(57)【要約】  本発明は、細胞マイクロキャリア（「細胞ラップ」）のアセンブリを供給するプロセスに関し、当該プロセスは、外部の刺激が付与されると、平面状態から丸められた状態へ変化する材料を有する２つの側面を持つ平面的２次元の対象物（「フレーク」）を供給するステップと、前記フレークの一方の側面（「細胞坦持側面」）上に細胞を供給するステップと、前記外部の刺激の付与により前記平面状態から丸められた状態へ前記フレークを変化させるステップと、少なくとも一つのタイプの結合剤を前記フレークへ結合するステップとを有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞マイクロキャリア（「細胞ラップ」）のアセンブリを供給するプロセスであって、
外部の刺激が付与されると、平面状態から丸められた状態へ変化する材料を有する２つの側面を持つ平面的２次元の対象物（「フレーク」）を供給するステップａ）と、
前記フレークの一方の側面（「細胞坦持側面」）上に細胞を供給するステップｂ）と、
前記外部の刺激の付与により前記平面状態から丸められた状態（「細胞ラップ」）へ前記フレークを変化させるステップｃ）と、
前記ステップａ）−ステップｃ）の何れかの前又は後で、少なくとも一つのタイプの結合剤を前記フレークへ結合するステップｄ）と
を有する、プロセス。
【請求項２】
前記結合剤は、前記細胞坦持側面とは反対側の前記フレークの側面に結合されることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
達成された少なくとも一つの細胞ラップを、前記結合剤の少なくとも一つにより少なくとも一つの他の構成要素に結合する追加のステップｅ）
を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記結合剤は、タンパク質及びポリペプチド、核酸、分子タグ、リガンド及び／若しくは荷電群からなるグループから選択され、並びに／又は前記結合剤は、フレーク又はフレークの小区分へ、疎水性及び／又は親水性の特性を付与するように選択されることを特徴とする、請求項１乃至３の何れか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記結合剤が共有結合を構築できることを特徴とする、請求項１乃至４の何れか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
少なくとも２つの異なるタイプの結合剤が、パターン化された形式で前記フレークに加えられることを特徴とする、請求項１乃至５の何れか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記ステップｂ）は、
前記フレーク上に細胞を播くステップｂ１）、及び
前記細胞を成長させるステップｂ２）
のサブステップを有することを特徴とする、請求項１乃至６の何れか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記刺激は、
・ｐＨの誘導変化、
・温度の誘導変化、
・電磁波への誘導付与、
・イオン、特定の塩若しくは有機化合物、又はこれらの所与の濃縮への誘導付与、
・電場の付与、
・磁場の付与、
・音波の付与、
・振動の付与、
・酵素及び他の生体分子への誘導付与又は誘導抑制、
・基板からの誘導開放、及び／又は
・溶媒組成への誘導付与
から成るグループから選択されることを特徴とする、請求項１乃至７の何れか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記フレークはヒドロゲルから成る材料を有し、並びに／又は前記フレークは２層構造、３層構造、マルチレイヤ構造及び／若しくは傾斜構造を有することを特徴とする、請求項１乃至８の何れか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
成長した細胞を坦持する種々異なるフレークが、平面状態から丸められた状態へ前記フレークを変化させる前に重ねられることを特徴とする、請求項１乃至９の何れか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記細胞ラップ及び／又は作られた細胞マイクロキャリアのアセンブリが、
ｉ）体外組織−及び／若しくは器官−エンジニアリング環境、並びに／又は
ｉｉ）人間若しくは動物の損傷した組織及び／又は器官
に送られることを特徴とする、請求項１乃至１０の何れか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
ａ１）フレークの形状を規定する井戸を作るグリッドを有するモールドを供給するステップと、
ａ２）外部刺激を付与すると、平面状態から丸められた状態へ変化する先駆体材料を前記モールドへ成型するステップと、
ａ３）フレークを得るために成型された材料を硬化するステップと、
ｇ）オプションとして、前記外部刺激の付与により前記平面状態から前記丸めた状態（「細胞ラップ」）へ変化させるステップと、
ｈ）前記ステップａ）乃至ｃ）の前又は後に、少なくとも一つのタイプの結合剤を前記フレークと結合させるステップと
を有する、請求項１乃至１１の何れか一項に記載のプロセスにより２次元の対象物（「フレーク」）及び／又は細胞ラップを製造するプロセス。
【請求項１３】
請求項１乃至１１の何れか一項に記載のプロセスが使用された又は請求項１２に記載のプロセスにより作られた２次元の対象物（「フレーク」）及び／又は細胞マイクロキャリア（「細胞ラップ」）。
【請求項１４】
請求項１乃至１１の何れか一項に記載のプロセスで作られた細胞マイクロキャリア（「細胞ラップ」）のアセンブリ。
【請求項１５】
請求項１２に記載のプロセスで作成された細胞マイクロキャリアを有するか、又は細胞を坦持する２次元の対象物から成り、外部の刺激の付与により丸められた状態へ変化する細胞マイクロキャリア（「細胞ラップ」）のアセンブリであって、少なくとも２つの細胞マイクロキャリアが少なくとも一つの結合剤により互いに結合されている、アセンブリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞マイクロキャリアのアセンブリを供給するためのプロセスに関する。上述のプロセスは、培養細胞の処理、細胞ハンドリング、組織エンジニアリング及び／又は器官エンジニアリングにおける細胞送出及び／又は細胞ターゲット、並びに細胞療法アプリケーションに関係がある。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、医学の分野内の新規な来るべき分野である。再生医療に使用される多数の方法及びアプローチがある。
【０００３】
生体外の再生医療において、組織は、足場材（ｓｃａｆｆｏｌｄ）及び細胞を利用して身体の外側で成長する。その後、加工された組織は、傷害を受けた又は失われた組織を置き換えるために、患者に移植される。
【０００４】
生体内の組織エンジニアリングにおいて、足場材は、傷害を受けた組織を復元するために周囲の健康な組織から細胞の成長を誘発する目的で、傷害を受けた組織領域に置かれる。
【０００５】
細胞治療法は、組織機能を復元するため、傷害を受けた組織領域に、細胞、特に幹細胞の送出に基づいている。
【０００６】
傷害を受けた組織領域に内在性細胞を補充するために、成長因子、例えばサイトカイン及び炎症性細胞遊走因子を利用する治療法がある。成長因子は、対象領域に、例えば注入を介して直接送出できる。
【０００７】
細胞が最初に適当な細胞源から、すなわち患者（「自己由来」）から、又はドナー（同種間の）から収穫され、細胞が傷害を受けた組織を置き換えるか又は復元するために患者に再び最終的に導入されるまで、その後幾つかの異なるステップに従属する生体外再生医療及び細胞治療法において、細胞は、重要な役割を果たす。細胞治療法及び再生医療における最近数年の相当な進展にもかかわらず、基本的且つ重要なステップ、例えば細胞の取扱い、足場材内の細胞の成長、細胞分化、細胞送出及び細胞坦持は、依然課題があり、再生医療が臨床的に関連する前に、更なる改良を必要とする。
【０００８】
欧州特許出願ＥＰ０７１０１１０４では、細胞の取扱い及び細胞送出の課題は、ヒドロゲルを有する多層フレーク（薄片）に細胞を包む（ラップする）ことに焦点があてられている。最初に、細胞が最適成長のための培養環境にさらされる平面フレーク上で細胞が成長する一方、細胞の取り扱い及び細胞送出において、平面フレークが丸くなった（丸められた）状態（ここでは、「マイクロキャリア」又は「細胞ラップ」と呼ばれる）に変形された。
【０００９】
上述のフレークは、細胞を包み、細胞を環境から保護するための効率的な方法を提供する。細胞成長の間、フレークは表面に取付けられる。フレークは、内部応力を備える単一の層、二重層又は複数の層である。丸められた状態に変形されるとき、フレークは細胞を包み、よって、本発明の主題でもある細胞ラップを作る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上述のアプローチは、適当なターゲット組織への細胞ラップのターゲッティング又は特別な送出のための解決案を提供しない。身体内の間違った場所に送出された細胞は、望ましくない場所でこれらの細胞の制御されない成長を導くので、このことは重要である。
【００１１】
その上、細胞ラップのターゲット組織への接着と、類似の及び異なる細胞ラップ間の接着とが重大な課題であることがわかった。
【００１２】
最後に、細胞の古い順及び／又は細胞ラップ結合プロセスと同様に、細胞及び／又は細胞ラップの空間配置両方に関して、特に非常に複雑な組織及び／又は器官の設計及び／又は修復に関して、組織及び器官の設計、又は傷害を受けた組織及び器官の修復が、高度な制御を必要とする複雑な事項であることが示された。しかしながら、上記のアプローチは、これらの要求に応ずるための何れの解決案も提供していない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、上述の欠点を克服するプロセス、対象物（フレーク）及びアセンブリを提供することである。
【００１４】
この目的は、独立請求項の下、述べられる方法及び二次元の対象物（フレーク）により達成される。従属請求項は、好ましい実施例を示す。この明細書において、以下に与えられるすべての範囲が、これらの範囲を定めている値を含むものとして理解されるべきであることは、注目に値する。
【００１５】
本発明によると、細胞マイクロキャリア（「細胞ラップ」）のアセンブリを供給するためのプロセスが提供され、当該プロセスは、
外部の刺激が付与されると、平面状態から丸められた状態（「細胞ラップ」）へ変化する材料を有する２つの側面を持つ平面的２次元の対象物（「フレーク」）を供給するステップａ）と、
前記フレークの一方の側面（「細胞坦持側面」）上に細胞を供給するステップｂ）と、
前記外部の刺激の付与により前記平面状態から丸められた状態へ前記フレークを変化させるステップｃ）と、
前記ステップａ）−ステップｃ）の何れかの前又は後で、少なくとも一つのタイプの結合剤を前記フレークへ結合するステップｄ）と
を有する。
【００１６】
そうすることによって、以下の利点のうちの少なくとも１つが、本発明の広範囲にわたるアプリケーションに対して達成できる。
−「細胞ラップ」技術により、例えば貯蔵の間、細胞を保護することが可能である。
−「フレーク」は、後述されるように、複雑な構造体を作り上げることを可能にする。
−幾何的に好ましくない環境に置いてセルを成長及び／又は供給するように強いられるよりはむしろ、外部の刺激により、細胞をフレークに供給するステップと、「ラッピング」ステップとを分離することが可能である。
【００１７】
少なくとも一つのタイプの結合剤をフレークに結合させる前記結合ステップは、それらの平面状態（すなわちステップｃの前に）においてだけでなく、それらの丸められた状態（すなわちステップｃの後で）においても起こることができる。更にまた、細胞がフレークに付着された後（すなわちステップｂの後）だけでなく、細胞がフレークに付着される前（すなわちステップｂの前）に、上述のステップが起こり得る。
【００１８】
ここで使用される用語「少なくとも一つのタイプの結合剤をフレークに結合させる」は、
（ｉ）結合剤機能を持つ別個の構成要素を文字通り付着する、例えば共有結合で若しくは非共有結合で別個の構成要素をフレークに結合すること、及び／又は
（ｉｉ）すでにフレークの一部を形成している合成物質の変更、すなわちフレークの表面分子の発動又は化学機能化を指す。
【００１９】
オプション（ｉ）に関して、好ましい実施例は、架橋剤の使用を含む。架橋剤は、互いの間の共有結合を確立できる分子である。ホモ二官能性架橋剤は２つの同一の反応基を持つ一方、ヘテロ二官能性架橋剤はシーケンシャル（二段階）な連結を可能にする２つの異なる反応基を所有する。架橋剤は、少なくとも２つの反応基を含む。架橋するためのターゲット基は、一級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、炭水化物及びカルボン酸を含む（表１）。
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表１
【００２０】
上記の意味で架橋するための例は、タンパク質ベースの結合剤（例えば抗体又はビオチン等）をＥＤＣ／ＮＨＳ―ケミストリ、すなわちＮ―（３―ジメチルアミノプロピル）―Ｎ'―エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ―ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を持つフレークに結合させることである。
【００２１】
他の可能性は、連結反応（特に、結合剤が核酸である場合は、下記参照）により、アミンとの（フレークの一部を形成する）エポキシドの反応により、二重結合へのアミンのマイケル付加により、又は非共有結合付着、例えば複数の水素結合、オリゴヌクレチオドハイブリダイゼーション及び／又はメチル・リガンド複合体形成による結合剤との結合である。
【００２２】
オプション（ｉｉ）に関して、例えば反応基で結合剤を修正することにより、フレークの形成プロセスの間、結合剤を組み込み、ヒドロゲルモノマー混合物と混合することは後者の重合の前に可能である。
【００２３】
好ましい実施例では、本発明によるプロセスは、前記結合剤が、前記細胞坦持側面とは反対側の前記フレークの側面（外側面）に結合されることを特徴とする。上述のプロセスは、以下で「細胞ラップ」とも呼ばれる、細胞含有の丸められたフレークを提供し、フレークの外側面上で、他の構成要素との結合を構築できる結合剤を坦持する。
【００２４】
更に本発明の他の好ましい実施例では、プロセスは、達成された少なくとも一つの細胞ラップを、前記結合剤の少なくとも一つにより少なくとも一つの他の構成要素に結合する追加のステップｅ）を有する。
斯様な他の構成要素は、
（ｉ）他の細胞ラップ、
（ｉｉ）例えば生分解性のもの若しくはコラーゲンを有する生体外組織エンジニアリングのために使用されている、例えば固体多孔質足場材のような三次元マトリクスである、細胞ラップが結合されるべき非細胞性化合物、
（ｉｉｉ）例えば細胞外マトリクス、細胞、組織及び／若しくは器官である、生命体
（ｉｖ）例えばウイルス、抗体、細菌、胞子である、循環マテリアル、
（ｖ）外科用器具、インプラント、培養皿及び／若しくは培養皿のパターン化された表面、又は、
上述の細胞ラップの結合が所望される何れの他の構成要素も含む。
【００２５】
これらの他の構成要素は、
（ｉ）少なくとも一つの相補的結合剤を持つか、又は
（ｉｉ）上述の結合剤に相補的である部分（「固有の結合部分」）を有することが重要である。
【００２６】
ここで使用される「相補的結合剤」は、他の結合剤との結合を可能にする結合剤を指す。上述の相補的結合剤が他の結合剤と高い特異性で結合することが好ましい。この手段により、上述の細胞ラップとそれぞれ他の構成要素との間のアセンブリが構築できる。結合剤及び相補的結合剤の種々異なる対が使用されている場合、高い複雑さのアセンブリが作られ得る。
【００２７】
更にまた、自動組立複合体が、すなわち異なる構成要素を上述の細胞ラップに単に結合することにより作成できる。
【００２８】
オプション（ｉ）は好適なオプションである一方、オプション（ｉｉ）は、第２の構成要素が上述の結合剤と相補的である固有の部分を持つ場合に使用される。斯様な部分は、例えば、抗原（この場合、結合剤は抗体である）、組織特異的マーカー（この場合、結合剤は、前記マーカーを識別できるタンパク質である）、又は糖（この場合、結合剤は、例えばレクチンである）である。
【００２９】
抗原、組織特異性マーカー及び糖は、上述の他の構成要素の一定的部分又は固有の部分でないとき、相補的結合剤としても作用することに言及することは重要である。
【００３０】
これは、結合剤が、広い意味で結合剤として、又は上記の意味で固有の結合部分として資格を得るかどうかは、当該結合剤が上述の構成要素の一定的部分又は固有の部分であるかどうかの問題であることを意味する。
【００３１】
好ましい実施例において、複数タイプの結合剤が、細胞ラップに加えられる。例えば、一方の結合剤タイプは、それが三次元マトリクスと結合する態様で選択されるのに対し、他方の結合剤は、相補的結合剤を担持して、他の細胞ラップと結合する態様で選択される。この実施例によると、第１の細胞ラップタイプが、他の細胞ラップタイプが結合する、アンカー装置として使われる。
【００３２】
再引用された結合剤は、共有結合又は非共有結合の何れかを達成できる。
【００３３】
本発明の好ましい実施例では、前記結合剤は、タンパク質及びポリペプチド、核酸、分子タグ、リガンド及び／若しくは荷電群からなるグループから選択されることが提供される。
【００３４】
上述の結合剤が他の結合剤と非共有結合を確立できることは、注目に値する。
【００３５】
上述の非共有結合は、とりわけ、水素結合、タンパク質間相互作用、イオン結合、疎水的相互作用、ファンデルワース力及び双極子結合を有する。
【００３６】
所与のターゲットに向けて特異的結合特性を呈する非常に多くのタンパク質及びオリゴペプチドがあることは、よく知られた事実である。これらのタンパク質の非限定的な例は、とりわけ、抗体（特に単クローン抗体）、コラーゲン結合タンパク質、アンキリンリピート、インテグリン、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンである。
【００３７】
コラーゲン結合タンパク質は、コラーゲンと結合するタンパク質である。斯様なタンパク質の例は、例えば、ＣｂｐＡ、Ａ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓのコラーゲン―結合タンパク質（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ａ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ＣＮＥ、ストレプトコッカス・エクイのコラーゲン―結合タンパク質、ＫＩＮＤＬＩＮ―３、レジオネラ・ニューモフィラ菌のコラーゲン結合タンパク質Ｍｉｐ、タイプＩ―ＩＶコラーゲン―結合タンパク質、インテグリン・タンパク質等である。
【００３８】
コラーゲン結合タンパク質の例は、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  Ｌ、Ｏｌｄｂｅｒｇ  Ａ、Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ  Ｄ．  コラーゲン結合タンパク質、骨関節炎軟骨部２００１；９：Ｓ２３―８．４に与えられていて、この内容は、参照によりここに組み込まれる。
【００３９】
ここで使用される用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、とりわけ、モノマー、オリゴマ、並びにＲＮＡ、ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、モルフォリノ及び他の核酸類似体のポリマーを指す。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、バックボーンがペプチド結合により連結されるＮ―（２―アミノエチル）―グリシン単位を繰り返すことで構成されるバックボーンを特徴づけるＤＮＡ又はＲＮＡと類似の人工的に合成されたポリマーである。ロックされた核酸（ＬＮＡ）は、リボース部分が２'及び４'炭素を接続する余分のブリッジで変形されている変形されたＲＮＡヌクレオチドである。モルフォリノは、モリフォルノが標準核酸ベースを持つという点で、ＤＮＡと構造的に異なるＤＮＡの合成類似体であり、これらのベースはデオキシリボース・リングの代わりにモルホリン・リングと結合され、リン酸塩の代わりにホスホロジアミデートのグループを通じてリンクされる。
【００４０】
上述のオリゴヌクレオチドは、一本鎖であるか、又は少なくとも部分的に二本鎖である。後者の場合、結合剤とその相補的結合剤との間の結合を実施するために、オリゴヌクレオチドは、一本鎖オーバーハングにより特徴づけられる、いわゆる「粘着性の端部」を持つ。オーバーハングは、ＤＮＡ分子の端の対になってないヌクレオチドのストレッチである。これらの対になってないヌクレオチドは、３'又は５'のオーバーハングを作る何れかの鎖にある。斯様な粘着性の端部は、例えば以下の通りに見える：
５’―ＡＴＣＴＧＡＣＴＡＴＴＴＣＧ―３’
３’―ＴＡＧＡＣＴＧＡ―５’
【００４１】
上述のオリゴヌクレオチドは、下記の配列の他の粘着性の端部―オリゴヌクレオチドと相補的である：
５’―ＡＴＣＴＧＡＣＴＣＧＡＡＡＴ―３’
３’―ＴＡＧＡＣＴＧＡ―５’
【００４２】
結合剤として２本鎖オリゴヌクレオチドを使用するときの他のオプションは、２本鎖変性を達成するために、二本鎖オリゴヌクレオチドの融解温度を上回る温度まで細胞ラップを加熱することである。これは、混合物を８５℃を超える温度まで加熱することにより一般になされる。
【００４３】
上述の融解温度を決定する１つのやり方は、長さ１８マー（ｍｅｒ）未満のオリゴヌクレオチドに適しているいわゆるウォレス法である。当該方法は、各ヌクレオチドベースの周波数を計数することによりなされている。方法の背後にある論法は、シトシン―グアニン対がアデノシンとチミンとの間の２つの水素結合と比較して３つの水素結合を形成するので、これらが螺旋２本鎖の安定により寄与するということである。
Ｔｍ＝２（Ａ＋Ｔ）＋３（Ｇ＋Ｃ）
【００４４】
上述のアプローチは、融解温度を上回るポイントまで温度を単に強めることにより、２本鎖オリゴヌクレオチド結合剤を備える細胞ラップの制御された結合を可能にするので、非常に有益である。
【００４５】
種々異なる細胞ラップの結合プロセスは、このように単にオン／オフに切替えられる。このアプローチは、もちろん細胞が斯様な手順を許容する場合、すなわち細胞が耐熱である場合にだけ可能である。しかしながら、ヌクレオチド融解温度を低下できる薬剤、例えば二糖類トレハロースが利用できる。
【００４６】
これらの薬剤は、生きている細胞との上述のアプローチの互換性を増大するのを助ける。
【００４７】
細胞ラップに含まれる細胞を損なうことなくこのアプローチを使用する他のやり方は、超音波、特に高い焦点超音波（ＨＩＦＵ）、照明（例えば２つの光子赤外線の励起、光子的針等）、又は、集中した交流電磁場により高周波振動の下にセットされる磁性粒子の使用のような、このように局所的に集中する温度増加を引き起こす局所的な加熱技術の適用である。
【００４８】
ここで使用される用語「リガンド」は、生物学的目的に役立つ、例えば細胞情報伝達プロセス等を実施する分子を持つ複合体を結合して形成できる物質を指す。
【００４９】
ここで使用される用語「磁気構成要素」は、他の物質に対して引きつける又は反発する力を行使するような、反磁性、常磁性、強磁性、フェリ磁性及び／又は超常磁性の特性を持つ構成要素を指す。上述の磁気構成要素は、例えば、つながれた磁気ビーズの形式を採用する。
【００５０】
ここで使用される用語「荷電群」は、部分的な電荷を含む負の、正の及び／又は中性の電気的電荷を坦持する物質を指す。これらのグループは、細胞ラップと他の構成要素、例えば相補的電荷を坦持する他の細胞ラップとの間のイオン結合を構築できる。フレークと結合される斯様な荷電グループの例は、とりわけ、帯電アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスティスチン（ｈｉｓｔｉｓｔｉｎｅ）、リジン）、有機酸及び塩基、スルホネート基、並びに／又はピリジン基から成るグループから選択される。
【００５１】
用語「相補的核酸」及び「相補的オリゴヌクレオチド」は、ワトソンクリック型塩基対メカニズムに従って他の核酸、ポリヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドと交雑できる、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ））のいずれかの塩基を有する塩基配列を持つ核酸、ポリヌクレオチド及び／若しくはオリゴヌクレオチド、又はヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、イソグアニン及びイソシトシンを指す。
【００５２】
用語「抗体」及び「単クローン抗体」は、予防接種をされた哺乳類、又は組換え微生物の何れかにより生成された、所与の抗原の方へ結合アフィニティを呈する免疫グロブリン分子を指す。
【００５３】
レクチンは、それらの糖部分に非常に特有である糖―結合タンパク質である。レクチンは、通常、細胞及びタンパク質に関わる生物学的認識現象で役割を果たす。例えば、幾つかの細菌は、感染の間、ホスト微生物の細胞に細菌自身を取付けるために、レクチンを使用する。
【００５４】
アンキリン反復は、２、３例を挙げれば、細胞信号伝達、キナーゼ抑制又は受容体結合のような多様な機能を持つ用途が広い結合タンパク質として現実には用いられる天然アンキリン反復タンパク質に由来する。これらのアンキリン反復は、欧州特許ＥＰ第１３３２２０９号に例えば記載されている。
【００５５】
ストレプトアビジンは、バクテリア・ストレプトマイセス属アビジン（ａｖｉｄｉｎｉｉ）から精製される５３ｋＤタンパク質であり、ビタミン・ビオチンに対する強い親和性を呈し、ビオチン―ストレプトアビジン複合体の解離定数（Ｋｄ）は、〜１０―１５モル／ｌのオーダーにある。アビジンは、同様に、ビオチンに強い親和性を持つ同様のタンパク質である。
【００５６】
用語「分子タグ」（時々「親和性タグ」とも呼ばれる）は、例えば、タンパク質の浄化のために使用される分子を指す。これらのタグは、とりわけ、下記を有する：
・Ｎｉ―ＮＴＡのような固定された金属イオン
・Ｈｉｓ―タグ（ヘキサヒスチジン）
・キチン質結合タンパク質（ＣＢＰ）
・マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）
・ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ
・Ｃκドメイン
・フラグ―タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）
・連鎖球菌―タグ
・Ａｒｇ―タグ
・ＨＡ―タグ
・真菌−タグ
・ＧＳＴ（グルタチオン―Ｓ―転移酵素）
・Ｖ５―タグ
・ＢＣＣＰタグ
・カルモジュリン―タグ
・Ｓ―タグ
・ＧＦＰ―タグ（緑色蛍光タンパク質）
・タンパク質Ａ―タグ
【００５７】
当業者は、追加の進歩性あるステップの要件なしに、
（ｉ）上記の分子タグと相補的である結合剤、及び／又は
（ｉｉ）ここに記載されていない他の分子タグ
を見出し得る包括的な教示を、上記のリストに見出すだろう。
上述の目的のために、当業者は、それぞれの教科書、文献データベース、カタログ等を参照してもよい。
【００５８】
上記からすでに明らかな様に、結合剤は、本発明による一つのフレークを他のフレークにリンクさせるために結合する相補的（補完的）結合剤を持つ。表２は、結合剤の幾つかの好ましい対の概要を与える。
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表２
【００５９】
相補的（補完的）結合剤（特にアステリスク＊でマークされる薬剤）の幾つかは、これらが、それぞれの構成要素の不可分の一部又は固有の部分であるかどうかに依存して、固有の結合部分として役立つ。
【００６０】
本発明の更に他の好ましい実施例では、前記結合剤は、フレーク又はフレークの小区分へ、疎水性及び／又は親水性の特性を付与するように選択されることが提供される。
【００６１】
この好ましい実施例において、用語「結合剤」は、他の構成要素との共有結合又は非共有結合を構築するためのものと理解されるべきではない。
【００６２】
例えばフレークが、疎水性及び親水性結合剤の交替パターンを具備する場合、このように作られた種々異なる細胞ラップが、種々異なる細胞ラップの親水性の領域が互いと接触し、種々異なる細胞ラップの疎水性領域も互いに接触するような態様で（例えば、図６参照）、混合されるときに整然とした態様で自己組織化するだろう。
【００６３】
本発明の更に他の好ましい実施例では、前記結合剤が共有結合を構築できることが提供される。
【００６４】
好ましい実施例において、これらの共有結合は、バイオ直交である、
すなわち、
（ｉ）共有結合は、フレーク（生体適合性でなければならない）上に成長する細胞の生存に有害な影響を及ぼしてはならない、
（ｉｉ）共有結合は、特定の結合挙動を供給するために、選択的な反応性を持つ必要がある、並びに
（ｉｉｉ）共有結合は、反応が起こる組織又はボディの生存及び機能について有害な効果を持つべきでない。
【００６５】
斯様な結合を構築できる結合機構は、例えば、いわゆる「シュタウディンガー反応」（すなわち、イミノホスホランを作るためにホスフィン又はリン酸塩とのアジ化物の組合せ）、「シュタウディンガー連結」（すなわち、アジ化物の終端の窒素原子でのホスフィンの求核付加及び窒素の放出を通じたイミノホスホランの形成）、又はいわゆる「クリック反応」（すなわち、いわゆる「歪み促進［３＋２］アジド―アルキン環状付加」）を有する。
【００６６】
斯様な機構を実施できる上述の結合機構及び結合剤は、例えば、米国特許公開公報ＵＳ第２００８００７５６６１号Ａ１、国際特許公開公報ＷＯ２００７１１０８１１Ａ２及び国際特許公開公報ＷＯ２００７０３９８６４に開示される。
【００６７】
本発明の他の好ましい実施例では、少なくとも２つの異なるタイプの結合剤が、パターン化された形式で前記フレークに加えられることが提供される。
【００６８】
この状況において、用語「パターン化された形式」は、フレークの所与の区域が１タイプの結合剤だけを有する様式で、種々異なる結合剤の部材が、互いから区別されていることを意味する。このように得られたパターンは、例えば通常のパターン、例えば格子、ストライプのアレイ、グリッド、スポットの二次元アレイ又は円等である。この定義は、更に、異質なパターン及び不規則なパターンを含んでいる。
【００６９】
上述のパターンは、例えば、マイクロ印刷（例えばミクロ接触印刷、インクジェット式印刷）、又はリソグラフィ及び／若しくはフォトリソグラフィ技術により得られる。
【００７０】
更にまた、本発明の好ましい実施例では、前記ステップｂ）は、
前記フレーク上に細胞を播くステップｂ１）、及び
前記細胞を成長させるステップｂ２）
のサブステップを有することが提供される。
【００７１】
前記変化の後、かつて平面のフレークは、例えば、開いた又は実質的に閉じた端部を持つ円筒形状を採る。斯様な形状の例について、図２又は図３を参照のこと。フレークの典型的寸法は、細胞の寸法のオーダーであるか、又はそれよりいくらか大きい。本発明の好ましい実施例によれば、これは、平面ヒドロゲルフレークのサイズ又は長さが、１０μｍ以上１００ｍｍ以下、より好ましくは、１０μｍ以上１０ｍｍ以下、より好ましくは、２０μｍ以上１ｍｍ以下、最も好ましくは５０μｍ以上５００μｍ以下である。
【００７２】
本発明の他の好ましい実施例によると、平面フレークの厚みは、１００ｎｍ以上１ｍｍ以下、より好ましくは、５００ｎｍ以上５００μｍ以下、最も好ましくは１μｍ以上１００μｍ以下である。
【００７３】
本発明の更に他の実施例によると、丸められた状態の（細胞を有する）フレークの内径は、１μｍ以上５ｍｍ以下、より好ましくは、５μｍ以上５００μｍ以下、最も好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下である。
【００７４】
単なる細胞成長に加えて、フレークが丸められた状態に変化する前に、細胞は分化のために平面フレーク上に残る。これは、ステップｂ）とステップｃ）との間に、分化ステップが導入できることを意味する。同様に、細胞分割、細胞成長及び細胞プロフィール動作は、ステップｂ）とステップｃ）との間で促進できる。当業者は、上述されたような細胞分化を達成するために適用されるべき条件を、当業者の知識又は適当な文献から容易に選択する。
【００７５】
多くの場合、標準細胞培養条件が、使用される。例えば、ヒトの細胞を含む哺乳動物の細胞が、生理的な範囲内のｐＨを維持するために、５％ＣＯ２大気下、３７℃で好ましくは培養される。ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）で補完された合成培地のような、標準成長培地が使用され、成長因子及び抗生物質等が、必要により加えられてもよい。しかしながら、本発明の範囲内である昆虫細胞、植物細胞及び原核細胞も、従来からよく知られた種々異なる条件で取り扱われてもよい。
【００７６】
その上、フレークの形状は正方形、長方形又は平行四辺形と類似できることも理解される。しかしながら、より複雑な形状が、より複雑な丸められた状態を達成するために使用できる。例えば、螺旋状の丸められた状態を達成するために、フレークは、長手の平行四辺形に似た形状を持つべきである。同様に、フレークは、また、円形、楕円形、台形、六角形、多角形、又は三角形を持つことができ、各場合において、種々異なる丸められた状態を導く。幾何学的、機械的又は組成において表面が構造化された、フレーク内のより複雑な層状化が、より複雑な丸められた状態を達成するために寄与できる。
【００７７】
この状況で、丸められた状態は、２つの場合を含む、すなわち図２でわかるように、少なくとも部分的に重なった柱状、又はちょうど閉じた柱状体を含むことを言及する価値がある。後者は、２つの接触エッジの重なりが基本的になく、フレークの閉じる側間に鋭角を許容するだろう。
【００７８】
通常、細胞はフレーク上に存在するだけで、フレーク間の基板上にないことが望ましい。フレーク間の間質（間隙）内に細胞が定着することを回避するために、基板下部の表面は、細胞が基板にくっつかない、又は基板上よりもむしろフレーク上で成長するための明確な好みを持つように変形できる。しかしながら、細胞も基板上で成長する幾つかの場合には、問題ではない。フレークが開放され（離され、リリースされ）丸められるとすぐに、細胞が去った基板は廃棄できる。
【００７９】
幾つかの特定の実施例では、フレーク間の間質（間隙）内に細胞を持つことが有益でさえある。例えば、幾つかの困難な細胞タイプは、成長のため、すなわち適当な成長因子の生産のため共フィーダー細胞を必要とする。これらのフィーダー細胞は、フレーク間に播くことができ、一方で対象の細胞がフレーク上に成長される。
【００８０】
更に他の実施例では、様々な細胞ラップが互いに接着できるだけでなく、容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）又は容器を含む細胞ラップが細胞ラップに接着もできる。これらの容器は、例えば、細胞を制御するのを補助する成長因子（例えば、細胞の分化を制御する成長因子）を配送するために使用できる。用語「容器」は、前記物質を有するヒドロゲル品目も有し、これらの物質の制御された開放（リリース）のために使用される。前記開放は、またここで説明された何れかの外部の刺激により誘発される。上述の大きな多用途性が、種々異なる成長因子の空間的及び時間的開放を制御するために使用できる。
【００８１】
適当な分化を得る多くの場合に、幾つかの成長因子及び／又はクロトキンが、正確に規定された時間に特定の順序で配送されなければならない。本発明によると、細胞を備える細胞ラップの第１のセットが配送され、次に、成長因子「Ａ」を含む細胞ラップが後続する。所定の時間後、成長因子「Ａ」を備えた容器が取り除かれ、成長因子「Ｂ」を備えた他の容器が配送できる。従って、種々異なる成長因子が、第１の場所に送られる細胞について申し合わせた作用で働く。その後、他のセットの細胞が例えば類似の又は異なるやり方で配送され処理される。
【００８２】
本発明のプロセスの好ましい実施例によると、前記刺激は、
・ｐＨの誘導変化、
・温度の誘導変化、
・電磁波への誘導付与、
・イオン、特定の塩若しくは有機化合物、又はこれらの所与の濃縮への誘導付与、
・電場の付与、
・磁場の付与、
・音波の付与、
・振動の付与、
・酵素及び他の生体分子への誘導付与又は誘導抑制、
・基板からの誘導開放、及び／又は
・溶媒組成への誘導付与
から成るグループから選択される。
【００８３】
温度刺激に関して、例えば、加熱すると（例えば３６℃以上）フレークが平面状態にあるのに対し、冷却すると（例えば３５℃以下）フレークが丸められた状態へ変化されることが好ましい。このことは、フレーク（及びそこに含まれる細胞）を冷却することにより細胞が成長を止め、代謝率が低減されるので、特に有益である。よって、細胞は、損傷又は有害な効果なしに、それぞれの反応に対して、輸送又は準備のために格納できる。付与される刺激は、細胞の生理機能を劣化させないように選択されることが、また好ましい。
【００８４】
その上、好ましい実施例では、フレークは、可逆隆起（膨れ）特性等を持つ刺激反応材料を有することが提供され、すなわち当該刺激が何回も付与できる。
【００８５】
用語「電磁波」は、可視光、紫外光、赤外光、Ｘ線、マイクロ波、無線波等を含むことが理解される。用語「音」は、可聴音だけでなく超音波、及び可聴下音を含むことが更に理解される。
【００８６】
結果的に丸められた状態へのフレークの変化となる誘発された基板からの開放は、例えば、温度シフト及び／又はｐＨシフトにより達成できる。
【００８７】
丸められた状態でのフレークは、上記種類の外部刺激に反応でき、正しい刺激が供給されるとき、平面状態へ再び変化し、よって細胞を環境へ曝すことが提供できることが理解されるべきである。この目的のため、例えば、フレークが、ｐＨ若しくは温度を下降又は上昇させることにより丸められた状態へ変化し、ｐＨ若しくは温度を上昇又は下降させることにより再び平面状態へ変化することが提供できる。
【００８８】
フレークを丸められた状態へ変化させる前、又は変化させている間に、フレークが接着している基板からフレークが開放されることが好ましい。フレークの開放及び丸くなること両方は、フレークの隆起（膨れ）により開始される。この実施例では、開放及び丸められた状態への変化は、同時に起こる。隆起していない状態では、フレークにはほとんど又は全くストレスがかからず、基板へのフレークの接着は最適ではないが、フレークは基板に接着しているだろう。隆起状態では、ヒドロゲル層の親水性の変化及び構築されるストレスがフレークの開放を生じるだろう。培養細胞は、ヒト由来の又はヒト由来でない幹細胞及び分化細胞、例えば成体間充識幹細胞、成体造血幹細胞、脂肪派生成体幹細胞、胚幹細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋芽細胞、心筋細胞、芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状突起細胞、赤血球、リンパ前駆細胞、骨髄前駆細胞等を含む。しかしながら、研究目的のために、又は生物製剤の生産に後に使用される細胞の生産のために、不死化細胞、すなわちハイブリドーマ細胞等でさえ使用できる。
【００８９】
これは、また、全能の幹細胞が使用される場合、細胞が分化を始める前にステップｃ）が起こることを意味する。多能性の細胞が使用されている場合、上記に図示されるように、ステップｃ）が誘発される前に、分化（少なくとも部分的に）が起こる。
【００９０】
更に好ましい実施例では、フレークは、ラベル又はマーカーを有する。斯様なラベル付けは、例えば、染料、磁気的ビーズ、Ｘ線マーカー、ＭＲＩマーカーの使用、又は抗原、レクチン、反応基等のような部分をターゲットすることにより達成できる。
【００９１】
細胞のラベル付けは、細胞生理学、細胞酵素、細胞代謝等に悪影響を及ぼすだけでなく、核及び核酸を含む細胞小器官に有害な影響を及ぼすので、細胞自身にラベル付けするよりもフレークにラベル付けする方が、かなり良い態様である。
【００９２】
例えば、斯様なラベル付けは、それぞれのフレークが、例えばこれらのラベル付けにより認識でき、選択でき、足場材内に位置決めできるので、複数の細胞タイプから成る組織のデザインを可能にする。斯様な位置決めは、例えば専用のロボットにより自動的になされ、例えばこの場合、それぞれのラベル又はマーカー（例えば蛍光マーカー）は、ロボットにより自動的に検出される。
【００９３】
その上ラベル付けは、成長因子の細胞タイプ特別なアプリケーションを可能にし、種々異なる細胞タイプを有する細胞の再生医療で非常に役立つ。また、ピペットロボットがこの目的のため使用されてもよい。
【００９４】
細胞療法に使用されるとき、細胞と接触していない層は、組織特異抗原でラベル付けされる。よって、ターゲットへのフレーク及びこれらの内容の配送がサポートされる。
【００９５】
この状況では、Ｘ線マーカー及びＭＲＩマーカーは、丸められたフレークのターゲッティングを促進する。この目的のため、Ｘ線トモグラフ又はＭＲＩトモグラフが使用できる。その上、それぞれのラベルが、ターゲット有機体内部のフレークのラッピング及びラッピングの開放、フレークの統合性又は分解それぞれを制御するために使用できる。
【００９６】
このアプローチは、細胞療法で必要とされる細胞の数を低減することを助け、例えば、培養細胞は高価でこれらの生産は時間及び労働量が多くなるので、結果的に、コスト及びリソースの削減となる。更に重要なことに、治療領域に残存する細胞の数が、低減される。このことは、ターゲットボディ内にフリーで浮遊している、よって、癌又は他の疾患を生じる細胞の望ましくない副作用を減らす。
【００９７】
更にまた、フレークは、生体適合性を強化する剤を有することが好ましい。例えば、細胞を含まない層は、凝血を避けるために、抗凝固剤、例えばヘパリン部分を有する。当業者は、特定のニーズに従って、生体適合性を強化する他の剤を選択するだろう。例えば、特別なアンカー分子、成長因子等と細胞を接触させて層を変形することが可能である。
【００９８】
本発明によるフレークは、ヒドロゲルから成る材料を有することが特に好ましい。
【００９９】
ここで用いられる用語「ヒドロゲル」は、それぞれの材料の一部が、水溶性であるポリマーチェーンのネットワーク及び／又は水膨張ネットワークを水内で形成するポリマーを有する。好ましくは、ヒドロゲル透過層は、膨張状態で５０％以上、更に好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上の水及び／又は溶媒を有し、これにより、好ましい溶媒は有機溶媒、好ましくは有機極性溶媒、最も好ましくはエタノール、メタノール及び／又は（イソ）プロパノールのようなアルカノールを含む。
【０１００】
反応ヒドロゲルが特に好ましい。本発明にとっては、用語「反応」は、特にターゲット分子の付加又は特別な刺激の付与のような特別なパラメータの変化の際に、形状及び全体量の変化を受けるような態様でヒドロゲルが反応することを意味及び／又は含み、特別なパラメータは上述で更に特定されている（例えば、ｐＨの誘発変化、温度の誘発変化、電磁波への誘発被放射、特別な塩若しくは有機化合物又はこれらの所与の凝縮への誘導、電場の付与、磁場の付与、音波の付与、振動の付与）。他の刺激は、酵素又は他の生体分子のような専用の検体の存在又は凝縮を含む（上記コメント参照）。
【０１０１】
ヒドロゲルは、ｐＨ、イオン濃度、温度、溶媒組成、及び電位に敏感な形状であることが知られている。これらのパラメータは、後で材料を元の状態へ戻すために逆転できる位相、形状、メカニクス、屈折率、認識率又は浸透率についての変化を生じる。刺激に敏感なヒドロゲルは、制御可能なアクチュエータをデザインするため、酵素、タンパク質模倣体及び抗体と統合されてもいる。これらのヒドロゲルは、ターゲット分子の付加により隆起又は縮むことが示された。これらのヒドロゲルの隆起（又は縮み）量は、ポリマーネットワーク内の非共有結合相互作用における変化に起因する。ヒドロゲルは、ターゲット分子が存在すると、隆起又は縮むようにデザインでき、これらは、隆起（又は縮み）の大きさが存在するリガンドの濃度に比例するように、構成することさえできる。
【０１０２】
本発明の実施例によると、ヒドロゲル材料は、エポキシ、オキセタン、及びチオーレンを含むだけでなく、ポリ（メタ）アクリル材料、置換ビニル材料又はこれらの混合物を有するグループから選択される材料を有する。
【０１０３】
本発明の他の実施例によると、ヒドロゲル材料は、少なくとも一つの（メタ）アクリルモノマー及び少なくとも一つの多機能性（メタ）アクリルモノマーの重合化で作られるポリ（メタ）アクリル材料を有する。
【０１０４】
本発明の更に他の実施例によると、（メタ）アクリルモノマーは、（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシエチル（メタ）アクリレート又はこれらの混合物を有するグループから選ばれる。
【０１０５】
本発明の更に他の実施例によると、多官能性の（メタ）アクリルモノマーは、ビス−（メタ）アクリル、トリ−（メタ）アクリル、テトラ−（メタ）アクリル及び／又はペンタ−（メタ）アクリルモノマーである。
【０１０６】
本発明の実施例によると、多官能性の（メタ）アクリルモノマーは、ビス（メタ）アクリルアミド、ジエチレングリコルジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコルジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコルジ（メタ）アクリレートトリプロピレングリコルジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレートポリエチレングリコルジ（メタ）アクリレート、エトキシ化ビスフェノール−Ａ−ジ（メタ）アクリレート、ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート又はこれらの混合物を有するグループから選ばれる。
【０１０７】
上記目的のため適当である本発明者により実施されるテストでわかった他の材料は、エチルヘキシルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ＰＮＩＰＡＡ−コ−イソブチルメタクリレート（８０：２０）、ＰＭＭＡ、ＰＭＭＡ−コ−トリメチロールプロパントリアクリレート、ＴＭＰＴＡ、ＤＥＧＤＡ、ＤＥＧＤＭＡ、ポリスチレン、ＰＭＭＡ−コ−ＤＥＧＤＡ（２：１）、ＰＭＭＡ−コ−ＤＥＧＤＭＡ（２：１）、ＰＳ−コ−ＤＥＧＤＡ（２：１）、ＰＳ−コ−ＤＥＧＤＭＡ（２：１）及びトリス２−ヒドロキシエチルイソシアヌレートトリアクリレートを含む。
【０１０８】
本発明の実施例によると、ヒドロゲル材料は、ビニルアセテート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、エトキシエチル（メタ）アクリレート若しくはこれらの混合物のグループから好ましくは選択される、中性モノマーのグループから選択される少なくとも一つのモノマーとの共重合化される、（メタ）アクリル酸、アリルスルホン酸、特にスチレンスルホン酸、イタコン酸、クロトン酸、スルホンアミド、若しくはこれらの混合物から好ましくは選択されるアニオン性ポリ（メタ）アクリル材料、及び／又は、ビニルピリジン、ビニルイミダゾール、アミノエチル（メタ）アクリレート、若しくはこれらの混合物を有するグループから好ましくは選択されるカチオンポリ（メタ）アクリル材料を有する。
【０１０９】
広範囲のこれらの共重合体が、ｐＨ又は温度の関数として形状を変化し、付与された電場及び／又は電流に応答することが知られている。従って、これらの材料は、本発明の範囲内で広い範囲のアプリケーションで利用される。
【０１１０】
本発明の実施例によると、ヒドロゲル材料は、置換ビニル材料、好ましくはビニルカプロラクタム及び／又は置換ビニルカプロラクタムを有する。
【０１１１】
本発明の実施例によると、ヒドロゲル材料は、Ｎ−イソプロピルアミド、ジエチルアクリルアミド、カルボキシイソプロピルアクリルアミド、ヒドロキシメチルプロピルメタクリルアミド、アクリロイルアルキルピペラジン及び、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸、アクリルアミド、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート若しくはこれらの混合物を有する親水性のモノマーのグループから選択されるモノマー、及び／又は（イソ）ブチル（メタ）アクリレート、メチルメタアクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート、若しくはこれらの混合物を有する疎水性のモノマーのグループから選択されるモノマーとのこれらの共重合体を有するグループから選択される熱反応性モノマーに基づく。
【０１１２】
これらの反応ヒドロゲルに対する好ましい例は、ポリ−ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡ）である。
【０１１３】
上述のヒドロゲルは、低分子化合物、すなわち塩、砂糖、脂質、成長因子、酸素等に対して高い浸透性がある。この理由のため、これらのゲルを有するフレークは、ラップされた状態であってさえも、細胞に対して適当な成長条件を提供するだろう。
【０１１４】
他の好ましい実施例では、細胞と接触する層が、ヒドロゲル材料ではない。これらの場合、接触層は、栄養物及び代謝産物の輸送を可能にするための穴又は微小孔を含むように構造化されることが好ましい。しかしながら、輸送は、ラップの「開いている側」を通じて起こり得る。
【０１１５】
更にまた、フレークは２層構造を有することが好ましい。異なる層のために適当な材料を選択することにより、２つの層の異なる隆起が所与の刺激、例えば異なる温度膨張係数、水吸収等を受けると達成できる。この違いが動き、すなわち結果的に丸められた状態となるフレークのカーリングのために必要となる駆動力を供給する。前者の好ましい実施例では、フレークは、無反応層及び反応ヒドロゲルから作られた層から成る。
【０１１６】
フレークは、３層若しくはそれ以上の層又は傾斜構造を有し、すなわち隆起又はゲル化成分の垂直方向の濃度傾斜を有し、結果的に同様の振る舞いとなる。上述の傾斜は、当業者に良く知られた方法で作ることができる。例えば、電気泳動法で傾斜ゲルを作るために一般に使用されるような傾斜ミキサが、この目的のために使用できる。成分傾斜を作るための他のアプローチは、重合化割合についての垂直方向の傾斜を使用することにより（例えば紫外線吸収物を使用することによる強度傾斜）、後者を誘導する。
【０１１７】
この明細書では、上述の層の少なくとも一つが構造化表面を有することに言及する価値がある。
【０１１８】
３層構造の実施例は、例えば、非常に薄いトップ層、したがって丸くなる動きを導く応力機構に影響を与えないが、細胞成長に適合する、又は細胞成長を促進さえする成分を有する当該トップ層を有する。
【０１１９】
更に、高い密集度を持つ接着性の細胞シートがフレーク上に成長する場合、単一層のフレーク、すなわち傾斜又は層状配列がないフレークを使用することも可能である。これらの場合、細胞シート自身が第２の層として働き、単一層の薄片層と接着細胞シートとの間の拡張振る舞いの違いが、フレークのラップされた状態への丸くなる結果となる。この特徴は、細胞のサイクル状態において、細胞が他の状態もより強い張力を接着ポイントに細胞が付与する状態を決定するために、細胞の接着が使用される本発明の他の好ましい実施例にとって特に有効である。
【０１２０】
更に他の好ましい実施例では、フレークが表面と接触する構造化細胞を有することが提供される。これは、細胞接着を刺激し、細胞の成長及び方向を明確に指向することを助ける。これらの場合、構造化された接触層又は構造化された非接触層が、フレークの好ましい丸め方向を誘導できる。
【０１２１】
細胞成長又は細胞分化に影響を与えるため、細胞培養中に、外部刺激が付与されることが更に好ましい。
【０１２２】
斯様な刺激は、例えば、成長因子の付与、機械的応力の付与、又は電場若しくは磁場の付与から成るグループから選択できる。特に、これらの刺激は、細胞成長の方向及び形状が制御可能なだけでなく、細胞のタイプ及びそれぞれのアプリケーションにしたがって、細胞の分化を強化するか又は防止できる。
【０１２３】
成長因子は、細胞がラップされると、細胞成長がまだ刺激されることを提供するために、細胞と接触する層に加えられる。
【０１２４】
更にまた、細胞が播かれる前に、フレークが支持構造上に置かれる又は支持構造上で作られることが好ましい。
【０１２５】
好ましい実施例では、フレークは、生体分解性及び／又は生物学的に安全な材料を有する。これは、再生医療及び細胞医療のフレークの使用両方にとって重要な特徴である。例えば、生分解性材料の使用は、特定の状況下、フレークが対象に直接投与することを可能にする。同様に、フレークが体外の再生医療のために使用されているとき、前記材料は、ゆっくりと分解するように選択でき、分解の速度は、細胞成長の速度及び成長している細胞による追加の細胞マトリクスの生産の速度に対応する。この実施例では、追加の細胞のゲルマトリクスは、生きている細胞物質により段階的に置換される。
【０１２６】
適当な生分解性材料は、例えば、文献Ｇｕｎａｔｉｌｌａｋｅ  Ｐ及びＡｄｈｉｋａｒｉ  Ｒによる「Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」（５）２００３、１−１６により説明されていて、当該文献の内容は参照によりここに組み込まれる。とりわけ、これらは、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）並びにポリ（ｄ、ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−グリコール酸）のようなこれらの共重合体及び派生物、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）のようなポリラクトン及びこれらの派生物、ポリ［１、６−２（カルボキシフェノキシ）ヘキサン］のようなポリ無水物、チロシン誘導ポリカーボネート及びこれらの派生物、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）及びこれらの派生物、リジンジイソシアン酸エステル（ＬＤＩ、２，６−ジイソシアン酸ヘキサン酸塩）のような無毒分解物を持つポリウレタン（ＰＵ）及びヘキサメチレンジイソシアン酸（ＨＤＩ）のような他の脂肪族のジイソシアン酸並びに１，４−ブタンジイソシアン酸、例えばポリ（グリコリド−ｃｏ−γ−カルポラクトン）、エチルグリシン酸塩ポリフォスファゼンのようなポリフォスファゼン及びこれらの派生物等である。
【０１２７】
他の生分解性ポリマーは、ポリ（オレイン酸）、ポリ（ｐ−ｄｉｏｘａｎｏｎｅ）、ポリ（トリメチレン−炭酸塩）、ポリ（３−ｈｙｄｒｏｘｉｂｕｔａｒａｔｅ）、ポリ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｏｒａｔｅ）及びこれらの共重合体を有する。適当な反応生分解性ポリマーのクラスは、Ｓｏｇａ  Ｏ等による文献Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２００４（５）８１８−８２１により説明されるように、ポリ（Ｎ―（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド  モノ／ジ乳酸塩）であり、当該文献の内容は、参照によりここに組み込まれる。
【０１２８】
他の適当な生分解性材料は、アルギン酸、ヒアルロン酸、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、シルク又はこれらの組み合わせを有する。
【０１２９】
これらの生分解性材料は、これら自身使用でき、架橋剤と一緒にネットワーク内で使用されている。作成されたネットワークは、しばらく後で分解し、架橋剤が小さな分子量を持つとすると、架橋剤は洗い流されるだろう。他の実施例では、生分解性材料は、生分解性でないものから成るネットワーク内で固定化される。
【０１３０】
他の好ましい実施例では、フレークは外部刺激が付与されると分解する材料を有することが提供される。この特徴は、例えば、ターゲット場所に細胞を開放することを強調するため、細胞療法に有効である。これは、例えば、超音波及び赤外光両方とも人体又は動物の体内へ良好に通るので、超音波又は赤外光の付与により達成できる。
【０１３１】
この目的のため、丸められたフレークが丸められたフレークの外側のターゲット部分を介して注入され、ターゲットされる。ターゲットされた丸められたフレークは、外部刺激が付与されると広がり、よって、細胞を対象の領域にさらす。代わりに、フレークがターゲットされないが、身体に均一的に配分される一方、外部刺激が対象の領域にだけ当てられる。そこにある丸められたフレークだけが広がり、これらの細胞内容物を開放するだろう。
【０１３２】
好ましくは、本発明による工程で使用される細胞は、接着細胞である。しかしながら、浮遊細胞が使用されてもよい。これらの場合、浮遊細胞を有する液体が毛細管力のために丸められたフレークに残ることが提供できる。
【０１３３】
上記のプロセスで作られるフレークの好ましいアプリケーションは、平面状態から丸められた状態へフレークを変化させた後、丸められたフレークは、３次元組織を作るために、既定の空間的パターンに配分されている。このアプローチは、同様に、生体内及び生体外の再生医療のために使用されてもよい。この目的を達成するため、作られるべき組織の形状、又は器官を予め決定し、本発明による細胞ラップが堆積される足場材が使用される。
【０１３４】
このアプローチで、培養され、特に種々異なる細胞培養内で処置され、結果的に種々異なるフレークにラップされた種々異なる細胞タイプの異種の分配を得ることが可能である。このようにして、どの細胞タイプが新しく成長した組織のどこにあるかを正確に制御することが可能である。代わりに、一つの各−又は多能性の細胞タイプ（幹細胞又は前駆細胞）が、種々異なる細胞タイプへの分化を刺激する種々異なる因子を含む種々異なるフレークに培養できる。ラップが、既定の態様で配分でき、再生医療中に細胞が成長して種々異なる組織タイプになる。よって、例えば、骨−軟骨インタフェース構築物が得られる。
【０１３５】
フレークの他の好ましい実施例は、平面状態から丸められた状態へフレークを変化させた後、丸められたフレークが、互いに開いた端部で揃えられている。このようにして、管又は連続的ニューロンが形成できる。丸められた状態の斯様な配列は、地理的制約、外部磁場又は電場、流れ及びせん断等のような外部因子により刺激できる。
【０１３６】
しかしながら、変化し、上述のらせんのような形状を採るフレークが使用されるとき、同じタイプの管状の組織が達成できる。
【０１３７】
フレークの更に他の好ましいアプリケーションは、成長した細胞を坦持する種々異なるフレークが、平面状態から丸められた状態へ前記フレークを変化させる前に重ねられることを提供する。重ねられたフレークを丸められた状態へ変化させることにより、種々異なる起源を持ってもよい細胞の同軸配置を達成する。これは、内皮、結合組織、血管平滑筋細胞及び外膜（神経を含む）のような種々異なる細胞の層状配列で、血管のような管状組織の生産を可能にする。
【０１３８】
しかしながら、同じ結果が、細胞を坦持するパターン化された平面的フレークを備えた基板上に、丸められたフレークを置いて位置合わせすることにより達成できる。上述の刺激の付与があると、これらのフレークが平面状態から丸められた状態へ変化し、よって、置かれている丸められたフレークをラップする。変化し、上述のらせんのような形状を採るフレークが使用されるとき、再び同じタイプの管状の組織が達成できる。
【０１３９】
フレークの他の好ましいアプリケーションは、丸められたフレークが冷凍されることを提供する。これにより、フレークは将来の使用のために蓄積でき、この明細書の他の所で特定される。
【０１４０】
本発明の更に他の好ましい実施例では、前記細胞ラップ及び／又は作られた細胞マイクロキャリアのアセンブリが、
ｉ）生体外組織−及び／若しくは器官−エンジニアリング環境
並びに／又は
ｉｉ）人間若しくは動物の損傷した組織及び／若しくは器官
に送られることが提供される。
【０１４１】
ここで使用される用語「生体外組織−及び／又は器官−エンジニアリング環境」は、細胞が組織及び／又は器官、又はこの少なくとも一つ以上の部分を形成するために急速に増殖することをサポートする培養環境を指す。
【０１４２】
斯様な培養環境は、浮遊細胞培養システム、２次元細胞培養システム、並びに／又は例えば生分解性物及び／若しくはコラーゲンを有する多孔質体足場材若しくはマトリクスのような３次元細胞培養システムを有する。
【０１４３】
後者の実施例の場合、損傷した組織の組織機能を回復するのを補助する幹細胞が、好ましくは使用される。斯様なアプローチは、例えば、心拍の結果として、壊死組織の修理のためだけでなく、アルツハイマー又はパーキンソンの疾患のような神経変性疾患の処置のために非常に有望である。
【０１４４】
ここで、再び、本発明による細胞ラップは、損傷の場所へ直接細胞をターゲットするための手段を提供する。これは、コスト及びリソースの低減、更に、治療の領域内に残っている細胞（最終的に癌等を生じる）の数の低減となる。この実施例では、結合剤は、これらが組織特有のエージェントと補完的であるように選択される。
【０１４５】
両者の場合、本発明による結合剤は、セルフ組み立てプロセスを供給するオプションで、互いに種々異なる細胞ラップの制御された結合のため、及び細胞ラップのサイト特定のターゲッティングのため、有効なツールを供給する。
【０１４６】
更にまた、他の好ましい実施例は、細胞を有するフレークが口から対象物へ投与され、すなわちフレークが飲み込まれることを提供する。フレークの組成は、唾液、胃液、酵素及び／又は小腸、膵臓若しくは胆嚢の酵素に対して抵抗があるように、選択できる。これにより、フレークが腸内の既定の位置に達するまで、フレークは細胞を防護するために無傷のままであることが達成でき、これは、上述の態様で前記結合剤によりサポートされる。特定の剤（エージェント）、例えば酵素の存在又は局部的ｐＨのため、そこでフレークは、それぞれ丸くなった状態がとれ、分解でき、細胞を働かせる。
【０１４７】
更に他の好ましい実施例は、丸められたフレークは、内分泌機能を引き継ぐために、注入により又は外科的に、対象に埋め込まれている。この場合、フレークは、内分泌細胞、すなわち、膵臓細胞、又はインシュリンのような内分泌剤を作る細胞を含む。フレークのターゲッティングが、上述のように、前記結合剤により可能である。
【０１４８】
フレークの浸透性のため、栄養分が管腔に入り、細胞に与えられる。同様にして、内分泌剤が隠され得る。同時に、Ｔ−細胞及びマクロファージが外に締め出され、よって、免疫反応を防止する。
【０１４９】
更にまた、請求項１乃至１１の何れか一項に記載のプロセスにより２次元の対象物（「フレーク」）及び／又は細胞ラップを製造するプロセスが提供され、当該プロセスは、
ａ１）フレークの形状を規定する井戸を作るグリッドを有するモールドを供給するステップと、
ａ２）外部刺激を付与すると、平面状態から丸められた状態へ変化する先駆体材料を前記モールドへ成型するステップと、
ａ３）フレークを得るために成型された材料を硬化するステップと、
ｇ）オプションとして、前記外部刺激の付与により前記平面状態から前記丸めた状態（「細胞ラップ」）へ変化させるステップと、
ｈ）前記ステップａ）乃至ｃ）の前又は後に、少なくとも一つのタイプの結合剤を前記フレークと結合させるステップと
を有する。
【０１５０】
硬化の後、フレークは、モールドから外され、その後上述のプロセスに従って使用される。しかしながら、フレークは、モールド内に残ることもできる。この実施例では、モールドは、例えば、後続の細胞培養のための支持構造として役立てる。
【０１５１】
このプロセスは、２枚、３枚又はそれ以上の複数の層状フレークを供給するために使用されることが提供される。この場合、成型及び硬化ステップが繰り返される。種々異なる層に対して種々異なる前駆材料を使用することにより、上述のように、結果としてのフレークは、外部刺激の付与により平面状態から丸められた状態へ変化できる。適当な材料は、上記に詳細に説明されている。例えば、硬化は、紫外線、電子線、加熱又は専用硬化剤の付与により達成できる。しかしながら、セルフ硬化材料も使用できる。
【０１５２】
このプロセスの好ましい実施例では、幾つかの層が複数の層のフレークを得るためにモールドに成型されることが提供される。これは、第１の層が最初に成型されて硬化されることを意味する。その後、第２の層が成型されて硬化され、以下同様である。このようにして、成型を通じて傾斜構造がフレーク内で達成され、例えば隆起又はゲル化コンポーネントの垂直の濃度傾斜が達成されることが提供される。当該傾斜は、例えば硬化中に層にわたって光強度の傾斜を付与することにより形成できる。
【０１５３】
更にまた、下記の添加物の何れかが、先駆体に加えられることが提供されてもよい。
（ｉ）生体適合性を増強する剤、
（ｉｉ）生分解性及び／又は生物学的に安全な材料、
（ｉｉｉ）ラベル又はマーカー
（ｉｖ）成長因子、
（ｖ）構成物質。
【０１５４】
更に他の実施例では、硬化の前又は後に構造化された表面がフレークにおいて達成されることが提供される。これは、例えば、フレークの表面にプレスされる構造化されたテンプレートを使用することによりなされる。厚さ方向に傾斜を得るため、例えば吸収材で前記ヒドロゲル層を光重合することも可能である。この状況では、ダブル（又は複数の）紫外線露光が、例えば使用できる。好ましくは、ステップの一つは、表面のパターンを達成するためにマスクを使用するステップを有する。
【０１５５】
他のオプションは、構造化された表面を作るために、偏光された光を使用することである。この場合、線形化された構造が、分極の平面において硬化又は光分解により得られる。分極の異なる平面でこのプロセスを繰り返すことにより、グリッドパターン等が表面に作成できる。
【０１５６】
本発明の他の態様によると、上記プロセスで述べられたような構造及び／又は材料特性を持つか、又は上記製造プロセスで作られた２次元対象物（「フレーク」）が提供される。
【０１５７】
説明された実施例における本発明により使用される要素（コンポーネント）及び請求項の要素だけでなく、前述の要素は、サイズ、形状、材料選択、及び技術概念に関して特別な例外に従属することなく、関連技術分野で知られる選択基準が制限なく適用できる。
【０１５８】
本発明の更なる目的は、
・本発明によるプロセスが使用された又は本発明によるプロセスにより作られた２次元の対象物（「フレーク」）及び／又は細胞マイクロキャリア（「細胞ラップ」）、
・本発明によるプロセスで作られた細胞マイクロキャリア（「細胞ラップ」）のアセンブリ、
・本発明によるプロセスで作成された細胞マイクロキャリアを有する細胞マイクロキャリア（「細胞ラップ」）のアセンブリ、及び／又は
・細胞を坦持する２次元の対象物から成り、外部の刺激の付与により丸められた状態へ変化する細胞マイクロキャリア（「細胞ラップ」）のアセンブリであって、
少なくとも２つの細胞マイクロキャリアが少なくとも一つの結合剤により互いに結合されている、アセンブリである。
【０１５９】
本発明の対象物の付加的な細部、特徴、特性及び利点は、本発明によるプロセス及びフレークの好ましい実施例を例示的に示す本発明の従属項、図面並びにそれぞれの図面及び例の下記の説明に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１は、本発明によるプロセスの第１のステップを示す。
【図２】図２は、本発明によるプロセスの次のステップを示す。
【図３】図３は、反応ヒドロゲル材料を含む二重層構造体を有する本発明による２つの細胞ラップの顕微鏡写真を示す。
【図４】図４は、フレークに結合剤を結合させる原理を示す。
【図５】図５は、結合剤が上述の細胞―細胞ラップを他の構成要素に結合するためにどのように用いられるかを示す。
【図６】図６は、異なる結合特性を持つ異なる領域を含む細胞ラップに基づく細胞アセンブリの形成を例証する。
【図７】図７は、所与の細胞ラップのタイプがマトリクス特有の結合剤を有するプロセスを図示する。
【図８】図８は、多数の異なる結合剤が使用される、本発明の実施例を示す。
【図９】図９は、細胞ラップが一時的にだけ他の細胞ラップに付着する本発明の実施例を示す。
【図１０】図１０は、細胞ラップが他の細胞ラップに付着され、後で切断することにより除去される実施例を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１６１】
以下に、本発明が例により示されるが、これは、本発明の範囲を限定するものであると理解されるべきでは決してない。
【０１６２】
図１は、本発明によるプロセスの第１のステップを示す。支持構造体１０が供給され、その上に２つの側面（「フレーク」）１を持つ二次元の対象物１１が配置されるか、又は作られる。
【０１６３】
前記フレークは、外部刺激が付与されると平面状態から丸くなる状態に変形される材料を有する。その後、細胞１２が、前記フレークの一方の側（「細胞坦持側」）に播かれ、基板は細胞成長を可能にする条件下に保たれる。フレークが更に加工される前に、フレークは支持構造体から開放される。フレークの典型的寸法は、細胞の寸法のオーダーであるか、又は例えば１００ｘ１００μｍよりいくらか大きい。
【０１６４】
細胞がフレーク上にだけ存在し、フレークの間の基板上にないことは、図１から明らかである。細胞がフレーク間の間隙に定着することを回避するために、下の基板の表面は、細胞が表面に付着しないか、又は細胞が基板よりもむしろフレーク上で成長するための明確な好みを持つように変更され得る。しかしながら、場合によっては、細胞が基板上で成長する場合も問題ではない。フレークが開放されて丸められるとすぐに、残った細胞を持つ基板は放棄できる。
【０１６５】
ここで示されない幾つかの特別な例では、フレークの間の間隙に細胞を持つことは、有益でさえあり得る。例えば、幾つかの困難な細胞タイプは、成長のため、すなわち、適当な成長因子の作成のために共同フィーダー細胞を必要とする。これらのフィーダー細胞はフレークの間に播かれる一方、対象の細胞はフレーク上で成長する。
【０１６６】
図２は、本発明によるプロセスの次のステップを示す。細胞２１を持つフレーク２０は、波状の矢印により表わされる外部の刺激を受ける。
【０１６７】
例えば、前記刺激は、熱、ｐＨ―変化又は電磁波への露出から成る（詳しくは明細書を参照）。前記刺激を受けると、フレークの反応を誘発し、すなわちフレークが、それぞれの矢印により示されるように、平面状態から丸められた状態（「細胞ラップ」）に変形される。このように、上記で定義された細胞ラップができる。
【０１６８】
図３は、反応ヒドロゲル材料を含む二重層構造体を有する本発明による２つの細胞ラップの顕微鏡写真を示す。細胞ラップは、７００×１４００μｍサイズであり、丸められてほぼ５００μｍの直径を持つ。平面状態から細胞ラップ状態へフレークを変化させるために用いた刺激は、熱刺激であった。細胞ラップ動きを誘発するために、フレークは、室温で水浴に置かれた。室温で、反応ヒドロゲルは水で強い膨張を示し、結果として、パターン化されたフレークが基板から放出されて、丸められた。３３℃より上に水浴を加熱すると、ヒドロゲルは壊れ（ＰＮＩＰＡＡは、３３℃で低い下位の臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を持つ）、ヒドロゲル層が縮む。結果として、二重層は、３３℃より上で水浴を加熱すると丸みがとれて広がる。
【０１６９】
図４は、この例では２枚の層２及び３から成るフレークに結合剤を結合させる原理を示す。簡潔に説明するために、このアプリケーションに示されるフレーク及び細胞は、３枚以上の層を持ってもよいが、１又は２枚の層だけを持って表されている。
【０１７０】
細胞１は、フレークの上位層２上に成長する。前記結合剤４は、矢印で示され、フレークの下位層３、すなわち細胞を支えている側の反対側に結合されている。フレークが丸められた状態（細胞ラップ）へ変化すると、上述の結合剤が、これら細胞ラップの外側に配置され、上述のように、少なくとも一つの他の構成要素と細胞ラップを結合するために使用される。
【０１７１】
図４に示されるプロセスの変形例として、フレークが丸められる状態に変化してしまった後で、結合剤がフレークに結合できることが、言及されるべきである。結合剤及びそれらの補完的な対応物のための例が、表１に挙げられている。
【０１７２】
図５は、前記細胞―細胞ラップを他の構成要素に結合するために結合剤がどのように用いられるかを示す。図５Ａによると、相補的である異なる結合剤４及び５は、２つの異なる又は同様の細胞ラップを、共有結合又は非共有結合性結合６の形成の下で各々と結合するために使用され、これは特有であって高い親和性を持つ。
【０１７３】
図５Ｂによると、前記結合剤は、細胞ラップを、器官、組織、人工の足場材等のような細胞―細胞ラップとは異なる構成要素９と結合するために使用できる。相補的な結合剤７は、例えば、細胞ラップを特定の組織８への目標とするために使用できる。この目的のために、前記相補的な結合剤７は、例えば、細胞ラップの結合剤と相補的な組織特異的マーカーである。
【０１７４】
同様に、構成要素８は、例えば生分解性物質及び／又はコラーゲンを有する、生体外組織エンジニアリングのために使われる固体多孔質足場材の様な、三次元マトリクスの一部であってもよい。
【０１７５】
図６は、異なる結合特性を持つ異なる領域を含む細胞ラップに基づいた細胞アセンブリの形成を例証する。この例では、細胞ラップの外部層は、６つの交替領域から成り、この例では、そのうちの３つは結合剤Ａ（１４）を有し、残りの３つは結合剤Ｂ（１５）を有する。この例では、使用される細胞ラップ全てが、結合領域の同じパターンを持つことが重要である。結合剤Ａ及びＢは、その時、薬剤の化学性質に依存して、共有結合性又は非共有結合的に各々と結合し、よって細胞ラップのネットワークが形成できる。特定の状況の下で、結合プロセスが追加ステップなしで起こる、すなわち、結合プロセスが自己組立プロセスであることが重要である。
【０１７６】
図７は、所与の細胞ラップのタイプが、早くに説明された結合剤Ａ（１４）及びＢ（１５）があるにもかかわらず、相補的結合剤Ｄ（１７）を担持する３次元マトリクス８（例えば人間の器官、組織、足場材等）と細胞ラップを結合するためのマトリクス特有の結合剤Ｃ（「ホーム分子」；１６）を有するプロセスを図示する。細胞ラップがマトリクスと結合すると、Ａ及びＢと相補的な結合剤を担持する細胞ラップは、第１の細胞ラップに結合され、これは本実施例においてアンカー装置としてダブルに作用する。斯様な方法において、構造的人工組織がデザインできる。従って、結合剤Ｃは、細胞ラップを特に身体内のターゲット組織にガイドするために使用できるが、その後、結合剤Ａ及びＢは構造的態様で、新しい人工組織を構築するために使用できる。
【０１７７】
図７−Ｉでは、第１の細胞ラップ（「アンカー装置」）と結合される細胞ラップが同一である一方、図７−ＩＩは、細胞ラップが同一でない上述のプロセスの変形例を示す。例えば、左に示される細胞ラップは、タイプＢの結合剤だけを坦持する。
【０１７８】
これらの異なる細胞ラップは、より複雑な組織の生産を可能にする一方、特定の環境の下、プロセスは依然自己組織化プロセスでありえる。
【０１７９】
図８Ａは、複数の種々異なる結合剤１９−２２が、各々特定の細胞タイプを含む種々異なる細胞ラップ１３、２３の多様体を結合するために用いられる、本発明の他の実施例を示す。この実施例では、結合剤はオリゴヌクレオチドであり、ここで、細胞ラップ１３は、当該細胞ラップ１３とは異なる細胞を例えば有する細胞ラップ２３と結合している。オリゴヌクレオチド結合剤２０（ＴＴＡＧ）がオリゴヌクレオチド結合剤２１（ＡＡＴＣ）とは補完的である一方、オリゴヌクレオチド結合剤２２（ＧＣＣＡ）は以下の細胞ラップのオリゴヌクレオチド結合剤と補完的である等である。
【０１８０】
上述のオリゴヌクレオチドが、もちろんより長くありえるし、及び／又は二本鎖でありえるにもかかわらず、図８Ａのオリゴヌクレオチド結合剤は、一本鎖の四量体から成る（上記参照）。オリゴヌクレオチドが高い特異性（それらのシーケンスに従って）を持って互いに結合するので、よって、結合組合せの高い多様性が達成できる。４つのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、４４＝２５６のバリエーションで作られ得る一方、６つのヌクレオチドを持つオリゴヌクレオチドは、４６＝４０９６のバリエーションで作られ得る。これは、オリゴヌクレオチドが長いほど、結合剤の多様性がより高く、結合強さ及び特異性がより高いことを意味する。
【０１８１】
図８Ｂは、種々異なる細胞ラップの高い特別な結合の原理と、１つの細胞ラップの種々異なる結合分子の使用との組み合わせを示す。斯様な態様において、複数の細胞タイプを、内蔵されるべき人工組織の範囲内の特定の位置に持ってくることを可能にする細胞ラップの複雑なネットワークを構築することが可能である。
【０１８２】
図９Ａは、本発明の他の実施例を示す。ここで、細胞ラップは、一時的にのみ他の細胞ラップに付着する。これは、特定の結合６を切断するか、又は特定のリンカー２４を切断することにより達成でき、これは、ちょうどこの目的のために結合剤の１つに組み込まれていた。切断プロセスにより、前記リンカーは、２つの部分２５及び２６に分離される。
【０１８３】
これを達成するために、リンカーは、
（ｉ）ペプチダーゼ又はプロテアーゼにより特に加水分解できるペプチドであるか、
（ｉｉ）図９Ｂに図示されるように、リンカーは、ＥｃｏＲＩのような規制エンドヌクレアーゼにより特に切断できるオリゴヌクレオチドから成るか、又は図９Ｃに図示されるように、リンカーは、（上記を参照して、特に融解温度を低下させる薬剤及び／又は局所的な加熱手順の補助の下）加熱すると溶解するオリゴヌクレオチドから成り得る。
【０１８４】
プロセスの間に細胞ラップを取り除く可能性は、図１０に図示されるように、異なる細胞ラップのシーケンシャルな結合及び除去を可能にする。
【０１８５】
図１０Ａにおいて、細胞ラップが他の細胞ラップに付着され、後でまた切断により除去され、その後他の細胞ラップが加えられる。図１０Ｂによると、ある種の細胞ラップが加えられ、続いて他の種が加えられ、その後第１の細胞ラップは、切断により除去される。少なくとも理論的には際限なく、上述のプロセスは、変化できるし継続できる。
【図１】
2011527903.tif 000005
【図２】
2011527903.tif 000006
【図３】
2011527903.tif 000007
【図４】
2011527903.tif 000008
【図５Ａ】
2011527903.tif 000009
【図５Ｂ】
2011527903.tif 000010
【図６】
2011527903.tif 000011
【図７】
2011527903.tif 000012
【図７−Ｉ】
2011527903.tif 000013
【図７−ＩＩ】
2011527903.tif 000014
【図８Ａ】
2011527903.tif 000015
【図８Ｂ】
2011527903.tif 000016
【図９Ａ】
2011527903.tif 000017
【図９Ｂ】
2011527903.tif 000018
【図９Ｃ】
2011527903.tif 000019
【図１０Ａ】
2011527903.tif 000020
【図１０Ｂ】
2011527903.tif 000021
【国際調査報告】
2011527903.tif 000022
2011527903.tif 000023
2011527903.tif 000024
2011527903.tif 000025