(57)【要約】【課題】エレクトロポレーションキュベットは、キュベット内の位置とともに幅が変化するギャップを形成するために非平行関係で配置されたエレクトロポレーション電極と、キュベット内の生体細胞を細胞のサイズに従って電気泳動させるために配置された１対の位置決め電極とによって構成される。【解決手段】一旦、含浸剤の溶液に懸濁された細胞が位置決め電極によってキュベット中に分布されると、非平行エレクトロポレーション電極によって電界パルスを生成する。キュベット中の細胞の分布によって、種々の細胞の幅の両端間の電圧差は、細胞の直径に関係なく一様になる。その理由は、大きい細胞が電極間のギャップが大きい位置に配置され、小さい細胞が電極間のギャップが比較的小さい位置に配置され、全体に亘るギャップの両端間の電圧降下が細胞の長さに沿って一様になるからである。細胞の幅の両端間の電圧差は、大抵細胞の直径に組み合わされ、これによって、平行電極による異なるサイズの細胞によって生じうる電圧差の不均衡が減少する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一様でないサイズの膜構造のエレクトロポレーション用のキュベットであって、前記キュベットは、長手方向の軸線を有する容器と、前記長手方向の軸線に沿って離間した１対の位置決め電極と、前記長手方向の軸線の両側に離間した１対のエレクトロポレーション電極とを備え、前記エレクトロポレーション電極は、前記長手方向の軸線に沿って幅が減少するギャップを規定するために細長くかつ非平行であることを特徴とするキュベット。
【請求項２】
前記エレクトロポレーション電極の各々は、真っ直ぐな中心線を有し、前記中心線の両方は、前記長手方向の軸線と同一平面にあり、約１°から約４５°までの角度を互いに形成する請求項１に記載のキュベット。
【請求項３】
前記角度が約５°から約３０°である請求項２に記載のキュベット。
【請求項４】
前記キュベットに及ぶとともに前記長手方向の軸線を横切るふるい膜を更に備えた請求項１に記載のキュベット。
【請求項５】
前記キュベットに及ぶとともに異なる孔のサイズを有する複数のふるい膜を更に備え、前記ふるい膜の各々を、前記長手方向の軸線を横切る方向に配置し、前記ふるい膜は、前記長手方向の軸線に沿って離間され、前記ギャップの幅が減少するのと同一の方向で前記長手方向の軸線に沿って孔のサイズが減少する請求項１に記載のキュベット。
【請求項６】
２から５の枚数の前記ふるい膜を備えた請求項５に記載のキュベット。
【請求項７】
一様でないサイズの膜構造の集団に外因性種をトランスフェクトする方法であって、
（ａ）前記外因性種が溶解した液状媒質の前記集団の懸濁液をキュベットに充填し、前記キュベットは、長手方向の軸線を有する容器と、前記長手方向の軸線に沿って離間した１対の位置決め電極と、前記長手方向の軸線の反対側で離間した１対のエレクトロポレーション電極とを備え、前記エレクトロポレーション電極は、前記長手方向の軸線に沿って幅が減少するギャップを規定するために細長くかつ非平行であり、
（ｂ）前記減少するギャップと同一方向でサイズが減少するように、前記長手方向の軸線の方向で実質的にサイズに従って、前記キュベット内で前記膜構造を分布させるために前記位置決め電極に電圧を印加し、
（ｃ）前記膜構造をそのように分布させた状態で、前記外因性種を前記膜構造にトランスフェクトするために前記エレクトロポレーション電極に電圧を印加することを特徴とする方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）の前に前記キュベットに緩衝溶液を充填し、ステップ（ａ）は、前記ギャップの幅が最大である前記長手方向の軸線の一端に前記膜構造を入れ、ステップ（ｂ）は、前記緩衝溶液を通過する前記膜構造の移動速度を異ならせることによって前記分布に影響を及ぼす大きさの電位を前記エレクトロポレーション電極の間に加える請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記キュベットはふるい分けマトリックスを有し、ステップ（ａ）は、前記ギャップの幅が最大である前記長手方向の軸線の一端で前記ふるい分けマトリックスの上に前記膜構造を配置し、ステップ（ｂ）は、前記ふるい分けマトリックスを通過する前記膜構造の移動速度を異ならせることによって前記分布に影響を及ぼす大きさの電位を前記エレクトロポレーション電極の間に加える請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記長手方向の軸線を横切るよう前記キュベットに及ぶふるい膜を装着し、ステップ（ａ）は、前記ギャップの幅が最大である前記長手方向の軸線の一端に前記膜構造を入れ、ステップ（ｂ）は、前記ふるい膜を通過する前記膜構造の移動速度を異ならせることによって前記分布に影響を及ぼす大きさの電位を前記エレクトロポレーション電極の間に加える請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記長手方向の軸線を横切るよう前記キュベットに及ぶ異なる孔のサイズの複数のふるい膜を装着し、前記複数のふるい膜は、前記長手方向の軸線に沿って互いに離間し、前記ギャップの幅が減少するに従って前記孔のサイズが連続的に減少し、ステップ（ａ）は、前記ギャップの幅が最大である前記長手方向の軸線の一端に前記膜構造を入れ、ステップ（ｂ）は、更なる移動を阻止するのに十分小さい孔を有するふるい膜まで前記膜構造を移動させることによって前記分布に影響を及ぼす大きさの電位を前記エレクトロポレーション電極の間に加える請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記エレクトロポレーション電極の各々は、真っ直ぐな中心線を有し、前記中心線の両方は、前記長手方向の軸線と同一平面にあり、約１°から約４５°までの角度を互いに形成する請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／０３０，０７４号の利益を主張し、その内容は、参照によりそのままここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は、エレクトロポレーション、すなわち、外因性分子種の溶液に膜構造を懸濁させるとともに結果的に得られる懸濁液に電界を加えることによって外因性分子種を膜構造に挿入するプロセスの分野にある。特に、本発明は、エレクトロポレーションキュベットに対応する。
【背景技術】
【０００３】
エレクトロポレーションすなわち電気パルス駆動されるトランスフェクションは、生きている生体細胞、リポソーム及びベシクルのような膜構造に外因性分子を含浸させるために広く用いられている。膜構造は、典型的には高伝導性バッファの外因性種の水溶液に懸濁される。通常の生理食塩水がバッファとしてよく用いられている。その理由は、電流の抵抗が比較的低くなるのに加えて、通常の生理食塩水が大抵の膜構造の生存に有利な環境を提供するからである。懸濁液は、典型的には、電極が備えられたキュベットに配置され、エレクトロポレーションは、キュベット内で行われる。
【０００４】
エレクトロポレーション手順の主な関心は、手順中に連続的に含浸される膜構造の数として規定される効率である。目標は、できるだけ多くの膜構造を所定のサンプルに含浸させ、含浸剤のできるだけ同数の分子を各膜構造に受け取らせることである。完全な均一が達成困難な目標である。しかしながら、電界に対する膜構造の位置及び物理的な方向が異なるので、ある程度の変化がエレクトロポレーション手順にある。膜構造が生体細胞であるとき、典型的な細胞集団がライフサイクルの諸段階の細胞を有するので、他の変動源は、細胞の十分な成長の範囲である。したがって、単一の細胞株は、種々の直径の細胞を有する。電界強度は、印加電圧を電極間の差で除算することによって決定されるが、単一の細胞の電圧は、細胞の直径に比例する。したがって、所定の電界強度に対して、小さい細胞は比較的小さい電圧差を有するのに対して、大きい細胞の電圧差は、比較的大きくなる。電圧差が非常に小さい場合、細胞壁は、分子が通過できる程度に十分に浸透しやすくならず、電圧差が非常に大きい場合、結果的に生じる双極子モーメントによって細胞が分解する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
単一の懸濁液中の種々の直径の細胞又は他の膜構造によって生じる電圧差の変動に対処するエレクトロポレーションキュベットを開発した。便宜上、用語「細胞」を、一般的に膜の種類を表すために用いる。エレクトロポレーション効果が生じたキュベットの電極は、強度がキュベットの位置に応じて変化する電界を生成するように構成され、電界強度の変化に相関する配置でサイズに従って細胞を位置決めする電界を加えるために第２の電極対がキュベット構造に組み込まれる。細胞を位置決めするのに用いられる電極を「位置決め電極」と称し、それに対し、エレクトロポレーションに用いられる電極を「エレクトロポレーション電極」又は「衝撃電極」(shocking electrode)と称する。エレクトロポレーション手順でキュベットを利用するために、細胞を所望の空間サイズで分布させるために最初に位置決め電極に電圧を印加し、細胞のサイズの分布に相関する電界強度変化を有するエレクトロポレーションを行うために次にエレクトロポレーション電極に電圧を印加するように、２組の電極に次々と電圧が印加される。位置決め電極は、エレクトロポレーション中に電圧を印加したままにすることができるが、発明の好適な実施の形態において、位置決め電極に印加される電圧をエレクトロポレーションの開始前に中断する。エレクトロポレーションに用いられる電界を、好適にはパルス電場とする。細胞位置決めステップで用いられる電圧は、少なくとも１桁の大きさのオーダーだけ、更には２〜３桁の大きさのオーダーだけエレクトロポレーションステップで用いられる電圧より大幅に小さい。
【発明の効果】
【０００６】
細胞の物理的なサイズの差の直接的な結果、細胞の表面電荷の量の結果又はその両方の組合せとして細胞をサイズに従って分布させることができる。表面電荷の量による分布を位置決め電極によって行うことができ、それに対し、物理的なサイズによる分布を、位置決め電極のみにより又は一連のふるい膜やふるい分けマトリックスの使用のような他の手段と組み合わせた位置決め電極により行うことができる。発明のこれら及び他の手段、実施の形態、目的及び利点を、以下で更に詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、本発明によるキュベット及び蓋の一例の斜視図である。
【図２】図２は、図１のキュベットの断面である。
【図３】図３は、本発明によるキュベット及び蓋の他の例の正面図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明を規定する特徴を種々の構成で実現することができるが、特定の実施の形態の精査により発明が全体として最もよく理解される。添付した図面は、そのような実施の形態を表す。
【０００９】
図１に示すキュベット１１は、開口上部と、取り付け又は分離することができる蓋１２とを有する。キュベット１１は、４側面の平坦な壁により水平断面で矩形となる。前壁１３及び後壁１４は平行であり、それに対し、端壁１５，１６は、上部で最も広い間隔を有するとともに底で最も狭い間隔を有する先細の輪郭を形成するために傾斜している。１対の対向電極１７，１８が二つの端壁に貼り付けられるとともにキュベットの内部に露出され、対向電極１７，１８は、これらが取り付けられる壁が傾斜しているために非平行である。これらの電極は衝撃電極であり、これらの電極が非平行な配置であるので、キュベットの上部付近の電極間の分離は、キュベットの底付近の分離より大きい。他の電極２１がキュベットの底１９すなわち床面に貼り付けられ、更に別の電極２２が蓋１２の裏面に貼り付けられる。底電極及び蓋電極が位置決め電極となる。
【００１０】
キュベット１１は、中心線２３に対して対称に形成され、衝撃電極１７，１８の各々は、平坦であり、中心線２４，２５を有する。３本の中心線２３，２４，２５は同一平面状にあり、キュベットそれ自体と同様に、衝撃電極は、キュベットの中心線２３の両側に対称に配置される。図２は、中心線の平面に沿ったセル及び衝撃電極の断面である。衝撃電極の中心線によって形成される角度αは、変えることができ、発明に重要でないが、最適な角度は、キュベットの細胞集団及び寸法に依存する。一般的に、好適な角度は、約１°から約４５°までの範囲内の角度であり、最適な角度は、約５°から約３０°の角度である。衝撃電極の非平行配置を、最も広い幅を有する電極間のギャップ２６と最も狭い幅を有する電極間のギャップ２７との比について表すこともできる。この比を大きく変化させることができるが、大抵の場合、適切な比は、約１．２から約３．０までの範囲内にあり、好適には、約１．３から約２．０の範囲内にある。細胞がサイズに従って配置される際の細胞の移動方向は、一般的に、位置決め電極によって印加される電位の方向であるキュベット２３の中心線に従う。衝撃電極間のギャップ幅も同様にキュベットの中心線２３の方向で減少し、後に説明するように、位置決め後のセルサイズの勾配は、衝撃電極のギャップ幅の減少と同一方向にあるセルサイズの減少する方向と同一方向にある。
【００１１】
図１及び図２のキュベットを利用するエレクトロポレーション手順において、一般的に含浸剤として用いられるＤＮＡ、たんぱく質又は外因性種の緩衝水溶液がキュベットに充填され、含浸すべき細胞が、キュベット１１が最大幅である端部にある溶液の露出表面に配置される。その後、キュベットの蓋１２が、上部開口を通じてキュベットに配置され、蓋の電極２２が確実に溶液に接触するために下方に押し下げられる。蓋の電極２２と底の電極２１との間に電位が与えられる。生体細胞は一般的に負の表面電荷を有するので、蓋の電極２２を負の電位にするとともに底の電極２１を正の電位にすることによって、細胞はキュベットの中心線２３に沿って下方向に移動する。電極をこれらの電位にすることによって、細胞は、底の電極２１に向かうようにキュベット内部を移動する電気泳動によって下方に移動する。小さい細胞は、質量が小さいので大きい細胞より速い速度で移動する。ある細胞がキュベットの底に到達する前、又は、最小の細胞がキュベットの底に到達した後の短時間だけ電位を中断し、その結果、小さい細胞の質量が小さいために上部から進む距離が長くなるので、キュベット内に細胞のサイズの勾配が生じる。その後、衝撃電極１７，１８にパルスが印加され、電極の間隔が狭いためにキュベットの底で強度が大きくなる電界が生じる。したがって、電界強度それ自体が（細胞サイズ勾配と逆の方向で）キュベットの底に向かって増大する勾配を有するので、細胞の幅の両端間の電位降下は、細胞サイズの範囲の間で一様に近づく。
【００１２】
図１のキュベット１１及び蓋１２の細胞サイズの勾配を形成する他の手段又は勾配を更に制御する手段は、キュベットにふるい分けマトリックスを配置することである。アガロースは、ふるい分けマトリックスの一例であり、ビーズの懸濁液は他の例である。一般的に、細胞の移動の障害となるとともに細胞が通過できるのに十分なサイズのギャップ又は孔を有するあらゆるマトリックスは、ふるい分けマトリックスとしての役割を果たす。マトリックスは含浸剤の緩衝溶液に入れられ、上記方法のように、細胞は、先ず、飽和し又は懸濁したマトリックスの露出された表面に配置され、細胞をマトリックスに電気泳動させるために位置決め電極に電圧を印加する。電界の影響下で、細胞は、マトリックスに移動し、マトリックスを通じてサイズに従って分布する。小さい細胞はマトリックスからの障害が小さいので、小さい細胞は高速で移動する。移動速度の差は、小さい質量、したがって、克服すべき電気泳動力に対する小さい細胞の小さい慣性からも生じうる。この方法の移動時間は、ふるい分けマトリックスが存在しない場合に移動が行われるときに比べて重大でないが、時間は、キュベットの上部から底までほぼ連続的な勾配とするための要因でもある。適切又は最適な移動時間は、結果的に得られる細胞の分布の観察を伴う通常の実験によって容易に決定される。一旦、所望の分布になると、位置決め電極に印加される電位が中断され、その後、衝撃電極１７，１８にパルスが印加され、電極間隔が狭いためにキュベットの底で強度が大きくなる電界を生成する。上記方法のように、電界強度それ自体がキュベットの底に向かって増大する勾配を有するので、細胞の幅に亘る電位降下は細胞のサイズにほぼ反比例する。
【００１３】
細胞サイズの勾配を生成し及び制御する更に別の手段を、図３に示すキュベット構造によって実現することができる。キュベット３１及び蓋３２は、キュベットの水平断面に及ぶふるい膜３３，３４を更に含む点を除いて図１及び図２のものと同一である。二つのふるい膜を本実施の形態で示すが、その数は、システムの要求に応じて変化し、中でも注目すべきは細胞のサイズの予測される範囲及びキュベットのサイズに応じて変化する。一部の場合には単一のふるい膜によって十分なサイズの分離が行われるが、大抵の場合には２から５の枚数のふるい膜が用いられることが予測される。ふるい膜は、キュベットの長手方向の軸線３５に沿って離間され、最も大きな孔のサイズを有する膜がキュベットの上部に最も近接するとともに膜の孔のサイズがキュベットの底に向かって連続的に減少するように配置される。図示した実施の形態において、２枚のふるい膜は、キュベット内部を、垂直方向に配置された三つのチャンバ３６，３７，３８に分割する。図１に関連して説明した第１の方法のように、ふるい膜の上下全てのキュベットの全ての部分に充填するために含浸剤の緩衝水溶液をキュベットに入れ、細胞を、キュベットの上部の溶液の露出表面に配置する。その後、負電極３９が溶液に接触するように蓋３２をキュベットの上に配置し、負の位置決め電極３９とキュベットの底にある正の位置決め電極４０との間に電位を印加し、電気泳動手段により細胞をキュベット内部に移動させる。最も大きな細胞は、上側のチャンバ３６に保持され、中間サイズの細胞は、上側のふるい膜３３を通過して中間のチャンバ３７に保持され、最も小さい細胞は、両方のふるい膜を通過し、下側のチャンバ３８に移動する。細胞が適切なチャンバに到達するまで電位が維持され、この手順における分離の時間的な制約は、図１に関連して既に説明した二つの手順のいずれかより小さい。その後、位置決め電位が中断され、衝撃電極４１，４２にパルスが印加され、下側のチャンバ３６で最も弱く、中間のチャンバ３７及び上側のチャンバ３８に行くにつれて徐々に強くなる強度を有する電界を生成する。したがって、細胞の幅に亘る結果的に得られる電位降下は、上記実施の形態のように細胞のサイズに反比例して変化する。
【００１４】
２組の電極に対する電気回路は従来のものであり、衝撃電極は、本願の出願時に市販されているジーンパルサーのいずれかの従来のキュベットの衝撃電極と同一の方法でパルスが印加される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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