(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(A)・(B)・(C)を配合してなる化粧料
(A) ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、セージ抽出液から選択されるいずれか1種以上
(B) リノール酸メントールエステル、サフラワー油メントールエステルから選択されるいずれか1種以上
(C) セバシン酸ジイソプロピル、メントキシプロパンジオール、シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコールから選択されるいずれか1種以上
【請求項２】
下記の(A)・(B)・(C)を配合してなる皮膚バリア機能改善用化粧料
(A) ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、セージ抽出液から選択されるいずれか1種以上
(B) リノール酸メントールエステル、サフラワー油メントールエステルから選択されるいずれか1種以上
(C) セバシン酸ジイソプロピル、メントキシプロパンジオール、シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコールから選択されるいずれか1種以上
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、時計遺伝子BMAL-1タンパク量の産生促進剤に特定成分を組み合せた化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常の季節変動などによる肌荒れには、ヒアルロン酸などの高分子や、コラーゲンのようなタンパク質及びその分解物のような保湿剤を配合した化粧料を使用することにより、予防、改善、治癒が行われてきた。
【０００３】
しかしながら、近年になって、アトピー性皮膚炎であるとか、寝不足やサーカディアンリズムの乱れなどに起因する病的な肌荒れは、単に皮膚外部から保湿成分を付与するだけの化粧料では改善される場合は少ない。
これは、季節変化によって生ずる肌荒れが皮膚機能の一時的低下によるものであり、これを化粧料の様なもので補えば一時的に回復するものの、アトピー性皮膚炎等に起因する肌荒れは皮膚表面の状態変化によるものではなく、表皮細胞の機能異常が原因となっているためである。
従って、アトピー性皮膚炎等は、皮膚内部から改善する必要があった。
【０００４】
近年、遺伝子解析結果によりアトピー性皮膚炎患者では、フィラグリン遺伝子に異常を持つ場合が多いことが明らかにされた。ヨーロッパにおいては、アトピー性皮膚炎患者の約４０％にフィラグリン遺伝子異常が認められたとの報告がある。フィラグリンは表皮細胞において産生されるタンパク質で、カスパーゼ１４という酵素で分解される。そしてその分解物は、天然保湿因子として皮膚の水分保持に重要な働きをしている。
【０００５】
アトピー性皮膚炎患者においてはフィラグリンの産生が充分でないため、天然保湿因子が産生されず皮膚の水分保持が保てなくなる。また、皮膚のバリアー機能も充分でないため、肌荒れや炎症が起こりやすい皮膚状態を呈することになる。
【０００６】
一方、生体の概日リズムを司る時計中枢は、視床下部の視交叉上核に存在している。しかし、生体の各組織においても、例えば、心臓、肝臓、肺、さらには皮膚においても抹消時計が存在し、中枢時計の支配を受けていることが明らかになった。
最近においては時計遺伝子の発現リズムにより、病気になり易い時間帯が存在することが明らかになってきた。例えば、心筋梗塞の発症は朝に多く、アトピー性皮膚炎のかゆみは夜間に増悪することが知られている。これは血液凝固系に関連する酵素活性に日周リズムがあるためであり、また細胞におけるホルモンやヒスタミンの感受性が時計遺伝子の作用により、夜間に増大するためであることがわかってきた。
【０００７】
これまで、体内時計を正常化または、体内時計の正常化による睡眠改善効果を発揮するものとして特開２００９−８４１９２（特許文献１）には、クリプトキサンチン及び／又はそのエステル体を含有することを特徴とする組成物、好ましくは、クリプトキサンチン及び／又はそのエステル体が、温州みかん、温州みかん加工物、温州みかんの酵素処理物及び温州みかんの溶媒抽出物からなる組成物の記載がある。
【０００８】
また、特開２００５−２４７７４０（特許文献２）には脂質代謝を制御しているＢＭＡＬ-１を阻害して生活習慣病(肥満など)を予防・治療可能な薬剤を提供することとして、脂肪酸代謝遺伝子の調整機能を有する蛋白質ＢＭＡＬ-１及び前記ＢＭＡＬ-１の阻害作用を持つ、チアゾリジン系化合物を生体に投与してＢＭＡＬ-１を阻害する方法が記載されている。
【０００９】
さらに、特開２００８−２６６３１９（特許文献３）には概日リズムを調整するために、フラボン、フラボノール、イソフラボン、フラバノン、アントシアニン及びフラバノールからなる群から選ばれるフラボノイド、およびステロイド系サポニン、セスキテルペノイド、およびモナコリンK、およびリスベラトロール、スコポレチン、オイゲノール、シリマリン、フォルスコリン、の誘導体およびセロリ種子からエタノールまたはグリセリンにより抽出される生成物が記載されている。
【００１０】
一方、特開２０１０−９００３７（特許文献４）には皮膚の保湿効果を発揮する事により乾燥肌、しわ、肌荒れ、アトピー性皮膚炎の改善及び予防を効果的に行うために、フィラグリン産生促進作用を有するロズマリン酸及びエリオジクチオール
７−Ｏ−ルチノシドを含有する組成物が記載されている。
【００１１】
特開２００８−２８５４２３（特許文献５）には、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用を有する毛穴目立ち抑制効果がある物質としてエイジツからの抽出物を含有する組成物が記載されている。
【００１２】
特開２００８−８８０７５（特許文献６）には、プロフィラグリン／フィラグリン産生促進剤、表皮角化細胞増殖促進剤、角層正常化及び／又は表皮正常化効果に優れた皮膚外用剤としてヒトリシズカ抽出物を有効成分とする組成物が記載されている。
【００１３】
このように、各種方法が提案されているが、直接的に保湿効果を付与する場合には、一時的な効果はあるものの長期的な効果は期待出来ないのが現状である。一方、細胞内部において保湿関連成分を産生させる場合には、根本的な改善が期待出来るものの、そもそも効果成分が皮膚内部まで到達しなければ、実際の効果は期待できない。従って、皮膚に直接保湿剤等を塗布しただけでは改善できないようなアトピー性皮膚炎等においては、細胞内において保湿関連成分を産生さえせる成分を、いかに細胞内に浸透させるかが重要になってくる。
【００１４】
経皮吸収効果を高める成分として、メントールが知られているが、メントールは特有な臭いを有する他、少ない量でも刺激が認められ、特に皮膚刺激の弱いアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患者用としては、用いることが出来なかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２００９−８４１９２号公報
【特許文献２】特開２００５−２４７７４０号公報
【特許文献３】特開２００８−２６６３１９号公報
【特許文献４】特開２０１０−９００３７号公報
【特許文献５】特開２００８−２８５４２３号公報
【特許文献６】特開２００８−８８０７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
細胞内でBMAL-1タンパクの産生を促進する効果成分を細胞内に浸透させ、細胞内で確実に効果を発揮させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上述の課題を達成するため、鋭意検討を進めた結果、時計遺伝子BMAL-1タンパクの産生を促進する効果成分（A）と、脂肪酸メントールエステル(B)、およびセバシン酸ジイソプロピル、メントキシプロパンジオール、シクロヘキサン-１、４-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコールによる経皮吸収促進作用成分(C)を組み合わせて使用することによって、課題を解決した。
以下、本願においては、BMAL-1が遺伝子を表す場合はBmal-1、タンパクを表す場合はBMAL-1と表記した。
【発明の効果】
【００１８】
皮膚のバリアー機能を高め、皮膚水分蒸散量を飛躍的に抑制させることが出来る。これにより、細胞内部からの根本的な改善が必要であったアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患を改善することが期待出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
セージ（Salvia
officinalis）は、シソ科アキギリ属の多年草で薬用サルビアとも称される。草丈は５０−７０ｃｍ程で、５-７月に紫または白色の唇状の花を咲かせる。葉を乾燥してハーブティーとして飲用したり、肉の臭み消しに利用し、豚肉と良く合わせられており、ソーセージの語源となったという説もある。中南米やヨーロッパを中心に世界に約900種が分布し、サルビア、セージがこれに含まれる。日本原産の種類としてはアキノタムラソウ、キバナアキギリ（黄花秋桐）などがあるが、いずれの種類でも利用可能である。
【００２０】
ニコチン酸アミドは、関連する化合物としてニコチン酸があり、生体内では糖質・脂質・タンパク質の代謝に不可欠である。循環系、消化系、神経系の働きを促進するなどの働きがあり、欠乏すると皮膚炎、口内炎、神経炎や下痢などの症状を生じる。また、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸は、エネルギー代謝中の酸化還元酵素の補酵素として重要な働きを担っており、いずれの化合物も利用できる。
【００２１】
パントテン酸カルシウムには、関連化合物としてパントテン酸、パンテノール、パンテニルエチルエーテルがある。パントテン酸はビタミンB5とも呼ばれており、CoA（補酵素A）の構成成分として、糖代謝や脂肪酸代謝において重要な反応に関わる物質である。たいていの食品に含まれており、特に多く含まれている食品は、乾燥酵母、卵、牛乳、レバー、納豆、落花生、干し椎茸、さけ、いわしなどである。
【００２２】
上記の化合物のニコチン酸アミドおよびパントテン酸カルシウムは、市販されている試薬を使用しても良いし、酵母のような微生物や、動物、植物などの細胞から抽出、精製したものでも本発明に使用できる。本発明では前記したような化合物のうちの一種以上を組み合わせて使用することができる。
【００２３】
本発明に用いるセージ抽出液の調製法は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて低温下から加温下で抽出することができる。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１、３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２  種以上を用いることが出来る。そのうち、水、エチルアルコール、１、３−ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適に示される。
【００２４】
また抽出方法はセージでは葉あるいは全草をそのまま、あるいは粉砕したものを質量比で２〜１０００倍量、特に５〜１００倍量の溶媒を用いることが出来る。常温抽出の場合には、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好適である。また、６０〜１００℃で０．５〜２４時間、加熱抽出しても良い。
【００２５】
以上のような条件で得られるセージ抽出液は、ろ過等の処理をして溶液のまま用いても良いが、更に必要により、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることが出来る。
【００２６】
脂肪酸メントールエステルは、脂肪酸とL-メントールをエステル結合させた化合物であり、代表的な脂肪酸としてラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、
パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが使用できる。また、サフラワー油や、菜種油、綿実油、大豆油のような油脂類から酵素合成により、混合脂肪酸のメントールエステルを作成することが可能である。
【００２７】
セバシン酸ジイソプロピルは日光ケミカルズ株式会社、メントキシプロパンジオールは高砂香料株式会社、シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコールは日本精化株式会社より市販されている化粧品原料を使用した。
【００２８】
本発明のセージ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウムおよび、脂肪酸メントールエステルおよび、セバシン酸ジイソプロピル、メントキシプロパンジオール、シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコールを配合してなる化粧料としては、例えば乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、洗顔料などの基礎化粧料、口紅、ファンデーション、リキッドファンデーション、メイクアッププレスドパウダーなどのメイクアップ化粧料、洗顔料、ボディーシャンプー、石けんなどの清浄用化粧料、さらには浴剤等が挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の化粧料中に於けるセージ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウムの配合量は一般に０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜３質量％の範囲である。
脂肪酸メントールエステルの配合量は一般に０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜１．０質量％の範囲である。
また、セバシン酸ジイソプロピル、メントキシプロパンジオール、シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコールの配合量は、一般に０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜３．０質量％の範囲である。
【００３０】
本発明の化粧料には、上記の必須成分の他に、通常化粧料に用いられる配合成分、例えば油性成分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００３１】
ここで、油性成分としては、例えばオリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米胚芽油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、植物由来スクワランなどの植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油などの動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリンなどのロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワランなどの炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ｃｉｓ−１１−エイコセン酸などの脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコールなどの高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、２−エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）などの合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。
【００３２】
界面活性剤としては，例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルなどの非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α−スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩などのアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級〜第三級脂肪酸アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩などのカチオン界面活性剤；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ−アシルアミドプロピル−Ｎ′，Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−β−ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタインなどの両性界面活性剤等を使用することができる。
【００３３】
保湿剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコール類、マルチトール、ソルビトール、キシリトール、トレハロース、グルコース等の糖類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸菌発酵米、ムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体など）、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、加水分解シルク蛋白質、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、フィトステロール、大豆リン脂質、イソステアリン酸コレステリル、海藻抽出物、各種アミノ酸及びそれらの誘導体等が挙げられる。また、ビロウドアオイエキス、ヨクイニンエキス、ジオウエキス、タイソウエキス、キダチアロエエキス、ゴボウエキス、マンネンロウエキス、アルニカエキス、トマトエキス、トウキエキス、トウキ根エキス、ダイズエキス、アスパラガスエキス、アシタバエキス、アマチヤエキス、アルテアエキス、アロエベラエキス、メリッサエキス等の植物エキスを使用するができる。
【００３４】
増粘剤としては、例えばアルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン、ファーセララン等の褐藻、緑藻或いは紅藻由来成分、ビャッキュウ抽出物、ペクチン、ローカストビーンガム、アロエ多糖体等の多糖類、キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム等のガム類、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリグルタミン酸及びその誘導体、グルコシルトレハロースと加水分解水添デンプンを主体とする糖化合物等が挙げられる。
【００３５】
防腐・殺菌剤としては、例えば尿素；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチルなどのパラオキシ安息香酸エステル類；フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、ジャーマル（イミダゾデイニールウレア）、１，２−ペンタンジオール、ウドなどのタラノキ属植物の抽出物、各種精油類、樹皮乾留物、プロポリスエキス等がある。
【００３６】
粉体成分としては、例えばセリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、６−又は１２−ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー等がある。
【００３７】
紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩、４−ターシャリーブチル−４−メトキシベンゾイルメタン、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等がある。
【００３８】
抗酸化剤としては、例えばスーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、カタラーゼなどの生体内活性酸素分解酵素、ビタミンＥ、ビタミンＤなどのビタミン類及びその誘導体、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ユビデカキノン（ユビキノン）、ルチン、ルチングルコシド、γ−オリザノール等がある。
【００３９】
さらに必要ならば、本発明の作用効果及び特長を損なわない範囲で、他の活性成分（美白剤、皮膚老化防止・肌荒れ改善剤、抗炎症剤等）を配合してもよく、かかるものとしては、例えば美白剤であれば、トラネキサム酸及びその誘導体、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、コウジ酸及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン誘導体、エラグ酸及びその誘導体、レゾルシノール誘導体、胎盤抽出物、システイン、ソウハクヒ抽出物、ユキノシタ抽出物、ハマメリス抽出物、イタドリ抽出物、甘草抽出物、ゲンノショウコ抽出物、ユキノシタ抽出物、ナツメ抽出物、シャクヤク抽出物、モモ抽出物、緑藻類、紅藻類又は褐藻類の海藻の抽出物、皮膚老化防止・肌荒れ改善成分であれば、動物又は魚由来のコラーゲン及びその誘導体、エラスチン及びその誘導体、セラミドなどの細胞間脂質、胎盤抽出物、培養酵母抽出物、グリチルリチン酸及びその誘導体（ジカリウム塩等）、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、ビタミンＡ前駆体、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、アラントイン、α−ヒドロキシ酸類、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、コエンザイムＱ−１０、アデノシン、α−リポ酸、ピコリン、カルニチン及びその誘導体、ゲンチアナエキス、甘草エキス、ハトムギエキス、カミツレエキス、ニンジンエキス、アロエエキスなどの生薬抽出エキス、米発酵エキス、緑藻類、紅藻類又は褐藻類の海藻の抽出物、ブナ抽出物、キダチアロエ抽出物、マンネンロウ抽出物、イチョウ抽出物、スギナ抽出物、ベニバナ抽出物、オタネニンジン抽出物、セイヨウニワトコ抽出物、ハゴロモグサ抽出物、レンゲ抽出物、マンゴー抽出物、卵殻膜抽出タンパク質、デオキシリボ核酸カリウム塩、紫蘭根抽出物、ムラサキシキブ抽出物、イネ抽出物等が、又抗炎症成分であれば、例えばグアイアズレンスルホン酸ナトリウム、グアイアズレンスルホン酸エチルなどのアズレン誘導体、グリチルリチン酸ジカリウム、グリチルリチン酸ステアリルなどのグリチルリチン酸誘導体、アラントイン、カンゾウ抽出物、クジン抽出物、ボタンピ抽出物、レンギョウ抽出物、リュウタン抽出物、トウキンセンカ抽出物、パセリ抽出物、オトギリソウ抽出物等が挙げられる。
【００４０】
次に、Bmal-1のmRNAをRNA干渉によりノックダウンさせた実験、およびその結果について具体的に説明する。処方例（化粧料の実施例）及び試験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、以下に於いて、部はすべて質量部を、又％はすべて質量％を意味する。
【００４１】
＜Bmal-1のRNA干渉試験＞
Bmal-1のRNA干渉を行うsiRNA配列はPNAS  August 23, vol.102,
no.34, 12071-12076, 2005に記載された下記の配列のものを用いた。
Bmal-1  siRNA配列
Sense      5’-CCA/CCA/ACC/CAU/ACA/CAG/AAG/CAA/A-3’
Anti
sense  5’-UGC/UUC/UGU/GUA/UGG/GUU/GGU/GGA/A-3’
control配列
Sense      5’-CCA/CCA/AAU/ACA/CAC/GAA/GCC/CAA/A
Anti
sense 5’-UGG/GCU/UCG/UGU/GUA/UUU/GGU/GGA/A
【００４２】
＜Bmal-1-siRNAの細胞への導入＞
細胞はヒト表皮細胞であるHacat細胞を培養し、実験を行った。培養液1mlに対して、Plus
Reagent  ８μｌ、Lipofectamine  ４μｌおよび、Bmal-1-siRNA  30 n molを添加調製後、８０％程度コンフルーエントになったHacat細胞へ添加した。3時間インキュベートし細胞へのsiRNAの導入を行った。その後、培養液を5%FBS含有D-MEM培地に交換し、21時間後に細胞中からmRNAを抽出した。mRNAの抽出は、RNeasy  mini  kit（Qiagen）にて行った。
【００４３】
＜細胞中で発現したmRNAの確認＞
細胞から抽出mRNAから、Prime Script RT reagent kit（Perfect Real time）Takaraを用いてcDNAの作成を行った。表-１に記載したPrimer、調製したcDNA、およびPower SYBR Green PCR Master Mix（Applied biosystem）にてReal time  PCRの操作を行った。mRNAの発現量はリファレンス遺伝子としてGAPDHのCt値で補正し、相対定量法であるΔΔCt法により求めた。
【００４４】
【表−１】
0005826075.tif 000002
【００４５】
実験結果
表−２にはBmal-1-siRNAを導入したHacat細胞でのmRNA発現量を、コントロール配列を導入した細胞の各mRNA量を100とした相対量を示した。
尚、事前にヒト表皮細胞であるHacat細胞への遺伝子導入効率をＸ−gal染色により確認した結果、細胞へのsiRNAの導入量が５０−６０％であった。
RNA干渉を行ったBmal-1のmRNA発現量は５８．２%であった。ヒト表皮細胞であるHacat細胞への遺伝子導入効率を考慮すると、siRNAが導入された細胞では、Bmal-1の発現は強く抑制されたものと考えられる。他のmRNA発現量はクローディン1は、５８．９％、フィラグリンは、６２．１％、カスパーゼ14は、４１．０％であった。この結果より、Bmal-1のmRNA量が減少することにより、クローディン1、フィラグリン、カスパーゼ14の各mRNA量も連動して減少することが明らかとなった。
【００４６】
【表−２】
0005826075.tif 000003
【００４７】
また、ウエスタン・ブロテッィングにより、タンパク量を確認した結果、Ｂｍａｌ-1  mRNAのRNA干渉により、BMAL−１タンパク量が６６％、ＦＩＬＡＧＧＲＩＮタンパク量が６９％、ＣＡＳＰＡＳＥ−１４タンパク量が４８％、ＣＬＡＵＤＩＮ−1タンパク量が７１％まで減少することを発見した。
以上のことより、BMAL−１タンパクがフィラグリン、カスパーゼ１４、クローディン１タンパクの産生に関与していることが初めて明らかになった。
【００４８】
時計遺伝子BMAL-1はCLOCKと共に、転写因子として作用することが既に知られている。
フィラグリンは皮膚の表皮細胞で産生される高分子タンパク質で、プロフィラグリンとして顆粒層細胞中に存在している。表皮細胞において、プロフィラグリンは酵素により分解され、フィラグリンとなり、カスパーゼ１４により分解されて天然保湿因子NMFとなり、皮膚の保湿成分として働くようになる。このため、BMAL-1タンパクが減少することは、フィラグリンおよびカスパーゼ14のタンパク量低下につながり、最終的には皮膚の保湿成分の低下をきたす結果となる。さらに、クローディン１は表皮細胞間の密着結合を構成するタンパク質である。密着結合は表皮細胞同士を結合させることにより、皮膚中の水分が蒸発するのを防御すると共に、外界からの刺激物や異物を防ぐ働きをしている。これらの密着結合の形成が不十分である場合、魚鱗癬様の皮膚状態を示すことからも、皮膚の保湿機能にとって重要な働きを担っている。このため、BMAL-1タンパクの産生を促進することで、皮膚の保湿機能の向上が期待できるものと考えられる。
【００４９】
＜BMAL-1タンパク産生促進試験＞
＜A成分の調整＞
セージの全草を乾燥し、乾燥物１０ｇに精製水１００ｇを加え、80℃で2時間加熱抽出を行い、冷却後固形物を除去し抽出エキスを得た。
ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウムは和光純薬工業の試薬を購入し、精製水に溶解した物を添加試料とした（濃度は表−３に記載）。
５％FBSを添加したD-MEM培地でHacat細胞を50cm2のplateにてコンフルーエントになるまで培養した。細胞がコンフルーエントになった後、FBSを含有しないD-MEM培地に交換し、上記Ａ成分を表―３の濃度になるように添加した。添加後、48時間37℃で培養し、細胞を回収してBMAL-1量を測定する試料とした。細胞はRIPA  buffer  ２００μｌで溶解し、Western  blottingにてBMAL-1量の測定を行った。
【００５０】
Western  blotting  の結果は表―３に示した。セージの抽出エキスを培地に１．２５％および２．５％添加した場合のBMAL-1タンパク産生量は、対照区と比較して１０３％および１２８％のタンパク産生促進効果が認められた。同じくニコチン酸アミド添加区では、それぞれ１０７％、１４２％を示した。またパントテン酸カルシウム添加区ではそれぞれ１１６％、１３５％となり、強いタンパク産生促進効果が認められた。また、BMAL-1産生促進効果の無い物質としてメリッサ抽出エキスを培地に１．２５％および２．５％添加した場合のBMAL-1タンパク産生量は、対照区と比較して１００％、および１０１％であり、タンパク産生促進効果は認められなかった。
【００５１】
【表−３】
0005826075.tif 000004
【００５２】
＜Ｂ成分の調整＞脂肪酸メントールエステルの作成
サフラワー油２５０ｇにL−メントール１４０ｇ、精製水７０ｇ、リパーゼ４６０，０００単位を混和し、室温で７２時間攪拌することによりメントールエステルを作成した。作成したメントールエステルを精製し、サフラワー油メントールエステルを得た。サフラワー油は、複数の脂肪酸を含んでいるので、最終的には、パルミチン酸メントールエステルが６．７１％、ステアリン酸メントールエステルが１．２８％、オレイン酸メントールエステルが１７．６％、リノール酸メントールエステルが７３．７％含まれているを確認した。
【００５３】
リノール酸２８０ｇにL-メントール１５６ｇ、精製水８０ｇ、リパーゼ５２０,０００単位を混和し、室温で７２時間攪拌し、メントールエステルを作成した。作成したメントールエステルを精製しリノール酸メントールエステルを作成した。
【００５４】
本発明の下記の(A)・(B)・(C)を配合してなる処方例３の化粧料を基に、比較例、各実施例の配合量に基づいた化粧料を用いて、皮膚水分蒸散の測定を行った。
(A)ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、セージ抽出液およびBMAL-1産生促進効果の無いが保湿効果があるものとしてメリッサ抽出液のいずれか1種以上。
(B)サフラワー油のメントールエステルおよびリノール酸メントールエステル、脂肪酸のメントールエステルの比較対照物としてリノール酸イソプロピル。
(C)セバシン酸ジイソプロピル、メントキシプロパンジオール、シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコールおよびセバシン酸ジイソプロピル、シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコールの対照物としてコハク酸ジオクチル、メントキシプロパンジオールの対照物としてメントールのいずれか1種以上。
尚（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）以外の成分は、グリセリン；５．０、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）；１．０、エタノール；６．０、香料；適量、防腐剤・酸化防止剤；適量、精製水；残部としている。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）成分において配合量が増減する場合は、精製水で調整した。
１０ｍｍφの大きさに切ったNo.２ろ紙に５％SDS水溶液２０μlを含浸させ、ヒト上腕及び下腕内側皮膚に４時間閉塞貼付を行った後、ろ紙を剥離し洗浄する。その後処方例３の化粧水を塗布した。翌日も同部位に同じ操作を繰り返し、4日間処理を行い、バリア機能が破壊された皮膚部位とした。SDSの塗布を繰り返した皮膚部位では、TEWA値は３０−３５ｇ/ｍ２ｈを示し、非処理部位ではTEWA値は５−１０ｇ/ｍ２ｈを示した。TEWA値の測定はVAPO  METER（Delfintech）を用いて測定を行った。
10人の被験者の平均を皮膚水分蒸散量ランクとして示した。
【００５５】
結果は表-４、表―５に示した。また、バリア機能の目安になる、皮膚水分蒸散量ランクの評価基準は、表―６に示した。
比較例２−４には(A)、(B)、(C)群からいずれか２群を組み合わせた化粧水を塗布した場合のTEWA値を示したが、３群を組み合わせた実施例１−３、実施例８、実施例１２と比較して、いずれもTEWA値が大きく、皮膚バリア機能の改善効果が弱かった。比較例５−７には(A)、(B)、(C)群からいずれか１群を配合した化粧水を塗布した場合のTEWA値を示したが、３群を組み合わせた実施例１−３、実施例８、実施例１２と比較して、いずれもTEWA値が大きく、皮膚バリア機能の改善効果がさらに弱いことを示していた。一方、(A)群の実施例3の比較対照物としてBMAL-1タンパク産生促進効果の無いが保湿効果はあるメリッサ抽出液を加えた比較例８ではTEWA値が大きく、皮膚バリア機能の改善効果がさらに弱いことを示していた。また、(B)群の実施例６のサフラワー油メントールエステルの比較対照物としてリノール酸イソプロピルを添加した比較例９ではTEWA値が大きく、皮膚バリア機能の改善効果がさらに弱いことを示していた。さらに、(C)群のセバシン酸ジイソプロピル、シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコールを配合した実施例１、実施例１２の比較対照物として同じジカルボン酸エステルであるコハク酸ジオクチルを添加した比較例１０ではTEWA値が大きく、皮膚バリア機能の改善効果がさらに弱いことを示していた。同じく、(C)群のメントキシプロパンジオールを配合した実施例８の比較対照物としてメントール添加した比較例１１ではTEWA値が大きく、皮膚バリア機能の改善効果がさらに弱いことを示していた。
また、実施例１と比較して、実施例６ではセバシン酸ジイソプロピルの添加量を増加させた化粧料、実施例７はサフラワー油メントールエステルの添加量を増加させたものであるが、TEWA値の値が低く、皮膚バリア機能の改善効果が高くなっていることが認められた。また、この効果は実施例８、１１に示したようにメントキシプロパンジオールにおいても認められた。さらに、実施例１２、１３に示したようにシクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコールにおいても認められた。
尚、本実施例を使用した者に刺激を訴えるものはいなかった。
【００５６】
【表−４】
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【００５７】
【表−５】
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【００５８】
【表−６】
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次に、本発明の処方例を示すが、本発明はこれに限定されるものでない。
化粧料の処方例
【００５９】
処方例１
（１）化粧用クリーム（質量％）
ａ）ミツロウ・・・２．０
ｂ）ステアリルアルコール・・・５．０
ｃ）ステアリン酸・・・８．０
ｄ）スクワラン・・・１０．０
ｅ）自己乳化型グリセリルモノステアレート・・・３．０
ｆ）ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
ｇ）サフラワー油メントールエステル・・・０．５
ｈ）メントキシプロパンジオール・・・１．０
i）セージ抽出液・・・１．０
j）１，３−ブチレングリコール・・・５．０
ｋ）水酸化カリウム・・・０．３
ｌ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｍ）精製水・・・残部
製法
ａ）〜ｇ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。ｈ）〜ｍ）までを加熱溶解し、８０℃に保ち、ａ）〜ｇ）に加えて乳化し、４０℃まで撹拌しながら冷却する。
【００６０】
処方例２
（２）乳液（  質量％  ）
ａ）ミツロウ・・・０．５
ｂ）ワセリン・・・２．０
ｃ）スクワラン・・・８．０
ｄ）ソルビタンセスキオレエート・・・０．８
ｅ）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．２
ｆ）リノール酸メントールエステル・・・５．０
ｇ）シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコール・・・０．０５
ｈ）ニコチン酸アミド・・・０．０１
i）１，３−ブチレングリコール・・・７．０
j）カルボキシビニルポリマー・・・０．２
ｋ）水酸化カリウム・・・０．１
ｌ）精製水・・・残部
ｍ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｎ）エタノール・・・７．０
製法
ａ）〜ｇ）までを加熱溶解し、８０℃に保つ。ｈ）〜ｍ）までを加熱溶解し、８０℃に保ち、ａ）〜ｇ）に加えて乳化し、５０℃まで撹拌しながら冷却する。５０℃  でｎ）を添加し、４０℃まで攪拌、冷却する。
【００６１】
処方例３
（３）化粧水（質量％）
ａ）ニコチン酸アミド・・・１．０
ｂ）グリセリン・・・５．０
ｃ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
ｄ）エタノール・・・６．０
ｅ）香料・・・適量
ｆ）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
ｇ）精製水・・・残部
ｈ）セバシン酸ジイソプロピル・・・０．５
i)オレイン酸メントールエステル・・・・０．１
製法
ａ）〜i）までを混合し、均一に溶解する。
【００６２】
処方例４
（４）洗顔料（質量％）
ａ）ステアリン酸・・・１２  ．０
ｂ）ミリスチン酸・・・１４  ．０
ｃ）ラウリン酸・・・５．０
ｄ）ホホバ油・・・３．０
e)サフラワー油メントールエステル・・・０．１
f)セバシン酸ジイソプロピル・・・０．０５
ｇ）グリセリン・・・１０．０
ｈ）ソルビトール・・・１５．０
i）１，３−ブチレングリコール・・・１０．０
j）ＰＯＥ（２０）グリセロールモノステアリン酸・・・２．０
ｋ）水酸化カリウム・・・５．０
ｌ）水・・・残部
ｍ）香料・・・適量
ｎ）セージ抽出液・・・１．０
製法
ａ）〜ｊ）までを加熱溶解し７０℃に保つ。ｌ）にｋ）を溶解後ａ）〜j）に加えケン化する。その後ｍ）、ｎ）を入れ攪拌しながら冷却する。
【００６３】
処方例５
（３）化粧水（質量％）
ａ）パントテン酸カルシウム・・・１．０
ｂ）ニコチン酸アミド・・・５．０
ｃ）グリセリン・・・５．０
ｄ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．）・・・１．０
e）エタノール・・・６．０
ｆ）リノール酸メントールエステル・・・０．０１
ｇ）シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸ビスエトキシジグリコール・・・１．０
ｈ）香料・・・適量
i）防腐剤・酸化防止剤・・・適量
j）精製水・・・残部
製法
ａ）〜ｊ）までを混合し、均一に溶解する。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
以上詳述したごとく、本発明の化粧料は、皮膚細胞に作用して細胞自ら保湿成分の産生を促進し、かつ皮膚のバリア機能を高める作用が強いため、カユミやカサツキといったアトピー症状の改善効果が期待できる。また、本発明の化粧料は、メントール特有の臭いも刺激もなく、安全性が高く、安心して使用することができる。