(57)【要約】本開示は、ＴＮＦ−αアンタゴニストドメインと、ＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２もしくはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬなどの異種標的に対してアンタゴニスト作用を有するかまたはＩＬ１０などの異種標的に対してアゴニスト作用を有する別の結合ドメインとから構成される多重標的融合タンパク質を提供する。また、この多重特異性融合タンパク質は、これらの結合ドメインを分離し、二量体化を可能にする介在ドメインも含むことができる。また、本開示は、これらの多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、これらの融合タンパク質の組成物、ならびにこれらの多重特異性融合タンパク質および組成物を使用する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端からカルボキシ末端までに、以下の構造のうちの１つを有する多重特異性融合タンパク質：
（ａ）ＢＤ−ＩＤ−ＥＤ、
（ｂ）ＥＤ−ＩＤ−ＢＤ、または
（ｃ）ＥＤ１−ＩＤ−ＥＤ２
［式中、
ＥＤは、ＴＮＦアンタゴニストであり、ＥＤ１とＥＤ２とは、異なる結合ドメインまたは外部ドメインであり、ＥＤ１またはＥＤ２は、ＴＮＦアンタゴニストであり、
ＩＤは、介在ドメインであり、かつ
ＢＤは、ＩＬ６アンタゴニスト、ＲＡＮＫＬアンタゴニスト、ＩＬ７アンタゴニスト、ＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニスト、ＴＷＥＡＫアンタゴニスト、ＣＳＦ２アンタゴニスト、ＩＧＦアンタゴニスト、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニストまたはＩＬ１０アゴニストである］。
【請求項２】
ＢＤが、免疫グロブリン可変結合ドメインである、請求項１に記載の多重特異性融合タンパク質。
【請求項３】
ＥＤ１およびＥＤ２が、受容体リガンド結合外部ドメインである、請求項１または２に記載の多重特異性融合タンパク質。
【請求項４】
介在ドメインが、以下の構造を有する、請求項１から３のいずれかに記載の多重特異性融合タンパク質：
−Ｌ１−ＣＨ２ＣＨ３−
［式中、
Ｌ１は、免疫グロブリンヒンジリンカーであって、場合により、ＩｇＧ１ヒンジが異なるアミノ酸で置換されている第１システインを有し、
−ＣＨ２ＣＨ３−は、ＩｇＧ１のＦｃドメインのＣＨ２ＣＨ３領域であり、場合により、変異させて、ＦｃＲｎへの結合性は保持されるが、ＦｃγＲＩ−ＩＩＩへの結合性が除かれている］。
【請求項５】
前記ＢＤが、第１のリンカーによって前記介在ドメインに接続しており、前記ＥＤが、第２のリンカーによって前記介在ドメインに接続しており、ここで、前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーは、同じであってもまたは異なっていてもよい、請求項１から４のいずれかに記載の多重特異性融合タンパク質。
【請求項６】
前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーが、配列番号４９７〜６０４および配列番号７９１〜７９６からなる群から選択され、場合により、前記第１リンカーが、配列番号５７６であり、前記第２リンカーが配列番号７９１である、請求項５に記載の多重特異性融合タンパク質。
【請求項７】
配列番号６０７〜６７０および配列番号７９８〜８０４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれかに記載の多重特異性融合タンパク質。
【請求項８】
１つまたは複数の請求項１から７のいずれかに記載の多重特異性融合タンパク質、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物。
【請求項９】
前記多重特異性融合タンパク質が、前記組成物に二量体または多量体として存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれか一項に記載の多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
発現制御配列に作動可能に連結している、請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
炎症性障害、自己免疫障害または過剰増殖障害を有する被験体を治療するための方法であって、治療有効量の前記請求項のいずれかに記載の多重特異性融合タンパク質またはその組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
前記障害が、関節リウマチ、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、乾癬、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病（Ｃｈｒｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎、重度の難治性喘息、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、子宮内膜症、全身性エリテマトーデスまたはアルツハイマー病である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、多重標的結合性分子およびそれらの治療的適応の分野、より具体的には、ＴＮＦ−αアンタゴニストドメインおよびＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２もしくはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬなどの異種標的に対してアンタゴニスト作用を有する別の結合ドメイン、またはＴＮＦ−αアンタゴニストドメインおよびＩＬ１０などの異種標的に対してアゴニスト作用を有する別の結合ドメインのいずれかから構成される融合タンパク質、ならびにそれらの組成物および治療上の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであり、また、ＣＤ１２０またはカケクチンとしても知られている腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の受容体である。このサイトカイン受容体には２つの変異体、すなわち、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２（それぞれ、ＣＤ１２０ａ受容体およびＣＤ１２０ｂ受容体）がある。ＴＮＦＲ１は、約５５ＫＤの分子量を有し、したがって、時にはｐ５５と呼ばれる。ＴＮＦＲ２は、約７５ＫＤの分子量を有し、したがって、時にはｐ７５と呼ばれる。
【０００３】
大半の細胞型および組織が、両方のＴＮＦ受容体を発現するようである。両方が、細胞表面にも可溶性の形態でも存在し、両方が、シグナル伝達において活性を示すが、これらは、別個の細胞応答を媒介することができる。ＴＮＦＲ１は、大部分のＴＮＦ応答のシグナル伝達に関与するようである。他の活性のうちでも、ＴＮＦＲ２は、胸腺細胞の増殖を刺激したり、ＮＦ−κβを活性化したり、細胞傷害性などのＴＮＦＲ１によって主として媒介される応答のシグナル伝達におけるＴＮＦＲ１に対するアクセサリーとなったりする。
【０００４】
抗ＴＮＦ抗体などのＴＮＦアンタゴニストは、種々の炎症性状態に正の影響を及ぼすことができる。例えば、インフリキシマブは、米国では、関節リウマチ、クローン病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、斑状乾癬（ｐｌａｑｕｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）および潰瘍性大腸炎の治療に適応がある。ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）の処方情報によれば、ＴＮＦに起因する生物学的活性には、インターロイキン（ＩＬ）１および６などの炎症性サイトカインの誘導、内皮層の透過性ならびに内皮細胞および白血球による接着分子の発現を増加させることによる白血球遊走の増強、好中球および好酸球の機能活性の活性化、急性相反応物質およびその他の肝臓タンパク質ならびに滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）および／または軟骨細胞が産生する組織分解酵素の誘導があげられる。最近になって、ＴＮＦα阻害剤であるエタネルセプトの脊髄周囲（ｐｅｒｉｓｐｉｎａｌ）送達によって、アルツハイマー病の患者の症状が減じることが示されている（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００５】
異種の分子に対して特異性を示す結合部位と一緒になった、ＴＮＦ受容体またはＴＮＦαのいずれかに対して特異性を示す結合部位を含む二重特異性分子が、以前に報告されている（例えば、ＵＳ２００８／０２６０７５７、ＵＳ２００６／００７３１４１、ＵＳ２００７／００７１６７５、ＷＯ２００６／０７４３９９およびＷＯ２００７／１４６９６８を参照されたい）。米国特許第７，３００，６５６号は、抗ＩＦＮ−γ抗体の抗原結合ドメインと、ＴＮＦ−α受容体またはその細胞外ドメインとを含む二重特異性分子を記載している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＴｏｂｉｎｉｃｋおよびＧｒｏｓｓ（２００８年）ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ８巻：２７〜３６頁
【非特許文献２】Ｇｒｉｆｆｉｎ（２００８年）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、５巻：３〜６頁
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異的（Ｘｃｅｐｔｏｒ）融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６と特異的に結合し、これら多重特異的融合タンパク質が、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒ単独よりもハイパーＩＬ６と優先的に結合することを示す図である。試験した２種の融合タンパク質だけがＩＬ６と結合し、ｓＩＬ６Ｒとは１つも結合しなかった。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異的（Ｘｃｅｐｔｏｒ）融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６と特異的に結合し、これら多重特異的融合タンパク質が、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒ単独よりもハイパーＩＬ６と優先的に結合することを示す図である。試験した２種の融合タンパク質だけがＩＬ６と結合し、ｓＩＬ６Ｒとは１つも結合しなかった。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異的（Ｘｃｅｐｔｏｒ）融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６と特異的に結合し、これら多重特異的融合タンパク質が、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒ単独よりもハイパーＩＬ６と優先的に結合することを示す図である。試験した２種の融合タンパク質だけがＩＬ６と結合し、ｓＩＬ６Ｒとは１つも結合しなかった。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異的融合タンパク質が、ＴＮＦ−αと結合することを示す図である。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異的融合タンパク質が、ハイパーＩＬ６およびＴＮＦ−αと同時に結合できることを示す図である。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異的融合タンパク質が、ｇｐ１３０をハイパーＩＬ６との結合からブロックすることを示す図である。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異的融合タンパク質が、ＴＦ−１細胞の、（Ａ）ＩＬ６誘導性増殖または（Ｂ）ハイパーＩＬ６誘導性増殖をブロックすることを示す図である。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異的融合タンパク質が、ＴＦ−１細胞の、（Ａ）ＩＬ６誘導性増殖または（Ｂ）ハイパーＩＬ６誘導性増殖をブロックすることを示す図である。
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＴＮＦＲ外部ドメインと融合した様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つを含有する多重特異的融合タンパク質が、ＴＮＦ−αをＴＮＦＲとの結合からブロックすることを示す図である。
【図７】図７は、様々な異なるハイパーＩＬ６結合ドメインの１つと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異的融合タンパク質が、Ｌ９２９細胞のＴＮＦ−α誘導性殺滅をブロックすることを示す図である。
【図８】図８は、ヒトＴＷＥＡＫ受容体の外部ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異的融合タンパク質が、ＨＴ２９細胞のＴＷＥＡＫ誘導性殺滅をブロックすることを示す図である。
【図９】図９は、ＯＰＧ外部ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異的融合タンパク質が、ＲＡＷ２４６．７細胞においてＲＡＮＫＬ媒介性破骨細胞形成をブロックすることを示す図である。
【図１０】図１０は、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異的融合タンパク質が、ＨｅｐＧ２（肝）細胞と結合しなかったことを示す図である。
【図１１】図１１は、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異的融合タンパク質が、マウスにおけるＨＩＬ６−誘導性ＳＡＡ応答をブロックしたことを示す図である。
【図１２】図１２は、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異的融合タンパク質が、マウスにおけるＨＩＬ６誘導性ｓｇｐ１３０応答をブロックしたことを示す図である。
【図１３】図１３ＡおよびＢは、ＩＬ６結合ドメインと融合したＴＮＦＲ外部ドメインを含有する多重特異的融合タンパク質の、それぞれ投与２時間後および２４時間後の、マウスにおけるＴＮＦα誘導性ＳＡＡ応答をブロックする能力に関する研究の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
本記載においては、任意の濃度の範囲、パーセントの範囲、割合の範囲、または整数の範囲は、別段の記載がない限り、列挙する範囲に属する任意の整数値、および適宜、その分数（例として、ある整数の１０分の１および１００分の１）を含むと理解されたい。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどの任意の物理的特性に関する、本明細書に列挙する任意の数の範囲は、別段の記載がない限り、列挙する範囲に属する任意の整数を含むと理解されたい。本明細書で使用する場合、「約（ａｂｏｕｔ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、別段の記載がない限り、表示する範囲、値または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用する場合、用語「ａ」および「ａｎ」は、列挙する構成成分のうちの「１つまたは複数」を指すと理解されるべきである。選択肢（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方、またはそれらの任意の組合せのうちのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」と「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」とは、同義語として使用する。さらに、本明細書に記載する構造および置換基の種々の組合せから得られる個々の化合物または化合物群は、それぞれの化合物または化合物群が、個々に記載されているのと同じ程度で本出願によって開示されると理解されるべきである。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本開示の範囲に属する。
【０００９】
本開示に従う「結合ドメイン」または「結合領域」は、例えば、生物学的分子（例えば、ＴＮＦ−αもしくはＩＬ６）、あるいは安定であっても一過性であっても、２つ以上の同じまたは異なる分子の複合体、または集合体もしくは凝集体（例えば、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体）を特異的に認識し、それに結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはペプチドであってよい。そのような生物学的分子として、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、アミノ酸、もしくはそれらの誘導体、脂質、脂肪酸、もしくはそれらの誘導体；炭水化物、糖類、もしくはそれらの誘導体；ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド核酸、核酸分子、もしくはそれらの誘導体；糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、リポタンパク質、プロテオリピド、もしくはそれらの誘導体；例えば、生物学的試料に存在し得るその他の生物学的分子；またはそれらの任意の組合せが挙げられる。結合領域は、生物学的分子にかまたはその他の目的の標的に対しての、任意の天然に存在する、合成の、半合成の、または組換えにより産生された結合パートナーを含む。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）解析を含めて、特定の標的と特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための多様なアッセイが公知である。
【００１０】
本開示の結合ドメインおよびそれらの融合タンパク質が、標的分子に、例えば、約１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１または１０１３Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位で示す、特定の結合相互作用の平衡結合定数）で結合する場合、それらは、標的に、「特異的または選択的に結合する」ことを含めて、所望の程度で結合することができ、一方、試験試料に存在するその他の構成成分に顕著に結合することはない。「高い親和性の」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１以上のＫａを有する結合ドメインを指す。あるいは、親和性を、Ｍの単位で示す、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）と定義することもできる。本開示に従う結合ドメインのポリペプチドおよび融合タンパク質の親和性は、従来の技法を使用して容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９年）Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１巻：６６０頁；米国特許第５，２８３，１７３号；第５，４６８，６１４号；Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）解析；または均等物を参照されたい）。
【００１１】
本開示の結合ドメインは、本明細書に記載される通りまたは当技術分野で公知の多様な方法（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号；第６，２９１，１５８号を参照されたい）によって生成することができる。供給源として、ヒト、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダもしくはラマに由来する；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６頁、およびＮｇｕｙｅｎら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７５巻：４１３頁）、サメ（Ｒｏｕｘら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５巻：１１８０４頁）、魚（Ｎｇｕｙｅｎら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５４巻：３９頁）、げっ歯類、トリ、ヒツジを含めた、種々の種に由来する抗体の遺伝子配列（これらは、ファージライブラリーなどにおいて、抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖもしくはＦａｂとしてフォーマットすることができる）、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、またはフィブリノーゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０巻：１３８８頁を参照されたい）、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照されたい）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４を参照されたい）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照されたい）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙおよびＧｒｅａｄｙ（２００５年）ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２巻：６１７９頁）、ｍＡｂ２、もしくはＦｃａｂＴＭ（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００７／０９８９３４号；第ＷＯ２００６／０７２６２０号を参照されたい）などのような代替の非抗体骨格のループ領域に工学的に作製される多様なアミノ酸をコードする配列などが挙げられる。さらに、好都合な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウスＴＭ、ＫＭ−マウス（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において、ヒトＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体またはＨｙｐｅｒ−ＩＬ６（ペプチドリンカーＩＬ６ＲによってつなげられたＩＬ６）などの合成単鎖ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体を免疫原として使用する、ハイブリドーマを開発するための伝統的な戦略を使用して、本開示の結合ドメインを開発することもできる。
【００１２】
抗体技術に関して当業者によって理解されている用語はそれぞれ、本明細書において明確に定義しない限り、当技術分野で与えられている意味を有する。例えば、用語「ＶＬ」および「ＶＨ」はそれぞれ、抗体の軽鎖および重鎖に由来する可変結合領域を指す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られている個別の明確に定義されたサブ領域から構成される。用語「ＣＬ」および「ＣＨ」はそれぞれ、「免疫グロブリン定常領域」、すなわち、抗体の軽鎖および重鎖に由来する定常領域を指し、後者の領域は、その領域が由来する抗体のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）に応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４の定常領域ドメインにさらに分割可能であると理解されている。定常領域ドメインの一部がＦｃ領域（「結晶化可能なフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）」領域）を構成し、この領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性）、ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞媒介型食作用）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）、および補体結合、Ｆｃ受容体に対する結合、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、Ｆｃ領域を欠くポリペプチドと比べてより長い半減期、プロテインＡ結合性、ならびに正におそらく胎盤移行（Ｃａｐｏｎら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３３７巻：５２５頁を参照されたい）などの免疫グロブリンのエフェクター機能に関与するドメインを含有する。さらに、Ｆｃ領域を含有するポリペプチドは、ポリペプチドの二量体化または多量体化も可能にする。「ヒンジ領域」は、本明細書においては「リンカー」とも呼び、抗体の単鎖の可変結合領域と定常領域との間に挿入され、それらを接続するアミノ酸配列であり、これは、ヒンジの形態をとって、抗体、または抗体様分子に可動性をもたらすことが当技術分野では公知である。
【００１３】
抗原結合ドメインおよびエフェクター機能を付与するドメインは、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスの間で交換することができることから、免疫グロブリンのドメイン構造は工学的に作製しやすい。免疫グロブリンの構造および機能が、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年）に概説されている。広範な序論、および組換え抗体技術の全ての態様に関する詳細な情報を、教科書Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９９年）に見出すことができる。詳細な抗体工学の実験室プロトコールの包括的なコレクションを、Ｒ．  ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＳ．  Ｄｕｅｂｅｌ編、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００年）に見出すことができる。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「誘導体」は、化合物の化学的または生物学的に改変した別形（ｖｅｒｓｉｏｎ）であって、親化合物に構造的に類似し、その親化合物から（実際または理論的に）誘導可能である別形を指す。一般に、親化合物は、「誘導体」を生成するための出発材料であり得、一方、「類似体」を生成するためには、親化合物を出発材料として必ずしも使用するとは限らない場合がある点で、「誘導体」は、「類似体」とは異なる。類似体は、親化合物とは異なる化学的または物理的な特性を示す場合がある。例えば、誘導体は、親化合物と比較して、より親水性である場合もあり、または変化した反応性を示す場合（例えば、標的に対する親和性を変化させるアミノ酸の変化を有するＣＤＲ）もある。
【００１５】
用語「生物学的試料」は、被験体または生物学的供給源に由来する血液試料、生検検体、組織外植片、器官培養物、生物学的液体、あるいは任意のその他の組織もしくは細胞またはその他の標本を含む。被験体または生物学的供給源は、例えば、ヒトまたは非ヒト動物、初代細胞培養物、または染色体に組み込まれたもしくはエピソーム性の組換え核酸配列を含有し得る遺伝子操作された細胞系、体細胞ハイブリッド細胞系、不死化したもしくは不死化可能な細胞系、分化したもしくは分化可能な細胞系、形質転換細胞系などを含めた、培養馴化細胞系（ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｄａｐｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）であってよい。本開示のさらなる実施形態では、被験体または生物学的供給源は、悪性の疾患、障害もしくは状態またはＢ細胞の障害を含めた、疾患、障害または状態を有することが疑われる場合、あるいはそうしたリスクを有する場合がある。特定の実施形態では、被験体または生物学的供給源は、過剰増殖疾患、炎症性疾患または自己免疫疾患である場合があり、本開示の特定のその他の実施形態では、被験体または生物学的供給源は、そのような疾患、障害または状態のリスクも、その存在も有さないことが知られている場合がある。
【００１６】
特定の実施形態では、本開示は、ＴＮＦ−αと、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体、核性因子カッパＢリガンドの受容体活性化物質（ＲＡＮＫＬ、また、ＴＮＦＳＦ１１、ＯＤＦ、ＣＤ２５４としても公知である）、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、腫瘍壊死因子様の、アポトーシスの弱い誘導物質（ＴＷＥＡＫ；また、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１２、ＴＮＦＳＦ１２としても公知である）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２、また、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子もしくはＧＭ−ＣＳＦとしても公知である）；インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ１）；インスリン様増殖因子−２（ＩＧＦ２）；ＩＬ１０；またはＴＮＦＳＦ１３ファミリータンパク質（例えば、ＴＮＦＳＦ１３、また、増殖誘導リガンド、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ２５６としても公知である；もしくはＴＮＦＳＦ１３Ｂ、また、Ｂリンパ球刺激物質、ＢＬｙＳ、ＣＤ２５７、ＢＡＦＦとしても公知である）などのＴＮＦ−α以外の第２の標的との両方に結合する多重特異性融合タンパク質を提供することによって、異常なＴＮＦ−α活性と関連がある細胞の枯渇または調節を可能にする。特定の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、第１および第２の結合ドメイン、第１および第２のリンカー、ならびに介在ドメインを含み、介在ドメインの一方の末端が、リンカーを介して、ＴＮＦ−α外部ドメイン（例えば、細胞外ドメイン、１つまたは複数のシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）、例としてＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３）である第１の結合ドメインに融合し、他方の末端が、リンカーを介して、第２の結合ドメインに融合している。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ−α外部ドメイン全体未満を利用する。具体的には、ＴＮＦ−αのアンタゴニストとして機能するかまたはリガンド結合性を付与する、外部ドメイン内部のドメインを利用する。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、抗ＩＦＮγ免疫グロブリンのドメインまたはＩＦＮγ受容体外部ドメインなどのＩＦＮγ結合ドメインではない。
【００１７】
特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、ＩＬ６アンタゴニスト（例として、ＩＬ６またはＩＬ６／ＩＬ６Ｒα複合体に対して特異性を示す免疫グロブリン可変領域）、ＲＡＮＫＬアンタゴニスト（例として、ＲＡＮＫＬに対して特異性を示す免疫グロブリン可変領域、またはオステオプロテジェリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）外部ドメイン（例えば、配列番号７３７）もしくはそのＲＡＮＫＬ結合断片）、ＩＬ７アンタゴニスト（例として、ＩＬ７またはＩＬ７Ｒαに対して特異性を示す免疫グロブリン結合ドメイン、あるいはＩＬ７Ｒα外部ドメイン（例えば、配列番号７３８もしくは７３９）またはそのＩＬ７結合断片）、ＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニスト（例として、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＡ／Ｃに対して特異性を示す免疫グロブリン結合ドメイン、ＩＬ１７ＲＡ外部ドメイン（例えば、配列番号７３９、８１６）、ＩＬ１７ＲＡ／Ｃ外部ドメイン、ＩＬ１７Ｒ／Ｃ外部ドメイン（例えば、配列番号７４０、８１７）、またはそのＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７ＦもしくはＩＬ１７Ａ／Ｆ結合断片）、ＴＷＥＡＫアンタゴニスト（例として、ＴＷＥＡＫもしくはＴＷＥＡＫＲに対して特異性を示す免疫グロブリン結合ドメイン、またはＴＷＥＡＫＲ外部ドメイン（例えば、配列番号７４１）もしくはそのＴＷＥＡＫ結合断片）、ＣＳＦ２アンタゴニスト（例として、ＣＳＦ２もしくはＣＳＦ２Ｒαに対して特異性を示す免疫グロブリン結合ドメイン、またはＣＳＦ２Ｒα外部ドメイン（例えば、配列番号７４２）もしくはそのＣＳＦ２結合断片）、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２のアンタゴニスト（例として、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２に対して特異性を示す免疫グロブリン結合ドメイン、あるいはＩＧＦ１Ｒ（例えば、配列番号７４６、８１８）もしくはＩＧＦＢＰ（例えば、配列番号７４７〜７５３）の外部ドメインまたはそのＩＧＦ結合断片）、または、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニスト（例として、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬまたはＴＡＣＩに対して特異性を示す免疫グロブリン結合ドメイン、あるいはＴＡＣＩ外部ドメイン（例えば、配列番号７４３）もしくはＢＡＦＦＲ（また、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃとしても公知である）外部ドメイン（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿４４３１７７．１のアミノ酸１〜７６）またはそのＢＬｙｓ／ＡＰＲＩＬ結合断片）である。さらなるその他の実施形態では、第２の結合ドメインは、ＩＬ１０アゴニスト、例として、ＩＬ１０（例えば、配列番号７５４）もしくはＩＬ１０Ｆｃまたはその機能性サブドメイン、あるいはＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２に特異的に結合する単鎖の結合性タンパク質、例として、ｓｃＦｖである。
【００１８】
本明細書では、膜または可溶性ＩＬ６受容体（ＩＬ６Ｒα）とのＩＬ６の複合体を、膜ＩＬ６Ｒαまたは可溶性ＩＬ６Ｒα（ｓＩＬ６Ｒα）のいずれかとのＩＬ６の複合体を指す場合には、ＩＬ６ｘＲと呼び、ｓＩＬ６ＲαとのＩＬ６の複合体のみを指す場合には、ｓＩＬ６ｘＲと呼ぶ。いくつかの実施形態では、ＩＬ６ｘＲに対して特異性を示す結合ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質は、以下の特性のうちの１つまたは複数を示す：（１）ＩＬ６ｘＲ複合体に対する親和性は、ＩＬ６単独もしくはＩＬ６Ｒα単独に対するものと比べて、同等以上であるか、またはＩＬ６Ｒα単独またはＩＬ６ｘＲ複合体に対する親和性は、ＩＬ６単独に対しするものと比べて、より大きい；（２）ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について、膜ｇｐ１３０と競合するか、または可溶性ｇｐ１３０のｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合を増強する；（３）ＩＬ６のシス−シグナル伝達よりも、ＩＬ６のトランス−シグナル伝達を優先的に阻害する；および（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。
ＴＮＦ−αアンタゴニスト
ＴＮＦＲは、ＴＮＦＲスーパーファミリーに特徴的な３つの秩序立ったシステインに富むドメイン（ＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３）、および第４の保存の度合いがより低い、膜に近接するＣＲＤを含有する細胞外ドメインを有するＩ型膜貫通型のタンパク質である（Ｂａｎｎｅｒら（１９９３年）Ｃｅｌｌ  ７３巻：４３１頁）。本開示のＴＮＦ−αアンタゴニストは、ＴＮＦ−αの炎症活性または過剰増殖活性を阻害する。アンタゴニストドメインは、ＴＮＦＲの、多量体化もしくはＴＮＦ−α結合性を遮断する場合もあり、またはこのドメインが、受容体系の構成成分に結合し、リガンド活性の阻害もしくは受容体複合体の集合の阻止のいずれかによって、活性を遮断する場合もある。抗ＴＮＦ抗体、例として、インフリキシマブ、および可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦＲ）を含めた、種々のＴＮＦ−αアンタゴニストが当技術分野では公知である。そのような抗体アンタゴニストは、ＴＮＦ−αに結合し、それを阻害するが、ＴＮＦ−βを顕著に阻害することはない。モノクローナル抗体を含めて、抗ＴＮＦ抗体を、公知の技法を使用して調製することができ、そうした抗体が、当技術分野では公知である（例えば、米国特許第６，５０９，０１５号を参照されたい）。また、本開示のＴＮＦ−αアンタゴニストは、ＴＮＦＲ外部ドメインに存在する１つまたは複数のＴＮＦ−α結合ドメインを含むこともできる。
【００１９】
意図するＴＮＦ−αアンタゴニストは、ＴＮＦＲの細胞外ドメインもしくはそのサブドメイン、１つもしくは複数のＴＮＦＲのＣＲＤドメイン（例として、ＣＲＤ２およびＣＲＤ３）、またはＴＮＦ−α特異的抗体由来結合ドメイン（本明細書に記載するＩＬ６特異的抗体由来結合ドメインもしくはＩＬ６ｘＲ複合体特異的抗体由来結合ドメインに類似する）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ−αアンタゴニストは、ＴＮＦＲの細胞外ドメイン（「外部ドメイン」）、例として、ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２の外部ドメインであってよい。本明細書で使用する場合、ＴＮＦＲ外部ドメインは、ＴＮＦＲドメインのうち、ｓＴＮＦＲ、１つもしくは複数のＣＲＤ、またはそれらの任意の組合せを指す。特定の実施形態では、ＴＮＦ−αアンタゴニストは、ＴＮＦＲ２（また、ｐ７５、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂとしても公知である）のアミノ末端の部分、例として、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０５７．１（配列番号６７１）に記載のＴＮＦＲ２の最初の２５７個のアミノ酸を含む。その他の実施形態では、ＴＮＦ−αアンタゴニストは、配列番号６７１のアミノ酸２３〜２５７を含む（すなわち、天然のリーダー配列を欠く）。好ましい実施形態では、ＴＮＦ−αアンタゴニストは、配列番号６７１のアミノ酸２３〜１６３、または配列番号６７１のアミノ酸２３〜１８５、または配列番号６７１のアミノ酸２３〜２３５のような、ＴＮＦＲ２の断片（例えば、外部ドメイン）を含む。その他の好ましい実施形態では、ＴＮＦ−αアンタゴニストは、配列番号６７１の、１０９位のアミノ酸グルタミンが欠失している、アミノ酸２３〜１６３、または配列番号６７１の、１０９位のアミノ酸グルタミンが欠失しており、１０９位のアミノ酸プロリンが欠失している、アミノ酸２３〜１８５、または配列番号６７１の、１０９位のアミノ酸グルタミンが欠失しており、１０９位のアミノ酸プロリンが欠失しており、２３５位のアミノ酸アスパラギン酸が（例えば、スレオニン、アラニン、セリンもしくはグルタミン酸に）置換されている、アミノ酸２３〜２３５のような、ＴＮＦＲ２断片の誘導体を含む。さらなる実施形態では、ＴＮＦ−αアンタゴニストは、ＴＮＦＲ１（また、ｐ５５、ＴＮＦＲＳＦ１Ａとしても公知である）のアミノ末端の部分、例として、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０５６．１（配列番号６７２）に記載のＴＮＦＲ１の最初の２１１個のアミノ酸を含む。その他の実施形態では、ＴＮＦ−αアンタゴニストは、配列番号６７２のアミノ酸３１〜２１１を含む（すなわち、天然のリーダー配列を欠く）。
【００２０】
一態様では、本開示のＴＮＦ−αアンタゴニストまたはその融合タンパク質は、ＴＮＦ−αに対して特異性を示し、約１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍまたはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する親和性を示す。特定の実施形態では、ＴＮＦ−αアンタゴニストまたはその融合タンパク質は、約３００ｐＭ未満の親和性でＴＮＦ−αに結合する。別の尺度、すなわち、本明細書ではｋＯＦＦとも呼ぶ速度論的解離（ｋｄ）が、複合体の解離速度、したがって、本開示のポリペプチド結合ドメインが結合している標的分子の「滞留時間」の尺度となる。ｋｄ（ｋＯＦＦ）は、１／秒の単位を有する。本開示の例示的なＴＮＦ−αアンタゴニストは、約１０−４／秒（例えば、約１日）〜約１０−８／秒またはそれ未満のｋＯＦＦを有することができる。特定の実施形態では、ｋＯＦＦは、約１０−１／秒、約１０−２／秒、約１０−３／秒、約１０−４／秒、約１０−５／秒、約１０−６／秒、約１０−７／秒、約１０−８／秒、約１０−９／秒、約１０−１０／秒またはそれ未満の範囲に及ぶことができる（Ｇｒａｆｆら（２００４年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  １７巻：２９３頁を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示のＴＮＦ−αアンタゴニストまたはその融合タンパク質は、ＴＮＦ−αに結合する同族のＴＮＦＲと比較して、ＴＮＦ−αに、より高い親和性で結合し、より低いｋＯＦＦを有する。さらなる実施形態では、ＴＮＦ−αの二量体化またはその他の細胞表面活性を遮断するかまたは変化させる本開示のＴＮＦ−αアンタゴニストまたはその融合タンパク質は、同族のＴＮＦＲの親和性および二量体化速度と比較して、より中等度の親和性（すなわち、約１０−８Ｍ〜約１０−９ＭのＫｄ）、およびより中等度のｏｆｆ速度（すなわち、約１０−４／秒付近のｋＯＦＦ）を有する場合がある。
【００２１】
本開示の、ＴＮＦ−αアンタゴニストとして機能する例示的な結合ドメインを、本明細書の記載に従ってまたは当技術分野で公知の多様な方法（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号、第６，２９１，１５８号を参照されたい）によって生成することができる。供給源として、ヒト、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダもしくはラマに由来する；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６頁、およびＮｇｕｙｅｎら（１９９８年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７５巻：４１３頁）、サメ（Ｒｏｕｘら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５巻：１１８０４頁）、魚（Ｎｇｕｙｅｎら（２００２年）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５４巻：３９頁）、げっ歯類、トリ、ヒツジを含めた、種々の種に由来する抗体の遺伝子配列（これらは、ファージライブラリーなどにおいて、ｓｃＦｖもしくはＦａｂとしてフォーマットすることができる）、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、またはフィブリノーゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０巻：１３８８頁を参照されたい）、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照されたい）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４を参照されたい）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照されたい）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙおよびＧｒｅａｄｙ（２００５年）ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７２巻：６１７９頁）などの代替の非抗体骨格のループ領域に工学的に作製される（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）多様なアミノ酸をコードする配列などが挙げられる。さらに、好都合な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウスＴＭ、ＫＭ−マウス（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において、合成ＴＮＦ−αまたは単鎖のＴＮＦＲ外部ドメインを免疫原として使用する、ハイブリドーマを開発するための伝統的な戦略を使用して、本開示の結合ドメインを開発することもできる。
【００２２】
例示的な例では、断片のＦａｂファージライブラリー（例えば、Ｈｏｅｔら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３巻：３４４頁を参照されたい）を使用して、（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５８５．２に記載のアミノ酸配列もしくはその断片を使用した）合成もしくは組換えのＴＮＦ−αにかまたは単鎖のＴＮＦＲ外部ドメインに対する結合についてスクリーニングすることによって、ＴＮＦ−αまたは単鎖のＴＮＦＲ外部ドメインに対して特異性を示す、本開示のＴＮＦ−αアンタゴニストを同定することができる。本明細書に記載するまたは当技術分野で公知のＴＮＦ−αまたは単鎖のＴＮＦＲ外部ドメインを、そのようなスクリーニングのために使用することができる。特定の実施形態では、ＴＮＦ−αアンタゴニストを生成するために使用するＴＮＦ−αまたは単鎖のＴＮＦＲ外部ドメインは、本明細書に記載するように、介在ドメインまたは二量体化ドメイン、例として、免疫グロブリンＦｃドメインまたはその断片をさらに含むことができる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本開示のＴＮＦ−αアンタゴニストドメインは、本明細書に記載するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ヒト化またはヒトである。さらなる実施形態では、１つもしくは複数の軽鎖可変領域（ＶＬ）または１つもしくは複数の重鎖可変領域（ＶＨ）または両方のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または少なくとも１００％同一である配列を有し、各ＣＤＲが多くて３つのアミノ酸の変化を有する（すなわち、変化のうちの多くがフレームワーク領域にある）本開示のＴＮＦ−αアンタゴニストドメインを提供する。
【００２４】
２つ以上のポリペプチドまたは核酸分子の配列の文脈においては、用語「同一の」または「パーセント同一性」は、手作業の整列によるか、または目視検査による、配列比較アルゴリズムなどの当技術分野で公知の方法を使用して測定するとおり、比較ウィンドウまたは指定領域にわたる最大の一致について比較および整列を行う場合に、同じである２つ以上の配列もしくはサブ配列、または、特定の領域にわたり同じである、アミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセントを有する（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である）２つ以上の配列もしくはサブ配列を意味する。例えば、パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適した好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９頁、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３頁に記載されている。
【００２５】
これらまたは本明細書に記載するその他の実施形態のうちのいずれにおいても、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、いずれの配向にも配置することができ、本明細書に開示する約５個〜約３０個のアミノ酸のリンカーまたはこれら２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能をもたらすことができる任意のその他のアミノ酸配列によって分離することができる。特定の実施形態では、ＶＨドメインとＶＬドメインとをつなぐリンカーは、配列番号４９７〜６０４および７９１〜７９６に記載のアミノ酸配列、例として、リンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）を含む。多重特異性結合ドメインは、ラクダ抗体の構成に類似する少なくとも２つの特異的なサブ結合ドメイン、またはより従来型の哺乳動物抗体の対形成するＶＨ鎖およびＶＬ鎖の構成に類似する少なくとも４つの特異的なサブ結合ドメインを有する。
【００２６】
さらなる実施形態では、本開示のＴＮＦ−αアンタゴニストドメインおよびそれらの融合タンパク質は、１つもしくは複数の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）または１つもしくは複数のそのようなＣＤＲの複数コピーを含む結合ドメインを含むことができ、これらのＣＤＲは、抗ＴＮＦ−αもしくは抗ＴＮＦＲのｓｃＦｖ断片もしくはＦａｂ断片の可変領域からか、またはその重鎖もしくは軽鎖の可変領域から、入手、誘導または設計されている。
【００２７】
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＡｂＭによる定義、および接触による定義（ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）を含めた、当技術分野に種々の方法において定義されている。Ｋａｂａｔの定義は、配列の変動性に基づいており、ＣＤＲ領域を予測するために最も一般的に使用されている定義である（Ｊｏｈｎｓｏｎら（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８巻：２１４頁）。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造的なループ領域の位置に基づいている（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６巻：９０１頁；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２巻：８７７頁）。ＡｂＭによる定義は、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義との間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ製の抗体構造のモデル化についてのプログラムの一体形の組（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｓｕｉｔｅ）である（Ｍａｒｔｉｎら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６巻：９２６８頁；Ｒｅｅｓら、ＡＢＭＴＭ、ａ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，  Ｌｔｄ．）。接触による定義として公知の追加の定義は、より最近になって導入されたものであり（ＭａｃＣａｌｌｕｍら（１９９６年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：７３２頁を参照されたい）、これは、入手可能な複合体の結晶構造の解析に基づいている。
【００２８】
慣例により、重鎖のＣＤＲドメインを、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３と呼び、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かう順に順次に番号が付けられている。ＣＤＲ−Ｈ１は、約１０〜１２残基の長さであり、Ｃｈｏｔｈｉａの定義およびＡｂＭによる定義に従えば、Ｃｙｓの後の４残基目から始まるか、またはＫａｂａｔの定義に従えば、５残基後から始まる。Ｈ１には、Ｔｒｐ、Ｔｒｐ−Ｖａｌ、Ｔｒｐ−ＩｌｅまたはＴｒｐ−Ａｌａが続くことができる。Ｈ１の長さは、ＡｂＭによる定義に従えば、およそ１０〜１２残基であり、一方、Ｃｈｏｔｈｉａの定義では、最後の４残基が除外される。ＣＤＲ−Ｈ２は、Ｋａｂａｔの定義およびＡｂＭによる定義に従えば、Ｈ１の末端の後の１５残基目から始まり、これには、一般に配列Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（しかし、いくつかの変動が公知である）が先行し、一般に配列Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが続く。Ｋａｂａｔの定義に従えば、Ｈ２の長さは約１６〜１９残基であり、一方、ＡｂＭによる定義では、この長さは９〜１２残基であることが予測されている。ＣＤＲ−Ｈ３は通常、Ｈ２の末端の後の３３残基目から始まり、これには、一般に、アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇが先行し、アミノ酸Ｇｌｙが続き、ＣＤＲ−Ｈ３は、３〜約２５残基の範囲に及ぶ長さを有する。
【００２９】
慣例により、軽鎖のＣＤＲ領域を、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３と呼び、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かう順に順次に番号が付けられている。ＣＤＲ−Ｌ１は一般に、残基２４あたりから始まり、一般にＣｙｓに続く。ＣＤＲ−Ｌ１の後の残基は常にＴｒｐであり、これから、以下の配列のうちの１つが始まる：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、またはＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ。ＣＤＲ−Ｌ１の長さは、およそ１０〜１７残基である。ＣＤＲ−Ｌ２は、Ｌ１の末端の後の１６残基目あたりから始まり、一般に、残基Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−ＬｙｓまたはＩｌｅ−Ｐｈｅに続く。ＣＤＲ−Ｌ２は、約７残基の長さである。ＣＤＲ−Ｌ３は通常、Ｌ２の末端の後の３３残基目から始まり、一般にＣｙｓに続き、ＣＤＲ−Ｌ３には一般に配列Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙが続き、ＣＤＲ−Ｌ３は、約７〜１１残基の長さを有する。
【００３０】
したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＴＮＦ−αまたは抗ＴＮＦＲの可変領域に由来する単一のＣＤＲを含んでもよく、または同じであるかもしくは異なる場合がある複数のＣＤＲを含んでもよい。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含むＴＮＦ−αまたはＴＮＦＲに対して特異性を示すＶＨドメインとＶＬドメインとを含み、ここで、（ａ）ＶＨドメインは、重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｂ）ＶＬドメインは、軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｃ）結合ドメインは、（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列とを含むか；もしくは結合ドメインは、（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列とを含み、そして、ここで、ＶＨおよびＶＬは同じ参照配列に見出される。さらなる実施形態では、本開示の結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含むＴＮＦ−αまたはＴＮＦＲに対して特異性を示すＶＨドメインとＶＬドメインとを含み、ここで、（ａ）ＶＨドメインは、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｂ）ＶＬドメインは、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むか；または（ｃ）結合ドメインは、（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列とを含むか；もしくは結合ドメインは、（ａ）のＶＨアミノ酸配列と（ｂ）のＶＬアミノ酸配列とを含み、ここで、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は同じ参照配列に由来する。
【００３１】
特異的なＣＤＲを含む、本明細書に記載する実施形態のうちのいずれにおいても、結合ドメインは、（ｉ）ＶＨドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり、各ＣＤＲが多くて３つのアミノ酸の変化を有する（すなわち、変化のうちの多くがフレームワーク領域にある）アミノ酸配列を有するＶＨドメイン；または（ｉｉ）ＶＬドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり、各ＣＤＲが多くて３つのアミノ酸の変化を有する（すなわち、変化のうちの多くがフレームワーク領域にある）アミノ酸配列を有するＶＬドメイン；または（ｉｉｉ）（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方；もしくはＶＨおよびＶＬが同じ参照配列に由来する、（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方を含むことができる。
【００３２】
本開示の融合タンパク質のＴＮＦ−αアンタゴニストドメインは、免疫グロブリン骨格などの免疫グロブリン様ドメインであってよい。本開示が意図する免疫グロブリン骨格として、これらに限定されないが、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体または重鎖のみの抗体が挙げられる。ｓｃＦｖの場合、本開示は、結合性分子におけるドメインまたは領域の被連結部分に適合することが当技術分野で公知である任意のリンカーペプチドによって、重鎖および軽鎖の可変領域がつながっていることを意図する。例示的なリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーモチーフに基づくリンカー、例として、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ［式中、ｎ＝１〜５］である。本開示の融合タンパク質の結合ドメインが、非ヒト免疫グロブリンに基づくか、または非ヒト免疫グロブリンＣＤＲを含む場合、結合ドメインは、当技術分野で公知の方法に従って「ヒト化」することができる。
【００３３】
あるいは、本開示の融合タンパク質のＴＮＦ−αアンタゴニストドメインは、免疫グロブリン骨格以外の骨格であってもよい。本開示が意図するその他の骨格として、機能性の立体構造をとるＴＮＦ−α特異的ＣＤＲ（複数可）を提示する。その他の意図する骨格として、これらに限定されないが、Ａドメイン分子、フィブロネクチンＩＩＩドメイン、アンチカリン、アンキリンリピートから工学的に作製された結合性分子、アドネクチン、クニッツドメイン、またはプロテインＡのＺドメインのａｆｆｉｂｏｄｙが挙げられる。
ＩＬ６アンタゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＩＬ６アンタゴニストである（例えば、優先的に、ＩＬ６トランス−シグナル伝達を阻害するか、またはＩＬ６シス−およびトランス−シグナル伝達の両方を阻害する）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、本開示は、以下の特性の１つまたは複数を有するＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に対して特異的な結合領域または結合ドメインを含有する、多重特異的融合タンパク質を提供する：（１）ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒα単独と比較してＩＬ６ｘＲ複合体に対して同等以上の親和性を有する、またはＩＬ６単独と比較してＩＬ６Ｒα単独もしくはＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体により大きな親和性を有する、（２）ｓＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体との結合について膜ｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体への可溶性ｇｐ１３０結合を増強する、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する、あるいは（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。特定の好ましい実施形態では、本開示によるＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に対して特異的な結合ドメインは、以下の特性を有する：（１）ＩＬ６単独と比較してＩＬ６Ｒα単独またはＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体とのより大きな親和性、（２）ｓＩＬ６ｘＲ複合体への可溶性ｇｐ１３０結合性を増強する、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する、および（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。例えば、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に特異的な結合領域または結合ドメインは、免疫グロブリンの可変結合ドメインまたはその誘導体、例えば抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどであることができる。この開示との関連で、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体に特異的な結合領域または結合ドメインは、本明細書に記載のｇｐ１３０でないことを理解すべきである。
【００３４】
本明細書で用いるように、「ＩＬ６ｘＲ複合体」または「ＩＬ６ｘＲ」は、ＩＬ６受容体とのＩＬ６の複合体を指し、そこにおいて、ＩＬ６受容体（例えばＩＬ６Ｒα、ＩＬ６ＲＡ、ＩＬ６Ｒ１およびＣＤ１２６としても公知である）は膜タンパク質（本明細書でｍＩＬ６ＲまたはｍＩＬ６Ｒαと称する）または可溶性の形態（本明細書でｓＩＬ６ＲまたはｓＩＬ６Ｒαと称する）である。用語「ＩＬ６Ｒ」は、ｍＩＬ６ＲαおよびｓＩＬ６Ｒαの両方を包含する。一実施形態では、ＩＬ６ｘＲは、ＩＬ６およびｍＩＬ６Ｒαの複合体を含む。特定の実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体は、１つまたは複数の共有結合を通して一緒に保持される。例えば、ＩＬ６Ｒのカルボキシ末端は、当技術分野でハイパーＩＬ６として公知である、ペプチドリンカーを通してＩＬ６のアミノ末端に融合させることができる（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒら（１９９７年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５巻：１４２頁を参照されたい）。ハイパーＩＬ６リンカーは、架橋化合物、１〜５０個のアミノ酸配列、またはその組合せで構成することができる。ハイパーＩＬ６は、追加の単数または複数のペプチドタグ（例えば、ＡｖｉＦｌａｇＨｉｓ）をさらに含むことができるか、または二量体化ドメイン、例えば免疫グロブリンＦｃドメインもしくは免疫グロブリン定常ドメインサブ領域をさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体は、非共有結合的相互作用を通して、例えば水素結合、静電的相互作用、ファンデルワールス力、塩橋、疎水性相互作用など、またはそれらの任意の組合せによって一緒に保持される。例えば、ＩＬ６およびＩＬ６Ｒは、非共有結合で自然に結合することができ（例えば、天然に見られるように、または合成もしくは組換えタンパク質として）、または各々は、複合体の安定性をさらに高めるために、免疫グロブリンＦｃドメインなどの多量体化を促進するドメインに融合させることができる。
【００３５】
本明細書で用いるように、「ｇｐ１３０」は、ＩＬ６ｘＲ複合体に結合するシグナル伝達タンパク質を指す。ｇｐ１３０タンパク質は、膜形態（ｍｇｐ１３０）、可溶性形態（ｓｇｐ１３０）またはそれらの任意の他の機能的形態であることができる。例示的なｇｐ１３０タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１７５．２に記載の配列またはその任意の可溶性もしくは誘導体の形態を有する（例えば、Ｎａｒａｚａｋｉら（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ  ８２巻：１１２０頁またはＤｉａｍａｎｔら（１９９７年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１２巻：３７９頁を参照されたい）。例示のために、そして理論によって縛られることを望まないが、ｍｇｐ１３０タンパク質は、ＩＬ６／ｍＩＬＲまたはＩＬ６／ｓＩＬＲ複合体に結合することができるが、ｓｇｐ１３０は主にＩＬ６／ｓＩＬＲ複合体に結合する（Ｓｃｈｅｌｌｅｒら（２００６年）Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６３巻：３２１頁を参照されたい）。したがって、本開示の結合ドメイン、またはその融合タンパク質の特定の実施形態は、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独よりも高い親和性でＩＬ６ｘＲに結合することによって、および好ましくは、ｓＩＬ６ｘＲ複合体がｍｇｐ１３０に結合するのと競合することによって、ＩＬ６ｘＲ複合体のトランス−シグナル伝達を阻害することができる。本開示の結合ドメインは、（１）結合ドメインまたはその融合タンパク質が、ｓＩＬ６ｘＲへのｇｐ１３０の結合を阻止し、そして結合ドメインが、ｓＩＬ６ｘＲとのｇｐ１３０の結合と比較して同等以上の親和性でｓＩＬ６ｘＲに結合するか、あるいは、（２）結合ドメインまたはその融合タンパク質が、ｓＩＬ６ｘＲへのｓｇｐ１３０の結合を強化または促進し、それによってｍｇｐ１３０への結合のためにｓＩＬ６ｘＲ複合体が利用可能である時間を減少させる場合に、ｇｐ１３０がｓＩＬ６ｘＲへ結合するのと「競合する」。
【００３６】
一態様では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、ＩＬ６Ｒα単独に対するよりも少なくとも２倍〜１０００倍高いＩＬ６またはＩＬ６ｘＲ複合体との親和性を有するか、あるいは、ＩＬ６単独に対するよりも少なくとも２倍〜１０００倍高いＩＬ６ＲαまたはＩＬ６ｘＲ複合体との親和性を有する。ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲ複合体に結合することによって、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、ＩＬ６シス−およびトランス−シグナル伝達を優先的に阻害する。特定の実施形態では、ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはｓＩＬ６ｘＲ複合体に対する結合ドメインの親和性は、ＩＬ６ｘＲ複合体に対するｇｐ１３０の親和性とほぼ同じであり、ここで「ほぼ同じ」は、同等のまたは最大で約２倍までの高い親和性を意味する。特定の実施形態では、ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲ複合体に対する結合ドメインの親和性は、ＩＬ６ｘＲ複合体に対するｇｐ１３０の親和性より少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、１０００倍またはそれを超えて高い。例えば、ＩＬ６ｘＲ複合体に対するｇｐ１３０の親和性が約２ｎＭ（例えば、Ｇａｉｌｌａｒｄら（１９９９年）Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．  １０巻：３３７頁を参照されたい）である場合、ＩＬ６ｘＲ複合体に対して少なくとも１０倍高い親和性を有する結合ドメインは約０．２ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有するであろう。
【００３７】
さらなる実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、（ａ）ｓＩＬ６ｘＲ複合体に、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独に対するより少なくとも２倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍〜１００倍、１００倍〜１０００倍高い親和性で結合し、（ｂ）ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について膜ｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体への可溶性ｇｐ１３０の結合を増強する、ポリペプチド配列を含む。さらなる実施形態では、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独に対するより少なくとも２倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍〜１００倍、１００倍〜１０００倍高い親和性で結合する本開示のポリペプチド結合ドメインは、（ｉ）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達をより顕著にまたは優先的に阻害すること、（ｉｉ）ＩＬ６以外のｇｐ１３０サイトカインファミリーメンバーのシグナル伝達を阻害しないこと、（ｉｉｉ）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害し、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を検出可能に阻害しないこともでき、（ｉｖ）これらの特性の２つ以上を有することができ、または（ｖ）これらの特性の全てを有することができる。
【００３８】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、ｓＩＬ６ｘＲ複合体に、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独に対するより少なくとも２倍〜１０００倍高い親和性で結合し、ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達をより顕著にまたは優先的に阻害する。「ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する」ことは、ｓＩＬ６ｘＲ活性は測定可能に低減されるが、ＩＬ６シス−シグナル伝達の減少は、実質的に変更されない程度にトランス−シグナル伝達を変化させることを指す（すなわち、阻害が最小限であるか、存在しないかまたは測定不能であることを意味する）。例えば、ｓＩＬ６ｘＲ活性（例えば、ＨｅｐＧ２細胞でのアンチキモトリプシン（ＡＣＴ）の急性相発現）のバイオマーカーを測定して、トランス−シグナル伝達阻害を検出することができる。代表的なアッセイは、Ｊｏｓｔｏｃｋら（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００１年）によって記載されている。簡潔には、ＨｅｐＧ２細胞を、ｓＩＬ６ｘＲ（トランス−シグナル伝達）またはＩＬ６（シス−シグナル伝達）の存在下で刺激してＡＣＴを過剰発現させることができるが、ｓｐｇ１３０を加えることは、ＩＬ６によって誘導される発現に実質的に影響せずに、ｓＩＬ６ｘＲによって誘導されるＡＣＴの過剰発現を阻害する。同様に、ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害する本開示のポリペプチド結合ドメインは、ｓＩＬ６ｘＲによって誘導されるＡＣＴの過剰発現を阻害する（すなわち、トランス−シグナル伝達を阻害する）が、ＩＬ６によって誘導される発現に実質的に影響しない（すなわち、シス−シグナル伝達を測定可能に減少させない）。このアッセイおよび当技術分野で公知である他のアッセイを用いて、ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達の優先的阻害を測定することができる（例えば、Ｓｐｏｒｒｉら（１９９９年）Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１巻：１０５３頁、Ｍｉｈａｒａら（１９９５年）Ｂｒ．  Ｊ．  Ｒｈｅｕｍ．  ３４巻：３２１頁、Ｃｈｅｎら（２００４年）Ｉｍｍｕｎ．  ２０巻：５９頁に記載の他のバイオマーカーを参照されたい）。
【００３９】
さらなる実施形態では、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインによるシグナル伝達は、本開示の結合ドメインポリペプチドまたはその多重特異性融合タンパク質によって実質的に阻害されない。例えば、ｇｐ１３０を経るＩＬ６ｘＲ複合体によるシス−およびトランス−シグナル伝達は阻害されるが、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、線毛神経向性因子（ＣＮＴＦ）、神経ポイエチン（ＮＰＮ）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＩＬ−１１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）またはそれらの任意の組合せを経るシグナル伝達など、１つまたは複数の他のｇｐ１３０ファミリーサイトカインによるシグナル伝達は、最小限に影響されるかまたは影響を受けない。
【００４０】
本開示の結合ドメインの好ましいｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、数日間または数週間のオーダーであるが、ＩＬ６およびｓＩＬ６の生成は疾患状態で非常に上昇することがあるので、結合ドメイン濃度は低くてもよいが、標的は豊富であることができることを、当業者は理解しよう（例えば、Ｌｕら（１９９３年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ５巻：５７８頁を参照されたい）。したがって、特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、約１０−５／秒（例えば、約１日）以下のｋＯＦＦを有する。特定の実施形態では、ｋＯＦＦは、約１０−１／秒から、約１０−２／秒、約１０−３／秒、約１０−４／秒、約１０−５／秒、約１０−６／秒、約１０−７／秒、約１０−８／秒、約１０−９／秒、約１０−１０／秒、またはそれ未満の範囲であってもよい。
【００４１】
例示的な実施例では、ＩＬ６またはＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な本開示の結合ドメインは、合成ＩＬ６ｘＲ複合体への結合についてスクリーニングすることによって、Ｆａｂファージの断片ライブラリーで同定された（Ｈｏｅｔら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３巻：３４４頁を参照されたい）。このスクリーニングのために用いられる合成ＩＬ６ｘＲ複合体は、Ｎ−ＩＬ６Ｒα（ｆｒａｇ）−Ｌ１−ＩＬ６（ｆｒａｇ）−Ｌ２−ＩＤ−Ｃの構造を含み、式中、Ｎはアミノ末端であり、Ｃはカルボキシ末端であり、ＩＬ６Ｒα（ｆｒａｇ）は完全長ＩＬ６Ｒαの断片であり、ＩＬ６（ｆｒａｇ）はＩＬ６の断片であり、Ｌ１およびＬ２はリンカーであり、ＩＤは免疫グロブリンＦｃドメインなどの介在ドメインまたは二量体化ドメインである。
【００４２】
より具体的には、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインを同定するために用いられるＩＬ６ｘＲ（ハイパーＩＬ６の形態）は、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の通りの構造を有する：（ａ）完全長タンパク質の最初の１１０個のアミノ酸および、カルボキシ末端部分（用いるアイソフォームに依存する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５５６．１、アイソフォーム１またはＮＰ＿８５２００４．１、アイソフォーム２を参照されたい））を欠くＩＬ６Ｒαからの２１２個のアミノ酸の中央断片を、（２）Ｇ３Ｓのリンカーに融合し、次にそれを、（３）ＩＬ６の１７５個のアミノ酸のカルボキシ末端断片（すなわち、完全長タンパク質ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５９１．１の最初の２７個のアミノ酸を欠く）に融合し、次にそれを、（４）配列番号５８９に記載のＩｇＧ２Ａヒンジであるリンカーに融合し、それを最後に、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃドメインからなる二量体化ドメインに融合する。特定の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインからなる二量体化ドメインは、以下のアミノ酸の１つまたは複数が変異している（すなわち、その位置に異なるアミノ酸を有する）：位置２３４のロイシン（Ｌ２３４）、位置２３５のロイシン（Ｌ２３５）、位置２３７のグリシン（Ｇ２３７）、位置３１８のグルタミン酸（Ｅ３１８）、位置３２０のリシン（Ｋ３２０）、位置３２２のリシン（Ｋ３２２）、またはそれらの任意の組合せ（ＥＵによる番号付け）。例えば、これらのアミノ酸のいずれか１つを、アラニンに変換することができる。さらなる実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２（ＥＵ番号付けによる）の各々がアラニンに変異している（すなわち、それぞれＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ）。
【００４３】
一実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインを同定するために用いられるＩＬ６ｘＲ複合体は、配列番号６０６に記載のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインを含むポリペプチドであって、ＩＬ６ｘＲがｓＩＬ６ｘＲであり、配列番号６０６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが提供される。さらなる実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインを含むポリペプチドは、（１）ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒα単独に対する親和性と比較してＩＬ６ｘＲ複合体に対して同等以上の親和性を有する、またはＩＬ６単独に対する親和性と比較してＩＬ６Ｒα単独もしくはＩＬ６ｘＲ複合体に対してより大きな親和性を有するか、（２）ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について膜ｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体への可溶性ｇｐ１３０の結合を増強するか、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害するか、あるいは、（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しないか、（５）特性（１）〜（４）の任意の組合せを有するか、あるいは（６）（１）〜（４）の特性の全てを有する。本開示の結合ドメインを同定するために用いることができるか、または前記結合特性のいずれかを測定するための参照複合体として用いることができる他の例示的なＩＬ６ｘＲ複合体が、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１７２４５８号、第２００７／００３１３７６号、および米国特許第７，１９８，７８１号、第５，９１９，７６３号に記載されている。
【００４４】
一部の実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、本明細書に記載のＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲ複合体、好ましくはヒトＩＬ６、ヒトＩＬ６ＲまたはヒトＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）のもの、ヒト化されたものまたはヒトのものである。ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲに特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例を、それぞれ配列番号４３５〜４９６および３７３〜４３４に記載する。さらなる実施形態では、ＩＬ６またはＩＬ６Ｒα単独と比較して同等以上の親和性でＩＬ６ｘＲに結合し、そしてｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について膜ｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体への可溶性ｇｐ１３０の結合を増強する、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なポリペプチド結合ドメインが提供され、そこにおいて、それぞれ配列番号３７３〜４３４および４３５〜４９６に記載のように、結合ドメインは、１つまたは複数の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列に、または１つまたは複数の重鎖可変領域（ＶＨ）に、またはその両方に、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、各ＣＤＲは、最大で３つのアミノ酸変化を有する（すなわち、変化の多くはフレームワーク領域内にある）。
【００４５】
さらなる実施形態では、本開示の結合ドメインは、それぞれ配列番号４３５〜４９６および３７３〜４３４に記載の、ＩＬ６ｘＲに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含み、それらは、そのようなＶＨドメイン、ＶＬドメイン、または両方のアミノ酸配列に少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であり、各ＣＤＲは、多くとも０〜３個のアミノ酸変化を有する。例えば、本開示のＶＨドメイン、ＶＬドメインまたは両方のアミノ酸配列は、結合ドメインＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２（配列番号６０８）を含む例示的なＸｃｅｐｔｏｒ分子からの、それぞれＶＨドメイン（例えば、アミノ酸５１２〜６３１）、ＶＬドメイン（例えば、アミノ酸６４９〜７５８）、または両方のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であることができ、そこにおいて、各ＣＤＲは、多くとも０〜３個のアミノ酸変化を有する。
【００４６】
本明細書に記載のこれらのまたは他の実施形態のいずれかでは、ＶＬおよびＶＨドメインは、いずれの向きにも配置することができ、本明細書に開示される最大で約１０個のアミノ酸リンカーで、または２個のサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供することができる他の任意のアミノ酸配列で分離されてもよい。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインを結合するリンカーは、リンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）のように、配列番号４９７〜６０４および７９１〜７９６に記載のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
さらなる実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、抗ＩＬ６、抗ＩＬ６Ｒまたは抗ＩＬ６ｘＲ複合体のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片の可変領域から、あるいはその重鎖または軽鎖可変領域から得られたか、誘導されたかまたは設計された、１つまたは複数の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、または１つまたは複数のそのようなＣＤＲの複数のコピーを含むことができる。したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＩＬ６、抗ＩＬ６Ｒまたは抗ＩＬ６ｘＲの可変領域からの単一のＣＤＲ３を含むことができ、またはそれは、同じであってもまたは異なってもよい複数のＣＤＲを含むことができる。特定の実施形態では、本開示のＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むＶＨおよびＶＬドメインを含み、そこにおいて、（ａ）ＶＨドメインは、配列番号４３５〜４９６のいずれか１つで見られる重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｂ）ＶＬドメインは、配列番号３７３〜４３４のいずれか１つで見られる軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｃ）結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、または結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、そこにおいて、ＶＨおよびＶＬは同じ参照配列で見られる。さらなる実施形態では、本開示の結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むＩＬ６ｘＲ複合体に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含み、そこにおいて、（ａ）ＶＨドメインは、配列番号４３５〜４９６のいずれか１つで見られる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｂ）ＶＬドメインは、配列番号３７３〜４３４のいずれか１つで見られる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｃ）結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、または結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、そこにおいて、ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は同じ参照配列に由来する。ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲに対して指向する例示的な軽鎖および重鎖可変ドメインのＣＤＲを、それぞれ配列番号１〜１８７および７８７〜７９２、ならびに配列番号１８７〜３７１および７９３〜７９８で提供する。
【００４８】
ＩＬ６アンタゴニスト軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４で、ＩＬ６アンタゴニスト重鎖可変領域を配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０で提供する。
【００４９】
ＩＬ６、ＩＬ６ＲまたはＩＬ６ｘＲに対する特異的ＣＤＲを含む本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、結合ドメインは、（ｉ）配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のいずれか１つで見られるＶＨドメインのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、または（ｉｉ）配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つで見られるＶＬドメインのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、または（ｉｉｉ）（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方、またはＶＨおよびＶＬが同じ参照配列に由来する、（ｉ）のＶＨドメインおよび（ｉｉ）のＶＬドメインの両方を含むことができる。
【００５０】
特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、免疫グロブリン骨格などの免疫グロブリン様ドメインであってもよい。本開示で意図される免疫グロブリン骨格には、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ドメイン抗体または重鎖のみの抗体が含まれる。さらなる実施形態では、抗ＩＬ６もしくは抗ＩＬ６ｘＲ抗体（例えば、マウスまたはラットなどのヒト以外、キメラ、ヒト化、ヒトの抗体）、またはそれぞれ配列番号４３５〜４９６および８０５〜８０１、ならびに３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つに記載のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＦａｂ断片もしくはｓｃＦｖ断片が提供され、それらは以下の特性の１つまたは複数を有することもできる：（１）ＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒα単独に対する親和性と比較してＩＬ６ｘＲ複合体に対して同等以上の親和性を有する、またはＩＬ６単独に対する親和性と比較してＩＬ６Ｒα単独もしくはＩＬ６ｘＲ複合体に対してより大きな親和性を有するか、（２）ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合について膜ｇｐ１３０と競合するか、またはｓＩＬ６ｘＲ複合体への可溶性ｇｐ１３０結合を増強するか、（３）ＩＬ６シス−シグナル伝達よりもＩＬ６トランス−シグナル伝達を優先的に阻害するか、あるいは（４）ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。そのような抗体、ＦａｂまたはｓｃＦｖは、本明細書に記載の方法のいずれかで用いることができる。特定の実施形態では、本開示は、ＩＬ６アンタゴニスト（すなわち、ＩＬ６シス−およびトランス−シグナル伝達を阻害することができる）である結合ドメインを含むポリペプチドを提供する。さらなる実施形態では、本開示によるＩＬ６アンタゴニストは、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーのサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。例示的なＩＬ６アンタゴニストには、ＩＬ６またはＩＬ６ｘＲに特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインまたはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）が含まれる。
【００５１】
あるいは、本開示の結合ドメインは、免疫グロブリン以外の骨格の一部であってもよい。意図される他の骨格には、Ａドメイン分子、フィブロネクチンＩＩＩドメイン、アンチカリン、アンキリンリピートを工作された結合分子、アドネクチン、クニッツドメインまたはプロテインＡのＺドメインのアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）が含まれる。
ＲＡＮＫＬアンタゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＲＡＮＫＬアンタゴニストである（すなわち、ＲＡＮＫシグナル伝達を阻害することができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＲＡＮＫＬアンタゴニストには、ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫに特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＯＰＧ外部ドメインもしくはその断片が含まれる。
【００５２】
オステオプロテグリン（ＯＰＧ、ＯＣＩＦとしても公知である）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＯＰＧは、２１個のアミノ酸残基シグナルペプチドを有する前駆体タンパク質として最初に発現される、分泌される、可溶性タンパク質である。そのタンパク質のアミノ末端半分は４つのシステインに富むリピートを含み、それはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの特徴である。そのタンパク質のカルボキシ末端部分は、２つのデスドメイン（ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）相同領域を含む。ＯＰＧは、骨芽細胞、および心臓、腎臓、肝臓、脾臓および骨髄を含む組織で発現される（例えば、ＢｏｙｃｅおよびＸｉｎｇ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．（２００７年）９巻（補遺１）：Ｓ１頁を参照されたい）。ＯＰＧに対するリガンドは、ＲＡＮＫＬおよびＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連のアポトーシス誘導リガンド）である。
【００５３】
ＯＰＧ／ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ系は、破骨細胞の形成に関与する。破骨細胞は骨吸収細胞であり、それは骨再形成および骨格の健全性のために重要である。ＲＡＮＫＬは、下流のシグナル伝達を引き起こすＲＡＮＫに結合する。活性化ＲＡＮＫは、次にＮＦ−κＢの活性化をもたらすＴＲＡＦ（腫瘍壊死因子受容体関連因子）に結合する。ＮＦ−κＢキナーゼ／ＮＦ−κＢ、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ／アクチベータタンパク質１、ｃ−ｍｙｃ、カルシニューリン／活性化Ｔ細胞の核性因子、ｓｒｃ、ＭＫＫ６／ｐ３８／ＭＩＴＦおよび細胞外シグナル関連キナーゼの阻害を含む、ＲＡＮＫ媒介シグナル伝達によって、７つの経路が活性化される。Ｇｒｂ−２関連結合タンパク質２もＲＡＮＫに結合して、シグナル伝達を媒介する。ＯＰＧは、ＲＡＮＫＬに結合して、ＲＡＮＫＬがＲＡＮＫと結合することを阻止することによって機能する。したがって、ＯＰＧは骨吸収の負の調節因子である。
【００５４】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、ヒトのものである。ＲＡＮＫＬに特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、米国特許第６，７４０，５２２号に開示のものが含まれる。
【００５５】
特定の実施形態では、ＲＡＮＫＬアンタゴニストは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２５３７．３（配列番号７３７）に記載のアミノ酸配列を有するＯＰＧタンパク質（ＴＲ１またはＯＣＩＦとしても公知である）、またはＲＡＮＫＬアンタゴニストとして機能し続けるその任意の断片を含む。他の実施形態では、ＲＡＮＫＬアンタゴニストは、配列番号７３７のアミノ酸２２〜４０１を含む（すなわち、天然の２１個のアミノ酸のリーダー配列を欠く）。さらなる実施形態では、ＲＡＮＫＬに特異的なポリペプチド結合ドメインが提供され、そこにおいて、結合ドメインは、配列番号７３７のアミノ酸配列、または配列番号７３７のアミノ酸２２〜４０１に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記ポリペプチド結合ドメインはＲＡＮＫＬに結合して、その活性を阻害する。
ＩＬ７アンタゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＩＬ７アンタゴニストである（すなわち、ＩＬ７Ｒαシグナル伝達を阻害することができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＩＬ７アンタゴニストには、ＩＬ７に特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＩＬ７Ｒα外部ドメインもしくはその断片が含まれる。
【００５６】
インターロイキン７（ＩＬ７）は、インターロイキン７受容体（ＩＬ７Ｒ）に結合する、リンパ器官のＴ細胞ゾーンの線維芽細胞細網細胞によって生成されるサイトカインである（Ｐａｌｍｅｒら（２００８年）Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎ．  ５巻：７９頁）。ＩＬ７は、Ｂ前駆細胞、胸腺細胞、Ｔ細胞前駆体および成熟ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激する。一般に、ＩＬ７は生存促進および増殖能力において機能し、樹状細胞で免疫調節的な役割を果たす。ＩＬ７系によって活性化される主要なシグナル伝達カスケードには、Ｊａｋ−ＳｔａｔおよびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路が含まれる。ＩＬ７ＲへのＩＬ７の結合は、受容体に結合したＪａｋキナーゼのトランスリン酸化を刺激する。活性化Ｊａｋキナーゼは受容体のチロシン残基をリン酸化し、生じたホスホチロシンは、Ｓｔａｔファミリーの転写因子を含む、ＳＨ２ドメインタンパク質に対するドッキング部位の役目を果たす。Ｊａｋキナーゼは、リン酸化を通して動員されたＳｔａｔタンパク質を次に活性化する。
【００５７】
ＩＬ７Ｒは、２つの別々のポリペプチド、ＩＬ７Ｒアルファ鎖（ＩＬ７Ｒα）および共通のガンマ鎖（ＩＬ７Ｒγｃ）で構成される。両タンパク質は、ヘマトポイエチンスーパーファミリーのメンバーである（Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅら（２００３年）Ｐｒｏｔ．  Ｅｘｐ．  Ｐｕｒ．  ３０巻：１５６頁）。ＩＬ７Ｒαは、Ｂ細胞、胸腺細胞、Ｔ細胞前駆体、成熟ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、樹状細胞および単球で発現される。それは、２０個のアミノ酸のシグナル配列、２１９個のアミノ酸の細胞外リガンド結合ドメイン、２５個のアミノ酸の膜貫通ドメインおよび１９５個のアミノ酸の細胞質ドメインを含む、４５９個のアミノ酸の前駆タンパク質として発現される。
【００５８】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＩＬ７に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインはヒトのものである。ＩＬ７に特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、例えば米国特許第５，７１４，５８５号に開示のものが含まれる。特定の実施形態では、ＩＬ７アンタゴニストは、ＩＬ７Ｒαの細胞外ドメイン（「外部ドメイン」）であることができる。本明細書で用いるように、ＩＬ７Ｒα外部ドメインとは、ＩＬ７Ｒα、可溶性ＩＬ７Ｒα、ＩＬ７Ｒαフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｏｎ）ＩＩ型ドメインまたはそれらの任意の組合せの細胞外の部分を指す。特定の実施形態では、ＩＬ７アンタゴニストは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１７６．２（配列番号７３８）に記載のＩＬ７Ｒαの最初の２４０個のアミノ酸などの、ＩＬ７Ｒαのアミノ末端部分、またはＩＬ７アンタゴニストとして機能し続けるその任意の断片を含む。他の実施形態では、ＩＬ７アンタゴニストは、配列番号７３８のアミノ酸２１〜２４０または１２０〜２３０を含む（すなわち、それぞれ天然のリーダー配列およびフィブロネクチンＩＩ型ドメインを欠く）。さらなる実施形態では、ＩＬ７に特異的なポリペプチド結合ドメインが提供され、そこにおいて、結合ドメインは、配列番号７３８のアミノ酸配列、または配列番号７３８のアミノ酸２１〜２４０または１２０〜１３０に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記ポリペプチド結合ドメインはＩＬ７に結合して、その活性を阻害する。
ＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニストである（すなわち、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＣまたはＩＬ１７ＲＡ／Ｃシグナル伝達を阻害することができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニストには、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７ＦまたはＩＬ１７Ａ／Ｆに特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＣもしくはＩＬ１７ＲＡ／Ｃ外部ドメインもしくはその断片が含まれる。
【００５９】
サイトカインのインターロイキン１７ファミリーは、Ｔｈ１７と呼ばれるヘルパーＴ細胞の異なる亜集団によって生成される。同定された６つのＩＬ１７サイトカイン（ＩＬ１７Ａ〜ＩＬ１７Ｆ）および５つの受容体（ＩＬ１７ＲＡ〜ＩＬ１７ＲＥ）がある（ＫｏｌｌｓおよびＬｉｎｄｅｎ、２００４年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２１巻：４６７頁）。ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆは約５５％の相同性を共有し、類似した生物学的機能を有するが、ＩＬ１７Ａの活性はＩＬ１７Ｆのそれらより少なくとも１０倍強力であると考えられている。ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆの両方はホモダイマーを形成し、最近の研究は、ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆが中間のシグナル伝達効力を有するヘテロダイマーも形成することを示している（Ｗｒｉｇｈｔら（２００７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２巻：１３４４７頁、Ｃｈａｎｇら（２００７年）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １７巻：４３５頁）。ＩＬ１７Ａ／ＩＬ１７Ｆヘテロダイマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでこのサイトカインの優勢な形態であり得る（ＳｈｅｎおよびＧａｆｆｅｎ（２００８年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４１巻：９１頁）。
【００６０】
インターロイキン１７Ａ（ＩＬ１７Ａ；当初、ＩＬ１７として公知である；ＣＴＬＡ８としても公知である）は、強力なサイトカインである。その受容体ＩＬ１７ＲＡへのＩＬ１７Ａの結合は、マクロファージからの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１β（ＩＬ１β）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を含む、様々な炎症性分子の分泌を刺激する（Ｊｏｖａｎｏｖｉｃら（１９９８年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０巻：３５１３頁）。ＩＬ６は最も早く定義されたＩＬ１７Ａ遺伝子標的の１つで、ＩＬ１７Ａ活性の標準のバイオアッセイとして用いられる。ＩＬ１７Ａは、ＩＬ１β、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ２２を含む他のサイトカインと相乗的にＩＬ６を活性化することが示されたが、相乗効果の根底にある機構はよく理解されていない（例えば、Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎら（１９９８年）Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １１１巻：６４５頁を参照されたい）。
【００６１】
インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ１７Ｆ；ＭＬ−１としても公知である）は、ＩＬ１７Ａと同様にジスルフィド結合しているホモダイマーを形成する、１７ｋＤの分泌タンパク質である。ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆは類似した生物学的機能を有するが、ＩＬ１７Ａの活性はＩＬ１７Ｆのそれらよりも強力であると考えられている。最近の研究は、ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆは、また、中間のシグナル伝達効力を有するヘテロダイマーを形成することを示している（Ｗｒｉｇｈｔら（２００７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２巻：１３４４７〜５５頁、Ｃｈａｎｇら（２００７年）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １７巻：４３５頁）。ＩＬ１７Ａ／ＩＬ１７Ｆヘテロダイマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでこのサイトカインの優勢な形態であり得ることが示唆されている（Ｓｈｅｎ  ＆  Ｇａｆｆｅｎ（２００８年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４１巻：９１頁）。ＩＬ１７Ａのように、ＩＬ１７Ｆは主に活性化Ｔ細胞によって発現されるが、ＩＬ１７Ｆは、活性化単球、活性化好塩基球および肥満細胞によって発現されることも示されている（Ｋａｗａｇｕｃｈｉら（２００２年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７巻：４４３０頁）。
【００６２】
受容体ＩＬ１７ＲＡは約０．５ｎＭの親和性でＩＬ１７Ａに結合することがわかっている遍在性のＩ型膜糖タンパク質である（Ｙａｏら（１９９５年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３巻：８１１頁）。ＩＬ１７ＲＣはヒトＩＬ１７Ｆのコグネイト受容体であるが、しかしＩＬ１７ＲＣはＩＬ１７Ａにも高い親和性で結合する（Ｋｅｕｓｔｎｅｒら（２００７年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７９巻：５４６２頁）。しかしながら、ＩＬ１７ＲＡ欠乏およびＩＬ１７ＲＡ抗体中和がＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆの両方の機能を消失させることが観察され、ＩＬ１７ＲＡの非存在下では、ＩＬ１７ＲＣ単独でＩＬ１７ＡまたはＩＬ１７Ｆシグナルを送達することができないことが示唆された（Ｔｏｙら（２００６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７巻：３６頁、ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒら（２００５年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７５巻：４０４頁）。さらに、ＩＬ１７ＲＡが不足しているマウスでのＩＬ１７ＲＣの強制発現は、ＩＬ１７ＡまたはＩＬ１７Ｆ機能を回復しない（Ｔｏｙら、２００６年）。
【００６３】
構造的に、ＩＬ１７ＲＡの細胞外ドメインは、柔軟なリンカーによって連結される２つのフィブロネクチンＩＩＩ様（ＦＮ）ドメイン（ＦＮ１（残基６９〜１８３）およびＦＮ２（残基２０５〜２８２））を含む。ＦＮドメインはＩ型サイトカイン受容体で通常見出され、そこにおいて、それらはタンパク質間相互作用およびリガンド結合を媒介する。Ｋｒａｍｅｒらは、完全にＦＮ２に位置するプレリガンドアセンブリドメイン（ＰＬＡＤ）を同定し、ＦＮ２リンカーがＩＬ１７Ａ結合部位をコードすることを確認した（Ｋｒａｍｅｒら（２００７年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７９巻：６３７９頁）。さらに、ＳＥＦＩＲドメインは、ＩＬ１７ＲＡ配列のアミノ酸３７８〜５３６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５５１５４．３；配列番号７３９）、およびＩＬ１７ＲＣ配列のアミノ酸４７３〜６２３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿５９８９２０．２；配列番号７４０）に位置する。
【００６４】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７ＦまたはＩＬ１７Ａ／Ｆに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインはヒトのものである。ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７ＦまたはＩＬ１７Ａ／Ｆに特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００６／０８８８３３号、第ＷＯ２００７／１１７７４９号、第ＷＯ２００８／０４７１３４号、第ＷＯ２００８／０５４６０３号、および米国特許出願公開第２００７／０２１２３６２号に開示のものが含まれる。ＩＬ１７Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質および関節リウマチのマウスのモデルで疾患の程度を低減させるためのその使用は、米国特許第６，９７３，９１９号に記載されている。
【００６５】
特定の実施形態では、ＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニストは、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＣまたはＩＬ１７ＲＡ／Ｃの細胞外ドメイン（「外部ドメイン」）であることができる。本明細書で用いるように、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＣまたはＩＬ１７ＲＡ／Ｃ外部ドメインは、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＣ、またはＩＬ１７ＲＡ／Ｃ、可溶性ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＣ、またはＩＬ１７ＲＡ／Ｃ、１つまたは複数のフィブロネクチン様ドメイン、１つまたは複数のプレリガンドアセンブリドメイン（ＰＬＡＤ）、１つまたは複数のＳＥＦＩＲドメイン、またはそれらの任意の組合せの細胞外の部分を指す。特定の実施形態では、ＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニストは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５５１５４．３（配列番号７３９）に記載のＩＬ１７ＲＡの最初の３０７個のアミノ酸などの、ＩＬ１７ＲＡのアミノ末端部分、またはＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニストとして機能し続けるその任意の断片を含む。他の実施形態では、ＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニストは、配列番号７３９のアミノ酸３２〜３０７（すなわち、リーダー配列がない）または配列番号８１６を含む。さらなる実施形態では、ＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニストは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿７０３１９１．１（配列番号７４０）に記載のＩＬ１７ＲＣの最初の５３９個のアミノ酸などの、ＩＬ１７ＲＣのアミノ末端部分、配列番号８１７、またはＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニストとして機能し続けるその任意の断片を含む。他の実施形態では、ＩＬ１７Ａ／Ｆアンタゴニストは、配列番号７４０のアミノ酸２１〜５３９を含む（すなわち、リーダー配列がない）。さらに他の実施形態では、ＩＬ１７Ａ／Ｆに特異的なポリペプチド結合ドメインが提供され、そこにおいて、結合ドメインは、配列番号７３９のアミノ酸配列、配列番号７３９のアミノ酸３２〜３０７、配列番号８１６のアミノ酸配列、配列番号７４０のアミノ酸配列、配列番号７４０のアミノ酸２１〜５３９、または配列番号８１７のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記ポリペプチド結合ドメインはＩＬ１７Ａ／Ｆに結合して、その活性を阻害する。
ＴＷＥＡＫアンタゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＴＷＥＡＫアンタゴニストである（すなわち、ＴＷＥＡＫＲシグナル伝達を阻害することができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＴＷＥＡＫアンタゴニストには、ＴＷＥＡＫに特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＴＷＥＡＫＲ外部ドメインもしくはその断片が含まれる。
【００６６】
ＴＷＥＡＫは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーに属し、炎症性活性、新脈管形成および細胞増殖を含む複数の細胞応答を調節するサイトカインである。ＴＷＥＡＫは、切断されて生物活性のある可溶性サイトカインを生成する、ＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＷＥＡＫタンパク質の様々なドメインの位置が、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２８０９４０号に示されている。ＴＷＥＡＫはＴＮＦと重複するシグナル伝達機能を有するが、ずっと広い組織分布を示す。ＴＷＥＡＫは、細胞型特異的様式で細胞死の複数の経路を通してアポトーシスを誘発することができ、内皮細胞の増殖および移動を促進することもわかり、したがって新脈管形成の調節因子として作用する。
【００６７】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＴＷＥＡＫに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインはヒトのものである。ＴＷＥＡＫに特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、例えば、米国特許第７，１６９，３８７号に開示されるもの、および配列番号３〜７として米国特許出願公開第２００８／０２７９８５３号に開示されるものが含まれ、それらの配列は、参照により本明細書に組み込まれる。ＴＷＥＡＫをブロックするモノクローナル抗体は、マウスコラーゲンによって誘発された関節炎（ＣＩＡ）モデルで有効であることが示されている（Ｋａｍａｔａら（２００６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７巻：６４３３頁、Ｐｅｒｐｅｒら（２００６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７巻：２６１０頁）。
【００６８】
特定の実施形態では、ＴＷＥＡＫアンタゴニストは、ＴＷＥＡＫＲ（ＦＮ１４としても公知である）の細胞外ドメイン（「外部ドメイン」）であってもよい。本明細書で用いるように、ＴＷＥＡＫＲ外部ドメインは、ＴＷＥＡＫＲ、可溶性ＴＷＥＡＫＲまたはそれらの任意の組合せの細胞外の部分を指す。特定の実施形態では、ＴＷＥＡＫアンタゴニストは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５７７２３．１（配列番号７４１）に記載のＴＷＥＡＫＲの最初の７０個のアミノ酸などの、ＴＷＥＡＫＲのアミノ末端部分、またはＴＷＥＡＫアンタゴニストとして機能し続けるその任意の断片を含む。他の実施形態では、ＴＷＥＡＫアンタゴニストは、配列番号７４１のアミノ酸２８〜７０を含む（すなわち、リーダー配列がない）。まだその上さらなる実施形態では、ＴＷＥＡＫアンタゴニストは、配列番号７４１のアミノ酸配列、または配列番号７４１のアミノ酸２８〜７０に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記アンタゴニストはＴＷＥＡＫに結合して、その活性を阻害する。
【００６９】
本明細書に記載の結合タンパク質または融合タンパク質の、ＴＷＥＡＫＲへのＴＷＥＡＫの結合を減少させる能力は、米国特許出願公開第２００７／０２８０９４０号および第２００８／０２７９８５３号に記載のものを含む当業者に公知であるアッセイを用いて判定することができる。
ＣＳＦ２アンタゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＣＳＦ２アンタゴニストである（すなわち、ＣＳＦ２Ｒαシグナル伝達を阻害することができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＣＳＦ２アンタゴニストには、ＣＳＦ２に特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＣＳＦ２Ｒα外部ドメインもしくはその断片が含まれる。
【００７０】
ＣＳＦ２は、白血球増殖因子として機能するサイトカインである。それは、リンパ球、単球、内皮細胞、線維芽細胞および一部の悪性細胞を含むいくつかの細胞型によって生成される。造血系前駆細胞の増殖および分化の刺激に加えて、ＣＳＦ２は、ＣＳＦ２受容体を発現する免疫系の細胞に様々な影響を及ぼす。これらの機能で最も重要なものは、いくつかの免疫および炎症の過程における単球、マクロファージおよび顆粒球の活性化である。成熟ＣＳＦ２は、２つのグリコシル化部位を有する１２７個のアミノ酸の単量体タンパク質であり、その活性型は細胞外のホモダイマーとして見出される。
【００７１】
ＣＳＦ２の作用は、その受容体ＣＳＦ２Ｒ（ＧＭＲ、ＧＭＣＳＦＲまたはＣｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １１６（ＣＤ１１６）としても公知である）によって媒介される。受容体は、骨髄細胞および内皮細胞の細胞表面で通常発現されるが、リンパ球の上では発現されない。天然の受容体は、少なくとも２つのサブユニット、アルファ鎖（ＣＳＦ２Ｒα）およびベータ鎖（βｃ）で構成されるヘテロダイマーである。アルファサブユニットはリガンド特異性を付与し、ナノモルの親和性でＣＳＦ２に結合する（Ｇｅａｒｉｎｇら（１９８９年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２巻：３６６７頁、Ｇａｓｓｏｎら（１９８６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３巻：６６９頁）。ベータサブユニットはインターロイキン３の受容体およびインターロイキン５受容体複合体にも存在し、シグナル伝達に関与する。ＣＳＦ２とのベータおよびアルファサブユニットの結合は、ピコモルの結合親和性を有する複合体の形成につながり（Ｈａｙａｓｈｉｄａら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７巻：９６５５頁）、受容体の活性化をもたらす。
【００７２】
受容体のためのＣＳＦ２上の結合ドメインがマッピングされている（Ｂｒｏｗｎら（１９９４年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２５巻：８７３頁、Ｓｈａｎａｆｅｌｔら（１９９１年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６巻：１３８０４頁、Ｓｈａｎａｆｅｌｔら（１９９１年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０巻：４１０５頁、Ｌｏｐｅｚら（１９８６年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ７８巻：１２２０頁）。さらに、ＭｃＣｌｕｒｅらは、ＣＳＦ２の１つの分子が１つのアルファサブユニットおよび２つのベータサブユニットと結合して、三元複合体を形成することを証明した（ＭｃＣｌｕｒｅら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ  １０１巻：１３０８〜１３１５頁）。ＣＳＦ２受容体複合体の形成は、ＪＡＷＳＴＡＴファミリーの分子、Ｓｈｃ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＡＰキナーゼ、ＮＦκＢおよびホスファチジルイノシトール−３−キナーゼを含む複雑なシグナル伝達カスケードの活性化をもたらし、最後にｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎの転写をもたらす。
【００７３】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＣＳＦ２に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインはヒトのものである。ＣＳＦ２に特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、例えば米国特許第７，３８１，８０１号に開示のものが含まれる。ＣＳＦ２に特異的な追加のＶＨおよびＶＬドメインには、それぞれ配列番号１１〜２０、４９〜５２および３１〜４０、５８〜６１として米国特許出願公開第２００９／００５３２１３号に開示のものが含まれ、それらの配列は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。中和抗ＣＳＦ２抗体は、マウスのコラーゲン誘発関節炎モデル（Ｃｏｏｋら（２００１年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  ３巻：２９３〜２９８頁）およびマウスの喘息モデル（Ｙａｍａｓｈｉｔａら（２００２年）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２１９巻：９２頁）で有効であることが示されている。
【００７４】
特定の実施形態では、ＣＳＦ２アンタゴニストは、ＣＳＦ２Ｒαの細胞外ドメイン（「外部ドメイン」）であることができる。本明細書で用いるように、ＣＳＦ２Ｒα外部ドメインは、ＣＳＦ２Ｒα、可溶性ＣＳＦ２Ｒαまたはそれらの任意の組合せの細胞外の部分を指す。特定の実施形態では、ＣＳＦ２アンタゴニストは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６１３１．２（配列番号７４２）に記載のＣＳＦ２Ｒαの最初の３２３個のアミノ酸などの、ＣＳＦ２Ｒαのアミノ末端部分、またはＣＳＦ２アンタゴニストとして機能し続けるその任意の断片を含む。他の実施形態では、ＣＳＦ２アンタゴニストは、配列番号７４２のアミノ酸２３〜３２３を含む（すなわち、天然のリーダー配列がない）。まだその上さらなる実施形態では、ＣＳＦ２アンタゴニストは、配列番号７４２のアミノ酸配列、または配列番号７４２のアミノ酸２３〜３２３に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記アンタゴニストはＣＳＦ２に結合して、その活性を阻害する。
ＣＳＦ２のその受容体への結合を減少させる、本明細書に記載の結合タンパク質および／または融合タンパク質の能力は、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００６／１２２７９７号および米国特許出願公開第２００９／００５３２１３号に記載のものを含む当業者に公知であるアッセイを用いて決定することができる。
ＩＧＦ１／２アンタゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２アンタゴニストである（すなわち、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２のシグナル伝達を阻害することができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＩＧＦ１またはＩＧＦ２アンタゴニストには、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２に特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＩＧＦ１ＲもしくはＩＧＦＢＰ外部ドメインもしくはそのサブドメインが含まれる。
【００７５】
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）は、哺乳動物の成長および発達で重要な役割を演ずるペプチドファミリーを含む。インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）は、以下の特徴を有する分泌タンパク質である：ジスルフィド結合（アミノ酸５４〜９６、６６〜１０９、９５〜１００）；Ｄペプチドドメイン（アミノ酸１１１〜１１８）；カルボキシル末端プロペプチドドメイン（Ｅペプチド）（アミノ酸１１９〜１５３）；インスリン鎖Ａ様ドメイン（アミノ酸９０〜１１０）；インスリン鎖Ｂ様ドメイン（アミノ酸４９〜７７）；インスリン連結Ｃペプチド様ドメイン（アミノ酸７８〜８９）；プロペプチドドメイン（アミノ酸２２〜４８）；およびシグナル配列ドメイン（アミノ酸１〜２１）。
【００７６】
ＩＧＦ１は、肝臓、骨格筋、骨および軟骨を含む複数の組織で合成される。ＩＧＦ１の血中濃度の変化は、実験動物で総血清ＩＧＦ１の８０％を占める、肝臓によるその合成および分泌の変化を反映する。ＩＧＦ１の残りは、末梢で、通常結合組織細胞型によって、例えばほとんどの組織に存在する間質細胞によって合成される。末梢で合成されるＩＧＦ１は、オートクリンおよびパラクリン機構によって細胞増殖を調節する働きをすることができる。これらの組織において、新しく合成され、分泌されるＩＧＦ１は、結合組織細胞自体に存在する受容体に結合して増殖を刺激する（オートクリン）こと、または、それは、実際はＩＧＦ１を合成しないが、局所的に分泌されるＩＧＦ１によって増殖が刺激される（パラクリン）隣接する細胞型（しばしば上皮細胞型）にある受容体に結合することができる（Ｃｌｅｍｍｏｎｓ、２００７年、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ６巻（１０号）：８２１〜３３頁）。ＩＧＦ１の合成は、ヒト下垂体成長ホルモン（ＧＨ、ソマトトロピンとしても公知である）を含むいくつかの因子によって制御される。ＩＧＦ２濃度は胎児の成長中に高いが、ＩＧＦ１と比較して成体の期間（ａｄｕｌｔ  ｌｉｆｅ）ではＧＨ依存性がより低い。
【００７７】
ＩＧＦ１は、筋骨格系、肝臓、腎臓、腸、神経系組織、心臓および肺を含む様々な組織で、細胞の増殖および／または生存を高める。ＩＧＦ１は細胞増殖を促進する重要な役割も演じ、その結果、ＩＧＦ１の阻害はアテローム硬化症の治療のための可能性のある補助的手段（ａｄｊｕｎｃｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅ）として探求されている。ＩＧＦ１作用を阻害することが、他の形態の抗癌療法の効果を強化するための、または腫瘍細胞増殖を直接に阻害するための特異的療法として提案されている。
【００７８】
ＩＧＦ１と同様に、ＩＧＦ２はＩＧＦ１Ｒを通して作用する。ＩＧＦ２は、その分裂誘発および抗アポトーシス性の機能により、腫瘍での重要なオートクリン増殖因子である（Ｋａｎｅｄａら、２００５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５巻（２４号）：１１２３６〜１１２４０頁）。ＩＧＦ２の発現の増加が、結腸直腸癌、肝臓癌、食道癌および副腎皮質の癌、ならびに肉腫を含む、多種多様の悪性腫瘍でしばしば見られる。悪性の乳房上皮細胞を囲む間質線維芽細胞でＩＧＦ２の大量の発現が見られるので、ＩＧＦ２によるパラクリンシグナル伝達も、乳癌を含む腫瘍で役割を果たす。
【００７９】
インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）は、ジスルフィド結合によって連結される２つのアルファ鎖および２つのベータ鎖の四量体である。前駆体の切断は、アルファおよびベータサブユニットを生成する。ＩＧＦ１Ｒは、タンパク質キナーゼスーパーファミリー、チロシンタンパク質キナーゼファミリーおよびインスリン受容体サブファミリーに関係している。それは、３つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、および１つのタンパク質キナーゼドメインを含む（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、２００７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７巻：６９９頁）。アルファ鎖はリガンド結合ドメインの形成に寄与し、ベータ鎖はキナーゼドメインを有する。それは１回貫通Ｉ型膜タンパク質であり、様々な組織で発現される。
【００８０】
キナーゼドメインは、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２によって刺激される下流シグナル伝達カスケードの活性化のために必要である、チロシン−タンパク質キナーゼ活性を有する。自己リン酸化は、キナーゼ活性を活性化する。ベータサブユニットの細胞質ドメインのチロシン残基の上で自己リン酸化されると、ＩＧＦ１Ｒはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＰＩＫ３Ｒ１と、ならびにＩＲＳ１およびＳＨＣ１のＰＴＢ／ＰＩＤドメインと相互作用する。ＩＧＦ１Ｒは、形質転換事象で重大な役割を演ずる。それはほとんどの悪性組織で非常に過剰発現され、そこでは、それは細胞生存を高めることによって抗アポトーシス因子として機能する。この受容体を欠く細胞は、ｖ−Ｓｒｃを除いて、ほとんどのオンコジーンによって形質転換することができない。
【００８１】
インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）ファミリーは、ナノモルの親和性でＩＧＦに結合する、約２５０個の残基の６個の可溶性タンパク質（ＩＧＦＢＰ１〜６）を含む。それらの配列相同性のため、ＩＧＦＢＰは、共通の全体的折畳みを共有すると想定され、緊密に関連するＩＧＦ結合決定因子を有すると予想される。各ＩＧＦＢＰは、ほぼ等しい長さの３つの異なるドメイン、すなわち、高度に保存されたシステインに富むＮおよびＣドメイン、ならびに各ＩＧＦＢＰ種に特有な中央リンカードメインに分けることができる。ＮおよびＣドメインは両方ともＩＧＦへの結合に関与するが、ＩＧＦ結合におけるこれらのドメインの各々の具体的な役割は確定されていない。Ｃ末端のドメインは、ＩＧＦの他の種よりもＩＧＦのある種をＩＧＦＢＰが好むことに関与している可能性がある。Ｃ末端のドメインは、細胞外マトリックス成分との相互作用を通してＩＧＦ結合親和性の調節にも関与し、多分、ＩＧＦ１非依存性作用の媒介に関与している。中央リンカードメインは最も保存されていない領域で、いかなるＩＧＦＢＰのＩＧＦ結合部位の一部としても言及されたことはない。このドメインは、ＩＧＦＢＰについて公知である、翻訳後修飾、特異的タンパク質分解、ならびに酸不安定性サブユニットおよび細胞外マトリックスの結合の部位である。このドメインでのタンパク分解性切断は、ＩＧＦに対するＩＧＦ受容体と競合することができない低親和性のＮ末端およびＣ末端の断片を生成すると考えられ、したがって、タンパク質分解はＩＧＦＢＰからのＩＧＦ放出の主な機構であると想定される。しかし、最近の研究は、生じるＮ末端およびＣ末端の断片がＩＧＦ活性をまだ阻害することができ、インタクトなタンパク質のそれらと異なる機能的特性を有することを示す（Ｓｉｔａｒら（２００６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  １０３巻（３５号）：１３０２８頁）。
【００８２】
ＩＧＦ結合タンパク質は、ＩＧＦの半減期を延長する分泌タンパク質であり、細胞培養物に及ぼすＩＧＦの増殖促進効果を阻害または刺激することが示されている。それらは、ＩＧＦの細胞表面受容体とのＩＧＦの相互作用を変化させ、その上細胞移動を促進する。それらは、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２に等しくよく結合する。全てのＩＧＦＢＰのＣ末端のドメインは、サイログロブリン１型ドメインと配列相同性を示し、二次構造の共通要素を共有する：すなわち、αヘリックスおよび３−から４−βストランドのβシート。分子のコアは、コンセンサスな３つのジスルフィド対合によって連結され、保存されているＴｙｒ／Ｐｈｅアミノ酸を有し、ＱＣ、ＣＷＣＶモチーフを有する。これらの基本的特徴はＣＢＰ１、ＣＢＰ４およびＣＢＰ６で保存され、Ｃドメインの構造はこれまでに解決されているが、詳細ではかなりの変動が存在する。例えば、ＣＢＰ４はヘリックスα２を有するが、ＣＢＰ１の対応する残基は、サイログロブリン１型ドメインスーパーファミリーの他の構造で見られる短いベータストランドを形成する。ＣＢＰのこの特定の領域は、高い配列多様性を有し、ＩＧＦ複合体の形成に関与し、したがって親和性調節因子の役割を果たすことができる。
【００８３】
ＩＧＦ／ＩＧＦ受容体結合の阻害は、細胞増殖を妨害し、糖尿病、アテローム硬化症および癌を含む、ＩＧＦ系の調節不全（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）から生じる多くの共通する疾患における天然のＩＧＦアンタゴニストとしての、ＩＧＦＢＰおよび変形形態の開発のための戦略となる。
【００８４】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２に特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインはヒトのものである。さらに、または代わりに、本開示の結合ドメインは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００８６６．１（配列番号７４６）のＩＧＦ１Ｒ外部ドメインもしくはそのサブドメイン、または配列番号８１８のアミノ酸、またはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５８７．１（ＩＧＦＢＰ１；配列番号７４７）のＩＧＦＢＰ外部ドメイン、配列番号８０４のアミノ酸４９０〜７２３、ＮＰ＿０００５８８．２（ＩＧＦＢＰ２；配列番号７４８）、ＮＰ＿００１０１３４１６．１（ＩＧＦＢＰ３アイソフォームａ；配列番号７４９）、ＮＰ＿０００５８９．２（ＩＧＦＢＰ３アイソフォームｂ；配列番号７５０）、ＮＰ＿００１５４３．２（ＩＧＦＢＰ４；配列番号７５１）、ＮＰ＿０００５９０．１（ＩＧＦＢＰ５；配列番号７５２）またはＮＰ＿００２１６９．１（ＩＧＦＢＰ６；配列番号７５３）またはそれらのサブドメインを含む。まだその上さらなる実施形態では、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２アンタゴニストは、配列番号７４６〜７５３または８１８のアミノ酸配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記アンタゴニストはＩＧＦ１およびＩＧＦ２の少なくとも１つの活性を阻害する。
ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニストである（すなわち、ＴＡＣＩシグナル伝達を阻害することができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。例示的なＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニストには、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬに特異的な結合ドメイン、例えば免疫グロブリン可変結合ドメインもしくはその誘導体（例えば、抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、またはＴＡＣＩ外部ドメインもしくはその断片が含まれる。
【００８５】
ＢＬｙＳ（ＢＡＦＦ、ＴＡＬＬ−１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ１３ＢまたはｚＴＮＦ４としても公知である）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬまたはＴＮＦＳＦ１３）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドスーパーファミリーに属するサイトカインである。ＢＬｙＳおよびＡＰＲＩＬは、Ｂ細胞の成熟、増殖および生存を促進し（Ｇｒｏｓｓら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０４巻：９９５頁、Ｇｒｏｓｓら（２００１年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５巻：２８９頁）、Ｂ細胞が関与する自己免疫疾患の持続に関与することができる。
【００８６】
ＢＬｙＳは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの３つのメンバー、ＴＡＣＩ（ＴＮＦＲＳＦ１３ＢまたはＣＤ２６７としても公知である）、ＢＣＭＡおよびＢＲ３（ＢＡＦＦ−Ｒとしても公知である）に結合することによってＢ細胞に作用する。ＢＣＭＡはより弱い親和性でＢＬｙＳに結合するが、ＡＰＲＩＬはＴＡＣＩおよびＢＣＭＡだけに結合する（例えば、ＢｏｓｓｅｎおよびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ（２００６年）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８巻：２６３頁を参照されたい）。ＴＡＣＩは、Ｔ細胞非依存性免疫応答の上方制御ならびにＢ細胞の活性化および増殖の下方制御の両方の機能を果たすようである（Ｙａｎ（２００１年）Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２巻：６３８頁、ＭａｃＫａｙおよびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ（２００８年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．  ９巻：２６３頁）。
【００８７】
一部の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬに特異的なＶＨおよびＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインはヒトのものである。ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬに特異的なそのようなＶＨおよびＶＬドメインを含む結合ドメインの例には、例えば米国特許出願公開第２００３／０２２３９９６号または米国特許第７，１８９，８２０号に開示のものが含まれる。関節リウマチ（Ｔａｋら（２００１年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ５８巻：６１頁）または全身性エリテマトーデス（Ｄａｌｌ’Ｅｒａら（２００７年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ５６巻：４１４２頁）の患者を治療するために、ＴＡＣＩ−免疫グロブリン融合タンパク質（アタシセプト（ａｔａｃｉｃｅｐｔ））がクリニックで用いられている。
【００８８】
特定の実施形態では、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ＴＡＣＩの細胞外ドメイン（「外部ドメイン」）であることができる。本明細書で用いるように、ＴＡＣＩ外部ドメインは、ＴＡＣＩ、可溶性ＴＡＣＩ、１つまたは複数のシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）を含む断片、またはそれらの任意の組合せの細胞外の部分を指す。特定の実施形態では、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６５８４．１（配列番号７４３）に記載のＴＡＣＩの最初の１６６個のアミノ酸などの、ＴＡＣＩのアミノ末端部分、またはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニストとして機能し続けるその任意の断片を含む。他の実施形態では、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニストは、配列番号７４３のアミノ酸２１〜１６６を含む（すなわち、天然のリーダー配列がない）。まだその上さらなる実施形態では、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニストは、配列番号７４３のアミノ酸配列、または配列番号７４３のアミノ酸２１〜１６６に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記アンタゴニストはＣＳＦ２に結合して、その活性を阻害する。
【００８９】
本明細書に記載の結合タンパク質および／または融合タンパク質の、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬのその受容体への結合を減少させる能力は、米国特許出願公開第２００３／０２２３９９６号、第２００５／００４３５１６号および米国特許第７，１８９，８２０号に記載のものを含む当業者に公知であるアッセイを用いて決定することができる。
ＩＬ１０アゴニスト
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、ＩＬ１０アゴニストである（すなわち、ＩＬ１０シグナル伝達を増加させることができる）結合領域または結合ドメインを含有するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ＩＬ１０アゴニスト結合ドメインは、ＩＬ１０もしくはＩＬ１０Ｆｃ、またはその機能性サブドメインである。その他の実施形態では、ＩＬ１０アゴニスト結合ドメインは、ＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２に特異的に結合する単鎖の結合性タンパク質、例として、ｓｃＦｖである。
【００９０】
ＩＬ１０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５６３．１；配列番号７５４）は、アルファへリックス構造を共有するサイトカインスーパーファミリーのメンバーである。実験的証拠は存在しないが、全てのファミリーメンバーが、６つのアルファ−へリックスを有することが示唆されている（Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒ，  Ｈ．ら、（２００２年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３巻：８９頁）。ＩＬ１０は、４つのシステインを有し、これらの１つのみが、ファミリーメンバー間で保存されている。ＩＬ１０は、その二量体化に寄与するＶ型の折畳みを示すことから、ジスルフィド結合は、この構造にとって重要ではないようである。ファミリーメンバーのＩＬ１０に対するアミノ酸同一性は、２０％（ＩＬ−１９）〜２８％（ＩＬ−２０）の範囲に及ぶ（Ｄｕｍｏｕｔｅｒら、（２００２年）Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｅｉｎ  Ｎｅｔｗ．  １３巻：５頁）。
【００９１】
ＩＬ１０は最初に、Ｔｈ１細胞によるサイトカインＩＦＮ−αおよびＧＭ−ＣＳＦの産生を阻害するマウスにおけるＴｈ２サイトカインとして記載された（Ｍｏｏｒｅら、２００１年、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９巻：６８３頁；Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏら、（１９８９年）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７０巻：２０８１頁）。ヒトＩＬ１０は、１７８アミノ酸長であり、１８個のアミノ酸のシグナル配列および１６０個のアミノ酸の成熟セグメントを有する。その分子量は、およそ１８ｋＤａ（単量体）である。ヒトＩＬ１０は、潜在的なＮ連結型グリコシル化部位を含有せず、グリコシル化されない（Ｄｕｍｏｕｔｅｒら、（２００２年）Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．  １３巻：５頁；Ｖｉｅｉｒａら、（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻：１１７２頁）。これは、２つの鎖内ジスルフィド結合を形成する４つのシステイン残基を含有する。１つの単量体のへリックスＡ〜Ｄが、第２の単量体のへリックスＥおよびＦと、非共有結合的に相互作用して、非共有結合性のＶ型ホモ二量体を形成する。機能を示す領域が、ＩＬ１０分子上で位置付けられている。Ｎ末端においては、プレ−へリックスＡ、残基番号１〜９が、肥満細胞の増殖に関与し、一方、Ｃ末端においては、へリックスＦ、残基番号１５２〜１６０が、白血球の分泌および走化性を媒介する。
【００９２】
ＩＬ１０を発現することが公知である細胞として、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ミクログリア、ＣＤ１４＋（しかし、ＣＤ１６＋ではない）単核球、Ｔｈ２ＣＤ４＋細胞（マウス）、ケラチノサイト、肝星細胞、Ｔｈ１ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴｈ２ＣＤ４＋Ｔ細胞（ヒト）、メラノーマ細胞、活性化マクロファージ、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞（ＣＤ５＋およびＣＤ１９＋）ならびに好酸球が挙げられる。Ｔ細胞において、ＩＬ１０によるＩＦＮ−ガンマ産生の阻害が最初に観察されたが、これは今では、アクセサリー細胞が媒介する間接的な作用であることが示唆されている。しかし、Ｔ細胞に対する追加の作用として、ＩＬ１０誘導型ＣＤ８＋Ｔ細胞走化性、ＩＬ−８に向かうＣＤ４＋Ｔ細胞の走化性の阻害、活性化に続くＩＬ−２産生の抑制、Ｂｃｌ−２上方制御を介するＴ細胞アポトーシスの阻害、および、ＣＤ２８による同時刺激が伴う抗原の低い曝露に続くＴ細胞増殖の妨害が挙げられる（Ａｋｄｉｓら、（２００１年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０３巻：１３１頁）。
【００９３】
Ｂ細胞において、ＩＬ１０は、いくつかの関連はあるが、明確に異なる機能を有する。ＩＬ１０は、ＴＧＦβおよびＣＤ４０Ｌと連携して、ナイーブ（ＩｇＤ＋）Ｂ細胞におけるＩｇＡの産生を誘導する。ＴＧＦβ／ＣＤ４０Ｌがクラススイッチを促し、一方、ＩＬ１０は分化および増殖を開始させると考えられている。ＴＧＦβが存在しない場合には、ＩＬ１０は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３（ヒト）の誘導においてＣＤ４０Ｌと協力する。したがって、ＩＬ１０は、ＩｇＧサブタイプについての直接的なスイッチ因子であり得る。興味深いことに、ＩＬ１０は、ＩＬ−４誘導型ＩｇＥ分泌に対しては多岐にわたる作用を有する。ＩＬ−４誘導型クラススイッチの時点においてＩＬ１０が存在すると、ＩＬ１０は、この作用を逆転させ、ＩｇＥコミットメント後にＩＬ１０が存在すると、ＩＬ１０は、ＩｇＥ分泌を増大させる。最後に、ＩＬ１０存在下におけるＣＤ２７／ＣＤ７０の相互作用は、メモリーＢ細胞からのプラズマ細胞形成を促進する（Ａｇｅｍａｔｓｕら（１９９８年）Ｂｌｏｏｄ  ９１巻：１７３頁）。
【００９４】
また、肥満細胞およびＮＫ細胞も、ＩＬ１０の影響を受ける。肥満細胞において、ＩＬ１０は、ヒスタミン放出を誘導し、一方、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの放出は遮断する。ＩＬ１０は、ラットにおいては肥満細胞によって放出されることが公知であることから、この作用は、オートクラインであり得る。その多指向性の証拠として、ＩＬ１０は、ＮＫ細胞に対しては反対の作用を示す。ＩＬ１０は、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦの産生を遮断するのではなく、実のところ、この機能をＮＫ細胞に対して促進する。さらに、ＩＬ１０は、ＩＬ−２誘導型ＮＫ細胞増殖を強化し、ＩＬ−１８によって予備刺激されたＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γ分泌を促進する。ＩＬ−１２および／またはＩＬ−１８と協力して、ＩＬ１０は、ＮＫ細胞の細胞傷害性を強化する（Ｃａｉら、１９９９年、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９巻：２６５８頁）。
【００９５】
ＩＬ１０は、好中球に対しては著しい抗炎症性の影響を示す。ＩＬ１０は、ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＩＬ−８の分泌を阻害し、炎症性メディエーターＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの産生を遮断する。さらに、ＩＬ１０は、好中球のスーパーオキシドを産生する能力も減少させ、その結果として、ＰＭＮ媒介型抗体依存性細胞傷害性を妨害する。また、ＩＬ１０は、ＩＬ−８誘導型走化性およびｆＭＬＰ誘導型走化性も、おそらくＣＸＣＲ１を介して遮断する（Ｖｉｃｉｏｓｏら、（１９９８年）Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．  ９巻：２４７頁）。
【００９６】
樹状細胞（ＤＣ）において、ＩＬ１０は、一般に、免疫抑制性の作用を示す。ＩＬ１０は、ＤＣを失って、ＣＤ１４＋マクロファージの分化を促進するようである。ＩＬ１０は、Ｔ細胞、特に、Ｔｈ１型細胞を刺激する、ＤＣの能力を減少させるように見える。ＭＨＣ−ＩＩの発現に関連して、ＩＬ１０が、下方制御される場合、変化しない場合または上方制御される場合がある（Ｓｈａｒｍａら、（１９９９年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３巻：５０２０頁）。ＣＤ８０およびＣＤ８６に関しては、ＩＬ１０は、その発現を上方制御するかまたは下方制御するかのいずれかである。Ｂ７−２／ＣＤ８６は、Ｔ細胞の活性化において重要な役割を担う。この分子については、ＩＬ１０は、上方制御および下方制御の両方に関与する。しかし、おそらく最も顕著な調節は、ＣＤ４０について生じる（ＩＬ１０は、その発現を低下させるように見える）。局所レベルにおいては、ＩＬ１０は、炎症性サイトカインに応答したランゲルハンス細胞の遊走を阻害することによって、免疫賦活を遮断することができる。あるいは、ＩＬ１０は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５の下方制御ならびにＣＣＲ７の上方制御が通常関与する炎症誘導型のＤＣの成熟ステップも遮断する。ＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５の保持を伴うこの遮断の結果、ＤＣが局所リンパ節へ遊走することができないようになる。この結果として、Ｔ細胞を刺激せず、炎症性ケモカインに結合する（かつそれらを除く）が、それらに対して応答はしない不動のＤＣが生じる（Ｄ−Ａｍｉｃｏら、（２０００年）Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １：３８７）。
【００９７】
単核球において、ＩＬ１０は、記載されているいくつかの作用を有する。例えば、ＩＬ１０は、細胞表面のＭＨＣ−ＩＩの発現を低下させ、また、刺激に続くＩＬ−１２の産生も阻害する。ＩＬ１０は、Ｍ−ＣＳＦと連携して、単核球のマクロファージへの移行を促進するが、このマクロファージの表現型（すなわち、ＣＤ１６＋／細胞傷害性対、ＣＤ１６−）は明らかではない。また、ＩＬ１０は、単核球のＧＭ−ＣＳＦ分泌およびＩＬ−８産生も低下させ、一方、ＩＬ−１ｒａの放出を促進する（Ｇｅｓｓｅｒら、（１９９７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４巻：１４６２０頁）。結合組織の構成成分であるヒアルロネクチンが、ＩＬ１０に応答して単核球によって分泌されることが現在公知である。この点については、ヒアルロネクチンは、細胞外空間を通しての細胞の遊走を妨害することが公知であり、細胞の遊走、特に、腫瘍細胞の転移において何らかの重要性があり得る（Ｇｅｓｓｅｒら、（１９９７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４巻：１４６２０頁）。
【００９８】
ＩＬ１０と、マウスまたはマカクのいずれかのＦｃ領域との融合タンパク質（ＩＬ１０Ｆｃと呼ぶ）が、マクロファージの機能を阻害し、膵島の異種移植片の生存を延長させること（Ｆｅｎｇら（１９９９年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８巻：１７７５頁；Ａｓｉｅｄｕら（２００７年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４０巻：１８３頁）、およびマウスモデルにおいて敗血症性ショックを低下させること（Ｚｈｅｎｇら（１９９５年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４巻：５５９０頁）が示されている。
【００９９】
ヒトＩＬ１０Ｒ１は、限定された数の細胞型において発現する９０〜１１０ｋＤａのＩ型１回膜貫通型の糖タンパク質であり（Ｌｉｕら、１９９４年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２巻：１８２１頁）、弱い発現が、膵臓、骨格筋、脳、心臓および腎臓において見られ、中間レベルの発現が、胎盤、肺および肝臓において見られる。単核球、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球およびＴ細胞は、高いレベルのＩＬ１０Ｒ１を発現する（Ｌｉｕら、１９９４年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２巻：１８２１頁）。発現したタンパク質は、５７８個のアミノ酸のタンパク質であり、２１個のアミノ酸のシグナルペプチド、２１５個のアミノ酸の細胞外領域、２５個のアミノ酸の膜貫通セグメント、および３１７個のアミノ酸の細胞質ドメインを含有する。細胞外領域内には２つのＦＮＩＩＩモチーフがあり、細胞質ドメイン内には、ＳＴＡＴ３ドッキング部位およびＪＡＫ１関連領域がある（Ｋｏｔｅｎｋｏら、２０００年  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９巻：２５５７頁；Ｋｏｔｅｎｋｏら、１９９７年、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６巻：５８９４頁）。ＩＬ１０Ｒ１は、ヒトＩＬ１０に２００ｐＭのＫｄで結合する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するように、本開示の結合ドメインは、ＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２に対して特異性を示すＶＬドメインとＶＨドメインとを含む。特定の実施形態では、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、ヒトのものである。ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、いずれの配向にも配置することができ、本明細書に開示する最大約３０個のアミノ酸のリンカーまたはこれら２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能をもたらすことができる任意のその他のアミノ酸配列によって分離することができる。特定の実施形態では、ＶＬドメインとＶＨドメインとをつなぐリンカーは、配列番号４９７〜６０４および７９１〜７９６に記載のアミノ酸配列を含む。多重特異性結合ドメインは、ラクダ抗体の構成に類似する少なくとも２つの特異的なサブ結合ドメイン、またはより従来型の哺乳動物抗体の対形成するＶＬ鎖およびＶＨ鎖の構成に類似する少なくとも４つの特異的なサブ結合ドメインを有することができる。さらなる実施形態では、本開示の、ＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２に対して特異性を示す結合ドメインは、１つもしくは複数の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）または１つもしくは複数のそのようなＣＤＲの複数コピーを含むことができ、これらのＣＤＲは、抗ＩＬ１０Ｒ１もしくは抗ＩＬ１０Ｒ２のｓｃＦｖ断片もしくはＦａｂ断片の可変領域からか、またはその重鎖もしくは軽鎖の可変領域から、入手、誘導または設計されている。したがって、本開示の結合ドメインは、抗ＩＬ１０Ｒ１または抗ＩＬ１０Ｒ２の可変領域に由来する単一のＣＤＲを含んでもよく、または同じであるかもしくは異なってもよい複数のＣＤＲを含むことができる。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインは、フレームワーク領域ならびにＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含むＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２に対して特異性を示すＶＬドメインとＶＨドメインとを含む。
【０１０１】
特定の実施形態では、ＩＬ１０アゴニストは、ＩＬ１０の細胞外ドメイン（「外部ドメイン」）であってよい。本明細書で使用する場合、ＩＬ１０外部ドメインは、ＩＬ１０の細胞外の部分、可溶性ＩＬ１０またはそれらの任意に組合せを指す。その上さらなる実施形態では、ＩＬ１０アゴニストは、配列番号７５４のアミノ酸配列、配列番号７５４のアミノ酸１９〜１７８のアミノ酸配列またはそれらの細胞外部分のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または少なくとも１００％同一である配列を含み、前記アゴニストは、ＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ１０Ｒ２に結合し、ＩＬ１０の活性を増加させる。
多重特異性融合タンパク質
本開示は、ＴＮＦ−アルファのアンタゴニストであるドメイン（「ＴＮＦ−アルファアンタゴニストドメイン」）、およびＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ｘＲ複合体、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬまたはＩＬ１０ＲなどのＴＮＦ−アルファ以外のリガンドと結合するドメイン（「異種結合ドメイン」）を含む、多重特異性融合タンパク質を提供する。ＴＮＦ−アルファアンタゴニストドメインは融合タンパク質のアミノ末端に存在し、異種結合ドメインは融合タンパク質のカルボキシ末端に存在してよく、または異種結合ドメインはアミノ末端に存在してよく、ＴＮＦ−アルファアンタゴニストはカルボキシ末端に存在してよいことは意図される。本明細書に言及するように、本開示の結合ドメインは、介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン定常領域またはそのサブ領域、好ましくはＩｇＧ１などのＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）のそれぞれの末端と融合することができる。さらに、２つ以上の結合ドメインを、当技術分野で公知であるかまたは本明細書に記載するリンカーによって、介在ドメインにそれぞれ接合させることが可能である。
【０１０２】
本明細書で使用する「介在ドメイン」は、１つまたは複数の結合ドメインの足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）として単に機能するアミノ酸配列を指し、したがって融合タンパク質は、組成物に単鎖ポリペプチドとして、主に（例えば、５０％以上の融合タンパク質集団）または実質的に（例えば、９０％以上の融合タンパク質集団）存在する。例えば、特定の介在ドメインは、構造機能（例えば、間隔、柔軟性、剛性）または生物機能（例えば、ヒト血液中などの血漿中の半減期増加）を有し得る。血漿中の本開示の融合タンパク質の半減期を増大することができる例示的な介在ドメインには、アルブミン、トランスフェリン、血清タンパク質と結合する足場ドメインなど、またはこれらの断片が含まれる。
【０１０３】
特定の好ましい実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質に含有される介在ドメインは、水素結合、静電的相互作用、ファンデルワース力、塩架橋、ジスルフィド結合、疎水性相互作用など、またはこれらの任意の組合せなどによる、非共有結合または共有結合相互作用による、少なくとも２つの単鎖ポリペプチドまたはタンパク質の結合を促進することができるアミノ酸配列を指す「二量体化ドメイン」である。例示的な二量体化ドメインには、免疫グロブリン重鎖定常領域またはサブ領域、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、好ましくはＩｇＧ１ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域などが含まれる。二量体化ドメインは、二量体の形成を促進することが好ましいが、より高次のマルチマー複合体（例えばトリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマーなど）を形成することができることは理解されるはずである。
【０１０４】
「定常サブ領域」は、全ての定常領域ドメインが供給源抗体において見られるわけではないが、１つまたは複数の免疫グロブリン定常領域ドメインの一部または全部に相当するかまたはそれらに由来する、好ましいペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列を指すために、本明細書で定義する用語である。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質の定常領域ドメインは、いくつかのＦＣ受容体と結合する能力を保持し（ＦＣＲｎ結合など）、かつｉｎ  ｖｉｖｏでの比較的長い半減期を保持しながら、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、または補体活性化および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の最小エフェクター機能を欠く、または有する。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインをヒトＩｇＧ１定常領域またはサブ領域と融合させ、ＩｇＧ１定常領域またはサブ領域は、以下の２３４位のロイシン（Ｌ２３４）、２３５位のロイシン（Ｌ２３５）、２３７位のグリシン（Ｇ２３７）、３１８位のグルタミン酸（Ｅ３１８）、３２０位のリシン（Ｋ３２０）、３２２位のリシン（Ｋ３２２）、またはこれらの任意の組合せ（ＥＵナンバリング）の変異したアミノ酸の１つまたは複数を有する。
【０１０５】
Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＦｃεＲ１、ＦｃＲｎ）とＦｃの相互作用、または補体成分Ｃ１ｑ（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；Ｐｒｅｓｔａ（２００２年）Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３：２３７を参照されたい）とＦｃの相互作用を変えることができる変異を、Ｆｃドメインの内側または外側に作製するための方法は、当技術分野で公知である。本開示の特定の実施形態は、ＦｃＲｎおよびプロテインＡとの結合が保たれ、Ｆｃドメインが他のＦｃ受容体またはＣ１ｑともはや相互作用しないかまたは最小限で相互作用する、ヒトＩｇＧ由来の定常領域またはサブ領域を有する免疫グロブリンまたは融合タンパク質を含む組成物を含む。例えば、本開示の結合ドメインは、位置２９７のアスパラギン（ＥＵナンバリングの下でＮ２９７）が別のアミノ酸に変異して、この位置におけるグリコシル化を低下または除外している、したがってＦｃγＲおよびＣ１ｑとの有効なＦｃの結合を無効にする、ヒトＩｇＧ１定常領域またはサブ領域と融合することができる。別の例示的な変異は、Ｃ１ｑの結合はノックアウトするがＦｃの結合には影響を与えないＰ３３１Ｓである。
【０１０６】
さらなる実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン参照配列と比較して改変型グリコシル化パターンを有することができる。例えば、様々な遺伝的技法のいずれかを利用して、グリコシル化部位を形成する１つまたは複数の特定のアミノ酸残基を変えることができる（Ｃｏら、（１９９３年）Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０巻：１３６１頁；Ｊａｃｑｕｅｍｏｎら、（２００６年）Ｊ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ４巻：１０４７頁；Ｓｃｈｕｓｔｅｒら、（２００５年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５巻：７９３４頁；Ｗａｒｎｏｃｋら、（２００５年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９２巻：８３１頁を参照されたい）。あるいは、本開示の融合タンパク質が産生される宿主細胞を操作して、改変型グリコシル化パターンを産生することができる。当技術分野で公知である１つの方法は、例えば、ＡＤＣＣを増大する両断型、非フコシル化変異体の形の改変型グリコシル化をもたらす。これらの変異体は、オリゴ糖修飾酵素を含有する宿主細胞での発現から生じる。あるいは、ＢｉｏＷａ／Ｋｙｏｗａ  ＨａｋｋｏのＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）技術により、本開示によるグリコシル化分子のフコース含有量を減らすことが意図される。公知である１つの方法では、ＧＤＰ−フコースの産生によって免疫グロブリンＦｃ領域のグリコシル化パターンを修飾する、組換え免疫グロブリン産生用のＣＨＯ宿主細胞を提供する。
【０１０７】
あるいは、化学的技法を使用して本開示の融合タンパク質のグリコシル化パターンを改変する。例えば、様々なグリコシダーゼ阻害剤および／またはマンノシダーゼ阻害剤は、ＡＤＣＣ活性の増大、Ｆｃ受容体の結合の増大、およびグリコシル化パターンの改変の、１つまたは複数の所望の効果をもたらす。特定の実施形態では、（ＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２またはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニストと結合した、またはＩＬ１０アゴニストと結合したＴＮＦ−アルファアンタゴニストドメインを含有する）本開示の多重特異性融合タンパク質を発現する細胞を、前記宿主細胞によって産生される免疫糖タンパク質分子のＡＤＣＣを増大する濃度で炭水化物修飾物質を含み、前記炭水化物修飾物質が８００μＭ未満の濃度で存在する、培養培地で増殖させる。好ましい実施形態では、これらの多重特異性融合タンパク質を発現する細胞を、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、または８００μＭなど１００〜８００μＭの濃度で、カスタノスペルミンまたはキフネンシン、より好ましくはカスタノスペルミンを含む培養培地で増殖させる。カスタノスペルミンなどの炭水化物修飾物質を用いてグリコシル化を改変するための方法は、米国特許出願公開Ｎｏ．２００９／００４１７５６またはＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ２００８／０５２０３０に与えられる。
【０１０８】
別の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、エフェクター細胞Ｆｃ受容体との結合に影響を与えるアミノ酸修飾を有してよい。これらの修飾は、Ｐｒｅｓｔａら（２００１年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ３０巻：４８７頁に開示された手法などの、当技術分野で公知である任意の技法を使用して作製することができる。別の手法では、Ｘｅｎｃｏｒ  ＸｍＡｂＴＭ技術を利用して、Ｆｃドメインに相当する定常サブ領域を操作して、細胞殺傷エフェクター機能を高めることが可能である（Ｌａｚａｒら、（２００６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  １０３巻：４００５頁を参照されたい）。この手法を使用して、例えば、ＦＣγＲに対する改善された特異性および結合性を有する定常サブ領域を作製し、それによって細胞殺傷エフェクター機能を高めることができる。
【０１０９】
まだその上さらなる実施形態では、定常領域またはサブ領域は、このような介在ドメインを欠く相当する融合タンパク質と比較して、血漿半減期または胎盤通過を場合によっては増大することができる。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の延長した血漿半減期は、ヒトで、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２４、少なくとも３０、少なくとも３６、少なくとも４０、少なくとも４８時間、少なくとも数日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも数週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも数カ月以上である。
【０１１０】
定常サブ領域は、以下のドメイン：ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、またはＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）のいずれかの一部または全部を含むことができる。したがって、本明細書で定義する定常サブ領域は、免疫グロブリン定常領域の一部分に相当するポリペプチドを指すことができる。定常サブ領域は、同じ、または異なる、免疫グロブリン、抗体アイソタイプ、または対立遺伝子変異体由来のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは切断型であり、その配列を参照によって本明細書に組み込む、配列番号３６６〜３７１としてＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ２００７／１４６９６８）に列挙されたカルボキシ末端配列を含む。特定の実施形態では、本開示のポリペプチドの定常サブ領域は、アミノ末端リンカー、カルボキシ末端リンカー、または両末端でのリンカーを場合によっては有してよい、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する。
【０１１１】
「リンカー」は、約２〜約１５０アミノ酸のリンカーなどの、他のペプチドまたはポリペプチドと接合または連結したペプチドである。本開示の融合タンパク質において、リンカーは介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン由来定常サブ領域）と結合ドメインを接合することができ、またはリンカーは結合ドメインの２つの可変領域を接合することができる。例えばリンカーは、抗体ヒンジ領域配列から得られる、由来する、または設計されるアミノ酸配列、結合ドメインを受容体に連結する配列、または結合ドメインを細胞表面膜貫通領域または膜アンカーに連結する配列であってよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、生理的条件または他の標準的ペプチド条件（例えば、ペプチド精製条件、ペプチド保存に関する条件）下で少なくとも１つのジスルフィド結合に関与することができる、少なくとも１つのシステインを有することができる。特定の実施形態では、免疫グロブリンヒンジペプチドに相当するかまたはそれに類似するリンカーは、そのヒンジのアミノ末端に向かって位置するヒンジシステインに相当するシステインを保持する。さらなる実施形態では、リンカーはＩｇＧ１またはＩｇＧ２Ａヒンジに由来し、ヒンジシステインに相当する１つのシステインまたは２つのシステインを有する。特定の実施形態では、１つまたは複数のジスルフィド結合は介在ドメイン間の鎖間ジスルフィド結合として形成される。他の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、結合ドメインと直接融合した介在ドメインを有することができる（すなわち、リンカーまたはヒンジなし）。いくつかの実施形態では、介在ドメインは二量体化ドメインである。
【０１１２】
本開示の多重特異性融合タンパク質の介在または二量体化ドメインを、ペプチドリンカーによって１つまたは複数の末端結合ドメインと結合させることが可能である。スペーシング機能を与える以外に、リンカーは、融合タンパク質内および融合タンパク質とそれらの標的（複数可）間の両方で、融合タンパク質の１つまたは複数の結合ドメインを正確に配向するのに適した、柔軟性または剛性を与えることができる。さらにリンカーは、ヒトなどの、投与の必要性のある被験体への投与後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で完全長融合タンパク質の発現および精製タンパク質の安定性を維持することができ、これらの同じ被験体で非免疫原性であるかまたは免疫原性が低いことが好ましい。特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在または二量体化ドメインのリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジの全部または一部を含むことができる。
【０１１３】
さらに、結合ドメインはＶＨおよびＶＬドメインを含むことができ、これらの可変領域ドメインはリンカーによって組合せることができる。例示的な可変領域結合ドメインリンカーには、ｎが１〜５の整数である、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなどの（ＧｌｙｎＳｅｒ）ファミリーに属するリンカーがある（例えば、それぞれ配列番号５１８、５２５、５４２、５８５、５８６および６０３に相当するリンカー２２、２９、４６、８９、９０および１１６を参照されたい）。好ましい実施形態では、これらの（ＧｌｙｎＳｅｒ）ベースのリンカーは可変ドメインを連結させるために使用し、結合ドメインの介在ドメインへの連結のためには使用しない。
【０１１４】
介在ドメイン（例えば、免疫グロブリン由来定常サブ領域）を結合ドメインに接合するため、または結合ドメインの２つの可変領域を接合するために使用することができる例示的なリンカーは、配列番号４９７〜６０４および７９１〜７９６で列挙する。
【０１１５】
本開示で意図するリンカーには、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの任意のドメイン間領域（例えば、抗体ヒンジ領域）、またはＣ型レクチン、ＩＩ型膜タンパク質のファミリーの茎部領域由来のペプチドが含まれる。これらのリンカーは、約２〜約１５０アミノ酸、または約２〜約４０アミノ酸、または約８〜約２０アミノ酸、好ましくは約１０〜約６０アミノ酸、より好ましくは約１０〜約３０アミノ酸、および最も好ましくは約１５〜約２５アミノ酸の長さ範囲である。例えば、リンカー１（配列番号４９７）は２アミノ酸長であり、リンカー１１６（配列番号５６０）は３６アミノ酸長である。
【０１１６】
一般的な長さ以外を考慮すると、本開示の融合タンパク質における使用に適したリンカーには、ＩｇＧヒンジ、ＩｇＡヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＩｇＥヒンジ、またはそれらの変異体から選択される抗体ヒンジ領域が含まれる。特定の実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、またはそれらの断片もしくは変異体から選択される抗体ヒンジ領域（上部およびコア領域）であってよい。本明細書で使用するように、「免疫グロブリンヒンジ領域」であるリンカーは、ＣＨ１のカルボキシル末端と（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤに関して）ＣＨ２のアミノ末端の間、または（ＩｇＥおよびＩｇＭに関して）ＣＨ３のアミノ末端の間に見られるアミノ酸を指す。本明細書で使用する「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の重鎖に見られる、（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤに関して）ＣＨ１領域とＣＨ２領域の間に介入しＣＨ１領域とＣＨ２領域を結び付ける、または（ＩｇＥおよびＩｇＭに関して）ＣＨ２領域とＣＨ３領域の間に介入しＣＨ２領域とＣＨ３領域を結び付ける、天然に存在するアミノ酸配列を指す。好ましい実施形態では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域配列はヒトのものである。
【０１１７】
結晶学的研究によれば、ＩｇＧヒンジドメインは、機能上および構造上３つの領域：上部ヒンジ領域、コアまたは中央ヒンジ領域、および底部ヒンジ領域に細区画することができる（Ｓｈｉｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０巻：８７頁（１９９２年））。例示的な上部ヒンジ領域には、ＩｇＧ１で見られるＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号８１９）、ＩｇＧ２で見られるＥＲＫＣＣＶＥ（配列番号８２０）、ＩｇＧ３で見られるＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴ  ＨＴ（配列番号８２１）またはＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ（配列番号８２２）、およびＩｇＧ４で見られるＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号８２３）が含まれる。例示的な中央ヒンジ領域には、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２で見られるＣＰＰＣＰ（配列番号８３４）、ＩｇＧ３で見られるＣＰＲＣＰ（配列番号８２４）、およびＩｇＧ４で見られるＣＰＳＣＰ（配列番号８２５）がある。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４抗体はそれぞれ１つの上部および中央ヒンジを有するようであり、一方ＩｇＧ３は、４つのヒンジ（１つのＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴ  ＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号８２６）および３つのＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰ  ＣＰＲＣＰ（配列番号８２７））をタンデムで有する。
【０１１８】
ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体はＩｇＧ様コア領域を欠くようであり、ＩｇＤは２つの上部ヒンジ領域をタンデムで有するようである（配列番号８２８および８２９を参照されたい）。ＩｇＡ１およびＩｇＡ２抗体で見られる例示的な野生型上部ヒンジ領域は、配列番号８３０および８３１に記載する。
【０１１９】
ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体は、対照的に、典型的なヒンジ領域の代わりに、ヒンジ様の性質を有するＣＨ２領域を有する。ＩｇＥおよびＩｇＭの例示的な野生型ＣＨ２上部ヒンジ様配列は、それぞれ配列番号８３２
【化１】
2011526792.tif 000002
【０１２０】
、および、配列番号８３３
【化２】
2011526792.tif 000003
【０１２１】
に記載される。
【０１２２】
「改変野生型免疫グロブリンヒンジ領域」または「改変型免疫グロブリンヒンジ領域」は、（ａ）最大３０％のアミノ酸が変化した（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失の）野生型免疫グロブリンヒンジ領域、（ｂ）最大３０％のアミノ酸が変化した（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失の）少なくとも１０アミノ酸長（例えば、少なくとも１２、１３、１４または１５アミノ酸長）である野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部分、または（ｃ）コアヒンジ領域を含む野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部分（その一部分は４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長であってよい）を指す。特定の実施形態では、野生型免疫グロブリンヒンジ領域の１つまたは複数のシステイン残基を、１つまたは複数の他のアミノ酸残基（例えば、１つまたは複数のセリン残基）によって置換することができる。改変型免疫グロブリンヒンジ領域は、別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によって置換された野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を、代替的または追加的に有することができる。
【０１２３】
結合領域（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）として使用することができる別のヒンジ配列およびリンカー配列は、ＩｇＶ様またはＩｇＣ様ドメインを結合させる細胞表面受容体の一部分から作製することができる。細胞表面受容体が複数のＩｇＶ様ドメインをタンデムで含有するＩｇＶ様ドメイン間の領域、および細胞表面受容体が複数のタンデムＩｇＣ様領域を含有するＩｇＣ様ドメイン間の領域も、結合領域またはリンカーペプチドとして使用することができる可能性がある。特定の実施形態では、ヒンジおよびリンカー配列は５〜６０アミノ酸長であり、主として柔軟性であり得るが、さらなる剛性特性を与えることもあり、最小のベータ−シート構造を有して、アルファ−らせん構造を主として含有し得る。配列は血漿および血清中で安定であり、タンパク質分解的切断に耐性があることが好ましい。いくつかの実施形態では、配列は１つまたは複数のジスルフィド結合を形成して分子のＣ末端を安定化する能力を与える、ＣＰＰＣなどの天然に存在するモチーフまたは加えられたモチーフを含有し得る。他の実施形態では、配列は１つまたは複数のグリコシル化部位を含有し得る。ヒンジおよびリンカー配列の例には、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ６６、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９６、ＣＤ１５０、ＣＤ１６６、およびＣＤ２４４の、ＩｇＶ様とＩｇＣ様ドメインの間またはＩｇＣ様またはＩｇＶ様ドメインの間のドメイン間領域が含有する。別のヒンジは、ＣＤ６９、ＣＤ７２およびＣＤ１６１などの非免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー由来のＩＩ型受容体のジスルフィド含有領域から作製することもできる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ヒンジリンカーは、鎖間ジスルフィド結合を形成するための単一のシステイン残基を有する。他の実施形態では、ヒンジリンカーは、鎖間ジスルフィド結合を形成するための２つのシステイン残基を有する。さらなる実施形態では、ヒンジリンカーは、免疫グロブリンドメイン間領域（例えば、抗体ヒンジ領域）、またはＩＩ型Ｃ型レクチンの茎部領域に由来する（ＩＩ型膜タンパク質由来、例えば、ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ２００７／１４６９６８からの配列番号１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８７、２８９、２９７、３０５、３０７、３０９〜３１１、３１３〜３３１、３４６、３７３〜３７７、３８０、または３８１（それらの配列を参照によって本明細書に組み込む）などの、ＰＣＴ出願公開Ｎｏ．ＷＯ２００７／１４６９６８に記載する例示的なレクチンの茎部領域配列を参照されたい）。
【０１２５】
一態様では、本明細書に記載するＴＮＦ−アルファアンタゴニストを含有する例示的な多重特異性融合タンパク質は、ＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２またはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニスト、またはＩＬ１０アゴニストなどのＴＮＦ−アルファ以外の標的に特異的である、少なくとも１つの追加的結合領域または結合ドメインも含有する。例えば、本開示の多重特異性融合タンパク質は、介在ドメインによって、ＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２またはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニストドメイン、またはＩＬ１０アゴニストドメインと連結したＴＮＦ−アルファアンタゴニストドメインを有する。特定の実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、第一および第２の結合ドメイン、第一および第２のリンカー、ならびに介在ドメインを含み、この介在ドメインの一末端は、第１のリンカーを介して、ＴＮＦ−アルファアンタゴニストである第１の結合ドメイン（例えば、ＴＮＦＲ外部ドメイン、抗ＴＮＦＲ、抗ＴＮＦ−アルファ）に融合し、他の末端では第２のリンカーを介して、ＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬＩ７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２またはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニスト、またはＩＬ１０アゴニストなどの異なる結合ドメインに融合する。
【０１２６】
特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の第１のリンカーと第２のリンカーは、例えば配列番号４９７〜６０４および７９１〜７９６からそれぞれ独立に選択される。例えば、第一または第２のリンカーは、リンカー１０２（配列番号５８９）、４７（配列番号５４３）、８０（配列番号５７６）、またはこれらの任意の組合せであってよい。さらなる例では、１つのリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）であり、そして他のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）であり、または１つのリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）であり、そして他のリンカーはリンカー８０（配列番号５７６）である。さらなる例では、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ｘＲ、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬまたはＩＬ１０、ＴＮＦＲ外部ドメイン、またはＴＮＦ−アルファに特異的なドメインなどの、ＶＨおよびＶＬドメインを含む本開示の結合ドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に、リンカー４６（配列番号５４２）などのさらなる（第３の）リンカーを有するこｔができる。これらの実施形態のいずれかにおいて、リンカーは１〜５個の追加的接合アミノ酸と隣接していてもよく、これは単にこのような組換え分子の作製の結果であり得（例えば、核酸分子と接合するための特定の制限酵素認識部位の使用により、１個〜数個のアミノ酸の挿入をもたらし得る）、または本開示の目的のために、任意の特定のリンカーコア配列の一部と考えることができる。
【０１２７】
さらなる実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインは、免疫グロブリン定常領域またはサブ領域から構成され（好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤのＣＨ２ＣＨ３、またはＩｇＥもしくはＩｇＭのＣＨ３ＣＨ４）、介在ドメインはＴＮＦ−アルファアンタゴニストドメインと、ＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２もしくはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニスト結合ドメイン、またはＩＬ１０アゴニスト結合ドメインの間に配置される。特定の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインは、アミノ末端にＴＮＦ−アルファアンタゴニスト、およびカルボキシ末端にＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２もしくはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニスト結合ドメイン、またはＩＬ１０アゴニスト結合ドメインを有する。他の実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質の介在ドメインは、アミノ末端にＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２もしくはＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬアンタゴニスト結合ドメイン、またはＩＬ１０アゴニスト結合ドメイン、およびカルボキシ末端にＴＮＦ−アルファアンタゴニストを有する。さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはサブ領域は免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。関連実施形態では、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、以下の変異したアミノ酸：２３４位のロイシン（Ｌ２３４）、２３５位のロイシン（Ｌ２３５）、２３７位のグリシン（Ｇ２３７）、３１８位のグルタミン酸（Ｅ３１８）、３２０位のリシン（Ｋ３２０）、３２２位のリシン（Ｋ３２２）、またはこれらの任意の組合せ（ＥＵナンバリング）の１つまたは複数を有する（すなわち、その位置に異なるアミノ酸を有する）。例えば、これらのアミノ酸のいずれか１つをアラニンに変えることができる。さらなる実施形態では、ＥＵナンバリングによれば、ＣＨ２ドメインは、それぞれアラニンに変異したＬ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２（すなわち、それぞれＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２）を有する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、ＴＮＦＲ細胞外ドメインまたはサブドメイン、１つまたは複数のＴＮＦＲ  ＣＲＤドメイン（ＣＲＤ２およびＣＲＤ３など）、または（本明細書に記載するＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、またはＩＬ６ｘＲ複合体特異的抗体由来結合ドメインに類似した）ＴＮＦ−アルファ特異的抗体由来結合ドメインを含む、ＴＮＦ−アルファアンタゴニストを有する。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ−アルファアンタゴニストは、ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２の外部ドメインである。特定の実施形態では、ＴＮＦ−アルファアンタゴニストは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０５７．１（配列番号６７１）に記載の最初の２５７アミノ酸などの、（ｐ７５、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂとしても知られる）ＴＮＦＲ２のアミノ末端部分を含む。他の実施形態では、ＴＮＦ−アルファアンタゴニストは、配列番号６７１のアミノ酸２３〜２５７を含む（すなわち、天然リーダー配列を含まない）。好ましい実施形態では、ＴＮＦ−アルファアンタゴニストは、配列番号６７１のアミノ酸２３〜１６３または配列番号６７１のアミノ酸２３〜１８５または配列番号６７１のアミノ酸２３〜２３５などの、ＴＮＦＲ２の断片（例えば、外部ドメイン）を含む。他の好ましい実施形態では、ＴＮＦ−アルファアンタゴニストは、ＴＮＦＲ２断片の誘導体、１０９位にアミノ酸グルタミンの欠失がある配列番号６７１のアミノ酸２３〜１６３、または１０９位にアミノ酸グルタミンの欠失および１０９位にアミノ酸プロリンの欠失がある配列番号６７１のアミノ酸２３〜１８５、または１０９位にアミノ酸グルタミンの欠失、１０９位にアミノ酸プロリンの欠失、および２３５位に（例えば、スレオニン、アラニン、セリン、またはグルタミン酸と）アミノ酸アスパラギン酸の置換がある配列番号６７１のアミノ酸２３〜２３５などを含む。さらなる実施形態では、ＴＮＦ−アルファアンタゴニストは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０５６．１（配列番号６７２）に記載の最初の２１１アミノ酸などの、（ｐ５５、ＴＮＦＲＳＦ１Ａとしても知られる）ＴＮＦＲ１のアミノ末端部分を含む。他の実施形態では、ＴＮＦ−アルファアンタゴニストは、配列番号６７２のアミノ酸３１〜２１１を含む（すなわち、天然リーダー配列を含まない）。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、ＴＮＦ−アルファアンタゴニスト結合ドメイン、およびＩＬ６またはＩＬ６Ｒアルファ単独のいずれかよりもＩＬ６ｘＲに対しより高い親和性で結合し、ｓＩＬ６ｘＲ複合体がｍｇｐ１３０に結合するのと競合し、またはｓｇｐ１３０がｓＩＬ６ｘＲ複合体に結合するのをを高める、ＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインを有する。特定の実施形態では、ＩＬ６ｘＲ複合体に特異的な結合ドメインは、（ｉ）配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のいずれか１つにおいて見られるＶＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、または（ｉｉ）配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つにおいて見られるＶＬドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、または（ｉｉｉ）（ｉ）のＶＨドメインと（ｉｉ）のＶＬドメインの両方、またはＶＨとＶＬが同じ参照配列に由来する（ｉ）のＶＨドメインと（ｉｉ）のＶＬドメインの両方を含む。一実施形態では、このようなＶＨおよびＶＬドメインは、例示的な結合ドメインＴＲＵ６−１００２を形成することができる（それぞれ配列番号３７４および４３６を参照されたい）。特定の実施形態では、ＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインを含む多重特異性融合タンパク質は、ＩＬ６シスおよびトランスシグナル伝達を測定可能に阻害し、そして場合によっては、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。
【０１３０】
まだその上さらなる実施形態では、ＩＬ６もしくはＩＬ６ＲアルファまたはＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒアルファいずれかの単独よりもＩＬ６ｘＲに対してより高い親和性で結合し、ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合に関してｇｐ１３０と競合し、またはｓｇｐ１３０のｓＩＬ６ｘＲ複合体への結合を高めるＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインは、フレームワーク領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むＶＨおよびＶＬドメインを含み、（ａ）ＶＨドメインは配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０のいずれか１つにおいて見られる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｂ）ＶＬドメインは配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４のいずれか１つにおいて見られる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、または（ｃ）結合ドメインは（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含み、または結合ドメインは、ＶＨアミノ酸配列とＶＬアミノ酸配列は同じ参照配列に由来する（ａ）のＶＨアミノ酸配列および（ｂ）のＶＬアミノ酸配列を含む。これらの多重特異性融合タンパク質のＶＬドメインとＶＨドメインはいずれかの配向に配置することができ、本明細書に開示する５〜３０アミノ酸のリンカーによって隔てることができる。特定の実施形態では、ＶＨドメインとＶＬドメインを接合するリンカーは、リンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＩＬ６アンタゴニスト結合ドメインを含む多重特異性融合タンパク質は、ＩＬ６シスおよびトランスシグナル伝達、好ましくはトランスシグナル伝達を測定可能に阻害し、そして場合によっては、ＩＬ６以外のｇｐ１３０ファミリーサイトカインのシグナル伝達を阻害しない。
【０１３１】
本明細書でＸｃｅｐｔｏｒ分子と呼ぶ、このような多重特異性融合タンパク質の例示的な構造は、ＢＤが免疫グロブリン様または免疫グロブリン可変領域結合ドメインであり、Ｘが介在ドメインであり、そしてＥＤが受容体外部ドメイン、セマフォリンドメインなどである、Ｎ−ＢＤ−Ｘ−ＥＤ−Ｃ、Ｎ−ＥＤ−Ｘ−ＢＤ−Ｃ、Ｎ−ＥＤ１−Ｘ−ＥＤ２−Ｃを含む。いくつかの構築物では、Ｘは第一と第２の結合ドメインの間に配置された免疫グロブリン定常領域またはサブ領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下のような構造：−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−、を含む介在ドメイン（Ｘ）を有し、ここで、Ｌ１およびＬ２がそれぞれ独立に２〜約１５０アミノ酸を含むリンカーであり、そしてＸが免疫グロブリン定常領域またはサブ領域（好ましくはＩｇＧ１のＣＨ２ＣＨ３）である。さらなる実施形態では、多重特異性融合タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、または別の血清中タンパク質結合タンパク質である介在ドメインを有し、前記融合タンパク質は組成物に単鎖ポリペプチドとして主にまたは実質的に残留する。なおさらなる実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、以下の構造：Ｎ−ＢＤ１−Ｘ−Ｌ２−ＢＤ２−Ｃを有し、ここで、ＮおよびＣがアミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ表し、ＢＤ１がＴＮＦＲ外部ドメインと少なくとも約９０％同一であるＴＮＦ−アルファアンタゴニストであり、−Ｘ−が−Ｌ１−ＣＨ２ＣＨ３−であり、前式でＬ１が第一システインの置換により場合によっては変異したＩｇＧ１ヒンジであり、そして−ＣＨ２ＣＨ３−が、場合によっては変異しＦｃＲｎの相互作用を保持しながらＦｃガンマＲＩ−ＩＩＩ相互作用を排除した、ＩｇＧ１ＦｃドメインのＣＨ２ＣＨ３領域であり、Ｌ２が配列番号４９７〜６０４および７９１〜７９６から選択される非（Ｇ４Ｓ）ベースリンカーであり、そしてＢＤ２が本明細書に記載するようなＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２またはＢＬｙｓ／ＡＰＲＩＬアンタゴニスト結合ドメインまたはＩＬ１０アゴニスト結合ドメインである。
【０１３２】
特定の実施形態では、多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号６７１もしくは６７２に記載の配列、または配列番号６７１もしくは６７２に記載の約１４０〜約２１５アミノ酸の隣接断片と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−アルファアンタゴニスト、および（ｂ）ＩＬ６、ＩＬ６ＲアルファまたはＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒアルファいずれかの単独よりもＩＬ６ｘＲに対してより高い親和性で結合し、ｓＩＬ６ｘＲ複合体との結合に関してｍｇｐ１３０と競合し、またはｓｇｐ１３０のｓＩＬ６ｘＲとの結合を高めるＩＬ６アンタゴニストを有し、それぞれ配列番号４３５〜４９６および８０５〜８１０に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１、ＣＤ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号３７３〜４３４および７９９〜８０４に記載の配列と少なくとも８０％〜１００％同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、ここで、アミノ末端からカルボキシ末端まで、またはカルボキシ末端からアミノ末端までにおいて、（ｉ）（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＬ６アンタゴニストが第１のリンカーと融合している、（ｉｉ）前記第１のリンカーが配列番号６０８のアミノ酸２７５〜４８９を含むＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合している、（ｉｉｉ）前記ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合している、かつ（ｉｖ）前記第２のリンカーが（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストと融合しているかまたは（ｂ）のＩＬ６アンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、前記第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）またはリンカー８０（配列番号５７６）であり、前記第２のリンカーはリンカー１０２（配列番号５８９）であり、前記ＩＬ６アンタゴニストのＶＨドメインとＶＬドメインの間のさらなる（第３の）リンカーはリンカー４６（配列番号５４２）である。
【０１３３】
なおさらなる実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、リーダーペプチド（すなわち、これらの配列に見られる最初の２３アミノ酸）有りまたは無しの配列番号６０７〜６６８のいずれか１つに記載の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、本開示の多重特異性融合タンパク質は、配列番号６７１のアミノ酸２３〜２５７、２３〜１６３、２３〜１８５、または２３〜２３５を含むＴＮＦ−アルファアンタゴニスト、およびＩＬ６、ＩＬ６ＲアルファまたはＩＬ６もしくはＩＬ６Ｒアルファいずれかの単独よりもＩＬ６ｘＲ複合体に対してより高い親和性で結合し、ｓＩＬ６ｘＲ複合体への結合に関してｍｇｐ１３０と競合し、またはｓＩＬ６ｘＲとのｓｇｐ１３０の結合を高めるＩＬ６アンタゴニストであって、リンカー４６（配列番号５４２）を介して配列番号４３６のＶＨと接合した配列番号３７４のＶＬを含み、ここで、前記ＴＮＦ−アルファアンタゴニストは、リンカー４７（配列番号５４３）を介して配列番号６０８のアミノ酸２７５〜４８９を含むＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域を含む介在ドメインのアミノ末端と接合し、前記ＩＬ６アンタゴニストはリンカー１０２（配列番号５８９）を介して前記介在ドメインのカルボキシ末端と接合している。一実施形態では、前記多重特異性融合タンパク質は配列番号６０８に記載のアミノ酸配列を有する。
【０１３４】
他の実施形態では、多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号６７１もしくは６７２に記載の配列、または配列番号６７１もしくは６７２に記載の約１４０〜約２１５アミノ酸の隣接断片と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−アルファアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号７４１と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＷＥＡＫアンタゴニスト結合ドメインを有し、アミノ末端からカルボキシ末端までまたはカルボキシ末端からアミノ末端までにおいて、（ｉ）（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＴＷＥＡＫアンタゴニストが第１のリンカーと融合している、（ｉｉ）前記第１のリンカーが配列番号７９８のアミノ酸２７５〜４８９を含むＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合している、（ｉｉｉ）前記ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合している、そして（ｉｖ）前記第２のリンカーが（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＴＷＥＡＫアンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、前記第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）であり、前記第２のリンカーはリンカー１７５（配列番号７９１）である。一実施形態では、前記多重特異性融合タンパク質は配列番号７９８に記載のアミノ酸配列を有する（配列番号８０５で示す核酸配列に相当）。
【０１３５】
他の実施形態では、多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号６７１もしくは６７２に記載の配列、または配列番号６７１もしくは６７２に記載の約１４０〜約２１５アミノ酸の隣接断片と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−アルファアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号７３７と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＲＡＮＫＬアンタゴニスト結合ドメインを有し、アミノ末端からカルボキシ末端までまたはカルボキシ末端からアミノ末端までにおいて、（ｉ）（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＲＡＮＫＬアンタゴニストが第１のリンカーと融合している、（ｉｉ）前記第１のリンカーが配列番号７９９のアミノ酸２５３〜４６８を含むＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合している、（ｉｉｉ）前記ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合している、そして（ｉｖ）前記第２のリンカーが（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＲＡＮＫＬアンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、前記第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）であり、前記第２のリンカーはリンカー１７５（配列番号７９１）である。一実施形態では、前記多重特異性融合タンパク質は配列番号７９９に記載のアミノ酸配列を有する（配列番号８０６で示す核酸配列に相当）。
【０１３６】
他の実施形態では、多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号６７１もしくは６７２に記載の配列、または配列番号６７１もしくは６７２に記載の約１４０〜約２１５アミノ酸の隣接断片と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−アルファアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号８１８または７４６と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＩＧＦアンタゴニスト結合ドメインを有し、ここで、アミノ末端からカルボキシ末端までまたはカルボキシ末端からアミノ末端までにおいて、（ｉ）（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＧＦアンタゴニストが第１のリンカーと融合している、（ｉｉ）前記第１のリンカーが配列番号８００のアミノ酸２５３〜４６８を含むＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合している、（ｉｉｉ）前記ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合している、そして（ｉｖ）前記第２のリンカーが（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＧＦアンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、前記第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）であり、前記第２のリンカーはリンカー１７５（配列番号７９１）である。一実施形態では、前記多重特異性融合タンパク質は配列番号８００に記載のアミノ酸配列を有する（配列番号８０７で示す核酸配列に相当）。
【０１３７】
他の実施形態では、多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号６７１もしくは６７２に記載の配列、または配列番号６７１もしくは６７２に記載の約１４０〜約２１５アミノ酸の隣接断片と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−アルファアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号７３８と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ７アンタゴニスト結合ドメインを有し、ここで、アミノ末端までからカルボキシ末端またはカルボキシ末端からアミノ末端までにおいて、（ｉ）（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＬ７アンタゴニストが第１のリンカーと融合している、（ｉｉ）前記第１のリンカーが配列番号８０１のアミノ酸２５３〜４６８を含むＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合している、（ｉｉｉ）前記ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合している、そして（ｉｖ）前記第２のリンカーが（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＬ７アンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、前記第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）であり、前記第２のリンカーはリンカー１７５（配列番号７９１）である。一実施形態では、前記多重特異性融合タンパク質は配列番号８０１に記載のアミノ酸配列を有する（配列番号８０８で示す核酸配列に相当）。
【０１３８】
他の実施形態では、多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号６７１もしくは６７２に記載の配列、または配列番号６７１もしくは６７２に記載の約１４０〜約２１５アミノ酸の隣接断片と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−アルファアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号７３９、７４０、８１６または８１７と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ１７アンタゴニスト結合ドメインを有し、ここで、アミノ末端からカルボキシ末端までまたはカルボキシ末端からアミノ末端までにおいて、（ｉ）（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＬ１７アンタゴニストが第１のリンカーと融合している、（ｉｉ）前記第１のリンカーが配列番号８０２または８０３のアミノ酸２５３〜４６８を含むＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合している、（ｉｉｉ）前記ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合している、そして（ｉｖ）前記第２のリンカーが（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＬ１７アンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、前記第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）であり、前記第２のリンカーはリンカー１７５（配列番号７９１）である。一実施形態では、前記多重特異性融合タンパク質は配列番号８０２または８０３に記載のアミノ酸配列を有する（それぞれ配列番号８０９および８１０で示す核酸配列に相当）。
【０１３９】
他の実施形態では、多重特異性ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、（ａ）配列番号６７１もしくは６７２に記載の配列、または配列番号６７１もしくは６７２に記載の約１４０〜約２１５アミノ酸の隣接断片と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−アルファアンタゴニスト、および（ｂ）配列番号７４７または８１８と少なくとも８０％〜１００％同一である、配列番号８０４のアミノ酸４９０〜７２３と少なくとも８０％〜１００％同一である、配列番号８１２のアミノ酸２１〜９２２と少なくとも８０％〜１００％同一である、または配列番号８１３のアミノ酸２１〜７２６と少なくとも８０％〜１００％同一であるアミノ酸配列を含むＩＧＦアンタゴニスト結合ドメインを有し、ここで、アミノ末端からカルボキシ末端までまたはカルボキシ末端からアミノ末端までにおいて、（ｉ）（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＧＦアンタゴニストが第１のリンカーと融合している、（ｉｉ）前記第１のリンカーが配列番号８０４のアミノ酸２５３〜４６８を含むＣＨ２およびＣＨ３の免疫グロブリン重鎖定常領域と融合している、（ｉｉｉ）前記ＣＨ２ＣＨ３定常領域ポリペプチドが第２のリンカーと融合している、そして（ｉｖ）前記第２のリンカーが（ａ）のＴＮＦ−アルファアンタゴニストまたは（ｂ）のＩＧＦアンタゴニストと融合している。特定の実施形態では、前記第１のリンカーはリンカー４７（配列番号５４３）であり、前記第２のリンカーはリンカー１７５（配列番号７９１）である。一実施形態では、前記多重特異性融合タンパク質は配列番号８０４に記載のアミノ酸配列を有する（それぞれ配列番号８１１で示す核酸配列に相当）。
多重特異性融合タンパク質の作製
本明細書に記載する任意の結合ドメインポリペプチドまたは融合タンパク質を効率よく産生するために、リーダーペプチドを使用して発現されるポリペプチドおよび融合タンパク質の分泌を容易にする。任意の従来のリーダーペプチド（シグナル配列）の使用は、初期に発現されたポリペプチドまたは融合タンパク質を分泌経路に誘導し、リーダーペプチドとポリペプチドまたは融合タンパク質の間の接合部またはその近辺での成熟ポリペプチドまたは融合タンパク質からのリーダーペプチドの切断をもたらすと予想される。特定のリーダーペプチドは、分子操作を容易にするためのリーダーペプチドのコード配列の開始点または終点における制限エンドヌクレアーゼ切断部位の容易な含有を可能にする、ポリヌクレオチドによってコードされる配列の使用など、当技術分野で公知である考慮事項に基づいて選択される。ただし、このような導入配列は、初期に発現されたタンパク質からのリーダーペプチドのいかなる所望のプロセシングにも許容されない形では干渉しない、またはリーダーペプチドがポリペプチドまたは融合タンパク質の成熟中に切断されない場合、ポリペプチドまたは融合タンパク質分子のいかなる所望の機能にも許容されない形では干渉しない、アミノ酸を指定するものとする。本開示の例示的なリーダーペプチドには、天然リーダー配列（すなわち、天然タンパク質で発現される配列）、またはＸが任意のアミノ酸でありｎが０〜３であるＨ３Ｎ−ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧ（Ｘ）ｎ−ＣＯ２Ｈ（配列番号７４４）またはＨ３Ｎ−ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ−ＣＯ２Ｈ（配列番号７４５）などの異種リーダー配列の使用が含まれる。
【０１４０】
本明細書に記すように、本明細書に記載する、外部ドメインなどの結合ドメインの変異体および誘導体、軽鎖および重鎖可変領域およびＣＤＲが意図される。一例では、１つまたは複数のアミノ酸残基が特異的結合因子のアミノ酸配列を補う挿入変異体を提供する。挿入はタンパク質の一末端または両末端に位置してよく、または特異的結合因子のアミノ酸配列の内部領域内に位置してよい。本開示の変異体生成物は、成熟状態の特異的結合因子の生成物、すなわちリーダーまたはシグナル配列が除去され、生成するタンパク質が追加的アミノ末端残基を有する特異的結合因子の生成物も含む。追加的アミノ末端残基は別のタンパク質に由来してよく、または特異的タンパク質に由来するとして同定可能ではない１つまたは複数の残基を含むことができる。位置−２および−１に追加的メチオニンおよびリシン残基を有する本開示のポリペプチドと同様に、位置−１に追加的メチオニン残基を有するポリペプチドを意図する。追加的Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−ＬｙｓまたはＬｙｓ残基（または一般に１つまたは複数の塩基性残基）を有する変異体は、細菌宿主細胞での高い組換えタンパク質産生に特に有用である。
【０１４１】
本明細書で使用する「アミノ酸」は、天然アミノ酸（自然界に存在するアミノ酸）、置換された天然アミノ酸、非天然アミノ酸、置換された非天然アミノ酸、またはこれらの任意の組合せを指す。天然アミノ酸に関する指定は、本明細書では標準一文字または三文字コードのいずれかとして記述する。天然極性アミノ酸は、アスパラギン（ＡｓｐまたはＮ）およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、およびアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、およびこれらの誘導体などの塩基性アミノ酸、ならびにアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、およびこれらの誘導体などの酸性アミノ酸を含む。天然疎水性アミノ酸は、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、およびこれらの誘導体、ならびにグリシン（ＧＩｙまたはＧ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、およびこれらの誘導体などの他の非極性アミノ酸を含む。中程度の極性の天然アミノ酸は、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、およびこれらの誘導体を含む。他に指定しない限り、本明細書に記載する任意のアミノ酸はＤ−またはＬ−形状（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）のいずれかであってよい。
【０１４２】
置換変異体は、アミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基が除去され別の残基に置換されている融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、置換は現実には保存性であるが、しかしながら、本開示は非保存的である置換も包含する。物理的性質および二次および三次タンパク質構造に対する寄与に従って、アミノ酸を分類することができる。保存的置換は、類似した性質を有する別のアミノ酸に代えて１つのアミノ酸の置換として、当技術分野で理解されている。例示的な保存的置換は、すぐ下の表１に述べる（１９９７年３月１３日に公開されたＷＯ９７／０９４３３、１０頁を参照されたい）。
【表１】
2011526792.tif 000004
【０１４３】
あるいは、保存的アミノ酸は、すぐ下の表２に述べるように、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．  ＮＹ：ＮＹ（１９７５年）、７１〜７７頁）に記載されたのと同様に分類することができる。
【表２】
2011526792.tif 000005
【０１４４】
変異体または誘導体は、特異的発現系の使用から生じる追加的アミノ酸残基を有することもできる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合生成物の一部として所望のポリペプチドを発現する市販のベクターの使用は、該所望のポリペプチドからのＧＳＴ成分の切断後に位置−１に追加的グリシン残基を有する、該所望のポリペプチドを与える。ヒスチジンタグが、アミノ酸配列、一般に配列のカルボキシおよび／またはアミノ末端に取り込まれている変異体を含めた、他のベクター系での発現から生じる変異体も意図される。
【０１４５】
本開示の結合ドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸残基が除去されている、欠失変異体も意図される。欠失は融合タンパク質の一末端もしくは両末端で生じ得るか、またはアミノ酸配列内の１つもしくは複数の残基の除去からもたらされ得る。
【０１４６】
特定の例示的実施形態では、本開示の融合タンパク質はグリコシル化されており、グリコシル化のパターンは、（組換え宿主細胞で調製される場合）タンパク質が発現される宿主細胞、および培養条件を含めた様々な要因に依存する。
【０１４７】
本開示は、融合タンパク質の誘導体も提供する。誘導体は、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾を有する特異的結合ドメインポリペプチドを含む。特定の実施形態では、修飾は現実には共有結合であり、例えば、ポリマー、脂質および他の有機または無機成分との化学結合を含む。本開示の誘導体を調製して特異的結合ドメインポリペプチドの循環半減期を増大することができ、または本開示の誘導体を設計して、所望の細胞、組織もしくは器官に対する該ポリペプチドの標的化能力を改善することができる。
【０１４８】
本開示は、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号および同第４，１７９，３３７号に記載されたような、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールなどの１つまたは複数の水溶性ポリマーの結合を含むように、共有結合により修飾されたかまたは誘導体化された融合タンパク質をさらに包含する。当技術分野で公知であるさらに他の有用なポリマーには、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースおよび他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、およびこれらのポリマーの混合物が挙げられる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体化タンパク質である。水溶性ポリマーは特異的位置、例えば本開示によるタンパク質およびポリペプチドのアミノ末端で結合することができ、またはポリペプチドの１つもしくは複数の側鎖とランダムに結合することができる。治療能力を改善するためのＰＥＧの使用は米国特許第６，１３３，４２６号に記載される。
【０１４９】
本開示の特定の実施形態は免疫グロブリンまたはＦｃ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、特にＦｃドメインがＦｃＲｎ、新生児Ｆｃ受容体と相互作用することができる場合、長い半減期、例えば数時間、１日以上、またはさらに１週間以上を有することができる。ＦｃドメインにおけるＦｃＲｎに関する結合部位は、細菌プロテインＡおよびＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質間の強い結合は、例えば、タンパク質精製にプロテインＡまたはタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを利用することによって、本開示の抗体または融合タンパク質を精製するための手段として使用することができる。
【０１５０】
タンパク質の精製技法は当業者には周知である。これらの技法は、１レベルでの、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分の粗製物分画を含む。部分的または完全な精製（または均質性までの精製）を実施するためにクロマトグラフィー技法および電気泳動技法を使用する、さらなる精製がしばしば所望される。純粋融合タンパク質の調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に有効な方法は、迅速タンパク質液体クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣである。
【０１５１】
本開示の特定の態様は、融合タンパク質の精製、および特定の実施形態では、融合タンパク質の実質的精製に関する。本明細書で使用する用語「精製融合タンパク質」は他の成分から単離可能な組成物を指すものとし、融合タンパク質は、その自然に得られる状態に対して任意の程度まで精製される。したがって精製融合タンパク質は、それが天然に存在し得る環境から遊離した融合タンパク質も指す。
【０１５２】
一般に「精製された」は、様々な他の成分を除去するための分画を施した融合タンパク質の組成物を指し、その組成物はその発現される生物活性を実質的に保持する。用語「実質的に精製された」を使用する場合、この表記は、融合タンパク質が組成物の主成分を形成する：例えば、組成物の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９重量％以上のタンパク質を構成する、融合結合タンパク質の組成物を指す。
【０１５３】
精製度を定量化するための様々な方法は、本開示に照らすと当業者には公知である。これらは例えば、活性画分の特異的結合活性の決定、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による画分の融合タンパク質の量の評価を含む。タンパク質画分の純度を評価するのに好ましい方法は、画分の結合活性を計算し、それを初期抽出物の結合活性と比較し、したがって「精製倍数」によって評価する本明細書の精製度を計算することである。結合活性の量を表すために使用する実際の単位は、当然ながら、精製を追跡するために選択する個々のアッセイ技法、および発現される融合タンパク質が検出可能な結合活性を示すかどうかに依存する。
【０１５４】
タンパク質精製において使用するのに適した様々な技法は、当業者には周知である。これらは例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いた沈澱、または熱変性、次に遠心分離；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、および親和性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；およびこれらの技法と他の技法の組合せを含む。当技術分野で一般に公知であるように、これらの様々な精製工程を実施する順序は変えることができること、または特定の工程を省略して、実質的に精製されたタンパク質の調製に適した方法をさらにもたらすことができることが考えられる。
【０１５５】
融合タンパク質は常にその最も精製された状態で提供されるという、一般要件は存在しない。実際、実質的にあまり精製されていないタンパク質が、特定の実施形態において有用性があるということが意図される。部分的な精製は、組合せにおいてより少ない精製工程を使用することによって、または同じ一般的な精製スキームの異なる形態を利用することによって実施することができる。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実施するカチオン交換カラムクロマトグラフィーは、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技法より高い精製を、一般にもたらすであろうことは理解される。相対的低精製度を示す方法は、タンパク質産物の全体的回収、または発現されたタンパク質の結合活性の維持において利点があり得る。
【０１５６】
ポリペプチドの移動は、異なるＳＤＳ／ＰＡＧＥ条件と共に、時には著しく変わる可能性があることは公知である（Ｃａｐａｌｄｉら、（１９７７年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ７６巻：４２５頁）。したがって、異なる電気泳動条件下において、精製または部分的に精製された融合タンパク質発現産物の見かけの分子量が、変わる可能性があることは理解されよう。
ポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞
本開示は、本開示の多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（単離または精製または純粋ポリヌクレオチド）、このようなポリヌクレオチドを含むベクター（クローニングベクターおよび発現ベクターを含む）、および本開示によるポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトした細胞（例えば、宿主細胞）を提供する。
【０１５７】
特定の実施形態では、本開示の結合ドメイン、または１つまたは複数のこのような結合ドメインを含有する多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を意図する。多重特異性融合タンパク質構築物をコードする発現カセットは、添付の実施例において提供される。
【０１５８】
本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含むベクター、および特に、組換え発現構築物にも関する。一実施形態では、本開示は、本開示のＴＮＦ−アルファアンタゴニストドメインおよびＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２もしくはＢＬｙｓ／ＡＰＲＩＬアンタゴニスト結合ドメインまたはＩＬ１０アゴニスト結合ドメイン、ならびにこのような多重特異性融合タンパク質コード配列の転写、翻訳およびプロセシングを引き起こすかまたは容易にする他のポリヌクレオチド配列を含有する多重特異性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを意図する。
【０１５９】
原核生物および真核生物宿主と共に使用するのに適したクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８９年）に記載される。例示的なクローニング／発現ベクターには、クローニングベクター、シャトルベクターおよびプラスミド、ファージミド、ファスミド、コスミド、ウイルス、人工染色体に基づいてよい発現構築物、または核酸媒体中に含有されるポリヌクレオチドの増幅、移動および／または発現に適していることが当技術分野で公知である任意の核酸媒体が挙げられる。
【０１６０】
本明細書で使用する「ベクター」は、連結した別の核酸を運ぶことができる核酸分子を意味する。例示的なベクターには、プラスミド、酵母人工染色体およびウイルスゲノムが含まれる。特定のベクターは宿主細胞で自己複製することができるが、一方他のベクターは宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼び、これらは発現制御配列と作動可能に連結し、したがってこれらの配列の発現を誘導することができる核酸配列を含有する。
【０１６１】
特定の実施形態では、発現構築物はプラスミドベクターに由来する。例示的な構築物には、アンピシリン耐性遺伝子、ポリアデニル化シグナルおよびＴ７プロモーター部位をコードする核酸配列を有する修飾ｐＮＡＳＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ＣＨＥＦ１プロモーターを有するｐＤＥＦ３８およびｐＮＥＦ３８（ＣＭＣ  ＩＣＯＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、およびＣＭＶプロモーターを有するｐＤ１８（Ｌｏｎｚａ）が挙げられる。他の適切な哺乳動物発現ベクターが周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲を参照；例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪからのカタログも参照されたい）。適切な選択剤（例えば、メトトレキセート）の施用後の遺伝子増幅に起因する融合タンパク質の高い産生レベルを促進するのに適した調節制御下で、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）コード配列を含む、有用な構築物を調製することができる。
【０１６２】
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカー、および前記したような下流構造配列の転写を誘導するための高発現遺伝子由来のプロモーターを含み得る。本開示によるポリヌクレオチドと作動可能に連結したベクターは、クローニングまたは発現構築物をもたらす。例示的なクローニング／発現構築物は、少なくとも１つの発現制御エレメント、例えば本開示のポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターを含有する。本開示によるベクターおよびクローニング／発現構築物における、エンハンサー、因子特異的結合部位、ターミネーターおよびリボソーム結合部位などの、追加の発現制御エレメントも意図される。本開示によるポリヌクレオチドの異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列とともに適切な段階で構築する。したがって、例えば、本明細書で提供する融合タンパク質コード核酸は、宿主細胞でこのようなタンパク質を発現させるための組換え発現構築物としての、様々な発現ベクター構築物のいずれか１つに含ませることができる。
【０１６３】
適切なＤＮＡ配列（複数可）を、様々な手順によって例えばベクターに挿入することができる。一般に、当技術分野で公知である手順によって、適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（複数可）にＤＮＡ配列を挿入する。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための標準的技法、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含めた酵素反応のための標準的技法、および様々な分離技法が意図される。いくつかの標準的技法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｉｎｃ．＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、１９９３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ、１９８２年）；Ｇｌｏｖｅｒ  （Ｅｄ．）（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９８５年）；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  （Ｅｄｓ．）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ、１９８５年）；およびその他に記載される。
【０１６４】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えば、構成的プロモーターまたは制御的プロモーター（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ））と作動可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を誘導する。このような発現制御配列の代表例には、前記したような真核生物細胞またはそれらのウイルスのプロモーターが含まれる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを選択マーカーとともに使用して、任意の所望の遺伝子から選択することができる。真核生物プロモーターには、ＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は十分に当業者のレベルの範囲内であり、本開示によるタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連結した少なくとも１つのプロモーターまたは制御的プロモーターを含む、特定の特に好ましい組換え発現構築物の調製は、本明細書に記載する。
【０１６５】
本開示のポリヌクレオチドの変異体も意図する。変異体ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する定義された配列のポリヌクレオチドの１つと少なくとも９０％、および好ましくは９５％、９９％、または９９．９％同一であり、または約６５〜６８℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または約４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドのストリンジェントハイブリダイゼーション条件下において、定義された配列のこれらのポリヌクレオチドの１つとハイブリダイズする。ポリヌクレオチド変異体は、結合ドメイン、またはその融合タンパク質をコードする能力を保持し、本明細書に記載する機能を有する。
【０１６６】
用語「ストリンジェント」を使用して、ストリンジェントとして当技術分野で一般に理解されている条件を指す。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関するストリンジェント条件の例は、約６５〜６８℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または約４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミドである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年参照されたい）。
【０１６７】
よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高濃度のホルムアミドまたは他の変性剤など）も使用することはできるが、しかしながら、ハイブリダイゼーションの割合は影響を受ける可能性がある。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する場合、さらなる例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチド用）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチド用）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチド用）、および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチド用）における６×ＳＳＣ、０．０５％のピロリン酸ナトリウム中での洗浄を含む。
【０１６８】
本開示のさらなる態様は、本開示のポリヌクレオチドまたはベクター／発現構築物のいずれかを用いて形質転換またはトランスフェクトした、または他の方法でそれらを含有する宿主細胞を提供する。本開示のポリヌクレオチドまたはクローニング／発現構築物は、形質転換、トランスフェクション、および形質導入を含めた、当技術分野で公知である任意の方法を使用して適切な細胞に導入する。宿主細胞は、例えばｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法を含めたｅｘ  ｖｉｖｏ細胞療法を受けた被験体の細胞を含む。本開示によるポリヌクレオチド、ベクター、またはタンパク質を有するとき本開示の一態様として意図する真核生物宿主細胞には、被験体自身の細胞（例えば、ヒト患者自身の細胞）に加えて、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（発現される多価結合分子のグリコシル化パターンを修飾することができる修飾型ＣＨＯ細胞を含む、米国特許出願公開Ｎｏ．２００３／０１１５６１４を参照されたい）、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｎ細胞、３Ｔ３細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、および本開示によるタンパク質またはペプチドの発現、そして場合によっては単離において有用であることが当技術分野で公知である任意の他の真核生物細胞が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｉｌ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ、または本開示によるタンパク質またはペプチドの発現、そして場合によっては単離に適していることが当技術分野で公知である任意の原核生物細胞を含めた、原核生物細胞も意図される。原核生物細胞からタンパク質またはペプチドを単離する際に、特に、封入体からタンパク質を抽出するための当技術分野で公知である技法を、使用することができることが意図される。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内にある。本開示の融合タンパク質をグリコシル化する宿主細胞が意図される。
【０１６９】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターを含有する細胞を指す。このような用語は、特定の被験体細胞だけでなく、このような細胞の子孫を指すことを目的とすることは理解されるはずである。特定の修飾は変異または環境の影響のいずれかによって後の世代で起こる可能性があるので、このような子孫は、実際は、親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
【０１７０】
組換え宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、または特定遺伝子の増幅に適するように改変した従来の栄養培地で培養することができる。例えば温度、ｐＨなどの、発現用に選択した特定宿主細胞のための培養条件は、当業者には容易に明らかであろう。様々な哺乳動物細胞培養系を利用して、組換えタンパク質を発現させることも可能である。哺乳動物発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１年）Ｃｅｌｌ  ２３巻：１７５頁によって記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合ベクターを発現することができる他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、例えば、多価結合タンパク質発現構築物の調製に関して本明細書に記載するように、複製起点、適切なプロモーター、そして場合によってはエンハンサー、およびさらに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列を含む。ＳＶ４０スプライス、およびポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を使用して、必要とされる非転写遺伝子エレメントを与えることができる。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓら、（１９８６年）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）を含めた、当業者が精通している様々な方法によって実施することができる。
【０１７１】
一実施形態では、本開示によるタンパク質またはポリペプチドの発現を誘導する組換えウイルス構築物を、宿主細胞に形質導入する。形質導入した宿主細胞は、ウイルス出芽中にウイルス粒子によって取り込まれた宿主細胞膜の一部分由来の、発現タンパク質またはポリペプチドを含有するウイルス粒子を生成する。
組成物および使用法
ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＢＬｙｓ／ＡＰＲＩＬまたはＩＬ１０調節不全と関連した疾患状態に罹患したヒトまたは非ヒト哺乳動物を治療するために、本開示の多重特異性融合タンパク質を、１回または複数回の投与過程後に疾患状態の症状を改善するのに有効である量で被験体に投与する。ポリペプチドであるので、本開示の多重特異性融合タンパク質は、以下でより十分に論じるように、注射または注入による静脈内投与に使用することができる、他の薬学的に許容される賦形剤の安定剤を場合によっては含む、薬学的に許容される希釈剤に縣濁または溶解することができる。
【０１７２】
薬学的に有効な用量は、疾患状態の発生を予防、阻害する、または疾患状態を治療する（症状を測定可能に、好ましくは症状全てを改善する）のに必要とされる用量である。薬学的に有効な用量は、治療薬、併用薬剤、および医学分野の当業者が認識している他の要因の考慮下での、疾患の型、使用する組成物、投与の経路、治療する被験体の型、特定被験体の身体特性に依存する。例えば、０．１ｍｇ／体重１ｋｇ〜１００ｍｇ／体重１ｋｇの量（一回用量として、または適切な間隔である１時間毎、毎日、毎週、毎月、またはこれらの任意の組合せで与える複数回用量で投与することができる）の活性成分を、本開示の結合ドメインポリペプチドまたは多重特異性融合タンパク質の効力に応じて投与することができる。
【０１７３】
特定の態様では、融合タンパク質の組成物を本開示によって提供する。本開示の医薬組成物は一般に、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と組合せて１つまたは複数の型の結合ドメインまたは融合タンパク質を含む。このような担体は、利用する用量および濃度でレシピエントに無毒である。治療用途の薬学的に許容される担体は薬剤分野では周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ  （Ｅｄ．）  １９８５年）に記載されている。例えば、生理的ｐＨで滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水を使用することができる。防腐剤、安定剤、色素などを医薬組成物内に提供することができる。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、またはｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを防腐剤として加えることができる。上記文献１４４９頁。さらに、抗酸化剤および縣濁剤を使用することができる。上記文献。本発明の化合物は遊離塩基または塩の形態のいずれかで使用することができ、両方の形態が本発明の範囲内に存在すると考えられる。
【０１７４】
医薬組成物は、バッファーなどの希釈剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、またはデキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオンまたは他の安定剤または賦形剤も含有することができる。中性緩衝生理食塩水、または非特異的血清アルブミンと混合した生理食塩水は、例示的な適切な希釈剤である。生成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液を使用して、凍結乾燥品として製剤にすることが好ましい。
【０１７５】
特定の実施形態では、ＩＬ６のシスシグナル伝達は最低限阻害されるかまたは全く阻害されない、すなわち、シスシグナル伝達のいかなる阻害も実質的ではなく、阻害が存在しない、無症状、または検出不能であることを意味する。ＩＬ６トランスシグナル伝達の阻害の程度は変わる可能性があるが、一般に、トランスシグナル伝達は、トランスシグナル伝達により媒介されるかまたはトランスシグナル伝達に関連する疾患状態の症状に対してプラスの作用を有する程度にまで変わる。特定の実施形態では、本開示の結合ドメインポリペプチドまたはその融合タンパク質によるＩＬ６のトランスシグナル伝達の阻害は、疾患の進行を遅延、停止、または逆行させることができる。
【０１７６】
本開示の組成物を使用して、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ６、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ７、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＴＷＥＡＫ、ＣＳＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬまたはＩＬ１０シグナル伝達によって媒介されるヒトおよび非ヒト哺乳動物における疾患状態を治療することができる。
【０１７７】
ＩＬ−６の生成の増大、したがってＩＬ−６シグナル伝達の生成の増大は、アルツハイマー病、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、ＳＬＥ）、炎症、心筋梗塞、ページェット病、骨粗しょう症、固形腫瘍（例えば、結腸癌、ＲＣＣ前立腺および膀胱癌）、特定の神経癌、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、キャッスルマン病、いくつかのリンパ腫亜型、慢性リンパ球性白血病、および特に、悪性メラノーマ）を含めた、様々な疾患のプロセスと関連している。いくつかの場合、ＩＬ−６は増殖経路と関連がある。それは、ヘパリン結合性上皮増殖因子および肝細胞増殖因子などの他の因子と作用するからである（例えば、Ｇｒａｎｔら、（２００２年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１巻：４６０頁；Ｂａｄａｃｈｅ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ（２００１年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１巻：３８３頁；Ｗａｎｇら、（２００２年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１巻：２５８４頁を参照されたい）。同様に、ＴＮＦスーパーファミリーが、数例を挙げると、癌（増殖、移動、転移を含めた腫瘍形成）、自己免疫疾患（ＳＬＥ、糖尿病）、慢性心不全、骨吸収、およびアテローム性動脈硬化症などの様々な障害と関係があることは公知である（例えば、Ａｇｇａｒｗａｌ（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  ３巻：７４５頁；Ｌｉｎら、（２００８年）Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２６巻：１３頁を参照されたい）。
【０１７８】
ＲＡＮＫ媒介シグナル伝達の増大を引き起こすＲＡＮＫ遺伝子における変異は、破骨細胞形成の増大をもたらし、家族性ページェット病を有する数人の患者で見られる増大した骨溶解の原因であることが示されている（例えば、Ｂｏｙｃｅ  ａｎｄ  Ｘｉｎｇ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００７年；９巻Ｓｕｐｐｌ１：Ｓ１を参照されたい）。ＲＡＮＫＬは腫瘍細胞増殖を誘導する役割を果たすと考えられる。それはいくつかの悪性腫瘍細胞によって、および乾癬性関節炎において発現されるからである（例えば、Ｒｉｔｃｈｌｉｎら、（２００３年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１１：８２１巻；Ｍｅａｓｅ（２００６年）Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  Ｆｏｒｕｍ  １２巻：４頁を参照されたい）。デノスマブ（ＲＡＮＫＬを阻害するモノクローナル抗体）を用いた、骨密度が低い閉経後女性の治療は、骨ミネラル濃度を増大させ、骨代謝マーカーを抑制することが示されている。同様に、デノスマブを臨床使用して、関節リウマチ（例えば、Ｃｏｈｅｎら、（２００８年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ５８巻：１２９９頁を参照されたい）および溶骨性癌（例えば、Ｌｉｐｔｏｎら、（２００７年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２５巻：４４３１頁を参照されたい）を有する個体を治療している。ＯＰＧの直接注射は骨吸収を低下させることが示されている（例えば、Ｍｏｒｏｎｙら、（１９９３年）Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．  Ｒｅｓ．  １４巻：１４７８頁を参照されたい）。
【０１７９】
ＩＬ７経路は、関節リウマチ、多発性骨髄腫、および歯周炎などの骨疾患と関連している（Ｃｏｌｕｃｃｉら、（２００７年）Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２１２巻：４７頁）。ＩＬ７経路は、それが炎症滑膜細胞によって生じるという点で関節リウマチにも関与し、滑膜Ｔ細胞と単球の同時培養において細胞接触依存性Ｔｈ１サイトカイン産生を誘導する（ｖａｎ  Ｒｏｏｎら、（２００８年）Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ．  ６７巻：１０５４頁）。ＩＬ７は、関節リウマチにおいて制御性Ｔ細胞機能を支配し得るＴ細胞活性化を含む、多数の炎症性応答を促進する。ＩＬ７はさらに、Ｔ細胞産生ならびに重要な破骨性サイトカインＲＡＮＫＬおよびＴＮＦアルファを誘導することによってｉｎ  ｖｉｖｏで骨消失を誘導する。さらにＩＬ７は、骨髄Ｂ２２０＋細胞の増殖を誘導することによってＯＣ前駆体プールの増大をもたらす（Ｔｏｒａｌｄｏら、（２００３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  １００巻：１２５頁）。関節リウマチを有する患者におけるＩＬ７のレベルおよび活性は、抗ＴＮＦアルファ治療に応答せず、ＩＬ７がこれらの患者における治療の良い標的であり得ることを示す（ｖａｎ  Ｒｏｏｎら、２００８年）。
【０１８０】
ＩＬ１７Ａの高いレベルは、関節リウマチ、乾癬および多発性硬化症を含めた、いくつかの慢性炎症疾患と関係している。例えばＩＬ１７のレベルの上昇は、関節リウマチ（ＲＡ）患者の滑液において生じることが報告されており、ＲＡの骨破壊特性において役割を果たすと考えられる。ＩＬ１７は、軟骨細胞およびヒト変形性関節症軟骨外植片でＮＯ生成を誘導することも示されている（Ａｔｔｕｒら、（１９９７年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ４０巻：１０５０頁）。さらに、ＩＬ１７Ａを中和する試薬は、ヒト疾患のいくつかのマウスモデルで疾患重度を顕著に改善することが示されている。
【０１８１】
ＩＬ１７Ｆは、関節炎（関節リウマチおよびライム病関節炎を含む）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症および喘息を含めた、いくつかの自己免疫疾患の発症と関係している（Ｂｅｔｔｅｌｉ  ａｎｄ  Ｋｕｃｈｒｏｏ（２００５年）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０１巻：１６９〜７１頁；Ｏｄａら、（２００６年）Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２００６年１月１５日；Ｎｕｍａｓａｋｅら、（２００４年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ９５巻：９７〜１０４頁）。Ｈｙｍｏｗｉｔｚらによる試験は、ＩＬ１７Ｆがプロテオグリカンの分解を増大し関節軟骨によるプロテオグリカンの合成を低下させる点で、ＩＬ１７Ｆは公知の炎症性サイトカインの中で特有であることを示している（Ｈｙｍｏｗｉｔｚら、（２００１年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２０巻：５３３２〜４１頁）。
【０１８２】
ＩＬ１７ＲＡは、関節炎、関節リウマチ、乾癬、炎症性腸疾患、多発性硬化症および喘息を含めた、いくつかの炎症状態において役割を果たすことが示されている（Ｌｉら、（２００４年）Ｈｕａｚｈｏｎｇ  Ｕｎｉｖ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  ２４巻：２９４頁；Ｆｕｊｉｎｏら、（２００３年）Ｇｕｔ  ５２巻：６５頁；Ｋａｕｆｆｍａｎら、（２００４年）Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １２３巻：１０３７〜１０４４頁；Ｍａｎｎｏｎら、（２００４年）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５１巻：２０６９頁；Ｍａｔｕｓｅｖｉｃｉｕｓら、（１９９９年）Ｍｕｌｔ．  Ｓｃｌｅｒ．  ５巻：１０１頁；Ｌｉｎｄｅｎら、（２０００年）Ｅｕｒ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｊ．  １５巻：９７３巻：およびＭｏｌｅｔら、（２００１年）Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０８巻：４３０頁）。
【０１８３】
同族ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＷＥＡＫＲまたは線維芽細胞増殖因子誘導性１４（Ｆｎ１４）は、非リンパ様細胞型によって発現されるＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｗｉｌｅｙら、（２００１年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５巻：８３７頁）。ＴＷＥＡＫおよびＴＷＥＡＫＲの発現は正常組織では比較的低いが、組織障害および疾患において顕著に上方制御される。ＴＷＥＡＫ／Ｒ経路は急性組織修復機能を容易にし、したがって生理学上は急性障害後に機能するが、慢性炎症疾患の状況では病理的に機能する。ＴＮＦとは対照的に、ＴＷＥＡＫは発生または恒常性において明らかな役割は果たさない。ＴＷＥＡＫ／Ｒ経路の概説はＢｕｒｋｌｙら、（２００７年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４０：１に与えられる。持続的に活性化されたＴＷＥＡＫは、慢性炎症、病的過形成および新脈管形成を促進し、前駆細胞の分化を阻害することによって組織修復をおそらく妨げる。ＴＷＥＡＫタンパク質は、活性化単球およびＴ細胞および腫瘍細胞系の表面で、および休止および活性化単球、樹状細胞およびＮＫ細胞においては細胞内で同定されている。ＴＷＥＡＫの発現は急性傷害、炎症疾患および癌では局所で顕著に増大し、これらは全て炎症細胞の浸潤および／または常在性の自然免疫細胞型の活性化と関係がある。循環ＴＷＥＡＫのレベルは、多発性硬化症および全身性エリテマトーデスなどの慢性炎症疾患を有する患者で顕著に増大することが示されている。
【０１８４】
ＴＷＥＡＫ阻害モノクローナル抗体は、マウスでのコラーゲン誘発型関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて有効であることが示されている（Ｋａｍａｔａら、（２００６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７巻：６４３３頁；Ｐｅｒｐｅｒら、（２００６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７巻：２６１０頁）。ヒト滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）に対するＴＷＥＡＫおよびＴＮＦの関節炎発症（ａｒｔｈｒｉｔｏｇｅｎｉｃ）活性は、しばしば付加的または相乗的であり、互いに無関係であるようであり、ＴＷＥＡＫとＴＮＦは関節リウマチの病状において平行して作用する可能性があることを示す。ＴＮＦ阻害剤に対するその臨床応答に関するＲＡ患者の不均一性は、ＴＷＥＡＫによる病的貢献を反映する可能性があると推測されている。
【０１８５】
米国特許第７，１６９，３８７号は、ＴＷＥＡＫに特異的なモノクローナル抗体の調製、および慢性ＧＶＨＤのマウスモデルを使用した、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症の様相を阻害するためのその使用を記載する。米国特許出願公開Ｎｏ．２００７／０２８０９４０は、ＴＷＥＡＫＲデコイ受容体、ならびにＴＷＥＡＫＲおよびＴＷＥＡＫに対する抗体、ならびに脳浮腫および細胞死と関係がある中枢神経系疾患の治療におけるそれらの使用を記載する。
【０１８６】
いくつかのグループは、ＣＳＦ２、およびその受容体が、関節炎患者の滑膜性の連結に存在することを示している（例えば、Ａｌｖａｒｏ−Ｇｒａｃｉａら、（１９９１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４６巻：３３６５頁を参照されたい）。さらにＣＳＦ２は、フェルティ症候群における好中球減少に関してＣＳＦ２で治療した患者において（Ｈａｚｅｎｂｅｒｇら、（１９８９年）Ｂｌｏｏｄ  ７４巻：２７６９頁）、または化学療法後に（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、（１９９１年）Ｌａｎｃｅｔ  ３３８巻：５１７頁）関節リウマチの再燃（ｆｌａｒｅ）を引き起こすことが示されている。多発性硬化症では、ＣＳＦ２の上昇したレベルは疾患の活動期と関係がある（Ｃａｒｒｉｅｒｉら、（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．  ２０巻：３７３頁；ＭｃＱｕａｌｔｅｒら、（２００１年）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９４巻：８７３頁）。肺および好酸球におけるＣＳＦ２の上昇したレベルは喘息において見られている（Ｂｒｏｉｄｅ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ（１９９１年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８８巻：１０４８頁）。
【０１８７】
ＩＧＦ１Ｒは、肉腫を含めた癌の治療において同定されている（Ｓｃｏｔｌａｎｄｉ  ＆  Ｐｉｃｃｉ（２００８年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２０巻：４１９〜２７頁；Ｙｕｅｎ  ＆  Ｍａｃａｕｌａｙ（２００８年）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ  １２巻：５８９〜６０３頁）。
【０１８８】
ＢＬｙＳ／ＡＰＲＩＬの上昇したレベルは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチおよびシェーグレン症候群などの自己免疫障害を有する患者において見られており、かつ高いＢＬｙＳのレベルは疾患重度の増大と関係がある（Ｃｈｅｅｍａら、（２００１年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ４４巻：１３１３頁；Ｇｒｏｏｍら、（２００２年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０９巻：５９頁；Ｚｈａｎｇら、（２００１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６巻：６頁）。さらに、ＡＰＲＩＬ、ＢＬｙＳ、およびＴＡＣＩ、ならびにＢＣＭＡは、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）腫瘍組織から得た悪性細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、強力な生存および増殖誘導シグナルを伝達することが示されており、ＨＬおよび他の型の癌の治療におけるこれらのタンパク質の考えられる役割が示される（Ｃｈｉｕら、（２００７年）Ｂｌｏｏｄ  １０９巻：７２９頁）。
【０１８９】
ＩＬ１０は免疫抑制の性質を有することは公知であり（Ｃｏｍｍｉｎｓら、（２００８）Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  ｌｍｍｕｎｏｌ．  １２１巻：１１０８〜１１頁；Ｍｉｎｇら、（２００８年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８巻：４６８〜４７６頁）、および乾癬（Ａｓａｄｕｌｌａｈら、（１９９９年）Ａｒｃｈ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １３５巻：１８７〜９２頁）および炎症性腸疾患（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、（２０００年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１９巻：１４６１〜７２頁）を有する患者へのＩＬ１０の投与後に有益な応答が見られている。
【０１９０】
本開示の結合ドメインを含む薬剤は、アルツハイマー病、関節リウマチ、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、乾癬、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、重度の難治性喘息、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、子宮内膜症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、シェーグレン症候群、多発性硬化症、グレーブス病、重度の難治性喘息、橋本病、キャッスルマン病、中枢神経系炎症、脳卒中、脳浮腫、移植片拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性および慢性炎症、アトピー性皮膚炎、ショック、腸疾患に基づく関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群、（セロネガティブ、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、強皮症、血管炎、骨髄炎（ｍｙｏｌｉｔｉｓ）、骨関節症、サルコイドーシス、硬化症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、狼瘡、スチル病、重症筋無力症、セリアック病、ギランバレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｉ型糖尿病、アジソン病、ページェット病、変形性関節疾患、骨粗しょう症および骨量の消失と関係がある他の障害、ならびにホルモン非依存性前立腺癌、溶骨性癌、多発性骨髄腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞増殖障害、および腎臓、乳房、結腸、肺、脳、および他の組織の進行癌を含めた癌を含めた、自己免疫障害および他の障害の治療に有用である。
【０１９１】
第２の薬剤と併せた、本開示の多重特異性融合タンパク質組成物の投与も意図される。第２の薬剤は、炎症、自己免疫、および癌などの特定の疾患状態に対する標準的治療剤として、当技術分野で認められている薬剤であってよい。意図される例示的な第２の薬剤には、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、化学療法剤、放射線療法剤、または他の活性薬剤および補助薬剤、またはこれらの任意の組合せが含まれる。
【０１９２】
「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され親化合物の所望の薬理活性を有する、本開示の結合ドメインポリペプチドまたは融合タンパク質の塩を指す。このような塩には、以下の（１）例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸で形成される酸付加塩、または例えば酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプタン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸で形成される酸付加塩、または（２）親化合物に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、またはアルミニウムイオンによって置換されるか、または例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基と配位結合するかのいずれかのときに形成される塩が挙げられる。
【０１９３】
特定の例示的実施形態では、本開示のポリペプチドまたは融合タンパク質を、例えばボーラス注射または注入によって静脈内投与する。静脈内以外の投与の経路には、経口、局所、非経口（例えば、舌下または口腔）、舌下、直腸、膣、鼻腔内、および脊髄周囲が含まれる。本明細書で使用する用語非経口は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、海綿内、鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）、尿道内注射または注入技法を含む。患者への組成物の投与により、その中に含有される活性成分に生物学的利用能を与えることができるように、医薬組成物を製剤化する。患者に投与される組成物は１つまたは複数の投薬単位（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ）の形態をとり、例えば錠剤は単一の投薬単位であってよく、かつエアロゾル形態での本開示の１つまたは複数の化合物の容器は複数の投薬単位を保持することができる。
【０１９４】
経口投与用に、スクロース、カオリン、グリセリン、スターチデキストラン、シクロデキストリン、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースなどの、賦形剤および／または結合剤が存在してよい。甘味剤、防腐剤、色素／着色剤、香味増進剤、またはこれらの任意の組合せが、場合によっては存在してよい。コーティングシェルも場合によっては使用することができる。
【０１９５】
注射により投与することを目的とする組成物に、１つまたは複数の界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、バッファー、安定剤、等張化剤、またはこれらの任意の組合せを、場合によっては含めることができる。
【０１９６】
核酸ベースの製剤に関して、または本開示による発現産物を含む製剤に関して、約０．０１μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を、例えば、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内経路によって、または所与の環境の状況下に適した当技術分野で公知である任意の経路によって投与する。好ましい用量は、例えば約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、約５μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇが特に好ましい。投与の回数および頻度は宿主の応答に依存することは、当業者には明らかであろう。
【０１９７】
本開示の医薬組成物は、例えば固体、液体、または気体（エアロゾル）の形などの、患者への投与を可能にする任意の形態であってよい。本明細書に記載する任意の経路による投与用に、組成物は液体の形態、例えばエリキシル剤、シロップ、溶液、乳濁液または懸濁液であってよい。
【０１９８】
本明細書で使用する液状医薬組成物は、溶液、懸濁液の形態、または他の同様の形態であれ、以下の構成成分：注射用水、食塩水溶液（例えば、生理食塩水溶液）、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、溶媒または懸濁媒体として働くことができる合成モノ−またはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファー、エチレンジアミン４酢酸などのキレート剤、およびナトリウム、塩化物、またはデキストロースなどの張性を調節するための薬剤の１つまたは複数を含むことができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。生理食塩水溶液は好ましい添加剤である。注射用医薬組成物は滅菌状態であることが好ましい。
【０１９９】
調製物に、アルミニウム塩、油中水型エマルジョン、生分解性油性ビヒクル、水中油型エマルジョン、生分解性マイクロカプセル、およびリポソームを含めた送達ビヒクルなどの、他の構成成分を含めることも所望される場合がある。このようなビヒクルにおいて使用するためのアジュバントの例には、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、グルカン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−インターフェロン、およびＩＬ−１５が含まれる。
【０２００】
当業者に公知である任意の適切な担体を本開示の医薬組成物において利用することができるが、担体の型は投与の形式、および徐放が所望されるかどうかに応じて変わる。非経口投与用に、担体は水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、バッファー、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。経口投与用に、前記の担体、または、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム、またはこれらの任意の組合せなどの固形担体のいずれかを利用することができる。
【０２０１】
本開示は、本開示の医薬組成物を含む投薬単位を意図する。このような投薬単位には、例えば、２区画バイアルまたはシリンジを含めた単回用量または複数用量バイアルまたはシリンジ、凍結乾燥形態で本開示の医薬組成物および他の再構成用希釈剤を含むバイアルまたはシリンジが含まれる。複数用量投薬単位は、例えば静脈内注入デバイスと結び付けるためのバッグまたはチューブであってもよい。
【０２０２】
本開示は、単位用量または複数用量容器、例えばバイアル中の医薬組成物、および本明細書に記載するような障害に罹患している患者に該組成物を投与するための説明書セットを含むキットも意図する。
【０２０３】
本明細書で言及する、全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、特許以外の刊行物、表、配列、ウエブページなどは、参照によってそれらの全容を本明細書に組み込む。以下の実施例は、本開示を制限するものではなく、例示することを目的とする。
【実施例】
【０２０４】
Ｘｃｅｐｔｏｒ配列
ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインおよび抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを有する例示的な多重特異性融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号６０７〜６６８で示され、かつ対応するヌクレオチド発現カセットはそれぞれ配列番号６７３〜７３４で示される（成熟タンパク質は配列番号６０７〜６６８で見られるシグナルペプチド配列を欠くことに留意する）。アミノ末端にＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインそしてカルボキシ末端に抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを有する多重特異性融合タンパク質は、本明細書ではＴＲＵ（ＸＴ６）−１００１〜ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０６２と呼ぶ。逆配向、すなわちアミノ末端に抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインそしてカルボキシ末端にＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインを有する融合タンパク質は、本明細書ではＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１００８およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９と呼ぶ。
【０２０５】
ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインおよびＴＷＥＡＫ、ＲＡＮＫＬ、ＩＧＦ１、ＩＬ７、ＩＬ１７またはＩＧＦアンタゴニスト結合ドメインを有する例示的な多重特異性融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号７９８〜８０４で示され、かつ対応するヌクレオチド発現カセットはそれぞれ配列番号８０〜８１１で示される。
【０２０６】
Ｆａｂ結合ドメインのファージライブラリーを、基本的にＨｏｅｔら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３巻：３４４頁に記載の通りに、ＩＬ６ｘＲ複合体に対して特異的な結合ドメインに関してスクリーニングした。結合ドメインは、ＰＣＲ増幅によってクローニングした。簡潔に述べると、ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、および重複によってＧ４Ｓリンカーを作製する適切なプライマーを用い、５６℃で９サイクルの初期アニーリング、次いで６２℃でさらに２０サイクルを行なって、Ｆａｂライブラリークローン由来のＶＬおよびＶＨ領域を増幅した。ＰＣＲ産物はアガロースゲルで分離し、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）ＰＣＲ精製カラムを使用して精製した。第二ラウンドのソーイング（ｓｅｗｉｎｇ）反応は、モル当量のＶＬおよびＶＨ産物とエクスパンドバッファーおよび水の混合、９５℃で５秒間の変性、次いで室温までゆっくりと冷却することを含んでいた。増幅のために、ｄＮＴＰの混合物を拡張酵素（Ｅｘｐａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅ）とともに加え、７２℃で１０秒間インキュベートした。外側プライマーを加え（５’ＶＨおよび３’ＶＬ）、混合物は６２℃のアニーリングおよび４５分の伸長反応で３５回サイクルに施した。生成した７５０塩基対の産物はゲルで精製し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、プラスミドｐＤ２８にクローニングした（さらなる詳細に関しては、米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号およびＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００７／１４６９６８を参照されたい）。結合活性は、Ｈｏｅｔら、（２００５年）に記載されたのと同様にＥＬＩＳＡによって調べた。
【０２０７】
本明細書に記載する様々なＳＭＩＰおよびＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質を、以下に記載するように活性に関して試験した。以下の実施例で使用した略語は、以下の用語を含む：ＰＢＳ−Ｔ：ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４および０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０；作業バッファー：ＰＢＳ−Ｔおよび１％のＢＳＡ；ブロッキングバッファー：ＰＢＳ−Ｔおよび３％のＢＳＡ。
【０２０８】
（実施例１）
ＸＣＥＰＴＯＲの発現
２９３細胞における、本明細書に開示のＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質の特定の発現を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、製造業者の指示書に従って実施した。
【０２０９】
個々の３０ｍｌのトランスフェクションのために、２８ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ中３×１０７細胞を使用した。トランスフェクション当日、細胞懸濁液の少量のアリコートを微小遠心管に移し、集塊をなす細胞の生存率および量を、トリパンブルー色素排除法を使用して決定した。この懸濁液を、４５秒間激しくボルテックスにかけ細胞の集塊を壊し、細胞総数をＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒまたは血球計数器を使用して決定した。細胞の生存率は９０％を上回った。所要の細胞を含有する振とうフラスコを、３７℃のインキュベーター内のオービタルシェイカーに配置した。
【０２１０】
個々のトランスフェクション試料について、脂質−ＤＮＡ複合体を以下のように調製した。３０μｇのプラスミドＤＮＡを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉで全容量１ｍｌに希釈し、緩やかに混合した。６０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉで全容量１ｍｌに希釈し、緩やかに混合し、室温において５分間インキュベートした。５分間のインキュベート後、希釈したＤＮＡを希釈した２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭに加え、全容量２ｍｌを得、緩やかに混合した。得られた溶液を、室温において２０〜３０分間インキュベートし、ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ複合体を形成させた。
【０２１１】
ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ複合体をインキュベートする一方で、細胞懸濁液をインキュベーターから取り出し、適量の細胞懸濁液を、滅菌、使い捨ての１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振とうフラスコに入れた。３０ｍｌのトランスフェクションのために、新鮮な、あらかじめ暖めておいたＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍを、全容量２８ｍｌまで加えた。
【０２１２】
ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ複合体のインキュベーション完了後、２ｍｌのＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ複合体を、振とうフラスコに加えた。２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉを、ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ複合体の代わりに陰性対照のフラスコに加えた。個々のフラスコは、全容量３０ｍｌを含有し、最終細胞密度はおよそ１×１０６生存細胞／ｍｌであった。この細胞を、空気中８％ＣＯ２の加湿雰囲気の３７℃のインキュベーターにおいて、１２５ｒｐｍで回転するオービタルシェイカーでインキュベートした。トランスフェクションのおよそ７日後に細胞を収穫し、組換えタンパク質の発現に関してアッセイした。
【０２１３】
ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインと、ＩＬ６／ＨＩＬ６結合ドメイン、ＴＷＥＡＫＲ外部ドメイン、ＯＰＧ外部ドメイン、ＩＬ７Ｒ外部ドメイン、ＩＬ１７Ｒ外部ドメインまたはＴＧＦβＲＩＩ外部ドメインのいずれかとを有するＸｃｅｐｔｏｒ分子を、上記のように２９３細胞において発現させた。
【０２１４】
（実施例２）
ＥＬＩＳＡによる、ＸＣＥＰＴＯＲのＩＬ６およびハイパーＩＬ６への結合
ハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６またはＩＬ６ｘＲ）、組換えヒトＩＬ６（ｒｈＩＬ６）およびヒト可溶性ＩＬ６Ｒの結合活性を、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２、１０１９、１０２５、１０４２、１０５８およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（それぞれ、配列番号６０８、６２５、６３１、６４８、６６４および６７０）に関して試験した。
ＨＩＬ６およびＩＬ６の結合
９６ウェルプレートの各ウェルに、ＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）中２μｇ／ｍｌ溶液のヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈した、Ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料およびヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中１５０ｐＭ溶液のヒトハイパーＩＬ６または組換えヒトＩＬ６から１００μｌ／ウェルを２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中１５０ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＩＬ６−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中で１：４，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（３，３，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｎｔｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、１ウェルあたりを５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
ｓＩＬ６Ｒの結合
９６ウェルプレートの各ウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中２μｇ／ｍｌ溶液のヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、それぞれ３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈した、Ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照の抗ヒトＩＬ−６Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および陰性対照のヒトＩｇＧまたはヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中７５ｐＭ溶液の組換えヒトｓＩＬ６Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中１００ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＩＬ６Ｒ−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中で１：４，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、１ウェルあたり５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２１５】
図１Ａおよび１Ｂのデータは、全Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質分子のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、ＨＩＬ６と結合できることを実証している。さらに、これらのアッセイは、Ｘｃｅｐｔｏｒのうち２種だけがｒｈＩＬ６と結合し（図１Ｂ）、ｓＩＬ６Ｒと結合するものはなかった（図１Ｃ）ので、Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質がＩＬ６ｘＲ複合体に対して特異性を有することを示している。関連する研究において、ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２およびＳＭＩＰ  ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２は、非ヒト霊長類のＭｕｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来のＩＬ６と交差反応することが見出された。
【０２１６】
（実施例３）
ＥＬＩＳＡによるＸＣＥＰＴＯＲのＴＮＦ−αへの結合
ＴＮＦ−αの結合活性を、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２、１０４２、１０５８、１０１９およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（それぞれ、配列番号６０８、６４８、６６４、６２５および６７０）に関して試験した。
【０２１７】
９６ウェルプレートの各ウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中２μｇ／ｍｌ溶液のヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファーを各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、それぞれ３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈した、Ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ））および組換えヒトＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）ならびに陰性対照のヒトＩｇＧまたはヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２ｎｇ／ｍｌ溶液の組換えヒトＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを２連のウェルに加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２００ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＴＮＦ−α−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で約１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中で１：１，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、１ウェルあたり５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２１８】
図２のデータは、検査した全てのＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、ＴＮＦ−αと結合できることを示している。
【０２１９】
（実施例４）
ＥＬＩＳＡによるＸＣＥＰＴＯＲのデュアルリガンドの結合
ＴＮＦ−αへの、およびＩＬ６ｘＲ複合体への同時結合を、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００６（配列番号６１２）に関して試験した。
【０２２０】
９６ウェルプレートの各ウェルに、１００μｌのヒトＨＩＬ−６溶液（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４）を加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファーを各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、３００ｎｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで３倍段階希釈したＸｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：ＨＩＬ６試料をＨＩＬ−６コーティングプレートの２連のウェルに１００μｌ／ウェル加えた。陰性対照は、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）および作業バッファーのみを含んだ。このプレートにカバーをして、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをして、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２００ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＴＮＦ−α−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをして、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：１，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を３から５分間加え、その後、１ウェルあたり５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２２１】
図３のデータは、Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質が、２種のリガンド（この場合、ＴＮＦ−αおよびハイパーＩＬ６）に同時に結合できることを実証している。
【０２２２】
（実施例５）
ＥＬＩＳＡによる、ハイパーＩＬ６のＧＰ１３０への結合のＸＣＥＰＴＯＲによる遮断
Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００４、１００６、１００７、１００８、１０１３および１０１９（配列番号６１０、６１２、６１３、６１４、６１９および６２５）による、ハイパーＩＬ６（ＩＬ６ｘＲ）の可溶性ｇｐ１３０受容体への結合の遮断を、実質的に以下のように試験した。
【０２２３】
９６ウェルプレートの各ウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中０．２５〜０．５μｇ／ｍｌ溶液のヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。以下の試料を、５０μｇ／ｍｌから出発して、作業バッファーで５倍段階希釈した：Ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照のヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ヒトＩＬ６Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに陰性対照の抗ヒトＩＬ６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトＩｇＧまたはＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）。等容量の段階希釈Ｘｃｅｐｔｏｒ試料を、ハイパーＩＬ６（最終ハイパーＩＬ６濃度が２．５ｎｇ／ｍｌ）と混合し、室温において１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、Ｘｃｅｐｔｏｒ／ＨＩＬ６混合物、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ、抗ヒトＩＬ６Ｒ、抗ヒトＩＬ６、ヒトＩｇＧおよびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）の段階希釈物を１００μｌ／ウェルで、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに加え、プレートにカバーをし、室温で約１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをして、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を約５から１５分間加え、その後、１ウェルあたり５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２２４】
図４のデータは、抗ＩＬ６ｘＲ結合ドメインを含有するＸｃｅｐｔｏｒタンパク質は、可溶性ｇｐ１３０がＨＩＬ６と結合することをブロックできることを実証している。
【０２２５】
（実施例６）
ＩＬ６誘導性細胞増殖およびハイパーＩＬ６誘導性細胞増殖のＸＣＥＰＴＯＲによる遮断
ＴＦ−１細胞のＩＬ６誘導性細胞増殖またはハイパーＩＬ６（ＩＬ６ｘＲ）誘導性細胞増殖の遮断を、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１１、１０１４、１０２５、１０２６、１００２およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（配列番号６１７、６２０、６３１、６３２、６０８および６７０）に関して試験した。
【０２２６】
９６ウェル平底プレートの各ウェルに、新鮮な成長培地（１０％のＦＢＳ−ＲＰＭＩ  １６４０；２ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム；および２ｎｇ／ｍｌのＨｕ  ＧＭ−ＣＳＦ）中０．３×１０６のＴＦ−１細胞（ヒト赤白血病細胞）を、増殖アッセイに使用する１日前に加えた。その後、細胞を収穫し、アッセイ培地（ＧＭ−ＣＳＦを含まないことを除いて成長培地と同じで、サイトカイン非含有）を用いて２回洗浄し、次いでアッセイ培地に１×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。ＩＬ６活性の遮断に関して、目的のＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：抗−ＨＩＬ６  Ｘｃｅｐｔｏｒまたは抗体の段階希釈物を、固定濃度の組換えヒトＩＬ６（ｒｈＩＬ６）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）またはハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６）と一緒に、９６ウェルプレート中で、３７℃、５％ＣＯ２において１時間プレインキュベートした。使用した対照は、ヒトＩｇＧ；ヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；抗ｈＩＬ６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；および抗−ｈＩＬ６Ｒ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだ。プレインキュベーション期間後、１×１０４細胞（１００μｌ中）を各ウェルに加えた。ＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：ＨＩＬ６、ｒｈＩＬ６またはＨＩＬ６および細胞を含有する、全容量２００μｌ／ウェルの最終アッセイ混合物を、３７℃、５％ＣＯ２において、７２時間インキュベートした。培養の最後の４から６時間の間に、３Ｈ−チミジン（アッセイ培地中２０μＣｉ／ｍｌ、２５μｌ／ウェル）を加えた。細胞をＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６ＧＦ／ｃプレートに回収し、とり込まれた３Ｈ−チミジンを、ＴｏｐＣｏｕｎｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して決定した。データは、３連の平均のｃｐｍ±ＳＤとして表した。遮断のパーセント＝１００−（試験物のｃｐｍ−対照のｃｐｍ／最大ｃｐｍ−対照のｃｐｍ）×１００。
【０２２７】
図５Ａおよび５Ｂのデータは、全Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質分子のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、ＩＬ６またはハイパーＩＬ６により誘導される細胞増殖を、個々にまたは両方をブロックできることを実証している。
【０２２８】
（実施例７）
ＥＬＩＳＡによる、ＴＮＦ−αのＴＮＦＲへの結合の、ＸＣＥＰＴＯＲによる遮断
Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００４、１００６、１００７、１００８、１０１３および１０１９（それぞれ、配列番号６１０、６１２、６１３、６１４、６１９および６２５）による、ＴＮＦ−αのＴＮＦ受容体への結合の遮断を、実質的に以下のように試験した。
【０２２９】
９６ウェルプレートの各ウェルに、ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中０．２５〜０．５μｇ／ｍｌ溶液の組換えヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から１００μｌを加えた。このプレートにカバーをし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて４回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡまたは１０％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において２時間（または４℃において一晩）インキュベートした。以下の試料を、５０μＭ〜２５０μＭから出発して、作業バッファーで５倍段階希釈した：Ｘｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料、陽性対照のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）および抗ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに陰性対照のヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびヒトＩｇＧ。等容量の段階希釈Ｘｃｅｐｔｏｒ試料を、ＴＮＦ−α（最終ＴＮＦ−α濃度が２．５ｎｇ／ｍｌ）と混合し、室温において１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、Ｘｃｅｐｔｏｒ／ＴＮＦ−α混合物、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）、抗ＴＮＦ−α、ヒトｇｐ１３０−Ｆｃキメラ、ヒトＩｇＧの段階希釈物を１００μｌ／ウェルで、組換えヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃコーティングプレートの２連のウェルに加え、プレートにカバーをし、室温において約１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファー中２００ｎｇ／ｍｌ溶液の抗ヒトＴＮＦ−α−ビオチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）から１００μｌ／ウェルを加え、プレートにカバーをして、室温において１から２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、作業バッファーで１：１，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を１００μｌ／ウェル加え、プレートにカバーをして、室温で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて６回洗浄後、１００μｌ／ウェルの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を約３から５分間加え、その後、１ウェルあたり５０μｌの停止バッファー（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を用いて反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２３０】
図６のデータは、Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質が、ＴＮＦ−αのＴＮＦ受容体への結合をブロックし、ＴＮＦＲ−Ｆｃによる遮断とおよそ同等であったことを示す。
【０２３１】
（実施例８）
ＴＮＦ−α誘導性細胞死滅のＸＣＥＰＴＯＲによる遮断
ＴＮＦ−α誘導性のＬ９２９細胞の死滅の遮断を、実質的に以下のように、Ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１１、１０１４、１０２５、１０２６、１００２およびＴＲＵ（Ｘ６Ｔ）−１０１９（それぞれ、配列番号６１７、６２０、６３１、６３２、６０８および６７０）に関して試験した。
【０２３２】
Ｌ９２９マウス線維芽細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）の懸濁液を、２×１０５細胞／ｍｌの密度で培養培地（１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ  １６４０、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）に調製し、次いで、１００μｌを、９６ウェル平底の黒色プレートの各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２において一晩、加湿インキュベーター内でインキュベートした。アッセイ培地（２％ＦＢＳを添加したことを除いて、培養培地と同じ）で段階的に希釈したＸｃｅｐｔｏｒ  ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６試料を、等容量の組換えヒトＴＮＦ−α（ｒｈＴＮＦ−α；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）と混合し、３７℃、５％ＣＯ２において１時間、加湿インキュベーター内でインキュベートした。陽性対照（すなわち、Ｌ９２９細胞のＴＮＦα誘導性死滅をブロックする薬剤）は、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）、ｒｈＴＮＦＲ２−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および抗ＴＮＦ−α抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含んだ。陰性対照は、アッセイ培地単独（ＴＮＦ−αは加えず）および抗体ｈＩｇＧ（ＴＮＦ−α添加）を含んだ。ＴＮＦ−αの活性を分析するために、Ｌ９２９細胞から培養培地を取り除き、次いで各ウェルに５０μｌのＴＮＦ−α／Ｘｃｅｐｔｏｒまたは対照混合物および５０μｌのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（４μｇ／ｍｌの新たに調製された作業溶液から）を加えた。その後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２において２４時間、加湿インキュベーター内でインキュベートした。細胞生存率を測定するために、各ウェルに、１００μｌのＡＴＰｌｉｔｅ  １  Ｓｔｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を製造業者の指示書に従って加え、２分間振とうし、次いでＴｏｐＣｏｕｎｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して発光を測定する。
【０２３３】
図７のデータは、全Ｘｃｅｐｔｏｒタンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインが融合タンパク質分子のアミノ末端にあっても、またはカルボキシ末端にあっても、このアッセイにおいてＴＮＦ−α誘導性の細胞死滅をブロックできることを実証している。
【０２３４】
（実施例９）
ＥＬＩＳＡによる、ＸＣＥＰＴＯＲのリガンドへの結合
ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインおよびＴＷＥＡＫＲ外部ドメイン（配列番号７９８）、ＯＰＧ外部ドメイン（配列番号７９９）、ＴＧＦβＲＩＩ外部ドメインまたはＩＬ７Ｒ外部ドメイン（配列番号８０１）のいずれかを含むｘｃｅｐｔｏｒ分子が、それぞれ、リガンドであるＴＷＥＡＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＧＦβまたはＩＬ７と結合する能力を、実質的に以下のように試験した。
【０２３５】
マウスおよびヒトのリガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＭＮ）を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）の濃度で、９６ウェルプレートのウェルに加えた。プレートを、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、２５０μｌのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ）を各ウェルに加え、プレートにカバーをし、室温（ＲＴ）において２時間インキュベートした。３００ｎｇ／ｍｌから出発するｘｃｅｐｔｏｒの３倍段階希釈物を、作業バッファー（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔ）で作製した。陰性対照として、無関係なｘｃｅｐｔｏｒを使用した。プレートを、ＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（作業バッファー中１：５０００）を１ウェルあたり１００μｌ加え、プレートにカバーをし、ＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄後、１００μｌのＱｕａｎｔ−Ｂｌｕ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を各ウェルに加えた。このプレートを、ＲＴにおいて１０〜３０分間インキュベートし、蛍光を、３２５／４２０ｎｍにおいて測定した。
【０２３６】
結果を以下の表３に示す。ＴＮＦＲｘＴＧＦβＲＩＩのマウスＴＧＦβへの結合は試験しなかったが、マウスおよびヒトのＴＧＦβは９９％同一であることに留意されたい。
【表３】
2011526792.tif 000006
【０２３７】
（実施例１０）
ＴＷＥＡＫ誘導性細胞死滅のＸＣＥＰＴＯＲによる遮断
ＴＷＥＡＫ誘導性のＨＴ２９細胞死滅の遮断を、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインおよびＴＷＥＡＫＲ外部ドメイン（配列番号７９８）を含むＸｃｅｐｔｏｒに関して、Ｎａｋａｙａｍａら、（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６８巻：７３４頁、２００２年）により記載された方法を使用して試験した。
【０２３８】
簡潔にいうと、９６ウェル平底プレートに、２００ｎｇ／ｍｌのヒトＴＷＥＡＫ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含有する、培養培地（１０％ＦＣＳおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム含有ＲＰＭＩ）で段階的に希釈したＸｃｅｐｔｏｒ試料を１００μＬ／ウェルで加え、３７℃、５％ＣＯ２において加湿インキュベーター内で１．５時間インキュベートした。陰性対照として、無関係のＸｃｅｐｔｏｒタンパク質（ＴＷＥＡＫ添加）およびアッセイ培地単独（ＴＷＥＡＫ添加または無添加）を含んだ。インキュベーション後、４０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含有する１００μｌの培養培地中５×１０３のＨＴ２９細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を各ウェルに加えた。次いで、このプレートを、３７℃、５％ＣＯ２において加湿インキュベーター内で９６時間インキュベートした。細胞生存率を測定することによってＴＷＥＡＫの活性を分析するために、１００μＬの培養培地をＨＴ２９細胞から取り除き、その後、１０μＬのＷＳＴ−８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、各ウェルに加えた。このプレートを、３７℃、５％ＣＯ２において２時間インキュベートし、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０２３９】
図８のデータは、ヒトＴＷＥＡＫ受容体外部ドメイン含有ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質が、このアッセイにおいて、ＴＷＥＡＫ誘導性細胞死滅をブロックしたことを実証している。
【０２４０】
（実施例１１）
ＲＡＮＫＬ媒介性破骨細胞形成の、ＸＣＥＰＴＯＲによる遮断
ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ外部ドメインおよびＯＰＧ外部ドメイン（配列番号７９９）を含むＸｃｅｐｔｏｒによる、ＲＡＷ２４６．７細胞におけるＲＡＮＫＬ−媒介性破骨細胞形成の遮断を、Ｌｅｅら、（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０巻（３３号）：２９９２９頁、２００５年）の方法を使用して試験した。
【０２４１】
簡潔にいうと、９６ウェルの平底プレートにおいて、ｘｃｅｐｔｏｒを、３０ｎｇ／ｍｌのｍＲＡＮＫＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含有する培養培地（１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ）で段階的に希釈した（５０μｌ／ウェル）。このプレートを、３７℃、５％ＣＯ２において加湿インキュベーター内で１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、５×１０３のＲＡＷ２４６．７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、５０μｌの培養培地を含む各ウェルに加えた。このプレートを、３７℃、５％ＣＯ２において加湿インキュベーター内で６日間インキュベートした。陰性対照は、無関係のｘｃｅｐｔｏｒタンパク質（ＲＡＮＫＬ含有）および培養培地単独（ＲＡＮＫＬ含有および不含）を含んだ。
【０２４２】
６日後、破骨細胞により生成される酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の活性を、ＥＬＩＳＡ（ＩＤＳ、Ｆｏｕｎｔａｉｎ  Ｈｉｌｌｓ  ＡＺ）によりアッセイした。簡潔にいうと、各ウェルから２５μｌを取り除き、抗マウスＴＲＡＰ抗体でコーティングされた調製済みのマイクロタイタープレートに加えた。７５μｌの０．９％ＮａＣｌ、その後２５μＬの放出試薬を各ウェルに加えた。キットからの、組換えマウスＴＲＡＰの様々な量のＥＬＩＳＡ陽性対照およびタンパク質が含まれた。このプレートを、室温において１時間インキュベートした。このプレートを、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄後、１００μｌのｐＮＰＰ基質溶液を全てのウェルに加え、このプレートを３７℃において２時間インキュベートした。各ウェルにおける反応を、２５μＬの０．３２ＭのＮａＯＨを加えて停止させ、吸光度を４０５ｎｍにおいて読み取った。
【０２４３】
図９のデータは、ヒトＯＰＧを含有するｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質が、ＲＡＮＫＬ処理ＲＡＷ２４６．７細胞においてＴＲＡＰ活性を測定することによって決定されたように、破骨細胞の発達をブロックしたことを示す。
【０２４４】
（実施例１２）
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により測定した、ＴＮＦ−αに対する結合親和性
ｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２（配列番号６０８）およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）の、ＴＮＦ−αと結合する能力を、以下のように、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して決定した。
【０２４５】
ＴＮＦ−αの結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）を、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃにより捕捉し、これは、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド使用して、アミンを介してカルボキシルメチルデキストラン表面（ＣＭ４）に共有結合させた。活性化表面の非占有部位を、エタノールアミンによりブロックした。捕捉抗体（抗ｈＦｃと称される）は、全てのサブクラスに対するＩｇＧ  ＦｃのＣＨ２ドメインに結合し、アッセイの過程の間、捕捉されたＴＮＦ−αバインダーからの認識できる解離は示さなかった。サイクルごとに、所与のＴＮＦ−α結合剤は、フローセル２において低密度（＜１００ＲＵ）で、フローセル４において高密度（＞３００ＲＵ）で捕捉され、一方フローセル１および３は参照セルとして使用した。サイクルごとに、単一濃度（０〜８ｎＭ）のＴＮＦ−αを４０マイクロリットル／分で５２５秒間注入した。解離時間は、０〜４ｎＭ  ＴＮＦ−αに対して１分、または０および８ｎＭのＴＮＦ−αに対して１時間のいずれかであった。サイクルの終わりに、抗ｈＦｃ捕捉抗体に結合したタンパク質を解離する３ＭのＭｇＣｌ２を使用して、表面を穏やか再生した。高密度表面の一面にわたる８ｎＭのＴＮＦ−αの注入によるデータを使用して、解離速度定数ｋｄを算出した。このパラメーターの値をその後固定し、低密度表面からのデータを使用して、会合速度定数、ｋａおよびＲｍａｘを算出した。この戦略は、解離相のデータに関するノイズに対するシグナルを最大にし、会合相のデータに関する質量輸送制限（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を減少させる。ＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、これらの分析を実施した。この研究の結果を以下の表４に示す。
【０２４６】
これらのデータは、二重特異性分子ＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２のＴＮＦ−αＲ部分が、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）と同様の親和性でＴＮＦ−αと結合することを実証している。
【表４】
2011526792.tif 000007
【０２４７】
（実施例１３）
ハイパーＩＬ６に対する結合特異性および他のＧＰ１３０サイトカインに対する非結合
ＩＬ６ならびに、ｇｐ１３０サイトカインであるＩＬ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）およびカルディオトロピン−１（ＣＴ−１）によるＴＦ−１細胞増殖の誘導に対するＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質の効果を、実質的に以下のように試験した。
【０２４８】
９６ウェル平底プレートの各ウェルに、新鮮な成長培地（１０％のＦＢＳ−ＲＰＭＩ  １６４０；２ｍＭのＬ−グルタミン；１００単位／ｍｌのペニシリン；１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム；および２ｎｇ／ｍｌのＨｕ  ＧＭ−ＣＳＦ）中０．３×１０６のＴＦ−１細胞（ヒト赤白血病細胞）を、増殖アッセイに使用する１日前に加えた。細胞を収穫し、アッセイ培地（ＧＭ−ＣＳＦを含まないことを除いて成長培地と同じ、サイトカイン非含有）を用いて２回洗浄し、次いでアッセイ培地に１×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。ＬＩＦ、ＯＳＭおよびＣＴ−１活性の遮断を試験するために、ＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：抗ＨＩＬ６  ｘｃｅｐｔｏｒのＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２（配列番号６０８）、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１９（配列番号６２５）、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０２２（配列番号６２８）およびＴＲＵ（ＸＴ６）−１０２５（配列番号６３１）の段階希釈物を、固定濃度の各ｇｐ１３０サイトカイン個々と一緒に、またはハイパーＩＬ６（ＨＩＬ６）と一緒に、９６ウェルプレートにおいて、３７℃、５％ＣＯ２において１時間プレインキュベートした。プレインキュベーション期間後、１×１０４細胞（１００μｌ中）を各ウェルに加えた。ＴＮＦＳＦＲ１Ｂ：：ＨＩＬ６、ｇｐ１３０サイトカインまたはＨＩＬ６、および細胞を含有する、全容量２００μｌ／ウェルの最終アッセイ混合物を、３７℃、５％ＣＯ２において、７２時間インキュベートした。培養の最後の４から６時間の間に、３Ｈ−チミジン（アッセイ培地中２０μＣｉ／ｍｌ、２５μＬ／ウェル）を加えた。細胞をＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６ＧＦ／ｃプレートに回収し、とり込まれた３Ｈ−チミジンを、ＴｏｐＣｏｕｎｔリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して決定した。遮断のパーセント＝１００−（試験物のｃｐｍ−対照のｃｐｍ／最大ｃｐｍ−対照のｃｐｍ）×１００。
【０２４９】
結果は、ｘｃｅｐｔｏｒがＩＬ６活性をブロックしたが、ＩＬ−１１、ＬＩＦ、ＯＳＭまたはＣＴ−１（データは示さず）をブロックしなかったことを示し、したがって、ハイパーＩＬ６に結合したが、試験した他のｇｐ１３０サイトカインに対して効果を有さなかったことを示した。
【０２５０】
（実施例１４）
肝細胞における、ＳＭＩＰおよびＸＣＥＰＴＯＲの、ＩＬ６Ｒへの結合
ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２、ＴＲＵ（ＸＴ６）−１０１９および抗ＩＬ６抗体ｈｕ−ＰＭ１が、肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞のＩＬ６Ｒと結合する能力を以下のように試験した。
【０２５１】
ＨｅｐＧ２細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ）中２×１０６細胞／ｍＬに調整した。９６ウェルプレートのウェルに、５０μＬのこの溶液を加えた（１０５細胞／ウェル）。プレートを、希釈した被検分子を加える用意ができるまで３７℃に保った。被検分子の段階希釈物をＦＡＣＳバッファーで調製し、細胞に加えるときに１×に希釈される、２×作業ストックを得た。希釈した被検分子を細胞に加え（５０μＬ／ウェル）、細胞を氷上で２０分間インキュベートした。ＩｇＧ全体（ｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ）を対照として使用した。その後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーを用いて２回洗浄し、フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ；ＦＡＣＳバッファーで１：２００希釈）に再懸濁した。暗所において氷上で２０分間インキュベート後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーを用いて２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、ＬＳＲＩＩＴＭフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において読み取った。
【０２５２】
図１０に示すように、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２およびＴＲＵ（ＸＴ６）−１０２９は、基本的にＨｅｐＧ２細胞とは結合しないことを示した。
【０２５３】
（実施例１５）
マウスにおけるＩＬ６活性およびＴＮＦの活性の、ＳＭＩＰおよびＸＣＥＰＴＯＲによる遮断
本明細書に開示するＳＭＩＰおよびＸｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質の、マウスにおける血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質のＩＬ−６誘導性産生またはＴＮＦ誘導性産生をブロックする能力を、下記のように試験した。ＳＡＡは、ヒトおよびマウスにおける主要な急性期タンパク質の１つである。血漿ＳＡＡレベルの長期的上昇が慢性炎症において見出され、肝臓、腎臓および脾臓に影響を与えるアミロイドーシスをもたらす（Ｒｉｅｎｈｏｆｆら、（１９９０年）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７巻：２８７頁）。ＩＬ６およびＴＮＦは双方とも、単独で投与された場合ＳＡＡの誘導を示した（Ｂｅｎｉｇｎｉら、（１９９６年）Ｂｌｏｏｄ  ８７巻：１８５１頁；Ｒａｍａｄｏｒｉら、（１９８８年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８巻：１２５９頁）。
（ａ）ハイパーＩＬ６活性の遮断
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（２００μｇ）、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２（２００μｇ）もしくはＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２（３００μｇまたは５００μｇ）を、後眼窩に注入した。１時間後、このマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中２μｇのヒトハイパーＩＬ６をＩＰ注入した。マウス血清を、ＩＰ注入の２時間後および２４時間後に採取した。ＳＡＡの血清濃度をＥＬＩＳＡにより決定し、ｓｇｐ１３０の濃度をＬｕｍｉｎｅｘに基づくマウス可溶性受容体アッセイにより決定した。図１１および１２に示すように、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２およびＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２は、ｓｇｐ１３０およびＳＡＡ双方のハイパーＩＬ６誘導性発現をブロックした。
（ｂ）ＴＮＦ活性の遮断
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（２００μｇ）、ＴＲＵ（Ｓ６）−１００２（２００μｇ）もしくはＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２（３００μｇ）を、後眼窩に注入した。１時間後、このマウスに、０．２ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳ中０．５μｇのマウスＴＮＦ−αをＩＰ注入した。マウス血清を、ＩＰ注入の２時間後および２４時間後に採取した。ＳＡＡの血清濃度をＥＬＩＳＡにより決定し、ｓｇｐ１３０の濃度をＬｕｍｉｎｅｘに基づくマウス可溶性受容体アッセイにより決定した。図１３ＡおよびＢに示すように、ＸｃｅｐｔｏｒのＴＲＵ（ＸＴ６）−１００２は、ＳＡＡのＴＮＦ−α誘導性発現をブロックし、注入２時間後に観察されたＳＡＡのレベルは、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）で観察されるレベルと同様であった。
【０２５４】
（実施例１６）
ＸＣＥＰＴＯＲのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
本明細書に記載のＸｃｅｐｔｏｒ分子の治療効力を、下記のように疾患の動物モデルにおいて試験する。
（ａ）多発性骨髄腫
Ｘｃｅｐｔｏｒ分子の活性を、２種の十分特徴付けられた多発性骨髄腫のマウスモデル、すなわち、５Ｔ２多発性骨髄腫（５Ｔ２ＭＭ）モデルおよび５Ｔ３３多発性骨髄腫（５Ｔ３３ＭＭ）モデルの少なくとも１種において試験する。５Ｔ３３モデルにおいて、マウスを、腫瘍細胞の注入のときからｘｃｅｐｔｏｒにより処置する（予防モード）。５Ｔ２ＭＭモデルにおいて、マウスを、疾患の発症から処置する（治療モード）。腫瘍の発達および新脈管形成に対する治療効果を、双方のモデルにおいて評価し、５Ｔ２ＭＭモデルにおいて、骨に関する研究もまたさらに実施する。
【０２５５】
骨髄腫の５ＴＭＭネズミモデルが始めにＲａｄｌらにより開発された（Ｊ．  ｌｍｍｕｎｏｌ．（１９７９年）１２２巻：６０９頁；さらにＲａｄｌら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．（１９８８年）１３２巻：５９３頁；Ｒａｄｌ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ（１９９０年）１１巻：２３４頁を参照されたい）。その臨床的特徴は、ヒトの疾患に非常に似ており、腫瘍細胞は骨髄に存在し、血清パラプロテイン濃度が疾患発達の尺度であり、新脈管形成は５Ｔ２ＭＭおよび５Ｔ３３ＭＭモデルの双方において増加し（Ｖａｎ  Ｖａｌｃｋｅｎｂｏｒｇｈら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．（１９８８年）１３２巻：５９３頁）、特定の系において明らかな溶骨性骨疾患が発症する。５Ｔ２ＭＭモデルは、中程度の腫瘍成長および溶骨性骨病変の発達を含む。これらの病変は、網状骨容量の減少、骨ミネラル密度の減少、および破骨細胞数の増加を伴う（Ｃｒｏｕｃｈｅｒら、Ｂｌｏｏｄ（２００１年）９８巻：３５３４頁）。５Ｔ３３ＭＭモデルは、腫瘍の取り込みがより迅速であり、骨髄に加えて、腫瘍細胞はさらに肝臓においても成長する（Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｋｅｎら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（１９９７年）７６巻：４５１頁）。
【０２５６】
５Ｔ２および５Ｔ３３ＭＭモデルは、広範囲にわたって特徴付けられている。特定のモノクローナル抗体は、５Ｔ２および５Ｔ３３ＭＭの双方のイディオタイプに対して産生されており（ｒａｉｓｅｄ）、高い感度で、ＥＬＩＳＡによる血清パラプロテインの検出を可能にし、ならびにＦＡＣＳ分析および組織切片の免疫染色の双方による腫瘍細胞の特異的染色を検出可能にする（Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｋｅｎら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（１９９７年）７６巻：４５１頁）。ＶＨ遺伝子の配列分析は、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット分析による細胞の検出を可能にする（Ｚｈｕら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８年）９３巻：１６２頁）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験の双方に使用できる５ＴＭＭモデルは、典型的なＭＭ疾患を生じ、様々な方法が、骨髄中腫瘍量、血清パラプロテイン濃度、（微小血管密度を測定することによる）骨髄新脈管形成および（Ｘ線撮影、密度測定および組織形態測定の組合せによる）溶骨性骨病変の評価に利用できる。これらの後者のパラメーターの調査は、前臨床設定ならびに完全な同系微小環境において骨髄腫細胞の成長および生物学的研究における５ＴＭＭモデルの使用を可能にする。ＭＭ細胞それ自体を標的にする分子および骨髄の微小環境を標的とする分子の双方が研究できる。具体的には、５Ｔ３３ＭＭモデルが微小環境およびＭＭ細胞それ自体の双方の研究に使用できるのに対して、一方、５Ｔ２ＭＭモデルは、骨疾患を伴う骨髄腫の研究にもさらに使用できる。
【０２５７】
本明細書に開示のＸｃｅｐｔｏｒ分子の予防効力を研究するために、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＲｉｊマウスに、２×１０６の５Ｔ３３ＭＭ細胞およびＸｃｅｐｔｏｒを０日目に注入する。２８日目にマウスを犠牲にし、腫瘍の発達を、血清パラプロテイン濃度および（抗イディオタイプ抗体を用いたフローサイトメトリーによって、または細胞標本によって決定される）単離骨髄細胞における腫瘍細胞の割合を決定することによって評価する。脾臓および肝臓の重量を決定し、さらなる分析のためにこれらの器官を４％ホルムアルデヒドで固定する。骨試料は、パラフィン切片のＣＤ３１免疫染色および微小血管密度の定量を含むさらなる処理のために固定する。
【０２５８】
本明細書に開示のＸｃｅｐｔｏｒ分子の治療効力を研究するために、マウスに、５Ｔ２ＭＭ細胞を０日目に注入し、検出可能なレベルの血清パラプロテインの存在によって決定されるような疾患の発症後に、Ｘｃｅｐｔｏｒを投与する。Ｘｃｅｐｔｏｒの投与後およそ５週間後にマウスを犠牲にし、腫瘍の発達を、予防的研究のために上記のように評価する。さらに、骨分析を、骨の病変の数および海綿質面積を決定するためにＸ線を使用して、ならびに破骨細胞の数を評価するためにＴＲＡＰ染色を使用して、実施する。
（ｂ）関節リウマチ
本明細書に開示の任意のｘｃｅｐｔｏｒ分子の治療効力を、関節リウマチ（ＲＡ）の２種のネズミモデル、すなわちコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）およびグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｇ６ＰＩ）モデルの少なくとも１種において試験する。これらのモデルの各々は、ＲＡにおける治療薬の特定のクラスの効力の予測にとって有用であることが示されている（Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２０００年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  ２巻：１６９頁；Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２００６年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １０３巻：８６頁；Ｈｏｌｍｄａｈｌ（２００７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  １３６巻：１８５頁；ＭｃＤｅｖｉｔｔ，  Ｈ．（２０００年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  ２巻：８５頁；ＫａｍｒａｄｔおよびＳｃｈｕｂｅｒｔ（２００５年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．  ７巻：２０頁を参照されたい）。
（ｉ）ＣＩＡモデル
ＣＩＡモデルは、関節炎の発症機序および免疫学的根拠に関する、関節炎の最もよく特徴付けられたマウスモデルである。さらに、ＣＩＡモデルは、最も広範囲に使用されるＲＡのモデルであって、患者において疾患を阻害する薬剤の能力を予測するためには完全ではないけれども、ＲＡの潜在的な新規の治療薬を調査する場合、多数の人に選択されるモデルであると考えられる（Ｊｉｒｈｏｌｔら、（２００１年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  ３巻：８７頁；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ、Ｗ．Ｂ．（２００２年）Ｃｕｒｒ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  Ｒｅｐ．  ４巻：２３２頁；Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃ（２００３年）Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ。Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ）。
【０２５９】
ＣＩＡモデルにおいて、関節炎は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）を用いた雄ＤＢＡ／１マウスの免疫によって誘導される。具体的には、マウスに、２１日前にＣＦＡ中のＣＩＩを皮内／皮下注入し、０日目に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のＣＩＩを追加免疫する。マウスは、ＣＩＩ／ＩＦＡの追加免疫の数日以内に関節炎の臨床的徴候を現わす。ＣＩＩ／ＣＦＡにより免疫化されたマウスのサブセット（０％から１０％）は、追加免疫をしなくても０日目の当日またはその周辺において関節炎の徴候を現わし、実験からは除外される。一部のＣＩＡ実験において追加免疫を省き、その代わりにマウスを、ＣＩＩ／ＣＦＡによる免疫後２１日から開始する、Ｘｃｅｐｔｏｒまたは対照での処置を行なう（すなわち、最初の処置の日が０日目である）。
【０２６０】
予防計画および／または治療計画において、マウスを、Ｘｃｅｐｔｏｒ、ビヒクル（ＰＢＳ）または陰性対照もしくは陽性対照を用いて処置する。予防的処置は０日目に開始し、対照（未処置）マウスにおける疾患のピークを通して続ける。治療的処置は、大部分のマウスが関節炎の軽度の徴候を示したときに開始する。関節炎のＣＩＡモデルおよびＧ６ＰＩ誘発性モデルの双方において優れた効力を有することが示されたＥｎｂｒｅｌ（登録商標）を、陽性対照として使用する。実験毎に収集したデータは、関節炎の臨床的スコアおよび累積発現率を含む。ＣＩＡモデルにおける関節炎の臨床的徴候を、以下の表５に示すような０から４のスケールを使用して採点する。
【表５】
2011526792.tif 000008
【０２６１】
（ｉｉ）Ｇ６ＰＩモデル
Ｇ６ＰＩモデルにおいて、関節炎は、アジュバント中のＧ６ＰＩを用いたＤＢＡ／１マウスの免疫により誘導される（ＫａｍｒａｄｔおよびＳｃｈｕｂｅｒｔ（２００５年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．  ７巻：２０頁；Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、（２００４年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２巻：４５０３頁；Ｂｏｃｋｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．ら、（２００５年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．  ７巻：Ｒ１３１６頁；Ｉｗａｎａｍｉら、（２００８年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ５８巻：７５４頁；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、（２００８年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  Ｔｈｅｒ．  １０巻：Ｒ６６頁）。Ｇ６ＰＩは、実質的に体内の全ての細胞に存在する酵素であり、免疫により関節特異的疾患を誘発する理由は公知ではない。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＴＮＦアンタゴニスト（例えばＥｎｂｒｅｌ（登録商標））および抗ＩＬ６受容体モノクローナル抗体などのいくつかの薬剤が、Ｇ６ＰＩモデルにおいて関節炎の発達を阻害することが示されている。
【０２６２】
雄ＤＢＡ／１マウスを、関節炎を誘発するために、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のＧ６ＰＩを用いて免疫する。具体的には、マウスに、ＣＦＡにおけるＧ６ＰＩを０日目に皮内／皮下注入し、免疫の数日以内に関節炎の臨床的徴候が現れる。上述のＣＩＡモデルでのように、マウスを、予防計画および／または治療計画において、ｘｃｅｐｔｏｒ、ビヒクル（ＰＢＳ）または陰性対照もしくは陽性対照を用いて処置する。予防的処置は０日目に開始し、対照マウスにおける疾患のピークを通して続ける。治療的処置は、大部分のマウスが関節炎の軽度の徴候を示したときに開始する。関節炎のＣＩＡモデルおよびＧ６ＰＩ誘発性モデルの双方において優れた効力を有することを示したＥｎｂｒｅｌ（登録商標）を、陽性対照として使用する。各実験において収集したデータは、関節炎の臨床的スコアおよび累積発現率を含む。Ｇ６ＰＩモデルにおける関節炎の臨床的徴候を、ＣＩＡモデルに対して用いたスケールと同様のスケールを使用して採点する。
（ｃ）多発性嚢胞腎
本明細書に開示したように、ＴＮＦアンタゴニストを含有するｘｃｅｐｔｏｒ融合タンパク質の、多発性嚢胞腎の治療における効力を、Ｇａｔｔｏｎｅら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．（２００３年）９巻：１３２３頁；Ｔｏｒｒｅｓら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．（２００４年）１０巻：３６３頁；  Ｗａｎｇら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．（２００５年）１６巻：８４６頁；およびＷｉｌｓｏｎ  （２００８年）Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ８４巻：３１１頁に記載されたような、ネズミモデルにおいて試験する。
【０２６３】
本発明は、上に概説した特定の実施形態と併せて記載しているが、多くの改変、変更および変形が当業者に明らかであろうことは明白である。したがって、上に説明したような本開示の実施形態は例示目的であって、限定するものではない。様々な改変が、以下の特許請求の範囲に規定したような本開示の精神および範囲から逸脱することなく実施可能である。本明細書において参照した全ての出版物は、全体を説明したかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６４】
配列番号１〜８３４は、添付の配列リストに提示する。添付の配列リストに使用した、シンボル「ｎ、」を含むヌクレオチド配列のコードは、ＷＩＰＯ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５（１９９８）、付録２、表１に一致する。
【図２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年4月21日(2011.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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