(57)【要約】  ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１  Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１  Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）のＳＮＰのうちの少なくとも１つと対応するヌクレオチド配列を構成する群からの少なくとも１つの構成要素の少なくとも一部からなる核酸断片を備えるパネルと接触する試料に対応する、１つ以上の遺伝子の発現の存在、不在及び／又は規模を評価する、患者の、例えば重症の又は持続型の喘息などのＴＮＦ媒介性疾患についての標的治療の適合性及び／又は有効性を評価するための方法であって、これは連鎖不平衡（ＬＤ）にある試料中の１つ以上のかかるＳＮＰの判定をもたらす。本方法は、患者対してかかる治療の前又は後に標的となる治療法の有効性の同定を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者におけるＴＮＦ媒介性疾患の治療の適合性を予測するための方法であって、
（ａ）被験者から得られた標本から、核酸試料を調製することと、
（ｂ）前記試料と、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）のうちの少なくとも１つの少なくとも一部分からなる核酸断片を備えるパネルとを接触させることと、
（ｃ）前記試料からの核酸が、連鎖不平衡（ＬＤ）にある一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）を示すかどうかを判定することと、
（ｄ）工程（ｃ）の判定に基づいて、ＴＮＦ媒介性疾患のため治療の適合性を予測することと、を含む方法。
【請求項２】
前記治療が抗ＴＮＦ剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＴＮＦ剤がゴリムマブである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＴＮＦ剤がインフリキシマブ、アダリムマブ又はエタネルセプトである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＮＦ媒介性疾患が重症の又は持続型の喘息である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記試料について観察される連鎖不平衡の程度が、少なくとも１つの参照標準と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記参照標準が、肺生検、口腔粘膜検体、あるいは未治療の重症の若しくは持続型の喘息被験者、治療に応答性の被験者、又は治療に応答性でない被験者の末梢血細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記パネルが核酸断片のアレイである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標本が治療を受けている患者から得た末梢血細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標本が、治療の開始から１週後、４週後又は８週後に得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料中に存在する少なくとも１つの核酸についての連鎖不平衡が、治療の適合性の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）が、参照標準に対して前記試料を評価して、前記試料中に存在する核酸の連鎖不平衡の程度を判定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記参照標準が、治療に関する投与より前の患者由来のもの、プラセボ治療したＴＮＦ媒介性の患者のもの、又はバイオバンクからの試料である、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記パネルからの少なくとも１つの構成要素が、サイトカイン、ケモカイン、細胞外マトリックスの再構築に関与するタンパク質、脈管形成に関連する増殖因子、細胞接着分子及びミエロペルオキシダーゼについての遺伝子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標本が前記被験者の抹消血細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標本が、重症の又は持続型の喘息を有することが疑われる患者の、又は重症の又は持続型の喘息であると診断され、未だ治療を受けていない患者の組織生検である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記標本が、治療に関する投与よりも前の患者のもの、プラセボで治療された、類似の疾病又は状態を有する患者のもの、又はバイオバンクからの試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）が、中程度の条件、厳しい条件又は非常に厳しい条件下で、前記核酸断片を備えるパネルに前記試料を曝露することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）が、前記試料からの核酸が、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）のうちの少なくとも１つと連鎖不平衡（ＬＤ）にある一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）を示すかどうかを判定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
マーカー遺伝子又はそれらの相補鎖の核酸配列と同一であるか又は相補的なオリゴヌクレオチドと、前記マーカー遺伝子を発現している細胞とを含むキットであって、前記マーカー遺伝子が、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）の少なくとも１つである、予後又は診断使用のためのキット。
【請求項２１】
前記キットが重症の又は持続型の喘息のための治療薬の適合性をスクリーニングするために適応される、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願番号第６１／０３７，９８９号の利益を主張し、その内容の全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、重症の又は持続型の喘息などのＴＮＦ媒介性のの発現プロファイルの同定及びこの疾患の指標となる核酸に関し、並びに重症の又は持続型の喘息及び関連する疾病の診断についての、かかる発現プロファイル及び核酸の使用に関する。本発明は更に、候補剤及び／又は重症の又は持続型の喘息を制御する標的を、同定、使用、及び試験することを目的とする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物製剤での重症の又は持続型の喘息の治療には数多くの課題が存在している。調査のために患者集団を判定し、どの被験者が治療に対して応答し、かつどの被験者が続く治療に対しての応答を失うのかを予測することは、治療及び臨床研究の設計に大きな影響を持つ。バイオマーカーはこれらの疑問に答えるのに有用であり得る。
【０００４】
バイオマーカーは、正常な生物学的過程、発病過程、又は治療介入に対する薬理学的な応答性の指標として客観的に測定され評価される特徴として定義される（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，２００１，ｉｎｆｒａ）。バイオマーカーの定義は、発現の変化が、疾病若しくは進行のリスク増加に、又は所定の治療に対する疾病の応答性の予測に、関連付けられ得るタンパク質として最近更に定義された。
【０００５】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、適応免疫系が活性化される前に、微生物の進入に対して即時的な宿主防御を提供する自然免疫応答において、重要なサイトカインである。ＴＮＦαは、タンパク質分解によるプロセシングを経て可溶性トリマーを形成する、膜貫通型前駆体として発現する。膜結合型及び可溶型形態のＴＮＦはどちらも、その受容体であるＴＮＦＲＳＦ１Ａ及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（それぞれＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２としても既知）へと結合して、いくつかの他の炎症性サイトカイン及び一般的な炎症マーカーの発現を開始する。ＴＮＦαは、多くの慢性の、免疫媒介性の炎症性疾患の既知のメディエーターである。
【０００６】
３つの生物学的なＴＮＦα拮抗剤である、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、及びエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））が、患者のための使用について認可されてきた。第４の生物学的なＴＮＦα拮抗剤（すなわちゴリムマブ）についての規制認可が現在懸案中である。米国特許番号第７，２５０，１６５号を参照されたい。これらの剤の主要なメカニズムは、血中のＴＮＦ濃度を低下させることにより、患者に全身性の免疫抑制を引き起こすことなく全身性の炎症を軽減し、疾患の臨床的徴候を寛解することである。これらの剤はリウマチ様関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、乾癬、及び強直性脊椎炎の治療においては有効であることがこれまで示されてきた。
【０００７】
これらの抗ＴＮＦα剤のいずれも喘息の治療をするためには認可されていないが、ＴＮＦαは喘息における気道病変、特にステロイド抵抗性喘息の数多くの態様に結び付けられる。予備的な抗ＴＮＦα治療研究は、中等症〜重症の喘息の患者において、増悪の頻度の低下とともに、肺機能、気道過敏及び喘息患者の生活の質における改善を実証してきた。
【０００８】
しかしながら、抗ＴＮＦ治療に対する応答性には個人差があり、一部の患者では治療効果が得られない。多発性の遺伝子変異が重要な役割を演じ得ると仮説が立てられてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、重症の又は持続型の喘息などの免疫媒介性炎症性疾患と、同様に他の疾病及び状態とを、診断及び治療するための方法、並びに患者がどのように治療介入に応答し得るかを予測するための方法、を開発するのに有用な血清若しくは血漿から関連のある、新しい遺伝子マーカーを同定して特徴付ける必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、重症の又は持続型の喘息及び／又は関連する疾病又は疾患を診断及び／又は治療する方法に関し、並びに治療のための候補剤の適合性を予測する方法に関する。本発明は、治療に対して非応答性の患者又はプラセボ治療を行った患者と比較して、重症の又は持続型の喘息の治療に対して応答性の（重症の又は持続型の喘息の症状の低減において効果的である）患者において発現レベルが修正されている、対象とする特定の遺伝子の発見を含む。修正された発現レベルは、治療に対する患者の応答性を予測するバイオマーカープロファイルとして役立ち、及び／又は好ましい投薬経路を提供することができる、プロファイルを構成する。
【００１１】
本発明は、重症、持続型の喘息を備える患者において、抗ＴＮＦα剤（例えば、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））及びゴリムマブ）に対して治療的な応答性を備える、ＴＮＦα受容体遺伝子多型−１つのＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ（ｒｓ４１４９５８１）及び２つのＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ（ｒｓ３７６６７３０及びｒｓ５９０９７７）のうちの少なくとも１つ、例えば、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）の少なくとも１つのＳＮＰ−のセットの遺伝的な関連付けを開示する。そこには、２つのＴＮＦ受容体遺伝子におけるＳＮＰにおいて共通の遺伝子型（主要対立遺伝子についてのホモ接合体）を有する患者で喘息増悪の低減を示す、薬理遺伝学的な効果についての証拠が存在する。これらのＳＮＰは、一般的にこれらの２つの遺伝子内部で未だ特徴付けられていない他のＳＮＰについて連鎖不平衡（ＬＤ）に存在することから、本発明は、被験者のＴＮＦ媒介性のに関して治療の適合性を予測する能力を提供し、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）のＳＮＰの少なくとも１つは、お互いに又は他のＳＮＰと、連鎖不平衡（ＬＤ）の状態で見出される。一実施形態では、配列番号１〜３のＳＮＰは、抗ＴＮＦ治療に更に応答性の、重症の喘息である被験者の同定においてバイオマーカーとして有用である。好ましい実施形態においては、抗ＴＮＦ治療は抗ＴＮＦ抗体である。他の好ましい実施形態においては、抗ＴＮＦ治療はエタネルセプトなどの抗ＴＮＦ剤である。他の好ましい実施形態においては、抗ＴＮＦ抗体はインフリキシマブ又はアダリムマブである。更に好ましい実施形態においては、抗ＴＮＦ抗体はゴリムマブである。
【００１２】
他の実施形態においては、本発明は、重症の若しくは持続型の喘息又は関連する疾患の治療のための候補剤の有効性を評価する方法において、例えば、治療の有効性が症状又は従来の疾病特徴では測定できない場合がある治療の初期の時点で、遺伝子パネルを用いる。
【００１３】
提供されるＳＮＰ（配列番号１、２及び／又は３）は、被験者におけるＴＮＦ媒介性ののための治療の適合性を予測するために、以下の（ａ）〜（ｄ）で使用することができる。
（ａ）患者から得られた標本から、核酸試料を調製することと、
（ｂ）試料を、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）のうちの少なくとも１つの少なくとも一部を有する核酸断片のパネルと接触させることと、
（ｃ）試料からの核酸が、連鎖不平衡（ＬＤ）にある一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）を示すかどうかを判定することと、
（ｄ）工程（ｃ）においてなされる判定に基づいて、ＴＮＦ媒介性ののため治療の適合性を予測すること。
【００１４】
特定の実施形態においては、本発明は、治療に対する被験者の応答性の指標となる１つ以上の遺伝子の遺伝子発現のパターンに基づいて、重症の又は持続型の喘息のための治療の適合性を、又はかかる遺伝子の特定の対立遺伝子の存在又は不在を予測する方法を含む。これらの遺伝子の１つ以上は、ＴＮＦα受容体遺伝子多型−ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）−のセットに関連する、遺伝子の分類に由来する。記載される方法で試験される被験者は、かかる試験を必要としていると考えられる任意の被験者であることができる。好ましい実施形態においては、被験者は、重症の又は持続型の喘息を有する疑いがある患者、及び重症の又は持続型の喘息であると診断されているが治療を受けていない患者からなる群から選択することができる。
【００１５】
記載される方法に関しての使用を目的とする試料は、試験される被験者の血液又は組織から得ることができる。例えば、血液標本、又は血清、血漿、ヘマトクリット、白血球、又は血液中に存在している有形成分などの、血液標本又はその構成成分由来であり得る。組織標本はまた、例えば肺生検、気管支生検、口腔粘膜検体及び同様物などの試験試料を得るために使用し得る。パネル又は試験試料をなすポリヌクレオチドなどの遺伝的要素はまた、サイトカイン、ケモカイン、細胞外マトリックスの再構築に関与するタンパク質、脈管形成に関連する増殖因子、細胞接着分子、ミエロペルオキシダーゼ、及び同様物などに関する、遺伝子由来であることができる。当業者は、パネル及び試験試料の両方の重要な構成要素として適切な標本を入手し得る数多くの供給源が、ほとんどのあらゆる組織又は体液から得ることができるＤＮＡ又はｍＲＮＡなどの遺伝物質であることを認識するであろう。
【００１６】
加えて本発明は、特定の治療剤による治療の候補である、重症の若しくは持続型の喘息及び／又は関連する疾病若しくは疾患の患者を、パネルの１つ以上のこれらのＴＮＦ受容体ＳＮＰの発現プロファイルを評価することによって、同定する方法を含む。
【００１７】
更なる実施形態においては、重症の又は持続型の喘息関連遺伝子プロファイルは、予後又は診断目的のためのアレイに基づく方法を作成するために使用され、かかる方法は以下の（ａ）〜（ｄ）を含む。
（ａ）被験者から得られた標本から、核酸試料を調製することと、
（ｂ）試料を、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）のうちの少なくとも１つの少なくとも一部を有する核酸断片のパネルと接触させることと、
（ｃ）試料からの核酸が、連鎖不平衡（ＬＤ）にある一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）を示すかどうかを判定することと、
（ｄ）工程（ｃ）においてなされる判定に基づいて、喘息のための治療の適合性を予測すること。
【００１８】
いくつかの実施形態においては、遺伝子プロファイルは、本明細書において提供される方法により得られる結果と、少なくとも１つの参照標準（reference standard）とを比較するのに有用であり得る。かかる比較は、最も効果的であろう治療の種類の判定、疾病の重症度又は疾病の進行度の判定、多様なＳＮＰ間の連鎖不平衡の程度の判定、被験者のゲノム中に存在する対象とする遺伝子の対立遺伝子の判定、多様な被験者間のそれぞれのパネルの構成要素についての平均強度値における変化の規模の判定、及び同等のこと、に有用であり得る。参照標準は、被験者からの肺生検、気管支生検、口腔粘膜検体、血清、血漿又は白血球細胞などの他の血液画分などの、任意の供給源由来の遺伝子プロファイルであってよい。参照標準試料を得る被験者は様々であることができ、例えば、疾病の治療を受けていない、中等症の、重症の若しくは持続性の喘息の一人以上の被験者、疾患の治療を受けている、中等症、重症若しくは持続性の喘息の一人以上の被験者、中等症、重症の一人以上の被験者、プラセボで疾患の治療を受けている中等症、重症若しくは持続性喘息の一人以上の被験者、又は疾患の治療を現在受けている持続性喘息の被験者、治療に応答性の被験者若しくは治療に応答性でない被験者、から試料を得ることができる。加えて、参照標準試料は、治療前に若しくは治療の初期の時点で参照標準として試験試料を得た被験者と同一の被験者、又は試験試料を得た異なる治療レジメンを受けている被験者と同一の被験者から得ることができる。参照標準はまたバイオバンク、又はかかる標本を有する若しくは蓄積する類似の団体から得られる標本由来であってもよい。当業者であれば、パネル及び試験試料の両方の重要な供給源として参照標準を調製するための適切な参照標準試料を入手し得る数多くの供給源が存在し、これらがほとんどのあらゆる組織又は体液から得ることができる、ＤＮＡ又はｍＲＮＡなどの遺伝物質であることを認識するであろう。参照標準は異なる時点での同一の患者から得られた標本由来であってもよく、例えば、参照標準は治療の前又は間又は後、あるいは治療の前、間及び後の同一の患者から得た標本由来であり得る。
【００１９】
所望により、これらの変化の有意性を評価し、どの構成要素がパネルの有意な構成要素であるのか同定するために、遺伝子ＳＮＰ対応パネルの構成要素の変化の程度について統計解析が実施される。
【００２０】
本明細書に提供される方法により評価されるヌクレオチドが、互いにＬＤにある、又は配列番号１、２及び／又は３のＳＮＰとＬＤにある、ＳＮＰを有するか否かについての判定は、提供される方法から逸脱することなく、様々であることができる。例えばかかる判定は参照標準との比較を通してなされ得、ここで、試料と参照標準との間の強度読み出し情報における差異はＬＤの指標となり、試料と参照標準とにおける同一のＳＮＰの存在はＳＮＰ間のＬＤを示すことができる。数多くのソフトウェアプログラム（いくつか例を挙げるならばＨａｐｌｏｖｉｅｗ、ＬｄＣｏｍｐａｒｅ、ＰｙＰｏｐ、及びＨｅｌｉｘＴｒｅｅ（登録商標））を、ＬＤ解析を実行するために利用することができる。
【００２１】
記載された方法はまた、測定されるＳＮＰを有するそれぞれのヌクレオチドについて平均強度値を判定するために、使用することもできる。一実施形態では、参照標準に関して観察された平均と等しいか又はそれよりも低い、試験されたＳＮＰの少なくとも１つについての平均強度値は、被験者が治療に対して望ましく応答するであろうことを示し、及び参照標準に関して観察された平均よりも高い、パネルのそれぞれの構成要素についての平均強度値は、被験者が治療に対して不十分に応答するであろうことを示す。あるいは一実施形態では、参照標準に関して観察された平均と等しいか又はそれよりも高い、試験されたＳＮＰの少なくとも１つについての平均強度値は、被験者が治療に対して望ましく応答するであろうことを示し、及び参照標準に関して観察された平均よりも低い、パネルのそれぞれの構成要素についての平均強度値は、被験者が治療に対して不十分に応答するであろうことを示す。いくつかの実施形態においては、試験される１つ以上のヌクレオチド配列は、更なる詳細を得るために、あるいはヌクレオチド配列の評価のために、配列解析で解析され得る。他の実施形態においては、試験される１つ以上のヌクレオチド配列を質量分析法により分析することができ、これは配列組成、メチル化状態、及び同等の状態のような状況を判定するのに役立ち得る。
【００２２】
代替的な実施形態においては、本発明は、重症の若しくは持続型の喘息及び／あるいは遺伝子発現のパターンに基づく関連する疾病又は疾患を治療するための、候補剤の適合性を予測するためのキットを含む。いくつかの実施形態においては、このキットは以下の物を任意で、又は全て含むことができる。マーカー遺伝子のヌクレオチド配列又はその相補鎖と同一の又は相補的なオリゴヌクレオチド、マーカー遺伝子を発現している細胞（マーカー遺伝子は、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）のＳＮＰの少なくとも１つのヌクレオチド配列、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）の１つ以上を備える、ＬＤにある既知のＳＮＰ、及びＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）の少なくとも１つを有するヌクレオチドアレイパネル、からなる群から選択される）。
【００２３】
本発明は、本明細書に記載する任意の発明を更に提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
以下の定義は、本明細書で発明を記載するために用いる種々の用語の意味及び範囲を説明及び定義するために記載される。
【００２５】
ポリペプチドの「活性」、生物活性及び機能活性は、標準的な技術により、生体内（in vivo）、原位置（in situ）又は体外（in vitro）で決定するとき、別のタンパク質又は分子との特異的相互作用に応答して重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子パネルの遺伝子により発揮される活性を指す。このような活性は、第２のタンパク質に関連する若しくはそれに対する酵素活性のような直接的活性、又はタンパク質と第２のタンパク質との相互作用により媒介される細胞プロセス、若しくは細胞内シグナル伝達若しくは凝固カスケードに見られるような一連の相互作用のような間接的活性であることができる。
【００２６】
「抗体」には、Ｈ鎖若しくはＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）又はそのリガンド結合部、Ｈ鎖若しくはＬ鎖の可変領域、Ｈ鎖若しくはＬ鎖の定常領域、フレームワーク領域、又はその任意の部分、断片又は変異体の少なくとも１つなどであるが、これらに限定されない、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のポリペプチド又はペプチド含有分子が挙げられる。用語「抗体」は、更に、抗体、その消化断片、特定部分及び変異体を包含することを意図し、これには抗体模倣薬が挙げられ、あるいは抗体の構造及び／若しくは機能を模倣する抗体の部分若しくはその特定断片若しくは一部を含み、単鎖抗体及びその断片が挙げられる。例えば、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）及びＦ（ａｂ’）２（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシン又はプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元及び再集合による）、Ｆｖ又はｓｃＦｖ（例えば、分子生物学的技術による）断片、及び単一ドメイン抗体（例えば、ＶH又はＶL）が挙げられるが、これらに限定されない抗体断片が、本発明に包含される（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００１年）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９７〜２００７年）を参照のこと）。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「アレイ」若しくは「マイクロアレイ」、又は「バイオチップ」若しくは「チップ」は、複数の不動化した標的要素（それぞれの標的要素は「クローン」、「フィーチャー」、「スポット」を含む）、あるいは複数の組成物（例えば以下に更に詳細に議論されるような、固体表面に不動化された核酸分子又はポリペプチドのような生体分子など）を含む画定された領域を含む、製品又はデバイス物品を指す。
【００２８】
本発明の核酸配列の「相補体」又は本発明の核酸配列と「〜と相補的なもの」は、第１のポリヌクレオチドと比較したときに、相補的な塩基配列及び逆向きの配向を有するポリヌクレオチド分子を指す。
【００２９】
当該技術分野において既知のように「同一性」は、配列を比較することにより判定される、２つ以上のポリペプチド配列間又は２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、「同一性」はまた、かかる配列の文字列間の適合によって判定されるような、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の配列的な関連性の度合いを意味する。「同一性」及び「類似性」は、限定するものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されるものが挙げられる、既知の方法によって容易に算出することができる。加えて、同一性の割合に関する値は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ８．０（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）の構成要素であるＡｌｉｇｎＸのセッティングのデフォルトを用いて作成される、アミノ酸及びヌクレオチド配列アラインメントから得ることができる。
【００３０】
本明細書で使用するとき、用語「〜に特異的なハイブリダイズ」、「〜に特異的にハイブリダイズする」、「特異的なハイブリダイゼーション」及び「〜に選択的にハイブリダイズする」は、核酸分子が、厳しい条件下で優先的に特定のヌクレオチド配列に結合すること、二本鎖形成すること、又はハイブリダイズすることを指す。用語「厳しい条件」は、プローブが優先的にその標的配列にハイブリダイズし、他の配列にはより低い程度でハイブリダイズするか又は全くハイブリダイズしない条件を指す。核酸ハイブリダイゼーション（例えばアレイ、サザン又はノーザンハイブリダイゼーションなど）の文脈における、「厳しいハイブリダイゼーション」及び「厳しいハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、異なる環境パラメータ下においては異なる。本発明を実行するために使用することができる代替的ハイブリダイゼーション（Alternative hybridization）の条件は、以下に詳細に記載する。選択的な態様においては、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄の条件は、以下に詳細に記載する中程度の条件（moderate conditions）、厳しい条件及び非常に厳しい条件下で実行される。代替的な洗浄条件（alternative wash condition）はまた、本明細書において更に詳細に記載されるように、異なる態様においても使用される。
【００３１】
本明細書で使用するとき、語句「標識された生体分子」又は「検出可能な組成物で標識された」又は「検出可能な部分で標識された」は、以下で詳細に記載するように、検出可能な組成物、すなわち標識を含む、例えば核酸などの生体分子を指す。標識はまた、以下に記載するように、例えば「分子指標」のようなステムループ構造の形態の核酸などの核酸のような、別の生体分子であることもできる。これは、例えばニックトランスレーション、ランダムプライマー伸長法、変性したプライマーによる増幅などにより、標識された塩基（又は検出可能な標識に結合できる塩基）を核酸に組み込むことを含む。例えば、化学発光標識、放射標識、酵素標識などの任意の標識を用いることができる。標識は、例えば、視覚的、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、物理的、化学的及び／又は化学発光的検出などの任意の手段により検出可能である。本発明は、検出可能な標識を含む固定化核酸を含むアレイを用いることができる。
【００３２】
本明細書で使用するとき、用語「核酸」は、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかであるデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を指す。かかる用語は、天然のヌクレオチドの既知のアナログを含有している核酸を包含する。用語「核酸」は遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ及び増幅産物と互換的に使用される。かかる用語はまた、例えばリン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオレート、メチルホスホン酸、ホスホロアミド酸、アルキルホスホトリエステル（alkyl phosphotriester）、スルファミン酸、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、及びペプチド核酸（ＰＮＡｓ）などの、ＤＮＡ骨格のアナログを包含する。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「試料」又は「核酸試料」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいは天然の供給源から単離されたＤＮＡ又はＲＮＡの代表的な核酸、を含む試料を指す。「核酸試料」は、他の核酸（例えば、不動化されたプローブ）とのハイブリダイゼーションに適合する形態（例えば可溶な水溶液として）である。試料核酸は特定の細胞又は組織から単離、クローニング又は抽出することができる。核酸試料が調製される細胞又は組織試料は、典型的にはＵＣ又は関連する疾病若しくは状態を有しているか又は有していると疑われる患者から採られる。細胞及び組織試料を単離する方法は当業者に周知であり、限定するものではないが、吸引法、組織切片法、針生検法、及び同様の方法などが挙げられる。しばしば試料は「臨床試料」であり得、凍結切片又はパラフィン切片などの、組織学的な目的のために採られた組織切片を含む、患者由来の試料である。試料はまた、（細胞の）上清又は患者若しくは細胞培養物から採られた細胞そのもの、又は組織培養からの細胞、又は候補剤に対する応答を検出するのに望ましいものであり得る他の培養液からの細胞由来であってもよい。場合によっては、核酸はハイブリダイゼーションに先立ちＰＣＲなどの標準的な技術を用いて増幅してもよい。プローブは１つ以上の特定の（予選択された）部位からの核酸供給源（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物の収集物、実質的に染色体全体又は染色体断片、あるいは例えば、ＢＡＣｓ、ＰＡＣｓ、ＹＡＣｓ、及び同様物（以下を参照のこと）などのクローンの収集物としての、実質的にゲノム全体）から調製することができ、総じてプローブはかかる核酸供給源の代表的な核酸であり得る。
【００３４】
「核酸」はヌクレオチドのポリマーであり、ヌクレオチドは糖と結合している塩基を含む（糖は順にリン酸などの少なくとも２価の分子をとりなすことで互いに結合されている）。天然に生じる核酸では、糖は２’−デオキシリボース（ＤＮＡ）又はリボース（ＲＮＡ）のいずれかである。非天然ポリ又はオリゴヌクレオチドは、修飾された塩基、糖、又は結合分子を含有するが、概して、かかるヌクレオチドは設計された後に、天然に生じる核酸の相補的な性質を模倣することが理解される。非天然のオリゴヌクレオチドの例は、ホスホロチオエート（phosphorothiorate）骨格鎖を有するアンチセンス分子組成物である。「オリゴヌクレオチド」は一般的に、３０個未満のヌクレオチドを有する核酸分子を指す。
【００３５】
用語「プロファイル」は、パターンを意味し、多数の特性の変化の規模及び方向に関する。プロファイルは、厳密に解釈してもよく、すなわち、特徴を示すプロファイル内のフィーチャーの規模及び／若しくは数の変化が実質的に参照プロファイルに類似し、あるいはフィーチャーの全て若しくは部分集合の絶対的な一致ではなく傾向を必要とすることにより、それ程厳密に解釈しなくてもよい。
【００３６】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、上記で詳細に論じたように、変異体の由来するポリペプチドに実質的に一致する構造及び活性を有する「類似体」又は「保存された変異体」及び「模倣物質」若しくは「ペプチド模倣物質」を含む。
【００３７】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合により結合したアミノ酸残基のポリマーであり、ペプチドは一般に１２個以下の残基のアミノ酸ポリマーを指す。ペプチド結合は、核酸テンプレートにより導かれるように天然に、又は当該技術分野で周知である方法により合成的に生成することができる。
【００３８】
「タンパク質」は、１つ又はそれ以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は更に、ペプチド結合の形成に関与しないアミノ酸の側基に結合した置換基を含んでもよい。典型的には、真核細胞の発現により形成されるタンパク質はまた、炭水化物を含有する。タンパク質は、本明細書では、既知であろうとなかろうと、そのアミノ酸配列又は骨格鎖及び置換基の観点で定義される。
【００３９】
用語「受容体」は、特異的リガンド又は結合パートナーとの相互作用の結果として、例えば細胞内で、生物活性に影響を及ぼす能力を有する分子を指す。細胞膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、１つ又はそれ以上の膜貫通又はトランスメンブレンドメイン、及び典型的にはシグナル伝達に関与する細胞内エフェクタードメインを特徴とする。細胞膜受容体にリガンドが結合することにより、細胞膜を超えて連絡している細胞外ドメインに変化が生じ、１つ又はそれ以上の細胞内タンパク質と直接的に又は間接的に相互作用し、酵素活性、細胞形状又は遺伝子発現プロファイルのような細胞特性を変化させる。受容体はまた、細胞表面に係留されていなくてもよく、細胞質性、核性であってよく、又は一緒に細胞から放出されてもよい。非細胞関連受容体は、可溶性受容体又はリガンドと呼ばれる。
【００４０】
用語「ＴＮＦ媒介性」は広範に使用され、ＴＮＦに関連する（related）及びＴＮＦに関連する（associated）などの代替的な程度の関連性を含み、またＴＮＦによって直接的に又は間接的に媒介されるプロセスを包含する。
【００４１】
【表１】
2011517406.tif 000002
【００４２】
本明細書で引用する全ての刊行物又は特許は、適宜明示されているかどうかによらず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本発明の時点での当該技術分野の状態を示し、並びに／又は、本発明の説明及び使用可能性を提供する。発行物とは、任意の科学的又は特許公開、又は全ての記録、電子、又は印刷形式を含む任意のメディア形式で入手可能な任意の他の情報を意味する。以下の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８７〜２００８年）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）、ａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００７年）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９７〜２００７年）。
【００４３】
遺伝子パネルの同定及び検証
本発明は、重症の又は持続型の喘息の症状を制御する組成物のスクリーニングを行うための、新規の方法を提供する。本発明は、ＴＮＦα受容体遺伝子多型−１つのＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ（ｒｓ４１４９５８１（配列番号１））及び２つのＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ（ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）及びｒｓ５９０９７７（配列番号３））の少なくとも１つと、重症の、持続性の喘息を罹患している被験者における抗ＴＮＦα剤（例えばゴリムマブ）に対する治療応答性とのセットの、遺伝的な関連付けを開示する。２つのＴＮＦ受容体遺伝子のＳＮＰに共通の遺伝子型（主要対立遺伝子についてのホモ接合体）を有する被験者で喘息増悪の低減を示す、薬理遺伝学的な効果についての証拠が存在する。これらのＳＮＰは一般的に、これら２つの遺伝子内部の、他の特徴付けられていないＳＮＰと連鎖不平衡（ＬＤ）にあることから、本発明は、より抗ＴＮＦ治療に応答性の重症の喘息患者を同定するのにあたってバイオマーカーとして有用である、連鎖不平衡（ＬＤ）にあるＴＮＦＲＳＦ１Ａ  ＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ３７６６７３０（配列番号２）又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰ  ｒｓ５９０９７７（配列番号３）のＳＮＰの１つ以上の、すなわちかかるＳＮＰの少なくとも１つの存在を提供する。
【００４４】
病変組織で異なる発現をするこれらのＴＮＦＲ  ＳＮＰ配列（遺伝子、すなわち以降「重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子配列」）を同定することで、数多くの方法におけるこの発現情報の使用が可能になる。例えば、特定の治療レジメンについての評価を評価することができる。評価は、これらのＴＮＦＲ  ＳＮＰ配列と相補的な配列のセットを含むバイオチップを製造することによりなすことができ、バイオチップは次いで生物学的な試料（例えば患者からの試料など）中のこれらの配列を同定するために使用できる。これらの方法はまた、タンパク質レベルで実施されてもよく、つまり重症の又は持続型の喘息に関連するＴＮＦＲ  ＳＮＰ産物のタンパク質発現レベルを診断目的で評価することができ、すなわち抗ＴＮＦ治療を選択するために、又は追加の治療上の候補を選別するために、発現レベルを評価することができる。加えて、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子プロファイルを含む核酸配列は、治療に先立ち、患者が治療に対して応答しやすいかどうかを測定するために使用できる。
【００４５】
重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子配列には、核酸配列及びアミノ酸配列のいずれをも含むことができる。好ましい実施形態においては、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子配列は組み換え核酸である。本明細書において、用語「組み換え核酸」は、概してポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、通常は天然には見出されない形態で、元来体外で形成される核酸を意味する。したがって、線状形態である単離された核酸、又は通常は繋がれていないＤＮＡ分子を連結することによって体外で形成された発現ベクターは、どちらも本発明の目的のための組み換え体として考慮される。一度組み換え核酸が作成され、宿主細胞又は微生物中に再導入されると、かかる核酸は組み換えられることなく（すなわち、体外操作によるよりも宿主細胞の生体内の細胞機構を用いて）複製されるであろうことが理解されるが、このような核酸は一度組み換え体として産生されると（続く複製は非組み換え的に行われるが）、引き続き本発明の目的のための組み換え体であるとみなす。
【００４６】
本発明を実施する方法
本発明は、体外、原位置又はシリコン内（insilico）での、２つ以上の試料における結合分子（例えば核酸配列）の相対的な量に依る、核酸、タンパク質及び／又はアレイに基づく方法を提供する。同様に、２つ以上の試料において結合分子（例えば核酸配列）の相対的な量を判定し、判定された相対的な結合量を用いて、特定の治療に対する応答性を予測する、コンピューターにより実行される方法が提供され、提供される方法は治療を監視し効果を高める。
【００４７】
本発明で実施される方法では、標識された生体分子（例えば核酸）の１つ以上の試料は、２つ以上のアッセイ又はアレイに適用され、アッセイ又はアレイは、不動化された結合分子（例えば標識された試料核酸にハイブリダイズする能力を有する、不動化された核酸）と実質的に同一である相補体を有する。典型的には２つ以上のアレイが、同一のアレイの複数のコピーである。しかしながら、核酸及び他のもののアレイに典型的である、アレイ上の各「スポット」、「クローン」又は「フィーチャー」は、類似の生体分子（例えば同じ配列の核酸）を有し、各スポット中の生体分子（例えば核酸）は既知であることから、本発明に用いられる複数のアレイでは配置が同じである必要はなく、基板上の各フィーチャーの位置のみが必要であることは既知であり、すなわちアレイはアドレスを有する。したがって、一態様では、試料中の複数の生体分子（例えば核酸）は競合的にアレイに結合し（例えば同時にハイブリダイズして）、集められた情報はコード化されるので、結果はフィーチャー（例えば核酸配列）の固有の特徴に基づき、その基板上の位置に基づくものではない。
【００４８】
核酸の増幅
オリゴヌクレオチドプライマーを用いる周知の核酸増幅法を、本発明の組成物及び方法に使用される核酸を生成するために、アレイにハイブリダイズする試験又は対照試料のレベルを検出又は測定するために、及び例えば本発明のＴＮＦＲ  ＳＮＰの存在を検出するなどのために、使用することができる。当事者は、適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択及び設計することができる。増幅方法はまた当該技術分野で周知であり、例えば以下のものが挙げられる；ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ（ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）及びＰＣＲ  ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ（１９９５），ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばＷｕ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７を参照されたい）、転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３を参照されたい）、並びに自家持続配列複製（self-sustainedsequencereplication）（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４を参照されたい）、Ｑβレプリカーゼによる増幅（例えば、Ｓｍｉｔｈ（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１４７７〜１４９１を参照されたい）、Ｑβレプリカーゼによる自動化された増幅アッセイ（例えば、Ｂｕｒｇ（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １０：２５７〜２７１を参照されたい）及び他のＲＮＡポリメラーゼ媒介性の技術（例えば、ＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、また、Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３０７〜３１６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、米国特許番号第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号、Ｓｏｏｋｎａｎａｎ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３〜５６４を参照されたい。
【００４９】
核酸ハイブリダイズ
本発明の方法を実施するにあたり、核酸の試験及び対照試料を、不動化された核酸プローブ（例えばアレイ上の）とハイブリダイズさせる。代替的な態様においては、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件は、中程度の条件下で、厳しい条件下で、及び非常に厳しい条件下で実行される。核酸のハイブリダイゼーションのための広範な手引は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｔｉｊｓｓｅｎに見出される。一般的に、極めて厳しいハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、定義されたイオン強度及びｐＨ下で、特異的な配列用に熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。Ｔｍは、（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）完全に適合するプローブに、標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。非常に厳しい条件が選択されると、特定のプローブについてのＴｍと等しいものになる。相補的な核酸（サザン又はノーザンブロットにおけるアレイ又はフィルタ上で１００個以上の相補的な残基を有する）のハイブリダイゼーションのための、厳しいハイブリダイゼーション条件は、標準的なハイブリダイゼーション溶液を用いて４２℃であり（例えばＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）、ハイブリダイゼーションは一晩実行される。極めて厳しい洗浄条件の例は、０．１５ＭのＮａＣｌで、７２℃下で約１５分間にわたる。厳しい洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣ洗浄液で、６５℃下で１５分間にわたる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。多くの場合、極めて厳しい洗浄は、バックグラウンドのプローブシグナルを除去するために溶媒すなわち厳しさの低い洗浄に先行する。二本鎖（例えば１００ヌクレオチド以上）についての中程度に厳しい洗浄の例は、１×ＳＳＣで、４５℃下で１５分間にわたる。二本鎖（例えば１００ヌクレオチド以上）についての厳しさの低い洗浄の例は、４〜６×ＳＳＣで、４０℃下で１５分間にわたる。
【００５０】
本発明の組成物及び方法の代替的な態様（例えば、アレイを備える比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などの、比較核酸ハイブリダイゼーションの実施における）では、蛍光色素Ｃｙ３（登録商標）及びＣｙ５（登録商標）が、２つの試料からの異なる標識核酸断片（例えば、アレイ不動化核酸対試料核酸、又は対照から生成される核酸対試験細胞若しくは試験組織から生成される核酸）のために使用される。多くの市販の装置が、これらの２つの色素の検出を収容するよう設計されている。蛍光色素であるＣｙ５（登録商標）、又は他の酸化感受性化合物の安定性を上昇させるために、抗酸化剤及びフリーラジカルスカベンジャーをハイブリダイゼーション混合液（ハイブリダイゼーション溶液及び／又は洗浄溶液）中に使用することができる。したがって、Ｃｙ５（登録商標）シグナルは劇的に上昇し、より長いハイブリダイゼーション時間が可能になる。国際公開第０１９４６３０  Ａ２号及び米国特許第２００２０００６６２２号を参照されたい。
【００５１】
ハイブリダイゼーション感度の更なる上昇のために、ハイブリダイゼーションは制御された、湿度が不飽和な環境で実行することができ、したがってハイブリダイゼーション効率は、湿度が飽和でない場合に有意に改善される。国際公開第０１９４６３０  Ａ２号及び米国特許第２００２０００６６２２号を参照されたい。ハイブリダイゼーション効率は、湿度が動的に制御される場合に、すなわちハイブリダイゼーションの間に湿度が変化する場合に改善され得る。質量移動（Mass transfer）は動的に平衡化された湿度環境において促進されるであろう。ハイブリダイゼーション環境における湿度は、段階的に又は連続的に調節することができる。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄及び／又は検出段階の間に、操作者に湿度の制御を可能にさせるハウジング及びコントロールを含むアレイデバイスを使用することができる。デバイスは、湿度及び温度制御（それらは一定及び正確であるか又は変動する）、並びに全体の手順サイクル（プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄及び検出工程が含まれる）中の他のパラメータを予めプログラミングすることを可能にするために、検出、制御、及びメモリ要素を有することができる。国際公開第０１９４６３０  Ａ２号及び米国特許第２００２０００６６２２号を参照されたい。
【００５２】
本発明の方法は、浸透圧の変動を含むハイブリダイゼーション条件を含むことができる。ハイブリダイゼーション効率（すなわち平衡までの時間）はまた、高／低浸透圧性（例えば溶質勾配）の変化を含む、ハイブリダイゼーション環境によって高めることもできる。溶質勾配はデバイス中に作り出す。例えば、低塩濃度ハイブリダイゼーション溶液をアレイハイブリダイゼーションチャンバの片面上に配置し、高塩濃度のバッファを他方の面上に配置することで、チャンバに溶液勾配を生成する。国際公開第０１９４６３０  Ａ２号及び米国特許第２００２０００６６２２号を参照されたい。
【００５３】
反復性核酸配列のハイブリッド形成する能力のブロッキング
本発明の方法は、不動化された核酸断片において、反復性核酸配列のハイブリッド形成する能力をブロッキングする（すなわち「ハイブリッド形成能」をブロッキングする）工程を含むことができる。試料核酸配列中の反復性核酸配列のハイブリッド形成能は、試料核酸配列と、非標識の又は代替的に標識された（alternatively labeled）反復性核酸配列とを混合することによってブロックすることができる。試料核酸配列は、アレイの不動化核酸断片と接触させる工程の前に反復性核酸配列と混合することができる。ブロッキング配列は、例えばＣｏｔ−１  ＤＮＡ、鮭精子ＤＮＡ、又は特異的な反復性ゲノム配列である。反復性核酸配列は非標識であってもよい。反復配列のハイブリッド形成能を除去及び／又は不能にする（例えばＣｏｔ−１を用いて）、数多くの方法が既知である、例えば、Ｃｒａｉｇ（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１００：４７２〜４７６、国際公開第９３／１８１８６号を参照されたい。反復性ＤＮＡ配列は、ライブラリプローブから磁気精製及び親和性ＰＣＲ（affinity PCR）の手法で除去することができる（例えばＲａｕｃｈ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４４：５９〜７２を参照されたい）。
【００５４】
アレイは一般的に、「スポット」若しくは「クラスタ」、又は「フィーチャー」として定義される、プレートの表面上に不動化された複数の標的要素であり、各標的要素は、試料中の分子に特異的に結合（例えばハイブリッド形成）するために、固体表面に対して不動化させた１つ以上の生体分子（例えば核酸又はポリペプチド）を含んでいる。不動化させた核酸は、具体的なメッセージ（例えば、ｃＤＮＡライブラリなど）又はヒトゲノムを含む遺伝子（例えば、ゲノムライブラリ）からの配列を含有することができる。他の標的要素には、参照配列及び同等のものを含有することができる。アレイの生体分子は異なる大きさ及び異なる密度で固体表面上に配列してよい。アレイ上の、クラスタにおける生体分子の密度及びクラスタの数は、例えば標識の性質、固体支持体、基板表面の疎水性の程度、及び同等のものなどの、因子の数によって決められるだろう。各フィーチャーは、実質的に同一の生体分子（例えば核酸）、又は生体分子の混合物（例えば異なる長さ及び／又は配列の核酸）を含むことができる。したがって、例えば、フィーチャーはＤＮＡの複製小片のコピーを１つ以上含有してもよく、各コピーは異なる長さの断片に切断することができる。
【００５５】
生体分子（例えば核酸）が不動化されたアレイ基板表面には、ニトロセルロース、ガラス、石英、石英ガラス、プラスチック及び同様のものが挙げられ、以下に更に詳細に議論される。本発明の組成物及び方法は以下に記載されるもののような、アレイの全体又は一部の設計、並びに関連する構成要素及び方法を組み込むことができる、例えば米国特許番号第６，３４４，３１６号、同第６，１９７，５０３号、同第６，１７４，６８４号、同第６，１５９，６８５号、同第６，１５６，５０１号、同第６，０９３，３７０号、同第６，０８７，１１２号、同第６，０８７，１０３号、同第６，０８７，１０２号、同第６，０８３，６９７号、同第６，０８０，５８５号、同第６，０５４，２７０号、同第６，０４８，６９５号、同第６，０４５，９９６号、同第６，０２２，９６３号、同第６，０１３，４４０号、同第５，９５９，０９８号、同第５，８５６，１７４号、同第５，８４３，６５５号、同第５，８３７，８３２号、同第５，７７０，４５６号、同第５，７２３，３２０号、同第５，７００，６３７号、同第５，６９５，９４０号、同第５，５５６，７５２号、同第５，１４３，８５４号、同様に例えば国際公開第９９／５１７７３号、同第９９／０９２１７号、同第９７／４６３１３号、同第９６／１７９５８号、同第８９／１０９７７号を参照されたい、同様に例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１〜１７４、Ｓｃｈｕｍｍｅｒ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１０８７〜１０９２；Ｋｅｒｎ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１２０〜１２４、Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ（１９９７）Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ＆  Ｃａｎｃｅｒ  ２０：３９９〜４０７、Ｂｏｗｔｅｌｌ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐ．２１：２５〜３２、Ｅｐｓｔｅｉｎ（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：３６〜４１、Ｍｅｎｄｏｚａ（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２７：７７８〜７８８、Ｌｕｅｋｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３〜１１１、Ｄａｖｉｅｓ（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２７：１２５８〜１２６１を参照されたい。
【００５６】
基板表面
本発明の組成物及び方法において使用できる基板表面には、例えばガラス（例えば米国特許番号第５，８４３，７６７号を参照されたい）、セラミックス、及び石英が挙げられる。アレイは、剛性の、半剛性の又は可撓性材料の基板表面を有することができる。基板表面は平らすなわち平面であってよく、あるいはウェル、隆起領域、エッチングした溝、孔、ビーズ、フィラメント、又は同様のものなどの形状であってもよい。基板表面はまた、例えばニトロセルロース、紙、結晶質基材（例えばガリウムヒ素）、金属、半金属、ポリアクリロイルモルホリド（polacryloylmorpholide）、様々なプラスチック及びプラスチックコポリマー、ナイロン（登録商標）、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ラテックス、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレン）、並びに酢酸セルロースなどの様々な材料を含むことができる。基板はコーティングすることができ、基板及びコーティングは官能化することができる（例えばアミンに対して共役可能であるように）。
【００５７】
較正配列を含んでいるアレイ
本発明は、アレイに基づくハイブリダイゼーション反応の結果を標準化するために、不動化した較正配列を含んでいるアレイ、及び例えば較正配列のコピー数対「標準」すなわち「較正」比プロファイルを判定するために、これらの較正配列を用いるための方法、の使用を想到する。較正配列は、アレイ上の不動化された核酸配列中のユニークな配列として、実質的に同一のものであることができる。例えば、アレイ上の各「スポット」又は「生物部位（biosite）」からの「マーカー」配列（スポット上にのみ存在し、そのスポットについての「マーカー」にする配列）は、１つ以上の「対照」又は「較正」スポット上の対応する配列で表現される。
【００５８】
「対照スポット」すなわち「較正スポット」は「標準化」のために用いられ、信頼性と再現性についての情報を提供する対照スポットはアレイに対してハイブリダイズした標識試料とは無関係に、一貫性のある結果を提供することができる（又は試料からの標識した結合分子）。対照スポットは「標準化」すなわち「較正」曲線を生成して、シリコン内での本発明のアレイに基づく方法において使用される、２つ（以上の）のアレイ間に生じ得る強度誤差をオフセットするために使用することができる。
【００５９】
アレイ上の対照を生成する方法の１つが、アレイ上にスポットされた全ての生体分子（例えば核酸配列）の等モル混合物に使用され、単一のスポットを生成する。この単一のスポットは、アレイ上の全ての他のスポットと等量の生体分子（例えば核酸配列）を有し得る。複数の対照スポットは、等モル混合物の濃度を変化させることにより生成することができる。
【００６０】
試料及び標本
特定の細胞、組織又は他の標本から、試料核酸を単離し、クローン化し、又は抽出することができる。核酸試料が調製される細胞又は組織試料は、典型的には重症の若しくは持続型の関連する状態を有している、又は有していると疑われる患者から採られる。細胞及び組織試料を単離する方法は当業者に周知であり、限定するものではないが、吸引法、組織切片法、針生検法、及び同様の方法などが挙げられる。しばしば試料は「臨床試料」であり得、全血、血清、血漿、又は例えば組織学的な目的のために採られた凍結切片若しくはパラフィン切片などの組織切片を含む、患者由来の試料である。試料はまた、（細胞の）上清又は患者若しくは細胞培養物から採られた細胞そのもの、又は組織培養からの細胞、又は候補剤に対する応答を検出するのに望ましいものであり得る他の培養液からの細胞由来であってもよい。場合によっては、核酸はハイブリダイゼーションに先立ちＰＣＲなどの標準的な技術を用いて増幅してもよい。
【００６１】
一実施形態では、本発明は疾病の退行又は回復を予測する、治療前の方法（pretreatment method）である。かかる方法は、（１）重症の若しくは持続型の喘息又は関連する疾病若しくは疾患であると診断された個人から、適切な組織生検又は他の標本を採ることと、（２）パネルのプロファイル遺伝子の発現レベルを測定することと、（３）治療応答者（treatment responders）から、遺伝子の治療前発現レベルと、治療前参照プロファイルとを比較することと、（４）遺伝子パネルの発現レベルを監視することによって治療応答性を予測することと、を含む。
【００６２】
バイオマーカーの有用性を評価する方法
疾病の治療又は予後に対しての患者の応答性を評価することに関する、本発明のバイオマーカー遺伝子パネルの予後診断的な有用性は、患者の病状を評価するための他の手段を用いることによって確認することができる。例えば、限定するものではないが、写真、放射測定、又は磁気共鳴技術による、イメージングなどのいくつかイメージング法によって、肉眼での疾病の測定を評価しかつ記録することができる。健康又は疾病の一般的な指標には、更に血清又は血液組成物（タンパク質、肝臓酵素、ｐＨ、電解質、赤血球容積、ヘマトクリット、ヘモグロビン、又は特定のタンパク質）が挙げられる。しかしながら、一部の疾病では病因に対しての理解は未だに乏しい。重症の又は持続型の喘息はそのような疾病の１つの例である。
【００６３】
患者の評価及び監視
治療過程にわたる遺伝子の発現パターンは、重症の又は持続型の喘息の治療においてはこれまで研究されてこず、かかる発現パターンを的中率を有するものとして同定した者はいない。本明細書で開示される遺伝子発現バイオマーカーのパネルは、迅速で信頼性のある予測のための方法、重症の又は持続型の喘息の治験の臨床的な結果を予測する診断ツール、又は重症の又は持続型の喘息治療の有効性を追跡するための予後診断ツールの作製を可能にする。これらの遺伝子を検出することに基づく予後診断法が提供される。例えばこれらの方法は、免疫媒介性炎症疾患、特にＴＮＦと関連する領域の診断、予防及び治療と結びつけて使用することができる。
【００６４】
治療薬
本明細書で使用するとき、用語「拮抗薬」は、重症の又は持続型の喘息に関する本発明の遺伝子パネルの遺伝子産物の生物活性を阻害又は中和する物質を指す。このような拮抗薬は、種々の方法でこの効果を実現する。ある部類の拮抗薬は、十分な親和性で遺伝子産物のタンパク質に結合し、タンパク質の生物学的効果を特異的に中和する。この部類の分子に含まれるのは、抗体及び抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）2分子など）である。別の部類の拮抗薬は、同種の結合パートナー又は遺伝子産物のリガンドに結合し、それにより遺伝子産物とその同種のリガンド又は受容体との特異的相互作用の生物活性を阻害する、遺伝子産物タンパク質、突然変異タンパク質、又は小有機分子、すなわちペプチド模倣薬の断片を含む。重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子拮抗薬は、遺伝子産物の少なくとも１つの生物活性を阻害する物質である限り、これらの部類のいずれであってもよい。
【００６５】
拮抗薬には、遺伝子産物タンパク質又はその断片の１つ又はそれ以上の領域に対する抗体、同種のリガンド又は受容体に対する抗体、及び遺伝子産物の少なくとも１つの生物活性を阻害する遺伝子産物又はその同種のリガンドの部分ペプチドが挙げられる。当該技術分野で既知であるような遺伝子配列を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス分子及びＤＮＡザイムを含む別の部類の拮抗薬が、本明細書に開示されている。
【００６６】
適切な抗体には、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物を結合するのにあたり、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物の活性をブロックするか又は喘息に関連する遺伝子産物がその同族のリガンドに結合するのを阻むような、あるいは重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物シグナル伝達を阻むようなモノクローナル抗体と競合する抗体が含まれる。
【００６７】
重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物の誘発因子を治療のための標的にすることは、成功の可能性をより高くし得る。遺伝子発現は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス分子及びＤＮＡザイムの使用が挙げられる、いくつかの異なる方法で調節することができる。合成ｓｉＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡｓ、及びＤＮＡザイムは１つ以上の標的遺伝子に特異的に設計することができ、体外でも体内でも、これらは容易に細胞に送達することができる。
【００６８】
本発明はアンチセンス核酸分子、すなわち重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチド（例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖の相補体又はｍＲＮＡ配列の相補体）をコードしている、センス鎖の核酸に相補的な分子を包含する。したがって、アンチセンス核酸はセンス鎖の核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、コード鎖全体又はそのほんの一部、例えば、タンパク質コード領域（すなわち翻訳領域）の全て又は一部に相補的であり得る。アンチセンス核酸分子は、重症の又は持続型の喘息関連遺伝子産物ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の、非コード領域の全体又は一部に対してアンチセンスであってよい。非コード領域（「５’及び３’非翻訳領域」）は、コード領域に隣接する５’及び３’配列であり、アミノ酸に翻訳されない。
【００６９】
本発明はまた、キメラタンパク質又は融合タンパク質を提供する。本明細書で使用するとき、「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド（すなわち、同じＵＣ関連遺伝子産物ポリペプチド以外のポリペプチド）に操作可能に結合する重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチドの全て又は一部（好ましくは生物学的に活性である）を含む。融合タンパク質内では、用語「操作可能に結合」は、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチド及び異種ポリペプチドが互いにインフレームで融合することを示すことを意図する。異種ポリペプチドは、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に融合することができる。別の実施形態では、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチド又はそのドメイン若しくは活性断片は、異種タンパク質配列又はその断片に融合してキメラタンパク質を形成することができ、そこではポリペプチド、ドメイン又は断片が端と端とで融合しないが、異種タンパク質のフレームワーク内に介入する。
【００７０】
更に別の実施形態では、融合タンパク質は、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチドの全て又は一部が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列に融合している、免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、薬剤組成物に組み込むことができ、また被験者に投与してリガンド（可溶性又は膜結合）と細胞の表面上のタンパク質（受容体）との間の相互作用を阻害して、それにより体内でのシグナル伝達を抑制することができる。免疫グロブリン融合タンパク質は、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチドの同族リガンドの、バイオアベイラビリティに影響を与えるために使用することができる。リガンド／受容体相互作用の阻害は、増殖性及び分化性疾患の治療並びに細胞生存の調節（例えば、促進又は阻害）の両方に対して、治療的に有用であり得る。更に、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、免疫原として使用することで、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチドに対する抗体を産生して、被験者においてはリガンドを精製することができ、スクリーニングアッセイにおいてはリガンドと受容体との相互作用を阻害する分子を同定することができる。
【００７１】
組成物及びその使用
本発明に従う、本明細書に記載されるようなモノクローナル抗体などの、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物の拮抗薬の中和を、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物の活性を阻害するために使用することができる。更に、かかる拮抗薬を、このような治療を受け入れられる、重症の又は持続性の喘息の、及びリウマチ性疾患が挙げられるがこれに限定されない関連する炎症性疾患の、病原性を阻害するために使用することができる。治療されるべき個体は任意の哺乳類であってよく、好ましくは霊長類、哺乳類であるコンパニオンアニマルであり、最も好ましくはヒトの患者である。投与される拮抗薬の量は、使用の目的及び投与方法によって変動する。
【００７２】
重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物拮抗薬は、病理活性を阻むこと又は停止することが所望される組織に効能をもたらす、任意の数の方法により投与することができる。更に、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物の活性に基づいて効能を付与するためには、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物に対する拮抗薬を局所的に存在させる必要はなく、したがってそれらは、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物を含有している体の区画又は体液のどこであろうと、アクセスできるように投与することができる。炎症を起こした、悪性の又は別の方法で易感染性である組織の場合、これらの方法には、拮抗薬を含有する製剤を直接適用することを挙げてもよい。このような方法には、液体組成物の静脈投与、液体若しくは固体製剤の経皮投与、経口、局所性投与、又は間質性若しくは手術中投与（inter-operative）が挙げられる。投与は、その主な機能が薬物送達賦形剤としての機能ではない場合があるデバイスの移植により影響を受ける場合がある。
【００７３】
抗体の場合、好ましい用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）（一般に約１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）である。抗体が脳で作用する場合、約５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量が通常適切である。一般に、部分的ヒト抗体及び完全なヒト抗体は、他の抗体よりもヒトの体内で長い半減期を有する。したがって、より少ない用量かつより少ない頻度の投与での使用が可能であることが多い。脂質化のような修飾を用いて、抗体を安定化し、（例えば、脳への）取り込み及び組織透過性を高めることができる。抗体の脂質化の方法は、Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９７年）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ１４巻：１９３頁）に記載されている。
【００７４】
重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物拮抗薬の核酸分子はベクターに挿入することができ、遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。遺伝子治療用ベクターは、例えば、静脈注射、局所性投与（米国特許第５，３２８，４７０号）又は、定位的注射（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４年）Ｐｒｏｃ．ＵＳＡ９１巻：３０５４〜３０５７頁）により被験者に送達することができる。遺伝子治療用ベクターの医薬品には、許容可能な希釈剤中の遺伝子治療用ベクターを挙げることができ、又はそれは遺伝子送達賦形剤が埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを組み換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターからインタクトに産生できる場合、医薬品は遺伝子送達系を生成する１つ又はそれ以上の細胞を含むことができる。
【００７５】
薬剤組成物は、投与の指示書とともに、容器、パック又はディスペンサに含むことができる。
【００７６】
薬理ゲノミクス
薬剤、あるいは本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにより同定されるような、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチドの活性又は発現に影響を及ぼす、刺激又は阻害効果を有するモジュレーターを、ポリペプチドの異常な活性に関連する疾患を治療（予防的に又は治療的に）するために、個体に投与することができる。このような治療とともに、個々の薬理ゲノミクス（すなわち、個人の遺伝子型間の関連性及び外来化合物又は薬剤に対する個人の応答性の調査）を考察することができる。治療の代謝における差異は、薬理学的な活性剤の投与量と血中濃度との間の関係を変更することで、重度の毒性又は治療の不全を引き起こし得る。したがって、個人の薬理ゲノミクスは、個人の遺伝型に対する考慮に基づいた、予防治療又は治療のための効果的な剤（例えば薬剤）の選択を可能にする。このような薬理ゲノミクスは更に、適切な投与量と治療レジメンを判定するために使用することができる。したがって、個人における、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチド、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物核酸の発現、又は重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物遺伝子の変異内容を判定することで、個人に対する治療又は予防治療のために適切な剤を選択することができる。
【００７７】
薬理ゲノミクスは、薬物の変更された体内動態及び罹患しているヒトの異常な機能に起因する、薬剤に対する応答性について臨床的に有意である遺伝変異を取り扱う。例えば、Ｌｉｎｄｅｒ（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４〜２６６を参照されたい。一般的に、２種類の薬理遺伝的な条件が差別化され得る。体に対する薬剤の作用の仕方を変更する１つの要因として伝達される遺伝的な条件は、「薬物作用の変更」として参照される。薬剤に対する体の作用の仕方を変更する１つの要因として伝達される遺伝的な条件は、「薬物代謝の変更」として参照される。これらの薬理遺伝学的な条件は、まれな欠損又は遺伝子多型のいずれかとして生じうる。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の欠損は一般的に遺伝される酵素病であり、酸化剤（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取及びソラマメの摂取後の溶血が主な臨床の合併症である。
【００７８】
例示的な実施形態としては、薬剤代謝酵素の活性は薬剤作用の強さ及び持続時間の両方の重要な決定因である。薬剤代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）、及びシトクロムＰ４５０酵素のＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、何故一部の患者が予測される薬剤効果を獲得しないのか、又は標準的で安全な薬物の投与量を採った後で、過剰な薬物応答及び深刻な毒性を示すのかを説明するものとして提供される。これらの遺伝子多型は、集団において２つの表現型、高代謝群（ＥＭ）及び低代謝群（ＰＭ）として発現する。ＰＭの羅患率は異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６についての遺伝子コードは、非常に遺伝子多型的であり、いくつかの変異が全てＣＹＰ２Ｄ６の機能の欠損を導くものとしてＰＭにおいて同定されてきた。ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な投与量を受け入れるときに、かなり頻繁に過剰な薬物応答及び副作用に悩まされる。例えば代謝産物が治療上の活性成分であるとき、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６により形成される代謝産物のモルヒネによって媒介される、コデインの鎮痛効果について示されるような、治療的な応答を示さないだろう。他の極端なものは標準的な投与量に対して応答しない、いわゆる超高速代謝群である。近年では、超高速代謝群の分子的機序はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因するものであると同定されてきた。
【００７９】
したがって、個人における重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチドの活性、ポリペプチドをコードしている核酸の発現、又はポリペプチドをコードしている遺伝子の変異内容を判定して、個人に対する治療又は予防治療について適切な剤を選択することができる。加えて、薬理遺伝学な研究は、薬物代謝酵素をコードしている対立遺伝子多型の遺伝子型を適用して、個人の薬物応答性の表現型を同定するために使用することができる。この知識は、投与又は薬物選択に適用されるときに副作用又は治療の不全を避けることができ、ひいては本明細書に記載される例示的なスクリーニングアッセイのうちの１つで同定されるモジュレーターのような、ポリペプチドの活性化又は発現のモジュレーターで患者を治療するとき、治療又は予防効率が高まる。
【００８０】
治療方法
本発明は、疾患の危険性を有する（又は疾病になりやすい）、又は重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチドの異常な発現若しくは活性に関連する及び／若しくは重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチドが関与している疾患を有する被験者を治療する、予防及び治療方法をともに提供する。
【００８１】
本発明は、当業者に既知であるか本明細書に記載されるような、細胞、組織、器官、動物又は患者における、少なくとも１つの重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物が関連する疾病又は状態を、少なくとも１つの重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物拮抗剤を用いて、調節又は治療する方法を提供する。重症の若しくは持続型の喘息に関連する遺伝子産物の拮抗剤の組成物は、重症の若しくは持続型の喘息、又は潰瘍性大腸炎若しくは他のＴＮＦ媒介性のなどの関連する状態の治療において治療用途を見出すことができる。
【００８２】
本発明はまた、限定するものではないが、胃潰瘍、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病の症状、及び同様の疾病などのうちの少なくとも１つが挙げられる、細胞、組織、器官、動物又は患者における、少なくとも１つの、ＴＮＦ媒介性の、免疫に関連する疾患を調節又は治療する方法を提供する。例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，１２ｔｈ〜１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９７２，１９７７，１９８２，１９８７，１９９２，１９９９），Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（１９９８，２０００）を参照されたい。それぞれ参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８３】
重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチドの異常な発現又は活性を特徴とする疾患については、本開示の他の箇所で更に説明される。
【００８４】
予防的方法
１つの態様では、本発明は、ポリペプチドの発現又は少なくとも１つの活性を調節する剤を被験者に投与することにより、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物ポリペプチドの異常な発現若しくは活性に関連する疾病又は状態を、被験者において少なくとも実質的に予防する方法を提供する。重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子産物の異常な発現又は活性を原因とする又はそれに起因する疾病のリスクを有する被験者は、例えば、本明細書に記載するような診断若しくは予後アッセイのいずれか又は組み合わせにより同定することができる。予防薬の投与は、疾病又は疾患を予防する、あるいはその進行を遅らせるように、異常型の特徴を有する症状が顕在化する前に行うことができる。異常型の種類に応じて、例えば、作用薬又は拮抗薬を被験者の治療に用いることができる。適切な剤は、本明細書に記載するスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
【００８５】
治療的方法
本発明の他の態様は、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子又は遺伝子産物の発現又は活性を、治療目的で調節する方法に関する。本発明の調節方法は、ポリペプチドの１つ又はそれ以上の活性を調節する剤と、細胞を接触させることを含む。活性を調節する剤は、核酸若しくはタンパク質、ポリペプチドの天然由来の同種リガンド、ペプチド、ペプチド模倣薬、又は他の小分子のような、本明細書に記載する剤であることができる。１つの実施形態では、剤は、ポリペプチドの生物活性の１つ又はそれ以上を刺激する。他の実施形態では、剤は、重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子又は遺伝子産物ポリペプチドの１つ以上の生物活性を阻害する。このような阻害剤の例には、アンチセンス核酸分子及び抗体、並びに本明細書に記載する他の方法が挙げられる。これらの調節方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、剤とともに細胞を培養することにより）又は、あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、被験者に剤を投与することにより）実施することができる。このように、本発明は、重症の又は持続型の喘息の関連遺伝子産物ポリペプチドの異常な発現若しくは活性を特徴とする疾病又は疾患に罹患している個体を治療する方法を提供する。１つの実施形態では、方法は、発現若しくは活性を調節する（例えば、上方制御又は下方制御）、剤（例えば、本明細書に記載するスクリーニングアッセイにより同定された剤）又は剤の組み合わせを投与することを含む。活性の阻害は、活性若しくは発現が異常に高いか若しくは上方制御されている状況で、及び／又は、活性の低下が有益な効果を有する可能性がある状況で、望ましい。
【００８６】
本発明は一般条件で記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例】
【００８７】
（実施例１）
調査のデザイン及び実行
本薬理ゲノミクス調査の目的は、重症の持続型の喘息に罹患している患者における、ゴリムマブ（ＴＮＦα（抗ＴＮＦ）モノクローナル抗体）による治療に対する治療応答性に影響を与えるＴＮＦα経路遺伝子−ＴＮＦα、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、及びＡＤＡＭ１７の遺伝的変異の有無を判定することである。多角的な、二重盲検の、プラセボで対照を採った投与範囲治験において、重症の喘息に罹患している治療を受けている１４４人の白色人患者のＤＮＡ試料を、ＴＮＦα、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ及びＡＤＡＭ１７中の５３個のＳＮＰについて解析した。ゴリムマブを異なる治療腕（treatmentarms）に異なる投与量で４週間毎に投与した。臨床の第一次エンドポイントは、予測されるＦＥＶ1％と、治療のベースラインから最初の２４週目までの間の重症の増悪の数とにおいて、ベースラインから２４週目までで変化した。
【００８８】
ＤＮＡ試料はＭａｓｓＡＲＲＡＹにより遺伝子型を同定した。複数の遺伝子多型が極めて隣接して存在する場合、又はＭａｓｓＡＲＲＡＹ解析を不可能にするほど複雑な遺伝子多型が存在する場合には、ＤＮＡ塩基配列決定法を使用した。全ての、遺伝子型の同定データは自動的にスコア化し、次いで精度について手動でチェックした。
【００８９】
単一のＳＮＰ及びハプロタイプ解析のどちらもが、喘息重症度遺伝子と、基準値測定と、治療のベースラインから最初の２４週目までの間の重症の増悪の数によって測定された治療応答と、の間の薬理遺伝学的な関連を評価するために実施された。近似的な一致のために、人種によるハーディ・ワインベルグ平衡割合について個人のＳＮＰ及び対立遺伝子の頻度を見積もり、試験した。遺伝子内部の複数のＳＮＰについて連鎖不平衡の見積もりを得、ハプロタイプ解析をしやすくするためにこの情報を使用した。
【００９０】
ＴＮＦＲＳＦ１Ａ及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂの多型
ヒトＴＮＦＲＳＦ１Ａ遺伝子は染色体の１２ｐ１３上に存在し、コーディング領域及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は１０以上のエキソンで約１ｋｂにわたって分布している。かかる遺伝子は４５５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている（配列番号４）。ヒトＴＮＦＲＳＦ１Ｂ遺伝子はおおよそ４３ｋｂにわたり染色体の１ｐ３６上に存在する。かかる遺伝子は１０個のエキソンと９個のイントロンからなる。かかる遺伝子は４６１個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている。
【００９１】
両方の遺伝子について多数のＳＮＰが見出されたが、それらの多くが連鎖不平衡であり、つまり一般的にかかるＳＮＰには高い相関性が存在しており、これらがひとまとまりとして世代から世代へと伝達されることを意味している。簡略化された遺伝的スクリーニングのために、選択された「タグＳＮＰ」をこの調査で使用し、遺伝子内の多型の領域全体を最良に現した。タグＳＮＰを、それらの潜在的な機能についてではなく、他のＳＮＰとの密接な相関について選択した。以下は、例として白人母集団におけるＴＮＦＲＳＦ１Ａ遺伝子についてのタグＳＮＰのＬＤプロットである。他の民族群は、異なる遺伝的な構成及び異なるＬＤプロットを有する可能性がある。
【００９２】
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【００９３】
ヒトＴＮＦＲＳＦ１Ａ遺伝子中の９個のタグＳＮＰのＬＤプロット。遺伝子配列全体を白いボックスとして上部に示し、それぞれのＳＮＰを黒いバーで指す。ＳＮＰ間のペアワイズな相関関係をそれぞれのブロットで表し、より暗いブロットほどよりよい相関関係を示し、より明るいブロットほど相関性は乏しい。
【００９４】
薬理遺伝学的な関連性
以下の表は、第一次エンドポイントの重症の喘息増悪の数についてのゴリムバブの治療応答性に有意に関連する、２つのＴＮＦ受容体遺伝子中の３つの遺伝的な変異を示す。例えば、主要な対立遺伝子の５４ホモ接合体である、ＴＮＦＳＦ１Ａ遺伝子中のＳＮＰ  ｒｓ４１４９５８１（配列番号１）は、７２ヘテロ接合体についての０．８３の増悪と比較して０．３７の重症な増悪の頻度平均値、及びマイナーな対立遺伝子の１８ホモ接合体について１．０６の増悪を有する。二乗検定は、ＴＮＦＳＦ１Ａ中のこのＳＮＰが、治験対象母集団の、ゴリムマブに対する治療応答性に関連することを示す０．０４のｐ値（ｐ＜０．０５は有意であるとみなされる）をもたらした。すなわち主要な対立遺伝子はマイナーな対立遺伝子よりもゴリムマブに対してより良好な治療応答性を持つ。
【００９５】
２つのＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  ＳＮＰについて同様の結論を出すことができる。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
ＥＸＳＥＶＰ＝重症の増悪の平均数（帰属（imputed））
上に説明された理由のために、これらの結果は３つの特定のタグＳＮＰに限定されないが、任意のＳＮＰがそれらとＬＤにある。したがって我々は、治験対象母集団において、ＴＮＦＲＳＦ１ＡとＴＮＦＲＳＦ１Ｂとの間の一般的な遺伝的関連性、並びにゴリムバブに対する治療応答性が存在すると結論付けた。更なる遺伝及び機能解析は、何故それらが治療に対する個人の応答性に影響するのかを機構的に説明する、特定のＳＮＰ又はＳＮＰのセットを正確に示すことを可能にし得る。
【００９８】
利点
我々はゴリムマブで治療された重症の喘息集団においてこれらの遺伝的なバイオマーカーを同定したが、インフリキシマブ、アダリムマブ又はエタネルセプトなどの他の抗ＴＮＦ治療剤についても、この薬剤群の作用機序が似ていることから、同様の関連性が存在し得ると考えられる。これらは全て２つのＴＮＦα受容体を介して作用し、受容体多型は類似の様式で個人の応答性に影響を与える可能性がある。また、ＴＮＦαがリウマチ様関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、乾癬、及び強直性脊椎炎などの疾患のメディエーターであることは既知であることから、かかる同様の関連性を、このような他の免疫媒介性疾患にまで拡大させることもできる。
【００９９】
これらの遺伝的なバイオマーカーは、患者から口腔スワブ試料を採り、次いで標準的なＤＮＡ試験でアッセイすることにより、容易に評価することができる。この試験は、抗ＴＮＦα治療が考慮される見込みのある患者についてのスクリーニングツールとして使用できる可能性がある。この試験結果は、患者とその医師が、抗ＴＮＦα治療から効果の公算を評価することによって、洗練された決定をなすことを可能にする。
【０１００】
参照を備えて、上記にいくつかの具体的な実施形態を例示し記載したが、本発明は示した詳細に限定されることを決して意図しない。むしろ、本発明は重症の又は持続型の喘息に関連する遺伝子及び遺伝子産物を目的とする。本明細書に開示されるポリヌクレオチド、抗体、装置及びキット、並びにそれらの使用、並びに治療に対する応答性を予測し重症の又は持続型の喘息に関連するバイオマーカー遺伝子のレベルを制御する方法、並びに様々な修正を、特許請求の範囲と同等の領域及び範囲内で、本発明の趣旨から逸脱することなく詳細になすことができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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