(57)【要約】  開示されているのは、検体を含有すると推測される液体サンプルを、ガス発生手段（例えば、カタラーゼと過酸または過酸素化合物）（ガス発生手段は、検体の有無または量に依存してガスを生成し、このガスは液体サンプル中に、流路に沿った液体の流れを変えるように作用する１つまたは複数の泡を生じる。）と接触させるステップ、および流路に沿った液体の流れの変化が、液体サンプル中の検体の存在および／または量を示す液体における流れの変化を決定するステップ、を含む液体サンプル中の対象の検体の存在および／または量を決定するための方法である。
2011517777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体を含有すると推測される液体サンプルを、ガス発生手段（ガス発生手段は、検体の有無または量に依存してガスを生成し、このガスは液体サンプル中に、流路に沿った液体の流れを変えるように作用する１つまたは複数の気泡を生じる。）と接触させるステップ、および流路に沿った液体の流れの変化が、液体サンプル中の検体の存在および／または量を示す液体における流れの変化を決定するステップ
を含む、液体サンプル中の対象の検体の存在および／または量を決定するための方法。
【請求項２】
ガス発生手段が、第１試薬および第２試薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試薬の１つが、検体のためか検体に対する結合試薬のために結合試薬により標識されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ａ）検体を含有すると推測される液体サンプルを、第１試薬により標識されている結合試薬（この結合試薬は、検体にまたは検体に対する結合試薬に結合することができる。）と接触させるステップ、
ｂ）蓄積ゾーンにおいて標識化結合試薬の蓄積（標識化試薬の蓄積ゾーンにおける蓄積は、液体サンプル中の検体の有無または量に依存する。）をもたらすステップ、および
ｃ）標識した結合試薬を蓄積ゾーンにおいて第２試薬と接触させて、第１試薬と第２試薬とが反応してガスを生成し、ガスが流路に沿った液体の流れを変える（前記流路に沿った液体の流れのこの変化は、液体サンプル中の検体の存在および／または量を示す。）ように作用する１つまたは複数の気泡を液体サンプル中に生じるようにするステップ
を含む、液体サンプル中の検体の存在および／または量を決定する方法。
【請求項５】
液体の流れの変化が、蓄積ゾーンの下流の表示領域において液体の存在または到着を検出することによって決定される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
液体の流れが減少または停止される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
第１試薬が触媒である、請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
触媒が酵素である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
酵素がカタラーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第２試薬が過酸または過酸素化合物である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ガスが酸素である、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
液体サンプルが生体サンプルを含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
生体サンプルが尿を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
検体が、ハプテン、ｈＣＧまたはＬＨのいずれか１つから選択される、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
流れが基準流路中の液体の流れと比較される、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれかに記載の方法を行うためのアッセイデバイス。
【請求項１７】
液体が平行して流れる少なくとも１つのアッセイ用流路；
検体の有無または量に依存してガスを発生する（このガスは液体サンプル中に、下流のゾーンまでの流路に沿った液体の流れを変えるように作用する１つまたは複数の気泡を生じる。）ガス発生手段；および
液体の流れにおける任意の変化を検出する検出手段および／または下流ゾーンにおける液体の存在または到着を検出するインジケータ手段（この流路に沿った液体の流れの変化は、検体の存在および／または量を示す。）
を含み、前記デバイスに塗布または導入した液体サンプル中の対象の検体の存在および／または量を決定するためのアッセイデバイス。
【請求項１８】
ガス発生手段が、第１試薬および第２試薬を含む、請求項１７に記載のアッセイデバイス。
【請求項１９】
試薬の１つが、検体のためか検体に対する結合試薬のために結合試薬により標識されている、請求項１８に記載のアッセイデバイス。
【請求項２０】
ガス発生手段が酸素ガスを発生する、請求項１７から１９のいずれかに記載のアッセイデバイス。
【請求項２１】
液体の流れおよび／または液体の存在もしくは到着を検出するために蓄積ゾーンの下流に備えられたインジケータ領域における任意の変化を検出するための検出手段をさらに含む、請求項１７から２０のいずれかに記載のアッセイデバイス。
【請求項２２】
ａ）このデバイスに液体サンプルを塗布するためのサンプル塗布ゾーン、
ｂ）液体が平行して流れる少なくとも１つのアッセイ用流路、
ｃ）第１試薬によって標識されており、前記流路内に備えられている蓄積ゾーンの上流に備えられている結合試薬（前記結合試薬は、検体または検体に対する結合試薬のいずれかに結合することができる。）、
ｄ）蓄積ゾーンにおける標識化試薬の集積が、液体サンプル中の検体の有無または量によって決まる標識化結合試薬を固定することができる蓄積ゾーン（このデバイスは、使用中、この蓄積ゾーンに固定された任意の標識化結合試薬と第２試薬との間で反応が起こってガスを生成し、前記ガスが、１つまたは複数の気泡を液体サンプル中に形成し、この気泡が流路に沿った液体の流れを変化させるように作用し、その液体の流れの変化が液体サンプル中の検体の存在または量を示すものである。）、および
ｅ）液体の流れおよび／または液体の存在または到着を検出するための蓄積ゾーンの下流に備えられているインジケータ手段の任意の変化を検出するための検出手段
を含む、液体サンプル中の対象の検体の存在および／または量を決定するためのアッセイデバイス。
【請求項２３】
第２試薬が、蓄積ゾーンの上流に備えられており、使用中、すべてのまたは実質的にすべての標識化結合試薬が、第２試薬の蓄積ゾーンへの到着前に前記ゾーンに運ばれる、請求項２２に記載のアッセイデバイス。
【請求項２４】
ａ）このデバイスに液体サンプルを塗布するためのサンプル塗布ゾーン、
ｂ）液体が平行して流れる少なくとも１つのアッセイ用流路、
ｃ）第１試薬によって標識されており、前記流路内に備えられている蓄積ゾーンの上流に備えられている結合試薬（前記結合試薬は、検体または検体に対する結合試薬のいずれかに結合することができる。）、
ｄ）蓄積ゾーンの上流に備えられている第２試薬、および
ｅ）蓄積ゾーンにおける標識化試薬の集積が、液体サンプル中の検体の有無または量によって決まる標識化結合試薬を固定することができる蓄積ゾーン（前記デバイスは、使用中、すべてのまたは実質的にすべての標識化結合試薬が、第２試薬の蓄積ゾーンへの到着前に前記ゾーンに運ばれ、第２試薬がこの蓄積ゾーンに到着すると同時に、この蓄積ゾーンに固定された任意の標識化結合試薬と第２試薬との間で反応が起こってガスを生成し、前記ガスが、１つまたは複数の気泡を液体中に形成し、前記気泡は、流路中の液体中に形成されまたは存在することが引き起こされ、この気泡が流路に沿った液体の流れを変化させるように作用し、その液体の流れの変化が液体サンプル中の検体の存在および／または量を示すものである。）
を含む、液体サンプル中の対象の検体の存在および／または量を決定するためのアッセイデバイス。
【請求項２５】
第１試薬が第１の流路に備えられ、第２試薬が第２の流路に備えられており、この第１および第２流路が蓄積ゾーンの領域内、または上流に集中する、請求項２２から２４のいずれかに記載のアッセイデバイス。
【請求項２６】
両方の流路の上流に備えられている共通のサンプル適用ゾーンを含む、請求項２５に記載のアッセイデバイス。
【請求項２７】
第１試薬が酵素である、請求項２２から２６のいずれかに記載のアッセイデバイス。
【請求項２８】
酵素がカタラーゼである、請求項２７に記載のアッセイデバイス。
【請求項２９】
液体の流れおよび／または液体の存在もしくは到着を検出するために蓄積ゾーンの下流に備えられたインジケータ領域における任意の変化を検出するための検出手段をさらに含む、請求項２４から２８のいずれかに記載のアッセイデバイス。
【請求項３０】
第２試薬が過酸または過酸素化合物から選択される、請求項２２から２９のいずれかに記載のアッセイデバイス。
【請求項３１】
基準流路をさらに備える、請求項２２から３０のいずれかに記載のアッセイデバイス。
【請求項３２】
基準流路が、蓄積ゾーンの下流のアッセイ流路との接合領域で合流する、請求項３１に記載のアッセイデバイス。
【請求項３３】
インジケータ領域が接合領域の下流に備えられている、請求項３２に記載のアッセイデバイス。
【請求項３４】
インジケータ領域が、接合領域の上流の基準流路およびアッセイ流路のそれぞれにおいて各々備えられている、請求項３２に記載のアッセイデバイス。
【請求項３５】
対照アッセイをさらに含む、請求項２２から３４のいずれかに記載のアッセイデバイス。
【請求項３６】
対照アッセイが、対照アッセイ流路および／または対照基準流路を含む、請求項３５に記載のアッセイデバイス。
【請求項３７】
対照テスト流路が、下流接合領域において対照基準流路と交差する、請求項３６に記載のアッセイデバイス。
【請求項３８】
非電子のバイナリーまたはデジタルアッセイ結果インジケータ手段を含む、請求項１７から３７のいずれかに記載のアッセイデバイス。
【請求項３９】
電源を必要とする任意の要素、および／または電源を含まない、請求項１７から３８のいずれかに記載のアッセイデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アッセイデバイス、アッセイ実行中のアッセイデバイスに沿った液体の流れを制御する方法、このアッセイデバイスを使用してアッセイを実行する方法、およびアッセイデバイスを作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、家庭でまたはポイントオブケアで日常的に使用される種類の安価で使い捨てできるアッセイデバイスは、２つのタイプ、すなわちラテラルフローアッセイデバイスおよびマイクロフルイディクスデバイスの１つに該当する傾向がある。
【０００３】
ＥＰ２９１１９４により開示されているようなラテラルフローアッセイデバイスは、液体サンプルが、多孔質の母材、例えばニトロセルロースまたは紙のフィルターなどに直接または（より普通には）間接的に塗布されるタイプのものである。この液体サンプルは、この多孔質の母材に沿って移動し、動かすことが可能なようにこの多孔質の母材に固定した乾燥したアッセイ試薬または成分（一般的には標識化抗体、例えば微粒子状の標識化抗体など）を通常は移動させる。一般的に、この標識化抗体は、サンプル中の対象の検体と複合体を形成し、その標識化複合体は、通常は、次に、対象の検体に対する二次抗体によって多孔質母材の検出領域中で捕捉される。この検出領域またはゾーン中の標識化結合試薬の蓄積は、それ故、液体サンプル中の検体の有無または程度を示す。当然のことながら、ラテラルフローアッセイのその他の変形、とりわけ、競合フォーマットアッセイが存在し、そこでは検体がサンプル中に存在しない場合に標識化試薬が検出ゾーン内で捕捉される傾向がある。ラテラルフローアッセイデバイスは、例えば、妊娠ホルモンｈＣＧの有無を判定するためおよびユーザーに妊娠しているかまたは妊娠していないかの指標を提供するために日常的に使用される。
【０００４】
検出ゾーンにおける標識化試薬の検出は、視覚的にまたは光検知器によって行うことができる。視覚読取りの非電子アッセイデバイスは、低価格である利点を有するが、かかるアッセイデバイス、特に妊娠テストデバイスおよび／または在宅使用のアッセイデバイスに伴う問題は、それらがある程度の説明を必要とし得る可変強度の信号としてのアッセイ結果を提供することである。これは、アッセイ結果が、特にそのアッセイデバイスのユーザーまたは読取り者が望ましいアッセイ結果を念頭においている場合に、誤った解釈を受けやすくする。これらのテストは、多くの場合、閾値テストとして提供され、サンドイッチアッセイの場合において、閾値より下の標識化試薬のレベルが否定的な結果を示し、閾値より上の標識化試薬のレベルが肯定的結果を示す。結果として、標識化試薬の存在または量が光検知器によって決定され、アッセイの結果が液晶ディスプレー上に示される電子デジタルデバイスが開発されている。そのようなデジタルデバイスは、それらが、説明を必要としない「ＹＥＳ」または「ＮＯ」のような明白な結果を提供する利点を有する。かかるデバイスは、１回だけの使用でそれ故使い捨て可能であり得る。それらは、しかしながら、それらが、１つまたは複数の光検知器、１つまたは複数の発光ダイオード（ＬＥＤ）等の光源、電源、電子回路およびデジタルディスプレーを一般的には必要とするために製造するのに費用がかかる。その上、電子デバイスの廃棄は、環境問題を有する。
【０００５】
マイクロフルイディクスアッセイデバイスにおいては、ラテラルフローアッセイにおいて使用されるのと同じ多くの方式を採用することができる。しかしながら、液体サンプルは多孔質母材に塗布される代わりに、このサンプルは導管またはチャネル中に適用または供給され、それに沿ってこの液体は、通常は毛細管作用によって前進する。検出ゾーンは、チャネルの内側表面に備えることができ、その上には例えば固定結合試薬が供給される。マイクロフルイディクスデバイスは、流路がはっきりしており、このデバイスをマイクロ加工した要素、例えば、分岐、混合領域、フロー制御要素、時間ゲート、フィルター等を組み込むように設計することができる特別な利点を有する。マイクロフルイディクスアッセイデバイスの例は、ＵＳ５４５８８５２に記載されている。
【０００６】
流路に沿った液体の流れの速度が検体の存在または程度を示す検体を測定するためのアッセイデバイスが知られている。
【０００７】
ＵＳ４９６３４９８は、流体サンプル中の検体またはデバイス中に存在する試薬がこのサンプルの流速に影響を及ぼす流体サンプルの特性を測定するためのマイクロフルイディクスデバイスを開示している。このデバイスは、テスト用毛細管および基準または対照用毛細管の両方を含むことができる。
【０００８】
ＥＰ４５６６９９は、それぞれのインジケータチャンバーより上流の多数の流体管に接続しているサンプル適用ポートを含む液体中の物質の存在をテストするための器具を開示している。一実施形態によれば、流体管中に存在する凝集試薬は、サンプルと相互作用して、その流速を変化させて、例えば、この液体がアッセイの時間枠の中でインジケータチャンバーに到達することを防ぐようにする。
【０００９】
物質の存在をテストするための毛細管デバイスも、ＷＯ２００４／０８３８５９によって開示されている。このデバイスは、対象の検体（一般的には、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ｈＣＧ）の存在下でのテスト用毛細管中の液体サンプルの凝集［この凝集は、テスト用毛細管中の液体サンプルの流れは阻止するが、対照用毛細管（凝集試薬を含んでいない。）中では阻止しない。］を引き起こすことによって正常に機能する。テスト用および対照用毛細管の下流部分における液体サンプルの有無は、電極によって検出される。
【００１０】
流路が、例えば、前進する液体サンプルによって埋められるには大きすぎる穴またはすき間を有する流路チャネルの一部の形でのその中の不連続と共に形成され、この穴またはすき間が同じまたは別の液体（例えば、第２の流路に沿って流れてきた。）によって満たすことができ、それによって液体サンプルがこの不連続を通過して前進することを可能にする「ブリッジ」として作用するマイクロフルイディクスアッセイデバイスを提供することも知られている（例えば、ＷＯ２００６／０９０１４４）。この配列は、サンプル中の対象の検体の有無が、液体サンプルのアッセイデバイス内の１つまたは複数の異なる流路に沿った前進の速度に影響を及ぼす「バイナリーアッセイデバイス」の基礎を形成することができ、それは、順に、特定の１つの流路に沿った液体流が、そのアッセイデバイスの「インジケータ」領域に入るかどうかを決め、それによってアッセイの結果を単純な定性的な用語（例えば「はい」または「いいえ」）で示すことができ、よって、アッセイ結果の解釈についてのどのような主観的な要素も最新の電子工学手段またはその他のディスプレー手段を必要としないで除去する。
【００１１】
「テスト」流路に沿った液流と基準流路に沿った液流の間の「競争」が存在する上記の配列の変形が、ＷＯ２００８／０２５９４５に開示されている。このテスト流路と基準流路が互いに接触する結合領域が存在する。基準流路に沿った液流が「競争に勝ち」、テスト流路に沿った液流より前に結合領域に到達する場合、そのときテスト流路に沿った液体のさらなる流れは阻止される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】欧州特許第２９１１９４号明細書
【特許文献２】米国特許第５４５８８５２号明細書
【特許文献３】米国特許第４９６３４９８号明細書
【特許文献４】欧州特許第４５６６９９号明細書
【特許文献５】国際公開第２００４／０８３８５９号
【特許文献６】国際公開第２００６／０９０１４４号
【特許文献７】国際公開第２００８／０２５９４５号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の態様において本発明は、検体を含有すると推測される液体サンプルを、ガス発生手段（ガス発生手段は、検体の有無または量に依存してガスを生成し、このガスは液体サンプル中に、流路に沿った液体の流れを変えるように作用する１つまたは複数の泡を生じる。）と接触させるステップ、および流路に沿った液体の流れの変化が、液体サンプル中の検体の存在および／または量を示す液体における流れの変化を決定するステップ、
を含む液体サンプル中の対象の検体の存在および／または量を決定するための方法を提供する。
【００１４】
流れの変化の決定は、液体の流れの変化の結果としての効果を決定することを含み得る。かかる効果は、例えば、液体が特定のゾーンに到達したことの表示であり得る。
【００１５】
流れの変化が決定される液体は、液体サンプル自体であり得る。あるいは、それは液体サンプルが第２の液体と流体的に接続して１つまたは複数の液体サンプル中の気泡の発生が第２の液体における流れの変化を引き起こすような第２の液体であり得る。この第２の液体は、この方法を行うことができるデバイスに適用することができ、またはこのデバイスの一部を構成することができる。
【００１６】
第２の態様において本発明は、
ａ）検体を含有すると推測される液体サンプルを、第１試薬により標識されている結合試薬（この結合試薬は、検体にまたは検体に対する結合試薬に結合することができる。）と接触させるステップ、
ｂ）蓄積ゾーンにおいて標識化結合試薬の蓄積（標識化試薬の蓄積ゾーンにおける蓄積は、液体サンプル中の検体の有無または量に依存する。）をもたらすステップ、および
ｃ）標識した結合試薬を蓄積ゾーンにおいて第２試薬と接触させて、第１試薬と第２試薬とが反応してガスを生成し、ガスが流路に沿った液体の流れを変える（前記流路に沿った液体の流れのこの変化は、液体サンプル中の検体の存在および／または量を示す。）ように作用する１つまたは複数の泡を液体サンプル中に生じるようにするステップ、
を含む液体サンプル中の検体の存在および／または量を決定する方法を提供する。
【００１７】
好ましい実施形態においては、アッセイデバイスが電子部品を有さないか有してもわずかである、液体サンプル中の検体の決定の明確なまたは「バイナリーの」またはデジタル式の結果を提供することができる比較的安価なアッセイデバイスを提供することが本発明の目的である。一実施形態において、本発明は、アッセイデバイスが、電源を必要とするデバイスまたは電源それ自体を含まない、場合によって検出可能なバイナリーのまたはデジタル式のアッセイ結果の提供が可能であるアッセイデバイスを提供することができる。要素としては、光ダイオード、光検知器、電子ディスプレーおよび電子回路の１つまたは複数が挙げられる。好ましくは、結果は、肉眼によって視覚的に検出可能である。
【００１８】
第３の態様によれば、本発明は、アッセイデバイスが、
液体が平行して流れる少なくとも１つのアッセイ用流路；
検体の有無または量に依存してガスを発生する（このガスは液体サンプル中に、下流のゾーンまでの流路に沿った液体の流れを変えるように作用する１つまたは複数の泡を生じる。）ガス発生手段；ならびに
液体の流れにおける任意の変化を検出する検出手段および／または下流ゾーンにおける液体の存在または到着を検出するインジケータ領域（この流路に沿った液体の流れの変化は、検体の存在および／または量を示す。）を含み、
前記デバイスに塗布または導入した液体サンプル中の対象の検体の存在および／または量を決定するためのアッセイデバイスを提供する。
【００１９】
このガス発生手段は、適切な第２試薬と接触したとき、直接的または間接的にガス生成物を発生する反応を引き起こすまたは反応に加わる第１試薬を含むことができる。本アッセイデバイスは、一般的には２つ以上の試薬間の反応において必要な少なくとも１つの試薬を含み、この反応は、直接的または間接的生成物として、ガスの形成をもたらす。好ましくは、本アッセイデバイスは、ガス生成反応が起こるために必要なすべての試薬を含む。該試薬は、例えば、２つ以上の反応物または少なくとも１つの反応物および１つまたは複数の反応物のガス生成物への転化に触媒作用をする触媒（例えば酵素など）を含むことができる。
【００２０】
１つまたは複数の泡の形成は、一般的には、この１つまたは複数の泡が位置するまたはこの１つまたは複数の泡の下流の領域における流路に沿った液体の流れを妨げる傾向がある。流路に沿った流れは、１つまたは複数の泡の形成によって停止され得る。あるいは、この泡の形成は、流路に沿った液体の流れの速度を増大させ得る。
【００２１】
第４の態様において本発明は、アッセイデバイスが、
ａ）このデバイスに液体サンプルを塗布するためのサンプル塗布ゾーン、
ｂ）液体が平行して流れる少なくとも１つのアッセイ用流路、
ｃ）第１試薬によって標識されており、前記流路内に備えられている蓄積ゾーンの上流に備えられている結合試薬（前記結合試薬は、検体または検体に対する結合試薬のいずれかに結合することができる。）、
ｄ）蓄積ゾーンにおける標識化試薬の集積が、液体サンプル中の検体の有無または量によって決まる標識化結合試薬を固定することができる蓄積ゾーン（このデバイスは、使用中、この蓄積ゾーンに固定された任意の標識化結合試薬と第２試薬との間で反応が起こってガスを生成し、前記ガスが、１つまたは複数の泡を液体サンプル中に形成し、この泡が流路に沿った液体の流れを変化させるように作用し、その液体の流れの変化が液体サンプル中の検体の存在または量を示すものである。）、
ｅ）液体の流れおよび／または液体の存在または到着を検出するための蓄積ゾーンの下流に備えられているインジケータ領域の任意の変化を検出するための検出手段、
を含む液体サンプル中の対象の検体の存在および／または量を決定するためのアッセイデバイスを提供する。
【００２２】
標識化結合試薬は、蓄積ゾーンにおいて検体に依存する形で蓄積され得る。液体中に存在する検体は、標識化結合試薬と検体−結合試薬の複合体を形成することができ、蓄積ゾーンにおいてその後蓄積され得る。
【００２３】
検体に対する第２結合試薬は、検体−標識化結合試薬の複合体を捕捉するために蓄積ゾーンにおいて不動化した形で提供され得る。あるいはまたはさらに、検体は、標識化結合試薬との複合体の形成前に蓄積ゾーンにおいて不動化した第２結合試薬によって捕捉され得る。
【００２４】
さらに別法では、その第２結合試薬は、移動可能な形で提供してよく、それは、蓄積ゾーンにおいて不動化され得る。例えば、蓄積ゾーンは、ビオチン等の結合試薬によって標識することができ、検体に対する第２結合試薬は、この結合試薬に対する相補的結合パートナー例えばストレプトアビジンなどにより蓄積ゾーンにおいて標識することができる。
【００２５】
さらなる実施形態において、検体に対する第２結合試薬は、磁性粒子に結合させることができる。磁石は、磁気的に標識した第２結合試薬を不動化するために蓄積ゾーンの近辺に備えることができる。形成された任意の第１結合試薬／検体／第２結合試薬の複合体を、例えば、磁石を用いて蓄積ゾーン中に移動させることができる。
【００２６】
さらに別法では、該蓄積ゾーンは、第２結合試薬がフィルターを通過することができないサイズ排除フィルターを含むことができる。第２結合試薬は、例えば、直径がフィルター中の微細孔の平均孔径のそれより大きい粒子に付着していることができる。それ故、標識化第１結合試薬／検体／第２結合試薬の複合体は、フィルターのところで保持され、一方錯化されていない標識化結合試薬はそれを通過することができる。
【００２７】
検体の決定は、競合または抑制型反応を用いて行うことができる。標識化結合試薬は、標識した検体または検体類似物を含むことができる。この方法は、小さい検体例えばハプテンなどの検出に適している。例えば、検体または検体類似物は、標識化結合試薬を捕捉するのに役立ち得る蓄積ゾーンにおいて固定することができる。あるいは、検体に対する結合試薬は、蓄積ゾーンに備え、標識した検体または検体類似物は、蓄積ゾーンにおいて結合試薬を獲得するために存在する任意の検体と競い合う蓄積ゾーンの上流に備えることができる。
【００２８】
標識化結合試薬は、蓄積ゾーンの上流に備える代わりまたはそれに加えて蓄積ゾーンに備えることができる。
【００２９】
このデバイスは、蓄積ゾーンの上流に備えられた第２の試薬を、使用中に、すべてのまたは実質的にすべての標識化結合試薬が、第２試薬が蓄積ゾーンに到着する前に前記ゾーンに移送されるように、さらに含むことができる。
【００３０】
第５の態様によれば、本発明は、アッセイデバイスが、
ａ）このデバイスに液体サンプルを塗布するためのサンプル塗布ゾーン、
ｂ）液体が平行して流れる少なくとも１つのアッセイ用流路、
ｃ）第１試薬によって標識されており、前記流路内に備えられている蓄積ゾーンの上流に備えられている結合試薬（前記結合試薬は、検体または検体に対する結合試薬のいずれかに結合することができる。）、
ｄ）蓄積ゾーンの上流に備えられている第２試薬、および
ｅ）蓄積ゾーンにおける標識化試薬の集積が、液体サンプル中の検体の有無または量によって決まる標識化結合試薬を固定することができる蓄積ゾーン（前記デバイスは、使用中、すべてのまたは実質的にすべての標識化結合試薬が、第２試薬の蓄積ゾーンへの到着前に前記ゾーンに運ばれ、第２試薬のこの蓄積ゾーンへの到着が、この蓄積ゾーンに固定された任意の標識化結合試薬と第２試薬との間のガスを生成する反応をもたらすと同時に、前記ガスが、１つまたは複数の泡を液体中に形成し、この泡が流路に沿った液体の流れを変化させるように作用し、その液体の流れの変化が液体サンプル中の検体の存在および／または量を示すものである。）、
を含む液体サンプル中の対象の検体の存在および／または量を決定するためのアッセイデバイスを提供する。
【００３１】
第２試薬は、第１試薬に対するとは別の流路中に供給することができる。本アッセイデバイスは、第１試薬を第１流路に供給し、第２試薬を第２流路に供給する２つの流路を含むことができる。この第１および第２流路は、交差点、蓄積ゾーンまたはその上流において合流することができる。この第１および第２流路は、標識化結合試薬が蓄積ゾーンに到着するのにかかる時間が、第２試薬が前記ゾーンに到着するのにかかる時間より短くなるように備えることができる。これを達成するためには多くの異なる方法が存在する。この２つの流路は、例えば、それらのそれぞれの長さ、幅、表面コーティングまたはそれらの組合せにおいて互いに異なり得る。流路の１つは、第２試薬が、すべてのまたは実質的にすべての標識化結合試薬の後に蓄積ゾーンに到着するように、１つまたは複数の流量制限または流量促進要素などを備えることができる。
【００３２】
使用中、このデバイスに適用された液体サンプルは、第１および第２流路にそれぞれ供給された第１および第２試薬を再懸濁させ、存在する検体の量に応じて、蓄積ゾーンにおける標識した結合試薬の蓄積をもたらす。第１流路と第２流路の間の違いによって、すべてのまたは実質的にすべての標識化結合試薬は、蓄積ゾーンに第２試薬が到着する前に到着する。蓄積ゾーンにおいて蓄積されなかった標識化結合試薬は、液体サンプルと一緒に下流へと通過する。よって、蓄積ゾーンにおける１つまたは複数の気泡の形成は、主として第２試薬と蓄積ゾーンにおいて蓄積された任意の第１試薬の間の反応によるものであり、それ故、存在する検体の存在および／または量を示す。
【００３３】
第１の流路と第２の流路の間の交差は、別々の流路からの２つの流れを単一の流路に一緒に持ち込むことを可能にする。好ましくはこの交差は、いずれかの流路からの液体の交差の下流への通過を妨げ得るエアロックを導入しないように設計する。
【００３４】
本アッセイデバイスは、第１および第２流路を接続する共通のサンプル適用領域を含むことができる。よって、本アッセイデバイスに適用されまたは導入される単一の液体サンプルが、第１および第２流路の両方に沿って同時に流れることが可能である。
【００３５】
第１および第２試薬を蓄積ゾーンに連続して送るその他の方法を、考えることができる。例えば、本アッセイデバイスは、デバイスに適用される液体サンプルが２つの方向にそれぞれ蓄積ゾーンから離れておよびそれに向かって流れるように流路に沿って分かれて位置するサンプル適用ゾーンを含むことができる。第１および第２試薬は、蓄積ゾーンから離れて流れる液体サンプルが第２試薬を移動させ、蓄積ゾーンに向かって流れる液体サンプルが第１試薬を移動させるようにデバイス中に供給することができる。本アッセイデバイスは、液体サンプルが接触したとき、一般的に第１試薬を含む部分が、このデバイスに適用されたすべての液体サンプルを蓄積ゾーンに向けて引き寄せることが可能である液体シンクを含むことができる。よって、使用中、すべてのまたは実質的にすべての第１試薬は、蓄積ゾーンに第２試薬が到着する前に到着することができる。
【００３６】
このデバイスは、液体の流れの変化を決定する手段を含むことができる。流れの変化を決定することは、液体の流速を測定することによって行うことができる。流れの変化は、１つまたは複数の流速閾値に対して決定され得る。
【００３７】
本アッセイデバイスは、流路中例えば蓄積ゾーンの下流における液体サンプルの存在を検出する手段を含むことができる。例えば、本アッセイデバイスは、液体サンプルの存在を検出するためのもう１つの電極対を含むことができる。それぞれの電極対間の流れの速さを測定することができ、これは、例えば、それぞれの電極対が液体サンプルの存在を決定することができる複数の電極対を１つまたは複数の空間間隔で備えることによって達成することができる。本アッセイデバイスは、液体サンプルが流路に沿って移動するのにかかる時間を記録するための簡単なタイマーをさらに含むことができる。
【００３８】
流れの変化の決定は、また、便宜上「テスト」流路とも呼ぶことができるアッセイ流路中の液体の流れを、基準流路における液体の流れに対して比較することによって行うこともできる。
【００３９】
本アッセイデバイスは、１つまたは複数の下流のゾーンにおける液体の到着を示す１つまたは複数のインジケータ領域を含むことができる。このインジケータ領域は、好ましくは視覚的に検知可能であり、例えば液体と反応して色を生み出す化学物質等の色変化手段を含むことができる。この色変化手段は、流路中に固定することができ、または例えば液体に溶解できる乾燥した着色染料を含むことができる。
【００４０】
この色変化手段は、ｐＨに敏感であり得る。そのインジケータ領域は一般的に蓄積ゾーンの下流に備えられる。このインジケータ領域は、例えば、液体が入ることができそこを液体が通過することができるチャンバーを含むことができる。このチャンバーは、液体がチャンバーに入り、これ以上の流れが停止するように流路の最後部に備えることができる。
【００４１】
本アッセイデバイスは、基準流路をさらに含むことができ、この基準流路に沿った液体の流れは、アッセイ流路に沿った液体の流れと比較される。この基準流路には、ガスを発生することができる試薬は何ら存在しなくてよい。
【００４２】
本アッセイデバイスは、それぞれテスト流路の蓄積ゾーンの下流および該基準流路に向かってまたはその遠位末端に備えられている２つのインジケータ領域を含むことができる。共通のサンプル適用ゾーンは、このデバイスに適用された液体サンプルがそれぞれの流路に沿って流れることができるように、アッセイ流路と基準流路とを接続することができる。
【００４３】
テスト流路および基準流路は、それぞれインジケータ領域を含むことができる。これらのインジケータ領域は、視覚的に異なる結果を提供するように互いに異なることができる。例えばテスト流路および基準流路のそれぞれのインジケータ領域は、異なる色変化手段を備えることによって異なる色を発生することができる。別法では、この２つのインジケータ領域は、例えば「正」または「負」を示す単語または記号を示すことができる。
【００４４】
液体の流れは、液体の流れまたはその一部を減少または停止することによって変えることができる。別法では、液体の流れは、液体の流れまたはその一部を増加または再スタートさせることによって変えることができる。
【００４５】
意外にも、本発明者らは、気泡は、第２試薬が蓄積ゾーンにおいて不動化した標識化結合試薬の比較的濃縮された量と接触するときにかなりの程度まで発生するのみであることを見出した。標識化結合試薬および第２試薬の量、デバイスの流体の寸法およびデバイス中の標識化結合試薬と第２試薬の相対位置を最適化することによって、第２試薬と不動化されていない結合試薬の間のどのような反応も最低限に保つことができ、本アッセイの性能に必ずしも有害ではない。
【００４６】
第６の態様において、本発明は、
ａ）標識化結合試薬を不動化することが可能な蓄積ゾーンが備えられている流路を含むアッセイデバイス、
ｂ）第１試薬により標識された結合試薬、および
ｃ）蓄積ゾーンにおいてこの第１試薬と反応してガスを生成し、前記ガスが１つまたは複数の泡を液体中に形成し、その泡が作用して流路に沿った液体の流れを変化させるように作用し、その液体の流れの変化が液体サンプル中の検体の存在または量を示すことができる第２試薬、
を含む液体サンプル中の検体の存在および／または量を決定するためのアッセイキットを提供する。
【００４７】
第７の態様において、本発明は、
ａ）サンプルを流路に適用し、それによって第１試薬を流路内に備えられた蓄積ゾーンにおいて蓄積させるステップ、および
ｂ）その後、不動化した試薬を、第１試薬と第２試薬が反応してガスを生成し、このガスが１つまたは複数の泡を液体中に生じ、これらが作用して流路に沿った液体の流れを変えるように、第２試薬と接触させるステップ、
を含む液体サンプルの流路に沿った流れを変える方法を提供する。
【００４８】
第７の態様による方法は、液体サンプルの流れにおける任意の変化を検出または決定するステップをさらに含むことができる。
【００４９】
第８の態様において、本発明は、デバイスが、
ａ）液体サンプルをデバイスに適用するためのサンプル適用ゾーン、
ｂ）液体が平行して流れる少なくとも１つの流路、
ｃ）蓄積ゾーンの上流に供給される第１試薬、
ｄ）この第１試薬を蓄積することができる蓄積ゾーン（このデバイスは、使用中、蓄積ゾーンにおいて、蓄積された第１試薬と第２試薬の間で反応が起こってガスを生成し、前記ガスは、液体中に１つまたは複数の泡を形成し、この泡は流路に沿った液体の流れを変えるものである。）、および
ｅ）液体サンプルの任意の流れの変化を検出する検出手段および／または蓄積ゾーンの下流に備えられた液体の存在または到着を検出するためのインジケータ領域、
を含む流路に沿った液体サンプルの流れの変化を検出するためのデバイスを提供する。
【００５０】
第８の態様によるデバイスは、使用中、すべてのまたは実質的にすべての第１試薬が、第２試薬が蓄積ゾーンに到着する前にこの蓄積ゾーンに輸送されるように、前記ゾーンの上流に供給される第２試薬をさらに含むことができる。
【００５１】
当該１つまたは複数の流路は、マイクロ流体チャネル、多孔質母材（例えば、クロマトグラフ膜）、またはこの２つの組合せを含むまたはこれらから成ることができる。好ましい多孔質母材としては、ニトロセルロースおよび濾紙が挙げられる。このマイクロ流体チャネルは、好ましくは、液体サンプルが毛細管流動によってチャネルに沿って進行することができるような毛細管の寸法のものである。典型的なマイクロ流体チャネルは、０．１と５００μｍの間、より一般的には１と１００μｍの間の内部横断面寸法を有する。マイクロ流体の１つのチャネルまたは複数のチャネルは、例えば、ポリカーボネート、ポリエステル、エポキシ樹脂等の合成プラスチック材料またはガラスもしくは金属から形成することができる。この１つのチャネルまたは複数のチャネルは、従来の技術を使用するエッチング、キャスティング、モールディング等により形成することができる。
【００５２】
デバイスは、１ｍｍの典型的な幅および１００ｕｍの典型的な高さを有するマイクロ流体チャネルを含むことができる。このデバイスは、多数の積層材、例えば下の基層、チャネル構造を含む中間層およびマイクロ流体チャネル（１つまたは複数）をシールする役割をする上層など、を含むことができる。
【００５３】
対象の検体は、例えば、ステロイド、ホルモン、ペプチドもしくはポリペプチド、糖質、脂質、タンパク質、リポタンパク質、ポリヌクレオチド、酵素、血液型マーカー、疾病マーカー、診断もしくは予後指標、陽イオン、陰イオン、または、ウイルス、細菌、酵母、真菌、胞子もしくは真核細胞等の分子複合体を含む。１つの好ましい実施形態において、対象の検体は、ｈＣＧを含む。別の実施形態において、検体はグルコースである。本発明によるアッセイデバイスはハプテン等の小分子を含む検体の検出に対して適している。ハプテンとは担体に結合したときにのみ免疫反応を引き起こすことができる小さな抗原決定基として定義することができる。ハプテンは、抗体に結合はするがそれら自体によっては、例えばハプテンを動物の体に注射することによって、抗体反応を引き出すことができない。ハプテンの非限定の例としては、アンフェタミン系の依存性薬物、例えば、ＭＤＡ（３，４−メチレンジオキシアンフェタミン）、「エクスタシー」としても知られるＭＤＭＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−メチルアンフェタミン）、ＭＤＥＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−エチルアンフェタミン）、ＢＤＢ（３，４−メチレンジオキシフェニル−２−ブタンアミン）、ＭＢＤＢ（３，４−メチレンジオキシフェニル−Ｎ−メチルブタンアミン）、およびＭＤＰＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−プロピルアンフェタミン）；オピエート、例えばモルヒネおよびコデイン、ならびに、ヘロイン、ヒドロモルホン、ヒドロコドン、オキシコドンおよびオキシモルホンを含むそれらの合成類似体；リセルグ酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）ならびにそれの代謝産物；テトラヒドロカンナビノールおよびコカイン；有毒な薬物、例えば、ジアゼパム、ニコチン、アセトアミノフェン、カフェイン、リスペリドン、フェノバルビタールなど；ホルモン、例えば、プロゲステロン、エストラジオールおよびそれらの代謝産物、テストステロンなど；殺虫剤；染料、例えばフルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッドなどが挙げられる。
【００５４】
液体サンプルは、任意の適当な液体、例えば、水、汚水サンプル、または水を含む抽出物（例えば、水を含む食品もしくは飲料サンプル）または生体サンプル、例えば、血液、血漿、血清、尿、膿、汗、唾液、膣液、もしくは涙などであり得る。好ましいサンプルは尿である。この液体サンプルは、このデバイスに「そのまま」適用でき、または前処理のステップ（例えば、次の、混合、かき混ぜ、超音波処理、希釈、培養、変性、または１つまたは複数の試薬との反応、の１つまたは複数を含む）にかけることができる。
【００５５】
１つの泡または複数の泡が生じる液体は、好都合なことに、実質的にはデバイスに適用するときのサンプルの液体であり得る（しかし、アッセイデバイスとの接触、例えば、アッセイデバイスの流路に堆積されまたは供給された試薬またはその他の物質のサンプル液体中での再懸濁または溶解の結果としてその液体の組成の任意の変化はあり得る）。別法では、またはさらに、１つの泡または複数の泡は、アッセイデバイスに別に適用されるバッファー洗液または追加の試薬溶液等の任意の他の液体中で形成させることができる。いずれにしても、この液体は一般に水を含む（すなわち、容積比で５０％を超えるＨ２Ｏ）。
【００５６】
当然のことながら、１つの試薬または複数の試薬によって形成されたガスは、アッセイが行われる温度および圧力の条件下で、液体の流れが阻止されまたは減少されるべき時間が過ぎるまで持続するために、少なくとも一部は該液体に不溶性でなくてはならない。通常、アッセイは、室温（すなわち、約１８℃から２５℃）で行われるが、このアッセイは冷たい部屋または冷蔵室で（約３℃から６℃で）行うことができまたは培養器中で（約２５℃から約４０℃までの温度で）行うことができる。一般的に、該アッセイは、大気圧（一般に、これは海抜ゼロで９７０ミリバールから約１０３０ミリバールの範囲である）で行われる。それ故、形成されるガスの濃度は、アッセイを行うために取られる時間の少なくとも一部のために、関連する液体中の溶解度より上でなくてはならない。液体サンプル中の低レベルの溶解度を有するガス、例えば酸素など、が好ましい。
【００５７】
前述の制限内で、気泡を形成するために使用されるガスは、明らかに毒性が強いまたは反応性が高い材料はあまり好ましくはないが、任意の適当なガスであり得る。適切なガスとしては、以下に限定はされないが、酸素、オゾン、二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、エタン、窒素、酸化窒素、水素、ヘリウム、希ガス、または前記のものの２つ以上の任意の組合せを挙げることができる。概して好ましいガスとしては、酸素、二酸化炭素、窒素および水素が挙げられる。
【００５８】
第１試薬は、第２試薬と反応してガスを発生することができるものである。この第１および／または第２試薬は、サンプルの液体の一部として、またはアッセイデバイスに対して別に添加する液体としてアッセイデバイスに供給することができる（またはより好ましくは、例えば、アッセイデバイスの上または中、一般的には１つまたは複数の流路の上または中に、乾燥または凍結乾燥した形で堆積してアッセイデバイスの不可欠の成分を形成する）。この第１試薬は酵素であり得る。
【００５９】
第１試薬として使用するための適当な酵素としては、カタラーゼまたはグルコース酸化酵素等のオキソレダクターゼが挙げられる。カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）は、過酸化水素の水および酸素への分解の触媒作用をする。この反応は、必要なガス（この場合は酸素）を発生すること以外は、唯一のその他の生成物はアッセイの実行またはその結果に重要な影響を有さない水であるので有用である。カタラーゼは、高純度で広く市販されており、凍結乾燥することができる。カタラーゼに基づくガス発生システムを使用するもう１つの利点は、たった１つだけのさらなる試薬、例えば過酸化水素など、を必要とすることである。よって、ガスを発生するために必要なのは、過酸化水素を酵素的に活性な量のカタラーゼと接触させることのみである。
【００６０】
第１試薬がカタラーゼ等のオキソレダクターゼである場合、第２試薬は、酸素ガスの源を含めばよい。酸素ガスの源の例は、過酸素化合物または過酸、例えば、過酸化水素、過酸化カルバミド、アルカリ金属過酸化物、過酸化尿素、アルカリ金属炭酸塩アルカリ金属過ホウ酸塩、およびアルカリ金属過炭酸塩である。過酸化尿素等の固体の酸素源は、それを乾燥状態のアッセイデバイスの一部として提供することができる利点を有する。
【００６１】
グルコース酸化酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．３．４）は、過酸化水素の共形成によるβ−Ｄ−グルコースのＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化に触媒作用を及ぼす。したがって、このシステムは、アッセイデバイス中の過酸化水素の原位置での発生のために使用することができ、それは次にカタラーゼによって作用を及ぼすことができる。したがって、一実施形態において、本発明のアッセイデバイスは、グルコース酸化酵素とカタラーゼの両方を含むことができる。グルコースは、乾燥した堆積物としてアッセイデバイスに容易に供給することができ、それは容易に再水和しサンプルの液体によって溶解される。順次カタラーゼによって酸素に変換される過酸化水素をグルコースと反応して形成するのに十分であるはずの少量の酸素を、（サンプルの液体中に溶解させるかまたは前進する液体の前方の流路中の空気中に存在させて）アッセイデバイス中に存在させることができる。
【００６２】
使用することができるその他のガス発生酵素としては、デヒドロゲナーゼおよびデカルボキシラーゼ等の二酸化炭素を発生するもの、例えば、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼ、シュウ酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびウレアーゼが挙げられ、後者は、尿素を加水分解して二酸化炭素とアンモニアにする触媒作用をすることができる。
【００６３】
結合試薬は、対象の検体に対する結合親和性を有し、結合対を形成する試薬であり得る。結合対は、当業者には周知であり、抗体−抗原、リガンド／受容体、相補的オリゴもしくはポリヌクレオチド、または互いに結合するその他の分子の対である。結合試薬は、対象の検体に対する抗体であり得る。結合試薬は検体または検体類似物であり得る。
【００６４】
好都合なことに、結合試薬は、免疫グロブリン分子またはかかる分子の抗原結合部分であり、この用語は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一領域抗体、任意のこれらのマルチマーなどを含むことが意図されている。免疫グロブリン（またはそれらの一部）を他の分子に架橋結合または結合する方法は、確立されている。特に免疫グロブリン（またはそれらの一部）を酵素等の他のポリペプチドに結合することは当業者には周知である。本発明のいくつかの実施形態において、該アッセイデバイス／方法は、酵素、特にガスを生成する反応に触媒作用を及ぼす酵素に結合した免疫グロブリン分子（またはそれの抗原結合部分または免疫グロブリンのマルチマーまたはそれの抗原結合部分）を含む。
【００６５】
結合試薬は、ガス生成反応に参加するまたは触媒作用を及ぼす第１試薬に結合させることができる。望ましくは、免疫グロブリン分子のような結合パートナーまたはその他の結合パートナー（またはそれの抗原結合部分）は、例えばカタラーゼのような酵素に結合する。別法では、標識化結合試薬を、第１試薬を結合パートナーに結合することによって原位置で生成させることができる。
【００６６】
液体（好ましくはサンプル液）の液体適用領域（例えば、サンプル適用ゾーンまたはポート）への適用は、アッセイデバイスにおける流路に沿った（好ましくは毛細管作用による）液体の流れを引き起こす。流動液体中に同伴するもの（例えば、デバイスに適用された液体中に含まれているか、デバイス中に既に存在し、液体との接触により移動したもの）は、第２試薬と接触または混合されたときガス生成反応に参加する第１試薬である。
【００６７】
本アッセイデバイスは、非電子の、バイナリーまたはデジタルのアッセイ結果発生および／またはインジケータ領域を含むことができ、すなわちそれはアッセイの結果を発生および／または表示するための電源を必要としない。好ましくは、本アッセイデバイスは、どんなものであれ、非電子の構成要素を含む。バイナリーまたはデジタルの結果は、与えられた結果が一義的である。それは、例えば、「正」または「負」、「はい」または「いいえ」、閾値より大きいまたは小さい等、２つの起こり得る結果から与えられる単一の回答であり得る。それは、３つ以上の起こり得る結果から与えられる単一の回答であり得る。その結果は、閾値に関して提供され得る。したがって肯定的な結果は、特定の閾値より高い検体のレベルに対して与えられ得る。バイナリーまたはデジタルの結果は、例えば、結果がテストラインの色強度に依存し、それ故ユーザーによる解釈の影響を受けるＣｌｅａｒＢｌｕｅ商標妊娠診断デバイス等の視覚読取りラテラルフローアッセイデバイスから視覚的に読み取った結果とは異なる。
【００６８】
バイナリーまたはデジタルのアッセイは、ＷＯ２００８／０２５９４５およびＷＯ２００６／０９０１４４に開示されており、本明細書に参照により援用される。バイナリーアッセイは、図８にさらに示されており、以下でさらに詳細に説明する。
【００６９】
備えられる基準の流路には、一般的にガス発生試薬は何ら存在しない。
【００７０】
本アッセイデバイスは、蓄積ゾーンの下流の接合領域において交差するテスト流路および基準流路を含むことができる。この接合領域は、また、液体の前方への流れを可能にする出口、導管、チャンバーまたはその他の部分も含むことができる。
【００７１】
この接合領域は、テスト流路中の液体または基準流路中の液体のいずれかの前方への通過のみを許すことができる。この接合領域は、基準流路に沿って流れている液体が、この接合領域に到着すると、テスト流路に沿った液体の流れを阻止する効果を有し、またはその逆であるような流体バルブまたはチョークを含むことができる。したがって、接合ゾーンの液体または下流の指標は、基準流路またはテスト流路からのいずれかの液体を示す。
【００７２】
テスト流路または基準流路は、容器内に含まれている液体の２つのインジケータ領域（１つは動作可能的に基準流路と関連し、もう１つは動作可能的にテスト流路と関連する）の１つへの前進流を可能にする接合領域に集中することができる。この容器の液体は、テスト流路からの液体が接合点に最初に到着するかまたは基準流路から液体が接合点に最初に到着するかによって、これらのインジケータ領域の１つに流れる。
【００７３】
接合領域は、１つの流路の流れを別のものによって阻むまたは容器チャネルのさらなる前進流を提供することが必要なときに有用である。しかしながら、状況次第でテストチャネル中の流れは、テストの時間内に完全に停止されてもよく、または流れはテストチャネル中の液体が接合点に到達せず、それ故接合領域は必須の要件でなくてよい。しかしながら、接合領域は、多くの実施形態において好ましい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、基準流路およびテスト流路からの流れが接合領域において同時に到着することを避けるようにアッセイデバイスを偏向させることが好ましいかもしれない。これは、基準流路およびテスト流路に、異なる幅、異なる長さなどを提供することによって達成することができる。本アッセイデバイスは、テスト流路中にガス発生がない場合は、液体がテスト流路から接合領域に基準流路からの液体が到着する前に到着するようにまたはその逆となるように偏向させることができる。このデバイスは、閾値に対して正または負の結果を提供するように適応させることができる。したがって、一定の閾値より下の検体の存在下での、それ故いくらかのガスの発生の存在下でのサンドイッチ型アッセイに対しては、テスト流路からの液体は、接合領域に基準流路からの液体が到着する前に到着できるかまたはその逆であり得る。
【００７５】
１つまたは複数のインジケータ領域を接合領域の上流または下流に備えることができる。
【００７６】
一実施形態によれば、本アッセイデバイスは、テスト流路または基準流路のどちらからの液体が接合領域に最初に到着したかを示すことができる接合領域の下流に備えられたインジケータ領域を含むことができる。このインジケータ領域の色の変化をもたらすことができる非常に多くの方法が存在する。
【００７７】
例えば、着色染料をテスト流路または基準流路のいずれかに供給することができ、または、異なる色の染料を、インジケータ領域中の特定色の染料の存在がどちらのルート（テスト流路または基準流路）によって液体がインジケータ領域に最初に到達したかを明らかにするように、それぞれのテスト流路および基準流路に供給することができる。別法では、該インジケータ領域は第１反応物を含むことができ、第２反応物を、第１および第２反応物が反応して色の変化を生じるように流路の１つに供給することができる。さまざまな反応物を、テスト流路および基準流路に供給することができ、それは、インジケータ領域中の反応物と反応して、さまざまな色の変化を、得られた色が、液体の進行流がテスト流路で起こったものによるかまたは基準流路で起こったものによるかによって異なるように提供することが可能である。さらなる例においては、２つの異なる酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびグルコース酸化酵素）をインジケータ領域に備えることができ、関連する酵素触媒の存在下で反応して着色した生成物を生成するそれらの酵素の１つに対するそれぞれの基質を流路の１つに提供することができる。その生成物の色は、どの基質がインジケータ領域に導入されたか（それ故、どの流路によって液体がそこに最初に到達したか）を明らかにする。一般論として、インジケータ領域（接合領域の下流に位置している場合）は、２つの異なる信号発生手段の要素を含むことができ、それらは移動できるように上流に配置されている各信号発生手段の１つまたは複数のさらなる要素により検出可能なように異なる信号を発生し、その１つの信号発生手段のさらなる要素は、テスト流路中に配置されており、その他の信号発生手段のさらなる要素は、基準流路中に配置されており、さらなる要素が、信号を発生するために、インジケータ領域中の他の要素と接触するために必要である。２つの信号発生手段のどちらが活性化されるかは、さらなる要素のどれがインジケータ領域に最初に到達するかに依存し、それは、立ち代って、テスト流路および基準流路に沿った液体の流れの相対速度に依存する。
【００７８】
一実施形態において、該インジケータ領域は、ｐＨに敏感なインジケータを含み、テスト流路および基準流路は、それぞれ、異なるｐＨに影響を及ぼす試薬、例えば、１つは比較的酸性のｐＨにおけるバッファーを含み、１つは比較的アルカリ性のｐＨにおけるバッファーを含む。液体がインジケータ領域に最初に到達する流路は、それ故、そのインジケータ領域におけるｐＨおよびそれ故インジケータの色を測定する。インジケータ領域中に備えられているインジケータは、固定した形、例えば、チャネルの表面またはインジケータ領域中に備えられている紙等の多孔質母材の上もしくは内部に備えることができる。
【００７９】
下流のインジケータ領域を有するこの一般タイプの実施形態は、テスト流路に沿った液体の流れを、基準流路に沿った液体の流れをインジケータ領域に最初に到達させるためまたはその逆のために大きく変えることを必要としなくてもよく、１秒または２秒といったわずかな時間差で十分であり得るという利点を有する。
【００８０】
他の実施形態においては、インジケータ領域は、基準流路およびテスト流路のそれぞれにおいて、接合領域の上流に備えられる。一実施形態において、基準流路に沿った液体のある点までの流れは、テスト流路に沿った液体の流れを、この液体がテスト流路上のインジケータ領域に到達する前に阻止するように作用し、その結果、確実なアッセイ結果がインジケータ領域において示される。いくつかの実施形態において、染料等の指標物質を、目に見える変化が、液体がテスト流路および／または基準流路のインジケータ領域に到達した場合／時に、見ることができるように、インジケータ領域の上流に備えることは有利であり得る。
【００８１】
一実施形態によれば、本アッセイデバイスは、接合領域の上流のテスト流路および基準流路の両方に備えられたインジケータ領域を含む。サンドイッチ型アッセイに対して１つまたは複数の気泡の発生をもたらす検体の存在下で、テスト流路に沿った流れは、減速または停止し、基準流路からの液体がそのインジケータ領域に最初に到達することを可能にし、検体の存在を示す。検体が存在しない場合は、テスト流路および基準流路は、テスト流路からの液体サンプルが、基準流路からの液体の前に接合領域に到達するように設定することができる。テスト流路からの液体が接合領域に一旦到達したら、それは、基準流路中の液体が、少なくともテストの時間内は、基準のインジケータ領域に決して到達しないように基準流路内の液体の流れを遮断する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、該インジケータ領域は、毛細管等のマイクロ流体チャネルを含み、これはユーザーの目に見える（例えば、他の不透明なハウジングの窓またはすき間を通して）。一実施形態において、該インジケータ領域は２つのチャネルまたは毛細管を含み、１つはテスト流路の一部を形成し、１つは基準流路の一部を形成している。１つの実施形態において、インジケータ領域内のこのマイクロ流体チャネルまたは毛細管は、アッセイの実施中に着色した液体によって満たされるようになる。その液体の色は、それ自体がアッセイの結果を示すことができる。あるいは、この着色した液体は、チャネルまたは毛細管の可視性を改めるために単に役立つだけであり得る。例えば、透明なまたは白色の背景に対する透明なプラスチックまたはガラスの毛細管は、見てすぐに分かることができない。そのようなチャネルまたは毛細管中への着色した液体の導入は、コントラストを増し、チャネルまたは毛細管を容易に見ることができるようにする。あるいは、チャネルまたは毛細管がその背景によって最初に高いコントラストのものである場合（例えば、赤の背景に対する白の毛細管）、そのとき背景と同じ色の着色した液体のチャネルまたは毛細管中への導入は、コントラストを減少し、毛細管またはチャネルを見ることを困難にする。これらはすべて、アッセイの結果に関する可視信号を伝達または示す異なる方法を表している。
【００８３】
いくつかの実施形態において、該インジケータ領域は、１つまたは複数の単語または記号（例えば「ＰＲＥＧＮＡＮＴ」またはプラスまたはマイナス記号など）を形成する１つまたは複数のチャネルまたは毛細管を含むことができる。本発明に従うアッセイデバイスが妊娠テストデバイスとして提供される１つの特定の実施形態において、１つの流路は、チャネルまたは毛細管が単語の「ＮＯＴ」を形成するインジケータ領域を含み、別の流路はチャネルまたは毛細管が単語の「ＰＲＥＧＮＡＮＴ」を形成するインジケータ領域を含む。一般的に、単語の「ＮＯＴ」は、テスト流路中に形成され、単語の「ＰＲＥＧＮＡＮＴ」は、基準流路中に形成される。サンプルがｈＣＧを何ら含有しないデバイスに適用される（すなわち、被験者が妊娠していない）場合、液体はテスト流路および基準流路の両方に沿って自由に流れる。着色された標識例えば染料は、両方の流路に沿って輸送され、単語の「ＮＯＴ」および「ＰＲＥＧＮＡＮＴ」がディスプレー中のメッセージとして現れる。ｈＣＧを含むサンプルがこのデバイスに適用される場合、テスト流路中に存在する凝集試薬（凝集？ガスではない？）（例えば、抗ｈＣＧ抗体をコートしたラテックスの粒子）は、流れの速度を基準流路中の液体が、テスト流路中の液体がインジケータ領域に到達できる前に合流点に到達できる程大幅に減少する。これにより、テスト流路は効果的にブロックされ、その結果単語の「ＮＯＴ」は見えなくなり、その代わり、そのディスプレーは「ＰＲＥＧＮＡＮＴ」のメッセージを与える。
【００８４】
本アッセイデバイス中の１つまたは複数の流路は、基本的に直線状である。あるいは、コンパクトな形状を提供するために流路はヘビ状またはその他の回旋状の経路をたどることがあり得る。この流路は、泡保持手段、例えば、気泡の捕捉を容易にし、よって、流れを減少または停止するための流路中のブロックの形成を助けるネックまたは１つまたは複数の狭窄部分などを含むことができる。この流路は、気泡捕捉または保持手段を含むことができる。例えば、この流路は、基部内に２つ以上の重なり合った指または突起を有するチャネルを含むことができる。かかる実施形態は、複数の互いにかみ合った指が、チャネルの対側から流路中に突出している「鋸歯状」の部分によって都合よく形成することができ、その配置は気泡を捕捉するのに非常に効果的であることが示されている。流路は気泡の形成を促進するために役立つ１つの突起または要素を含むことができる。この突起は、例えば、鋸の歯のような要素であり得る。流路は、気泡の発生を促進するために役立つ化学的または物理的な核形成部位を含むことができる。泡による流れの減速化または停止を促すためのその他の方法は、流路のその幅または高さ、疎水性領域、および流路の表面積を増すために腐食した表面を狭めるために１つまたは複数の流れ制限要素を提供することである。この表面は例えばグリッドパターンに腐食するか一連の平行腐食ラインを含むことができる。
【００８５】
流れを減速するには多孔質構造物を使用することができる。例えば、該流路はガラス繊維またはその他の多孔質不活性物質等の多孔質物質を含むマイクロ流体チャネルおよびチャンバーを含むことができる。
【００８６】
気泡が生成する領域において、該流路は、泡が流体サンプルから周囲の環境中に逃げるのを防ぐためにじかに接している環境に対して有利には実質的に密閉することができる。したがって、泡は少なくともテストの持続中はそれらが液体またはそれの一部の流速を変えることができるようにデバイス中に保持することができる。この流路（またはそれの１つまたは複数の部分）は、例えば、実質的にガス不浸透性である材料を含む壁によって取り巻かれたマイクロ流体チャネルであり得る。一般的に、該デバイスは、じかに接している環境に対して完全に密閉されて、液体サンプル適用の１つのゾーンまたは複数のゾーンおよびそのデバイス中に存在することができる空気穴から離れている。
【００８７】
本アッセイデバイスは、さらなる試薬、例えば、砂糖および／またはアッセイデバイス中に存在する１つまたは複数の試薬の再懸濁もしくは可溶化を安定化させまたは促すために役立つウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク質などを含むことができる。
【００８８】
別の態様において、本発明は、アッセイを実施する方法を提供し、その方法は液体サンプルを本発明の態様に従うアッセイデバイスに適用するステップを含む。
【００８９】
さらに別の態様において、本発明は、アッセイデバイスを製造する方法を提供し、その方法は、アッセイの実施中、ガス生成反応に参加またはそれに触媒作用を及ぼす少なくとも１つの試薬をアッセイデバイス内またはそれに堆積させるステップを含む。
【００９０】
一実施形態によれば、本アッセイデバイスは、遊離の第１試薬および第２試薬の間の反応を防ぐために、蓄積ゾーンのすぐ上流および／または下流に備えられた固定された防止剤を含むことができる。そのようにして、ガスは第２試薬が第１試薬と蓄積ゾーンにおいて反応する結果として発生するのみである。
【００９１】
適切な防止剤は、酸素ガスを生成するカタラーゼと過酸化物の間の反応を防止するアジドである。例えば、検体が存在しない液体サンプルを用いるときのサンドイッチアッセイにおいて、標識した試薬の殆どは蓄積ゾーンにおいて結合することはなく、したがって蓄積ゾーンの下流に移動する。来続ける基質（カタラーゼの場合は過酸化物）は、蓄積ゾーンの下流に存在する標識した試薬と反応し、泡を発生する。このようにして生成した泡は、検体がサンプル中に存在しないときはそれらがテストチャネル中の流れを減少または停止するので逆効果である。この蓄積ゾーンの下流に防止剤の酵素を包含させることにより、蓄積ゾーンの下流における泡の生成は減少する。同様の効果が、蓄積サイトの下流のチャネル中のｐＨを酵素活性が破壊されるか著しく減少するように極めて酸性またはアルカリ性に変えることによって達成され得る。
【００９２】
本アッセイデバイスは、そのアッセイが正しく行われたことを示すことができる対照アッセイをさらに含むことができる。対照アッセイは、例えば、そのアッセイデバイスそれ自体が正しく機能したかどうか、または、ユーザーがそのデバイスを正しいやり方で使用したかどうかを確定するのに有用である。多数の要因が単独または組み合わさってデバイスに誤った結果を与えることに関与し得る。例えば、１つまたは複数の流路における欠陥、例えば、試験デバイスにおける妨害物、供給された１つまたは複数の試薬の劣化または不足などが存在し得る。対照アッセイの目的は、したがって、テスト結果が有効であることを示すことである。
【００９３】
該対照アッセイは、テスト流路および基準流路と類似していることができ、例えば、対照基準流路中の流れが対照テスト流路中の流れと比較され得る対照テスト流路および／または対照基準流路を含むことができる。この対照テスト流路は、例えば、流体サンプル中に存在する検体の量とは無関係の１つまたは複数の泡を生成するために所定量のガスを発生する１つまたは複数の試薬を含むことができる。この１つまたは複数のガス発生試薬は、テスト流路において採用されたものと同じものであり得る。対照基準流路は、一般的にはガス発生試薬は何ら含まない。テスト対照流路および基準流路は、下流の接合領域において交差することができる。対照アッセイは、接合ゾーンの上流または下流に備えられた１つまたは複数のインジケータ領域を含むことができる。
【００９４】
一実施形態において、インジケータ領域は、対照テスト流路および対照基準流路の両方における接合領域の上流にそれぞれ備えられる。使用中、対照テスト流路中の流れは、減速または停止されて対照基準チャネル中の流れが接合点に最初の到達することを可能にし、よって対照テストチャネル中の流れを詰まらせる。その際、対照基準チャネル中のインジケータは、ユーザーにテストが正しく機能したことを示す。反対に、対照テストチャネル中の流れがデバイスの不調によって減速されないか停止されずに対照テストチャネル中に泡を発生しない場合、対照基準チャネル中の流れは接合点に最初に到達し、よってデバイスの不調が接合点の上流の対照基準チャネル中に存在するインジケータのおかげで示される。共通のサンプル適用領域は、テスト流路および基準流路ならびに存在する場合は対照テスト流路および対照基準流路を接続することができる。
【００９５】
本アッセイデバイスは、サンプルを適用することができる流体サンプル容器を含むことができる。したがって、デバイスに適用される液体サンプルは、１つまたは複数の流路に連続的に供給することができる。
【００９６】
誤解を避けるために、本明細書に、「典型的な」、「好ましい」、「便利な」、「望ましい」、「有利な」等のように記載されている本発明のどんな特徴も、文脈がそうでないように述べていない限り、孤立して、またはそのように記載されている任意の１つまたは複数のその他の特徴との任意の組合せで本発明には存在し得ることをここで明白に述べておく。同様に、文脈がそうでないようにはっきりと述べていない限り、本発明の一態様に関して記載されている特徴は、本発明の他の態様に関して一般に適用可能である。
【００９７】
本発明をここで説明に役立つ例によって添付の図面を参照しながらさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】過酸化物の不動化したカタラーゼとの接触による気泡の発生を概略的に示す図である。
【図２】以下の実施例１に従って調製したアッセイデバイスについての流速対検体濃度のグラフを示す図である。
【図３】以下の実施例２のそれに従って調製したデバイスを示す図である。
【図４】実施例３に従って調製した蛇行路を両方とも有する基準チャネルおよびテストチャネルを示す図である。
【図５】実施例３に従って調製したアッセイデバイスの一部を概略的に示す図である。
【図６】実施例３に従って調製したアッセイデバイスについての流速対検体濃度のグラフを示す図である。
【図７】本発明の実施形態に従うさらなるアッセイデバイスを示す図である。
【図８】本発明のその他の可能性のある実施形態の概略の配置を示す図である。
【図９】本発明のその他の可能性のある実施形態の概略の配置を示す図である。
【図１０】本発明のその他の可能性のある実施形態の概略の配置を示す図である。
【図１１】本発明のその他の可能性のある実施形態の概略の配置を示す図である。
【図１２】コンジュゲートの相対量に対する平均停止間隔（ループの数）のグラフを示す図である。
【図１３】本発明の実施形態に従うさらなるデバイスを示す図である。
【図１４】本発明の実施形態に従うデバイスの副層を示す図である。
【図１５】本発明の実施形態に従う完成したデバイスを示す図である。
【図１６】図１５に示されており実施例６に記載されているデバイスに適用されたさまざまな濃度のｈＣＧを含有するバッファーサンプルに対する平均停止時間のグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
以下はこれまで以上に詳しく図の説明をする。
【０１００】
図１はｈＣＧの検出のために使用中のデバイスの一部を示している。ｈＣＧ結合試薬複合体標識化カタラーゼが過酸化水素試薬と接触する前に蓄積ゾーンにおいて不動化される。過酸化水素と接触した時点で、カタラーゼは酸素ガス生成に触媒作用を及ぼす。
【０１０１】
図２は、実施例１に従って調製したさまざまなアッセイデバイスについての流速対検体濃度のグラフを示している。アッセイデバイスに沿った液体サンプルの流速の顕著な変化が、液体サンプル中のｈＣＧ量が変化するにつれて見られた。
【０１０２】
図３は、マイクロ流体のテストチャネル（Ａ）および基準チャネル（Ｂ）を含む実施例２に従って調製されたデバイスを示している。このデバイスは各アッセイに対して適用ポート（３２）、チャネル（３１）およびシンク（３３）を含む。カタラーゼ標識した結合試薬は、テストアッセイのチャネルの長さに沿って供給される。過酸化水素の水溶液および可視染料をデバイスに添加するとすぐに、テストチャネル中で過酸化水素が標識化結合試薬と反応して気泡を発生した。これは、流路に沿った液体サンプルの流れの減少をもたらした。基準チャネルは、標識化カタラーゼを何ら含まず、基準チャネルに沿った液体サンプルの流れの減少は見られなかった。したがって、染料は基準チャネル中のシンク３３を殆ど完全に満たしたが、一方、染料はテストチャネル中のシンクはごく一部を満たすのみであった。
【０１０３】
図５は、気泡捕捉性突起を含む実施形態に従うアッセイデバイスの一部を示している。
【０１０４】
図７は、２つの絶え間なく続く流体がチャネルＡおよびＢからエアロックを取り込むことなく一緒にされることを可能にするマイクロ流体のゲートＸ（キッスゲート）を含む本発明に従うアッセイデバイスの実施形態を示している。
【０１０５】
図８から１０は、本発明に従うアッセイデバイスのさまざまな実施形態の概略の配置である。図８には、何らのエレクトロニクスを使うことなく、および、電気またはその他の出力の供給なしで、デジタルまたはバイナリーのアッセイ結果（「はい」または「いいえ」の答え）を生じさせることができるアッセイデバイスが描かれている。このデバイスは、確定した体積を有するチャンバーまたは容器２０を含む。チャンバー２０は、分析すべき液体のテストサンプルを導入することができる注入口２２を有する。チャンバー２０に導入された液体が、その後２つのテスト流路２４ａ、ｂに同時に入り始めるように、２つのテスト流路２４ａおよび２４ｂは、注入口２２から等距離の点においてチャンバー２０から分岐している。
【０１０６】
２つのインジケータ液流路がデバイス内に備えられており、１つはチャンバー２０から下流のインジケータ領域２６ａまでであり、１つはチャンバー２０からインジケータ領域２６ｂまでである。しかしながら、チャンバー２０内の液体が毛管現象によって下流のインジケータ領域２６ａ、ｂに進行することは、いずれも、それぞれの障害物２８ａ、ｂによって妨げられる。この例においてその障害は、それぞれのインジケータ液流路を有するＴ型接合部を形成するそれぞれのテスト流路２４ａ、ｂのボアによって形成される断絶により生み出される。
【０１０７】
図示されている例においては、同じ液体サンプルが、テスト液（テスト用毛細管２４ａ、ｂに沿って流れる）としておよびインジケータ液（最終的にはチャンバー２０からインジケータ領域２６ａまたは２６ｂの１つまで流れる）としての両方として作動する。この液体サンプルは、例えば、血液、尿またはその他の体液であり得る。テスト流路２４ａ、ｂの１つの中に、例えば対象の検体の存在下でガスを発生するガス発生試薬を堆積させることができる。このガスは、流路に沿った液体のさらなる前進を遮断する泡を形成する。これは図８において蛇行している流路２４ｂによって示されている。
【０１０８】
チャンバー２０中に留まっているサンプル液は、インジケータ液として機能する。それはチャンバーを実質的に満たすが、テスト流路２４ａ、ｂのボアによって構成される毛細管断絶によって与えられる障害物２８ａ、ｂを前進して通過することはできない。上で説明したように、テスト液は、流路２４ｂに気泡が形成されるためにそれがテスト流路２４ｂの終点に到達する前にテスト流路２４ａの終点に到達する。テスト液が流路２４ａの終点に到達すると、断絶は破壊され、それによって障害物２８ａは効果的に除去されて、インジケータ液のチャンバーから下流のインジケータ領域２６ａ（これはインジケータ領域２６ｂとは別で分離している。）中への前進が可能となる。インジケータ液がインジケータ領域２６ａ中に入ると視覚信号の形成および出現がもたらされる。これは、多数の方法で、典型的には色の変化によって、達成することができる。
【０１０９】
インジケータ領域２６ａの容積は、チャンバー２０からの実質的にすべての液体を受け入れるのに十分である。
【０１１０】
液体がインジケータ領域２６ａ中への移動を開始すると共に、チャンバー２０中の液体は、障害物２８ｂとの接触から離され断絶の大きさを効果的に増大する。
【０１１１】
したがって、テスト液が最終的にテスト流路２４ｂの終点に到達した場合／とき、それは何の効果も有さず、チャンバー２０中のインジケータ液は、下流のインジケータ領域２６ｂに依然として入ることができない。
【０１１２】
図９および１０は、この概念の変形を概略的に示しており、この場合もやはり、デジタルまたはバイナリーのアッセイ結果の読み出しを与える「レース」アッセイを提供する。
【０１１３】
図９に示されているデバイスは、両方とも毛細管チャネルを含むテスト流路４および基準流路６に流体的に接続しているサンプル適用領域２を有する。フィルター８を、流路の１つまたは両方に場合によって備えることができる。これらの流路は下流の接合領域１０において合流して共通のチャネル１２に通じる。インジケータ領域１４は、接合領域１０の下流に備えることができる。
【０１１４】
サンプル適用領域２中のサンプル適用ポートを経てデバイスに適用された液体サンプルは、それぞれテスト流路４および基準流路６に沿って接合領域１０に向けて流れることができる。１つまたは複数のベントが、デバイスからの空気が毛細管に沿った液体の前進によって置き換えられるように、共通チャネル１２およびインジケータ領域１４に備えられている。しかしながら、流体前部の１つが接合領域１０に到達した途端にそれはベントからの他の流路を遮断して、他の流路に沿った液体のさらなる前進を阻止する。よって、このデバイスは、流体前部が接合領域１０に最初に到達する流路に沿って流れる流体のインジケータ領域１４中への到着のみを許す。インジケータ領域は、観察者がそれぞれのチャネル中のどの流体が最初に到達したかを断定することを可能にするように流体チャネル中に備えることができる。例えば、さまざまな色の染料を、流体サンプルがその染料と相互作用して特定の色の液体を生成することができるように、各チャネル中に備えることができる。よって、インジケータ領域中の特定の色をした染料の存在は、どの流体が流体ゲートに最初に到達したかをユーザーが断定することを可能にする。
【０１１５】
流路４、６に沿って液体が前進する相対速度は、流路の１つにおいて、例えば、対象の検体の存在に応答してガスを発生する流路中に不動化されたガス発生手段を備えることにより、検体特有の様式で気泡の形成をもたらすことによって影響され得る。
【０１１６】
別の実施形態を図１０に示す。
【０１１７】
前の実施形態と同様に、このアッセイデバイスは、共通のサンプル適用領域２の中にサンプル適用ポートを含み、そこから、液体サンプルは、テスト流路４の一部を形成する毛細管および基準流路６の一部を形成する別の毛細管中に流れることができる。別法では、それぞれの流路は、独自の別のサンプル適用領域を備えることができる。当業者には当然のことながら、この例に記載されているアッセイデバイスは、さらなる対象の検体の存在についてテストするためのさらなるテスト流路を備えることができる。このまたはそれぞれのさらなるテスト流路は、必要に応じて、対応する基準流路を備えることができる。
【０１１８】
図２に描かれている実施形態において、各流路は、接合領域１０の上流にフィルター要素８およびインジケータ領域１４を含む。
【０１１９】
フィルター要素８は、１つまたは複数のガス発生試薬を含む。対象の検体（この例ではｈＣＧ）の存在下で、試薬は流路４を閉鎖する泡を形成するガスを発生する。
【０１２０】
それぞれの流路には、液体サンプルと接触して集められて共に移動する着色染料を備えることもできる。
【０１２１】
それぞれの流路のインジケータ領域１４は、テスト流路４中に単語の「ＮＯＴ」を、および基準流路中に単語の「ＰＲＥＧＮＡＮＴ」を形成する毛細管チャネルを含む。これらの毛細管は透明な合成プラスチック材料から形成され、低いコントラストの背景（例えば、白または透明な合成プラスチック材料）に接している。したがって、アッセイの実行前に、毛細管は非常に目立つことはない。
【０１２２】
しかしながら、アッセイが一旦開始されると、インジケータ領域の上流の流路中にある染料は、前進する液体サンプルによって集められる。サンプルがｈＣＧを含んでいない場合、液体は両方の流路に沿って自由に流れる。染料を含有する液体は、よって両方の毛細管を満たして「ＮＯＴ  ＰＲＥＧＮＡＮＴ」のアッセイ結果を示す。ベントを基準流路に沿ったいくつかのポイントに提供してそれに沿った液体の流れを促進することができる。特にこれらのベントは、液体が基準流路のインジケータ領域を満たすことを助けるために提供することができる。好ましくは、かかるベントはテスト流路中には存在せずに、空気はテスト流路の毛細管４から、接合領域１０の下流の共通チャネル１２中の１つまたは複数のベントによってのみ放出され、基準流路６に沿って流れる液体はテスト流路４に沿って流れる液体の先端より前に接合領域１０に到達する場合には、空気をもはやテスト流路の毛細管からは移動させることができず、そのチャネルに沿った液体のさらなる前進は妨げられる。
【０１２３】
テスト流路および基準流路に沿った液体の流速、および／またはそれぞれの流路の長さは、ｈＣＧが存在しない場合、液体が流路４、６の両方に沿って流れ、それぞれのインジケータ領域を満たすように調節される。一般的に、サンプル中にｈＣＧが存在しない場合、基準流路に沿って流れる液体は、テスト流路に沿って流れる液体と同時に、またはそれよりほんの１秒か２秒早く接合領域１０に到達する。
【０１２４】
しかしながら、適用されたサンプルがｈＣＧを含む場合は、テスト流路の毛細管に沿った液体のインジケータ領域に向けた前進を実質的に妨害するガスの発生および泡の形成がテスト流路４において起こる。これにより基準流路に沿った液流が接合領域まで容易に「レースに勝つ」ことが可能となる。基準流路に沿った液流は、テスト流路４に沿った液流がインジケータ領域に到達する前に接合領域１０に到達する。この場合は、単語「ＮＯＴ」は染料で満たされることはなくぼやけたままであり、一方単語「ＰＲＥＧＮＡＮＴ」は非常に目立つようになり、このようにしてアッセイ結果を示す。
【０１２５】
図１３は、それぞれ基準流路およびテスト流路に接続しているサンプル適用領域２および３を有する基準流路４およびテスト流路５を含むデバイス１を示している。泡捕捉領域６ならびにテスト用インジケータ領域８および基準インジケータ領域７もまた示されている。接合領域は１０に指し示されており、蓄積ゾーンは９に示されている。図１３のデバイスを使用して行われたアッセイは、実施例５に記載されている。この図に示されている基準チャネルは、その遠位末端に蛇行形状を有する大部分が直線状であり、一方テストチャネルは殆どが蛇行した形状をしている。この場合はデバイスをよりコンパクトにするために両方のチャネルが入り組んだ形状を採用した。
【０１２６】
図１４および１５は、それぞれ、サブ積層構造のデバイスＡ、ＢおよびＣならびに完成したデバイス３０を示している。デバイス３０は、同じ形状および寸法の２つのテストチャネル３２を含み、それぞれ、エッチング加工した泡トラップ３１およびサンプル適用ゾーン３４を含む。
（実施例）
【実施例１】
【０１２７】
ニトロセルロース多孔質担体を含むｈＣＧに対する流量制限イムノアッセイ
アッセイデバイスを次のようにして用意した。
試薬の準備：
抗−αｈＣＧおよびカタラーゼの青色ポリスチレンラテックス粒子への共不動化。
【０１２８】
材料
・Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの青色ポリスチレンラテックス粒子、直径４００ｎｍ、固形分１０％（ｗ／ｖ）、ロットＣＢ１８６０
・ＢＤＨ  Ａｎａｌａｒの９５％エタノール＋０．５％酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）
・脱イオン水中２００ｍｇ／ｍｌとして調製したＩｎｔｅｒｇｅｎのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）Ｃｏｈｎ  ５ＹＴ  １９２０２
・抗−αｈＣＧ体内クローン３２９９、ロットＰＬ１２５７、ＰＢＳＡ中３．４ｍｇ／ｍｌ
・Ｓｉｇｍａのヒト赤血球からのカタラーゼ、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス中で供給された５２２００単位／ｍｇタンパク質における９０％純度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｃ３５５６、ロット１１６Ｋ１４６３
・１０ｍＭのホウ酸塩バッファー、ｐＨ８．５
方法
１．ラテックス粒子を１０ｍＭホウ酸塩バッファー中０．５％固形分（ｗ／ｖ）に希釈する（１．７ｍｌのエッペンドルフチューブ中に１ｍｌの希釈したラテックスを用意する）。
２．そのエッペンドルフチューブをＨｅｒａｅｕｓ  Ｂｉｏｆｕｇｅ  １７ＲＳ遠心分離機により１５℃で５分間１７，５００ｒｐｍ（２５，８４８ｒｃｆ）で遠心分離する。
３．上澄み液を除去し、ペレットを１ｍｌの１０ｍＭホウ酸塩バッファー中に再懸濁させる。
４．１００μｇのカタラーゼを新たな１．７ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、１００μｇの抗−ｈＣＧを加える。
５．ステップ３からの洗浄したラテックスを、ステップ４のエッペンドルフチューブに加え、マイクロピペットに入れたり出したりを繰り返すことによって（入れて出すサイクルをほぼ６回）よく混合する。
６．直ちに２００μｌのエタノール−アセテートを加えて約５秒間ミキサーによりよく混合する。
７．エッペンドルフチューブを回転ミキサー（約６０ｒｐｍ）上に周囲温度で６０分間置く。
８．５０μｌの２００ｍｇ／ｍｌＢＳＡを加え、回転ミキサー（約６０ｒｐｍ）上の混合を３０分間続ける。
９．ステップ２を繰り返し、上澄み液を廃棄する。ペレットを１ｍｌの１０ｍＭホウ酸塩バッファー中に再懸濁させる。５０μｌの２００ｍｇ／ｍｌＢＳＡを加え、よく混合する。
１０．ステップ２を繰り返し、上澄み液を廃棄する。ペレットを１ｍｌの１０ｍＭホウ酸塩バッファー中に再懸濁させる。５０μｌの２００ｍｇ／ｍｌＢＳＡを加え、よく混合する。
１１．ステップ２を繰り返し、上澄み液を廃棄する。ペレットを１ｍｌの１０ｍＭホウ酸塩バッファー中に再懸濁させる。５０μｌの２００ｍｇ／ｍｌＢＳＡを加え、よく混合し、４℃で一晩保存する。
１２．ステップ２を繰り返し、上澄み液を廃棄する。ペレットを１ｍｌの１０ｍＭホウ酸塩バッファー中に再懸濁させる。５０μｌの２００ｍｇ／ｍｌＢＳＡを加え、よく混合する。
【０１２９】
抗−βｈＣＧの不動化したゾーンを有するニトロセルロース膜の準備
材料
マイラー支持材上の８μｍのニトロセルロース膜
３ｍｇ／ｍｌの単クローンの抗−βｈＣＧ体内クローン３４６８
Ｓｉｇｍａの脱イオン水（ブロッキングバッファー）中の１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）１０，０００の分子量＋３％（ｗ／ｖ）スクロース（Ｓｉｇｍａ  Ｓ８５０１）
方法
１．３ｍｇ／ｍｌの抗−βｈＣＧを計量ポンプおよびシリンジを用いて、幅約１ｍｍおよび長さ約３００ｍｍのニトロセルロース膜に堆積させてゾーンを生じさせる（約０．１μｌ／ｍｍで堆積）。
２．このニトロセルロース膜を暖気の下５０℃で約１０分間乾燥させる。膜の一端にブロッキングバッファーを塗布し、そのままそれがテストラインの長さ方向に沿ってそれが膜を満たすまで流れて膜を濡らすようにする。
３．このニトロセルロース膜を暖気の下７５℃で約１０分間乾燥させる。
４．この膜を、幅が約６ｍｍと長さが４０ｍｍのストリップであって、その幅（６ｍｍ）を横切る抗−βｈＣＧのテストゾーンを有し、テストラインがそのストリップのベースから約１０ｍｍであるストリップに切断する。
【０１３０】
ｈＣＧに対する流量制限イムノアッセイを実施するプロトコール
１．実験台のベースに接しているテストストリップの近接端部を有する垂直な支持材上にニトロセルロース膜のストリップを配列する（テストラインはベースに対して約１０ｍｍの位置にある）。シンクとしてのゲル吸取紙をテストストリップの遠位末端に貼り付ける。
２．１０μｌの抗−αｈＣＧ中のコートしたラテックス＋５０μｌの０ｍＩＵ／ｍｌのｈＣＧを含有するバッファー処理した標準（ＰＢＳＡ）の混合物を準備する。この混合物をテストストリップのベースに塗布し、それをそのままベースが乾燥するまでクロマトグラフにかける。５０μｌのホウ酸塩バッファーをストリップのベースに塗布し、それをそのままベースが乾燥するまでクロマトグラフにかける。
３．テストストリップを周囲温度で約３時間乾燥させる。
４．ニトロセルロース膜の表面に、そのストリップの幅全体をそれが覆うように、その膜の近接端部から約２ｍｍのところから遠位末端まで達する接着ラミネート膜（ＡＲＣａｒｅ  ７７５９  ｃｏ  ＃Ｄ９０１２）を貼付する。
５．テストストリップを２つの顕微鏡スライドの間にはさみ、これらをワニ口クリップと共に保持する。テストストリップを実験台と接している近接端部と垂直に立てる。
６．５０μｌの５％Ｈ２Ｏ２（ｖ／ｖ）（３０％Ｈ２Ｏ２Ｓｉｇｍａ  Ｈ−１００９ロット０２１Ｋ３２５０のストックから脱イオン水＋５ｍｇ／ｍｌＢＳＡを用いて希釈）を、テストストリップのベースに適用し、そのままクロマトグラフにかける。溶媒前部の動きを観察し、その溶媒前部がＨ２Ｏ２を適用した段階から３２ｍｍの間隔を移動するのに要する時間を記録する。
７．０ｍＩＵ／ｍｌｈＣＧによるテストストリップの３つのさらなる反復データを生じさせるために上記のことを繰り返す。
８．それぞれ１０、２５および５０ｍＩＵ／ｍｌｈＣＧのバッファー処理した標準により行った４つのテストストリップを生じさせるために上記のことを繰り返す。
【０１３１】
サンプル中に存在するｈＣＧ検体の量対液体サンプル溶媒前部が多孔質母材に沿って移動するのに要する時間についてプロットした。
【０１３２】
そのグラフを図１に示す。図１から、液体サンプル中のｈＣＧ検体の存在は、液体サンプルの流速の低下をもたらすことを見ることができる。
【実施例２】
【０１３３】
検体依存様式で流れを停止する酸素の泡を用いる毛細管アッセイ
毛細管の構成：
ベース：ポリスチレン顕微鏡スライド
中央：約１０μｍの両面白色ＰＳＡテープ（Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＡＲＣａｒｅ  ７８４０）
トップ：１７５μｍポリエステルフィルム（帯電防止処理済み）
２×１ｍｍの毛細管を顕微鏡スライドの長さに沿った白色ＰＳＡテープに中に作った。（下記参照）
ボリューム収集チャンバー：
ベースおよびトップ： １７５μｍポリエステルフィルム（帯電防止処理済み）
中央：約１０μｍの両面白色ＰＳＡテープ（Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＡＲＣａｒｅ  ７８４０）
プロトコールの最後のステップのために毛細管スライドに付けることができる各末端において１ｍｍまで細くなる６ｍｍのチャンバー。（下記参照）
アッセイ型式：
両方のチャネルに対するプロトコール
１．チャネルの長さに沿って１５μｌの３４６８を２．０３ｍｇ／ｍｌバッチＰＬ１３２２で適用し、１０分間そのまま置く。
２．２０μｌのＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌのベータカゼインを適用する。１０分間そのまま置く。
３．さらに５ｍｇ／ｍｌベータカゼインを適用する、１０×５μｌ／チャネル。
４．５ｍｇ／ｍｌベータカゼイン中で作製した５×５μｌの５ＫｍＩＵ／ｍｌのｈＣＧスタンダードまたは０スタンダードをロードする。５分間そのまま置く。
５．３と同じ。
６．５×５μｌの０．０５％（ＢＲ１０１００７）３２９９−カタラーゼラテックス粒子（４００ｎｍ）をロードする。２０分間そのまま置く。
７．洗浄、２０×５μｌＰＢＳ、次いで２×５μｌの赤色染料／チャネル。
８．収集チャンバーを取り付け、ビデオを開始する。
９．５μｌのＰＢＳ中１％の過酸化水素を１／６青色染料と共に加える。１０分間そのまま置き、次に続いて過酸化水素の５μｌのロットを加える。
【実施例３】
【０１３４】
検体依存様式において酸素の泡を用いて流れを停止させる毛細管アッセイ
第１結合試薬−検体−標識化結合試薬複合体を反応ゾーンにおいて磁石を用いて不動化または捕捉するマイクロ流体タイプの毛細管アッセイを構成した。この例によれば、第１結合試薬は、磁性粒子によって標識された。
【０１３５】
毛細管の構成：
ベースおよびトップ：１７５μｍポリエステルフィルム（帯電防止処理済み）ＨｉＦｉ  ＰＭＸ  ７１５
中央：約１０μｍの両面白色ＰＳＡテープ（Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＡＲＣａｒｅ  ７８４０）
２×１ｍｍの毛細管を、蛇行型をしたデバイスの長さに沿った白色ＰＳＡテープに中に作製した。サンプル適用部分の末端に大きな輪を切り抜き、パターンの前のまっすぐなチャネル中は一連の「鮫」の歯である。その歯のすぐ前のデバイスの下部にはステープルと磁石を、１μｍの磁性ビーズの捕捉を可能にする磁場に焦点を合わせるやり方で配置した。
【０１３６】
プロトコール
１．テスト用と対照用サンプルを準備：
試薬：ｈＣＧスタンダード、アジドを含まず。１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ＋０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００  ３４６８磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ−ＭｙＯｎｅのトシル活性化物）
３２９９−カタラーゼコンジュゲート（グルタルアルデヒドＤＴ  Ｃｌ  ２９／１１／０７）
対照：５μｌの磁性ビーズ、５μｌのＣｌコンジュゲートおよび１０μｌの０ｈＣＧ
テスト：５μｌの磁性ビーズ、５μｌのＣｌコンジュゲートおよび１０μｌの５００ｍＩＵ／ｍｌのｈＣＧ
２．２μｌの染料溶液を加える。（１／４青色食用染料）
３．ＴまたはＣチャネルに２μｌの粒子／コンジュゲート／ｈＣＧ混合物を加える。
４．各チャネルに６０μｌの１％過酸化水素を加える。
５．毛細管に沿った染料前面を観察する（ビデオ）。
【０１３７】
多数の上記デバイスを準備し、多様な濃度のｈＣＧ検体を含む多数の液体サンプルについてテストをし、この液流前部がチャネルに沿って流れたｍｍの距離（停止距離）を測定した。停止距離対ｈＣＧ濃度のグラフを図６に示す。
【０１３８】
図７に示されているアッセイデバイスは、容器Ａ中の第１の流体および容器Ｂ中の第２の流体がそれらのそれぞれのチャネルに沿って流れ、接合点またはゲート（Ｘ）で交わることができるように使用することができる。さらに、この構造は、第１の容器（Ａ）からの液体が、流路に沿って流れて、不動化ゾーン（Ｙ）に、第２の容器（Ｂ）からの液体がその不動化ゾーンに到着する前に到着するようになっている。容器Ｂ（またはそれから下流の流路）は、第２試薬を含むことができ、容器Ａ（またはそれから下流の流路）は、標識化第１試薬を含むことができる。基準チャネルＣを備えることもできる。
【０１３９】
図７は、２つの流体の流れが、エアロックを取り込まないで一緒にされることを可能にするマイクロ流体のゲート（キッスゲート）を組み立てるために使用される３つの層を概略的に示している。
ベースおよびトップ（７１＆７３）：１７５μｍポリエステルフィルム（帯電防止処理済み）ＨｉＦｉ  ＰＭＸ  ７１５
中央（７２）：約１００μｍの両面白色ＰＳＡテープ（Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＡＲＣａｒｅ  ７８４０）
ベース層（７１）は、２つの液体の流れが出合う位置におけるポリエステルフィルムの親水性の側面上に、その中に刻まれた溝を有する。中央層（７２）は、約１ｍｍの幅であり、２つのフィードＡおよびＢを有するテストチャネルならびに基準チャネルＣを含むチャネルを構成するために使用される。トップ層（７３）は、ＰＳＡ中央層上に疎水性表面の側が下向きに接着されており、サンプルが同時に流体チャネルＡ、ＢおよびＣに適用されることを可能にするそれに切り込まれた穴を有する。トップ層７３は、チャネルＡの末端におけるベントとして作用する開口部を有することもできる。
【０１４０】
イムノアッセイ試薬は、容器Ａ中で乾燥され、過酸化水素発生試薬（例えば過酸化尿素）は、容器Ｂ中で乾燥される。
【０１４１】
サンプルが３つの容器すべてに同時に適用されるとき、流れは３つの流路において起こる。
【０１４２】
イムノアッセイ試薬（例えばｈＣＧについてのアッセイにおける例えば抗体を塗布した磁性ビーズおよびカタラーゼ−抗体コンジュゲート）は、サンプルによって再水和され、チャネルＡを下方に通りすぎる。チャネルＢとの交差点に到着すると、親水性ベース中の切り込み線がチャネルＢ中への液体の横断を防ぎ、そのため流れは流れ続けてそのチャネルの末端に至る。検体の存在下では形成された免疫複合体は、キッスゲートの下流のチャネルの鋸歯状部分（テストまたは捕捉ゾーンＹ）において捕捉される。
【０１４３】
過酸化水素を発生する試薬は、チャンバーＢ中で再水和され、より長いチャネルＢを通過してチャネルＡとの交差点（キッスゲート）まで下る。チャネルＢ中の流体がキッスゲートに到着したとき、チャネルＡ中の流体の存在は、今や発生した過酸化水素がチャネルＡ中に移ることを可能にする。容器ＡおよびＢに供給されるサンプル量は、容器Ａが、容器Ｂ中の流体がキッスゲートに到着する時間までに空になるようになっており、これにより、流れは１００％Ａの流れから１００％Ｂの流れに切り替わる。過酸化水素がＹにおいて免疫複合体を横切るときに、酸素が発生して流れを減速または停止する泡を形成する。
【０１４４】
均一な乾燥および再水和の際の試薬の徐放を助けるために構造物を容器中に導入することができる。これらの構造物の形状、高さ、表面特性および密度は乾燥および再水和プロセスに影響を及ぼす。容器のチャネルへの入り口の直前への柱（全体高さ約１ｍｍ、直径の周りが１００μｍのＰＳＡテープ）の付加は、再水和した複合体を、流れがチャネルの壁によって影響される側面にではなくチャネルの中心に注ぎ込むために使用することができる。これによって試薬の容器からのより完全でより速い排出が可能となる。
【実施例４】
【０１４５】
乾燥したコンジュゲート試薬
吸着した抗−βｈＣＧ（クローン３４６８）−３４６８磁性ビーズによる１ミクロンの直径の磁性ラテックス、抗−αｈＣＧ（クローン３２９９）と結ばれているヒト赤血球カタラーゼでできているコンジュゲート、およびさらにＢＳＡ、スクロース、リン酸緩衝生理食塩水を含んで成り、ｐＨ７．４で０．０５％のＰｒｏＣｌｉｎ３００を含むこれを、表１に合わせて混合した。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
４マイクロリットルの試薬を、空気中で乾燥したテストデバイスの蓋の適切な領域上で乾燥し、次いで、分子篩を詰めたデシケーター中に入れたままにして一晩乾燥した。デバイスを組み立て、最初に試薬を、ＰＢＳ中の３μＬのｈＣＧ溶液、０．１％のオボアルブミン、０．１％のアジ化ナトリウムによりｐＨ７．４で６０秒間再水和させ、次にこれを磁気捕捉ゾーンに追い払い、次にＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中の過酸化水素の１０μＬ、０．０５％ＰＣ３００を過酸化物試薬ゾーンに加え、捕捉した粒子の層と６０秒間接触させたままにした後、３５μＬの同じ過酸化物溶液の２番目の添加により過酸化物試薬ゾーンへの流れを引き起こした。蛇行流路に沿った液体メニスカスによって移動した距離を測定し、いくつかの反復測定の平均を図１２に描いた。図１１は、この実施例で採用したものと似たアッセイデバイスの概略図である。
【０１４８】
図１２において、８ループ以上にあるデータは、メニスカスがデバイスの末端まで及んだことを示している（１ループ＝２０ｍｍの長さ）。明らかに、磁性材料の堆積層を形成している結集された試薬は、ｈＣＧの存在下でカタラーゼを捕捉し、流体の流れを停止させることができる。
【０１４９】
過酸化水素試薬
１３１ｍｇの過酸化尿素粉末（Ｆｌｕｋａ製品９５３１４、ロット１３２６０５３の錠剤を粉砕することによって製造）および０．７５ｍｌのＰＢＳに溶解した４７ｍｇのスクロースの溶液、０．０５％のＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．４を、２ＭのＮａＯＨによりｐＨ６．９にした。２つの４μＬの量をデバイスのベースの上の領域Ｂにおいて乾燥し、室温（約２２℃）の空気の流れの中で乾燥し、次に分子篩乾燥剤を含むデシケーター中に収納した。領域Ｂにおけるベースは、試薬がピペットでその上に置かれたときそれがその試薬を取り込んでそれをその場所に限定することを可能にするために傷を付けた。
【０１５０】
テストのため：
１．８μＬの抗−βｈＣＧが結合している１ｍｍ直径の磁性ラテックスビーズ（１０ｍｇ／ｍｌの５０ｍＬ）、７５ｍＬのカタラーゼが結合している０．００５４ｍｇ／ｍｌの１ｍｍ直径の磁性ビーズ、および７５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、（０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．４）を領域Ａに加えて、いくらかのカタラーゼ粒子および抗−βｈＣＧ粒子を、Ｃにおいてラインを形成する捕捉磁気ステープルに供給する。メニスカスの位置に印を付ける。
２．７ｍＬのＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ｐＨ７．４（バッファーＡ）を、領域Ｂにおいて乾燥した過酸化尿素試薬に加え、６０秒そのままにして水和させる。メニスカスはキッスゲートの手前で停止する。
３．３０ｍＬのバッファーＡを、領域Ｂに加えて溶解した過酸化尿素を磁性ビーズベッドの中を追跡する。マニスカスが移動を停止する位置に印を付ける。
【０１５１】
結果：
泡は、流れを停止させた磁性ビーズベッド中およびその近くで発生し、過酸化物がそのベッドに供給されていたことを示した。停止距離は、１、１．３、０．８、１．３、１．７、０．６ループ（１ループ＝２０ｍｍの長さの曲がりくねった毛細管）
さらなる作業により乾燥した試薬中のスクロースの％、乾燥した試薬の体積およびベース上の模様付けの深さへのある程度の依存度が存在することが示された。この初期の作業から、乾燥した配合物中に２６％のスクロースを含む上で詳細に記した処方が、テストした３つ（それらのサンプルは、乾燥した配合物中にそれぞれ、０、２６％および４２％のスクロースを含んだ。）の中のベストであった。
【実施例５】
【０１５２】
図１３に従うデバイスを以下のようにして準備した。
【０１５３】
寸法が２５ｍｍの幅×９０ｍｍの長さ×１７５μｍの高さの２つの未処理ポリエステル層および１つの２５ｍｍの幅×９０ｍｍの長さ×１００μｍの高さのものを準備し（ＨｉＦｉ  ＰＭＸ  ７３９）、それぞれ診断用デバイスのベース、蓋およびガスケットを形成した。
【０１５４】
蓋の裏面を帯電防止親水性コーティング（ＨｉＦｉ  ＰＭＸ  ７１５）により処理し、図１３に示されているマイクロ流体のデザインを、Ｇｒａｐｈｔｅｃプロッターを用いてガスケットから切り取った。糊をガスケットの上面と下面に塗布し、３つの層を一緒に積層した。得られたデバイスは、親水性屋根と未処理の壁および床を有するマイクロ流体チャネルを有した。
【０１５５】
チャネルの高さは１００μｍ、幅は１ｍｍであった。基準チャネルのサンプル適用ゾーン２からインジケータ領域７までの長さはほぼ１２ｍｍであり、テストチャネルのサンプル適用ゾーン３からインジケータ領域８までの長さはほぼ１１．５ｍｍであった。泡トラップ６は、寸法が１ｍｍ幅×５ｍｍ長さのガラス繊維（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇ０２８）を含んだ。蓄積ゾーン９は、泡トラップの１ｍｍ上流に位置した。インジケータゾーンは、それぞれ、Ｂｒｉｌｌｉｎａｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ色インジケータを含有する４ｍｍ２のＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１濾紙を含んだ。
【０１５６】
１μｍの磁性粒子に付着させたｈＣＧ（インハウスクローン３４６８）に対する抗体、ｈＣＧ（１０，０００ｍＩＵ／ｍｌ）、およびカタラーゼで標識したｈＣＧ（インハウスクローン３２９９）に対する第２の抗体の２μｌのインキュベートした混合物を、サンプル適用ゾーン３に加えた。磁性粒子を取り出し、磁石により蓄積ゾーン９に保持した。６μｌのＰＢＳバッファーを、その後標識した複合体を洗浄するためにサンプル適用ゾーン３に加えた。１０μｌのＰＢＳ中０．５％の過酸化物および１０μｌのＰＢＳをサンプル適用ゾーン３と２それぞれに同時に加えた。蓄積ゾーンにおいて過酸化物がカタラーゼと反応して泡を発生し、それは泡トラップ６において捕捉され、テストチャネル中の流れを停止させた。基準チャネル中では流れが継続し、それはインジケータ領域７における色の変化によって示された。インジケータ領域８においては色の変化は見られなかった。過酸化物のサンプル適用ゾーン３への適用後、流れはテストチャネル中で３４秒と４０秒の間で捕捉された。
【実施例６】
【０１５７】
デバイスを図１４および１５に示されているデバイスに従って準備した。デバイスの外形寸法および積層材Ａ、ＢおよびＣの高さ、幅、長さおよび材料は実施例５によるデバイスと同じである。
【０１５８】
積層材Ｃの上面の３ｍｍ×２ｍｍの部分を、泡トラップを備えるために、Ｇｒａｐｈｔｅｃプロッターにより、０．２ｍｍの距離間隔を有する多数の食刻ラインを含む細かく刻まれたデザインにエッチングした。仕上がったデバイス中の得られた泡トラップは、１ｍｍ幅×２ｍｍ長さである。
【０１５９】
図１５中の３６におけるチャネルを、泡の収集を助け、それらの流れの制限を高めるために泡トラップの上流の小さい領域におけるその幅を制限した。
【０１６０】
このアッセイのプロトコールは次の通りであった：
・ビオチニル化抗−βｈＣＧ中でコートしたＡｄｅｍｔｅｃｈ製の磁性粒子（ストレプトアビジン中でプレコート）
・アッセイ用バッファーＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
・アッセイ用バッファー中のバッファー用ｈＣＧスタンダード
・エアブラシ用バッファー（１００ｍＭのトリス＋１０％ＢＳＡおよび２０％スクロース、ｐＨ９）
・グルタルアルデヒド接合Ｃｌ２によってカタラーゼに連結された抗−α−ｈＣＧ：アッセイ用バッファー中で１：４に希釈
・Ｓｉｇｍａ過酸化物原液３０％（ｗ／ｖ）
１．１％固形分のエアブラシ用バッファー中の磁性ビーズを準備する。
２．５μｌのエアブラシ用バッファー中の磁性ビーズを、５μｌの０ｈＣＧを含むバッファースタンダードと混合する。２．５μｌの希釈したコンジュゲートＣｌ２を加え、その混合物を室温で９０秒間インキュベートする。
３．チャネルの収縮した領域の約１ｍｍ上流に位置する磁気トラップにより積層したデバイスを配置する。
４．２μｌの上記混合物をチャネルに適用し、これを流す。磁性ビーズがトラップ領域に集まるのが見られた。
５．６μｌのアッセイ用バッファーをデバイスに適用し、これを流す。流れが停止したら、溶媒の前部が到達した点に印を付ける。
６．４０μｌの０．５％（ｖ／ｖ）の過酸化物（アッセイ用バッファー中で調製）をデバイスに加え、流れが停止するまでにかかる時間を観察する。
７．新しい試薬および新しい積層したデバイスを用いて上記のことを繰り返す。
８．ｈＣＧの各濃度に対して２つの複製が生じるように、２０，０００または２，５００または３１２または１５６ｍＩＵ／ｍｌのｈＣＧを含有するｈＣＧスタンダードを用いて上記のことを繰り返す。
【０１６１】
結果
０ｈＣＧで通されたデバイス中の流れは、捕捉されず、その液体はテストチャネルの末端まで移動するのが見られた。テストしたさまざまな濃度のｈＣＧで通したデバイス中の流れは、０ｈＣＧで通したデバイスとの差異を見出すことができた（±２の標準偏差に基づく）。
【０１６２】
ｈＣＧを含有する多数のバッファーサンプルについての秒数で表した平均停止時間を図１６に示す。このグラフ中に記されているｈＣＧの濃度は、上記のステップ２において引き起こされた希釈の際に生じた実際のｈＣＧレベルである。この図から分かるように、ｈＣＧのレベルの増大は平均の停止時間の減少をもたらした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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