(57)【要約】１６Ｓ  ｒＲＮＡ、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、または１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡにおいて特定の配列を標的化することによって、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ核酸を増幅および標的化するための方法が開示される。１６Ｓもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡ、または１６Ｓもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ中のＰ．ａｃｎｅｓ核酸配列に対して特異的な核酸オリゴヌクレオチド配列組成物が、開示される。これらは、増幅オリゴヌクレオチド、サンプル調製における捕捉プローブ、およびＰ．ａｃｎｅｓ核酸配列の検出のためのプローブのために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０、配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０の完全に相補的な配列、ならびに配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０のＲＮＡ等価物からなる群より選択される配列番号１９９内に含まれる、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに対して特異的な少なくとも２つのオリゴマーを含む、組成物であって、ここで該少なくとも２つのオリゴマーのうちの第１のオリゴマーが、配列番号１６〜２６、１３５〜１６０、１８４および２１０からなる群より選択される場合、第２のオリゴマーは、配列番号３５〜５４からなる群より選択される、組成物。
【請求項２】
配列番号１〜８、７５〜９８、１２７〜１３０、１８１、１８２、１９５〜１９８、および２１１〜２２６、配列番号１〜８、７５〜９８、１２７〜１３０、１８１、１８２、１９５〜１９８、および２１１〜２２６の完全に相補的な配列、ならびに配列番号１〜８、７５〜９８、１２７〜１３０、１８１、１８２、１９５〜１９８、および２１１〜２２６のＲＮＡ等価物からなる群より選択される少なくとも１つの第３のオリゴマーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも２つのオリゴマーは、配列番号３５〜５４および１３５〜１６０からなる群より選択されるプロモーター提供者オリゴマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの第３のオリゴマーは、配列番号１〜８、配列番号１〜８の完全に相補的な配列、配列番号１〜８のＲＮＡ等価物からなる群より選択され、そして該群から選択される該第３のオリゴマーは、３’がブロックされた末端を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの第３のオリゴマーは、配列番号７５〜９８、１８１、および１８２、配列番号７５〜９８、１８１、および１８２の完全に相補的な配列、ならびに配列番号７５〜９８、１８１、および１８２のＲＮＡ等価物からなる群より選択され、該群から選択される該第３のオリゴマーは、該第３のオリゴマーに結合された標識を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７、配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７の完全に相補的な配列、ならびに配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７のＲＮＡ等価物からなる群より選択される、配列番号２０２内に含まれるＰ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに対して特異的な少なくとも２つのオリゴマーを含む組成物であって、ここで該少なくとも２つのオリゴマーの第１のオリゴマーが配列番号２７〜３４、１６１〜１８０、および１８５からなる群より選択される場合、第２のオリゴマーは、配列番号５５〜７２、１８６、および１８７からなる群より選択される、組成物。
【請求項７】
配列番号９〜１５、９９〜１２６、１３１〜１３４、１８３、および１８８、配列番号９〜１５、９９〜１２６、１３１〜１３４、１８３、および１８８の完全に相補的な配列、ならびに配列番号９〜１５、９９〜１２６、１３１〜１３４、１８３、および１８８のＲＮＡ等価物からなる群より選択される、少なくとも１つの第３のオリゴマーをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも２つのオリゴマーは、配列番号５５〜７２、１８６、および１８７、配列番号５５〜７２、１８６、および１８７の完全に相補的な配列、ならびに配列番号５５〜７２、１８６、および１８７のＲＮＡ等価物からなる群より選択されるプロモーター提供者オリゴマーを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの第３のオリゴマーは、配列番号９〜１５および１８８、配列番号９〜１５および１８８の完全に相補的な配列、ならびに配列番号９〜１５および１８８のＲＮＡ等価物からなる群より選択され、そして該群より選択される該第３のオリゴマーは、３’がブロックされた末端を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの第３のオリゴマーは、配列番号９９〜１２６および１８３、配列番号９９〜１２６および１８３の完全に相補的な配列、ならびに配列番号９９〜１２６および１８３のＲＮＡ等価物からなる群より選択され、そして該群より選択される該第３のオリゴマーは、該第３のオリゴマーに結合された標識を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｐ．ａｃｎｅｓ  ｒＲＮＡもしくはＰ．ａｃｎｅｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡである標的核酸配列を検出することによって、サンプル中のＰ．ａｃｎｅｓを特異的に検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）配列番号１９９に含まれる１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中のＰ．ａｃｎｅｓ標的領域、および／または配列番号２０２に含まれる２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ＲＮＡをコードする遺伝子中の標的領域を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）該Ｐ．ａｃｎｅｓ標的領域中の配列を増幅して、少なくとも１つの増幅オリゴマーの酵素的伸長を含むインビトロ増幅反応において少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用することによって、増幅生成物を作製する工程であって、
ここで該標的配列が配列番号１９９中に含まれる該１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは該１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中に存在する場合、該少なくとも２つの増幅オリゴマーは、配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０、配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０の完全に相補的な配列、ならびに配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０のＲＮＡ等価物からなる群より選択され、そして
ここで該標的配列は、配列番号２０２に含まれる該２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは該２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中に存在し、該少なくとも２つの増幅オリゴマーは、配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７、配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７の完全に相補的な配列、ならびに配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７のＲＮＡ等価物からなる群より選択される、工程；ならびに
（ｃ）該増幅された生成物を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記標的配列は、前記１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは前記１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中に存在し、前記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、配列番号１６〜２６、１３５〜１６０、１８４および２１０からなる群より選択される第１の増幅オリゴマーを、配列番号３５〜５４からなる群より選択される第２の増幅オリゴマーとともに使用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは前記１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中の標的配列について増幅する工程は、配列番号１〜８、配列番号１〜８の完全に相補的な配列、ならびに配列番号１〜８のＲＮＡ等価物からなる群より選択される第３のオリゴマーをさらに含み、そして該群より選択される該第３のオリゴマーは、３’がブロックされた末端を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは前記１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中の標的配列から作製される増幅生成物についての前記検出工程は、配列番号７５〜９８、１８１、および１８２、配列番号７５〜９８、１８１、および１８２の完全に相補的な配列、ならびに配列番号７５〜９８、１８１、および１８２のＲＮＡ等価物からなる群より選択される検出プローブを使用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは前記１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに、配列番号１２７〜１３０からなる群より選択される標的捕捉プローブをハイブリダイズさせることによって、該１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは該１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを、前記サンプルから精製するために標的捕捉工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的配列は、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは前記２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中に存在し、前記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、配列番号２７〜３４、１６１〜１８０、および１８５からなる群より選択される第１の増幅オリゴマーを、配列番号５５〜７２、１８６、および１８７からなる群より選択される第２の増幅オリゴマーとともに使用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは前記２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中の標的配列についての前記増幅工程は、配列番号９〜１５および１８８、配列番号９〜１５および１８８の完全に相補的な配列、ならびに配列番号９〜１５および１８８のＲＮＡ等価物からなる群より選択される第３のオリゴマーをさらに含み、そして該群より選択される該第３のオリゴマーは、３’がブロックされた末端を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは前記２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中の標的配列から作製される増幅生成物についての前記検出工程は、配列番号９９〜１２６および１８３、配列番号９９〜１２６および１８３の完全に相補的な配列、ならびに配列番号９９〜１２６および１８３のＲＮＡ等価物からなる群より選択される検出プローブを使用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは前記２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに、配列番号１３１〜１３４からなる群より選択される標的捕捉プローブをハイブリダイズさせることによって、該２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは該２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを、前記サンプルから精製するために、標的捕捉工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅生成物は、標識を含む検出プローブを使用することによって検出される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、分子生物学的方法を使用することによって、サンプル中で細菌を検出することに関し、より具体的には、Ｐ．ａｃｎｅｓから核酸を増幅させ、上記増幅核酸配列を検出することによって、サンプル中のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓは、グラム陽性の、非芽胞形成の桿状細菌である。Ｐ．ａｃｎｅｓは、皮膚、口腔、大腸および結膜の常在細菌叢の一部である。Ｐ．ａｃｎｅｓは、１ｃｍ２あたり１０２〜１０６の生物の推定密度で全ての皮膚微生物叢の約半分を占める（非特許文献１）。Ｐ．ａｃｎｅｓは、尋常性ざ瘡と主に関連するが、多くの炎症状態、免疫抑制宿主における術後障害および日和見感染と関連していた（非特許文献２，非特許文献３）。
【０００３】
Ｐ．ａｃｎｅｓは、培養するのが困難な、培養条件の面倒な生物であり、嫌気培養のための特定の装置および専門技術を要する。慣用的な培養では、特に、培養条件があまり面倒でない好気性細菌が存在する場合に、Ｐ．ａｃｎｅｓをしばしば取り損なう。また、臨床サンプル中のＰ．ａｃｎｅｓの存在は、しばしば、他の医療的に重要な細菌が存在する場合に夾雑物として退けられる（非特許文献４）。Ｐ．ａｃｎｅｓは、ゆっくりと増殖し（例えば、４日後に１ｍｍ未満のコロニーを形成する）、従って、Ｐ．ａｃｎｅｓを含むと疑われるサンプルは、最大２週間まで培養されなければならない。
【０００４】
ヒト皮膚上にＰ．ａｃｎｅｓが多量にあることに起因して、Ｐ．ａｃｎｅｓは、人々の存在を必要とする任意のプロセスにおいて夾雑物になり得る。多くの産業において、細菌夾雑物を特定のレベル未満に保つことは、重要である。食品産業、薬物産業、診断産業および化粧品産業の製品を作製するために使用される物質（例えば、水）は、製造プロセス全体を通して夾雑物について試験される。米国の薬物、デバイスもしくは診断製造業において使用される水は、化学物質夾雑物および微生物夾雑物の量を制限する米国局方（ＵＳＰ）仕様を満たさねばならない。薬物、デバイスおよび診断剤の上記ＵＳＰ純度標準は、米国食品医薬品局によって実施されている。例えば、コロニー形成単位（ＣＦＵ）として測定される上記ＵＳＰ  ２３標準は、微生物夾雑物を純水１ｍｌあたり１００ＣＦＵ以下に制限している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５；４３：３２６
【非特許文献２】Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００６；４２：１８５
【非特許文献３】Ａｎａｅｒｏｂｅ  ２００３；９：５
【非特許文献４】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４；５３：１２４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｐ．ａｃｎｅｓを検出するための、特に、汚染源が正確に検出され、その後排除されるように、サンプルを製造することにおいて、迅速で、感度の高いかつ正確な方法が必要である。Ｐ．ａｃｎｅｓ感染個体の迅速で有効な処置を可能にしかつさらなる感染を最小限にするために、ヒトにおけるＰ．ａｃｎｅｓ感染の迅速でかつ正確な診断を可能にする方法もまた、必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０、配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０の完全に相補的な配列、ならびに配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０ＲＮＡ等価物からなる群より選択される、配列番号１９９内に含まれるＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに対して特異的な少なくとも２つのオリゴマーを含む組成物であって、ここで上記少なくとも２つのオリゴマーのうちの第１のオリゴマーが、配列番号１６〜２６、１３５〜１６０、１８４および２１０からなる群より選択される場合、第２のオリゴマーは、配列番号３５〜５４からなる群より選択される、組成物。上記組成物の一実施形態は、配列番号１〜８、７５〜９８、１２７〜１３０、１８１、１８２、１９５〜１９８、および２１１〜２２６、配列番号１〜８、７５〜９８、１２７〜１３０、１８１、１８２、１９５〜１９８、および２１１〜２２６の完全に相補的な配列、ならびに配列番号１〜８、７５〜９８、１２７〜１３０、１８１、１８２、１９５〜１９８、および２１１〜２２６のＲＮＡ等価物からなる群より選択される少なくとも１つの第３のオリゴマーをさらに含む。上記組成物の別の実施形態は、配列番号３５〜５４および１３５〜１６０からなる群より選択されるプロモーター提供者オリゴマー（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｏｖｉｄｅｒ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ）を含む。少なくとも１つの第３のオリゴマーを含む上記組成物の一実施形態は、配列番号１〜８、配列番号１〜８の完全に相補的な配列、ならびに配列番号１〜８のＲＮＡ等価物からなる群より選択されるオリゴマーを含み、そのために、上記群から選択される第３のオリゴマーは、３’がブロックされた末端を含む。別の実施形態において、上記少なくとも１つの第３のオリゴマーは、配列番号７５〜９８、１８１、および１８２、配列番号７５〜９８、１８１、および１８２の完全に相補的な配列、ならびに配列番号７５〜９８、１８１、および１８２のＲＮＡ等価物からなる群より選択され、そのために、上記群より選択される上記第３のオリゴマーは、上記第３のオリゴマーに結合された標識を含む。
【０００８】
配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７、配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７の完全に相補的な配列、ならびに配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７のＲＮＡ等価物からなる群より選択される、配列番号２０２内に含まれるＰ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに対して特異的な少なくとも２つのオリゴマーを含む組成物であって、ここで上記少なくとも２つのオリゴマーのうちの第１のオリゴマーが、配列番号２７〜３４、１６１〜１８０、および１８５からなる群より選択される場合、第２のオリゴマーは、配列番号５５〜７２、１８６、および１８７からなる群より選択される、組成物。一実施形態において、上記組成物は、配列番号９〜１５、９９〜１２６、１３１〜１３４、１８３、および１８８、配列番号９〜１５、９９〜１２６、１３１〜１３４、１８３、および１８８の完全に相補的な配列、ならびに配列番号９〜１５、９９〜１２６、１３１〜１３４、１８３、および１８８のＲＮＡ等価物からなる群より選択される少なくとも１つの第３のオリゴマーをさらに含む。上記組成物の別の実施形態において、上記少なくとも２つのオリゴマーは、配列番号５５〜７２、１８６、および１８７、配列番号５５〜７２、１８６、および１８７の完全に相補的な配列、ならびに配列番号５５〜７２、１８６、および１８７のＲＮＡ等価物からなる群より選択されるプロモーター提供者オリゴマーを含む。少なくとも１つの第３のオリゴマーを含む上記組成物の一実施形態において、上記第３のオリゴマーは、配列番号９〜１５および１８８、配列番号９〜１５および１８８の完全に相補的な配列、ならびに配列番号９〜１５および１８８のＲＮＡ等価物からなる群より選択され、上記群より選択される上記第３のオリゴマーは、３’がブロックされた末端を含む。別の実施形態において、上記少なくとも１つの第３のオリゴマーは、配列番号９９〜１２６および１８３、配列番号９９〜１２６および１８３の完全に相補的な配列、ならびに配列番号９９〜１２６および１８３のＲＮＡ等価物からなる群より選択され、そのために、上記群より選択される上記第３のオリゴマーは、上記第３のオリゴマーに結合された標識を含む。
【０００９】
Ｐ．ａｃｎｅｓ  ｒＲＮＡもしくはＰ．ａｃｎｅｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡである標的核酸配列を検出することによって、サンプル中のＰ．ａｃｎｅｓを特異的に検出するための方法であって、上記方法は、配列番号１９９に含まれる１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中のＰ．ａｃｎｅｓ標的領域、および／または配列番号２０２に含まれる２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ＲＮＡをコードする遺伝子中の標的領域を含むサンプルを提供する工程；少なくとも１つの増幅オリゴマーの酵素的伸長を含むインビトロ増幅反応において少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用することによって、上記Ｐ．ａｃｎｅｓ  標的領域中の配列を増幅して、増幅生成物を作製する工程であって、ここで上記標的配列が、配列番号１９９に含まれる１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記１６Ｓ  ｒＲＮＡををコードするＤＮＡ中に存在する場合、上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０、配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０の完全に相補的な配列、ならびに配列番号１６〜２６、３５〜５４、１３５〜１６０、１８４、および２１０のＲＮＡ等価物からなる群より選択され、そして上記標的配列が、配列番号２０２に含まれる上記２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中に存在する場合、上記少なくとも２つの増幅オリゴマーは、配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７、配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７の完全に相補的な配列、ならびに配列番号２７〜３４、５５〜７２、１６１〜１８０、および１８５〜１８７のＲＮＡ等価物からなる群より選択される、工程；ならびに上記増幅生成物を検出する工程を包含する、方法。上記標的配列が上記１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中に存在する上記方法の一実施形態は、上記増幅オリゴマーは、配列番号１６〜２６、１３５〜１６０、１８４および２１０からなる群より選択される第１の増幅オリゴマーを、配列番号３５〜５４からなる群より選択される第２の増幅オリゴマーとともに使用する。上記増幅工程が、上記１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中の標的配列を増幅する一実施形態において、上記方法は、配列番号１〜８、配列番号１〜８の完全に相補的な配列、および配列番号１〜８のＲＮＡ等価物からなる群より選択される第３のオリゴマーをさらに含み、そのために、上記群より選択される上記第３のオリゴマーは、３’がブロックされた末端を含む。一実施形態において、上記１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中の標的配列から作製された増幅生成物についての検出工程は、配列番号７５〜９８、１８１、および１８２、配列番号７５〜９８、１８１、および１８２の完全に相補的な配列、ならびに配列番号７５〜９８、１８１、および１８２のＲＮＡ等価物からなる群より選択される検出プローブを使用する。別の実施形態において、上記方法は、上記１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに、配列���号１２７〜１３０からなる群より選択される標的捕捉プローブをハイブリダイズさせることによって、上記１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを、上記サンプルから精製するための標的捕捉工程をさらに包含する。上記標的配列が、上記２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中に存在する方法の一実施形態において、上記２つの増幅オリゴマーは、配列番号２７〜３４、１６１〜１８０、および１８５からなる群より選択される第１の増幅オリゴマーを、配列番号５５〜７２、１８６、および１８７からなる群より選択される第２の増幅オリゴマーとともに使用する。上記増幅工程が、上記２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中の標的配列を増幅する別の実施形態において、上記増幅工程は、配列番号９〜１５および１８８、配列番号９〜１５および１８８の完全に相補的な配列、ならびに配列番号９〜１５および１８８のＲＮＡ等価物からなる群より選択される第３のオリゴマーをさらに含み、そのために上記群より選択される上記第３のオリゴマーは、３’がブロックされた末端を含む。一実施形態において、上記２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中の標的配列から作製される増幅生成物についての検出工程は、配列番号９９〜１２６および１８３、配列番号９９〜１２６および１８３の完全に相補的な配列、ならびに配列番号９９〜１２６および１８３のＲＮＡ等価物からなる群より選択される検出プローブを使用する。上記方法の一実施形態は、上記２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに、配列番号１３１〜１３４からなる群より選択される標的捕捉プローブをハイブリダイズさせることによって、上記２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは上記２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを、上記サンプルから精製するための標的捕捉工程をさらに包含する。上記方法の一実施形態において、上記増幅生成物は、標識を含む検出プローブを使用することによって検出される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（詳細な説明）
サンプル中のＰ．ａｃｎｅｓの存在もしくは非存在を検出するための方法が開示され、上記サンプルとしては、食品標本、水標本、産業標本、環境標本もしくは生物学的標本を含む。これら方法は、Ｐ．ａｃｎｅｓ核酸の感度の高いかつ特異的な検出を提供する。上記方法は、Ｐ．ａｃｎｅｓに対して特異的な１６Ｓ  ＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡの配列の核酸増幅を行う工程、および上記増幅生成物を検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、検出は、上記増幅生成物と、上記サンプル中のＰ．ａｃｎｅｓの存在を示すためにシグナルを提供する核酸プローブとを特異的にハイブリダイズさせることによって起こる。上記サンプル中のＰ．ａｃｎｅｓの非存在は、Ｐ．ａｃｎｅｓ標的核酸の同時増幅のために処理されるが、増幅Ｐ．ａｃｎｅｓ生成物が作製されない一方で、増幅生成物が上記反応混合物中で内部コントロールに対して作製される、反応混合物中の非Ｐ．ａｃｎｅｓ核酸である内部コントロールを含む方法の一実施形態において検出される。すなわち、上記反応混合物中の内部コントロールの増幅は、上記方法工程が、適切に行われ、その反応条件が、増幅核酸を作製するのに機能的であったが、Ｐ．ａｃｎｅｓ標的核酸が上記試験されたサンプル中に存在しなかったので、Ｐ．ａｃｎｅｓ増幅生成物が作製されたことを示す。
【００１１】
増幅は、上記サンプルと、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）もしくはｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、より具体的には、１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡ、または１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中の標的配列に対して特異的な１つ以上の増幅オリゴヌクレオチドとを接触させて、上記Ｐ．ａｃｎｅｓ標的核酸が上記サンプル中に存在する場合に、増幅生成物を生成することを包含する。増幅は、上記標的配列もしくはその相補体を、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼを使用して、上記標的核酸もしくはその相補鎖の一部であるテンプレート鎖を使用することによって増幅オリゴマー（例えば、プライマー）からの配列を伸長することによって、さらなるコピーを合成する。一実施形態は、上記増幅生成物と、上記増幅オリゴヌクレオチドによって増幅される配列に対して特異的な少なくとも１つのプローブ（例えば、選択された増幅オリゴマーの対が隣り合う標的配列に含まれる配列）とを接触させる工程を包含するハイブリダイゼーション工程を使用することによって、上記増幅生成物を検出する。
【００１２】
上記増幅生成物を検出する工程は、上記増幅反応が完了した後に行われてもよいし、上記標的領域を増幅する工程と同時に（すなわち、リアルタイムで）行われてもよい。一実施形態において、上記検出工程は、均質な検出（すなわち、上記混合物からのハイブリダイズしていないプローブを除去せずに、上記増幅生成物に対してハイブリダイズしたプローブの検出）を可能にする（例えば、米国特許第５，６３９，６０４号および同第５，２８３，１７４号（Ａｒｎｏｌｄ  Ｊｒ．ら）を参照のこと）。上記増幅工程の終わり付近もしくは終わりに上記増幅生成物を検出する実施形態において、直線状プローブは、上記増幅生成物への上記プローブのハイブリダイゼーションを示すためのシグナルを提供するために使用され得る。リアルタイム検出を使用する他の実施形態において、上記プローブは、ヘアピンプローブ（例えば、分子ビーコン、分子トーチ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｒｃｈ）、もしくはハイブリダイゼーションスイッチプローブ）であり得る。これらは、上記プローブが増幅生成物に結合する場合に検出されるレポーター部分で標識される。例えば、ヘアピンプローブは、上記プローブの一方の末端に結合された標識（例えば、蛍光団（「Ｆ」））、および上記ヘアピン構造が閉じた構造であり、上記増幅生成物にハイブリダイズされない場合に、上記標識からのシグナル生成を阻害するための上記ヘアピン構造の他方の末端に結合された相互作用化合物（例えば、クエンチャー（「Ｑ」））を含み得るのに対して、シグナルは、上記プローブが上記増幅生成物中の相補的配列にハイブリダイズされるので、上記プローブが「開いた」構造である場合に検出可能である。このようなプローブの種々の形態は公知である（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号（Ｌｉｚａｒｄｉら）、米国特許第５，９２５，５１７号および同第６，１５０，０９７号（Ｔｙａｇｉら）、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号（Ｂｅｃｋｅｒら）、ならびにＵＳ２００６−００６８４１７Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）、およびＵＳ２００６−０１９４２４０Ａ１（Ａｒｎｏｌｄ  Ｊｒ．）を参照のこと）。
【００１３】
本開示の局面を理解するのを助けるために、本明細書で使用されるいくつかの用語は、より詳細に記載される。本明細書で使用される全ての他の科学的用語および技術的用語は、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，１９９４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，１９９１，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、および本明細書で引用される参考文献において提供され得るように、関連分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。別段言及されない限り、本明細書で使用されるかもしくは企図される技術は、分子生物学の分野の当業者に周知の標準的方法である。
【００１４】
「サンプル」とは、Ｐ．ａｃｎｅｓもしくはその成分（例えば、核酸もしくは核酸のフラグメント）を含み得る任意の標本を含む。サンプルは、環境源もしくは製造源（例えば、水、土壌、スラリー、細片、水溶液の容器のバイオフィルム、空中粒子もしくはエアロゾルなど）から得られ得る。これは、処理されたサンプル（例えば、濾過デバイスの上もしくは濾過デバイスを通ったサンプルから、もしくは遠心分離後のサンプルから、または媒体、マトリクスもしくは支持体への接着によって得られる）を含み得る。サンプルは、「生物学的サンプル」を含み、生物学的サンプルとしては、Ｐ．ａｃｎｅｓもしくはこれに由来する標的核酸を含み得る、生きているもしくは死んでいる哺乳動物もしくや生物に由来する任意の組織もしくは物質（例えば、呼吸器組織もしくは滲出物（例えば、気管支鏡、気管支肺胞洗浄液、肺生検、喀痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、または他の体液もしくは物質が挙げられる）が挙げられる。サンプルは、組織凝集物もしくは細胞を物理的にもしくは機械的に粉砕するために処理され得、従って、細胞内成分（核酸を含む）を他の成分（例えば、酵素、緩衝化剤、塩、界面活性剤など）を含み得る溶液へと放出する。
【００１５】
「核酸」とは、ヌクレオシドもしくはヌクレオシドアナログ（これは、窒素を含む複素環塩基、複素環塩基、もしくは塩基アナログを有する）を含むマルチマー化合物であって、上記ヌクレオシドが、ホスホジエステル結合もしくは他の連結によって一緒に連結されて、ポリヌクレオチドを形成するものをいう。核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくはキメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマーまたはオリゴヌクレオチド、およびこれらのアナログが挙げられる。核酸「骨格」は、種々の連結（糖−ホスホジエステル連結、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」もしくはＰＮＡ中の）（ＰＣＴ番号ＷＯ  ９５／３２３０５を参照のこと）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、もしくはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む）から作製され得る。上記核酸の糖部分は、リボースもしくはデオキシリボース、または既知の置換（例えば、２’メトキシ置換および２’ハライド置換（例えば、２’−Ｆ））を有する類似の化合物のいずれかであり得る。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、そのアナログ（例えば、イノシン、５−メチルイソシトシン、イソグアニン；Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，Ａｄａｍｓら，編，第１１版，１９９２，Ａｂｒａｈａｍら，２００７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４３：６１７−２４）であり得、これらとしては、プリン塩基もしくはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−プリンもしくはアザ−プリン、デアザ−ピリミジンもしくはアザ−ピリミジン）、５位もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基、２位、６位および／もしくは８位に改変基もしくは置換基を有するプリン塩基（例えば、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン、ならびにピラゾロ化合物（例えば、置換されていないもしくは３−置換されたピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号、同第６，９４９，３６７号およびＰＣＴ番号ＷＯ  ９３／１３１２１）が挙げられる。核酸は、上記骨格が１つ以上の残基について窒素含有塩基を含まない「無塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号（Ａｒｎｏｌｄら））。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡにおいて見いだされるような従来の糖、塩基および連結のみを含んでいてもよいし、従来の成分および置換（例えば、２’メトキシ骨格によって連結される従来の塩基、もしくは従来の塩基および１種以上の塩基アナログの混合物を含む核酸）を含んでいてもよい。核酸は、「ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸」（ＬＮＡ）を含み得、ここで１つ以上のヌクレオチドモノマーは、ＲＮＡ模倣糖構造においてロックされた二環式フラノースユニットを有し、これは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、もしくは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）における相補性配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める（Ｖｅｓｔｅｒら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（４２）：１３２３３−４１）。核酸をインビトロで作���するための合成法は、当該分野で周知であるが、核酸は、慣用的な技術を使用して、天然供給源から精製され得る。
【００１６】
交換可能な用語「オリゴマー」および「オリゴヌクレオチド」とは、一般に１，０００未満のヌクレオチド（ｎｔ）残基を有する核酸であって、約５ｎｔ残基の下限および約５００〜９００ｎｔ残基の上限を有する範囲のポリマーを含むものをいう。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１２〜１５ｎｔの下限および約５０〜６００ｎｔの上限を有するサイズ範囲であり、他の実施形態は、約１５〜２０ｎｔの下限および約２２〜１００ｎｔの上限を有する範囲である。オリゴヌクレオチドは、天然に存在する供給源から精製されてもよいが、種々の周知の酵素的方法もしくは化学的方法のうちのいずれかを使用して合成されてもよい。
【００１７】
「増幅オリゴマー」は、標的核酸、もしくはその相補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴマーである。増幅オリゴマーの例は、テンプレート核酸にハイブリダイズする「プライマー」であり、増幅プロセスにおいてポリメラーゼによって伸長される３’  ＯＨ末端を含む。増幅オリゴマーの別の例は、ポリメラーゼによって伸長されない（例えば、これは、３’がブロックされた末端を有するので）が、増幅に関与するかもしくは促進するオリゴマーである。増幅オリゴヌクレオチドのサイズ範囲は、約１０〜約７０ｎｔ長（プロモーター配列もしくはポリ−Ａテイルを含まない）であり、上記標的核酸配列（もしくはその相補鎖）の領域に相補的な、少なくとも約１０連続する塩基、もしくはさらに少なくとも１２連続する塩基を含むものを含む。上記連続する塩基は、上記増幅オリゴマーが結合する標的配列に対して、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは完全に相補的である。増幅オリゴマーは、必要に応じて、増幅反応に関与するが、上記標的核酸、もしくはテンプレート配列に対して相補的でなく、上記配列にも含まれない改変ヌクレオチドもしくはアナログ、またはさらなるヌクレオチドを含み得る。例えば、増幅オリゴヌクレオチドの５’領域は、上記標的核酸に相補的でないプロモーター配列（これは、「プロモーター−プライマー」もしくは「プロモーター提供者」といわれ得る）を含み得る。当業者は、プライマーとして機能する増幅オリゴマーが、５’プロモーター配列を含むように改変され得、従って、プロモーター−プライマーとして機能し得ることを理解する。同様に、プロモーター−プライマーは、プロモーター配列の除去もしくはプロモーターなしの合成によって改変され得、プライマーとしてさらに機能する。別の例において、３’がブロックされているが、標的核酸にハイブリダイズし得かつ転写を開始するように働く上流プロモーター配列を提供し得る増幅オリゴマーは、「プロモーター提供者」オリゴマーといわれる。
【００１８】
核酸  ポリメラーゼによって伸長されることが意図されないオリゴマーは、３’ＯＨを置換して、増幅反応における上記オリゴマーの酵素媒介性伸長を妨げるブロッカー基を含み得る。例えば、増幅の間に存在する、ブロックされた増幅オリゴマーおよび／もしくは検出プローブは、機能的３’ＯＨを有さなくてもよく、代わりに、上記３’末端にもしくはその付近に位置した１つ以上のブロッキング基を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上記３’末端付近のブロッキング基は、上記３’末端の５残基内にあってもよく、上記オリゴマーへのポリメラーゼの結合を制限するに十分大きい。他の実施形態において、ブロッキング基は、上記３’末端に共有結合されている。多くの異なる化学基は、上記３’末端をブロックするために使用され得る（例えば、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシヌクレオチド残基、およびコルジセピン）。
【００１９】
「増幅」とは、標的核酸配列またはその相補鎖もしくはフラグメントの複数のコピーを得るための任意の公知の手順をいう。「フラグメント」の増幅は、例えば、上記標的核酸の内部にハイブリダイズし、そこから重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを使用することによって生成される、完全ではない（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ）標的核酸もしくはその相補鎖を含む増幅された核酸の生成をいう。公知の増幅法としては、例えば、レプリカーゼ媒介性増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介性もしくは転写関連増幅が挙げられる。レプリカーゼ媒介性増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびレプリカーゼ（例えば、ＱＢ−レプリカーゼ）を使用する（例えば、米国特許第４，７８６，６００号（Ｋｒａｍｅｒら））。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの対、およびサーマルサイクリングを使用して、ｄｓＤＮＡの２つの相補鎖の複数のコピーを合成するかまたはｃＤＮＡを形成する（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号（Ｍｕｌｌｉｓら））。ＬＣＲ増幅は、４つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを使用して、複数サイクルのハイブリダイゼーション、連結、および変性を使用することによって、標的およびその相補鎖を増幅する（例えば、米国特許第５，４２７，９３０号（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒら）、米国特許第５，５１６，６６３号（Ｂａｃｋｍａｎら））。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼおよび上記標的配列を含む半改変（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖にニックを入れるエンドヌクレアーゼについての認識部位を含むプライマーを使用し、それによって、増幅が、一連のプライマー伸長および鎖置換工程において起こる（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号（Ｗａｌｋｅｒら）、同第５，５４７，８６１号（Ｎａｄｅａｕら）、および同第５，６４８，２１１号（Ｆｒａｉｓｅｒら）を参照のこと）。
【００２０】
「転写関連増幅」もしくは「転写媒介性増幅」（ＴＭＡ）とは、ＲＮＡポリメラーゼを使用して、核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写物を生成する核酸増幅をいう。これら方法は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、リボヌクレオシドトリホスフェート、およびプロモーター配列を含むテンプレート相補性オリゴヌクレオチドを使用し、必要に応じて、１つ以上の他のオリゴヌクレオチドを含み得る。転写関連増幅のバリエーションは、以前に詳細に開示されているように、当該分野で周知である（米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら）；米国特許第５，４３７，９９０号（Ｂｕｒｇら）；ＰＣＴ番号ＷＯ  ８８／０１３０２およびＷＯ  ８８／１０３１５（Ｇｉｎｇｅｒａｓら）；米国特許第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）；米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号（Ｕｒｄｅａら）；ＰＣＴ番号ＷＯ  ９５／０３４３０（Ｒｙｄｅｒら）；ならびにＵＳ  ２００６−００４６２６５  Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）を参照のこと）。ＴＭＡ法（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号）および単一プライマー転写関連増幅法（ＵＳ  ２００６−００４６２６５  Ａ１）は、本明細書で開示されるように、Ｐ．ａｃｎｅｓ標的配列の検出のために使用される増幅法の実施形態である。当業者は、開示される組成物が、ポリメラーゼによるオリゴマー配列の伸長に基づいて、増幅法において使用され得ることを認識する。
【００２１】
「プローブ」とは、核酸中、もしくは増幅核酸中の標的配列に、上記標的配列もしくは増幅核酸の検出を可能にするためにハイブリダイゼーションを促進する条件下で、特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーをいう。検出は、直接的（すなわち、その標的配列に直接ハイブリダイズしたプローブ）もしくは間接的に（すなわち、中間分子構造を介して、その標的に連結されたプローブ）かのいずれかであり得る。プローブの「標的配列」とは、一般に、標準的塩基対合によって、プローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、より大きな配列（例えば、増幅配列の部分セット）内の配列をいう。プローブは、標的特異的配列および上記プローブの三次元構造に寄与する他の配列を含み得る（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号（Ｌｉｚａｒｄｉら）；ならびに米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、同第６，３６１，９４５号、およびＵＳ  ２００６−００６８４７  Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）に記載される）。
【００２２】
互いにハイブリダイズする配列は、標準的核酸塩基対合（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：ＴもしくはＡ：Ｕの対合）によって、意図された標的配列に完全に相補的であってもよいし、部分的に相補的であってもよい。「十分に相補的」とは、一連の相補的な塩基間の水素結合によって別の配列にハイブリダイズし得る連続配列を意味し、これは、標準的塩基対合によって上記配列中の各位置において相補的であってもよいし、相補的でない１つ以上の残基（無塩基残基を含む）を含んでいてもよい。十分に相補的な連続塩基は、代表的には、オリゴマーが、特異的にハイブリダイズするように意図される配列に対して、少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％相補的である。「十分に相補的」な配列は、たとえ上記配列が完全に相補的ではないとしても、適切なハイブリダイゼーション条件下で、その標的配列との核酸オリゴマーの安定なハイブリダイゼーションを可能にする。適切なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で周知であり、配列組成に基づいて推定され得るか、または慣用的な試験法を使用することによって決定され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、§§１．９０〜１．９１、７．３７〜７．５７、９．４７〜９．５１および１１．４７〜１１．５７、特に、§§９．５０〜９．５１、１１．１２〜１１．１３、１１．４５〜１１．４７および１１．５５〜１１．５７）。
【００２３】
「サンプル調製」とは、上記サンプルに存在するＰ．ａｃｎｅｓ核酸のその後の増幅および／もしくは検出のために、サンプルを処理する任意の工程もしくは方法をいう。サンプルは、上記標的核酸が少量の成分である、成分の複雑な混合物であり得る。サンプル調製は、成分（例えば、微生物もしくは核酸）を、より大きなサンプル容積から濃縮する任意の公知の方法（例えば、空中粒子もしくは水中粒子の、より大きな容積のサンプルからの濾過によって、または標準的な微生物学方法を使用することによる、サンプルからの微生物の単離によって）を含み得る。サンプル調製は、細胞内成分を実質的に水性相もしくは油性相へ放出するための細胞成分の物理的破壊および／もしくは化学的溶解、ならびに細片の除去（例えば、濾過、遠心分離もしくは吸着を使用することによる）を含み得る。サンプル調製は、標的核酸を選択的にもしくは非特異的に捕捉し、これを他のサンプル成分から分離する核酸オリゴヌクレオチドの使用を含み得る（例えば、米国特許第６，１１０，６７８号（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら）、およびＵＳ  ２００８−０２８６７７５  Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）に記載されるように）。
【００２４】
「捕捉プローブ」もしくは「捕捉オリゴマー」とは、塩基対ハイブリダイゼーションを使用することによって標的配列および固定化オリゴマーをつなぐ、少なくとも１つの核酸オリゴマーをいう。捕捉オリゴマーの一実施形態は、通常、同じオリゴマーの上に２つの結合領域：標的配列結合領域および固定化プローブ結合領域を含むが、上記２つの領域は、１つ以上のリンカーによって連結される異なるオリゴヌクレオチド上に存在し得る。例えば、第１のオリゴマーは、上記固定化プローブ結合領域を含み得、第２のオリゴマーは、上記標的配列結合領域を含み得、そして上記２つの異なるオリゴヌクレオチドは、上記第１および第２のオリゴヌクレオチドの２つの配列を連結するリンカーで、水素結合によって連結される。捕捉オリゴマーの別の実施形態は、標的核酸に非特異的に結合し、そしてこれを支持体上の固定化プローブに連結するために、無作為もしくは非無作為のポリ−ＧＵ、ポリ−ＧＴ、もしくはポリＵ配列を含む標的配列結合領域を使用する。
【００２５】
「固定化プローブ」もしくは「固定化核酸」とは、直接的にもしくは間接的に、固定化支持体に捕捉オリゴマーを連結する核酸をいう。固定化プローブの一実施形態は、結合した標的配列のサンプル中の結合されていない物質からの分離を促進する支持体に連結されたオリゴマーである。支持体は、公知の物質（例えば、溶液中で遊離しているマトリクスおよび粒子）を含み得、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、ポリプロピレン、金属、もしくは他の組成物から作製され得、そのうちの一実施形態は、磁性的に引き寄せ得る粒子である。支持体は、単分散性の磁性スフィア（例えば、均一サイズ±５％）であり得、これに対して、固定化プローブが直接連結される（共有結合、キレート過、もしくはイオン性相互作用を介して）か、または間接的に連結される（１つ以上のリンカーを介して）。ここで上記プローブと支持体との間の上記連結もしくは相互作用は、ハイブリダイゼーション条件の間に安定である。
【００２６】
「分離」もしくは「精製」は、サンプルのうちの１つ以上の成分が、他のサンプル成分から除去もしくは分離されることを意味する。サンプル成分は、通常は、概して水性溶液相中に標的核酸を含み、水性溶液相はまた、細胞断片、タンパク質、炭水化物、脂質、および他の核酸を含み得る。分離もしくは精製は、上記標的核酸のうちの少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９５％を、他のサンプル成分から取り出す。
【００２７】
「標識」とは、検出され得るか、または検出可能な応答もしくはシグナルをもたらす分子部分もしくは化合物をいう。標識は、核酸プローブに直接的もしくは間接的に連結され得る。直接的標識は、上記標識を上記プローブに連結する結合もしくは相互作用（共有結合もしくは非共有結合的相互作用（例えば、水素結合、疎水性相互作用およびイオン性相互作用、またはキレートもしくは配位錯体の形成）を含む）を介して起こり得る。間接的標識は、結合部分もしくは「リンカー」（例えば、結合対メンバー、抗体もしくはさらなるオリゴマー）の使用を介して起こり得、上記結合部分もしくはリンカーは、直接的もしくは間接的のいずれかで標識され、上記検出可能なシグナルを増幅し得る。標識は、任意の検出可能な部分（例えば、放射性核種、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン）、酵素もしくは酵素基質、反応性基、もしくは発色団（例えば、色素、粒子、もしくは検出可能な色を付与したビーズ）、発光化合物（例えば、生体発光標識、リン光標識、もしくは化学発光標識）、または蛍光団が挙げられる。標識は、混合物中の結合した標識プローブが、結合されていない標識プローブのものとは異なる検出可能な変化（例えば、不安定性もしくは差示的な分解特性）を示す、均質なアッセイにおいて検出可能であり得る。「均質な検出可能な標識」とは、上記標識もしくは標識プローブの結合されていない携帯から結合したものを物理的に除去することなく検出され得る（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。標識としては、化学発光化合物（例えば、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物（標準的なＡＥおよび誘導体を含む（例えば、米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号））が挙げられる。合成および標識を核酸に結合し、標識を検出する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、Ｃｈａｐｔｅｒ  １０；米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、および同第４，５８１，３３３号）。
【００２８】
「〜から本質的になる」は、本発明の基本的および新規な特徴を本質的に変化させないさらなる成分、組成物もしくは方法の工程が、本発明の組成物もしくはキットもしくは方法において含まれ得ることを意味するために使用される。このような特徴は、Ｐ．ａｃｎｅｓの約１０４コピーというコピー数において、生物学的サンプル中のＰ．ａｃｎｅｓ核酸を検出する能力を含む。他の特徴としては、他の細菌もしくは哺乳動物の核酸との制限された交差反応性および１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡを標的とすることが挙げられる。本発明の基本的および新規な特徴に対して重要な効果を有する任意の成分、組成物、もしくは方法の工程は、この用語の範囲外にある。
【００２９】
開示されるのは、Ｐ．ａｃｎｅｓ核酸、具体的には、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ、もしくは１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の配列を増幅および検出するための方法である。上記方法は、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＮＲＡおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくはこれらの相補的配列、または１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくはこれらの相補的配列をコードする遺伝子の標的配列を特異的に認識するオリゴヌクレオチド配列を含む。このようなオリゴヌクレオチドは、幅オリゴヌクレオチドとして使用され得、これは、プライマー、プロモータープライマー、ブロックされたオリゴヌクレオチド、およびプロモーター提供者オリゴヌクレオチドを含み得、その機能は、以前に記載された（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号および同第５，８２４，５１８号（Ｋａｃｉａｎら）；ならびにＵＳ  ２００６−００４６２６５  Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）、および米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号（Ｍｕｌｌｉｓら））。他のオリゴヌクレオチドは、Ｐ．ａｃｎｅｓの増幅配列を検出するためのプローブとして使用され得る。
【００３０】
ＴＭＡ増幅を使用する増幅方法は、以下の工程を包含する（米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号および同第５，８２４，５１８号（Ｋａｃｉａｎら）に記載される）。簡潔には、増幅されるべき配列を含む上記標的核酸は、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡもしくはｓｓＤＮＡ）として提供される。当業者は、二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の従来の融解が、一本鎖標的核酸を検出するために使用され得ることを認識する。プロモータープライマーは、上記標的核酸に、その標的配列において特異的に結合し、そして逆転写酵素（ＲＴ）は、上記標的配列鎖のｃＤＮＡコピーを作り出すために、テンプレートとして上記標的鎖を使用して、上記プロモータープライマーの３’末端を伸長し、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を生じる。ＲＮａｓｅ（例えば、上記ＲＴのＲｎａｓｅＨ）は、上記ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の上記ＲＮＡ鎖を消化し、第２のプライマーは、その標的配列（これは、上記プロモーター−プライマー末端から下流にある上記ｃＤＮＡ鎖上に位置している）に特異的に結合する。ＲＴは、新たなＤＮＡ鎖を、上記第１のｃＤＮＡテンプレートを使用して、上記第２のプライマーの３’末端を伸長して、機能的プロモーター配列を含むｄｓＤＮＡを作り出すことによって、合成する。次いで、上記プロモーター配列に対して特異的なＲＮＡポリメラーゼは、上記反応中の最初の標的鎖の約１００〜１０００増幅コピー（「アンプリコン」）であるＲＮＡ転写物を生成するために、転写を開始する。増幅は、上記第２のプライマーが、上記アンプリコンの各々におけるその標的配列に特異的に結合しかつＲＴが、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を生成するための上記アンプリコンＲＮＡテンプレートからＤＮＡコピーを作り出す場合に、継続される。上記反応混合物中のＲＮａｓｅは、上記ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖からの上記アンプリコンＲＮＡを消化し、上記プロモータープライマーは、上記新たに合成されたＤＮＡにおけるその相補的な配列に特異的に結合する。ＲＴは、機能的プロモーター（これに対して上記ＲＮＡポリメラーゼが、上記標的鎖に対して相補的なさらなるアンプリコンを転写するために結合する）を含むｄｓＤＮＡを作り出すために、上記プロモータープライマーの３’末端を伸長する。より多くのアンプリコンコピーを作製する自触媒性サイクルは、上記サンプルに存在する上記標的核酸の約１０億倍の増幅を生じる反応の過程の間に反復する。上記増幅生成物は、増幅の間に、すなわち、リアルタイムで、もしくは上記増幅反応の最後に、上記増幅生成物に含まれる標的配列に特異的に結合するプローブを使用することによって、検出され得る。上記結合されたプローブから生じるシグナルの検出は、上記サンプル中の上記標的核酸の存在を示す。
【００３１】
転写関連増幅の一方法は、核酸をインビトロで増幅するために、１つのプライマーおよび１つ以上のさらなる増幅オリゴヌクレオチドを使用し、サンプルにおける上記標的配列の存在を示す転写物（アンプリコン）を作製する（ＵＳ２００６−００４６２６５  Ａ１および米国特許第７，３７４，８８５号（Ｂｅｃｋｅｒら）を参照のこと）。簡潔には、上記単一のプライマー増幅法は、プライマー（もしくは「開始（ｐｒｉｍｉｎｇ）オリゴマー」）、その３’末端から（例えば、３’−ブロッキング部分を含めることによって）ＤＮＡ合成の開始を妨げるために改変される改変プロモーターオリゴマー（もしくは「プロモーター提供者」）、および必要に応じて、結合分子（例えば、３’がブロックされたエクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）オリゴマー）を使用して、上記標的鎖からｃＤＮＡの伸長を終わらせる。この方法は、標的配列の複数のコピーを合成する。標的配列を含む標的ＲＮＡを、プライマーおよび結合分子で処置する工程を包含し、ここで上記プライマーは、上記標的鎖の３’末端にハイブリダイズする。ＲＴは、上記標的鎖を有するＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖におけるｃＤＮＡを生成するために、プライマーの３’末端からのプライマー伸長を開始する。結合分子（例えば、３’がブロックされたエクステンダーオリゴマー）が、上記反応に使用される場合、増幅されるべき上記標的配列の５’末端の隣にある上記標的鎖に結合する。上記プライマーが、ｃＤＮＡを生成するために、ＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長される場合、上記ｃＤＮＡの３’末端は、上記結合分子の位置によって決定される。なぜなら、重合は、上記プライマー伸長生成物が、上記標的鎖に結合した上記結合分子に達する場合に停止する。従って、上記ｃＤＮＡの３’末端は、上記標的配列の５’末端に相補的である。上記ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二重鎖は、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＴのＲＮａｓｅ  Ｈ）が上記ＲＮＡ鎖を分解する場合に分離されるが、当業者は、鎖分離の任意の形態が使用され得ることを認識する。次いで、上記プロモーター提供者オリゴマーは、上記ｃＤＮＡ鎖の３’末端付近にあるｃＤＮＡにハイブリダイズする。上記プロモーター提供者オリゴマーは、ＲＮＡポリメラーゼに対する５’プロモーター配列および上記ｃＤＮＡの３’配列における配列に対して相補的な３’領域を含む。上記プロモーター提供者は、上記プロモーター提供者の３’末端からのＤＮＡ合成の開始を妨げるために、ブロッキング部分を含む改変３’末端を有する。上記プロモーター提供者：ｃＤＮＡ二重鎖において、上記ｃＤＮＡの３’末端は、プロモーター配列を上記ｃＤＮＡに付加し、二本鎖の機能的プロモーターを作り出すために、テンプレートとして上記プロモーターオリゴマーを使用して、ＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長される。次いで、上記プロモーター配列に対して特異的なＲＮＡポリメラーゼは、上記機能的プロモーターに結合し、上記ｃＤＮＡに相補的な複数のＲＮＡ転写物を転写し、これらＲＮＡ転写物は、上記最初の標的鎖から増幅された上記標的領域配列に同一の増幅ＲＮＡである。上記増幅ＲＮＡは、上記プライマーを結合し、さらなるｃＤＮＡ生成のためのテンプレートとして働くこ��によって、再び上記プロセスを通じてサイクルし得、最終的に、上記サンプルに存在する最初の標的核酸から多くの増幅生成物もしくはアンプリコンを生成する。上記単一プライマー増幅法のいくつかの実施形態は、上記結合分子を含まないので、上記プライマーから作製された上記ｃＤＮＡ生成物は、中間の３’末端を有するが、上記増幅工程は、実質的に上記のように進む。
【００３２】
上記増幅生成物の検出は、種々の方法によって達成され得る。上記核酸は、物理的変化（例えば、検出可能な電気的変化）を生じる表面と関連し得る。増幅された核酸は、これらをマトリクス中もしくはマトリクス上に濃縮させ、上記核酸もしくはこれらと関連する色素（例えば、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、エチジウムブロミドもしくはサイバーグリーン）を検出するか、または液相中の核酸と関連する色素の増大を検出することによって、検出され得る。他の検出法は、上記増幅生成物中の配列に相補的な核酸プローブを使用し得、および上記プローブ：生成物複合体の存在を検出する工程、または上記増幅生成物と関連する検出可能なシグナルを増幅し得るプローブの複合体を使用することによる（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号および同第５，４５１，５０３号（Ｈｏｇａｎら）、ならびに同第５，８４９，４８１号（Ｕｒｄｅａら））。上記増幅生成物と具体的に関連する、直接的にもしくは間接的に標識されたプローブは、上記サンプル中の上記標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを提供する。例えば、上記標的核酸が、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡである場合、上記増幅生成物は、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ配列中の配列もしくはＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に相補的な配列を含み、プローブは、上記増幅生成物に含まれる配列に直接的にもしくは間接的に結合して、上記試験されたサンプル中のＰ．ａｃｎｅｓの存在を示す。
【００３３】
上記増幅配列にハイブリダイズするプローブの実施形態は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせを含むオリゴヌクレオチド、または改変骨格で合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、１つ以上の２’−メトキシ置換されたリボヌクレオチドを含む）であり得る。上記増幅されたＰ．ａｃｎｅｓ  ｒＲＮＡ配列の検出のために使用されるプローブは、標識されておらず、間接的に検出されてもよいし（例えば、上記プローブ上の部分への別の結合パートナーの結合によって）、種々の検出可能な標識で標識されてもよい。標識実施形態は、検出可能な光シグナルを放出する化合物（例えば、均質な混合物中で検出され得る、蛍光団もしくは発光化合物）を含む。１つより多い標識、および１つより多い標識タイプが、特定のプローブ上に存在してもよく、検出は、各プローブが、検出可能なシグナルを生成する化合物で標識されるプローブの混合物を使用してもよい（例えば、米国特許第６，１８０，３４０号および同第６，３５０，５７９号（Ｎｅｌｓｏｎ））。標識は、共有結合、キレート化、およびイオン性相互作用を含む種々の手段によってプローブに結合され得る。プローブは、分子内結合によって保持された形態を実質的に形成しない直線状オリゴヌクレオチドであり得る。他のプローブは、分子内ハイブリダイゼーションを使用することによる形態（例えば、ヘアピン）を形成し得る。直線状プローブ実施形態は、化学発光化合物を標識として含む（例えば、ＡＥ化合物）。
【００３４】
ヘアピンプローブは、種々の異なるタイプの相互作用標識のうちのいずれかで標識され得る。ここで一方の相互作用メンバーは、通常、上記ヘアピンプローブの５’末端に結合され、他方の相互作用メンバーは、上記ヘアピンプローブの３’末端に結合される。このような相互作用メンバー（これらは、一般に、レポーター色素およびクエンチャーといわれ得る）は、発光／クエンチャー対、発光／付加物対、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー移動対、もしくは色素ダイマーを含む。発光／クエンチャー対は、１つ以上の発光標識（例えば、化学発光標識もしくは蛍光標識）、および１つ以上のクエンチャーから作製され得る。一実施形態において、ヘアピンプローブは、一方の末端において、特定の波長および範囲の光を吸収しかつ別の発光波長もしくは範囲で光を発する蛍光標識（「Ｆ」）で標識され、そしては方の末端において、Ｑが上記蛍光団と近位にある場合に、上記励起されたＦから発せられたシグナルを部分的にもしくは完全に失わせるクエンチャー（「Ｑ」）で標識される。このようなヘアピンプローブは、蛍光／クエンチャー（Ｆ／Ｑ）対で標識されているといわれ得る。蛍光団は、周知の化合物であり、これら化合物としては、例えば、アクリジンおよびその誘導体（例えば、２−メトキシ−６−クロロ−９−アミノ−アクリジン）、クマリン５００、エチジウム、フルオレセインおよびその誘導体（例えば、５  カルボキシ−フルオレセイン（ＦＭＡ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、および２，７−ジメチル−４，５−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（ＪＯＥ））、ローダミンおよびその誘導体（例えば、スルホローダミン１０１、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシ−ローダミン（ＴＡＭＲＡＴＭ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ４１、５−（２’−アミノエチル）アミナフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳＴＭ）、テキサスレッド、ＲｅｄＸ、エオシンおよびその誘導体、ＡＬＥＸＡ色素（例えば、ＡＬＥＸＡ−４８８、ＡＬＥＸＡ−５３２、ＡＬＥＸＡ−５４６、ＡＬＥＸＡ−５６８およびＡＬＥＸＡ−５９４）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ−６３０／６５０およびＢＯＤＩＰＹ−６５０−６７０）、シアミン色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５およびＣｙ５）、オキサジン蛍光団（例えば、ＭＲ１２１）、ルシファーイエローならびに当該分野で周知の他の色素、または蛍光塩基（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｂａｓｅ）（例えば、２−アミノプリンおよびピロロ−ｄＣ）（Ｔｙａｇｉら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３、Ｖｅｔら，２００２，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２（１）：７７−８６、Ｍａｒｔｉら，２００６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４（６）：５０）が挙げられる。クエンチャーはまた周知であり、以下が挙げられる：例えば、４−（４’−ジメチル−アミノ−フェニラキソ(ｐｈｅｎｙｌａｘｏ)）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬＴＭ）、タリウム、セシウム、ｐ−キシレン−ビス−ピリジニウムブロミド、および核酸中のヌクレオチドの本質的な特性（例えば、デオキシグアノシン残基）。異なるＦ／Ｑの組み合わせが周知であり、多くの組み合わせが、一緒に機能し得る（例えば、ＤＡＢＣＹＬＴＭとフルオレセイン、ローダミン、もしくはＥＤＡＮＳ化合物）。ヘアピンプローブに対する標識の他の組み合わせは、ｉｎｃｌｕｄｅ  ａ  レポーター色素（例えば、クエンチャー（例えば、ＴＡＭＲＡＴＭもしくは非蛍光性クエンチャー）と組み合わせたＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＪＯＥＴＭ、ＶＩＣＴＭ）。
【００３５】
ヘアピンプローブの一実施形態は、標的Ｐ．ａｃｎｅｓ配列が、上記増幅工程後に、上記サンプル中に存在するか否かを示すために、増幅生成物を検出する「分子トーチ」である。分子トーチプローブは、存在する場合、「開いた」形態を生じる上記標的配列にハイブリダイズするための標的結合ドメイン；「閉じた」形態を生じる、上記標的配列の非存在下で上記標的結合ドメインにハイブリダイズする標的トーチ閉鎖ドメイン；および上記２つのドメインを連結する連結領域（例えば、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号（Ｂｅｃｋｅｒら）を参照のこと）。上記標的結合ドメインは、同じハイブリダイゼーション条件下で、上記増幅された標的配列の存在下で、上記閉じた形態のものとは区別可能なシグナル量を生成する開いた形態であるように、標的閉鎖ドメインとよりも、上記標的配列とより安定なハイブリッドを形成する。別のヘアピンプローブ実施形態は、上記ヘアピン配列の一方のアーム上に標識を、他方のアーム上にクエンチャーを、および上記２つのアームを連結するループ領域を含む「分子ビーコン」である（Ｔｙａｇｉら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３、米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号（Ｌｉｚａｒｄｉら）を参照のこと）。標的配列の存在を検出するためにこのようなヘアピンプローブを使用するための方法は、当該分野で周知である。
【００３６】
Ｐ．ａｃｎｅｓ配列の検出のための方法の一実施形態は、転写関連増幅と、ヘアピンプローブ（例えば、分子トーチもしくは分子ビーコン）を使用し、これらプローブは、増幅の前もしくはその間に添加され得、検出は、その後に試薬を添加することなく行われる。例えば、プローブは、上記ヘアピンプローブの上記ハイブリダイズしたアーム（例えば、標的結合ドメイン：分子トーチの標的閉鎖ドメイン複合体）のＴｍが、上記プローブが、増幅された標的配列に早くから結合しないように、上記増幅反応温度より高いように設計される。増幅間隔の後に、上記混合物は、上記トーチプローブアームを開くために加熱され、上記標的結合ドメインが上記増幅生成物中のその標的配列へハイブリダイズすることを可能にする。次いで、上記溶液は、増幅生成物に結合されていないプローブを閉じるために冷却され、これは、上記標識／クエンチャー（例えば、Ｆ／Ｑ）対を一緒にし、均質な様式において、上記増殖された標的配列にハイブリダイズしたプローブからのシグナルの検出を可能にする。上記Ｆ／Ｑ標識したヘアピンプローブを含む混合物は、適切な励起光で照射され、その発光シグナルは測定される。
【００３７】
他の実施形態において、上記ヘアピン検出プローブは、上記増幅生成物が、増幅の間に上記プローブの上記標的結合ドメインにハイブリダイズするように設計され、増幅の間に、上記ヘアピンのその開いた形態への変化を生じ、上記増幅反応混合物は、増幅の間に、リアルタイムで上記開いたプローブから発せられたシグナルを検出するために、間隔をおいて照射される。
【００３８】
増幅のためのサンプルの調製およびＰ．ａｃｎｅｓ配列の検出は、サンプルに含まれる生物を、他のサンプル成分から分離および／もしくは濃縮するための方法を包含し得る（例えば、空気、水、もしくは他のタイプのサンプルからの粒状物質の濾過）。サンプル調製は、細胞内内容物（Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡ、または１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子配列を含む）を放出するように、細胞を破壊するかもしくは細菌を溶解するための慣用的方法を含み得る。増幅の前のサンプル調製は、上記標的核酸を他のサンプル成分から特異的にもしくは非特異的に分離するために、標的捕捉の選択肢的工程を包含し得る。非特異的標的捕捉法は、実質的に水性の混合物からの核酸の選択的沈殿、他のサンプル成分を除去するために洗浄される支持体への核酸の接着、Ｐ．ａｃｎｅｓ核酸および他のサンプル成分を含む混合物から核酸を物理的に分離するための他の方法を包含し得る。
【００３９】
一実施形態において、Ｐ．ａｃｎｅｓ  ｒＲＮＡもしくはｒＲＮＡをコードする遺伝子は、上記Ｐ．ａｃｎｅｓ核酸を、標的配列：捕捉プローブ複合体を形成するためにＰ．ａｃｎｅｓ標的配列に対して特異的な捕捉オリゴマーに特異的にハイブリダイズすることによって、他のサンプル成分から選択的に分離される。上記標的配列：捕捉プローブ複合体は、上記のように、Ｐ．ａｃｎｅｓ標的：捕捉プローブ複合体を、固定化プローブに結合させ、上記Ｐ．ａｃｎｅｓ標的：捕捉プローブ：固定化プローブ複合体を、上記サンプルから分離することによって、サンプル成分から分離される（米国特許第６，１１０，６７８号、同第６，２８０，９５２号、および同第６，５３４，２７３号（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら））。簡潔には、上記捕捉プローブは、１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡ中の、または１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子中の上記Ｐ．ａｃｎｅｓ標的配列に特異的に結合する配列を含み、そしてまた、上記標的配列を、上記サンプル成分から分離するのを促進するために、上記捕捉プローブと、支持体にその結合した標的配列を結合させる特異的結合パートナーを含む。一実施形態において、上記捕捉プローブの上記特異的結合パートナーは、Ｐ．ａｃｎｅｓ標的配列に相補的でないが、支持体に結合した固定化プローブ上の相補的配列にハイブリダイズする３’「テイル」配列である。任意の配列は、テイル領域において使用され得、この領域は、一般に、約５〜５０ｎｔ長であり、他の実施形態は、上記支持体（例えば、マトリクスもしくは粒子）に結合した、相補的な固定化配列（例えば、ポリ−Ｔ）に結合する、約１０〜４０ｎｔ（例えば、Ａ１０〜Ａ４０）、もしくは約１４〜３３ｎｔ（例えば、Ａ１４〜Ａ３０もしくはＴ３Ａ１４〜Ｔ３Ａ３０）の実質的ホモポリマーテイルを含む。標的捕捉は、Ｐ．ａｃｎｅｓ  ｒＲＮＡもしくは遺伝子標的配列に、ハイブリダイズする条件下で、通常は、上記テイル配列：固定化プローブ配列二重鎖のＴｍより高い温度で、特異的にハイブリダイズする１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを含む液相混合物中で起こり得る。上記Ｐ．ａｃｎｅｓ標的：捕捉プローブ複合体は、上記捕捉プローブテイルが、上記固定化プローブにハイブリダイズし、次いで、上記支持体上のその全体の複合体が、他のサンプル成分から分離されるように、上記ハイブリダイゼーション条件を調節することによって、捕捉される。上記結合した固定化プローブ：捕捉プローブ：Ｐ．ａｃｎｅｓ標的配列を有する支持体は、他のサンプル成分をさらに除去するために、１回以上洗浄され得る。他の実施形態は、上記結合したＰ．ａｃｎｅｓ標的：捕捉プローブ：固定化プローブ複合体を有する粒子が、洗浄溶液中に懸濁され得、磁力を使用することによって、上記洗浄溶液から回収され得るように、粒状支持体（例えば、磁性ビーズ）を使用する。取り扱い工程の回数を制限するために、Ｐ．ａｃｎｅｓ標的核酸は、上記支持体上の複合体中の上記標的配列と、増幅オリゴヌクレオチドとを混合し、上記増幅工程を行うことによって、増幅され得る。
【００４０】
別の標的捕捉法は、Ｐ．ａｃｎｅｓ核酸に非特異的に結合しかつ上記Ｐ．ａｃｎｅｓ標的：捕捉プローブ複合体を支持体に（例えば、上記支持体上の固定化プローブもしくは結合対メンバーを使用することによって）捕捉する捕捉プローブを使用する。非特異的捕捉プローブは、ポリ−Ｕ、ポリ−ＧＵ、ポリ−ＧＴ、もしくはランダム配列（ＵＳ  ２００８−０２８６７７５  Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）に詳細に記載される）であり得る。
【００４１】
Ｐ．ａｃｎｅｓ核酸の検出のためのアッセイは、必要に応じて、非Ｐ．ａｃｎｅｓ内部制御（ＩＣ）核酸を含み得る。この非Ｐ．ａｃｎｅｓ内部制御（ＩＣ）核酸は、増幅および上記ＩＣ配列に対して特異的な検出オリゴマーを使用することによって、同じアッセイ反応混合物中で増幅および検出される。上記増幅されたＩＣ配列からのシグナルの増幅および検出は、シグナルなしが、上記意図された標的Ｐ．ａｃｎｅｓ核酸（すなわち、Ｐ．ａｃｎｅｓについてネガティブを試験するサンプル）に対して得られる場合に、アッセイ工程の上記アッセイ試薬、条件、および性能が、上記アッセイにおいて適切に使用されたことを実証する。ＩＣは、定量的結果が望ましい場合に、上記アッセイについての内部較正として使用され得る。すなわち、ＩＣ増幅および検出から得られるシグナルは、増幅されたＰ．ａｃｎｅｓ標的配列に対して得られるシグナルに基づいて、サンプル中のＰ．ａｃｎｅｓ核酸の量を提供するためのアルゴリズムにおいて使用されるパラメーターを設定するために、使用される。ＩＣの一実施形態は、天然に存在する供給源から得られた無作為化した配列（例えば、無作為に再配置したＨＩＶ配列）である。ＩＣは、アッセイ中のＩＣコピーの数が、正確に決定されるように、クローニングされた無作為化配列から転写物を作製することによって、天然に存在する供給源から得られるかもしくはインビトロで合成されるＲＮＡ転写物であり得る。上記ＩＣ標的配列に対するプライマーおよびプローブは、任意の周知の方法を使用することによって設計されかつ合成されるが、ただし、上記プライマーおよびプローブは、Ｐ．ａｃｎｅｓ標的配列を増幅および検出するために使用される実質的に同じアッセイ条件を使用して、上記ＩＣ標的配列の増幅および上記増幅されたIC配列の検出に機能する。標的捕捉の基づく精製工程を含む実施形態において、上記サンプルに添加される上記ＩＣ標的の捕捉は、上記ＩＣが、上記意図されたＰ．ａｃｎｅｓ分析物に類似したアッセイ工程の全てにおいて処理されるように、上記アッセイに含められ得る。内部コントロールを増幅および検出するために使用されうる配列は、配列番号２０５〜２０９を含む。
【００４２】
（Ｐ．ａｃｎｅｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の増幅および検出）
Ｐ．ａｃｎｅｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列中に見いだされる配列（これは、１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子を含む）の増幅および検出に関して、オリゴヌクレオチドを、１６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子配列の既知の配列を比較し、Ｐ．ａｃｎｅｓ単離物に共通するが、他のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種もしくは他の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と完全には共有されなくてもよい配列を選択することによって設計した。このオリゴヌクレオチドは、増幅オリゴマーおよび検出プローブとして作用する。配列比較を、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｐ．ｔｈｅｏｎｉｉ、Ｐ．ａｖｉｄｕｍ、Ｐ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｐ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ、Ｐ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、Ｐ．ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ、およびＰ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ）および他の細菌種（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）の既知の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列（ｒＲＮＡもしくは遺伝子）を使用することによって、行った。特定の配列を選択し、インビトロで合成し、上記オリゴマーを、標準的実験法を使用することによって、上記Ｐ．ａｃｎｅｓオリゴマーのＴｍおよびハイブリダイゼーション特徴を、相補的な標的配列（合成ｒＲＮＡもしくは細菌からの精製ｒＲＮＡ）で決定することによって特徴付けた。次いで、選択されたオリゴマー配列を、合成１６Ｓ  ＲＮＡ標的配列もしくは培養において増殖させた種々のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種から精製された１６Ｓ  ｒＲＮＡでの増幅反応において増幅オリゴマーの異なる組み合わせ（表１に示されるものから選択される）を作製し、増幅反応を行って、上記１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的配列の増幅の効率を決定することによって、さらに試験した。増幅オリゴマーの異なる組み合わせの相対的効率を、上記増幅反応の上記増幅生成物を検出することによって、一般に、標識されたプローブ（表２）を上記増幅生成物に結合させ、作製された増幅生成物の量を示したシグナルの相対的量を検出することによって、モニターした。
【００４３】
特定のオリゴヌクレオチドを設計して、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６４２０４８中に含まれる）に基づいている、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡもしくは１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中の標的配列（すなわち、配列番号１９９内にある）を増幅および検出した。２セットの増幅オリゴマーおよび検出オリゴマーを設計し、これらオリゴマーは、第１の部分セット標的領域（これは、配列番号２００である）内の上記１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的配列に対して特異的であり、第２のセットのオリゴマーは、配列番号２０１内の１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的配列に対して特異的である。
【００４４】
Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ配列についての増幅オリゴマーの実施形態は、表１に示されるものを含む。増幅オリゴマーは、プライマー、プロモータープライマー、およびプロモーター提供者オリゴマーとして機能し得るものを含む（プロモーター配列は、表１において小文字で示される）。いくつかの実施形態は、表１に列挙されるプロモータープライマーオリゴマーの標的特異的配列であり、これは、必要に応じて、任意の公知のプロモーター配列の３’末端に結合されうる。バクテリオファージＴ７の上記ＲＮＡポリメラーゼに対して特異的なプロモーター配列の例としては、配列番号７３および７４のものが挙げられる。
【００４５】
増幅オリゴマーは、３’がブロックされた末端を有するオリゴマーを合成することによって、改変されうる。上記ブロックされたオリゴマーは、増幅反応と関連する単一プライマー転写において使用され得、すなわち、プロモーター提供者オリゴマーのブロッキング分子として機能する。３’がブロックされたオリゴマーの実施形態は、配列番号１〜８および３５〜５４のものを含み、ここでさらなるブロックされたＣは、上記配列の３’末端に付加される。
【００４６】
【表１】
2011514159.tif 000002
１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の増幅生成物の検出のための検出プローブオリゴマーの実施形態は、表２に示される。検出プローブ実施形態は、上記プローブ配列の分子内ハイブリダイゼーションによってヘアピン構造を形成し得るオリゴマーを含み、これらは、配列番号７５〜９８のものを含む。表２に列挙された配列について、小文字は、ヘアピンオリゴマーを閉じた構造において保持する配列を示す。上記ヘアピンプローブオリゴマーの実施形態を、上記配列の一方の末端において結合した蛍光標識および上記配列の他方の末端において結合したクエンチャー化合物とともに合成した。ヘアピンプローブの実施形態は、５’蛍光団および３’クエンチャー（例えば、５’フルオレセイン標識および３’  ＤＡＢＣＹＬクエンチャー）で標識されうる。ヘアピンオリゴマーのいくつかの実施形態はまた、上記配列内の選択された位置において非ヌクレオチドリンカー部分を含む。このような実施形態の例としては、配列番号７５〜８４の残基１６と残基１７との間、配列番号８５〜８８の残基１７と残基１８との間、配列番号８９〜９２の残基１８と残基１９との間、配列番号９３および９４の残基１９と残基２０との間、配列番号９５および９６の残基２０と残基２１との間、ならびに配列番号９７および９８の残基２１と残基２２との間に無塩基９−炭素（「Ｃ９」）リンカーを含むものが挙げられる。
【００４７】
別の検出プローブ実施形態は、上記プローブ配列に、リンカーを介して結合される化学発光ＡＥ化合物で標識した直線状検出プローブオリゴマーである（米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，６３９，６０４号、特に、第１０欄６行目〜第１１欄３行目、および実施例８において実質的に記載される）。標識位置の例は、上記プローブオリゴマーの中心領域、および上記オリゴマーの３’末端もしくは５’末端におけるＡ：Ｔ塩基対合の領域付近、ならびに上記所望の標的配列でない既知の配列を有するミスマッチ部位もしくはその付近である。
【００４８】
上記検出プローブは、標識されていないヘルパープローブとともに使用され得、上記標識プローブの、その標的への結合を促進する（米国特許第５，０３０，５５７号（Ｈｏｇａｎら）を参照のこと）。
【００４９】
【表２】
2011514159.tif 000003
捕捉プローブオリゴマーは、他のサンプル成分からＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ標的核酸を分離するために、サンプル調製において使用され得、配列番号１２０および１２２の上記標的特異的配列を含むものが挙げられる。上記捕捉プローブの実施形態は、上記標的核酸および上記捕捉プローブから作製されたハイブリダイゼーション複合体を、支持体上の固定化プローブに結合する結合パートナーとして働くように、上記標的特異的配列に共有結合される３’テイル領域を含む。配列番号１２８および１３０の標的特異的配列を含む捕捉プローブの実施形態は、実質的にホモポリマーの配列（例えば、ｄＴ３Ａ３０ポリマー）から作製される３’テイル領域をさらに含む（配列番号１２７および１２９）。標的捕捉プローブの例は、表３に列挙される。
【００５０】
【表３】
2011514159.tif 000004
（Ｐ．ａｃｎｅｓの２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列の増幅および検出）
増幅および検出  ｏｆ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡにおいて見いだされるＰ．ａｃｎｅｓ配列（これは、２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む）に関して、オリゴヌクレオチドを、２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子配列の既知の配列を比較し、Ｐ．ａｃｎｅｓ単離物に共通するが、他のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種もしくは他の細菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列と完全には共有されなくてもよい配列を選択することによって設計した。このオリゴヌクレオチドは、増幅オリゴマーおよび検出プローブとして作用する。配列比較を、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（Ｐ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｐ．ａｖｉｄｕｍ、Ｐ．ｔｈｏｅｎｉｉ、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ、Ｐ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ、およびＰ．ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）および他の細菌種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ種）の既知の２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列（ＲＮＡもしくは遺伝子）を使用することによって、行った。特定の配列を選択肢、インビトロで合成し、上記オリゴマーを、標準的実験法を使用することによって、上記Ｐ．ａｃｎｅｓオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特徴を相補的な標的配列（合成ｒＲＮＡもしくは細菌からの精製ｒＲＮＡ）で決定することによって、特徴付けた。次いで、選択されたオリゴヌクレオチド配列を、合成２３Ｓ  ＲＮＡ標的配列もしくは培養において増殖させた種々のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種から精製された２３Ｓ  ｒＲＮＡでの増幅反応において増幅オリゴマーの異なる組み合わせ（表４に示されるものから選択される）を作製し、増幅反応を行って、上記２３Ｓ  ｒＲＮＡ標的配列の増幅の効率を決定することによって、さらに試験した。増幅オリゴマーの異なる組み合わせの相対的効率を、上記増幅反応の上記増幅生成物を検出することによって、一般に、標識されたプローブを上記増幅生成物に結合させ、作製された増幅生成物の量を示したシグナルの相対的量を検出することによって、モニターした。
【００５１】
特定のオリゴヌクレオチドを設計して、Ｐ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１７２８３に含まれる）に基づいている、Ｐ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中の標的配列（すなわち、配列番号２０２内にある）を増幅および検出した。２セットの増幅オリゴマーおよび検出オリゴマーを設計し、これらオリゴマーは、第１の部分セット標的領域（これは、配列番号２０３である）内の上記２３Ｓ  ｒＲＮＡ標的配列に対して特異的であり、上記第２のセットのオリゴマーは、配列番号２０４内の上記２３Ｓ  ｒＲＮＡ標的配列に対して特異的である。
【００５２】
Ｐ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列についての増幅オリゴマーの実施形態は、表４に示されるものを含み、ここで小文字は、上記プロモータープライマー中のプロモーター配列について使用される。プロモータープライマーの他の実施形態は、種々のプロモーター配列のうちのいずれかの３’末端に結合された、表４に列挙されるオリゴマーの標的特異的配列を含み得る。
【００５３】
【表４】
2011514159.tif 000005
２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の増幅生成物のための検出プローブオリゴマーの実施形態は、表５に示される。検出プローブ実施形態は、上記プローブ配列の分子内ハイブリダイゼーションによってヘアピン構造を形成し得るオリゴマーであり、これらは、配列番号９９〜１２６および１８３のものを含む。検出プローブの実施形態は、５’蛍光団（例えば、フルオレセイン）、３’クエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬ）、ならびに配列番号１２１〜１２６の残基５と残基６との間、もしくは配列番号９９〜１００の残基１６と残基１７との間、もしくは配列番号１０３〜１０６の残基１７と残基１８との間、もしくは配列番号１１１〜１１２の残基１８と残基１９との間、もしくは配列番号１０７〜１１０および１１３〜１１４の残基１９と残基２０との間、もしくは配列番号１０１〜１０２および１１３〜１１６の残基２０と残基２１との間に無塩基部分（例えば、Ｃ９）を含む。別の実施形態は、非ヌクレオチドリンカーによって、上記オリゴマーに結合されるＡＥで標識された検出プローブを含む。
【００５４】
【表５】
2011514159.tif 000006
Ｐ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ標的核酸を他のサンプル成分から分離するために、サンプル調製において使用するための捕捉プローブオリゴマーの実施形態は、２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは２３Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子（例えば、配列番号１３２および１３４の標的特異的配列）にハイブリダイズする標的特異的配列を含むものである。捕捉プローブの実施形態は、上記標的核酸および上記捕捉プローブから作製されるハイブリダイゼーション複合体を、支持体上の固定化プローブに結合する結合パートナーとして働くように、上記標的特異的配列に共有結合される３’テイル領域を含む。上記共有結合した３’テイル領域の実施形態は、実質的にホモポリマーの配列（例えば、配列番号１３１および１３３に示されるように、３’末端に連結されたｄＴ３Ａ３０）である。標的捕捉プローブ実施形態の配列は、表６にある。
【００５５】
【表６】
2011514159.tif 000007
【実施例】
【００５６】
（実施例１：アッセイ試薬およびプロトコール）
以下の実施例において記載される実験は、以下の試薬のうちの１つ以上を使用し得るが、当業者は、他の試薬が、ここで記載されるものと置換されうることを認識する。プローブマトリクス溶解試薬は、０．１％  （ｗ／ｖ）  ＬＬＳ、２０ｍＭ  コハク酸リチウム、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んでいた。溶解試薬は、１％  （ｗ／ｖ）  ＬＬＳ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭ  コハク酸、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５００ｍＭ  塩化リチウム（ＬｉＣｌ）（ｐＨ６．５〜７．５）を含んでいた。標的捕捉試薬は、３００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．８８Ｍ  塩化リチウム、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．４）、および２５０μｇ／ｍｌの常磁性粒子（０．７〜１．０５μ粒子、ＳＥＲＡ−ＭＡＧＴＭ  ＭＧ−ＣＭ，Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、これに共有結合した（ｄＴ）１４オリゴマーとともに含んでいた。標的捕捉に使用される洗浄溶液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％（ｗ／ｖ）  ドデシル硫酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含んでいた。増幅試薬を、他の反応成分と混合して、溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３３ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１０ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＣＴＰ、１２．７ｍＭ  ＵＴＰ、２ｍＭ  ＧＴＰ（ｐＨ７．７）を含む）を生成した。増幅オリゴヌクレオチド（プライマー、プロモータープライマー、ブロッカーオリゴヌクレオチド、プロモーター提供者オリゴヌクレオチド、および必要に応じてプローブ）を、上記増幅試薬中で、もしくは上記増幅試薬から別個に、反応混合物に添加し得る。酵素試薬は、３６０ＲＴＵ／μｌのモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（ＲＴ）および約８０ＰＵ／μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、７５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％  ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）  Ｘ−１００、１６０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を含んでいた。ここで１ＲＴＵのＲＴは、３７℃において２０分間で１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを組み込み、１ＰＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、３７℃において２０分間において５ｎｍｏｌのＲＮＡ転写物を生じる。ハイブリダイゼーション緩衝液は、０．６Ｍ  ＬｉＣｌ、１％  ラウリル硫酸リチウム、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭ  コハク酸、１１５ｍＭ  水酸化リチウム（ｐＨ４．７）を含んでいた。
【００５７】
転写媒介性増幅（ＴＭＡ）反応は、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら）に詳細に実質的に開示されるように、上記手順を使用する。単一プライマー転写関連増幅は、ＵＳ  ２００６−００４６２６５  Ａ１および米国特許第７，３７４，８８５号（Ｂｅｃｋｅｒら）に詳細に実質的に開示される手順を使用する。上記ＴＡＧ増幅法は、ＵＳ  ２００７−０２８１３１７  Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）に実質的に開示されるように手順を使用した。標的配列とのハイブリダイゼーション複合体を検出するためにＡＥ標識プローブからのシグナルの使用および検出は、実質的に以前に詳細に開示されるように、手順を使用する（米国特許第５，２８３，１７４号および同第５，６５６，７４４号（Ａｒｎｏｌｄら）、ならびに米国特許第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら））。ヘアピンプローブを使用するための方法は、周知であり、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号（Ｂｅｃｋｅｒら）に詳細に既に開示されるものを含む。
【００５８】
検出可能なシグナルを提供するために増幅オリゴヌクレオチドおよび標識された検出プローブの種々の組み合わせを使用することによって、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を、適切な標的核酸を含むサンプル中で特異的に検出した。以下の実施例は、Ｐ．ａｃｎｅｓ標的配列の検出のためのこれら方法および組成物についての好ましい実施形態のうちのいくつかを例示する。
【００５９】
（実施例２：  Ｐ．ａｃｎｅｓの培養および溶解）
Ｐ．ａｃｎｅｓを、嫌気条件下で３〜４日間、３７℃において強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）上で増殖させた。コロニーを選択し、３７℃において嫌気条件下で２４〜４８時間にわたって、脱気した強化クロストリジウムブロス中でさらに増殖させた。細菌（約２×１０７ＣＦＵ）をペレット化し、１ｍＬのプローブマトリクス溶解試薬中に、１５〜６０分間にわたって８０℃もしくは１００℃において懸濁した。上記細菌を、実質的に以前に詳細に記載されるように、方法および試薬を使用して検出した（Ａｒｎｏｌｄら，１９８９，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．３５，ｐｐ．１５８８−９４）。簡潔には、上記細菌を溶解した後に、１ｍＬの２×ハイブリダイゼーション緩衝液を、上記プローブマトリクス溶解試薬に添加した。ハイブリダイゼーション緩衝液は、細菌種の中で保存されたｒＲＮＡ配列に対して特異的な核酸プローブを含んでいた（米国特許第４，８５１，３３０号、同第５，５６７，５８７号、同第５，６０１，９８４号、同第５，６８８，６４５号、同第５，７１４，３２４号、および同第５，７２３，５７９号（Ｋｏｈｎｅ）、ならびに同第５，６７９，５２０号（Ｈｏｇａｎら）を参照のこと）。そして上記プローブを、アクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識した（米国特許第４，９４６，９５８号（Ｃａｍｐｂｅｌｌら）；ならびに同第５，１８５，４３９号、同第５，５８５，４８１号、同第５，６５６，７４４号、および同第５，６９６，２５１号（Ａｒｎｏｌｄら）を参照のこと）。ハイブリダイズしていないプローブを不活性化し、続いて、上記ＡＥを活性化し、ルミノメーターで検出した（米国特許第５，２３８，１７４号および同第５，６３９，６０４号（Ａｒｎｏｌｄら）を参照のこと）。放出される核酸の量は、相対光ユニット（ＲＬＵ）において測定した。表７は、２つの異なるインキュベーション温度で一定の期間にわたるＲＬＵシグナルを示す。温度制御装置（例えば、ヒートブロック）を使用する代わりに、細菌を、マイクロ波オーブンを使用して溶解し得る。例えば、３０％  出力で１５分間にわたるマイクロ波処理は、９５℃で６０分間にわたるインキュベートと同様の結果を提供し得る。このことは、溶解時間を短縮するが、マイクロ波オーブン出力差に起因して、上記出力レベルおよび時間が、調節するために必要とされ得る。
【００６０】
【表７】
2011514159.tif 000008
別の実施形態において、Ｐ．ａｃｎｅｓ細菌を、濾過システム（例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標）  Ｍｉｃｒｏｆｉｌ  Ｓシステム）を使用して、液体から濾過し得る。Ｐ．ａｃｎｅｓを、０．９％  生理食塩水へと分散させ、Ｍｉｃｒｏｆｉｌ  Ｓシステムを通過させた。上記濾過を外し、１ｍＬのプローブマトリクス溶解試薬を含む容器中においた。上記容器を、１００℃において３０〜６０分間にわたってインキュベートし、続いて、１ｍＬの２×ハイブリダイゼーション緩衝液を添加した。表８における結果は、ペレット化した細菌および濾過した再起人についてのＲＬＵシグナルを示す。
【００６１】
【表８】
2011514159.tif 000009
別の実施形態において、Ｐ．ａｃｎｅｓを、公知の酵素（例えば、リゾチーム、ムタノライシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）、およびプロテインＫ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋ）を、単独もしくは組み合わせにおいて使用して、溶解し得る。例えば、Ｐ．ａｃｎｅｓ細菌を、５００μｌ  ＴＥＳ緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）；５ｍＭ  ＥＤＴＡ；５０ｍＭ  ＮａＣｌ）＋リゾチーム中で、３０分間にわたって３７℃でインキュベートした。さらに５００μｌのＴＥＳ緩衝液＋０．５％  ＬＤＳ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびムタノライシンもしくはプロテイナーゼＫを添加し、さらに３０分間、３７℃においてインキュベートし、続いて、１ｍＬの２×ハイブリダイゼーション緩衝液を添加した。プローブマトリクス溶解試薬およびプロテアーゼ消化の比較を、表９に示す。
【００６２】
【表９】
2011514159.tif 000010
（実施例３：Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ増幅オリゴマーセットの設計および最初の試験）
増幅および検出オリゴヌクレオチドを、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡを増幅および検出するために設計した。上記設計を、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６４２０４８．１およびＧＩ番号５００８２５７１）に基づいた。２セットの増幅および検出オリゴマーを、ＧＩ番号５００８２５７１の最初の５００塩基（配列番号１９９）内の標的配列に対して特異的であるように設計し、ここで上記第１のセットのオリゴマーを、塩基１〜２００（配列番号２００）に含まれる標的配列に対して特異的であり、上記第２のセットのオリゴマーは、塩基３２５〜５００（配列番号２０１）に含まれる標的配列に対して特異的である。上記Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ増幅および検出オリゴマーは、配列番号１〜８、１６〜２６、３５〜５４、７５〜９８、１３５〜１６０、１８１〜１８２、１８４、１８９〜１９３、２１０、および２１１〜２１６である。
【００６３】
Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の既知の量は、表１および表２におけるオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用して、リアルタイム単一プライマー転写関連増幅（実質的にＵＳ２００６００４６２６５  Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）に詳細に記載されるように）を使用して増幅した。オリゴマー組み合わせを、０コピーおよび１０５コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡを使用して試験した。上記増幅オリゴヌクレオチド、標的および増幅試薬（酵素ではない）を含む上記反応混合物を、エバポレーションを妨げるために覆い、５分間、９５℃においてインキュベートし、次いで、２分間、４２℃でインキュベートし、次いで、酵素を添加し、上記反応系を混合し、３０分間にわたって４２℃でインキュベートし、酵素添加後の上記増幅反応の間に、通常の時間間隔で蛍光を測定した（すなわち、３０秒ごと）。上記反応混合物を、リアルタイム蛍光検出系（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＯｐｔｉｃｏｎＴＭもしくはＣｈｒｏｍｏ４ＴＭ、またはＦｌｕｏＤｉａ（登録商標）  Ｔ７０機器）を使用してモニターした。リアルタイムアルゴリズムは、当該分野で周知である（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２  Ｊｕｎ  ７；２９４（２）：３４７−５３およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４  ３２（２２）：ｅ１７８を参照のこと）。ネガティブコントロール（Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡのゼロコピーを使用して同じ様式で行われる反応）を試験して、バックグラウンド蛍光シグナルレベルを試験した。オリゴマー組み合わせを、シグナル発生時間、最大相対蛍光ユニット（ＲＦＵ）シグナル、シグモイド曲線の傾き、およびバックグラウンドシグナルに関して評価した。１０５コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡにおける蛍光曲線を生じ、ネガティブコントロールにおいて０．１未満の相対蛍光ユニット（ＲＦＵ）を有したアッセイオリゴマー組み合わせを、さらなる試験のために選択した。
【００６４】
以下のアッセイオリゴマー組み合わせを、感度についてさらに試験した：（１）配列番号８、２０、３５および７５；（２）配列番号７、２０、３５、および７９；（３）配列番号７、２０、３５および７７；（４）配列番号１、１６、３７、および７５；（５）配列番号１、１８、３７、および７５；（６）配列番号３、２０、４１、および７５；（７）配列番号８、１９、３７、および７９；（８）配列番号１、１６、３７、および７９；（９）配列番号３、１９、３７、および９５；（１０）配列番号４、２２、４７、および８１；ならびに（１１）配列番号４、２３、５１、および８１。各組み合わせを、０コピー、１０３コピー、１０４コピー、および１０５コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡにおいて試験した。これら結果を、アッセイオリゴマー組み合わせを同定するために使用した。上記組み合わせは、１０５コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡを含んだ反応について約２０分間の出現時間を示し、最大シグナルは、０．９８〜１．５  ＲＦＵであり、バックグラウンドシグナルレベルは、０．２  ＲＦＵ未満であった。これら試験の結果は、選択されたアッセイオリゴマー組み合わせが、１０４コピー程度のＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡを増幅することを示した。組み合わせ１（配列番号８、２０、３５および７５）、組み合わせ２（配列番号７、２０、３５、および７９）、および組み合わせ３（配列番号７、２０、３５および７７）の上記１６Ｓ  増幅および検出オリゴマー組み合わせを使用することによって得られた結果は、表１０に示され、同じサンプル条件における複製サンプルに関する、上記シグナルの出現（ＴＴｉｍｅ）および平均ＲＦＵ（「ＡｖｅＲａｎｇｅ」もしくは検出ＲＦＵの平均（試験結果についての最小検出ＲＦＵを同じ試験結果からの最大検出ＲＦＵから差し引いた後に平均した）として報告した。
【００６５】
【表１０】
2011514159.tif 000011
増幅および検出オリゴマー組み合わせ１（配列番号８、２０、３５および７５）、組み合わせ２（配列番号７、２０、３５、および７９）および組み合わせ３（配列番号７、２０、３５、および７７）を、以下のチャレンジ生物に対する交差反応性について試験した：Ｐ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｐ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ，ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ｐ．ａｖｉｄｕｍおよびＰ．ｔｈｅｏｎｉｉ。各オリゴマー組み合わせを、単一プライマー転写関連増幅を使用して各チャレンジ生物について試験した。上記オリゴマー組み合わせ１、２および３を、Ｐ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｐ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ、Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉおよびＡ．ｉｓｒａｅｌｉｉについて１０４ＣＦＵを使用して、ならびにＰ．ａｖｉｄｕｍおよびＰ．ｔｈｅｏｎｉｉについては１０２ＣＦＵを使用して試験した。増幅および検出オリゴマー組み合わせは、上記チャレンジ生物のうちのいずれかを増幅も検出もしなかった。交差反応性試験からのデータを、表１１に示し、上記オリゴマー組み合わせの各々について上記に記載されるように報告される。
【００６６】
【表１１】
2011514159.tif 000012
上記増幅および検出オリゴマー組み合わせを、さらに試験して、チャレンジ生物（すなわち、関連する非Ｐ．ａｃｎｅｓ種）が、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡの増幅を阻害しないことを確実にした。３種のチャレンジ生物（Ｐ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ、Ｐ．ａｖｉｄｕｍおよびＰ．ｔｈｅｏｎｉｉ）を選択した。なぜなら、Ｐ．ａｖｉｄｕｍは、Ｐ．ａｃｎｅｓに対して最高程度の相動性を示すのに対して、Ｐ．ｔｈｅｏｎｉｉおよびＰ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍは、最初の交差反応性研究において蛍光曲線に対して最も強い影響を示したからである。ゼロコピーもしくは１０６コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡを、１０４コピーのＰ．Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍまたは１０２コピーのＰ  ａｖｉｄｕｍもしくはＰ  ｔｈｅｏｎｉｉで試験した。上記試験を、０もしくは１０４  ＣＦＵのＰ．ａｃｎｅｓ溶解物および１０４コピーのＰ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ、Ｐ．ａｖｉｄｕｍもしくはＰ．ｔｈｅｏｎｉｉを使用して反復した。Ｐ．ａｃｎｅｓなしのサンプルは、増幅を示さなかったのに対して、Ｐ．ａｃｎｅｓを有するサンプルは、増幅を示した。他の細菌の存在は、バックグラウンドシグナルおよび最大ＲＦＵを低下させたが、出現時間は、影響を受けなかった。上記試験からのデータは、表１２に示される。
【００６７】
【表１２】
2011514159.tif 000013
（実施例４：Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ標的捕捉オリゴマーの設計および試験）
標的捕捉を、その後の増幅のために、核酸サンプルを精製および調製するために使用する（米国特許第６，１１０，６７８号、同第６，２８０，９５２号、および同第６，５３４，２７３号（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら）を参照のこと）。簡潔には、溶解試薬中に既知の量の標的核酸を含むサンプルを調製した。サンプルを、共有結合したｄＴ３Ａ３０テイル、およびポリｄＴ−磁性粒子とともに標的特異的配列を含む標的捕捉オリゴマーと混合した。上記混合物を、３０分間６０℃においてインキュベートし、次いで、３０分間室温でインキュベートして、上記磁性粒子上に上記標的ＲＮＡを捕捉したハイブリダイゼーション複合体を形成した。磁性粒子を、磁場を、上記容器の外側に印加し、上記磁性粒子を別の溶液に移すことによって、上記溶液から分離した。上記標的配列を有する上記磁性粒子を、洗浄溶液で１回洗浄した。上記標的核酸を有する上記磁性粒子を、増幅試薬中に再懸濁し、その後の増幅の準備ができた。標的捕捉を、手動でもしくは自動化デバイスで行い得る（例えば、標的捕捉システム（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）もしくはＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒＴＭシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ））。
【００６８】
３つの標的捕捉オリゴヌクレオチドを、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡのために設計した（Ｅ．ｃｏｌｉアクセッション番号Ｖ００３３１およびＧＩ番号４２７５６（配列番号１２７〜１３０）の塩基２２１および塩基２５０に対応する２つの特異的オリゴヌクレオチドおよび１つの特異的捕捉オリゴヌクレオチド）。非特異的捕捉オリゴヌクレオチドの使用は、以前に記載されていた（ＵＳ  ２００８−０２８６７７５  Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）を参照のこと）。簡潔には、以下の試験において使用される上記非特異的捕捉プローブは、ＧおよびＵの無作為配列（核酸に非特異的に結合する１８塩基長）のオリゴヌクレオチドである。標的捕捉オリゴヌクレオチドを試験して、これらが上記増幅反応と干渉しないことを確認した。具体的には、２．５ｐｍｏｌの標的捕捉オリゴマー（配列番号１２７もしくは１２９）もしくは２．５ｐｍｏｌの非特異的捕捉プローブを、標的ＲＮＡの１０５コピーを含むサンプル中でスパイクした（ｓｐｉｋｅｄ）。サンプルを、本明細書で先に記載された上記アッセイオリゴマー組み合わせのうちの１つで、リアルタイム単一プライマー転写関連増幅を使用して増幅した。標的捕捉オリゴヌクレオチドは、上記増幅反応に対して最小限の影響を示した。データは、表１３に示される。
【００６９】
【表１３】
2011514159.tif 000014
標的捕捉オリゴマー感度を、（１）Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡの量を一定に維持し、標的捕捉オリゴマーの量を変化させる、および（２）標的捕捉オリゴマーの量を一定に維持し、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡの量を変化させる、ことによって、決定した。最初の試験、０コピーもしくは１０６コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡを、溶解試薬１ｍＬあたり、０ピコモル、２．５ピコモル、５ピコモル、１０ピコモル、もしくは２０ピコモルの捕捉プローブを使用して増幅した。第２の試験において、０コピー、１０３コピー、１０４コピー、１０５コピー、および１０６コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡを、溶解試薬１ｍＬあたり５ピコモルの捕捉プローブを使用して増幅した。両方の試験において、核酸サンプルを、リアルタイム単一プライマー転写関連増幅を使用して、アッセイオリゴマー組み合わせ１を使用して、増幅した。感度実験からのデータを、表１４および表１５に示す。
【００７０】
【表１４】
2011514159.tif 000015
【００７１】
【表１５】
2011514159.tif 000016
標的捕捉オリゴヌクレオチドをまた、以下のチャレンジ生物：Ｐ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ、Ｐ．ａｖｉｄｕｍおよびＰ．ｔｈｅｏｎｉｉに対する交叉反応性について試験した。簡潔には、標的捕捉プローブを、１０４ＣＦＵのチャレンジ生物を含むサンプルに添加した。０コピーもしくは１０６コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡを含むコントロールを、作動させた。全てのサンプルを、リアルタイム単一プライマー転写関連増幅を使用して、アッセイオリゴマー組み合わせ１を使用して、増幅した。データを、表１６に示す。
【００７２】
【表１６】
2011514159.tif 000017
標的捕捉オリゴマーを、交差反応性についてさらに試験して、上記チャレンジ生物、Ｐ．ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｉｃｕｍ、Ｐ．ａｖｉｄｕｍおよびＰ．ｔｈｅｏｎｉｉが、増幅を阻害しないことを確実にした。簡潔には、標的捕捉プローブを、１０４ＣＦＵの上記チャレンジ生物ありまたはなしの、０コピー、１０３コピー、１０４コピー、１０５コピーもしくは１０６コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡを含むサンプルに添加した。標的捕捉の後に、全てのサンプルを、リアルタイム単一プライマー転写関連増幅を使用して、アッセイオリゴマー組み合わせ１を使用して増幅した。標的捕捉を、配列番号１２９を用いて行った試験の結果を、表１７に示される。
【００７３】
【表１７】
2011514159.tif 000018
（実施例５：  Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡのＴＡＧ増幅およびリアルタイム検出）
バックグラウンド蛍光を減少させるための方法は公知であり、１つのこのような方法（ＴＡＧ増幅といわれる）を使用して、Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡのリアルタイム検出のためのバックグラウンドシグナルを低下させた。ＴＡＧ増幅は、以前に詳細に記載された（ＵＳ．  ２００７−０２８１３１７  Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）を参照のこと）。簡潔には、ＴＡＧ増幅は、上記増幅オリゴマーのうちの１つ（ＴＡＧオリゴマーといわれる）を、５’末端において非標的結合配列を含むように改変する。ＴＡＧオリゴマーは、上記標的捕捉工程の間に上記標的捕捉プローブとともに含められ得る。従って、上記サンプル核酸は、上記標的捕捉プローブおよび上記ＴＡＧオリゴマーの両方に同時にハイブリダイズする。過剰なＴＡＧオリゴマーを含む全ての結合していない核酸は、洗い流される。サンプルを増幅し、第１回のラウンドの増幅は、上記ＴＡＧオリゴマーを使用するのに対して、その後のラウンドの増幅は、上記ＴＡＧ配列に対して特異的なオリゴマーを使用する。Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡを増幅するためのＴＡＧオリゴマーの実施形態を表１８に示し、ここで小文字は、上記ＴＡＧ配列を表す。
【００７４】
【表１８−１】
2011514159.tif 000019
【００７５】
【表１８−２】
2011514159.tif 000020
ＴＡＧ増幅を使用する最初の試験を、０コピーもしくは１０５コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡを含むサンプルに対して行った。標的捕捉を、標的特異的捕捉プローブおよび上記ＴＡＧオリゴマーを使用して行った。リアルタイム単一プライマー転写関連増幅を、アッセイオリゴマー組み合わせ１のバリエーションを使用して行った。上記バリエーションは、以下を含んだ：（１）配列番号２０の代わりに配列番号１３５を使用する工程、および（２）さらなる増幅オリゴマー配列番号１８９を添加する工程。ＴＡＧ増幅を、バックグラウンド蛍光を大きく低下させたが、出現時間を遅らせ、いくつかの擬陽性が存在した。いくつかの実験を行って、増幅条件を変動させることによって、擬陽性を排除した。ゼロコピーもしくは１０５コピーのＰ．ａｃｎｅｓを、標的捕捉の間に添加したブロックオリゴマーありまたはなしで、増幅の間に添加した過剰のブロッカーオリゴマーありまたはなしで、および標的捕捉後の５分間にわたって６０℃もしくは６５℃におけるさらなるインキュベーションありまたはなしで増幅した。Ｐ．ａｃｎｅｓの独特の性質に起因して、上記擬陽性は、上記増幅系に伴う問題ではなく、汚染に起因し得る。データを、表１９に示す。
【００７６】
【表１９】
2011514159.tif 000021
増幅されたＴＡＧオリゴマーを設計して（配列番号１３７〜１６０）、擬陽性および偽陰性を減少させた。上記増幅されたＴＡＧオリゴマーは、上記標的結合配列および／もしくは上記ＴＡＧ配列の全てもしくは一部にハイブリダイズする閉鎖配列を使用して、ヘアピン構造を形成する。上記閉鎖配列は、６〜２２塩基長の範囲に及ぶ。ヘアピンＴＡＧオリゴマーの上記標的結合領域は、上記標的に優先的に結合するので、上記ヘアピン構造におけるｓｔａｙではなく、上記ヘアピンを開く。上記ヘアピンは、上記ＴＡＧオリゴマーの非標的ハイブリダイゼーションを減少させる。サンプルを、２つの変更とともに、アッセイオリゴマー組み合わせ２を使用して試験した。配列番号２０を、配列番号１３７〜１６０から選択される配列で置換した。配列番号１３７〜１４０を使用した場合、配列番号１９０を、上記増幅オリゴマーに添加した。配列番号１４１〜１４４を使用した場合、配列番号１９１を、上記増幅オリゴマーに添加した。配列番号１４５〜１４８を使用した場合、配列番号１９２を、上記増幅オリゴマーに添加した。配列番号１４９〜１６０を使用した場合、配列番号１９３を、上記増幅オリゴマーに添加した。サンプルを、リアルタイム単一プライマー転写関連増幅を使用して増幅した。データは、配列番号１３７〜１４８については、表２０に示される。
【００７７】
【表２０】
2011514159.tif 000022
配列番号１３７〜１４０は、最も良好なバックグラウンドシグナル低下を提供し、感度についてさらに試験した。上記オリゴマー組み合わせを、０コピー、１０４コピー、および１０５コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡにおいて試験し、データを、表２１に示す。配列番号１３７とのアッセイオリゴマー組み合わせを、感度についてさらに試験した。上記配列番号１３７オリゴマー組み合わせは、１０４コピーおよび１０５コピーの１６Ｓ  ｒＲＮＡにおいて、１／１５  擬陽性および偽陰性なしを、ならびに１０３コピーにおいて１／１５  偽陰性を生じた。
【００７８】
【表２１】
2011514159.tif 000023
（実施例６：Ｐ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ検出における感度の増大）
実験を行って、感度が、配列番号１９５〜１９８から選択される１つ以上のヘルパープローブ（表２２を参照のこと）を上記標的捕捉工程に添加することによって改善され得るか否かを決定した。ヘルパープローブは、以前に記載された（米国特許第５，０３０，５５７号（Ｈｏｇａｎ）を参照のこと）。簡潔には、ヘルパープローブは、二次構造に起因してハイブリダイゼーション阻害を低下させるのを助ける短いプローブである。それらの小さなサイズは、ヘルパープローブが二次構造付近の領域を結合することを可能にし、次いで、上記二次構造は変化し、このことは、より長いオリゴマーが上記核酸にハイブリダイズするのを可能にする。
【００７９】
【表２２】
2011514159.tif 000024
サンプルを、２つの変化とともに、アッセイオリゴマー組み合わせ２を用いて試験した：配列番号１４１を配列番号２０で置換し、配列番号１９１を、上記増幅オリゴヌクレオチドに添加した。第１の試験を、ヘルパープローブありおよびなしのサンプルと比較し、第２の試験を、異なるヘルパープローブで比較した。両方の試験は、リアルタイム単一プライマー転写関連増幅を使用する。第１の試験において、０コピー、１０３コピーもしくは１０５コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡは、ヘルパープローブ（配列番号１９５）ありまたはなしで、特異的捕捉プローブ（配列番号１２９）を使用して、標的捕捉を受けた。第１の試験の結果は、感度を改善しなかったが、曲線の傾きを改善した。第２の試験において、０コピーもしくは１０４コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡは、特異的捕捉プローブ（配列番号１２９）および配列番号１９６〜１９８から選択される１つのヘルパープローブを使用して、標的捕捉を受けた。第２の試験の結果は、増幅阻害もしくは実験設定に伴う問題を示した。なぜなら、配列番号１９５についてのデータは、以前の試験より低いからである。上記２つの試験のデータを、表２３および表２４に示される。「ＡｖｅＳｌｏｐｅ」は、上記リアルタイム増幅曲線の平均傾きであり；「ＡｖｅＲａｎｇｅ」は、同じ条件において試験した複製サンプルについての検出したＲＦＵの平均（ａｖｅｒａｇｅ）（平均（ｍｅａｎ））を表す。
【００８０】
【表２３】
2011514159.tif 000025
【００８１】
【表２４】
2011514159.tif 000026
（実施例７：塩基処理での擬陽性の低下）
環境中およびヒト皮膚上のＰ．ａｃｎｅｓの広がりに起因して、人々の存在下で作製される緩衝液およびオリゴマーは、微量のＰ．ａｃｎｅｓを含み得、従って、擬陽性を引き起こし得る。増幅オリゴマーおよび緩衝液の、塩基での前処理は、上記試薬中に存在する任意のＰ．ａｃｎｅｓ  ＲＮＡを分解することによって、擬陽性を低下させ得る。上記オリゴマーを塩基処理するための１つの方法は、ｐＨ７．５にされない溶解試薬（実施例１を参照のこと）を使用する；これを、塩基もしくは塩基性溶解試薬という。標的捕捉オリゴマーおよび上記増幅オリゴマーのうちのいくつかを、上記塩基溶解試薬に添加し、６０℃において９０分間にわたって加熱し、室温へと冷却する。冷却後、上記塩基溶解試薬を、滅菌シリンジを使用して、塩酸を上記チューブに注入することによって中和する。いったん中和されると、上記サンプルを、上記溶解緩衝液およびオリゴマーに添加し得る。
【００８２】
（実施例８：改変標的捕捉プローブでの擬陽性の低下）
擬陽性を低下させる１つの方法は、ヘアピン形成を含むように改変された標的捕捉プローブを使用する。ヘアピン標的捕捉プローブは、以前に記載された（ＵＳ  ２００６−００６８４１７  Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）を参照のこと）。Ｐ．ａｃｎｅｓ核酸を捕捉するためのヘアピン標的捕捉プローブの実施形態は、表２５に列挙され、ここで小文字は、ヘアピン閉鎖配列を表す。
【００８３】
【表２５】
2011514159.tif 000027
直線状標的捕捉プローブ（配列番号２１９）を、１０塩基長、１２塩基長、もしくは１４塩基長であるヘアピン閉鎖配列を有するヘアピン標的捕捉プローブに対して比較した（それぞれ、配列番号２２４、２２５、および２２６）。標的捕捉を、上記標的捕捉プローブおよび増幅オリゴマー（配列番号２１０および８）で行った。上記標的捕捉複合体を分離した後に、上記サンプルは、配列番号３５、１９３および１８１を使用して、リアルタイム単一プライマー転写関連増幅を受けた。結果を表２６に示す。上記直線状標的捕捉プローブに関して、１２個の陰性サンプルのうちの６個は、陽性であった。１０塩基閉鎖配列もしくは１２塩基閉鎖配列を有する上記ヘアピン標的捕捉プローブについては、１２個の陰性サンプルのうちの１個は、陽性であった。１４塩基閉鎖配列を有する上記ヘアピン標的捕捉プローブについて、擬陽性は存在しなかった。上記ヘアピン標的捕捉プローブは、擬陽性の数を低下させたが、これらはまた、上記アッセイの感度を低下させた。
【００８４】
【表２６】
2011514159.tif 000028
擬陽性を低下しつつ感度を改善するために、ヘアピン標的捕捉を、上記標的捕捉プローブを塩基処理することおよび実施例７に記載されるとおりの上記増幅オリゴマーのうちのいくつかと組み合わせた。上記ヘアピン標的捕捉オリゴマーの閉鎖配列は、７塩基長、８塩基長、もしくは９塩基長（それぞれ、配列番号２２１、２２２、もしくは２２３）に減少した。配列番号２１０および８を、塩基溶解緩衝液と、配列番号２１９もしくは２２１もしくは２２２もしくは２２３のいずれかを含むチューブに添加し、６０℃において９０分間にわたって加熱した。上記チューブを室温へと冷却し、塩酸を無菌的に注入して、上記緩衝液を中和した。上記標的捕捉複合体を分離した後、上記サンプルは、配列番号３５、１９３および１８１を使用するリアルタイム単一プライマー転写関連増幅を受けた。結果を、表２７に示す。上記塩基処理は、上記直線状の標的捕捉オリゴマーを使用する場合ですら、擬陽性を生じなかった。さらに、上記アッセイ感度は、上記直線状標的捕捉プローブと上記ヘアピン標的捕捉プローブとの間で等しかった。
【００８５】
【表２７】
2011514159.tif 000029
（実施例９：  スカベンジャーオリゴマーでの擬陽性の低下）
スカベンジャーオリゴマーは、非標的結合オリゴマー（例えば、過剰な増幅オリゴマーもしくは捕捉プローブ）にハイブリダイズするように設計される短いオリゴマー（一般に、２０塩基未満）である。上記過剰のオリゴマーと、スカベンジャーとをハイブリダイズさせることは、上記過剰なオリゴマーが、非標的物質に非特異的にハイブリダイズしないように助ける。スカベンジャーオリゴマーは、一般に、非特異的標的に潜在的にハイブリダイズし得る上記標的捕捉オリゴマーもしくは上記増幅オリゴマーのいずれかの上の領域にハイブリダイズするように設計される。例えば、標的捕捉プローブは、ポリＡテイルを有するので、非特異的標的中の任意のポリ−Ｔ部位は、上記ポリ−Ａテイルに非特異的にハイブリダイズし得る。あるいは、スカベンジャーは、構造的領域（例えば、ヘアピン）にハイブリダイズし得る。スカベンジャーオリゴマーの例は、以下の表２８に列挙される。配列番号２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、および２１６は、ＴＡＧオリゴマー（配列番号２１０）とともに使用されうる。配列番号２１７および２１８は、配列番号２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、もしくは２２６の標的捕捉オリゴマーとともに使用されうる（上記の表２５を参照のこと）。
【００８６】
【表２８】
2011514159.tif 000030
スカベンジャーオリゴマーを、上記標的捕捉プローブもしくは上記増幅オリゴマーのいずれかに添加した。スカベンジャーオリゴマーを、上記標的プローブに添加したアッセイについては、１つのスカベンジャーオリゴマーを、配列番号２１１〜２１８から選択し、配列番号２１９、２１０、および８に添加した。ゼロコピーもしくは１０４コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  ｒＲＮＡを添加し、標的捕捉を、実施例４に記載されるように行った。標的捕捉の後に、上記サンプルを、配列番号８、３５、１８１、および１９３を使用して、実施例３に記載されるように、リアルタイム単一プライマー転写関連増幅によって増幅した。スカベンジャーオリゴマーを上記増幅オリゴマーに添加したアッセイについては、標的捕捉を、ゼロコピーもしくは１０４コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  ｒＲＮＡに対して、配列番号２１９、２１０、および８を使用して行った。標的捕捉の後、上記サンプルを、配列番号８、３５、１８１、および１９３＋配列番号２１１〜２１８から選択される１つの配列を使用して、リアルタイム単一プライマー転写関連増幅によって増幅した。結果を、表２８および表３０に示す。スカベンジャーオリゴマーを上記標的捕捉プローブに添加することは、擬陽性を排除しなかった（以下に報告される結果は、報告された各条件について行った１５回の合計アッセイあたりの擬陽性の数である）。スカベンジャーオリゴマーを上記増幅オリゴマーに添加することは、増幅を阻害せず、配列番号２１５および２１７は、いかなる擬陽性をも有さなかった。
【００８７】
【表２９】
2011514159.tif 000031
【００８８】
【表３０】
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（実施例１０：  Ｐ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ増幅オリゴマーセットの設計および最初の試験）
増幅および検出オリゴヌクレオチドを、Ｐ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡを増幅および検出するために設計した。一般に、増幅および検出を、アクセッション番号ＡＥ０１７２８３およびＧＩ番号５０８３９０９８の塩基６０８、７４５〜６０９、２９５に標的化した（配列番号２０２）。第１のセットの増幅および検出オリゴマーは、塩基６０８、７７５〜６０９、０４５に対応し（配列番号２０３）、第２のセットの増幅および検出オリゴマーは、アクセッション番号ＡＥ０１７２８３およびＧＩ番号５０８３９０９８の塩基６０８、９９５〜６０９、２７５（配列番号２０４）に対応する（配列番号９〜１５、２７〜３４、５５〜７２、９９〜１２６、１８３、および１８５〜１８８）。既知の量のＰ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を、表４および表５中のオリゴマーの組み合わせを使用するリアルタイム転写関連増幅を使用して増幅した。
【００８９】
増幅オリゴヌクレオチド組み合わせを、実施例３に類似の条件下で、０コピーおよび１０５コピーのＰ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡにおいて試験した。オリゴマー組み合わせを、シグナル出現時間、最大ＲＦＵシグナル、シグモイド曲線の傾き、およびバックグラウンドシグナルレベルに対して評価した。Ｐ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの第１の領域を標的化するアッセイオリゴマー組み合わせは、以下であった：（１）配列番号１１、２７、６１および１０７；（２）配列番号１１、３２、６１、および１０５；（３）配列番号１１、２７、６１、および９９；（４）配列番号１１、３２、６１、および１０３；（５）配列番号１１、３１、６１、および１０３；ならびに（６）配列番号１１、３２、５９、および１０１。Ｐ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡの第２の領域を標的化するアッセイオリゴマー組み合わせは、以下であった：（７）配列番号１４、３４、６９、および１１７；（８）配列番号１４、３４、６７、および１１７；（９）配列番号１４、３３、６７、および１１７；（１０）配列番号１４、３３、６７、および１１９；ならびに（１１）配列番号１８３、１８５、１８６、および１８８。アッセイオリゴマー組み合わせ２および１１についてのデータを、表３１に示す。
【００９０】
【表３１】
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（実施例１１：  Ｐ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡのＴＡＧ増幅オリゴマー）
上記ＴＡＧ増幅系を使用してＰ．ａｃｎｅｓ  ２３Ｓ  ｒＲＮＡを増幅するために使用されうるオリゴマーを、表３２に列挙する。小文字は、上記ＴＡＧ配列を表す。実施例５に記載されるように、この方法は、リアルタイム検出アッセイにおいてバックグラウンド蛍光を低下させるために使用される。表３２に示される群からのアッセイオリゴマーの選択された組み合わせを使用して、増幅を、実質的に実施例５に記載されるように行うが、増幅のための標的に関して２３Ｓ  ＲＮＡ転写物を使用する。上記増幅生成物を、増幅の間に（すなわち、リアルタイムで）、プローブ（例えば、分子ビーコンもしくは分子トーチ）を使用することによって検出する。上記プローブは、上記増幅されたｔａｇ配列から作製された上記増幅生成物に特異的にハイブリダイズするか、または表2中の選択された増幅オリゴマーの間に位置した増幅された２３Ｓ配列に特異的にハイブリダイズする。上記２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列特異的プローブから選択されるものを含む増幅オリゴマーは、表６に示される。
【００９１】
【表３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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