(57)【要約】本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡの発現方法に関し、具体的にはＰＡをＮ末端前２５６位アミノ酸及びＣ末端第２５７−７１６位アミノ酸ポリペプチド断片のようにＮ末端とＣ末端両部分に分け、そして別々にＮ末端前２５６位アミノ酸及びＣ末端第２５７−７１６位アミノ酸ポリペプチド断片を発現する方法；及びＰＡのＣ末端第２５７−７１６位アミノ酸断片とインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１のＮ末端オリゴペプチドの発現、共精製と共結晶化の方法；及びＰＡのＣ末端第２５７−７１６位アミノ酸断片とインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１のＮ末端オリゴペプチドの共発現、精製と共結晶の方法；及びＰＡ第２５７−７１６位残基断片とＰＢ１のＮ末端オリゴペプチドの複合体の結晶体構造及び結晶体構造の薬物選別並びに薬物設計における応用に関する。【選択図】図５
2011515074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造であって、前記インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣは前記インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡの約２０１〜約３０１位アミノ酸から約６５０〜末端のアミノ酸までであり、前記ＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎは前記インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎの４８個以内のアミノ酸のオリゴペプチドであり、前記結晶体三次元構造中の原子は表１中で挙げた少なくとも４０％の原子座標を持ち、又はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造中少なくとも４０％のアミノ酸の主鎖炭素骨格の原子構造座標と表１中の座標の平均二乗偏差が１．７Å以下である、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造。
【請求項２】
前記インフルエンザ・ウイルスはＡ、Ｂ、Ｃ型インフルエンザ・ウイルスより選択され、好ましくは、前記インフルエンザ・ウイルスはＡ型インフルエンザ・ウイルス株：Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６、Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８；Ｂ型インフルエンザ・ウイルス株：Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／１９６６又はＣ型インフルエンザ・ウイルス株：Ｃ／ＪＪ／１９５０より選択される、請求項１に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造。
【請求項３】
前記複合体の結晶体はＰ４（１）２（１）２の空間群を持ち、格子定数は約α＝ｂ＝１２２Å、ｃ＝１３３Å、α＝β＝γ＝９０°である、請求項１又は２に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造。
【請求項４】
前記Ａ型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣはインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス４、即ち４０６−４１４位を含むアミノ酸領域、αへリックス５、即ち４４０−４５０位を含むアミノ酸領域、αへリックス８、即ち５８３−６０３位を含むアミノ酸領域、αへリックス９、即ち６０８−６１３位を含むアミノ酸領域、αへリックス１０、即ち６３３−６４９位を含むアミノ酸領域、αへリックス１１、即ち６５３−６７３位を含むアミノ酸領域、αへリックス１２、即ち６８３−６９１位を含むアミノ酸領域、とαへリックス１３、即ち６９８−７１４位を含むアミノ酸領域、及び二つのβシート：βシート８とβシート９、それぞれ６１９−６２３位を含むアミノ酸領域と６２８−６３１位を含むアミノ酸領域、がＰＡのＣ末端ＰＡＣの第一部分を構成し、Ａ型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣは主要なβシート折り畳み断片より成り、これらのβシートにはβシート１、即ち２９０−２９２位を含むアミノ酸領域、βシート２、即ち３１７−３２４位を含むアミノ酸領域、βシート３、即ち４８０−４９１位を含むアミノ酸領域、βシート４、即ち４９６−５０６位を含むアミノ酸領域、βシート５、即ち５１７−５２６位を含むアミノ酸領域、βシート６、即ち５４１−５５０位を含むアミノ酸領域、βシート７、即ち５５７−５７１位を含むアミノ酸領域などが含まれ、これらのβシートが共同でＰＡのＣ末端ＰＡＣ第二部分の折り畳みシート層の主な部分を構成し、前記Ａ型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣはαへリックス１、即ち３０３−３１１位を含むアミノ酸領域、αへリックス２、即ち３３１−３４９位を含むアミノ酸領域、αへリックス３、即ち３６４−３６９位を含むアミノ酸領域、αへリックス６、即ち４５４−４７５位を含むアミノ酸領域及びαへリックス７、即ち５７２−５７８位を含むアミノ酸領域、がＰＡのＣ末端ＰＡＣ第二部分の前記折り畳みβシート層の周囲を囲い、その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、請求項２に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造。
【請求項５】
Ａ型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣは主にαへリックス８、αへリックス１０、αへリックス１１とαへリックス１３を通してＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎ相互作用に関与し、好ましくは、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのαへリックス１１のＬｅｕ６６６、αへリックス１３のＰｈｅ７１０、αへリックス１０のＶａｌ６３６、Ｌｅｕ６４０、αへリックス１３のＴｒｐ７０６、αへリックス１１のＧｌｎ６７０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸をインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１との相互作用に関与させ、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、請求項２に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造。
【請求項６】
前記Ａ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス９とαへリックス１０の間の環状ペプチド・セグメントのＩｌｅ６２１、Ｇｌｙ６２２、Ｇｌｕ６２３、Ｔｈｒ６１８とＰｒｏ６２０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１との相互作用に関与させ、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、請求項２に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造。
【請求項７】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＡｓｎ６４７、Ｇｌｎ４０８、Ｃｙｓ５８４、Ｇｌｎ５８７、Ｇｌｎ５９１、Ｌｙｓ６４３、Ａｓｎ６４７、Ｓｅｒ６５９、Ｌｙｓ６６３、Ｔｒｐ６９９、Ａｓｎ７０３から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１Ｎと結合する「袋状」のアミノ・サイトを構成し、前記Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、請求項２に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造。
【請求項８】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＴｒｐ４０６、Ｇｌｕ４１０、Ｌｙｓ４６１、Ｇｌｕ５２４、Ｐｈｅ５２５、Ｓｅｒ５２６、Ｌｙｓ５３６、Ｌｙｓ５３９、Ｔｙｒ５４０、Ｌｅｕ５６３、Ｔｙｒ５６４、Ａｒｇ５６６及びＬｙｓ５７４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸はヌクレオチド、ＲＮＡ若しくはその他小分子又はタンパク質と結合するＰＡＣ中の主溝及びチャンネルの形成に関与し、前記Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、請求項２に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造。
【請求項９】
前記Ａ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣの３７０から４０５位アミノ酸残基が一つの大環状を構成し、前記Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、請求項２に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造。
【請求項１０】
前記Ａ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのαへリックス１２、αへリックス１３をその他タンパク質の相互作用に関与させ、好ましくは、αへリックス１２及αへリックス１３中のＩｌｅ６９０、Ｇｌｕ６９１、Ｇｌｕ６９２、Ｃｙｓ６９３、Ａｓｎ６９６から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、その他タンパク質との相互作用に関与させ、前記Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、請求項４に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造。
【請求項１１】
前記Ａ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのＬｙｓ５０６、Ｇｌｙ５０７、Ａｒｇ５０８、Ｓｅｒ５０９、Ｈｉｓ５１０、Ｌｅｕ５１１、Ａｒｇ５１２、Ａｓｎ５１３及びＡｓｐ５１４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、その他タンパク質との相互作用に関与させ、Ｈｉｓ５１０はポリメラーゼ複合体ＲＮａｓｅの一部分を構成し、前記Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、請求項４に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造。
【請求項１２】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス８、αへリックス１０、αへリックス１１とαへリックス１３から構成される群より選択される少なくとも一つのメンバーと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物であって、前記インフルエンザ・ウイルスはＡ、Ｂ、Ｃ型インフルエンザ・ウイルスより選択され、好ましくは、前記インフルエンザ・ウイルスはＡ型インフルエンザ・ウイルス株：Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６、Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８；Ｂ型インフルエンザ・ウイルス株：Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／１９６６又はＣ型インフルエンザ・ウイルス株：Ｃ／ＪＪ／１９５０より選択され、好ましくは、前記ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物は前記Ａ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのαへリックス１１のＬｅｕ６６６、αへリックス１３のＰｈｅ７１０、αへリックス１０のＶａｌ６３６、Ｌｅｕ６４０、αへリックス１３のＴｒｐ７０６、αへリックス１１のＧｌｎ６７０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物であり、前記Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物。
【請求項１３】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス９とαへリックス１０との間の環状ペプチド・セグメントのＡ型インフルエンザ・ウイルスＩｌｅ６２１、Ｇｌｙ６２２、Ｇｌｕ６２３、Ｔｈｒ６１８とＰｒｏ６２０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
【請求項１４】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣでＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＡｓｎ６４７、Ｇｌｎ４０８、Ｃｙｓ５８４、Ｇｌｎ５８７、Ｇｌｎ５９１、Ｌｙｓ６４３、Ａｓｎ６４７、Ｓｅｒ６５９、Ｌｙｓ６６３、Ｔｒｐ６９９、Ａｓｎ７０３から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
【請求項１５】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣでＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＴｒｐ４０６、Ｇｌｕ４１０、Ｌｙｓ４６１、Ｇｌｕ５２４、Ｐｈｅ５２５、Ｓｅｒ５２６、Ｌｙｓ５３６、Ｌｙｓ５３９、Ｔｙｒ５４０、Ｌｅｕ５６３、Ｔｙｒ５６４、Ａｒｇ５６６及びＬｙｓ５７４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
【請求項１６】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣでＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣの３７０から４０５位より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
【請求項１７】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中αへリックス１２、αへリックス１３と結合し、好ましくはＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのαへリックス１２及αへリックス１３中Ｉｌｅ６９０、Ｇｌｕ６９１、Ｇｌｕ６９２、Ｃｙｓ６９３、Ａｓｎ６９６から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
【請求項１８】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中シートβ４とシートβ５との間の環状領域内でＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのＬｙｓ５０６、Ｇｌｙ５０７、Ａｒｇ５０８、Ｓｅｒ５０９、Ｈｉｓ５１０、Ｌｅｕ５１１、Ａｒｇ５１２、Ａｓｎ５１３及びＡｓｐ５１４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物であって、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
【請求項１９】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１と競合的にＰＡＣと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
【請求項２０】
主にＰＡＣ中αへリックス８、αへリックス１１、αへリックス１３、αへリックス１０が形成する疎水性コアと相互に作用し、好ましくはＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中αへリックス８中のＭｅｔ５９５、αへリックス１１中のＬｅｕ６６６、αへリックス１３中のＴｒｐ７０６とＰｈｅ７１０、及びαへリックス１０中のＶａｌ６３６とＶａｌ６４０と相互に作用し、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである、請求項１９に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１と競合的にＰＡＣと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
【請求項２１】
前記ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列における、野生型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎ残基５から１０位Ｐｒｏ５、Ｔｈｒ６、Ｌｅｕ７、Ｌｅｕ８、Ｐｈｅ９とＬｅｕ１０が形成する短へリックス領域を含む短ＰＴＬＬＦＬモチーフの中の少なくとも三つは、該モチーフとのポリペプチド配列対比において対応する位置のアミノ酸が同じである、請求項１９に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１と競合的にＰＡＣと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
【請求項２２】
請求項１２〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を含む組成物であって、キャリア又は賦形剤を選択的に含む、組成物。
【請求項２３】
インフルエンザ・ウイルスによる病気の治療薬物の製薬における、請求項２２に記載の組成物の応用。
【請求項２４】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の発現と精製方法であって、
（ａ）標識タンパク質遺伝子を融合した又は融合していないインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ約２０１〜約３０１位アミノ酸から約６５０〜末端位アミノ酸をコードする遺伝子配列のベクターを構築し、該ベクターを使って原核又は真核細胞を形質転換し、よって標識タンパク質がついているＰＡＣを発現することと；
（ｂ）ＰＡＣの発現と似た方法で標識が付く又は付かないＰＢ１Ｎを発現することと；
（ｃ）（ａ）で取得されるインフルエンザ・ウイルスＰＡＣを発現する細胞と（ｂ）で取得されるインフルエンザ・ウイルスＰＢ１のＮ末端４８個のアミノ酸以内のアミノ酸ＰＢ１Ｎを発現する細胞を一定比率で混合し、特異標識を特異的に識別する方法でこの混合タンパク質を分離し、酵素性分解で標識がつくポリペプチド中の標識タンパク質を取り去り、ＰＡＣとＰＢ１Ｎとの複合体を分離し、タンパク質の濃度を確定することと、
を含み、
前記ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造中の原子は表１中で挙げた少なくとも４０％の原子座標を持ち、又はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造中の少なくとも４０％のアミノ酸の主鎖炭素骨格の原子構造座標は表１中の座標と平均二乗偏差が１．７Å以下である、方法。
【請求項２５】
前記標識タンパク質はＧＳＴ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＭＢＰ−ｔａｇ、特異性抗体より選ばれ；前記ベクターは選択性標識遺伝子を含み、ステップ（ｃ）中での一定比率とは標識タンパク質−ＰＡＣと標識タンパク質−ＰＢ１Ｎのタンパク質総量のモル比が０．１：１〜１：０．１となるものであり、好ましくは標識タンパク質−ＰＡＣと標識タンパク質−ＰＢ１Ｎのタンパク質総量のモル比を０．５：１〜１：０．５にさせ、更に好ましくは標識タンパク質−ＰＡＣと標識タンパク質−ＰＢ１のタンパク質総量のモル比を１：１に近づかせ、更に好ましくは標識タンパク質はＧＳＴであり、特異標識を識別する前記方法はアフィニティ・カラムを使用し、標識を取り除く前記方法はプロティナーゼ酵素性分解を使用し、前記ＰＡＣとＰＢ１Ｎとの複合体の分離方法はゲル濾過法又はイオン交換クロマトグラフィーで行い、前記タンパク質の濃度確定はゲル電気泳動法で行う、請求項２４に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の発現と精製方法。
【請求項２６】
前記原核細胞は大腸菌である、請求項２５に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の発現と精製方法。
【請求項２７】
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の共結晶方法であって、
精製したＰＡＣとＰＢ１Ｎ複合体のタンパク質濃度を５〜３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮することと；
ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法またはｓｉｔｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法で結晶体成長条件を選別することと；
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体を得ることと
を含む、方法。
【請求項２８】
ＰＡのＮ末端１〜約５０位アミノ酸から約２００〜約３００位アミノ酸までであるＰＡＮの野生型又は変異型タンパク質の発現方法であって、標識タンパク質遺伝子を融合した又は融合していないインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＮ末端ＰＡＮの１〜約５０位アミノ酸から約２００〜約３００位アミノ酸までをコードする遺伝子配列の発現ベクターを構築し、該ベクターで真核又は原核細胞を形質転換し、よって標識タンパク質を持つ又は持たないＰＡＮを発現し、前記ＰＡのＮ末端ＰＡＮ中のアミノ酸配列は図１Ｃ中の少なくとも４０％のアミノ酸と同じである、方法。
【請求項２９】
前記原核細胞は大腸菌である、請求項２８に記載のＰＡのＮ末端ＰＡＮの野生型又は変異型タンパク質の発現方法。
【請求項３０】
ＰＢ１Ｎと競合的にＰＡＣと結合する候補化合物の選別方法であって、
（ａ）ＰＡＣを固定ベクターの表面に結合させることと；
（ｂ）過剰量の標識付きＰＢ１Ｎを前記固定したＰＡＣに接触させることと；
（ｃ）溶出液で充分に溶出して、未結合のＰＢ１Ｎを取り除くことと；
（ｄ）テスト化合物の溶液を（ｂ）の項で記述した固定され且つＰＢ１Ｎと結合したＰＡＣに接触させることと；
（ｅ）前記溶出液で充分に溶出して、テスト溶液を取得することと；
（ｆ）前記テスト溶液中の標識つき遊離ＰＢ１Ｎの濃度を測定することと；
（ｇ）テスト溶液中の標識つき遊離ＰＢ１Ｎの濃度を基に、候補化合物のＰＡＣとの結合能力を求めることと
を含む、方法。
【請求項３１】
前記ステップ（ａ）のＰＡＣを固定表面上に結合させることは、共有結合性架橋又はＰＡＣをアフィニティ・マトリックスと結合させることにより実現され、前記アフィニティ・マトリックスは、固定表面上にそのアフィニティ・マトリックスが結合できる結合基を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アフィニティ・マトリックスはＧＳＴ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＭＢＰ−ｔａｇ、特異性抗体から選択され、固定表面上は対応アフィニティ・マトリックスの結合基を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記標識付きＰＢ１Ｎポリペプチドは同位体又はその他の化学分子で標識したタンパク質より選択され、好ましくは、その他の化学分子での標識は緑色蛍光タンパク質、各種融合ポリペプチドより選び使用される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記固定表面はアフィニティ・クロマトカラムである、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶体三次元構造の、インフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いる各種ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物の設計と選別における応用であって、
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を設計することと；
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合可能なポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子をスクリーニングすることと；
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或はスクリーニングしたポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を前記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ配列と少なくとも５０％同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼタンパク質に結合させ、更に結合状況を分析することと；
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或はスクリーニングしたポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を前記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ配列と少なくとも５０％同じ配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質に結合させ結晶にし、よってタンパク質Ｘ線結晶構造解析方法にてポリペプチド及び化合物分子のタンパク質との結合状況を分析することと
を含み、
前記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ配列と少なくとも５０％の同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質と結合する前記ポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子が即ち候補化合物である、応用。
【請求項３６】
任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼの三つのサブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の構造であって、その中に含まれる一つのタンパク質又はそのある一領域は、前記ＰＡＣタンパク質と少なくとも４０％同配列を持つ、任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼの三つのサブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の構造。
【請求項３７】
任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の三次元構造であって、含まれる一つのタンパク質又はそのある一領域の主鎖三次元構造座標は、前記ＰＡＣタンパク質と、前記ＰＡＣタンパク質配列の少なくとも４０％の主鎖炭素骨格の原子と三次元座標の平均二乗偏差が１．７Å以下である、任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の三次元構造。
【請求項３８】
任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の構造であって、含まれる一箇所のタンパク質領域は前記ＰＢ１Ｎポリペプチドのアミノ酸１−１１領域と２０％の配列の相同性を持ち、好ましくは４０％の配列の相同性を有する、任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の構造。
【請求項３９】
前記インフルエンザ・ウイルスＰＡサブユニット上の任意アミノ酸と相互作用を持つことを特徴とするポリペプチド又は小分子。
【請求項４０】
請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の構造の、薬物選別及び薬物設計方面における応用。
【請求項４１】
ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎタンパク質三次元構造に基づくタンパク質と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物の選別方法であって、タンパク質結晶方法でＰＡＣを含む結晶体を取得し、又はＰＡＣ及びＰＢ１Ｎタンパク質複合体結晶体の三次元構造座標を取得することを含み；前記三次元構造は、この座標における少なくとも４０％のアミノ酸残基を含有する主鎖炭素骨格原子の三次元座標との平均二乗偏差が１．７Å以下である構造を全て含む、方法。
【請求項４２】
インフルエンザ・ウイルス亜型ＰＡサブユニット・タンパク質の発現精製方法であって、ＰＡを分けて細菌又は真核発現システムで発現し、該方法で、含有するあらゆるタンパク質からある一箇所の断片が前記配列相応領域と同じアミノ酸配列を４０％持つタンパク質を発現し精製する、方法。
【請求項４３】
請求項５に記載のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体構造中のαへリックス８、１０、１１、１３中任意領域と少なくとも４０％同じアミノ酸を有するタンパク質のアミノ酸残基と相互に作用するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインフルエンザ・ウイルスＰＡとＰＢ１のＮ末端ポリペプチドの細菌における発現、その精製と結晶方法及びＰＡのＣ末端とＰＢ１のＮ末端ポリペプチドの三次元結晶構造とそれらの薬物設計における応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ・ウイルスは曾て人類に重大な災難をもたらした（非特許文献１）。対策に乏しく、ウイルス自体変異し続けている為、この種のウイルスは人類にとって脅威の存在である。近年、世界範囲で頻繁に発生している鳥インフルエンザの伝染及び鳥インフルエンザのヒトの間での感染例の頻出は人類の健康及び経済活動に対しても重大な脅威を示した。このようなウイルスについての研究は人類の健康にとって重大な意義がある。鳥インフルエンザはＡ型インフルエンザ・ウイルスであり、彼らは共にＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科の一員である。そのウイルス・ゲノムは負の電荷を持つ８本の一本鎖ＲＮＡによって形成されている。鳥インフルエンザ由来遺伝子をほかのＡ型インフルエンザ・ウイルスと比較分析すると、一次構造上に散在する突然変異が存在する。これらの突然変異は異なるインフルエンザ・ウイルスの異なった病原性をもたらす。目下、インフルエンザ・ウイルスは１１種のタンパク質がコードできると思われている。その中インフルエンザ・ウイルス・ゲノムＲＮＡの複製とｍＲＮＡへの転写は全てウイルス自身が携帯したＲＮＡポリメラーゼにより行われ、このポリメラーゼが潜在した重要な薬物ターゲットと成りつつある。最近の研究により一部インフルエンザ・ウイルスの高病原性がポリメラーゼの突然変異と直接関連していることが明らかとなり（非特許文献２；非特許文献３）、この複合体に対した薬物設計の必要性が更に示唆された。この複合体に対する研究は、ウイルス複製の分子機構の解明やこの複合体を標的にした薬物設計などに対し、共に重大な意義を持つ。このＲＮＡポリメラーゼは三つのサブユニットＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡから構成された複合体である。そのうちＰＢ１は触媒活性サブユニットであり、ＰＢ２が宿主細胞のｍＲＮＡキャップ（ＣＡＰ構造）をｃａｐ−ｓｎａｔｃｈｉｎｇ機構で切り取り、それをウイルスｍＲＮＡ転写のプライマーとするが、但しこの過程においてＰＢ１はエンドヌクレアーゼである。一種の温度感受性変異体ｔｓ５３により、ＰＡがウイルス・ゲノム複製過程に関与している事が示唆されたが、その具体的な機能はまだ明らかではない（非特許文献４；非特許文献５）。ポリメラーゼはウイルスに必要な３種のＲＮＡ即ちｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ（複製中間体）及びｖＲＮＡを合成する活性を持つ。ｍＲＮＡの合成はキャップ付きオリゴヌクレオチド・プライマーから始まり、ｖＲＮＡ末端から１５−１７番目のヌクレオチドで終了し、且つポリアデニン（ｐｏｌｙ  Ａ）末端がつく。ポリメラーゼはウイルス全長のｃＲＮＡ中間体を新たに合成し、よって更に全長のｖＲＮＡを合成することができる。昆虫細胞発現システムによりポリメラーゼ各サブユニットを発現させ、三種の異なった複合体を形成させる事ができるが、複合体の一種はポリメラーゼの三つのサブユニットＰＢ１／ＰＢ２／ＰＡよりなる三元複合体で、他の二種はそれぞれＰＢ１／ＰＢ２とＰＢ１／ＰＡの二元複合体であり、ＰＢ２／ＰＡの二元複合体は形成できない（非特許文献６）。その中、ＰＢ１のＮ末端２５個のアミノ酸はＰＡのＣ末端と相互に作用するのに充分であり、ＰＢ１のＣ末端はＰＢ２のＮ末端との相互に作用を担う。一つの合成されたＰＢ���のＮ端競合性オリゴペプチドはウイルス・ポリメラーゼ活性を顕著に抑制できる。非特許文献６のジヌクレオチドＡｐＧをプライマーとしたＲＮＡ合成実験により、ＰＢ１／ＰＡ複合体によりウイルスのゲノムＲＮＡ複製が有効に開始でき、ＰＢ１／ＰＢ２によりウイルスｍＲＮＡの合成がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行なえることが明らかにされた。（非特許文献６）。但し、Ｄｅｎｇら（２００６）が２９３細胞を使って発現精製した組み替えポリメラーゼの結果は、三つのサブユニットが複製と転写に共に必要であることを示唆した（非特許文献７）。ＰＡが主にウイルスＲＮＡ複製過程に関与するのは、一種の温度感受性変異体（Ｌ２２６Ｐ）により非許容温度でウイルスにゲノム複製障害をもたらすが転写活性には影響を及ぼさないことの発見がその由来のもとであり（非特許文献５）；ＰＢ２はウイルスｍＲＮＡの転写に関与する。更なる研究によりＰＡは幅広く転写と複製及びウイルスの安定性等の過程に関与すると考えられている（非特許文献８）。ＰＢ１／ＰＡ複合体はウイルス５’末端プロモーターと結合でき、ＰＢ１単独ではこのプロモーターと結合できない。架橋実験結果によりＰＡがｖＲＮＡ及びｃＲＮＡプロモーターと結合できることを明らかにしたが（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献８）（Ｆｏｄｏｒ  １９９４；Ｇｏｎｚａｌｅｚ  １９９９；Ｊｕｎｇ  ２００６；Ｈａｒａ  ２００６）、その具体的な結合サイトはまだ不明である。ＰＡにキモトリプシンに似たプロティナーゼ活性のあることが認められ、Ｓａｎｚ−Ｅｚｑｕｅｒｒｏら（１９９６）によりそのＮ末端の約２５０のアミノ酸が当該プロティナーゼ活性域であることが見出された（非特許文献１１）。しかしその後、Ｈａｒａら（２００１）は自らの研究により、Ｃ末端の第６２４位セリンがＰＡプロティナーゼ活性サイトであり、そのサイトの変異がプロティナーゼ活性の消失をもたらす故、Ｓｅｒ６２４もこのプロティナーゼ活性領域を構成し得ると考察した（非特許文献１２）。ＰＡのプロティナーゼ活性のポリメラーゼ機能に対する影響についてはまだ議論が続いている。２００６年、Ｈａｒａ等はトリプシン加水分解作用を通じて精製したＰＡ組み替えタンパク質はＰＡをそれぞれ分子量約２５ｋＤａ及び約５５ｋＤａの両断片に分解できると報告した（非特許文献８）。タンパク質の三次元構造が薬物設計に対し重要な手助けになるのはよく知られており、ＰＡの三次元構造解明はそれに対した薬物設計及び機能研究にとって重要な価値がある。また、過去の研究でインフルエンザ・ウイルス・タンパク質ＰＡの細菌での発現精製に関する報告はまだ見られず、細菌で発現精製したタンパク質を得ることができればＰＡの機能研究及び薬物スクリーニング作業に対し重大な助けとなり、時間の多量節約や作業コストと労働強度の大幅低下が可能であろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ．Ｋ．Ｔａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ及びＤ．Ｍ．Ｍｏｒｅｎｓ、“Ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．”、２００７年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐａｔｈｏｌ
【非特許文献２】Ｈｕｌｓｅ−Ｐｏｓｔ，Ｄ．Ｊ．、Ｊ．Ｆｒａｎｋｓら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  （ＰＡ  ａｎｄ  ＰＢ１）  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈ５Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｍａｌｌａｒｄ  ｄｕｃｋｓ”、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００７年、第８１巻、第１６号、ｐ．８５１５−２４
【非特許文献３】Ｖ．Ｊ．Ｍｕｎｓｔｅｒ、Ｅ．ｄｅ  Ｗｉｔら、“Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｕｔｃｈ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ７Ｎ７  ｖｉｒｕｓｅｓ”、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００７年、第１９６巻、第２号、ｐ．２５８−６５
【非特許文献４】Ａ．Ｓｕｇｉｕｒａ、Ｍ．Ｕｅｄａら、“Ｆｕｒｔｈｅｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ”、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９７５年、第６５巻、第２号、ｐ．３６３−７３
【非特許文献５】Ａ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ、Ｔ．Ｎａｉｔｏら、“Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ＰＡ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．”、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００５年、第７９巻、第２号、ｐ．７３２−４４
【非特許文献６】Ａ．Ｈｏｎｄａ、Ｋ．Ｍｉｚｕｍｏｔｏら、“Ｍｉｎｉｍｕｍ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ”、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２年、第９９巻、第２０号、ｐ．１３１６６−７１
【非特許文献７】Ｔ．Ｄｅｎｇ、Ｊ．Ｌ．Ｓｈａｒｐｓら、“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００６年、第８７巻（Ｐｔ  １１）、ｐ．３３７３−７
【非特許文献８】Ｋ．Ｈａｒａ、Ｆ．Ｉ．Ｓｃｈｍｉｄｔら、“Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＡ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｌａｙ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ｃａｐ  ｂｉｎｄｉｎｇ，  ａｎｄ  ｖｉｒｉｏｎ  ＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ”、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００６年、第８０巻、第１６号、ｐ．７７８９−９８
【非特許文献９】Ｅ．Ｆｏｄｏｒ，Ｄ．Ｃ．Ｐｒｉｔｌｏｖｅら、“Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｐａｎｈａｎｄｌｅ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９４年、第６８巻、第６号、ｐ．４０９２−６
【非特許文献１０】Ｔ．Ｄｅｎｇ、Ｊ．Ｓｈａｒｐｓら、“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＰＢ２  ｗｉｔｈ  ａ  ＰＢ１−ＰＡ  ｄｉｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ａ  ｎｅｗ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ”、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００５年、第７９巻、第１３号、ｐ．８６６９−７４
【非特許文献１１】Ｊ．Ｊ．Ｓａｎｚ−Ｅｚｑｕｅｒｒｏ、Ｔ．Ｚｕｒｃｈｅｒら、“Ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｏｎｅ−ｔｈｉｒｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ＰＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ”  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９６年、第７０巻、第３号、ｐ．１９０５−１１
【非特許文献１２】Ｋ．Ｈａｒａ、Ｍ．Ｓｈｉｏｔａら、“Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＰＡ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｅｒ６２４  ａｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ”  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２００１年、第６巻、第２号、ｐ．８７−９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ複合体サブユニットＰＡの野生型又は変異型タンパク質のＮ末端とＣ末端をそれぞれクローン化、発現する方法、並びにＰＡのＮ末端を個別に発現、精製及び結晶させる方法、並びにインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１の野生型又は変異型タンパク質のＮ末端オリゴペプチドを発現する方法、並びにＰＡのＣ末端とＰＢ１のＮ末端オリゴペプチド共精製の方法を提供する。本発明で使用したＰＡはＮ末端の前２５６のアミノ酸及びＣ末端の２５７−７１６アミノ酸残基の断片であり、これとＰＢ１のＮ末端２５個アミノ酸ペプチド複合体の大腸菌中での発現、共精製の方法、及びＰＡのＣ末端とＰＢ１のＮ末端ペプチド・タンパク質複合体の結晶方法及びそれらが形成する複合体の結晶の三次元構造が提供される。
【０００５】
本発明はインフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡの野生型又は変異型タンパク質をＮ末端とＣ末端の二つの部分に分けて発現、精製する方法を提供する一方、ＰＡのＮ末端を単独で発現精製及び結晶させる方法を提供し、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼのもう一つのサブユニットＰＢ１の野生型又は変異型タンパク質のＮ末端ポリペプチドの発現を通じて、ＰＡのＣ末端とＰＢ１のＮ末端オリゴペプチド複合体を共精製し、タンパク質の結晶に使う。本発明は大腸菌の原核細胞発現系を好ましく使用して（但し、他の発現系を除外するわけでなく、例えば他の細菌中又はその他真核生物細胞での発現も可）上記のポリペプチドをＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質の形で発現し、そしてＰＡのＣ末端及びＰＢ１のＮ末端オリゴペプチドの２種の発現細菌を混合し、さらに細菌から上記ＰＡのＣ末端及びＰＢ１のＮ末端オリゴペプチドのタンパク質複合体を共精製し出し、タンパク質を結晶する方法に使用した。本発明は、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡタンパク質Ｎ末端の前２５６位アミノ酸とＣ末端第２５７から第７１６位アミノ酸ポリペプチドを大腸菌を利用して発現して得る発現方法、並びに大腸菌からインフルエンザ・ウイルス・タンパク質ＰＢ１のＮ末端２５個又は４８個のアミノ酸以内のポリペプチドを発現する細菌叢を得る方法に及ぶが、記述する方法で、対応する遺伝子をｐＧＥＸ−６ｐベクターへクローン化し、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）を融合した融合タンパク質を発現させる。
【０００６】
もう一方では、本発明はＰＡのＣ末端（ＰＡＣ）とＰＢ１Ｎ末端ペプチド複合体を精製する方法を提供するが、その方法は下記を含む：インフルエンザ・ウイルスＰＡのＣ末端第２５７から第７１６のアミノ酸を発現する細菌叢とインフルエンザ・ウイルスＰＢ１のＮ末端２５個又は４８個アミノ酸以内のオリゴペプチドを発現する細菌叢をそれぞれ緩衝液に懸濁させ、そして一定の比率でこの２種類の発現菌を混合し、ＧＳＴ−ＰＡＣとＧＳＴ−ＰＢ１Ｎのタンパク質の総含量が一定のモル比に達するようにし、よってこの２種類のタンパク質の混合タンパク質を発現し、アフィニティ・カラムの方法を使い上記混合タンパク質を精製し、そしてＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロティナーゼで酵素分解によりＧＳＴ融合タンパク質を切断し；更にゲル濾過とイオン交換クロマトグラフィー等の方法でＰＡとＰＢ１のＮ端ペプチド複合体を分離精製し；ゲル電気泳動法でタンパク質の純度を測定すること。
【０００７】
もう一方では、本発明は上記で得られたＰＡＣとＰＢ１Ｎ末端ペプチド複合体を結晶する方法を提供したが、その方法は下記を含む：上記ＰＡＣとＰＢ１Ｎ末端ペプチド複合体を５〜３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し；摂氏４〜３０度中、ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法で結晶成長条件をスクリーニングし；当該タンパク質複合体の結晶を得ること。
【０００８】
もう一方では、本発明はＰＡＣとＰＢ１Ｎ末端ペプチド複合体結晶を提供する。
【０００９】
もう一方では、本発明はＰＡＣとＰＢ１Ｎ末端ペプチド複合体結晶の三次元構造を提供し、この構造はＰＡＣとＰＢ１Ｎ相互作用様式とその相互作用サイト、そしてその複合体のＰＡＣとＰＢ１Ｎポリペプチド・タンパク質の二次構造の仕組み、ペプチド鎖の方向及び三次元分子構造を描き出した。その中で、ＰＡＣとＰＢ１Ｎ末端ペプチド複合体結晶にＸ線回折を行ない、ＰＡＣとＰＢ１Ｎ末端ペプチド複合体のタンパク質結晶の回折データをとり、上記これらのタンパク質結晶の回折データを元に更なる構造解析過程を通じて、ＰＡＣとＰＢ１Ｎ末端ペプチド複合体の三次構造モデルを構築する。
【００１０】
一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、その中でインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣはインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡの約２０１〜約３０１位アミノ酸から約６５０〜末端のアミノ酸までであり、ＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎはインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎの４８個アミノ酸以内のオリゴペプチドであり、結晶三次元構造中の原子は表１中に挙げた少なくとも一部の原子座標を有し、又はこの座標中の少なくとも４０％アミノ酸残基主鎖炭素骨格原子との三次元座標の平均二乗偏差（ａｖｅｒａｇｅ  ｒｏｏｔ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ（ＲＭＳＤ））が１．７Å以下である。
【００１１】
好ましくは、ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶がＰ４（１）２（１）２の空間群を持ち、格子定数はおよそα＝ｂ＝１２２Å、ｃ＝１３３Å、α＝β＝γ＝９０°である。
【００１２】
一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス株はＡ型、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスより選出される。好ましくは、Ａ型インフルエンザ・ウイルス株：Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６、Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８；Ｂ型インフルエンザ・ウイルス株：Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／１９６６；又はＣ型インフルエンザ・ウイルス株：Ｃ／ＪＪ／１９５０である。
【００１３】
一つの具体的な実施態様を通して、Ａ型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣはインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス４、即ち４０６−４１４位を含むアミノ酸領域、αへリックス５、即ち４４０−４５０位を含むアミノ酸領域、αへリックス８、即ち５８３−６０３位を含むアミノ酸領域、αへリックス９、即ち６０８−６１３位を含むアミノ酸領域、αへリックス１０、即ち６３３−６４９位を含むアミノ酸領域、αへリックス１１、即ち６５３−６７３位を含むアミノ酸領域、αへリックス１２、即ち６８３−６９１位を含むアミノ酸領域、とαへリックス１３、即ち６９８−７１４位を含むアミノ酸領域、及び二つのβシート：βシート８とβシート９、それぞれ６１９−６２３位を含むアミノ酸領域と６２８−６３１位を含むアミノ酸領域が、ＰＡのＣ末端ＰＡＣの第一部分を構成する（即ち図４に示す如く結晶構造の口先の部分を構成）、その中でＡ型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣは主要なβシート折り畳み断片より成り、これらのβシートにはβシート１、即ち２９０−２９２位を含むアミノ酸領域、βシート２、即ち３１７−３２４位を含むアミノ酸領域、βシート３、即ち４８０−４９１位を含むアミノ酸領域、βシート４、即ち４９６−５０６位を含むアミノ酸領域、βシート５、即ち５１７−５２６位を含むアミノ酸領域、βシート６、即ち５４１−５５０位を含むアミノ酸領域、βシート７、即ち５５７−５７１位を含むアミノ酸領域などが含まれ、これらのβシートが共同でＰＡのＣ末端ＰＡＣ第二部分（即ち図４に示す結晶構造の頭部）の折り畳みシート層の主な部分を構成する。その中でＡ型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣはαへリックス１、即ち３０３−３１１位を含むアミノ酸領域、αへリックス２、即ち３３１−３４９位を含むアミノ酸領域、αへリックス３、即ち３６４−３６９位を含むアミノ酸領域、αへリックス６、即ち４５４−４７５位を含むアミノ酸領域及びαへリックス７、即ち５７２−５７８位を含むアミノ酸領域が、ＰＡのＣ末端ＰＡＣ第二部分の上記折り畳みβシート層の周囲を囲い、その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００１４】
一つの具体的な実施態様を通して、Ａ型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣは主にαへリックス８、αへリックス１０、αへリックス１１とαへリックス１３の関与を通じてＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎと相互に作用するが、好ましくは、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのαへリックス１１のＬｅｕ６６６、αへリックス１３のＰｈｅ７１０、αへリックス１０のＶａｌ６３６、Ｌｅｕ６４０、αへリックス１３のＴｒｐ７０６、αへリックス１１のＧｌｎ６７０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１との相互作用に関与させる。その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００１５】
一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス９とαへリックス１０の間の環状ペプチド断片中のＩｌｅ６２１、Ｇｌｙ６２２、Ｇｌｕ６２３、Ｔｈｒ６１８とＰｒｏ６２０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１との相互作用に関与させた。その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００１６】
一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＡｓｎ６４７、Ｇｌｎ４０８、Ｃｙｓ５８４、Ｇｌｎ５８７、Ｇｌｎ５９１、Ｌｙｓ６４３、Ａｓｎ６４７、Ｓｅｒ６５９、Ｌｙｓ６６３、Ｔｒｐ６９９、Ａｓｎ７０３から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、記述のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡＣのインフルエンザウイルスポリメラーゼサブユニットＰＢ１Ｎと結合する「袋状」のアミノ・サイトを構成させた。その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００１７】
一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＴｒｐ４０６、Ｇｌｕ４１０、Ｌｙｓ４６１、Ｇｌｕ５２４、Ｐｈｅ５２５、Ｓｅｒ５２６、Ｌｙｓ５３６、Ｌｙｓ５３９、Ｔｙｒ５４０、Ｌｅｕ５６３、Ｔｙｒ５６４、Ａｒｇ５６６及びＬｙｓ５７４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、ＰＡＣ中ヌクレオチド、ＲＮＡ若しくはその他の小分子又はタンパク質と結合する主溝及びチャンネルの形成に関与させた。その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００１８】
一つの具体的な実施態様を通して、ＰＡのＣ末端ＰＡＣの３７０から４０５位のアミノ酸残基は大きい環を構成するが、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００１９】
一つの具体的な実施態様を通して、そこで記述したαへリックス１２、αへリックス１３はその他のタンパク質との相互作用に関与するが、好ましくは、αへリックス１２及αへリックス１３中のＩｌｅ６９０、Ｇｌｕ６９１、Ｇｌｕ６９２、Ｃｙｓ６９３、Ａｓｎ６９６から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、その他のタンパク質との相互作用に関与させる。
【００２０】
一つの具体的な実施態様を通して、Ｌｙｓ５０６、Ｇｌｙ５０７、Ａｒｇ５０８、Ｓｅｒ５０９、Ｈｉｓ５１０、Ｌｅｕ５１１、Ａｒｇ５１２、Ａｓｎ５１３及びＡｓｐ５１４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、その他のタンパク質との相互作用に関与させた。その中、Ｈｉｓ５１０はポリメラーゼ複合体ＲＮａｓｅの一部分を構成し、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００２１】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス８、αへリックス１０、αへリックス１１とαへリックス１３から構成される群より選択される少なくとも一つのメンバーと結合したポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、好ましくは、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのαへリックス１１のＬｅｕ６６６、αへリックス１３のＰｈｅ７１０、αへリックス１０のＶａｌ６３６、Ｌｅｕ６４０、αへリックス１３のＴｒｐ７０６、αへリックス１１のＧｌｎ６７０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供する。その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００２２】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中αへリックス９及びαへリックス１０の間の環状ペプチド断片中のＩｌｅ６２１、Ｇｌｙ６２２、Ｇｌｕ６２３、Ｔｈｒ６１８とＰｒｏ６２０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供する。その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００２３】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣの中でそのインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＡｓｎ６４７、Ｇｌｎ４０８、Ｃｙｓ５８４、Ｇｌｎ５８７、Ｇｌｎ５９１、Ｌｙｓ６４３、Ａｓｎ６４７、Ｓｅｒ６５９、Ｌｙｓ６６３、Ｔｒｐ６９９、Ａｓｎ７０３から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供する。その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００２４】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣの中でそのインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＴｒｐ４０６、Ｇｌｕ４１０、Ｌｙｓ４６１、Ｇｌｕ５２４、Ｐｈｅ５２５、Ｓｅｒ５２６、Ｌｙｓ５３６、Ｌｙｓ５３９、Ｔｙｒ５４０、Ｌｅｕ５６３、Ｔｙｒ５６４、Ａｒｇ５６６及びＬｙｓ５７４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供する。その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００２５】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中で第３７０から４０５位のアミノ酸から選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供する。その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００２６】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中αへリックス１２、αへリックス１３と結合する、好ましくはαへリックス１２及αへリックス１３中Ｉｌｅ６９０、Ｇｌｕ６９１、Ｇｌｕ６９２、Ｃｙｓ６９３、Ａｓｎ６９６から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供するが、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりであり、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００２７】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中シートβ４とシートβ５の間の環状領域内のＬｙｓ５０６、Ｇｌｙ５０７、Ａｒｇ５０８、Ｓｅｒ５０９、Ｈｉｓ５１０、Ｌｅｕ５１１、Ａｒｇ５１２、Ａｓｎ５１３及びＡｓｐ５１４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供するが、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００２８】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１と競合的にＰＡＣと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供するが、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００２９】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は主にＰＡＣ中αへリックス８、αへリックス１１、αへリックス１３、αへリックス１０により形成した疎水性コアとの相互作用を、好ましくはαへリックス８中のＭｅｔ５９５、αへリックス１１中のＬｅｕ６６６、αへリックス１３中のＴｒｐ７０６とＰｈｅ７１０、及びαへリックス１０中のＶａｌ６３６とＶａｌ６４０との相互作用を提供するが、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００３０】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１と競合的にＰＡＣと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供するが、その中で記述したポリペプチド、タンパク質、抗体又は免疫結合物のアミノ酸配列における、野生型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎ残基５から１０位Ｐｒｏ５、Ｔｈｒ６、Ｌｅｕ７、Ｌｅｕ８、Ｐｈｅ９とＬｅｕ１０が形成する短へリックス領域を含む短ＰＴＬＬＦＬモチーフの中少なくとも三つは、該モチーフとのポリペプチド配列比較において対応する位置のアミノ酸が同じである。
【００３１】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は上記のポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物含む組成物を提供する。
【００３２】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は上記組成物のインフルエンザ・ウイルスによる疾病の治療薬物の製造における応用を提供する。
【００３３】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は（ａ）標識タンパク質遺伝子を融合した又は融合してないインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ第約２０１〜約３０１位のアミノ酸から約６５０〜末端位置アミノ酸をコードする遺伝子配列のベクターを構築し、そのベクターで原核又は真核細胞を形質転換し、よって標識タンパク質を持つＰＡＣを発現することと；（ｂ）ＰＡＣの発現と似た方法で標識が付く又は付かないＰＢ１Ｎを発現することと；（ｃ）上記（ａ）で得たインフルエンザ・ウイルスＰＡＣの発現細胞と（ｂ）で得たインフルエンザ・ウイルスＰＢ１のＮ末端４８個のアミノ酸以内のアミノ酸ＰＢ１Ｎの発現細胞を一定比率で混合し、特異的に特異標識を識別する方法で記述の混合タンパク質を分離し、酵素分解により標識つきポリペプチド中の標識タンパク質を取り除き、ＰＡＣとＰＢ１Ｎとの複合体を分離し、タンパク質濃度を測定することとを含むインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体を発現精製する方法を提供する。
【００３４】
その中、上記ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造中の原子は表１の中で挙げた４０％の原子座標を持ち、又はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造中の少なくとも４０％のアミノ酸の主鎖炭素骨格の原子構造座標は表１中の座標と平均二乗偏差が１．７Å以下である。
【００３５】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体を発現精製する方法を提供するが、そこで記述した標識タンパク質はＧＳＴ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＭＢＰ−ｔａｇ、特異性抗体より選び；記述したベクターは選択性標識遺伝子を含み、ステップ（ｃ）で記述した一定比率とは標識タンパク質−ＰＡＣと標識タンパク質−ＰＢ１Ｎのタンパク質総量のモル比が０．１：１〜１：０．１に成る様にする比率であり、好ましくは標識タンパク質−ＰＡＣと標識タンパク質−ＰＢ１Ｎのタンパク質総量のモル比を０．５：１〜１：０．５に、更に好ましくは標識タンパク質−ＰＡＣと標識タンパク質−ＰＢ１のタンパク質総量のモル比を１：１に近づかせる。好ましい標識タンパク質はＧＳＴであり、記述した特異的に特異標識を識別する方法はアフィニティ・カラム・クロマトグラフィーであり、記述した標識を取り除く方法はプロティナーゼによる酵素分解法、記述したＰＡＣとＰＢ１Ｎとの複合体の分離方法はゲル濾過又はイオン交換クロマトグラフィーで行い、記述したタンパク質の濃度確定はゲル電気泳動法で行う。
【００３６】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の発現と精製方法を提供するが、そこに記述したベクターはｐＧＥＸ−６ｐプラスミド・ベクターで、そこに記述した選択性標識遺伝子はペニシリン耐性遺伝子で、そのステップ（ｃ）で使用したプロティナーゼはＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎプロティナーゼである；ベクターで使用したプライマーの酵素切断サイトはＳａｌＩとＮｏｔＩから構成される群より選択される酵素切断サイトであり；遺伝子断片の挿入時に使用した酵素切断サイトはＳａｌＩとＮｏｔＩから構成される群より選択される酵素切断サイトであり；記述したインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣの遺伝子断片はＰＣＲ方法を利用して、Ａ型インフルエンザ・ウイルス株Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６ゲノムを元に増幅して得られ；上記ベクター及び上記挿入遺伝子断片はそれぞれ対応するＤＮＡエンドヌクレアーゼを使用し、たとえばＢａｍＨＩとＸｈｏＩから構成される群より選択されるエンドヌクレアーゼで処理をした後、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを利用して上記挿入遺伝子を上記ベクターに連結し、よって例えば大腸菌のような原核細胞を形質転換してプラスミド・クローンを取得し；クローン化済みの例えば上記のプラスミド・クローンで大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、得られる形質転換細菌を培養し、ＩＰＴＧで誘導をかけるが、ＩＰＴＧの好ましい濃度は０．１ｍＭから１ｍＭであり；培養して得られる上記細菌を遠心して、上記融合タンパク質を発現する細菌叢が得られる。
【００３７】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は、上記精製したＰＡＣとＰＢ１Ｎ複合体のタンパク質濃度を５−３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮することと；ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法またはｓｉｔｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法を利用した結晶成長条件のスクリーニングすることと；インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶を得ることとを含むインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の共結晶化方法を提供する。
【００３８】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は、ＰＡのＮ末端１位〜約５０位のアミノ酸から約２００位〜約３００位のアミノ酸までであるＰＡＮの野生型又は変異型タンパク質を発現させる方法を提供し、標識タンパクの質遺伝子を融合したインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＮ末端ＰＡＮの１位〜約５０位のアミノ酸から約２００位〜約３００位のアミノ酸をコードする遺伝子配列の発現ベクターを構築し、このベクターで細胞を形質転換して、よって標識タンパク質を持つＰＡＮを発現させるが、そのＰＡのＮ末端ＰＡＮにおけるアミノ酸配列は、図１Ｃに示すアミノ酸配列と比べ少なくとも４０％の同アミノ酸配列を有する。
【００３９】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はＰＡのＮ末端ＰＡＮの野生型又は変異型タンパク質を発現させる方法を提供するが、その方法では、ＰＡＮのＮ末端にＧＳＴを融合した融合タンパク質ＧＳＴ−ＰＡＮを発現させるため、ＰＣＲ方法及び分子クローン技術を利用して、記述したポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＮ末端ＰＡＮの遺伝子配列をそれぞれ例えばｐＧＥＸ−６ｐ、ｐＧＥＸ−４  Ｔ等ｐＧＥＸ系ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴ系ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＭＡＬ−ｃ２  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）系ベクター等のプラスミド・ベクターにクローン化し；上記プラスミド・ベクターはペニシリン耐性遺伝子を含有し、上記ＰＡのＮ末端ＰＡＮポリペプチドの遺伝子クローン化時にベクターの使用した酵素切断サイトはｐＧＥＸ−６ｐマルチ・クローン・サイトのＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩから構成される群より選択される酵素切断サイトであり；使用したＰＡＮ遺伝子クローン断片の酵素切断サイトはそれぞれＢａｍＨＩとＸｈｏＩであり；ＰＡＮタンパクの遺伝子断片はＰＣＲ方法を利用してウイルス株Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６ゲノムを元に増幅して得られ；ベクターと挿入遺伝子断片はそれぞれ対応するＤＮＡエンドヌクレアーゼ例えばＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩから構成される群より選択されるエンドヌクレアーゼで処理した後、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅで挿入遺伝子とベクターを結合させ、大腸菌を形質転換してプラスミドクローンを取得し；クローン化済みの例えば上記のプラスミド・クローンで大腸菌ＢＬ２１を形質転換して、その形質転換細菌を培養し、０．１ｍＭから１ｍＭのＩＰＴＧで誘導をかけ、培養した細菌を遠心して上記融合タンパク質を発現する細菌叢が得られる。
【００４０】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は、（ａ）ＰＡＣを固定ベクターの表面に結合させることと；（ｂ）過剰量の標識付きＰＢ１Ｎを上記固定されたＰＡＣに接触させることと；（ｃ）溶出液で充分に溶出して、未結合ＰＢ１Ｎを取り除くことと；（ｄ）テスト候補化合物の溶液を（ｂ）の項で記述した固定され且つＰＢ１Ｎと結合したＰＡＣに接触させることと；（ｅ）記述した溶出液で充分に溶出して、テスト溶液を得ることと；（ｆ）上記テスト溶液中の標識つき遊離ＰＢ１Ｎの濃度を測定することと；（ｇ）テスト溶液中の標識つき遊離ＰＢ１Ｎの濃度を基に、候補化合物のＰＡＣとの結合能力を求めることとを含むことを特徴とするＰＢ１Ｎと競合的にＰＡＣと結合する候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４１】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は、記述したステップ（ａ）中ＰＡＣの固定表面上への結合は、共有結合性架橋又はＰＡＣをアフィニティ・マトリックスと結合させることにより実現し、上記アフィニティ・マトリックスは固定表面上にはそのアフィニティ・マトリックスが結合できる結合基を有することを特徴とするＰＢ１Ｎと競合的にＰＡＣと結合する候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４２】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は、記述したアフィニティ・マトリックスにはＧＳＴ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＭＢＰ−ｔａｇ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、特異性抗体等その他ポリペプチドが挙げられ、固定表面上はそれぞれのマトリックスに対応する結合基を有することを特徴とするＰＢ１Ｎと競合的にＰＡＣと結合する候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４３】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は、記述した標識付きＰＢ１Ｎポリペプチドは同位体又はその他の化学分子で標識したタンパク質より選び出し、好ましくは、その他の化学分子標識は緑色蛍光タンパク質、各種その他融合ポリペプチド、例えば結合したペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、プロテインキナーゼ、各種トランスフェラーゼ等より選び出したことを特徴とするＰＢ１Ｎと競合的にＰＡＣと結合する候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４４】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明は、上記固定表面はアフィニティクロマトカラムでもよいことを特徴とするＰＢ１Ｎと競合的にＰＡＣと結合する候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４５】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造の、インフルエンザ・ウイルス感染による疾病の治療に使用できる各種ポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物の設計とスクリーニングにおける応用を提供する。
【００４６】
上記ＰＡＣタンパク質の発現精製方法；上記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ端ポリペプチド複合体の発現精製方法；上記タンパク質結晶の獲得方法に基づいて薬物のスクリーニングを行ない、ＰＡＣとＰＢ１Ｎの三次元構造に基づいて薬物設計を行う。
【００４７】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造の、インフルエンザ・ウイルス感染による疾病の治療に使用できる各種ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物の設計とスクリーニングにおける応用であって、
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を設計することと；
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合可能なポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を捜すことと；
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或は捜したポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を上記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ配列と少なくとも５０％同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質に結合させ、更に結合状況を分析することと；及び
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或は捜したポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を上記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ配列と少なくとも５０％同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質に結合させ結晶し、タンパク質Ｘ線結晶構造解析方法にてポリペプチド及び化合物分子のタンパク質との結合状況を分析することと；
を含み、
上記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ配列と少なくとも５０％の同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質と結合する上記ポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子が候補化合物である応用を提供する。
【００４８】
ＰＡのポリメラーゼ中での機能及びその三次元微細構造を明らかにする為、本発明者らはＰＡのＣ末端２５７−７１６残基断片（ＰＡＣ）とＰＢ１のＮ末端２５個のペプチド（ＰＢ１Ｎ）の複合体の２．９Å分解能の結晶構造を解析した。この構造により、ＰＡのＣ末端とＰＢ１のＮ末端の相互作用方式及び結合に関与したアミノ酸残基の組成と空間的相対位置がはっきりと示され、ＰＡとＲＮＡの結合サイト、ＰＡのＣ末端及びＰＢ１のＮ末端複合体の三次元構造モデル、タンパク質の二次構造構成、ＰＡタンパク質分子中の核酸結合サイト、ＰＡタンパク質分子における小分子チャンネル等及びＰＡタンパク質表面の電荷分布が明らかとなり、更なるＰＡのウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体における機能研究のための構造学的基盤が提供された。また、上記本発明のタンパク質発現精製方法、結晶方法を使用して薬物スクリーニングを行い、ＰＡとＰＢ１相互作用及びＰＡとＲＮＡその他タンパク質相互作用を標的にした薬物を設計し、よってインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ活性を抑制する目的を達成する為のタンパク質結晶プラットフォーム並びに三次元構造プラットフォームを提供した。
【００４９】
注意すべきは、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスのαへリックスとβシートに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりであり、詳細はここでは略す。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】三種の異なったタイプのインフルエンザ・ウイルス由来に基づいたＰＡタンパク質Ｃ末端の配列の比較であり、その中、Ａ＿ＯＵＲＳは鳥インフルエンザＡ型ウイルス株Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６のＰＡタンパク質Ｃ末端の配列；Ａ＿１９１８は１９１８年ヨーロッパで爆発した広範囲インフルエンザで重大な人類死亡事件を引き起こしたＡ型インフルエンザ・ウイルス株Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８  Ａ型インフルエンザ・ウイルスＰＡタンパク質配列；Ｂ＿１９６６は１９６６  Ａｎｎ  ａｂｏｒのインフルエンザＢ型ウイルスＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／１９６６のＰＡタンパク質配列；Ｃ＿１９５０は１９５０の一種のインフルエンザＣ型ウイルスＣ／ＪＪ／１９５０のＰＡタンパク質配列であり；これらの結果は、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡタンパク質に高度に保存的なアミノ酸残基が含有されていることを示す。図中、…．は該当領域のアミノ酸欠失を表すが、明細書及び特許請求の範囲では具体的なアミノ酸位置を全てＡ＿ＯＵＲＳを例に説明した。
【図１Ｂ】四種の異なったタイプのインフルエンザ・ウイルス由来に基づいたＰＢ１Ｎタンパク質配列の比較であり、その中、Ａ＿ＯＵＲＳ、Ａ＿１９１８、Ｂ＿１９６６、Ｃ＿１９５０は図１Ａと同様であり、図中、…．は該当領域のアミノ酸欠失を表すが、明細書及び特許請求の範囲では具体的なアミノ酸位置を全てＡ＿ＯＵＲＳを例に説明した。
【図１Ｃ】三種の異なったタイプのインフルエンザ・ウイルス由来に基づいたＰＡタンパク質Ｎ末端の配列であり、図中、…．は該当領域のアミノ酸欠失を表すが、明細書及び特許請求の範囲では具体的なアミノ酸位置を全てＡ＿ＯＵＲＳを例に説明した。
【図２】鳥インフルエンザＡ型ウイルス野生型ウイルス株Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６のＰＡのＮ末端前２５６アミノ酸ポリペプチド断片の精製。その中、Ａ図は精製したタンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）における溶出ピーク位置を示し、Ｂ図はその溶出ピークのＰＡのＮ末端タンパク質電気泳動結果を示し、Ｃ図は最終精製したＰＡのＮ末端タンパク質を示す。
【図３】精製したＰＡのＮ末端（１−２５６残基）タンパク質より得られたタンパク質結晶及びＸ線回析状況。その中、Ａ及びＢは異なる結晶条件下で得た結晶であり、Ｃ及びＤは二種のＰＡのＮ末端タンパク質結晶のＸ線回析像である。
【図４】大腸菌で発現精製したＰＡＣ及びＧＳＴ−ＰＢ１Ｎタンパク質、及びＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ペプチド相互結合実験並びにＰＡＣとＰＢ１Ｎポリペプチド複合体の構造のリボン図。（Ａ）精製したＰＡＣタンパク質及び精製したＰＡＣとＰＢ１Ｎポリペプチド・タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ相互作用試験。（Ｂ）ＰＡＣとＰＢ１Ｎポリペプチド複合体三次元構造の線状（Ｗｉｒｅｆｌａｍｅ）図で、咀嚼する狼頭状全体構造を呈する。
【図５】ＰＡのＣ末端とＰＢ１のＮ末端ペプチド複合体の全体構造：（Ａ）ＰＡＣとＰＢ１Ｎ末端ペプチド複合体の全体構造の横視図、タンパク質鎖の成り行きを明瞭に示す。（Ｂ）図５（Ａ）中の図をＹ軸に沿って１８０度回転し、二次構造には標識を行ない、その中のＰＢ１のＮ末端ペプチドとＰＡＣの二つの末端を矢印で示した。
【図６】ＰＡＣとＰＢ１Ｎポリペプチド間の相互作用：（Ａ）ＰＡタンパク質分子の表面図；ＰＢ１のＮ末端ポリペプチドをリボン図で表示し、ＰＡ分子は表面電荷分布で表示する。（Ｂ）ＰＡとＰＢ１間の相互作用は主に疎水相互作用であることを観察し易いように部分拡大する。
【図７】ＰＡタンパク質分子の表面電荷図。その中でＡ及びＢはそれぞれ図５中Ａ及びＢ図の方向と一致している。
【図８】ＰＡＣ／ＰＢ１Ｎ末端ペプチド複合体分子構造中に存在する大溝領域とチャンネルの図解。Ａ図は大溝領域、その中に分布されている一部アルカリ性アミノ酸残基を表示する。Ｂ及びＣ図はそれぞれ分子の両面から（Ｘ軸に沿って１８０度転回）ＰＡ分子中のチャンネル領域構造を観察する図である。チャンネル内外の一部の保存的アミノ酸を表示した。
【図９】ＰＡ−ＣとＰＢ１−Ｎポリペプチド間の相互作用の図解：（Ａ）ＰＡ−ＣとＰＢ１−Ｎポリペプチド・タンパク質複合体分子三次元構造のリボン図；ＰＡ分子はＮ末端からＣ末端まで青から赤に変化するリボン図で表示する。（Ｂ）ＰＡタンパク質分子の一つの表面図；ＰＢ１Ｎ端ポリペプチドはリボン図で表示し、ＰＡ分子は表面電荷分布で表示する。（Ｃ）ＰＡ分子上ＰＢ１ポリペプチド相互作用に関与する主なへリックス８、１０、１１、１３の観察用に複合体構造部分を拡大する。（Ｄ）ＰＡ及びＰＢ１間の相互作用観察用に部分拡大する。ＰＢ１Ｎ末端ポリペプチドはリボン図で表示し、ＰＡ分子は表面電荷分布で表示する。この二つのポリペプチドは主に疎水相互作用で結合する。
【図１０】図１Ａと図１Ｂと同様に、三種の異なったタイプのインフルエンザ・ウイルス由来に基づいたＰＡタンパク質Ｃ末端の配列及びＰＢ１Ｎのタンパク質配列。（Ａ）三種の異なったタイプのインフルエンザ・ウイルス由来に基づいたＰＡタンパク質の配列比較であり、図中、Ａ＿ＯＵＲＳは鳥インフルエンザＡ型ウイルス  ウイルス株Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６のＰＡタンパク質Ｃ末端の配列；Ａ＿１９１８は１９１８年ヨーロッパで爆発した大範囲インフルエンザで重大な人類死亡事件を引き起こしたＡ型インフルエンザ・ウイルス株Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８  Ａ型インフルエンザ・ウイルスＰＡタンパク質配列；Ｂ＿１９６６は１９６６  Ａｎｎ  ａｂｏｒのインフルエンザＢ型ウイルスＢ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／１９６６のＰＡタンパク質配列；Ｃ＿１９５０は１９５０の一種のインフルエンザＣ型ウイルスＣ／ＪＪ／１９５０のＰＡタンパク質配列である。これらの結果はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡタンパク質に高度に保存的なアミノ酸残基が含まれていることを示す。（Ｂ）四種の異なったタイプのインフルエンザ・ウイルス由来に基づいたＰＢ１Ｎのタンパク質配列比較であり、図中、Ａ＿ＯＵＲＳ、Ａ＿１９１８、Ｂ＿１９６６、Ｃ＿１９５０は（Ａ）と同様であり、図中、…．は該当領域のアミノ酸欠失を表し、明細書及び特許請求の範囲では具体的なアミノ酸位置を全てＡ＿ＯＵＲＳを例に説明した。ボックスの中にＲｏｕｎｄ  ｌｏｏｐと標記されているのは構造中の大環状領域、もう一方のボックス（未標記）は核酸結合可能領域である。矢印はＰＡのＣ末端がＰＢ１オリゴペプチドとの結合に関与するアミノ酸残基を示す。明細書及び特許請求の範囲では具体的なアミノ酸位置を全てＡ＿ＯＵＲＳを例に説明した。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡの野生型又は変異型タンパク質を幾つかに分けて発現し、即ちＮ末端とＣ末端両部分をそれぞれ大腸菌にて発現し、精製する方法を提供した。それには、ＰＡのＮ末端を単独に結晶実験に使う方法、ＰＡより得た２５７−７１６残基を含むＣ末端断片とインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１の野生型又は変異型タンパク質のＰＢ１のＮ末端ペプチドをそれぞれ大腸菌にて発現方する方法、精製方法、またＰＡのＣ末端とＰＢ１のＮ末端ペプチド複合体で結晶する方法、及びこれによって得られたＰＡＣ／ＰＢ１Ｎオリゴペプチド複合体の結晶構造、とこれら結晶方法に基づいた薬物スクリーニング及びこれら結晶構造に基づいた薬物設計の実施を提供した。
【００５２】
一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、その中でインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣはインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡの約２０１〜約３０１位アミノ酸から約６５０〜末端のアミノ酸までであり、ＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎはインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎの４８個アミノ酸以内のオリゴペプチドであり、そこに記述した結晶三次元構造中の原子は表１の中で挙げた４０％の原子座標を持ち、又はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造中の少なくとも４０％のアミノ酸の主鎖炭素骨格の原子構造座標は表１中の座標と平均二乗偏差が１．７Å以下である。
【００５３】
一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、そこに記述したインフルエンザ・ウイルスはＡ、Ｂ、Ｃ型インフルエンザ・ウイルスより選び、そのうち、そこに記述したインフルエンザ・ウイルスは好ましくはＡ型インフルエンザ・ウイルス株Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６とＡ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８、Ｂ型インフルエンザ・ウイルス株Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／１９６６又はＣ型インフルエンザ・ウイルス株Ｃ／ＪＪ／１９５０より選んだ。
【００５４】
一つの好ましい実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、その中で上記複合体の結晶はＰ４（１）２（１）２の空間群を持ち、格子定数はおよそα＝ｂ＝１２２Å、ｃ＝１３３Å、α＝β＝γ＝９０°である。
【００５５】
一つの好ましい実施態様を通して、本発明インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、そこに記述したＡ型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣはインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス４、即ち４０６−４１４位を含むアミノ酸領域、αへリックス５、即ち４４０−４５０位を含むアミノ酸領域、αへリックス８、即ち５８３−６０３位を含むアミノ酸領域、αへリックス９、即ち６０８−６１３位を含むアミノ酸領域、αへリックス１０、即ち６３３−６４９位を含むアミノ酸領域、αへリックス１１、即ち６５３−６７３位を含むアミノ酸領域、αへリックス１２、即ち６８３−６９１位を含むアミノ酸領域、とαへリックス１３、即ち６９８−７１４位を含むアミノ酸領域、及び二つのβシート：βシート８とβシート９、それぞれ６１９−６２３位を含むアミノ酸領域と６２８−６３１位を含むアミノ酸領域が、ＰＡのＣ末端ＰＡＣの第一部分を構成し、その中でＡ型インフルエンザウイルスのポリメラーゼサブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣは主要なβシート折り畳み断片より成り、これらのβシートにはβシート１、即ち２９０−２９２位を含むアミノ酸領域、βシート２、即ち３１７−３２４位を含むアミノ酸領域、βシート３、即ち４８０−４９１位を含むアミノ酸領域、βシート４、即ち４９６−５０６位を含むアミノ酸領域、βシート５、即ち５１７−５２６位を含むアミノ酸領域、βシート６、即ち５４１−５５０位を含むアミノ酸領域、βシート７、即ち５５７−５７１位を含むアミノ酸領域などが含まれ、これらのβシートが共同でＰＡのＣ末端ＰＡＣ第二部分の折り畳みシート層の主な部分を構成し、その中でＡ型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣはαへリックス１、即ち３０３−３１１位を含むアミノ酸領域、αへリックス２、即ち３３１−３４９位を含むアミノ酸領域、αへリックス３、即ち３６４−３６９位を含むアミノ酸領域、αへリックス６、即ち４５４−４７５位を含むアミノ酸領域及びαへリックス７、即ち５７２−５７８位を含むアミノ酸領域が、ＰＡのＣ末端ＰＡＣ第二部分の上記折り畳みβシート層の周囲を囲い、その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００５６】
一つの好ましい実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、そこに記述したＡ型インフルエンザ・ウイルスのポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣは主にαへリックス８、αへリックス１０、αへリックス１１とαへリックス１３の関与を通じてＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎと相互に作用するが、好ましくは、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのαへリックス１１のＬｅｕ６６６、αへリックス１３のＰｈｅ７１０、αへリックス１０のＶａｌ６３６、Ｌｅｕ６４０、αへリックス１３のＴｒｐ７０６、αへリックス１１のＧｌｎ６７０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１との相互作用に関与させる。その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００５７】
一つの好ましい実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、そこに記述したＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス９とαへリックス１０の間の環状ペプチド断片のＩｌｅ６２１、Ｇｌｙ６２２、Ｇｌｕ６２３、Ｔｈｒ６１８とＰｒｏ６２０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１との相互作用に関与させた。その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００５８】
一つの好ましい実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、その中、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＡｓｎ６４７、Ｇｌｎ４０８、Ｃｙｓ５８４、Ｇｌｎ５８７、Ｇｌｎ５９１、Ｌｙｓ６４３、Ａｓｎ６４７、Ｓｅｒ６５９、Ｌｙｓ６６３、Ｔｒｐ６９９、Ａｓｎ７０３から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を、記述のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡＣのインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＢ１Ｎと結合する「袋状」のアミノ・サイトを構成させた。その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００５９】
一つの好ましい実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、その中、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＴｒｐ４０６、Ｇｌｕ４１０、Ｌｙｓ４６１、Ｇｌｕ５２４、Ｐｈｅ５２５、Ｓｅｒ５２６、Ｌｙｓ５３６、Ｌｙｓ５３９、Ｔｙｒ５４０、Ｌｅｕ５６３、Ｔｙｒ５６４、Ａｒｇ５６６及びＬｙｓ５７４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が、上記Ａ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣでヌクレオチド、ＲＮＡ若しくはその他の小分子又はタンパク質と結合する主溝及びチャンネルの形成に関する。その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００６０】
一つの好ましい実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、そこに記述したＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣの３７０から４０５位に位置するアミノ酸残基は一つの大環状を構成し、そこに記述したＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００６１】
一つの好ましい実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、そこに記述したＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのαへリックス１２、αへリックス１３は他のタンパク質との相互作用に関与するが、好ましくは、αへリックス１２及びαへリックス１３中のＩｌｅ６９０、Ｇｌｕ６９１、Ｇｌｕ６９２、Ｃｙｓ６９３、Ａｓｎ６９６から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を他のタンパク質との相互作用に関与させる。そこに記述したＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００６２】
一つの好ましい実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を提供し、上記Ａ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのＬｙｓ５０６、Ｇｌｙ５０７、Ａｒｇ５０８、Ｓｅｒ５０９、Ｈｉｓ５１０、Ｌｅｕ５１１、Ａｒｇ５１２、Ａｓｎ５１３及びＡｓｐ５１４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸をその他タンパク質との相互作用に関与させ、その中でＨｉｓ５１０はポリメラーゼ複合体ＲＮａｓｅの一部分を構成し、その中で上記Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００６３】
もう一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス８、αへリックス１０、αへリックス１１とαへリックス１３から構成される群より選択される少なくとも一つのメンバーと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物を提供し、その中で上記インフルエンザ・ウイルスはＡ、Ｂ、Ｃ型インフルエンザ・ウイルスより選び、好ましくは、上記インフルエンザ・ウイルスはＡ型インフルエンザ・ウイルス株：Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６、Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８；Ｂ型インフルエンザ・ウイルス株：Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／１９６６又はＣ型インフルエンザ・ウイルス株：Ｃ／ＪＪ／１９５０より選び、その中で、好ましくは、上記ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物は上記Ａ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのαへリックス１１のＬｅｕ６６６、αへリックス１３のＰｈｅ７１０、αへリックス１０のＶａｌ６３６、Ｌｅｕ６４０、αへリックス１３のＴｒｐ７０６、αへリックス１１のＧｌｎ６７０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物であり、その中で上記Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００６４】
もう一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス９とαへリックス１０の間の環状ペプチド断片中のＡ型インフルエンザ・ウイルスＩｌｅ６２１、Ｇｌｙ６２２、Ｇｌｕ６２３、Ｔｈｒ６１８とＰｒｏ６２０から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供し、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００６５】
もう一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣでＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＡｓｎ６４７、Ｇｌｎ４０８、Ｃｙｓ５８４、Ｇｌｎ５８７、Ｇｌｎ５９１、Ｌｙｓ６４３、Ａｓｎ６４７、Ｓｅｒ６５９、Ｌｙｓ６６３、Ｔｒｐ６９９、Ａｓｎ７０３から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供し、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００６６】
もう一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣでＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のＴｒｐ４０６、Ｇｌｕ４１０、Ｌｙｓ４６１、Ｇｌｕ５２４、Ｐｈｅ５２５、Ｓｅｒ５２６、Ｌｙｓ５３６、Ｌｙｓ５３９、Ｔｙｒ５４０、Ｌｅｕ５６３、Ｔｙｒ５６４、Ａｒｇ５６６及びＬｙｓ５７４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供し、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００６７】
もう一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣでＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣの３７０から４０５位より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供し、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００６８】
もう一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのαへリックス１２、αへリックス１３と結合し、好ましくはＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのαへリックス１２及αへリックス１３中のＩｌｅ６９０、Ｇｌｕ６９１、Ｇｌｕ６９２、Ｃｙｓ６９３、Ａｓｎ６９６から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供し、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００６９】
もう一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のシートβ４とシートβ５の間の環状領域内でＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣのＬｙｓ５０６、Ｇｌｙ５０７、Ａｒｇ５０８、Ｓｅｒ５０９、Ｈｉｓ５１０、Ｌｅｕ５１１、Ａｒｇ５１２、Ａｓｎ５１３及びＡｓｐ５１４から構成される群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供し、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００７０】
もう一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１と競合的にＰＡＣと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供する。
【００７１】
一つの好ましい実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１と競合的にＰＡＣと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物は主にＰＡＣ中αへリックス８、αへリックス１１、αへリックス１３、αへリックス１０からなる疎水性コアを介して相互作用を起こし、好ましくはＡ型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ中のαへリックス８中のＭｅｔ５９５、αへリックス１１中のＬｅｕ６６６、αへリックス１３中のＴｒｐ７０６とＰｈｅ７１０、及びαへリックス１０中のＶａｌ６３６とＶａｌ６４０を介して相互作用を起こし、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりである。
【００７２】
一つの好ましい実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１と競合的にＰＡＣと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供し、上記ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列における、野生型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎ残基５から１０位Ｐｒｏ５、Ｔｈｒ６、Ｌｅｕ７、Ｌｅｕ８、Ｐｈｅ９とＬｅｕ１０が形成する短へリックス領域を含む短ＰＴＬＬＦＬモチーフの中の少なくとも三つは、該モチーフとのポリペプチド配列対比において対応する位置のアミノ酸が同じである。
【００７３】
もう一つの具体的な実施態様を通して、上記ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物の組成物を提供し、キャリア又は賦形剤を選択的に含む。
【００７４】
もう一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルスによる病気の治療薬物の製造における上記組成物の応用を提供する。
【００７５】
もう一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の発現精製方法であって、
（ａ）標識タンパク質遺伝子コードを融合した又は融合しないインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣ第約２０１〜約３０１位アミノ酸から約６５０〜末端位アミノ酸をコードする遺伝子配列のベクターを構築し、このベクターを使い原核又は真核細胞を形質転換し、よって標識タンパク質が付いているＰＡＣを発現することと；
（ｂ）ＰＡＣの発現と似た方法で標識が付く又は付かない上記ＰＢ１Ｎを発現することと；
（ｃ）（ａ）で取得されたインフルエンザ・ウイルスＰＡＣの発現細胞と（ｂ）で取得されたインフルエンザ・ウイルスＰＢ１のＮ末端４８個のアミノ酸以内のアミノ酸ＰＢ１Ｎの発現細胞を一定比率で混合し、特異的に特異標識を識別する方法でこの混合タンパク質を分離し、酵素性分解で標識がつくポリペプチド中の標識タンパク質を取り去り、ＰＡＣとＰＢ１Ｎとの複合体を分離し、タンパク質の濃度を確定することと；
を含み、
その中で上記ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造中の原子は表１の中で挙げた少なくとも４０％の原子座標を持ち、又はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造中の少なくとも４０％のアミノ酸の主鎖炭素骨格の原子構造座標は表１中の座標との平均二乗偏差が１．７Å以下である、方法が提供される。
【００７６】
一つの好ましい実施態様を通して、その中で上記標識タンパク質はＧＳＴ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＭＢＰ−ｔａｇ、特異性抗体より選ばれ；上記ベクターは選択性標識遺伝子を含み、ステップ（ｃ）中での一定比率とは標識タンパク質−ＰＡＣと標識タンパク質−ＰＢ１Ｎのタンパク質総量のモル比が０．１：１〜１：０．１となるものであり、好ましくは標識タンパク質−ＰＡＣと標識タンパク質−ＰＢ１Ｎのタンパク質総量のモル比を０．５：１〜１：０．５にさせ、更に好ましくは標識タンパク質−ＰＡＣと標識タンパク質−ＰＢ１のタンパク質総量のモル比を１：１に近づかせ、好ましい標識タンパク質はＧＳＴであり、上記特異標識識別方法はアフィニティ・カラムを使用し、上記標識を取り除く方法はプロティナーゼ酵素性分解を使用し、上記ＰＡＣとＰＢ１Ｎとの複合体の分離方法はゲル濾過法又はイオン交換クロマトグラフィーで行い、上記タンパク質の濃度確定はゲル電気泳動法で行う。
【００７７】
更に好ましい実施態様では、その中の上記原核細胞は大腸菌である。
【００７８】
もう一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の共結晶化方法であって、
上記精製したＰＡＣとＰＢ１Ｎ複合体のタンパク質濃度を５〜３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮することと；
ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法またはｓｉｔｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法で結晶成長条件をスクリーニングすることと；
インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶を得ることと、
を含む方法を提供する。
【００７９】
もう一つの具体的な実施態様を通して、本発明はＰＡのＮ末端１〜約５０位アミノ酸から約２００〜約３００位のアミノ酸までであるＰＡＮの野生型又は突然変異型タンパク質の発現方法であって、標識タンパク質遺伝子を融合した又は融合していないインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＮ末端ＰＡＮの１〜約５０位アミノ酸から約２００〜約３００位アミノ酸までをコードする遺伝子配列の発現ベクターを構築し、このベクターで細胞を形質転換し、よって標識タンパク質を持つＰＡＮを発現し、その中で上記ＰＡのＮ末端ＰＡＮ中のアミノ酸配列は図１Ｃ中の少なくとも４０％のアミノ酸と同じである方法を提供する。
【００８０】
一つの好ましい実施態様で、そこに記述した原核細胞は大腸菌である。
【００８１】
他のもう一つの具体的な実施態様で、ＰＢ１Ｎと競合的にＰＡＣと結合する候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ＰＡＣを固定ベクターの表面に結合させることと；
（ｂ）過剰量の標識付きＰＢ１Ｎを上記の固定されたＰＡＣに接触させることと；
（ｃ）溶出液で充分に溶出して、未結合の遊離ＰＢ１Ｎを取り除くことと；
（ｄ）テスト化合物の溶液を（ｂ）の項で記述した操作でＰＢ１Ｎと結合したＰＡＣに接触させることと；
（ｅ）記述した溶出液で充分に溶出して、テスト溶液を得ることと；
（ｆ）上記テスト溶液中の標識つき遊離ＰＢ１Ｎの濃度を測定することと；
（ｇ）テスト溶液中の標識つき遊離ＰＢ１Ｎの濃度を基に、候補化合物のＰＡＣとの結合能力を求めることと、
を含む方法を提供する。
【００８２】
好ましい実施態様では、上記ステップ（ａ）中ＰＡＣの固定表面上への結合を、共有結合性架橋又はＰＡＣをアフィニティ・マトリックスと結合させることにより実現した。上記アフィニティ・マトリックスは固定表面上にはそのアフィニティ・マトリックスが結合できる結合基を有する。
【００８３】
好ましくは、上記アフィニティ・マトリックスはＧＳＴ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＭＢＰ−ｔａｇ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、特異性抗体から選択され、固定表面上は対応マトリックスの結合基を有する。
【００８４】
好ましくは、上記標識付きＰＢ１Ｎポリペプチドは同位体又はその他の化学分子で標識したタンパク質より選択され、好ましくは、その他の化学分子での標識は緑色蛍光タンパク質、各種融合ポリペプチドより選び使用した。
【００８５】
好ましくは、上記固定表面はアフィニティ・クロマトカラムである。
【００８６】
一つの具体的な実施態様を通して、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造の、インフルエンザ・ウイルス感染による疾病の治療に使用できる各種ポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物の設計とスクリーニングにおける応用であって、
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を設計することと；
タンパク質三次元構造座標に基づき、コンピューター・シミュレーションにて特定位置に結合可能なポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子をスクリーニングすることと；
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或はスクリーニングしたポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を上記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ配列と少なくとも５０％同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質に結合させ、更に結合状況を分析することと；
タンパク質三次元構造座標に基づき、設計或はスクリーニングしたポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子を上記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ配列と少なくとも５０％同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質に結合させ結晶にし、よってタンパク質Ｘ線結晶構造解析方法にてポリペプチド及び化合物分子のタンパク質との結合状況を分析することと、
を含み、
その中、上記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ配列と少なくとも５０％の同配列を持つ任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質と結合する上記ポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物分子が即ち候補化合物である。
【００８７】
一つの具体的な実施態様を通して、任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼの三つのサブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の構造を提供したが、その中に含まれる一つのタンパク質又はそのある一領域は、上記ＰＡＣタンパク質と少なくとも４０％の同じ配列を持つ応用を提供する。
【００８８】
一つの具体的な実施態様を通して、任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の三次元構造を提供したが、その中に含まれる一つのタンパク質又はそのある一領域の主鎖の三次元構造座標は、上記ＰＡＣタンパク質配列の少なくとも４０％の主鎖炭素骨格の原子三次元座標と平均二乗偏差が１．７Å以下である。
【００８９】
一つの具体的な実施態様を通して、任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の構造を提供したが、そこに含まれる一箇所のタンパク質領域は上記のＰＢ１Ｎポリペプチドのアミノ酸１−１１領域と２０％の配列相同性を持ち、好ましくは４０％の配列相同性を持つ。
【００９０】
一つの具体的な実施態様を通して、一種のポリペプチド又は小分子を提供したが、それらの特徴は上記インフルエンザ・ウイルスＰＡサブユニット上の任意のアミノ酸と相互作用を有することにある。
【００９１】
一つの具体的な実施態様を通して、上記の三次元結晶構造の薬物スクリーニング及び薬物設計における応用を提供した。
【００９２】
一つの具体的な実施態様を通して、ＰＡＣとＰＢ１Ｎタンパク質三次元構造に基づいて、タンパク質と結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物をスクリーニングする方法であって、タンパク質結晶方法でＰＡＣを含む結晶を取得し、又はＰＡＣ及びＰＢ１Ｎを含むタンパク質複合体結晶の三次元構造座標を取得し；そこに記述した三次元構造はこの座標における少なくとも４０％のアミノ酸残基を含有する主鎖炭素骨格原子の三次元座標と比べ平均二乗偏差が１．７Å以下である全ての構造を含む方法を提供する。
【００９３】
一つの具体的な実施態様を通して、下記のようなインフルエンザ・ウイルス亜型ＰＡサブユニット・タンパク質の発現精製方法を提供し：ＰＡを断片に分けて細菌又は真核発現システムにて発現するが、記述した方法で、含有するあらゆるタンパク質からある一箇所の断片が記述配列相応領域と同じアミノ酸配列を４０％持つタンパク質を発現し精製する。
【００９４】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体構造中のαへリックス８、１０、１１、１３中任意一つの領域と少なくとも４０％の同じアミノ酸を有するタンパク質上のアミノ酸残基と相互に作用するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、抗体又は免疫結合物を提供した。
【００９５】
注意すべきは、その中、Ｂ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりであり、ここでは一々詳述することを略す。採用しうるタンパク質又はポリペプチド配列の比較方法としてはＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を例に挙げる。
【００９６】
インフルエンザ・ウイルスＰＡとＰＢ１タンパク質の発現精製方法：
鳥インフルエンザ由来ウイルス遺伝子Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６、そのコードタンパク質配列はそれぞれ：
（１）ＰＡタンパク質配列：
【表１】
2011515074.tif 000003
即ち：
【表２】
2011515074.tif 000004
【００９７】
（２）ＰＢ１タンパク質配列：
【表３】
2011515074.tif 000005
即ち：
【表４】
2011515074.tif 000006
である。
【００９８】
分子クローン技術にて、インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡ遺伝子をタンパク質のＮ末端とＣ末端の二部分に分けてクローン化する。Ｎ末端には２５６位までのアミノ酸を含み、Ｃ末端には２５７番目から７１６番目のアミノ酸を含む。これら両遺伝子は、Ｎ末端にＧＳＴを融合した融合タンパク質（ＧＳＴ−ＰＡ−Ｎ及びＧＳＴ−ＰＡＣ）を発現させるため、それぞれｐＧＥＸ−６ｐベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．より）へクローン化し、クローン化したプラスミドにて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、形質の転換されたＢＬ２１にて最終濃度０．１−１ｍＭのＩＰＴＧ（イソペニル−β−Ｄ−チオガラクトシド）で大腸菌による二種のタンパク質の発現を誘導して当該二種類タンパク質の各自発現菌を獲得した。詳細は実施例１を参照。
【００９９】
ＰＢ１  Ｎ末端の４８個以内のアミノ酸の遺伝子（前から２５ペプチドを含む）を同様にｐＧＥＸ−６ｐベクターへクローン化し、ＧＳＴ−ＰＢ１Ｎ末端ペプチドを融合した融合タンパク質を発現した。
【０１００】
同じく、ＧＳＴを融合したＰＢ１Ｎ末端２５個アミノ酸のオリゴペプチド又は４８個以内のアミノ酸のオリゴペプチドをそれぞれ発現した。同様に当該プラスミドにて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、形質の転換されたＢＬ２１にて最終濃度０．１−１ｍＭのＩＰＴＧで大腸菌によるタンパク質の発現を誘導してそのタンパク質の発現菌を獲得する。
【０１０１】
ＧＳＴ−ＰＡ−Ｎを発現した細菌をバッファーに懸濁して溶解し、遠心分離して上清を得たあと、アフィニティ・クロマトカラムを使って、その中からＧＳＴ−ＰＡ−Ｎ融合タンパク質を精製し出す。
【０１０２】
ＧＳＴ−ＰＡＣを発現した発現菌とＧＳＴ−ＰＢ１オリゴペプチドを発現した発現菌をそれぞれ約２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーに懸濁し、そして二種の発現菌を比率にあわせ混合して、ＧＳＴ−ＰＡＣとＧＳＴ−ＰＢ１のタンパク質総含有量のモル比が０．１：１〜１：０．１になるようにするが、好ましくはＧＳＴ−ＰＡＣとＧＳＴ−ＰＢ１のタンパク質総含有量のモル比を０．５：１〜１：０．５に、更に好ましくはＧＳＴ−ＰＡＣとＧＳＴ−ＰＢ１のタンパク質総含有量のモル比を１：１に近づかせる。
【０１０３】
そして、その混合ＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティ・カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）を使用して精製する。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロティナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．より）にて酵素分解後、ゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００及びイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）等の方法でＰＡＣ／ＰＢ１オリゴペプチド複合体（クロマトカラムは全てＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．より）を分離精製し出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてタンパク質の純度を測定後、更なる結晶実験に使用する。
【０１０４】
タンパク質の結晶化とその最適化：
上記方法で発現精製したＰＡＣ及びＰＢ１Ｎポリペプチドの複合物を約５−３０ｍｇ／ｍｌ濃度まで濃縮し、ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法にて、結晶化試薬（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して結晶成長条件をスクリーニングし、多種結晶化試薬の使用条件下でイニシャル結晶を得た。
【０１０５】
更なる最適化を通じて、その中、異なるｐＨバッファーの条件下（ｐＨ  ４〜９）約１Ｍの酢酸ナトリウム溶液より外見の良好な結晶を得た。濃度１〜１．３Ｍの酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａより）のバッファー（ｐＨ４〜９）より比較的大きい三角錐体結晶を取得し、分解能約４Åくらいであった。
【０１０６】
Ｘ線回折データ収集を行う際、回折に必要な結晶を懸濁液から１．４Ｍの酢酸ナトリウム約１０μｌと１０％のグリセリン（Ｓｉｇｍａより）を含有する結晶バッファーへ移し、ドロップをオープン放置して空気脱水を１時間以上行った後、分解能が３Åに到る母体及びセレノ結晶と相応のＸ線回折データを得た。
【０１０７】
結晶のデータ収集と構造解析：
ＦＲ−Ｅ  Ｘ線回折機（Ｒｉｇａｋｕより）を使用し、１．５４１８Åの波長下でまずＰＡ−ＰＢ１のＮ端２５ペプチド複合体結晶の分解能２．９Åの母体データを一セット収集した。そして、アメリカ、シカゴのＡＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）シンクロトロン放射光施設（ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）（ビームライン番号：ＳＢＣ  １９ＩＤ；ビームモニター：ＡＤＳＣ  Ｑ３１５）を利用して、波長０．９７８３Åと０．９７８５Åの下で、このタンパク質結晶の分解能が約３．３Åに到るｐｅａｋとｅｄｇｅとした２セットのセレン化物結晶データを収集した。ＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ  １９９７）を利用して、得られた３セットのデータを処理し、それらの空間群が全てＰ４（１）２（１）２であることを発見した。多波長異常分散法（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  １９９１）で位相を計算し、処理しで得たｓｃａファイルよりＳＨＥＬＸＤ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ  １９９８）でセレン原子を探した。タンパク質自身１４個のメチオニンを含むが、本発明者らは合わせて１４個のセレン原子を見つけ出し、セレン原子座標及び処理して得たＰｅａｋとＥｄｇｅ二セットのデータをａｕｔｏＳＨＡＲＰプログラム（Ｖｏｎｒｈｅｉｎ、Ｂｌａｎｃら、２００７）にインプットして、位相計算と電子密度図の修飾を行なった。計算して得られた電子密度図より、幾つかの二次構造（一部のαへリックスとβシートを含む）がはっきりと見出せる。そして、プログラムＣＡＤを利用して位相拡張を行い、受け取った母体データを利用して位相を２．９Åまでを広げて構造モデルの構築を行なった。モデル構築に使ったプログラムはＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Ｐｅｒｒａｋｉｓ、Ｍｏｒｒｉｓら、１９９９）とＰｈｅｎｉｘ（Ａｄａｍｓ、Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅら、２００２）である。この二種のプログラムの自動モデル構築で全体構造の約６０％が完成でき、残りの部分はプログラムＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃｏｗｔａｎ  ２００４）を利用して手動で構築した。
【０１０８】
最後に、得られたモデルをプログラムＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ、Ａｄａｍｓら、１９９８）とＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ、Ｖａｇｉｎら、１９９７）で修正した結果、当該タンパク質構造の解析完成に至り、修正した構造の最終Ｒ因子と自由Ｒ因子はそれぞれ０．２２と０．２６である。
【０１０９】
ＰＡＣ／ＰＢ１Ｎオリゴペプチドタンパク質複合体結晶構造原子座標は表１を参照。
【実施例】
【０１１０】
実施例１
インフルエンザ・ウイルスＰＡとＰＢ１ポリペプチドの発現方法：
本発明の一種の実施態様はＰＡを二段に分けて発現し、よってＰＡのＮ末端前２５６アミノ酸残基セグメント及び２５７−７１６個アミノ酸残基セグメントを別々に発現し、この二つのタンパク質ポリペプチドをコードする二つの遺伝子セグメントを別々に大腸菌発現ベクター上へクローン化し、細菌中でタンパク質の発現を行う。単独にＰＡのＮ末端（１−２５６アミノ酸）を発現する細菌中からＰＡのＮ端ポリペプチドを精製し、ＰＡのＮ端ペプチドをタンパク質結晶に使用する。ＰＡのＮ末端発現菌を遠心収集後、ＰＢ１のＮ端ポリペプチドとの共同精製に備える。
【０１１１】
ＰＢ１のＮ末端前２５座又は４８座アミノ酸以内を含むポリペプチド（第一位メチオニンは含まず）をＧＳＴ融合タンパク質の形式で細菌中で発現する。インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質・サブユニットＰＡを段分けで細菌中又はその他真核生物細胞中で少なくとも５０％の領域が２５７−７１６アミノ酸領域の一部分のＰＡタンパク質・セグメントで発現する。
【０１１２】
インフルエンザ・ウイルスＰＡのＮ末端を大腸菌中で発現精製
分子クローン技術を使用し、インフルエンザ・ウイルスＰＡのＮ末端（第１から２５６位アミノ酸）をｐＧＥＸ−６ｐベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．より）へクローン化し、そのクローン・サイトはＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩであり得る。クローン化で得たＰＡのＮ末端遺伝子を含む発現プラスミドで大腸菌ＢＬ２１を形質転換してタンパク質を発現し、よって細菌にＰＡタンパク質Ｎ端（Ｎ末端）にＧＳＴ融合タンパク質が接続され発現すると同時にＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎプロティナーゼ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって切断可能な酵素切断サイトを含むためＧＳＴタンパク質標識と標的タンパク質ＰＡポリペプチドが分離できる。培養した大腸菌ＢＬ２１細胞中で最終濃度が０．１−１ｍＭあたりのＩＰＴＧを使用して大腸菌を触発し、当該タンパク質の発現菌を獲得する。使用されたベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含む。クローン化で構築した融合タンパク質発現プラスミドにて大腸菌、例えばＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した後、３７度でＬＢ等細菌培養器を使用し一晩細菌培養し、約１２時間後１：１００あたりで大量の培養器へ移し、３７度温度下でＯＤが１．０あたりまで培養し、そして０．１〜１ｍＭのＩＰＴＧを加え発現誘導を行い、およそ３−６時間後遠心して細菌を収集し、収集した沈澱細菌は−２０度から−８０度の冷蔵庫で保存し、ＰＡのＮ末端タンパク質の精製に備える。
【０１１３】
インフルエンザウイルスＰＡのＣ末端とＰＢ１ポリペプチド複合体の発現精製：
分子クローン技術を通して、インフルエンザ・ウイルスＰＡのＣ末端（第２５７から第７１６アミノ酸）をｐＧＥＸ−６ｐベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．より）上へクローン化し、そのクローン遺伝子座はＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩである。クローン化したＰＡのＣ末端遺伝子を含む発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１中で形質転換しタンパク質の発現を行い、よって細菌にタンパク質Ｎ端（Ｎ末端）にＧＳＴ融合タンパク質が繋ぐのを発現させ、同時にＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎプロティナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって切断可能な酵素切断遺伝子座が含まれることによって、ＧＳＴタンパク質標識と標的タンパク質ＰＡポリペプチドを分離する。培養した大腸菌ＢＬ２１細胞に最終濃度が０．１−１ｍＭあたりのＩＰＴＧを使用してタンパク質発現を誘導し、当該タンパク質の発現菌を獲得する。使用されたベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含む。クローン化で構築した融合タンパク質発現プラスミドにて大腸菌例えばＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した後、３７度でＬＢ等細菌培養器を使用し一晩細菌培養し、約１２時間後１：１００あたりで大量の培養器へ移し、３７度温度下でＯＤが１．０あたりまで培養し、それから培養温度を１６度まで下げ、そして０．１−１ｍＭのＩＰＴＧを加え触発発現を行い、およそ１２−２４時間後遠心して細菌を収集し、収集した沈澱細菌は−２０度から−８０度の冷蔵庫で保存するか、直接精製に使う。
【０１１４】
ＰＢ１  Ｎ端４８個以内のアミノ酸の遺伝子（発明者らはＰＢ１のＮ末端前４８個アミノ酸ポリペプチド及び前２５個アミノ酸ポリペプチドを発現）を同様にｐＧＥＸ−６ｐベクターの多クローン遺伝子座上へクローン化し、使われた酵素切断サイトはＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで、細菌にＧＳＴ融合タンパク質を含む発現ができ、並びに当該融合タンパク質はＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎプロティナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって切断可能なプロティナーゼ遺伝子座を含み、ＧＳＴ標識及び標的タンパク質ＰＢ１ポリペプチドを分離できるようにする。上記通り、ＰＡ融合タンパク質発現方法は大腸菌ＢＬ２１中で融合のＧＳＴ−ＰＢ１Ｎ端ペプチドの融合タンパク質を発現することであり、選択性遺伝子はアンピシリン耐性遺伝子であり、タンパク質の発現は３７度下であり、使用される誘導物質はＩＰＴＧである。最後に遠心分離で発現細菌を収集し、当該細菌はそのままタンパク質の精製に使用し、若しくは−２０度から−８０度の冷蔵庫で保管する。
【０１１５】
遠心分離で収集したＧＳＴ−ＰＡＮ末端ポリペプチドの発現菌を約２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌのバッファー又は１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）燐酸バッファーに懸濁し、超音波にて細胞を破砕し、不溶沈殿を遠心して除去し、上清を収集して、グルタチオンアフィニティ・クロマトグラフィーにてＧＳＴ−ＰＡ−Ｎ端ポリペプチドを精製し、よってＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎプロティナーゼ酵素性で融合タンパク質を分解し、融合プロティナーゼをＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）とＰＡ−Ｎの二段に分解し、更にイオン交換クロマトグラフィー及びゲルサイズ排除クロマトグラフィーにてＰＡ−Ｎタンパク質ポリペプチドを精製する。このタンパク質を５〜３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、結晶成長に使用する。
【０１１６】
ＧＳＴ−ＰＡＣＣ末端ポリペプチドの発現菌とＧＳＴ−ＰＢ１Ｎオリゴペプチドの発現菌をそれぞれ約２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌのバッファー又は１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）燐酸バッファーに懸濁し、そして二種類の発現菌を一定比率で混合し、ＧＳＴ−ＰＡとＧＳＴ−ＰＢ１のタンパク質総含有量のモル比を０．１：１〜１：０．１にさせ、好ましくはＧＳＴ−ＰＡとＧＳＴ−ＰＢ１のタンパク質総含有量のモル比が０．５：１〜１：０．５で、更に好ましくはＧＳＴ−ＰＡとＧＳＴ−ＰＢ１のタンパク質総含有量のモル比を１：１に近づかせる。
【０１１７】
混合された細菌懸濁液は超音波又はその他細胞溶解法で細胞を破砕した後、遠心して細胞溶解物の不溶部と可溶部に分離され、高速遠心（約２０，０００ｇ）した後得た上清をグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティ・カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．より）を通して、初歩的にこの混合タンパク質を分離精製し、ＧＳＴ標識を含むタンパク質はグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティ・カラムに結合でき、その他タンパク質は当該アフィニティ・カラム上には結合できない。タンパク質がアフィニティ・カラムと結合したら、上記の細菌懸濁バッファーで不純物タンパク質を洗い流す。適量のＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎプロティナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．より）を使用し、アフィニティ・カラム上の混合ＧＳＴ融合タンパク質を酵素性分解し、この過程が約２４時間かかる。そして酵素性分解で切断したＰＡＣとＰＢ１Ｎ融合タンパク質をゲル濾過法Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．より）及びＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換クロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．より）等の方法で、ＰＡＣ／ＰＢ１Ｎオリゴペプチド複合体（クロマトグラフィー・カラムは全てＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．より）を分離精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法でタンパク質純度を確定後、純度は通常９０％以上に達する。上記ステップを通して精製されたタンパク質を濃縮管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社より）で約５−３０ｍｇ／ｍＬあたりまで濃縮し、更なる結晶実験で使用する。
【０１１８】
当業者が知るとおり、インフルエンザ・ウイルスのＰＡのＮ末端及びＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎは本願明細書上記の原核細胞、例えば大腸菌細胞の中だけで発現できるのではなく、真核細胞、例えば昆虫細胞の中でも発現でき；同時に任意のそのエンドヌクレアーゼ、酵素切断サイト、リガーゼが使用でき；精製待ちの目標ポリペプチドをＧＳＴ如くその他標識と融合させ、そして相応の分離精製方法を選び精製し、最後に目標ポリペプチド中に融合した標識を除去できる。上記本発明に対する各種変更と修飾は全て本発明の保護範囲内にある。
【０１１９】
注意すべきは、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザウイルスにおけるＡ型インフルエンザウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりであり、ここでは略述する。
【０１２０】
実施例２
ＰＡＣ／ＰＢ１Ｎオリゴペプチド複合体の結晶
上記方法で発現精製したＰＡのＮ末端ポリペプチドの複合物を濃度約５−３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法で結晶化試薬（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社等よりのＳｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔ  Ｉ／ＩＩ、Ｉｎｄｅｘ等の試薬キット）を使用して結晶成長条件をスクリーニングする。プライマリスクリーニングで、本発明者らは各種異なる結晶化試薬の使用条件下でイニシャル結晶を獲得する。
【０１２１】
更なる最適化を通じて、その中、異なるｐＨバッファーの条件下（ｐＨ  ４〜９）約１Ｍの酢酸ナトリウム溶液より外見の良好な結晶を得た。濃度１〜１．３Ｍの酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａより）のバッファー（ｐＨ４〜９）より比較的大きい三角錐体結晶を取得し、分解能は約４Åくらいであった。
【０１２２】
Ｘ線回折データ収集を行う際、回折に必要な結晶を懸濁液から１．４Ｍの酢酸ナトリウム約１０μｌと１０％のグリセリン（Ｓｉｇｍａより）を含有する結晶バッファーへ移し、ドロップをオープン放置して空気脱水を１時間以上行った後、高解析度のタンパク質結晶が得られたが、母体及びセレノタンパク質結晶解析度は２．９Å以上にも達する。
【０１２３】
注意すべきは、その中でＢ型又はＣ型インフルエンザ・ウイルスにおけるＡ型インフルエンザ・ウイルスに対応する領域のアミノ酸はそれぞれ図１Ａと図１Ｂ及び図１Ｃ及び図１０Ａと図１０Ｂに示すとおりであり、ここでは略述する。
【０１２４】
実施例３
ＰＡＣ／ＰＢ１Ｎオリゴペプチド複合体の結晶構造
ＦＲ−Ｅ  Ｘ線回折機（Ｒｉｇａｋｕより）を使用し、１．５４１８Åの波長下でまずＰＡ−ＰＢ１のＮ端２５ペプチド複合体結晶の分解能２．９Åの母体データを一セット収集した。そして、アメリカ、シカゴのＡＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ）シンクロトロン放射光施設（ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）（ビームライン番号：ＳＢＣ  １９ＩＤ；ビーム・モニター：ＡＤＳＣ  Ｑ３１５）を利用して、波長０．９７８３Åと０．９７８５Åの下で、このタンパク質結晶の分解能が約３．３Åに到るｐｅａｋとｅｄｇｅとした２セットのセレン化物結晶データを収集した。ＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ  １９９７）を利用して、得られた３セットのデータを処理し、これらの空間群が全てＰ４（１）２（１）２であることを発見した。多波長異常分散法（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  １９９１）で位相を計算し、処理しで得たｓｃａファイルよりＳＨＥＬＸＤ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ  １９９８）でセレン原子を探した。タンパク質自身１４個のメチオニンを含むが、本発明者らは合わせて１４個のセレン原子を見つけ出し、セレン原子座標及び処理して得たＰｅａｋとＥｄｇｅ二セットのデータをａｕｔｏＳＨＡＲＰプログラム（Ｖｏｎｒｈｅｉｎ、Ｂｌａｎｃら、２００７）にインプットして、位相計算と電子密度図の修飾を行なった。計算して得られた電子密度図より、幾つかの二次構造（一部のαへリックスとβシートを含む）がはっきりと見出せる。そして、プログラムＣＡＤを利用して位相拡張を行い、受け取った母体データを利用して位相を２．９Åまでを広げて構造モデルの構築を行なった。モデル構築に使ったプログラムはＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Ｐｅｒｒａｋｉｓ、Ｍｏｒｒｉｓら、１９９９）とＰｈｅｎｉｘ（Ａｄａｍｓ、Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅら、２００２）である。この二種のプログラムの自動モデル構築で全体構造の約６０％が完成でき、残りの部分はプログラムＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ及びＣｏｗｔａｎ  ２００４）を利用して手動で構築した。
【０１２５】
最後に、得られたモデルをプログラムＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ、Ａｄａｍｓら、１９９８）とＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ、Ｖａｇｉｎら、１９９７）で修正した結果、当該タンパク質構造の解析完成に至り、修正した構造の最終Ｒ因子と自由Ｒ因子はそれぞれ０．２２と０．２６である。
【０１２６】
実施例４
ＰＡのＮ末端タンパク質結晶
上記方法で発現精製したＰＡのＮ末端ポリペプチドの複合物を濃度約５−３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法で結晶化試薬（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社等よりのＳｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔ  Ｉ／ＩＩ、Ｉｎｄｅｘ等の試薬キット）使用して結晶成長条件をスクリーニングする。プライマリ・スクリーニングで、本発明者らは各種異なる結晶化試薬の使用条件下でイニシャル結晶を獲得する。
【０１２７】
更に最適化を通じて、その中で、ｐＨ６．５のＭＥＳバッファー条件下で約２０％ＰＥＧ８０００又は２０％３３５０、０．１Ｍの塩化マグネシウム又は０．１Ｍの酢酸マグネシウム溶液（使用した試薬は全てＳｉｇｍａ  Ｉｎｃ．より）からは全てＸ線回折良好な結晶が得られ（図３のＡ及びＢ結晶図及びＣ及びＤ回折図）、結晶のＸ線回折解析度は約２−４Åあたりである。
【０１２８】
実施例５
ＰＢ１Ｎと競合的にＰＡＣと結合する小分子のスクリーニング方法
ＰＡＣ／ＰＢ１Ｎオリゴペプチド複合体を脱重合させる一種の小分子薬物のスクリーニング過程において、その中でＰＢ１Ｎオリゴペプチドの遺伝子とＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現する遺伝子を融合させ、ＧＦＰ融合のＰＢ１Ｎオリゴペプチド・タンパク質を発現し、小分子化合物脱重合タンパク質複合体の指示分子とする。分子クローン化方法でＰＢ１オリゴペプチド遺伝子セグメントをＧＦＰ遺伝子断片上に繋ぎ、一つのＮ末端又はＣ末端に繋ぐＧＦＰのＰＢ１ペプチド融合タンパク質を発現する。
【０１２９】
方法１：上記ＰＡのＣ末端及びＰＢ１オリゴペプチドの発現精製方法、Ｎ末端にＧＳＴのあるＰＡのＣ末端融合タンパク質即ちＧＳＴ−ＰＡＣ融合タンパク質とＧＦＰ−ＰＢ１Ｎオリゴペプチド融合タンパク質の複合体を発現精製する。ＧＳＴ−ＰＡＣ融合タンパク質とＧＦＰ−ＰＢ１Ｎオリゴペプチド融合タンパク質の複合体をグルタチオンアフィニティ・カラム上に流し、結合させる。当該複合体にはＧＦＰタンパク質が含まれているため、ＧＳＴ−ＰＡＣはこのアフィニティ・カラムと結合後、ＧＳＴ−ＰＡＣと結合したＧＦＰ−ＰＢ１Ｎ融合タンパク質はこのアフィニティ・カラムを緑色に染める。ＧＳＴ−ＰＡＣ及びＧＦＰ−ＰＢ１Ｎ複合体タンパク質と結合後のアフィニティ・カラムをバッファーで充分に洗浄し、未結合のタンパク質を徹底的に除去する。そして、スクリーニング用の小分子化合物の混合物をこのアフィニティ・カラムに流し（当該混合物中にはグルタチオン又はその他ＧＳＴをアフィニティ・カラムから分離され、洗い落とされる成分は含まれるべきではない）、もしも混合物中にＰＢ１Ｎポリペプチドに代わってＰＡＣと結合する小分子が含まれていれば、一部ＰＡＣ上に結合しているＧＦＰ−ＰＢ１Ｎポリペプチド融合タンパク質が代わりに洗い落とされ、洗い出した溶液の中にはこのＧＦＰ融合タンパク質が含まれているため、一定波長の蛍光顕微鏡で緑色を示す。更に混合物中より小分子を分離精製し、上記緑色蛍光タンパク質追跡方法で、ＰＢ１Ｎポリペプチドを替えられる成分を追跡し、ＰＡとＰＢ１ペプチドの結合を阻害する小分子化合物を最終確定する。上記の方法の様にＧＳＴをアフィニティ・マトリックスとして使用する以外にも、例えばＦｌａｇ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、マルクトース結合タンパク質）−ｔａｇ、特異性抗体等その他ポリペプチドをアフィニティ・マトリックス結合基として使用でき、相応に、アフィニティ・クロマトカラムにも相応なアフィニティ・マトリックスを使うべきで、例えばＦｌａｇ−ｔａｇ使用時、対Ｆｌａｇ−ｔａｇの抗体（例えばＳｉｇｍａ  Ｉｎｃ．社のａｎｔｉ−ｆｌａｇ単クローン抗体）を使用し、それをアフィニティ・クロマトカラムに固定し、Ｆｌａｇと結合するゲル・マトリックスとして使う。ＰＡに結合且つＰＢ１ペプチド（具体構造）の代わりとなる化合物分子は例えばＭＳ等の方法でその化学構造を確定できる。
【０１３０】
方法２：ＰＡＣを単独で精製し（融合タンパク質又は非融合タンパク質）、それを化学的架橋方法を利用して、共有結合性架橋でゲル・マトリックスに繋ぎ、但しタンパク質は不変性を保たせる。ＧＦＰ−ＰＢ１Ｎを共有結合したゲル・カラムを通して、ＧＦＰ−ＰＢ１Ｎ融合タンパク質とＰＡＣタンパク質を結合させ、よってゲル・カラムはＧＦＰ緑色蛍光を表す。小分子混合物溶液がこのゲル・カラムに流れ、もしもＧＦＰ−ＰＢ１Ｎに代わってＰＡＣと結合する化合物があれば、ＧＦＰ−ＰＢ１Ｎ融合タンパク質が洗い落とされ、溶出液は特定波長光の下で緑色を示し、ＧＦＰ−ＰＢ１Ｎの代わりの化合物分子は即ちゲルカラム上のＰＡＣ分子上に結合した。バッファーでゲル・カラムを洗い流していらないものを取り除き、更に尿素等でＰＡＣを変質させ、その上に結合した小分子を洗い落とし、質量分析等の方法で、ＰＡ上に結合した小分子を分析し、この小分子の構造情報を得る。この化合物はＰＡＣ／ＰＢ１Ｎオリゴペプチド複合体を分解させる小分子薬物に成りうる。
【０１３１】
実施例６：
ＰＡＣ／ＰＢ１Ｎの複合体の結晶三次元構造を利用した、インフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いる各種ポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物の設計とスクリーニング方法
インフルエンザ・ウイルスポリメラーゼ・サブユニットＰＡのＣ末端ＰＡＣとＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎとの複合体の結晶三次元構造を利用した、インフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いる各種ポリペプチド、タンパク質又は無機若しくは有機化合物の設計とスクリーニングの具体的ステップは下記通りである：タンパク質三次元構造の座標に基づき、コンピューター・シミュレーションを通して特定位置に結合するポリペプチド及び化合物分子を設計し；タンパク質三次元構造の座標に基づき、コンピューター・シミュレーションを通して特定位置に結合する可能性のあるポリペプチド及び化合物分子を探索し；タンパク質三次元構造の座標に基づき、設計又は探索し出したポリペプチド及び化合物分子を、上記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ配列と少なくとも５０％同じ配列を持つ任意亜型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質の中へ結合させ、更に結合状況の方法を分析し；タンパク質三次元構造の座標に基づき、設計又は探索し出したポリペプチド及び化合物分子を、上記ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ配列と少なくとも５０％同じ配列を持つ任意亜型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・タンパク質の中へ結合させ、並びに結晶させ、よって結晶回折三次元構造分析方法でポリペプチド及び化合物分子とタンパク質の結合状況を分析する。
【０１３２】
実施例７：
ＰＡＣ／ＰＢ１Ｎの複合体の結晶三次元構造を利用した、インフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いるペプチドの設計とスクリーニング
実験による実証では、一種のＭ１、Ｄ２、Ｖ３、Ｎ４、Ｐ５、Ｔ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｆ９、Ｌ１０及びＫ１１を含むオリゴペプチドはＰＡのＣ末端と結合する。発明者らはＰＢ１Ｎから、第一座Ｍ１から第１１座Ｋ１１までを含むポリペプチド遺伝子をｐＦＥＸ−６ｐベクター上へクローン化し、このＧＳＴ−ＰＢ１Ｎ融合タンパク質を精製し、体外結合実験を通して、アフィニティ・ゲル・カラムに固定されたこの融合タンパク質で溶液中のＰＡ−Ｃと結合させ、発明者らはこの融合タンパク質がＰＢ１Ｎが持つＰＡ−Ｃと結合する能力を所有していることを発見した。
【０１３３】
同じ実験方法を通して、発明者らは一種のＭ１、Ｄ２、Ｖ３、Ｎ４、Ｐ５、Ｔ６、Ｌ７、Ｌ８、Ｆ９、Ｌ１０、Ｋ１１、Ｖ１２及びｐ１３を含む融合タンパク質もＰＢ１Ｎが持つＰＡ−Ｃと結合する能力を所有していることを発見した。これで、この二種類のオリゴペプチドが持つＰＡ−Ｃと結合する能力により、これらオリゴペプチドは潜在的なインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ活性を阻害するポリペプチド薬物又は更に薬物設計をする模型と成りうる。
【０１３４】
同様に、スクリーニングされたポリペプチドが、上記ポリペプチドと少なくとも３座同じアミノ酸配列がある場合、このポリペプチドは潜在的にインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ活性を阻害するポリペプチド薬物に成りうる。
【０１３５】
任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の構造で、その中に含まれる一つのタンパク質又はそのある一領域は、上記ＰＡＣタンパク質と少なくとも４０％同じ配列を持つ。
【０１３６】
任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の構造で、その中に含まれる一つのタンパク質又はそのある一領域の主鎖三次元構造座標は、上記のＰＡＣタンパク質配列の少なくとも４０％の主鎖炭素骨格三次元座標と平均二乗偏差が１．７Å以下である。
【０１３７】
任意亜型のインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼ・サブユニットＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ、ＰＢ１とＰＢ２複合体の構造で、その中に含まれる一つのタンパク質領域は上記のＰＢ１Ｎポリペプチドのアミノ酸２−１２領域と４０％の配列同様性がある。
【０１３８】
任意ポリペプチド又は小分子と、上記インフルエンザ・ウイルスＰＡサブユニット上のキーアミノ酸との間では相互作用がある。
【０１３９】
上記構造の薬物スクリーニング及び薬物設計においての応用：
ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎタンパク質三次元構造に基づいた、タンパク質結合の化合物又はポリペプチドのスクリーニング方法は下記を含む：タンパク質結晶方法でＰＡＣ及びＰＢ１Ｎタンパク質複合体結晶を取得し、当該タンパク質複合体結晶はＰ４（１）２（１）２の空間群を持ち、単位胞は約α＝ｂ＝１２２Å、ｃ＝１３３Å、α＝β＝γ＝９０°である；Ｘ線回折結晶学技術で、ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎタンパク質複合体の三次元構造座標を取得し；該三次元構造は、当該座標中の少なくとも４０％アミノ酸残基の主鎖炭素骨格三次元座標と平均二乗偏差が１．７Å以下である構造を全て含む。
【０１４０】
インフルエンザ・ウイルス亜型ＰＡサブユニット・タンパク質の発現精製方法：ＰＡを段分けで細菌又は真核発現系で発現し、上記でこの方法により、任意タンパク質中のある一領域と上記の配列相応領域が４０％の同じアミノ酸配列であるタンパク質を発現精製する。
【０１４１】
一つの好ましい実施例の中で、ＰＡＣ／ＰＢ１Ｎ複合体がインフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いられるポリペプチド、タンパク質、化合物又は薬物設計と探索中での応用が提供される。
【０１４２】
一つの好ましい実施例の中で、インフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いるポリペプチド、上記で挙げた複合体も含み、少なくとも一種の上記αへリックス又はβシート、少なくとも一個のアミノ・サイトと相互に作用するポリペプチドが含まれる。
【０１４３】
一つの好ましい実施例の中で、インフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いるタンパク質、上記で挙げた複合体も含み、少なくとも一種の上記のαへリックス又はβシート、少なくとも一個のアミノ・サイトと相互に作用するタンパク質が含まれる。
【０１４４】
一つの好ましい実施例の中で、インフルエンザ・ウイルス感染による病気の治療に用いる化合物、上記で挙げた複合体も含み、少なくとも一種の上記αへリックス又はβシート、少なくとも一個のアミノ・サイトと相互に作用する化合物が含まれる。
【０１４５】
一つの好ましい実施例の中で、薬物混合物、上記で挙げたポリペプチド、タンパク質又は化合物を含む。
【０１４６】
本発明の薬物混合物は通常一種の媒体又は賦形剤、一種の薬学的に許容できる媒体に溶解できる抗体及び／又は免疫結合物含み、好ましくは水性媒体である。各種水性媒体が応用できる、例えば、緩衝塩水等。これら溶液は無菌且つ通常不純物質が混ざっていない。これら成分は通常の、一般に知られている滅菌技術で滅菌ができる。これら成分は薬学上許容できる、生理条件の必要に近い補助物質、例えばｐＨ調整用の緩衝剤、毒性調整剤等、たとえば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等である。これら成分中の融合タンパク質の濃度変化は非常に大きい、主に特定の投薬方式と患者のニーズに相応しい液体料、粘度、体重等をもとに選択する。
【０１４７】
従って、本発明中の一つの典型的な脳部投薬の薬学免疫毒素成分は毎日約１．２−１２００μｇ投与するべきである。一つの典型的な静脈投薬で乳腺、卵巣及び肺腫瘍の治療の成分では、各患者に毎日約０．１−１０ｍｇを投与する。一人一日０．１−１００ｍｇの投薬量が使用可能で、特に薬物を隠蔽した位置に投与し且つ血液循環又はリンパ機構に入らない場合、例えば一つの体腔又は一つの器官の腔隙に投与する場合はそうである。薬成分の製造の実際操作方法は専門家が理解又は把握しており、一部出版物でも詳細が書かれている。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９５）を参照。
【０１４８】
本発明中の成分は治療処理に使用できる。治療での応用は、成分を一人の特定の病気（例えば膠芽腫、乳腺癌、卵巣癌及び肺癌）にかかった患者に施され、その投与量は少なくとも緩和又は部分的にその患者の病気及び合併症を制御できる量である必要がある。これらの任務が果たせる最低投与量が「治療有効投与量」と呼ばれる。有効投与量は病気の程度と患者の一般的健康状況に依存する。この成分の有効投与量はある症状に対する主観的緩和、又は臨床医師若しくはその他資格の観察者の記録による客観的改善が提供できる。
【０１４９】
患者のニーズと認容できる投与量及び頻度で一回又は数回投薬を決める。有効的に患者を治療する為にも、なんにせよ、十分な量のこの免疫毒素を提供するべきである。好ましくは、薬物投与量は、一回きり投与、若しくは周期性投与を、ある種治療効果が達成されるまで又は不良反応で治療の継続が阻止されるまで続ける。通常、これら投与量は治療に足りるか又は病症を改善し且つ患者の認容できない毒性を引き出さない量である。
【０１５０】
本発明の免疫結合物は胃腸外の徐放剤（例えば挿入物、油注射液、又は微粒子系）に製造できる。タンパク質・デリバリー・システムに対する全面的理解にはＢａｎｇａ，Ａ．  Ｊ．，  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  ＰＡ（１９９５）が参照できる。微粒子系には微球体、微粒、マイクロカップセル、ナノマイクロカップセル、ナノ微球体、及びナノ微粒子が含まれる。マイクロカップセルは薬効のあるタンパク質をそのコア核にしている。小微球体では、治療性物質が粒子の中に分散されている。約１μｍより小さい粒子、微球体、及びマイクロカップセルは通常それぞれナノ微粒、ナノ球体と、ナノマイクロカプセルと呼ばれている。毛細血管の直径はおよそ５μｍであるのでナノ微粒子のみが静脈を通して投与できる。微粒子の直径は約１００μｍであり、皮下又は筋肉注射で投与する。例は下記を参照：Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．，  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊ．  Ｋｒｅｕｔｅｒ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ｐｐ．２１９−３４２（１９９４）；及びＴｉｃｅ  ＆  Ｔａｂｉｂｉ，  Ｔｒｅａｔｉｓｅ  ｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ａ．  Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ，  ｅｄ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ｐｐ．３１５−３３９（１９９２）（両方とも本願明細書に援用される）。
【０１５１】
ポリマーは本発明中の免疫結合物成分のイオン・コントロール・リリースに使われることができる。多種の薬物コントロール・リリースに使用可能な分解可または不可のポリマーは専門領域でよく知られている（Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．、Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ２６：５３７−５４２（１９９３））。例えば、遅延剤であるポリマーｐｏｌａｘａｍｅｒ  ４０７は低温では粘性があり流動的であるが、体温下では半固体ゲルになるが、組み替えＩＬ−２とウレアーゼの形成と持続輸送の一つの有効な媒体であることがすでに証明された（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ等、Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ９：４２５−４３４（１９９２）；及びＰｅｃ等，  Ｊ．  Ｐａｒｅｎｔ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈ．  ４４（２）：５８−６５（１９９０））。同じく、ハイドロキシアパタイトもすでにタンパク質コントロール・リリースの一個のミクロマトリクスとして使われている（Ｉｊｎｔｅｍａ等，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  １１２：２１５−２２４（１９９４））。他方では、リポソームは脂質に被膜された薬物のコントロールリリースと標的デリバリー過程に使われている（Ｂｅｔａｇｅｒｉ等，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  ＰＡ（１９９３））。その他多くの治療タンパク質のコントロールリリースシステムが既に知られている。例として、米国特許第５，０５５，３０３号、同第５，１８８，８３７号、同第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、同第４，９５７，７３５号、同第５，０１９，３６９号、同第５，０５５，３０３号、同第５，５１４，６７０号、同第５，４１３，７９７号、同第５，２６８，１６４号、同第５，００４，６９７号、同第４，９０２，５０５号、同第５，５０６，２０６号、同第５，２７１，９６１号、同第５，２５４，３４２号、及び同第５，５３４，４９６号（これらは、全て本願明細書に援用される）。
【０１５２】
実験結果
ＰＡＣ及びＰＢ１Ｎ複合体構造の原子座標は表１の通りである。
【０１５３】
【表５】
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【０１５４】
【表６】
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【０１５５】
【表７】
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【０１５６】
【表８】
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【０１５７】
【表９】
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【０１５８】
【表１０】
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【０１５９】
【表１１】
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【０１６０】
【表１２】
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【０１６１】
【表１３】
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【０１６２】
【表１４】
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【０１６３】
【表１５】
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【０１６４】
【表１６】
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【０１６５】
【表１７】
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【０１６６】
【表１８】
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【０１６７】
【表１９】
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【０１６８】
【表２０】
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【０１６９】
【表２１】
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【０１７０】
【表２２】
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【０１７１】
【表２３】
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【０１７２】
【表２４】
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【０１７３】
【表２５】
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【０１７４】
【表２６】
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【０１７５】
【表２７】
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【０１７６】
【表２８】
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【０１７７】
【表２９】
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【０１７８】
【表３０】
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【０１７９】
【表３１】
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【０１８０】
【表３２】
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【０１８１】
【表３３】
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【０１８２】
【表３４】
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【０１８３】
【表３５】
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【０１８４】
【表３６】
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【０１８５】
【表３７】
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【０１８６】
【表３８】
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【０１８７】
【表３９】
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【０１８８】
【表４０】
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【０１８９】
【表４１】
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【０１９０】
【表４２】
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【０１９１】
【表４３】
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【０１９２】
【表４４】
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【０１９３】
【表４５】
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【０１９４】
【表４６】
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【０１９５】
【表４７】
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【０１９６】
【表４８】
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【０１９７】
【表４９】
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【０１９８】
【表５０】
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【０１９９】
【表５１】
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【０２００】
【表５２】
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【０２０１】
【表５３】
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【０２０２】
【表５４】
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【０２０３】
【表５５】
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【０２０４】
【表５６】
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【０２０５】
【表５７】
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【０２０６】
【表５８】
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【０２０７】
【表５９】
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【０２０８】
【表６０】
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【０２０９】
【表６１】
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【０２１０】
【表６２】
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【０２１１】
【表６３】
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【０２１２】
【表６４】
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【０２１３】
Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザ・ウイルス株（Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６）由来のポリメラーゼ・サブユニットＰＡタンパク質と１９１８年ヨーロッパで爆発した広範囲インフルエンザのＡ型インフルエンザ・ウイルス株Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８、及び二種類のそれぞれＢ型インフルエンザ・ウイルス株Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／１９６６とＣ型インフルエンザ・ウイルス株Ｃ／ＪＪ／１９５０に属するＰＡタンパク質の配列について比較を行った結果は図１の通りである。
【０２１４】
本発明者らはＰＡを二つの部分に分け、違う長さのＰＡ遺伝子の二つの断片を別々に多数クローン化し、大腸菌の中で発現した。その中でＰＡより分けられたＮ端１−２５６残基（図１及び図２参照）と２５７−７１６残基（図４Ａ参照）は、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）との融合で良好な発現と精製ができた。その中で精製したＰＡのＮ末端（ＰＡ＿Ｎ）からは良好回折のある母体結晶体が得られた（図３参照）。
【０２１５】
大変な努力を費やしたが、ＰＡのＣ末端自身は結晶は得られないということが結晶実験によって初歩的に明らかとなった。従って、本発明者らはＧＳＴ融合方法も使用し、別々にＰＢ１  Ｎ端２５と４８ペプチドを発現した（図４Ａ参照、ＰＡのＣ末端とＰＢ１のＮ末端のＧＳＴ融合前後の電気泳動図、その中でリボン１  ＰＡ＿Ｃ  ＣＴはＰＡのＣ末端の対照サンプル、リボン２  ＧＳＴ−ＰＢ１＋ＰＡＣはＰＡのＣ末端とＰＢ１  Ｎ末端の複合体とＧＳＴ融合後のサンプル、リボン３  ＧＳＴ−ＰＢ１はＰＢ１Ｎ末端とＧＳＴ融合後のサンプル、リボン４  ＧＳＴ＋ＰＡ＿ＣはＰＡ  Ｃ末端とＧＳＴ融合後のサンプル、リボン５  ＧＳＴ  ＣＴはＧＳＴ対照サンプルであり；その中で、ＰＡ＿ＣはＰＡ＿Ｃの電気泳動リボンを表し、ＧＳＴ−ＰＢ１はＰＢ１Ｎ末端とＧＳＴ融合後の電気泳動リボンを表し、ＧＳＴはＧＳＴ対照の電気泳動リボンを表す）、ＧＳＴ−ＰＢ１は精製されたＰＡ＿Ｃタンパク質と結合ができるということが結果として明らかとなった。
【０２１６】
ある一定比率でＰＡ及びＰＢ１のポリペプチド発現菌を混合し、グルタチオンアフィニティ・カラム及びゲルサイズ排除クロマトグラフィー等を通してこの二つのタンパク質を共精製すると、両者は共精製が出来ることが体外結合実験から判明し、これによって、精製されたＰＡのＣ末端４６０アミノ酸とＧＳＴ−ＰＢ１ポリペプチドは安定した複合体が形成できることが明らかとなった。
【０２１７】
更に、プロティナーゼでＧＳＴ融合ペプチドを切断後、ＰＡＣ／ＰＢ１Ｎポリペプチド複合体を分離精製し、そして結晶実験に使用し、その結果、多条件下で結晶が得られ、その中の一つの条件下で回折良好な結晶体が得られた。但し、単独精製されたＰＡのＣ末端タンパク質は結晶が得られなかったが、それはＰＢ１ポリペプチドの加入がＰＡタンパク質の安定に補助作用があることを示唆した。
【０２１８】
ＰＡＣ／ＰＢ１Ｎポリペプチド複合体三次元構造：
ＭＡＤ方法を使用し、ＰＡのＣ末端４６０アミノ酸及びＰＢ１Ｎ末端２５ペプチドの複合体結晶体構造を解析し、解析度は２．９Å、最終修正したＲ因子は２３％，自由Ｒ因子は２６％である。全体的に、構造を線状で表した場合、側面から見ると、ＰＡ部分はまるで狼の頭に喩えられ、伸び出す口先、その後ろの頭部と環状の首を有する（図４Ｂ）。ＰＢ１はまるでＰＡの口の中に骨を一本くわえているかのようである。ＰＡ部分は主に１３個のαへリックス、一切れの小さい３１０へリックス、７つのβシート及びこれらを繋ぐ環（ｌｏｏｐ）より形成されている（図１、図４Ｂ及び図５）。構造から見ると、ＰＡタンパク質部分は二つの構造領域と見なせ、一つはＰＢ１ポリペプチドと結合する領域（構造域Ｉ、即ちＰＡのＣ末端構造の第一部分）、全部へリックス及び環で形成されており、へリックスは４、５、８、９、１０、１１、１２及び１３で狼の口と頬の部分を構成している。この構造域は狼頭部の天辺から見るとやや細く；もう一つの構造域（構造域ＩＩ即ちＰＡのＣ末端構造の第二部分）は残りのへリックス及びβシートからなる狼頭部の後半部分で、天辺から見るとやや太く、下に大きい環が繋がっており、狼の頭部の首の部分に見える。ＰＢ１ポリペプチドのＮ端は狼の頭部の片面に位置しており、Ｃ末端はもう片方に位置し、狼の頭部の両方の頬の部分に位置することに値する。本発明者らの結晶体中のＰＡはＰＡのＮ端２５６残基を取り除いたポリペプチドで、ある報告ではＮ端はＰＡプロティナーゼの主な活性領域であり、もう一つの離れている活性遺伝子座Ｓｅｒ６２４は他の片方の頬に位置し、それによるとＳｅｒ６２４はＰＡプロティナーゼ活性中心アミノ酸で、それはＰＡの取り除いた部分と共にプロティナーゼ活性領域を構成し、従ってＰＡのＮ端の取り除いた部分はもう片方の頬に位置する。狼の頭部の後半部分第二構造域は残りの多数のへリックス及びβシートによって形成されている。長さ、方向が異なる７つのβシートが波のある平面を構成し、構造域の中心部に位置しており、αへリックスはへリックス周辺に分布しており、共にＲｏｓｓｍａｎｎフォールド構造を構成している。二つの構造域の交差する部分には大きな溝があり、下部の首環と直径約２５Åの大きい環を形成する（図５）。
【０２１９】
ＰＡとＰＢ１ポリペプチド間の相互作用
構造域ＩのＰＢ１ポリペプチドに結合するへリックスはそれぞれへリックス４（４０６−４１５）、８（５８２−６０４ａａ）、１０（６３３−６５０ａａ）、１１（６５３−６７４ａａ）と１３（６９８−７１４ａａ）であり、その中の三つのへリックス（８、１１、１３）は互いにほぼ平行に伸びだし、へリックス軸の方向から見るとほぼ三角形の形状になっており、四つ目のへリックス（１０）は斜めに伸び出し、これらはＰＢ１ポリペプチドを真ん中に挟む（図５及び図６）、へリックス４は側面でＰＢ１Ｎ端ペプチド残基と相互に作用をする。四つのへリックスはＰＢ１ポリペプチドと結合する領域で疎水性コアを形成し、これらの側鎖とＰＢ１上の疎水アミノ酸残基は疎水相互作用及び水素相互作用で結合されている。電子雲密度上ではＰＢ１ポリペプチドの第二位アスパラギン酸から１５位グルタミンまでが見られ、この結果とは、Ｐｅｒｅｚ等の報告によるＰＢ１Ｎ末端前１２位アミノ酸はＰＢ１とＰＡ結合のキーアミノ酸であるという結果とほぼ一致している（Ｐｅｒｅｚ及びＤｏｎｉｓ  ２００１）。更に本発明者らはこれらアミノ酸残基とＰＡ間の相互作用を分析した。Ｐｅｒｅｚ等（Ｐｅｒｅｚ及びＤｏｎｉｓ  ２００１）の文献での報告のＰＢ１保存的ＬＬＦＬペプチド断片は一つの短いへリックス上に存在し、ＰＡが形成する疎水内核中間に浮いている。疎水性コアの形成に関与するＰＡアミノ酸残基はへリックス１１上のＬｅｕ６６６、へリックス１３のＰｈｅ７１０及びへリックス１０上のＩｌｅ６３３、Ｖａｌ６３６とＬｅｕ６４０等がある。ＰＢ１ポリペプチドとの結合に関与するＰＡ中アミノ酸はへリックス１３のＴｒｐ７０６、へリックス１１のＧｌｎ６７０等があり、その中でＴｒｐ７０６とＰＢ１オリゴペプチド上のＶａｌ３、Ｎ４等アミノ酸は疎水又はファンデルワールス力等を通して相互に作用し、Ｇｌｎ６７０はＰＢ１のＦ９、Ｖ１２、Ｐ１３及びＡ１４とそれぞれ水素、疎水及びファンデルワールス力等を通して相互に作用する。へリックス１０のＴ６３９はＶａｌ３との作用（ファンデルワールス力）に関与する。へリックス４上のＱ４０８及びＮ４１２はＰＢ１のＶａｌ３、Ｄ２との相互作用に関与する。それらとは別に、９と１０の間に挟まれている緩い環もＰＢ１との相互作用に関与し、その中でＩ６２１、Ｇ６２２とＥ６２３はＤ２、Ｎ５とそれぞれ相互に作用し、Ｔ６１８及びＰ６２０はそれぞれＬ８及びＫ１１と相互に作用する。へリックス８とＰＢ１ポリペプチドの距離が離れているため、主にファンデルワールス力が作用している。この結果は、文献報告でのＰＢ１ポリペプチド上の残基結合に関与する作用とほぼ一致している。これらＰＡとの結合に関与するアミノ酸はＡ、Ｂ及びＣ型インフルエンザウイルスの中では全て保存的で；同様に、ＰＢ１ポリペプチドとの結合に関与するＰＡ残基も大半は保存的である（図１）。ＰＡとＰＢ１結合方式の精細な三次元構造解析は、薬物設計でインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼの機能を阻害する為の有力な三次元構造情報のプラットフォームを提供した。
【０２２０】
ＰＡ構造の分析結果では更に、二つの構造域の接続箇所では、構造域Ｉの下に一つの大溝がある（構造域ＩＩＩ）（図８Ａ）。大溝表面にはアルカリ性アミノ酸が豊富にあり、その中で一部アミノ酸、例えばＫ５３６、Ｋ３２８、Ｒ５６６等は３型インフルエンザ中で全て保存的で、別途で３９９座のＬｙｓ及び４０１座のＡｒｇも保存的である（図１）。Ｋ５３６等遺伝子座突然変異体はこれら遺伝子座の重要性を実証し、この大溝部はヌクレオチド又はＲＮＡ結合と関することを提示した。これ以外では、この溝の下部には一つの大きな環状鎖部分があり、この断片のポリペプチドは結晶体積み重ね中、当該環状ポリペプチド領域ともう一つの分子表面に近き、相互作用によって引き離され形成し、一部分のアミノ酸ははっきりとした電子雲密度が見られなかった。大溝と首部分の環は共同で直径約２５Åの大きい環を形成し、この空間は二つのＲＮＡへリックスが収納できる程十分広い。上記のように、環状内部溝のところには表面に保存的アルカリ性アミノ酸が分布されていて、鎖領域上のアミノ酸は保守性は高くないが、ただし三つの類型のインフルエンザウイルス中は全て主に酸性アミノ酸より形成されている。ＰＡ分子中この溝及びこの環状構造の保守性及び構造の特異性は彼らがポリメラーゼ中での重要な機能を示唆し、よってそれらを共にＰＡとＰＢ１結合領域以外の二つ目の薬物作用ターゲットとする。
【０２２１】
ＲＮＡプロモーター結合能力。本発明者らが解析した構造から見ると、本発明者らはこの大溝はヌクレオチド又はＲＮＡ結合遺伝子座であることを見出した。その中で、Ｋ５３９、Ｅ５３８、Ｋ３２８遺伝子座は三つの類型のインフルエンザウイルス中では非常に保存的であり、これらアミノ酸はＲＮＡヌクレオチドとの結合に関与し、特にＲＮＡとの結合に関与していると本発明者らは考える。ＰＡサブユニットは、プロモーター及びＲＮＡとの結合能力及びＲＮＡ合成過程において重要な機能を果たすことが明らかとなった。
【０２２２】
構造域Ｉ及び構造域ＩＩの間で、構造域Ｉのへリックス及び構造域ＩＩのβシートで直径約８Å−１５Åのチャンネルが形成される（図８Ｂ及び図８Ｃ）。本発明者らが解析したこの構造中では、ＰＡのＮ端の一切れの緩い断片はまるで紐のようにこのチャンネル中に垂れている。このＮ端断片はチャンネル両端から距離が離れているため、ポリメラーゼ複合体又はその他宿主タンパク質が作用しポリメラーゼの機能を発揮する時にこのＮ端断片がこのチャンネルから離れると本発明者らは考える。これで、ＰＡ大溝からチャンネルを通って狼の頭部の他の片方の頬まで、構造域の中間に一つのチャンネルが存在する。このチャンネルの表面には三種類のインフルエンザ・ウイルス全ての中で保存的なアミノ酸が存在し、それは例えば大溝表面のＲ５６６、Ｋ５３９及びＫ５７４に位置するもの、及びチャンネル中間保存的なＥ４１０、Ｋ４６０、Ｅ５２４とＫ５３６等に位置するものである。その中で一部残基はポリメラーゼの活性に影響を持つことが発見された。Ｆｏｄｏｒ等の研究によると、Ｅ５２４Ａの突然変異はウイルスにＲＮＡ合成能力を喪失させ、よってウイルスの発生を抑制した；Ｅ４１０の突然変異はポリメラーゼ活性の低下を招き（Ｆｏｄｏｒ、Ｃｒｏｗら、２００２）、Ｋ５３９Ａの突然変異はｍＲＮＡ合成に影響はしないが、遺伝子からｃＲＮＡ及びｖＲＮＡのコピーに重大な影響が現れることが発見された。この領域がウイルス遺伝子コピーに対して非常に重要なことが判明した。既に知られているヌクレオチドの大きさはこのチャンネルと非常に近く、（例えばＡＴＰ、長さ約１４Å、幅約８Å、その他三種類ヌクレオチドＵＣＧもこれと類似）、従ってこのチャンネルは、とある状況下ではヌクレオチド若しくはその他小分子を通過させ、又はその他タンパク質と相互に作用させ、よって、その表面残基の突然変異はポリメラーゼ活性の顕著な変革をもたらすと本発明者らは考える。このチャンネル独特の構造及び機能の重要性は、チャンネルを三つ目の薬物設計結合ターゲットとさせた。
【０２２３】
一つの具体的な実施態様を通して、本発明はインフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１と競合してＰＡＣと結合するポリペプチド、タンパク質、無機若しくは有機化合物、その中で上記ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列は野生型インフルエンザ・ウイルス・ポリメラーゼＰＢ１のＮ末端ＰＢ１Ｎ残基５から１１で形成された短いへリックス領域の短いＬＬＦＬ配列を含む。
【０２２４】
その中で、Ｍｅｔ５９５とＶａｌ１２、Ｌｅｕ６６６とＰｈｅ９、Ｌｅｕ６４０とＬｅｕ８；Ｌｅｕ６３６とＬｅｕ８；Ｍｅｔ６２８とＬｅｕ７；Ｐｈｅ７１０とＴｈｒ６；Ｔｒｐ７０６とＴｈｒ６；Ｔｒｐ７０６とＰｒｏ５；Ｐｈｅ４１１とＰｒｏ５；Ｔｒｐ７０６とＡｓｎ４の間の一部分の原子は４Å相互作用の範囲内に位置するので、それらの間では疎水相互作用で結合されていることが解る。従って、ＰＡのＣ末端の当該アミノ酸と疎水相互作用が形成できるポリペプチド又は化合物が、即ちインフルエンザ・ウイルス抑制の薬物となれる。
【０２２５】
標的タンパク質の構造を基にした薬物設計は既に数多くの成功事例がある（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｇ．及びＦｅｃｈｎｅｒ，Ｕ．、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２００５，４，６４９）、北京大学来魯華教授のワークグループが開発したＬｉｇＢｕｉｌｄｅｒプログラムは国際登録者が７００件を超えている（Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｘ．；Ｇａｏ，Ｙ．；Ｌａｉ，Ｌ．Ｈ．，ＬｉｇＢｕｉｌｄｅｒ：Ａ  ｍｕｌｔｉ−ｐｕｒｐｏｓｅ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｏｄ．  ２０００，６，４９８）、既に数多くのＬｉｇＢｕｉｌｄｅｒプログラムを応用した高活性抑制剤設計の例が報告されている。例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ製薬会社はＬｉｇＢｕｉｌｄｅｒ  １．２を利用し、繋ぎ操作補助設計で高活性のＰ３８  キナーゼ抑制剤を最適化する（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＤＲ，Ｈａｏ，Ｍ−Ｈ．ら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２００７，５０，４０１６）。
【０２２６】
Ｈ５Ｎ１ウイルスＲＮＡポリメラーゼのＰＡＣ−ＰＢ１Ｎ複合物結晶体構造に基づき、ＬｉｇＢｕｉｌｄｅｒ２．０プログラムを利用し全新な薬物設計計算を行った。まずはＰＡＣタンパク質に対し結合遺伝子座分析を行い、点数が一番高い二つの結合遺伝子座は当該構造の“口”区と“チャンネル”区に位置する。ＬｉｇＢｕｉｌｄｅｒ２．０プログラムを利用して、別々にこの二つの遺伝子座に対して全新薬物設計計算を行い、一部高予測活性且つ合成し易い化合物が得られた。
【０２２７】
ＰＡ分子中の“チャンネル”区と結合する分子の具体例は下記通りである：
【化１】
2011515074.tif 000067
Ｒ１＝−ＣＨ３，−ＣＨ２ＣＨ３
Ｒ２＝−ＣＨ３，−ＣＨ２ＮＨ２，−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３，−ＣＨ（ＣＨ３）２
予測Ｋｄ：８．６４〜９．６０。
【化２】
2011515074.tif 000068
Ｒ１＝−ＮＨ２
Ｒ２＝−ＣＯＣＨ３，−ＣＨ２ＣＯＣＨ３，−ＣＯ，−ＯＣＨ２ＣＨ３
Ｒ３＝−ＣＨ２ＮＨ２，−ＣＨ２（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ３，−ＣＨ２（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３
予測Ｋｄ：８．５１〜９．６５。
【０２２８】
ＰＡ分子“口”区と結合する分子の具体例は下記通りである：
【化３】
2011515074.tif 000069
Ｒ１＝−ＯＨ
Ｒ２＝−ＯＨ，−ＣＯ，−ＣＯＮＨ２，−ＣＯＮＨＣＨ３，ＣＯＯＨ
Ｒ３＝−ＣＯＯＨ，−ＮＨ２，−Ｃ（ＮＨ２）２＋
Ｒ４＝−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３，ＣＯＮＨ２，ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＯＨ
予測Ｋｄ：８．５２〜８．９６。
【化４】
2011515074.tif 000070
Ｒ１＝−ＯＨ，−ＮＨＣＯ
Ｒ２＝−ＣＨ２（ＯＨ）ＣＨ３，−ＮＨＣＨ３，−ＣＨ２ＯＨ，−ＣＨ２ＮＨ２，−ＮＨ２，−Ｃ（ＮＨ２）２＋
Ｒ３＝−ＮＨ２，−Ｃ（ＮＨ２）２＋，−ＣＨ２ＯＨ，−ＣＯ，−ＣＨ２ＣＯ，−ＮＨＣＯ
Ｒ４＝−ＯＨ，−ＯＣＨ３。
【０２２９】
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【図１Ａ−ａ】
2011515074.tif 000071
【図１Ａ−ｂ】
2011515074.tif 000072
【図１Ａ−ｃ】
2011515074.tif 000073
【図１Ａ−ｄ】
2011515074.tif 000074
【図１Ｂ】
2011515074.tif 000075
【図１Ｃ−ａ】
2011515074.tif 000076
【図１Ｃ−ｂ】
2011515074.tif 000077
【図１Ｃ−ｃ】
2011515074.tif 000078
【図３Ａ】
2011515074.tif 000079
【図３Ｂ】
2011515074.tif 000080
【図３Ｃ】
2011515074.tif 000081
【図３Ｄ】
2011515074.tif 000082
【図１０−ａ】
2011515074.tif 000083
【図１０−ｂ】
2011515074.tif 000084
【図１０−ｃ】
2011515074.tif 000085
【図１０−ｄ】
2011515074.tif 000086
【図１０−ｅ】
2011515074.tif 000087
【図２】
2011515074.tif 000088
【図４】
2011515074.tif 000089
【図５】
2011515074.tif 000090
【図６】
2011515074.tif 000091
【図７】
2011515074.tif 000092
【図８】
2011515074.tif 000093
【図９】
2011515074.tif 000094
【配列表】
2011515074000001.app
【国際調査報告】
2011515074.tif 000095
2011515074.tif 000096
2011515074.tif 000097
2011515074.tif 000098
2011515074.tif 000099
2011515074.tif 000100
2011515074.tif 000101
2011515074.tif 000102
2011515074.tif 000103
2011515074.tif 000104
2011515074.tif 000105
2011515074.tif 000106
2011515074.tif 000107
2011515074.tif 000108