融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＢＤが、第１のリンカーによって前記介在ドメインに接続しており、前記ＥＤが、第２のリンカーによって前記介在ドメインに接続しており、前記第１および前記第２のリンカーは、同じであってもまたは異なっていてもよい、請求項１から４のいずれかに記載の多重特異性融合タンパク質。
【請求項６】
前記第１および前記第２のリンカーが、配列番号４９７〜６０４および１２２３〜１２２８から選択され、場合により、前記第１リンカーが、配列番号５７６であり、前記第２リンカーが配列番号１２２３である、請求項５に記載の多重特異性融合タンパク質。
【請求項７】
配列番号７３５〜７４２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれかに記載の多重特異性融合タンパク質。
【請求項８】
１つまたは複数の請求項１から７のいずれかに記載の多重特異性融合タンパク質、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物。
【請求項９】
前記多重特異性融合タンパク質が、前記組成物において二量体または多量体として存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか一項に記載の多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
発現制御配列に作動可能に連結している請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
悪性の状態を有する被験体を治療するための方法であって、治療有効量の請求項１から９のいずれかに記載の多重特異性融合タンパク質またはその組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
前記悪性の状態が、乳癌、腎細胞癌、メラノーマまたは前立腺癌である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、多重標的結合性分子およびそれらの治療的適応の分野、より具体的には、形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦβ）アンタゴニストドメインとＩＬ６、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＧＦ１もしくはＩＧＦ２などの異種標的に対してアンタゴニスト作用を有する別の結合ドメイン、またはＴＧＦβアンタゴニストドメインとＧＩＴＲなどの異種標的に対してアゴニスト作用を有する別の結合ドメインのいずれかから構成される融合タンパク質、ならびにそれらの組成物および治療上の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦβ）は、免疫系において顕著な作用を有する強力なサイトカインである。免疫系におけるＴＧＦβの主要な機能は、寛容および外来病原体に対する初期の免疫応答を維持することである。哺乳動物において、ＴＧＦβの３つのアイソフォーム、すなわち、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３が同定されており、ＴＧＦβ１が、主要なアイソフォームである。ＴＧＦβは、潜伏性型で分泌され、分泌されたＴＧＦβ全部のうち、わずかなパーセントのみが、生理的状態下で活性化されるに過ぎない。ＴＧＦβの生物学的作用は大部分、ＴＧＦβの、受容体ＡＬＫ５およびＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲ２）への結合を通して生じる。具体的には、活性なＴＧＦβ二量体が、ＡＬＫ５とＴＧＦβＲ２との四量体複合体に結合して、細胞のシグナル伝達を開始する。ＡＬＫ５は、ＴＧＦβの最初の結合には必要でないが、シグナル伝達には必要である。
【０００３】
ＴＧＦβは、細胞の増殖、分化、細胞間および細胞−マトリックス間の接着、細胞の運動性、ならびにリンパ球の活性化などの多くの細胞機能に影響を及ぼすことが示されている。（免疫応答の調節におけるＴＧＦβの役割の総説については、Ｌｉら（２００６年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４巻：９９〜１４６頁を参照されたい）さらに、ＴＧＦβは、骨粗鬆症、高血圧、アテローム動脈硬化、肝硬変ならびに腎臓、肝臓および肺の線維性疾患などの多くの疾患の進行や腫瘍の進行を誘導または媒介するとも考えられている。ＴＧＦβは、慢性炎症によって引き起こされる終末器官の傷害を増大させる恐れがあり、ＴＧＦβアンタゴニストは、糖尿病性腎臓疾患、糸球体腎炎、シクロスポリン媒介型腎臓損傷および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの疾患の動物モデルにおいて、この傷害を減弱させるのに有効であることが示されている（Ｂｏｒｄｅｒら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６巻：３７１〜３７４頁；Ｂｏｒｄｅｒら（１９９２年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６０巻：３６１〜３６４頁；Ｉｓａｋａら（１９９９年）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．  ５５巻：４６５〜４７５頁；Ｓｈａｒｍａら（１９９６年）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５巻：５２２頁；Ｘｉｎら（２００４年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １５巻：１４３３頁；Ｂｅｎｉｇｎｉら（２００３年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １４巻：１８１６頁）。癌に関しては、ＴＧＦβは、悪性の細胞に対して直接的な阻害活性を示すことができ、様々な腫瘍増殖因子および脈管形成因子の産生または活性を増大させることができる。
【０００４】
ＴＧＦβノックアウトマウスが、制御されない炎症および自己免疫に関連する重篤な病態を示すが、ＴＧＦβアンタゴニストの投与は、マウスおよびヒトにおいて忍容性良好である（Ｒｕｓｅｋら（２００３年）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．  ２５巻：２３５〜５７頁；Ｄｅｎｔｏｎら（２００７年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ５６巻：３２３〜３３頁）。当技術分野で公知の、ＴＧＦアンタゴニストを使用する治療方法は、ＴＧＦβに対する抗体の使用、ＴＧＦβＲ２外部ドメインＩｇ融合タンパク質の使用、およびＴＧＦβＲＩキナーゼ（ＴＧＦβＲＩ  ｋｉｎａｓｅ）活性の小型分子阻害剤の使用を含む。これらの方法は全て、疾患のげっ歯類モデルまたはヒトの臨床治験において、中程度の有益な影響を示している（Ｄｅｎｔｏｎら（２００７年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ５６巻：３２３頁）。実際に、マウスにおけるＴＧＦβアンタゴニストの連続使用からは、ＴＧＦβ−／−ノックアウトマウスの表現型から予想されるであろう免疫系の活性化の証拠は示されない。このことは、ヒト疾患におけるサイトカイン、インターロイキン、ケモカインおよび増殖因子の生物学の複雑な性質、ならびに２つ以上の経路を同時に阻害して、患者にとっての利益を最大化するための要件を部分的に反映している可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性（Ｘｃｅｐｔｏｒ）融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６と特異的に結合し、これら多重特異性融合タンパク質が、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒ単独よりもハイパーＩＬ６と優先的に結合することを示す図である。試験した２種の融合タンパク質だけがＩＬ６と結合し、ｓＩＬ６Ｒとは１つも結合しなかった。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性（Ｘｃｅｐｔｏｒ）融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６と特異的に結合し、これら多重特異性融合タンパク質が、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒ単独よりもハイパーＩＬ６と優先的に結合することを示す図である。試験した２種の融合タンパク質だけがＩＬ６と結合し、ｓＩＬ６Ｒとは１つも結合しなかった。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性（Ｘｃｅｐｔｏｒ）融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６と特異的に結合し、これら多重特異性融合タンパク質が、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒ単独よりもハイパーＩＬ６と優先的に結合することを示す図である。試験した２種の融合タンパク質だけがＩＬ６と結合し、ｓＩＬ６Ｒとは１つも結合しなかった。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＴＮＦ−αと結合することを示す図である。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６およびＴＮＦ−αと同時に結合できることを示す図である。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性融合タンパク質が、ｇｐ１３０をハイパーＩＬ６との結合からブロックすることを示す図である。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＴＦ−１細胞の、（Ａ）ＩＬ６誘導性増殖または（Ｂ）ハイパーＩＬ６誘導性増殖をブロックすることを示す図である。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＴＦ−１細胞の、（Ａ）ＩＬ６誘導性増殖または（Ｂ）ハイパーＩＬ６誘導性増殖をブロックすることを示す図である。
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＴＮＦ−αをＴＮＦＲとの結合からブロックすることを示す図である。
【図７】図７は、様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、Ｌ９２９細胞のＴＮＦ−α誘導性死滅をブロックすることを示す図である。
【図８】図８は、ＥＬＩＳＡにより測定した、様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つと融合したＴＧＦβＲ２外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＴＧＦβ１と結合することを示す図である。
【図９】図９は、ＴＧＦβＲＩＩ外部ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＨＴ２細胞のＩＬ４による増殖のＴＧＦβ−１誘導性阻害をブロックすることを示す図である。
【図１０】図１０は、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、ＨｅｐＧ２（肝）細胞と結合しなかったことを示す図である。
【図１１】図１１は、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、マウスにおけるＨＩＬ６−誘導性ＳＡＡ応答をブロックしたことを示す図である。
【図１２】図１２は、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質が、マウスにおけるＨＩＬ６誘導性ｓｇｐ１３０応答をブロックしたことを示す図である。
【図１３】図１３ＡおよびＢは、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質の、それぞれ投与２時間後および２４時間後の、マウスにおけるＴＮＦα誘導性ＳＡＡ応答をブロックする能力に関する研究の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本開示は、多重特異性融合タンパク質を提供し、これを、本明細書ではｘｃｅｐｔｏｒ分子と呼ぶ。そのような多重特異性融合タンパク質の例示的な構造は、Ｎ−ＢＤ−ＩＤ−ＥＤ−Ｃ、Ｎ−ＥＤ−ＩＤ−ＢＤ−Ｃ、およびＮ−ＥＤ１−ＩＤ−ＥＤ２−Ｃ［式中、Ｎ−および−Ｃはそれぞれ、アミノ末端およびカルボキシ末端を表し、ＢＤは、免疫グロブリン様または免疫グロブリン可変領域の結合ドメインであり、ＩＤは、介在ドメインであり、かつＥＤは、外部ドメイン（例えば、細胞外ドメイン）、例として、受容体リガンド結合ドメイン、システインに富むドメイン（Ａドメイン；ＷＯ０２／０８８１７１およびＷＯ０４／０４４０１１を参照されたい）、セマフォリンまたはセマフォリン様のドメインなどである］を含む。いくつかの構築物中では、ＩＤは、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間に配置された免疫グロブリンの定常領域またはそのサブ領域を含むことができる。その上さらなる構築物中では、ＢＤおよびＥＤがそれぞれ、同じまたは異なるリンカー（例えば、１〜５０個のアミノ酸を含むリンカー）、例として、（例えば、上部領域およびコア領域から構成される）免疫グロブリンヒンジ領域もしくはその機能性変異体、またはレクチンのドメイン間領域もしくはその機能性変異体、または分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）（ＣＤ）分子の茎領域もしくはその機能性変異体を介して、ＩＤに連結されている。
【０００７】
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書において使用しようとする特定の用語の定義を提供することによって、本開示の理解を助けることができる。追加の定義も、本開示の全体を通して記載する。
【０００８】
本記載においては、任意の濃度の範囲、パーセントの範囲、割合の範囲、または整数の範囲は、別段の記載がない限り、列挙する範囲に属する任意の整数値、および適宜、その分数（例として、ある整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されたい。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどの任意の物理的特性に関する、本明細書に列挙する任意の数の範囲は、別段の記載がない限り、列挙する範囲に属する任意の整数を含むと理解されたい。本明細書で使用する場合、「約（ａｂｏｕｔ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、別段の記載がない限り、表示する範囲、値または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用する場合、用語「ａ」および「ａｎ」は、列挙する構成成分のうちの「１つまたは複数」を指すと理解されるべきである。選択肢（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方、またはそれらの任意の組合せのうちのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」と「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」とは、同義語として使用する。さらに、本明細書に記載する構造および置換基の種々の組合せから得られる個々の化合物または化合物群は、それぞれの化合物または化合物群が、個々に記載されているのと同じ程度で本出願によって開示されると理解されるべきである。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本開示の範囲に属する。
【０００９】
本開示に従う「結合ドメイン」または「結合領域」は、例えば、生物学的分子（例えば、ＴＧＦβもしくはＩＬ６）、あるいは安定であっても一過性であっても、２つ以上の同じまたは異なる分子の複合体、または集合体もしくは凝集体（例えば、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体）を特異的に認識し、それに結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはペプチドであってよい。そのような生物学的分子として、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、アミノ酸、もしくはそれらの誘導体、脂質、脂肪酸、もしくはそれらの誘導体；炭水化物、糖類、もしくはそれらの誘導体；ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド核酸、核酸分子、もしくはそれらの誘導体；糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、リポタンパク質、プロテオリピド、もしくはそれらの誘導体；例えば、生物学的試料中に存在し得るその他の生物学的分子；またはそれらの任意の組合せが挙げられる。結合領域は、生物学的分子にかまたはその他の目的の標的に対しての、任意の天然に存在する、合成の、半合成の、または組換えにより産生された結合パートナーを含む。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ解析を含めて、特定の標的と特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための多様なアッセイが公知である。
【００１０】
本開示の結合ドメインおよびそれらの融合タンパク質が、標的分子に、例えば、約１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１または１０１３Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位で示す、特定の結合相互作用の平衡結合定数）で結合する場合、それらは、標的に、「特異的または選択的に結合する」ことを含めて、所望の程度で結合を可能にすることができ、一方、試験試料中に存在するその他の構成成分に顕著に結合することはない。「高い親和性の」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１以上のＫａを有する結合ドメインを指す。あるいは、親和性を、Ｍの単位で示す、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）と定義することもできる。本開示に従う結合ドメインのポリペプチドおよび融合タンパク質の親和性は、従来の技法を使用して容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９年）Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１巻：６６０頁；および米国特許第５，２８３，１７３号；第５，４６８，６１４号；Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）解析；または均等物を参照されたい）。
【００１１】
本開示の結合ドメインは、本明細書の記載に従ってまたは当技術分野で公知の多様な方法（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号；第６，２９１，１５８号を参照されたい）によって生成することができる。供給源として、ヒト、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダもしくはラマに由来する；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６頁、およびＮｇｕｙｅｎら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７５巻：４１３頁）、サメ（Ｒｏｕｘら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５巻：１１８０４頁）、魚（Ｎｇｕｙｅｎら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５４巻：３９頁）、げっ歯類、トリ、ヒツジを含めた、種々の種に由来する抗体の遺伝子配列（これらは、ファージライブラリーなどにおいて、抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖもしくはＦａｂとしてフォーマットすることができる）、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、またはフィブリノーゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０巻：１３８８頁を参照されたい）、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照されたい）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４を参照されたい）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照されたい）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙおよびＧｒｅａｄｙ（２００５年）ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２巻：６１７９頁）、ｍＡｂ２、もしくはＦｃａｂ（商標）（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００７／０９８９３４号；第ＷＯ２００６／０７２６２０号を参照されたい）などの代替の非抗体骨格のループ領域に工学的に作製される多様なアミノ酸をコードする配列などが挙げられる。さらに、好都合な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウス（商標）、ＫＭ−マウス（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において、ヒトＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体またはＨｙｐｅｒ−ＩＬ６（ペプチドリンカーによってＩＬ６ＲにつなげられたＩＬ６）などの合成単鎖ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体を免疫原として使用する、ハイブリドーマを開発するための伝統的な戦略を使用して、本開示の結合ドメインを開発することもできる。
【００１２】
抗体技術に関して当業者によって理解されている用語はそれぞれ、本明細書において明確に定義しない限り、当技術分野で与えられている意味を有する。例えば、用語「ＶＬ」および「ＶＨ」はそれぞれ、抗体の軽鎖および重鎖に由来する可変結合領域を指す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られている個別の明確に定義されたサブ領域から構成される。用語「ＣＬ」および「ＣＨ」はそれぞれ、「免疫グロブリン定常領域」、すなわち、抗体の軽鎖および重鎖に由来する定常領域を指し、後者の領域は、その領域が由来する抗体のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）に応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４の定常領域ドメインにさらに分割可能であると理解されている。定常領域ドメインの一部がＦｃ領域（「結晶化可能なフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）」領域）を構成し、この領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性）、ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞媒介型食作用）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）、および補体結合、Ｆｃ受容体に対する結合、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｆｃ領域を欠くポリペプチドと比べてより長い半減期、プロテインＡ結合性、ならびに正におそらく胎盤移行（Ｃａｐｏｎら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３３７巻：５２５頁を参照されたい）などの免疫グロブリンのエフェクター機能に関与するドメインを含有する。さらに、Ｆｃ領域を含有するポリペプチドは、ポリペプチドの二量体化または多量体化も可能にする。「ヒンジ領域」は、本明細書においては「リンカー」とも呼び、抗体の単鎖の可変結合領域と定常領域との間に挿入され、それらを接続するアミノ酸配列であり、これは、ヒンジの形態をとって、抗体、または抗体様分子に可動性をもたらすことが当技術分野では公知である。
【００１３】
抗原結合ドメインおよびエフェクター機能を付与するドメインは、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスの間で交換することができることから、免疫グロブリンのドメイン構造は工学的に作製しやすい。免疫グロブリンの構造および機能が、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年）に概説されている。広範な序論、および組換え抗体技術の全ての態様に関する詳細な情報を、教科書Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９９年）に見出すことができる。詳細な抗体工学の実験室プロトコールの包括的なコレクションを、Ｒ．  ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳ．  Ｄｕｅｂｅｌ編、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００年）に見出すことができる。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「誘導体」は、化合物の化学的または生物学的に改変した別形（ｖｅｒｓｉｏｎ）であって、親化合物に構造的に類似し、その親化合物から（実際または理論的に）誘導可能である別形を指す。一般に、親化合物は、「誘導体」を生成するための出発材料であり得、一方、「類似体」を生成するためには、親化合物を出発材料として必ずしも使用するとは限らない場合がある点で、「誘導体」は、「類似体」とは異なる。類似体は、親化合物とは異なる化学的または物理的な特性を示す場合がある。例えば、誘導体は、親化合物と比較して、より親水性である場合もあり、または変化した反応性を示す場合（例えば、標的に対する親和性を変化させるアミノ酸の変化を有するＣＤＲ）もある。
【００１５】
用語「生物学的試料」は、被験体または生物学的供給源に由来する血液試料、生検検体、組織外植片、器官培養物、生物学的液体、あるいは任意のその他の組織もしくは細胞またはその他の調製物を含む。被験体または生物学的供給源は、例えば、ヒトまたは非ヒト動物、初代細胞培養物、または染色体に組み込まれたもしくはエピソーム性の組換え核酸配列を含有し得る遺伝子操作された細胞系、体細胞ハイブリッド細胞系、不死化したもしくは不死化可能な細胞系、分化したもしくは分化可能な細胞系、形質転換細胞系などを含めた、培養馴化細胞系（ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｄａｐｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）であってよい。本開示のさらなる実施形態では、被験体または生物学的供給源は、悪性の疾患、障害もしくは状態またはＢ細胞の障害を含めた、疾患、障害または状態を有することが疑われる場合、あるいはそれらを有する危険性がある場合がある。特定の実施形態では、被験体または生物学的供給源は、過剰増殖疾患、炎症性疾患または自己免疫疾患を有する疑いがある場合、またはそれらを有する危険性がある場合があり、本開示の特定のその他の実施形態では、被験体または生物学的供給源は、そのような疾患、障害または状態のリスクも、そのような疾患、障害または状態の存在も有さないことが知られている場合がある。
【００１６】
特定の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβと、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体、ＩＬ１０、ＧＩＴＲ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、腫瘍壊死因子様の、アポトーシスの弱い誘導物質（ＴＷＥＡＫ；また、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１２、ＴＮＦＳＦ１２としても公知である）、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２などのＴＧＦβ以外の第２の標的との両方に結合する多重特異性融合タンパク質を提供することによって、異常なＧＦβ活性と関連がある細胞の枯渇または調節を可能にする。特定の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、第１および第２の結合ドメイン、第１および第２のリンカー、ならびに介在ドメインを含み、介在ドメインの一方の末端が、リンカーを介して、ＴＧＦβＲ２外部ドメイン（例えば、細胞外ドメイン）である第１の結合ドメインに融合し、そして他方の末端が、リンカーを介して、第２の結合ドメインに融合している。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβＲ２外部ドメイン全体の一部を利用する。具体的には、ＴＧＦβのアンタゴニストとして機能するかまたはリガンド結合性を付与する、外部ドメイン内部のドメインを利用する。
【００１７】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、ＩＬ６アンタゴニスト（例として、ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６／ＩＬ６Ｒａ複合体に対して特異性を示す免疫グロブリン可変領域）、ＩＬ１０アンタゴニスト（例として、ＩＬ１０に対して特異性を示す免疫グロブリン可変領域、ＩＬ１０Ｒ１外部ドメイン（例えば、配列番号７４５）またはＩＬ１０Ｒ１外部ドメインのサブドメイン）、ＧＩＴＲアゴニスト（例として、ＧＩＴＲに対して特異性を示す免疫グロブリン可変領域、ＧＩＴＲＬ外部ドメイン（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５０８３．２、配列番号７４６のアミノ酸７４〜１８１）またはＧＩＴＲＬ外部ドメインのサブドメイン）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例として、ＶＥＧＦに対して特異性を示す免疫グロブリン可変領域、ＶＥＧＦＲ２外部ドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２２４４．１、配列番号７４７を参照されたい）またはＶＥＧＦＲ２外部ドメインのサブドメイン）、ＴＮＦアンタゴニスト（例として、ＴＮＦに対して特異性を示す免疫グロブリン可変領域、ＴＮＦＲ１外部ドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０５６．１；配列番号７４９を参照されたい）、ＴＮＦＲ１外部ドメインのサブドメイン、ＴＮＦＲ２外部ドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０５７．１；配列番号７４８を参照されたい）またはＴＮＦＲ２外部ドメインのサブドメイン）、ＨＧＦアンタゴニスト（例として、ＨＧＦに対して特異性を示す免疫グロブリン可変領域、ｃ−Ｍｅｔ外部ドメインまたはｃ−Ｍｅｔ外部ドメインのサブドメイン（例えば、配列番号７５０〜７５２））、ＴＷＥＡＫアンタゴニスト（例として、ＴＷＥＡＫもしくはＴＷＥＡＫＲに対して特異性を示す免疫グロブリン結合ドメイン、またはＴＷＥＡＫＲ外部ドメイン（例えば、配列番号７６１）もしくはそのＴＷＥＡＫ結合断片）、それとも、ＩＧＦ１アンタゴニストあるいはＩＧＦ２アンタゴニスト（例として、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２に対して特異性を示す免疫グロブリン可変領域、ＩＧＦ１Ｒ外部ドメイン（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００８６６．１（配列番号７５３）のＩＧＦ１Ｒ外部ドメインまたはそのサブドメイン）、あるいはＩＧＦＢＰ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５８７．１（ＩＧＦＢＰ１；配列番号７５４）、ＮＰ＿０００５８８．２（ＩＧＦＢＰ２；配列番号７５５）、ＮＰ＿００１０１３４１６．１（ＩＧＦＢＰ３アイソフォームａ；配列番号７５６）、ＮＰ＿０００５８９．２（ＩＧＦＢＰ３アイソフォームｂ；配列番号７５７）、ＮＰ＿００１５４３．２（ＩＧＦＢＰ４；配列番号７５８）、ＮＰ＿０００５９０．１（ＩＧＦＢＰ５；配列番号７５９）もしくはＮＰ＿００２１６９．１（ＩＧＦＢＰ６；配列番号７６０）のＩＧＦＢＰ外部ドメイン）またはそのサブドメイン）である。
【００１８】
本明細書では、膜または可溶性のＩＬ６受容体（ＩＬ６Ｒα）とのＩＬ６の複合体を、膜ＩＬ６Ｒαまたは可溶性ＩＬ６Ｒα（ｓＩＬ６Ｒα）のいずれかとのＩＬ６の複合体を指す場合には、ＩＬ６ｘＲと呼び、ｓＩＬ６ＲαとのＩＬ６の複合体のみを指す場合には、ｓＩＬ６ｘＲと呼ぶ。いくつかの実施形態では、ＩＬ６ｘＲに対して特異性を示す結合ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質は、以下の特性のうちの１つまたは複数を示す：（１）ＩＬ６ｘＲ複合体に対して、ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒα単独に対してと比べて、同等以上の親和性を示すか、またはＩＬ６Ｒα単独またはＩＬ６ｘＲ複合体に対して、ＩＬ６単独に対してと比べて、より大きい親和性を示す；（２）ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について、膜ｇｐ１３０と競合するか、または可溶性ｇｐ１３０のｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合を増強する；（３）ＩＬ６のシス−シグナル伝達よりも、ＩＬ６のトランス−シグナル伝達を優先的に阻害する；および（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。
ＴＧＦβアンタゴニスト
上記で概要を述べたように、ＴＧＦβは、線維症、自己免疫および癌などのいくつかの疾患に関連付けられている。腫瘍の発生の早期においては、ＴＧＦβは、増殖阻害因子として作用する。しかし、腫瘍が発達するにつれて、ＴＧＦβの増殖阻害特性を逃れる機構を発達させ、その結果、腫瘍の侵襲性の増加、転移の可能性の増加、および周囲の免疫応答の阻害が生じる（Ｌｕｗｏｒら（２００８年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ６月１０日（電子出版））。本開示のＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦの腫瘍促進活性を阻害する。このアンタゴニストドメインは、ＴＧＦβの二量体化およびＴＧＦβ結合性を遮断する場合もあり、または、このドメインが、受容体系の構成成分に結合し、リガンド活性の阻害もしくは受容体複合体の集合の阻止のいずれかよって、活性を遮断する場合もある。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメイン（「外部ドメイン」）であってよい。特定の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、配列番号７４３、７４４に記載のＴＧＦβＲ２外部ドメインまたはそれらの任意の組合せを含む。
【００２０】
一態様では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはその融合タンパク質は、ＴＧＦβに対して特異性を示し、約１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍまたはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する親和性を示す。特定の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストまたはその融合タンパク質は、約３００ｐＭ未満の親和性でＴＧＦβに結合する。別の尺度、すなわち、本明細書ではｋＯＦＦとも呼ぶ速度論的解離（ｋｄ）が、複合体の解離速度、したがって、本開示のポリペプチド結合ドメインが結合している標的分子の「滞留時間」の尺度となる。ｋｄ（ｋＯＦＦ）は、１／秒の単位を有する。本開示の例示的なＴＧＦβアンタゴニストは、約１０−４／秒（例えば、約１日）〜約１０−８／秒またはそれ未満のｋＯＦＦを有することができる。特定の実施形態では、ｋＯＦＦは、約１０−１／秒、約１０−２／秒、約１０−３／秒、約１０−４／秒、約１０−５／秒、約１０−６／秒、約１０−７／秒、約１０−８／秒、約１０−９／秒または約１０−１０／秒以下の範囲に及ぶことができる（Ｇｒａｆｆら（２００４年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  １７巻：２９３頁を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはその融合タンパク質は、ＴＧＦβに結合する同族のＴＧＦβ受容体と比較して、ＴＧＦβに、より高い親和性で結合し、より低いｋＯＦＦ速度を有する。さらなる実施形態では、ＴＧＦβの二量体化またはその他の細胞表面活性を遮断するかまたは変化させる本開示のＴＧＦβアンタゴニストまたはその融合タンパク質は、同族のＴＧＦβ受容体の親和性および二量体化速度と比較して、より中等度の親和性（すなわち、約１０−８Ｍ〜約１０−９ＭのＫｄ）、およびより中等度のｏｆｆ速度（すなわち、約１０−４／秒付近のｋＯＦＦ）を有する場合がある。
【００２１】
本開示の、ＴＧＦβアンタゴニストとして機能する例示的な結合ドメインを、本明細書の記載に従ってまたは当技術分野で公知の多様な方法（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号、第６，２９１，１５８号を参照されたい）によって生成することができる。供給源として、ヒト、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダもしくはラマに由来する；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６頁、およびＮｇｕｙｅｎら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７５巻：４１３頁）、サメ（Ｒｏｕｘら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５巻：１１８０４頁）、魚（Ｎｇｕｙｅｎら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５４巻：３９頁）、げっ歯類、トリ、ヒツジを含めた、種々の種に由来する抗体の遺伝子配列（これらは、ファージライブラリーなどにおいて、ｓｃＦｖもしくはＦａｂとしてフォーマットすることができる）、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、またはフィブリノーゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０巻：１３８８頁を参照されたい）、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照されたい）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４を参照されたい）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照されたい）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙおよびＧｒｅａｄｙ（２００５年）ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２巻：６１７９頁）などの代替の非抗体骨格のループ領域中に工学的に作製される多様なアミノ酸をコードする配列などが挙げられる。さらに、好都合な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウス（商標）、ＫＭ−マウス（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において、合成ＴＧＦβまたは単鎖のＴＧＦβＲ２外部ドメインを免疫原として使用する、ハイブリドーマを開発するための伝統的な戦略を使用して、本開示の結合ドメインを開発することもできる。
【００２２】
例示的な例では、断片のＦａｂファージライブラリー（例えば、Ｈｏｅｔら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３巻：３４４頁を参照されたい）を使用して、（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００６５１．３に記載のアミノ酸配列もしくはその断片を使用した）合成もしくは組換えのＴＧＦβに対する結合についてスクリーニングすることによって、ＴＧＦβに対して特異性を示す、本開示のＴＧＦβアンタゴニストを同定することができる。本明細書に記載するまたは当技術分野で公知のＴＧＦβを、そのようなスクリーニングのために使用することができる。特定の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストを生成するために使用するＴＧＦβは、本明細書に記載するように、介在ドメインまたは二量体化ドメイン、例として、免疫グロブリンＦｃドメインまたはその断片をさらに含むことができる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストドメインは、本明細書に記載するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ヒト化またはヒトである。さらなる実施形態では、１つもしくは複数の軽鎖可変領域（ＶＬ）または１つもしくは複数の重鎖可変領域（ＶＨ）または両方のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または少なくとも１００％同一である配列を有し、各ＣＤｒが、本明細書に示す通り、最大３つのアミノ酸の変化を有する（すなわち、変化のうちの多くがフレームワーク（複数可）領域中にある）本開示のＴＧＦβアンタゴニストドメインを提供する。
【００２４】
さらなる実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストドメインは、本明細書に記載するＶＨドメインとＶＬドメインとを含み、これらは、そのようなＶＨドメイン、ＶＬドメインまたは両方のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一であり、各ＣＤｒが多くて最大３つのアミノ酸の変化を有する（すなわち、変化のうちの多くがフレームワーク領域（複数可）中にある）。
【００２５】
２つ以上のポリペプチドまたは核酸分子の配列の文脈においては、用語「同一の」または「パーセント同一性」は、手作業による整列によるか、または目視検査による、配列比較アルゴリズムなどの当技術分野で公知の方法を使用して測定して、比較ウィンドウまたは指定領域にわたる最大の一致について比較および整列を行う場合に、同じである２つ以上の配列もしくはサブ配列、または特定の領域にわたり、同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセントを有する（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である）２つ以上の配列もしくはサブ配列を意味する。例えば、パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適した好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９頁、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３頁に記載されている。
【００２６】
これらまたは本明細書に記載するその他の実施形態のうちのいずれにおいても、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、いずれの配向にも配置することができ、本明細書に開示する約５個〜約３０個のアミノ酸のリンカーまたはこれら２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能をもたらすことができる任意のその他のアミノ酸配列によって分離することができる。特定の実施形態では、ＶＨドメインとＶＬドメインとをつなぐリンカーは、配列番号４９７〜６０４および１２２３〜１２２８に記載のアミノ酸配列、例として、リンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）を含む。多重特異性結合ドメインは、ラクダ抗体の構成に類似する少なくとも２つの特異的なサブ結合ドメイン、またはより従来型の哺乳動物抗体の対形成するＶＨ鎖およびＶＬ鎖の構成に類似する少なくとも４つの特異的なサブ結合ドメインを有する。
【００２７】
さらなる実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストドメインおよびそれらの融合タンパク質は、１つもしくは複数の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）または１つもしくは複数のそのようなＣＤＲの複数コピーを含む結合ドメインを含むことができ、これらのＣＤＲは、抗ＴＧＦβもしくは抗ＴＧＦβＲ２のｓｃＦｖ断片もしくはＦａｂ断片の可変領域からか、またはその重鎖もしくは軽鎖の可変領域から、入手、誘導または設計されている。
【００２８】
当技術分野において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＡｂＭによる定義、および接触による定義（ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）を含めた、当技術分野における種々の方法によって定義されている。Ｋａｂａｔの定義は、配列の変動性に基づいており、ＣＤＲ領域を予測するために最も一般的に使用されている定義である（Ｊｏｈｎｓｏｎら（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８巻：２１４頁）。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づいている（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６巻：９０１頁；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２巻：８７７頁）。ＡｂＭによる定義は、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義との間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ製の抗体構造のモデル化についてのプログラムの一体形の組（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｓｕｉｔｅ）である（Ｍａｒｔｉｎら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６巻：９２６８頁；Ｒｅｅｓら、ＡＢＭＴＭ、ａ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  Ｌｔｄ．）。接触による定義として公知の追加の定義は、最近になって導入されたものであり（ＭａｃＣａｌｌｕｍら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：７３２頁を参照されたい）、これは、入手可能な複合体の結晶構造の解析に基づいている。
【００２９】
慣例により、重鎖のＣＤＲドメインを、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３と呼び、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かう順に順次に番号が付けられている。ＣＤＲ−Ｈ１は、約１０〜１２残基の長さであり、Ｃｈｏｔｈｉａの定義およびＡｂＭによる定義に従えば、Ｃｙｓの後の４残基目から始まるか、またはＫａｂａｔの定義に従えば、５残基後から始まる。Ｈ１には、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ−Ｖａｌ、Ｔｒｐ−ＩｌｅまたはＴｒｐ−Ａｌａが続くことができる。Ｈ１の長さは、ＡｂＭによる定義に従えば、およそ１０〜１２残基であり、一方、Ｃｈｏｔｈｉａの定義では、最後の４残基が除外される。ＣＤＲ−Ｈ２は、Ｋａｂａｔの定義およびＡｂＭによる定義に従えば、Ｈ１の末端の後の１５残基目から始まり、これには、一般に配列Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（しかし、いくつかの変動が公知である）が先行し、一般に配列Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが続く。Ｋａｂａｔの定義に従えば、Ｈ２の長さは約１６〜１９残基であり、一方、ＡｂＭによる定義では、この長さは９〜１２残基であることが予測されている。ＣＤＲ−Ｈ３は通常、Ｈ２の末端の後の３３残基目から始まり、これには、一般に、アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇが先行し、アミノ酸Ｇｌｙが続き、ＣＤＲ−Ｈ３は、３〜約２５残基の範囲に及ぶ長さを有する。
【００３０】
慣例により、軽鎖のＣＤＲ領域を、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３と呼び、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かう順に順次に番号が付けられている。ＣＤＲ−Ｌ１は一般に、残基２４あたりから始まり、一般にＣｙｓに続く。ＣＤＲ−Ｌ１の後の残基は常にＴｒｐであり、これから、以下の配列のうちの１つが始まる：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、またはＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ。ＣＤＲ−Ｌ１の長さは、およそ１０〜１７残基である。ＣＤＲ−Ｌ２は、Ｌ１の末端の後の１６残基目あたりから始まり、一般に、残基Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−ＬｙｓまたはＩｌｅ−Ｐｈｅに続く。ＣＤＲ−Ｌ２は、約７残基の長さである。ＣＤＲ−Ｌ３は通常、Ｌ２の末端の後の３３残基目から始まり、一般にＣｙｓに続き、ＣＤＲ−Ｌ３には一般に配列Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙが続き、ＣＤＲ−Ｌ３は、約７〜１１残基の長さを有する。本開示の結合ドメインは、抗ＴＧＦβもしくは抗ＴＧＦβＲ２の可変領域に由来する単一のＣＤＲを含んでもよく、または同じであるかもしくは異なる場合がある複数のＣＤＲを含んでもよい。
【００３１】
したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＴＧＦβまたは抗ＴＧＦβＲ２の可変領域に由来する単一のＣＤＲを含んでもよく、または同じであるかもしくは異なる場合がある複数のＣＤＲを含んでもよい。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含むＴＧＦβまたはＴＧＦβＲ２に対して特異性を示すＶＨドメインとＶＬドメインとを含み、（ａ）ＶＨドメインは、重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｂ）ＶＬドメインは、軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｃ）結合ドメインは、（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列とを含むか；もしくは結合ドメインは、（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列とを含み、ＶＨおよびＶＬは同じ参照配列に見出される。さらなる実施形態では、本開示の結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含むＴＧＦβまたはＴＧＦβＲ２に対して特異性を示すＶＨドメインとＶＬドメインとを含み、（ａ）ＶＨドメインは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｂ）ＶＬドメインは、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｃ）結合ドメインは、（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列とを含むか；もしくは結合ドメインは、（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列とを含み、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は同じ参照配列に由来する。
【００３２】
特異的なＣＤＲを含む、本明細書に記載する実施形態のうちのいずれにおいても、結合ドメインは、（ｉ）ＶＨドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり、各ＣＤＲが多くて３つのアミノ酸の変化を有する（すなわち、変化のうちの多くがフレームワーク領域にある）アミノ酸配列を有するＶＨドメイン；または（ｉｉ）ＶＬドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり、各ＣＤＲが多くて３つのアミノ酸の変化を有する（すなわち、変化のうちの多くがフレームワーク領域にある）アミノ酸配列を有するＶＬドメイン；または（ｉｉｉ）（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方；もしくはＶＨおよびＶＬが同じ参照配列に由来する、（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方を含むことができる。
【００３３】
本開示の融合タンパク質のＴＧＦβアンタゴニストドメインは、免疫グロブリン骨格などの免疫グロブリン様ドメインであってよい。本開示が意図する免疫グロブリン骨格として、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体または重鎖のみの抗体が挙げられる。ｓｃＦｖの場合、本開示は、結合性分子中のドメインまたは領域の被連結部分に適合することが当技術分野で公知である任意のリンカーペプチドによって、重鎖および軽鎖の可変領域がつながっていることを意図する。例示的なリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーモチーフに基づくリンカー、例として、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ［式中、ｎ＝１〜５］である。本開示の融合タンパク質の結合ドメインが、非ヒト免疫グロブリンに基づくか、または非ヒトＣＤＲを含む場合、結合ドメインは、当技術分野で公知の方法に従って「ヒト化」することができる。
【００３４】
あるいは、本開示の融合タンパク質のＴＧＦβアンタゴニストドメインは、免疫グロブリン骨格以外の骨格であってもよい。本開示が意図するその他の骨格として、機能性の立体構造をとるＴＧＦβ特異的ＣＤＲ（複数可）を提示する。その他の意図する骨格として、これらに限定されないが、Ａドメイン分子、フィブロネクチンＩＩＩドメイン、アンチカリン、アンキリンリピートから工学的に作製された結合性分子、アドネクチン、クニッツドメイン、またはプロテインＡのＺドメインのＡｆｆｉｂｏｄｙが挙げられる。
ＩＬ６アンタゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＩＬ６アンタゴニストである（例えば、優先的に、ＩＬ６トランス−シグナル伝達を阻害するか、またはＩＬ６シス−およびトランス−シグナル伝達の両方を阻害する）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、本開示は、以下の特性の１つまたは複数を有するＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に対して特異的な結合領域または結合ドメインを含有する、多重特異性融合タンパク質を提供する：（１）ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒα単独と比較してＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に同等以上の親和性、またはＩＬ６単独と比較してＩＬ６Ｒα単独もしくはＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に対してより大きな親和性を有する、（２）ｓＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体との結合について膜ｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体への可溶性ｇｐ１３０の結合を増強する、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する、あるいは（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。特定の好ましい実施形態では、本開示によるＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に対して特異的な結合ドメインは、以下の特性を有する：（１）ＩＬ６単独と比較してＩＬ６Ｒα単独またはＩＬ６ｘＲ複合体とのより大きな親和性、（２）ｓＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体への可溶性ｇｐ１３０の結合性を増強する、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する、および（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。例えば、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に特異的な結合領域または結合ドメインは、免疫グロブリンの可変結合ドメインまたはその誘導体、例えば抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどであることができる。この開示との関連で、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に特異的な結合領域または結合ドメインは、本明細書に記載のｇｐ１３０でないことを理解すべきである。
【００３５】
本明細書で用いるように、「ＩＬ６ｘＲ複合体」または「ＩＬ６ｘＲ」は、ＩＬ６受容体とのＩＬ６の複合体を指し、そこにおいて、ＩＬ６受容体（例えばＩＬ６Ｒα、ＩＬ６ＲＡ、ＩＬ６Ｒ１およびＣＤ１２６としても公知である）は膜タンパク質（本明細書でｍＩＬ６ＲまたはｍＩＬ６Ｒαと称する）または可溶性の形態（本明細書でｓＩＬ６ＲまたはｓＩＬ６Ｒαと称する）である。用語「ＩＬ６Ｒ」は、ｍＩＬ６ＲαおよびｓＩＬ６Ｒαの両方を包含する。一実施形態では、ＩＬ６ｘＲは、ＩＬ６およびｍＩＬ６Ｒαの複合体を含む。特定の実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体は、１つまたは複数の共有結合を通して一緒に保持される。例えば、ＩＬ６Ｒのカルボキシ末端は、当技術分野でハイパーＩＬ６として公知である、ペプチドリンカーを通してＩＬ６のアミノ末端に融合させることができる（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら（１９９７年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５巻：１４２頁を参照されたい）。ハイパーＩＬ６リンカーは、架橋化合物、１〜５０個のアミノ酸配列、またはその組合せで構成することができる。ハイパーＩＬ６は、二量体化ドメイン、例えば免疫グロブリンＦｃドメインもしくは免疫グロブリン定常ドメインサブ領域をさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体は、非共有結合的相互作用を通して、例えば水素結合、静電的相互作用、ファンデルワールス力、塩橋、疎水性相互作用など、またはそれらの任意の組合せによって一緒に保持される。例えば、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒは、非共有結合で自然に結合することができ（例えば、天然に見られるように、または合成もしくは組換えタンパク質として）、または各々は、複合体の安定性をさらに高めるために、免疫グロブリンＦｃドメインなどの多量体化を促進するドメインに融合させることができる。
【００３６】
本明細書で用いるように、「ｇｐ１３０」は、ＩＬ６ｘＲ複合体に結合するシグナル伝達タンパク質を指す。ｇｐ１３０タンパク質は、膜形態（ｍｇｐ１３０）、可溶性形態（ｓｇｐ１３０）またはそれらの任意の他の機能的形態であることができる。例示的なｇｐ１３０タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１７５．２に記載の配列またはその任意の可溶性もしくは誘導体の形態を有する（例えば、Ｎａｒａｚａｋｉら（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ  ８２巻：１１２０頁またはＤｉａｍａｎｔら（１９９７年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１２巻：３７９頁を参照されたい）。例示のために、そして理論によって縛られることを望まないが、ｍｇｐ１３０タンパク質は、ＩＬ６／ｍＩＬＲまたはＩＬ６／ｓＩＬＲ複合体に結合することができるが、ｓｇｐ１３０は主にＩＬ６／ｓＩＬＲ複合体に結合する（Ｓｃｈｅｌｌｅｒら（２００６年）Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６３巻：３２１頁を参照されたい）。したがって、本開示の結合ドメイン、またはその融合タンパク質の特定の実施形態は、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかよりも高い親和性でＩＬ６ｘＲに結合することによって、および好ましくはｓＩＬ６ｘＲ複合体がｍｇｐ１３０に結合するのと競合することによって、ＩＬ６ｘＲ複合体トランス−シグナル伝達を阻害することができる。本開示の結合ドメインは、（１）結合ドメインまたはその融合タンパク質が、ｓＩＬ６ｘＲへのｇｐ１３０の結合を阻止し、そして結合ドメインが、ｓＩＬ６ｘＲとのｇｐ１３０の結合と比較して同等以上の親和性でｓＩＬ６ｘＲに結合するか、あるいは（２）結合ドメインまたはその融合タンパク質がｓＩＬ６ｘＲへのｓｇｐ１３０の結合を強化または促進する場合に、ｇｐ１３０がｓＩＬ６ｘＲへ結合するのと「競合する」。
【００３７】
一態様では、本開示のＩＬ６アンタゴニストは、ＩＬ６Ｒα単独よりも少なくとも２倍〜１０００倍高いＩＬ６またはＩＬ６ｘＲ複合体との親和性を有するか、あるいはＩＬ６単独よりも少なくとも２倍〜１０００倍高いＩＬ６ＲαまたはＩＬ６ｘＲ複合体との親和性を有する。ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲ複合体に結合することによって、本開示のＩＬ６アンタゴニストは、ＩＬ６シス−およびトランス−シグナル伝達を優先的に阻害する。特定の実施形態では、ＩＬ６またはｓＩＬ６ｘＲ複合体に対する結合ドメインの親和性は、ＩＬ６ｘＲ複合体に対するｇｐ１３０の親和性とほぼ同じであり、ここで「ほぼ同じ」は、同等のまたは最大約２倍まで高い親和性を意味する。特定の実施形態では、ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲ複合体に対する結合ドメインの親和性は、ＩＬ６ｘＲ複合体に対するｇｐ１３０の親和性より少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、１０００倍またはそれを超えて高い。例えば、ＩＬ６ｘＲ複合体に対するｇｐ１３０の親和性が約２ｎＭ（例えば、Ｇａｉｌｌａｒｄら（１９９９年）Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．  １０巻：３３７頁を参照されたい）である場合、ＩＬ６ｘＲ複合体に対して少なくとも１０倍高い親和性を有する結合ドメインは約０．２ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有するであろう。
【００３８】
さらなる実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、（ａ）ｓＩＬ６ｘＲ複合体に、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかより少なくとも２倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍〜１００倍、１００倍〜１０００倍高い親和性で結合し、そして（ｂ）ｓＩＬ６ｘＲ複合体への結合について膜ｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体への可溶性ｇｐ１３０の結合を増強する、ポリペプチド配列を含む。さらなる実施形態では、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかより少なくとも２倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍〜１００倍、１００倍〜１０００倍高い親和性で結合する本開示のポリペプチド結合ドメインは、（ｉ）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達をより顕著にまたは優先的に阻害すること、（ｉｉ）ＩＬ６以外のｇｐ１３０サイトカインファミリーメンバーのシグナル伝達を阻害しないこと、（ｉｉｉ）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害し、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を検出可能的に阻害しないこともでき、（ｉｖ）これらの特性の２つ以上を有することができ、または（ｖ）これらの特性の全てを有することができる。
【００３９】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に対して、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかより少なくとも２倍〜１０００倍高い親和性で結合し、ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達をより顕著にまたは優先的に阻害する。「ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する」ことは、ｓＩＬ６ｘＲ活性は測定可能に低減するが、ＩＬ６シス−シグナル伝達の減少は実質的に変更されない程度にトランス−シグナル伝達を変化させることを指す（すなわち、阻害が最小限であるか、存在しないかまたは測定不能であることを意味する）。例えば、ｓＩＬ６ｘＲ活性（例えば、ＨｅｐＧ２細胞でのアンチキモトリプシン（ＡＣＴ）の急性相発現）のバイオマーカーを測定して、トランス−シグナル伝達阻害を検出することができる。代表的なアッセイは、Ｊｏｓｔｏｃｋら（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００１年）によって記載されている。簡潔には、ＨｅｐＧ２細胞を、ｓＩＬ６ｘＲ（トランス−シグナル伝達）またはＩＬ６（シス−シグナル伝達）の存在下で刺激してＡＣＴを過剰発現させることができるが、ｓｐｇ１３０を加えることは、ＩＬ６によって誘導される発現に実質的に影響せずに、ｓＩＬ６ｘＲによって誘導されるＡＣＴの過剰発現を阻害する。同様に、ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する本開示のポリペプチド結合ドメインは、ｓＩＬ６ｘＲによって誘導されるＡＣＴの過剰発現を阻害する（すなわち、トランス−シグナル伝達を阻害する）が、ＩＬ６によって誘導される発現に実質的に影響しない（すなわち、シス−シグナル伝達を測定可能に減少させない）。このアッセイおよび当技術分野で公知である他のアッセイを用いて、ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達の優先的阻害を測定することができる（例えば、Ｓｐｏｒｒｉら（１９９９年）Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１巻：１０５３頁、Ｍｉｈａｒａら（１９９５年）Ｂｒ．  Ｊ．  Ｒｈｅｕｍ．  ３４巻：３２１頁、Ｃｈｅｎら（２００４年）Ｉｍｍｕｎ．  ２０巻：５９頁に記載の他のバイオマーカーを参照されたい）。
【００４０】
さらなる実施形態では、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインによるシグナル伝達は、本開示の結合ドメインポリペプチドまたはその多重特異性融合タンパク質によって実質的に阻害されない。例えば、ｇｐ１３０を経るＩＬ６ｘＲ複合体によるシス−およびトランス−シグナル伝達は阻害されるが、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、線毛神経向性因子（ＣＮＴＦ）、神経ポイエチン（ＮＰＮ）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＩＬ−１１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）またはそれらの任意の組合せを経るシグナル伝達など、１つまたは複数の他のｇｐ１３０ファミリーサイトカインによるシグナル伝達は、最小限に影響されるかまたは影響を受けない。
【００４１】
本開示の結合ドメインの好ましいｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、数日間または数週間のオーダーであるが、ＩＬ６およびｓＩＬ６の両方の生成は疾患状態で非常に上昇することがあるので、結合ドメイン濃度は低くてもよいが、標的は豊富であることができることを、当業者は理解しよう（例えば、Ｌｕら（１９９３年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ５巻：５７８頁を参照されたい）。したがって、特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、約１０−５／秒（例えば、約１日）以下のｋＯＦＦを有する。特定の実施形態では、ｋＯＦＦは、約１０−１／秒から、約１０−２／秒、約１０−３／秒、約１０−４／秒、約１０−５／秒、約１０−６／秒、約１０−７／秒、約１０−８／秒、約１０−９／秒、約１０−１０／秒、またはそれ未満の範囲であってもよい。
【００４２】
例示的な実施例では、ＩＬ６またはＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な本開示の結合ドメインは、合成ＩＬ６ｘＲ複合体への結合についてスクリーニングすることによってＦａｂファージの断片ライブラリーで同定された（Ｈｏｅｔら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３巻：３４４頁を参照されたい）。このスクリーニングのために用いられる合成ＩＬ６ｘＲ複合体は、Ｎ−ＩＬ６Ｒα（ｆｒａｇ）−Ｌ１−ＩＬ６（ｆｒａｇ）−Ｌ２−ＩＤ−Ｃの構造を含み、式中、Ｎはアミノ末端であり、Ｃはカルボキシ末端であり、ＩＬ６Ｒα（ｆｒａｇ）は完全長ＩＬ６Ｒαの断片であり、ＩＬ６（ｆｒａｇ）はＩＬ６の断片であり、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、ＩＤは免疫グロブリンＦｃドメインなどの介在ドメインまたは二量体化ドメインである。
【００４３】
より具体的には、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインを同定するために用いられるＩＬ６ｘＲ（ハイパーＩＬ６の形態）は、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の通りの構造を有する：（ａ）完全長タンパク質の最初の１１０個のアミノ酸および、カルボキシ末端部分（用いるアイソフォームに依存する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５５６．１、アイソフォーム１またはＮＰ＿８５２００４．１、アイソフォーム２を参照されたい））を欠くＩＬ６Ｒαからの２１２個のアミノ酸の中央断片を、（２）Ｇ３Ｓのリンカーに融合し、次にそれを、（３）ＩＬ６の１７５個のアミノ酸のカルボキシ末端断片（すなわち、完全長タンパク質ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５９１．１の最初の２７個のアミノ酸を欠く）に融合し、次にそれを、（４）配列番号５８９に記載のＩｇＧ２Ａヒンジであるリンカーに融合し、それを最後に、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃドメインからなる二量体化ドメインに融合する。特定の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインからなる二量体化ドメインは、以下のアミノ酸の１つまたは複数が変異している（すなわち、その位置に異なるアミノ酸を有する）：位置２３４のロイシン（Ｌ２３４）、位置２３５のロイシン（Ｌ２３５）、位置２３７のグリシン（Ｇ２３７）、位置３１８のグルタミン酸（Ｅ３１８）、位置３２０のリシン（Ｋ３２０）、位置３２２のリシン（Ｋ３２２）、またはそれらの任意の組合せ（ＥＵ番号付け）。例えば、これらのアミノ酸のいずれか１つを、アラニンに変換することができる。さらなる実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２（Ｋａｂａｔ番号付けによる）の各々がアラニンに変異している（すなわち、それぞれＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ）。
【００４４】
一実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインを同定するために用いられるＩＬ６ｘＲ複合体は、配列番号６０６に記載のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインを含むポリペプチドであって、ＩＬ６ｘＲがｓＩＬ６ｘＲであり、配列番号６０６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが提供される。さらなる実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインを含むポリペプチドは、（１）ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒα単独に対する親和性と比較してＩＬ６ｘＲ複合体に対して同等以上の親和性を有する、またはＩＬ６単独に対する親和性と比較してＩＬ６Ｒα単独もしくはＩＬ６ｘＲ複合体に対してより大きな親和性を有するか、（２）ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について膜ｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体への可溶性ｇｐ１３０の結合を増強するか、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害するか、あるいは、（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しないか、（５）特性（１）〜（４）のうちの任意の組合せを有するか、あるいは（６）（１）〜（４）の特性の全てを有する。本開示の結合ドメインを同定するために用いることができるか、または前記結合特性のいずれかを測定するための参照複合体として用いることができる他の例示的なＩＬ６ｘＲ複合体が、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１７２４５８号、第２００７／００３１３７６号、および米国特許第７，１９８，７８１号、第５，９１９，７６３号に記載されている。
【００４５】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、本明細書に記載のＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲ複合体、好ましくはヒトＩＬ６、ヒトＩＬ６ＲまたはヒトＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）のもの、ヒト化されたものまたはヒトのものである。ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲに特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例を、それぞれ配列番号４３５〜４９６および３７３〜４３４に記載する。さらなる実施形態では、ＩＬ６ｘＲに特異的なポリペプチド結合ドメインが提供され、そこにおいて、それぞれ配列番号３７３〜４３４および４３５〜４９６に記載のように、結合ドメインは、１つまたは複数の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に、または１つまたは複数の重鎖可変領域（ＶＨ）に、またはその両方に、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、各ＣＤＲは、最大で３つのアミノ酸変化を有する（すなわち、変化の多くは１つまたは複数のフレームワーク領域内に見られる）。
【００４６】
さらなる実施形態では、本開示の結合ドメインは、それぞれ配列番号４３５〜４９６および３７３〜４３４に記載の、ＩＬ６ｘＲに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含み、それらは、そのようなＶＨドメイン、ＶＬドメイン、または両方のアミノ酸配列に少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、各ＣＤＲは、０、１、２または３個のアミノ酸変化を有する。例えば、本開示のＶＨドメイン、ＶＬドメインまたは両方のアミノ酸配列は、結合ドメインＴＲＵ６−１００２（配列番号６０８を参照されたい）を含む例示的なｘｃｅｐｔｏｒ分子からの、それぞれＶＨドメイン（例えば、アミノ酸５１２〜６３６）、ＶＬドメイン（例えば、アミノ酸６５２〜７５９）、または両方のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であることができ、そこにおいて、各ＣＤＲは、０、１、２または３個のアミノ酸変化を有する。
【００４７】
本明細書に記載のこれらのまたは他の実施形態のいずれかでは、ＶＬおよびＶＨドメインは、いずれの向きにも配置することができ、本明細書に開示される最大で約１０個のアミノ酸リンカーで、または２個のサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供することができる他の任意のアミノ酸配列で分離されてもよい。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインを結合するリンカーは、リンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）のように、配列番号４９７〜６０４および配列番号１２２３〜１２２８に記載のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
さらなる実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、抗ＩＬ６、抗ＩＬ６Ｒまたは抗ＩＬ６ｘＲ複合体のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から得られたか、誘導されたかまたは設計された、１つまたは複数の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、または１つまたは複数のそのようなＣＤＲの複数のコピーを含むことができる。したがって、本開示の結合ドメインは、ＩＬ６または抗ＩＬ６ｘＲの可変領域からの単一のＣＤＲを含むことができ、またはそれは、同じであってもまたは異なってもよい複数のＣＤＲを含むことができる。特定の実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むＶＨおよびＶＬドメインを含み、そこにおいて、（ａ）ＶＨドメインは、配列番号４３５〜４９６のいずれか１つで見られる重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｂ）ＶＬドメインは、配列番号３７３〜４３４のいずれか１つで見られる軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｃ）結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、または結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、そこにおいて、ＶＨおよびＶＬは同じ参照配列中に見られる。さらなる実施形態では、本開示の結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含み、そこにおいて、（ａ）ＶＨドメインは、配列番号４３５〜４９６のいずれか１つで見られる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｂ）ＶＬドメインは、配列番号３７３〜４３４のいずれか１つで見られる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｃ）結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、または結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、そこにおいて、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は同じ参照配列に由来する。ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲ複合体に対する例示的な軽鎖および重鎖可変ドメインのＣＤＲを、それぞれ配列番号１〜１８６および１１８７〜１１９２、ならびに１８７〜３７２および１１９３〜１１９８で提供する。
【００４９】
ＩＬ６アンタゴニスト軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３７３〜４３４および１１９９〜１２０４で提供し、それぞれ対応する重鎖可変領域を配列番号４３５〜４９６および１２０５〜１２１０で提供する。
【００５０】
ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲに対する特異的ＣＤＲを含む本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、結合ドメインは、（ｉ）配列番号４３５〜４９６のいずれか１つで見られるＶＨドメインのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、または（ｉｉ）配列番号３７３〜４３４のいずれか１つで見られるＶＬドメインのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、または（ｉｉｉ）（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方、またはＶＨおよびＶＬが同じ参照配列に由来する、（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方を含むことができる。
【００５１】
特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、免疫グロブリン骨格などの免疫グロブリン様ドメインであってもよい。本開示で意図される免疫グロブリン骨格には、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ドメイン抗体または重鎖のみの抗体が含まれる。さらなる実施形態では、抗ＩＬ６もしくは抗ＩＬ６ｘＲ抗体（例えば、マウスまたはラットなどのヒト以外、キメラ、ヒト化、ヒトの抗体）、またはそれぞれ配列番号４３５〜４９６、ならびに３７３〜４３４のいずれか１つに記載のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＦａｂ断片もしくはｓｃＦｖ断片が提供され、それらは以下の特性の１つまたは複数を有することもできる：（１）ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒα単独に対する親和性と比較してＩＬ６ｘＲ複合体に対して同等以上の親和性、またはＩＬ６単独に対する親和性と比較してＩＬ６Ｒα単独もしくはＩＬ６ｘＲ複合体に対してより大きな親和性を有するか、（２）ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について膜ｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体への可溶性ｇｐ１３０の結合を増強するか、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害するか、あるいは（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。そのような抗体、ＦａｂまたはｓｃＦｖは、本明細書に記載の方法のいずれかで用いることができる。特定の実施形態では、本開示は、ＩＬ６アンタゴニスト（すなわち、ＩＬ６シス−およびトランス−シグナル伝達を阻害することができる）である結合ドメインを含むポリペプチドを提供する。さらなる実施形態では、本開示によるＩＬ６アンタゴニストは、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。例示的なＩＬ６アンタゴニストには、ＩＬ６またはＩＬ６ｘＲに特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインまたはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）が含まれる。
【００５２】
あるいは、本開示の結合ドメインは、免疫グロブリン以外の骨格の一部であってもよい。意図される他の骨格には、Ａドメイン分子、フィブロネクチンＩＩＩドメイン、アンチカリン、アンキリンリピートを工学的に作製された結合分子、アドネクチン、クニッツドメインまたはプロテインＡのＺドメインアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）が含まれる。
ＩＬ１０アンタゴニスト
特定の実施形態では、本開示は、ＩＬ１０アンタゴニストである（すなわち、ＩＬ１０シグナル伝達を阻害することができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＩＬ１０アンタゴニストには、ＩＬ１０またはＩＬ１０Ｒ１に特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＩＬ１０Ｒ１外部ドメインが含まれる。
【００５３】
ＩＬ１０は、アルファ−らせん構造を共有するサイトカインスーパーファミリーのメンバーである。実験的証拠は存在しないが、全てが６つのアルファ−らせんを有することが示唆されている（Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ，  Ｈ．ら、２００２年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３巻：８９頁）。ＩＬ１０は４つのシステインを有し、その内１つだけがファミリーメンバーの間で保存されている。ＩＬ１０はその二量体化に寄与するＶ字形の折たたみを証明しているので、この構造にジスルフィド結合は重要でないようである。ＩＬ１０へのファミリーメンバーのアミノ酸同一性は、２０％（ＩＬ−１９）〜２８％（ＩＬ−２０）の範囲である（Ｄｕｍｏｕｔｅｒら、２００２年、Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．  １３巻：５頁）。
【００５４】
ＩＬ１０は、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−αおよびＧＭ−ＣＳＦサイトカイン生成を阻害した、マウスにおけるＴｈ２サイトカインとして最初に記載された（Ｍｏｏｒｅら、２００１年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９巻：６８３頁、Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏら、１９８９年、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７０巻：２０８１頁）。
【００５５】
ヒトＩＬ１０は、長さが１７８アミノ酸であり、１８アミノ酸のシグナル配列および１６０アミノ酸の成熟セグメント、および約１８ｋＤａ（モノマー）の分子量を有する。ヒトＩＬ１０は可能性のあるＮ連結グリコシル化部位を含まず、グリコシル化されていない（Ｄｕｍｏｕｔｅｒら、２００２年、Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．  １３巻：５頁、Ｖｉｅｉｒａら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻：１１７２頁）。それは、２つの鎖内ジスルフィド結合を形成する４つのシステイン残基を含む。ヒトＩＬ１０のαらせんＡ〜Ｆの長さは、それぞれ、２１、８、１９、２０、１２および２３アミノ酸である。１つのモノマーのらせんＡ〜Ｄは、第２のモノマーのらせんＥおよびＦと非共有結合的に相互作用して、非共有結合性のＶ字形ホモダイマーを形成する。機能的領域は、ＩＬ１０分子上にマッピングされている。Ｎ末端では、前らせんＡ残基番号１〜９は肥満細胞増殖に関与するが、Ｃ末端では、らせんＦ残基番号１５２〜１６０は白血球分泌および化学走性を媒介する。
【００５６】
ＩＬ１０を発現することが公知である細胞には、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ミクログリア、ＣＤ１４＋（ＣＤ１６＋ではない）単球、Ｔｈ２  ＣＤ４＋細胞（マウス）、ケラチノサイト、肝臓の星状細胞、Ｔｈ１およびＴｈ２のＣＤ４＋  Ｔ細胞（ヒト）、黒色腫細胞、活性化マクロファージ、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞（ＣＤ５＋およびＣＤ１９＋）ならびに好酸球が含まれる。
【００５７】
Ｔ細胞において、ＩＦＮ−ガンマ生成のＩＬ１０による阻害の最初の観察は、今では補助細胞によって媒介される間接作用であると考えられている。しかし、Ｔ細胞に対するさらなる作用には以下のものが含まれる：ＩＬ１０誘導性のＣＤ８＋  Ｔ細胞化学走性、ＩＬ−８に向けてのＣＤ４＋  Ｔ細胞化学走性の阻害、活性化に続くＩＬ−２生成の抑制、Ｂｃｌ−２上方制御を通してのＴ細胞アポトーシスの阻害、ならびにＢ７／ＣＤ２８同時刺激が付随する弱い抗原曝露に続くＴ細胞増殖の妨害（Ａｋｄｉｓら、２００１年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０３巻：１３１頁）。
【００５８】
Ｂ細胞では、ＩＬ１０は関連するが異なるいくつもの機能を有する。ＴＮＦ−βおよびＣＤ４０Ｌと共同して、ＩＬ１０はナイーブ（ＩｇＤ＋）Ｂ細胞で、ＩｇＡ生成を誘導する。ＴＧＦ−β／ＣＤ４０Ｌはクラススイッチを促進するが、ＩＬ１０は分化および増殖を開始すると考えられている。ＴＧＦ−βが存在しない場合、ＩＬ１０は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３（ヒト）の誘導においてＣＤ４０Ｌと協力し、したがってＩｇＧサブタイプの直接のスイッチ因子であり得る。ＩＬ１０は、ＩＬ−４によって誘導されるＩｇＥ分泌に対して様々な作用を有する。ＩＬ−４によって誘導されるクラススイッチの時にＩＬ１０が存在する場合、それはその作用を逆転させる。ＩｇＥ関与（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）の後にそれが存在する場合、それはＩｇＥ分泌を増強する。ＩＬ１０の存在下でのＣＤ２７／ＣＤ７０相互作用は、記憶Ｂ細胞からのプラズマ細胞の形成を促進する（Ａｇｅｍａｔｓｕら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９１巻：１７３頁）。
【００５９】
肥満細胞およびＮＫ細胞も、ＩＬ１０によって影響される。肥満細胞に対し、ＩＬ１０はＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−α放出をブロックしつつ、ヒスタミン放出を誘導する。ＩＬ１０はラットでは肥満細胞によって放出されることが公知であるので、この作用はオートクリンであるかもしれない。その多面的（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｃ）性質の証拠として、ＩＬ１０はＮＫ細胞に対して反対の作用を及ぼす。ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦ生成をブロックするよりは、実際には、ＩＬ１０はＮＫ細胞においてこの機能を促進する。さらに、それはＩＬ−２によって誘導されたＮＫ細胞増殖を強化し、ＩＬ−１８によって刺激されたＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γ分泌を促進する。ＩＬ−１２および／またはＩＬ−１８の両方と協力して、ＩＬ１０はＮＫ細胞の細胞傷害性を強化する（Ｃａｉら、１９９９年、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９巻：２６５８頁）。
【００６０】
ＩＬ１０は、好中球に対する明らかな抗炎症効果を有する。それはケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＩＬ−８の分泌を阻害し、炎症性媒介物質ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの生成をブロックする。さらに、それは、スーパーオキシドを生成する好中球の能力を低下させ、その結果ＰＭＮによって媒介される抗体依存性細胞傷害を妨害する。ＩＬ１０は、おそらくＣＸＣＲ１を通して、ＩＬ−８およびｆＭＬＰによって誘導される化学走性もブロックする（Ｖｉｃｉｏｓｏら、１９９８年、Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．  ９巻：２４７頁）。
【００６１】
樹状細胞（ＤＣ）に対して、ＩＬ１０は一般に免疫抑制作用を示す。それは、ＤＣを犠牲にしてＣＤ１４＋マクロファージ分化を促進するようである。食作用中、マクロファージは貧弱な抗原提示細胞である。ＩＬ１０は、Ｔ細胞（特にＴｈ１型細胞に対して）を刺激するＤＣの能力を低下させるようである。文献中のデータが相反しているので、ＩＬ１０がどのようにこれを達成するかは不明である。ＭＨＣ−ＩＩ発現と比較して、それは下方制御されるか、不変であるか、または上方制御されることがある（Ｓｈａｒｍａら、１９９９年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３巻：５０２０頁）。Ｂ７−１／ＣＤ８０に関して、ＩＬ１０はその発現を上方制御または下方制御する。Ｂ７−２／ＣＤ８６は、Ｔ細胞の活性化で重要な役割を演ずる。この分子に対して、ＩＬ１０は上方制御および下方制御の両方に関与する。しかし、おそらく最も重要な調節は、ＣＤ４０で起こる（ＩＬ１０はその発現を低下させるようである）。局所のレベルでは、ＩＬ１０は、炎症性サイトカインに応じるランゲルハンス細胞移動を阻害することによって、免疫賦活をブロックすることができる。あるいは、ＩＬ１０は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５の下方制御およびＣＣＲ７の上方制御を通常含む、炎症によって誘導されるＤＣ成熟段階をブロックする。この妨害により、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５の停滞（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）を伴い、ＤＣが局所リンパ節に移動できなくなる。結果は、Ｔ細胞を刺激しないが、それらに応答することなく炎症性ケモカインに結合（および除去）する、不動のＤＣである（Ｄ−Ａｍｉｃｏら、２０００年Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １巻：３８７頁）。
【００６２】
単球に対して、ＩＬ１０はいくつかの実証された作用を及ぼす。例えば、ＩＬ１０は細胞表面のＭＨＣ−ＩＩ発現を明らかに低下させるようである。それは、刺激の後にＩＬ−１２の生成も阻害する。それは、Ｍ−ＣＳＦと共同して単球からマクロファージへの移行を促進するが、マクロファージの表現型は明白でない（すなわちＣＤ１６＋／細胞傷害性対ＣＤ１６−）。ＩＬ１０は単球のＧＭ−ＣＳＦ分泌およびＩＬ−８の生成も減少させ、一方ではＩＬ−１ｒａの放出を促進する（Ｇｅｓｓｅｒら、１９９７年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４巻：１４６２０頁）。結合組織構成要素のヒアルロネクチンは、今ではＩＬ１０に応じて単球によって分泌されることが公知である。これは、細胞移動、特にヒアルロネクチンが細胞外間隙を通しての細胞移動を妨害することが公知である腫瘍細胞転移において、なんらかの重要性を有するかもしれない（Ｇｅｓｓｅｒら、１９９７年）。
【００６３】
ヒトＩＬ１０Ｒ１は、限られた数の細胞型で発現される、９０〜１１０ｋＤａの、１回貫通型のＩ型膜貫通糖タンパク質である（Ｌｉｕら、１９９４年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２巻：１８２１頁）。膵臓、骨格筋、脳、心臓および腎臓では、弱い発現が見られる。胎盤、肺および肝臓は中間レベルの発現を示したが、単球、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球およびＴ細胞は高レベルを発現する（Ｌｉｕら、１９９４年）。発現されるタンパク質は、２１アミノ酸のシグナルペプチド、２１５アミノ酸の細胞外領域、２５アミノ酸の膜貫通セグメントおよび３１７アミノ酸の細胞質ドメインを含む、５７８アミノ酸のタンパク質である。細胞外領域に２つのＦＮＩＩＩモチーフ、および、細胞質ドメインにＳＴＡＴ３ドッキング部位に加えてＪＡＫ１結合領域がある（Ｋｏｔｅｎｋｏら、２０００年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９巻：２５５７頁、Ｋｏｔｅｎｋｏら、１９９７年、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６巻：５８９４頁）。ＩＬ１０Ｒ１は、約２００ｐＭのＫｄでヒトＩＬ１０に結合する。
【００６４】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＩＬ１０またはＩＬ１０Ｒ１に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）のもの、ヒト化されたものまたはヒトのものである。ＩＬ１０に特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、米国特許出願公開第２００７／０１７８０９７Ａ１号に開示のものが含まれるが、それらに限定されない。さらに、または代わりに、本開示の結合ドメインは、例えば配列番号７４５に示すＩＬ１０Ｒ１外部ドメイン、またはその断片を含むこともできる。さらなる実施形態では、ＩＬ１０に特異的なポリペプチド結合ドメインが提供され、そこにおいて、結合ドメインは、配列番号７４５のアミノ酸配列、または配列番号７４５のアミノ酸２２〜４０１に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、ポリペプチド結合ドメインはＩＬ１０に結合して、その活性を阻害する。
ＧＩＴＲアゴニスト
特定の実施形態では、本開示は、ＧＩＴＲアンタゴニストである（すなわち、ＧＩＴＲシグナル伝達を増加させることができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＧＩＴＲアンタゴニストには、ＧＩＴＲまたはＧＩＴＲＬに特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＧＩＴＲＬ外部ドメインが含まれる。
【００６５】
グルココルチコイドによって誘導される腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ；ＡＩＴＲとしても公知である）は、Ｉ型膜貫通タンパク質およびＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉら、（２００７年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３７巻：１１６５〜９頁）。細胞質ドメインは、４−１ＢＢおよびＣＤ２７の細胞質ドメインと相同性を有する。ＧＩＴＲは末梢血Ｔ細胞、骨髄、胸腺、脾臓およびリンパ節で発現され、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞で構成的に発現される（Ｋｗｏｎら、（２００３年）Ｅｘｐ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ３５巻：１３頁）。さらに、それはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞において低レベルで構成的に発現され、Ｔｏｌｌ様受容体リガンドまたはＩＬ−１５のいずれかによる刺激の際に誘導される（Ｌｉｕら、（２００８年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８３巻：８２０２頁）。
【００６６】
ＧＩＴＲの発現は、Ｔ細胞の活性化の後に増加する。ＧＩＴＲの活性化は、エフェクターＴリンパ球を同時活性化し、調節Ｔ細胞活性を調節する。そのリガンドＧＩＴＲＬへのＧＩＴＲの結合は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の阻害作用に対して耐性にすることが示されている。
【００６７】
ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）は、ＩＩ型膜タンパク質である。それは、長さが１７３アミノ酸であり、２０ｋＤａの推定分子量を有する。２５〜２８ｋＤａの実験による分子量は、グリコシル化を示唆するものである。ＧＩＴＲＬは抗原提示細胞（ＡＰＣ）で発現され、ヒト臍静脈内皮細胞で構成的に発現される（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉら、同上）。しかし、それは休止または刺激されたＴ細胞、Ｂ細胞系または末梢血単核細胞では発現されない。
【００６８】
ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ系は、腫瘍およびウイルス感染に対する耐性を高めることが示されている（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉら、同上）。具体的には、抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体ＤＴＡ−１は、調節Ｔ細胞依存性抑制を阻害し、Ｔ細胞応答を高めることが示された。マウスでのＤＴＡ−１の投与は、Ｂ１６黒色腫腫瘍の拒絶を誘導した。ＧＩＴＲは、自己免疫／炎症過程にも関与し、白血球溢出も調節する。ＧＩＴＲ−／−マウスは、炎症性疾患状態への感受性の低下を示し、炎症でのＧＩＴＲの正の役割を示す。
【００６９】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＧＩＴＲまたはＧＩＴＲＬに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）のもの、ヒト化されたものまたはヒトのものである。ＧＩＴＲに特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、米国特許出願公開第２００７／００９８７１９Ａ１号に開示のものが含まれるが、それらに限定されない。さらに、または代わりに、本開示の結合ドメインは、ＧＩＴＲＬ外部ドメイン（例えばＧｅｎｂａｎｋ受託ＮＰ＿００５０８３．２（配列番号７４６）のアミノ酸７４〜１８１）またはその断片を含むこともできる。さらなる実施形態では、ＧＩＴＲに特異的なポリペプチド結合ドメインが提供され、前記結合ドメインは、配列番号７４６のアミノ酸７４〜１８１に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記ポリペプチド結合ドメインはＧＩＴＲに結合して、その活性を高める。
ＶＥＧＦアンタゴニスト
特定の実施形態では、本開示は、ＶＥＧＦアンタゴニスト（すなわち、ＶＥＧＦシグナル伝達を阻害することができる）である結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ２に特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＶＥＧＦＲ２外部ドメインが含まれる。
【００７０】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ａ）は、新脈管形成および脈管形成で重要な役割を演ずる、進化の過程で保存されたホモ二量体糖タンパク質および強力な内皮細胞特異的マイトジェンである（Ｌｅｅら（２００７年）ＰＬＯＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６巻：１１０１〜１１１６頁）。ＶＥＧＦは、新脈管形成に必要不可欠な様々な細胞内シグナル伝達および生理的応答、例えば細胞内Ｃａ２＋流入、化学走性（移動）、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ受容体およびコラゲナーゼの発現、ならびに血管透過性を誘導する。その生物学的作用は、主に内皮細胞で発現される２つの高親和性受容体チロシンキナーゼ、すなわちＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）および２（ＶＥＧＦＲ２）を通して引き出される。
【００７１】
ＶＥＧＦＡは、ジスルフィド結合によって連結されるホモダイマーである、分泌タンパク質である。それは、Ｐ１ＧＦとのヘテロダイマーとしても見出される。ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、ヒトのＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６、ならびにマウスのＶＥＧＦ１２０、ＶＥＧＦ１６４およびＶＥＧＦ１８８を含む、様々なアイソフォームをもたらす。１つのＶＥＧＦアイソフォームだけを発現する遺伝子操作マウスの研究は、これらのマウスでの組織特異血管欠損が表すように、ＶＥＧＦアイソフォームが血管の発達および機能において、異なるが、幾分重複する役割を有することを示す。ＶＥＧＦアイソフォームは、ニューロピリンおよびヘパラン硫酸へのＶＥＧＦ１２０結合を含まないがＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１８８との受容体結合を含む、それらの生化学的性状の差を示す。ヘパラン硫酸はこれらの受容体の結合およびトランス活性化を媒介することができるので、ヘパラン硫酸への識別的親和性は、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦ２へのそれらの結合で重要である。さらに、ヘパラン硫酸への識別的な結合は、内皮細胞生存、接着および血管分岐形成を含む、異なるＶＥＧＦ作用をもたらすと報告されている。ＶＥＧＦ１６４およびＶＥＧＦ１８８の両方はヘパラン硫酸に結合し、それらをそれぞれ部分的または完全に細胞に結合した状態にするが、ＶＥＧＦ１２０はヘパラン硫酸に結合せず、自由に拡散する。
【００７２】
ＶＥＧＦアイソフォームは、発現の組織特異的パターンを示す。ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ−１６５およびＶＥＧＦ−１２１アイソフォームは広く発現されるが、ＶＥＧＦ２０６およびＶＥＧＦ−１４５は一般的でない。その発現は、増殖因子、サイトカイン、ゴナドトロピン、一酸化窒素、低酸素、低血糖および腫瘍形成突然変異によって調節される。
【００７３】
腫瘍進行におけるＶＥＧＦの古典的役割は、既存の血管から新しい毛細管を形成する過程である血管形成の正の調節因子としてである。腫瘍増殖は、それら自身の血管新生を誘導する腫瘍の能力に強く依存する。ＶＥＧＦ発現は、いくつかの癌細胞系で、ならびに乳癌、脳癌および卵巣癌に由来するいくつかの臨床検体で報告されている。したがって、ＶＥＧＦの拮抗は、不完全な血管形成を通して腫瘍増殖を効果的に防止することができる。ＶＥＧＦは、腫瘍細胞などの他の細胞によるその放出の後にパラクリン様式で、またはＶＥＧＦ産生内皮細胞でオートクリンの方法で、内皮細胞に対してその作用を発揮する。ＶＥＧＦは、そのコグネイト受容体ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ１としても公知である）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲまたはＦＬＫ１としても公知である）およびニューロピリン１（ＮＲＰ１）に結合する。
【００７４】
成体でのＶＥＧＦ発現は、細胞型特異的で、転写から翻訳までの多くのレベルで制御され、腫瘍および様々な病的状態で上方制御される。ＶＥＧＦ転写の最も特徴のわかっている刺激因子の１つは低酸素であり、それは低酸素誘導性因子１アルファ（ＨＩＦ１α）転写因子の安定化によって作用する。ＶＥＧＦの低酸素調節は、ｍＲＮＡの安定化を通して転写後にも起こる。ＶＥＧＦ発現は、ＩＧＦ−１、Ｉｌ−６、Ｉｌ−１、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＦＧＦ−４を含む他の増殖因子およびサイトカインによって誘導される。さらに、ＶＥＧＦ発現は、伸長を含む物理的力によっても刺激され、１つの推定上の転写因子はＫｒｕｐｐｅｌ様因子２である。ＶＥＧＦプロモーターの分析は他の多くの可能性のある転写因子応答エレメントを明らかにし、例えばＳＰ１応答エレメントを経るＥＧＦおよびＨＧＦシグナル伝達など、そのいくつかの経路は解明されている。
【００７５】
ＶＥＧＦファミリーのメンバーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで２つの非常に重要な過程である新脈管形成およびリンパ管形成を促進し、それらは、既存の脈管構造からのそれぞれ新しい血管およびリンパ管の増殖に関与する。これらの過程は、創傷治癒、卵巣濾胞の発達、子宮内膜増殖の正常な過程、ならびに網膜症、関節リウマチおよび固形腫瘍増殖などの病理学的過程を制御する。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ１６５ｂの新しく同定されたスプライス変異体は、新脈管形成に対して阻害作用を有すると仮定される。リンパ管形成は、リンパ系を通すリンパ節転移および癌の広がりと相関している。
【００７６】
ＶＥＧＦ活性は、内皮細胞で主に発現される高親和性受容体チロシンキナーゼによって媒介される。これらは以下の通りである：主に血管内皮細胞によって発現されるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）、ならびにリンパ内皮細胞で発現されるＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）。これらの受容体は、増殖因子に結合する７つの細胞外の免疫グロブリン様ドメインと、それに続く、キナーゼ挿入配列によって遮断される単一の膜貫通領域および保存された細胞内チロシンキナーゼドメインを特徴とする。これらの受容体はそれ自体酵素であり、リガンド結合によって活性化されると、それらは二量体化し、自己リン酸化を経る。この段階は、特定のチロシン残基の上でそれらをリン酸化することによって他の標的タンパク質を直接活性化する受容体の能力を高める。
【００７７】
ＶＥＧＦキナーゼリガンド／受容体のシグナル伝達系は、血管の発達および血管透過性の調節で重要な役割を演ずる。ＨＩＶ−１感染の場合には、細胞外のウイルスＴａｔタンパク質との相互作用が、カポジ肉腫病変での新脈管形成を高めるようである。
【００７８】
ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｎｒｐ−１およびＮｒｐ−２に結合するが、内皮でのその主なシグナル伝達受容体はＶＥＧＦＲ２である。ＶＥＧＦＲ２は受容体チロシンキナーゼのファミリーに属し、ＶＥＧＦとの結合後、チロシンキナーゼの二量体化および活性化があり、細胞質テールの特定のチロシン残基のリン酸化がもたらされ、それは次にシグナル伝達分子のドッキングを促進する。ＶＥＧＦＲ２は、内皮細胞内のシグナル伝達経路の開始を担う。ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合に続いて、ＶＥＧＦは、内皮細胞における増殖、生存、接着、移動、毛細管形態形成および遺伝子発現に対するその作用を媒介する。そのキナーゼ活性がＶＥＧＦＲ２のそれより１０倍低いので、ＶＥＧＦＲ１は、ＶＥＧＦＲ２と比較してＶＥＧＦ媒介シグナル伝達で相対的に小さい役割を有する。乳癌細胞系は、ＶＥＧＦならびにＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＮＲＰ１を両方発現する。最近の研究は、ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ受容体発現腫瘍細胞のためのオートクリン増殖および生存因子として働くことを示している。しかし、ＶＥＧＦが腫瘍細胞の生存を媒介する機構は、深く調査する必要がある（Ｌｅｅら、２００７年、ＰＬＯＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６巻：１１０１〜１１１６頁）。
【００７９】
ＶＥＧＦＲ１は内皮細胞（ＥＣ）によっても発現されるが、それは主にＶＥＧＦＲ２シグナル伝達を調節する作用をすると考えられている。有糸分裂誘発、化学走性、細胞生存および内皮細胞の形態変化は、主にＶＥＧＦＲ−２によって媒介される。分裂誘発シグナルはＲａｆ−Ｍｅｋ−Ｅｒｋ経路の活性化によって誘導されるが、抗アポトーシス性の作用および化学走性はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔの活性化によって媒介される。ＶＥＧＦＲ−２へのＶＥＧＦの結合は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ依存的に、新脈管形成に関与する接着分子であるいくつかのインテグリンの活性化ももたらす。内皮細胞で発現されることとは別に、ＶＥＧＦＲ−２は造血幹細胞で見出され、それが造血幹細胞の生存を高め、そして、ＶＥＧＦＲ−２が網膜前駆体細胞でも見出され、それが神経発生および脈管形成で重要な役割を演ずる。
【００８０】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ２に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）のもの、ヒト化されたものまたはヒトのものである。ＶＥＧＦに特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、米国特許出願公開第２００７／０１４１０６５Ａ１号に開示のものが含まれるが、それらに限定されない。さらに、または代わりに、本開示の結合ドメインは、ＶＥＧＦＲ２外部ドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＰ＿００２２４４．１、配列番号７４７を参照されたい）またはその断片を含むこともできる。さらなる実施形態では、ＶＥＧＦに特異的なポリペプチド結合ドメインが提供され、前記結合ドメインは、配列番号７４７のアミノ酸配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記ポリペプチド結合ドメインはＶＥＧＦに結合して、その活性を阻害する。
ＴＮＦαアンタゴニスト
特定の実施形態では、本開示は、ＴＮＦαアンタゴニスト（すなわち、ＴＮＦαシグナル伝達を阻害することができる）である結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＴＮＦαアンタゴニストには、ＴＮＦαに特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＴＮＦＲ１もしくはＴＮＦＲ２外部ドメインが含まれる。
【００８１】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであり、ＣＤ１２０またはカケクチンとしても公知である腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の受容体である。このサイトカイン受容体の２つの変異体、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ａ受容体およびＣＤ１２０ｂ受容体）がある。ＴＮＦＲ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０５６．１）は、約５５ＫＤの分子量を有し、したがってｐ５５と呼ばれることもある。開示されている融合タンパク質でＴＮＦα結合ドメインとして用いることができるＴＮＦＲドメインは、ＴＮＦＲ１配列のアミノ酸４４〜１４９に位置する。ＴＮＦＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０５７．１）は、約７５ＫＤの分子量を有し、したがってｐ７５と呼ばれることもある。開示されている融合タンパク質でＴＮＦα結合ドメインとして用いることができるＴＮＦＲドメインは、ＴＮＦＲ２配列のアミノ酸４０〜１４１に位置する。
【００８２】
大多数の細胞型および組織は、両方のＴＮＦ受容体を発現するようである。両方とも細胞表面ならびに可溶性の形態で存在し、両方ともシグナル伝達で活性であるが、それらは異なる細胞応答を媒介することができる。ＴＮＦＲ１は、ほとんどのＴＮＦ応答をシグナル伝達する役割を担うようである。他の活性の中でも、ＴＮＦＲ２は胸腺細胞増殖を刺激し、ＮＦ−κβを活性化し、細胞傷害性のような主にＴＮＦ−Ｒ１によって媒介される応答のシグナル伝達で、ＴＮＦＲ１を補助する。
【００８３】
抗ＴＮＦ抗体などのＴＮＦアンタゴニストは、様々な炎症状態に正の影響を及ぼすことができる。例えば、インフリキシマブは、米国で、関節リウマチ、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、プラーク乾癬および潰瘍性大腸炎の治療に対し適用される。近年では、ＴＮＦα阻害剤エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）の脊髄周囲への送達が、アルツハイマー病患者で症状を軽減することが示されている（ＴｏｂｉｎｉｃｋおよびＧｒｏｓｓ（２００８年）ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ８巻：２７〜３６頁、Ｇｒｉｆｆｉｎ（２００８年）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、５巻：３〜６頁）。
【００８４】
ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）処方情報によると、ＴＮＦに帰せられる生物活性には、以下のものが含まれる：インターロイキン（ＩＬ）１および６などの炎症性サイトカインの誘導、内皮層透過性を増加させることによる白血球移動の強化、ならびに内皮細胞および白血球による接着分子の発現、好中球および好酸球機能活性の活性化、急性相反応物質および他の肝臓タンパク質の誘導、ならびに滑膜細胞および／または軟骨細胞によって生成される組織分解酵素の誘導。
【００８５】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＴＮＦαに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインはヒトのものである。ＴＮＦαに特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、米国特許出願公開第２００７／０２４９８１３号に開示のものが含まれるが、それらに限定されない。さらに、または代わりに、本開示の結合ドメインは、ＴＮＦＲ１外部ドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＰ＿００１０５６．１、配列番号７４９を参照されたい）もしくはその断片、またはＴＮＦＲ２外部ドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＰ＿００１０５７．１、配列番号７４８を参照されたい）もしくはその断片を含むこともできる。ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２外部ドメインは、米国特許出願公開第２００７／０１２８１７７号に記載されている。さらなる実施形態では、ＴＮＦαに特異的なポリペプチド結合ドメインが提供され、そこにおいて、前記結合ドメインは、配列番号７４８または７４９のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記ポリペプチド結合ドメインはＴＮＦαに結合して、その活性を阻害する。
ＨＧＦアンタゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＨＧＦアンタゴニスト（すなわち、ＨＧＦシグナル伝達を阻害することができる）である結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＨＧＦアンタゴニストには、ＨＧＦに特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはｃ−Ｍｅｔ外部ドメインもしくはそのサブドメイン（例えば、ｃ−ＭｅｔのＳｅｍａドメイン、ＰＳＩドメインまたは両ドメイン）が含まれる。
【００８６】
チロシンキナーゼ受容体ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）はそのリガンドの１つであるので、肝細胞増殖因子受容体ＨＧＦＲとしても公知である）は、胚形成および組織修復の正常な過程の間に活性である。これらの両過程で、細胞は隣接細胞から解離して、血流に入る。血流では、ｃ−Ｍｅｔによって誘導されるアポトーシスからの保護、および固着非依存的な増殖能力は、細胞が溢出、増殖して最終的に分化するまで、それらが生存することを可能にする。組織修復では、損傷に隣接した上皮細胞が分離、変形し、それらが増殖して上皮層を再構成する損傷域に向かって移動する場合に、ｃ−Ｍｅｔは上皮−間葉移行の過程に関与する。
【００８７】
しかし、ｃ−Ｍｅｔが構成的に活性化される場合、それを発現する細胞は腫瘍形成性および転移性になる。構成的ｃ−Ｍｅｔ活性化は、複数の機構によっておこることが証明されている。最も一般的なものは受容体の過剰発現であり、それは、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子増幅（例えば、結腸直腸（ｃｏｌｅｃｔｏｒａｌ）腫瘍で）、他のオンコジーンによって誘導される強化されたｃ−Ｍｅｔ転写、または低酸素活性化転写の結果として起こる。別の機構には、点突然変異（例えば、遺伝性の乳頭状腎癌、小児肝細胞癌、散発性の乳頭状腎癌、胃癌および頭頸部扁平上皮癌で）および染色体転座を含む、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の構造的変化が含まれる。さらに別の機構には、異常な翻訳後プロセシング、前駆体タンパク質の切断の欠落、受容体の下方制御を阻止する突然変異および受容体の切断（例えば、筋骨格腫瘍で）などのｃ−Ｍｅｔの構造的変化が含まれる。さらに別の機構は、ＨＧＦ依存性オートクリン／パラクリン活性化である。パラクリン活性化により、間葉細胞による異常なＨＧＦ生成の存在下で病的になることができる。オートクリン活性化は、腫瘍細胞がｃ−ＭｅｔおよびＨＧＦの両方を異常に発現する場合に起こる（例えば、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経膠腫ならびに甲状腺、乳房および肺の癌腫で）。最後に、構成的ｃ−Ｍｅｔ活性化は、他の膜受容体（例えば、ＲＯＮ、ＥＧＦ受容体ファミリーメンバー、ＦＡＳおよびＢプレキシン）によるトランス活性化に起因することもある。Ｃｏｒｓｏら、ＴＲＥＮＤＳ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  １１巻：２８４頁（２００５年）を参照。
【００８８】
ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路を標的にする抗癌戦略も、上掲のＣｏｒｓｏらに記載されている。これらには、ＨＧＦの拮抗または中和、ｃ−Ｍｅｔキナーゼ活性の阻害、ｃ−Ｍｅｔ二量体化の阻止、ｃ−Ｍｅｔ細胞内活性の阻害、およびｃ−ＭｅｔまたはＨｇｆ発現のサイレンシングが含まれていた。Ｍｉｃｈｉｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、６巻：６１〜７３頁（２００４年）は、ｃ−ＭｅｔへのＨＧＦ結合およびｃ−Ｍｅｔホモ二量体化を両方妨害する、「デコイＭｅｔ」と呼ばれる可溶性のｃ−Ｍｅｔ受容体を記載している。マウスでのレンチウイルスベクターによるデコイＭｅｔの送達は、ヒト異種移植片の腫瘍細胞の増殖および生存を阻害すると報告された。デコイＭｅｔは、腫瘍新脈管形成を損ない、自発的転移の形成を抑制し、腫瘍退縮の誘導において放射線療法と相乗的に作用することが観察された。
【００８９】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＨＧＦに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）のもの、ヒト化されたものまたはヒトのものである。ＨＧＦに特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、米国特許出願公開第２００５／０１１８６４３号に開示のものが含まれるが、それらに限定されない。さらに、または代わりに、本開示の結合ドメインは、配列番号７５０、７５１もしくは７５２のｃＭｅｔ外部ドメイン、またはその断片を含むこともできる。さらなる実施形態では、ＨＧＦに特異的なポリペプチド結合ドメインが提供され、そこにおいて、前記結合ドメインは、配列番号７５０、７５１または７５２のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記ポリペプチド結合ドメインはＨＧＦに結合して、その活性を阻害する。
【００９０】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、本明細書に記載のＶＨおよびＶＬドメインを含むｃ−Ｍｅｔアンタゴニストドメインである。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインはヒトのものである。そのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例を、それぞれ配列番号１１３２〜１１８４および１０７９〜１１３１に示す。さらなる実施形態では、それぞれ配列番号１０７９〜１１３１および１１３２〜１１８４に示すような、１つまたは複数の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に、または１つまたは複数の重鎖可変領域（ＶＨ）に、またはその両方に、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有する本開示のｃ−Ｍｅｔアンタゴニストドメインが提供され、各ＣＤＲは、多くとも最大で３個のアミノ酸変化を有する。
【００９１】
さらなる実施形態では、本開示のｃ−Ｍｅｔアンタゴニストドメインは、それぞれ配列番号１１３２〜１１８４および１０７９〜１１３１に記載のＶＨおよびＶＬドメインを含み、それらは、そのようなＶＨドメイン、ＶＬドメインまたは両方のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、そこにおいて、各ＣＤＲは、０、１、２または３個以下の突然変異を有する。例えば、本開示のＶＨドメイン、ＶＬドメインまたは両方のアミノ酸配列は、例示的な結合ドメインＴＲＵ（Ｈ）−３４３からのそれぞれＶＨドメイン（配列番号１１７４）、ＶＬドメイン（配列番号１１２１）または両方のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であることができる。
【００９２】
本開示の結合ドメインは、抗ＨＧＦまたは抗ｃ−Ｍｅｔの可変領域からの単一のＣＤＲを含むことができ、またはそれは、同じであってもまたは異なってもよい複数のＣＤＲを含むことができる。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むＨＧＦまたはｃ−Ｍｅｔに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含み、そこにおいて、（ａ）ＶＨドメインは、配列番号１１３２〜１１８４のいずれか１つで見られる重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１０７９〜１１３１のいずれか１つで見られる軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｃ）結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、あるいは結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、そして、そこにおいて、ＶＨおよびＶＬは同じ参照配列に見られる。さらなる実施形態では、本開示の結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むＨＧＦまたはｃ−Ｍｅｔに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含み、そこにおいて、（ａ）ＶＨドメインは、配列番号１１３２〜１１８４のいずれか１つで見られる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｂ）ＶＬドメインは、配列番号１０７９〜１１３１のいずれか１つで見られる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｃ）結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、あるいは結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、そこにおいて、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は同じ参照配列に由来する。
【００９３】
特異的ＣＤＲを含む本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、結合ドメインは、（ｉ）配列番号１１３２〜１１８４のいずれか１つで見られるＶＨドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、または（ｉｉ）配列番号１０７９〜１１３１のいずれか１つで見られるＶＬドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、または（ｉｉｉ）（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方を含むことができ、あるいは、ＶＨおよびＶＬが同じ参照配列に由来する、（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方を含むことができる。ｃ−Ｍｅｔに対する例示的な軽鎖および重鎖の可変ドメインＣＤＲを、それぞれ配列番号７６２〜９２０および９２１〜１０７８に提供する。
【００９４】
ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストの軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０７９〜１１３１および１１３２〜１１８４に提供する。
ＴＷＥＡＫアンタゴニスト
特定の実施形態では、本開示は、ＴＷＥＡＫアンタゴニストである（すなわち、ＴＷＥＡＫＲシグナル伝達を阻害することができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＴＷＥＡＫアンタゴニストには、ＴＷＥＡＫに特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＴＷＥＡＫＲ外部ドメインもしくはその断片が含まれる。
【００９５】
ＴＷＥＡＫは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーに属し、炎症性活性、新脈管形成および細胞増殖を含む複数の細胞応答を調節するサイトカインである。ＴＷＥＡＫは、切断されて生物活性のある可溶性のサイトカインを生成する、ＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＷＥＡＫタンパク質中の様々なドメインの位置が、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２８０９４０号に示されている。ＴＷＥＡＫはＴＮＦと重複するシグナル伝達機能を有するが、ずっと広い組織分布を示す。ＴＷＥＡＫは、細胞型特異的に細胞死の複数の経路を通してアポトーシスを誘導することができ、内皮細胞の増殖および移動を促進することもわかり、したがって新脈管形成の調節因子として作用する。
【００９６】
コグネイトＴＷＥＡＫ受容体、ＴＷＥＡＫＲまたは線維芽細胞増殖因子誘導性１４（Ｆｎ１４）は、非リンパ系細胞型によって発現されるＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである（Ｗｉｌｅｙら（２００１年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５巻：８３７頁）。ＴＷＥＡＫおよびＴＷＥＡＫＲの発現は、正常な組織では比較的低いが、組織損傷および疾患の状況では劇的な上方制御を受ける。ＴＷＥＡＫ／Ｒ経路は急性組織修復機能を促進し、したがって急性損傷の後に生理的に機能するが、慢性炎症疾患状況では病理的に機能する。ＴＮＦと対照的に、ＴＷＥＡＫは発達またはホメオスタシスでいかなる明らかな役割も演じない。ＴＷＥＡＫ／Ｒ経路の概説は、Ｂｕｒｋｌｙら（２００７年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４０巻：１頁に提供されている。持続的に活性化されているＴＷＥＡＫは、慢性炎症、病理的過形成および新脈管形成を促進し、前駆体細胞の分化を阻害することによって組織修復を潜在的に妨げる。ＴＷＥＡＫタンパク質は、活性化単球およびＴ細胞の表面、および腫瘍細胞系上で、ならびに休止および活性化単球、樹状細胞およびＮＫ細胞では細胞内で同定されている。ＴＷＥＡＫ発現は、全てが炎症性細胞の浸潤および／または常在の先天性免疫細胞型の活性化に関連する急性損傷、炎症疾患および癌との関連で、標的組織において局所的に顕著に増加する。循環中のＴＷＥＡＫレベルは、多発性硬化症および全身性エリテマトーデスなどの慢性炎症疾患を有する患者で、顕著に増加することが示されている。
【００９７】
ＴＷＥＡＫをブロックするモノクローナル抗体は、マウスのコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルで有効であることが示されている（Ｋａｍａｔａら（２００６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７巻：６４３３頁、Ｐｅｒｐｅｒら（２００６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７巻：２６１０頁）。ヒト滑膜細胞に及ぼすＴＷＥＡＫおよびＴＮＦの関節炎誘発（ａｎｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ）活性は、しばしば相加的であったりまたは相乗的であってお互いに無関係のようであり、ＴＷＥＡＫおよびＴＮＦは関節リウマチの病理において平行して作用することができることを示している。ＴＮＦ阻害剤に対するＲＡ患者の臨床上の応答に関する該患者の不均一性が、ＴＷＥＡＫによる病理的寄与を反映し得ると推測されている。
【００９８】
米国特許第７，１６９，３８７号は、ＴＷＥＡＫに特異的なモノクローナル抗体の調製、および慢性ＧＶＨＤのマウスモデルを用いる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生の局面をブロックするためのその使用を記載する。米国特許出願公開第２００７／０２８０９４０号は、ＴＷＥＡＫＲおよびＴＷＥＡＫに対するＴＷＥＡＫＲデコイ受容体および抗体、ならびに脳浮腫および細胞死に関連する中枢神経系の疾患の治療におけるそれらの使用を記載する。
【００９９】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＴＷＥＡＫに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ヒト化またはヒトのものである。ＴＷＥＡＫに特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、例えば、米国特許第７，１６９，３８７号に開示されるものが含まれる。ＴＷＥＡＫをブロックするモノクローナル抗体は、マウスのコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルで有効であることが示されている（Ｋａｍａｔａら（２００６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７巻：６４３３頁、Ｐｅｒｐｅｒら（２００６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７巻：２６１０頁）。
【０１００】
特定の実施形態では、ＴＷＥＡＫアンタゴニストは、ＴＷＥＡＫＲ（ＦＮ１４としても公知である）の細胞外ドメイン（「外部ドメイン」）であってもよい。本明細書で用いるように、ＴＷＥＡＫＲ外部ドメインは、ＴＷＥＡＫＲ、可溶性ＴＷＥＡＫＲまたはそれらの任意の組合せの細胞外の部分を指す。特定の実施形態では、ＴＷＥＡＫアンタゴニストは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５７７２３．１（配列番号７６１）に記載のＴＷＥＡＫＲの最初の７０個のアミノ酸などの、ＴＷＥＡＫＲのアミノ末端部分、またはＴＷＥＡＫアンタゴニストとして機能し続けるその任意の断片を含む。他の実施形態では、ＴＷＥＡＫアンタゴニストは、配列番号７６１のアミノ酸２８〜７０を含む（すなわち、天然のリーダー配列がない）。その上さらなる他の実施形態では、ＴＷＥＡＫアンタゴニストは、配列番号７６１のアミノ酸配列、または配列番号７６１のアミノ酸２８〜７０に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記アンタゴニストはＴＷＥＡＫに結合して、その活性を阻害する。
【０１０１】
本明細書に記載の結合タンパク質または融合タンパク質の、ＴＷＥＡＫＲへのＴＷＥＡＫの結合を減少させる能力は、米国特許出願公開第２００７／０２８０９４０号に記載のものを含む当業者に公知であるアッセイを用いて決定することができる。
ＩＧＦアンタゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２アンタゴニストである（すなわち、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２シグナル伝達を阻害することができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＩＧＦ１またはＩＧＦ２アンタゴニストには、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２に特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＩＧＦ１ＲまたはＩＧＦＢＰ外部ドメインもしくはそのサブドメインが含まれる。
【０１０２】
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）は、哺乳動物の成長および発達で重要な役割を演ずるペプチドファミリーを含む。インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）は、以下の特徴を有する分泌タンパク質である：ジスルフィド結合（アミノ酸５４〜９６、６６〜１０９、９５〜１００）；Ｄペプチドドメイン（アミノ酸１１１〜１１８）；カルボキシル末端プロペプチドドメイン（Ｅペプチド）（アミノ酸１１９〜１５３）；インスリン鎖Ａ様ドメイン（アミノ酸９０〜１１０）；インスリン鎖Ｂ様ドメイン（アミノ酸４９〜７７）；インスリン連結Ｃペプチド様ドメイン（アミノ酸７８〜８９）；プロペプチドドメイン（アミノ酸２２〜４８）；およびシグナル配列ドメイン（アミノ酸１〜２１）。
【０１０３】
ＩＧＦ１は、肝臓、骨格筋、骨および軟骨を含む複数の組織で合成される。ＩＧＦ１の血中濃度の変化は肝臓によるその合成および分泌の変化を反映し、それは、実験動物で総血清ＩＧＦ１の８０％を占める、。ＩＧＦ１の残りは、末梢で、通常結合組織細胞型によって、例えばほとんどの組織に存在する間質細胞によって合成される。末梢で合成されるＩＧＦ１は、オートクリンおよびパラクリン機構によって細胞増殖を調節する働きをすることができる。これらの組織の中で、新しく合成され、分泌されるＩＧＦ１は、結合組織細胞自体に存在する受容体に結合して増殖を刺激することができる（オートクリン）か、または、それは、実際はＩＧＦ１を合成しないが、局所的に分泌されるＩＧＦ１によって増殖が刺激される、隣接する細胞型（しばしば上皮細胞型）の上の受容体に結合することができる（パラクリン）（Ｃｌｅｍｍｏｎｓ、２００７年、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ６巻（１０号）：８２１〜３３頁）。ＩＧＦ１の合成は、ヒト下垂体成長ホルモン（ＧＨ、ソマトトロピンとしても公知である）を含むいくつかの因子によって調節される。ＩＧＦ２濃度は胎児の成長中に高いが、ＩＧＦ１と比較して成体の期間ではＧＨ依存性がより低い。
【０１０４】
ＩＧＦ１は、筋骨格系、肝臓、腎臓、腸、神経系組織、心臓および肺を含む様々な組織で、細胞の増殖および／または生存を高める。ＩＧＦ１は細胞増殖を促進する重要な役割も演じ、その結果、ＩＧＦ１の阻害はアテローム硬化症の治療のための潜在的な補助的手段として探求されている。ＩＧＦ１作用を阻害することが、他の形態の抗癌療法の効果を強化するための、または腫瘍細胞増殖を直接に阻害するための特異的療法として提案されている。
【０１０５】
ＩＧＦ１と同様に、ＩＧＦ２はＩＧＦ１Ｒを通して作用する。ＩＧＦ２は、その分裂促進性および抗アポトーシス性の機能により、腫瘍での重要なオートクリン増殖因子である（Ｋａｎｅｄａら、２００５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５巻（２４号）：１１２３６〜１１２４０頁）。ＩＧＦ２の発現の増加が、結腸直腸癌、肝臓癌、食道癌および副腎皮質の癌、ならびに肉腫を含む、多種多様の悪性疾患でしばしば見られる。悪性の乳房上皮細胞を囲む間質線維芽細胞でＩＧＦ２の大量の発現が見られるので、ＩＧＦ２によるパラクリンシグナル伝達も、乳癌を含む腫瘍で役割を果たす。
【０１０６】
インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）は、ジスルフィド結合によって連結される２つのアルファ鎖および２つのベータ鎖の四量体である。前駆体の切断は、アルファおよびベータサブユニットを生成する。ＩＧＦ１Ｒは、タンパク質キナーゼスーパーファミリーである、チロシンタンパク質キナーゼファミリー、およびインスリン受容体サブファミリーに関係している。それは、３つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、および１つのタンパク質キナーゼドメインを含む（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、２００７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７巻：６９９頁）。アルファ鎖はリガンド結合ドメインの形成に寄与し、ベータ鎖はキナーゼドメインを有する。それは１回貫通Ｉ型膜タンパク質であり、様々な組織で発現される。
【０１０７】
キナーゼドメインは、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２によって刺激される下流シグナル伝達カスケードの活性化のために必要である、チロシン−タンパク質キナーゼ活性を有する。自己リン酸化は、キナーゼ活性を活性化する。ベータサブユニットの細胞質ドメインのチロシン残基が自己リン酸化されると、ＩＧＦ１Ｒはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＰＩＫ３Ｒ１と、ならびにＩＲＳ１およびＳＨＣ１のＰＴＢ／ＰＩＤドメインと相互作用する。ＩＧＦ１Ｒは、形質転換事象で重大な役割を演ずる。それはほとんどの悪性組織で高度に過剰発現され、そこでは、それは細胞生存を高めることによって抗アポトーシス因子として機能する。この受容体を欠く細胞は、ｖ−Ｓｒｃを除いては、ほとんどのオンコジーンによって形質転換することができない。
【０１０８】
インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）ファミリーは、ナノモルの親和性でＩＧＦに結合する、約２５０個の残基の６個の可溶性タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）を含む。それらの配列相同性のため、ＩＧＦＢＰは、共通の全体的折畳みを共有すると想定され、緊密に関連するＩＧＦ結合決定因子を有すると予想される。各ＩＧＦＢＰは、ほぼ同等の長さの３つの異なるドメイン、すなわち、高度に保存されたシステインに富むＮおよびＣドメイン、ならびに各ＩＧＦＢＰ種に特異な中央リンカードメインに分割することができる。ＮおよびＣドメインは両方ともＩＧＦへの結合に関与するが、ＩＧＦ結合におけるこれらのドメインの各々の具体的な役割は確定されていない。Ｃ末端のドメインが、ＩＧＦの他の種よりもＩＧＦの１つの種に対するＩＧＦＢＰの優先傾向についての役割を担うことができる。Ｃ末端のドメインは、細胞外マトリックス成分との相互作用を通してＩＧＦ結合親和性の調節にも関与し、ほぼ確実に、ＩＧＦ１非依存性作用の媒介に関与している。中央のリンカードメインは最も保存されていない領域で、いかなるＩＧＦＢＰのＩＧＦ結合部位の一部としても引用されたことはない。このドメインは、ＩＧＦＢＰについて公知である、翻訳後修飾、特異的タンパク質分解、ならびに酸不安定性サブユニットおよび細胞外マトリックスの結合の部位である。このドメインでのタンパク分解性切断は、ＩＧＦに対するＩＧＦ受容体と競合することができない低親和性のＮ末端およびＣ末端の断片を生成すると考えられ、したがって、そのタンパク質分解はＩＧＦＢＰからのＩＧＦ放出の主な機構であると想定される。しかし、最近の研究は、生じるＮ末端およびＣ末端の断片がＩＧＦ活性をまだ阻害することができ、インタクトなタンパク質のそれらと異なる機能的特性を有することを示す（Ｓｉｔａｒら（２００６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  １０３巻（３５号）：１３０２８〜３３頁）。
【０１０９】
ＩＧＦ結合タンパク質は、ＩＧＦの半減期を延長する分泌タンパク質であり、細胞培養に及ぼすＩＧＦの増殖促進効果を阻害または刺激することが示されている。それらは、ＩＧＦとＩＧＦの細胞表面受容体との相互作用を変化させ、その上細胞移動を促進する。それらは、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２に等しくよく結合する。全てのＩＧＦＢＰのＣ末端のドメインは、サイログロブリン１型ドメインと配列相同性を示し、二次構造の共通要素（αヘリックスおよび３−βストランドから４−βストランドのβシート）を共有する。分子のコアは、コンセンサスな３つのジスルフィド対合によって連結され、保存されているＴｙｒ／Ｐｈｅアミノ酸を有し、ＱＣ、ＣＷＣＶモチーフを有する。これらの基本的特徴はＣＢＰ１、ＣＢＰ４およびＣＢＰ６で保存され、Ｃドメインの構造はこれまでに解決されているが、詳細では顕著な変動が存在する。例えば、ＣＢＰ４はヘリックスα２を有するが、ＣＢＰ１の対応する残基は、サイログロブリン１型ドメインスーパーファミリーの他の構造で見られる短いベータストランドを形成する。ＣＢＰのこの特定の領域は、高い配列多様性を有し、ＩＧＦ複合体の形成に関与し、したがって親和性調節因子の役割を果たすことができる。
【０１１０】
ＩＧＦ／ＩＧＦ受容体結合の阻害は、細胞増殖を妨害し、糖尿病、アテローム硬化症および癌を含む、ＩＧＦ系の調節の欠乏から生じる多くの共通する疾患における天然のＩＧＦアンタゴニストとしての、ＩＧＦＢＰおよびバリアントの開発のための戦略を表わす。
【０１１１】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ヒト化またはヒトのものである。さらに、または代わりに、本開示の結合ドメインは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００８６６．１（配列番号７５３）のＩＧＦ１Ｒ外部ドメインもしくはそのサブドメイン、またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５８７．１（ＩＧＦＢＰ１；配列番号７５４）、ＮＰ＿０００５８８．２（ＩＧＦＢＰ２；配列番号７５５）、ＮＰ＿００１０１３４１６．１（ＩＧＦＢＰ３アイソフォームａ；配列番号７５６）、ＮＰ＿０００５８９．２（ＩＧＦＢＰ３アイソフォームｂ；配列番号７５７）、ＮＰ＿００１５４３．２（ＩＧＦＢＰ４；配列番号７５８）、ＮＰ＿０００５９０．１（ＩＧＦＢＰ５；配列番号７５９）またはＮＰ＿００２１６９．１（ＩＧＦＢＰ６；配列番号７６０）のＩＧＦＢＰ外部ドメイン、またはそれらのサブドメインを含み得る。まだその上さらなる実施形態では、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２アンタゴニストは、配列番号７５４〜７６０のアミノ酸配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記アンタゴニストはＩＧＦ１およびＩＧＦ２の少なくとも１つの活性を阻害する。
多重特異性融合タンパク質
本開示は、ＴＧＦβのアンタゴニストであるドメイン（「ＴＧＦβアンタゴニストドメイン」）、およびＩＬ６アンタゴニスト、ＩＬ１０アンタゴニスト、ＧＩＴＲアゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＴＮＦアンタゴニスト、ＨＧＦアンタゴニスト、ＴＷＥＡＫアンタゴニストまたはＩＧＦアンタゴニストなどのＴＧＦβリガンド以外のリガンドのアンタゴニストまたはアゴニストであるドメイン（「異種結合ドメイン」）を含む、多重特異性融合タンパク質を提供する。ＴＧＦβアンタゴニストドメインは融合タンパク質のアミノ末端に存在し、異種結合ドメインは融合タンパク質のカルボキシ末端に存在してよく、または異種結合ドメインはアミノ末端に存在してよく、ＴＧＦβアンタゴニストはカルボキシ末端に存在してよいことは意図される。本明細書に言及するように、本開示の結合ドメインは、介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン定常領域またはそのサブ領域）のそれぞれの末端と融合することができる。さらに、２つ以上の結合ドメインを、当技術分野で公知であるかまたは本明細書に記載するリンカーによって、介在ドメインにそれぞれ接合させることが可能である。
【０１１２】
本明細書で使用する「介在ドメイン」は、１つまたは複数の結合ドメインの足場としてのみ働くアミノ酸配列を指し、したがって融合タンパク質は、組成物中に単鎖ポリペプチドとして、主に（例えば、５０％以上の融合タンパク質集団）または実質的に（例えば、９０％以上の融合タンパク質集団）存在する。例えば、特定の介在ドメインは、構造機能（例えば、スペーシング、柔軟性、剛性）または生物機能（例えば、ヒト血液中などの血漿中の半減期の増加）を有し得る。血漿中の本開示の融合タンパク質の半減期を増加することができる例示的な介在ドメインには、アルブミン、トランスフェリン、血清タンパク質と結合する足場ドメインなど、またはこれらの断片が含まれる。
【０１１３】
特定の好ましい実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質に含有される介在ドメインは、水素結合、静電的相互作用、ファンデルワース力、ジスルフィド結合、疎水性相互作用など、またはこれらの任意の組合せなどによる、非共有結合または共有結合相互作用による、少なくとも２つの単鎖ポリペプチドまたはタンパク質の結合を促進することができるアミノ酸配列を指す「二量体化ドメイン」である。例示的な二量体化ドメインには、免疫グロブリン重鎖定常領域またはサブ領域が含まれる。二量体化ドメインは、二量体、またはより高次のマルチマー複合体（例えばトリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマーなど）の形成を促進することができることが理解されるはずである。
【０１１４】
「定常サブ領域」は、供給源の抗体中で見られる全ての定常領域ドメインを含むわけではないが、１つまたは複数の免疫グロブリン定常領域ドメインの一部または全部に相当するかまたはそれらに由来する、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列を指すために、本明細書で定義する用語である。好ましい実施形態では、本開示の融合タンパク質の定常領域ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、より好ましくはＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３、およびさらにより好ましくはヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３を含有する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質の定常領域ドメインは、いくつかのＦｃ受容体と結合する能力を保持し（ＦｃＲｎ結合など）、かつｉｎ  ｖｉｖｏでの比較的長い半減期を保持しながら、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、および補体活性化および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の最小エフェクター機能を欠くか、または有する。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインをヒトＩｇＧ１定常領域またはサブ領域と融合させ、ＩｇＧ１定常領域またはサブ領域は、以下：２３４位のロイシン（Ｌ２３４）、２３５位のロイシン（Ｌ２３５）、２３７位のグリシン（Ｇ２３７）、３１８位のグルタミン酸（Ｅ３１８）、３２０位のリシン（Ｋ３２０）、３２２位のリシン（Ｋ３２２）、またはこれらの任意の組合せ（ＥＵナンバリング）が突然変異した１つまたは複数のアミノ酸を有する。
【０１１５】
Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＦｃεＲ１、ＦｃＲｎ）または補体成分Ｃ１ｑ（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；Ｐｒｅｓｔａ（２００２年）Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３：２３７を参照されたい）とＦｃの相互作用を変えることができる突然変異を、Ｆｃドメインの内側または外側に作製するための方法は、当技術分野で公知である。本開示の特定の実施形態は、ＦｃＲｎおよびプロテインＡとの結合が保たれ、Ｆｃドメインが他のＦｃ受容体またはＣ１ｑともはや相互作用しないかまたは最小限で相互作用する、ヒトＩｇＧ由来の定常領域またはサブ領域を有する免疫グロブリンまたは融合タンパク質を含む組成物を含む。例えば、本開示の結合ドメインは、位置２９７のアスパラギン（ＥＵナンバリングの下でＮ２９７）が別のアミノ酸に突然変異して、この位置におけるグリコシル化を低下または消失しており、したがってＦｃγＲおよびＣ１ｑへのＦｃの効果的な結合が無効にされている、ヒトＩｇＧ１定常領域またはサブ領域と融合することができる。別の例示的な突然変異は、Ｃ１ｑの結合はノックアウトしているがＦｃの結合には影響を与えないＰ３３１Ｓである。
【０１１６】
さらなる実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン参照配列と比較して改変型グリコシル化パターンを有し得る。例えば、様々な遺伝的技法のいずれかを利用して、グリコシル化部位を形成する１つまたは複数の特定のアミノ酸残基を変えることができる（Ｃｏら、（１９９３年）Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０巻：１３６１頁；Ｊａｃｑｕｅｍｏｎら、（２００６年）Ｊ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ４巻：１０４７頁；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、（２００５年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５巻：７９３４頁；Ｗａｒｎｏｃｋら、（２００５年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９２巻：８３１頁を参照されたい）。あるいは、本開示の融合タンパク質が産生される宿主細胞を操作して、改変型グリコシル化パターンを生み出すことができる。当技術分野で公知である１つの方法は、例えば、ＡＤＣＣを増大する両断型、非フコシル化変異体の形の改変型グリコシル化をもたらす。これらの変異体は、オリゴ糖修飾酵素を含有する宿主細胞での発現から生じる。あるいは、ＢｉｏＷａ／Ｋｙｏｗａ  ＨａｋｋｏのＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ技術は、本開示によるグリコシル化分子のフコース含有量を減らすために意図される。公知である１つの方法では、ＧＤＰ−フコースの産生によって、免疫グロブリンＦｃ領域のグリコシル化パターンを修飾する、組換え免疫グロブリン産生用のＣＨＯ宿主細胞を提供する。
【０１１７】
あるいは、化学的技法を使用して本開示の融合タンパク質のグリコシル化パターンを改変する。例えば、様々なグリコシダーゼ阻害剤および／またはマンノシダーゼ阻害剤は、ＡＤＣＣ活性の増大、Ｆｃ受容体の結合を増大、およびグリコシル化パターンの改変の、１つまたは複数の所望の効果をもたらす。特定の実施形態では、（ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ｘＲ、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＧＦアンタゴニストと、またはＧＩＴＲアゴニストと結合したＴＧＦβアンタゴニストドメインを含有する）本開示の多重特異性融合タンパク質を発現する細胞を、前記宿主細胞によって産生される免疫糖タンパク質分子のＡＤＣＣを増大する濃度で炭水化物修飾物質を含み、前記炭水化物修飾物質が８００μＭ未満の濃度で存在する培地で増殖する。好ましい実施形態では、これらの多重特異性融合タンパク質を発現する細胞を、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、または８００μＭなど１００〜８００μＭの濃度で、カスタノスペルミンまたはキフネンシン、より好ましくはカスタノスペルミンを含む培地で増殖する。カスタノスペルミンなどの炭水化物修飾物質を用いてグリコシル化を改変するための方法は、米国特許出願公開Ｎｏ．２００９／００４１７５６またはＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ２００８／０５２０３０中に与えられる。
【０１１８】
別の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、エフェクター細胞Ｆｃ受容体への結合に影響を与えるアミノ酸修飾を有し得る。これらの修飾は、Ｐｒｅｓｔａら（２００１年）Ｂｉｏｃｈｅｎｎ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ３０巻：４８７頁に開示された手法などの、当技術分野で公知である任意の技法を使用して作製することができる。別の手法では、Ｘｅｎｃｏｒ  ＸｍＡｂ技術を利用して、Ｆｃドメインに相当する定常サブ領域を操作して、細胞殺傷エフェクター機能を高めることが可能である（Ｌａｚａｒら、（２００６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  １０３巻：４００５頁を参照されたい）。この手法を使用して、例えば、ＦＣγＲに対する改善された特異性および結合性を有する定常サブ領域を作製し、それによって細胞殺傷エフェクター機能を高めることができる。
【０１１９】
またさらなる実施形態では、定常領域またはサブ領域は、このような介在ドメインを欠く、相当する融合タンパク質と比較して、血漿半減期または胎盤通過を場合によっては増大することができる。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の延長した血漿半減期は、ヒトにおいて、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２４、少なくとも３０、少なくとも３６、少なくとも４０、少なくとも４８時間、少なくとも数日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも数週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも数カ月以上である。
【０１２０】
定常サブ領域は、以下のドメイン：ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ）、およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）のいずれかの一部または全部を含むことができる。したがって、本明細書で定義する定常サブ領域は、免疫グロブリン定常領域の一部分に相当するポリペプチドを指すことができる。定常サブ領域は、同じ、または異なる、免疫グロブリン、抗体アイソタイプ、または対立遺伝子変異体由来のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは切断型であり、その配列を参照によって本明細書に組み込む、配列番号３６６〜３７１としてＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ２００７／１４６９６８中に挙げられたカルボキシ末端配列を含む。特定の実施形態では、本開示のポリペプチドの定常サブ領域は、アミノ末端リンカー、カルボキシ末端リンカー、または両末端のリンカーを場合によっては有してよい、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する。
【０１２１】
「リンカー」は、約２〜約１５０アミノ酸のリンカーなどの、他のペプチドまたはポリペプチドと接合または連結したペプチドである。本開示の融合タンパク質において、リンカーは介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン由来定常サブ領域）と結合ドメインを接合することができ、またはリンカーは結合ドメインの２つの可変領域を接合することができる。例えばリンカーは、抗体ヒンジ領域配列から得られる、由来する、または設計されるアミノ酸配列、結合ドメインを受容体に連結する配列、または結合ドメインを細胞表面膜貫通領域または膜アンカーに連結する配列であってよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、生理的条件または他の標準的ペプチド条件（例えば、ペプチド精製条件、ペプチド保存に関する条件）下で少なくとも１つのジスルフィド結合に関与することができる、少なくとも１つのシステインを有することができる。特定の実施形態では、免疫グロブリンヒンジペプチドに相当するかまたはそれに類似するリンカーは、そのヒンジのアミノ末端に向けて位置するヒンジシステインに相当するシステインを保持する。さらなる実施形態では、リンカーはＩｇＧ１またはＩｇＧ２Ａヒンジに由来し、ヒンジシステインに相当する１つのシステインまたは２つのシステインを有する。特定の実施形態では、１つまたは複数のジスルフィド結合は介在ドメイン間の鎖間ジスルフィド結合として形成される。他の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、結合ドメインに直接融合した介在ドメインを有することができる（すなわち、リンカーまたはヒンジなし）。いくつかの実施形態では、介在ドメインは二量体化ドメインである。
【０１２２】
本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインまたは二量体化ドメインを、ペプチドリンカーによって１つまたは複数の末端結合ドメインに結合させることが可能である。スペーシング機能を与えることに加え、リンカーは、融合タンパク質内および、融合タンパク質とそれらの標的（複数可）間またはそれらの中の両方で、融合タンパク質の１つまたは複数の結合ドメインを正確に配向するのに適した、柔軟性または剛性を与えることができる。さらにリンカーは、ヒトなどの、投与の必要性のある被験体への投与後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で完全長融合タンパク質の発現および精製タンパク質の安定性を助長することができ、これらの同じ被験体で非免疫原性であるかまたは免疫原性が低いことが好ましい。特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインまたは二量体化ドメインのリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジの一部または全部を含むことができる。
【０１２３】
さらに、結合ドメインはＶＨおよびＶＬドメインを含むことができ、これらの可変領域ドメインはリンカーによって組合せることができる。例示的な可変領域結合ドメインリンカーには、ｎが１〜５の整数である、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなどの（ＧｌｙｎＳｅｒ）ファミリーに属するリンカーが含まれる（例えば、それぞれ配列番号５１８、５２５、５４２、５８５、５８６および６０３に相当するリンカー２２、２９、４６、８９、９０および１１６を参照されたい）。好ましい実施形態では、これらの（ＧｌｙｎＳｅｒ）ベースのリンカーは可変ドメインを連結させるために使用し、結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を介在ドメイン（例えば、ＩｇＧ  ＣＨ２ＣＨ３）に連結させるためには使用しない。
【０１２４】
介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン由来定常サブ領域）を結合ドメインに接合するため、または結合ドメインの２つの可変領域を接合するために使用することができる例示的なリンカーは、配列番号４９７〜６０４および１２２３〜１２２８で提供する。
【０１２５】
本開示で意図するリンカーには、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの任意のドメイン間領域（例えば、抗体ヒンジ領域）、またはＩＩ型膜タンパク質のファミリーであるＣ型レクチンの茎部領域由来のペプチドが含まれる。これらのリンカーは、約２〜約１５０アミノ酸、または約２〜約４０アミノ酸、または約８〜約２０アミノ酸、好ましくは約１０〜約６０アミノ酸、より好ましくは約１０〜約３０アミノ酸、および最も好ましくは約１５〜約２５アミノ酸の長さ範囲である。例えば、リンカー１（配列番号４９７）は２アミノ酸長であり、リンカー１１６（配列番号６０３）は３６アミノ酸長である。
【０１２６】
一般的な長さ以外を考慮すると、本開示の融合タンパク質における使用に適したリンカーには、ＩｇＧヒンジ、ＩｇＡヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＩｇＥヒンジ、またはそれらの変異体から選択される抗体ヒンジ領域が含まれる。特定の実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、またはそれらの断片もしくは変異体から選択される抗体ヒンジ領域（上部およびコア領域）であってよい。本明細書で使用するように、「免疫グロブリンヒンジ領域」であるリンカーは、ＣＨ１のカルボキシル末端と（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤに関して）ＣＨ２のアミノ末端または（ＩｇＥおよびＩｇＭに関して）ＣＨ３のアミノ末端の間に見られるアミノ酸を指す。本明細書で使用する「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の重鎖に見られる、（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤに関して）ＣＨ１領域とＣＨ２領域の間に介入しそれらを結び付ける、または（ＩｇＥおよびＩｇＭに関して）ＣＨ２領域とＣＨ３領域の間に介入しそれらを結び付ける、天然に存在するアミノ酸配列を指す。好ましい実施形態では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列はヒトである。
【０１２７】
結晶学的研究によれば、ＩｇＧヒンジドメインは、機能上および構造上３つの領域：上部ヒンジ領域、コアまたは中央ヒンジ領域、および底部ヒンジ領域に分割することができる（Ｓｈｉｎら、（１９９２年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０巻：８７頁）。例示的な上部ヒンジ領域には、ＩｇＧ１で見られるＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１２４０）、ＩｇＧ２で見られるＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号１２４１）、ＩｇＧ３で見られるＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴ  ＨＴ（配列番号１２４２）またはＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ（配列番号１２４３）、およびＩｇＧ４で見られるＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号１２４４）が含まれる。例示的な中央ヒンジ領域には、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２で見られるＣＰＰＣＰ（配列番号１２４５）、ＩｇＧ３で見られるＣＰＲＣＰ（配列番号１２４６）、およびＩｇＧ４で見られるＣＰＳＣＰ（配列番号１２４７）が含まれる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４抗体はそれぞれ１つの上部および中央ヒンジを有するようであり、一方ＩｇＧ３は、４つ（１つのＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴ  ＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号１２４８）および３つのＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ  ＣＰＲＣＰ（配列番号１２４９））をタンデムで有する。
【０１２８】
ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体はＩｇＧ様コア領域を欠くようであり、ＩｇＤは２つの上部ヒンジ領域をタンデムで有するようである（配列番号１２５０および１２５１を参照されたい）。ＩｇＡ１およびＩｇＡ２抗体で見られる例示的な野生型上部ヒンジ領域は、配列番号１２５２および１２５３において述べる。
【０１２９】
ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体は、対照的に、典型的なヒンジ領域の代わりに、ヒンジ様の性質を有するＣＨ２領域を有する。ＩｇＥおよびＩｇＭの例示的な野生型ＣＨ２上部ヒンジ様配列は、それぞれ配列番号１２５４（ＶＣＳＲＤＦＴＰＰＴ  ＶＫＩＬＱＳＳＳＤＧ  ＧＧＨＦＰＰＴＩＱＬ  ＬＣＬＶＳＧＹＴＰＧ  ＴＩＮＩＴＷＬＥＤＧ  ＱＶＭＤＶＤＬＳＴＡ  ＳＴＴＱＥＧＥＬＡＳ  ＴＱＳＥＬＴＬＳＱＫ  ＨＷＬＳＤＲＴＹＴＣ  ＱＶＴＹＱＧＨＴＦＥ  ＤＳＴＫＫＣＡ）および配列番号１２５５（ＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳ  ＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦ  ＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣ  ＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩ  ＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱ  ＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶ  ＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴ  ＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩ  ＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭ  ＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬ  ＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣ  ＶＰ）に記載される。
【０１３０】
「改変野生型免疫グロブリンヒンジ領域」または「改変型免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ａ）最大３０％のアミノ酸が変化した（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失の）野生型免疫グロブリンヒンジ領域、（ｂ）最大３０％のアミノ酸が変化した（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失の）少なくとも１０アミノ酸長（例えば、少なくとも１２、１３、１４または１５アミノ酸長）である野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部分、または（ｃ）コアヒンジ領域を含む野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部分（その一部分は４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長であってよい）を指す。特定の実施形態では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域の１つまたは複数のシステイン残基を、１つまたは複数の他のアミノ酸残基（例えば、１つまたは複数のセリン残基）によって置換することができる。改変型免疫グロブリンヒンジ領域は、別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によって置換された野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を、代替的または追加的に有することができる。
【０１３１】
結合領域（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）として使用することができる代わりのヒンジおよびリンカー配列は、ＩｇＶ様またはＩｇＣ様ドメインを結合させる細胞表面受容体の一部分から作製することができる。細胞表面受容体が多数のＩｇＶ様ドメインをタンデムで含有するＩｇＶ様ドメイン間の領域、および細胞表面受容体が複数のタンデムＩｇＣ様領域を含有するＩｇＣ様ドメイン間の領域も、結合領域またはリンカーペプチドとして使用することができる可能性がある。特定の実施形態では、ヒンジおよびリンカー配列は５〜６０アミノ酸長であり、主として柔軟性である場合があるが、さらなる剛性特性を与える場合もあり、最小β−シート構造とともにα−らせん構造を主として含有する場合がある。配列は血漿および血清中で安定であり、タンパク質分解的切断に耐性があることが好ましい。いくつかの実施形態では、配列は１つまたは複数のジスルフィド結合を形成して分子のＣ末端を安定化する能力を与える、ＣＰＰＣなどの天然に存在するモチーフまたは加えられたモチーフを含んでよい。他の実施形態では、配列は１つまたは複数のグリコシル化部位を含んでよい。ヒンジおよびリンカー配列の例には、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ６６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９６、ＣＤ１５０、ＣＤ１６６、およびＣＤ２４４の、ＩｇＶ様とＩｇＣ様の間またはＩｇＣ様またはＩｇＶ様ドメインの間のドメイン間領域が含まれる。代わりのヒンジは、ＣＤ６９、ＣＤ７２およびＣＤ１６１などの非免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー由来のＩＩ型受容体のジスルフィド含有領域から作製することもできる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ヒンジリンカーは、鎖間ジスルフィド結合を形成するための１つのシステイン残基を有する。他の実施形態では、リンカーは、鎖間ジスルフィド結合を形成するための２つのシステイン残基を有する。さらなる実施形態では、ヒンジリンカーは、免疫グロブリンドメイン間領域（例えば、ＩｇＧ１ヒンジの上部およびコア配列を含む抗体ヒンジ領域など）、またはＩＩ型Ｃ型レクチンの茎部領域（ＩＩ型膜タンパク質由来、例えば、ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ２００７／１４６９６８からの配列番号１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８７、２８９、２９７、３０５、３０７、３０９〜３１１、３１３〜３３１、３４６、３７３〜３７７、３８０、または３８１などの、該刊行物に記載された例示的なレクチンの茎部領域配列を参照されたい）に由来しており、、それらの配列は参照によって本明細書に組み込む。
【０１３３】
一態様では、本明細書に記載するＴＧＦβアンタゴニストを含有する例示的な多重特異性融合タンパク質は、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＧＦアンタゴニスト、またはＧＩＴＲアゴニストなどのＴＧＦβ以外の標的に特異的である、少なくとも１つの追加的結合領域（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）または結合ドメインも含有する。例えば、本開示の多重特異性融合タンパク質は、介在ドメイン（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ＣＨ３  Ｆｃ領域など）によって、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＧＦアンタゴニスト、またはＧＩＴＲアゴニストドメインと連結したＴＧＦβアンタゴニストドメインを有する。特定の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、第一および第２の結合ドメイン、第一および第２のリンカー、ならびに介在ドメインを含み、この介在ドメインの一末端は、ＴＧＦβアンタゴニストである第１の結合ドメイン（例えば、ＴＧＦβＲ２外部ドメイン、抗ＴＧＦβＲ２外部ドメイン、抗ＴＮＦ−ＴＧＦβ）に第１のリンカーを介して融合し、そして他の末端では第２のリンカーを介して、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＧＦアンタゴニスト、またはＧＩＴＲアゴニストである異なる結合ドメインに融合している。
【０１３４】
特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の第１のリンカーと第２のリンカーは、例えば配列番号４９７〜６０４および１２２３〜１２２８からそれぞれ独立に選択される。例えば、第１または第２のリンカーは、リンカー１０２（配列番号５８９）、４７（配列番号５４３）、８０（配列番号５７６）、またはこれらの任意の組合せであってよい。さらなる例では、１つのリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）であり、かつ他のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）であり、または１つのリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）であり、かつ他のリンカーはリンカー８０（配列番号５７６）である。さらなる例では、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ｘＲ、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＧＦ、ＧＩＴＲ、ＴＧＦβＲ２外部ドメイン、またはＴＧＦβに特異的なドメインなどの、ＶＨおよびＶＬドメインを含む本開示の結合ドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に、リンカー４６（配列番号５４２）などのさらなる（第３の）リンカーを有することができる。これらの実施形態のいずれかにおいて、リンカーは１〜５個の追加的接合アミノ酸と隣接している場合があり、これは単にこのような組換え分子の作製の結果であり得るか（例えば、核酸分子を接合するための特定の制限酵素認識部位の使用は、１個〜数個のアミノ酸の挿入をもたらす場合がある）、または本開示の目的のために、任意の特定のリンカーコア配列の一部と考えることができる。
【０１３５】
さらなる実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインは、免疫グロブリン定常領域またはサブ領域から構成され（好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤのＣＨ２ＣＨ３、またはＩｇＥもしくはＩｇＭのＣＨ３ＣＨ４）、介在ドメインはＴＧＦβアンタゴニストドメインと、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＧＦ、アンタゴニスト結合ドメインまたはＧＩＴＲアゴニスト結合ドメインの間に配置される。特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインは、アミノ末端にＴＧＦβアンタゴニスト、およびカルボキシ末端にＩＬ６、ＩＬ６ｘＲ、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＧＦまたはＧＩＴＲに特異的な結合ドメインを有する。他の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインは、アミノ末端にＩＬ６、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＧＦアンタゴニスト結合ドメインまたはＧＩＴＲアゴニスト結合ドメインに特異的な結合ドメイン、およびカルボキシ末端にＴＧＦβアンタゴニストを有する。さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域サブ領域は免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。関連実施形態では、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、以下の突然変異したアミノ酸（すなわち、その位置に異なるアミノ酸を有する）：２３４位のロイシン（Ｌ２３４）、２３５位のロイシン（Ｌ２３５）、２３７位のグリシン（Ｇ２３７）、３１８位のグルタミン酸（Ｅ３１８）、３２０位のリシン（Ｋ３２０）、３２２位のリシン（Ｋ３２２）、またはこれらの任意の組合せ（ＥＵナンバリング）の１つまたは複数を有する。例えば、これらのアミノ酸のいずれか１つをアラニンに変えることができる。さらなる実施形態では、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、ＣＨ２ドメインは、それぞれアラニンに突然変異したＬ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２（すなわち、それぞれＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ）を有する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、ＴＧＦβＲ２外部ドメインまたはＴＧＦβＲ２外部ドメインのサブドメイン、またはこれらの任意の組合せを含む、ＴＧＦβアンタゴニストを有する。例えば、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０２００１８．１に記載のアミノ酸７３〜１７６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２３３．４に記載のアミノ酸４８〜１５１、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。さらなる実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、配列番号７４３または７４４に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１３７】
さらなる実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストを有する本開示の多重特異性融合タンパク質はまた、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独のいずれかに対するよりＩＬ６ｘＲに対して高い親和性を有し、ｓＩＬ６ｘＲ複合体のｍｇｐ１３０への結合と競合し、またはｓｇｐ１３０のｓＩＬ６ｘＲ複合体への結合を高める、ＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインを有する。特定の実施形態では、ＩＬ６ｘＲに特異的な結合ドメインは、（ｉ）配列番号４３５〜４９６のいずれか１つにおいて見られるＶＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、または（ｉｉ）配列番号３７３〜４３４のいずれか１つにおいて見られるＶＬドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、または（ｉｉｉ）（ｉ）のＶＨドメインと（ｉｉ）のＶＬドメインの両方、またはＶＨとＶＬが同じ参照配列に由来する（ｉ）のＶＨドメインと（ｉｉ）のＶＬドメインの両方を含む。一実施形態では、このようなＶＨおよびＶＬドメインは、例示的な結合ドメインＴＲＵ６−１０１９を形成することができる（それぞれ配列番号４５３および３９１を参照されたい）。
【０１３８】
なおさらなる実施形態では、ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒαに対するより、またはＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒαいずれかの単独に対するよりも、ＩＬ６ｘＲに対して高い親和性で結合し、ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合に関してｇｐ１３０と競合し、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体へのｓｇｐ１３０の結合を高めるＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、フレームワーク領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むＶＨおよびＶＬドメインを含み、（ａ）ＶＨドメインは配列番号４３５〜４９６おのいずれか１つにおいて見られる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｂ）ＶＬドメインは配列番号３７３〜４３４のいずれか１つにおいて見られる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｃ）結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含むか、または、ＶＨアミノ酸配列とＶＬアミノ酸配列が同じ参照配列に由来する結合ドメインは、（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含む。これらの多重特異性融合タンパク質のＶＬドメインとＶＨドメインはいずれかの配向に配置することができ、本明細書に開示する最大約５〜３０アミノ酸のリンカーによって隔てることができる。特定の実施形態では、ＶＨドメインとＶＬドメインを接合するリンカーは、リンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインを含む多重特異性融合タンパク質は、ＩＬ６シスおよびトランスシグナル伝達、好ましくはトランスシグナル伝達を測定可能に阻害し、および場合によっては、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。
【０１３９】
本明細書でＸｃｅｐｔｏｒ分子と呼ぶ、このような多重特異性融合タンパク質の例示的な構造は、ＢＤが免疫グロブリン様または免疫グロブリン可変領域結合ドメインであり、Ｘが介在ドメインであり、かつＥＤが受容体外部ドメインなどである、Ｎ−ＢＤ−Ｘ−ＥＤ−Ｃ、Ｎ−ＥＤ−Ｘ−ＢＤ−Ｃ、Ｎ−ＥＤ１−Ｘ−ＥＤ２−Ｃを含む。いくつかの構築物では、Ｘは第１と第２の結合ドメインの間に配置された免疫グロブリン定常領域またはサブ領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下のような構造：−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−（Ｌ１およびＬ２がそれぞれ独立に２〜約１５０アミノ酸を含むリンカーであり、かつＸが免疫グロブリン定常領域またはサブ領域である）を含む介在ドメイン（Ｘ）を有する。さらなる実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、または別の血清タンパク質結合タンパク質である介在ドメインを有し、該融合タンパク質は組成物中に単鎖ポリペプチドとして主にまたは実質的に存在する。なおさらなる実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、以下の構造：Ｎ−ＢＤ１−Ｘ−Ｌ２−ＢＤ２−Ｃを有し、ここで、ＮおよびＣがアミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ表し、ＢＤ１がＴＧＦβＲ２の外部ドメインと少なくとも約９０％同一であるＴＧＦβアンタゴニストであり、−Ｘ−が−Ｌ１−ＣＨ２ＣＨ３−であり、式中のＬ１が第一システインの置換により場合によっては突然変異した第一ＩｇＧ１ヒンジであり、式中の−ＣＨ２ＣＨ３−が、場合によっては突然変異して、ＦｃＲｎの相互作用を保持しながらＦｃγＲＩ−ＩＩＩ相互作用が消失した、ＩｇＧ１ＦｃドメインのＣＨ２ＣＨ３領域であり、Ｌ２が配列番号４９７〜６０４および１２２３〜１２２８から選択されるリンカーであり、かつＢＤ２がＩＬ６またはＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインである。
【０１４０】
特定の実施形態では、多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号７４３もしくは７４４に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦβアンタゴニスト、および（ｂ）それぞれ配列番号４３５〜４９６に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１、ＣＤ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号３７３〜４３４に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むＩＬ６アンタゴニストを有し、アミノ末端からカルボキシ末端またはカルボキシ末端からアミノ末端で、（ｉ）（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＬ６アンタゴニストが第１のリンカーと融合しており、（ｉｉ）第１のリンカーが配列番号６２５のアミノ酸２７６〜４８９を含むＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合しており、（ｉｉｉ）ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合しており、そして（ｉｖ）第２のリンカーが（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＬ６アンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）であり、第２のリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）であり、ＩＬ６アンタゴニストのＶＨドメインとＶＬドメインの間のさらなる（第３の）リンカーはリンカー４６（配列番号５４２）である。
【０１４１】
他の実施形態では、多重特異性Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号７４３もしくは７４４に記載の配列に少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦβアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号７４５のアミノ酸配列または配列番号７４５のアミノ酸２２〜４０１と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ１０アンタゴニストを有し、アミノ末端からカルボキシ末端またはカルボキシ末端からアミノ末端で、（ｉ）（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＬ１０アンタゴニストが第１のリンカーと融合しており、（ｉｉ）第１のリンカーがＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合しており、（ｉｉｉ）ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合しており、そして（ｉｖ）第２のリンカーが（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＬ１０アンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）であり、第２のリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）である。
【０１４２】
さらなる実施形態では、多重特異性Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号７４３もしくは７４４に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦβアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号７４７のアミノ酸配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＥＧＦアンタゴニストを有し、ここで、アミノ末端からカルボキシ末端またはカルボキシ末端からアミノ末端で、（ｉ）（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＶＥＧＦアンタゴニストが第１のリンカーと融合しており、（ｉｉ）第１のリンカーがＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合しており、（ｉｉｉ）ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合しており、そして（ｉｖ）第２のリンカーが（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＶＥＧＦアンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）であり、第２のリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）である。
【０１４３】
さらなる実施形態では、多重特異性Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号７４３もしくは７４４に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦβアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号７４８または７４９のアミノ酸と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦαアンタゴニストを有し、ここで、アミノ末端からカルボキシ末端またはカルボキシ末端からアミノ末端で、（ｉ）（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＴＮＦαアンタゴニストが第１のリンカーと融合しており、（ｉｉ）第１のリンカーがＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合しており、（ｉｉｉ）ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合しており、そして（ｉｖ）第２のリンカーが（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＴＮＦαアンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）であり、第２のリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）である。具体的な実施形態では、多重特異性Ｘｃｅｐｔｏ融合タンパク質は配列番号１２３６のアミノ酸配列を有する。
【０１４４】
さらなる実施形態では、多重特異性Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号７４３または７４４に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦβアンタゴニスト、および（ｂ）それぞれ配列番号９２１〜１０７８に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１、ＣＤ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号７６２〜９２０に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むＨＧＦアンタゴニストを有し、ここで、アミノ末端からカルボキシ末端またはカルボキシ末端からアミノ末端で、（ｉ）（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＨＧＦアンタゴニストが第１のリンカーと融合しており、（ｉｉ）第１のリンカーがＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合しており、（ｉｉｉ）ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合しており、そして（ｉｖ）第２のリンカーが（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＨＧＦアンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）であり、第２のリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）であり、ＨＧＦアンタゴニストのＶＨドメインとＶＬドメインの間のさらなる（第３の）リンカーはリンカー４６（配列番号５４２）である。
【０１４５】
さらに他の実施形態では、多重特異性Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号７４３または７４４に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦβアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号７６１のアミノ酸配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＷＥＡＫアンタゴニストを有し、ここで、アミノ末端からカルボキシ末端またはカルボキシ末端からアミノ末端で、（ｉ）（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＴＷＥＡＫアンタゴニストが第１のリンカーと融合しており、（ｉｉ）第１のリンカーがＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合しており、（ｉｉｉ）ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合しており、そして（ｉｖ）第２のリンカーが（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＴＷＥＡＫアンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）であり、かつ第２のリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）である。具体的実施形態では、多重特異性Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は配列番号１２３７のアミノ酸配列を有する。
【０１４６】
さらに他の実施形態では、多重特異性Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号７４３もしくは７４４に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦβアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号７５４〜７６０のアミノ酸配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＩＧＦアンタゴニストを有し、ここで、アミノ末端からカルボキシ末端またはカルボキシ末端からアミノ末端で、（ｉ）（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＧＦアンタゴニストが第１のリンカーと融合しており、（ｉｉ）第１のリンカーがＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合しており、（ｉｉｉ）ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合しており、そして（ｉｖ）第２のリンカーが（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＧＦアンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）であり、かつ第２のリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）である。
【０１４７】
他の実施形態では、多重特異性Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号７４３または７４４に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦβアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号７４６のアミノ酸７４〜１８１と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＧＩＴＲアゴニストを有し、ここで、アミノ末端からカルボキシ末端またはカルボキシ末端からアミノ末端で、（ｉ）（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＧＩＴＲアゴニストが第１のリンカーと融合しており、（ｉｉ）第１のリンカーがＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合しており、（ｉｉｉ）ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合しており、そして（ｉｖ）第２のリンカーが（ａ）のＴＧＦβアンタゴニストまたは（ｂ）のＧＩＴＲアゴニストと融合している。特定の実施形態では、第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）であり、第２のリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）である。
多重特異性融合タンパク質の作製
本明細書に記載する任意の結合ドメインポリペプチドまたは融合タンパク質を効率よく産生するために、リーダーペプチドを使用して発現されるポリペプチドおよび融合タンパク質の分泌を容易にする。任意の従来のリーダーペプチド（シグナル配列）の使用により、新たに（ｎａｓｃｅｎｔｌｙ）発現されたポリペプチドまたは融合タンパク質を分泌経路に誘導し、リーダーペプチドとポリペプチドまたは融合タンパク質の間の接合部においてまたはその近辺での成熟ポリペプチドまたは融合タンパク質からのリーダーペプチドの切断をもたらすと予想される。特定のリーダーペプチドは、分子操作を容易にするためのリーダーペプチドのコード配列の最初のところまたは最後のところに制限エンドヌクレアーゼ切断部位の容易な含有（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）を可能にする、ポリヌクレオチドによってコードされる配列の使用など、当技術分野で公知である考慮事項に基づいて選択される。ただし、このような導入配列は、新たに発現されたタンパク質からのリーダーペプチドのいかなる所望のプロセシングにも許容されない形では干渉しない、またはリーダーペプチドがポリペプチドまたは融合タンパク質の成熟中に切断されない場合、ポリペプチドまたは融合タンパク質分子のいかなる所望の機能にも許容されない形では干渉しないかのいずれかである、アミノ酸を指定するものとする。本開示の例示的なリーダーペプチドには、天然リーダー配列（すなわち、天然タンパク質で発現される配列）、またはＸが任意のアミノ酸でありｎが０〜３であるＨ３Ｎ−ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧ（Ｘ）ｎ−ＣＯ２Ｈ（配列番号１１８５）またはＨ３Ｎ−ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ−ＣＯ２Ｈ（配列番号１１８６）などの異種リーダー配列の使用が含まれる。
【０１４８】
本明細書に記すように、本明細書に記載する、外部ドメインなどの結合ドメインの変異体および誘導体、軽鎖および重鎖可変領域およびＣＤＲが意図される。一例では、１つまたは複数のアミノ酸残基が特異的結合因子のアミノ酸配列を補充する挿入変異体を提供する。挿入はタンパク質の一末端または両末端に位置してよく、または特異的結合因子のアミノ酸配列の内部領域内に位置してよい。本開示の変異体生成物は、成熟状態の特異的結合因子の生成物、すなわちリーダー配列またはシグナル配列が除去され、生成するタンパク質が追加的アミノ末端残基を有する特異的結合因子の生成物も含む。追加的アミノ末端残基は別のタンパク質に由来してよく、または特異的タンパク質に由来するとして同定可能ではない１つまたは複数の残基を含むことができる。位置−２および−１に追加的メチオニンおよびリシン残基を有する本開示のポリペプチドと同様に、位置−１に追加的メチオニン残基を有するポリペプチドを意図する。追加のＭｅｔ、Ｍｅｔ−ＬｙｓまたはＬｙｓ残基（または一般に１つまたは複数の塩基性残基）を有する変異体は、細菌宿主細胞中での高い組換えタンパク質産生に特に有用である。
【０１４９】
本明細書で使用する「アミノ酸」は、天然アミノ酸（自然界に存在するアミノ酸）、置換された天然アミノ酸、非天然アミノ酸、置換された非天然アミノ酸、またはこれらの任意の組合せを指す。天然アミノ酸に関する指定は、本明細書では標準一文字または三文字コードのいずれかとして記す。天然極性アミノ酸は、アスパラギン（ＡｓｐまたはＮ）およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、およびアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、およびこれらの誘導体などの塩基性アミノ酸、ならびにアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、およびこれらの誘導体などの酸性アミノ酸を含む。天然疎水性アミノ酸は、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、およびこれらの誘導体、ならびにグリシン（ＧＩｙまたはＧ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、およびこれらの誘導体などの他の非極性アミノ酸を含む。中程度の極性の天然アミノ酸は、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、およびこれらの誘導体を含む。他に指定しない限り、本明細書に記載する任意のアミノ酸はＤ−またはＬ−形状（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）のいずれかであってよい。
【０１５０】
置換変異体は、アミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基が除去され代わりの残基に置換されている融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、置換は現実には保存性であるが、しかしながら、本開示は非保存的である置換も包含する。物理的性質および二次および三次タンパク質構造に対する寄与に従って、アミノ酸を分類することができる。保存的置換は、類似した性質を有する別のアミノ酸に代えて１つのアミノ酸の置換として、当技術分野で理解されている。例示的な保存的置換は、すぐ下の表１に記載する（１９９７年３月１３日に公開されたＷＯ９７／０９４３３、１０頁を参照されたい）。
【０１５１】
【表１】
2011526794.tif 000002
あるいは、保存的アミノ酸は、すぐ下の表２に述べるように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．  ＮＹ：ＮＹ（１９７５年）、７１〜７７頁）に記載されたのと同様に分類することができる。
【０１５２】
【表２】
2011526794.tif 000003
変異体または誘導体は、特異的発現系の使用から生じる追加のアミノ酸残基を有することもできる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合生成物の一部として所望のポリペプチドを発現する市販のベクターの使用は、該所望のポリペプチドからのＧＳＴ成分の切断後に位置−１に追加のグリシン残基を有する、該所望のポリペプチドを与える。ヒスチジンタグが、アミノ酸配列、一般に配列のカルボキシおよび／またはアミノ末端に取り込まれている変異体を含めた、他のベクター系での発現から生じる変異体も意図される。
【０１５３】
本開示の結合ドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸残基が除去されている、欠失変異体も意図される。欠失は融合タンパク質の一末端もしくは両末端で生じ得るか、またはアミノ酸配列内の１つもしくは複数の残基の除去からもたらされ得る。
【０１５４】
特定の例示的実施形態では、本開示の融合タンパク質はグリコシル化されており、グリコシル化のパターンは、（組換え宿主細胞で調製される場合）タンパク質が発現される宿主細胞、および培養条件を含めた様々な要因に依存する。
【０１５５】
本開示は、融合タンパク質の誘導体も提供する。誘導体は、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾を有する特異的結合ドメインポリペプチドを含む。特定の実施形態では、修飾は現実には共有結合であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機および無機成分との化学結合を含む。本開示の誘導体を調製して特異的結合ドメインポリペプチドの循環半減期を増大することができ、または本開示の誘導体を設計して、所望の細胞、組織もしくは器官に対する該ポリペプチドの標的化能力を改善することができる。
【０１５６】
本開示は、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号および同第４，１７９，３３７号に記載されたような、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールなどの１つまたは複数の水溶性ポリマーの結合を含むように、共有結合により修飾されたかまたは誘導体化された融合タンパク質をさらに包含する。当技術分野で公知であるさらに他の有用なポリマーには、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースおよび他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、およびこれらのポリマーの混合物が挙げられる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体化タンパク質である。水溶性ポリマーは特異的位置、例えば本開示によるタンパク質およびポリペプチドのアミノ末端で結合することができ、またはポリペプチドの１つもしくは複数の側鎖とランダムに結合することができる。治療能力を改善するためのＰＥＧの使用は米国特許第６，１３３，４２６号に記載される。
【０１５７】
本開示の特定の実施形態は免疫グロブリンまたはＦｃ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、特にＦｃドメインがＦｃＲｎ、新生児Ｆｃ受容体と相互作用することができる場合、長い半減期、例えば数時間、１日以上、またはさらに１週間以上を有することができる。ＦｃドメインにおけるＦｃＲｎに関する結合部位は、細菌プロテインＡおよびＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質間の強い結合は、例えば、タンパク質精製中にプロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーを利用することによって、本開示の抗体または融合タンパク質を精製するための手段として使用することができる。
【０１５８】
タンパク質の精製技法は当業者には周知である。これらの技法は、１レベルでの、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分の粗製物分画を含む。部分的または完全な精製（または均質性までの精製）を実施するためにクロマトグラフィー技法および電気泳動技法を使用する、さらなる精製がしばしば所望される。純粋融合タンパク質の調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に有効な方法は、迅速タンパク質液体クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣである。
【０１５９】
本開示の特定の態様は、融合タンパク質の精製、および特定の実施形態では、融合タンパク質の実質的精製に関する。本明細書で使用する用語「精製融合タンパク質」は他の成分から単離可能な組成物を指すものとし、融合タンパク質は、その自然に得られる状態に対して任意の程度まで精製される。したがって精製融合タンパク質は、それが天然に存在し得る環境から遊離した融合タンパク質も指す。
【０１６０】
一般に「精製された」は、様々な他の成分を除去するための分画を施した融合タンパク質の組成物を指し、その組成物はその発現される生物活性を実質的に保持する。用語「実質的に精製された」を使用する場合、この表記は、融合タンパク質が組成物の主成分を形成する：例えば、組成物の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９重量％以上のタンパク質を構成する、融合結合タンパク質の組成物を指す。
【０１６１】
精製度を定量化するための様々な方法は、本開示に照らすと当業者には公知である。これらは例えば、活性画分の特異的結合活性の決定、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による画分の融合タンパク質の量の評価を含む。タンパク質画分の純度を評価するのに好ましい方法は、画分の結合活性を計算し、それを初期抽出物の結合活性と比較し、したがって「精製倍数」によって評価する本明細書の精製度を計算することである。結合活性の量を表すために使用する実際の単位は、当然ながら、精製を追跡するために選択する個々のアッセイ技法、および発現される融合タンパク質が検出可能な結合活性を示すかどうかに依存する。
【０１６２】
タンパク質精製において使用するのに適した様々な技法は、当業者には周知である。これらは例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いた沈澱、または熱変性、次に遠心分離；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、および親和性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；およびこれらの技法と他の技法の組合せを含む。当技術分野で一般に公知であるように、これらの様々な精製工程を実施する順序は変えることができること、または特定の工程を省略して、実質的に精製されたタンパク質の調製に適した方法をさらにもたらすことができることが考えられる。
【０１６３】
融合タンパク質は常にその最も精製された状態で提供されるという、一般要件は存在しない。実際、実質的にあまり精製されていないタンパク質が、特定の実施形態において有用性があるということが意図される。部分的な精製は、組合せにおいてより少ない精製工程を使用することによって、または同じ一般的な精製スキームの異なる形態を利用することによって実施することができる。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実施するカチオン交換カラムクロマトグラフィーは、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技法より高い精製を、一般にもたらすであろうことは理解される。相対的低精製度を示す方法は、タンパク質産物の全体的回収、または発現されたタンパク質の結合活性の維持において利点があり得る。
【０１６４】
ポリペプチドの移動は、異なるＳＤＳ／ＰＡＧＥ条件と共に、時には著しく変わる可能性があることは公知である（Ｃａｐａｌｄｉら（１９７７年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ７６巻：４２５頁）。したがって、異なる電気泳動条件下において、精製または部分的に精製された融合タンパク質発現産物の見かけの分子量が、変わる可能性があることは理解されよう。
ポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
本開示は、本開示の多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（単離または精製または純粋ポリヌクレオチド）、このようなポリヌクレオチドを含むベクター（クローニングベクターおよび発現ベクターを含む）、および本開示によるポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトした細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。
【０１６５】
特定の実施形態では、本開示の結合ドメイン、または１つまたは複数のこのような結合ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意図する。多重特異性融合タンパク質構築物をコードする発現カセットは、添付の実施例おいて提供される。
【０１６６】
本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含むベクター、および特に、組換え発現構築物にも関する。一実施形態では、本開示は、本開示のＴＧＦβアンタゴニストドメインおよびＩＬ６またはＩＬ６／ＩＬ６Ｒ結合ドメイン、ならびにこのような多重特異性融合タンパク質コード配列の転写、翻訳およびプロセシングを引き起こすかまたは容易にする他のポリヌクレオチド配列を含有する多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを意図する。
【０１６７】
原核生物および真核生物宿主と共に使用するのに適したクローニングおよび発現ベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８９年）に記載される。例示的なクローニング／発現ベクターには、クローニングベクター、シャトルベクターおよびプラスミド、ファージミド、ファスミド、コスミド、ウイルス、人工染色体に基づいてよい発現構築物、または核酸媒体中に含有されるポリヌクレオチドの増幅、移動および／または発現に適していることが当技術分野で公知である任意の核酸媒体が挙げられる。
【０１６８】
本明細書で使用する「ベクター」は、連結した別の核酸を運ぶことができる核酸分子を意味する。例示的なベクターには、プラスミド、酵母人工染色体およびウイルスゲノムが含まれる。特定のベクターは宿主細胞で自己複製することができるが、一方他のベクターは宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼び、これらは発現制御配列と作動可能に連結し、したがってこれらの配列の発現を誘導することができる核酸配列を含有する。
【０１６９】
特定の実施形態では、発現構築物はプラスミドベクターに由来する。例示的な構築物には、アンピシリン耐性遺伝子、ポリアデニル化シグナルおよびＴ７プロモーター部位をコードする核酸配列を有する修飾ｐＮＡＳＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ＣＨＥＦ１プロモーターを有するｐＤＥＦ３８およびｐＮＥＦ３８（ＣＭＣ  ＩＣＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、およびＣＭＶプロモーターを有するｐＤ１８（Ｌｏｎｚａ）が挙げられる。他の適切な哺乳動物発現ベクターが周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲を参照；例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪからのカタログも参照されたい）。適切な選択剤（例えば、メトトレキセート）の施用後の遺伝子増幅に起因する融合タンパク質の高い産生レベルを促進するのに適した調節制御下で、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）コード配列を含む、有用な構築物を調製することができる。
【０１７０】
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカー、および前記したような下流構造配列の転写を誘導するための高発現遺伝子由来のプロモーターを含む。本開示によるポリヌクレオチドと作動可能に連結したベクターは、クローニングまたは発現構築物をもたらす。例示的なクローニング／発現構築物は、少なくとも１つの発現制御エレメント、例えば本開示のポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターを含有する。本開示によるベクターおよびクローニング／発現構築物における、エンハンサー、因子特異的結合部位、ターミネーターおよびリボソーム結合部位などの、追加発現制御エレメントも意図される。本開示によるポリヌクレオチドの異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列とともに適切な段階で構築する。したがって、例えば、本明細書で提供する融合タンパク質コード核酸は、宿主細胞でこのようなタンパク質を発現させるための組換え発現構築物としての、様々な発現ベクター構築物のいずれか１つに含ませることができる。
【０１７１】
適切なＤＮＡ配列（複数可）を、様々な手順によって例えばベクターに挿入することができる。一般に、当技術分野で公知である手順によって、適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（複数可）にＤＮＡ配列を挿入する。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための標準的技法、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含めた酵素反応のための標準的技法、および様々な分離技法が意図される。いくつかの標準的技法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｉｎｃ．＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、１９９３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８２年）；Ｇｌｏｖｅｒ  （Ｅｄ．）（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９８５年）；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  （Ｅｄｓ．）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９８５年）；およびその他に記載される。
【０１７２】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えば、構成的プロモーターまたは制御的プロモーター（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ））と作動可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を誘導する。このような発現制御配列の代表例には、前記したような真核生物細胞またはそれらのウイルスのプロモーターが含まれる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを選択マーカーとともに使用して、任意の所望の遺伝子から選択することができる。真核生物プロモーターには、ＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は十分に当業者のレベルの範囲内であり、本開示によるタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連結した少なくとも１つのプロモーターまたは制御的プロモーターを含む、特定の特に好ましい組換え発現構築物の調製は、本明細書に記載する。
【０１７３】
本開示のポリヌクレオチドの変異体も意図する。変異体ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する定義された配列のポリヌクレオチドの１つと少なくとも９０％、および好ましくは９５％、９９％、または９９．９％同一であり、または約６５〜６８℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または約４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドのストリンジェントハイブリダイゼーション条件下において、定義された配列のこれらのポリヌクレオチドの１つとハイブリダイズする。ポリヌクレオチド変異体は、結合ドメイン、またはその融合タンパク質をコードする能力を保持し、本明細書に記載する機能を有する。
【０１７４】
用語「ストリンジェント」を使用して、ストリンジェントとして当技術分野で一般に理解されている条件を指す。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関するストリンジェント条件の例は、約６５〜６８℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または約４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を参照されたい）。
【０１７５】
よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高濃度のホルムアミドまたは他の変性剤など）も使用することはできるが、しかしながら、ハイブリダイゼーションの割合は影響を受ける可能性がある。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する場合、さらなる例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチド用）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチド用）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチド用）、および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチド用）における６×ＳＳＣ、０．０５％のピロリン酸ナトリウム中での洗浄を含む。
【０１７６】
本開示のさらなる態様は、本開示のポリヌクレオチドまたはベクター／発現構築物のいずれかを用いて形質転換またはトランスフェクトした、または他の方法でそれらを含有する宿主細胞を提供する。本開示のポリヌクレオチドまたはクローニング／発現構築物は、形質転換、トランスフェクション、および形質導入を含めた、当技術分野で公知である任意の方法を使用して適切な細胞中に導入する。宿主細胞は、例えばｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法を含めたｅｘ  ｖｉｖｏ細胞療法を受けた被験体の細胞を含む。本開示によるポリヌクレオチド、ベクター、またはタンパク質を有するとき本開示の一態様として意図する真核生物宿主細胞には、被験体自身の細胞（例えば、ヒト患者自身の細胞）に加えて、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（発現される多価結合分子のグリコシル化パターンを修飾することができる修飾型ＣＨＯ細胞を含む、米国特許出願公開Ｎｏ．２００３／０１１５６１４を参照されたい）、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｎ細胞、３Ｔ３細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、および本開示によるタンパク質またはペプチドの発現、そして場合によっては単離において有用であることが当技術分野で公知である任意の他の真核生物細胞が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｉｌ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ、または本開示によるタンパク質またはペプチドの発現、そして場合によっては単離に適していることが当技術分野で公知である任意の原核生物細胞を含めた、原核生物細胞も意図される。原核生物細胞からタンパク質またはペプチドを単離する際に、特に、封入体からタンパク質を抽出するための当技術分野で公知である技法を、使用することができることが意図される。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内にある。本開示の融合タンパク質をグリコシル化する宿主細胞が意図される。
【０１７７】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターを含有する細胞を指す。このような用語は、特定の被験体細胞だけでなく、このような細胞の子孫を指すことを目的とすることは理解されるはずである。特定の修飾は変異または環境の影響のいずれかによって後の世代で起こる可能性があるので、このような子孫は、実際は、親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
【０１７８】
組換え宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、または特定遺伝子の増幅に適するように改変した従来の栄養培地で培養することができる。例えば温度、ｐＨなどの、発現用に選択した特定宿主細胞のための培養条件は、当業者には容易に明らかであろう。様々な哺乳動物細胞培養系を利用して、組換えタンパク質を発現させることも可能である。哺乳動物発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１年）Ｃｅｌｌ  ２３巻：１７５頁によって記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合ベクターを発現することができる他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、例えば、多価結合タンパク質発現構築物の調製に関して本明細書に記載するように、複製起点、適切なプロモーター、そして場合によってはエンハンサー、およびさらに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列を含む。ＳＶ４０スプライス、およびポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を使用して、必要とされる非転写遺伝子エレメントを与えることができる。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓら、（１９８６年）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）を含めた、当業者が精通している様々な方法によって実施することができる。
【０１７９】
一実施形態では、本開示によるタンパク質またはポリペプチドの発現を誘導する組換えウイルス構築物を、宿主細胞に形質導入する。形質導入した宿主細胞は、ウイルス出芽中にウイルス粒子によって取り込まれた宿主細胞膜の一部分由来の、発現タンパク質またはポリペプチドを含有するウイルス粒子を生成する。
組成物および使用法
ＴＧＦβ、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＧＩＴＲ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＨＧＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２調節不全と関連した疾患状態に罹患したヒトまたは非ヒト哺乳動物を治療するために、本開示の多重特異性融合タンパク質を、１回または複数回の投与過程後に疾患状態の症状を改善するのに有効である量で被験体に投与する。ポリペプチドであるので、本開示の多重特異性融合タンパク質は、以下でより十分論じるように、注射または注入による静脈内投与に使用することができる、他の薬学的に許容される賦形剤の安定剤を場合によっては含む、薬学的に許容される希釈剤に縣濁または溶解することができる。
【０１８０】
薬学的に有効な用量は、疾患状態の発生を予防、阻害する、または疾患状態を治療する（症状をある程度、好ましくは症状全てを改善する）のに必要とされる用量である。薬学的に有効な用量は、治療薬、併用薬剤、および医学分野の当業者が認識している他の要因の考慮下での、疾患の型、使用する組成物、投与の経路、治療する被験体の型、特定被験体の身体特性に依存する。例えば、０．１ｍｇ／体重１ｋｇ〜１００ｍｇ／体重１ｋｇの量（一回用量として、または適切な間隔である１時間毎、毎日、毎週、毎月、またはこれらの任意の組合せで与える複数回用量で投与することができる）の活性成分を、本開示の結合ドメインポリペプチドまたは多重特異性融合タンパク質の効力に応じて投与することができる。
【０１８１】
特定の態様では、融合タンパク質の組成物を本開示によって提供する。本開示の医薬組成物は一般に、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と組合せて１つまたは複数の型の結合ドメインまたは融合タンパク質を含む。このような担体は、利用する用量および濃度でレシピエントに無毒である。治療用途の薬学的に許容される担体は薬剤分野では周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ  （Ｅｄ．）  １９８５年）に記載されている。例えば、生理的ｐＨで滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水を使用することができる。防腐剤、安定剤、色素などを医薬組成物内に提供することができる。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、またはｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを防腐剤として加えることができる。上記文献１４４９頁。さらに、抗酸化剤および縣濁剤を使用することができる。上記文献。本発明の化合物は遊離塩基または塩の形態のいずれかで使用することができ、両方の形態が本発明の範囲内に存在すると考えられる。
【０１８２】
医薬組成物は、バッファーなどの希釈剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、またはデキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオンまたは他の安定剤または賦形剤も含有することができる。中性緩衝生理食塩水、または非特異的血清アルブミンと混合した生理食塩水は、例示的な適切な希釈剤である。生成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液を使用して、凍結乾燥品として製剤にすることが好ましい。
【０１８３】
本開示の組成物を使用して、ＴＧＦβまたはＩＬ６調節不全の結果であるかまたはこれと関係するヒトおよび非ヒト哺乳動物における疾患状態を治療することができる。ＴＧＦβの増大した産生または活性は、腫瘍形成、新脈管形成、転移、転移性移動、ならびに上皮癌および間葉癌を含めた、様々な疾患プロセスに関与している（例えば、Ｏｆｔら（１９９８年）Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  ８巻：１２４３頁；Ｐａｒｄａｌｉ  ＆  Ｍｏｕｓａｋａ（２００７年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １７７５巻：２１頁を参照されたい）。さらに、ＴＧＦβシグナル伝達は、新脈管形成および血管障害の発症と関係している（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｏら（２００５年）Ｃｈｅｓｔ  １２８巻：５８５Ｓ頁）。
【０１８４】
ＩＬ１０はリンパ球疾患の発生において重要な役割を果たすことができること（米国特許第５，６３９，６００号）、およびＩＬ１０は、非ホジキンリンパ腫細胞の増殖を増大することができることが示唆されている（Ｖｏｏｒｚａｎｇｅｒら（１９９６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６巻：５４９９頁）。さらに近年、ＴＧＦβとＩＬ１０は一緒に働いて制御された炎症応答を確実にすることが提議されている（Ｌｉ  ＆  Ｆｌａｖｅｌｌ、（２００８年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８巻：４６８頁）。腫瘍発現型ＧＩＴＲＬはヒトにおいて免疫破壊を媒介することが示唆されている（Ｂａｌｔｚら（２００７年）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２１巻：２４４２頁）。ＶＥＧＦおよびＴＧＦβの過剰発現は子宮頸癌の発症と関係している（Ｂａｒｉｔａｋｉら（２００７年）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．  ３１巻：６９頁）。ＴＮＦαは腎細胞癌の発症と関係している（Ｈａｒｒｉｓｏｎら（２００７年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２５巻：４５４２〜９頁）。ＴＧＦβは扁平上皮癌細胞のＨＧＦ依存的浸潤を促進することが示されており（Ｌｅｗｉｓら（２００４年）Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、９０巻：８２２頁）、そしてＨＧＦは細胞増殖を刺激し、ヒト膵臓癌細胞でのＴＧＦαの発現を高めることが示されている（Ｏｈｂａら（１９９９年）Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ３４巻：４９８〜５０４頁）。さらに、ＴＧＦβおよびＨＧＦは胃癌細胞の浸潤性を刺激することが示されている（Ｉｎｏｕｅら、（１９７巻）Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ８８巻：１５２頁）。ＩＧＦ１Ｒは、肉腫を含めた癌の治療において同定されている（Ｓｃｏｔｌａｎｄｉ  ＆  Ｐｉｃｃｉ（２００８年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２０巻：４１９〜２７頁；Ｙｕｅｎ  ＆  Ｍａｃａｕｌａｙ（２００８年）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ  １２巻：５８９〜６０３頁）。
【０１８５】
ＩＬ−６トランスシグナル伝達は結腸癌などの悪性疾患に関与しており、一方ＩＬ６シスシグナル伝達は、ホルモン非依存性前立腺癌、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞増殖障害、および腎臓、乳房、結腸、肺、脳、および他の組織の進行癌を含めた悪性疾患に関与している（例えば、Ｓａｎｓｏｎｅら（２００７年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１７巻：３９８８頁を参照されたい）。したがって、本開示の多重特異性融合タンパク質は、様々なＴＧＦβ関連自己免疫障害（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または関節リウマチなど）、アルツハイマー病または過剰増殖疾患、または多発性嚢胞腎、肺癌、結腸癌、尿路上皮癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、頭頸部癌、メラノーマ、グリア芽腫、膵臓癌、または肝細胞癌などを含めた悪性疾患障害を治療する際に有用である。
【０１８６】
「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され親化合物の所望の薬理活性を有する、本開示の結合ドメインポリペプチドまたは融合タンパク質の塩を指す。このような塩には、以下の（１）例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸で形成される酸付加塩、または例えば酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプタン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸で形成される酸付加塩、または（２）親化合物に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、またはアルミニウムイオンによって置換されるか、または例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基と配位結合するかのいずれかのときに形成される塩が挙げられる。
【０１８７】
特定の例示的実施形態では、本開示のポリペプチドまたは融合タンパク質を、例えばボーラス注射または注入によって静脈内投与する。静脈内以外の投与の経路には、経口、局所、非経口（例えば、舌下または口腔）、舌下、直腸、膣、および鼻腔内が含まれる。本明細書で使用する用語非経口は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、海綿内、鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）、尿道内注射、脊髄周囲または注入技法を含む。患者への組成物の投与により、その中に含有される活性成分に生物学的利用能を与えることができるように、医薬組成物を製剤化する。患者に投与される組成物は１つまたは複数の投薬単位（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ）の形態をとり、例えば錠剤は１つの投与単位であってよく、かつエアロゾル形態での本開示の１つまたは複数の化合物の容器は複数の投薬単位を保持することができる。
【０１８８】
経口投与用に、スクロース、カオリン、グリセリン、スターチデキストラン、シクロデキストリン、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースなどの、賦形剤および／または結合剤が存在してよい。甘味剤、防腐剤、色素／着色剤、香味増進剤、またはこれらの任意の組合せが、場合によっては存在してよい。コーティングシェルも場合によっては使用することができる。
【０１８９】
注射により投与することを目的とする組成物に、１つまたは複数の界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、バッファー、安定剤、等張化剤、またはこれらの任意の組合せを、場合によっては含めることができる。
【０１９０】
核酸ベースの製剤に関して、または本開示による発現産物を含む製剤に関して、約０．０１μｇ／体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇを、例えば、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内経路によって、または所与の環境の状況下に適した当技術分野で公知である任意の経路によって投与する。好ましい用量は、例えば約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、約５μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇが特に好ましい。投与の回数および頻度は宿主の応答に依存することは、当業者には明らかであろう。
【０１９１】
本開示の医薬組成物は、例えば固体、液体、または気体（エアロゾル）の形などの、患者への投与を可能にする任意の形態であってよい。本明細書に記載する任意の経路による投与用に、組成物は液体の形態、例えばエリキシル剤、シロップ、溶液、乳濁液または懸濁液であってよい。
【０１９２】
本明細書で使用する液状医薬組成物は、溶液、懸濁液の形態、または他の同様の形態であれ、以下の構成成分：注射用水、食塩水溶液（例えば、生理食塩水溶液）、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、溶媒または懸濁媒体として働くことができる合成モノ−またはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファー、エチレンジアミン４酢酸などのキレート剤、およびナトリウム、塩化物、またはデキストロースなどの張性を調節するための薬剤の１つまたは複数を含むことができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。生理食塩水溶液は好ましい添加剤である。注射用医薬組成物は滅菌状態であることが好ましい。
【０１９３】
調製物に、アルミニウム塩、油中水型エマルジョン、生分解性油性ビヒクル、水中油型エマルジョン、生分解性マイクロカプセル、およびリポソームを含めた送達ビヒクルなどの、他の構成成分を含めることも所望される場合がある。このようなビヒクルにおいて使用するためのアジュバントの例には、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、グルカン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−インターフェロン、およびＩＬ−１５が含まれる。
【０１９４】
当業者に公知である任意の適切な担体を本開示の医薬組成物において利用することができるが、担体の型は投与の形式、および徐放が所望されるかどうかに応じて変わる。非経口投与用に、担体は水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、バッファー、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。経口投与用に、前記の担体、または、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム、またはこれらの任意の組合せなどの固形担体のいずれかを利用することができる。
【０１９５】
第２の薬剤と併せた、本開示の多重特異性融合タンパク質組成物の投与も意図される。第２の薬剤は、炎症、自己免疫、および癌などの、特定の疾患状態用の標準的治療剤として、当技術分野で認められている薬剤であってよい。意図される例示的な第２の薬剤には、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、化学療法剤、放射線療法剤、または他の活性および補助薬剤がある。
【０１９６】
本開示は、本開示の医薬組成物を含む投薬単位を意図する。このような投薬単位には、例えば、２区画バイアルまたはシリンジを含めた一回用量または複数回用量バイアルまたはシリンジ、凍結乾燥形態での本開示の医薬組成物および他の再構成用希釈剤を含むバイアルまたはシリンジが挙げられる。複数回用量投薬単位は、例えば静脈内注入デバイスと結び付けるためのバッグまたはチューブであってもよい。
【０１９７】
本開示は、単位用量または複数回用量容器、例えばバイアル中の医薬組成物、および本明細書に記載するように障害に罹患する患者に組成物を投与するための説明書セットを含むキットも意図する。
【０１９８】
本明細書中で言及する、全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、非特許刊行物、表、配列、ウエブページなどは、参照によってそれらの全容を本明細書に組み込む。以下の実施例は、本開示を制限するものではなく、例示することを目的とする。
【実施例】
【０１９９】
Ｘｃｅｐｔｏｒ配列
本明細書において、例示的ＩＬ６アンタゴニスト可変領域（ＶＬおよびＶＨ）結合配列（配列番号３７３〜４９６）を開示する。さらに、ＴＧＦβＲ２外部ドメインおよび抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを含む例示的Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質のアミノ酸配列および核酸発現カセットを開示する。アミノ末端にＴＧＦβＲ２外部ドメインを有し、カルボキシ末端に抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを有するＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、本明細書においてＴＲＵ（ＸＢ６）−１０１９．１およびＴＲＵ（ＸＢ６）−１０１９．２と称ぶ（アミノ酸配列はそれぞれ配列番号７３７および７３８で示され、対応するヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号７４１および７４２で提供される）。逆配向の、すなわちアミノ末端に抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメイン、カルボキシ末端にＴＧＦβＲ２外部ドメインを有するＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、本明細書において、ＴＲＵ（Ｘ６Ｂ）−１０１９．１およびＴＲＵ（Ｘ６Ｂ）−１０１９．２と称される（アミノ酸配列はそれぞれ配列番号７３５および７３６で提供され、対応するヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号７３９および７４０で提供される）。
活性の実施例
本明細書に記載する様々なＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質を、以下に記載するように活性に関して試験した。以下の実施例で使用した略語は、他に指示がない限りは、以下の用語を含む：
ＰＢＳ−Ｔ：ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４および０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０
作業バッファー：１％のＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ
ブロッキングバッファー：３％のＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ
（実施例１）
ＴＧＦβ結合ドメイン
Ｆａｂ結合ドメインのファージライブラリーを、基本的にＨｏｅｔら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３巻：３４４頁に記載のように、ＴＧＦβまたはＩＬ６ｘＲ複合体のどちらかに特異的な結合ドメインに関してスクリーニングする。結合ドメインを、ＰＣＲ増幅によりクローニングする。簡潔にいうと、Ｆａｂライブラリーのクローン由来のＶＬおよびＶＨ領域を、ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびオーバーラップを介してＧ４Ｓリンカーを作り出す適切なプライマーを使用して、初期アニーリングを５６℃で９サイクル、その後６２℃でさらに２０サイクルで増幅する。ＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて分離し、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎカラムを使用して精製する。第２ラウンドのソーイング反応は、モル当量のＶＬおよびＶＨ産物を、拡張バッファー（Ｅｘｐａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ）および水と混合し、９５℃で５秒間変性させ、その後室温でゆっくり冷却する工程を含む。増幅のために、ｄＮＴＰの混合物をＥｘｐａｎｄ酵素に加え、７２℃で１０秒間インキュベートする。外部プライマーを加え（５’ＶＨおよび３’ＶＬ）、混合物を、６２℃におけるアニーリングおよび４５分間の伸長反応を３５サイクル実施する。得られた７５０塩基対産物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、プラスミドｐＤ２８内にクローニングする。（より詳細には、米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号およびＰＣＴ出願公開ＷＯ２００７／１４６９６８を参照されたい）。
【０２００】
（実施例２）
ＥＬＩＳＡによる、ＸＣＥＰＴＯＲのＩＬ６およびハイパーＩＬ６への結合
ハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６またはＩＬ６ｘＲ）、組換えヒトＩＬ６（ｒｈＩＬ６）およびヒト可溶性ＩＬ６Ｒの結合活性を、実質的に以下のように、例示的なＸｃｅｐｔｏｒ  ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２、１０１９、１０２５、１０４２、１０５８およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（それぞれ、配列番号６０８、６２５、６３１、６４８、６６４および６７０）に関して試験した。これらのＸｃｅｐｔｏｒはそれぞれ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインおよび抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを含む。
ＨＩＬ６およびＩＬ６の結合
９６ウェルプレートの個々のウェルに、ＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）中２μｇ／ｍｌ溶液のヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）および０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温で２時間（または４℃で一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、１００μｌ／ウェルのＸｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料および３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈したヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中１５０ｐＭ溶液のヒトハイパーＩＬ６または組換えヒトＩＬ６から１００μｌ／ウェルを２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中１５０ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＩＬ６−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中で１：４，０００に希釈した１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（３，３，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｎｔｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
ｓＩＬ６Ｒの結合
９６ウェルプレートの個々のウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中２μｇ／ｍｌ溶液のヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温で２時間（または４℃で一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、それぞれ３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈した、１００μｌ／ウェルのＸｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照の抗ヒトＩＬ−６Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および陰性対照のヒトＩｇＧまたはヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中７５ｐＭ溶液の組換えヒトｓＩＬ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中１００ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＩＬ６−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、カバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中で１：４，０００に希釈した１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２０１】
図１Ａ〜１Ｃのデータは、全Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質分子のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、ＨＩＬ６と結合できることを実証している。さらに、これらのアッセイは、Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質のうち２種だけがｒｈＩＬ６と結合し（図１Ｂ）、ｓＩＬ６Ｒと結合するものはなかった（図１Ｃ）ので、Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がＩＬ６ｘＲ複合体に対して特異性を有することを示している。関連する研究において、ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２およびＳＭＩＰ  ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２は、非ヒト霊長類のＭｕｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来のＩＬ６と交差反応することが見出された。
【０２０２】
（実施例３）
ＥＬＩＳＡによるＸＣＥＰＴＯＲのＴＮＦ−αへの結合
ＴＮＦ−αの結合活性を、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２、１０４２、１０５８、１０１９およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（それぞれ、配列番号６０８、６４８、６６４、６２５および６７０）に関して試験した。
【０２０３】
９６ウェルプレートの個々のウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中２μｇ／ｍｌ溶液のヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファーを各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温で２時間（または４℃で一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、それぞれ３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈した、１００μｌ／ウェルのＸｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ））および組換えヒトＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）−ＦＣキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）ならびに陰性対照のヒトＩｇＧまたはヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２ｎｇ／ｍｌ溶液の組換えヒトＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２００ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＴＮＦ−α−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中で１：１，０００に希釈した１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２０４】
図２のデータは、被検全Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、ＴＮＦ−αと結合できることを示している。
【０２０５】
（実施例４）
ＥＬＩＳＡによるＸＣＥＰＴＯＲのデュアルリガンドの結合
ＴＮＦ−αへの、およびＩＬ６ｘＲ複合体への同時結合を、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００６（配列番号６１２）に関して試験した。
【０２０６】
９６ウェルプレートの各ウェルに、１００μｌのヒトＨＩＬ−６溶液（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４）を加えた。このプレートにカバーをし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファーを各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温で２時間（または４℃で一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈した１００μｌ／ウェルのＸｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：ＨＩＬ６試料をＨＩＬ−６コーティングプレートの２連のウェルに加えた。陰性対照は、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）および作業バッファーだけを含んだ。このプレートにカバーをして、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２００ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＴＮＦ−α−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：１，０００に希釈した１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を３から５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２０７】
図３のデータは、Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質が、２種のリガンド（この場合、ＴＮＦ−αおよびハイパーＩＬ６）に同時に結合できることを実証している。
【０２０８】
（実施例５）
ＥＬＩＳＡによる、ハイパーＩＬ６のＧＰ１３０への結合のＸＣＥＰＴＯＲによるブロッキング
Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００４、１００６、１００７、１００８、１０１３および１０１９（それぞれ、配列番号６１０、６１２、６１３、６１４、６１９および６２５）による、ハイパーＩＬ６（ＩＬ６ｘＲ）の可溶性ｇｐ１３０受容体への結合のブロッキングを、実質的に以下のように試験した。
【０２０９】
９６ウェルプレートの個々のウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中０．２５〜０．５μｇ／ｍｌ溶液のヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温で２時間（または４℃で一晩）インキュベートした。以下の試料を、５０μｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで５倍段階希釈した：Ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照のヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ヒトＩＬ６Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに陰性対照抗ヒトＩＬ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＩｇＧまたはＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）。等容量の段階希釈Ｘｃｅｐｔｏｒ試料を、ハイパーＩＬ６（最終ハイパーＩＬ６濃度が２．５ｎｇ／ｍｌ）と混合し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、Ｘｃｅｐｔｏｒ／ＨＩＬ６混合物、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ、抗ヒトＩＬ６Ｒ、抗ヒトＩＬ６、ヒトＩｇＧおよびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）の段階希釈物を１００μｌ／ウェルで、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに加え、プレートにカバーをし、室温で約１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：１０，０００に希釈した１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を加え、プレートにカバーをして、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を約５から１５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２１０】
図４のデータは、抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを含有するＸｃｅｐｔｏｒタンパク質は、可溶性ｇｐ１３０がＨＩＬ６と結合することをブロックできることを実証している。
【０２１１】
（実施例６）
ＩＬ６誘導性細胞増殖およびハイパーＩＬ６誘導性細胞増殖のＸＣＥＰＴＯＲによるブロッキング
ＴＦ−１細胞のＩＬ６誘導性細胞増殖またはハイパーＩＬ６（ＩＬ６ｘＲ）誘導性細胞増殖のブロッキングを、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１１、１０１４、１０２５、１０２６、１００２およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（それぞれ、配列番号６１７、６２０、６３１、６３２、６０８および６７０）に関して試験した。
【０２１２】
９６ウェル平底プレートの個々のウェルに、新鮮な成長培地（１０％のＦＢＳ−ＲＰＭＩ  １６４０；２ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム；および２ｎｇ／ｍｌのＨｕ  ＧＭ−ＣＳＦ）中０．３×１０６のＴＦ−１細胞（ヒト赤白血病細胞）を、増殖アッセイに使用する１日前に加えた。その後、細胞を収穫し、アッセイ培地（ＧＭ−ＣＳＦを含まないことを除いて成長培地と同じで、サイトカイン非含有）を用いて２回洗浄し、次いでアッセイ培地に１×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。ＩＬ６活性のブロッキングに関して、目的のＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：抗−ＨＩＬ６  Ｘｃｅｐｔｏｒまたは抗体の段階希釈物を、固定濃度の組換えヒトＩＬ６（ｒｈＩＬ６）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）またはハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６）と一緒に、９６ウェルプレート中で、３７℃、５％ＣＯ２において１時間プレインキュベートした。使用した対照は、ヒトＩｇＧ；ヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；抗ｈＩＬ６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；および抗−ｈＩＬ６Ｒ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだ。プレインキュベーション期間後、１×１０４細胞（１００μｌ中）を各ウェルに加えた。ＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：ＨＩＬ６、ｒｈＩＬ６またはＨＩＬ６および細胞を含有する、全容量２００μｌ／ウェルの最終アッセイ混合物を、３７℃、５％ＣＯ２において、７２時間インキュベートした。培養の最後の４から６時間の間に、３Ｈ−チミジン（アッセイ培地中２０μＣｉ／ｍｌ、２５ｕＬ／ウェル）を加えた。細胞をＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６ＧＦ／ｃプレートに回収し、とり込まれた３Ｈ−チミジンを、ＴｏｐＣｏｕｎｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して決定した。データは、３連の平均のｃｐｍ±ＳＤとして表す。ブロッキングのパーセント＝１００−（試験物のｃｐｍ−対照のｃｐｍ／最大ｃｐｍ−対照のｃｐｍ）×１００。
【０２１３】
図５Ａおよび５Ｂのデータは、全Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質分子のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、ＩＬ６またはハイパーＩＬ６により誘導される細胞増殖を、それぞれにまたは両方をブロックできることを実証している。
【０２１４】
（実施例７）
ＥＬＩＳＡによる、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲへの結合のＸＣＥＰＴＯＲによるブロッキング
Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００４、１００６、１００７、１００８、１０１３および１０１９（それぞれ、配列番号６１０、６１２、６１３、６１４、６１９および６２５）による、ＴＮＦ−αのＴＮＦ受容体への結合のブロッキングを、実質的に以下のように試験した。
【０２１５】
９６ウェルプレートの個々のウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中０．２５〜０．５μｇ／ｍｌ溶液の組換えヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温で２時間（または４℃で一晩）インキュベートした。以下の試料を、５０μＭ〜２５０μＭから出発して、作業バッファーで５倍段階希釈物を作製した：Ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）および抗ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに陰性対照のヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびヒトＩｇＧ。等容量の段階希釈Ｘｃｅｐｔｏｒ試料を、ＴＮＦ−α（最終ＴＮＦ−α濃度が２．５ｎｇ／ｍｌ）と混合し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、Ｘｃｅｐｔｏｒ／ＴＮＦ−α混合物、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦ−α、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ、ヒトＩｇＧの段階希釈物を１００μｌ／ウェルで、組換えヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに加え、プレートにカバーをし、室温で約１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２００ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＴＮＦ−α−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：１，０００に希釈した１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２１６】
図６のデータは、Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質が、ＴＮＦ−αのＴＮＦ受容体への結合をブロックし、ＴＮＦＲ−Ｆｃによるブロッキングとおよそ同等であったことを示す。
【０２１７】
（実施例８）
ＴＮＦ−α誘導性細胞死滅のＸＣＥＰＴＯＲによるブロッキング
ＴＮＦ−α誘導性のＬ９２９細胞の死滅のブロッキングを、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１１、１０１４、１０２５、１０２６、１００２およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（それぞれ、配列番号６１７、６２０、６３１、６３２、６０８および６７０）に関して試験した。
【０２１８】
Ｌ９２９マウス線維芽細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）の懸濁液を、２×１０５細胞／ｍｌの密度で培養培地（１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ  １６４０、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中に調製し、次いで、１００μｌを、９６ウェル平底の黒色プレートの個々のウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２において一晩、加湿インキュベーター内でインキュベートした。アッセイ培地（２％ＦＢＳを添加したことを除いて、培養培地と同じ）で段階的に希釈したＸｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料を、等容量の組換えヒトＴＮＦ−α（ｒｈＴＮＦ−α；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）と混合し、３７℃、５％ＣＯ２において１時間、加湿インキュベーター内でインキュベートした。陽性対照（すなわち、Ｌ９２９細胞のＴＮＦ−α誘導性死滅をブロックする薬剤）は、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、ｒｈＴＮＦＲ２−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および抗ＴＮＦ−α抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含んだ。陰性対照は、アッセイ培地単独（ＴＮＦ−αは加えず）および抗体ｈＩｇＧ（ＴＮＦ−α添加）を含んだ。ＴＮＦ−αの活性を分析するために、Ｌ９２９細胞から培養培地を取り除き、次いで個々のウェルに５０μｌのＴＮＦ−α／Ｘｃｅｐｔｏｒまたは対照混合物および５０μｌのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（４μｇ／ｍｌの新たに調製された作業溶液から）を加えた。その後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２において２４時間、加湿インキュベーター内でインキュベートした。細胞生存率を測定するために、個々のウェルに、１００μｌのＡＴＰｌｉｔｅ  １  Ｓｔｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を製造業者の指示書に従って加え、２分間振とうし、次いでＴｏｐＣｏｕｎｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して発光を測定する。
【０２１９】
図９のデータは、全Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質分子のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、このアッセイにおいてＴＮＦ−α誘導性の細胞死滅をブロックできることを実証している。
【０２２０】
（実施例９）
ＥＬＩＳＡによる、ＸＣＥＰＴＯＲのＴＧＦβへの結合
ＴＧＦβの結合活性を、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ  Ｘ６ＢおよびＸＢ６に関して試験した。
【０２２１】
９６ウェルプレートの各ウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中２μｇ／ｍｌ溶液のヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（１０％ＮＧＳ含有ＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温で２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、それぞれ作業バッファー（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ）で３００ｎｇ／ｍｌに希釈した、１００μｌ／ウェルのＸｃｅｐｔｏｒ  ＴＧＦβＲ２：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照の組換えヒトＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および陰性対照の組換えヒトＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに加えた。プレートにカバーをして、室温で約１時間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ））を用いて５回洗浄後、４ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで２倍段階希釈した１００μｌ／ウェルのＴＧＦβ−１リガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えた。プレートにカバーをして、室温で１時間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファーを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２００ｎｇ／ｍｌ溶液のビオチン化抗ＴＧＦβ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加えた。プレートにカバーをして、室温で１時間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファーを用いて５回洗浄後、作業バッファー中で１：２０，０００に希釈した１００μｌ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、洗浄バッファーを用いて５回洗浄後、１００μｌ／ウェルのＱｕａｎｔａＢｌｕ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ；９ｍｌの基質溶液と１ｍｌの過酸化物溶液を混合することによって調製した）を加え、プレートにカバーをして、室温で２０分間インキュベートした。５０μｌのＱｕａｎｔａＢｌｕ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ／ウェルを用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を３２５ｎｍにおいて読み取った。
【０２２２】
図８のデータは、被検Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、ＴＧＦβＲ２外部ドメインが融合タンパク質のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、ＴＧＦβ−１と結合したことを示す。
【０２２３】
（実施例１０）
ＸＣＥＰＴＯＲ融合タンパク質の発現
２９３細胞における、本明細書に開示の特定のＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質の発現を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、製造業者の指示書に従って実施した。
【０２２４】
それぞれの３０ｍｌのトランスフェクションのために、２８ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ中３×１０７細胞を使用した。トランスフェクション当日、細胞懸濁液の少量のアリコートを微小遠心管に移し、集塊をなす細胞の生存率および量を、トリパンブルー色素排除法を使用して決定した。この懸濁液を、４５秒間激しくボルテックスにかけ細胞の集塊を壊し、細胞総数をＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒまたは血球計数器を使用して決定した。細胞の生存率は９０％を上回った。所要の細胞を含有する振とうフラスコを、３７℃のインキュベーター内のオービタルシェイカーに配置した。
【０２２５】
それぞれのトランスフェクション試料について、脂質−ＤＮＡ複合体を以下のように調製した。３０μｇのプラスミドＤＮＡを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉで全容量１ｍｌに希釈し、緩やかに混合した。６０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉで全容量１ｍｌに希釈し、緩やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。５分のインキュベーション後、希釈したＤＮＡを希釈した２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）に加え、全容量２ｍｌを得、緩やかに混合した。得られた溶液を、室温で２０〜３０分間インキュベートし、ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）複合体を形成させた。
【０２２６】
ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）複合体をインキュベートする一方で、細胞懸濁液をインキュベーターから取り出し、適量の細胞懸濁液を、滅菌、使い捨ての１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振とうフラスコに入れた。３０ｍｌのトランスフェクションのために、新鮮な、あらかじめ暖めておいたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを、全容量２８ｍｌまで加えた。
【０２２７】
ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）複合体のインキュベーション完了後、２ｍｌのＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）複合体を、振とうフラスコに加えた。２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉを、ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）複合体の代わりに陰性対照のフラスコに加えた。各フラスコは、全容量３０ｍｌを含有し、最終細胞密度はおよそ１×１０６生存細胞／ｍｌであった。この細胞を、空気中８％ＣＯ２の加湿雰囲気の３７℃のインキュベーターにおいて、１２５ｒｐｍで回転するオービタルシェイカーでインキュベートした。トランスフェクションのおよそ７日後に細胞を収穫し、組換えタンパク質の発現に関してアッセイした。
【０２２８】
ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインおよびＴＧＦβＲＩＩ外部ドメインを有するＸｃｅｐｔｏｒ分子を、上記のように２９３細胞において発現させた。
【０２２９】
（実施例１１）
ＥＬＩＳＡによる、ＸＣＥＰＴＯＲのリガンドへの結合
ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインおよび、ＴＷＥＡＫＲ外部ドメイン、ＯＰＧ外部ドメイン、ＴＧＦβＲＩＩ外部ドメインまたはＩＬ７Ｒ外部ドメインのいずれかを含むｘｃｅｐｔｏｒ分子が、それぞれ、リガンドであるＴＷＥＡＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＧＦβまたはＩＬ７に結合する能力を、実質的に以下のように試験した。
【０２３０】
マウスおよびヒトのリガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＭＮ）を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度で、９６ウェルプレートのウェルに加えた（１００μｌ／ウェル）。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温（ＲＴ）において２時間インキュベートした。３００ｎｇ／ｍｌから出発するｘｃｅｐｔｏｒの３倍段階希釈物を、作業バッファー（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ）で作製した。陰性対照として、無関係なｘｃｅｐｔｏｒを使用した。プレートを、ＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、１００μＬ／ウェルのＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（作業バッファー中１：５０００）を加え、プレートにカバーをし、ＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、１００μＬのＱｕａｎｔ−Ｂｌｕ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を個々のウェルに加えた。このプレートを、ＲＴにおいて１０〜３０分間インキュベートし、蛍光を、３２５／４２０ｎｍにおいて測定した。
【０２３１】
結果を以下の表３に示す。ＴＮＦＲｘＴＧＦβＲＩＩのマウスＴＧＦβへの結合は試験しなかったが、マウスおよびヒトのＴＧＦβは９９％同一であることに留意されたい。
【０２３２】
【表３】
2011526794.tif 000004
（実施例１２）
ＴＧＦβ−１誘導性細胞増殖の阻害に関するＸＣＥＰＴＯＲによるブロッキング
ＩＬ４によるＨＴ２細胞増殖に関するＴＧＦβ−１誘導性阻害のブロッキングを、Ｔｓａｎｇら（Ｔｓａｎｇ，  Ｍ．ら（１９９５年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ７巻：３８９頁）により記載された方法を使用して、配列番号１２３６のＸｃｅｐｔｏｒに関して試験した。
【０２３３】
簡潔にいうと、９６ウェルプレートにおいて、Ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲ：：ＴＧＦβＲＩＩ試料を、１ｎｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ−１を含有する培養培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、０．０５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）で段階希釈した；１００μｌ／ウェル。このプレートを、３７℃、５％ＣＯ２において、加湿インキュベーター内で１．５時間インキュベートした。陰性対照は、無関係のｘｃｅｐｔｏｒタンパク質（ＴＧＦβ−１添加）および培養培地（ＴＧＦβ−１添加または無添加）を含んだ。陽性対照は、組換えＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）であった。インキュベーション後、１５ｎｇ／ｍｌ  ｍＩＬ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含有する培養培地１００μｌ中１×１０４のＨＴ２細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を各ウェルに加えた。その後、このプレートを、３７℃、５％ＣＯ２において、加湿インキュベーター内で７２時間インキュベートした。
【０２３４】
細胞生存率を測定することによってＴＧＦβ−１の活性を分析するために、１００μｌの培養培地を個々のウェルから取り除き、１０μＬのＷＳＴ−８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で置き換えた。このプレートを、３７℃で２時間インキュベートし、個々のウェルの吸光度を４５０ｎＭにおいて読み取った。
【０２３５】
図９のデータは、ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質が、ＩＬ４−媒介型ＨＴ２細胞増殖のＴＧＦβ−１による阻害をブロックしたことを示している。
【０２３６】
（実施例１３）
ハイパーＩＬ６に対する結合特異性および他のＧＰ１３０サイトカインに対する非結合
ＩＬ６ならびに、ｇｐ１３０サイトカインであるＩＬ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）およびカルディオトロピン−１（ＣＴ−１）によるＴＦ−１細胞増殖の誘導に対するＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質の効果を、実質的に以下のように試験した。
【０２３７】
９６ウェル平底プレートの個々のウェルに、新鮮な成長培地（１０％のＦＢＳ−ＲＰＭＩ  １６４０；２ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム；および２ｎｇ／ｍｌのＨｕ  ＧＭ−ＣＳＦ）中０．３×１０６のＴＦ−１細胞（ヒト赤白血病細胞）を、増殖アッセイに使用する１日前に加えた。細胞を収穫し、アッセイ培地（ＧＭ−ＣＳＦを含まないことを除いて成長培地と同じ、サイトカイン非含有）を用いて２回洗浄し、次いでアッセイ培地に１×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。ＬＩＦ、ＯＳＭおよびＣＴ−１活性のブロッキングを試験するために、ＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６  ｘｃｅｐｔｏｒのＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２（配列番号６０８）、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１９（配列番号６２５）、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０２２（配列番号６２８）およびＴＲＵ（ＸＴ６）−１０２５（配列番号６３１）の段階希釈物を、固定濃度の各ｇｐ１３０サイトカイン個々と一緒に、またはハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６）と一緒に、９６ウェルプレートにおいて、３７℃、５％ＣＯ２において１時間プレインキュベートした。プレインキュベーション期間後、１×１０４細胞（１００μｌ中）を各ウェルに加えた。ＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：ＨＩＬ６、ｇｐ１３０サイトカインまたはＨＩＬ６、および細胞を含有する、全容量２００μｌ／ウェルの最終アッセイ混合物を、３７℃、５％ＣＯ２において、７２時間インキュベートした。培養の最後の４から６時間の間に、３Ｈ−チミジン（アッセイ培地中２０μＣｉ／ｍｌ、２５μｌ／ウェル）を加えた。細胞をＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６  ＧＦ／ｃプレートに回収し、とり込まれた３Ｈ−チミジンを、ＴｏｐＣｏｕｎｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して決定した。ブロッキングのパーセント＝１００−（試験ｃｐｍ−対照のｃｐｍ／最大ｃｐｍ−対照のｃｐｍ）×１００。
【０２３８】
結果は、ｘｃｅｐｔｏｒがＩＬ６活性をブロックしたが、ＩＬ−１１、ＬＩＦ、ＯＳＭまたはＣＴ−１をブロックしなかったことを示し（データ非掲載）、したがって、ハイパーＩＬ６に結合したが、他の被検ｇｐ１３０サイトカインに対して効果を有さなかったことを示した。
【０２３９】
（実施例１４）
肝細胞における、ＳＭＩＰおよびＸＣＥＰＴＯＲの、ＩＬ６Ｒへの結合
肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞のＩＬ６Ｒへの、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１９および抗ＩＬ６抗体ｈｕ−ＰＭ１の結合能力を以下のように試験した。
【０２４０】
ＨｅｐＧ２細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ）中２×１０６細胞／ｍＬに調整した。９６ウェルプレートのウェルに、５０μＬのこの溶液を加えた（１０５細胞／ウェル）。プレートを、希釈した被検分子を加える用意ができるまで３７℃に保った。被検分子の段階希釈物をＦＡＣＳバッファーで調製し、２×作業ストックを得、細胞に加えるときにそれを１×に希釈した。希釈した被検分子を細胞に加え（５０μＬ／ウェル）、細胞を氷上で２０分間インキュベートした。ＩｇＧ全体（ｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ）を対照として使用した。その後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーを用いて２回洗浄し、フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ；ＦＡＣＳバッファーで１：２００希釈）に再懸濁した。暗所において氷上で２０分間インキュベート後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーを用いて２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、ＬＳＲＩＩ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において読み取った。
【０２４１】
図１０に示すように、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２およびＴＲＵ（ＸＴ６）−１０２９は、基本的にＨｅｐＧ２細胞とは結合しないことを示した。
【０２４２】
（実施例１５）
マウスにおけるＩＬ６活性およびＴＮＦの活性の、ＳＭＩＰおよびＸＣＥＰＴＯＲによるブロッキング
本明細書に開示する、ＳＭＩＰおよびＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質の、マウスにおける血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質のＩＬ−６誘導性産生またはＴＮＦ誘導性産生をブロックする能力を、下記のように試験した。ＳＡＡは、ヒトおよびマウスにおける主要な急性期タンパク質の１つである。血漿ＳＡＡレベルの長期的上昇が慢性炎症において見出され、肝臓、腎臓および脾臓に影響を与えるアミロイドーシスをもたらす（Ｒｉｅｎｈｏｆｆら、（１９９０年）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７巻：２８７頁）。ＩＬ６およびＴＮＦは双方とも、単独で投与された場合ＳＡＡの誘導を示した（Ｂｅｎｉｇｎｉら、（１９９６年）Ｂｌｏｏｄ  ８７巻：１８５１頁；Ｒａｍａｄｏｒｉら、（１９８８年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８巻：１２５９頁）。
（ａ）ハイパーＩＬ６活性のブロッキング
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（２００μｇ）、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２（２００μｇ）もしくはＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２（３００μｇまたは５００μｇ）を、後眼窩に注入した。１時間後、このマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中２μｇのヒトハイパーＩＬ６をＩＰ注入した。マウス血清を、ＩＰ注入の２時間後および２４時間後に採取した。ＳＡＡの血清濃度をＥＬＩＳＡにより決定し、ｓｇｐ１３０の濃度をＬｕｍｉｎｅｘに基づくマウス可溶性受容体アッセイにより決定した。図１１および１２に示すように、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２およびＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２は、ｓｇｐ１３０およびＳＡＡ双方のハイパーＩＬ６誘導性発現をブロックした。
（ｂ）ＴＮＦ活性のブロッキング
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（２００μｇ）、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２（２００μｇ）もしくはＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２（３００μｇ）を、後眼窩に注入した。１時間後、このマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中０．５μｇのマウスＴＮＦ−αをＩＰ注入した。マウス血清を、ＩＰ注入の２時間後および２４時間後に採取した。ＳＡＡの血清濃度をＥＬＩＳＡにより決定し、ｓｇｐ１３０の濃度をＬｕｍｉｎｅｘに基づくマウス可溶性受容体アッセイにより決定した。図１３ＡおよびＢに示すように、ＸｃｅｐｔｏｒのＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２は、ＳＡＡのＴＮＦ−α誘導性発現をブロックし、注入２時間後に観察されたＳＡＡのレベルは、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）で観察されるレベルと同様であった。
【０２４３】
（実施例１６）
ＸＣＥＰＴＯＲのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
本明細書に記載のＸｃｅｐｔｏｒ分子の治療効力を、下記のように疾患の動物モデルにおいて試験する。
（ａ）多発性骨髄腫
Ｘｃｅｐｔｏｒ分子の活性を、２種の十分特徴付けられた多発性骨髄腫のマウスモデル、すなわち、５Ｔ２多発性骨髄腫（５Ｔ２ＭＭ）モデルおよび５Ｔ３３多発性骨髄腫（５Ｔ３３ＭＭ）モデルの少なくとも１種において試験する。５Ｔ３３モデルにおいて、マウスを、腫瘍細胞の注入のときからＸｃｅｐｔｏｒにより処置する（予防モード）。５Ｔ２ＭＭモデルにおいて、マウスを、疾患の発症から処置する（治療モード）。腫瘍の発達および新脈管形成に対する治療効果を、双方のモデルにおいて評価し、５Ｔ２ＭＭモデルにおいて、骨に関する研究もまた実施する。
【０２４４】
骨髄腫の５ＴＭＭネズミモデルが始めにＲａｄｌらにより開発された（Ｊ．  ｌｍｍｕｎｏｌ．（１９７９年）１２２巻：６０９頁；さらにＲａｄｌら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．（１９８８年）１３２巻：５９３頁；Ｒａｄｌ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ（１９９０年）１１巻：２３４頁もまた参照されたい）。その臨床的特徴は、ヒトの疾患に非常に似ており、腫瘍細胞は骨髄に位置し、血清パラプロテイン濃度が疾患発症の尺度であり、新生血管形成は５Ｔ２ＭＭおよび５Ｔ３３ＭＭモデルの双方において増加し（Ｖａｎ  Ｖａｌｃｋｅｎｂｏｒｇｈら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．（１９８８年）１３２巻：５９３頁）、特定の系において明らかな溶骨性骨疾患が発症する。５Ｔ２ＭＭモデルは、中程度の腫瘍成長および溶骨性骨病変の発達を含む。これらの病変は、網状骨容量の減少、骨ミネラル密度の減少、および破骨細胞数の増加を伴う（Ｃｒｏｕｃｈｅｒら、Ｂｌｏｏｄ（２００１年）９８巻：３５３４頁）。５Ｔ３３ＭＭモデルは、腫瘍の取り込みがより迅速であり、骨髄に加えて、腫瘍細胞はさらに肝臓においても成長する（Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｋｅｎら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（１９９７年）７６巻：４５１頁）。
【０２４５】
５Ｔ２および５Ｔ３３ＭＭモデルは、広範囲にわたって特徴付けられている。特定のモノクローナル抗体は、５Ｔ２および５Ｔ３３ＭＭの双方のイディオタイプに対して産生されており（ｒａｉｓｅｄ）、高い感度で、ＥＬＩＳＡによる血清パラプロテインの検出を可能にし、ならびにＦＡＣＳ分析および組織切片の免疫染色の双方による腫瘍細胞の特異的染色を検出可能にする（Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｋｅｎら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（１９９７年）７６巻：４５１頁）。ＶＨ遺伝子の配列分析は、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット分析による細胞の検出を可能にする（Ｚｈｕら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８年）９３巻：１６２頁）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験の双方に使用できる５ＴＭＭモデルは、典型的なＭＭ疾患を生じ、様々な方法が、骨髄中腫瘍量、血清パラプロテイン濃度、（微小血管密度を測定することによる）骨髄新脈管形成および（Ｘ線撮影、密度測定および組織形態測定の組合せによる）溶骨性骨病変の評価に利用できる。これらの後者のパラメーターの調査は、前臨床設定ならびに完全な同系微小環境において骨髄腫細胞の成長および生物学的研究における５ＴＭＭモデルの使用を可能にする。ＭＭ細胞それ自体を標的にする分子および骨髄の微小環境を標的とする分子の双方が研究できる。具体的には、５Ｔ３３ＭＭモデルが微小環境およびＭＭ細胞それ自体の双方の研究に使用できるのに対して、一方、５Ｔ２ＭＭモデルは、骨疾患を伴う骨髄腫の研究にもさらに使用できる。
【０２４６】
本明細書に開示のＸｃｅｐｔｏｒ分子の予防効力を研究するために、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスに、２×１０６の５Ｔ３３ＭＭ細胞およびＸｃｅｐｔｏｒを０日目に注入する。２８日目にマウスを犠牲にし、腫瘍の発達を、血清パラプロテイン濃度および（抗イディオタイプ抗体を用いたフローサイトメトリーによって、または細胞標本によって決定される）単離骨髄細胞における腫瘍細胞の割合を決定することによって評価する。脾臓および肝臓の重量を決定し、さらなる分析のためにこれらの器官を４％ホルムアルデヒドで固定する。骨試料は、パラフィン切片のＣＤ３１免疫染色および微小血管密度の定量を含むさらなる処理のために固定する。
【０２４７】
本明細書に開示のＸｃｅｐｔｏｒ分子の治療効力を研究するために、マウスに、５Ｔ２ＭＭ細胞を０日目に注入し、検出可能なレベルの血清パラプロテインの存在によって決定されるような疾患の発症後に、Ｘｃｅｐｔｏｒを投与する。Ｘｃｅｐｔｏｒの投与後およそ５週間後にマウスを犠牲にし、腫瘍の発達を予防的研究のために上記のように評価する。さらに、骨分析を、骨の病変の数および海綿質面積を決定するためにＸ線を使用して、ならびに破骨細胞の数を評価するためにＴＲＡＰ染色を使用して、実施する。
（ｂ）関節リウマチ
本明細書に開示のＸｃｅｐｔｏｒ分子の治療効力を、関節リウマチ（ＲＡ）の２種のネズミモデル、すなわちコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）およびグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｇ６ＰＩ）モデルの少なくとも１種において試験する。これらのモデルの各々は、ＲＡにおける治療薬の特定のクラスの効力の予測にとって有用であることが、他者によって示されている（Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２０００年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  ２巻：１６９頁；Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２００６年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １０３巻：８６頁；Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２００７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  １３６巻：１８５頁；ＭｃＤｅｖｉｔｔ（２０００年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  ２巻：８５頁；ＫａｍｒａｄｔおよびＳｃｈｕｂｅｒｔ（２００５年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．  ７巻：２０頁を参照されたい）。
（ｉ）ＣＩＡモデル
ＣＩＡモデルは、関節炎の発症機序および免疫学的根拠に関する、関節炎の最もよく特徴付けられたマウスモデルである。さらに、ＣＩＡモデルは、最も広範囲に使用されるＲＡのモデルであって、患者において疾患を阻害する薬剤の能力を予測するためには完全ではないけれども、ＲＡの潜在的な新規の治療薬を調査する場合、多数の人に選択されるモデルであると考えられる（Ｊｉｒｈｏｌｔ，Ｊ．ら、（２００１年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  ３巻：８７〜９７頁；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ、Ｗ．Ｂ．（２００２年）Ｃｕｒｒ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  Ｒｅｐ．  ４巻：２３２〜２３９頁；Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ，Ｅ．（２００３年）Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ。Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ）。
【０２４８】
ＣＩＡモデルにおいて、関節炎は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）を用いた雄ＤＢＡ／１マウスの免疫によって誘導される。具体的には、マウスに、２１日前にＣＦＡ中のＣＩＩを皮内／皮下注入し、０日目に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のＣＩＩを追加免疫する。マウスは、ＣＩＩ／ＩＦＡの追加免疫の数日以内に関節炎の臨床的徴候を現わす。ＣＩＩ／ＣＦＡにより免疫化されたマウスのサブセット（０％から１０％）は、追加免疫をしなくても０日目の当日またはその周辺において関節炎の徴候を現わし、実験からは除外される。一部のＣＩＡ実験において追加免疫を省き、その代わりにマウスを、ＣＩＩ／ＣＦＡによる免疫後２１日から開始する、Ｘｃｅｐｔｏｒまたは対照での処置を行なう（すなわち、最初の処置の日が０日目である）。
【０２４９】
予防計画および／または治療計画において、マウスを、Ｘｃｅｐｔｏｒ、ビヒクル（ＰＢＳ）または陰性対照もしくは陽性対照を用いて処置する。予防的処置は０日目に開始し、対照（未処置）マウスにおける疾患のピークを通して続ける。治療的処置は、大部分のマウスが関節炎の軽度の徴候を示したときに開始する。関節炎のＣＩＡモデルおよびＧ６ＰＩ誘発性モデルの双方において優れた効力を有することが示されたＥｎｂｒｅｌ（登録商標）を、陽性対照として使用する。実験毎に収集したデータは、関節炎の臨床的スコアおよび累積発現率を含む。ＣＩＡモデルにおける関節炎の臨床的徴候を、以下の表４に示すような０から４のスケールを使用して採点する。
【０２５０】
【表４】
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（ｉｉ）Ｇ６ＰＩモデル
Ｇ６ＰＩモデルにおいて、関節炎は、アジュバント中のＧ６ＰＩを用いたＤＢＡ／１マウスの免疫により誘導される（Ｋａｍｒａｄｔ，Ｔ．およびＤ．Ｓｃｈｕｂｅｒｔ（２００５年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．  ７巻：２０〜２８頁；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．ら（２００４年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２巻：４５０３〜４５０９頁；Ｂｏｃｋｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．ら、（２００５年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．  ７巻：Ｒ１３１６〜１３２４頁；Ｉｗａｎａｍｉ，Ｋ．ら、（２００８年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ５８巻：７５４〜７６３頁；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｉ．ら（２００８年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．  １０巻：Ｒ６６頁）。Ｇ６ＰＩは、実質的に体内の全ての細胞に存在する酵素であり、免疫により関節特異的疾患を誘発する理由は公知ではない。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＴＮＦアンタゴニスト（例えばＥｎｂｒｅｌ（登録商標））および抗ＩＬ６受容体モノクローナル抗体などのいくつかの薬剤が、Ｇ６ＰＩモデルにおいて関節炎の発達を阻害することが示されている。
【０２５１】
雄ＤＢＡ／１マウスを、関節炎を誘発するために、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中Ｇ６ＰＩを用いて免疫する。具体的には、マウスに、ＣＦＡ中Ｇ６ＰＩを０日目に皮内／皮下注入し、免疫の数日以内に関節炎の臨床的徴候が現れる。上述のＣＩＡモデルでのように、マウスを、予防計画および／または治療計画において、Ｘｃｅｐｔｏｒ、ビヒクル（ＰＢＳ）または陰性対照もしくは陽性対照を用いて処置する。予防的処置は０日目に開始し、対照マウスにおける疾患のピークを通して続ける。治療的処置は、大部分のマウスが関節炎の軽度の徴候を示したときに開始する。関節炎のＣＩＡ誘導性モデルおよびＧ６ＰＩ誘発性モデルの双方において優れた効力を有することを示したＥｎｂｒｅｌ（登録商標）を、陽性対照として使用する。各実験において収集したデータは、関節炎の臨床的スコアおよび累積発現率を含む。Ｇ６ＰＩモデルにおける関節炎の臨床的徴候を、ＣＩＡモデルに対して用いたスケールと同様のスケールを使用して採点する。
（ｃ）多発性嚢胞腎
ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質の、多発性嚢胞腎の治療における効力（好ましくは、本明細書に開示したように、ＴＮＦアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストを含有する）を、Ｇａｔｔｏｎｅら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．（２００３年）９巻：１３２３〜６頁；Ｔｏｒｒｅｓら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．（２００４年）１０巻：３６３〜４頁；  Ｗａｎｇら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．（２００５年）１６巻：８４６〜８５１頁；およびＷｉｌｓｏｎ  （２００８年）Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ８４巻：３１１〜５０頁に記載されたように、ネズミモデルにおいて試験する。
【０２５２】
配列番号１〜１２５５は、添付の配列リストに提示する。添付の配列リストに使用した、シンボル「ｎ、」を含むヌクレオチド配列のコードは、ＷＩＰＯ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５（１９９８）、付録２、表１に一致する。
【図２】
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【図８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年4月21日(2011.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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