(57)【要約】  本発明は、ＦＯＸＰ３遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置、特にその「上流」調節領域、特に遺伝子ｆｏｘｐ３のプロモーター領域及びＴＳＤＲ領域のメチル化状態を分析することを含み、分析された試料中の少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％の脱メチル化がＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の指標となる、哺乳動物のＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を同定する方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、並びに制御性Ｔ細胞の検出及び品質保証及び制御のための転写因子ＦｏｘＰ３の遺伝子の上記ＤＮＡメチル化分析の使用に関する。さらに、本発明は上記の方法を行うためのキット及びそれぞれの使用に関する。本発明は、採取直後でない血液又は血清試料といった品質が最適以下の試料からであっても正確な分析を可能にする、遺伝子ｆｏｘｐ３中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析する改善された方法をさらに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を同定する方法であって、ＴＳＤＲ領域等の該ｆｏｘｐ３遺伝子の１つ又は複数の調節領域における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、前記少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％又は少なくとも９２％以上の脱メチル化が、ＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の指標となる、方法。
【請求項２】
前記ＣｐＧ位置が、該遺伝子ｆｏｘｐ３のＣｐＧアイランド、プロモーター領域及び／又はＴＳＤＲ領域等の上流領域から選択される調節領域に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチル化状態の分析を、全血、パラフィン包埋組織、血液、組織、固形組織の画分、細胞又は組織の培養物、体液、器官、及びＴｒｅｇを含有することが疑われる他の試料の群から選択される試料中で行う、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記メチル化状態の分析が、メチル化特異的酵素消化、プロモーターメチル化、ＣｐＧアイランドメチル化、バイサルファイトシークエンシング、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ＰＣＲ及び／又はリアルタイムＰＣＲを含む方法を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記メチル化状態の分析が、配列番号４及び配列番号５並びに配列番号６及び配列番号７から選択されるプライマー対の少なくとも１つのプライマーを用いた増幅を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記メチル化状態の分析が、配列番号１８及び配列番号１９によるプローブのいずれかにより分析されるような少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態の分析を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ａ）パラフィン包埋試料等の哺乳動物起源の保存組織試料を準備する工程、
ｂ）前記試料のｆｏｘｐ３遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置におけるメチル化状態を分析する工程、及び
ｃ）前記試料中に存在する制御性Ｔ細胞の量を前記メチル化状態に基づいて同定する工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組織のＴｒｅｇ浸潤及びＦｏｘＰ３発現の状態に応じて組織状態を決定する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物の免疫状態を診断する方法であって、
ａ）診断を受ける前記哺乳動物に由来するＴ細胞を含有する試料を準備する工程、
ｂ）ｆｏｘｐ３遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析する工程、
ｃ）前記試料中に存在する制御性Ｔ細胞の量を前記メチル化状態に基づいて同定する工程、及び
ｄ）前記哺乳動物の免疫状態を同定された前記量に基づいて決定する工程を含み、１つの対立遺伝子における前記少なくとも１つのＣｐＧの脱メチル化が少なくとも９１％又は少なくとも９２％以上であることが、ＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の指標となる、方法。
【請求項１０】
前記ＣｐＧ位置が、該遺伝子ｆｏｘｐ３のＣｐＧアイランド、プロモーター領域又はＴＳＤＲ領域等の上流領域に位置する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記メチル化状態の分析を、全血、パラフィン包埋組織、血液、組織、固形組織の画分、細胞又は組織の培養物、体液、器官、及びＴｒｅｇを含有することが疑われる他の試料の群から選択される試料中で行う、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記制御性Ｔ細胞の量を、該制御性Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３発現を調節する、Ｔｒｅｇの量を変更する、又はＴｒｅｇ増加、Ｔｒｅｇレベル、Ｔｒｅｇ移動挙動若しくはＴｒｅｇ生存を調節することが疑われる化学的及び／又は生物学的物質に応じて測定及び／又はモニタリングすることをさらに含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｔ細胞、幹細胞若しくは前駆細胞におけるｆｏｘｐ３発現、又はｔｒｅｇの増殖、分化、生存及び細胞死を調節する化学的及び／又は生物学的物質、及び／又は培養条件を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、前記化学的及び／又は生物学的物質の１つ又は複数をＴ細胞と接触させること、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を行うこと、並びに前記化学的及び／又は生物学的物質又は条件が分析されたＣｐＧ位置のメチル化を調節するか否かを検出することを含み、前記物質又は条件が該分析されたＣｐＧ位置の脱メチル化を少なくとも９０％又は９１％又は９２％増大させる、方法。
【請求項１４】
制御性Ｔ細胞を該遺伝子ｆｏｘｐ３中のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するキットであって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を行うための材料を含む、キット。
【請求項１５】
ＦｏｘＰ３陽性制御性Ｔ細胞又はＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を、検出及び／又は同定するための、請求項１４に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＯＸＰ３遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置、特にその「上流」調節領域、特に遺伝子ｆｏｘｐ３のプロモーター領域及びＴＳＤＲ領域のメチル化状態を分析することを含み、分析された試料中の少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％の脱メチル化がＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の指標となる、哺乳動物のＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を同定する方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、並びに制御性Ｔ細胞の検出及び品質保証及び制御のための転写因子ＦｏｘＰ３の遺伝子の上記ＤＮＡメチル化分析の使用に関する。さらに、本発明は上記の方法を行うためのキット及びそれぞれの使用に関する。本発明は、採取直後でない血液又は血清試料といった品質が最適以下の試料からであっても正確な分析を可能にする、遺伝子ｆｏｘｐ３中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析する改善された方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ（単数又は複数））は、一方で無害な自己抗原及び外来抗原に対する寛容を確立することと、他方で有害な抗原に対する拮抗作用をもたらすこととの橋渡し役としてのその役割から免疫学的研究の主要な焦点となっている。Ｔｒｅｇレベルの増大が多くのヒト癌において確認されている。このことは、Ｔｒｅｇレベルの調節不全が腫瘍細胞に対する過度の寛容につながるという理論を推進した。免疫反応を低下させるというＴｒｅｇの性質も、免疫系の調節を含む治療戦略に重要である。
【０００３】
転写因子Ｆｏｘｐ３は制御性Ｔ細胞において特異的に発現され、これらの細胞の発生及び機能のマスタースイッチとして機能すると考えられている。近年、通常の（conventional）Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の異所性発現が活性抑制をもたらすことが実証された（非特許文献１）。
【０００４】
Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の大部分は、胸腺内でのＴ細胞発生過程で生成され、個別の系統を示すと考えられている。また、Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞が、免疫寛容を生じる条件下での抗原認識時にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で通常のＴ細胞から生じることも報告されている。いかなる場合でも、Ｆｏｘｐ３の発現は制御性Ｔ細胞の発生に特徴的なものである。
【０００５】
どのシグナルがＦｏｘｐ３の発現につながるかについてはほとんど不明ではあるが、ＴＧＦ−βを含む幾つかの因子が通常のＴ細胞においてＦｏｘｐ３発現を誘導することが報告されている。しかしながら、ＴＧＦ−β誘導がＴｒｅｇへの完全な分化をもたらすか、又は抑制表現型の有無を問わず、単にＦＯＸＰ３を一時的にしか発現しないＴ細胞をもたらすかについては不明である。したがって、本発明の出発点は、安定な抑制表現型を有するＴ細胞に明らかに関連する表現型を探求することであった。
【０００６】
Ｔｒｅｇレベルのモニタリングに対する障害の１つは、現行の最良の検出法であるＦＯＸＰ３及びＣＤ２５のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の分析では、Ｔｒｅｇ及び活性化Ｔ細胞の両方が検出されるため、これらの表現型を区別することが不可能であるということである。
【０００７】
高等生物は、個体のほとんどの細胞がＤＮＡコードの全く同じ相補体を含有するにもかかわらず、様々な組織型において異なるパターンの遺伝子発現を行い、維持する必要がある。大抵の遺伝子調節は細胞の現状に応じた一時的なものであり、外部刺激によって変化する。一方で、持続的な調節は、エピジェネティクス（ＤＮＡの基本的な遺伝コードを変更しない遺伝的な調節パターン）の基本的法則（role）である。ＤＮＡメチル化は後成的調節の典型的な形態であり、安定な細胞記憶として機能し、様々な細胞型の長期同一性を維持するうえで重要な役割を果たす。
【０００８】
メチル化の主要な標的は、２ヌクレオチド配列であるシトシン−グアニン（「ＣｐＧ部位」）であり、この状況でシトシン（Ｃ）は簡単な化学修飾を受けて５−メチル−シトシンとなる場合がある。ヒトゲノムにおいては、ＣＧ配列は或る特定の比較的密なクラスター（「ＣｐＧアイランド」と呼ばれる）以外については予想されるよりもはるかに稀である。ＣｐＧアイランドは遺伝子プロモーターと関連することが多く、ヒト遺伝子の半数以上がＣｐＧアイランドを有すると推定されている（非特許文献２）。
【０００９】
異常なＤＮＡメチル化は、しばしば健常細胞から癌性細胞への形質転換を伴う。観察される影響には、ゲノム規模での低メチル化、腫瘍抑制遺伝子のメチル化の増大及び多くの癌遺伝子の低メチル化がある（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５に概説される）。メチル化プロファイルは腫瘍特異的である（すなわち、特定の遺伝子又はさらには個々のＣｐＧのメチル化パターンの変化は、特定の腫瘍型の診断に用いられる）ことが認識されており、現在では、膀胱癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、肺癌及び前立腺癌の大規模な診断マーカー群が存在する（非特許文献５に要約される）。
【００１０】
Chen et al.（非特許文献６）は、制御性ＣＤ２５（高）ＣＤ４  Ｔ細胞のマーカーとしてＦｏｘＰ３タンパク質発現を記載している。
【００１１】
特許文献１には、細胞、組織又は核から単離したＤＮＡのメチル化パターンについての情報を収集すること、及び得られた情報を分析することを含む、細胞、組織又は核を同定する方法が記載されている。
【００１２】
特許文献２は、Ｔ細胞の亜群を記載しており、それらを制御性Ｔ細胞として規定する特徴に関する。該出願には、かかるＴ細胞の使用、それらを含む組成物及び免疫応答調節の際にそれらを動員するケモカインも記載されている。
【００１３】
最後に、特許文献３には、遺伝子ｆｏｘｐ３、又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、哺乳動物のＦｏｘＰ３陽性制御性Ｔ細胞、好ましくはＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を同定する方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、並びに制御性Ｔ細胞の検出及び品質保証及び制御のための、転写因子ＦｏｘＰ３の遺伝子のＤＮＡメチル化分析の使用が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】欧州特許第１２１３３６０号
【特許文献２】国際公開第２００４／０５０７０６号
【特許文献３】欧州特許第１８２６２７９号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Fontenot and Rudensky, Nat Immunol 6:331-337,2005
【非特許文献２】Antequera andBird, Proc Natl Acad Sci U S A.90:11995-9, 1993
【非特許文献３】Jones and Laird, Nature Genetics 21:163-167,1999
【非特許文献４】Esteller, Oncogene21:5427-5440, 2002
【非特許文献５】Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003
【非特許文献６】Chen L, Cohen AC, Lewis DB. ImpairedAllogeneic Activation andT-helper 1 Differentiation of Human Cord Blood NaiveCD4 T Cells. Biol Blood Marrow Transplant. 2006Feb;12(2):160-71
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上記を鑑みると、哺乳動物から得られる、及び／又は哺乳動物における安定なＦｏｘＰ３陽性制御性Ｔ細胞、好ましくはＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を、より便利かつ確実に同定するための優れた手段（tool）として、ＤＮＡメチル化分析に基づく改善された方法を提供することが本発明の一目的である。さらに、確実な表現型の検出は、純度、保存性（storage）、また或る程度は組織の品質とは無関係に利用可能でなくてはならない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、その第１の態様によると、哺乳動物のＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を同定する方法であって、ｆｏｘｐ３遺伝子の１つ又は複数の調節領域、特に（かつ好ましくは）遺伝子ｆｏｘｐ３のＴＳＤＲ領域における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％の脱メチル化が、ＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の指標となる、方法を提供することによって上記の目的を解決する。「少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％の脱メチル化」という用語は、細胞における１つの対立遺伝子中の（分析された）１つの個々のＣｐＧの脱メチル化レベルが９０％以上であることを意味するものとする。上記ＣｐＧ位置は、遺伝子ｆｏｘｐ３の調節領域、例えばＣｐＧアイランド領域（複数可）、プロモーター領域若しくはＴＳＤＲ領域（例えば配列番号１による）といった転写開始部位の上流の領域、又は（好ましくは少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％の）脱メチル化が、ＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の指標となる、ｆｏｘｐ３遺伝子座中に含有される任意の他の配列に位置し得る。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施の形態では、哺乳動物における、例えば特にヒト試料（血液の全血画分、新鮮組織若しくは凍結組織、パラフィン包埋組織及び／又は培養物等）、並びに他の体液、Ｔｒｅｇを含有することが疑われる任意の所与の（固形）組織、器官又は細胞型におけるＴｒｅｇレベルをモニタリングする新規かつより特異的な方法をさらに提示する。
【００１９】
本発明のアッセイは、Ｔｒｅｇ（ＴＳＤＲ、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域）中に見られるＦＯＸＰ３プロモーターの特異的脱メチル化に基づく。本発明者らは、簡単かつ正確な定量ＰＣＲ方法を用いて、ＦＯＸＰ３脱メチルが活性化ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞の同時測定（co-measurement）を回避するＴｒｅｇ数の代理マーカーとなることを示す。このアッセイの精度及び品質を様々な研究で示した。血液に関しては、該方法を精製血液細胞亜型、固形腫瘍及び健常固形組織においてＩＬ２免疫療法設定下で検証した。本発明者らはこのようにして、安定な、潜在的にＦＯＸＰ３陽性の、（大抵は）機能的に抑制性の制御性Ｔ細胞の存在に機能的に関与するか、又は無条件に（mandatorily）関連するＦｏｘｐ３遺伝子内の特定の領域を同定した。好ましい一実施の形態では、特に好適な一領域は、プロモーター又は例えば配列番号１によるヌクレオチド配列を示すＴＳＤＲである。
【００２０】
本発明者らは、Ｆｏｘｐ３＋細胞において、上記のモチーフ中のＣｐＧがほぼ完全に（すなわち７０％超、好ましくは８０％、好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超）脱メチル化されている一方で、Ｆｏｘｐ３−細胞においては同じモチーフが完全にメチル化されていることをさらに実証することができた。Ｔｒｅｇ表現型（実際の抑制表現型）とＦｏｘＰ３脱メチル化との相関が最良ではある（脱メチル化がＦｏｘＰ３の安定な長期の発現（したがって安定なＴｒｅｇ）を示す）が、上述の領域内のＣｐＧモチーフの差次的（differential）メチル化は、Ｆｏｘｐ３発現と相関し、抑制を一時的にしか、又は全くもたらさない一時的発現とは相関しないようである。したがって、ｆｏｘｐ３遺伝子座のメチル化状態の決定は、制御性Ｔ細胞の安定な集団を同定するうえで有益な手段であり、例えば、所望される任意の想定され得る状況下での自己免疫疾患、移植片拒絶反応、癌、アレルギー又はＴｒｅｇ関連免疫状態の診断においてＴｒｅｇを測定するのに必要とされるか、又は少なくとも幾らか有用である。本発明によるアッセイは、精製又は任意の染色手順なしにＴｒｅｇを同定するための測定を可能にする。この測定は固形腫瘍又は他の固形組織においても奏功する。
【００２１】
本発明は、ＦｏｘＰ３遺伝子の特定の領域、いわゆる「ＴＳＤＲ」（Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域）において、ＣｐＧモチーフがほぼ完全に（すなわち９０％超、好ましくは９１％、好ましくは９２％超、最も好ましくは９５％超）脱メチル化されている一方で、全ての非Ｔｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３−細胞）においては同じモチーフが完全にメチル化されているという驚くべき発見を基にしている。したがって、この領域は、本発明による診断分析に対して有益かつ確実な手段を与えるものである。驚くべきことに、メチル化は必ずしも遺伝子発現と１対１で関連するものではなく、むしろ実際の細胞型機能、すなわち抑制表現型と関連している。
【００２２】
本発明者らは以前に、ヒト及びマウスの両方で、天然のＴｒｅｇにおけるＦｏｘＰ３の構成的発現が常に後成的調節、すなわちＤＮＡメチル化に基づく調節と同時に起こることを示した。ＤＮＡメチル化は生物学的かつ化学的に安定な後成的修飾であり、長期の遺伝子発現変化をもたらす。ヒトのＦＯＸＰ３遺伝子座での脱メチル化は、全ての主要な末梢血細胞型について試験し、非血液細胞を選択したところ、Ｔｒｅｇに限定されることが分かった。Ｔｒｅｇに対する高い特異性の他にも、ＦｏｘＰ３脱メチル化が天然のＴｒｅｇにおいてのみ起こり、ＦｏｘＰ３を一時的に発現する活性化されたＴ細胞においては起こらないことが観察された。これは、Ｔｒｅｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増加の際の安定なＦＯＸＰ３発現とさらに関連していた。これらのデータによって、ＦｏｘＰ３遺伝子座における後成的修飾が、活性化Ｔ細胞ではなく、安定なＴｒｅｇ表現型を有する細胞の同定に対する有益なマーカーとなることが示された。
【００２３】
本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記メチル化状態の分析は、配列番号（SEQ ID No. SEQ
ID No.）２〜配列番号１７、特に配列番号４及び配列番号５から選択されるプライマー対の少なくとも１つのプライマーを用いた増幅を含む。
【００２４】
好ましくは、例えばＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ、ＭＳ−ＳＮＵＰＥ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、シークエンシング、メチル特異的制限アッセイ等、及びそれらの組み合わせ、例えばプローブに基づく検出と併用したＭＳＰ（プローブはメチル化特異的であっても（Ｍｅｔｈｙｌｉｇｈｔ）、又はメチル化非特異的であってもよい）等の状況における増幅には、ポリメラーゼ酵素、ＰＣＲ増幅反応若しくは化学的増幅反応、又は下記に記載されるような当業者に既知の他の増幅方法が含まれる。増幅によって、本発明による方法（複数可）を行うための特に好ましい「手段」である、ＦｏｘＰ３遺伝子又は本明細書中に記載されるような任意のパラログ若しくはオーソログ中のＴＳＤＲ又は任意の他の領域の単位複製配列が生成される。結果として、配列番号２〜配列番号１１のいずれかによるオリゴマー、又は配列番号４及び配列番号５から選択されるプライマー対によって増幅される単位複製配列は、配列番号１８及び配列番号１９又はＦＯＸＰ３遺伝子座中の他の好適な配列に従うプローブと共に、本発明の好ましい実施の形態を構成する。
【００２５】
当業者であれば、分析すべき部位、例えば配列番号１又はＦｏｘＰ３遺伝子座中の他の好適な配列（プロモーター配列等）上に存在する全ての部位の量を最小限にするために、ＣｐＧ位置の特異的サブセットをさらに選択することが可能である。
【００２６】
ＣｐＧ位置（単数又は複数）のメチル化状態を分析するために、ＤＮＡメチル化を分析する任意の既知の方法を用いることができる。本発明による方法の好ましい実施の形態では、メチル化状態の分析は、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧアイランドメチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥから選択される分析、又は増幅ＤＮＡの検出に基づく他の方法を含む。これらの方法は当業者に既知であり、それぞれの文献中に見ることができる。
【００２７】
本発明による方法は、ｆｏｘｐ３遺伝子又はそのオーソログ若しくはパラログを有する任意の哺乳動物を用いて行うことができる。本発明による方法において、上記哺乳動物がマウス、ラット、齧歯類、イヌ、ネコ、ブタ、サル又はヒトであるのが好ましい。
【００２８】
本発明の別の態様では、本発明による方法はＴＧＦ−β、他のサイトカイン又はサイトカイン様タンパク質、機能的サイトカイン等価物等による誘導をさらに含む。治療アプローチにおける制御性Ｔ細胞及び他の白血球の適用に関する重要な問題は、多数の細胞の利用可能性、又はサイトカイン投与（cytokine challenge）によってｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで誘導され得る様々な種類の白血球細胞型の生成である。近年の刊行物では、通常のＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴＧＦ−βの存在下での刺激によってＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞に変換され得ることが報告されている（Chen W, Jin W, Hardegen N, Lei KJ, Li L, Marinos N, McGrady G, Wahl
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【００２９】
本発明の別の態様では、本発明は、哺乳動物の免疫状態を診断する方法であって、ａ）診断を受ける上記哺乳動物に由来するＴ細胞を含有する試料を得る工程、ｂ）上記Ｔ細胞における遺伝子ｆｏｘｐ３、又は本発明によるそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析する工程、ｃ）上記試料中に存在する制御性Ｔ細胞の量を上記メチル化状態に基づいて同定する工程、及びｄ）上記哺乳動物の免疫状態を同定された上記量に基づいて決定する工程を含む、方法を提供する。この特定の方法の一態様では、（例えば全血、任意の他の完全な組織、予め選別した又は選別した任意の組織の亜画分（例えばバフィーコート等の血液）、制御性Ｔ細胞及び非制御性細胞の２つの細胞型のうち少なくとも一方を含有する器官又は細胞の）試料中の細胞の全集団を、そのｆｏｘｐ３遺伝子におけるメチル化状態について分析する。部位の全体的なメチル化頻度に基づいて、分析した集団内での制御性Ｔ細胞の比率及び／又は量を決定することができる。上記結果から、診断を受ける哺乳動物の免疫状態及び／又はＴ細胞状態について結論付けることができる。該方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。概して、好適なＴ細胞を含有する限り、全ての生物学的試料を使用することができる。該方法において、上記試料が血液試料、バフィーコート試料、血中リンパ球若しくはその画分の試料、又は生検試料、又は体液であるのが好ましい。
【００３０】
本発明による方法は、ｆｏｘｐ３遺伝子又はそのオーソログ若しくはパラログを有する任意の哺乳動物を用いて行うことができる。本発明による方法において、上記哺乳動物がマウス、ラット、サル又はヒトであるのが好ましい。該方法において、上記哺乳動物が自己免疫疾患、同種移植レシピエントにおける副作用、腫瘍性疾患、卵巣癌、慢性移植片対宿主病、アレルギー性ぜんそく、ハンセン病及び多発性硬化症から選択される疾患を患う患者であるのが好ましい。
【００３１】
さらに好ましくは、該方法において、制御性Ｔ細胞の量が分析されたＣｐＧ位置の少なくとも９０％、好ましくは９１％、より好ましくは９２％の脱メチル化に相当する。
【００３２】
上記制御性Ｔ細胞の量又は比率を、好ましくは制御性Ｔ細胞におけるｆｏｘｐ３発現を調節する化学的及び／又は生物学的物質に応じて測定及び／又はモニタリングすることをさらに含む方法がさらにより好ましい。すなわち、例えば、（例えば本明細書中に記載されるような）疾患の治療、並びに制御性Ｔ細胞に対する影響についての上記治療の成功及び／又は進行によって引き起こされる制御性Ｔ細胞の量又は比率における変化を、この方法を用いて追跡することができる。測定される試料におけるＦｏｘＰ３マーカーのメチル化パターンの追跡調査は、場合によっては表現型の変化が観察され得る前であっても、上記化学的及び／又は生物学的物質に対する応答による細胞における変化を示す。
【００３３】
本発明のさらに別の態様では、本発明は、Ｔｒｅｇを所望の成分又は推定汚染物質（すなわち医学上の意図に反する）として含有し得る、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成又は増加させた制御性Ｔ細胞又は他の細胞移植片の患者への移植に対する適合性を決定する方法であって、本発明による方法、及び分析されたＣｐＧ位置が少なくとも９０％、好ましくは９１％、より好ましくは９２％脱メチル化されているか否かを検出することを含む、方法を提供する。該方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。例えば、ｆｏｘｐ３  ＣｐＧメチル化の変化、特に低下を示すように思われるＴ細胞は、通常は安定であるとは見なされず、さらに使用されることはない。
【００３４】
本発明のさらに別の態様では、本発明は、Ｔ細胞におけるｆｏｘｐ３メチル化を調節する化学的及び／又は生物学的物質を同定する方法であって、上記化学的及び／又は生物学的物質の１つ又は複数をＴ細胞と接触させること、上記のような本発明による方法を行うこと、並びに上記化学的及び／又は生物学的物質が分析されたＣｐＧ位置のメチル化を調節するか否かを検出することを含む、方法を提供する。該方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。この態様では、本発明は、抑制Ｔ細胞型の長期表現型（本明細書中で「Ｔｒｅｇエピジェノタイプ」とも称される）の指標となるｆｏｘｐ３脱メチル化を調節する化学的及び／又は生物学的物質の同定を図る方法（「スクリーニング方法」と呼ばれる場合もある）を包含する。同定されたこれらの物質を、制御性Ｔ細胞に特異的な薬物及びそれぞれの医薬組成物の開発の出発点として使用することができる。
【００３５】
本発明のアッセイは、マーカーＦｏｘＰ３の遺伝子発現を（直接的に）検出するのではなく、ＦｏｘＰ３の遺伝子の短期若しくは長期の、又は安定した（stabilizing）活性化の一般的特徴をメチル化分析によって検出することによってＴｒｅｇを検出する代替方法に基づく。これは、「アナログ」方式の変化（「なし」から「少し」、「もう少し」、「たくさん」．．．）を示し、また、Ｔｒｅｇへの決定的なコミットメントの「前」であっても、それがなくとも或る程度（extend）まで現れる発現の測定とは対照的である。
【００３６】
本方法は、ｆｏｘｐ３遺伝子が制御性Ｔ細胞の発生に中心的な役割を果たすことが広く認められているという事実にさらに基づく。したがって、Ｆｏｘｐ３発現を調節する因子も、自己免疫疾患又は同種移植レシピエントを治療するうえで興味深い手段である。
【００３７】
Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞は強い抗腫瘍応答を予防することが示されており、したがって、Ｔｒｅｇの産生／活性を阻害する因子も腫瘍患者の治療にとって興味深い。かかる因子（Ｆｏｘｐ３メチル化の安定な修飾、したがって安定なＴｒｅｇをもたらす）は、本発明において記載される方法を用いて検出することができる。
【００３８】
さらに、制御性Ｔ細胞の分化を増進し、自己免疫障害及びアレルギー性障害の緩和をもたらす因子は、本方法を用いて同定することができる。スクリーニング化合物として好適な化学的及び／又は生物学的物質は当業者に既知であり、例えば小分子、ペプチド及びタンパク質、並びに抗体又はその断片を含む。さらに、スクリーニングは市販の（commercially）化合物ライブラリを、最適にはロボット等の好適な自動装置と共に用いて行うことができる。化学的及び／又は生物学的物質を同定する方法の好ましい一実施の形態では、上記物質は分析されたＣｐＧ位置の少なくとも９０％、好ましくは９１％、より好ましくは９２％の脱メチル化をもたらす。
【００３９】
ＦｏｘＰ３の発現は、卵巣癌における予後不良と関連することが記載されている（Wolf, D., et al. The expression of the regulatory T cell-specific
forkhead box transcription factor FoxP3 is associated withpoor prognosis in
ovarian cancer. Clin. Cancer Res.11 (23), 8326-8331
(2005)）。ＦｏｘＰ３の高い発現レベルは卵巣癌と関連する。さらに、制御性Ｔ細胞転写因子ＦＯＸＰ３の遺伝子発現は慢性移植片対宿主病患者において減少した（Zorn, E., et al. Reduced
frequency of FOXP3+ CD4+CD25+ regulatory Tcells in patients with chronic graft-versus-host
disease. Blood 106 (8),2903-2911 (2005)）。また、アレルギー性ぜんそくにおけるＦｏｘＰ３の役割が記載されている（Schmidt-Weber, CB. and Blaser, K. The roleof the FOXP3 transcription factor in the immune regulation
of allergic asthma. Curr Allergy Asthma Rep 5 (5), 356-361 (2005)）。
【００４０】
したがって、本発明による別の好ましい方法は、異常な（又は望ましくない）数のＴｒｅｇと関連する疾患を診断する方法であって、本発明による方法、及び分析されたＣｐＧ位置が少なくとも９０％、好ましくは９１％、より好ましくは９２％脱メチル化されているか否かを検出することを含み、疾患が自己免疫疾患、同種移植レシピエントにおける副作用、腫瘍性疾患、卵巣癌、慢性移植片対宿主病、アレルギー性ぜんそくから選択される、方法である。本方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができ、特にヒトの系におけるＦｏｘＰ３の一時的発現が活性化された非制御性Ｔ細胞においても検出されているため（Ziegler SF. FOXP3: Of Mice and Men. AnnuRev Immunol. 2005 Dec 1）、パラメータＦｏｘＰ３のより具体的な測定を可能にする。
【００４１】
本発明の別の好ましい態様は、制御性Ｔ細胞を遺伝子ｆｏｘｐ３中のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するキットであって、本発明による方法を行うための材料を含む、キットに関する。本発明による好ましい一実施の形態では、該キットは、ａ）バイサルファイト試薬、及びｂ）ＦｏｘＰ３遺伝子のＴＳＤＲ又は他の好適な領域（プロモーター領域等）中のＣｐＧ位置のメチル化分析のための材料を含む。当業者であれば、分析すべき部位、例えば配列番号１による単位複製配列上に存在する全ての部位（又は遺伝子中の他の好適なＣｐＧ含有領域）の量を最小限にするために、ＣｐＧ位置の特異的サブセット用の材料をさらに選択することが可能である。該キットは診断用キットであってもよい。
【００４２】
本発明によるキットは、１．細胞試料を処理するための化学物質（バイサルファイト等）；２．手順書；３．オリゴヌクレオチドプローブ、単位複製配列、バイサルファイト処理バージョン若しくは非バイサルファイト処理バージョンの鋳型ＤＮＡ、遮断剤及び／又は伸長プライマー、並びに酵素、特定の細胞型に関連するマーカーを検出する、本発明による器具（カラム、管等を含む）（オリゴヌクレオチドは、標準ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）又は一塩基伸長法（ＳＢＥ）、シークエンシングといった一般に利用可能な検出プラットフォーム上でシグナルを発生するように構成され得る。各々のシグナルは、試料中の特定の標的部位でのメチル化レベルを示す。代替案として、記載の核酸に従うプローブをチップ上で使用するために作製する場合もある）；４．結果を処理するためのバイオインフォマティクス手段（これ（例えばソフトウェア）は、生データからシグナルを正規化する、読出し値を解釈するための結果の行列を含有する、又は例えば細胞型の割合を算出するか、若しくは効力を予測する様々なアルゴリズムを実行するものであり得る）も含有し得る。
【００４３】
本発明のさらに別の好ましい態様は、上で記載したものと同様のＦｏｘＰ３陽性制御性Ｔ細胞、好ましくはＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を検出及び／又は同定するための本発明によるオリゴマー、プローブ若しくは単位複製配列若しくは鋳型ＤＮＡ、又は本発明によるキットに関する。
【００４４】
本発明のさらに別の好ましい態様は、Ｆｏｘｐ３発現に関連する疾患、例えば自己免疫疾患、同種移植レシピエントにおける副作用、腫瘍性疾患、卵巣癌、慢性移植片対宿主病、アレルギー性ぜんそく、多発性硬化症等を治療する方法に関する。該方法は、有効量の安定なＦｏｘＰ３陽性制御性Ｔ細胞、好ましくはＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞をそれを必要とする上記患者に投与することを含む。有効量の安定なＦｏｘＰ３陽性制御性Ｔ細胞、好ましくは安定なＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を投与する方法は、文献（例えば、Bharat A, Fields RC, Mohanakumar T.Regulatory T cell-mediated
transplantation tolerance. ImmunolRes.
2006;33(3):195-212、June CH, Blazar BR. Clinical
applicationof expanded CD4(+)25(+) cells. Semin
Immunol. 2006 Jan 31、Khazaie K, von BoehmerH. The
impact of CD4(+)CD25(+) Treg on tumor specificCD8(+) T
cell cytotoxicity and cancer. Semin CancerBiol. 2006 Apr;16(2):124-136. Epub
2006 Jan 26.、及びそれらに引用される参考文献）に記載されており、当業者であれば本発明の状況下でこれらの方法を適用することが可能である。「治療」という用語は上記Ｆｏｘｐ３発現関連疾患の予防も含む。
【００４５】
本発明のさらに別の好ましい態様は、疾患を治療する方法であって、上記の本発明による方法、及び上記方法で上記患者におけるＴｒｅｇ数の低下が検出された場合にＴｒｅｇを投与すること、又は上記方法で上記患者におけるＴｒｅｇ数の上昇が検出された場合にＴｒｅｇ数を低下させる薬物を投与することを含む。治療される疾患の好ましい例は、自己免疫疾患（上記患者においてＴｒｅｇ数の低下が検出される）、及び腫瘍性疾患（上記患者において正常よりも高いＴｒｅｇ数が検出される）である。好ましくは、本発明による方法は、Ｔｒｅｇ数を低下させる薬剤を、例えば直接薬（低用量シクロホスファミド（cyclophosohamide）、サリドマイド（thalodomide）、Ｏｎｔａｋ等）として、又は例えばペプチドワクチン（peptide based vaccine）、ヒト化抗体若しくはマウス抗体、及び／又は抗イディオタイプモノクローナル抗体等による改善された癌ワクチン接種戦略のための誘導物質として投与するためのいわゆる「コンパニオン診断」として使用することができる。
【００４６】
本発明のさらに別の好ましい態様は、癌の転帰を予後判定及び／又は予測する方法であって、本発明による方法、及び上記癌の転帰を検出されたＴｒｅｇ数に基づいて予後判定及び／又は予測することを含み、分析された試料中の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの数の増大が、上記癌の転帰の予後を規定する（prognostic）及び／又は予測に役立つ（predictive）、方法に関する。好ましくは、上記試料は腫瘍組織であり、上記疾患は卵巣癌である。
【００４７】
本発明のさらに別の好ましい態様は、細胞集団がＦｏｘＰ３遺伝子を安定に発現するか否かを予測するために、ＴＳＤＲ領域又はｆｏｘｐ３遺伝子座内の任意の他の好適な領域のメチル化状態を分析する方法に関する。したがって、この方法は、自己免疫疾患を患っているか、又は同種移植を受けた患者への養子移入の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成及び／又は増加させた制御性Ｔ細胞の品質管理として使用することができる。ＣｐＧモチーフが或る程度（例えば９０％超、好ましくは９５％超、より好ましくは９８％超）脱メチル化されている場合に限り、これらの細胞がＦｏｘｐ３遺伝子を安定に発現し、一定期間が経ってもｆｏｘｐ３発現を失う（loose）ことがないと確信することができる。後者のシナリオは、養子移入細胞がＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞からエフェクター細胞へと変換される場合があり、これが病状の悪化につながる恐れがあるため禁忌である。したがって、かかる状況においては、養子移入細胞の制御性表現型の安定性に関する品質管理は絶対に必須なものであり、Ｆｏｘｐ３遺伝子座の上述の領域（複数可）のメチル化状態を分析することによって容易に達成することができる。
【００４８】
本発明の別の態様では、本発明は、哺乳動物における皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）を診断する方法であって、本発明による方法を行う工程、及びＣＤ２５＋＋細胞の量をＦｏｘＰ３遺伝子のメチル化状態に基づいて検出する工程を含む、方法を提供する。本発明のさらに別の好ましい態様は、ＣＴＣＬを治療する方法であって、ａ）哺乳動物をＣＴＣＬに対する好適な薬剤（ＯＮＴＡＫ等）で処理すること、ｂ）上記の本発明による方法を行うこと、並びに上記ＣＴＣＬの治療における上記薬剤の効力を、ＦｏｘＰ３遺伝子のメチル化状態に基づいて同定されたＣＤ２５＋＋細胞の量に基づいて予後判定及び／又は予測することを含む、方法に関する。上記方法の一実施の形態では、担当医は、少なくとも部分的に上記本発明の方法を用いて得られた結果に基づいて、さらなるＣＴＣＬの治療（例えば、ＯＮＴＡＫのさらなる使用又は中止）を決めることができる。
【００４９】
本発明のさらに別の好ましい態様は、悪性黒色腫を治療する方法であって、歩哨リンパ節から得られる試料中のＴｒｅｇの量、存在及び／又は数を、本発明によるＦｏｘＰ３遺伝子のメチル化状態に基づいて検出すること、及び同定されたＴｒｅｇの量、存在及び／又は数に基づいて上記悪性黒色腫の治療を継続／中止することを含み、Ｔｒｅｇの量、存在及び／又は数の変化が再発の高い可能性の指標となる、方法に関する。
【００５０】
手短に述べると、本発明は、哺乳動物のＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を同定する方法であって、ＴＳＤＲ領域等の該ｆｏｘｐ３遺伝子の１つ又は複数の調節領域における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、上記少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％の脱メチル化が、ＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の指標となる、方法に関する。好ましくは、上記ＣｐＧ位置は、遺伝子ｆｏｘｐ３のＣｐＧアイランド、プロモーター領域及び／又はＴＳＤＲ領域等の上流領域から選択される調節領域に位置する。
【００５１】
さらに好ましくは、本発明による方法において、１つの細胞における１つの対立遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧの脱メチル化が少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％以上であることが、ＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の指標となる。
【００５２】
好ましくは、上記制御性Ｔ細胞は安定な制御性Ｔ細胞である。
【００５３】
本発明による方法は、全血、パラフィン包埋組織、血液、組織、固形組織の画分、細胞又は組織の培養物、体液、器官、及びＴｒｅｇを含有することが疑われる他の試料の群から選択される試料中で有利に行うことができる。上記メチル化状態の分析は、メチル化特異的酵素消化、プロモーターメチル化、ＣｐＧアイランドメチル化、バイサルファイトシークエンシング、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ、ＰＣＲ及び／又はリアルタイムＰＣＲを含む方法を含み得る。
【００５４】
好ましくは、上記メチル化状態の分析は、配列番号４及び配列番号５並びに配列番号６及び配列番号７から選択されるプライマー対の少なくとも１つのプライマーを用いた増幅を含む。好ましくは、上記メチル化状態の分析は、配列番号１７及び配列番号１８によるプローブのいずれかによって分析される少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態の分析を含む。
【００５５】
さらに好ましくは、本発明による方法において、上記哺乳動物がマウス、ラット、齧歯類、イヌ、ネコ、ブタ、サル又はヒトである。本発明による方法が、ＴＧＦ−β又は他のサイトカイン様因子を用いた誘導をさらに含むのがさらに好ましい。
【００５６】
本発明による方法が、ａ）パラフィン包埋試料等の哺乳動物起源の保存組織試料を準備する工程、ｂ）上記試料のｆｏｘｐ３遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置におけるメチル化状態を分析する工程、及びｃ）上記試料中に存在する制御性Ｔ細胞の量を上記メチル化状態に基づいて同定する工程を含むのが特に好ましい。保存組織試料とは、分析される哺乳動物起源から新たに採取したのではない試料を意味し、上記試料は、全血、パラフィン包埋組織、血液、組織、固形組織の画分、細胞又は組織の培養物、体液、器官、及びＴｒｅｇを含有することが疑われる他の試料の群から選択され得る。パラフィン包埋組織、血液、組織、固形組織の画分、細胞又は組織の培養物の試料が好ましい。好ましくは、上記方法は、上記組織のＴｒｅｇ浸潤及びＦｏｘＰ３発現の状態に関して組織状態を決定することをさらに含む。
【００５７】
本発明の別の態様は次に、哺乳動物の免疫状態を診断する方法であって、ａ）診断を受ける上記哺乳動物に由来するＴ細胞を含有する試料を準備する工程、ｂ）ｆｏｘｐ３遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析する工程、ｃ）上記試料中に存在する制御性Ｔ細胞の量を上記メチル化状態に基づいて同定する工程、及びｄ）上記哺乳動物の免疫状態を同定された上記量に基づいて決定する工程を含む、方法に関する。好ましくは、上述と同様に、上記ＣｐＧ位置は遺伝子ｆｏｘｐ３のＣｐＧアイランド、プロモーター領域又はＴＳＤＲ領域等の上流領域に位置する。好ましくは、１つの細胞における１つの対立遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧの脱メチル化が少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％以上であることが、ＦｏｘＰ３陽性ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の指標となる。さらに好ましくは、上記メチル化状態の分析を、全血、パラフィン包埋組織、血液、組織、固形組織の画分、細胞又は組織の培養物、体液、器官、及びＴｒｅｇを含有することが疑われる他の試料の群から選択される試料中で行う。上記方法を腫瘍性疾患の予防的検出として個体において行うのがさらに好ましい。
【００５８】
好ましくは、上記哺乳動物は自己免疫疾患、同種移植レシピエントにおける副作用、卵巣癌等の腫瘍性疾患、慢性移植片対宿主病、アレルギー性ぜんそく及び多発性硬化症から選択される疾患を患う患者である。
【００５９】
本発明の別の（Anther）態様は、前記制御性Ｔ細胞の量を、該制御性Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３発現を調節する、Ｔｒｅｇの量を変更する、又はＴｒｅｇ増加、Ｔｒｅｇレベル、Ｔｒｅｇ移動挙動若しくはＴｒｅｇ生存を調節することが疑われる化学的及び／又は生物学的物質に応じて測定及び／又はモニタリングすることをさらに含む、本発明による方法に関する。
【００６０】
本発明の別の態様は次に、患者への移植に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成又は増加された制御性Ｔ細胞の適合性及び／又は量を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、本発明による方法、及び分析されたＣｐＧ位置が少なくとも９０％、好ましくは９１％、より好ましくは９２％脱メチル化されているか否かを検出することを含む、方法に関する。
【００６１】
本発明の別の態様は次に、Ｔ細胞、幹細胞若しくは前駆細胞におけるｆｏｘｐ３発現、又はＴｒｅｇの増殖、分化、生存及び細胞死を調節する化学的及び／又は生物学的物質、及び／又は培養条件を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、上記化学的及び／又は生物学的物質の１つ又は複数をＴ細胞と接触させること、本発明による方法を行うこと、並びに上記化学的及び／又は生物学的物質又は条件が分析されたＣｐＧ位置のメチル化を調節するか否かを検出することを含む、方法に関する。好ましくは、本発明による化学的及び／又は生物学的物質を同定する方法において、上記物質が分析されたＣｐＧ位置の脱メチル化を少なくとも９０％、好ましくは９１％、より好ましくは９２％増大させる。
【００６２】
本発明の別の態様は次に、配列番号２〜配列番号１７のいずれかによるオリゴマー、又は配列番号１による増幅核酸に関する。
【００６３】
本発明の別の態様は次に、患者における疾患を治療する方法であって、本発明による方法、及び上記患者の上記疾患を、決定されたＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の量に基づいて上記のように治療することを含む、方法に関する。好ましくは、上記疾患は自己免疫疾患、同種移植レシピエントにおける副作用、卵巣癌等の腫瘍性疾患、慢性移植片対宿主病、アレルギー性ぜんそく、ハンセン病及び多発性硬化症から選択される。好ましくは、上記治療は化学療法、抗体による治療、生物学的薬物検査、例えばワクチン手法、殺Ｔｒｅｇ物質、サイトカイン、細胞増殖抑制因子、及びサリドマイド等のＴｒｅｇ数を減少させる化合物（chemical compounds）から選択される。
【００６４】
本発明の別の態様は次に、制御性Ｔ細胞を遺伝子ｆｏｘｐ３中のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて同定するキットであって、本発明による方法を行うための材料を含む、キットに関する。
【００６５】
本発明の別の態様は次に、ＦｏｘＰ３陽性制御性Ｔ細胞、好ましくはＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を検出及び／又は同定するための、本発明によるオリゴマー若しくは増幅核酸、又は本発明によるキットの使用に関する。
【００６６】
本発明をここで、以下の実施例（これに限定されるものではない）においてさらに説明する。本発明の目的上、本明細書中に引用される全ての参考文献及び配列表は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１Ａ：ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ用の定量ＰＣＲシステムを示す図である。ＦＯＸＰ３遺伝子座及び増幅戦略を示す。２つのメチル感受性増幅プライマー及びメチル感受性ハイブリダイゼーションプローブを設計した。プローブを損傷せずにクエンチされる検出色素は、特異的鎖伸長におけるエキソヌクレアーゼ消化の際に放出される。図中英語訳は以下：FOXP3 gene on chromosome Xp11.23:染色体Ｘｐ１１．２３上のＦＯＸＰ３遺伝子Reverse Strand:リバース鎖Exon No:エクソン番号FOXP3 coding region:ＦＯＸＰ３コーディング領域Conserved region:保存領域CpG island:ＣｐＧアイランドElongation:伸長    図１Ｂ：ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ用の定量ＰＣＲシステムを示す図である。上の２列のプロットは該ｑＰＣＲシステムの増幅プロファイルを示す。左パネルには非メチル化特異的増幅システム、右パネルにはメチル化特異的増幅システムを示す。上の列では、非メチル化ＤＮＡに相当するプラスミド（ＴＳＤＲ中の全てのＣがＴに置き換わっている）が２億コピー〜２０コピーの希釈系列（dilution row）で使用される。中央のパネルには、メチル化ＤＮＡに相当するプラスミド（ＣＧ以外の全てのＣがＴに置き換わっている）を用いた同じ希釈系列が示される。下のパネルには、プラスミド希釈系によって作成された標準曲線が完全に対数線形で示される。図中英語訳は以下：Plasmid:プラスミドFluorescence:蛍光Cycle:サイクルCrossing point:交点Log-concentration:対数濃度
【図２】図２Ａ：ＦＡＣＳ又はｑＰＣＲを用いたＴｒｅｇ及びＴｎａｉｖｅの分析を示す図である。ＣＤ２５＋＋細胞（左パネル）とＣＤ２５−細胞（右パネル）とに分けた、男性ドナー（上パネル）及び女性ドナー（下パネル）から得たＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析を示す。細胞を固定し、染色し、ＦＯＸＰ３抗体を用いてＦＡＣＳ計数した。数値はＦＯＸＰ３＋細胞のパーセンタイルレベルである。    図２Ｂ：ＦＡＣＳ又はｑＰＣＲを用いたＴｒｅｇ及びＴｎａｉｖｅの分析を示す図である。ＦＡＣＳ選別したＣＤ２５＋＋細胞及びＣＤ２５−細胞（各々が図２Ａに示す男性ドナー及び女性ドナーに関する）についてのｑＰＣＲ増幅プロットを示す。数値は、左パネルでは非メチル化ＤＮＡ（ｎｍ）、右パネルではメチル化ＤＮＡ（ｍ）についてのコピー数を表す。表中の数値は、メチル化画分中のＦＯＸＰ３タンパク質発現細胞又はＦＯＸＰ３脱メチル化細胞を用いて決定されたＴｒｅｇのパーセンタイル数を示す。図中英語訳は以下：Fluorescence:蛍光Cycle:サイクルFemale donor:女性ドナーMale donor:男性ドナー% demethylated FOXP3 promotor:脱メチル化ＦＯＸＰ３プロモーター（％）qPCR corrected:ｑＰＣＲ（補正）qPCR results for female donor x2: 女性ドナーについてのｑＰＣＲ結果（２倍）
【図３】黒色腫患者のＰＢＭＣ中のＴｒｅｇ数を示す図である。Ｔｒｅｇ数（ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ  ｑＰＣＲ（左）及びＦＯＸＰ３タンパク質ＦＡＣＳ分析（右）によって測定される）は、ＩＬ２療法前及びＩＬ２療法の３週間後に決定した。両タイプの測定は同じ患者に対して同じ時点で行った。図中英語訳は以下% non-methylated FOXP3 DNA:非メチル化ＦＯＸＰ３  ＤＮＡ（％）Prior IL-2:ＩＬ−２前Post IL-2:ＩＬ−２後Patient:患者
【図４】図４Ａ：種々の腫瘍を示す患者におけるＦＯＸＰ３  ＤＮＡ脱メチル化を示す図である。箱ひげ図によって、患者の診断結果によりグループ分けしたＦＯＸＰ３非メチル化レベルの分布を視覚化する。縦軸は非メチル化率である。個々の箱ひげ図はデータの中央の５０％を示し、中央のラインは中央値であり、ひげは箱から四分位範囲の１．５倍を超えない最も端のデータ点まで伸びている。灰色の点は個々の測定値である。それぞれのグループに対する患者数を箱ひげ図の上部に示す。図中英語訳は以下Nolmal:正常    図４Ｂ：種々の腫瘍を示す患者におけるＦＯＸＰ３  ＤＮＡ脱メチル化を示す図である。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。正常患者と結腸直腸癌患者（左パネル）及び肺癌患者（右パネル）との区別のためにＲＯＣ曲線をプロットする。図中英語訳は以下Normal vs. CRC:正常対ＣＲＣTrue positive rate:真陽性率False positive rate:偽陽性率Normal vs. LCa:正常対ＬＣａ
【図５】種々の腫瘍を示す患者におけるＦＯＸＰ３非メチル化を示す図である。箱ひげ図によって、患者の診断結果及び性別によりグループ分けしたＦＯＸＰ３非メチル化レベルの分布を視覚化する。縦軸は非メチル化率である。個々の箱ひげ図はデータの中央の５０％を示し、中央のラインは中央値であり、ひげは箱から四分位範囲の１．５倍を超えない最も端のデータ点まで伸びている。灰色の点は個々の測定値である。それぞれのグループに対する患者数を箱ひげ図の上部に示す。図中英語訳は以下図５ＡMale:男性Normal:正常Female:女性図５ＢFemale Normal vs. BCa:正常女性対ＢＣａTrue positive rate:真陽性率False positive rate:偽陽性率Normal vs. BCa:正常男性対ＢＣａ図５ＣBreast Cancer:乳癌Colorectal Cancer:結腸直腸癌Lung Cancer:肺癌Prostate Cancer:前立腺癌All patients:全患者Male patients:男性患者Female patients:女性患者
【図６】アクセッション番号ＮＣ＿００００２３のヒトｆｏｘｐ３遺伝子の遺伝子構成を示す図である。図中英語訳は以下Coding region:コーディング領域Untranslated region:非翻訳領域Isoform:アイソフォーム
【図７】配列を示す。図中英語訳は以下Reverse:リバースProbe:プローブNon-methylated:非メチル化Methylated:メチル化
【００６８】
配列番号１はＦｏｘＰ３のＴＳＤＲの配列を示す。
【００６９】
配列番号２〜配列番号１９は、実施例において使用されるプライマー及びプローブの配列を示す。
【００７０】
オリゴヌクレオチド
配列は５’から３’の方向で示す。プライマーはバイサルファイト特異的ＰＣＲ及びシークエンシング反応に使用した。鎖特異性及び配向：プライマー「ｐ」及び「ｏ」は＋１鎖に基づいて単位複製配列を生成し、プライマー「ｐ」はフォワード配向を示し、プライマー「ｏ」はリバース配向を示す。
ｐ−ＴＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号１２）
ｏ−ＴＡＴＣＡＣＣＣＣＡＣＣＴＡＡＡＣＣＡＡ（配列番号１３）
ｐ−メチル化ＧＴＴＴＴＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴ（配列番号１４）
ｐ−非メチル化ＧＴＴＴＴｔＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴｔＧＴＴ（配列番号１５）
ｏ−メチル化ＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＴＡＡＴＡＴＣＧ（配列番号１６）
ｏ−非メチル化ＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＣＡ（配列番号１７）
【００７１】
プローブ
非メチル化７７６＿２０９−２２２＿ｎｍ  ＡＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＴＧＴＧＴＴＧＧＧＴＴ（配列番号１８）
メチル化７７６＿２０９−２２２＿ｍ  ＡＴＧＧＣＧＧＴＣＧＧＡＴＧＣＧＴＣ（配列番号１９）
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７２】
過去１０年間で、制御性Ｔ細胞は免疫学的研究の中心的な焦点となっており、そのため腫瘍免疫において重要な役割を果たしている。理解及び医学的開発の進歩にもかかわらず、この細胞型は依然として難解である。これは主にＦＯＸＰ３及びＣＤ２５のｍＲＮＡマーカー及びタンパク質マーカーの特異性の欠如によるものである。どちらのマーカーも活性化された通常のＴ細胞によって発現されるため、これらと真のＴｒｅｇとを区別することは可能ではなかった。これに対し、本発明者らの以前の研究（Baron et al.、Floess
et al.）による全ての証拠は、ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲの脱メチル化が安定なＴｒｅｇ表現型だけに限定されており、一時的にＦＯＸＰ３を発現する活性化Ｔ細胞においては起こらないことを示唆するものである。したがって、メチル化分析は遺伝子発現及びタンパク質合成の分析と比べて明らかな利点をもたらす。
【００７３】
本発明者らは、報告した癌患者の末梢血における存在量の上昇を精査するにはＴｒｅｇの正確な同定が必要であると主張する。これまで、一時的にＦＯＸＰ３を発現する活性化Ｔ細胞が、測定されたＦＯＸＰ３＋細胞画分に有意に寄与することを排除することはできなかった。結果として、Ｔｒｅｇレベルが実際に癌患者の末梢血又はサイトカイン療法において上昇するということは最終的に立証されなかった。しかしながら、後者の点を仮定すると、不明確な混合物は分析上の不明瞭さにつながるため、これまでＴｒｅｇ計数は効率的なモニタリング、ましてや診断手段としては使用することができなかった。本発明者らのｑＰＣＲアッセイは、上述の分析上の不明瞭さを払拭することを目的とする。
【００７４】
本発明者らは、免疫系の他の全ての主要な構成要素と比べた、Ｔｒｅｇに対するＴＳＤＲ脱メチル化の特異性を確認した。Ｂ細胞では、１％〜２％のわずかな（residual）脱メチル化が見られた。これは、Ｂ細胞をＰＢＭＣから磁気分離により最初に選別した場合（一部のＴｒｅｇが分離カラムに非特異的に結合した可能性がある）の分離手順に起因する混入であると考えられ、アッセイの仕様に影響を与えるものではない。別の説明は、１％〜２％のＢ細胞画分においてＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲが脱メチル化されるということである。しかしながら、Ｂ細胞は全ての血液白血球のおよそ１％でしかないため、全血におけるＦＯＸＰ３レベルのおよそ０．００１％〜０．００２％というごくわずかなＢ細胞誘導変動しか引き起こさない。
【００７５】
ＣＤ２５＋＋ＦＯＸＰ３＋抗体を用いて精製及び選別した白血球画分を用いると、本発明者らのアッセイでは男性ドナーにおいて９３％の脱メチル化が報告される。残りの７％であるメチル化された細胞画分は、実際にＣＤ２５−細胞及びＦＯＸＰ３−細胞の安定なＴｒｅｇ画分を構成せずに、ＦＯＸＰ３を一時的にしか発現しないＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞から成ると考えられる。選別されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞及び記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の分析によって、ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲの脱メチル化によって見出されたようにＣＤ４＋Ｔ細胞のおよそ５％〜１０％がＴｒｅｇであるという仮説が確認される。実験的には、このことはＣＤ２５＋＋画分を全てのＣＤ４＋細胞から除去することによって完全にメチル化された細胞のプールが生じるという事実によって掌握された。女性ドナーについては、不活性化Ｘ染色体の完全なメチル化と一致する、精製ＣＤ２５＋＋ＦＯＸＰ３＋細胞画分における４６％の脱メチル化が認められた。
【００７６】
潜在的な日常用途、アッセイの臨床的有意性及び実現可能性を試験するために、ＩＬ−２治療計画について選択された黒色腫患者から得た血液試料を測定した。以前の観察結果から、ＩＬ−２治療におけるＴｒｅｇの有意な増大が示唆された。これらの観察結果は、この治療が（ＮＫ細胞及びエフェクターＴ細胞の増進のために）有益であるか、又は（Ｔｒｅｇの免疫抑制活性の増進のために）治癒に対立するものであるかについての議論に火を付けた。また、ＦＯＸＰ３及び高レベルのＣＤ２５を一時的に発現するＴ細胞の全体的な活性化は、ＦＡＣＳ分析によって除外することができなかった。活性化Ｔ細胞がＴＳＤＲのメチル化の低下を示さないという事実（Baron et al., 2007）に基づくと、本発明者らのデータは、ＩＬ−２療法の過程で次第に多くの脱メチル化ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲを有する細胞が、実際にＣＤ２５エフェクターＴ細胞ではなく機能的Ｔｒｅｇを構成するという概念を強く支持し、ＩＬ−２療法が免疫抑制Ｔｒｅｇを刺激するという懸念を確認するものである。臨床的には、このデータセットをさらに評価して、別に最終的な結論を引き出す必要がある。しかしながら、ここでは、ＩＬ−２療法をより小さいが、おそらくは応答性のより高い集団に用いるために個人化する目的で患者コホートを階層化するために、ＩＬ−２療法を受けた黒色腫患者のＴｒｅｇレベルを再分析することは一選択肢であり得る。
【００７７】
これらの結果に加えて、ＦＡＣＳ分析と比べたｑＰＣＲにおける患者間の差異の有意な低下が見出されたが、これはより限定された生物学的又は技術的システムによるものであり得る。この結果は、ＦＯＸＰ３脱メチル化はＴｒｅｇに特異的であるが、ＣＤ２５＋＋ＦＯＸＰ３＋タンパク質又はｍＲＮＡの数は、Ｔｒｅｇ及び全体的なＴ細胞活性化の組み合わせであるという仮説に一致するものである。
【００７８】
本発明者らは、これらの所見を受けて、ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ脱メチル化アッセイが固形腫瘍の早期検出のための新たな方法を提供し得るという考えを検討した。
【００７９】
この目的のために、末梢血中のＴｒｅｇを測定することが癌スクリーニングの重要なパラメータとなり得るという主張（raising）を、以前の実験の曖昧さを回避して、再試験する、乳房、前立腺、結腸及び肺の４種の異なる腫瘍型を有する患者並びに健常ドナーを含む盲検研究を行った。最近の報告（Meloni 2006、Miller et al. 2006）に基づき、肺癌患者及び前立腺癌患者から得た血液において、健常対照におけるよりも有意に高い脱メチル化ＴＳＤＲのシグナルが見られることが示された。結腸癌患者の末梢血においてＣＤ４＋Ｔｒｅｇの数が増大するという報告（Clark et al. 2006、Ling et al. 2007）とは対照的に、ＴＳＤＲ脱メチル化を分析したところ差は見られなかった。乳癌患者については、脱メチル化アッセイによって決定したＴｒｅｇ数は、あまり有意ではないにしろ、対照におけるよりも極めて高かった。より多くの患者及び対照を分析することで、乳癌についての有意性が明らかとなり、肺癌及び前立腺癌についてもこれらの点が明らかとなり得る。特に、３種の癌についてのＲＯＣ曲線において０．７を上回るＡＵＣ値は、ＦＯＸＰ３脱メチル化を早期検出マーカーとして応用するうえで有望なものである（Lofton-Day et al., 2007）。本発明者らの見解では、２つの結論を本発明者らの結果から引き出すことができる：ｉ）この研究は、体内での悪性腫瘍の発生のパラメータとしてのＴｒｅｇレベルのモニタリングの最終判断となる。ｉｉ）ＴＳＤＲ脱メチル化を各々の悪性腫瘍のマーカーとして実証するには、様々な癌適応症についてのさらに広範な研究が必要とされる。
【００８０】
本発明者らの所見は（進展し、完全に立証された場合）、ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲの分析による制御性Ｔ細胞数の測定を、早期腫瘍認識だけでなく、抗腫瘍戦略のための主要な標的とするものである。ＤＮＡメチル化の一般的性質、アッセイの仕様及びＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ脱メチル化の生物学的性質によって、Ｔｒｅｇ数の分析がおよそ１０μｌの分離していない、急冷凍結した（snap-frozen）血液から可能であることが示唆される。メチル化特異的ｑＰＣＲによるＴｒｅｇ数のモニタリングはＦＡＣＳ分析と比較して、大規模な試料コホートの分析及び多施設共同研究におけるスクリーニングを大いに単純化し得る。ここで、このＴｒｅｇ数の直接的な検出法は、Ｔｒｅｇが癌ワクチンの天然の対抗物（opponent）であるため、全ての癌ワクチン研究に含まれるべきである。患者の階層化はＴｒｅｇレベルに合わせるべきである。また、記載のＩＬ−２研究において例示されるより一般的な臨床的モニタリングは、Ｔｒｅｇ数の分析を必要とする。このことは、特にＩＬ−７、ＩＬ１２療法等の新規のサイトカインに基づく薬物治療についても言える。これは、本明細書中で提示したアッセイを用いて、保管したＤＮＡ又は血液試料が利用可能なレトロスペクティブ分析においても可能であり得る。
【００８１】
ここで、本発明者らは、試験される全ての組織において、試料の量及び品質にほとんど依存せずに、Ｔｒｅｇ、すなわち脱メチル化ＦＯＸＰ３  ＤＮＡを特異的かつ高感度に検出することが可能な定量ＰＣＲに基づくメチル化アッセイを確立した。本発明者らは次に、ＩＬ２サイトカイン治療（以前に他の技術を用いて、末梢血中のＴｒｅｇレベルの上昇を誘導することが示されている）を受ける前後の黒色腫患者から得た血液を用いて、この手段がｉｎ  ｖｉｖｏ用途においてＴｒｅｇ数を確実に伝えるか否かという問題に対処した。アッセイの有効性が証明されたため、本発明者らは体内での悪性腫瘍の存在を予測するために、血流におけるＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ脱メチル化の能力を試験する完全盲検研究を行った。
【００８２】
実施例Ｉ
材料及び方法
試料、試料調製−健常ドナー
末梢血試料を、地方倫理委員会の承認を踏まえたインフォームドコンセントの後に健常ドナーから得た。主要な末梢血白血球集団の選別については、試料をBaron et al.（EJI 2007）に従って処理した。ＣＤ４選別については、フィコール−ハイパーク（Sigma-Aldrich）を用いた密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をバフィーコート由来ＰＢＭＣから、抗ＣＤ４マイクロビーズ及びＡｕｔｏＭＡＣＳ磁気分離システム（Miltenyi Biotec）を用いて単離した。細胞表面染色用の抗体は全てBD
Pharmingenから入手した。ＰＥ抗ヒトＦＯＸＰ３染色セットは、eBioscienceから入手した。全てのマイクロビーズはMiltenyi Biotecから購入した。ＭＡＣＳ選別したＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ２５−ＡＰＣを用いて染色した。細胞をＦＡＣＳ（Aria，BD-Bioscience）によってＣＤ２５高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇと、ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴ細胞とに選別した。一定分量のＣＤ４集団を用いて、フローサイトメトリーによってＦＯＸＰ３＋細胞の含量を決定した。ここでは、分析ゲートは選別ゲートと類似している。サイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star）を用いて、以前に記載されているように行った（Huehn, J., Siegmund, K.,
Lehmann, J., Siewert,C.,
Haubold, U., Feuerer,M.,
Debes, G. F., Lauber,J., Frey, O., Przybylski, G. K., Niesner,U., Rosa, M. d.
l., Schmidt, C. A., Braeuer, R., Buer, J.,Scheffold, A. and Hamann,A.,
Developmental stage, phenotype and migration distinguish naive- andeffector/memory-like
CD4+ regulatory T cells. J ExpMed 2004. 199:303-313.）。細胞内ＦＯＸＰ３染色は、ＰＥ抗ヒトＦＯＸＰ３染色セット（eBioscience）を用いて、製造業者の使用説明書に従って行った。
【００８３】
試料、試料調製−ＩＬ−２療法の黒色腫患者
黒色腫患者はステージＩＶの転移性疾患を有しており、ヒスタミン二塩酸塩を添加した、若しくは添加しないＩＬ−２の皮下投与、又はＩＦＮ−αと併用した、５日間にわたって漸減させた（decrescendo）ＩＬ−２の静脈内投与による３回の異なるＩＬ−２に基づく治療計画を受けていた（Asemissen AM, Scheibenbogen C, Hellstrand K, Thoren F, Gehlsen K,
Lesch A, Thiel E, Keilholz U.Addition of histamine to IL-2 treatment augments
type 1 T cell responses inmelanoma patients in vivo: immunological results from
a randomized clinicaltrial of IL-2 with or without histamine. Clinical Cancer
Res 11, 290-297, 2005、及びKeilholz U, Goey SH, Punt CJA,
Proebstle T,Salzmann R, Scheibenbogen C, SchadendorfD, Lienard D, Hantich B,
Geueke A-M, Eggermont AMM. IFNβ/IL-2 with or without Cisplatinum inmetastatic
melanoma: a randomized trial of the EORTC melanoma cooperativegroup. J Clin
Oncology, 2579-2588, 1997）。インフォームドコンセントの後、ＩＬ−２療法の前及び２週間後にヘパリン添加血液試料を採取し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール−ハイパーク１．０７７（Biochrom，Berlin，Germany又はSigma-Aldrich）を用いた密度勾配遠心分離によって単離し、液体窒素中で保管した。細胞外染色については、以下の表面ｍＡｂを使用した：抗ＣＤ３−ＰｅｒｃＰ（クローンＳＫ７）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（Ｂ９．１１）。核抗ＦＯＸＰ３−ＡＰＣ染色は、抗ＦＯＸＰ３−ＡＰＣ（ＰＣＨ１０１）（eBioscience，SanDiego，USA）を用いて、製造業者の使用説明書に従って行った。データ収集をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Bioscience）で行った。
【００８４】
試料、試料調製−盲検研究
血液を１つ又は複数の１０ｍｌ容ＢＤバキュテナー管（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｐｌｕｓ採血管、ＢＤ  ３６６６４３  １６ｍｍ×１００ｍｍ、１０．０ｍｌ、Ｋ２  ＥＤＴＡ）に採取し、各々の管を血液凝固を避けるために即座に約１０回反転させた。採血管を遠心ブレーキを切っている状態で、４℃、１５００ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離の後、血漿と赤血球との間の細胞層を含む液を約０．５ｍｌ〜１ｍｌ、プレラベル２ｍｌ容クライオバイアル（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  ２−ｍｌ  Ｒｏｕｎｄ−Ｓｔｙｌｅ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｖｉａｌ（Fisher Scientific  ＃１２−５６７−５０１））に、使い捨てピペット（Ｊｕｍｂｏ  Ｂｕｌｂ  Ｐｉｐｅｔｔｅ（VWR  ＃１００５００−６２２））を用いて移した。採血から４時間以内に試料を−７０／８０℃で凍結して、ドライアイス上で輸送するまでこの温度で保管した。
【００８５】
メチル化分析プロトコル
ｆｏｘｐ３遺伝子を有するｓｆ遺伝子座（Brunkow ME et al(2001) Nat Gen.
27:68）の３０．８ｋｂ領域に焦点をあわせ、ＣｐＧ密度に基づいてメチル化分析のための配列を選択した。特に、プロモーター領域及びエクソン・イントロン境界には単位複製配列設計を考慮した。ＰＣＲの際に、ＴＳＤＲ領域を分析するようにプライマーを設計した。
【００８６】
ゲノムＤＮＡを、精製リンパ球からＤＮｅａｓｙ組織キット（Qiagen，Hilden，Germany）を用いて、供給業者の推奨に従って単離した。
【００８７】
ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム処理を、Olek et al.（Olek, A., Oswald,J.,
Walter, J. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066）に従って（一部変更して）行ったが、これにより非メチル化シトシンがウラシルへと変換される一方で、メチル化シトシンは変化しないままであった。続くＰＣＲ増幅において、ウラシルがチミンに置き換わる。このため、シークエンシング反応における「Ｃ」の検出は、この部位でのゲノムＤＮＡのメチル化を反映する。同じ部位での「Ｔ」の検出は反対に、ゲノムシトシンのメチル修飾の非存在を反映する。
【００８８】
ＰＣＲをMJ Research（Waltham，Massachusetts，United States）製のサーモサイクラー上で、１×ＰＣＲバッファー、１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Qiagen，Hilden，Germany）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、各々１２．５ｐｍｏｌのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに７ｎｇのバイサルファイト処理ゲノムＤＮＡを含有する２５μｌの最終容量で行った。増幅条件は９５℃で１５分間、及び９５℃で１分間、５５℃で４５秒間、７２℃で１分間の４０サイクル、及び７２℃で１０分間の最終伸長工程であった。ＰＣＲ産物をＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（USB Corp.，Cleveland，Ohio，United States）を用いて精製し、ＰＣＲプライマー（複数可）及びＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１サイクルシークエンシング化学（Applied Biosystems，Foster City，California，United States）を適用してシークエンシングした後、ＡＢＩ  ３１００遺伝子分析装置上でキャピラリー電気泳動を行った。トレースファイルを、配列トレースを正規化し、不完全なバイサルファイト変換を補正し、メチル化シグナルの定量化を可能にするＥＳＭＥを用いて解析した（Lewin, J.,Schmitt, A.O.,
Adorjan, P., Hildmann,T.,
Piepenbrock, C. (2004) Bioinformatics. 20,3005-3012）。
【００８９】
結果
示唆されたＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ脱メチル化のＴｒｅｇに対する特異性を検証するために、定量リアルタイムＰＣＲシステム（ｑＰＣＲ）を確立した。このシステムは、ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲのバイサルファイト変換されたメチル化ＤＮＡ及びバイサルファイト変換された非メチル化ＤＮＡの両方に対する、メチル化依存性プライマー及びハイブリダイゼーションプローブから成る（図１Ａ）。このシステムを試験することによって、非生理的に高い濃度（２億コピーのプラスミドＤＮＡ）であっても高い特異性があり、異なる種との交差反応性がないことを示した（図１Ｂ）。検出は、１００００個のメチル化コピー中、単一のＤＮＡコピーまでという絶対感度、かつ最低でも２．５個の非メチル化コピーという相対感度で可能であった（データは示さない）。
【００９０】
指定の技術的パラメータを用いて、男性及び女性のドナーから得た選別したＣＤ２５＋＋Ｔ細胞においてＦＯＸＰ３タンパク質を染色して、ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲでの脱メチル化データを比較した（図２）。生物学的特異性の対照として、ＣＤ２５＋欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ２５−）を使用した。データから、ＣＤ２５＋＋細胞のＦＯＸＰ３染色によって、およそ９５％のＦＯＸＰ３＋細胞が得られることが示される。メチル化分析によって、男性ドナーにおいてはおよそ９３％のＣＤ２５＋細胞、女性ドナーにおいては４５．９％のＣＤ２５＋細胞（Ｘ不活性化のために２倍に補正した場合、細胞のおよそ９２％）が非メチル化ＦＯＸＰ３プロモーターを示し、これらの所見が確認される。ＦＡＣＳ分析では、３％〜４％のＣＤ２５−細胞がＦＯＸＰ３＋であると考えられ、１％未満の細胞がＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲにおいて脱メチル化されている。したがって、原理上は、ＦＯＸＰ３の脱メチル化はＦＡＣＳ分析によって測定される結果に従うものである。
【００９１】
血液細胞亜型におけるＦＯＸＰ３  ｑＰＣＲメチル化アッセイ
次に、全血におけるＦＯＸＰ３脱メチル化によるＴｒｅｇ計数の実現可能性を引き出すために、様々な白血球画分のメチル化レベルを試験した。本発明者らは、単離したＣＤ１５＋顆粒球、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ５８＋ナチュラルキラー細胞、並びにＣＤ８＋記憶（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）及びＣＤ８＋ナイーブ（ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ−）細胞傷害性Ｔ細胞画分の両方が、この遺伝子座でＤＮＡの１％未満というわずかな脱メチル化しか示さなかったことを示す。ＣＤ１９＋記憶及びナイーブＢ細胞画分は、２％未満の脱メチル化ＦＯＸＰ３プロモーターを含む（表１）。この画分が不完全な精製に起因するのか、又は脱メチル化ＦＯＸＰ３を有する天然のＢ細胞亜画分に起因するのかについては不明確である。
【００９２】
ＣＤ４＋ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴ細胞は６．２％の脱メチル化画分を示し、ＣＤ４＋ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ−記憶Ｔ細胞は１０．８６％の脱メチル化ＦＯＸＰ３の割合を示した。どちらの画分も、およそ１０％のＣＤ２５＋＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞を含有することが記載されており、したがってその規模で脱メチル化ＤＮＡを含有することが予想される。全ＣＤ４＋Ｔ細胞画分からのＣＤ２５＋＋細胞の選択的除去によって、脱メチル化ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ部分がほぼ完全に取り除かれた。
【００９３】
【表１】
2011526148.tif 000002
【００９４】
ＩＬ２療法による黒色腫患者におけるＦＯＸＰ３  ＤＮＡの脱メチル化
ＣＤ２５＋＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ以外の、末梢血から得た全ての単離白血球画分は、ｅｘ  ｖｉｖｏ実験において完全にメチル化される。したがって、安定にＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇに相当する細胞画分の全血試料からの同定及び定量化は、本発明者らのｑＰＣＲアッセイを適用して脱メチル化ＤＮＡを検出することによって可能である。免疫調節（immunmodulating）療法のレポーターとしての、末梢血におけるＤＮＡメチル化によるＴｒｅｇレベルを分析するために、臨床的に応用されたサイトカイン癌療法におけるアッセイの有効性を試験した。このために、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化を達成するために利用されるＩｌ−２療法を選択する。つい最近では、Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞もこの療法によって増進されることが研究から示されている。後者の効果は、該療法が免疫系を抑制するというよりも刺激する働きをするため、禁忌である。しかしながら、ＣＤ２５＋＋細胞及びＦＯＸＰ３＋細胞のＦＡＣＳ分析は、制御特性のない活性化Ｔ細胞の測定を除外することができない。本発明者らは、転移性黒色腫を有する６人の患者の末梢血におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの頻度に対するＩＬ−２療法の影響を、メチル化及びＦＡＣＳ分析の両方によって分析した（図３）。患者は、ヒスタミン二塩酸塩を添加した、若しくは添加しないＩＬ−２の長期皮下投与、又はＩＦＮ−αと併用した、５日間にわたって漸減させたＩＬ−２の静脈内投与による３回の異なるＩＬ−２に基づく療法計画を受けていた。療法の前に、ＦＡＣＳ測定によって、ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの平均レベルが４．５％であり（１．９％〜８．９％の範囲にわたる）、標準偏差が２．４％であることが示された。Ｔｒｅｇ数をｑＰＣＲによって決定した場合、ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ脱メチル化の平均レベルは３．４％であり（２．４％〜４．２％の範囲にわたる）、標準偏差が０．７％であった。ＩＬ−２療法後の平均ＦＯＸＰ３レベルは、ＦＡＣＳによって測定した場合、１１．６％であり（５．１％〜１７．３％の範囲にわたる）、標準偏差が４．６％であることが分かったが、これは療法後にＴｒｅｇが１．７倍〜４．１倍増大することと解釈される。ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲの脱メチル化によって決定した場合、平均Ｔｒｅｇ数は８．８％であり（６．９％〜１１．５％の範囲にわたる）、標準偏差が１．６％であったが、これは療法後に２．１倍〜２．８倍増大することと解釈される。２つの技法によるＴｒｅｇ数の推定値はよく相関しており（ピアソン相関  Ｒ＝０．６５、Ｐ＝０．０２３）、共にＩＬ２治療時にＴｒｅｇがおよそ２倍増大することを示唆している。この研究において観察される、全血試料におけるＦＯＸＰ３脱メチル化についての患者間の差異は小さく、かかるアッセイが、以前に報告された、健常個体と比べた癌患者におけるＴｒｅｇの増大を保持しつつ、癌患者の血液試料におけるＴｒｅｇを決定する場合の差異を低減する可能性が再確認された。
【００９５】
癌患者におけるＦＯＸＰ３  ＤＮＡ脱メチル化
本発明者らは、健常対照、結腸直腸癌患者、肺癌患者、前立腺癌患者及び乳癌患者から得た合計１１５種の凍結「バフィーコート」において、ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲのメチル化状態を完全盲検研究で測定した。ＦＯＸＰ３はＸ連鎖性であるため、女性ドナーについての脱メチル化は、Ｔｒｅｇ数を報告するうえで２倍に補正した。健常ドナーについては、平均Ｔｒｅｇ数は１．４％であった（０．４％〜２．９％の範囲にわたる）。結腸直腸癌患者については、平均Ｔｒｅｇ数は２．３％であり（０．６％〜３．５％の範囲にわたる、１９％という不測の外れ値が１つ）。外れ値を除外すると、平均Ｔｒｅｇ数は１．６４％であり、健常ドナーよりわずかにしか高くなかった。肺癌患者におけるＴｒｅｇ数は０．５％〜４．４％の範囲であり、平均は２．３％であった。結腸直腸癌患者の結果は正常対照とは有意に異ならなかったが、肺癌患者におけるＴｒｅｇ数は有意に上昇している（ｐ＝０．００３）。早期肺腫瘍（ステージ1及びステージＩＩ、補足情報を参照されたい）から得られた試料において、９種のうち６種でＴｒｅｇ数が有意に上昇していることが分かった。結腸癌及び肺癌に関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、結腸癌についてはＡＵＣ（曲線下面積）が０．６６であり、肺癌についてはＡＵＣが０．７５であることを示している（図４、図５Ｃ）。
【００９６】
乳癌患者及び前立腺癌患者におけるＴｒｅｇ数を、性別をマッチングした（sex-matched）健常対照と比較すると、平均Ｔｒｅｇ数は、正常対照の１．７％及び１．４％と比べて、それぞれ２．４％及び２．４％と上昇していた。正常個体と比べた変化はそれぞれ、前立腺癌についてはｐ＝０．０３で統計学的に有意であり、乳癌についてはｐ＝０．０８でわずかに有意ではなかった。乳癌及び前立腺癌の両方に関するＲＯＣ曲線は、乳癌についてはＡＵＣが０．７１であり、前立腺癌についてはＡＵＣが０．７３であることを示している（図５）。
【００９７】
実施例ＩＩ
試料、試料調製−健常ドナー
末梢血試料を、地方倫理委員会の承認を踏まえたインフォームドコンセントの後に健常ドナーから得た。主要な末梢血白血球集団の選別については、試料をBaron et al.（３６）に従って処理した。ＣＤ４＋Ｔ細胞選別については、フィコール−ハイパーク（Sigma-Aldrich，Munich，Germany）を用いた密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をバフィーコート由来ＰＢＭＣから、抗ＣＤ４マイクロビーズ及びＡｕｔｏＭＡＣＳ磁気分離システム（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany）を用いて単離した。全てのマイクロビーズはMiltenyi Biotecから購入し、細胞表面染色用の抗体は全てBD Pharmingen（Heidelberg，Germany）から入手した。細胞内ＦＯＸＰ３染色は、ＰＥ抗ヒトＦＯＸＰ３染色セット（eBioscience，SanDiego，USA）を用いて、製造業者の使用説明書に従って行った。ＭＡＣＳ選別したＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ４５ＲＡ  ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ２５−ＡＰＣを用いて染色した。細胞をＦＡＣＳ（Aria，BD-Bioscience，Heidelberg，Germany）によってＣＤ２５高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇと、ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴ細胞とに選別した。一定分量のＣＤ４集団を用いて、フローサイトメトリーによってＦＯＸＰ３＋細胞の含量を決定した。ここでは、分析ゲートは選別ゲートと類似している。サイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star，Ashland，OR，USA）を用いて、以前に記載されているように行った（５０）。
【００９８】
試料、試料調製−ＩＬ−２療法の黒色腫患者
黒色腫患者はステージＩＶの転移性疾患を有しており、以前に記載されるようなヒスタミン二塩酸塩を添加した、若しくは添加しないＩＬ−２の皮下投与を受けていた。インフォームドコンセントの後、ＩＬ−２療法の前及び２週間後にヘパリン添加血液試料を採取し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール−ハイパーク１．０７７（Biochrom，Berlin，Germany又はSigma-Aldrich）を用いた密度勾配遠心分離によって単離し、液体窒素中で保管した。細胞外染色については、以下の表面ｍＡｂを使用した：抗ＣＤ３−ＰｅｒｃＰ（クローンＳＫ７）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（Ｂ９．１１）。核抗ＦＯＸＰ３−ＡＰＣ染色は、抗ＦＯＸＰ３−ＡＰＣ（ＰＣＨ１０１）（eBioscience）を用いて、製造業者の使用説明書に従って行った。データ収集をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（BD Bioscience）で行った。
【００９９】
試料、試料調製−盲検研究
血液を１つ又は複数の１０ｍｌ容ＢＤバキュテナー管（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｐｌｕｓ採血管、ＢＤ  ３６６６４３  １６ｍｍ×１００ｍｍ、１０．０ｍＬ、Ｋ２  ＥＤＴＡ）に採取し、各々の管を血液凝固を避けるために即座に約１０回反転させた。採血管を遠心ブレーキを切っている状態で、４℃、１５００ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離の後、血漿と赤血球との間の細胞層を含む液を約０．５ｍｌ〜１ｍｌ、プレラベル２ｍｌ容クライオバイアル（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  ２−ｍＬ  Ｒｏｕｎｄ−Ｓｔｙｌｅ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｖｉａｌ（Fisher Scientific，Schwerte，Germany，＃１２−５６７−５０１））に、使い捨てピペット（Ｊｕｍｂｏ  Ｂｕｌｂ  Ｐｉｐｅｔｔｅ（VWR，Darmstadt，Germany，＃１００５００−６２２））を用いて移した。採血から４時間以内に試料を−７０／８０℃で凍結して、ドライアイス上で輸送するまでこの温度で保管した。書面によるインフォームドコンセントを、地方倫理指針に従って全ての研究の参加者から得た。
【０１００】
試料調製−ＦＦＰＥ試料
結腸直腸癌患者の腫瘍及び健常組織に由来する、ホルマリン固定し、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）した組織から得た最大で８つの切片のＤＮＡ単離を、Ｑｉａ−ＡＭＰ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ組織キット（Qiagen，Hilden，Germany）を用いて、製造業者のプロトコルに従って行った。ＤＮＡ単離前の変性として、ホルマリンから取り出した（formalin released）組織を、２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０中で一晩インキュベートし、続いて９０℃で１０分間インキュベートした。
【０１０１】
ＤＮＡ調製及びバイサルファイト変換
ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ血液及び組織キット（Qiagen，Hilden，Germany）を用いて単離した。ＰＢＭＣ及び選別した血液細胞については、培養細胞用のプロトコルに従い、バフィーコートからのＤＮＡ単離については全血プロトコルを用いた。ゲノムＤＮＡのバイサルファイト処理は、Olek et al.（Olek, A.,
Oswald,J., Walter, J. 1996. A modified and improved
method for bisulphitebased cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res.
24:5064-6）に従って（一部変更して）行った。
【０１０２】
リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲは、各々１５ｐｍｏｌのＴＳＤＲ用のメチル化又は非メチル化特異的フォワード及びリバースプライマー（３６）、５ｐｍｏｌの加水分解プローブ、２００ｎｇのλ−ＤＮＡ（New England Biolabs，Frankfurt，Germany）、及び３０ｎｇのバイサルファイト処理ゲノムＤＮＡ鋳型又は各量のプラスミド標準を含有するＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）を用いて、２０μｌの最終反応容量中で行った。各々の試料を、Ｌｉｇｈｔ−Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｓｙｓｔｅｍ（Roche）を用いて三連で（in triplicate）分析した。サイクリング条件は、９５℃で１０分間の予熱工程、及び９５℃で１５秒間、続いて６１℃で１分間の５０サイクルから成るものであった。
【０１０３】
プラスミド標準
ＰＣＲ産物は、選別したナイーブＴ細胞及び制御性Ｔ細胞から得たバイサルファイト処理ゲノムＤＮＡを用いて、ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ用のメチル特異的及び非メチル特異的プライマーによって生成させた。ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ（Invitrogen，Karlsruhe，Germany）を用いて、製造業者の使用説明書に従ってクローニングし、シークエンシングによって検証した。プラスミドをQiagen製のＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いて精製し、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（Invitrogen）によって濃度を決定し、希釈して、各々メチル化及び非メチル化ＦＯＸＰ３  ｑＰＣＲアッセイのためのｑＰＣＲ反応の標準として、１００ｆｇ、１０ｆｇ、１ｆｇ及び０．１ｆｇの最終濃度（２００００個、２０００個、２００個及び２０個のプラスミドコピーに相当する）を得た。
【０１０４】
統計分析
メチル化及び非メチル化ＦＯＸＰ３  ＤＮＡの量は、二次導関数最大法（second-derivative
maximum method）による交点での線形回帰による検量線から推定した。中央値を用いてバフィーコート試料の三連の測定値を統合した。非メチル化ＤＮＡの割合は、非メチル化ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ−ＤＮＡと、メチル化及び非メチル化ＦＯＸＰ３  ＴＳＤＲ−ＤＮＡの合計との比率としてコンピューターで計算した。女性患者については、この比率を２倍に乗じた。ＲＯＣ曲線下面積は台形法則を用いて推定した。ウイルコクソンの順位和検定を用いて、正常患者と癌患者との脱メチル化率を比較した。ウイルコクソンの符号付き順位検定を用いて、ＩＬ−２治療前と治療後との脱メチル化率を比較した。相関分析については、ピアソンの積率相関係数及びｔ検定統計値を使用した。全てのＰ値は両側Ｐ値であった。
【０１０５】
免疫組織化学
免疫組織化学染色を以前に記載されるように行った。手短に述べると、スライドガラスをヒトＦＯＸＰ３タンパク質に対するラットモノクローナル抗体（ＰＣＨ１０１、２００倍；eBioscience，SanDiego，USA）、続いてビオチン結合ウサギ抗ラット及びＥｎＶｉｓｉｏｎペルオキシダーゼキット（Dako，Glostrup，Denmark）と共にインキュベートした。１０個の無作為に選択した高倍率視野（１ＨＰＦ＝０．２３７ｍｍ２）を、腫瘍組織及び対応する正常結腸粘膜／肺実質におけるＦＯＸＰ３＋細胞浸潤について分析し、各事例において１０個のＨＰＦを平均化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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