(57)【要約】本明細書では、酵母細胞壁粒子を使用して物質（例えば、遺伝子サイレンシング物質）および分子を細胞に送達するための方法および組成物が提示される。本発明の態様は、核酸（例えば、siRNA）を細胞に送達するために特に有用である。2011517279.tif 000022
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母細胞壁粒子（YCWP）外部および多層状ナノ粒子内部を含むsiRNA送達系であって、前記多層状ナノ粒子内部がコア、少なくとも1つのペイロード層、および少なくとも1つの捕捉層を含み、前記ペイロード層はsiRNAを含む、siRNA送達系。
【請求項２】
捕捉層がコアおよびペイロード層の間にある、請求項1記載のsiRNA送達系。
【請求項３】
捕捉層がペイロード層の外側にある、請求項1記載のsiRNA送達系。
【請求項４】
少なくとも第2捕捉層を含む、請求項1記載のsiRNA送達系。
【請求項５】
第2捕捉層がペイロード層およびYCWP外部の間である、請求項4記載のsiRNA送達系。
【請求項６】
前記ペイロード層および捕捉層が静電相互作用によって結び付いている、請求項1〜5のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項７】
コアおよび捕捉層が静電相互作用によって結び付いている、請求項1〜6のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項８】
コアがカチオン性界面活性剤を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項９】
捕捉層がカチオン性である、請求項1〜8のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項１０】
コアが表面上でカチオン性である、請求項8記載のsiRNA送達系。
【請求項１１】
コアがカチオン性界面活性剤を含む、請求項8記載のsiRNA送達系。
【請求項１２】
siRNAがMap4k4 siRNAである、請求項1〜11のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項１３】
siRNAが炎症性サイトカインsiRNAである、請求項1〜11のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項１４】
siRNAがTNF-αsiRNAである、請求項1〜11のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項１５】
siRNAがRIP140 siRNAである、請求項1〜11のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項１６】
siRNAがTLR4シグナリングsiRNAである、請求項1〜11のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項１７】
siRNAがaP2 siRNAである、請求項1〜11のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項１８】
コアがペイロードをさらに含むペイロードコアである、請求項1〜17のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項１９】
ペイロードがsiRNAである、請求項18記載のsiRNA送達系。
【請求項２０】
ペイロードコアおよびペイロード層が同一siRNAを含む、請求項18または19記載のsiRNA送達系。
【請求項２１】
ペイロードコアおよびペイロード層が別個のsiRNAを含む、請求項18または19記載のsiRNA送達系。
【請求項２２】
siRNAがYCWPに付き約0.1×10-7〜100×10-7pmolのsiRNAの比率で存在している、請求項1〜20のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項２３】
ペイロードが非siRNAペイロードである、請求項18記載のsiRNA送達系。
【請求項２４】
非siRNAペイロードがDNA、タンパク質、非siRNA RNA、アンチセンスDNA、および低分子からなる群より選択される、請求項23記載のsiRNA送達系。
【請求項２５】
DNAが発現ベクターである、請求項24記載のsiRNA送達系。
【請求項２６】
捕捉層が荷電ポリマー、荷電界面活性剤またはそれらの混合物を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項２７】
捕捉層がカチオン性ポリマー、カチオン性界面活性剤またはそれらの混合物を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項２８】
コアがカチオン性ポリマー、カチオン性界面活性剤またはそれらの混合物を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項２９】
カチオン性ポリマーがキトサン、ポリ-L-リシンおよびポリエチレンイミン（PEI）からなる群より選択される、請求項27または28記載のsiRNA送達系。
【請求項３０】
カチオン性ポリマーがタンパク質、ポリペプチド、短鎖合成ペプチド、ヘリカル両親媒性ペプチド、カチオン性デンドリマー類、グルカラミド（glucaramide）ポリマー、N置換グリシンオリゴマー、ポリ（2-メチル-アクリル酸2-［（2-ジメチルアミノ）-エチル）-メチル-アミノ］-エチルエステル）（poly(2-methyl-acrylic acid 2-[(2- dimethylamino)-ethyl)-methyl-amino]-ethy- 1 ester)）、ポリ（2-ジメチルアミノエチル）-メタクリレートおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項27または28記載のsiRNA送達系。
【請求項３１】
カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン（PEI）である、請求項29記載のsiRNA送達系。
【請求項３２】
非siRNAペイロードをさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項３３】
コアがアニオン性ポリマー、アニオン性界面活性剤またはそれらの混合物を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項３４】
アニオン性ポリマーがアルギネートまたはキサンタンである、請求項32または33記載のsiRNA送達系。
【請求項３５】
コアが核酸、タンパク質、生体ポリマー、無機塩、およびそれらの混合物からなる群より選択される生体適合性物質をさらに含む、請求項1〜34のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項３６】
生体適合性物質が核酸である、請求項35記載のsiRNA送達系。
【請求項３７】
生体適合性物質がトランスファーRNA（tRNA）である、請求項36記載のsiRNA送達系。
【請求項３８】
YCWPが細胞または組織特異的ターゲティング物質を含むように化学修飾されている、請求項1〜37のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項３９】
ペイロード核酸が109粒子のYCWPに付き約1μg〜約2,000μgの核酸の比率で存在している、前記請求項のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項４０】
ペイロード核酸が109粒子のYCWPに付き約1μg〜約12μgの核酸の比率で存在している、前記請求項のいずれか一項記載のsiRNA送達系。
【請求項４１】
ペイロード核酸が1mgのYCWPに付き4μgの比率で存在している、請求項39のsiRNA送達系。
【請求項４２】
siRNAを食細胞へ送達する方法であって、siRNAの送達が発生するように、前記細胞を、siRNA送達系の食作用を促進する条件下で前記請求項のいずれか一項記載の前記siRNA送達系と接触させる工程を含む、方法。
【請求項４３】
食細胞が単球、好中球および樹状細胞からなる群より選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
食細胞がマクロファージである、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
siRNA送達系を作製する方法であって、前記siRNA送達系が形成されるような条件下で、YCWPを
（a）少なくとも1つのコア成分;
（b）少なくとも1つのペイロード層の形成を促進する条件下で、ペイロード成分;および
（c）少なくとも1つの捕捉層の形成を促進する条件下で、捕捉成分と接触させる工程を含む、方法。
【請求項４６】
疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、前記疾患または障害が治療されるように、ペイロードの送達を促進する条件下で、前記請求項のいずれか一項記載のsiRNA送達系を投与する工程を含む、方法。
【請求項４７】
TLR4-媒介性疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜36のいずれか一項記載のsiRNA送達系を投与する工程を含み、siRNAが、前記疾患または障害が治療されるように、前記siRNAの送達およびTLR4シグナリングの変調を促進する条件下でTLR4シグナリング成分を標的とする、方法。
【請求項４８】
siRNA送達系が経口投与される、請求項46または47記載の方法。
【請求項４９】
siRNA送達系が全身性投与される、請求項46または47記載の方法。
【請求項５０】
疾患または障害が炎症性疾患または障害である、請求項46〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
疾患または障害が自己免疫障害、敗血症、腸の障害、感染性疾患、悪性腫瘍、肺障害、心障害、および神経障害からなる群より選択される、請求項46〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
疾患または障害がクローン（Crohn）病、HIV、関節炎、心血管疾患および癌からなる群より選択される、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
疾患が代謝性疾患または障害である、請求項46〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
疾患または障害が耐糖能、インスリン感受性、糖尿病および肥満症からなる群より選択される、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
インスリン感受性を増強する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜11および請求項17〜36のいずれか一項記載のsiRNA送達系を投与する工程を含み、siRNAがsiRNAのマクロファージへの送達を促進する条件下でaP2を標的とし、aP2のサイレンシングは結果として前記被験者における増強されたインスリン感受性を生じさせる、方法。
【請求項５６】
インスリン感受性を増強する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜12および請求項17〜36のいずれか一項記載のsiRNA送達系を投与する工程を含み、siRNAがsiRNAのマクロファージへの送達を促進する条件下でMap4K4を標的とし、Map4K4のサイレンシングは結果として前記被験者における増強されたインスリン感受性を生じさせる、方法。
【請求項５７】
siRNA送達系が経口投与される、請求項55または56記載の方法。
【請求項５８】
siRNA送達系が全身性投与される、請求項55または56記載の方法。
【請求項５９】
被験者が2型糖尿病を有する、請求項55〜58のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
経口薬物送達の方法であって、被験者に前記請求項のいずれか一項記載のsiRNA送達系を、siRNAがマクロファージへ送達されるように、siRNA薬物送達系と前記被験者内のマクロファージとの接触を促進する条件下で投与する工程を含む、方法。
【請求項６１】
マクロファージ媒介性siRNA送達法であって、siRNAの送達が発生するように、マクロファージを、siRNA送達系の食作用を促進する条件下で前記請求項のいずれか一項記載の前記siRNA送達系と接触させる工程を含む、方法。
【請求項６２】
マクロファージがインビトロで接触させられる、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
マクロファージがインビボで接触させられる、請求項61記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景技術
RNA干渉（RNAi）は、抑制される遺伝子と相同である二本鎖RNA（dsRNA）によって開始される配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの機序である。dsRNAは、細胞リボヌクレアーゼIIIであるDicerによって処理すると、配列特異的mRNA分解を媒介する3'-オーバーハング（短鎖干渉RNA、siRNA）を備える約21ntのデュープレックスを生成する。哺乳動物細胞内では、siRNA分子は非特異的インターフェロン応答経路を誘導せずに遺伝子発現を特異的にサイレンシングすることができる。そこで、siRNAは、遺伝子機能を分析するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムなどの他の遺伝的ツールにとって新規かつ強力な選択肢となってきた。さらに、siRNAは、ヒトにおける疾患遺伝子をサイレンシングするという治療目的のために開発されている。
【０００２】
効果的な遺伝子療法技術の開発における重要な問題は、インビボの細胞への核酸の送達である。負電荷の遺伝物質とカチオン性ポリマーとの間での安定性複合体の形成は、非ウイルス性送達物質を開発するために最も一般的に研究されているアプローチである。幾つかのグループの研究は、細胞内へDNAを送達できる負電荷ナノ粒子内での遺伝物質の分解を防止するために必要な良好なDNA凝縮を提供するために、ある範囲のカチオン性ポリマーの合成および特性解析に焦点を当ててきた。いったん細胞の内側に組み込まれると、これらのナノ複合体はDNAを放出できなければならず、遊離カチオン性ポリマーの毒性は最小でなければならない。ポリエチレンイミン（PEI）は、DNAとのナノ複合体形成のために最善のカチオン性ポリマーの1つであることが証明されており、優れたトランスフェクション効率を提供する;しかしPEIは細胞にとって毒性であるので、使用可能な濃度範囲が限定される。非毒性であり、DNAを効率的に保護して細胞の内部へDNAを送達することのできる送達物質を生成するという目標は、課題が多いことが実証されており、理想的な遺伝子送達系は依然として入手しにくい。
【発明の概要】
【０００３】
核酸を包含するペイロード分子（payload molecule）を送達するための方法および組成物は、酵母細胞壁粒子を用いて作製されてきた。本発明の態様は、様々な分子を細胞に送達するために有用である。本発明の局面は、ペイロード分子を含むナノ粒子を封入している酵母細胞壁粒子を包含する。
【０００４】
1つの局面では、本発明は、外部およびコアを包含するペイロード送達系であって、該コアが捕捉物質とともに複合体化されたペイロードを含むペイロード送達系を特徴とする。また別の局面では、ペイロード送達系は、外部および多層状内部を包含しており、該多層状内部はコア物質および捕捉物質、少なくとも1つのペイロード層、および少なくとも1つの捕捉層を含むコアを有している。関連する局面では、本発明は、酵母細胞壁粒子（YCWP）外部および多層状ナノ粒子内部から作り上げられたペイロード送達系であって、該多層状ナノ粒子内部は捕捉物質とともに複合体化されたペイロードを含むコアを有するペイロード送達系を特徴とする。また別の関連する局面では、送達系は、YCWP外部および多層状内部から作り上げられており、該多層状ナノ粒子内部はコア物質および捕捉物質、少なくとも1つのペイロード層、および少なくとも1つの捕捉層を含むコアを有している。一部の態様では、コア物質は、ペイロード物質である。一部の態様では、ペイロード送達系は、少なくとも1つの第2ペイロード層および捕捉層を有している。また別の態様では、ペイロード送達系は、第3、4、5または6以上のペイロード層および/または捕捉層を有している。所定の態様では、外部は、酵母グルカン粒子（YGP）である。他の態様では、外部は、酵母グルカンマンナン粒子（YGMP）である。
【０００５】
本発明の所定の局面では、本発明のペイロード送達系のペイロード層および捕捉層は、静電相互作用によって結び付いている。他の局面では、本発明のペイロード送達系のコアおよび捕捉物質は、静電相互作用によって結び付いている。一部の態様では、コアは、アニオン性物質およびカチオン性物質、例えばコアが表面上でカチオン性であるように複合体化されたカチオン性捕捉物質を含んでいる。一部の態様では、コアは、捕捉層、例えばカチオン性捕捉層でコーティングされる。一部の態様では、コアおよび/またはペイロード層をコーティングする捕捉層は、カチオン性である。関連する態様では、コアおよび/または捕捉層は、カチオン性ポリマー、カチオン性界面活性剤またはそれらの混合物を含んでいる。また別の態様では、カチオン性ポリマーは、キトサン、ポリ-L-リシンおよびポリエチルイミン（PEI）、またはそれらの誘導体を包含することができる。関連する態様では、これらの局面のカチオン性ポリマーは、タンパク質類、ポリペプチド類、短鎖合成ペプチド類、ヘリカル両親媒性ペプチド類、カチオン性デンドリマー類、グルカラミド（glucaramide）ポリマー類、N置換グリシンオリゴマー類、ポリ（2-メチル-アクリル酸2-［（2-ジメチルアミノ）-エチル）-メチル-アミノ］-エチ
ルエステル）（poly(2-methyl-acrylic acid 2-[(2- dimethylamino)-ethyl)-methyl-amino]-ethy- 1 ester)）、ポリ（2-ジメチルアミノエチル）-メタクリレートおよびそれらの混合物を包含することができる。例示的な態様では、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（PEI）である。
【０００６】
また別の態様では、コアは、カチオン性物質およびアニオン性物質、例えばコアが表面上でアニオン性であるように複合体化されたアニオン性捕捉物質を含んでいる。一部の態様では、コアは、捕捉層、例えばアニオン性捕捉物質でコーティングされる。一部の態様では、コアおよび/またはペイロード層をコーティングする捕捉層は、アニオン性である。関連する態様では、コアおよび/または捕捉層は、アニオン性ポリマー、アニオン性界面活性剤またはそれらの混合物を含んでいる。別の態様では、アニオン性ポリマーは、アルギネートまたはキサンタンである。別の局面では、本発明のペイロード送達系のコア、ペイロードおよび/または捕捉層は、疎水性相互作用、ファン・デル・ワールス（Van der Waals）相互作用、および/または物理的相互作用によって結び付いている。
【０００７】
本発明の様々な局面では、ペイロードは、DNA、RNA、タンパク質、低分子、またはそれらの混合物である。1つの局面では、ペイロード送達系は核酸送達系であり、該ペイロード層は核酸分子から作り上げられる。この局面の1つの態様では、核酸は、DNA、もしくはRNA、またはそれらの混合物である。また別の態様では、核酸分子は、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、siRNA、shRNA、siRNAもしくはshRNA発現ベクター、酵素的RNA、組換えDNA、発現ベクター、アンチセンスDNA、またはそれらの混合物である。
【０００８】
本発明のまた別の局面では、本発明のペイロード送達系または核酸送達系は、追加してペイロードを含むペイロードコアであるコアを特徴とする。この局面の1つの態様では、ペイロードコアは、核酸分子、タンパク質、低分子またはそれらの混合物であるペイロードを有する。別の態様では、核酸分子は、DNAまたはRNAである。1つの態様では、核酸分子は、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、siRNA、shRNA、siRNAもしくはshRNA発現ベクター、酵素的RNA、組換えDNA、発現ベクター、またはそれらの混合物である。1つの局面では、ペイロードコアおよびペイロード層は、同一ペイロードを含んでいる。また別の局面では、ペイロードコアおよびペイロード層は、別個のペイロードを含んでいる。一部の態様では、コアは、ナノプレックス化（nanoplexed）コアである。
【０００９】
また別の局面では、本発明のペイロード送達系もしくは核酸送達系は、生体適合性物質を含有するコアをさらに特徴とする。1つの態様では、生体適合性物質は、核酸、タンパク質、生体高分子、無機塩、またはそれらの混合物である。例示的な態様では、生体適合性物質は、核酸、例えばトランスファーRNA（tRNA）である。また別の態様では、生体適合性コアは、磁気物質を包含している。また別の局面では、本発明のペイロードもしくは核酸送達系のYCWPは、修飾されており、例えば、細胞もしくは組織特異的ターゲティング物質を含有するように化学修飾されている。
【００１０】
また別の局面では、本発明は、ペイロードを食細胞へ送達する方法であって、ペイロードの送達が発生するようにペイロード送達系の食作用を促進する条件下で、前記細胞をペイロード送達系と接触させる工程を含む方法を特徴とする。この局面の1つの態様では、食細胞は、単球、好中球および樹状細胞からなる群より選択される。また別の態様では、食細胞は、マクロファージである。また別の局面では、本発明は、ペイロードを非食細胞へ送達する方法であって、前記系の全部または一部の送達が前記送達系の一部分（例えばペイロードを含む部分）の第2（例えば、非食）細胞への運搬（例えば、二次運搬）を促進する条件下で行われるように、ペイロード送達系の食作用を促進する条件下で、食細胞を本発明のペイロード送達系と接触させる工程を含む方法を特徴とする。
【００１１】
また別の局面では、本発明は、ペイロード送達系を作製する方法であって、コアの形成を促進する条件下でYCWPを少なくともコア成分と接触させる工程を含む方法を特徴とする。任意で、コア含有YCWPは、コアを被覆する捕捉層の形成を促進する条件下で捕捉成分と接触させることができる。一部の態様では、コア成分は、一つまたは複数のペイロード成分を含んでいる。一部の態様では、コア成分は、非ペイロード成分である。一部の態様では、コア含有YCWPは、ペイロード送達系が形成されるように、少なくとも1つのペイロード層の形成を促進する条件下でペイロード成分;および少なくとも1つの捕捉層の形成を促進する条件下で捕捉成分と接触させることができる。例示的な態様では、本系は、レイヤー・バイ・レイヤー（layer-by-layer:LbL）アプローチを用いて作製される。
【００１２】
また別の局面では、本発明は疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、該疾患または障害が治療されるように、本発明のペイロード送達系を、該ペイロードの送達を促進する条件下で投与する工程を含む方法を特徴とする。この局面の1つの態様では、疾患または障害は、炎症性疾患または障害である。また別の態様では、疾患または障害は、自己免疫障害、敗血症、腸の障害、感染性疾患、悪性腫瘍、肺障害、心障害、および神経障害からなる群より選択される。また別の態様では、疾患または障害は、クローン（Crohn）病、HIV、関節炎、心血管疾患および癌からなる群より選択される。また別の態様では、疾患または障害は、代謝性疾患または障害である。さらに別の態様では、疾患または障害は、耐糖能、インスリン感受性、糖尿病および肥満症からなる群より選択される。これらの局面の様々な態様では、ペイロード送達系は、非経口、皮下（s.c.）、およびまたは腹腔内（i.p.）投与される。これらの局面の1つの態様では、ペイロード送達系は、経口投与される。別の態様では、ペイロード送達系は、全身性投与される。さらに別の態様では、ペイロード送達系は、局所投与される。一部の態様では、ペイロード送達系は、注射によって投与される。
【００１３】
1つの局面では、本発明は、経口薬物送達の方法であって、被験者に本発明のペイロード送達系を投与する工程を含む方法を特徴とする。また別の局面では、本発明は、経口薬物送達の方法であって、ペイロードがマクロファージへ送達されるように、被験者に本発明のペイロード送達系を、前記ペイロード送達系と前記被験者内のマクロファージとの接触を促進する条件下で投与する工程を含む方法を特徴とする。また別の局面では、本発明は、マクロファージ媒介性ペイロード送達方法であって、ペイロードの送達が発生するように、ペイロード送達系の食作用を促進する条件下でマクロファージを本発明のペイロード送達系と接触させる工程を含む方法を特徴とする。1つの態様では、マクロファージは、インビトロで接触させられる。また別の態様では、マクロファージは、インビボで接触させられる。
【００１４】
1つの局面では、本発明は、外部およびコアを包含するsiRNA送達系であって、コアが捕捉物質とともに複合体化されたsiRNAを含むsiRNA送達系を特徴とする。また別の局面では、siRNA送達系は、外部および多層状内部を包含しており、該多層状内部はコア物質および捕捉物質、少なくとも1つのsiRNA層、および少なくとも1つの捕捉層を含むコアを有している。また別の局面では、siRNA送達系は、外部と、コア物質および少なくとも1つのsiRNAを含む内部コアとを包含している。1つの局面では、本発明は、酵母細胞壁粒子（YCWP）外部および多層状ナノ粒子内部から作り上げられたsiRNA送達系であって、該多層状ナノ粒子内部は捕捉物質とともに複合体化されたsiRNAを含むコアを有するsiRNA送達系を特徴とする。また別の関連する局面では、siRNA送達系は、YCWP外部および多層状ナノ粒子内部から作り上げられており、該多層状ナノ粒子内部はコア物質および捕捉物質、少なくとも1つのsiRNA層、および少なくとも1つの捕捉層を含むコアを有している。一部の態様では、コア物質は、siRNAである。一部の態様では、siRNA送達系は、少なくとも1つの第2 siRNAおよび捕捉層を有している。また別の態様では、siRNA送達系は、第3、4、5または6以上のsiRNA層および/または捕捉層を有している。所定の態様では、外部は、酵母グルカン粒子（YGP）である。他の態様では、外部は、酵母グルカンマンナン粒子（YGMP）である。
【００１５】
本発明の所定の局面では、本発明のsiRNA送達系のペイロード層および捕捉層は、静電相互作用によって結び付いている。他の局面では、本発明のsiRNA送達系のコアおよび捕捉物質は、静電相互作用によって結び付いている。一部の態様では、コアは、siRNA物質およびカチオン性物質、例えばコアが表面上でカチオン性であるように複合体化されたカチオン性捕捉物質を含んでいる。一部の態様では、コアは、捕捉層、例えばカチオン性捕捉層でコーティングされる。一部の態様では、コアおよび/またはsiRNA層をコーティングする捕捉層は、カチオン性である。
【００１６】
1つの局面では、本発明のsiRNA送達系は、Map4k4 siRNA、すなわちMap4k4をターゲティングするsiRNAである。また別の局面では、siRNA送達系は、炎症性サイトカインsiRNA、すなわち炎症性サイトカインをターゲティングするsiRNAを含有する。さらにまた別の局面では、本発明のsiRNA送達系は、TNF-α siRNAを含有する。また別の局面では、siRNAは、RIP140 siRNAである。また別の局面では、siRNAは、TLR4シグナリングsiRNAである。また別の局面では、siRNAは、TNF-α siRNAである。
【００１７】
また別の局面では、本発明のsiRNA送達系は、追加してペイロードを含むペイロードコアであるコアを特徴とする。一部の態様では、ペイロードは、siRNAである。また別の態様では、ペイロードコアおよびペイロード層は、同一siRNAを含んでいる。また別の態様では、ペイロードコアおよびペイロード層は、相違するsiRNAを含んでいる。一部の態様では、siRNA送達系は、約1×10-7〜10×10-7pmol（ピコモル）/YCWPのsiRNAを含有している。一部の態様では、siRNA送達系は、約0.1×10-7〜100×10-7pmol/YCWPのsiRNAを含有している。例示的な態様では、siRNA送達系は、約4×10-7pmol/YCWPのsiRNAを含有している。例示的な態様では、siRNA送達系は、約4μg/mg（YCWP）のsiRNAの比率で存在するsiRNAを含有している。この局面の別の態様では、ペイロードは、非siRNAペイロードである。1つの態様では、非siRNAペイロードは、DNA、タンパク質、非siRNA RNA、アンチセンスDNA、または低分子である。別の態様では、DNAは、発現ベクターである。一部の態様では、コアは、ナノプレックス化コアである。
【００１８】
また別の局面では、本発明のsiRNA送達系の捕捉層は、荷電ポリマー、荷電界面活性剤、および/またはそれらの混合物を含有している。この局面の1つの態様では、捕捉層は、カチオン性ポリマー、カチオン性界面活性剤またはそれらの混合物から作り上げられる。関連する局面では、コアは、荷電ポリマー、荷電界面活性剤、および/またはそれらの混合物を含有している。この局面の1つの態様では、コアは、カチオン性ポリマー、カチオン性界面活性剤またはそれらの混合物から作り上げられる。別の態様では、これらの局面のカチオン性ポリマーは、キトサン、ポリ-L-リシンおよびポリエチレンイミン（PEI）、またはそれらの誘導体を包含することができる。関連する態様では、これらの局面のカチオン性ポリマーは、タンパク質類、ポリペプチド類、短鎖合成ペプチド類、ヘリカル両親媒性ペプチド類、カチオン性デンドリマー類、グルカラミドポリマー類、N置換グリシンオリゴマー類、ポリ（2-メチル-アクリル酸2-［（2-ジメチルアミノ）-エチル）-メチル-アミノ］-エチルエステル）、ポリ（2-ジメチルアミノエチル）-メタクリレートおよびそれらの混合物を包含することができる。例示的な態様では、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（PEI）である。一部の態様では、siRNA送達系は、一つまたは複数の追加のペイロード層を含んでいる。追加のペイロードの性質に依存して、関連する捕捉層および/またはコア層は、カチオン性ポリマー、界面活性剤、もしくはそれらの混合物、あるいはアニオン性ポリマー、界面活性剤、またはそれらの混合物（例えば、アルギネートもしくはキサンタン）から作り上げることができる。他の局面では、ペイロード層および捕捉層は、疎水性相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用、および/または物理的相互作用によって結び付いている。本発明の追加の局面は、捕捉層を備えないsiRNA送達系を特徴とする。
【００１９】
また別の局面では、本発明のsiRNA送達系は、生体適合性物質を含有するコアをさらに特徴とする。1つの態様では、生体適合性物質は、核酸、タンパク質、生体高分子、無機塩、またはそれらの混合物である。例示的な態様では、生体適合性物質は、核酸、例えばトランスファーRNA（tRNA）である。また別の態様では、生体適合性コアは、磁気物質を包含している。また別の局面では、本発明のsiRNA送達系のYCWPは、さらに細胞もしくは組織特異的ターゲティング物質を含有するコート層を有している。
【００２０】
別の局面では、本発明のsiRNA送達系は、約1×10-7〜10×10-7pmol/YCWPのsiRNA比のペイロード核酸を含有している。別の局面では、本発明のsiRNA送達系は、約0.1×10-7〜100×10-7pmol/YCWPのsiRNA比のペイロード核酸を含有している。別の局面では、本発明のsiRNA送達系は、約0.01×10-7〜1000×10-7pmol/YCWPのsiRNA比のペイロード核酸を含有している。この局面の1つの態様では、ペイロード核酸は、4μg/mg（YCWP粒子）の比率で存在する。1つの態様では、核酸は、siRNA、shRNA、またはDNAであってよい。
【００２１】
1つの局面では、本発明は、siRNAを食細胞へ送達する方法であって、siRNAの送達が発生するように、siRNA送達系の食作用を促進する条件下で前記細胞を本発明のsiRNA送達系と接触させる工程を含む方法を特徴とする。この局面の1つの態様では、食細胞は、単球、好中球および樹状細胞からなる群より選択される。また別の態様では、食細胞は、マクロファージである。また別の局面では、本発明は、siRNAを非食細胞へ送達する方法であって、前記系の全部または一部の送達が前記送達系の一部分（例えばペイロードを含む部分）の第2（例えば、非食）細胞への運搬（例えば、二次運搬）を促進する条件下で行われるように、siRNA送達系の食作用を促進する条件下で、食細胞を本発明のsiRNA送達系と接触させる工程を含む方法を特徴とする。
【００２２】
また別の局面では、本発明は、siRNA送達系を作製する方法であって、コアの形成を促進する条件下でYCWPを少なくともコア成分と接触させる工程を含む方法を特徴とする。任意で、コア含有YCWPは、コアを被覆する捕捉層の形成を促進する条件下で捕捉成分と接触させることができる。一部の態様では、コア成分は、siRNAを含んでいる。一部の態様では、コア成分は、非siRNA成分である。一部の態様では、コア含有YCWPは、siRNA送達系が形成されるように、少なくとも1つのsiRNA層の形成を促進する条件下でsiRNA成分;および少なくとも1つの捕捉層の形成を促進する条件下で捕捉成分と接触させることができる。例示的な態様では、本系は、レイヤー・バイ・レイヤー（LbL）アプローチを用いて作製される。他の例示的な態様では、コア含有YCWPは、siRNA送達系が捕捉層を伴わずに形成されるように、少なくとも1つのsiRNA層の形成を促進する条件下で、siRNAと接触させることができる。
【００２３】
また別の局面では、本発明は疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、該疾患または障害が治療されるように、本発明のsiRNA送達系を、前記ペイロードの送達を促進する条件下で投与する工程を含む方法を特徴とする。この局面の1つの態様では、疾患または障害は、炎症性疾患または障害である。また別の態様では、疾患または障害は、自己免疫障害、敗血症、腸の障害、感染性疾患、悪性腫瘍、肺障害、心障害、炎症性障害および神経障害からなる群より選択される。また別の態様では、疾患または障害は、クローン病、HIV、関節炎、心血管疾患および癌からなる群より選択される。また別の態様では、疾患または障害は、代謝性疾患または障害である。さらに別の態様では、疾患または障害は、耐糖能、インスリン感受性、糖尿病および肥満症からなる群より選択される。関連する局面は、TLR4-媒介性疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、siRNAの送達とTLR4シグナリングの変調を促進する条件下で、該疾患または障害が治療されるように、本発明のsiRNA送達系を投与する工程を含む方法を特徴としており、該ペイロードは、TLR4シグナリング成分を標的とするsiRNAである。これらの局面の様々な態様では、siRNA送達系は、局所、非経口、および/または腸内投与される。例示的な態様では、siRNA送達系は、経口投与される。一部の態様では、siRNAは、全身性送達される。さらにまた別の態様では、siRNAは、局所送達される。
【００２４】
したがって、1つの局面では、本発明は、経口薬物送達の方法であって、被験者に本発明のsiRNA送達系を投与する工程を含む方法を特徴とする。この局面の1つの態様では、本発明の方法を用いて被験者に投与されるsiRNAの量は、約0.1〜100μg/kgである。また別の態様では、本発明の方法を用いて被験者に投与されるsiRNAの量は、約1〜10μg/kgである。また別の態様では、本発明の方法を用いて被験者に投与されるsiRNAの量は、約0.01〜1,000μg/kgである。理論によって拘束することは望まないが、本発明のsiRNA送達系の驚くべき局面は、高効率のsiRNA送達である。したがって、これらの送達系は、それらに関連するより低いコストおよび毒性という利点を提供する。これとは対照的に、siRNA送達系は、所望であれば、例えば100,000μg/kgまでの高用量のsiRNAを送達できると考えられている。
【００２５】
また別の局面では、本発明は、経口薬物送達の方法であって、siRNAがマクロファージへ送達されるように、被験者に本発明のsiRNA送達系を、前記siRNA送達系と前記被験者内のマクロファージとの接触を促進する条件下で投与する工程を含む方法を特徴とする。また別の局面では、本発明は、マクロファージ媒介性siRNA送達方法であって、siRNAの送達が発生するように、siRNA送達系の食作用を促進する条件下でマクロファージを本発明のsiRNA送達系と接触させる工程を含む方法を特徴とする。1つの態様では、マクロファージは、インビトロで接触させられる。また別の態様では、マクロファージは、インビボで接触させられる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】（a）YCWP内で構築されたナノ粒子コア、（b）ナノ粒子コア上へのDNAの吸着、および（c）GeRPを生成するための、パン酵母から出発してグルカン封入siRNA粒子（GeRP）の形成で終了するプロセス、を示す略図である。
【図２】負荷されたtRNAの関数としてのYCWPナノプレックスコア内で結合したtRNAの量（μg）を示す図である。
【図３】0.01の一定tRNA/YCWP比で、負荷されたPEIの関数としての、ナノプレックスコアを形成するためにYCWP内でtRNAに結合したPEI（μg）の量を示す図である。
【図４】DNA濃度の関数としての結合した超音波処理ローダミン標識サケ精子DNAの量（DNA（μg）/粒子（1×109個））を示す図である。
【図５】0.05のtRNA:YCWP比および4w/wのPEI:YCWP比の粒子配合を伴う一定DNA負荷（10μgのDNA）で負荷されたPEIの関数としてのYCWP-tRNA-PEI-DNAに結合したPEI（μg）の量を示す図である。
【図６】相違するYGMP/PEI比でYGMP-tRNAコアに結合したRho-PEIからの蛍光の一様な増加を示すFACS結果を含む。
【図７】YGPおよびYGMPの両方へのRho-PEI結合についての平均蛍光強度を示す図である。
【図８】DNA/PEI複合体の吸着:（A）0.1のtRNA/YGMP比でYGMP内に吸着されたRho-tRNA;（B）3.75のPEI/YGMP比でYGMP-tRNAに結合したRho-PEI;（C）625ngのRho-DNAの109 YGMP/tRNA/PEI粒子への吸着;（D）YCWP-tRNA-PEI-DNAへのRho-PEIの吸着（25μLの0.01％  Rho-PEIが500ngのDNAに加えられた）を示しているFACS結果（青色の線は陰性対照を示す）を示す図である。
【図９】0.01（A）および0.05（B）のtRNA/YCWP比、および4のPEI/YCWP比で、YCWP-tRNA-PEI粒子についてのトランスフェクション結果を示す図である。
【図１０】図10a-cは、TNF-α siRNA-GeRPが基底TNF-α mRNA発現を効果的にサイレンシングすることを示す図である（図10aは、Scr siRNAサンプル中のTNF-α mRNAに比較したTNF-α siRNAサンプル中のTNF-α mRNAを示している。図10bおよび10cは、直接mRNA測定を示している）。
【図１１】Map4k4、TNF-αおよびRIP140に対して向けられたsiRNA種を含有するGeRPを用いた処置の48時間後のマウス腹腔マクロファージ内のMap4k4、TNF-αおよびRIP140についての発現レベルを示す図である。
【図１２】図12aおよびbは、RT-PCR定量法によって評価した、MAP4K4 siRNA-GeRP処置PEC内でのインビトロMAP4K4 mRNA発現を示している。図12cは、PBS、未負荷GeRPおよびscr siRNAが負荷されたGeRPを用いた処置が、PEC内でのMAP4K4およびTNF-α mRNAの発現に及ぼす作用を示している。
【図１３】siRNAを含有していない対照FITC-YCWPを用いた処置の前後に採取した血液サンプルからの血漿中のTNF-α濃度を示す図である。
【図１４】抗Map4k4 siRNAを含有するGeRPが事前に注射されていたマウスから単離されたマウス腹腔マクロファージのプールからのMap4k4発現を示す図である。
【図１５】さらにFACSを用いた蛍光についてソーティングされていたMap4k4 siRNAを含有するGeRPが注射されたマウスから単離されたマウス腹腔マクロファージからのMap4k4発現を示す図である。
【図１６】実施例9に詳述した実験における処置およびマウスからの細胞単離についての時系列を示す図である。
【図１７】最終注射後の様々な時点にMap4k4 siRNAまたは対照FITC-YCWPを含有するGeRPが注射されたマウスから単離された腹腔マクロファージ内のMap4k4発現を示す図である。
【図１８】同様に処置されたマウスから単離された脾臓マクロファージ内のMap4k4発現を示す図である。
【図１９】MAP4K4 siRNAを含有するGeRPのI.P.投与がインビボでのマクロファージ内のMAP4K4 mRNA発現を減少させることを示す図である。図19aは、siRNA調製物を用いたi.p.処置およびPEC単離の時系列を示している。10週齢のC57BL6/J雄性マウスは、初期3日間にわたりDy547に結合したScrまたはMAP4K4 siRNA（10μg/kg）を含有するFITC-GeRPの1日1回i.p.注射を受けた。第4日目に、マウスにはチオグリコレートをi.p.注射し、第5日目にPECを単離した。図19bは、MAP4K4 mRNA発現のRT-PCR分析を示している。結果は、任意単位で表示し、4回の独立実験の平均値±SEMである。＊p＜0.001。
【図２０】インビボでのマクロファージによる経口投与されたFL-グルカン粒子（YCWP）の取込みおよびGeRPがインビボでの遺伝子発現を抑制する能力についての試験のプロトコルおよび結果を示す図である。図20a〜bは、処置プロトコルおよびサンプル収集の時系列を示している。図20cは、図20bのプロトコルによってMAP4K4 siRNA（1）を用いた処置後のRT-PCRによって分析したPEC内のMAP4K4発現の分析を示している。その後の実験からのデータを用いて、図20dは、図20bのプロトコルによってMAP4K4 siRNA（1）を用いた処置後のRT-PCRによって分析したPEC内のMAP4K4発現のさらなる分析および組織からの付着性細胞を示している。図20eは、対照手順からの血清中INFγレベルを示している（Scr siRNA負荷GeRP、未負荷GeRPおよびPBS）。図20f、gおよびhは、図20bのプロトコルによってMAP4K4（2）、TNF-α（1）またはTNF-α（2）siRNAの経口投与後の組織からのPECおよび付着性細胞内のMAP4K4またはTNF-α発現を示す図である。比較データ分析は、図21および22に提供されている。
【図２１】腹腔対脾臓マクロファージ内のMap4K4発現を比較している。
【図２２】腹腔対肺マクロファージ内のMap4K4発現を比較している。
【図２３】マクロファージ内のリポ多糖誘起性TNF-α発現にMap4k4またはTNF-α siRNA FITC-GeRP注射が及ぼす作用を示す図である。
【図２４】図24a〜bは、40pmolのScr、MAP4K4 siRNA（map4K4 siRNA（1）、図24のパネルa）または第2MAP4K4 siRNA（「MAP4K4（2）」、図24のパネルb）を含有するGeRPで処置したPEC内のTNF-α mRNA発現を示している。結果は、任意単位で表示し、平均値±SEMである（n＝4）。統計的有意性は、分散分析およびTukey事後検定によって決定した。＊（p＜0.01）。図24cは、40pmolのScr（1）またはMAP4K4（1）siRNAを含有するGeRPで処置され、様々な濃度のLPSとともにインキュベートしたPEC内のTNF-α mRNA発現を示しているが、図24dは同一条件下で処置されたPECによるTNF-α分泌を示している。図24eは、Scr（1）siRNAまたはScr（2）siRNAが負荷されたGeRPがMAP4K4またはTNF-αの発現に有意な作用を及ぼさないことを示している。
【図２５】対照またはsiRNA FITC-GeRPを用いた処置後のリポ多糖処置マクロファージによる細胞培養培地中へ分泌されたTNF-αの濃度（fg/mL）を示す図である。
【図２６】図26aは、40pmolのScrまたはMAP4K4 siRNAを含有するGeRPで処置されたPECによるTNF-α分泌を示している。図26bは、40pmolのScr siRNAを含有するGeRP、未負荷GeRP（siRNAなし）またはPBS（GeRPなし）で処置されたPECによるTNF-α分泌を示している。TNF-α mRNAおよびタンパク質レベルは、RT-PCRおよびELISAによって各々測定した。結果は、任意単位で表示し、平均値±SEMである（n＝4）。統計的有意性は、分散分析およびStudentの両側T検定によって決定した。＊（p＜0.01）。
【図２７】MAP4K4サイレンシングが、MAPキナーゼのLPS活性化およびNFkBシグナリング経路に影響を及ぼさないことを示す図である。PECは、40pmolのScrまたはMAP4K4 siRNAを含有するGeRPで処置した。48時間後、細胞は指示した時間量にわたって1μg/mLのLPSを用いて処置した。細胞溶解液は、リン酸化および全（a）JNK 1/2、（b）ERK 1/2、（c）p38MAPK、（d）ATF-2、（e）リン酸化cJUNおよび（f）全IkBαについてウェスタンブロッティングした。グラフは、3回の相違する実験からのウェスタンブロットシグナルの平均デンシトメトリー分析値±SEMを示しており、任意単位で表示した（n＝3）:Scr-siRNAデータは黒色の四角によって表示し、MAP4K4-siRNAは白色の三角によって表示した。これらの条件下で、MAP4K4欠失はTNF-α発現を顕著に減衰させた（図示していない）。（g）例えばTNF-αおよびIL-1βなどの炎症遺伝子の発現を調節する潜在的MAP4K4シグナリングの略図。
【図２８】MAP4K4サイレンシングがLPS誘導性致死性ならびにインビボでのTNF-αおよびIL-1β産生を阻害することを示す図である。図28aは、siRNAおよびD-ガラクトサミン（D-GalN）/LPS投与の時系列を示している。図28bは、GeRP siRNA調製物（10μg/kg）で経口処置されたマウスから単離されたPEC内でのTNF-α、IL-1β、IL-10およびCCR2の発現を示している。統計的有意性は、Studentの両側T検定によって決定した。図28c〜dは、LPS/D-GalN注射の1.5、4および28時間後にMAP4K4 siRNA処置されたマウスにおける血清中および腹腔液中TNF-αレベルを示している。統計的有意性は、分散分析およびTukey事後検定によって決定した。図28e〜gは、MAP4K4（2）siRNAによるTNF-αおよびIL-1βのノックダウンをTNF-α（1）および（2）siRNAによるIL-1βのノックダウンと比較した図である。
【図２９】siRNA調製物で経口処置され、次にLPS/D-GalNが注射されたマウスの生存率を示す図である。生存率は、24時間にわたり1時間毎に評価した。各実験において、siRNA GeRPを用いて、しかしLPSを用いずに経口処置された3匹のマウスからなる追加の群を使用してPEC内のMAP4K4ノックダウンを評価した（挿入図）。結果は、3回の独立実験の平均値である。PBS（GeRPなし）、GeRP Scr（n＝22）およびGeRP MAP4K4（1）siRNA（n＝22）調製物を用いて処置されたマウスについての生存確率は、Kaplan-Meier分析を用いて決定した。統計的有意性は、対数順位検定（Mantel-Cox）を用いて評価した（p＜0.01）。
【図３０】siRNA負荷GeRP（Scr、MAP4K4（2）、TNF-α（1）およびTNF-α（2））（図30a）を用いて経口処置されたマウスにおける血清中TNF-αレベルおよびLPS/D-GalNを用いた注射後の生存率（図30b）を示す図である。
【図３１】対照GeRP調製物およびPBS（GeRPなし）を用いて経口処置されたマウスの血清中TNF-αレベル（パネルa）および生存率（パネルb）を示す図である。生存率は、24時間にわたり1時間毎に評価した。
【図３２】siRNA-GeRPを用いた処置後のインビトロのマクロファージによるインターフェロン応答を示す図である。106 PECは、PBS、107未負荷GeRP（tRNA/PEIコアを含有するがsiRNAは含有しない）または40pmolのScrが負荷されたGeRPで処置した。全RNAは処置48時間後に採取し、INFβ標的遺伝子、OAS1およびMX1もしくはINFγ標的遺伝子、IL-12の発現についてリアルタイムPCRによって分析した。結果は、平均値±SEMである（n＝3）。
【図３３】siRNA-GeRP経口処置後のインビボでの血清中肝酵素レベルを示す図である。マウスに、PBSまたは10μg/kgのScrもしくはMAP4K4（1）siRNAを含有するGeRPを強制経口投与した。（a）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）および（b）アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（AST）は、最終強制経口投与の4、8および20日後に血清中で測定した（n＝3）。
【図３４】MAP4K4およびaP2 siRNAを含有するGeRP（プロトコル、パネルa）のi.p.注射は、皮下（パネルb）および副睾丸脂肪パッド（パネルc）マクロファージ内の遺伝子発現を減少させることを示す図である。
【図３５】耐糖能異常を示すob/obマウス（対照、パネルb）におけるMAP4K4およびaP2 siRNAを含有するGeRPのi.p.注射（プロトコル、パネルa）が、耐糖能を増加させる（すなわち、ピーク血漿糖レベルを減少させる）ことができる（パネルcおよびd）ことを示す図である。
【図３６】図36a〜bは、aP2 siRNA、MAP4K4（1）siRNAまたはScr siRNA（（1）もしくは（2））が負荷されたGeRPを用いた処置後のaP2 mRNA（パネルaおよびb）ならびにMAP4K4 mRNA（パネルb）の発現を示している。MAP4K4およびaP2 siRNAを用いた処置は、それらの各遺伝子の発現を減少させる。図36c〜dは、siRNAが負荷されたGeRPを用いた処置後のPECによるTNF-α発現および分泌に及ぼす作用を示している。MAP4K4 siRNAが負荷されたGeRPを用いた処置だけがTNF-α発現および分泌を減少させた。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
二本鎖RNAの短い配列は真核細胞における認識RNA転写産物の枯渇を誘発する可能性があるという発見は、遺伝子調節に関する本発明者らの理解を大きく拡大させた。RNA干渉（RNAi）による遺伝子サイレンシングの特異性および効力は、これらの作用を媒介する細胞機構によって促進される。治療用途のためには、二本鎖短鎖干渉RNA（siRNA）オリゴヌクレオチドは比較的非毒性であり、高い特異性のために容易に設計され、そして低分子薬物に結合するタンパク質をコードする遺伝子に制限する必要はない。そこでRNAiは、タンパク質配列をコードする全ての遺伝子を標的とすることができる。さらに、siRNAは、二本鎖RNAの長い配列への細胞の曝露に結び付いたインターフェロン応答を最小限に抑えるように設計される。
【００２８】
これらの特性にもかかわらず、siRNAのインビボ送達にとっての障害は多数あって手強い。これらには、細胞外環境におけるsiRNAオリゴヌクレオチドの急速な分解、腎臓を通しての急速な排出、および密着帯を貫通して細胞表面膜を越える透過性の低さが包含される。そこで、siRNA媒介性遺伝子サイレンシングを特異的標的組織および細胞タイプへ経口送達する技術を開発する必要が存在する。
【００２９】
この目標を達成するためにマクロファージが標的として使用されるが、それはマクロファージは、関節リウマチ、結腸炎、およびアテローム硬化症などの主要疾患に結び付いた炎症性反応を制御するからである。特殊宿主防衛細胞として、マクロファージは、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）およびインターロイキン-1ベータ（IL-1β）などの炎症性サイトカインの分泌を通しての発病の一因となる、妥当性が確認された薬学的標的である。
【００３０】
マウスにおけるマクロファージへのsiRNAの経口送達を遂行するために、本発明は、β1,3-D-グルカンのミクロンサイズの粒子およびそれらが腸壁内のパイアー斑（Peyer's patches）内のM細胞を通って下にある腸管関連リンパ組織（GALT）まで通過する能力を利用する。GALT内へのそのようなβ1,3-D-グルカン粒子のトランスサイトーシス後に、それらはdectin-1受容体および場合によってはその他のβグルカン受容体媒介性経路を介して常在マクロファージおよび樹状細胞による食作用を受ける。GALTマクロファージは腸から移動して、時間とともに全身マクロファージの有意な割合が摂取されたグルカン粒子を含有するように、他の細網内皮系組織に浸潤する。
【００３１】
本発明の態様は、酵母細胞壁内で見いだされる物質を含む粒子を使用して、細胞へペイロードを送達するための方法および組成物を特徴とする。本発明の粒子は、酵母細胞壁粒子（YCWP）外部およびナノ複合体化内部を包含することができる。本発明のナノ複合体化内部は、ペイロード物質、例えば、siRNA、および捕捉物質、例えばカチオン性ポリマーおよび/または界面活性剤を包含することができる。
【００３２】
好ましい局面では、本発明は、酵母細胞壁粒子（YCWP）として公知である微小粒子を含有するβグルカン内のナノ複合体化内部のレイヤー・バイ・レイヤー（LbL）合成法を用いて作製された、グルカン封入核酸送達系（例えば、siRNAを包含するDNAおよびRNA）を特徴とする。YCWPは、例えばパン酵母から調製された、中空および多孔性の2〜4μのミクロスフェアである。親水コロイドシェルは、主としてβ1,3-D-グルカン、マンノプロテインおよびキチンから構成され、典型的には厚さが＜200nmである（図1a）。
【００３３】
封入系は、腸管関連マクロファージおよび樹状細胞内への経口取込み、ならびに細胞内核酸（例えば、siRNA）送達およびこれらの細胞内での遺伝子変調を促進するYCWP内に、核酸を含有する高分子電解質ナノ複合体を閉じ込める。高分子電解質ナノ複合体の形成は、静電相互作用を通して組み立てられる様々な成分を用いて、レイヤー・バイ・レイヤー（LbL）アプローチにしたがう。一過性遺伝子療法のための担体としてのYCWPの使用は、正荷電している最外層を伴うYCWP内でのナノ粒子状コアの形成を必要とする。このカチオン性層を使用すると、核酸を正荷電したコア表面へ静電的に結合させることができる。核酸は、次に核酸を保護するために第2カチオン性ポリマー層でコーティングされ、YCWP閉じ込めナノプレックス化核酸調製物は、容易に細胞に送達される、または動物に投与される。
【００３４】
I.定義
本発明をより容易に理解できるように、最初に所定の用語について定義する。
【００３５】
本明細書において使用する用語「ナノ粒子」は、径が1μ未満、例えば径が500、200、100、50nm（ナノメートル）以下である粒子（例えば、球状粒子）を意味する。
【００３６】
本明細書において使用する用語「酵母細胞壁粒子」（「YCWP」）は、細胞質成分および/またはその他のタンパク質および/または多糖類を取り除くために酵母のアルカリ、酸および/または溶媒抽出の結果として生じるミクロンサイズのβグルカンシェルもしくは粒子を意味する。
【００３７】
本明細書において使用する用語「酵母グルカンマンナン粒子（「YGMP」）またはグルカンマンナン粒子（「GMP」）またはグルカンマンナンシェル（「GMS」）は、有意なパーセンテージの酵母細胞壁βグルカンおよびマンナンを含むYCWPを意味する。抽出プロセスは、起源酵母細胞壁内に存在する有意なパーセンテージのβグルカンおよびマンナンが抽出後に粒子内に残留するようなプロセスである。
【００３８】
本明細書において使用する用語「酵母グルカン粒子（「YGP」）またはグルカン粒子（「GP」）またはグルカンシェル（「GS」）は、主として酵母細胞壁βグルカンを含むYCWPを意味する。マンナンが粒子壁から除去されるように、YGMPを作成するための条件に比較してより厳しい抽出条件が使用される。
【００３９】
本明細書において使用する用語「グルカン封入siRNA粒子」（「GeRP」）は、その中に封入されたsiRNAを含有するYCWP、GPまたはグルカンシェルを意味する。
【００４０】
本明細書において使用する用語「コア」は、その周囲に層（例えば、ペイロード層および/または捕捉層）または区間が封入化によって形成されるナノ粒子の中心を意味する。
【００４１】
本明細書において使用する用語「コア物質」は、コア内に組み込まれる物質または分子（例えば、化合物、ポリマーなど）を意味する。コア物質は、ペイロード分子、捕捉分子などを包含することができる。
【００４２】
本明細書において使用する用語「ペイロード分子」または「ペイロード物質」は、ナノ粒子または前記ナノ粒子を含む送達系から送達もしくは放出される関心対象の物質または分子（例えば、薬学的活性物質）を意味する。例示的な態様では、ペイロード分子は、核酸、ペプチド、タンパク質、小有機活性物質、小無機活性物質、およびそれらの混合物からなる群より選択される。例えば、ペイロード分子は、治療薬または診断薬であってよい。
【００４３】
本明細書において使用する用語「ペイロード層」は、少なくとも1つのペイロード分子または物質を含む層（例えば、ナノ粒子の層）である。
【００４４】
本明細書において使用する用語「ペイロードコア」は、少なくとも1つのペイロード分子または物質をさらに含むコアである。
【００４５】
本明細書において使用する用語「捕捉分子」または「捕捉物質」は、少なくともある期間にわたりナノ粒子内のペイロード分子または物質（または前記ナノ粒子を含む送達系）の滞留（例えば、一時的滞留）を促進する分子または物質を意味する。所定の態様では、捕捉分子または物質は、標的細胞による送達系の取込みまでの分子の滞留を促進する。所定の態様では、捕捉分子は、生体適合性で薬理学的に許容される。好ましくは、ペイロード分子および捕捉分子は、同一溶媒系内に可溶性である。例示的なペイロード分子は、天然および合成ポリマー（例えば、アガロース、ポリアクリルアミド、多糖類）、荷電（例えば、カチオン性またはアニオン性）ポリマー、界面活性剤などを包含している。
【００４６】
本明細書において使用する用語「捕捉層」は、少なくとも1つの捕捉分子を含む層である。
【００４７】
II.核酸ペイロード物質
例示的な態様では、本発明の組成物は、核酸をベースとするペイロード物質を含んでいる。例示的なペイロード物質には、RNAサイレンシング物質（例えば、siRNA、siRNA様分子、miRNA、shRNA）、遺伝子サイレンシング活性を備えるその他の核酸（例えば、アンチセンス分子および/またはリボザイム）、または前記RNAサイレンシング物質および他の遺伝子サイレンシング核酸をコードする核酸構築物（例えば、DNA構築物）が包含されるがそれらに限定されない。
【００４８】
A.RNAサイレンシング物質
本発明は、本発明の様々な組成物および手順において使用するためのRNAサイレンシング物質（例えば、siRNA、miRNA、shRNA）を特徴とする。RNAサイレンシング物質はアンチセンス鎖（もしくはその部分）を含んでおり、該アンチセンス鎖はRNA媒介性サイレンシング機序（例えば、RNAi）を介してmRNAのサイレンシングを媒介するために標的mRNAに対して十分な相補性を有している。
【００４９】
i.siRNA分子
本発明のsiRNA分子は、センス鎖および相補的アンチセンス鎖からなるデュープレックスであり、前記アンチセンス鎖は標的特異的RNAサイレンシング機序を指令するために標的mRNA配列に対する十分な相補性を有する。好ましい態様では、アンチセンス鎖は本明細書に規定したように、RNA干渉（RNAi）を指令するために標的mRNAに対して十分な相補性を有する、すなわち、siRNAはRNAサイレンシング機構またはプロセスによる標的mRNAの破壊を誘発するために十分な配列を有している。また別の態様では、siRNAのアンチセンス鎖は、標的mRNAの翻訳抑制を指令するために標的mRNA配列に対する十分な相補性を有している。
【００５０】
所定の態様では、siRNA分子は、5〜60（例えば、約10〜50）以上のヌクレオチドの長さを有している、すなわち各鎖は、5〜60（例えば、10〜50）のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）を含んでいる。所定の例示的な態様では、siRNA分子は各鎖内に約16〜30、例えば16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドの長さを有しており、該鎖の1本は標的領域に対して十分に相補的であり、もう1本の鎖は第1鎖と同一または実質的に同一である（例えば、第1鎖と比較して5つ以下（例えば、1、2、3、または4つ）のミスマッチを有する）。所定の特定態様では、siRNA分子は、約18〜25ヌクレオチド（例えば、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチド）の長さを有する。他の特定態様では、siRNA分子は、約25〜30ヌクレオチド（例えば、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド）の長さを有する。他の特定態様では、siRNA分子は、約25〜35ヌクレオチド（例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35ヌクレオチド）の長さを有する。他の態様では、siRNAは、より短い、またはより長い長さを有してよい。1つの態様では、siRNAは、各鎖内に約5〜15ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ（例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチド）の長さを有しており、該鎖の一方は標的領域に対して十分に相補的である。また別の態様では、siRNAは、約30〜35ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ（例えば、各鎖内に30、31、32、33、34、または35ヌクレオチド）の長さを有しており、該鎖の一方は標的領域に対して十分に相補的である。また別の態様では、siRNAは、約30〜60ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ（例えば、各鎖内に35、40、45、50、55、または60ヌクレオチド）の長さを有しており、該鎖の一方は標的領域に対して十分に相補的である。
【００５１】
所定の態様では、siRNA分子の鎖は相違する長さである（例えば、それらは長さが5ヌクレオチド以内（例えば、1、2、3、または4）相違する）。他の態様では、siRNA分子の鎖は、同一の長さである。
【００５２】
所定の態様では、siRNA分子の鎖は、siRNA分子の一方または両方の末端が平滑末端（すなわち、オーバーハングが欠如する）であるように整列させられる。他の態様では、siRNA分子の鎖は、鎖がアニーリングされたときに1、2または3残基のオーバーハングがデュープレックスの一方または両方の末端で発生するように、整列しない（すなわち、対向する鎖内で相補的塩基が発生しないために）鎖の末端に少なくとも1、2、または3塩基が存在するように整列させられる。所定の態様では、デュープレックスの少なくとも一方（好ましくは両方）の末端は、2ヌクレオチドオーバーハンド（例えば、dTdTオーバーハング）を含んでいる。
【００５３】
一般に、siRNAは、例えば、以下のプロトコルを用いて、当技術分野において公知の任意の方法を使用することによって設計できる:
【００５４】
1.標的mRNAを選択し、一つまたは複数の標的部位を前記標的mRNA内で同定する。これらの部位でのmRNAの切断は、mRNA分解を生じさせ、対応するタンパク質の産生を防止する。変異体遺伝子の他の領域からの多型性もまたターゲティングのために適合する。
【００５５】
好ましい態様では、標的配列はAAジヌクレオチド配列を含んでいる;各AAおよび3'隣接16以上のヌクレオチドは潜在的siRNA標的である。また別の好ましい態様では、核酸分子は、開始コドンの、例えば標的mRNAの配列の少なくとも50〜100nt下流で始まる標的mRNA配列の1領域から選択する。さらに、低G/C含量（35〜55％）を備えるsiRNAは、55％より高いG/C含量を備えるsiRNAより活性が高い可能性がある。そこで1つの態様では、本発明は、35〜55％のG/C含量を有する標的配列を包含しているが、本発明はこの点に関して限定されない。
【００５６】
2.siRNAのセンス鎖は、選択された標的部位の配列に基づいて設計される。例えば、センス鎖は、約18〜25ヌクレオチド、例えば18、19、20、21、22、23、24または25ヌクレオチドを包含することができる。しかし当業者であれば、19ヌクレオチド未満または25ヌクレオチドを超える長さを有するsiRNAはRNAiを媒介するためにも機能できることを理解する。例えば、所定の態様では、センス鎖は、約25〜約30ヌクレオチド、例えば25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドを包含することができる。他の態様では、センス鎖は、約30〜約35ヌクレオチド、例えば30、31、32、33、34、または35ヌクレオチドを包含することができる。したがって、そのような長さのsiRNAもまた、それらがRNAiを媒介する能力を保持することを前提に、本発明の範囲内に含まれる。より長い長さのRNAサイレンシング物質は、望ましくない可能性がある所定の哺乳動物細胞内でインターフェロンもしくはPKR反応を引き出すことが証明されてきた。好ましくは、本発明のRNAサイレンシング物質は、PKR反応を引き出さない（すなわち、十分に短い長さである）。しかし、より長いRNAサイレンシング物質も、例えば、PRK反応を生成できない細胞タイプにおいて、またはPKR反応が代替手段によってダウンレギュレートまたは弱められている状況では有用な可能性がある。
【００５７】
本発明のsiRNA分子は、siRNAがRNAiを媒介できるように標的部位との十分な相補性を有する。一般に、標的遺伝子のRISC媒介性切断を実行するためには標的遺伝子の一部分と十分に同一であるヌクレオチド配列を含有するsiRNAが好ましい。したがって、好ましい態様では、siRNAのセンス鎖は、標的の一部分と十分に同一である配列を有するように設計される。例えば、センス鎖は、標的部位との100％同一性を有していてよい。しかし、100％同一性は必要とされない。センス鎖と標的RNA配列との間では、80％を超える同一性、例えば、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一性さえ好ましい。本発明は、RNAiの効率および特異性を強化するために所定の配列変動を忍容できるという利点を有する。1つの態様では、センス鎖は、標的領域との4、3、2、1、または0個のミスマッチヌクレオチドを有しており、他方の鎖は、第1鎖と同一または実質的に同一である。さらに、1または2ヌクレオチドの小さな挿入もしくは欠失を備えるsiRNA配列もまた、RNAiを媒介するために効果的な場合がある。または、ヌクレオチドアナログ置換もしくは挿入を備えるsiRNA配列は、阻害のために有効な可能性がある。
【００５８】
配列同一性は、当技術分野において公知の配列比較およびアラインメントアルゴリズムによって決定できる。2つの核酸配列（または2つのアミノ酸配列）の同一性率を決定するためには、配列は最適比較の目的で整列させる（例えば、最適アラインメントのためには第1配列または第2配列内にギャップを導入できる）。次に対応するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置でのヌクレオチド（またはアミノ酸残基）を比較する。第1配列内の位置が第2配列内の対応する位置と同一残基によって占められる場合は、それらの分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性率は、導入されたギャップの数および/または導入されたギャップの長さについてスコアに任意でペナルティを科して、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち相同性率（％）＝同一位置の数/位置の総数×100）である。
【００５９】
2つの配列間の配列比較および同一性率の決定は、数学アルゴリズムを用いて遂行できる。1つの態様では、アラインメントは十分な同一性を有する整列された配列の所定部分にわたっては生じたが、低い同一性度を有する部分にわたっては生じなかった（すなわち、局所的アラインメント）。配列比較のために利用される局所的アラインメントアルゴリズムの好ましい非限定的例は、Karlin and Altschul （1993） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改訂されたKarlin and Altschul （1990） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschul, et al. （1990） J. Mol. Biol. 215:403-10のBLASTプログラム（バージョン2.0）内に組み入れられている。
【００６０】
また別の態様では、アラインメントは適切なギャップを導入することによって最適化し、同一性率は整列された配列の長さにわたって決定する（すなわち、ギャップ付きアラインメント）。比較目的のためにギャップ付きアラインメントを得るためには、Altschul et al., （1997） Nucleic Acids Res. 25（17）:3389-3402に記載されたようにGapped BLASTを利用できる。また別の態様では、アラインメントは適切なギャップを導入することによって最適化し、同一性率は整列された配列の全長にわたって決定する（すなわち、包括的アラインメント）。配列の包括的比較のために利用される数学アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS （1989）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）内に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合は、PAM 120重量残基表（weight residue table）、12のギャップ長ペナルティ、および4のギャップペナルティを使用できる。
【００６１】
3.アンチセンス鎖配列は、所望の標的切断部位に対応するヌクレオチドが本質的には前記鎖の中央にあるように設計される。例えば、21ヌクレオチドsiRNAが選択されると、標的切断部位に対応するヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチド6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16（すなわち、センス鎖の5'末端から6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16ヌクレオチド）にある。22ヌクレオチドsiRNAについては、標的切断部位に対応するヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチド7、8、9、10、11、12、13、14、15または16にある。23ヌクレオチドsiRNAについては、標的切断部位に対応するヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチド7、8、9、10、11、12、13、14、15または16にある。24ヌクレオチドsiRNAについては、標的切断部位に対応するヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチド9、10、11、12、13、14または16にある。25ヌクレオチドsiRNAについては、標的切断部位に対応するヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチド9、10、11、12、13、14、15、16または17にある。中心を外れた位置に対応してヌクレオチドを移動させることは、一部の例では、siRNAによる切断の効率を減少させ得る。そのような組成物、すなわち低効率組成物は、第2（非標的）mRNAのオフサイレンシングが検出される場合に使用するために望ましいことがある。
【００６２】
センス鎖は、siRNAのアンチセンス鎖とセンス鎖との間に相補性が存在するように設計される。所定の例示的な態様では、siRNAは、鎖が平滑末端を有するように設計される。他の例示的な態様では、siRNAは、鎖がsiRNAの一方または両方の末端でオーバーハング末端、例えば1、2、3、4、5つ以上のヌクレオチドのオーバーハングを有するように設計される。例示的なオーバーハングは、デオキシヌクレオチドオーバーハング、例えば、dTdTテール部である。
【００６３】
4.siRNAのアンチセンスまたはガイド鎖は、ルーチン的にセンス鎖と同一長さであり、相補性ヌクレオチドを包含している。1つの態様では、ガイドおよびセンス鎖は十分に相補性である、すなわち鎖はアラインメントまたはアニーリングされると平滑末端化される。また別の態様では、siRNAの鎖は、1〜4、例えば2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有するような方法で対合させることができる。オーバーハングは、標的遺伝子配列（またはそれらの相補体）に対応するヌクレオチドを含む（またはそれらからなる）ことができる。または、オーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド、例えばdT、もしくはヌクレオチドアナログ、または他の適切な非ヌクレオチド物質を含む（またはそれらからなる）ことができる。そこでまた別の態様では、核酸分子は、例えばTTなどの2ヌクレオチドの3'オーバーハングを有することができる。オーバーハンギングヌクレオチドは、RNAまたはDNAのいずれであってもよい。
【００６４】
5.当技術分野において公知の任意の方法を用いて、適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラットなど）と潜在的標的を比較し、考察から他のコーディング配列との有意な相同性を備える任意の標的配列を排除する。そのような相同性検索のための1つのそのような方法は、米国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトから入手できるBLASTとして公知である。
【００６５】
6.評価のための基準を満たす一つまたは複数の配列を選択する。siRNAの設計および使用についての詳細な一般情報は、Max-Plank-Institut fur Biophysikalishe Chemie（生物物理化学研究所）のウェブサイトから入手できる「The siRNA User Guide」の中に見いだすことができる。
【００６６】
または、siRNAは、標的配列とハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）を有するアンチセンスまたはガイド鎖を含むと機能的に定義することができる（例えば、400mM NaCl、40mM PIPES（pH6.4）、1mM EDTA、12〜16時間にわたる50℃または70℃のハイブリダイゼーション;その後に洗浄を行う）。追加の好ましいハイブリダイゼーション条件は、70℃の1×SSC中もしくは50℃の1×SSC、50％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション、その後の70℃の0.3×SSC中での洗浄、または70℃の4×SSC中もしくは50℃の4×SSC、50％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション、その後の67℃の1×SSC中での洗浄を包含している。長さが50塩基対未満であると予想されたハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Tm）より5〜10℃低くなければならないが、このときTmは以下の方程式にしたがって決定する。長さが18塩基対未満のハイブリッドについては、Tm（℃）＝2（A＋T塩基の数）＋4（G＋C塩基の数）。長さが18〜49塩基対のハイブリッドについては、Tm（℃）＝81.5＋16.6（log10［Na＋］）＋0.41（％G＋C）-（600/N）（式中、Nはハイブリッド内の塩基の数であり、［Na＋］はハイブリダイゼーション緩衝液内のナトリウムイオンの濃度である（1×SSCに対する［Na＋］＝0.165M）。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の追加の例は、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 9 and 11、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4参照。
【００６７】
陰性対照siRNAは、選択されたsiRNAと同一のヌクレオチド組成を有していなければならないが、適切なゲノムとの有意な配列相補性を有していない。そのような陰性対照は、選択されたsiRNAのヌクレオチド配列を無作為にスクランブルすることによって設計することができる;相同性検索は、陰性対照が適切なゲノム内の任意の他の遺伝子との相同性を欠くことを保証するために実施できる。陰性対照siRNA。さらに、陰性対照siRNAは、有意な数の塩基ミスマッチを配列内に導入することによって設計できる。
【００６８】
7.それによりsiRNAが標的mRNA（例えば、変異体mRNA）を切断する有効性の妥当性を確認するために、siRNAは、ドロソフィラ（Drosophila）をベースとするインビトロmRNA発現系内で標的cDNAとともにインキュベートすることができる。32Pで放射標識し、新規に合成した変異体標的mRNAは、アガロースゲル上でオートラジオグラフィーによって検出する。切断された変異体mRNAの存在は、mRNAヌクレアーゼ活性を指示する。適切な対照は、siRNAの排除を包含している。または、選択されたsiRNAと同一のヌクレオチド組成を有するが、適切な標的遺伝子との有意な配列相補性を有していない対照siRNAを選択する。そのような陰性対照は、選択されたsiRNAのヌクレオチド配列を無作為にスクランブルすることによって設計することができる;相同性検索は、陰性対照が適切なゲノム内の任意の他の遺伝子との相同性を欠くことを保証するために実施できる。さらに、陰性対照siRNAは、一つまたは複数の塩基ミスマッチを配列内に導入することによって設計できる。
【００６９】
a.好ましいsiRNA分子
本発明の態様は、siRNAを含む封入ナノ粒子を特徴とする。一部の好ましい態様では、siRNAは、代謝性障害および/または炎症性障害に関係する遺伝子の発現を減少させるように設計される。一部の好ましい態様では、これらの遺伝子は、Map4k4、TNF-α、RIP140、TLR4およびaP2を包含している。
【００７０】
本明細書では本発明の一部の態様とともに使用するための例示的なsiRNA分子を提供する。そのような分子は、マウスMap4k4
2011517279.tif 000003
、マウスTNF-α
2011517279.tif 000004
およびマウスRipl40
2011517279.tif 000005
に対するsiRNAを包含している（本明細書では5'〜3'の配列を列挙した）。一部の態様では、これらのsiRNA配列は、siRNAの3'末端をオーバーハングする追加の2つのヌクレオチド（UU）を包含している。
【００７１】
本発明の態様は、ヒトMap4k4（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ・キナーゼ・キナーゼ・キナーゼ4）の発現を減少させることに向けられたsiRNAを包含しており、以下の表1内のオープン・リーディング・フレーム配列を含んでいる:
【００７２】
（表1）ヒトMap4K4のセンス鎖配列
2011517279.tif 000006
一部の態様では、これらのsiRNA配列は、siRNAの3'末端をオーバーハングする追加の2つのヌクレオチド（UU）を包含している。
【００７３】
本発明の態様とともに使用するための追加の例示的なsiRNA配列（5'〜3'配列）は:
2011517279.tif 000007
を包含している。
【００７４】
ii.siRNA様分子
他の態様では、本発明の組成物は、siRNA様分子を含んでいる。本発明のsiRNA様分子は、RNAサイレンシングまたは翻訳抑制のいずれかによって遺伝子サイレンシングを指示するために標的mRNAに対して「十分に相補性」である配列を有する（すなわち、配列を有する鎖を有する）。siRNA様分子は、siRNA分子と同一方法で設計されるが、センス鎖と標的RNAとの間の配列同一性度はmiRNAとその標的との間で観察される配列同一性度と近似する。一般に、miRNA配列と対応する標的遺伝子配列との間の配列同一性度が減少するにつれて、RNAサイレンシングではなくむしろ翻訳抑制によって転写後遺伝子サイレンシングを媒介する傾向は増加する。このため、標的遺伝子の翻訳抑制による転写後遺伝子サイレンシングが望ましい代替態様では、miRNA配列は標的遺伝子配列との部分的相補性を有する。所定の態様では、miRNA配列は、標的mRNA内（例えば、標的mRNAの3'-UTR内）に分散した一つまたは複数の短い配列（相補性部位）との部分的相補性を有する（Hutvagner and Zamore, Science, 2002; Zeng et al., Mol. Cell, 2002; Zeng et al., RNA, 2003; Doench et al., Genes & Dev., 2003参照）。翻訳抑制の機序は協調的であるので、所定の態様では、複数の相補性部位（例えば、2、3、4、5、または6）を標的とすることができる。
【００７５】
siRNA様デュープレックスがRNAiまたは翻訳抑制を媒介する能力は、相補性の部位での標的遺伝子配列とサイレンシング物質のヌクレオチド配列との間の非同一ヌクレオチドの分布によって予測することができる。1つの態様では、翻訳抑制による遺伝子サイレンシングが所望である場合は、少なくとも1つの非同一ヌクレオチドは、miRNAガイド鎖および標的mRNAによって形成されたデュープレックスが中心「バルジ」を含有するように相補性部位の中心部分に存在する（Doench JG et al., Genes & Dev., 2003参照）。別の態様では、2、3、4、5、または6つの隣接または非隣接非同一ヌクレオチドが導入される。非同一ヌクレオチドは、それがウォッブル（wobble）塩基対（例えば、G:U）またはミスマッチ塩基対（G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:C、U:U）を形成するように選択することができる。また別の好ましい態様では、「バルジ」は、miRNA分子の5'末端からヌクレオチド12および13位で中心に位置する。
【００７６】
iii.miRNA
所定の態様では、本発明の組成物は、miRNAを含んでいる。miRNAは、植物および動物発達中に転写後または翻訳レベルでの遺伝子発現を調節できるおよそ22ヌクレオチドの非コーディングRNAである。miRNAの1つの一般的特徴は、それら全部が、場合によってはDicer、RNase IIIタイプの酵素、またはそれらのホモログによって、およそ70ヌクレオチドの前駆体RNAステムループと呼ばれるpre-miRNAから切り取られることである。
【００７７】
miRNA配列は、任意の天然型miRNAの配列と類似または同一であってよい（例えば、The miRNA Registry; Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004参照）。今までに1,000を超える天然miRNAが同定されており、共にそれらはゲノム内の全ての予想遺伝子の約1％を含むと考えられる。多数の天然miRNAは、pre-mRNAのイントロン内で共にクラスター化しており、候補miRNA遺伝子がpri-mRNAのステムループ構造を形成する能力を予測する、相同性をベースとする検索（Pasquinelli et al., 2000; Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001参照）またはコンピュータアルゴリズム（例えば、MiRScan, MiRSeeker）を用いてインシリコで同定することができる（Grad et al., Mol. Cell., 2003; Lim et al., Genes Dev., 2003; Lim et al., Science, 2003; Lai EC et al., Genome Bio., 2003参照）。オンラインレジストリは、公表された全てのmiRNA配列の検索可能なデータベースを提供する（サンガー（Sanger）研究所のウェブサイトにあるmiRNAレジストリ;Griffiths-Jones S, Nuc. Acids Res., 2004参照）。例示的な天然miRNAは、lin-4、let-7、miR-10、mirR-15、miR-16、miR-168、miR-175、miR-196およびそれらのホモログ、ならびに国際特許出願WO03/029459号に記載されたようにキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、シノラブディス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）、ゼブラフィッシュ（zebrafish）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thalania）、マウスおよびラットを含むヒトおよび所定のモデル生物由来の他の天然miRNAを包含している。
【００７８】
天然型miRNAは、インビボで内因性遺伝子によって発現させられ、Dicerまたはその他のRNAseによってヘアピンもしくはステムループ前駆体（pre-miRNAまたはpri-miRNA）から処理される（Lagos-Quintana et al., Science, 2001; Lau et al., Science, 2001; Lee and Ambros, Science, 2001; Lagos-Quintana et al.,Curr. Biol., 2002; Mourelatos et al., Genes Dev., 2002; Reinhart et al., Science, 2002; Ambros et al., Curr. Biol., 2003; Brennecke et al., 2003; Lagos-Quintana et al., RNA, 2003; Lim et al., Genes Dev., 2003; Lim et al., Science, 2003参照）。miRNAは、二本鎖デュープレックスとしてインビボで一過性に存在することができるが、遺伝子サイレンシングを指令するために1本の鎖だけがRISC複合体によって取り上げられる。所定のmiRNA、例えば植物miRNAは、それらの標的mRNAに対して完全またはほぼ完全な相補性を有しており、そこで標的mRNAの切断を指令する。他のmiRNAはそれらの標的mRNAに対して完全未満の相補性を有しており、このために標的mRNAの翻訳抑制を指令する。miRNAとその標的mRNAとの間の相補性度は、その作用機序を決定すると考えられる。例えば、miRNAとその標的mRNAとの間の完全またはほぼ完全な相補性は切断機序を予測するが（Yekta et al., Science, 2004参照）、他方、完全未満の相補性は翻訳抑制機序を予測する。特定の態様では、miRNA配列は、天然型miRNA配列の配列であり、その異常な発現または活性は、miRNA障害と相関している。
【００７９】
天然型miRNA前駆体（pre-miRNA）は、一般的に相補性である2つの部分を含むデュープレックスステムを形成する一本鎖、および前記ステムの2つの部分を結合するループを有している。典型的なpre-miRNAでは、ステムは、一つまたは複数のバルジ、例えばステムの1つの部分内で単一ヌクレオチド「ループ」を生成する追加のヌクレオチド、および/または前記ステムの2つの部分の相互へのハイブリダイゼーションにおいてギャップを生成する一つまたは複数の非対合ヌクレオチドを包含している。短鎖ヘアピンRNA、または遺伝子組換えRNA前駆体は、これらの天然型pre-miRNA由来の配列を含むことができるが、所望のRNAサイレンシング物質（例えば、本発明のsiRNA）を送達するために遺伝子組み替えされている。例えば、標的mRNAに対して相補的な配列を備えるpre-miRNAのステム配列を置換することによって、shRNAが形成される。shRNAは、細胞の全遺伝子サイレンシング経路によって処理され、それによってRNAiを効率的に媒介する。
【００８０】
標的遺伝子の翻訳抑制による転写後遺伝子サイレンシングが望ましい所定の態様では、miRNA配列は標的遺伝子配列との部分的相補性を有する。例示的な態様では、miRNA配列は、標的mRNA内（例えば、標的mRNAの3'-UTR内）に分散した一つまたは複数の短い配列（相補性部位）との部分的相補性を有する（Hutvagner and Zamore, Science, 2002; Zeng et al., Mol. Cell, 2002; Zeng et al., RNA, 2003; Doench et al., Genes & Dev., 2003参照）。翻訳抑制の機序は協調的であるので、所定の態様では、複数（例えば、2、3、4、5、または6つ）の相補性部位を標的とすることができる。
【００８１】
iv.短鎖ヘアピンRNA（shRNA）分子
所定の態様では、本発明の組成物は、shRNAを含んでいる。siRNAとは対照的に、shRNAはミクロRNA（miRNA）の天然前駆体を模倣し、遺伝子サイレンシング経路の上部で進入する。このために、shRNAは、全天然遺伝子サイレンシング経路を通して供給されることによって、遺伝子サイレンシングをより効率的に媒介すると考えられる。
【００８２】
shRNA分子の必須要素は、デュープレックスもしくは二本鎖ステム部分を形成するためにアニーリングまたはハイブリダイズするために十分な相補性を有する第1部分および第2部分を包含している。2つの部分は、十分または完全に相補性である必要はない。第1および第2「ステム」部分は、shRNAの他の部分へアニーリングまたはハイブリダイズするために不十分な配列相補性を有する配列を有する部分によって接続されている。この後者の部分は、shRNA分子内の「ループ」部分と呼ばれる。shRNA分子は、siRNAを生成するために処理される。shRNAは、さらにまた一つまたは複数のバルジ、すなわちステムの一部分内に小さなヌクレオチド「ループ」、例えば1-、2-または3-ヌクレオチドループを生成する追加のヌクレオチドを包含することもできる。ステム部分は、同一長さであってよい、または1つの部分は例えば1〜5ヌクレオチドのオーバーハングを包含することができる。オーバーハンギングヌクレオチドは、例えばウラシル（U）包含することができ、例えば全てをUとすることができる。そのようなUは、顕著にも転写の終結をシグナリングするshRNAコーディングDNA内のチミジン（T）によってコードされる。
【００８３】
例示的なshRNAでは、デュープレックスステムの1つの部分は、標的mRNAに対して相補的（またはアンチセンス）である核酸配列である。好ましくは、shRNAのステム部分の1本の鎖は、RNA干渉（RNAi）を介して前記標的RNAの分解または切断を媒介するために標的RNA（例えば、mRNA）配列に対して十分に相補性（例えば、アンチセンス）である。そこで、shRNAは、2つの部分を備えるデュープレックスステムおよび前記2つのステム部分を接続するループを含むことができる。アンチセンス部分は、ステムの5'または3'末端上にあってよい。shRNAのステム部分は、好ましくは長さが約15〜約50ヌクレオチドである。好ましくは、2つのステム部分は、長さが約18または19〜約21、22、23、24、25、30、35、37、38、39、または40ヌクレオチド以上である。好ましい態様では、ステム部分の長さは、21ヌクレオチド以上でなければならない。哺乳動物細胞内で使用する場合は、ステム部分の長さは、インターフェロン経路などの非特異的反応を誘起することを回避するために約30ヌクレオチド未満でなければならない。非哺乳動物細胞では、ステムは、30ヌクレオチドより長くてよい。実際に、ステムは、標的mRNAに対して相補性であるはるかに大きな区間（全mRNAまで、および全mRNAを包含する）を包含することができる。実際に、1つのステム部分は、標的mRNAに対して相補性であるはるかに大きな区間（全mRNAまで、および全mRNAを包含する）を包含することができる。
【００８４】
デュープレックスステムの2つの部分は、デュープレックスステムを形成するためにハイブリダイズするために十分に相補性でなければならない。そこで、2つの部分は、十分または完全に相補性であってよいが、そうである必要はない。さらに、2つのステム部分は、同一長さであってよい、または1つの部分は1、2、3または4ヌクレオチドのオーバーハングを包含することができる。オーバーハンギングヌクレオチドは、例えばウラシル（U）を包含することができ、例えば全てをUとすることができる。shRNA内のループは、長さが2、3、4、5、6、7、8、9以上、例えば15または20ヌクレオチド以上であってよい。
【００８５】
好ましいループは、「テトラループ」配列からなる、またはそれらを含んでいる。例示的なテトラループ配列は、配列GNRA（式中、Nは任意のヌクレオチドであり、Rはプリンヌクレオチド、GGGG、およびUUUUである）を包含するが、それらに限定されない。
【００８６】
所定の態様では、本発明のshRNAは、上記で記載した所望のsiRNA分子の配列を包含している。他の態様では、shRNAのアンチセンス部分の配列は、本質的に上述したように設計することができる、または一般には18、19、20、21ヌクレオチド以上の配列を標的RNA内から、例えば翻訳開始の上流または下流の100〜200または300ヌクレオチドの領域から選択することによって設計できる。一般に、配列は、5'UTR（未翻訳領域）、コーディング配列、または3'UTRを包含する標的RNA（例えば、mRNA）の任意の部分から選択することができる。この配列は任意で、2つの隣接AAヌクレオチドを含有する標的遺伝子の領域の直後に続いてよい。ヌクレオチド配列の最後の2ヌクレオチドは、UUであるように選択できる。この21などのヌクレオチド配列を使用すると、shRNA内のデュープレックスステムの1つの部分を生成することができる。この配列は、野生型pre-miRNA配列のステム部分に、例えば酵素的に置換することができる、または合成される完全配列内に包含される。例えば、全ステムループ遺伝子組換えRNA前駆体をコードする、または前記前駆体のデュープレックスステム内に挿入すべき部分だけをコードするDNAオリゴヌクレオチドを合成することができ、そして制限酵素を用いて例えば野生型pre-miRNAから遺伝子組換えRNA前駆体構築物を構築することができる。
【００８７】
遺伝子組換えRNA前駆体は、デュープレックスステム内にインビボで産生されることが望ましいsiRNA、siRNA様デュープレックス、またはmiRNAの21〜22などのヌクレオチド配列を包含している。そこで、遺伝子組換えRNA前駆体のステム部分は、その発現を減少させるべき、または阻害すべき遺伝子のエキソン部分の配列に対応する少なくとも18または19ヌクレオチド対を包含している。ステムのこの領域を挟んでいる2つの3'ヌクレオチドは、遺伝子組換えRNA前駆体からのsiRNAの産生を最大化できるように、ならびにインビボおよびインビトロでのRNAiによる翻訳抑制または破壊のために対応するmRNAをターゲティングする際に結果として生じるsiRNAの有効性を最大化できるように選択される。所定の態様では、shRNAは、RISC内への進入を強化するために、miRNA配列、任意で末端が修飾されたmiRNA配列を包含することができる。
【００８８】
B.化学修飾されたRNAサイレンシング物質
所定の局面では、本発明の組成物はRNAサイレンシング物質を含んでおり、該センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、ヌクレオチドと化学修飾されたヌクレオチドとの置換によって修飾される。1つの態様では、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、一つまたは複数の内部化学修飾を用いて修飾される。本明細書において規定したように、「内部」ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端以外の任意の位置で発生するヌクレオチドである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子内またはデュープレックスもしくは二本鎖分子の1本の鎖内にあってよい。1つの態様では、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、5'末端および/または3'末端で修飾される。1つの態様では、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、5'末端および/または3'末端の両方で修飾される。本明細書において使用する用語「末端で修飾された」は、5'または3'末端に関連して使用される場合は、最初および最終ヌクレオチドから10ヌクレオチド内の任意のヌクレオチド、例えば、最初および最終ヌクレオチドから7ヌクレオチド内の任意のヌクレオチドを意味する。1つの態様では、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、少なくとも1つの内部ヌクレオチドの置換によって修飾される。また別の態様では、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25またはそれ以上のヌクレオチドの置換によって修飾される。また別の態様では、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％またはそれ以上のヌクレオチドの置換によって修飾される。さらに別の態様では、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、ヌクレオチド全部の置換によって修飾される。本発明で使用されるRNAサイレンシング物質内では、1つのような小数、および全ヌクレオチドのような多数のオリゴヌクレオチドを修飾することができる。一部の態様では、RNAサイレンシング物質は費用有効性を維持しながら所望のレベルのインビボ安定性および/または生体接近可能性を達成するために必要な限り小数の修飾されたヌクレオチドを含有する。
【００８９】
化学修飾は、例えば、RNAサイレンシング物質を追跡するため、RNAサイレンシング物質を精製するため、またはそれと関連しているRNAサイレンシング物質および細胞成分を精製するために、非修飾RNAサイレンシング物質または使用できる標識と比較して増加した安定性、例えば増加もしくは強化されたインビボ安定性をもたらすことができる。そのような化学修飾は、さらにまた細胞（または細胞抽出物もしくは有機体）内のRISC活性/RNAサイレンシング応答性を強化するためにsiRNAの第1（プライミング）鎖を安定化させるため、そしてRNAサイレンシング/遺伝子サイレンシングが現在は進行できる第2鎖をその後に受領するためにその細胞内半減期を改良するために使用できる。修飾はさらにまた、例えばRNAサイレンシング物質の細胞内取込みおよび/またはRNAサイレンシング物質の安定性などの特性を増強することができ、塩基対間の相互作用を安定化することができ、そしてアンチセンスRNAサイレンシング物質-標的RNAデュープレックスの構造的完全性を維持することができる。RNAサイレンシング物質の修飾は、さらにまたインビボ適用、特に、ヒト治療適用のために重要な特性が、RNAサイレンシング物質のRNAサイレンシング活性、例えばヌクレアーゼに対するsiRNAもしくはmiRNA分子の抵抗性を増加させる修飾を傷つけることなく、改良されるように設計することができる。所定の態様では、本発明の修飾されたsiRNA分子は、対応する未修飾siRNAに比較して標的RNA阻害の効率を増強することができる。一部の態様では、修飾されたヌクレオチドはアンチセンス鎖が、標的RNA配列と塩基対合した場合にA形らせん立体配座、例えば標的RNA配列と塩基対合した場合に正常な主溝（major groove）を含むA形らせん立体配座を採用する能力に影響を及ぼさない。
【００９０】
化学修飾は、一般にはリボヌクレオチドへの末端、糖、塩基および/または主鎖の修飾を包含している（すなわち、リン酸-糖主鎖の修飾を包含している）。
【００９１】
1つの態様では、本発明のRNAサイレンシング物質は、一つまたは複数（例えば、約1、2、3、または4つ）の末端修飾を含んでいる。例えば、siRNA分子の5'末端での修飾は、例えば、5'-プロピルアミン基を含んでいる。5'末端の修飾は、さらにまた例えば式I:
2011517279.tif 000008
（式中、各XおよびYは、独立してO、S、N、アルキル、置換アルキル、またはアルキルハロである;各ZおよびWは、独立してO、S、N、アルキル、置換アルキル、O-アルキル、S-アルキル、アルカリル、アラルキル、アルキルハロ、またはアセチルである）によって記載される基などの5'末端リン酸基を包含していてよい。一部の態様では、W、X、YおよびZは全部がOではない。siRNA分子の3'OH末端への修飾は、3'-ピューロマイシン、3'-ビオチン（例えば、光切断可能なビオチン）、ペプチド（例えば、Tatペプチド）、ナノ粒子、ペプチドミメティック、有機化合物（例えば、蛍光色素などの色素）、またはデンドリマー類を包含できるが、それらに限定されない。末端修飾は、センス鎖上、アンチセンス鎖上、または両方であってよい。一部の態様では、5'修飾は、センス鎖上だけである。
【００９２】
また別の態様では、本発明のRNAサイレンシング物質は、一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の糖修飾ヌクレオチドを含んでいてよい。例示的な糖修飾は、式II:
2011517279.tif 000009
（式中、各R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11およびR12は、独立してH、OH、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、F、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、OCN、O-アルキル、S-アルキル、N-アルキル、O-アルケニル、S-アルケニル、N-アルケニル、SO-アルキル、アルキル-OSH、アルキル-OH、O-アルキル-OH、O-アルキル-SH、S-アルキル-OH、S-アルキル-SH、アルキル-S-アルキル、アルキル-O-アルキル、ONO2、NO2、N3、NH2、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ONH2、O-アミノアルキル、O-アミノ酸、またはO-アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリルである;R9は、O、S、CH2、S＝O、CHF、またはCF2であり、Bは、ヌクレオシド塩基である）によって表される修飾を包含していてよい。糖修飾ヌクレオチドには、2'-フルオロ修飾リボヌクレオチド、2'-OMe修飾リボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、2'-アミノ修飾リボヌクレオチドおよび2'-チオ修飾リボヌクレオチドが包含されるがそれらに限定されない。糖修飾ヌクレオチドは、例えば、2'-フルオロ-シチジン、2'-フルオロ-ウリジン、2'-フルオロ-アデノシン、2'-フルオロ-グアノシン、2'-アミノ-シチジン、2'-アミノ-ウリジン、2'-アミノ-アデノシン、2'-アミノ-グアノシンまたは2'-アミノ-ブチリル-ピレン-ウリジンであってよい。1つの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、2'-フルオロリボヌクレオチドである。一部の態様では、2'-デオキシリボヌクレオチドが存在する場合は、それはアンチセンス鎖と関連する切断部位の上流またはアンチセンス鎖と関連する切断部位の下流にある。2'-フルオロリボヌクレオチドは、センスおよびアンチセンス鎖内にあってよい。一部の態様では、2'-フルオロリボヌクレオチドは、全てのウリジンおよびシチジンである。他の態様では、2'-フルオロリボヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の3'および5'末端にのみ存在する。
【００９３】
また別の態様では、本発明のRNAサイレンシング物質は、一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の核酸塩基修飾ヌクレオチドを含んでいる。本発明において有用な核酸塩基修飾ヌクレオチドには:5位で修飾されたウリジンおよび/またはシチジン（例えば、5-ブロモ-ウリジン、5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-アミノ-アリル-ウリジン、5-ヨード-ウリジン、5-メチル-シチジン、5-フルオロ-シチジン、および5-フルオロ-ウリジン）、リボ-チミジン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、4-チオ-ウリジン、8位で修飾されたアデノシンおよび/またはグアノシン（例えば、8-ブロモグアノシン）、デアザヌクレオチド（例えば、7-デアザ-アデノシン）、O-およびN-アルキル化ヌクレオチド（例えば、N6-メチルアデノシン）ならびに非ヌクレオチド型塩基（例えば、デオキシ無塩基、イノシン、N3-メチル-ウリジン、N6、N6-ジメチル-アデノシン、プソイドウリジン、プリンリボヌクレオシドおよびリバビリン）が包含されるがそれらに限定されない。
【００９４】
また別の態様では、本発明のRNAサイレンシング物質は、一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の主鎖修飾ヌクレオチドを含んでいる。例えば、主鎖修飾は、式III:
2011517279.tif 000010
（式中、各R1およびR2は、独立して本明細書に記載した任意のヌクレオチドであり、各XおよびYは独立してO、S、N、アルキル、または置換アルキルであり、各ZおよびWは独立してO、S、N、アルキル、置換アルキル、O-アルキル、S-アルキル、アルカリル、アラルキル、またはアセチルである）によって表される修飾を包含していてよい。一部の態様では、W、X、YおよびZは全部がOではない。例示的な主鎖修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート基またはホスホロジチオエートを含有している。また別の態様では、本発明の主鎖修飾は、ホスホノ酢酸塩および/またはチオホスホノ酢酸塩ヌクレオチド間結合を含んでいる（例えば、Sheehan et al., 2003, Nucleic Acids Research, 31, 4109-4118参照）。主鎖修飾は、センス鎖内、アンチセンス鎖内、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方内にあってよい。一部の態様では、ヌクレオチド間結合の一部分だけが一方または両方の鎖内で修飾される。他の態様では、ヌクレオチド間結合の全部が一方または両方の鎖内で修飾される。1つの態様では、修飾されたヌクレオチド間結合は、一方または両方の鎖の3'および5'末端に存在する。
【００９５】
また別の態様では、本発明のsiRNA分子は、一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の架橋結合、例えばセンス鎖がsiRNAデュープレックスのアンチセンス鎖に架橋結合している架橋結合を含んでいてよい。本発明において有用な架橋剤は、例えば、プソラーレン、マイトマイシンC、シスプラチン、クロロエチルニトロソウレアなどのように当技術分野において一般に公知の架橋剤である。1つの態様では、本発明の架橋結合は、プソラーレン架橋結合である。好ましくは、架橋結合は、アンチセンス鎖に関連する切断部位の下流に存在しており、より好ましくは架橋結合は、センス鎖の5'末端に存在する。
【００９６】
また別の態様では、本発明のRNAサイレンシング物質は、アンチセンス鎖および標的mRNA配列が一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）のミスマッチを含む配列を含んでいる。一部の態様では、ミスマッチは、アンチセンス鎖と関連する切断部位の下流、例えば、アンチセンス鎖の3'末端から1〜6ヌクレオチド以内にある。また別の態様では、核酸分子、例えば、本発明のRNAサイレンシング物質は、デュープレックスsiRNA内に1つのバルジ、例えば、一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の非対合塩基を含んでいるsiRNA分子である。一部の態様では、バルジは、センス鎖内にある。
【００９７】
上記の組み合わせのいずれも、本発明の修飾されたRNAサイレンシング物質を提供するために任意の組み合わせで使用できることを理解されたい。例えば、一部の態様では、本発明はsiRNAを包含しており、該センス鎖は一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および/または一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の2'-デオキシ、2'-O-メチル、および/または2'-フルオロ糖修飾、および/または一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の塩基修飾ヌクレオチド、および/またはセンス鎖の3'末端、5'末端、または3'および5'末端の両方での末端修飾を包含している。一部の態様では、本発明はsiRNAを包含しており、該アンチセンス鎖は一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および/または一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の2'-デオキシ、2'-O-メチル、および/または2'-フルオロ糖修飾、および/または一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の塩基修飾ヌクレオチド、および/またはアンチセンス鎖の3'末端、5'末端、または3'および5'末端の両方での末端修飾を包含している。さらに他の態様では、本発明はsiRNAを包含しており、該センス鎖およびアンチセンス鎖の両方は一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および/または一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の2'-デオキシ、2'-O-メチル、および/または2'-フルオロ糖修飾、および/または一つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の塩基修飾ヌクレオチド、および/またはセンス鎖および/またはアンチセンス鎖のいずれかまたは両方の3'末端、5'末端、または3'および5'末端の両方での末端修飾を包含している。
【００９８】
本発明の修飾されたRNAサイレンシング物質（すなわち、デュープレックスsiRNA分子）は、5'末端、3'末端、5'および3'末端、および/または内部残基で、またはそれらの任意の組み合わせで修飾されてよい。RNAサイレンシング物質の修飾は、例えば、末端修飾、糖修飾、核酸塩基修飾、主鎖修飾であってよく、そしてミスマッチ、バルジ、または架橋結合を含有していてよい。さらに、3'末端、5'末端、または3'および5'末端および/または内部修飾が包含され、該修飾は、例えば、架橋剤、ヘテロ官能性架橋剤などである。本発明のRNAサイレンシング物質は、RNAサイレンシング物質のインビボ薬理学的特性を改良する化学的成分（例えば、コレステロール）を用いて修飾されてもよい。
【００９９】
本発明の所定の局面では、本発明の化学修飾されたsiRNAは、「末端修飾されたsiRNA」である。つまり、siRNAは、センスおよび/またはアンチセンス鎖の3'末端および5'末端の一方または両方で修飾される。所定の態様では、化学修飾されたsiRNAは、センス/アンチセンス鎖の両方の3'末端および5'末端の両方で修飾される。一部の態様では、センスおよび/またはアンチセンス鎖の3'末端および/または5'末端は、1つの末端に付き2または3または4つの修飾されたヌクレオチドが（例えば、5〜7末端ヌクレオチド内、例えばデュープレックス内に）組み入れられるように末端修飾される。一部の態様では、センスおよび/またはアンチセンス鎖の3'末端および/または5'末端は、1つの末端に付き2または3または4つの2'-フルオロヌクレオチド、例えば2'-フルオロシチジンおよび/または2'フルオロウラシルが（例えば、5〜7末端ヌクレオチド内、例えばデュープレックス内）に組み入れられるように末端修飾される。一部の態様では、センスおよび/またはアンチセンス鎖の3'末端および/または5'末端は、1つの末端に付き2または3または4つのヌクレオチド間結合が（例えば、5〜7末端ヌクレオチド間、例えばデュープレックス内の）ホスホロチオエート結合であるように末端修飾される。一部の態様では、修飾は、本明細書に記載した修飾のいずれかを包含している。他の態様では、修飾は、ホスホロチオエート結合を包含している。さらに他の態様では、修飾は、2'-糖修飾を包含している。さらに他の態様では、修飾は、2'-フルオロヌクレオチド修飾を包含している。さらに他の態様では、修飾は、ホスホロチオエート結合および2'-フルオロヌクレオチド修飾の両方を包含している。
【０１００】
他の局面では、RNAサイレンシング物質は、各々が参照により本明細書に組み入れられる当技術分野において記載された方法（Amarzguioui et. al., Nuc. Acids. Res.,（2003） 31: 589-95; Chiu and Rana, RNA, （2003）, 9: 1034-48; Chiu and Rana, Mol. Cell., （2002）, 10: 549-61）; Morrissey et al., Nat. Biotech., （2005）, 23: 2002-7参照）によって修飾することができる。1つの態様では、RNAサイレンシング物質は、脂肪親和性成分と共役結合されてよい。1つの態様では、脂肪親和性成分は、カチオン性基を包含するリガンドである。また別の態様では、脂肪親和性成分は、siRNAの一方または両方の鎖に付着させられる。好ましい態様では、脂肪親和性成分は、siRNAのセンス鎖の一端に付着させられる。また別の好ましい態様では、脂肪親和性成分は、センス鎖の3'末端に付着させられる。所定の態様では、脂肪親和性成分は、コレステロール、ビタミンE、ビタミンK、ビタミンA、葉酸、またはカチオン性色素（例えば、Cy3）からなる群より選択される。好ましい態様では、脂肪親和性成分は、コレステロールである。他の脂肪親和性成分は、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-（オレオイル）リトコール酸、O3-（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンを包含している。一部の態様では、本発明のRNAサイレンシング物質は、さらに核局在性/核ターゲティングシグナルを含有していてよい。そのような修飾は、本明細書に記載した他の修飾の任意の組み合わせから排他的に、またはそれらに加えて作製することができる。核ターゲティングシグナルは、例えば、NLSシグナル配列ペプチドを包含する、分子への核局在化を実施できる任意の当技術分野で認識されたシグナルを包含している。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドRNAサイレンシング物質は、酵素的に、または部分/完全有機合成によって生成することができる。1つの態様では、RNAサイレンシング物質、例えばsiRNAは、化学的に調製される。RNAおよびDNA分子を合成する方法は当技術分野において公知であり、詳細にはVerma and Eckstein （1998） Annul Rev. Biochem. 67:99-134に記載された化学合成法である。RNAは、溶媒もしくは樹脂を用いた抽出、沈降法、電気泳動法、クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせによって混合物から精製できる。または、RNAは、サンプル処理に起因する損失を回避するために精製を行わずに、または最小限の精製を行って使用できる。または、RNA分子、例えばRNAサイレンシングオリゴヌクレオチドは、さらにまた合成DNA鋳型から、または組換え細菌から単離されたDNAプラスミドからの酵素的転写によって調製することもできる。典型的には、例えばT7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼなどのファージRNAポリメラーゼが使用される（Milligan and Uhlenbeck （1989） Methods Enzymol. 180:51-62参照）。RNAは、貯蔵のために乾燥させる、または水溶液中に溶解させることができる。この溶液は、アニーリングを阻害するため、および/または単一鎖の安定化を促進するために緩衝液または塩を含有していてよい。
【０１０２】
1つの態様では、siRNAは、インビボ、インサイチュー、またはインビトロのいずれかで合成される。細胞の内因性RNAポリメラーゼは、インビボまたはインサイチューでの転写を媒介できる、またはクローン化RNAポリメラーゼは、インビボまたはインビトロでの転写のために使用できる。インビボでの導入遺伝子または発現構築物からの転写のために、調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライス供与体および受容体、ポリアデニル化）はsiRNAを転写させるために使用できる。阻害は、器官、組織、または細胞タイプ内での特異的転写;環境条件（例えば、感染、ストレス、温度、化学誘導物質）の刺激;および/または発達段階もしくは年齢での遺伝子組換え転写による標的とすることができる。組換え構築体からのsiRNAを発現するトランスジェニック生物は、構築物を接合体、胚幹細胞、または適切な生物由来の他の多能性細胞内に導入することによって生成できる。標的および任意の他の調査対象のRNAおよびタンパク質の発現レベルは、非転写核酸、および転写核酸もしくはタンパク質の発現を検出するために極めて様々な周知の方法のいずれかによって評価することができる。そのような方法の非限定的例には、PCR産物のサイズ分離がその後に続くRNAのRT-PCR、核酸ハイブリダイゼーション法、例えばノーザンブロットおよび/または核酸アレイの使用;核酸増幅法;タンパク質を検出するための免疫学的方法;タンパク質精製方法;ならびにタンパク質機能もしくは活性アッセイが包含される。
【０１０３】
RNA発現レベルは、細胞、組織または生物からmRNA/cDNA（すなわち、転写ポリヌクレオチド）を調製する工程と、mRNA/cDNAを、アッセイされる核酸、またはそのフラグメントの相補体である参照ポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズする工程とによって評価することができる。cDNAは、任意で、相補的ポリヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションに先行して様々なポリメラーゼ連鎖反応もしくはインビトロ転写法のいずれかを用いて増幅させることができる;好ましくは、cDNAは、増幅されない。一つまたは複数の転写産物の発現は、前記転写産物の発現レベルを評価するために定量的PCRを用いて検出することもできる。
【０１０４】
C.他の核酸分子
他の態様では、本発明の組成物において使用される核酸分子は、RNAサイレンシング物質以外の核酸分子である。所定の態様では、前記核酸分子は、上記で考察した化学的修飾のいずれかを含んでいてよい。
【０１０５】
i.アンチセンスオリゴヌクレオチド
1つの態様では、本発明において使用される核酸分子は、標的mRNAもしくは前記mRNAの一部分に相補的であるアンチセンス核酸分子、または前記アンチセンス核酸分子をコードする組換え発現ベクターである。アンチセンス核酸分子は、一般には、一つまたは複数のヌクレオチドアナログを含んでいてよい一本鎖DNA、RNA、またはDNA/RNA分子である。細胞内の特定タンパク質の発現をダウンレギュレートするためのアンチセンス核酸の使用は、当技術分野において周知である（例えば、Weintraub, H. et al, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1（1） 1986; Askari, F.K. and McDonnell, W.M. （1996） N. Eng. J. Med. 334:316-318; Bennett, M.R. and Schwartz, S.M. （1995） Circulation 92:1981-1993; Mercola, D. and Cohen, J.S. （1995） Cancer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, J.J. （1995） Br. Med. Bull. 51:217-225; Wagner, R.W. （1994） Nature 372:333-335参照）。アンチセンス核酸分子は、標的mRNA配列に相補的であり、したがってmRNAに水素結合することのできるヌクレオチド配列を含んでいる。mRNAの配列に相補的なアンチセンス配列は、mRNAのコーディング領域、mRNAの5'もしくは3'未翻訳領域またはコーディング領域および未翻訳領域を架橋する領域（例えば、5'未翻訳領域およびコーディング領域の結合部）内で見いだされた配列に相補的であってよい。好ましくは、アンチセンス核酸は、mRNAの3'未翻訳領域内の開始コドンに先行する、またはその全域に及ぶ領域に相補的であるように設計される。
【０１０６】
標的mRNAの公知のヌクレオチド配列を前提にすると、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック（Watson and Crick）塩基対合の法則にしたがって設計できる。アンチセンス核酸分子は、mRNAの全コーディング領域に相補的であってよいが、より好ましくは、mRNAのコーディングまたは非コーディング領域の一部分にのみアンチセンスである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的mRNAの翻訳開始部位を取り囲んでいる領域に相補的であってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、100、500、1,000ヌクレオチドまたはそれ以上であってよい。一部の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とされるmRNAの長さと同じ長さであってよい、またはより長くてよい。
【０１０７】
本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野において公知の方法を使用して、化学合成および酵素的ライゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然型ヌクレオチド、もしくは分子の生物学的安定性を増加させるため、またはアンチセンスおよびセンス核酸の間で形成されたデュープレックスの物理的安定性を増加させるために設計された、様々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用できる。アンチセンス核酸を生成するために使用できる修飾されたヌクレオチドの例は、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキトシン、プソイドウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、および2,6-ジアミノプリンを包含している。細胞内での発現を阻害するためには、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用できる。
【０１０８】
または、アンチセンス核酸は、その中にアンチセンス方向でcDNAの全部または一部分がサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に生成することができる（すなわち、挿入された核酸から転写された核酸は、関心対象の標的核酸に対してアンチセンス方向にある）。関心対象の細胞内でのアンチセンスRNA分子の発現を指令するアンチセンス方向でクローン化された核酸へ機能的に連結した調節配列を選択することができ、例えば、アンチセンスRNAの構成的、組織特異的または誘導性発現を指令するプロモーターおよび/またはエンハンサーまたはその他の調節配列を選択できる。アンチセンス発現ベクターは、cDNA（またはその部分）がアンチセンス方向でベクター内へクローン化されることを除いて、組換え発現ベクターを構築するための標準組換えDNA法にしたがって調製される。アンチセンス発現ベクターは、例えば、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態にあってよい。アンチセンス発現ベクターは、標準トランスフェクション技術を用いて細胞内に導入することができる。
【０１０９】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、それらがタンパク質をコードする細胞mRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズする、またはそれと結合し、それによって例えば転写および/または翻訳を阻害することによってタンパク質の発現を阻害するように被験者に投与される、またはインサイチューで生成される。ハイブリダイゼーションは、従来のヌクレオチド相補性によって安定性デュープレックスを形成することができ、また、例えば、DNAデュープレックスに結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二本鎖らせんの主溝内での特異的相互作用を通して、安定性デュープレックスを形成することができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位での直接注射を包含している。または、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするために修飾し、その後に全身性投与することができる。例えば、全身性投与のためには、アンチセンス分子は、それが選択された細胞表面上で発現する受容体もしくは抗原に、例えば細胞表面受容体もしくは抗原に結合するペプチドまたは抗体へアンチセンス核酸分子を連結させることによって特異的に結合するように修飾することができる。アンチセンス核酸分子は、さらにまた本明細書に記載したベクターを用いて細胞に送達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が好ましい。
【０１１０】
1つの特定の態様では、上述したRNAサイレンシング物質（例えば、miRNA分子）の一つまたは複数に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用できる。前記抗miRNAオリゴヌクレオチドは、DNAもしくはRNAオリゴヌクレオチドであってよい、またはそれらはリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドもしくはそれらのアナログの両方から構成されてよい。好ましい態様では、前記抗miRNAオリゴヌクレオチドは、一つまたは複数（例えば、実質的に全部）の2'O-メチルリボヌクレオチドを含んでいる。そのような分子はmiRNA媒介性サイレンシングの強力かつ不可逆性阻害剤であり、このためインビトロおよびインビボ両方のRNAサイレンシング変調のために有用である。インビボ方法は、一般的RNAサイレンシング調節目的ならびにRNAサイレンシング変調（例えば、阻害）が望ましい治療用途の両方のために有用である。例えば、インスリン分泌は、少なくとも1つのmiRNAによって調節されることは証明されており（Poy et al. 2004参照）、miRNAについての役割もまた、脊髄性筋萎縮症において関係付けられてきた（SMA; Mourelatos et al. 2002参照）。
【０１１１】
ii.α-アノマー核酸分子
さらに別の態様では、本発明で使用される核酸分子は、α-アノマー核酸分子である。α-アノマー核酸分子は、通常β-単位とは反対に、鎖が相互に平行に走っている相補的RNAとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Gaultier et al. （1987） Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641参照）。そのような核酸分子は、さらにまた2'-o-メチルリボヌクレオチド（Inoue et al. （1987） Nucleic Acids Res. 15:6131-6148参照）またはキメラRNA-DNAアナログ（Inoue et al. （1987） FEBS Lett. 215:327-330参照）を含むことができる。
【０１１２】
iii.リボザイム
さらに別の態様では、本発明で使用される核酸分子は、リボザイムである。リボザイムは、広範囲に及ぶ二次構造を有し、それに対してそれらが相補的領域を有するmRNAなどの一本鎖核酸を本質的に切断できる触媒性RNA分子である。そこで、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Haselhoff and Gerlach （1988） Nature 334:585-591に記載されている）を使用すると、それによりmRNAの翻訳を阻害するためにmRNA転写産物を触媒的に切断することができる。例えばRCK（またはRCKオルソログまたはRCKインターアクター）をコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、cDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計できる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が標的mRNA内で切断対象のヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナ（Tetrahymena）L-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる。例えば、Cech et al.、米国特許第4,987,071号およびCech et al.、米国特許第5,116,742号参照。または、標的mRNAを使用すると、RNA分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAを選択することができる。例えば、Bartel, D. and Szostak, J.W. （1993） Science 261:1411-1418参照。
【０１１３】
iv.三重らせん分子
または、遺伝子発現は、標的細胞内の遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成するために標的遺伝子の調節領域に相補的なヌクレオチド配列をターゲティングすることによって阻害できる。一般には、Helene, C. （1991） Anticancer Drug Des. 6（6）:569-84; Helene, C. et al. （1992） Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; and Maher, L.J. （1992） Bioassays 14（12）:807-15参照。
【０１１４】
v.核酸ベクター
他の態様では、本発明の核酸分子は、ベクター、例えば遺伝子産物（またはその部分、例えばタンパク質）をコードする核酸またはRNAサイレンシング物質もしくは上記で考察した任意の他の核酸を含有する発現ベクターである。本明細書において使用する用語「ベクター」は、それに連結しているまた別の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味する。ベクターの1つのタイプは、その中に追加のDNAセグメントをライゲートできる環状二本鎖DNAループを意味する「プラスミド」である。ベクターのまた別のタイプは、追加のDNAセグメントをウイルスゲノム内にライゲートすることのできるウイルスベクターである。所定のベクターは、その中にそれらが導入される宿主細胞内での自律複製をすることができる（例えば、細菌複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内への導入後に宿主細胞のゲノム内に統合され、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、所定のベクターは、それにそれらが機能的に連結している遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、互換的に使用できる。しかし、本発明は、同等の機能を保存している例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルス）などの発現ベクターの他の形態を包含することが意図されている。
【０１１５】
所定の局面では、本発明のベクターは、上述したRNAサイレンシング物質、例えば短鎖ヘアピンRNA（shRNA）をコードする。shRNAの転写は、ポリメラーゼIII（pol III）プロモーターで開始され、4-5-チミン転写終結部位の第2位で終結すると考えられている。発現後には、shRNAは3'UU-オーバーハングを備えるステムループ構造に折り畳まれると考えられている;引き続いて、これらのshRNAの末端は処理され、shRNAが約21ヌクレオチドのsiRNA様分子に変換される。Brummelkamp et al. （2002）, Science, 296, 550-553; Lee et al, （2002）、上記; Miyagishi and Taira （2002）, Nature Biotechnol., 20, 497-500; Paddison et al. （2002）、上記; Paul （2002）、上記; Sui （2002）、上記; Yu et al. （2002）、上記参照。そのような発現構築物は、一つまたは複数の誘導性プロモーター、例えばU6 snRNAプロモーターもしくはH1 RNA ポリメラーゼIIIプロモーターなどのRNA Pol IIIプロモーター系、または当技術分野において公知の他のプロモーターを包含することができる。これらの構築物は、RNAサイレンシング物質の一方または両方の鎖を包含することができる。両方の鎖を発現する発現構築物は、さらに両方の鎖を連結するループ構造を包含することができる、または各々の鎖は同一構築物内の別個のプロモーターから個別に転写させることができる。各鎖は、さらにまた別個の発現構築物から転写させることができる。Tuschl （2002）、上記参照。
【０１１６】
III.酵母細胞壁粒子
A.酵母グルカン粒子および酵母グルカン-マンナン粒子
手短には、グルカン粒子（GP）を生成するプロセスは、酵母または真菌細胞壁からのアルカリ不溶性グルカン粒子の抽出および精製を伴っている。グルカン粒子調製の構造-機能特性は、それが入手される起源、および最終生成物の純度に直接的に左右される。グルカン粒子の起源は酵母もしくはその他の真菌、または本明細書に記載した特性を有するグルカンを含有する任意の他の起源であってよい。所定の態様では、酵母細胞は、グルカンの好ましい起源である。本発明のプロセスで使用される酵母菌株は、例えば、S.セレビジエ（cerevisiae）、S.デルブリュッキイ（delbrueckii）、S.ロゼイ（rosei）、S.ミクロエリプソデス（microellipsodes）、S.カールスベルゲンシス（carlsbergensis）、S.ビスポラス（bisporus）、S.フェルメンタチ（fermentati）、S.ロウキシイ（rouxii）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ポリスポラス（Kluyveromyces polysporus）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、C.クロアカエ（cloacae）、C.トロピカリス（tropicalis）、C.ユチリス（utilis）、ハンセヌラ・ウィンゲイ（Hansenula wingei）、H.アルニ（arni）、H.ヘンリチイ（henricii）、H.アメリカーナ（americana）、H.カナディエンシス（canadiensis）、H.カプスラータ（capsulata）、H.ポリモルファ（polymorpha）、ピチア・クルイベリ（Pichia kluyveri）、P.パストリス（pastoris）、P.ポリモルファ（polymorpha）、P.ローダネシス（rhodanensis）、P.オーメリ（ohmeri）、トルロプシス・ボビン（Torulopsis bovin）、およびT.グラブラタ（glabrata）を包含する、酵母の任意の菌株であってよい。または、変異体酵母菌株を使用できる。
【０１１７】
酵母細胞は、当技術分野において公知の方法によって生成できる。典型的な増殖培地は、例えば、グルコース、ペプトンおよび酵母抽出物を含んでいる。酵母細胞は、典型的には液体培地からバイオマスを分離するために適用される方法によって、増殖培地から採取して分離することができる。そのような方法は、典型的には、例えば濾過または遠心分離などの固液分離プロセスを使用する。本発明のプロセスでは、細胞は、好ましくは、酵母細胞内のグリコーゲンおよびキチンの量を最小限に抑えるために、中期から後期の対数増殖期において採取される。グリコーゲン、キチンおよびタンパク質は、グルカン粒子の生物学的および流体力学的特性に影響を及ぼす望ましくない汚染物質である。
【０１１８】
グルカン粒子の調製は、酵母の一部分を溶解させ、主としてβ（1,6）およびβ（1,3）結合を有する水酸化アルカリ不溶性グルカン粒子を形成するために適切な濃度にあるアルカリ水溶液で酵母を処理する工程を伴っている。一般に使用されるアルカリは、例えば水酸化ナトリウムもしくはカリウムなどのアルカリ金属水酸化物または同等物である。出発材料は、増殖培地から分離された酵母を含むことができる。
【０１１９】
処理する工程は、水酸化物水溶液中で酵母を抽出することによって実施される。細胞の細胞内成分、および任意で、マンナン部分は、水酸化物水溶液中に可溶化され、実質的にタンパク質を含んでおらず、実質的に未変化のβ（1,6）およびβ（1,3）結合グルカンを有する不溶性細胞壁材料が残される。細胞内構成要素は、加水分解されて可溶性相内に放出される。消化の条件は、少なくとも細胞の主要部分において、細胞壁の三次元マトリックス構造は破壊されないような条件である。特別の状況では、実質的に全部の細胞壁グルカンは、未変化で完全なままとなる。
【０１２０】
所定の態様では、水性水酸化物消化工程は、約0.1〜約10.0の初期規定度を有する水酸化物溶液中で実施される。好ましい水酸化物水溶液は、水酸化ナトリウムである。消化は、約20℃〜約121℃、例えば約70℃〜約100℃の温度で実施することができ、温度が低いほど長い消化時間が必要になる。水酸化ナトリウムが水性水酸化物として使用される場合は、温度は、約70℃、80℃、90℃または約100℃であってよく、溶液は約0.75〜約1.5の初期規定度を有する。
【０１２１】
一般に水酸化物溶液1L（リットル）につき約10〜約500gの乾燥酵母が使用される。所定の態様では、水性水酸化物消化工程は、連続の接触させる工程によって実施され、それによって、例えばタンパク質などの残留汚染物質の量が、接触させる工程が1回しか利用されない場合よりも少なくなるように実施される。所定の態様では、実質的に大部分の量のタンパク質材料を、細胞から除去することが望ましい。追加の抽出工程は、好ましくは約2.0〜約6.0のpHを有する弱酸性溶液中で実施される。典型的な弱酸性溶液は、塩酸、塩酸および酢酸緩衝液を用いて必要なpHに調整された塩化ナトリウムを包含している。その他の典型的な弱酸性溶液は、適切な緩衝液中の硫酸および酢酸である。この抽出工程は、好ましくは約20℃〜約100℃の温度で実施される。消化されたグルカン粒子は、必要であれば、または所望であれば、タンパク質および汚染物質レベルを低下させるために、さらに洗浄および抽出を受けさせることができる。処理後、生成物のpHは、約6.0〜約7.8の範囲に調製することができる。
【０１２２】
グルカン粒子は、必要に応じて、さらに処理および/またはさらに精製することができる。例えば、グルカンは微細粉末へ（例えば、オーブン内での乾燥によって）乾燥させることができる;または任意の痕跡もしくは有機溶解性材料を除去するために有機溶媒（例えば、アルコール、エーテル、アセトン、メチルエチルケトン、クロロホルム）を用いて処理できる、または存在する可能性がある追加のタンパク質もしくはその他の不純物を除去するために水酸化物溶液を用いて再処理することができる。
【０１２３】
例示的な方法では、約100gの酵母、例えばパン酵母を約1Lの1M NaOH中に懸濁させ、約1時間にわたり約80℃へ加熱する。遠心分離後、不溶性材料は約1Lの水に懸濁させ、pHはHClを用いて約4〜5へ調整し、約1時間にわたり約55℃でインキュベートする。水および溶媒による洗浄は、約1〜5回実施できる。
【０１２４】
B.酵母細胞壁粒子成分
新規な分子送達系は、酵母細胞壁粒子（YCWP）の使用に基づいて開発されてきた。YCWPは、主としてβ1,3-D-グルカン、キチン、およびマンノプロテインから構成される酵母、例えば、パン酵母から調製された中空および多孔性の2〜4μのミクロスフェアである。YCWPは、細胞へ関心対象の分子を送達するために使用できる。酵母細胞壁粒子から構成されるペイロードは、核酸、タンパク質、薬物分子、ホルモン、または細胞へ送達することが望ましい広範囲の様々な分子種のいずれか1つであってよい。一部の態様では、この封入系は、全身性もしくは経口投与、効率的な細胞内核酸送達および放出、ならびに遺伝子発現のいずれかを提供するためにYCWP内に閉じ込められた高分子電解質-核酸ナノ粒子を組み入れている。YCWP封入高分子電解質ナノ粒子の形成は、静電相互作用を通して組み立てられる様々な成分を用いて、レイヤー・バイ・レイヤー（LbL）アプローチにしたがう。一部の態様では、本発明とともに使用するための核酸ペイロード物質は、DNAおよびRNAを包含している。一部の態様では、YCWP内に包含されたRNAは、RNAi物質であり、siRNAであってよい。本明細書において使用する用語「RNAi物質」は、RNAi経路によってRNAをサイレンシングする任意のアニオン性ポリマーを意味する。一部の態様では、ペイロードは、細胞へのその送達が望ましい様々な分子の混合物を含んでいる。
【０１２５】
頑丈な送達系は、追加の成分から構成されるナノ複合体の形成によって作製できる。これは、コロイド粒子を作製するために様々な鋳型上への核酸およびカチオン性ポリマーのレイヤー・バイ・レイヤー（LbL）沈着によって証明することができる。例えば、シリカ、ポリスチレンもしくは金ナノ粒子および生物学的材料は、様々な合成ポリマーおよびバイオポリマーと組み合わせて鋳型として使用できる。これらの多層被覆粒子は、2種の方法によって、例えば核酸および酵素などの生物学的材料の多機能担体として機能することができる。1つのアプローチは、多層構造の一部として送達材料を組み入れることであってよい。第2方法は、残留する中空高分子電解質シェルの内側に材料を封入するための除去可能なコアを利用することである。どちらの方法も、細胞内で発生する高分子電解質層の効率的なデフォリエーション（defoliation）を利用する。
【０１２６】
本発明の態様は、一つまたは複数の要素を含むナノ粒子を含有するYCWPを特徴とする。YCWPによって封入された本発明のナノ粒子は、捕捉物質および関心対象のペイロード分子を包含することができる。本発明のナノ粒子の追加の要素は、ナノ粒子のコア要素を包含することができる。好ましい態様では、ナノ粒子は例えばtRNAまたはスクランブルRNAなどの不活性核酸を含むコア、および捕捉物質の周囲に形成される。他の例示的なコア成分には、アニオン性多糖類、タンパク質、合成ポリマーおよび無機マトリックスが包含されるがそれらに限定されない。例示的な捕捉物質はカチオン性物質であり、カチオン性多糖類、タンパク質および合成ポリマーを包含できるが、それらに限定されない。
【０１２７】
静電相互作用によって共に保持される材料のレイヤー・バイ・レイヤー（LbL）自己組立ては、遺伝子療法において潜在的用途を備えるナノ材料を作製するための簡便な方法である。本発明の一部の態様は、多層構造を含むYCWPを特徴とする。平面2Dまたは3D表面上のLbL構造の特性解析は様々な技術によって可能であるが、これらの技術の大部分は、YCWPの内部の多層構造を特性付けることには適応しない。YCWP内のYCWP封入高分子電解質ナノプレックス形成の定量的特性解析は、YCWP内でこれらの複合体を調製するための実験条件を最適化するために蛍光マーカーを用いて多層状ナノ複合体の各層を選択的に標識することによって取り組むことができる。本発明の態様は、例えば細胞内へトランスフェクトするための核酸を調製するために使用される物質などのカチオン性物質であってよいペイロードのための捕捉分子;tRNAなどの不活性核酸;および/または例えばDNAおよび/またはRNAなどの核酸、タンパク質、例えば色素分子および/または他の分子などの追跡分子または細胞に送達するために望ましい分子種であってよいペイロード分子を含む層を特徴とする。
【０１２８】
YCWP内の様々な層の評価は、定性的蛍光顕微鏡および定量的蛍光分光法およびフローサイトメトリーによって特性付けた。以下の実施例のセクションから明らかなように、一部の態様では、YCWP内で合成されたナノ粒子のレイヤー・バイ・レイヤー形成および特性解析について哺乳動物細胞トランスフェクションのためのこの核酸送達系を最適化をもたらす方法として記載する。
【０１２９】
本発明の態様は、ペイロード捕捉分子を含むナノ複合体およびナノ粒子を特徴とする。一部の態様では、捕捉分子は、例えばカチオン性ポリマーなどのカチオンである。1つの効果的な合成カチオン性ポリマーは、遺伝子送達のために使用されてきた市販の化合物であるポリエチレンイミン（PEI）である。本発明の一部の態様は、アニオン性核酸の効率的凝縮を可能にする高い正荷電を有するPEIを利用する。アミン（生理的pHでは15〜20％しかプロトン化されない）の存在は、エンドソームDNA放出を媒介すると考えられ、その高いDNAトランスフェクション活性の原因であるプロトン-スポンジ機序に寄与する。一部の態様は、ナノ複合体およびナノ粒子の作製および/または機能を促進する戦略および/または構成成分を特徴とする。トランスフェクション効率を増強すると以前に報告された他の戦略は、例えばEndoPorter（商標）などのPEI、およびデフォリエーションおよびエンドソームDNA放出を促進するためのDNA層内のヒアルロン酸、ならびにDNA核取込みを増強するために核局在化シグナルを含有するカチオン性ペプチドであるペネトラチン（Penetratin）に加えてコポリマーを使用した。
【０１３０】
しかし、PEIの使用は、その毒性によって制限される可能性がある。PEIの毒性は、任意の未結合PEIを除去するためにPEI被覆YCWP閉じ込めナノプレックス/ナノ粒子を洗浄することによって低下させることができる。または、例えば、洗浄の代わりに低比率のPEIを使用することができる。幾つかの試験は、PEIより減少した毒性および高い遺伝子送達効率の利点を備える遺伝子送達ベクターとして他の潜在的に有用なカチオン性ポリマーを同定してきた。例えば、PEIの毒性は、アミン基、または生分解性エステル単位から構築されたポリマーの部分アセチル化によって大きく低下させることができる。一部の態様は、例えば2つ以上のカチオン性物質などの1つより多い捕捉物質を利用する。本発明の一部の態様は、PEIの同時使用を伴って、または伴わずに、一つまたは複数の非PEIカチオン性物質を利用するナノ粒子/ナノ複合体を特徴とする。
【０１３１】
ペイロード捕捉分子は、好ましくは薬学的に許容される賦形剤である。ペイロードおよび捕捉分子は、どちらも1つの溶媒系内に可溶性である。ペイロードおよび捕捉分子は、好ましくは水溶性である。好ましい態様では、捕捉分子は、生分解性である。
【０１３２】
本発明の態様は、それによってペイロードが捕捉分子に組み入れられる様々な機序を特徴とする。所定のペイロードとの捕捉反応の作用機序は、ペイロード捕捉分子の選択を指令する。静電相互反応のためには、ペイロードの反対荷電の荷電ペイロード捕捉分子が好ましい。物理的捕捉のためには、ペイロード捕捉分子は、ペイロードの核酸を減少させるマトリックスの形成に適切に関与する。他の態様では、ペイロード捕捉分子は、ペイロードの滞留に寄与する疎水性結合特性に関与する。また別の態様では、ペイロード捕捉分子は、ペイロードに選択的に結合し、ペイロードの滞留に寄与する親和性相互作用を提供する。
【０１３３】
一般に、高分子電解質は、適切なペイロード捕捉分子であってよい。数種の適切な高分子電解質は、米国特許第6,133,229号に開示されている。一部の態様では、高分子電解質は、カチオン性またはアニオン性高分子電解質であってよい。両親媒性高分子電解質もまた使用できる。カチオン性高分子電解質は、好ましくは分子鎖に沿って分布したカチオン性基を備えるポリマーである。所定の態様では第4級アンモニウム由来成分を包含していてよいカチオン性基は、前記鎖から吊り下がった側鎖機内に配置されてよい、またはその中に組み入れられてよい。カチオン性高分子電解質の例には:ビニルピロリドンおよび第4級メチルメタクリレートのコポリマー、例えばISP社から入手したGAFQUAT.RTM..シリーズ（755N、734、HS-100）;置換ポリアクリルアミド;ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミンおよび置換誘導体;ポリアミンホモポリマー（GOLCHEM.RTM. CL118）;ポリアミンコポリマー（例えば、エピクロロヒドリンおよびモノまたはジメチルアミンの凝縮物）;ポリジアリルジメチル塩化アンモニウム（polyDADMAC）;置換デキストラン;修飾グアーガム（ヒドロキシプロピルトリモニウムクロリドで置換された）;置換タンパク質（例えば、ダイズタンパク質および加水分解コラーゲン上で置換された第4級基）;ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン）;低分子量ポリアミノ化合物（例えば、スペルミンおよびスペルミジン）が包含される。天然もしくは人工ポリマーを使用できる。150〜5,000,000、好ましくは5,000〜500,000、より好ましくは5,000〜100,000のMW（分子量）を備えるカチオン性高分子電解質が使用されてよい。0.01〜10％の量が好ましく、より好ましくは0.1〜2％（w/v）、特別には0.05〜5％である。
【０１３４】
アニオン性高分子電解質は、好ましくは分子鎖に沿って分布したアニオン性基を備えるポリマーである。カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩または他の負電荷イオン化可能な基を包含していてよいアニオン性基は、鎖から吊り下がっている、またはポリマー主鎖へ直接的に結合している基の上に配置されてよい。天然もしくは人工ポリマーを使用できる。
【０１３５】
アニオン性高分子電解質の例には:メチルビニルエーテルおよびマレイン酸無水物のコポリマー、メチルビニルエーテルおよびマレイン酸のコポリマー（各々Gantrez ANシリーズおよびS-シリーズ、International Specialty Products社（ニュージャージー州ウェーン））;アルギン酸および塩類;カルボキシメチルセルロースおよび塩類;置換ポリアクリルアミド（例えば、カルボン酸基で置換された）;ポリアクリル酸および塩類;ポリスチレンスルホン酸および塩類;硫酸デキストラン類;置換糖類、例えばスクロースオクトスルフェート;ヘパリンが包含される。150〜5,000,000、好ましくは5,000〜500,000、より好ましくは5,000〜100,000のMWを備えるアニオン性高分子電解質が使用されてよい。0.01〜10％の量が好ましく、特別には0.05〜5％、より特別には0.1〜2％（w/v）である。
【０１３６】
多糖類などの生物学的ポリマーは、好ましい捕捉ポリマーである。好ましくは、ポリマーは、100,000Da（ダルトン）未満の平均分子量へ処理される。ポリマーは、好ましくは、カチオン性またはアニオン性特性を提供するために誘導体化される。適切な多糖類には、キトサン（脱アセチル化キチン）、アルギネート、例えば2-（ジエチルアミノ）エチルエーテルデキストラン（DEAE-デキストラン）および硫酸デキストランなどのデキストラン類、キサンタン、ローカスト・ビーン・ガムおよびグアーガムが包含される。
【０１３７】
カチオン性分子の2つの一般的クラスは、例えばポリヌクレオチド、カチオン性ポリマーおよび所定のカチオン性脂質などの負電荷ペイロードを備える捕捉分子として使用するために適合する。
【０１３８】
タンパク質［例えば、ヒストン類（Fritz, J.D., et al, （1996） Hum. Gene Ther. 7, 1395-1404参照）および高移動度基（HMG）タンパク質（Mistry A.R., et al. （1997） BioTechniques 22, 718-729参照）］ならびにポリペプチド類［例えばポリリシン（Wu, G.Y. & Wu, C.H. （1987） J. Biol. Chem. 262, 4429-4432, Wagner, E., et al., （1991） Bioconjugate Chem. 2, 226-231参照）、短鎖合成ペプチド類（Gottschalk, S., et al., （1996） Gene Ther. 3, 448-457; Wadhwa, M.S., et al., （1997） Bioconjugate Chem. 8, 81-88参照）、およびらせん形両親媒性ペプチド（Legendre, J.Y., et al., （1997） Bioconjugate Chem. 8, 57-63; Wyman, T.B., et al., （1997） Biochemistry 36, 3008-3017）参照］から合成ポリマー［例えばポリエチレンイミン（Boussif, O., et al., （1996） Gene Ther. 3, 1074-1080）、カチオン性デンドリマー類（Tang, M.X., et al., （1996） Bioconjugate Chem. 7, 703-714; Haensler, J. et al., （1993） Bioconjugate Chem. 4, 372-379参照）、およびグルカラミドポリマー（Goldman, C.K., et al., （1997） Nat. Biotech. 15, 462-466）参照］の範囲に及ぶ広範囲のカチオン性ポリマーは、インビトロトランスフェクションを媒介することが証明されている。その他の適切なカチオン性ポリマーには、N-置換グリシンオリゴマー類（ペプトイド類）（Murphy, J.E., et al, A combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery, Proc Natl Acad. Sci. USA, 1998 95 （4） 1517-1522参照）、pDAMAと省略されるポリ（2-メチル-アクリル酸2-［（2-ジメチルアミノ）-エチル）-メチル-アミノ］-エチルエステル）、およびポリ（2-ジメチルアミノエチル）-メタクリレート（pDMAEMA）（Funhoff, A.M., et al., 2004 Biomacromolecules, 5, 32-39参照）が包含される。
【０１３９】
カチオン性脂質は、トランスフェクションのために適合することが当技術分野においても公知である。Felgner, P. Ll, et al., Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci USA. 1987 84 （21）:7413-7参照。適切なカチオン性脂質には、N-［1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、［N,N,N',N'-テトラメチル-N,N'--ビス（2-ヒドロキシエチル）-2,3-ジ（オレオイルオキシ）-1,4-ブタンジアンモニウムヨーダイド］（Promega社、米国ウィスコンシン州マディソン）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（Promega社、米国ウィスコンシン州マディソン）、N-［1-（2,3-ジオレオイルオキシ）］-N,N,N-トリメチルアンモニウムプロパンメチルスルフェート（DOTAP）、N-［1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、ジミリストレオイルホスホノメチルトリメチルアンモニウム（DMPTA）（例えば、Floch et al. 1997. Cationic phosphonolipids as non-viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molec. & Diseases 23: 69-87参照）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-（7-ニトロ-2-1,3-ベンゾキサジアゾール-4-イル）、アンモニウム塩（Avanti Polar Lipids社、米国アラバマ州アラバスター）、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパンクロリド（Avanti Polar Lipids社、米国アラバマ州アラバスター）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（Avanti Polar Lipids社、米国アラバマ州アラバスター）および1,3-ジオレイルオキシ-2-（6-カルボキシスペルミル）プロピルアミド（DOSPER）が包含される。
【０１４０】
本発明の送達系のコアおよび/または層は、他の機能を促進するコポリマーをさらに包含することができる。例えば、ペイロードのエンドソーム放出を促進するコポリマーを包含することができる。エンドソーム放出を促進する例示的なコポリマーは、Endoporterである（これにより全体として参照により本明細書に組み入れられる、Summerton JE. Ann NY Acad Sci. 1058:62-75 （2005）参照）。一部の態様では、核局在化を促進するコポリマーは、例えば、一つまたは複数のペイロード層内に包含することができる。一部の態様では、デフォリエーション動態を促進するコポリマーを包含することができる。例えば、ヒアルロン酸またはグルタミン酸は、デフォリエーション動態および/またはペイロード放出を促進するアニオン性コアポリマーとして包含することができる。追加のコポリマーには、ヘパリン硫酸などが含まれるが、それには限定されない。
【０１４１】
本発明の態様は、減少した量のペイロード捕捉分子を含むナノ複合体およびナノ粒子をさらに包含している。例えば、本発明の1つの態様では、tRNA/PEIコアを備える1×109 YCWPに付き100μgのペイロード核酸が加えられる;次に捕捉分子（例えば、PEI）は核酸/tRNA-PEIコアをコーティングするために2.5の捕捉分子/核酸比で加えられる。本発明の他の態様では、例えば、2.25、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005、0.0025または0.0001の捕捉分子/核酸比のより少量の捕捉分子が使用される。
【０１４２】
本発明の態様は、捕捉分子/層がYCWP/tRNA-PEIコア/ペイロード核酸複合体には適用されないナノ複合体およびナノ粒子をさらに包含している。追加の態様は、ペイロード分子は、tRNAを伴って、または伴わずにコア内へ直接的に組み込まれているナノ複合体およびナノ粒子を包含している。追加の態様は、エンドソーム放出（例えば、EndoPorter）を促進する化合物が包含されるナノ複合体およびナノ粒子を包含している。
【０１４３】
C.分子送達のためのYCWP
遺伝子療法の発達は、例えばsiRNAを包含するDNAおよびRNAなどの核酸物質の送達および発現および/または活性のために最適な系の設計に依存する。遺伝子送達系は、組換えウイルス、および例えばカチオン性ポリマーおよび脂質などの非ウイルスベクターに基づいて開発されてきた。本発明の態様は、核酸ペイロード物質、他の核酸および/または他のペイロード分子を細胞へ送達するための送達系としてのYCWPの使用を特徴とする。
【０１４４】
本発明の態様は、少なくとも1つのポリヌクレオチドを投与するための粒子を特徴とする。一部の態様では、一つまたは複数のポリヌクレオチドは、DNAまたはRNA、例えばcDNA、リボザイムもしくは他の触媒性RNA、siRNA、miRNA、shRNAなどであってよい。一部の態様では、本発明の粒子は、欠損（missing）遺伝子の遺伝子産物をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを投与するために使用され、該遺伝子産物の発現は、遺伝的障害またはある状態の遺伝子成分の治療において有用である。好ましい態様では、本発明の粒子は、例えば、遺伝子サイレンシングによって（例えば、RNAiによって）粒子が投与される被験者において一つまたは複数のタンパク質の活性を減少させるRNAを包含している。一部の態様では、粒子は、siRNAを包含する。好ましい態様では、siRNAを含有する粒子は、炎症性反応に関係する遺伝子のmRNAに相補的な配列を有するsiRNAを含有している。
【０１４５】
本発明の封入粒子は、コア物質および捕捉物質を含むナノ粒子コアを含んでいてよい。一部の態様では、コアは、捕捉層を有している。本発明の封入粒子は、2つ以上の層を含むナノ粒子を含んでいてよい。本発明の封入ナノ粒子は、ナノ粒子にとっての新規な層もしくは区間が作り出されるように、コアの表面に分子を加えるために適切なコア要素などの、ナノ粒子中のコア要素を包含することができる。一部の態様では、コアおよび事前にコアへ加えられた任意の層を含む、コア複合体への分子の添加は、コアの中心からさらに外側で追加の層または区間を作り出すために1回以上実施することができる。最初およびその後の層または区間は、同一組成を有していてよい、または相違する組成を有していてよい。一部の態様では、コア複合体に加えられた層または区間は、捕捉分子を含有していてよい。一部の態様では、コア複合体に加えられた層または区間は、ペイロード分子および/または核酸ペイロード物質を含むペイロード物質を含有していてよい。本発明の多層封入粒子は、捕捉層によって捕捉されたペイロード物質から本質的になる、および/またはペイロード分子、捕捉分子、および/または他の分子の混合物を含む一つまたは複数の層を有していてよい。一部の態様では、本発明のナノ粒子は、本質的に一様に共に混合された2つ以上のペイロード分子を含んでいてよい。一部の態様では、粒子の様々な別個の層は、別個のペイロード分子または一つまたは複数のペイロード分子の別個の混合物を含んでいる。
【０１４６】
本発明の態様は、酵母細胞壁成分内の多層状ナノ粒子を特徴とするが、該多層状ナノ粒子はより内部のパーツおよびより外部のパーツを有するように設計される。これらのパーツは、別個の組成物を有していてよく、これらの層の組成物は一般に一つまたは複数の構成分子種を含有していてよい。一部の態様では、多層状ナノ粒子の様々な層は、様々なペイロード分子および/または核酸ペイロード物質を含んでいる。例えば、ナノ粒子の2つの層は、別個の核酸分子を含有していてよい。一部の態様では、多層状ナノ粒子は、1つより多い捕捉分子を含んでいる。本発明の一部のナノ粒子は、2つ以上の捕捉分子を含んでおり、一部の多層状ナノ粒子は2つ以上の捕捉分子を含んでおり、該分子は粒子の別個の層または区間内で見いだされる、および/または粒子の別個の領域、層または区間内において様々な相対量で見いだされる。
【０１４７】
本発明の一部の封入ナノ粒子では、2つ以上のペイロード分子は、粒子の別個の層または区間内で見いだされる、および/または粒子の別個の領域、層または区間内において様々な相対量で見いだされる。一部の態様では、一つまたは複数のペイロード分子は一つまたは複数のペイロード分子より外部の区間もしくは層内で見いだされる、および/または一つまたは複数のペイロード分子は、一つまたは複数のペイロード分子より外部の区間もしくは層内で主として見いだされる。
【０１４８】
本発明の多層状ナノ粒子は、外層、内層または介在層内の様々なペイロードを特徴とすることができる。外層、内層および介在層は、固有のペイロード分子、固有の捕捉分子および/または他の層および/または他のナノ粒子と比較して捕捉分子、ペイロード分子またはその他の分子の別個の調製物を含んでいてよい。
【０１４９】
本発明のナノ粒子の設計は、YCWPからのペイロード放出の動態に影響を及ぼすことができる。本発明の一部の態様では、細胞と接触させられていた、もしくは細胞によって組み入れられたYCWPからの細胞内へのペイロード分子の導入の速度は、YCWPのナノ粒子の設計を調整することによって調整できる。一つまたは複数のペイロード分子が放出される相対時間および速度は、YCWP内に包含される封入ナノ粒子の構造および調製に依存する可能性がある。任意の特定の理論またはモデルによって拘束することを望まなくても、ナノ粒子の外部から、またはナノ粒子の外部またはその近くでの層もしくは区間からのペイロード分子の放出は、粒子の内部から、またはナノ粒子の中心、コアもしくはコア複合体またはその近くの層もしくは区間からのペイロード分子の放出より早く、およびより高速で発生する。一部の態様では、多層状ナノ粒子は、最初に粒子の外層を消失し、これは取り囲んでいる媒質もしくは細胞質マトリックス内に溶解もしくは分散し、層内に含有されたペイロード分子を遊離させる。外側の層または区間の放出および/または溶解は、より内側の層の粒子を取り囲んでいる媒質との接触を許容する。粒子を取り囲んでいる媒質と接触すると、より内側の層または区間からのペイロード分子の放出が始まる、または加速する。一部の態様は、ペイロード分子を伴わない介在する層または区間を特徴とする。ペイロード分子またはペイロード物質を伴わない層を特徴とする一部の態様は、本質的に捕捉分子または物質からなる層または区間を特徴とする。外層に内層が続く連続的消失は、粒子のデフォリエーション・プロセスの一部であり、粒子のレイヤー・バイ・レイヤー構築を逆の順序で再現している。一般に、外層内で見いだされるペイロード分子は、内層内で見いだされるペイロード分子より早く、高速で放出される。本発明のこの特徴は、例えば、複数のペイロードを送達する場合に利用できる。例えば、急性作用のために適合する治療用ペイロードは外層内に調製することができ、慢性作用のために適合する治療用ペイロードは、内層および/またはペイロードコア内に調製することができる。デフォリエーションのプロセスは、本発明の封入ナノ粒子送達系を相互に相違する回数および/または速度で2つ以上のペイロード分子を送達することを許容する。一部の態様では、2つ以上のペイロード分子または物質は、同一の回数および速度で、または類似の回数および速度で放出される。一部の態様では、コアは、例えば適切な環境信号があると爆発してそれらが高速でペイロードを放出するように設計することができる。
【０１５０】
本発明の一部の態様は、別個の層または区間内に一つまたは複数のペイロード分子を備えて設計されたナノ粒子を特徴とする。これは、相互に相違する回数および/または速度で一つまたは複数のペイロード分子の放出を許容する。本発明のナノ粒子内に組み入れられた各ペイロード分子は、その独自の動態放出プロファイルを有することができる。一つまたは複数のペイロード分子は、放出動態プロファイルを共有することができる。一部の態様では、ナノ粒子は、一つまたは複数のペイロード分子または物質が、粒子内の他のペイロード分子または物質より早く、または高速で放出されるように設計される。一部の態様では、ナノ粒子は、一つまたは複数のペイロード分子または物質が、同一YCWP内の他のナノ粒子からの、または他のYCWP内の他の粒子からのペイロード分子または物質より早く、または高速で放出されるように設計される。
【０１５１】
好ましい態様では、グルカン粒子は、パン酵母から、精製された多孔性2〜4ミクロンの中空β1,3-D-グルカン粒子を産生する外側細胞壁および細胞内成分を加水分解する一連のアルカリおよび溶媒抽出によって精製される（図1c）。中空グルカン粒子は次に、グルカンシェルを追跡するためにフルオレセインで標識される。カチオン性コアは、粒子を部分的に膨潤させるために半飽和量の酵母tRNAを吸収させ、その後に蛍光グルカンシェル内の相が明確な構造によって証明される封入複合化カチオン性コアを形成するために過剰のポリエチレンイミン（PEI）との反応によってグルカンシェルの内側で合成される。次にレイヤー・バイ・レイヤー合成法を使用すると、アニオン性Dy547標識siRNAをコアのカチオン性表面上に吸収させ、その後に一番右下上の共焦点顕微鏡画像において蛍光グルカンシェル（緑色）の内側の蛍光siRNA（赤色）によって明らかなように、PEIを最終コーティングすることができる（図1c）。
【０１５２】
本発明の封入粒子送達系は、例えばオリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチド、アンチセンス構築物、siRNA、miRNA、shRNA、酵素的RNA、および発現ベクターを含む組換えDNA構築物などを包含するがそれらに限定されないペイロード分子のインビボまたはインビトロ送達のために有用である。
【０１５３】
例示的な態様では、核酸は、109個（粒子）に付き0.001〜2,000μg、109個（粒子）に付き約0.005〜1,000μgまたは1〜100μg、例えば109個（粒子）に付き50μg〜100μg、25〜50μg、5〜25μgまたは1〜12μg（例えば、109個（粒子）に付き5、7.5、10、12、12.5、15、20または25μg）の比率で粒子内に包含することができる。
【０１５４】
i.siRNA送達
本発明の好ましい態様は、siRNAを細胞に送達するためにYCWPを包含している。これらの態様の封入ナノ粒子内では、一つまたは複数のsiRNAを見いだすことができる。ナノ粒子は、粒子全体にわたって本質的に一様であってよい、または別個の層もしくは区間を含んでいてよい。ナノ粒子の別個の層もしくは区間は、本質的に1つの分子成分からなってよく、そして互いに対して別個の処方を有していてよい。
【０１５５】
本発明の態様は、YCWP内にさらに封入されるナノ粒子内へのsiRNAの組み入れを特徴とする。siRNAは、粒子全体にわたって本質的に一様である、または様々な層もしくは区間を有するナノ粒子内で見いだすことができる。siRNAは、多層状ナノ粒子内の特定の層に局在化することができる。本発明の一部の態様は、粒子内の同一もしくは相違する場所に局在化できる2つ以上のsiRNA種を含有している。
【０１５６】
特定のナノ粒子の設計を通して、YCWPからのsiRNAの放出の時機および/または速度を調整することができる。本発明の一部の態様は、本質的に一つまたは複数の捕捉分子を含む外層からのナノ粒子に対するsiRNA内部を特徴とする。一つまたは複数のsiRNA種は、ナノ粒子の別個の層もしくは区間内で見いだすことができ、これは様々なsiRNAのための放出の様々な時機および速度をもたらすことができる。
【０１５７】
本発明の一部の態様では、粒子は、PEIでコーティングされたtRHA（例えば、過剰なPEIでコーティングまたは捕捉された5×108個（YCWP）に付き約50μgのtRNA）を含むカチオン性コア、siRNA層（任意でEndoPorter（例えば、107-108個（粒子）に付き1〜10μgのEndoPorter）を包含する）（コレイヤー（colayer）として）、およびPEI捕捉層（例えば、107〜108個（粒子）に付き5〜100μg）を包含している。
【０１５８】
例示的な粒子は、下記の実施例において記載した方法にしたがって形成される。粒子は、高い濃度または量のサイレンシング物質を包含するように調製することができる。例えば、粒子は、15μg、20μg、25μg、30μg、40μg、50μg/1×109個（YCWP）またはそれ以上までのサイレンシング物質（例えば、siRNA）を包含するように調製することができる。しかし、包含される濃度または量は、この系によって提供される高効率の送達、例えば、1〜12μg/1×109個（YCWP）のサイレンシング物質に起因してルーチン的に低下させられる。siRNAの例示的な量または濃度は、10〜1,000pmol/5×107個（粒子）、例えば、20、40、100、200または500pmolのsiRNA/5×107個（粒子）を包含することができる。
【０１５９】
量は、粒子送達の性質に依存して変動する可能性がある。例えば、細胞（例えば、106cells）へのインビトロ送達は、細胞を40pmolのsiRNA/107個（粒子）（または40×10-7pmolのsiRNA/粒子）と接触させる工程を特徴とすることができ、I.P.送達は40pmolのsiRNA/107個（粒子））（または8×10-7pmol/107個（粒子））を投与する工程を特徴とすることができる。経口送達は、40pmolのsiRNA/1×107個（粒子）（または4×10-7pmol/粒子）を投与する工程を特徴とすることができる。例示的な態様は、約1×10-7〜約500×10-7pmolのsiRNA/粒子を含有している粒子を投与する工程を特徴とする。しかし本発明の送達系は、有意により高用量のsiRNAを送達できると考えられる。
【０１６０】
動物へのI.P.送達は、5×107個（粒子）（100μgの粒子）中の約40pmolのsiRNAを投与する工程を特徴とすることができ、動物への経口送達は1×108個（粒子）（200μgの粒子）中の約40pmol以上のsiRNAを投与する工程を特徴とすることができる。
【０１６１】
送達は、さらにまた動物の体重1kg当たり投与すべきsiRNAの所望の量に基づいて調整することができる。例えば、約0.01〜1mg/kg、0.05〜5mg/kg、0.1〜0.35mg/kg、または例えば0.25mg（40pmol）のsiRNA/kgの送達が望ましい場合がある。
【０１６２】
ii.DNAの送達
好ましい態様では、本発明は、遺伝的成分を有する遺伝的障害もしくは状態を治療するための組成物および方法を提供する。さらに好ましい態様では、本発明は、遺伝的成分を有する遺伝的障害もしくは状態を治療するための薬学的製剤を製造するために有用な組成物を提供する。本発明の態様は、上記に記載した核酸ペイロード物質、および/または他のペイロード分子を送達するためのYCWP組成物を包含している。
【０１６３】
環境的および遺伝的因子の両方は、任意の疾患の発生に役割を有する。遺伝的障害は、個体の遺伝物質（ゲノム）における異常によって誘発される疾患である。遺伝的障害には4種のタイプ:（1）単一遺伝子性、（2）多因子性、（3）染色体性、および（4）ミトコンドリア性がある。
【０１６４】
1）単一遺伝子性（メンデル性または一遺伝子性とも呼ばれる）-このタイプは、1つの遺伝子のDNA配列内で発生する変化または突然変異によって誘発される。遺伝子は、多くの作用を実行しており、生命機能の大半を実施し、かつ、細胞構造の大部分をも構築する分子である、たんぱく質をコードしている。そのタンパク質産物がもはやその正常機能を実施できなくなるように遺伝子が突然変異させられると、結果として障害が生じる可能性がある。6,000種を超える公知の単一遺伝子障害が存在しており、出生200例に付き約1例において発生する。一部の例は、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、マルファン（Marfan）症候群、ハンティントン（Huntington）病、および遺伝性ヘモクロマトーシスである。
【０１６５】
2）多因子性（複雑性または多遺伝子性とも呼ばれる）-このタイプは、環境因子および複数遺伝子における突然変異の組み合わせによって誘発される。例えば、乳癌感受性に影響を及ぼす様々な遺伝子は、染色体6、11、13、14、15、17、および22上で見いだされてきた。そのより複雑な性質は、単一遺伝子性もしくは染色体性障害より分析するのをはるかに困難にする。最も一般的な慢性障害の一部は、多因子障害である。例には、心疾患、高血圧、アルツハイマー（Alzheimer）病、関節炎、糖尿病、癌、および肥満症が包含される。多因子遺伝的形質は、例えば指紋の文様、身長、眼の色、および皮膚の色などの遺伝形質とも関連している。
【０１６６】
3）染色体性-DNAおよびタンパク質からなる独特の構造である染色体は、各細胞の核内に所在する。染色体は遺伝物質の運搬体であるので、欠失もしくは余分のコピーまたは全体破壊（gross break）および再結合（転座）などの染色体構造内の異常は疾患を生じさせる可能性がある。主要な染色体異常の一部のタイプは、顕微鏡検査によって検出できる。ダウン（Down）症候群またはトリソミー21は、ヒトが染色体21の3つのコピーを有する場合に発生する一般的障害である。
【０１６７】
4）ミトコンドリア性-これは、ミトコンドリアの非染色体性DNA内の突然変異によって誘発される相当に珍しいタイプの遺伝的障害である。ミトコンドリアは、細胞呼吸に関係しており、植物および動物細胞の細胞質内で見いだされる小円形または棒状オルガネラである。各ミトコンドリアは、5〜10個のDNAの環状片を含有していてよい。
【０１６８】
好ましい態様では、本発明の封入粒子送達系は、補償遺伝子を含む少なくとも1つのポリヌクレオチドを投与するために使用される。他の好ましい態様では、本発明の粒子送達系は、欠損遺伝子の遺伝子産物をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを投与するために使用され、該遺伝子産物の発現は、遺伝的障害またはある状態の遺伝的成分の治療において有用である。
【０１６９】
遺伝子療法に関連する本発明の局面では、核酸組成物は、補償遺伝子または治療用タンパク質をコードする遺伝子のいずれかを含有している。補償遺伝子の例には、ジストロフィンもしくは機能的フラグメントをコードする遺伝子、嚢胞性線維症に罹患している患者における欠陥遺伝子を補償する遺伝子、ADAに罹患している患者における欠陥遺伝子を補償する遺伝子、および第VIII因子をコードする遺伝子が包含される。治療用タンパク質をコードする遺伝子の例には、エリスロポエチン、インターフェロン、LDL受容体、GM-CSF、IL-2、IL-4およびTNFをコードする遺伝子が包含される。さらに、毒性物質に特異的に結合する一本鎖抗体成分をコードする核酸組成物を投与できる。
【０１７０】
DNA粒子は、上記のセクションiに類似する方法で調製することができる。DNAは、例えば、10〜2,000ng/106個（粒子）で包含されてよい。
【０１７１】
iii.その他のペイロードの送達
本発明の態様は、個別または組み合わせて、様々な相違する分子を細胞に送達することのできるYCWPを特徴とする。
【０１７２】
一部の好ましい態様では、本発明の封入粒子送達系は、例えばアミノ酸、ペプチドおよびタンパク質などのペイロード分子のインビボまたはインビトロ送達のために有用である。「タンパク質」は、そのために鎖長が高レベルの第3級および/または第4級構造を生成するために十分であるアミノ酸の配列を意味する。これは、「ペプチド」またはそのような構造を有していない低分子量薬物から識別するためである。典型的には、本明細書のタンパク質は、少なくとも約15〜20kDa（キロダルトン）、好ましくは少なくとも約20kDaの分子量を有する。
【０１７３】
一部の態様では、タンパク質ペイロード分子は、好ましくは本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均質である（すなわち、夾雑タンパク質などを含んでいない）。「本質的に純粋な」タンパク質は、組成物の総重量に基づいて少なくとも約90重量％、好ましくは少なくとも約95重量％を含む組成物を意味する。「本質的に同質な」タンパク質は、組成物の総重量に基づいて少なくとも約99重量％を含む組成物を意味する。タンパク質は、天然起源に由来してよい、または組換え工学技術によって生成することができる。タンパク質は、アミノ酸置換または指向性タンパク質進化（Kurtzman, A.L., et al., Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins, Curr Opin Biotechnol. 2001 12 （4）: 361-70参照）ならびに例えばPEG化タンパク質などの誘導体によって生成されたタンパク質変異体を包含している。
【０１７４】
所定の態様では、タンパク質は抗体である。抗体は、例えば、上記の分子のいずれかに結合することができる。本発明によって含まれる抗体にとっての例示的な分子標的には、例えばCD3、CD4、CD8、CD19、CD20およびCD34などのCDタンパク質;例えばEGF受容体、HER2、HER3もしくはHER4受容体などのHER受容体ファミリー;例えばLFA-I、Mo1、pl50,95、VLA-4、ICAM-I、VCAMおよびそれらのαもしくはβサブユニットを含むαv/β3インテグリン（例えば、抗CDlla、抗CD18もしくは抗CDllb抗体）;例えばVEGFなどの成長因子;IgE;血液型抗原;flk2/flt3受容体;肥満症（OB）受容体;プロテインCなどが包含される。
【０１７５】
ペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに加えて、本発明の粒子送達系は、低分子を送達するため、好ましくは薬学的活性物質、より好ましくは治療用低分子を送達するために適合する。本発明の送達系のために適合する低分子ペイロードには、例えばジエチルスチルベストロール、17-β-エストラジオール、エストロン、エチニルエストラジオール、メストラノールなどの避妊薬;例えばノルエチンドロン、ノルゲストリル、二酢酸エチノジオール、リネストレノール、酢酸メドロキシプロゲストロン、ジメチステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、ノルゲスチメート、ノルエチステロン、エチステロン、メレンゲストロール、ノルエチノドレルなどのプロゲスチン類;ならびに例えばノニルフェノキシポリオキシエチレングリコール、塩化ベンゼトニウム、クロリンダノールなどの殺精子化合物が包含される。好ましくは、そのようなステロイド性ペイロードに対しては、ペイロードを安定化させるために十分な量の界面活性剤および酵母細胞壁粒子内にペイロードを保持するポリマーを含む捕捉分子の混合物が使用される。
【０１７６】
本発明の送達系内に組み入れることのできるその他の活性物質には、例えば水酸化アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウムなどの消化器治療薬;非ステロイド性避妊薬;副交感神経作用薬;精神治療薬;例えば塩酸クロロプロマジン、クロザピン、メソリダジン、メチアピン、レセルピン、チオリダジンなどのメジャートランキライザー;例えばクロルジアゼポキシド、ジアゼパム、メプロバメート、テマゼパムなどのマイナートランキライザー;耳科充血除去剤;例えばコデイン、フェノバルビタール、ペントバルビタールナトリウム、セコバルビタールナトリウムなどの催眠鎮静薬;例えばテストステロンおよびプロピオン酸テストステロンなどの他のステロイド剤;スルホンアミド;交感神経様作用薬;ワクチン類;ビタミン類および例えば必須アミノ酸、必須脂肪などの栄養素類;例えば4-アミノキノリン類、8-アミノキノリン類およびピリメタミンなどの抗マラリア薬;例えばマジンドール、フェンテルミンなどの片頭痛薬;L-ドパなどの抗パーキンソン（Parkinson）薬;アトロピン、臭化メトスコポラミンなどの鎮痙薬;例えば胆汁療法薬、消化薬、酵素などの鎮痙薬および抗コリン薬;例えばデキストロメトルファン、ノスカピンなど鎮咳薬;気管支拡張薬;例えば降圧薬、ラウウォルフィア（Rauwolfia）アルカロイド類、冠血管拡張薬、ニトログリセリン、有機硝酸塩薬、ペンタエリトリトテトラニトレートなどの心血管薬;例えば塩化カリウムなどの電解質補給剤;例えばカフェインを含む、もしくは含まないエルゴタミン、水素化麦角アルカロイド類、ジヒドロエルゴクリスチンメタンスルフェート、ジヒドロエルゴコミンメタンスルホネート、ジヒドロエルゴクリオプチンメタンスルフェートおよびそれらの組み合わせなどの麦角アルカロイド類;例えば硫酸アトロピン、ベラドンナ、臭化水素酸ヒオスシンなどのアルカロイド類;鎮痛剤;例えばコデイン、ジヒドロコジエノン、メペリジン、モルヒネなどの麻酔薬;例えばサリチル酸塩、アスピリン、アセトアミノフェン、d-プロポキシフェンなどの非麻酔薬が包含される。
【０１７７】
好ましい態様では、本発明の系は、例えばセファロスポリン類、クロラムフェニコール（chloramphenical）、ゲンタマイシン、カナマイシンA、カナマイシンB、ペニシン類、アンピシリン、ストレプトマイシンA、アンチマイシンA、クロロパンテニロール、メトロニダゾール、オキシテトラサイクリン、ペニシリンG、テトラサイクリン類などの抗生物質を送達するために使用される。好ましい態様では、身体のマクロファージが病原体を不活性化する能力は、例えばテトラサイクリンなどの抗生物質をマクロファージへ送達することによって増強される。
【０１７８】
他の好ましい態様では、本発明は、抗癌剤;例えばメフェニロイン、フェノバルビタール、トリメタジオンなどの鎮痙薬;例えばトリエチルペラジンなどの制吐薬;例えばクロロフィナジン、ジメンヒドリネート、ジフェンヒドラミン、ペルフェナジン、トリペレナミンなどの抗ヒスタミン薬;例えばホルモン剤、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、非ホルモン薬、アロプリノール、アスピリン、インドメタシン、フェニルブタゾンなどの抗炎症薬;プロスタグランジン類;例えばチオテパ、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、メトトレキセートなどの細胞毒性薬を送達する系を提供する。
【０１７９】
他の態様では、本系は、例えばリボヌクレアーゼ、ノイラミニダーゼ、トリプシン、グリコーゲンホスホリラーゼ、精子乳酸デヒドロゲナーゼ、精子ヒアルロニダーゼ、アデノシントリホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、アルカリホスファターゼエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、トリプシンキモトリプシン、アミラーゼ、ムラミダーゼ、アクロソームプロテイナーゼ、ジエステラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、β-グリコホスファターゼ、リパーゼ、ATP-アーゼ、α-ペプテートγ-グルタミロトランスペプチダーゼ、ステロール-3-β-オール-デヒドロゲナーゼ、DPN-ジ-アプロラーゼなどの酵素類を送達するために使用できる。
【０１８０】
好ましい態様では、本系は、バイオテロ臨界生物学的物質の抗原を送達することができる。好ましい態様では、本系は、トキソイド類（不活性化されたが抗原性である毒素）、およびトキソイドコンジュゲートを含む、例えばアナトキシン抗原などの不活性化抗原性毒素を送達するために使用できる。本発明の態様の中に組み入れることのできる広範囲のペイロードは、参照して本明細書に組み入れられる、Ostroffへの米国特許出願第2005/0281781号に記載されている。
【０１８１】
IV.siRNA標的
A.炎症シグナリング経路標的
炎症は、侵入する病原体および疾患から哺乳動物を保護する機序である。しかし、急性炎症は哺乳動物を感染から保護するために必要であるが、慢性炎症は組織損傷を誘発し、代謝性疾患および障害を包含する多数の疾病の基礎となる原因である。代謝性障害における炎症の役割は、少なくとも一部には、脂肪細胞集団および脂肪組織内の浸潤性マクロファージ集団の両方において、脂肪組織内の炎症シグナリングの活性化に起因すると考えられる。炎症シグナリングは、代謝異常調節中にIKKβ/NF-κBおよびJNK経路の両方を活性化し、さらに炎症媒介因子およびマーカーの増加した発現をもたらすことがある。炎症経路の活性化は肥満症に関連付けられており（すなわち、肥満症はインスリン応答性組織内で炎症状態を誘発する）、2型糖尿病に関連するインスリン耐性に対して、少なくとも一部には原因があると考えられている。したがって、炎症活性を用いた薬理学的介入は、代謝性疾患および障害を治療するための所望の標的となると考えられる。
【０１８２】
炎症に関係する代謝性障害の例には、肥満症、I型糖尿病、II型糖尿病、アテローム硬化症、クローン病/IBD、関節炎、AIDS（HIVは、長期疾患においては他の細胞内で複製することが遮断された場合にマクロファージ内に潜伏していると考えられている）、過食症、食欲低下症、内分泌異常、トリグリセリド貯蔵症、バルデー・ビーデル（Bardet-Biedl）症候群、ローレンス・ムーン（Laurence-Moon）症候群、プラダー・ラブハート・ウィリー（prader-labhart-willi）症候群、カーンズ・セイヤー（Kearns-Sayre）症候群、食欲減退、中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症、および悪液質が包含される。
【０１８３】
本発明は、炎症シグナリング経路遺伝子のターゲティングを通して炎症を減少させることによって代謝性障害を治療する方法を提供する。本発明の態様は、細胞への核酸ペイロード物質の送達を通しての特定遺伝子のターゲティング（例えば、サイレンシング）を特徴とする。これらの遺伝子の多数は、マクロファージおよび食作用を受けて免疫応答を増強するその他の細胞によって媒介される調節された炎症プロセスに関係している。好ましい遺伝子標的は、マクロファージ内の遺伝子産物である。特に好ましい遺伝子標的には、TNF-α、Map4k4、RIP140、およびTLR4が包含される。
【０１８４】
i.TNF-α
腫瘍壊死因子（TNF）-αは、感染に対する保護ならびにショック症状および炎症性疾患の誘導を含む、多数の生物学的プロセスを調節するためにTNF受容体を通して作用するサイトカインである。TNF分子は、「TNFリガンド」スーパーファミリーに属しており、それらの受容体もしくは対リガンドである「TNF受容体」スーパーファミリーと共に作用する。これまで、TNFリガンドスーパーファミリーの16のメンバーが同定されており、TNF受容体スーパーファミリーの17のメンバーが特性解析されてきた。
【０１８５】
TNF-αは、低グレード炎症および肥満症において観察されたインスリン耐性に寄与するマクロファージおよび脂肪細胞によって分泌されるサイトカインである。TNF-αシグナリングは、酵母Ste20タンパク質キナーゼオルソログMap4k4によって一部には媒介されるインスリン作用を損傷させる、脂肪細胞におけるPPARγおよびGLUT4グルコーストランスポーターの発現を減少させる（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Tang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103（7）: 2087-2092, 2006参照）。TNF-αは、転写因子であるcJUNおよびATF2を標的とするTNFR1依存性機序を通してその独自のシグナリング経路の重要な成分であるMap4k4の発現を選択的にシミュレートする（その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Tesz et al, J. Biol. Chem., 282（27）:19302-19312, 2007参照）。実施例においてより詳細に記載するように、TNF-αのサイレンシングはマクロファージ内のTNF-αを枯渇させることに成功し、炎症の減少を引き起こす。そこで、TNF-α発現の阻害は、例えばII型糖尿病、肥満症、および脂肪酸代謝障害などの炎症に関連する代謝性疾患を治療するために使用できる。
【０１８６】
ii.Map4k4
マイトジェン活性化プロテイン・キナーゼ・キナーゼ・キナーゼ4（Map4k4;NCK-相互作用性キナーゼ、もしくはNIKとしても公知である;さらに本明細書ではMap4k4/NIKとも呼ぶ）は、細胞移動を含む様々なシグナリング経路を調節するセリン/トレオニンキナーゼであり、哺乳動物発達のために必須である（例えば、それらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Xue et al., Development, 128（9）:1559-1572, 2001; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 103（10）: 3775-3780, 2006;および米国特許出願公開第20050239731号参照）。このキナーゼは、MAPK8/JNKを特異的に活性化し、GLUT4を阻害することが証明されている。Map4k4によるMAPK8の活性化は、MAP3K7/TAK1、MAP2K4/MKK4、およびMAP2K7/MKK7のドミナント・ネガティブ変異体によって阻害されることが見いだされているが、これはこのキナーゼがMAP3K7-MAP2K4-MAP2K7キナーゼカスケードを通して機能でき、TNF-αシグナリング経路を媒介することを示唆している（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第20060160133号参照）。詳細には、実施例においてより詳細に記載するようにマクロファージ内でのMap4k4のサイレンシングは、TNF-αおよびその他の炎症性サイトカインの分泌の鈍化をもたらすが、これは炎症を促進するマクロファージ機能がMap4k4のサイレンシングによって軽減されることを指示している。さらにまた、MAP4K4発現は、脂質生成の軽減をもたらすTNF-αまたはPPARTの枯渇によっても上昇する。そこで、MAP4K4は、培養された脂肪細胞中でGLUT4を包含する脂肪生成遺伝子発現を負に調節するシグナリング経路において機能する。そこで、Map4k4の発現の阻害は、例えばII型糖尿病、肥満症、および脂肪酸代謝障害などの炎症に関連する代謝性疾患を治療するために使用できる。
【０１８７】
ヒトMap4k4についての例示的な核酸およびアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号NM＿145686およびNP＿663719各々の下で見いだされる。ヒトMap4k4ポリペプチドのN末端は、11のキナーゼサブドメインを備える触媒性キナーゼドメインを有する（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Yao et al., J. Biol. Chem., 274: 2118-2125, 1999参照）。Map4k4は、造血前駆細胞キナーゼ1（HPK1）および胚中心キナーゼ（GCK）各々の触媒性ドメインとの47％および48％アミノ酸配列同一性を共有する。ヒトMap4k4と相互作用することが証明されているその他のポリペプチドには:カスパーゼ8、ドッキング（Docking）タンパク質1;グアニレート結合タンパク質3;インテグリンβ1;Nckアダプタータンパク質1;溶質担体ファミリー9、アイソフォームA1;RasGAP;溶質担体ファミリー9（ナトリウム/水素交換体）、メンバー1;およびMEKK1が包含される。
【０１８８】
iii.RIP140
RIP140（核受容体相互作用タンパク質1に対する、NRIP1としても公知である受容体相互作用タンパク質140）は、多数の核受容体の転写活性を阻害できるコリプレッサーである（例えば、それらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Cavailles et al., EMBO J. 14:3741-3751, 1995 and L'Horset et al, Mol. Cell. Biol. 16:6029-6036, 1996参照）。RIP140は、女性の受胎能力にとって必須であり、脂質代謝において重要な役割を果たす（例えば、それらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる、White et al., Nat. Med, 6:1368-1374, 2000; Leonardsson et al, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 101:8437-8442, 2004; and Christian et al, Mol. Cell Biol., 25:9383-9391, 2005参照）。Affymetrix GeneChipプロファイリングは、RIP140の枯渇はこれらの細胞内でのグルコース取込み、解糖、TCA周期、脂肪酸酸化、ミトコンドリア生物発生、および酸化的リン酸化の経路における遺伝子群の発現をアップレギュレートすることを証明している（例えば、それらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Powelka et al, J. Clin. Invest., 116（1）: 125-136, 2006参照）。高脂肪食での体重増加に抵抗するRIP140-ヌルマウスは、マッチした野生型マウスと比較して強化された耐糖能およびインスリンに対する強化された応答性を示す（例えば、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Leonardsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 101:8437-8442, 2004参照）。そこで、RIP140はエネルギー消費を制御する遺伝子を抑制し、インスリンによる刺激（例えば、脂肪細胞）に応答して通常はグルコース輸送を実施する細胞内のRIP140の発現の阻害は、炎症の減少を生じさせる（例えば、それらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Christian et al, Trends Endocrinology & Metabolism, 17（6）:243-250, 2006参照）。そこで、RIP140発現の阻害は、例えばII型糖尿病、肥満症、および脂肪酸代謝障害などの炎症に関連する代謝性疾患を治療するために使用できる。
【０１８９】
RIP140は、およそ128kDaのサイズを備える、およそ1,158アミノ酸を含有する核タンパク質である。RIP140はLXXLLモチーフを介して核受容体に結合するが、このときLはロイシンであり、Xは任意のアミノ酸である（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Heery et al, Nature, 387（6634）:733-6, 1997参照）。10個のLXXLLモチーフがRIP140配列内で見いだされる。RIP140はさらに、ヒストンデアセチラーゼと、およびRIP140配列内で見いだされるPXDLSモチーフを介してC末端結合タンパク質（CTBP）と相互作用する。
【０１９０】
ヒトRIP140ヌクレオチド配列は、GenBank（商標）内にアクセッション番号NM＿003489を付けて列挙されている。対応するヒトアミノ酸配列は、アクセッション番号NP＿003480の下で見いだされる。全ヒトRIP140遺伝子を含有する染色体領域のヌクレオチド配列は、GenBank（商標）内にアクセッション番号AF248484の下で見いだすことができる。マウスRIP140ヌクレオチド配列は、GenBank（商標）内にアクセッション番号NM＿173440の下で見いだすことができる。対応するマウスアミノ酸配列は、アクセッション番号NP＿775616の下で見いだされる。RIP140は、脊椎動物種間で高度に保存されている。RIP140ホモログの数は、当技術分野において公知である（例えば、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第第20050261223号参照）。
【０１９１】
一部の態様では、RIP140活性は、PPARへのRIP140結合のレベル試験することによって決定できる。PPAR配列は、当技術分野において公知であり、例えばGenBank（商標）アクセッション番号NP＿005027（PPARα）、Q03181（PPARδ）、P37231（PPARγ）を参照されたい。
【０１９２】
iv.Toll様受容体4（TLR4）
Toll様受容体（TLR）は一般に、侵入する病原体によって発現させられる異種構成成分（多糖類、タンパク質および核酸パターン）を認識するパターン認識分子として記載されている。そこで、TLRは、事前の曝露の必要を伴わずに新規に遭遇した微生物を認識して応答する、免疫系の第一線の先天性免疫防御である（例えば、それらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Kopp and Medzhitov, Curr. Opin. Immunol. 2003 15:396-401; Beutler and Rietschel, Nat. Rev. Immunol. 2003 3:169-176参照）。TLRシグナリングの初期誘因は、炎症性応答の刺激および病原体防御遺伝子の誘導を生じさせる（例えば、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Zhang et al., Science 303: 1522-1526, 2004参照）。TLRは、先天的および適応的免疫応答を架橋するさいにも重要である。TLRシグナリングは、記憶（適応的）免疫応答の発達を刺激し、その後の応答のタイプを形作る。侵入する病原体に関連するパターンを認識することに加えて、TLRはさらに進行中の病状をシグナルできる内因性分子の異常な発現を認識する「無菌性炎症」に関与する。
【０１９３】
特にTLR依存性免疫応答の即時の転帰は、例えばマクロファージなどの炎症細胞によるサイトカインの産生である。そのようなサイトカインの産生および放出は、細菌感染に付随する炎症性応答の原因である。グラム陰性細菌によって産生するエンドトキシンまたはリポ多糖（LPS）によるToll様受容体4（TLR4）活性化は、敗血症性ショックを引き起こす（その全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Cohen, J. Nature 2002 420:885-891参照）。さらに、TLR4とコレステロール依存性細胞溶解素であるニューモリシン（pneumolysin）との相互作用は、グラム陽性菌のシュードコッカス（Pseudococcus）への先天性免疫応答に臨界的に関係していると近年報告された（その全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Malley et al. Proc. Natl Acad. Sci 2003 100（4）:1966-1971参照）。特別には、これらの実験は、マクロファージの炎症性応答がTLR4依存性であることを証明している。
【０１９４】
TLR4は、細胞外ドメイン上の22個のロイシン・リッチリピート（LRR）の存在を特徴とするI型膜貫通糖タンパク質である。ヒトTLR4ヌクレオチド配列は、GenBank（商標）内にアクセッション番号NM＿138554を付けて列挙されている。対応するヒトアミノ酸配列は、アクセッション番号NP＿612564下で見いだされる。LPSによって誘発されるシグナルの開始は、TLR4の細胞質TIR（ToIl-インターロイキン-1耐性）ドメインの二量体化に左右される。活性化シグナルは、次に専用アレイの細胞内シグナリングタンパク質アダプターの動員、その後の免疫学的に重要な遺伝子の転写を最終的に引き起こす複雑なセリン/トレオニンキナーゼカスケードの活性化によって伝播される。
【０１９５】
近年、食細胞およびマクロファージ内の栄養脂肪酸はToll様受容体-4（TLR4）シグナリングを活性化すること、そして脂肪酸が脂肪細胞もしくは組織内で炎症シグナリングを誘導し、マクロファージはTLR4の非存在下では平滑化されることが証明されている（例えば、それらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Shi et al, J. Clin. Invest., 116: 3015-3025, 2006参照）。さらに、肥大脂肪細胞からの脂肪組織の脂肪分解は、TLR4が炎症を誘導するための天然型リガンドとして機能できる（例えば、それらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Suganami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 354:45-49, 2007参照）。さらに、TLR4 mRNA濃度は、さらに遊離脂肪酸誘導性炎症を増強する脂肪細胞分化中に誘導された（例えば、それらの各々の全内容は参照により本明細書に組み入れられる、Song et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 346:739-745, 2006参照）。このため、TLR4発現の阻害は、例えばII型糖尿病、肥満症、および脂肪酸代謝障害などの炎症に関連する代謝性疾患を治療するために使用できる。
【０１９６】
v.二次ノックダウン標的
特定遺伝子の直接ターゲティング（例えば、その配列を標的とするsiRNAを用いて）は、その遺伝子の発現を効果的にノックダウンするためには必要とされない。本発明の一部の態様では、siRNAは、その産物が第2遺伝子の発現を誘導またはアップレギュレートする遺伝子の発現をノックダウンするために細胞へ送達される。例えば、抗MPA4K siRNAを細胞内のMAP4K4へターゲティングすることによって、TNF-αの発現は減少または実質的に排除することができる（例えば、図24〜26参照）。MAP4K4 siRNAの送達は、例えばIL-1βなどの他の炎症性分子およびマークの発現を減少させることもできる（例えば、図29f参照）。
【０１９７】
B.aP2
脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質（aP2）は、脂肪細胞ならびにマクロファージ内の脂肪酸の細胞内輸送および代謝を媒介する。マウスaP2ヌクレオチド配列は、GenBank（商標）内にアクセッション番号NM＿024406を付けて列挙されている。対応するマウスアミノ酸配列は、アクセッション番号NP＿077717の下で見いだされる。aP2発現は、PPARγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）およびCCAAT/エンハンサー結合タンパク質α（C/EBPα）の活性を介して調節される（Sun et al., Journal of Lipid Research, 44:1877 （2003）参照）。aP2が欠損性であるマウスについての試験は、aP2が代謝性症候群、II型糖尿病およびアテローム硬化症の発生において役割を果たすこと、そしてaP2の低分子阻害剤はマウス分子において重症アテローム硬化症およびII型糖尿病を撲滅するために有効な薬剤である可能性があることを示してきた（参照により本明細書に組み入れられる、Furuhashi et al, Nature 447:959 （2007）参照）。
【０１９８】
以下の実施例16に示すように、aP2のプラスの作用は、aP2特異的siRNAが負荷されたGeRPの送達によっても得ることができる。
【０１９９】
V.送達の様式
本発明は、細胞へペイロード分子を送達するためのペイロード送達系を含んでいる。好ましい態様は、核酸ペイロード物質（例えば、遺伝子サイレンシング物質）の送達を特徴とする。本発明の送達系は、酵母細胞壁粒子を形成するために酵母から抽出された成分を使用する。一つまたは複数のペイロード分子および一つまたは複数の他の分子は、YCWP内に組み入れられ、YCWPと細胞との相互作用を通して細胞に送達することができる。
【０２００】
A.機序
上述したように、抽出された酵母細胞壁粒子は、径が約2〜4μmの、容易に入手できる生物分解性の実質的に球状の粒子である。抽出された酵母細胞壁粒子の調製は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第4,992,540号、第5,082,936号、第5,028,703号、第5,032,401号、第5,322,841号、第5,401,727号、第5,504,079号、第5,968,811号、第6,444,448 B1号、第6,476,003B1号、米国特許出願公開第2003/0216346A1号、第2004/0014715A1号、および国際公開第WO02/12348A2号に記載されている。「全グルカン粒子」と呼ばれる抽出された酵母細胞壁粒子の1つの形態は、送達ビヒクルとして提案されてきたが、粒子からの有効成分の単純な拡散による放出、または粒子マトリックスの生物分解による全グルカン粒子へ化学的に架橋した物質の放出のいずれかに限定されてきた。米国特許第5,032,401号および第5,607,677号参照。
【０２０１】
抽出された酵母細胞壁粒子は、主としてそれらのβグルカン含量に起因して、例えばマクロファージおよびリンパ組織の細胞などの食細胞へターゲティングされる。粘膜関連リンパ様組織（MALT）は、上皮および身体の粘膜表面の下方に存在する固有層内の全リンパ球様細胞を含んでいる。粘膜関連リンパ様組織の主要部位は、腸関連リンパ様組織（GALT）、および気管支関連リンパ様組織（BALT）である。
【０２０２】
GI免疫系のまた別の重要な成分は、M細胞すなわち小襞細胞である。M細胞は様々なタンパク質およびペプチド抗原を取り込むリンパ濾胞の上方の腸上皮内の特異的細胞タイプである。これらのタンパク質を消化する代わりに、M細胞はそれらを基底組織内に輸送し、そこで局所的樹状細胞およびマクロファージによって取り込まれる。
【０２０３】
M細胞は、エンドサイトーシスまたは食作用によって腸管内腔から分子および粒子を取り上げる。この物質は次に小嚢内の細胞の内部を通って基底細胞膜へ輸送され、そこで細胞外空間へ放出される。このプロセスは、トランスサイトーシスとして公知である。M細胞から放出された輸送物質を取込み、それを抗原提示のために処理するリンパ球および抗原提示細胞の周囲で、それらの基底面においてM細胞の細胞膜は広範囲に折り畳まれる。
【０２０４】
ある試験は、パイアー斑のM細胞による酵母粒子（径:3.4±0.8ミクロン）のトランスサイトーシスは1時間未満を要することを証明している（Beier, R., & Gebert, A., Kinetics of particle uptake in the domes of Peyer’s patches, Am J. Physiol. 1998 July; 275 （1 Pt l）:G130-7参照）。上皮内マクロファージによる有意な食作用を受けずに、酵母粒子は2.5〜4時間以内は基底膜を下がって横断して移動し、そこで迅速に食作用を受け、パイアー斑ドームから運び出される。ヒト鼻咽頭リンパ様組織（扁桃腺およびアデノイド）内で見いだされるM細胞は、呼吸感染症を誘発するウイルスのサンプリングに関係することが証明されている。インビトロM細胞モデルに関する研究は、蛍光標識ミクロスフェア（Fluospheres、0.2μm）およびキトサン微粒子（0.2μm）の取込みを証明している（van der Lubben I.M., et al., Transport of chitosan microparticles for mucosal vaccine delivery in a human intestinal M-cell model, J Drug Target, 2002 September; 10 （6）:449-56参照）。レクチンであるコマツナギ（Ulex europaeus）アグルチニン1（UEAl、α-L-フコース残基に対して特異的）は、ポリスチレンミクロスフェア（0.5μm）または重合リポソーム（0.2μm）のいずれかにM細胞をターゲティングするために使用されてきた（Clark, M.A., et al., Targeting polymerised liposome vaccine carriers to intestinal M cells, Vaccine. 2001 Oct. 12; 20（1-2）:208-17参照）。マウスにおけるインビボ試験は、ポリ-D,L-乳酸（PDLLA）ミクロスフェアまたはゼラチンミクロスフェア（GM）がマクロファージおよびM細胞によって効率的に取り上げられることを報告している（Nakase, H., et al., Biodegradable microspheres targeting mucosal immune-regulating cells: new approach for treatment of inflammatory bowel disease, J Gastroenterol. 2003 March; 38 Suppl 15:59-62参照）。
【０２０５】
しかし、ポリ（DL-ラクチド-コ-グリコリド）微粒子およびリポソームを包含する合成粒子送達ビヒクルの取込みは高度に可変性であり、粒子およびM細胞両方の物理的特性によって決定されることが報告されている（Clark, M.A., et al., Exploiting M cells for drug and vaccine delivery, Adv Drug Deliv Rev. 2001 Aug. 23; 50（1-2）:81-106参照）。同一の試験は、送達は、粒子またはリポソームを適切なレクチン、微生物アドヘシンおよびM細胞表面へ選択的に結合する免疫グロブリンでコーティングすることによって増強できることを報告した。さらに、Florence, A.T., The oral absorption of micro- and nanoparticulates: neither exceptional nor unusual, Pharm Res. 1997 March; 14 （3）:259-66も参照されたい。
【０２０６】
病原体パターン認識受容体（RPR）は、微生物表面上に存在する一般的な構造および分子モチーフを認識し、先天性免疫応答の誘導に寄与する。マンノース受容体およびβグルカン受容体は、一部には真菌病原体の認識に関与する。マクロファージのサブセット上で発現した炭水化物結合受容体マンノース受容体（MR）は、1つのそのようなPRRであると考えられる。マクロファージは、これらの糖を提示する分子に結合して内在化できるマンノースおよびマンノース-6-リン酸塩の両方に対する受容体を有する。分子は、エンドサイトーシスによってプレリソソーム・エンドソームによって内在化させられる。この内在化は、マンノース-6-リン酸塩を用いて修飾され、修飾3'末端へのジスルフィド架橋によってオリゴデオキシヌクレオチドへ連結されたウシ血清アルブミンを使用して、オリゴヌクレオチドのマクロファージ内への進入を増強するために使用されてきた（Bonfils, E., et al., Nucl. Acids Res. 1992 20, 4621-4629参照）。例えば、E. Bonfils, C. Mendes, A.C. Roche, M. Monsigny and P. Midoux, Bioconj. Chem., 3, 277-284 （1992）参照。マクロファージは、さらにまた、CR3（Ross, G.D., J.A. Cain, B.L. Myones, S.L. Newman, and P.J. Lachmann. 1987. Specificity of membrane complement receptor type three （CR3） for β-glucans. Complement Inflamm. 4:61参照）、dectin-1（Brown, G.D. and S. Gordon. 2001. Immune recognition. A new receptor for β-glucans. Nature 413:36参照）、およびラクトシルセラミド（Zimmerman JW, Lindermuth J, Fish PA, Palace GP, Stevenson TT, DeMong DE. A novel carbohydrate-glycosphinglipid interaction between a beta-（1-3）-glucan immunomodulator, PGG-glucan, and lactosylceramide of human leukocytes. J Biol. Chem. 1998 Aug. 21:273 （34）:22014-20参照）を包含するβグルカン受容体もまた発現する。βグルカン受容体であるCR3は、主として単球、好中球およびNK細胞上で発現するが、dectin-1は、主としてマクロファージの表面細胞上で発現する。ラクトシルセラミドは、M細胞中において高レベルで見いだされる。ミクログリアは、βグルカン受容体もまた発現することができる（Muller, C.D., et al. Functional beta-glucan receptor expression by a microglial cell line, Res Immunol. 1994 May; 145（4）:267-75参照）。
【０２０７】
食作用には、マンノースおよびβグルカン受容体の両方への結合に追加の作用を及ぼすという証拠がある。Giaimis et al.は、マウスマクロファージ様細胞系ならびにマウス腹膜在住マクロファージによる非オプソニン化熱殺菌酵母（S.セレビジエ）の食作用がマンノースおよびβグルカン受容体の両方によって媒介されることを示唆する観察所見を報告した。非オプソニン化熱殺菌酵母の最大食作用を達成するためには、マンノースおよびβグルカン受容体の両方の共発現が必要とされる（Giaimis, J., et al., Both mannose and beta-glucan receptors are involved in phagocytosis of unopsonized, heat-killed Saccharomyces cerevisiae by murine macrophages, J Leukoc Biol. 1993 December; 54（6）:564-71参照）。
【０２０８】
上述したように、本発明のナノ粒子は、ペイロード分子作用の動態を変調させるように設計することができる。ナノ粒子のLbL構築は、YCWPと細胞または生体との接触または進入に応じて効果的に逆転させることができる。ナノ粒子の特定の層または区間内に特定のペイロード分子を特に含有するように本発明のナノ粒子を設計することによって、ペイロード分子の放出の時機および速度を調節することができる。
【０２０９】
特定種のペイロード分子が細胞または生体内に放出されるにつれて、前記細胞または生体へのペイロード分子の作用が始まる。本発明のナノ粒子の設計を通して、細胞または生体へのペイロード分子の導入によって作り出される細胞または生体への作用の開始は、作用の発生速度および/または持続時間について調節することができる。一部の態様では、ペイロード分子は、急性状態を治療するためにより早く、および/またはより高速で放出される。一部の態様では、ペイロード分子は、慢性状態を治療するためにより遅く、および/またはより緩徐に放出される。一部の態様では、2つ以上のペイロード分子は、同一のナノ粒子内に含有された、または1組の2つ以上のナノ粒子内に含有されたナノ粒子によって送達される。放出の動態は、放出される任意の2つのペイロード分子に対して同一または相違していてよい。放出の動態は、一つまたは複数のナノ粒子の2つ以上の層または区間内に含有されたペイロード分子に対して相違していてよい。
【０２１０】
本発明の態様は、一部のペイロード分子が他のペイロード分子より高速で、および/または緩徐に送達されるように、一つまたは複数のナノ粒子の一つまたは複数の層または区間からの細胞または生体へのペイロード分子の送達を含む治療を特徴とする。一部の態様は、一つまたは複数のナノ粒子の類似または相違する層または区間内で、2つ以上のペイロード分子を含む一つまたは複数のナノ粒子を特徴とする。一部の態様では、ナノ粒子は、放出期間の間に一部の重複を含む、または重複を含まない、一つまたは複数の種のペイロード分子を連続的に放出するように設計される。一部の態様は、ペイロード分子の細胞または生体への連続的放出を必要とする、またはそれによって改良される治療を特徴とする。
【０２１１】
本発明の好ましい態様では、2つ以上のsiRNAはYCWP封入ナノ粒子から、前記siRNAによって作り出される遺伝子サイレンシング作用が相違する速度および/またはスピードでも発生するように、相違する速度および/またはスピードで放出される。一部の態様は、siRNAの放出が同一または本質的に類似する速度およびスピードで発生することを可能にする、粒子内に共局在した2つ以上のsiRNAを特徴とする。一部の好ましい態様では、放出されたsiRNAは、炎症を作り出す、または強化するために重要なシグナリング経路において見出される遺伝子の発現をサイレンシングするように設計される。
【０２１２】
B.調製物
本発明の態様は、ナノ粒子（例えば、GeRP）を封入するYCWPを特徴とする。ナノ粒子は、一様な稠度を有していてよい。一部のナノ粒子は、別個の調製物または成分を含有する層または区間を含有していてよい。単一割当量もしくは用量内の相違するYCWPは、相違する成分、構造、または処方を備えるナノ粒子を含有していてよい。
【０２１３】
好ましい態様では、所望のペイロード分子を包含する本発明の粒子送達系は、遺伝的障害またはある状態の遺伝的成分を治療するための薬学的製剤の製造において有用である。好ましい態様は、送達のための所望のペイロード分子としての核酸ペイロード物質を特徴とする。そのような薬学的製剤は、適切には経口、経直腸、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、もしくは皮下）、小脳内、膣内、腹腔内、膀胱内、局所的（例えば、粉末、軟膏剤もしくは滴剤）、または口腔もしくは鼻腔スプレーとして投与される。薬学的製剤は、好ましくは、経口、経口腔、および非経口、より好ましくは経口投与される。相違するペイロード、例えば、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド発現ベクターまたは低分子治療薬が負荷された粒子は、例えば併用療法のために、カプセル内で適切な比率で混合して投与することができる。
【０２１４】
本発明の封入粒子送達系は、患者に治療有効量で投与される。封入粒子送達系は、単独で、または薬学的に許容される組成物の一部として投与することができる。さらに、化合物または組成物は、全部を一回で、例えばボーラス注射によって、例えば一連の錠剤によるなどの複数回で、または例えば制御放出調製物を使用してある期間にわたって実質的に一様に送達することができる。さらにまた、化合物の用量は経時的に変動させることができることも留意されたい。粒子送達系は、即時放出調製物、制御放出調製物、またはそれらの組み合わせを用いて投与することができる。用語「制御放出」は、持続性放出、遅延性放出、およびそれらの組み合わせを包含している。
【０２１５】
本発明の実践において使用するために適切な経口調製物は、カプセル剤、ゲル剤、カシェ剤、錠剤、発泡剤もしくは非発泡性粉末剤もしくは錠剤、粉末剤もしくは顆粒剤;水溶液もしくは非水溶液中の液剤もしくは懸濁剤;または水中油型エマルジョンもしくは油中水型エマルジョンを包含している。本発明の化合物は、さらにまたボーラス、舐剤、またはペースト剤として提示することもできる。
【０２１６】
一般に、調製物は、有効成分を液体担体もしくは微粉末化された固体担体または両方とともに一様に混合し、次に必要であれば製剤を成形する工程によって調製される。薬学的担体は、選択された投与経路および標準的製薬実践に基づいて選択される。各担体は、調製物の他の成分と適合性であり、被験者にとって有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。この担体は、固体または液体であってよく、そのタイプは、一般には使用される投与のタイプに基づいて選択される。適切な固体担体の例には、ラクトース、スクロース、ゼラチン、寒天およびバルク粉末が包含される。適切な液体担体の例には、水、薬学的に許容される脂肪および油、アルコールもしくは、エステル、エマルジョン、シロップもしくはエリキシル、懸濁液、溶液および/または懸濁液を包含する他の有機溶媒、ならびに非発泡性顆粒から再構成された液剤および/または懸濁剤および発泡性顆粒から再構成された発泡性調製物が包含される。そのような液体担体は、例えば、適切な溶剤、保存料、乳化剤、懸濁化剤、希釈剤、甘味料、増粘剤、および融解剤を含有していてよい。好ましい担体は、食用油、例えばコーン油もしくはキャノーラ油である。ポリエチレングリコール、例えばPEGもまた好ましい担体である。
【０２１７】
経口投与のための調製物は、非毒性の薬学的に許容される、例えばラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体などの不活性担体を含んでいる。
【０２１８】
カプセル剤または錠剤は容易に調製することができ、嚥下または咀嚼を容易にすることができる。錠剤は、適切な担体、結合剤、潤滑剤、希釈剤、崩壊座、着色剤、フレーバー剤、流動誘導剤、または融解剤を含有していてよい。錠剤は、任意で一つまたは複数の追加の成分とともに、圧縮または成形によって作製することができる。圧縮錠は、任意で結合剤（例えば、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤（例えば、グリコール酸デンプンナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロース）、界面活性剤もしくは分散剤と混合された自由流動形（例えば、粉末、顆粒）にある有効成分を圧縮する工程によって調製することができる。適切な結合剤には、デンプン、ゼラチン、例えばグルコースもしくはβラクトースなどの天然糖、コーンシロップ、例えばアカシア、トラガント、もしくはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス類などが包含される。これらの剤形に使用される潤滑剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが包含される。崩壊剤には、例えば、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが包含される。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末状有効成分の混合物を適切な機械で成形する工程によって作製できる。
【０２１９】
錠剤は、任意でコーティングする、または割線を入れることができ、有効成分の緩徐もしくは制御放出を提供できるように調製することができる。錠剤にはさらに、任意で胃以外の腸部分での放出を提供するために腸溶コーティングを提供することができる。
【０２２０】
本発明の経口剤形を調製するために使用できる例示的な薬学的に許容される担体および賦形剤は、参照により全体として本明細書に組み入れられる、1975年9月2日にRobertへ発行された米国特許第3,903,297号に記載されている。本発明において有用な剤形を作製するための技術および組成物は、下記の参考文献に記載されている:7 Modem Pharmaceutics, Chapters 9 and 10 （Banker & Rhodes, Editors, 1979）; Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets （1981）; and Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2nd Edition （1976）。
【０２２１】
非経口投与のために適切な調製物には、意図されるレシピエントの血液と等張性の水性および非水性調製物;ならびに血液成分または一つまたは複数の器官へ前記化合物をターゲティングするために設計された懸濁化系を包含していてよい水性および非水性無菌懸濁液が包含される。調製物は、単用量または多用量密封容器、例えばアンプルまたはバイアル内に入れられてよい。即時注射液剤および懸濁剤は、以前に記載した種類の無菌粉末剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。非経口および静脈内投与形は、さらにまた無機物および選択された注射のタイプまたは送達系と適合させるためのその他の材料を包含することができる。
【０２２２】
VI.治療方法
分子ペイロード（例えば、GeRP）を備えるYCWPは、細胞および組織へのインビボ分解を受けやすい感受性分子を送達するため、ならびにマクロファージの特異的ターゲティングおよび生体全体の極めて多数の組織および細胞へのペイロードの送達のための強力かつ新規な方法を提供する。GALT内へのYCWPのトランスサイトーシス後に、YCWPは、引き続いて他の組織および器官へ移動するマクロファージによる食作用を受ける。
【０２２３】
A.代謝性疾患および障害
本明細書では、代謝性疾患および障害（例えば、糖代謝に関連する障害）を治療する方法が提供される。「治療する工程」は、障害、障害の症状または障害に向かう素因を治癒させる、軽減する、救済する、変化させる、緩和する、抑える、改善する、または影響を及ぼす方法を包含している。本方法は、インビボまたは培養中の細胞上、例えばインビトロもしくはエクスビボで使用できる。インビボ態様のためには、本方法は、被験者において実施され、本物質を前記被験者に、前記物質が細胞内の標的遺伝子またはポリペプチドの発現または活性を変調させることを許容するために有効な条件下で投与する工程を包含している。
【０２２４】
本発明の態様は、インビボの標的遺伝子またはタンパク質の発現を変調させる（例えば、ダウンレギュレートする）ための物質を調製して被験者に投与する方法を包含している。好ましい態様は、核酸を含む封入ナノ粒子を備えるYCWPを包含するナノ粒子封入YCWPを特徴とする。一部の態様では、核酸は、siRNA（例えば、GeRP）である。好ましい態様では、siRNAは、Map4k4を包含する、炎症性経路に関係する遺伝子の活性に対して向けられる。一部の態様では、封入ナノ粒子を備えるYCWPは、経口投与される。一部の態様では、YCWP物質は、注射によって送達される。
【０２２５】
インビトロの標的遺伝子またはポリペプチドの発現または活性を変調させる物質は、さらに動物モデルにおいてインビボで試験することができる。例えば、標的遺伝子またはポリペプチドの変調因子として同定された化合物が、例えば肥満症または糖尿病のための動物モデル（例えば、II型糖尿病、例えばJackson Laboratoriesから入手されたob/obマウス（菌株名:B6.V-Lep.sup.ob/J）、db/dbマウス;例えば、Sima AAF, Shafrir E. Animal Models in Diabetes: A Primer. Taylor and Francis, Publ Amsterdam, Netherlands, 2000参照）などの動物において試験される。試験物質の投与後の様々な時点での標的遺伝子またはポリペプチドの発現または活性のレベル。炎症シグナリング（例えば、炎症マーカーまたは媒介因子）のレベルおよび/またはグルコース、耐糖能、および血漿中インスリンのレベルは、試験化合物が対照に比較して代謝性疾患または障害に有益な作用を有するかどうか、すなわち、試験化合物がインスリン感受性の増加、インスリン耐性の減少、高血糖もしくは血漿中インスリンレベルの減少を誘発するかどうかを決定するために監視される。遺伝子活性および生体全体の状態の他の測定を行うことができる。以下の実施例6〜14は、経口または腹腔内注射のいずれかでマウスに投与されたsiRNAを封入しているYCWP物質を試験することを特徴とする。
【０２２６】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための適切な用量の任意の所定物質を調製するために使用できる。物質の治療有効量は、客観的徴候（例えば、増加したインスリン感受性、減少した血糖レベル、例えば空腹時血糖レベル）または疾患の主観的症状における改善によって明白であってもなくても、状態の一つまたは複数の症状の進行を遅延させる、または改善する量である。所定の因子は、被験者（例えば、疾患または障害の重症度、以前の治療、被験者の全身健康状態および/または年齢、ならびに存在する他の疾患）を効果的に治療するために必要とされる用量および時機に影響を及ぼすことができる。ナノ粒子を封入しているYCWPは、ペイロード分子の送達動態を順番に改善するために上述したように設計することができる。
【０２２７】
インビボでの標的遺伝子またはタンパク質の発現または活性を変調させるために有用な組成物は、薬学的組成物に組み入れて、例えば糖代謝に関係するなどの遺伝子もしくはタンパク質の活性に関連する（例えば、例えばI型糖尿病、II型糖尿病、または肥満症などの無調節糖代謝に関連する）障害もしくは状態を有する、または発生するリスク状態にある被験者に投与することができる。そのような組成物は、遺伝子またはタンパク質の発現または活性を変調させる一つまたは複数の物質および薬学的に許容される担体（例えば、実質的に非毒性である溶媒、分散溶媒、コーティング、緩衝液、吸収遅延剤など）を包含する。さらにまた補助活性化合物を組成物中に組み入れることができる。好ましい態様では、インビボの遺伝子またはタンパク質の発現または活性を変調させるために有用な組成物は、上述したような核酸ペイロード物質（例えば、遺伝子発現をノックダウンするためのサイレンシング物質）を含んでいる。
【０２２８】
経口であろうと非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、経粘膜（例えば、鼻腔スプレーが吸入のために調製される）、もしくは経皮（例えば、当技術分野において一般に公知であるような局所軟膏剤、軟膏剤、ゲル剤、パッチ剤またはクリーム剤））であろうと、それらの所定の投与経路と適合する薬学的組成物が調製される。本組成物は、無菌希釈剤（例えば、無菌水もしくは食塩液）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくはその他の合成溶媒;例えばベンジルアルコールもしくはメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの抗菌剤もしくは抗真菌剤;例えばアスコルビン酸もしくは亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤;例えばエチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;例えば酢酸塩、クエン酸もしくはリン酸塩などの緩衝液;ならびに例えば糖（例えば、デキストロース）、多価アルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）、または塩（例えば、塩化ナトリウム）などの等張剤を包含することができる。リポソーム懸濁液（神経抗原に対して特異的なモノクローナル抗体が罹患細胞にターゲティングされたリポソームを包含する）は、さらにまた薬学的に許容される担体としても使用できる（例えば、米国特許第4,522,811号参照）。本組成物の調製物は、調製してアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは多用量バイアル内に密封することができる。必要であれば（例えば、注射用調製物中のように）、適正な流動性は、例えばレシチン、または界面活性剤などのコーティングの使用によって維持することができる。有効成分の吸収は、吸収を遅延させる物質（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を包含することによって延長させることができる。または、制御放出は、生物分解性、生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、およびポリ乳酸;Alza CorporationおよびNova Pharmaceutical社）を包含することのできるインプラントおよびマイクロカプセル化送達系によって達成することができる。
【０２２９】
経口投与が意図される場合は、本物質はピル剤、カプセル剤、トローチ剤などに包含されてよく、以下の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含有することができる;例えば微結晶セルロース、トラガントガムもしくはゼラチンなどの結合剤;デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤;例えばアルギン酸、Primogel、またはコーンスターチなどの崩壊剤;例えばステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤;例えばコロイド状二酸化ケイ素などの潤滑剤;例えばスクロースもしくはサッカリンなどの甘味料;または例えばペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーなどのフレーバー剤。
【０２３０】
例えばグルコース輸送関連ポリペプチドなどの、インビボでの標的タンパク質およびペプチドの遺伝子発現を変調させる物質を含有する組成物は、経口または非経口投与のために、単位製剤形（すなわち、投与の容易さおよび用量の一様性のために規定量の活性化合物を含有する物理的に別個の単位）で調製することができる。化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物において標準の薬学的方法によって決定することができる。例えば、LD50（集団の50％にとって致死性の用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効である用量）を決定することができ、治療指数はLD50:ED50の比率である。高い治療指数を示す物質が好ましい。物質が望ましくない副作用を示す場合は、罹患組織の部位へその物質をターゲティングするために注意を払わなければならない（目的は、非罹患細胞への潜在的損傷を最小限に抑え、それによって副作用を減少させることである）。毒性および治療有効性は、その他の標準的な薬学的方法によって決定することができる。
【０２３１】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための適切な用量の任意の所定物質を調製するために使用できる。物質の治療有効量は、客観的徴候（例えば、血糖レベル）または疾患の主観的症状における改善によって明白であってもなくても、状態の一つまたは複数の症状の進行を遅延させる、または改善する量である。所定の因子は、被験者（例えば、疾患または障害の重症度、以前の治療、被験者の全身健康状態および/または年齢、ならびに存在する他の疾患）を効果的に治療するために必要とされる用量および時機に影響を及ぼすことができる。
【０２３２】
上述したように、本明細書に記載した本方法によって投与されるペイロード分子は、低分子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド（もしくはそのアナログ）、または有機もしくは無機化合物であってよい。典型的には、そのような分子は、約10,000g/M（モル）未満（例えば、約7,500、5,000、2,500、1,000、または500g/M未満）の分子量を有する。これらの化合物のいずれかの塩、エステル、およびその他の薬学的に許容される形態はアッセイすることができ、所望の活性が検出されると、本明細書に記載した治療方法によって投与される。例示的な用量は、被験者またはサンプル重量1kgに付きmgもしくはμg量の低分子を包含している（例えば、約1μg〜500mg/kg;約100μg〜500mg/kg;約100μg〜50mg/kg;10μg〜5mg/kg;10μg〜0.5mg/kg;または1μg〜50μg/kg）。これらの用量は広範囲をカバーしているが、当業者は、低分子を含む治療薬はその効力において変動すること、そして有効量は当技術分野において公知の方法によって決定できることを理解する。典型的には、最初は相当に低用量が投与され、担当医または獣医（治療適用の場合）または研究者（臨床開発段階で依然として研究している場合）は、引き続いて適切な応答が得られるまで用量を段階的に増量することができる。さらに、任意の特定被験者のための特定用量レベルは、使用される特定化合物の活性、被験者の年齢、体重、全身状態、性別および食事、投与の時機、投与経路、排出速度、任意の併用薬、ならびに変調すべき発現または活性の程度を包含する様々な因子に依存すると理解されている。
【０２３３】
薬学的組成物は、投与についての取扱説明書と共に容器、パック、またはディスペンサー内に包含することができる。
【０２３４】
以下では、請求項に記載した本発明の範囲を限定するものではない実施例において詳細に説明する。
【０２３５】
上記の開示は、当業者に、本発明の作製方法および使用方法を包含する本発明の態様を教示する。以下の実施例は、本発明の詳細な説明を提供することが意図されているが、それらの制限であることは意図されていない。
【実施例】
【０２３６】
非ウイルス遺伝子送達技術は、DNAを保護して細胞へ送達するナノ粒子材料を提供するために静電相互作用によって共に保持されるナノ材料のレイヤー・バイ・レイヤー自己組立て法を用いて開発されてきた。本明細書では、本発明者らは、中空酵母細胞壁粒子（YCWP）内に閉じ込められたナノ粒子のインサイチュー・レイヤー・バイ・レイヤー合成法に基づく新規なペイロード物質送達技術について報告する。YCWPは、保護を提供し、食細胞へのペイロード分子の経口および全身性の受容体標的化送達を促進する。
【０２３７】
特定の態様では、酵母細胞壁粒子は、中空YCWP内に閉じ込められた静電相互作用によるポリマーのレイヤー・バイ・レイヤー組立て後にDNAを封入するために有効な材料であることが証明されている。ローダミンを用いた各層の標識化は、YCWP内のLbLナノプレックス形成の定量的蛍光分析および最適化を許容した。YCWP DNA送達系は、プラスミド、gWizGFP、およびトランスフェクトNIH3T3-D1細胞を効率的に送達した。
【０２３８】
YCWPは、主としてβ1,3-D-グルカン、マンノプロテイン、およびキチンから構成される、パン酵母から調製された多孔性の、中空の2〜4μのミクロスフェアである。アニオン性およびカチオン性ポリマーから構成されるナノ粒子コアは、上述したようにYCWP内のtRNAおよびPEIから構築した（図1a）。これらのYCWP封入カチオン性ナノ粒子コアを使用して、ナノ粒子表面上にDNAを吸収させ、次にYCWP DNAトランスフェクション調製物を生成するためにPEIでコーティングした（図1b）。
【０２３９】
ローダミン標識tRNA、DNAまたはPEIを使用して、封入ナノ粒子の各層の形成を最適化した。各標識化合物についての検量線を使用して、結合を定量した。
【０２４０】
YCWP内のナノ粒子は、tRNA/ポリエチレンイミン（PEI）のコアに続く、最終的にはPEIの保護層でコーティングされるDNA層からなる。tRNA、PEIおよびDNAのローダミン標識化を用いて、ナノ粒子のレイヤー・バイ・レイヤー形成は蛍光顕微鏡によって可視化し、蛍光分光法およびフローサイトメトリーによって定量した。YCWP封入ナノ粒子を合成するための最適条件（tRNA/YCWP、PEI/YCWP比およびDNA負荷）は、これらの結果から決定した。DNAおよびトランスフェクト細胞を送達するためのこのDNA封入技術の有効性は、3T3-D1細胞へYCWP tRNA/PEI/gWizGFP/PEI調製物によって送達されるプラスミドgWizGFPによってコードされる緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現によって評価した。
【０２４１】
材料および方法
トルラ酵母VI型由来のリボ核酸（tRNA）;高分子量無水ポリエチレンイミン（PEI、25kDa）;サケ精巣由来のデオキシリボ核酸ナトリウム塩（DNA）;およびローダミンBイソチオシアネートは、Sigma Aldrich社（ペンシルバニア州アレンタウン）から購入し、受領したままで使用した。5-（［4,6-ジクロロトリアジン-2-イル］-アミノ）フルオレセインモノヒドロクロリド（DTAF）は、Research Organics社（オハイオ州クリーブランド）から購入した。溶媒および緩衝溶液は、Sigma Aldrich社またはVWR社から購入し、それ以上精製せずに使用した。
【０２４２】
核酸のローダミンおよびフルオレセイン標識
DNAまたはtRNA（10mg）を10mLの5mM EDTA中に溶解させた。この材料を粘度が消失するまで超音波処理し、1.2mLの0.1M炭酸塩緩衝液（pH9.2）を加えた。DMSO中で1mg/mLの濃度にあるDTAFまたはローダミンを緩衝したDNA溶液（10v/v％）に加え、この溶液を暗所の室温で一晩攪拌した。Tris緩衝液（2mL、1M、pH8.3）を加え、反応混合液を室温でさらに15分間攪拌して、遊離蛍光標識試薬をクエンチさせた。塩化ナトリウム（1mLの1M NaCl水溶液）およびエタノール（30mL）を溶液に加え、有色沈降物が出現するまで-20℃でインキュベートした。沈降物は遠心分離によって収集し、上清が透明になるまで70％エタノールで洗浄した。固体を完全に乾燥させ、10mg/mLで水に溶解させ、暗所の4℃で保管した。各核酸に結合した蛍光プローブの量は、495nm（DTAF）または540nm（ローダミン）の吸光度での分光光度法で決定した。標識DNAは、約2.3±0.3％（w/w）のローダミン、および5.9±1.7w/w％のDTAFを含有している。tDNAは、約0.15±0.05％（w/w）のローダミン、および0.6±0.1％（w/w）のDTAFを用いて標識した。
【０２４３】
PEIのローダミンおよびフルオレセイン標識
PEIは、下記の変更を含めて、DNAおよびtRNAを標識するために使用した類似の方法にしたがって標識した。PEIは3mg/mLの濃度で5mM EDTA中に溶解させた。ローダミンおよびDTAFは、DMSO中において1mg/mLの濃度で使用した。Tris緩衝液を用いたインキュベーション後、1M NaClを加えた（各10mLの初期PEI溶液に対して1mL）。生成物は、水に対する透析によって精製し、凍結乾燥させた。標識PEIの分光光度法による特性解析は、最終産物が約3.1±0.3％（w/w）のローダミンおよび5.7±0.1％（w/w）のDTAFを含有することを証明した。酵母細胞壁粒子（YCWP）（24）、酵母グルカン粒子（YGP）の調製:サッカロミセス・セレビジエ（100gのFleishmansパン酵母（AB Mauri（商標）Food社（ミズーリ州チェスターフィールド））を1時間にわたり80℃へ加熱した1Lの1M NaOH中に懸濁させた。酵母細胞壁を含有する不溶性材料は、10分間にわたり2,000×gで遠心分離することによって収集した。この不溶性材料は次に水1L中に懸濁させ、HClを用いてpH4〜5にさせ、1時間にわたり55℃でインキュベートした。不溶性残留物は再び遠心分離によって収集し、水1Lを用いて1回、200mLのイソプロパノールを用いて4回、および200mLのアセトンを用いて2回洗浄した。結果として生じるスラリーをガラストレイ内に配置し、室温で乾燥させると、微細な、かすかにオフホワイトの粉末12.4gが生成された。酵母グルカンマンナン粒子（YGMP）:S.セレビジエ細胞壁（75gのSAF-Mannan（SAF Agri社（ワイオミング州ミルウォーキー））を水1L中に懸濁させ、1M NaOHを用いてpH12〜12.5へ調整し、1時間にわたり60℃へ加熱した。細胞壁を含有する不溶性材料は、10分間にわたり2,000×gで遠心分離することによって回収した。この材料は次に水1L中に懸濁させ、HClを用いてpH4〜5にさせ、1時間にわたり55℃でインキュベートした。不溶性残留物は遠心分離によって回収し、水1Lを用いて1回、200mLの脱水イソプロパノールを用いて4回、および200mLのアセトンを用いて2回洗浄した。結果として生じるスラリーをガラストレイ内に配置し、室温で乾燥させると、微細な、かすかにオフホワイトの粉末15.6gが生成された。
【０２４４】
YCWPカチオン化コアの調製
乾燥酵母グルカン粒子または酵母グルカンマンナン粒子は、ある容量のアニオン性コアポリマーtRNA（50mM Tris HCl（pH8）、2mM EDTAおよび0.15M NaCl（TEN）中の10mg/mL）と混合してYCWPをわずかに水和させ、YCWPが膨潤してtRNA溶液を吸収できるように2時間にわたりインキュベートした。中性PEI（TEN中の2mg/mL）を過剰に加えるとYCWP封入ポリプレックスが形成されるので、YCWPを均質化または超音波処理によって再懸濁させた。PEIの吸着およびナノ複合体の形成は、少なくとも1時間にわたり進行するに任せた。懸濁液を遠心分離し、粒子は粒子を滅菌するために70％エタノール中に懸濁化させ、次に0.9％食塩液中で3回洗浄し、再懸濁させ、計数し、1×108個（粒子）/mL（0.9％食塩液）へ希釈し、-20℃で保管した。
【０２４５】
DNA-PEI被覆ナノ複合体を用いたYCWPコアの調製
YCWP内のカチオン化ナノプレックス化コアへのDNA層の結合は、YCWP-tRNA-PEIコア（1×108個（粒子）/mL）、DNAおよび食塩溶液の懸濁液（総容量＝75μL）を調製することによって実施した。懸濁液は2時間にわたりインキュベートしてDNAをカチオン性ナノ粒子表面に結合させ、0.9％食塩液中の中性PEI（25μLの0.01％（w/w））を加えて結合DNAをコーティングした。
【０２４６】
蛍光アッセイ
蛍光特性解析は、1つの蛍光標識層を含有するYCWPサンプルを調製することによってナノプレックス送達系の各層について実施した。サンプルは、各層についての最適濃度を決定するために、一連のtRNA/YCWPおよびPEI/YCWP比率、ならびにDNA濃度にわたって調製した。蛍光測定値は、SoftMax Pro v 5.0.1ソフトウエアを用いて、Spectra Max Gemini XSプレート・リーダー（Molecular Devices社、カリフォルニア州ユニオンシティ）を用いて入手した。ローダミン蛍光測定値は、540nmでの励起後に573nmで入手し、最終蛍光試験結果は、9回の測定の平均値であった。サンプルは、測定前5秒間にわたり混合した。粒子によって生成される光散乱によって誘導される誤差を回避するために、対照測定値は、任意の蛍光化合物を伴わない同一量の粒子/mLを含有するサンプルを用いて入手した。最終蛍光試験結果は、対照サンプルに対する反応をYCWP封入蛍光ナノプレックスサンプルから減じることによって収集した。YCWP内に含有された、結合した任意の特定蛍光化合物の量は、線形範囲反応にわたって溶液内の各ローダミン標識材料の蛍光を測定することによって得た検量線を用いて蛍光反応から決定した。
【０２４７】
蛍光顕微鏡
Arcturus蛍光顕微鏡を使用して、蛍光顕微鏡写真を取得し、緑色蛍光タンパク質（GFP）についてのトランスフェクション結果をスコア付けした。
【０２４８】
フローサイトメトリー（FACS）
FACS測定値は、Becton Dickinson FACSCalibur機械（BD社、ニュージャージー州フランクリンレークス）を用いて入手した。サンプルは、FACS分析のためにPBS中で2×106個（粒子）/mLの濃度で調製した。未修飾YGPおよびYGMP粒子は陰性対照として使用し、ローダミンを用いて化学修飾した酵母細胞壁を備えるYCWP粒子は陽性対照として使用した。粒子は、20,000回の測定値を収集することによって、FL2レーザー（570〜610nm）を用いて分析した。ゲーティングおよび分析は、FlowJo 6.4.2ソフトウエアを用いて実施した。
【０２４９】
トランスフェクション実験
YCWP-tRNA/PEI（10μL、1×108個（粒子）/mL）懸濁液を指示した量の0.01〜0.1μg/μLの濃度範囲にわたるgWizGFPプラスミドDNA（Genlantis社、カリフォルニア州サンディエゴ）と混合し、0.9％食塩溶液を加えて総量を75μLとした。DNAは、室温で2時間にわたりYCWP/tRNA/PEIカチオン性ナノ粒子表面に結合させた。次に、0.9％食塩液中の25μLの0.01％中性PEIを加えて、20分間にわたりDNA表面をコーティングした。ダルベッコ（Dulbecco）の改変イーグル培地（10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシンおよび1％グルタミンを含むDMEM培地）を加え、最終混合物は、5×105cells/ウエルのマウス線維芽細胞系NIH3T3-D1を含有する24ウエルプレートに移した。これらのプレートは37℃の5％  CO2雰囲気下で一晩インキュベートし、培地を取り替え、これらのプレートをさらに16〜24時間にわたりインキュベートした。40〜48時間後、培地を取り除き、細胞をリン酸緩衝食塩液（PBS）で1回洗浄し、PBS中の250μLの0.5％ホルマリンを用いて固定し、蛍光顕微鏡を用いて蛍光細胞の比率を手動計数によってGFP発現についてスコア付けした。
【０２５０】
中空β1,3-D-グルカンシェルの調製およびsiRNA封入
siRNAは、レイヤー・バイ・レイヤー合成戦略によってグルカン封入siRNA粒子（GeRP）を作製するために、中空グルカンシェルの内部に組み入れた。全てのsiRNAは、Dharmacon社（コロラド州ラファイエット）に特注した。トルラ酵母VI型由来のリボ核酸（tRNA）、高分子量無水ポリエチレンイミン（PEI、25kDa）、コラゲナーゼ、D-ガラクトサミン、大腸菌（Escherichia coli）リポ多糖（LPS）、ウシ血清アルブミン（BSA）およびチオグリコール酸ブロスは、Sigma Aldrich社（ペンシルバニア州アレンタウン）から購入し、受領したままで使用した。5-（［4,6-ジクロロトリアジン-2-イル］-アミノ）フルオレセインモノヒドロクロリド（DTAF）は、Invitrogen社（オレゴン州ユージーン）から購入した。溶媒および緩衝溶液は、Sigma Aldrich社またはVWR社（ペンシルバニア州ウェストチェスター）から購入し、それ以上精製せずに使用した。
【０２５１】
中空グルカンシェルは、下記の通りに、サッカロミセス・セレビジエから調製した。S.セレビジエ（100gのFleishmansパン酵母（AB Mauri（商標）Food社（ミズーリ州チェスターフィールド））を1Lの1M NaOH中に懸濁し、1時間にわたり80℃へ加熱した。酵母細胞壁を含有する不溶性材料は、10分間にわたり2,000×gで遠心分離することによって収集した。この不溶性材料は次に水1L中に懸濁させ、HClを用いてpH4〜5にさせ、1時間にわたり55℃でインキュベートした。不溶性残留物を次に再び遠心分離によって収集し、水1Lを用いて1回、200mLのイソプロパノールを用いて4回、および200mLのアセトンを用いて2回洗浄した。結果として生じるスラリーをガラストレイ内に配置し、室温で乾燥させると、微細な、かすかにオフホワイトの粉末12.4gが生成された。
【０２５２】
グルカン粒子は、下記の通りに、フルオレセインを用いて標識した。グルカンシェル（1g）は、100mLの0.1M炭酸塩緩衝液（pH9.2）中に懸濁させ、10分間にわたり2,000×gでの遠心分離により収集し、100mLの0.1M炭酸塩緩衝液（pH9.2）中に再懸濁させた。DMSO中で1mg/mLの濃度にある5-（4,6-ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセインを緩衝グルカンシェル懸濁液（10％（v/v））に加え、この反応液を暗所の室温で一晩攪拌した。Tris緩衝液（2mL、1M、pH8.3）を加え、反応混合液を室温でさらに15分間攪拌して、遊離蛍光標識試薬をクエンチさせた。蛍光標識グルカンシェルは、10分間にわたり2,000×gでの遠心分離によって収集し、色が消えるまで無菌発熱物質無含有水を用いて洗浄した。グルカンシェルは、次に無水エタノールを用いた4回、アセトンを用いた2回の洗浄によって脱水し、室温の暗所で乾燥させた。結果として生じた粉末は、約1gのFL-グルカンシェルを生成するために微細な鮮黄色粉末へ粉砕した。
【０２５３】
次に、RNAは、下記の通りにカチオン性ポリマー捕捉によって形成された乾燥中空グルカンシェルおよび封入カチオン性ナノ複合体に吸収させた。乾燥グルカンシェルまたはFL-グルカンシェルは、グルカンシェルをわずかに水和させるためにある容量のアニオン性コアポリマーtRNA（50mMのTris HCl（pH8）、2mM EDTAおよび0.15M NaCl（TEN）中の10mg/mL）と混合し、グルカンシェルが膨潤してtRNA溶液を吸着するように2時間にわたりインキュベートした。中性PEI（TEN中の2mg/mL）を過剰に加えるとグルカン封入ナノプレックス化粒子が形成されるので、封入ナノプレックスを均質化または超音波処理によって再懸濁させた。PEI吸着およびナノ複合体形成はすくなくとも1時間にわたり進行させた。懸濁液を遠心分離し、粒子は70％エタノール中に懸濁化させ、次に0.9％食塩液中で3回洗浄し、再懸濁させ、計数し、1×108個（粒子）/mL（0.9％食塩液）へ希釈し、-20℃で保管した。
【０２５４】
負電荷蛍光標識siRNAを正荷電ナノ複合体表面上に吸収させ、下記の通りに最後に多層状GeRP調製物を生成するためにカチオン性ポリマー層でコーティングした。グルカンシェルもしくはFL-グルカンシェル内のカチオン化ナノプレックス化コア表面へのsiRNA層の結合は、グルカン封入ナノプレックス化粒子（1×108個（粒子）/mL）、siRNAおよび食塩溶液の懸濁液（総容量＝75μL）を調製することによって実施した。懸濁液は2時間にわたりインキュベートしてsiRNAをカチオン性ナノ粒子表面に結合させ、0.9％食塩液中の中性PEI（25μLの0.01％（w/v）を加えて結合siRNAをコーティングした。動物実験のためには、siRNA調製プロセスは、全成分の20倍以上の高濃度で実施し、PEIの最終層の添加後にGeRP調製物を10分間にわたる2,000×gでの遠心分離によって収集し、200μL中の100μgの調製物を送達するために無菌発熱物質無含有食塩液中に再懸濁させた。濃縮GeRP調製物は、任意の凝集物を破壊するために短時間超音波処理し、使用時まで冷凍した。
【０２５５】
例示的調製物は、下記の通りである。
【０２５６】
2011517279.tif 000011
600μLの媒質（DMEM＋10％  FBS＋PECのための抗生物質）を加え、細胞を600μLの最終混合物で処置する。
【０２５７】
2011517279.tif 000012
2,000rpmで10分間遠心し、ペレットを200μLの食塩液中に懸濁させ、超音波処理する。
【０２５８】
2011517279.tif 000013
2,000rpmで10分間遠心し、ペレットを200μLの食塩液中に懸濁させ、超音波処理する。
【０２５９】
細胞培養およびGeRP処置
10週齢のC57BL6/J雄性に1mLの4％チオグリコール酸ブロスをI.P.注射した。1〜3日後、以前に決定されたように（参照により本明細書に組み込まれるHong et al., J Immunol 173, 797-806 （2004）参照）、腹腔浸出細胞（PEC）（106）を単離し、10:1の粒子:細胞比でGeRPおよびFL-GeRPとともに48時間にわたってインキュベートした。顕微鏡分析のために、細胞は、AbD-Serotec社（ノースカロライナ州ローリー）からのAlexaFluor405プローブに結合したマクロファージ特異的抗体であるF4/80を用いて染色した。
【０２６０】
RNAの単離およびリアルタイムPCR
RNA単離は、Invitrogen社（カリフォルニア州カールズバッド）からのTrizol試薬プロトコルにしたがって実施した。cDNAは、Bio-Rad社（カリフォルニア州ハーキュリーズ）からの製造業者の取扱説明書にしたがってiScript cDNA合成キットを用いて1μgの全RNAから合成した。リアルタイムPCRのためには、iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）と共に合成したcDNAフォワードおよびリバースプライマーをMyIQリアルタイムPCRシステム（Bio-Rad社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）上でランした。使用したプライマーの配列は下記の表2に列挙し、Primer Bankを用いて設計した（Xu, V. et al. Nucleic Acids Res 31, 5582（2003）参照）。
【０２６１】
（表２）プライマー配列
2011517279.tif 000014
【０２６２】
リボソームmRNAである36B4（参照により本明細書に全体として組み入れた、Aouadi, M. et al., Diabetes 55, 281 （2006）参照）を内部負荷対照として使用したが、これはその発現が本試験において使用したLPS、TNF-αの添加、または遺伝子のサイレンシングを行っても24時間にわたって変化しなかったためである。相対遺伝子発現レベルは、デルタCT法（Livak, K. and Schmittgen, T., Methods 25, 402 （2001）参照）を用いて決定した。
【０２６３】
siRNA配列
siRNA実験は、以下の表3に見いだされるような配列を備えるsiRNAを含有するGeRPを利用した。
【０２６４】
（表3）siRNA配列
2011517279.tif 000015
【０２６５】
動物.GeRPのi.p.注射
10週齢C57BL6/J雄性マウスには第1日から第3日までの3日間にわたり、10μg/kgのスクランブル（Scr）またはMAP4K4 siRNAを含有する2×109 GeRP/kg（4mg/kg）を1日1回i.p.注射した。第4日に、マウスにはチオグリコレートをi.p.注射し、第5日にPECを単離した。GeRP強制経口投与。10週齢C57BL6/J雄性マウスには第1日から第8日までの8日間にわたり、10μg/kgのScrまたはMAP4K4 siRNAを含有する4×109 GeRP/kg（8mg/kg）を1日1回強制経口投与により投与した。食物摂取に起因する胃酸分泌を最小限に抑えるために、マウスは強制経口投与前後の2時間は絶食させた。第9日に、マウスにはチオグリコレートをi.p.注射し、第10日にはPECおよび細胞を脾臓、肝臓、肺および筋肉から単離した。脾臓、肝臓、肺および筋肉組織を小片に切片作製し、ダルベッコのリン酸緩衝食塩液（PBS）で洗浄し、10mg/mLのコラゲナーゼを用いて攪拌しながら30分間にわたり37℃で消化した。消化した組織は次に70mmの多孔性ナイロンメッシュ・フィルター（VWR）に通して濾過し、2,000rpmで10分間にわたり遠心した。細胞を3時間にわたりプラスチック製シャーレ内で平板培養し、次に洗浄し、付着性細胞を実験に使用した。
【０２６６】
LPS致死率試験。
図5AのプロトコルにしたがってScrまたはMAP4K4 siRNAを含有するGeRPを用いて処置された11週齢のマウス（20〜25g）にD-ガラクトサミン（マウス1匹に付き25mg）の単回用量をi.p.注射し、次に1％  BSAを含有する総量が0.2mLのPBS中に含まれる大腸菌LPS（マウス1匹に付き0.25μg）をi.p.注射した。動物は、LPS/D-GalN惹起投与後24時間にわたり致死率について監視した（n＝1処置群当たり22）。血液および腹腔液は、TNF-αレベル測定のためにLPS/DGalN注射の1.5および4時間後に採取した。動物が関係する全方法は、マサチューセッツ州立大学医学部学内動物実験委員会（Animal Care and Use Committee）によって承認された。
【０２６７】
ELISAアッセイ
PEC上清、血漿および腹腔液中のマウスTNF-αの濃度を測定するために、マウスTNF-α ELISAキット（Pierce社製、イリノイ州ロックランド）を使用した。ELISA免疫反応性は、450nmでO.D.（光学密度）を測定することによって定量化し、標準曲線によって定量した。
【０２６８】
組織学およびTUNELアッセイ
これらのセクションは、F4/80-AlexaFruor405抗体およびヘマトキシリンにより染色した。TUNELアッセイは、製造業者の取扱説明書（Upstate社、ニューヨーク州レイクプラシッド）にしたがってLPS/D-GalNが惹起投与されたマウス由来の肝切片上で実施した。組織学的画像は、Nikon TE2000-E2倒立顕微鏡上に取り付けたSolamere CSUlO回転盤共焦点型システムを用いて入手した。画像は、N.A. 0.75;Oil:W.D.＝0.35mmを備える多重浸漬20×対物レンズ、またはNA＝I.4;Oil:W.D.＝0.13mmを備える100×Plan Apo VC対物レンズを用いて獲得した。TUNEL画像は、1,300×1,030ピクセルの基本解像度を備えるZeiss AxioCam HR CCDカメラおよびZeiss Plan NeoFluar 20x/0.50 Ph2（DIC II）対物レンズを装備したZeiss Axiovert 200倒立顕微鏡を用いて入手された。
【０２６９】
統計学
転帰の分布特性は、残余モデル上で実施されたヒストグラムの目視検査およびKolmogorov-Smirnoz検定の両方によって評価した。一部の事例では、正規分布へより近づき、分散を安定化させるためには、自然対数による変換を使用した。観察された作用は、一方向または多因子分散分析（ANOVA）によって評価した。有意な主要作用および/または相互作用の存在下では、ペアワイズ比較は、Kaplan-Meier分析が使用された図5Fを除いて、Tukey（HSD）多重比較方法を用いて実施した。p＜0.01の統計的有意性は、対数順位（Mantel-Cox）検定、Breslow検定およびTarone-Ware検定を用いて決定した。計算は、SASまたはSPSS統計ソフトウエアパッケージを用いて実施した。データは、平均値±SEMとして示した。
【０２７０】
YCWPの内側でのナノ複合体の調製を最適化するために、一連の実験を実施し、封入ナノ複合体内の各層の最大結合が生じる条件を決定した。これらの試験（実施例1〜5）はナノ粒子コアを形成するためのtRNAおよびPEI、ペイロードとしてのDNAおよびYCWPの内側に閉じ込められたDNAペイロードをコーティングして保護するためのPEIを使用した。これらのポリマーの各々は、ローダミンを用いて蛍光標識し、これらの材料を用いて調製したナノ複合体は、各層の成分の結合を定量化するために使用した。
【０２７１】
実施例1:YCWP封入tRNA/PEIナノプレックスコアの形成および最適化
第1工程は、YCWP閉じ込めナノ複合体化コア形成を最大にするためにtRNA/PEI濃度を特性解析して最大化することであった。これらの実験では、YCWP封入tRNA:PEIナノ複合体は、ローダミン標識tRNAを使用して様々なPEI/tRNA比で調製した。YCWP封入ローダミン標識tRNAの蛍光は、YCWP内の不溶性PEI/tRNAナノ複合体の形成の結果として増加した。これらの測定値から、封入ナノ複合体内へtRNAを最適に組み入れるためには5以上のPEI/tRNA比が必要であると決定された。これらの比率では、50〜60％のtRNAがYCWP内にナノ粒子として有効に封入された。図2に示した結果は、200μgのYCWP粒子（1×107個）当たり30μgを超えるtRNAを含有するYCWP封入カチオン性ナノ複合体を調製することが可能であったことを示している。
【０２７２】
107 YCWP内のナノプレックスコア内に結合したtRNAの量は、表2に示したように0〜0.25の範囲内のtRNA:YCWP比で評価した。図2は、蛍光シグナルが各tRNA:粒子比を表している、ナノプレックスコア内のtRNAの対応する量を示している。tRNAは、試験したtRNA:粒子比にわたってYCWP封入ナノプレックス内に効率的に組み入れられた。YGP粒子は、それらのより大きな中空内腔に起因して、YGMP粒子より多くのtRNAをナノプレックス内に組み入れることができた。
【０２７３】
YCWPの内側のtRNA:PEIナノ複合体内のPEI組み入れを定量するために、様々なPEI/tRNA比を備えるコアを調製するために0.05のtRNA/YCWP比を選択した。図3の結果は、標識PEIを備えるYCWPナノ複合体化コアの蛍光は、5という低いPEI/tRNA比で飽和値に達することを示している。FACSによって生成された、粒子1個当たりのベースでのtRNAおよびPEIの結合に関するデータは、以下の実施例4に見いだすことができる。
【０２７４】
（表2）YCWPの内側でのtRNAナノプレックス形成を評価するために使用した調製物
2011517279.tif 000016
【０２７５】
107 YCWPの内側のtRNAナノプレックスコア内に組み入れられたPEIの量は、表2に示した調製物を使用して0.01の一定tRNA:YCWP比で測定した。図3に示したこれらの試験の結果は、10（w/w）のPEI-tRNA比まではtRNAナノプレックスコア内にPEIを効率的に組み入れられたことを示している。試験した全部の比率でより多くのPEIがYGMP粒子に結合したが、これは場合によってYGMP壁内の負電荷マンノプロテインへのカチオン性PEI結合に起因した。
【０２７６】
（表3）YCWPの内側でのtRNAナノプレックスコアへのPEI結合を評価するために使用した調製条件
2011517279.tif 000017
【０２７７】
これらの試験からの結果は、その後の層のためにYCWP内に十分な空間を残しながら、最大のDNA結合のために十分なカチオン性ナノ粒子表面積を提供するために、YCWP内に閉じ込められるtRNA/PEIナノ複合体コア形成の最適化を可能にした。ナノプレックスコア形成のための最適条件は、0.01〜0.05のtRNA/YCWP比および0.5より高いPEI/YCWP重量比を必要とした。
【０２７８】
実施例2:YCWP-tRNA/PEIナノ複合体コア上のDNA/PEI複合体形成についての蛍光分析
次の工程は、YCWP閉じ込めtRNA/PEI/DNA/PEIナノ複合体を形成するためにDNA結合およびPEIコーティングを最適化することであった。DNAは、高DNAレベルが必ずしも高いトランスフェクションレベルに移されなかったので、高いトランスフェクション効率を達成するために最適濃度範囲内で使用しなければならないことが観察された。DNA層をコーティングするためにPEI調製工程を最適化することもまた重要であった。PEIは、DNA層が細胞内に遊離する前に分解しないように保護するために、DNA層を完全にコーティングしなければならない。しかし、PEIは毒性であり、その濃度は毒性を低下させるために最小限に抑えられなければならない。
【０２７９】
0.05のtRNA/YCWP比および4のPEI/YP比を備えるYCWP:tRNA/PEIのYCWP調製物を、蛍光標識DNAを含有するサンプルを調製するために出発材料として使用した。ローダミン標識DNAは、0〜100μgのDNA/1×109個（粒子）の範囲にわたってこの調製物に加えた。PEIは次にDNA層をコーティングし、tRNA:PEIカチオン性コア表面からDNAが洗い流されるのを防止するために2.5のPEI/DNA比で加えた。図4は、超音波処理サケ精子DNA（約5kDa）を用いて調製したサンプルについて結合したDNAの量を示している。DNAは、試験したDNA濃度範囲にわたって効果的に結合した（80±10％）。比較すると、高分子量DNA（＞40kDa）は余り有効に結合していないが（40±15％）、これはYCWP親水コロイドマトリックスが高分子量DNA分子の浸透を部分的に排除することを示唆している（データは示していない）。これらの結果は、プラスミドサイズのDNAのDNA結合能力が約8μgのDNA/1×109個（粒子）（約4μgのDNA/mg（粒子））であることを示している。
【０２８０】
0.05のtRNA/YP比および4のPEI/YP比を備えるYCWP/tRNA/PEI粒子調製物を、封入ナノプレックスコアに結合するRho-DNAの量を定量するために使用した。Rho-DNAは、PEIコーティング前により低い粒子関連蛍光によって証明されたように、コアへ大まかに結合することが見いだされた。DNA層をコーティングするためにPEIを使用すると、封入コアに関連するDNAのパーセンテージは＞80％に増加した（図4）。
【０２８１】
実施例3:YCWP tRNA-PEI-DNA-PEIナノ複合体内の最終PEI層についての蛍光分析
保護捕捉ポリマー層を用いたDNA層のコーティングは、トランスフェクション効率を最大化するために重要である。DNA層に結合したPEIの量を様々なDNA濃度で測定した。
【０２８２】
0.05のtRNA/YP比、4のPEI/YP比および10μgのDNA/1×109個（粒子）（0.005のDNA/YP比）の定負荷を備えるYCWP/tRNA/PEI粒子調製物を使用して、封入ナノプレックスコアのRho-PEIコーティングの量を定量した。図5に示した結果は、PEIは、粒子の内側に捕捉されたローダミン-PEIについての蛍光応答がこのPEI/DNA比ではプラトーに達するので、3:1という低いPEI/DNA比で使用できることを示している。この3:1のPEI/DNA重量比は、約8のN/P比と同等である。25kDaのPEIについては、2.3:1の臨界的N/P比がDNA/PEIナノ粒子の形成のために報告されているが、6〜8のN/P比は細胞へのDNA送達中の効率的なDNA凝縮および保護のために必要な最小限であると考えられる。このため、YCWP内のDNA凝縮のために必要なN/P比は、DNA/PEIナノ粒子形成のために他の研究者によって報告された適正な範囲内に見いだされる。
【０２８３】
PEI吸着は、3:1（w/w）より高いPEI/DNA比で最大値に達すると決定された（図5）。
【０２８４】
実施例4:フローサイトメトリー（FACS）および蛍光顕微鏡検査による粒子1個当たりの分析
FACS測定値は、粒子1個当たりのベースでのtRNA、PEIもしくはDNA結合を定量するため、およびYCWP内のナノ複合体形成の均質性を評価するために様々なセットの滴定実験について入手された。この定量の例は、ナノ粒子コア形成について図6および7に提供されている。FACS結果は、YGP-tRNAに結合したローダミン標識PEIの蛍光が蛍光PEI/YGMP-tRNA比が増加するにつれて一様に増加することを示している（図6）。さらに、同一等級の最大蛍光応答は、1より大きいPEI/YCWP比について観察されており（図7）、これはバルク蛍光測定値を確証している。他の層の分析についても類似の結果が得られた（データは示していない）。図8は、0.05のYGMP/tRNA比でのRho-tRNA（パネルA）、および4のPEI/YGMP比でのRho-PEI（パネルB）についての最大応答を示している。YCWP-tRNA-PEIナノ複合体へのDNA結合は、FACSによる蛍光DNA結合後の粒子1個当たりのベースで評価した。FACS分析（図8、パネルD）は、＞95％の粒子がDNAに結合することを示している。YCWP-tRNA-PEI-DNA-PEIナノ複合体の最終PEI層の形成は、蛍光PEI結合後の粒子1個当たりのベースで評価した。FACS分析（図7、パネルE）は、＞85％の粒子がFACS分析によって検出されたレベルへPEIに結合することを示している。
【０２８５】
FACSの使用によって、本発明者らは粒子1個当たりのベースでtRNAおよびPEI結合を定量することができた。図8におけるRho-PEIについての結果は、YCWP内の均質なナノ複合体形成を証明している、増加しつつあるRho-PEI/YCWP-tRNA比に伴う蛍光の一様な増加を示している。1以上のRho-PEI/YCWP-tRNA比で、測定された蛍光は一定値に達するので、これはPEIについての飽和値を示している。これらの結果は、バルク蛍光測定から決定されたコア形成についての実験値を裏付けている。
【０２８６】
実施例5:インビトロでの細胞についてのトランスフェクション結果
トランスフェクション効率に封入DNA被覆ナノプレックスカチオン性コアのLbL組立てプロセスの最適化が及ぼす影響を、培養細胞へのプラスミドgWizGFPのYCWP媒介送達後に評価した。トランスフェクション実験は、NIH3T3-D1細胞を用いて実施した。この細胞系は、YCWPファゴサイトーシスを可能にする細胞表面dectin-1を発現する細胞を生成するためのdectin-1遺伝子の統合によるNIH3T3から引き出した。一定の4のPEI/YP比での様々なtRNA/YP比を備える数種の粒子調製物について評価した。2種のtRNA/YP比および一定の4のPEI/YP比を備える粒子調製物についてのトランスフェクション結果は、図9に示した。
【０２８７】
図9は、一貫して最高トランスフェクション結果を提供した2つの調製物についての様々なDNA負荷でのトランスフェクション結果を示している。最適化されたYCWP送達系で送達されたDNAは、0.05のtRNA/YGMP比を備えるYGMP調製物を使用した場合に、NIH3T3-D1を効率的にトランスフェクトする（50％を超える細胞は125ng DNA/1×105cellsによってトランスフェクトされた）。YCWPの内側に捕捉されていないDNA/PEIナノ複合体のトランスフェクション効率は、125ng/1×105cellsのDNA負荷でごくわずかであった。比較して、他のグループは、DNA/PEIナノ複合体を用いた効率的なトランスフェクションを報告したが、50％より高いトランスフェクションレベルを得るためにYCWP送達系を用いて必要とされた量と比較して少なくとも16倍の量の送達プラスミドDNA/細胞を必要とする。
【０２８８】
下記の実施例は、哺乳動物への核酸ペイロード物質のYCWP封入ナノ粒子送達の有効性を例示している。siRNAは注射および経口送達によってマウスに送達され、インビボでの標的遺伝子の発現をノックダウンすることができた。
【０２８９】
詳細には、これらの実施例は、インビトロおよびインビボのマウスマクロファージ内で遺伝子を強力にサイレンシングする封入siRNAナノ粒子の使用を証明している。この方法を使用すると、マイトジェン活性化プロテイン4キナーゼ4（MAP4K4）は炎症性応答の新規な媒介因子であることが証明されている。10μg/kgという少量のsiRNAの経口送達は、マウスにおける腹腔、脾臓、肝臓および肺から回収されたマクロファージ内でMAP4K4を枯渇させた。重要なことに、マクロファージ内のMAP4K4のサイレンシングは、腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン-1βの産生を阻害することによって、マウスをリポ多糖誘導性致死性から保護した。これらの結果は、ヒト疾患における炎症性応答を減衰させるためにsiRNAを経口送達するための新規な戦略を提供する。詳細には、この戦略は、インビボの組織へターゲティングするためにsiRNAの選択的で安全な送達を提供する。
【０２９０】
二本鎖RNAの短い配列は真核細胞における認識RNA転写産物の枯渇を誘発する可能性があるという発見は、遺伝子調節に関する本発明者らの理解を大きく拡大させた（Fire, A. et al. Nature 391, 806-11 （1998）参照）。RNA干渉（RNAi）による遺伝子サイレンシングの特異性および効力は、これらの作用を媒介する細胞機構によって促進される。治療用途のためには、二本鎖短鎖干渉RNA（siRNA）オリゴヌクレオチドは比較的に非毒性であり、高特異性のために容易に設計され、そして低分子薬物に結合するタンパク質をコードする遺伝子に制限する必要はない（Grimm, D. & Kay, M.A. J Clin Invest 117, 3633-41 （2007）; Elbashir, S.M. et al. Nature 411, 494-8 （2001）参照）。そこでRNAiは、タンパク質配列をコードする全ての遺伝子を標的とすることができる。さらに、siRNAは、二本鎖RNAの長い配列への細胞の曝露に結び付いたインターフェロン応答を最小限に抑えるように設計される（Bridge, A.J. et al., Nat Genet 34, 263-4 （2003）; Xiang, S. et al., Nat Biotechnol 24, 697-702 （2006）参照）。これらの特性にもかかわらず、siRNAのインビボ送達にとっての障害は依然として残っている。これらには、細胞外環境におけるsiRNAオリゴヌクレオチドの急速な分解、腎臓を通しての急速な排出、ならびに密着帯を貫通して細胞表面膜を越える透過性の低さが包含される（Xie, F. et al. Drug Discov Today 11, 67-73 （2006）; Sioud, M. & Sorensen, D.R., Methods Mol Biol 252, 515-22 （2004）参照）。創造的な努力は、これらの問題の一部を取り扱い、そして小数の臨床試験が進行中である（Akhtar, S. & Benter, I.F., J Clin Invest 117, 3623-32 （2007）参照）。しかし、当技術分野における重要な目標は、特異的標的組織および細胞タイプへsiRNA媒介性遺伝子サイレンシングを経口送達する技術を開発することである。
【０２９１】
実施例6〜15に記載した試験は、この目標を達成している。マクロファージは、関節リウマチ、結腸炎、およびアテローム硬化症などの主要疾患に結び付いた炎症性反応を制御するので、潜在的標的であると同定された。特殊宿主防衛細胞として、マクロファージは、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）およびインターロイキン-1ベータ（IL-1β）などの炎症性サイトカインの分泌を通しての発病に寄与する妥当性が確認された薬学的標的である（Duffield, J.S., Clin Sci （Lond） 104, 27-38 （2003）; Moghimi, S. et al. Pharmacol Rev 53, 283-318 （2001）参照）。マウスにおけるマクロファージへのsiRNAの経口送達を遂行するために、それらが腸壁内のパイアー斑内のM細胞を通って下にある腸管関連リンパ組織（GALT）まで通過することを可能にする明確な特性を有するβ1,3-D-グルカンのミクロンサイズの粒子を使用した（どちらも参照により全体として本明細書に組み入れられる、Beier, R. & Gebert, A., Am J Physiol 275, G130-7 （1998）; Hong, F. et al. J Immunol 173, 797-806 （2004）参照）。GALT内へのそのようなβ1,3-D-グルカン粒子のトランスサイトーシス後に、それらはdectin-1受容体および場合によってはその他のβグルカン受容体媒介性経路を介して常在マクロファージおよび樹状細胞による食作用を受ける（どちらも参照により全体として本明細書に組み入れられる、Herre, J. et al. Mol Immunol 40, 869-76 （2004）; Willment, J. et al. J Biol Chem 276, 43818-23 （2001）参照）。GALTマクロファージは腸から移動して、経時的には全身マクロファージの有意な部分が消化されたグルカン粒子を含有するように、他の細網内皮系組織に浸潤する。
【０２９２】
主としてβ1,3-D-グルカンから構成される中空で多孔性のミクロンサイズのシェルは、細胞質成分、ならびにその他の細胞壁多糖類を除去するために一連のアルカリ、酸、および溶媒抽出を用いてパン酵母を処置することによって調製した（参照により本明細書に全体として組み入れられる、図1c; Soto, E. & Ostroff, G.R., NSTI Nanotech 2007 Technical Proceedings 2, 378-381 （2007）参照）。そのような中空グルカンシェルは、径が約2〜4μである。レイヤー・バイ・レイヤーナノ粒子合成法を開発し、次に中空グルカンシェルにsiRNAを負荷し、図1cに示したようにβ1,3-D-グルカン封入siRNA粒子（GeRP）を産生した。最初に、アニオン性物質（RNA、DNAまたはその他の負電荷ポリマー）のナノ粒子コアは、カチオン性ポリマーを用いた静電ナノプレックス形成によってグルカンシェル内で合成する。グルカンシェルの内側での正荷電ナノコアは、GeRPを形成するためにアニオン性siRNAペイロード（任意でEndoporterと共に）を静電的に吸収する。次に、トランスフェクション物質としてその有効作用およびインビボでの相当に低い毒性のために選択された例えばPEIなどのカチオン性ポリマーの層が加えられる（Boussif, O. et al. Proc Natl Acad Sci USA 92, 7297-301 （1995）参照）。アニオン性siRNAおよびカチオン性PEIの追加の層は、単一および複数siRNAから構成される多層状GeRPを合成するために適用できる。GeRP内のアニオン性siRNAは、pH依存方法で静電相互作用を通してカチオン性ポリエチレンイミン（PEI）層間で結合している。マクロファージによるファゴサイトーシスを受けると、GeRPはエンドソーム区画へ移動し、そこで酸性pHが層の電荷を変化させる。これは、多孔性GeRP壁およびエンドソーム膜を通してマクロファージ細胞質内への多層状ナノ粒子複合体からのsiRNA遊離を促進する。
【０２９３】
マクロファージ内のsiRNA媒介性遺伝子サイレンシングのためのGeRP調製物を試験するために、マウス腹腔浸出液細胞（PEC）は、上記の材料および方法の項において記載したように、腹腔内（i.p.）チオグリコレート注射後に調製した。GeRP内に封入された様々のsiRNAを用いた予備実験は、一次マクロファージによるGeRPの広汎なファゴサイトーシスおよび有意な遺伝子サイレンシングを示した（例えば、図10のTNF-α siRNA参照）。
【０２９４】
実施例6:siRNA-含有蛍光YCWP（FITC-YCWP）のインビトロマクロファージ取込みおよびその後の遺伝子サイレンシング
10週齢のC57BL6/Jマウスに炎症性物質（チオグリコレート）をIP（腹腔内）注射した。注射の4日後、化学誘引性マクロファージを腹腔から単離し、平板培養した。プレートおよび赤血球に付着したマクロファージは、洗浄によって排除した。1×106cellsは、Map4k4、TNF-αおよびRIP140遺伝子に対して向けられた0.25μgまたは40pmolのsiRNAを含有する1×107 FITC-YCWP粒子（緑色蛍光色素を組み入れているYCWP）を用いて処置した。処置48時間後、共焦点分析は、一部分のマクロファージ上でAlexaFluor405プローブ（青色）に結合したマクロファージ特異的抗体F4/80を用いて実施した。蛍光顕微鏡検査は、青色標識マクロファージ内に局在する緑色蛍光を明らかにし、これはFITC-YCWPがマクロファージによって取り込まれて内在化していることを示した。
【０２９５】
マクロファージは、siRNA含有FITC-YCWPを用いた処置48時間後に採取した。全RNAは、リアルタイムPCRを用いて遺伝子発現を測定するために単離した。図11は、Map4K4、TNF-αおよびRIP140についての発現レベルの全部がSCRと比較して減少したことを示している（y軸:吸光度単位）。36B4遺伝子は、内部対照として使用した（データは示していない）。「Scr」は、任意の公知の遺伝子に対応しないランダム化RNA配列を含むスクランブルRNAiである。そこでscrRNAは任意の公知の遺伝子をノックダウンしないので、陰性対照として機能する。
【０２９６】
類似の結果は、特異的TNF-α siRNA（1）、
2011517279.tif 000018
を用いて得られた。1×106 PECは、40pmolのScrまたはTNF-α siRNAを含有する1×107 FITC-YCWP/GeRPを用いて処置した。全RNAは処置48時間後に採取し、TNF-αの発現についてRT-PCRによって分析した。図10は、TNF-α siRNA-GeRPが基底TNF-α mRNA発現（TNF-α siRNA配列1（TNF-α（1））およびTNF-α siRNA配列2（TNF-α（2）の両方について）を効果的にサイレンシングしたことを示している。
【０２９７】
この遺伝子サイレンシングの系は、次に候補細胞内シグナリングタンパク質がTNF-α発現を制御できるかどうか試験するために一次マクロファージで使用した。これらの1つは、本発明者らおよび他の研究者がTNF-αシグナリング自体を促進することを見いだした胚中心タンパク質キナーゼであるマイトジェン活性化プロテイン4キナーゼ4（MAP4K4）であった（それらの全部が参照により全体として本明細書に組み入れられる、Bouzakri, K. & Zierath, J.R., J Biol Chem 282, 7783-9 （2007）; Tesz, G.J. et al. J Biol Chem 282, 19302-12 （2007）; Yao, Z. et al. J Biol Chem 274, 2118-25 （1999）; Tang, X. et al. Proc Natl Acad Sci USA 103, 2087-92 （2006）参照）。これらの実験では、グルカンシェルは、緑色蛍光（FL）プローブを用いて最初に誘導体化した。それらには次に、上記の材料および方法の項で記載したように、GeRPを調製するためのレイヤー・バイ・レイヤー合成法を用いて、赤色蛍光プローブDy547に結合したスクランブル（Scr）またはMAP4K4 siRNA（l）
2011517279.tif 000019
を負荷した。PECは、インビトロでこれらの二重標識Scr siRNA-またはMAP4K4 siRNA含有GeRP（10:1の粒子対細胞比）、未負荷GePRまたはPBS（対照）とともに12時間インキュベートし、次にマクロファージ特異的F4/80-AlexaFluor405抗体で染色した。マクロファージの約90％は、フルオレセインまたはDy547-siRNA蛍光によって視認されるように、少なくとも1つのFL-GeRPを内在化させ、他方では大多数の細胞が複数のFL-GeRPを内在化させていた。MAP4K4 siRNAを含有するGeRPを使用して、MAP4K4 mRNAの70〜80％のノックダウンが、40pmolという少量のsiRNAを用いて106 PECで達成された（図12aおよびb:（パネルaでは1.6、4、40または80pmolのMAP4K4 siRNA（1）;パネルbでは40pmolのMAP4K4 siRNA（2））。MAP4K4 mRNAまたはTNF-α mRNAの発現レベルにおける有意差は、Scr siRNA含有GeRP、未負荷GeRPおよびPBSを用いて処置したマクロファージ間で見られなかった（対照:GeRPなし）（図12c）。
【０２９８】
実施例7:マウスにおけるFITC-YCWPの経口およびIP注射送達
10週齢のC57BL6/Jマウスは、3〜10日間にわたって毎日、IP注射による100μg（5×107）または強制経口投与による200μg（1×108）FITC-YCWPを用いて処置した。3または10日後、血液サンプルを採取し、脾臓を固定して染色した。脾臓組織サンプルは、ペルオキシダーゼに結合したF4/80マクロファージ特異的抗体を用いて染色し、蛍光について分析した。顕微鏡検査は、ペルオキシダーゼシグナルが、脾臓組織切片中に蛍光と共局在化することを明らかにした。
【０２９９】
処置の前後に採取した血液サンプルからの血漿中のTNF-α濃度を分析した。図13から明らかなように、対照FITC-YCWP（siRNA非含有）の投与に対して応答した血清中TNF-αレベル上で有意な作用は観察されなかった。
【０３００】
実施例8:IP注射されたsiRNA負荷FITC-YCWPを用いたMap4k4のインビボサイレンシング
10週齢のC57BL6/Jマウスに、0.25μg、0.825μgおよび2.5μgのスクランブル（対照）またはMap4k4 siRNAを含有する100μg（5×107）FITC-YCWPを3日間にわたり1日1回IP注射した。最終投与の24時間後、マウスにチオグリコレートをIP注射した。化学誘引性マクロファージは、チオグリコレート注射24時間後に腹腔から単離した。RNAは、全腹腔細胞（マクロファージおよび赤血球;データは図14に示されている）またはFACSによって分類されたFITC陽性細胞（図15）から単離した。Map4k4発現は、リアルタイムPCRを用いて測定した。36B4遺伝子は、内部対照として使用した。
【０３０１】
結果は、YCWPを用いた0.25μgおよび0.825μgのMap4k4 siRNAの送達が、腹腔細胞内のMap4k4発現を有意に減少させたことを示している。遺伝子発現を減少させることに最大量のsiRNAの低い有効性は、siRNA分野からのデータと一致している:細胞内へ（任意の手段によって）大量のRNAを送達することは、場合によってはRNAを分解するヌクレアーゼを活性化することによって、サイレンシング機序を妨害する細胞応答を誘引する。
【０３０２】
実施例9:IP注射されたsiRNA負荷FITC-YCWPを用いたMap4k4のインビボサイレンシングについての経時的変化の分析
10週齢のC57BL6/Jマウスに、0.25μgのスクランブルまたはMap4k4 siRNAを含有する100μg（5×107）のFITC-YCWPを3日間にわたり1日1回IP注射した。最終注射の1、2、3または7日間後、マウスにチオグリコレートをIP注射した。マクロファージは、チオグリコレート注射24時間後に腹腔および脾臓から単離した。図16は、この実験におけるマウスからの処置および細胞単離についての時系列を示している。付着したマクロファージおよび赤血球は、洗浄によって排除した。RNAは、リアルタイムPCRを用いてMap4K4を測定するために腹腔（図17）または脾臓マクロファージ（図18）から単離した。36B4遺伝子は、内部対照として使用した（図には示していない）。Map4k4発現は、腹腔マクロファージ内では8日間を通して、脾臓マクロファージ内では4日間まで減少した。
【０３０３】
MAP4K4発現をサイレンシングするためのMAP4K4 siRNA-GeRPの有効性についても、FL-GeRP内でのDy547標識MAP4K4 siRNAまたはScr siRNAのIP注射による送達後にマクロファージ内で試験した。以前の試験は、2×109個（中空グルカンシェル）/kgの1日3回のIP注射は、マウスにおけるマクロファージへの実質的送達を達成した（どちらも参照により全体として本明細書に組み入れられる、Beier, R. & Gebert, A., Am J Physiol 275, G130-7 （1998）; Hong, F. et al. J Immunol 173, 797-806 （2004）参照）。マウスを3日間にわたり1日1回、10μg/kgのDy547標識MAP4K4 siRNAまたはScr siRNAを2×109/kg（FL-GeRP）中でのi.p.注射によって処置し、次に第4日にチオグリコレートを用いて処置した（図19a）。蛍光顕微鏡検査は、PEC内の回収されたマクロファージ内のDy547-siRNA含有GeRPがMAP4K4 mRNAの30％ノックダウンを生じさせることを明らかにした（図19b）。これらの結果は、経口送達に類似して、GeRPのi.p.投与がインビボでのマクロファージ内の効率的な遺伝子サイレンシングを誘発することを証明している。
【０３０４】
実施例10:経口投与されたFITC-GPは、移動性GALTマクロファージによって取り込まれ、脾臓、肺および肝臓内に移動する
全身を通してマクロファージへ経口送達するためのグルカンシェルを試験するために、マウスには8日間にわたりFL-グルカンシェルを1日1回強制経口投与し、次に脾臓、肝臓、肺および骨格筋組織を獲得した（図20a）。組織切片を作製し、FL-グルカンシェルを含有するマクロファージの存在について蛍光顕微鏡によって分析した。これらの試験は、脾臓、肝臓および肺への蛍光細胞の広汎な浸潤を明らかにし、より高倍率ではFL-グルカンシェルを抱いていることを所見できた。これらの細胞は、F4/80抗体を用いてマクロファージとして同定された。対照的に、骨格筋の分析は、FL-グルカンシェル含有細胞の証拠をほとんど、または全く示さなかった。これらのデータは、GALT内のマクロファージが経口吸収されたグルカンシェルを内在化させ、腸から移動して全身にわたって様々な組織を浸潤させることを証明している。さらに、全身を通して、有意な比率のマクロファージが強制経口投与後の標識グルカンシェルを含有している。
【０３０５】
インビボでのsiRNAの経口送達媒介性遺伝子サイレンシングについてのGeRPを評価するために、マウスに、連続8日間にわたり1日1回強制経口投与によってFL-GeRP（4×109 FL-GeRP/kg）内に含有されたDy547-コンジュゲート化ScrまたはMAP4K4 siRNA（1）（10μg/kg）を与えた。マウスには次に第9日にチオグリコレートをi.p.注射し、PECを第10日に単離した（図20bに記載のプロトコル参照）。これらのマウスから回収したPECのマクロファージ特異的抗体F4/80-AlexaFluor405を用いた染色およびその後の蛍光顕微鏡検査は、Dy547-siRNAを含有するFL-GeRPは、実際にマクロファージによって効率的に取り込まれたことを明らかにした。付着性マクロファージ内のAlexaFluor405、FL、およびDy547蛍光シグナルの共局在化は、容易に観察された。顕著なことに、RT-PCRによって評価したMAP4K4 mRNA発現は、Scr siRNA-GeRPで処置された対照マウス由来のPECに比較してMAP4K4 siRNA-GeRPが強制経口投与されたマウスから単離されたPEC中での70％ノックダウンを明らかにした（図20c）。
【０３０６】
実施例11:強制経口投与によるsiRNA負荷FITC-YCWPを用いたインビボMap4K4サイレンシング
10週齢のC57BL6/Jマウスに、0.25μgのスクランブルまたは抗map4k4 siRNAを含有する200μg（1×108）のFITC-YCWPを8日間にわたり1日1回強制経口投与によって処置した。最終注射の24時間後、マウスにチオグリコレートをIP注射した。マクロファージは、チオグリコレート注射24時間後に腹腔、脾臓または肺から単離した。図20bは、処置および単離の時間経過を示している。付着したマクロファージおよび赤血球は、洗浄によって排除した。RNAは、リアルタイムPCRを用いてMap4K4発現を測定するために腹腔、脾臓または肺マクロファージから単離した。図21は、腹腔対脾臓マクロファージ内のmap4K4発現を比較しており、図22は、腹腔対肺マクロファージ内のmap4K4発現を比較している。36B4遺伝子は、内部対照として使用した（図示していない）。図は、siRNA負荷YCWPが経口送達された場合にマウスにおけるインビボマクロファージmap4K4発現を有意に抑制できることを示している。
【０３０７】
MAP4K4サイレンシングはさらにまた、プロトコル（図20b）の第10日にコラゲナーゼを用いて脾臓、肝臓、肺および骨格筋組織から細胞を分離させ、その後に富裕マクロファージ集団を単離することによって他の組織へ移動したマクロファージ内で分析した（方法の項参照）。MAP4K4 mRNAレベルにおける約50％、80％および40％の有意な欠失は、Scr siRNA-GeRPで処置された対照マウスに比較してMap4K4 siRNA-GeRPで処置されたマウスにおいて、脾臓、肝臓および肺組織各々から単離されたこれらのマクロファージ富裕細胞中で観察された（図20d）。しかし、骨格筋由来のマクロファージ内では、骨格筋で見いだされたFL-グルカン粒子含有マクロファージの欠如と一致して、MAP4K4発現に及ぼす作用は観察されなかった（図20d）。上記の実施例10において言及したように、蛍光標識GeRPが強制経口投与されたマウスの脾臓、肝臓および肺組織から単離したマクロファージはGeRPを含有することが所見されたが、GeRP含有マクロファージは、これらのマウス由来の筋組織サンプル中では検出されなかった。これらをまとめると、これらのデータは、GALT内のマクロファージが経口吸収されたGeRPを内在化し、siRNA媒介性遺伝子サイレンシングを受けて、腸から移動して全身にわたる組織を浸潤させることを示している。
【０３０８】
経口送達されたGeRPによる遺伝子サイレンシングは多重siRNAによって媒介され得ることを証明するために、本発明者らは、マウスにまた別のMAP4K4（MAP4K4 siRNA（2））を含有するGeRPを強制経口投与し、2つのTNF-α siRNAオリゴヌクレオチドがインビトロのマクロファージ上で有効であることが見いだされた（図10b〜c参照）。図20f〜hに示したように、これらの3つの他のsiRNAオリゴヌクレオチドを含有するGeRPの強制経口投与（各々個別に試験した）は、PECならびに脾臓、肝臓および肺から単離したマクロファージ富裕細胞内の同種遺伝子をサイレンシングすることに高度に有効であった。重要なことに、siRNAを含有するGeRP、またはsiRNAを含有していない（未負荷GeRP）のいずれかの強制経口投与は血清中のインターフェロンγレベルを変化させず（図20e）、これはインビトロでGeRPにより処置したマクロファージ内でのインターフェロン応答遺伝子の誘導の欠如と一致していた（図32）。肝酵素の血清中レベルもまた全部が正常範囲内にあり（AST＜255IU/L;ALT＜77IU/L）（Schnell, M.A. et al.. Hum Gene Ther 13, 155-61 （2002）参照）、いずれの処置の影響もほとんど見られなかった（図33）。他の実験は、未修飾siRNAを用いた遺伝子サイレンシングは、これらの実験条件下でGeRPの経口投与の終了後に約8日間持続することを示した（図示していない）。そこで、本発明者らは、経口送達されたGeRPを用いて4種のsiRNA配列を備える2つの遺伝子の効率的なノックダウンを証明した。
【０３０９】
実施例12:腹腔マクロファージによるTNF-α発現にMAP4K4発現サイレンシングが及ぼす作用
インビトロでのマクロファージ炎症性応答にMAP4K4サイレンシングが及ぼす作用を試験する際に、マクロファージをグラム陰性菌の外膜の主要構造成分であるリポ多糖（LPS）で刺激した。LPSは、単球およびマクロファージを活性化して、内因性炎症媒介因子として作用する例えばTNF-αおよびIL-1βなどのサイトカインを産生する（Beutler, B, et al. J Leukoc Biol 74, 479-85 （2003）参照）。
【０３１０】
10週齢のC57BL6/JマウスにチオグリコレートをIP注射した。注射の4日後、化学誘引性マクロファージを腹腔から単離し、平板培養した。付着したマクロファージおよび赤血球は、洗浄によって排除した。1×106cells（PEC）は0.25μg、または40pmolのsiRNA（スクランブル、抗TFN-α（1）または抗map4K4）および1μg/mLのリポ多糖を含有する1×107個のsiRNA負荷FITC-YCWP粒子（GeRP）により6時間にわたり処置した。細胞は、48時間後に採取し、RNAは、リアルタイムPCRを用いてTNF-α発現を測定するために単離した。36B4遺伝子は、内部対照として使用した。図25から明らかなように、抗TNF-αまたは抗map4K4 siRNA粒子のいずれかを摂取したマクロファージ内のリポ多糖誘起TNF-α産生は、陰性対照（スクランブル）siRNA粒子を摂取した細胞内で見られた産生の1/3に過ぎなかった。
【０３１１】
第2実験では、細胞（PEC）は48時間にわたり40pmolのScrまたはMAP4K4 siRNAを含有するGeRPとともにインキュベートし、次にさらに6時間にわたり食塩液またはLPSを用いて処置し、その後に全mRNAを採取して、RT-PCRによって分析した。TNF-α mRNAレベルは、Scr siRNAを含有するGeRPに比較してMAP4K4 siRNA含有GeRPを用いて処置した対照細胞中では40％減少した。重要なことに、MAP4K4サイレンシングはほぼ50％までLPS誘導性TNF-α発現を阻害したが（図24a）、同一プロトコルを用いたMAP4K4に対する第2 siRNA配列の使用はより一層強固なノックダウンをもたらす（図24b）。このノックダウンレベルはTNF-α自体に対してsiRNAを用いて達成されたレベルに匹敵する（図10）。PEC内のMAP4K4サイレンシングはLPS誘導性TNF-αタンパク質分泌の平均30％減少を生じさせた（下記の実施例13参照）。しかしScr siRNAを備えるGeRP、未負荷GeRP（tRNA/PEIコアを含有するがsiRNAを含有していないGeRP）またはPBS（GeRPなし）は、TNF-αの発現（図12c参照）または分泌（図26b）に影響を及ぼすことができず、これらの対照実験もまた、インターフェロン応答遺伝子の発現には影響を及ぼせなかった（図32）。
【０３１２】
追加の実験では、PECは、40pmolのScr（1）またはMAP4K4（1）siRNAならびに様々な濃度のLPS（0、0.05、0.1、1および10μg/mL）を含有するGeRPとともにインキュベートした。TNF-α発現は、0.1μg/mLおよび上記のLPS濃度でのMAP4K4発現によって減少した（図24c）。しかしTNF-α分泌における減少は、0.05μg/mLの最小LPS濃度で見られた（図24d）。Scr（1）またはScr（2）siRNAによる処置は、MAP4K4またはTNF-αの発現レベルに影響を及ぼさなかった（図24e）。
【０３１３】
実施例13:血清中のTNF-αタンパク質にMAP4K4サイレンシングが及ぼす作用
10週齢のC57BL6/JマウスにチオグリコレートをIP注射した。注射の4日後、化学誘引性マクロファージは、腹腔から単離し、平板培養した。付着したマクロファージおよび赤血球は、洗浄によって排除した。1×106cellsは、0.25μgまたは40pmolのsiRNA（スクランブル、抗TFN-αスマートプールまたは抗map4K4）および1μg/mLのリポ多糖を含有する1×107個のsiRNA負荷FITC-YCWP粒子（GeRP）により6時間にわたり処置した。媒質サンプルは、ELISA TNF-αアッセイを用いてTNF-αレベルを測定するために48時間後に採取した。図26は、処置したマクロファージによる細胞培養培地中へ分泌されたTNF-αの濃度（fg/mL）を示している。抗TNF-αまたは抗map4K4 siRNAのいずれかを含有するYCWPによる処置は、TNF-α発現を有意な量まで、対照測定値の約70％へノックダウンさせた。
【０３１４】
細胞を48時間にわたり40pmolのScrまたはMAP4K4 siRNAを含有するGeRPにより処置し、その後さらに6時間にわたり食塩液またはLPSにより処置すると、MAP4K4、LPS誘導性TNF-αタンパク質分泌の平均30％の減少が観察された（図26a）。未負荷GeRPおよびPBS（図26b）ならびに中空グルカンシェル（データは示していない）は、TNF-α分泌により測定されたようにインビトロでの炎症性応答を引き出すことができなかった。
【０３１５】
実施例14:MAP4K4サイレンシングはMAPキナーゼおよびNFκBシグナリング経路のLPS活性化に影響を及ぼさない
cJUN-n末端キナーゼ1および2（JNK1/2）、細胞外シグナル関連キナーゼ1/2（ERK1/2）、p38 MAPKおよびNFκB経路は様々な細胞タイプにおけるTNF-α産生を調節する（Hacker, H. & Karin, M., Sci STKE 2006, rel3 （2006）; Aouadi, M. et al. Biochimie 88, 1091-8 （2006）参照）。興味深いことに、MAP4K4は、JNK1/2、p38、ERK1/2およびNFκB経路とは無関係にTNF-α発現を活性化する炎症促進性経路を規定することが見いだされた（図27a〜g）。MAP4K4のサイレンシングは、JNK1/2、p38およびERK1/2、ATF2、またはcJunの発現またはリン酸化に影響を及ぼさなかった。同様に、LPSに応答したNFκB経路調節因子であるIkBαの分解へのMAP4K4枯渇の作用は全く観察されなかった。そこで、一次マクロファージ内のMAP4K4ノックダウンは、TNF-α発現の阻害にもかかわらず、これらのタンパク質キナーゼのLPS誘導性リン酸化、またはIkBαのLPS誘導性分解に影響を及ぼすことができなかった（図27a〜g）。これらのデータは、MAP4K4が、TNF-αの作用を媒介することにおける以前より公知の役割に加えて、LPS誘導性マクロファージ炎症性応答におけるTNF-α発現の抑制にとって新規な標的であることを証明している。
【０３１６】
実施例15:抗map4K4 siRNA含有YCWPの経口送達後のマウスへのリポ多糖惹起投与
MAP4K4はインビトロでマクロファージによってTNF-α発現および分泌を制御するので、MAP4K4 siRNA-GeRPの経口送達がマウスにおいてサイトカイン産生およびLPS誘導性致死率を減衰させるかどうかを試験するためにプロトコルを設計した（図28a）。予備実験は、強制経口投与またはi.p.投与いずれかによる中空グルカンシェルを用いた3または10日間の処置が血清中TNF-αレベルに及ぼす作用はないことを明らかにした（図13）。注目すべきことに、PEC中のTNF-α発現の80％減少が、MAP4K4 siRNA対Scr siRNAを含有するGeRPを強制経口投与されたマウスにおいて観察された（図28b）。これには炎症性サイトカインIL-1βの同等に劇的な80％ノックダウンが付随したが、IL-10またはLPSによってダウンレギュレートされることが公知のケモカイン受容体CCR2のノックダウンは付随しなかった（Martinez, F. et al. Front Biosci 13, 453-61 （2008）; Zhou, Y. et al. J Leukoc Biol 65, 265-9 （1999）参照）。これらの結果は、MAP4K4 siRNAを含有するGeRPの経口送達を通してのMAP4K4のサイレンシングは、インビボのマクロファージ内で炎症性サイトカインTNF-αおよびIL-1βの発現を強力にダウンレギュレートすることを示している。重要なことに、MAP4K4 siRNAとは相違して、TNF-α siRNAはマクロファージ内のIL-1βの発現をサイレンシングせず、MAP4K4ノックダウンへのこの応答の特異性を証明している（図28e:MAP4K4 siRNAはTNF-αおよびIL-1β発現の両方をノックダウンする;図28fおよび28g:TNF-α siRNAはIL-1β発現をノックダウンできない）。
【０３１７】
次に、強力な炎症性応答を誘発することが公知であるLPSおよびD-ガラクトサミン（D-GalN）の注射によりマウスに惹起投与した後に、循環中TNF-αタンパク質レベルを測定した。10週齢のC57BL6/Jマウスを、0.25μgの抗map4k4 siRNAを含有する200μg（1×108）のFITC-YCWPを8日間（第1日〜第8日）にわたり1日1回強制経口投与によって処置した。第8日に、マウスには単回用量のD-ガラクトサミン（25mg/マウス）をIP注射し、次にP.ジンジバリス（gingivalis）LPS（0.25μg/マウス）をIP注射した。全動物は、LPS/D-GalN惹起投与後24時間にわたりLPS誘導性D-ガラクトサミン依存性致死率について継続的に監視した（1処置群当たりn＝6）。致死率は、24時間にわたり1時間毎または2時間毎に評価した。以前の報告に一致して（Endo, Y. et al. Br J Pharmacol 128, 5-12 （1999）参照）、本発明者らは、循環中TNF-αレベルがLPS/D-GalN注射の1.5時間後に強度に上昇し、その後、4時間後には基底レベルへ減少した。MAP4K4 siRNA含有GeRPの経口送達は、LPS/GalN注射によって誘導された血清中TNF-αタンパク質の上昇を遮断した。これらのマウスでは、D-GalN/LPS注射1.5時間後に腹腔液内のTNF-αレベルの有意な減少もまた観察された（図28c）。これらのデータは、GeRPの経口送達を通してのMAP4K4 mRNAの枯渇による炎症性刺激へのTNF-α応答の著しいダウンレギュレーションを証明している。
【０３１８】
LPS/D-GalN惹起投与された動物において観察された致死率は炎症性サイトカインの毒性に帰せられ、相互に相乗作用するTNF-αおよびIL-1βの投与によって模倣することができる（Okusawa, S. et al. J Clin Invest 81, 1162-72 （1988）参照）。さらに、TNF-α受容体TNFRp55が欠如するマウスならびにTNF-αおよびIL-1β遊離が欠損するマウス（C3H/HeJ）はLPS誘導性致死性に耐性である（Pfeffer, K. et al. Cell 73, 457-67 （1993）; Poltorak, A. et al. Science 282, 2085-8 （1998）参照）。正常マウスは、さらにまたTNF-αおよび/またはIL-1β作用または遊離を選択的に阻害する物質によって致死性内毒素血症から保護することもできる（どちらも参照により全体として本明細書に組み入れられる、Novogrodsky, A. et al. Science 264, 1319-22 （1994）; Maruyama, H. et al. Shock 13, 160-5 （2000）参照）。このため、そのような保護が、図28aにおけるプロトコルを用いてMAP4K4 siRNA-GeRPの経口送達によって誘発されるかどうかについて試験した。Scr siRNAまたはMAP4K4 siRNA GeRP（10μgのsiRNA/kg）を用いた8日間にわたる1日1回の強制経口投与後に、マウスには25mgのD-GalN、その後に0.25μgのLPSをi.p.投与した。図29に示したように、Scr siRNA含有GeRPにより処置された対照マウスの90％は4〜8時間の間に死亡した（すなわち、対照Scr siRNAを備えるYCWPが投与されたマウスは全部がLPS惹起投与後7時間を超えて生存しなかった）。これとは対照的に、MAP4K4（1）siRNAを含有するGeRPにより処置されたマウスの50％は、LPS/D-GalN注射後8時間にわたり生存した。抗map4K4 YCWPが与えられたマウスの3分の1（約40％）は惹起投与後24時間にわたりLPS惹起投与を生き延び、非生存動物についての死亡までの時間は対照動物と比較して延長された（表4）。
【０３１９】
（表4）PBS、ScrまたはMAP4K4 siRNA-GeRPを用いて処置されたマウスのLPS惹起投与後の生存率
2011517279.tif 000020
【０３２０】
Scr対MAP4K4 siRNAの投与間のこの差は、Kaplan-Meier分析およびMantel-Cox検定を用いると高度に統計的有意であった（p＜0.01）（表5）。
【０３２１】
（表5）LPS/D-ガラクトサミン惹起投与におけるScrおよびMAP4K4 siRNA-GeRP処置間の生存確率の質についての統計試験
2011517279.tif 000021
【０３２２】
その後の実験は、LPS誘導性TNF-α産生からの保護およびMAP4K4（2）siRNAおよびTNF-α siRNAによるインビボ致死率を証明した。上述したように、マウスにはsiRNA-GeRPを強制経口投与した。最終強制経口投与の4時間後、マウスにD-GalNをi.p.注射し、次にLPSのi.p.注射を続けた。図30aは、LPS/D-GalN注射の1.5および4時間後にsiRNA処置されたマウスにおける血清中TNF-αレベルを示しており、MAP4K4（2）siRNAがTNF-α産生の最強の抑制を示している。結果は、平均値±SEMである（n＝5）。統計的有意性は、ANOVAおよびTukey事後検定によって決定した;＊p＜0.05。図30bは、siRNA-GeRPを用いて経口処置し、次にLPS/DGalN注射によって処置されたマウスの生存率を示している。Scr siRNAを含有するGeRPで処置されたマウスは、7時間さえ生存しなかった。
【０３２３】
図31は、未負荷GeRP（tRNA/PEIコアを含有するがsiRNAを含有していない）またはスクランブルsiRNAが負荷されたGeRPは、インビボでのLPS誘導性TNF-α産生および致死率に影響を及ぼさないことを示している。マウスに、未負荷GeRPまたは10μg/kgのScr siRNAが負荷されたGeRPを強制経口投与した。最終強制経口投与の4時間後、マウスにD-GalNをi.p.注射し、次にLPSのi.p.注射を続けた。TNF-αレベルは図31aに示し、LPS/D-GalN注射の1.5および4時間後に測定した。結果は、平均値±SEMである（n＝5）。統計的有意性は、ANOVAおよびTukey事後検定によって決定した。図31bは、Scr siRNA負荷GeRP、未負荷GeRPおよびPBS（GeRPなし）を用いて経口処置され、次にLPS/D-GalNが注射されたマウスの生存率を示している。生存率は、24時間にわたり1時間毎に評価した。Scr siRNA負荷GeRPおよび未負荷GeRPによる処置は、生存時間に影響を及ぼさなかった。
【０３２４】
マウスモデルでは、LPS/D-GalN惹起投与の致死作用は、肝細胞アポトーシスに起因することが明確に認められた（Silverstein, R.J Endotoxin Res 10, 147-62 （2004）参照）。そこで、本発明者らは、D-GalN/LPS注射の4および28時間後に、ScrまたはMAP4K4 siRNA-GeRPを用いて処置されたマウスの肝臓内でのアポトーシスを検出するためにTUNELアッセイを使用した。TUNELアッセイは、LPS/D-GalN注射の4および28時間後にマウス由来の肝組織学検査切片上で実施した。LPS注射に応答した肝細胞アポトーシスは、MAP4K4 siRNA-GeRPによって強度に減衰させられた。それゆえ、MAP4K4 siRNA-GeRPの強制経口投与によるMAP4K4発現のサイレンシングは、マクロファージ内のTNF-αおよびIL-1β産生の阻害を通してマウスをGalN/LPS誘導性致死性から有意に保護する。
【０３２５】
本明細書に記載したGeRP送達系の幾つかの技術的特徴は、注目に値する。極めて顕著なことに、GeRP内の10μgのsiRNA/kgが遺伝子サイレンシングを媒介するインビボ効力は、静脈内注射による全身性送達を報告している以前の試験より10〜500倍高い。インビボでの有意な作用のためには、siRNA調製物の静脈内注射は、マウスにおいて125μg/kg〜50mg/kgの範囲内（これにより全体として参照により本明細書に組み入れられる、Filleur, S. et al. Cancer Res 63, 3919-22 （2003）; McCaffrey, A.P. et al. Nature 418, 38-9 （2002）; Peer, D. et al. Proc Natl Acad Sci USA 104, 4095-100 （2007）; Song, E. et al. Nat Biotechnol 23, 709-17 （2005）; Soutschek, J. et al. Nature 432, 173-8 （2004）; Wesche-Soldato, D.E. et al. Blood 106, 2295-301 （2005）参照）および非ヒト霊長類においての1mg/kg（Zimmermann, T.S. et al. Nature 441, 111-4 （2006）参照）の用量を必要とする。i.p.注射によってマウスにおけるLPS誘導性致死率を軽減するためには、1.2mgのTNF-α siRNA/kgが必要とされた（参照により全体として本明細書に組み入れられる、Sorensen, D.R. et al. J Mol Biol 327, 761-6 （2003）参照）。これらの試験は、一般には安定性を増強するために化学修飾されたsiRNAを使用した。GeRP（10μg/kg）内の経口送達されたsiRNAの高効力は、本発明者らの試験では未修飾siRNAが使用されたので、一層驚くべきことである。この高効力は場合によってGeRP内のPEIによるヌクレアーゼ分解に対するsiRNAの保護、腸のパイアー斑への途上のGeRPの非特異的結合およびGALT内の食細胞によるGeRP取込みの高効率に帰せられる。さらに、グルカンシェルの中空腔内のsiRNA負荷能力は本発明者らが本明細書において使用した能力よりはるかに高く、siRNA、DNA、タンパク質および低分子の組み合わせを経口共送達する能力を有している。潜在的に、GeRPはマクロファージおよび樹状細胞から隣接細胞へのsiRNAの移動を促進し、そこで多数の組織および細胞タイプにおいて遺伝子サイレンシングを実行するように修飾できよう。
【０３２６】
TNF-αまたはMAP4K4に対するsiRNAのGeRP媒介性送達によってのLPSへのマクロファージ炎症性応答の強力な低減を示している本試験の結果は、有意な治療上の意味を有している。詳細には、炎症性サイトカインおよびTNF-αはヒトにおいて病原性であり、注射可能な抗TNF-αタンパク質治療薬は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、クローン病、および乾癬を治療するために認められた市販の製剤である（Shealy, D.J. & Visvanathan, S. Handb Exp Pharmacol, 101-29 （2008）参照）。マクロファージ媒介性病因は、肥満症関連性インスリン耐性（Ferrante, A.W., Jr. J. Intern Med 262, 408-14 （2007）参照）およびアテローム硬化症（Hansson, G.K. & Libby, P. Nat Rev Immunol 6, 508-19 （2006）参照）のマウスモデルにおいても明確に特性付けられているが、例えば1型糖尿病などの自己免疫疾患は、炎症性サイトカインの有害作用を含んでいる（Shoda, L.K. et al. Immunity 23, 115-26 （2005）; Koulmanda, M. et al. Proc Natl Acad Sci USA 104, 13074-9 （2007）参照）。siRNAのGeRP媒介性送達による炎症の変調は、これらやその他のヒト疾患にとって有益な可能性がある。
【０３２７】
実施例16:2型糖尿病におけるsiRNA治療薬に対する標的としてのMAP4K4およびaP2の使用:
脂肪組織のマクロファージ浸潤は、肥満症のヒトにおける2型糖尿病の進行における重要な事象であることが証明されている。マクロファージによって誘発された炎症は、異常な耐糖能および糖尿病を駆動する脂肪組織および骨格筋におけるインスリン耐性に寄与する。GeRP内に負荷されたMAP4K4 siRNAはマクロファージからの基底およびLPS刺激TNF-α産生の両方を効果的に低下させ、炎症を減少させる。実験は、2型糖尿病に対する潜在的治療標的としてのMAP4K4を評価するために実施された。
【０３２８】
全身代謝およびインスリン感受性を改善するGeRP媒介性遺伝子ノックダウンの能力を試験するために、インスリン耐性の高速の発生を示す遺伝的に肥満症のレプチン欠損性（ob/ob）マウス（8週齢まで）を使用した。多数の様々な遺伝子および遺伝子産物がob/obモデル系を用いて肥満症に関連付けられてきた。例えば、肥満症の発生は増加した脂肪TNF-αレベルと関連しており、TNF-αに対する中和抗体の利用はob/obモデル系におけるインスリン感受性を改善し、炎症性マーカーを低下させた。このモデルによって関係付けられてきたインスリン感受性を増加させるための追加の治療標的は、タンパク質aP2を包含している。以下の実験は、aP2および/またはMAP4K4発現を軽減し、インスリン耐性を軽減するためにGeRPを使用するように設計された。
【０３２９】
結果
GeRPのi.p.注射は内臓脂肪マクロファージを標的とする:GeRPのi.p.注射が脂肪およびその他の組織中のマクロファージ集団をターゲティングしていたかどうかを決定するために、組織を、未負荷の蛍光標識GeRPの8日間の1日1回注射（1.25×109 GeRP/kg/日）後にレプチン欠損性の遺伝的に肥満症（ob/ob）マウスから単離した。組織を採取し、単細胞懸濁液はコラゲナーゼ消化および濾過を通して調製した。単球は、抗F4/80抗体を用いて単球/マクロファージマーカーF4/80について染色し、経口活性化細胞（FAC）分析によって分析した。GeRPの大多数は、精巣上体脂肪パッドの間質血管分画内のマクロファージ内で出現した。
【０３３０】
MAP4K4およびaP2 siRNAを含有するGeRPは精巣上体脂肪組織中での標的遺伝子発現をサイレンシングする:遺伝子サイレンシングの効率を評価するために、マクロファージをGeRPのi.p.投与後の様々な組織から単離した。
マウスに、スクランブルされたMAP4K4 siRNAまたはaP2 siRNA（10μg/kg）を含有する未負荷のGeRP（1.25×109GeRP/kg/日）を8日間にわたり注射した。組織マクロファージは第10日にコラゲナーゼ消化によって（200RPMで攪拌しながら、5mg/mL、37℃で）単離し、75μフィルターに通して濾過し、遠心分離によって濃縮し、血清無含有DMEM中で3時間にわたり平板培養によって濃縮した（図34a）。接着細胞は、トリゾールを用いて採取し、MAP4K4（図34b）およびaP2（図34c）の発現は、リアルタイムPCRによって測定した。
【０３３１】
MAP4K4 GeRPの投与は、精巣上体（Epi）脂肪組織マクロファージ内のMAP4K4発現をサイレンシングしたが、皮下（SubQ）脂肪組織から得られたマクロファージはサイレンシングしなかった（図34b）。aP2 siRNA含有GeRPの投与は、皮下および精巣上体マクロファージ内のaP2発現をサイレンシングした（図34c）。
【０３３２】
ob/obマウスにおけるインスリン耐性を減衰させるためのGeRPの投与:次にインスリン耐性を減衰させることにおけるGeRP処置の有効性を評価した。マウスは、図35aに示したように処置した。手短には、全身糖感受性を評価するために8週齢マウスにおいて糖耐性を評価した。マウスにはグルコース（1g/kg）を注射し、血糖レベルの変化を監視した。予想通りに、ob/obマウスは、痩せた同腹子より有意に耐糖能異常であった（図35b）。耐糖能試験後に、マウスにはMAP4K4またはaP2を標的とするスクランブルsiRNAまたはsiRNAのいずれかを含有するGeRPを投与した。マウスに、10μg/kgの適切なsiRNAを含有する1.25×109GeRP/kgを8日間にわたりi.p.注射した。8日間のi.p.注射後、第9日に第2回耐糖能試験を実施した（図35cおよび35d）。
【０３３３】
MAP4K4 siRNA GeRP処置に応答した糖感受性の増加は有意であり、aP2 siRNA負荷GeRPの作用はより実質的であった。これらの実験は、マクロファージへのsiRNAのGeRP送達が糖感受性を改善するための潜在的機序であることを示している。
【０３３４】
結論:aP2およびMAP4K4に対するsiRNAが負荷されたGeRPの送達は、インスリン感受性を改善することが証明された。これらの結果は、GeRPを利用するとaP2のような確立された標的を用いて代謝性疾患およびその症状（例えば、耐糖能異常）を治療するために利用できること、そしてMAP4K4の減衰はインスリン感受性を増強することを証明している。
【０３３５】
実施例17:aP2ノックダウンが炎症性マーカーに及ぼす作用
aP2 siRNAのインビトロでのPECのGeRP送達および強制経口投与によって媒介されるaP2ノックダウンの作用を試験した。
【０３３６】
aP2 siRNA、Scr siRNA（（1）もしくは（2）のいずれか）またはMAP4K4（1）siRNAが負荷されたGeRP、あるいは未負荷GeRPを上記で詳述したように抽出したPECとともにインキュベートした。図36aから明らかなように、aP2 siRNAを運ぶGeRPを用いて処置されたPECだけがaP2遺伝子発現のノックダウンを示したが、Scr siRNA GeRPで処置されたPECまたは未負荷GeRPはノックダウンを示さなかった。図36bでは、40pmolのaP2 siRNA、Scr siRNA（（1）もしくは（2）のいずれか）またはMAP4K4（1）siRNAを運ぶGeRPによる処置がPECに及ぼす作用が示されている。MAP4K4およびaP2 siRNAは、インビトロでPEC内のそれらの各遺伝子をノックダウンした。図36cでは、siRNAを運ぶGeRPが、LPS処置を用いて、または用いずのいずれかで、インビトロでのPECによるTNF-α産生に及ぼす作用が示されている。MAP4K4 siRNAだけが、両方の条件下で、インビトロでのPEC内のTNF-α発現を有意にノックダウンする能力を証明した。図36dはこの所見を確証しており、MAP4K4 siRNAを運ぶGeRPを用いて処置されたPECだけがTNF-α分泌の減少を示すことを証明している。
【０３３７】
aP2 siRNAまたはScr siRNAが負荷されたGeRPは、強制経口投与により送達され（8日間にわたり1日1回、10μg/kg ScrまたはaP2 siRNA）、第9日にチオグリコレートが注射され、次にPECが第10日に単離された。図37aは、処置されたマウスから回収されたPEC中でのaP2、MAP4K4、ACRP30、CCR2、TNF-αおよびPPAR-γ発現の分析を示している。結果は、平均値±SEMである（n＝3）。aP2の発現は、有意な減少を示した。＊（p＜0.03）。
【０３３８】
GeRPがインビボのTNF-α分泌に及ぼす作用を試験するために、マウスには10μg/kgのScrまたはaP2 siRNAが負荷されたGeRPを強制経口投与した。siRNA処置マウスにおける血清中TNF-αレベルをELISAによってLPS/D-GalN注射の1.5および4時間後に測定し（n＝6）、図37bに示した。aP2 siRNAが負荷されたGeRPによる処置は、血清中TNF-αレベルへの作用を及ぼさなかった。
【０３３９】
統計的有意性は、図37aについては両側StudentのT検定によって、そして図37bについてはANOVAおよびTukey事後検定によって決定した。
【０３４０】
同等物
本明細書では、所定の実施例および態様だけを参照しながら本発明について記載してきた。本発明の全ての考えられる実施例および態様を徹底的に説明するための努力はされていない。実際に、当業者であれば上記の実施例および態様に、以下の特許請求項に言及した本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な追加、削除、修飾および他の変更を加えられることを理解する。そのような全ての追加、削除、修飾および他の変更を以下の特許請求項の範囲内に包含できることが意図されている。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２０ｄ】
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【図２０ｅ】
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【図２０ｆ】
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【図２０ｇ】
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【図２０ｈ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２４ｄ】
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【図２４ｅ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【図２７ｃ】
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【図２７ｄ】
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【図２７ｅ】
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【図２７ｆ】
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【図２７ｇ】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２８ｃ】
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【図２８ｄ】
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【図２８ｅ】
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【図２８ｆ】
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【図２８ｇ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６ａ】
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【図３６ｂ】
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【図３６ｃ】
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【図３６ｄ】
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【図３７】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月29日(2010.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011517279000001.app
【国際調査報告】
2011517279.tif 000088
2011517279.tif 000089
2011517279.tif 000090
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