(57)【要約】試料中における、ＢＫＶなどのポリオーマウイルスの存在または不在について試験するための方法およびキットが提供される。該方法およびキットは、ＢＫＶを定量し、ＢＫＶをＪＣＶから区別するために有用である。本発明のある態様によると、試料中のポリオーマウイルスの存在または不在を試験するための方法であって、配列番号１の配列を有する核酸、その逆相補物または配列番号１と９０％以上の配列相同性を有する配列の存在または不在について前記試料を試験するステップを含む方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のポリオーマウイルスの存在または不在を試験する方法であって、配列番号１の配列を有する核酸、その逆相補物または配列番号１と９０％以上の配列相同性を有する配列の存在または不在について前記試料を試験するステップを含む、方法。
【請求項２】
配列番号１の核酸もしくはその逆相補物またはそれらのいずれかの一部を増幅するステップ、次いで、得られるアプリコンの存在または不在について試験するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験するステップが、前記試料を、ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸またはその逆相補物とハイブリッド形成可能な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験するステップが、融解曲線分析を行うことをさらに含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号２（ＢＫ＿Ｆ＿１．１）および配列番号３（ＢＫ＿Ｒ＿１．２）の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号４（ＢＫ＿Ｐ＿１．３）および配列番号５（ＢＫ＿Ｐ＿１．４）のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号２（ＢＫ＿Ｆ＿１．１）および配列番号６（ＢＫ＿Ｒ＿１．５）の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号４（ＢＫ＿Ｐ＿１．３）および配列番号５（ＢＫ＿Ｐ＿１．４）のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号２（ＢＫ＿Ｆ＿１．１）および配列番号３（ＢＫ＿Ｒ＿１．２）の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号４（ＢＫ＿Ｐ＿１．３）および配列番号２３（ＪＣ＿Ｐ＿１．５）のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号２（ＢＫ＿Ｆ＿１．１）および配列番号３（ＢＫ＿Ｒ＿１．２）の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号５（ＢＫ＿Ｐ＿１．４）および配列番号２３（ＪＣ＿Ｐ＿１．５）のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号８（ＢＫ＿Ｆ＿２．１）および配列番号９（ＢＫ＿Ｒ＿２．２）の増幅プライマーの使用を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験するステップが、２本鎖ＤＮＡと結合するシアニン色素の使用を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号４（ポリオーマウイルス＿Ｆ＿３．１）および配列番号６（ポリオーマウイルス＿Ｒ＿３．２）の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号９（ＢＫ＿Ｐ＿３．３）および配列番号１３（ＪＣＶ＿Ｐ＿３．４）のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号４（ポリオーマウイルス＿Ｆ＿３．１）および配列番号６（ポリオーマウイルス＿Ｒ＿３．２）の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号９（ＢＫ＿Ｐ＿３．３）のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号４（ポリオーマウイルス＿Ｆ＿４．１）および配列番号６（ポリオーマウイルス＿Ｒ＿４．２）の増幅プライマーの使用を含み、前記試験するステップが、少なくとも配列番号１４（ＢＫ＿Ｐ＿４．３）および配列番号１５（ＪＣＶ＿Ｐ＿４．４）のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成可能な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含むキット。
【請求項１５】
配列番号１の核酸、相補物もしくは転写産物またはその一部を増幅するための増幅プライマーをさらに含む請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
配列番号２（ＢＫ＿Ｆ＿１．１）および配列番号３（ＢＫ＿Ｒ＿１．２）の増幅プライマーと、配列番号４（ＢＫ＿Ｐ＿１．３）および配列番号５（ＢＫ＿Ｐ＿１．４）のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
配列番号２（ＢＫ＿Ｆ＿１．１）および配列番号６（ＢＫ＿Ｒ＿１．５）の増幅プライマーと、配列番号４（ＢＫ＿Ｐ＿１．３）および配列番号５（ＢＫ＿Ｐ＿１．４）のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
配列番号２（ＢＫ＿Ｆ＿１．１）および配列番号３（ＢＫ＿Ｒ＿１．２）の増幅プライマーと、配列番号４（ＢＫ＿Ｐ＿１．３）および配列番号２３（ＪＣ＿Ｐ＿１．５）のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
配列番号２（ＢＫ＿Ｆ＿１．１）および配列番号３（ＢＫ＿Ｒ＿１．２）の増幅プライマーと、配列番号５（ＢＫ＿Ｐ＿１．４）および配列番号２３（ＪＣ＿Ｐ＿１．５）のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項１５に記載のキット。
【請求項２０】
配列番号４（ポリオーマウイルス＿Ｆ＿３．１）および配列番号６（ポリオーマウイルス＿Ｒ＿３．２）の増幅プライマーと、配列番号９（ＢＫ＿Ｐ＿３．３）および配列番号１３（ＪＣＶ＿Ｐ＿３．４）のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項１５に記載のキット。
【請求項２１】
配列番号４（ポリオーマウイルス＿Ｆ＿３．１）および配列番号６（ポリオーマウイルス＿Ｒ＿３．２）の増幅プライマーと、配列番号９（ＢＫ＿Ｐ＿３．３）のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項１５に記載のキット。
【請求項２２】
配列番号４（ポリオーマウイルス＿Ｆ＿４．１）および配列番号６（ポリオーマウイルス＿Ｒ＿４．２）の増幅プライマーと、配列番号１４（ＢＫ＿Ｐ＿４．３）および配列番号１５（ＪＣＶ＿Ｐ＿４．４）のオリゴヌクレオチドプローブとを含む請求項１５に記載のキット。
【請求項２３】
配列番号８（ＢＫ＿Ｆ＿２．１）および配列番号９（ＢＫ＿Ｒ＿２．２）の増幅プライマーを含むキット。
【請求項２４】
請求項１から１３のいずれかに記載の方法を含む、ポリオーマウイルスの存在について臓器提供者からの血液試料を試験する方法。
【請求項２５】
提供が検討される前記臓器が、腎臓、肝臓および心臓からなる群より選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ポリオーマウイルスについて陽性であることが見出された臓器提供者からの臓器を拒否するステップをさらに含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ポリオーマウイルスを有する患者の治療を監視する方法であって、請求項１から１３のいずれかに記載の方法を用いて前記患者におけるポリオーマウイルスのウイルス量を測定するステップを含む、方法。
【請求項２８】
前記ウイルス量が、前記治療の前または治療中に測定される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療が、抗ウイルス剤の投与を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗ウイルス剤が、シドフォビル、レフルノミド、キノロン抗生物質および静脈内免疫グロブリンからなる群より選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号２および配列番号６の増幅プライマーと、配列番号１４のプローブとの使用を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号４および配列番号６の増幅プライマーと、配列番号１４のプローブとの使用を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号２およびプライマーＢＫＶ＿５．２の増幅プライマーと、配列番号１４のプローブとの使用を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記増幅ステップが、少なくとも配列番号４およびプライマーＢＫＶ＿５．２の増幅プライマーと、配列番号１４のプローブとの使用を含む請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する特許出願への相互参照）
この出願は、２００８年２月２０日に出願された、米国仮特許出願第６１／０６４，１６６号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先日の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトポリオーマウイルスＪＣおよびＢＫは集団に遍在する。これらのウイルスによる一次感染は、通常無症候性であり、一過的なウイルス尿症をもたらし得る。一次感染に続いて、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）およびＢＫウイルス（ＢＫＶ）は、両方とも腎組織およびＢリンパ球における潜伏を確立する（非特許文献１）。ポリオーマウイルス関連疾患は、免疫の減損に多大に関連し、免疫無防備状態の患者における、この病因因子の迅速な検出および鑑別は、臨床上の管理を補助するのに重要である。ＪＣＶは、主にＡＩＤＳ患者で生じる、神経学的な疾患である進行性多病巣性白質脳障害の原因因子である一方、ＢＫＶ関連疾患としては、出血性膀胱炎、尿管狭窄症および他の尿路疾患が挙げられ、これらは、免疫抑制療法を受けている移植患者において最も一般的に見出される。
【０００３】
ポリオーマウイルスを検出し同定するための従来の方法は、血清学的方法、細胞培養によるウイルス単離および電子顕微鏡検査を含む。最近、ある範囲の臨床試料においてポリオーマウイルスを検出するためにＰＣＲが有効なツールであることが研究により示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇ．Ｌｅｃａｔｓａｓ、Ｂ．Ｄ．Ｓｃｈｏｕｂ、Ａ．Ｒ．ＲａｂｓｏｎおよびＭ．Ｊｏｆｆｅ、Ｌｅｔｔｅｒ、Ｌａｎｃｅｔ（１９７６）２：９０７〜９０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ポリオーマウイルスについての有効な検出アッセイの開発における主な障害は、ＢＫＶおよびＪＣＶのヌクレオチド配列中の多数の種内多形性である。ＳＮＰ、挿入および欠失のようなヌクレオチド多形性は、これまで、感染を検出するための信頼できる手段の開発を妨げてきた。より堅固なアッセイが、したがって、必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のある態様によると、試料中のポリオーマウイルスの存在または不在を試験するための方法であって、配列番号１の配列を有する核酸、その逆相補物または配列番号１と９０％以上の配列相同性を有する配列の存在または不在について前記試料を試験するステップを含む方法が提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、方法は、配列番号１の核酸もしくはその逆相補物またはそれらのいずれかの一部を増幅するステップ、次いで、得られるアプリコンの存在または不在について試験するステップをさらに含む。いくつかの態様において、試験するステップは、試料を、ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸またはその逆相補物とハイブリッド形成可能な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含むか、または融解曲線分析を行うことによる。
【０００８】
ある実施形態において、方法は、少なくとも配列番号２および配列番号３の増幅プライマーの使用を含み、試験するステップは、少なくとも配列番号４および配列番号５のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。
【０００９】
別の実施形態において、方法は、少なくとも配列番号２および配列番号６の増幅プライマーの使用を含み、試験するステップは、少なくとも配列番号４および配列番号５のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。
【００１０】
別の実施形態において、方法は、少なくとも配列番号２および配列番号３の増幅プライマーの使用を含み、試験するステップは、少なくとも配列番号４および配列番号２３のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。
【００１１】
さらに別の実施形態において、方法は、少なくとも配列番号２および配列番号６の増幅プライマーの使用を含み、試験するステップは、少なくとも配列番号４および配列番号２３のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。
【００１２】
さらに別の実施形態において、方法は、少なくとも配列番号８および配列番号９の増幅プライマーの使用を含む。ある態様において、試験するステップは、２本鎖ＤＮＡに結合するシアニン色素の使用を含む。
【００１３】
別の実施形態において、方法は、少なくとも配列番号４および配列番号６の増幅プライマーの使用を含み、試験するステップは、少なくとも配列番号９および配列番号１３のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。配列番号９および配列番号１３のプローブは、試験するステップにおいて別個にまたは同時に用いることができる。
【００１４】
別の実施形態において、方法は、少なくとも配列番号４および配列番号６の増幅プライマーの使用を含み、試験するステップは、少なくとも配列番号１４および配列番号１５のオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む。
【００１５】
別の実施形態において、方法は、少なくともＢＫＶ＿５．２およびＢＫＶ＿５．１の増幅プライマーの使用を含む。これらのプライマーは、ＶＰ２／３遺伝子の尾部近くにある。ＶＰ２／３とＶＰ１とは別々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するが、ＢＫＶ５．２およびＢＫＶ５．１プライマーは、ＶＰ１遺伝子の始めと重複するＶＰ２／３遺伝子領域を増幅する。
【００１６】
別の態様において、配列番号１の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成可能な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含むキットが提供される。ある態様において、キットは、配列番号１の核酸、相補物もしくは転写産物またはそれらの一部を増幅するための増幅プライマーをさらに含む。
【００１７】
ある実施形態において、キットは、配列番号２および配列番号３の増幅プライマーと、配列番号４および配列番号５のオリゴヌクレオチドプローブとを含む。
【００１８】
別の実施形態において、キットは、配列番号２および配列番号６の増幅プライマーと、配列番号４および配列番号５のオリゴヌクレオチドプローブとを含む。
【００１９】
別の実施形態において、キットは、配列番号２および配列番号３の増幅プライマーと、配列番号４および配列番号２３のオリゴヌクレオチドプローブとを含む。
【００２０】
さらに別の実施形態において、キットは、配列番号２および配列番号６の増幅プライマーと、配列番号４および配列番号２３のオリゴヌクレオチドプローブとを含む。
【００２１】
別の実施形態において、キットは、配列番号４および配列番号６の増幅プライマーと、配列番号９および配列番号１３のオリゴヌクレオチドプローブとを含む。配列番号９および配列番号１３のプローブは、別個にまたは同時に用いることができる。
【００２２】
ある実施形態において、キットは、配列番号４および配列番号６の増幅プライマーと、配列番号１４および配列番号１５のオリゴヌクレオチドプローブとを含む。
【００２３】
ある実施形態において、キットは、配列番号８および配列番号９の増幅プライマーを含む。
【００２４】
別の実施形態において、キットは、ＢＫＶ＿５．２およびＢＫＶ＿５．１の増幅プライマーを含む。これらのプライマーは、ＶＰ２／３遺伝子の尾部近くにある。ＶＰ２／３とＶＰ１とは別々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するが、ＢＫＶ５．２およびＢＫＶ５．１プライマーは、ＶＰ１遺伝子の始めと重複するＶＰ２／３遺伝子領域を増幅する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、増幅プライマーの少なくとも１つは、ＢＫＶゲノムＤＮＡとストリンジェントな条件下で特異的に結合する。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つは、ＢＫＶゲノムＤＮＡと特異的に結合する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つは、ＪＣＶゲノムＤＮＡと特異的に結合する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、キットは、アンプリコンまたは結合したプローブの検出を容易にする試薬も含む。
【００２７】
別の態様において、上記の方法を用いてポリオーマウイルスの存在について臓器提供者からの血液試料を試験するための方法が提供される。別に、ポリオーマウイルスを有する患者の治療を監視するための方法であって、上記の方法を用いて前記患者におけるポリオーマウイルスのウイルス量を測定するステップを含む方法が提供される。ある例において、ウイルス量は、治療前および治療中に測定される。このような治療は、シドフォビル、レフルノミド、キノロン抗生物質および／または静脈内免疫グロブリンなどの抗ウイルス剤の投与を含み得る。
【００２８】
その他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになる。詳細な記載および具体的な実施例は、本発明の精神および範囲内の種々の変更および改変がこの詳細な記載から当業者に明らかになるので、説明のためにのみ与えられる。さらに、実施例は本発明の原理を証明するのであり、当業者に明らかに有用な全ての実施例への本発明の使用を具体的に説明することは期待できない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＢＫＶおよびＪＣＶのＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。試料Ａ１およびＡ７は、ウイルスＤＮＡを含まない対照である。Ａ２は、ＢＫＶ  ＤＮＡを８×１０５コピーの最終濃度で含む。Ａ３からＡ６は、それぞれ８×１０４コピー、８×１０３コピー、８×１０２コピー、８×１０１コピーの濃度でのＢＫＶ  ＤＮＡの系列希釈を含む。Ａ８は、ＪＣＶ  ＤＮＡを８×１０５コピーの最終濃度で含む。Ａ９からＡ１２は、それぞれ８×１０４コピー、８×１０３コピー、８×１０２コピー、８×１０１コピーの濃度でのＪＣＶ  ＤＮＡの系列希釈を含む。
【図２】図２は、図１の増幅曲線に基づく標準回帰曲線を示す。標準曲線の誤差率（Ｐ値）は０．０９４９であり、効率は１．９３５である。
【図３】図３は、融解曲線解析を示す。この図は、それぞれ、ウイルスＤＮＡを含まない試料、ＪＣＶ  ＤＮＡのみを含む試料およびＢＫＶ  ＤＮＡのみを含む試料の融解ピークを示す。
【図４】図４は、ＢＫＶおよびＪＣＶのＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。試料Ｄ１は、ウイルスＤＮＡを含まない陰性対照である。Ｄ２は、ＢＫＶ  ＤＮＡを８×１０５コピーの最終濃度で含む。Ｄ３からＤ６は、それぞれ８×１０４コピー、８×１０３コピー、８×１０２コピー、８×１０１コピーの濃度でのＢＫＶ  ＤＮＡの系列希釈を含む。ウェルＤ７からＤ１２は、それぞれウェルＤ１からＤ６の重複である。試料Ｅ１はブランク対照である。試料Ｅ２は、８×１０５のＢＫＶ  ＤＮＡコピーと８×１０５のＪＣＶ  ＤＮＡコピーの濃度でＢＫＶ  ＤＮＡ対ＪＣＶ  ＤＮＡを１：１の比率で含む。試料Ｅ３〜Ｅ６は、ウェルＥ２の試料の１０倍系列希釈を含み、Ｅ３：８×１０４のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび８×１０４のＪＣＶ  ＤＮＡコピー；Ｅ４：８×１０３のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび８×１０３のＪＣＶ  ＤＮＡコピー；Ｅ５：８×１０２のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび８×１０２のＪＣＶ  ＤＮＡコピー；Ｅ６：８×１０１のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび８×１０１のＪＣＶ  ＤＮＡコピーの濃度である。ウェルＥ７〜Ｅ１２は、それぞれウェルＥ１〜Ｅ６の重複である。
【図５】図５は、図４の増幅曲線に基づく標準回帰曲線を示す。標準曲線の誤差率（Ｐ値）は０．０３９１であり、効率は１．９３４である。
【図６】図６は、融解曲線解析を示す。この図は、ＢＫＶ  ＤＮＡとＪＣＶ  ＤＮＡとを１：１の比率で異なる濃度にて含む試料についての融解ピークを示す。Ｅ１：ウイルスＤＮＡを含まない陰性対照試料；Ｅ２：８×１０５のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび８×１０５のＪＣＶ  ＤＮＡコピー；Ｅ３：８×１０４のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび８×１０４のＪＣＶ  ＤＮＡコピー；Ｅ４：８×１０３のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび８×１０３のＪＣＶ  ＤＮＡコピー；Ｅ５：８×１０２のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび８×１０２のＪＣＶ  ＤＮＡコピー；Ｅ６：８×１０１のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび８×１０１のＪＣＶ  ＤＮＡコピー。ウェルＥ７〜Ｅ１２は、それぞれウェルＥ１〜Ｅ６の重複である。
【図７】図７は、アッセイの能力を示す。米国病理学会（ＣＡＰ）により行われる比較アッセイにおいて種々のアッセイを比較した。本出願の方法を用いる定量的な結果は、それぞれの陽性ＣＡＰ試料についての中央値またはその付近であったが、他の技術を用いる他の実験室により得られる定量的な結果は、非常に多様であった。
【図８】図８は精度アッセイを示す。増幅曲線は、広範なダイナミックレンジにわたる本発明の方法の精度および再現性を証明する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
ＢＫＶゲノムの安定で保存された領域が明らかにされ、試料がポリオーマウイルス、特にＢＫＶを含むかどうかを評価するために有効な標的であると決定された。１０種を超えるポリオーマウイルスからのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を、形態および機能の点で厳密な生物学的限定の下にヌクレオチド配列が置かれている領域、宿主免疫系からの限定的選択圧を経験した配列の産物、ならびにヌクレオチド配列または配列の産物が、効果的なウイルス複製および感染に必要であることについて比較して判断した。ＶＰ２遺伝子（ＮＣＢＩ受入番号ＹＰ＿７１７９３７）のＣ末端、特にアミノ酸２７２〜３２３を含む領域が、理想的な標的であると同定された。よって、ＢＫＶおよびＪＣＶを検出および定量する方法とともに、そのような方法において用いるためのプライマー、プローブおよびキットが提供される。
【００３１】
生物学的配列
本明細書で用いられる生物学的配列は、以下に説明される。
【００３２】
１４３７位〜１５９２位のＮＣＢＩ受入番号ＮＣ＿００１５３８の配列の一部を、標的ＢＫＶ配列として用いることができる（配列番号１）：
ＴＣＡＧＧＡＧＡＧＴＴＴＡＴＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＧＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＡＴＧＧＡＴＧＴＴＧＣＣＴＴＴＡＣＴＴＣＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＧＡＣＴＧＴＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＴＧ
さらに、１４３７位〜１６０５位のＮＣＢＩ受入番号ＮＣ＿００１５３８の別の部分を、標的配列として用いることができる。
【００３３】
さらに、１４３７位〜１６７９位のＮＣＢＩ受入番号ＮＣ＿００１５３８の別の部分を、標的配列として用いることができる。
【００３４】
さらに、１位〜５１５３位のＮＣＢＩ受入番号ＮＣ＿００１５３８の別の部分を、標的配列として用いることができる。
【００３５】
さらに、１位〜５１３０位のＮＣＢＩ受入番号ＮＣ＿００１６９９の別の部分を、標的配列として用いることができる。
【００３６】
表１は、例示的プライマーおよびプローブを同定し、ＮＣＢＩ受入番号ＮＣ＿００１５３８またはＮＣ＿００１６９９に対するそれらの位置を示す。
【００３７】
【表１−１】
2011512160.tif 000003
【００３８】
【表１−２】
2011512160.tif 000004
【００３９】
【表１−３】
2011512160.tif 000005
方法
本発明は、全般的に、試料中のポリオーマウイルス、特にＢＫＶの検出に関する。ある態様において、ＢＫＶは、定量され、および／またはＪＣＶから区別される。
【００４０】
ある態様において、ポリオーマウイルスの存在または不在を試験する方法は、配列番号１の配列を有する核酸もしくはその逆相補物の存在または不在について試料を試験するステップを含む。いくつかの実施形態において、核酸はＤＮＡを含み、別の実施形態において、核酸はＲＮＡを含む。
【００４１】
配列番号１の核酸およびその逆相補物は、当該技術において公知の任意の方法を用いて検出できる。ある実施形態において、配列番号１の核酸またはその逆相補物は、該核酸と特異的にハイブリッド形成するプローブを用いて検出される。典型的には、検出は、プローブを試料と、プローブが存在するならば領域と特異的にハイブリッド形成する条件下で接触させるステップと、ハイブリッド形成産物の存在または不在を検出するステップとを含む。ハイブリッド形成産物の存在は、配列番号１の核酸の存在を示す。逆に、ハイブリッド形成産物の不在は、配列番号１の核酸の不在を示す。
【００４２】
プローブは、典型的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたは合成核酸などの核酸である。プローブは、配列番号１の核酸またはそれぞれその逆相補物と優先的にまたは選択的にハイブリッド形成するが、その他のいずれのＤＮＡまたはＲＮＡ配列ともハイブリッドしないならば、配列番号１の核酸またはその逆相補物と特異的にハイブリッド形成する。
【００４３】
プローブは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で配列番号１の核酸と特異的にハイブリッド形成する。ハイブリッド形成を許容する条件は、当該技術において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５年））。
【００４４】
一般的に、「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」とは、完全な塩基対形成２本鎖ＤＮＡハイブリッドの融解温度のおよそ１０℃下のことである（Ｔｍ−１０という）。完全な塩基対形成２本鎖ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）は、以下のよく確立された式を用いて正確に予測できる：
Ｔｍ＝１６．６×ｌｏｇ［Ｎａ３０］＋０．４１×％Ｇ：Ｃ＋８１．５−０．７２×（％）（ｗ／ｖ）ホルムアミド
この式は、種々の塩およびホルムアミドの濃度を有する溶液中での種々のＤＮＡについての非ストリンジェントおよびストリンジェントなハイブリッド形成条件を決定するための参照点を、それぞれのハイブリッド形成条件でそれぞれ個別のＤＮＡについてのＴｍを実験的に測定する必要なく設定するための簡便な手段を提供する。
【００４５】
プローブは、配列番号１の核酸と同じ長さ、それより短いかまたはそれより長いことが可能である。プローブは、典型的には、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも７５または少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。例えば、プローブは、５〜２００、７〜１００、１０〜５０ヌクレオチドの長さであり得る。プローブは、好ましくは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチドの長さである。プローブは、好ましくは、配列番号１の核酸またはその逆相補物との配列同一性に基づいて、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を共有する配列を含む。
【００４６】
配列相同性を決定するために当該技術における標準的な方法を用いてよい。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、例えばそのデフォルト設定で使用して、相同性を決定するために用いることができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４年；１２巻：３８７〜３９５頁）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ、１９９３年；３６巻：２９０〜３００頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９９０年；２１５巻：４０３〜１０頁）に記載されるように、相同性の計算または配列の整列（等価な残基または相当する配列の同定など（典型的にはそれらのデフォルト設定で））に使用できる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。
【００４７】
プローブは、検出可能に標識される。検出可能標識は、プローブと普遍的領域との間の特異的ハイブリッド形成により形成されるハイブリッド形成産物の存在または不在（よって、普遍的領域の存在または不在）が決定されることを可能にする。任意の標識を用いることができる。適切な標識は、それらに限定されないが、蛍光分子、放射性同位体、例えば１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体およびビオチンなどのリンカーを含む。
【００４８】
ある態様において、プローブは、分子ビーコンプローブであり得る。分子ビーコンプローブは、一方の端に蛍光標識を、他方の端に消光分子を含む。検出される領域が不在の場合、プローブはヘアピンループを形成し、消光分子が蛍光標識に接近して、それゆえシグナルが検出できない。検出される領域とのプローブのハイブリッド形成の際に、ループがほどかれ、蛍光分子が消光剤から離れて、それゆえシグナルが検出できる。分子ビーコンにおいて用いるための適切な蛍光分子と消光剤との組合せは、当該技術において公知である。このような組合せは、それらに限定されないが、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）およびダブシル（ｄａｂｃｙｌ）を含む。
【００４９】
別の実施形態において、プローブは、当該技術において公知の任意の技術を用いて支持体上に固定化できる。適切な固体支持体は、当該技術において周知であり、マルチウェルプレートなどのプレート、フィルタ、メンブレン、ビーズ、チップ、ピン、ディップスティックおよび多孔性担体を含む。
【００５０】
ある実施形態において、核酸自体が検出される。別の実施形態において、核酸から転写されたＲＮＡが検出される。核酸から転写されたＲＮＡが試料中に存在することは、それ自体で、試料中の核酸の存在を示す。
【００５１】
いくつかの実施形態において、方法は、配列番号１の核酸もしくはその逆相補物またはそれらのいずれかの一部を増幅するステップ、次いで、得られるアンプリコンの存在または不在について試験するステップをさらに含む。例えば、増幅は、配列番号２と配列番号３、配列番号２と配列番号６、配列番号７と配列番号１７または配列番号７と配列番号１８などのフォワードプライマーとリバースプライマーとの対を用いて達成できる。フォワードおよびリバースプライマーのわずかにより長いかまたはより短いバージョンも用い得ることが理解される。例えば、増幅ステップは、配列番号１９および配列番号２０のプライマーの使用を含み得る。異なる組合せのフォワードおよびリバースプライマーを用いてアンプリコンを生成できることも理解される。
【００５２】
ある実施形態において、標的は、その存在が決定される前に増幅される。別の実施形態において、標的は、その存在が決定されるのと同時にリアルタイムで検出される。リアルタイム法は実施例に開示され、当該技術において記載されている。このような方法は、例えば米国特許第５，４８７，９７２号およびＡｆｏｎｉａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００２年；３２巻：９４６〜９頁）に記載される。
【００５３】
ＤＮＡまたはＲＮＡは、当該技術において公知の日常的な方法を用いて増幅できる。いくつかの実施形態において、標的核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号を参照）；リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）（例えばＬａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１巻：１０７７〜１０８０頁（１９８８年）；Ｄ．Ｙ．  ＷｕおよびＲ．Ｂ．  Ｗａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４巻：５６０〜５６９頁（１９８９年）；ならびにＦ．  Ｂａｒａｎｙ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．  １巻：５〜１６頁（１９９１年）を参照されたい）；ループ媒介型等温増幅（「ＬＡＭＰ」）（Ｎａｇａｍｉｎら、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ４７巻（９号）：１７４２〜１７４３頁（２００１年）；Ｎｏｔｏｍｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８巻（１２号）：Ｅ６３頁（２０００年））；核酸配列に基づく分析（ＮＡＳＢＡ）（Ｊ．  Ｃｏｍｐｔｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０巻：９１〜９２頁（１９９１年））；自家持続配列複製（「３ＳＲ」）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８７巻（５号）：１８７４〜１８７８頁（１９９０年））；鎖置換型増幅（「ＳＤＡ」）（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻：１６９１〜１６９６頁（１９９２年）；およびＷａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９巻：３９２〜３９６頁（１９９２年））；または転写媒介型増幅（「ＴＭＡ」）（Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３５巻（３号）：６７６〜６７８頁（１９９７年））を用いて行われる。
【００５４】
当業者は、配列番号１の核酸を増幅するための特異的プライマーを設計できる。プライマーは、通常、増幅される配列のいずれかの端で配列と相補的であるが、いずれのその他の配列とも相補的でないように設計される。プライマー設計は、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、２００１年で論じられている。
【００５５】
アンプリコンは、上記のものを含む当該技術で公知の任意の方法を用いて検出できる。いくつかの実施形態において、副溝結合剤（ＭＧＢ）分子を用いる加水分解プローブフォーマット（例えばＴａｑｍａｎ）を用いてアンプリコンを検出できる。その他の実施形態において、２本鎖ＤＮＡと結合するシアニン色素が用いられる。例示的なシアニン色素は、それらに限定されないが、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＩＩ、ＳＹＢＲ  ＧＯＬＤ、ＹＯ（オキサゾールイエロー）、ＴＯ（チアゾールオレンジ）およびＰＧ（ピコグリーン）を含む。
【００５６】
その他の実施形態において、試験するステップは、融解曲線分析を行うことを含み得る。ＰＣＲの最後での蛍光−対−温度プロットの検分は、ある色素またはプローブフォーマットが用いられる場合に、さらなる情報を与え得る。例えば、色素ＳＹＢＲグリーンを用いて、ＰＣＲ産物の融解温度により、それらの純度およびそれが何であるかを確認できる。同様に、ハイブリッド形成プローブを用いる場合、多形性を含めた配列の変化が、プローブ融解温度により識別できる。
【００５７】
ある例において、最後のＰＣＲサイクルの直後に、試料を９０℃〜９５℃にて変性させ、対象のＴｍ範囲の約５℃〜１０℃下まで冷却し、典型的には０．１〜０．４℃／秒の範囲の傾斜速度にてゆっくりと加熱し、その間に蛍光を連続的に監視する。特定の蛍光化学に応じて、（ａ）プローブがアンプリコンから解離する（ハイブリッド形成プローブの場合）場合、または（ｂ）２本鎖ＰＣＲ産物が１本鎖ＤＮＡに解離するいずれかの温度に到達した場合に、蛍光の顕著な減少が観察される。
【００５８】
融解温度の移行は、まとめて生じるのでなく、温度の小さい範囲にわたって生じる。蛍光−対−温度プロット上の融解曲線勾配の中央は、Ｔｍとよばれる。融解温度またはＴｍは、ＤＮＡ２本鎖の熱安定性の指標であり、長さ、Ｇ／Ｃ含量およびそれぞれのタイプのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃなど）の相対的位置を含む多数の因子に依存する（Ｗｅｔｍｕｒ，  Ｊ．Ｇ．１９９７年．ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２６巻：２２７〜２５９頁）。融解温度は、ＤＮＡ：ＤＮＡまたはプローブ：ＤＮＡ２本鎖の間で生じ得るヌクレオチドミスマッチ（Ａ：Ａ、Ａ：Ｇ、Ｇ：Ｔ、Ｇ：Ａなど）の数、相対的な位置およびタイプにさらに依存する（Ｓ．Ｈ．  ＫｅおよびＷａｒｔｅｌｌ，  Ｒ．  １９９３年．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ  ｉｎ  ｌｏｎｇ  ＤＮＡ：  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１巻：５１３７〜５１４３頁）。標的産物のサイズおよび配列がわかっていれば、融解温度により特定のアンプリコンの存在を確認することが、よって、可能である。同様に、配列変動による異なる融解温度に基づいて、２つの別々の種を区別することが可能である。ＰＣＲに基づく検出系における融解曲線分析の実用性および有用性は周知である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、増幅ステップは、少なくとも一方のプライマーがＢＫＶに特異的でないプライマー対の使用を含む。例えば、方法は、それらに限定されないが、配列番号２と配列番号３、配列番号２と配列番号６、配列番号１９と配列番号２０、配列番号７と配列番号１７、配列番号７と配列番号１８または配列番号４と配列番号６を含むプライマー対と試料とを接触させることにより、配列番号１の核酸を増幅するステップを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ストリンジェントな条件下でＢＫＶと特異的にハイブリッド形成できる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む試験するステップをさらに含む。例示的なプローブは、それらに限定されないが、配列番号５、配列番号９、配列番号１４、配列番号１６および配列番号２１を含む。
【００６０】
その他の実施形態において、増幅ステップは、少なくとも一方のプライマーがＢＫＶに特異的なプライマー対の使用を含む。例えば、方法は、配列番号８および配列番号９の核酸配列を有するプライマーを少なくとも用いて配列番号１の核酸を増幅するステップを含み得る。ある実施形態において、試験するステップは、２本鎖ＤＮＡと結合するシアニン色素の使用を含む。
【００６１】
さらに別の態様において、試料中のＪＣＶの存在または不在について試験するための方法が提供される。このような方法は、試料中の配列番号１の核酸、その逆相補物もしくは配列番号１と９０％以上の配列相同性を有する配列の存在または不在について試験するステップを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、増幅ステップは、少なくとも一方のプライマーがＢＫＶに特異的でないプライマー対の使用を含む。このようないくつかの実施形態において、方法は、それらに限定されないが、配列番号２と配列番号３、配列番号２と配列番号６、配列番号１９と配列番号２０、配列番号７と配列番号１７、配列番号７と配列番号１８または配列番号４と配列番号６を含むプライマー対と試料とを接触させることにより、配列番号１の核酸を増幅するステップを含む。このようないくつかの実施形態において、方法は、ストリンジェントな条件下でＪＣＶと特異的にハイブリッド形成できる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む試験するステップをさらに含む。例示的なプローブは、それらに限定されないが、配列番号１３、配列番号１５および配列番号２３を含む。
【００６３】
その他の態様において、方法は、１種または複数種のポリオーマウイルスの存在または不在について同時に試験するための多重反応において用いることができる。例えば、本発明の方法は、ＢＫＶおよびＪＣＶのそれぞれの存在または量を試料中で同時に検出するために用いることができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、プライマーは、ＢＫＶおよびＪＣＶの両方のＤＮＡを増幅でき、次いで、一方はＢＫＶに特異的であり、他方はＪＣＶに特異的な少なくとも２つのプローブを用いて、ＢＫＶおよびＪＣＶのそれぞれの存在または量について試験する。例えば、フルオレセインおよびローダミンのような異なる標識を、それぞれＢＫＶ特異的プローブおよびＪＣＶ特異的プローブについて用いてよい。代わりに、フルオレセインを両方のプローブについて用いる場合、それぞれのプローブについてのフルオロフォアは、２つのプローブ同士を識別するのに十分に異なる発光波長を有さなければならない。
【００６５】
キット
試料中の１種または複数種のポリオーマウイルスの存在について試験するためのキットが提供される。ある実施形態において、キットは、ハイブリッド形成プローブ：配列番号５および配列番号２３と、配列番号２および配列番号３を含むプライマー対とを含む。ある例において、配列番号５および配列番号２３は、５’端に受容体フルオロフォアと、３’端にＣ３ブロッカーまたはホスフェートとを含む。その他の実施形態において、キットは、ハイブリッド形成プローブ：配列番号９および配列番号１３と、配列番号４および配列番号６を含むプライマー対とを含む。ある例において、配列番号９および配列番号１３は、独特で識別可能な発光波長で蛍光を発する２つの別々のフルオロフォアで標識される。別の実施形態において、キットは、ハイブリッド形成プローブ：配列番号１４および配列番号１５と、配列番号４および配列番号６を含むプライマー対とを含む。
【００６６】
キットは、上記の本発明の方法を行うことを可能にする１つもしくは複数のその他の試薬または機器をさらに含んでよい。このような試薬または機器は、以下の１つまたは複数を含む：適切な緩衝剤（複数可）（水溶液）、またはそこで反応を行うことができるウェルを含む支持体。試薬は、キット中に、流体の試料が試薬を再懸濁するように乾燥状態で存在してよい。キットは、所望により、キットが本発明の方法において用いられることを可能にするための指示書を含んでよい。
【実施例】
【００６７】
（実施例１）
ポリオーマウイルスの検出
配列番号２および配列番号３のプライマーと、配列番号４および配列番号５のプローブを用いて、リアルタイム増幅アッセイを行った。アッセイは、ストリンジェントな条件下でＢＫＶのＤＮＡと特異的にハイブリッド形成するように設計された配列番号４のフルオレセイン標識供与体プローブと配列番号５のＬＣ６１０標識受容体プローブとを用いるリアルタイム検出を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を含んだ。種々の濃度のＢＫＶのＤＮＡおよびＪＣＶのＤＮＡを、ＤＮＡ試料を含まない陰性対照とともに試験した。
【００６８】
リアルタイムＰＣＲ増幅は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０  ＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で行い、データ分析は、製品とともに提供されるソフトウェアバージョンＬＣＳ４８０  １．２．９．１１を用いて行った。Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からの試薬を全ての反応について用いた。それぞれの２０μｌのＰＣＲ反応は、ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼを含む１×Ｆａｓｔ−Ｓｔａｒｔ  Ｈｙｂ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と、０．５μＭの各プライマー（配列番号２および配列番号３）と、０．２μＭの各プローブ（配列番号４および配列番号５）を含んだ。追加のＭｇＣｌ２を加えて、４．１２５ｍＭのＭｇＣｌ２の最終濃度を得た。種々の濃度でのＢＫＶのＤＮＡおよびＪＣＶのＤＮＡをそれぞれの反応ウェルに加え、Ａ２〜Ａ６のウェルはＢＫＶのＤＮＡをそれぞれ８×１０５コピー、８×１０４コピー、８×１０３コピー、８×１０２コピーおよび８×１０１コピー含み、ウェルＡ８〜Ａ１２はＪＣＶのＤＮＡをそれぞれ８×１０５コピー、８×１０４コピー、８×１０３コピー、８×１０２コピーおよび８×１０１コピー含んだ。ウェルＡ１およびＡ７はウイルスＤＮＡを含まず、陰性対照として機能した。サーマルサイクラーパラメータは、９５℃にて１０分間の１サイクル、９５℃にて１０秒間、５５℃にて５秒間、および７２℃にて１０秒間の４５サイクルを含んだ。ＰＣＲ増幅中の蛍光シグナルを、６１０ｎｍの波長にてＬＣＳ４８０ソフトウェアを用いてリアルタイムで監視した。
【００６９】
融解曲線分析も、製造業者の指示書に従って行った。特に、融解曲線サイクルは、９５℃まで１０秒間の試料の加熱と、次いで４２℃まで１分間の冷却、次いで９０℃への温度の上昇を含んだ。それぞれの反応についての蛍光出力は、１℃当たり５回の収集にて連続的に測定した。プローブについての融解温度は、ＬＣＳ４８０ソフトウェアにより決定した。
【００７０】
結果を、図１〜３に示す。
【００７１】
図１に示すように、試験した試料は、明確で重複しない蛍光シグナルを示す。最も早い交点（Ｃｐ、蛍光レベルがバックグラウンドを超えて上昇するときのサイクル数）を有する試料は、最大濃度のＢＫＶのＤＮＡを有する試料に相当する。蛍光の指数関数的上昇は、ＢＫＶのＤＮＡを含む試料中でのみ検出された。バックグラウンドレベルを超える蛍光は、ＪＣＶのＤＮＡのみを含む試料中では観察されず、このことは、プローブが、５５℃のアニーリング温度にてＢＫＶ  ＤＮＡのみとハイブリッド形成し、ＪＣＶ  ＤＮＡとはハイブリッド形成しなかったことを示す。試験は２連で行い、キットの精度と信頼性を示す。全体として、アッセイは、プローブの特異性と、ＢＫＶとＪＣＶとを区別するキットの能力とを示す。
【００７２】
図２の標準曲線は、０．０９４９の低い誤差率（Ｐ値）を有し、１０５〜１０１のＢＫＶ  ＤＮＡコピー濃度の範囲にわたってＢＫＶ  ＤＮＡの量を測定することにおけるアッセイの正確性を示す。プライマーの高い効率は、１．９３５の実験的に得られたＰＣＲ増幅効率により証明される。
【００７３】
図３に示すように、陽性試料は、融解温度によりＢＫＶと確証できる。受容体フルオロフォアによる蛍光発光は、配列番号４および配列番号５の両方が標的アンプリコンとハイブリッド形成して、ＦＲＥＴが生じることを可能にしたときにのみ検出される。配列番号４のプローブのヌクレオチド配列は、ＢＫＶおよびＪＣＶに対して１００％相同である。つまり、配列番号４は、ＢＫＶおよびＪＣＶの両方と結合する。配列番号５は、ＢＫＶのＤＮＡと１００％相同であるが、ＪＣＶのＤＮＡとは３ヌクレオチドのミスマッチがある。このことは、ＢＫＶについて６０℃〜６４℃で観察されたＴｍ、およびＪＣＶの場合の４７℃〜５０℃で観察されたＴｍに対応する。よって、ＢＫＶ  ＤＮＡとＪＣＶ  ＤＮＡとの間では、配列番号４のプローブのＴｍにおいておよそ１０℃の差が観察される。その結果、プライマー／プローブのアニーリングステップが５５℃以上で行われた場合、ＪＣＶ  ＤＮＡのみを含む試料では蛍光の増加が観察されない。よって、配列番号４は、プライマーまたはプローブのいずれかとして用いられるが、ＢＫＶをＪＣＶから区別できる。
【００７４】
（実施例２）
ＢＫＶおよびＪＣＶを含む試料の評価
ＢＫＶおよびＪＣＶの両方を含む試料を、実施例１に記載される一般的な条件を用いて評価した。ウェルＤ１は、ウイルスＤＮＡを含まない陰性対照である。ウェルＤ２〜Ｄ６は、ＢＫＶ  ＤＮＡをそれぞれ８×１０５コピー、８×１０４コピー、８×１０３コピー、８×１０２コピーおよび８×１０１コピーで含む。ウェルＤ７〜Ｄ１２は、それぞれウェルＤ１〜Ｄ６の重複である。ウェルＥ１はウイルスＤＮＡを含まない陰性対照である。ウェルＥ２〜Ｅ６は、ＢＫＶ  ＤＮＡ：ＪＣＶ  ＤＮＡの両方を１：１の比率で、それぞれＥ２：１０５のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび１０５のＪＣＶ  ＤＮＡコピー；Ｅ３：１０４のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび１０４のＪＣＶ  ＤＮＡコピー；Ｅ４：１０３のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび１０３のＪＣＶ  ＤＮＡコピー；Ｅ５：１０２のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび１０２のＪＣＶ  ＤＮＡコピー；Ｅ６：１０１のＢＫＶ  ＤＮＡコピーおよび１０１のＪＣＶ  ＤＮＡコピーの濃度で含む。ウェルＥ７〜Ｅ１２は、それぞれウェルＥ１〜Ｅ６の重複である。
【００７５】
増幅曲線、標準回帰曲線および融解ピークは、図４、図５および図６にそれぞれ示す。
【００７６】
図４は、プローブが、５５℃以上のアニーリング温度にてＢＫＶとハイブリッド形成するがＪＣＶ  ＤＮＡとはハイブリッド形成しないことを示す。図１の増幅曲線と比較すると、試料中にＢＫＶ  ＤＮＡと１：１の比率でＪＣＶ  ＤＮＡが存在することは、キットの再現性または精度に影響しない。よって、１：１までの比率でＢＫＶおよびＪＣＶの両方のＤＮＡを含む試料中で、高レベルの正確性および精度が維持される。
【００７７】
図５は、図２で観察される高レベルの正確性が再現可能であることを示す。
【００７８】
図６のグラフは、ＢＫＶおよびＪＣＶの両方のＤＮＡの混合物を含む試料中で観察される特徴的な２重融解ピークを示す。ＢＫＶ  ＤＮＡについての予測されるＴｍでの１つのピークと、ＪＣＶ  ＤＮＡについての予測されるＴｍでの２番目のピークとの２重融解ピークは、ＢＫＶおよびＪＣＶの両方を含む混合試料を示す。
【００７９】
（実施例３）
臨床試験
臨床試料の日常的な試験を、以下のプライマー／プローブの組合せを用いて行った：配列番号６および配列番号４のプライマーと配列番号１４のプローブ配列とからなる組合せ１；配列番号６および配列番号２のプライマーと配列番号１４のプローブ配列とからなる組合せ２；ＢＫＶ＿５．２および配列番号４のプライマーと配列番号１４のプローブ配列とからなる組合せ３；ＢＫＶ＿５．２および配列番号２のプライマーと配列番号１４のプローブ配列とからなる組合せ４。
【００８０】
ＰＣＲ反応は、４０μｌの最終反応容量を含む；１０μｌの試料および３０μｌのマスターミックス。マスターミックスの組成（３０μｌ）は、試料ウェルあたり４０μｌの合計容量について、３．１２５μＭの濃度のフォワードプライマー、３．１２５μＭの濃度のリバースプライマー、２．０〜２．５μＭの濃度のＭＧＢ  Ｔａｑｍａｎプローブ、２０μｌのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０プローブマスターミックスおよび１０μｌの試料ＤＮＡを含む。プライマープローブ組合せについてのＰＣＲサイクルパラメータは、ｉ）９５℃にて１０分間の最初の１回の変性サイクル、その後、ｉｉ）各サイクルの最後に１回の蛍光測定を行って９５℃にて１０秒間、６０℃にて１５秒間および７２℃にて１秒間を４５サイクル、そして所望によりｉｉｉ）４０℃にて３０秒間の９６ウェルプレートの最後の冷却であった。
【００８１】
４２個の尿検体および４０個の血漿検体の８２個の臨床検体の群を試験して、上記のプロトコルを用いてポリオーマウイルスを検出した。試験した尿試料について、３５個が陽性であると同定され、７個が陰性であると同定された。血漿試料について、２２個が陽性であると同定され、１８個が陰性であると同定された。合計で、試験した８２個の臨床試料のうち５７個がポリオーマウイルス陽性であると同定された。陽性と同定された全ての試料は、ウイルス尿症（ｖｉｕｒｉａ）および／またはウイルス血症の臨床的に確認された症例からであることが決定された。
【００８２】
（実施例４）
ＢＫＶウイルス量についての米国病理学会（ＣＡＰ）調査
２つの試料を、２つの別々のｃａｐ調査において検査して、ＢＫＶウイルス量について試験した。実施例３に詳細に記載した上記のアッセイプロトコルを用いて、全てのＢＫＶ陽性試料は、例えばＢＫＶ検出について商業的に入手可能なキットを含む多様な一連の技術を用いる全ての４３の調査参加者と一致することが同定された。図７に例示するように、ＣＡＰ精度管理試験の結果は、本出願の方法が、それぞれの陽性ＣＡＰ試料についての中央値またはその近傍であったことを示す。重要なことに、本出願の方法はそれぞれの試料についての中央値またはその近傍であったが、異なる方法を用いた他の参加者により得られた定量値は非常に変動していた。
【００８３】
（実施例５）
外部検査室との比較研究
本出願の方法を、外部の独立実験室との比較研究によりさらに検証した。合計で７４個の臨床試料を試験した。ポリオーマウイルス陽性またはポリオーマウイルス陰性のようなそれぞれの試料の臨床状態は、試験のときには未知であった。合計で７４個の未知試料は、３０個の尿試料と４４個の血漿試料との試料の組を含んだ。３０個の尿試料のうち、１０個はＢＫＶ陽性であり、２０個は陰性であった。４４個の血漿試料のうち、２４個はＢＫＶ陽性であり、２０個は陰性であった。本出願の方法を用いて、１００％の感度が達成された。感度および特異性は、以下の式を用いて算出された：
尿試料感度（％）＝（真の陽性／（真の陽性＋偽陽性））×１００＝（３４／（３４＋０））×１００＝１００％
血漿試料特異性（％）＝（真の陰性／（真の陰性＋偽陽性））×１００＝（４０／（４０＋０）×１００＝１００％  。
【００８４】
本方法の精度は、アッセイの精度を決定するための既知濃度の商業的な標準物質を用いて測定した。既知のＢＫウイルスＤＮＡの系列希釈を、配列番号４、ＢＫＶ＿５．２および配列番号１４のプライマープローブセットを用いる上記の方法に従って増幅した。増幅は３連で行い、表２は、本方法の精度についてまとめる。本出願の方法は、複数回行われた実験がわずかしか変動せず、それらの結果を直接比較し得ることを示す。
【００８５】
図８は、本方法の精度および再現性を示す２つ目の例を示す。増幅曲線は、広い幅の範囲にわたる本方法の精度および再現性を示す。
【００８６】
よって、本発明は、試料中のポリオーマウイルスＤＮＡの存在または不在について試験する方法であって、前記試験の結果が、予め決定された交点（Ｃｐ）にて９５％を超える精度、好ましくは９７％を超える精度で再現できる方法に関する。より好ましくは、試験する方法は、測定されるＤＮＡの出発量が低いか、中程度かまたは高いかを決定する。
【００８７】
【表２−１】
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【００８８】
【表２−２】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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